(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水不溶性担体の表面に、アミノ基を有する官能基が導入されており、
インターロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、モノサイトケモタクティックプロテイン１及びマクロファージ炎症性タンパク質１βからなる群から選択される１以上のサイトカインが吸着除去される、肝炎治療用のハイモビリティーグループタンパク吸着担体。
【請求項２】
前記官能基は、アミド結合を有する、請求項１記載のハイモビリティーグループタンパク吸着担体。
【請求項３】
前記官能基は、尿素結合及び／又はチオ尿素結合を有する、請求項１又は２記載のハイモビリティーグループタンパク吸着担体。  
【請求項４】
前記ハイモビリティーグループタンパクは、ＨＭＧＢ−１である、請求項１〜３のいずれか一項記載のハイモビリティーグループタンパク吸着担体。
【請求項５】
形状が、繊維、編地、フェルト、スポンジ、ビーズ又はネットである、請求項１〜４のいずれか一項記載のハイモビリティーグループタンパク吸着担体。  
【請求項６】
前記肝炎は、急性肝炎又は劇症肝炎である、請求項１〜５のいずれか一項記載のハイモビリティーグループタンパク吸着担体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項記載のハイモビリティーグループタンパク吸着担体が充填されている、肝炎治療用の血液循環カラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイモビリティーグループタンパク吸着担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝炎とは、肝臓に炎症が起こり発熱、黄疸、全身倦怠感などの症状を来たす疾患の総称であり、発症原因によって、ウイルス性肝炎（発症原因：Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型及びＧ型肝炎ウイルスの感染）、アルコール性肝炎（発症原因：飲酒）、薬剤性肝炎（発症原因：服用した薬剤）、自己免疫性肝炎（発症原因：免疫機構の異常、特に自己抗体等の産生）の４つに分類されている。
【０００３】
また肝炎は、発症の仕方や症状の経過から、１）突然的に発症し一過性の症状である急性肝炎、２）６ヶ月以上肝機能検査の異常が持続し、やがては肝硬変や肝細胞癌へと進行する恐れがある慢性肝炎、３）急性肝炎のうちの特殊な肝炎で、最初の症状が出てから８週間以内に肝性脳症を呈し、プロトロンビン時間が４０％以下となる劇症肝炎（集中治療を施しても救命率が２０％程度である重篤な肝炎）の３つに大きく分類されている。
【０００４】
慢性肝炎の治療では、肝硬変へ移行するのを食止め慢性肝炎の段階で治癒することが目標となるため、肝炎ウイルスの増殖を抑える抗ウイルス剤（インターフェロン、ラミブジン）及び肝臓の炎症を抑える肝庇護薬の投与が中心とされている。
【０００５】
急性肝炎の治療では、安静に保つことが基本となり、食欲がないときにはブドウ糖中心の点滴を行って栄養を与えて経過を観察して症状が治まるのを待つことになるが、劇症肝炎の治療では、人工肝補助療法が中心となり、凝固因子を補って出血傾向を改善する血漿交換と肝臓の解毒作用を補う血液濾過透析等を併用する血液浄化療法がなされている。
【０００６】
肝炎治療における血液浄化療法では、肝炎患者の血液からビリルビン、胆汁酸、クレアチニン、芳香族アミノ酸を除去することが主な目的とされ、血液濾過透析では効率的な除去が困難なビリルビンについては、ビリルビン吸着剤やビリルビン除去方法が考案され報告されている（特許文献１〜３）。
【０００７】
一方、最近になって、急性肝炎や劇症肝炎等の患者や動物モデルの血液中では、ハイモビリティーグループタンパクの濃度が上昇していることが報告された（非特許文献１〜４）。ハイモビリティーグループタンパクとは、真核細胞内に存在する一群の非ヒストン性のＤＮＡ結合タンパク質のことであり、ＨＭＧＢ−１、ＨＭＧＢ−２、ＨＭＧＢ−３、ＨＭＧ−１Ｌ１０、ＨＭＧ−４Ｌ、ＳＰ１００−ＨＭＧ、ＨＭＧＢ−１４、ＨＭＧＢ−１７及びＨＭＧ−Ｉ（Ｙ）がハイモビリティーグループタンパクとして知られている。
【０００８】
当初、ハイモビリティーグループタンパクは、細胞内でＤＮＡに結合して転写の促進や細胞の増殖などに関与する因子であると考えられていたが、ＨＭＧＢ−１が神経突起を伸張させる因子であるアンフォテリンと同一の分子であり、単球やマクロファージを刺激してインターロイキン−１β又はインターロイキン−６に代表される炎症性サイトカインを誘導する性質を有していることが報告されたため、生体内において幅広い作用を有する可能性が示唆されている（非特許文献５、６及び７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開昭６３−２７５３５１号公報
【特許文献２】特開平０２−２８６１７３号公報
【特許文献３】特許第３２５９８６０号公報
【特許文献４】特開２００７−２９５１１号公報
【特許文献５】特開２００５−２９６０３３号公報
【特許文献６】国際公開第０１／０７４４２０号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｚｈａｎｇら、Ｊ  Ｈｕａｚｈｏｎｇ  Ｕｎｉｖ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ.、２００８年２月、第２８巻、第１号、ｐ．５２−５５
【非特許文献２】高野ら、日本消化器外科学会雑誌、２００８年７月、第４１巻、第７号、ｐ．１２３０
【非特許文献３】Ｌｉｕら、Ｚｈｏｎｇｈｕａ  Ｇａｎ  Ｚａｎｇ  Ｂｉｎｇ  Ｚａ  Ｚｈｉ.、２００７年１１月、第１５巻、第１１号、ｐ．８１２−８１５
【非特許文献４】Ｔａｋａｎｏら、Ｓｈｏｃｋ．、２０１０年３月、ｐ．２３
【非特許文献５】Ｊａｃｅｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００１年、第４０巻、第２６号、ｐ．７８６０−７８６７
【非特許文献６】Ａｇｎｅｌｌｏら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ.、２００２年５月、第２１巻、第２１号、ｐ．２３１−２３６
【非特許文献７】Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．、２００３年４月、第４８巻、第４号、ｐ．９７１−９８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、既存の血液浄化療法による肝炎の治療効果は満足できるものではなく、特に劇症肝炎の患者に既存の血液浄化療法を施したとしても、患者が死亡してしまう例が少なくなかった。さらに、血漿交換による治療ではウイルス感染の危険性が伴うことから、より治療効果の高い、安全な治療方法の開発が切望されている。
【００１２】
一方で、ハイモビリティーグループタンパクを吸着する材料等は報告されているものの（特許文献４〜６）、ハイモビリティーグループタンパクの吸着除去が肝炎の治療に有効であることを示唆している報告はなく、ＨＭＧＢ−１に加えて炎症性サイトカインを併せて吸着除去できる担体については開示も示唆もされていない。
【００１３】
そこで本発明は、体液中のハイモビリティーグループタンパクに加えて炎症性サイトカインを併せて吸着除去し、血液浄化療法による肝炎の治療に使用できるハイモビリティーグループタンパク吸着担体及び血液循環カラムを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（７）に記載した肝炎治療用のハイモビリティーグループタンパク吸着担体及び血液循環カラムを提供する。
（１）  水不溶性担体の表面に、アミノ基を有する官能基が導入されている、肝炎治療用のハイモビリティーグループタンパク吸着担体。
（２）  上記官能基は、アミド結合を有する、上記（１）記載のハイモビリティーグループタンパク吸着担体。
（３）  上記官能基は、尿素結合及び／又はチオ尿素結合を有する、上記（１）又は（２）記載のハイモビリティーグループタンパク吸着担体。
（４）  上記ハイモビリティーグループタンパクは、ＨＭＧＢ−１である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のハイモビリティーグループタンパク吸着担体。
（５）  インターロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、モノサイトケモタクティックプロテイン１及びマクロファージ炎症性タンパク質１βからなる群から選択される１以上のサイトカインが吸着除去される、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のハイモビリティーグループタンパク吸着担体。
（６）  形状が、繊維、編地、フェルト、スポンジ、ビーズ又はネットである、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のハイモビリティーグループタンパク吸着担体。
（７）  上記肝炎は、急性肝炎又は劇症肝炎である、上記（１）〜（６）のいずれかに記載のハイモビリティーグループタンパク吸着担体。
（８）  上記（１）〜（７）のいずれかに記載のハイモビリティーグループタンパク吸着担体が充填されている、肝炎治療用の血液循環カラム。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のハイモビリティーグループタンパク吸着担体によれば、体液中のハイモビリティーグループタンパク及びハイモビリティーグループタンパクによって誘導される炎症性サイトカイン等を高率的に吸着除去することができ、血液浄化療法による肝炎患者の治療に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ブタ肝炎モデルの生存曲線を示す図である。
【図２】ブタ肝炎モデルの血液サンプル中の、ＨＭＧＢ−１濃度の経時変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の肝炎治療用のハイモビリティーグループタンパク吸着担体は、水不溶性担体の表面に、アミノ基を有する官能基が導入されていることを特徴とする。
【００１８】
「肝炎」とは、肝臓に炎症を呈している病態をいい、例えば、薬剤性肝炎、アルコール性肝炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎若しくはＥ型肝炎、又は、敗血症（グラム陰性菌由来の敗血症、グラム陽性菌由来の敗血症、培養陰性敗血症、真菌性敗血症）、インフルエンザ、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺傷害（ＡＬＩ）膵炎、炎症性腸炎（潰瘍性大腸炎、クローン病）、血液製剤の輸血、臓器移植、臓器移植後の再灌流障害、胆嚢炎、胆管炎若しくは新生児血液型不適合により発症する肝炎が挙げられるが、上記のハイモビリティーグループタンパク吸着担体は、上記の肝炎のうち急性肝炎又は劇症肝炎の治療に用いられることが好ましい。
【００１９】
「ハイモビリティーグループタンパク」（以下、「ＨＭＧタンパク」）とは、体液中に存在する非ヒストン性のＤＮＡ結合タンパクであり、例えば、ＨＭＧＢ−１、ＨＭＧＢ−２、ＨＭＧＢ−３、ＨＭＧ−１Ｌ１０、ＨＭＧ−４Ｌ、ＳＰ１００−ＨＭＧ、ＨＭＧＢ−１４、ＨＭＧＢ−１７又はＨＭＧ−Ｉ（Ｙ）が挙げられるが、肝炎治療を目的とする場合には、体液中からＨＭＧＢ−１が除去されることが好ましい。
【００２０】
肝炎治療効果を高めるためには、ＨＭＧタンパクと併せて、ＨＭＧタンパクによって誘導されるタンパク及び炎症によって誘導されるタンパクが体液中から除去されることが好ましい。
【００２１】
ＨＭＧタンパクによって誘導されるタンパク及び炎症によって誘導されるタンパクとしては、例えば、ＴＮＦα、インターロイキン（以下、「ＩＬ」）−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−γ、モノサイトケモタクティックプロテイン１（以下、「ＭＣＰ−１」）、マクロファージ炎症性タンパク質（以下、「ＭＩＰ」）−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２、ＭＩＦ又はＰＡＦが挙げられるが、肝炎治療を目的とする場合には、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１及びＭＩＰ−１βが体液中から除去されることが好ましい。
【００２２】
「体液」とは、血液、血漿、血清、腹水若しくはリンパ液又はこれらから得られた分画成分若しくは生体由来の液体成分をいう。
【００２３】
「水不溶性担体」としては、例えば、ポリエチレン（以下、「ＰＥ」）若しくはポリプロピレン（以下、「ＰＰ」）等のポリオレフィン、ポリエチレンテレフタレート若しくはポリブチレンテレフタレート等のポリエステル、ポリ（ｐ−フェニレンエーテルスルホン）等のポリスルホン系重合体、ポリエーテルイミド、ポリイミド、ポリアミド、ポリエーテル、ポリフェニレンサルファイド、ポリスチレン（以下、「ＰＳ」）又はポリアクリロニトリル系ポリマーあるいはこれら高分子化合物の誘導体又はこれら高分子化合物をブレンド、アロイ化したものが挙げられるが、アミドメチル化法等による水不溶性担体の表面の修飾容易性の観点からはＰＳが好ましく、耐熱性又はフェルトの形状保持の観点からはＰＰ又はＰＰ−ＰＥ共重合体が好ましい。
【００２４】
水不溶性担体の形状は、繊維、編地、フェルト、スポンジ、ビーズ又はネットであることが好ましい。
【００２５】
上記の水不溶性担体の形状の内、編地、フェルト及びネットは、繊維を原料として、公知の方法により製造することができる。フェルトの製造方法としては、例えば、湿式法、カーディング法、エアレイ法、スパンボンド法又はメルトブロー法が挙げられる。また、編地及びネットの製造方法としては、例えば、平織り法又は筒網法が挙げられる。
【００２６】
上記の繊維の構造としては、例えば、１種類のポリマーからなる単独糸又は芯鞘型、海島型若しくはサイドバイサイド型の複合繊維が挙げられるが、芯がＰＰ、鞘がＰＳ、海がＰＥテレフタレートの多芯海島型複合繊維や、島がＰＰ、海がＰＳの海島型複合繊維が好ましい。また、繊維を含めた水不溶性担体に強度や耐熱性を付与するために、ホルムアルデヒドやパラホルムアルデヒドにより架橋構造を導入するか、他のポリマーで表面を皮膜することも好ましい。
【００２７】
上記の水不溶性担体の形状がシート状のフェルト等である場合には、その厚さは、０．１〜１００ｍｍが好ましく、編地やネット等である場合には、その厚さは、０．０１〜５ｍｍが好ましい。これらの水不溶性担体を中心パイプに巻き付けてトレミキシン（登録商標；東レ株式会社）のようなラジアルフロータイプのモジュールに組み込むのであれば、巻き始め部分と巻き終わり部分の段差を抑制するために、フェルト等では１０ｍｍ以下であることがより好ましく、編地やネット等では１ｍｍ以下であることがより好ましい。
【００２８】
水不溶性担体の形状がフェルトである場合には、形態保持性を向上させるために、水不溶性担体と、他の素材からなるネットとの、２層以上の積層構造を採ることが好ましい。
【００２９】
上記の積層構造としては、例えば、フェルトとネットとの２層構造又はフェルトの間にネットを挟み込んだ構造、すなわちフェルト−ネット−フェルトのサンドイッチ構造が挙げられるが、体液又は体液を含む溶液（以下、「体液等」）がこれらを通過するときの圧力損失に影響のない範囲であれば、さらなる多層構造であっても構わない。
【００３０】
上記の積層構造を採るためのネットとしては、例えば、結節網、無結節網又はラッシェル網が挙げられる。また、網目の形状としては、例えば、長方形、菱形又は亀甲形が挙げられ、その大きさとしては、３ｍｍ角程度が好ましい。
【００３１】
上記の積層構造を採るためのネットの素材としては、例えば、ポリアミド、ポリエステル、ポリアクリロニトリル系ポリマー、ＰＥ又はＰＰが挙げられるが、生体適合性や耐蒸気滅菌性を考慮するとＰＰが特に好ましく、放射線滅菌を行う場合にはポリエステルやＰＥが好ましい。
【００３２】
上記の積層構造を採るためのネットは、強度を保持し、体液等がこれを通過するときの圧力損失を増加させないよう、モノフィラメントで形成されていることが好ましい。
【００３３】
上記の積層構造を採るためのネットの厚みは、５０〜１２００μｍが好ましい。
【００３４】
上記のモノフィラメントの直径は、５０〜１０００μｍが好ましい。
【００３５】
水不溶性担体の形状がネットである場合にも、これを中心パイプに巻きつけて多層構造を採ることが可能である。
【００３６】
「アミノ基」としては、例えば、アミノヘキサン、モノメチルアミノヘキサン、アミノオクタン、アミノドデカン、アミノジフェニルメタン、１−（３−アミノプロピル）イミダゾール、３−アミノ−１−プロペン、アミノピリジン、アミノベンゼンスルホン酸、トリス（２−アミノエチル）アミン、ジメチルアミン又はジアミノエタン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ジプロピレントリアミン、ポリエチレンイミン、Ｎ−メチル−２，２’−ジアミノジエチルアミン、Ｎ−アセチルエチレンジアミン、１，２−ビス（２−アミノエトキシエタン）等のアミノ基を複数有する化合物（以下、「ポリアミン」）由来のアミノ基が挙げられるが、ポリアミン由来のアミノ基であることが好ましい。また、アミノ基は、１級又は２級のアミノ基が好ましい。
【００３７】
アミノ基の窒素原子１個当たりの炭素原子数は、反応率に影響を及ぼす求核性や立体障害を考慮すると、１８以下が好ましく、１４以下がより好ましく、８以下がさらに好ましい。なお、アミノ基の窒素原子は、アルキル基で置換されていることが好ましい。
【００３８】
上記の水不溶性担体へのアミノ基の導入量は、少なすぎると所望の吸着性能が得られない一方で、多すぎると水不溶性担体の物理的強度が悪くなり、かつ吸着性能も下がる傾向にあるので、水不溶性担体の乾燥重量１ｇ当たり０．０３μｍｏｌ〜１ｍｍｏｌが好ましく、０．１μｍｏｌ〜０．１ｍｍｏｌがより好ましい。また、アミノ基を導入する水不溶性担体がＰＳである場合には、ＰＳを構成するモノマーであるスチレン１ｍｏｌ当たり０．１μｍｏｌ〜１ｍｏｌが好ましく、１μｍｏｌ〜５００ｍｍｏｌがより好ましい。
【００３９】
「アミノ基を有する官能基」を形成する具体的方法としては、例えば、反応性官能基としてクロルアセトアミドメチル基を有するＰＳに、テトラエチレンペンタミンやポリエチレンイミンを反応させる方法が挙げられる。反応に用いるポリエチレンイミンとしては、分子量が６００以上である直鎖状又は分岐状のポリエチレンイミンが好ましいが、低毒性であり、かつ入手及び取り扱いが容易であることから、分岐状のポリエチレンイミンがより好ましい。
【００４０】
上記の反応性官能基としては、クロルアセトアミドメチル基等のハロアセトアミドメチル基以外にも、例えば、ハロメチル基、ハロアセチル基若しくはハロゲン化アルキル基等の活性ハロゲン基、エポキサイド基、カルボキシル基、イソシアン酸基、チオイソシアン酸基又は酸無水物基が挙げられる。
【００４１】
「アミノ基を有する官能基」は、さらにアミド結合を有することが好ましい。
【００４２】
アミノ基を有する官能基にさらにアミド結合を形成する方法としては、例えば、上記の反応性官能基としてハロアセトアミドメチル基を選択することが挙げられる。
【００４３】
「アミノ基を有する官能基」は、さらに、尿素結合及び／又はチオ尿素結合を有することが好ましい。
【００４４】
アミノ基を有する官能基にさらに尿素結合又はチオ尿素結合を形成する方法としては、例えば、アミノ基を有する官能基と、イソシアネート、イソチオシアネート酸、酸塩化物又は酸無水物と、を反応させる方法が挙げられる。
【００４５】
上記の反応に用いるイソシアネート、イソチオシアネート、酸、酸塩化物又は酸無水物の導入量は、反応対象であるアミノ基の１ｍｏｌ当たり５μｍｏｌ〜３００ｍｍｏｌが好ましく、２０μｍｏｌ〜１００ｍｍｏｌがより好ましい。
【００４６】
イソシアネート又はイソチオシアネートとしては、例えば、エチルイソシアネート、ステアリルイソシアネート、ｎ−ブチルイソシアネート、ｉｓｏ−ブチルイソシアネート、ｎ−プロピルイソシアネート、メチルイソチオシアネート、エチルイソチオシアネート、ｎ−ブチルイソチオシアネート、ベンジルイソチオシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート、シクロヘキシルイソシアネート、シクロヘキシルイソチオシアネート若しくはシクロヘキシルジイソシアネート等の脂肪族イソシアネート又は脂肪族イソチオシアネートあるいはフェニルイソシアネート、クロロフェニルイソシアネート、フルオロフェニルイソシアネート、ブロモフェニルイソシアネート、ニトロフェニルイソシアネート、トリルイソシアネート、メトキシフェニルイソシアネート、１−ナフチルイソシアネート、４,４'−ジフェニルメタンジイソシアネート、３,３',５,５'−テトラエチル−４,４'−ジイソシアナトジフェニルメタン、フェニルイソチオシアネート、クロロフェニルイソチオシアネート、フルオロフェニルイソチオシアネート、ニトロフェニルイソチオシアネート、トリルイソチオシアネート、メトキシフェニルイソチオシアネート若しくは１−ナフチルイソチオシアネート等の芳香族イソシアネート又は芳香族イソチオシアネートが挙げられるが、アミノ基の求核性を制御し、体液中の有用成分の吸着を抑制する観点から、芳香族イソシアネート又はイソチオシアネートが好ましい。
【００４７】
アミノ基を有する官能基にさらに尿素結合を形成する具体的方法としては、例えば、反応性官能基としてクロルアセトアミドメチル基を有するＰＳに、テトラエチレンペンタミン及びクロロフェニルイソシアネートを反応させる方法が挙げられる。この方法における各試薬の導入量としては、ＰＳを構成するモノマーであるスチレン１ｍｏｌ当たり、テトラエチレンペンタミン３μｍｏｌ〜５００ｍｍｏｌ、クロロフェニルイソシアネート５μｍｏｌ〜３００ｍｍｏｌが好ましく、テトラエチレンペンタミン１μｍｏｌ〜１００ｍｍｏｌ、クロロフェニルイソシアネート２０μｍｏｌ〜１００ｍｍｏｌがより好ましい。
【００４８】
本発明の肝炎治療用のＨＭＧタンパク吸着担体は、体液等と一定時間接触させる処理によって、体液中の被吸着物であるＨＭＧタンパク及びＨＭＧタンパクによって誘導されるタンパク（以下、「ＨＭＧタンパク等」）を吸着することが可能である。
【００４９】
本発明の肝炎治療用のＨＭＧタンパク吸着担体を、体液等と一定時間接触させる処理前後のＨＭＧタンパク等の吸着率は、以下の式１により算出される。
吸着率（％）＝（Ｃ０−Ｃ）／Ｃ０×１００  ・・・・・・式１
Ｃ０  ：  処理前溶液中の被吸着物の濃度
Ｃ    ：  処理後溶液中の被吸着物の濃度
【００５０】
本発明の肝炎治療用の血液循環カラムは、本発明のＨＭＧタンパク吸着担体が充填されていることを特徴とする。
【００５１】
本発明の血液循環カラムを用いた体液等の処理方法としては、例えば、本発明の血液循環カラムと患者とを血液回路で接続し、患者から取り出した体液を本発明の血液循環カラムに通過させ、これを患者に戻すという体外循環方法が好ましい。
【００５２】
本発明の血液循環カラムは、他の体液処理方法や医療機器と併用しても構わない。他の体液処理方法や医療機器としては、例えば、血漿交換、腹膜透析、血漿分離器、ヘモフィルター、人工心肺又はＥＣＭＯが挙げられる。
【００５３】
本発明の血液循環カラムを用いた体液等の処理時間としては、血液中のＨＭＧタンパクによるさらなる炎症誘発を抑制する観点から、持続的な処理が好ましく、４時間以上がより好ましく、２４時間以上がさらに好ましい。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明のＨＭＧタンパク吸着担体及び血液循環カラムについて、実験例により具体的に説明する。
【００５５】
（吸着担体Ａの作製）
５０重量比の海成分（４６重量比のＰＳと４重量比のＰＰの混合物）と５０重量比の島成分（ＰＰ）とからなる海島型複合繊維（厚さ：２．６デニール、島の数：１６；米国特許第４６６１２６０号明細書）を筒網状にした編地５０ｇを、５０ｇのＮ−メチロール−α−クロロアセトアミド、４００ｇのニトロベンゼン、４００ｇの９８重量％硫酸及び０．８５ｇのパラホルムアルデヒドからなる混合溶液中に浸し、４℃で１時間反応させた。反応後の繊維を０℃の氷水５Ｌ中に浸して反応を停止させた後、水で洗浄し、さらに繊維に付着しているニトロベンゼンをメタノールで抽出除去した。この繊維を５０℃で真空乾燥して、クロロアセトアミドメチル化架橋ＰＳ編地（以下、「ＡＭＰＳｔ編地」）７１ｇを得た。
【００５６】
テトラエチレンペンタミン１．５ｇをジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」）５００ｍＬに溶解し、ここへ２０ｇのＡＭＰＳｔ編地を撹拌しながら加え、２５℃で６時間反応させた。反応後のＡＭＰＳｔ編地は、ガラスフィルター上で５００ｍＬのＤＭＳＯで洗浄した。洗浄後のＡＭＰＳｔ編地３．０ｇを、１．０ｇのパラクロロフェニルイソシアネートを溶解した１５０ｍＬのＤＭＳＯの溶液中に加え、２５℃で１時間反応させてから、ガラスフィルター上でそれぞれ６０ｍＬのＤＭＳＯ及び蒸留水で洗浄し、さらにそれぞれ３Ｌの蒸留水及び生理食塩水で洗浄して、吸着担体である編地（以下、「吸着担体Ａ」）を得た。吸着担体Ａに導入された官能基の構造式を以下に示す。
【化１】
0005824873.tif 000002
【００５７】
（吸着担体Ｂの作製）
島の芯成分：ポリプロピレン、島の鞘成分：ポリスチレン９５質量％、ポリプロピレン５質量％、海成分：エチレンテレフタレート単位を主たる繰り返し単位とし、共重合成分として５−ナトリウムスルホイソフタル酸３質量％含む共重合ポリエステル、複合比率（質量比率）：芯：鞘：海＝４５：４０：１５で構成される繊維８５質量％と直径２０μｍのポリプロピレン繊維１５質量％からなるフェルトを作製した後、このフェルト２枚の間にシート状のポリプロピレン製ネット（厚さ：０．５ｍｍ、単糸径：０．３ｍｍ、開口部：２ｍｍ角）を挟み、ニードルパンチすることによって３層構造にした。
【００５８】
次に、この３層構造フェルトを９５℃、３質量％の水酸化ナトリウム水溶液で処理して、海成分のエチレンテレフタレート単位を主たる繰り返し単位とし、共重合成分として５−ナトリウムスルホイソフタル酸３質量％含む共重合ポリエステルを溶解することによって、芯鞘繊維の直径が４．５μｍで、嵩密度が０．０２５ｇ／ｃｍ３の３層構造フェルトを作製した。
【００５９】
水酸化ナトリウム水溶液処理後の３層構造フェルト５０ｇを、５０ｇのＮ−メチロール−α−クロロアセトアミド、４００ｇのニトロベンゼン、４００ｇの９８重量％硫酸及び０．８５ｇのパラホルムアルデヒドからなる混合溶液中に浸し、４℃で１時間反応させた。反応後の繊維を０℃の氷水５Ｌ中に浸して反応を停止させた後、水で洗浄し、さらに繊維に付着しているニトロベンゼンをメタノールで抽出除去した。この繊維を５０℃で真空乾燥して、クロロアセトアミドメチル化架橋ＰＳフェルト（以下、「ＡＭＰＳｔフェルト」）７１ｇを得た。
【００６０】
テトラエチレンペンタミン５．０ｇを５００ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、ここへ２０ｇのＡＭＰＳｔフェルトを撹拌しながら加え、２５℃で６時間反応させた。反応後のＡＭＰＳｔフェルトは、ガラスフィルター上でそれぞれ６０ｍＬのＤＭＳＯ及び蒸留水で洗浄し、さらにそれぞれ３Ｌの蒸留水及び生理食塩水で洗浄して、吸着担体であるフェルト（以下、「吸着担体Ｂ」）を得た。吸着担体Ｂに導入された官能基の構造式を以下に示す。
【化２】
0005824873.tif 000003
【００６１】
（吸着担体Ｃの作製）
ポリエチレンイミン（分子量１万；和光純薬）１１．４ｇ及びトリエチルアミン１９ｇを、１０００ｇのＤＭＳＯに溶解し、ここへ２０ｇのＡＭＰＳｔ編地を撹拌しながら加え、３０℃で６時間反応させた。反応後のＡＭＰＳｔ編地は、ガラスフィルター上でそれぞれ６０ｍＬのＤＭＳＯ、メタノール及び蒸留水で洗浄して、吸着担体である編地（以下、「吸着担体Ｃ」）を得た。吸着担体Ｃに導入された官能基の構造式を以下に示す。
【化３】
0005824873.tif 000004
【００６２】
（吸着担体Ｄの作製）
セルロース繊維とＮ，Ｎ'−ジメチルホルムアルデヒド３酸化硫酸塩複合体とを７０℃で２０分混合し、さらに５０℃で５時間混合してから、アルカリ溶液で中和し、最後に蒸留水で洗浄して、硫酸化エステル基が硫黄原子含量として０．５％の密度で導入されている繊維（以下、「吸着担体Ｄ」）を得た。
【００６３】
（実施例１）
アダルト・ウシ血清に、ブタ由来のＨＭＧＢ−１（初期濃度：１００ｎｇ／ｍＬ）と、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＧｒｏｕｐＩ  １７−Ｐｌｅｘ（ＢＩＯ  ＲＡＤ社）に付属の標準品（ＩＬ−１β（初期濃度：１３２３ｐｇ／ｍＬ）、ＩＬ−２（初期濃度：７０８ｐｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（初期濃度：１０９６ｐｇ／ｍＬ）、ＩＬ−７（初期濃度：１５６６ｐｇ／ｍＬ）、ＩＬ−８（初期濃度：８４１ｐｇ／ｍＬ）、ＭＣＰ−１（初期濃度：８６５ｐｇ／ｍＬ）及びＭＩＰ−１β（初期濃度：１１３４ｐｇ／ｍＬ））とを添加した溶液を、１ｍＬを調製した。ここへ吸着担体Ａ、吸着担体Ｂ又は吸着担体Ｃを３０ｍｇ加え、ローテーターを用いて３７℃で２時間処理をして、ＨＭＧＢ−１等について処理前後の吸着率をそれぞれ算出した。ＨＭＧＢ−１の濃度は、ＨＭＧＢ１  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ２（株式会社シノテスト）を用いて測定した。また、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１及びＭＩＰ−１βの濃度は、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＧｒｏｕｐＩ  １７−Ｐｌｅｘ（ＢＩＯ  ＲＡＤ社）の測定Ｋｉｔ及びＢｉｏ−ＰｌｅｘＴＭ  ワークステーション（ＢＩＯ  ＲＡＤ社）を用いて測定した。結果を表１に示す。
【００６４】
（比較例１）
実施例１と同様の方法により、吸着担体Ｄについても、ＨＭＧＢ−１等について処理前後の吸着率をそれぞれ算出した。結果を表１に示す。
【００６５】
【表１】
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【００６６】
表１の結果から、水不溶性担体の表面に導入された官能基がアミノ基を有する吸着担体Ｂ及びＣと、アミノ基に加えて尿素結合を有する吸着担体Ａとが、ＨＭＧタンパクの一つであるＨＭＧＢ−１並びにＨＭＧタンパクから誘導されるタンパク等であるＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１及びＭＩＰ−１βのいずれについても顕著な除去率を示すことは明らかである。一方で、水不溶性担体の表面に導入された官能基が硫酸化エステル基のみであって、アミノ基、尿素結合及びチオ尿素結合のいずれも有さない吸着担体Ｄは、ＨＭＧＢ−１については一定の除去率を示すものの、他のＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１及びＭＩＰ−１βについてはいずれも低い除去率しか示さなかった。
【００６７】
（血液循環カラムＡの作製）
吸着担体Ａを中心パイプに巻き付け、１６５ｍＬの容量のＰＰ製のカラムケースにこれを充填した。このカラムの内部をエンドトキシンフリー水で２時間洗浄した後、生理食塩液をカラムに充填し、最後に２５ｋＧｙのγ線滅菌をして、血液循環カラムＡを作製した。
【００６８】
（コントロールカラムの作製）
１６５ｍＬの容量のＰＰ製のカラムケースに生理食塩液のみを充填し、２５ｋＧｙのγ線滅菌をして、コントロールカラムを作製した。
【００６９】
（実施例２）
血液循環カラムＡ及びコントロールカラムは、その使用前に生理食塩液１．５Ｌを用いて洗浄した後、０．５Ｌの生理食塩液に抗凝固剤のメシル酸ナファモスタット７０ｍｇを添加した水溶液でプライミングをしておいた。
【００７０】
雄性ブタ（体重２０〜２５ｋｇ、Ｎ＝５）にＤ−ガラクトサミンを０．６ｇ／ｋｇの容量で静脈内投与して肝炎モデルを作製し、投与から２０時間後に血液循環カラムＡ及びコントロールカラムを用いて、血液容量６０〜８０ｍＬ／ｍｉｎで全血灌流という条件で血液の体外循環処理を行った。なお、抗凝固剤としてヘパリン又はメシル酸ナファモスタットを血液に添加し、活性化凝固時間（ＡＣＴ）を１５０〜２００程度に維持するようにした。
【００７１】
予め採取しておいた体外循環処理開始時の血液サンプル及び体外循環処理終了時の血液サンプルについて、ＨＭＧＢ−１、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１及びＭＩＰ−１βの濃度並びにＡＬＴ、ＡＳＴ、ＬＤＨ、ＡＬＰ及びＮＨ３の値をそれぞれ測定した。また、ＨＭＧＢ−１については血液の体外循環処理開始から１時間おきに血液サンプルを採取し、その濃度測定した。ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＬＤＨ及びＡＬＰはＪＳＣＣ標準化対応法に、ＮＨ３はＯｋｕｄａ−Ｆｕｊｉｉ変法に準拠した手法により測定した。
【００７２】
体外循環処理後の肝炎ブタは、体外循環後の治療効果を確認するために飼育ケージに戻し、生存状況を確認した。
【００７３】
血液循環カラムＡを用いて血液の体外循環処理を行った肝炎ブタ（以下、「ブタＡ」）、コントロールカラムを用いて血液の体外循環処理を行った肝炎ブタ（以下、「コントロールブタ」）、それぞれについて、体外循環処理開始時並びに体外循環処理終了時の血液サンプル中のＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１及びＭＩＰ−１βの濃度から、各タンパクの濃度の変化率を算出した。具体的には、体外循環処理終了時の濃度を、体外循環処理開始時の濃度で除した値を、各タンパクの濃度の変化率とした。算出した各タンパクの濃度の変化率の平均値を、表２に示す。
【００７４】
【表２】
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【００７５】
ブタＡ及びコントロールブタのそれぞれの死亡時間に基づき作成した生存曲線を、図１に示す。
【００７６】
表２及び図１の結果から、血液循環カラムＡを用いて血液の体外循環処理を行い、血液中からＨＭＧＢ−１並びにＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１及びＭＩＰ−１βをいずれも高率に除去することで、肝炎ブタの生存時間を延長可能であることが明らかとなった。すなわち、表２及び図１の結果から、ＨＭＧタンパク等を高率に除去可能である本発明のＨＭＧタンパク吸着担体が、優れた肝炎治療効果を有することは明らかである。
【００７７】
ブタＡ及びコントロールブタのそれぞれの血液サンプル中のＨＭＧＢ−１濃度の変化率すなわちＨＭＧＢ−１変化率の経時変化を、図２及び表３に示す。変化率は、ＩＬ−１β等と同様に、各サンプル中のＨＭＧＢ−１濃度を、体外循環処理開始時のＨＭＧＢ−１濃度で除した値とし、図２及び表３にはその平均値を示した。
【００７８】
【表３】
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【００７９】
図２及び表３の結果から、コントロールブタと比較して、ブタＡの血液中のＨＭＧＢ−１の除去率が、有意に低下していることは明らかである。
【００８０】
ブタＡ及びコントロールブタのそれぞれについて、体外循環処理開始時並びに体外循環処理終了時の血液サンプルのＡＬＴ、ＡＳＴ、ＬＤＨ、ＡＬＰ及びＮＨ３の値から、各値の変化率を算出した。具体的には、体外循環処理終了時の値を、体外循環処理開始時の値で除した値を、各値の変化率とした。算出した各値の濃度の変化率の平均値を、表４に示す。
【００８１】
【表４】
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【００８２】
表４の結果から、ＨＭＧタンパク等を高率に除去可能である本発明のＨＭＧタンパク吸着担体が、優れた肝炎治療効果を有することは明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明は、医療分野の肝炎治療用の血液循環カラムとして用いることができる。
【図１】
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【図２】
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