(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）で表される化合物。
【化１】
0005682850.tif 000013
（Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素原子又はアルキル基を示す。）
【請求項２】
前記式（１）中のＲ１、Ｒ２が、それぞれ独立に、水素原子、メチル基、又はエチル基を示す、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
下記式で表される、請求項１又は２に記載の化合物。
【化２】
0005682850.tif 000014
【請求項４】
請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の化合物を有効成分とする標識試薬。
【請求項５】
標識された糖鎖試料の調製方法であって、
（ａ）糖鎖を含む試料を、糖鎖を捕捉するための官能基としてヒドラジド基又はアミノオキシ基を有する担体に接触させ、当該糖鎖のアルデヒド基と当該担体のヒドラジド基又はアミノオキシ基とを反応させることにより、当該糖鎖を当該担体に捕捉する工程、
（ｂ）糖鎖を捕捉した担体を洗浄する工程、及び
（ｃ）糖鎖を捕捉した担体に請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の化合物を接触させて、当該担体から糖鎖を遊離させると同時に、前記化合物を糖鎖に結合させる工程、
を含む方法。
【請求項６】
前記担体が下記の式（２）で表される架橋型ポリマー構造を有する高分子物質により被覆されているものである、請求項５に記載の方法。
【化３】
0005682850.tif 000015
（Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示し、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は、それぞれ独立に、Ｈ、ＣＨ３、又は炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ、ｎは、それぞれ独立に、モノマーユニット数を示す。）
【請求項７】
前記担体が下記の式（３）で表される架橋型ポリマー構造を有する高分子物質により被覆されているものである、請求項６に記載の方法。
【化４】
0005682850.tif 000016
（ｍ、ｎは、それぞれ独立に、モノマーユニット数を示す。）
【請求項８】
糖鎖の分析方法であって、請求項５から７のいずれかに記載の方法により調製された標識された糖鎖試料を質量分析に供して糖鎖を検出する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖試料を標識するための新規な化合物、並びに当該化合物を利用した糖鎖試料の調製方法及び糖鎖の分析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖、糖タンパク、糖ペプチド、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク、核酸、脂質などといった生体高分子は、医学、細胞工学、臓器工学などのバイオテクノロジー分野において重要な役割を担っており、これら物質による生体反応の制御機構を明らかにすることはバイオテクノロジー分野の発展に繋がることになる。【０００３】
糖鎖は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸などの単糖及びこれらの誘導体がグリコシド結合によって鎖状に結合した分子の総称である。生体高分子の中でも、糖鎖は、非常に多様性に富んでおり、天然に存在する生物が有する様々な機能、例えば、細胞間情報伝達や、タンパク質の機能や相互作用の調整などに深く関わっていることが明らかになりつつある。【０００４】
糖鎖は生体内でタンパク質や脂質などに結合した複合糖質として存在することが多い。糖鎖を有する生体高分子としては、例えば、細胞の安定化に寄与する植物細胞の細胞壁のプロテオグリカン、細胞の分化、増殖、接着、移動等に影響を与える糖脂質、及び細胞間相互作用や細胞認識に関与している糖タンパク質等が挙げられる。これらの生体高分子に含まれる糖鎖が、この生体高分子と互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あるいは阻害しあいながら高度で精密な生体反応を制御する機構が次第に明らかにされつつある。このような糖鎖と細胞の分化増殖、細胞接着、免疫、及び細胞の癌化との関係が明確にされれば、この糖鎖工学と、医学、細胞工学、あるいは臓器工学とを密接に関連させて新たな展開を図ることが期待できる。【０００５】
糖タンパク質性医薬品では、その糖鎖が生物活性発現等に重要な役割を担っている場合が多い。したがって、糖タンパク質性医薬品の品質管理のパラメーターとして、糖鎖の評価はきわめて重要である。特に抗体医薬品については、その糖鎖構造が抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を左右するとの報告がされており、糖鎖構造解析の重要性が高まっている。【０００６】
このため、近年、糖鎖構造を迅速、簡便、かつ精度高く解析する方法が求められるようになり、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、核磁気共鳴法、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ法）、質量分析法、レクチンアレイ法などの多種多様の方法により糖鎖解析が行われている。【０００７】
これら種々の手法を用いて糖鎖を解析するためには、あらかじめ生体試料中に含まれるタンパク質、ペプチド、脂質、核酸などと糖鎖を分離・精製することが必要である。しかしながら、これら糖鎖の精製や標識化は時間と工数がかかり、一度に多種多量の試料を調製するのは困難を要する。【０００８】
この問題を解決する技術として、糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基（例えば、ヒドラジド基やアミノオキシ基）を持つ糖鎖捕捉物質を利用して糖鎖試料を調製する方法が報告されている（特許文献１）。この方法においては、糖鎖捕捉物質に捕捉された糖鎖を遊離し、標識した上で質量分析や高速液体クロマトグラフィーによる分析に供する。そして、特に、質量分析に供する場合には、分析対象である糖鎖のイオン化効率を高めるための標識試薬として、下記の構造を有する化合物（Ｎ−Ａｍｉｎｏｏｘｙａｃｅｔｙｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈｙｌ−（ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ）；以下、「ａｏＷＲ」と称する）が用いられている。【０００９】
【化１】
0005682850.tif 000002
【００１０】
ａｏＷＲは末端にアミノオキシ基を有し、このアミノオキシ基が糖鎖捕捉物質と糖鎖との間のヒドラゾン結合又はオキシム結合に作用する。そして、ヒドラゾン−オキシム交換反応又はオキシム−オキシム交換反応により、糖鎖捕捉物質から糖鎖が遊離すると同時に、ａｏＷＲが糖鎖に結合することができる。このため効率的な糖鎖の標識が可能となるという利点を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００８／０１８１７０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、糖鎖捕捉物質を利用して調製した糖鎖試料を質量分析により分析するに際して、より効率的な分析を可能とする標識化合物を提供することにある。さらなる本発明の目的は、当該標識化合物を利用した糖鎖試料の調製方法及び糖鎖の分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、下記構造を有する化合物を見出した。【００１４】
【化２】
0005682850.tif 000003
【００１５】
式（１）中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素原子又はアルキル基を示す。この化合物は、従来のａｏＷＲのメチルエステル（−ＣＯ−ＣＨ３）基がアミド基（−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２）に変換された化合物であるが、その蛍光強度を測定したところ、例えば、前記アミド基が−ＣＯ−ＮＨ２である化合物（Ｎ−Ａｍｉｎｏｏｘｙａｃｅｔｙｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈｙｌ−（ａｒｇｉｎｉｎｅ  ａｍｉｄｅ）；以下、「ａｏＷＲ−ＮＨ２」と称する）では、ａｏＷＲと比較して約２．７倍もの顕著な蛍光強度を示した（図１、図２）。また、糖鎖捕捉物質による糖鎖試料の調製において、標識試薬として加湿処理したａｏＷＲを用いた場合には、質量分析により糖鎖を検出する際に、糖鎖のピークの近傍に標識試薬の分解産物のピークが生じたが、上記化合物のうち、例えば、ａｏＷＲ−ＮＨ２を用いた場合には、このような分解産物のピークが生じなかった（図３）。【００１６】
以上から、本発明者らは、上記式（１）で表される化合物が、イオン化効率の向上のみならず、蛍光強度や保存安定性に優れ、糖鎖捕捉物質による糖鎖試料の調製及び糖鎖試料の検出において極めて有用な化合物であることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１７】
従って、本発明は、上記式（１）で表される新規化合物、当該化合物を有効成分とする標識試薬、並びに当該化合物を利用した糖鎖試料の調製方法及び糖鎖の分析方法に関するものであり、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。【００１８】
［１］  下記の式（１）で表される化合物。【００１９】
【化３】
0005682850.tif 000004
【００２０】
（Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素原子又はアルキル基を示す。）
［２］  前記式（１）中のＲ１、Ｒ２が、それぞれ独立に、水素原子、メチル基、又はエチル基を示す、［１］に記載の化合物。【００２１】
［３］  下記式で表される、［１］又は［２］に記載の化合物。【００２２】
【化４】
0005682850.tif 000005
【００２３】
［４］  ［１］〜［３］のうちのいずれかに記載の化合物を有効成分とする標識試薬。【００２４】
［５］  標識された糖鎖試料の調製方法であって、
（ａ）糖鎖を含む試料を、糖鎖を捕捉するための官能基としてヒドラジド基又はアミノオキシ基を有する担体に接触させ、当該糖鎖のアルデヒド基と当該担体のヒドラジド基又はアミノオキシ基とを反応させることにより、当該糖鎖を当該担体に捕捉する工程、
（ｂ）糖鎖を捕捉した担体を洗浄する工程、及び
（ｃ）糖鎖を捕捉した担体に［１］〜［３］のうちのいずれかに記載の化合物を接触させて、当該担体から糖鎖を遊離させると同時に、前記化合物を糖鎖に結合させる工程、
を含む方法。【００２５】
［６］  前記担体が下記の式（２）で表される架橋型ポリマー構造を有する高分子物質により被覆されているものである、［５］に記載の方法。【００２６】
【化５】
0005682850.tif 000006
【００２７】
（Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示し、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は、それぞれ独立に、Ｈ、ＣＨ３、又は炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ、ｎは、それぞれ独立に、モノマーユニット数を示す。）
［７］  前記担体が下記の式（３）で表される架橋型ポリマー構造を有する高分子物質により被覆されているものである、［６］に記載の方法。【００２８】
【化６】
0005682850.tif 000007
【００２９】
（ｍ、ｎは、それぞれ独立に、モノマーユニット数を示す。）
［８］  糖鎖の分析方法であって、［５］から［７］のいずれかに記載の方法により調製された標識された糖鎖試料を質量分析に供して糖鎖を検出する工程を含む方法。
【発明の効果】
【００３０】
本発明により、夾雑物の混入の多い未精製の生体試料から標識された糖鎖を効率的に調製することが可能となるとともに、こうして調製した標識された糖鎖を質量分析により効率的に検出することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＨＰＬＣ装置を用いてａｏＷＲ−ＮＨ２及びａｏＷＲの蛍光強度を検出した結果、ａｏＷＲ−ＮＨ２及びａｏＷＲの検出された蛍光のピークを示すグラフである。
【図２】図１において、ａｏＷＲ−ＮＨ２及びａｏＷＲの検出された蛍光のピーク面積値を示すグラフである。。
【図３】ａｏＷＲ−ＮＨ２又はａｏＷＲで標識された糖鎖試料を質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）により検出した結果を示す図である。図（上）は、加湿処理しなかったａｏＷＲを検出した結果であり、図（中）は、加湿処理したａｏＷＲを検出した結果であり、図（下）は、加湿処理したａｏＷＲ−ＮＨ２を検出した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、下記の式（１）で表される新規化合物を提供する。
【００３３】
【化７】
0005682850.tif 000008
【００３４】
式（１）中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素原子又はアルキル基を示す。前記Ｒ１及び／又はＲ２がアルキル基である場合にはイオン化効率が高くなるため、本発明の化合物で標識された糖鎖試料を下記の質量分析に供した場合に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳでの分析が更に容易になる傾向にある。前記アルキル基としては、メチル基又はエチル基が好ましい。他方、前記Ｒ１及び／又はＲ２が水素原子である場合には、一般に市販されている試薬をそのまま使用して合成することができるため製造工程の短縮化が容易となり、コストの低減を行うことが可能となる。
【００３５】
本発明の化合物としては、コスト低減の観点からは、Ｒ１及びＲ２がいずれも水素原子であることが好ましく、ａｏＷＲ−ＮＨ２と名付けられた下記の構造を有する化合物が好ましい。
【００３６】
【化８】
0005682850.tif 000009
【００３７】
前記式（１）で表される本発明の化合物は、糖鎖に結合すると、質量分析の際に、糖鎖のイオン化効率を高める作用を発揮するが、さらに、本実施例１に示すように極めて高い蛍光強度を発揮することもできる。本発明の化合物自体の蛍光強度は、驚くべきことに、例えば、ａｏＷＲ−ＮＨ２では、従来のａｏＷＲの約２．７倍にも達する。従って、本発明は、イオン化効率を高めるための、又は蛍光特性を付与するための、本発明の化合物を有効成分とする標識試薬をも提供するものである。
【００３８】
本発明の化合物は、糖鎖を捕捉するための官能基を有する担体を用いた糖鎖の調製方法において、担体に捕捉された糖鎖の遊離及び標識化に用いることができる。従って、本発明は、標識された糖鎖試料の調製方法であって、（ａ）糖鎖を含む試料を、糖鎖を捕捉するための官能基としてヒドラジド基又はアミノオキシ基を有する担体に接触させ、当該糖鎖のアルデヒド基と当該担体のヒドラジド基又はアミノオキシ基とを反応させることにより、当該糖鎖を当該担体に捕捉する工程、（ｂ）糖鎖を捕捉した担体を洗浄する工程、及び（ｃ）糖鎖を捕捉した担体に本発明の化合物を接触させて、当該担体から糖鎖を遊離させると同時に、前記本発明の化合物を糖鎖に結合させて本発明の化合物で標識された糖鎖試料を得る工程、を含む方法を提供する。
【００３９】
工程（ａ）に用いる「担体」としては、ポリマー粒子を用いることが好ましい。ポリマー粒子が固体粒子あるいはゲル粒子であれば、ポリマー粒子に糖鎖を捕捉させたのち、遠心分離やろ過などの手段によって容易に回収することができる。また、ポリマー粒子をカラムに充填して用いることも可能である。カラムに充填して用いる方法は、特に連続操作化の観点から重要となる。反応容器としてフィルタープレート（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  Ｓｏｌｖｉｎｅｒｔ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ）を用いることにより、複数のサンプルを同時に処理することが可能となり、例えばゲルろ過に代表されるカラム操作による従来の精製手段と比較して、糖鎖精製のスループットが大幅に向上される。また、当該粒子として磁性体ビーズを用いれば、磁力を使って容器壁面等にビーズを集積できるため、ビーズの洗浄を容易に行うことができる。
【００４０】
ポリマー粒子の形状は特に限定しないが、球状又はそれに類する形状が好ましい。ポリマー粒子が球状の場合、平均粒径は好ましくは０．０５〜１０００μｍであり、より好ましくは０．０５〜２００μｍであり、さらに好ましくは０．１〜２００μｍであり、最も好ましくは０．１〜１００μｍである。平均粒径が下限値未満では、ポリマー粒子をカラムに充填して用いる際、通液性が悪くなるために大きな圧力を加える必要がある。また、ポリマー粒子を遠心分離やろ過で回収することも困難となる。平均粒径が上限値を超えると、ポリマー粒子と試料溶液の接触面積が少なくなり、糖鎖捕捉の効率が低下する。
【００４１】
担体は、少なくとも表面の一部に糖鎖を捕捉するための官能基として、ヒドラジド基又はアミノオキシ基を有している。これら官能基は、糖鎖のアルデヒド基と反応して、糖鎖を捕捉することができる。
【００４２】
糖鎖を捕捉するための担体としては、下記式（２）又は式（３）で表される架橋型ポリマー構造を有する架橋型ポリマー（高分子物質）、或いは、前記高分子物質により被覆されたものを担体として用いることが特に好ましい。
【００４３】
【化９】
0005682850.tif 000010
【００４４】
（Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示し、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は、それぞれ独立に、Ｈ、ＣＨ３、又は炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ、ｎは、それぞれ独立に、モノマーユニット数を示す。）
架橋型ポリマーとして、例えば、下記の構造を有する架橋型ポリマーを挙げることができる。
【００４５】
【化１０】
0005682850.tif 000011
【００４６】
（ｍ、ｎは、それぞれ独立に、モノマーユニット数を示す。）
本発明においては、ヒドラジド基含有ポリマー粒子である「ＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（Ｒ）」（住友ベークライト株式会社製、＃ＢＳ−４５６０３）を好適に用いることができる。
【００４７】
糖鎖を捕捉するポリマー粒子によって糖鎖を捕捉する際の反応系のｐＨは、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜７であり、さらに好ましくは２〜６である。ｐＨ調整のためには、各種緩衝液を用いることができる。糖鎖捕捉時の温度は、好ましくは４〜９０℃、より好ましくは４〜７０℃、さらに好ましくは３０〜８０℃であり、最も好ましくは４０〜８０℃である。反応時間は適宜設定することができる。ポリマー粒子をカラムに充填して試料溶液を通過させてもよい。
【００４８】
工程（ｂ）における、糖鎖を捕捉した担体の洗浄により、担体に捕捉された物質のうち糖鎖以外の物質（非特異的に吸着した物質）を除去することができる。
【００４９】
糖鎖以外の物質を除去する方法としては、疎水結合を解離する能力のあるカオトロピック試薬であるグアニジン水溶液で洗浄する方法や、純水や水溶性緩衝液（例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液等）で洗浄する方法を用いることができる。洗浄工程における洗浄条件としては、温度が４〜４０℃、洗浄時間が１０秒〜３０分である。洗浄方法としては、担体がポリマー粒子の場合は、洗浄液に浸漬し、洗浄液の交換を繰り返すことで洗浄することができる。
【００５０】
具体的には、遠沈管やチューブにポリマー粒子を入れ、洗浄液を加え、振とうの後、遠心操作によりポリマー粒子を沈殿させて、上清を除去する操作を繰り返すことにより洗浄する。例えば、遠心チューブ内にポリマー粒子を入れ、洗浄液を加え、ポリマー粒子を自然沈降、又は、遠心分離により強制的に沈降させた後、上清を除去する操作を繰り返すことで洗浄することができる。前記洗浄操作は３〜６回行うことが好ましい。磁性ビーズを用いる場合には、遠心操作は不要であり、簡便である。
【００５１】
また、チューブ状の容器であって、底面部に、液体透過可能で該ビーズが不透過な孔径を有するフィルターを装着するフィルターチューブを用いることも可能である。該フィルターチューブにポリマー粒子を入れて使用することで、洗浄に要した洗浄液を、フィルターを介して除去することが可能となり、前記の遠心操作後の上清除去の工程が必要なくなり、作業性の向上を図ることができる。
【００５２】
また、６〜３８４穴のマルチウェルプレートの底部が前記フィルターを装着したものが各種市販されており、これらのプレートを用いることでハイスループット化することが可能である。特に９６穴マルチウェルプレートは、溶液分注機器、吸引除去システム、及びプレートの搬送システム等が開発されており、ハイスループット化に最適である。
【００５３】
連続式にて糖鎖捕捉反応を行った場合には、洗浄処理は、カラムに洗浄溶液を通して糖鎖捕捉反応から連続的に処理してもよい。また、マルチプレートを用いた場合には、ろ過操作あるいは遠心操作により糖鎖を捕捉した担体以外の物質を除去してもよい。
【００５４】
なお、担体上の余剰官能基は、例えば、無水酢酸などを利用してキャッピングすることができる。
【００５５】
工程（ｃ）では、糖鎖を捕捉した担体に本発明の化合物を接触させて、当該担体から糖鎖を遊離させると同時に、本発明の化合物を糖鎖に結合させる。糖鎖を捕捉するための担体としてヒドラジド基を有する担体を用いた場合には、本発明の化合物の末端に存在するアミノオキシ基が、担体と糖鎖の間のヒドラゾン結合に作用し、ヒドラジド−オキシム交換反応により、本工程が達成される。糖鎖を捕捉するための担体としてアミノオキシ基を有する担体を用いた場合には、本発明の化合物の末端に存在するアミノオキシ基が、担体と糖鎖の間のオキシム結合に作用し、オキシム−オキシム交換反応により、本工程が達成される。このように本発明の化合物によれば、一つの処理で、担体からの糖鎖の遊離と糖鎖の標識を行うことが可能となる。
【００５６】
交換反応時の反応液のｐＨは、ｐＨ２〜７が好ましく、ｐＨ３〜６がより好ましく、ｐＨ３．５〜５．５が最も好ましい。酢酸／アセトニトリル溶液を加えることにより、反応液を上記のｐＨに調整することができる。交換反応時の温度は、５０〜９５℃が好ましく、６０〜９０℃がより好ましく、７０〜９０℃が最も好ましい。交換反応時、反応容器を開放して加熱操作を行うことにより、溶媒を蒸発させながら反応を進め、最終的に乾固させることにより、効率よく交換反応を行うことができる。
【００５７】
回収した標識された糖鎖溶液はそのまま、あるいは、過剰に含まれる標識化合物を除去したのち、質量分析法などの分析手段によって分析することができる。
【００５８】
また、本発明は、糖鎖の分析方法であって、上記方法により調製された標識された糖鎖試料を質量分析に供して糖鎖を検出する工程を含む方法を提供する。実施例２に示すように、本発明の化合物（ａｏＷＲ−ＮＨ２）で標識された糖鎖は、質量分析に供した場合に、その分解産物のピークが糖鎖のピークの近傍に検出されない。このため質量分析を利用した糖鎖の検出を効率的に実施することが可能となる。質量分析の手法としては、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを好適に利用することができる。質量分析の結果得られたマススペクトルは、解析ソフト等を用いて解析することができる。質量電荷比（ｍ／ｚ値）を読み取ることにより、試料糖鎖のピークを検出することができる。さらに、質量電荷比やピーク強度（ピーク高さ、ピーク面積など任意の指標）から、糖鎖の定量や糖鎖の構造を分析することができる。糖鎖の分析においては、各種データベース（例えば、ＧｌｙｃｏＳｕｉｔｅなど）を利用することができる。
【実施例】
【００５９】
以下、合成例、実施例、及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は、以下の合成例や実施例に限定されるものではない。
［合成例１］  ａｏＷＲ−ＮＨ２の合成
合成スキームを以下に示す。【００６０】
【化１１】
0005682850.tif 000012
【００６１】
Ｂｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ（メルク：８５３０３８、４．６６ｇ）にＴＨＦ（４０ｍＬ）を添加し、溶液を−５０℃に冷却した。前記溶液に４−メチルモルホリン（１．８６ｇ）とクロロギ酸イソブチル（２．５１ｇ）を添加し、−４０℃で１０分間、その後０℃に昇温しながら３０分間攪拌することで、混合酸無水物（Ａ）を調製した。次に、Ｈ−Ａｒｇ−ＮＨ２・２ＨＣｌ（渡辺化学工業：Ｋ００１２５、４．５３ｇ）にメタノール（４０ｍＬ）を添加して５℃に冷却し、トリエチルアミン（１．８６ｇ）を添加して調製した溶液を（Ａ）に添加した。０℃で１０分間、その後室温に昇温しながら９０分間攪拌し、反応溶液を減圧濃縮することで、化合物１（１５．９６ｇ）を得た。【００６２】
化合物１（１５．９６ｇ）にメタノール（２６ｍＬ）を添加して０℃に冷却し、続いて４Ｍ  ＨＣｌ／ジオキサン溶液（２６ｍＬ）を添加した。０℃にて３０分間、その後室温に昇温しながら３時間撹拌し、反応溶液を減圧濃縮することで、化合物２（１３．８２ｇ）を得た。【００６３】
Ｂｏｃ−ａｍｉｎｏ−ｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（メルク：８５１０１７、２．４５ｇ）にＴＨＦ（４０ｍＬ）を添加し、溶液を−４０℃に冷却した。前記溶液に４−メチルモルホリン（１．５５ｇ）とクロロギ酸イソブチル（２．０９ｇ）を添加し、−３０℃で１５分間、その後０℃に昇温しながら３５分間攪拌することで、混合酸無水物（Ｂ）を調製した。次に、化合物２（１３．８２ｇ）に蒸留水（２０ｍＬ）を添加して５℃に冷却し、炭酸水素ナトリウム（１．２９ｇ）を添加して調製した溶液を（Ｂ）に添加した。５℃で１時間、その後室温に昇温しながら６時間攪拌し、反応溶液を減圧濃縮した。続いてＯＤＳ中圧クロマトグラフィーにより精製することで、化合物３（４．８２ｇ）を得た。【００６４】
化合物３（４．８２ｇ）にメタノール（１４．５ｍＬ）を添加して０℃に冷却し、続いて４Ｍ  ＨＣｌ／ジオキサン溶液（１４．５ｍＬ）を添加した。室温に昇温しながら２時間撹拌し、反応溶液を減圧濃縮した。得られた残留物３．９６ｇのうち３．２ｇをＯＤＳ中圧クロマトグラフィーにより精製することで、化合物４（ａｏＷＲ−ＮＨ２、１．２９ｇ）を得た。【００６５】
［実施例１］
２０ｍＭ  ａｏＷＲ及び２０ｍＭ  ａｏＷＲ−ＮＨ２について、ＨＰＬＣ装置としてＮｅｘｅｒａ（島津製作所）を用いて、以下の条件によりＨＰＬＣを実施し、それぞれの蛍光強度を測定した。【００６６】
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｇｌｙｃａｎ  １．７μｍ  ２．１ｘ１５０ｍｍ
溶媒Ａ：５０ｍＭ  ギ酸／アンモニア水溶液（ｐＨ４．４）
溶媒Ｂ：アセトニトリル
勾配：Ａ液  ２５％（０分）→Ａ液  ４２％（３８．５分）
カラム温度：６０℃→流速：０．５ｍＬ／分
Ｅｘ：２８０ｎｍ  Ｅｍ：３５０ｎｍ  インジェクト量：１μＬ
その結果、ａｏＷＲ−ＮＨ２は、ａｏＷＲと比較して、約２．７倍もの蛍光強度を示した（図１、図２）。【００６７】
［実施例２］
（糖タンパク質からのＮ−結合型糖鎖の遊離）
ヒト血清由来ＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ、Ｉ４５０６）４０ｍｇに、超純水２ｍＬ、１Ｍ重炭酸アンモニウム（和光純薬、０１７−０２８７５）水溶液及び１２０ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール、ＳＩＧＭＡ、Ｄ９７７９）水溶液を２００μＬずつ添加し、６０℃で３０分間反応させた。反応後、１２３ｍＭ  ＩＡＡ（ヨードアセトアミド、和光純薬、０９３−０２１５２）水溶液４００μＬを加えて遮光下、室温で１時間反応させた。続いて１６０００Ｕのトリプシン（ＳＩＧＭＡ、Ｔ０３０３）を４００μＬの１ｍＭ塩酸に溶解した溶液を全量添加し、３７℃で１．５時間反応させてタンパク質部分をペプチド断片化した。溶液を９０℃で１０分間加熱してトリプシンを失活させた後に、８０Ｕのペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ、１−３６５−１９３）による処理を行って糖鎖をペプチドから遊離させ、糖鎖溶液を得た。【００６８】
（Ｎ−結合型糖鎖の標識及び精製）
糖鎖捕捉用の担体であるヒドラジド基を有する粒子５ｍｇ（ＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（Ｒ））、住友ベークライト株式会社製、ＢＳ−４５６０３）が入ったディスポカラムに上記糖鎖溶液２０μＬ及び１８０μＬの２％酢酸／アセトニトリル溶液を加え、８０℃で１時間反応させた。反応は開放系で行い、溶媒が完全に蒸発し粒子が乾固した状態であることを目視で確認した。【００６９】
Ｎ−結合型糖鎖が結合した粒子を２Ｍグアニジン水溶液、水、及び１％トリエチルアミン／メタノール溶液にて洗浄後、１０％無水酢酸／メタノール溶液を添加し、室温で３０分間反応させ、未反応のヒドラジド基をキャッピングした。キャッピング後、１０ｍＭ塩酸、メタノール、及びジメチルスルホキシドにてビーズを洗浄した。【００７０】
続いて、シアル酸残基のカルボン酸のメチルエステル化を行った。５００ｍＭの１−メチル−３−ｐ−トリルトリアゼン（ＭＴＴ）（東京化成、Ｍ０６４１）／ジメチルスルホキシド溶液を１００μＬ加え、６０℃で１時間反応させた。反応後、メタノール及び水で洗浄した。【００７１】
最後に、粒子から糖鎖の切り出し及び標識反応を行った。ａｏＷＲ−ＮＨ２水溶液２０μＬ及び２％酢酸／アセトニトリル溶液１８０μＬを加え、８０℃で１時間反応させた。ａｏＷＲ−ＮＨ２水溶液は、加湿処理（粉末状態で湿度１００％、３７℃で１５時間放置）後、超純水を添加し、２０ｍＭの水溶液に調整した。反応は開放系で行い、溶媒が完全に蒸発し粒子が乾固した状態であることを目視で確認した。乾燥したビーズに２ｍＭ塩酸を５０μＬ加え、Ｎ−結合型糖鎖を回収した。【００７２】
（余剰標識試薬の除去）
回収した糖鎖溶液をアセトニトリルで１０倍に希釈した後に、シリカカラム（ＢｌｏｔＧｌｙｃｏキット付属品）に添加してシリカゲルに標識糖鎖を吸着させた。アセトニトリルにてカラムを洗浄後、超純水５０μＬにて標識糖鎖を回収した。
［比較例１］
標識にａｏＷＲを使用したこと、及び、乾燥したビーズに超純水を５０μＬ加え、Ｎ−結合型糖鎖を回収したこと以外は、実施例２と同様に精製を行った。
［比較例２］
標識にａｏＷＲ（加湿処理なし）を使用したこと、及び、乾燥したビーズに超純水を５０μＬ加え、Ｎ−結合型糖鎖を回収したこと以外は、実施例２と同様に精製を行った。【００７３】
（標識糖鎖の分析）
回収した標識糖鎖溶液をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（Ａｕｔｏｆｌｅｘ  ＩＩＩ  ｓｍａｒｔｂｅａｍ、  Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製）によりリフレクターモード、ポジティブイオンモードにて分析した。マトリックスには２，５−ジヒドロキシ安息香酸（Ｂｒｕｋｅｒ、２０１３４６）を用いた。【００７４】
図３に示した結果から明らかなように、ａｏＷＲでは加湿すると本来の質量電荷比よりも約１４小さい、メチルエステル基の加水分解が原因と思われる夾雑ピークが生じたが、前記官能基をアミド基に置換したａｏＷＲ−ＮＨ２では、夾雑ピークは生じなかった。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明によれば、生物学的試料から効率的に標識された糖鎖試料を調製することが可能となるとともに、調製された標識された糖鎖試料を質量分析などにより効率的に検出することが可能となる。従って、本発明は、糖鎖に関する試験研究の分野において広く利用可能であり、また、例えば、糖鎖を含む医薬品や食品の特性分析や品質管理などの分野にも応用可能である。
【要約】
下記構造を有する化合物を見出した。
【化１】
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（Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素原子又はアルキル基を示す。）【図２】
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【図３】
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【図１】
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