(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化合物。
【化１】
0005706686.tif 000054
【請求項２】
下の工程を含む請求項１の化合物を製造する方法。
【化２】
0005706686.tif 000055
【請求項３】
下記化合物。
【化３】
0005706686.tif 000056
【請求項４】
下の工程を含む請求項３の化合物を製造する方法。
【化４】
0005706686.tif 000057
【請求項５】
下記反応性化合物。
【化５】
0005706686.tif 000058
（式中、
Ｘ−は対イオンであり；
Ｘ１は−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｘ２は−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｌは１〜８個の炭素原子を有する低級アルキレンであり；および
Ｚはメタクリロイル−またはアクリロイル−である。）
【請求項６】
請求項５に記載の下記化合物。
【化６】
0005706686.tif 000059
【請求項７】
下の工程を含む請求項６の化合物を製造する方法。
【化７】
0005706686.tif 000060
【請求項８】
下記化合物。
【化８】
0005706686.tif 000061
（式中、
Ｚは、メタクリルアミド−またはアクリルアミド−であり；
Ｙは、
【化９】
0005706686.tif 000062
（式中、ＲはＨまたは低級アルキルである。）
および
【化１０】
0005706686.tif 000063
から選択される３価の連結基であり；
Ｘ１およびＸ２は−Ｏ−または−ＮＨ−であり；および
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は独立して直接結合、または、末端がアミド−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−でもよい１〜８個の炭素原子を有する低級アルキレンより選択される。）
【請求項９】
下記化合物。
【化１１】
0005706686.tif 000064
（式中、ｎは１〜１０の整数である。）
【請求項１０】
下の工程を含む請求項９の化合物であってｎが４である化合物を製造する方法。
【化１２】
0005706686.tif 000065
【請求項１１】
下記化合物。
【化１３】
0005706686.tif 000066
（式中、
Ｘ−は対イオンであり；
Ｘ１は−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｘ２は−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｌは１〜８個の炭素原子を有する低級アルキレンであり；
Ｚは、
【化１４】
0005706686.tif 000067
（式中、ＲはＨまたはＣＨ３である）
であり；
中心のベンゼン環からの結合は、隣接するピリジニウム環上のオルト、メタまたはパラ位であり；および
−Ｂ（ＯＨ）２は、オルト、メタまたはパラ位でよい。）
【請求項１２】
請求項１１に記載の下記化合物。
【化１５】
0005706686.tif 000068
【請求項１３】
下の工程を含む請求項１２の化合物を製造する方法。
【化１６】
0005706686.tif 000069
【請求項１４】
下記化合物。
【化１７】
0005706686.tif 000070
（式中、
Ｘ−は対イオンであり；
Ｘ１は−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｘ２は−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｌは１〜８個の炭素原子を有する低級アルキレンであり；
Ｚは、メタクリロイル−またはアクリロイル−であり、
曖昧に表現されている結合は、オルト、メタまたはパラ位であり；および
−Ｂ（ＯＨ）２は、オルト、メタまたはパラ位でよい。）
【請求項１５】
請求項１４に記載の下記化合物。
【化１８】
0005706686.tif 000071
【請求項１６】
下の工程を含む請求項１５の化合物を製造する方法。
【化１９】
0005706686.tif 000072
【請求項１７】
請求項１、３、６、９、１２および１５のいずれか一項に記載の１種類以上の化合物と、蛍光染料とを含むグルコースセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００７年５月１日付け出願の米国仮出願第６０／９１５，３７２号の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一般に、ポリヒドロキシル−置換有機分子の検出、特に、蛍光染料の消光体としてボロン酸で機能化されたピリジニウム塩を使用することに関する。
【背景技術】
【０００３】
研究者らは、ポルフィリン環に結合されたＮ−ベンジル−２−ボロン酸ピリジニウム基により蛍光色素体を作製してきた（Ａｒｉｍｏｒｉ、Ｓ．ら  １９９６年  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １１８巻：２４５〜２４６頁（非特許文献１））。それらは、分子間のエステル形成を介して、サッカリド基で置換されたもう一つのポルフィリンとの凝集を促進するために使用された。また、置換ポルフィリンにおけるピリジン窒素上のベンジル−２−およびベンジル−４−ボロン酸置換基も記載された（Ａｒｉｍｏｒｉら  １９９６年  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２５巻：７７頁（非特許文献２））。それらは、糖におけるキラルの向きを区別するために使用された。これらのポルフィリンおよびアントラキノンジスルホン酸塩の間で錯体を形成することで、蛍光が減衰することが示された。ボロン酸をフルクトースと反応することで錯体は解離し、結果として蛍光が増加した。この場合、消光体部分構造は、アントラキノン構成成分であった（Ａｒｉｍｏｒｉら  １９９５年  Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ、Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ  ９巻：９６１〜９６２頁（非特許文献３））。引き続いて、研究者らは、その構造においてベンジル−２−ボロン酸基で窒素上が置換されているピリジン環を有する染料を記載した（Ｔａｋｅｕｃｈｉら、１９９６年  Ｂｕｌｌ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ（Ｊｐｎ）６９巻：２６１３〜２６１８頁（非特許文献４））。オルト位のピリジニウム基によってボロン酸のジオールとの反応性が増加することが述べられた。この染料は、ヌクレオチドを検出するために使用された。トリアルキルアンモニウム置換ベンジル−２−ボロン酸に関する論文において、置換基がＲ基（即ち、アルキル）として特定され、パラ置換されたピリジンのＮ−ベンジル−２−ボロン酸誘導体に対する一般式が与えられた（Ｔａｋｅｕｃｈｉら  １９９６年  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５２巻：１２９３１〜１２９４０頁（非特許文献５））。
【０００４】
ボロン酸置換基を有していないピリジニウム塩が、消光の研究における参照化合物として使用された（Ｃｏｒｄｅｓら  ２００５年  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２１巻：６５４０〜６５４７頁（非特許文献６））。他の研究者らは、Ｎ−ベンジルボロン酸ピリジニウム塩の３種類の異性体の蛍光消光活性およびグルコース応答を測定した。これらの化合物はピラニンの蛍光消光に劣り、グルコース応答を与えなかった（例えば、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｗｉｔｈ  ａｒｙｌｂｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｖｉｏｌｏｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄ  ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｃａｐｐｕｃｃｉｏ、Ｆｒａｎｋ  Ｅ．博士論文；カリフォルニア大学、サンタクルーズ、２００４年（非特許文献７）参照）。
【０００５】
メチルビオロゲン（ＭＶ）および一連の４−置換Ｎ−メチルピリジニウムによるＲｕ（ｂｐｙ）３の消光について比較研究が報告された（ＪｏｎｅｓおよびＭａｌｂａ  １９８５年  Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ５０巻：５７７６〜５７８２頁（非特許文献８））。この研究により、環に共役している電子求引基で４位が置換されているピリジニウムはＭＶと同様に挙動することが示された。これらの化合物は同様のポテンシャルにおいて可逆的な減衰を示し、同一範囲のシュテルン−フォルマー定数を有していた。
【０００６】
アルキルピリジニウム界面活性剤が蛍光消光体として広く研究されてきた。成功裏に消光した蛍光色素体としては、多環式芳香族炭化水素（Ｐａｎｄｅｙら  １９９９年  Ｔａｌａｎｔａ  ４８巻：１１０３〜１１１０頁（非特許文献９）；Ｐａｌｉｔら  １９９７年  Ｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓ  Ｌｅｔｔ  ２６９巻：２８６〜２９２頁（非特許文献１０）；ＷａｄｅｋおよびＴｕｃｋｅｒ  ２０００年  Ｔａｌａｎｔａ  ５３巻：５７１〜５７８頁（非特許文献１１）；Ｍａｏら  ２００３年  Ｊ  Ｓｅｐ  Ｓｃｉ  ２６巻：１６４３〜１６４９頁（非特許文献１２））、アミノフルオレン（Ｓａｈａら  １９９９年  Ｊ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ  Ａ  １２１巻：１９１〜１９８頁（非特許文献１３））およびポリマー上のカルバゾール置換基（Ｙａｔｓｕｅら  １９９２年  Ｊ  Ｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  ９６巻：１０１２５〜１０１２９頁（非特許文献１４））が挙げられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｒｉｍｏｒｉ、Ｓ．ら  １９９６年  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １１８巻：２４５〜２４６頁
【非特許文献２】Ａｒｉｍｏｒｉら  １９９６年  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２５巻：７７頁
【非特許文献３】Ａｒｉｍｏｒｉら  １９９５年  Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ、Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ  ９巻：９６１〜９６２頁
【非特許文献４】Ｔａｋｅｕｃｈｉら、１９９６年  Ｂｕｌｌ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ（Ｊｐｎ）６９巻：２６１３〜２６１８頁
【非特許文献５】Ｔａｋｅｕｃｈｉら  １９９６年  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５２巻：１２９３１〜１２９４０頁
【非特許文献６】Ｃｏｒｄｅｓら  ２００５年  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２１巻：６５４０〜６５４７頁
【非特許文献７】「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｗｉｔｈ  ａｒｙｌｂｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｖｉｏｌｏｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄ  ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｃａｐｐｕｃｃｉｏ、Ｆｒａｎｋ  Ｅ．博士論文；カリフォルニア大学、サンタクルーズ、２００４年
【非特許文献８】ＪｏｎｅｓおよびＭａｌｂａ  １９８５年  Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ５０巻：５７７６〜５７８２頁
【非特許文献９】Ｐａｎｄｅｙら  １９９９年  Ｔａｌａｎｔａ  ４８巻：１１０３〜１１１０頁
【非特許文献１０】Ｐａｌｉｔら  １９９７年  Ｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓ  Ｌｅｔｔ  ２６９巻：２８６〜２９２頁
【非特許文献１１】ＷａｄｅｋおよびＴｕｃｋｅｒ  ２０００年  Ｔａｌａｎｔａ  ５３巻：５７１〜５７８頁
【非特許文献１２】Ｍａｏら  ２００３年  Ｊ  Ｓｅｐ  Ｓｃｉ  ２６巻：１６４３〜１６４９頁
【非特許文献１３】Ｓａｈａら  １９９９年  Ｊ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ  Ａ  １２１巻：１９１〜１９８頁
【非特許文献１４】Ｙａｔｓｕｅら  １９９２年  Ｊ  Ｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  ９６巻：１０１２５〜１０１２９頁
【非特許文献１５】Ｐａｎｄａら  １９９８年  Ｊ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏ  Ａ  １１３巻：７３〜８０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
殆どの研究が単純なＮ−アルキルピリジニウム塩についてであり、アルキル基は塩の表面を活性にするのに十分大きいものであった。ポリマーの研究は、４−アセチルピリジン、イソニコチン酸メチルおよびイソニコチンアミドの誘導体を含むパラ−置換Ｎ−アルキルピリジニウムで行われた。環置換ピリジニウムでの他の研究においては、ナフトールの蛍光を消光するために、Ｎ，Ｎ’−アルキレン架橋基を有するビス−ピコリニウム塩が使用された。そのビス化合物の消光効率は対照であるモノ−ピコリニウムの消光効率より実質的に高く；メチレン結合体を有する化合物にとっては最高であった（Ｐａｎｄａら  １９９８年  Ｊ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏ  Ａ  １１３巻：７３〜８０頁（非特許文献１５）。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の好ましい実施形態に従い、下の構造（Ｔ−１）を有するターピリジニウム消光体が開示される。
【００１０】
【化１】
0005706686.tif 000002
下の工程を含む本発明のもう一つの実施形態に従い、Ｔ−１の製造方法が開示される。
【００１１】
【化２】
0005706686.tif 000003
本発明の好ましい実施形態に従い、下の構造（Ｔ−２）を有するターピリジニウム消光体が開示される。
【００１２】
【化３】
0005706686.tif 000004
下の工程を含む本発明のもう一つの実施形態に従い、Ｔ−２の製造方法が開示される。
【００１３】
【化４】
0005706686.tif 000005
本発明の好ましい実施形態に従い、下に示す通りの一般構造を有するピリジニウム消光体が開示される。
【００１４】
Ａ．＜反応性化合物＞
【００１５】
【化５】
0005706686.tif 000006
式中、
Ｘ−は対イオンであり；
Ｘ１は−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｘ２は−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｌは直接結合または１〜８個の炭素原子を有する低級アルキレンより選択される２価の結合基であり、末端または途中がスルホンアミド（−ＳＯ２ＮＨ−）、アミド−（Ｃ＝Ｏ）Ｎ−、エステル−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、エーテル−Ｏ−、スルフィド−Ｓ−、スルホン（−ＳＯ２−）、フェニレン−Ｃ６Ｈ４−、ウレタン−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、ウレア−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、チオウレア−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ−、アミド−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、アミン−ＮＲ−（式中、Ｒは１〜６個の炭素原子を有するアルキルと定義される）より選択される１個以上の２価の連結基でもよく；
Ｚは、メタクリルアミド−、アクリルアミド−、メタクリロイル−、アクリロイル−またはスチリル−より選択されるが限定されない重合性でエチレン的に不飽和の基であるか、または、Ｚはポリマーまたはマトリクスと共有結合を形成できる反応性官能基でもよいかのいずれかである。その様な基としては、限定することなく、−Ｂｒ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ２Ｈおよび−ＮＨ２が挙げられる。ある実施形態において、Ｚは、
【００１６】
【化６】
0005706686.tif 000007
（式中、ＲはＨまたはＣＨ３である。）
であり；
【００１７】
【化７】
0005706686.tif 000008
は、メタまたはパラ位でピリジニウム環上に置換されており；および
−Ｂ（ＯＨ）２は、オルト、メタまたはパラ位でよい。
【００１８】
Ｂ．＜非反応性化合物＞
【００１９】
【化８】
0005706686.tif 000009
式中、
Ｘは−Ｏ−または−ＮＨ−であり；および
Ｒ’はアルキルであり、炭素鎖中に−Ｏ−単位を含んでいてもよく、末端が−ＯＨまたは−ＯＣＨ３でもよい。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態に従い、下の構造（Ｐ−１）を有するピリジニウム消光体が開示される。
【００２１】
【化９】
0005706686.tif 000010
下の工程を含む本発明のもう一つの実施形態に従い、Ｐ−１の製造方法が開示される。
【００２２】
【化１０】
0005706686.tif 000011
本発明の好ましい実施形態に従い、下の一般構造を有するピリジニウム消光体が開示される。
【００２３】
【化１１】
0005706686.tif 000012
式中、
Ｚは、メタクリルアミド−、アクリルアミド−、メタクリロイル−、アクリロイル−またはスチリル−より選択されるが限定されない、反応性でエチレン的に不飽和の基であるか、または、Ｚはポリマーまたはマトリクスと共有結合を形成できる反応性官能基でよい。その様な基としては、限定することなく、−Ｂｒ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ２Ｈおよび−ＮＨ２が挙げられる。ある実施形態において、Ｚは、
【００２４】
【化１２】
0005706686.tif 000013
（式中、ＲはＨまたはＣＨ３である。）
であり；
Ｙは、
【００２５】
【化１３】
0005706686.tif 000014
（式中、ＲはＨまたは低級アルキルである。）
および
【００２６】
【化１４】
0005706686.tif 000015
より選択される３価の連結基であり；
Ｘ１およびＸ２は−Ｏ−または−ＮＨ−であり；および
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は直接結合または１〜８個の炭素原子を有する低級アルキレンより選択され、末端または途中がスルホンアミド（−ＳＯ２ＮＨ−）、アミド−（Ｃ＝Ｏ）Ｎ−、エステル−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、エーテル−Ｏ−、スルフィド−Ｓ−、スルホン（−ＳＯ２−）、フェニレン−Ｃ６Ｈ４−、ウレタン−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、ウレア−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、チオウレア−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ−、アミド−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、アミン−ＮＲ−（式中、Ｒは１〜６個の炭素原子を有するアルキルと定義される）またはそれらの組合せより選択される１個以上の２価の連結基でもよい。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態に従い、下の構造（Ｐ−２）を有するピリジニウム消光体が開示される。
【００２８】
【化１５】
0005706686.tif 000016
式中、ｎは１〜１０である。
【００２９】
下の工程を含む本発明のもう一つの実施形態に従い、Ｐ−２の製造方法が開示される。
【００３０】
【化１６】
0005706686.tif 000017
本発明の好ましい実施形態に従い、下の一般構造を有するもう一つのピリジニウムボロン酸消光体が開示される。
【００３１】
【化１７】
0005706686.tif 000018
式中、
Ｘ−は対イオンであり；
Ｘ１は−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｘ２は−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｌは直接結合または１〜８個の炭素原子を有する低級アルキレンより選択される２価の結合であり、末端または途中がスルホンアミド（−ＳＯ２ＮＨ−）、アミド−（Ｃ＝Ｏ）Ｎ−、エステル−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、エーテル−Ｏ−、スルフィド−Ｓ−、スルホン（−ＳＯ２−）、フェニレン−Ｃ６Ｈ４−、ウレタン−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、ウレア−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、チオウレア−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ−、アミド−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、アミン−ＮＲ−（式中、Ｒは１〜６個の炭素原子を有するアルキルと定義される）またはそれらの組合せより選択される１個以上の２価の連結基でもよく；
Ｚはカップリング基またはオレフィン的に不飽和の基より選択される反応性基であるか、または、Ｚは、
【００３２】
【化１８】
0005706686.tif 000019
（式中、ＲはＨまたはＣＨ３である）
であり；
中心のベンゼン環からの結合は、隣接するピリジニウム環上のオルト、メタまたはパラ位であり；および
−Ｂ（ＯＨ）２は、オルト、メタまたはパラ位でよい。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態に従い、下の構造を有し、Ｐ−３と呼ばれる特定のピリジニウムボロン酸消光体が開示される。
【００３４】
【化１９】
0005706686.tif 000020
下の工程を含む本発明のもう一つの実施形態に従い、Ｐ−３の製造方法が開示される。
【００３５】
【化２０】
0005706686.tif 000021
本発明の好ましい実施形態に従い、下の一般構造を有するもう一つのピリジニウムボロン酸消光体が開示される。 
【００３６】
【化２１】
0005706686.tif 000022
式中、
Ｘ−は対イオンであり；
Ｘ１は−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｘ２は−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｌは直接結合または１〜８個の炭素原子を有する低級アルキレンより選択される２価の結合であり、末端または途中がスルホンアミド（−ＳＯ２ＮＨ−）、アミド−（Ｃ＝Ｏ）Ｎ−、エステル−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、エーテル−Ｏ−、スルフィド−Ｓ−、スルホン（−ＳＯ２−）、フェニレン−Ｃ６Ｈ４−、ウレタン−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、ウレア−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、チオウレア−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ−、アミド−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、アミン−ＮＲ−（式中、Ｒは１〜６個の炭素原子を有するアルキルと定義される）またはそれらの組合せより選択される１個以上の２価の連結基でもよく；
Ｚは、メタクリルアミド−、アクリルアミド−、メタクリロイル−、アクリロイル−またはスチリル−より選択されるが限定されず、重合性でエチレン的に不飽和の基であるか、または、Ｚはポリマーまたはマトリクスと共有結合を形成できる反応性官能基でもよいかのいずれかである。その様な基としては、限定することなく、−Ｂｒ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ２Ｈおよび−ＮＨ２が挙げられる。ある実施形態において、Ｚは、
【００３７】
【化２２】
0005706686.tif 000023
（式中、ＲはＨまたはＣＨ３である。）
であり；
曖昧に表現されている結合は、オルト、メタまたはパラ位であり；および
−Ｂ（ＯＨ）２は、オルト、メタまたはパラ位でよい。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態に従い、下の構造を有し、Ｐ−４と呼ばれるもう一つピリジニウムボロン酸消光体が開示される。
【００３９】
【化２３】
0005706686.tif 000024
下の工程を含む本発明のもう一つの実施形態に従い、Ｐ−４の製造方法が開示される。
【００４０】
【化２４】
0005706686.tif 000025
ある実施形態において、第１の波長において光を吸収し、第２の波長において光を発するように構成された蛍光色素体と、被分析物濃度に関する量によって蛍光色素体により発せられた光を変更するように構成された消光体（ただし、消光体はボロン酸−置換ピリジニウムを含む）とを具備する被分析物センサーが開示される。好ましい実施形態において、消光体はＰ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４からなる群より選択される。
【００４１】
本発明のもう一つの実施形態に従い、Ｔ−１、Ｔ−２、Ｐ−１、Ｐ−２、Ｐ−３およびＰ−４から成る群より選択される１種類以上の被分析物結合部分構造と；蛍光染料、例えば、ＨＰＴＳ−トリＣｙｓ−ＭＡと；および、任意成分として、染料および消光体を固定化するための部材を提供する被分析物透過性の構成成分、例えば、ポリマーマトリクスまたは半透膜とを具備するグルコースセンサーが開示される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ヒドロゲルで光ファイバーのチップに固定化された消光体Ｐ−１および染料ＨＰＴＳ−トリＣｙｓ−ＭＡを含むセンサーのグルコース応答を図解する。検出化学物質は４７０ｎｍで励起され、濃度が増加するグルコースの存在下において、５２０〜７００ｎｍの間で蛍光を測定した。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
被分析物に結合すると蛍光を変調する蛍光染料および被分析物結合部分構造は既知であり、被分析物を検出するための測定器システムにおいて使用されてきた。例えば、米国特許第６，６５３，１４１、６，６２７，１７７、５，５１２，２４６、５，１３７，８３３、６，８００，４５１、６，７９４，１９５、６，８０４，５４４、６，００２，９５４、６，３１９，５４０、６，７６６，１８３、５，５０３，７７０および５，７６３，２３８号明細書、および同時係属中の米国特許出願公開第１０／４５６，８９５、１１／２９６，８９８、１１／６７１，８８０、６０／８３３，０８１、６０／８８８，４７７および６０／８８８，４７５号公報を参照；それぞれが、それを参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４４】
本出願人らは提案された作動機構に束縛される意図はないが、上で参照した同時係属中の米国特許出願に記載される好ましい測定器システムの幾つかで利用できる１つの機構としては、とりわけ、被分析物結合部分構造および蛍光染料の間で基底状態錯体を形成することが挙げられる。錯体を形成した結果として、蛍光を消光できる。好ましい被分析物結合部分構造上のボロン酸基がグルコースなどのポリヒドロキシル−置換有機分子と反応すると、ホウ素が負の電荷を帯びる。これにより錯体が弱まって、結果として解離し、グルコース濃度に関連して蛍光が増加する。
【００４５】
ポリヒドロキシル−置換有機分子（例えば、糖）を検出するための本発明の測定器システムは、被分析物結合部分構造としてボロン酸で機能化された新規なものに分類されるピリジニウム塩を含む。本発明の実施形態において、被分析物結合ピリジニウム消光体は以下の１つ以上の特徴を示す。それらは：１）水性媒体に相溶性があり；２）ボロン酸基で置換されており；３）好ましくはボロン酸１つ当たり少なくとも１つのカチオン基で、本質的に正に帯電しており；および４）固定化しやすい。被分析物結合消光体は優れた電子受容体であると仮定され、電子の移動過程は可逆的である。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「ボロン酸」とは構造−Ｂ（ＯＨ）２のことを言う。本発明の消光体を合成する各種の段階において、ボロン酸はボロン酸エステルとして存在してもよいことが当業者によって認識される。ボロン酸は、そのようなエステルを含むことが意図されている。
【００４７】
「蛍光色素体」とは、特定の波長で光により照らされると、より長い波長で光を発する、即ち、蛍光を発する物質のことを言う。蛍光色素体としては、有機染料、有機金属化合物、金属キレート、蛍光共役ポリマー、量子ドットまたはナノ粒子および上のものの組み合わせが挙げられる。蛍光色素体は、ポリマーに接続され別々の部分構造または置換基でもよい。「蛍光染料」または「染料」は、第２の別々の化合物または重合性化合物に転化可能な別々の化合物または反応性中間体より選択される。
【００４８】
「Ｌ」とも言われる「結合基」は、検出部分構造をポリマーまたはマトリクスに共有結合する２価の部分構造を指す。Ｌの例としては、直接結合または１〜８個の炭素原子を有する低級アルキレンよりそれぞれ独立に選択されるものが挙げられ、末端または途中がスルホンアミド（−ＳＯ２ＮＨ−）、アミド−（Ｃ＝Ｏ）Ｎ−、エステル−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、エーテル−Ｏ−、スルフィド−Ｓ−、スルホン（−ＳＯ２−）、フェニレン−Ｃ６Ｈ４−、ウレタン−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、ウレア−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、チオウレア−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ−、アミド−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、アミン−ＮＲ−（式中、Ｒは１〜６個の炭素原子を有するアルキルと定義される）などより選択される１個以上の２価の連結基でもよい。
【００４９】
「消光体」は、それが存在すると蛍光色素体の発光が減衰する化合物を言う。
【００５０】
「ピリジニウム」は窒素上で置換され正電荷のオニウム塩を形成するピリジンを言い、ピリジン環の他の位置で置換されていてもよい。
【００５１】
＜ピリジニウム消光体＞
被分析物結合消光体として使用するために、ボロン酸で機能化されたピリジニウム塩を合成した。好ましい実施形態に従い、有用なピリジニウムをカルボニル基で置換し、ポリヒドロキシル−置換有機分子（例えば、糖）に結合するよう構造的に構成し、機能的に適合させ、例えば同時係属中の米国特許出願公開第１１／２９６，８９８および１１／６７１，８８０号公報に記載され、３，３’−ｏＢＢＶまたはそれの誘導体などのビオロゲン−ボロン酸付加物の代替としてグルコースセンサーの化学的測定器システムにおいて使用できる。
【００５２】
ポリヒドロキシル−置換有機分子（例えば、糖）を認識する部分構造は芳香族ボロン酸である。ボロン酸は、結合基または共有結合のいずれかを介して、共役窒素含有ヘテロ環式芳香族構造に接続されている。ボロン酸で置換された消光体は、好ましくは、約４および９の間のｐＫａを有し、約６．８〜７．８のｐＨにおいて水性媒体中でグルコースと可逆的に反応してボロン酸エステルを形成する。反応の程度は、媒体中のグルコース濃度に関係する。ボロン酸エステルを形成することでピリジニウムによる蛍光の消光が低下し、グルコース濃度に依存して蛍光が増加する結果となる。
【００５３】
反応性化合物の一般構造を下に示す。
【００５４】
【化２５】
0005706686.tif 000026
式中、
Ｘ−は対イオンであり；
Ｘ１は−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｘ２は−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｌは直接結合または１〜８個の炭素原子を有する低級アルキレンより選択される２価の結合であり、末端または途中がスルホンアミド（−ＳＯ２ＮＨ−）、アミド−（Ｃ＝Ｏ）Ｎ−、エステル−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、エーテル−Ｏ−、スルフィド−Ｓ−、スルホン（−ＳＯ２−）、フェニレン−Ｃ６Ｈ４−、ウレタン−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、ウレア−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、チオウレア−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ−、アミド−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、アミン−ＮＲ−（式中、Ｒは１〜６個の炭素原子を有するアルキルと定義される）またはそれらの組合せより選択される１個以上の２価の連結基でもよく；
Ｚは、メタクリルアミド−、アクリルアミド−、メタクリロイル−、アクリロイル−またはスチリル−より選択されるが限定されない重合性でエチレン的に不飽和の基であるか、または、Ｚは任意にポリマーまたはマトリクスと共有結合を形成できる反応性官能基であるかのいずれかである。その様な基としては、限定することなく、−Ｂｒ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ２Ｈおよび−ＮＨ２が挙げられる。ある実施形態において、Ｚは、
【００５５】
【化２６】
0005706686.tif 000027
（式中、ＲはＨまたはＣＨ３である。）
であり；
【００５６】
【化２７】
0005706686.tif 000028
は、メタまたはパラ位でピリジニウム環上に置換されており；および
−Ｂ（ＯＨ）２は、オルト、メタまたはパラ位でよい。
【００５７】
非反応性化合物の一般構造を下に示す。
【００５８】
【化２８】
0005706686.tif 000029
式中、
Ｘは−Ｏ−または−ＮＨ−であり；および
Ｒ’はアルキルであり、炭素鎖中に−Ｏ−単位を含んでいてもよく、末端が−ＯＨまたは−ＯＣＨ３でもよい。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態に従い、下の構造（Ｐ−１）を有するピリジニウム消光体が開示される。
【００６０】
【化２９】
0005706686.tif 000030
下の工程を含む本発明のもう一つの実施形態に従い、Ｐ−１の製造方法が開示される。
【００６１】
【化３０】
0005706686.tif 000031
本発明の好ましい実施形態に従い、下の一般構造を有するピリジニウム消光体が開示される。
【００６２】
【化３１】
0005706686.tif 000032
式中、
Ｚは、先に定義される通りの反応性基であり；
Ｙは、
【００６３】
【化３２】
0005706686.tif 000033
（式中、ＲはＨまたは低級アルキルである。）
および
【００６４】
【化３３】
0005706686.tif 000034
より選択される３価の連結基であり；
Ｘ１およびＸ２は−Ｏ−または−ＮＨ−であり；および
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は直接結合または１〜８個の炭素原子を有する低級アルキレンより選択され、末端または途中がスルホンアミド（−ＳＯ２ＮＨ−）、アミド−（Ｃ＝Ｏ）Ｎ−、エステル−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、エーテル−Ｏ−、スルフィド−Ｓ−、スルホン（−ＳＯ２−）、フェニレン−Ｃ６Ｈ４−、ウレタン−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、ウレア−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、チオウレア−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ−、アミド−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、アミン−ＮＲ−（式中、Ｒは１〜６個の炭素原子を有するアルキルと定義される）またはそれらの組合せより選択される１個以上の２価の連結基でもよい。
【００６５】
本発明の好ましい実施形態に従い、下の構造（Ｐ−２）を有するピリジニウム消光体が開示される。
【００６６】
【化３４】
0005706686.tif 000035
式中、ｎは１〜１０である。
【００６７】
ボロン酸で機能化されたピリジニウム基間の架橋基の１つの目的は、２個のボロン酸を１個のグルコース分子に協調的に結合させることである。本発明者らは、これによりグルコースの選択性が向上する結果となると仮定している。単純な炭素鎖（図解される通り、ただし、ｎは１〜１０）だけではなく、結合基は他の化学的結合、例えば、エチレンオキシド断片などを含むこともできる。Ｐ−２はポリベンジルボロン酸ピリジニウム塩族の代表であり、ただし、ピリジニウム環はカルボニル置換基を介してメタおよびパラ位に結合している架橋基により連結されている。
【００６８】
下の工程を含む本発明のもう一つの実施形態に従い、Ｐ−２の製造方法が開示される。
【００６９】
【化３５】
0005706686.tif 000036
本発明の好ましい実施形態に従い、下の一般構造を有するもう一つのピリジニウムボロン酸消光体が開示される。
【００７０】
【化３６】
0005706686.tif 000037
式中、
Ｘ−は対イオンであり；
Ｘ１は−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｘ２は−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｌは直接結合または１〜８個の炭素原子を有する低級アルキレンより選択される２価の結合であり、末端または途中がスルホンアミド（−ＳＯ２ＮＨ−）、アミド−（Ｃ＝Ｏ）Ｎ−、エステル−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、エーテル−Ｏ−、スルフィド−Ｓ−、スルホン（−ＳＯ２−）、フェニレン−Ｃ６Ｈ４−、ウレタン−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、ウレア−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、チオウレア−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ−、アミド−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、アミン−ＮＲ−（式中、Ｒは１〜６個の炭素原子を有するアルキルと定義される）またはそれらの組合せより選択される１個以上の２価の連結基でもよく；
Ｚは、メタクリルアミド−、アクリルアミド−、メタクリロイル−、アクリロイル−またはスチリル−より選択されるが限定されず、重合性でエチレン的に不飽和の基であるか、または、Ｚは任意にポリマーまたはマトリクスと共有結合を形成できる反応性官能基であるかのいずれかである。その様な基としては、限定することなく、−Ｂｒ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ２Ｈおよび−ＮＨ２が挙げられる。ある実施形態において、Ｚは、
【００７１】
【化３７】
0005706686.tif 000038
（式中、ＲはＨまたはＣＨ３である。）
であり；
中心のベンゼン環からの結合は、隣接するピリジニウム環上のオルト、メタまたはパラ位であり；および
−Ｂ（ＯＨ）２は、オルト、メタまたはパラ位でよい。
【００７２】
本発明の好ましい実施形態に従い、下の構造を有し、Ｐ−３と呼ばれる特定のピリジニウムボロン酸消光体が開示される。
【００７３】
【化３８】
0005706686.tif 000039
下の工程を含む本発明のもう一つの実施形態に従い、Ｐ−３の製造方法が開示される。
【００７４】
【化３９】
0005706686.tif 000040
本発明の好ましい実施形態に従い、下の一般構造を有するもう一つのピリジニウムボロン酸消光体が開示される。
【００７５】
【化４０】
0005706686.tif 000041
式中、
Ｘ−は対イオンであり；
Ｘ１は−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｘ２は−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｌは直接結合または１〜８個の炭素原子を有する低級アルキレンより選択される２価の結合であり、末端または途中がスルホンアミド（−ＳＯ２ＮＨ−）、アミド−（Ｃ＝Ｏ）Ｎ−、エステル−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、エーテル−Ｏ−、スルフィド−Ｓ−、スルホン（−ＳＯ２−）、フェニレン−Ｃ６Ｈ４−、ウレタン−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、ウレア−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、チオウレア−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ−、アミド−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、アミン−ＮＲ−（式中、Ｒは１〜６個の炭素原子を有するアルキルと定義される）またはそれらの組合せより選択される１個以上の２価の連結基でもよく；
Ｚは、メタクリルアミド−、アクリルアミド−、メタクリロイル−、アクリロイル−またはスチリル−より選択されるが限定されず、重合性でエチレン的に不飽和の基であるか、または、Ｚは任意にポリマーまたはマトリクスと共有結合を形成できる反応性官能基であるかのいずれかである。その様な基としては、限定することなく、−Ｂｒ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ２Ｈおよび−ＮＨ２が挙げられる。ある実施形態において、Ｚは、
【００７６】
【化４１】
0005706686.tif 000042
（式中、ＲはＨまたはＣＨ３である。）
であり；
曖昧に表現されている結合は、オルト、メタまたはパラ位であり；および
−Ｂ（ＯＨ）２は、オルト、メタまたはパラ位でよい。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態に従い、下の構造を有し、Ｐ−４と呼ばれるもう一つピリジニウムボロン酸消光体が開示される。
【００７８】
【化４２】
0005706686.tif 000043
下の工程を含む本発明のもう一つの実施形態に従い、Ｐ−４の製造方法が開示される。
【００７９】
【化４３】
0005706686.tif 000044
本明細書で開示される幾つかのピリジニウム消光体は、単一のベンジルボロン酸基を有する１価の構造を包含する。Ｐ−１は、この新しく分類される重合性でベンジルボロン酸ピリジニウム塩の１つのそのような代表である。それは容易に入手可能な中間体より作製が簡単で単純な分子であり、それはビオロゲン系ヒドロゲルのように機能する。
【００８０】
ポリピリジニウム消光体と呼ばれるピリジニウム消光体の他の実施形態は、３個以上のベンジルボロン酸基（例えば、Ｔ−１およびＴ−２）を有する。これらの化合物は、Ｐ−１などの１価のピリジニウム変異形および２個のベンジルボロン酸基を含むビオロゲンのいずれとも異なる。Ｔ−１およびＴ−２は完全にＮ−アルキル化されたポリピリジンで、ピリジン環は直接カップルしている（即ち、環の間に結合基がない）。また、それらは拡張共役ビオロゲンと分類することもできる（即ち、２個のピリジニウム環が共役架橋部分構造で連結されている）。Ｔ−２ポリピリジニウム消光体は、反応性基および２個のターピリジニウム基につながる３官能性部分構造を含む。
【００８１】
本明細書で開示される通り、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４はビスピリジニウムである。ボロン酸で置換されたポリピリジニウムは好ましい消光体のもう一つに分類され、共にカップルされた環が２個より多くある。用語「ポリピリジニウム」としては、結合基によって共に共有結合した３個以上のピリジニウム基を含む別々の化合物、鎖中にピリジニウム繰り返し単位を含むポリマー、鎖へのペンダント基であるピリジニウムを有するポリマー、好ましくはピリジニウム末端基が挙げられるピリジニウム単位を含むデンドリマー、好ましくはピリジニウム末端基が挙げられるピリジニウム単位を含むオリゴマーおよびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００８２】
実施形態によっては、本明細書で開示される消光体は少なくとも２個のボロン酸基で置換されており、水に溶解または分散でき、ポリピリジニウムボロン酸を含むポリマーまたはヒドロゲルである。あるいは、ポリピリジニウムボロン酸は不活性な基体に直接結合している。ポリピリジニウムボロン酸を含む消光体の前駆体としては、重合性基またはカップリング基で更に置換された低分子量ポリピリジニウムボロン酸が挙げられる。
【００８３】
本明細書で開示される構造のいくつかは、検知ポリマーを作製するために使用される消光体の前駆体（即ち、モノマー）である。生体外用途のための消光体としてモノマーを使用することは、それらの反応性のため実用的ではないであろう。一方、生体外用途のために有用で非重合性の異形を作製することができる。これらの実施形態は非重合性基を含む（例えば、ＰＥＧ置換基などの可溶化基でメタクリルアミド基を置き換えることができる）。
【００８４】
実施形態によっては、１価またはポリピリジニウムボロン酸付加物は約４００ダルトン以上の分子量を有する別々の化合物でもよい。他の実施形態において、また、それは約１０，０００ダルトンを超える分子量を有する水溶性または水分散性ポリマーのペンダント基または鎖単位でもよい。ある実施形態において、消光体ポリマー単位は非共有的にポリマーマトリクスと会合していてもよく、そこに物理的に固定化されている。更にもう一つの実施形態において、消光体ポリマー単位は負に帯電した水溶性ポリマーとの錯体として固定化されていてもよい。
【００８５】
他の実施形態において、１価またはポリピリジニウムボロン酸部分構造は、平衡が成立するために被分析物（例えば、グルコース）を十分に透過できる架橋された親水性ポリマーまたはヒドロゲルにおけるペンダント基または鎖単位でもよい。
【００８６】
他の実施形態において、消光体は本明細書で記載される通りの結合体により第２の非水溶性ポリマーマトリクスに共有結合されていてもよい。実施形態によっては、消光体が１箇所または２箇所で非水溶性ポリマーマトリクスに結合されていてもよい。
【００８７】
＜被分析物センサー＞
本発明の好ましい実施形態に従って使用される化学測定器システムは被分析物結合部分構造に動作可能にカップルされた蛍光色素体を含み、被分析物が結合することで蛍光色素体濃度における明らかな光学的変化（例えば、発光強度）が生じる。更に、蛍光色素体は異なる酸および塩基の形態を有し、レシオメトリックにｐＨを検知できるようにスペクトル特性において検出可能な差異を示すことが望ましい；例えば、同時係属の米国特許出願公開第１１／６７１，８８０号公報を参照。例えば、グルコース結合部分構造、例えば、ＨＰＴＳ−トリＣｙｓＭＡなどの蛍光染料に動作可能にカップルされたＰ−１は蛍光染料の発光強度を消光するはずで、グルコースが結合すると消光の程度が減少し、グルコース濃度に関連して発光強度が増加する。Ｐ−１はピリジニウム１個につき少なくとも１個のボロン酸を有している一方で、他のピリジニウム消光体は複数のピリジニウム環を有していてもよく、それらの幾つかはボロン酸基で置換されていない。
【００８８】
また、更なる好ましい実施形態において、測定器システムは、検知部分構造が互いに反応（消光）するために物理的に十分近くにとどまるように検知部分構造（例えば、染料−消光体）を固定化するための部材も含む。生体内検知が望まれる場合、そのような固定化部材は、好ましくは、水性環境（例えば、血管内）において不溶性であり、標的の被分析物を透過でき、検知部分構造を透過できない。典型的には、固定化部材は非水溶性の有機ポリマーマトリクスを含む。例えば、染料および消光体をＤＭＡＡ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）ヒドロゲルマトリクス中に効率よく固定化でき、生体内でグルコースを検知できる。
【００８９】
幾つかの例示的な蛍光色素体および固定化部材を下により詳細に述べる。実施形態によっては、有用な染料として、ピラニン誘導体（例えば、ヒドロキシピレントリスルホンアミド誘導体など）が挙げられる。他の実施形態では、染料はヒドロキシピレントリスルホン酸の重合体誘導体の１つでもよい。
【００９０】
ある好ましい実施形態において、蛍光染料はＨＰＴＳ−トリＣｙｓ−ＭＡでよい：
【００９１】
【化４４】
0005706686.tif 000045
当然、実施形態によっては、ＨＰＴＳ核上のＣｙｓ−ＭＡ以外の置換も、その置換が負に帯電しており重合性基を有している限り、本発明の態様と整合する。システインのＬまたはＤ立体異性体のいずれかを使用できる。実施形態によっては、１個のみまたは２個のスルホン酸が置換されていてもよい。同様に、上で示されるＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡに対する変体において、ＮＢｕ４＋に加え他の対イオンも使用でき、正に帯電した金属が挙げられ、例えば、Ｎａ＋である。他の変体において、スルホン酸基は、例えば、リン酸、カルボン酸などの官能基で置き換えられていてもよい。
【００９２】
実施形態によっては、移動流に関与せず生体外において使用するために、検知構成要素を個別の（別々の）部品として使用する。蛍光色素体および消光体を液体溶液中で共に混合し、被分析物を加え、蛍光強度の変化を測定し、部品を破棄する。検知構成要素を捕捉し浸出を防ぐために使用できる重合体マトリクスは存在する必要はない。場合によっては、検知構成要素を固定化し、移動流中で被分析物を測定するために検知構成要素を使用できる。
【００９３】
＜生体内用途＞
生体内での用途のために、被分析物センサーを１種類以上のポリヒドロキシル有機化合物を含有する生理的流体の移動流中で使用するか、または、前記化合物を含有する筋肉などの組織中に埋め込む。従って、センサー組立品より検知部分構造が逃避しないことが好ましい。よって、生体内で使用するためには、検知構成要素が、好ましくは、有機ポリマー検知組立品の一部である。被分析物を通過させるが検知部分構造の通過は阻害する半透膜により、可溶性染料および消光体を閉じ込めることができる。これは、被分析物分子より実質的に大きい（被分析物の分子量の少なくとも２倍の分子量または１０００より大きく、好ましくは５０００より大きい）可溶性分子を検知部分構造として使用し；および、検知部分構造が定量的に保持されるように２つの間で特定の分子量分画を有する透析または限外濾過膜などの選択的半透膜を利用することで実現できる。
【００９４】
好ましくは、検知部分構造を、グルコースを自由に透過する不溶性ポリマーマトリクス中に固定する。ポリマーマトリクスは、有機、無機またはそれらのポリマーの組み合わせを含む。マトリクスは、生体適合性材料から成っていてもよい。あるいは、マトリクスは、興味ある被分析物を透過する第２の生体適合性ポリマーで被覆されている。
【００９５】
ポリマーマトリクスの機能は、同時に被分析物との接触を可能とし被分析物をボロン酸に結合しながら、蛍光色素体および消光体部分構造を共に保持し固定化することである。この効果を達成するためには、マトリクスは媒体中で不溶でなければならず、マトリクスおよび被分析物溶液間の高度な表面領域界面を確立することにより、それと密に会合している。例えば、超薄膜または微細孔支持マトリクスを使用する。あるいは、マトリクスは被分析物溶液において膨潤性であり、例えば、ヒドロゲルマトリクスを水性系用に使用する。幾つかの例において、検知ポリマーはライトコンジットの表面などの表面に結合されているか、または、微細孔膜中に含浸されている。全ての場合において、２相間で平衡を成立できるように結合部位への被分析物の輸送をマトリクスが妨げてはならない。超薄膜、微細孔ポリマー、微細孔ソフトゲルおよびヒドロゲルを調製する技術は当該技術で確立されている。全ての有用なマトリクスは被分析物透過性として定義される。
【００９６】
実施形態によっては、ヒドロゲルポリマーを使用する。本明細書で使用される場合、ヒドロゲルとの用語は水中で実質的に膨潤するが溶解しないポリマーを言う。そのようなヒドロゲルは、直線状、分岐状または網状ポリマーでよく、または、高分子電解質複合体が可溶性または浸出性の画分を含まないとの条件で高分子電解質複合体でもよい。典型的には、ヒドロゲルのネットワークを、水溶性ポリマーが水性媒体中で膨潤するが溶解しないように水溶性ポリマー上で行う架橋工程によって調製する。あるいは、ヒドロゲルポリマーを親水性および架橋性モノマーの混合物を共重合することで調製し、水膨潤性の網状ポリマーを得る。そのようなポリマーを、付加または縮合重合、または組み合わせの工程のいずれかで形成する。これらの場合、ネットワークを形成するモノマーと組み合わせてモノマー性の誘導体を使用する共重合により、検知構造単位がポリマー中に組み込まれる。あるいは、後の反応での重合を利用して、反応性部分構造を既に調製されたマトリクスにカップルする。前記検知部分構造はポリマー鎖中の単位または鎖に結合しているペンダント基である。
【００９７】
また、本発明において有用なヒドロゲルは、染料および消光体の両者が共有結合された単一のネットワークなどの単一体ポリマー、または複数の構成要素のヒドロゲルである。複数の構成要素のヒドロゲルとしては、相互貫入ネットワーク、高分子電解質錯体および水膨潤複合体を得るための２種類以上のポリマーの各種の他の混合物が挙げられ、ヒドロゲルマトリクス中の第２のポリマーの分散体および交互ミクロ層集合体が挙げられる。
【００９８】
単一体ヒドロゲルは、典型的には、親水性モノマーの混合物をフリーラジカル共重合することで形成し、限定することなく、ＨＥＭＡ、ＰＥＧＭＡ、メタクリル酸、アクリル酸ヒドロキシエチル、Ｎ−ビニルピロリドン、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド；メタクリロイルアミノプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、スルホプロピルメタクリル酸ナトリウムなどが挙げられるイオン性モノマー；エチレンジメタクリレート、ＰＥＧＤＭＡ、トリメチロールプロパントリアクリレートなどが挙げられる架橋体などが挙げられる。当該技術においてよく確立されている原理を使用し、透過性、膨潤指数およびゲル強度が含まれるネットワーク特性を最適化するために、モノマーの比率を選択する。実施形態によっては、８−アセトキシピレン−１，３，６−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス（メタクリルアミドプロピルスルホンアミド）などの染料分子のエチレン的に不飽和な誘導体より染料部分構造を誘導し、ジハロゲン化４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−４’−Ｎ’−（ベンジル−４エテニル）−ジピリジニウム（ｍ−ＳＢＢＶ）などのエチレン的に不飽和なビオロゲンより消光体部分構造を誘導し、ＨＥＭＡおよびＰＥＧＤＭＡよりマトリクスを作製する。発光強度を最適化するために、染料の濃度を選択する。所望の測定可能な信号を生成し十分な消光を与えるために、染料に対する消光体の比を調節する。
【００９９】
実施形態によっては、縮合重合により単一体ヒドロゲルを形成する。例えば、アセトキシピレントリススルホニルクロリドを過剰のＰＥＧジアミンと反応させ、未反応のジアミン中に溶解するトリス−（アミノＰＥＧ）付加物を得る。過剰のトリメソイルクロリドおよび酸受容体の溶液をジハロゲン化４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−４’−Ｎ’−（２ヒドロキシエチル）ビピリジニウムと反応させ、ビオロゲンの酸塩化物官能性エステルを得る。例えば、一方の混合物の薄膜をキャストし、それを他方に浸漬することで、２つの反応性混合物を互いに接触させ、反応させ、ヒドロゲルを形成する。
【０１００】
他の実施形態においては、染料が一方の構成要素に、および消光体がもう一方に組み込まれている複数の構成要素のヒドロゲルが本発明のセンサーを作製するために好ましい。更に、構成要素間の相互作用を増加し、他のポリヒドロキシ被分析物に対してグルコースの選択性を与えるために、これらの系は分子インプリントされていてもよい。好ましくは、多構成要素系は相互貫入ポリマーネットワーク（ＩＰＮ）または準相互貫入ポリマーネットワーク（準ＩＰＮ）である。
【０１０１】
ＩＰＮポリマーは、典型的には、逐次重合で作製される。第１に、消光体を含むネットワークを形成する。次いで、染料モノマーを含有するモノマー混合物でネットワークを膨潤し、第２の重合を行い、ＩＰＮヒドロゲルを得る。
【０１０２】
染料部分構造を含有する可溶性ポリマーを消光体モノマーを含有するモノマー混合物中に溶解し、混合物を重合することで、準ＩＰＮヒドロゲルを形成する。実施形態によっては、ポリヒドロキシル化合物を自由に透過する不溶性のポリマーマトリクスで検知部分構造を固定化する。ヒドロゲル系に関する追加の詳細は米国特許出願公開第２００４／００２８６１２および２００６／００８３６８８号公報に開示されており、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０３】
ポリマーマトリクスは、有機、無機またはそれらのポリマーの組み合わせを含む。マトリクスは、生体適合性材料から成っていてもよい。あるいは、マトリクスは、興味ある被分析物を透過する第２の生体適合性ポリマーで被覆されている。ポリマーマトリクスの機能は、同時に被分析物（例えば、ポリヒドロキシル化合物、Ｈ＋およびＯＨ−）との接触を可能としポリヒドロキシル化合物をボロン酸に結合しながら、蛍光染料および消光体部分構造を共に保持し固定化することである。従って、マトリクスは媒体中で不溶であり、マトリクスおよび被分析物溶液間の高度な表面領域界面を確立することにより、それと密に会合している。また、２相間で平衡を成立できるように結合部位への被分析物の輸送をマトリクスは妨げない。ある実施形態においては、超薄膜または微細孔支持マトリクスを使用してもよい。もう一つの実施形態においては、被分析物溶液中で膨潤可能なマトリクス（例えば、ヒドロゲルマトリクス）を水性系用に使用できる。実施形態によっては、検知ポリマーはライトコンジットの表面などの表面に結合されているか、または、微細孔膜中に含浸されている。超薄膜、微細孔ポリマー、微細孔ソフトゲルおよびヒドロゲルを調製する技術は先行技術で確立されている。
【実施例】
【０１０４】
＜例１＞
【０１０５】
【化４５】
0005706686.tif 000046
＜化合物２７＞水分を含まない１，４−ジオキサン（１５ｍＬ）中の３，５−ジブロモピリジン（０．４７ｇ、２．０ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ３ＰＯ４の水溶液（２Ｍ、３ｍＬ）、続いて、ＰＰｈ３（０．２１ｇ、０．８ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＯＡｃ）２（０．０５ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を加えた。５分間撹拌後、［５−（メトキシカルボニル）ピリジン−３−イル］ボロン酸（０．９ｇ、５ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン気流を穏やかおよび定常的に溶液を通して泡立てながら反応物を２時間還流した。室温まで冷却後、水（１０ｍＬ）を加え、反応物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を分離し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、真空中で濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（１００％ＣＨＣｌ３）で精製し、化合物２７（０．３ｇ、５１％）を与えた。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．４９（２％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）δ４．０１（ｓ、３Ｈ）、８．０８（ｔ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、８．４９（ｔ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、８．７７（ｄ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．８０（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、１Ｈ）、９．０（ｄ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、９．２８（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、１Ｈ）。
【０１０６】
＜化合物２８＞水分を含まない１，４−ジオキサン（５ｍＬ）中の化合物２７（０．３ｇ、１．０ｍｍｏｌ）および３−ピリジンボロン酸（０．１４ｇ、１．１ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ＰＰｈ３（０．０５ｇ、０．２ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＯＡｃ）２（０．０１ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、続いて、Ｋ３ＰＯ４の水溶液（２Ｍ、１．１ｍＬ）を加えた。アルゴン気流を穏やかおよび定常的に溶液を通して泡立てながら、反応物を１．５時間還流した。室温まで冷却後、ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）を加え、有機層を希ＮａＨＣＯ３（５ｍＬ）、塩水（５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、真空中で濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中２％〜２０％メタノール）で精製し、化合物２８（０．２４ｇ、８３％）を与えた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００  ＭＨｚ）δ４．０２（ｓ、３Ｈ）、７．４８（ｄｄ、Ｊ＝８．１、４．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．９７（ｄｔ、Ｊ＝７．９、１．９Ｈｚ、１Ｈ）、８．１０（ｔ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．５７（ｔ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、８．７２（ｄｄ、Ｊ＝４．８、４．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．９３（ｍ、３Ｈ）、９．０８（ｄ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、９．３０（ｄ、Ｊ＝１．９Ｈｚ、１Ｈ）。
【０１０７】
＜化合物２９＞ＴＨＦ（１５ｍＬ）、ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）および水（３ｍＬ）中の化合物２８（０．２４ｇ、０．８ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ＬｉＯＨ（０．０３ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を加えた。１５分間撹拌後、反応物は透明になった。反応物を１８時間撹拌し、次いで、揮発物を蒸発させた。残った水性溶液をＮａＯＨ（１Ｍ、２０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（１０ｍＬ）で洗浄し、ＫＨＳＯ４（１Ｍ）でｐＨを４に調節して、生成物を沈殿させた。白色固体を濾過により回収し、水で洗浄し、真空下で乾燥した、２９（０．２１ｇ、９５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、５００  ＭＨｚ）δ７．５６（ｄｄｄ、Ｊ＝７．９、４．８、０．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．３３（ｄｄｄ、Ｊ＝７．９、２．３、１．７Ｈｚ、１Ｈ）、８．５９（ｔ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．６６（ｄｄ、Ｊ＝４．８、１．６Ｈｚ、１Ｈ）、８．６８（ｔ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、９．０４（ｄｄ、Ｊ＝４．１、２．２Ｈｚ、２Ｈ）、９．１２（ｍ、２Ｈ）、９．２６（ｄ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）。
【０１０８】
＜化合物３０＞ジクロロメタン（５０ｍＬ）中の化合物２９（０．２１ｇ、０．７６ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）された懸濁液に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．１７ｇ、０．９ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール水和物（０．１２ｇ、０．９ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．１５ｍＬ、１．１ｍｍｏｌ）を加えた。０℃で３０分間撹拌後、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（０．１６ｇ、０．９ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．１５ｍＬ、１．１ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を１８時間撹拌し、次いで、飽和ＮａＨＣＯ３（３×２５ｍＬ）で洗浄した。ＤＣＭ層をＭｇＳＯ４で乾燥し、真空中において体積を減少させ、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中２％〜２０％メタノール）で精製し、化合物３０（０．１９ｇ、６２％）を白色固体として与えた。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５０（トリエチルアミンで処理したプレート上で１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）δ１．８４（ｐ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、２Ｈ）、１．９８（ｓ、３Ｈ）、３．５１（ｑ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．５５（ｑ、Ｊ＝６．１Ｈｚ、２Ｈ）、５．３９（ｓ、１Ｈ）、５．７９（ｓ、１Ｈ）、６．３０（ｔ、１Ｈ）、７．４６（ｄｄ、Ｊ＝７．９、４．９Ｈｚ、１Ｈ）、７．９８（ｄｄｄ、Ｊ＝７．９、２．３、１．７Ｈｚ、１Ｈ）、８．０６（ｔ、１Ｈ）、８．１８（ｔ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．５８（ｔ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．７１（ｄｄ、Ｊ＝４．８、１．５Ｈｚ、１Ｈ）、８．９２（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、８．９４（ｄ、Ｊ＝１．９Ｈｚ、１Ｈ）、８．９８（ｄ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、９．０４（ｄ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、９．２２（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）。
【０１０９】
＜化合物Ｔ−１＞２−ブロモメチルフェニルボロン酸（０．６ｇ、２．８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（３ｍＬ）およびエチレングリコール（０．１６ｍＬ、２．８ｍｍｏｌ）中の化合物３０（０．１９ｇ、０．４７ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応物を５５℃で７２時間撹拌した。ジエチルエーテル（２０ｍＬ）を加え、生成物をオイルとして分離した。溶媒を静かに移し、残ったオイルが淡黄色の粉体となるまでオイルをアセトン中で超音波処理した。固体を遠心により回収し、アセトンで数回洗浄し、アルゴン下で乾燥した（０．２９ｇ、５９％）。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、５００ＭＨｚ）δ１．８９（ｐ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、２．２２（ｓ、３Ｈ）、３．３６（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、３．５０（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、５．４０（ｓ、１Ｈ）、５．６５（ｓ、１Ｈ）、６．１０（ｓ、２Ｈ）、６．１６（ｓ、２Ｈ）、６．１７（ｓ、２Ｈ）、７．６０（ｍ、９Ｈ）、７．８０（ｍ、３Ｈ）、８．２６（ｄｄ、Ｊ＝８．１、６．３Ｈｚ、１Ｈ）、８．９３（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、９．０７（ｔ、Ｊ＝６．２Ｈｚ、１Ｈ）、９．２５（ｍ、２Ｈ）、９．２８（ｔ、Ｊ＝１．６Ｈｚ、１Ｈ）、９．３２（ｄ、Ｊ＝５．３Ｈｚ、２Ｈ）、９．３９（ｓ、１Ｈ）、９．４６（ｓ、１Ｈ）。
【０１１０】
【化４６】
0005706686.tif 000047
＜例２＞
【０１１１】
【化４７】
0005706686.tif 000048
＜化合物１９＞水分を含まない１，４−ジオキサン（４０ｍＬ）中の３，５−ジブロモピリジン（２．１ｇ、９．０ｍｍｏｌ）および３−ピリジンボロン酸（１．１ｇ、９．０ｍｍｏｌ）の懸濁液に、Ｋ３ＰＯ４の水溶液（２Ｍ、９ｍＬ）、続いて、ＰＰｈ３（０．５ｇ、２．０ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＯＡｃ）２（０．１１ｇ、０．５ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン気流を穏やかおよび定常的に溶液を通して泡立てながら、反応物を２時間還流した。室温まで冷却後、水性層をＥｔＯＡｃ（１×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を希ＮａＨＣＯ３（３×５０ｍＬ）および塩水（１×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、真空中で濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中２％〜２０％メタノール）で精製し、化合物１９（１．３ｇ、６１％）を与えた。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．６３（１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、５００ＭＨｚ）δ７．５９（ｄｄｄ、Ｊ＝８．０、４．９、０．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．１８（ｄｄｄ、Ｊ＝８．０、２．３、１．６Ｈｚ、１Ｈ）、８．３８（ｔ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、８．６３（ｄｄ、Ｊ＝４．９、１．５Ｈｚ、１Ｈ）、８．７２（ｄ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．８５（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．８８（ｄｄ、Ｊ＝２．４、０．７Ｈｚ、１Ｈ）。
【０１１２】
＜化合物２０＞温度計を備える三口丸底フラスコに、化合物１９（１．２ｇ、５．１ｍｍｏｌ）、トルエン（８ｍＬ）、ＴＨＦ（３ｍＬ）およびホウ酸トリイソプロピル（１．４ｍＬ、６．０ｍｍｏｌ）を充填した。−４０℃（ドライアイス／アセトン）まで冷却後、３０分の過程にわたってｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中１．６Ｍ、３．７５ｍＬ）をゆっくりと加えた。次いで、反応物を放置して−２０℃まで温め、ＨＣｌ（２Ｍ、５ｍＬ）を加えた。反応物が室温まで達した時点で、水性層を除去し、ＮａＯＨ（３Ｍ、２ｍＬ）でｐＨを７．６に調節し、ＮａＣｌで飽和させ、ＴＨＦ（３×６ｍＬ）で抽出した。ＴＨＦ層を合わせて、ＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸発させてオイルとし、ＣＨ３ＣＮ（４０ｍＬ）で希釈し、７０℃で３０分間加熱した。４℃において７２時間で溶液を結晶化させた。黄色の固体を濾過し、氷冷されたＣＨ３ＣＮで洗浄し、空気乾燥した（０．３８ｇ、３７％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、５００ＭＨｚ）δ７．６１（ｄｄ、Ｊ＝７．７、４．９Ｈｚ、１Ｈ）、８．２１（ｄｔ、Ｊ＝８．０、１．９Ｈｚ、１Ｈ）、８．６０（ｓ、１Ｈ）、８．６５（ｄｄ、Ｊ＝４．９、１．４Ｈｚ、１Ｈ）、８．７２（ｓ、１Ｈ）、８．８９（ｄ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．９１（ｄ、Ｊ＝１．９Ｈｚ、１Ｈ）。
【０１１３】
＜化合物３１を経由して化合物２９＞水分を含まない１，４−ジオキサン（２０ｍＬ）中の化合物２０（０．３７ｇ、１．８５ｍｍｏｌ）およびエチル−５−ブロモニコチネート（０．３９ｇ、１．６８ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ＰＰｈ３（０．１ｇ、０．３７ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＯＡｃ）２（０．０２ｇ、０．０９ｍｍｏｌ）、続いて、Ｋ３ＰＯ４の水溶液（２Ｍ、１．６５ｍＬ）を加えた。アルゴン気流を穏やかおよび定常的に溶液を通して泡立てながら、反応物を１．５時間還流した。室温まで冷却後、ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）を加え、有機層を水（１０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、真空中で蒸発させ、粗物３１を黄色の固体として得た。メタノール（２０ｍＬ）および水（５ｍＬ）中のこの固体の懸濁液に、ＬｉＯＨ（０．１２ｇ、５．１ｍｍｏｌ）を加え、反応物を４時間撹拌した。真空中でメタノールを除去後、更に水（１０ｍＬ）を加え、塩基性水溶液をＥｔＯＡｃ（３×５ｍＬ）で洗浄し、次いで、ＫＨＳＯ４（１Ｍ）でｐＨを約４に調節し、結果として沈殿を生じた。白色沈殿を濾過により回収し、アセトンおよびヘキサンで洗浄し、乾燥して、化合物２９（０．３１ｇ、６７％）を与えた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、５００ＭＨｚ）δ７．５６（ｄｄｄ、Ｊ＝７．９、４．８、０．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．３３（ｄｄｄ、Ｊ＝７．９、２．３、１．７Ｈｚ、１Ｈ）、８．５９（ｔ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．６６（ｄｄ、Ｊ＝４．８、１．６Ｈｚ、１Ｈ）、８．６８（ｔ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、９．０４（ｄｄ、Ｊ＝４．１、２．２Ｈｚ、２Ｈ）、９．１２（ｍ、２Ｈ）、９．２６（ｄ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）。
【０１１４】
＜化合物３２＞ジクロロメタン（１５ｍＬ）中の化合物２９（０．３ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）された懸濁液に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．２３ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール水和物（０．１６ｇ、１．２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．２８ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）を加えた。０℃で３０分間撹拌後、化合物１０（０．１４ｇ、０．４ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を２４時間撹拌した。白色の沈殿が形成された。飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）を添加後、両層に著しい量の固体が残存した。固体を濾過し、ＤＣＭ、ＮａＨＣＯ３、ヘキサンで洗浄し、乾燥して化合物３２（０．１９ｇ、６１％）を与えた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、５００ＭＨｚ）δ１．６０（ｍ、２Ｈ）、１．７３（ｍ、４Ｈ）、１．８６（ｓ、３Ｈ）、１．９６（ｍ、２Ｈ）、３．２３（ｍ、４Ｈ）、３．４９（ｍ、２Ｈ）、４．５８（ｄｄ、Ｊ＝９．２、５．１Ｈｚ、２Ｈ）、５．２９（ｓ、１Ｈ）、５．６３（ｓ、１Ｈ）、７．６０（ｄｄ、Ｊ＝７．６、５．０Ｈｚ、２Ｈ）、８．２６（ｍ、２Ｈ）、８．４６（ｓ、１Ｈ）、８．４９（ｓ、１Ｈ）、８．５３（ｓ、１Ｈ）、８．６３（ｄ、Ｊ＝４．６Ｈｚ、２Ｈ）、８．７２（ｓ、１Ｈ）、８．９３（ｍ、７Ｈ）、９．０５（ｓ、３Ｈ）。
【０１１５】
＜化合物Ｔ−２＞２−ブロモメチルフェニルボロン酸（０．４７ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（４ｍＬ）およびエチレングリコール（０．１２ｍＬ、２．２ｍｍｏｌ）中の化合物３２（０．１９ｇ、０．２４ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応物を５５℃で７２時間撹拌した。アセトン（４０ｍＬ）を加え、結果として生じた沈殿を、細かいピンク色の粉体が得られるまで超音波処理した。固体を遠心により回収し、アセトンで数回洗浄し、アルゴン下で乾燥した（０．３０ｇ、６０％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （Ｄ２Ｏ、５００ＭＨｚ）δ１．５３（ｍ、２Ｈ）、１．７０（ｍ、４Ｈ）、１．７８（ｓ、３Ｈ）、１．９５（ｍ、２Ｈ）、３．２０（ｍ、４Ｈ）、３．４７（ｍ、２Ｈ）、４．４６（ｔ、１Ｈ）、５．３０（ｓ、１Ｈ）、５．５３（ｓ、１Ｈ）、６．０９（ｓ、４Ｈ）、６．１４（ｓ、４Ｈ）、６．１６（ｓ、４Ｈ）、７．５６（ｍ、１８Ｈ）、７．７７（ｍ、６Ｈ）、８．２５（ｔ、２Ｈ）、８．９１（ｄ、Ｊ＝７．９、２Ｈ）、９．１０（ｄ、２Ｈ）、９．２６（ｍ、６Ｈ）、９．３３（ｍ、４Ｈ）、９．３８（ｍ、２Ｈ）、９．４６（ｓ、１Ｈ）、９．５０（ｓ、１Ｈ）。
【０１１６】
【化４８】
0005706686.tif 000049
＜例３＞
【０１１７】
【化４９】
0005706686.tif 000050
＜化合物３３＞ジクロロメタン（８０ｍＬ）中のイソニコチン酸（０．５７ｇ、４．７ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）された懸濁液に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（１．１ｇ、５．６ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール水和物（０．７６ｇ、５．６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．８ｍＬ、５．６ｍｍｏｌ）を加えた。０℃で３０分間撹拌後、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（１．０ｇ、５．６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．８ｍＬ、５．６ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を２時間撹拌し、次いで、飽和ＮａＨＣＯ３（３×２５ｍＬ）で洗浄した。ＤＣＭ層をＭｇＳＯ４で乾燥し、真空中において体積を減少させ、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中２％〜１０％メタノール）で精製し、化合物３３（０．３７ｇ、３２％）を白色固体として与えた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）δ１．７７（ｍ、２Ｈ）、２．０１（ｓ、３Ｈ）、３．４７（ｑ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．５０（ｑ、Ｊ＝６．１Ｈｚ、２Ｈ）、５．４０（ｓ、１Ｈ）、５．８０（ｓ、１Ｈ）、６．３６（ｔ、１Ｈ）、７．７６（ｄ、Ｊ＝６．１Ｈｚ、２Ｈ）、７．９０（ｔ、１Ｈ）、８．７６（ｄ、Ｊ＝６．１Ｈｚ、１Ｈ）。
【０１１８】
＜化合物Ｐ−１＞２−ブロモメチルフェニルボロン酸（０．４５ｇ、２．１ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（７５ｍＬ）中の化合物３３（０．１９ｇ、０．２４ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応物を５０℃で１６時間撹拌した。反応物を、残りが約５ｍＬとなるまで真空中で濃縮した。エーテル（２０ｍＬ）を加え、沈殿を超音波処理し、遠心により回収した。過剰の出発材料を除去するために、白色沈殿をＤＣＭ中で１時間、超音波処理した。ＤＣＭをオイルより静かに移し、次いで、白色の粉体が得られるまで、オイルをエーテル中で超音波処理した。固体を遠心により回収し、エーテルで数回洗浄し、アルゴン下で乾燥した（０．２３ｇ、３６％）。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、５００ＭＨｚ）δ１．８７（ｍ、２Ｈ）、１．８９（ｓ、３Ｈ）、３．３４（ｔ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．４８（ｔ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）、５．４０（ｓ、１Ｈ）、５．６５（ｓ、１Ｈ）、６．０３（ｓ、２Ｈ）、７．５５（ｍ、３Ｈ）、７．７６（ｄ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、１Ｈ）、８．２５（ｄ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、２Ｈ）、８．９６（ｄ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、１Ｈ）。
【０１１９】
＜例４＞
【０１２０】
【化５０】
0005706686.tif 000051
＜化合物１０＞ジクロロメタン（２００ｍＬ）中のＮ，Ｎ−ジ−ｂｏｃ−リジン（ジシクロヘキシルアンモニウム）塩（４．２ｇ、８．０ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）された溶液に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（１．８ｇ、９．６ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール水和物（１．３ｇ、９．６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．３ｍＬ、９．６ｍｍｏｌ）を加えた。０℃で３０分間撹拌後、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（１．７ｇ、９．６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．３ｍＬ、９．６ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を８時間撹拌し、次いで、飽和ＮａＨＣＯ３（３×７５ｍＬ）で洗浄した。ＤＣＭ層をＭｇＳＯ４で乾燥し、真空中において体積を減少させ、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中２％〜２０％メタノール）で精製し、化合物６を与えた。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．７１（１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）。適当な画分を貯めて、約５ｍＬに濃縮し（重合を避けるため乾燥させない）、次いで、１．２５ＭのメタノールＨＣｌ（３０ｍＬ）を加え、反応物を４８時間撹拌し、真空中で濃縮して、１０を白色の発泡体として与えた（２．１ｇ、７８％）。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、５００ＭＨｚ）δ１．４４（ｐ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、２Ｈ）、１．７１（ｐ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、２Ｈ）、１．７８（ｐ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、２Ｈ）、１．９０（ｍ、２Ｈ）、１．９２（ｓ、３Ｈ）、３．００（ｔ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．２９（ｍ、４Ｈ）、３．９５（ｔ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、１Ｈ）、５．４４（ｓ、１Ｈ）、５．６７（ｓ、１Ｈ）。
【０１２１】
＜化合物３４＞
化合物１０（０．４ｇ、１．２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）およびトリエチルアミン（０．９ｍＬ、６．４ｍｍｏｌ）の溶液中に懸濁し、０℃に冷却した。次いで、イソニコチン酸（０．４ｇ、３．２ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．７３ｇ、３．８ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール水和物（０．５１ｇ、３．８ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．９ｍＬ、６．４ｍｍｏｌ）を加えた。０℃で１時間撹拌後、固体が溶解するのを助けるため反応物を３時間、超音波処理した。飽和ＮａＨＣＯ３（３×７５ｍＬ）で洗浄後、ＤＣＭ層をＭｇＳＯ４で乾燥し、真空中において体積を減少させ、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中２％〜２０％メタノール、１％トリエチルアミンで事前処理したシリカゲル）で精製し、化合物３４（１９ｍｇ、３％）を与えた。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５９（１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ、トリエチルアミンで事前処理したプレート）。
【０１２２】
＜化合物Ｐ−２＞２−ブロモメチルフェニルボロン酸（０．０２ｇ、０．１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１ｍＬ）中の化合物３４（１８．７ｍｇ、４０μｍｏｌ）の溶液に加えた。反応物を５５℃で７２時間撹拌した。ジエチルエーテル（２０ｍＬ）を加え、生成物をオイルとして分離した。溶媒を静かに移し、残ったオイルがベージュ色の粉体となるまでオイルをエーテル中で超音波処理した。固体を遠心により回収し、エーテルで数回洗浄し、アルゴン下で乾燥した（３５ｍｇ、９６％）。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、５００ＭＨｚ）δ１．４６（ｍ、２Ｈ）、１．６９（ｍ、４Ｈ）、１．８６（ｓ、３Ｈ）、１．９０（ｍ、２Ｈ）、３．２２（ｍ、４Ｈ）、３．４４（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、４．４２（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．３８（ｓ、１Ｈ）、５．６１（ｓ、１Ｈ）、６．０２（ｓ、２Ｈ）、６．０３（ｓ、２Ｈ）、７．５６（ｍ、６Ｈ）、７．７６（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、８．２３（ｄ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）、８．２８（ｄ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）、８．９７（ｍ、４Ｈ）。
【０１２３】
＜例５＞
【０１２４】
【化５１】
0005706686.tif 000052
＜例６＞
【０１２５】
【化５２】
0005706686.tif 000053
＜例７＞
＜センサーの調製および試験＞
消光体であるＰ−１を、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド（１００ｍｇ）およびＮ，Ｎ’−メチレンビスメタクリルアミド（２ｍｇ）を含有する保存液の４１．４μＬ中に溶解した。次いで、この消光体溶液（２０．７μＬ）を、ＨＰＴＳ−トリＣｙｓ−ＭＡ（５０μＬの２ｍＭ水溶液）、ＨＣｌ（２０μＬの１００ｍＭ溶液）、２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二塩酸塩（１０μＬの４０ｍｇ／ｍＬ溶液）およびＤＩ水（９９．３μＬ）を含有する溶液に加えた。次いで、３７℃で２４時間加熱してヒドロゲルを形成することで、光ファイバーセンサーのチップ上でこの溶液の幾つかを重合した。
【０１２６】
センサーを、０ｍｇ／ｄＬ〜４００ｍｇ／ｄＬの範囲の異なるグルコース濃度を含有する溶液中に配置し、センサーを試験した。光ファイバーのチップにおけるヒドロゲル指示化学物質は４７０ｎｍの波長における光で励起された。蛍光発光を５２０〜７００ｎｍの間で測定した。結果を図１に図解する。
【０１２７】
明瞭性および理解の目的のために、かなり詳しく本発明を記載したが、本発明の真の範囲より逸脱することなく、形態および詳細を種々に変えることができると当業者には分かるであろう。上で参照される全ての図、表および付属書ならびに特許、出願および公開が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
0005706686.tif 000073