(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）エーリキア・カニスに感染した動物と；（ｂ）Ｅ．ｃａｎｉｓに感染していない動物とを、該動物がＥ．ｃａｎｉｓに関してワクチン接種されているか否かにかかわらず識別する方法であって：
（ａ）動物由来の生物学的サンプルと、Ｅ．ｃａｎｉｓワクチンに対する該動物の免疫応答の成分である抗体に特異的に結合しない１つ以上の精製されたポリペプチドとを接触させる工程であって；ここで該１つ以上の精製されたポリペプチドが配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、または３３に対して少なくとも９５％の同一性を有し、不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓ細胞が該Ｅ．ｃａｎｉｓワクチンとして使用される工程と；
（ｂ）該生物学的サンプル中の抗体が１つ以上の精製されたＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドに対して特異的に結合するか否かを検出する工程と；
を包含し、
ここで該生物学的サンプル中の抗体が１つ以上の精製されたポリペプチドに特異的に結合するならば、該動物はＥ．ｃａｎｉｓに感染している、方法。
【請求項２】
前記１つ以上の精製されたポリペプチドが１５〜７５アミノ酸長である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ以上の精製されたポリペプチドが、異種のアミノ酸配列、指示薬、アミノ酸スペーサー、アミノ酸リンカー、シグナル配列、輸送停止配列、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンドまたはそれらの組み合わせに結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
試験サンプル中でＥ．ｃａｎｉｓに特異的である抗体またはその抗原結合フラグメントの存在を判定する方法であって：
（ａ）１つ以上の精製されたポリペプチドが抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合するのに適した条件下で、試験サンプルを、配列番号２２、２３、２５、２６、２８、３０、または３３からなる１つ以上の精製されたポリペプチドと接触させる工程であって、ここで、
１つ以上の精製されたポリペプチドは、Ｅ．ｃａｎｉｓに特異的である抗体に特異的に結合する；および
（ｂ）該１つ以上の精製されたポリペプチドの、該抗体またはその抗原結合フラグメントへの特異的な結合の存在を検出する工程；
を包含し、
ここで、該１つ以上の精製されたポリペプチドの該抗体または抗原結合フラグメントへの特異的な結合の存在は、該試験サンプル中のＥ．ｃａｎｉｓに特異的な該抗体またはその抗原結合フラグメントの存在を示す、方法。
【請求項５】
前記１つ以上の精製されたポリペプチドが、異種のアミノ酸配列、指示薬、アミノ酸スペーサー、アミノ酸リンカー、シグナル配列、輸送停止配列、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンドまたはそれらの組み合わせに結合される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が特異的結合の量を検出する工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上の精製ポリペプチドが固相支持体に固定される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
組成物であって：
（ａ）配列番号２２、２３、２５、２６、２８、３０、または３３からなる１つ以上の精製されたポリペプチド；あるいは
（ｂ）１位のＸが存在しないかまたはＣであり、４位のＸがＨまたはＱであり、２５位のＸがＤまたはＧであり、３６位のＸがＥまたはＧである、配列番号３３；
（ｃ）１位のＸがＣであり、４位のＸがＨであり、２５位のＸがＤまたはＧである、配列番号３３のアミノ酸１〜２７；
（ｄ）２５位のＸがＤまたはＧであり、３６位のＸがＥまたはＧであり；かつＣが任意にアミノ末端に存在している、配列番号３３のアミノ酸１３〜４１；
（ｅ）１位のＸがＣであるかまたは存在せず、かつここで２５位のＸがＤまたはＧである、配列番号３３のアミノ酸１〜２７；
（ｆ）２５位のＸがＤまたはＧであり、３６位のＸがＥまたはＧであり、かつＣが任意にアミノ末端に存在している、配列番号３３のアミノ酸１３〜４１；
（ｇ）２５位のＸがＤまたはＧであり、かつＣが任意にアミノ末端に存在している、配列番号３３のアミノ酸１３〜２７；
（ｈ）２５位のＸがＤまたはＧであり、３６位のＸがＥまたはＧであり、かつＣが任意にアミノ末端に存在している、配列番号３３のアミノ酸１３〜４１；あるいは
（ｉ）（ａ）〜（ｈ）の組み合わせ、
を含んでいる、組成物。
【請求項９】
前記１つ以上の精製されたポリペプチドが多量体型である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記１つ以上の精製されたポリペプチドが、異種のタンパク質、指示薬、アミノ酸スペーサー、アミノ酸リンカー、シグナル配列、輸送停止配列、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンドまたはそれらの組み合わせに結合される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
非ヒト動物において免疫応答を生じさせる方法であって：該動物に対して配列番号２２、２３、２５、２６、２８、３０、または３３からなる１つ以上の精製されたポリペプチドまたはそれらの組み合わせを投与する工程を包含し、該１つ以上の精製されたポリペプチドが該動物において免疫応答を生じる方法。
【請求項１２】
前記１つ以上の精製されたポリペプチドが多量体型である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つ以上の精製されたポリペプチドが、異種のタンパク質、指示薬、アミノ酸スペーサー、アミノ酸リンカー、シグナル配列、輸送停止配列、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンドまたはそれらの組み合わせに結合される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
非ヒト動物におけるエーリキア・カニス感染の予防、治療または回復のための方法であって、
該動物に対して：
（ａ）配列番号２２、２３、２５、２６、２８、２９、３０、または３３からなる１つ以上の精製されたポリペプチド、またはそれらの組み合わせ；あるいは
（ｂ）配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、または３３を含んでいる１つ以上の精製されたポリペプチドをコードする１つ以上の核酸、またはそれらの組み合わせ；あるいは
（ｃ）配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、または３３を含んでいる１つ以上の精製されたポリペプチドに特異的に結合する１つ以上の抗体、またはそれらの組み合わせ；
を投与する工程を包含し、
これによってＥ．ｃａｎｉｓ感染が予防、回復または治療される、方法。
【請求項１５】
患者においてＥ．ｃａｎｉｓ感染の治療をモニタリングする方法であって：（ａ）Ｅ．ｃａｎｉｓ感染のための治療の前または初期段階において、患者由来の第一のサンプル中の抗Ｅ．ｃａｎｉｓ抗体のレベルを請求項４に記載の方法によって測定する工程と；（ｂ）治療がなされた後の該患者由来の第二のサンプル中の抗Ｅ．ｃａｎｉｓ抗体のレベルを請求項４に記載の方法によって測定する工程と；（ｃ）該第一のサンプル中の抗Ｅ．ｃａｎｉｓ抗体の量と、該第二のサンプル中の抗Ｅ．ｃａｎｉｓ抗体の量とを比較して、変化を測定し、それによって治療をモニタリングする工程と；を包含する、方法。
【請求項１６】
Ｅ．ｃａｎｉｓに感染した動物とＥ．ｃａｎｉｓに感染していない動物とを識別する方法であって：
（ａ）動物由来の生物学的サンプルと、配列番号２２、２３、２５、２６、２８、３０、または３３からなる１つ以上の精製されたポリペプチドとを接触させる工程と；
（ｂ）該生物学的サンプル中の抗体が１つ以上の精製されたＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドに対して特異的に結合するか否かを検出する工程と；
を包含し、
ここで該生物学的サンプル中の抗体が１つ以上の精製されたポリペプチドに特異的に結合するならば、該動物はＥ．ｃａｎｉｓに感染している、方法。
【請求項１７】
前記１つ以上の精製されたポリペプチドが、異種のアミノ酸配列、指示薬、アミノ酸スペーサー、アミノ酸リンカー、シグナル配列、輸送停止配列、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンドまたはそれらの組み合わせに結合される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が特異的結合の量を検出する工程をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つ以上の精製ポリペプチドが固相支持体に固定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が特異的結合の量を検出する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ以上の精製ポリペプチドが固相支持体に固定される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２００７年１０月３１日に出願され、その全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許出願第６０／９８４，０１９号の恩典を請求する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）は、哺乳動物宿主において循環中の白血球に感染する偏性細胞内病原体である。エーリキア・カニス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ）は、イヌおよびヒトに感染し得、それぞれ、イヌ単球エーリキア症（ＣＭＥ）およびヒト単球エーリキア症（ＨＭＥ）を生じ得る。このイヌの疾患は、発熱、リンパ節腫脹、体重減少および汎血球減少によって特徴付けられる。ヒトではこの疾患は、発熱、頭痛、筋肉痛および白血球減少によって特徴付けられる。初期の検出および治療はイヌおよびヒトの両方のエーリキア症を治療するために重要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
発明の要旨
一実施形態では、本発明は、（ａ）エーリキア・カニスに感染した動物と；（ｂ）エーリキア・カニス（Ｅ．ｃａｎｉｓ）に感染していない動物とを、この動物がＥ．ｃａｎｉｓに関してワクチン接種されているか否かにかかわらず識別する方法を提供する。この方法は、
（ａ）動物由来の生物学的サンプルと、Ｅ．ｃａｎｉｓワクチンに対するこの動物の免疫応答の成分である抗体に特異的に結合しない１つ以上の第一の精製されたポリペプチドとを接触させる工程であって；ここでこの１つ以上の第一の精製されたポリペプチドが配列番号２２〜３３に対して少なくとも９５％の同一性を有しており、かつここでこの１つ以上の第一の精製されたＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドがＥ．ｃａｎｉｓに特異的である抗体に特異的に結合する；および
（ｂ）この生物学的サンプル中の抗体が１つ以上の第一の精製されたＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドに対して特異的に結合するか否かを検出する工程、を包含する。
生物学的サンプル中の抗体が、１つ以上の第一の精製されたポリペプチドに特異的に結合するならば、この動物はＥ．ｃａｎｉｓに感染している。この１つ以上の第一の精製されたポリペプチドは約１５〜約７５アミノ酸長であってもよい。この１つ以上の第一の精製されたポリペプチドは、異種のアミノ酸配列、指示薬、アミノ酸スペーサー、アミノ酸リンカー、シグナル配列、輸送停止配列、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンドまたはそれらの組み合わせに結合され得る。この方法はさらに、Ｅ．ｃａｎｉｓワクチンの要素である１つ以上の第二の精製されたＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドに対して、上記生物学的サンプル中の抗体が特異的に結合するか否かを決定する工程をさらに包含し得る。もし、この生物学的サンプル中の抗体が１つ以上の第一の精製されたＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドに特異的に結合し、かつ１つ以上の第二の精製されたＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドに特異的に結合するならば、この動物はＥ．ｃａｎｉｓに感染しており、かつＥ．ｃａｎｉｓに関するワクチン接種状態が不明である。もし、このサンプル中の抗体が１つ以上の第一の精製されたＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドに特異的に結合せず、かつ１つ以上の第二の精製されたＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドに特異的に結合するならば、この動物は、Ｅ．ｃａｎｉｓに感染しておらず、かつＥ．ｃａｎｉｓについてワクチン接種されている。もし、このサンプル中の抗体が１つ以上の第一の精製されたポリペプチドに特異的に結合せず、かつ１つ以上の第二の精製されたポリペプチドに特異的に結合しないならば、この動物はＥ．ｃａｎｉｓについてワクチン接種されておらず、かつＥ．ｃａｎｉｓに感染していない。
【０００４】
本発明の別の実施形態は、Ｅ．ｃａｎｉｓについて動物のワクチン接種および感染状態を判定する方法を提供する。この方法は：
（ａ）動物由来の生物学的サンプルと、Ｅ．ｃａｎｉｓワクチンに対する動物の免疫応答の成分である抗体に特異的に結合しない１つ以上の第一の精製されたポリペプチドであって、配列番号２２〜３３に対して少なくとも９５％の同一性を有しており、Ｅ．ｃａｎｉｓに特異的である抗体に特異的に結合する、１つ以上の第一の精製されたポリペプチド、ならびにＥ．ｃａｎｉｓワクチンに対する動物の免疫応答の成分である抗体に特異的に結合する１つ以上の第二の精製されたポリペプチドとを接触させる工程と；
（ｂ）この生物学的サンプル中の抗体が１つ以上の第一の精製されたポリペプチドに対して、および１つ以上の第二の精製されたポリペプチドに対して特異的に結合するか否かを検出する工程と；を包含する。
この生物学的サンプル中の抗体が１つ以上の第一の精製されたＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドに特異的に結合し、かつ１つ以上の第二の精製されたＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドに特異的に結合するならば、この動物は、Ｅ．ｃａｎｉｓに感染しており、かつＥ．ｃａｎｉｓについてワクチン接種状態が不明である。もしこのサンプル中の抗体が１つ以上の第一の精製されたＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドに特異的に結合せず、かつ１つ以上の第二の精製されたＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドに特異的に結合するならば、この動物は、Ｅ．ｃａｎｉｓに感染しておらず、かつＥ．ｃａｎｉｓについてワクチン接種されている。もしこのサンプル中の抗体が１つ以上の第一の精製されたポリペプチドに特異的に結合せず、かつ１つ以上の第二の精製されたポリペプチドに特異的に結合しないならば、この動物はＥ．ｃａｎｉｓについてワクチン接種されておらず、かつＥ．ｃａｎｉｓに感染していない。上記１つ以上の第一の精製されたポリペプチドは約１５〜約７５アミノ酸長であってもよい。この１つ以上の第一の精製されたポリペプチドは、異種のアミノ酸配列、指示薬、アミノ酸スペーサー、アミノ酸リンカー、シグナル配列、輸送停止配列、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンドまたはそれらの組み合わせに結合されてもよい。
【０００５】
本発明のさらに別の実施形態は、試験サンプル中でＥ．ｃａｎｉｓに特異的である抗体またはその抗原結合フラグメントの存在を判定する方法を提供する。この方法は：
（ａ）１つ以上の精製されたポリペプチドが抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合するのに適した条件下で、試験サンプルを、配列番号２２〜３３に対して少なくとも９５％の同一性を有する１つ以上の精製されたポリペプチドと接触させる工程であって、ここで、１つ以上の精製されたポリペプチドは約１５〜約７５アミノ酸長であり、１つ以上の第一の精製されたポリペプチドは、Ｅ．ｃａｎｉｓに特異的である抗体に特異的に結合する；および
（ｂ）該１つ以上の精製されたポリペプチドの、該抗体またはその抗原結合フラグメントへの特異的な結合の存在を検出する工程；
を包含する。
この１つ以上の精製されたポリペプチドの該抗体または抗原結合フラグメントへの特異的な結合の存在は、この試験サンプル中のＥ．ｃａｎｉｓに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメントの存在を示す。上記１つ以上の精製されたポリペプチドは、異種のアミノ酸配列、指示薬、アミノ酸スペーサー、アミノ酸リンカー、シグナル配列、輸送停止配列、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンドまたはそれらの組み合わせに結合され得る。この方法はさらに、特異的な結合の量を検出する工程を包含し得る。この１つ以上の精製ポリペプチドは固相支持体に固定されてもよい。
【０００６】
本発明のさらに別の実施形態では以下：
（ａ）配列番号２２〜３３からなる１つ以上の精製されたポリペプチド；あるいは
（ｂ）配列番号２２〜３３に対して少なくとも９５％の同一性を有しており、約１５〜約７５アミノ酸長であり、Ｅ．ｃａｎｉｓに特異的である抗体に特異的に結合する、１つ以上の精製されたポリペプチド；
（ｃ）１位のＸが存在しないかまたはＣであり、４位のＸがＨまたはＱであり、２５位のＸがＤまたはＧであり、３６位のＸがＥまたはＧである、配列番号３３；
（ｄ）１位のＸがＣであり、４位のＸがＨであり、２５位のＸがＤまたはＧである、配列番号３３のアミノ酸１〜２７；
（ｅ）２５位のＸがＤまたはＧであり、３６位のＸがＥまたはＧであり；かつＣが任意にアミノ末端に存在している、配列番号３３のアミノ酸１３〜４１；
（ｆ）２５位のＸがＤまたはＧであり、３６位のＸがＥまたはＧであり、かつＣが任意にアミノ末端に存在している、配列番号３３のアミノ酸２４〜４９；
（ｇ）１位のＸがＣであるかまたは存在せず、かつここで２５位のＸがＤまたはＧである、配列番号３３のアミノ酸１〜２７；
（ｈ）２５位のＸがＤまたはＧであり、３６位のＸがＥまたはＧであり、かつＣが任意にアミノ末端に存在している、配列番号３３のアミノ酸１３〜４１；
（ｉ）２５位のＸがＤまたはＧであり、３６位のＸがＥまたはＧであり、かつＣが任意にアミノ末端に存在している、配列番号３３のアミノ酸２４〜４９；
（ｊ）２５位のＸがＤまたはＧであり、かつＣが任意にアミノ末端に存在している、配列番号３３のアミノ酸１３〜２７；
（ｋ）２５位のＸがＤまたはＧであり、３６位のＸがＥまたはＧであり、かつＣが任意にアミノ末端に存在している配列番号３３のアミノ酸２４〜４１；
（ｌ）２５位のＸがＤまたはＧであり、３６位のＸがＥまたはＧであり、かつＣが任意にアミノ末端に存在している、配列番号３３のアミノ酸１３〜４１；
（ｍ）２５位のＸがＤまたはＧであり、３６位のＸがＥまたはＧであり、かつＣが任意にアミノ末端に存在している、配列番号３３のアミノ酸２４〜４９；
（ｎ）２５位のＸがＤまたはＧであり、３６位のＸがＥまたはＧであり、かつＣが任意にアミノ末端に存在している、配列番号３３のアミノ酸２４〜４１；あるいは
（ｏ）（ａ）〜（ｎ）の組み合わせ、
を含んでいる、組成物を提供する。
上記１つ以上の精製されたポリペプチドは多量体型であってもよい。この１つ以上の精製されたポリペプチドは、異種のタンパク質、指示薬、アミノ酸スペーサー、アミノ酸リンカー、シグナル配列、輸送停止配列、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンドまたはそれらの組み合わせに結合されてもよい。
【０００７】
本発明の別の実施形態は、動物において免疫応答を生じさせる方法であって：この動物に対して、配列番号２２〜３３に対して少なくとも９５％の同一性を有している１つ以上の精製されたポリペプチドまたはそれらの組み合わせを投与する工程を包含し、この１つ以上の精製されたポリペプチドがこの動物において免疫応答を生じる方法を提供する。この１つ以上の精製されたポリペプチドは約１５〜約７５アミノ酸長であってもよい。この１つ以上の精製されたポリペプチドは多量体型であってもよい。この１つ以上の精製されたポリペプチドは、異種のタンパク質、指示薬、アミノ酸スペーサー、アミノ酸リンカー、シグナル配列、輸送停止配列、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンドまたはそれらの組み合わせに結合されてもよい。
【０００８】
本発明のさらに別の実施形態は、動物におけるエーリキア・カニス感染の予防、治療または回復のための方法を提供し、この方法は、この動物に対して：
（ａ）配列番号２２〜３３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有している１つ以上の精製されたポリペプチド、またはそれらの組み合わせ；あるいは
（ｂ）配列番号２２〜３３を含んでいる１つ以上の精製されたポリペプチドをコードする１つ以上の核酸、またはそれらの組み合わせ；あるいは
（ｃ）配列番号２２〜３３を含んでいる１つ以上の精製されたポリペプチドに特異的に結合する１つ以上の抗体、またはそれらの組み合わせ；
を投与する工程を包含し、これによってＥ．ｃａｎｉｓ感染が予防、回復または治療される。
【０００９】
本発明のさらに別の実施形態は、患者においてＥ．ｃａｎｉｓ感染の治療をモニタリングする方法であって：（ａ）請求項１０の方法によるＥ．ｃａｎｉｓ感染のための治療の前または初期段階において、患者由来の第一のサンプル中の抗Ｅ．ｃａｎｉｓ抗体のレベルを測定する工程と；（ｂ）請求項１０の方法によって治療がなされた後の該患者由来の第二のサンプル中の抗Ｅ．ｃａｎｉｓ抗体のレベルを測定する工程と；（ｃ）この第一のサンプル中の抗Ｅ．ｃａｎｉｓ抗体の量と、第二のサンプル中の抗Ｅ．ｃａｎｉｓ抗体の量とを比較して、変化を評価し、それによって処置をモニタリングする工程と；を包含する、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実験用ビーグル犬のＳＮＡＰ（登録商標）３Ｄｘ（登録商標）アッセイ評価を示す。ＳＮＡＰ（登録商標）デバイスは、製造業者によって記載されるとおりに用いた。「プレ、前（Ｐｒｅ）」サンプルは、０日目由来である。「ポスト、後（Ｐｏｓｔ）」サンプルは４２日目由来である。Ｅ．ｃａｎｉｓ陽性のスポットは、４２日目のサンプルについて４匹全てのイヌで陽性になった。同様の結果が７０日目のサンプルについて観察された。
【図２】図２は、２Ｄゲル電気泳動を用いて分離したＥ．ｃａｎｉｓのタンパク質のゲルを示す。ＢＩＯＳＡＦＥ（登録商標）クマシーブルー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．）で染色した。
【図３】図３は、０日目に収集したイヌ血清を用いたＥ．ｃａｎｉｓのタンパク質のウエスタンブロットを示す。血漿希釈１：１００である。これらのイヌは、Ｅ．ｃａｎｉｓの抗原との反応性について陰性であった。
【図４】図４は、４匹のワクチン接種した動物のプール由来のイヌ血清を用いたＥ．ｃａｎｉｓのタンパク質のウエスタンブロットを示す。血清希釈は１：１００である。
【図５】図５は、感染した動物のプール由来のイヌ血漿を用いたＥ．ｃａｎｉｓのタンパク質のウエスタンブロットを示す。血清希釈は１：１０００である。
【図６】図６は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現されて、４匹の感染した動物のプール由来のイヌ血清（Ａ）、または４匹のワクチン接種した動物由来のプールしたイヌ血清（Ｂ）のいずれかを用いてプローブされた６つの異なるＥ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原のウエスタンブロットを示す。血清希釈は、ワクチン接種した動物については１：１００であり、感染した動物については１：５００であった。提示されるＤＩＶＡ抗原としては以下が挙げられる：（１）２００ｋＤａの抗原、（２）リボソームタンパク質Ｌ１、（３ａおよび３ｂ）「ＡＴＰアーゼ」−２つの異なるセグメント、（４）１２０ｋＤａ抗原、（５）熱ショックタンパク質／ｐ１６抗原。
【図７】図７は、クローニングされたｐ１６抗原が、Ｅ．ｃａｎｉｓに感染したイヌ由来の血清によって認識されるが、ワクチン接種されたイヌ由来の血清（「攻撃した（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）血清」として示す）では認識されないことを示す。ｐ１６抗原またはもとのゲノムフラグメント（＋Ｃ）を発現するベクターで形質転換された、未誘導（Ｕ）または誘導された（Ｉ）細菌由来の溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、ウエスタンブロット分析のためにニトロセルロースに転写した。
【図８】図８は、イヌにおいて配列番号２３に示されるポリペプチドを用いたＥ．ｃａｎｉｓに特異的な抗体の検出を、感染、治療および回復を含めて、経時的に示す。
【図９Ａ】図９Ａは、Ｅ．ｃａｎｉｓについてワクチン接種されていないイヌにおいて、配列番号１０に示されるポリペプチドを用いるＥ．ｃａｎｉｓに特異的な抗体の検出を、感染の時間経過にわたって示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、Ｅ．ｃａｎｉｓについてワクチン接種されていないイヌにおいて、配列番号１０に示されるポリペプチドを用いるＥ．ｃａｎｉｓに特異的な抗体の検出を、感染の時間経過にわたって示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、Ｅ．ｃａｎｉｓについてワクチン接種された（ＲＩＢＩアジュバント）イヌにおいて、配列番号１０に示されるポリペプチドを用いるＥ．ｃａｎｉｓに特異的な抗体の検出を、感染の時間経過にわたって示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、Ｅ．ｃａｎｉｓについてワクチン接種された（ＲＩＢＩアジュバント）イヌにおいて、配列番号１０に示されるポリペプチドを用いるＥ．ｃａｎｉｓに特異的な抗体の検出を、感染の時間経過にわたって示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、Ｅ．ｃａｎｉｓについてワクチン接種された（ＲＩＢＩアジュバント）イヌにおいて、配列番号１０に示されるポリペプチドを用いるＥ．ｃａｎｉｓに特異的な抗体の検出を、感染の時間経過にわたって示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、Ｅ．ｃａｎｉｓについてワクチン接種された（ＲＩＢＩ＋ＢＣＧアジュバント）イヌにおいて、配列番号１０に示されるポリペプチドを用いるＥ．ｃａｎｉｓに特異的な抗体の検出を、感染の時間経過にわたって示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、Ｅ．ｃａｎｉｓについてワクチン接種された（ＲＩＢＩ＋ＢＣＧアジュバント）イヌにおいて、配列番号１０に示されるポリペプチドを用いるＥ．ｃａｎｉｓに特異的な抗体の検出を、感染の時間経過にわたって示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、Ｅ．ｃａｎｉｓについてワクチン接種された（ＲＩＢＩ＋ＢＣＧアジュバント）イヌにおいて、配列番号１０に示されるポリペプチドを用いるＥ．ｃａｎｉｓに特異的な抗体の検出を、感染の時間経過にわたって示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
エーリキア・カニス抗原であって、これを用いて、Ｅ．ｃａｎｉｓに対してワクチン接種されている動物からＥ．ｃａｎｉｓに自然感染した動物を識別することができる抗原が開示されている。「ワクチン接種された」とは、病原体に対する免疫を確立または恒常させることによってこの病原体による感染の影響を予防または回復し得るワクチン組成物の投与を意味する。ワクチン組成物は死んだ、不活性化されたもしくは減弱された病原体、またはその病原体の精製された産物もしくは部分を含んでもよい。ワクチン接種は１００％有効性である必要はない。
【００１２】
本発明を詳細に記載する前に、多数の用語を規定する。本明細書において用いる場合、単数形「１つの、ある（ａ、ａｎ：不定冠詞）」、および「この、その（ｔｈｅ：定冠詞）」は、文脈上明確に違ったふうに指示しない限り複数の言及を包含する。
【００１３】
本明細書において用いる場合、「ポリペプチド」という用語は、単鎖の化合物またはペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の２つ以上の鎖の複合体を指す。この鎖（単数または複数）は任意の長さであってもよく、融合タンパク質を含んでもよい。「タンパク質」は比較的大きいポリペプチドについて言及する場合に用いられることが多く、「ペプチド」は、小型のポリペプチドに関して用いられることが多いが、当該分野でのこれらの用語の使用は、重複しており、かつ変化する。従って、本明細書において用いる場合、「ポリペプチド」という用語は、他に注記しない限り、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または融合タンパク質を交換可能に言及する。「アミノ酸」という用語は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のモノマー単位を指す。「ポリペプチド」という用語は、１つのタイプのポリペプチド（１セットのポリペプチド）の１つ以上を指すこともできる。「ポリペプチド」とはまた、２つ以上の異なるタイプのポリペプチドの混合物（ポリペプチドの混合物）を指すこともできる。「ポリペプチド（複数）」または「ポリペプチド（単数）」という用語は各々がまた、「１つ以上のポリペプチド」を意味する場合がある。
【００１４】
本発明のポリペプチドは、「単離され」てもよい。単離されたポリペプチドとは、天然には会合しているアミノおよびカルボキシ隣接アミノ酸配列の一方または両方と直接には近接していないポリペプチドである。詳細には、「配列番号２２〜３３に示される単離されたポリペプチド」とは、このポリペプチドがＥ．ｃａｎｉｓのタンパク質分子中に天然に会合するアミノおよびカルボキシ隣接アミノ酸配列の一方または両方と直接には隣接しないことを意味する（ここでこのポリペプチドは天然に存在するポリペプチドである）。
【００１５】
本明細書において用いる場合、「抗原」とは、それに対して被験体が体液性および／または細胞性免疫応答を開始し得る分子を指す。抗原は、任意のタイプの生物学的分子であってもよく、これには、例えば、単純な中間代謝物、糖、脂質およびホルモン、ならびに高分子（例えば、複雑な炭水化物、リン脂質、核酸およびタンパク質）が挙げられる。本発明の組成物および方法では、抗原はポリペプチド、例えば、少なくとも６つ以上のアミノ酸を含んでいるものであってもよい。
【００１６】
本明細書において用いる場合、Ｅ．ｃａｎｉｓ抗原のポリペプチドの「誘導体」、またはＥ．ｃａｎｉｓの抗原もしくはポリペプチド「に由来する」抗原もしくはポリペプチドとは、天然の型が精製、修飾または改変されている抗原またはポリペプチドを指す。このような修飾としては限定するものではないが以下が挙げられる：アミノ酸の置換、修飾、付加または欠失；脂質化、グリコシル化もしくはリン酸化のパターンの変更；このポリペプチドに存在するアミノ酸残基の遊離のアミノ側鎖、カルボキシル側鎖もしくはヒドロキシル側鎖と他の有機および非有機の分子との反応；ならびに他の修飾であって、そのいずれかが一次、二次または三次構造中の変化を生じ得る修飾。
【００１７】
「生物学的サンプル」とは、免疫グロブリンを含んでいると予想される動物由来の任意のサンプルである。例えば、生物学的サンプルとは、血漿であっても、血液であっても、血清であっても、唾液であっても、尿であっても、糞便であっても、創傷浸出液であっても、脳脊髄液（ＣＳＦ）であっても、精液であっても、痰であっても、組織抽出液であっても、細胞抽出液であってもよい。本発明の一実施形態では、試験サンプルは、ウマ、イヌ、ウシ、ラマ、ヒツジ、ヤギ、シカ、ヘラジカ（エルク）、げっ歯類または任意の他の動物などの動物から得ることができる。ヒトは本明細書では動物であるとみなされる。これらの例は、本発明に適用可能なサンプルの種類または動物を限定すると解釈されるべきではない。
【００１８】
「感染」とは、例えば、Ｅ．ｃａｎｉｓ感染では、ある動物が、Ｅ．ｃａｎｉｓの臨床症状を示すか否かにかかわらず、Ｅ．ｃａｎｉｓに曝されていることを意味する。自然感染とは、ダニによる伝播などの、Ｅ．ｃａｎｉｓの天然の伝播方法の１つの結果として生じる曝露を指す。感染にはワクチン接種を通じたＥ．ｃａｎｉｓに対する曝露は含まない。
【００１９】
「Ｅ．ｃａｎｉｓのワクチンの要素ではないポリペプチドまたは抗原」とは、特定のＥ．ｃａｎｉｓのワクチン（単数または複数）に存在しない任意のＥ．ｃａｎｉｓのポリペプチドまたは抗原である。「Ｅ．ｃａｎｉｓのワクチンの要素ではないポリペプチドまたは抗原」とは、Ｅ．ｃａｎｉｓワクチンの免疫原として活性な部分ではない任意のＥ．ｃａｎｉｓのポリペプチドまたは抗原でもある。すなわち、このポリペプチドまたは抗原はワクチン中に存在し得るが、ポリペプチドまたは抗原に対する免疫応答（例えば、ポリペプチドまたは抗原に特異的に結合する抗体の生成）は、Ｅ．ｃａｎｉｓのワクチンの投与に応答して生じることはない。ワクチン（単数または複数）の成分は、細菌全体ではないサブユニットワクチンの一部であってもよく；これらの部分はワクチンの一部となる前に、化学的に合成されても、または組み換え発現されてもよく、これらの部分は、インビボの免疫原性組成物を発現する１つ以上のベクターによってコードされてもよい。
【００２０】
「Ｅ．ｃａｎｉｓワクチンに対する動物の免疫応答の成分である抗体」とは、Ｅ．ｃａｎｉｓのワクチンでのワクチン接種の結果として惹起される抗体を指す。これらの抗体は、天然のＥ．ｃａｎｉｓ感染の結果として惹起された抗体と同一であっても、または類似であってもよい。これらの抗体は、十分な力価で維持され、それによって、この細菌に対する防御効果および中和効果を得ることができる。十分なワクチン接種によって、Ｅ．ｃａｎｉｓワクチンの成分によって惹起される抗体（単数または複数）の測定可能なレベルが生じる。Ｅ．ｃａｎｉｓワクチンに対する動物の免疫応答の成分であり得る抗体を惹起するＥ．ｃａｎｉｓ抗原の例は、ｐ２８−１、ｐ２８−２、ｐ２８−３、ｐ２８−４、ｐ２８−５、ｐ２８−６、ｐ２８−７、ｐ２８−８、ｐ２８−９（米国特許第６６６０２６９号；同第６，４５８，９４２号；同第６，４０３，７８０号；同第６，３９２，０２３号を参照のこと）、ｐｒｏＡ、ＰｒｏＢ、ｍｍｐＡ、チトクロームオキシダーゼ（米国特許出願公開第２００４０１７０９７２号を参照のこと）、ｐ１５３のＮ末端部分であるｐ４３（米国特許第６，３５５，７７７号を参照のこと）、糖タンパク質（米国特許出願公開第２００４／０１２１４３３号を参照のこと）、ｐ１５３、ならびにｐ３０−１、ｐ３０−２、ｐ３０−３、ｐ３０−４、ｐ３０−５、ｐ３０−６、ｐ３０−７、ｐ３０−８、ｐ３０−９、ｐ３０−１０、ｐ３０−１１、ｐ３０−１２、ｐ３０−１３、ｐ３０−１４、ｐ３０−１５、ｐ３０−１６、ｐ３０−１７、ｐ３０−１８、ｐ３０−１９、ｐ３０−２０（Ｏｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２００１、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６９（４）：２０８３〜９１）である。
【００２１】
免疫応答とは、ポリペプチドなどの抗原に対する細胞性および／または抗体媒介性の免疫応答の生物における発達である。通常、このような応答は、限定するものではないが、以下のうちの１つ以上を包含する：抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞の産生。免疫応答は、当業者に公知の任意のいくつかのアッセイを用いて検出され得る。
【００２２】
本発明のポリペプチド
Ｅ．ｃａｎｉｓに対してワクチン接種されている動物由来の生物学的サンプルは、ワクチンに対する応答において産生された抗体の存在に起因して、Ｅ．ｃａｎｉｓの感染についての試験で陽性の結果を生じる能力を有する。一態様では、本発明は、Ｅ．ｃａｎｉｓについて動物がワクチン接種されているか否かにかかわらず、Ｅ．ｃａｎｉｓに感染している動物とＥ．ｃａｎｉｓに感染していない動物とを識別する方法を提供する。この方法は、動物由来の生物学的サンプルと、特定のＥ．ｃａｎｉｓワクチンに対するこの動物の抗体応答の成分である抗体に特異的に結合しないが、Ｅ．ｃａｎｉｓの感染に対する応答で生成される抗体に特異的に結合する、Ｅ．ｃａｎｉｓ由来の抗原とを接触させる工程を包含する。
【００２３】
ワクチンに対する動物でのＥ．ｃａｎｉｓ抗体の発生は、この動物をワクチン接種するために用いた特定のワクチンに依存する。Ｅ．ｃａｎｉｓに対してワクチン接種されている動物と、Ｅ．ｃａｎｉｓに自然感染したまたは実験的に感染させた動物との間の免疫応答の相違によって、動物がＥ．ｃａｎｉｓについてワクチン接種されているか否かにかかわらず、この動物がＥ．ｃａｎｉｓで自然に感染したまたは実験的に感染しているか否かを判定するための手段を提供する。従って、本発明の方法を用いて、Ｅ．ｃａｎｉｓに感染している動物は、Ｅ．ｃａｎｉｓに感染していない動物、および／またはＥ．ｃａｎｉｓに対してワクチン接種されている動物から識別され得る。本発明の抗原、それらの免疫優性領域、およびエピトープを本発明の方法において用いてもよい。これらの組成物は、Ｅ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ  Ａｎｉｍａｌｓ（ワクチン接種した動物から感染した動物を区別する））と呼ばれる場合がある。Ｅ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原は、特定のＥ．ｃａｎｉｓワクチンによって動物において誘導される免疫応答とは区別される、動物における免疫応答、例えば、特定の抗体の産生を誘導する。
【００２４】
従って、Ｅ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原と、特定のワクチンに対する動物の免疫応答の成分ではない抗体との間の特異的な結合の検出は、自然のまたは実験的なＥ．ｃａｎｉｓ感染を示し得る。このような結合がなければ、Ｅ．ｃａｎｉｓ感染がないことが示され得る。さらに、第二の、別の抗原、例えば、特定のＥ．ｃａｎｉｓワクチンに対する動物の免疫応答の成分である抗体に特異的に結合するＥ．ｃａｎｉｓ抗原を用いて、ワクチン接種に対する応答で生じた抗体を検出してもよい（本明細書では「Ｅ．ｃａｎｉｓのワクチン抗原」と呼ばれる）。Ｅ．ｃａｎｉｓワクチンの抗原は、特定のＥ．ｃａｎｉｓワクチンに対する動物の免疫応答の成分である抗体に特異的に結合するだけでなく、またＥ．ｃａｎｉｓの感染に対する動物の免疫応答の成分である抗体にも特異的に結合し得る。もしＥ．ｃａｎｉｓワクチンの抗原に特異的な抗体が検出されるならば、この動物はワクチン接種されているか、および／または感染している。いずれの抗体の検出もなければ感染もワクチン接種もないことを示す。そのようなものとして、別々の捕獲試薬の種々の組み合わせで、試験被験体におけるワクチン接種および／または感染の状態の判定を行うことができる。
【００２５】
一局面では、本発明の方法は、動物由来の生物学的サンプルと、Ｅ．ｃａｎｉｓ菌の一部であるが、特定のＥ．ｃａｎｉｓワクチンの構成要素ではない抗原とを接触させる工程を包含する。別の局面では、本発明の方法は、動物由来の生物学的サンプルと、Ｅ．ｃａｎｉｓ菌およびＥ．ｃａｎｉｓのワクチンに存在するかまたはそれらの一部である抗原とを接触させる工程を包含し、ここでこの抗原に対する免疫応答（例えば、この抗原に特異的に結合する抗体の産生）は、Ｅ．ｃａｎｉｓ菌の感染に応答して生じるが、Ｅ．ｃａｎｉｓワクチンの投与に応答しては生じない。別の局面では、動物由来の生物学的サンプルを分析して、Ｅ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原に特異的な抗体の有無、ならびにＥ．ｃａｎｉｓワクチンの抗原に特異的な抗体の有無を検出する。次いで、このような抗体がないことを判定することによって、動物が感染しておらず、かつワクチン接種されていないかワクチン接種されていることを判定する。
【００２６】
本発明の一局面では、ＤＩＶＡ抗原はＥ．ｃａｎｉｓのワクチンの要素ではない。本発明の別の局面では、ＤＩＶＡ抗原は、Ｅ．ｃａｎｉｓのワクチンの一部であるが、免疫応答（例えば、ＤＩＶＡ抗原に特異的に結合する抗体の産生）は、Ｅ．ｃａｎｉｓのワクチンの投与に応答しては生じない。動物のワクチン接種または感染の状況は、サンプル中の抗体が１つ以上のＥ．ｃａｎｉｓワクチンの抗原に特異的に結合するか否か、およびサンプル中の抗体が１つ以上のＤＩＶＡ抗原に特異的に結合するか否かを検出することによって判定され得る。サンプル中の抗体が、１つ以上のワクチンの抗原に特異的に結合し、かつ１つ以上のＤＩＶＡ抗原に特異的に結合するならば、その動物は、Ｅ．ｃａｎｉｓに感染しており、かつその動物のワクチン接種の状態は不明である。サンプル中の抗体が１つ以上のＥ．ｃａｎｉｓワクチンの抗原に特異的に結合し、かつ１つ以上のＤＩＶＡ抗原に特異的に結合しないならば、その動物はＥ．ｃａｎｉｓについてワクチン接種されており、かつＥ．ｃａｎｉｓに感染していない。サンプル中の抗体が１つ以上のＥ．ｃａｎｉｓワクチンの抗原に特異的に結合せず、かつ１つ以上のＤＩＶＡ抗原に特異的に結合しないならば、その動物は、Ｅ．ｃａｎｉｓに感染しておらず、かつＥ．ｃａｎｉｓに関してワクチン接種されていない。
【００２７】
本発明の一局面では、（ａ）エーリキア・カニスに感染している動物と；（ｂ）Ｅ．ｃａｎｉｓに感染していない動物とを、それらの動物のＥ．ｃａｎｉｓワクチンの状態にかかわらず識別する方法を提供する。この方法は、動物由来の生物学的サンプルと、Ｅ．ｃａｎｉｓワクチンに対するこの動物の免疫応答の成分である抗体に実質的に特異的に結合しない第一の精製されたＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドとを接触させる工程であって；ここでこの第一の精製されたＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドが配列番号２２〜３３またはその組み合わせを含んでいる工程と、このサンプル中の抗体が第一の精製されたＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドに対して特異的に結合するか否かを検出する工程と、を包含する。このサンプル中の抗体が、第一の精製されたＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドに特異的に結合するならば、この動物はＥ．ｃａｎｉｓに感染しており；このサンプル中の抗体が、第一の精製されたＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドに実質的に特異的に結合しないならば、この動物はＥ．ｃａｎｉｓに感染していない。
【００２８】
この方法はさらに、Ｅ．ｃａｎｉｓワクチン抗原を含む第二の精製されたＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドに対して、上記サンプル中の抗体が特異的に結合するか否かを判定する工程を包含し得る。もし、このサンプル中の抗体が１つ以上のＥ．ｃａｎｉｓワクチンの抗原に特異的に結合し、かつ１つ以上のＤＩＶＡ抗原に特異的に結合するならば、この動物はＥ．ｃａｎｉｓに感染しており、かつこの動物のワクチン接種状態が不明である。もし、このサンプル中の抗体が１つ以上のＥ．ｃａｎｉｓワクチン抗原に特異的に結合し、かつ１つ以上のＤＩＶＡ抗原に特異的に結合しないならば、この動物は、Ｅ．ｃａｎｉｓについてワクチン接種されており、かつＥ．ｃａｎｉｓに感染していない。もし、このサンプル中の抗体が１つ以上のＥ．ｃａｎｉｓワクチンの抗原に特異的に結合せず、かつ１つ以上のＤＩＶＡ抗原に特異的に結合しないならば、この動物はＥ．ｃａｎｉｓに感染しておらず、かつＥ．ｃａｎｉｓについてワクチン接種されていない。本発明の一実施形態では、試験サンプル中の抗体は、ＤＩＶＡ抗原および／またはＥ．ｃａｎｉｓワクチンの抗原に対して実質的に特異的に結合しない。実質的に、非特異的な結合とは、当業者によって陰性の結果とみなされる結合の量である。
【００２９】
本発明の一局面では、Ｅ．ｃａｎｉｓに関する動物のワクチン接種および感染状態を判定する方法が得られる。この方法は：
（ａ）動物由来の生物学的サンプルと、Ｅ．ｃａｎｉｓワクチンに対する動物の免疫応答の成分である抗体に実質的に特異的に結合しない第一の精製されたポリペプチドであって、配列番号２２〜３３またはその組み合わせを含んでいるポリペプチド、ならびにＥ．ｃａｎｉｓワクチンに対する動物の免疫応答の成分である抗体に特異的に結合する第二のポリペプチドとを接触させる工程と；
（ｂ）このサンプル中の抗体が第一および第二の精製されたポリペプチドに特異的に結合するか否かを検出する工程と；を包含し、
ここでこの生物学的サンプル中の抗体が１つ以上の第一の精製されたＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドに特異的に結合し、かつ１つ以上の第二の精製されたＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドに特異的に結合するならば、この動物は、Ｅ．ｃａｎｉｓに感染しており、かつＥ．ｃａｎｉｓについてワクチン接種状態が不明であり；ここでこのサンプル中の抗体が１つ以上の第一の精製されたＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドに特異的に結合せず、かつ１つ以上の第二の精製されたＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドに特異的に結合するならば、この動物は、Ｅ．ｃａｎｉｓに感染しておらず、かつＥ．ｃａｎｉｓについてワクチン接種されており；もしこのサンプル中の抗体が１つ以上の第一の精製されたポリペプチドに特異的に結合せず、かつ１つ以上の第二の精製されたポリペプチドに特異的に結合しないならば、この動物はＥ．ｃａｎｉｓについてワクチン接種されておらず、かつＥ．ｃａｎｉｓに感染していない。
【００３０】
表１は、Ｅ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原およびＥ．ｃａｎｉｓワクチン抗原を用いて判定できる、動物の感染および／またはワクチン接種の状態を示す。表１の「行わず（Ｎｏｔ  Ｄｏｎｅ）」とは、特定の試験を完了しておらず、従って結果が利用できないことを意味する。例えば、動物由来の生物学的サンプルをＥ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原を用いて試験し、かつその結果が陽性であって、Ｅ．ｃａｎｉｓのワクチン抗原では試験が完了していないならば、その動物の状態は感染であるが、ワクチン接種の状態は不明である。
【００３１】
【表１】
0005759724.tif 000002
【００３２】
本発明の別の局面は、試験サンプル中の抗体またはその抗原結合フラグメントの有無を判定するための方法を提供し、ここでこの抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０、２２〜３３またはそれらの組み合わせからなる精製されたポリペプチドに特異的に結合する。この方法は、試験サンプルと、配列番号１０、２２〜３３またはそれらの組み合わせを含んでいる精製されたポリペプチドとを、抗体またはその抗原結合フラグメントに、精製されたポリペプチドが特異的に結合するのに適した条件下で接触させる工程と；特異的な結合の有無を検出する工程とを包含する。この特異的な結合の存在によって、この抗体またはその抗原結合フラグメントの存在が示され、この特異的な結合が無いことによって、この抗体またはその抗原結合フラグメントが無いことが示される。
【００３３】
ワクチンは、感染を予防または回復するのに完全に有効ではない場合がある。従って、ワクチン接種された動物がワクチン接種にかかわらず、感染したか否かを判定するための方法があることが望ましい。配列番号１０、２２〜３３は、Ｅ．ｃａｎｉｓに関してワクチン接種されており、かつＥ．ｃａｎｉｓに感染していないイヌにおいて、抗Ｅ．ｃａｎｉｓ抗体を検出しない。配列番号１０、２２〜３３は、Ｅ．ｃａｎｉｓのワクチンを投与されているか、または投与されていないイヌにおいて、Ｅ．ｃａｎｉｓ感染を検出するために用いられ得る。本発明の一実施形態では、この動物は、Ｅ．ｃａｎｉｓのワクチン接種を受けて、Ｅ．ｃａｎｉｓの検出がすでに可能になった後、Ｅ．ｃａｎｉｓに感染する。
【００３４】
本発明の別の局面は、配列番号１０、２２〜３３を含むかまたはそれらからなる１つ以上の精製されたポリペプチド、またはそれらの組み合わせを含んでいるかまたはそれらからなる組成物を含む。本発明のポリペプチドは、翻訳後に修飾されてもよい。精製されたポリペプチドとは、細胞性物質、他の種類のポリペプチド、化学的前駆体、ポリペプチドの合成に用いられる化学物質、またはそれらの組み合わせを実質的に含まないポリペプチド調製物である。細胞性物質、培地、化学的前駆体、ポリペプチドの合成に用いられる化学物質などを実質的に含まないポリペプチド調製物とは、他のポリペプチド、培地、化学的前駆体、および／または合成に用いられる他の化学物質が約３０％、２０％、１０％、５％、１％またはそれよりも少ない。従って精製されたポリペプチドとは約７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上純粋である。精製されたポリペプチドは、未精製の細胞抽出物も半精製の細胞抽出物も、または純度が７０％未満であるポリペプチドの混合物も含まない。
【００３５】
本発明の一実施形態は、配列番号２２〜３３を含んでいる精製されたポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、約５０、４５、４０、３５、３０、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６またはそれ未満（または５０と６との間の任意の範囲）の連続する天然に存在するエーリキア・カニスのアミノ酸からなる（すなわち、この精製されたポリペプチドは、完全な天然に存在するエーリキア・カニスのポリペプチドを包含しない）。天然に存在するエーリキア・カニスのアミノ酸は、エーリキア・カニスの生物体によって通常産生される任意のポリペプチドである。本発明の一実施形態では、精製されたポリペプチドは配列番号２２〜３３を含み、このポリペプチドは、約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上連続する天然に存在するエーリキア・カニスのアミノ酸（または約６〜１００個の任意の範囲のアミノ酸）を含む。
【００３６】
配列番号２２〜３３のポリペプチドは、全長のエーリキア・カニスのポリペプチドよりも小さいという事実は重要である。なぜなら、ポリペプチドが小さいほど、検出アッセイで全長ポリペプチドよりも大きい特異性および／または感度を有し得るからである。さらに、これらのポリペプチドが小さいほど、製造は安価になり得、そして全長ポリペプチドよりも高い純度を得ることができる。
【００３７】
本発明の一実施形態は、約５０、４５、４０、３５、３０、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７または６の連続する天然のエーリキア・カニスのアミノ酸よりも少なく、かつ配列番号２２〜２３の約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００の連続するアミノ酸よりも大きい（または６〜１００アミノ酸の任意の範囲）、精製されたポリペプチドを提供する。従って、本発明のポリペプチドは、例えば、約１５〜約３０；約１５〜約５０；または約１５〜約１００アミノ酸長であってもよい。
【００３８】
変異ポリペプチドは、配列番号２２〜３３に示されるポリペプチド配列に対して少なくとも約７９％、８０％、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％またはそれ以上同一であり、また本発明のポリペプチドでもある。変異ポリペプチドは、１つ以上の保存的アミノ酸変異または他のマイナーな修飾を有し、かつ生物学的活性を保持し、すなわち、生物学的に機能的な等価物である。生物学的に活性な等価物は、対応する野性型ポリペプチドに比較した場合実質的に等価な機能を有する。本発明の一実施形態では、ポリペプチドは約１、２、３、４、５、１０、２０またはそれより少ない保存的アミノ酸置換を有する。
【００３９】
これらのポリペプチドは、配列番号２２〜３３のアミノ酸残基を超える追加のアミノ酸残基を有してもよい。すなわち、このポリペプチドは、このポリペプチドの５’末端または３’末端に追加された追加のアミノ酸残基を有してもよく、一方で配列番号２２〜３３の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、または４８の連続するアミノ酸（特定の配列番号の長さに依存する）にそった配列同一性は少なくとも約９５％である。ポリペプチドの５’末端または３’末端上に付加された追加のアミノ酸は、配列同一性のパーセンテージに影響するとはみなされない。この追加のアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であってもよいし、または天然には存在しないアミノ酸であってもよい。このポリペプチドは、例えば、約１５〜約５０アミノ酸長であっても、または約７５アミノ酸長であってもよい。
【００４０】
変異ポリペプチドは、１つ以上の保存的アミノ酸の置換、欠失、付加または他のマイナーな修飾を有し、かつ生物学的活性を保持している、すなわち、生物学的に機能的な等価物である。生物学的に活性な等価物は、対応する野性型のポリペプチドに比較した場合、実質的に等価な機能を有する。
【００４１】
配列同一性パーセントは、意味を認識する技術を有し、２つのポリペプチド配列の間またはポリヌクレオチド配列の間で同一性を測定するには多数の方法がある。例えば、Ｌｅｓｋ，Ｅｄ．，Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）；Ｓｍｉｔｈ，Ｅｄ．，Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９３）；Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＆  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｅｄｓ．，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，（１９９４）；ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８７）；ならびにＧｒｉｂｓｋｏｖ  ＆  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｅｄｓ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９１）を参照のこと。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをアラインメントさせるための方法は、コンピュータープログラムにコードされており、このプログラムとしては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０））、およびＢｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズムを用いる（Ａｄｖ．Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．，２：４８２−４８９（１９８１）））が挙げられる。例えば、ＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用するコンピュータープログラムＡＬＩＧＮを、−１２のギャップ・オープン・ペナルティーおよび−２のギャップ・伸長・ペナルティーを用いるアフィン・ギャップ・サーチ（ａｆｆｉｎｅ  ｇａｐ  ｓｅａｒｃｈ）で用いてもよい。
【００４２】
特定の配列が参照配列と例えば約９５％の相同性を有するか否かを決定するために任意の配列アラインメントプログラムを用いるとき、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全長にわたって同一性のパーセンテージが計算され、かつ同一性におけるギャップが参照ポリヌクレオチドのヌクレオチドまたはアミノ酸の総数の最大５％まで許容されるように、パラメーターを設定する。
【００４３】
変異ポリペプチドは一般に、本発明のポリペプチド配列の１つを修飾すること、および修飾したポリペプチドの特性を評価して生物学的に等価であるか否かを決定することによって同定され得る。変異体は、例えば、免疫組織化学アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫酵素アッセイ、またはウエスタンブロットアッセイなどのアッセイにおいて本発明のポリペプチドと実質的に同じように反応し、例えばもとのポリペプチドの９０〜１１０％の活性を有する場合、生物学的に等価である。一実施形態において、アッセイは競合アッセイであって、ここでは生物学的に等価なポリペプチドは、対応する反応性の抗原または抗体への本発明のポリペプチドの結合を、約８０、９５、９９、または１００％まで減少させることができる。対応する野生型ポリペプチドに特異的に結合する抗体はまた、変異体ポリペプチドにも特異的に結合する。
【００４４】
保存的置換とは、あるアミノ酸が、ペプチド化学の当業者がポリペプチドの二次構造および疎水性親水性指標の性質が実質的に変化しないだろうと予測するような、同様の性質を有する別のアミノ酸に置換された置換である。一般に、以下のアミノ酸のグループは保存的変化を示す：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。
【００４５】
本発明のポリペプチドは、タンパク質輸送を翻訳と同時または翻訳後に指示するシグナル（またはリーダー）配列をさらに含んでもよい。ポリペプチドは、このポリペプチドの合成、精製、または同定を容易にするため（例えばポリ−Ｈｉｓ）、または固相支持体へのポリペプチドの結合を強化するために、リンカーまたは他の配列を含んでもよい。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域またはウシ血清アルブミンとコンジュゲートさせてもよい。
【００４６】
ポリペプチドは、このポリペプチドが天然において通常会合していないアミノ酸配列、すなわち異種のアミノ酸配列と共有結合されていてもまたは非共有結合されていてもよい。異種のアミノ酸配列は、非Ｅ．ｃａｎｉｓ生物体由来であっても、合成配列であっても、または天然には本発明のポリペプチドのカルボキシ末端もしくはアミノ末端に位置しないＥ．ｃａｎｉｓ配列であってもよい。さらに、ポリペプチドはアミノ酸以外の化合物または分子、例えば、指示薬に、共有結合されてもまたは非共有結合されてもよい。ポリペプチドは、指示薬、アミノ酸スペーサー、アミノ酸リンカー、シグナル配列、輸送停止配列、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンド、またはそれらの組み合わせと共有結合されても、または非共有結合されてもよい。ポリペプチドはまた、免疫応答（例えば、ＩＬ−２などのサイトカイン）を増強する部分（すなわち、ポリペプチドであっても他の化合物であってもよい官能基）、精製を容易にする部分（例えば、アフィニティータグ（例えば、６ヒスチジンタグ、ｔｒｐＥ、グルタチオン、マルトース結合タンパク質））、またはポリペプチド安定性を促進する部分（例えば、ポリエチレングリコール；アミノ末端保護基、例えば、アセチル、プロピル、スクシニル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニルまたはｔ−ブチルオキシカルボニル；カルボキシル末端保護基、例えば、アミド、メチルアミドおよびエチルアミド）に連結されてもよい。本発明の一実施形態では、タンパク質精製リガンドは、例えば、本発明のポリペプチドのアミノ末端もしくはＣ末端、またはその両方の末端における１つ以上のＣアミノ酸残基であってもよい。アミノ酸スペーサーとは、天然において本発明のポリペプチドと会合していないアミノ酸の配列である。アミノ酸スペーサーは約１、５、１０、２０、１００、または１０００のアミノ酸を含んでもよい。
【００４７】
必要に応じて、本発明のポリペプチドは融合タンパク質の一部であってもよく、ここでは、例えばアミノ酸リンカー、アミノ酸スペーサー、シグナル配列、ＴＭＲ輸送停止配列、膜貫通ドメイン、ならびにグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、およびブドウ球菌プロテインＡまたはそれらの組み合わせなどのタンパク質精製に有用なリガンドなどの他のアミノ酸配列を含んでもよい。本発明の２つ以上のポリペプチドは、融合タンパク質で存在してもよい。本発明のポリペプチドフラグメントは、本発明の融合タンパク質の状態で存在してもよい。本発明のポリペプチドを、非エーリキア・カニスタンパク質または非エーリキア・カニス  ｐ１６タンパク質に作動可能に連結して、融合タンパク質を形成してもよい。本発明の融合タンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３に示される１つ以上のポリペプチドもしくはそれらのフラグメント、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。融合タンパク質は、天然には生じない。「作動可能に連結された」という用語は、本発明のポリペプチドまたは他のポリペプチドが、本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに対してお互いにインフレームで融合されていることを意味する。
【００４８】
本発明のポリペプチドは多量体型であってもよい。すなわち、ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３のうちの１つ以上のコピーまたはそれらの組み合わせを含んでもよい。多量体のポリペプチドは、多重抗原タンパク質（ＭＡＰ）であってもよい。例えば、Ｔａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９６：１７〜３２（１９９６）を参照のこと。
【００４９】
本発明のポリペプチドは、Ｅ．ｃａｎｉｓに特異的な抗体により認識される抗原を含んでもよい。この抗原は１つ以上のエピトープ（すなわち、抗原決定基）を含んでもよい。エピトープは、直線状エピトープ、連続（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）エピトープ、またはコンフォメーショナル（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉａｌ）エピトープであってもよい。本発明のポリペプチド内のエピトープは、いくつかの方法で同定され得る。例えば、米国特許第４，５５４，１０１号；Ｊａｍｅｓｏｎ  ＆  Ｗｏｌｆ，ＣＡＢＩＯＳ  ４：１８１〜１８６（１９８８）を参照のこと。例えば、本発明のポリペプチドは単離され、スクリーニングされてもよい。合わせると完全なポリペプチド配列となるような一連の短いペプチドは、タンパク質切断により調製することができる。例えば３０マー（またはそれより短い）ポリペプチドフラグメントから始めることによって、各々のフラグメントはＥＬＩＳＡにおいて認識されるエピトープの存在について試験することができる。例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにおいては、３０マーのポリペプチドフラグメントなどのＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドを、プラスチックのマルチウェルプレートの壁などの固相支持体に結合させる。抗体の集団を標識し、固相支持体に加え、非特異的な吸収がブロックされる条件下で非標識の抗原に結合させ、そして結合していない抗体および他のタンパク質を洗い流す。抗体の結合は、例えば、無色の基質を有色の反応物に変換する反応によって検出する。次に、同定した３０マーから漸減的に小さくかつ重複しているフラグメントを試験して、目的とするエピトープをマッピングしてもよい。
【００５０】
本発明の一実施形態では、ＤＩＶＡ抗原は、免疫優性エピトープまたは領域を含む。それは、他のエピトープに比較した場合、その集団中でさらに高頻度に抗体を惹起し、かつ抗体に結合するエピトープまたは領域である。抗原は、１つ以上の免疫優性エピトープを有し得る。免疫優性エピトープは、ポリペプチドが動物に投与された後、またはそのような投与の前に、例えば、ポリペプチド上にマッピングされてもよい。例えば、米国特許出願公開第２００４／０２０９３２４号を参照のこと。
【００５１】
本発明のポリペプチドは、組み換えで作成することができる。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、組換え発現ベクターに導入されてもよく、このベクターは当該技術分野において周知の技術を用いて、適切な発現宿主細胞系において発現され得る。種々の細菌、酵母、植物、哺乳動物、および昆虫の発現系が当該技術分野において利用可能であり、任意のこのような発現系を用いてもよい。任意に、ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、無細胞の翻訳系において翻訳され得る。ポリペプチドは化学的に合成しても、またはＥ．ｃａｎｉｓ細胞から得てもよい。
【００５２】
本発明の免疫原性ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３に示されるアミノ酸配列、またはそのフラグメントを含んでもよい。免疫原性ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、または３３を有するポリペプチドのエピトープを認識する抗体または他の免疫応答（例えば免疫系のＴ細胞反応）を誘発することができる。本発明の免疫原性ポリペプチドはまた、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、または３３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメントであってもよい。本発明の免疫原性ポリペプチドフラグメントは、約５０、４５、４０、３５、３０、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６またはそれ以下（または約５０〜約６の間の任意の範囲）のアミノ酸長であってもよい。本発明の免疫原性ポリペプチドフラグメントは、約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上のアミノ酸長（または約６〜約１００の間の任意の範囲のアミノ酸）であってもよい。
【００５３】
Ｅ．ｃａｎｉｓに特異的な抗体は、本発明のポリペプチドを用いて当該分野で公知の任意の方法によって生体液または組織中で検出され得る。最も簡易な方法は一般にはイムノアッセイ法である。このような方法の１つは、競合ベースの方法であって、ここでは血清サンプルを、Ｅ．ｃａｎｉｓのワクチンの要素ではないＥ．ｃａｎｉｓ抗原（例えば、Ｅ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原）とともにプレインキュベートし、次いでＥ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原に特異的な固定されたモノクローナル抗体を有する、マイクロタイタープレートのような固相に加える。サンプル中のＥ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原に特異的な抗体は、Ｅ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原が固定された抗体に対して結合することを妨げるであろう。固定された抗体に対するＥ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原のなんらかの結合の検出は、直接標識されているか、または標識を有する別の結合パートナーに対する結合を通じて標識され得る、Ｅ．ｃａｎｉｓ抗原についての第二の結合パートナーを加えることによって確認できる。陽性のサンプル、すなわち、Ｅ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原に特異的な抗体を有しているサンプルは、標識由来のシグナルにおける減少に関連している。
【００５４】
１つの特定の実施形態では、生物学的サンプル中のＥ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原に対する抗体は、このサンプルとＥ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原とを接触させること、およびこのサンプルを抗ＤＩＶＡ抗原モノクローナル抗体でコーティングされたマイクロタイタープレートに添加することによって検出され得る。マイクロタイタープレートへのＤＩＶＡ抗原の結合は、ＤＩＶＡ抗原に対してウサギポリクローナル抗体を添加すること、およびＨＲＰ−コンジュゲートされたロバ抗ウサギポリクローナル抗体を添加することによって検出され得る。サンプル中の抗体は固定された抗体に対するＤＩＶＡ抗原の結合を妨げ、それによってシグナルの減少を生じる。
【００５５】
Ｅ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原に特異的である抗体を検出するための別の方法は、サンドイッチアッセイであって、ここでは、Ｅ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原に特異的な抗体を含んでいると疑われる生物学的サンプルを、固定されたＥ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原と接触させ、免疫学的複合体を形成させる。Ｅ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原に特異的な抗体の存在は、二次抗体などのＥ．ｃａｎｉｓ抗体についての標識された結合パートナーの結合の検出によって決定される。
【００５６】
本発明の一局面では、Ｅ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原を適切な固相支持体に固定してもよい。生物学的サンプルを、Ｅ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原と接触させて、抗Ｅ．ｃａｎｉｓ抗体がこのサンプル中に存在する場合、ここに結合する。この結合は、任意の適切な方法、例えば、酵素、放射性核種、微粒子または蛍光標識によって検出され得る。適切な実施形態では、検出試薬は、抗Ｅ．ｃａｎｉｓ抗体（存在する場合）を捕獲するために用いられるタンパク質と同じかまたは類似しているタンパク質に会合され得る。１つの特定の実施形態では、Ｅ．ｃａｎｉｓに対する抗体は、固相支持体上のＥ．ｃａｎｉｓ抗原に対する固定によって検出され得る。生物学的サンプルを固相支持体と接触させもよく、未結合のサンプルの除去後に、抗原に対するＥ．ｃａｎｉｓ抗体の結合を、例えば、標識されたＩｇＧ抗体で達成してもよい。
【００５７】
本発明のＤＩＶＡ抗原はまた、本発明のＤＩＶＡ抗原のミミトープを含んでもよい。ミミトープはエピトープ提示の間、天然の抗原性エピトープを模倣するランダムなペプチドエピトープである。ランダムなペプチドエピトープは、ランダムなペプチドエピトープのライブラリーを作製することまたは選択することによって同定され得る。このライブラリーを抗体に接触させる。抗体と特異的に免疫応答性であるミミトープを同定する。ランダムなペプチドライブラリーは、例えば、ファージ上に提示してもよく、コンビナトリアルライブラリーとして作製してもよい。
【００５８】
Ｅ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原、例えば、ポリペプチドは、天然であってもよく、すなわち天然の供給源から単離されてもよいし、または合成であってもよい（すなわち、化学的に合成されるか、または遺伝子操作技術を用いて組み換え産生される）。天然のタンパク質は、アフィニティクロマトグラフィーなどの従来の技術によって丸ごとの細菌から単離されてもよい。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いて、周知の技術によって適切なアフィニティカラムを調製してもよい。
【００５９】
天然のＥ．ｃａｎｉｓのタンパク質と免疫学的に交差反応性であるタンパク質を化学的に合成してもよい。例えば、約１００アミノ酸より少なく、通常は約８０アミノ酸よりも少なく、典型的には約５０アミノ酸よりも少ないポリペプチドを、成長中の鎖にアミノ酸が連続的に添加される周知のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法によって合成してもよい（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９〜２１５６）。組み換えタンパク質も用いてもよい。これらのタンパク質は、Ｅ．ｃａｎｉｓのゲノムの所望の部分をコードする組み換えＤＮＡ分子の、培養細胞における発現によって産生されてもよい。Ｅ．ｃａｎｉｓのゲノムの部分は、それ自体天然であっても合成であってもよく、これには、従来の技術によって単離された細菌から獲得できる天然の遺伝子を伴う。
【００６０】
Ｅ．ｃａｎｉｓのポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、完全な微生物のゲノムより少なく、一本鎖または二本鎖の核酸であってもよい。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成したＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはそれらの組み合わせであってもよい。ポリヌクレオチドは、タンパク質、脂質、他のポリヌクレオチドなどの他の成分を含まないほどに精製することができる。例えば、ポリヌクレオチドは５０％、７５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％精製することができる。例えば、ｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリー内の数百から数百万の他の核酸分子、またはゲノムＤＮＡの制限酵素消化物を含んでいるゲルスライスの中に存在する核酸分子は、単離されたポリヌクレオチドとみなすべきではない。本発明のポリヌクレオチドは、上記の本発明のポリペプチドをコードする。本発明の一実施形態では、このポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３に示されるポリペプチド、そのフラグメントまたはそれらの組み合わせをコードする。本発明のポリヌクレオチドは、約２００、１２０、１００、９０、７５、６０、５７、５４、４５未満（または２００〜４５の間の任意の範囲）連続の、天然に存在するエーリキア・カニスのポリヌクレオチドからなってもよい。本発明のポリヌクレオチドは、約４５、５４、５７、６０、７５、９０、１００、１２０、１５０、２００より大きい、（または４５〜２００の間の任意の範囲）、またはさらに多い連続の、天然に存在するエーリキア・カニスのポリヌクレオチドから構成され得る。この精製されたポリヌクレオチドは、追加の異種ヌクレオチド（すなわち、エーリキア・カニス由来ではないヌクレオチド）、さらに追加のエーリキア・カニスのアミノ酸を、それらが本発明のエーリキア・カニスのｐ１６ポリヌクレオチドまたは本発明の他のポリヌクレオチドと天然には連続して存在しない限り含んでもよい。本発明のポリヌクレオチドは、他のヌクレオチド配列、例えば、リンカー、シグナル配列、ＴＭＲ輸送停止配列、膜貫通ドメイン、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、およびブドウ球菌プロテインＡなどのタンパク質精製に有用なリガンドをコードする配列を含んでもよい。
【００６１】
本発明のポリヌクレオチドは単離され得る。単離されたポリヌクレオチドとは、天然では結合している５’および３’の隣接するゲノム配列の一方または両方と直接には連続していない、天然に生じるポリヌクレオチドである。単離されたポリヌクレオチドは、例えば、任意の長さの組み換えＤＮＡ分子であってもよいが、ただし、天然に生じるゲノムにおいて、組換えＤＮＡ分子に直接隣接して天然に見出される核酸配列が取り除かれているかまたは欠けている。単離されたポリヌクレオチドはまた、天然には存在しない核酸分子も含む。例えばｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリー、またはゲノムＤＮＡの制限酵素消化物を含むゲルのスライス内の数百から数百万の、他の核酸分子中に存在している核酸分子は、単離したポリヌクレオチドであるとみなすべきではない。Ｅ．ｃａｎｉｓの完全なヌクレオチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣＢＩ：ＮＺ＿ＡＡＥＪ０１０００００１から入手可能である。
【００６２】
本発明のポリヌクレオチドはまた、免疫原性ポリペプチドをコードするフラグメントを含んでもよい。本発明のポリヌクレオチドは、全長ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、および変異体または融合ポリペプチドをコードし得る。
【００６３】
本発明のポリペプチドをコードしている縮重ヌクレオチド配列、ならびに本発明のポリヌクレオチド配列およびそれらの相補鎖と少なくとも約８０％、または約９０、９６、９８、もしくは９９％同一である相同のヌクレオチド配列も、本発明のポリヌクレオチドである。配列同一性のパーセントは、「ポリペプチド」の節に記載されるとおり、計算することができる。縮重ヌクレオチド配列とは、本発明のポリペプチドまたはそれらのフラグメントをコードするが、遺伝コードの縮重に起因して野生型ポリヌクレオチド配列とは核酸配列が異なるポリヌクレオチドである。相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子、種のホモログ、および生物学的に機能的なＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドをコードするＥ．ｃａｎｉｓポリヌクレオチドの変異体も、Ｅ．ｃａｎｉｓポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドは、例えば感染した個体由来の血液、血清、唾液、または組織などの生物学的サンプル中に存在する核酸配列から単離することができる。ポリヌクレオチドはまた、例えば自動合成機を用いて、研究室において合成することもできる。ＰＣＲ等の増幅法を用いて、ポリペプチドをコードしているゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡからポリヌクレオチドを増幅してもよい。
【００６４】
本発明のポリヌクレオチドは、天然に存在するポリペプチドのコード配列を含んでもよいし、または天然には存在しない変更された配列をコードしてもよい。必要に応じて、ポリヌクレオチドは発現制御エレメント、例えば複製起点、プロモーター、エンハンサー、または宿主細胞において本発明のポリヌクレオチドの発現を駆動する他の調節エレメントなどを含んでいる発現ベクターにクローニングされてもよい。発現ベクターは、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、もしくはＣｏｌＥｌなどのプラスミド、またはアデノウイルス２型ベクターもしくは５型ベクターなどのアデノウイルスベクターであってもよい。任意に、限定するものではないがシンドビスウイルス、サルウイルス４０、アルファウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ならびにサイトメガロウイルスおよびレトロウイルスベクター、例えば、マウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、およびラウス肉腫ウイルスを含めて、他のベクターも使用され得る。ＭＣおよびＭＣ１、バクテリオファージ、ファージミド、酵母人工染色体、細菌人工染色体、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、コスミド（λファージｃｏｓ部位に挿入したプラスミド）およびレプリコン（細胞において自らの制御のもと、複製することができる遺伝因子）などのミニ染色体も用いてもよい。
【００６５】
発現制御配列に作動可能に連結されているポリヌクレオチドを調製し、それらを宿主細胞中で発現させるための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、米国特許第４，３６６，２４６号を参照のこと。本発明のポリヌクレオチドは、１つ以上の発現制御エレメントの付近にまたは近接して位置する時、作動可能に連結されており、これがポリヌクレオチドの転写および／または翻訳を指示する。
【００６６】
本発明のポリヌクレオチドは、例えばプローブまたはプライマー、例えばＰＣＲプライマーとして、生物学的サンプルなどの試験サンプル中のＥ．ｃａｎｉｓのポリヌクレオチドの存在を検出するために用いてもよい。プローブとは、例えば、ハイブリダイゼーションを通じて、典型的には配列特異的な方式で標的核酸と相互作用し得る分子である。プライマーとは、酵素的操作を支持し得、かつ酵素的操作が生じるように標的核酸とハイブリダイズし得る１サブセットのプローブである。プライマーは、酵素的操作を邪魔しない当該分野で利用可能なヌクレオチドまたはヌクレオチドの誘導体もしくはアナログの任意の組み合わせから作製され得る。
【００６７】
プローブまたはプライマーは、例えば、配列番号２２〜３３に示されるポリペプチドをコードする約１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上連続するヌクレオチドであってもよい。
【００６８】
核酸のハイブリダイゼーションは、当該分野で周知である。典型的には、プローブは当該分野で利用可能なヌクレオチドまたはヌクレオチドの誘導体もしくはアナログの任意の組み合わせから作製され得る。このようなプローブおよびプライマーが有するＥ．ｃａｎｉｓのポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする能力を、所定の試験サンプル中における相補配列の存在を検出するために利用することができる。本発明のポリヌクレオチドプローブおよびプライマーは、唾液、痰、血液、血漿、血清、尿、糞便、脳脊髄液、羊水、傷からの浸出液、または組織を含めた生物学的サンプルなどの試験サンプル中で相補配列とハイブリダイズできる。サンプル由来のポリヌクレオチドは、例えば、ゲル電気泳動もしくは他のサイズ分離技術に供してもよいし、またはサイズ分離なしで固定化してもよい。ポリヌクレオチドプローブまたはプライマーを標識してもよい。適した標識、ならびにプローブおよびプライマーを標識するための方法は、当該技術分野において公知であり、これらとしては、例えば、ニックトランスレーションまたはキナーゼにより取り込まれた放射性の標識、ビオチン標識、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、金属キレート標識、および酵素標識が挙げられる。サンプル由来のポリヌクレオチドを、適切なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、プローブまたはプライマーと接触させる。
【００６９】
適用次第で、多様なハイブリダイゼーション条件を用いて、標的配列に対するプローブまたはプライマーの選択性の様々の程度を得ることができる。高選択性が要求される適用のためには、低塩濃度および／または高温条件など、例えば約５０℃〜約７０℃の温度で約０．０２Ｍ〜約０．１５Ｍの塩濃度により提供されるような、比較的高いストリンジェンシーの条件を用いてもよい。低選択性が要求される適用のためには、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を用いてもよい。例えば約２０℃〜約５５℃にわたる温度で約０．１４Ｍ〜約０．９Ｍの塩濃度。プローブまたはプライマーと試験サンプル由来の相補的なポリヌクレオチドとを含んでいるハイブリダイズした複合体の存在によって、このサンプル中にＥ．ｃａｎｉｓまたはＥ．ｃａｎｉｓのポリヌクレオチドが存在することが示される。
【００７０】
抗体
本発明の抗体は、本発明のＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドに特異的に結合する抗体分子、本発明の変異体ポリペプチド、またはそのフラグメントである。本発明の抗体は、エーリキア・カニスポリペプチドに特異的、例えば、配列番号１０、２２〜３３の１つ以上に特異的な抗体であり得る。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体（ｓｃＦＶ）、または抗体の抗原結合フラグメントであってもよい。抗体の抗原結合フラグメントは、インタクトな抗体の抗原結合部位または可変領域を含んでいる、インタクトな抗体の抗原結合部分であって、この部分はインタクトな抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメインを含まない。抗原結合フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦvフラグメントが挙げられる。
【００７１】
本発明の抗体は、任意の抗体クラス、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥであってもよい。抗体またはそれらのフラグメントは、本発明のポリペプチドのエピトープに結合する。抗体は、適切な実験動物においてインビボで、または組換えＤＮＡ技術を用いてインビトロで作製され得る。抗体を調製し特徴付けるための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｄｅａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８０：２３〜３７（１９９８），Ｄｅａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：３６１〜７９（１９９４），Ｂａｉｌｅｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：３８１〜８８（１９９４），Ｇｕｌｌｉｃｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：３８９〜９９（１９９４），Ｄｒｅｎｃｋｈａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３７：７〜５６（１９９３），Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２３９〜６５（１９９２），Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１２５〜６８（１９９２）を参照のこと。例えば、ポリクローナル抗体は、本発明のポリペプチドをヒトまたは他の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ブタ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ロバもしくはウマなどの動物に投与することにより作製される。免疫された動物から血清が集められ、抗体は、例えば、硫酸アンモニウムを用いた沈降に続いてアフィニティクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーによって血漿から精製される。ポリクローナル抗体を作製、加工するための技術は、当該技術分野において公知である。
【００７２】
「特異的に結合」または「特異的な」とは、第１の抗原、例えば、Ｅ．ｃａｎｉｓのポリペプチドが本発明の抗体を認識し、他の非特異的な分子に対してよりも大きい親和性でもって結合することを意味する。「特異的に結合」または「特異的な」とはまた、第１の抗体、例えば、配列番号２２〜３３に対して産生された抗体が配列番号２２〜３３を認識し、他の非特異的な分子に対してよりも大きい親和性でもって結合することを意味する。非特異的な分子とは、第１の抗原と共通のエピトープを共有しない抗原である。本発明の好ましい実施形態では、非特異的な分子は、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐ．由来ではなく、詳細にいえばエーリキア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）由来でも、またはエーリキア・カニス由来でもない。「Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐ．」とは、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ属の全ての種をいう。例えば第一の抗原（例えば、ポリペプチド）に対して産生された抗体であって非特異的な抗原に対してよりも効率的に結合する抗体は、第一の抗原に対して特異的に結合すると記載することができる。一実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合部分は、１０7ｌ／ｍｏｌまたはそれ以上の結合親和性Ｋaをもって結合する場合、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９のポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する。特異的な結合は、当該技術分野において周知の方法論を用いて、例えば、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、またはウエスタンブロットアッセイを用いて試験することができる。
【００７３】
本発明の抗体は、（ａ）配列番号２２〜３３またはそれらの抗原結合フラグメントに対する結合について参照抗体と競合するか；（ｂ）配列番号２２〜３３またはその抗原結合フラグメントが、参照抗体と同じエピトープに対して結合するか；（ｃ）配列番号２２〜３３またはその抗原結合フラグメントに対して、参照抗体と実質的に同じＫdでもって結合するか；および／または（ｄ）配列番号２２〜３３またはそのフラグメントと、参照抗体と実質的に同じ解離速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）で結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを包含し、ここでこの参照抗体は、配列番号２２〜２３のポリペプチドまたはそれらの抗原結合フラグメントに対して、１０7ｌ／モル以上の結合親和性Ｋaでもって特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントである。
【００７４】
さらに、本発明のポリペプチド上に存在するエピトープに対するモノクローナル抗体も容易に作製され得る。例えば、本発明のポリペプチドで免疫されたマウスなどの哺乳動物由来の正常なＢ細胞を、例えばハイブリドーマを作製するためにＨＡＴ感受性マウスミエローマ細胞と融合してもよい。Ｅ．ｃａｎｉｓ特異的な抗体を作製するハイブリドーマは、ＲＩＡまたはＥＬＩＳＡを用いて同定することができ、半流動性の寒天でのクローニング、または限界希釈法により単離することができる。Ｅ．ｃａｎｉｓ特異的な抗体を産生するクローンは、さらに１回のスクリーニングにより単離される。モノクローナル抗体は、標準的な技術を用いて、例えば、本発明のポリペプチドのマイクロタイタープレートへの結合、およびＥＬＩＳＡアッセイによるモノクローナル抗体の結合の測定によって、特異性についてスクリーニングされ得る。モノクローナル抗体を作製し、加工する技術は、当該技術分野において公知である。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）を参照のこと。モノクローナル抗体の特定のアイソタイプは、最初の融合からの選択によって直接的に調製してもよいし、またはクラススイッチ変異体を単離するための同胞選択技術を用いることによって、異なるアイソタイプのモノクローナル抗体を分泌する親のハイブリドーマから二次的に調製してもよい。Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８２：８６５３  １９８５，Ｓｐｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｍｅｔｈ．７４：３０７，１９８４を参照のこと。本発明のモノクローナル抗体は、組換えモノクローナル抗体であってもよい。例えば、米国特許第４，４７４，８９３号、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと。本発明の抗体はまた、化学的に作成することもできる。例えば、米国特許第４，６７６，９８０号を参照のこと。
【００７５】
本発明の抗体は、キメラ（例えば、米国特許第５，４８２，８５６号を参照のこと）、ヒト化抗体（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３（１９９２）を参照のこと）であっても、またはヒト抗体であってもよい。ヒト抗体は、例えば、直接の不死化、ファージディスプレイ、トランスジェニックマウス、またはトリメラ（Ｔｒｉｍｅｒａ）の方法論（例えば、Ｒｅｉｓｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２４２〜２４６（１９９８）を参照のこと）によって作製され得る。
【００７６】
Ｅ．ｃａｎｉｓ抗原（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３に示されるＥ．ｃａｎｉｓポリペプチド）に特異的に結合する抗体は、ヒトまたはイヌなどのＥ．ｃａｎｉｓに感染した動物由来のサンプル、例えば、血清、血液、血漿、糞便、細胞、組織、尿、または唾液サンプルなどのサンプル中のＥ．ｃａｎｉｓまたはＥ．ｃａｎｉｓ抗原の存在を検出するために特に有用である。Ｅ．ｃａｎｉｓまたはＥ．ｃａｎｉｓ抗原のイムノアッセイは、１つの抗体を利用してもよいし、またはいくつかの抗体を利用してもよい。Ｅ．ｃａｎｉｓまたはＥ．ｃａｎｉｓ抗原のイムノアッセイは、例えば、Ｅ．ｃａｎｉｓエピトープに特異的なモノクローナル抗体、１つのＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドのエピトープに特異的なモノクローナル抗体、異なるＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドのエピトープに特異的なモノクローナル抗体、同じＥ．ｃａｎｉｓ抗原に特異的なポリクローナル抗体、異なるＥ．ｃａｎｉｓ抗原に特異的なポリクローナル抗体の組み合わせ、またはモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の組み合わせを用いてもよい。イムノアッセイのプロトコールは、例えば、標識した抗体を用いる、例えば、競合、直接反応、またはサンドイッチ型アッセイに基づいてもよい。本発明の抗体は、例えば蛍光、化学発光、放射活性、酵素、コロイド金属、放射性同位体、および生物発光の標識などの、当該技術分野において公知の任意の型の標識で標識され得る。
【００７７】
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを支持体に結合させて、Ｅ．ｃａｎｉｓまたはＥ．ｃａｎｉｓ抗原、例えば、Ｅ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原またはＥ．ｃａｎｉｓのワクチン抗原の存在を検出するために用いてもよい。支持体としては、例えばガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然のおよび修飾したセルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、およびマグネタイト（ｍａｇｌｅｔｉｔｅ）が挙げられる。
【００７８】
本発明の抗体は、さらにＥ．ｃａｎｉｓ生物体、またはＥ．ｃａｎｉｓ抗原をイムノアフィニティカラムにより単離するために用いることができる。この抗体は、この抗体が免疫選択活性を保持するように、例えば、吸収によりまたは共有結合により固相支持体に固定できる。必要に応じて、抗体の抗原結合部位がアクセス可能なままであるように、スペーサー基を含めてもよい。固定化された抗体は、唾液、血清、痰、血液、尿、糞便、脳脊髄液、羊水、創傷浸出液、または組織を含む生物学的サンプルなどのサンプル由来のＥ．ｃａｎｉｓ生物体、またはＥ．ｃａｎｉｓ抗原に結合するために用いてもよい。結合したＥ．ｃａｎｉｓ生物体、またはＥ．ｃａｎｉｓ抗原は、例えばｐＨの変化によりカラムのマトリクスから回収される。
【００７９】
本発明の抗体は、免疫局在性の研究において、多様な細胞事象または生理的条件の間に本発明のポリペプチドの存在および分布を分析するために、用いることができる。抗体はまた、受動免疫に関与する分子を同定するため、および非タンパク抗原の生合成に関与する分子を同定するためにも用いられ得る。このような分子の同定は、ワクチン開発において有用であり得る。例えばモノクローナル抗体および単鎖抗体を含めて本発明の抗体は、Ｅ．ｃａｎｉｓにより引き起こされる疾患の回復の経過をモニターするために用いることができる。動物からの試験サンプル中のＥ．ｃａｎｉｓ抗原に特異的なＥ．ｃａｎｉｓ抗体の増加または減少を測定することによって、疾患の回復を目的とした特定の治療計画が有効か否かを判定することができる。抗体は、例えばＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、またはウエスタンブロットアッセイなどの直接結合アッセイを用いて、検出および／または定量できる。
【００８０】
検出
本発明の方法は、生物学的サンプル、環境的サンプル、または実験室サンプルなどの試験サンプル中のエーリキア・カニスの抗原またはエーリキア・カニスのポリヌクレオチドに特異的な抗体または抗原結合する抗体フラグメントを検出するために用いられ得る。試験サンプルは可能性として、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐ．のポリヌクレオチド、エーリキア・カニスのポリヌクレオチド、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐ．のポリペプチド、エーリキア・カニスのポリペプチド、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐ．に特異的な抗体および／またはエーリキア・カニスに特異的な抗体、無関係のポリヌクレオチドおよびポリペプチド、それらの組み合わせを含んでもよいし、上記を何も含まなくてもよい。生物学的サンプルは、例えばウマ、ネコ、イヌ、またはヒトなどの哺乳類由来の血清、血液、細胞、血漿、唾液、尿、糞便または組織を含んでもよい。試験サンプルは未処理であっても、沈殿させても、分画しても、分離しても、希釈しても、濃縮しても、または精製してもよい。
【００８１】
一実施形態では、本発明の方法は、本発明の１つ以上のポリペプチドを、ポリペプチド／抗体の複合体、すなわち免疫複合体を形成できる条件下で、試験サンプルと接触させる工程を包含する。すなわち、本発明のポリペプチドは、サンプル中にあるＥ．ｃａｎｉｓ抗原に特異的な抗体に特異的に結合する。本発明の一実施形態では、本発明の１つ以上のポリペプチドは、エーリキア・カニス抗原に特異的である抗体に特異的に結合し、かつ他の病原体由来の抗原、例えばエーリキア・シャフェンシスの抗原には特異的に結合しない。当業者は、抗体／ポリペプチドの複合体結合を検出するために用いられるアッセイおよび条件には詳しい。サンプル中のポリペプチドと抗体との間の複合体の形成が検出される。抗体／ポリペプチド複合体の形成によって、サンプル中にエーリキア・カニスのポリペプチドが存在することが示される。ポリペプチド／抗体の複合体の検出がなければ、エーリキア・カニスのポリペプチドはサンプル中に存在しないことが示される。
【００８２】
本発明の抗体は、例えば、エーリキア・カニスの感染が疑われるヒトまたは動物から試験サンプルを得ることにより、エーリキア・カニス抗原の検出の方法に用いることができる。試験サンプルを、抗体−抗原複合体（すなわち、免疫複合体）を形成できる条件下で本発明の抗体と接触させる。当業者は、抗原／抗体複合体の形成を可能にし、かつ適切である条件を承知している。抗体−抗原複合体の量は、当該技術分野において公知である方法論により決定できる。陰性コントロールのサンプル中で形成されるよりも高レベルであれば、エーリキア・カニス抗原の存在を示している。陰性コントロールサンプルとは、なんらエーリキア・カニスのポリペプチドを含まないサンプルである。本発明の一実施形態では、陰性コントロールは、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐ．のポリペプチドを含まない。本発明の一実施形態では、抗体は、エーリキア・カニスの抗原に特異的であって、他の病原体由来の抗原、例えば、エーリキア・シャフェンシスの抗原などには特異的ではない。あるいは、本発明のポリペプチドを、試験サンプルと接触させてもよい。陽性の試験サンプル中のエーリキア・カニスに特異的な抗体は、適した条件化で抗体−抗原複合体を形成するであろう。抗体−抗原複合体の量は、当該技術分野において公知の方法により決定され得る。
【００８３】
本発明の一実施形態において、エーリキア・カニスの感染は、被験体中で検出され得る。生物学的サンプルは、この被験体から得られる。配列番号２２〜３３を含んでいる１つ以上の精製されたポリペプチド、または本発明の他のポリペプチドを、ポリペプチド／抗体複合体の形成を可能にする条件下で生物学的サンプルと接触させる。このポリペプチド／抗体複合体が検出される。このポリペプチド／抗体複合体の検出によって、エーリキア・カニスに特異的な抗体が存在することが示される。ポリペプチド／抗体複合体の検出がなければ、この哺乳動物は、エーリキア・カニスに特異的な抗体を有していないことが示される。
【００８４】
本発明の一実施形態では、本発明のイムノアッセイによって検出されるエーリキア・カニス抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥである。本発明の別の実施形態では、エーリキア・カニス抗原を検出するために用いられる抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥである。
【００８５】
本発明の一実施形態では、エーリキア・カニスの感染は、被験体がエーリキア・カニスに感染した約５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日以上後でその被験体において検出できる。本発明の一実施形態では、エーリキア・カニス感染は、被験体がエーリキア・カニス感染した後約２１日、２０日、１９日、１８日、１７日、１６日、１５日、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日未満で検出できる。
【００８６】
本発明の一実施形態では、抗体に結合している酵素複合体などの指示薬が検出可能な反応を触媒する場合、ポリペプチド／抗体の複合体が検出される。必要に応じて、シグナル生成化合物を含む指示薬を、ポリペプチド／抗体／指示薬の複合体を形成できる条件下で、ポリペプチド／抗体の複合体に適用することができる。このポリペプチド／抗体／指示薬の複合体が検出される。必要に応じて、ポリペプチドまたは抗体は、ポリペプチド／抗体の複合体が形成される前に指示薬で標識してもよい。この方法は、必要に応じて陽性コントロールまたは陰性コントロールを含んでもよい。
【００８７】
本発明の一実施形態において、本発明の１つ以上の抗体を、固相または基板に結合させる。本発明のポリペプチドを含んでいるタンパク質を潜在的に含む試験サンプルを、基板に加える。本発明のポリペプチドに特異的に結合する１つ以上の抗体を加える。この抗体は、固相で使用したものと同じ抗体であってもよく、または異なる供給源もしくは種由来の抗体であってもよく、さらに酵素複合体などの指示薬と結合させてもよい。洗浄の工程は、それぞれの添加の前に行ってもよい。発色団または酵素の基質を加え、発色させてもよい。呈色反応を停止し、例えば分光光度計を用いて色を定量してもよい。
【００８８】
本発明の別の実施形態において、本発明の１つ以上の抗体を、固相または基板に結合させる。本発明のポリペプチドを含んでいるタンパク質を潜在的に含む試験サンプルを、基板に加える。本発明のポリペプチドに特異的に結合する二次抗−種抗体を加える。これらの二次抗体は、固相の抗体とは異なる種由来である。二次抗体に特異的に結合し、固相の抗体に特異的に結合しない三次抗−種抗体を加える。三次抗体は、酵素コンジュゲートなどの指示薬を含んでもよい。洗浄の工程は、それぞれの添加の前に行ってもよい。発色団または酵素の基質を添加し、発色させることができる。呈色反応を停止し、例えば分光光度計を用いて色を定量することができる。
【００８９】
本発明のアッセイとしては、限定するものではないが、競合、直接反応、またはサンドイッチ型アッセイに基づくものを包含し、これには、限定するものではないが、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、ＩＦＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、赤血球凝集（ＨＡ）、蛍光偏光免疫測定法（ＦＰＩＡ）、およびマイクロタイタープレートアッセイ（マイクロタイタープレートの１つ以上のウェルにおいて行われる任意のアッセイ）を包含する。本発明のアッセイの１つは、逆相クロマトグラフィー結合アッセイ、例えばＳＮＡＰ（登録商標）アッセイを含む。例えば、米国特許５，７２６，０１０号を参照のこと。
【００９０】
アッセイは固相もしくは基板を用いてもよく、または免疫沈降もしくは固相を利用しない任意の他の方法によって行ってもよい。固相または基板が用いられる場合には、本発明の１つ以上のポリペプチドを直接または間接的に、マイクロタイターウェル、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、カラム、マトリックス、膜、合成もしくは天然の繊維からなる繊維性のマット（例えばガラス、またはセルロースを基にした材料、またはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステルなどの熱可塑性ポリマー）、微粒子材料（例えばガラス、または多様な熱可塑性ポリマー）から構成される焼結構造、またはニトロセルロース、ナイロン、ポリスルホン等（一般に天然に合成される）から構成されるキャスト膜フィルムなどのような、固相支持体または基板に結合させる。本発明の一実施形態では、基板は、一般に多孔性ポリエチレンとして公知のポリエチレンの焼結した微粒子であり、これには、例えばＣｈｒｏｍｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ，ＮＭ）の１０〜１５ミクロンの多孔性ポリエチレンがある。これらの基板材料のすべては、フィルム、シートもしくはプレートなどの適した形態で用いることが可能であり、または紙、ガラス、プラスチックフィルム、もしくは布などの適当な不活性支持体にコーティングされても、結合されても、ラミネート加工されてもよい。固相上にペプチドを固定化するために適した方法としては、イオン相互作用、疎水性相互作用、共有結合性相互作用などが挙げられる。分析物捕獲試薬がサンプル、希釈および／または洗浄の手順によって洗い流されないように、デバイスまたは固相支持体上へ、１つ以上の分析物捕獲試薬、例えば、Ｅ．ｃａｎｉｓポリペプチドの固定を行う。１つ以上の分析物捕獲試薬を物理的吸着によって（すなわち、化学的リンカーの使用なしに）、または化学的結合によって（すなわち、化学的リンカーの使用によって）表面に対して結合してもよい。化学的結合は、表面上の捕獲試薬のさらに強力な結合を生じ、かつ表面結合分子の規定された方向および高次構造を得ることができる。
【００９１】
１種のアッセイ形式では、１つ以上のポリペプチドを固相または基板上にコーティングしてもよい。抗エーリキア・カニス抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでいることが疑われる試験サンプルを、試験サンプル中の抗体と固相のポリペプチドとの、またはエーリキア・カニスに特異的な抗体とコンジュゲートさせた指示薬の化合物と固相のポリペプチドとの抗原／抗体複合体が形成されるのに十分な時間および条件の下で、エーリキア・カニスに特異的な抗体または抗体フラグメントとコンジュゲートさせたシグナル生成化合物を含んでいる指示薬とともにインキュベートする。抗エーリキア・カニス抗体とコンジュゲートさせた指示薬の固相への結合の減少は、定量的に測定することができる。例えば、確認済みのエーリキア・カニス陰性の試験サンプルから生じるシグナルに比較した、シグナルの測定可能な減少によって、この試験サンプル中に抗エーリキア・カニス抗体が存在することが示される。この種のアッセイで、試験サンプル中の抗エーリキア・カニス抗体の量を定量することができる。
【００９２】
別の種のアッセイ形式において、本発明の１つ以上のポリペプチドは、支持体または基板上にコーティングされる。本発明のポリペプチドは、指示薬とコンジュゲートされて、試験サンプルに加えられる。この混合物は支持体または基板に適用される。もしもエーリキア・カニスに特異的な抗体が試験サンプル中に存在するならば、それらは指示薬とコンジュゲートされた１つ以上のポリペプチドおよび支持体上に固定された１つ以上のポリペプチドに結合するであろう。次に、ポリペプチド／抗体／指示薬の複合体が検出され得る。この種のアッセイは、試験サンプル中の抗エーリキア・カニス抗体の量を定量することができる。
【００９３】
別の種のアッセイ形式において、本発明の１つ以上のポリペプチドを、支持体または基板上にコーティングする。試験サンプルを支持体または基板に適用して、インキュベートする。サンプル由来の結合していない成分を、洗浄液による固相支持体の洗浄によって洗い流す。もしもエーリキア・カニスに特異的な抗体が試験サンプル中に存在するならば、それらは固相上にコーティングされたポリペプチドに結合するであろう。このポリペプチド／抗体複合体は、指示薬とコンジュゲートされている二次種−特異的抗体を用いて検出され得る。次に、ポリペプチド／抗体／抗−種抗体指示薬の複合体が検出され得る。この種のアッセイは、試験サンプル中の抗エーリキア・カニス抗体の量を定量することができる。
【００９４】
本発明の別の実施形態では、側方流動アッセイに適切なデバイスが提供される。例えば、試験サンプルをフロー・マトリックスに最初の領域（サンプル適用ゾーン）で添加する。この試験サンプルはフロー・マトリックスの第二の領域へ毛細管現象によって流体流路中、運ばれ、ここで標識は、試験サンプル中の分析物と結合して第一の複合体を形成し得る。この第一の複合体は、フロー・マトリックスの第三領域に運ばれて、ここでＥ．ｃａｎｉｓのポリペプチドは離れた位置に固定される。第二の複合体が、固定されたポリペプチドと、サンプル由来の抗体を含んでいる第一の複合体との間で形成される。例えば、金ゾル粒子およびＥ．ｃａｎｉｓ抗体に結合したＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドを含んでいる第一の複合体は、第二の固定されたＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドと、またはＥ．ｃａｎｉｓ抗体に対する第二の抗体と、特異的に結合して第二の複合体を形成する。第二の複合体の一部である標識は、直接可視化され得る。
【００９５】
別の局面では、本発明は、本発明のデバイスに適用する前に試験サンプルと混合され得る１つ以上の標識された結合試薬を含む。この場合、デバイス中で特定の結合試薬パッド上に沈着されて乾燥された、標識された特定の結合試薬を有している必要はない。標識された特定の結合試薬は、試験サンプルに加えられてもまたはデバイス上に事前に沈着されていても、例えば、Ｅ．ｃａｎｉｓの抗体に特異的に結合する標識された抗体であってよい。
【００９６】
Ｅ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原またはＥ．ｃａｎｉｓのワクチン抗原、例えば、ポリペプチドは、反応ゾーン（固相）中の固定された分析物捕獲試薬であってもよい。第二の分析物捕獲試薬、例えば、標識に結合されている抗ＩｇＧまたは抗ＩｇＭ抗体は、サンプルがデバイスに付加される前にサンプルに添加されてもよいし、または第二の分析物捕獲試薬はデバイスに組み込まれてもよい。例えば、標識された特定の結合試薬は、サンプル適用ゾーンと固相との間の液体連絡をもたらす流体流路上に沈着し乾燥させてもよい。標識された特定の結合試薬と流体サンプルとの接触によって、標識された特定の結合試薬の溶解が生じる。
【００９７】
このデバイスはまた、反応ゾーン（固相）から未結合の物質（例えば、未反応の流体サンプルおよび未結合の特異的結合試薬）を輸送する液体試薬を備えてもよい。液体試薬は、洗浄試薬であって、反応ゾーンから未結合の物質を取り除くようにのみ作用してもよいし、または検出試薬を含み、未結合の物質を取り除くようにかつ分析物検出を容易にするように機能してもよい。例えば、酵素にコンジュゲートされた特定の結合試薬の場合には、検出試薬としては、反応性ゾーンでの酵素−抗体コンジュゲートとの反応の際に検出可能なシグナルを生じる基質が挙げられる。放射性、蛍光または光吸収分子にコンジュゲートされた標識された特異的な結合試薬の場合、この検出試薬は、未結合の標識試薬を洗い流すことによって反応ゾーンでの複合体形成の検出を容易にする単なる洗浄溶液として機能する。
【００９８】
２つ以上の液体試薬がデバイス中に存在してもよく、例えば、デバイスは、洗浄試薬として機能する液体試薬、および検出試薬として機能しかつ分析物検出を容易にする液体試薬を備えてもよい。
【００９９】
液体試薬はさらに、限定量の「インヒビター」、すなわち、検出可能な最終生成物の発生をブロックする物質を含んでもよい。限定量とは、ほとんどまたは全ての過剰な未結合の物質が第二の領域から輸送され、その時点で検出可能な最終生成物が産生されるまで、最終生成物の発生をブロックするのに十分なインヒビターの量である。
【０１００】
ポリペプチド／抗体の複合体またはポリペプチド／抗体／指示薬の複合体の形成は、例えば、放射測定、比色定量、蛍光定量、サイズ分離、または沈殿法により検出され得る。必要に応じて、ポリペプチド／抗体複合体の検出は、シグナル生成化合物を含んでいる指示薬とカップリングされている二次抗体の添加により行われる。ポリペプチド／抗体複合体と会合した、シグナル生成化合物（標識）を含んでいる指示薬は、上述の方法を用いて検出することが可能で、これには、発色剤、酵素コンジュゲートなどの触媒、フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光化合物、ジオキセタン、アクリジニウム、フェナントリジニウム、ルテニウムおよびルミノールなどの化学発光化合物、放射活性元素、直接可視化する標識、ならびに補助因子、インヒビター、磁性粒子などが挙げられる。酵素コンジュゲートの例としては、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼなどが挙げられる。特定の標識の選択は決定的なものではないが、それ自体で、または１つ以上の追加の基質と組み合わせて、シグナルを生成することができるであろう。
【０１０１】
複合体の形成は、試験サンプル中に抗エーリキア・カニス抗体が存在することを示す。従って、本発明の方法は、動物におけるエーリキア・カニスの感染を診断するために用いられ得る。
【０１０２】
本発明の方法は、試験サンプル中の抗エーリキア・カニス抗体の量または分量も示すことができる。酵素コンジュゲートなどの多くの指示薬を用いると、存在する抗体の量は生成されるシグナルに比例する。試験サンプルの種類によって、適した緩衝液で希釈することができ、濃縮することができ、またはいかなる操作もなしで固相に接触させることができる。例えば、抗体の存在および／または存在する抗体の量を決定するために、通常、あらかじめ希釈されている血清もしくは血漿サンプル、または尿などの濃縮された試料を試験することが好ましい。
【０１０３】
本発明はさらに、サンプル中の抗エーリキア・カニス抗体もしくは抗原結合する抗体フラグメント、またはエーリキア・カニスのポリペプチドを検出するためのアッセイキット（例えば製品）を含む。キットは、本発明の１つ以上のポリペプチド、および試験サンプル中の抗エーリキア・カニス抗体または抗体フラグメントへのこのポリペプチドの結合を決定するための手段を備える。キットまたは製品はまた、本発明の１つ以上の抗体または抗体フラグメント、およびサンプル中のエーリキア・カニスのポリペプチドへのこの抗体または抗体フラグメントの結合を決定するための手段を備えてもよい。キットは、本発明の１つ以上のポリペプチドまたは抗体を含んでいるデバイス、および１つ以上のポリペプチドまたは抗体を、例えば哺乳動物におけるエーリキア・カニス感染の同定のために使用するための説明書を備えてもよい。このキットは、このキットの１つ以上のポリペプチドまたは抗体が、エーリキア・カニス感染の同定のために使用され得ることを示すラベルを含むパッケージング材料も備えてもよい。当業者に公知である、緩衝液、安定化剤、陽性コントロール、陰性コントロール、検出試薬などの他の構成要素が、このような試験キットに備えられてもよい。本発明のポリペプチド、抗体、アッセイ、およびキットは、例えば、患者のエーリキア・カニス感染の個々の症例の診断、ならびにエーリキア・カニスの発生の疫学的な調査において有用である。種々の試薬の相対的な量は、そのアッセイの感度を実質的に最適化する溶液中での試薬濃度が得られるように変化されてもよい。特にその試薬は、通常は凍結乾燥された乾燥粉末として提供されてもよく、この溶解の際に、サンプルと組み合わせるための適切な濃度を有する試薬溶液が得られる。
【０１０４】
本発明のポリペプチドおよびアッセイを他のポリペプチドやアッセイと組み合わせて、他の生物とともにエーリキア・カニスの存在を検出することができる。例えば、本発明のポリペプチドおよびアッセイは、イヌ糸状虫、および／またはボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）および／またはエーリキア・シャフェンシスおよび／またはアナプラズマ・プラチス（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｌａｔｙｓ）および／またはアナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）を検出する試薬と組み合わせてもよい。
【０１０５】
本発明のポリヌクレオチドは、サンプル中のエーリキア・カニスのポリヌクレオチドの存在を検出するために用いられ得る。このポリヌクレオチドは、単純なハイブリダイゼーション反応によってサンプル中のエーリキア・カニスのポリヌクレオチドを検出するために用いてもよく、また例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えば、リアルタイムＰＣＲ反応で用いてもよい。本発明の方法および組成物はまた、エーリキア・シャフェンシスなどの他のＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐ．からエーリキア・カニスの存在を示差的に検出するために用いてもよい。
【０１０６】
ＰＣＲアッセイは、当該分野でかなり記載されており、これには例えば、米国特許第４，６８３，１９５号；米国特許第４，６８３，２０２号；米国特許第４，９６５，１８８号が挙げられる。一般には、ポリヌクレオチドプライマーは、標的核酸の変性された鎖にアニーリングされる。プライマー伸長産物が、ポリメラーゼによるデオキシヌクレオシド三リン酸の重合化によって形成される。次いでＰＣＲは、反復性サイクルのテンプレート核酸変性、プライマーアニーリングおよび熱安定性ポリメラーゼの作用によるこのアニーリングされたプライマーの伸長を包含する。このプロセスは、試験サンプル中の標的エーリキア・カニス核酸の指数関数的な増幅を生じ、これによってサンプル中で極めて低濃度で存在する標的ポリヌクレオチドの検出が可能になる。
【０１０７】
リアルタイムＰＣＲアッセイは、シグナル、例えば、蛍光レポーターシグナルの検出に基づく。このシグナルは、反応中のＰＣＲ産物の量に直接比例して増大する。リアルタイムＰＣＲは、進行中の増幅反応の漸進的変化をモニター可能にさせる任意の増幅技術である。Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）を参照のこと。各々のサイクルで蛍光発光の量を記録することによって、ＰＣＲ産物の量の第一の有意な増大が、標的テンプレートの最初の量に関連する対数期の間のＰＣＲ反応をモニターすることが可能になる。核酸標的の最初のコピー数が多いほど、蛍光の有意な増大がより早く観察される。
【０１０８】
本発明の一実施形態では、試験サンプル中のエーリキア・カニスポリヌクレオチドを検出および／または定量するための方法が提供される。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーを、ポリメラーゼ連鎖反応に適切な条件下で試験サンプルに添加してもよい。このプライマーは、エーリキア・カニスポリヌクレオチドとハイブリダイズして、その結果エーリキア・カニスポリヌクレオチドが試験サンプル中に存在する場合、増幅産物が形成される。増幅産物を検出して、エーリキア・カニスポリヌクレオチドの存在および／または量を決定する。増幅産物は、ポリメラーゼ連鎖反応に適切な条件下でエーリキア・カニスポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブを用いて検出できる。この増幅産物は、プローブ由来の検出シグナルを測定すること、およびこの検出シグナルを定量標準由来の第二のプローブ検出シグナルに対して比較することによって定量され得る。定量標準は、試験サンプルと平行して抽出できる。
【０１０９】
Ｅ．ｃａｎｉｓにより引き起こされる疾患の治療、回復、または予防の方法
本発明の一実施形態では、本発明のＤＩＶＡポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体は、Ｅ．ｃａｎｉｓにより引き起こされる疾患の治療、回復、または予防のために用いられ得る。しかし、ＤＩＶＡポリペプチドがＥ．ｃａｎｉｓにより引き起こされる疾患の治療、回復、または予防のために用いられるならば、その後には、これを感染動物、非ワクチン接種動物およびワクチン接種した動物の検出および識別のためのＤＩＶＡポリペプチドとして用いることはできない。なぜなら、ワクチン接種された動物の免疫系は、ワクチン接種のために用いられたＤＩＶＡ抗原を認識し得るからである。しかし、Ｅ．ｃａｎｉｓにより引き起こされる疾患の治療、回復、または予防のために用いられるＤＩＶＡポリペプチドに対する抗体と交差反応しないＤＩＶＡポリペプチドは、Ｅ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原としてやはり用いられ得る。
【０１１０】
例えば、配列番号２またはそのフラグメントをワクチンとして用いるならば、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３またはそれらの組み合わせを、それらが配列番号２に特異的な抗体とは交差反応しない場合に、ＤＩＶＡポリペプチドとして用いてもよい。現在のところ、市販のサブユニットＥ．ｃａｎｉｓワクチンでは配列番号１０、２２〜３３は使用されておらず、配列番号１０、２２〜３３は、丸ごとの不活性化されたＥ．ｃａｎｉｓ細胞でワクチン接種された動物中のＥ．ｃａｎｉｓ特異的な抗体を検出しない。従って、ＤＩＶＡポリペプチドの選択は、現在のところ問題ではない。しかし、当業者はＥ．ｃａｎｉｓのワクチンの組成を承知している。市販のＥ．ｃａｎｉｓサブユニットワクチンが配列番号１０、２２〜３３を含んでいるならば、当業者は、ワクチン接種の状況を識別するために配列番号１０、２２〜３３の使用を回避し（必要であれば配列番号１０、２２〜３３に特異的なＥ．ｃａｎｉｓ抗体の産生に起因する）、代わりに他のＥ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原を用いるであろう。
【０１１１】
従って、ＤＩＶＡのポリペプチド、ポリヌクレオチド、および抗体は、２つの異なる方法で用いられ得る：（１）Ｅ．ｃａｎｉｓにより引き起こされる疾患または感染の治療、回復、または予防のための組成物として；ならびに（２）Ｅ．ｃａｎｉｓでワクチン接種：非ワクチン接種；感染または感染していない動物の検出および識別のためのＥ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原として。
【０１１２】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体は、Ｅ．ｃａｎｉｓにより引き起こされる疾患の治療、回復、または予防のために用いられる。例えば、本発明のモノクローナル抗体などの抗体またはそのフラグメントは、ヒトなどの動物に投与され得る。本発明の一実施形態において、抗体またはそれらのフラグメントは、薬学的に受容可能な担体を含んでいる医薬組成物の状態で動物に投与される。医薬組成物は、治療上有効量の抗体またはそのフラグメントを含む。治療上有効量とは、Ｅ．ｃａｎｉｓ感染の症状を緩和するのに、または被験体中のＥ．ｃａｎｉｓ生物体の量を減少するのに効果的な量である。
【０１１３】
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、免疫原性の組成物中に存在してもよく、宿主における免疫応答を誘発するために用いてもよい。免疫原性の組成物は、動物において免疫応答を誘導することができる。本発明の免疫原性のポリペプチドまたはポリヌクレオチド組成物は、１つの結果としてエーリキア・カニス感染の影響を回復または予防する免疫応答が生じるように、動物の免疫系を感作するのに特に有用である。動物モデルにおける免疫応答の誘発は、例えば、至適投与量や投与経路等を決定するために有用となり得る。免疫応答の誘発は、エーリキア・カニスにより引き起こされる病気または感染を治療、予防、または回復するためにも用いられ得る。免疫応答は、体液性免疫応答もしくは細胞性免疫応答、またはそれらの組み合わせを含む。免疫応答は、例えばデフェンシン類の産生を促進することによる、全身の宿主応答の促進を含んでもよい。
【０１１４】
動物によるＥ  ｃａｎｉｓに対する抗体価の生成は、感染からの防御および感染の排除において重要となり得る。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの送達後の抗体価の検出および／または定量化は、抗体価の誘発に特に効果的であるエピトープを同定するために使用され得る。Ｅ．ｃａｎｉｓに対する強い抗体応答を担うエピトープは、種々の長さのＥ．ｃａｎｉｓポリペプチドに対する抗体を誘発することにより同定され得る。次に、特定のポリペプチドエピトープにより誘導された抗体を、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて試験して、どのポリペプチドが強い応答の生成に最も効果的なエピトープを含んでいるかを決定することができる。次に、これらのエピトープまたはエピトープをコードするポリヌクレオチドを含んでいるポリペプチドまたは融合タンパク質を構築し、これを用いて、強い抗体反応を誘発することができる。
【０１１５】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体は、インビボで抗体を誘発するため、マウス、ウサギ、モルモット、マカク、ヒヒ、チンパンジー、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコなどの哺乳動物に、またはニワトリもしくはアヒルなどの動物に投与され得る。ポリヌクレオチドの注入には、構成および修飾の単純性という実践上の利点がある。さらに、ポリヌクレオチドの注入は、結果的に宿主においてポリペプチドの合成をもたらす。したがって、ポリペプチドは、自然の翻訳後修飾、構造、および高次構造で宿主の免疫系に提示される。ポリヌクレオチドは、「裸のＤＮＡ」として被験体に送達してもよい。
【０１１６】
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または抗体の投与は、当該技術分野において公知である任意の手段により、例えば、筋肉内、静脈内、肺内、筋肉内、皮内、腹腔内、または皮下注射、エアロゾル、鼻腔内、注入ポンプ、座剤、粘膜、局所、および経口、例えば、生物学的弾道銃（「遺伝子銃」）を用いる注入により行うことができる。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または抗体は、経口投与用にタンパク質担体を伴ってもよい。免疫応答を誘発するために、投与方法の組み合わせを用いることもできる。抗体は、約０．５ｍｇから約２００ｍｇの１日投与量で投与することができる。本発明の一実施形態においては、抗体は、約２０から約１００ｍｇの１日投与量で投与される。
【０１１７】
治療用途の薬学的に受容可能な担体および希釈剤は当該技術分野において周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄ．（１９８５））に記載されている。担体はそれ自体で宿主に対して有害な抗体の産生を誘導してはならない。そのような担体としては、限定するものではないが、大きなゆっくり代謝される高分子、例えばタンパク質、多糖類、例えば、ラテックス官能化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）、アガロース、セルロース、セルロースビーズなど、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、多量体アミノ酸、例えばポリグルタミン酸、ポリリジンなど、アミノ酸コポリマー、ペプトイド、リピトイド、および不活性な無毒性のウイルス粒子または細菌細胞が挙げられる。リポソーム、ハイドロゲル、シクロデキストリン、生物分解性ナノカプセル、および生物接着性材料もまた、本発明の組成物のための担体として用いることができる。
【０１１８】
本発明の組成物においては、薬学的に受容可能な塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、または硫酸塩などの無機塩、ならびに酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、または安息香酸塩などの有機酸の塩を用いることもできる。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイド、および当業者に周知の他のタンパク質である。本発明の組成物はまた、液体または賦形剤、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、リンゲル溶液、ハンクス溶液、グルコース、グリセロール、デキストロース、マロデキストリン、エタノール等を単独でまたは組み合わせて、ならびに湿潤剤、乳化剤、浸透圧調節剤、界面活性剤、またはｐＨ緩衝剤などの物質を含んでもよい。追加の活性な薬剤、例えば殺菌剤を用いてもよい。
【０１１９】
所望の場合には、リンパ球への免疫原の提示を改善する共刺激（副刺激）分子、例えばＢ７−１またはＢ７−２、またはサイトカイン、例えばＭＩＰ１α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２を本発明の組成物に含めてもよい。必要に応じて、アジュバントを組成物に含めてもよい。アジュバントとは、特異的免疫応答を非特異的に増強させるために用いることができる物質である。一般に、アジュバントおよび本発明のポリペプチドを免疫系に提示する前に混合するか、または別々に提示するが、動物の同じ部位に提示する。アジュバントとしては、例えば、油性アジュバント（例えば、フロイント完全および不完全アジュバント）、無機塩（例えば、Ａｌｋ（ＳＯ4）2；ＡｌＮａ（ＳＯ4）2、ＡｌＮＨ4（ＳＯ4）、シリカ、ミョウバン、Ａｌ（ＯＨ）3、およびＣａ3（ＰＯ4）2）、ポリヌクレオチド（すなわち、ＰｏｌｙｉｃおよびポリＡＵ酸）、およびある種の天然物（例えば、結核菌由来のワックスＤ、ならびにコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、百日咳菌およびブルセラ属のメンバーに見いだされる物質）を挙げることができる。使用することができるアジュバントとしては、限定されないが、ＭＦ５９−０、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７）、ｎｏｒ−ＭＤＰと称される）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと称される）、およびＲＩＢＩ（細菌から抽出した３つの成分、すなわちモノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０のエマルジョン中に含む）が挙げられる。
【０１２０】
本発明の組成物は、摂取可能な錠剤、口腔内錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハ、注射可能な処方物、口腔洗浄液、歯磨剤などに製剤することができる。そのような組成物および製剤中の本発明の１つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体のパーセンテージは、単位重量の０．１％から６０％まで変化し得る。
【０１２１】
ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体の投与によって、動物において免疫応答を誘発することができ、これは少なくとも１週間、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年またはそれ以上持続する。必要に応じて、最初の注射の１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年またはそれ以上の後に、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体を１回またはそれ以上ブースター投与することにより、動物において免疫応答を維持することができる。所望の場合には、共刺激分子またはアジュバントを、組成物の前に、後に、または一緒に投与することができる。
【０１２２】
ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、またはそれらの組み合わせを含む本発明の組成物は、用いられる特定の組成物と適合した方法で、および、例えば、ＥＬＩＳＡにより検出して免疫応答を誘発するのに有効な量で投与する。ポリヌクレオチドは、哺乳動物、例えばヒヒ、チンパンジー、イヌ、またはヒトの筋肉内に、１ｎｇ／ｋｇ、１０ｎｇ／ｋｇ、１００ｎｇ／ｋｇ、１０００ｎｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．５ｍｇ／ｋｇの投与量で注入することができる。ポリペプチドまたは抗体は、哺乳動物の筋肉内に、０．０１、０．０５、０．５、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、５または１０ｍｇ／ｋｇの投与量で注入することができる。
【０１２３】
ポリペプチド、ポリヌクレオチド、もしくは抗体、またはそれらの組み合わせは、Ｅ．ｃａｎｉｓに感染していない動物に投与してもよく、Ｅ．ｃａｎｉｓに感染した動物に投与してもよい。組成物中のポリヌクレオチド、ポリペプチド、または抗体の特定の用量は、多くの要因、例えば、限定するものではないが、組成物を投与する哺乳動物の種、年齢、性別、併用薬物、一般的健康状態、およびその組成物の投与様式によって異なる。本発明の組成物の有効量は、慣用的な実験のみを用いて容易に決定することができる。
【０１２４】
患者においてＥ．ｃａｎｉｓ感染をモニタリングする方法も提供される。この方法は、本発明のポリペプチドを用いて第一の時点でＥ．ｃａｎｉｓ感染を被っているかまたはＥ．ｃａｎｉｓ感染のリスクのある患者由来の生体液のサンプル中の抗Ｅ．ｃａｎｉｓ抗体のレベルを決定する工程を包含する。抗Ｅ．ｃａｎｉｓ抗体のレベルは、１つ以上の異なる時点で患者由来の生物学的液体の１つ以上のサンプル中で決定される。抗Ｅ．ｃａｎｉｓ抗体のレベルは、Ｅ．ｃａｎｉｓ感染がモニターされるように異なる時点で決定する。抗Ｅ．ｃａｎｉｓ抗体のレベルまたは量によって、処置もしくは治療の成功の指標、または感染の進行の指標が得られる。
【０１２５】
本明細書のいずれかに言及される全ての特許、特許出願、および他の化学的または技術的な文書は、その全体が参照によって本明細書に援用される。本明細書に例示的に記載されている発明は、本明細書に具体的に開示されていないいかなる要素（単数または複数）、限定（単数または複数）なしでも適切に実施することができる。従って、例えば、本明細書における各例において、「〜を含む」、「〜本質的になる」および「〜からなる」といういずれかの用語は、そのもとの意味を維持したまま、他の２つの用語と置き換えることができる。使用されている用語および表現は、説明の用語として用いるものであり、限定ではなく、そのような用語および表現の使用においては、示されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図するものではなく、特許請求される本発明の範囲内で種々の変更が可能であることが理解される。従って、本発明を実施形態によって詳細に開示してきたが、本明細書に開示される概念の任意の特徴、改変および変化が、当業者には実現可能であること、ならびにそのような変更および変化も詳細な説明および特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【０１２６】
さらに、発明の特徴および局面がマーカッシュグループまたは他の代替グループの用語で記載されている場合、当業者は、本発明が、マーカッシュグループまたは他のグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
【実施例１】
【０１２７】
イヌへの免疫のためのホルマリン不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓの調製
Ｅ．ｃａｎｉｓは、文献中に記載される方法を用いてイヌ細胞培養中で増殖した。例えば、Ｂｒｅｉｔｓｃｈｗｅｒｄｔ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，１９９８，Ｖｏｌ  ４２：３６２〜３６８を参照のこと。光学顕微鏡を用いて、０３０細胞はＥ．ｃａｎｉｓによる感染が８０％より大きいと見積もられた。Ｅ．ｃａｎｉｓ感染した細胞培養物を２リットル収集して、遠心分離して、そのペレットを保持して、７．３１グラムの物質（湿重量）を得た。１．４６２グラム（その物質の重量の２０％）という推定の乾燥重量によって、水が物質の重量の８０％までを構成していると推定される。その細胞ペレットを、７３ｍｌの総容積についてＰＢＳ中で２０ｍｇ／ｍｌ（乾燥重量）に再懸濁した。
【０１２８】
この再懸濁した細胞ペレットに、０．０４％という最終ホルムアルデヒド濃度になるよう、０．７３ｍｌのホルマリン溶液を添加した（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＨＴ５０−１−２ホルマリン溶液１０％、中性に緩衝化）。この溶液を４℃で一晩撹拌した。この不活性化混合物を遠心して、細胞ペレットを保持した。そのペレットを２５０ｍｌのＰＢＳへの再懸濁によって洗浄した。その物質を遠心分離によって回収して、洗浄を１回繰り返した。
【０１２９】
その洗浄した細胞ペレットを７３ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁した。そのサンプルを７３スクリューキャップバイアルに分注して、−８０℃で凍結した。各々のバイアルは、動物への免疫のための適切なアジュバントと組み合わせるために適切な２０ｍｇ（乾燥重量）のホルマリン不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓ細胞培養物を含む。
【実施例２】
【０１３０】
２つの異なるアジュバントを用いるホルマリン不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓの調製、Ｅ．ｃａｎｉｓ抗原を用いるビーグル犬の免疫、およびＳＮＡＰ（登録商標）３Ｄｘ（登録商標）を用いる免疫されたビーグル犬由来の血清の試験のためのプロトコール。
水酸化アルミニウムアジュバントを用いる抗原の調製は、当業者に周知の技術である。例えば、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８，ｐｐ  ９９を参照のこと。
【０１３１】
イヌ（実験用ビーグル犬）への免疫のために、２セットの用量を、上記にように調製した水酸化アルミニウムアジュバントを用いて調製し、製造業者によって記載されるプロトコールを用いてＲｉｂｉアジュバント（Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ  ＷＡ）を用いて調製した。各々の用量は、約２０ｍｇのホルマリン不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓ細胞培養物（乾燥重量）を含んでいた。
【０１３２】
犬小屋で飼っている実験用ビーグル犬をＥ．ｃａｎｉｓホルマリン不活性化抗原での免疫のために選択した。各々２匹のイヌの２つの群；異なるアジュバントを用いる各々の群に、ホルマリン不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓ調製物（酸化アルミニウムまたはＲｉｂｉ）を投与した。０日目に４匹のイヌ全てが、ＳＮＡＰ（登録商標）３Ｄｘ（登録商標）診断、およびＥ．ｃａｎｉｓ生物体を用いるウエスタンブロット分析の両方を用いて血清陰性であることを見出した。
【０１３３】
Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．のＩＡＣＵＣ委員会は、実験用ビーグル犬の免疫のためのプロトコールを承認した。イヌに０日目、２８日目および５６日目にワクチン接種し、毎週１ｍｌを採血してＳＮＡＰ（登録商標）３Ｄｘ（登録商標）を用いてモニターした。全てのイヌに、肩甲骨背側（ｄｏｒｓｏｓｃａｐｕｌａｒ）の領域に適切な試験品を皮下投与した。４匹の全ての動物は４２日までにＳＮＡＰ（登録商標）３Ｄｘ（登録商標）Ｅ．ｃａｎｉｓの試験で、陽性に血清転換した。生成物の採血は４２日目および７０日目に採取した（約５０ｍｌの血液で約２５ｍｌの血清が得られた）。
【０１３４】
図１は、実験用ビーグル犬のＳＮＡＰ（登録商標）３Ｄｘ（登録商標）アッセイ評価を示す。ＳＮＡＰ（登録商標）デバイスは、製造業者によって記載されるとおり用いた。「プレ（ｐｒｅ）」サンプルは０日目からである。「ポスト（ｐｏｓｔ）」サンプルは４２日目からである。Ｅ．ｃａｎｉｓ陽性のスポットは、４２日のサンプルについて４匹全てのイヌで陽性になる。同様の結果が７０日のサンプルで観察された。
【０１３５】
第三のアジュバント、ＢＣＧ、（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ｏｆ  ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含んでいる第三のワクチンを用いた実験で、同様の結果が明らかになった。第三のワクチンの調製は、以下を除いて上記のＲｉｂｉアジュバントワクチンについて記載された調製と同一であった：１）ホルマリン不活性化が４℃で２４時間であった、２）１ｍｇのＢＣＧを添加した。ワクチン接種スケジュールは０日目、１４日目であって、毎週採血をＥ．ｃａｎｉｓのタンパク質との反応性についてアッセイした。
【実施例３】
【０１３６】
ＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）勾配を用いる細胞培養物からのＥ．ｃａｎｉｓの濃縮
ＤＮＡ単離およびウエスタンブロット分析のために、Ｅ．ｃａｎｉｓを、ＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）密度勾配を用いて細胞培養物から濃縮した。Ｅｈｒｌｉｃｈｉａなどの細胞培養物から細胞内病原体を単離するプロセスは、当業者に周知の技術である。例えば、Ａｋｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ  ｂｙ  ＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２６：３２１〜３２８を参照のこと。
【０１３７】
典型的なＥ．ｃａｎｉｓ濃縮は、１．５リットルの感染した細胞培養物（上記を参照のこと）で開始した。その細胞を６，０００ｘｇで遠心分離して、細胞ペレットを保持して上清を廃棄した。細胞ペレットを２０ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁して、その後に２回目の遠心分離をした。その上清を廃棄して、上清を保持した。次いでそのペレットを２０ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁して、Ｂｒａｎｓｏｎ超音波処理器を用いて２０ｋＨｚ、１．５のパワー設定で５秒間超音波処理した。次いでそのサンプルを５００ｘｇで５分間遠心分離して、大きい砕片をペレットにした。
【０１３８】
ＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）を３２％という最終濃度まで上清に添加した（４．５ｍｌのＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）と１０ｍｌのサンプル）。このサンプルを、７０．１Ｔｉの超遠心分離ローターと適合したＯａｋ  Ｒｉｄｇｅチューブ中にロードして、６３，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。不透明なバンドを、パスツールピペットを用いて収集した。不透明なバンドは、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａが高度に濃縮されている（収集したサンプルを光学顕微鏡を用いて確認した）。ＰＢＳで１：４希釈した後、サンプルをアリコートして１２，０００ｘｇで遠心分離した。その上清を廃棄して、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａのペレットを−８０℃で保管した。
【実施例４】
【０１３９】
ワクチン接種したおよび感染したイヌ由来の血清または血漿のウエスタンブロットによる試験
１次元のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析および２次元のゲル分析（１次元の等電点電気泳動、２次元のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の使用は、当業者に周知である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，１９９７，１０．２．２−１０．３．１１頁を参照のこと。これらの方法を用いて分離したタンパク質を分析するためのウエスタンブロットの使用は、当業者に周知である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，１９９７，１０．８．１−１０．８．１１６頁を参照のこと。
【０１４０】
最初の作業は、１Ｄゲルで分離したタンパク質のウエスタン分析を用いて行い（データ示さず）、続いて２Ｄゲルを用いて分離したタンパク質のウエスタン分析を用いて行った。細胞培養物から収集した丸ごとのＥ．ｃａｎｉｓ由来のタンパク質を、２Ｄゲル電気泳動を用いて分析した（物質および試薬は製造業者によって記載されるように用いた；Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ  ９４５４７）。１ゲルあたりにロードするサンプルの量は、経験的に決定した（図２を参照のこと）。そのタンパク質をニトロセルロースにブロットして、ホルマリン不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓ抗原でワクチン接種した実験用ビーグル犬由来の０日目のイヌ血清（上記を参照のこと）、またはＥ．ｃａｎｉｓに感染した動物由来の血清を用いてプローブした（図３、図４および図５を参照のこと）。
【０１４１】
陽性のイヌの血清および血漿を、Ｅ．ｃａｎｉｓに感染したイヌから単離した。Ｅ．ｃａｎｉｓ感染は、これらのイヌ由来の全血から回収したリンパ球のウエスタン分析によって確認し、ＩＤＥＸＸ  ＳＮＡＰ（登録商標）３Ｄｘ（登録商標）アッセイの使用によって、イヌの血清または血漿を用いて確認した（ＩＤＥＸＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，から市販されており、製造業者によって記載されるとおり用いる）。
【０１４２】
ウエスタンブロット分析のために、タンパク質を１ＤのＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは２Ｄの等電点電気泳動／ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて、続いてゲルからニトロセルロースへのタンパク質の電気ブロッティングによって分離した。このニトロセルロースブロットを、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．５）、０．０５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０に溶解した２．５％の脱脂粉乳のブロッキング溶液中でインキュベートした。イヌの血清または血漿を、３０％正常仔牛血清で非特異的な結合をブロックするためにＥ．ｃｏｌｉ溶解液を含んでいる緩衝液中に記載されるような力価に希釈して、室温で２時間または４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳ−ＴＷＥＥＮ（登録商標）（０．０５％）中で３回洗浄した後、そのブロットを５０％のウシ胎仔血清、５０％ＴＢＳ−ＴＷＥＥＮ（登録商標）−Ｋａｔｈｏｎ（それぞれ、０．０５％および０．５％）を含んでいる緩衝液に移して、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートされたウサギ抗イヌＦｃポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ  １９３９０）の非特異的な結合を妨げた。ウサギ抗イヌＦｃポリクローナル抗体コンジュゲートを１：５，０００に希釈した。そのゲルをＴＢＳ  ＴＷＥＥＮ（登録商標）（０．０５％）を用いて３回洗浄し、ＴＢＳを用いて１回洗浄して、ここでＨＲＰの存在は、ＥＣＬウエスタンブロット検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ  ０８８５５−１３２７）を、製造業者によって記載されるとおりに用いて検出した。露光されたＸ線フィルムのデジタル画像は、ＧｅｌＤｏｃ  ２０００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．）を用いて撮った。
【実施例５】
【０１４３】
Ｅ．ｃａｎｉｓ由来のＤＮＡの単離、およびλ発現ライブラリーの構築、およびＤＩＶＡ活性を有しているクローンのためのＥ．ｃａｎｉｓλ発現ライブラリーのスクリーニング
λ発現ライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者に周知の技術である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，１９９７，第５．１頁〜５．８．６頁を参照のこと。発現ライブラリーの構築のために、ゲノムＤＮＡを、ＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）勾配遠心分離（上記を参照のこと）によって細胞培地から単離されたＥ．ｃａｎｉｓから精製した。ＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）から市販されているゲノムＤＮＡ精製キットを用いて精製した。λＺＡＰ（登録商標）ＩＩプレ消化ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰベクターキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ  ９２０３７）をライブラリーの構築について製造業者によって特定されたとおり用いた。Ｅ．ｃａｎｉｓのゲノムＤＮＡをＴＳＰ５０９で部分的に消化して、２〜６ｋｂにおよぶフラグメントを、アガロースゲル電気泳動を用いて単離し、λベクター中に連結した。ファージは、製造業者によって特定されたとおりパッケージして増殖させた。
【０１４４】
約１２０，０００個の個々のλプラークを、Ｅ．ｃａｎｉｓの感染に陽性であるが、ホルマリン不活性化したＥ．ｃａｎｉｓでワクチン接種された動物由来の血清との反応性については陰性と同定されたイヌから単離された血清に対する結合についてスクリーニングした（上記を参照のこと）。最初のスクリーニングから８４個の個々のプラークをこの活性を有しているものとして同定した。
【０１４５】
λプラークを２回のプラーク精製に供して、再試験して、Ｅ．ｃａｎｉｓ感染動物由来の血清との陽性の反応性、ワクチン接種した動物由来の血清とスクリーニングした場合の陰性の反応性を確認した。
【０１４６】
単離されたλプラークを、アナプラズマ・ファゴサイトフィラ（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｉａ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（ライム病の原因因子）、リケッチア・リケッチ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）（ロッキー山紅斑熱の原因因子）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）およびイヌ糸状虫（フィラリアの原因因子）について血清陽性であると特定された動物由来の血清との交差反応性についてスクリーニングした。
【０１４７】
スクリーニングプロセスの終わりに、ワクチン接種したイヌ由来の血清とも、他のイヌ病原体で感染したイヌ由来の血清とも反応しない、Ｅ．ｃａｎｉｓに感染した動物由来の血清と反応する４３個のλプラークを見出した（上記を参照のこと）。
【０１４８】
製造業者の指示に従ってクローニングベクターのＺＡＰ（登録商標）を用いて、λベクターへの挿入物をプラスミドに変換した。このプラスミドは、タンパク質発現およびウエスタンブロットによるコードされたタンパク質の分析のためにＥ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１ブルーに形質転換した。Ｅ．ｃａｎｉｓ  ＤＮＡ挿入物の末端を、Ｔ７およびＴ３配列決定プライマーを用いてＤＮＡ配列分析に供した。
【０１４９】
全ての４３個のクローンについてＴ７およびＴ３反応の両方からの配列情報は、ＢＬＡＳＴ分析のため、ＮＣＢＩウェブサイトに提示した。結果をエクセルのフォーマットで表にした。クローンとＥ．ｃａｎｉｓについて利用可能なショットガンゲノム配列（ＮＣＢＩ：ＮＺ＿ＡＡＥＪ０１０００００１）との間の配列同一性に基づいて、各々のクローンのゲノムＤＮＡのセグメントを同定した。共通の遺伝子を共有する個々のクローンを、感染したイヌおよびワクチン接種したイヌの血清のプールを用いるウエスタンブロットによってさらなる分析のために分類した。類似のバンド形成パターンに基づいて、重複したクローンを除去した。両方のセットの血清に対して反応性を示すいずれのクローンも除去した。この分析の結果として、２３個のクローンをさらなる評価のために選択した。グループごとのクローンおよび共通抗原の分類を表２に示す。
【０１５０】
【表２】
0005759724.tif 000003
【実施例６】
【０１５１】
個々のＥ．ｃａｎｉｓ陽性のイヌ血清サンプルを用いたウエスタンブロット分析
２３個の全てのクローンを個々のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。各々のゲルをニトロセルロースに移して、ＥＬＩＳＡ／ＳＮＡＰ（登録商標）試験によってＥ．ｃａｎｉｓ感染についてのみ陽性であったイヌ由来のイヌ血清の個々のサンプルを用いてウエスタンブロットに供した。イヌ血清は、Ｅ．ｃｏｌｉの溶解液を含有している実施例４に記載の同じ希釈液で１：５００に希釈して、標準的な比色定量ホースラディッシュペルオキシダーゼ技術（Ｏｐｔｉ−４ＣＮ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて反応性を検出した。全部で１３個の個々のイヌ血清サンプルを評価した。ブロットはサンプルにまたがって比較して、優勢なバンドまたは１クローンあたりのバンドのセットに対する反応性を示しているイヌの番号を決定した。その結果を表３および図６にまとめる（太字で挙げたクローンを図に示す）。
【０１５２】
【表３】
0005759724.tif 000004
【０１５３】
全ての２３個のクローンを、他のベクター保有の感染性疾患について陽性と試験されたプールされたイヌ血清を用いてウエスタンブロットによって分析した。以下の単一の感染についてＥＬＩＳＡまたはＳＮＡＰ（登録商標）によって陽性と試験されたサンプルを評価した：イヌ糸状虫、ライム（Ｌｙｍｅ）、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム，またはエーリキア・エウィンギ（Ｅ．ｅｗｉｎｇｉｉ）。上記の表で特定されたクローンのうち、これらの他のベクター保有感染について陽性のイヌ血清と交差反応性を示したものはない。
【実施例７】
【０１５４】
Ｅ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡ抗原をコードする関連の遺伝子セグメントの特定
ａ．１２０ｋＤａの抗原
この抗原は以前に、Ｙｕらによって記載されており（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０００  Ｊａｎ；３８（１）：３６９〜７４；また、ＭｃＢｒｉｄｅら、２０００  Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．６８：１３）、イヌでのＥ．ｃａｎｉｓ感染の診断に有用であることが示されている。この抗原は、「ｐ１２０」および「ｐ１４０」の両方のＥ．ｃａｎｉｓ抗原として記載されている。同書を参照のこと。Ｙｕらは、ｐ１２０遺伝子によって発現される組み換えタンパク質がドデシル硫酸ナトリウムゲルで、予想されるタンパク質の分子量よりも大きい１４０ｋＤａの分子サイズを有することを説明している。Ｙｕらの第３７３頁を参照のこと。Ｗａｌｋｅｒのグループ（Ｙｕら、およびＭｃＢｒｉｄｅら）は、タンパク質をＥ．ｃａｎｉｓ  ｐ１２０およびｐ１４０の両方と言っている。従って、この開示は、ｐ１２０およびｐ１４０の両方を交換可能に用いてこのタンパク質を記載する。Ｅ．ｃａｎｉｓのｐ１２０／１４０遺伝子についてのアクセッション番号は、ＡＦ１１２３６９であり、かつ関連のタンパク質はＡＡＤ３４３３０である。また、アクセッション番号ＹＰ３０２６６６も参照のこと。クローン２、１０、１７および３３は１２０ｋＤａの抗原遺伝子の全長セグメントを含む。クローン３５は、この遺伝子の短縮（ｔｒａｎｃａｔｉｏｎ）を含む場合がある（配列番号１および２を参照のこと）。
【０１５５】
この遺伝子を、Ｅ．ｃａｎｉｓのゲノムＤＮＡから増幅して、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従って６−Ｈｉｓタグを用いてｐＥＴ発現系にサブクローニングした。このプラスミドの配列決定の結果は、配列番号２、アミノ酸５８〜５８９に示されるタンパク質をコードする遺伝子配列に正確にマッチした。このタンパク質を発現するように誘導されたＢＬ２１細菌由来のタンパク質溶解液を、感染したイヌ血清を用いるウエスタンブロットによって分析して、ホルマリン不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓ細胞でワクチン接種された動物由来の血清でプローブしたウエスタンブロットと比較した。以前の知見と一致して、感染したイヌ由来の血清のみが、予想される分子量のこのタンパク質を認識した（データ示さず）。
【０１５６】
Ｐ１２０は、１４回繰り返される３６アミノ酸のモチーフを有する。配列番号１５を参照のこと。この反復される部分（配列番号１５の下線の領域は６０ｋＤａのペプチドである）。配列番号１６は、アラインメントされた１４リピートを示す。配列番号１７は、１４リピートのコンセンサス配列を示す。
【０１５７】
本発明の一実施形態は、以下を含むポリペプチドを提供する：
ＫＥＥＸ1ＴＰＥＶＸ2ＡＥＤＬＱＰＡＶＤＸ3ＳＸ4ＥＨＳＳＳＥＶＧＸ5ＫＶＳＸ6ＴＳ（配列番号１７）。
ここでＸ1＝ＳまたはＮ
Ｘ2＝ＫまたはＲ
Ｘ3＝Ｇ、Ｄ、またはＳ
Ｘ4＝ＶまたはＩ
Ｘ5＝ＥまたはＫ
Ｘ6＝ＥまたはＫである。
本発明の別の実施形態は、配列番号１７が２回以上繰り返される多量体ポリペプチドを提供する。この多量体ポリペプチドはまた、１つ以上の異種ポリペプチドを含んでもよい。
【０１５８】
別の実施形態では、本発明は、配列番号２１のポリペプチドであるＸＰＥＶＫＡＥＤＬＱＰＡＶＤＧＳＶＥＨＸを提供し、ここで各々のＸは＝０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸である。
【０１５９】
ｂ．２００ｋＤａの抗原
この抗原は以前にＭｃＢｒｉｄｅら（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００１  Ｊａｎ；３９（１）：３１５〜２２）によって記載されており、エーリキア症の診断に有用であることが示された。この遺伝子のアクセッション番号はＡＦ２５２２９８であり、関連のタンパク質はＡＡＫ０１１４５である。このタンパク質配列の一部は、公開された特許と関連している（米国特許第６，３５５，７７７号の配列番号２、アクセッション番号ＡＡＥ９６２５４）。本発明者らは、エーリキア症の診断抗原およびＤＩＶＡ試薬として機能するこのタンパク質の異なる領域を同定した。この遺伝子のこの部分は、ＡＦ２５２２９８のヌクレオチド１０８１から終わりのヌクレオチド４２６６にまたがる（配列番号３および４を参照のこと）。
【０１６０】
この遺伝子を、Ｅ．ｃａｎｉｓのゲノムＤＮＡから増幅して、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従って６−Ｈｉｓタグを用いてｐＥＴ発現系にサブクローニングした。このプラスミドの配列決定の結果は、配列番号４のアミノ酸１〜１０６１に示されるタンパク質をコードする遺伝子配列に正確にマッチした。このタンパク質を発現するように誘導されたＢＬ２１細菌由来のタンパク質溶解液を、感染したイヌ血清を用いるウエスタンブロットによって分析して、ホルマリン不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓでワクチン接種された動物由来の血清でプローブしたウエスタンブロットと比較した。以前の知見と一致して、感染したイヌ由来の血清のみが、予想される分子量のこのタンパク質を認識した（データ示さず）。
【０１６１】
ｃ．ＡＴＰアーゼ
この遺伝子（Ｌｏｃｕｓタグ「Ｅｃａｎ０２０００６９９」）は、Ｅ．ｃａｎｉｓのショットガンゲノム配列の自動化コンピューター分析によって予測された。これは、４０００個を超えるアミノ酸のタンパク質をコードする（ＺＰ＿００２１０５７５）。このＥ．ｃａｎｉｓのＤＩＶＡスクリーニングによって、この遺伝子の２つの別の領域およびその関連するタンパク質を、潜在的な免疫優性抗原およびＤＩＶＡ試薬として同定した。クローン８４および７において同定されるタンパク質のセグメントは、アクセッション番号４６３０８３８２のそれぞれアミノ酸１９８４〜２７７４および２９８０〜３７４０である（配列番号５、６、７、８を参照のこと）。
【０１６２】
この遺伝子の両方のフラグメントをＥ．ｃａｎｉｓのゲノムＤＮＡから増幅して、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従って６−ＨｉｓタグとともにｐＥＴ発現系に別々にサブクローニングした。このプラスミドの配列決定の結果は、配列番号６および配列番号８のそれぞれアミノ酸１〜７８２および１〜７４６に示されるタンパク質に関連する遺伝子配列に正確にマッチした。これらのタンパク質を発現するように誘導されたＢＬ２１細菌由来のタンパク質溶解液を、感染したイヌ血清を用いるウエスタンブロットによって分析して、ホルマリン不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓでワクチン接種された動物由来の血清でプローブしたウエスタンブロットと比較した。以前の知見と一致して、感染したイヌ由来の血清のみが、予想される分子量のこれらのタンパク質を認識した（データ示さず）。
【０１６３】
ｄ．熱ショックタンパク質
このクローンは熱ショックタンパク質の遺伝子ＧｒｐＥを含むが、免疫優性抗原をコードする遺伝子配列は、このゲノムの自動的なコンピューター分析によって予測される仮定的なタンパク質配列から生じる。タンパク質の分子量およびｐＩに基づいて、クローン９中の目的の遺伝子は、遺伝子座番号「Ｅｃａｎ０２０００４９５」であって、その関連するタンパク質は４６３０８９５４である。
【０１６４】
このタンパク質は、ゲノムのコンピューターアノテーションから予測されるだけで、Ｅ．ｃａｎｉｓ生物体から免疫優性タンパク質として以前に同定された訳ではないので、これは、この遺伝子がＥ．ｃａｎｉｓで発現されて、感染したイヌ宿主の免疫応答を刺激するという最初の証拠である。このタンパク質は、ｐ１６抗原として同定される（配列番号９および１０を参照のこと）。
【０１６５】
この遺伝子を、目的のゲノムＤＮＡを含んでいるｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクターから増幅して、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従って６−Ｈｉｓタグを用いてｐＥＴ発現系にサブクローニングした。このプラスミドの配列決定の結果は、遺伝子座番号「Ｅｃａｎ０２０００４９５」に関連する遺伝子配列に正確にマッチした。このタンパク質を発現するように誘導されたＢＬ２１細菌由来のタンパク質溶解液を、感染したイヌ血清を用いるウエスタンブロットによって分析して、ホルマリン不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓでワクチン接種された動物由来の血清でプローブしたウエスタンブロットと比較した。以前の知見と一致して、感染したイヌ由来の血清のみが、予想される分子量のこのタンパク質を認識した（図７を参照のこと）。
【０１６６】
ｅ．リボソームタンパク質Ｌ１
この遺伝子は、Ｅ．ｃａｎｉｓのゲノムから遺伝子座タグ「Ｅｃａｎ０２０００４７６」によって同定される。この関連のタンパク質は、アクセッション番号ＺＰ＿００２１１１３０を有する（配列番号１１および１２を参照のこと）。このタンパク質の同定は、このゲノムの自動化コンピューター分析に基づいて推測される。このタンパク質のＢＬＡＳＴ分析は、この配列が、Ｅ．ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓの表面タンパク質（アクセッション番号４８９４５７６）と約７０％同一であることを明らかにする。Ｅ．ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓタンパク質の免疫応答性は、Ｙｕらによって以前に報告されている（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９  Ａｕｇ；３７（８）：２５６８〜７５）。Ｅ．ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓのタンパク質（アクセッション番号４８９４５７６）は１０６ｋＤａのタンパク質前駆体と呼ばれる。
【０１６７】
ｆ．可能な非１２０ｋＤａの抗原
１２０ｋＤａの抗原の遺伝子を含んでいるゲノムフラグメント内に、免疫優性であってかつＤＩＶＡ試薬でもあり得る他の遺伝子が存在する。例えば、クローン１０は、１２０ｋＤａの抗原のみを含んでいるクローンに比較して、感染された血清でプローブされたウエスタンブロット上に異なるバンドパターンを生じる。クローン１０は、ＩＶ型分泌経路のＶｉｒＤ４成分の遺伝子情報を含み、この遺伝子配列は、遺伝子座タグ「Ｅｃａｎ０２０００６２４」で同定される。この遺伝子は、７２３個のアミノ酸のタンパク質（ＺＰ＿００２１１２４４）をコードするが、ゲル上で同定したタンパク質の分子量によって判定すると合、このタンパク質の一部のみがクローン１０によって発現されるものと考えられる（配列番号１３および１４を参照のこと）。
【実施例８】
【０１６８】
Ｅ．ｃａｎｉｓのＰ１４０ペプチドの評価
ホルマリン不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓ（ワクチンサンプル）で免疫したビーグル犬由来の血清を、Ｅ．ｃａｎｉｓのｐ１４０タンパク質（ｐ１２０としても公知、実施例７を参照のこと）由来の合成ペプチドを用いて調製したマイクロタイタープレートに基づくイムノアッセイを用いて試験した。
【０１６９】
ホルマリン不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓの調製およびビーグル犬の免疫を、実施例１および２に記載した。免疫したビーグル犬由来のサンプルは、間接的および直接的なアッセイ方式で合成ペプチド（配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０）を用いて調製したマイクロタイタープレートに基づくイムノアッセイを用いて試験した。
【０１７０】
間接的なアッセイ形式
サンプルを、合成ペプチド（配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０）を用いて調製したマイクロタイタープレートに基づくイムノアッセイを用いて試験した。個々のペプチドを直接吸着によってマイクロタイターウェル上に固定した。試験サンプルの希釈（１：１００）をこのマイクロタイターウェルに添加して、洗浄することによって未結合の抗体を取り除いた。固定されたペプチドに結合した抗体を、抗−種、この場合イヌ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）コンジュゲート（１：２０００希釈）との反応、洗浄およびＨＲＰＯ基質の添加によって検出した。個々のマイクロタイターウェルの吸光度（Ａ６５０）を、マイクロタイター・プレート・リーダーを用いて測定した。
【０１７１】
直接的なアッセイ形式
個々のペプチド（配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０）をウシ血清アルブミンにコンジュゲートして、直接吸着によってマイクロタイターウェル上に固定した。合成ペプチド（配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０）を、指示薬であるホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）にコンジュゲートした。試験サンプルおよびイムノアッセイ・ペプチド／指標を、対応するペプチドでコーティングされたマイクロタイターウェルに加えて、これをインキュベートして洗浄した。固定されたペプチドに結合した抗体およびペプチド／指示薬を、ＨＲＰＯ基質試薬の添加によって検出した。個々のマイクロタイターウェルの吸光度（Ａ６５０）を、マイクロタイター・プレート・リーダーを用いて測定した。
【０１７２】
アッセイの結果を表４に示す。陽性コントロール（ＰＣ，ＩＤ  １０４９：１６Ｅ）および陰性コントロール（ＮＣ，３８１８：５７Ｂ）は、それぞれ公知のＥ．ｃａｎｉｓ陽性および陰性の血清サンプルであった。全てのサンプルを、Ｅ．ｃａｎｉｓ抗体について市販のＳＮＡＰ（登録商標）４Ｄｘ（登録商標）試験を用いて試験した。異なるアジュバントを用いて処方したホルマリン不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓ抗原を投与された６匹のイヌ（ＣＶＹＤＥＨ、ＣＷＭＢＤＣ、ＣＶＸＣＳＭ、ＣＷＭＡＸＫ、ＣＶＳＣＶＡおよびＣＶＸＣＡＰ）由来の連続的な時間的なサンプルの結果を、免疫後０日〜４２日の間示す。ＳＮＡＰ（登録商標）４Ｄｘ（登録商標）試験の結果、ワクチン接種した動物では抗体応答が誘導されたことが実証される。ワクチン接種した動物由来の血清サンプルのうち、直接アッセイ方式で反応性のものはなかった。いくつかのサンプル（例えば、ＣＷＭＡＸＫのイヌ由来のサンプル）は、間接的なアッセイ形式ではバックグラウンド反応が高かった。
【０１７３】
この結果、ホルマリン不活性化ワクチンを用いた免疫の結果として誘導された抗体は、Ｅ．ｃａｎｉｓのｐ１４０タンパク質由来の合成ペプチドに対して有意に反応性ではなかったことが示される（配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０）。
【０１７４】
【表４】
0005759724.tif 000005
【実施例９】
【０１７５】
Ｅ．ｃａｎｉｓ陽性および陰性であることが知られたイヌ由来の血清を、Ｅ．ｃａｎｉｓのタンパク質ｐ１４０タンパク質（ｐ１２０としても公知、実施例７を参照のこと）から得た合成ペプチドを用いて調製したマイクロタイタープレートに基づくイムノアッセイを用いて試験した。
【０１７６】
Ｅ．ｃａｎｉｓ陽性および陰性の野外サンプルを入手して、Ｅ．ｃａｎｉｓに対する抗体についてＳＮＡＰ（登録商標）４Ｄｘ（登録商標）試験を用いて試験した。次いで、サンプルを、Ｅ．ｃａｎｉｓのｐ１４０タンパク質に由来する合成ペプチド（配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０）を用いて作成した間接的および直接的なマイクロタイタープレート形式のアッセイを用いて試験した。
【０１７７】
間接的なアッセイ形式
サンプルは、合成ペプチド（配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０）を用いて調製したマイクロタイタープレートに基づくイムノアッセイを用いて試験した。個々のペプチドを直接吸着によってマイクロタイターウェル上に固定した。試験サンプルの希釈（１：１００）を、マイクロタイターウェルに添加して、未結合の抗体を洗浄によって除去した。固定されたペプチドに結合された抗体を、抗−種、この場合イヌ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）コンジュゲート（１：２０００希釈）との反応、洗浄およびＨＲＰＯ基質の添加によって検出した。個々のマイクロタイターウェルの吸光度（Ａ６５０）を、マイクロタイター・プレート・リーダーを用いて測定した。
【０１７８】
直接的なアッセイ形式
個々のペプチド（配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０）をウシ血清アルブミンにコンジュゲートして、直接吸着によってマイクロタイターウェル上に固定した。合成ペプチド（配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０）を、指示薬であるホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）にコンジュゲートした。試験サンプルおよびイムノアッセイ・ペプチド／指標を、対応するペプチドでコーティングされたマイクロタイターウェルに加えて、これをインキュベートして洗浄した。固定されたペプチドに結合した抗体およびペプチド／指示薬を、ＨＲＰＯ基質試薬の添加によって検出した。個々のマイクロタイターウェルの吸光度（Ａ６５０）を、マイクロタイター・プレート・リーダーを用いて測定した。
【０１７９】
表４は、間接的アッセイ形式を用いて試験したＥ．ｃａｎｉｓ陽性および陰性の野外サンプルについての結果を示す。陽性コントロール（ＰＣ，ＩＤ  １０４９：１６Ｅ）および陰性コントロール（ＮＣ，３８１８：５７Ｂ）は、それぞれＥ．ｃａｎｉｓ陽性および陰性が既知の血清サンプルであった。サンプルは、ＳＮＡＰ（登録商標）４Ｄｘ（登録商標）試験を用いてＥ．ｃａｎｉｓの抗体陽性または陰性であることを判定した。アッセイの結果は、ペプチド試薬（配列番号１８，配列番号１９および配列番号２０）を用いて作製したマイクロタイタープレート形式のアッセイについて示す。
【０１８０】
表５は、直接的なアッセイ形式を用いて試験したＥ．ｃａｎｉｓ陽性および陰性の野外サンプルについての結果を示す。陽性コントロール（ＰＣ，ＩＤ  １０４９：１６Ｅ）および陰性コントロール（ＮＣ，３８１８：５７Ｂ）はそれぞれ、Ｅ．ｃａｎｉｓ陽性および陰性であることが既知の血清サンプルであった。サンプルは、ＳＮＡＰ（登録商標）４Ｄｘ（登録商標）試験を用いてＥ．ｃａｎｉｓ抗体陽性または陰性であることを判定した。アッセイ結果は、ペプチド試薬（配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０）を用いて行ったマイクロタイタープレート形式のアッセイについて示す。
【０１８１】
【表５】
0005759724.tif 000006
【０１８２】
【表６】
0005759724.tif 000007
【０１８３】
この結果、自然感染の結果として誘導された抗体は、Ｅ．ｃａｎｉｓのｐ１４０タンパク質（配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０）由来の合成ペプチドと反応性であったことが示される。
【実施例１０】
【０１８４】
Ｅ．ｃａｎｉｓのタンパク質であるｐ１６タンパク質から得た合成ペプチド（配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４）を用いて調製したマイクロタイタープレートに基づくイムノアッセイを用いるＥ．ｃａｎｉｓ陽性および陰性が既知のイヌ由来の血清の試験。指標として抗イヌＨＲＰＯコンジュゲートを利用する間接的アッセイ形式を用いてアッセイを行った。
６匹のＥ．ｃａｎｉｓ−抗体陽性および３匹のＥ．ｃａｎｉｓ−抗体陰性のイヌ由来の血清をＳｉｎｃｌａｉｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＯ）から入手した。血清サンプルは、Ｅ．ｃａｎｉｓ抗体について、ライセンスを受けた可逆性のフロー・クロマトグラフィック結合アッセイＩＤＥＸＸ  ＳＮＡＰ（登録商標）４Ｄｘ（登録商標）試験を用いて試験することによって、陽性または陰性であることを見出した。可逆性のフロー・クロマトグラフィックＳＮＡＰ（登録商標）アッセイの結果を表７に示す。
【０１８５】
サンプルは、Ｅ．ｃａｎｉｓのｐ１６表面タンパク質由来の合成ペプチド（配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４）を用いて調製したマイクロタイタープレートに基づくイムノアッセイを用いて試験した。合成ペプチドを、Ｉｍｍｕｌｏｎマイクロタイターウェル中に０．２５μｇ／ｍｌで固定した（配列番号２２および２３、または０．５μｇ／ｍｌ（配列番号２４））。試験サンプルの希釈物（１：１００）をこのマイクロタイターウェルに添加して、洗浄することによって未結合の抗体を取り除いた。固定されたペプチドに結合した抗体を、抗−種、この場合イヌ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）コンジュゲート（１：２０００希釈）との反応、洗浄およびＨＲＰＯ基質の添加によって検出した。個々のマイクロタイターウェル中の６５０ｎｍでの流体の吸光度（Ａ６５０）を、マイクロタイター・プレート・リーダーを用いて測定した。
【０１８６】
結果：
陽性および陰性のサンプルについての結果を表７に示す。陽性のサンプルＨＰ−３１９、ＨＰ−３２２、ＨＰ−３２６、ＨＰ−３４２、ＨＰ−３５４、ＨＰ−３５８は、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４に示されるペプチド配列と反応性であった。陰性のサンプルＨＰ−３０２、ＨＰ−３０３およびＨＰ−３０６は、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４に示されるペプチド配列に対して反応性ではなかった。
【０１８７】
結論：
この結果、自然感染の結果として誘導された抗体は、上記の間接的なアッセイ形式でＥ．ｃａｎｉｓのｐ１６タンパク質（配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４）由来の合成ペプチドと反応性であったことが示される。
【０１８８】
【表７】
0005759724.tif 000008
【実施例１１】
【０１８９】
Ｅ．ｃａｎｉｓのｐ１６タンパク質配列由来の合成ペプチド（配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４）を用いて調製したマイクロタイタープレートに基づくイムノアッセイを用いるＥ．ｃａｎｉｓ陽性および陰性が既知のイヌ由来の血清の試験。アッセイは、指標としてＨＲＰＯ標識したペプチドを利用して直接的なアッセイ形式を用いて行った。
７匹のＥ．ｃａｎｉｓ−抗体陽性および３匹のＥ．ｃａｎｉｓ−抗体陰性のイヌ由来の血清を野外のイヌから得た。血清サンプルは、Ｅ．ｃａｎｉｓ抗体について、ライセンスを受けた可逆性のフロー・クロマトグラフィックＩＤＥＸＸ  ＳＮＡＰ（登録商標）３Ｄｘ（登録商標）試験を用いて試験することによって、陽性または陰性であることを見出した。アッセイの結果を表８に示す。
【０１９０】
サンプルは、Ｅ．ｃａｎｉｓのｐ１６表面タンパク質由来の合成ペプチド（配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４）を用いて調製した、マイクロタイタープレートに基づくイムノアッセイを用いて試験した。合成ペプチドは、マイクロタイターウェル上に１μｇ／ｍｌで固定した。別々の量の合成ペプチドを、指示薬ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）にコンジュゲートした。その試験サンプルおよびペプチド：ＨＲＰＯコンジュゲート（１μｇ／ｍｌ）を、ペプチドでコーティングしたマイクロタイターウェルに加えて、これをインキュベートして洗浄した。固定されたペプチドおよびペプチド：：ＨＲＰＯコンジュゲートに結合したサンプル抗体をマイクロタイターウェル中に固定した。この複合体をＨＲＰＯ基質試薬の添加によって検出した。個々のマイクロタイターウェルの吸光度を、マイクロタイター・プレート・リーダーを用いて測定した。
【０１９１】
結果：
陽性および陰性のサンプルについての結果を表８に示す。陽性のサンプル８１３：９１Ｉ、１０４９：１６Ａ、１０４９：１６Ｕ、１０６１：０３Ｉ、１１７７：２１Ｇ、１１７７：２１Ｋおよび１１７７：６３Ｏは、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４に示されるペプチド配列と反応性であった。陰性のサンプル３８１８：５７Ａ、３８１８：５７Ｃおよび３８１８：５７Ｄは、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４に示されるペプチド配列に対して反応性ではなかった。
【０１９２】
結論：
この結果、自然感染の結果として誘導された抗体は、上記の直接アッセイ形式で、Ｅ．ｃａｎｉｓのｐ１６タンパク質（配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４）由来の合成ペプチドと反応性であったことが示される。
【０１９３】
【表８】
0005759724.tif 000009
【実施例１２】
【０１９４】
合成ペプチド（配列番号２３）でコーティングしたマイクロタイタープレートと抗イヌコンジュゲートを指標として用いるＥ．ｃａｎｉｓに実験的に感染させた６匹のイヌ由来の血清のアッセイ結果
６匹のナイーブなイヌを、Ｅ．ｃａｎｉｓのルイジアナ分離株を用いて実験的に感染させた。血清サンプルは、感染後３、７、１０、１３、１７、２１、２４、２８および３５日で入手した。サンプルは、Ｅ．ｃａｎｉｓ  ｐ１６表面タンパク質由来のｐ１６−２合成ペプチド（配列番号２３）を用いて調製したマイクロタイタープレートに基づくイムノアッセイを用いて試験した。合成ペプチドは、マイクロタイターウェル中に固定し、試験サンプルの希釈物（１：１００）をこのマイクロタイターウェルに添加して、洗浄することによって未結合の抗体を取り除いた。固定されたペプチドに結合した抗体を、抗−イヌ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）コンジュゲート（１：２０００希釈）との反応、洗浄およびＨＲＰＯ基質の添加によって検出した。個々のマイクロタイターウェル中の吸光度を、マイクロタイター・プレート・リーダーを用いて測定した。
【０１９５】
結果：
アッセイの結果を表９に示す。６匹のイヌ全ては、市販の可逆性フロー・クロマトグラフィックＳＮＡＰ（登録商標）４Ｄｘ（登録商標）アッセイによって測定した場合、実験的感染後に、陰性の状態から陽性の状態に変化した。全てのイヌ由来の血清が、感染後種々の時点で配列番号２３に示されるＥ．ｃａｎｉｓのｐ１６ペプチドと反応した。実験的感染と配列番号２３のペプチドに対する最初の反応との間の時間は以下のとおりであった：Ｄｏｇ  １０８５３２、感染後１７日；Ｄｏｇ  １１５８５３，感染後１３日；Ｄｏｇ  ２６５００６、感染後１７日；Ｄｏｇ  ２６８８３０、感染後１３日；Ｄｏｇ  ２８５３０７、感染後１３日、およびＤｏｇ  ５３３５７３、感染後１３日。
【０１９６】
結論：
この結果、実験的な感染の結果として誘導された抗体は、Ｅ．ｃａｎｉｓのｐ１６タンパク質（配列番号２３）由来の合成ペプチドと反応性であったことが示される。
【０１９７】
【表９】
0005759724.tif 000010
【表１０】
0005759724.tif 000011
【実施例１３】
【０１９８】
イヌへの免疫のためのホルマリン不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓの調製
Ｅ．ｃａｎｉｓは文献に記載されている方法を用いてイヌ細胞培養物中で増殖させた。Ｂｒｅｉｔｓｃｈｗｅｒｄｔ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，１９９８，Ｖｏｌ  ４２：３６２〜３６８を参照のこと。光学顕微鏡を用いて、０３０細胞は、Ｅ．ｃａｎｉｓに８０％より多くが感染していると見積もられた。２リットルのＥ．ｃａｎｉｓに感染した細胞培養物を収集し、遠心分離して、保持されたペレットで７．３１グラムの物質（湿重量）を得た。１．４６２グラム（その物質の重量のうち２０％）という推定の乾燥重量とすれば、水がその物質の重量のうち８０％を構成すると推定される。その細胞ペレットを総容積７３ｍｌとしてＰＢＳ中に２０ｍｇ／ｍｌ（乾燥重量）まで再懸濁した。
【０１９９】
この再懸濁された細胞ペレットに、０．０４％という最終ホルムアルデヒド濃度になるよう、０．７３ｍｌのホルマリン溶液を添加した（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＨＴ５０−１−２ホルマリン溶液１０％、中性緩衝化）。その溶液を４℃で１２〜２４時間攪拌した。その不活性化された混合物を遠心分離して、細胞ペレットを保持した。そのペレットを２５０ｍｌのＰＢＳ中へ再懸濁することによって洗浄した。その物質を遠心分離によって収集し、その洗浄を１回繰り返した。
【０２００】
そのサンプルを７３個のスクリューキャップバイアルに分注して、−８０℃で凍結した。各々のバイアルは、動物への免疫のための適切なアジュバントとの組み合わせに適切な、２０ミリグラム（乾燥重量）のホルマリン不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓ細胞培養物を含む。
【実施例１４】
【０２０１】
２つの異なるアジュバントを用いるホルマリン不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓの調製、およびＥ．ｃａｎｉｓ抗原を用いるビーグル犬の免疫のためのプロトコール
犬小屋で飼育しているイヌ（実験用ビーグル犬）への免疫のため、ホルマリン不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓ抗原を、３つの異なるアジュバントを用いて処方した。ホルマリン不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓ抗原を、製造業者に記載されるプロトコールを用いてＲｉｂｉアジュバント（Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ  ＷＡ）で調製した。各々の用量は、約２０ｍｇのホルマリン不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓ細胞培養物（乾燥重量）を含んだ。免疫原の追加の調製物を、Ｒｉｂｉアジュバント（上記）およびアジュバントＢＣＧ（１用量あたり１ｍｇ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ｏｆ  ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の組み合わせを用いて調製した。各々３匹のイヌからなる２つの群を、Ｒｉｂｉアジュバント単独、またはＲｉｂｉアジュバントとＢＣＧアジュバントとを組み合わせて含んでいる不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓのいずれかを用いて１７０日にわたって４回（０日、１４日、１５６日、１７０日）投与した。ワクチン誘導性の高度免疫状態を生成する目的で、全てのイヌは、アジュバント  ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）（ＣｙｔＲｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）を用いるか、またはアジュバント  ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）とアジュバントＢＣＧとを組み合わせて製造業者の指示を用いて処方したホルマリン不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓの単回用量を投与された（２４７日）。イヌには、以下のスケジュールに従ってワクチンを投与した：
【０２０２】
【表１１】
0005759724.tif 000012
【０２０３】
Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．のＩＡＣＵＣ委員会が実験用ビーグル犬の免疫についてのプロトコールを承認した。全てのイヌに、肩甲骨背側（ｄｏｒｓｏｓｃａｐｕｌａｒ）の領域に適切な試験品を皮下投与した。０日に６匹の全てのイヌは、可逆性フロー・クロマトグラフィックＳＮＡＰ（登録商標）３Ｄｘ（登録商標）診断、およびＥ．ｃａｎｉｓ生物体を用いるウエスタンブロット分析の両方を用いて血清陰性であることが見出された。６匹の動物の全てが４２日までに可逆性フロー・クロマトグラフィックＳＮＡＰ（登録商標）３Ｄｘ（登録商標）Ｅ．ｃａｎｉｓアッセイで、陽性に血清転換した。生成物の採血は２２６、２６１、２６８および２８２日目に採取した（約５０ｍｌの血液で約２５ｍｌの血清が得られた）。
【実施例１５】
【０２０４】
Ｅ．ｃａｎｉｓのタンパク質であるｐ１６タンパク質から得た合成ペプチド（配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４）を用いて調製したマイクロタイタープレートに基づくイムノアッセイを用いるホルマリン不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓ（ワクチンサンプル）を用いて免疫したビーグル犬由来の血清の試験
ホルマリン不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓの調製およびビーグル犬の免疫は、実施例１３および１４に記載された。免疫したビーグル犬由来のサンプルを、合成ペプチド（配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４）を用いて調製した直接のマイクロタイタープレートに基づくイムノアッセイを用いて試験した。
【０２０５】
直接的なアッセイ形式
サンプルは、合成ペプチド（配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４）を用いて調製した、マイクロタイタープレートに基づくイムノアッセイを用いて試験した。合成ペプチドは、マイクロタイターウェル上に１．０μｇ／ｍｌで固定した。別々の量の合成ペプチドを、指示薬ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）にコンジュゲートした。その試験サンプルおよびイムノアッセイ・ペプチド／指標を、ペプチドでコーティングしたマイクロタイターウェルに加えて、これをインキュベートして洗浄した。固定されたペプチドおよびペプチド／指示薬に結合した抗体をマイクロタイターウェル中に固定した。この複合体をＨＲＰＯ基質試薬の添加によって検出した。個々のマイクロタイターウェルの吸光度を、マイクロタイター・プレート・リーダーを用いて判定した。
【０２０６】
結果
アッセイの結果を表１０に示す。陽性コントロール（ＰＣ，ＩＤ  １０４９：１６Ｅ）および陰性コントロール（ＮＣ，３８１８：５７Ｂ）は、それぞれ、Ｅ．ｃａｎｉｓ陽性および陰性が既知の血清サンプルであった。全てのサンプルを、Ｅ．ｃａｎｉｓ抗体について市販の可逆性フロー・クロマトグラフィックＳＮＡＰ（登録商標）４Ｄｘ（登録商標）試験を用いて試験した。異なるアジュバントを用いて処方したホルマリン不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓ抗原を投与された６匹のイヌ（ＣＶＹＤＥＨ、ＣＷＭＢＤＣ、ＣＶＸＣＳＭ、ＣＷＭＡＸＫ、ＣＶＳＣＶＡおよびＣＶＸＣＡＰ）由来の連続的な時間的なサンプルの結果を、免疫後２２６日、２６１日、２６８日および２８２日について示す。可逆性のフロー・クロマトグラフィックＳＮＡＰ（登録商標）４Ｄｘ（登録商標）試験の結果、ワクチン接種した動物では抗体応答が誘導されたことが実証される。ワクチン接種した動物由来の血清サンプルのうち、ペプチド（配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４）マイクロタイタープレート形式のアッセイで反応性のものはなかった。
【０２０７】
【表１２】
0005759724.tif 000013
【０２０８】
結論
この結果によって、ホルマリン不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓ抗原を用いる免疫の結果として誘導された抗体が可逆性のフロー・クロマトグラフィックＳＮＡＰ（登録商標）４Ｄｘ（登録商標）試験で反応性であり、抗Ｅ．ｃａｎｉｓ抗体応答が開始されたことが示される。これらの同じサンプルは、Ｅ．ｃａｎｉｓ  Ｐ１６タンパク質（配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４）由来の合成ペプチドに対して非反応性であった。
【０２０９】
ホルマリン不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓ抗原で免疫したイヌ由来の血清は、Ｅ．ｃａｎｉｓのＰ１６タンパク質（配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４）由来のペプチドに非反応性であった。合成ペプチド（配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４）は、ワクチン接種の結果として誘導された抗体に対して非反応性であった。
【実施例１６】
【０２１０】
Ｅ．ｃａｎｉｓ感染の治療のモニタリング
６匹のイヌを実験的にＥ．ｃａｎｉｓに感染させた。ドキシサイクリンを感染後２８日で投与した。Ｅ．ｃａｎｉｓに特異的な抗体を、間接的アッセイプロトコールを用いて配列番号２３を用いて検出した。配列番号２３に示されるポリペプチドを直接吸着によってマイクロタイターウェル上に固定した。試験サンプルの希釈物（１：１００）をこのマイクロタイターウェルに添加して、洗浄することによって未結合の抗体を取り除いた。固定されたペプチドに結合した抗体を、抗−種、この場合ウサギ抗−イヌホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）コンジュゲート（１：１０００希釈）との反応によって検出した。個々のマイクロタイターウェルの吸光度（Ａ６５０）を、マイクロタイター・プレート・リーダーを用いて測定した。陰性のカットフは２ｘの陰性のコントロールＯ．Ｄ．値であった。
【０２１１】
結果を図８に示す。Ｅ−１、Ｅ−２、Ｅ−３、Ｅ−４、Ｅ−５、およびＥ−６のイヌをＥ．ｃａｎｉｓに実験的に感染させたが、感染については治療しなかった。図８によって、配列番号２３に結合する抗体のレベルは、実験的な感染の後にはかなり増大し、実験の時間経過の間には減少しなかったことが示される。ＥＤＴｘ−１、ＥＤＴｘ−２、ＥＤＴｘ−３、ＥＤＴｘ−４、ＥＤＴｘ−５、およびＥＤＴｘ−６のイヌをＥ．ｃａｎｉｓで実験的に感染させ、次いで感染後２８日でドキシサイクリンを用いて処置した。図８によって、配列番号２３に結合する抗体のレベルは、実験的な感染の後にはかなり増大し、ドキシサイクリンの投与後には減少したことが示される。従って、配列番号２３は、進行、治療に対する応答、またはＥ．ｃａｎｉｓ感染の治療の有効性をモニターするために用いることができる。
【実施例１７】
【０２１２】
Ｅ．ｃａｎｉｓに関してワクチン接種されたイヌ、およびＥ．ｃａｎｉｓに関してワクチン接種されたが、Ｅ．ｃａｎｉｓに感染したイヌの識別
ワクチンは、感染予防に完全に有効ではない場合もある。従って、ワクチン接種した動物がワクチン接種にかかわらず感染したか否かを決定する方法があることが望ましい。検出因子としてｐ１６を用いるイムノアッセイでは、Ｅ．ｃａｎｉｓに関してワクチン接種されており、Ｅ．ｃａｎｉｓに感染していないイヌにおける抗Ｅ．ｃａｎｉｓ抗体を検出しない。ここで、Ｅ．ｃａｎｉｓのｐ１６タンパク質（配列番号１０）がＥ．ｃａｎｉｓワクチンを投与されたイヌでのＥ．ｃａｎｉｓ感染を検出するために用いることができることが発見された。
【０２１３】
Ｅ．ｃａｎｉｓに関してワクチン接種された６匹のイヌおよび２匹のワクチン接種されていないイヌを、１０％のＤＭＳＯ中でＥ．ｃａｎｉｓ感染したＫ９細胞を用いて攻撃した（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）。各々のイヌを、配列番号１０を含んでいるイムノアッセイを用いて抗Ｅ．ｃａｎｉｓ抗体について経時的に試験した。ワクチン接種したイヌおよび２匹のコントロールのイヌの全てがＥ．ｃａｎｉｓに感染した。Ｅ．ｃａｎｉｓ感染は、２つの独立した感染マーカーで確認した。イムノアッセイは、ワクチン接種されたイヌおよびワクチン接種されていないイヌにおいてＥ．ｃａｎｉｓ感染を検出できた。全てのイムノアッセイシグナルは、バックグラウンドのシグナルを有意に上回った。図９Ａ−Ｂ、１０Ａ−Ｃ、および１１Ａ−Ｃを参照のこと。
【０２１４】
配列：
【化１】
0005759724.tif 000014
【０２１５】
【化２】
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【０２１６】
【化３】
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【０２１７】
【化４】
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【０２１８】
【化５】
0005759724.tif 000018
【０２１９】
【化６】
0005759724.tif 000019
【０２２０】
【化７】
0005759724.tif 000020
【０２２１】
【化８】
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【０２２２】
【化９】
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【０２２３】
【化１０】
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【０２２４】
【化１１】
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【０２２５】
【化１２】
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【０２２６】
【化１３】
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【０２２７】
【化１４】
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【０２２８】
【化１５】
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【０２２９】
【化１６】
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【０２３０】
【化１７】
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【０２３１】
【化１８】
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【０２３２】
【化１９】
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【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
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【化２４】
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【化２５】
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【化２６】
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【化２７】
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【化２８】
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【化２９】
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【化３０】
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【化３１】
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【化３２】
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【０２３３】
本発明の他の実施形態によって以下のポリペプチドが得られる：
（ａ）１位のＸが存在しないかまたはＣであり、４位のＸがＨまたはＱであり、２５位のＸがＤまたはＧであり、かつ３６位のＸがＥまたはＧである、配列番号３３；
（ｂ）１位のＸがＣであり、４位のＸがＨであり、２５位のＸがＤまたはＧである、配列番号３３のアミノ酸１〜２７；
（ｃ）２５位のＸがＤまたはＧであり、３６位のＸがＥまたはＧであり；かつＣが必要に応じてアミノ末端に存在している、配列番号３３のアミノ酸１３〜４１；
（ｄ）２５位のＸがＤまたはＧであり、３６位のＸがＥまたはＧであり、かつＣが必要に応じてアミノ末端に存在している、配列番号３３のアミノ酸２４〜４９；
（ｅ）１位のＸがＣであるかまたは存在せず、かつ２５位のＸがＤまたはＧである、配列番号３３のアミノ酸１〜２７；
（ｆ）２５位のＸがＤまたはＧであり、３６位のＸがＥまたはＧであり、かつＣが必要に応じてアミノ末端に存在している、配列番号３３のアミノ酸１３〜４１；
（ｇ）２５位のＸがＤまたはＧであり、３６位のＸがＥまたはＧであり、かつＣが必要に応じてアミノ末端に存在している、配列番号３３のアミノ酸２４〜４９；
（ｈ）２５位のＸがＤまたはＧであり、かつＣが必要に応じてアミノ末端に存在している、配列番号３３のアミノ酸１３〜２７；
（ｉ）２５位のＸがＤまたはＧであり、３６位のＸがＥまたはＧであり、かつＣが必要に応じてアミノ末端に存在している、配列番号３３のアミノ酸２４〜４１；
（ｊ）２５位のＸがＤまたはＧであり、３６位のＸがＥまたはＧであり、かつＣが必要に応じてアミノ末端に存在している、配列番号３３のアミノ酸１３〜４１；
（ｋ）２５位のＸがＤまたはＧであり、３６位のＸがＥまたはＧであり、かつＣが必要に応じてアミノ末端に存在している、配列番号３３のアミノ酸２４〜４９；
（ｌ）２５位のＸがＤまたはＧであり、３６位のＸがＥまたはＧであり、かつＣが必要に応じてアミノ末端に存在する、配列番号３３のアミノ酸２４〜４１。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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