(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析により得られたマススペクトルデータに基づいて目的試料のアミノ酸配列を推定するためのアミノ酸配列解析方法であって、
a)マススペクトルデータに基づいて目的試料に由来するピークの質量電荷比とピーク強度とを集めたピークリストを作成するピークリスト作成ステップと、
b)前記ピークリストに含まれるデータと既知である前記目的試料のアミノ酸組成情報とに基づいて、分枝限定法による探索アルゴリズムを利用したデノボシーケンス解析を行って複数のアミノ酸配列候補を選出するアミノ酸配列候補決定ステップと、
c)該アミノ酸配列候補決定ステップで選出された複数のアミノ酸配列候補のそれぞれについて、マススペクトルデータを利用してそのアミノ酸配列候補が目的試料のアミノ酸配列に合致する確からしさを示す確度情報を算出する確度算出ステップと、
d)該確度算出ステップで算出された確度情報に基づいて前記アミノ酸配列候補決定ステップにより選出されたアミノ酸配列候補を選別して又は序列を決めて該アミノ酸配列候補の全て又は一部を提示する情報提示ステップと、
を有し、前記アミノ酸配列候補決定ステップでは、前記ピークリストに挙げられているピークの中で順次選択するピークの強度を加算して算出されるスコアを最大化する又はより大きくするようなアミノ酸配列候補の選定を、部分的にアミノ酸を配したアミノ酸配列を節点とし次に配するアミノ酸に対応したピーク強度を枝とする木構造の有向グラフにおける最長路及びより長い有向路を見い出す問題として定式化し、前記アミノ酸組成情報によるアミノ酸種類及び個数を拘束条件として、ピークリストを利用し前記有向グラフ上でアミノ酸配列の一方の末端から両末端交互に配列内方に向かってアミノ酸を配置しながら、配置可能なアミノ酸に一致するピークがピークリスト中に存在しない場合にはアミノ酸未定の節点として探索を継続する一方、探索途中で予想スコアが小さい場合には探索を中止しつつ、前記アミノ酸組成情報に適合する有向路を探索するようにしたことを特徴とするアミノ酸配列解析方法。
【請求項２】
質量分析により得られたマススペクトルデータに基づいて目的試料のアミノ酸配列を推定するためのアミノ酸配列解析装置であって、
a)マススペクトルデータに基づいて目的試料に由来するピークの質量電荷比とピーク強度とを集めたピークリストを作成するピークリスト作成手段と、
b)前記ピークリストに含まれるデータと既知である前記目的試料のアミノ酸組成情報とに基づいて、分枝限定法による探索アルゴリズムを利用したデノボシーケンス解析を行って複数のアミノ酸配列候補を選出するアミノ酸配列候補決定手段と、
c)該アミノ酸配列候補決定手段により選出された複数のアミノ酸配列候補のそれぞれについて、マススペクトルデータを利用してそのアミノ酸配列候補が目的試料のアミノ酸配列に合致する確からしさを示す確度情報を算出する確度算出手段と、
d)該確度算出手段で算出された確度情報に基づいて前記アミノ酸配列候補決定手段により選出されたアミノ酸配列候補を選別して又は序列を決めて該アミノ酸配列候補の全て又は一部を提示する情報提示手段と、
を備え、前記アミノ酸配列候補決定手段では、前記ピークリストに挙げられているピークの中で順次選択するピークの強度を加算して算出されるスコアを最大化する又はより大きくするようなアミノ酸配列候補の選定を、部分的にアミノ酸を配したアミノ酸配列を節点とし次に配するアミノ酸に対応したピーク強度を枝とする木構造の有向グラフにおける最長路及びより長い有向路を見い出す問題として定式化し、前記アミノ酸組成情報によるアミノ酸種類及び個数を拘束条件として、ピークリストを利用し前記有向グラフ上でアミノ酸配列の一方の末端から両末端交互に配列内方に向かってアミノ酸を配置しながら、配置可能なアミノ酸に一致するピークがピークリスト中に存在しない場合にはアミノ酸未定の節点として探索を継続する一方、探索途中で予想スコアが小さい場合には探索を中止しつつ、前記アミノ酸組成情報に適合する有向路を探索するようにしたことを特徴とするアミノ酸配列解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド混合物を含む目的試料を質量分析し、これにより得られたマススペクトルデータを用いて目的試料中のペプチドのアミノ酸配列を推定するためのアミノ酸配列解析方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ポストゲノム研究としてタンパク質の構造や機能の解析が急速に進められている。このようなタンパク質の構造・機能解析手法（プロテオーム解析）の一つとして、質量分析装置を用いたタンパク質の発現解析や一次構造解析が広く行われるようになってきており、四重極型イオントラップや衝突誘起分解（ＣＩＤ）などによって特定のピークの捕捉と開裂を行う、いわゆるＭＳn分析（ｎは２以上の整数）が威力を発揮している。一般にＭＳ2（＝ＭＳ／ＭＳ）分析では、まず、分析対象物から特定の質量電荷比m/zを有するイオンをプリカーサイオンとして選別し、該プリカーサイオンをＣＩＤによって開裂させる。その後、開裂によって生成したイオン（プロダクトイオン）を質量分析することによって、目的とするイオンの質量や化学構造についての情報を得ることができる。
【０００３】
上記のようなＭＳn分析によってタンパク質のアミノ酸配列を同定する場合には、まず、タンパク質を適当な酵素で消化してペプチド断片の混合物としてから、該ペプチド混合物を質量分析する。このとき、各ペプチドを構成する元素には質量の異なる安定同位体が存在するため、同一のアミノ酸配列から成るペプチドであっても、その同位体組成の違いによって質量電荷比の異なる複数のピークを生じる。該複数のピークは、天然存在比が最大の同位体のみで構成されたイオン（主イオン）のピークと、それ以外の同位体を含むイオン（同位体イオン）のピークから成り、これらはイオンの価数が１の場合には１Da間隔で並んだ複数本のピークから成る同位体ピーク群を形成する。
【０００４】
続いて、上記のようなペプチド混合物のマススペクトルデータの中から、単一のペプチドに由来する一組の同位体ピーク群をプリカーサイオンとして選択し、該プリカーサイオンを開裂させて得られたイオン（プロダクトイオン）の質量分析（ＭＳ2分析）を行う。また、１回の開裂操作では十分に小さな断片に開裂しない場合には、開裂操作を複数回行うことも考えられる。
【０００５】
以上のようにして得られたプロダクトイオンのマススペクトルパターンや上記プリカーサイオンのマススペクトルパターンを基に、例えばマトリックスサイエンス社が提供しているマスコット（MASCOT）等の検索エンジンを利用してアミノ酸配列同定用データベース検索を実行することにより、被検ペプチドのアミノ酸配列を決定することができる。しかしながら、データベースに登録されていない新規なタンパク質の場合には上記方法を利用できないため、デノボ（De Novo）シーケンシングと呼ばれる方法でマススペクトルからアミノ酸配列を推定する方法が採られている。簡単に言うと、デノボシーケンシングは、マススペクトルに現れる複数のピークの間の質量電荷比差に一致する質量電荷比のアミノ酸を探索することで被検ペプチドのアミノ酸配列を推定する方法である。このための探索のアルゴリズムは従来より各所で検討されており、グラフ理論を利用した方法、動的計画法を利用した方法（特許文献１、非特許文献１参照）などが開発・提案されている。
【０００６】
非特許文献１に記載のアルゴリズムのポイントは、チャミー・ペア（Chummy Pair）と名付けられた、特異的なＮ末端側アミノ酸配列ＡとＣ末端側アミノ酸配列Ａ’とによるサンドウィッチ（Sandwich）アルゴリズムである。該文献では、同定対象である未知のペプチドＰのアミノ酸配列は、チャミー・ペアを利用しＡ−ａ−Ａ’とサンドウィッチ形式で表される。いま、Ｎ末端側アミノ酸配列Ａの質量電荷比をｘ、アミノ酸ａの質量電荷比を‖ａ‖ 、Ｃ末端側アミノ酸配列Ａ’の質量電荷比をｙ、エラー境界をδと表すと、アミノ酸配列の推定は｜ｘ＋ｙ＋‖ａ‖−Ｍ｜≦δの関係を満たすペプチドを見つけることに帰着される。但し、質量電荷比Ｍは、正しいアミノ酸質量の総和＋Ｎ末端質量電荷比（Ｎterm＝Ｈ＝1.00782Da）＋Ｃ末端質量電荷比（Ｃterm＝ＯＨ＋Ｈ＋Ｈ＝19.0184Da）である。こうして複数個のアミノ酸配列の候補が複数挙げられるから、それらは所定のスコアリング手法により順序付けされる。
【０００７】
スコアリング手法としては例えば非特許文献２に記載の方法を用いることができる。このスコアリング手法では次式のスコアリング関数が用いられている。
ｆ（ｈ１／ｈ）×ｆ（ｈ２／ｈ）×ｆ（ｈ３／ｈ）×exp｛−［（ｍ’−ｍ）／Δ］２｝×logｈ
ここで、ｈはｂ／ｙ系列イオンの強度、ｈ１、ｈ２はサポーティングイオン（supporting ions＝neutral lossと副シリーズ）の強度、ｍ’は測定質量電荷比、ｍは理論質量電荷比、Δは測定質量電荷比ｍ’の許容誤差（tolerance）である。即ち、これは、ｂ／ｙ系列イオンが存在すればサポーティングイオンに応じてその強度にボーナス点を付与する方法であると理解できる。なお、ボーナス点を与えるための関数ｆは経験的に与えられている。
【０００８】
しかしながら、本願発明者の検討によれば、上述したような非特許文献１、２に基づく従来のアミノ酸配列推定方法によっても、正しいアミノ酸配列を推定できる確率は必ずしも高くないことが明らかになっている。その理由の一つは、上述のような動的計画法のアルゴリズムでは複数の候補が挙げられるが、その中に正しいアミノ酸配列が含まれない場合があるからである。また他の理由は、動的計画法で得られた複数の候補の中に正しいアミノ酸配列が含まれていたとしても、上述したようなスコアリング法ではこれを必ずしも最上位にランキングできない場合があるからである。
【０００９】
本願発明者らは上記従来の動的計画法の欠点を解決する手法を特許文献１で提案した。この特許文献１に記載の手法では、マススペクトルデータに基づいてアミノ酸配列候補を選定する際に、その信頼度を示すスコアを最大化するアミノ酸配列候補を見い出す問題を、一方向の軸がアミノ酸配列上の位置、他方向の軸がマススペクトルの質量電荷比である２次元的な非巡回的グラフ上の最長路問題として定式化する。そして、被検ペプチドに由来するピークの質量電荷比と強度とを集めたピークリストに基づいて経路探索を実行しながらピーク強度を加算したスコアを求め、スコアの大きなものを選択して経路を逆に辿りながら各アミノ酸を特定することによりアミノ酸配列を求める。
【００１０】
上記改良型の動的計画法は、初めに経路探索を行う際に最大のスコアを与えるものだけでなくスコアの大きな複数のものを選択して経路を逆に辿ってアミノ酸配列を求めることにより、複数のアミノ酸配列候補を挙げることができる。そうして多数のアミノ酸配列候補を挙げることで、候補の中に正しいアミノ酸配列が含まれない検知漏れをなくすことが可能である。ところが、本願発明者の検討によれば、精度が高いスコアを計算しても、正しいアミノ酸配列が必ずしも上位にランキングできない場合があり、アミノ酸配列解析に有用な情報をユーザに提供する上で必ずしも性能が十分でないという課題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００８−１４５２２１号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】ビン・マ（Bin Ma）ほか、「アン・エフェクティブ・アルゴリズム・フォー・ザ・ペプチド・デ・ノボ・シーケンシング・フロム・エムエス／エムエス・スペクトラム（An Effective Algorithm for the Peptide De Novo Sequencing from MS/MS Spectrum）」、シンポジウム・コンビナトリアル・パターン・マッチング（Symp. Comb. Pattern Matching）、2003、pp.266-277
【非特許文献２】ビン・マ（Bin Ma）ほか、「ピークス：パワフル・ソフトウエア・フォー・ペプチド・デ・ノボ・シーケンシング・バイ・タンデム・マス・スペクトロメトリ（PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry）」、ラピッド・コミュニケーション・オブ・マス・スペクトロメトリ（Rapid Communication of Mass Spectrometry）、17、20 (2003)、 pp.2337-2342
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は上記課題に鑑みて成されたものであり、デノボシーケンシングを利用したアミノ酸配列解析方法及び装置において、選出された複数のアミノ酸配列候補の中で正しいアミノ酸配列を上位にランキングさせることにより、ユーザが解析を行う上で有用な情報を提供することができるようにすることを主たる目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するために成された第１発明は、質量分析により得られたマススペクトルデータに基づいて目的試料のアミノ酸配列を推定するためのアミノ酸配列解析方法であって、
a)マススペクトルデータに基づいて目的試料に由来するピークの質量電荷比とピーク強度とを集めたピークリストを作成するピークリスト作成ステップと、
b)前記ピークリストに含まれるデータと既知である前記目的試料のアミノ酸組成情報とに基づいて、分枝限定法による探索アルゴリズムを利用したデノボシーケンス解析を行って複数のアミノ酸配列候補を選出するアミノ酸配列候補決定ステップと、
c)該アミノ酸配列候補決定ステップで選出された複数のアミノ酸配列候補のそれぞれについて、マススペクトルデータを利用してそのアミノ酸配列候補が目的試料のアミノ酸配列に合致する確からしさを示す確度情報を算出する確度算出ステップと、
d)該確度算出ステップで算出された確度情報に基づいて前記アミノ酸配列候補決定ステップにより選出されたアミノ酸配列候補を選別して又は序列を決めて該アミノ酸配列候補の全て又は一部を提示する情報提示ステップと、
を有し、前記アミノ酸配列候補決定ステップでは、前記ピークリストに挙げられているピークの中で順次選択するピークの強度を加算して算出されるスコアを最大化する又はより大きくするようなアミノ酸配列候補の選定を、部分的にアミノ酸を配したアミノ酸配列を節点とし次に配するアミノ酸に対応したピーク強度を枝とする木構造の有向グラフにおける最長路及びより長い有向路を見い出す問題として定式化し、前記アミノ酸組成情報によるアミノ酸種類及び個数を拘束条件として、ピークリストを利用し前記有向グラフ上でアミノ酸配列の一方の末端から両末端交互に配列内方に向かってアミノ酸を配置しながら、配置可能なアミノ酸に一致するピークがピークリスト中に存在しない場合にはアミノ酸未定の節点として探索を継続する一方、探索途中で予想スコアが小さい場合には探索を中止しつつ、前記アミノ酸組成情報に適合する有向路を探索するようにしたことを特徴としている。
【００１５】
また第２発明に係るアミノ酸配列解析装置は、コンピュータ上で上記第１発明に係るアミノ酸配列解析方法を実現するための装置であって、質量分析により得られたマススペクトルデータに基づいて目的試料のアミノ酸配列を推定するためのアミノ酸配列解析装置であって、
a)マススペクトルデータに基づいて目的試料に由来するピークの質量電荷比とピーク強度とを集めたピークリストを作成するピークリスト作成手段と、
b)前記ピークリストに含まれるデータと既知である前記目的試料のアミノ酸組成情報とに基づいて、分枝限定法による探索アルゴリズムを利用したデノボシーケンス解析を行って複数のアミノ酸配列候補を選出するアミノ酸配列候補決定手段と、
c)該アミノ酸配列候補決定手段により選出された複数のアミノ酸配列候補のそれぞれについて、マススペクトルデータを利用してそのアミノ酸配列候補が目的試料のアミノ酸配列に合致する確からしさを示す確度情報を算出する確度算出手段と、
d)該確度算出手段で算出された確度情報に基づいて前記アミノ酸配列候補決定手段により選出されたアミノ酸配列候補を選別して又は序列を決めて該アミノ酸配列候補の全て又は一部を提示する情報提示手段と、
を備え、前記アミノ酸配列候補決定手段では、前記ピークリストに挙げられているピークの中で順次選択するピークの強度を加算して算出されるスコアを最大化する又はより大きくするようなアミノ酸配列候補の選定を、部分的にアミノ酸を配したアミノ酸配列を節点とし次に配するアミノ酸に対応したピーク強度を枝とする木構造の有向グラフにおける最長路及びより長い有向路を見い出す問題として定式化し、前記アミノ酸組成情報によるアミノ酸種類及び個数を拘束条件として、ピークリストを利用し前記有向グラフ上でアミノ酸配列の一方の末端から両末端交互に配列内方に向かってアミノ酸を配置しながら、配置可能なアミノ酸に一致するピークがピークリスト中に存在しない場合にはアミノ酸未定の節点として探索を継続する一方、探索途中で予想スコアが小さい場合には探索を中止しつつ、前記アミノ酸組成情報に適合する有向路を探索するようにしたことを特徴としている。
【００１６】
上記「マススペクトルデータ」とは、目的とする被検ペプチドをプリカーサイオンとして、これを１乃至複数段階に開裂させることで発生したプロダクトイオンを検出するＭＳｎ分析により得られたマススペクトルデータである。
【００１７】
また「既知である前記目的試料のアミノ酸組成情報」は、例えば、質量分析装置又は別の分析装置を用いて目的試料であるペプチド（又はタンパク質）を分析した結果により得られた、アミノ酸の組成、つまりアミノ酸の種類と個数とに関する情報である。目的試料のペプチド（又はタンパク質）の質量を非常に高い精度で得ることが可能な質量分析装置であれば、その質量からアミノ酸組成情報を計算することが可能である。また、例えば島津製作所製、ＬＣ／ＭＳ高速アミノ酸分析システム「UF-Amino Station」等の分析装置により、アミノ酸組成情報を得ることも可能である。
【００１８】
本発明に係るアミノ酸配列解析方法及び装置では、デノボシーケンシングを利用して、つまりはピークリスト中の各ピークの質量電荷比に基づいてアミノ酸配列候補を見いだす問題を、深さｋ番目の節点にｋ個のアミノ酸を含んで構成されるアミノ酸配列を配置した木構造の有向グラフ上の最長路問題として定式化するが、その際に、配置されるアミノ酸について上述したような既知のアミノ酸組成情報を拘束条件として課す。また、最初の節点、つまり初期設定としてはアミノ酸配列の一方の末端（Ｎ末端又はＣ末端）に一つのアミノ酸を配置し、その後は、一層ずつ深くなる毎に両末端交互に配列内方に向かって順次アミノ酸を配置していくものとする。なお、初期設定の末端や該末端に配置されるアミノ酸は、例えば目的試料を調製する際にタンパク質を断片化する手段（消化酵素の種類など）に依存するから、その手段に応じて決めることができる。
【００１９】
そしてアミノ酸配列候補決定ステップでは、被検ペプチドに由来するピークの質量電荷比と強度とを集めたピークリストに基づいて、指定されたアミノ酸組成によるアミノ酸の数までの経路探索を実行することで、ピーク強度を加算したスコアが大きいアミノ酸配列を求める。上記のような木構造を下層に向かって辿っていく際に、アミノ酸配列中に配置可能なアミノ酸に質量電荷比が一致するピークがピークリスト中に存在すれば該アミノ酸を配置すればよいが、存在しない場合にはアミノ酸未定であるとして次の節点を一旦定め探索を継続する。但し、その際には、加算すべきピーク強度が存在しないから、スコアは増加させない。一方、アミノ酸組成が既知であることから、探索途中で、配置可能な残りのアミノ酸に応じて最終的に獲得可能なスコアの範囲を予測することが可能である。そこで、その予測スコアが小さい場合にはその経路の探索を中断し、可能性がある別の経路について探索を行う。そうして最終的に相対的に大きなスコアが得られた経路に基づくアミノ酸配列を候補として挙げる。
【００２０】
上記探索に伴って算出されるスコアの精度が高ければ最長路のみを求めればよいが、実際にはこのスコアが最大のものが正解のアミノ酸配列となるとは限らない。そこで、最長路のみならず、２番目、３番目、…、Ｋ番目に長い経路も求め、これに対応したアミノ酸配列を候補として挙げる。経路探索を高速化するには、探索の際にスコアの算出を簡素化しておく必要があるが、ピーク強度を単に加算して求めたスコアの精度は必ずも十分に高くない。
【００２１】
そこで、本発明に係るアミノ酸配列解析方法では、アミノ酸配列候補決定ステップで選出された複数のアミノ酸配列候補のそれぞれについて、マススペクトルデータを利用してそのアミノ酸配列候補が目的試料のアミノ酸配列に合致する確からしさを示す確度情報を算出する確度算出ステップを有し、情報提示ステップは、該確度算出ステップで算出された確度情報によりアミノ酸配列候補決定ステップにより選出されたアミノ酸配列候補を選別して又は序列を決めて提示するようにしている。なお、確度算出ステップにより確度、つまりスコアを再計算する際には、例えばマススペクトルに現れているｂ／ｙ系列以外のａ／ｃ／ｘ／ｚ系列イオンについての強度情報やニュートラルロスの情報などを加えるようにするとよい。
【発明の効果】
【００２２】
従来の動的計画法では高いスコアを示してしまうようなアミノ酸配列であっても、本発明に係るアミノ酸配列解析方法及び装置によれば、アミノ酸組成情報に合致しないようなものは候補から落とされる。また、アミノ酸組成情報を拘束条件とすることで候補の数自体もかなり絞られる。それにより、得られた候補についてスコアに基づく順位付けを行うと、正しいアミノ酸配列候補が上位に位置付けられる可能性がかなり高くなり、ユーザに対し信頼度の高い情報を提供することができる。また、本発明に係るアミノ酸配列解析方法及び装置によれば、探索途中で予測スコアに基づいて的確に枝切りを行うことができるので、無駄な経路探索を行うことがなくなり、探索時間を短縮して実用的な時間内に正確なアミノ酸配列を含む候補を挙げることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の一実施例によるアミノ酸配列解析装置のブロック構成図。
【図２】本実施例のアミノ酸配列解析装置で実施するアミノ酸配列解析方法の概略フローチャート。
【図３】一解析例において作成したピークリストをマススペクトルで示した図。
【図４】本解析例における木構造の一部を示す図。
【図５】本解析例における経路探索途中でのスコア予測の説明図。
【図６】本解析例において得られるアミノ酸配列候補を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明に係るアミノ酸配列解析方法を用いたアミノ酸配列解析装置の一実施例について添付図面を参照して説明する。
図１は本実施例によるアミノ酸配列解析装置のブロック構成図である。本装置の実体はコンピュータであって、アミノ酸配列解析用プログラムを記録した、例えばＣＤ−ＲＯＭ（ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ）、ＭＯ、ＤＶＤ−ＲＡＭ、メモリカードなどの着脱自在の記録媒体、ＨＤＤなどの一般的に着脱自在ではない記録媒体など、様々な記録媒体をコンピュータで読み取らせることで取得したプログラム、又は通信回線等を通して外部から取り込んだプログラムを外部から当該コンピュータ上で実行することにより具現化されるものである。
【００２５】
本実施例のアミノ酸配列解析装置は、スペクトルデータ記憶部２１、スペクトル処理部２２、デノボ候補配列算出部２３、スコア算出部２４、表示処理部２５、を含む解析処理部２と、該解析処理部２に接続された入力部３と、表示部４とから成る。質量分析計１は例えばＭＡＬＤＩ−イオントラップ型ＴＯＦＭＳなどのＭＳn型質量分析装置であり、目的とする被検ペプチドを含む試料に対する質量分析（ＭＳｎ分析）を実行して得られたマススペクトルデータがスペクトルデータ記憶部２１に保存される。解析処理部２では、このマススペクトルデータを用いた解析処理により被検体のアミノ酸配列が推定される。
【００２６】
図２は解析処理部２で実施されるアミノ酸配列解析処理の概略フローチャートである。以下、ヘモグロビン（Hemoglobin）のトリプシン消化物であるペプチド［ＬＬＶＶＹＰＷＴＱＲ］を測定したデータに基づいて解析を行う場合を例に挙げて、本実施例に特徴的な解析処理について説明する。
【００２７】
まず解析実行に先だって分析者は、解析対象であるマススペクトル、アミノ酸分析装置等で得られたアミノ酸組成情報、及び、正しいアミノ酸配列を求めるために必要な算出候補のランク数、を入力部３により指定又は入力する（ステップＳ１）。アミノ酸組成情報はペプチドを構成するアミノ酸の種類と数のみの情報であり、本解析例では、アミノ酸組成はＬ（ロイシン）：２個、Ｖ（バリン）：２個、Ｙ（チロシン）：１個、Ｐ（プロリン）：１個、Ｗ（トリプトファン）：１個、Ｔ（トレオニン）：１個、Ｑ（グルタミン）：１個、Ｒ（アルギニン）：１個、であることが既知であり、これが入力される。
【００２８】
なお、アミノ酸組成は、例えば島津製作所製、ＬＣ／ＭＳ高速アミノ酸分析システム「UF-Amino Station」などの分析装置を用いることで求めることが可能である。そのほか、非常に高い質量精度を持つ質量分析装置で得られた被検ペプチドの質量電荷比から計算により求めることも可能である。
【００２９】
通常、マススペクトルデータに基づいて得られるマススペクトルにはノイズを含めて多数のピークが出現する。そこで、スペクトル処理部２２は、マススペクトルの中で目的とする被検ペプチド由来のピークを選択し、解析対象となるピークの質量電荷比と強度とを集めたピークリストを作成する（ステップＳ２）。ここでピークの選択は、例えば、ロビン・グラス（Robin Gras）ほか、「インプルービング・プロテイン・アイデンティフィケイション・フロム・ペプチド・マス・フィンガープリンティング・スルー・ア・パラメタライズド・マルチ−レベル・スコアリング・アルゴリズム・アンド・アン・オプティマイズド・ピーク・デテクション（Improving protein identification from peptide mass fingerprinting through a parameterized multi-level scoring algorithm and an optimized peak detection）」、エレクトロフォレシス（Electrophoresis）、20、pp.3535-3550 (1999)、に開示されている方法を利用することができる。即ち、同位体ピーククラスタ（同一の元素組成を有するイオンに由来し、イオン中の同位体組成の相違によって異なる質量電荷比を示す複数本のピークから成るピーク群）の強度比を理論値と測定値とで比較することにより、不所望のノイズのピークを除外して解析対象とすべきピークを選択することができる。もちろん、それ以外のノイズ除去法を使用したり併用したりしてもよい。
【００３０】
図３は本解析例において作成したピークリストをマススペクトルで示した図である。即ち、図３に示したマススペクトル中に現れているピークが解析対象となる。
【００３１】
次にデノボ候補配列算出部２３は、スペクトル処理部２２で作成されたピークリストと入力部３を介して指定されたアミノ酸組成情報とに基づき、アミノ酸の組み合わせの最適化問題を分枝限定法により解くことで、多数のアミノ酸配列候補を算出する（ステップＳ３）。周知のように、分枝限定法は組み合わせ最適化問題を解くための有用なアルゴリズムの一つであり、一つの節点から分岐する複数本の枝を下層に伸ばして多層化した木構造の有向グラフにおいて最長路を探索するものである。ここでは、木構造の各節点（ノード）には、少なくとも一部分にアミノ酸（残基）が配置され残りが未定であるようなアミノ酸配列を布置し、木構造の枝にはピークリストにおいてアミノ酸の質量電荷比と一致するｂ系列／ｙ系列イオンピークの強度値を割り当てる。入力されたアミノ酸組成情報に依存するアミノ酸を全て使用して木構造の末端に到達したときに、最初の節点から最後の節点までに通過した枝に割り当てられている強度値の総和（スコア）が大きいアミノ酸配列を求めることが、最長路探索の目的である。図３に示したピークリストに基づく解析例における木構造の一部分を図４に示す。
【００３２】
分枝限定法の解法の中心となるのは、分枝操作と限定操作である。実用的な計算時間内で解を求めるためには、分枝操作において枝の数をできるだけ少なくし、限定操作により計算実行前に枝を切り取ることが重要である。そのため、ここではアミノ酸配列や分析手法の特徴を考慮して、以下のような特徴的な工夫を施したアルゴリズムとした。
【００３３】
即ち、分枝操作は次のような手順で行う。まず、初期設定でもある最初の節点には、Ｃ末端又はＮ末端の一方にアミノ酸組成情報から求まる一つのアミノ酸を配置したアミノ酸配列を布置する。このとき、Ｎ／Ｃいずれの末端とするか、また、いずれのアミノ酸を配置するのか、はタンパク質を断片化する際の手法、具体的には酵素消化による断片化では消化酵素の種類に依存する。本解析例で用いられたトリプシン消化の場合には、それによる断片化の特性から、最初の節点に布置されるアミノ酸配列ではＣ末端にアルギニン（Ｒ）かリシン（Ｋ）が割り当てられるが、本解析例では、アミノ酸組成中にリシンはないため、必然的にアルギニンをＣ末端に割り当てる（図４中の1st depth）。なお、この割り当てにより、アミノ酸組成中のアルギニンが使用されるため、以降はアルギニンはアミノ酸から除かれる。
【００３４】
その１段階下層である２番目の深さの節点（図４中の2nd depth）には、その直前にアミノ酸を配置した末端とは反対側の末端、図４の解析例ではＮ末端、にアミノ酸組成情報から求まる一つのアミノ酸を配置する。上記解析例では、１番目の節点においてアルギニン（Ｒ）を割り当てたため、アミノ酸組成中の残りのアミノ酸、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）、トリプトファン（Ｗ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｑ）が候補であるが、これらをそれぞれＮ末端に配置したアミノ酸配列の全てを新たな節点とすると節点の数が多くなりすぎる。そこで、ピークリスト中のピークの質量電荷比と一致するアミノ酸をＮ末端に配置したアミノ酸配列を次の節点に布置することとする。一方、それ以外の、つまりはピークリスト中のピークの質量電荷比と一致しなかったアミノ酸については、それらをまとめて未定アミノ酸（Ｘ）と仮に定義し、この未定アミノ酸をＮ末端に配置したアミノ酸配列を次の節点に布置する。
【００３５】
図４の解析例では、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）の二種のアミノ酸はピークリスト中に質量電荷比が一致するピークが存在したためにそれぞれ別の節点とされ、それ以外の五種のアミノ酸はピークリスト中に質量電荷比が一致するピークが存在しないために未定アミノ酸（Ｘ）としてまとめて別の節点とされている。このように、ピークリスト中に一致する質量電荷比が存在しないものについて未定アミノ酸として処理することによって、枝の数を少なくすることができる。本解析例では、未定アミノ酸Ｘを使用することで、採り得る枝の総数を6,236,020個（＝10＋10×9＋10×9×8＋……＋10×9×8×7×6×5×4×3×2 ）から4,299個に減少させることができた。なお、図４中の1st depthから2nd depthへの分枝において、マススペクトル中のピークの質量電荷比と一致するロイシン（Ｌ）とバリン（Ｖ）の枝にはそれぞれピーク強度15.3と8.4とがスコアとして与えられるが、未定アミノ酸Ｘの枝のスコアはゼロである。
【００３６】
一方、限定操作は次のように行われる。上述したように、節点に布置されるアミノ酸配列では、一層ずつ下がる（深くなる）毎に、Ｃ末端→Ｎ末端→Ｃ末端から内側に向かって２番目→Ｎ末端から内側に向かって２番目→…と、配列の両端から交互に配列の中央に向かって一つずつアミノ酸が配置される。一般に、限定操作を行わなければ、節点の数は膨大なものとなる。そこで、ここでは各節点に布置されたアミノ酸配列の質量電荷比から残りのピーク探索質量電荷比範囲を求め、木構造の末端に達するときのスコアを予測する。そして、その予測スコアが小さい場合、具体的には、その時点で求められている、ステップＳ１で指定された候補配列ランク数以内のアミノ酸配列候補が獲得した最小スコアに比べて小さい場合には、その経路の探索を中止する。簡単に言えば、探索途中において最終的に得られるスコアを予測し、そのスコアによっては枝切りを行うわけである。それによって、探索経路の数を限定できるとともに、最終的なスコアが低い候補についての無駄なスコア計算の時間を省くことができる。
【００３７】
図４に示した例で、４番目の深さ（4th depth）の節点に布置されたアミノ酸配列［ＬＬ＊＊＊＊＊＊ＱＲ］（但し＊は未配置部分）について考えてみる。図５はこの解析例のアミノ酸配列についてｂ系列イオン及びｙ系列イオンの理論質量電荷比を示したものである。図中、斜線を施した部分は、既に帰属されたピークを表す。図５（ａ）では本実施例のアルゴリズムのように配列の両端交互に４個のアミノ酸を配置した状態で既知である理論質量電荷比を示している。他方、図５（ｂ）では比較例として、配列の一方の端部（具体的にはＣ末端）から順に４個のアミノ酸を配置した状態で既知である理論質量電荷比を示している。図５（ａ）に示したｂ系列／ｙ系列イオンの理論質量電荷比を参考にすると、アミノ酸配列［ＬＬ＊＊＊＊＊＊ＱＲ］が得られた時点で残りのアミノ酸に対応するピーク質量電荷比の範囲は、ｂ系列イオンで227.1754以上972.5553以下、ｙ系列イオンで303.1775以上1048.557以下である。この時点での残りのアミノ酸配列に対応するピークの探索範囲は、これらｂ系列イオン及びｙ系列イオンでの質量電荷比範囲を合わせた最大範囲とするため、227.1754以上1048.557以下となる。この限られた質量電荷比範囲において、本アミノ酸配列において帰属されるべき残り１０個のピークについて、ピークリスト中で強度が高い順に１０個のピークの強度の総和を残りのイオンの予測スコアとする。
【００３８】
これに対し、図５（ｂ）に示したようにＣ末端から内方に順番に４個のアミノ酸を配置した場合には、４番目の深さの節点に布置されたアミノ酸配列［＊＊＊＊＊＊ＷＴＱＲ］において、残りのｂ系列イオンの質量電荷比は685.4283以下、残りのｙ系列イオンの質量電荷比は590.3045以上である。そのため、予測スコアを算出する際にピークリスト中の全ての質量電荷比範囲内のピークの中から強度が高い順に１０個のピークを選ぶことになり、上述した場合に比べてスコアは大きくなってしまう。このように、アミノ酸配列の一方の末端のみからではなく両末端交互にアミノ酸を配置してゆくことによって予測スコアの値を速く小さくする、即ち、実際の最終スコアに近づけることができるので、無駄な探索である場合に探索中止、つまり枝切りを早い段階で行うことができる。それにより、節点の数を減らして探索経路を絞ることができる。図４に示した解析例では、こうした特徴的な限定操作を行うことで、実際に評価した節点は4,299個中324個に絞られた。
【００３９】
以上のようにしてステップＳ３では最終的にステップＳ１で指定されたランク数の複数のアミノ酸配列候補が得られる。次に、スコア算出部２４はその複数のアミノ酸配列候補のそれぞれについてピークリストに基づいてスコアを再計算し、精度の高いスコア値を求める（ステップＳ４）。これは、上述のアミノ酸配列候補の算出時にはスコア計算に要する時間を節約するためにピーク強度のみを用いた簡易的な演算を行っており、選出されたアミノ酸配列候補の確度を分析者に提示するには必ずしも十分な精度でないからである。スコア再計算の際には、例えば、スコアに加える強度値の対象であるフラグメントイオンの種類を、ｂ系列やｙ系列だけでなく、ａ、ｃ、ｘ、ｚ系列フラグメントイオンとしたりＨ2Ｏ／ＮＨ3ニュートラルロスのいくつかを組み合わせたり、それらの加算の重み付けを適宜調整したりする。質量分析装置の種類によって、フラグメントイオンの現れ方には特徴があるため、使用する質量分析装置の種類やイオン解離条件などに応じて、スコア再計算の手法を変更するとよい。さらに、実測の質量電荷比と理論質量電荷比との誤差を考慮したり、アミノ酸配列から得られるフラグメントの強度パターンを考慮したりしたスコア再計算を行うようにしてもよい。
【００４０】
そして表示処理部２５は、スコア算出部２４で算出された高精度のスコア値に従って信頼度の高いアミノ酸配列候補を所定個数だけ選出し、そのスコア値と共に表示部４の画面上に表示する（ステップＳ５）。もちろん、全てのアミノ酸配列候補をスコア順に並べ替えて表示してもよい。また、このときには、解析の元となったマススペクトルと推定したアミノ酸配列候補の対応も併せて表示するのが好ましい。
【００４１】
上記解析例のデータに対して従来法を適用した場合に得られたランク上位１０個のアミノ酸配列候補を図６（ａ）に示す。この結果では、正しいアミノ酸配列［ＬＬＶＶＹＰＷＴＱＲ］はランク上位１０個には入らなかった。一方、上述した本実施例のアミノ酸配列解析装置によるアルゴリズムにより求めたランク上位１０個までのアミノ酸配列候補を図６（ｂ）に示す。この場合には、正しいアミノ酸配列は２番目に現れている。このように、上述した特徴的なアルゴリズムによるアミノ酸配列推定によれば、正しいアミノ酸配列がランク上位の候補中に含まれる可能性が高まり、高い信頼度の情報を分析者に提供することができる。
【００４２】
なお、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【符号の説明】
【００４３】
１…質量分析計
２…解析処理部
２１…スペクトルデータ記憶部
２２…スペクトル処理部
２３…デノボ候補配列算出部
２４…スコア算出部
２５…表示処理部
３…入力部
４…表示部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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