(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１及び第２のタグ配列を有するＤＮＡ断片のライブラリーを作製し、且つシークエンシングする方法であって：
（ａ）標的ＤＮＡを提供する工程；
（ｂ）複数のトランスポソーム複合体を提供する工程であって、
（１）少なくとも１つの前記トランスポソーム複合体が、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼと、Ｔｎ５型トランスポゾン末端配列及び第１のタグ配列を含む少なくとも第１のポリヌクレオチドとを含み、
（２）少なくとも１つの前記トランスポソーム複合体が、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼと、Ｔｎ５型トランスポゾン末端配列及び第２のタグ配列を含む少なくとも第２のポリヌクレオチドとを含む、
工程； 
（ｃ）前記標的ＤＮＡと前記トランスポソーム複合体を、前記標的ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡ断片へと断片化されて且つ前記第１又は第２のポリヌクレオチドの１つが前記ＤＮＡ断片の各末端に連結される条件下でインキュベートする工程；及び
（ｄ）前記ＤＮＡ断片を同時に１回のマルチプレックス形態でシークエンシングする工程、
を含み、それにより、前記第１及び第２のタグ配列を有するＤＮＡ断片のライブラリーが作製される、方法。
【請求項２】
工程（ｂ）（１）の前記トランスポソーム複合体が、前記第１のポリヌクレオチドを２つ含み、工程（ｂ）（２）の前記トランスポソーム複合体が、前記第２のポリヌクレオチドを２つ含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）（１）及び工程（ｂ）（２）の前記トランスポソーム複合体が異なる配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記トランスポソーム複合体が、ヘアピンを形成する１つのポリヌクレオチドを含み、前記ヘアピンが、必要に応じて、扇形のＤＮＡ断片を作製するために切断することができる切断可能な部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ｄ）前記ＤＮＡ断片のライブラリーを、（１）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ組成物、（２）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼ及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼのブレンド、（３）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ組成物、（４）鎖置換活性及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の両方を有さないＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼ、又は（５）リガーゼ及びライゲーションオリゴヌクレオチドと、前記ＤＮＡ断片中の任意の一本鎖ギャップが埋められる条件下でインキュベートする工程を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのタグ配列が第１のシークエンシングタグドメインを含み、前記方法が、（ｄ）前記第１のシークエンシングタグドメインに対応する部分を含む第１のシークエンシングプライマーを提供する工程、を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのタグ配列が第１の増幅タグドメインを含み、前記方法が、（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ及び前記第１の増幅タグドメインに対応する部分を有する第１のプライマーを提供する工程；及び（ｅ）前記ＤＮＡ断片を増幅する工程、を更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記増幅工程（ｅ）が、鎖置換増幅反応、ローリングサークル増幅反応、及びループ仲介増幅反応からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのタグ配列が、（１）制限部位ドメイン、（２）転写プロモーター配列、（３）アドレスタグドメイン、（４）捕捉ドメイン、又は（５）検出タグドメインのいずれかを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
複数のトランスポソーム複合体を含む、マルチプレックスシークエンシングのための組成物であって、
（１）少なくとも１つの前記トランスポソーム複合体が、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼと、Ｔｎ５型トランスポゾン末端配列及び第１のタグ配列を含む少なくとも第１のポリヌクレオチドとを含み；
（２）少なくとも１つの前記トランスポソーム複合体が、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼと、Ｔｎ５型トランスポゾン末端配列及び第２のタグ配列を含む少なくとも第２のポリヌクレオチドとを含む、
組成物。
【請求項１１】
前記（１）の前記トランスポソーム複合体が前記第１のポリヌクレオチドを２つ含み、前記（２）の前記トランスポソーム複合体が前記第２のポリヌクレオチドを２つ含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記（１）及び（２）の前記トランスポソーム複合体が異なる配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記トランスポソーム複合体が、ヘアピンを形成する１つのポリヌクレオチドを含み、前記ヘアピンが、必要に応じて、切断可能な部位を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組成物を含むキットであって、切断酵素組成物を更に含むキット。
【請求項１５】
請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組成物を含むキットであって、（１）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ組成物、（２）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼ及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼのブレンド、（３）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ組成物、（４）鎖置換活性及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のどちらも有さないＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼ、又は（５）リガーゼ及びライゲーションオリゴヌクレオチド、を更に含む、キット。
【請求項１６】
請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組成物を含むキットであって、少なくとも１つの前記タグ配列が第１のシークエンシングタグドメインを含み、前記第１のシークエンシングタグドメインに対応する部分を含む第１のシークエンシングプライマーを更に含む、キット。
【請求項１７】
前記第１のプライマーが、シークエンスタグドメインを含むシークエンシングアダプターを更に含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組成物を含むキットであって、少なくとも１つの前記タグ配列が第１の増幅タグドメインを含み、ＤＮＡポリメラーゼ及び前記第１の増幅タグドメインに対応する部分を有する第１のプライマーを更に含む、キット。
【請求項１９】
少なくとも１つの前記タグ配列が、（１）制限部位ドメイン、（２）転写プロモーター配列、（３）アドレスタグドメイン、（４）捕捉ドメイン、又は（５）検出タグドメインのいずれかを含む、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
標的ＤＮＡを更に含む、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００８年１０月２４日付で提出された米国仮出願第６１／１０８，３２１号、２００８年１０月２４日付で提出された同第６１／１０８，３２６号、２００８年１０月２４日付で提出された同第６１／１０８，３２９号、２００９年２月２５日付で提出された同第６１／１５５，４３１号、及び２００９年６月５日付で提出された同第６１／１８４，５３０号の優先権を主張するものであり、これらそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
技術分野
本発明は、トランスポザーゼ及びトランスポゾン末端組成物を用いて標的ＤＮＡからタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する方法、組成物、及びキットに関する。作製されたｓｓＤＮＡ断片は、例えばハイスループット、大規模並列、及び／又はマルチプレックスＤＮＡシークエンシングを初めとする種々の用途のための鋳型として有用である。
【背景技術】
【０００３】
二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的分子から断片化及びタグ化されたＤＮＡ分子のライブラリーを作製することが望まれる種々の方法及びアプリケーションがある。多くの場合、その目的は、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼ反応の鋳型（例えばタグにプライマーをアニーリングさせてポリメラーゼで伸張させるＤＮＡシークエンシング反応中又はＤＮＡ若しくはＲＮＡの増幅反応中の鋳型）として使用するためにより大きなｄｓＤＮＡ分子からより小さな一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子（例えばＤＮＡ断片）を作製することである。
【０００４】
近年まで、ほとんどのＤＮＡシークエンシングは、シークエンシングするＤＮＡを鋳型として用いてポリメラーゼでプライマーを伸張させるサンガージデオキシ連鎖停止シークエンシング法を用いて行われていた。全ての標準的ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）の混合物及び４種類の連鎖停止ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、又はｄｄＴＴＰ）の１つをそれぞれ用いて４つの反応を行い、各反応はプライマーから始まりジデオキシヌクレオチドで終了する入れ子状態の連鎖停止断片の集合を生成する。これらの連鎖停止ＤＮＡ分子を電気泳動でサイズに従って分離すると、ｄｄＮＴＰが取り込まれた順番が鋳型ＤＮＡの配列を反映する。これらの方法を用いて、プライマー部位から数百又は千塩基の配列を決定することができる。より大きな配列を決定するためには、多くのクローンから重複する情報をより大きな配列へとつなぎ合わせる必要がある。
【０００５】
これらの従来の方法は大量のＤＮＡ鋳型を必要とし、大量の非鋳型ＤＮＡが存在するとこれらの方法では良い結果が得られないため、サンガージデオキシシークエンシングはクローニング又は増幅されたＤＮＡを用いて行われることが多い。例えば、１９９０年に正式に開始され、２０００年にヒトゲノム配列の「大まかなドラフト（ｒｏｕｇｈ  ｄｒａｆｔ）」の完了宣言をし、２００６年に最後のヒト染色体の配列を公開すると共に終了したヒトゲノムプロジェクトの間に行われたシークエンシングのほとんどは、ＤＮＡベクターにクローニングされたＤＮＡ分子をそれぞれが保有する宿主細菌の集合からなるゲノムライブラリーの使用に基づいており、それぞれがゲノムＤＮＡのピースを保有するＤＮＡクローン全てのコレクションでゲノム全体を表し、これは退屈で繰り返しの多いプロセスであり、多数のＤＮＡクローン（例えばＢＡＣクローン）が構築及び保存され、その後、しばしばサブクローニングことでより小さいＤＮＡクローンを作製し、これをシークエンシング鋳型として使用した。しばしば、これらの方法で使用されるプライマーは、クローニングされた未知のＤＮＡ中にシークエンシング反応中に伸張するように、ベクターとアニーリングするように設計された。このアプローチは、多くの異なるクローンの分析に同じプライマーセットを用いることができる。
【０００６】
ヒトゲノムシークエンシングプロジェクトに必要なサブクローニングの量を減らすために時々使用された方法の１つが「インビトロ転位」であった。インビトロ転位法では、トランスポゾンと呼ばれる可動遺伝要素を用いて、既知配列のＤＮＡの小さなピースを未知ＤＮＡの中に挿入する。方法は、ゲノムライブラリーからのＤＮＡクローンとトランスポゾンをＤＮＡクローン中にトランスポゾンが１つだけ挿入される条件下でインキュベートする工程、次いで、インビトロ転位反応物で大腸菌細胞を形質転換する工程、抗生物質耐性マーカー等のトランスポゾンにコードされるマーカーを含む細胞をセレクションする工程を含む。したがって、インビトロ転位反応は、親ＤＮＡクローンから、それぞれのＤＮＡクローン中の異なる位置にトランスポゾンが挿入された「トランスポゾン挿入クローン」のライブラリーを生成する。次いで、各ＤＮＡ鎖に異なるプライマーを用いて、各トランスポゾン末端から外側に各挿入クローンをシークエンシングする。前述したように、種々の挿入クローンから得られた配列を重複させることで親ＤＮＡクローンの完全配列を構築する。ヒトゲノムプロジェクトへのこのトランスポゾン挿入法の使用例は非特許文献１〜３に記載されている。ヒトゲノムプロジェクトにインビトロ転位プロセスが使用されたことで、ゲノムＤＮＡクローン及びゲノムＤＮＡにコードされるｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡクローンの両方のシークエンシングの完了が早まった。しかし、このインビトロ転位法の欠点の１つは、大腸菌細胞の形質転換ステップ、トランスポゾンが挿入された大腸菌コロニーのセレクションステップ、次いでシークエンシングのためにトランスポゾン挿入クローンからＤＮＡを単離するステップが必要なため、完全にインビトロでないことである。
【０００７】
トランスポゾン挿入クローンを得るためにインビトロ転位反応物で大腸菌細胞を形質転換して大腸菌細胞を選択培地で培養する必要をなくすために、Ｔｅｋｎａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（特許文献１）は、シークエンシング鋳型のセレクションにインビトロ転位反応及びＰＣＲ増幅反応を含む完全にインビトロなトランスポゾンをベースとした方法を開発した。Ｔｅｋｎａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．によれば、方法で試験に用いたＤＮＡ又は標的ＤＮＡは、数塩基対から４万塩基対にわたり得、更に長いＤＮＡセグメントを標的ＤＮＡとして用いなかった唯一の限定要因はＰＣＲ等の増幅反応で更に長いセグメントを増幅することができないことであった。したがって、この方法を用いてシークエンシング鋳型を作製するいくつかの実施形態では、約４万Ｋｂまでの調べるＤＮＡ又は標的ＤＮＡを最初にインビトロ転位反応にかけ、その後、第１のＰＣＲプライマーとして、標的ＤＮＡ中の既知配列に相補的な固定プライマー、あるいは標的ＤＮＡがベクターにクローニングされている場合、ベクター中の配列に相補的な固定プライマーを用い、第２のＰＣＲプライマーとして、標的ＤＮＡが連結されているトランスポゾン末端の配列に相補的な選択的プライマーに、必要に応じて更に３’末端に既知の１〜１０ヌクレオチドを付加して用い、ＰＣＲで増幅する。別の実施形態では、ＰＣＲ増幅ステップに２つの選択的プライマーを用い、その少なくとも１つは３’末端に既知の更なる１〜１０ヌクレオチドを有する。Ｔｅｋｎａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．の方法は、トランスポゾンが挿入されたＤＮＡ分子のセレクションに大腸菌細胞を用いる必要がないため、サンガー・シークエンシングにある程度の利点を付与する。しかし、これらの方法は、４万Ｋｂまでの標的ＤＮＡサイズに限定され、固定プライマー又は選択的プライマーを使用するので、この方法は標的ＤＮＡが示す配列の一部だけを示すＤＮＡ分子を選択する。したがって、これらの方法はサンガー・シークエンシングには有用であるが、大規模並列形態又はマルチプレックス形態を用いて１回のシークエンシング・ランで数百万までのシークエンシング鋳型から配列データを作製することができるより新しい「次世代」ＤＮＡシークエンシング法のシークエンシング鋳型の作製には適していない。
【０００８】
次世代シークエンシングのプラットフォームとしては、４５４ＦＬＸ（商標）又は４５４  ＴＩＴＡＮＩＵＭ（商標；ロシュ社）、ＳＯＬＥＸＡ（商標） Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（イルミナ社）、ＨＥＬＩＳＣＯＰＥ（商標）Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ヘリコスバイオサイエンス社（Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びＳＯＬＩＤ（商標）ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）／アプライドバイオシステムズ社製）機器）、並びにインテリジェントバイオシステムズ社（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びパシフィックバイオシステムズ社（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等の会社が開発中のその他のプラットフォームが含まれる。配列情報が作製される化学反応は種々の次世代シークエンシング・プラットフォームで異なるが、それらは全て、非常に多数のシークエンシング鋳型に同時にシークエンシング反応を行い配列データを作製するという特徴を共有する。一般的に、これらのシークエンシング反応で得られるデータは全て、スキャナーで収集され、次いでコンピュータ及び強力なバイオインフォマティクスプログラムを用いてアセンブルされて解析される。これらのシークエンシング反応は、「大規模並列」又は「マルチプレックス」形式で行われ、読まれ、アセンブルされ、解析される。これらの機器の大規模並列という性質は、どのような種類のシークエンシング鋳型が必要であるか及びこれらの強力な機器から可能な限り多くのシークエンスデータを得るためにそのようなシークエンシング鋳型をどのように作製するかについて、考え方の転換を要求する。したがって、大腸菌中のＤＮＡクローンのゲノムライブラリーを必要とするのではなく、試料中の標的ＤＮＡから作製したＤＮＡ断片のコレクション又は集合を含むＤＮＡ断片ライブラリーを作製するインビトロ系という観点から考えることが現在必要であり、コレクション又は集合に含まれるＤＮＡ断片全ての組合せにより、ＤＮＡ断片の作製に用いた標的ＤＮＡの配列を定性的及び／又は定量的に表す配列が示される。実際、場合によっては、配列決定された各断片の起源（ｓｏｕｒｃｅ）が同定できるように異なるアドレスタグ又はバーコードでそれぞれが標識された複数のゲノムＤＮＡ断片ライブラリーからなるＤＮＡ断片ライブラリーの作製という観点から考える必要がある。
【０００９】
一般的に、これらの次世代シークエンシング法では、ゲノムＤＮＡ又は（ＲＮＡから調製された）二本鎖ｃＤＮＡをより小さなｓｓＤＮＡ断片に断片化し、ｓｓＤＮＡ断片の少なくとも一方の鎖、好ましくは両方の鎖にタグを付加する必要がある。いくつかの方法では、タグはＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡシークエンシングのプライミング部位を提供する。いくつかの方法では、（例えば、これらの方法の一部で用いるエマルションＰＣＲ増幅の前に；例えば特許文献２に記載の方法を用いて）タグはビーズ等の表面上に断片を捕捉するための部位も提供する。ほとんどの場合、次世代シークエンシングの鋳型として用いるＤＮＡ断片ライブラリーは、５’及び３’がタグ化されたＤＮＡ断片すなわち「ジタグ化（ｄｉ−ｔａｇｇｅｄ）ＤＮＡ断片」を含む。一般的に、次世代シークエンシング用のＤＮＡ断片ライブラリーを作製する現行の方法では、ソニケーター、噴霧器、又はヌクレアーゼを用いて、シークエンシングしたい標的ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡの逆転写後の二本鎖ｃＤＮＡを含む標的ＤＮＡ）を断片化し、断片の５’及び３’末端にアダプター又はタグからなるオリゴヌクレオチドを（例えばライゲーションにより）連結する。
【００１０】
世界で最も大きなゲノムセンターの１つであるウェルカム・トラスト・サンガー研究所（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で使用されているワークフローに示されているように、（例えば、非特許文献４に記載されているように）次世代シークエンシング鋳型を作製するための現行の方法は複数の問題点があり、非効率的である。例えば、Ｑｕａｉｌ  ｅｔ  ａｌ．は、シークエンシングのためにゲノムＤＮＡを噴霧化すると、ＤＮＡの質量が半減し、イルミナ社のＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いたシークエンシングに望ましい約２００ｂｐのサイズ範囲の断片からなるのは元々のＤＮＡの約５％だけであることを見出している。彼らは、「焦点適応超音波（ａｄａｐｔｅｄ  ｆｏｃｕｓｅｄ  ａｃｏｕｓｔｉｃ）」と呼ばれる代替法で断片化ＤＮＡの収率が高くなり、元々のＤＮＡの約１７％が所望される２００ｂｐサイズ範囲の断片からなることを見出したが、このプロセスでさえ、試料又は標的ＤＮＡの点で不経済である。更に、得られたＤＮＡ断片はしばしば、ゲル電気泳動によるサイズ選択及びサイズ選択されたＤＮＡ断片をタグ化する追加的ステップを必要とし、これは困難且つ手間及び時間がかかり、費用も高い。
【００１１】
したがって、次世代シークエンシングで使用するための二本鎖ＤＮＡの断片化及びタグ化に現在用いられている方法の多くは、ＤＮＡを無駄にし、断片化のために高価な機器を必要とし、断片化、タグ化、及びタグ化ＤＮＡ断片の回収の手順が、困難、退屈、非効率的であり、手間、時間、コストがかかり、比較的大量の試料核酸を必要とする。更に、これらの方法の多くで、作製元の試料核酸に含まれる配列を完全に表さないタグ化ＤＮＡ断片が作製される。そこで当該技術分野で必要とされているのが、現行の方法の制限を克服する大規模並列様式のジタグ化ＤＮＡ断片ライブラリーを作製する方法である。
【００１２】
次世代シークエンシング法の一部はシークエンシングプロセスに環状ｓｓＤＮＡ基質を使用する。例えば、それぞれを参照により本明細書に援用するＤｒｍａｎａｃ  ｅｔ  ａｌ．の特許文献３〜９は、大規模並列ＤＮＡシークエンシング用の環状ｓｓＤＮＡ鋳型の作製を開示している。Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｍｅｒｓの特許文献１０は、デジタルＤＮＡ球の作製（例えば、特許文献１０の図８参照）；及び／又は例えば多重置換増幅若しくは全ゲノム増幅による増幅のため（例えば、同文献中の図１７）若しくは増幅された核酸のアレイ（例えば、イルミナ社のＢｅａｄＡｒｒａｙ（商標）；米国カリフォルニア州サンディエゴのイルミナ社）を作製する超分枝ＲＣＡ（例えば、同文献中の図１８）による増幅のため等のゲノムＤＮＡを初めとするＤＮＡの遺伝子座特異的切断及び増幅、を含む方法を開示している。
【００１３】
生体試料のＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、又はプラスミド、ＢＡＣ、フォスミド、若しくはその他のエピソームベクターにクローニングされたＤＮＡを含むエピソームＤＮＡ）から、増幅又はＤＮＡシークエンシング法（Ｄｒｍａｎａｃ  ｅｔ  ａｌ．の特許文献３〜９若しくはＧｕｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｍｅｒｓの特許文献１０に記載の方法又はパシフィックバイオサイエンス社のＴｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．が記載している方法及びそのウェブサイトｗｗｗ．ｐａｃｉｆｉｃｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍに投稿されている方法等）に使用するためのタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片を作製する方法、組成物、及びキットが必要とされている。
【００１４】
更に、全ゲノム増幅等の一部の増幅法ではゲノムＤＮＡの断片化及びタグ化も必要である。これらの方法の一部が、参照により本明細書に援用する非特許文献５（ｓｃｉｏｎｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．ｃｏｍのウェブサイト上）に概説されている。
【００１５】
種々の目的（例えば、研究、診断、及び産業的目的）のためのＤＮＡ特異的標識プローブ（例えば、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）等のための、例えば染色体特異的プローブ、例えば染色体ペイント、又は例えば遺伝子特異的プローブ）を作製するため又は（例えばリアルタイムＰＣＲ、エマルションＰＣＲ、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、比較ゲノムシークエンシング（ＣＧＳ）による）更なる分析のための一生物（例えば臨床試料由来）又は複数の生物（例えば、環境試料由来のメタゲノム標的ＤＮＡ）の全ゲノム又は部分的ゲノムの増幅を初めとする増幅のために、標的ＤＮＡ分子からＤＮＡ断片のライブラリーを作製する改善された方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第６，５９３，１１３号明細書
【特許文献２】米国特許第７，３２３，３０５号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００９００１１９４３号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００９０００５２５２号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００８０３１８７９６号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００８０２３４１３６号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００８０２１３７７１号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２００７００９９２０８号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２００７００７２２０８号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００８０２４２５６０号明細書
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Butterfield, YSN et al., Nucleic Acids Res 30: 2460-2468, 2002
【非特許文献２】Shevchenko, Y et al., Nucleic Acids Res 30: 2469-2477, 2002
【非特許文献３】Haapa, S et al., Genome Res 9: 308- 315, 1999
【非特許文献４】Quail, MA et al, Nature Methods 5: 1005-1010, 2008
【非特許文献５】Whole Genome Amplification, ed. by S. Hughs and R. Lasken, 2005, Scion Publishing Ltd
【００１８】
そこで、標的ＤＮＡから次世代シークエンシング及び増幅法等の核酸分析法に使用するためのタグ化ＤＮＡ断片ライブラリーを作製するより良い、より効率の高い方法が当該技術分野で必要とされている。特別な機器を必要とせず、より容易且つ迅速で手作業の時間が少なく、より少ないＤＮＡ試料及びより少ない体積で行うことができ、断片の一方又は両方の末端のタグ化が効率的であり、作製に用いた試料中の標的核酸を定性的且つ定量的に表すタグ化ＤＮＡ断片が生成される、ＤＮＡ断片ライブラリーの作製方法が必要とされている。
【発明の概要】
【００１９】
本発明は、核酸を処理する方法、組成物、及びキットに関し、特に、トランスポゾンを用いてＤＮＡを断片化及びタグ化する方法及び組成物に関する。本発明の方法、組成物、及びキットは、例えば、次世代シークエンシング法、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等に使用するタグ化ＤＮＡ断片のライブラリー作製に有用である。いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、ゲノム分析、サブゲノム分析、転写産物分析、メタゲノム分析、又はＲＮＡ発現分析のための、任意の起源の任意の目的のｄｓＤＮＡ（ＲＮＡから調製した二本鎖ｃＤＮＡを含む）を含む標的ＤＮＡからの直鎖ｓｓＤＮＡ断片又はタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片（及びその増幅産物）の調製に関する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本発明は、標的ＤＮＡのタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する方法であって、標的ＤＮＡと、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端又は５’部分にタグドメインを有する転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物とを、トランスポザーゼにより転位反応が触媒される条件下でインキュベートする工程であって、標的ＤＮＡが断片化されて複数の標的ＤＮＡ断片が生成され、トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物の転移鎖が複数の標的ＤＮＡ断片のそれぞれの５’末端に連結され、複数の５’タグ化標的ＤＮＡ断片が生成される工程、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は更に、複数の５’タグ化標的ＤＮＡ断片と少なくとも１つの核酸修飾酵素を３’タグが５’タグ化標的ＤＮＡ断片の３’末端に連結されてジタグ化標的ＤＮＡ断片が生成される条件下でインキュベートする工程を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本発明は、標的ＤＮＡの断片をタグ化する方法であって、標的ＤＮＡと、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端又は５’部分にタグドメインを含む転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物とを、トランスポザーゼにより転位反応が触媒される条件下でインキュベートする工程であって、標的ＤＮＡが断片化され、トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物の転移鎖が標的ＤＮＡの断片の５’末端に連結されて５’タグ化標的ＤＮＡ断片が生成される工程、を含む方法を提供する。いくつかの好ましい実施形態では、方法は更に、５’タグ化標的ＤＮＡ断片と核酸修飾酵素を５’タグ化標的ＤＮＡ断片の３’末端に３’タグが連結されてジタグ化標的ＤＮＡ断片が生成される条件下でインキュベートする工程を含む。本方法は如何なる特定の核酸修飾酵素の使用にも限定される。例えば、核酸修飾酵素としては、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、リガーゼ等が含まれる。いくつかの好ましい実施形態では、核酸修飾酵素にＤＮＡポリメラーゼが含まれ、５’タグ化標的ＤＮＡ断片の３’末端の伸張により３’タグが形成される。いくつかの実施形態ではＤＮＡポリメラーゼは鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼを含み、いくつかの実施形態ではＤＮＡポリメラーゼは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性及び／又は５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼである。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本方法に用いられる核酸修飾酵素はリガーゼであり、５’タグ化標的ＤＮＡ断片の３’末端にオリゴヌクレオチドがライゲーションされることで３’タグが形成される。いくつかの実施形態ではリガーゼは鋳型依存性リガーゼを含み、いくつかの実施形態ではリガーゼは鋳型非依存性リガーゼが含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、転移末端はタグドメインを含む。特定の好ましい実施形態では、タグドメインは、制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、及び転写プロモータードメインの１又は複数を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、ロシュ社の４５４Ａ及び４５４Ｂシークエンシングタグ、イルミナ（商標）社のＳＯＬＥＸＡ（商標）シークエンシングタグ、アプライドバイオシステムズ社のＳＯＬＩＤ（商標）シークエンシングタグ、パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシングタグ、ポロネイター・ポロニー社のシークエンシングタグ、又はコンプリート・ゲノミクス社のシークエンシングタグから選択されるシークエンシングタグを含む又はからなるシークエンシングタグドメインである。
【００２４】
いくつかの実施形態は、１又は複数の５’タグ化標的ＤＮＡ断片及び／又はジタグ化標的ＤＮＡ断片の増幅を更に含む。いくつかの好ましい実施形態では、増幅は、ＰＣＲ増幅反応、鎖置換増幅反応、ローリングサークル増幅反応、リガーゼ連鎖反応、転写仲介増幅反応、又はループ仲介増幅反応の１又は複数の使用を含む。本発明の特定の好ましい実施形態では、増幅は、ＤＮＡ断片ライブラリーを含む５’タグ化標的ＤＮＡ断片又はＤＮＡ断片ライブラリーを含むジタグ化標的ＤＮＡ断片の非選択的増幅を含む。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態では、断片又はライブラリーのタグ化に用いるトランスポゾン末端組成物は、核酸配列の少なくとも１つのヌクレオチドが異なる複数の転移鎖を含み、増幅は、５’末端のタグ又はタグドメインの核酸配列に基づくジタグ化ＤＮＡ断片の選択的増幅を含む。別の実施形態では、増幅は、ジタグ化標的ＤＮＡ断片の３’タグに相補的な１種類のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、増幅は、１種類のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる鎖置換増幅反応を含み、オリゴヌクレオチドプライマーは、リボヌクレオチドのみからなるか、プリンリボヌクレオチドのみからなるか、ピリミジン２’−Ｆ−２’−デオキシリボヌクレオチドのみからなり、鎖置換増幅反応は、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ及びリボヌクレアーゼＨを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、増幅は、それぞれが３’末端部分を含む第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を含み、第１のＰＣＲプライマーの少なくとも３’末端部分はジタグ化標的ＤＮＡ断片の３’タグに相補的であり、第２のＰＣＲプライマーの少なくとも３’末端部分はジタグ化標的ＤＮＡ断片の５’のタグ又はタグドメインの少なくとも一部の配列を示す。特定の好ましい実施形態では、第１又は第２のオリゴヌクレオチドプライマーは５’末端部分を含み、第１のプライマーの少なくとも５’末端部分がジタグ化標的ＤＮＡ断片の３’タグに相補的でないか、第２のプライマーの５’部分がジタグ化標的ＤＮＡ断片の５’のタグ又はタグドメインの少なくとも一部の配列を示さない。特に好ましい実施形態では、第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーはそれぞれ５’末端部分を含み、第１のＰＣＲプライマーの少なくとも５’末端部分はジタグ化標的ＤＮＡ断片の３’タグに相補的でなく且つ／又は第２のＰＣＲプライマーの５’末端部分はジタグ化標的ＤＮＡ断片の５’タグドメインの少なくとも一部の配列を示さない。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本発明は、標的ＤＮＡからタグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片の集合を作製する方法を提供する。特定の実施形態では、方法は、標的ＤＮＡと、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端又は５’部分にタグドメインを有し３’部分にトランスポゾン末端を有する転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物とをトランスポザーゼにより転位反応が触媒される条件下でインキュベートする工程を含み、その結果、標的ＤＮＡが断片化されて複数の標的ＤＮＡ断片が生成され、トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物の転移鎖が複数の標的ＤＮＡ断片のそれぞれの５’末端に連結されて、５’タグ化標的ＤＮＡ断片の集合が生成される。これらの方法は更に、５’タグ化標的ＤＮＡ断片を変性させて一本鎖５’タグ化標的ＤＮＡ断片を生成するステップ；及び一本鎖５’タグ化標的ＤＮＡ断片と核酸リガーゼを、一本鎖５’タグ化標的ＤＮＡ断片が分子内ライゲーションされてそれぞれが転移鎖の配列及び標的ＤＮＡの一部の配列を示すタグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片が形成される条件下でインキュベートするステップ、を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、そのような環状一本鎖ＤＮＡを切断することが望ましい。したがって、本発明の方法のいくつかの実施形態では、タグドメインは切断部位の配列又は構造を示し、方法は更に、タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片を、切断酵素組成物を含む少なくとも１つの酵素とインキュベートする工程であって、切断酵素組成物がタグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片を切断してジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片が生成される工程を含む。特定の好ましい実施形態では、切断酵素組成物は制限酵素を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは制限部位の配列を示し、方法は更に、タグドメインに相補的なオリゴヌクレオチドをタグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片にアニーリングさせる工程及び制限部位を認識する制限エンドヌクレアーゼとタグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片をインキュベートする工程を含み、制限エンドヌクレアーゼがタグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片を切断してジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片が生成される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本発明の断片及びライブラリーの増幅が有用である。したがって、いくつかの形態は、タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片及び／又はジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片の１又は複数の増幅を更に含む。特定の好ましい実施形態では、増幅は、それぞれが３’末端部分を含む第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を含み、第１のＰＣＲプライマーの少なくとも３’末端部分は、タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片中又はジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片中の転移鎖の配列の少なくとも一部に相補的であり、第２のＰＣＲプライマーの少なくとも３’末端部分は、タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片中又はジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片中の転移鎖の相補体の少なくとも一部に相補的である。
【００３１】
タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片を増幅するいくつかの実施形態では、第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーのそれぞれが５’末端部分を含み、第１のＰＣＲプライマーの５’末端部分は、タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片中又はジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片中の転移鎖の配列に相補的でなく、第２のＰＣＲプライマーの５’末端部分は、タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片中又はジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片中の転移鎖の相補体に相補的でない。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本発明は、標的ＤＮＡからタグ化環状ＤＮＡ断片の集合を作製する方法であって、標的ＤＮＡと、トランスポザーゼと、５’末端に非転移鎖配列を示し且つ３’末端に転移鎖配列を示し且つタグドメインを含む介在ループ配列を示すオリゴヌクレオチドを含むヘアピントランスポゾン末端組成物とを、オリゴヌクレオチドが分子内ステムループを形成でき且つトランスポザーゼにより転位反応が触媒される条件下でインキュベートする工程であって、それにより、標的ＤＮＡが断片化されて複数の標的ＤＮＡ断片が生成され且つヘアピントランスポゾン末端組成物のオリゴヌクレオチドが複数の標的ＤＮＡ断片のそれぞれの５’末端に連結される工程を含み、５’タグ化標的ＤＮＡ断片の集合が生成される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は更に、断片分子中のギャップを埋める工程及びニックをライゲーションする工程を含む。いくつかの実施形態では、これは、５’タグ化標的ＤＮＡ断片の集合と、鋳型依存性リガーゼと、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性、及び鎖置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼ又はトランスポザーゼ及びヘアピントランスポゾン末端組成物を用いた転位反応後に生じる５’タグ化ＤＮＡ断片中の一本鎖ギャップと同じ長さを単独又は組合せで有する１又は複数のサイズのランダム配列オリゴヌクレオチドとを、５’タグ化標的ＤＮＡ断片中の一本鎖ギャップが埋められ且つ各５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端が標的ＤＮＡの相補的部分を含む別の５’タグ化ＤＮＡ断片の５’末端に連結される条件下でインキュベートすることで、ループ構造中のタグドメイン及び標的ＤＮＡの一部の両方の鎖を含むタグ化環状ＤＮＡ断片を形成する工程、を含む。特定の好ましい実施形態では、埋める工程及び連結工程は、５’タグ化ＤＮＡ断片とＤＮＡポリメラーゼを、各５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端が伸張されて５’タグ化ＤＮＡ断片伸張産物の集合が形成される条件下でインキュベートする工程及び５’タグ化ＤＮＡ断片伸張産物と鋳型依存性リガーゼを５’タグ化ＤＮＡ断片伸張産物がライゲーションされる条件下でインキュベートすることでタグ化環状ＤＮＡ断片を生成する工程を含む。特に好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼが混合物中に提供され、埋める工程及びライゲーションする工程が単一の反応混合物中で行われる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、埋めるステップ及びライゲーションするステップは、５’タグ化ＤＮＡ断片と、１又は複数のサイズのランダム配列オリゴヌクレオチドと、鋳型依存性リガーゼとを、ランダム配列オリゴヌクレオチドがアニーリングして一本鎖ギャップを埋め且つ互いに又は５’タグ化ＤＮＡ断片の隣接する末端にライゲーションされる条件下でインキュベートすることでタグ化環状ＤＮＡ断片を形成することを含む。
【００３４】
好ましい実施形態では、方法は、直鎖ＤＮＡ、ライゲーションされていないランダム配列オリゴヌクレオチド、及び／又は標的ＤＮＡに連結されていないヘアピントランスポゾン末端組成物から前記タグ化環状ＤＮＡ断片を分離する工程を更に含む。特に好ましい実施形態では、タグ化環状ＤＮＡ断片を含む反応混合物をＴ５エキソヌクレアーゼで処理して、ライゲーションされていない断片及びランダム配列オリゴヌクレオチド等の直鎖ＤＮＡを除去する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、タグ化環状ＤＮＡ分子を切断することが望ましい。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、タグ化環状ＤＮＡ断片をループ構造中で切断することで、それぞれの鎖が５’末端にタグの一部を有し且つ３’末端にタグの一部を有する扇形二本鎖ＤＮＡ断片を作製するステップを更に含む。したがって、本発明の方法のいくつかの実施形態では、ループ構造中のタグドメインは切断部位の配列又は構造を示し、方法は更に、タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片を切断酵素組成物を含む少なくとも１つの酵素とインキュベートし、切断酵素組成物によりタグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片が切断されて扇形二本鎖ＤＮＡ断片が生成されることを含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、切断酵素組成物は、Ｎ−グリコシラーゼ及びＡＰエンドヌクレアーゼを含む。特定の好ましい実施形態では、切断酵素はウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ、ＡＰエンドヌクレアーゼ、及びＦＰＧタンパク質から選択されるＮ−グリコシラーゼであり、ＡＰエンドヌクレアーゼは大腸菌エンドヌクレアーゼＩＩＩ又はエンドヌクレアーゼＩＶから選択される。
【００３７】
特定の好ましい実施形態では、切断酵素組成物は制限酵素を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは制限部位の配列を示し、方法は更に、タグドメインに相補的なオリゴヌクレオチドをタグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片にアニーリングさせ、制限部位を認識する制限エンドヌクレアーゼとタグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片をインキュベートする工程であって、制限エンドヌクレアーゼがタグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片を切断して、それぞれの鎖が５’末端にタグの一部を有し且つ３’末端にタグの一部を有する扇形二本鎖ＤＮＡ断片が生成される工程を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態は、扇形二本鎖ＤＮＡ断片を変性させてジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片を作製することを更に含む。
【００３９】
環状及び扇形の実施形態は、ＤＮＡシークエンシング法又は増幅反応の鋳型としてＤＮＡ断片を用いることを含む方法において使用される。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、タグ化環状ＤＮＡ断片、扇形二本鎖ＤＮＡ断片、及び／又はジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片の増幅を更に含む。好ましい実施形態では、増幅は、ＰＣＲ増幅反応、鎖置換増幅反応、ローリングサークル増幅反応、リガーゼ連鎖反応、転写仲介増幅反応、又はループ仲介増幅反応の１又は複数の使用を含む。特に好ましい実施形態では、増幅は、３’末端部分をそれぞれが含む第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を含み、第１のＰＣＲプライマーの少なくとも３’末端部分はタグドメインの少なくとも一部に相補的であり、第２のＰＣＲプライマーの少なくとも３’末端部分はタグドメインの少なくとも一部の配列を示す。いくつかの実施形態では、第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーのそれぞれが５’末端部分を含み、第１のＰＣＲプライマーの５’末端部分はタグ配列に相補的でなく、第２のＰＣＲプライマーの５’末端部分はタグドメインの配列を示さない。
【００４０】
上記のＰＣＲ増幅のいずれかの好ましい実施形態は、第１及び／又は第２のＰＣＲプライマーの５’末端部分がタグドメインを示す増幅を含む。更により好ましい実施形態では、タグドメインは制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、及び転写プロモータードメインの１又は複数を含む。
【００４１】
本明細書に記載の方法の特に好ましい実施形態では、タグドメインは、ロシュ社の４５４Ａ及び４５４Ｂシークエンシングタグ、イルミナ（商標）社のＳＯＬＥＸＡ（商標）シークエンシングタグ、アプライドバイオシステムズ社のＳＯＬＩＤ（商標）シークエンシングタグ、パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシングタグ、ポロネイター・ポロニー社のシークエンシングタグ、又はコンプリート・ゲノミクス社のシークエンシングタグから選択されるシークエンシングタグを含む又はからなるシークエンシングタグドメインである。
【００４２】
いくつかの実施形態では、本発明は、標的ＤＮＡの断片をタグ化する方法であって、標的ＤＮＡと、トランスポザーゼと、５’部分にトランスポゾン末端ではないタグドメインの配列を示し且つ３’部分に転移トランスポゾン末端の配列を示す転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物とをインキュベートする工程であって、標的ＤＮＡが断片化され且つトランスポゾン末端組成物の転移鎖が標的ＤＮＡの断片の５’末端に連結される工程を含み、５’タグ化標的ＤＮＡ断片が生成される、方法を提供する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本発明は、５’タグ化ＤＮＡ断片ライブラリーを作製する方法であって、標的ＤＮＡと、トランスポザーゼと、特定の目的のための１又は複数のタグドメインの配列を５’末端に示し且つ転移トランスポゾン末端の配列を３’部分に示す転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物とを、トランスポザーゼにより転位反応が触媒される条件下でインキュベートする工程であって、標的ＤＮＡが断片化され且つトランスポゾン末端組成物の転移鎖が標的ＤＮＡの断片の５’末端に連結されて５’タグ化標的ＤＮＡ断片が生成される工程を含み、その結果、転位反応により、標的ＤＮＡに由来するＤＮＡ断片ライブラリーを含む複数の５’タグ化標的ＤＮＡ断片が生成される、方法を提供する。
【００４４】
本発明は組成物も提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、タグドメインを含む５’部分及びトランスポゾン末端の転移鎖を含む３’部分を有する合成核酸分子を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、複数の合成核酸分子を含む組成物であって、核酸分子が、少なくとも１つのヌクレオチドが異なるタグドメインを含む５’部分及びトランスポゾン末端の転移鎖を含む３’部分を含む、組成物を提供する。
【００４５】
上記の組成物のいくつかの実施形態では、核酸分子の少なくとも３’部分は二本鎖ＤＮＡである。特定の好ましい実施形態では、トランスポゾン末端はＴｎ５トランスポゾン末端であり、別の実施形態では、トランスポゾン末端はＭｕトランスポゾン末端である。
【００４６】
いくつかの実施形態では、核酸分子組成物のタグドメインは、制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、及び転写プロモータードメインの１又は複数を含む。特に好ましい実施形態では、タグドメインは、ロシュ社の４５４Ａ及び４５４Ｂシークエンシングタグ、イルミナ（商標）社のＳＯＬＥＸＡ（商標）シークエンシングタグ、アプライドバイオシステムズ社のＳＯＬＩＤ（商標）シークエンシングタグ、パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシングタグ、ポロネイター・ポロニー社のシークエンシングタグ、又はコンプリート・ゲノミクス社のシークエンシングタグから選択されるシークエンシングタグを含む又はからなるシークエンシングタグを含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、核酸分子を含む組成物は精製されたトランスポザーゼを更に含む。好ましい実施形態では、トランスポザーゼはＴｎ５トランスポザーゼ及びＭｕトランスポザーゼから選択される。好ましい実施形態では、核酸分子及びトランスポザーゼは混合物中に提供される。特に好ましい実施形態では、混合物は非イオン性界面活性剤を更に含む。更により好ましい実施形態では、非イオン性界面活性剤はＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０及び／又はＴｗｅｅｎ−２０を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本発明は、上記又は本明細書中の別の箇所に記載の組成物のいずれかを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、リガーゼ、ポリメラーゼ、及び／又は増幅反応用の試薬の１又は複数を更に含む。特に好ましい実施形態では、増幅反応用の試薬は、ポリメラーゼ連鎖反応用の試薬を含む。好ましい実施形態では、試薬又は増幅反応及び／又はポリメラーゼ連鎖反応は少なくとも１つのプライマーを含み、特に好ましい実施形態では、試薬は、核酸分子の５’部分のタグドメインの相補体に相補的な３’部分を含むプライマーを含む。好ましい実施形態では、タグドメインは制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、及び転写プロモータードメインの１又は複数を含み、特に好ましい実施形態では、タグドメインは、ロシュ社の４５４Ａ及び４５４Ｂシークエンシングタグ、イルミナ（商標）社のＳＯＬＥＸＡ（商標）シークエンシングタグ、アプライドバイオシステムズ社のＳＯＬＩＤ（商標）シークエンシングタグ、パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシングタグ、ポロネイター・ポロニー社のシークエンシングタグ、又はコンプリート・ゲノミクス社のシークエンシングタグから選択されるシークエンシングタグを含む又はからなるシークエンシングタグドメインを含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本発明のキットは、ＤＮＡシークエンシング反応用の試薬を更に含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本発明は、前述のタグ化トランスポゾン末端核酸分子及び／又はトランスポザーゼ組成物のいずれかと二本鎖標的ＤＮＡとを含む反応混合物を含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本発明は、精製されたトランスポザーゼと複数の合成トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物とを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、トランスポゾン末端組成物はヘアピントランスポゾン末端を含み、いくつかの実施形態では、合成トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物は別個の転移鎖及び非転移鎖を含む。いくつかの好ましい実施形態では、転移鎖は、例えば制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、及び転写プロモータードメインの１又は複数を含む５’タグドメインを含む。特に好ましい実施形態では、タグドメインは、ロシュ社の４５４Ａ及び４５４Ｂシークエンシングタグ、イルミナ（商標）社のＳＯＬＥＸＡ（商標）シークエンシングタグ、アプライドバイオシステムズ社のＳＯＬＩＤ（商標）シークエンシングタグ、パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシングタグ、ポロネイター・ポロニー社のシークエンシングタグ、又はコンプリート・ゲノミクス社のシークエンシングタグから選択されるシークエンシングタグを含む又はからなるシークエンシングタグを含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、精製されたトランスポザーゼを含む組成物は、少なくとも１つのヌクレオチドが互いに異なる少なくとも２つの転移鎖を含む複数の合成トランスポゾン末端を含み、好ましい実施形態では、転移鎖は５’部分及び３’部分を含み、転移鎖の５’部分の少なくとも２つは、少なくとも１つのヌクレオチドが互いに異なるタグを含み、転移鎖の３’部分は同じトランスポゾン末端配列を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、トランスポゾン末端はＭｕトランスポゾン末端を含み、トランスポザーゼはＭｕトランスポザーゼであり、いくつかの好ましい実施形態では、転移鎖の３’部分はＭｕトランスポゾン末端由来の配列を含み、転移鎖の５’部分はＭｕトランスポゾンに由来しない。
【００５４】
いくつかの実施形態では、トランスポゾン末端はＴｎ５トランスポゾン末端を含み、トランスポザーゼはＴｎ５トランスポザーゼであり、いくつかの好ましい実施形態では、転移鎖の３’部分はＴｎ５トランスポゾン末端由来の配列を含み、転移鎖の５’部分はＴｎ５トランスポゾンに由来しない。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＤＮＡ断片ライブラリーを含む組成物であって、ＤＮＡ断片ライブラリーがトランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物の転移鎖由来の配列を含む５’末端を有する標的ＤＮＡ断片を含む、組成物を提供する。好ましい実施形態では、転移鎖由来の配列は５’タグドメインを含み、更により好ましい実施形態では、ＤＮＡ断片ライブラリー-は、トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物の転移鎖に相補的な３’タグを含む標的ＤＮＡ断片を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ断片ライブラリーは標的ＤＮＡの二本鎖断片を含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本発明は、標的ＤＮＡのタグ化環状ＤＮＡ断片を含む組成物であって、タグ化環状ＤＮＡ断片に含まれる部分が、５’末端部分に非転移鎖配列を含み且つ３’末端又は部分に転移鎖配列を含み且つタグドメインを含む介在ループ配列及び標的ＤＮＡの一部の両方の鎖の配列を含む、組成物を提供する。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本発明は、標的ＤＮＡのタグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片を含む組成物であって、トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物の転移鎖配列と標的ＤＮＡの一本鎖部分とを含む、組成物を提供する。好ましい実施形態では、転移鎖配列はタグドメインを含む。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本発明は、標的ＤＮＡの扇形二本鎖ＤＮＡ断片を含む組成物であって、標的ＤＮＡの二本鎖部分を含み、各鎖が、転移鎖配列の少なくとも一部を含む５’末端及び非転移鎖配列の少なくとも一部を含む３’末端を有する、組成物を提供する。
【００５９】
ここで述べた概要及び参照により本明細書に援用する以下の本発明の詳細な説明に本発明の実施形態が記載されている。本発明を特定の実施形態に関連付けて記載したが、特許請求される発明はそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないと理解されるべきである。
【００６０】
添付の図面は本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様を更に説明するために含めるものである。本明細書に記載する特定の実施形態の詳細な説明と共にこれらの図の１又は複数を参照することで本発明が更に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、転位反応における標的ＤＮＡへのトランスポゾンの挿入を示す模式図である。
【図２】図２は、転位反応におけるトランスポゾン末端の挿入による標的ＤＮＡの断片化及びタグ化を示す模式図である。
【図３】図３は、トランスポザーゼにより触媒されるトランスポゾン末端組成物の挿入が２回起こった産物の模式図である。したがって、図の左側に描かれているトランスポザーゼにより触媒されるトランスポゾン末端組成物挿入の産物は、トランスポゾン末端組成物の転移鎖が上の鎖中にある（すなわち、転移トランスポゾン末端が配列５’ＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ３’（配列番号１）を示し、３’末端が標的ＤＮＡに連結されている）トランスポゾン末端の向きを示しており、図の右側に描かれているトランスポザーゼにより触媒されるトランスポゾン末端組成物挿入の産物は、転移鎖が下の鎖中にあるトランスポゾン末端の向きを示している。非転移鎖は配列番号２である。
【図４】図４は、タグ化ＤＮＡ断片ライブラリーの作製に使用するための異なるタグを５’部分に有する転移鎖オリゴヌクレオチドをそれぞれが含む２つの異なるタグ化トランスポゾン末端の例を示す図である。各鎖の３’末端を例えば５’ヌクレアーゼ又は鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて伸張させることでジタグ化ｓｓＤＮＡ断片が生成される。図示した転移鎖配列は配列番号１であり、非転移鎖は配列番号２である。
【図５】図５は、種々のトランスポソーム濃度を用いて生成された５’タグ化ＤＮＡ断片転位産物のサイズ範囲を示すアガロースゲルの画像である。
【図６】図６は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の存在下又は非存在下で種々の温度及び種々の反応バッファーで５分間の反応により生成された５’タグ化ＤＮＡ断片転位産物のサイズ範囲を示すアガロースゲルの画像である。
【図７】図７は、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ活性及び／又は５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて、インビトロ転位反応で得られた５’タグ化ＤＮＡ断片に転移鎖の相補体を連結し、ジタグ化ｓｓＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片のライブラリーを作製する方法の例を示す図である。図示されているように、ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性及び／又は５’→３’エキソヌクレアーゼによりＤＮＡポリメラーゼ伸張産物の下流のアニーリングしているＤＮＡが置換又は消化され、ＤＮＡポリメラーゼによる伸張によって、逆鎖に挿入された第１のタグに相補的なＤＮＡ配列を含む又はからなる第２のタグが連結される。いくつかの実施形態では、転移鎖の相補体に相補的なオリゴヌクレオチドを用いてジタグ化ＤＮＡ断片産物をＰＣＲ増幅する。図示した転移鎖配列は配列番号１であり、非転移鎖は配列番号２である。
【図８】図８は、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ活性及び／又は５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて、インビトロ転位反応で得られた５’タグ化ＤＮＡ断片に第２のタグを連結し、ジタグ化ＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片のライブラリーを作製する方法の例を示す図である。図示されているように、ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性及び／又は５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりＤＮＡポリメラーゼ伸張産物の下流のアニーリングしているＤＮＡが置換又は消化され、ＤＮＡポリメラーゼによる伸張によって、逆鎖に挿入された第１のタグに相補的なＤＮＡ配列を含む又はからなる第２のタグが連結される。いくつかの実施形態では、各第１又は第２のタグ中の異なる配列に相補的なオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして用いてジタグ化ｓｓＤＮＡ断片産物をＰＣＲ増幅する。図示した転移鎖配列は配列番号１であり、非転移鎖は配列番号２である。
【図９】図９は、本発明の実施形態に従って作製したＤＮＡ断片ライブラリーを用いたシークエンシングのリード長、精度、及び１つのコンティグのカバレッジを噴霧化を用いて作製した対照ライブラリーと比較した図である。
【図１０】図１０は、転位反応でタグ化トランスポゾンを挿入することによりロシュ／４５４に適合するライブラリーを作製するための標的ＤＮＡの断片化及びタグ化並びにその後のタグ特異的ＰＣＲ（＋／−バーコード）を示す模式図である。
【図１１】図１１は、図１０に示すロシュ／４５４ＦＬＸに適合するバーコード化シークエンシングライブラリーの調製について、インプットＤＮＡ（レーン２）、５’タグ化ＤＮＡ断片転位産物のサイズ範囲（レーン３）、ＰＣＲ反応産物のサイズ範囲（レーン４）、及び対照反応（レーン５）を示すアガロースゲルの画像である。
【図１２】図１２は、図１０に示す方法と同様な、アンプリコンＤＮＡからのロシュ／４５４ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍに適合するシークエンシングライブラリーの調製について、５’タグ化ＤＮＡ断片転位産物のサイズ範囲（レーン２）、ＰＣＲ反応産物のサイズ範囲（レーン３）、及び対照反応（レーン５）を示すアガロースゲルの画像である。
【図１３】図１３は、転位反応でタグ化トランスポゾン末端を挿入することによりイルミナ／Ｓｏｌｅｘａに適合するライブラリーを作製するための標的ＤＮＡの断片化及びタグ化並びにその後のタグ特異的ＰＣＲ（＋／−バーコード）を示す模式図である。
【図１４】図１４は、図１３に示すようなイルミナ社ＧＡＩＩに適合するバーコード化シークエンシングライブラリーの調製について、インプットＤＮＡ（レーン２）、５’タグ化ＤＮＡ断片転位産物のサイズ範囲（レーン３）、ＰＣＲ反応産物のサイズ範囲（レーン４）、及び対照反応（レーン５）を示すアガロースゲルの画像である。
【図１５】図１５は、従来のライブラリー調製方法のプロセス及び複雑さを本発明の実施形態に係るＤＮＡ断片ライブラリー調製と比較した図である。
【図１６】図１６は、二本鎖標的ＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡ又は二本鎖ｃＤＮＡ）存在下のインビトロトランスポザーゼ反応でトランスポザーゼ（例えば、ここではＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ）及びヘアピントランスポゾン末端組成物（例えば、ここで描かれているのはＥＺ−Ｔｎ５（商標）「ｐＭＥＴＳ−Ｎ−ＭＥＮＴＳ」ヘアピントランスポゾン末端組成物）をインキュベートして得られる本発明の方法の産物の例を示す図である。
【図１７】図１７は、ヘアピントランスポゾン末端組成物を用いた標的ＤＮＡの断片化及びタグ化を示す図である。図１７Ａは、トランスポザーゼにより触媒される標的ＤＮＡへのヘアピントランスポゾン末端組成物の挿入が２回起こることで得られる（多くのそのような産物の集合の中の）産物を示す模式図である。簡潔には、トランスポザーゼ及びヘアピントランスポゾン末端組成物（例えば、ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ及びＥＺ−Ｔｎ５（商標）ヘアピントランスポゾン末端組成物）を含むインビトロトランスポザーゼ反応液中で標的ＤＮＡ（例えば、二本鎖ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを含む）をインキュベートする。挿入された各ヘアピントランスポゾン末端組成物の転移鎖配列はループ構造を介してトランスポゾン末端の非転移鎖配列に連結されている。ループは、制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、転写プロモータードメイン、又は増幅タグドメイン等のあらゆる任意のタグドメインを有し得る。例えば、シークエンシングタグドメインは、ロシュ社の４５４Ａ又は４５４Ｂシークエンシングタグの配列を示し得る。例えば、この図中では、シークエンシングタグドメインは、相補的トランスポゾン末端配列（ステム）の間のループ中に１又は複数の配列を示している。図１７Ｂは、０、０．５、１、２、又は３μＭのｐＭＥＴＳ−Ｎ−ＭＥＮＴＳヘアピントランスポゾン末端組成物及び等モル量のＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ（ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社製）を用いて３３ｍＭ  トリス−酢酸（ｐＨ７．６）、６６ｍＭ  ＫＯＡｃ、及び１０ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２中で３７℃にて２時間インキュベートした後の、１μｇのＴ７  Ｄ１１１のゲノムｄｓＤＮＡの５’タグ化及び断片化産物のＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ染色した１％アガロース電気泳動ゲルを示す図である。
【図１８】図１８は、５’タグ化環状ＤＮＡ鋳型の作製を示す図である。図１８Ａは、方法の一実施形態の模式図である。簡潔には、標的ＤＮＡにヘアピントランスポゾン末端組成物が２つ挿入されることで生じた９ヌクレオチドのギャップを、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性及び鎖置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ）を用い且つギャップ領域中の一本鎖ＤＮＡを鋳型として用いて、生成された５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端を伸張し、次いで、鋳型依存性リガーゼ（例えば大腸菌ＤＮＡリガーゼ）を用いて５’タグ化ＤＮＡ断のＤＮＡポリメラーゼ伸張産物をライゲーションさせて埋めることで、タグ化環状ＤＮＡ断片が生成される。このタグ化環状ＤＮＡ断片は、ライゲーションされていない直鎖の一本鎖及び二本鎖ＤＮＡを除去するために図中の実施形態で用いているＴ５エキソヌクレアーゼに抵抗性である。図１８Ｂは、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ及び／又は大腸菌ＤＮＡリガーゼの存在下又は非存在下で生成された反応産物のＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ染色した１％アガロース電気泳動ゲルを示す図である。図示されているように、タグ化環状ＤＮＡ断片は、Ｔ５エキソヌクレアーゼ処理に抵抗性であり、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ及び大腸菌ＤＮＡリガーゼの両方が存在する場合にだけ生成された。
【図１９】図１９は、５’タグ化ＤＮＡ断片に第２の（３’）タグを連結して５’及び３’がタグ化された（「ジタグ化」）ｓｓＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片のライブラリーを作製するためのターミナルトランスフェラーゼの使用を示す図である。図示した実施形態では、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、シークエンシングタグ（ＳＥＱ）を含むシークエンシングタグドメインが付加されている。
【図２０】図２０は、５’タグ化ｓｓＤＮＡ断片に第２の（３’）タグを付加してジタグ化ｓｓＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片のライブラリーを作製するための鋳型としての末端タグ化用オリゴヌクレオチドの使用を示す図である。
【図２１】図２１は、ＤＮＡリガーゼ及びライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドの存在下で５’タグ化ＤＮＡ断片をインキュベートする実施形態を示す図であり、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドは、５’末端にリン酸基を有し且つＥＺ−Ｔｎ５トランスポザーゼにより触媒される標的ＤＮＡへのＥＺ−Ｔｎ５ＭＥトランスポゾン末端の挿入により生じた９塩基のギャップ又は一本鎖ＤＮＡ領域にアニーリングするランダム配列を示す５’部分と、第２のタグ配列（タグ＃２）を示す３’部分とを含む。この例では、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドの５’部分６ヌクレオチドのランダム配列を示す。このランダム配列は、二本鎖標的ＤＮＡへのトランスポゾン末端（例えば、ここでは１９塩基対のＥＺ−Ｔｎ５モザイク末端又はＭＥトランスポゾン末端）の挿入により生じる９塩基ギャップ領域中の一本鎖のアニーリングされている標的ＤＮＡにアニーリングする。次いで、５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端に５’リン酸化末端が接するようにギャップ領域中の一本鎖標的ＤＮＡにアニーリングするライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドを鋳型依存性ライゲーション反応において核酸リガーゼにより連結することで、５’末端に第１のタグを有し３’末端に第２のタグを有する５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片が作製される。したがって、トランスポゾン末端の挿入が標的ＤＮＡの両方の鎖中に近接して（例えば、標的ＤＮＡ中で互いに約５０Ｋｂ，約４０Ｋｂ、約３０Ｋｂ、約２０Ｋｂ、約１０Ｋｂ、約５Ｋｂ、約１Ｋｂ、約５００ｂｐ以内、又は好ましくは約１５０ｂｐ〜約５００ｂｐ以内である部位で）起こる場合、この二重タグ化鎖を精製し、ＰＣＲ増幅し、必要に応じて検出可能な色素で標識（例えば発現解析のためにマイクロアレイにアニーリングさせる標的として使用するため）してもよく、又は、最初に表面上（例えばビーズ上；例えば次世代シークエンシング用のビーズ）で捕捉し、その後、増幅してもよい（例えば次世代シークエンシングの鋳型として用いるために例えばエマルションＰＣＲを用いるか；例えばマイクロアレイ上での比較ゲノムハイブリダイゼーションによるコピー数変化（ＣＮＶ）実験で使用するためのサイクル数を限定したＰＣＲを用いる）。
【図２２】図２２（Ａ）は、本発明の方法を用いたゲノムＤＮＡのＤＮＡ断片化、タグ化、及び環状化の実施形態の模式図である。黒い線が付いた先端のとがったボックスはｐ４５４．１ＭＥＤＳトランスポゾン末端組成物を表す。破線はＴ７  Ｄ１１１ゲノムｄｓＤＮＡ断片を表す。図２２（Ｂ）は、ｐ４５４．１ＭＥＤＳトランスポゾン末端組成物及びＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ（エピセンターバイオテクノロジーズ社製）を用いたＴ７  Ｄ１１１ゲノムｄｓＤＮＡの５’タグ化及び断片化の産物のアガロースゲルを示す図である。記載されているように、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポザーゼの存在下又は非存在下で、３３ｍＭ  トリス−酢酸（ｐＨ７．６）、６６ｍＭ  ＫＯＡｃ、及び１０ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２中で、１μｇのＴ７  Ｄ１１１ゲノムｄｓＤＮＡを、０．５μＭのｐ４５４．１ＭＥＤＳトランスポゾン末端組成物あり又はなしで、３７℃にて１時間インキュベートした。５’タグ化直鎖ｓｓＤＮＡ反応産物を１％アガロースゲル電気泳動で分離し、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄで染色した。
【図２３】図２３（Ａ）は、ＰＣＲプライマーとしてｐＭＥＴＳオリゴヌクレオチド及びｐ４５４．１オリゴヌクレオチドを用いたタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅の模式図である。図２３（Ｂ）は、ＰＣＲプライマーとしてｐＭＥＴオリゴヌクレオチドＳ及びｐｃ４５４．１オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲで本発明の方法を用いて得られたタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片を増幅した時に得られたＰＣＲ増幅産物のアガロースゲルを示す図である。最初に、図２２（Ｂ）に示すように得られた５’タグ化断片化ｄｓＤＮＡを９５℃で３分間加熱して氷上で急冷することで変性させた。５’タグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片を環状化するために、実施例１７に記載したように、得られた変性させた５’タグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片の一部を、４００ユニットのＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）  ｓｓＤＮＡリガーゼの存在下又は非存在下で、３３ｍＭ  トリス−酢酸（ｐＨ７．６）、６６ｍＭ  ＫＯＡｃ、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、及び１Ｍベタイン中で６０℃にて２時間インキュベートした。ＰＣＲ増幅の前に、反応産物をエキソヌクレアーゼＩ及びエキソヌクレアーゼＩＩＩと３７℃で１時間インキュベートして直鎖ｓｓＤＮＡ断片を消化した。次いで、ＰＣＲプライマーとしてｐＭＥＴＳオリゴヌクレオチド及びｐｃ４５４．１オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによりタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ産物を１％アガロース電気泳動で分離し、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ染色で可視化した。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
定義
特に断りのない限り又は本明細書中に異なるように記載されていない限り、本発明に関する用語及び記述は以下に記すように理解されるものとする。
【００６３】
「例えば」、「等」、「含む」、又はそのバリエーションを本明細書で用いる場合、これらの用語は限定するための用語と見なされるべきではなく、「限定されるものではない」を意味するものと解釈される。
【００６４】
本発明を説明する文脈中（特に添付の特許請求の範囲中）における単数形の使用は、本明細書に反対の記載がない限り又は文脈から明らかに否定されない限り、単数及び複数の両方を含むと解釈されるべきである。
【００６５】
本明細書において、用語「単離された」、「単離する」、「単離」、「精製された」、「精製する」、「精製」、及びその文法的同等物は、本明細書において使用されているように、特に断りのない限り、材料が単離される試料又は起源（例えば細胞）に由来する少なくとも１つの混入物（例えばタンパク質及び／又は核酸配列）の量の減少を意味する。したがって、精製すると、「濃縮」、すなわち試料中の所望するタンパク質及び／又は核酸配列の量の増加が起こる。
【００６６】
本明細書において、「タグ」とは、タグが連結された核酸断片にアドレスする手段を提供する非標的核酸成分、通常はＤＮＡ、を意味する。例えば、好ましい実施形態では、タグは、（例えば、ＤＮＡポリメラーゼによる伸張のためのプライマー等のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせるための部位、又は捕捉若しくはライゲーション反応のためのオリゴヌクレオチドを提供することで）タグが連結されたＤＮＡの特定、認識、及び／又は分子的若しくは生化学的操作を可能にする塩基配列を含む。タグをＤＮＡ分子に連結するプロセスを本明細書中で「タグ化（ｔａｇｇｉｎｇ）」と言うこともあり、タグ化を受けたＤＮＡ又はタグを含むＤＮＡは「タグ化された（ｔａｇｇｅｄ）」（例えば「タグ化ＤＮＡ（ｔａｇｇｅｄ  ＤＮＡ）」）と言う。
【００６７】
本明細書において、用語「リガーゼ」とは、核酸鎖の５’リン酸末端と３’ヒドロキシル末端の間で分子内及び分子間のホスホジエステル結合形成を触媒する核酸修飾酵素を意味する。リガーゼには、例えば、一本鎖のＲＮＡ及びＤＮＡの末端を連結できるＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ等の鋳型非依存性リガーゼ、及び二本鎖ＤＮＡ中のニックを埋める鋳型依存性リガーゼ又は相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）リガーゼが含まれる（以下に例を示す）。
【００６８】
本明細書において、「相同性リガーゼ」又は「鋳型依存性リガーゼ」とは、相補的ポリヌクレオチドにアニーリングした時に互いに隣接しているＤＮＡ鎖の５’リン酸末端及び３’ヒドロキシル末端の間のホスホジエステル結合の分子内及び分子間における形成を触媒するＤＮＡリガーゼを意味する。分子内ライゲーションのいくつかの実施形態では環状分子が生成し、これは「環状化」と呼ばれる。ライゲーションすべきＤＮＡ末端の両端が隣接してアニーリングする相手のポリヌクレオチドを、本明細書中では「ライゲーション鋳型」といい、このライゲーションを「相同性ライゲーション」又は「鋳型依存性ライゲーション」と呼ぶ。ライゲーション鋳型は、生体試料中のゲノムＤＮＡ又は他のＤＮＡ中の相補的ＤＮＡ配列であってよく（その場合、しばしば「標的配列」と呼ばれる）、あるいは、ライゲーション鋳型は、特定のアッセイ又は方法で使用するために特別に合成及び／又は提供される「架橋オリゴデオキシリボヌクレオチド」又は「ライゲーションスプリント（ｓｐｌｉｎｔ）オリゴデオキシリボヌクレオチド」（又は「ライゲーションスプリント」）であってもよい。相同性又は鋳型依存性のＤＮＡリガーゼの例としては、ライゲーション鋳型の存在下でのみｓｓＤＮＡ分子の分子内ライゲーションを触媒する、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｆｌ  ＤＮＡリガーゼ、及びＡＭＰＬＩＧＡＳＥ（登録商標）ＤＮＡリガーゼ（米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製）等のＮＡＤ型ＤＮＡリガーゼ、並びに平滑末端ライゲーションにライゲーション鋳型を必要としないが、鋳型依存性ライゲーションをはるかに効率良く触媒する、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ又はＦＡＳＴＬＩＮＫ（商標）ＤＮＡリガーゼ（エピセンターバイオテクノロジーズ社製）等のＡＴＰ型ＤＮＡリガーゼが含まれる。
【００６９】
いくつかの好ましい実施形態では、（例えばライゲーション連結部を形成するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列のＴｍが低い場合に）ライゲーションを低温で実施できるように、鋳型依存性リガーゼは低温細菌又は低温バクテリオファージ（ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）に由来する。方法中、ＤＮＡリガーゼは、連結に用いられるＤＮＡ分子（例えば５’タグ化ＤＮＡ断片伸張産物又は５’タグ化ＤＮＡ断片及びランダム配列オリゴヌクレオチド）をリガーゼによりライゲーションされるのに十分な時間アニーリングさせる際の温度で活性なものを選択する。
【００７０】
本発明の方法の実施形態における重要なステップは、標的ＤＮＡを断片化及びタグ化してタグ化ＤＮＡ断片を作製するためのインビトロ転位反応の使用である。インビトロ転位反応には、トランスポザーゼ、トランスポゾン末端組成物、及び好適な反応条件が必要である。
【００７１】
「トランスポザーゼ」とは、トランスポゾン末端含有組成物（例えばトランスポゾン、トランスポゾン末端、トランスポゾン末端組成物）と機能的複合体を形成でき且つインビトロ転位反応において一緒にインキュベートした二本鎖標的ＤＮＡへのトランスポゾン末端含有組成物の挿入又は転位を触媒できる酵素を意味する。
【００７２】
用語「トランスポゾン末端」とは、インビトロ転位反応で機能的なトランスポザーゼ又はインテグラーゼ酵素と複合体を形成するために必要なヌクレオチド配列（「トランスポゾン末端配列」）だけを呈する二本鎖ＤＮＡを意味する。トランスポゾン末端は、トランスポゾン末端を認識して結合するトランスポザーゼ又はインテグラーゼと「複合体」、「シナプス複合体」、「トランスポソーム複合体」、又は「トランスポソーム組成物」を形成し、この複合体は、インビトロ転位反応で一緒にインキュベートした標的ＤＮＡにトランスポゾン末端を挿入又は転位することができる。トランスポゾン末端は、「転移トランスポゾン末端配列」又は「転移鎖」及び「非転移トランスポゾン末端配列」又は「非転移鎖」からなる２つの相補的配列を示す。例えば、インビトロ転位反応で活性な高活性Ｔｎ５トランスポザーゼ（例えば、ＥＺ−Ｔｎ５（商標）  トランスポザーゼ、米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社）と複合体を形成するトランスポゾン末端の１つは、以下の「転移トランスポゾン末端配列」：
５’ＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ３’（配列番号１）
を示す転移鎖及び以下の「非転移トランスポゾン末端配列」：
５’ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ３’（配列番号２）．
を示す非転移鎖を含む。
【００７３】
転移鎖の３’末端はインビトロ転位反応中に標的ＤＮＡに連結又は転移される。転移トランスポゾン末端配列に相補的なトランスポゾン末端配列を示す非転移鎖は、インビトロ転位反応中に標的ＤＮＡに連結又は転移されない。
【００７４】
いくつかの実施形態では、転移鎖と非転移鎖が共有結合により連結されている。例えば、いくつかの実施形態では、転移鎖配列及び非転移鎖配列は、単一のオリゴヌクレオチド上に例えばヘアピン形態で提供される。したがって、非転移鎖の自由末端は転位反応によって標的ＤＮＡに直接は連結されないが、ヘアピン構造のループにより非転移鎖が転移鎖に連結されているため、非転移鎖は間接的にＤＮＡ断片に連結される。
【００７５】
「トランスポゾン末端組成物」とは、転移トランスポゾン末端配列の５’及び／又は非転移トランスポゾン末端配列の３’に必要に応じて更なる配列を含んでもよい、トランスポゾン末端（すなわち、トランスポザーゼと共に作用して転位反応を受けることができる最小限の二本鎖ＤＮＡセグメント）を含む組成物を意味する。例えば、タグに連結したトランスポゾン末端は「トランスポゾン末端組成物」である。いくつかの実施形態では、トランスポゾン末端組成物は、「転移トランスポゾン末端オリゴヌクレオチド」又は「転移鎖」及び「非転移鎖末端オリゴヌクレオチド」又は「非転移鎖」からなる２つのトランスポゾン末端オリゴヌクレオチドを含む又はからなり、「転移鎖」及び「非転移鎖」が組み合わされてトランスポゾン末端の配列が示され、これらの鎖の片方又は両方の鎖が更なる配列を含む。
【００７６】
用語「転移トランスポゾン末端オリゴヌクレオチド」及び「転移鎖」は同義で使用しており、「トランスポゾン末端」及び「トランスポゾン末端組成物」の両方の転移される部分を指し、すなわち、トランスポゾン末端がタグ又は他の部分に連結しているかは関係しない。同様に、用語「非転移トランスポゾン末端オリゴヌクレオチド」及び「非転移鎖」も同義で使用しており、「トランスポゾン末端」及び「トランスポゾン末端組成物」の両方の転移されない部分を指す。「いくつかの実施形態では、トランスポゾン末端組成物は「ヘアピントランスポゾン末端組成物」である。本明細書において、「ヘアピントランスポゾン末端組成物」とは、転位反応でトランスポゾン末端部分が機能できるように、５’末端に非転移トランスポゾン末端配列を示し且つ３’末端に転移トランスポゾン末端配列を示し且つ非転移トランスポゾン末端配列と転移トランスポゾン末端配列の間に分子内ステムループを形成できるほど十分に長い介在任意配列を示す単一のオリゴデオキシリボヌクレオチドからなるトランスポゾン末端組成物を意味する。いくつかの実施形態では、ヘアピントランスポゾン末端組成物の５’末端は、５’ヌクレオチドの５’位にリン酸基を有する。いくつかの実施形態では、ヘアピントランスポゾン末端組成物の非転移トランスポゾン末端配列と転移トランスポゾン末端配列の間の介在任意配列は、特定の使用又は応用のためのタグ（例えば、１又は複数のタグドメインを含む）を提供する。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本発明の方法はタグ化された環状ｓｓＤＮＡ断片を生成する。いくつかの実施形態では、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片はトランスポゾン末端組成物の転移鎖の配列のみを示し、トランスポゾン末端組成物の非転移鎖の配列を示さない。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法で用いられるトランスポゾン末端組成物は、トランスポザーゼ又はインテグラーゼとの複合体形成及び転位反応に必要なトランスポゾン末端配列のみを示すトランスポゾン末端オリゴヌクレオチドを含み、これらの実施形態では、本方法を用いて生成されたタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片中のタグは転移トランスポゾン末端配列のみを示す。
【００７９】
しかし、いくつかの実施形態では、トランスポゾン末端組成物は、トランスポゾン末端配列に加えて１又は複数のその他のヌクレオチド配列を示す少なくとも１つのトランスポゾン末端オリゴヌクレオチドを含む又はからなる。したがって、いくつかの実施形態では、トランスポゾン末端組成物は、転移トランスポゾン末端配列の５’に１又は複数のその他のヌクレオチド配列を示す転移鎖を含み、この１又は複数のヌクレオチド配列はタグによっても示される。したがって、転移トランスポゾン末端配列に加え、タグが１又は複数のその他のタグ部分又はタグドメインを有してもよい。
【００８０】
本明細書において、「タグ部分」又は「タグドメイン」とは、タグ中の、所望の意図する目的又は用途のための配列を示す部分又はドメインを意味する。タグ部分又はタグドメインの１つは「トランスポゾン末端ドメイン」であり、このタグ部分又はタグドメインは転移トランスポゾン末端配列を示す。転移鎖が転移トランスポゾン末端配列の５’に１又は複数のその他のヌクレオチド配列をも示すいくつかの実施形態では、タグも前記５’部分に１又は複数のその他の「タグドメイン」を有し、このタグドメインのそれぞれは任意の所望の目的のために提供される。例えば、本発明のいくつかの実施形態は、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）を含む又はからなるトランスポゾン末端組成物を含む又はからなる：（ｉ）制限部位タグドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、及び転写プロモータードメインの１又は複数から選択されるタグドメインを含む又はからなる１又は複数の配列を転移トランスポゾン末端配列の５’に示す転移鎖；及び（ｉｉ）非転移トランスポゾン末端配列を示す非転移鎖。本発明は、前記トランスポゾン末端組成物の任意の１又は複数を用いる方法の実施形態を含む。
【００８１】
本明細書において、「切断ドメイン」とは、感受性の核酸配列を意味する。
【００８２】
本明細書において、「制限部位ドメイン」とは、制限エンドヌクレアーゼを用いた切断を促進する配列を示すタグドメインを意味する。例えば、いくつかの実施形態では、制限部位ドメインはジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片を作製するために用いられる。いくつかの実施形態では、制限部位ドメインは、鋳型依存性ＤＮＡリガーゼを用いて末端を別のＤＮＡ分子にライゲーションさせることができるように、タグドメイン中に適合する二本鎖５’末端を作製するために用いられる。いくつかの好ましい実施形態では、タグ中の制限部位ドメインは、標的ＤＮＡにたとえ存在したとしてもまれである制限部位（例えば、ＮｏｔＩ又はＡｓｃＩ等の切断がまれな制限酵素の制限部位）の配列を示す。いくつかの好ましい実施形態では、制限部位ドメイン中の制限部位は、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ等のＩＩ型制限エンドヌクレアーゼの制限部位である。
【００８３】
トランスポゾン末端組成物の転移鎖が転移トランスポゾン末端配列の５’に１又は複数の制限部位ドメインを含むいくつかの実施形態では、方法は更に、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片の一本鎖制限部位に相補的なオリゴデオキシリボヌクレオチドをアニーリングさせ、その後、制限部位を認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて制限部位でタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片を切断することを含む。したがって、いくつかの実施形態では、方法は、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片を線状化してジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片を作製することを含む。
【００８４】
トランスポゾン末端組成物の転移鎖が転移トランスポゾン末端配列の５’に１又は複数の制限部位ドメインを含むいくつかの別の実施形態では、トランスポゾン末端組成物の転移鎖は、制限部位を含む二本鎖ヘアピンを含み、方法は更に、制限部位を認識する制限エンドヌクレアーゼを用いてタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片を制限部位で切断するステップを含む。しかし、いくつかの実施形態では、二本鎖ヘアピンが、トランスポザーゼ又はインテグラーゼによりトランスポゾン末端組成物が転位され得るｄｓＤＮＡ部位を提供してしまうので、この方法は好ましくない。
【００８５】
（ｉ）一本鎖制限部位に相補的なオリゴデオキシリボヌクレオチドをアニーリングさせるか、二本鎖ヘアピンを含む転移鎖を用いるかのいずれかによって、二本鎖制限部位を作製し、（ｉｉ）その後、二本鎖制限部位を認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて制限部位を切断することを含むいくつかの好ましい実施形態では、方法は更に、制限エンドヌクレアーゼで切断したタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片を適合する３’末端を有する別のＤＮＡ分子にライゲーションさせるステップを含む。
【００８６】
本明細書において、「捕捉タグドメイン」又は「捕捉タグ」とは、タグドメインが連結されたｓｓＤＮＡ断片の捕捉を容易化する（例えば、ビーズ又は他の表面上でタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片を捕捉するためのアニーリング部位又は親和性タグを提供するためであり、例えばタグドメイン配列のアニーリング部位により、ビーズ上、マイクロチップ若しくはマイクロアレイ上、又はシークエンシングビーズ上の、プローブ等の表面上の特異的配列にアニーリングさせることによる捕捉を可能にする）配列を示すタグドメインを意味する。方法のいくつかの実施形態では、表面上の相補的プローブへのアニーリングによりタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片が捕捉された後、この捕捉タグドメインは、前記タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片又は前記ジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片（又は前記タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片若しくはジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片の相補体）を鋳型として用いたＤＮＡ合成のプライミング部位を提供する。いくつかの別の実施形態では、捕捉タグドメインは、親和結合分子を含む又はからなる化学基又は化学的部分に連結された転移鎖の５’部分を含む（例えば、ここで、転移鎖の５’部分は、ビオチン、ストレプトアビジン、抗原、又は抗原に結合する抗体等の第１の親和結合分子に連結されており、この第１の親和結合分子は、これと特異的結合対を形成する第２の親和結合分子が連結した表面上での環状タグ化ｓｓＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片の捕捉を可能にする）。
【００８７】
本明細書において、「シークエンシングタグドメイン」又は「シークエンシングタグ」とは、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片の合成法を用いてタグが連結されたｓｓＤＮＡ断片のシークエンシングを容易化する（例えば、合成によるシークエンシングのためのプライミング部位を提供するか、ライゲーションによるシークエンシングのためのアニーリング部位を提供するか、ハイブリダイゼーションによるシークエンシングのためのアニーリング部位を提供する）配列を示すタグドメインを意味する。例えば、いくつかの実施形態では、シークエンシングタグドメインは、前記ｓｓＤＮＡ断片又は前記ｓｓＤＮＡ断片の相補体のＤＮＡ合成のためのプライミング部位を提供する。
【００８８】
本明細書において、「増幅タグドメイン」とは、前記タグが付加された核酸の増幅を容易化するための配列を示すタグドメインを意味する。例えば、いくつかの実施形態では、増幅タグドメインは、ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ増幅反応、鎖置換増幅反応、又はローリングサークル増幅反応）のプライミング部位又は核酸増幅反応において鋳型依存性リガーゼを用いるプローブのライゲーション（例えばライゲーション連鎖反応）のためのライゲーション鋳型を提供する。
【００８９】
本明細書において、「検出タグドメイン」又は「検出タグ」とは、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片の検出を容易化する配列又は検出可能な化学的若しくは生化学的部分を示すタグドメインを意味する（例えば、配列又は化学的部分は、以下から選択される検出可能な分子等の検出可能な分子を含む又はこれに連結されている：可視色素、蛍光色素、化学発光色素、又はその他の検出可能な色素；基質の存在下で検出可能な酵素、例えばＮＢＴ及びＢＣＩＰとアルカリホスファターゼ又は好適な基質とペルオキシダーゼ）；検出可能なタンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質；及び検出可能な部分に結合された親和結合分子又は別の検出可能な親和結合分子と親和性結合対若しくは特異的結合対を形成することができる親和結合分子；又は当該技術分野で公知の多くのその他の検出可能な分子又は系のいずれか）。
【００９０】
本明細書において、「アドレスタグドメイン」又は「アドレスタグ」とは、特定の試料の同定を可能にする配列を示すタグドメインを意味する（例えば、転移鎖が、各試料で異なる配列を示す異なるアドレスタグドメインを有する）。
【００９１】
本明細書において、「転写プロモータードメイン」又は「プロモータードメイン」とは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのセンスプロモーター配列又はアンチセンスプロモーター配列のための配列を示すタグドメインを意味する。本明細書において、「センスプロモーター配列」とは、転写に適した反応条件下でＲＮＡポリメラーゼプロモーターに結合してそこからの転写を開始させるＲＮＡポリメラーゼによる転写の鋳型の役目をするＤＮＡ鎖に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列を意味する。本明細書において、「アンチセンスプロモーター配列」とは、センスプロモーター配列に相補的なＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列を意味する。いくつかの実施形態では、転写プロモータードメインに示されるセンスプロモーター配列は、一本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに結合してそこからの転写を開始させるＲＮＡポリメラーゼ用の配列であり、この実施形態では、センスプロモーター配列は、（例えば、バクテリオファージＮ４  ＲＮＡポリメラーゼの）ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして機能するのに十分である。いくつかの実施形態では、センスプロモーター配列は、二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに結合してそこから転写を開始させるＲＮＡポリメラーゼのための配列であり、この実施形態では、方法は、二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに結合してそこからの転写を開始させるＲＮＡポリメラーゼを用いた転写の前に、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター二本鎖を作製する（例えば、センスプロモーター配列に相補的なアンチセンスプロモーター配列を示すオリゴデオキシリボヌクレオチドをセンスプロモーター配列にアニーリングさせるか、あるいは、センスプロモーター配列を含む又はからなるｄｓＤＮＡを合成するための鋳型としてタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片を用いる）ことを含む。いくつかの実施形態では、センスプロモーター配列はＴ７型ＲＮＡポリメラーゼである（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼから選択される）。センスプロモーター配列を示す転写プロモータードメインは、トランスポゾン末端組成物の転移鎖が本方法を用いてライゲーションされた一本鎖標的ＤＮＡに相補的なＲＮＡの合成を可能にする。アンチセンスプロモーター配列を示す転写プロモータードメインを有する転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物を用いて作製したタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片は、ＲＮＡポリメラーゼで転写することはできない。しかし、いくつかの実施形態では、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片にアニーリングするプライマーを伸張することで合成したｄｓＤＮＡを、二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに結合してそこからの転写を開始させるＲＮＡポリメラーゼによる転写に用い、これらの実施形態では、合成されたＲＮＡはタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片と同じ配列を示す。
【００９２】
種々のタグドメインの名称及び記述は便宜上のものであり、例えば、種々の実施形態における種々のタグ部分又はタグドメインの意図する目的及び用途を理解及び説明し易くためのものである。しかし、これらの名称及び記述は、タグ又はタグドメインのいずれの使用又は用途も何ら限定することを意図していない。したがって、任意の特定のタグ又はタグドメインを、意図する又は主な目的又は用途は用途に加えて、又はその代わりに、任意の目的に用いることができる。また、１つのタグドメインが２つ以上のその他のタグドメインを含んでもよく（例えば、シークエンシングタグドメインがトランスポゾン末端ドメイン及びトランスポゾン末端ドメインの５’の別のタグドメインの両方を含んでもよい）、１つのタグドメインが２つ以上の異なるタグドメインの機能、目的、又は用途を提供してもよい（例えば、トランスポゾン末端ドメインが転移トランスポゾン末端の目的を提供し、且つ、特定の用途のためにシークエンシングタグドメイン及び／又は捕捉タグドメインの機能又は目的を提供してもよい）。更に、任意の特定の目的、用途、又は機能に用いるために、タグを１又は複数の異なるドメインの点から記述する必要はない。
【００９３】
本明細書において、核酸又は核酸反応に関連して用いられる用語「増幅する」又は「増幅された」とは、標的核酸等の特定の核酸又は例えば本発明の実施形態により生成されたタグ化核酸のコピーを作製するインビトロでの方法を意味する。核酸を増幅するための多数の方法が当該技術分野で公知であり、増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅反応、ローリングサークル増幅反応、ＮＡＳＢＡ（例えば米国特許第５，４０９，８１８号）等の転写仲介増幅法、ループ仲介増幅法（例えば、米国特許第 ６，４１０，２７８号に記載されているような、ループ形成配列を用いる「ＬＡＭＰ」増幅）が含まれる。増幅される核酸は、修飾されたＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡとＲＮＡの混合物を含む又はからなるかこれらに由来するＤＮＡであってよい。核酸分子の増幅により得られる産物（すなわち「増幅産物」）は、開始核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその両方であれ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡとＲＮＡのヌクレオシド又はヌクレオチドの混合物にいずれであってもよく、あるいは、修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡのヌクレオシド又はヌクレオチドを含んでもよい。「コピー」は、標的配列に相補的又は同一な完全な配列を必ずしも意味しない。例えば、コピーには、デオキシイノシン又はデオキシウリジン等のヌクレオチドアナログ、意図的な配列変化（例えば、標的配列とハイブリダイズ可能であるが相補的ではない配列を含むプライマー及び／又は増幅中に起こる配列の誤りにより導入される配列変化が含まれ得る。
【００９４】
本明細書において、「親和結合物質」、「親和結合分子」、又は「親和性分子」とは、「特異的結合対」を形成するための「結合条件」と呼ばれる特定の条件下で互いに親和性であり結合する分子を意味する。例えば、ビオチン及びストレプトアビジン、ビオチン及びアビジン、又はジゴキシゲニン及びジゴキシゲニンに結合する特異的抗体が「特異的結合対」の例であり、各特異的結合対のメンバーは、「親和結合分子」、「親和結合物質」、又は「親和性分子」を含む。親和結合分子（例えば、ビオチン及び／又はストレプトアビジン）は、当該技術分野で公知の方法を用いて（例えば、Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook, by D. Savage et al., Pierce Chemical Company, 1992；Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, Ninth Edition, by R.P. Hoagland, Molecular Probes, Inc.；及びBIOCONJUGATE Techniques, by Greg T. Hermanson, Published by Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996に記載されているような試薬及び方法を用いて）、他の分子（例えばＲＮＡ又はＤＮＡ）又は固体表面に、共有結合的に連結又はコンジュゲートしているか、非共有結合的に結合していてよい。ＤＮＡ又はＲＮＡにコンジュゲートしている親和性分子は、当該技術分野で公知の試薬及び方法を用いるオリゴヌクレオチド合成機を用いて合成することもできる。
【００９５】
本発明において、用語「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」とは、非共有結合、例えば、限定されるものではないが、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス結合、及びイオン結合等による、親和性分子と親和結合物質の間の相互作用を意味する。理論により限定されるものではないが、当該技術分野では、これらの種類の非共有結合は、一部、特異的結合対に関与する分子の相補的な形状又は構造により結合をもたらすと考えられている。「結合」の定義及び種々の親和結合分子又は特異的結合対に基づくと、種々の特異的結合対に対して結合条件が異なることは明らかである。当業者は、試料中で親和結合分子間に結合が生じる条件を容易に発見又は決定することができる。特に、当業者は、当該技術分野で「特異的結合」と見なされる親和結合分子間の結合を生じさせることのできる条件を容易に決定することができる。当該技術分野で理解されているように、そのような特異性は通常、試料中のその他の物質及び成分（例えば管壁、固体支持体）よりも親和結合分子間の親和性が高いことによるものである。特定の場合には、特異性は、試料中のその他の物質又は成分よりもかなり速い親和結合分子間の会合が関わってもよく、それによるものであってもよい。
【００９６】
用語「アニーリングする・させる」又は「ハイブリダイズする」及びその活用形は、ワトソン・クリック塩基対形成を介して複合体を形成するのに十分な相補性のヌクレオチド配列間における複合体形成を意味する。本発明に関して、互いに「相補的である」、「ハイブリダイズする」、又は「アニーリングする」核酸配列は、意図した目的を果たすための十分に安定な「ハイブリッド」又は「複合体」を互いに形成できるべき又は形成するべきである。２つの核酸分子又はその中に示されるそれぞれの配列が互いに「相補的である」、「アニーリングする」、又は「ハイブリダイズする」ためには、１つの核酸分子が示す配列中の全核酸塩基が第２の核酸分子が示す配列中の全核酸塩基と塩基対形成可能であるか、対形成するか、複合体を形成する必要はない。本明細書において、用語「相補的」又は「相補性」は、塩基対形成の規則に関連したヌクレオチド配列を指して使用されている。例えば、配列５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’は、配列３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’に相補的である。相補性は「部分的」であってもよく、その場合、塩基対形成規則に従って合致する核酸の塩基は一部のみである。あるいは、核酸間に「完全な」相補性があってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に大きな影響を与える。これは、核酸のハイブリダイゼーションに依存する検出方法は元より、増幅反応において特に重要である。用語「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は、１つの核酸配列と別の核酸配列の相補性の程度を意味する。部分的相同性又は完全な相同性（すなわち、相補性）があり得る。部分的に相補的な配列は、完全に相補的な配列が標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害するものであり、「実質的に相同な」という機能的用語を用いて言及される。完全に相補的な配列の標的配列へのハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロット又はノザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて調べることができる。実質的に相同な配列又はプローブは、低ストリンジェンシー条件下で、完全に相同な配列の標的への結合（すなわちハイブリダイゼーション）に対して競合又は阻害を示す。これは、低ストリンジェンシー条件が非特異的な結合を許すようなものであるということはなく、低ストリンジェンシー条件においても２つの配列の互いの結合は特異的（すなわち選択的）相互作用でなければならない。非特異的結合がないことは、相補性がない又は低い程度の相補性（例えば約３０％未満の相補性）しか有さない第２の標的を用いることで試験できる。特異的結合が弱い又は存在しない場合、プローブは核酸標的にハイブリダイズしない。ｃＤＮＡ又はゲノミッククローン等の二本鎖核酸配列に関連して用いる場合、用語「実質的に相同な」とは、本明細書に記載の低ストリンジェンシー条件下で二本鎖核酸配列の一方又は両方の鎖にハイブリダイズできる任意のオリゴヌクレオチド又はプローブを指す。本明細書において、用語「アニーリング」又は「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸鎖の対形成に関連して用いられる。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション強度（すなわち、核酸鎖間の会合強度）は、核酸間の相補性の程度、塩濃度のような条件に影響を受ける関与する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴｍ（融解温度）、その他の成分の存在（例えば、ポリエチレングリコール又はベタインの有無）、ハイブリダイズ鎖のモル濃度、核酸鎖のＧ：Ｃ含量等の当該技術分野で周知の多くの要因に影響を受ける。
【００９７】
一般的に、「ｃＤＮＡ」又は「ｃＤＮＡ分子」とは、目的のＲＮＡ分子の少なくとも一部を鋳型として用いて目的のＲＮＡ分子にアニーリングするプライマーをＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素が触媒して伸張すること（このプロセスは「逆転写」ともいう）で合成される「相補的ＤＮＡ」を指す。合成されたｃＤＮＡ分子は、鋳型の少なくとも一部と「相同である」、「塩基対形成する」、又は「複合体を形成する」。
【００９８】
本明細書において、「ＤＮＡ断片の集合（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）」とは、例えば標的ＤＮＡに由来する、複数のＤＮＡ断片又はＤＮＡ断片のコレクションを意味する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ断片の集合には、標的ＤＮＡの配列を定性的及び／又は定量的に表す配列を含むＤＮＡ断片ライブラリーが含まれ、一方、いくつかの実施形態では、ＤＮＡ断片の集合にはＤＮＡライブラリーの亜集合（ｓｕｂｓｅｔ）が含まれ、例えばこれは標的ＤＮＡの配列を表さなくてもよい。
【００９９】
本明細書において、「ＤＮＡ断片ライブラリー」又は「ＤＮＡ断片のライブラリー」とは、標的ＤＮＡから作製したタグ化ＤＮＡ断片（例えば、ジタグ化ＤＮＡ断片又はタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片）のコレクション又は集合を意味し、コレクション又は集合中のタグ化ＤＮＡ断片の組合せは、タグ化ＤＮＡ断片の作製に用いた標的ＤＮＡの配列を定性的及び／又は定量的に表す配列を示し、コレクション又は集合中のタグ化ＤＮＡ断片は、標的ＤＮＡのヌクレオチド又は配列組成物に基づいてタグ化ＤＮＡ断片を含める又は排除する方法を意図的に用いて選択又は排除されていない。種々の理由により、ＤＮＡ断片ライブラリーは、標的ＤＮＡが示す全配列を表すタグ化ＤＮＡ断片を含まなくてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、タグ化ＤＮＡ断片ライブラリーは、直鎖ｄｓＤＮＡを含む標的ＤＮＡの末端配列を示すタグ化ＤＮＡ断片を含まなくてもよい（例えば、標的ＤＮＡ末端部分に２つのトランスポゾン末端組成物が挿入される頻度が低いため）。一般的に、標的ＤＮＡの特定の部分又は領域の配列を示すタグ化ＤＮＡ断片が低頻度である又はないことは、意図する目的又は用途に許容可能である。しかし、本発明はまた、タグ化ＤＮＡ断片の作製に用いた標的ＤＮＡが示す全配列をタグ化ＤＮＡ断片が示す確率が高いＤＮＡ断片ライブラリーを作製することが特定の目的又は用途に重要である又は望ましいと考えられる状況のための更なる方法の実施形態を含む（例えば、本明細書の（「標的ＤＮＡの末端配列をより良く表すＤＮＡ断片ライブラリーの作製方法」という題のセクションを参照されたい）。更に、いくつかの場合には、本方法の転位反応ステップでより多くの標的ＤＮＡ分子が存在し、それにより本方法を用いてより多くの５’タグ化ＤＮＡ断片分子が作製されることで、ＤＮＡ断片ライブラリーが標的ＤＮＡの全配列を示すタグ化ＤＮＡ断片を含む確率が上がる。したがって、標的ＤＮＡが示す全配列を示すタグ化ＤＮＡ断片がＤＮＡ断片ライブラリーに含まれる確率を上げるための更に別の方法は、標的ＤＮＡを増幅し、その後、増幅された標的ＤＮＡを標的ＤＮＡの代わりに用いてＤＮＡ断片ライブラリーを作製することである。逆転写反応を用いてＲＮＡから調製したｄｓＤＮＡが標的ＤＮＡに含まれる更に別の実施形態では、逆転写ステップを用いてそれをｄｓＤＮＡに変換する前にＲＮＡを増幅することで、標的ＤＮＡの量を増幅する。増幅された標的ＤＮＡを得るために用いることができるＲＮＡ及びＤＮＡ分子の増幅方法のいくつかが本明細書に開示されている。しかし、本発明は、標的ＤＮＡの増幅に用いる方法に関して限定されない。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、本明細書に開示されている方法の１つを用いて増幅され、一方、いくつかの別の実施形態では、当該技術分野で公知の別の方法が用いられる。
【０１００】
本明細書において、用語「核酸修飾酵素」は、ＤＮＡに作用して修飾、例えば切断、ライゲーション、重合化、リン酸化等を行う任意の酵素を意味する。核酸修飾酵素としては、例えば、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、リガーゼ、ホスホリラーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、トランソザーゼ等が含まれる。「ＤＮＡ修飾酵素」には、ＤＮＡに作用する任意の酵素が含まれ、ＲＮＡ等のその他の基質にも作用する酵素も含まれる。
【０１０１】
本明細書において、「ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡ鎖へのデオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する酵素を意味する。ＤＮＡポリメラーゼには、ポリマー中に付加するデオキシリボヌクレオチドの順序を決定するために鋳型核酸を必要とする「鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ」が含まれ、あるいは、鋳型配列を参照せずに重合を触媒する「鋳型非依存性」であってもよい。
【０１０２】
「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡ鋳型にアニーリングしたプライマーを伸張することで相補的ＤＮＡ（「ｃＤＮＡ」）コピーを合成する酵素である。いくつかのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼはＲＮＡ鋳型からも相補的ＤＮＡコピーを合成することができ、このプロセスは「逆転写」ともいう。逆転写できるＤＮＡポリメラーゼを「逆転写酵素」ともいう。
【０１０３】
ＤＮＡポリマーの合成に加えて、ＤＮＡポリメラーゼはその他の特徴又は活性を含んでもよい。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性（５’エキソヌクレアーゼ活性又は５’ヌクレアーゼ活性ともいう）、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性、鎖置換活性を有する又は有さないことで特徴付けられてもよく、以下により詳細に記載するように、前進型（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ）又は分配型（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｖｅ）の程度に関連して特徴付けられてもよい。
【０１０４】
ＤＮＡポリメラーゼには、ポリメラーゼにより新規のＤＮＡ鎖が合成される際に鋳型鎖に相補的な鎖を置換することができるものがある。このプロセスは「鎖置換」と呼ばれ、この活性を有するＤＮＡポリメラーゼを本明細書では「鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ」と呼ぶ。鎖置換ＤＮＡ合成の鋳型は直鎖又は環状の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）又は二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）であってよい。ＤＮＡ鋳型が一本鎖の環である場合、プライムしたＤＮＡ合成が環の周囲を回って進み、鎖の複製に先立ち、鎖が連続的に置換される。このプロセスは「ローリングサークル複製」と呼ばれる。ローリングサークル複製では、環状鋳型のタンデムコピーが合成される。一般的に、本発明の方法に用いるＤＮＡ鋳型特異的ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型から「解離する（ｆａｌｌｉｎｇ  ｏｆｆ）」（すなわちＤＮＡの合成を終える）ことなく、意図する目的に適した長さのＤＮＡを効率良く合成することが好ましく、これを酵素の前進性（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）という。ＤＮＡポリメラーゼが鎖置換する能力は、Ｆｉｒｅ  ａｎｄ  Ｘｕ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4641-4645, 1995）に記載されているようにローリングサークル複製アッセイにポリメラーゼを用いることで容易に決定することができる。鎖置換及びＤＮＡポリメラーゼの前進性は、Ｋｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（J. Biol. Chem. 268: 1965-1975, 1993）に記載の方法を用いてアッセイすることもできる。本明細書ではターミナルトランスフェラーゼもＤＮＡポリメラーゼとして定義され、このＤＮＡポリメラーゼは、本発明のキット及び方法のいくつかの実施形態における組成物として用いられる。ターミナルトランスフェラーゼは、ＤＮＡの３’ヒドロキシル末端へのｄＮＴＰの鋳型非依存性的な付加を触媒するので、いくつかの実施形態で好ましい。
【０１０５】
いくつかの実施形態は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ組成物を使用して、ＤＮＡ重合をアッセイするための手段として検出可能な部分（例えば、可視分子、蛍光分子、化学発光分子、又はその他の検出可能な分子を含む部分）で標識されたヌクレオチドを遊離させることで試料中の鋳型として機能する核酸分子の存在を（例えば、アプライドバイオシステムズ社のＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイと同様な様式で）検出及び／又は定量する方法を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼ組成物を含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼ組成物を使用する方法を含む。例えば、いくつかの実施形態では、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼ組成物をＤＮＡシークエンシングに用いる。例えば、いくつかの別の実施形態では、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼ組成物を全ゲノム増幅に用いる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本発明は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ組成物を含む。（例えば、本明細書に記載の方法の１つにおいて連結のために鋳型依存性リガーゼに加えてＤＮＡポリメラーゼを用いる）いくつかの好ましい実施形態では、方法は、５’ヌクレアーゼ活性（５’→３’エキソヌクレアーゼ活性及び５’構造依存性ヌクレアーゼ活性の両方を含む）を有さないＤＮＡポリメラーゼ組成物を使用する。例えば、いくつかの別の実施形態では、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼ組成物を用いてギャップを埋める。したがって、方法又はキットのいくつかの実施形態では、本発明は、５’ヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼ組成物を含む。しかし、ＤＮＡ重合化をアッセイすることで試料中の鋳型として機能する核酸分子の存在を（例えば、アプライドバイオシステムズ社のＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイと同様な様式で）検出及び／又は定量するための手段として、検出可能な部分（例えば、可視分子、蛍光分子、化学発光分子、又はその他の検出可能な分子を含む部分）で標識されたヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを遊離させる５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ組成物を、本発明の方法を用いて作製したＤＮＡ分子を定量するために用いてもよい。
【０１０８】
使用できる鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの例としては、ＲｅｐｌｉＰＨＩ（商標）ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｉｓｐｌａｃｅＡｃｅ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＧｋａ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、及びＭＭＬＶ逆転写酵素（以上は全て米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社から入手可能）が含まれるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、３’→５’エキソヌクレアーゼ校正活性を有さないＤＮＡポリメラーゼと、この活性を有するＦＡＩＬＳＡＦＥ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡポリメラーゼとのブレンドを、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとして用いる。酵素ブレンドは、ＤＮＡ合成中のフィデリティーが向上する（すなわち、鋳型に相補的でないヌクレオチドが少ないＤＮＡを合成する）ため、いくつかの実施形態で有用である。特定の条件下における多くのＤＮＡポリメラーゼのフィデリティー及び／又は誤りの割合及びフィデリティーの測定方法（例えばシークエンシングによる）は公知である。
【０１０９】
一般的に、本発明の鎖置換増幅方法では、方法中に用いる鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの量は、反応を阻害したり反応に悪影響を与えない限り、可能な限り多いことが望ましい。例えば、ＲＥＰＬＩＰＨＩ（商標）ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（エピセンター社製）は反応液２０マイクロリットル中にタンパク質約１マイクログラムで用いることができ、ＤＩＳＰＬＡＣＥ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（エピセンター社製）は反応液５０マイクロリットル中に約５０〜約３００ユニットで用いることができる。異なるＤＮＡポリメラーゼ、更には供給業者又は起源が異なる同様なＤＮＡポリメラーゼについてでさえ、ユニットの定義が異なり、また、各酵素の活性も種々の温度及び種々の反応条件下で異なるため、使用する各ＤＮＡ鋳型及びプライマーについて、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの量及び反応条件を最適化することが望ましい。
【０１１０】
ヘリカーゼ等の鎖置換因子を使用することで鎖置換を促進することができるが、本発明には種々のＤＮＡポリメラーゼが使用可能であるため、そのような鎖置換因子は通常は不要である。鎖置換因子の存在下でローリングサークル複製を行うことができるＤＮＡポリメラーゼはいずれも、たとえそのＤＮＡポリメラーゼがそのような因子の非存在下ではローリングサークル複製を行わないとしても、鎖置換を含む本発明の実施形態における使用に適していると考えられる。ローリングサークル複製を可能にする鎖置換因子としては、限定されるものではないが、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット（Tsurumi et al, J. Virology, 67: 7648-7653, 1993）、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質（Zijderveld and van der Vliet, J. Virology, 68: 1158-1164, 1994）、単純ヘルペスウイルスタンパク質ＩＣＰ８（Boehmer and Lehman, J. Virology, 67: 711-715, 1993）；Skaliter and Lehman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 : 10,665-10,669, 1994）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（SSB; Rigler and Romano, J. Biol. Chem., 270: 8910-8919, 1995）、及びウシ胸腺ヘリカーゼ（Siegel et al., J. Biol Chem., 267: 13,629-13,635, 1992）が含まれ、これら全てを参照により本明細書に援用する。
【０１１１】
本明細書において、「モノヌクレオシド」又は「ヌクレオシド」とは、五炭糖に共有結合したプリン（グアニン（Ｇ）又はアデニン（Ａ））又はピリミジン（チミン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、又はシチジン（Ｃ））塩基からなる化合物を指し、「ヌクレオチド」とは、五炭糖のヒドロキシル基の１つがリン酸化されたヌクレオシドを指す。用語「標準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）」は、ＤＮＡ中に一般的に見られる４種類の一般的な核酸塩基アデニン、シトシン、グアニン、及びチミン又は標準的な塩基を含むそれぞれのデオキシリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオチド、又は２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−三リン酸を指して用いられる。用語「非標準的」は、４種類の標準的塩基以外のＤＮＡ中の核酸塩基又は非標準的塩基を含むそれぞれのデオキシリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオチド、又は２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−三リン酸を指して用いられる。例えば、ウラシルはＲＮＡ中に一般的な核酸塩基であるが、ＤＮＡ中の非標準的塩基である。「非標準的塩基」は、非標準的ヌクレオチドを導入した結果（例えばオリゴヌクレオチド合成機を用いた合成又はＤＮＡポリメラーゼを用いた合成）又は既存の（標準的又は非標準的な）塩基が修飾された結果として核酸中に見られる。
【０１１２】
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、「ヌクレオシド」とも呼ばれる一連の「モノヌクレオシド」を含むポリマー分子を意味し、１つのヌクレオシドの五炭糖の３’位は次のヌクレオシドの五炭糖の５’位に、限定されるものではないがホスホジエステル結合等の、ヌクレオシド間連結により連結されている。リン酸基に連結されたヌクレオシドは「ヌクレオチド」と呼ばれる。次のヌクレオチドの５’位に連結されたヌクレオチドを「〜の５’」又は「５’ヌクレオチド」と呼び、５’ヌクレオチドの３’位に連結されたヌクレオチドを「〜の３’」又は「３’ヌクレオチド」と呼ぶ。本明細書において、用語「〜の５’」及び「〜の３’」は、核酸の一本鎖内の、特定の化学基、ヌクレオチド、ヌクレオチド配列、又は遺伝因子（例えばＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列）の、別の化学基、ヌクレオチド、ヌクレオチド配列、又は遺伝因子に対する位置又は向きを指す。１つの鎖上で第１の核酸配列が第２の配列の３’にある場合、相補鎖上では第１の配列の相補体が第２の配列の相補体の５’にある。本発明の説明は、特定の核酸鎖内の配列又は遺伝因子の相対的な５’又は３’の位置及び向きに関して理解される。
【０１１３】
核酸のホスホジエステル連結は置換基モノヌクレオチドの糖部分の５’炭素及び３’炭素で生じるため、直鎖核酸分子は「５’末端（５’−ｔｅｒｍｉｎｕｓ；５’ｅｎｄ）」及び「３’末端（３’−ｔｅｒｍｉｎｕｓ；３’ｅｎｄ）」を有すると言われる。５’炭素に新たな連結がなされるポリヌクレオチドの末端がその５’末端ヌクレオチドである。３’炭素に新たな連結がなされるポリヌクレオチドの末端がその３’末端ヌクレオチドである。本明細書において、末端ヌクレオチドとは、３’末端又は５’末端の末端位のヌクレオチドである。
【０１１４】
核酸の五炭糖はリボースであってよく、その場合、核酸又はポリヌクレオチドは「ＲＮＡ」と呼ばれ、あるいは核酸の五炭糖は２’−デオキシリボースであってもよく、その場合、核酸又はポリヌクレオチドは「ＤＮＡ」と呼ばれる。あるいは、特に、核酸を化学的に合成する場合、核酸はＤＮＡ及びＲＮＡ両方のモノヌクレオチドで構成されてもよい。ＲＮＡ及びＤＮＡの両方において、各五炭糖は４種類の一般的又は「標準的」な核酸塩基（それぞれ「塩基」ともいう）の１つに共有結合している。糖に連結している主な天然塩基の３つ（アデニン、シチジン、及びグアニン）はＤＮＡ及びＲＮＡで共通であるが、１つの塩基は異なる。ＤＮＡは更なる塩基チミンを有し、一方，ＲＮＡは更なる塩基ウリジンを有する。場合により、ＤＮＡの塩基としてウリジンが存在してもよい。当業者は一般に小さいポリヌクレオチドを「オリゴヌクレオチド」と見なす。本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」は、２以上、好ましくは約６〜１００ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含む分子と定義されるが、オリゴヌクレオチドの長さは明確に限定されるものではない。正確なサイズは多くの要因に応じて変わり、オリゴヌクレオチドの最終的な機能又は用途に応じて変わる。
【０１１５】
また、種々の理由により、本発明の核酸又はポリヌクレオチドは、１又は複数の修飾された核酸塩基、糖部分、又はヌクレオシド間連結を含んでもよい。例えば、修飾塩基、糖部分、又はヌクレオシド間連結を含む核酸又はポリヌクレオチドを用いる理由の一部として、限定されるものではないが、以下のものが含まれる：（１）Ｔｍの調整；（２）１又は複数のヌクレアーゼに対するポリヌクレオチドの感受性の変更；（３）標識が連結するための部分の付与；（４）標識又は標識の消光剤を提供する；又は（５）溶液中にあるか表面に結合している別の分子に連結するためのビオチン等の部分を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、プライマー等のオリゴヌクレオチドは、ランダム部分が、立体構造の制限された１又は複数のリボ核酸アナログ、例えば、限定されるものではないが、リボース環が２’のＯ原子と４’のＣ原子を連結するメチレン架橋で「固定された（ｌｏｃｋｅｄ）」１又は複数のリボ核酸アナログを含むように合成してもよく（例えば、エクシコン社（Ｅｘｉｑｏｎ，Ｉｎｃ．）から「ＬＮＡ（商標）」の商標で利用可能）、これらの修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチドモノマー１個当たりＴｍすなわち融解温度を約２〜約８℃上昇させる。Ｔｍが上昇すれば、末端タグ化用オリゴリボヌクレオチドのランダム３’部分のランダムヌクレオチドの数を減らすことができる可能性がある。しかし、ＬＮＡ等の修飾ヌクレオチドは、方法のその他の基準を満たすことに加え、その意図する目的のための方法において機能するように検証しなければならない。例えば、リボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いるいくつかの実施形態では、方法中で修飾ヌクレオチドを用いるための基準の１つは、それを含むオリゴヌクレオチドが一本鎖特異的ＲＮａｓｅで消化できることであり得る。
【０１１６】
本発明の目的を達成するために、例えば、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの１又は複数の部分のモノヌクレオチド中の核酸塩基がグアニン、アデニン、ウラシル、チミン、又はシチジンを含んでもよく、あるいは、核酸塩基の１又は複数が修飾塩基、例えば、限定されるものではないが、キサンチン、アリアミノ−ウラシル、アリアミノ−チミジン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、４−チオウラシル、６−チオグアニン、アザ及びデアザウラシル、チミジン、シトシン、アデニン、又はグアニンを含んでもよい。更に、これらは、ビオチン部分、ジゴキシゲニン部分、蛍光部分又は化学発光部分、クエンチング部分、又は何らかのその他の部分で誘導体化された核酸塩基を含んでもよい。本発明は列記された核酸配列に限定されず、リストは、方法において特定の目的のために使用できる種々の塩基の例を示すために記載するものである。
【０１１７】
本発明の核酸又はポリヌクレオチドに関して、糖部分の１又は複数が２’−デオキシリボースを含んでもよく、あるいは、糖部分の１又は複数が何らかのその他の糖部分、例えば、限定されるものではないが、一部のヌクレアーゼに対する抵抗性を付与するリボース、すなわち２’−フルオロ−２’−デオキシリボース若しくは２’−Ｏ−メチル−リボース、又は求電子性、光反応性、アルキニル、若しくはその他の反応性化学部分を有する可視色素、蛍光色素、赤外蛍光色素、若しくはその他の検出可能な色素若しくは化学物質と反応させることで標識することができる２’−アミノ−２’−デオキシリボース若しくは２’−アジド−２’−デオキシリボースであってもよい。
【０１１８】
本発明の核酸又はポリヌクレオチドのヌクレオシド間連結はホスホジエステル連結であってもよく、あるいは、ヌクレオシド間連結の１又は複数が、修飾された連結、例えば、限定されるものではないが、一部のヌクレアーゼに抵抗性であるホスホロチオアート連結、ホスホロジチオアート連結、ホスホロセレナート連結、又はホスホロジセレナート連結を含んでもよい。
【０１１９】
「ランダム配列」を示すオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド部分と言う場合、ランダム配列部分内の全ヌクレオチド位置に標準的なヌクレオチド塩基（全４種類Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴ又はＵ）を等量用いてオリゴヌクレオチド又はその部分が（例えばオリゴヌクレオチド合成機を用いて）合成されていることを意味する。この方法では、（４のｎ乗）＋１種類の異なるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの混合物が合成される（ｎはランダム配列部分内のヌクレオチド位の数に等しい）。したがって、これらの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ランダム配列部分に可能な全配列を表す多くの異なるオリゴヌクレオチドの混合物を含む。「半ランダム配列」を示すオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド部分と言う場合、一部のヌクレオチド位置は標準的なヌクレオチド塩基全４種類（Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴ又はＵ）を等量用いて合成される（すなわち、これらの位置は前述のように「ランダム」である）が、半ランダム部分内の１又は複数のその他の位置は標準的塩基ヌクレオチド（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴ又はＵ）の全４種類ではなく１、２、又は３種類だけを用いて合成され、半ランダムなオリゴヌクレオチド又は部分が（例えば、オリゴヌクレオチド合成機を用いて）合成されることを意味する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは「縮重塩基（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｂａｓｅ）」を有する１又は複数のヌクレオチドを含み、縮重塩基とは、ＡがＴ又はＵと対を形成しＧがＣと対を形成する標準的な塩基対形成規則に従うもの以外に１又は複数の核酸塩基と塩基対形成することができる核酸塩基を意味し、「縮重ヌクレオチド」とは、縮重塩基を含むヌクレオチドである。ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド（プライマーを含む）の「部分」又は「領域」は、本明細書中で同義で使用されており、２以上の塩基の連続配列である。別の実施形態では、領域又は部分は、少なくとも約１、２、３、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、又はそれ以上の連続ヌクレオチドのいずれかである。
【０１２０】
「プライマー」は、オリゴヌクレオチド（「オリゴ」）であり、通常、核酸ポリメラーゼにより伸張することができるフリーの３’−ＯＨ基を有する。鋳型依存性ポリメラーゼの場合、通常、プライマーオリゴの少なくとも３’部分は、オリゴが水素結合及びその他の分子力により鋳型に「結合」（又は「複合体形成」、「アニーリング」、又は「ハイブリダイズ」）する鋳型核酸の一部に相補的であり、ＤＮＡポリメラーゼによる合成開始のためのプライマー／鋳型複合体を形成し、ＤＮＡ合成プロセス中に、鋳型に相補的な塩基が３’末端に共有結合による連結で付加されることで伸張される（すなわち、「プライマー伸張」）。その結果、プライマー伸張産物が得られる。通常、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素を含む）がＤＮＡ合成を開始するためにはオリゴヌクレオチドプライマーが一本鎖鋳型と複合体形成（「プライミング」）することが必要であるが、ＲＮＡポリメラーゼは通常、ＤＮＡ鋳型に相補的なＲＮＡを合成（転写）するためにプライマーを必要としない。
【０１２１】
「一本鎖特異的ＤＮａｓｅ」とは、一本鎖ＤＮＡを特異的に消化するが、一本鎖ＲＮＡは消化せず、また、相補的なＲＮＡ又はＤＮＡとアニーリング又は複合体形成したＲＮＡ又はＤＮＡも消化しないＤＮａｓｅを意味し、ここで前記相補的なＲＮＡ又はＤＮＡは別の核酸分子の一部であってもよく（例えば分子間塩基対形成による）、同じ核酸分子の一部であってもよい（例えば分子内塩基対形成による）。一本鎖特異的ＤＮａｓｅは、一本鎖ＤＮＡを特異的に消化してモノマー又は短いオリゴデオキシリボヌクレオチドにする活性があれば、エンドヌクレアーゼであってもエキソヌクレアーゼであってもよい。いくつかの好ましい実施形態では、プライマー等のオリゴデオキシリボヌクレオチドは、方法中のそれらを用いるステップの後、一本鎖特異的ＤＮａｓｅで消化することで反応混合物から除去される。エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、及びＲｅｃ  Ｊ  エキソヌクレアーゼが一本鎖特異的ＤＮａｓｅの例として挙げられる。
【０１２２】
本明細書において、「Ｔ７型ＲＮＡポリメラーゼ」（ＲＮＡＰ） とは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Studier, FW et al., pp. 60-89 in Methods in Enzymology, Vol. 185, ed. by Goeddel, DV, Academic Press, 1990参照）又はバクテリオファージＴ７と同様な遺伝子構成のバクテリオファージを意味する「Ｔ７型」バクテリオファージに由来するＲＮＡＰを意味する。調べられている全てのＴ７型ファージの遺伝子構成はＴ７と本質的に同じであることが分かっている。本発明に係るＴ７型バクテリオファージの例としては、限定されるものではないが、大腸菌ファージＴ３、ｐｈｉＩ、ｐｈｉ  ＩＩ、Ｗ３１、Ｈ、Ｙ、Ａ１、１２２、ｃｒｏ、Ｃ２１、Ｃ２２、及びＣ２３；シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ファージｇｈ−１；サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ファージＳＰ６；セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ファージＩＶ；シトロバクターファージＶｉＩＩＩ；及びクレブシエラファージＮｏ. １１（Hausmann, Current Topics in Microbiology and Immunology 75:77-109, 1976；Korsten et al., J. Gen. Virol. 43:57-73, 1975；Dunn, et al., Nature New Biology 230:94-96, 1971；Towle, et al., J. Biol. Chem. 250:1723-1733, 1975；Butler and Chamberlin, J. Biol. Chem. 257:5772-5778, 1982）、並びにそのようなＲＮＡＰの変異体形態（例えば、Ｓｏｕｓａ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，８４９，５４６号；Padilla, R and Sousa, R, Nucleic Acids Res., 15: e138, 2002；Sousa, R and Mukherjee, S, Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 73: 1-41, 2003；Ｇｕｉｌｌｅｒｅｚ，Ｊ，ｅｔ  ａｌ．の米国特許出願公開第２００４００９１８５４号）が含まれる。本発明の好ましい実施形態では、使用されるプロモーターはＴ７型ＲＮＡポリメラーゼにより認識される野生型又は変異体のプロモーター配列である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、一本鎖、例えば偽プロモーター（ｐｓｅｕｄｏｐｒｏｍｏｔｏｒ；例えば、Ohmichi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:54-59, 2002）、又はＮ４  ｖＲＮＡＰプロモーターであってよく、その場合、Ｎ４  ｖＲＮＡＰの転写活性な１，１０６アミノ酸ドメイン（アミノ酸９９８〜２１０３に相当）を含む切断型タンパク質（「ミニｖＲＮＡＰ」と命名されている；米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社製）が用いられる（Kazmierczak, K.M., et al., EMBO J., 21 : 5815-5823, 2002）。
【０１２３】
本明細書において、「標的ＤＮＡ」とは、例えばタグ化ＤＮＡ断片（例えば、５’及び３’がタグ化された、すなわちジタグ化された直鎖のｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡ断片、又はタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片）のライブラリーを作製するのための、転位を受ける、目的の任意のｄｓＤＮＡを指す。
【０１２４】
「標的ＤＮＡ」は、生きていても死んでいてもよい１又は複数の細胞、組織、器官、又は生物を含む任意のインビボ又はインビトロの起源（ｓｏｕｒｃｅ）に由来してよく、任意の生体又は環境的起源（例えば、水、空気、土壌）に由来してよい。例えば、いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、ヒト、動物、植物、真菌（例えばかび又は酵母）、細菌、ウイルス、ウイロイド、マイコプラズマ、又はその他の微生物を起源とするか又はそれらに由来する真核及び／又は原核ｄｓＤＮＡを含む又はからなる。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは以下を含む又はからなる：ゲノムＤＮＡ、サブゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ（例えば単離した染色体又は染色体の一部に由来し、例えば染色体の１又は複数の遺伝子又は遺伝子座に由来する）、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、プラスミド又はその他のエピソーム由来ＤＮＡ（又はそれに含まれる組換えＤＮＡ）、又はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ若しくは逆転写酵素を用いたＲＮＡの逆転写によって一本鎖ｃＤＮＡを作製し、その後その一本鎖ｃＤＮＡにアニーリングさせたプライマーを伸張させてｄｓＤＮＡを作製することで作製された、二本鎖ｃＤＮＡ。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、核酸分子に含まれる又はそれから調製された複数のｄｓＤＮＡ分子を含む（例えば、生体起源（例えば、細胞、組織、器官、生物）又は環境的起源（例えば、水、空気、土壌、唾液、痰、尿、糞便）に含まれる又はそれに由来するゲノムＤＮＡ又はＲＮＡから調整したｃＤＮＡに含まれる又はそれから調製された複数のｄｓＤＮＡ分子。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡはインビトロを起源とする。例えば、いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、インビトロで一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）から調製されたｄｓＤＮＡ又は一本鎖若しくは二本鎖のＲＮＡから（例えば、好適なＤＮＡ依存性及び／又はＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を用いたプライマー伸張等の当該技術分野で周知の方法を用いて）調製されたｄｓＤＮＡを含む又はからなる。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて１又は複数の二本鎖又は一本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ分子の全体又は一部から調製されたｄｓＤＮＡを含む又はからなり、そのような方法としては以下が含まれる：ＤＮＡ又はＲＮＡ増幅（例えば、１又は複数の核酸分子の全体又は一部を増幅する、ＰＣＲ又は逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、転写仲介増幅方法）；好適な宿主細胞中で後に複製されるプラスミド、フォスミド、ＢＡＣ、又はその他のベクターへの１又は複数の核酸分子の全体又は一部の分子的クローニング；あるいはアレイ又はマイクロアレイ上のＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーション等のハイブリダイゼーションによる１又は複数の核酸分子の捕捉（例えば、「配列捕捉（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃａｐｔｕｒｅ）」による；例えば、ロシュ・ニンブルジェン社（ＲＯＣＨＥ ＮＩＭＢＬＥＧＥＮ）、アジレント社（ＡＧＩＬＥＮＴ）、又はＦＥＢＩＴ社のキット及び／又はアレイを用いる）。
【０１２５】
いくつかの実施形態では「標的ＤＮＡ」は、タグ化ＤＮＡ断片（例えば、５’及び３’がタグ化された、すなわちジタグ化された直鎖のｓｓＤＮＡ若しくはｄｓＤＮＡ断片、又はタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片）のライブラリー作製に使用する前に（例えば種々の生化学的又は分子生物学的技術を用いて）調製又は修飾されたｄｓＤＮＡを意味する。例えば、本発明者らは、サイズが１０Ｋｂ未満のｄｓＤＮＡ分子を含む標的ＤＮＡの末端から得られる次世代配列データの提示が、標的ＤＮＡの中央から得られる配列データの提示よりも少ないことを観察した。理論により限定されるものではないが、この観察結果に対する説明の１つとして、２個のトランスポゾン末端組成物が直鎖ｄｓＤＮＡ分子の末端に逆向きに挿入されたＤＮＡ断片を見つける確率が、２個のトランスポゾン末端組成物が直鎖ｄｓＤＮＡ分子の真ん中に逆向きに挿入されたＤＮＡ断片を見つける確率よりも低い可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、末端配列をより良く表すジタグ化ＤＮＡ断片又はタグ化環状ＤＮＡ断片のライブラリーを作製するために、方法は更に、５’及び／又は３’末端に既にタグを有するｄｓＤＮＡ（例えば、二本鎖の、ｍＲＮＡ等のＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）を含む標的ＤＮＡを方法での使用に提供することを含む。例えば、いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、以下のようにしてＲＮＡから調製された二本鎖ｃＤＮＡを含む：ＲＮＡの３’末端部分に相補的な３’部分と第１のタグを含む５’部分とを有する第１ｃＤＮＡ合成プライマー鎖を伸張することで第１ｃＤＮＡ鎖を合成し；次いで、本明細書の別の箇所に記載されているような末端タグ化用オリゴヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼを用いて、第１ｃＤＮＡ鎖の３’末端に第２のタグを連結し；次いで、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、第２のタグにアニーリングする第２ｃＤＮＡ合成プライマー鎖を伸張することで、二本鎖ｃＤＮＡを合成する。あるいは、他のいくつかの好ましい実施形態では、末端配列をより良く表すジタグ化ＤＮＡ断片ライブラリーを作製するために、ジタグ化ＤＮＡ断片又はタグ化環状ＤＮＡ断片の作製方法において用いる標的ＤＮＡが、直鎖ｄｓＤＮＡの分子内ライゲーションにより調製された（例えば、二本鎖ゲノムＤＮＡの分子内ライゲーション又はｍＲＮＡ等のＲＮＡから調製された二本鎖ｃＤＮＡの分子内ライゲーションにより調製された）環状ｄｓＤＮＡを含む。したがって、いくつかの実施形態では、方法は更に、リガーゼ（例えばＴ４  ＤＮＡリガーゼ）を用いて直鎖ｄｓＤＮＡをライゲーションすることで方法中で標的ＤＮＡとして用いるための環状ｄｓＤＮＡを作製することを含む。直鎖ｄｓＤＮＡをライゲーションすることにより標的ＤＮＡとして使用するための環状ｄｓＤＮＡを作製することを含む方法のいくつかの実施形態では、直鎖ｄｓＤＮＡは、末端の平滑化及び５’末端のリン酸化のために、ライゲーションステップの前にＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理される（例えば、ＥＮＤ−Ｉｔ（商標）ＤＮＡ  Ｅｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｋｉｔ（米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社）を用いる。
【０１２６】
本明細書において、「ＤＮＡ断片」とは、より長いＤＮＡ分子から切断、放出、又は分解されて親分子にもはや連結されていない標的ＤＮＡの一部、ピース、又はセグメントを意味する。ＤＮＡ断片は二本鎖（「ｄｓＤＮＡ断片」）であっても一本鎖（「ｓｓＤＮＡ断片」）であってもよく、標的ＤＮＡからＤＮＡ断片を作製するプロセスを標的ＤＮＡの「断片化」と呼ぶ。いくつかの好ましい実施形態では、方法は、タグ化ＤＮＡ断片のコレクション又は集合を含む「ＤＮＡ断片ライブラリー」を作製するために用いられる。
【０１２７】
「鋳型」とは、ＤＮＡポリメラーゼ等の核酸ポリメラーゼによりコピーされている核酸分子である。核酸分子が２つの鎖を含む（すなわち「二本鎖」である）か１つの鎖だけを含む（すなわち「一本鎖」である）かに関わらず、合成された核酸が示すヌクレオチド配列を特定する役割をする前記核酸分子の鎖は「鋳型」又は「鋳型鎖」である。核酸ポリメラーゼにより合成される核酸は鋳型に相補的である。ＲＮＡ及びＤＮＡはどちらも常に、５’から３’の方向に合成され、合成は鋳型鎖の３’末端から始まり、核酸二重鎖の２つの鎖は常に２つの鎖の５’末端が二重鎖の逆の末端にあるように整列されている（必然的に３’末端も同様である）。ＲＮＡ鋳型及びＤＮＡ鋳型のどちらも、ＤＮＡポリメラーゼによる合成を開始させるにはプライマーを必要とするが、簡潔に「ＲＮＡポリメラーゼ」と呼ばれるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる合成開始にはプライマーは必要ない。
【０１２８】
「ターミナルトランスフェラーゼ」は「ターミナル・デオキシリボヌクレオチジル・トランスフェラーゼ」又は「ＴｄＴ」ともいい、ＤＮＡの３’ヒドロキシル末端へのデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）又は単一のジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の鋳型非依存的付加（又はテイル付加）を触媒するＤＮＡポリメラーゼである。当該技術分野で一般的に用いられる市販のターミナルトランスフェラーゼは、ウシ胸腺に由来する組換え遺伝子を発現する大腸菌株で生産される。いくつかの実施形態では、本発明は更に、変性後に、ホモポリマーＤＮＡテイルを含む第２のタグを有する５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片が合成される条件下で、そのために十分な時間、ＴｄＴ及びｄＮＴＰと共に５’タグ化ＤＮＡ断片をインキュベートするステップを含む。いくつかの実施形態では、ホモポリマーＤＮＡテイルは、二本鎖ｃＤＮＡ合成のためのプライミング部位としても使用される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡの第２の鎖を合成するために用いられるプライマーは、ホモポリマーテイルを含む第２のタグに相補的な３’部分と、第１のタグに相補的でない任意の所望の配列を示す５’部分とを有し、標的ＤＮＡ又は第２のタグはホモポリマーテイルを含む。例えば、いくつかの実施形態では、プライマーの５’部分はＲＮＡポリメラーゼプロモーターのアンチセンスプロモーター配列を示し、方法は更に、ＲＮＡが合成される条件下で、そのために十分な時間、得られた二本鎖ｃＤＮＡをＲＮＡポリメラーゼとインキュベートすることを含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本発明の方法に用いられるトランスポゾン末端オリゴヌクレオチドは、転位反応に必要なトランスポゾン末端配列だけを示す。しかし、いくつかの実施形態では、トランスポゾン末端オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、それに加えて、トランスポゾン末端配列の５’に１又は複数のその他の塩基配列を示す。したがって、いくつかの実施形態では、方法又はキットは、３’部分及び５’部分を有する転移鎖を用い、３’部分は転移トランスポゾン末端配列を示し、５’部分はトランスポザーゼとの機能的複合体の形成に関与しない１又は複数の更なる配列を示す。転移鎖の５’部分中の１又は複数の更なる配列にどのような更なる配列が用いられるかは限定されず、この配列は任意の所望の目的を達成するために用いられ得る。例えば、いくつかの実施形態では、転移鎖の５’部分は、１又は複数の更なるタグ配列（例えば、マイクロチップ又はアレイ上のビーズ又はプローブ等の表面上の特異的配列にアニーリングすることによる捕捉を可能にするタグ配列；例えば、次世代シークエンシング用のビーズ上での捕捉のためのタグ配列；例えば、ロシュ社の４５４  Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いたシークエンシング用のビーズ上で捕捉するための４５４Ａ又は４５４Ｂタグ配列）あるいは方法の産物を同定、検出（例えば蛍光検出）、又はソートするための１又は複数の配列を示す。いくつかの別の実施形態では、転移鎖の５’部分は、親和結合性のものを含む又はからなる１又は複数の更なるヌクレオチド、配列、又は化学基若しくは化学的部分（例えば、マイクロチップ又はアレイ上のビーズ又はプローブ等の表面上の特異的配列へのアニーリングによる捕捉を可能にするタグ配列）を示す。いくつかの好ましい実施形態では、転移鎖の５’部分に含まれる１又は複数の更なる配列のサイズは、インビトロトランスポザーゼ反応中に自身に転移鎖が挿入される確率又は頻度を最小限に抑えるために最小限に抑えられている。例えば、いくつかの実施形態では、転移鎖の５’部分のサイズは、約１５０ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、約７５ヌクレオチド未満、約５０ヌクレオチド未満、約２５ヌクレオチド未満、又は約１５ヌクレオチド未満である。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、転移鎖の５’末端は５’モノリン酸基を有する。いくつかの実施形態では、転移鎖及び非転移鎖の両方が５’モノリン酸基を有する。いくつかの好ましい実施形態では、非転移鎖の５’末端だけが５’モノリン酸基を有する。いくつかの別の実施形態では、転移鎖の５’末端に５’モノリン酸基がない。
【０１３１】
本発明に関して用語「トランスポザーゼ」は、転位反応に必要なトランスポゾン末端又はトランスポゾン末端配列と機能的複合体を形成できる酵素を意味することを意図する。本発明のトランスポザーゼには、レトロトランスポゾン及びレトロウイルスに由来するインテグラーゼも含まれる。
【０１３２】
「転位反応」とは、標的ＤＮＡのランダムな部位又はほぼランダムな部位に１又は複数のトランスポゾン末端が挿入される反応である。転位反応中の必須成分は、トランスポザーゼ及びトランスポゾン末端のヌクレオチド配列を示すＤＮＡオリゴヌクレオチド、例えば転移トランスポゾン末端配列及びその相補体、非転移トランスポゾン末端配列等、並びに機能的転位複合体を形成するために必要なその他の成分である。本発明の方法は、典型的には、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼ及びＴｎ５型トランスポゾン末端（Goryshin, I. and Reznikoff, W.S., J. Biol. Chem., 273: 7367, 1998）又はＭｕＡトランスポザーゼ及びＲ１及びＲ２末端配列を含むＭｕトランスポゾン末端（Mizuuchi, K., Cell, 35: 785, 1983; Savilahti, H, et al, EMBO J., 14: 4893, 1995）により形成される転位複合体を使用する。しかし、その意図する目的のために標的ＤＮＡを５’タグ化及び断片化するのに十分な効率でランダム又はほぼランダムにトランスポゾン末端を挿入できる任意の転位系が本発明に用いられ得る。本方法のために評価され得る当該技術分野で公知の転位系の例としては、限定されるものではないが、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｔｎ５５２（Colegio OR et al, J Bacteriol., 183: 2384-8, 2001；Kirby C et al, Mol Microbiol, 43: 173-86, 2002）、Ｔｙ１（Devine SE, and Boeke JD., Nucleic Acids Res., 22: 3765-72, 1994及び国際公開第９５／２３８７５号）、トランスポゾンＴｎ７（Craig, NL, Science. 271 : 1512, 1996；Craig, NL, Review in: Curr Top Microbiol Immunol, 204: 27-48, 1996）、Ｔｎ１０及びＩＳ１０（Kleckner N, et al, Curr Top Microbiol Immunol, 204: 49-82, 1996）、マリナートランスポザーゼ（Lampe DJ, et al, EMBO J., 15: 5470-9, 1996）、Ｔｃ１（Plasterk RH, Curr Top Microbiol Immunol, 204: 125-43, 1996）、Ｐ因子（Gloor, GB, Methods Mol Biol, 260: 97-114, 2004）、Ｔｎ３（Ichikawa H, and Ohtsubo E., J Biol Chem. 265: 18829-32, 1990）、細菌性挿入配列（Ohtsubo, F and Sekine, Y, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204: 1-26, 1996）、レトロウイルス（Brown PO, et al, Proc Natl Acad Sci USA, 86: 2525-9, 1989）、及び酵母のレトロトランスポゾン（Boeke JD and Corces VG, Annu Rev Microbiol. 43: 403-34, 1989）が含まれる。
【０１３３】
標的配列にトランスポゾン末端を挿入する方法は、好適なインビトロ転位系が利用可能な又は当該技術分野の知見に基づいて開発することができる任意の好適なトランスポゾン系を用いてインビトロで実行され得る。一般的に、本発明の方法における使用に適したインビトロ転位系は、最低でも、十分な純度、十分な濃度、及び十分なインビトロ転位活性のトランスポザーゼ酵素と、転位反応を触媒できるそれぞれのトランスポザーゼを含む機能的複合体をトランスポザーゼと形成するトランスポゾン末端を必要とする。本発明で使用され得る好適なトランスポザーゼトランスポゾン末端配列としては、限定されるものではないが、野生型、誘導体、又は変異体形態のトランスポザーゼから選択されたトランスポザーゼと複合体を形成する野生型、誘導体、又は変異体トランスポゾン末端配列が含まれる。本発明の方法中で出願人らが使用して成功した例示的トランスポザーゼには、野生型又は変異体の形態のＴｎ５トランスポザーゼ及びＭｕＡトランスポザーゼが含まれる（但し、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポザーゼは、本発明の方法における５’タグ化ＤＮＡ断片の作製において同じタンパク質量のＭｕＡトランスポザーゼよりかなり効率が高かった）が、所定のトランスポゾン末端を効率的にインビトロで転位するための組成物及び条件が公知である又は今後開発され得る任意のその他のトランスポザーゼが本発明に使用され得る。野生型又は変異体形態のＴｎ５トランスポザーゼ又はＭｕＡトランスポザーゼに認識されるトランスポゾン末端配列が好ましく、トランスポザーゼと複合体を形成した時に最も高い転位効率が得られるトランスポゾン末端配列及びそれと複合体を形成する対応する最適な活性を有するトランスポザーゼ酵素が本発明の実施形態に最も好ましい。好ましくは、トランスポザーゼが転移に要求するトランスポザーゼ末端配列が大きすぎないトランスポゾンが選択され、このトランスポゾン末端配列は、意図する目的のために十分に機能する可能な限り最小限のサイズであり且つ標的ＤＮＡ又は試料ＤＮＡ中に同じ配列がわずかにしか存在しない又は好ましくは全く存在しないために十分なサイズである。例えば、Ｔｎ５由来ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポゾン末端配列のトランスポゾン末端配列は１９ヌクレオチドしか含まず、一方、一部のその他のトランスポザーゼは転位のためにはるかに大きな末端配列を必要とする（例えば、ＭｕＡトランスポザーゼは約５１ヌクレオチドのトランスポゾン末端配列を必要とする）。
【０１３４】
標的核酸中にトランスポゾン末端を挿入するために用いることのできる好適なインビトロ転位系としては、限定されるものではないが、ウィスコンシン州マディソンのエピセンター・テクノロジーズ社から入手可能なＥＺ−Ｔｎ５（商標）高活性Ｔｎ５トランスポザーゼ、又はエピセンター社のＨｙｐｅｒＭｕ（商標）高活性ＭｕＡトランスポザーゼ、又はフィンランドのエスポーのフィンザイム（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）社等から入手可能な別のＭｕＡトランスポザーゼを用いるものが含まれる。各トランスポゾン末端の配列を示すトランスポゾン末端オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド合成機を用いて合成してもよく、それぞれの供給業者から利用可能な情報に基づいて又は当該技術分野で公知の情報を用いて市販の供給元から購入してもよい。例えば、ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ用の高活性トランスポゾンモザイク末端のヌクレオチド配列が実施例１に示されており、米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社の刊行物又はオンラインでｗｗｗ．ＥｐｉＢｉｏ．ｃｏｍからＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼに関する更なる情報が入手可能である。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本発明に従う標的ＤＮＡへのトランスポゾン末端の挿入をインビボで行ってもよい。転位をインビボで行う場合、標的ＤＮＡへの転位は、米国特許第６，１５９，７３６号（参照により本明細書に援用する）に記載されているように、トランスポザーゼと好適なトランスポゾン末端組成物とのシナプス複合体を宿主細胞中にエレクトロポレーションすることでなされることが好ましい。この転位方法は、典型的には、（Goryshin, I. and Reznikoff, W.S.（J. Biol. Chem., 273: 7367, 1998）に記載されているのと同様な方法で高活性Ｔｎ５トランスポザーゼ及び好適なＴｎ５型トランスポゾン末端組成物により形成される転位複合体又はＨｙｐｅｒＭｕ（商標）高活性ＭｕＡトランスポザーゼ（ウイスコンシン州マディソンのエピセンター社製）及びこのトランスポザーゼにより認識されるＲ１及びＲ２末端配列を示す好適なＭｕＡトランスポゾン末端組成物により形成される転位複合体を用いる。トランスポゾン末端組成物とトランスポザーゼの好適なシナプス複合体又は「トランスポソーム（商標）複合体（エピセンター社製）は、各ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの、通常は末端又は末端近くに、２個のトランスポゾン末端を有するポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの代わりに１個のトランスポゾン末端のみを示すオリゴヌクレオチドを使用すること以外は、Ｇｏｒｙｓｈｉｎ  ａｎｄ  Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆに付与された米国特許第６，１５９，７３６号及びその関連特許又はウイスコンシン州マディソンのエピセンターテクノロジーズ社のＴｎ５型ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポソーム（商標）複合体若しくはＨｙｐｅｒＭｕ（商標）  ＭｕＡトランスポソーム（商標）複合体の製品関連文書に記載されているように作製することができる。
【０１３６】
本発明は、本発明の方法のいずれかのためのキット及び個々の組成物も含む。キットは本発明の方法を実施するのに有用な個々の組成物の組合せであり、これらの組成物は方法で一緒に使用するために最適化されている。組成物は、本発明の方法の少なくとも１つのステップのための個々の成分又は成分のブレンドを含む。本発明は、本発明の任意の２つの組成物の組合せ及び本発明のキット又は方法中で使用される任意の新規の組成物から構成される任意のキットを含む。あるいは、キットは、使用に便利な構成の、例えば一回分が予め分注されている、単一の成分又は組成物から構成されてもよく、成分又は組成物を使用するための説明書一式を含んでもよい。
【０１３７】
発明の説明
序論
本発明は、核酸を処理する方法及び組成物、特にトランスポゾン組成物を用いてＤＮＡを断片化及びタグ化する方法及び組成物に関する。本発明の方法、組成物、及びキットは、ゲノム、サブゲノム、転写産物、メタゲノム、又はＲＮＡ発現の分析のために（例えば、マイクロアレイ分析のための標識された標的の作製における使用のため；例えば、コピー数変化の分析のため、一塩基多型の検出及び分析のため、及び土壌起源又は水起源等の環境試料に由来する遺伝子を発見するため）、任意の起源（ｓｏｕｒｃｅ）に由来する任意の目的のｄｓＤＮＡ（ＲＮＡから調製された二本鎖ｃＤＮＡを含む）を含む標的ＤＮＡからジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片又はタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片（及びその増幅産物）のライブラリーを作製するのに有用である。方法は種々のプロセスにおいて有用であり、そのようなプロセスとしては、限定されるものではないが、培養又は成長の条件が未知の１又は複数の微生物又は環境生物を含む１又は複数の生物の全ゲノムを増幅するプロセス（例えば全ゲノム増幅すなわちＷＧＡ）、リアルタイムＰＣＲ、エマルションＰＣＲ、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、比較ゲノムシークエンシング（ＣＧＳ）、及び蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）等の用途向けのＤＮＡ特異的プローブ（例えば染色体特異的プローブ、例えば染色体ペイント、又は例えば遺伝子若しくは遺伝子座に特異的なプローブ）を調製するプロセスが含まれる。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、方法は、大規模並列ＤＮＡシークエンシング（いわゆる「次世代シークエンシング」）の鋳型の作製にも使用される。これらのプロセス及び用途のそれぞれは、研究及び分子診断目的の両方で使用される。
【０１３８】
本発明は、任意の目的の試料に含まれる二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含む標的ＤＮＡからタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製するための方法、組成物、及びキットを提供する。方法は、より容易且つ迅速であり、手作業の時間（ｈａｎｄｓ−ｏｎ  ｔｉｍｅ）が少なく、より少ない試料及びより少ない量の試料核酸で実施することができ、断片の両端のタグ化がより効率的であり、作製元の試料核酸を定性的及び／又は定量的に表すジタグ化ＤＮＡ断片を生成する。方法は機器を用いずに手作業で容易に行うことができるが、ハイスループット環境のロボット自動化にも容易に適合される。
【０１３９】
方法の実施形態
本明細書に開示する本発明の方法の全実施形態で、標的ＤＮＡの切断による断片化及び各断片の５’末端へのタグの連結を同時に行うためにインビトロの転位反応を用いる。方法は全て関連しているので、特定の実施形態に関連して特に断りのない限り、一実施形態に関して本明細書中に示す方法は本明細書に記載の別の実施形態にも用いることができる。インビトロ転位反応を用いる本明細書に開示する方法の全実施形態は、別個のトランスポザーゼ及びトランスポゾン末端組成物、又は、トランスポザーゼとトランスポゾン末端組成物との間で形成された安定な複合体を含む単一のトランスポソーム組成物、のいずれかを用いて反応を組み立てることで行うことができる。したがって、トランスポザーゼ及びトランスポゾン末端組成物の使用を記載しているいずれの方法でも、トランスポザーゼとトランスポゾン末端組成物とから作製されるトランスポソーム組成物を使用してよく、トランスポソーム組成物の使用を記載しているいずれの方法でも、トランスポソーム組成物を構成するトランスポザーゼ及びトランスポゾン末端組成物を別個に使用してよいと理解される。このことを本発明の一般的方法の１つを以下にの２通りに記述することで説明する。
【０１４０】
本発明の一実施形態は、任意の目的のｄｓＤＮＡを含む標的ＤＮＡからタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する方法（例えば次世代シークエンシング又は増幅の鋳型として使用するため）であって、方法は、インビトロ転位反応中で、標的ＤＮＡと、少なくとも１つのトランスポザーゼと、トランスポザーゼと転位複合体を形成するトランスポゾン末端組成物とを、標的ＤＮＡへの複数の挿入が起こる条件下で、そのために十分な時間、インキュベートする工程であって、トランスポゾン末端組成物が、（ｉ）転移トランスポゾン末端配列及び必要に応じて転移トランスポゾン末端配列の５’に更なる配列を示す転移鎖並びに（ｉｉ）転移トランスポゾン末端配列に相補的な配列を示す非転移鎖を含み、各挿入が、転移鎖を含む又はからなる第１のタグを標的ＤＮＡのヌクレオチドの５’末端に連結し、それによって、標的ＤＮＡが断片化され、それぞれが５’末端に第１のタグを有するアニーリングした５’タグ化ＤＮＡ断片の集合が生成される工程；次いで、５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端を第１のタグ又は第２のタグに連結することでタグ化ＤＮＡ断片のライブラリー（例えば、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片又は５’及び３’がタグ化されたＤＮＡ断片（すなわち「ジタグ化ＤＮＡ断片」）のいずれかを含む）を作製する工程、を含む。
【０１４１】
好ましい一実施形態では、前述したように、方法は別個のトランスポザーゼ及びトランスポゾン末端組成物を用いて行われ、いくつかのその他の好ましい実施形態では、方法は、トランスポザーゼとトランスポゾン末端組成物との間で形成された複合体を含むトランスポソーム組成物を用いて行われる。
【０１４２】
したがって、本発明の好ましい一実施形態は、（例えば次世代シークエンシング又は増幅の鋳型として使用するために）インビトロ転位反応において任意の目的のｄｓＤＮＡを含む標的ＤＮＡからタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する方法であって、方法は、標的ＤＮＡと、トランスポザーゼと、トランスポザーゼと転位複合体を形成するトランスポゾン末端組成物の複合体をそれぞれが含む１又は複数のトランスポソーム組成物とを、標的ＤＮＡへの複数の挿入が起こる条件下で、そのために十分な時間、インキュベートする工程であって、トランスポゾン末端組成物が（ｉ）転移トランスポゾン末端配列及び必要に応じて転移トランスポゾン末端配列の５’に更なる配列を示す転移鎖並びに（ｉｉ）転移トランスポゾン末端配列に相補的な配列を示す非転移鎖を含み、各挿入によって転移鎖を含む又はからなる第１のタグが標的ＤＮＡのヌクレオチドの５’末端に連結され、それによって、標的ＤＮＡが断片化され、それぞれが５’末端に第１のタグを有するアニーリングした５’タグ化ＤＮＡ断片の集合が生成される、工程；次いで、５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端を第１のタグ又は第２のタグに連結することで、タグ化ＤＮＡ断片のライブラリー（例えば、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片又は５’及び３’がタグ化されたＤＮＡ断片（すなわち「ジタグ化ＤＮＡ断片」）のいずれかを含む）を作製する工程、を含む。
【０１４３】
本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、インビトロ転位反応で使用するトランスポザーゼ及びトランスポゾン末端組成物又はトランスポソーム組成物の量は、反応５０マイクロリットル当たり、標的ＤＮＡ５０ナノグラムに対して約１〜約２５ピコモルである。本発明の方法のいずれかのいくつかの好ましい実施形態では、インビトロ転位反応で使用するトランスポザーゼ及びトランスポゾン末端組成物又はトランスポソーム組成物の量は、反応５０マイクロリットル当たり、標的ＤＮＡ５０ナノグラムに対して約５〜約５０ピコモルである。トランスポザーゼが高活性Ｔｎ５トランスポザーゼであり且つトランスポゾン末端組成物がＭＥＤＳトランスポゾン末端組成物を含むか、あるいはトランスポソーム組成物が前記高活性Ｔｎ５トランスポザーゼとＭＥＤＳトランスポゾン末端を含むトランスポゾン末端組成物とを含む、本発明の方法のいずれかのいくつかの好ましい実施形態では、インビトロ転位反応に使用する前記トランスポザーゼ及びトランスポゾン末端組成物又は前記トランスポソーム組成物の量は反応５０マイクロリットル当たり、標的ＤＮＡ５０ナノグラムに対して約５〜約２５ピコモルである。トランスポザーゼが高活性Ｔｎ５トランスポザーゼ又はＭｕＡトランスポザーゼである本発明の方法のいずれかのいくつかの好ましい実施形態では、インビトロ転位反応で使用するトランスポザーゼ及びトランスポゾン末端組成物又はトランスポソーム組成物の終濃度は少なくとも２５０ｎｍであり；いくつかの別の実施形態では、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼ若しくはＭｕＡトランスポザーゼ又はその対応するトランスポゾン末端組成物若しくはトランスポソーム組成物の終濃度は少なくとも５００ｎｍである。
【０１４４】
本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、インビトロ転位反応の反応時間は、２時間以下、１時間以下、３０分以下、又は１５分以下である。本発明の方法のいずれかのいくつかの好ましい実施形態では、インビトロ転位反応の反応時間は５分以下である。トランスポソーム組成物が高活性Ｔｎ５トランスポザーゼとＭＥＤＳトランスポゾン末端を含むトランスポゾン末端組成物とを含む本発明の方法のいずれかのいくつかの好ましい実施形態では、インビトロ転位反応の反応時間は５分以下である。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、方法は更に、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及び第１のタグ又は第２のタグに相補的な少なくとも１つのプライマーを用いて、ジタグ化ＤＮＡ断片又はタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片を非選択的に増幅するステップを含む。インビトロ転位反応で１つのトランスポソームだけを使用する方法のいくつかの好ましい実施形態では、タグ化ＤＮＡ断片の増幅ステップは、転移鎖の少なくとも一部の配列を示す１つのプライマーを用いてジタグ化ＤＮＡ断片又はタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片を増幅することを含む。いくつかの実施形態では、１つのプライマーを用いてタグ化ＤＮＡ断片を増幅するステップは、ＰＣＲ又はローリングサークル複製反応を含む。いくつかの実施形態では、増幅に使用するプライマーの５’部分は、シークエンシングタグドメインを含む又はからなる。
【０１４６】
本発明の方法のいずれかのいくつかの好ましい実施形態では、ＤＮＡ断片のライブラリーを用いてＤＮＡシークエンシング又は核酸増幅のための鋳型を提供する。
【０１４７】
本発明は、後述するように、ジタグ化ＤＮＡ断片又はタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片のいずれかを含むタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する複数の実施形態を含む。
【０１４８】
ジタグ化ＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片を生成する鎖置換活性又は５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの使用
方法の好ましい実施形態の１つは、インビトロ転位反応中で標的ＤＮＡと少なくとも１つのトランスポソームを、アニーリングされた５’タグ化ＤＮＡ断片の集合が生成される条件下で、そのために十分な時間、インキュベートする工程；次いで、アニーリングされた５’タグ化ＤＮＡ断片の集合を、熱サイクルなしの条件下で、鎖置換活性又は５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼとインキュベートする工程であって、アニーリングされた５’タグ化ＤＮＡ断片が変性されず、ＤＮＡポリメラーゼが、アニーリングされた５’タグ化ＤＮＡ断片の各鎖の３’末端を相補鎖を鋳型として用いて伸張させるか、非転移鎖を置換又は消化し、その結果、ジタグ化ｄｓＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーが生成される工程を含む。
【０１４９】
方法の好ましい実施形態の１つは、インビトロ転位反応中で標的ＤＮＡを少なくとも１つのトランスポソームとインキュベートしてアニーリングされた５’タグ化ＤＮＡ断片の集合を作製する工程；アニーリングされた５’タグ化ＤＮＡ断片の集合を、鎖置換活性又は５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼとインキュベートしてジタグ化ｄｓＤＮＡ断片を作製する工程；及びジタグ化ｄｓＤＮＡ断片を変性させてジタグ化ｓｓＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する（例えば９５℃に加熱して急冷することによる）工程を含む。この方法の実施形態の好ましい形態の１つでは、如何なる精製ステップも介さずに１つの管中で標的ＤＮＡからジタグ化ｓｓＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する。
【０１５０】
鎖置換活性又は５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いてジタグ化ＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製することを含む方法のいくつかの実施形態では、方法は、更に、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及び第２のタグに相補的な少なくとも１つのプライマーを用いてジタグ化ＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片を増幅するステップを含む。この方法のいくつかの好ましい実施形態では、ジタグ化ＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを増幅するステップは、転移鎖の少なくとも一部の配列を示すオリゴデオキシリボヌクレオチド１つだけをＰＣＲプライマーとして用い、ジタグ化ＤＮＡ断片を鋳型として用いるＰＣＲによりタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを増幅することを含む。したがって、この実施形態は、標的ＤＮＡから作製したジタグ化ＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを１つのプライマーでＰＣＲ増幅する方法である。標的ＤＮＡが生物の全ゲノムＤＮＡを含む場合、この実施形態は非選択的全ゲノム増幅方法である。
【０１５１】
鎖置換活性又は５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いてジタグ化ＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する工程及び作製されたジタグ化ＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅する工程を更に含む方法のインビトロ転位反応で１つのトランスポゾン末端組成物を使用するいくつかの好ましい実施形態では、２つの異なるＰＣＲプライマーを用い、ＰＣＲプライマーのぞれぞれは、トランスポゾン末端組成物を構成する転移トランスポゾン末端の少なくとも一部の配列を示す。いくつかの好ましい実施形態では、各ＰＣＲプライマーは３’部分及び５’部分を含み、３’部分は各転移トランスポゾン末端配列を示し、５’部分は特定の目的のための各タグドメイン（例えば、次世代シークエンシング又は増幅のためのシークエンシングタグドメイン又は増幅タグドメイン、及び必要に応じて、アドレスタグドメイン）の配列を示す。
【０１５２】
鎖置換活性又は５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いてジタグ化ＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する工程を含む方法のいずれかのいくつかの好ましい実施形態では、インビトロ転位反応中の少なくとも１つのトランスポソームは、２つの異なるトランスポソームを含む又はからなる。２つの異なるトランスポソームを使用するいくつかの好ましい実施形態では、２つのトランスポソームのそれぞれは、同じトランスポザーゼを含むが異なるトランスポゾン末端組成物を含む。２つの異なるトランスポソームを使用するいくつかの好ましい実施形態では、２つの異なるトランスポソームはそれぞれ同じトランスポザーゼを含み、トランスポゾン末端組成物は異なる転移鎖を含む。２つの異なるトランスポソームを使用するいくつかの好ましい実施形態では、２つのトランスポソームのそれぞれは、異なるトランスポザーゼ酵素及び各トランスポザーゼとそれぞれが機能的複合体を形成する異なるトランスポゾン末端組成物を含む。インビトロ転位反応中で２つの異なるトランスポゾン末端組成物を使用し、鎖置換活性又は５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いてジタグ化ｓｓＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する方法のいくつかの好ましい実施形態では、第１のタグは一方のトランスポゾン末端組成物の転移鎖の配列を示し、第２のタグは他方のトランスポゾン末端組成物の非転移鎖の配列を示す。
【０１５３】
鎖置換活性又は５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いてジタグ化ＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製することを含み、インビトロ転位反応で２つの異なるトランスポゾン末端組成物を使用し、作製したジタグ化ＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅するステップを更に含む、方法のいくつかの好ましい実施形態では、２つの異なるＰＣＲプライマーを用い、このＰＣＲプライマーの一方は、一方のトランスポゾン末端組成物を構成する転移鎖の少なくとも一部の配列を示し、ＰＣＲプライマーのもう一方は、他方のトランスポゾン末端組成物を構成する転移鎖の少なくとも一部の配列を示す。それぞれのトランスポゾン末端組成物を構成する転移鎖が３’部分及び５’部分を含み、３’部分がそれぞれの転移トランスポゾン末端配列を示し、それぞれの転移鎖の５’部分が特定の目的のためのタグドメイン（例えば、次世代シークエンシング又は増幅のためのシークエンシングタグドメイン又は増幅タグドメイン、及び必要に応じてアドレスタグドメイン）を含む異なる配列を示す、いくつかの好ましい実施形態では、各ＰＣＲプライマーは、それぞれの転移トランスポゾンオリゴヌクレオチドのタグドメインの配列を示す。
【０１５４】
ジタグ化ＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片を作製するためのターミナルトランスフェラーゼの使用
方法の別の実施形態は、インビトロ転位反応中で標的ＤＮＡを少なくとも１つのトランスポソームとインキュベートして５’タグ化ｄｓＤＮＡ断片を作製する工程；５’タグ化ｄｓＤＮＡ断片を変性させて５’タグ化ｓｓＤＮＡ断片を作製する工程；及び５’タグ化ｓｓＤＮＡ断片と、ターミナルトランスフェラーゼからなるＤＮＡポリメラーゼ及びターミナルトランスフェラーゼ用の少なくとも１つのｄＮＴＰ基質とを、ターミナルトランスフェラーゼがポリ（ｄＮＭＰ）からなる第２のタグを５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端に連結する条件下で、そのために十分な時間、インキュベートすることで、ジタグ化ＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する工程、を含む（例えば図３）。この方法のいくつかの実施形態では、トランスポソームのトランスポゾン末端組成物を構成する非転移トランスポゾン末端オリゴヌクレオチドの３’末端がブロックされており（例えば、３’末端ヌクレオチドとしてジデオキシヌクレオチド又は３’−Ｏ−メチル−ヌクレオチドを有する非転移トランスポゾン末端オリゴヌクレオチドを用いる）、このブロックされた３’ヌクレオチドは、ターミナルトランスフェラーゼによるポリ（ｄＮＭＰ）の付加を防止することで、非転移トランスポゾン末端オリゴヌクレオチドの後ろのタグ化を防止する。
【０１５５】
方法の更に別の実施形態は、インビトロ転位反応中で標的ＤＮＡを少なくとも１つのトランスポソームと一緒にインキュベートして５’タグ化ＤＮＡ断片を作製する工程；事前の変性ステップなしに、５’タグ化ＤＮＡ断片と、ターミナルトランスフェラーゼからなるＤＮＡポリメラーゼと、ターミナルトランスフェラーゼ用の少なくとも１つのｄＮＴＰ基質とを、ターミナルトランスフェラーゼがポリ（ｄＮＭＰ）からなる第２のタグを５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端に連結する条件下で、そのために十分な時間、インキュベートすることで、ジタグ化ＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する工程を含む。この方法のいくつかの実施形態では、トランスポソームのトランスポゾン末端組成物を構成する非転移トランスポゾン末端オリゴヌクレオチドの３’末端がブロックされている（例えば、ジデオキシヌクレオチド又は３’−Ｏ−メチル−ヌクレオチドを有する非転移トランスポゾン末端オリゴヌクレオチドを３’末端ヌクレオチドとして用いる）。
【０１５６】
ジタグ化ＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片を作製するためのＤＮＡポリメラーゼ及び末端タグ化用オリゴヌクレオチドの使用
方法の更に別の実施形態は、インビトロ転位反応中で標的ＤＮＡを少なくとも１つのトランスポソームとインキュベートして５’タグ化ｄｓＤＮＡ断片を作製する工程；５’タグ化ｄｓＤＮＡ断片を変性させて５’タグ化ｓｓＤＮＡ断片を作製する工程（例えば９５℃に加熱して急冷する）；並びにＤＮＡポリメラーゼ及び末端タグ化用オリゴヌクレオチド（例えば図４）を用いて第２のタグを５’タグ化ｓｓＤＮＡ断片に連結することで、ジタグ化ＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する工程、を含む。いくつかの好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ及び末端タグ化用オリゴヌクレオチドを用いて第２のタグを５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端に連結するステップは、
（１）５’部分及び３’部分を含む又はからなる末端タグ化用オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、５’部分が、５’タグ化ｓｓＤＮＡ断片の３’末端に連結したい第２のタグの配列に相補的な配列を示し、３’部分が、ＤＮＡポリメラーゼにより伸張されないように３’末端ヌクレオチドがブロックされた３〜８個（例えば３、４、５、６、７、又は８個のランダムヌクレオチドを含む又はからなるランダム配列を示す、工程；
（２）末端タグ化用オリゴヌクレオチドが５’タグ化ｓｓＤＮＡ断片にアニーリングする条件下で、そのために十分な時間、５’タグ化ｓｓＤＮＡ断片を末端タグ化用オリゴヌクレオチドに接触させる工程；
（３）末端タグ化用オリゴヌクレオチドを鋳型として５’タグ化ｓｓＤＮＡ断片の３’末端が伸張されるＤＮＡ重合条件下で、そのために十分な時間、末端タグ化用オリゴヌクレオチドをアニーリングさせた５’タグ化ｓｓＤＮＡ断片を反応混合物中でＤＮＡポリメラーゼと接触させることで、第２のタグを３’末端に連結して５’及び３’タグ化ｓｓＤＮＡ断片を作製する工程、を含む。いくつかの実施形態では、末端タグ化用オリゴヌクレオチド中にランダム配列の代わりに半ランダム配列を用いる。
【０１５７】
この実施形態のいくつかの変形例では、末端タグ化用オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドを含む又はからなる。この実施形態のいくつかの変形例では、末端タグ化用オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドを含む又はからなり、そのような実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの好ましい実施形態では、末端タグ化用オリゴヌクレオチドの３’部分は７個のランダムヌクレオチドからなる。５’タグ化ｓｓＤＮＡ断片に第２のタグを連結するために末端タグ化用オリゴヌクレオチドを用いる方法のいくつかの好ましい実施形態では、第２のタグは第１のタグに相補的でない。
【０１５８】
ジタグ化ＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片を作製するための鋳型依存性（又は相同性）リガーゼ及びライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドの使用
方法の好ましい実施形態の１つは、アニーリングされた５’タグ化ＤＮＡ断片の集合が作製される条件下で、そのために十分な時間、インビトロ転位反応中で標的ＤＮＡを少なくとも１つのトランスポソームとインキュベートする工程；次いで、アニーリングされた５’タグ化ＤＮＡ断片に第２のタグが連結される条件下で、そのために十分な時間、アニーリングされた５’タグ化ｄｓＤＮＡ断片の集合を鋳型依存性（又は相同性）ＤＮＡリガーゼ並びに３’部分及び５’部分を含む又はからなるライゲーションタグ化用オリゴデオキシヌクレオチドとインキュベートすることで、アニーリングされたジタグ化ＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片のライブラリーを作製する工程であって、ライゲーションタグ化用オリゴデオキシヌクレオチドの３’部分が、アニーリングされた５’タグ化ＤＮＡ断片の集合の３’末端に連結したい任意の配列を示す第２のタグ（例えば任意配列）を示し、５’部分が、５’モノリン酸基を有し且つランダム配列を示す、工程、を含む。いくつかの好ましい実施形態では、方法は更に、アニーリングされたジタグ化ＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片のライブラリーを変性させる（例えば９５℃に加熱して急冷する）ことでジタグ化ｓｓＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片のライブラリーを作製するステップを含む。
【０１５９】
いくつかの好ましい実施形態では、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドは、約３〜約８個のヌクレオチドからなるランダム配列を示す５’部分を含む。いくつかの好ましい実施形態では、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドは、４ヌクレオチドからなるランダム配列を示す５’部分を含む。いくつかの好ましい実施形態では、鋳型依存性リガーゼは大腸菌のＤＮＡリガーゼである。方法のこの実施形態の好ましい形態の１つでは、ジタグ化ｓｓＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを、精製ステップを介さずに１つの管中で標的ＤＮＡから作製する。
【０１６０】
タグ化環状ＤＮＡ断片、扇形ｄｓＤＮＡ断片、又はジタグ化ＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製するためのヘアピントランスポゾン末端組成物及び鋳型依存性リガーゼの使用
インビトロ転位反応で標的ＤＮＡからタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する方法の好ましい一実施形態では、方法は、標的ＤＮＡを１又は複数のトランスポソーム組成物とインキュベートする工程であって、各トランスポソーム組成物がトランスポザーゼ及びトランスポザーゼと転位複合体を形成するヘアピントランスポゾン末端組成物の複合体を含み、ヘアピントランスポゾン末端組成物が５’リン酸含有オリゴヌクレオチドを含む又はからなり、５’リン酸含有オリゴヌクレオチドが、５’末端に非転移トランスポゾン末端配列を示し且つ３’末端に転移トランスポゾン末端配列を示し且つ細胞内ステムループを形成するのに十分な長さの介在任意タグ配列を非転移トランスポゾン末端配列と転移トランスポゾン末端配列の間に示すものであり、標的ＤＮＡにヘアピントランスポゾン末端組成物が挿入されることでアニーリングされた５’タグ化ＤＮＡ断片が生成される条件下で、そのために十分な時間インキュベートする工程；次いで、アニーリングされた５’タグ化ＤＮＡ断片の集合を、インビトロ転位反応後に生じるアニーリングされた５’タグ化ＤＮＡ断片中の一本鎖ギャップと同じ長さを単独又は組合せで有する１又は複数のランダム配列５’リン酸含有オリゴヌクレオチドと一緒にインキュベートする工程であって、標的ＤＮＡの一本鎖ギャップにランダム配列オリゴヌクレオチドがアニーリングすることでアニーリングされた５’タグ化ＤＮＡ断片の集合中の一本鎖ギャップが埋められる条件下で、そのために十分な時間、インキュベートする工程；次いで、アニーリングしたランダム配列オリゴヌクレオチドが互いに又は隣接する５’タグ化ＤＮＡ断片の５’末端にライゲーションされる条件下で、そのために十分な時間、一本鎖ギャップが埋められ且つアニーリングされた５’タグ化ＤＮＡ断片の集合を鋳型依存性リガーゼとインキュベートすることで、タグ化環状ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する工程、を含む。
【０１６１】
インビトロ転位反応で標的ＤＮＡからタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する方法の別の好ましい実施形態では、方法は、標的ＤＮＡを１又は複数のトランスポソーム組成物とインキュベートする工程であって、各トランスポソーム組成物がトランスポザーゼ及びトランスポザーゼと転位複合体を形成するヘアピントランスポゾン末端組成物の複合体を含み、ヘアピントランスポゾン末端組成物が、５’リン酸含有オリゴヌクレオチドを含む又はからなり、５’リン酸含有オリゴヌクレオチドが５’末端に非転移トランスポゾン末端配列を示し且つ３’末端に転移トランスポゾン末端配列を示し且つ細胞内ステムループを形成するのに十分な長さの介在任意タグ配列を非転移トランスポゾン末端配列と転移トランスポゾン末端配列の間に示すものであり；標的ＤＮＡにヘアピントランスポゾン末端組成物が挿入されることでアニーリングされた５’タグ化ＤＮＡ断片が生成される条件下でそのために十分な時間、インキュベートする工程；次いで、アニーリングされた５’タグ化ＤＮＡ断片を、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、構造依存性５’ヌクレアーゼ活性、及び鎖置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼとインキュベートする工程であって、インビトロ転位反応後のアニーリングされた５’タグ化ＤＮＡ断片の集合中に存在する一本鎖ギャップがＤＮＡポリメラーゼによる各アニーリングされた５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端の伸張により埋められる条件下で、そのために十分な時間インキュベートする工程；次いで、アニーリングされたＤＮＡポリメラーゼ伸張産物の３’末端が隣接するアニーリングされた５’タグ化ＤＮＡ断片の５’末端にライゲーションされる条件下で、そのために十分な時間、一本鎖ギャップが埋められ且つアニーリングされた５’タグ化ＤＮＡ断片を鋳型依存性リガーゼとインキュベートすることで、タグ化環状ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する工程、を含む。
【０１６２】
この方法のいくつかの好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ及び鋳型依存性リガーゼの両方が１つの反応混合物中に提供され、ＤＮＡポリメラーゼ伸張及び鋳型依存性ライゲーションの両方が１つの反応混合物中で行われる。
【０１６３】
タグ化環状ＤＮＡ断片のライブラリーを作製するためのこれらの方法のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は更に、鋳型依存性リガーゼとインキュベートしてタグ化環状ＤＮＡ断片のライブラリーを作製するステップの後に、ライゲーションされていない直鎖ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡ（例えば、ランダム配列オリゴヌクレオチド、直鎖標的ＤＮＡ及び／又は標的ＤＮＡに連結されていないヘアピントランスポゾン末端組成物を含む）を除去する１又は複数のステップを含む。ライゲーションされていない直鎖ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡを除去するための好ましい一実施形態では、方法は更に、タグ化環状ＤＮＡ断片を含む反応混合物をＴ５エキソヌクレアーゼで処理する工程を含む。
【０１６４】
タグ化環状ＤＮＡ断片のライブラリーを作製するためのこれらの方法のいずれかのいくつかの好ましい実施形態では、方法は更に、タグ化環状ＤＮＡ断片を、ヘアピントランスポゾン末端組成物に由来する各ループ構造中で切断して、各鎖が５’末端にタグ部分を有し且つ３’末端にタグの一部を有する扇形ｄｓＤＮＡ断片を作製する工程を含む。いくつかの実施形態では、タグ化環状ＤＮＡ断片を各ループ構造中で切断するステップは、切断可能な部位でタグ化環状ＤＮＡ断片が切断されて扇形ｄｓＤＮＡ断片が生成される条件下で、そのために十分な時間、タグ化環状ＤＮＡ断片を切断酵素組成物と接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、各ループ構造中でタグ化環状ＤＮＡ断片を切断するステップは、タグ内の制限部位にアニーリングするオリゴデオキシリボヌクレオチドをタグ化環状ＤＮＡ断片にアニーリングさせ、その後、扇形ｄｓＤＮＡ断片のライブラリーが生成される条件下で、そのために十分な時間、その二本鎖制限部位で切断する制限エンドヌクレアーゼとインキュベートする工程を含む。いくつかの好ましい実施形態では、各ループ構造中でタグ化環状ＤＮＡ断片を切断するステップは、タグ化環状ＤＮＡ断片をＤＮＡグリコシラーゼ及びＡＰエンドヌクレアーゼと接触させる工程であって、ＤＮＡグリコシラーゼがタグ内に存在する非標準的ヌクレオチド（例えば、ｄＵＭＰ又は８−オキソ−ｄＧＭＰ）から核酸塩基を除去し、ＡＰエンドヌクレアーゼで脱塩基部位にてタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片を切断する工程を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡグリコシラーゼはウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ及びＦＰＧタンパク質から選択され、ＡＰエンドヌクレアーゼは大腸菌のエンドヌクレアーゼＩＩＩ又はエンドヌクレアーゼＩＶから選択される。
【０１６５】
扇形ｄｓＤＮＡ断片のライブラリーを作製するための方法のいずれかのいくつかの好ましい実施形態では、方法は更に、扇形ｄｓＤＮＡ断片のライブラリーを変性させてジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片のライブラリーを作製するステップを含む。
【０１６６】
タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片を作製するための鋳型非依存性リガーゼの使用
方法の好ましい実施形態の１つは、インビトロ転位反応中で標的ＤＮＡを少なくとも１つのトランスポソームとインキュベートする工程であって、トランスポソームを構成する転移鎖の５’末端が５’リン酸基を有し、アニーリングされた５’タグ化ＤＮＡ断片の集合が作製される条件下でそのために十分な時間インキュベートする工程；次いで、アニーリングされた５’タグ化ｄｓＤＮＡ断片を変性させて５’タグ化ｓｓＤＮＡ断片を得る工程（例えば９５℃に加熱して急冷する）；次いで、ライゲーション反応中で５’タグ化ｓｓＤＮＡ断片を鋳型非依存性（又は非相同性（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ））リガーゼとインキュベートする工程であって、５’タグ化ｓｓＤＮＡ断片が分子内でライゲーションされて標的ＤＮＡの一部の配列及びタグ配列をそれぞれが示すタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片のライブラリーが作製される条件下でそのために十分な時間インキュベートする工程、を含む。
【０１６７】
方法のこの実施形態の好ましい形態の１つでは、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを、精製ステップを介さずに１つの管中で標的ＤＮＡから作製する。好ましい一実施形態では、鋳型非依存性リガーゼはバクテリオファージＴＳ２１２６耐熱性ＲＮＡリガーゼ及び古細菌のＲＮＡリガーゼ（例えば高温メタン生成菌のＲＮＡリガーゼ１）から選択される。いくつかの好ましい実施形態では、鋳型依存性リガーゼがアデニル化された形態で提供され、５’タグ化ｓｓＤＮＡ断片を鋳型非依存性リガーゼとインキュベートするステップは、ライゲーション反応のためのＡＴＰ又はＮＡＤを添加せずに行われる。
【０１６８】
いくつかの好ましい実施形態では、方法は更に、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片をタグ内の部位で切断することでジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する工程を含む。いくつかの実施形態では、切断ステップは、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片のタグ内の一本鎖制限部位に相補的であるオリゴデオキシリボヌクレオチドをアニーリングさせ、その後、制限部位を認識する制限エンドヌクレアーゼを用いてタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片を制限部位で切断することを含む。いくつかの別の実施形態では、切断ステップは、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片をＤＮＡグリコシラーゼ及びエンドヌクレアーゼと接触させ、ＤＮＡグリコシラーゼにタグ内に存在する非標準的ヌクレオチド（例えば、ｄＵＭＰ又は８−オキソ−ｄＧＭＰ）から核酸塩基を除去させ、エンドヌクレアーゼで、生じた脱塩基部位にてタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片を切断することを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡグリコシラーゼはウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ及びＦＰＧタンパク質から選択され、ＡＰエンドヌクレアーゼは大腸菌のエンドヌクレアーゼＩＩＩ又はエンドヌクレアーゼＩＶから選択される。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、方法は更に、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを増幅することにより、増幅されたタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製するステップを含む。いくつかの好ましい実施形態では、タグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを増幅するステップは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことで、増幅されたジタグ化ＤＮＡ断片を含む増幅されたタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製することを含む。いくつかの好ましい実施形態では、ＰＣＲ反応は第１のＰＣＲプライマー及び第２のＰＣＲプライマーを用いて行われ、ＰＣＲプライマーはそれぞれ３’部分及び５’部分を有し、第１のＰＣＲプライマーの３’部分はタグ化ＤＮＡ断片中のタグにより示される配列に相補的であり、第２のＰＣＲプライマーの３’部分はタグに相補的な配列に相補的であり、各５’部分は、作製された増幅されたジタグ化ＤＮＡ断片を特定の次世代シークエンシング・プラットフォームを用いた次世代シークエンシングの鋳型として用いることを可能にする適切なシークエンシングタグ（例えば、ロシュ社の４５４Ａ及び４５４Ｂシークエンシングタグ、イルミナ（商標）社のＳＯＬＥＸＡ（商標）シークエンシングタグ、アプライドバイオシステムズ社のＳＯＬＩＤ（商標）シークエンシングタグ、パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシングタグ、ポロネイター・ポロニー社（Ｐｏｌｌｏｎａｔｏｒ  Ｐｏｌｏｎｙ）のシークエンシングタグ、又はコンプリート・ゲノミクス社のシークエンシングタグ）を含む又はからなるシークエンシングタグドメインを含む。
【０１７０】
標的ＤＮＡの末端配列をより良く表すＤＮＡ断片ライブラリーの作製方法
本発明者らが観察した特定の配列データは、サイズが１０Ｋｂ未満のｄｓＤＮＡ分子を含む標的ＤＮＡの末端から得られた次世代配列データの提示が、その標的ＤＮＡの中央から得られた配列データの提示と比べて少ないことを示していた。理論により限定されるものではないが、この観察結果に対する説明の１つとして、２つのトランスポゾン末端組成物が直鎖ｄｓＤＮＡ分子の末端に逆向きに挿入されたＤＮＡ断片を見つける確率が、２つのトランスポゾン末端組成物が直鎖ｄｓＤＮＡ分子の中央に逆向きに挿入されたＤＮＡ断片を見つける確率よりも低い可能性がある。この問題を解決するために、本発明者らは、標的ＤＮＡを構成するｄｓＤＮＡ分子の末端の配列を示すＤＮＡ断片をより良く表すＤＮＡ断片ライブラリーを作製する更なる方法を開発した。
【０１７１】
１つの好ましい実施形態は、標的ＤＮＡを構成するｄｓＤＮＡ分子の末端の配列を示すＤＮＡ断片をより良く表すＤＮＡ断片ライブラリーを作製する方法であって、方法は、標的ＤＮＡを、少なくとも１つのトランスポザーゼ及びそれと転位複合体を形成する少なくとも１つのトランスポゾン末端組成物を含む少なくとも１つのトランスポソーム組成物とインキュベートする工程であって、トランスポゾン末端組成物が転移鎖及び非転移鎖を含み、転移鎖が標的ＤＮＡに連結される条件下でそのために十分な時間インビトロ転位反応でインキュベートすることで、それぞれが５’末端に転移鎖を含む又はからなる第１のタグを有するアニーリングされた５’タグ化ｓｓＤＮＡ断片を含む５’タグ化ｄｓＤＮＡ断片を作製する工程；５’タグ化ｄｓＤＮＡ断片を変性させて５’タグ化ｓｓＤＮＡ断片を放出させる工程；次いで、ｓｓＤＮＡをライゲーションする鋳型非依存性リガーゼ（例えば、バクテリオファージＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ；例えば、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）耐熱性ｓｓＤＮＡリガーゼ、米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンター社製）を用いた分子内ライゲーションにより５’タグ化ｓｓＤＮＡ断片を環状化することでタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片のライブラリーを作製する工程、を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトランスポザーゼ及び少なくとも１つのトランスポゾン末端組成物を、トランスポソーム組成物を含む単一の成分としてではなく、別個の成分として反応に添加する。いくつかの実施形態では、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片は、次世代シークエンシングの鋳型として、又は標識した後にアレイ若しくはマイクロアレイのプローブへのアニーリングの標的として、又は本明細書に記載のその他の用途に使用される。いくつかの別の実施形態では、方法は更に、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片を第１のタグ内で線状化することでジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片を作製するステップを含む。タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片の線状化を含むこれらの実施形態のいずれかのいくつかでは、第１のタグは複数のタグドメインを含み、第１のタグの線状化ステップにより、５’末端に第１のタグの１つの部分が生じ、３’末端に第１のタグの別の部分が生じる。例えば、いくつかの実施形態では、転移トランスポゾン末端組成物の転移鎖は複数のタグドメイン（例えば、ロシュ社の４５４Ａ及びロシュ社の４５４Ｂシークエンシングタグドメインの両方）を含む第１のタグを示し、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片の線状化ステップで生成されたジタグ化ｓｓＤＮＡ断片の３’末端に少なくとも１つのタグドメインが連結されている。例えば、いくつかの実施形態では、５’タグ化ＤＮＡは、そのヌクレオチド部位における切断を可能にする１又は複数のヌクレオチドを含む転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物を用いて作製され、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片をタグ内で線状化するステップは、前記１又は複数のヌクレオチドにおいてタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片を切断することを含む。例えば、いくつかの実施形態では、転移鎖は１若しくは複数のデオキシウリジンヌクレオチド又は１若しくは複数の８−オキソグアニンヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド合成機を用いて合成されたもの）を含み、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片をタグ内で線状化するステップは、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片をそれぞれウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ又はホルムアミドピリミジン−ＤＮＡグリコシラーゼ及び脱塩基部位でＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼ（例えばエンドヌクレアーゼＩＶ）とインキュベートすることでタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片を切断することを含む。例えば、いくつかの別の実施形態では、相補的なオリゴヌクレオチドをタグにアニーリングさせ、二本鎖タグ内の制限部位を認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて線状化することで、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片がタグ内で線状化される。タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片の線状化を含む実施形態のいずれかのいくつかでは、方法は更に、（例えば、キアゲン社のＰＣＲクリーンアップカラムを用いて）ジタグ化ｓｓＤＮＡ断片を精製する工程を含む。これらの実施形態のいくつかでは、ジタグ化ｓｓＤＮＡ断片は、次世代シークエンシング鋳型として、又は標識後にアレイ若しくはマイクロアレイ上のプローブにアニーリングさせる標的として、又は本明細書に記載のその他の用途に使用される。
【０１７２】
タグ化ＤＮＡ断片の増幅及びその他の実施形態
タグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製するための本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は更に、ジタグ化ＤＮＡ断片、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片、又は扇形ＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを増幅する工程を含む。
【０１７３】
方法のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は更に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ、タグ化環状ＤＮＡ断片、又は扇形ｄｓＤＮＡ断片のライブラリーを増幅するステップを含む。したがって、いくつかの実施形態では、方法は更に、（ａ）（ｉ）第１及び第２のＰＣＲプライマーであって、第１のＰＣＲプライマーの少なくとも３’末端が、タグ化環状ＤＮＡ断片のタグ配列の少なくとも一部、扇形ｄｓＤＮＡ断片の３’末端に連結されるタグ配列の少なくとも一部、又は直鎖ｓｓＤＮＡ断片の３’末端に連結されているタグ配列の少なくとも一部に相補的であり、第２のＰＣＲプライマーの少なくとも３’末端が、タグ化環状ＤＮＡ断片のタグ配列の相補体の少なくとも一部に相補的であり（すなわち、第２のＰＣＲプライマーの少なくとも３’末端がタグ配列の少なくとも一部と同じ配列を示す）、あるいは、第２のＰＣＲプライマーの少なくとも３’末端が、扇形ｄｓＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片の５’末端に連結されているタグ配列の相補体の少なくとも一部に相補的である（すなわち、第２のＰＣＲプライマーの少なくとも３’末端が、扇形ｄｓＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片の５’末端に連結されているタグ配列の少なくとも一部と同じ配列を示す）、第１及び第２のＰＣＲプライマー；及び（ｉｉ）ＰＣＲに使用可能な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、を提供する工程；及び（ｂ）増幅されたジタグ化直鎖ｄｓＤＮＡ断片が生成されるＰＣＲ増幅条件下で、そのために十分な時間、タグ化環状ＤＮＡ断片、扇形ｄｓＤＮＡ断片、又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片をそれぞれの第１及び第２のＰＣＲプライマー並びに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとインキュベートする工程を含む。
【０１７４】
方法がＰＣＲを用いてタグ化環状ＤＮＡ断片を増幅する工程を含むいくつかの実施形態では、第１のＰＣＲプライマーは、タグ化環状ＤＮＡ断片の標的ＤＮＡに挿入されているヘアピントランスポゾン末端組成物のループ構造の少なくとも一部に含まれるタグ配列に相補的であり、且つ／又は第２のＰＣＲプライマーは、タグ化環状ＤＮＡ断片の標的ＤＮＡに挿入されているヘアピントランスポゾン末端組成物のループ構造の少なくとも一部と同じ配列を示す。いくつかの実施形態では、第１のＰＣＲプライマーは、転移トランスポゾン末端配列又は非転移トランスポゾン末端配列の少なくとも一部に相補的であり、第２のＰＣＲプライマーは、転移トランスポゾン末端配列又は非転移トランスポゾン末端配列の少なくとも一部と同じである。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、第１のＰＣＲプライマーの５’部分又は第２のＰＣＲプライマーの５’部分、又は第１及び第２のＰＣＲプライマー両方の５’部分は、それぞれ、特定のシークエンシング・プラットフォームの次世代シークエンシングの鋳型を作製するための第１及び第２のシークエンシングタグ（例えば、ロシュ社の４５４Ａ又は４５４Ｂシークエンシング・プラットフォーム；イルミナ社のＳＯＬＥＸＡシークエンシング・プラットフォーム；アプライドバイオシステムズ社のＳＯＬＩＤ（商標）シークエンシング・プラットフォーム；パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシング・プラットフォーム；ポロネイター・ポロニー社のシークエンシング・プラットフォーム；ヘリコス社（ＨＥＬＩＣＯＳ）のシークエンシング・プラットフォーム；コンプリート・ゲノミクス社のシークエンシング・プラットフォーム；インテリジェント・バイオシステムズ社のシークエンシング・プラットフォーム；又は任意のその他のシークエンシング・プラットフォームのためのシークエンシングタグ）を含む又はからなる。いくつかの実施形態では、第１のＰＣＲプライマーの５’部分又は第２のＰＣＲプライマーの５’部分は更に、アドレスタグドメイン又は特定の目的のための別のタグドメインを含む又はからなる。別の実施形態では、タグ化環状ＤＮＡ断片のタグは、特定のプラットフォームを用いる次世代シークエンシングのためのシークエンシングタグを含む。
【０１７６】
５’ヌクレアーゼ活性又は鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いてジタグ化ＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する方法の実施形態では、ライブラリーを増幅するステップは、第２のタグに相補的な１種類のオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーだけを用いたＰＣＲによりタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを増幅する工程を含む。いくつかの実施形態では、ＰＣＲに用いる１種類のプライマーは、転移トランスポゾン末端配列の少なくとも一部を示す。いくつかの別の実施形態では、ＰＣＲに用いられる１種類のプライマーは、転移トランスポゾン末端オリゴヌクレオチドの５’部分の配列の少なくとも一部を示す。いくつかのその他の好ましい実施形態では、１種類のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてジタグ化ＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを増幅するステップは、タグ化ＤＮＡ断片の３’末端の第２のタグに相補的な１種類のオリゴヌクレオチドプライマー及びＰＣＲに適した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを提供し、タグ化ＤＮＡ断片のライブラリーがＰＣＲ増幅されて増幅されたタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーが生成されるＰＣＲ増幅条件下で、そのために十分な時間、タグ化ＤＮＡ断片のライブラリーをオリゴヌクレオチドプライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとインキュベートすることを含む。
【０１７７】
ジタグ化ＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーが、５’ヌクレアーゼ活性又は鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて作製されないいくつかの別の実施形態では、ライブラリーを増幅するステップはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う工程を含み、方法は更に、（１）（ａ）第１及び第２のＰＣＲプライマーであって、第１のＰＣＲプライマーの少なくとも３’末端が、ジタグ化ＤＮＡ断片又は扇形ＤＮＡ断片の３’末端の第１のタグの少なくとも一部に相補的であるかタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片中のタグの少なくとも一部に相補的であり、第２のＰＣＲプライマーの少なくとも３’末端が、ジタグ化ＤＮＡ断片又は扇形ＤＮＡ断片の第２のタグの相補体の少なくとも一部に相補的であるかタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片中のタグの相補体の少なくとも一部に相補的である、第１及び第２のＰＣＲプライマー、及び（ｂ）ＰＣＲに適した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、を提供する工程；及び（２）タグ化ＤＮＡ断片のライブラリーが増幅されて増幅されたタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーが生成されるＰＣＲ増幅条件下で、そのために十分な時間、タグ化ＤＮＡ断片のライブラリーをＰＣＲプライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとインキュベートする工程、を含む。いくつかの実施形態では、第１又は第２のＰＣＲプライマーは５’部分及び３’部分を含み、５’部分はタグ化ＤＮＡ断片中の各タグ又はその相補体中の配列に相補的でなく、３’部分は各タグ又はその相補体の配列に相補的である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＰＣＲプライマーの５’部分は次世代シークエンシングの鋳型を作製するために用いることを可能にする適切な第１及び第２のシークエンシングタグ（例えば、ロシュ社の４５４Ａ及び４５４Ｂシークエンシングタグ又は別のシークエンシング・プラットフォーム、例えば、限定されるものではないがイルミナ社のＳｏｌｅｘａ若しくはアプライドバイオシステムズ社のＳｏｌｉｄプラットフォームに適した第１及び第２のシークエンシングタグ）を含む又はからなる。
【０１７８】
ＰＣＲによる増幅反応を行うために種々の酵素及びキットが利用可能である。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅は、ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社のＦＡＩＬＳＡＦＥ（商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ又はＭＡＳＴＥＲＡＭＰ（商標）Ｅｘｔｒａ−Ｌｏｎｇ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍをメーカーの取扱説明書に従って用いて行われる。これらの系では、特定の鋳型及びプライマー対に最適なＰｒｅＭｉｘを特定するために各系と共に提供される一連の２Ｘ  ＰＣＲ  ＰｒｅＭｉｘを用いて、ＰＣＲ反応条件を迅速に最適化することができる。しかし、本発明は、増幅反応に用いる製品又は条件に限定されず、標的配列にアニーリングするプライマーとトランスポゾンにアニーリングするプライマーの間の配列を増幅することができる任意の好適な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及び反応混合物を使用することができる。
【０１７９】
本発明はまた、タグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを増幅するためのＰＣＲの使用にも限定されない。同じ配列を増幅し、意図する目的に適した組成及び量の増幅産物を生成する任意の好適な増幅方法（例えば、ローリングサークル増幅、リボプライマー増幅（例えば、米国特許第７，４１３，８５７号）、ＩＣＡＮ、ＵＣＡＮ、ｒｉｂｏｓｐｉａ、末端タグ化（米国特許出願公開第２００５０１５３３３３号）、Ｅｂｅｒｗｉｎｅ型のａＲＮＡ増幅又は鎖置換増幅）を本発明の実施形態で使用することができる。例えば、使用できるいくつかの鎖置換方法が、日本、京都の宝酒造株式会社のＰＣＲ国際公開第０２／１６６３９号、同第００／５６８７７号、及びＡＵ００／２９７４２；ベクトン・ディッキンソン・アンドカンパニー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）の米国特許第５，５２３，２０４号、同第５，５３６，６４９号、同第５，６２４，８２５号、同第５，６３１，１４７号、同第５，６４８，２１１号、同第５，７３３，７５２号、同第５，７４４，３１１号、同第５，７５６，７０２号、及び同第５，９１６，７７９号；ナノゲン／ベクトン・ディッキンソン・パートナーシップ社（Ｎａｎｏｇｅｎ／  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ）の米国特許第６，２３８，８６８号、同第６，３０９，８３３号、及び同第６，３２６，１７３号；ビオメリュー社（Ｂｉｏ  Ｍｅｒｉｅｕｘ）の米国特許第５，８４９，５４７号、同第５，８７４，２６０号、及び同第６，２１８，１５１号；ジェン・プローブ社（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．）の米国特許第５，７８６，１８３号，同第６，０８７，１３３号、及び同第６，２１４，５８７号；Ｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌの米国特許第 ６，０６３，６０４号；Ｋｕｒｎの米国特許第６，２５１，６３９号；日本、東京の栄研化学株式会社の米国特許第６，４１０，２７８号及びＰＣＴ国際公開第００／２８０８２号；Ａｕｅｒｂａｃｈの米国特許第５，５９１，６０９号、同第５，６１４，３８９号、同第５，７７３，７３３号、同第５，８３４，２０２号、及び同第６，４４８，０１７号；並びにＬｉｚａｒｄｉの米国特許第６，１２４，１２０号及び同第６，２８０，９４９号に記載されている。
【０１８０】
本発明の好ましい実施形態では、インビトロ転位反応で作製した５’タグ化ＤＮＡ断片のライブラリー又はタグ化ＤＮＡ断片の最終的ライブラリーをサイズ選択する必要はない。特定の用途のためにサイズ選択又は選択が必要な場合、５’タグ化ＤＮＡ断片はアガロースゲル電気泳動でサイズ選択し（例えば、アガロースの割合が所望のサイズ範囲のＤＮＡ断片に適した低融点非変性アガロースゲルを用いる）、精製することができる（例えば挿入されなかったトランスポゾン末端オリゴヌクレオチド、その他の反応産物、及びアガロースゲルを除去する；例えば所望のサイズ範囲の５’タグ化ＤＮＡ断片を含むアガロースゲル部分を米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社製ＧＥＬａｓｅ（商標）アガロースゲル消化酵素で消化し、その後、アルコール沈殿又はＧＥＬａｓｅ製品の指示に従うその他の精製ステップを用いるか、あるいは、当該技術分野で公知の任意のその他の精製方法を用いる）。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿を含む精製ステップを用いて、混入物質（例えば、限定されるものではないが、ライゲーションされなかったライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチド又はその他の反応成分）を沈殿させることなくタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを沈殿させる。いくつかの実施形態では、スピンカラム又は当該技術分野で公知の任意のその他の精製方法が用いられる。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、タグ化環状ＤＮＡ断片をＤＮＡシークエンシングの鋳型として使用する。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、タグ化ＤＮＡ断片をＤＮＡシークエンシングの鋳型として使用する。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、タグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを増幅反応の鋳型として使用する（例えば、ジタグ化ＤＮＡ断片若しくは扇形ＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片の第１及び第２のタグに相補的なＰＣＲプライマー又はタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片のタグに相補的なＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲ増幅反応）。いくつかの好ましい実施形態では、増幅されたタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーは、標的ＤＮＡに示される配列のほとんど又はほぼ全体を含む。標的ＤＮＡが生物のゲノムＤＮＡを含むいくつかの実施形態では、増幅反応は全ゲノムの増幅反応である。
【０１８４】
タグ化ＤＮＡ断片の増幅を含む方法のいくつかの実施形態では、増幅産物は、増幅方法（例えば、ＰＣＲ増幅反応法）の１又は複数のステップ中に標識ヌクレオチドを取り込ませることで標識される。いくつかの実施形態では、標識を含む増幅されたタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーは、特定の用途のための標識を含む増幅されたタグ化ＤＮＡ断片の検出又は捕捉のいずれか又は両方のために用いられる。
【０１８５】
タグ化ＤＮＡ断片（例えばジタグ化ＤＮＡ断片）のライブラリーを作製するための本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態は、「標識された」タグ化ＤＮＡ断片のライブラリーの作製を含み、このライブラリーは、標識されたタグ化ＤＮＡ断片の表面上での捕捉を可能にする１若しくは複数の部分（例えば１又は複数の親和結合分子）又は標識されたタグ化ＤＮＡ断片の検出を可能にする１若しくは複数の検出可能な部分（例えば、染色体中の相補的ＤＮＡ等の相補的ＤＮＡにアニーリングするもの）を含む。また、タグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを更に増幅する工程を含む本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態は、表面上での捕捉を可能にする１若しくは複数の部分（例えば１又は複数の親和結合分子）又は標識されたタグ化ＤＮＡ断片の検出を可能にする１若しくは複数の検出可能な部分（例えば、染色体中の相補的ＤＮＡ等の相補的ＤＮＡにアニーリングするもの）を含む「標識」及び増幅されたタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーの作製を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチド（例えば、標識された転移トランスポゾン末端オリゴヌクレオチド、標識されたライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチド、又は少なくとも１つの標識された増幅用プライマー、例えば少なくとも１つ（又は２つ以上）のＰＣＲプライマー）を用いて、標識されたタグ化ＤＮＡ断片又は標識及び増幅されたタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する。いくつかの別の実施形態では、増幅反応中に増幅産物に取り込まれる標識ｄＮＴＰを含めることで標識及び増幅されたタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する。標識ｄＮＴＰは、直接標識であれ間接標識であれ、標識及び増幅されたタグ化ＤＮＡ断片の作製に使用できる当該技術分野で公知の任意の標識を有し得る。「直接標識」という用語は、捕捉部分又は検出可能な部分とタグ化ＤＮＡ断片又は増幅されたタグ化ＤＮＡ断片の間にその他の部分を必要とせずに、増幅されたタグ化ＤＮＡ断片に捕捉部分又は検出可能な標識が直接連結されることを意味する。「間接標識」という用語は、捕捉部分又は検出可能な部分とタグ化ＤＮＡ断片又は増幅されたタグ化ＤＮＡ断片の間に少なくとも１つのその他の部分があることを意味する。直接標識の１つの例は、色素で標識されたヌクレオチドをタグ化ＤＮＡ断片に取り込ませることであり、間接標識の１つの例は、ビオチン標識ヌクレオチドをタグ化ＤＮＡ断片に取り込ませ、その後、色素標識ストレプトアビジンがビオチン標識ヌクレオチドに結合する条件下で色素標識ストレプトアビジンとインキュベートすることにより、タグ化ＤＮＡ断片を色素検出可能な部分で標識することである。本発明は、標識されたタグ化ＤＮＡ断片又は標識及び増幅されたタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する任意の好適な方法の使用を含み、その後、捕捉又は検出に標識を利用する。
【０１８６】
いくつかの別の実施形態では、本発明の方法を用いて作製されたライブラリー中のタグ化ＤＮＡ断片は、その後、タグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを、反応性色素分子（例えば、オレゴン州ユージーンのモレキュラープローブ社のＮ−ヒドロキシサクシニミジル又は「ＮＨＳ」エステルを含む反応性蛍光色素のいずれか）又は反応性親和結合分子（例えば、イリノイ州ロックフォードのピアス・ケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）のビオチン−ＮＨＳ化合物等の反応性ビオチン化試薬）と接触させることで、直接又は間接的に、標識される。例えば、いくつかの実施形態では、標識及び増幅されたタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーの作製は、増幅反応中にアミノアリル基を含むｄＮＴＰを取り込ませ、その後、アミノアリル基を含む増幅されたタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを標識蛍光色素−ＮＨＳエステル又はビオチン−ＮＨＳエステルに接触させることでそれぞれ蛍光色素標識及び増幅されたタグ化ＤＮＡ断片又はビオチン標識及び増幅されたタグ化ＤＮＡ断片を作製することでなされる。当該技術分野の知識を有する者は、増幅されたタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを特定の目的のため（例えば、検出又は表面上での捕捉を可能にするため）に標識するための、例えばモレキュラープローブ社の、キットを含む多くの更なる特異的方法及び試薬を知っている又は見つける方法を知っている。例えば、実施例には、アミノアリル基、プロピニル基、ビオチン基、蛍光色素若しくはその他の検出可能な色素、又は当該技術分野で公知の任意のその他の検出可能な分子又は分子の組合せ、例えば量子ドット、酵素（例えば、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、又はピロホスファターゼ）、又は検出可能なタンパク質（例えば、フィコビリンタンパク質、フィコエリトリン）を有する１又は複数の修飾ヌクレオチドが含まれる。いくつかの別の実施形態では、標識及び増幅されたタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーは、増幅反応中、例えばＰＣＲ増幅反応中に、親和結合分子又は検出可能な部分で標識された１又は複数の修飾ｄＮＴＰを取り込ませることで作製され、例えば、親和結合分子（例えば、ストレプトアビジン、抗体）に連結された量子ドット、酵素、又は検出可能なタンパク質（例えば、フィコビリンタンパク質、フィコエリトリン）等の当該技術分野で公知の任意のその他の検出可能な分子又は分子の組合せを用いた標識後の直接又は間接的な検出を可能にするアミノアリル基、ビオチン基、蛍光色素若しくはその他の検出可能な色素、又はその他の部分、を有する１又は複数の修飾ｄＮＴＰを取り込ませることで作製される。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、タグ化ＤＮＡ断片（例えばジタグ化ＤＮＡ断片は、表面に連結したプローブにハイブリダイズさせるための標識ＤＮＡ断片（例えば、アレイ又はマイクロアレイ上のＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションのための標識された標的ＤＮＡ断片）の調製に用いられる。いくつかの実施形態では、タグ化ＤＮＡ断片（例えば、ジタグ化ＤＮＡ断片を含む）は、（例えば蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションすなわちＦＩＳＨのための）固定された細胞又は組織切片中の染色体又は染色体の一部とのハイブリダイゼーションに用いられる。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、方法は、染色体とのハイブリダイゼーションに使用するための標識されたタグ化ＤＮＡ断片又は標識及び増幅されたタグ化ＤＮＡ断片（例えば標識されたジタグ化ＤＮＡ断片又は標識及び増幅されたジタグ化ＤＮＡ断片）の作製を含む（例えば、標識されたタグ化ＤＮＡ断片は、１又は複数の特定の染色体のＤＮＡを含む標的ＤＮＡから、「染色体ペイント」として使用するために（例えば、染色体の分類等の用途又は研究、医学、診断、生物の性判別、若しくはその他の細胞生物学的用途のための、固定された細胞又は組織雪片中の１又は複数の染色体との、例えば蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションすなわちＦＩＳＨを用いた、ハイブリダイゼーションのために、調製される）。いくつかの実施形態では、方法は、染色体の一部を含む標的ＤＮＡから、標識されたタグ化ＤＮＡ断片又は標識及び増幅されたタグ化ＤＮＡ断片を作製することを含む（例えば、タグ化ＤＮＡ断片は、１又は複数の染色体の１又は複数の特定の遺伝子又は遺伝子座をコードするＤＮＡから調製される（例えば蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いる固定された細胞又は組織切片中の１又は複数の染色体とのハイブリダイゼーションのため又は分析物特異的アッセイ若しくは医学的診断試薬、産業、環境、分子生物学的研究、若しくは細胞生物学的研究等の用途のためのインビトロアッセイにおいて遺伝子特異的又は遺伝子座特異的プローブとして使用するため）。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、表面（例えば、アレイ又はマイクロアレイ、ディップスティック、量子ドット、ビーズ、又はマイクロ流体デバイスのマイクロチャネル）上のプローブと標識されたタグ化ＤＮＡ断片のハイブリダイゼーションは、天然源（例えば、細胞由来のゲノムＤＮＡ；例えばコピー数変化すなわち「ＣＮＶ」を評価するためのヒトＤＮＡ、又は病原体である病原菌、真菌、マイコプラズマ、ウイルス、若しくは線虫の細胞に由来するＤＮＡ）中に含まれる又はそれに由来する、又はインビトロ起源（例えば、天然源から分離した又はＤＮＡ若しくはＲＮＡの増幅法等の核酸増幅法を用いて天然源から増幅したｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ等のＲＮＡの逆転写により作製された二本鎖ｃＤＮＡ）に由来する１又は複数のＤＮＡ分子又はその一部の検出、定量、相対量の決定、又は特徴解析に用いられる。
【０１９０】
方法がタグ化ＤＮＡ断片の増幅を含むいくつかの別の実施形態では、方法は、増幅反応中、例えばＰＣＲ増幅反応中に、親和結合分子又は検出可能な部分を有する１又は複数の修飾ｄＮＴＰを取り込ませる（例えば、親和結合分子（例えば、ストレプトアビジン、抗体）に連結された量子ドット、酵素、又は検出可能なタンパク質（例えば、フィコビリンタンパク質、フィコエリトリン）等の当該技術分野で公知の任意のその他の検出可能な分子又は分子の組合せを用いた標識後の直接又は間接的な検出を可能にするアミノアリル基、ビオチン基、蛍光色素若しくはその他の検出可能な色素、又はその他の部分、を有する１又は複数の修飾ｄＮＴＰを取り込ませる）ことで標識及び増幅されたタグ化ＤＮＡ断片を作製することを含む。
【０１９１】
いくつかの別の実施形態では、本発明の方法を用いて調製されたタグ化ＤＮＡ断片又は増幅されたタグ化ＤＮＡ断片は、増幅反応中（例えば各転写、ＲＣＲ、又はＰＣＲ反応中に、親和結合分子又は検出可能な部分を有する１又は複数の修飾ｄＮＴＰを取り込ませることにより標識され、例えば、親和結合分子（例えば、ストレプトアビジン、抗体）に連結された量子ドット、酵素、又は検出可能なタンパク質（例えば、フィコビリンタンパク質、フィコエリトリン）等の当該技術分野で公知の任意のその他の検出可能な分子又は分子の組合せを用いた標識後の直接又は間接的な検出を可能にするアミノアリル基、ビオチン基、ジゴキシゲニン基、蛍光色素若しくはその他の検出可能な色素、又はその他の部分を有する１又は複数の修飾ｄＮＴＰを取り込ませることで、標識される。いくつかの実施形態では、各産物は、（例えばアレイ又はマイクロアレイ上のＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションのための標識された標的核酸として）表面に連結されたプローブとのハイブリダイゼーションのための標識された核酸断片の調製に用いられる。いくつかの実施形態では、各標識産物は、（例えば蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）のための）固定された細胞又は組織切片中の染色体又は染色体の一部とのハイブリダイゼーションに用いられる。いくつかの実施形態では、表面上のプローブへの標識産物のハイブリダイゼーションを、天然源（例えば細胞由来のゲノムＤＮＡ；例えば、コピー数変化すなわち「ＣＮＶ」を評価するため）又はインビトロ起源（例えば、天然源から分離した又はＲＮＡ増幅法を用いて天然源から増幅したｍＲＮＡ又は非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）等のＲＮＡの逆転写により作製された二本鎖ｃＤＮＡ）に由来する標的ＤＮＡの１若しくは複数の部分の検出、定量、相対量の決定、又はそのような特徴解析に用いる。
【０１９２】
タグ化環状ＤＮＡ断片のライブラリーの作製を含む方法のいくつかの実施形態では、転移トランスポゾン末端オリゴヌクレオチドは、３’部分に転移トランスポゾン末端の配列を示すことに加え、５’部分に二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの一方の鎖の配列を示す。ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチド及び鋳型依存性リガーゼを用いたジタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーの作製を含む方法のいくつかの実施形態では、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドは、３’部分に二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの一方の鎖の配列を示す。転移トランスポゾン末端オリゴヌクレオチド又はライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を示さない方法のいくつかの実施形態では、方法は更に、「プロモータープライマー」である少なくとも１つのＰＣＲプライマーを用いたジタグ化ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む。プロモータープライマーは、ジタグ化ＤＮＡ断片にアニーリングせず且つ二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの一方の鎖の配列を示す「５’フラップ」又は「５’テイル」部分及び５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片の第１のタグ若しくは第２のタグ又はその相補体にアニーリングする３’部分を有する。
【０１９３】
転移トランスポゾン末端オリゴヌクレオチド、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチド、又はＰＣＲプライマーがＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を示すいくつかの好ましい実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターはＴ７型ＲＮＡポリメラーゼプロモーターであり、方法は更に、プロモーターを認識するＴ７型ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロで５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片を転写するステップを含む。最も好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼ及びプロモーターは、Ｔ７  ＲＮＡＰ、Ｔ３  ＲＮＡＰ、及びＳＰ６  ＲＮＡＰ並びに対応する同族プロモーターから選択される。しかし、本発明の方法の転写ステップは、特異性の高い転写を可能にする好適なプロモーター配列が公知である又は得ることができる、任意のＲＮＡＰを使用することができる。インビトロ転写のためのキット及び酵素は多くの供給業者から市販されており、インビトロ転写を含む本発明のステップを行うための適切な反応混合物及び条件には、これらの製品をメーカーが記載しているように使用することができる。例えば、Ｔ７  ＲＮＡＰを用いたインビトロ転写をウィスコンシン州マディソン、エピセンターバイオテクノロジーズ社製のＡＭＰＬＩＳＣＲＩＢＥ（商標）Ｔ７−Ｆｌａｓｈ（商標）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ又はＡＭＰＬＩＳＣＲＩＢＥ（商標）Ｔ７  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔを製品の関連文書に従って用いて行うことができる。同様に、本発明の方法でインビトロ転写にＴ３  ＲＮＡＰ又はＳＰ６  ＲＮＡＰを使用する場合はそれぞれＡＭＰＬＩＳＣＲＩＢＥ（商標）Ｔ３−Ｆｌａｓｈ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ又はＡＭＰＬＩＳＣＲＩＢＥ（商標）ＳＰ６  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ウィスコンシン州マディソン、エピセンターバイオテクノロジーズ社製）を記載されているように用いることができる。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、転移トランスポゾン末端オリゴヌクレオチド、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチド、又はＰＣＲプライマーは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列に加えて、翻訳のための更なる配列、例えば、限定されるものではないが、リボソーム結合部位及び翻訳開始コドン（「翻訳開始シグナル」ともいう）を示し、方法は更に、転写されたＲＮＡの翻訳を含む。これらの実施形態のいくつかでは、方法は更に、得られたＲＮＡ転写産物のインビトロ翻訳ステップを含む。ＲＮＡ転写産物のインビトロ翻訳のための系及びキットも多くの供給業者から市販されており、本発明に使用することができる。例えば、限定されるものではないが、ウィスコンシン州マディソンのプロメガ社のウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽抽出液、大腸菌Ｓ３０抽出液の系を本発明に用いることができる。更に、プロメガ社のＴＮＴ（登録商標）Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ等のインビトロ転写とインビトロ翻訳を組み合わせたキットも市販されており、使用することができる。
【０１９５】
方法のいくつかの好ましい実施形態では、細胞又は生物の全ゲノムのＤＮＡ試料を含む標的ＤＮＡから作製したジタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーをＰＣＲ増幅する（すなわち、方法は、全ゲノムを増幅する方法を含む又はからなる）。いくつかの実施形態では、全ゲノムを増幅する方法を用いて１種類の細胞から全ゲノムを増幅する。本明細書に記載の全ゲノム増幅方法のいくつかの好ましい実施形態では、細胞又は生物の全ゲノムに由来するＤＮＡ試料から作製したタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを、第２のタグに相補的な１種類のオリゴヌクレオチドプライマー（又はＰＣＲプライマー）を用いてＰＣＲ増幅する。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、本発明の方法を用いて作製されたタグ化ＤＮＡ断片は、（例えば、産業、医学、又は研究用途を含むメタゲノム又はメタ転写産物用途のための）環境試料中に存在する全生物（例えば複数の生物）のＲＮＡから調製した二本鎖ｃＤＮＡ及び／又はゲノムを含む又はからなる標的ＤＮＡから作製される。
【０１９７】
方法のいくつかの別の実施形態では、タグ化ＤＮＡ断片のライブラリーは、１つの染色体又は染色体の一部を含む又はからなるＤＮＡを含む標的ＤＮＡから作製される。これらの実施形態のいくつかでは、方法は、例えばＰＣＲで色素標識ｄＮＴＰを用いて、ＰＣＲ増幅産物が検出可能な部分（例えば、蛍光色素、赤外蛍光色素、化学発光色素、可視色素、又はその他の検出可能な色素で標識される条件下で、１つの染色体又は１若しくは複数の遺伝子若しくは遺伝子座位を含む染色体の一部を含む染色体の一部のＤＮＡを含む又はからなる標的ＤＮＡから作製したタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーをＰＣＲ増幅することを含む。いくつかの実施形態では、検出可能な部分で標識されたＰＣＲ増幅産物は、その場で（ｉｎ  ｓｉｔｕ）固定細胞を染色するために用いられる（例えば、ＰＣＲ増幅産物は染色体ペイントとして用いられる）。したがって、いくつかの好ましい実施形態では、方法は、染色体ペイント、サブ染色体ペイント、又は染色体マーカーの作製方法を含む又はからなる。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、本方法を用いて作製したタグ化ＤＮＡ断片又は増幅されたタグ化ＤＮＡ断片は、本発明の方法を用いた第２ラウンドの断片化及びタグ化の標的ＤＮＡとして用いられる。いくつかの実施形態では、方法の第１及び第２ラウンドの両方で同じトランスポソームが用いられる。いくつかの実施形態では、第２の異なるトランスポザーゼ及び異なるトランスポゾン末端が第２ラウンドに用いられる。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、本方法を用いて作製したタグ化ＤＮＡ断片又は増幅されたタグ化ＤＮＡ断片はベクター（例えば、米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社製ＣＯＰＹＣＯＮＴＲＯＬ（商標）フォスミドベクター）にクローニングされる。方法が更にタグ化ＤＮＡ断片又は増幅されたタグ化ＤＮＡ断片のクローニングを含み、タグ化ＤＮＡ断片又は増幅されたタグ化ＤＮＡ断片（例えばＰＣＲ増幅されたタグ化ＤＮＡ断片がＲＮＡポリメラーゼプロモーターを示すいくつかの実施形態では、方法は更に、クローニングされたタグ化ＤＮＡ断片又は増幅されたタグ化ＤＮＡ断片の少なくとも１つの鎖の転写を含む。いくつかの実施形態では、クローニングされたタグ化ＤＮＡ断片又は増幅されたタグ化ＤＮＡ断片は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロで転写される。いくつかの実施形態では、クローニングされたタグ化ＤＮＡ断片又は増幅されたタグ化ＤＮＡ断片は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼの発現を誘導し且つその後ＲＮＡポリメラーゼが結合するプロモーターを含むＤＮＡ鋳型を転写することができる宿主細胞中で、インビボで転写される（例えば、誘導されたＴ７型ＲＮＡポリメラーゼからのインビボタンパク質発現にはｐＥＴシステムが広く用いられている）。いくつかの好ましい実施形態では、インビトロ又はインビボの発現用ＲＮＡポリメラーゼはＴ７型ＲＮＡポリメラーゼであり、転写はそれと同じ系統のＴ７型ＲＮＡＰプロモーターから開始される。いくつかの好ましい実施形態では、Ｔ７型ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼから選択される。
【０２００】
方法のいずれかのいくつかの実施形態では、転移トランスポゾン末端オリゴヌクレオチド、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチド、又はＰＣＲプライマーのいずれかが、親和性分子（例えば、ビオチン又はジゴキシゲニン）を含むか又はこれに連結されており、方法は更に、親和性分子と特異的に結合して特異的結合対を形成することができる親和結合物質（例えば、ビオチンとの結合にはストレプトアビジン又はアビジン、ジゴキシゲニンとの結合には抗体）で共有結合又は非共有結合的にコーティングされた固体表面を提供するステップ；及び、関連するステップの前又は後に、親和性分子に化学的に連結されている転移トランスポゾン末端オリゴヌクレオチド、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチド、又はＰＣＲプライマーを用いて作製された産物を、それが固体表面に連結されている親和結合物質に結合する条件下で、そのために十分な時間、接触させるステップを含む。
【０２０１】
本発明は、特定の固体表面に限定されず、固体表面は多孔性であっても非多孔性であってもよく、特定の方法及び用途に適した任意の組成物、サイズ、又は形状のものであってよい。例えば、限定されるものではないが、固体表面は、ガラス、プラスチック（例えば、ラテックス又はポリスチレン）、シリカ、テフロン、又は他の好適な材料からなる磁気ビーズ、コーティングされたビーズ、スライド、マイクロタイタープレートのウェル、管、及びディップスティックからなる群から選択することができる。親和結合物質でコーティングされた固体表面の目的は、親和性分子に化学的に連結されている転移トランスポゾン末端オリゴヌクレオチド、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチド、又はＰＣＲプライマーの操作（例えば、反応混合物中のその他の分子から分離するための捕捉及び洗浄）、単離、捕捉を可能にすること又は５’タグ化ＤＮＡ断片、５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片、又はそれから作製されたＰＣＲ産物の操作、単離、及び捕捉を可能にすることである。非特異的結合を防ぐために、いくつかの実施形態では、固体支持体を、ＤＮＡフリーのｔＲＮＡ；タンパク質（例えばＢＳＡ）、多糖（例えばグリコーゲン、硫酸デキストラン、又はヘパリン）からなる群から選択される過剰量の物質で処理する。本発明は、特異的親和性分子又は親和結合物質が特異的に結合して特異的結合対を形成しさえすれば、特異的親和性分子又は親和結合物質に限定されない。
【０２０２】
したがって、いくつかの実施形態では、タグ化ＤＮＡ断片又は増幅されたタグ化ＤＮＡ断片は、固体表面に結合することで、捕捉、単離、又は精製されるか、別の方法に使用され、方法は、試薬の存在下且つ固体表面に連結されている親和結合物質への結合を促進する条件化で、親和性分子を含むタグ化ＤＮＡ断片又は増幅されたタグ化ＤＮＡ断片を固体表面に接触させて、タグ化ＤＮＡ断片又は増幅されたタグ化ＤＮＡ断片を表面に結合させるステップを含む。
【０２０３】
いくつかの好ましい実施形態では、親和性分子がビオチンであり、親和結合物質がアビジン又はストレプトアビジンであるか、あるいは、親和性分子がジゴキシゲニンであり、親和結合物質がジゴキシゲニンに特異的に結合する抗体である。
【０２０４】
本明細書において、用語「トランスポザーゼ」、「ＤＮＡポリメラーゼ」、及び「リガーゼ」は、特定の化学反応及び生物学的反応の触媒に関与するタンパク質分子又はタンパク質分子アグリゲートを指す。一般的に、本発明の方法、組成物、又はキットは、特定の起源（ｓｏｕｒｃｅ）に由来する特定のトランスポザーゼ又はＤＮＡポリメラーゼ酵素の使用に限定されない。むしろ、本発明の方法、組成物、又はキットは、特定の方法、組成物、又はキットとの関連で本明細書に開示する特定の酵素と同等の酵素活性を有する任意の起源に由来する任意のトランスポザーゼ又はＤＮＡポリメラーゼ酵素を含む。更に、本発明の方法は、本方法のステップで提供及び使用される任意の１つの特定の酵素を、組み合わせて使用した時にこの１つの特定の酵素を用いて得られるのと同じ結果が得られる２種以上の酵素の組合せで置換した実施形態も含み、２種以上の酵素は別個に段階的に用いてもよく、同時に反応混合物に用いてもよい。実施例中を含む本明細書に記載の方法、バッファー、及び反応条件は、本発明の方法、組成物、及びキットの実施形態に現在好ましいものである。しかし、本発明の酵素のいくつかに使用するためのその他の酵素貯蔵バッファー、反応バッファー、及び反応条件が当該技術分野で公知であり、これらも本発明における使用に適し得、本明細書に含まれる。
【０２０５】
組成物及びキットの実施形態
本発明の方法のためのキット及び組成物も本発明に含まれる。キットは、本発明の方法を実施するために有用な個々の組成物の組合せであり、組成物は方法中で一緒に使用するために最適化されている。組成物は、本発明の方法の少なくとも１つのステップのための個々の成分を含む。本発明は、本発明の任意の２つの新規な組成物若しくはキットの組合せ又はキットに用いられる任意の新規な組成物から構成され得る任意のキットを含む。いくつかの実施形態では、キット又は組成物は、本明細書に記載の任意のキット又は組成物の亜集合を含む又はからなり、これは、特定の目的又は用途に方法を適合できる柔軟性を使用者に与えたり、亜集合を含む又はからなるキット又は組成物と一緒に使用者が他の組成物を使用できるようにする等の任意の理由のための任意の適当な組合せであり得る。
【０２０６】
組成物の実施形態
本発明の組成物の一実施形態は、トランスポザーゼと（ｉ）転移トランスポゾン末端配列を示す３’部分及びタグドメインの配列を示す５’部分を有する転移鎖、並びに（ｉｉ）非転移トランスポゾン末端配列のみを示す５’リン酸含有非転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物とがインビトロ転位反応で活性な複合体を形成する、トランスポソーム組成物である。いくつかの実施形態では、タグドメインは次世代のシークエンシング又は増幅で使用するためのタグドメインである。いくつかの実施形態では、タグドメインは、制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、増幅タグドメイン、及び転写プロモータードメインから選択される。
【０２０７】
本発明のその他の組成物の１つは、転移鎖が３’部分及び５’部分を含み、３’部分が転移トランスポゾン末端配列を示し、５’部分がＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を示す転写プロモータードメインを含む、転移トランスポゾン末端組成物である。
【０２０８】
本発明の別の組成物は、５’末端に非転移トランスポゾン末端配列を示し且つ３’末端に転移トランスポゾン末端配列を示し且つ分子内ステムループを形成するのに十分な長さの介在任意タグ配列を非転移トランスポゾン末端配列と転移トランスポゾン末端配列の間に示す５’リン酸含有オリゴヌクレオチドを含む又はからなるヘアピントランスポゾン末端組成物である。いくつかの好ましい実施形態では、ヘアピントランスポゾン末端組成物は、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼのトランスポゾン末端配列を含む。いくつかの別の実施形態では、ヘアピントランスポゾン末端組成物は５’リン酸基を有さず、５’リン酸基がアデニル化されている。
【０２０９】
方法を実施するための組成物も本発明に含まれる。例えば、本発明の組成物の１つは、３’部分及び５’部分を含むオリゴヌクレオチドであって、３’部分が転移トランスポゾン末端配列を示し、５’部分が（例えば、ＮｏｔＩ又はＡｓｃＩ等の切断がまれな制限エンドヌクレアーゼ又はＦｏｋＩ等のＩＩ型制限エンドヌクレアーゼの）制限部位ドメインを示す、オリゴヌクレオチドである。例えば、本発明のその他の組成物の１つは、３’部分及び５’部分を含むオリゴヌクレオチドであって、３’部分が転移トランスポゾン末端配列を示し、５’部分が（例えば、ファージＴ７、Ｔ３、ＳＰ６、又はＮ４  ＲＮＡポリメラーゼの）ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を示す、オリゴヌクレオチドである。いくつかの好ましい実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列はこれらのＲＮＡポリメラーゼのいずれかのセンスプロモーター配列である。いくつかの別の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列はこれらのＲＮＡポリメラーゼのいずれかのアンチセンスプロモーター配列である。本発明のその他の組成物の１つは、３’部分及び５’部分を含むオリゴヌクレオチドであって、３’部分が転移トランスポゾン末端配列を示し、５’部分が、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、捕捉タグドメイン、アドレスタグドメイン、検出タグドメイン、及び制限部位タグドメインから選択されるタグドメインを示す、オリゴヌクレオチドである。
【０２１０】
いくつかの好ましい実施形態では、転移トランスポゾン末端配列は、ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ（エピセンター社製）用のＭＥＤＳ又はｐＭＥＤＳ転移トランスポゾン末端組成物である。いくつかの好ましい実施形態では、配列タグドメインは、ロシュ社の４５４シークエンシング・プラットフォーム、イルミナ（商標）社のＳＯＬＥＸＡ（商標）シークエンシング・プラットフォーム、ライフテクノロジーズ／アプライドバイオシステムズ社のＳＯＬＩＤ（商標）シークエンシング・プラットフォーム、パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシング・プラットフォーム、ポロネイターポロニー社のシークエンシング・プラットフォーム、コンプリート・ゲノミクス社のシークエンシング・プラットフォーム、インテリジェント・バイオシステムズ社のシークエンシング・プラットフォーム、又はヘリコス社のシークエンシング・プラットフォームに適したシークエンシングタグを示す。
【０２１１】
キットの実施形態
本発明の一実施形態は、次世代又は核酸増幅用の鋳型の調製に使用するための５’タグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製するためのキットであって、トランスポザーゼと、（ｉ）転移トランスポゾン末端配列を示す３’部分及び次世代シークエンシング又は増幅反応で使用するためのタグドメインのための配列を示す５’部分を有する転移鎖並びに（ｉｉ）非転移トランスポゾン末端配列のみを示す５’リン酸含有非転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物と、を含み、トランスポザーゼがトランスポゾン末端組成物とインビトロ転位反応で活性な複合体を形成する、トランスポソーム組成物；及びインビトロ転位反応中での終濃度が１０％になる量のジメチルホルムアミドを含む反応バッファー、を含む、キットである。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、キットは更に、５’ヌクレアーゼ活性又は鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ；５’ヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼ；鋳型依存性ＮＡＤリガーゼ、及び鋳型非依存性リガーゼから選択される少なくとも１つのその他の酵素成分を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのその他の酵素成分は、ＦＡＩＬＳＡＦＥ（商標）  ＤＮＡポリメラーゼミックス；Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、バクテリオファージＴＳ２１２６耐熱性ＲＮＡリガーゼ、Ｍｔｈ  Ｒｎ  ｌ耐熱性ＲＮＡリガーゼ、及びＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）耐熱性ｓｓＤＮＡリガーゼから選択される。
【０２１３】
キット中の少なくとも１つの酵素が鋳型依存性リガーゼ（例えば、大腸菌ＤＮＡリガーゼ）であるいくつかの好ましい実施形態では、大部分のリガーゼ分子がアデニル化されており、キット中にＡＴＰは提供されない。キット中の少なくとも１つの酵素が鋳型依存性リガーゼ（例えば大腸菌ＤＮＡリガーゼ）であるいくつかの実施形態では、キットは更に、タグドメインの配列を示す３’部分及び約３〜約８ヌクレオチドからなるランダム配列を示す５’部分を含むライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの好ましい実施形態では、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドは、４ヌクレオチドからなるランダム配列を示す５’部分を含む。キット中の少なくとも１つの酵素が鋳型依存性リガーゼであるいくつかの別の実施形態では、キットはヘアピントランスポゾン末端組成物を更に含む。ヘアピントランスポゾン末端組成物がアデニル化された５’末端を有するいくつかの実施形態では、キット中に提供される鋳型依存性核酸リガーゼを構成する分子の５０％未満がアデニル化されており、ＡＴＰ又はＮＡＤはキット中に提供されない。
【０２１４】
キット中の少なくとも１つの酵素がバクテリオファージＴＳ２１２６耐熱性ＲＮＡリガーゼ、Ｍｔｈ  Ｒｎ  ｌ耐熱性ＲＮＡリガーゼ、及びＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標） 耐熱性ｓｓＤＮＡリガーゼから選択される鋳型非依存性リガーゼであるいくつかの好ましい実施形態では、鋳型非依存性リガーゼは高アデニル化形態で提供され、ＡＴＰはキット中に提供されない。
【０２１５】
キットの好ましい一実施形態では、トランスポソームは、インビトロ転位反応中のトランスポソームの終濃度が少なくとも２５０ｎｍとなる濃度で提供される野生型又は高活性Ｔｎ５トランスポザーゼ又はＭｕＡトランスポザーゼを含む。いくつかの別の実施形態では、野生型又は高活性Ｔｎ５トランスポソーム又はＭｕＡトランスポソームの終濃度は少なくとも５００ｎｍである。
【０２１６】
１つの好ましい実施形態は、ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ及び大腸菌ＤＮＡリガーゼを用いてタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片を作製するための、以下を含むキットである：（１）野生型又は変異体形態のＴｎ５トランスポザーゼ（例えば、ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ）；（２）転移トランスポゾン末端配列を示す転移鎖及びＥＺ−Ｔｎ５トランスポザーゼ用の非転移トランスポゾン末端配列を示す非転移鎖からなるトランスポゾン末端組成物；（３）ＥＺ−Ｔｎ５トランスポザーゼ反応バッファー；及び（４）ライゲーション鋳型非存在下でｓｓＤＮＡの分子内ライゲーションを触媒できる鋳型非依存性核酸リガーゼ（例えば、好熱性ファージＴＳ２１２６（米国特許第７，３０３，９０１号）；ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）耐熱性ｓｓＤＮＡリガーゼ（米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社）；及びＭｔｈ  ＲＮＡリガーゼ．１から選択されるＲＮＡリガーゼから選択される）。好ましい一実施形態では、キット中のトランスポザーゼは、１マイクロリットル当たり約５ユニット；１マイクロリットル当たり約１０〜２０ユニット；１マイクロリットル当たり約２０〜４０ユニット；１マイクロリットル当たり約４０〜６０ユニット；１マイクロリットル当たり約６０〜８０ユニット；又は１マイクロリットル当たり約８０〜１００ユニット以上の濃度の野生型又は変異体形態のＴｎ５トランスポザーゼ（例えばＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ）である。ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ及び鋳型非依存性リガーゼを含むキットの好ましい一実施形態では、ＥＺ−Ｔｎ５  ｐＭＥＤＳトランスポゾン末端組成物は、５’モノリン酸基を有するＥＺ−Ｔｎ５  ｐＭＥＴＳ転移鎖及び５’モノリン酸基を有するＥＺ−Ｔｎ５  ｐＭＥＮＴＳ非転移鎖の両方を含む。
【０２１７】
好ましい一実施形態では、キット中のトランスポザーゼは、１マイクロリットル当たり約５ユニット；１マイクロリットル当たり約１０〜２０ユニット；１マイクロリットル当たり約２０〜４０ユニット；１マイクロリットル当たり約４０〜６０ユニット；１マイクロリットル当たり約６０〜８０ユニット；１マイクロリットル当たり又は１マイクロリットル当たり約８０〜１００ユニット以上の濃度の野生型又は変異体形態のＴｎ５トランスポザーゼ（例えばＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ）である。ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ及び鋳型非依存性核酸リガーゼを含むキットの好ましい一実施形態では、ＥＺ−Ｔｎ５  ｐＭＥＤＳトランスポゾン末端組成物は、５’モノリン酸基を有するＥＺ−Ｔｎ５  ＭＥＴＳ転移鎖及び５’モノリン酸基を有するＥＺ−Ｔｎ５  ｐＭＥＮＴＳ非転移鎖の両方を含む。
【０２１８】
本発明の方法、組成物、及びキットは、ゲノム、サブゲノム、又はメタゲノム分析のために（例えばマイクロアレイ分析のための標識標的の作製における使用；例えばコピー数変化の分析、一塩基多型の検出及び分析、並びに土壌起源又は水起源等の環境試料から遺伝子を発見するため）、任意の起源の標的ＤＮＡからタグ化環状ＤＮＡ断片、扇形ｄｓＤＮＡ断片、又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片（及びその増幅産物）を作製するのに有用である。方法は、培養又は成長条件が未知の１又は複数の微生物又は環境生物を含む１又は複数の生物の全ゲノム増幅（例えば、全ゲノム増幅すなわちＷＧＡ）、リアルタイムＰＣＲ、エマルションＰＣＲ、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、比較ゲノムシークエンシング（ＣＧＳ）、及び蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）等の用途のためのＤＮＡ特異的プローブ（例えば、染色体特異的プローブ、例えば染色体ペイント）を作製するためのプロセスを含む種々のプロセスに有用である。いくつかの実施形態では、方法は、大規模並列ＤＮＡシークエンシング（いわゆる「次世代シークエンシング」）の鋳型の作製にも使用される。これらのプロセス又は用途のそれぞれは、研究及び分子診断目的の両方で使用される。
【０２１９】
発明の実施形態の詳細な説明
本発明の例示的実施形態の詳細な説明を以下のセクションに記載する。
Ｉ．トランスポザーゼ及びＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡの断片化及びジタグ化
ＩＩＩ．標的ＤＮＡの断片化、タグ化、及び１種類のプライマーを用いた増幅
ＩＩ．トランスポザーゼ及びリガーゼを用いたＤＮＡの断片化及びタグ化
ＩＶ．トランスポザーゼ及びリガーゼを用いたｄｓ標的ＤＮＡからのタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片の作製
Ｖ．ヘアピントランスポゾン末端組成物のインビトロ転位によるｄｓＤＮＡの断片化及びタグ化
【０２２０】
Ｉ．トランスポザーゼ及びＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡの断片化及びジタグ化
本発明は、トランスポザーゼを用いて１又は複数の二本鎖（ｄｓＤＮＡ）分子を含む又はからなる標的ＤＮＡから５’タグ化断片を作製し、その後、第１のタグとは異なるＤＮＡ配列を示す第２のタグを前記５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端に連結する、方法、組成物、及びキットを含む。第１のタグは、トランスポザーゼにより認識されるトランスポゾン末端の転移鎖の配列を示し、また、必要に応じて、前記転移トランスポゾン末端の配列の５’に１又は複数のその他の配列を示してもよい。第２のタグは、ＰＣＲ増幅反応を行わずにＤＮＡポリメラーゼを用いてインビトロで５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端に連結される。
【０２２１】
本発明の方法の１つは、転移トランスポゾン末端が標的ＤＮＡに連結される条件下で、そのために十分な時間、インビトロ転位反応中でトランスポザーゼ及びそれと転位複合体を形成するトランスポゾン末端を標的ＤＮＡとインキュベートして５’末端に第１のタグを有する５’タグ化ＤＮＡ断片を作製する工程；熱サイクルを含まないＤＮＡ重合条件下で十分な時間５’タグ化ＤＮＡ断片をＤＮＡポリメラーゼとインキュベートして第１のタグとは異なる配列を示す第２のタグを５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端に連結して５’及び３’タグ化されたＤＮＡ断片を作製する工程、を含む。いくつかの実施形態では、方法は更にＤＮＡポリメラーゼと第２のタグに相補的な少なくとも１つのプライマーとを用いて５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片を増幅するステップを含む。標的ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、サブゲノムＤＮＡ、又はプラスミド若しくはその他のエピソーム由来ＤＮＡ若しくはそれに含まれる組換えＤＮＡ、又はＲＮＡの逆転写により作製された二本鎖ｃＤＮＡ等の任意のインビボ又はインビトロ起源に由来する二本鎖ＤＮＡを含んでもよい又はからなってよい。ゲノムＤＮＡは生物起源又は環境起源に由来する１又は複数のゲノムを含んでもよい又はからなってよい。したがって、本発明の方法、組成物、及びキットは、ゲノム分析、サブゲノム分析、又はメタゲノム分析（例えば、コピー数変化の分析、一塩基多型、又はその他のゲノム分析法）のための当該技術分野で公知の方法及び用途に用いるための任意の起源に由来する標的ＤＮＡからの５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片の作製、及び必要に応じて、作製された５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片の増幅に有用である。方法は、限定されるものではないが、培養又は成長条件が未知の１又は複数の微生物又は環境生物を含む１又は複数の生物のゲノムのメタゲノム分析、リアルタイムＰＣＲ、エマルションＰＣＲ、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、比較ゲノムシークエンシング（ＣＧＳ）を初めとする種々のプロセスに有用である。方法は、ある種の大規模並列ＤＮＡシークエンシング（いわゆる「次世代シークエンシング」）用の鋳型の作製に特に有用である。
【０２２２】
異なるトランポゾン末端の配列を示す５’タグ及び３’タグを有するＤＮＡ断片を作製するための、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ及び／又は５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの使用
いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、１又は複数の二本鎖（ｄｓＤＮＡ）分子を含む又はからなる標的ＤＮＡから、５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片のライブラリーを作製する方法であって、
以下の１〜４を提供する工程：
１．１又は複数の二本鎖（ｄｓＤＮＡ）分子を含む又はからなる標的ＤＮＡ（例えば、真核及び／又は原核のゲノムＤＮＡ又はＲＮＡの逆転写により調製された二本鎖ｃＤＮＡ）
２．トランスポザーゼ（例えば野生型又は変異体のトランスポザーゼ；例えば野生型又は変異体のＴｎ５トランスポザーゼ、例えばＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ、又は例えばＨＹＰＥＲＭＵ（商標）ＭｕＡトランスポザーゼ、米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社製）、及び
３．転位反応中にトランスポザーゼと機能的複合体を形成できるトランスポゾン末端（例えば野生型又は変異体のＴｎ５トランスポザーゼ、例えばＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼにより認識される、１９ｂｐ外側末端（「ＯＥ」）トランスポゾン末端、内側末端（「ＩＥ」）トランスポゾン末端、又は「モザイク末端」（「ＭＥ」）トランスポゾン末端、あるいは、例えばＨＹＰＥＲＭＵ（商標）ＭｕＡトランスポザーゼにより認識されるＲ１及びＲ２トランスポゾン末端）であって、組み合わされて二本鎖トランスポゾン末端の配列を示す転移鎖及び非転移鎖からなる二本鎖ＤＮＡを含み、転移鎖が第１のタグの配列を示す、トランスポゾン末端、及び
４．ＤＮＡポリメラーゼによる伸張が行われているＤＮＡ分子の３’末端の下流にある鋳型鎖にアニーリングしているＤＮＡを鎖置換又は消化するＤＮＡポリメラーゼ（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼは鎖置換活性及び／又は５’ヌクレアーゼ活性を有する。例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＡＩＬＳＡＦＥ（商標）ＤＮＡポリメラーゼミックス；ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、及びＤＩＳＰＬＡＣＥＡＣＥ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、全て米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社から入手可能）；
標的ＤＮＡの両方の鎖へのトランスポザーゼが触媒するトランスポゾン末端の挿入によりそれぞれが５’末端に第１のタグを有する５’タグ化ＤＮＡ断片（例えば図２）が生成される条件下で、そのために十分な時間、標的ＤＮＡをトランスポザーゼ及びトランスポゾン末端とインキュベートする工程；及び
ＤＮＡポリメラーゼにより５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端が伸張される条件下で、そのために十分な時間、インビトロ転位反応で生成された５’タグ化ＤＮＡ断片をＤＮＡポリメラーゼとインキュベートすることで、非転移トランスポゾン末端配列の少なくとも一部を示す第２のタグを５’タグ化ＤＮＡ断片に連結して５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片を作製する工程
を含む方法を提供する。
【０２２３】
いくつかの好ましい実施形態では、転移鎖は転移トランスポゾン末端配列のみを示し、したがって、５’タグ化ＤＮＡ断片中に存在する第１のタグは転移トランスポゾン末端配列のみを示す。いくつかの別の実施形態では、転移鎖は３’部分及び５’部分を含む又はからなり、３’部分は転移トランスポゾン末端の配列を示し、５’部分は任意のその他の所望の配列を示し、そのような実施形態では、第１のタグは３’部分及び５’部分の両方を含む又はからなる。転移鎖が３’部分及び５’部分を含む又はからなる実施形態では、非転移鎖は、必ずではないが、転移鎖の５’部分に相補的な配列を示してもよい。
【０２２４】
転移鎖が３’部分及び５’部分を含む又はからなるいくつかの実施形態では、５’部分はシークエンシングタグを示し（例えば、ロシュ社の４５４Ａシークエンシングタグ；例えば、図１０に図示）、３’部分はトランスポゾン末端の転移鎖の配列を示す。これにより、シークエンシングタグ（例えば、ロシュ社の４５４Ａシークエンシングタグ）を含む又はからなる第１のタグを有する５’タグ化ＤＮＡ断片が作製される。その後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、別のシークエンシングタグ（例えば、ロシュ社の４５４Ｂシークエンシングタグ）を含む又はからなる第２のタグを５’タグ化ＤＮＡ断片に連結することで、両方のシークエンシングタグ（例えば、４５４Ａ及び４５４Ｂ；図１０に模式的に示す）を有する５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片のライブラリーが作製される。ロシュ社製４５４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ  Ｓｙｓｔｅｍを用いた次世代シークエンシング用の鋳型として所望のサイズ範囲の５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片が用いられる。別の実施形態では、任意のその他のシークエンシング・プラットフォーム（例えば、ロシュ社の４５４シークエンシング・プラットフォーム、イルミナ（商標）社のＳＯＬＥＸＡ（商標）シークエンシング・プラットフォーム、ライフテクノロジーズ／アプライドバイオシステムズ社のＳＯＬＩＤ（商標）シークエンシング・プラットフォーム、パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシング・プラットフォーム、ポロネイターポロニー社のシークエンシング・プラットフォーム、コンプリート・ゲノミクス社のシークエンシング・プラットフォーム、インテリジェント・バイオシステムズ社のシークエンシング・プラットフォーム、又はヘリコス社のシークエンシング・プラットフォーム）を用いた次世代シークエンシング用のシークエンシングタグとして適切な第１及び第２のタグを用いてライブラリー中の５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片を作製する。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、１つの特定のトランスポザーゼに複数の二本鎖トランスポゾン末端を用いるか、異なるトランスポザーゼ酵素により認識される複数の異なるトランスポゾン末端を用いる。鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ又は５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いるいくつかの好ましい実施形態では、２つの異なるトランスポゾン末端が標的ＤＮＡの逆鎖中の互いに近い位置に挿入され、その後、逆鎖を鋳型として用いてＤＮＡポリメラーゼが５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端を伸張し、その結果、３’末端と５’末端に異なるトランスポゾン末端配列を示すタグを有する５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片のライブラリー（例えば第１のトランスポゾン末端の転移鎖及び第２のトランスポゾン末端の転移鎖が異なり且つ標的ＤＮＡの逆鎖に連結されている（例えば図７）が作製される。
【０２２６】
したがって、いくつかの実施形態では、方法は更に、
５．第１のトランスポザーゼにより認識されるトランスポゾン末端（この実施形態中では「第１のトランスポザーゼ」に認識される「第１のトランスポゾン末端と呼ぶ）とは異なるトランスポゾン末端を認識する第２のトランスポザーゼ；及び
６．転位反応中で第２のトランスポザーゼと機能的複合体を形成できる第２のトランスポゾン末端であって、組み合わされて二本鎖トランスポゾン末端の配列を示す転移鎖及び非転移鎖を含み、転移鎖が第２のタグにより示される配列に相補的な配列を示す、トランスポゾン末端
を更に提供する工程；及び
標的ＤＮＡへの第１及び第２のトランスポザーゼが触媒する第１及び第２のトランスポゾン末端の挿入によりそれぞれが５’末端に第１のトランスポゾン末端又は第２のトランスポゾン末端の転移鎖の配列を示すＤＮＡ断片が生成される条件下で、そのために十分な時間、標的ＤＮＡを第１のトランスポザーゼ及び第１のトランスポゾン末端並びに第２のトランスポザーゼ及び第２のトランスポゾン末端とインキュベートする工程；及び
ｄｓＤＮＡの変性又は熱サイクルを含まないＤＮＡ重合条件下で、ＤＮＡポリメラーゼにより５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端が伸張されるのに十分な時間５’タグ化ＤＮＡ断片をＤＮＡポリメラーゼとインキュベートすることで第２のタグを５’タグ化ＤＮＡ断片に連結し、増幅反応を行うことなく、タグ化ＤＮＡ断片（例えば、５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片）のライブラリーを作製する工程
を含む。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、方法は、同じ反応混合物中で、標的ＤＮＡを第１のトランスポザーゼ及び第１のトランスポゾン末端オリゴヌクレオチド並びに第２のトランスポザーゼ及び第２のトランスポゾン末端オリゴヌクレオチドの両方と同時にインキュベートする工程を含む。いくつかの別の実施形態では、方法は、標的ＤＮＡを第１のトランスポザーゼ及び第１のトランスポゾン末端オリゴヌクレオチドとインキュベートし、次いで、その反応産物を第２のトランスポザーゼ及び第２のトランスポゾン末端オリゴヌクレオチドとインキュベートすることで、順次行われる。方法を順次行ういくつかの実施形態では、標的ＤＮＡと第１のトランスポザーゼ及び第１のトランスポゾン末端オリゴヌクレオチドの反応の産物を、第２のトランスポザーゼ及び第２のトランスポゾン末端オリゴヌクレオチドとインキュベートする前に精製する。
【０２２８】
転移鎖が３’部分及び５’部分を含む又はからなる方法のいくつかの実施形態では、５’部分がシークエンシングタグ（例えば、第１のロシュ社の４５４シークエンシングタグ、例えば、ロシュ社の４５４Ａ）の配列を示し、３’部分がトランスポゾン末端の転移鎖の配列を示す。本明細書において、「シークエンシングタグ」とは、標的ＤＮＡ分子から作製した一本鎖ＤＮＡ断片の５’末端又は３’末端に連結された、前記ＤＮＡ断片のシークエンシングを容易化するためのタグを意味する。例えば、いくつかの実施形態では、シークエンシングタグは、表面上で前記ＤＮＡ断片鎖を捕捉するため並びに／又は前記ＤＮＡ断片及び／若しくは前記ＤＮＡ断片の相補体のＤＮＡ合成をプライミングするための部位を提供する（例えば、ロシュ社の４５４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ  Ｓｙｓｔｅｍにロシュ社の４５４Ａ及び４５４Ｂシークエンシングタグを用いる）。したがって、転移鎖の５’部分がシークエンシングタグの配列を示す場合、５’タグ化ＤＮＡ断片は、シークエンシングタグ（例えばロシュ社の４５４シークエンシングタグ）を含む又はからなる第１のタグを有する。その後、ＤＮＡポリメラーゼで第２のシークエンシングタグ（例えばロシュ社の４５４シークエンシングタグ）を含む又はからなる第２のタグを５’タグ化ＤＮＡ断片に連結することで、各末端にシークエンシングタグ（例えば４５４Ａ及びロシュ社の４５４Ｂシークエンシングタグ）を有する５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する。所望のサイズ範囲のライブラリー中の５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片をロシュ社の４５４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ  Ｓｙｓｔｅｍを用いた次世代シークエンシングの鋳型として用いる。別の実施形態では、別のシークエンシング・プラットフォーム（例えば、ロシュ社の４５４シークエンシング・プラットフォーム、イルミナ（商標）社のＳＯＬＥＸＡ（商標）シークエンシング・プラットフォーム、ライフテクノロジーズ／アプライドバイオシステムズ社のＳＯＬＩＤ（商標）シークエンシング・プラットフォーム、パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシング・プラットフォーム、ポロネイターポロニー社のシークエンシング・プラットフォーム、コンプリート・ゲノミクス社のシークエンシング・プラットフォーム、インテリジェント・バイオシステムズ社のシークエンシング・プラットフォーム、又はヘリコス社のシークエンシング・プラットフォーム）を用いた次世代シークエンシング用のシークエンシングタグである第１及び第２のタグを用いて５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片を作製する。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、異なる二本鎖トランスポゾン末端のそれぞれが、５’部分及び３’部分を有する異なる転移鎖を含み、各異なる転移鎖の５’部分は異なる所望のタグ配列を示し、３’部分はそれぞれの転移トランスポゾン末端配列を示す。いくつかの実施形態では、例えば、図８中の例に示すように、ライブラリー中の５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片は５’末端の第１のタグ及び３’末端の第２のタグの両方を有する。図８に示す異なるトランスポゾン末端は、同じトランスポザーゼにより触媒される別個のインビトロ転位イベント中に異なる位置に挿入されたものである。しかし、いくつかの別の実施形態では、異なるトランスポゾン末端と機能的転位複合体を形成する異なるトランスポザーゼを用いる。各トランスポゾン末端の転移鎖の５’部分に含まれる異なるタグは、任意の所望の目的のための任意の所望の配列を示し得る。例えば、いくつかの実施形態では、５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片の第１のタグ及び第２のタグは、ロシュ社の４５４Ａ及び４５４Ｂシークエンシングタグの配列を示し、所望のサイズ範囲の断片を単離した後、ロシュ社の４５４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ  Ｓｙｓｔｅｍを用いた次世代用の鋳型として用いられる。同様に、別の実施形態では、５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片は、所望のサイズ範囲のものを単離した後、別のシークエンシング・プラットフォーム（例えば、ロシュ社の４５４シークエンシング・プラットフォーム、イルミナ（商標）社のＳＯＬＥＸＡ（商標）シークエンシング・プラットフォーム、ライフテクノロジーズ／アプライドバイオシステムズ社のＳＯＬＩＤ（商標）シークエンシング・プラットフォーム、パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシング・プラットフォーム、ポロネイターポロニー社のシークエンシング・プラットフォーム、コンプリート・ゲノミクス社のシークエンシング・プラットフォーム、インテリジェント・バイオシステムズ社のシークエンシング・プラットフォーム、又はヘリコス社のシークエンシング・プラットフォーム）を用いた次世代用の鋳型として用いられる。いくつかの好ましい実施形態では、５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片は、この方法を用いて細胞又は生物の全ゲノムを含む標的ＤＮＡから作製される。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、第１のトランスポゾン末端の転移鎖又は第２のトランスポゾン末端の転移鎖は、親和結合分子（例えばビオチン）又は検出可能な分子（例えば、蛍光色素）で標識され、これは、５’末端に親和結合分子又は検出可能な分子を有するタグを有する５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片の捕捉（例えば、ビオチン化分子の捕捉にはストレプトアビジンが結合した表面を用いる）又は検出を可能にする。
【０２３１】
５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片へのタグドメインの付加：
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ及びタグドメインの鋳型を含むオリゴヌクレオチドを用いて、タグ化ＤＮＡ断片のライブラリーに含まれる５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端にタグドメインを付加する（例えば図１９）。いくつかの実施形態では、タグドメインの付加に使用するＤＮＡポリメラーゼは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであり、オリゴヌクレオチドはＰＣＲプライマーであり、タグドメインはＰＣＲを行うことで第２のタグに連結される。
【０２３２】
ＩＩＩ．標的ＤＮＡの断片化、タグ化、及び１種類のプライマーを用いた増幅
本発明の好ましい方法の１つは、トランスポザーゼ及びそれと転位複合体を形成するトランスポゾン末端からなるトランスポソーム複合体をインビトロ転位反応中で標的ＤＮＡとインキュベートする工程であって、標的ＤＮＡの両方の鎖中の複数の部位に転移トランスポゾン末端が挿入される条件下でそのために十分な時間インキュベートする工程；インビトロ転位反応産物を鎖置換活性及び／又は５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼとインキュベートする工程であって、５’末端に転移トランスポゾン末端が連結された標的ＤＮＡの各鎖の３’末端が標的ＤＮＡの逆鎖を鋳型として伸張される条件下で、そのために十分な時間インキュベートし、前記ＤＮＡポリメラーゼにより触媒されるそれぞれの伸張により、標的ＤＮＡの逆鎖に連結された転移トランスポゾン末端にアニーリングしている非転移トランスポゾン末端が置換又は消化され、その結果、５’末端に転移鎖を有し且つ３’末端に非転移鎖を有し且つそれぞれが標的ＤＮＡの異なる部分を含むジタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーが生成され、ジタグ化ＤＮＡ断片の全集合が、その作製の元となった標的ＤＮＡの配列を実質的に表す、工程；及び、ＰＣＲ熱サイクル条件下で、ジタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、転移トランスポゾン末端配列の少なくとも一部を示す１種類のプライマーとをインキュベートすることでジタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを増幅する工程、を含む。いくつかの好ましい実施形態では、方法は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに基質として使用される１又は複数の標識ｄＮＴＰの存在下で、ジタグ化ＤＮＡ断片の増幅されたライブラリーを作製することにより、標識されたジタグ化ＤＮＡ断片の増幅されたライブラリーを作製することを含む。
【０２３３】
したがって、本発明の一実施形態は、標的ＤＮＡから作製したＤＮＡ断片を１種類のプライマーで増幅するインビトロでの方法であって、方法が、標的ＤＮＡの存在下且つ転移トランスポゾン末端配列を示す転移鎖及び非転移トランスポゾン末端配列を示す非転移鎖からなるトランスポゾン末端の存在下で転位反応を行う工程であって、前記転位反応により、標的ＤＮＡの各鎖への転移トランスポゾン末端の連結を含む複数の挿入が起こることで、転移トランスポゾン末端配列を示す第１のタグを５’末端にそれぞれが有する互いにアニーリングした５’タグ化ＤＮＡ断片が生成する、工程；５’タグ化ＤＮＡ断片とアニーリングしている逆鎖を鋳型として用いて鎖置換活性及び及び／又は５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼで５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端を伸張する工程；並びに転移トランスポゾン末端配列の少なくとも一部を示す１種類のプライマーと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに基質として使用される少なくとも１つの標識ｄＮＴＰとを用いてＰＣＲ増幅反応を行うことで、標的ＤＮＡを表すジタグ化ＤＮＡ断片の増幅されたライブラリーを作製する工程、を含む方法である。
【０２３４】
いくつかの好ましい実施形態では、標的ＤＮＡは、真核及び／若しくは原核のゲノムＤＮＡ又はＲＮＡの逆転写により調製された二本鎖ｃＤＮＡから選択される。
【０２３５】
いくつかの好ましい実施形態では、トランスポソームは、Ｔｎ５トランスポザーゼ、ＭｕＡトランスポザーゼ、ミヤマカタバミ（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）トランスポザーゼ、マリナー・トランスポザーゼ、Ｔｎ７トランスポザーゼ、Ｔｎ１０トランスポザーゼ、Ｔｙ１トランスポザーゼ、及びＴｎ５５２トランスポザーゼから選択される野生型又は高活性変異体の形態のトランスポザーゼと、トランスポザーゼが転位反応中で活性な複合体を形成するトランスポゾン末端との複合体である。
【０２３６】
いくつかの好ましい実施形態では、１種類の酵素又は酵素ミックスを、鎖置換活性及び５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ並びに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの両方として使用し、このＤＮＡポリメラーゼ又はミックスは、野生型又は組換え形態のＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、及びＦＡＩＬＳＡＦＥ（商標）  ＤＮＡポリメラーゼミックスから選択される。
【０２３７】
いくつかの好ましい実施形態では、少なくとも１つの標識ｄＮＴＰは、標識、例えばシアニン（例えば、Ｃｙ５．５、Ｃｙ５、Ｃｙ３、Ｃｙ２）、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（例えば、６４７、５９４）、テキサスレッド、ＪＯＥ、５−ＦＡＭ、６−ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＨＥＸ、６−ＲＯＸ、ローダミン、リサミン、シアン５００等（例えば、参照により本明細書に援用するHandbook of Molecular Probes, R. Haughland, Molecular Probe, Eugene, OR.を参照されたい）を含む。
【０２３８】
いくつかの好ましい実施形態では、この方法を用いて作製した５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片のライブラリー又は増幅されたライブラリーは、細胞又は生物の全ゲノムを含む又はからなる標的ＤＮＡに由来する。いくつかの実施形態では、この方法を用いて作製されたジタグ化ＤＮＡ断片のライブラリー又は増幅されたライブラリーは、（例えば、メタゲノム的又はメタ転写産物的な研究又は用途のための）環境試料中に存在する全生物のゲノム及び／又は二本鎖ｃＤＮＡを含む又はからなる標的ＤＮＡに由来する。
【０２３９】
方法のいくつかの好ましい実施形態では、転移鎖は転移トランスポゾン末端配列のみを示し、したがって、５’タグ化ＤＮＡ断片中に存在する第１のタグは転移トランスポゾン末端配列のみを示す。いくつかの別の実施形態では、転移鎖は３’部分及び５’部分を含む又はからなり、３’部分が転移トランスポゾン末端配列を示し、５’部分が任意のその他の所望のヌクレオチド又はヌクレオチド配列を示し、そのような実施形態では、第１のタグは３’部分及び５’部分の両方を含む又はからなる。転移鎖が３’部分及び５’部分を含む又はからなる実施形態では、非転移鎖は、必ずではないが、転移鎖の５’部分に相補的な配列を示してもよい。転移鎖が３’部分及び５’部分を含む又はからなるいくつかの好ましい実施形態では、５’部分は捕捉ドメインを含む少なくとも１つのヌクレオチド（例えば、表面に結合させたストレプトアビジン部分により捕捉することができるビオチン部分を含むヌクレオチド；又は例えば他の親和結合分子）を示す。
【０２４０】
ＩＩ．トランスポザーゼ及びリガーゼを用いたＤＮＡの断片化及びタグ化
本発明は、トランスポザーゼを用いて１又は複数の二本鎖（ｄｓＤＮＡ）分子を含む又はからなる標的ＤＮＡから５’タグ化断片を作製し、その後、第１のタグとは異なるＤＮＡ配列を示す第２のタグを前記５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端に連結する、方法、組成物、及びキットを含む。第１のタグは、トランスポザーゼにより認識されるトランスポゾン末端の転移鎖の配列を示し、必要に応じて、前記転移トランスポゾン末端配列の５’に１又は複数のその他の配列を更に示す。第２のタグは核酸リガーゼを用いてインビトロで５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端に連結される。
【０２４１】
本発明の方法の１つは、転移トランスポゾン末端が標的ＤＮＡに連結される条件下で、十分な時間、トランスポザーゼ及びそれと転位複合体を形成するトランスポゾン末端をインビトロ転位反応中で標的ＤＮＡとインキュベートすることで、５’末端に第１のタグを有する５’タグ化ＤＮＡ断片を作製する工程；５’タグ化ＤＮＡ断片と、核酸リガーゼ及び第２のタグを含む又はからなるライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドとを、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドが５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端に連結される条件下でそのために十分な時間インキュベートすることで、５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する工程、を含む。いくつかの実施形態では、方法は更に、ＤＮＡポリメラーゼ及び第２のタグに相補的な少なくとも１つのプライマーを用いて５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを増幅するステップを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼを用いて５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを増幅するステップは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、第２のタグに相補的な第１のＰＣＲプライマーと、第１のタグが示す配列の少なくとも一部と同じ配列を示す第２のＰＣＲプライマーとを用いるＰＣＲ増幅を含む。
【０２４２】
本発明の好ましい実施形態１つは、１又は複数の二本鎖（ｄｓＤＮＡ）分子を含む又はからなる標的ＤＮＡから、５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する方法であって、
以下の１〜５を提供する工程：
１．１又は複数の二本鎖（ｄｓＤＮＡ）分子を含む又はからなる標的ＤＮＡ（例えば、真核及び／又は原核のゲノムＤＮＡ又はＲＮＡの逆転写により調製された二本鎖ｃＤＮＡ）、
２．トランスポザーゼ（例えば野生型又は変異体のトランスポザーゼ；例えば野生型又は変異体のＴｎ５トランスポザーゼ、例えばＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ、又は例えばＨＹＰＥＲＭＵ（商標）ＭｕＡトランスポザーゼ、米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社）、
３．転位反応中でトランスポザーゼと機能的複合体を形成できるトランスポゾン末端（例えば野生型又は変異体のＴｎ５トランスポザーゼ、例えばＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼにより認識される、１９ｂｐ外側末端（「ＯＥ」）トランスポゾン末端、内側末端（「ＩＥ」）トランスポゾン末端、又は「モザイク末端」（「ＭＥ」）トランスポゾン末端、あるいは、例えばＨＹＰＥＲＭＵ（商標）  ＭｕＡトランスポザーゼにより認識されるＲ１及びＲ２トランスポゾン末端）であって、組み合わされて二本鎖トランスポゾン末端の配列を示す転移鎖及び非転移鎖からなる二本鎖ＤＮＡを含み、転移鎖が第１のタグの配列を示す、トランスポゾン末端、
４．ＤＮＡ分子の３’ヒドロキシルにライゲーションさせることができる５’末端を有し、第２のタグの配列を示す、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチド、及び
５．核酸リガーゼ；
標的ＤＮＡへのトランスポザーゼが触媒するトランスポゾン末端の挿入によりそれぞれが５’末端に第１のタグを有する５’タグ化ＤＮＡ断片が生成される条件下でそのために十分な時間、標的ＤＮＡをトランスポザーゼ及びトランスポゾン末端とインキュベートする工程；及び
５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端に第２のタグが連結されてタグ化ＤＮＡ断片のそれぞれが５’末端に第１のタグを有し且つ３’末端に第２のタグを有する５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片のライブラリーが生成される条件下で、そのために十分な時間、５’タグ化ＤＮＡ断片を核酸リガーゼ及びライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドとインキュベートする工程
を含む方法である。
【０２４３】
いくつかの好ましい実施形態では、転移鎖は転移トランスポゾン末端配列のみを示し、したがって、タグ化ＤＮＡ断片中に存在する第１のタグは転移トランスポゾン末端配列のみを示す。いくつかの別の実施形態では、転移鎖は３’部分及び５’部分を含む又はからなり、３’部分が転移トランスポゾン末端の配列を示し、５’部分が任意のその他の所望の配列を示し、そのような実施形態では、第１のタグは３’部分及び５’部分の両方を含む又はからなる。転移鎖が３’部分及び５’部分を含む又はからなる実施形態では、非転移鎖は、必ずではないが、転移鎖の５’部分に相補的な配列を示してもよい。
【０２４４】
転移鎖が３’部分及び５’部分を含む又はからなるいくつかの実施形態では、５’部分はシークエンシングタグ（例えば、第１のロシュ社の４５４シークエンシングタグ、例えばロシュ社の４５４Ａ）の配列を示し、３’部分はトランスポゾン末端の転移鎖の配列を示す。本明細書において、「シークエンシングタグ」とは、標的ＤＮＡ分子から作製した一本鎖ＤＮＡ断片の５’末端又は３’末端に連結された、前記ＤＮＡ断片のシークエンシングを容易化するためのタグを意味する。例えば、いくつかの実施形態では、シークエンシングタグは、表面上で前記ＤＮＡ断片鎖を捕捉するための部位及び／又は前記ＤＮＡ断片若しくは前記ＤＮＡ断片の相補体のＤＮＡ合成をプライミングするための部位を提供する（例えば、ロシュ社の４５４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ  Ｓｙｓｔｅｍにはロシュ社の４５４Ａ及び４５４Ｂシークエンシングタグを用いる）。したがって、転移鎖の５’部分がシークエンシングタグの配列を示す場合、５’タグ化ＤＮＡ断片はシークエンシングタグ（例えばロシュ社の４５４シークエンシングタグ）を含む又はからなる第１のタグを有する。その後、核酸リガーゼを用いて、第２のシークエンシングタグを含む又はからなる第２のタグ（例えば、ロシュ社の４５４Ｂシークエンシング）を有するライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドを５’タグ化ＤＮＡ断片にライゲーションさせることで、各末端にシークエンシングタグ（例えば、４５４Ａ及びロシュ社の４５４Ｂシークエンシングタグ）を有する５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する。この５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片は、ロシュ社の４５４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ  Ｓｙｓｔｅｍを用いた次世代シークエンシングの鋳型として用いるのに適した所望のサイズ範囲を有するように作製される。別の実施形態では、別のシークエンシング・プラットフォーム（例えば、ロシュ社の４５４シークエンシング・プラットフォーム、イルミナ（商標）社のＳＯＬＥＸＡ（商標）シークエンシング・プラットフォーム、ライフテクノロジーズ／アプライドバイオシステムズ社のＳＯＬＩＤ（商標）シークエンシング・プラットフォーム、パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシング・プラットフォーム、ポロネイターポロニー社のシークエンシング・プラットフォーム、コンプリート・ゲノミクス社のシークエンシング・プラットフォーム、インテリジェント・バイオシステムズ社のシークエンシング・プラットフォーム、又はヘリコス社のシークエンシング・プラットフォーム）を用いた次世代シークエンシング用のシークエンシングタグとしての使用に適した第１及び第２のタグを有するあるサイズのタグ化ＤＮＡ断片を含むようにタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する。
【０２４５】
第２のタグの鋳型依存性ライゲーション
いくつかの好ましい実施形態では、方法は、３’部分及び５’部分を含む又はからなるライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、３’部分が、５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端に連結することを所望する任意の配列（すなわち、任意配列）を含む又はからなる第２のタグを示し、５’部分が、５’モノリン酸基を有し且つ５’末端にランダム配列（例えば約３〜約８ヌクレオチドからなるランダム配列）を示す、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドを提供する工程を含む。いくつかの好ましい実施形態（例えば、トランスポザーゼが野生型又は変異体のＴｎ５トランスポザーゼ（例えばＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ、又は例えばＨＹＰＥＲＭＵ（商標）  ＭｕＡトランスポザーゼ、米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社）であり、核酸リガーゼが大腸菌ＤＮＡリガーゼである本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドの５’部分は４ヌクレオチドのランダム配列を示す。
【０２４６】
本発明は、５’部分に約３〜約８ヌクレオチドからなるランダム配列を示すライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドに限定されない。例えば、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドの５’部分が、２ヌクレオチドだけからなるランダム配列を示すか、８以上のヌクレオチドからなるランダム配列を示すか、完全なランダム配列ではなく半ランダム配列を示すか、完全なランダム配列ではなく１又は複数の縮重ヌクレオチド（例えば、イノシンヌクレオチド）を含む配列を示す方法も本発明に含まれる。しかし、５’部分が約３〜約８ヌクレオチドからなるランダム配列を示すライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドが好ましい。
【０２４７】
いくつかの好ましい実施形態では、５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端へのライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドのライゲーションは、ライゲーション連結部に完全に相補的な配列を示すＤＮＡ鋳型の存在下でのみ起こり、そのような実施形態においてライゲーションされる２つの核酸分子がアニーリングする鋳型を本明細書では「ライゲーション鋳型」と呼び、ライゲーションを「鋳型依存性ライゲーション」と呼ぶ。ライゲーションがライゲーション鋳型存在下でのみ起こるいくつかの実施形態では、核酸リガーゼはライゲーション鋳型を必要とするＤＮＡリガーゼであり、これを本明細書では「鋳型依存性リガーゼ」と呼ぶ（例えば、限定されるものではないが、米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社から入手可能な大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｆｌ  ＤＮＡリガーゼ、又はＡＭＰＬＩＧＡＳＥ（登録商標）ＤＮＡリガーゼ等のＮＡＤ型鋳型依存性ＤＮＡリガーゼ等）。ライゲーションがライゲーション鋳型存在下でのみ起こるいくつかの別の実施形態では、核酸リガーゼは、ライゲーションにライゲーション鋳型を必要としないがライゲーション鋳型非存在下よりも存在下でより効率良くライゲーションを触媒するＤＮＡリガーゼである（例えば、限定されるものではないが、米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社から入手可能なＴ４  ＤＮＡリガーゼ又はＦＡＳＴＬＩＮＫ（商標）ＤＮＡリガーゼ等のＡＴＰ型鋳型依存性ＤＮＡリガーゼ）。ライゲーションがライゲーション鋳型上で起こる場合、リガーゼが鋳型非依存性ライゲーションも触媒できる場合でも、このライゲーションを本明細書では「鋳型依存性ライゲーション」と呼ぶ。好ましい実施形態では、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドのランダム配列は短く、そのような実施形態では、低温（例えば、約４０℃以下、約３７℃以下、約３０℃以下、約２５℃以下、又は約２０℃以下）で鋳型依存性リガーゼを触媒する核酸が好ましい。いくつかの好ましい実施形態では、鋳型依存性リガーゼは大腸菌ＤＮＡリガーゼである。
【０２４８】
本発明は、使用するライゲーション方法に関して限定されないが、鋳型依存性ライゲーションを含む実施形態に関して、ライゲーションは、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドと５’タグ化ＤＮＡ断片が隣り合ってアニーリングするための標的配列の存在下で効率的に起こるべきであり、ライゲーションは、標的配列の非存在下ではほとんど又は全く起こらないべきである。本明細書において、「鋳型依存性ライゲーション」とは、標的配列にアニーリングした時に互いに隣接する又は隣り合う又は接する、隣接するライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドの５’末端と５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端とを連結するための任意の好適な方法を指す。
【０２４９】
トランスポザーゼにより触媒される標的ＤＮＡの両方の鎖へのトランスポゾン末端の挿入の結果、標的ＤＮＡが断片化され、標的ＤＮＡの各鎖に転移トランスポゾン末端が連結され、転移トランスポゾン末端の連結部位の３’に９塩基の一本鎖標的ＤＮＡ領域が形成され、標的ＤＮＡの逆鎖にギャップ領域ができる（例えば、図３）。転移トランスポゾン末端の下流の標的ＤＮＡの一本鎖領域は、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドのランダム部分がアニーリングするライゲーション鋳型となり得る。５’部分にランダム配列を示すライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドが示す全配列（全ての可能な配列を含む）のうち、その少なくとも１つは、標的ＤＮＡ中の各一本鎖領域にアニーリングすることができる配列を５’末端に示し、それにより、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドの５’リン酸化末端が５’タグ化ＤＮＡ断片に相補的な標的ＤＮＡの３’末端に隣接して接し、その場合、核酸リガーゼがその後、前記３’末端へのライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドの鋳型依存性ライゲーションを触媒することができる。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡの逆鎖の比較的近接した２ヶ所にトランスポゾン末端の転移鎖が挿入され、図２に示すような２つの５’タグ化ＤＮＡ断片及び図７に示すような２つの５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片が生成する。２つの５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片を変性させた後、これらは、増幅（例えば、第２のタグに相補的な第１のＰＣＲプライマー及び第１のタグに相補的な第２のＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲ）等の種々の用途に用いることができる。
【０２５０】
５’タグ化ＤＮＡ断片への第２のタグの連結に核酸リガーゼ及び鋳型依存性ライゲーションを利用することを含む方法のいくつかの実施形態では、５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片は、トランスポゾン末端配列を示す５’の第１のタグ及びトランスポゾン末端配列を示さない３’の第２のタグを含む（但し、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドの３’部分は、所望であれば、トランスポゾン末端配列を含む任意の所望の配列を示す第２のタグを含んでもよい又はからなってもよい）。例えば、いくつかの実施形態では、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドの３’部分は、ロシュ社の４５４シークエンシングタグの配列又は他のシークエンシング・プラットフォーム（例えば、ロシュ社の４５４シークエンシング・プラットフォーム、イルミナ（商標）社のＳＯＬＥＸＡ（商標）シークエンシング・プラットフォーム、ライフテクノロジーズ／アプライドバイオシステムズ社のＳＯＬＩＤ（商標）シークエンシング・プラットフォーム、パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシング・プラットフォーム、ポロネイターポロニー社のシークエンシング・プラットフォーム、コンプリート・ゲノミクス社のシークエンシング・プラットフォーム、インテリジェント・バイオシステムズ社のシークエンシング・プラットフォーム、又はヘリコス社のシークエンシング・プラットフォーム）用のシークエンシングタグの配列を示す。
【０２５１】
例えば、いくつかの実施形態では、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドの３’部分中の第２のタグは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７型ＲＮＡポリメラーゼプロモーター；例えばＴ７、Ｔ３、ＳＰ６、又はファージＮ４  ＭＩＮＩ−Ｖ（商標）ＲＮＡポリメラーゼプロモーター；米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社）の配列を示し、一般的に、ＲＮＡポリメラーゼが二本鎖のＲＮＡポリメラーゼプロモーターを必要とする場合、これらの実施形態中の第２のタグは、ＲＮＡポリメラーゼにより転写される鋳型ＤＮＡ鎖の３’末端に連結されているＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列を意味する「センスＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列］を示し、そのような実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼにより認識される二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを作製する方法中のステップ中に、相補的な「アンチセンスＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列」も提供又は合成されなければならない。いくつかの実施形態では、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドの３’部分中の第２のタグは、（例えば各標的ＤＮＡ試料で異なる配列を示すライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチド中のアドレスタグを用いることで）特定の試料の同定を可能にする配列を意味する「アドレスタグ」の配列も示す。いくつかの実施形態では、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドの３’部分は、方法中の特定の目的のための１又は複数のその他のタグの配列も示す。
【０２５２】
いくつかの好ましい実施形態では、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドの５’部分は、トランスポザーゼが触媒する標的ＤＮＡの両方の鎖へのトランスポゾン末端の挿入により生じた５’タグ化ＤＮＡ断片の一本鎖部分にアニーリング可能な長さのランダム配列である。ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドの５’部分中のランダム配列は、５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端に隣接する一本鎖ギャップ領域にアニーリングし、この一本鎖ギャップ領域は、標的ＤＮＡ相補鎖の３’末端にライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドを鋳型依存的にライゲーションするためのライゲーション鋳型となる。ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼを用いる実施形態では、標的ＤＮＡの両方の鎖に１９ｂｐのＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポゾン末端オリゴヌクレオチドを挿入することで、転移トランスポゾン末端の挿入部位とは反対側に一本鎖領域からなる９塩基のギャップを示す５’タグ化ＤＮＡ断片が作製される。しかし、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドがアニーリングできるギャップのサイズは種々のトランスポザーゼ酵素で異なる。例えば、ＭｕＡトランスポザーゼで転移トランスポゾン末端挿入部位の下流に生じる標的ＤＮＡの一本鎖領域はたった５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドのランダム配列は約３〜約８個のランダムヌクレオチドを含む又はからなる。しかし、生じる一本鎖領域のサイズ並びに使用する各核酸リガーゼ及びライゲーション条件において最も効率的にライゲーションされるランダム配列の長さ等のその他の因子に基づき、種々のトランスポザーゼ酵素でライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドのランダム配列部分の長さは変わり得る。例えば、出願人らは、ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼを用いて作製した５’タグ化ＤＮＡ断片を用いた場合、４ヌクレオチドのランダム配列からなる５’部分を有するライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドにより、核酸リガーゼとして大腸菌ＤＮＡリガーゼを用いて高収量の５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片が生成されることを観察した。しかし、この４ヌクレオチドのランダム配列からなる５’部分を有するライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドは、同様なライゲーション条件下で、ＡＭＰＬＩＧＡＳＥ（登録商標）耐熱性リガーゼ等の耐熱性ＤＮＡ依存性リガーゼでは効率的にライゲーションされなかった。好ましい実施形態では、５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ試料から生じた全ＤＮＡ断片を含む又はからなる。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、鋳型依存性ライゲーション用の核酸リガーゼは、ＮＡＤを補因子として用いるリガーゼである。いくつかの実施形態では、鋳型依存性ライゲーション用の核酸リガーゼは以下のＮＡＤ型ＤＮＡリガーゼから選択される：大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｆｌ  ＤＮＡリガーゼ、及びＡｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）ＤＮＡリガーゼ（全て米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社から入手可能）、並びにＴｓｃ  ＤＮＡリガーゼ（米国インディアナ州インディアナポリスのロシュ・アプライドシステムズ社（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）製）。いくつかの実施形態では、鋳型依存性ライゲーション用の核酸リガーゼはＡＴＰ型ＤＮＡリガーゼである。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ型ＤＮＡリガーゼは以下から選択される：Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ及びＦＡＳＴＬＩＮＫ（商標）ＤＮＡリガーゼ（米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社製）。いくつかの好ましい実施形態では、核酸リガーゼは、ＮＡＤを補因子として用いる大腸菌ＤＮＡリガーゼ又はその他の中温性細菌ＤＮＡリガーゼから選択される。いくつかの好ましい実施形態では、ＤＮＡ鋳型依存性ＤＮＡリガーゼ（例えば、大腸菌ＤＮＡリガーゼ）を用いた５’タグ化ＤＮＡ断片へのライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドのライゲーション効率を向上させるために、５’タグ化ＤＮＡ断片のサイズ選択を行い、サイズ選択された５’タグ化ＤＮＡ断片の精製を行う。
【０２５４】
第２のタグの鋳型非依存性ライゲーション
核酸リガーゼを用いて５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端に第２のタグを連結することを含む方法のいくつかの実施形態では、５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端に隣接するライゲーション鋳型にライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドをアニーリングさせずに、第２のタグを示すライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドを５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端に直接ライゲーションする。これらの実施形態では、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドは、ランダム配列を示さず、５’タグ化ＤＮＡ断片への連結を所望する第２のタグの配列のみを示す。これらの実施形態では、ライゲーション鋳型を用いずに一本鎖５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端にライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドが直接ライゲーションされる。これらの方法の実施形態では、核酸リガーゼは、ライゲーション連結部位での相補的な配列へのアニーリングを用いずに、３’ヒドロキシル基を有する一本鎖ＤＮＡ分子を５’モノリン酸基を有する一本鎖ＤＮＡ分子にライゲーションさせることができる核酸リガーゼ（例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、バクテリオファージＴＳ２１２６耐熱性ＲＮＡリガーゼ、及びＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ＤＮＡリガーゼ（米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社製）から選択される）であり、方法は更に、５’タグ化ＤＮＡ断片を核酸リガーゼ及びライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドとインキュベートする前に５’タグ化ＤＮＡ断片を含むｄｓＤＮＡを変性させるステップを含む。
【０２５５】
本発明は特定の核酸リガーゼに限定されず、５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端に第２のタグが連結されて５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片のライブラリーが生成する条件下でそのために十分な時間５’タグ化ＤＮＡ断片を核酸リガーゼとインキュベートする工程を含む方法は、鋳型依存性の連結又は鋳型非依存性の連結に、核酸リガーゼの代わりに他の組成物を使用することをも含むと理解される。例えば、その他のライゲーション方法を用いてもよく、例えば、限定されるものではないが、トポイソメラーゼを介したライゲーションを含むライゲーションにおいてトポイソメラーゼ部分を含むライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドを使用してもよい（例えば、参照により本明細書に援用する米国特許第５，７６６，８９１号）。但し、トポイソメラーゼを介したライゲーションはほとんどの実施形態で好ましくない。
【０２５６】
ＩＶ．トランスポザーゼ及びリガーゼを用いたｄｓ標的ＤＮＡからのタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片の作製（３０８４２）
本発明は試料中の標的ＤＮＡからＤＮＡシークエンシング又は核酸増幅反応における鋳型として使用するためのタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片の集合を含むライブラリーを作製するための方法、組成物、及びキットを含む。一般的に、ライブラリー中の各タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片は、標的ＤＮＡの一部とタグが隣り合った配列を示す。
【０２５７】
簡潔には、特定の実施形態では、方法は、通常はｄｓＤＮＡである標的ＤＮＡをインビトロ転位反応中でトランスポザーゼ及びトランスポゾン末端組成物とインキュベートして、標的ＤＮＡを同時に断片化及びタグ化し、タグ化ＤＮＡ断片の集合を作製する工程；次いで、タグ化ＤＮＡ断片を変性させて５’タグ化ｓｓＤＮＡ断片を作製する工程；次いで、ｓｓＤＮＡの鋳型非依存成分子内ライゲーション（すなわち環状化）を触媒できる鋳型非依存性又は非相同性核酸リガーゼと５’タグ化ｓｓＤＮＡ断片をインキュベートしてタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片のライブラリーを作製する工程、を含む。いくつかの実施形態では、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片を、タグ内の制限部位にアニーリングするオリゴデオキシリボヌクレオチドをアニーリングさせた後に制限エンドヌクレアーゼで処理して線状化することで、５’末端にタグの一部を有し３’末端にタグの残りの部分を有する直鎖ｓｓＤＮＡ断片を作製する（この直鎖ｓｓＤＮＡ断片を本明細書では「ジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片」又は単に「ジタグ化ｓｓＤＮＡ断片」と呼ぶ）。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片を核酸増幅反応及び／又はＤＮＡシークエンシング反応のＤＮＡ鋳型として用いる。いくつかの実施形態では、方法はタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片のライブラリーを増幅及び／又はシークエンシングするステップを更に含む（例えば標的ＤＮＡを増幅するため又は標的ＤＮＡの配列を決定するため）。いくつかの実施形態では、方法は更に、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片の増幅により得られた標的ＤＮＡに相補的なＤＮＡをシークエンシングするステップを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ及び（例えば合成によるシークエンシング用の）タグに相補的な少なくとも１つのプライマーを用いて、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片のそれぞれに含まれる標的ＤＮＡの少なくとも一部をシークエンシングする。いくつかの実施形態では、タグに相補的な少なくとも１つのオリゴデオキシリボヌクレオチドと標的配列の一部にアニーリングする少なくとも１つのその他のオリゴデオキシリボヌクレオチドとをライゲーションさせる鋳型依存性リガーゼを用いて、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片のそれぞれに含まれる標的ＤＮＡの少なくとも一部をシークエンシングする（例えばライゲーションによるシークエンシング）。いくつかの実施形態では、タグ及び標的配列の一部にアニーリング又はハイブリダイズするオリゴデオキシリボヌクレオチドをアニーリングさせることで、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片のそれぞれに含まれる標的ＤＮＡの少なくとも一部をシークエンシングする（例えばハイブリダイゼーションによるシークエンシング）。いくつかの実施形態では、合成によるシークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング、又はハイブリダイゼーションによるシークエンシングにより、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片に相補的なＤＮＡをシークエンシングする。
【０２５９】
したがって、本発明の好ましい実施形態の１つは、試料中の標的ＤＮＡから、ＤＮＡシークエンシング反応又は核酸増幅反応の鋳型として用いるため、各タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片が標的ＤＮＡの一部の配列と標的配列の一部に連結されたタグの配列とを示すタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片の集合を含むライブラリーを作製する方法であって、
以下の１〜４を提供する工程：
１．１又は複数の二本鎖（ｄｓＤＮＡ）分子を含む又はからなる標的ＤＮＡ（例えば、真核及び／又は原核のゲノムＤＮＡ、あるいは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素を用いたＲＮＡの逆転写により第１のｃＤＮＡ鎖を作製し、次いで第１のｃＤＮＡ鎖にアニーリングさせたプライマーを伸張させてｄｓＤＮＡを作製することで調製された二本鎖ｃＤＮＡ）；
２．ランスポザーゼ（例えば野生型又は変異体のトランスポザーゼ；例えば野生型又は変異体のＴｎ５トランスポザーゼ、例えばＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ、例えばＨＹＰＥＲＭＵ（商標）ＭｕＡトランスポザーゼ、米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社）、
３．転位反応中でトランスポザーゼと機能的複合体を形成できるトランスポゾン末端組成物（例えば野生型又は変異体のＴｎ５トランスポザーゼ、例えばＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼにより認識される、１９ｂｐ外側末端（「ＯＥ」）トランスポゾン末端、１９ｂｐ内側末端（「ＩＥ」）トランスポゾン末端、又は１９ｂｐ「モザイク末端」）「ＭＥ」）トランスポゾン末端を含む又はからなる）であって、組み合わされて二本鎖トランスポゾン末端の配列を示す転移鎖及び非転移鎖を含む又はからなり、転移鎖がタグの配列を示す、トランスポゾン末端組成物；
４．５’モノリン酸及び３’ヒドロキシル基を有するｓｓＤＮＡを鋳型非依存的に分子内ライゲーション又は環状化できる鋳型非依存性又は非相同性の核酸リガーゼ（例えば、ＲＮＡリガーゼ分子の大部分がアデニル化されているファージＴＳ２１２６耐熱性ＲＮＡリガーゼ）；
トランスポザーゼにより触媒される標的ＤＮＡへの転移鎖の挿入により５’タグ化ＤＮＡ断片（例えば図２）が生成される条件下で、そのために十分な時間、標的ＤＮＡをトランスポザーゼ及びトランスポゾン末端組成物とインキュベートする工程；
５’タグ化ＤＮＡ断片を含む標的ＤＮＡを変性させて５’タグ化ｓｓＤＮＡ断片を得る工程；及び
５’タグ化ｓｓＤＮＡ断片が分子内でライゲーションされて、それぞれが標的ＤＮＡの一部の配列及びタグの配列を示すタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片のライブラリーが生成される条件下で、そのために十分な時間、５’タグ化ｓｓＤＮＡ断片を核酸リガーゼとインキュベートする工程；
を含む、方法である。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、ライゲーションステップの前に、方法は更に、転位反応でタグ化されなかった標的ＤＮＡの除去及び／又は標的ＤＮＡに連結されていないトランスポゾン末端組成物要素の除去のための１又は複数のステップを含む。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、方法は更に、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片を含むライブラリーをエキソヌクレアーゼＩで処理してライゲーションされていない直鎖ｓｓＤＮＡを除去する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は更に、反応混合物をエキソヌクレアーゼＩ及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社製）で処理してライゲーションされていない直鎖ｓｓＤＮＡを除去するステップを含む。エキソヌクレアーゼＩＩＩは、分子内又は分子間のアニーリングにより生じた直鎖ｓｓＤＮＡ分子の二本鎖領域を消化することで直鎖ｓｓＤＮＡの一部を除去するのに役立つ。いくつかの好ましい実施形態では、方法は更に、グ化環状ｓｓＤＮＡ断片のライブラリーをＴ５エキソヌクレアーゼ（ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社製）で処理してライゲーションされていない直鎖ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡ（例えば、ニックの入った及び／又は一本鎖領域を含むＤＮＡ断片）を除去する工程を含む。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、方法は更に、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片を転写により増幅する工程を含み、方法は、（ａ）センスプロモーター配列に、相補的アンチセンスプロモーター配列を示すオリゴデオキシリボヌクレオチドをアニーリングさせるか、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片に、それに相補的なプライマーをアニーリングさせて、二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが合成される条件下でＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマーを伸張させる工程；及び（ｂ）ＲＮＡが合成される条件下で、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに結合するＲＮＡポリメラーゼとｄｓＤＮＡ産物をインキュベートする工程、を含む。
【０２６３】
転移鎖又はＰＣＲプライマーがＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を示すいくつかの好ましい実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターはＴ７型ＲＮＡポリメラーゼプロモーターであり、方法は更に、プロモーターを認識するＴ７型ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロでタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片を転写するステップを含む。最も好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼ及びプロモーターは、Ｔ７  ＲＮＡＰ、Ｔ３  ＲＮＡＰ、及びＳＰ６  ＲＮＡＰ、並びに対応する同じ系統のプロモーターから選択される。しかし、本発明の方法の転写ステップでは、特異性の高い転写を可能にする好適なプロモーター配列が知られている又は得ることができる任意のＲＮＡＰを使用することができる。インビトロ転写用のキット及び酵素は多くの供給業者から市販されており、インビトロ転写を含む本発明のステップを行うための適切な反応混合物及び条件には、メーカーが記載するようにこれらの製品を使用することができる。例えば、Ｔ７  ＲＮＡＰを用いたインビトロ転写は、ウィスコンシン州マディソンエピセンターバイオテクノロジーズ社のＡＭＰＬＩＳＣＲＩＢＥ（商標）Ｔ７−ＦＬＡＳＨ（商標）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ又はＡＭＰＬＩＳＣＲＩＢＥ（商標）Ｔ７  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔを製品の関連文書に記載されているように用いて行うことができる。同様に、本発明の方法でインビトロ転写にＴ３  ＲＮＡＰ又はＳＰ６  ＲＮＡＰを用いる場合はそれぞれ、ＡＭＰＬＩＳＣＲＩＢＥ（商標）Ｔ３−ＦＬＡＳＨ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ又はＡＭＰＬＩＳＣＲＩＢＥ（商標）ＳＰ６  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社製）を記載通りに用いることができる。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、転移鎖、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチド、又はＰＣＲプライマーは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列に加えて、翻訳のための更なる配列を示し、そのような更なる配列としては、例えば、限定されるものではないが、リボソーム結合部位及び翻訳開始コドン（「翻訳開始シグナル」ともいう）が挙げられ、方法は更に、転写されたＲＮＡの翻訳を含む。これらの実施形態のいくつかでは、方法は更に、得られたＲＮＡ転写産物のインビトロ翻訳ステップを含む。ＲＮＡ転写産物をインビトロで翻訳するための系及びキットも多くの供給業者から市販されており、これらも本発明に使用することができる。例えば、ウィスコンシン州マディソンのプロメガ社のウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽抽出液、大腸菌Ｓ３０抽出液の系を本発明に使用することができる。更に、プロメガ社のＴＮＴ（登録商標）Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ等のインビトロ転写及びインビトロ翻訳を組み合わせたキットも市販されており、使用することができる
【０２６５】
いくつかの別の実施形態では、方法は更に、ＤＮＡポリメラーゼ及びタグに相補的な少なくとも１つのプライマーを用いてタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片中の標的ＤＮＡを増幅及び／又はシークエンシングするステップを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼを用いてタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片を増幅するステップはローリングサークル複製を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼを用いてタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片を増幅するステップは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、タグの少なくとも一部に相補的な第１のＰＣＲプライマーと、タグの相補体の少なくとも一部に相補的な第２のＰＣＲプライマーとを用いるＰＣＲ増幅を含む。いくつかの実施形態では、方法は更に、ＲＮＡポリメラーゼを用いてタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片を増幅するステップを含む。
【０２６６】
したがって、いくつかの別の実施形態では、方法は更に、ローリングサークル複製（ＲＣＲ）によりタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片を増幅する工程を含み、方法は、（ａ）タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片に相補的なプライマーをアニーリングさせる工程；及び（ｂ）タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片にアニーリングしたプライマーを鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ又はｒＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼの大きな断片（エピセンター社製）又はＤＩＳＰＬＡＣＥＡＣＥ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（エピセンター社製）を用いて伸張させる工程、を含む。これらの実施形態では、ＲＣＲ増幅産物は、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片に相補的なコンカテマーｓｓＤＮＡ分子である。タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片がアンチセンスプロモーター配列を示すいくつかの実施形態では、コンカテマーＲＣＲ増幅産物はセンスプロモーター配列を示し、方法は更に、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター二本鎖を作る工程を含む（例えば、センスプロモーター配列に、アンチセンスプロモーター配列を示す相補的オリゴデオキシリボヌクレオチドをアニーリングさせ、次いで、二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに結合してそこから転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを用いてコンカテマーＤＮＡを転写する。
【０２６７】
いくつかの好ましい実施形態では、トランスポゾン末端組成物は、転移トランスポゾン末端配列のみを示す転移鎖を含み、したがって、タグは転移トランスポゾン末端配列のみを示す。いくつかの別の実施形態では、トランスポゾン末端組成物は、３’部分及び５’部分を含む又はからなる転移鎖を含み、３’部分は転移トランスポゾン末端配列を示し、５’部分は任意のその他の所望の配列を示し、そのような実施形態では、タグは３’部分及び５’部分の両方を含む又はからなる。トランスポゾン末端組成物が３’部分及び５’部分を含む又はからなる転移鎖を含むいくつかの実施形態では、非転移鎖は転移鎖の５’部分に相補的な配列を示す。しかし、トランスポゾン末端組成物のいくつかの好ましい実施形態では、非転移鎖は転移鎖の５’部分に相補的な配列を示さない。いくつかの好ましい実施形態では、非転移鎖は非転移トランスポゾン末端配列のみを示す。いくつかの好ましい実施形態では、非転移鎖は、転移鎖に相補的でない配列を非転移トランスポゾン末端配列の３’に示す。
【０２６８】
トランスポゾン末端組成物が５’部分及び３’部分を含む又はからなる転移鎖を含む方法のいずれかのいくつかの実施形態では、５’部分はシークエンシングタグドメイン又は捕捉タグドメインの配列を示し（例えば、ロシュ社の４５４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ  Ｓｙｓｔｅｍ用のシークエンシングタグドメイン又は捕捉タグドメイン、例えば、ロシュ社の４５４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ  Ｓｙｓｔｅｍを用いたシークエンシングにロシュ社の４５４Ａ及び４５４Ｂタグを使用する）、３’部分は転移トランスポゾン末端配列を示す。したがって、トランスポゾン末端組成物がシークエンシングタグドメイン又は捕捉タグドメインを有する転移鎖を含む場合、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片はシークエンシングタグドメイン又は捕捉タグドメインを含むタグ（例えば、ロシュ社の４５４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ  Ｓｙｓｔｅｍを用いたシークエンシングに使用されるロシュ社の４５４Ａ又は４５４Ｂタグ）を有する。所望のサイズ範囲を有するように作製したタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片を、ロシュ社の４５４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ  Ｓｙｓｔｅｍを用いた次世代シークエンシングの鋳型として使用する。別の実施形態では、（例えば、ロシュ社の４５４シークエンシング・プラットフォーム、イルミナ（商標）社のＳＯＬＥＸＡ（商標）シークエンシング・プラットフォーム、ライフテクノロジーズ／アプライドバイオシステムズ社のＳＯＬＩＤ（商標）シークエンシング・プラットフォーム、パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシング・プラットフォーム、ポロネイターポロニー社のシークエンシング・プラットフォーム、コンプリート・ゲノミクス社のシークエンシング・プラットフォーム、インテリジェント・バイオシステムズ社のシークエンシング・プラットフォーム、又はヘリコス社のシークエンシング・プラットフォームを用いた）シークエンシングに用いるための１又は複数の制限部位ドメイン、シークエンシングタグドメイン、捕捉タグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン及び／又はアドレスタグドメインを含むタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片を作製する。
【０２６９】
転移鎖の５’部分中又は非転移鎖の３’部分中の１又は複数の更なる配列にどのような更なる配列を用いるかは限定されず、そのような配列は任意の所望の目的を達成するために使用され得る。いくつかの実施形態では、転移鎖の５’部分又は非転移鎖の３’部分は１又は複数のタグドメイン配列を示す。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、方法は更に、転位反応で作製した５’タグ化ＤＮＡ断片を含む転移鎖を、鎖置換活性及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、エピセンター社製）を用いて伸張し、次いで、鋳型依存性ＤＮＡリガーゼ（例えば、大腸菌ＤＮＡリガーゼ）を用いて、各ＤＮＡ伸張産物の３’末端を、逆鎖をライゲーション鋳型として用いて、タグ化ＤＮＡ断片を含む非転移鎖の５’末端にライゲーションさせるステップ、を含み、これらの実施形態では、トランスポゾン末端組成物の非転移鎖の５’末端は５’モノリン酸基を有する。この方法の実施形態ではジタグ化ｓｓＤＮＡ断片が作製される。
【０２７１】
本発明の実施形態の開発中に続けられた研究により、転位がｄｓＤＮＡ中に起こることが観察された。したがって、いくつかの好ましい実施形態では、トランスポゾン末端組成物は、転移鎖の５’部分が一本鎖になるように、非転移トランスポゾン末端配列のみを示す非転移鎖を含む又はからなる（例えば、インビトロ転位反応中に自身の二本鎖部分中に転移鎖が挿入される確率又は頻度を最小限に抑えるため）。非転移鎖が転移鎖の５’部分に相補的な３’部分を示すいくつかの好ましい実施形態では、インビトロ転位反応中に自身に転移鎖が挿入される確率又は頻度を最小限に抑えるために、転移鎖の５’部分のサイズが最小限に抑えられている。例えば、いくつかの実施形態では、転移鎖の５’部分のサイズ（及び非転移鎖の相補的３’部分のサイズ）は約１５０ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、約７５ヌクレオチド未満、約５０ヌクレオチド未満、約２５ヌクレオチド未満、又は約１５ヌクレオチド未満である。
【０２７２】
いくつかの好ましい実施形態では、トランスポゾン末端組成物の転移鎖の５’末端は５’モノリン酸基を有する。いくつかの好ましい実施形態では、非転移鎖の５’末端は５’モノリン酸基を有する。いくつかの好ましい実施形態では、転移鎖及び非転移鎖の両方が５’モノリン酸基を有する。転移鎖が５’モノリン酸基を有さない実施形態では、方法は更に、方法のライゲーションステップの前に、転移トランスポゾン末端オリゴヌクレオチドの５’末端を（例えばポリヌクレオチドキナーゼ；例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて）リン酸化するステップを含む。
【０２７３】
トランスポザーゼにより触媒される標的ＤＮＡへのトランスポゾン末端の挿入により、標的ＤＮＡの一方の鎖の５’末端に転移トランスポゾン末端が連結され、転移トランスポゾン末端配列が標的ＤＮＡに連結された部位でその鎖が切断又は断片化され、それに伴い、標的ＤＮＡの逆鎖中に９塩基のギャップ領域ができることにより、標的ＤＮＡに転移トランスポゾン末端が連結した部位の３’に９塩基の一本鎖標的ＤＮＡ領域が生じる。例えば、図１は、標的ＤＮＡの逆鎖中に転移トランスポゾン末端が２つ独立して挿入された結果を示している。図２に示すように、標的ＤＮＡの逆鎖への独立した転移トランスポゾン末端の挿入が、標的ＤＮＡ中の比較的近接した位置で起こることがあり、これにより２つの５’タグ化ＤＮＡ断片が生じる。変性後、２つの５’タグ化ｓｓＤＮＡ断片が遊離される。
【０２７４】
５’タグ化ｓｓＤＮＡ断片の鋳型非依存性ライゲーション
いくつかの実施形態では、５’タグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片を環状化する本発明の方法において、（例えば、３’ヒドロキシル基及び５’モノリン酸基を有するｓｓＤＮＡの分子内ライゲーション、すなわち、環状化を行う）鋳型非依存性又は非相同性核酸リガーゼが用いられる。いくつかの好ましい実施形態では、核酸リガーゼは耐熱性ＲＮＡリガーゼである（例えば、バクテリオファージＴＳ２１２６耐熱性ＲＮＡリガーゼ（米国特許第７，３０３，９０１号及びBlondal et al, Nucleic Acids Res 33: 135-142, 2005）、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）  ｓｓＤＮＡリガーゼ（米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社製）、及び古細菌ＲＮＡリガーゼ（例えば、高温メタン生成菌ＲＮＡリガーゼ１又は「ＭｔｈＲｎｌ」；Torchia, C et al., Nucleic Acids Res. 36:6218-6227, 2008）から選択される。「鋳型非依存性リガーゼ」又は「非相同性リガーゼ」とは、連結又はライゲーションすべきｓｓＤＮＡの末端に相補的配列をアニーリングさせずにｓｓＤＮＡのライゲーションを行う（すなわち、ライゲーションステップ中、２つの末端を互いに隣接させておくために２つの末端が相補的配列にアニーリングされない）リガーゼを意味する。これらの実施形態では、方法は、５’タグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片を核酸リガーゼとインキュベートすることによりインビトロ転位反応で生成したアニーリングされた５’タグ化ＤＮＡ断片を変性させるステップを含む。「分子内ライゲーション」とは、他のＤＮＡ分子の末端とライゲーションさせるのではなく、１つのｓｓＤＮＡの２つの末端を互いにライゲーションさせて環状ｓｓＤＮＡ断片を作製することを意味する。
【０２７５】
いくつかの好ましい実施形態では、「改善されたライゲーション反応混合物」中で非相同性ライゲーション反応が行われる。本明細書において「改善されたライゲーション反応混合物」とは、ａ）タグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片；ｂ）ｐＨを維持するバッファー；ｂ）Ｍｎ２＋陽イオン；及び（ｃ）耐熱性ＲＮＡリガーゼ分子大部分がアデニル化されている耐熱性ＲＮＡリガーゼ分子の組成物；を含み、アデニル化されている耐熱性ＲＮＡリガーゼ分子の濃度が少なくとも直鎖ｓｓＤＮＡ断片のモル濃度と等しく、ＡＴＰ又はＭｇ２＋陽イオンがライゲーション反応混合物に添加されていない、ライゲーション反応混合物を意味する。
【０２７６】
「耐熱性ＲＮＡリガーゼ分子の大部分がアデニル化されている」という記述は、改善されたライゲーション反応混合物中の全耐熱性ＲＮＡリガーゼ分子の少なくとも約５０％がアデニル化されていることを意味する。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施形態では、全耐熱性ＲＮＡリガーゼ分子の約６０％超がアデニル化されている。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施形態では、全耐熱性ＲＮＡリガーゼ分子の約７０％超がアデニル化されている。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施形態では、全耐熱性ＲＮＡリガーゼ分子の約８０％超がアデニル化されている。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの好ましい実施形態では、全耐熱性ＲＮＡリガーゼ分子の約９０％超がアデニル化されている。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの好ましい実施形態では、全耐熱性ＲＮＡリガーゼ分子の約９５％超がアデニル化されている。いくつかの好ましい実施形態では、耐熱性ＲＮＡリガーゼ分子の大部分がアデニル化されている組成物を作製するために、精製プロセスの間又は後に、耐熱性ＲＮＡリガーゼをＡＴＰとインキュベートすることでアデニル化する。例えば、耐熱性ＲＮＡリガーゼのアデニル化に用いることができるプロトコールの１つは、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、及び０．５ｍＭ  ＡＴＰを含む溶液中で５０℃で１５分間、酵素をインキュベートし；次いで、ＥＤＴＡを終濃度５ｍＭとなるように添加することで反応を停止させ；次いで、透析又はゲル濾過により反応液の要素を除去することである。アデニル化された耐熱性ＲＮＡリガーゼの割合はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により評価することができる。いくつかの好ましい実施形態では、耐熱性ＲＮＡリガーゼ分子の大部分がアデニル化されている耐熱性ＲＮＡリガーゼはバクテリオファージＴＳ２１２６耐熱性ＲＮＡリガーゼである。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施形態では、バッファーはｐＨを６．５〜８．０に維持する。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの好ましい実施形態では、バッファーはｐＨを７．０〜８．０に維持する。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの好ましい実施形態では、ｐＨを７．０〜８．０に維持するバッファーはトリスバッファーである。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施形態では、Ｍｎ２＋陽イオンの濃度は０．５〜１０ｍＭである。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施形態では、Ｍｎ２＋陽イオンの濃度は１〜１０ｍＭである。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施形態では、Ｍｎ２＋陽イオンの濃度は１〜５ｍＭである。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの好ましい実施形態では、Ｍｎ２＋陽イオンの濃度は２．５ｍＭである。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの好ましい実施形態では、Ｍｎ２＋陽イオンはＭｎＣｌ２として提供される。いくつかの実施形態では、改善されたライゲーション反応混合物中のアデニル化されている耐熱性ＲＮＡリガーゼ分子の濃度は、直鎖ｓｓＤＮＡ断片のモル濃度の少なくとも２倍である。いくつかの実施���態では、改善されたライゲーション反応混合物中のアデニル化されている耐熱性ＲＮＡリガーゼ分子の濃度は直鎖ｓｓＤＮＡ断片のモル濃度の少なくとも５倍である。いくつかの実施形態では、改善されたライゲーション反応混合物中のアデニル化されている耐熱性ＲＮＡリガーゼ分子の濃度は、直鎖ｓｓＤＮＡ断片のモル濃度の少なくとも１０倍である。いくつかの好ましい実施形態では、改善されたライゲーション反応混合物は更に、塩化カリウム又は酢酸カリウム等の塩を含む（例えば約５０〜約１００ｍＭの濃度で）。いくつかの好ましい実施形態では、改善されたライゲーション反応混合物は更に、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の還元試薬を含む（例えば約０．５〜約１ｍＭの濃度で）。いくつかの実施形態では、改善されたライゲーション反応混合物は更に、両性トリメチルグリシン（ベタイン）を０．２５〜５．２Ｍの濃度で含む。いくつかの実施形態では、改善されたライゲーション反応混合物は更に、両性トリメチルグリシン（ベタイン）を０．５〜２Ｍの濃度で含む。いくつかの実施形態では、改善されたライゲーション反応混合物は更に、両性トリメチルグリシン（ベタイン）を約１Ｍの濃度で含む．
【０２７７】
いくつかの好ましい実施形態では、改善されたライゲーション反応混合物は、ａ）５’リン酸基及び３’ヒドロキシル基を有する直鎖ｓｓＤＮＡ断片（例えば、０．５マイクロモル）；ｂ）ｐＨ７．８の３３ｍＭ  トリス酢酸；ｂ）２．５ｍＭのＭｎ２＋陽イオン；及び（ｃ）耐熱性ＲＮＡリガーゼ分子の７０％超がアデニル化されている耐熱性ＲＮＡリガーゼ分子の組成物；を含み、アデニル化されている耐熱性ＲＮＡリガーゼ分子の濃度が、少なくとも直鎖ｓｓＤＮＡ断片のモル濃度と等しく（例えば０．５マイクロモルのタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片に対して約１マイクロモルのアデニル化された耐熱性ＲＮＡリガーゼ）、ライゲーション反応混合物にＡＴＰ又はＭｇ２＋陽イオンが添加されていない。いくつかの好ましい実施形態では、アデニル化されている耐熱性ＲＮＡリガーゼ分子の濃度は、直鎖ｓｓＤＮＡ断片のモル濃度の少なくとも５倍、少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍である（例えば、０．５マイクロモルのタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片に対して、約２．５マイクロモル、約５マイクロモル、又は約１０マイクロモルのアデニル化された耐熱性ＲＮＡリガーゼ）。いくつかの好ましい実施形態では、改善されたライゲーション反応混合物は６６ｍＭの酢酸カリウム及び０．５ｍＭのＤＴＴを更に含む。いくつかの好ましい実施形態では、改善されたライゲーション反応混合物は１Ｍのベタインを更に含む。
【０２７８】
方法のいくつかの好ましい実施形態では、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片を合成するための５’タグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片の分子内ライゲーションは、タグ化環状ｓｓＤＮＡ断片が合成されるようにライゲーション反応混合物中で約４０〜約７０℃の温度にて十分な時間（例えば約１〜約７２時間）行われる。いくつかの好ましい実施形態では、分子内ライゲーションは、環状ｓｓＤＮＡ断片合成されるように約６０℃の反応温度にて十分な時間行われる。
【０２７９】
本発明は本明細書に記載の特定の核酸リガーゼだけに限定されない。当業者には、本明細書に記載したのと同様な活性を有する、すなわち３’ヒドロキシル及び５’モノリン酸基を有するｓｓＤＮＡの非相同成分子内ライゲーションが得られる任意の核酸リガーゼを用いて分子内ライゲーションを行うことができることが理解されるであろう。
【０２８０】
Ｖ．ヘアピントランスポゾン末端のインビトロ転位によるｄｓＤＮＡの断片化及びタグ化（３０９６３）
簡潔には、いくつかの実施形態では、方法は、ｄｓＤＮＡである標的ＤＮＡをインビトロ転位反応中でトランスポザーゼ及びヘアピントランスポゾン末端組成物とインキュベートして標的ＤＮＡを同時に断片化及びタグ化することで５’タグ化ＤＮＡ断片の集合を含むライブラリーを作製する工程；次いで、標的ＤＮＡの一方の鎖の一部を含む各５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端を、相補的部分（例えば標的ＤＮＡの逆鎖）を含む別の５’タグ化ＤＮＡ断片の５’末端に連結することで、共有結合で閉じたタグ化環状ＤＮＡ断片（例えば一本鎖の環状又はダンベル型構造を示す）のライブラリーを作製する工程、を含む。いくつかの好ましい実施形態では、連結ステップは、５’→３’エキソヌクレアーゼ（構造依存性５’ヌクレアーゼを含む）活性及び鎖置換の活性を有さないＤＮＡポリメラーゼを用いて５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端を伸張して５’タグ化ＤＮＡ断片伸張産物を作製する工程及び鋳型依存性ＤＮＡリガーゼ（例えば、大腸菌ＤＮＡリガーゼ又は低温細菌若しくは低温バクテリオファージの鋳型依存性ＤＮＡリガーゼ）を用いて前記５’タグ化ＤＮＡ断片伸張産物のそれぞれの３’末端を相補的な５’タグ化ＤＮＡ断片伸張産物の５’末端にライゲーションする工程を含む。別の好ましい実施形態では、連結ステップは、インビトロ転位反応で生じた一本鎖ギャップを正確に埋める１又は複数の好適なサイズのランダム配列オリゴデオキシリボヌクレオチド（例えば、５’モノリン酸化又は５’アデニル化された、ランダム配列又は半ランダム配列オリゴデオキシリボヌクレオチド）（例えば、ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼを用いたインビトロ転位により生じる一本鎖ギャップを埋めるための、ランダム配列又は半ランダム配列の９マー又はランダム配列の４マー及びランダム配列の５マーを含む又はからなる５’モノリン酸化ランダム配列オリゴデオキシリボヌクレオチド）と鋳型依存性ＤＮＡリガーゼ（例えば、大腸菌ＤＮＡリガーゼ又は低温細菌若しくは低温バクテリオファージの鋳型依存性ＤＮＡリガーゼ）と、５’タグ化ＤＮＡ断片とを、ランダム配列オリゴヌクレオチドがアニーリングして５’タグ化ＤＮＡ断片中の一本鎖ギャップを埋めてライゲーションされる条件下でそのために十分な時間インキュベートすることでタグ化環状ＤＮＡ分子の集合を作製することを含む。
【０２８１】
したがって、本発明の好ましい実施形態の１つは、二本鎖標的ＤＮＡから、ＤＮＡシークエンシング又は核酸増幅反応の鋳型として用いるための、各タグ化環状ＤＮＡ断片が標的ＤＮＡの一部の両方の鎖の配列及びタグの配列を示すタグ化環状ＤＮＡ断片の集合を含むライブラリーを作製する方法であって、
以下の１〜５を提供する工程：
１．１又は複数の二本鎖（ｄｓＤＮＡ）分子を含む又はからなる標的ＤＮＡ（例えば、真核細胞に由来するゲノム、ミトコンドリア、葉緑体若しくはその他のｄｓＤＮＡ及び／又は原核細胞に由来するゲノム若しくはエピソームＤＮＡ、又は真核及び／若しくは原核細胞のＲＮＡを逆転写して第１のｃＤＮＡ鎖を作製した後、第１のｃＤＮＡ鎖にアニーリングさせたプライマーを伸張させることで調製した二本鎖ｃＤＮＡ）；
２．トランスポザーゼ（例えば野生型又は変異体のトランスポザーゼ；例えば野生型又は変異体のＴｎ５トランスポザーゼ、例えばＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ、例えばＨＹＰＥＲＭＵ（商標）ＭｕＡトランスポザーゼ、米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社製）；
３．転位反応中でトランスポザーゼと機能的複合体を形成でき且つタグの配列を示すヘアピントランスポゾン末端組成物であって、５’末端に非転移トランスポゾン末端配列（例えば、本明細書では、ＥＺ−Ｔｎ５（商標）の非転移トランスポゾン末端配列に関して「ＭＥＮＴＳ」と呼ぶ）、３’末端に転移トランスポゾン末端配列（例えば、本明細書では、ＥＺ−Ｔｎ５（商標）の転移トランスポゾン末端配列に関して「ＭＥＴＳ」と呼ぶ）、及び非転移トランスポゾン末端配列と転移トランスポゾン末端配列との間に分子内ステムループを形成できる十分な長さの介在配列（例えば、タグを付与するため等の任意の目的のためのもの）を示す５’リン酸含有オリゴヌクレオチドを含む又はからなり、ステムが、転位のための機能的な複合体をトランスポザーゼと形成する二本鎖トランスポゾン末端の配列を示し（例えば、ステムは、野生型又は変異体のＴｎ５トランスポザーゼにより認識される、例えばＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼにより認識される、１９ｂｐ外側末端（「ＯＥ」）トランスポゾン末端、１９ｂｐ内側末端（「ＩＥ」）トランスポゾン末端、又は１９ｂｐ「モザイク末端」（「ＭＥ」）トランスポゾン末端の配列を示す）（又は、例えばＭｕＡトランスポザーゼ用のＲ１及びＲ２ＭｕＡトランスポゾン末端）、ループが、任意配列であってよい介在配列を示す、ヘアピントランスポゾン末端組成物；
４．（ａ）５’ヌクレアーゼ活性（５’→３’エキソヌクレアーゼ活性及び構造依存性５’ヌクレアーゼ活性を含む）及び鎖置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ）；又は（ｂ）単独又は組み合わせた長さが、トランスポザーゼ及びヘアピントランスポゾン末端組成物を用いた転位反応後に生じる５’タグ化ＤＮＡ断片中の一本鎖ギャップと同じである、１又は複数のサイズのランダム配列オリゴヌクレオチド；
５．鋳型依存性リガーゼ（例えば、大腸菌ＤＮＡリガーゼ又は低温細菌若しくは低温バクテリオファージの鋳型依存性リガーゼ）；
標的ＤＮＡにヘアピントランスポゾン末端組成物が挿入されて５’タグ化ＤＮＡ断片の集合が生成される条件下で、そのために十分な時間、インビトロ転位反応中で標的ＤＮＡをトランスポザーゼ及びヘアピントランスポゾン末端組成物とインキュベートする工程（例えば、図２及び図３参照）；
ＤＮＡ断片中の一本鎖ギャップが埋められ且つ各５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端が伸張されて標的ＤＮＡの相補的部分を含む別の５’タグ化ＤＮＡ断片の５’末端に連結される条件下でそのために十分な時間５’タグ化ＤＮＡ断片をインキュベートすることで、タグ化環状ＤＮＡ断片のそれぞれが標的ＤＮＡの一部の両方の鎖の配列及びタグの配列を示すタグ化環状ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する工程；
を含む、方法である。
【０２８２】
（図７及び８に図示するように）方法のいくつかの好ましい実施形態では、連結ステップは、（１）各５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端が伸張されて５’タグ化ＤＮＡ断片伸張産物の集合が生成される条件下で、５’タグ化ＤＮＡ断片を５’ヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼとインキュベートする工程；及び（２）５’タグ化ＤＮＡ断片伸張産物がライゲーションされる条件下でそのために十分な時間５’タグ化ＤＮＡ断片伸張産物を鋳型依存性リガーゼとインキュベートすることでタグ化環状ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する工程、を含む。いくつかの実施形態では、混合物中に５’ヌクレアーゼ活性及び鎖置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼ及び鋳型依存性リガーゼが提供され、連結ステップは１つの反応混合物中で行われる。
【０２８３】
方法のいくつかのその他の好ましい実施形態では、連結ステップは、ランダム配列オリゴヌクレオチドが５’タグ化ＤＮＡ断片中の一本鎖ギャップ領域にアニーリングしてギャップを埋め且つ前記アニーリングしたランダム配列オリゴヌクレオチドが互いに又は５’タグ化ＤＮＡ断片の隣接する末端にライゲーションされる条件下で、そのために十分な時間、５’タグ化ＤＮＡ断片を１又は複数のサイズのランダム配列オリゴヌクレオチド及び鋳型依存性リガーゼとインキュベートすることで、タグ化環状ＤＮＡ断片を作製する工程、を含む。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、方法は更に、ライゲーションステップ後に、ランダム配列オリゴヌクレオチド、直鎖標的ＤＮＡ、及び／又は標的ＤＮＡに連結されていないヘアピントランスポゾン末端組成物を除去するための１又は複数のステップを含む。
【０２８５】
いくつかの好ましい実施形態では、方法は更に、タグ化環状ＤＮＡ断片を含む反応混合物をＴ５エキソヌクレアーゼ（ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社製）で処理してライゲーションされていない直鎖のｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡ（例えば、ニックの入った及び／又は一本鎖領域を含むＤＮＡ断片）を除去する工程を含む。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、方法は更に、各ループ構造中でタグ化環状ＤＮＡ断片を切断して、ＤＮＡ断片の各鎖が５’末端にタグの一部を有し且つ３’末端にタグの一部を有する直鎖二本鎖ＤＮＡ断片を作製する工程を含む（本明細書ではこの直鎖ＤＮＡ断片を「扇形ジタグ化直鎖ｄｓＤＮＡ断片」又は「扇形ｄｓＤＮＡ断片」と呼ぶ）。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、切断方法は、タグ内の制限部位にアニーリングするオリゴデオキシリボヌクレオチドをタグ化環状ＤＮＡ断片にアニーリングさせる工程；次いで、二本鎖制限部位を切断する制限エンドヌクレアーゼとインキュベートして扇形ｄｓＤＮＡ断片を作製する工程、を含む。
【０２８８】
いくつかの別の実施形態では、ヘアピントランスポゾン末端組成物は、（例えばループ構造内に）切断酵素組成物を用いて切断可能な１又は複数の切断可能部位（例えば、大腸菌エンドヌクレアーゼＩＩＩ又はエンドヌクレアーゼＩＶ等のＡＰエンドヌクレアーゼ及びウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを含む切断酵素組成物を用いて切断可能なｄＵＭＰ残基からなる切断可能部位；又あるい、例えば大腸菌エンドヌクレアーゼＩＩＩ又はエンドヌクレアーゼＩＶ等のＡＰエンドヌクレアーゼ±ＦＰＧタンパク質を含む切断酵素組成物を用いて切断可能な８−オキソ−グアニン−２’−デオキシリボヌクレオシド−モノリン酸残基からなる切断可能部位）を有し、切断方法は、タグ化環状ＤＮＡ断片が切断可能部位で切断されて扇形ｄｓＤＮＡ断片が生成される条件下で、そのために十分な時間、タグ化環状ＤＮＡ断片を切断酵素組成物とインキュベートする工程を含む。方法のいくつかの実施形態では、切断可能部位を付与するために種なる非標準的ヌクレオチドが使用され、切断酵素組成物中に種なるＮ−グリコシラーゼが使用される。ヘアピントランスポゾン末端組成物は、ライブラリー中のタグ化環状ＤＮＡ断片の切断を所望する１又は複数の部位（例えば、タグ化環状ＤＮＡ断片の切断が所望される部位は、タグ化環状ＤＮＡ断片に挿入されるヘアピントランスポゾン末端組成物のループ構造内である）に標準的ヌクレオチドの代わりに非標準的ヌクレオチド（例えば、切断酵素組成物の成分としてウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを用いる場合には、ＴＭＰの代わりに非標準的ヌクレオチドとしてｄＵＭＰ、あるいは、例えば、切断酵素組成物の成分としてＦＰＧタンパク質を用いる場合には、ＧＭＰの代わりに非標準的ヌクレオチドとして８−オキソ−ＧＭＰ）からなる切断可能部位を含むように合成される（例えばオリゴヌクレオチド合成機を用いる）。
【０２８９】
したがって、トランスポゾン末端組成物が１又は複数の切断可能部位を有するいくつかの好ましい実施形態では、切断酵素組成物は、脱塩基部位又は脱ピリミジン塩基部位／脱プリン塩基（ＡＰ）部位を作出するためにＮ−グリコシラーゼ（又は「ＤＮＡグリコシラーゼ」）を用いる。本明細書に定義するように、「Ｎ−グリコシラーゼ」とは、ＤＮＡ中の非標準的核酸塩基と糖の間の結合の加水分解を触媒して脱塩基（ＡＰ）部位を形成する酵素である。そのような酵素は多くの種に存在する。大腸菌からの例としては、ウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）が挙げられ、これはウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）とも呼ばれる。ＵＮＧは、ＤＮＡ中の糖デオキシリボースからのウラシル塩基の切断を触媒する（Lindahl, Prog. Nucl. Acid Res. MoI. Biol. 22:135-192, 1979）が、遊離ｄＵＴＰ、遊離デオキシウリジン、又はＲＮＡからのウラシルの切断は触媒しない（Duncan, in The Enzymes, Boyer ed., pp. 565-586, 1981）。切断酵素として用いることができるＮ−グリコシラーゼのその他の例は、Ｄｅｍｐｌｅ  ａｎｄ  Ｈａｒｉｓｏｎ（Annu. Rev. Biochem. 63: 915-48, 1994）及びＤｕｎｃａｎ（"DNA Glycosylases," in The Enzymes, Boyer ed., p. 565-586, 1981）に記載されている。「Ｎ−グリコシラーゼ」又は「ＤＮＡ−グリコシラーゼ」では、酵素が正式にグリコシラーゼと呼ばれるかどうか、あるいは他の酵素活性と組み合わさったグリコシラーゼ活性を有するかどうかに関わらず、Ｎ−グリコシラーゼ活性を有する酵素を意味する。グリコシラーゼは、「グリコシダーゼ」と呼ばれることもあるので、本発明者らは、Ｎ−グリコシラーゼの定義にＮ−グリコシダーゼも含める。例えば、本明細書中で定義するように、ＦＰＧタンパク質もＮ−グリコシラーゼである。ＦＰＧタンパク質（ホルムアミドピリミジンＤＮＡ  Ｎ−グリコシラーゼ）は、８−ヒドロキシグアニン（生理学的ｐＨにおける好ましい６，８−ジケト互変異性体を指す７−ヒドロ−８−オキソグアニン又は８−オキソグアニンとしても知られる）（Tchou, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4690-4694, 1991）、それぞれ４，６−ジアミノ−５−ホルムアミドピリミジン及び２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−ホルムアミドピリミジンと命名されているアデニン又はグアニンのイミダゾール開環誘導体（Chetsanga, et al., Biochemistry 20: 5201-5207, 1981；及びBreimer, Nucl. Acids Res. 12: 6359-6367, 1984）、Ｎ７−メチルホルムアミドピリミジン、５−ヒドロキシウラシル及び５−ヒドロキシシトシン（Hatahet, et al., J. Biol. Chem. 269:18814-18820, 1994）等の多様な、しかし構造的に関連のある、修飾核酸塩基を認識し、ＤＮＡ中の修飾塩基とデオキシリボース−ホスホジエステル骨格の間のＮ−グリコシル連結の切断を触媒してＡＰ部位を生じさせる塩基除去修復酵素である。更に、ＦＰＧタンパク質はＡＰリアーゼ活性も有する。酵素のＡＰリアーゼ活性は、ベータ脱離反応、デルタ脱離反応を触媒し、ＤＮＡ中に１ヌクレオチドギャップを残す（Bailly, et al, Biochem. J. 261 : 707-713, 1989）。ＦＰＧタンパク質及び８−ヒドロキシグアニンＤＮＡグリコシラーゼは同一であることが示されている（Chung, MH et al., Mutation Research 254: 1-12, 1991）。メチレンブルーと可視光（Floyd, et al., Arch Biohem Biophys 273: 106-111, 1989）又はローズベンガルと紫外光（Friedmann and Brown, Nucleic Acids Research 5: 615-622, 1978）でＤＮＡを処理すると、ＦＰＧタンパク質で切断可能なグアニン特異的修飾が誘導される。その他の特異的Ｎ−グリコシラーゼが当業者に公知及び利用可能である。Ｎ−グリコシラーゼが本発明に適しているかどうかを決定するためには、まず非標準的ヌクレオチドをＤＮＡに取り込ませ、ＵＮＧタンパク質及びＦＰＧタンパク質によるそれぞれウラシル又は８−オキソ−グアニンの除去と同様に候補のＮ−グリコシラーゼで非標準的塩基が特異的に除去されるかどうかを調べる。脱塩基部位すなわちＡＰ部位の作製後、脱塩基部位の切断には当該技術分野で種々の方法が知られている。脱塩基部位でＤＮＡ分子を切断するために熱及び／又は塩基性条件を用いることができる。例えば、以下のプロトコールを用いることができる：非標準的塩基を除去した後の脱塩基（ＡＰ）部位を含む核酸を、アミン、例えば２５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ及び１〜５ｍＭのマグネシウムイオンを含むバッファー溶液中で１０〜３０分間、７０〜９５℃に加熱する。あるいは、以下の処置を用いてＤＮＡを脱塩基部位で切断してもよい：エタノール沈殿して真空乾燥させたＤＮＡに１．０Ｍのピペリジン塩基を添加する。次いで、溶液を９０℃で３０分間加熱し、凍結乾燥してピペリジンを除去する。いくつかの好ましい実施形態では、当該技術分野で公知の脱プリン塩基／脱ピリミジン塩基エンドヌクレアーゼ（ＡＰエンドヌクレアーゼ）を用いる酵素処理（Lindahl, Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. 22: 135-192, 1979；Demple and Harison Annu. Rev. Biochem. 63: 915-48, 1994）を用いてＤＮＡ高分子を脱塩基部位で切断してもよい。本明細書で定義するように、ＡＰエンドヌクレアーゼとは、脱塩基（ＡＰ）部位におけるＤＮＡの切断を触媒する任意の酵素である。そのような酵素は多くの種に存在する。大腸菌のＡＰエンドヌクレアーゼの例としては、限定されるものではないが、エンドヌクレアーゼＩＩＩ及びエンドヌクレアーゼＩＶが含まれる。また、カルシウムイオン存在下の大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩもＡＰエンドヌクレアーゼである。本発明に有用な酵素としては、それがどのように呼ばれているかに関わらず、ＡＰエンドヌクレアーゼ様の活性を有する任意の酵素が含まれる。
【０２９０】
いくつかの好ましい実施形態では、方法は更に、（例えば、ＤＮＡシークエンシング又はＤＮＡ増幅の鋳型として使用するために）扇形ｄｓＤＮＡ断片を変性させてジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片のライブラリーを作製する工程を含む。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、本方法を用いて作製したライブラリー中のタグ化環状ＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片を核酸増幅反応及び／又はＤＮＡシークエンシング反応のＤＮＡ鋳型として用いる。いくつかの実施形態では、方法は更に、タグ化環状ＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片中の標的ＤＮＡを増幅及び／又はシークエンシングするステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は更に、タグ化環状ＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片の増幅により得られた標的ＤＮＡに相補的なＤＮＡをシークエンシングするステップを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ及び（例えば合成によるシークエンシングのための）タグに相補的な少なくとも１つのプライマーを用いて、各タグ化環状ＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片中の標的ＤＮＡの少なくとも一部をシークエンシングする。いくつかの実施形態では、（例えばライゲーションによるシークエンシングのための）タグに相補的な少なくとも１つのオリゴデオキシリボヌクレオチドと、標的配列の一部にアニーリングする少なくとも１つ別のオリゴデオキシリボヌクレオチドと、をライゲーションする鋳型依存性リガーゼを用いて、各タグ化環状ＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片中の標的ＤＮＡの少なくとも一部をシークエンシングする。いくつかの実施形態では、（例えばハイブリダイゼーションによるシークエンシングのための）タグ及び標的配列部分にアニーリング又はハイブリダイズするオリゴデオキシリボヌクレオチドを各タグ化環状ＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片中の標的ＤＮＡの少なくとも一部にアニーリングさせることでシークエンシングする。いくつかの実施形態では、合成によるシークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング、又はハイブリダイゼーションによるシークエンシングにより、タグ化環状ＤＮＡ断片又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片に相補的なＤＮＡをシークエンシングする。
【０２９２】
例えば、いくつかの好ましい実施形態では、本発明のキット中に提供される又は本発明の方法で使用されるヘアピントランスポゾン末端組成物が示す転移トランスポゾン末端配列は、Ｔｎ５トランスポザーゼにより認識される転移トランスポゾン末端配列である。いくつかの好ましい実施形態では、転移トランスポゾン末端配列はＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ（米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社製）により認識される配列である。
【０２９３】
一般的に、本発明の方法でヘアピントランスポゾン末端組成物を用いて作製されたタグ化環状ＤＮＡ断片、扇形ｄｓＤＮＡ断片、及びジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片は、転移トランスポゾン末端配列及び非転移トランスポゾン末端配列の両方を示し、ヘアピントランスポゾン末端組成物の非相補的ループ部分を含む又はこれに由来する更なる配列を示す。したがって、いくつかの実施形態では、ヘアピントランスポゾン末端組成物は、転移トランスポゾン末端配列の５’及び非転移トランスポゾン末端配列の３’に１又は複数のその他のヌクレオチド配列を示し、この１又は複数のその他のヌクレオチド配列はタグによっても示される。したがって、トランスポゾン末端配列に加えて、ヘアピントランスポゾン末端組成物のタグは１又は複数のその他のタグ部分又はタグドメインを有し得る。
【０２９４】
ヘアピントランスポゾン末端組成物が１又は複数の制限部位ドメインをいくつかの実施形態では、方法は更に、タグ化環状ＤＮＡ断片の一本鎖制限部位に相補的なオリゴデオキシリボヌクレオチドをアニーリングさせ、次いで、制限部位を認識する制限エンドヌクレアーゼを用いてタグ化環状ＤＮＡ断片を制限部位で切断する工程を含む。したがって、いくつかの実施形態では、方法はタグ化環状ＤＮＡ断片を線状化して扇形ｄｓＤＮＡ断片を作製するか、変性後にジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片を作製する工程を含む。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、方法は更に、制限エンドヌクレアーゼで切断されたタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片を１又は複数のその他のＤＮＡ分子にライゲーションさせるステップを含む（例えばタグを連結するため）。
【０２９６】
したがって、いくつかの実施形態では、方法は更に、タグ化環状ＤＮＡ断片、扇形ｄｓＤＮＡ断片、又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片を転写により増幅する工程を含み、方法は、（ａ）センスプロモーター配列に、相補的アンチセンスプロモーター配列を示すオリゴデオキシリボヌクレオチドをアニーリングさせるか、タグ化環状ＤＮＡ断片、扇形ｄｓＤＮＡ断片、又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片に、それに相補的なプライマーをアニーリングさせて、二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むｄｓＤＮＡが合成される条件下で、ＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマーを伸張させる工程；及び（ｂ）ＲＮＡ合成条件下で、ｄｓＤＮＡ産物を、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに結合するＲＮＡポリメラーゼとインキュベートする工程、を含む。
【０２９７】
ヘアピントランスポゾン末端組成物又はＰＣＲプライマーがＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を示すいくつかの好ましい実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターはＴ７型ＲＮＡポリメラーゼプロモーターであり、方法は更に、プロモーターを認識するＴ７型ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロでタグ化環状ＤＮＡ断片を転写するステップを含む。最も好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼ及びプロモーターは、Ｔ７  ＲＮＡＰ、Ｔ３  ＲＮＡＰ、及びＳＰ６  ＲＮＡＰ並びに対応する同じ系統のプロモーターから選択される。しかし、本発明の方法の転写ステップには、特異性の高い転写が可能な好適なプロモーター配列が公知である又は得ることができる、任意のＲＮＡＰを使用することができる。インビトロ転写のためのキット及び酵素は多くの供給業者から市販されており、インビトロ転写を含む本発明のステップを行うための適切な反応混合物及び条件に、これらの製品をメーカーの記載通りに使用することができる。例えば、ウィスコンシン州マディソン、エピセンターバイオテクノロジーズ社製のＡＭＰＬＩＳＣＲＩＢＥ（商標）Ｔ７−ＦＬＡＳＨ（商標）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ又はＡＭＰＬＩＳＣＲＩＢＥ（商標）Ｔ７  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔを製品の関連文書に従って用いてＴ７  ＲＮＡＰを用いたインビトロ転写を行うことができる。同様に、本発明の方法でインビトロ転写にＴ３  ＲＮＡＰ又はＳＰ６  ＲＮＡＰを使用する場合はそれぞれＡＭＰＬＩＳＣＲＩＢＥ（商標）Ｔ３−ＦＬＡＳＨ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ又はＡＭＰＬＩＳＣＲＩＢＥ（商標）ＳＰ６  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社製）を記載通りに用いることができる。
【０２９８】
いくつかの別の実施形態では、方法は更に、ＤＮＡポリメラーゼ及びタグに相補的な少なくとも１つのプライマーを用いてタグ化環状ＤＮＡ断片中の標的ＤＮＡを増幅及び／又はシークエンシングするステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は更に、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを用いたローリングサークル複製によるタグ化環状ＤＮＡ断片の増幅を含む。いくつかの別の実施形態では、方法は更に、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、タグの少なくとも一部に相補的な第１のＰＣＲプライマーと、タグの相補体の少なくとも一部に相補的な第２のＰＣＲプライマーとを用いたＰＣＲによるタグ化環状ＤＮＡ断片の増幅を含む。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、方法は、ローリングサークル複製（ＲＣＲ）によるタグ化環状ＤＮＡ断片の増幅を更に含み、方法は、（ａ）タグ化環状ＤＮＡ断片に相補的なプライマーをアニーリングする工程；及び（ｂ）タグ化環状ＤＮＡ断片にアニーリングしたプライマーを鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼの大断片又はＤＩＳＰＬＡＣＥＡＣＥ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（エピセンター社製）を用いて伸張させる工程、を含む。これらの実施形態では、ＲＣＲ増幅産物はタグ化環状ＤＮＡ断片に相補的なコンカテマーｓｓＤＮＡ分子である。タグ化環状ＤＮＡ断片がアンチセンスプロモーター配列を示すいくつかの実施形態では、コンカテマーＲＣＲ増幅産物はセンスプロモーター配列を示し、方法は更に、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター二本鎖の形成を含む（例えば、センスプロモーター配列に、アンチセンスプロモーター配列を示す相補的オリゴデオキシリボヌクレオチドをアニーリングさせ、次いで、二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに結合してそこから転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを用いてコンカテマーＤＮＡを転写することによる。
【０３００】
いくつかの好ましい実施形態では、ヘアピントランスポゾン末端組成物のステム部分は転移及び非転移トランスポゾン末端配列のみを示し、ループは一本鎖である（例えば、インビトロ転位反応中に自身の二本鎖部分にヘアピントランスポゾン末端組成物が挿入される確率又は頻度を最小限に抑えるため）。いくつかの別の実施形態では、ヘアピントランスポゾン末端組成物のステム部分は、転移及び非転移トランスポゾン末端配列に加えて、転移トランスポゾン末端配列のすぐ５’側及び非転移トランスポゾン末端配列のすぐ３’側に更なる配列を示す。しかし、これらの実施形態では、ヘアピントランスポゾン末端組成物のステム部分中の更なる配列のサイズは、インビトロ転位反応中に自身にヘアピントランスポゾン末端組成物が挿入される確率又は頻度を最小限に抑えるために、最小限に抑えられている。例えば、いくつかの実施形態では、ヘアピントランスポゾン末端組成物中のステムの長さは約７５ヌクレオチド未満、約５０ヌクレオチド未満、又は約３０ヌクレオチド未満である。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、ヘアピントランスポゾン末端組成物のループ部分は、シークエンシングタグドメイン又は捕捉タグドメイン（例えば、ロシュ社の４５４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ  Ｓｙｓｔｅｍを用いたシークエンシングに用いられるロシュ社の４５４Ａ及び４５４Ｂタグのシークエンシングタグドメインの配列を示す、ロシュ社の４５４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ  Ｓｙｓｔｅｍ用のシークエンシングタグドメイン及び／又は捕捉タグドメイン）の配列を示す。ヘアピントランスポゾン末端組成物がシークエンシングタグドメイン又捕捉タグドメインを有するいくつかの実施形態では、タグ化環状ＤＮＡ断片、扇形ｄｓＤＮＡ断片、又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片は、シークエンシングタグドメイン及び／又は捕捉タグドメインを含むタグ（例えば、ロシュ社の４５４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ  Ｓｙｓｔｅｍを用いたシークエンシングに用いられるロシュ社の４５４Ａ又は４５４Ｂタグ）を有する。所望のサイズ範囲のタグ化環状ＤＮＡ断片、扇形ｄｓＤＮＡ断片、又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片を単離した後、これらをロシュ社製４５４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ  Ｓｙｓｔｅｍを用いた次世代シークエンシングの鋳型として用いる。別の実施形態では、作製したタグ化環状ＤＮＡ断片、扇形ｄｓＤＮＡ断片、又はジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片は、（例えば、ロシュ社の４５４シークエンシング・プラットフォーム、イルミナ（商標）社のＳＯＬＥＸＡ（商標）シークエンシング・プラットフォーム、ライフテクノロジーズ／アプライドバイオシステムズ社のＳＯＬＩＤ（商標）シークエンシング・プラットフォーム、パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシング・プラットフォーム、ポロネイターポロニー社のシークエンシング・プラットフォーム、コンプリート・ゲノミクス社のシークエンシング・プラットフォーム、インテリジェント・バイオシステムズ社のシークエンシング・プラットフォーム、又はヘリコス社のシークエンシング・プラットフォームを用いた）シークエンシングに使用するための１又は複数の制限部位ドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、捕捉タグドメイン、検出タグドメイン、及び／又はアドレスタグドメインを有する。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、ヘアピントランスポゾン末端組成物は１又は複数のタグドメイン配列を示し、これらの配列は、任意の所望の目的を達成するために使用され得る。ヘアピントランスポゾン末端組成物のループ部分中の１又は複数の更なる配列にどのような更なる配列を用いるかは限定されない。
【０３０３】
いくつかの好ましい実施形態では、ヘアピントランスポゾン末端組成物の５’末端は５’モノリン酸基を有する。ヘアピントランスポゾン末端組成物が５’モノリン酸基を有さない実施形態では、方法は更に、方法のライゲーションステップの前に、ヘアピントランスポゾン末端組成物の５’末端をリン酸化するステップを含む（例えばポリヌクレオチドキナーゼ；例えばＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いる）。
【０３０４】
トランスポザーゼにより触媒される標的へのトランスポゾン末端の挿入により、標的ＤＮＡの一方の鎖のヌクレオチドの５’位に転移トランスポゾン末端配列の３’末端が連結され、その結果、標的ＤＮＡに転移トランスポゾン末端配列が連結された部位でその鎖の切断又は断片化が起こり、それに伴い、標的ＤＮＡの逆鎖中の９塩基のギャップ領域ができることにより、標的ＤＮＡに転移トランスポゾン末端が連結した部位の３’に９塩基の一本鎖標的ＤＮＡ領域が生じる。例えば、図１６は、標的ＤＮＡ中にヘアピントランスポゾン末端組成物が２つ独立して挿入された際に起こり得る結果を示している。図１６に示すように、標的ＤＮＡの逆鎖への独立した転移トランスポゾン末端の挿入が標的ＤＮＡ中の複数の位置に起こることがあり、それにより、図１６に示すように２つの５’タグ化ＤＮＡ断片が生じる。連結後にタグ化環状ＤＮＡ断片が生成される。
【０３０５】
本発明は本明細書に記載の特定の核酸リガーゼのみに限定されない。当業者には、本明細書に記載した酵素と同様な活性を有する任意の鋳型依存性核酸リガーゼ並びに鋳型依存性ライゲーションにそのような酵素を用いる方法及び条件は当該技術分野で公知であり、容易に入手可能であることが理解されよう。
【実施例】
【０３０６】
本発明を以下に実施例を用いて更に詳細に説明する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、説明のためだけに記載するものであると理解されるべきである。上記の説明及びこれらの実施形態から、当業者は本発明に必須な構成を確認することができ、その趣旨及び範囲から逸脱せずに本発明に種々の変更及び修正を行って種々の利用及び条件に適合させることができる。
【０３０７】
使用される標準的な分子生物学的技術は当該技術分野で周知であり、Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載されている。
【０３０８】
実施例で用いる定義、用語、及び略語
「ｐＭＥＴＳ」とは、ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポゾン末端配列を示す１９塩基の５’リン酸含有一本鎖トランスポゾン末端オリゴヌクレオチドを指す。
５’ｐＡＧＡ ＴＧＴ ＧＴＡ ＴＡＡ ＧＡＧ ＡＣＡＧ ３’（配列番号１）
【０３０９】
「ＭＥＴＳ」とは、ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポゾン末端配列を示す１９塩基の一本鎖トランスポゾン末端オリゴヌクレオチドを指す。
５’ＡＧＡ ＴＧＴ ＧＴＡ ＴＡＡ ＧＡＧ ＡＣＡＧ３’（配列番号１）
【０３１０】
「ｐＭＥＮＴＳ」とは、ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポゾン末端配列を示す１９塩基の５’リン酸含有一本鎖トランスポゾン末端オリゴヌクレオチドを指す。
５’ｐＣＴＧ ＴＣＴ ＣＴＴ ＡＴＡ ＣＡＣ ＡＴＣＴ３’（配列番号２）
【０３１１】
「ｐＭＥＤＳ」とは、両方の５’末端がリン酸を含む１９塩基対の二本鎖ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポゾン末端を指す。
５’ｐＡＧＡ ＴＧＴ ＧＴＡ ＴＡＡ ＧＡＧ ＡＣＡＧ３’（配列番号１）
３’  ＴＣＴ ＡＣＡ ＣＡＴ ＡＴＴ ＣＴＣ ＴＧＴＣｐ５’（配列番号２）
【０３１２】
ｐＭＥＤＳ  ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポゾン末端は、ｐＭＥＴＳトランスポゾン末端オリゴヌクレオチドをｐＭＥＮＴＳトランスポゾン末端オリゴヌクレオチドにアニーリングさせることでが作製される。
【０３１３】
「ＭＥＤＳ」とは、非転移鎖（ｐＭＥＮＴＳ）だけが５’リン酸を含む、１９塩基対の二本鎖ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポゾン末端を指す。
５’ ＡＧＡ ＴＧＴ ＧＴＡ ＴＡＡ ＧＡＧ ＡＣＡＧ ３’（配列番号１）
３’ ＴＣＴ ＡＣＡ ＣＡＴ ＡＴＴ ＣＴＣ ＴＧＴＣｐ  ５’（配列番号２）
【０３１４】
ＭＥＤＳ  ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポゾン末端は、ＭＥＴＳトランスポゾン末端オリゴヌクレオチドをｐＭＥＮＴＳトランスポゾン末端オリゴヌクレオチドにアニーリングさせることで作製される。
【０３１５】
「ｐ４５４．１ＭＥＴＳ」とは、下線を引いた１９塩基のＥＺ−Ｔｎ５（商標）転移トランスポゾン末端配列（ｐＭＥＴＳ）の５’末端に以下の配列を示すロシュ社の４５４シークエンシングタグからなる５’部分が付加された３６塩基の５’リン酸含有一本鎖転移鎖を指す。
５’ｐＧＣＣ ＴＴＧ ＣＣＡ ＧＣＣ ＣＧＣ ＴＣＡ ＧＡＴ ＧＴＧ ＴＡＴ ＡＡＧ ＡＧＡ ＣＡＧ３’（配列番号４）
【０３１６】
ｐ４５４．１ＭＥＴＳ転移鎖（配列番号４）をｐＭＥＮＴＳ非転移鎖（配列番号：２）にアニーリングさせることで「ｐ４５４．１ＭＥＤＳ」ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポゾン末端組成物が作製される。
５’ｐＧＣＣ ＴＴＧ ＣＣＡ ＧＣＣ ＣＧＣ ＴＣＡ ＧＡＴ ＧＴＧ ＴＡＴ ＡＡＧ ＡＧＡ ＣＡＧ ３’
３’Ｔ ＣＴＡ ＣＡＣ ＡＴＡ ＴＴＣ ＴＣＴ ＧＴＣｐ５’
【０３１７】
「ｐｃ４５４．１」とは、ｐ４５４．１ＭＥＴＳの５’部分に相補的な次の配列を有する１８塩基の５’リン酸含有一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。
５’ｐＴＧＡ ＧＣＧ ＧＧＣ ＴＧＧ ＣＡＡ ＧＧＣ３’（配列番号５）
【０３１８】
「Ａ−ＭＥＴＳ」とは、下線を引いた１９塩基のＥＺ−Ｔｎ５（商標）転移トランスポゾン末端配列（ＭＥＴＳ）の５’末端に以下の配列を示すロシュ社の４５４シークエンシングタグからなる５’部分が付加された３８塩基の一本鎖転移鎖を指す。
５’ＧＣＣ ＴＣＣ ＣＴＣ ＧＣＧ ＣＣＡ ＴＣＡ ＧＡＧ ＡＴＧ ＴＧＴ ＡＴＡ ＡＧＡ ＧＡＣ ＡＧ３’（配列番号７）
【０３１９】
Ａ−ＭＥＴＳ転移鎖（配列番号：７）をｐＭＥＮＴＳ非転移鎖（配列番号：２）にアニーリングさせることで、「Ａ−ＭＥＤＳ」ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポゾン末端組成物が作製される。
５’ＧＣＣ ＴＣＣ ＣＴＣ ＧＣＧ ＣＣＡ ＴＣＡ ＧＡＧ ＡＴＧ ＴＧＴ ＡＴＡ ＡＧＡ ＧＡＣ ＡＧ３’
３’ＴＣ ＴＡＣ ＡＣＡ ＴＡＴ ＴＣＴ ＣＴＧ ＴＣｐ５’
【０３２０】
「Ｂ−ＭＥＴＳ」とは、下線を引いた１９塩基のＥＺ−Ｔｎ５（商標）転移トランスポゾン末端配列（ＭＥＴＳ）の５’末端に以下の配列を示すロシュ社の４５４シークエンシングタグからなる５’部分が付加された３８塩基の一本鎖転移鎖を指す。
５’ＧＣＣ ＴＴＧ ＣＣＡ ＧＣＣ ＣＧＣ ＴＣＡ ＧＡＧ ＡＴＧ ＴＧＴ ＡＴＡ ＡＧＡ ＧＡＣ ＡＧ３’（配列番号８）
【０３２１】
Ｂ−ＭＥＴＳ転移鎖（配列番号：８）をｐＭＥＮＴＳ非転移鎖（配列番号：２）にアニーリングさせることで「Ｂ−ＭＥＤＳ」ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポゾン末端組成物が作製される。
５’ＧＣＣ ＴＴＧ ＣＣＡ ＧＣＣ ＣＧＣ ＴＣＡ ＧＡＧ ＡＴＧ ＴＧＴ ＡＴＡ ＡＧＡ ＧＡＣ ＡＧ３’
３’ＴＣ ＴＡＣ ＡＣＡ ＴＡＴ ＴＣＴ ＣＴＧ ＴＣｐ５’
【０３２２】
「ＦＬＸ−Ａ」とは、以下の配列を示すロシュ社の４５４シークエンシングタグからなる１９塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。
５’ＧＣＣ ＴＣＣ ＣＴＣ ＧＣＧ ＣＣＡ ＴＣＡ Ｇ３’（配列番号９）
【０３２３】
「ＦＬＸ−Ｂ」とは、以下の配列を示すロシュ社の４５４シークエンシングタグからなる１９塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。
５’ＧＣＣ ＴＴＧ ＣＣＡ ＧＣＣ ＣＧＣ ＴＣＡ Ｇ３’（配列番号１０）
【０３２４】
「Ａ−ＭＩＤ２−ＭＥＴＳ」とは、下線を引いた１９塩基のＥＺ−Ｔｎ５（商標）転移トランスポゾン末端配列（ＭＥＴＳ）の５’末端に以下の配列を示すロシュ社の４５４シークエンシングタグ及びバーコード配列（ＭＩＤ２、イタリック体）からなる５’部分が付加された４８塩基の一本鎖転移鎖を指す。
５’ＧＣＣ ＴＣＣ ＣＴＣ ＧＣＧ ＣＣＡ ＴＣＡ Ｇ ＡＣＧＣＴＣＧＡＣＡ ＡＧ ＡＴＧ ＴＧＴ ＡＴＡ ＡＧＡ ＧＡＣ ＡＧ３’（配列番号１１）
【０３２５】
「Ｔｉ  Ａ−ＭＥＴＳ」とは、下線を引いた１９塩基のＥＺ−Ｔｎ５（商標）転移トランスポゾン末端配列（ＭＥＴＳ）の５’末端に以下の配列を示すロシュ社の４５４シークエンシングタグからなる５’部分が付加された４９塩基の一本鎖転移鎖を指す。
５’ＣＣＡ ＴＣＴ ＣＡＴ ＣＣＣ ＴＧＣ ＧＴＧ ＴＣＴ ＣＣＧ ＡＣＴ ＣＡＧ ＡＧＡ ＴＧＴ ＧＴＡ ＴＡＡ ＧＡＧ ＡＣＡ Ｇ３’（配列番号１２）
【０３２６】
「Ｔｉ  Ｂ−ＭＥＴＳ」とは、下線を引いた１９塩基のＥＺ−Ｔｎ５（商標）転移トランスポゾン末端配列（ＭＥＴＳ）の５’末端に以下の配列を示すロシュ社の４５４シークエンシングタグからなる５’部分が付加された４９塩基の一本鎖転移鎖を指す。
５’ＣＣＴ ＡＴＣ ＣＣＣ ＴＧＴ ＧＴＧ ＣＣＴ ＴＧＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＡＧ ＡＧＡ ＴＧＴ ＧＴＡ ＴＡＡ ＧＡＧ ＡＣＡ Ｇ３’（配列番号１３）
【０３２７】
「Ｔｉ  Ａ」とは、以下の配列を示すロシュ社の４５４シークエンシングタグからなる２６塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。
５’ＣＣＡ ＴＣＴ ＣＡＴ ＣＣＣ ＴＧＣ ＧＴＧ ＴＣＴ ＣＣＧ ＡＣ３’（配列番号１４）
【０３２８】
「Ｔｉ  Ｂ」とは、以下の配列を示すロシュ社の４５４シークエンシングタグからなる２６塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。
５’ＣＣＴ ＡＴＣ ＣＣＣ ＴＧＴ ＧＴＧ ＣＣＴ ＴＧＧ ＣＡＧ ＴＣ３’（配列番号１５）
【０３２９】
「ＢＰ１−Ａ」とは、ＦＬＸ−Ａ配列（以下に下線で示す）に以下の配列を示すイルミナ社のブリッジＰＣＲタグからなる５’部分が付加された４８塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。
５’ＡＡＴ ＧＡＴ ＡＣＧ ＧＣＧ ＡＣＣ ＡＣＣ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＡＣ ＡＣＧ ＣＣＴ ＣＣＣ ＴＣＧ ＣＧＣ ＣＡＴ ＣＡＧ３’（配列番号１６）
【０３３０】
「ＢＰ２−Ｂ」とは、ＦＬＸ−Ｂ配列（以下に下線で示す）に以下の配列を示すイルミナ社のブリッジＰＣＲタグからなる５’部分が付加された４９塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。
５’ ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＡＡ ＧＡＣ ＧＧＣ ＡＴＡ ＣＧＡ ＧＡＴ ＣＧＧ ＴＣＴ ＧＣＣ ＴＴＧ ＣＣＡ ＧＣＣ ＣＧＣ ＴＣＡ Ｇ３’（配列番号１７）
【０３３１】
「ＢＰ２−ＩＤ１−Ｂ」とは、ＦＬＸ−Ｂ配列（以下に下線で示す）に以下の配列を示すイルミナ社のブリッジＰＣＲタグ及びバーコード配列（ＩＤ２、イタリック体）からなる５’部分が付加された４９塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。
５’ ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＡＡ ＧＡＣ ＧＧＣ ＡＴＡ ＣＧＡ ＧＡＴ ＧＣＡＴＧＴ ＣＧＧ ＴＣＴ ＧＣＣ ＴＴＧ ＣＣＡ ＧＣＣ ＣＧＣ ＴＣＡ Ｇ３’（配列番号１８）
【０３３２】
「ＢＰ１」とは、以下の配列を示すイルミナ社のｂＰＣＲアダプタータグからなる２０塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。
５’ＡＡＴ ＧＡＴ ＡＣＧ ＧＣＧ ＡＣＣ ＡＣＣ ＧＡ３’（配列番号１９）
【０３３３】
「ＢＰ２」とは、以下の配列を示すイルミナ社のｂＰＣＲアダプタータグからなる２１塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。
５’ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＡＡ ＧＡＣ ＧＧＣ ＡＴＡ ＣＧＡ３’（配列番号２０）
【０３３４】
「ｐＭＥＴＳ−Ｎ−ＭＥＮＴＳ」とは、「（Ｎ）ｘ」で表される介在任意配列で連結されたＥＺ−Ｔｎ５（商標）非転移トランスポゾン末端配列及びＥＺ−Ｔｎ５（商標）転移トランスポゾン末端配列をそれぞれ５’末端及び３’末端に示す５’リン酸含有オリゴヌクレオチドを含む又はからなるヘアピントランスポゾン末端組成物を指す。ＭＥＴＳ配列及びＭＥＮＴＳ配列の間の介在配列は、ステムループ形成を可能にするのに十分な数のヌクレオチドからなる。
５’ＰＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ−（Ｎ）ｘ−ＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ３’（配列番号３）
【０３３５】
ｐＭＥＴＳ−Ｎ−ＭＥＮＴＳオリゴヌクレオチド内でｐＭＥＮＴＳ非転移トランスポゾン末端配列にｐＭＥＴＳ転移トランスポゾン末端配列が分子内アニーリングすることでヘアピンＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポゾン末端組成物が形成される。例えば、ｘ=６の場合；
ＮＮ
Ｎ    ＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ  ３’
Ｎ    ＴＣＴＡＣＡＣＡＴＡＴＴＣＴＣＴＧＴＣｐ５’（配列番号：３）
ＮＮ
【０３３６】
「ＴＳａｓｅ」とは、５０ｍＭ  トリスクロリド（ｐＨ７．５）、５０％グリセロール、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５００ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ｖ／ｖＮＰ−４０、０．５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ−２０中の高活性ＥＺ−Ｔｎ５（商標）Ｔｎ５トランスポザーゼ（米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社製）を指す。
【０３３７】
「トランスポソーム」とは、非共有結合的な複合体形成を支持する条件下で二本鎖トランスポゾンＤＮＡとプレインキュベートした高活性ＥＺ−Ｔｎ５（商標）  Ｔｎ５トランスポザーゼ（米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社製）を指す。二本鎖トランスポゾンＤＮＡは、限定されるものではないが、Ｔｎ５  ＤＮＡ、Ｔｎ５  ＤＮＡの一部、トランスポゾン末端組成物、トランスポゾン末端組成物の混合物、又は高活性ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼと相互作用することができるその他の二本鎖ＤＮＡからなってよい。
【０３３８】
１０Ｘ  ＴＡ反応バッファー：        ３３０ｍＭトリス酢酸、ｐＨ７．８
１００ｍＭ酢酸マグネシウム
６６０ｍＭ酢酸カリウム
５Ｘ  ＴＡ−ＤＭＦ反応バッファー：  １６５ｍＭトリス酢酸、ｐＨ７．８
５０ｍＭ酢酸マグネシウム
３３０ｍＭ酢酸カリウム
５０％ｖ／ｖジメチルホルムアミド
１０Ｘ  ＴＭｇＣｌ反応バッファー：  １００ｍＭトリスクロリド、ｐＨ８．０
５０ｍＭ塩化マグネシウム
５Ｘ  ＴＭｇＣｌ−ＤＭＦ反応バッファー：  ５０ｍＭトリスクロリド、ｐＨ８．０
２５ｍＭ塩化マグネシウム
５０％ｖ／ｖジメチルホルムアミド
１０Ｘ  ＴＭｇＡｃ反応バッファー：  １００ｍＭトリス酢酸、ｐＨ７．６
５０ｍＭ塩化マグネシウム
５Ｘ  ＴＭｇＡｃ−ＤＭＦ反応バッファー：  ５０ｍＭトリス酢酸、ｐＨ７．６
２５ｍＭ塩化マグネシウム
５０％ｖ／ｖジメチルホルムアミド
【０３３９】
「標的ＤＮＡ」とは、転位を受けるＤＮＡを指す。以下の実施例では、標的ＤＮＡとしてバクテリオファージＴ７Ｄ１１１のＤＮＡを使用する。
【０３４０】
「ＴＳａｓｅ」とは、高活性ＥＺ−Ｔｎ５（商標）Ｔｎ５トランスポザーゼ（米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社製）を指す。
【０３４１】
１０Ｘ  トランスポザーゼ反応バッファー：  ３３０ｍＭトリス酢酸、ｐＨ７．８
１００ｍＭ酢酸マグネシウム
６６０ｍＭ酢酸カリウム
【０３４２】
実施例１
ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ及びＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポゾン末端を用いたインビトロ転位を介したＤＮＡの断片化及び５’タグ化
以下の反応混合物を混合した。
【０３４３】
ｘ                  水で最終体積５０マイクロリットルに
５マイクロリットル  １０Ｘ  ＥＺ−Ｔｎ５（商標）転位バッファー
１マイクログラム    標的ＤＮＡ１〜４０マイクロリットル
２マイクロリットル  ｐＭＥＤＳ（２５マイクロモル）＊
２マイクロリットル  ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ（１０ユニット／マイクロリットル）
５０マイクロリットル
【０３４４】
＊いくつかの実施形態では、転移トランスポゾン末端配列の５’側の転移トランスポゾン末端５’部分にそれぞれが異なる任意配列を更に示す２つの異なるｐＭＥＤＳトランスポゾン末端（図４）。
【０３４５】
混合後、反応液を３７℃で１時間インキュベートした。１０マイクロリットルの停止溶液（１５％スクロース、６６ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．０）、０．１％ＳＤＳ、０．９％オレンジＧ［シグマ社製、Ｏ−７２５２］、及び１００マイクログラム／ｍｌのプロテイナーゼＫ）を用いて反応を停止し、混合し、５０℃で１０分間加熱した。
【０３４６】
ＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル電気泳動でＤＮＡを分析した。ＬＭＰアガロースを用いてＤＮＡをサイズで分けた。ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄで染色し、非ＵＶ光でＤＮＡを可視化した。ＬＭＰゲルのゲルスライスを７０℃で５分間インキュベートしてゲルを液化した。３７℃で５分後、１００分の１体積のＧｅｌａｓｅ（商標）アガロース消化溶液（エピセンターバイオテクノロジーズ社製）を添加した。反応液を混合し、３７℃で１時間インキュベートした。
【０３４７】
実施例３及び４で同等の量及び濃度のＥＺ−Ｔｎ５（商標）Ｔｎ５トランスポザーゼ及びトランスポゾン末端を用いた場合と同様な程度及び同様なサイズ範囲に標的ＤＮＡは断片化された。サイズ化手順後のＤＮＡを実施例２で５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端のタグ化に用いた。
【０３４８】
実施例２
種々のＥＺ−Ｔｎ５（商標）Ｔｎ５トランスポザーゼ濃度を用いた５’タグ化ＤＮＡ断片転位産物のサイズ範囲
濃度９０ユニット／マイクロリットルのＴｎ５高活性ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ（エピセンター社製）を終濃度４５、２２．５、１１．３、及び９ユニット／マイクロリットルに希釈した。各濃度の酵素２マイクロリットルを、１マイクログラムのファージＴ７Ｄ１１１標的ＤＮＡ（サイズ約３９Ｋｂｐ）及び１マイクロモルのｐＭＥＤＳトランスポゾン末端と共にＴＡバッファー中で反応混合物の最終体積５０マイクロリットルで３７℃にて１時間インキュベートした。
【０３４９】
１５％スクロース、６６ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１％ＳＤＳ、０．９％オレンジＧ、及び１００マイクログラム／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む停止溶液１０マイクロリットルを用いて反応を停止した。混合して５０℃で１０分間インキュベートした後、１０マイクロリットルずつ、ＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル上で、１００ボルトで１時間電気泳動にかけた。ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄで染色し、Ａ３４０透過光を用いて写真を撮った。
【０３５０】
反応混合物中の終濃度が約０．９ユニット／マイクロリットルのＴｎ５トランスポザーゼがファージＴ７Ｄ１１１標的ＤＮＡを最も断片化した。これより高濃度のＴｎ５トランスポザーゼは阻害的であり、より低い濃度では断片サイズの範囲が上方にシフトした。終濃度約０．９ユニット／マイクロリットルのＴｎ５トランスポザーゼでは、ファージＴ７Ｄ１１１標的ＤＮＡの大部分が、ゲル上でマーカーのバンドを基準に約１５０ｂｐ〜約１．５Ｋｂｐのサイズに泳動されるＤＮＡに断片化された。終濃度０．４５ユニット／マイクロリットルのＴｎ５トランスポザーゼでは、ファージＴ７Ｄ１１１標的ＤＮＡの大部分が、ゲル上でマーカーのバンドを基準に約４００ｂｐ〜約３．５Ｋｂｐのサイズに泳動されるＤＮＡに断片化された。
【０３５１】
実施例３
種々のｐＭＥＤＳトランスポゾン末端濃度を用いた５’タグ化ＤＮＡ断片転位産物のサイズ範囲
２５マイクロモルのｐＭＥＤＳトランスポゾン末端ストックをＴ１０Ｅ１バッファーで２倍、４倍、及び８倍に段階希釈した。次いで、２マイクロリットルの各トランスポゾン末端希釈物及びトランスポゾン末端を含まないバッファー対照を、１Ｘ  ＴＡバッファー、１マイクログラムのファージ７Ｄ１１１標的ＤＮＡ、及び０．４ユニット／マイクロリットルの高活性Ｔｎ５トランスポザーゼを含む５０マイクロリットルの反応液中で３７℃にて１時間インキュベートした。
【０３５２】
実施例２と同様に、反応を停止させ、試料を１％アガロースゲル電気泳動で分析した。
【０３５３】
反応混合物中のｐＭＥＤＳトランスポゾン末端の終濃度が０．２５マイクロモルになる２５μＭストックの４倍希釈は、標的ＤＮＡの断片化が良好であり、おそらく、ｐＭＥＤＳトランスポゾン末端の使用の観点から最も効率的であった。この濃度では、ファージＴ７Ｄ１１１標的ＤＮＡの大部分が、ゲル上でマーカーのバンドを基準に約４００ｂｐ〜約３．５Ｋｂｐのサイズに泳動されるＤＮＡに断片化された。０．５及び１マイクロモル濃度のｐＭＥＤＳトランスポゾン末端では、断片化されたＤＮＡのサイズは、約２００〜約３００ｂｐから約３Ｋｂｐとわずかに下方にシフトした。
【０３５４】
実施例４
種々のトランスポソーム濃度を用いた５’タグ化ＤＮＡ断片転位産物のサイズ範囲
１２．５μＭのＴＳａｓｅを１２．５μＭのＡ−ＭＥＤＳトランスポゾン末端組成物又は１２．５μＭのＢ−ＭＥＤＳトランスポゾン末端組成物と３７℃で６０分間プレインキュベートすることでそれぞれ「Ａ−ＭＥＤＳトランスポソーム」及び「Ｂ−ＭＥＤＳトランスポソーム」を形成した。Ａ−ＭＥＤＳ及びＢ−ＭＥＤＳトランスポソームを同じ比率で混合して「Ａ／Ｂトランスポソーム」を形成した。
【０３５５】
次いで、トランスポソームを、１２．５μＭで用いるか、ＴＳａｓｅ貯蔵バッファー（５０ｍＭトリスクロリド（ｐＨ７．５）、５０％グリセロール、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５００ｍＭ塩化ナトリウム、０．５ｖ／ｖ％ＮＰ−４０、０．５ｖ／ｖ％Ｔｗｅｅｎ−２０）で１０μＭ、７．５μＭ、５μＭ、２．５μＭ、若しくは１μＭに希釈した。
【０３５６】
Ａ／Ｂトランスポソームを用いて以下の反応液中で大腸菌ゲノムＤＮＡを５’タグ化及び断片化した。
【０３５７】
0005794572.tif 000002
【０３５８】
この反応液を５５℃で５分間インキュベートした。その後、５マイクロリットルの停止溶液（１５％スクロース、６６ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．０）、０．１％ＳＤＳ、０．９％オレンジＧ［シグマ社製、Ｏ−７２５２］、及び１００マイクログラム／ｍｌのプロテイナーゼＫ）を用いて反応を停止し、混合し、７０℃で１０分間加熱した。
【０３５９】
ＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを分析した。ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄでゲルを染色し、非ＵＶ光でＤＮＡを可視化した。
【０３６０】
１２．５μＭのトランスポソームストックの１２．５倍希釈まで、標的ＤＮＡ断片化の程度は添加したトランスポソームの量に比例する。高濃度のトランスポソームではＤＮＡ断片の大部分がゲル中で１０００ｂｐ未満のサイズに泳動された（図５、レーン３及び９）低濃度のトランスポソームでは、ＤＮＡ断片はゲル中で主に５００ｂｐ〜６０００ｂｐに泳動された（図５、レーン８及び１４）。ブロック矢印はゲル中の遊離のトランスポゾン末端組成物の泳動を表す。
【０３６１】
実施例５
ジメチルホルムアミド存在下で５５℃及び３７℃における標的ＤＮＡの断片化及び５’タグ化
標的ＤＮＡの断片化及び５’タグ化に対するジメチルホルムアミドの影響を調べるために、ＭＥトランスポソーム又はＡ／Ｂトランスポソームを用いて以下のようにＨｅＬａゲノムＤＮＡを断片化及びタグ化した
【０３６２】
１２．５μＭのＴＳａｓｅを１２．５μＭのＭＥＤＳトランスポゾン末端組成物と３７℃で６０分間プレインキュベートすることで「ＭＥトランスポソーム」を形成した。
【０３６３】
以下のように反応液を２つ（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）調製した。
【０３６４】
0005794572.tif 000003
【０３６５】
１２．５μＭのＴＳａｓｅを１２．５μＭのＡ−ＭＥＤＳトランスポゾン末端組成物又は１２．５μＭのＢ−ＭＥＤＳトランスポゾン末端組成物と３７℃で６０分間プレインキュベートすることでそれぞれ「Ａ−ＭＥＤＳトランスポソーム」及び「Ｂ−ＭＥＤＳトランスポソーム」を形成した。Ａ−ＭＥＤＳ及びＢ−ＭＥＤＳトランスポソームを同じ比率で混合して「Ａ／Ｂトランスポソーム」を形成した。
【０３６６】
以下のように反応液を２つ調製した。
【０３６７】
0005794572.tif 000004
【０３６８】
反応液を３７℃で５分間又は５５℃で５分間インキュベートした。５マイクロリットルの停止溶液（１５％スクロース、６６ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．０）、０．１％ＳＤＳ、０．９％オレンジＧ［シグマ社製、Ｏ−７２５２］、及び１００マイクログラム／ｍｌのプロテイナーゼＫ）を用いて反応を停止し、混合し、７０℃で１０分間加熱した。
【０３６９】
ＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを分析した。ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄでゲルを染色し、非ＵＶ光でＤＮＡを可視化した。
【０３７０】
ジメチルホルムアミドは、断片化及び５’タグ化反応の効率を向上させた。このことは反応産物ＭＷ分布の減少により判断される（図６、レーン４、６、８、１０、１３、１５、１７、及び１９をそれぞれレーン３、５、７、９、１２、１４、１６、及び１８と比較されたい）。同様にＴＭｇＣｌバッファー存在下での反応は、ＴＡ反応バッファー存在下の反応よりも効率的であった。最後に、５５℃での反応は３７℃での反応と比べて全体的な反応効率が向上されているようであった（図６、レーン４〜１０とレーン１２〜１９を比較されたい）。ブロック矢印はゲル中の遊離トランスポゾン末端組成物の泳動を表す。
【０３７１】
実施例６
ＭｕＡトランスポザーゼを用いた標的ＤＮＡの断片化タグ化
終濃度１ユニット／マイクロリットルのＨｙｐｅｒＭｕ（商標）  ＭｕＡトランスポザーゼ（エピセンター社製）、次いで、反応混合物１マイクロリットル当たり約０．０１〜約０．５マイクログラムタンパク質の一連の濃度のＭｕＡトランスポザーゼタンパク質を、ＭｕＡトランスポザーゼ反応バッファー（エピセンター社製）、１マイクログラムのファージＴ７Ｄ１１１標的ＤＮＡ、及び１マイクロモルのｐＲ１Ｒ２ＭｕＡトランスポゾン末端を含む５０マイクロリットルの反応液中で３７℃にて１時間インキュベートした。
【０３７２】
実施例３と同様に、反応を停止し、反応産物をアガロースゲル電気泳動により分析した。
【０３７３】
ファージＴ７Ｄ１１１標的ＤＮＡの断片化は、調べた全てのレベルのＭｕＡトランスポザーゼでＥＺ−Ｔｎ５（商標）Ｔｎ５トランスポザーゼを用いた場合に観察されたよりもはるかに少なかった。調べた最も高い濃度のＭｕＡトランスポザーゼでのみ非常に少量の断片化が観察された。したがって、ＭｕＡトランスポザーゼ及びｐＲ１Ｒ２  ＭｕＡトランスポゾン末端の使用は、ＥＺ−Ｔｎ５（商標）Ｔｎ５高活性トランスポザーゼ及びＥＺ−Ｔｎ５（商標）Ｔｎ５  ＭＥトランスポゾン末端よりも標的ＤＮＡの断片化及び５’タグ化の効率がはるかに低かった。
【０３７４】
実施例７
５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端のタグ化
Ａ．２つのプライマーによるＰＣＲ
転位により生成された５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端を転移トランスポゾン末端配列でタグ化するために、以下の反応を行う。
【０３７５】
２２マイクロリットル  ０．５〜１Ｋｂｐのサイズ選択された５’タグ化転位産物
２５マイクロリットル  ＦａｉｌＳａｆｅ（商標）ＰＣＲ  ＰｒｅＭｉｘ  Ｃ
１マイクロリットル  ＦａｉｌＳａｆｅ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（エピセンター社製）
２マイクロリットル  ２つの異なる転移トランスポゾン末端の５’部分のそれぞれに１つが相補的なそれぞれ５マイクロモルのＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー
５０マイクロリットル  全反応体積  
【０３７６】
ＦａｉｌＳａｆｅ  ＤＮＡポリメラーゼは鎖置換活性及び５’ヌクレアーゼ活性を有するので、反応液を７０℃で１０分間インキュベートすることで本方法の重合化を行い（３’ＤＮＡポリメラーゼ伸張ステップ）、５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片を作製する（図８）。
【０３７７】
次いで、反応液を９４℃で５分間インキュベートしてＤＮＡを変性させる。
【０３７８】
２つの異なる転移トランスポゾン末端の一方の５’部分にそれぞれが相補的な２種類のＰＣＲプライマーを用いて５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅することで５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片を増幅する。
【０３７９】
上記のＰＣＲ反応ミックスを以下のサイクル条件で２０サイクルのＰＣＲにかける。
９４℃、１０秒
５５℃、１０秒
７２℃、２分
【０３８０】
ゲル分析から、予想サイズ範囲（０．５〜１Ｋｂｐ）のＰＣＲ産物が産生されたことが示された。
【０３８１】
対照反応も行う。サイズ選択された転位産物をＰＣＲ前に熱変性し、３’ＤＮＡポリメラーゼ伸張ステップを行わない場合、０．５〜１ＫｂｐのＰＣＲ産物は生成されない。
【０３８２】
Ｂ．１種類のプライマーによるＰＣＲ
転位により生成された５’ＭＥタグ化断片の３’末端をＭＥ配列でタグ化するために以下の反応を行った。
【０３８３】
２３マイクロリットル  ０．５〜１Ｋｂｐのサイズ選択された５’タグ化転位産物
２５マイクロリットル  ＦａｉｌＳａｆｅ（商標）ＰＣＲ  ＰｒｅＭｉｘ  Ｃ
１マイクロリットル  ＦａｉｌＳａｆｅ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（エピセンター社製）
１マイクロリットル  ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーとして５マイクロモルのｐＭＥＴＳ
５０マイクロリットル    
【０３８４】
ＦａｉｌＳａｆｅ  ＤＮＡポリメラーゼは鎖置換活性及び５’ヌクレアーゼ活性を有するので、反応液を７０℃で１０分間インキュベートすることで方法を行い（３’ＤＮＡポリメラーゼ伸張ステップ）、５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片を作製した（図７）。
【０３８５】
次いで、反応液を９４℃で５分間インキュベートしてＤＮＡを変性させた。
【０３８６】
ｐＭＥＴを唯一のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーとして用いて５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅することで５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片を増幅した。上記のＰＣＲ反応ミックスを以下のサイクル条件で２０サイクルのＰＣＲにかけた。
９４℃、１０秒
５５℃、１０秒
７２℃、２分
【０３８７】
ゲル分析から、予想サイズ範囲（０．５〜１Ｋｂｐ）のＰＣＲ産物が産生されたことが示された。
【０３８８】
対照反応も行った。サイズ選択した転位産物をＰＣＲの前に熱変性し、３’ＤＮＡポリメラーゼ伸張ステップを行わなかった場合、０．５〜１ＫｂｐのＰＣＲ産物は生成しなかった。
【０３８９】
実施例８
ＤＮＡ断片ライブラリーの増幅及びディープシークエンシング
ライブラリー調製前に増幅することができる非選択的ＤＮＡ断片ライブラリーを作製するために、ＤＮＡ断片を作製し、「ＭＥトランスポソーム」を用いて３’末端及び５’末端でタグ化した。
【０３９０】
１０μＭのＴＳａｓｅを１０μＭのＭＥＤＳトランスポゾン末端組成物と氷上で１０分間プレインキュベートすることで「ＭＥトランスポソーム」を形成した。
【０３９１】
以下の反応液中で、４３ｋｂのコスミドＤＮＡを断片化及び５’タグ化した。
【０３９２】
0005794572.tif 000005
【０３９３】
反応液を３７℃で２時間分インキュベートした。反応液に更に１０μＭのＭＥトランスポソーム５μｌを添加し、３７℃で更に２時間インキュベートした。
【０３９４】
転位により生成された５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端を転移トランスポゾン末端配列でタグ化するために、反応産物を鎖置換型のポリメラーゼミックス（ＦａｉｌＳａｆｅ（商標））及びｄＮＴＰとインキュベートした。
【０３９５】
転位により生成された５’タグ化ＤＮＡ断片の一部を１：１０に希釈して３’末端のタグ化及び増幅を行い、４ｎｇのＤＮＡライブラリー鋳型の増幅を特徴を分析した。１種類のプライマーを用いてタグ化ＤＮＡ断片の全集合を非選択的に増幅するために、トランスポゾン末端配列だけにハイブリダイズし更なる３’配列情報を含まないＭＥＴＳ  ＰＣＲプライマーを用いて、以下の反応を行った。
【０３９６】
0005794572.tif 000006
【０３９７】
反応液を以下のようにインキュベートした。
・７２℃／２：００＊
・９８℃／１：００
・（９８℃／０：１０、５５℃／０：１０、７２℃／１：００）２５サイクル
・４℃維持
＊−転位により生成された５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端を転移トランスポゾン末端配列でタグ化するために、変性ステップの前に反応産物を鎖置換型のポリメラーゼミックス（ＦａｉｌＳａｆｅ（商標））及びｄＮＴＰとインキュベートした（図７参照）。
【０３９８】
増幅された反応産物及び増幅されなかった反応産物を、キアゲン社のＰＣＲ−Ｃｌｅａｎ−ｕｐカラムをメーカーの取扱説明書に従って用いて精製し、メーカーの取扱説明書（ＵＳＭ０００４８．Ａ、２００８年１０月）に従って標準的なロシュ／４５４ＦＬＸライブラリー調製プロトコールのステップ３．４のインプットとして用いた。
【０３９９】
トランスポゾン断片化ライブラリーのディープシークエンシングにより、噴霧化を用いて作製した対照ライブラリーに匹敵するリード長、精度、及びカバレッジを有する予想されるサイズの１つのコンフィグが得られた（図９）。これらのデータは、ＤＮＡ断片ライブラリーの非選択的な大規模並列増幅と一致している。
【０４００】
実施例９
アダプターオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより更なる５’及び３’シークエンシングタグ情報を付加することによる、ロシュ／４５４ＦＬＸに適合するバーコード化されたシークエンシングライブラリーの調製
４５４ＧＳ  ＦＬＸシークエンシングのｅｍＰＣＲに直接使用することができるバーコード化されたＤＮＡ断片ライブラリーを作製するために、ＭＥトランスポソームを用いてラムダゲノムＤＮＡを断片化及び５’タグ化した。ＰＣＲに非選択的アダプターオリゴヌクレオチドを用いて、ＤＮＡライブラリーに、４５４ＦＬＸのｅｍＰＣＲ及びシークエンシング用のアダプター並びにバーコード配列を付加した（図１０）。
【０４０１】
１２．５μＭのＴＳａｓｅを１２．５μＭのＭＥＤＳトランスポゾン末端組成物と３７℃で６０分間プレインキュベートして「ＭＥトランスポソーム」を形成した。
【０４０２】
以下の反応液中でラムダゲノムＤＮＡを断片化及び５’タグ化した。
【０４０３】
0005794572.tif 000007
【０４０４】
反応液を３７℃で２時間インキュベートした。反応液に１２．５μＭのＭＥトランスポソームを更に２μｌ添加して３７℃で更に２時間インキュベートした。
【０４０５】
キアゲン社のＰＣＲ−Ｃｌｅａｎ−Ｕｐカラムをメーカーの取扱説明書に従って用いて反応産物を精製した。
【０４０６】
ＤＮＡ断片ライブラリーを非選択的に増幅し、ロシュ／４５４ＦＬＸのｅｍＰＣＲ及びシークエンシングに適合するアダプターを付加するために、トランスポゾン末端配列にハイブリダイズし且つ更なる３’配列情報を含まないアダプターオリゴを用いてＰＣＲを行った（図１０）。
【０４０７】
0005794572.tif 000008
【０４０８】
反応液を以下のようにインキュベートした。
・７２℃／５：００＊
・９８℃／２：００
・（９８℃／０：１０、３７℃／０：３０、７２℃／３：００）４サイクル
・（９８℃／０：１０、６４℃／３：００）６サイクル
・４℃維持
＊−転位により生成された５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端を転移トランスポゾン末端配列でタグ化するために、変性ステップの前に反応産物を鎖置換型のポリメラーゼミックス（ＦａｉｌＳａｆｅ（商標））及びｄＮＴＰとインキュベートした（図７参照）。
【０４０９】
対照反応液にはＡ−ＭＩＤ２−ＭＥＴＳ及びＢ−ＭＥＴＳ  ＰＣＲプライマーを入れずに２０ｎｇの５’タグ化ＤＮＡ断片を含めた。
【０４１０】
このＰＣＲ反応は、転位により生成された５’タグ化ＤＮＡ断片と同様な予想されるＭＷ分布のｅｍＰＣＲに適合するライブラリーを生じた（図１１、レーン３及び４）。アダプタープライマー（Ａ−ＭＩＤ２−ＭＥＴＳ及びＢ−ＭＥＴＳ）を含めなかった反応液中に検出可能な増幅産物がないことは、ＦＬＸ−Ａ及びＦＬＸ−Ｂでタグ化されたＤＮＡライブラリーを特異的に増幅したことと合致する（図１１、レーン５）
【０４１１】
実施例１０
５０ｎｇのウイルスアンプリコンｃＤＮＡから作製したロシュ／４５４ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍに適合するシークエンシングライブラリーのディープシークエンシング
ロシュ／４５４ＦＬＸ  ＴｉｔａｎｉｕｍシークエンシングのｅｍＰＣＲに直接使用することができる非選択的ＤＮＡ断片ライブラリーを作製するために、アンプリコンＤＮＡをＭＥトランスポソームで断片化及び５’タグ化した。非選択的アダプターオリゴヌクレオチドを用いてＤＮＡライブラリーにロシュ／４５４ＦＬＸ  ＴｉｔａｎｉｕｍのｅｍＰＣＲ及びシークエンシング用のアダプター配列を付加した（図１０）。
【０４１２】
１２．５μＭのＴＳａｓｅを１２．５μＭのＭＥＤＳトランスポゾン末端組成物と３７℃で６０分間プレインキュベートすることで「ＭＥトランスポソーム」を形成した。このストックをＴＳａｓｅ貯蔵バッファー（５０ｍＭ  トリスクロリド（ｐＨ７．５）、５０％グリセロール、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５００ｍＭ塩化ナトリウム、０．５ｖ／ｖ％ＮＰ−４０、０．５ｖ／ｖ％Ｔｗｅｅｎ−２０）で７．５μＭに希釈した。
【０４１３】
以下の反応液中でウイルスアンプリコンｃＤＮＡを断片化及び５’タグ化した。
【０４１４】
0005794572.tif 000009
【０４１５】
反応液を５５℃で１５分間インキュベートした。反応液に７．５μＭのＭＥトランスポソームを更に１μｌ添加して５５℃で更に１５分間インキュベートした。
【０４１６】
キアゲン社のＰＣＲ−Ｃｌｅａｎ−Ｕｐカラムをメーカーの取扱説明書に従って用い、合わせた１１μｌの溶出液２つを用いて反応産物を精製した。
【０４１７】
ＤＮＡ断片ライブラリーを非選択的に増幅してロシュ／４５４ＦＬＸ  ＴｉｔａｎｉｕｍのｅｍＰＣＲ及びシークエンシングに適合するアダプターを付加するために、トランスポゾン末端配列にハイブリダイズし且つ更なる３’配列情報を含まないアダプターオリゴを用いてＰＣＲを行った（図１０）。
【０４１８】
0005794572.tif 000010
【０４１９】
反応液を以下のようにインキュベートした。
・７２℃／５：００＊
・９８℃／２：００
・（９８℃／０：１０、５５℃／０：３０、７２℃／３：００）４サイクル
・（９８℃／０：１０、６４℃／３：００）６サイクル
・４℃維持
＊−転位により生成された５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端を転移トランスポゾン末端配列でタグ化するために、変性ステップの前に反応産物を鎖置換型のポリメラーゼミックス（ＦａｉｌＳａｆｅ（商標））及びｄＮＴＰとインキュベートした（図７参照）。
【０４２０】
このＰＣＲ反応は、転位により生成された５’タグ化ＤＮＡ断片と同様な予想されるＭＷ分布のｅｍＰＣＲに適合するライブラリーを生じた（図１２、レーン２及び３）。
【０４２１】
ロシュ／４５４ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍプレートの１／８でライブラリーのディープシークエンシングを行ったところ、約８０，０００のリードが得られ、リードの約９５％が参照のウイルスゲノムを予想されたカバレッジでマッピングしていた（データ示さず）。これらのデータは、ＤＮＡ断片ライブラリーが非選択的且つ大規模並列に増幅されたことと合致する。
【０４２２】
実施例１１
アダプターオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより更なる５’及び３’シークエンシングタグ情報を付加することによる、イルミナ社のＧＡＩＩに適合するバーコード化シークエンシングライブラリーの調製
イルミナＧＡＩＩシークエンシングのｂＰＣＲに直接使用することができるＤＮＡ断片ライブラリーを作製するために、Ａ／Ｂトランスポソームを用いてラムダゲノムＤＮＡを断片化及び５’タグ化した。非選択的アダプターオリゴヌクレオチドを用いて、ＤＮＡライブラリーにイルミナ社のＧＡＩＩのｂＰＣＲアダプター及びバーコード配列を付加した（図１３）。
【０４２３】
１２．５μＭのＴＳａｓｅを１２．５μＭのＡ−ＭＥＤＳトランスポゾン末端組成物又は１２．５μＭのＢ−ＭＥＤＳトランスポゾン末端組成物と３７℃で６０分間プレインキュベートすることでそれぞれ「Ａ−ＭＥＤＳトランスポソーム」及び「Ｂ−ＭＥＤＳトランスポソーム」を形成した。
【０４２４】
以下の反応液中でラムダゲノムＤＮＡを断片化及び５’タグ化した。
【０４２５】
0005794572.tif 000011
【０４２６】
反応液を３７℃で２時間インキュベートした。反応液に１２．５μＭのＡ−ＭＥＤＳトランスポソーム２μｌ及び１２．５μＭのＢ−ＭＥＤＳトランスポソーム２μｌを更に添加し、３７℃で更に２時間インキュベートした。
【０４２７】
キアゲン社のＰＣＲ−Ｃｌｅａｎ−Ｕｐカラムをメーカーの取扱説明書に従って用いて反応産物を精製した。
【０４２８】
ＤＮＡ断片ライブラリーを非選択的に増幅してイルミナ社のＧＡＩＩのブリッジＰＣＲ及びシークエンシングに適合するアダプターを付加するために、トランスポゾン末端配列にハイブリダイズし且つ更なる３’配列情報を含まないアダプターオリゴを用いてＰＣＲを行った（図１３）。
【０４２９】
0005794572.tif 000012
【０４３０】
反応液を以下のようにインキュベートした。
・７２℃／５：００＊
・９８℃／２：００
・（９８℃／０：１０、５８℃／０：３０、７２℃／３：００）１０サイクル
・４℃維持
＊−転位により生成された５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端を転移トランスポゾン末端配列でタグ化するために、変性ステップの前に反応産物を鎖置換型のポリメラーゼミックス（ＦａｉｌＳａｆｅ（商標））及びｄＮＴＰとインキュベートした（図８参照）。
【０４３１】
対照反応にはＢＰ１−Ａ  ＰＣＲプライマー及びＢＰ２−ＩＤ１−Ｂ  ＰＣＲプライマーを含めず、２０ｎｇの５’タグ化ＤＮＡ断片を含めた。
【０４３２】
このＰＣＲ反応は、転位により生成された５’タグ化ＤＮＡ断片と同様な予想されるＭＷ分布のｂＰＣＲ適合性ライブラリーを生じた（図１４、レーン３及び４）。アダプタープライマー（ＢＰ１−Ａ及びＢＰ２−ＩＤ１−Ｂ）を含まない反応において検出可能な増幅産物がないことは、ＢＰ１及びＢＰ２でタグ化したＤＮＡライブラリーの特異的増幅と一致する図１４、レーン５）。
【０４３３】
実施例１２
イルミナ社のＧＡＩＩに適合するシークエンシングライブラリーのディープシークエンシング
イルミナ社のＧＡＩＩシークエンシングのｂＰＣＲに直接使用することができる非選択的ＤＮＡ断片ライブラリーを作製するために、Ａ／Ｂトランスポソームを用いて大腸菌ＣＣ１１８ゲノムＤＮＡを断片化及び５’タグ化した。非選択的アダプターオリゴヌクレオチドを用いてＤＮＡライブラリーにイルミナ社のＧＡＩＩのｂＰＣＲアダプターを付加した（図１３）。
【０４３４】
実施例Ｄ２と同様に大腸菌ＣＣ１１８ゲノムＤＮＡを断片化、５’タグ化、及び精製した。ＤＮＡ断片ライブラリーを非選択的に増幅してイルミナ社のＧＡＩＩのブリッジＰＣＲ及びシークエンシングに適合するアダプターを付加するために、トランスポゾン末端配列にハイブリダイズし更なる３’配列情報を含まないアダプターオリゴを用いてＰＣＲを行った。
【０４３５】
0005794572.tif 000013
【０４３６】
反応液を以下のようにインキュベートした。
・７２℃／５：００＊
・９８℃／２：００
・（９８℃／０：１０、５８℃／０：３０、７２℃／３：００）１０サイクル
・４℃維持
＊−転位により生成された５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端を転移トランスポゾン末端配列でタグ化するために、変性ステップの前に反応産物を鎖置換型のポリメラーゼミックス（ＦａｉｌＳａｆｅ（商標））及びｄＮＴＰとインキュベートした（図８参照）。
【０４３７】
作製されたライブラリーのディープシークエンシングは、平均の深度が約１１５Ｘで約４．６Ｍｂゲノムのカバレッジを達成した（データ示さず）。これらのデータは、ロシュ／４５４ＦＬＸ  ＴｉｔａｎｉｕｍのｅｍＰＣＲ及びシークエンシングに適合するＤＮＡ断片ライブラリーの非選択的な大規模並列増幅と合致する。
【０４３８】
実施例１３
従来の方法と本発明の実施形態及びキット用プロトコールの比較
本発明の方法によるタグ化ＤＮＡ断片ライブラリー調製のワークフロー及びタイムラインを、現在一般的に用いられている方法によりそのようなライブラリーを調製するためのワークフロー及びタイムラインと比較する。プロセス工程及び各工程に必要な時間を比較した表を図１５に示す。本発明の方法では、工程数、手作業の時間、及び全体の時間が少ない。
【０４３９】
実施例１４
ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ及びヘアピンＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポゾン末端組成物を用いるインビトロ転位を介したＤＮＡの断片化及びタグ化
以下の成分を混合してヘアピントランスポソーム（商標；すなわち、トランスポザーゼとのヘアピン型トランスポゾン末端組成物複合体）を終濃度２５マイクロモルで形成した（図１６参照）。
【０４４０】
１０マイクロリットル  ＥＺ−Ｔｎ５（商標）ヘアピントランスポゾン末端組成物（２５０マイクロモル）
２７マイクロリットル  ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ（９１．４マイクロモル）
６３マイクロリットル  トランスポザーゼ貯蔵バッファー
１００マイクロリットル  
【０４４１】
以下の反応混合物を混合した。
【０４４２】
ｘマイクロリットル  水で最終体積５０マイクロリットルに
５マイクロリットル  １０Ｘ  ＥＺ−Ｔｎ５（商標）転位バッファー
１マイクログラム    標的ＤＮＡ１〜４０マイクロリットル
０、１、２、４、又は６マイクロリットル  ２５マイクロモルのヘアピントランスポソーム（商標）
５０マイクロリットル
【０４４３】
混合後、反応液を３７℃で２時間インキュベートした。等量の停止溶液（１５％スクロース、６６ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．０）、０．１％ＳＤＳ、０．９％オレンジＧ［シグマ社製、Ｏ−７２５２］）を用いて反応を停止し、混合し、７０℃で１０分間加熱した。
【０４４４】
ＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを分析した。ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄでゲルを染色し、非ＵＶ光でＤＮＡを可視化した。
【０４４５】
標的ＤＮＡの断片化は添加したトランスポソームの量に比例している（図１７）。
【０４４６】
実施例１５
タグ化環状ＤＮＡ断片はＴ５エキソヌクレアーゼに抵抗性である
ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ＮｕｃｌｅｏＴｒａＰ（登録商標）ＣＲ（マッハライ・ナーゲル社（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，  ＧｍｂＨ）製）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、実施例１４の５’タグ化ＤＮＡ断片を単離した。タグ化環状ＤＮＡ断片を作製するために、回収したＤＮＡを、ｄＮＴＰＳ及びβ−ＮＡＤ存在下で、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さない非鎖置換型ポリメラーゼ（例えばＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ）及び鋳型依存性リガーゼ（例えば大腸菌リガーゼ）とインキュベートした。
【０４４７】
以下の反応液を混合した。
【０４４８】
１４マイクロリットル  実施例１の５’タグ化ＤＮＡ断片
２マイクロリットル  １０Ｘ  ＥＺ−Ｔｎ５（商標）転位バッファー
１マイクロリットル  ２ｍＭ  β−ＮＡＤ
１マイクロリットル  ４ｍＭ  ｄＮＴＰ
１マイクロリットル  大腸菌ＤＮＡリガーゼ（１０Ｕ／μｌ）
１マイクロリットル  Ｔ４ポリメラーゼ（０．５Ｕ／μｌ）
２０マイクロリットル
【０４４９】
反応液を周囲温度で１５分間インキュベートした。７５℃で２０分間インキュベートすることで反応を停止した。反応液の一部（１０μｌ）を１０ユニットのＴ５エキソヌクレアーゼと３７℃で５分間インキュベートして直鎖（非環状）ＤＮＡ断片を分解した。
【０４５０】
全反応液を２μｌの停止溶液（１５％スクロース、６６ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．０）、０．１％ＳＤＳ、０．９％オレンジＧ［シグマ社製、Ｏ−７２５２］）で処理し、混合し、７０℃で５分間加熱した。
【０４５１】
ＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを分析した。ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄでゲルを染色し、非ＵＶ光でＤＮＡを可視化した。
【０４５２】
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ及び大腸菌リガーゼによる処理は、ＤＮＡ断片の一部をＴ５エキソヌクレアーゼ抵抗性の容易に検出可能なタグ化環状ＤＮＡ断片分子に変換した（図１８、レーン９）。更に、このＴ５エキソヌクレアーゼ抵抗性ＤＮＡの分子量分布はインプットＤＮＡと同等であり、この反応に分子量によるバイアスがないことを示している。
【０４５３】
対照反応も行った。ＤＮＡ断片を処理しなかった場合、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼだけで処理した場合、又は大腸菌リガーゼだけで処理した場合、Ｔ５エキソヌクレアーゼ抵抗性タグ化環状ＤＮＡ断片は検出されなかった（図１８、レーン３、５、及び７）。
【０４５４】
実施例１６
核酸リガーゼ及びライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドを用いた、転位により生成された５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端のタグ化
上記（実施例１）のサイズ化手順で得られた５’タグ化断片化ＤＮＡを、核酸リガーゼ及びライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドを用いた５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端のタグ化に用いた（図２１）。
【０４５５】
転位により生成された５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端をロシュ社の４５４シークエンシングタグ（４Ｎ４５４Ｂ）を含む第２のタグでタグ化するために、以下の反応を行った。
【０４５６】
４３マイクロリットル  実施例１の０．５〜１Ｋｂｐのサイズ選択された５’タグ化ＤＮＡ断片
５マイクロリットル  １０Ｘ  リガーゼ反応バッファー
（０．２Ｍ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．３、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  β−ＮＡＤ）
１マイクロモル  ４Ｎ４５４Ｂオリゴヌクレオチド
（５’ｐＮＮＮＮＣＴＧＡＧＣＧＧＧＣＴＧＧＣＡＡＧＧＣ３’（配列番号６））  
１マイクロリットル  大腸菌ＤＮＡリガーゼ（１０ユニット／マイクロリットル）    
【０４５７】
混合後、反応液を室温で１時間インキュベートした。次いで、反応を停止し、リガーゼを失活させ、９５℃で５分間インキュベートしてＤＮＡを変性させた。その後、反応液をすぐに氷水浴中で冷却した。
【０４５８】
ＰＣＲ分析を行い、ＤＮＡ断片の５’末端がＥＺ−Ｔｎ５トランスポゾン末端の転移トランスポゾン末端配列を示し３’末端がロシュ社の４５４シークエンシングタグ（４Ｎ４５４Ｂ）を示すことが示された。
【０４５９】
以下のＰＣＲ反応を以下のように行った。
【０４６０】
２１マイクロリットル  水
１マイクロリットル  二重タグ化５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片
１マイクロリットル  ５マイクロモルのＰＣＲプライマー１（ｐＭＥＴＳ）
１マイクロリットル  ５マイクロモルのＰＣＲプライマー２
（５’ＡＴＡ  ＧＧＣ  ＧＣＧ  ＣＣＧ  ＣＣＴ  ＴＧＣ  ＣＡＧ  ＣＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＧ３’０（配列番号２１））  
１マイクロリットル  ＦａｉｌＳａｆｅ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ
２５マイクロリットル  ＦａｉｌＳａｆｅ（商標）２Ｘ  ＰＣＲ  ＰｒｅＭｉｘ  Ｃ
５０マイクロリットル
【０４６１】
以下の条件でＰＣＲを２０サイクル行った。
９４℃、１０秒
５５℃、１０秒
７２℃、２分
【０４６２】
ゲル分析から、０．５〜１．０ＫＢの予想サイズ範囲のＰＣＲ産物が産生されたことが示された（データ示さず）。
【０４６３】
対照反応も行った。リガーゼなし又はロシュ社の４５４シークエンシングタグ（４Ｎ４５４Ｂ）なしでライゲーション反応を行った場合、ＰＣＲ産物は何も得られなかった。ＰＣＲ反応にｐＭＥＴＳ  ＰＣＲプライマー１又はＰＣＲプライマー２を入れなかった場合、０．５〜１ＫＢの産物は得られなかった。リガーゼなし又はロシュ社の４５４シークエンシングタグ（４Ｎ４５４Ｂ）なしでライゲーション反応を行った場合、ＰＣＲ産物は何も得られなかった。ＰＣＲ反応にｐＭＥＴＳ  ＰＣＲプライマー１又はＰＣＲプライマー２を入れなかった場合、０．５〜１ＫＢの産物は得られなかった（データ示さず）。
【０４６４】
実施例１７
ｐ４５４．１ＭＥＤＳトランスポゾン末端組成物及びＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼを用いるインビトロ転位を介したＤＮＡの断片化及び５’タグ化により得られたタグ化ｓｓＤＮＡ断片の環状化
以下の反応液中で、ｐ４５４ＭＥＤＳ  ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポゾン末端組成物を用いてＴ７Ｄ１１１ゲノムＤＮＡを５’末端タグ化及び断片化した。
【０４６５】
ｘ                  水で最終体積５０マイクロリットルに
５マイクロリットル  １０Ｘ  ＥＺ−Ｔｎ５（商標）転位バッファー
１マイクログラム    標的ＤＮＡ１〜４０マイクロリットル
２マイクロリットル  ｐ４５４．１ＭＥＤＳトランスポゾン末端組成物（２５μＭ）
２マイクロリットル  ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ（１０ユニット／マイクロリットル）
５０マイクロリットル  最終反応体積
【０４６６】
混合後、反応液を３７℃で１時間インキュベートした。次いで、１０マイクロリットルの停止溶液（１５％スクロース、６６ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．０）、０．１％ＳＤＳ、０．９％オレンジＧ［シグマ社製、Ｏ−７２５２］、及び１００マイクログラム／ｍｌのプロテイナーゼＫ）を用いて反応を停止し、混合し、５０℃で１０分間加熱した。
【０４６７】
ＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを分析した。ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄでゲルを染色し、非ＵＶ光でＤＮＡを可視化した。
【０４６８】
実施例３で同等な量及び濃度のＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ及びｐＭＥＤＳトランスポゾン末端を用いた場合と同様な程度及びサイズ範囲に標的ＤＮＡが断片化された（図２２Ｂ、レーン５）。これらのデータは、更なるロシュ社の４５４シークエンシングタグでｐＭＥＴＳオリゴを長くしてもＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼによるＤＮＡの断片化及びタグ化の効率があまり変化しないことを示している。ｐ４５４．１ＭＥＤＳトランスポゾン末端組成物又はＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼを入れなかった場合、検出可能なＤＮＡ断片化は起こらなかった（図２２、レーン３及び４）。
【０４６９】
図２２、レーン５の５’タグ化断片化ＤＮＡを、以下の反応液中で熱変性し、鋳型非依存性リガーゼを用いて環状化した（図２２Ａ参照）。
【０４７０】
ｘ                  水で最終体積２０マイクロリットルに
１マイクロリットル  ３３０ｍＭトリス酢酸、ｐＨ７．８、６６０ｍＭ  ＫＯＡｃ
１マイクロリットル  ５０ｍＭ  ＭｎＣｌ２
４マイクロリットル  ５Ｍベタイン  
１０マイクロリットル  ２０μｇ ／ｍｌ  変性させた５’タグ化断片化ＤＮＡ
４マイクロリットル  １００Ｕ／μｌ  ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（エピセンター社製）
２０マイクロリットル  最終反応体積
【０４７１】
反応液を６０℃で２時間インキュベートした。次いで、反応産物を１８ユニットのＥｘｏＩ及び２０ユニットのＥｘｏＩＩＩを用いて３７℃で１時間処理して環状化されていない直鎖ＤＮＡを除去した。
【０４７２】
実施例１８
タグ化環状ｓｓＤＮＡのＰＣＲ分析
環状化を実証するために、ｐＭＥＴＳ及びｐｃ４５４．１をプライマーとして用いてＰＣＲ分析を行った。このＰＣＲでは、ライゲーションした環状ｓｓＤＮＡだけが増幅され、環状ｓｓＤＮＡのサイズに対応する直鎖ｄｓＤＮＡ産物が生成される。ＰＣＲ反応は以下のように行った。
【０４７３】
２１マイクロリットル  水
１マイクロリットル  エキソヌクレアーゼ処理されたＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ反応（１：１０００）
１マイクロリットル  プライマーとして５μＭ  ｐＭＥＴＳオリゴヌクレオチド
１マイクロリットル  プライマーとして５μＭ  ｐｃ４５４．１オリゴヌクレオチド
１マイクロリットル  ＦａｉｌＳａｆｅ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ
２５マイクロリットル  ＦａｉｌＳａｆｅ（商標）２Ｘ  ＰＣＲ  ＰｒｅＭｉｘ  Ｃ
５０マイクロリットル  最終反応体積
【０４７４】
以下の条件でＰＣＲを２９サイクル行った。
９４℃、１０秒
５０℃、１０秒
７２℃、１分
【０４７５】
ゲル分析から、生成したＰＣＲ産物のサイズ範囲が５’タグ化断片化ＤＮＡと同様であることが示された（図２３）。
【０４７６】
対照反応も行った。ライゲーション反応にＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）  ｓｓＤＮＡリガーゼを含めなかった場合、ｐ４５４．１ＭＥＴＳ転移鎖の環状化を示すＰＣＲ産物は生成したが、５’タグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片を示す産物は得られなかった（図２３、レーン１）。ｐＭＥＴＳオリゴヌクレオチド（ＰＣＲプライマーとして）又はｐｃ４５４．１ＰＣＲプライマーをＰＣＲ反応に含めなかった場合、産物は何も得られなかった（データ示さず）。
【０４７７】
ＰＣＲ産物が５’タグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片と同じサイズ分布を有する（図２２のレーン５と図２３のレーン２を比較されたい）ことは、１）ｐ４５４．１ＭＥＤＳトランスポゾン末端組成物が標的ＤＮＡを効率的に５’タグ化及び断片化できること；２）アニーリングした相補的５’タグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片の熱変性により、鋳型非依存性ライゲーションの鋳型となる変性されたタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片が得られること；及び３）（エキソヌクレアーゼＩ及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ処理後のＰＣＲ増幅により確認される）検出可能なバイアスなしに５’タグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片がタグ化環状ｓｓＤＮＡ断片に効率的に変換できること、を示している。
【０４７８】
上記本明細書中で言及した全ての刊行物及び特許を参照により本明細書に援用する。本発明の範囲及び趣旨を逸脱しない記載した本発明の方法及び系の種々の修正例及び変更例が当業者には明らかであろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関連付けて説明したが、特許請求する発明はそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないと理解されるべきである。実際、本発明を実施するための記載されている形態の当業者に明らかな種々の修正例が添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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