(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の構造Ｉを有する標識シスチン化合物を含んでなるイメージング剤。
【化１】
0005709841.tif 000020
式中、Ｒ及びＲ’の一方はＢＯＤＩＰＹ蛍光色素及び放射性同位体ラベルから選択されるラベルを含み、Ｒ及びＲ’の他方は水素である。
【請求項２】
標識シスチン化合物が次の構造ＩＩを有する、請求項１記載のイメージング剤。
【化２】
0005709841.tif 000021
式中、
点線の結合は単結合又は二重結合を表し、
Ｒ1は放射性同位体ラベルを含み、
点線の結合が単結合である場合にＲ2は水素であり、
点線の結合が二重結合である場合にＲ2は存在しない。
【請求項３】
前記放射性同位体ラベルが11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、17Ｆ、18Ｆ、75Ｂｒ、76Ｂｒ、124Ｉ、123Ｉ、131Ｉ及び77Ｂｒから選択される、請求項１又は請求項２記載のイメージング剤。
【請求項４】
前記放射性同位体ラベルが18Ｆであり、前記標識シスチン化合物が次の構造ＩＩ、Ｖ又はＶＩの化合物から選択される、請求項３記載のイメージング剤。
【化３】
0005709841.tif 000022
【化４】
0005709841.tif 000023
【化５】
0005709841.tif 000024
【請求項５】
標識シスチン化合物が蛍光ラベルを含んでいて次の構造ＩＶを有する、請求項１記載のイメージング剤。
【化６】
0005709841.tif 000025
【請求項６】
シスチン／グルタミン酸輸送体を有するインビトロ細胞培養物である生物学的試料のイメージングを行う方法であって、
シスチン／グルタミン酸輸送体を介して請求項１記載のイメージング剤を前記生物学的試料中に導入する段階、及び
蛍光顕微鏡検査、レーザー共焦点顕微鏡検査又は交差偏光顕微鏡検査を用いて前記イメージング剤を検出する段階
を含んでなる方法。
【請求項７】
シスチン／グルタミン酸輸送体を有するインタクトな哺乳動物被験体である生物学的試料のイメージング方法に用いられる請求項２乃至請求項４のいずれか１項記載のイメージング剤を含む医薬組成物であって、前記イメージング方法が、
シスチン／グルタミン酸輸送体を介して前記イメージング剤を前記生物学的試料中に導入する段階、及び
陽電子放射断層撮影法又は単光子放射断層撮影法を用いて前記イメージング剤を検出する段階
を含む、医薬組成物。
【請求項８】
前記イメージング剤が請求項４記載の標識シスチン化合物を含み、前記検出段階が陽電子放射断層撮影法を用いて実施される、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載のイメージング剤を、哺乳動物への投与に適した形態の生体適合性キャリヤーと共に含んでなる医薬組成物。
【請求項１０】
Ｒ及びＲ’の一方が放射性同位体ラベルを含んでいてＲ及びＲ’の他方が水素である請求項１記載のイメージング剤を合成するための前駆体化合物であって、当該前駆体化合物が次の構造Ｘを有する、前駆体化合物。
【化７】
0005709841.tif 000026
式中、
Ｒ''及びＲ'''の一方は前駆体基であり、Ｒ''及びＲ'''の他方は水素であり、
前記前駆体基は好都合な化学形態の放射性同位体ラベルと反応して放射性同位体ラベルを部位特異的に導入する化学基であり、
当該前駆体化合物は任意にはヒドロキシ、カルボニル及びアミン官能基の１以上に対する保護基を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的には標識分子イメージング剤に関し、さらに詳しくはシスチン／グルタミン酸輸送体を介して細胞に取り込まれるイメージング剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
シスチン／グルタミン酸輸送体は、大抵の組織で通例は発現されないか又は極めて低い発現を示すが、酸化ストレスに暴露された細胞ではアップレギュレートされる。２つのジスルフィド結合システインアミノ酸からなるシスチンは、この輸送体に対する天然の基質である。シスチン／グルタミン酸アンチポーター（ｘｃ−系）は、２つのタンパク質サブユニット、即ち若干の種類の輸送体系に共通のサブユニットである４Ｆ２ｈｃ／ＣＤ９８及びシスチン／グルタミン酸交換体に対して特異的なｘＣＴから構成された（ＳＬＣ７Ａ１１と呼ばれる）アミノ酸輸送体である。輸送体のアップレギュレーション効果はシスチン取込みの増加であり、次いでこれは細胞内でシステインに還元される。細胞内システインは、グルタチオン合成のための律速基質である。グルタチオンは、酸化ストレスから細胞を守るための主たる酸化防止剤である。細胞内システインは、２つの経路の一方（即ち、グルタチオン合成又はタンパク質合成）に取り込まれる。
【０００３】
シスチンのアミン基の両方に結合した蛍光ラベルを含む蛍光標識シスチン化合物は、当技術分野で公知である。その一例は、Ｓｉｇｍａ社（カタログ＃Ｄ０６２５）から商業的に入手できるＮ，Ｎ’−ジダンシル−Ｌ−シスチン（ＤＤＣ）であり、これは次の構造を有している。
【０００４】
【化１】
0005709841.tif 000002
別の例は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社からの市販製品（カタログ＃Ｂ２０３４０）であるジＢＯＤＩＰＹ−Ｌ−シスチン（ＤＢＣ）であり、これはこれは酸性条件下でのジスルフィド交換反応によるヌクレオチド、タンパク質及び細胞の可逆チオール標識のために販売されている。ＤＢＣは以下に示す構造を有する。
【０００５】
【化２】
0005709841.tif 000003
シスチンの放射性標識バージョンも当技術分野で公知である。例えば、99mＴｃで標識されたシスチンが知られている。Ｔｕｂｉｓ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｗ（１９６８  Ｉｎｔ  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｒａｄ  Ｉｓｏｔｏｐ；１９：８３５−８４０）は、システインの−ＳＨ基が99mＴｃＯ4-を還元すると同時に酸化されてシスチンになるシステインと99mＴｃＯ4-との直接反応を開示している。また、35Ｓで標識されたシスチンも知られており、これは以下の構造を有する。
【０００６】
【化３】
0005709841.tif 000004
35Ｓは、例えば動物のラジオトレーサー研究において使用されてきた（例えば、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，１９８０  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ；３５：４１７−４２４を参照されたい）。
【０００７】
分子イメージングの概念は、病理学的状態の分子シグナチュアの特異的コントラスト増強を約束すると共に、特定の病理学的徴候について特異的に調節される標的化可能なバイオマーカーを要求する。かかる特異的分子コントラスト剤は疾患のイメージング及び診断のため大いに有用であり得るものの、真に特異的なバイオマーカーの確認は非常に困難であることが判明している。かかる特異的バイオマーカーに対するコントラスト剤が創製されても、かかるコントラスト剤の市場はこの徴候の罹患率に限定される。したがって、各種の病理学的徴候をイメージ化するために利用できる分子コントラスト剤を開発することに大きな関心が集まっている。大抵のイメージング剤は特定の組織又は細胞タイプ或いは特定の療法を標的化し、さもなければ時間と共に急速に分解する。広範な用途に向けられるイメージング剤の一例は、グルコース輸送体を利用する１８−Ｆ−フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）である。18Ｆ−ＦＤＧは、グルコース要求量の増加した細胞によって優先的に取り込まれ、次いで細胞内に捕捉される。ＦＤＧは、多くの癌の診断、ステージング及びモニタリング並びに心臓及び脳における代謝のモニタリングのため臨床的に使用できる。18Ｆ−ＦＤＧは、腎細管中に見出されるナトリウム依存性グルコース輸送体の基質ではなく、このことがそれの腎再吸収を防止してクリアランスを促進する。
【０００８】
インビボ酸化ストレスは、細胞ストレスの指標として認められている。このストレスをイメージ化しようという努力には、電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）を用いて動物のイメージングを行うことが含まれていた。ＥＰＲは、酸化ストレスにおいてフリーラジカルの生成と共に生じる不対電子を検出するための技法である。本質的に、酸化ストレスの尺度としての臓器抗酸化活性に対して感受性を有するＥＰＲプローブと見なされる薬剤が使用される。
【０００９】
他の研究者達はまた、１３−Ｃ−グリシン化学シフトＭＲＩを用いて、インビボでの腫瘍の化学療法治療の動物モデルにおいてグリシンの取込み及びグルタチオンへの転化を検出することを考察した。さらに他の研究者達は、化学療法治療をモニターするためにインビボでアポトーシス細胞を検出するためのイメージング剤を開発した。かかるイメージング剤には、例えば、やや大きいタンパク質である標識アネキシンＶ、及びアポトーシス細胞中にのみ特異的に侵入することが報告されている１群の小分子であるＮｅｕｒｏｓｕｒｖｉｖａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＡｐｏｓｅｎｓｅがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
国際公開第２００６／０３０２９１号パンフレット
【発明の概要】
【００１１】
本発明のイメージング剤及び方法は、細胞酸化ストレスの条件下で活性化される細胞アミノ酸輸送体（シスチン／グルタミン酸アンチポーター、ｘｃ−）を利用する。本発明のこれらの標識分子イメージング剤及び方法はいくつかの利益をもたらす。このような利益としては、特に限定されないが、これらは多種多様の診断用及び治療用モニタリング用途において使用できること、これらは小分子であると共に体内に見出される天然化合物の標識変異体を含み、毒性応答を生じる濃度より十分に低い生理的濃度を有するトレーサーレベルで投与され、したがって毒性／免疫応答は低いと予想されること、並びにかかるイメージング剤は輸送体基質として作用するので、イメージング剤の信号が細胞表面エピトープの化学量論的結合に限定される他の分子結合剤と違ってかかる分子イメージング剤は細胞内に一旦捕捉され、したがって信号が増幅されるという利益を受けることが挙げられる。シスチン／グルタミン酸輸送体に対する本発明の標識基質は、治療目的のため、標的中に化合物を導入するためにも使用できる。
【００１２】
シスチン／グルタミン酸輸送体の標識基質として、これらのイメージング剤は増加した酸化ストレスに関係する任意の疾患又は状態に対して使用できる。例えば、かかるイメージング剤はインビボでアポトーシス細胞をイメージ化するために使用できる。このようなアポトーシス細胞死の非侵襲的モニタリングは、例えば特に限定されないが、化学療法の有効性、虚血／発作による組織損傷、外傷性傷害及び移植片拒絶をモニターするために有用である。酸化ストレスのイメージングはまた、炎症性疾患或いは酸化ストレス又は組織損傷を含む任意の病理学的徴候の診断及びイメージングのためにも有用である。
【００１３】
さらに、シスチン／グルタミン酸輸送体のアップレギュレーションは、ある種の腫瘍における化学療法耐性にも関連している。したがって、基礎的な高いシスチン取込みを有する腫瘍の非侵襲的イメージングにより、特定の療法に対して耐性を有する可能性がある腫瘍を同定でき、これは治療計画の有効な変更を可能にするであろう。
【００１４】
細胞における酸化ストレスを検出するための本発明方法の一例は、一般に、標識シスチンを含むイメージング剤を細胞のシスチン／グルタミン酸アンチポーター中に導入する段階、細胞内の標識シスチンを標識システインに還元させる段階、及び細胞内の標識システインを検出する段階を含んでなる。例えば、ある種の用途に関しては、標識シスチンはアポトーシス細胞で検出できる。かかる方法の若干の非限定的な例では、酸化ストレスを検出するための方法で使用する標識シスチンは、以下に一層詳しく定義される構造Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶから選択される。
【００１５】
本発明のイメージング剤の別の実施形態は、一般に、シスチン／グルタミン酸輸送体（ｘｃ−）の標識小分子基質（例えば、特に限定されないが、以下に一層詳しく定義される構造Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ又はＶＩ）を含んでなる。
【００１６】
本発明のイメージング方法の非限定的な一例は、一般に、特に限定されないが、以下に一層詳しく定義される構造Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶのようなシスチン化合物を使用すると共に、蛍光顕微鏡検査、レーザー共焦点顕微鏡検査、交差偏光顕微鏡検査、光学イメージング、核シンチグラフィー、陽電子放射断層撮影法又は単光子放射断層撮影法を用いて該化合物を検出することを含んでなる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明の上記その他の特徴、態様及び利点は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明を読んだ場合に一層よく理解されよう。添付の図面中では、図面全体を通じて類似の部分は同一の符号で表されている。
【図１】図１は、シスチン／グルタミン酸アンチポーターを介して細胞中に取り込まれる本発明のイメージング剤の一実施形態を示す流れ図である。
【図２】図２Ａは、非アポトーシスＪｕｒｋａｔ細胞（暗い灰色）と異なる顆粒度を有する若干の後期アポトーシスＪｕｒｋａｔ細胞（明るい灰色）を示す前方散乱／側方散乱プロットである。図２Ｂは、非アポトーシス細胞を表すアネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性の細胞を象限Ｄ３内に示し、初期アポトーシス細胞を表すアネキシンＶ−Ｃｙ５陽性でヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性の細胞を象限Ｄ４内に示し、後期アポトーシス細胞及び壊死細胞を表すアネキシンＶ陽性の細胞を象限Ｄ２内に示す多象限散乱プロットである。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、酸化ストレス／アポトーシスを誘発するためのスタウロスポリン（ＳＴＮ）の存在下及び不存在下、並びにシスチン／グルタミン酸輸送体を阻害するためのスルファサラジン（ｓａｓｚ）の存在下及び不存在下で、Ｊｕｒｋａｔ細胞中へのＤＢＣ取込みをフローサイトメトリーによって分析した結果を示している。図３Ａは、未処理細胞がＤＢＣ分子の若干の取込み又は非特異的結合を表すことを示すグラフである。図３Ｂは、スタウロスポリン誘発細胞が３つの細胞亜集団（即ち、低強度ＤＢＣ蛍光によって表される正常細胞、中間強度によって表される初期アポトーシス細胞、及び高強度によって表される後期アポトーシス細胞）を有することを示すグラフである。図３Ｃは、シスチン／グルタミン酸輸送体阻害剤スルファサラジン（ｓａｓｚ）に暴露されたスタウロスポリン誘発細胞が異なる結果を有すること、即ち、中間のＤＢＣ染色を示す細胞集団が後期アポトーシス細胞を表す一方、初期アポトーシス細胞は低ＤＢＣ強度集団中にあることを示すグラフである。図３Ｄは、（アネキシンＶ及びＰＩ染色によって決定された）正常細胞、初期アポトーシス細胞及び後期アポトーシス細胞に関し、基線ＤＢＣ染色より高度に標識された細胞のパーセントを示す棒グラフである。
【図４】図４Ａは、ＳＴＮで１８時間処理したＪｕｒｋａｔ細胞におけるＤＢＣの取込みを示している。図４Ｂは、ジＢＯＤＩＰＹ（６５０）シスチン（ＤＢＣ（６５０））と共にインキュベートした同じ細胞の比較を示している。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、シスチン／グルタミン酸を阻害するためのスルファサラジン（ｓａｓｚ）の存在下及び不存在下で、酸化ストレス／アポトーシスを誘発するためのスタウロスポリン（ＳＴＮ）を用いた場合におけるＪｕｒｋａｔ細胞中へのモノＢＯＤＩＰＹシスチン（ＭＢＣ）取込みをフローサイトメトリーによって分析した結果を示している。図５Ａは、スタウロスポリン誘発細胞が２つの細胞亜集団（即ち、無ＭＢＣ蛍光によって表される正常細胞並びに高ＭＢＣ強度によって表される初期及び後期アポトーシス細胞）を有することを示すグラフである。図５Ｂは、シスチン／グルタミン酸輸送体阻害剤スルファサラジン（ｓａｓｚ）に暴露されたスタウロスポリン誘発細胞が異なる結果を有することを示すグラフである。即ち、中間のＤＢＣ染色を示す細胞集団が後期アポトーシス細胞を表す一方、初期アポトーシス細胞はＭＢＣ蛍光強度を示さない。図５Ｃは、（アネキシンＶ及びＰＩ染色によって決定された）正常細胞、初期アポトーシス細胞及び後期アポトーシス細胞に関し、基線ＭＢＣ染色より高度に標識された細胞のパーセントを示す棒グラフである。
【図６】図６Ａは、５種の蛍光イメージング剤（即ち、ＤＢＣ、ＤＢＣ（６５０）、ジＢＯＤＩＰＹシスタチオニン（ＤＢシスタチオニン）、ＭＢＣ及び陰性対照蛍光分子（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ  Ｃ５））で標識された標識された（アネキシンＶ及びＰＩ染色によって決定された）正常細胞、初期アポトーシス細胞及び後期アポトーシス細胞のパーセントを示す棒グラフである。図６Ｂは、図６Ａに示した５種のイメージング剤の各々で標識された初期アポトーシス細胞に関する平均倍率強度シフトを示す表である。
【図７】図７は、培養中のＪｕｒｋａｔ細胞及びＡ５４９細胞におけるモノＡＯ−［18Ｆ］−ＦＢＡ−シスチンの取込みを示す棒グラフである。
【図８】図８Ａは、天然のＢａｌｂ／ｃマウスにおける体内分布結果を％ＩＤ／器官として示すグラフである。図８Ｂは、図８Ａに示したものと同じデータの％ＩＤ／グラムを示すグラフである。図８Ｃは、Ａ５４９異種移植腫瘍を有するヌードマウスにおける体内分布結果を％ＩＤ／グラムとして示すグラフである。図８Ｄは各時点における腫瘍／血液比を示しており、これは図８Ｃに示したものと同じデータから導かれている。
【図９】図９は、モノＡＯ−［18Ｆ］−ＦＢＡ−シスチン分子の経時的安定性を示すグラフである。
【図１０】図１０は、注射から６０分後における天然マウスのＰＥＴ画像中での18Ｆ−ＡＯ−ＦＢ−シスチンを示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
一態様では、本発明は、次の構造Ｉを有する標識シスチン化合物を含んでなるイメージング剤を提供する。
【００１９】
【化４】
0005709841.tif 000005
式中、Ｒ及びＲ’の一方は蛍光ラベル及び放射性同位体ラベルから選択されるラベルを含み、Ｒ及びＲ’の他方は水素である。
【００２０】
本明細書中で使用する「イメージング剤」という用語は、インビトロ又はインビボイメージング技法を用いて検出できる化合物を包括するものである。
【００２１】
本明細書中で使用する「蛍光ラベル」という用語は、特に限定されないが、特定波長の光に暴露された場合に異なる波長の光を発生する化合物である蛍光イメージング剤及び発蛍光団を包含する。発蛍光団は、その発光プロファイル又は色によって記述することができ、分子に蛍光性を付与する分子の成分である。それは通例、特定の波長又は波長範囲のエネルギーを吸収し、異なるが等しく特定の波長又は波長範囲のエネルギーを再放出する官能基である。
【００２２】
本明細書中で使用する「放射性同位体ラベル」という用語は、特に限定されないが、化学的又は生物学的プロセス或いは生物学的物質、有機体及び装置において、化合物の追跡又は可視化或いは化学反応の機構の追跡又は可視化のために化合物中で使用される放射性同位体を包含する。かかるラベルは、例えば、イメージング装置及び検出装置に関連して有用である。
【００２３】
一般に、本発明のイメージング剤は、シスチン／グルタミン酸輸送体の基質となるために必要な属性を維持する標識シスチン及び任意のシスチン類似体を含む。図１に示されるように、イメージング剤はシスチン／グルタミン酸輸送体に対する基質として役立つ。遊離アミンの位置で標識されたシスチンは、シスチン／グルタミン酸輸送体に対する基質である。細胞中に輸送された後、Ｒ−シスチンはＲ−システイン及び非標識システインに還元される。Ｒ−システインは代謝されず、輸送体を介して出ることができない。したがって、それは酸化ストレスに応答している細胞内に保持される。
【００２４】
本明細書中で使用される「シスチン／グルタミン酸輸送体」という用語は、シスチン／グルタミン酸アンチポーター、シスチン／グルタミン酸交換体、シスチン輸送体、ｘｃ(−)、Ｘｃ(−)、系ｘｃ(−)及びアミノ酸輸送系Ｘｃ(−)という用語と互換的に使用されかつこれらを包含する。この輸送系は２種のタンパク質の二量体を含み、特に限定されないが、タンパク質ｘＣＴ及びタンパク質ＣＤ９８（４Ｆ２ｈｃ、４Ｆ２表面抗原のＨ鎖、ＳＬＣ３Ａ２）、ｘｃ(−)に対して特異的なサブユニットであるタンパク質ｘＣＴ、様々な基質に関する複数の輸送体に共通するサブユニットであるタンパク質ＣＤ９８、並びに複数の輸送体に共通する別のサブユニットであるｒＢＡＴと二量体化し得るタンパク質ｘＣＴを包含する。
【００２５】
本発明のイメージング剤は、それの放出信号によって検出できる。化合物の検出方法には、特に限定されないが、蛍光顕微鏡検査、レーザー共焦点顕微鏡検査、交差偏光顕微鏡検査、光学イメージング、核シンチグラフィー、陽電子放射断層撮影法及び単光子放射断層撮影法が挙げられる。
【００２６】
本発明のイメージング剤が蛍光ラベルを含む標識シスチン化合物を含んでなる場合、好適な検出方法には、蛍光顕微鏡検査、レーザー共焦点顕微鏡検査、交差偏光顕微鏡検査及び光学イメージングがある。蛍光ラベルは、好適な検出方法のいずれかで直接又は間接に検出できる任意の部分である。好ましい蛍光ラベルには、広範な非局在化電子系を有する群、例えばシアニン類、メロシアニン類、インドシアニン類、フタロシアニン類、ナフタロシアニン類、トリフェニルメチン類、ポルフィリン類、ピリリウム色素、チアピリリウム色素、スクアリリウム色素、クロコニウム色素、アズレニウム色素、インドアニリン類、ベンゾフェノキサジニウム色素、ベンゾチアフェノチアジニウム色素、アントラキノン類、ナフトキノン類、インダスレン類、フタロイルアクリドン類、トリスフェノキノン類、アゾ色素、分子内及び分子間電荷移動色素及び色素錯体、トロポン類、テトラジン類、ビス（ジチオレン）錯体、ビス（ベンゼン−ジチオレート）錯体、ヨードアニリン色素、ビス（Ｓ，Ｏ−ジチオレン）錯体がある。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び異なる吸収／発光特性を有するＧＦＰの変種のような蛍光タンパク質も有用である。特定の状況においてはある種の希土類金属（例えば、ユウロピウム、サマリウム、テルビウム又はジスプロシウム）の錯体が使用され、蛍光ナノ結晶（量子ドット）についても同様である。本発明のイメージング剤の１以上は、標識がシスチンのアミン基の位置で起こる場合に蛍光ラベルを含む標識シスチン化合物を含んでいる。その非限定的な例には、ジＢＯＤＩＰＹ（ＦＬ）−シスチン及びモノＢＯＤＩＰＹ（ＦＬ）−シスチンのような緑色蛍光シスチン分子、並びにジＢＯＤＩＰＹ（６５０）−シスチン及びモノＢＯＤＩＰＹ（６５０）−シスチンのような赤色蛍光シスチン分子がある。ＢＯＤＩＰＹ蛍光色素のような蛍光ラベルは、細胞酸化ストレスのインビボイメージング及びインビトロ検出のために特に適している。
【００２７】
蛍光ラベルを含む特定の標識シスチン化合物は、次の構造ＩＶを有している。
【００２８】
【化５】
0005709841.tif 000006
この化合物は、本明細書中ではモノＢＯＤＩＰＹシスチン（ＭＢＣ）ともいわれる。
【００２９】
シスチンに対する蛍光ラベルのコンジュゲーションは、当業者にとって公知の合成化学技法によって実施できる。例えば、光学イメージングのために適する蛍光ラベルで標識されたイメージング剤及びその製法は、Ｌｉｃｈａ（”Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ”ｉｎ  Ｏｐｔｉｃａｌ，Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ，Ｘ−Ｒａｙ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｍａｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ２００２，Ｋｒａｕｓｅ  Ｅｄ．）によって総説されている。
【００３０】
本発明のイメージング剤が放射性同位体ラベルを含む標識シスチン化合物を含んでなる場合、好適な検出方法には、核シンチグラフィー、陽電子放射断層撮影法及び単光子放出断層撮影法がある。陽電子放射断層撮影法のための好ましい放射性同位体ラベルには、11Ｃ、13Ｎ、13Ｏ、17Ｆ、18Ｆ、75Ｂｒ、76Ｂｒ及び124Ｉがある。最も好ましい陽電子放出型放射性非金属は、11Ｃ、13Ｎ、18Ｆ及び124Ｉ、特に11Ｃ及び18Ｆ、とりわけ18Ｆである。単光子放出断層撮影法のための好ましい放射性同位体ラベルは、γ線放出型放射性ハロゲンである。好ましいγ線放出型放射性ハロゲンは、123Ｉ、131Ｉ及び77Ｂｒ、特に123Ｉである。本発明のイメージング剤の１以上は、標識がシスチンのアミン基の位置で起こる場合に放射性同位体標識を可能にする補欠分子族を含んでいる。その非限定的な例には、18Ｆ−フルオロベンズアルデヒドで標識されたシスチンのアミノキシ（ＡＯ）誘導体がある。
【００３１】
シスチン／グルタミン酸輸送体に対する本発明の標識基質もまた、標識化合物（例えば、特に限定されないが、131Ｉで標識されたシスチン基質）を治療目的用の標的中に導入するために使用できる。
【００３２】
好ましい態様では、本発明のイメージング剤は次の構造ＩＩを有する標識シスチン化合物を含む。
【００３３】
【化６】
0005709841.tif 000007
式中、
Ｒ1は放射性同位体ラベルを含み、
点線の結合が単結合である場合にＲ2は水素であり、
点線の結合が二重結合である場合にＲ2は存在しない。
【００３４】
構造ＩＩの特定の標識シスチン化合物は、次の一層詳細な構造ＩＩＩを有する。
【００３５】
【化７】
0005709841.tif 000008
この化合物は、本明細書中ではモノＡＯ−［18Ｆ］−ＦＢＡ−シスチンともいわれる。
【００３６】
18Ｆ標識シスチン化合物の他の例には、特に限定されないが、次の構造Ｖを有する［18Ｆ］フルオロエチル−シスチン又は［18Ｆ］ＦＥ−シスチン
【００３７】
【化８】
0005709841.tif 000009
及び次の構造ＶＩを有する［18Ｆ］フルオロプロパンアミド−シスチン又は［18Ｆ］ＦＰ−シスチンがある。
【００３８】
【化９】
0005709841.tif 000010
標識シスチン化合物が放射性同位体ラベルを含む本発明のイメージング剤は、好適には前駆体化合物から製造される。「前駆体化合物」は、好都合な化学形態の放射性同位体ラベルとの化学反応が部位特異的に起こり、最小数の段階（理想的にはただ１つの段階）で反応を実施でき、かつ格別の精製の必要なしに（理想的にはいかなる追加の精製も必要なしに）所望の標識シスチン化合物が得られるように設計された、標識シスチン化合物の誘導体からなる。かかる前駆体は合成品であり、良好な化学純度で簡便に得ることができる。前駆体化合物は、任意にはある種の官能基に関して１以上の保護基を含むことができる。保護基は当業者にとって公知であり、‘Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ’，Ｔｈｅｏｒｏｄｏｒａ  Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ（Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，２００７）に記載されている。前駆体化合物は、理想的には無菌で非発熱性の形態で供給される。したがって前駆体化合物は、イメージング剤を哺乳動物への投与に適した生体適合性キャリヤーと共に含んでなる医薬組成物の製造のために使用できる。前駆体化合物はまた、かかる医薬組成物を製造するためのキット中に一成分として含めるためにも適している。好ましい実施形態では、前駆体化合物はキット又は自動化合成装置で使用するように設計されたカセットの一部として溶液状態で供給される。
【００３９】
本発明の特定の前駆体化合物は次の構造Ｘを有する。
【００４０】
【化１０】
0005709841.tif 000011
式中、Ｒ''及びＲ'''の一方は前駆体基であり、Ｒ''及びＲ'''の他方は水素であり、前記前駆体化合物は任意にはヒドロキシ、カルボニル及びアミン官能基の１以上に対する保護を含む。「前駆体基」は、好都合な化学形態の放射性同位体ラベルと反応して放射性同位体ラベルを部位特異的に導入する化学基である。好適なかかる前駆体基は、特定の放射性同位体ラベルに関連して以下に記載する。
【００４１】
イメージング剤の放射性同位体ラベルが18Ｆである場合、放射性フッ素原子はフルオロアルキル基又はフルオロアルコキシ基の一部をなすことができる。これは、アルキルフルオリドがインビボでの代謝に耐えるからである。別法として、放射性フッ素原子は直接共有結合によって芳香環に結合することができる。放射性フッ素化は、18Ｆ−フッ化物と良好な脱離基（例えば、ブロミド、メシレート又はトシレート）を含む前駆体基との反応を用いる直接標識によって実施できる。18Ｆはまた、［18Ｆ］−フルオロアルキルブロミド、［18Ｆ］−フルオロアルキルメシレート又は［18Ｆ］−フルオロアルキルトシレートでヒドロキシル前駆体基をＯ−アルキル化することによっても導入できる。アリールジアゾニウム塩、アリールニトロ化合物又はアリール第四級アンモニウム塩からの求核置換が、アリール−18Ｆ誘導体への好適な経路である。18Ｆ標識技法に関する徹底的な総説を、Ｓｎｙｄｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｌｂｏｕｒｎ，”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｉｎｅ−１８  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ”ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｄ．Ｍ．Ｊ．Ｗｅｌｃｈ  ａｎｄ  Ｃ．Ｓ．Ｒｅｄｖａｎｌｙ（２００３，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）に見出すことができる。
【００４２】
放射性ヨウ素化のためには、前駆体化合物は好ましくは、（放射性ヨウ素交換を可能にするための）アリールヨージド又はブロミド、活性化前駆体化合物アリール環（例えば、フェノール基）、有機金属前駆体化合物（例えば、トリアルキルスズ、トリアルキルシリル又は有機ホウ素化合物）、或いはトリアゼンのような有機前駆体化合物又は求核置換のための良好な脱離基（例えば、ヨードニウム塩）を含む。放射性ヨウ素を有機分子中に導入するための前駆体化合物及び方法は、Ｂｏｌｔｏｎ（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｏｍｐ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２００２；４５：４８５−５２８）によって記載されている。好適なボロネートエステル有機ホウ素化合物及びその製法は、Ｋａｂａｌｋａ  ｅｔ  ａｌ（Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２００２；２９：８４１−８４３及び２００３；３０：３６９−３７３）によって記載されている。好適なオルガノトリフルオロボレート及びその製法は、Ｋａｂａｌｋａ  ｅｔ  ａｌ（Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２００４；３１：９３５−９３８）によって記載されている。放射性ヨウ素化用の好ましい前駆体化合物は有機金属前駆体基を含み、最も好ましくはトリアルキルスズを含む。
【００４３】
放射性ヨウ素を結合できるアリール前駆体基の例を以下に示す。
【００４４】
【化１１】
0005709841.tif 000012
これらの前駆体基はいずれも、芳香環上への容易な放射性ヨウ素置換を可能にする置換基を含んでいる。放射性ヨウ素を含む別の置換基は、例えば次式のように、放射性ハロゲン交換による直接ヨウ素化で合成することができる。
【００４５】
【化１２】
0005709841.tif 000013
放射性臭素化は、放射性ヨウ素化化合物に関して上記に記載した前駆体化合物を用いて実施できる。Ｋａｂａｌｋａ  ａｎｄ  Ｖａｒｍａは、放射性臭素化化合物を含む放射性ハロゲン化化合物を合成するための様々な方法を総説している（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９８９；４５（２１）：６６０１−２１）。
【００４６】
本発明の11Ｃ標識イメージング剤は、イメージング剤のデスメチル化バージョンである前駆体化合物を11Ｃ−メチルヨージドと反応させることで直截的に合成できる。また、所望のイメージング剤の特定の炭化水素のグリニャール試薬を［11Ｃ］−ＣＯ2と反応させて、前駆体化合物中のアミン前駆体基と反応して所望の11Ｃ標識ボイメージング剤を与える11Ｃ試薬を得ることによって11Ｃを導入することも可能である。グリニャール試薬は、所望の放射性標識部位にハロゲン化マグネシウム前駆体基を含んでいる。11Ｃの半減期は２０．４分にすぎないので、11Ｃ標識中間体は高い比放射能を有すること、したがってできるだけ速い反応プロセスを用いてそれを製造することが重要である。かかる11Ｃ標識技法に関する徹底的な総説を、Ａｎｔｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ，”Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  11Ｃ−Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｄ．Ｍ．Ｊ．Ｗｅｌｃｈ  ａｎｄ  Ｃ．Ｓ．Ｒｅｄｖａｎｌｙ（２００３，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）に見出すことができる。
【００４７】
構造Ｉのジスルフィド結合は細胞内で還元され、もはやｘｃ−輸送体の基質ではなくなる結果、イメージング剤はこの経路を通して細胞から出ることはできない。蛍光ラベル又は放射性同位体ラベル（Ｒ）はアミンにコンジュゲートされているので、得られる細胞内の還元イメージング剤は代謝されない。したがって、イメージング剤は活性化されたｘｃ−輸送体を介して細胞に入り、そして細胞内に保持される。単一標識シスチン化合物はＲ’の位置にＨを有しているが、Ｒ’の位置にある第２のアミンに追加のラベルを付加することもできる。
【００４８】
標識シスチンを例に挙げれば、シスチンは１つ又は２つの遊離アミンの位置で標識される。輸送体を介して細胞中に導入される際、それは標識システインに還元される。これはもはや輸送体の基質ではなく、したがって同じ侵入機構によって細胞から排出することはできない。アミンはラベルにコンジュゲートされているので、標識システインはグルタチオン合成又はタンパク質合成のための基質ではなく、ラベルは細胞内に捕捉される。
【００４９】
検査した多種多様のヒト組織及び細胞のうち、ｘｃ−輸送体は主として脳において発現され、また膵臓及び培養細胞株においても発現される。ｘｃ−輸送体の発現は大抵の組織において非常に低いが、酸化ストレスの条件下及び培養中の細胞が増殖する場合にアップレギュレートされることがある。ｘｃ−輸送体は、アポトーシス刺激、酸化ストレス、炎症、シスチン欠乏及び化学療法耐性を含む複数の条件下で誘発される。
【００５０】
好適なもの及び好ましいものとして上記に定義された本発明のイメージング剤は、好ましくはイメージング剤を哺乳動物への投与に適した形態の生体適合性キャリヤーと共に含んでなる医薬組成物として提供される。これらの医薬組成物は、本発明の独立した態様をなしている。
【００５１】
「生体適合性キャリヤー」は、医薬組成物が生理学的に認容され得るようにして（即ち、毒性又は過度の不快感なしに哺乳動物体に投与できるようにして）イメージング剤を懸濁又は溶解するための流体（特に液体）である。生体適合性キャリヤーは、好適には、無菌のパイロジェンフリー注射用水、（有利には注射用の最終生成物が等張性又は非低張性になるように平衡させ得る）食塩水のような水溶液、或いは１種以上の張度調整物質（例えば、血漿陽イオンと生体適合性対イオンとの塩）、糖（例えば、グルコース又はスクロース）、糖アルコール（例えば、ソルビトール又はマンニトール）、グリコール（例えば、グリセロール）又は他の非イオン性ポリオール物質（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の水溶液のような注射可能なキャリヤー液体である。生体適合性キャリヤーはまた、エタノールのような生体適合性有機溶媒を含んでいてもよい。かかる有機溶媒は、親油性の高い化合物又は配合物を可溶化するために有用である。好ましくは、生体適合性キャリヤーはパイロジェンフリー注射用水、等張食塩水又はエタノール水溶液である。静脈内注射用生体適合性キャリヤーのｐＨは好適には４．０〜１０．５の範囲内にある。
【００５２】
シスチン／グルタミン酸アンチポーター（ｘｃ−輸送体系）を介して細胞中に取り込のれるこれらのイメージング剤は、特に限定されないが、細胞酸化ストレスを含む病変又は病状のイメージングをはじめとして、インビボでの細胞酸化ストレスのイメージングを行うために使用できる。これらのイメージング剤が有益であるイメージング用途には、特に限定されないが、化学療法治療モニタリング、虚血／発作、炎症、外傷性脳損傷及び臓器移植モニタリングがある。
【００５３】
したがって、別の態様では、本発明は、シスチン／グルタミン酸輸送体を有する生物学的試料のイメージングを行う方法であって、
シスチン／グルタミン酸輸送体を介して請求項１記載のイメージング剤を前記生物学的試料中に導入する段階、及び
蛍光顕微鏡検査、レーザー共焦点顕微鏡検査、交差偏光顕微鏡検査、光学イメージング、核シンチグラフィー、陽電子放射断層撮影法又は単光子放射断層撮影法を用いて前記イメージング剤を検出する段階
を含んでなる方法に関する。
【００５４】
生物学的試料は、好ましくはインビトロ細胞培養物である。この場合、本発明のイメージング剤を導入する段階は、適当な緩衝液中に懸濁したイメージング剤をインビトロ細胞培養物に添加し、次いで好ましくは生理的温度で所定時間のインキュベーションを行うことで実施される。続いて、当業者にとって公知の蛍光顕微鏡検査、レーザー共焦点顕微鏡検査又は交差偏光顕微鏡検査技法を用いて検出段階が実施される。例えば、”Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００６，Ｌａｋｏｗｉｔｚ，Ｅｄ．を参照されたい。
【００５５】
別法として好ましくは、生物学的試料はインタクトな哺乳動物被験体である。生物学的試料がインタクトな哺乳動物被験体である場合、イメージング剤は好ましくは本発明の医薬組成物として投与される。好ましくは、前記被験体への投与は非経口的に実施され、最も好ましくは静脈内に実施される。静脈内経路は、イメージング剤を被験体の身体全域に送達するための最も効率的な方法である。静脈内投与は、実質的な物理的介入も実質的な健康リスクももたらさない。本発明のイメージング剤は、好ましくは本明細書中に定義された本発明の医薬組成物として投与される。
【００５６】
生物学的試料がインタクトな哺乳動物被験体である場合、好ましくは前記イメージング剤は上記に定義された構造ＩＩ又は構造ＩＩＩのシスチン化合物を含み、イメージング方法の検出段階は好ましくは陽電子放射断層撮影法又は単光子放出断層撮影法を用いて実施される。陽電子放射断層撮影法のためには、前記イメージング剤は上記に定義された構造ＩＩＩの標識シスチン化合物を含むことが好ましい。
【００５７】
さらに別の態様では、本発明は、細胞における酸化ストレスを検出する方法であって、
請求項１記載のイメージング剤を細胞のシスチン／グルタミン酸アンチポーター中に導入する段階、
細胞内の標識シスチン化合物を標識システインに還元させる段階、及び
細胞内の標識システインを検出する段階
を含んでなる方法を提供する。
【００５８】
前記イメージング方法及び前記酸化ストレス検出方法に関して好ましくは、前記検出はアポトーシス細胞で実施される。
【実施例】
【００５９】
以下、イメージング剤及び使用方法の様々な実施形態を例示するために使用した非限定的な実施例を示す。
【００６０】
実施例１
アポトーシス細胞に関するインビトロアッセイにおいて、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞を１μＭスタウロスポリンの存在下又は不存在下で１６時間培養し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）及びＣｙ５−アネキシンＶ（アネキシン）で染色した。通例、約３０〜５０％の細胞は何らかのアポトーシス又は壊死段階にあることが判明した。フローサイトメトリーを用いて、正常（ＰＩ及びアネキシン陰性）、初期アポトーシス（ＰＩ陰性、アネキシン陽性）並びに後期アポトーシス及び壊死（ＰＩ及びアネキシン陽性）として定義される細胞集団を同定した。結果を図２Ａ及び図２Ｂに示す。図２Ａは、非アポトーシス細胞（暗い灰色）と異なる顆粒度を有する若干の後期アポトーシス細胞（明るい灰色）を示す前方散乱／側方散乱プロットである。図２Ｂには、アネキシンＶ及びＰＩ陰性の細胞が象限Ｄ３内に示されており、これらは非アポトーシス細胞を表している。象限Ｄ４内の細胞は、アネキシンＶ染色に対して陽性であるがＰＩ染色に対しては陰性である初期アポトーシス細胞を表している。象限Ｄ２内の細胞は、アネキシンＶ染色及びＰＩ染色の両方に対して陽性である後期アポトーシス細胞及び壊死細胞を表している。
【００６１】
実施例２
Ｊｕｒｋａｔ細胞を１μＭスタウロスポリン（ＳＴＮ）の存在下（図３Ｂ）及び不存在下（図３Ａ）で１６〜１８時間インキュベートし、アネキシンＶ−Ｃｙ５及びヨウ化プロピジウムで染色し、ＤＢＣと共に３０分間インキュベートした。ＤＢＣはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社からの市販製品（カタログ＃Ｂ２０３４０）であって、酸性条件下でのジスルフィド交換反応によるヌクレオチド、タンパク質及び細胞の可逆チオール標識のために販売されている。ＤＢＣは以下に示す構造を有する。
【００６２】
【化１３】
0005709841.tif 000014
図３Ａでは、未処理細胞がＤＢＣ分子の取込み又は非特異的結合に対応する若干の低強度蛍光を示している。図３Ｂでは、スタウロスポリン誘発細胞が高強度ＤＢＣ染色を示す細胞亜集団を有しており、これは主として後期アポトーシス／壊死細胞（＋アネキシンＶ、＋ＰＩ）と相関していた。中間のＤＢＣ染色を示す細胞集団も出現したが、これは初期アポトーシス細胞（＋アネキシンＶ、−ＰＩ）とよく相関している。このアポトーシス細胞標識アッセイにおけるｘｃ−輸送体の役割を一層詳しく検討するため、Ｊｕｒｋａｔ細胞をｘｃ−輸送体の強力な特異的阻害剤であるスルファサラジンとも一緒にインキュベートした。細胞は、ＤＢＣと同時にシスチン／グルタミン酸輸送体の特異的阻害剤（スルファサラジン、ｓａｓｚ）を添加した点を除き、図２Ｂと同様に処理した（図３Ｃ）。図３Ｃでは、中間のＤＢＣ染色を示す細胞集団が見出されたが、これは後期アポトーシス細胞（＋アネキシンＶ、＋ＰＩ）のみとよく相関していた。図３Ｄでは、実施例１と同様に細胞を正常、初期アポトーシス又は後期アポトーシスとして類別し、増加したＤＢＣ染色を示す細胞のパーセントを各カテゴリーに関して記録した。初期及び後期アポトーシス細胞はＤＢＣで標識されたが、これは初期アポトーシス細胞のみにおいてｓａｓｚにより阻害された。したがって、ＤＢＣはシスチン／グルタミン酸輸送体の活性によって初期アポトーシス細胞を標識し、シスチンのアミンを介して２つの発蛍光団にコンジュゲートするものの、輸送体基質として作用する。このデータは、ＤＢＣに関して初期アポトーシス細胞で見られる取込みが何らかの他の機構ではなくｘｃ−輸送体に依存することを示している。
【００６３】
実施例３
アポトーシスＪｕｒｋａｔ細胞によるＤＢＣの取込みは、ｘｃ−輸送体が酸化ストレス（及びこの場合にはアポトーシス）を受ける細胞で活性化されることばかりでなく、ｘｃ−輸送体がこの基質（シスチン）をアミン付加緑色発蛍光団（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ）と共に細胞中に導入するのに十分な程度に無差別的であることも示している。輸送体の無差別性をさらに確認するため、赤色発蛍光団（ＢＯＤＩＰＹ６５０）を有する標識シスチンを合成した。ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ標識シスチンとの並行比較において、ＤＢＣ−６５０は図４Ａ及び図４Ｂに示されるように正常細胞以上にアポトーシス細胞を標識するようには見えず、ある種のラベルはｘｃ−輸送体の基質状態を維持するには十分でないことを示している。この実施例では、ＢＯＤＩＰＹ６５０発蛍光団及び関連するリンカーはＤＢＣ（図４Ａ）の場合より大きく、したがってサイズが輸送体を通過する能力を維持しながらアミンに付加される基を制限する一因をなしている。
【００６４】
実施例４
前出の実施例から、ラベルのサイズを小さく保つことが重要である。小さい標識シスチン化合物は、ＤＢＣ−６５０やＤＢＣのような大きい標識シスチン化合物よりも適切な基質として役立つ。したがって、アミンの一方のみの位置にＢＯＤＩＰＹ蛍光ラベルを用いて、小さい蛍光シスチン化合物であるモノＢＯＤＩＰＹシスチン（ＭＢＣ）を合成した。この分子は、市販のシスチン及びＢＯＤＩＰＹ  ＦＬスクシンイミジルエステル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｄ２１８４）を用いて創製し、逆相ＨＰＬＣによって精製し、質量分析法で分析して正しい生成物であることを確認した。ＭＢＣは以下に示す構造を有する。
【００６５】
【化１４】
0005709841.tif 000015
Ｊｕｒｋａｔ細胞を１μＭ  ＳＴＮと共に１６〜１８時間インキュベートし、アネキシンＶ−Ｃｙ５及びヨウ化プロピジウムで染色し、シスチン／グルタミン酸阻害剤（ｓａｓｚ）を添加しない場合（図５Ａ）及び添加した場合（図５Ｂ）においてＭＢＣと共に３０分間インキュベートした。図５Ａでは、ＭＢＣ標識は高強度蛍光シフトを示す細胞亜集団として可視化され、これは初期及び後期アポトーシス細胞（図５Ｃ）の両方によく対応している。中間の集団は明らかでなく、これはＭＢＣがＤＢＣより高い強度で初期アポトーシス細胞を標識することを示唆していた。図５Ｂでは、スルファサラジンの添加はより少数の標識細胞をもたらし、蛍光強度のシフトも小さかった。この集団は後期アポトーシス細胞とよく相関しており、初期アポトーシス細胞とはあまり相関していなかった（図５Ｃ）。この実施例では、（ただ１つのラベルしか持たない）ＭＢＣはＤＢＣより小さく、天然の輸送体基質であるシスチンに一層よく似ている結果、初期アポトーシス細胞を標識するために向上した性能を有するイメージング剤を与える。ＭＢＣの場合、正常細胞中へのバックグラウンド取込みが少なく、シスタチオニン化合物当たりの発蛍光団が１つ少ないものの、アポトーシス細胞に関する蛍光強度の増加の大きさが犠牲にならない。
【００６６】
実施例５
還元可能なジスルフィド結合を含むイメージング剤は細胞内区画の内部で還元されるはずであり、したがってシスチン／グルタミン酸輸送体によって排出されるべき基質とはならず、ラベルは細胞内に捕捉されることになる。この作用を示すため、以下の構造を有するジＢＯＤＩＰＹシスタチオニン（ＤＢシスタチオニン）イメージング剤を処方した。
【００６７】
【化１５】
0005709841.tif 000016
また、陰性対照として、以下の構造を有するＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ  Ｃ５（これはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から商業的に入手できる）も使用した。
【００６８】
【化１６】
0005709841.tif 000017
図６Ａは、ＤＢＣ、ＤＢＣ（６５０）、ＤＢシスタチオニン、ＭＢＣ及び陰性対照（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ  Ｃ５）による正常、初期アポトーシス及び後期アポトーシスＪｕｒｋａｔ細胞のＢＯＤＩＰＹ染色の比較を示している。ＤＢＣ、ＤＢシスタチオニン及びＭＢＣは初期アポトーシス細胞を染色し、ＤＢＣ（６５０）は後期アポトーシス細胞のみを染色し、陰性対照はアポトーシス細胞に関していかなる蛍光シフトも示さない。このデータから、ＤＢＣ、ＤＢシスタチオニン及びＭＢＣはアポトーシス細胞に対してすべて同等のラベルである。しかし、図６Ｂでは、初期アポトーシス細胞における蛍光強度の倍率シフトが各イメージング剤について正常細胞と比較されている。ＭＢＣが使用した他の蛍光イメージング剤より強力な染色を与えることは明らかである。
【００６９】
実施例６
前出の実施例から明らかな通り、ただ１つの小さいラベルを有することが有益である。小さい標識シスチン化合物は、ＤＢＣ−６５０のような大きい標識シスチン化合物よりも適切な基質として役立つ。したがって、ただ１つのアミンが［18Ｆ］アミノキシ−フルオロベンズアルデヒドにコンジュゲートされた標識シスチン化合物（モノＡＯ−［18Ｆ］−ＦＢＡ−シスチン）を合成したが、これはＰＥＴイメージング用途のために使用できる。最初に、以下の構造を有するアミノキシ−シスチン前駆体（モノＡＯ−シスチン）を合成した。
【００７０】
【化１７】
0005709841.tif 000018
一般には、次いでモノＡＯ−シスチンを［18Ｆ］フルオロベンズアルデヒドにコンジュゲートすることで、以下の構造を有するモノＡＯ−［18Ｆ］−ＦＢＡ−シスチンを得た。
【００７１】
【化１８】
0005709841.tif 000019
モノＡＯ−［18Ｆ］−ＦＢＡ−シスチンの合成方法の一層詳しい非限定的な一例を以下に示す。
【００７２】
すべての反応は、窒素雰囲気下又は窒素でパージしたクリンプトップ密封バイアル中で実施した。Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ  ２２２（Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びＫ2ＣＯ3（ＥＭＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）は購入し、受け入れたままで使用した。Ｏｐｔｉｍａ（商標）グレードのアセトニトリルをＨＰＬＣ溶媒及び反応溶媒として使用した。
【００７３】
［18Ｆ］ＫＦ（精製水中で４０ｍＣｉ・ｍＬ-1（１４８０ＭＢｑ・ｍＬ-1））をＩＢＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社（オールバニー、米国ニューヨーク州）又はＰＥＴＮＥＴ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社（オールバニー、米国ニューヨーク州）から入手し、受け入れたままで使用した。［18Ｆ］−フッ化物をまずＣｈｒｏｍａｆｉｘ  ３０−ＰＳ−ＨＣＯ3陰イオン交換カートリッジ（ＡＢＸ社、ラーデベルク、ドイツ）上に固定化し、次いでＫｒｙｐｔｏｆｉｘ  Ｋ２２２（３７６ｇ・ｍｏｌ-1、８ｍｇ、２．１３×１０-5ｍｏｌ）及び炭酸カリウム（１３８．２ｇ・ｍｏｌ-1、２．１ｍｇ、１．５２×１０-5ｍｏｌ）を含むアセトニトリル及び蒸留脱イオン水（ｄｄＨ2Ｏ）の４：１混合物１ｍＬを用いてドライダウン容器内に溶出した。穏やかに加熱（約４５℃）しながら部分真空及び窒素流下で溶媒を除去した（約１５分）。次に、Ｋ２２２（８ｍｇ）を含む０．５ｍＬのアセトニトリルで供給源バイアル及び陰イオン交換カートリッジを洗浄し、再び反応混合物を部分真空及び穏やかな加熱下で乾固した（約１０分）。反応器を窒素で再加圧し、さらに０．５ｍＬのアセトニトリルを用いて共沸ドライダウンを２回繰り返した。４−ホルミル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアニリニウムトリフレート（３１３．３０ｇ・ｍｏｌ-1、３．１ｍｇ、９．８９×１０-6ｍｏｌ）を０．３５ｍＬの無水ＤＭＳＯ（Ａｃｒｏｓ社）に溶解し、［18Ｆ］ＫＦ・Ｋ２２２及びＫ2ＣＯ3を含む反応器に直接添加した。反応混合物を９０℃で１５分間加熱し、直ちに３ｍＬの蒸留脱イオンＨ2Ｏ（ｄｄＨ2Ｏ）で冷却しかつ奪活した。続いて、この混合物を陽イオン交換カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ  ＳｅｐＰａｋ  Ｌｉｇｈｔ  Ａｃｃｅｌｌ  Ｐｌｕｓ  ＣＭ）に通し、ｄｄＨ2Ｏで１０ｍＬに希釈し、逆相Ｃ１８  ＳｅｐＰａｋ（Ｗａｔｅｒｓ  ＳｅｐＰａｋ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８）上に装填した。ＳｅｐＰａｋを１０ｍＬのｄｄＨ2Ｏでフラッシュし、次いで３０ｍＬの空気でパージした。［18Ｆ］４−フルオロベンズアルデヒド（［18Ｆ］ＦＢＡ）を１．０ｍＬのメタノールで溶出した。
【００７４】
別途、高回収バイアル（２ｍＬ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にモノアミノキシシスチン（３８６．２７ｇ・ｍｏｌ-1、２．７ｍｇ、６．９９×１０-6ｍｏｌ）を仕込んだ。固体を２５０μＬのｄｄＨ2Ｏ及び８μＬのトリフルオロ酢酸中に懸濁した。メタノール中の［18Ｆ］ＦＢＡ（上記参照）５００μＬを反応バイアルに移した。容器にキャップを付け、クリンプ加工し、加熱ブロック中に配置し（反応開始時の放射能４．６６ｍＣｉ／１７２ＭＢｑ）、６０℃に１５分間保った。この時点で分析ＨＰＬＣでの分析のために小アリコート（＜５μＬ）を取り出した。半分取ＨＰＬＣ精製のための準備として、０．１％ＴＦＡを含む２５０μＬのｄｄＨ2Ｏを用いて溶液を約１０００μＬに希釈してｄｄＨ2Ｏ及びＭｅＯＨの１：１最終粗生成物を得た。［18Ｆ］ＦＢ−シスチンを半分取ＨＰＬＣによって単離精製した。生成物（０．４０９ｍＣｉ／１５．１ＭＢｑ）を含むＨＰＬＣ画分をｄｄＨ2Ｏで５：１に希釈し、次いでｔＣ１８  Ｐｌｕｓ  ＳｅｐＰａｋ（Ｗａｔｅｒｓ社）上に固定化した。ＳｅｐＰａｋをまず５ｍＬのｄｄＨ2Ｏで、次いで３０ｍＬの空気でフラッシュした。まずボイド容積（約０．５ｍＬ）を溶出させ、次いで２５０〜３００μＬの溶出液を独立のフラスコ内に集めることにより、［18Ｆ］ＦＢ−Ｃｙｓ（０．１７ｍＣｉ、６．３ＭＢｑ）を最小量のＤＭＳＯ中に単離した。放射化学純度及び化学純度を確定するため、単離した生成物に関してＲＰ−ＨＰＬＣ分析を実施した。通例、処方後分析のためには１０μＬの０．１μＣｉ／μＬ溶液を注入した。単離放射化学収率は３．６％（［18Ｆ］ＦＢＡ添加からの崩壊補正値６．６％）であり、放射化学純度は９６．８％であった。
【００７５】
分析ＨＰＬＣ条件：分析は、Ｇ１３１１Ａ  ＱｕａｔＰｕｍｐ、１００μＬシリンジ及び２．０ｍＬシートキャピラリーを有するＧ１３１３Ａオートインジェクター、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、５μ、１００Å（Ｓ／Ｎ  ４２０４７７−１０））、Ｇ１３１６Ａカラムヒーター、Ｇ１３１５Ａ  ＤＡＤ並びにＲａｍｏｎ  Ｓｔａｒ−ＧＡＢＩγ線検出器を備えたＨＰ  Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００上で実施した。９５：５  ｄｄＨ2Ｏ：ＣＨ3ＣＮ（０．０５％ＴＦＡを含む）、溶媒Ｂ：ＣＨ3ＣＮ（０．０５％ＴＦＡを含む）。勾配溶出：０分，０％Ｂ、１分，１５％Ｂ、１０分，３１％Ｂ、１０．５分，１００％Ｂ、１３．５分，１００％Ｂ、１４分，０％Ｂ、１７分，０％Ｂ（ＴＲ約７．１分）。
【００７６】
半分取ＨＰＬＣ条件：精製は、ＤＧ−２０８０−５４  ４ラインデガッサー、ＭＸ−２０８０−３２ダイナミックミキサー、２台のＰＵ−２０８６  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｅｐポンプ、大容量注入キットを取り付けたＡＳ−２０５５  Ｐｌｕｓ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔオートインジェクター、ガード（Ｓ／Ｎ  ２９５８６０−１、Ｐ／Ｎ  ００Ｇ−４２５２−Ｎ０）付きのＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ５μ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）１００Å，２５０×１０ｍｍ，５μカラム、ＭＤ−２０５５  ＰＤＡ、及び固体ＳｉＰＩＮフォトダイオードγ線検出器に取り付けたＣａｒｒｏｌ  ＆  Ｒａｍｓｅｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｍｏｄｅｌ  １０５Ｓアナログレートメーターを備えたＪａｓｃｏ  ＬＣ上で実施した。勾配溶出：０分，０％Ｂ、３分，２０％Ｂ、４２分，７０％Ｂ、４２．５分，１００％Ｂ、４６分，１００％Ｂ、５０分，０％Ｂ。溶媒Ａ：ｄｄＨ2Ｏ：ＣＨ3ＣＮ（０．０５％ＴＦＡを含む）、溶媒Ｂ：ＣＨ3ＣＮ（０．０５％ＴＦＡを含む）（ＴＲ約１４．７分）。
【００７７】
モノＡＯ−［18Ｆ］−ＦＢＡ−シスチンをインビトロ細胞取込みアッセイで使用した。かかるアッセイでは、モノＡＯ−［18Ｆ］−ＦＢＡ−シスチンを培養細胞と共に３０分間インキュベートし、食塩水で２回洗浄した後、細胞を１Ｎ  ＮａＯＨで溶解し、γ線カウンターでの分析のために集めた。図７は２種の細胞株におけるモノＡＯ−［18Ｆ］−ＦＢＡ−シスチンの取込みを示しており、これはＪｕｒｋａｔ細胞株及びＡ５４９細胞株におけるシスチン／グルタミン酸輸送体の基礎発現及び活性が異なることを表している。
【００７８】
７％エタノール／食塩水中に処方したこの分子の薬物動態学的プロファイルを健常マウスで確定し、図８Ａ及び図８Ｂに示す。天然のＢａｌｂ／ｃマウスに薬物１５μＣｉの18Ｆ−シスチンを注射し、注射後５分、３０分及び１２０分の時点を取り上げた。図８Ａは、天然のＢａｌｂ／ｃマウスにおける体内分布結果を注射量の％（％ＩＤ）として示している。体外へのクリアランスは、腎臓、膀胱及び尿のプロファイルによって示されるように主として腎排泄による。図８Ｂは、図８Ａに示したものと同じデータの％ＩＤ／グラムを示している。２頭のマウスにおいて、ラジオトレーサーの注射から２時間前に抗Ｆａｓ抗体の注射でアポトーシスを誘発した。モノＡＯ−［18Ｆ］−ＦＢＡ−シスチンの注射から２時間前に抗Ｆａｓ抗体の注射で肝臓にアポトーシスを誘発した２頭の動物を調べた。これまでに調べた動物の数は少ないものの、両者とも対照動物より高い肝臓取込みを示している。
【００７９】
図８Ｃは、Ａ５４９腫瘍の異種移植片を有するヌードマウスにおいて行った研究からの（％ＩＤ／グラムで表した）同様な体内分布結果を示している。１２０分及び２４０分の時点で、ラジオトレーサーは、血液又は他の組織（腎臓及び膀胱を除く）中より多くの％ＩＤ／グラムを腫瘍中に検出するのに十分な程度まで排出された。各時点に関する腫瘍／血液比を図８Ｄに示す。これらの結果は、放射性標識シスチン化合物がインビボでシスチン／グルタミン酸輸送体活性を検出するために使用できることを示唆している。
【００８０】
図９は、食塩水中におけるモノＡＯ−［18Ｆ］−ＦＢＡ−シスチン分子の経時的安定性を示している。図示の通り、４時間にわたってγ線トレースプロファイルのいかなる変化も存在しなかった。
【００８１】
図１０は注射から６０分後における天然マウスのＰＥＴ画像中でのモノＡＯ−［18Ｆ］−ＦＢＡ−シスチンを示しており、これは主として腎臓及び膀胱経由でのクリアランスを示している。
【００８２】
別の非限定的な実施例として、シスチンを123Ｉ−ヨードベンズアルデヒドで標識することができる。これを製造するには、フルオロベンズアルデヒドと同様に、まずＡＯ−Ｃｙｓ（２．５ｍｇ）を含む高回収バイアル（２ｍＬ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に［123Ｉ］４−ヨードベンズアルデヒド（［123Ｉ］ＩＢＡ）を添加する。ポリペプチドを０．５ｍＬのｄｄＨ2Ｏに溶解し、８μＬのトリフルオロ酢酸を添加し、次いで０．５ｍＬのメタノール中の［123Ｉ］ＩＢＡを添加することで反応が開始する。容器にキャップを付け、クリンプ加工し、加熱ブロック中に配置し、６０℃に１５分間保つ。小アリコート（＜５μＬ）を取り出し、分析ＨＰＬＣでの分析を行って反応の状態を評価する。［123Ｉ］ＩＢ−シスチンを半分取ＨＰＬＣによって単離精製する。生成物を含むＨＰＬＣ画分をさらにｄｄＨ2Ｏで（５：１に）希釈し、次いで生成物をｔＣ１８  Ｐｌｕｓ  ＳｅｐＰａｋ（Ｗａｔｅｒｓ社）上に固定化する。ＳｅｐＰａｋをまず５ｍＬのｄｄＨ2Ｏで、次いで３０ｍＬの空気でフラッシュする。まずボイド容積（約０．５ｍＬ）を溶出させ、次いで２５０〜３００μＬの溶出液を独立のフラスコ内に集めることにより、［123Ｉ］ＩＢ−シスチンを最小量のエタノール中に得る。次いで、単離した生成物に関してＲＰ−ＨＰＬＣ分析を実施して放射化学純度及び化学純度を確定する。
【００８３】
本明細書中には本発明の若干の特徴のみを例示し説明したが、当業者には数多くの修正及び変更が想起されるであろう。したがって、添付特許請求の範囲は本発明の真の技術思想の範囲内に含まれるすべてのかかる修正及び変更を包含することを理解すべきである。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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