(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
2-ヒドロキシ-5-[2-（4-トリフルオロメチル-フェニル）-エチルアミノ]-安息香酸もしくは2-アセトキシ-5-[2-（4-トリフルオロメチル-フェニル）-エチルアミノ]-安息香酸またはその薬学的に許容可能な塩を含むことを特徴とする急性ストレス障害もしくは心的外傷後ストレス障害、不安障害またはうつ病の治療用または予防用の薬学的組成物。
【請求項２】
前記不安障害は、社交(社会)不安障害、全般性不安障害、パニック障害、広場恐怖症、強迫症、物質誘導性不安障害や一般的な不安障害であることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の化学式を持つ化合物を用いたストレス性疾患、うつ病や不安障害の治療または予防方法に関する。本発明はまた、特定の化学式を持つ化合物を有効成分として含むストレス性疾患、うつ病や不安障害の治療または予防用薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ストレスは、感情や身体的な脅威に適切に対応できないために発生し、組織の損傷、出血、感染症、低血糖症、痛みなどの症状を伴うこともある。また、過度なストレスはうつ病や不安障害などの精神疾患の原因となる。
【０００３】
ストレスに関連する精神疾患であるうつ病は、しばしば再発し、慢性化する傾向があり、自殺などの深刻な結果をもたらす。憂鬱な気持ちや感情が主症状であり、それによる睡眠、食欲、興味の低下や不安、無気力感、罪悪感、孤立感、虚無感、自殺衝動などの症状と一緒に現れる。体重の変化が酷く、非常に鈍くて遅くなる。また、自分の無気力感、不適切な罪悪感が伴い、集中力や記憶力が落ちる。慢性的な疲れと眠れないことが多く、睡眠が多くなってもすっきりした睡眠ではない。感情、思考、欲望と共に身体症状も現れるが、頭痛、消化不良、首や肩こり、胸の圧迫感等が現れる。重度のうつ病の場合は、妄想や幻覚が現れることもある。
【０００４】
うつ病が発生する原因はいくつかの心理的要因、衝撃やストレスなどの社会環境要因だけでなく、神経系や内分泌系の異常のような生物学的な要因が複合的に作用することが知られている。また、誘発可能性がある降圧薬、抗不安薬、麻薬類、中枢神経興奮剤などの薬物服用が原因になることがあり、糖尿病、膵臓癌、および内分泌疾患も原因になることがある。
【０００５】
1950年代から、三環系抗うつ薬（tricyclic antidepressant）は、セロトニンとノルエピネフリンのシナプス内濃度を増加させる機序を介して効果的なうつ病の一次治療薬として使われ始めた。しかし、三環系抗うつ薬の場合、薬効が優れているが、鎮静、錯乱、妄想、強迫症、頭痛、睡眠障害などの中枢神経系の副作用、および起立性低血圧、頻脈などの心血管系の副作用、抗コリン作動性の副作用はかなりの問題点として残っている。その後、1980年代から同様の効果を見せながらも、副作用や安全性の面で優れた選択的セロトニン再取り込み阻害薬（Selective Serotonin Reuptake Inhibitor）が発売され、うつ病治療の大きな変化をもたらした。現在、フルオキセチン（fluoxetine）、シタロプラム（citalopram）、セルトラリン（sertraline）、パロキセチン（paroxetine）、エスシタルロプラム（escitalopram）など多くの種類が市販されており、うつ病の治療薬の約70％程度を占めている。
【０００６】
しかし、このようなセロトニン再取り込み阻害薬はまた、頭痛、嘔吐、食欲低下、性機能障害、睡眠障害、疲労感、体重の変化、自殺思考および錐体外路性副作用等が現れる。最近では、セロトニン・ノルエピネピリン再取り込み阻害薬（Serotonin and Norepinephrine reuptake inhibitor）のベンラファキシン（venlafaxine）、ミルナシプラン（milnacipran）、ノルエピネフリン作動性・特異的セロトニン作動性抗うつ薬（Noradrenergic and specific serotonergic antidepressant）のミルタザピン（mirtazapine）、そして、ノルエピネフリン・ドーパミン再取り込み阻害薬（Norepinephrine and Dopamine Reuptake Inhibitor）であるブプロピオン（bupropion）などの複合的薬理作用を持つ薬物が治療効果を向上するために使用されている。
【０００７】
うつ病性障害（major depression）の臨床症状と薬物治療は、パニック障害と広場恐怖症（panic-agoraphobia syndrome）、深刻な恐怖症（severe phobias）、全般性不安障害（generalized anxiety disorder）、社交(社会)不安障害（social anxiety disorder）、心的外傷後ストレス障害（post-traumatic stress disorder）、強迫性障害（obsessive-compulsive disorder）などの不安障害と重なる傾向がある。実際には三環系抗うつ薬やセロトニン再取り込み阻害薬のようなうつ病の治療薬は、パニック障害、広場恐怖症、強迫症、心的外傷後ストレス障害などの治療に使用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明が成し遂げようとする技術的課題は、ストレス性疾患、うつ病や不安障害の治療または予防に有用な化合物、これらの化合物を含む薬学的組成物及びこれらの化合物を治療が必要な患者に投与することを含む上記の疾患の治療や予防方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記の技術的課題を達成するために、本発明は有効成分として下記化学式1で表される5-ベンジルアミノサリチル酸（5-benzylaminosalicylic acid）誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を含むことを特徴とするストレス性疾患、うつ病や不安障害の治療または予防用薬学組成物を提供する。
【００１０】
【化１】
0005650134.tif 000002
【００１１】
前記化学式1において、Xは、CO、SO2、または（CH2）n（nは1〜5の整数）、R1は水素、アルキル（alkyl）またはアルカノイル（alkanoyl）; R2は水素またはアルキル;  R3は、水素またはアセチル（acetyl）;  およびR4は、非置換型フェニルまたはニトロ（nitro）、ハロゲン（halogen）、ハロアルキル（haloalkyl）とC1-C5アルコキシ（alkoxy）からなる群から選択された1つまたはそれ以上で置換されたフェニルである。
本発明はまた、前記化学式1で表される5-ベンジルアミノサリチル酸（5- benzylaminosalicylic acid）誘導体またはその薬学的に許容可能な塩の治療学的に有効な量を治療が必要なオブジェクトに投与することを含むストレス疾患、うつ病や不安障害の治療または予防方法を提供する。
【００１２】
本発明者らは、いくつかの化合物を製造し、評価していたところ、前記化学式1で表される5-ベンジルアミノサリチル酸（BAS）誘導体またはその薬学的に許容可能な塩が安全であるだけでなく、ストレス性疾患、うつ病や不安障害の疾患の治療または予防に非常に有用であることを発見し、本発明を完成した。
【００１３】
本発明において、前記5-ベンジルアミノサリチル酸誘導体は、5-ベンジルアミノサリチル酸自体を含んでいる。
【００１４】
前記化学式1で、アルキル（ハロアルキルのアルキルを含む）は、炭素数1〜5のアルキルであることが好ましく、炭素数1または3のアルキルである方がもっと望ましい。具体的には、前記アルキル基はメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、2次-ブチル及び3次-ブチル基が望ましいが、これらに限定されるものではない。アルコキシ（ハロアルコキシのアルコキシを含む）は、炭素数1〜5のアルコクシであることが好ましく、炭素数1または3であるアルコキシの方がもっと望ましい。具体的には、前記アルコキシとしてはメトキシ、エトキシ、およびプロトキシ基が望ましいが、これらに限定されるものではない。ハロゲンはフッ素、塩素、臭素及びヨウ素であることが望ましいが、これらに限定されるものではない。アルカノイル（alkanoyl）は、炭素数2〜10のアルカノイルであることが好ましく、炭素数2または5の方がもっと好ましい。具体的には前記アルカノイルとしてはエタンノイル（ethanoyl）、プロパノイル（propanoyl）及びシクロヘクサンカルボニル（cyclohexancarbonyl）が望ましいが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
前記化学式1で表される5-ベンジルアミノサリチル酸誘導体の望ましい例は、2-ヒドロキシ-5-フェネチルアミノ-安息香酸（化合物1）、2-ヒドロキシ-5-[2-（4 -トリフルオロメチル-フェニル）-エチルアミノ]-安息香酸（化合物2）、2-ヒドロキシ-5-[2-（3-トリフルオロメチル-フェニル）-エチルアミノ]-安息香酸（化合物3）、5-[2-（3,5-ビス-トリフルオロメチル-フェニル）-エチルアミノ]-2-ヒドロキシ-安息香酸（化合物4）、2-ヒドロキシ-5-[2-（2-ニトロ-フェニル）-エチルアミノ]-安息香酸（化合物5）、5-[2-（4-クロロ-フェニル）-エチルアミノ]-2-ヒドロキシ-安息香酸（化合物6）、5-[2-（3,4-ジフルオロ-フェニル）-エチルアミノ]-2-ヒドロキシ-安息香酸（化合物7）、5-[2-（3,4-ジクロロ-フェニル）-エチルアミノ]-2-ヒドロキシ-安息香酸（化合物8）、5-[2-（4-フルオロ-2-トリフルオロメチル-フェニル）-エチルアミノ]-2-ヒドロキシ-安息香酸（化合物9）、5-[2-2-フルオロ-4-トリフルオロメチル-フェニル）-エチルアミノ]-2-ヒドロキシ-安息香酸（化合物10）、2-ヒドロキシ-5-[2-（4-メトキシ-フェニル）-エチルアミノ]-安息香酸（化合物11）、2-ヒドロキシ-5-（2-o-トルリル-エチルアミノ）-安息香酸（化合物12）、2-ヒドロキシ-5-（3-フェニル-プロピルアミノ）-安息香酸（化合物13）、2-ヒドロキシ-5-[3-（4-トリフルオロメチル-フェニル）-プロピルアミノ]-安息香酸（化合物14）、5-[3-（4-フルオロ-フェニル）-プロピルアミノ]-2-ヒドロキシ-安息香酸（化合物15）、5-[3-（3,4-ジクロロ-フェニル）-プロピルアミノ]-2- ヒドロキシ-安息香酸（化合物16）、2-ヒドロキシ-5-（3-p-トルリル-プロピルアミノ）-安息香酸（化合物17）、2-アセトキシ-5-[2-（4-トリフルオロメチル-フェニル）-エチルアミノ]-安息香酸（化合物18）、5-[2-（2-クロロ-フェニル）-エチルアミノ]-2-ヒドロキシ-安息香酸（化合物19）、5-ベンジルアミノサリチル酸（化合物20）、5-（4-ニトロベンジル）アミノサリチル酸（化合物21）、5-（4-クロロベンジル）アミノサリチル酸（化合物22）、5-（4-トリフルオロメチルベンジル）アミノサリチル酸（化合物23）、5-（4-フルオロベンジル）アミノサリチル酸（化合物24）、5-（4-メトキシベンジル）アミノサリチル酸（化合物25）、5-（4- ペンタフロオロベンジル）アミノサリチル酸（化合物26）、5-（4-ニトロベンジル）アミノ-2-ヒドロキシエチルベンゾエイト（化合物27）、5-（4-ニトロベンジル）- N-アセチルアミノ-2-ヒドロキシエチルベンゾエイト（化合物28）、5-（4-ニトロベンジル）-N-アセチルアミノ-2-アセトキシエチルベンゾエイト（化合物29）、5-（4-ニトロベンゾイル）アミノサリチル酸（化合物30）、5-（4-ニトロベンゼンスルホニル）アミノサリチル酸（化合物31）、5-[2-（4-ニトロフェニル）エチル]アミノサリチル酸（化合物32）および5-[3-（4-ニトロフェニル）-n-プロピル]アミノサリチル酸（化合物33）を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明の5-ベンジルアミノサリチル酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩は、米国登録特許第6,573,402号に開示された方法と同様に製造することできるが、本発明は、これらの製造方法に限定されるものではない。
【００１６】
本発明の「薬学的に許容可能な塩」は、毒性がないか少ない酸または塩基で製造された塩を言う。本発明の化合物が相対的に酸性の場合、塩基（base）付加塩は十分な量の所望の塩基と適切な不活性（inert）溶媒によりその化合物の中性形態を接触して得ることができる。薬学的に許容可能な塩基付加塩は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、マグネシウムまたは有機アミノからなる塩を含むが、これらに限定されるものではない。本発明の化合物が相対的に塩基性である場合、酸（acid）付加塩は十分な量の所望の酸と適当な不活性溶媒によりその化合物の中性形態を接触して得ることができる。薬学的に許容可能な酸付加塩は、プロピオン酸、イソブチル酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸（suberic）、フマル酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸、塩酸、ブロム酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸（monohydrogencarbonic acid）、リン酸、一水素リン酸、二水素りん酸、硫酸、一水素硫酸、よう化水素、亜リン酸（phosphorous acid）などで形成された塩を含むが、これらに限定されるものではない。また、アルジネート（arginate）のようなアミノ酸の塩及びグルクロニック（glucuronic）またはガラクツロン（galactunoric）酸のような有機酸の類似塩を含むが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
例えば、本発明の望ましい一実施例である2-ヒドロキシ-5-[2-（4-トリフルオロメチル-フェニル）-エチルアミノ]-安息香酸（化合物2）の薬学的に許容可能な塩は、下記のような反応式1を通じて製造することができるが、これに限定されるものではない。
【００１８】
【化２】
0005650134.tif 000003
【００１９】
式において、Mは、ジエチルアミン、リチウム、ナトリウム、カリウム等の薬学的に許容される金属や塩基性有機化合物であることができる。
【００２０】
より具体的には、ジエチルアミン塩は、アルコールに化合物を溶解した後、ジエチルアミンを滴加して攪拌後、減圧蒸留し、残った残渣にエーテルを添加して結晶化させて得る。アルカリ金属塩を製造する方法としては、アルコール、アセトン、アセトニトリルなどのような溶媒下でアルカリ金属を提供できる水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの無機試薬（inorganic reagent）を利用して目的とする塩形の化合物を製造し、凍結乾燥を介して得ることができる。また、同じような方法を用いて、リチウム塩としてリチウムアセテートを使用し、ナトリウム塩としてナトリウム2-エチルヘキサノエートまたはナトリウムアセテートを使用し、カリウム塩としてカリウムアセテートを使用して、目的とする塩を製造することができる。
【００２１】
本発明の一部の化合物は水和物の形態を含む溶媒和された形態である溶媒和物として存在するだけでなく、非溶媒和された（unsolvated）形態として存在することもできる。本発明の一部の化合物は、結晶形または無定形で存在することができ、これらのすべての物理的形状は、本発明の範囲に含まれる。また、本発明の一部の化合物は光学中心の非対称炭素原子または二重結合を持つことができ、ラセミ体、鏡像異性体、ジアステレオマー、幾何異性体などが存在することができるが、これらもまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００２２】
本発明はまた、前記化学式1で表される5-ベンジルアミノサリチル酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩と薬剤学的に許容される賦形剤や添加剤を含む薬学的組成物を提供する。本発明の5-ベンジルアミノサリチル酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩は、単独で、あるいはいくつかの便利な担体、賦形剤などと一緒に混合して投与することができ、そのような投与剤形は、単回投与または反復投与剤形であることができる。
【００２３】
本発明の薬学的組成物は、固形製剤または液状製剤であることができる。固形製剤は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、坐剤などがあるが、これに限定されるものではない。固形製剤には、本発明が属する分野で通常使用される賦形剤、着香剤、結合剤、防腐剤、崩壊剤、滑沢剤、充填剤などが含まれることができるが、これらに限定されるものではない。液状製剤は、水、プロピレングリコール溶液のような溶液剤、懸濁液剤、乳剤などがあるが、これに限定されるわけではなく、適切な着色剤、着香剤、安定化剤、増粘剤などを添加して製造することができる。
【００２４】
たとえば、散剤は、本発明の5-ベンジルアミノサリチル酸誘導体化合物、乳糖、デンプン、微結晶セルロース等の薬剤学的に許容される適当な賦形剤を、単純混合することにより製造することができる。顆粒剤は、本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、薬剤学的に許容される適当な賦形剤、およびポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース等の薬剤学的に許容される適当な結合剤を混合した後、水、エタノール、イソプロパノールなどの溶媒を用いた湿式造粒法または圧縮力を利用した乾式造粒法を用いて製造することができる。また、錠剤は、上記顆粒剤をステアリン酸マグネシウム等の薬剤学的に許容される適切な滑沢剤を混合した後、打錠機を用いて打錠することにより製造することができる。
【００２５】
本発明の薬学的組成物は、治療すべき疾患、およびオブジェクトの状態に応じて経口剤、注射剤（例えば、筋肉内注射、腹腔内注射、静脈内注射、注入（infusion）、皮下注射、インプラント）、吸入剤、点鼻剤、膣に適用する製剤、直腸に適用する製剤、舌下錠、経皮製剤、局所用製剤などで投与されることができるが、これらに限定されるものではない。投与経路によって通常使用され、非毒性の、薬剤学的に許容される担体、添加剤、ビークルを含む適切な投与単位剤形に製剤化することができる。一定時間薬物を持続的に放出できるデポー（ｄｅｐｏｔ）剤形もまた本発明の範囲に含まれる。
【００２６】
前記のように、本発明は、前記の化学式1で表される5-ベンジルアミノサリチル酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含むことを特徴とするストレス性疾患、うつ病や不安障害の治療または予防用組成物を提供する。より具体的には、本発明の5-ベンジルアミノサリチル酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩は、急性ストレス障害、心的外傷後ストレス障害などのストレス疾患、社交(社会)不安障害、全般性不安障害、パニック障害、広場恐怖症、物質誘発性不安障害、一般的な不安障害などを含む不安障害、およびうつ病の治療または予防のために使用することができる。
【００２７】
ストレス性疾患、うつ病、不安障害などの治療のための使用において、本発明の5-ベンジルアミノサリチル酸誘導体は、毎日約 0.01 mg/kgないし約 100 g/kgを投与することができるが、約0.1 mg/kgないし約10 g/kgの1日投与量が望ましい。しかし、前記の投与量は患者の状態（年齢、性別、体重など）、治療している状態の重要度、使用された化合物などによって変わる可能性がある。必要に応じて、利便性のために1日の総投与量が分かれ、一日中数回に分けて投与することができる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明は、ストレス性疾患、うつ病や不安障害の治療または予防に有用な薬学的組成物を提供する。本発明はまた、ストレス性疾患、うつ病や不安障害に効果的に治療または予防する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図1は、尾懸垂試験を用いて、本発明による化合物2の抗うつ効果を評価した結果である。* p<0.05 vs vehicleグループ、BID（twice a day）
【図２】図2は、束縛のストレスモデルを用いて、本発明による化合物2の抗ストレス効果を評価した結果である。
【図３】図3は、オープンスペースの試験で、本発明による化合物の投与が及ぼす影響を示す結果である。* p<0.05 vs vehicleグループ
【図４】図4は、強制水泳試験を用いて、本発明による化合物の抗うつ効果を評価した結果である。* p<0.05 vs vehicleグループ
【図５】図5は、拘束ストレステストを使用して、本発明による化合物の抗うつ効果を評価した結果である。* p<0.05 vs non- stressed vehicle（対照群1）のグループ＃p<0.05 vs stressed vehicle（対照群2）のグループ
【図６】図6は、ストレス誘発不安反応において、本発明による化合物の抗不安効果を示す結果である。* p<0.05 vs non- stressed vehicle（対照群1）のグループ＃p<0.05 vs stressed vehicle（対照群2）のグループ
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明の理解を助けるために実施例などを挙げて詳細に説明することにする。しかし、本発明による実施例は、さまざまな形に変形されることができ、本発明の範囲が下記の実施例に限定されるものと解釈されてはならない。本発明の実施例は、当業界で平均的な知識を持った者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【００３１】
<実施例1>マウスの尾懸垂試験による化合物2の抗うつ効果の評価
抗うつ薬効の生体内（in  vivo）検査法であるマウス尾懸垂法（tail-suspension test）により、試験化合物の有効性を評価した。本試験では、通常、5〜10分間、実験動物が不動の姿勢でいる時間を手動または自動装置で記録する。尾がぶら下がるマウスは、活動（運動）と不動の姿勢を交互に見せるが、抗うつ作用を持つ薬剤は、本試験では不動の姿勢を見せる時間を減らす。
【００３２】
体重28-30gの雄マウス（ICR mice）を研究全体に使用した。実験動物は12時間の明暗周期で照明を調整する動物の飼育室で、動物ケージ（cage）1個あたり8匹のグループで収容し、飼料と水を自由に供給した。マウス8匹からなる試験グループを無作為に治療群に割り付けた。
【００３３】
化合物2は10％、ルートロールに懸濁し、1日2回投与した。すべての化合物は、体重1kgあたり4mlの容積で経口投与した。対照群には10％ルートロールのみを同様に投与した。試験の1時間前に共同で処理した（各群  n=8）。
1。対照群（10％ルートロール）
2。化合物2、1.25mg/kg（1日2回経口投与）
3。化合物2、2.5mg/kg（1日2回経口投与）
4。化合物2、5mg/kg（1日2回経口投与）
5。化合物2、12.5mg/kg（1日2回経口投与）
6。化合物2、25mg/kg（1日2回経口投与）
7。化合物2、50mg/kg（1日2回経口投与）
具体的には文献[Psycopharmacology 85、367-370、Steru et al。 （1985）]に記載された方法によって評価した。実験当日、60分以上実験場で動物を馴化し、化合物を経口投与した後試験を実施した。薬物投与1時間後、マウスの尾の端から1cmほどになる部分を実験室用粘着テープを利用して付ける。尾に貼られたテープを高さ58cmほどの実験台に付着し、騒音が遮断された状態で6分間の尾懸垂法を施行して不動の姿勢を見せる時間を測定した。収集されたデータは、合計6分の試験期間中の後半4分間で不動の姿勢を見せる時間の平均値で示し、一元配置の分散分析（One - Way ANOVA）とTukeyのHSD（honestly significant difference test）事後検定法を用いて統計学的分析を行った。
【００３４】
その結果を図1に示した。化合物2を投与したすべての実験群で4分間の試験時間中に不動の姿勢を見せる時間が減少した。1.25mg/kg投与群は46％、2.5mg/kg投与群は43％、5mg/kg投与群は42％、12.5mg/kg投与群は38％、25mg/kg投与群は54％、50mg/kg投与群は57％で、対照群に比べ不動の時間が有意義に減少した。したがって、本発明による化合物2は、抗うつ活性を持つことがわかる。
【００３５】
<実施例2>ストレスモデルにおいて、化合物2の抑制効果
2-1. ラットに水浸及び拘束ストレスモデルの誘導
体重200g前後の成熟ラット（Sprague-Dawley rat）を通常の飼育条件下で24時間以上絶食させた後、試験薬を投与し、1時間後ストレスケージに入れて剣状突起が水に浸かるまで水中に入れ、水温を24℃に維持しながら10時間放置することで、ストレスを誘導する。
【００３６】
2-2. ストレス性のモデルで、化合物2を投与した後の抑制効果
ラット（Sprague-Dawleyラット）を通常の飼育条件下で24時間以上絶食させた後、化合物2（30 mg/kg）を投与し、1時間後ストレスケージに入れて水中に入れ、10時間放置した。10時間後、すぐにエーテル（ether）麻酔下で致死させた後、胃を摘出し、2％ホルマリン溶液10mlに10分間浸して固定させた後、胃の大湾部に沿って切開し広げた。胃を展開し、ストレスによる出血性病変を目視で確認し、その結果を図2に示した。図2に表示されるように、化合物2を30mg/kg投与した群で、ストレス性の胃損傷が確実に減っていることが確認できた。
【００３７】
<実施例3>オープンフィールド試験を利用した活動性への影響評価
薬物の投与が、実験動物の活動性に及ぼす影響を調べるために、オープンフィルド試験（Open  field  test）を使用し、開放空間における実験動物の活動性を測定した。
【００３８】
体重28-30gの雄マウス（ICR mice）を研究全体に使用した。実験動物は12時間の明暗周期で照明を調整する動物の飼育室で、動物ケージ（cage）1個あたり8匹のグループで収容し、飼料と水を自由に供給した。マウス8匹からなる試験グループを無作為に治療群に割り付けた。
【００３９】
化合物2は10％、ルートロールに懸濁し、1日2回投与した。すべての化合物は、体重1kgあたり5mlの容積で経口投与した。対照群には10％ルートロールを同様に投与した。試験の1時間前に共同で処理した（各群n=8）。
1。対照群（10％ルートロール）
2。化合物2、1.25mg/kg（1日2回経口投与）
3。化合物2、2.5mg/kg（1日2回経口投与）
4。化合物2、5mg/kg（1日2回経口投与）
5。化合物2、12.5mg/kg（1日2回経口投与）
6。化合物2、25mg/kg（1日2回経口投与）
7。化合物2、50mg/kg（1日2回経口投与）
オープンフィールドは 高さ30cmの壁に囲まれた全周58×58cmの正方形の床で構成されており、これを計12個のゾーンに分けた。実験動物を一匹ずつ、底のいっぺんの角区域に静かに置いてから5分間、ラットが動いた軌跡を測定した。実験動物の行動を中央部の天井に設置されたカメラとコンピュータプログラム（etho vision 3.0、NoldusInformation Technology）を利用して記録し、分析した。収集されたデータは、一元配置分散分析（One-Way  ANOVA）とTukeyのHSD（honestly significant difference test）、事後検定法を用いて統計学的分析を行った。
【００４０】
その結果を図３に示した。化合物を投与した群で、オープンフィールド試験をした結果、対照群および化合物2を投与したすべての群で活動性に差がないことが観察された。したがって、化合物2の投与が活動性に影響を与えずに、抗うつ活性を示すことが分かった。
【００４１】
<実施例4> 強制水泳試験による抗うつ効果の評価
強制水泳試験（Forced swim test）は、うつ病の治療効果について化合物をスクリーニングするために使われる行動試験である。水の入ったシリンダ型の容器に置かれた実験動物は、様々な逃避行動や不動の姿勢を見せる。この時、もがくことなく水に浮いている状態で水面から頭を出すために必要な動き以外は何の動きもない状態を不動の姿勢と測定する。抗うつ薬は、逃避行動を著しく増加させたり、不動の姿勢の指標に改善を示す。
【００４２】
9週齢の体重20-23gの雄マウス（C57BL / 6  mice）を研究全体に使用した。実験動物は12時間の明暗周期で照明を調整する動物の飼育室で、ケージ（cage）1個あたり8匹のグループで収容し、飼料と水を自由に供給した。マウス8匹からなる試験グループを無作為に治療群に割り付けた。
【００４３】
化合物2は10％ルートロールに懸濁し、1日2回投与した。すべての化合物は、体重1kgあたり５mlの容積で経口投与した。対照群には10％ルートロールを同様に投与した。試験の1時間前に共同で処理した（各群n=8）。
1。対照群（10％ルートロール）
2。化合物2、1.25mg/kg（1日2回経口投与）
3。化合物2、2.5mg/kg（1日2回経口投与）
4。化合物2、5mg/kg（1日2回経口投与）
5。化合物2、12.5mg/kg（1日2回経口投与）
実験当日、60分以上、実験場で動物を馴化し、化合物2、または対照群に経口投与した後、試験を実施した。直径14cm、高さ26cmの上面が開放された円筒形の水槽に24±1℃の水を16cmほど詰めて実験動物の尾が水槽の底に届かないようにした。化合物2またはルートロールを経口投与し、1時間後に実験動物を水槽に入れて6分間の強制水泳をさせ、ビデオカメラを用いて、動物の動きを録画した。収集されたデータは、合計6分の試験期間中の後半4分の間、不動の姿勢を見せた時間の平均値で示し、一元配置分散分析（One- Way ANOVA）とTukeyのHSD（honestly significant difference test）事後検定法を用いて統計学的分析を行った。
【００４４】
その結果を図４に示した。化合物２を投与したすべての実験群で4分間の試験時間中に不動の姿勢を見せる時間が減少した。1.25mg/kg投与群は31％、2.5mg/kg投与群は34％、5mg/kg投与群は30％、12.5mg/kg投与群は34％減少し、対照群に比べ不動性時間が有意義に減少した。
【００４５】
<実施例５> 反復拘束ストレス試験による抗うつ効果の評価
現在、実験動物の行動を用いたうつ病の研究では、うつ病の両側面である抗うつ薬の効能とストレスに対する反応が主に利用される。
【００４６】
ヒトでの疾患の原因となる状況と同じような境遇を動物に与え、うつ病に相当する症状を誘発させる現実的な動物モデルの場合、その病気に内在する原因となる生理的欠陥に関する研究が可能となる。このような現実的なうつ病のモデルでは、主に孤立、電気ショック、強制的に水につけること、周辺環境や温度変化などのストレスを加えることにより、動物にうつ病を誘発する方法を使用している。
【００４７】
ストレスによるうつ病モデルにおける化合物の効果を調べるために、拘束ストレス（restraint stress）の動物モデルを使用した。動けない狭い空間に実験動物を閉じ込めるストレスを加えて、うつ病に相当する症状を誘発し、化合物を投与した時、抗うつ効果があるか否かを調べようとした。
【００４８】
9週齢の体重20-23gの雄マウス（C57BL / 6 mice）を研究全体に使用した。実験動物は12時間の明暗周期で照明を調整する動物の飼育室で、ケージ（cage）1個あたり5〜6匹を収容し、飼料と水を自由に供給した。マウス11匹からなる試験グループを無作為に治療群に割り付けた。
【００４９】
化合物2は10％ルートロールに懸濁して投与した。すべての化合物は、体重1kg当たり5mlの容積で経口投与した。対照群は10％ルートロールを同じ方法で投与した。試験の1時間前に共同で処理した（各群n=11）。
1。対照群1（10％ルートロール）
2。化合物2  2.5mg/kg（1日2回経口投与）
3。化合物2  5mg/kg（1日2回経口投与）
4。対照群2（10％ルートロール）+  拘束ストレス
5。化合物2  2.5mg/kg（1日2回経口投与）+  拘束ストレス
6。化合物2  5mg/kg（1日2回経口投与）+  拘束ストレス
化合物2またはルートロールを経口投与し、1時間後、ストレスを加えた。これを一日に2時間ずつ2週間繰り返して行った。2週間の反復拘束ストレスの後、うつ病のの指標として、実施例4に示すように、強制水泳試験を実施して観察した。
【００５０】
その結果を図5に示した。 2週間のストレスを受けた対照群2で、不動の姿勢を見せる時間を観察した結果、ストレスを受けていない対照群1に比べて16％有意義に増加した。一方、ストレスを受けながら、化合物2を投与したすべての実験群では、4分間の試験時間中に不動の姿勢を見せる時間が減少した。2.5mg/kg投与群は32％、5mg/kg投与群は39％減少し、対照群2と比較して不動性時間が有意義に減少した。
【００５１】
また、化合物2の長期投与がうつ病に及ぼす影響を調べるために2週間投与した後の強制水泳試験を実施した結果、不動の姿勢を見せる時間が減少した。2.5mg/kg投与群は21％、5mg/kg投与群は26％減少し、対照群1に比べて不動性時間が有意義に減少した。
【００５２】
<実施例6>ストレス誘発不安反応において抗不安効果の評価
ストレスによって誘発された不安反応において、本発明による化合物の不安解消作用を調べるために、拘束ストレス（restraint stress）動物モデルを使用した。動けない狭い空間に実験動物を閉じ込めるストレスを加えた後、不安の症状を検査し、化合物を投与した時、抗不安効果があるか否かを調べた。
【００５３】
実験動物がストレスを受けるときは、いくつかの生理学的な変化が起こり、このような異常現象は、いくつかの行動検査を通じて測定できる。本実験では、高架迷路試験（elevated plus maze）を通じて実験動物の不安度を検定した。高架迷路試験は、2つの開放通路（open arms）と2つの閉鎖通路（closed arms）が水平方向に交差されており、実験動物が十字道の底から60cmの高さに位置しており、実験動物にとって不安を惹起するように考案された。
【００５４】
9週齢の体重20-23gの雄マウス（C57BL / 6 mice）を研究全体に使用した。実験動物は12時間の明暗周期で照明を調整する動物の飼育室で、ケージ（cage）1個あたり８匹のグループとして収容し、飼料と水を自由に供給した。マウス1６匹からなる試験グループを無作為に治療群に割り付けた。
【００５５】
化合物2は10％ルートロールに懸濁して投与した。すべての化合物は、体重1kg当たり5mlの容積で経口投与した。対照群は10％ルートロールを同じ方法で投与した。試験の1時間前に共同で処理した（各群n=11）。
1。対照群1（10％ルートロール）
2。対照群２（10％ルートロール）+  拘束ストレス
3。化合物2  2.5mg/kg（1日2回経口投与）+  拘束ストレス
4。化合物2  5mg/kg（1日2回経口投与）+  拘束ストレス
化合物2またはルートロールを経口投与し、1時間後、ストレスを加えた。これを一日に4時間ずつ2週間繰り返して行った。2週間の反復拘束ストレス後に、不安症状の指標として、高架迷路試験を実施して観察した。
【００５６】
実験当日、60分以上、実験場で動物を馴化し、化合物を経口投与した後、試験を実施した。化合物2またはルートロールを経口投与し、1時間後に実験動物を迷路装置の中心に位置させ、真上の天井に設置されたカメラとコンピュータプログラム（etho vision3.0、NoldusInformation Technology）を用いて、5分間の動物の行動を観察した。収集されたデータは、全体の実験時間中に開放通路における滞在時間（％time spent in open arms）の値として示し、一元配置分散分析（One- Way ANOVA）とLSD（Least significant difference test）事後検定法を用いて統計学的分析を行った。
【００５７】
その結果を図6に示す。開放通路での滞在率を観察した結果、ストレスを受けていない対照群1は21％、ストレスを受けた対照群2は9％であり、ストレスによって不安症状が誘発されることが分かった。一方、ストレスを受けながら、化合物2を投与したすべての実験群では、開放通路での滞在時間が増加した。2.5mg/kg投与群は24％、5mg/kg投与群は23％であり、開放通路での滞留率が対照群2に比べて有意義に増加し、対照群1のレベルであることがわかった。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図２】
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