(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液型抗体と結合可能な血液型抗原を有する細胞膜フラグメントを固定した固体基板を含む、血液型抗原に対する抗体を検出するためのアッセイであって、前記細胞膜フラグメントは、細胞溶解により細胞ゴーストを生成し、かつ、該細胞ゴーストをフラグメント化することにより得られたものであることを特徴とする、アッセイ。
【請求項２】
前記細胞ゴーストのフラグメント化が超音波処理によりなされたものである、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
前記細胞フラグメントは、洗浄されたものである、請求項１または２に記載のアッセイ。
【請求項４】
前記細胞フラグメントは、前記細胞溶解の後、かつ、前記細胞ゴーストのフラグメント化の前に洗浄されたものである、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項５】
前記細胞膜フラグメントのサイズが１μｍ以下である、請求項１〜４のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項６】
前記細胞膜フラグメントのサイズが０．５μｍ以下である、請求項５に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記細胞膜フラグメントのサイズが０．１〜０．５μｍの範囲である、請求項６に記載のアッセイ。
【請求項８】
前記細胞膜フラグメントが、Ａ、Ｂ、ｃ、Ｄ、Ｅ、ｅおよびＫ抗原を有する、請求項１〜７のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項９】
前記細胞膜フラグメントが、Ａ（Ａ1およびＡ2）、Ｂ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、Ｅ，ｃ、ｅ、ＣW、Ｋ、ｋ、Ｋｐa、Ｋｐb、Ｊｓa、Ｊｓb、Ｆｙa、Ｆｙb、Ｊｋa、Ｊｋb、Ｌｅa、Ｌｅb、Ｍ、Ｎ、Ｍｉa、Ｓ、ｓ、Ｕ、Ｐｌ、Ｌｕa、Ｌｕb、Ｗｒa、Ｃｏb、Ｘｇa、Ｔｊa、Ｄｉa、Ｄｉbなど、臨床的に意義のあるすべての抗原を有する、請求項８に記載のアッセイ。
【請求項１０】
前記細胞膜フラグメントが赤血球から作られる、請求項１〜９のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１１】
前記細胞膜フラグメントがプロテアーゼで前処理される、請求項１〜１０のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１２】
試験材料の添加を示す陽性対照をさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１３】
プローブの作成に使用したバッファおよびブロッキング剤から選択される陰性対照を含む、請求項１〜１２のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１４】
前記基板が、膜フラグメントを担持し、効果的に抗原を発現させるためのコーティングを備える、請求項１〜１３のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１５】
前記コーティングの厚みが、１μｍ以上である、請求項１４に記載のアッセイ。
【請求項１６】
前記コーティングの厚みが、１〜１００μｍである、請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項１７】
前記コーティングの厚みが、５〜２０μｍである、請求項１６に記載のアッセイ。
【請求項１８】
前記コーティングの材料が親水性および水溶性である、請求項１４〜１７のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１９】
前記コーティングが、ポリエチレングリコールを含むポリマーである、請求項１４〜１８のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項２０】
前記ポリエチレングリコールを含むポリマーが、オレイル−ｏ−ポリ（エチレングリコール）−スクシニル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンミジルエステルである、請求項１９に記載のアッセイ。
【請求項２１】
前記コーティングが第４級の窒素含有塩基性ポリマーを含む、請求項１４〜１８のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項２２】
前記第４級の窒素含有塩基性ポリマーが、塩化ポリジアリルジメチルアンモニウムである、請求項２１に記載のアッセイ。
【請求項２３】
前記コーティングが、ポリペプチドを含む、請求項１４〜１８のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが、ポリ−Ｌ−リジンである、請求項２３に記載のアッセイ。
【請求項２５】
前記コーティングが、シランである、請求項１４〜１８のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項２６】
前記シランが、３−グリシドキシプロピル−トリメトキシシランである、請求項２５に記載のアッセイ。
【請求項２７】
前記基板が、ガラスまたはプラスチック材料で形成されたプレートまたはビーズである、請求項１〜２６のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項２８】
前記細胞膜フラグメントが、抗原スポットアレイ内の基板上に存在する、請求項１〜２７のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項２９】
前記基板が、マルチウェルプレートであり、各ウェル内に抗原スポットアレイが存在する、請求項２８に記載のアッセイ。
【請求項３０】
前記スポットが、直径１ｍｍ以下である、請求項２８または２９に記載のアッセイ。
【請求項３１】
前記スポットが、直径５０〜１０００μｍである、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項３２】
前記基板の膜フラグメントが固定されていない領域は、ブロッキング剤で処理される、請求項１〜３１のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項３３】
血液型検査、直接抗グロブリン試験（ＤＡＴ）、梅毒スクリーニング、ＨＩＶスクリーニング、ＨＣＶスクリーニング、Ｂ型肝炎スクリーニング、ＨＴＬＶスクリーニング、および血小板スクリーニングから選択された検査をさらに含む、請求項１〜３２のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれかに記載したアッセイに、被験者から採取した血液サンプルを接触させ、非結合の赤血球を除去し、前記基板に結合した抗体の存在を検出するというステップからなる、血液型抗原に対する抗体の存在を検査するための血液サンプル検査方法。
【請求項３５】
血液サンプル中の臨床的に意義のある血液型抗体を検出するのに適した血液検査方法であって、
様々な前記抗体と特異的に結合することが可能な複数の血液型抗原を発現する細胞膜フラグメントを、基板上のあらかじめ定めた位置に個別に固定したマイクロアレイであって、前記細胞膜フラグメントは、細胞溶解により細胞ゴーストを生成し、かつ、該細胞ゴーストをフラグメント化することにより得られたものであるマイクロアレイを提供し、
前記マイクロアレイに、被験者から採取した血液サンプルを接触させ、
前記結合剤を固定した１つ以上の領域から、非結合の赤血球を実質的にすべて除去し、および、
前記マイクロアレイに結合した抗体の存在を検出し、
これにより、被験者の血液中に前記抗体が存在するかどうかを判断する、
というステップからなる、血液検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、輸血検査に係り、より具体的には、血液型抗原に対する抗体の検出に関する。また、本発明は、好ましい表面コーティングを有したアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
血液または血液成分の輸血は、一般的に行われている医療行為である。輸血検査に使用される血液製剤および器具は、厳格な要件に従って製造され標準化されねばならない。患者に輸血される血液成分の安全性を保証するため、可能な限りの処置が現に実行されている。従って、輸血および輸血検査に関する分野は、高度に統制された分野であるといえる。英国において輸血検査は、英国法および欧州法の両者によって規定されており、また地域品質システムや世界法によってもカバーされている。輸血前試験の大部分は、血液型抗体およびその他の抗体のスクリーニングで構成される。これは、ドナーおよび患者双方の適合性を判断し、その後の免疫反応を最小限に抑えるためである。血液型抗体スクリーニング検査は、主として、赤血球表面の血液型抗原に対する抗体を、血液サンプルが含んでいるかどうかを検出するために行われる。このような抗体が個人的に作り出される原因は、多くの場合、同種免疫によるものであり、抗原陽性血液が抗原陰性の人に導入されると、非自己抗原に対する抗体が作られる可能性がある。輸血および妊娠時における胎児母体出血が、同種免疫を引き起こす可能性のある２つの事由である。このメカニズムによって産生された抗体は、通常、不規則血液型同種抗体と呼ばれる。また、同種抗体には、免疫原が不明なものがあり、こちらは自然発生的同種抗体と呼ばれる。
【０００３】
臨床的に意義のある血液型同種抗体を検出することは、ドナーおよび輸血者の輸血前試験において、非常に重要な意味を持つ検査である。臨床的に意義のある抗体を検出することにより、患者が抗体を産生した抗原を含まない安全な血液を患者に提供することが可能となる。
【０００４】
従来的に抗体スクリーニング検査は、試験管内における凝集試験として行われてきた。この試験には、血漿・血清試薬に対して試験された、既知の特異性を有するヒト赤血球が使用される。一定の培養期間を経た後、多くの場合、二次抗体溶液を加えて、この混合物の赤血球凝集を観察する。最近では、マイクロプレートやカラムを使用した凝集テクノロジーシステム（たとえば、Ｄｉａ  Ｍｅｄ社のＩＤ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｏｒｔｈｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社のＢｉｏ  Ｖｕｅ）を用いて、ある程度自動化して試験を行うことも可能となってきている。検査方法および検出限界要件は、検査の対象となるのが、ドナーのサンプルであるか患者のサンプルであるかによって異なる。ドナーの場合は、パパイン処理したＯＲ1Ｒ2Ｋ陽性細胞群が、抗Ｄの検出限界０．５ＩＵ／ｍｌで使用されるが、患者の場合には、より精度の高い技術が用いられ、検出限界は抗Ｄ０．０５ＩＵ／ｍｌである。ドナー試験において最も一般的に使用されている方法は、かなり大ざっぱで、感度の低いものである。現行の規制要件に従ってはいるものの、現在行われている試験はかなり限定されており、検出可能な臨床的に意義のある抗体の範囲は限られている（この検査では、パパイン処理したＯＲ1Ｒ2Ｋ陽性細胞群を用いて、オリンパス株式会社の血液型アッセイで行う）。より広い範囲の臨床的に意義のある血液型抗体をドナーから検出できれば、輸血医療の安全性は、さらに向上するといえる。また、本明細書において提案するように、多重化技術を用いれば、より一層の利益がもたらされるといえる。
【０００５】
血液型抗原は、構造も複雑度も様々であるが、本来的に主として糖質またはタンパク質である。糖鎖抗原は、単純構造の場合もあれば、高度に分岐した構造をとる場合もある。タンパク質抗原は、外膜に付着していたり、膜を何度も貫通して膜と一体化（膜貫通型）していたり、本来的に糖タンパク質であったりする。
【０００６】
通常、ほとんどの抗体スクリーニングアッセイは、赤血球全体の溶液を使用する。最近では、赤血球ゴースト（すなわち、空の細胞膜）を用いた固相血液型判定が実証され（Ｉｍｍｕｃｏｒ社による米国特許第５０３０５６０号）、いくつかの実験室においては、日常的に抗体スクリーニングに用いている。この方法は費用が高くつく上に、ある種の特異性をもつ偶発的ＩｇＭ抗体や、多様な特異性をもつＩｇＧ抗体を見逃してしまうことが知られている。小型化すれば、試薬の使用量が少なくなるため、費用効率を改善することができ、このことは特に、稀な特異性の赤血球の場合に意味がある。また、マイクロアレイなどをベースとした小型アッセイは、反応速度を高め、より良好な感度を示すことが多い（Ｅｋｉｎｓ、１９９８年）。しかしながら、スポットサイズは５０〜７００μｍ、より頻繁には１００〜２５０μｍであるから、赤血球全体または溶解赤血球（「ゴースト」）の構造はスポット用としてはかなり大きい。さらに、全体的な細胞は、長期間にわたって安定的であるとはいえない。マイクロアレイ上のプローブとして細胞膜フラグメントを使用し（Ｃｏｒｎｉｎｇ社による米国特許出願公開第２００２／００１９０１５号、同第２００４／０２１３９０９号、国際公開第ＷＯ２００５／０１０５３２号、同第ＷＯ２００６／０５８２３７号）、Ｇタンパク共役受容体の相互作用を調べることについては、すでに開示されている。しかしながら、赤血球膜のフラグメントについては、記述されていない。より厳密には、これまで赤血球またはその他の細胞（たとえば、トランスフェクト細胞）からの膜フラグメントが、血液型抗原同種抗体の検出に用いられたことはなかったのである。先に引用した特許文献において、Ｃｏｒｎｉｎｇ社グループは、様々なスライド表面上に、ポリエチレンイミンのリンカー／モディファイアーで膜フラグメントを固定して使用しているが、中でも最も良好な結果が得られたのは、金でコーティングしたスライドであった。金コーティングは、かなり高価であり、また、その不透明性が原因で、ある種のスキャナの場合、問題が生ずる可能性がある。赤血球の大きさは、７．５〜８．５μｍであり、その平均寿命はおよそ１２０日である。ある種の重要な低頻度抗原を発現する赤血球は、しばしばきわめて稀少である。小型化の特質として、試験のために用意する必要のある各プローブ細胞の量はナノリットル／マイクロリットルで足り、献血から大量のストック抗原を準備できるため、ある種の血液型抗原を調べる際の稀少性の問題が緩和される。赤血球を酵素処理すると、表面電荷が変化し、細胞からある種の化学構造が除去されることが知られている。こうした処理を施すことにより、多くの血液型抗原の検出を最適化することが可能である。タンパク質血液型抗原（エピトープ）は、抗原決定基配列からなるペプチドで表すことも可能であり、これらのペプチドを抗体スクリーニングに使用することも実証されている。しかしながらペプチドは、通常、線状エピトープに対してのみ作用し、複数回貫通型膜タンパクの場合、組み換え抗原は適切な配座を支持できない。
【０００７】
遺伝子組み換え細胞は、その表面に組み換え血液型抗原が表れるよう作成可能である。このことは、Ｋｅｌｌ式、Ｋｎｏｐｓ式およびＤｕｆｆｙ式の抗原に対してすでに実証されている（Ｒｉｄｇｗｅｌｌその他、２０００年；Ｙａｚｄａｎｂａｋｈｓｈその他、２０００年；Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄその他、２００６年；国際公開第ＷＯ２００５／０２４０２６号公報）。これらの抗原形態は、ヒト血漿／血清の抗体スクリーニングに用いられ、成功をおさめてはいるものの、特異性の範囲は制限されている。さらに、検出方法として、主にフローサイトメトリーを用いなければならないが、フローサイトメトリーの処理容量は低く、利用可能なラボは少なく、固相への適応が必要となる。酵素免疫測定法や、免疫プロット法を用いる試みも行われている。こうした細胞を用いれば、有効保存期間が短いという問題を解決でき、また潜在的なバイオハザードの危険性を回避できる。しかしながら、血液型抗原を発現するこうした細胞のフラグメントについては、これまで記述されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５０３０５６０号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２００２／００１９０１５号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／０２１３９０９号公報
【特許文献３】国際公開第ＷＯ２００５／０１０５３２号公報
【特許文献４】国際公開第ＷＯ２００６／０５８２３７号公報
【特許文献５】国際公開第ＷＯ２００５／０２４０２６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Robb, J.S., Roy, D.J., Ghazal, P., Allan, J. and Petrik, J.(2006). "Development of non-agglutination microarray blood grouping" Transfusion Medicine. 16, 119-129
【非特許文献２】Campbell, C.J., O'Looney, N., Chong Kwan, M., Robb, J.S., Ross, A.J., Beattie, J.S., Petrik, J. and Ghazal, P. (2006). "Cell Interaction Microarray for Blood Phenotyping" Analytical Chemistry. 78, 1930-1938.
【非特許文献３】Ekins, R.P. (1998). Ligand assays: from electrophoresis to miniaturised microarrays. Clinical Chemistry, 44, 2015-2030.
【非特許文献４】K. Ridgwell, J. Dixey and M. L. Scott (2000). The production of soluble recombinant Kell antigens and their use in screeing human sera for anti-Kell blood group antibodies. Transfusion Medicine. 13, Supplement 1, 9.
【非特許文献５】Yazdanbakhsh, K., Oyen, R., Yu, Q., Lee, S. Antoniou, M., Chaudhuri, a. and Reid, M. E.(2000). High-level. stable expression of blood group antigens in a homologous system. American Journal of Hematology. 63:114-124.
【非特許文献６】Sheffield, W.P., Bhakta, V., Branch, D. R. and Denomme, G. A. (2006). Detection of antibodies reactiong with the antithetical duffy blood group antigens Fy(a) and Fy(b) using recombinant fusion proteins containing the duffy extracellular domain. Transfus Apher Sci. Dec; 35(3): 207-16.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そして今、われわれは、次のような発見をした。すなわち、フラグメント化した赤血球膜を用いて発現させた血液型抗原や、細胞株を発現する他の抗原は、固体表面に固定化すること可能であり、これらは処理後もなお固体表面に保持され、抗原性を維持できるため、マイクロアレイ技術を用いて、血液サンプル内に存在する抗体を検出することが可能だ、ということである。これにより、従来の抗体スクリーニング検査を効果的に代替する試験を提供することができ、さらには、血液処理において重要なその他の検査、たとえば、赤血球表面上にある多重抗原の血液表現型検査、直接抗グロブリン試験、微生物学的試験、病原菌検査などとともに、単一のマイクロアレイで行うことが可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第一の態様は、血液型抗原に対する抗体を検出するためのアッセイを提供するものであり、このアッセイは、血液型抗体と結合可能な血液型抗原を発現する細胞膜フラグメントを固定した固体基板を含む。
【００１２】
本発明の第二の態様は、前記アッセイを用いた血液検査方法を提供する。
【００１３】
このように、本発明は、マイクロアレイプリントにより適した、小さな均等サイズの細胞膜フラグメントを使用することにより、赤血球ゴーストに吸着または結合した細胞由来の不要物質を最小限に抑えるものであり、特に、この発明で行われているように、膜フラグメントを超音波処理で作成すれば、アッセイのバックグランド（ノイズ）値を軽減できる。
【００１４】
しかしながら、細胞をフラグメント加工するプロセスにおいて、膜フラグメント上に小気胞ができてしまう可能性があり、場合によっては、適用不能なものとなることが知られている。フラグメント化のプロセスは、慎重に制御されねばならない。であるからこそ、固相マイクロアレイの表面に固定化（スポッティング）するというプロセスをさらに経た赤血球膜のフラグメントが、同じ特異性をもつ完全な赤血球または赤血球ゴーストに匹敵する、あるいはこれらを上回る性能を示す（試験結果参照）ことは、驚嘆に値する。
【００１５】
本発明の第三の態様は、血液サンプルから臨床的に意義のある血液型抗体を検出するために使用する適切な血液検査方法を提供するものであり、この方法は、次のステップ、すなわち、
様々な前記特徴的抗体と特異的に結合することが可能な多数の血液型抗原を、基板上のあらかじめ定めた位置に個別に固定したマイクロアレイを提供し、
前記マイクロアレイに、被験者から採取した血液サンプルを接触させ、
前記結合剤を固定した基板上の１つ以上の領域から、非結合の赤血球を実質的にすべて除去し、
前記マイクロアレイに結合した抗体の存在を検出し、これにより前記特徴的抗体が被験者の血液中に存在するかどうかを判断する、ステップからなる。
【００１６】
抗体の結合にタンパク質／抗原マイクロアレイを使用することは、すでに公知ではあるものの、固体基板と結合した赤血球フラグメントが、必要とされるさらなる処理にも耐えうるものであり、依然としてマイクロアレイに付着し、ここに係留し、かつ抗原性を維持し続けており、従って、効果的に血液型抗体スクリーニングに用いることができるということは、驚嘆に値する。細胞膜フラグメントは、公知のどのような方法を用いて作成してもよい。好ましくは、完全細胞を低張溶解で溶解したり、その他の周知の方法を用いたりして、細胞内容物を放出させ、空の細胞膜（細胞ゴースト）が残るようにする。細胞ゴーストは、超音波処理、冷凍／解凍、スパニングなどの寸断方法でフラグメントにする。細胞をプロテアーゼで前処理して、ある種の抗体−抗原相互作用を最適化することもできる。典型的に、細胞フラグメントのサイズは、１μｍ以下（たとえば、＜０．５μｍあるいは＜０．３μｍ）であり、多くの場合、０．１〜０．５μｍの範囲である。フラグメントをふるいにかけて、固体基板上にスポットするのに最も適したサイズとすることも可能である。さらなるプロセスとして、最初に行うブロッキングや、非結合物質を除去し、非特異的結合を減じるためのマイクロアレイの洗浄、スキャンを行うための乾燥などが含まれる。
【００１７】
マイクロアレイは比較的新しい技術であるが、その便益と用途は、当業者には周知である。マイクロアレイ技術に関するほとんどの出版物は、プローブおよび標的として遺伝物質を用いることに言及している。マイクロアレイは、通常、マイクロサイズまたはナノサイズのプローブサンプルのスポットを、固体基板上に配置する専門ロボットを使用して作成される。この技術がもたらす多重化機能は、きわめて大きな利益を提供する。たとえば、１標的−１プローブであった従来の検査と異なり、１つのサンプルを、ほとんど無限に近い数のプローブに対して、同時に検査することが可能である。同様に、多重化により、処理スピードおよび処理容量がアップする。このことは、ひいてはコストの削減、人員の削減、サンプル数の削減、試薬の削減、繰り返し試験の削減につながる。マイクロアレイには、データ生成レベルの向上をともなった高レベルの反復が含まれており、より効率的なデータ一致が可能となるからである。
【００１８】
本発明のアッセイによれば、単一の検査システムに、抗体スクリーニング検査、血液型検査、表現型検査、ＤＡＴ試験および梅毒検査をまとめて含めることができる。これにより、スクリーニング検査と同時に、様々な特徴的抗体を同定することが可能なため、血液検査手続きにおける効率と有効性が向上する。また、識別可能因子の臨床的意義を決定する際の遅延を短縮できる。
【００１９】
その他含めることが可能な検査には、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）スクリーニング、Ｂ型肝炎スクリーニング、Ｃ型肝炎スクリーニング、ヒトＴ細胞白血球ウィルス（ＨＴＬＶ）スクリーニング、微生物学的スクリーニング、血小板スクリーニングなどがある。
【００２０】
アッセイ上に供給される膜結合抗原は、標的となる特徴的な抗体のアイデンティティーに即して選択することが好ましい。これらの抗原は、一般的に、従来的な抗体スクリーニング検査で使用されているもの、たとえば、少なくともＡ、Ｂ、Ｃ、ｃ、Ｄ、Ｅ、ｅおよびＫなどである。また、ある種の抗体との結合を最適化するため、修飾抗原を含めることもできる。さらに、臨床的に意義が認められているその他の抗原、たとえば異なる個体数で存在する抗体に対する抗原（たとえばＤｉｅｇｏ）を含めると有益である。
【００２１】
具体的には、ＡＢＯおよびＨ式、Ｒｈ式、Ｋｅｌｌ式、Ｄｕｆｆｙ式、Ｋｉｄｄ式、Ｌｅｗｉｓ式、ＭＮＳ式、Ｐ式、Ｌｕｔｈｅｒａｎ式、Ｗｒｉｇｈｔ式、Ｄｉｅｇｏ式、Ｃｏｌｔｏｎ式およびＸｇ式といった血液型分類法による、臨床的に意義のある血液型抗原のすべてを、細胞膜フラグメントに含めることが可能である。これらを、その抗原（もっと多数あるが、臨床的に意義のあるもののみを示す）とともに、以下に表示する。
【００２２】
ＡＢＯおよびＨ式    Ａ（Ａ１およびＡ２）Ｂ、Ｈ；
Ｒｈ式              Ｃ、Ｄ、Ｅ，ｃ、ｅ、ＣＷ；
Ｋｅｌｌ式          Ｋ、ｋ、Ｋｐａ、Ｋｐｂ、Ｊｓａ、Ｊｓｂ；
Ｄｕｆｆｙ式        Ｆｙａ、Ｆｙｂ；
Ｋｉｄｄ式          Ｊｋａ、Ｊｋｂ；
Ｌｅｗｉｓ式        Ｌｅａ、Ｌｅｂ；
ＭＮＳ式            Ｍ、Ｎ、Ｓ、ｓ、Ｍｉａ、Ｕ；
Ｐ式                Ｐｌ、Ｔｊａ；
Ｌｕｔｈｅｒａｎ式  Ｌｕａ、Ｌｕｂ；
Ｗｒｉｇｈｔ式      Ｗｒａ；
Ｄｉｅｇｏ式        Ｄｉａ、Ｄｉｂ；
Ｃｏｌｔｏｎ式      Ｃｏｂ；
Ｘｇ式              Ｘｇａ。
【００２３】
基板上に固定される血液型抗原は、赤血球膜フラグメントであってもよいし、代替的な細胞株に発現した抗原であってもよい。また、検査を十分に対照化するため、関連する対照プローブも含めることが好ましい。こうした陽性対照には、たとえば抗ヒトＩｇなど、試験材料の添加を示す抗体が含まれる。陰性対照には、プローブの作成に使用されるバッファや、ブロッキング剤が含まれ、また、他の種／源に由来する同種の細胞／プローブを、本発明の検査プローブと同様に修飾・処理したものを含めることもできる。
【００２４】
固体基板には、血液型抗原をキャリーする膜フラグメントを支持するためのコーティングを施すことが好ましい。コーティングは、抗原の効果的な発現が可能になるよう、膜フラグメントを固定するために十分な厚さであることが好ましい。これにより、検査対象となる血液抗体は有効な免疫複合体を形成できる。通常、コーティングは、少なくとも１分子以上の厚さであり、とりわけ０．１μｍ以上、さらには１μｍ以上、またさらには１０μｍ以上でありうる。コーティングの厚さは、１００μｍ以下、たとえば１０μｍ以下でありうる。好ましい範囲は、１〜１００μｍ（とりわけ、５〜２０μｍ）である。コーティング材料は、この分野において、生物学的物質を固定する目的で、固体基板をコーティングするのに適するとされる材料であれば、何を用いてもよい。通常コーティング材料は、親水性、水溶性であり、溶液状態で塗布し、これを乾燥させ、固体状また半固体状で基板上に残るようにする。
【００２５】
表面改質およびコーティングに適した材料は、数多く存在する。たとえば、天然および合成ゴム、ゲル、ポリマーなどである。適切なポリマーには、オレイル−ｏ−ポリ（エチレングリコール）−スクシニル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンミジルエステルのようなポリエチレングリコールや、高分子塩基、中でも高分子窒素塩基、とりわけ塩化ポリジアリルジメチルアンモニウムのような第４級窒素塩基、およびポリ−Ｌ−リジンのようなポリペプチドが含まれる。適切なシランには、３−グリシドキシプロピル−トリメトキシシランが含まれる。
【００２６】
マイクロアレイのスライド用に最も頻繁に使われるのはガラスであるが、こうした固体表面は、ＧＡＰＳ（ガンマアミノプロピルシラン）、ＡＰＴＳ（３−アミノプロピルトリエトキシシラン）、エポキシシラン、ＧＯＰＳ（３−グリシドキシプロピル−トリメトキシラン）などで改質できる。ポリアクリルアミドのパッチは、三次元構造を形成できる。また、ニトロセルロースやＰＶＤＦなどの膜で、ガラスをコーティングすることも可能である。膜フラグメントの固定化において重要なことは、ポリマーのコーティング材料が側方への運動に対しては柔軟性を保持するということである。換言すれば、膜フラグメントは、固体表面上に直接固定しない方がよいということである。これは、適切なポリマーのクッションを、固体表面と固定する膜フラグメントとの間に用いることによって達成できる。金の表面とポリエチレンイミンのクッションは非常によく作用するが、高価である。本発明は、高い処理容量の血液スクリーニングを目指しており、このようなコーティングは高すぎて使用できない。そこで、日油株式会社の「サンブライト（登録商標）」製品（オレイル−ｏ−ポリ（エチレングリコール塩化ポリジアリルジメチルアンモニウム）−スクシニル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンミジルエステル）など、表面に使用できそうな様々なポリマーを分析した。本発明は、有効期限が長い膜フラグメントを、生細胞とは非常に異なる処理・加工を施し、理想的に使用することを目的とする。赤血球は、他の組織培養真核細胞とはかなり異なる。したがって、超音波処理を施し、ある種の抗体−抗原相互作用を最適化するため、しばしば特殊プロテアーゼで処理した小さなサイズ（典型的に０．５μｍ以下）の赤血球膜フラグメントが、「サンブライト（登録商標）」でコーティングされた表面に依然として保持され、抗体スクリーニングアッセイに使用できるという発見は、驚くべきものである。
【００２７】
もう１つのポリマー、塩化ポリジアリルジメチルアンモニウム（ｐＤＡＤＭＡＣ）は、通常、大規模工業用水処理用途に使用されているものの、マイクロアレイに用いる固相コーティングとしては、今まで使用されたことがない。これは、金でコーティングした固相と比して、はるかに安価であり、実際、他のほとんどのコーティング剤よりも安い。このポリマーが、膜フラグメントの固定化に非常に適しているということは、驚くべき発見である。さらには、抗体のような対照タンパク質分子の固定化にも適しており（実験結果参照）、このことは、ｐＤＡＤＭＡＣをコーティングしたスライド、マイクロプレート、その他のバイオアッセイ用の固体表面、とりわけ本発明のバイオアッセイに基づくマイクロアレイが、幅広い用途に使用可能だということを示唆するものである。
【００２８】
典型的に、抗原はアレイ内の基板に結合される。ここで「アレイ」という用語を使用する場合、これは、赤血球抗体と特異的に結合する抗源が、ガラスやプラスチックなどの基板上に、通常の秩序で配列され固定化されものを意味する。典型的にアレイは、別々に仕切られた領域が規則正しく連続して並んだ形状をしており、ここに、抗原が結合される。このような抗原を結合したアレイを、一般に「抗原チップ」と呼ぶ。
【００２９】
抗原は、たとえば平面状あるいは球状の基板上に配列される。平面アレイは、自動装置により容易にスキャンされる。さらに、各々の特異的抗原につき、数々の希釈物を用意し、および／または数回繰り返して（たとえば、３〜１０回）配置する。これにより、何らかのアッセイを実行する際に発生する可能性がある、偽陽性／偽陰性反応を最小限に抑えることが可能となる。
【００３０】
アレイは、従来的な基板のいずれで形成してもよい。たとえば、ガラス、プラスチック、ケイ素、酸化ケイ素、金属、金属酸化物などで作られたプレートまたはビーズを使用することができる。抗原を結合させる基板は、ウェル、トレンチ、ピン、チャネルおよび孔など、様々な表面形状とすることができるが、マルチウェル式のマイクロプレートが好ましい。蛍光検出を改良するための好ましい基板表面構造は、国際公開第ＷＯ０２／０５９５８３号公報および同第ＷＯ０３／０２３３７７号公報に記載されている。ある種の実施態様においては、基板は、光学的に透明であることが好ましい。
【００３１】
一般に、本発明のアッセイは、小さな平面基板（たとえば辺長５０〜１００ｍｍの長方形）で構成され、スライドまたはマイクロプレート当り１００００個までの抗原スポットを有する。通常、各抗原は、既知の方法を使用して、基板にスポット付け、プリントまたは他の方法で結合させる。たとえば、Michael J. Heller, Annual Review of Biomedical Engineering, 2002 Vol. 4: 129-153、DNA Microarray Technology: Devices, Systems and Applications、Angenendt, P.; Glokler, J.; Murpy, D.; Lehrach, H.; Cahill, D.J. Anal. Biochem., 2002, 309, 252-260；Angendt, P.; Glokler, J.; Sobek, J.; Lehrach, H.; Cahill, D. J. Chromatogr. A, 2003 100, 997-104を参照されたい。典型的なスポットは、直径１ｍｍ以下、たとえば、直径５００μｍ以下または１００μｍ以下である。通常、スポットサイズは５０〜１０００μｍである。この方法においては、必要に応じて、１〜１０００個、好ましくは１０〜１００個の抗原スポットを単一アレイ内に収めることができる。
【００３２】
また、本発明のアッセイを使用して、１以上のサンプルを試験することが可能である。各チップは、基板表面上に個別のアレイを複数有し、別々のサンプルと各アレイとが、各サンプルが混合しないようなやり方でアレイと接触するよう配列される。たとえば各アレイは、異なる各サンプル同士の接触を阻止するように工夫された壁、リッジ、堤、疎水性領域等により、互いに連結される。
【００３３】
上記のような構造の特定例の１つとして、従来型フォーマットのマイクロプレートがあげられるが、本発明の目的に則するのは、平らなガラスのウェル底を有するものである。このフォーマットのマイクロプレートにおいて、数あるアレイのうちの１つは、典型的に、９６のプローブアレイを含んだ９６ウェルプレート（３８４ウェル、またはそれ以上のサイズも可能ではあるが）を使用する。各ウェルは、予め定めたパターンに配した抗原スポットのアレイを備える。各ウェルは、試験対象となる血液サンプルを容れられるようになっており、単一の抗原（異なる濃度とすることもできる）で構成してもよいし、多数の抗原で構成してもよい。パターンを予め定めておくことにより、自動的にアレイをスキャンし、その結果をコンピューターを用いて読み取り、保存することが可能となる。
【００３４】
基板表面の結合剤でカバーされていない領域（非特異的結合部位を提供する可能性がある領域）は、ブロッキング剤で処理し、前記抗原と抗体との非特異的結合を回避することが好ましい。様々なブロッキング剤が、この分野では周知である。一般的に、これらのブロッキング剤は、無脂肪乳タンパク質、カゼイン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）など、アルブミンまたは血清（血液型抗体や抗ＩｇＧ抗体、あるいは同一マイクロアレイ上における試験プローブの相互作用を阻害する可能性のある抗体といった、好ましくない抗体を有さないもの）を、バッファに入れたものが都合よく用いられる。一例を挙げれば、１〜４％Ｗ／Ｖのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＩＤ  Ｂｉｏ社、フランス）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）｛０．１５Ｍ塩化ナトリウム、２．６３２ｍＭリン酸緩衝原液（Ａｌｂａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、スコットランド)、ｐＨ７．０｝に入れたものなどが便利である。
【００３５】
抗体スクリーニングにおいて、二次検出に用いる抗体は、あらゆる結合抗体（たとえば、ヒトＩｇＧまたはＩｇＭ）と反応するものでなければならない。これは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤといったあらゆる免疫グロブリンクラスの抗体についても同様であり、またこれらのサブクラスにも適用される。
【００３６】
生物学的要素の結合を検出する方法は、数多い。たとえば、発光タグ、化学ルミネッセンス、ラジオアイソトープ、無標識検出（たとえば、ビアコア）などである。マイクロアレイに最も頻繁に用いられるのは、共焦点走査を用いた蛍光検出であるが、代替的な選択肢としては画像システムがあり、こちらは、よりコスト効率がよく、用途が広く、より迅速である。以下に記述するように、結合抗体の検出にきわめて便利な方法として、検出が望まれる結合抗体への特異性を有する、蛍光標識した二次抗体複合体の使用があげられる。蛍光の存在は、共焦点走査型レーザを用いて蛍光を励起し、これに続く発光を検出することにより検出されるが、代替的に、発光ダイオード（ＬＥＤ）やメタルハライドランプなどによる照明法を用い、カメラ画像キャプチャで検出することも可能である。
【００３７】
本発明のアッセイ法では、血液サンプル中に存在するあらゆる抗体を、一定期間（１０秒〜数時間、たとえば１分〜６０分）にわたって、固定化された膜結合抗原と特異的に反応させる。典型的に、この反応は、室温で実施されるが、たとえば、３７℃で実施することも可能である。
【００３８】
非結合物質の除去は、たとえば、基板表面を水または塩水のような溶液で洗浄することにより、または空気を基板表面全体に吹き付けたり、吸引したりすることにより、あるいは遠心分離または振動を利用して非結合物質を基板表面から払拭することにより行う。さらに、抗原を結合させる限定領域以外の基板領域を、試験サンプルの細胞に対して浸透性（多孔性）とすることにより、抗体と接触しない細胞が基板を通過できるようにし、除去を容易にすることも可能である。前述したように、結合抗体の存在は、二次標識検出（蛍光・化学ルミネッセンス複合抗体）、ローリング・サークル増幅など、様々な周知技術により検出できる。
【００３９】
このように、マイクロアレイに結合した抗体は、蛍光シグナルによって検出できる。基板上の各特異的抗原の位置を知ることにより、試験対象の血液中に存在する抗体を同定することが可能であり、これにより、試験対象となる血液サンプルの血液型特異性を同定することができる。
【００４０】
蛍光は、分光光度計など、この技術分野で既知の適切な光検知器を用いて検出できる。励起レーザを伴った共焦点スキャナを用いれば、スキャナで蛍光出力を検出し、その強度を数値化して、解釈およびデータ処理に活用できるため、便利である。
【００４１】
適切なエレクトロニクスおよびソフトウェアを使用して、適切な装置をプログラムすることにより、基板表面上の特異的抗体を同定し、その位置を知り、これを発生した蛍光シグナルと相関させることが可能となり、これにより、特殊な血液型であるかどうかが判定され、テスターで同定できる。さらに、統計用ソフトウェアを組み込むことにより、基板上に種々に繰り返された抗体および／または様々に希釈された抗体から得た結果を、組み合わせて定式化することが可能となる。この方法においては、多数の特異的抗原スポットから得た蛍光シグナルが合わせて解析され、統計的に有意な結果がテスターに表示される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、「サンブライト（登録商標）」でコーティングされ、赤血球（Ｒ1Ｒ1、Ｒ2Ｒ2およびｒｒ細胞）膜フラグメントをキャリーするスライドの、モノクロナール抗体パネルに対する反応性を示したものである。
【図２】図２は、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングされ、赤血球膜フラグメントをキャリーするスライドの反応性を示したものである。
【図３】図３は、ｐＤＡＤＭＡＣでコーティングされ、赤血球膜フラグメントをキャリーするスライドの反応性を示したものである。
【図４】図４は、ｐＤＡＤＭＡＣ上に固定した赤血球フラグメント（超音波処理あり）と赤血球ゴースト（超音波処理なし）の反応性を、平均分子量の異なる５つのｐＤＡＤＭＡＣにおいて対比したものである。
【図５（ａ）】図５（ａ）は、コーティング剤の濃度の増加に伴う効果を、抗Ｄを抗体に用いて示したものである。
【図５（ｂ）】図５（ｂ）は、コーティング剤の濃度の増加に伴う効果を、抗Ｄを抗体に用いて示したものである。
【図５（ｃ）】図５（ｃ）は、コーティング剤の濃度の増加に伴う効果を、抗Ｄを抗体に用いて示したものである。
【図６】図６は、「サンブライト（登録商標）」でコーティングされ、様々な赤血球型（Ｒ1Ｒ1、Ｒ2Ｒ2およびｒｒ）の膜フラグメントをキャリーするマイクロアレイの、抗Ｄモノクロナール抗体に対する反応性を、それぞれ示したものである。
【図７】図７は、「サンブライト（登録商標）」でコーティングされ、様々な赤血球型（Ｒ1Ｒ1、Ｒ2Ｒ2およびｒｒ）の膜フラグメントをキャリーするマイクロアレイの、抗Ｅモノクロナール抗体に対する反応性を、それぞれ示したものである。
【図８】図８は、図６と同様の反応性を、ｐｏｌｙＤＡＤＭＡＣでコーティングしたマイクロアレイにつき示したものである。
【図９】図９は、図７と同様の反応性を、ｐｏｌｙＤＡＤＭＡＣでコーティングしたマイクロアレイにつき示したものである。
【図１０】図１０は、図６と同様の反応性を、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングしたマイクロアレイにつき示したものである。
【図１１】図１１は、図７と同様の反応性を、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングしたマイクロアレイにつき示したものである。
【図１２（ａ）】図１２（ａ）は、ｐＤＡＤＡＭＣでコーティングされ、グリコフォリンＡおよびＢ遺伝子（Ａは血液型抗原Ｍ／Ｎを、Ｂは血液型抗原Ｓ／ｓを有する）をトランスフェクトしたＴ２９３細胞のコロニー（１，１；１，２；２，３；４，７，１など）の膜フラグメントをキャリーするスライドの、抗Ｍ抗体に対する反応性を、それぞれ示したものである。
【図１２（ｂ）】図１２（ｂ）は、ｐＤＡＤＡＭＣでコーティングされ、グリコフォリンＡおよびＢ遺伝子（Ａは血液型抗原Ｍ／Ｎを、Ｂは血液型抗原Ｓ／ｓを有する）をトランスフェクトしたＴ２９３細胞のコロニー（１，１；１，２；２，３；４，７，１など）の膜フラグメントをキャリーするスライドの、抗Ｎ抗体に対する反応性を、それぞれ示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明のさらなる特徴および利点は、例証として以下に示す実施例により、明らかにされる。
【実施例１】
【００４４】
修飾赤血球および未処理赤血球からの膜フラグメントの作成：
対象抗原を発現しているヒト赤血球を、献血および／またはドナー検査サンプルから選択した。適切なドナー血液を各３ｍｌずつ、別々の２２５ｍｌファルコンチューブにピペットで滴下し、氷で冷却したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を２００ｍｌまで加えた。この赤血球懸濁液を、そっと混ぜ合わせ、その後３０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。上澄みを捨て、同じプロセスを、２回はＰＢＳを用いて、１回はバッファ３１０（０．１Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4を使用してｐＨ７．３にしたもの）を用いて、計３回繰り返した。いずれの場合も、遠心分離された赤血球ペレットを、そっと再懸濁した。ヘマトクリット値（すなわち、赤血球が占める容積のパーセンテージ）が測定された。ヘマトクリット値は、＞赤血球１０％であった。必要に応じて、バッファ３１０を用いてヘマトクリット値を１０％に調整した。１０％の細胞懸濁液１０ｍｌをソルヴァル（Ｓｏｒｖａｌ 遠心分離機)のチューブに移し、ここに氷で冷した溶解バッファ（４６．５ｍｌのバッファ３１０を希釈して１Ｌの逆浸透水（ＲＯ）にしたもの）を加えて３６ｍｌにし、そっと混ぜ合わせた。これを、速度１９０００ｒｐｍ、温度４℃で、１５分間遠心分離した。溶血した上澄みを捨て、ペレットを再懸濁し、氷で冷やした溶解バッファ３６ｍｌでもう１度洗浄した。これを再び、速度１９０００ｒｐｍ、温度４℃で、１５分間、遠心分離した。普通の容器内の５ｍｌのＰＢＳにペレットをそっと再懸濁し、これを氷の上に保った。こうして得た赤血球ゴースト（すなわち、空の細胞膜）を、最大出力の５０％で１分間超音波処理（Ｓｔａｔｕｓ  ２００  超音波処理機）してフラグメント化した。
【００４５】
酵素修飾細胞が必要な場合には、前記したゴースト化、フラグメント化のプロセスの前に、次の処理を行った。上澄みが透明になるまで（通常４回）ＰＢＳで赤血球懸濁液を洗浄し、ＰＢＳ内でヘマトクリット値を５０％に調整した。５０％の赤血球懸濁液１ｍｌ毎に、１ｍｌのパパイン酵素を加え、別々の２２５ｍｌファルコンチューブ内でそっと混ぜ合わせた。この混合物を、室温で８分±０．５分、終始混ぜ合わせながらインキュベートした。インキュベート後、各フラスコを０．９％の生理食塩水またはＰＢＳで満たし、そっと混ぜ合わせた。その後、各フラスコを３６００ｒｐｍで６分間、ノーブレーキで遠心分離した。上澄みを蠕動ポンプで吸引廃棄した。この作業を、上澄みが透明になるまで３回以上繰り返した。最終洗浄の際、懸濁液にＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ａｌｓｅｖｅｒｓ溶液（Ａｌｂａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を追加して５０％の懸濁液とした。
【実施例２】
【００４６】
クローン化血液型抗原（Ｍ／ＮおよびＳ／ｓ抗原）を発現しているトランスフェクト細胞株からの膜フラグメントの作成：
ＲＮＡ源：  赤血球細胞株Ｋ５６２は、グリコフォリンＡおよびＢを発現することが知られている。グリコフォリンＡは血液型抗原Ｍ／Ｎを、グリコフォリンＢは血液型抗原Ｓ／ｓを、それぞれキャリーする。Ｋ５６２を、１０％の子牛血清で強化したＲＰＭＩ培地で培養した。ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社）をメーカーの指示に従って使用し、１０７個の細胞を用いてトータルＲＮＡを分離した。ＡｃｃｕＳｃｒｉｐｔ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  １st  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用し、ＲＮＡの一部を用いて２０μｌの反応液内で、ｃＤＮＡの第１ストランドを合成した。その後０．５〜２μｌを使用して、グリコフォリンＡ（ＧＹＰＡ）およびＢ（ＧＹＰＢ）のコード配列をＰＣＲ増幅した。この２つのタンパク質のＮ端末は同一であるため、同じフォワードプライマーを使用した（ＳａｃIIＧＹＰ  ＡＢ  ｆｗｌ）。
【００４７】
プライマー：
ＳａｃIIＧＹＰ  ＡＢ  ｆｗｌ：
ＣＡＴＣＧＡＣＣＧＣＧＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＡＴＧＧＡＡＡＡＡＴＡＡＴＣＴＴＴＧＴＡＴ、
ＥｃｏＲIＧＹＰ  Ａ  ｒ：
ＧＴＴＣＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＧＡＴＣＡＣＴＴＧＴＣＴＣＴＧＧ、
ＥｃｏＲIＧＹＰ  Ｂ  ｒ：
ＧＴＴＣＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＧＣＣＴＴＴＡＴＣＡＧＴＣＧＧＣ。
【００４８】
ＰＣＲ条件：  ０．７μｌのｃＤＮＡを使用した；
プライマー各１μｌ（２０ｐｍｏｌｅｓ／μｌ）、
水２５μｌ以下、
Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ２ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  ミックス (Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）２５μｌ。
【００４９】
プログラム：  ９５℃／３分  １サイクル、
９５℃／３０秒、
５４．５℃／３０秒  ３５サイクル、
７２℃／１分、
７２℃／１０分  １サイクル、
４℃  ホールド。
【００５０】
フォワードプライマーは、制限エンドヌクレアーゼＳａｃIIの認識配列と、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲIのリバースプライマーとをキャリーする付加配列を含む。このため、ＮＦＢバッファ４内において、３７℃で２時間、ＰＣＲ産物を両酵素で同時に分解し、その後ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社）で精製した。ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）５μｇを、２０μｌの反応液内で、同じ制限エンドヌクレアーゼで分解し、２．５μｌの１０ｘ  Ａｎｔｒａｃｔｉｃ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅバッファと２．５μｌのＡｎｔａｒｃｔｉｃ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（５Ｕ／μｌ）を加えた後に、３７℃で１５分間、脱リン酸化し、続いて酵素を３６℃で１５分間インキュベートした。その後、線状化プラスミドをＰＣＲ精製キットで精製した。精製されたＰＣＲ産物とプラスミドを、３０μｌの溶出バッファに溶出した。
【００５１】
ライゲーション：  前記のように処理した０．６μｌのｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔプラスミドを、２．４μｌの対応するＰＣＲ産物および３μｌの２ｘ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘライゲーションミックス（タカラバイオ株式会社）で連結した。ライゲーションは、１６℃で２０分間行った。
【００５２】
形質転換：  ４μｌのライゲーションミックスを使用して、Ｅ．ｃｏｉｌ  Ｔｏｐ  １０化学的コンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のアリコート５０μｌをメーカーの指示に従いトランスフォームした。２５０μｌのＳＯＣ培地を加え、２５０ｒｐｍでシェイクしながら、３７℃で１時間、細胞培養を行い、プレーティング前に取り出した。形質転換細胞を各々２０μｌおよび２００μｌずつ、５０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する寒天培地にプレーティングした。
【００５３】
組み換えプラスミドの作成：  各形質変換体から４コロニーを、５０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する５ｍｌの液体ＬＢ培地内で、２５０ｒｐｍでシェイクしながら３７℃で１晩、培養した。Ｑｉａｇｅｎ社のミニプレップ・キットを使用し、メーカーの指示に従ってプラスミドをミニプレップし、５０μｌの溶出バッファに溶出した。各プラスミドＤＮＡを３μｌずつ、ＮＥＢバッファ４内で、制限エンドヌクレアーゼ（ＮＥＢ）ＳａｃＩＩおよびＥｃｏＲＩで同時に分解し、１％アガロース／ＴＢＥゲル内の電気泳動とエチジウムプロマイド染色を用いて、クローン挿入部の存在をチェックした。
【００５４】
トランスフェクション：  プラスミドＤＮＡを、紫外分光光度法により２６０ｎｍで定量し、各プラスミドＤＮＡを１５μｇずつ、４５μｌのＧｅｎｅＪｕｉｃｅと混ぜ合わせ、エレクトロポレーションを用いて２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。エレクトロポレーションの後、１０ｃｍシャーレの上で、１０％の子牛血清で強化したＲＰＭＩ培地内に、細胞をプレーティングした。プレートの１／２の細胞を、トランスフェクション後２４時間で、残りの半分を４８時間で、スクラッピングにより回収し、スピニングし、ＰＢＳで洗浄し、再度スピニングして、細胞ペレットをスナップ冷凍した。
【００５５】
トランスフェクト細胞からの膜フラグメントの作成：  赤血球の場合（実施例１）と同じ超音波処理法を用いて膜フラグメントを作成した。ただし、細胞の数は大幅に少なく、その結果、トランスフェクト２９３Ｔ細胞からのフラグメントの希釈係数はより大きいものとなった。
【実施例３】
【００５６】
コーティングしたスライドおよびプレートの作成：
一般材料：  ウシ血清アルブミン（最低限９６％電気泳動）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（ドーセット、英国）から購入した。ＰＢＳタブレット（１００ｍｌにつき１タブレット）は、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ社（ノッティンガム、英国）から購入するか、Ａｌｂａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ自社製のＰＢＳを使用した。
【００５７】
マイクロプレート：  ９６ウェルのガラス底のＭａｔｒｉｘマイクロプレートは、Ｍａｔｒｉｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（英国）から購入し、９６ウェルのガラス底のＰｏｒｖａｉｒマイクロプレートは、Ｐｏｒｖａｉｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社（シェパートン、英国）から購入した。
【００５８】
コーティング試薬：  オレイル−Ｏ−ポリ（エチレングリコール）−スクシニル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンミジルエステル、「サンブライト（登録商標）」ＯＥ−０４０Ｃ（ポリエチレングリコール部分に、平均して９０のエチレンオキサイド繰り返し単位を有し、分子量は４０００である）は、ＮＯＦ  ＥＵＲＯＰＥ  （ＢＥＬＧＩＵＭ）ＮＶ社から購入した。中間分子量の塩化ポリジアリルジメチルアンモニウム（ｐｏｌｙＤＡＤＭＡＣ）ＦＬ４４４０（活性率３９〜４２％）は、ＳＮＫ社（キャッスルフォード、英国）が提供してくれた。ポリ−Ｌ−リジン溶液ＰＬＬ（１％Ｗ／Ｖの水溶液）と３−グリシドキシプロピル−トリメトキシシラン（ＧＯＰＳ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（ドーセット、英国）から購入した。
【００５９】
方法：
スライドの浄化：  スライドを、５０ｇＮａＯＨ／２５０ｍｌ９６％ＥｔＯＨ／２００ｍｌＭｉｌｌｉＱ精製水の中で、室温で２時間、そっとシェイクしながら浄化した。
【００６０】
マイクロプレートの浄化：  ０．２モル濃度のＮａＯＨを２００μｌずつ、マイクロプレートの９６ウェルの各々にピペットで滴下し、室温で３０分放置した。Ｄｙｎｅｘ  Ｕｌｔｒａｗａｓｈ  Ｐｌｕｓ  ＥＬＩＳＡマイクロプレート・ウォッシャーを使用し、逆浸透精製水でプレートを２×３回洗浄した。９０％のＥｔＯＨをさらに２００μｌ各ウェルに追加した後、３０分間室温に放置してインキュベートした。マイクロプレートを前記のように洗浄した。遠心分離機ＩＥＣ  Ｃｅｎｔｒａ−４Ｂを使用し、４００００ｒｐｍ以下で５分間、各マイクロプレートを逆さまに遠心分離にかけ、乾燥させた。
【００６１】
マイクロプレートのコーティング：
ポリ−Ｌ−リジン：  １００μｌのポリ−Ｌ−リジン（０．１ｍｇ／ｍｌを１０％のＰＢＳ／ＲＯ水で希釈したもの）を各ウェルにピペット滴下し、室温に一晩放置した。自動ピペット洗浄器を使用し、１００μｌのＲＯ水で２回、非結合のＰＬＬ溶液を洗い流し、前記と同様に遠心分離機にかけて乾燥させた。プレートを４０℃のオーブンに５分間入れた。
【００６２】
ＧＯＰＳ：  １００μｌのＧＯＰＳ（１０ｍｇ／ｍｌ以下を９４％のＥｔＯＨ／ＲＯ水に入れたもの）をマイクロプレートの各ウェルにピペット滴下し、室温に一晩放置した。自動ピペット洗浄器を使用し、１００μｌの９０％ＥｔＯＨ／ＲＯ水で２回、非結合のＧＯＰＳ溶液を洗い流し、前記と同様に遠心分離機にかけて乾燥させた。プレートを６０℃のオーブンに６０分間入れた。
【００６３】
「サンブライト（登録商標）」ＯＥ−０４０Ｃ：１００μｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＲＯ水溶液をマイクロプレートの各ウェルにピペット滴下し、室温に一晩放置した。自動ピペット洗浄器を使用し、１００μｌのＰＢＳ水で２回、過剰な１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＲＯ水溶液を洗い流し、前記と同様に遠心分離機にかけて乾燥させた。１００μｌのＳＵＮＢＲＩＧＨＴＯＥ−０４０Ｃ（０．０８ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ／ＲＯ水に入れたもの）をマイクロプレートの各ウェルにピペット滴下し、室温に１時間放置してインキュベートした。自動ピペット洗浄器を使用し、１００μｌのＰＢＳ／ＲＯ水で２回、非結合のＳＵＮＢＲＩＧＨＴＯＥ−０４０Ｃを洗い流し、前記と同様に遠心分離機にかけて乾燥させた。
【００６４】
ＦＬ  ４４４０（ｐｏｌｙＤＡＤＭＡＣ）：  １００μｌの０．０８ｍｇ／ｍｌ  ｐｏｌｙＤＡＤＭＡＣＰＢＳをマイクロプレートの各ウェルにピペット滴下し、室温に１時間放置した。自動ピペット洗浄器を使用し、１００μｌのＲＯ水で２回、非結合のｐｏｌｙＤＡＤＭＡＣを洗い流し、前記と同様に遠心分離機にかけて乾燥させた。
【００６５】
スライドのコーティング：  マイクロプレートの場合と同様の濃度、温度およびインキュベート時間を用いて、スライドをＰＬＬ、「サンブライト（登録商標）」ＯＥ−０４０ＣおよびＦＬ４４４０でコーティングした。
【実施例４】
【００６６】
タンパク質マイクロアレイの作成：
前記のように表面をコーティングしたスライドを基板として使用した。スポットする膜フラグメントのサンプルを、ＰＢＳまたはその他の安定液剤内に準備した。
【００６７】
ＳｐｏｔＢｏｔ（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ／Ａｒｒａｙｉｔ）またはＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃ  ＭｉｃｒｏＧｒｉｄ  II  Ａｒｒａｙｅｒを用い、２００〜７００μｍの硬質ピンで、スライドをプリントした。各サンプルの複製を、各スライド上にプリントし、スライドを少なくとも１時間、空気乾燥させてからバック内に密閉し、４℃の温度で、必要となるまで保った。スライドを、ＰＢＳ内で軽くすすいでから、ＰＢＳ−ＢＳＡブロッキング剤の容器内で、絶えず混ぜ合わせながら１時間、室温で処理した。取り出す際、スライドをＰＢＳで軽くすすぎ、遠心分離機内で１分間、１０００ｒｐｍで遠心分離して乾燥させた。
【実施例５】
【００６８】
タンパク質マイクロアレイを使用した抗体スクリーニング検査：
実施例４に従って準備した各マイクロアレイを、チャンバで覆った。被験者の血液サンプルを、ＰＢＳ内で１／１０に希釈した。その後、４５０μｌの抗体溶液を、チャンバの小窓の１つからピペットでマイクロアレイのスライド上に滴下し、付属のシールで小窓を密閉した。スライドをスライドボックスに入れ、室温で１時間、混ぜ合わせた。
【００６９】
チャンバを取り外し、スライドを軽くＰＢＳに浸して、過剰な標的溶液を除去し、その後、ＰＢＳ内で１０分間、２回洗浄した。最後の洗浄を済ませた後、スライドを遠心分離機にかけて乾燥させ、無塵の暗所にスキャニングまで保管した。なお、抗体は、Ａｌｂａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社（エディンガム、英国）から入手した。
【実施例６】
【００７０】
データの抽出および分析：
Ｇｅｎｅｐｉｘ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  ４１００Ａ  Ｓｃａｎｎｅｒまたは同様のスキャナを用いて、スライドをスキャンした。波長設定は、Ｃｙ３／ＦＩＴＣ用のものを使用した。すべてのスライドを、１０μｍの画素サイズでスキャンし、ＢＭＰおよびＴＩＦの両ファイルに保存した。
【００７１】
ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ４．１（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）または同様の機具を用いて、マイクロアレイから数値データを抽出した。スキャニング、データ入力、およびマイクロアレイからのデータ抽出を、ソフトウェアで制御した。テキスト入力ファイルは、マイクロアレイのカラムおよび列の位置を用いて自動作成され、各プローブを同定し、その位置を決定した。これを用いて、アレイリストを作成し、マイクロアレイグリッドの設定完了後にロードした。グリッドとアレイリストの作成が完了すると、データはテキストファイルに抽出された。このプロセスにより、各スポット中心からの蛍光強度の中央値、およびスライドのバックグラウンド全体からの蛍光強度の中央値を得た。この情報を、エクセルのワークシートに収集した。
【００７２】
各スポットにつき、蛍光強度値からバックグラウンド蛍光値を差し引いた。スライド毎に、それぞれ異なるスキャン設定からのシグナル強度値を、１つのワークシートに並べた。設定ごとの各設定に対する全数値を用いて、散布図にした。こうして得られたデータの形状は、スキャンの質の目安となるものであり、設定が低すぎたり、高すぎたりした場合は、飽和スポットとして表わされた。各グラフにＲ２値を適用し、１に最も近い数値を出したものを、最良のデータとした。将来的データ処理用に、各スライドから１スキャンを選択した。
【００７３】
最良のスキャンデータを選択した後、以下のように処理した。不要なデータをワークシートから除去し、マイクロアレイ上の１スポットにつき１つの数値（各スポットにつき、蛍光強度値からバックグラウンド蛍光値を差し引いたもの）だけを残した。陰性対照の数値を用いて、「ノイズ」値を計算した。すなわち、陰性対照の平均値に、標準偏差の２倍をプラスした（平均＋２標準偏差）。この数値は、非特異的結合（ＮＳＢ）を表す。各スポットの数値を陰性対照の「平均＋２標準偏差」で割って、シグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を求めた。１以上の数値であれば、有意と判断し得た。各サンプルの反復スポットにつき、Ｓ／Ｎの中央値を計算した。
【００７４】
マイクロソフト社のエクセルを用いて、処理データを、必要に応じて分析した。データの分析には、一般に棒グラフを活用した。棒グラフのＹ軸は、サンプルのＳ／Ｎ中央値を示す。
【００７５】
結果：
こうして得た結果を、図１〜図１２に示す。
【００７６】
図１〜３は、「サンブライト（登録商標）」、ポリ−Ｌ−リジンおよびｐｏｌｙＤＡＤＭＡＣでコーティングしたスライドのモノクロナール抗体パネル（抗Ｄ、抗Ｃ、抗Ｅ、抗ｃおよび抗ｅ）に対する反応性を示す。Ｒ1Ｒ1、Ｒ2Ｒ2およびｒｒの赤血球型からの膜フラグメントが固定化された。ＰＢＳバッファを対照とした。蛍光標識した抗ヒト二次抗体を用いて、結合抗体を検出した。
【００７７】
シグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）が１よりも大きければ、陽性と見なした。抗体に対する様々な細胞型の反応性として期待されるのは、既知の反応性に基づき、次のような結果であった：
Ｒ1Ｒ1：  Ｄ+ Ｃ+ Ｅ- ｃ- ｅ+、
Ｒ2Ｒ2：  Ｄ+ Ｃ- Ｅ+ ｃ+ ｅ-、
ｒｒ：    Ｄ- Ｃ- Ｅ- ｃ+ ｅ+。
【００７８】
図１〜図３には、前記赤血球膜フラグメントを固定した表面のすべてから、期待通りの反応性が得られたことが示されている（ただし、Ｒ2Ｒ2ｃ抗原の反応性については、一貫した結果が得られなかった）。このことは、固定化された細胞膜フラグメントが、様々な抗原に対する抗原性を十分に保持しているということを示している。
【００７９】
図４は、抗Ｓ抗体でインキュベートした、様々な分子量のｐＤＡＤＭＡＣ上に固定した、赤血球膜フラグメント（超音波処理あり）と赤血球ゴースト（超音波処理なし）の反応性を比較したものである。
【００８０】
*ＮＳ：超音波処理なし（ゴースト）； Ｓ：超音波処理あり（膜フラグメント）、
赤血球  Ｓ／ｓ  表現型：
Ｒ1Ｒ1：  Ｓ-ｓ+
Ｒ2Ｒ2：  Ｓ-ｓ+
ｒｒ：    Ｓ+ｓ-。
【００８１】
期待される反応性：  ｒｒのみ陽性、
ＩｇＧ：直接スポットした二次抗体の陽性対照。
【００８２】
Ｆｌｏｑｕａｔ(ｐＤＡＤＭＡＣ）は、前記実験で処方されたものを使用した。
【００８３】
結論：  すべての処方のｐＤＡＤＭＡＣが適切と判断できた。少なくとも抗Ｓ抗体に関する限り、平均分子量が少ないものの方が、Ｓ／Ｎ値が良好であった。また、膜フラグメント（超音波処理あり）の方が、幾分か良好な結果（５つ処方のうち３つにおいて）を示した。フラグメントのさらなる利益（安定性、サイズの均一性など）は、よりサイズ小さいスポット（２００μｍ位）の方が顕著である。ここで使用したスポットは、およそ１μｍであり、マニュアルでスポッティングされた。
【００８４】
図５ａ〜図５ｃは、先の実施例と同様のＲ1Ｒ1、Ｒ2Ｒ2およびｒｒの細胞型と、抗Ｄ（ヒトＩｇＭ）抗体を使用し、コーティング剤の濃度の増加に伴う効果を示したものである。１／１０００希釈のｐＤＡＤＭＡＣと２μＭの「サンブライト（登録商標）」が先例でコーティングに使用された濃度であった。この実験は、コーティング濃度の増加が、膜フラグメントの固定化を向上させるかどうか、従って、より良い結果を生むどうかを調べるためのものであった。これらの実験結果は、これまでに用いてきた濃度が効果的であり、濃度を増加させても結果の改善が見られないことを示した。
【００８５】
結論：コーティング剤の濃度を増加させても、反応性の改善は見られず、最も低いコーティング濃度でさえ、飽和濃度であることが分かった。
【００８６】
図６〜図１１は、「サンブライト（登録商標）」、ｐｏｌｙＤＡＤＭＡＣおよびポリ−Ｌ−リジンでコーティングされ、赤血球膜フラグメント（Ｒ1Ｒ1、Ｒ2Ｒ2およびｒｒ）をキャリーするマイクロアレイの、抗Ｄおよび抗Ｅモノクロナール抗体に対する反応性をそれぞれ示している。結合抗体は、蛍光標識二次抗体（Ｃｙ３）を用いて検出された。
【００８７】
条件は以下の通りである：
二次抗体の陽性対照：直接スポットした抗Ｄ（ヒトＩｇＭ）および抗ｃ（ヒトＩｇＭ）、
二次抗体の陰性対照：直接スポットした抗Ｓ（ヒトＩｇＧ）、
Ｒ1Ｒ1、Ｒ2Ｒ2およびｒｒ細胞からの赤血球膜フラグメントに期待される反応性：
抗Ｅ（ヒトＩｇＭ）：Ｒ2Ｒ2陽性、ｒｒおよびＲ1Ｒ1陰性。
【００８８】
抗Ｄ（ヒトＩｇＭ）：Ｒ1Ｒ1およびＲ2Ｒ2陽性、ｒｒ陰性、
なお、陽性反応のカットオフ値は２とした。
【００８９】
結論：
ＰＬＬ／抗Ｄ：  反応パターンに一貫性が見られなかった。原液では幾分かの反応性を示し、１／１０希釈では全く反応せず、１／１００希釈において最良の反応性を示した;
ＰＬＬ／抗Ｅ：  Ｒ2Ｒ2において、非常に低いＳ／Ｎ値を示した;
「サンブライト（登録商標）」／抗Ｄ：  反応パターンに幾分が矛盾が見られた;
「サンブライト（登録商標）」／抗Ｅ：  Ｒ2Ｒ2の１／１０、１／１００希釈において良好な反応性良好な反応性を示した;
ｐＡＤＭＡＣ／抗Ｄ： 一貫した反応パターンを見せた。プリントしたフラグメントの希釈度が増すにつれ、Ｓ／Ｎ値は増加した。これは、非特異的なバックグラウンドシグナルが、希釈されて消失したためと考えられる；
ｐＤＡＤＭＡＣ／抗Ｅ*：  上記と同様の反応を示した；
*ただし、Ｒ1Ｒ1の１／１００希釈、１／２０００二次抗体だけは、偽陽性反応を示した。
【００９０】
図１２ａおよび図１２ｂは、トランスフェクト細胞（コロニー１，１；１，２；２，３；４，３および７，１）および赤血球（Ｒ1Ｒ1、Ｒ2Ｒ2およびｒｒ）からの膜フラグメントをキャリーするｐＤＡＤＭＡＣコーティングの反応性を示している。対照は、Ｋ５６２、ＰＢＳおよび標的細胞（陰性）である。膜フラグメントは、グリコフォリンＡおよびＢのコード配列を含むｐＣＭＶ発現プラスミドをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞から作成した。細胞から作成された膜フラグメントは、トランスフェクトの２４時間後に収集された。
【００９１】
赤血球表現型：
Ｒ1Ｒ1：  Ｋ-、Ｆｙ（ａ-）、Ｊｋ（ｂ-）、Ｓ-ｓ+、Ｍ-、Ｎ+、
Ｒ2Ｒ2：  Ｋ+ｋ+、Ｆｙ（ａ+ｂ+）、Ｊｋ（ａ-）、Ｓ+ｓ+、Ｍ+、Ｎ-、
ｒｒ：  Ｋ+、Ｆｙ（ａ+ｂ-）、Ｊｋ（ａ+ｂ+）、Ｓ+ｓ-、Ｍ+、Ｎ-。
【００９２】
期待される反応性：
１，１；１，２および７，１は、ＭまたはＮ（グリコフォリンＡのクローン遺伝子を含む）と反応することが期待される：
１，２は、あまり反応しないものと考えられる；
１，１は、抗Ｎモノクロナール抗体とよく反応する；
７，１は、抗Ｍモノクロナール抗体とよく反応する；
２，３および４，３は、抗ＭまたはＮ（グリコフォリンＢのクローン遺伝子を含む）と、反応しないことが期待される。ただし、両遺伝子（Ｍ／Ｎ特異性を有する）のＮ端末は同一であるため、何らかの交差反応は起こりうる：
特に４，３は、何らかの交差反応を示す可能性がある。
【００９３】
標的細胞−陰性対照：  非トランスフェクトＴ細胞；
Ｋ５６２−陽性対照：  ＭＮＳを発現する赤血球系細胞株。ただし、使用される細胞数が少ないため、スポットされる膜フラグメントの密度はかなり低い；
ＰＢＳ−陰性対照：  バッファ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５（ａ）】
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【図５（ｂ）】
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【図５（ｃ）】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２（ａ）】
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【図１２（ｂ）】
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