(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の酵素学的性質を有する、プレクトスファエレラ ＫＳＭ−Ｐ５７（Plectosphaerella sp.KSM−P57; FERM P-22057）由来のポリガラクツロナーゼ。
（１）作用：ポリガラクツロン酸、ペクチン及びプロトペクチンに作用し、ポリガラクツロン酸のα−１，４結合をエンド的に加水分解し、オリゴガラクツロン酸を生成する。
（２）最適反応ｐＨ：ｐＨ５付近（酢酸緩衝液）
（３）最適反応温度：約５０℃（酢酸緩衝液、ｐＨ５）
（４）分子量：約２４０００（ゲル濾過法）
【請求項２】
更に、下記（５）及び（６）から選択される１以上の酵素学的性質を有する請求項１記載のポリガラクツロナーゼ。
（５）ｐＨ安定性：ｐＨ２〜１２（４０℃、６０分間処理）
（６）耐熱性：約５０℃まで安定（酢酸緩衝液、ｐＨ５、１５分間処理）
【請求項３】
プレクトスファエレラ ＫＳＭ−Ｐ５７（Plectosphaerella sp.KSM−P57; FERM P-22057）で特定される真菌。
【請求項４】
プレクトスファエレラ ＫＳＭ−Ｐ５７（Plectosphaerella sp.KSM−P57; FERM P-22057）で特定される真菌を培養し、培養物からポリガラクツロナーゼを採取することを特徴とする請求項１記載のポリガラクツロナーゼの製造法。
【請求項５】
ポリガラクツロン酸又はペクチンに、請求項１又は２記載のポリガラクツロナーゼを作用させることを特徴とするモノ及びオリゴガラクツロン酸の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はエンド型分解様式を示すポリガラクツロナーゼ及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリガラクツロナーゼは、一般にペクチナーゼとも呼ばれ、ポリガラクツロン酸（「ペクチン酸」とも称する）やペクチンを分解する加水分解酵素である。斯かるポリガラクツロナーゼは、その最適反応ｐＨを酸性−弱酸性に有していることから、主に食品工業用酵素として用いられているが、衣料用洗剤酵素としての利用も試みられている（特許文献１〜３）。
食品工業においては、一般的に作用pHの低い領域で効率良く働くポリガラクツロナーゼが必要とされるが、衣料用洗浄剤、繊維処理等に使用される場合には、界面活性剤、キレート剤等に対し安定であることが必要とされる。また、更に植物性繊維においてペクチン質は不溶性ペクチンであるプロトペクチンとして存在しているため、プロトペクチンを分解する能力（プロトペクチナーゼ活性）も有していることが好ましい。
【０００３】
一方、ペクチン又はペクチン酸にポリガラクツロナーゼを作用させ生成されるオリゴガラクツロン酸には、大腸菌などに対する静菌作用や植物の対微生物防御反応を誘導する作用があるとされ、当該酵素を用いてオリゴガラクツロン酸をより効率よく製造する方法も検討されている（特許文献４）。
【０００４】
ポリガラクツロナーゼには、作用様式がエキソ型のものとエンド型のものがあるが、メチルエステル化等の修飾を受けた基質に対する反応性が良い点から、洗剤酵素として使用する場合、エンド型のものが好ましい。エンド型のものはカビや植物由来のものが多く、例えば、至適ｐＨが４で、分子量が３６０００のＰＥＣ−Ｍ１（シグマ社）、至適ｐＨが５．５で、分子量が４２０００のＰＥＣ−Ｍ２（シグマ社）、また至適ｐＨが4.5で、分子量が４１０００の糸状菌アクレモニウム・セルロリティカス由来のポリガラクツロナーゼ（特許文献５）が知られている。
しかしながら、常温での安定ｐＨ領域が狭かったり、プロトペクチナーゼ活性が低い等の問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭６０−２２６５９９号公報
【特許文献２】特許第２０３３５８０号公報
【特許文献３】国際公開第９８／０６８０９号パンフレット
【特許文献４】特開平６−２０５６８７号公報
【特許文献５】特開２００１−６１４７３公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、エンド型分解様式を示し、プロトペクチナーゼ活性を有し、常温で広いｐＨ領域において安定で、食品工業用のみならず衣料用洗剤酵素としても有用なポリガラクツロナーゼ及びその製造法、並びに当該酵素を用いたモノ及びオリゴガラクツロン酸の製造法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、土壌中の微生物が産生する酵素のスクリーニングを行ったところ、高いプロトペクチナーゼ活性を有し、界面活性剤、キレート剤に耐性で、且つ常温で酸性からアルカリ性領域の広いｐＨ領域において安定である、エンド型のポリガラクツロナーゼを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の[１]〜[９]に係るものである。
［１］下記の酵素学的性質を有するポリガラクツロナーゼ。
（１）作用：ポリガラクツロン酸、ペクチン及びプロトペクチンに作用し、ポリガラクツロン酸のα−１，４結合をエンド的に加水分解し、オリゴガラクツロン酸を生成する。
（２）最適反応ｐＨ：ｐＨ５付近（酢酸緩衝液）
（３）最適反応温度：約５０℃（酢酸緩衝液、ｐＨ５）
（４）分子量：約２４０００（ゲル濾過法）
［２］プレクトスファエレラ属真菌由来である［１］のポリガラクツロナーゼ。
［３］プレクトスファエレラ属真菌がプレクトスファエレラ ＫＳＭ−Ｐ５７（Plectosphaerella sp.KSM−P57; FERM P-22057）である［２］のポリガラクツロナーゼ。
［４］更に、下記（５）及び（６）から選択される１以上の酵素学的性質を有する［１］〜［３］のポリガラクツロナーゼ。
（５）ｐＨ安定性：ｐＨ２〜１２（４０℃、６０分間処理）
（６）耐熱性：約５０℃まで安定（酢酸緩衝液、ｐＨ５、１５分間処理）
［５］［１］のポリガラクツロナーゼを産生するプレクトスファエレラ属真菌。
［６］プレクトスファエレラ ＫＳＭ−Ｐ５７（Plectosphaerella sp.KSM−P57; FERM P-22057）である［５］の真菌。
［７］プレクトスファエレラ属真菌を培養し、培養物からポリガラクツロナーゼを採取することを特徴とする［１］のポリガラクツロナーゼの製造法。
［８］プレクトスファエレラ属真菌がプレクトスファエレラ ＫＳＭ−Ｐ５７（Plectosphaerella sp.KSM−P57; FERM P-22057）である［７］のポリガラクツロナーゼの製造法。
［９］ポリガラクツロン酸又はペクチンに、［１］〜［４］のポリガラクツロナーゼを作
用させることを特徴とするモノ及びオリゴガラクツロン酸の製造法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のポリガラクツロナーゼは、ポリガラクツロン酸及びペクチンに対しエンド的に作用し、最適反応pHをpH５付近に有し、常温で広いｐＨ領域において安定であることから、保存自由度が高い。そして、優れたプロトペクチナーゼ活性を示し、キレート剤存在下、界面活性剤存在下においても活性を維持することから、食品工業用のみならず衣料用洗剤酵素、繊維処理用酵素としても有用である。また、本発明のポリガラクツロナーゼを用いることによりモノ及びオリゴポリガラクツロン酸を生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明のポリガラクツロナーゼ活性に及ぼすpHの影響を示す図である。
【図２】本発明のポリガラクツロナーゼ活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図３】本発明のポリガラクツロナーゼ安定性に及ぼすpHの影響を示す図である。
【図４】本発明のポリガラクツロナーゼ安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図５】本発明のポリガラクツロナーゼのプロトペクチナーゼ活性を市販のポリガラクツロナーゼのそれと比較した図である。Ｍ１：ＰＥＣ−Ｍ１、Ｍ２：ＰＥＣ−Ｍ２
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のポリガラクツロナーゼは、下記の（１）〜（４）の酵素学的性質を有する。
（１）作用：
ポリガラクツロン酸（ペクチン酸）、ペクチン及びプロトペクチンに作用し、ポリガラクツロン酸のα−１，４結合をエンド的に加水分解し、オリゴガラクツロン酸を生成する。
また、ペクチンに対しては、エステル化度３０％のペクチンでは約１０６％、エステル化度６０％のペクチンに対しては約４８％、エステル化度９０％のペクチンでは約８％、の反応速度でこれを分解する。
また、プロトペクチンに作用して、モノ−、ジ−又はトリ−ガラクツロン酸を生成するプロトペクチナーゼ活性を有する。
（２）最適反応ｐＨ：
pH５．０の酢酸緩衝液中で最も高い反応速度を示し、また、pH４．５〜６．５の広範囲で最大活性の５０％以上の活性を示す（図１）。従って、最適反応ｐＨは、４．５〜６、すなわちｐＨ５付近（酢酸緩衝液）である。
（３）最適反応温度：
酢酸緩衝液（pH５．０）中で酵素反応を行った場合、約４０〜５０℃、すなわち５０℃付近に最適反応温度を示す。また、３０℃〜６０℃の範囲で最大活性の５０％以上の活性を示す（図２）。
（４）分子量：
ゲル濾過法（塩化ナトリウムを含む酢酸緩衝液（pH５．０）にて平衡化したＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ２０００ＳＷＸＬを用い、１mL／ｍｉｎの流速で溶出）により測定した推定分子量は、２２０００〜２６０００、すなわち約２４０００である。
【００１２】
また、本発明のポリガラクツロナーゼは、更に詳細には、以下の（５）〜（８）の性質を有する。
（５）ｐＨ安定性：
各緩衝液（ｐH１〜１３）中、４０℃、６０分間恒温した後の残存活性は、酢酸緩衝液（pH５）中での残存活性を１００％とした場合、pH２．０〜１２．０の範囲で７０％以上である（図３）。
すなわち、ｐＨ安定性は、ｐＨ２〜１２（４０℃、６０分間処理）である。
（６）耐熱性：
５０mM酢酸緩衝液（pH５．０）中、１０℃〜８０℃の各温度で１５分間恒温した場合、約６０℃まで安定である（図４）。
（７）キレート剤の影響：
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）等のキレート剤の添加によって殆ど阻害されない（表１）。
【００１３】
（８）界面活性剤の影響：
陽イオン界面活性剤（０．２％（ｗ／ｖ））の存在下においても安定である（表２）。
例えば、ポリオキシエチレン（３）ラウリルエーテル０．２％含有液中で１２４％、ポリオキシエチレン（８）ラウリルエーテル０．２％含有液中で１２１％以上の活性を保持する。
【００１４】
以上のとおり、本発明のポリガラクツロナーゼは、常温で広いｐＨ領域において安定で、ポリガラクツロナーゼ活性、すなわちポリガラクツロン酸の加水分解活性を有する。当該ポリガラクツロナーゼ活性は、エンド型であり、ポリガラクツロン酸よりオリゴガラクツロン酸を生成する。
さらに、本発明のポリガラクツロナーゼは、不溶性天然ペクチンであるプロトペクチンに作用することから、不溶性ペクチンを基質としたペクチン分解物の製造、植物性繊維上のプロトペクチンに付着した汚れや、ケチャップ、ジャム等の不溶性ペクチン含量の高い食物の食べこぼしや染み汚れの除去に有効である。
【００１５】
本発明のポリガラクツロナーゼは、ポリガラクツロナーゼ生産菌を培養し、培養物から採取することにより製造される。
本発明のポリガラクツロナーゼを生産する菌としては、プレクトスファエレラ（Plectosphaerella）属に属する真菌、例えばプレクトスファエレラ ＫＳＭ−Ｐ５７（Plectosphaerella sp.KSM−P57）株を挙げることができる。当該プレクトスファエレラ ＫＳＭ−Ｐ５７株は次の形態学的性質を有する。
【００１６】
本菌株をポテトデキストロース寒天培地「ダイゴ」（日本製薬、東京）（PDA培地）、２％Malt Agar（MA培地）、Bacto Oatmeal Agar（Becton Dickinson,MD,USA）（OA培地）又はLcA（三浦培地）（LcA培地）にて、培養温度：２５℃、培養期間：２週間の条件にて培養した場合、直径約６０ｍｍの黄色〜薄肌色の湿生コロニーを形成する。分生子柄の先端部にフィアライドが頂生あるいは側生し、フィアライドの先端部には円筒形のカラレットを有し、楕円形〜紡錘形で１〜２細胞性の分生子が塊状に形成される。子嚢果などの有性生殖器官の形成は認められない。
【００１７】
プレクトスファエレラ ＫＳＭ−Ｐ５７は、２８ＳｒＤＮＡ塩基配列の相同性検索の結果から、Plectosporium tabacinumに対して相同率100％の最も高い相同性を示したことから、本菌株はPlectosphaerella cucumerinaのアナモルフであるPlectosporium tabacinumであると考えられた。プレクトスファエレラ属細菌として本菌株を、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1  つくばセンター 中央第6）へ、平成２３年２月１日付で、プレクトスファエレラ  ＫＳＭ−Ｐ５７（Plectosphaerella sp.KSM−P57；FERM P-22057）として寄託した。
【００１８】
プレクトスファエレラ  ＫＳＭ−Ｐ５７株等のポリガラクツロナーゼ生産菌を用いて本発明のポリガラクツロナーゼを生産するには、菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い振盪培養あるいは通気攪拌培養すれば良い。培地のｐＨは、７〜９に調整するのが好ましい。
【００１９】
かくして得られた培養物中からのポリガラクツロナーゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。即ち、培養物から遠心分離または濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から硫酸アンモニウム沈殿、溶剤沈殿、限外濾過、各種クロマトグラフィー、凍結乾燥、噴霧乾燥等の常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液または乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
プレクトスファエレラ  ＫＳＭ−Ｐ５７株由来のポリガラクツロナーゼの詳細な酵素学的性質を実施例４に記載した。
【００２０】
本発明のポリガラクツロナーゼを用いてペクチン又はポリガラクツロン酸を原料として、モノ及びオリゴガラクツロン酸を製造することができる。
ここで、オリゴガラクツロン酸としては、ガラクツロン酸が２〜８個結合したものが挙げられる。
本発明のポリガラクツロナーゼと原料との酵素反応は、特に限定されるものではなく、公知の方法を採用することができるが、例えばペクチン又はポリガラクツロン酸を水又は緩衝液に溶解又は懸濁させ、これにポリガラクツロナーゼを作用させることや、ポリガラクツロナーゼを不溶性固定化担体に結合させて、これにペクチン又はポリガラクツロン酸を流下させること等により行うことができる。
【００２１】
ここで、用いられる緩衝液としては、酢酸、塩酸、クエン酸、リン酸、トリスアミノメタン、ビス−トリス、グリシン、水酸化ナトリウム等を組み合わせた緩衝液が好ましい。例えば、酢酸緩衝液（pH３．５〜５．５）、ビス−トリス緩衝液（pH６．０〜７．０）等が挙げられる。
【００２２】
ポリガラクツロナーゼの使用量は、効果を損なわない限り限定されないが、例えば、原料であるペクチン又はポリガラクツロン酸に対して０．１〜１０質量％、好ましくは０．２〜８．０質量％である。
【００２３】
反応の条件は、ポリガラクツロナーゼの至適温度、至適ｐＨにおいて反応させるのが好ましく、例えば、２５〜６０℃、好ましくは３５〜５５℃の温度範囲、ｐＨ４．０〜６．５、好ましくはｐＨ５．０〜６．０のｐＨ範囲で反応させることができる。
【００２４】
反応時間は、本発明の効果を損なわない限り特に限定されないが、６〜７２時間が好ましく、１８〜４８時間がより好ましい。
【００２５】
斯くして得られたモノ及びオリゴガラクツロン酸は、そのまま使用することもできるが、必要に応じて、更にイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過等により脱塩、分離、精製することができる。
尚、原料であるペクチン又はペクチン酸は、植物由来のものであれば種類は問わず、植物体からの抽出等により調製できる、或いは調製されたものを購入することもできる。
【実施例】
【００２６】
実施例１  ポリガラクツロナーゼ生産菌のスクリーニング
日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したものを、下記組成の寒天平板培地に塗布した。３０℃の培養器で３〜５日間静置培養した。菌の生育後、０．２％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸、０．１％リン酸１水素カリウム、１％塩化ナトリウム、５０ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス−塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）０．８％寒天からなる軟寒天を重層し、室温で一夜恒温した。重層した軟寒天上に１％セチルトリメチルアンモニウムブロマイド溶液を注ぎ、室温で１時間放置後、生育した菌の周辺にペクチンの分解に伴う溶解斑が検出されたものについて選抜し、シングルコロニー化を繰り返し、ポリガラクツロン酸分解酵素の生産能を検定した。このようにして得られた多くの菌株は、主にペクチン酸リアーゼを生産したが、その中でポリガラクツロナーゼ生産菌としてプレクトスファエレラ ＫＳＭ−Ｐ５７株を得た。当該菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターへ、プレクトスファエレラ ＫＳＭ−Ｐ５７（Plectoshaerella sp. ＫＳＭ−Ｐ５７；FERM P-22057）として寄託した。
【００２７】
実施例２  プレクトスファエレラ ＫＳＭ−Ｐ５７株によるポリガラクツロナーゼの生産
上述のスクリーニングにより得られたプレクトスファエレラ ＫＳＭ−Ｐ５７株の培養は、５００mL容坂口フラスコに５０mLの培地を加え、３０℃、２日間好気的に行った。培地組成は、０．５％（ｗ／ｖ）ペクチン、２．０％ポリペプトンＳ、０．５％酵母エキス、１．０％魚肉エキス、０．１5％リン酸一水素二カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム７水塩、０．００５％硫酸マンガン５水塩であった。培養液中に生産されるポリガラクツロナーゼ活性は、５mM ＥＤＴＡを添加しペクチン酸リアーゼ活性を完全に失活させて測定を行った。この測定法により、培養液あたり０．１〜０．２Ｕ／Ｌの生産量を得た。
【００２８】
実施例３  ポリガラクツロナーゼの精製
プレクトスファエレラ ＫＳＭ−Ｐ５７株の培養液を遠心分離（８０００×ｇ、３０分間、４℃）し上清液（約３Ｌ）を得た。得られた上清に対し、フェニルメタンスルホニルフルオリド溶液を終濃度１ｍＭとなるように、塩化カルシウム溶液を終濃度５０ｍＭとなるように添加・攪拌後、再び遠心分離（８０００×ｇ、３０分間、４℃）を行った。得られた上清は限外濾過用モジュール（ＡＣＰ１０１０：旭化成）により濃縮、脱塩を行った。得られた濃縮液（４５５mL）は１mMジチオスレイトールを含む２０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．０）にて平衡化しておいたDEAEトヨパール６５０Ｍカラム（５×７cm：東ソー）に供した。約４００mLの平衡化緩衝液を用いて非吸着タンパク質を洗浄溶出させた。非吸着部分にエンド型ポリガラクツロナーゼ活性が溶出された。得られた非吸着画分は限外濾過用モジュール（ＹＭ−１０：ミリポア）により濃縮（２１ｍＬ）を行った。そのうち２０ｍＬを用いて、Ｐ６−ＤＧ脱塩カラム（２．５ｃｍ×３０ｃｍ：バイオラッド）を用いて１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に置換を行い、同緩衝液にて平衡化したSPトヨパール６５０Ｍカラムカラム（１．５ｃｍ×１３．５ｃｍ:東ソー）に供した。平衡化緩衝液にて洗浄した後、０から１００ｍＭ NaCLを用い吸着タンパク質を濃度勾配法にて溶出させた。エンド型ポリガラクツロナーゼ活性は約１０ｍＭのNaCL濃度付近に溶出され、その画分を集め、限外濾過により濃縮し、予め１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平行化しておいたＰ１０−ＤＧカラム（バイオラッド）により緩衝液置換を行った。（４mL、１１．９Ｕ、６４０μgタンパク質）。
【００２９】
実施例４  酵素学的性質の測定
実施例３の精製操作により得られたポリガラクツロナーゼ画分について、各種酵素学的性質を測定した。
なお、ポリガラクツロナーゼ活性の測定は、以下のように行った。
〔標準酵素活性測定法〕
試験管に０．２mLの０．５Ｍ酢酸緩衝液（pH５．０）、０．２mLの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸（ＩＣＮバイオメディカル；ｌｏｔ１４４８２、水酸化ナトリウム溶液にてpH６．８に調整）、０．５mLの脱イオン水を添加し、４０℃で５分間恒温した。これに０．１mLの適当に希釈した酵素液（希釈は脱イオン水により行った）を加え３０分間反応させた後、１mLのジニトロサリチル酸試薬を添加し、沸水中で５分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷した後、４mLの脱イオン水を加え５３５nmにおける吸光度を測定し還元糖の生成量を求めた。尚、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μmol のＤ−ガラクツロン酸相当の還元糖を生成する量とした。
【００３０】
（１）基質特異性
ポリガラクツロン酸の代わりにエステル化度の異なるペクチン（３０、６０、９０％）を基質とし、標準活性測定法により反応速度を調べた。エステル化度３０％のペクチン（シグマ；ｌｏｔ１１８K０９７４）では約１０６％、エステル化度６０％のペクチン（シグマ；ｌｏｔ０６９Ｋ０９７６）に対しては約４８％、エステル化度９０％のペクチン（シグマ；ｌｏｔ１８Ｋ１６５０）に対しては約８％の分解活性を有していた。次に基質として１５ｃｍのしつけ糸（金鈴印）１本（約１２ｍｇ）を基質に用い４０℃で１時間の反応を行った後、上清を液体クロマトグラフィーでの分析を行った。その結果、反応生成物としてモノ・ジ・トリガラクツロン酸が検出されたことから本酵素は、木綿繊維中に含まれるプロトペクチンに作用できるプロトペクチナーゼ活性を有すると考えられた。
【００３１】
（２）基質の分解様式
１００mMトリス−塩酸緩衝液（pH５．０）、０．２％ポリガラクツロン酸、５ｍＭ ＥＤＴＡからなる反応液に０．０５Ｕの酵素を添加し、全量を０．1mLとした。４０℃、６０分間反応させた液を液体クロマトグラフィーで分析を行った。その結果、反応生成物としてジ・トリガラクツロン酸及び、それ以上の溶出時間帯にもピークが検出され、本酵素はエンド型のポリガラクツロナーゼであった。
【００３２】
（３）ポリガラクツロナーゼ活性の最適反応pH
酢酸緩衝液（pH３．５〜５．５）、ビストリス−塩酸緩衝液（pH６．０〜７．０）、ＭＯＰＳ緩衝液（pH７．０〜８．５）の各緩衝液（１００mM）を用いて最適反応pHを調べた結果、本酵素はpH５．０の酢酸緩衝液中で最も高い反応速度を示し、また、pH４．５〜６．５の広範囲で最大活性の５０％以上の活性を示した（図１）。
【００３３】
（４）最適反応温度
１００mM酢酸緩衝液（pH５．０）中、１０℃〜７０℃の各温度で酵素反応を行い、最適反応温度を調べた結果、本酵素は５０℃付近に最適反応温度を示し、３０℃〜６０℃の範囲で最大活性の５０％以上の活性を示した（図２）。
【００３４】
（５）安定pH範囲
塩化カリウム−塩酸緩衝液（ｐH１）マックルベイン氏緩衝液（ｐH２〜３）、酢酸緩衝液（pH４〜５）、ビストリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７〜８）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９〜１０）、塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐH１２〜１３）の各緩衝液（５０mM）中に本酵素を加え、４０℃、６０分間恒温した後、残存活性を測定した結果、本酵素は酢酸緩衝液（pH５）中での残存活性を１００％とした場合、pH２．０〜１２．０の範囲で７０％以上の残存活性を示した（図３）。
【００３５】
（６）耐熱性
５０mM酢酸緩衝液（pH５．０）中に本酵素を添加し、１０℃〜８０℃の各温度で１５分間恒温した後の残存活性を測定した。本酵素は、この条件下において６０℃まで非常に安定である（図４）。
【００３６】
（７）分子量
ゲル濾過法：１００mM塩化ナトリウムを含む５０mM酢酸緩衝液（pH５．０）にて平衡化したＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ２０００ＳＷＸＬ（７．８×３０ｍm）に本酵素を載せ、１mL／ｍｉｎの流速で溶出を行った。標準タンパク質としてチログロブリン（６７００００）、γ−グロブリン（１５８０００）、卵白アルブミン（４４０００）、ミオグロビン（１７０００）、ビタミンＢ１２（１３５０）を用い、それぞれの溶出液量と分子量から検量線を作製し、本酵素の分子量を求めたところ約２４０００と推定された。
【００３７】
（９）各種化合物の影響
本酵素の活性に及ぼす各種化合物の影響は、各化合物を所定濃度になるよう反応系へ添加し、活性測定を行うことにより調べた結果、本酵素は、下表に記載の修飾剤やキレート剤に耐性を示した（表１）。
【００３８】
【表１】
0005779368.tif 000002
【００３９】
（１０）界面活性剤の影響
各種界面活性剤を０．２％（ｗ／ｖ）になるように添加した反応系において、酵素の反応性を調べた結果、陽イオン界面活性剤の存在下において、本酵素は、対象に比べ約１２０％の活性を発現した（表２）。
【００４０】
【表２】
0005779368.tif 000003
【００４１】
（１１）金属塩の影響
各種金属塩を標準活性測定条件に１ｍＭ添加し、酵素活性に与える影響を調べた。その結果、本酵素は記載の金属化合物に対して耐性を示した（表３）。
【００４２】
【表３】
0005779368.tif 000004
【００４３】
実施例５  プロトペクナーゼ活性
上述の標準酵素活性測定法において、ポリガラクツロン酸の代わりに、基質として１５ｃｍのしつけ糸（金鈴印）１本（約１２ｍｇ）を用いて３０℃で２４時間の反応を行った後、上清の還元糖の発色を測定した。各酵素はポリガラクツロン酸の分解活性として１００ｍＵ/ｍＬの濃度で使用した。その結果、本酵素は市販のペクチナーゼ（ＰＥＣ−Ｍ１（シグマ社）、ＰＥＣ−Ｍ２（シグマ社））と比較して約３倍のプロトペクチナーゼ活性を有することが判明した（図５）。
【図１】
0005779368.tif 000005
【図２】
0005779368.tif 000006
【図３】
0005779368.tif 000007
【図４】
0005779368.tif 000008
【図５】
0005779368.tif 000009