(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織を含む生物物質の流体潅流システムであって、
（ａ）保存ガスを製造するガス発生器と、
（ｂ）大量の流体潅流液を備える流体潅流システムと、
（ｃ）前記組織に挿入可能であり、前記ガス発生器におよび前記流体潅流システムに連結され、少なくとも２つの選択的な態様に従って作動する流体供給管であって、前記少なくとも２つの選択的な態様は、前記ガス発生器からの前記保存ガスが前記組織に供給され、前記流体潅流システムからの前記流体潅流液が前記組織に供給されない第１態様と、前記流体潅流システムからの前記流体潅流液が前記組織に供給され、前記ガス発生器からの前記保存ガスが前記組織に供給されない第２態様と、を含む流体供給管と、
を備える流体潅流システム。
【請求項２】
前記保存ガスは気体酸素を含む、請求項１に記載の流体潅流システム。
【請求項３】
前記ガス発生器は気体酸素を発生させる電気化学的手段を備える、請求項２に記載の流体潅流システム。
【請求項４】
気体酸素を発生させる前記電気化学的手段は電気化学的酸素濃縮器を備える、請求項３に記載の流体潅流システム。
【請求項５】
前記保存ガスはさらに水蒸気を含む、請求項２に記載の流体潅流システム。
【請求項６】
前記ガス発生器は前記保存ガスにおける気体酸素の濃度を調整する手段を備える、請求項２に記載の流体潅流システム。
【請求項７】
前記保存ガスは気体酸素からなる、請求項１に記載の流体潅流システム。
【請求項８】
組織を含む前記生物物質を受容するのに適した寸法に形成された容器をさらに備える、請求項１に記載の流体潅流システム。
【請求項９】
前記容器は断熱された容器である、請求項８に記載の流体潅流システム。
【請求項１０】
前記容器の内容物を所望温度に維持する温度制御手段をさらに備える、請求項９に記載の流体潅流システム。
【請求項１１】
前記温度制御手段は、前記容器内の温度を感知する温度センサーと、前記容器内の前記温度を変更する温度制御デバイスと、前記温度センサーに応答して該温度制御デバイスの稼働を制御するプロセスコントローラとを備える、請求項１０に記載の流体潅流システム。
【請求項１２】
いかなる保存ガスおよび／または組織を含む前記生物物質を潅流した液体潅流液も排出する流体排出管をさらに備える、請求項１に記載の流体潅流システム。
【請求項１３】
前記液体潅流液は液体細胞培地と、臓器保存溶液と、塩類溶液と、ＨＥＰＥＳ緩衝液と、これらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の流体潅流システム。
【請求項１４】
前記液体潅流液は、さらに、抗酸化物質と、抗アポトーシス剤と、血管拡張剤／血管収縮剤と、酸素担体と、キレート剤と、毒素結合剤と、抗凝固剤とからなる群から選択される添加物を含む、請求項１３に記載の流体潅流システム。
【請求項１５】
前記少なくとも２つの選択的な態様は、前記ガス発生器からの前記保存ガス及び前記流体潅流システムからの流体潅流液の両方が前記組織に供給される、第３態様を含む請求項１に記載の流体潅流システム。
【請求項１６】
前記流体供給管は、前記少なくとも２つの選択的な態様の２つまたは２つ以上の態様を切り替えるための１つまたは１つ以上のバルブを備える請求項１に記載の流体潅流システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１０年６月１８日に出願された発明者Ｔｅｍｐｅｌｍａｎらによる米国特許出願第１２／８０３，０８３号の一部継続出願であり、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）項の下で２００９年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／２６８，９７３号の利益を主張するものであり、両出願の開示は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
（米国連邦政府の後援による研究または開発に関する記述）
米国政府は、本発明における支払い済みのライセンスと、米国国立衛生研究所によって授与された米国中小企業技術革新研究プログラム第１期契約番号Ｒ４３ＤＫ０７０４００、Ｒ４３ＤＫ０７０４００−０２Ｓ１、およびＲ４４ＤＫ０７０４００の条件によって規定されるような合理的な条件で特許権者が他者にライセンスを与えることを必要とする限定された状況における権利とを有する。
【０００３】
本発明は一般に、移植または他の目的のための組織を含む生物物質の保存に関し、より具体的には流体潅流を用いた、組織を含む生物物質の保存に関する。
【背景技術】
【０００４】
ラット由来の膵島の同種移植が化学的に誘発された糖尿病を逆転させると示されて以来、ランゲルハンス島の移植は３０年超にわたり１型真性糖尿病のための治療としてのその可能性について研究されてきた（非特許文献１参照。これは参照により本明細書に援用される）。
【０００５】
数年後、ドナーへの膵島の自己移植は膵炎を患う人々における糖尿病の発症を予防することが可能な治療であることが示された（非特許文献２参照。これは参照により本明細書に援用される）。
【０００６】
しかしながら、膵島の同種移植は、エドモントンプロトコルの開発によって複数の膵臓由来の膵島を移植された７名の続発性患者で成功を収める２０００年までは、成功を収めるのが困難なままであった（非特許文献３参照。これは参照により本明細書に援用される。）。
【０００７】
前述の成功はグルココルチコイドなしでの免疫抑制の使用に帰するところが大きいとされてきた。この成功は、この後、ミネソタ大学を含む他の機関において繰り返され、２０００〜２００６年に世界中でエドモントンプロトコルの変法が５００例を超える移植に利用された（非特許文献４、非特許文献５参照。これらはいずれも参照により本明細書に援用される。）。
【０００８】
膵島移植は、糖尿病について現在利用されている他の治療を上回るいくつかの利点を提供する。インスリン生産を介したグルコースレベルを監視および調節する膵島の生得的能力によって、移植は、血糖値の定常で厳密な制御を可能にし、これは患者の自己監視によってはなされ得ない。厳密なグルコース制御が完全になされ得ないときでさえ、膵島移植は、低血糖を示す身体症状が欠如している無自覚性低血糖症を呈する患者において特に重要である。加えて、他の移植処置と比較して、膵島の門脈への注入は侵襲的手術（ｏｐｅｎ  ｓｕｒｇｅｒｙ）を必要としないので、この移植では感染の可能性が最小限となる。
【０００９】
糖尿病の一貫した逆転のための膵島移植の使用が実証されてきたが、臨床の場においてこの療法を広範に実施するためにはなおいくつかの障害が残されている。単一のドナーからの移植体を用いて成功を収めているものも多少あるが、多くの施設は、ドナーあたりの膵島の収量が少ないことおよび／または品質が低いことを含む様々な理由から、１名の患者に対して複数のドナー臓器を必要とし続けている（非特許文献６参照。これは参照により本明細書に援用される。）。
【００１０】
現在のところ高品質のドナー臓器が不足しており、これが可能な移植数を制限している。膵島移植への関心が高まるにつれ、および新たな施設が治験薬（ＩＮＤ）の有資格性を米国食品医薬品局（ＦＤＡ）へ申請するのに伴って、入手可能な臓器の数および品質の両方を最大にすることが従来にも増して重要である。該臓器の数および品質の両方を最大にするためには、臓器調達および膵島加工から移植体受容者における最終的な生着までの時点で始まる損傷から膵島を保護する必要がある。
【００１１】
膵島移植の主要な課題の１つは、生存可能な機能的移植体組織を、治療を成功させるために十分な量で獲得することである（非特許文献７参照。これは参照により本明細書に援用される。）。したがって、（１）臨床用途のために許容され得るドナー臓器を最大にし、（２）該ドナー臓器を許容し得る状態に保つために、該臓器の保存、貯蔵、および輸送を改善し、かつ（３）膵島の分離、培養、および貯蔵の改善によって臓器から収集される膵島の収量および品質を高めることが重要である。単一のドナーからの移植を成功させるために、生存可能な膵島の臨界量が存在するようであり、現行のプロトコルでは、この臨界量の一般的にはまさに最低限界の移植体組織を産生する。
【００１２】
膵臓調達についての現行のプロトコルは、実際に温虚血（ＷＩ）時間のない脳死があって心臓は拍動しているドナーを含む。膵臓保存（輸送および貯蔵の時間を含む）は、８時間以内の冷蔵（４〜８℃）でなければならない。冷蔵プロトコルは、あるものがＵＷ（ウィスコンシン大学）溶液などの確立された低温保存溶液（ＣＰＳ）を用い、その他のものが実験用ＣＰＳもしくはＣＰＳの組み合わせを用いることで、異なる。２００２年以降、２層法（ＴＬＭ）がより多くの注目を集めてきた。ＴＬＭは、１９８０年代後期から１９９０年代初期に膵臓保存の方法として開発された（非特許文献８、非特許文献９、及び非特許文献１０参照。これらすべては参照により本明細書に援用される。）。
【００１３】
ＴＬＭは、ＣＰＳの層と含酸素ペルフルオロカーボン（ＰＦＣ）の層の中間に膵臓を浮遊させることを包含する。基本概念は、ＰＦＣの高い酸素担持能により、ＣＰＳと比較して多量の酸素を臓器表面に供給することによって、貯蔵中の組織の酸素化を高めることである。ＴＬＭは、エドモントンプロトコルの開発に続く２０００年代初期における膵臓保存のための最先端技術として大きく前進し、多くの膵島加工施設が古典的な方法と比較した場合のこの臓器保存へのアプローチの優位性を公開した（非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、及び、非特許文献１７参照。これらすべては参照により本明細書に援用される。）。
【００１４】
ＴＬＭへの関心の多くは、移植を成功させるために最低限度のドナー臓器を使用することについての可能性のためであった。現在、好適なドナー臓器が不足しており、一部の国では、心臓の拍動しているドナーの利用は文化的タブーにより禁止されている。しかしながら、最近、ＴＬＭの場合と同様に、表面拡散に依存する酸素化が大多数のヒト膵臓を酸素化するには不十分である可能性が明らかになってきた。ミネソタ大学のグループによる膵臓の拡散モデリングは、酸素が膵臓の外面１ｍｍまでしか浸透できないことを実証している（非特許文献１８参照。これは参照により本明細書に援用される。）。加えて、複数の膵島移植施設は、ごく最近になって、膵臓がＴＬＭによって保存される場合とＣＰＳ（ＵＷ）のみにおける古典的な貯蔵によって保存される場合とで、膵島の分離にも移植の結果にも有意な改善がないことを実証する後ろ向きなデータを公開している（非特許文献１９、非特許文献２０参照。これらはいずれも参照により本明細書に援用される。）。
【００１５】
上記にかんがみて、改善された膵臓保存方法に対する切実な必要性が今もあることは明らかである。
【００１６】
ヒトの他の臓器の場合、ＣＰＳにおける受動的な冷蔵が一般的であり、査読された文献において報告されている。また、臓器の液体潅流保存のためのいくつかのプロトコルおよび市販の機器がある。これらの方法のいずれにおいても、酸素の供給はごく僅かであり、最適な臓器保存には不適当である可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｓｕｒｇｅｒｙ，７２（２）：１７５−８６（１９７２）、“Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔａｃｔ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ，” Ｂａｌｌｉｎｇｅｒら
【非特許文献２】Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ，１９２（４）：５２６−４２（１９８０）、“Ｔｏｔａｌ  ｏｒ  ｎｅａｒ  ｔｏｔａｌ  ｐａｎｃｒｅａｔｅｃｔｏｍｙ  ａｎｄ  ｉｓｌｅｔ  ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ，” Ｎａｊａｒｉａｎら
【非特許文献３】Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３４３（４）：２３０−８（２０００）、“Ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｅｖｅｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ｆｒｅｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｒｅｇｉｍｅｎ，”Ｓｈａｐｉｒｏら
【非特許文献４】Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，３６２（９３９１），１２４２（２００３）、“Ｅｄｍｏｎｔｏｎ’ｓ  ｉｓｌｅｔ  ｓｕｃｃｅｓｓ  ｈａｓ  ｉｎｄｅｅｄ  ｂｅｅｎ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅｄ  ｅｌｓｅｗｈｅｒｅ，” Ｓｈａｐｉｒｏら
【非特許文献５】Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１６（１）：１−８（２００７）、“Ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ  ｉｎ  ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，” Ｅｍａｍａｕｌｌｅｅら
【非特許文献６】ＪＡＭＡ，２９３（７）：８３０−（５）（２００５）、“Ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｎｏｒ，ｍａｒｇｉｎａｌ−ｄｏｓｅ  ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｄｉａｂｅｔｅｓ，” Ｈｅｒｉｎｇら
【非特許文献７】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１３（２）：１３５−１４１（２００８）、“Ｐａｎｃｒｅａｓ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ａｎｄ  ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ｉｎｖｉｔｅｄ  ｒｅｖｉｅｗ，” Ｉｗａｎａｇａら
【非特許文献８】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，４６（３）：４５７−６０（１９８８）、“Ａ  ｎｅｗ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｃｏｌｄ−ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ，” Ｋｕｒｏｄａら
【非特許文献９】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，５１（５）：１１３３−５（１９９１）、“Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｉｎｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｆｏｒ  ９６  ｈｏｕｒｓ  ｂｙ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｔｗｏ−ｌａｙｅｒ（ＵＷ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ／ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ）ｃｏｌｄ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｍｅｔｈｏｄ，” Ｆｕｊｉｎｏら
【非特許文献１０】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，５４（３）：５６１−２（１９９２）、“Ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｔｗｏ−ｌａｙｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ／ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ）ｃｏｌｄ−ｓｔｏｒａｇｅ  ｍｅｔｈｏｄ，” Ｋｕｒｏｄａら
【非特許文献１１】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７４（１２）：１８１３−６（２００２）、“Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｔｗｏ−ｌａｙｅｒ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｉｓｌｅｔ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，” Ｈｅｒｉｎｇら
【非特許文献１２】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７４（１２）：１８１１−２（２００２）、“Ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｘｙｇｅｎａｔｅｄ  ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ  ｔｏｗａｒｄ  ｍａｋｉｎｇ  ｅｖｅｒｙ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｃｏｕｎｔ，” Ｆｒａｋｅｒら
【非特許文献１３】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７４（１２）：１６８７−９１（２００２）、“Ｈｕｍａｎ  ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｐａｎｃｒｅａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｃｏｌｄ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｕｓｉｎｇ  ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｔｗｏ−ｌａｙｅｒ（ＵＷ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ／ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ）ｃｏｌｄ−ｓｔｏｒａｇｅ  ｍｅｔｈｏｄ，” Ｔｓｕｊｉｍｕｒａら
【非特許文献１４】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７４（１２）：１８０９−１１（２００２）、“Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｂｅｆｏｒｅ  ｉｓｌｅｔ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｔｗｏ−ｌａｙｅｒ（ＵＷ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ−ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ）ｃｏｌｄ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｍｅｔｈｏｄ，” Ｌａｋｅｙら
【非特許文献１５】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７５（９）：１５２４−７（２００３）、“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｓｌｅｔ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｆｒｏｍ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｏｎｏｒｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｘｙｇｅｎａｔｅｄ  ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｏｌｄ−ｓｔｏｒａｇｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，” Ｒｉｃｏｒｄｉら
【非特許文献１６】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，３６（４）：１０３７−９  ２００４、“Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｗｏ−ｌａｙｅｒ  （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ／ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ）ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｇｒａｄｅ  ｐａｎｃｒｅａｔａ  ｐｒｉｏｒ  ｔｏ  ｉｓｌｅｔ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，” Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら
【非特許文献１７】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，３７（８），３３９８−４０１（２００５）、“Ｔｗｏ−ｌａｙｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｉｓｌｅｔ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，” Ｗｉｔｋｏｗｓｋｉら
【非特許文献１８】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，３７（８），３５０１−４（２００５）、“Ｐａｎｃｒｅａｓ  ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｔｗｏ−ｌａｙｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ，” Ｐａｐａｓら
【非特許文献１９】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，８２（１０）：１２８６−９０（２００６）、“Ｉｓｌｅｔ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｔｗｏ−ｌａｙｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｅｄ  ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ，” Ｋｉｎら
【非特許文献２０】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，８４（７）：８６４−９（２００７）、“Ｎｏ  ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｗｏ−ｌａｙｅｒ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ＵＷ−ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｓｌｅｔ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，” Ｃａｂａｌｌｅｒｏ−Ｃｏｒｂａｌａｎら
【非特許文献２１】Ｌｉｖｅｒ  Ｔｒａｎｓｐｌ，１４（３）：３５８−６４（２００８年３月）、“Ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｐｅｒｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒｓ：ａ  ｐｉｌｏｔ  ｓｔｕｄｙ，” Ｔｒｅｃｋｍａｎｎら
【非特許文献２２】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１３（６）：６７３−４（２００７）、“Ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｈｉｇｈｗａｙ  ｔｏ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ，” Ｗｏｏｄら
【非特許文献２３】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１３（６）：６８８−９４（２００７）、“Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ａｃｔｓ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｂｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｏｘｙｇｅｎ  ｒａｄｉｃａｌｓ，” Ｏｈｓａｗａら
【非特許文献２４】Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５４（５）：１４００−６（２００５）、“Ｄｏｎｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｃａｒｂｏｎ  ｍｏｎｏｘｉｄｅ  ｃａｎ  ｙｉｅｌｄ  ｉｓｌｅｔ  ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，” Ｗａｎｇら
【非特許文献２５】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７１（４）：４９８−５０２（２００１）、“Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｌｉｖｅｒｓ  ｂｙ  ｃｏｌｄ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｇａｓｅｏｕｓ  ｏｘｙｇｅｎ，” Ｓａａｄら
【非特許文献２６】Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７（３）：７０７−１３（２００７）、“Ｈｕｍａｎ  ｉｓｌｅｔ  ｏｘｙｇｅｎ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ  ｒａｔｅ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｉｎ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ，ｃ” Ｐａｐａｓら
【非特許文献２７】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９８：１０７１−８２（２００７）、“Ａ  ｓｔｉｒｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｃｈａｍｂｅｒ  ｆｏｒ  ｏｘｙｇｅｎ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ  ｒａｔｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ，” Ｐａｐａｓら
【非特許文献２８】Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，  １０（５）：４８４（２００３）、“Ｉｓｌｅｔ  ｏｘｙｇｅｎ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ  ｒａｔｅ  ａｓ  ａ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，”Ｋｏｕｌｍａｎｄａら
【非特許文献２９】Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１２：１７６−１７６（２００３）、“Ｉｓｌｅｔ  ｑｕａｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｏｘｙｇｅｎ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ  ｒａｔｅ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｇｒａｆｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ，”Ｐａｐａｓら
【非特許文献３０】Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１０（６）：５１９（２００１）、“Ｒａｐｉｄ  Ｉｓｌｅｔ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｐｒｉｏｒ  ｔｏ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，”Ｐａｐａｓら
【非特許文献３１】Ｔｒａｎｓｐｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ，３３：１７０９（２００１）、“Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｌｅｔ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｒｉｃｏｒｄｉら
【非特許文献３２】Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，５（７）：１６３５−４５（２００５）、“Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｅｔａ−ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｓｌｅｔ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，” Ｉｃｈｉｉら
【非特許文献３３】Ａｍ．Ｊ．Ｔｈｅｒ，１２：６００−４（２００５），“Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｉｓｓｕｅｓ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，”Ｗｏｎｎａｃｏｔｔら
【非特許文献３４】Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７（３）：７０７−１３（２００７）、“Ｈｕｍａｎ  ｉｓｌｅｔ  ｏｘｙｇｅｎ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ  ｒａｔｅ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｉｎ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ，”Ｐａｐａｓら
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的は、組織を含む生物物質の流体潅流システムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の一態様によると、（ａ）保存ガスを製造するガス発生器と、（ｂ）該保存ガスを組織に供給するために該ガス発生器に連通し該組織に挿入可能な流体管とを備える、組織を含む生物物質の流体潅流システムが提供される。
【００２０】
前述のシステムの特徴によると、保存ガスは気体酸素を含んでもよい。
前述のシステムの別の特徴によると、ガス発生器は気体酸素を発生させる電気化学的手段を備えていてもよい。
前述のシステムのさらなる特徴によると、気体酸素を発生させる電気化学的手段は電気化学的酸素濃縮器を備えていてもよい。
前述のシステムのさらなる特徴によると、保存ガスはさらに水蒸気を含んでもよい。
前述のシステムのさらなる特徴によると、ガス発生器は保存ガスにおける気体酸素の濃度を調整する手段を備えていてもよい。
前述のシステムのさらなる特徴によると、保存ガスは気体酸素からなっていてもよい。
前述のシステムのさらなる特徴によると、ガス発生器は保存ガスを含むガス流を出力する少なくとも１つの出口を備えていてもよい。
前述のシステムのさらなる特徴によると、ガス発生器は保存ガスを含む対応する複数のガス流を出力する複数の出口を備えていてもよい。
前述のシステムのさらなる特徴によると、ガス流は、独立して調整可能な流量を有していてもよい。
【００２１】
前述のシステムのさらなる特徴によると、流体管はカニューレを備えていてもよい。
前述のシステムのさらなる特徴によると、システムは、組織を含む生物物質を受容するのに適した寸法に形成された容器をさらに備えていてもよい。
前述のシステムのさらなる特徴によると、容器は断熱された容器であってもよい。
前述のシステムのさらなる特徴によると、システムはさらに前記容器の内容物を所望温度に維持する温度制御手段を備えていてもよい。
前述のシステムのさらなる特徴によると、温度制御手段は前記容器内の温度を感知する温度センサーと、前記容器内の温度を変更する温度制御デバイスと、前記温度センサーに応答して前記温度制御デバイスの稼働を制御するプロセスコントローラとを備えていてもよい。
【００２２】
前述のシステムのさらなる特徴によると、システムはさらに液体潅流システムを備えていてもよい。
前述のシステムのさらなる特徴によると、液体潅流システムは、液体潅流液の槽と、槽から組織を含む生物物質に液体潅流液を供給する流体供給管と、組織を含む生物物質を潅流した液体潅流液を排出する流体排出管とを備えていてもよい。
前述のシステムのさらなる特徴によると、システムはさらに大量の液体を備えていてもよく、この中で、保存ガスは、流体管によって組織に供給されるガス／液体溶液を形成するよう、液体中に溶解している。
前述のシステムのさらなる特徴によると、液体は液体細胞培地と、臓器保存溶液と、塩類溶液と、ＨＥＰＥＳ緩衝液と、これらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。
前述のシステムのさらなる特徴によると、液体はさらに、抗酸化物質と、抗アポトーシス剤と、血管拡張剤／血管収縮剤と、酸素担体と、キレート剤と、毒素結合剤と、抗凝固剤からなる群から選択される添加物を含んでもよい。
【００２３】
前述のシステムの別の態様によると、組織を含む生物物質の流体潅流システムが提供され、システムは（ａ）組織を含む生物物質を貯蔵する貯蔵容器と、（ｂ）貯蔵容器の内容物を所望温度に維持する温度制御手段と、（ｃ）保存ガスを製造するガス発生器と、（ｄ）保存ガスを組織に供給するためにガス発生器に連通し組織に挿入可能な流体管とを備える。
前述のシステムの一特徴によると、保存ガスは気体酸素を含んでもよい。
前述のシステムの別の特徴によると、ガス発生器は気体酸素を発生させる手段を備えていてもよい。
前述のシステムのさらなる特徴によると、気体酸素発生手段は気体酸素を発生させる電気化学的手段を備えていてもよい。
前述のシステムのさらなる特徴によると、気体酸素を発生させる電気化学的手段は電気化学的酸素濃縮器を備えていてもよい。
前述のシステムのさらなる特徴によると、システムはさらに、流体管を通して組織に搬送されるガス／ガス混合物を形成するよう前記保存ガスを希釈する手段を備えていてもよい。
【００２４】
前述のシステムのさらなる特徴によると、システムはさらに液体潅流システムを備えていてもよい。
前述のシステムのさらなる特徴によると、液体潅流システムは、液体潅流液の槽と、槽から組織を含む生物物質に液体潅流液を供給する流体供給管と、組織を含む生物物質を潅流した液体潅流液を排出する流体排出管とを備えていてもよい。
前述のシステムのさらなる特徴によると、システムはさらに、ガス発生器もしくは槽を出る流体または容器に入るもしくは容器を出る流体、のうちの少なくとも１つにおけるガス濃度を監視する少なくとも１つのガスセンサーを備えていてもよい。
【００２５】
本発明の別の態様によると、組織を含む生物物質の保存において使用するシステムが提供され、前記システムは（ａ）組織を含む生物物質を貯蔵する貯蔵容器と、（ｂ）貯蔵容器の内容物を所望温度に維持する温度制御手段と、（ｃ）保存ガスを発生させるガス発生器と、（ｄ）少なくとも１つのガス流の中で保存ガスを前記貯蔵容器の内容物に供給する手段とを備える。
前述のシステムの特徴によると、少なくとも１つのガス流は複数のガス流を含んでもよく、前記複数のガス流は、独立して調整可能な流量を有していてもよい。
前述のシステムの別の特徴によると、システムはさらにガス発生器の稼働を制御する手段を備えていてもよい。
前述のシステムのさらなる特徴によると、システムはさらに流体潅流システムを備えていてもよい。
【００２６】
本発明の別の態様によると、組織を含む生物物質の流体潅流システムが提供され、該システムは、（ａ）保存ガスを生体内原位置で発生させる手段と、（ｂ）生体内原位置で発生した保存ガスを用いて組織を潅流する手段とを備える。
前述のシステムの特徴によると、システムはさらに、生体内原位置で発生した保存ガスを流体で希釈する手段を備えていてもよく、この中で、前記潅流する手段は、希釈された生体内原位置で発生した保存ガスを用いて組織を潅流することを含む。
【００２７】
本明細書および特許請求の範囲の意図のために、「流体」という用語は、液体状態の純粋な物質、気体状態の純粋な物質、ならびに、２つまたは３以上の液体の混合物、２つまたは３以上のガスの混合物、および少なくとも１つの液体と少なくとも１つのガスとの混合物などだがこれらに限定されない液体物質および／または気体物質の混合物を包含するがそれらに限定されないよう意図される。
【００２８】
また、本明細書および特許請求の範囲の意図のために、「組織を含む生物物質」という用語は、組織を含む天然生物物質、組織を含む人工発生生物物質、およびその複合物を包含するよう意図される。加えて、「組織を含む生物物質」という用語は、ヒトから分離された組織を含む生物物質を、または動物から分離された組織を含む生物物質を包含するよう意図される。その上、「組織を含む生物物質」という用語は、単一の生物組織、臓器、部分的臓器、複式臓器、臓器系内の複式臓器、完全な臓器系、複式部分的臓器系（一般に複合組織と称される。）、および組織全体を含むこれ以下の複式完全臓器系などだがそれらに限定されない、１つまたは２以上の生物組織からなるあるいは該生物組織を含む生物物質を包含するよう意図される。
【００２９】
加えて、本明細書および特許請求の範囲の意図のために、「流体潅流」という用語は、組織を含む生物物質内の１つまたは２以上の天然のおよび／または人工の流体分配網に１つまたは２以上の流体を供給することを指すよう意図される。天然の流体分配網の例として、組織を含む生物物質内の血管系の少なくとも一部分、組織を含む生物物質内の導管系の少なくとも一部分、および組織を含む生物物質内のリンパ系の少なくとも一部分が挙げられるが、これらに限定されない。人工の流体分配網の例として、組織を含む生物物質の中に作製または提供された人工のまたは機械製の流路が挙げられるが、これらに限定されない。「流体潅流」は、組織を含む生物物質への純ガスの投与またはガスの混合物の投与を指すために使用される場合、本明細書では代替的に「気体潅流（ｐｅｒｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）」と称され得る。
【００３０】
本発明の追加的な目的は、本発明の態様、特徴、および利点と同様に、以下の説明で部分的に記述されており、一部分は説明から明らかになり、または一部分は本発明の実施によって分かるかもしれない。説明では、説明の一部を形成しかつ、本発明を実施するための様々な実施形態が実例として示されている、添付図面を参照する。実施形態は、当業者が本発明を実施できるように可能な限り詳しく説明する。実施形態は、当業者が本発明を実施できるよう十分詳細に説明されており、本発明の範囲から逸脱することなく他の実施形態が利用されてもよく、および構造上の変更がなされてもよいことは理解されるべきである。それゆえ、以下の詳細な説明は、制限的な意味に解釈されるべきでなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって最良に規定される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
本明細書に援用されて本明細書の一部を構成する添付図面は、本発明の様々な実施形態を例示するもので、説明とともに、本発明の原理を説明するよう機能する。図面では、同様の参照番号は同様の部分を表す。
【図１】組織を含む生物物質の流体潅流システムの第１の実施形態のブロック図であり、システムは本発明の教示に従って構成されている。
【図２】図１に示した気体潅流システムの一実施形態の回路図であり、気体潅流システムは電源とともに示されている。
【図３】図２に示す電気化学的酸素濃縮器の一実施形態の部分分解斜視図である。
【図４】組織を含む生物物質の流体潅流システムの第２の実施形態の斜視図であり、システムは本発明の教示に従って構成されている。
【図５】組織を含む生物物質の流体潅流システムの第３の実施形態のブロック図であり、システムは本発明の教示に従って構成されている。
【図６】組織を含む生物物質の流体潅流システムの第４の実施形態の簡略回路図であり、システムは本発明の教示に従って構成されている。
【図７（ａ）】実施例１で説明されるように、保存なしに曝露された膵臓から分離されてジチゾン染色された膵島の影像である。
【図７（ｂ）】実施例１で説明されるように、６時間の気体潅流保存に曝露された膵臓から分離されてジチゾン染色された膵島の影像である。
【図７（ｃ）】実施例１で説明されるように、６時間のＴＬＭ保存に曝露された膵臓から分離されてジチゾン染色された膵島の影像である。
【図８】図８は、保存方法を膵島の収量および品質に基づいて比較する表である。
【図９（ａ）】ＴＬＭによる２４時間保存後のブタ膵臓の切片の顕微鏡写真である。
【図９（ｂ）】気体潅流による２４時間後のブタ膵臓の切片の顕微鏡写真である。
【図９（ｃ）】時間＝０（調達直後）におけるブタ膵臓の切片の顕微鏡写真である。
【図１０】保存方法をヌードマウスバイオアッセイに基づいて比較する表である。
【図１１】気体潅流による２４時間保存、ＴＬＭによる２４時間保存、および保存なしの間の膵島の分離結果を比較する表である（２日後は分離４８〜７２時間後として定義される。最初の３行はその下の３組のデータの平均値である。）。
【図１２】実施例２において説明した調製物についての気体潅流結果の百分率としてのＴＬＭ結果を示すグラフである（誤差棒は平均の標準誤差を示す）。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は一般に、組織を含む生物物質が、保存流体を用いた組織の潅流によって保存されることができるという発見に関する。特に、本発明は、組織を含む生物物質の流体潅流用に設計されたシステムを対象とする。
【００３３】
より具体的には、本発明の一態様によると、組織を含む生物物質の流体潅流システムが提供され、システムは、（ａ）保存ガスを生体内原位置で発生させる手段と、（ｂ）生体内原位置で発生した保存ガスを用いて組織を潅流する手段とを備える。保存ガス発生手段は、電気化学的手段および／またはその他の手段を備えていてもよい。たとえば、保存ガス発生手段は、電気化学的酸素濃縮器および／または水電解層を備えていてもよい。あるいは、保存ガス発生手段は、追加的または代替的に、圧力スイング吸着法によっておよび／または化学的酸素放出によって（たとえば、過塩素酸塩または酸素キャンドルを燃焼させることによって）このようなガスを発生させる手段を備えていてもよい。生体内原位置で発生した保存ガスを用いて組織を潅流する手段は、たとえば、ガス発生手段に連通し組織に挿入可能なカニューレまたは他の流体誘導手段を備えていてもよい。
【００３４】
組織を潅流するために使用される保存ガスは、液体中に溶存した後、ガス／液体溶液として組織に投与されてもよく、あるいは大気中にまたは１つもしくは２以上の他のガスに溶存した後、ガス／ガス混合物として組織に投与されてもよい。ガスを用いたまたはガス／ガス混合物を用いた潅流は、代替的に「気体潅流」と称され得る。気体潅流は、ガスを分配することのできる分配網を有する組織に適用されることができる。気体潅流中にガスを分配する最も一般的な分配網は、動脈、静脈、および毛細血管からなる血管系である。別の分配網は、膵臓および乳腺の広範な導管系を含むがこれに限定されない導管系である。リンパ系は、気体潅流の分配網でもあることができる、身体中の管状容器からなる誘導系を有する。加えて、分配網は、組織に穿孔すること、または組織を「針で刺すこと」によって作製されることができる（非特許文献２１参照。これは参照により本明細書に援用される。）。人工組織構成物の場合、人工のまたは代用の血管系または導管系として機能するガス透過性管など、自然のまたは人工の分配網であり得る。ガス分配網は、前述の分配網タイプの任意の組み合わせを備え得る。これらの分配網による分配は、生理的に起きる方向（すなわち、脈管構造に対して順行性）であることができ、または他の様式（たとえば、脈管構造に対して逆行性）で利用されることができる。
【００３５】
気体潅流に適した分配網を有する組織を含む生物物質は、組織、臓器、部分的臓器、複式臓器、臓器系内の複式臓器、完全な臓器系、複式部分的臓器系（一般に複合組織と称される。）、および生体全体を含むこれ以下の複式完全臓器系を含む。臓器の例として、膵臓、肝臓、腎臓、心臓、肺、大腸および小腸、眼、胆嚢、胃、皮膚、ならびに雌雄の生殖器が挙げられるが、これらに限定されない。部分的臓器の例として、膵臓の１つの葉が挙げられるが、これに限定されない。複式臓器の例として、２つの腎臓、１つの腎臓および１つの膵臓、ならびに２つの肺など、前述の臓器の２つまたは３以上が挙げられるが、これらに限定されない。臓器系内の複式臓器の例として、全体として腎臓、尿管、膀胱（ｂｌａｄｅｒ）、および尿道からなる排泄器系の一部である腎臓および膀胱を含み得るが、これらに限定されない。複式部分的臓器系の例として、指、手、足、肢、耳、鼻、顔、植皮、生殖器、腹壁、および他の複合組織が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
保存ガスの例として、気体酸素（細胞が必要とする栄養分である。）、気体水素（その抗酸化特性および抗アポトーシス特性によって細胞を保護するように働く可能性がある（非特許文献２２、非特許文献２３参照。）、気体二酸化炭素（代謝を調節する可能性がある。）、気体一酸化炭素（抗炎症性作用および抗アポトーシス性作用を有する可能性がある（非特許文献２４参照。））、および水蒸気が挙げられ得るが、これらに限定されない。保存ガスは、生体内原位置で電気化学的手段または他の手段によって発生してもよい。たとえば、保存ガスが酸素である場合、保存ガスは生体内原位置で電気化学的酸素濃縮器を用いることで発生してもよい。あるいは、保存ガスが酸素および／または水素である場合、保存ガスは、電解槽を用いることで生体内原位置で発生してもよい。あるいは、保存ガスが酸素である場合、保存ガスは圧力スイング吸着法によってまたは化学的酸素放出によって（たとえば、過塩素酸塩または酸素キャンドルを燃焼させることによって）生体内原位置で発生してもよい。
【００３７】
また、気体潅流による保存中の生物物質の品質を高めるために、組織または臓器の表面に対するあるいは該表面における導管系または血管系に対する細胞培地または臓器保存溶液による置換パージまたは浴の追加的な使用が組み込まれてもよい（非特許文献２５参照。これは参照により本明細書に援用される。）。また、保存中の生物物質の品質を改善するために、気体潅流プロトコルへの抗酸化物質の置換パージの追加を使用することができる。加えて、栄養分、抗酸化物質、または他の保存料を気体潅流中にエアロゾル形態で添加することができる。
【００３８】
液体潅流中または気体潅流中に、保存された生物物質の外部を浸漬するために、保存液および該保存液への添加物を利用することができる。また、保存液および保存液への添加物を、気体潅流の前もしくは後の一定期間、または気体潅流の代わりに、保存された生物物質を潅流する液体において利用することができる。
【００３９】
保存液は、細胞培養液（たとえば、冷凍保存肝細胞回収培地（ＣＰＲＭ））、臓器保存液（たとえば、ウィスコンシン大学（ＵＷ）液またはヒスチジン−トリプトファン−ケトグルタル酸塩（ＨＴＫ）溶液）、または医療手順で利用される他の溶液（たとえば、塩類溶液または４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液）であり得る。保存を高めるために、抗酸化物質（たとえば、ビタミンＣおよびＥならびにこれらの誘導体、触媒性抗酸化物質ＣＡ：Ｒｅｄｏｘ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  Ｉｓｌｅｔｓ  Ｆｒｏｍ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｉｎｊｕｒｙ，Ｍａｒｔｈａ  Ｍ．Ｓｋｌａｖｏｓ，Ｓｕｚａｎｎｅ  Ｂｅｒｔｅｒａ，Ｈｕｂｅｒｔ  Ｍ．Ｔｓｅ，Ｒｉｔａ  Ｂｏｔｔｉｎｏ，Ｊｉｎｇ  Ｈｅ，Ｊｏｓｈｕａ  Ｎ．Ｂｅｉｌｋｅ，Ｍａｒｉｌｙｎｅ  Ｇ．Ｃｏｕｌｏｍｂｅ，Ｒｏｎａｌｄ  Ｇ．Ｇｉｌｌ，Ｊａｍｅｓ  Ｄ．Ｃｒａｐｏ，Ｍａｓｓｉｍｏ  Ｔｒｕｃｃｏ，ａｎｄ  Ｊｏｎ  Ｄ．Ｐｉｇａｎｅｌｌｉ，ＤＩＡＢＥＴＥＳ，ＶＯＬ．５９，２０１０年７月  １７３１−１７３８）、抗アポトーシス剤（たとえば、カスパーゼ選択的阻害剤ＥＰ１０１３：Ｔｈｅ  Ｃａｓｐａｓｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＥＰ１０１３  Ａｕｇｍｅｎｔｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｓｌｅｔ  Ｇｒａｆｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｍａｒｇｉｎａｌ  Ｍａｓｓ  Ｉｓｌｅｔ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ，Ｊｕｌｉｅｔ  Ａ．Ｅｍａｍａｕｌｌｅｅ，Ｊｏｙ  Ｄａｖｉｓ，Ｒｅｎａ  Ｐａｗｌｉｃｋ，ＤＩＡＢＥＴＥＳ，ＶＯＬ．５７，２００８年６月  ｐ．１５５６−１５６６、“Ｃａｓｐａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｎｅｒｇｉｚｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｉｎｄｅｆｉｎｉｔｅ  Ｉｓｌｅｔ  Ａｌｌｏｇｒａｆｔ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ，Ｊｕｌｉｅｔ  Ａ．Ｅｍａｍａｕｌｌｅｅ，Ｊｏｙ  Ｄａｖｉｓ，Ｒｅｎａ  Ｐａｗｌｉｃｋ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｔｏｓｏ，Ｓｈａｈｅｅｄ  Ｍｅｒａｎｉ，Ｓｕｉ−Ｘｉｏｎｇ  Ｃａｉ，Ｂｅｎ  Ｔｓｅｎｇ，ａｎｄ  Ａ．Ｍ．Ｊａｍｅｓ  Ｓｈａｐｉｒｏ，ＤＩＡＢＥＴＥＳ，ＶＯＬ．５９，２０１０年６月  １４６９−１４７７）、血管拡張剤／血管収縮剤（たとえば、αアドレナリン受容体アンタゴニスト（α遮断薬、アルギニンバソプレッシン））、酸素担体（たとえば、ペルフルオカーボン、人工血液成分）、キレート剤／他の毒素結合剤（たとえば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、抗凝固剤（たとえば、ヘパリン）、およびその他の栄養分（たとえば、糖、アミノ酸、ビタミン））などの添加物を液体中に含むことができる。
【００４０】
たとえば、保存されている生物物質がヒトまたはブタの膵臓である場合、１つまたは２以上の動脈を通じて、１つまたは２以上の静脈を通じて、１つまたは２以上の導管を通じて、動脈と導管の組み合わせを通じて、あるいは静脈と導管の組み合わせを通じて膵臓を気体潅流してもよい。たとえば、ヒト膵臓の場合、気体潅流は以下の血管の１つまたは２以上の挿管、すなわち、（ｉ）腹腔動脈および上腸間膜動脈を含むように大動脈の剥離を伴う一括の膵十二指腸切除術および／または脾摘出術、（ｉｉ）腹腔動脈および上腸間膜動脈の直接的挿管を伴う一括の膵十二指腸一括切除術および／または脾摘出術、ならびに（ｉｉｉ）近位脾動脈および上腸間膜動脈の直接的挿管を伴う一括の膵十二指腸一括切除術および／または脾摘出術を介して順行性であってもよい。あるいは、気体潅流は、以下の血管の挿管、すなわち、（ｉ）下腸間膜静脈または脾静脈の挿管を伴う一括の膵十二指腸切除術および／または脾摘出術、（ｉｉ）上腸間膜静脈の挿管を伴う一括の膵十二指腸一括切除術および／または脾摘出術、ならびに（ｉｉｉ）門脈の挿管を伴う一括の膵十二指腸切除術および／または脾摘出術を介して逆行性であってもよい。
【００４１】
あるいは、ブタ膵臓の場合、気体潅流は以下の血管の１つまたは２以上の挿管、すなわち、（ｉ）腹腔動脈および上腸間膜動脈を含むように大動脈の剥離を伴う一括の膵十二指腸切除術および／または脾摘出術、（ｉｉ）腹腔動脈および上腸間膜動脈の直接的な挿管を伴う一括の膵十二指腸切除術および／または脾摘出術、ならびに（ｉｉｉ）近位脾動脈および上腸間膜動脈の直接的な挿管を伴う一括の膵十二指腸切除術および／または脾摘出術を介して順行性であってもよい。あるいは、気体潅流は、以下の血管の挿管、すなわち、（ｉ）脾静脈の挿管を伴う一括の膵十二指腸切除術および／または脾摘出術、（ｉｉ）上腸間膜静脈の挿管を伴う一括の膵十二指腸切除術および／または脾摘出術、ならびに（ｉｉｉ）下腸間膜静脈の挿管を伴う一括の膵十二指腸切除術および／または脾摘出術、ならびに（ｉｖ）門脈の挿管を伴う一括の膵十二指腸切除術および／または脾臓摘出を介して逆行性であってもよい。
【００４２】
肝臓の場合、気体潅流は、以下の血管の１つまたは２以上、すなわち、（ｉ）総肝動脈、（ｉｉ）固有肝動脈、（ｉｉｉ）門脈、の挿管を介して順行性であってもよい。である。あるいは、気体潅流は、以下の血管の１つまたは２以上、すなわち、（ｉ）肝静脈、および（ｉｉ）肝下部下大静脈または肝上部下大静脈、の挿管を介して逆行性であってもよい。
【００４３】
たとえば、生体内原位置で発生した保存ガスが純粋な気体酸素からなる場合、水または水性溶媒などの液体溶媒で気体酸素を希釈すること、およびガス／液体溶液を用いて組織を含む生物物質を潅流することが望ましいかもしれず、あるいは、大気などの別のガスまたは他のガスで気体酸素を希釈すること、およびガス／ガス混合物を用いて生物物質を気体潅流することが望ましいかもしれない。ガス／液体溶液を用いる潅流の場合、溶液中の気体酸素の濃度はほぼ液体飽和点にあってもよく、分圧およそ０．３〜１気圧であってもよい。加えて、生物物質に対する溶液の流量は、たとえば、約２００ｃｃ／分以上であってもよい。気体潅流の場合、混合物中の気体酸素の濃度は、約２０〜１００％、より好ましくは約３０〜８０％、さらにより好ましくは約４０％であってもよい。加えて、生物物質に対する混合物の流量は、たとえば、およそ１０〜６０ｃｃ／分、好ましくは１５〜２２ｃｃ／分であってもよく、投与される溶液のガス圧は、たとえば、約２２ｍｍＨｇ以下であってもよい。必然的な場合において、気体潅流がおよそ４〜８℃などの低い温度で実施されると、保存は高まるかもしれない。
【００４４】
保存されている組織を含む生物物質が膵臓である場合、膵臓全体に小さな凝血塊が生じるのを防止するために、死亡の少なくとも５分前に１００，０００単位を使用する膵臓の全身性ヘパリン化が好ましくは実施される。加えて、この臓器は、保存のために該臓器を準備するために、いかなる残存血液も血管系から除去するために、および高い温度（８℃超）における膵臓の中心領域の虚血への曝露を低下させる臓器全体の冷却を加速するために、調達中に５リットルのヘパリン化冷保存溶液で洗い流されるべきである。調達後、臓器は、冷保存溶液で血管系を洗い流すことによって漏れ口について広範に試験されるべきであり、発見されたいかなる漏れ口も塞がれるべきである。膵臓および付随する血管系は、この後、特に挿管の部位において血管系のいかなる屈曲も防ぐために、冷保存溶液中に自由に浮かせておくべきである。残存するいかなる小さな漏れ口も、ガスがすべて膵臓を流れているのを確実にするために血管系から現れる気泡の存在によって突き止められるべきであり、これらの漏れ口は塞がれるべきである。挿管のためのアクセス地点は先に説明されている。他の臓器もヘパリン化の恩恵を受けるかもしれない。
【００４５】
本調達方法を使用すると、膵臓の大部分が冷保存溶液で洗い流され、それによって臓器全体の気体潅流のための経路がきれいになる。この技術を用いて調達された臓器の組織切片は、より徹底した洗い流しにより、気体潅流によってもＴＬＭによっても、保存された組織に赤血球が存在しないことを示した。調達直後（ｔ＝０）に収集された臓器サンプルと気体潅流の６時間後または２４時間後に収集された臓器サンプルの間に、組織像による顕著な差は観察されなかった。しかしながら、ＴＬＭを用いて保存された組織は、特に２４時間保存後の気体潅流されたサンプルと比較して、高い壊死／自己分解および核濃縮した核の高い発生率を呈した。
【００４６】
前述の方法は、ヒト膵臓を使用する手段および、異種移植のためにブタ膵臓を使用する手段を可能にするかもしれない。膵臓の保存を高めて結果的に膵島の収量および品質を、および究極的には臨床転帰の改善をもたらす方法は、膵島移植の分野を確立した医療行為へと前進させるために喫緊に必要とされている。毛細血管レベルで臓器全体に酸素を供給するための貯蔵中の膵臓の動脈気体潅流は、実現可能な技術であることが本明細書において示される。特に、電気化学的に発生した酸素を、ブタ膵臓およびヒト膵臓の気体潅流に適切な流量および圧力で供給することに関する実現可能性が実証されている。その結果は、保存なしと比較して、およびＴＬＭ貯蔵を上回る改善として、この技術の有望性を示す。
【００４７】
膵臓保存における本方法の２つの応用は以下の通りである。すなわち、（１）ドナープールを増大させ臓器および膵島の調達のロジスティックスを容易にするために、８時間の現行基準を超えて低温保存時間を延長することを目標とする（ドナー臓器摘出から膵島分離までの）低温保存を通じての酸素気体潅流、ならびに（２）膵島加工施設において膵島の収量および品質を高める回収方法としての、標準冷蔵（約１２時間のＴＬＭ）をしながらの臓器輸送後の酸素気体潅流（約３時間）である。これらの２つの応用は、標準ドナー由来の膵臓についての膵島の収量および品質ならびに／または貯蔵時間の改善を伴う。一応用において、膵臓は貯蔵時間全体の間気体潅流され、第２の応用において、気体潅流は、標準冷蔵後の回復処置として使用される（膵臓保存では、保存時間と膵島の収量および品質の間にほぼ常にトレードオフがあることに留意されたい）。（同様の膵島の収量および品質における）貯蔵時間の延長は、手順の柔軟性およびより多くの臓器の使用をもたらすことができる。（現行の貯蔵時間における）膵島の高い収量および品質は、個々の移植結果により大きな影響を及ぼすかもしれない。成功すればこれもまたきわめて有用であろう完全に独立した応用の支流は、臓器品質を高めるために、したがって心臓死の範疇に入った後のドナーと引き換えの臓器供給を改善するために、気体潅流を使用することであろう。
【００４８】
ここで、図１を参照すると、組織を含む生物物質の流体潅流システムの第１の実施形態のブロック図が示されており、システムは本発明の教示に従って構成され、一般的には参照番号１１によって表されている。
【００４９】
システム１１は、ガス発生器または気体潅流システム１００と、生物物質容器２００と、プロセスコントローラ３００と、温度制御デバイス４００と、電源５００とを備えていてもよい。
【００５０】
ここで、図２を参照すると、気体潅流システム１００はより詳細に示されており、気体潅流システム１００は電源５００とともに示されている。気体潅流システム１００は電気化学的酸素濃縮器（ＥＯＣ）１０１を備えていてもよい。ＥＯＣ１０１は、その細部が下記により詳細に説明されており、単一の酸素濃縮器セル、または複数の直列もしくは並列接続された酸素濃縮器セルを備えていてもよい。前記１つまたは２以上の酸素濃縮器セルの各々はアノード１０３とカソード１０５とを備えていてもよく、アノード１０３およびカソード１０５はイオン伝導性セパレータ１０７と直接接触し、かつ該セパレータ１０７によって分離されている。セパレータ１０７は、たとえば、ＮＡＦＩＯＮ（登録商標）ＮＲＥ−１１３５膜（Ｅ．Ｉ．ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）などの固体プロトン交換膜（ＰＥＭ）であってもよい。アノード１０３およびカソード１０５は、それぞれ導線１１１−１および１１１−２を用いて電源５００に電気的に連結されていてもよく、また、図示されていない手段によってプロセスコントローラ３００（図２に示されていない。）に連結されていてもよい（気体潅流システム１００の追加的な構成要素が電源５００および／またはプロセスコントローラ３００に連結されてもよいが、これらの接続は明瞭にするために本明細書では示されていない。）。
【００５１】
下記に示すように、ＥＯＣ１０１は大気からの酸素を濃縮するために使用されてもよい。
アノード：２Ｈ２Ｏ←→４Ｈ＋＋４ｅ−＋Ｏ２（純粋）                      ［１］
カソード：Ｏ２（空気）＋４Ｈ＋＋４ｅ−←→２Ｈ２Ｏ                      ［２］
正    味：カソードにおけるＯ２（空気）←→アノードにおけるＯ２（純粋）［３］
【００５２】
ＥＯＣ１０１は、アノード１０３に供給されるべき大量の水を入れておく貯水槽１１３を追加的に備えていてもよい。下記にさらに説明するように、浸透気化膜１１５（これは、たとえば、ＮＡＦＩＯＮ（登録商標）ＮＲＥ−１１３５膜であってもよい。）が貯水槽１１３の底出口とアノード１０３との間に設置されてもよく、浸透気化膜１１５はアノード１０３に気相水を着実に供給するよう機能すると同時に、アノード１０５において製造された酸素が水と混合するのを防止する。換言すると、この配置によって水がアノード１０３に受動的に供給されることができると同時に、製造物である酸素が流れ場の間隙を通り端に沿ってアノードから流出することができる。本蒸気供給システムが、給水中に存在する可能性のある多くの不純物をアノード１０３に供給しないようにするという点において、前述の蒸気供給システムは、対応する液体供給システムと比べて有利であると考えられる。たとえば、水道水が給水として使われる場合、水中にハロゲン、アルカリ金属、アルカリ土類金属、遷移金属元素、有機化合物、および／または微生物が存在する可能性がある。これらの元素、化合物、および／または微生物は、ＥＯＣ１０１の活動中の素子に運ばれると、たとえば、膜汚染または触媒被毒に起因するＥＯＣの性能および効率の劣化をもたらす可能性がある。また、これらの材料は、保存されている生物物質に有害であるかもしれない。浸透気化膜１１５は、ＥＯＣ１０１の活動中の素子とその下流の保存された生物物質へのこれらの種の出入りを効果的に制限して、貯留水の生体内原位置での蒸留を効果的に可能にする。
【００５３】
ＥＯＣ１０１は、一端がカソード１０５に連結され、反対端が貯水槽１１３に連結された回復管１１７を追加的に備えていてもよく、回復管１１７はカソード１０５で製造された水を貯水槽１１３に誘導するために使用される。こうして、水をシステムに添加する必要がある頻度は減少する。
【００５４】
気体潅流システム１００は、さらに、アノード１０３で製造された気体酸素を冷却して乾燥させる手段を備えていてもよい。本実施形態では、前記冷却乾燥手段は、酸素クーラー１２１と、酸素／水セパレータ１２３と、酸素ドライヤーまたは乾燥剤１２５とを備えていてもよい。流体ライン１２７は、一端がアノード１０３の出口に接続され、他端が酸素クーラー１２１の入口に接続されてもよい。加えて、流体ライン１２９は、一端が酸素クーラー１２１の出口に接続され、他端が酸素／水セパレータ１２３の入口に接続されてもよい。加えて、流体ライン１３１は、一端が酸素／水セパレータ１２３の出口に接続され、反対端が酸素ドライヤー１２５の入口に接続されてもよい。その上、流体ライン１３３は、一端が酸素ドライヤー１２５の出口に接続されてもよい。酸素／水セパレータ１２３を排水する流体ライン１３５は酸素／水セパレータ１２３の底に接続されてもよく、排水栓１３７は流体ライン１３５の出口端部に接続されてもよい。
【００５５】
気体潅流システム１００はさらに、大気供給手段を備えていてもよい。本実施形態では、前記大気供給手段は流体ライン１４１を備えていてもよく、流体ライン１４１は流体ライン１４１に大気を取り込む入口１４３を有する。大気から一定の不純物を除去するために、エアフィルター１４５がライン１４１に沿って設置されてもよい。エアフィルター１４５は、粒子を物理的に捕獲する種類のもの（たとえば、１０μ孔径フィルター）であってもよく、または粒子を化学的に捕獲または改変するタイプのもの（たとえば、炭素フィルターまたは過マンガン酸塩フィルター）であってもよい。（カソード１０５に空気を供給するとともにＥＯＣ１０１によって製造された酸素を希釈するために）ライン１４１を通じて空気を送る空気ポンプ１４７は、エアフィルター１４５の下流のライン１４１に沿って設置されてもよい。空気ポンプ１４７の下流では、ライン１４１が流体ライン１４９と流体ライン１５１に分岐してもよい。バルブ１５３は、流量インジケータも含んでいてもよく、ライン１４９に沿って設置されてもよく、ライン１４９の出口はカソード１０５に空気を供給するように適切に設置されている。所望の酸素濃度が得られる可能性があるように、ライン１５１の空気の流れを調節し、そうすることで大気が純酸素と混合されるべき割合を調整するために、ライン１５１に沿って可変流量バルブ１５５が設置されてもよい。この様式で、たとえば、得られる酸素／大気溶液中に存在する酸素の濃度に連続的な調整をしてもよい。これは、たとえば、第１の酸素濃度を有するガスで生物組織を気体潅流し、その後に異なる酸素濃度を有するガスで生物組織を気体潅流したい状況では望ましいかもしれない。バルブ１５５の下流のライン１５１に沿ってチェックバルブ１５７が設置されてもよい。
【００５６】
気体潅流システム１００はさらに、ライン１３３からの純酸素をライン１５１の大気と混合するために、ライン１３３および１５１の出口に連結された流体ライン１６１を備えていてもよい。たとえば、０．２μの孔径を有し得る医用等級フィルター１６３は、ライン１６１に沿って設置されてもよい。フィルター１６３の下流のライン１６１に沿って、酸素濃度センサー１６５が設置されてもよい。圧力変換器／ゲージ１６７および圧力リリーフ弁１６９が、センサー１６５の下流のライン１６１に沿って設置されてもよい。調圧弁１７１が、変換器／ゲージ１６７および弁１６９の下流のライン１６１に沿って設置されてもよい。圧力変換器ゲージ１７３が、ゲージ１７３の下流のライン１６１に沿って設置されてもよい。ゲージ１７３の下流では、ライン１６１がライン１７５−１と、１７５−２と、１７５−３とに分岐してもよい。流量インジケータを有するバルブ１７７−１がライン１７５−１の出口端部に設置されてもよく、流量インジケータを有するバルブ１７７−２がライン１７５−２の出口端部に設置されてもよく、流量インジケータを有するバルブ１７７−３がライン１７５−３の出口端部に設置されてもよい。
【００５７】
それゆえ、図から分かるように、気体潅流システム１００では、保存ガスの３種類までの下流を生物物質に投与することができ、３種類の下流の各々は、独立して調整可能な流量を有する。加えて、３つの下流の酸素濃度および最大供給圧力は、互いに非独立的に関連しているにもかかわらず、調整され得ることも留意されるべきである。各下流にさらなる独立した圧力および流量の調節を提供するために、追加的な調圧弁または質量流量コントローラがこれらの下流に新たに採用されてもよい。その上、所望の場合、気体潅流システムシステム１００は、たとえば、酸素ドライヤー１２５を省くことによって、加湿したガスを製造する能力を有する。
【００５８】
ここで図３を参照すると、ＥＯＣ１０１がより詳細に示されている。図から分かるように、ＥＯＣ１０１は、膜電極アセンブリ１８１を備えていてもよい。アセンブリ１８１はさらに、アノード１０３、セパレータ１０７、およびカソード１０５（これは図３には示されていないが、セパレータ１０７の下側のアノード１０３の反対側に設置される。）を備えていてもよい。ＥＯＣ１０１はさらに、アノードコレクタ１８２およびカソードコレクタ１８３を備えていてもよい。アノードコレクタ１８２は、流体拡散チャンバーを規定する多孔性中心領域１８２−１を有していてもよく、アノード１０３の上面に隣接して設置されてもよく、カソードコレクタ１８３は、流体拡散チャンバーを規定する多孔性中心領域１８３−１を有していてもよく、カソードの底面に隣接して設置されてもよい。ＥＯＣ１０１はさらに、浸透気化膜１１５を備えていてもよく、浸透気化膜１１５はアノードコレクタ１８２の上面に隣接して設置されてもよい。先に説明したように、浸透気化膜１１５は、アノード１０３に対して気相で水を供給するために使用されてもよい。
【００５９】
ＥＯＣ１０１はさらに、環状アノードガスケット１８５およびカソード絶縁体１８６を備えていてもよい。ガスケット１８５は浸透気化膜１１５の上面に隣接して設置されてもよく、カソード絶縁体１８６はカソードコレクタ１８３の底面に隣接して設置されてもよい。ＥＯＣ１０１はさらに、アノードエンドプレート１８７およびカソードエンドプレート１８８を備えていてもよい。アノードエンドプレート１８７は、多孔性中心領域１８７−１を備えていてもよく、アノードガスケット１８５に隣接して設置されてもよく、カソードエンドプレート１８８は、カソード絶縁体１８６に隣接して設置されてもよい。
【００６０】
ＥＯＣ１０１はさらに、カソード入口ポート１８９およびカソード出口ポート１９０を備えていてもよく、入口ポート１８９および出口ポート１９０はカソードエンドプレート１８８に機械的に連結されており、かつカソードに連通している。
【００６１】
ＥＯＣ１０１はさらに、貯水槽１１３を備えていてもよく、貯水槽１１３はアノードエンドプレート１８７の上に設置されてもよい。貯水槽Ｏリング１９１が、アノードエンドプレート１８７に嵌められてもよく、貯水槽１１３からアノードエンドプレートの多孔性中心領域１８７−１へ流れる水に対する流体シールを形成するために使用されてもよい。アノード締付環１９２が貯水槽１１３の周辺フランジ１１３−１に取り付けられてもよい。
【００６２】
ＥＯＣ１０１はさらに、アノード１０３から出る気体酸素を誘導する酸素出口管１９３を備えていてもよく、酸素出口管１９３は一端がアノードエンドプレート１８７に取り付けられており、かつ貯水槽１１３のフランジ１１３−１とアノード締付環１９２とを通って延びる。
【００６３】
ＥＯＣ１０１はさらに、開口１１３−２を介して槽１１３に連結されてもよい注水ポート１９４、開口１１３−３を介して槽１１３に連結されてもよい槽ベントポート１９５−１、および開口１１３−４を介して槽１１３に連結されてもよい水回復ポート１１７を備えていてもよい。
【００６４】
ＥＯＣ１０１はさらに、前述の構成要素の多くを一緒に機械的に連結するハードウェアを備えていてもよい。このようなハードウェアは、複数の単電池組付けボルト１９６と、対応する複数のワッシャ１９７と、ベルヴィルワッシャ１９８と、ナット１９９とを備えていてもよい。
【００６５】
ここで図１に戻って参照すると、容器２００は、当該生物物質を貯蔵するのに好適に寸法を決められていてもよく、容器２００に貯蔵された生物物質内の天然のまたは人工の流体分配網に気体潅流システム１００によって製造された気体酸素溶液を供給するために、バルブ１７７−１、１７７−２、および１７７−３の出口に連結された１つまたは２以上の流体管５５０が通過してもよい開口（図示せず）を備えていてもよい。流体管５５０は、たとえば、一端が生物物質の中へと挿入可能であるカニューレと、一端がカニューレに連結され反対端がバルブ１７７−１〜１７７−３の１つに連結された１本の配管とを備えていてもよい。また、流体管５５０は、一端がバルブ１７７−１〜１７７−３の１つまたは２以上に連結され、その反対端が生物物質の表面上にバルブ１７７−１〜１７７−３の１つまたは２以上から気体出力を流すことができるように適合した１本の配管または同様の構造を備えていてもよい。容器２００の内部には、酸素センサー２０３または他のガスセンサーと温度センサー２０５とが提供されてもよく、センサー２０３および２０５は、それぞれ、酸素、ガス、および／または温度の示度をフィードバック制御用のプロセスコントローラ３００に提供するために使用される。
【００６６】
コントローラ３００は、様々なシステム構成要素を管理しユーザー制御を容易にするためにキーパッド／ＬＣＤユーザーインターフェースを有する組込み型コントローラを備えていてもよい。加工条件の自己調節を可能にするために、一方がＥＯＣ単電池電流用で他方が希釈後酸素濃度用である２つの閉ループ制御が組み込まれてもよい。ＥＯＣ単電池電流（および、それゆえ純酸素製造量）をユーザーの流量および酸素濃度の全必要条件によって必要とされる量に制御するために、電流センサーおよび可変電圧ＤＣ−ＤＣコンバータがソフトウェアベースの比例−積分制御アルゴリズムとともに採用されてもよい。同様に、コントローラ３００はまた、所望の酸素濃度設定値を実現するよう空気／酸素混合の程度を制御するために、酸素センサー２０３およびバルブ１５５とともに使用されてもよい。また、組込み型コントローラは、システム解放（ｓｙｓｔｅｍ  ｒｅｌｉｅｆ）およびマニホールド供給圧力のリアルタイムの示度をユーザーに提供するために使用されてもよい。
【００６７】
温度制御デバイス４００は、たとえば、ＶＥＣＴＯＲ（登録商標）熱電冷却器などの、市販の熱電性の（または、ペルチェの）箱を備えていてもよい。蒸気圧縮冷却または氷もしくは他の冷却材からの物理的冷却が熱電気手段の代わりに使用されてもよいが、容器２００の温度を下げることとは対照的に容器２００に熱を供給したい場合、熱電気手段の双方向ヒートポンピング能力が蒸気圧縮冷却または物理的冷却ではなし得ない方法でこのことを可能にする。受動冷却または能動冷却の場合、非常に効率の良い真空パネルを使うことで容器２００の断熱を高めることができる。
【００６８】
電源５００は、たとえば、２つの２４Ｖニッケル水素（ＮｉＭＨ）バッテリと、これらのバッテリ用充電器と、２４Ｖ  ＤＣ−ＤＣコンバータ（調節用）と、バッテリの重放電を防止するためのバッテリ遮断回路とを収納するバッテリパックモジュールを備えていてもよい。
【００６９】
システム１１を使用するために、保存したい組織を含む生物物質は容器２００に入れられてもよく、気体潅流システム１００の出口１７７−１〜１７７−３の１つまたは２以上は、組織の順行性または逆行性の気体潅流を可能にするために、一端が出口１７７−１〜１７７−３の１つに連通し、反対端が組織の流体分配網（たとえば、血管系、導管系、リンパ系）の適切な門形の中に挿入された流体管５５０によって生物物質に連通してもよい。気体潅流システム１００は、この後、組織を気体潅流するために、電源５００から給電されて、所定のパラメータに従ってプロセスコントローラ３００によって稼働してもよい、加えて、電源５００から給電される温度制御４００は、容器２００および容器２００に含まれる生物物質を事前に選択された温度で維持するために使用されてもよい。酸素センサー２０３および温度センサー２０５は、気体潅流１００および温度制御デバイス４００のフィードバック制御を提供するために、プロセスコントローラ３００とともに使用されてもよい。
【００７０】
ここで図４を参照すると、組織を含む生物物質の流体潅流システムの第２の実施形態の斜視図が示されており、システムは本発明の教示に従って構成されており、一般的に参照番号６００によって表されている（システム６００のいくつかの構成部品は明瞭化または簡略化するために図示されていない）。この実施形態は可搬式システムとして示されている。
【００７１】
システム６００は多くの点でシステム１１に類似しており、システム６００は、気体潅流システム１００と、容器２００と、プロセスコントローラ３００と、温度制御デバイス４００と、電源５００とを備える。システム６００はさらに、断熱されたハウジング６１０を備えていてもよく、ハウジング６１０内には気体潅流システム１００と、容器２００と、プロセスコントローラ３００と、温度制御デバイス４００と、電源５００とが配置されてもよい（ハウジング６１０の内部に配置される構成要素の一部を示すために、ハウジング６１０の側壁は図示されておらず、容器２００の最上部と容器２００を着脱自在に挿入し得る開口６２０とを示すために、ハウジング６１０に着脱自在に取り付けられた断熱蓋は図示されていない。）。何らかの特定の寸法に限定するつもりはないが、ハウジング６１０はピクニック用クーラーと同等の設置面積（たとえば、高さ約３０．５ｃｍ（１２インチ）×奥行き約２５．４ｃｍ（１０インチ）×幅約５５．９ｃｍ（２２インチ））を有していてもよい。システム６００の運搬を容易にするために、キャスター６３０およびハンドル６４０がハウジング６１０に取り付けられてもよい。また、システム６００は、流体を気体潅流システム１００から生物物質に輸送する流体管５５０と同様の流体管（図示せず）を備えていてもよい。
【００７２】
システム６００はさらに、ロギング／診断機能を備えていてもよい。この機能によって、システムユーザーはシステムプロセス示度（回路基板上のコントローラインターフェースでは得られないかもしれない圧力、濃度、温度など）を、貯蔵時間の終了時に外部コンピュータにダウンロードすることによって表示／記録することができるであろう。電力調整回路網、リレー、およびいくつかのセンサートランスデューサはすべて、利用される回路基板に集積化されてもよい。ヒートポンプは、ペルチェ素子を稼働させるために非標準のまたは可変のＤＣ電源を必要とする場合があり、これには電源が適切であることの確認が必要となるであろう。この設計には、オプションのＡＣコンバータおよび回路基板上の電池充電器を使用する、２４時間稼働用の電池設計が含まれてもよい。電池は、リチウムイオン電池よりも安価、安全、かつ便利でありかつ妥当なエネルギー蓄積密度を有するＮｉＭＨ充電式バッテリであってもよい。
【００７３】
ここで図５を参照すると、組織を含む生物物質の流体潅流システムの第３の実施形態のブロック図が示され、システムは本発明の教示に従って構成されており、一般的に参照番号１０００によって表されている。簡素化および明瞭化のために、システム１０００の一部の構成要素は示されておらず本明細書では説明されてもいない。
【００７４】
システム１０００は、気体潅流システム１１００と、液体潅流システム１６００と、切換システム１７００と、容器１２００と、プロセスコントローラ１３００と、温度制御デバイス１４００と、電源１５００とを備えていてもよい。
【００７５】
気体潅流システム１１００と、容器１２００と、プロセスコントローラ１３００と、温度制御デバイス１４００と、電源１５００とは、構造および機能がシステム１１の気体潅流システム１００と、容器２００と、プロセスコントローラ３００と、温度制御デバイス４００と、電源５００とにそれぞれ類似していてもよい。
【００７６】
液体潅流システム１６００は、大量の保存液（「潅流液」）を貯蔵する槽と、潅流液を臓器容器１２００に供給する手段と、潅流液を臓器容器１２００から排出する手段とを備えていてもよい。槽は、静脈内投与用の流体を入れるために使用されるバッグなど、液体含有バッグを備えていてもよい。潅流液を臓器容器１２００に供給する手段は、槽から臓器容器１２００に接続された管を備えていてもよく、それにより潅流液は重力によって管を流れる。潅流液が槽から臓器容器１２００に相互接続管を介して流れる場合、液体潅流システム１６００は容器１２００の高さよりも上にある槽を支持する手段を追加的に備えていてもよい。あるいは、潅流液を槽から容器１２００に相互接続管を介して供給するために、電気的にまたは手動で作動するポンプが使用されてもよい。潅流液を供給する代替手段は、気体潅流システム１１００から槽に接続された管を備えていてもよく、それによって気体潅流システム１１００により加えられたガス圧力が槽内の液体を槽から容器１２００に相互接続管を介して強制的に流す。潅流液を容器１２００から排出する手段は、潅流液を重力、電気的に作動するポンプもしくは手動ポンプ、または気体潅流システム１１００からのガス圧力によって、容器１２００から流出させる管を備えていてもよく、それによって液体はその後、レセプタクルまたはドレーンに集められる。
【００７７】
切換システム１７００は、気体潅流システム１１００と、液体潅流システム１６００と、容器１２００とからきている管に接続するように設計された配管コネクタを備えていてもよい。切換システム１７００はさらに、プロセスコントローラ１３００からの信号によって作動する電気作動型バルブを備えていてもよく、それによって、プロセスコントローラ１３００は容器１２００に供給されている流れが気体潅流システム１１００または液体潅流システム１６００のいずれに由来するかを制御する。あるいは、切換システム１７００は、容器１２００に供給されている流れが気体潅流システム１１００または液体潅流システム１６００のいずれに由来するかをユーザーが手動制御し得る手動バルブを備えていてもよい。あるいは、切換システム１７００は、２以上の電気作動型バルブおよび手動バルブを備えていてもよく、それによって容器１２００に供給されている流れは手動または電動で制御されることができる。
【００７８】
システム１０００はさらに、入口および出口の流れにおける酸素ガスおよび二酸化炭素ガスの濃度をそれぞれ測定するために使用される酸素センサー１２０３および二酸化炭素ガスセンサー１２０７などのガスセンサーを備えていてもよい。ガスセンサーは、気体潅流システム１１００および液体潅流システム１６００の出口の流れに接続されてもよい。また、ガスセンサーは、容器１２００の入口および出口の流れに接続されてもよい。プロセスコントローラ１３００は、ガスセンサー１２０３および１２０７に電気的に接続されてもよく、酸素センサー１２０３および二酸化炭素センサー１２０７の各々に対するデータロギング機能を備えていてもよい。加えて、特定ガスの濃度が規定範囲から外れると警報器または閉止弁を作動させるなどのプロセス決定を行うために、プロセスコントローラ１３００はガスセンサーから収集された信号を使用してもよい。
【００７９】
システム１０００はさらに、容器１２００内の温度を測定する温度センサー１２０５を備えていてもよい。プロセスコントローラ１３００は、温度センサー１２０５に電気的に接続されてもよく、温度センサー１２０５に対するデータロギング機能を備えていてもよい。加えて、容器１２００内の温度が規定範囲内に入りあるいは規定範囲から外れると温度制御デバイス１４００を作動させあるいは停止させるなどのプロセス決定を行うために、プロセスコントローラ１３００は、温度センサー１２０５から収集された信号を使用してもよい。
【００８０】
システム１０００はさらに、液体をガスの流れから分離し、重要なシステム構成要素への汚染物質の流入を防止し、粒子状物質が保存された臓器もしくは組織に入るのを防止し、または液体がガス濃度監視に干渉するのを防止するために使用されるフィルターなど、フィルターを備えていてもよい。フィルターは、気体潅流システム１１００および液体潅流システム１６００の出口の配管アセンブリと、ガスセンサーを接続する配管アセンブリの配管アセンブリと、臓器容器１２００の入口および出口の配管アセンブリとに設置されてもよい。
【００８１】
システム１０００はさらに、管内の液体またはガスの存在を測定するために使用される電気光学センサーを備えていてもよい。電気光学センサーは、容器１２００の入口管および出口管に接続されてもよく、ならびに気体潅流システム１１００および液体潅流システム１６００の出口管に接続されてもよい。プロセスコントローラ１３００は、電気光学センサーによって提供される信号を処理し、切換システム１７００を作動させて気体潅流システム１１００と液体潅流システム１６００とを切り換えるために使用されることができる。
【００８２】
システム１０００は、システム１１に関して先に説明したのと同様の様式で使用されてもよく、２つのシステムの主な違いは、システム１０００の場合、組織を含む生物物質が気体潅流システム１１００を用いて気体潅流される前、間、もしくは後に液体潅流システム１６００からの液体潅流液に浸漬されてもよく、または気体潅流システム１１００を用いて気体潅流される代わりに液体潅流液で潅流されてもよいことである。
【００８３】
ここで図６を参照すると、組織を含む生物物質の液体潅流システムの第４の実施形態の簡略図が示され、システムは本発明の教示に従って構成されており、一般的に参照番号２０００によって表されている。簡素化および明瞭化のために、システム２０００の一部の構成要素は示されておらず本明細書で説明されてもいない。
【００８４】
システム２０００は、気体潅流システム１００と構成および機能が類似していてもよい気体潅流システム２１００を備えていてもよいが、例外は、システム２１００が３つの出口１７７−１〜１７７−３の代わりに１つの出口２１０１を備えていてもよいことである。１本の配管２１０３は、一端が出口２１０１に流体的に接続されてもよく、反対端がバルブ２１０５の１つのポートに接続されてもよい。１本の配管２１０７は、一端がバルブ２１０５の別のポートに流体的に接続されてもよい。配管２１０７の反対端は、コネクタ２１０８に流体的に接続されてもよい。コネクタ２１０８は、コネクタ２１０９に流体的に接続されてもよい。コネクタ２１０９は、さらに、供給カニューレ２１１１の一端に流体的に接続されてもよく、供給カニューレ２１１１の反対端は臓器Ｏの適切な潅流／気体潅流入口に挿入されており、臓器Ｏは容器２１１３内に配置されており、容器２１１３は容器２００または１２００に類似していてもよい。
【００８５】
システム２０００はさらに、液槽２１２１を備えていてもよく、液槽２１２１は静脈内輸液バッグの形態でもよい。槽２１２１は大量の液体潅流液２１２３を含んでいてもよい。１本の配管２１２５は、一端が槽２１２１の出口２１２７に流体的に接続されてもよく、反対端がバルブ２１２９の１つのポートに接続されてもよい。１本の配管２１３１は、一端がバルブ２１２９の別のポートに流体的に接続されてもよい。配管２１３１の反対端は、コネクタ２１３２に流体的に接続されてもよい。コネクタ２１３２は、コネクタ２１０９に流体的に接続されてもよい。
【００８６】
システム２０００はさらに、出口カニューレ２１４１を備えていてもよく、出口カニューレ２１４１は一端が臓器Ｏの適切な潅流／気体潅流出口に挿入されている。出口カニューレ２１４１の反対端は、コネクタ２１４３に流体的に接続されてもよい。
【００８７】
システム２０００はさらに、１本の配管２１５１を備えていてもよい。配管２１５１は一端がコネクタ２１５３に流体的に接続されていてもよく、コネクタ２１５３はコネクタ２１４３に流体的に接続されてもよい。配管２１５１の反対端は、バルブ２１５５の１つのポートに接続されてもよい。１本の配管２１５７はバルブ２１５５の別のポートに流体的に接続されてもよい。
【００８８】
システム２０００はさらに、１本の配管２１７１を備えていてもよい。配管２１７１は、一端がコネクタ２１７３に接続されていてもよく、コネクタ２１７３はコネクタ２１４３に流体的に接続されてもよい。配管２１７１の反対端は、バルブ２１７５の１つのポートに接続されてもよい。１本の配管２１７７は、バルブ２１７５の別のポートに流体的に接続されてもよい。
【００８９】
使用中に、コネクタ２１０８および２１３２はコネクタ２１０９に接続され、コネクタ２１５３および２１７３はコネクタ２１４３に接続され、カニューレ２１１１および２１４１は臓器Ｏに挿入される。潅流液２１２３を用いて臓器Ｏを潅流するために（この潅流は、気体潅流の前、気体潅流の後、気体潅流の間、および／または気体潅流の代わりに実施することが望ましいかもしれない。）、バルブ２１２９および２１５５を開放され、それによって、潅流液２１２３がカニューレ２１１１を通じて臓器Ｏに供給され、臓器Ｏを循環し、カニューレ２１４１を通じて臓器Ｏから排出される。臓器Ｏを保存ガスまたはガス／ガス混合物で気体潅流するために、バルブ２１０５および２１７５が開放され、気体潅流システム２１００が稼働し、それによって、ガスまたはガス／ガス混合物が気体潅流システム２１００からカニューレ２１１１を通じて臓器Ｏに供給され、臓器Ｏを循環し、カニューレ２１４１を通じて臓器Ｏから排出される。理解されるように、保存ガスまたはガス／ガス混合物で同時に気体潅流せずに臓器Ｏを液体潅流液で潅流したい場合、バルブ２１０５および２１７５は閉鎖されるが、バルブ２１２９および２１５５は開放される。逆に、液体潅流液でも潅流せずに臓器Ｏを保存ガスまたはガス／ガス混合物で気体潅流したい場合、バルブ２１２９および２１５５は閉鎖されるが、バルブ２１０５および２１７５は開放される。潅流すると同時に気体潅流して、それによって液体潅流液に解放された臓器Ｏにガスが供給されるようにしたい場合、バルブ２１０５、２１２９、２１５５、および２１７５が開放される。
【００９０】
下記の例は単なる例示であって本発明を限定するものではない。
（実施例）
実施例１：
電気化学的酸素発生による改良された膵島気体潅流酸素化法の実例による説明
膵島分離に及ぼす気体潅流の影響は、５つの臓器の各々を３つの葉に分割し、膵頭部を即時分離のために採取し、膵尾部を気体潅流で６時間保存し、膵体部をＴＬＭで６時間保存することによって試験された。一実験では、保存が２４時間まで延長された。気体潅流システムでは、４０ｃｍ２の活発に触媒される面積を有しかつセパレータ１０７および水浸透気化膜１１５としてＮＡＦＩＯＮ（登録商標）ＮＲＥ−１１２膜を採用するＥＯＣを利用した。アノード１０３およびカソード１０５では、それぞれが４ｍｇ／ｃｍ２負荷量の白金−イリジウム黒触媒および白金黒触媒を有するセパレータ１０７に適用される溶射インクデカールを含んでいた。いずれも２１℃において、ＥＯＣ槽に脱イオン水を、カソードに空気を３００ｃｍ３で供給した場合、このＥＯＣの性能は、８Ａ（２００ｍＡ／ｃｍ２）で０．８４Ｖであり、１２Ａ（３００ｍＡ／ｃｍ２）で０．９３Ｖであった。気体潅流システムはさらに図２に示すように構成された。単一膵葉の気体潅流は、１５〜２２ｃｍ３の４０％酸素および約２０ｍｍＨｇの圧力を使用して行われ、これには０．９４〜１．４ＡのＥＯＣ電流を必要とした。各臓器をその葉に分離する方法は、ドナーのばらつきを排除することによって保存方法の対応のある比較ができるように選定された。５つの臓器の個数が少なかったので、各条件に対して使用される葉を（無作為化するよりもむしろ）標準化することにした。
【００９１】
臓器を調達後および膵島分離直前に肉眼で評価した。すべての葉は、調達後で洗い流しが完全であり、かつ肌理が良好であった。しかしながら、ＴＬＭによって保存された葉と比較すると、気体潅流された臓器は分離中に酵素による膨化を実施する外科医にとって主観的に良好と「見え」て「感じる」（より堅く引き締まっており、より新鮮である）ことが観察された。このことは、分離前に２４時間保存された臓器について特に明白であった。
【００９２】
気体潅流貯蔵による改善を示す第１の重要な観察およびデータは、膵島形態に関連していた。図７（ａ）〜７（ｃ）を参照すると分かるように、気体潅流で保存されたブタ膵臓からは形態学的に最も保存状態の良い膵島が得られ、断片化はＴＬＭ貯蔵されたものから分離された膵島において広範囲に及んでいた（ジチゾンは、膵島内のβ細胞を染色するインスリン染色剤である）。
【００９３】
下記の表１は、気体潅流された臓器からの膵島がＴＬＭ貯蔵されかつ新鮮でさえある（ｔ＝０）臓器からの膵島よりも優れた平均形態学スコアを有していたことを示し、対応のあるｔ検定比較では、その改善度は、気体潅流（ＰＳＦ）保存がＴＬＭを上回り、統計的に有意（ｐ＝０．００８）であった。
表１．分離後０日後の膵島の形態学スコア
０日後の形態学スコア
ブタ膵臓ＩＤ    保存時間    ｔ＝０    ＰＳＦ    ＴＬＭ
――――――――――――――――――――――――――
Ｐ６４７          ６時間              ３．０    ２．０
Ｐ６４８          ６時間    ７．０    ７．５    ７．０
Ｐ６４９          ６時間    ５．０    ７．５    ６．０
Ｐ６５０        ２４時間    ６．０    ６．０    ４．０
Ｐ６５６          ６時間    ６．０    ９．０    ７．０
―――――――――――――――――――――――――――
平均                        ６．０    ６．６    ５．２
標準偏差                  ０．８２    ２．３    ２．２
対応のあるｔ検定による比較    ０．１３４｜０．００８６
【００９４】
全体として、気体潅流保存により貯蔵されたブタ葉からの膵島は、調達直後に分離された膵島またはＴＬＭで貯蔵された葉からの膵島よりも優れた形態を示した。図８は、様々な方法によって保存されたブタ膵臓からの膵島の量および質の様々な測定結果を要約したものである。酸素消費量（ＯＣＲ）測定は、膵島品質評価用の迅速、単純かつ定量的な期待されるアッセイであることが示されており（非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２８、非特許文献２９、及び、非特許文献３０参照）、標準膵島等価計数、ＤＮＡ測定、および断片化評価とともに本研究における尺度の１つとして実施された。図８に呈示する尺度を下記に簡単に定義する。
【００９５】
０日後ＩＥ収量：消化した組織１ｇ当たりの計数による膵島当量。膵島当量（ＩＥ）は１５０μｍ径球の体積単位に等しい体積単位である。
【００９６】
２日後ＩＥ回収率％：０日後と比較した２日後の計数による％ＩＥ（２日後の計数は０日後のＩＥ収量にＩＥ回収率％を乗じた値になる）。
【００９７】
２日後ＯＣＲ／ＤＮＡ：膵島酸素消費量（ＯＣＲ）（ｎｍｏｌ／分）は生存膵島数の量の尺度であり、ＤＮＡ（ｍｇ）は膵島総数の尺度であり、ＯＣＲ／ＤＮＡはしたがって、生存膵島数と膵島総数の比であり、膵島生存能力の尺度である。
【００９８】
２日後ＯＣＲ量：消化した組織の重量（ｇ）当たりの生存膵島組織の量［膵島ＯＣＲ（ｎｍｏｌ／分）］
【００９９】
２日後断片化比：ＤＮＡ測定（１ＤＮＡ  ＩＥ＝１０．４  ｎｇ  ＤＮＡ）と計数によるＩＥとから計算された膵島当量の割合。調製物の品質の測定。断片化された膵島が移植に耐えてインスリンを提供する可能性が低いという兆候がある。
【０１００】
２日後ＩＥに基づくＯＣＲ量：断片化されていない膵島についてのＯＣＲ量（ＯＣＲ／消化された組織ｇ）。
【０１０１】
図から分かるように、基本的な気体潅流貯蔵結果は、即時分離およびＴＬＭ貯蔵により得られた結果よりも優れていた。しかしながら、膵臓の数が少ないこととドナー間（および／または分離間）のばらつきが本質的に大きなことに起因して、ほとんどの差は統計的に有意でなかった。生存能力の尺度であるＯＣＲ／ＤＮＡは、ＴＬＭと比較して、２日間培養の後の気体潅流では一貫して高く、６時間保存について統計的に有意である傾向（ｐ＝０．０９０、ｎ＝４）が、ならびに６時間保存および２４時間保存がひとまとめにされたものについては統計的有意性（ｐ＝０．０３６、ｎ＝５）が得られた。図８の最後の列は計数された膵島（ＩＥ計数を用いて計算された。）に関連するＯＣＲ量における気体潅流の優位性を示しており、ＯＣＲ量は培養後の全生存無傷膵島組織の尺度である。この優位性は、気体潅流で観察される膵島断片化が低いことに一部は起因しており、ＤＮＡ  ＩＥ（１  ＤＮＡ  ＩＥ＝１０．４ｎｇのＤＮＡ）とＩＥ計数の比で表される。この断片化は、図９（ａ）〜９（ｃ）から分かるように、膵島計数サンプルから撮影した顕微鏡写真に反映される（ＴＬＭ保存した膵臓（図９（ａ））における多くの核濃縮した核（矢印）がアポトーシス性または壊死性の細胞死を示すことに留意されたい。核濃縮した核は、膵島および外分泌組織に存在した。この特徴は、気体潅流された膵臓（図９（ｂ））および対照（ｔ＝０）膵臓（図９（ｃ））ではほとんど明らかでない）。重要なことには、ＴＬＭを上回る気体潅流の利点は、一貫しており、２４時間の保存後にさらに顕著であることが明らかであった（１回の実験）。
【０１０２】
ヌードマウスバイオアッセイ（ＮＭＢ）におけるヌードマウスへの膵島移植は、膵島機能についての「優れた標準」試験である（非特許文献３１、非特許文献３２、非特許文献３３、及び、非特許文献３４参照）。予算と膵島の入手とが認められたので、気体潅流後の５回のブタ膵島分離では実験条件および対照条件にＮＭＢを使用した。すべてのデータが図１０に要約されている。主なデータセットは、糖尿病逆転率であり、正常血糖（血糖＜２００ｍｇ／ｄＬ）を持続するマウスの数を、処置したマウスの数と比較した。移植を目的として無傷膵島のみが（アッセイプロトコルに従って）選択されていることに留意することが重要であり、それゆえ、このアッセイでは、（ＴＬＭ条件の典型である）断片化に起因して失われた（したがって移植されていない）膵島の品質が低いことを考慮していない。こうした制限にもかかわらず、膵臓保存技術としての気体潅流は、種々の条件（貯蔵時間および培養時間）からのデータが分類されると、糖尿病逆転率、糖尿病逆転までの時間、および平均血糖（曲線下面積に相当）の観点から即時分離とＴＬＭの両方に対して都合よく比較された。結果は統計的に有意ではなかったが、平均血糖は気体潅流と即時分離に対して統計的に有意な傾向をやはり示した（２標本ｔ検定、ｐ＝０．０７６）。
【０１０３】
実施例２：
ブタ膵臓およびヒト膵臓に関する電気化学的酸素濃縮器（ＥＯＣ）を用いた
追加的な気体潅流実験
これらの実験では、膵島分離が含まれており、保存されていない葉（対照）からの結果を、二層法（ＴＬＭ）を使用してまたは気体潅流によって２４時間保存された葉からの結果と比較した。その結果、分離に使用されたブタ膵臓の数は７個であり、そのうちの４個を６時間保存の評価に使用し、残りの３個を２４時間保存の評価に使用した。ブタ膵臓で実施した実験に加えて、本発明者らは研究等級のヒト膵臓を入手することができ、この膵臓は気体潅流技術を試験するために利用した。いくつかの重要な発見は以下の通りである。すなわち、（１）電気化学的に発生した酸素を用いた気体潅流での２４時間保存では、ＴＬＭでの２４時間貯蔵と比べて優れた結果が得られ（図１１および１２参照）、（２）ヒト膵臓の気体潅流は実現可能であり、ブタ膵臓の気体潅流ほど外科的に複雑ではない。加えて、ヒト膵臓の気体潅流は、膵臓を２分割すると膵臓の一部分で達成されることができる。この実証は、今後の研究において同じ臓器を使って、気体潅流保存とＴＬＭの間、または気体潅流保存と保存なしの間の直接的な対応のある比較が可能となるので重要である。
【０１０４】
一実験では、膵島分離に及ぼす気体潅流の影響は、各ブタ臓器を３つの葉に分割し、膵頭部を即時分離用とし、膵尾部を気体潅流で２４時間保存し、膵体部をＴＬＭで２４時間保存することによって試験された。各臓器をその葉に分離する方法は、ドナーのばらつきを排除することによって保存方法の対応のある比較ができるように選定された。サンプルの個数が少なかったので、各条件に使用される葉を（無作為化するよりもむしろ）標準化することにした。本発明者らのブタ分離データベース（合計約６５０回）からのデータは、膵臓組織１ｇ当たりの期待される膵島収量に３つの葉の間で差がないことを示している。
【０１０５】
調達直後（ｔ＝０）に収集された臓器サンプルと２４時間気体潅流の後に収集された臓器サンプルと間に組織像の顕著な差は見られなかった。しかしながら、ＴＬＭで保存された組織は、特に２４時間保存後の気体潅流されたサンプルと比較して、図７（ａ）〜７（ｃ）に見られるように核濃縮した核の多発を呈した。
【０１０６】
図１１は、様々な方法によって保存されたブタ膵臓からの膵島の量と質の様々な尺度（平均値および標準偏差）を要約したものである。対応のある両側ｔ検定に基づいて、気体潅流は、２日後のＩＥ回収（ｐ＝０．０１１、ｎ＝２）および２日後のＯＣＲ／ＤＮＡ（ｐ＝０．０１１、ｎ＝３）についてＴＬＭよりも有意に優れていた。すべてのパラメータの平均値は気体潅流に関してより良い結果を示唆したが、いずれの尺度においても即時分離と気体潅流との間に統計的に有意な差はなかった。図１２は、ＴＬＭ結果を２４時間保存後の気体潅流の百分率として要約したものである。加えて、気体潅流された葉と対照葉（貯蔵なし）とから分離された膵島を、培養後に糖尿病性無胸腺ヌードマウスに移植した。ＴＬＭによって貯蔵された葉では、培養後にヌードマウスに移植し得る十分な膵島は得られなかった。初期の結果（移植５日後）によると、２４時間気体潅流された葉から得られた培養済み膵島を移植した４匹のマウスのうちの３匹は２００ｍｇ／ｄＬ未満の血糖を有していた（糖尿病の逆転を示唆している。）が、保存されていない対照葉から分離された膵島を移植した３匹のマウスの１匹しか２００ｍｇ／ｄＬ未満の血糖を有さなかった。
【０１０７】
前述した本発明の実施形態は単なる例示を意図するものであり、当業者は本発明の趣旨から逸脱することなく本発明の実施形態に対して多くの変更および修正を行うことができるものとする。こうした変更および修正はすべて、添付の特許請求の範囲で定められる本発明の範囲内あるものとする。
【符号の説明】
【０１０８】
１００  気体潅流システム
１０３  アノード
１０５  カソード
１４３  大気
２００  容器
２０３  酸素センサー
２０５  温度センサー
３００  プロセスコントローラ
４００  温度制御デバイス
５００  電源
５５０  流体管
１１００  気体潅流システム
１２００  容器
１２０３  酸素センサー
１２０５  温度センサー
１２０７  二酸化炭素センサー
１３００  プロセスコントローラ
１４００  温度制御デバイス
１５００  電源
１６００  液体潅流システム
１７００  切換システム
【図１】
0005650191.tif 000002
【図２】
0005650191.tif 000003
【図３】
0005650191.tif 000004
【図４】
0005650191.tif 000005
【図５】
0005650191.tif 000006
【図６】
0005650191.tif 000007
【図７ａ】
0005650191.tif 000008
【図７ｂ】
0005650191.tif 000009
【図７ｃ】
0005650191.tif 000010
【図８】
0005650191.tif 000011
【図９ａ】
0005650191.tif 000012
【図９ｂ】
0005650191.tif 000013
【図９ｃ】
0005650191.tif 000014
【図１０】
0005650191.tif 000015
【図１１】
0005650191.tif 000016
【図１２】
0005650191.tif 000017