(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
【化１】
0005709138.tif 000018
（式中、
−  Ｓ１はＭＭＰ酵素（ＭＭＰ型のプロテアーゼ酵素）Ｅ１の第一標的ペプチド配列であり；Ｓ２はＭＭＰ酵素Ｅ２の第二標的ペプチド配列であり；Ｓ１およびＳ２は同一であっても、異なっていてもよく；当該第一標的ペプチド配列Ｓ１および当該第二標的ペプチド配列Ｓ２は４個ないし１４個の範囲のアミノ酸の長さをもつ線状配列であり；Ｅ１およびＥ２は同じＭＭＰ酵素に、または異なるＭＭＰ酵素に相当していてもよく；Ｘ１は蛍光供与体基を担持するプローブであり；そしてＸ２は蛍光または非蛍光受容体基を担持するプローブである；
−  Ｒ１およびＲ２は独立して、単結合、アミノ酸残基またはペプチド配列に相当する；
−  Ｙは−ＣＯＮＨ−基または−ＮＨＣＯ−基に相当する）
に一致する環状ペプチド。
【請求項２】
該ＭＭＰ酵素がＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−５、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６、ＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−１９、ＭＭＰ−２３、ＭＭＰ−２５およびＭＭＰ−２６およびその混合物から選択されるものである請求項１記載の環状ペプチド。
【請求項３】
該ペプチドがＭＭＰ−１酵素の標的である場合、第一配列Ｓ1および／または第二配列Ｓ2は少なくとも以下の配列：
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−
配列番号：１
−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
配列番号：２
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
配列番号：３
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−
配列番号：４
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−
配列番号：５
−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−
配列番号：６
−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−
配列番号：７
−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−
配列番号：８
−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−
配列番号：９
−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−
配列番号：１０
−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−
配列番号：１１
−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−
配列番号：１２
−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−
配列番号：１３
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−
配列番号：１４
−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−
配列番号：１５
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：１６
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：１７
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ａｂｕ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：１８
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：１９
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２０
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−［２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル］−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
配列番号：２２
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：１７
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：２３
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−
配列番号：２４
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｎｖａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２５
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−
配列番号：２６
の１つであるか、または
該ペプチドがＭＭＰ−２酵素の標的である場合、第一配列Ｓ1および／または第二配列Ｓ2は少なくとも以下の配列：
−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−
配列番号：１０
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−
配列番号：２７
−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−
配列番号：１２
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−
配列番号：２８
−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−
配列番号：１３
−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−
配列番号：２９
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：１６
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：３０
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−
配列番号：３１
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＳＣＨ［ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2］−ＣＯ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
配列番号：３２
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−
配列番号：３３
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−［２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル］−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
配列番号：２２
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：２３
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−
配列番号：２４
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｎｖａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２５
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−
配列番号：２６
の１つであるか、または
該ペプチドがＭＭＰ−３酵素の標的である場合、第一配列Ｓ1および／または第二配列Ｓ2は少なくとも以下の配列：
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−
配列番号：５
−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−
配列番号：３４
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−
配列番号：３５
−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−
配列番号：３６
−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−
配列番号：３７
−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−
配列番号：１０
−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−
配列番号：３８
−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−
配列番号：３９
−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−
配列番号：４０
−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−
配列番号：４１
−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−
配列番号：４２
−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−
配列番号：４３
−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−
配列番号：４４
−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−
配列番号：４５
−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−
配列番号：１３
−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−
配列番号：４６
−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−
配列番号：４７
−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−
配列番号：１２
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−
配列番号：２８
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−
配列番号：４８
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−
配列番号：４９
−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−
配列番号：１５
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−
配列番号：５０
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：１６
−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−
配列番号：５１
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−
配列番号：５２
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２０
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−［２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル］−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
配列番号：２２
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−
配列番号：２６
の１つであるか、または
該ペプチドがＭＭＰ−５酵素の標的である場合、第一配列Ｓ1および／または第二配列Ｓ2は少なくとも以下の配列：
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−
配列番号：５０
の１つであるか、または
該ペプチドがＭＭＰ−７酵素の標的である場合、第一配列Ｓ1および／または第二配列Ｓ2は少なくとも以下の配列：
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：１６
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−
配列番号：２４
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２０
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−［２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル］−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
配列番号：２２
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：１７
−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−
配列番号：５１
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−
配列番号：５２
の１つであるか、または
該ペプチドがＭＭＰ−８酵素の標的である場合、第一配列Ｓ1および／または第二配列Ｓ2は少なくとも以下の配列：
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：５３
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：１６
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２０
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−［２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル］−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
配列番号：２２
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：１７
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：２３
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−
配列番号：２４
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｎｖａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２５
の１つであるか、または
該ペプチドがＭＭＰ−９酵素の標的である場合、第一配列Ｓ1および／または第二配列Ｓ2は少なくとも以下の配列：
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
配列番号：５４
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−
配列番号：５５
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
配列番号：５６
−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−
配列番号：５７
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−
配列番号：５８
−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−
配列番号：１２
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−
配列番号：１４
−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−
配列番号：１５
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−
配列番号：５０
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：１６
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：１９
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＳＣＨ［ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2］−ＣＯ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
配列番号：３２
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−
配列番号：３３
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２０
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−［２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル］−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
配列番号：２２
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：２３
の１つであるか、または
該ペプチドがＭＭＰ−１０酵素の標的である場合、第一配列Ｓ1および／または第二配列Ｓ2は少なくとも以下の配列：
−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−
配列番号：１２
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−
配列番号：２８
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
の１つであるか、または
該ペプチドがＭＭＰ−１１酵素の標的である場合、第一配列Ｓ1および／または第二配列Ｓ2は少なくとも以下の配列：
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２０
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
の１つであるか、または
該ペプチドがＭＭＰ−１２酵素の標的である場合、第一配列Ｓ1および／または第二配列Ｓ2は少なくとも以下の配列：
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２０
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−［２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル］−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
配列番号：２２
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：１７
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：２３
−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−
配列番号：５１
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−
配列番号：５２
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−
配列番号：２４
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｎｖａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２５
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−
配列番号：２６
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−
配列番号：５９
の１つであるか、または
該ペプチドがＭＭＰ−１３酵素の標的である場合、第一配列Ｓ1および／または第二配列Ｓ2は少なくとも以下の配列：
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−
配列番号：４９
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−
配列番号：５０
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｎｖａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｄｐａ−
配列番号：２５
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２０
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−［２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル］−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
配列番号：２２
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：１６
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：１７
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：２３
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−
配列番号：３１
−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−
配列番号：５１
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−
配列番号：５２
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−
配列番号：２４
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：５３
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｎｖａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２５
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−
配列番号：２６
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−
配列番号：５９
の１つであるか、または
該ペプチドがＭＭＰ−１４酵素の標的である場合、第一配列Ｓ1および／または第二配列Ｓ2は少なくとも以下の配列：
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｃｙｓ（ｐ−ＯＭｅＢｚ）−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：６０
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２０
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−［２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル］−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
配列番号：２２
の１つであるか、または
該ペプチドがＭＭＰ−１５酵素の標的である場合、第一配列Ｓ1および／または第二配列Ｓ2は少なくとも以下の配列：
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
の１つであるか、または
該ペプチドがＭＭＰ−１６酵素の標的である場合、第一配列Ｓ1および／または第二配列Ｓ2は少なくとも以下の配列：
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
の１つであるか、または
該ペプチドがＭＭＰ−１７酵素の標的である場合、第一配列Ｓ1および／または第二配列Ｓ2は少なくとも以下の配列：
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−［２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル］−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
配列番号：２２
の１つであるか、または
該ペプチドがＭＭＰ−１９酵素の標的である場合、第一配列Ｓ1および／または第二配列Ｓ2は少なくとも以下の配列：
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
の１つであるか、または
該ペプチドがＭＭＰ−２３酵素の標的である場合、第一配列Ｓ1および／または第二配列Ｓ2は少なくとも以下の配列：
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
の１つであるか、または
該ペプチドがＭＭＰ−２５酵素の標的である場合、第一配列Ｓ1および／または第二配列Ｓ2は少なくとも以下の配列：
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
の１つであるか、または
該ペプチドがＭＭＰ−２６酵素の標的である場合、第一配列Ｓ1および／または第二配列Ｓ2は少なくとも以下の配列：
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：１６
の１つである請求項２記載の環状ペプチド。
【請求項４】
プローブＸ１が担持する供与体基およびプローブＸ２が担持する受容体基が芳香族基を含んでなる請求項１ないし３のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
【請求項５】
該芳香族核がベンゼン、アントラセンまたはクマリン核である請求項４記載の環状ペプチド。
【請求項６】
プローブＸ１が担持する供与体基およびプローブＸ２が担持する受容体基が以下の対合から選択されるものである請求項１ないし５のいずれか一項に記載の環状ペプチド：
＊トリプトファン／２，４−ジニトロフェニル；
＊ｏ−アミノ安息香酸／２，４−ジニトロフェニル；
＊（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル／２，４−ジニトロフェニル；
＊（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル／Ｎ−３−（２，４−ジニトロフェニル）−Ｌ−２，３−ジアミノプロピル；
＊トリプトファニル／ダンシル；
＊Ｎ−メチルアントラノイル／２，４−ジニトロフェニル；
＊６，７−ジメトキシクマリン−４−イル−アセチル／６−Ｎ−（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノヘキサン酸；
＊５−（２’−アミノメチル）ナフタレンスルホン酸／４−（４’−ジメチルアミノフェニルアザ）安息香酸；
＊７−メトキシクマリン−３−カルボン酸／７−ジエチルアミノ−クマリン−３−カルボン酸。
【請求項７】
プローブＸ１が担持する供与体基およびプローブＸ２が担持する受容体基がクマリン核を含んでなる請求項１ないし６のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
【請求項８】
プローブＸ１が担持する供与体基およびプローブＸ２が担持する受容体基が、それぞれ以下の式：
【化２】
0005709138.tif 000019
に相当するものである請求項１ないし７のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
【請求項９】
プローブＸ１およびＸ２がアミノ酸残基である請求項１ないし８のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
【請求項１０】
プローブＸ１およびＸ２がそれぞれ以下の式：
【化３】
0005709138.tif 000020
に一致するものである請求項９記載の環状ペプチド。
【請求項１１】
該ペプチド配列Ｓ１およびＳ２が以下の式：
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−
に一致するものである請求項１に記載の環状ペプチド。
【請求項１２】
以下の式：
【化４】
0005709138.tif 000021
（式中、Ｒ１、ＹおよびＲ２は請求項１に記載の定義と同じ定義を有する）
に一致するものである請求項１１に記載の環状ペプチド。
【請求項１３】
以下の式：
【化５】
0005709138.tif 000022
に一致するものである請求項１１または１２に記載の環状ペプチド。
【請求項１４】
請求項１に記載の環状ペプチドの製造法であって、下記工程：
ａ）固相上の化学合成により線状ペプチドを調製するための調製工程；
ｂ）固相から線状ペプチドを脱離する脱離工程；および
ｃ）該線状ペプチドの末端をカップル結合させて環状ペプチドを形成するカップリング工程；
からなることを特徴とする製造法。
【請求項１５】
請求項１に記載の環状ペプチドの製造法であって、下記工程：
ａ）固相上の化学合成により線状ペプチドを調製するための調製工程；
ｂ）該線状ペプチドの遊離の末端と該線状ペプチドの線状残基の末端官能基とをカップル結合させるカップリング工程；および
ｃ）環状ペプチドを固相から脱離するための脱離工程であって、工程ｂ）およびｃ）を付随して実施し得る脱離工程；
からなることを特徴とする製造法。
【請求項１６】
請求項１ないし１３のいずれか一項に記載した少なくとも１種の環状ペプチドを含有してなる即時使用し得る試薬。
【請求項１７】
−  請求項１ないし１３のいずれか一項に記載した少なくとも１種の環状ペプチドを含んでなる第一区分；および
−  緩衝液を含んでなる第二区分；
を含んでなるキット。
【請求項１８】
少なくとも１種のＭＭＰ酵素の活性をインビトロで測定するための、請求項１ないし１３のいずれか一項に記載した少なくとも１種の環状ペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、通常、いわゆるＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動またはフォースター共鳴エネルギー移動の略）法によるプロテアーゼ酵素の酵素活性測定において使用し得る新規蛍光環状ペプチドに関する。
本発明は酵素障害を原因とする疾患の診断分野において特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
酵素は調節現象を顕著に伴う複雑な作用メカニズムを有し、その破壊は、病理学的障害の発症の原因となり得る。
【０００３】
メタロプロティナーゼ（ＭＭＰの略号でも知られる）は顕著な事例であり、このものは細胞外マトリックス要素のすべてと、一部の増殖因子および接着分子を切断し得る。これらの酵素は自然の過程によってＴＩＭＰ（メタロプロティナーゼの組織インヒビター）などのインヒビターにより調節される。ＭＭＰ／ＴＩＭＰの平衡が崩れると、腫瘍増殖、転移、関節リウマチ、心疾患などの病的プロセスが生じ得る。
【０００４】
多くの病態において酵素が関わっていることから、認知された病態との可能な相関を確立するためには、これらの酵素活性を測定可能とする手段の提供が必須であることが間もなく証明された。現時点で入手し得る手段は、活性を測定すべき酵素の基質からなり、これらの基質は蛍光基を有すると共に、その活性を蛍光測定により定量することからなる。特に、最も頻繁に使用される蛍光法は蛍光共鳴エネルギー移動法またはＦＲＥＴである。しかし、この技法は厳密な意味で蛍光移動の測定に基づくものではなく、電子エネルギー移動の測定に基づくものである。従って、識別は放射移動と非放射（または共鳴）移動間でなされなければならない。放射移動は基と基の間の距離、それらの方向性などの情報の入手手段を提供するものではなく、試験するシステムを理解するための、または特性化するための必須のデータであり得る。
【０００５】
放射移動は２段階で起こるプロセスである。初期段階では、光子が供与体基により放出され、第二段階では、この光子が供与体基と同じ光子受容体基または異なる光子受容体基により吸収される。この移動には基と基の間の相互作用を必要としないが、種のスペクトルの重なり合いと濃度のスペクトルの重なり合いに左右される。
【０００６】
励起エネルギーの非放射移動は供与体基および受容体基の間の相互作用を必要とする。この移動は供与体基の発光スペクトルが受容体基の吸収スペクトルと重なり合った場合にのみ起こり、その結果、供与体基の振電遷移と受容体基の振電遷移との間のエネルギー対応が存在する。当該遷移はカップル結合している、または＜共鳴している＞と言われる。
【０００７】
非放射エネルギー移動の現象はフォースター（Forster）が研究した。彼はこの物理現象が１０ないし１００Åという位数の非常に短い距離にまたがって起こることを証明し得た。供与体基と受容体基の距離が大きくなる場合、これはエネルギー移動の変化と解釈される。従って、この現象はプロテアーゼ酵素の酵素活性を評価するために使用し得る。対照的に、各末端でそれぞれ配列した供与体基と受容体基両方を含んでなる基質を特異的プロテアーゼ酵素と接触させると、基質が切断され、その結果、供与体基と受容体基間の距離が増大し、結果として、励起エネルギー（または共鳴エネルギー）の移動の変化が起こる。この変化に基づき、酵素活性の評価に到達することができる。
【０００８】
現在使用されている基質は殆どの部分が線状構造の基質についてであり、その基質は、明らかにエキソプロテアーゼおよび非特異的プロテアーゼにより分解されると思われるので、生物媒体においては殆ど安定性のないことが証明されている。
【０００９】
それ故、所定のプロテアーゼ酵素の酵素活性を定量するための手段として使用し得る、安定で、特にＦＲＥＴ法を用いる当該酵素の酵素活性のモニターを可能とするペプチドが紛れもなく必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
それ故、本発明者らは上記の必要性に一致する新規なペプチドを開発してきた。
【００１１】
それ故、第一の主題によると、本発明は以下の配列：
−Ｓ１−Ｘ１−Ｓ２−Ｘ２−
（式中、Ｓ１はプロテアーゼ酵素Ｅ１の第一標的ペプチド配列であり；Ｓ２はプロテアーゼ酵素Ｅ２の第二標的ペプチド配列であり；Ｓ１およびＳ２は同一であっても、異なっていてもよく；当該第一のペプチド配列Ｓ１および当該第二のペプチド配列Ｓ２は４個ないし１４個のアミノ酸を含んでなり；Ｅ１およびＥ２は同じプロテアーゼ酵素に、または異なるプロテアーゼ酵素に相当していてもよく；Ｘ１は蛍光供与体基を担持するプローブであり；そしてＸ２は蛍光または非蛍光受容体基を担持するプローブである）
を含んでなる環状ペプチド（シクロペプチドとも呼称する）に関する。
【００１２】
好ましくは、該供与体基および受容体基は、供与体基の蛍光発光スペクトルが受容体基の吸収スペクトルと少なくとも部分的に重なり合うように選択する。
【００１３】
それ故、１つのプロテアーゼ酵素Ｅ（Ｅ１とＥ２が１つかつ同一の酵素を形成するのみであり、Ｓ１とＳ２が同一のプロテアーゼ酵素の標的ペプチド配列である場合）またはプロテアーゼＥ１とプロテアーゼＥ２（それらが異なっている場合、またＳ１がプロテアーゼ酵素Ｅ１の標的ペプチド配列であり、Ｓ２がプロテアーゼ酵素Ｅ２の標的ペプチド配列である場合）両方の存在下、本発明の環状ペプチドは、第一のペプチド配列Ｓ１および第二のペプチド配列Ｓ２の両方で切断され、そして、プローブＸ１およびＸ２の配置を原因として、プローブＸ１とＸ２の空間に距離を生じる。次いで、供与体基と受容体基の距離が離れ、次に、これらの２つの基の間の共鳴エネルギーの移動に変化が生じる。それ故、この共鳴エネルギーの変化を用いて、プロテアーゼ酵素Ｅまたはプロテアーゼ酵素Ｅ１とＥ２の酵素活性に到達することが可能である。
【００１４】
さらに、本発明のペプチドが環状であるという事実は、常套的に先行技術において使用される線状ペプチドの欠点、特に先行技術の線状ペプチドが遭遇する安定性の問題を克服することが可能であることを意味する。
【００１５】
本発明の特定の一実施態様によると、Ｅ１およびＥ２は同一のプロテアーゼ酵素に相当する。
プロテアーゼ酵素Ｅの酵素活性を検討するために（Ｅ１＝Ｅ２の場合）、本発明者らは検討すべきプロテアーゼ酵素Ｅの標的である１本の線状ペプチド配列の環状化について極単純に仮想した；該ペプチド配列は以下の工程図に示すプローブＸ１およびＸ２をその末端に含んでなる：
【００１６】
【化１】
0005709138.tif 000002
【００１７】
検討すべきプロテアーゼ酵素Ｅの存在下、環状ペプチドは以下の工程図に示すように切断される：
【００１８】
【化２】
0005709138.tif 000003
【００１９】
切断後、基Ｘ１およびＸ２の距離は変化しないままである。結果として、共鳴移動の変化はなく、従って、プロテアーゼ酵素Ｅの活性を定量することは不可能である。
詳細な説明に入る前に、我々は以下の定義を提案する。
【００２０】
蛍光供与体基が慣例として意味するのは、光エネルギー（励起光といい、その波長は一般に紫外部領域に属する）を吸収し、その環境に依存的に２つの可能な形状でこの光を再発光することができる基である。
ａ）受容体基との共鳴による励起エネルギーの移動の形状で、ただし、後者は先に記載したＦＲＥＴ現象と互換性のある距離に、好ましくは１０ないし１００Åの範囲の距離にある；または
ｂ）一般に波長が可視領域に属する蛍光（供与体発光光と呼称）の形状にある。
【００２１】
受容体基が慣例として意味するのは、本発明の意味において、共鳴エネルギーによる供与体基の励起エネルギーを吸収することのできる基である。この励起エネルギーは２つの主要な様式で再発光され得る：
ａ）放射発光（光子の放出）による；この場合、蛍光受容体基という用語が使用される；または
ｂ）非放射発光（すなわち、光子放出以外の不活性化様式）による；この場合、非蛍光受容体基という用語が使用される。
【００２２】
プローブが通常意味するのは、また本発明の意味において、供与体基（プローブＸ１について）を担持するアミノ酸残基、または受容体基（プローブＸ２について）を担持するアミノ酸残基である。
【００２３】
アミノ酸残基が通常意味するのは、アミノ酸の−ＮＨ２官能基または−ＣＯ２Ｈ等と別の化合物の官能基とが反応して共有結合を形成するような残基アミノ酸である。
【００２４】
標的ペプチド配列が通常意味するのは、また本発明の意味において、プロテアーゼ酵素が認識して切断し得るペプチド配列である。
【００２５】
プロテアーゼ酵素Ｅ１およびプロテアーゼ酵素Ｅ２（Ｅ１およびＥ２は同一であっても、異なっていてもよい）の２つの標的ペプチド配列（これら配列の間に本発明に適合するプローブＸ１およびプローブＸ２がそれぞれ配列されている）を含んでなる環状ペプチドの使用が、上記で説明したように、当該プロテアーゼ酵素の活性を定量するための良好な手段の提供を可能とする。
本発明の環状ペプチドは、下記式：
【００２６】
【化３】
0005709138.tif 000004
【００２７】
（式中、
−  Ｓ１、Ｘ１、Ｓ２およびＸ２は上記と同一の定義を示す；
−  Ｒ１およびＲ２は独立して、単結合、アミノ酸残基またはペプチド配列に相当する；
−  Ｙは−ＣＯＮＨ−基または−ＮＨＣＯ−基に相当する）
に一致する。
【００２８】
Ｓ１およびＳ２は、該ペプチドが単一のプロテアーゼ酵素（Ｅ１およびＥ２が同一である）の活性を定量しようとする場合は、同一であり、または該ペプチドが同一のプロテアーゼ酵素のイソ型の存在または２種の異なるプロテアーゼ酵素Ｅ１およびＥ２の存在の間を識別しようとする場合は明らかに異なり得る。
【００２９】
Ｓ１およびＳ２が同一である場合、それらは同一方向に、または逆方向に配置され得る。例えば、Ｓ１が配列−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−に相当する場合、配列Ｓ２は逆方向に配置された同一配列、すなわち、以下の配列−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−に相当する。
【００３０】
本発明の特定の一実施態様において、Ｒ１およびＲ２はアミノ酸残基に、またはペプチド配列に相当し得る。このことは該環状ペプチドが医薬投与形態を企図する場合、特に生物媒体において該ペプチドが安定であるという理由で特に有利である。
【００３１】
本発明の環状ペプチドは、ＭＭＰ型のプロテアーゼ酵素（“細胞外マトリックスメタロプロティナーゼ”としても知られる）の酵素活性を測定するために特に適用される。
【００３２】
この場合、プロテアーゼ酵素Ｅ１およびプロテアーゼ酵素Ｅ２はＭＭＰ型の酵素であり、その場合の第一ペプチド配列Ｓ１はＭＭＰプロテアーゼ酵素の標的であり、第二ペプチド配列Ｓ２はＭＭＰプロテアーゼ酵素の標的である。
【００３３】
ＭＭＰ類はその活性部位に亜鉛原子を含む２８の数に及ぶエンドぺプチダーゼの系統群である。それらは分泌されるか、または膜と会合しているかによって２つの系統群に分類し得る。分泌されるＭＭＰは、コラゲナーゼ（例：ＭＭＰ−１、８、１３および１８）、ゼラチナーゼ（例：ＭＭＰ−２および９）、マトリリシン（例：ＭＭＰ−７および２６）、ストロメリシン（例：ＭＭＰ−３、１０および１１）、エピリシン（ＭＭＰ−２８）、エナメリシン（ＭＭＰ−２０）を包含する。膜と会合するＭＭＰは、膜貫通ＭＭＰ、例えば、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６、ＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−２３、ＭＭＰ−２４およびＭＭＰ−２５を包含する。
【００３４】
ＭＭＰ類は細胞外マトリックス要素のすべて、一部の増殖因子、または接着分子さえも切断することができる。ＭＭＰはＴＩＭＰなどの天然のインヒビターにより調節され、生理的プロセス（胚増殖、血管新生、骨組織の改造作用など）において重要な役割を果たしている。ＭＭＰ／ＴＩＭＰのバランスが崩れると、腫瘍増殖、転移、関節リウマチ、心疾患などの病的プロセスが生じる。
【００３５】
腫瘍進行におけるＭＭＰ類の役割は多様であるが、とりわけ細胞外マトリックスを分解するＭＭＰの能力が理由であり、それにより腫瘍の侵入を促進する。また、ＭＭＰは非マトリックスタンパク質に対してタンパク分解活性を有し、腫瘍の進行、接着喪失、侵入、増殖、血管新生、血管内異物侵入、管外遊出および転移増殖などの幾つかの他の工程においてそれらに対し複雑な役割を与える。
【００３６】
それ故、環状ペプチドはＭＭＰタイプのプロテアーゼ酵素の酵素活性をモニターするための、特に、酵素活性と認知された病態との間のつながりを確立するための、優れた手段であること証明する。
【００３７】
より正確には、環状ペプチドがＭＭＰ活性の追跡を企図する場合、標的のペプチド配列Ｓ１およびＳ２は１個のＭＭＰ酵素（Ｓ１＝Ｓ２であるか、またはＳ１およびＳ２が１つの同じ酵素の２つの同型間を識別しようとする異なる標的配列である場合）の、または２個のＭＭＰ酵素（Ｓ１およびＳ２が異なっていて、それぞれが２つの異なるプロテアーゼ酵素の標的である場合）の標的であり、それらの配列はその活性をモニターしようとするＭＭＰ（類）が認識するＭＭＰ（類）の基質の配列に相当する。
【００３８】
特に、標的ペプチド配列Ｓ１およびＳ２は、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−５、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６、ＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−１９、ＭＭＰ−２３、ＭＭＰ−２５およびＭＭＰ−２６およびその混合物から選択されるＭＭＰ酵素の標的となり得る。
【００３９】
ペプチド配列Ｓ１およびＳ２は、４個ないし１４個の範囲のアミノ酸の長さをもつ線状配列であり、活性を示すために必要なコンホメーションをもつ同じ配列の環状ペプチドを可能とする。Ｓ１およびＳ２は、そのＮ末端とＣ末端の間の距離が１０Åと１００Åの間となるように選択され、当該距離は先に定義したような供与体基と受容体基の間でＦＲＥＴを実施するために有効な距離と矛盾しない距離とすると有利である。分子モデル化ソフトウエアを使用することで、信頼し得る当該距離の予測が可能である。
【００４０】
ペプチド配列Ｓ１およびＳ２は、ＭＭＰの天然基質に見出される天然のペプチド配列から誘導し得るか、またはＭＭＰの合成基質として知られる合成配列から誘導し得る。
【００４１】
有利なことに、本発明の環状ペプチドは天然のアミノ酸のみを含み、それがそれらの可能性のある細胞毒性を制限し得るものとし、また関係する生物体への非天然アミノ酸の導入を回避する。
【００４２】
一部の事例においては、天然または合成基質がＭＭＰ類によって認識され、切断されることがあり得る。どのＭＭＰが切断に関与しているかを決定するためには、この基質についての異なるＭＭＰ類の酵素動力学データを使用し、比較することが必要である。
【００４３】
数種のＭＭＰ類間の識別を可能とするこれら酵素動力学データは、一般に、その基質に対する酵素の親和性の指標であるミカエリス定数（Ｋｍ）、および触媒定数（Ｋｃａｔ、１秒あたり且つ酵素１モルあたりに形成される産物のモル数）と酵素の触媒効率の指標であるミカエリス定数との比である。それ故、一般に、ＭＭＰ／基質対合についての値の特定の対合（Ｋｍおよびｋｃａｔ／Ｋｍ）が存在する。それ故、例えば２つのＭＭＰが同じ基質を認識する場合、どちらが可視化活性に関与しているかを決定することが可能である。
【００４４】
合成配列は、例えば、以下のアミノ酸または基を含んでなる：
Ｎｖａ  （ノル−バリン）；  Ｃｈａ  （３−シクロヘキシルアラニン）；  Ｄｐａ  （Ｎ−３（２，４−ジニトロフェニル）−Ｌ−２，３−ジアミノプロピオニル）；  Ａｂｕ：α−アミノ酪酸；  Ｓ−メチルシステインに対応するＣｙｓ（Ｍｅ）、このものは基−ＳＨが−Ｓ−ＣＨ３基と置換されていることを意味する；  Ｄ−アルギニンに対応するＤ−Ａｒｇ。
【００４５】
本明細書の残りの記載において、下記掲載の略号は具体的に以下の意味を有する：
Ｇｌｙ：グリシン；  Ｐｒｏ：プロリン；  Ｌｅｕ：ロイシン；  Ａｌａ：アラニン；  Ｇｌｎ：グルタミン；  Ｉｌｅ：イソロイシン；  Ａｒｇ：アルギニン；  Ｖａｌ：バリン；  Ｔｙｒ：チロシン；  Ｇｌｕ：グルタメート；  Ｍｅｔ：メチオニン；  Ｐｈｅ：フェニルアラニン；  Ａｓｎ：アスパラギン；  Ｔｈｒ：トレオニン；  Ｔｒｐ：トリプトファン；  Ｓｅｒ：セリン；  Ｈｉｓ：ヒスチジン、これらの略号はアミノ酸についての公式の３文字命名法に準拠する。
【００４６】
第一の配列Ｓ１および／または第二の配列Ｓ２をＭＭＰ−１酵素の標的とするとき、それらは従って少なくとも１種の以下の配列に対応する：
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−
配列番号：１
−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
配列番号：２
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
配列番号：３
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−
配列番号：４
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−
配列番号：５
−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−
配列番号：６
−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−
配列番号：７
−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−
配列番号：８
−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−
配列番号：９
−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−
配列番号：１０
−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−
配列番号：１１
−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−
配列番号：１２
−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−
配列番号：１３
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−
配列番号：１４
Deng, S.J., et al. 2000. J. Biol. Chem. 275, 31422
【００４７】
−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−
配列番号：１５
Beekman, B., et al. 1996. FEBS Lett 390, 221
【００４８】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：１６
Bickett, D.M., et al. 1993. Anal. Biochem. 212, 58
Knight, C.G., et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263
Darlak, K., et al. 1990. J. Biol. Chem. 265, 5199
Stack, M.S., and Gray, R.D. 1989. J. Biol. Chem. 264, 4277
【００４９】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：１７
Netzel-Arnett, S., et al. 1991. Anal. Biochem.195, 86
【００５０】
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ａｂｕ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：１８
McGeehan, G.M., et al. 1994. J. Biol. Chem.269, 32814
【００５１】
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：１９
Bickett, D.M., et al. 1993. Anal. Biochem. 212, 58
【００５２】
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２０
Mohan, M.J.  et al. 2002. Biochemistry41, 9462
Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066
Ambrose, W.P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150
【００５３】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
Knauper, V. et al. 1996. J. Biol. Chem. 271, 1544
【００５４】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−［２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル］−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
配列番号：２２
Weingarten, H.; Feder, J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437
Weingarten, H. et al. 1985. Biochemistry.  24, 6730
【００５５】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：１７
A. Santala, A. et al. 1999. FEBS Lett. 461, 153-156
Nagase, H. et al. 1994 J.Biol.Chem. 269, 20952-20957
【００５６】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：２３
J. Berman et al. 1992. J.Biol.Chem. 267, 1434-1437
【００５７】
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−
配列番号：２４
Kraft, P.J. et al. 2001. Connect.Tissue Res. 42, 149-163
Itoh, M. et al. 1997. J.Pharm.Biomed.Anal. 15, 1417-1426
Welch, A.R. et al. 1995. Arch.Biochem.Biophys. 324, 59-64
【００５８】
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｎｖａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２５
Lauer-Fields, J.L. and Fields, G.B. 2002 Biol.Chem. 383, 1095-1105
Lauer-Fields, J.L. et al. 2001. Biochemistry 40, 5795-5803
【００５９】
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−
配列番号：２６
Bremer, C. et al.2002. Acad.Radiol. 9 Suppl 2, S314-S315
Nagase, H. et al. 1994. J.Biol.Chem. 269, 20952-20957
【００６０】
第一の配列Ｓ１および／または第二の配列Ｓ２をＭＭＰ−２酵素の標的とするとき、それらは従って少なくとも１種の以下の配列に対応する：
−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−
配列番号：１０
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−
配列番号：２７
−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−
配列番号：１２
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−
配列番号：２８
−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−
配列番号：１３
−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−
配列番号：２９
Beekman, B., et al. 1996. FEBS Lett 390, 221
【００６１】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：１６
Bickett, D.M., et al. 1993. Anal. Biochem. 212, 58
Knight, C.G., et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263
Darlak, K., et al. 1990. J. Biol. Chem. 265, 5199
Stack, M.S., and Gray, R.D. 1989. J. Biol. Chem. 264, 4277
【００６２】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：３０
Murphy, G., et al. 1994. J. Biol. Chem. 269, 6632
【００６３】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
Knight, C.G., et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263
【００６４】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−
配列番号：３１
Netzel-Arnett, S., et al. 1991. Anal. Biochem. 195, 86
【００６５】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＳＣＨ［ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２］−ＣＯ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
配列番号：３２
Weingarten, H., et al. 1985. Anal. Biochem. 147, 437
Weingarten, H., et al. 1985. Biochemistry 24, 6730
【００６６】
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−
配列番号：３３
G.D. Johnson and K. Ahn 2000. Anal. Biochem. 286, 112
【００６７】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
Knight, C.G.  et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263
【００６８】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−［２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル］−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
配列番号：２２
Weingarten, H.; Feder, J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437
Weingarten, H. et al. 1985. Biochemistry.  24,6730
Xia, T. et al. 1996. Biochim. Biophys. Acta 1293,259
【００６９】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：２３
J. Berman et al., 1992. J.Biol.Chem. 267, 1434-1437
【００７０】
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−
配列番号：２４
Kraft, P.J. et al. 2001. Connect.Tissue Res. 42, 149-163
Itoh, M. et al. 1997. J.Pharm.Biomed.Anal. 15, 1417-1426
Welch, A.R. et al. 1995. Arch.Biochem.Biophys. 324, 59-64
【００７１】
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｎｖａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２５
Lauer-Fields, J.L. and Fields, G.B. 2002 Biol.Chem. 383, 1095-1105
Lauer-Fields, J.L. et al. 2001. Biochemistry 40, 5795-5803
【００７２】
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−
配列番号：２６
Bremer, C. et al.2002. Acad.Radiol. 9 Suppl 2, S314-S315
Nagase, H. et al. 1994. J.Biol.Chem. 269, 20952-20957
【００７３】
第一の配列Ｓ１および／または第二の配列Ｓ２をＭＭＰ−３酵素の標的とするとき、それらは従って少なくとも１種の以下の配列に対応する：
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−
配列番号：５
−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−
配列番号：３４
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−
配列番号：３５
−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−
配列番号：３６
−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−
配列番号：３７
−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−
配列番号：１０
−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−
配列番号：３８
−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−
配列番号：３９
−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−
配列番号：４０
−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−
配列番号：４１
−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−
配列番号：４２
−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−
配列番号：４３
−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−
配列番号：４４
−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−
配列番号：４５
−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−
配列番号：１３
−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−
配列番号：４６
−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−
配列番号：４７
−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−
配列番号：１２
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−
配列番号：２８
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−
配列番号：４８
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−
配列番号：４９
Deng, S.J., et al. 2000. J. Biol. Chem. 275, 31422
【００７４】
−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−
配列番号：１５
Beekman, B., et al. 1996. FEBS Lett 390, 221
【００７５】
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−
配列番号：５０
Beekman, B., et al. 1997. FEBS Lett 418, 305
【００７６】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：１６
Bickett, D.M., et al. 1993. Anal. Biochem. 212, 58
Knight, C.G., et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263
Darlak, K., et al. 1990. J. Biol. Chem. 265, 5199
Stack, M.S., and Gray, R.D. 1989. J. Biol. Chem. 264, 4277
【００７７】
−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−
配列番号：５１
Netzel-Arnett, S., et al. 1991. Anal. Biochem. 195, 86
【００７８】
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−
配列番号：５２
Bickett, D.M., et al. 1994. Ann. N.Y. Acad. Sci. 732, 351
【００７９】
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２０
Mohan, M.J.  et al. 2002. Biochemistry41, 9462
Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066
Ambrose, W.P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150
【００８０】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
Knight, C.G.  et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263
【００８１】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−［２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル］−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
配列番号：２２
Weingarten, H.; Feder, J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437
Weingarten, H. et al. 1985. Biochemistry.  24,6730
【００８２】
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−
配列番号：２６
Bremer, C. et al.2002. Acad.Radiol. 9 Suppl 2, S314-S315
Nagase, H. et al. 1994. J.Biol.Chem. 269, 20952-20957
【００８３】
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−
配列番号：５０
Bremer, C. et al.2002. Acad.Radiol. 9 Suppl 2, S314-S315
Nagase, H. et al. 1994. J.Biol.Chem. 269, 20952-20957
【００８４】
第一の配列Ｓ１および／または第二の配列Ｓ２をＭＭＰ−５酵素の標的とするとき、それらは従って少なくとも１種の以下の配列に対応する：
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−
配列番号：５０
Beekman, B., et al. 1997. FEBS Lett 418, 305
【００８５】
第一の配列Ｓ１および／または第二の配列Ｓ２をＭＭＰ−７酵素の標的とするとき、それらは従って少なくとも１種の以下の配列に対応する：
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：１６
Bickett, D.M., et al. 1993. Anal. Biochem. 212, 58
Knight, C.G., et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263
Darlak, K., et al. 1990. J. Biol. Chem. 265, 5199
Stack, M.S., and Gray, R.D. 1989. J. Biol. Chem. 264, 4277
【００８６】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
Knight, C.G., et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263
【００８７】
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−
配列番号：２４
Welch, A.R., et al. 1996. Biochemistry35, 10103
Welch, A.R., et al. 1995. Arch. Biochem. Biophys. 324, 59
【００８８】
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２０
Mohan, M.J.  et al. 2002. Biochemistry41, 9462
Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066
Ambrose, W.P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150
【００８９】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−［２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル］−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
配列番号：２２
Weingarten, H.; Feder, J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437
Weingarten, H. et al. 1985. Biochemistry.  24, 6730
【００９０】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：１７
A. Santala, A. et al. 1999. FEBS Lett. 461, 153-156
Shabani, F. et al.1998. Free Radic.Res. 28, 115-123
Nagase, H. et al. 1994 J.Biol.Chem. 269, 20952-20957
【００９１】
−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−
配列番号：５１
Finch-Arietta, M. et al., 1993. Agents Actions 39 SpecNo,C189-C191
Netzel-Arnett, S.  et al. 1991 Anal.Biochem.195, 86-92
【００９２】
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−
配列番号：５２
Finch-Arietta, M. et al., 1993. Agents Actions 39 SpecNo,C189-C191
Bickett, D.M. et al., 1994. Ann.N.Y.Acad.Sci. 732, 351-355
【００９３】
第一の配列Ｓ１および／または第二の配列Ｓ２をＭＭＰ−８酵素の標的とするとき、それらは従って少なくとも１種の以下の配列に対応する：
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：５３
Netzel-Arnett, S., et al. 1991. Anal. Biochem.195, 86
【００９４】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：１６
Grams, F.  et al. 2001. Biol. Chem. 382, 1277
【００９５】
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２０
Mohan, M.J.  et al. 2002. Biochemistry41, 9462
Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066
Ambrose, W.P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150
【００９６】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
Knauper, V. et al. 1996. J. Biol. Chem. 271,1544
【００９７】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−［２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル］−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
配列番号：２２
Weingarten, H.; Feder, J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437
Weingarten, H. et al. 1985. Biochemistry.  24, 6730
【００９８】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：１７
A. Santala, A. et al. 1999. FEBS Lett. 461, 153-156
Shabani, F. et al.1998. Free Radic.Res. 28, 115-123
Nagase, H. et al. 1994 J.Biol.Chem. 269, 20952-20957
【００９９】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：２３
J. Berman et al., 1992. J.Biol.Chem. 267, 1434-1437
【０１００】
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−
配列番号：２４
Kraft, P.J. et al. 2001. Connect.Tissue Res. 42, 149-163
Itoh, M. et al. 1997. J.Pharm.Biomed.Anal. 15, 1417-1426
Welch, A.R. et al. 1995. Arch.Biochem.Biophys. 324, 59-64
【０１０１】
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｎｖａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２５
Lauer-Fields, J.L. and Fields, G.B. 2002 Biol.Chem. 383, 1095-1105
Lauer-Fields, J.L. et al. 2001. Biochemistry 40, 5795-5803
【０１０２】
第一の配列Ｓ１および／または第二の配列Ｓ２をＭＭＰ−９酵素の標的とするとき、それらは従って少なくとも１種の以下の配列に対応する：
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
配列番号：５４
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−
配列番号：５５
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
配列番号：５６
−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−
配列番号：５７
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−
配列番号：５８
−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−
配列番号：１２
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−
配列番号：１４
Deng, S.J., et al. 2000. J. Biol. Chem. 275, 31422
【０１０３】
−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−
配列番号：１５
Beekman, B., et al. 1996. FEBS Lett 390, 221
【０１０４】
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−
配列番号：５０
Beekman, B., et al. 1997. FEBS Lett 418, 305
【０１０５】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：１６
Bickett, D.M., et al. 1993. Anal. Biochem. 212, 58
Knight, C.G., et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263
Darlak, K., et al. 1990. J. Biol. Chem. 265, 5199
Stack, M.S., and Gray, R.D. 1989. J. Biol. Chem. 264, 4277
【０１０６】
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：１９
Bickett, D.M., et al. 1993. Anal. Biochem. 212, 58
【０１０７】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＳＣＨ［ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２］−ＣＯ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
配列番号：３２
Weingarten, H., et al. 1985. Anal. Biochem. 147, 437
Weingarten, H., et al. 1985. Biochemistry 24, 6730
【０１０８】
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−
配列番号：３３
G.D. Johnson and K. Ahn 2000. Anal. Biochem. 286, 112
【０１０９】
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２０
Mohan, M.J.  et al. 2002. Biochemistry41, 9462
Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066
Ambrose, W.P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150
【０１１０】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
Roy, N. et al. 1999. Prot. Expr. Purif. 16, 324
【０１１１】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−［２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル］−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
配列番号：２２
Weingarten, H.; Feder, J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437
Weingarten, H. et al. 1985. Biochemistry.  24, 6730
Xia, T. et al. 1996. Biochim. Biophys. Acta 1293, 259
【０１１２】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：２３
J. Berman et al., 1992. J.Biol.Chem. 267, 1434-1437
【０１１３】
第一の配列Ｓ１および／または第二の配列Ｓ２をＭＭＰ−１０酵素の標的とするとき、それらは従って少なくとも１種の以下の配列に対応する：
−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−
配列番号：１２
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−
配列番号：２８
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
Kannan, R. et al. 1999. Prot. Expr. Purif. 16, 76
【０１１４】
第一の配列Ｓ１および／または第二の配列Ｓ２をＭＭＰ−１１酵素の標的とするとき、それらは従って少なくとも１種の以下の配列に対応する：
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２０
Mohan, M.J.  et al. 2002. Biochemistry41, 9462
Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066
Ambrose, W.P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150
【０１１５】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
Kannan, R. et al. 1999. Prot. Expr. Purif. 16, 76
【０１１６】
第一の配列Ｓ１および／または第二の配列Ｓ２をＭＭＰ−１２酵素の標的とするとき、それらは従って少なくとも１種の以下の配列に対応する：
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２０
Mohan, M.J.  et al. 2002. Biochemistry41, 9462
Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066
Ambrose, W.P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150
【０１１７】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
Park, H.I. et al. 2000. J. Biol. Chem. 275, 20540
【０１１８】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−［２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル］−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
配列番号：２２
Weingarten, H.; Feder, J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437
Weingarten, H. et al. 1985. Biochemistry.  24, 6730
【０１１９】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：１７
A. Santala, A. et al. 1999. FEBS Lett. 461, 153-156
Shabani, F. et al.1998. Free Radic.Res. 28, 115-123
Nagase, H. et al. 1994 J.Biol.Chem. 269, 20952-20957
【０１２０】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：２３
Berman, J. et al., 1992. J.Biol.Chem. 267, 1434-1437
【０１２１】
−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−
配列番号：５１
Finch-Arietta, M. et al., 1993. Agents Actions 39 SpecNo,C189-C191
Netzel-Arnett, S.  et al. 1991 Anal.Biochem.195, 86-92
【０１２２】
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−
配列番号：５２
Finch-Arietta, M. et al., 1993. Agents Actions 39 SpecNo,C189-C191
Bickett, D.M. et al., 1994. Ann.N.Y.Acad.Sci. 732, 351-355
【０１２３】
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−
配列番号：２４
Kraft, P.J. et al. 2001. Connect.Tissue Res. 42, 149-163
Itoh, M. et al. 1997. J.Pharm.Biomed.Anal. 15, 1417-1426
Welch, A.R. et al. 1995. Arch.Biochem.Biophys. 324, 59-64
【０１２４】
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｎｖａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２５
Lauer-Fields, J.L. and Fields, G.B. 2002 Biol.Chem. 383, 1095-1105
Lauer-Fields, J.L. et al. 2001. Biochemistry 40, 5795-5803
【０１２５】
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−
配列番号：２６
Bremer, C. et al.2002. Acad.Radiol. 9 Suppl 2, S314-S315
Nagase, H. et al. 1994. J.Biol.Chem. 269, 20952-20957
【０１２６】
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−
配列番号：５０
Bremer, C. et al.2002. Acad.Radiol. 9 Suppl 2, S314-S315
Nagase, H. et al. 1994. J.Biol.Chem. 269, 20952-20957
【０１２７】
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−
配列番号：５９
Bickett, D.M. et al. 1994. Ann.N.Y.Acad.Sci. 732, 351-355
【０１２８】
第一の配列Ｓ１および／または第二の配列Ｓ２をＭＭＰ−１３酵素の標的とするとき、それらは従って少なくとも１種の以下の配列に対応する：
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−
配列番号：４９
Deng, S.J., et al. 2000. J. Biol. Chem. 275, 31422
【０１２９】
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−
配列番号：５０
Beekman, B., et al. 1997. FEBS Lett 418, 305
【０１３０】
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｎｖａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｄｐａ−
配列番号：２５
Knauper, V., et al. 1996. J. Biol. Chem. 271, 1544
【０１３１】
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２０
Mohan, M.J.  et al. 2002. Biochemistry41, 9462
Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066
Ambrose, W.P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150
【０１３２】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
Knauper, V. et al. 1996. J. Biol. Chem. 271, 1544
【０１３３】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−［２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル］−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
配列番号：２２
Weingarten, H.; Feder, J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437
Weingarten, H. et al. 1985. Biochemistry.  24, 6730
【０１３４】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：１６
Netzel-Arnett, S. et al. 1991. Anal.Biochem.195, 86-92
Santala, A. et al. 1999. FEBS Lett. 461, 153-156
Bickett, D.M. et al., 1993.  Anal.Biochem. 212, 58-64
【０１３５】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：１７
A. Santala, A. et al. 1999. FEBS Lett. 461, 153-156
Shabani, F. et al.1998. Free Radic.Res. 28, 115-123
Nagase, H. et al. 1994 J.Biol.Chem. 269, 20952-20957
【０１３６】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：２３
J. Berman et al., 1992. J.Biol.Chem. 267, 1434-1437
【０１３７】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−
配列番号：３１
Netzel-Arnett, S. et al.1991. Anal.Biochem.195, 86-92
d'Ortho, M.P. et al., 1997. Eur.J.Biochem. 250, 751-757
【０１３８】
−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−
配列番号：５１
Finch-Arietta, M. et al., 1993. Agents Actions 39 SpecNo,C189-C191
Netzel-Arnett, S.  et al. 1991 Anal.Biochem.195, 86-92
【０１３９】
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−
配列番号：５２
Finch-Arietta, M. et al., 1993. Agents Actions 39 SpecNo,C189-C191
Bickett, D.M. et al., 1994. Ann.N.Y.Acad.Sci. 732, 351-355
【０１４０】
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−
配列番号：２４
Kraft, P.J. et al. 2001. Connect.Tissue Res. 42, 149-163
Itoh, M. et al. 1997. J.Pharm.Biomed.Anal. 15, 1417-1426
Welch, A.R. et al. 1995. Arch.Biochem.Biophys. 324, 59-64
【０１４１】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：５３
Aschi, M. et al. 2002. J.Comput.Aided Mol.Des 16, 213-225
Netzel-Arnett, S.  et al. 1991. Anal.Biochem.195, 86-92
【０１４２】
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｎｖａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２５
Lauer-Fields, J.L. and Fields, G.B. 2002 Biol.Chem. 383, 1095-1105
Lauer-Fields, J.L. et al. 2001. Biochemistry 40, 5795-5803
【０１４３】
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−
配列番号：２６
Bremer, C. et al.2002. Acad.Radiol. 9 Suppl 2, S314-S315
Nagase, H. et al. 1994. J.Biol.Chem. 269, 20952-20957
【０１４４】
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−
配列番号：５９
Bickett, D.M. et al. 1994. Ann.N.Y.Acad.Sci. 732, 351-355
【０１４５】
第一の配列Ｓ１および／または第二の配列Ｓ２をＭＭＰ−１４酵素の標的とするとき、それらは従って少なくとも１種の以下の配列に対応する：
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｃｙｓ（ｐ−ＯＭｅＢｚ）−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：６０
Mucha, A., et al. 1998. J. Biol. Chem. 273, 2763
Holtz, B., et al. 1999. Biochemistry 38, 12174
【０１４６】
−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
配列番号：２０
Mohan, M.J.  et al. 2002. Biochemistry41, 9462
Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066
Ambrose, W.P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150
【０１４７】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
Roderfeld, M. et al. 2000 . Prot. Expr. Purif. 19, 369
Kannan, R. et al. 1999. Prot. Expr. Purif. 16, 76
【０１４８】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−［２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル］−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
配列番号：２２
Weingarten, H.; Feder, J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437
Weingarten, H. et al. 1985. Biochemistry.  24, 6730
【０１４９】
第一の配列Ｓ１および／または第二の配列Ｓ２をＭＭＰ−１５酵素の標的とするとき、それらは従って少なくとも１種の以下の配列に対応する：
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
Xue, C.-B.  et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 2636
【０１５０】
第一の配列Ｓ１および／または第二の配列Ｓ２をＭＭＰ−１６酵素の標的とするとき、それらは従って少なくとも１種の以下の配列に対応する：
Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
Shimada, T. et al. 1999. Eur. J. Biochem. 262, 907
Xue, C.-B.  et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 2636
【０１５１】
第一の配列Ｓ１および／または第二の配列Ｓ２をＭＭＰ−１７酵素の標的とするとき、それらは従って少なくとも１種の以下の配列に対応する：
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
English, W.R.  et al. 2001. FEBS Lett. 491, 137
【０１５２】
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−［２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル］−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
配列番号：２２
【０１５３】
第一の配列Ｓ１および／または第二の配列Ｓ２をＭＭＰ−１９酵素の標的とするとき、それらは従って少なくとも１種の以下の配列に対応する：
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
Pendas, A.M. et al. 1997. J. Biol. Chem. 272, 4281
【０１５４】
第一の配列Ｓ１および／または第二の配列Ｓ２をＭＭＰ−２３酵素の標的とするとき、それらは従って少なくとも１種の以下の配列に対応する：
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
Velasco, G. et al. 1999. J. Biol. Chem. 274, 4570
【０１５５】
第一の配列Ｓ１および／または第二の配列Ｓ２をＭＭＰ−２５酵素の標的とするとき、それらは従って少なくとも１種の以下の配列に対応する：
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
配列番号：２１
English, W.R.  et al. 2001. FEBS Lett. 491, 137
【０１５６】
第一の配列Ｓ１および／または第二の配列Ｓ２をＭＭＰ−２６酵素の標的とするとき、それらは従って少なくとも１種の以下の配列に対応する：
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−
配列番号：１６
Park, H.I. et al. 2002. J. Biol. Chem. 277, 35168
【０１５７】
前記に起因するものとして、特定のＭＭＰは数種の配列を認識することが可能であり、それらの配列は本来、正確なメカニズムに従い、一部の病態に関与する異なるタンパク質に属する配列である。
【０１５８】
上記のように、本発明の環状ペプチドは、蛍光受容体基を担持する少なくとも１種のプローブＸ１、および蛍光受容体もしくは非蛍光受容体基を担持する少なくとも１種のプローブＸ２を含んでなる。一般に、これらは供与体基の蛍光発光スペクトルと受容体基の吸収スペクトルとが、少なくとも一部、重なり合うように選択される；このものは励起エネルギーを供与体基から受容体基へ非放射転移（または共鳴エネルギー転移）現象として移動する。
当該基は通常、芳香族核、例えば、ベンゼン、アントラセンまたはクマリン核を含んでなる。
【０１５９】
例として、以下の対合を例示し得る（対合の第一の構成基は供与体基であり、対合の第二の構成基は受容体基である）：
＊トリプトファン／２，４−ジニトロフェニル（略号Ｗ／Ｄｎｐにより記号化）；
＊ｏ−アミノ安息香酸／２，４−ジニトロフェニル（略号Ａｂｚ／Ｄｎｐにより記号化）；
＊（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル／２，４−ジニトロフェニル（略号Ｍｃａ／Ｄｎｐにより記号化）；
＊（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル／Ｎ−３−（２，４−ジニトロフェニル）−Ｌ−２，３−ジアミノプロピル（略号Ｍｃａ／Ｄｐａにより記号化）；
＊トリプトファニル／ダンシル（略号Ｗ／Ｄｎｓにより記号化）；
＊Ｎ−メチルアントラノイル／２，４−ジニトロフェニル（略号Ｎｍａ／Ｄｎｐにより記号化）；
＊６，７−ジメトキシクマリン−４−イル−アセチル／６−Ｎ−（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノヘキサン酸（略号ＤＭＣ／Ｎｂｄにより記号化）；
＊５−（２’−アミノメチル）ナフタレンスルホン酸／４−（４’−ジメチルアミノフェニルアザ）安息香酸（略号ＥＤＡＮＳ／Ｄａｂｃｙｌにより記号化）；
＊７−メトキシクマリン−３−カルボン酸／７−ジエチルアミノ−クマリン−３−カルボン酸（略号ＭＣ／ＤＡＣにより記号化）；当該基は以下の式に一致する：
【０１６０】
【化４】
0005709138.tif 000005
【０１６１】
【化５】
0005709138.tif 000006
【０１６２】
供与体基および受容体基がクマリン核を含んでなる基であると有利である。
これらの基はクマリン型の共通の芳香族単位を有するので、これが疎水型またはπ−スタッキング型の複合体の形成を可能とし、このものは本発明環状ペプチドの安定性において役割をもつ。
特に好適な対合はＭＣ／ＤＡＣ対合であり、このものは一旦プローブに結合すると以下の式をもつ：
【０１６３】
【化６】
0005709138.tif 000007
【０１６４】
Ｘ１およびＸ２プローブはアミノ酸残基であり得る。
従って、Ｘ１プローブの一例は、以下の式を有する−Ｌｙｓ（ＭＣ）−プローブであってもよい：
【０１６５】
【化７】
0005709138.tif 000008
【０１６６】
一方、Ｘ２プローブの例は以下の式を有する−Ｌｙｓ（ＤＡＣ）−プローブであってもよい：
【０１６７】
【化８】
0005709138.tif 000009
【０１６８】
Ｓ１およびＳ２は、上記定義のようなＭＭＰの標的配列、とりわけ以下の配列に対応し得る：
-Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−
または
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
これらの配列はそれぞれＭＭＰ−１酵素およびＭＭＰ−９酵素が認識する配列に対応するものである。
【０１６９】
本発明の環状ペプチドは以下の式を有する環状ペプチドであってもよい：
【０１７０】
【化９】
0005709138.tif 000010
【０１７１】
（Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、ＹおよびＲ２は上記定義と同じ定義に一致する）
本発明に適合する具体的な環状ペプチドは以下の式に一致する：
【０１７２】
【化１０】
0005709138.tif 000011
【０１７３】
（基−Ｌｙｓ（ＤＡＣ）−および−Ｌｙｓ（ＭＣ）−は上記定義と同じ定義に一致する）
太字の配列はＭＭＰ１酵素の存在下に切断され、それによってＬｙｓ（ＤＡＣ）プローブとＬｙｓ（ＭＣ）プローブの距離を互いに離すことに寄与する。それが共鳴移動の変化につながり、それによってＭＭＰ１酵素の活性の定量を可能とする。
【０１７４】
本発明の環状ペプチドは、ペンダント機能（リジンまたはアスパラギン酸残基に由来するアミン官能基など）を介して、粒子などの担体に固定されるに至る。
【０１７５】
本発明の環状ペプチドは、常套のプロセスを用いる固相上の自動合成工程からなり、次いで、固相から該ペプチドを脱離した後、またはその後にそれを固相から脱離させ、線状ペプチドの末端をカップリング結合させることからなる方法により調製し得る。
【０１７６】
固相とは、通常、−ＮＨ２または−ＣＯＯＨ官能基と反応して共有結合を形成し得る基を担持する樹脂であり、この共有結合は一旦合成したペプチドを切断・脱離するように企図したものである。
【０１７７】
当該樹脂は以下の式の基をそれぞれ担持するトリチル、２−クロロ  クロロ  トリチル樹脂であってもよい：
【０１７８】
【化１１】
0005709138.tif 000012
【０１７９】
（中括弧はその部分を介して上記の基が樹脂に結合する部分を示す）
第一の実施態様によると、本発明方法は：
ａ）固相上の化学合成により線状ペプチドを調製するための調製工程；
ｂ）固相から線状ペプチドを脱離する脱離工程；および
ｃ）該線状ペプチドの末端をカップル結合させて環状ペプチドを形成するカップリング工程；
からなることを特徴とする。
【０１８０】
第二の実施態様によると、本発明方法は：
ａ）固相上の化学合成により線状ペプチドを調製するための調製工程；
ｂ）該線状ペプチドの遊離の末端と該線状ペプチドの線状残基の末端官能基とをカップル結合させるカップリング工程；および
ｃ）環状ペプチドを固相から脱離するための脱離工程であって、工程ｂ）およびｃ）を付随して実施し得る脱離工程；
からなることを特徴とする。
【０１８１】
第一の実施態様または第二の実施態様についても、工程ａ）を実施する場合、その第一相は固相に第一のアミノ酸を固定化することからる。
本固定化は幾つかの方法で実施し得る：
−  第一アミノ酸のＣ−末端を介して固相上に固定化；
−  第一アミノ酸の側鎖を介して固相上に固定化；
−  第一アミノ酸の主鎖を介して固相上に固定化。
【０１８２】
第一の型の固定化の場合、一旦ペプチドを合成すると、ペプチドにおける脱保護されたＮ−末端官能基は、樹脂上から脱離した、またはなお固定化したままのカルボキシル官能基上で、求核付加メカニズムにより反応する。カルボキシル官能基がまだ樹脂上に固定化されたままである場合、求核付加反応（分子内付加である）は環化と樹脂からのペプチドの脱離を一緒に生じる。
【０１８３】
アミノ酸の側鎖を介して起こる固定化の第二の型は、一般に、以下のアミノ酸で行う：アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸エステル、リジン、ヒスチジン、セリン、トレオニン、アルギニンおよびチロシン；これらは樹脂が担持する反応性基と反応し得る−ＣＯ２Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２またはＮＨ２ＣＯなどの官能基を担持する側鎖を有する。
【０１８４】
樹脂上の主鎖の固定化に基づく第三の方法の場合、合成されたペプチドは主鎖のアミド結合の窒素原子の１つにより樹脂に結合される。
当業者は所望の配列を合成するために、明らかに、適切な保護基を使用するであろう。
【０１８５】
上記のように、本発明の環状ペプチドは、プロテアーゼ酵素Ｅの活性をモニターするために使用することを企図する。
より正確には、本発明の環状ペプチドの使用は、幾つかの様式で想定し得る：
−  それらは酵素活性と認知された病態との間に限定的な相関関係を与える；
−  それらは、酵素活性と認知された病態の間の相関関係が既知であるならば、生物サンプル中に存在する酵素をアッセイすることにより、病態を診断するために使用することができる。
【０１８６】
それらは、その活性を評価したいと所望する酵素を含んでなる液体のインビトロ分析を実施するために、特に使用することができる。
それらはまた、Ｘ１／Ｘ２対合が赤色で発光する場合、特にインビボでの使用に供される。
【０１８７】
従って、本発明は、本発明に適合する少なくとも１種の環状ペプチドを含んでなる即時使用試薬；および
−  本発明に適合する少なくとも１種の環状ペプチドを含んでなる第一区分；および
−  緩衝液を含んでなる第二区分；
を含んでなるキットに関する。
【０１８８】
このキットは保存液の調製を企図するものであり、この保存液を、活性を測定しようとするプロテアーゼ酵素と接触させる。該プロテアーゼ酵素は、生物液中に含まれていてもよい。
その名称が示唆するように、緩衝液は溶液のｐＨを一定に維持することを企図するものであり、引き続く酵素活性の測定に影響しかねないｐＨの過度な酸性への、または過度な塩基性への変化を起こさないようにする。
最終的に、本発明は、少なくとも１種のプロテアーゼ酵素の活性をインビトロで測定するための、本発明による少なくとも１種の環状ペプチドの使用に関する。
【０１８９】
本発明のその他の特徴と有益性は、説明のために示した、限定するものではない以下の実施例を読み解くことにより明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１】図１は実施例に従い調製した環状ペプチドの蛍光強度ΔIF 供与体（ａ．ｕ．）の変化を時間ｔ（分）の関数として示すグラフである；この環状ペプチドはＭＭＰ−１溶液（１ｎＭ）の存在下に９０μＭの濃度とする。
【図２】図２は、調製した環状ペプチドの初期加水分解速度の逆数（１／ｖｉ）（ａ．ｕ．−１．ｓ）をその濃度の逆数（１／［Ｓ］）（μＭ−１）の関数として示す二重逆数プロットである。
【発明を実施するための形態】
【０１９１】
以下の実施例は、それぞれＭＭＰ１標的配列に対応する２つのペプチド配列Ｓ１およびＳ２を含んでなる本発明による環状ペプチドの製造について説明するものである；この配列は以下の：−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−である。
【０１９２】
この環状ペプチドの製造は以下の工程からなる：
ａ）その側鎖を介して樹脂上に接合することを企図する出発アミノ酸の合成工程：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−Ｏ−アリル；
ｂ）当該出発アミノ酸を樹脂に接合する工程；
ｃ）接合した樹脂上で２種のペプチド配列を合成する工程；
ｄ）環化工程。
【０１９３】
これら工程の詳細を以下に説明する。
以下に示すプロトコールにおいては、以下の略号を使用する：
ＡＣＮ：アセトニトリル；  Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル；  ＤＡＣ：７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸；  ＤＣＭ：ジクロロメタン；  ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルジエチルアミン；  ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；  ＥＳＭＳ：エレクトロスプレー質量分析法；  Ｅｔ２Ｏ：ジイソプロピルエーテル；  Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル；  ＨＢＴＵ：ヘキサ−フルオロリン酸Ｎ−［１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル］ジメチルアミノ）メチレン）−Ｎ−メチルメタナミニウムＮ−オキシド；  ＨＯＢｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール；  ＭＣ：７−メトキシクマリン−３−カルボン酸；  ＡＭＰＡ：４−アミノフェニル水銀酢酸塩；  ＰｙＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリドノホスホニウム；  ＴＡ：外界温度；  ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸；  ＴＨＦ：テトラヒドロフラン；  ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン；  ＴＲＩＳ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン。
【０１９４】
化学製品および溶媒はすべて分析精度のものであり、シグマ社から購入した。２−クロロ  クロロトリチル樹脂、ＰｙＢＯＰおよびすべてのアミノ酸（ＦｍｏｃにてＮα−保護）はアドバンスドケムテック（Advanced Chemtech）から購入した。
【０１９５】
化学反応はすべてＮ２下に無水溶媒を用いて実施した。ＤＭＦは還流下にＣａＨ２にて一夜乾燥し、蒸留する。ＤＣＭは使用前に蒸留した。
【０１９６】
ＵＶ／可視スペクトルは日立分光光度計装置モデルＵ−２０１０で記録した。蛍光スペクトルはＰＴＩおよびジョビン−イボン（Jobin-Yvon）ＪＹ３分光蛍光光度計装置で実施し、サンプルホルダーは３７℃の恒温とした。固相でのペプチド合成はアップライドバイオシステム４３３Ａシンセサイザーにて実施した。精製は逆相島津ＨＰＬＣ（コントローラー：ＳＬＣ−１０ＡＶＰ；  ポンプ：ＬＣ８Ａ；  ＵＶ／可視検出器：ＳＰＤ−１０ＡＶＰ［波長：２１４、２６７および２５４ｎｍ］およびＣ１８サティスファクションカラムＲＰ１８ＡＢ  ５μｍ  ２５０×４．６ｍｍ）にて実施した。溶出に使用した溶媒系は、（Ａ）０．１％ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）７０％ＡＣＮ水溶液であった。
【実施例】
【０１９７】
ａ）Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−Ｏ−アリルの合成
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−Ｏ−アリルは下記式に一致する：
【０１９８】
【化１２】
0005709138.tif 000013
【０１９９】
このものは以下の反応工程図に従い調製する：
【０２００】
【化１３】
0005709138.tif 000014
【０２０１】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（２ｇ、４．３ｍｍｏｌ）および臭化アリル（１０ｍＬ、１１８．２ｍｍｏｌ）の溶液に、１．４５ｍＬのＤＩＥＡ（８．５ｍｍｏｌ）を加える。８０℃にて３．５時間攪拌した後、この溶液を２００ｍＬの酢酸エチルで希釈し、次いで、０．１Ｎ−ＨＣｌ（３×１００ｍＬ）、１０％ＮａＨＣＯ３（３×１００ｍＬ）およびＮａＣｌ飽和溶液（３×１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥する。減圧下に蒸発させた後、１．９ｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｏ−アリル（３．８７ｍｍｏｌ、９０％）を白色粉末の形状で得る。
【０２０２】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｏ−アリル（１．９ｇ、３．８７ｍｍｏｌ）をＴＦＡ／ＤＣＭ混合物（７０ｍＬ、１：１）に溶解する。この溶液を外界温度で３時間攪拌する。この溶液を濃縮した後、エーテルで洗い、引き続き蒸発させて、１．４５ｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−Ｏ−アリル（３．５６ｍｍｏｌ、９２％）を白色粉末の形状で回収する。
【０２０３】
ｂ）Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｏ−アリルの樹脂への接合、およびＬｙｓ（ＭＣ）プローブの接合
反応工程図は以下のとおりである：
【０２０４】
【化１４】
0005709138.tif 000015
【０２０５】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｏ−アリル（１．８１ｇ、４．４３ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（７３４μＬ、４．２３ｍｍｏｌ）を加える。外界温度で１０分間攪拌した後、５７０ｍｇの２−クロロトリチル樹脂を加える。この混合物を外界温度で５時間混合する。次いで、樹脂を濾取し、ＤＭＦ（２０ｍＬ）、ＤＣＭ／メタノール／ＤＩＥＡ混合物（１７：２：１）（２×２０ｍＬ）、ＤＭＦ（１０ｍＬ）およびＤＣＭ（２０ｍＬ）で洗浄する。この新たな樹脂の置換率は、ピペリジンで処理した後、ジベンゾフルベン複合体のＵＶ測定を介して０．４ｍｍｏｌ／ｇと判定した。最初に、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−Ｏ−アリル−クロロトリチル樹脂（３００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ／ｇ）を、２０％ピペリジン／ＤＭＦ混合物と外界温度で３時間接触させることによって、当該樹脂からＦｍｏｃ基を脱離させて脱保護した。遊離一級アミンの存在をカイザーテストにより証明した。この樹脂を、ＤＭＦ（５ｍＬ）中、ＰｙＢＯＰ（１７３ｍｇ、０．３９２ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（５４ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１００μＬ、０．８ｍｍｏｌ）の存在下、外界温度で６時間、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＭＣ）−ＯＨ（２２８ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ／ｇ）と反応させる。次いで、この樹脂を濾取し、ＤＭＦ、ＤＣＭおよびメタノールで洗浄する。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＭＣ）−Ｌｙｓ−Ｏ−アリル−クロロトリチル樹脂（２７０ｍｇ）を回収する。この新たな樹脂の置換率は、ピペリジンで処理した後、ジベンゾフルベン複合体のＵＶ測定により０．３８ｍｍｏｌ／ｇと判定した。反応しなかったアミン官能基は、ＤＭＦ（５ｍＬ）中、酢酸スクシミニドエステル（２５．１２ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、ピペリジン（１２ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の存在下に、外界温度で４０分間アセチル化した。
【０２０６】
ｃ）ペプチド合成
反応工程図は以下のとおりである：
【０２０７】
【化１５】
0005709138.tif 000016
【０２０８】
（記号Ｇ、Ｐ、Ｑ、ＬおよびＡはそれぞれアミノ酸のグリシン、プロリン、グルタミン、ロイシン、アラニンに相当する）
【０２０９】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＭＣ）−Ｌｙｓ−Ｏ−アリル−クロロトリチル樹脂をシンセサイザー反応機に加える。Ｆｍｏｃ基によりＮα−保護したアミノ酸（Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、ＬｅｕおよびＡｌａ）を過剰（１０倍）に加える。カップリング工程をＨＢＴＵ、ＨＯＢｔおよびＤＩＥＡの存在下に実施し、その後、以下のペプチドＧＰＱＧＬＬＧＡ−（ＡはＬｙｓ（ＭＣ）に結合）を得る。１８時間後、樹脂に結合したペプチド（３７０ｍｇ）を得る。
【０２１０】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＤＡＣ）−ＯＨ（１９０ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を、シンセサイザー反応機外部にて、ＤＭＦ（５ｍＬ）中、ＰｙＢＯＰ（１５３ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（４０．５３ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（９９．１μＬ、０．６ｍｍｏｌ）の存在下、外界温度で５時間、樹脂上のペプチドとカップル結合させる。次いで、樹脂を濾取し、前記のように洗浄する。４０１ｍｇを取得する。置換率は０．２５ｍｍｏｌ／ｇと評価する。反応しなかったアミン官能基は上記と同じ手順でアセチル化する。
【０２１１】
樹脂上のペプチドを再び自動ペプチドシンセサイザー反応機に入れ、前記と同じアミノ酸配列を最初の工程に従って合成する。５３０ｍｇを回収する。
【０２１２】
ｄ）環化反応
この樹脂を高真空下に４時間乾燥し、次いでアルゴン下に置いた。Ｐｄ（Ｐ（Ｐｈ３））４（３４６．６ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）をアルゴン気流下にてクロロホルム／酢酸／Ｎ−メチルモルホリン混合物（３７：２：１、８ｍＬ）に溶解する。次いで、この溶液を樹脂と接触させ、得られた混合物を外界温度で２時間、時折攪拌する。次いで、樹脂を濾取し、０．５％ＤＩＥＡ／ＤＭＦ溶液（２×１０ｍＬ）で、次いで、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム／ＤＭＦ溶液（０．５％ｗ／ｗ）で洗い、触媒を除去する。
【０２１３】
Ｆｍｏｃを切断した後、樹脂を１Ｍ−ＨＯＢｔ／ＤＭＦにて洗浄する。Ｎ末端およびＣ末端間の環化反応を実施するために、２６０ｍｇのＰｙＢＯＰ（０．５ｍｍｏｌ）、６９ｍｇのＨＯＢｔ（０．５１ｍｍｏｌ）および１８０μＬのＤＩＥＡ（１ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのＮ−メチルピロリドンに加える。この溶液を外界温度で４８時間攪拌し、その後、樹脂を３０ｍＬのＤＭＦ、ＤＣＭおよびメタノールで洗浄する。
【０２１４】
次いで、この樹脂をＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ溶液（９５：２．５：２．５）に懸濁する。室温３時間後、樹脂を濾取し、ＴＦＡ（２×１ｍＬ）およびＤＣＭ（１０ｍＬ）で洗浄する。濾液を一部減圧下に蒸発させ、次いで、冷エーテルに浸漬する。
【０２１５】
−２０℃で１２時間後、沈殿を濾取し、洗浄して１７０ｍｇの粗生成物を得る。準分取ＨＰＬＣ精製の後、９２．１ｍｇのペプチドを得た。このペプチドの構造をＥＳＭＳで証明した。
本実施例で得られた環状ペプチドは以下の式に一致する：
【０２１６】
【化１６】
0005709138.tif 000017
【０２１７】
酵素アッセイは、０．１Ｍ−ＴＲＩＳ、０．１Ｍ−ＮａＣｌおよび１０ｍＭ−ＣａＣｌ２を含有するｐＨ７．６の緩衝液中で実施した。２５μＬの市販ＭＭＰ−９（９０％チモーゲン形状）を緩衝液中、３７℃、４時間、１ｍＭ−ＡＭＰＡ溶液で活性化する。市販のＭＭＰ−１はすでに活性化した形状にある。上記のプロトコールに従い調製した環状ペプチドの保存液を、上記定義のような緩衝液により調製し、最終濃度９０μＭとする。最終濃度９０μＭの溶液を出発溶液として用い、異なる希釈を実施して、１０、５、１および０．５μＭの４段階の環状ペプチド／緩衝液とする。
【０２１８】
アッセイはすべて２ｍＬの最終反応容量中、１ｎＭ活性ＭＭＰ−１または２ｎＭ−ＡＭＰＡ−活性化ＭＭＰ−９で実施する。
【０２１９】
酵素を添加した後、初期加水分解速度を、４０３ｎｍで（３４０ｎｍの励起波長で）の蛍光強度の経時的変化により測定する。アッセイしたペプチド濃度の各濃度について、図１に示すように、時間ｔ（分）の関数として供与体基ΔＩＦ（ａ．ｕ．）の蛍光強度の変化を表す曲線をプロットした（環状ペプチド濃度、１０、５、１および０．５μＭ）。
【０２２０】
以下の等式：
蛍光（ｔ）＝蛍光ｍａｘ（１−ｅｘｐ（−ｋｏｂｓｔ））
から、一次定数を決定することができた。二次定数（特異的定数と呼称）ｋｃａｔ／ＫＭの計算は、等式ｋｃａｔ／Ｋｍ＝ｋｏｂｓ／［Ｅ０］に関して使用される活性酵素Ｅの濃度により得られる。該ペプチドのｋｃａｔ／Ｋｍは、文献に記載されたＭＭＰ−１の最良の基質と比較して、３１９１２０ｓ−１・Ｍ−１という非常に高い値で評価する；この値はＭＭＰ−１について、本発明に従い調製した環状ペプチドの非常に高い特異性を証明するものである。
【０２２１】
異なるアッセイ法の初期速度を用いることによる、図２に示した二重逆数グラフ（１／Ｖｉ）＝ｆ（１／［環状ペプチド］）は、合計３．８μＭとなる環状ペプチドのＫｍの決定を可能とした。この値は文献に記載された最良のＭＭＰ−１基質で得られる値よりも低いが、ＭＭＰ−１に対して本発明に従い調製した環状ペプチドの優れた親和性を証明するものである。
【０２２２】
また、本発明の環状ペプチドについては、２ｎＭの活性ＭＭＰ−９の存在下でもアッセイした。供与体基の蛍光強度には、経時的変化が測定できなかった。従って、この環状ペプチドはＭＭＰ−９の基質ではなく、この環状ペプチドの選択性を示している。また、この環状ペプチドはＭＭＰ−１に対して非常に高い選択性と強力な親和性を示す。
【図１】
0005709138.tif 000023
【図２】
0005709138.tif 000024
【配列表】
0005709138000001.app