(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物：
【化１】
0005830013.tif 000062
および薬学的に許容されるその塩、
式Ｉ中、Ｘ１は、ケト、ヒドロキシ、および
【化２】
0005830013.tif 000063
から選択され、
Ｘ２は、ケト、ヒドロキシ、および
【化３】
0005830013.tif 000064
から選択され、
Ｘ３は、ケト、ヒドロキシ、および
【化４】
0005830013.tif 000065
から選択され、
Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３のうちの少なくとも１つは、それぞれ、
【化５】
0005830013.tif 000066
であり、
ここで、Ｒ１またはＲ２は、−ＣＨ（ＣＨ３）２、および−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３から独立に選択される。
【請求項２】
Ｘ１が、
【化６】
0005830013.tif 000067
であり、ここで、Ｒ１は、−ＣＨ（ＣＨ３）２または−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｘ２が、
【化７】
0005830013.tif 000068
であり、ここで、Ｒ２は、−ＣＨ（ＣＨ３）２または−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｘ３が、
【化８】
0005830013.tif 000069
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｘ１、Ｘ２またはＸ３のうちの少なくとも１つが、
【化９】
0005830013.tif 000070
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｘ１とＸ２が両方とも、
【化１０】
0005830013.tif 000071
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｘ１またはＸ２のうちの少なくとも１つが−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｘ１とＸ２が両方とも、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
Ｘ１が−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）２であり、かつＸ２およびＸ３がＯＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｘ１が−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３であり、かつＸ２およびＸ３が−ＯＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｘ２が−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）２であり、かつＸ１およびＸ３がＯＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｘ２が−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３であり、かつＸ１およびＸ３がＯＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
【化１１】
0005830013.tif 000072
【化１２】
0005830013.tif 000073
【化１３】
0005830013.tif 000074
および
【化１４】
0005830013.tif 000075
からなる群から選択される化合物、ならびに薬学的に許容されるそれらの塩。
【請求項１４】
前記薬学的に許容される塩が塩酸塩である、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸６α，１６β−ジヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（α）フェナントレン−３β−イルエステル；
２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸６α−（２−アミノ−３−メチル−ブチリルオキシ）−１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（α）フェナントレン−３β−イルエステル；
２−（Ｌ）−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−メチル−酪酸３β−アセトキシ−１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（α）フェナントレン−６α−イルエステル；
２−（Ｌ），３−ジメチル−ペンタン酸６α，１６β−ジヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（α）フェナントレン−３β−イルエステル、
２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−３−オキソ−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（α）フェナントレン−６α−イルエステル；
２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−ペンタン酸６α−（２−アミノ−３−メチル−ペンタノイルオキシ）−１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（α）フェナントレン−３β−イルエステル；
２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸３β，６α−ジヒドロキシ−１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（α）フェナントレン−１６β−イルエステル；
および薬学的に許容されるそれらの塩からなる群から選択される化合物。
【請求項１６】
前記薬学的に許容される塩が塩酸塩である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
前記化合物が、
２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸６α，１６β−ジヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（α）フェナントレン−３β−イルエステル  塩酸塩；
２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸６α−（２−アミノ−３−メチル−ブチリルオキシ）−１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（α）フェナントレン−３β−イルエステル塩酸塩；
２−（Ｌ）−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−メチル−酪酸３β−アセトキシ−１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（α）フェナントレン−６α−イルエステル塩酸塩；および
２−（Ｌ），３−ジメチル−ペンタン酸６α，１６β−ジヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（α）フェナントレン−３β−イルエステル塩酸塩
からなる群から選択される請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
細胞または組織におけるテロメラーゼ活性を増大するのに使用する医薬であって、前記細胞または組織を請求項１〜１７に記載の単離された化合物と接触させる際に使用することを特徴とする医薬。
【請求項１９】
前記細胞または組織が、テロメラーゼ活性の増大を必要とするものとして同定するのに使用される、請求項１８に記載の医薬。
【請求項２０】
薬学的に許容されるビヒクル中に請求項１〜１７に記載の化合物を含む薬学的組成物。
【請求項２１】
前記化合物が、少なくとも０．１％（ｗ／ｖ）の濃度で前記組成物中に存在する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１〜１７に記載の化合物の局所処方物を含む薬学的組成物。
【請求項２３】
前記局所処方物が、乳化剤、増粘剤、担体、および皮膚軟化剤からなる群から選択される１以上の成分を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
インビトロまたはエクスビボで細胞の複製能力を増強する方法であって、前記細胞におけるテロメラーゼ活性の増大を達成させる量で、前記細胞を請求項１〜１７に記載の化合物と接触させることを含む、方法。
【請求項２５】
前記細胞が患者から得られた外植片細胞である、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
先行出願への参照
本出願は、２００９年５月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／１７９，３０５号の恩典を主張し、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、細胞内のテロメラーゼ活性を増大させるための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
テロメラーゼは、テロメアの末端へのテロメア反復の付加を触媒するリボ核タンパク質である。テロメアは、染色体の末端をキャップする反復配列の長いストレッチであり、染色体を安定化すると考えられている。ヒトでは、テロメアは、通常７〜１０ｋｂの長さであり、配列−ＴＴＡＧＧＧ−の多重反復を含む。テロメラーゼは、大部分の成体細胞では発現されず、テロメア長は、度重なる複製とともに減少する。ある一定の複製回数の後に、テロメアの累積的な短縮により、細胞はテロメアの危機段階に入り、次いでそれが細胞老化へと至る。特定の疾患は、早過ぎる細胞老化をもたらす急速なテロメア喪失と関連している。ヒト細胞でヒトテロメラーゼタンパク質をコードする遺伝子を発現させると、おそらくは細胞の自然な老化経路を迂回することによって、不死表現型が付与されることが示されている。さらに、短いテロメアを有する老化細胞でテロメラーゼ遺伝子発現させると、テロメア長の増加がもたらされ、通常はより若い細胞と関連する表現型が回復することが示されている。
【０００４】
腫瘍細胞および特定の幹細胞とは対照的に、体細胞は、テロメラーゼ活性をほとんどまたは全く持たず、少なくともいくつかの染色体のテロメア末端が危機的な長さまで短縮すると、分裂を停止し、プログラム化された細胞老化（細胞死）へと至る。老化に至りつつある体細胞におけるテロメア反復の喪失は、低いテロメラーゼ活性によって強化されるので、テロメア反復の配列をテロメアに付加する作用を有するテロメラーゼ活性を誘導すると、死ぬべき運命にある体細胞に増大した複製能力が付与され、老化細胞に、損傷組織の修復時に増殖し、適切に細胞周期から抜け出る能力が付与される。
【０００５】
治療的にテロメラーゼ活性を増大させる方法は、例えば、Ｂｏｄｎａｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９（５３４９）：３４９−５２（１９９８年１月１６日）；Ｗｈｉｔｅ，ＰＣＴ国際出願公報ＷＯ２０００／０８１３５号（２０００年２月）；Ｈａｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ国際出願公報ＷＯ９９／３５２４３号（１９９９年７月）およびＰＣＴ国際出願公報ＷＯ２０００／０３１２３８号（２０００年６月）；Ｆｒａｎｚｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ  ６９（１３）  １５０９−２０（２００１）、ならびにＹｕｄｏｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓ．１６（８）：１４５３−１４６４（２００１）によって研究されている。これらの報告では、テロメラーゼ活性は、一般に、ヒトテロメラーゼのタンパク質成分をコードする遺伝子であるｈＴＥＲＴの過剰発現によるか、またはテロメラーゼの会合を仲介するタンパク質、例えば、熱ショックタンパク質（Ｗｈｉｔｅ、ＰＣＴ番号ＷＯ２０００／０８１３５号）の発現によって増大させられている。Ｆｒａｎｚｅｓｅらは、ＨＩＶ感染の治療用に処方されるプロテアーゼ阻害剤であるサキナビルが、末梢血単核細胞内のテロメラーゼ活性を増大させることを報告し、Ｖａｓａら（Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．８７（７）  ５４０−２（２０００））は、一酸化窒素（ＮＯ）前駆体の投与によるテロメラーゼの活性化と、それにより生じる内皮老化の遅れを記載した。
【０００６】
アストラガロシドファミリーの様々なサポニンは、テロメラーゼ活性の増大を含む様々な生物学的作用を有することが報告されている（Ｈａｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ国際出願公報ＷＯ２００５／０００２４５号）。効果的なテロメラーゼ活性化因子となる化合物を開発することは有益であろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書に記載の本発明は、一般に、細胞内のテロメラーゼ活性を増大させる化合物および方法ならびにそのような方法で使用される組成物に関する。そのような方法および組成物は、細胞培養物中、すなわち、インビトロもしくはエクスビボの細胞、またはヒト対象および非ヒト哺乳動物を含む対象の組織中で増殖している細胞などのインビボの細胞に対して使用し得る。
【０００８】
アストラガロシドファミリーの様々なサポニンは、テロメラーゼ活性の増大を含む様々な生物学的作用を有することがこれまでに報告されていた（Ｈａｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ国際出願公報ＷＯ２００５／０００２４５号）。しかしながら、本発明者らは、特定の哺乳動物種に経口投与された場合に、シクロアストラゲノールをはじめとする本明細書に記載の天然化合物のバイオアベイラビリティが極めて限られていることを見出した。この限られたバイオアベイラビリティが、哺乳動物による化合物の取込みが低いことに起因するのか、特定の哺乳動物種における化合物の代謝が高いことに起因するのか、両方の組合せに起因するのかは明確ではなかった。そのような低いバイオアベイラビリティは、これまでに記載された化合物が、特定の哺乳動物種における経口テロメラーゼ活性化因子として極めて効果が低かったことを意味する。
【０００９】
強力なテロメラーゼ活性化因子であり、いくつかの哺乳動物種において経口的に利用可能でもあり、代表的な哺乳動物種において改善された半減期を有する新しい化合物が必要であることが明らかになった。本明細書に記載の化学的化合物は、これらの望ましい特性を有する。
【００１０】
特定の実施形態では、組成物は、下記のような式Ｉの化合物およびその薬学的塩を含む。本発明の態様は、薬学的用途、特に細胞内のテロメラーゼ活性の増大が有益であることが示されているか、または有益であると考えられている用途で使用される、そのような化合物の処方物を含む。細胞または組織内のテロメラーゼ活性を増大させる必要性、またはその利点が明らかにされた後で、そのような処方物を適用または投与するための方法を含む、そのような用途のための化合物およびその処方物の使用方法も提供される。
【００１１】
本発明は、一態様では、式Ｉの化合物：
【化１】
0005830013.tif 000002
および薬学的に許容されるその塩を含み、
式Ｉ中、Ｘ１は、ケト（＝Ｏ）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、および
【化２】
0005830013.tif 000003
から選択され、
Ｘ２は、ケト（＝Ｏ）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、および
【化３】
0005830013.tif 000004
から選択され、
Ｘ３は、ケト（＝Ｏ）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、および
【化４】
0005830013.tif 000005
から選択され、
Ｘ１、Ｘ２、またはＸ３のうちの少なくとも１つは、それぞれ、
【化５】
0005830013.tif 000006
であり、
ここで、Ｒ１またはＲ２は、−ＣＨ（ＣＨ３）２、および−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３から独立に選択される。
【００１２】
一実施形態では、Ｘ１は−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）Ｒ１であり、式中、Ｒ１は、−ＣＨ（ＣＨ３）２または−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３からなる群から選択される。別の実施形態では、Ｘ２は−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）Ｒ２であり、式中、Ｒ２は、−ＣＨ（ＣＨ３）２または−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３からなる群から選択される。
【００１３】
一実施形態では、Ｘ１、Ｘ２またはＸ３のうちの少なくとも１つは、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）２である。別の実施形態では、Ｘ１とＸ２は両方とも、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）２である。
【００１４】
一実施形態では、Ｘ１またはＸ２のうちの少なくとも１つは、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３である。別の実施形態では、Ｘ１とＸ２は両方とも、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３である。
【００１５】
式Ｉの選択された実施形態では、Ｘ１は−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）２であり、Ｘ２およびＸ３は、ヒドロキシおよびケトからから独立に選択される。さらなる実施形態では、Ｘ２は−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）２であり、Ｘ１およびＸ３は、ヒドロキシおよびケトからから独立に選択される。さらなる実施形態では、Ｘ３は−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）２であり、Ｘ１およびＸ２は、ヒドロキシおよびケトからから独立に選択される。さらなる実施形態では、Ｘ１とＸ２は両方とも、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）２であり、Ｘ３はＯＨである。またさらなる実施形態では、Ｘ１は−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）２であり、Ｘ２とＸ３は各々ＯＨである。またさらなる実施形態では、Ｘ２は−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）２であり、Ｘ１とＸ３は各々ＯＨである。
【００１６】
式Ｉの選択された実施形態では、Ｘ１は−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３であり、Ｘ２およびＸ３は、ヒドロキシおよびケトからから独立に選択される。さらなる実施形態では、Ｘ２は−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３であり、Ｘ１およびＸ３は、ヒドロキシおよびケトからから独立に選択される。さらなる実施形態では、Ｘ１とＸ２は両方とも、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３であり、Ｘ３はＯＨである。またさらなる実施形態では、Ｘ１は−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３であり、Ｘ２とＸ３は各々ＯＨである。またさらなる実施形態では、Ｘ２は−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３であり、Ｘ１とＸ３は各々ＯＨである。
【００１７】
式Ｉのいくつかの実施形態では、薬学的に許容される塩は塩酸塩である。
【００１８】
アミノ酸置換はＬまたは天然の立体異性体であると想定される。
【００１９】
式Ｉの例示的化合物としては、本明細書で以下のように命名されたものが挙げられる：２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸６α，１６β−ジヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β−イルエステル（本明細書では４と表す）、２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸６α−（２−アミノ−３−メチル−ブチリルオキシ）−１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β−イルエステル（本明細書では７と表す）、２−（Ｌ）−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−メチル−酪酸３ｂ−アセトキシ−１６ｂ−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−６ａ−イルエステル（本明細書では１２と表す）、２−（Ｌ），３−ジメチル−ペンタン酸６α，１６β−ジヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β−イルエステル（本明細書では１４と表す）、２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−３−オキソ−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−６α−イルエステル（本明細書では３０と表す）、２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−ペンタン酸６α−（２−アミノ−３−メチル−ペンタノイルオキシ）−１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β−イルエステル（本明細書では３２と表す）、２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸３β，６α−ジヒドロキシ−１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−１６β−イルエステル（本明細書では３６と表す）および薬学的に許容されるその塩。
【００２０】
式Ｉの例示的化合物としては、本明細書で以下のように命名されたものが挙げられる：２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸６α，１６β−ジヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β−イルエステル塩酸塩、２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸６α−（２−アミノ−３−メチル−ブチリルオキシ）−１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β−イルエステル塩酸塩、２−（Ｌ）−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−メチル−酪酸３ｂ−アセトキシ−１６ｂ−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−６ａ−イルエステル塩酸塩、２−（Ｌ），３−ジメチル−ペンタン酸６α，１６β−ジヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β−イルエステル塩酸塩、２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−３−オキソ−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−６α−イルエステル塩酸塩、２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−ペンタン酸６α−（２−アミノ−３−メチル−ペンタノイルオキシ）−１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β−イルエステル塩酸塩または２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸３β，６α−ジヒドロキシ−１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−１６β−イルエステル塩酸塩．
【００２１】
上記の式Ｉの化合物は、溶媒中に処方した場合、本明細書に記載されたようなＴＲＡＰアッセイで測定される、該溶媒で処理された該細胞におけるレベルよりも、少なくとも５０％大きい、少なくとも７０％大きい、少なくとも８０％大きい、または少なくとも９０％大きい、ＴＲＡＰアッセイで測定される、ケラチノサイトまたはＰＢＭＣにおけるテロメラーゼ活性のレベルを生じさせるのに有効である。さらなる実施形態では、化合物は、本明細書に記載されたようなＴＲＡＰアッセイで測定される、該溶媒で処理した該細胞におけるレベルよりも、少なくとも１００％大きい、ＴＲＡＰアッセイで測定される、ケラチノサイトまたはＰＢＭＣにおけるテロメラーゼ活性のレベルを生じさせるのに有効である。
【００２２】
本発明は、一態様では、細胞または組織内のテロメラーゼ活性を増大させる方法を含む。本方法は、細胞または組織を式Ｉの単離された化合物と接触させることを含む。本方法は、テロメラーゼ活性の増大が望まれる細胞または組織を同定する予備工程をさらに含み得る。
【００２３】
単離された式Ｉの化合物を細胞または組織と接触させる方法は、該接触前に、テロメラーゼ活性の増大が望まれる細胞または組織を同定することを含み得る。細胞または組織におけるテロメラーゼ活性の増大によって実現すべき利益としては、例えば、該細胞または該組織内の細胞の複製能力の増強および／または寿命の延長が挙げられる。
【００２４】
本方法は、対象の細胞または組織におけるテロメラーゼ活性の増大が望まれるような対象における状態の同定、決定または診断、およびその対象への化合物の投与を含み得る。対象は、家畜化された動物（例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、サル）またはヒト対象もしくはヒト患者などの哺乳動物対象である。
【００２５】
予防または治療されるそのような状態または疾患としては、例えば、ＨＩＶを含むウイルス感染および日和見感染、様々な変性疾患（例えば、神経変性疾患、骨または関節、および結合組織の変性疾患、黄斑変性、糖尿病性網膜症）、中枢および末梢血管疾患を含む心血管疾患、クローン病および他の免疫学的状態、線維症および肝硬変を含む肝疾患、肺線維症、喘息、肺気腫、およびＣＯＰＤを含む肺疾患、造血障害（貧血、血小板減少症、好中球減少症および他の血球減少症を含む）、慢性炎症性消化管疾患（例えば、バレット食道）、幹細胞または前駆細胞集団の増殖能力の喪失に関連する任意の疾患を挙げることができる。そのような状態としては、骨髄不全症候群、再生不良性貧血、骨髄異形成貧血または骨髄異形成症候群を挙げることができる。そのような状態としては、例えば、火傷、擦過傷、切創、移植片、感染性因子により生じる病変、慢性静脈潰瘍、糖尿病性潰瘍、圧迫潰瘍または褥瘡性潰瘍、粘膜潰瘍、ケロイド形成、抜け毛または色素喪失、ならびに皮膚およびその付属器官の他の構造異常などの、表皮およびその付属器官の創傷または他の急性もしくは慢性の状態を挙げることもできる。そのような状態としては、少ないテロメラーゼまたは短縮したテロメアがゲノムの不安定性、または突然変異率の増大、または腫瘍抑制機能の喪失を伴い、結果として、対象が、腫瘍のイニシエーション、腫瘍の進行、または腫瘍の再発を起こすリスクが高い癌および前癌状態も挙げられる。
【００２６】
本発明は、患者の細胞または組織におけるテロメラーゼ活性を増大させることによって、患者における状態（例えば、上述したもの）を予防または治療する方法であって、そのような予防または治療を必要とする患者に、上で定義したような単離された式Ｉの化合物を投与することを含む方法を提供する。組成物は、様々な経路（例えば、経口、局所、非経口、皮下、吸入および静脈内）で投与し得る。
【００２７】
さらなる実施形態では、本発明は、表皮の急性または慢性状態を治療する方法であって、上皮細胞を上で定義したような単離された式Ｉの化合物の局所処方物と接触させることを含む方法を提供する。
【００２８】
処方物を接触させる細胞としては、例えば、細胞に基づく治療用にエクスビボで接触させる外植片細胞、または他の培養細胞を挙げることもできる。したがって、本発明は、インビトロまたはエクスビボで細胞の複製能力および改善された機能的能力を増強する方法であって、該細胞を有効量の上で定義したような単離された式Ｉの化合物（上で定義したような化合物の選択された実施形態を含む）を含む組成物と接触させることを含む方法を提供する。一般に、細胞は哺乳動物細胞であり、選択された実施形態では、細胞は、骨髄幹細胞または前駆細胞などの幹細胞、骨髄間質細胞、皮膚ならびに腸、肝臓および膵臓を含む他の組織由来の表皮および上皮幹細胞、膵島前駆細胞、ニューロスフェア細胞、副腎皮質細胞、筋衛星細胞、骨芽細胞前駆体を含む間質幹細胞および前駆細胞、網膜色素上皮細胞、内皮前駆細胞、周皮細胞、ならびにメモリーＴおよびナイーブＴ（ＣＤ４およびＣＤ８）細胞ならびにＢ細胞を含むクローン性拡大が可能な免疫細胞である。
【００２９】
さらなる実施形態では、本発明は、生きているドナーまたは死体から生きている患者への組織の移植を増進する方法であって、移植組織を上で定義したような単離された式Ｉの化合物と接触させることを含む方法を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、ドナーから生きている患者への組織の移植を増進する方法であって、組織の移植の前に、組織の移植と同時に、または組織の移植の後しばらくの間、上で定義したような単離された式Ｉの化合物を患者に投与することを含む方法を提供する。移植される組織は、固形組織（例えば、腎臓、心臓、肺など）、または造血組織（例えば、限定するものではないが、血液細胞、例えば、白血球、リンパ球もしく骨髄に由来し得る造血前駆細胞）であり得る。
【００３０】
一実施形態では、本発明は、薬学的に許容されるビヒクル中に上で示したような式Ｉの化合物を含む薬学的組成物を提供する。
【００３１】
別の実施形態では、本発明は、上で定義したような式Ｉの単離された化合物の局所用薬学的処方物を提供する。化合物の選択された実施形態も上で定義されている。局所処方物は、通常、乳化剤、担体（例えば、リポソーム）、増粘剤、および皮膚軟化剤からなる群から選択される１以上の成分を含む。そのような組成物を表皮の創傷または他の急性もしくは慢性状態の治療に使用し得る。
【００３２】
疾患または状態の予防または治療のための医薬品の製造における上記のような選択された実施形態を含む、上で定義したような単離された式Ｉの化合物の使用。細胞または組織におけるテロメラーゼ活性の増大による予防または治療の対象となる疾患の予防または治療のための医薬品の製造における上で定義したような上記のような選択された実施形態を含む、単離された式Ｉの化合物の使用。疾患または状態の予防または治療のための上で定義したような上記のような選択された実施形態を含む、単離された式Ｉの化合物の使用。細胞または組織におけるテロメラーゼ活性の増大による予防または治療の対象となる疾患の予防または治療のための上で定義したような上記のような選択された実施形態を含む、単離された式Ｉの化合物の使用。使用は、テロメラーゼ活性の増大が望まれる細胞または組織を同定する予備工程をさらに含み得る。細胞または組織におけるテロメラーゼ活性の増大によって実現すべき利益としては、例えば、該細胞または該組織内の細胞の複製能力の増強および／または寿命の延長ならびに機能的能力の増強が挙げられる。
【００３３】
使用は、対象の細胞または組織におけるテロメラーゼ活性の増大が望まれるような対象における状態または疾患を同定、決定または診断することを含み得る。そのような状態としては、例えば、ＨＩＶを含むウイルス感染および日和見感染、様々な変性疾患（例えば、神経変性疾患、骨または関節、および結合組織の変性疾患、糖尿病性網膜症、黄斑変性）、中枢および末梢血管疾患を含む心血管疾患、クローン病および他の免疫学的状態、線維症および肝硬変を含む肝疾患、肺線維症、喘息、肺気腫、およびＣＯＰＤを含む肺疾患、造血障害（貧血、血小板減少症、好中球減少症および他の血球減少症を含む）、慢性炎症性消化管疾患（例えば、バレット食道）、幹細胞または前駆細胞集団の増殖能力の喪失に関連する任意の疾患を挙げることができる。そのような状態としては、骨髄不全症候群、再生不良性貧血、骨髄異形成貧血または骨髄異形成症候群を挙げることができる。そのような状態としては、例えば、火傷、擦過傷、切創、移植片、感染性因子により生じる病変、慢性静脈潰瘍、糖尿病性潰瘍、圧迫潰瘍または褥瘡性潰瘍、粘膜潰瘍、ケロイド形成、抜け毛または色素喪失、ならびに皮膚およびその付属器官の他の構造異常などの、表皮およびその付属器官の創傷または他の急性もしくは慢性の状態を挙げることもできる。そのような状態としては、少ないテロメラーゼまたは短縮したテロメアがゲノムの不安定性、または突然変異率の増大、または腫瘍抑制機能の喪失を伴い、結果として、対象が、腫瘍のイニシエーション、腫瘍の進行、または腫瘍の再発を起こすリスクが高い癌および前癌状態も挙げられる。
【００３４】
同様に、表皮の慢性または急性状態の治療用の医薬品の製造のための上記のような選択された実施形態を含む、上で定義したような式Ｉの単離された化合物の使用も想定されている。別の実施形態は、表皮の慢性または急性状態の治療のための上記のような選択された実施形態を含む、上で定義したような式Ｉの単離された化合物の使用である。
【００３５】
本発明のこれらのおよび他の目的および特徴は、本発明の以下の詳細な説明を添付の図面とともに読んだとき、より完全に明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＴＲＡＰアッセイで測定された、１用量の化合物４、Ｃ３−（Ｌ）−バリル−シクロアストラゲノール後のマウス末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるテロメラーゼ活性の増大を示している。
【図２】ＴＲＡＰアッセイで測定された、１用量の化合物４、Ｃ３−（Ｌ）−バリル−シクロアストラゲノール後のマウスのひげにおけるテロメラーゼ活性の増大を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
Ｉ．定義
本明細書で使用される以下の用語は、別途示されない限り、下記の意味を有する。
【００３８】
本明細書に記載の化合物の命名に用いられた一般的な炭素原子付番体系は、下記に示されている。
【化６】
0005830013.tif 000007
【００３９】
したがって、Ｃ３−（Ｌ）バリルシクロアストラゲノールは、化合物構造の炭素３のエステル結合を介して結合した（Ｌ）バリンを指す。
【００４０】
「Ｃ１−５アルキル」は、１〜５個の炭素原子を有して、分枝状または線状であり得る、炭素および水素を含む完全に飽和した非環式の一価のラジカルを指す。アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルがある。
【００４１】
「ケト」は＝Ｏを意味する。
【００４２】
「ヒドロキシ」は−ＯＨを意味する。
【００４３】
「アミノ酸」という用語は、Ｄ形またはＬ形の天然アミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｌ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ａｎｄ  Ｖａｌ）、および非天然アミノ酸の残基を含む。この用語はまた、従来のアミノ保護基（例えば、アセチルまたはベンジルオキシカルボニル）を担持する天然および非天然のアミノ酸を含む。他の好適な保護アミノ保護基は当業者に公知である（例えば、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；第３版，Ｗｉｌｅｙ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９９を参照されたい）。別途記述しない限り、アミノ酸置換は、エステル結合を介してそのカルボキシ基を通じてシクロアストラゲノールに結合している。したがって、Ｃ３−（Ｌ）バリルシクロアストラゲノールは、Ｃ３−（Ｌ）バリルシクロアストラゲノールエステルである。
【００４４】
「異性体」という用語は、光学異性体および類似体、構造異性体および類似体、配座異性体および類似体などを含むが、これらに限定されない。
【００４５】
キラル中心を有する本発明の化合物は、光学活性形態およびラセミ形態で存在し得、単離され得ることが当業者には理解されるであろう。いくつかの化合物は多型を示し得る。本発明は、本明細書に記載された有用な特性を有する本発明の化合物の、任意のラセミ形態、光学活性形態、多型形態もしくは立体異性形態またはそれらの混合物を包含することを理解すべきであり、（例えば、再結晶化技術によるラセミ形態の分割によって、光学活性出発材料からの合成によって、キラル合成によって、またはキラル固定相を用いるクロマトグラフ分離によって）光学活性形態をどのように調製するかということや、本明細書に記載された試験を用いてテロメラーゼ活性を増大させる化合物の能力をどのように決定するかということは当技術分野で周知である。一実施形態では、アミノ酸は、天然に存在する（Ｌ）形である。
【００４６】
本発明は、一実施形態では、生成して、アルカリ金属塩を形成し得るおよび遊離酸または遊離塩基の遊離付加塩を形成し得る、本発明の化合物の「薬学的に許容される塩」を含む。本発明の化合物の好適な薬学的に許容される酸付加塩は、無機酸からまたは有機酸から調製され得る。一実施形態では、無機酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、カルボン酸、硫酸およびリン酸がある。一実施形態では、有機酸は、脂肪酸、脂環式酸、芳香族酸、アラリファチック（ａｒａｌｉｐｈａｔｉｃ）酸、複素環式酸、カルボン酸およびスルホン酸の部類の有機酸から選択され得、その例としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、シュウ酸、メシル酸、サリチル酸、ステアリン酸およびガラクツロン酸がある。一実施形態では、本発明の化合物の好適な薬学的に許容可能な塩基付加塩としては、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛から作られた金属塩またはＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、コリン、クロロプロカイン、エタノールアミン、エチレンジアミン、およびプロカインから作られた有機塩が挙げられる。これらの塩は全て、対応する化合物から従来の手段によって調製され得る。薬学的に許容される塩は、他の実施形態では、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウムで処理することによって調製することができる。別の実施形態では、例えば、酢酸エステルおよび安息香酸エステルなどの、化合物のエステルは、脂肪族および芳香族カルボン酸で作ることができる。
【００４７】
「幹細胞」は、出生後の生涯を通して分裂し、サイクルして、さらに分化し、特殊化することができる細胞を提供する能力を保持する共通の系譜の比較的未分化な細胞（例えば、皮膚の基底層における、または様々なあらゆる種類の血液細胞が由来する骨髄における原始細胞などの造血組織における幹細胞）を指す。
【００４８】
化合物に関して、「細胞におけるテロメラーゼ活性を増大させるのに有効な」とは、１０μＭ以下の濃度の化合物を含む組成物が、ＴＲＡＰアッセイで測定された、化合物を含まない同様の処方物によって生じるレベルよりも少なくとも１．５倍大きい（すなわち、少なくとも５０％大きい）、本明細書に記載されたようなテロメラーゼ活性アッセイ（例えば、ＴＲＡＰ）アッセイで測定された、ケラチノサイトまたは線維芽細胞におけるテロメラーゼ活性のレベルを生じさせるのに有効であることを意味する。いくつかの実施形態では、化合物は、化合物を含まない同様の処方物によって生じるレベルよりも少なくとも２倍（すなわち、少なくとも１００％大きい）、本明細書に記載されたようなＴＲＡＰアッセイで測定された、そのような細胞におけるテロメラーゼ活性のレベルを生じさせるのに１０μＭ以下の濃度で有効である。
【００４９】
「対象」は哺乳動物である。対象は、家畜化された哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、サルなどであり得る。対象または患者はヒトであり得る。
【００５０】
患者への化合物の投与に関して、「有効量」は、所望の治療結果が達成されるような、患者の細胞または組織内のテロメラーゼ活性を増大させるのに有効な量を指す。インビトロまたはエクスビボでの細胞の治療に関して、「有効量」とは、細胞内のテロメラーゼ活性を増大させ、それにより細胞の複製能力を増大させ、かつ／または寿命を延長させるのに有効な量を指す。
【００５１】
本明細書で％（ｗ／ｖ）と表される濃度において、１００％（ｗ／ｖ）は、１ｇの溶質／ｍｌ溶媒に相当する。例えば、０．１％（ｗ／ｖ）＝１ｍｇ／ｍｌである。
【００５２】
「単離された化合物の処方物」は、処方物を作製するために、単離された化合物を１以上の他の成分（活性成分であっても、または不活性成分であってもよい）と組み合わせることによって調製される処方物を指す。「単離された化合物」という語句は、８０％（ｗ／ｗ）以上の純度の化合物の調製物を生じさせる、１以上の化学合成工程を含むプロセスによって（処方の前に）製造された化合物を指す。
【００５３】
ＩＩ．テロメラーゼ活性を増大させるための方法および組成物
本発明によって、細胞内のテロメラーゼ活性を増大させるための、組成物および方法が提供される。
【００５４】
本発明の化合物は、細胞内のテロメラーゼ活性を増大させることができ、かつ静脈内かまたは経口的かのいずれかで哺乳動物に投与したときに、すぐに生物学的に利用可能となることが見出されている。
【００５５】
本方法によって、細胞または組織を、化合物の非存在下での細胞または組織内のテロメラーゼ活性レベルと比べて、細胞または組織内のテロメラーゼ活性を増大させるのに有効な量で、本明細書に開示されたような式Ｉの単離された化合物と接触させる。本方法はまた、テロメラーゼ活性の増大が望まれる細胞または組織を同定する予備工程を含み得る。
【００５６】
本発明は、一態様では、式Ｉの化合物：
【化７】
0005830013.tif 000008
および薬学的に許容されるその塩を含み、
式Ｉ中、Ｘ１は、ケト（＝Ｏ）、ヒドロキシ、および
【化８】
0005830013.tif 000009
から選択され、
Ｘ２は、ケト（＝Ｏ）、ヒドロキシ、および
【化９】
0005830013.tif 000010
から選択され、
Ｘ３は、ケト（＝Ｏ）、ヒドロキシ、および
【化１０】
0005830013.tif 000011
から選択され、
Ｘ１、Ｘ２、またはＸ３のうちの少なくとも１つは、それぞれ、
【化１１】
0005830013.tif 000012
であり、
ここで、Ｒ１またはＲ２は、−ＣＨ（ＣＨ３）２、および−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３から独立に選択される。
【００５７】
一実施形態では、Ｘ１は−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）Ｒ１であり、式中、Ｒ１は、−ＣＨ（ＣＨ３）２または−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３からなる群から選択される。別の実施形態では、Ｘ２は−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）Ｒ２であり、式中、Ｒ２は、−ＣＨ（ＣＨ３）２または−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３からなる群から選択される。
【００５８】
一実施形態では、Ｘ１、Ｘ２またはＸ３のうちの少なくとも１つは、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）２である。別の実施形態では、Ｘ１とＸ２は両方とも、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）２である。
【００５９】
一実施形態では、Ｘ１またはＸ２のうちの少なくとも１つは−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３である。別の実施形態では、Ｘ１とＸ２は両方とも、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３である。
【００６０】
式Ｉの選択された実施形態では、Ｘ１は−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）２であり、Ｘ２およびＸ３は、ヒドロキシおよびケトからから独立に選択される。さらなる実施形態では、Ｘ２は−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）２であり、Ｘ１およびＸ３は、ヒドロキシおよびケトからから独立に選択される。さらなる実施形態では、Ｘ３は−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）２であり、Ｘ１およびＸ２は、ヒドロキシおよびケトからから独立に選択される。さらなる実施形態では、Ｘ１とＸ２は両方とも、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）２であり、Ｘ３はＯＨである。またさらなる実施形態では、Ｘ１は−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）２であり、Ｘ２とＸ３は各々ＯＨである。またさらなる実施形態では、Ｘ２は−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）２であり、Ｘ１とＸ３は各々ＯＨである。
【００６１】
式Ｉの選択された実施形態では、Ｘ１は−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３であり、Ｘ２およびＸ３は、ヒドロキシおよびケトからから独立に選択される。さらなる実施形態では、Ｘ２は−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３であり、Ｘ１およびＸ３は、ヒドロキシおよびケトからから独立に選択される。さらなる実施形態では、Ｘ１とＸ２は両方とも、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３であり、Ｘ３はＯＨである。またさらなる実施形態では、Ｘ１は−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３であり、Ｘ２とＸ３は各々ＯＨである。またさらなる実施形態では、Ｘ２は−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３であり、Ｘ１とＸ３は各々ＯＨである。
【００６２】
式Ｉのいくつかの実施形態では、薬学的に許容される塩は塩酸塩である。
【００６３】
式Ｉの例示的化合物としては、本明細書で以下のように命名されたものが挙げられる：２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸６α，１６β−ジヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β−イルエステル（本明細書では４と表す）、２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸６α−（２−アミノ−３−メチル−ブチリルオキシ）−１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β−イルエステル（本明細書では７と表す）、２−（Ｌ）−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−メチル−酪酸３ｂ−アセトキシ−１６ｂ−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−６ａ−イルエステル（本明細書では１２と表す）、２−（Ｌ），３−ジメチル−ペンタン酸６α，１６β−ジヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β−イルエステル（本明細書では１４と表す）、２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−３−オキソ−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−６α−イルエステル（本明細書では３０と表す）、２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−ペンタン酸６α−（２−アミノ−３−メチル−ペンタノイルオキシ）−１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β−イルエステル（本明細書では３２と表す）、２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸３β，６α−ジヒドロキシ−１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−１６β−イルエステル（本明細書では３６と表す）および薬学的に許容されるその塩。
【００６４】
式Ｉの例示的化合物としては、本明細書で以下のように命名されたものが挙げられる：２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸６α，１６β−ジヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β−イルエステル塩酸塩、２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸６α−（２−アミノ−３−メチル−ブチリルオキシ）−１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β−イルエステル塩酸塩、２−（Ｌ）−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−メチル−酪酸３ｂ−アセトキシ−１６ｂ−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−６ａ−イルエステル塩酸塩、２−（Ｌ），３−ジメチル−ペンタン酸６α，１６β−ジヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β−イルエステル塩酸塩、２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−３−オキソ−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−６α−イルエステル塩酸塩、２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−ペンタン酸６α−（２−アミノ−３−メチル−ペンタノイルオキシ）−１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β−イルエステル塩酸塩  ｏｒ  ２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸３β，６α−ジヒドロキシ−１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−１６β−イルエステル塩酸塩。
【００６５】
一実施形態では、化合物は、以下の式Ｉの化合物：
【化１２】
0005830013.tif 000013
【化１３】
0005830013.tif 000014
【化１４】
0005830013.tif 000015
【化１５】
0005830013.tif 000016
および薬学的に許容されるそれらの塩から選択される。
【００６６】
式Ｉの例示的化合物は、式Ｉ：
【化１６】
0005830013.tif 000017
に関して、以下の表中の化合物を含む。
【表１】
0005830013.tif 000018
0005830013.tif 000019
【００６７】
上記の式Ｉの化合物は、溶媒中に処方した場合、本明細書に記載されたようなＴＲＡＰアッセイで測定された、該溶媒で処理された該細胞におけるレベルよりも少なくとも５０％大きい、少なくとも７０％大きい、少なくとも８０％大きい、または少なくとも９０％大きい、ＴＲＡＰアッセイで測定された、ケラチノサイトまたは線維芽細胞におけるテロメラーゼ活性のレベルを生じさせるのに有効である。さらなる実施形態では、化合物は、本明細書に記載されたようなＴＲＡＰアッセイで測定された、該溶媒で処理した該細胞におけるレベルよりも少なくとも１００％大きい、ＴＲＡＰアッセイで測定された、ケラチノサイトまたは線維芽細胞におけるテロメラーゼ活性のレベルを生じさせるのに有効である。
【００６８】
本発明はまた、１以上の式Ｉの化合物を含む薬学的組成物を提供する。
【００６９】
さらなる態様では、本発明は、細胞または組織を式Ｉの単離された化合物と接触させることによって、細胞または組織内のテロメラーゼを増大させる方法を提供する。この場合も、本方法は、テロメラーゼ活性の増大が望まれる細胞または組織を同定する工程を含み得る。
【００７０】
ＩＩＩ．式Ｉの化合物の源および合成
式の化合物は、下記のように合成することができる。
【００７１】
アストラガロシドＩ〜ＶＩＩは、例えば、Ａ．Ｋａｄｏｔａら、特開昭６２０１２７９１  Ａ２号（１９８７）に記載されているように、キバナオウギ（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ）の根から単離することができる。その中で報告されているように、有益な薬草の様々な源から商業的に利用可能な根組織（８ｋｇ）をＭｅＯＨで還流し、その濃縮抽出物（２００ｇ）をＭｅＯＨに再溶解させ、溶出液としてＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ混合物を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって分画する。各画分を、同様の溶媒混合物を用いる逆相シリカゲルクロマトグラフィーによって後処理すると、以下の概算量の単離された化合物：アセチルアストラガロシドＩ（０．２ｇ）、アストラガロシドＩ（３．５ｇ）、イソアストラガロシドＩ（０．３ｇ）、アストラガロシドＩＩ（２．３ｇ）、アストラガロシドＩＩＩ（１．０ｇ）、アストラガロシドＩＶ（０．８ｇ）、アストラガロシドＶ（０．１ｇ）、アストラガロシドＶＩ（０．３ｇ）、およびアストラガロシドＶＩＩ（０．１ｇ）が得られる。Ｋｉｔａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３１（２）：６９８−７０８（１９８３ｂ）も参照されたい。
【００７２】
シクロアストラゲノール（２）は、下記の実験の節（実施例１）に記載されているように、アストラガロシドＩＶ（１）をメタノール性ＨＣｌで処理した後、中和し、標準的な後処理をし、クロマトグラフィーで精製することによって調製することができる。シクロアストラゲノールは、Ｐ−Ｈ  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．４９：１０３−６（２００２）によって記載されているように、キバナオウギのブタノール抽出物の酸化的分解（酸素および元素ナトリウムによる処理）によって得ることもできる。
【００７３】
式Ｉの様々な実施形態、例えば、様々な程度にエステル化、アルキル化もしくはアシル化された化合物、またはケト基を有する化合物の調製物は、天然のおよび／または市販の出発材料（例えば、シクロアストラゲノール）を用いて、必要ならば生成物を分離して、有機合成の公知の方法によって調製することができる。下記の実験の節にいくつかの例が示されている。
【００７４】
ＩＶ．生物学的活性の決定
Ａ．ＴＲＡＰアッセイプロトコル
細胞内のテロメラーゼ活性を増大させる化合物の能力は、当技術分野で公知のＴＲＡＰ（テロメア反復増幅プロトコル）アッセイを用いて決定することができる（例えば、Ｋｉｍら、米国特許第５，６２９，１５４号；Ｈａｒｌｅｙら、米国特許第５，８９１，６３９号）。本明細書で使用するとき、「ＴＲＡＰアッセイで測定されたテロメラーゼ活性」とは、以下のプロトコルに従って、ケラチノサイトまたは線維芽細胞において測定されたテロメラーゼ活性を指す。活性は、通常、そのような細胞の対照アッセイで同様に測定される活性（例えば、溶媒対照で観察されるものより５０％大きいテロメラーゼ活性）と比較される。
【００７５】
このアッセイで使用するのに好適な細胞株である、正常ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または正常ヒト表皮ケラチノサイト（新生児）（ＨＥＫ）は、Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲもしくは４Ｃ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓｅｎｅｆｆｅ，ＢｅｌｇｉｕｍのＣａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓなどの商業的供給源、またはＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から得ることができる。ＡＴＣＣウェブサイトで探し出すことができるＡＴＣＣ正常ヒト線維芽細胞株としては、例えば、ＣＣＬ１３５、ＣＣＬ１３７およびＣＣＬ１５１が挙げられる。
【００７６】
例えば、新生児ヒト表皮ケラチノサイト（ＨＥＫ）を、増殖培地（例えば、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社により供給されるＥｐｉ−Ｌｉｆｅ培地＋ケラチノサイト増殖因子補給剤）中、約５０００細胞／ウェルで、９６ウェルマイクロタイタープレートにプレーティングし、１日間インキュベートする。９５％エタノールまたはＤＭＳＯなどの好適な溶媒中の試験組成物を、ある範囲の濃度で、選択されたウェルに添加し、さらに２４±１時間インキュベートする。
【００７７】
まず、試験すべき化合物を所望の最終濃度の１０倍で１０％ＤＭＳＯ中に処方する。処方された化合物をＤＭＳＯの対照とともに９６ウェル培養物に添加すると、様々な濃度の化合物が得られる。最終的なＤＭＳＯ濃度は、全ウェル中、１％であってもよい。他の細胞型についてまたは他の状況では、より高いまたはより低い濃度のＤＭＳＯが望ましい場合がある。
【００７８】
試験化合物とのインキュベーションの開始時および終了時の細胞の数を評価するために、同じ化合物で処理した２つ複製した細胞培養プレートを調製し、アラマーブルー（Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ）などの代謝応答性色素を用いることによって、テロメラーゼＴＲＡＰ試験と並行して細胞毒性アッセイを行なってもよい。
【００７９】
試験化合物の細胞毒性を客観的に測定しない場合、処理された細胞の形態をまず顕微鏡下で観察して、目に見える不規則な増殖の兆候がないことを確認することができる。
【００８０】
ＴＲＡＰアッセイを実施するために、培地をウェルから除去し、細胞を（ＣａとＭｇを含まない）ＰＢＳ中で２回すすぐ。ディッシュを氷上で冷やし、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０細胞溶解バッファーを添加し（１ウェル当たり約１００μｌ）、ピペッティングで数回上下させることによって粉砕化する。この細胞を氷上で１時間インキュベートする。
【００８１】
あるいは、増殖培地を除去し、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）で１回洗浄し、できる限り多くの培地を除去することによって、細胞を２４時間±１時間で回収してもよい。その後、５０μＬのＭ−Ｐｅｒバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔ＃  ７８５０３＆７８５０１）を添加し、氷上で１時間±１５分間インキュベートすることによって、細胞を溶解させる。場合により、プレートを２０００ＲＰＭで５分間遠心分離する。プレートの各ウェルからライセートを慎重に回収し、新しいＶ底の貯蔵９６ウェルプレートに移し、単層細胞をインタクトの状態にしておく。
【００８２】
あるいは、細胞溶解溶液は、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼを含まない５．０ｍＬのＨ２Ｏに、３．０ｍＬのＮｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ４０、１．０ｍＬのＣＨＡＰＳ溶解バッファー（下記参照）、および１．０ｍＬの１０×ＴＲＡＰバッファー（下記参照）を添加することによって調製され得る（ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼを含まない水は、ＤＥＰＣ（ジエチルピロカルボナート）処理によって作製してもよいし、またはＳｉｇｍａなどの販売会社から購入してもよい）。
【表２】
0005830013.tif 000020
【００８３】
細胞ライセート中のテロメラーゼ活性のレベルをＴＲＡＰアッセイを用いて測定する。
【表３】
0005830013.tif 000021
【００８４】
以下の材料を組み合わせて、マスターＰＣＲ混合物を作製する。
【表４】
0005830013.tif 000022
【００８５】
ＰＣＲ混合物は以下の成分を含む。Ｃｙ５−ＴＳプライマー（５’−ＡＡＴ  ＣＣＧ  ＴＣＧ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＧＴＴ−３’（配列番号１）という配列を有する５’−Ｃｙ５標識オリゴヌクレオチド）は、テロメラーゼの基質である。培地中のテロメラーゼ活性に応じて、テロメア反復（配列（ＡＧＧＧＴＴ）ｎを有する）が基質に付加され、テロメラーゼ産物とも呼ばれるテロメラーゼ伸長産物が形成されることになる。５’−ＧＣＧ  ＣＧＧ  ＣＴＴ  ＡＣＣ  ＣＴＴ  ＡＣＣ  ＣＴＴ  ＡＣＣ  ＣＴＡ  ＡＣＣ−３’（配列番号２）という配列を有するＡＣＸプライマーは、テロメラーゼ伸長産物にハイブリダイズする固定復帰プライマーである。
【００８６】
細胞ライセートのサンプル（例えば、５μＬ）を反応チューブ中のＰＣＲ混合物に添加し、テロメア伸長およびＰＣＲ増幅を、卓上ＰＣＲ機器にて、以下のサイクルプロファイルで行なう。すなわち、３０℃で３０分の後、以下の３段階の反応：９４℃／３０秒、６０℃／３０秒、および７２℃／１分を２８サイクル繰り返し、次いで７２℃／４分の後、４℃で保持する。
【００８７】
例えば、ブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノールを含むローディング色素を添加し、ブロモフェノールブルーがゲルから消えるまで、サンプルを、１×ＴＢＥ中、１０〜１５％の非変性ＰＡＧＥに供する。ＣＹ５標識テロメラーゼ産物の検出（６５０ｎｍで最大励起；６７０ｎｍで最大放出）のために、例えば、蛍光画像装置を用いて、ＴＲＡＰ反応産物を観察する。
【００８８】
テロメラーゼ活性は、各ゲルレーンのバックグラウンドを上回る捕捉された全ピクセル体積（ＤＮＡラダーバンド）によって測定し得る。活性は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ製のリボグリーン（登録商標）ＲＮＡ定量キット（カタログ＃  Ｒ−１１４９０）および商業的に推奨されている以下の条件（０．８〜２００ｎｇ／ｍＬのＲＮＡ標準範囲、１：２００希釈のＲＧ色素、１００〜２５０倍希釈のサンプル）を用いて、全ＲＮＡ（ｎｇ／ｍＬ）を測定することにより正規化し得る。
【００８９】
全ピクセル体積／ＲＮＡ＝正規化された相対テロメラーゼ活性である。
【００９０】
（細胞毒性の評価に使用される）細胞数は、アラマーブルーの読取値と正比例した。
【００９１】
あるいは、１組の内部標準とプライマーを定量目的で添加することができる。まず、ＴＳＵ２内部標準（ＴＳプライマー配列の伸長物の、５’−ＡＡＴ  ＣＣＧ  ＴＣＧ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＧＴＴ  ＡＡＡ  ＡＧＧ  ＣＣＧ  ＡＧＡ  ＡＧＣ  ＧＡＴ−３’；配列番号３という配列を有するオリゴヌクレオチド）を制御されたわずかな量で添加する。５’−ＡＴＣ  ＧＣＴ  ＴＣＴ  ＣＧＧ  ＣＣＴ  ＴＴＴ（配列番号４）という配列を有するＵ２プライマーは、内部標準の３’領域にハイブリダイズするように設計された復帰プライマーである。
【００９２】
増幅後のＴＳＵ２内部標準の最終量は、通常、５０μＬの反応混合物当たり５〜１０ｐｍｏｌである。この内部対照は、第１のテロメア付加産物の下に、ゲル上の明瞭な１本のバンドとして現れる特定の３６ｍｅｒのＰＣＲ増幅産物（すなわち、ＴＳオリゴヌクレオチドにテロメアが１つ付加された後、ＡＣＸ復帰プライマーで増幅された産物）を生じる。この内部対照バンドを用いて、様々なサンプルからのＰＣＲ増幅を正規化することができる。
【００９３】
このアッセイで生成したテロメラーゼ産物分子（ＴＭ）の相対数は、下式：
ＴＭ＝（ＴＴＲＡＰ産物−ＴＢＫＤ１）／（Ｔ内部標準−ＴＢＫＤ２）
（式中：ＴＴＲＡＰ産物は、全てのテロメラーゼ産物についてゲル上で測定された合計強度であり、ＴＢＫＤ１は、テロメラーゼ産物によって囲まれた面積と等しい大きさの面積について空白レーンで測定されたバックグラウンドであり、Ｔ内部標準は、内部標準バンドについての強度であり、ＴＢＫＤ２は、内部標準バンドよって囲まれた面積と等しい大きさの面積について空白レーンで測定されたバックグラウンド強度である）によって決定される。結果として得られた数は、ＴＭを決定する目的で、本明細書では３０分と指定される所与のインキュベーション時間に生成されたテロメラーゼ産物の分子数である。
【００９４】
上記のような式Ｉの化合物は、１μＭ以下の濃度で、線維芽細胞またはケラチノサイトにおいて、溶媒対照で見られるテロメラーゼ活性のレベルよりも少なくとも５０％大きいテロメラーゼ活性のレベルを生じさせることができる。１０μＭ以下の濃度で、記載されたＴＲＡＰアッセイで測定される、溶媒対照で見られるそのような活性のレベルよりも少なくとも約７５％、１００％または５００％大きいテロメラーゼ活性を生じさせる化合物などの、さらにより強力な活性が、いくつかの用途には適切である場合がある。
【００９５】
テロメラーゼ活性の増大における有効性を様々な濃度の上記の式Ｉの化合物について評価した。上記のプロトコルに従って、ＨＥＫｎｅｏＰ細胞（新生児ケラチノサイト）でアッセイを行なった。濃度は、通常、ＤＭＳＯ中約０．００１μＭ〜１０μＭの範囲であった。
【００９６】
テロメラーゼの活性を増大させる化合物の能力を表２に示す。
【００９７】
Ｂ．創傷治癒アッセイプロトコル
式Ｉの化合物を用いて、下記でさらに論じられるように、創傷、火傷、擦過傷または表皮の他の急性もしくは慢性状態の治癒を促進することができる。本明細書で使用するとき、「スクラッチアッセイで測定された創傷治癒活性」とは、以下のプロトコルに従って、ケラチノサイトまたは線維芽細胞で測定され、下式で示されたＷＨの数値で表される活性を指す。
【００９８】
細胞をフラスコにプレーティングし（フラスコ１つ当たり５×１０５細胞）、５％ＣＯ２、３７℃の加湿チャンバ内で２日間培養する。「創傷」を作り出すために、２ｍｌのプラスチックピペットを静かに引き動かして細胞表面を「スクラッチ」する。理想的な創傷は、幅が約２〜３ｍｍ、長さが５０ｍｍ（組織培養フラスコの長軸に沿って）である。ビヒクル（ＤＭＳＯ；対照サンプル）または複数の濃度の試験組成物のいずれかを含む培地で細胞を再処理する。創傷部分を特定し、フラスコに印を付け、細胞の外観を、３〜４日間細胞培養を続ける間、写真で記録する。
【００９９】
ビヒクル処理細胞または他の対照細胞と比べた化合物処理サンプルの経時的な創傷の幅を測定することによって、創傷閉鎖の量が決定される。測定は、１日目（スクラッチした直後）、２日目、３日目、および４日目に各サンプルについて撮られた写真から行われる。創傷治癒のパーセンテージ（「創傷治癒活性」とも表される）を、下式：
ＷＨ＝１００−（１００×Ｗｎ／Ｗ０）
（式中、Ｗｎは、ｎ日目の創傷の幅であり、Ｗ０は、１日目（すなわち、スクラッチした直後）の創傷の幅である）から算出した。
【０１００】
Ｖ．治療適応症および治療方法
本発明は、細胞または組織を、細胞内のテロメラーゼ活性を増大させるのに有効な量の上記の第ＩＩ節に開示されたような単離された式Ｉの化合物の処方物と接触させることによって、細胞内のテロメラーゼ活性を増大させる方法を提供する。本方法は、テロメラーゼ活性の増大が望まれる細胞または組織を同定する予備工程を含み得る。細胞は、培養されているもの、すなわち、インビトロもしくはエクスビボにあるものでもよいし、またはインビボで対象もしくは患者内にあるものでもよい。
【０１０１】
細胞または組織内のテロメラーゼ活性の増大によって実現すべき利益としては、例えば、接触した細胞の複製能力の増強および／または寿命の延長ならびに細胞の改善された機能的能力（すなわち、細胞の通常の分化した機能の改善された発現）の増強が挙げられる。本方法は、患者の細胞または組織におけるテロメラーゼ活性の増大が望まれる対象または患者における状態の診断、例えば、細胞または組織におけるテロメラーゼ活性の増大による治療の対象となる疾患の診断をさらに含み得る。したがって、本発明は、該患者の細胞または組織におけるテロメラーゼ活性を増大させることによって、患者における状態を治療する方法であって、そのような治療を必要とする対象に、有効量の上記の第ＩＩ節に開示されたような式Ｉの化合物を投与することを含む方法を提供する。「有効量」とは、治療結果が達せられるように、患者の細胞または組織内のテロメラーゼ活性を増大させるのに有効な量を指す。
【０１０２】
治療または予防されるそのような状態または疾患には、例えば、細胞老化と関連するかまたはテロメア反復の喪失の加速を導く、テロメラーゼの非存在下における細胞の増殖速度の増加に関連する状態が含まれ得る。「増殖速度の増加」とは、その細胞型の正常な細胞と比較して、またはその細胞型の他の個体内の正常な細胞と比較して、より高い細胞分裂速度を意味する。異常に早い年齢におけるそれらの細胞群の老化は、いずれは疾患に至ること可能性がある（Ｗｅｓｔら、米国特許第６，００７，９８９号を参照されたい）。
【０１０３】
特定の細胞型におけるテロメラーゼ活性の増大が有益であり得る様々な疾患状態が存在する。したがって、本発明は、患者の細胞内のテロメラーゼ活性を増大させることによって、以下から選択される状態または疾患を患者において治療する方法であって、そのような治療を必要とする対象に、有効量の上記のような式Ｉの化合物を投与することを含む方法をを提供する。場合によっては、この状態は、関連した細胞型（括弧内に示されている）を利用する、以下でさらに記載されているような、エクスビボ細胞療法による治療の対象となり得る。
（ａ）アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および脳卒中（ニューロン、グリア細胞、例えば、星状細胞、内皮細胞、線維芽細胞をはじめとする中枢神経系の細胞）、
（ｂ）皮膚の萎縮および菲薄化、弾力線維分解および皮膚のしわ、皮脂腺の過形成もしくは低形成、老年性黒子および他の色素沈着異常、白髪化および抜毛または菲薄化、または慢性皮膚潰瘍などの、皮膚の加齢関連疾患（線維芽細胞、皮脂腺細胞、メラニン形成細胞、ケラチノサイト、ランゲルハンス細胞、微小血管内皮細胞、毛嚢細胞）、
（ｃ）変性関節疾患（軟骨細胞ならびに陰窩線維芽細胞および滑膜線維芽細胞などの関節軟骨の細胞）、
（ｄ）骨粗鬆症および骨格系の他の変性状態（骨芽細胞、骨髄間質細胞または間充織細胞、骨芽前駆細胞などの骨格系の細胞）、
（ｅ）アテローム性動脈硬化症、石灰化症、血栓症および動脈瘤をはじめとする血管系の加齢およびストレス関連疾患（内皮細胞、平滑筋細胞、および外膜線維芽細胞をはじめとする心血管系の細胞）、
（ｆ）加齢関連黄斑変性（色素沈着上皮細胞および血管内皮細胞などの眼の細胞）
（ｇ）ＡＩＤＳ（ＨＩＶ制限ＣＤ８＋細胞）；
（ｈ）自然的加齢、癌、癌療法、急性または慢性感染に伴って、または細胞代謝回転の加速を引き起こす遺伝子障害に伴って生じる、組織代謝回転の障害、ならびに関連貧血および他の変性状態をはじめとする加齢およびストレス関連免疫系障害（Ｂリンパ球およびＴリンパ球、単球、循環マクロファージおよび特殊化した組織マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、ＮＫ細胞、ならびにそれらのそれぞれの前駆体などの、リンパ系、骨髄系および赤血球系の細胞をはじめとする、免疫系の他の細胞）；ならびに
（ｉ）肺線維症または肝硬変または肝線維症；
（ｊ）バレット食道などの慢性炎症性消化管疾患；ならびに
（ｋ）骨髄不全症候群、再生不良性貧血、骨髄異形成貧血または骨髄異形成症候群。
【０１０４】
上述の細胞型に加えて、テロメラーゼ活性の増大が治療的に有益であり得るさらなる細胞型としては、肝臓、内分泌腺および外分泌腺、平滑筋系、または骨格筋系の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
一例として、ＨＩＶ感染個体の場合、ＣＤ８＋細胞の代謝回転は、これらの細胞が、ＨＩＶ感染ＣＤ４＋細胞のレベルを制御しようとするときに増大する。ＡＩＤＳ（上記（ｇ）の項）では、ＨＩＶ制限ＣＤ８＋細胞の早期老化によって疾患が生じると考えられている。そのような細胞の老化は、１回の細胞倍加当たりの異常な量のテロメア配列の喪失によるだけでなく、それに加えて、テロメアの損耗が、その細胞群の通常のテロメア損耗よりも大きくなるように、細胞の複製速度が増大することにもよる。したがって、本発明は、ＨＩＶ感染対象を治療する方法、およびより具体的には、そのような治療を必要とする対象に、有効量の上記の第ＩＩ節に開示されたような式Ｉの化合物を投与することによって、ＨＩＶ感染対象におけるＨＩＶ制限ＣＤ８＋細胞の早期老化を軽減する方法を提供する。
【０１０６】
テロメラーゼ活性の増大は、例えば、心不全または脳卒中における虚血などの、ストレスによる細胞死に対する感受性の増大に関連した状態において、非分裂細胞および増殖細胞に利益をもたらすことができる（例えば、Ｏｈ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ３４（７）：７１７−２４；Ｍａｔｔｓｏｎ，Ｅｘｐ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．３５（４）：４８９−５０２を参照されたい）。したがって、本発明は、対象の細胞内のテロメラーゼ活性を増大させることによって、対象（例えば、心不全または脳卒中による組織の虚血状態を経験している対象）におけるストレスまたはＤＮＡ損傷誘導性の細胞死を減少させる方法であって、そのような治療を必要とする対象に、有効量の上記の第ＩＩ節に開示されたような式Ｉの化合物を投与することを含む方法を提供する。上述のように、本方法は、示された状態を対象において診断する予備工程を含み得る。
【０１０７】
別の態様では、組成物を、１以上の細胞型がその患者において限界となっており、かつそれらの細胞が複製を続ける能力またはストレス誘導性細胞死に抵抗する能力を拡大することによって、その寿命を延長することができる個体の治療に使用してもよい。そのような細胞群の一例は、ダウン症候群の患者に存在するリンパ球である。したがって、本発明は、患者の該細胞におけるテロメラーゼ活性を増大させることによって、ダウン症候群の患者に存在するリンパ球の複製能力を増強するおよび／または寿命を延長する方法であって、そのような患者に、有効量の上記の第ＩＩ節に開示されたような式Ｉの化合物を投与することを含む方法を提供する。また、組成物を、通常の老化時に生じるストレス誘導性細胞死に対する抵抗性を改善するために使用してもよい。
【０１０８】
本発明のさらなる態様では、テロメラーゼ活性の増大は、肺線維症を予防するかまたは肺線維症の治癒を促進するのに有効である。短いテロメアは、特発性肺線維症および原因不明肝硬変のシグナチャーであることが明らかにされている（Ａｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（２００８）  １０５（３５）１３０５１−１３０５６）。化合物を肺線維症または肝硬変を治療するために使用してもよい。
【０１０９】
さらなる態様では、本発明は、生きているドナーまたは死体から生きている患者または対象への組織の移植を増進する方法であって、移植組織を上で定義したような単離された式Ｉの化合物と接触させることを含む方法を提供する。さらなる態様では、本発明は、生きている患者または対象への組織の移植を増進する方法であって、患者への組織の移植の前に、組織の移植と同時に、または組織の移植の後しばらくの間、上で定義したような単離された式Ｉの化合物を患者に投与することを含む方法を提供する。移植される組織は、固形組織（例えば、腎臓、心臓、肺など）、または造血組織（例えば、限定するものではないが、血液細胞、例えば、白血球、リンパ球もしく骨髄に由来し得る造血前駆細胞）などであり得る
【０１１０】
本発明のさらなる態様では、テロメラーゼ活性の増大は、創傷、火傷、擦過傷または表皮の他の急性もしくは慢性状態の治癒を促進するのに有効である。したがって、本発明は、そのような治療を必要とする患者に対して、患部に局所的に、有効量の上記の第ＩＩ節に開示されたような単離された式Ｉの化合物の処方物を投与することによって、表皮の急性または慢性状態を治療する方法を提供する。
【０１１１】
本明細書で使用するとき、「表皮の急性または慢性状態」としては、外傷、火傷、擦過傷、外科的切開部位、ドナー移植部位で負った病変、および感染性因子により生じた病変などの急性状態、ならびに慢性静脈潰瘍、糖尿病性潰瘍、圧迫潰瘍、床擦れ、および粘膜表面の潰瘍またはびらんなどの慢性状態が挙げられる。また、永続的な炎症状態または感染によるかまたは遺伝子欠陥によって生じた皮膚または上皮表面の病変（例えば、ケロイド形成および凝固異常）も挙げられる。例えば、ＰＣＴ刊行物ＷＯ０２／９１９９９号を参照されたい。
【０１１２】
そのような治療におけるテロメラーゼ活性の増大の望ましい効果としては、治療部位における細胞増殖もしくは細胞移動、表面の上皮形成、創傷の閉鎖（存在する場合）、または正常な生理学的機能の回復が挙げられる。治療部位の「上皮形成」または「再上皮形成」とは、適用された療法の結果としてのその部位における上皮細胞の密度の増加を意味する。
【０１１３】
また、本方法を、移植された細胞の増殖を増強するために使用してもよい。そのような治療におけるテロメラーゼ活性の増大の望ましい効果としては、治療部位の被覆、移植された細胞の生存、免疫拒絶が無いこと、創傷の閉鎖（存在する場合）、または正常な生理学的機能の回復が挙げられる。移植された細胞は、治癒過程に直接関与する（例えば、治癒組織の一部となる）ことによるか、または創傷を被覆し、それにより宿主細胞による治癒を促進する環境を提供することによって、創傷閉鎖に関与し得る。
【０１１４】
本発明はまた、皮膚の操作および皮膚表面における何らかの認められる欠陥の修復を想定している。
【０１１５】
さらなる態様では、本発明の方法および組成物を、細胞内のテロメラーゼ活性を増大させることによって、培養において（例えば、エクスビボもしくはインビトロ細胞療法において）、またはモノクローナル抗体産生において、細胞の複製能力を増強し、かつ／または寿命を延長させるために使用することができる。テロメラーゼ活性の増大は、細胞増殖時のテロメラーゼ反復の喪失を遅延させ、かつ／またはストレス誘導性の細胞死に対する抵抗性を改善することによって、そのような細胞の複製能力を増大させる。
【０１１６】
エクスビボ用途の場合、有効量の上記のような式Ｉの化合物を、対象から得られた外植片細胞に添加する。「有効量」とは、細胞内のテロメラーゼ活性を増大させ、それにより細胞の複製能力を増大させ、かつ／または寿命を延長させるのに有効な量を指す。
【０１１７】
外植片細胞としては、例えば、骨髄幹細胞などの幹細胞（米国特許第６，００７，９８９号）、骨髄間質細胞（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０（６）：５９２−６，２００２）、または副腎皮質細胞（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８（１）：３９−４２，２０００）を挙げることができる。上記（ａ）〜（ｇ）項に記述されたものなどの疾患状態もまた、エクスビボでの細胞に基づく療法の対象となり得る。例としては、筋ジストロフィ治療のための筋衛星細胞、骨粗鬆症治療のための骨芽細胞、加齢関連黄斑変性に対する網膜色素沈着上皮細胞、骨関節炎に対する軟骨細胞などの使用が挙げられる。
【０１１８】
例えば、ＡＩＤＳ患者では、感染したＣＤ４＋細胞の拡大を制御するのに、機能的ＣＤ８＋細胞が限界になっているという認識から、ＡＩＤＳが最初に検出された早い段階で、ＨＩＶ感染個体からＨＩＶ制限ＣＤ８＋細胞を取り出し、バンクに保存し、その後、その個体に必要な利用できるＣＤ８＋細胞がもはやなくなってしまう、より後の段階で、その個体に再導入するという治療プロトコルを考案することができる。したがって、適切な時点での限界になった個体の細胞の継続的投与を含むプロトコルによって、その個体の寿命を延長することができる。これらの適切な時点は、その後のＣＤ８＋細胞の老化によるか、またはそれらの細胞が老化する時の兆候としての、そのようなＣＤ８＋細胞内のテロメアの長さを測定することによって、決定することができる。本発明によって、テロメア反復の喪失を遅延させる薬剤、すなわち、上記の第ＩＩ節に開示されたような式Ｉの化合物の存在下で保存細胞の数を拡大することができる。
【０１１９】
したがって、本発明は、対象から細胞集団を得て、この細胞集団をエクスビボで拡大することを含む、エクスビボでの細胞に基づく療法の方法を提供し、ここで、この細胞集団は、細胞集団のテロメラーゼ活性を増大させ、それにより細胞集団の複製能力を増大させ、かつ／または細胞集団の寿命を延長させるのに有効な量の上記の第ＩＩ節に開示されたような式Ｉの化合物で処理される。本方法は一般に、エクスビボでの細胞に基づく療法による治療の対象となる状態（例えば、上述の状態）を対象において診断することを含む。
【０１２０】
さらなる実施形態では、本発明は、幹細胞増殖の方法を提供し、ここで、この幹細胞集団は、細胞集団のテロメラーゼ活性を増大させ、それにより細胞集団の複製能力を増大させ、かつ／または細胞集団の寿命を延長させるのに有効な量の上記の第ＩＩ節に開示されたような式Ｉの化合物で処理される。
【０１２１】
ＶＩ．処方物および投与の方法
本発明は、細胞内のテロメラーゼ活性を増大させ、かつ／または創傷治癒を促進するのに有用な薬学的組成物を調製する方法を包含する。したがって、第ＩＩ節に記載されたような単離された式Ｉの化合物は、薬学的賦形剤、ならびに任意で他の医療用の薬剤、補助剤（これらは、活性成分および非活性成分を含み得る）などと組み合わされる。組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、徐放処方物、液剤、懸濁剤、エマルジョン、坐剤、クリーム、軟膏、ローション、エアロゾルなどの固体、半固体、凍結乾燥粉末、または液体の投薬形態を取り得る。処方物は、正確な投薬量の簡単な投与に好適な単位投薬形態として提供され得る。
【０１２２】
単離された式Ｉの化合物はまた、経口投与用に処方され得る。経口薬学的処方物の場合、好適な賦形剤としては、マンニトール、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、デンプン、セルロース、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、および／またはカルボン酸マグネシウムなどの薬学的等級の担体が挙げられる。経口液体処方物において使用するために、組成物は、例えば、塩類溶液、デキストロース溶液、グリセロール、もしくはエタノール、ポリエチレングリコール、マクロゴール−１５ヒドロキシステアラート、または例えば、水もしくは生理食塩水などの水性担体における水和に好適な固体または液体形態のいずれかで供給される、液剤、懸濁剤、エマルジョンまたはシロップとして調製されてもよい。所望の場合、組成物はまた、湿潤剤、乳化剤、または緩衝剤などの微量の非毒性補助物質を含み得る。
【０１２３】
創傷治癒または表皮の他の急性もしくは慢性状態の治療において使用するために、式Ｉの化合物は、局所投与用に処方される。局所適用のためのビヒクルは、様々な形態のうちの１つ、例えば、ローション、クリーム、ゲル、軟膏、スティック、スプレー、またはペーストであってもよい。これらの製品形態は、周知の方法に従って処方することができる。それらは、限定するものではないが、液剤、エアロゾル、エマルジョン、ゲルおよびリポソームなどの様々な種類の担体を含み得る。担体は、例えば、水中油基剤または油中水基剤を有するエマルジョンとして処方され得る。エマルジョンで利用される好適な疎水性（油性）成分としては、例えば、植物油、動物油脂、合成炭化水素、ならびにポリエステルをはじめとする、それらのエステル類およびアルコール類、ならびに有機ポリシロキサン油が挙げられる。そのようなエマルジョンはまた、連続相内の不連続相を分散および懸濁させるために、当技術分野でよく知られているような、乳化剤および／または界面活性剤（例えば、非イオン性界面活性剤）を含み得る。
【０１２４】
局所処方物は通常、構造化剤、増粘剤またはゲル化剤、および皮膚軟化剤または潤滑剤から選択される１以上の成分を含む。よく利用される構造化剤としては、ステアリルアルコールなどの長鎖アルコール類、ならびにグリセリルエーテル類またはそのエステル類およびオリゴ（エチレンオキシド）エーテル類またはそのエステル類が挙げられる。増粘剤およびゲル化剤としては、例えば、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーおよびそれらのエステル類、ポリアクリルアミド類、ならびに寒天、カラギーナン、ゼラチン、およびグアーゴムなどの天然増粘剤が挙げられる。皮膚軟化剤の例としては、トリグリセリドエステル類、脂肪酸エステル類およびアミド類、蜜ろう、鯨ろう、カルナウバろうなどのろう、レシチンなどのリン脂質、ならびにステロール類およびその脂肪酸エステル類が挙げられる。局所処方物は、当技術分野で公知の他の成分、例えば、収斂剤、芳香剤、色素、皮膚浸透促進剤、日焼け止めなどをさらに含み得る。
【０１２５】
薬学的組成物はまた、非経口、経皮、または吸入による投与用に処方され得る。非経口投与用の注射可能組成物は通常、滅菌生理食塩水などの好適なＩＶ溶液中に活性化合物を含む。組成物はまた、脂質もしくはリン脂質中、リポソーム懸濁液中、または水性エマルジョン中の懸濁液として処方され得る。
【０１２６】
吸入による投与のために、活性化合物は、固体または液体のエアロゾル粒子として処方される。処方物はまた、噴射剤および／またはエアロゾル形成を容易にするための分散剤（例えば、乳糖）を含み得る。経皮投与のために、活性化合物は、選択された皮膚領域への化合物の緩徐な送達を可能にし、かつ脂肪族アルコール類またはグリセロールなどの浸透促進物質も含み得る経皮パッチに含まれる。
【０１２７】
そのような処方物を調製するための方法は、当業者に知られているか、または当業者に明白となるであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１９版，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９９５）を参照されたい。投与される組成物は、標的細胞または標的組織においてテロメラーゼ活性を増大させる上で薬学的に安全でかつ有効な量の一定量の選択された化合物を含む。
【０１２８】
薬学的組成物は、０．１％（ｗ／ｖ）よりも多く、約１０％（ｗ／ｖ）まで、約５％（ｗ／ｖ）まで、および約１％（ｗ／ｖ）までの、少なくとも０．１％（ｗ／ｖ）の上記のような式Ｉの化合物を含む。好適な濃度の選択は、活性剤の所望の用量、送達の頻度および送達の方法などの因子によって決まる。
【０１２９】
哺乳動物またはヒト患者などの対象または患者の治療のために、投薬量は、対象の体重および全身の健康、治療の対象となる状態、症状の重症度などの因子に基づいて決定される。投薬量および濃度は、所望の利益をもたらすと同時に、望ましくない副作用を避けるように決定される。対象化合物の通常の投薬量は、１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、１〜２５ｍｇ／ｋｇ／日、１〜２０ｍｇ／ｋｇ／日、４〜１５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。対象化合物の通常の投薬量は、ヒト患者の場合、約１〜１，５００ｍｇ／日、約１〜５００ｍｇ／日の範囲である。特定の実施形態では、例えば、本明細書で４と表された化合物は、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ／日または少なくとも５ｍｇ／ｋｇ／日のレベルで投与される。
【０１３０】
式Ｉの化合物の投与は、１日おき、毎日、１日２回またはそれより頻繁であってもよい。投与は、１回、１〜２０日間、５〜１０日間、または予防または治療中の疾患もしくは状態を予防もしくは治療する必要がある限り途切れることなく行なわれてもよい。
【０１３１】
以下の実施例は、実例として提示されるのであって、限定として提示されるのではない。
（実施例）
【０１３２】
実施例１．アストラガロシドＩＶ（１）の１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β，６α，１６β−トリオール（シクロアストラゲノール）（２）への変換
【化１７】
0005830013.tif 000023
【０１３３】
アストラガロシドＩＶ（１）（５．００ｇ、ｍｍｏｌ）に、「ＨＣｌ−ＭｅＯＨ  １０」（ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ）（５００ｍＬ）を添加し、混合物を、室温で７日間撹拌した。反応混合物を減圧下２０℃（加熱せず）で約半分の容量まで濃縮した。この混合物を、重炭酸ナトリウム水溶液および酢酸エチルに分配した。水層を、酢酸エチルで再び抽出した。有機層を合わせ、飽和塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（２０：１〜１４：１のクロロホルム／メタノール）で精製した。残留溶媒をエタノールと置き換えるために、精製物質をエタノールに溶解させ、この溶媒を減圧下で除去して、２（２．１ｇ、６４％）を得た。
【０１３４】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）０．３４（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ），０．４８（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，１Ｈ），０．９２（ｓ，３Ｈ），０．９３（ｓ，３Ｈ），１．０−１．８（ｍ，１３Ｈ），１．１１（ｓ，３Ｈ），１．１９（ｓ，３Ｈ），１．２２（ｓ，６Ｈ），１．２７（ｓ，３Ｈ），１．９−２．０（ｍ，４Ｈ），２．３０（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），２．５４（ｑ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，１Ｈ），３．２７（ｍ，１Ｈ），３．５０（ｍ，１Ｈ），３．７２（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），４．６５（ｑ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ）。  ＥＳＩ−ＭＳ  正のｍ／ｚ４９１（Ｍ＋Ｈ）＋、負のｍ／ｚ５４９（Ｍ＋ＡｃＯ）−。ＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ，Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０）  Ｒｆ＝０．３３（６：１クロロホルム／メタノール）。
【０１３５】
実施例２．２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸６α，１６β−ジヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β−イルエステル塩酸塩（Ｃ３−（Ｌ）−バリル−シクロアストラゲノール）（４）の調製
【化１８】
0005830013.tif 000024
３の調製：Ｂｏｃ−（Ｌ）−バリン−ＯＨ（１８ｇ、８１．６３ｍｍｏｌ）（Ｂａｃｈｅｍ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を１５０ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解させた。これに、１５ｇ（８１．６３ｍｍｏｌ）のペンタフルオロフェノールを添加した。反応液を氷浴中で冷却した後、１２．８ｍｌ（８１．６３ｍｍｏｌ）の１，３ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）をゆっくりと添加した。全て添加した後、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。３０分の時点で、反応混合物は混濁していた（ジイソプロピルカルボジイミド−尿素沈殿）。次に、この混合物に、１０ｇ（２０．４１ｍｍｏｌ）の（２）、次いで１０ｇ（８１．６３ｍｍｏｌ）のジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を添加し、反応液を室温で２４時間撹拌した。反応混合物を分液漏斗に移し、Ｈ２Ｏ（２×）、１％水性ＨＣｌ（２×）、０．１Ｎ水性ＮａＯＨ（２×）、飽和ＮａＨＣＯ３（３×）、Ｈ２Ｏ（１×）およびブライン（１×）で洗浄し、有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で蒸発させた。残渣を、ＤＣＭ中２％−５％ＭｅＯＨの溶媒勾配を用いるフラッシュクロマトグラフィーを用いて精製すると、７．０ｇ（５０％）の標的生成物３が６．０ｇ（３３％）のビス生成物とともに得られた。
【０１３６】
３についての１Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：０．３８（１Ｈ，ｂｓ），０．５２（１Ｈ，ｂｓ），０．９０−１．３８（ｍ，３０Ｈ），１．３９−１．４５（ｓ，ｍ１２Ｈ），１．５９−１．６３（ｍ，５Ｈ），１．７６−１．８２（ｍ，２Ｈ），１．９６−２．０１（ｍ，４Ｈ），２．１６−２．２０（ｍ，１Ｈ），２．３０−２．３５（ｄ，１Ｈ），２．４９−２．５４（ｑ，１Ｈ），３．４５−３．５７（ｔ，１Ｈ），３．７１−３．７６（ｔ，１Ｈ），４．１９−４．２１（ｍ，１Ｈ），４．５３−４．６１（ｍ，１Ｈ），４．６９−４．７１（ｑ，１Ｈ），５．０−５．２（ｄ，１Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）６９０。
【０１３７】
【化１９】
0005830013.tif 000025
４の調製：１ｇ（１．４５ｍｍｏｌ）の３に、１．８ｍｌの４．０Ｍ  ＨＣｌ／ジオキサンを添加し、４時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、生成物を１０ｍｌの冷ジエチルエーテル中で沈殿させ、固体を濾過した。次に、この固体を高真空下で乾燥させると、８００ｍｇ（８８％）の標的生成物４（２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸６α，１６β−ジヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β−イルエステル塩酸塩）が白色の固体として得られた。
【０１３８】
４についての１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ６）δｐｐｍ：０．３６（ｂｓ，１Ｈ），０．４９（ｂｓ，１Ｈ），０．８０−１．３９（ｍ，２９Ｈ），１．４４−１．６０（ｍ，３Ｈ），１．６１−１．７０（ｍ，２Ｈ），１．８１−１．８９（ｍ，４Ｈ），２．１９−２．３０（ｍ，２Ｈ），２．４１−２．６０（ｍ，２Ｈ），３．２９−３．４１（ｍ，２Ｈ），３．５８−３．６１（ｔ，１Ｈ），３．８１−３．８３（ｍ，１Ｈ），４．１８−４．３９（ｂｓ，４Ｈ），４．４９−４．５１（ｑ，２Ｈ），４．５４−４．５９（ｍ，１Ｈ），８．４０−８．５８（ｂｓ，２Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）５９０。
【０１３９】
実施例３．２−（Ｄ）−アミノ−３−メチル−酪酸６α，１６β−ジヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β−イルエステル塩酸塩（Ｃ３−（Ｄ）−バリル−シクロアストラゲノール）（５）の調製
【化２０】
0005830013.tif 000026
Ｂｏｃ−（Ｄ）バリン−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）（１８ｇ、８１．６３ｍｍｏｌ）とともに実施例２の手順を用いて、化合物５を調製した。
【０１４０】
５についての１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ６）δｐｐｍ：０．３０（ｂｓ，１Ｈ），０．５０（ｂｓ，１Ｈ），０．８０−１．３９（ｍ，２９Ｈ），１．４６−１．５８（ｍ，３Ｈ），１．６１−１．７０（ｍ，２Ｈ），１．７９−１．８９（ｍ，４Ｈ），２．１６−２．３２（ｍ，２Ｈ），２．３８−２．５４（ｍ，２Ｈ），３．２９−３．４１（ｍ，２Ｈ），３．５８−３．６１（ｔ，１Ｈ），３．８１−３．８３（ｍ，１Ｈ），４．１３−４．２４（ｂｓ，４Ｈ），４．５０−４．５２（ｑ，２Ｈ），４．５４−４．５９（ｍ，１Ｈ），８．４３−８．６０（ｂｓ，２Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）５９０。
【０１４１】
実施例４：２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸６α−（２−アミノ−３−メチル−ブチリルオキシ）−１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β−イルエステル塩酸塩（Ｃ３，Ｃ６−（Ｌ，Ｌ）−ビスバリル−シクロアストラゲノール）−７の調製
【化２１】
0005830013.tif 000027
６の調製：Ｂｏｃ−（Ｌ）バリン−ＯＨ（１０ｇ、４６．０８ｍｍｏｌ）を８０ｍｌのＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）に溶解させた。これに、８．５ｇ（４６．０８ｍｍｏｌ）のペンタフルオロフェノールを添加した。反応液を氷浴中で冷却した後、７．２ｍｌ（４６．０８ｍｍｏｌ）のＤＩＣをゆっくりと添加した。全て添加した後、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。３０分の時点で、反応混合物は混濁していた（ジイソプロピルカルボジイミド−尿素沈殿）。次に、この混合物に、３．２ｇ（６．６０ｍｍｏｌ）の２、次いで５．５ｇ（４５ｍｍｏｌ）のＤＭＡＰを添加し、反応液を室温で２４時間撹拌した。反応混合物を分液漏斗に移し、Ｈ２Ｏ（６×）、１％水性ＨＣｌ（２×）、０．１Ｎ水性ＮａＯＨ（２×）、飽和ＮａＨＣＯ３（３×）、Ｈ２Ｏ（１×）およびブライン（１×）で連続的に洗浄し、有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で蒸発させた。残渣をＤＣＭ中２％−５％ＭｅＯＨの溶媒勾配を用いるフラッシュクロマトグラフィーを用いて精製すると、４．８ｇ（８３％）の標的生成物６が得られた。
【０１４２】
６についての１Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：０．３８（１Ｈ，ｂｓ），０．６０（１Ｈ，ｂｓ），０．８０−１．０（ｍ，２４Ｈ），１．１５（ｓ，ｓ６Ｈ），１．２０（ｓ，ｓ６Ｈ），１．３１（ｓ，６Ｈ），１．３５（ｓ，ｓ４Ｈ）１．４１（ｓ，ｓ１８Ｈ），１．５６−１．６０（ｍ，４Ｈ），１．７９−１．８３（ｍ，３Ｈ），３．７１−３．７６（ｔ，１Ｈ），４．０８−４．２１（ｍ，２Ｈ），４．５８−４．６０（ｍ，１Ｈ），４．６１−４．７０（ｑ，１Ｈ），４．７２−４．８０（ｍ，１Ｈ），４．８２−４．８４（ｄ，１Ｈ），４．９−５．０（ｄ，１Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）８８９。
【０１４３】
【化２２】
0005830013.tif 000028
７の調製：４．５ｇ（５．０６ｍｍｏｌ）の６に、１３ｍｌの４．０Ｍ  ＨＣｌ／ジオキサンを添加し、４時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、生成物を４０ｍｌの冷ジエチルエーテルで沈殿させ、固体を濾過して除去した。次に、この固体を高真空下で乾燥させると、３．１ｇ（９１％）の標的生成物７が白色の固体として得られた。７についての１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ６）δｐｐｍ：０．２４（ｂｓ，１Ｈ），０．５９（ｂｓ，１Ｈ），０．８０−１．２０（ｍ，３５Ｈ），１．４１−１．８５（ｍ，１２Ｈ），２．１０−２．２２（ｍ，２Ｈ），２．３２−２．４２（ｍ，４Ｈ），２．１９−２．３０（ｍ，２Ｈ），３．５９−３．６２（ｍ，１Ｈ），３．８１−３．８３（ｍ，２Ｈ），４．４０−４．５３（ｍ，１Ｈ），４．６０−４．７１（ｍ，１Ｈ），４．８１−４．９（ｍ，１Ｈ），８．４０−８．７０（ｄ，４Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）６８９。
【０１４４】
実施例５：２−（Ｄ）−アミノ−３−メチル−酪酸６α−（２−アミノ−３−メチル−ブチリルオキシ）−１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β−イルエステル塩酸塩（Ｃ３，Ｃ６−（Ｄ，Ｄ）−ビスバリル−シクロアストラゲノール）８の調製
実施例４の手順およびＢｏｃ−（Ｄ）バリン−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を用いて、化合物８を調製した。
【化２３】
0005830013.tif 000029
【０１４５】
８についての１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ６）δｐｐｍ：０．２６（ｂｓ，１Ｈ），０．６０（ｂｓ，１Ｈ），０．７８−１．２３（ｍ，３５Ｈ），１．３９−１．８０（ｍ，１２Ｈ），２．１０−２．２２（ｍ，２Ｈ），２．１９−２．３０（ｍ，２Ｈ）２．３５−２．４０（ｍ，４Ｈ），３．６０−３．６２（ｍ，１Ｈ），３．８０−３．８５（ｍ，２Ｈ），４．４２−４．５３（ｍ，１Ｈ），４．５８−４．７０（ｍ，１Ｈ），４．８１−４．９（ｍ，１Ｈ），８．４０−８．７０（ｄ，４Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）６８９。
【０１４６】
実施例６．２−（Ｌ）−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−メチル−酪酸３ｂ−アセトキシ−１６ｂ−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−６ａ−イルエステル塩酸塩（Ｃ６−（Ｌ）−バリル−シクロアストラゲノール）１２の調製
【化２４】
0005830013.tif 000030
９の調製：５ｇ（１０．２２ｍｍｏｌ）の２に、４０ｍｌのＣＨＣｌ３および２．１ｍｌ（２６ｍｍｏｌ）のピリジンを添加した。反応混合物を氷浴中で冷却し、これに２．５ｍｌ（２６ｍｍｏｌ）の無水酢酸をゆっくりと添加した。全て添加した後、反応液を４℃で２４時間撹拌した。ＴＬＣは、９とモノアセチル化生成物とビスアセチル化生成物とに対応する３つのスポットを示した。反応混合物を１００ｍｌのＤＣＭで希釈し、以下のもので連続的に洗浄した：飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×）、１Ｍ  ＨＣｌ（１×）、Ｈ２Ｏ（１×）およびブライン（１×）。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させた。粗生成物をＤＣＭ中２％のＭｅＯＨを用いるフラッシュクロマトグラフィーで精製すると、２．３ｇ（４２％）の９が白色の固体として得られた。９についての１Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：０．３８（１Ｈ，ｂｓ），０．４９（１Ｈ，ｂｓ），０．９０−１．２５（ｍ，３２Ｈ），１．３９−１．４５（ｍ２Ｈ），１．５０−１．６０（ｍ，２Ｈ），１．７０−１．８２（ｍ，２Ｈ），１．９６−２．０１（ｍ，４Ｈ），２．１８−２．２０（ｓ，３Ｈ），２．３０−２．３５（ｄ，１Ｈ），３．４５−３．５７（ｍ，１Ｈ），３．７１−３．７６（ｍ，１Ｈ），４．４９−４．５９（ｍ，１Ｈ），４．６９−４．７２（ｍ，１Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）５３３。
【０１４７】
１０の調製：１．０８ｇ（５．０ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−（Ｌ）−バリンを５ｍｌのＤＣＭに溶解させた。これに、９２０ｍｇ（５．０ｍｍｏｌ）のペンタフルオロフェノールを添加した。反応液を氷浴中で冷却した後、０．７８ｍｌ（５．０ｍｍｏｌ）のＤＩＣをゆっくりと添加した。全て添加した後、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。次に、この混合物に、５３２ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）の９、次いで４９０ｍｇ（４．０ｍｍｏｌ）のＤＭＡＰを添加し、反応液を室温で２４時間撹拌した。反応混合物を分液漏斗に移し、飽和ＮａＨＣＯ３（３×）、０．１Ｎ  ＨＣｌ（１×）、Ｈ２Ｏ（３×）およびブライン（１×）で洗浄し、有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で蒸発させた。２０ｍｌのＥｔ２Ｏを残渣に添加し、白色の沈殿を吸引下で濾過した。この操作をもう１度繰り返し、濾液を蒸発させ、残渣を、ＤＣＭ中２％−５％ＭｅＯＨの溶媒勾配を用いるフラッシュクロマトグラフィーを用いて精製すると、５９０ｍｇ（８１％）の１０が得られた。
【０１４８】
１０についての１Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：０．３５（１Ｈ，ｂｓ），０．５３（１Ｈ，ｂｓ），０．７５−１．３０（ｍ，３８Ｈ），１．４５（ｓ９Ｈ），１．５０−１．６０（ｍ，２Ｈ），１．７０−１．８２（ｍ，２Ｈ），１．９６−２．０１（ｍ，４Ｈ），２．１８−２．２０（ｓ，３Ｈ），２．３０−２．３５（ｄ，１Ｈ），３．７１−３．７６（ｍ，１Ｈ），４．１３−４．１９（ｍ，１Ｈ），４．４０−４．４１（ｍ，１Ｈ），４．５１−４．５３（ｍ，１Ｈ），４．６０−４．６３（ｍ，１Ｈ），４．６９−４．７２（ｍ，１Ｈ），．４．８１−４．８３（ｍ，１Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）７３１。
【０１４９】
１１の調製：５００ｍｇ（０．６８ｍｍｏｌ）の１０を５．０ｍｌの無水ＭｅＯＨに溶解させ、それに、２．８ｍｌの０．５Ｍ  ＭｅＯＮａ／ＭｅＯＨを添加した。反応液を室温で２４時間撹拌した。反応液を（ｐＨメーターでモニタリングしながら）１ＭのＨＣｌ／ＭｅＯＨを滴加して注意深く中和し、溶媒を真空下で蒸発させた。残渣を３０ｍｌのＤＣＭに溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３（１×）、Ｈ２Ｏ（１×）、ブライン（１×）で連続的に洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で蒸発させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーを用いて精製すると、４０３ｍｇ（８６％）の１１が白色の固体として得られた。この粗生成物を精製することなく次の工程に持ち越した。１１についての１Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：０．３９（１Ｈ，ｂｓ），０．５８（１Ｈ，ｂｓ），０．８６−１．３５（ｍ，３８Ｈ），１．４７（ｓ９Ｈ），１．５３−１．６１（ｍ，２Ｈ），１．７０−１．８２（ｍ，２Ｈ），１．９６−２．０１（ｍ，４Ｈ），２．３０−２．３５（ｄ，１Ｈ），３．１９−３．２２（ｍ，１Ｈ），３．７１−３．７６（ｍ，１Ｈ），４．１３−４．１９（ｍ，１Ｈ），４．４０−４．４１（ｍ，１Ｈ），４．６０−４．６３（ｍ，１Ｈ），４．６９−４．７２（ｍ，１Ｈ），．４．８１−４．８３（ｍ，１Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）６９０。
【０１５０】
１２の調製：４００ｍｇ（０．５８ｍｍｏｌ）の１０に、０．７３ｍｌの４．０Ｍ  ＨＣｌ／ジオキサンを添加し、４時間撹拌した。次に、溶媒を真空下で蒸発させ、残渣を５ｍＬの冷ジエチルエーテルで洗浄した。固体を完全濾過し、高真空下で一晩乾燥させると、２９０ｍｇ（８０％）の１２が白色の固体として得られた。
【０１５１】
１２についての１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ６）δｐｐｍ：０．３０（ｂｓ，１Ｈ），０．４５（ｂｓ，１Ｈ），０．８０−１．１９（ｍ，２９Ｈ），１．４７−１．５８（ｍ，３Ｈ），１．６１−１．７０（ｍ，２Ｈ），１．８１−１．８９（ｍ，４Ｈ），２．１９−２．３０（ｍ，２Ｈ），２．４３−２．６０（ｍ，２Ｈ），３．０３−３．０５（ｍ，１Ｈ），３．５６−３．６０（ｔ，１Ｈ），３．７３−３．７５（ｍ，１Ｈ），３．８０−４．０９（ｂｓ，４Ｈ），４．４０−４．５１（ｍ，１Ｈ），４．７１−４．７９（ｍ，１Ｈ），８．４０−８．５８（ｂｓ，２Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）５９０。
【０１５２】
実施例７．２−（Ｌ），３−ジメチル−ペンタン酸６α，１６β−ジヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β−イルエステル塩酸塩（Ｃ３−（Ｌ）−イソロイシル−シクロアストラゲノール）１４の調製
【化２５】
0005830013.tif 000031
１３の調製：Ｂｏｃ−（Ｌ）イソロイシン−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）（１．９ｇ、８．１６ｍｍｏｌ）を２５ｍｌのＤＣＭに溶解させた。これに、１．５ｇ（８．１６ｍｍｏｌ）のペンタフルオロフェノールを添加した。反応液を氷浴中で冷却した後、１．３ｍｌ（８．１６ｍｍｏｌ）のＤＩＣをゆっくりと添加した。全て添加した後、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。３０分の時点で、反応混合物は混濁していた（ジイソプロピルカルボジイミド−尿素沈殿）。次に、この混合物に、１．０ｇ（２．０４ｍｍｏｌ）の２、次いで９７６ｍｇ（８．０ｍｍｏｌ）のＤＭＡＰを添加し、反応液を室温で２４時間撹拌した。反応混合物を分液漏斗に移し、Ｈ２Ｏ（２×）、１％水性ＨＣｌ（２×）、０．１Ｎ水性ＮａＯＨ（２×）、飽和ＮａＨＣＯ３（３×）、Ｈ２Ｏ（１×）およびブライン（１×）で洗浄し、有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で蒸発させた。残渣を、ＤＣＭ中２％−５％ＭｅＯＨの溶媒勾配を用いるフラッシュクロマトグラフィーを用いて精製すると、９４３ｍｇ（６７％）の標的生成物１３が３３０ｍｇのビス生成物とともに得られた。
【０１５３】
１３についての１Ｈ  ＮＭＲ  ：（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：０．３８（１Ｈ，ｂｓ），０．５２（１Ｈ，ｂｓ），０．９３−１．２８（ｍ，３３Ｈ），１．３９−１．４５（ｓ，ｍ１２Ｈ），１．５９−１．６３（ｍ，５Ｈ），１．７６−１．８２（ｍ，２Ｈ），１．９６−２．０１（ｍ，４Ｈ），２．１６−２．２０（ｍ，１Ｈ），２．３０−２．３５（ｄ，１Ｈ），２．４９−２．５４（ｑ，１Ｈ），３．４５−３．５７（ｍ，１Ｈ），３．７１−３．７６（ｔ，１Ｈ），４．１９−４．２１（ｄｄ，１Ｈ），４．５３−４．６１（ｍ，１Ｈ），４．６９−４．７１（ｑ，１Ｈ），５．０−５．２（ｄ，１Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）７０４。
【化２６】
0005830013.tif 000032
【０１５４】
１４の調製：７００ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）の１１に１．２５ｍｌの４．０Ｍ  ＨＣｌ／ジオキサンを添加し、４時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、生成物を１０ｍｌの冷ジエチルエーテル中で沈殿させ、固体を濾過した。次に、この固体を高真空下で乾燥させると、５１２ｍｇ（８０％）の標的生成物１２が白色の固体として得られた。１２についての１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ６）δｐｐｍ：０．３６（ｂｓ，１Ｈ），０．４９（ｂｓ，１Ｈ），０．８０−１．３９（ｍ，３２Ｈ），１．４４−１．６０（ｍ，３Ｈ），１．６１−１．７０（ｍ，２Ｈ），１．８１−１．８９（ｍ，４Ｈ），２．１９−２．３０（ｍ，２Ｈ），２．４１−２．６０（ｍ，２Ｈ），３．２９−３．４１（ｍ，１Ｈ），３．５８−３．６１（ｔ，１Ｈ），３．８６−３．９０（ｍ，１Ｈ），４．１８−４．３９（ｂｓ，４Ｈ），４．５１−４．５３（ｍ，２Ｈ），４．５４−４．５９（ｍ，１Ｈ），８．４０−８．５８（ｂｓ，２Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）６０４。
【０１５５】
実施例８：２−（Ｌ）−アミノ−ヘキサン酸６ａ，１６ｂ−ジヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３ｂ−イルエステル塩酸塩（Ｃ３−（Ｌ）−オルニチニル−シクロアストラゲノール）１６ａと、２（Ｌ），５−ジアミノ−ペンタン酸３ｂ，１６ｂ−ジヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−６ａ−イルエステル塩酸塩（Ｃ６−（Ｌ）−オルニチニル−シクロアストラゲノール）１６ｂと、２（Ｌ），５−ジアミノ−ペンタン酸３ｂ，６ａ−ジヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−１６ｂ−イルエステル塩酸塩（Ｃ１６−（Ｌ）−オルニチニル−シクロアストラゲノール）１６ｃの混合物の調製
【化２７】
0005830013.tif 000033
【０１５６】
１５ａ、１５ｂ、１５ｃの調製：（Ｂｏｃ）２−（Ｌ）オルニチン−ＯＨ（４．５ｇ、１３．６ｍｍｏｌ）（Ｂａｃｈｅｍ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を１５ｍｌのＤＣＭに溶解させた。これに、２．５ｇ（１３．６ｍｍｏｌ）のペンタフルオロフェノールを添加した。反応液を氷浴中で冷却した後、２．２ｍｌ（１３．６ｍｍｏｌ）のＤＩＣをゆっくりと添加した。全て添加した後、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。３０分の時点で、反応混合物は混濁していた（ジイソプロピルカルボジイミド−尿素沈殿）。次に、この混合物に、７００ｍｇ（１．４３ｍｍｏｌ）の２、次いで１．６ｇ（１３．６ｍｍｏｌ）のＤＭＡＰを添加し、反応液を室温で２４時間撹拌した。反応混合物を分液漏斗に移し、Ｈ２Ｏ（２×）、１％水性ＨＣｌ（２×）、０．１Ｎ水性ＮａＯＨ（２×）、飽和ＮａＨＣＯ３（３×）、Ｈ２Ｏ（１×）およびブライン（１×）で洗浄し、有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で蒸発させた。次に、この残渣に、２５ｍｌのジエチルエーテルを添加し、尿素を完全に沈殿させた。濾液を蒸発させ、残渣を、ＤＣＭ中２％−５％ＭｅＯＨの溶媒勾配を用いるフラッシュクロマトグラフィーを用いて精製すると、６９０ｍｇ（６０％）の生成物（１５ａと１５ｂと１５ｃの混合物）、および１２０ｍｇ（８％）のＣ３，Ｃ６ビス生成物が得られた。
【０１５７】
１Ｈ  ＮＭＲにより、多量の１５ａおよび１５ｂの生成物が、２％の位置異性体１５ｃとともに示された。混合物（１５ａ、１５ｂおよび１５ｃ）についての１Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：０．３８（１Ｈ，ｂｓ），０．５２（１Ｈ，ｂｓ），０．９０−１．３８（ｍ，２６Ｈ），１．３９−１．４５（ｓ，ｍ２７Ｈ），１．５９−１．６３（ｍ，５Ｈ），１．７６−１．８２（ｍ，２Ｈ），１．９６−２．０１（ｍ，４Ｈ），２．１６−２．２０（ｍ，１Ｈ），２．３０−２．３５（ｄ，１Ｈ），２．４９−２．５４（ｑ，１Ｈ），３．１０−３．１９（ｍ，６Ｈ），３．１９−３．２２（ｍ，１Ｈ），３．４５−３．５７（ｔ，１Ｈ），３．７１−３．７６（ｍ，１Ｈ），４．１９−４．２１（ｍ，１Ｈ），４．２２−４．３０（ｍ，１Ｈ），４．５２−４．６０（ｍ，１Ｈ），４．６１−４．６５（ｍ，１Ｈ），４．７９−４．８１（ｍ，１Ｈ），４．９５−５．０１（ｍ，１Ｈ），５．１３−５．２１（ｍ，１Ｈ），５．３８−５．４１（ｍ，１Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）８０４。
【化２８】
0005830013.tif 000034
【０１５８】
１６ａ、１６ｂ、１６ｃの調製。２００ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）の１５ａと１５ｂと１５ｃの混合物に、１０ｍｌの１．０Ｍ  ＨＣｌ／ジエチルエーテルを添加し、１６時間撹拌した。白色の固体を濾過し、１０ｍｌのＥｔ２Ｏ（４×）で洗浄した。次に、この固体を高真空下で乾燥させると、１６０ｍｇ（９５％）の標的生成物１６ａ、１６ｂ、１６ｃが白色の固体として得られた。１Ｈ  ＮＭＲにより、多量の１６ａおよび１６ｂの生成物が、２％のＣ−１６（１６ｃ）位置異性体とともに示された。
【０１５９】
混合物（１６ａ、１６ｂおよび１６ｃ）についての１Ｈ  ＮＭＲ：（Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ：０．２６（１Ｈ，ｂｓ），０．５２（１Ｈ，ｂｓ），０．９０−１．１８（ｍ，２６Ｈ），１．４９−１．７４（ｍ，５Ｈ），１．８３−２．１０（ｍ，２Ｈ），２．２０−２．３１（ｍ，４Ｈ），２．８１−２．９２（ｍ，２Ｈ），３．１９−３．２０（ｍ，１Ｈ），３．３９−３．４２（ｍ，１Ｈ），３．６２−３．７１（ｍ，１Ｈ），３．８８−４．００（ｍ，１Ｈ），４．０８−４．１２（ｍ，１Ｈ），４．５２−４．５７（ｍ，１Ｈ），４．６１−４．６５（ｍ，１Ｈ），４．７９−４．８１（ｍ，１Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）：６０５。
【０１６０】
実施例９：２−（Ｌ）−アミノ−グルタール酸１−｛６ａ，１６ｂ−ジヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３ｂ−イル｝エステル塩酸塩（Ｃ３（Ｌ）−グルタマート−シクロアストラゲノール）１８ａと、２−（Ｌ）−アミノ−グルタール酸１−｛３ｂ，１６ｂ−ジヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−６ａ−イル｝エステル塩酸塩（Ｃ６（Ｌ）−グルタマート−シクロアストラゲノール）１８ｂと、２−（Ｌ）−アミノ−グルタール酸１−｛３ｂ，６ａ−ジヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−１６ｂ−イル｝エステル塩酸塩（Ｃ１６（Ｌ）−グルタマート−シクロアストラゲノール）１８ｃの混合物の調製
【化２９】
0005830013.tif 000035
【０１６１】
１７ａ、１７ｂ、１７ｃの調製：Ｂｏｃ−（Ｌ）−グルタミン酸（Ｂａｃｈｅｍ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）（Ｏ−ｔＢｕ）−ＯＨ（４．５ｇ、１４．８２ｍｍｏｌ）を１５ｍｌのＤＣＭに溶解させた。これに、２．７３ｇ（１４．８２ｍｍｏｌ）のペンタフルオロフェノールを添加した。反応液を氷浴中で冷却した後、２．３ｍｌ（１４．８２ｍｍｏｌ）のＤＩＣをゆっくりと添加した。全て添加した後、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。３０分の時点で、反応混合物は混濁していた（ジイソプロピルカルボジイミド−尿素沈殿）。次に、この混合物に、７６５ｍｇ（１．５６ｍｍｏｌ）のシクロアストラゲノール２、次いで１．８ｇ（１４．８２ｍｍｏｌ）のＤＭＡＰを添加し、反応液を室温で２４時間撹拌した。反応混合物を分液漏斗に移し、Ｈ２Ｏ（２×）、１％水性ＨＣｌ（２×）、０．１Ｎ水性ＮａＯＨ（２×）、飽和ＮａＨＣＯ３（３×）、Ｈ２Ｏ（１×）およびブライン（１×）で洗浄し、有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で蒸発させた。次に、この残渣に、５０ｍｌのジエチルエーテルを添加し、尿素を完全に沈殿させた。濾液を蒸発させ、残渣を、ＤＣＭ中２％−５％ＭｅＯＨの溶媒勾配を用いるフラッシュクロマトグラフィーを用いて精製すると、７１４ｍｇ（６０％）の分離不可能な生成物（１７ａと１７ｂと１７ｃの混合物）、および１４０ｍｇ（９％）のビス生成物（Ｃ３，Ｃ６）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲにより、多量の１７ａおよび１７ｂの生成物が、２％の位置異性体（１７ｃ）とともに示された。
【０１６２】
混合物（１７ａ、１７ｂおよび１７ｃ）の１Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：０．２９（１Ｈ，ｂｓ），０．５６（１Ｈ，ｂｓ），０．９０−１．２０（ｍ，２６Ｈ），１．３０−１．４０（ｓ，ｍ２５Ｈ），１．４８−１．６５（ｍ，３Ｈ），１．８２−１．９２（ｍ，２Ｈ），２．１６−２．２２（ｍ，２Ｈ），２．４２−２．５０（ｍ，２Ｈ），３．２０−３．４０（ｍ，１Ｈ），３．５５−３．６１（ｍ，１Ｈ），３．８２−３．９６（ｍ，１Ｈ），４．４２−４．５０（ｍ，１Ｈ），４．６２−４．７１（ｍ，１Ｈ），４．７９−４．８１（ｍ，１Ｈ），４．９５−５．０１（ｍ，１Ｈ），５．１３−５．２１（ｍ，１Ｈ），５．３８−５．４１（ｍ，１Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）７７６。
【化３０】
0005830013.tif 000036
【０１６３】
１８ａ、１８ｂ、１８ｃの調製：２６０ｍｇ（０．３４ｍｍｏｌ）の１７ａと１７ｂと１７ｃの混合物に、１０ｍｌの１．０Ｍ  ＨＣｌ／ジエチルエーテルを添加し、１６時間撹拌した。白色の固体を濾過し、１０ｍｌのＥｔ２Ｏ（４×）で洗浄した。次に、この固体を高真空下で乾燥させると、２１０ｍｇ（９５％）の標的生成物１８が白色の固体として得られた。１Ｈ  ＮＭＲにより、多量のＣ−３（１８ａ）およびＣ−６（１８ｂ）の生成物が、２％未満のＣ−１６（１８ｃ）位置異性体とともに示された。混合物（１８ａ、１８ｂおよび１８ｃ）の１Ｈ  ＮＭＲ：（Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ：０．２６（１Ｈ，ｂｓ），０．４９（１Ｈ，ｂｓ），０．９０−１．１８（ｍ，２６Ｈ），１．４９−１．７４（ｍ，４Ｈ），１．８３−２．１０（ｍ，２Ｈ），２．２０−２．３１（ｍ，４Ｈ），２．３９−２．５０（ｍ，４Ｈ），２．８１−２．９２（ｍ，２Ｈ），３．２９−３．３０（ｍ，１Ｈ），３．３９−３．４２（ｍ，１Ｈ），３．６２−３．７１（ｍ，１Ｈ），３．８８−４．０２（ｍ，３Ｈ），４．５２−４．５７（ｍ，１Ｈ），４．６１−４．６５（ｍ，１Ｈ），４．７９−４．８１（ｍ，１Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）：６２０。
【０１６４】
実施例１０：２−（Ｌ）−アミノ−３−フェニル−プロピオン酸６ａ，１６ｂ−ジヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３ａ−イルエステル塩酸塩（Ｃ３−（Ｌ）−フェニルアラニル−シクロアストラゲノール）２０ａと、２−（Ｌ）−アミノ−３−フェニル−プロピオン酸３ｂ，１６ｂ−ジヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−６ａ−イルエステル塩酸塩（Ｃ６−（Ｌ）−フェニルアラニル−シクロアストラゲノール）２０ｂの混合物の調製
【化３１】
0005830013.tif 000037
１９ａ、１９ｂの調製：Ｂｏｃ−（Ｌ）−フェニルアラニン−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）（５．０ｇ、１８．８４ｍｍｏｌ）を３０ｍｌのＤＣＭに溶解させた。これに、３．５ｇ（１８．８４ｍｍｏｌ）のペンタフルオロフェノールを添加した。反応液を氷浴中で冷却した後、２．９ｍｌ（１．９ｍｍｏｌ）のＤＩＣをゆっくりと添加した。全て添加した後、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。３０分の時点で、反応混合物は混濁していた（ジイソプロピルカルボジイミド−尿素沈殿）。次に、この混合物に、１．０ｇ（１．５６ｍｍｏｌ）のシクロアストラゲノール２、次いで１．８ｇ（１５ｍｍｏｌ）のＤＭＡＰを添加し、反応液を室温で２４時間撹拌した。反応混合物を分液漏斗に移し、Ｈ２Ｏ（２×）、１％水性ＨＣｌ（２×）、０．１Ｎ水性ＮａＯＨ（２×）、飽和ＮａＨＣＯ３（３×）、Ｈ２Ｏ（１×）およびブライン（１×）で洗浄し、有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で蒸発させた。次に、この残渣に、５０ｍｌのジエチルエーテルを添加し、尿素を完全に沈殿させた。濾液を蒸発させ、残渣を、ＤＣＭ中１％−２％のＭｅＯＨの溶媒勾配を用いるフラッシュクロマトグラフィーを用いて精製すると、９５０ｍｇ（６８％）の分離できない生成物混合物（Ｃ−３およびＣ−６）と、２９０ｍｇ（３０％）のビス生成物（Ｃ３およびＣ６）とが得られた。１Ｈ  ＮＭＲにより、多量のＣ−３生成物（１９ａ）およびＣ−６生成物（１９ｂ）が示された。
【０１６５】
混合物（１９ａおよび１９ｂ）の１Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：０．３２（１Ｈ，ｂｓ），０．６０（１Ｈ，ｂｓ），０．７０−１．２０（ｍ，１４Ｈ），１．３０−１．４０（ｓ，ｍ１２Ｈ），１．４８−１．６５（ｍ，２Ｈ），１．７６−１．９２（ｍ，４Ｈ），２．２２−２．３２（ｍ，１Ｈ），２．５２−２．５８（ｍ，１Ｈ），２．８６−２．９１（ｍ，１Ｈ），３．０−３．１８（ｍ，１Ｈ），３．２０−３．２４（ｍ，１Ｈ），３．５５−３．６１（ｍ，１Ｈ），３．７２−３．８０（ｍ，１Ｈ），４．０−４．１０（ｍ，１Ｈ），４．４２−４．５８（ｍ，２Ｈ），４．６１−４．６３（ｍ，１Ｈ），４．７７−４．７８（ｍ，１Ｈ），４．８１−４．９０（ｍ，１Ｈ），７．０８−７．２５（ｍ，５Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）７３８。
【０１６６】
【化３２】
0005830013.tif 000038
２０ａと２０ｂの混合物の調製：３３０ｍｇ（０．４５ｍｍｏｌ）の１９ａと１９ｂの混合物に、１０ｍｌの１．０Ｍ  ＨＣｌ／ジエチルエーテルを添加し、８時間撹拌した。白色の固体を濾過し、１０ｍｌの冷Ｅｔ２Ｏ（３×）で洗浄した。次に、この固体を高真空下で乾燥させると、２６０ｍｇ（８６％）の標的生成物２０ａおよび２０ｂが白色の固体として得られた。
【０１６７】
混合物（２０ａおよび２０ｂ）の１Ｈ  ＮＭＲ：（ＤＭＳＯｄ６）δｐｐｍ：０．２２（１Ｈ，ｂｓ），０．５５（１Ｈ，ｂｓ），０．７０−１．１０（ｍ，２４Ｈ），１．２０−１．３０（ｍ，３Ｈ），１．４２−１．５５（ｍ，２Ｈ），１．６１−１．８０（ｍ，２Ｈ），１．８７−１．８９（ｍ，２Ｈ），２．１９−２．２０（ｄ，１Ｈ），２．４２−２．５０（ｍ，１Ｈ），２．９２−３．１０（ｍ，２Ｈ），３．２０−３．２１（ｍ，２Ｈ），３．３０−３．３４（ｍ，１Ｈ），３．５５−３．６１（ｍ，１Ｈ），３．７８−３．８８（ｍ，１Ｈ），４．１２−４．２０（ｍ，２Ｈ），４．４２−４．４５（ｍ，１Ｈ），４．４８−４．５３（ｍ，１Ｈ），４．８０−４．８２（ｍ，１Ｈ），７．０８−７．２５（ｍ，５Ｈ），８．６２−８．８０（ｂｓ，３Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）６３８。
【０１６８】
実施例１１．３−メチル−２−（Ｌ）−メチルミノ−酪酸１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−６α−メトキシ−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β−イルエステル塩酸塩（Ｃ３−（Ｌ）−バリル−Ｃ６−メトキシ−シクロアストラゲノール）（２２）の調製
この類似体は、以下の手順によって中間体３から作製された。
【化３３】
0005830013.tif 000039
【０１６９】
２１の調製：２８０ｍｇ（０．４１ｍｍｏｌ）の３を１．５ｍＬのＮＭＰに溶解させ、それに、３３ｍｇ（０．８２ｍｍｏｌ）のＮａＨ（６０％油中分散）を添加した。反応液を１０分間撹拌した後、８０μＬのジメチルスルファートを添加し、周囲温度で１６時間撹拌した。反応混合物を２５ｍＬのＤＣＭで希釈し、Ｈ２Ｏ（４×５ｍＬ）およびブライン（１×５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過した。濾液を減圧下で濃縮した。粗生成物をＤＣＭ中１％−３％ＭｅＯＨの溶媒勾配を用いるフラッシュクロマトグラフィーで精製すると、１７０ｍｇ（５８％）の２１が得られた。
【０１７０】
１２についての１Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：０．３８（１Ｈ，ｂｓ），０．５２（１Ｈ，ｂｓ），０．９０−１．３８（ｍ，３０Ｈ），１．３９−１．４５（ｓ，ｍ１２Ｈ），１．５９−１．６３（ｍ，５Ｈ），１．７６−１．８２（ｍ，２Ｈ），１．９６−２．０１（ｍ，４Ｈ），２．１６−２．２０（ｍ，１Ｈ），２．３０−２．３５（ｄ，１Ｈ），２．４９−２．５４（ｑ，１Ｈ），２．７０−２．７３（ｓ，ｓ，３Ｈ），３．２０−３．２２（ｓ，ｓ３Ｈ），３．２６−３．２８（ｔ，１Ｈ），３．７０−３．７５（ｔ，１Ｈ），４．１９−４．２１（ｍ，１Ｈ），４．５３−４．６１（ｍ，１Ｈ），４．７０−４．７３（ｑ，１Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）７１８。
【０１７１】
【化３４】
0005830013.tif 000040
２２の調製：１５０ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌ）の２１に、８ｍｌの１．０Ｍ  ＨＣｌ／ジエチルエーテルを添加し、２４時間撹拌した。白色の固体を濾過し、ジエチルエーテル（２×５ｍＬ）で洗浄した。次に、この固体を高真空下で乾燥させると、１１５ｍｇ（８５％）の標的生成物２２が白色の固体として得られた。
【０１７２】
２２についての１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ６）δｐｐｍ：０．３５（ｂｓ，１Ｈ），０．４８（ｂｓ，１Ｈ），０．８１−１．４０（ｍ，２９Ｈ），１．４５−１．６０（ｍ，３Ｈ），１．６１−１．７０（ｍ，２Ｈ），１．８１−１．８９（ｍ，４Ｈ），２．１９−２．３０（ｍ，２Ｈ），２．４１−２．７０（ｍ，５Ｈ），３．０−３．１８（ｍ，３Ｈ）３．２０−３．２８（ｍ，２Ｈ），３．５８−３．６１（ｔ，１Ｈ），３．８１−３．８３（ｍ，１Ｈ），４．０−４．１２（ｂｓ，４Ｈ），４．４９−４．５１（ｍ，１Ｈ），４．６２−４．７０（ｍ，１Ｈ），９．２０−９．４２（ｂｓ，２Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）６１８。
【０１７３】
実施例１２．２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸６α，１６β−ジメトキシ−１７−（５−（１−メトキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β−イルエステル塩酸塩（Ｃ３−（Ｌ）−バリル−Ｃ６，Ｃ１６−ジメトキシ−シクロアストラゲノール）２７の調製
【化３５】
0005830013.tif 000041
２３の調製：５．０ｇ（１０．２ｍｍｏｌ）の２をピリジン（５０ｍｌ）に溶解させ、０℃まで冷却した。ベンゾイルクロリド（２．３５ｍｌ、２０．４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。反応混合物を２００ｍｌのジエチルエーテルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（２×）、Ｈ２Ｏ（２×）およびブライン（１×）で洗浄した。ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で蒸発させた。粗生成物をＤＣＭ中１％−２％のＭｅＯＨを用いるカラムクロマトグラフィーで精製すると、１．６ｇ（２６％）の２３が白色の固体として得られた。
【０１７４】
２３についての１Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：０．３８（ｂｓ，１Ｈ），０．５５（ｂｓ，１Ｈ），０．９０−２．０（ｍ，３７Ｈ），１．７０−１．８２（ｍ，２Ｈ），２．３０−２．３５（ｍ，１Ｈ），２．５０−２．６（ｍ，１Ｈ），３．４５−３．５７（ｍ，１Ｈ），３．７１−３．７６（ｍ，１Ｈ），４．６９−４．７２（ｍ，１Ｈ），４．７９−４．８１（ｍ，１Ｈ），７．４１（ｔ，２Ｈ），７．５２（ｔ，１Ｈ），８．０３（ｄ，２Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）５９５。
【０１７５】
２４の調製：６００ｍｇ（１．０１ｍｍｏｌ）の２３をＴＨＦ（１０ｍｌ）に溶解させ、ＮａＨ（３２３ｍｇ、８．０８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を２０分間撹拌した。ジメチルスルファート（５０９ｍｇ、４．０４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物を１００ｍｌのジエチルエーテルで希釈し、Ｈ２Ｏでクエンチし、Ｈ２Ｏ（２×）およびブライン（１×）で連続的に洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で蒸発させた。粗生成物をＤＣＭ中１％−２％のＭｅＯＨを用いるカラムクロマトグラフィーで精製すると、４６０ｍｇ（７２％）の２４が白色の固体として得られた。
【０１７６】
２４についての１Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：０．３０（ｂｓ，１Ｈ），０．５３（ｂｓ，１Ｈ），０．９０−２．０（ｍ，３７Ｈ），２．４０−２．４５（ｍ，２Ｈ），２．９２−２．９６（ｍ，１Ｈ），３．１０−３．１４（ｓ，３Ｈ），３．２２−３．２４（ｓ，３Ｈ），３．８０−３．８２（ｍ，１Ｈ），３．９−４．１０（ｍ，１Ｈ），４．６９−４．７９（ｍ，１Ｈ），７．４３（ｔ，２Ｈ），７．５２（ｔ，１Ｈ），８．０４（ｄ，２Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）６３７。
【０１７７】
２５の調製：４６０ｍｇ（０．７２ｍｍｏｌ）の２４をＤＣＭ（１０ｍｌ）に溶解させ、これに、１０ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＯＭのＭｅＯＨ溶液を添加し、反応混合物を４０℃で４８時間撹拌した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液でクエンチし、次に、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗生成物をＤＣＭ中１％−２％のＭｅＯＨを用いるカラムクロマトグラフィーで精製すると、２１０ｍｇ（５５％）の２５が白色の固体として得られた。
【０１７８】
２５についての１Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：０．２４（ｂｓ，１Ｈ），０．４９（ｂｓ，１Ｈ），０．９０−２．０（ｍ，３７Ｈ），２．４０−２．４５（ｍ，２Ｈ），２．９２−２．９６（ｍ，１Ｈ），３．１０−３．１４（ｓ，３Ｈ），３．２２−３．２４（ｓ，３Ｈ），３．２６−３．２８（ｍ，１Ｈ），３．８０−３．８２（ｍ，１Ｈ），３．９−４．１０（ｍ，１Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）５３３。
【０１７９】
２６の調製：Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（６８５ｍｇ、３．１６ｍｍｏｌ）を３ｍｌのＤＣＭに溶解させた。これに、５８１ｍｇ（３．１６ｍｍｏｌ）のペンタフルオロフェノールを添加した。反応液を氷浴中で冷却した後、０．４９ｍｌ（３．１６ｍｍｏｌ）のＤＩＣをゆっくりと添加した。全て添加した後、反応混合物を室温で１０分間撹拌し、その時、反応混合物は混濁していた（ジイソプロピルカルボジイミド−尿素沈殿）。この混合物に、２１０ｍｇ（０．３９５ｍｍｏｌ）の２５、次いで３８５ｍｇ（３．１６ｍｍｏｌ）のＤＭＡＰを添加し、反応液を室温で４８時間撹拌した。反応混合物を分液漏斗に移し、Ｈ２Ｏ（２×）、１％水性ＨＣｌ（２×）、０．１Ｎ水性ＮａＯＨ（２×）、飽和ＮａＨＣＯ３（３×）、Ｈ２Ｏ（１×）およびブライン（１×）で洗浄し、有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で蒸発させた。次に、この残渣に、１０ｍｌのジエチルエーテルを添加し、尿素を完全に沈殿させた。濾液を蒸発させ、残渣を、ＤＣＭ中２％−５％ＭｅＯＨの溶媒勾配を用いるフラッシュクロマトグラフィーを用いて精製すると、２７７ｍｇ（９６％）の標的生成物２６が得られた。
【０１８０】
２６についての１Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：０．２３（ｂｓ，１Ｈ），０．４９（ｂｓ，１Ｈ），０．９０−２．０（ｍ，５２Ｈ），２．２０−２．２５（ｍ，１Ｈ），２．３２−２．４５（ｍ，１Ｈ），２．９２−３．０（ｍ，１Ｈ），３．０８−３．１０（ｓ，３Ｈ），３．１９−３．２０（ｓ，３Ｈ），３．２２−３．２５（ｓ，３Ｈ），３．８２−３．８４（ｍ，１Ｈ），３．９０−３．９２（ｍ，１Ｈ），４．１０−４．２１（ｍ，１Ｈ），４．５０−４．５８（ｍ，１Ｈ），４．９１−５．０１（ｍ，１Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）７３２。
【０１８１】
２７の調製。１００ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ）の２６に、８ｍｌの１．０Ｍ  ＨＣｌ／ジエチルエーテルを添加し、８時間撹拌した。白色の固体を濾過し、ジエチルエーテル（２×５ｍＬ）で洗浄した。次に、この固体を高真空下で乾燥させると、６５ｍｇ（７０％）の標的生成物２７が白色の固体として得られた。
【０１８２】
２７についての１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ６）δｐｐｍ：０．２０（ｂｓ，１Ｈ），０．３８（ｂｓ，１Ｈ），０．７５−１．９０（ｍ，４３Ｈ），２．１０−２．１５（ｍ，１Ｈ），２．２０−２．２５（ｍ，１Ｈ），２．８２−２．８８（ｍ，１Ｈ），２．９３−３．０３（ｓ，３Ｈ），３．１９−３．２０（ｓ，３Ｈ），３．２２−３．２５（ｓ，３Ｈ），３．７０−３．７９（ｍ，１Ｈ），３．９０−３．９２（ｍ，１Ｈ），４．１０−４．２１（ｍ，１Ｈ），４．５０−４．５８（ｍ，１Ｈ），８．１４−８．２４（ｂｓ，３Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）６３２。
【０１８３】
実施例１３：２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−３−オキソ−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−６α−イルエステル塩酸塩（Ｃ６−（Ｌ）−バリル−シクロアストラゲノン）（３０）の調製：３−（Ｌ）バリル−シクロアストラゲノンの調製
【化３６】
0005830013.tif 000042
２８の調製：−６０〜−７０℃のＤＭＳＯ（６．４ｇ、４当量、１００ｍＬのＤＣＭ）の撹拌溶液に、塩化オキサリル（１０ｍＬのＤＣＭ中５．２ｇ）を添加し、それを１０分間撹拌した。化合物２（２００ｍＬのＤＣＭ中１０ｇ）を１０分間かけて添加し、反応混合物を３０分間撹拌した後、トリエチルアミン（５分間かけて１０．３ｇ）を添加した。反応が終わるまで、反応液を−６０〜−７０℃で１〜２時間撹拌した。粗生成物２８をカラムクロマトグラフィーで精製した。石油エーテル：酢酸エチル＝４：１で溶出すると、８ｇのモノ酸化生成物が得られた。
【０１８４】
２８についての１Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：０．３８（ｂｓ，１Ｈ），０．５８（ｂｓ，１Ｈ），０．８０−１．３２（ｍ，２５Ｈ），１．５０−２．２０（ｍ，１２Ｈ），２．３０−２．７０（ｍ，４Ｈ），２．５０−２．６（ｍ，１Ｈ），３．４５−３．５２（ｍ，１Ｈ），３．７１−３．７６（ｍ，１Ｈ），４．６９−４．７２（ｍ，１Ｈ）、ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）４８９。
【０１８５】
２９の調製：Ｂｏｃ−（Ｌ）Ｖａｌ−ＯＨ（０．５４ｇ）を１５ｍｌのＤＣＭに溶解させた。この溶液に、０．４５ｇのペンタフルオロフェノールを添加した。反応液を氷浴中で冷却した後、０．４ｍｌのＤＩＣをゆっくりと添加した。全て添加した後、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。３０分の時点で、反応混合物は混濁していた（ジイソプロピルカルボジイミド−尿素沈殿）。次に、この混合物に、０．３ｇの化合物２８、次いで０．３ｇのＤＭＡＰを添加し、反応液を室温で２４時間撹拌した。反応混合物を分液漏斗に移し、０．１Ｎ水性ＮａＯＨ（２×）、Ｈ２Ｏ（３×）およびブライン（１×）で洗浄し、有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で蒸発させた。化合物２９を含む残渣は、精製するのではなく、次の脱保護の工程に移した。
【０１８６】
３０の調製：上記の粗生成物を酢酸エチル中のＨＣｌで１２時間処理した。次に、生成物を水で抽出して単離し、乾燥させると、粗ＨＣｌ塩が得られた。これを、石油エーテルと酢酸エチルの混合物を用いる分取ＨＰＬＣで精製した。純粋な画分をプールして、１２０ｍｇの最終生成物３０を得た。
【０１８７】
３０についての１Ｈ  ＮＭＲ：（ＤＭＳＯｄ６）δｐｐｍ：０．４０（ｂｓ，１Ｈ），０．８０（ｂｓ，１Ｈ），０．８０−１．３２（ｍ，２９Ｈ），１．５０−２．２０（ｍ，１２Ｈ），２．３０−２．３２（ｍ，２Ｈ），２．４０−２．４５（ｍ，２Ｈ），３．６０−３．６２（ｍ，１Ｈ），３．９３−４．０１（ｍ，１Ｈ），４．４９−４．５１（ｍ，１Ｈ），４．７９−４．８１（ｍ，１Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）５８８。
【０１８８】
実施例１４：２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−ペンタン酸６α−（２−アミノ−３−メチル−ペンタノイルオキシ）−１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−３β−イルエステル塩酸塩（Ｃ３，Ｃ６−（Ｌ，Ｌ）−ビス−イソロイシン−シクロアストラゲノール）−３２の調製
【化３７】
0005830013.tif 000043
３１の調製：Ｂｏｃ−（Ｌ）−Ｉｌｅ−ＯＨ（４．６ｇ、２０ｍｍｏｌ）を２５ｍｌのＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）に溶解させた。これに、３．７ｇ（２０ｍｍｏｌ）のペンタフルオロフェノールを添加した。反応液を氷浴中で冷却した後、３．１ｍｌ（２０ｍｍｏｌ）のＤＩＣをゆっくりと添加した。全て添加した後、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。３０分の時点で、反応混合物は混濁していた（ジイソプロピルカルボジイミド−尿素沈殿）。次に、この混合物に、１．０ｇ（２．０４ｍｍｏｌ）の２、次いで１．７ｇ（１４ｍｍｏｌ）のＤＭＡＰを添加し、反応液を室温で２４時間撹拌した。反応混合物を分液漏斗に移し、Ｈ２Ｏ（６×）、１％水性ＨＣｌ（２×）、０．１Ｎ水性ＮａＯＨ（２×）、飽和ＮａＨＣＯ３（３×）、Ｈ２Ｏ（１×）およびブライン（１×）で連続的に洗浄し、有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で蒸発させた。残渣を、ＤＣＭ中２％−５％ＭｅＯＨの溶媒勾配を用いるフラッシュクロマトグラフィーを用いて精製すると、１．４ｇ（８０％）の標的生成物３１が得られた。
【０１８９】
３１についての１Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：０．３８（１Ｈ，ｂｓ），０．６０（１Ｈ，ｂｓ），０．８０−１．０（ｍ，２４Ｈ），１．１３（ｓ，ｓ６Ｈ），１．２０（ｓ，ｓ６Ｈ），１．３２（ｓ，６Ｈ），１．３５（ｓ，ｓ４Ｈ）１．４１（ｓ，ｓ１８Ｈ），１．５５−１．６０（ｍ，６Ｈ），１．７９−１．８３（ｍ，３Ｈ），３．７１−３．７５（ｔ，１Ｈ），４．０８−４．２０（ｍ，２Ｈ），４．５８−４．６０（ｍ，１Ｈ），４．６１−４．７１（ｑ，１Ｈ），４．７２−４．８０（ｍ，１Ｈ），４．８２−４．８４（ｄ，１Ｈ），４．９−５．０（ｄ，１Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）９１５。
【０１９０】
【化３８】
0005830013.tif 000044
３２の調製：４ｍｌの無水Ｅｔ２Ｏ中の１．５ｇ（１．６ｍｍｏｌ）の３１に、３．５ｍｌの４．０Ｍ  ＨＣｌ／ジオキサンを添加し、４時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、生成物を４０ｍｌの冷ジエチルエーテルで３回沈殿させた。固体を濾過して除去した。次に、この固体を高真空下で乾燥させると、３．１ｇ（９１％）の標的生成物３２が白色の固体として得られた。３２についての１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ６）δｐｐｍ：０．２２（ｂｓ，１Ｈ），０．５７（ｂｓ，１Ｈ），０．８０−１．２０（ｍ，３５Ｈ），１．４１−１．８０（ｍ，１４Ｈ），２．１０−２．２１（ｍ，２Ｈ），２．３４−２．４２（ｍ，４Ｈ），２．２０−２．３０（ｍ，２Ｈ），３．５９−３．６２（ｍ，１Ｈ），３．８１−３．８３（ｍ，２Ｈ），４．４２−４．５３（ｍ，１Ｈ），４．６１−４．７１（ｍ，１Ｈ），４．８１−４．９（ｍ，１Ｈ），８．４０−８．７０（ｄ，４Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）７１７。
【０１９１】
実施例１５：２−（Ｌ）−アミノ−３−メチル−酪酸３β，６α−ジヒドロキシ−１６β−ヒドロキシ−１７−（５−（１−ヒドロキシ−１−メチル−エチル）−２−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−４，４，１３，１４−テトラメチル−テトラデカヒドロ−シクロプロパ（９，１０）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−１６β−イルエステル塩酸塩（Ｃ１６−（Ｌ）−バリル−シクロアストラゲノール）−３６の調製
【化３９】
0005830013.tif 000045
0005830013.tif 000046
３３の調製：４ｇ（８．２ｍｍｏｌ）の２に、１００ｍｌのピリジンを添加し、氷浴中で冷却した。これに、７７ｍｌ（８２０ｍｍｏｌ）の無水酢酸、次いで１００ｍｇ（０．８１ｍｏｌ）のＤＭＡＰをゆっくりと添加した。反応混合物を１６時間撹拌した。反応混合物を氷浴中で冷却し、３％水性ＨＣｌでクエンチし、２００ｍｌのＤＣＭで希釈し、以下のもの：飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×）、Ｈ２Ｏ（３×）およびブライン（１×）で連続的に洗浄した。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させた。粗生成物をＤＣＭ中１％のＭｅＯＨを用いるフラッシュクロマトグラフィーで精製すると、４．２ｇ（８９％）の３３が白色の固体として得られた。３３についての１Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：０．３８（１Ｈ，ｂｓ），０．４９（１Ｈ，ｂｓ），０．９０−１．２５（ｍ，３２Ｈ），１．３９−１．４５（ｍ２Ｈ），１．５０−１．６０（ｍ，２Ｈ），１．７０−１．８２（ｍ，２Ｈ），１．９６−２．０１（ｍ，４Ｈ），２．１８−２．２０（ｓ，ｓ６Ｈ），２．３０−２．３５（ｄ，１Ｈ），３．７１−３．７６（ｍ，１Ｈ），４．４９−４．５９（ｍ，１Ｈ），４．６９−４．７２（ｍ，２Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）５７５。
【０１９２】
３４の調製：１．５４ｇ（２．７ｍｍｏｌ）の３３を８．０  ｍｌのＮＭＰに溶解させた。この透明な溶液に、８００ｍｇ（８．３ｍｍｏｌ）のカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドを添加し、４５分間撹拌した。これに、３．０ｇ（８．９ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−Ｖａｌ−ＯＮｐ、次いで２４５ｍｇ（２ｍｍｏｌ）のＤＭＡＰを添加し、２４時間撹拌した。反応混合物を１００ｍｌのＤＣＭで希釈し、以下のもの：Ｈ２Ｏ（４×）、１％水性ＨＣｌ（１×）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×）、Ｈ２Ｏ（３×）およびブライン（１×）で連続的に洗浄した。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させた。粗生成物を石油エーテル／酢酸エチルを用いるフラッシュクロマトグラフィーで精製すると、１．０ｇ（４８％）の３４が白色の固体として得られた。３４についての１Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：０．３８（１Ｈ，ｂｓ），０．４９（１Ｈ，ｂｓ），０．９０−１．２５（ｍ，３８Ｈ），１．３９−１．４５（ｍ，ｓ１１Ｈ），１．５０−１．６０（ｍ，２Ｈ），１．７０−１．８２（ｍ，２Ｈ），１．９６−２．０１（ｍ，４Ｈ），２．１８−２．２０（ｓ，ｓ６Ｈ），２．３０−２．３５（ｄ，１Ｈ），３．７１−３．７６（ｍ，１Ｈ），４．１３−４．１８（ｍ，１Ｈ），４．４９−４．５９（ｍ，１Ｈ），４．６２−４．７２（ｍ，１Ｈ），５．１２−５．１７（ｍ，１Ｈ），５．３８−５．４２（ｍ，１Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＋）７９６。
【０１９３】
３５の調製：７００ｍｇ（０．９１ｍｍｏｌ）の３４に、２０ｍｌの０．５Ｍ  ＭｅＯＨ／ＭｅＯＮａ溶液を添加し、１６時間撹拌した。反応液を氷浴中で冷却し、ｐＨ５になるまで１％水性ＨＣｌ溶液でクエンチした。メタノールを減圧下で蒸発させ、水層に飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を添加し、ＤＣＭ（４×）で抽出し、合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させた。粗生成物を２％から３％へのＭｅＯＨ／ＤＣＭの勾配を用いるフラッシュクロマトグラフィーで精製すると、３６０ｍｇ（５８％）の３５が白色の固体として得られた。３５についての１Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：０．３８（１Ｈ，ｂｓ），０．４９（１Ｈ，ｂｓ），０．９０−１．２５（ｍ，３８Ｈ），１．３９−１．４５（ｍ，ｓ１１Ｈ），１．５０−１．６０（ｍ，２Ｈ），１．７０−１．８２（ｍ，２Ｈ），２．１０−２．２０（ｍ，２Ｈ），２．３０−２．３５（ｄ，１Ｈ），３．２０−３．２５（ｍ，１Ｈ），３．４１−３．５０（ｍ，１Ｈ），３．７１−３．７６（ｍ，１Ｈ），４．１３−４．１８（ｍ，１Ｈ），５．１２−５．１７（ｍ，１Ｈ），５．３８−５．４２（ｍ，１Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＋）７１２。
【０１９４】
３６の調製：３５０ｍｇ（０．５１ｍｍｏｌ）の３５に、１０ｍｌの１．０Ｍ  ＨＣｌ／Ｅｔ２Ｏ溶液を添加し、５時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を１０ｍｌの無水Ｅｔ２Ｏ（３×）で洗浄し、真空下で濾過した。白色の固体を高真空下で乾燥させると、２５０ｍｇ（７８％）の３６が白色の固体として得られた。３６についての１Ｈ  ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：０．３８（１Ｈ，ｂｓ），０．４９（１Ｈ，ｂｓ），０．８０−１．２５（ｍ，２９Ｈ），１．３９−１．８３（ｍ，４Ｈ），２．１０−２．２０（ｍ，２Ｈ），２．３０−２．４０（ｍ，４Ｈ），３．１８−３．２１（ｍ，１Ｈ），３．３８−３．４０（ｍ，１Ｈ），３．７１−３．７６（ｍ，１Ｈ），４．１３−４．１７（ｍ，１Ｈ），５．４０−５．４２（ｍ，１Ｈ），８．３８−８．５３（ｂｓ，３Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）５９０。
【０１９５】
生物学的サンプル１：ケラチノサイト細胞／テロメラーゼ反復増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）アッセイ
化合物が細胞内のテロメラーゼ活性を増大させる能力をＴＲＡＰ（テロメア反復増幅プロトコル）アッセイを用いて決定することができる。このアッセイは、当技術分野で公知である（例えば、Ｋｉｍら、米国特許第５，６２９，１５４号；Ｈａｒｌｅｙら、米国特許第５，８９１，６３９号）。活性は、通常、そのような細胞の対照アッセイで同様に測定される活性（例えば、溶媒対照で観察されるよりも５０％大きいテロメラーゼ活性）と比較される。
【０１９６】
このアッセイで使用するのに好適な細胞株である、正常ヒト線維芽細胞（ＮＨＦ）または正常ヒトケラチノサイト（ＮＨＫ）は、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲもしくは４Ｃ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓｅｎｅｆｆｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍなどの市販供給源から、またはＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手することができる。ＡＴＣＣウェブサイトで探し出すことができるＡＴＣＣの正常ヒト線維芽細胞株としては、例えば、ＣＣＬ１３５、ＣＣＬ１３７、およびＣＣＬ１５１が挙げられる。
【０１９７】
３人の個別のドナー由来のヒト表皮ケラチノサイト（新生児ＨＥＫ）（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ  ＯＲ）を１つにまとめてプールし、ワーク細胞バンクを作製した。これらの細胞を、ＨＫＧＳ（ヒトケラチノサイト増殖用補給剤）（Ｃａｓｃａｄｅ，カタログ＃  Ｓ−００１−５）を補充したＥｐｉＬｉｆｅ培地（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，カタログ＃  Ｍ−ＥＰＩ−５００，Ｐｏｒｔｌａｎｄ  ＯＲ）中で培養した。細胞をトリプシン処理し、消化物を中和バッファーＴＮ（登録商標）（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ  ＯＲ）で中和して、細胞懸濁液を作製する２４時間前に、ＨＥＫｎｅｏ−Ｐ細胞を９６ウェルプレートに播種した。細胞を増殖培地中５０００細胞／１００μＬ／ウェルで播種し、プレートを加湿式組織培養インキュベーターにて３７℃、５％ＣＯ２／９５％大気でインキュベートした。細胞が７５〜８０％コンフルエンスに達するとき、播種密度は、約２．５×１０３／ｃｍ２となるはずである。
【０１９８】
試験しようとする化合物を所望の濃度にして１０％ＤＭＳＯ中に処方した。０．０１〜１０μＭの濃度の処方された化合物１１μＬを対照の１０％ＤＭＳＯ  １１μＬとともに９６ウェル培養物に添加した。未処理対照（ＮＴ）も含まれた。増殖培地を除去し、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）で１回洗浄し、できる限り多くの培地を除去することによって、細胞を２４時間±１時間で回収した。５０μＬのＭ−Ｐｅｒバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔ＃  ７８５０３＆７８５０１）を添加し、氷上で１時間±１５分間インキュベートすることによって、細胞を溶解させた。場合により、プレートを２０００ＲＰＭで５分間遠心分離した。プレートの各ウェルからライセートを慎重に回収し、新しいＶ底の貯蔵９６ウェルプレートに移して、単層細胞をインタクトの状態にしておいた。
【０１９９】
同じ化合物で処理した２つ複製した細胞培養プレートを調製することによって、細胞溶解と並行して細胞毒性アッセイを行なった。化合物とのインキュベーションの２４時間±１時間後に、１×アラマーブルー１１μＬを、２つ複製したプレートに添加し、プレートを３７℃でインキュベートした。励起波長５３０ｎｍおよび放出波長５９０ｎｍで蛍光プレートリーダーを用いて、プレートを１時間および３時間で読み取った。細胞生存率（細胞毒性）は、アラマーブルーの読取値と正比例した。
【表５】
0005830013.tif 000047
【表６】
0005830013.tif 000048
【０２００】
Ｔａｑポリメラーゼは、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ＃  Ｎ８０８０１７１）およびｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ＃  Ｒ７２５０１）であった。
【表７】
0005830013.tif 000049
【０２０１】
ＰＣＲ混合物は、以下の成分を含む：Ｃｙ５−ＴＳプライマー（５’−ＡＡＴ  ＣＣＧ  ＴＣＧ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＧＴＴ−３’（配列番号１）という配列を有する５’−Ｃｙ５標識オリゴヌクレオチド）は、テロメラーゼの基質である。培地中のテロメラーゼ活性に応じて、テロメア反復（配列．．ＡＧＧＧＴＴ．．を有する）が基質に付加され、テロメラーゼ産物またはＴＲＡＰ産物とも呼ばれるテロメラーゼ伸長産物が形成されることになる。５’−ＧＣＧ  ＣＧＧ  ＣＴＴ  ＡＣＣ  ＣＴＴ  ＡＣＣ  ＣＴＴ  ＡＣＣ  ＣＴＡ  ＡＣＣ−３’（配列番号２）という配列を有するＡＣＸプライマーは、テロメラーゼ伸長産物にハイブリダイズする固定復帰プライマーである。
【０２０２】
細胞ライセートのサンプル（５〜１０μＬ）を反応チューブ中のＰＣＲ混合物に添加し、混合物を以下の温度で指示された時間インキュベートすることによって、すなわち、３０℃で３０分の後、２８サイクルの３段階のＰＣＲ反応：９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、および７２℃で１分、次いで７２℃で４分の後、４℃で保持することによって、テロメア伸長／増幅を行なった。このＰＣＲ反応産物をすぐにポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。
【０２０３】
例えば、ブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノールを含むローディング色素を反応混合物に添加し、サンプルを、１×ＴＢＥ中１０〜１５％の非変性ＰＡＧＥにかけた。ＣＹ５標識テロメラーゼ産物の検出（６５０ｎｍで最大励起；６７０ｎｍで最大放出）のために、例えば、蛍光画像装置を用いて、ＴＲＡＰ反応産物を観察した。
【０２０４】
各ゲルレーンのバックグラウンドを上回る捕捉された全ピクセル体積（ＤＮＡラダーバンド）によって、テロメラーゼ活性を測定した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ製のリボグリーン（登録商標）ＲＮＡ定量キット（カタログ＃  Ｒ−１１４９０）および業者によって推奨されている条件（０．８〜２００ｎｇ／ｍＬのＲＮＡ標準範囲、１：２００希釈のＲＧ色素、１００〜２５０倍希釈のサンプル）を用いて、全ＲＮＡ（ｎｇ／ｍＬ）を測定することによって、活性を正規化した。
【０２０５】
全ピクセル体積／ＲＮＡ＝正規化された相対テロメラーゼ活性である。
【０２０６】
細胞生存率（細胞毒性）は、ＡＢの読取値と正比例した。
【０２０７】
結果を表２に示す。
表２
【表８】
0005830013.tif 000050
0005830013.tif 000051
0005830013.tif 000052
0005830013.tif 000053
＋テロメラーゼ活性化は、完全用量曲線のピーク時のビヒクル対照と比較して２倍以上である。
【０２０８】
生物学的サンプル２：末梢血単球細胞／テロメラーゼ反復増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）アッセイ
ＰＢＭＣ単離。血液をヘパリンナトリウムバキュテナー中に回収し、１本の５０ｍＬポリプロピレンチューブ中にプールした。血液を１×ＰＢＳで１：１希釈し、逆さにして完全に混合した。２５ｍＬの希釈した血液を１２ｍＬのＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−Ｈ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の上に重ねて、８００ｇにて室温で２０分間遠心分離した。ピペットを用いて、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−Ｈの界面にあるリンパ球層を慎重に取り除き、新しい５０ｍＬチューブに移した。移した細胞を１×ＰＢＳで１：１希釈し、８００ｇで１０分間遠心分離して、リンパ球をペレット化した。このリンパ球を「完全」培地（これは、１０％の非働化ＦＢＳおよび１０ｍＭのＨｅｐｅｓが補充されたＲＰＭＩ（Ｓｉｇｍａ，カタログＮｏ．Ｒ８７５８）からなる）で２回洗浄した。
【０２０９】
培養条件。トリパンブルー排除を用いて細胞を計数し、細胞の最終濃度が１×１０６／ｍＬとなるように完全培地（５０ユニットのｈＩＬ−２／ｍＬが補充されている）に再懸濁した。細胞懸濁液に、Ｔ細胞活性化／拡大キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，カタログＮｏ．１３０−０９１−４４１）からのＣＤ２／３／２８  Ａｂがコーティングされたビーズを１：２（ビーズ：細胞）の比で添加した。細胞をフラスコ中で増殖させ、培地の半分を（２０ユニットのｈＩＬ−２／ｍＬとともに）２〜３日おきに交換した。少なくとも１週間に１回、細胞を計数し、培地の量を調整して、細胞を約５×１０５／ｍＬに維持した。
【０２１０】
類似体の処方。純粋な培養等級ＤＭＳＯ中に１ｍＭの濃度で類似体を処方した。このストックから、類似体を１００μＭになるまで完全ＲＰＭＩ培地に希釈した。１００μＭの処方物の一部を１０μＭになるまで１０％ＤＭＳＯを含む完全ＲＰＭＩ培地に希釈した。また、ビヒクル対照を、ＤＭＳＯを含む完全ＲＰＭＩ培地に希釈して処方し、１０％溶液を得た（これは、類似体希釈物中のＤＭＳＯの量と等しい）。
【０２１１】
類似体による処理。培養１０〜１４日後に、細胞を計数し、１×１０６／ｍＬの濃度で馴化培地に再懸濁した。この細胞懸濁液０．５ｍＬを２４ウェルプレートのウェルにプレーティングした。２μＭ（１００μＭストックから）および０．２μＭ（１０μＭストックから）の濃度を得るために、類似体を新鮮な完全ＲＰＭＩ培地に１：５０で希釈した。また、ビヒクル対照（１０％ＤＭＳＯを含むＲＰＭＩ培地）を１：５０で新鮮な完全ＲＰＭＩ培地に希釈した。０．５ｍＬの細胞懸濁液を含む各ウェル（１ウェル当たり５×１０５のはずである）に０．５ｍＬの希釈した類似体またはＤＭＳＯビヒクル対照を入れた。それゆえ、類似体の最終濃度は１μＭおよび０．１μＭであり、（ビヒクル対照を含む）全てのウェル中のＤＭＳＯの最終濃度は０．１％であった。
【０２１２】
細胞の回収および細胞ライセートの調製。類似体およびＤＭＳＯビヒクル対照を培養物に添加して２４時間後、細胞をウェルから取り出し、微量遠心チューブに入れた。細胞を１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、培地を吸引した後、０．５ｍＬの冷１×ＰＢＳに再懸濁した。細胞を再び２分間遠心分離し、ＰＢＳを吸引した。細胞ペレットを１００μＬのＭ−ＰＥＲ（哺乳動物タンパク質抽出試薬）に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、懸濁液を１４，０００ｒｐｍにて４℃で２０分間遠心分離した。スピンした後、８０μＬのライセートを、細胞破片を移さないように慎重に、事前に冷やした微量遠心チューブに移した。細胞ライセートの最終濃度は５０００細胞／μＬであった。
【０２１３】
ＴＲＡＰ反応およびゲル。１段階のＴＲＡＰ  ＰＣＲ反応を用いて、サンプルを解析した。反応を実施する前に、サンプルを１：５でＭ−ＰＥＲバッファーに希釈した（１０００細胞／μＬ）。各反応について、以下の混合物を使用した：３７．５μＬのＨ２０、５μＬの１０×ＴＲＡＰバッファー（ＢＳＡを含む）、１μＬの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μＬの０．１ｍｇ／ｍＬ  ＡＣＸプライマー、０．１μＬの０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｃｙ５標識ＴＳプライマー、０．４μＬの５  Ｕ／μＬ  Ｔａｑポリメラーゼ、および５μＬの希釈したサンプル（反応液全体で５０μＬ）。ＰＣＲ反応は以下の通りであった：３０℃で３０分、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、および７２℃で１分を２８サイクル、その後、７２℃で４分。ＰＣＲ産物を１２．５％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ＳＴＯＲＭホスホイメージャーを用いて解析した。
【表９】
0005830013.tif 000054
【０２１４】
生物学的実施例３：マウスへの化合物の投与ならびに血漿レベルおよび組織におけるテロメラーゼ活性の解析
雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに対して静脈内に、経口で、腹腔内に、または皮下に単回投与した後の化合物の血漿レベルを測定した。血漿サンプルを回収し、それを用いて、化合物および代謝産物の血漿濃度を測定した。さらに、テロメラーゼ活性解析のために、組織サンプル（ひげサンプルを含む）、および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を回収した。
【０２１５】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを処理群に分けた。経口投与前の一晩の絶食期間を除いて、マウスには、研究期間の存命中ずっと、ＳＬＡＣ−ＭＯ１  ＃Ｗ０８０２０８（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）を自由に与えた。水は自由に飲めた。
【０２１６】
動物部屋の環境制御は、２３±２℃の温度、５０〜７０％の湿度および１２時間明／１２時間暗の周期を維持するように設定された。１２時間の暗周期は、研究手順に合わせるために一時的に中断されることがある。最初の投与を施す前の１〜７日間、動物を研究手順に順応させた。
【０２１７】
この研究で使用された動物は、平均体重±２０％の範囲に入る体重、全身の健康および飼育（ｃａｇｉｎｇ）への順応に基づいて選択された。動物は、経口投与前の一晩の絶食期間を除く、全研究期間中、食餌と水の両方を自由に摂ることができた。
【０２１８】
表３に示すように、尾静脈経由で静脈内に、経口で、皮下に、または腹腔内に投与を施した。投与を施した日に、体重を測定した。投与の容量は、投与する日に測定された個々の体重に基づいて決定された。
【０２１９】
投与後の様々な時点で、麻酔後に心穿刺または後眼窩穿刺により、Ｋ２−ＥＤＴＡ抗凝固剤および１ｍｇ／ｍｌのＮａＦを含むチューブに血液サンプル（約３００μＬ）を回収した。血液を氷上で保存した後、遠心分離（８０００ｒｐｍ×６分）で血漿を分離した。血漿はＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析まで２０℃で保存した。
【０２２０】
二酸化炭素吸入によって安楽死させた後、瀉血した。何匹かの動物では、３０時間でひげおよび末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を回収し、処理するまで−８０℃で保存した。
【０２２１】
Ｋ２ＥＤＴＡを抗凝固剤として用いて血液からＰＢＭＣを回収した。回収後、チューブを穏やかに８〜１０回転倒混和した。チューブを１２０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離して、細胞をペレット化し、上清を除去して、得られたＰＢＭＣペレットをドライアイス／メタノール中で瞬間凍結させ、−８０℃で保存した。生物学的実施例２に示したように細胞を処理した。図１は、化合物４で処理した後のＰＢＭＣにおける経時的なテロメラーゼ活性を示す。
【０２２２】
１本または１束のひげを抜き取り、動物１匹当たり１０〜２０本のひげを２００μＬのＭ−Ｐｅｒバッファー（Ｐｉｅｒｃｅカタログ＃：７８５０３／７８５０１／７８５０５、毛包を浸す）に入れた。これらのサンプルを抜き取ってから１時間以内にドライアイス／メタノール中で凍結させた。図２は、化合物４で処理した後のひげにおける経時的なテロメラーゼ活性テロメラーゼ活性を示す。
【０２２３】
式Ｉのモノ−アミノ酸置換化合物は、マウスに投与したときに、シクロアストラゲノールへの一部変換を示し、また、ジ−アミノ酸置換化合物は、微量のモノ置換化合物への変換を示し得ることが明らかになった。
【０２２４】
位置異性体混合物である、Ｃ３−（Ｌ）−オルニチニル−シクロアストラゲノール、Ｃ６−（Ｌ）−オルニチニル−シクロアストラゲノール、Ｃ１６−（Ｌ）−オルニチニル−シクロアストラゲノール（１６ａ、１６ｂ、１６ｃ混合物）およびＣ３−（Ｌ）−グルタマート−シクロアストラゲノール、Ｃ６−（Ｌ）−グルタマート−シクロアストラゲノール、Ｌ−グルタマート−Ｃ１６−  シクロアストラゲノール（１８ａ、１８ｂ、１８ｃ混合物）はマウスでは生物学的に利用可能ではなかった。
【０２２５】
化合物のバイオアベイラビリティを表３に示す。
【表１０】
0005830013.tif 000055
【０２２６】
生物学的実施例４：雄ラットへの化合物の投与ならびに血漿レベルおよび組織におけるテロメラーゼ活性
頸動脈にカニューレを挿入した雄のスプラーグドーリーラットに対して静脈内におよび経口で単回投与した後の化合物の血漿レベルを測定した。血漿サンプルを回収し、それを用いて、化合物および代謝産物の血漿濃度を測定した。さらに、テロメラーゼ活性解析のために、組織サンプル（ひげサンプルを含む）およびＰＢＭＣ細胞を回収した。
【０２２７】
頸動脈にカニューレを挿入した雄のスプラーグドーリーラットを表６による処理群に分けた。経口投与前の一晩の絶食期間を除いて、ラットには、研究期間の存命中ずっと、ＳＬＡＣ−ＭＯ１  ＃ＹＹ０８０２０８（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）を自由に与えた。水は自由に飲めた。
【０２２８】
動物部屋の環境制御は、２３±２℃の温度、５０〜７０％の湿度および１２時間明／１２時間暗の周期を維持するように設定された。１２時間の暗周期は、研究手順に合わせるために一時的に中断されることがある。最初の投与を施す前の１〜７日間、動物を研究手順に順応させた。
【０２２９】
この研究で使用された動物は、平均体重±２０％の範囲に入る体重、全身の健康および飼育への順応に基づいて選択された。動物は、経口投与前の一晩の絶食期間を除く、全研究期間中、食餌と水の両方を自由に摂ることができた。
【０２３０】
化合物を２％ＥｔＯＨ／９８％水に溶解させると、静脈内投与と経口投与の両方について、それぞれ、２．５ｍｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌの最終濃度が得られた。各化合物の濃度をＨＰＬ分析で確認した。
【０２３１】
表４に示すように、尾静脈経由で静脈内におよび経口で投与を施した。投与を施した日に、体重を測定した。投与の容量は、投与する日に測定された個々の体重に基づいて決定された。
【０２３２】
適当な時点で、動脈カニューレを通して、Ｋ２−ＥＤＴＡ抗凝固剤および１ｍｇ／ｍｌのＮａＦを含むチューブに血液サンプル（約２５０μＬ）を回収した。血液を氷上で保存した後、遠心分離（８０００ｒｐｍ×６分）で血漿を分離した。血漿はＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析まで２０℃で保存した。
【０２３３】
組織サンプル：何匹かの動物において、止血剤の投与後３０時間でひげサンプルを回収し、動物１匹当たり１０〜２０本のひげを、２００μＬのＭ−Ｐｅｒバッファー（Ｐｉｅｒｃｅカタログ＃：７８５０３／７８５０１／７８５０５）を含む１．５ｍＬエッペンドルフチューブに入れた。これらのサンプルを抜き取ってから１時間以内にドライアイス／メタノール中で凍結させた。
【０２３４】
式Ｉのモノ−アミノ酸置換化合物は、ラットに投与したときに、シクロアストラゲノールへの一部変換を示し、また、ジ−アミノ酸置換化合物は、微量のモノ置換化合物への変換を示し得ることが明らかになった。
【０２３５】
バイオアベイラビリティのパーセンテージを算出した。
【表１１】
0005830013.tif 000056
【０２３６】
生物学的実施例５：雄のビーグル犬への化合物の投与ならびに血漿レベルおよび組織におけるテロメラーゼ活性
雄のビーグル犬に対して静脈内におよび経口で単回投与した後の化合物の血漿レベルを測定した。血漿サンプルを回収し、それを用いて、化合物および代謝産物の血漿濃度を測定した。さらに、テロメラーゼ活性解析のために、ひげサンプルを含む組織サンプルおよびＰＢＭＣ細胞を回収した。
【０２３７】
雄のビーグル犬を表５による処理群に分けた。経口投与前の一晩の絶食期間を除いて、イヌには、研究期間の存命中ずっと、ＳＬＡＣ−ＭＯ１  ＃０８０７０１（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）を自由に与えた。水は自由に飲めた。
【０２３８】
動物部屋の環境制御は、２３±２℃の温度、５０〜７０％の湿度および１２時間明／１２時間暗の周期を維持するように設定された。１２時間の暗周期は、研究手順に合わせるために一時的に中断されることがある。最初の投与を施す前の１〜７日間、動物を研究手順に順応させた。
【０２３９】
この研究で使用された動物は、平均体重±２０％の範囲に入る体重、全身の健康および飼育への順応に基づいて選択された。動物は、経口投与前の一晩の絶食期間を除く、全研究期間中、食餌と水の両方を自由に摂ることができた。
【０２４０】
化合物を２％ＥｔＯＨ／９８％水または５％ＰＥＧ４００、５％ソルトールＨＳ−１５（ＢＡＳＦ，ＴＸ）、９０％水の溶液に溶解させると、静脈内投与と経口投与の両方について、それぞれ、２．５ｍｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌの最終濃度が得られた。各化合物の濃度をＨＰＬ分析で確認した。
【０２４１】
左大腿静脈経由で静脈内に投与を施し、次いで１週間後に、経口で投与を施した。投与を施した日に、体重を測定した。投与の容量は、投与する日に測定された個々の体重に基づいて決定された。
【０２４２】
適当な時点で、右大腿静脈を通して、Ｋ２−ＥＤＴＡ抗凝固剤および１ｍｇ／ｍｌのＮａＦを含むチューブに血液サンプル（約２５０μＬ）を回収した。血液を氷上で保存した後、遠心分離（８０００ｒｐｍ×６分）で血漿を分離した。血漿はＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析まで２０℃で保存した。
【０２４３】
バイオアベイラビリティのパーセンテージを算出した。これを表５に示す。
【表１２】
0005830013.tif 000057
【０２４４】
生物学的実施例６：骨髄造血幹細胞／前駆細胞テロメラーゼの上方調節および細胞増殖
ヒト骨髄由来ＣＤ３４＋造血前駆細胞を４７歳の健康ドナーから得た。
【０２４５】
ｉ）短期液体ヒト細胞培養物における化合物４によるテロメラーゼ活性化
ヒト骨髄由来ＣＤ３４＋造血前駆細胞を、化合物４（１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ）、ビヒクル（１％ＤＭＳＯ）の存在下、または何も加えないで、イスコフの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）にて３日間増殖させた。テロメラーゼ活性は、（従来のゲル−ＴＲＡＰアッセイで評価したとき）ビヒクル対照と比べて、１００ｎＭの化合物４サンプルで約６０〜７０％増大した。
【表１３】
0005830013.tif 000058
【０２４６】
ｉｉ）化合物４で処理したヒト細胞培養物におけるコロニー形成単位の数の増加（１４日の処理）
ヒト造血前駆ＣＤ３４＋細胞（４７歳の健康ドナー）を、化合物４（１００ｎＭ）、ビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）の存在下、または何も加えないで、標準的なコロニー形成アッセイにプレーティングした。１４日後、造血コロニーを数えた（ＣＦＵ−Ｅ、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ、およびＣＦＵ−ＧＥＭＭ）。化合物４を含むプレートは、ビヒクルのみよりも１７％コロニー形成単位が多かった（総コロニー数は、以下の通りであった：未処理、１０６．５；ビヒクル処理、１０３．５；化合物４処理、１２１．５）。
【表１４】
0005830013.tif 000059
【０２４７】
マウス骨髄由来の系統除去細胞（造血幹細胞および前駆細胞が濃縮されているが、純粋な集団ではない）を得た。
【０２４８】
ｉ）化合物４で処理したマウス骨髄由来細胞培養物（正常野生型マウスＨＳＣ由来）におけるコロニー形成単位の数の増加（１２日の処理）
野生型マウスの系統除去骨髄細胞（２匹の別々のマウス由来）を、化合物４（１００ｎＭおよび５００ｎＭ）、ビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）の存在下、または何も加えないで、標準的なコロニー形成アッセイにプレーティングした。１２日後、造血コロニーを数えた（ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ、およびＣＦＵ−ＧＥＭＭ）。
【０２４９】
マウス１において、総コロニー数は、以下の通りであった：未処理、１３６；ビヒクル処理、１２２；１００ｎＭの化合物４、１６１；５００ｎＭの化合物４、１６２。
【０２５０】
マウス２において、総コロニー数は、以下の通りであった：未処理、１０７；ビヒクル処理、１１７；１００ｎＭの化合物４、１２１；５００ｎＭの化合物４、１２９。
【表１５】
0005830013.tif 000060
【０２５１】
総コロニー数の増加は、化合物４を投与した場合に認められた。
【０２５２】
ｉｉ）ｍＴＥＲＴヘテロ接合マウスおよび（同じ親由来の）野生型対照に由来するマウス骨髄由来の系統除去細胞の短期液体培養物における化合物４によるテロメラーゼ活性化
ｍＴＥＲＴヘテロ接合マウスおよび野生型マウス由来の系統除去骨髄細胞を、化合物４（１μＭ、１００ｎＭ、または１０ｎＭ）、ビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）の存在下、または何も加えないで、幹細胞因子（Ｋｉｔｌ）、ＩＬ−３、およびＩＬ−１１を含むＩＭＤＭ＋１５％ＦＢＳ中で、３日間増殖させた。野生型細胞におけるテロメラーゼ活性は、１００ｎＭおよび１μＭの化合物４で処理したとき、ビヒクル処理した対照と比べて、４０〜５０％増大した。
【０２５３】
ｍＴＥＲＴヘテロ接合細胞におけるテロメラーゼ活性は、１μＭの化合物４で処理したとき、ビヒクル処理した対照と比べて、５０％増大した。
【０２５４】
ｉｉｉ）化合物４で処理したｍＴＥＲＴヘテロ接合マウス細胞の培養物におけるコロニー形成単位の数の増加（１２日の処理）
ｍＴＥＲＴヘテロ接合マウスの系統除去骨髄細胞を、化合物４（１００ｎＭおよび５００ｎＭ）、ビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）の存在下、または何も加えないで、標準的なコロニー形成アッセイにプレーティングした。１２日後、造血コロニーを数えた（ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ、およびＣＦＵ−ＧＥＭＭ）。総コロニー数は、以下の通りであった：未処理：６７；ビヒクル処理：６４；１００ｎＭの化合物４：６８および５００ｎＭの化合物４：７７。
【表１６】
0005830013.tif 000061
【０２５５】
生物学的実施例７：マトリゲルプラグにおけるテロメラーゼ活性および毛細血管密度と、骨髄幹細胞／前駆細胞におけるテロメラーゼ活性とに対するＢＡＬＢ／ｃマウスへの化合物４投与の効果
ＢＡＬＢ／ｃマウス（２〜３カ月齢）に、２％エタノール中の化合物４を１０ｍｇ／ｋｇ／日ＰＯ（ＢＩＤ）で投与した。マウスに、１日間、予投与した（１日目）。０日目に、腹部に、マトリゲル（商標）（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を皮下注射し、１２日目に、マトリゲル（商標）プラグを回収した。
【０２５６】
プラグの半分を、ＴＲＡＰアッセイを用いて、テロメラーゼ活性について解析した（ＲＢＣ細胞バッファー抽出後に、Ｍ−ＰＥＲ抽出）。化合物４で処理した後のマトリゲル（商標）プラグにおいて、テロメラーゼ活性の１．９倍の増大（ｐ＜０．２）（ｎ＝５／群）が認められた。
【０２５７】
細胞数を反映するトータルＲＮＡは、化合物４で処理した後のマトリゲル（商標）プラグで１．６倍増大した（ｐ＜０．２）（ｎ＝５／群）。
【０２５８】
毛細血管密度を解析するために、もう半分のマトリゲル（商標）プラグは、組織診およびＣＤ３１免疫染色に使用した（ＣＤ３１は、毛細血管を裏打ちする内皮細胞のマーカーである）。化合物４で処理した後、（ＣＤ３１免疫染色）（ｐ＜０．５）（ｎ＝５／群）における毛細血管密度の１．３倍の増大が認められた。
【０２５９】
ｉｉ）回収された骨髄細胞
系統除去磁気選別技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣＳカラム）を用いて、処理マウスから骨髄幹細胞および前駆細胞を純化した。ＴＲＡＰアッセイで測定される１．３〜１．５倍のテロメラーゼ活性の増大は、対照と比較したとき、化合物４で処理した骨髄幹細胞および前駆細胞で認められた（ｐ＜０．１）（ｎ＝３／群）。
【０２６０】
生物学的実施例８：マトリゲル（商標）プラグにおけるテロメラーゼ活性および毛細血管密度と、骨髄幹細胞／前駆細胞のテロメラーゼ活性および数とに対するＣ５７ＢＬ／６の年老いたＴＥＲＴ（＋／−）マウスへの化合物４投与の効果
Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド（８〜９カ月齢）の年老いたＴｅｒｔ（＋／−）マウスに、２％エタノール中１０ｍｇ／ｋｇ／日ＰＯ（ＢＩＤ）で化合物４を投与した。マウスに、１日間、予投与した（−１日目）。０日目に、腹部に、マトリゲル（商標）（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を皮下注射し、１２日目に、マトリゲル（商標）プラグを回収した。
【０２６１】
プラグの半分をテロメラーゼ活性およびヘモグロビン含量（これは、血管形成を示すものである）について解析した（ＲＢＣ細胞バッファー抽出後に、Ｍ−ＰＥＲ抽出）。もう半分のプラグを組織診用に処理した。
【０２６２】
マトリゲル（商標）プラグは、２回反復のＴＲＡＰ実験で測定したとき、化合物４で処理したマウスのテロメラーゼ活性において１．８倍の増大（ｐ＜０．０２）または２．６倍の増大（ｐ＜０．０１）を示した（ｎ＝１５／群）。
【０２６３】
マトリゲル（商標）プラグは、化合物４で処理したマウスのヘモグロビンレベルにおいて１．２倍の増大（ｐ＜０．２）を示した（ｎ＝１５／群）。
【０２６４】
化合物４で処理した後、細胞数を反映するトータルＲＮＡは、マトリゲル（商標）プラグにおいて１．５倍増大した（ｐ＜０．１）（ｎ＝１５／群）。
【０２６５】
系統除去磁気選別技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣＳカラム）を用いて、骨髄幹細胞および前駆細胞を純化した。骨髄は、２回反復のＴＲＡＰ実験で測定したとき、化合物４で処理したマウスのテロメラーゼ活性において１．３倍の増大（ｐ＜０．１８）または１．９倍の増大（ｐ＜０．０３）を示した（ｎ＝６／群）。
【０２６６】
純化された骨髄幹細胞／前駆細胞の数は、化合物４で処理したマウスにおいて１．５倍増大した（ｐ＜０．１）（ｎ＝６／群）。
【０２６７】
生物学的実施例９：ヒト脳周皮細胞に対する化合物４および化合物７投与の効果
ＰＤ１０におけるヒト脳周皮細胞（２７歳の女性ドナー）を、水に溶解させた０．５μＭの化合物７中で合計３０時間培養した。テロメラーゼ活性および管形成を解析した。
【０２６８】
まず、脳周皮細胞をＴ−７５フラスコにて０．５μＭの化合物７中で２４時間培養し、その後、管形成を促進するためにマトリゲルがコーティングされた２４ウェルプレートにスプリットした（３つ複製して行なった）。再度、０．５μＭの化合物７を培地に含めた。６時間後、サンプルを固定し、１つの条件につき３ウェル、１ウェルにつき５つの視野で、顕微鏡を用いて、分岐点を計数した。化合物７で処理した周皮細胞は、対照よりも１．９倍分岐点が多かった（ｐ＜０．１５）。
【０２６９】
細胞を調整し、上記のように処理したが、２４ウェルプレートはマトリゲルでコーティングしなかった。６時間後、ＴＲＡＰ解析のために細胞を回収した（Ｍ−ＰＥＲ抽出物）。化合物７で処理した周皮細胞において２．８倍のテロメラーゼ活性の増大が認められた。
【０２７０】
ＰＤ１０におけるヒト脳周皮細胞（２７歳の女性ドナー）をプレーティングし、播種２４時間後、０．１および０．１％ＤＭＳＯ中０．５μＭの化合物４で処理した。細胞を薬物とともに３０時間インキュベートし、ＴＲＡＰ解析のために回収した（Ｍ−ＰＥＲ抽出物）。０．１および０．５μＭの化合物４で処理した場合、それぞれ、１．８および１．９倍のテロメラーゼ活性の増大が認められた。２つ複製したサンプルを試験した。
【０２７１】
生物学的実施例１０：ヒト小気道上皮細胞に対する化合物４および化合物１２投与の効果
ヒト小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）および気道由来線維芽細胞（胎児肺線維芽細胞株ＩＭＲ−９０を含む）を、テロメラーゼ活性に対する化合物の効果を試験するためのインビトロ実験に使用した。
【０２７２】
ＳＡＥＣおよび気道由来線維芽細胞株ＩＭＲ−９０を２４ウェルプレートに播種した。それらを、最終濃度０．２％のエタノールを含む培地中、１μＭまたは０．１μＭの化合物１２で４８時間処理した。細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｍ−Ｐｅｒ溶解バッファーで溶解させた。ゲルＴＲＡＰアッセイを行ない、テロメラーゼ活性を評価した。化合物１２は、上皮由来細胞（ＳＡＥＣ）においてテロメラーゼ活性を選択的に２〜４倍上方調節するが、線維芽細胞由来細胞ＩＭＲ−９０では上方調節しないことことが分かった。反復実験で、これらの発見が確認された。同様の研究で、化合物４は、化合物１２と類似した特性および効力を有していた。
【０２７３】
ＳＡＥＣを、連続培養にて、最終濃度０．００４％のエタノール中、０．１μＭの化合物４で６０日間連続して培養した。化合物４は、ＳＡＥＣの長期複製能力を集団倍加約２回分増大させた（算出される細胞数は４倍増加）。長期培養された肺線維芽細胞では、化合物４で効果が見られなかった。
【０２７４】
ヒトＳＡＥＣまたはヒト線維芽細胞を、最終濃度１％のＤＭＳＯを含む培地中、様々な濃度の化合物４の存在下で増殖させた。３日後、細胞を回収し、アラマーブルー増殖アッセイを用いて増殖を測定した。ＳＡＥＣは、短期培養実験で約５０％の増殖の増大を示した。長期増殖された肺線維芽細胞では、化合物４処理で効果が見られなかった。老化マーカーのｐ１６およびｐ２１は、３日間だけ化合物４で処理したＳＡＥＣで著しく低下し、線維芽細胞におけるこれらのマーカーの低下は非常にわずかであった。
【０２７５】
ＳＡＥＣを２４ウェルプレートに播種し、最終濃度０．２％のエタノールを含む培地中、１μＭおよび０．１μＭの化合物１２で処理した。２４時間後、培地を交換し、細胞を化合物１２で再度処理した。さらに、一部の細胞をブレオマイシン（１０μｇ／ｍｌ）およびＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。２回目の処理の４８時間後、細胞を洗浄し、Ｍ−Ｐｅｒ溶解バッファーで溶解させた。ゲルＴＲＡＰアッセイを行ない、細胞内のテロメラーゼ活性を評価した。ＴＧＦβおよびブレオマイシンで処理したＳＡＥＣを用いた線維症のインビトロモデルでは、筋線維芽細胞／線維症バイオマーカーのα−平滑筋アクチン（ａＳＭＡ）が増大し、上皮マーカーのＥ−カドヘリン（Ｅ−ＣＡＤ）発現が減少した。ＴＧＦβとブレオマイシンは両方とも、ＳＡＥＣテロメラーゼ活性を抑制し、化合物４の添加は、培養物におけるこれらの化合物の効果に逆らってテロメラーゼ活性を部分的に回復させるかまたは保護した。
【０２７６】
本発明は特定の実施形態および用途に関して記載されているが、当業者であれば、本明細書に開示された本発明の用途および方法の範囲を理解するであろう。
【図１】
0005830013.tif 000076
【図２】
0005830013.tif 000077