(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リパーゼ活性を有するポリペプチドであって、当該ポリペプチドが、以下の、
ａ）２８０ｎｍでの吸収（Ａ２８０）に対するリパーゼ活性（ＬＵ）が５００ＬＵ／Ａ２８０未満であり、ここでＬＵの１単位（１ＬＵ）は、３０℃、ｐＨ７で、１分当たり１マイクロモルのブチル酸を放出できる酵素量として定義され、且つポリペプチドの吸収は２８０ｎｍで測定される；
ｂ）リスク機能臭気（Risk performance odor）（Ｒ）が０．５未満であり、ここでＲは、ポリペプチド洗浄見本から放出されたブチル酸量と参照ポリペプチド洗浄見本から放出されたブチル酸量の比として計算され、ここで両方の値は、比の計算の前に、非ポリペプチド洗浄見本から放出されたブチル酸量で補正されている；又は
ｃ）利益リスク因子（Benefit Risk factor）（ＢＲ）が少なくとも１．８であり、ここで、ＢＲは、リスク機能臭気（Ｒ）で除した平均洗浄機能（wash performance）（ＲＰavg）として定義される、
のうち少なくとも１つを有すると共に、
配列番号２において、Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋのアミノ酸変更を有すると共に、更に
ａ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ、又は、
ｂ）Ｅ２１０Ｖ／Ｇ
のうち少なくとも何れかのアミノ酸変更を更に含む、ポリペプチド。
【請求項２】
位置Ｉ８６Ｖ又はＴ１４３Ｓに少なくとも１つのアミノ酸変更をさらに含んでなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２の、位置Ｅ１、Ｄ２７、Ｎ３３、Ｓ８３、Ｇ９１、Ｎ９４、Ｋ９８、Ｅ９９、Ｄ１０２、Ｄ１１１、Ｇ１６３、Ｉ２０２、Ｅ２１０、Ｓ２１６、Ｌ２５９又はＬ２６９に対応する位置で、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失又は付加から選択される、少なくとも１つのさらなる変更を含んでなる、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記少なくとも１つの変更が、配列番号２の、Ｅ１Ｎ／*、Ｄ２７Ｎ、Ｎ３３Ｑ、Ｓ８３Ｔ、Ｇ９１Ｎ、Ｎ９４Ｒ、Ｋ９８Ｉ、Ｅ９９Ｋ、Ｄ１０２Ａ、Ｄ１１１Ｎ、Ｇ１６３Ｋ、Ｉ２０２Ｌ、Ｅ２１０Ａ、Ｓ２１６Ｐ、Ｌ２５９Ｆ、及びＬ２６９ＡＰＩＡからなる群から選択される、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
リパーゼ活性を有するポリペプチドであって、
配列番号２において、Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋのアミノ酸変更を有すると共に、更に
ａ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ；又は
ｂ）Ｅ２１０Ｖ／Ｇ；
の少なくとも何れかのアミノ酸変更を含んでなる、ポリペプチド。
【請求項６】
位置Ｉ８６Ｖ又はＴ１４３Ｓに少なくとも１つのアミノ酸変更をさらに含んでなる、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号２の、位置Ｅ１、Ｄ２７、Ｎ３３、Ｓ８３、Ｇ９１、Ｎ９４、Ｋ９８、Ｅ９９、Ｄ１０２、Ｄ１１１、Ｇ１６３、Ｉ２０２、Ｅ２１０、Ｓ２１６、Ｌ２５９又はＬ２６９に対応する位置で、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失又は付加から選択される、少なくとも１つのさらなる変更を含んでなる、請求項５又は６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記少なくとも１つの変更が、配列番号２の、Ｅ１Ｎ／*、Ｄ２７Ｎ、Ｎ３３Ｑ、Ｓ８３Ｔ、Ｇ９１Ｎ、Ｎ９４Ｒ、Ｋ９８Ｉ、Ｅ９９Ｋ、Ｄ１０２Ａ、Ｄ１１１Ｎ、Ｇ１６３Ｋ、Ｉ２０２Ｌ、Ｅ２１０Ａ、Ｓ２１６Ｐ、Ｌ２５９Ｆ、及びＬ２６９ＡＰＩＡからなる群から選択される、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ａ）Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｌ２６９ＡＰＩＡ；
ｂ）Ｓ５８Ｔ＋Ｖ６０Ｋ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｉ＋Ｄ２３４Ｇ；
ｃ）Ｓ５８Ｔ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｄ１０２Ａ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ；
ｄ）Ｓ５８Ｎ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｐ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｓ；
ｅ）Ｓ５８Ｎ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｓ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｓ；及び
ｆ）Ｓ５８Ｎ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｔ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｌ、
からなる群から選択される変更を含んでなる、請求項１又は５に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ａ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８３Ｔ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；
ｂ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；
ｃ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；
ｄ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｇ１６３Ｋ＋Ｓ２１６Ｐ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；
ｅ）Ｅ１*＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；
ｆ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；
ｇ）Ｅ１Ｎ＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ＋Ｌ２５９Ｆ；
ｈ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｄ１０２Ａ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；
ｉ）Ｎ３３Ｑ＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；
ｊ）Ｅ１*＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；
ｋ）Ｅ１Ｎ＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｓ２１６Ｐ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；
ｌ）Ｄ２７Ｎ＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｇ９１Ｎ＋Ｎ９４Ｒ＋Ｄ１１１Ｎ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；
ｍ）Ｅ１Ｎ＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｅ２１０Ａ＋Ｓ２１６Ｐ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；
ｎ）Ａ１５０Ｇ＋Ｅ２１０Ｖ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；
ｏ）Ｉ２０２Ｌ＋Ｅ２１０Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；
ｐ）Ｅ１Ｎ＋Ａ１８Ｋ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｉ８６Ｖ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｅ２１０Ａ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ；
ｑ）Ｅ１Ｌ＋Ｄ２７Ｋ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｉ８６Ｖ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｓ２１９Ｐ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ；
ｒ）Ｅ１Ｎ＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｓ８３Ｔ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；
ｓ）Ｅ１Ｎ＋Ｓ５８Ｔ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｄ１０２Ａ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；
ｔ）Ｅ１Ｎ＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｄ１０２Ａ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｓ２１６Ｐ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；及び
ｕ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｓ８３Ｔ＋Ａ１５０Ａ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ、
からなる群から選択される変更を含んでなる、請求項１又は５に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号２と、少なくとも９０％同一である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
発現宿主において、前記ポリペプチドの作製を指示する少なくとも１つのコントロール配列と作動的に結合する、請求項１２のポリヌクレオチドを含んでなる、核酸構築物。
【請求項１４】
請求項１３の核酸構築物を含んでなる、組換え発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１３の核酸構築物又は請求項１４の組換え発現ベクターを含んでなる、形質転換宿主細胞。
【請求項１６】
ａ）前記ポリペプチドの作製に適する条件下、前記ポリペプチドを含んでなる核酸構築物又は組換え発現ベクターを含んでなる、前記形質転換宿主細胞を培養するステップ；及び
ｂ）前記ポリペプチドを回収するステップ、
を含んでなる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチドを含んでなる調製物。
【請求項１８】
固体又は液体の調製物である、請求項１７に記載の調製物。
【請求項１９】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチドを使用することにより、脂質加水分解の間、臭気発生性短鎖脂肪酸の形成を低減する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臭気発生に対して向上した洗浄効果を有するリパーゼ変異体、及びその製造方法に関する。それは、具体的には、サーモマイセス・ラヌギノーサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼの変種に関する。
【背景技術】
【０００２】
リパーゼは、例えば、衣服及び他の織物から脂質又は脂肪の染みを除去するための洗浄酵素として、且つパン及び他の焼き製品用のパン生地を作製するための添加剤として有用である。このように、サーモマイセス・ラヌギノーサス（別名、フミコラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ、ＥＰ２５８０６８及びＥＰ３０５２１６）由来のリパーゼは、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓの製品）の商標名で洗浄剤としての用途で販売されている。ＷＯ ００６００６３には、洗浄溶液において特に良好な第一洗浄機能を有するＴ．ラヌギノーサスリパーゼの変種が記載されている。ＷＯ ９７０４０７９、ＷＯ ９７０７２０２及びＷＯ ００３２７５８にも、Ｔ．ラヌギノーサスリパーゼの変種が開示されている。
【０００３】
いくつかの出願においては、臭気発生性短鎖脂肪酸の形成を最小化することが注目されている。リパーゼを含む洗濯洗剤は、ミルクで汚れた衣服に付いている残存臭気が残る場合があることが知られている（ＥＰ ４３０３１５）。ＷＯ ０２０６２９７３は、Ｃ末端伸長を付加することにより、当該臭気発生が低減したリパーゼ変種を開示する。最近公開されたＷＯ ０７０８７５０８は、親リパーゼにおいて確認された、１又は複数の領域における変異導入により、当該臭気発生が低減したリパーゼ変種を開示する。ＷＯ ０７０８７５０８は、リパーゼ活性を有するポリペプチドを開示し、これは、明細書に提示される試験条件において、ＲＰが少なくとも０．８、ＢＲが少なくとも１．１であることがさらに開示されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
第一の態様によれば、本発明は、リパーゼ活性を有する第一のポリペプチドに関し、ここで当該ポリペプチドは、
ａ）２８０ｎｍでの吸収（Ａ２８０）に対するリパーゼ活性（ＬＵ）が５００ＬＵ／Ａ２８０未満であり、ここでＬＵの１単位（１ＬＵ）は、３０℃、ｐＨ７で、１分当たり１マイクロモルのブチル酸を放出できる酵素量として定義され、且つポリペプチドの吸収は２８０ｎｍで測定される；
ｂ）リスク機能臭気（Ｒｉｓｋ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｄｏｒ）（Ｒ）が０．５未満であり、ここでＲは、ポリペプチド洗浄見本から放出されたブチル酸量と参照ポリペプチド洗浄見本から放出されたブチル酸量の比として計算され、ここで両方の値は、比の計算の前に、非ポリペプチド洗浄見本から放出されたブチル酸量で補正されている；又は
ｃ）損益因子（Ｂｅｎｅｆｉｔ Ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒ）（ＢＲ）が少なくとも１．８であり、ここで、ＢＲは、リスク機能臭気（Ｒ）で除した平均洗浄機能（ｗａｓｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）（ＲＰavg）として定義される、
の少なくとも１つを有する。
【０００５】
第二の態様によれば、本発明は、配列番号２に対応する位置で、Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ、及び
ａ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ；又は
ｂ）Ｅ２１０Ｖ／Ｇ；
の少なくとも１つの位置にアミノ酸変更を含んでなる、リパーゼ活性を有する第二ポリペプチドに関する。
【０００６】
さらなる態様によれば、本発明は、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物、前記核酸構築物を含んでなる組換え発現ベクター、及び前記核酸及び前記組換え発現ベクターを含んでなる形質転換宿主細胞に関する。
【０００７】
さらなる態様によれば、本発明は、
ａ）前記ポリペプチドの作製に適する条件下、前記ポリペプチドを含んでなる核酸構築物又は組換え発現ベクターを含んでなる、前記形質転換宿主細胞を培養するステップ；及び
ｂ）前記ポリペプチドを回収するステップ、
を含んでなる、ポリペプチドの製造方法に関する。
【０００８】
さらなる態様によれば、本発明は、ポリペプチドを含んでなる調製物に関する。
【０００９】
さらなる態様によれば、本発明は、前記ポリペプチドを使用することにより、脂質加水分解の間の、臭気発生性短鎖脂肪酸の形成を低減する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１−Ａ】図１は、リパーゼのアラインメントを示す。
【図１−Ｂ】図１は、リパーゼのアラインメントを示す。
【図１−Ｃ】図１は、リパーゼのアラインメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
脂質及び脂肪の染みを除去するためのリパーゼの使用は、当該技術分野で既知であり、ここでは、例えばブチル酸等の遊離短鎖脂質の放出をもたらすリパーゼの活性は、不快な臭気に関連する。基質トリブチリンの加水分解は、ブチル酸の放出をもたらす。本発明のポリペプチドは、驚くべきことに、ＬＵ／Ａ２８０として測定した場合、中性ｐＨでのトリブチリンに対して、低い比活性を有することがわかった。実施例２及び表３を参照されたい。
【００１２】
利益リスク因子（ＢＲ）は、リスク機能臭気（リスク、Ｒ）で、相対的な（洗浄）機能（利益、ＲＰ）を除することにより計算される。当該洗浄機能は、自動機械ストレスアッセイ（ＡＭＳＡ）により測定でき（実施例３を参照されたい）、臭気発生は、ガスクロマトグラフィで直接測定できる（実施例４及び表３を参照されたい）。低減された臭気が、ＢＲに影響を及ぼし、そしてＢＲの増加がもたらされてもよい。本発明のポリペプチドは、当該技術分野で既知のリパーゼより、臭気発生が低減し、ＢＲが増加することがわかった（実施例５及び表３を参照されたい）。
【００１３】
リパーゼ活性（ＬＵ）：本明細書で使用される場合、「リパーゼ活性」なる用語は、ジアクリルグリセロール及びカルボキシレートの形成のもと、トリアシルグリセロールの加水分解を触媒する、カルボン酸エステル加水分解酵素活性を意味する。本発明の目的によれば、リパーゼ活性は、以下の方法により決定される：リパーゼのための基質は、乳化剤としてのアラビアゴムを用いて、トリブチリン（トリブチル酸グリセリン）を乳化することにより調製される。３０℃、ｐＨ７又は９でのトリブチリンの加水分解は、ｐＨスタット滴定実験において行われる。リパーゼ活性の１単位（１ＬＵ）は、３０℃、ｐＨ７で、１分当たり１マイクロモルのブチル酸を放出できる酵素量として定義される。
【００１４】
リスク機能臭気（Ｒ）：本明細書で使用される「リスク機能臭気」なる用語は、ポリペプチド洗浄見本から放出されたブチル酸量と参照ポリペプチド洗浄見本から放出されたブチル酸量の比として計算され、ここで両方の値は、比の計算の前に、非ポリペプチド洗浄見本から放出されたブチル酸量で補正されている。
【００１５】
相対機能（ＲＰ）：本明細書で使用される「相対機能」なる用語は、参照ポリペプチドの洗浄機能と比較した、当該ポリペプチドの洗浄機能を意味する。本発明の目的によれば、相対機能は、実施例３で記載される方法により決定される。
【００１６】
参照ポリペプチド：本明細書で使用される「参照ポリペプチド」、「参照酵素」又は「参照リパーゼ」なる用語は、置換Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒを有する配列番号２の成熟部分を意味する。
【００１７】
利益リスク因子（ＢＲ）：本明細書で使用される場合「利益リスク因子」なる用語は、臭気発生のリスク（Ｒ）と比較した平均相対機能（ＲＰavg）を意味し、以下の式：
ＢＲ＝ＲＰavg／Ｒ
で表される。
【００１８】
アミノ酸置換のための命名法
本発明のリパーゼ変種について記載する場合、参照の容易性のために以下の命名法を使用する：
（１又は複数の）本来のアミノ酸：（１又は複数の）位置：（１又は複数の）置換アミノ酸
【００１９】
この命名法によれば、例えば、位置１９５におけるグリシンのグルタミン酸への置換は、Ｇ１９５Ｅと示される。同じ位置でのグリシンの欠失は、Ｇ１９５*と示され、そして付加的なアミノ酸残基の挿入、例えばリジンならば、Ｇ１９５ＧＫと示される。他のリパーゼとの比較で「欠失」を含む特定のリパーゼの場合、このような位置での挿入は、位置３６におけるアスパラギン酸の挿入であれば、*３６Ｄのように示される。
【００２０】
多重変異はプラスにより分けられる。すなわち：Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅは、位置１７０及び１９５での、それぞれアルギニン及びグリシンからチロシン及びグルタミン酸への置換を表す変異である。
【００２１】
記載するアラインメント方法を適用する場合、Ｘ２３１は、位置２３１に対応する親ポリペプチドにおけるアミノ酸を示す。Ｘ２３１Ｒは、このアミノ酸がＲで置換されることを示す。配列番号２について、ＸはＴであり、そしてＸ２３１Ｒは、位置２３１のＴをＲで置換することを示す。ある位置（例えば２３１）でのアミノ酸が、アミノ酸群、例えば、Ｒ及びＰ及びＹからなる群から選択される別のアミノ酸により置換されてもよく、これはＸ２３１Ｒ／Ｐ／Ｙと示されることになる。
【００２２】
全ての場合において、一般に認められるＩＵＰＡＣの１文字又は３文字アミノ酸の略記が使用される。
【００２３】
同一性：本明細書で使用される場合「同一性」なる用語は、２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の同系性を意味し、「同一性」というパラメータにより記載される。
【００２４】
本発明の目的によれば、２つのアミノ酸配列のアラインメントは、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（http://emboss.org）第２.８.０版のＮｅｅｄｌｅプログラムを用いて決定される。このＮｅｅｄｌｅプログラムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３に記載される国際的なアラインメントアルゴリズムを実施する。使用される置換マトリクスは、ＢＬＯＳＵＭ６２であり、ギャップ・オープニング・ペナルティが１０、及びギャップ・エクステンション・ペナルティが０．５である。
【００２５】
本発明のアミノ酸配列（「発明配列」；例えば、配列番号２のアミノ酸１〜２６９）と、異なるアミノ酸配列（「外来配列」）との間の同一性の度合いは、２つの配列のアラインメントにおける正確な一致の数を、「発明配列」の長さ又は「外来配列」の長さのいずれか短い方で除して計算される。この結果は、同一性の割合で表される。
【００２６】
「発明配列」及び「外来配列」が重複する同じ位置に、同一のアミノ酸残基を有する場合、正確な一致となる。配列の長さは、配列におけるアミノ酸残基の数である（例えば、配列番号２の長さは２６９である）。
【００２７】
上記手法は、アラインメントのための、同一性及び相同性の計算のために使用されてもよい。本発明において相同性及びアラインメントは、下記の通り計算している。
【００２８】
相同性及びアラインメント
本発明の目的によれば、相同性の度合いを、当該技術分野で既知のコンピュータプログラム、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８，Ａｕｇｕｓｔ １９９４，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ ５３７１１）（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ． ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．，（１９７０），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８，４４３−４５）から提供されるＧＡＰ等を用い、ポリペプチド配列比較のための以下の設定：ＧＡＰクリエーション・ペナルティ３．０及びＧＡＰエクステンション・ペナルティ０．１でＧＡＰを用いることにより、好適に決定してもよい。
【００２９】
本発明において、以下のリパーゼにおける対応する（又は相同である）位置は、図１に示すアラインメントにより定義される。前記リパーゼは、アブシディア・レフレクサ（Ａｂｓｉｄｉａ ｒｅｆｌｅｘａ）、アブシディア・コリムビフェラ（Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、リゾプス・デレマル（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ）、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｒｕｍ）、フサリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・カメンバーティレクサ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｌｅｘａ）、アスペルギルス・ホエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、サーモマイセス・ラヌギノーサス（別名、フミコラ・ラヌギノーサ）及びランデリナ・ペニサポラ（Ｌａｎｄｅｒｉｎａ ｐｅｎｉｓａｐｏｒａ）である。
【００３０】
アラインメントにおいて示されないリパーゼ配列における、相同位置を見つけるために、注目の配列を、図１に示す配列と並べる。新規な配列は、ＧＡＰアラインメントを用いることにより、ＧＡＰプログラムにより発見される最も相同性の高い配列と、図１における現在のアラインメントとを配列する。ＧＡＰは、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８，Ａｕｇｕｓｔ １９９４，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ ５３７１１）（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ． ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．，（１９７０），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８，４４３−４５）において提供される。ポリペプチド配列比較のために、以下の設定を用いる：ＧＡＰクリエーション・ペナルティ３．０及びＧＡＰエクステンション・ペナルティ０．１。
【００３１】
リパーゼ活性を有するポリペプチドの供給源
任意の好適なポリペプチドを使用してよい。ある実施態様によれば、ポリペプチドは、真菌ポリペプチドであってよい。
【００３２】
ポリペプチドは、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、又はヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）等の属起源の酵母ポリペプチド；又はより好ましくは、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、オウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィロバシジウム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオプソラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ネウロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロマイセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、サーモマイセス又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）等の属起源の糸状菌ポリペプチドでもよい。
【００３３】
ポリペプチドは、さらに、サッカロマイセス・カールスバーゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ジアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、又はサッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）又はサッカロマイセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）リパーゼ活性を有するポリペプチドでもよい。
【００３４】
あるいは、ポリペプチドは、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ホエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・タービゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｒｂｉｇｅｎｓｉｓ）、フサリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フサリウム・クルークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フサリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フサリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フサリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フサリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・レチクラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フサリウム・ロセウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フサリウム・サムブシナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フサリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フサリウム・スポロトリチオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フサリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フサリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、サーモマイセス・ラヌギノーサス（別名、フミコラ・ラヌギノーサス）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリフソラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ネウロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・パープロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、トリコデルマ・ハージアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラチアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、又はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）ポリペプチドである。
【００３５】
ある実施態様によれば、本発明は、サーモマイセス・リパーゼであるポリペプチドに関する。
【００３６】
ある実施態様によれば、本発明は、サーモマイセス・ラヌギノーサ・リパーゼであるポリペプチドに関する。
【００３７】
ある実施態様によれば、本発明は、ポリペプチドに関し、ここで当該ポリペプチドは、配列番号２と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％同一である。
【００３８】
リパーゼ活性を有するポリペプチドにおける変更の確認
以下に述べる位置は、配列番号２におけるアミノ酸残基の位置である。「相同性及びアラインメント」の段落に記載される方法を使用し、異なるリパーゼにおけるアミノ酸残基の対応する又は相同の位置を発見した。
【００３９】
ある実施態様によれば、本発明は、リパーゼ活性を有する第一のポリペプチドに関し、ここで当該ポリペプチドは：（ａ）２８０ｎｍでの吸収（Ａ２８０）に対するリパーゼ活性（ＬＵ）が、５００未満、４５０未満、３５０未満、３００未満、２５０未満、２００未満、１５０未満、１００未満、又は５０未満ＬＵ／Ａ２８０であり、ここでＬＵの１単位（１ＬＵ）は、３０℃、ｐＨ７で、１分当たり１マイクロモルのブチル酸を放出できる酵素量として定義され、且つポリペプチドの吸収は２８０ｎｍで測定される；（ｂ）リスク機能臭気（Ｒｉｓｋ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｄｏｒ）（Ｒ）が０．５未満、０．４未満、０．３未満、０．２未満、０．１未満、０．０５未満であり、ここでＲは、ポリペプチド洗浄見本から放出されたブチル酸量と参照ポリペプチド洗浄見本から放出されたブチル酸量の比として計算され、ここで両方の値は、比の計算の前に、非ポリペプチド洗浄見本から放出されたブチル酸量で補正されている；又は（ｃ）利益リスク因子（Ｂｅｎｅｆｉｔ Ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒ）（ＢＲ）が少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２．０、少なくとも２．５、少なくとも３．０、少なくとも４．０、少なくとも５．０、少なくとも６．０であり、ここで、ＢＲは、リスク機能臭気（Ｒ）で除した平均洗浄機能（ｗａｓｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）（ＲＰavg）として定義される、
のうち少なくとも１つを有するポリペプチドである。
【００４０】
ある実施態様によれば、本発明は、第一のポリペプチドに関し、ここで当該ポリペプチドは、配列番号２に対応する位置の、Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ、及びａ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ；又はｂ）Ｅ２１０Ｖ／Ｇの少なくとも１つの位置にアミノ酸変更を含んでなる。
【００４１】
ある実施態様によれば、本発明は、さらに、位置Ｉ８６Ｖ又はＴ１４３Ｓに少なくとも１つのアミノ酸変更をさらに含んでなる、第一のポリペプチドに関する。
【００４２】
ある実施態様によれば、本発明は、第一のポリペプチドに関し、ここで当該ポリペプチドは、配列番号２の、位置Ｅ１、Ｄ２７、Ｎ３３、Ｓ８３、Ｇ９１、Ｎ９４、Ｋ９８、Ｅ９９、Ｄ１０２、Ｄ１１１、Ｇ１６３、Ｉ２０２、Ｅ２１０、Ｓ２１６、Ｌ２５９又はＬ２６９に対応する位置で、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失又は付加から選択される、少なくとも１つのさらなる変更を含んでなる。
【００４３】
ある実施態様によれば、本発明は、第一のポリペプチドに関し、前記少なくとも１つの変更が、配列番号２の、Ｅ１Ｎ／*、Ｄ２７Ｎ、Ｎ３３Ｑ、Ｓ８３Ｔ、Ｇ９１Ｎ、Ｎ９４Ｒ、Ｋ９８Ｉ、Ｅ９９Ｋ、Ｄ１０２Ａ、Ｄ１１１Ｎ、Ｇ１６３Ｋ、Ｉ２０２Ｌ、Ｅ２１０Ａ、Ｓ２１６Ｐ、Ｌ２５９Ｆ、及びＬ２６９ＡＰＩＡからなる群から選択される。
【００４４】
ある実施態様によれば、本発明は、配列番号２に対応する位置である、Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ、及びａ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ；又はｂ）Ｅ２１０Ｖ／Ｇの少なくとも１つの位置でのアミノ酸変更を含んでなる、第二のポリペプチドに関する。
【００４５】
ある実施態様によれば、本発明は、位置Ｉ８６Ｖ又はＴ１４３Ｓに少なくとも１つのアミノ酸変更をさらに含んでなる第二のポリペプチドに関する。
【００４６】
ある実施態様によれば、本発明は、第二のポリペプチドに関し、ここで当該ポリペプチドは、配列番号２の、位置Ｅ１、Ｄ２７、Ｎ３３、Ｓ８３、Ｇ９１、Ｎ９４、Ｋ９８、Ｅ９９、Ｄ１０２、Ｄ１１１、Ｇ１６３、Ｉ２０２、Ｅ２１０、Ｓ２１６、Ｌ２５９又はＬ２６９に対応する位置で、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失又は付加から選択される、少なくとも１つのさらなる変更を含んでなる。
【００４７】
ある実施態様によれば、本発明は第二のポリペプチドに関し、ここで、前記少なくとも１つの変更が、配列番号２の、Ｅ１Ｎ／*、Ｄ２７Ｎ、Ｎ３３Ｑ、Ｓ８３Ｔ、Ｇ９１Ｎ、Ｎ９４Ｒ、Ｋ９８Ｉ、Ｅ９９Ｋ、Ｄ１０２Ａ、Ｄ１１１Ｎ、Ｇ１６３Ｋ、Ｉ２０２Ｌ、Ｅ２１０Ａ、Ｓ２１６Ｐ、Ｌ２５９Ｆ、及びＬ２６９ＡＰＩＡからなる群から選択される。
【００４８】
ある実施態様によれば、本発明は、第一のポリペプチドに関し、ここで当該ポリペプチドは、（ａ）Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｌ２６９ＡＰＩＡ；（ｂ）Ｓ５８Ｔ＋Ｖ６０Ｋ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｉ＋Ｄ２３４Ｇ；（ｃ）Ｓ５８Ｔ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｄ１０２Ａ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｄ）Ｓ５８Ｎ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｐ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｓ；（ｅ）Ｓ５８Ｎ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｓ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｓ；及び（ｆ）Ｓ５８Ｎ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｔ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｌ、からなる群から選択される変更を含んでなる。
【００４９】
ある実施態様によれば、本発明は、第二のポリペプチドに関し、ここで当該ポリペプチドは、（ａ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８３Ｔ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｂ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｃ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｄ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｇ１６３Ｋ＋Ｓ２１６Ｐ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｅ）Ｅ１*＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｆ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｇ）Ｅ１Ｎ＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ＋Ｌ２５９Ｆ；（ｈ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｄ１０２Ａ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｉ）Ｎ３３Ｑ＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｊ）Ｅ１*＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｋ）Ｅ１Ｎ＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｓ２１６Ｐ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｌ）Ｄ２７Ｎ＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｇ９１Ｎ＋Ｎ９４Ｒ＋Ｄ１１１Ｎ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｍ）Ｅ１Ｎ＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｅ２１０Ａ＋Ｓ２１６Ｐ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｎ）Ａ１５０Ｇ＋Ｅ２１０Ｖ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｏ）Ｉ２０２Ｌ＋Ｅ２１０Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｐ）Ｅ１Ｎ＋Ａ１８Ｋ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｉ８６Ｖ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｅ２１０Ａ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｑ）Ｅ１Ｌ＋Ｄ２７Ｋ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｉ８６Ｖ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｓ２１９Ｐ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｒ）Ｅ１Ｎ＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｓ８３Ｔ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｓ）Ｅ１Ｎ＋Ｓ５８Ｔ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｄ１０２Ａ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｔ）Ｅ１Ｎ＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｄ１０２Ａ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｓ２１６Ｐ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；���び（ｕ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｓ８３Ｔ＋Ａ１５０Ａ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ、からなる群から選択される変更を含んでなる。
【００５０】
【表１】
0005650543.tif 000002
【００５１】
【表２】
0005650543.tif 000003
【００５２】
ある実施態様によれば、本発明は、第一又は第二のポリペプチドに関し、ここで当該ポリペプチドは、（ａ）Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｌ２６９ＡＰＩＡ；（ｂ）Ｓ５８Ｔ＋Ｖ６０Ｋ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｉ＋Ｄ２３４Ｇ；（ｃ）Ｓ５８Ｔ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｄ１０２Ａ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｄ）Ｓ５８Ｎ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｐ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｓ；（ｅ）Ｓ５８Ｎ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｓ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｓ；及び（ｆ）Ｓ５８Ｎ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｔ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｌ、からなる群から選択される変更を含んでなる。
【００５３】
ある実施態様によれば、本発明は、第一又は第二のポリペプチドに関し、ここで当該ポリペプチドは、（ａ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８３Ｔ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｂ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｃ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｄ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｇ１６３Ｋ＋Ｓ２１６Ｐ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｅ）Ｅ１*＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｆ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｇ）Ｅ１Ｎ＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ＋Ｌ２５９Ｆ；（ｈ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｄ１０２Ａ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｉ）Ｎ３３Ｑ＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｊ）Ｅ１*＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｋ）Ｅ１Ｎ＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｓ２１６Ｐ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｌ）Ｄ２７Ｎ＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｇ９１Ｎ＋Ｎ９４Ｒ＋Ｄ１１１Ｎ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｍ）Ｅ１Ｎ＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｅ２１０Ａ＋Ｓ２１６Ｐ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｎ）Ａ１５０Ｇ＋Ｅ２１０Ｖ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｏ）Ｉ２０２Ｌ＋Ｅ２１０Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｐ）Ｅ１Ｎ＋Ａ１８Ｋ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｉ８６Ｖ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｅ２１０Ａ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｑ）Ｅ１Ｌ＋Ｄ２７Ｋ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｉ８６Ｖ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｓ２１９Ｐ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｒ）Ｅ１Ｎ＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｓ８３Ｔ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｓ）Ｅ１Ｎ＋Ｓ５８Ｔ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｄ１０２Ａ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｔ）Ｅ１Ｎ＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｄ１０２Ａ＋Ｔ１４３Ｓ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｓ２１６Ｐ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２���６Ｋ；及び（ｕ）Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｓ８３Ｔ＋Ａ１５０Ａ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ａ＋Ｐ２５６Ｋ、からなる群から選択される変更を含んでなる。
【００５４】
ポリヌクレオチド、発現ベクター、宿主細胞、ポリペプチドの作製
ある実施態様によれば、本発明は、当該ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。当該ポリヌクレオチドは、非常に低ストリンジェンシー条件、好ましくは低ストリンジェンシー条件、より好ましくは中ストリンジェンシー条件、より好ましくは中−高ストリンジェンシー条件、さらにより好ましくは高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは非常に高ストリンジェンシー条件下で、（i）配列番号１のヌクレオチド１７８〜６６０、（ii）配列番号１のヌクレオチド１７８〜６６０に含まれるｃＤＮＡ、（iii）（i）又は（ii）のサブ配列、又は（iv）（i）、（ii）又は（iii）の相補鎖とハイブリダイズできる（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｕｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。配列番号１のサブ配列は、少なくとも１００個の連続ヌクレオチド、又は好ましくは少なくとも２００個の連続ヌクレオチドを含む。さらに、当該サブ配列は、リパーゼ活性を有するポリペプチド断片をコードしてよい。
【００５５】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブについて、非常に低〜非常に高のストリンジェンシー条件は、以下の溶液中での、４２℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションとして定義され、当該溶液は、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００ｕｇ／ｍｌ剪断及び変性させたサケ精子ＤＮＡに加え、２５％ホルムアミドの場合は、非常に低及び低ストリンジェンシー、３５％ホルムアミドの場合は、中及び中−高ストリンジェンシー、又は５０％ホルムアミドの場合は、高及び非常に高ストリンジェンシー条件であり、その後、標準的サザンブロット法を、好ましくは１２〜２４時間行う。
【００５６】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブについて、担体物質は、以下の溶液を用いて、各々１５分間、最終的に３回洗浄され、ここで溶液とは、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳであり、これが、好ましくは少なくとも４５℃（非常に低ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５０℃（低ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５５℃（中ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも６０℃（中−高ストリンジェンシー）、さらにより好ましくは少なくとも６５℃（高ストリンジェンシー）、及び最も好ましくは７０℃（非常に高ストリンジェンシー）でなされる。
【００５７】
ある実施態様によれば、本発明は、発現宿主において、ポリペプチドの作製を指示する少なくとも１つのコントロール配列と作動的に結合するポリヌクレオチドを含んでなる、核酸構築物に関する。
【００５８】
ある実施態様によれば、本発明は、前記核酸構築物を含んでなる、組換え発現ベクターに関する。
【００５９】
ある実施態様によれば、本発明は、前記核酸構築物又は前記組換え発現ベクターを含んでなる、形質転換宿主細胞に関する。
【００６０】
ポリヌクレオチドをコードする単離ポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物、当該核酸構築物を含んでなる組換え発現ベクター、及び当該核酸構築物又は当該組換え発現ベクターを含んでなる形質転換宿主細胞は、全て、当該技術分野で既知の方法により得てもよい。
【００６１】
ある実施態様によれば、本発明は、（ａ）前記ポリペプチドの作製に適する条件下、核酸構築物又は核酸構築物を含んでなる組換え発現ベクターを含んでなる、形質転換宿主細胞を培養するステップ；及び（ｂ）前記ポリペプチドを回収するステップ、を含んでなるポリペプチドの調製方法に関する。この方法は、当該技術分野で既知の原理に従って実施されてよい。
【００６２】
使用
本発明の酵素は、脂肪分の除去のための工業的使用等で使用されてよい。
【００６３】
ある実施態様によれば、本発明は、ポリペプチドを含んでなる調製物に関する。さらなる実施態様によれば、本発明は、調製物に関し、ここで当該調製物は、固体又は液体の調製物であってよい。ポリペプチドは、固体及び液体調製物のいずれの状態で使用してもよい。
【００６４】
ある実施態様によれば、本発明は、ポリペプチドを使用することにより、脂肪加水分解の間の、臭気発生性短鎖脂肪酸の形成を低減する方法に関する。
【実施例】
【００６５】
本発明は、以下の実施例によりさらに記載され、これは本発明の範囲を制限すると解されるべきではない。
【００６６】
緩衝剤及び基質として使用される化学物質は、少なくとも試薬級の市販品であった。
【００６７】
実施例１−リパーゼ変種の作製
ポリペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドを構築し、そして当該技術分野の標準的方法を用いて、好適な宿主細胞に形質転換する。
【００６８】
発酵は、一定の培地温度３４℃、開始容量１．２リットルを用いる硫加（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）発酵として行われる。培地の初期ｐＨを６．５に設定する。ｐＨが７．０まで上昇したら、１０％のＨ3ＰＯ4を添加して、この値を維持する。培地中の溶解酸素レベルを、攪拌速度を変えながら、且つ培地１リットル当たり１分当たり１．０リットルの固定通気速度を用いることにより制御する。フィード（ｆｅｅｄ）添加速度を、硫加段階全体で一定レベルに維持する。
【００６９】
バッチ培地は、炭素源としてマルトース、窒素源として尿素及び酵母抽出物、及び微量金属及び塩の混合物を含有する。硫加段階の間、連続的に添加したフィードは、炭素源としてマルトースシロップを含み、一方、十分な窒素供給を確実にするため、酵母抽出物及び尿素を添加する。
【００７０】
ポリペプチドの精製は、当該技術分野で既知の標準的方法、例えば、発酵上清の濾過及び続く疎水性クロマトグラフィ及びイオン交換クロマトグラフィによりなされてもよく、例えばＥＰ ０ ８５１ ９１３ ＥＰ、実施例３に記載されている。
【００７１】
実施例２−２８０ｎｍでの吸収に対するリパーゼ活性単位（ＬＵ）（ＬＵ／Ａ２８０）
リパーゼの活性（ＬＵ）は、上記のリパーゼ活性の節で記載した通りに決定する。２８０ｎｍでのリパーゼの吸収（Ａ２８０）を測定する。ポリペプチドの特定の活性は、ＬＵ／Ａ２８０の比率として表現すことができる。
【００７２】
相対ＬＵ／Ａ２８０は、参照酵素のＬＵ／Ａ２８０で除したポリペプチドのＬＵ／Ａ２８０として計算される。本発明において、参照酵素は、Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒの置換を有する配列番号２のリパーゼである。
【００７３】
実施例３−自動機械ストレスアッセイ（ＡＭＳＡ）から得られるデータによる相対機能（ＲＰ）の計算
本発明のポリペプチドは、自動機械ストレスアッセイ（ＡＭＳＡ）を用いて試験される。ＡＭＳＡ試験では、多数の少量酵素−洗剤溶液の洗浄機能を調べることができる。ＡＭＳＡプレートは、試験溶液のための多数のスロットと、全ての当該スロット開口に対する、洗浄される織物見本を堅く絞る蓋を有する。洗浄時間の間、プレート、試験溶液、織物及び蓋を勢いよく振り、織物に試験溶液を接触させるとともに機械ストレスを与える。さらなる記載は、ＷＯ ０２／４２７４０、特に第２３〜２４頁の「特別方法実施態様（Ｓｐｅｃｉａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ）」を参照されたい。この容器は、洗剤試験溶液を含み、金属プレートにおける円筒状の穴（直径６ｍｍ、深さ１０ｍｍ）からなる。染みの付いた布（試験物質）を、金属プレートの頂部に置き、容器の上の蓋とシールとして使用する。別の金属プレートは、染み付いた布の頂部に置き、各容器から任意の漏出を回避する。２つの金属プレートを染み付いた布と一緒に、上下、３０Ｈｚ、２ｍｍの振幅で振動させる。
【００７４】
【表３】
0005650543.tif 000004
【００７５】
【表４】
0005650543.tif 000005
【００７６】
クリーム−ウコンの見本及びコーヒークリームウコンの見本を、５ｇのウコン（Ｓａｎｔａ  Ｍａｒｉａ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、それぞれ１００ｇのクリーム（３８％脂肪、Ａｒｌａ、Ｄｅｎｍａｒｋ）及び１００ｇのコーヒークリーム（９％脂質、Ａｒｌａ、Ｄｅｎｍａｒｋ）と共に、５０℃で混合することにより調製した。混合物を、この温度に約２０分間放置し、濾過し（５０℃）、任意の不溶粒子を除去した。混合物を２０℃に冷却し、織物綿見本、ＥＭＰ２２１をクリーム−ウコン混合物に浸漬させ、その後、室温で一晩乾燥させ、使用まで凍結させた。クリーム−ウコン見本の調製は、ＷＯ ０６１２５４３７に記載されている。
【００７７】
ポリペプチドの機能を、特定のポリペプチドで洗浄した織物サンプルの色の明度として測定した。明度はまた、白色光で照らした場合、織物サンプルから反射する光の強度として表される。織物に染みがある場合、反射光の強度は、清浄な織物のものよりも低い。したがって、反射光の強度は、ポリペプチド変種の洗浄機能を測定するために使用できる。
【００７８】
色測定は、洗浄織物サンプルの画像を捕捉するために使用する、ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ｆｌａｔｂｅｄ ｓｃａｎｎｅｒ（ＰＦＵ ＤＬ２４００ｐｒｏ）を用いて行った。スキャンは、解像度２００ｄｐｉ及び出力色濃度（ｄｅｐｔｈ）を２４ｂｉｔｓで行った。正確な結果を得るために、スキャナーをＫｏｄａｋ ｒｅｆｌｅｃｔｉｖｅ ＩＴ８ターゲットを用いて頻繁に校正した。
【００７９】
スキャンした画像からの光強度の値を抽出するため、特別に設計したソフトウェアアプリケーションを使用した（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ｃｏｌｏｒ Ｖｅｃｔｏｒ Ａｎａｌｙｚｅｒ）。当該プログラムは、画像から２４ｂｉｔピクセルの値を読み取り、これらを赤、緑及び青（ＲＧＢ）の値に変換する。強度値（Ｉｎｔ）を、ベクターとしてＲＧＢ値を添加することにより計算し、その後、得られるベクターの長さを取る。
【００８０】
【数１】
0005650543.tif 000006
【００８１】
ポリペプチドの洗浄機能（Ｐ）を、以下の式により計算した。
Ｐ＝Ｉｎｔ（ｖ）−Ｉｎｔ（ｒ）
ここで、Ｉｎｔ（ｖ）は酵素で洗浄した織物表面の光強度値であり、Ｉｎｔ（ｒ）は酵素なしで洗浄した織物見本の光強度値である。
【００８２】
相対機能スコアは、定義に従って、ＡＭＳＡ洗浄の結果として得られる。相対機能スコア（ＲＰ）は、参照ポリペプチドに対する、試験ポリペプチドの機能（Ｐ）の合計である。
ＲＰ＝Ｐ（試験ポリペプチド）／Ｐ（参照ポリペプチド）
【００８３】
ＲＰavgは、０．５ｍｇ ｅｐ／ｌでなされた測定の参照ポリペプチドと比較した平均の相対機能を示す。
【００８４】
ポリペプチドは、それが参照よりも良好に機能すれば、洗浄機能の向上を呈すると考えられる。本発明において、参照酵素は、置換Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒを有する配列番号２のリパーゼである。
【００８５】
実施例４−固相マイクロ抽出ガスクロマトグラフ（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｍｉｃｒｏ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ）測定から得られるリスク因子（Ｒ）の計算
リパーゼ洗浄見本から放出されるブチル酸を、固相マイクロ抽出ガスクロマトグラフ（ＳＰＭＥ−ＧＣ）により、以下の方法を用いて測定した。０．５ｍｇ／ｌのリパーゼを含有する表２で特定される溶液において洗浄した、４片の織物（直径５ｍｍ）を、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）バイアルに移した。サンプルを３０℃で２４時間インキュベートし、その後、１４０℃で３０分加熱し、分析前に、２０℃〜２５℃で少なくとも４時間保存した。分析を、Ｓｔａｂｉｌｗａｘ−ＤＡ ｗ／Ｉｎｔｅｇｒａ−ガードカラム（３０ｍ、０．３２ｍｍ ＩＤ及び０．２５マイクロ−ｍ ｄｆ）及びＣａｒｂｏｘｅｎ ＰＤＭＳ ＳＰＭＥ ｆｉｂｒｅ（８５マイクロ−ｍ）を備え付けたＶａｒｉａｎ３８００ＧＣで行った。各ＧＣバイアルからのサンプリングは、５０℃で８分間、ＳＰＭＥ ｆｉｒｅで、織物片上のヘッドスペースで行い、その後サンプリングした化合物を、カラムに注入した（注入温度＝２５０℃）。カラム流＝２ｍｌ ヘリウム／分。カラムオーブン温度勾配：０分＝５０℃、２分＝５０℃。６分４５秒＝２４０℃、１１分４５秒＝２４０℃である。検出を、Ｆｌａｍｅ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＦＩＤ）を用いて行い、ブチル酸の保持時間を、真正の標準品を用いて確認した。
【００８６】
ポリペプチドのリスク機能臭気（Ｒ）は、ポリペプチド洗浄織物から放出されたブチル酸量（ピーク面積）と、参照ポリペプチド洗浄織物から放出されたブチル酸量（ピーク面積）の値を、非ポリペプチド洗浄織物（ブランク）から放出されたブチル酸量（ピーク面積）で補正した後の、その両方の値の間の比である。参照ポリペプチドは、置換Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒを有する配列番号２のポリペプチドである。ポリペプチドのリスク機能臭気（Ｒ）を、以下の式に従って計算した。
臭気＝織物表面から放出された測定ブチル酸（ピーク面積）
α試験酵素＝臭気試験酵素−臭気ブランク
α参照酵素＝臭気参照酵素−臭気ブランク
Ｒ＝α試験酵素／α参照酵素
ポリペプチドは、Ｒ因子が１より低い場合、参照と比較して臭気の低減が示されたと考えられる。
【００８７】
実施例５−利益リスク因子（ＢＲ）
低減した臭気リスクと比較した洗浄機能について述べる利益リスク因子は、以下の通り定義される。
ＢＲ＝ＲＰavg／Ｒ
【００８８】
変種は、ＢＲ因子が１より高い場合、洗浄機能が向上し、且つ臭気が低減したと考えられる。
【００８９】
【表５】
0005650543.tif 000007
【００９０】
【表６】
0005650543.tif 000008
【００９１】
【表７】
0005650543.tif 000009
【配列表フリーテキスト】
【００９２】
配列番号１は、サーモマイセス・ラヌギノーサス由来のリパーゼをコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号２は、サーモマイセス・ラヌギノーサス由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、アブシディア・レフレクサ（Ａｂｓｉｄｉａ ｒｅｆｌｅｘａ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、アブシディア・コリムビフェラ（Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｒｕｍ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０は、フサリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２は、ペニシリウム・カメンバーティレクサ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｌｅｘａ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３は、アスペルギルス・ホエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４は、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５は、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６は、ランデリナ・ペニサポラ（Ｌａｎｄｅｒｉｎａ ｐｅｎｉｓａｐｏｒａ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
【図１−１】
0005650543.tif 000010
【図１−２】
0005650543.tif 000011
【図１−Ｃ】
0005650543.tif 000012
【配列表】
0005650543000001.app