(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a) 2倍体の雄からの精子により2倍体の雌からの卵母細胞を受精させ、その後、受精卵の第1極体の放出阻止を誘導し、
b) 前記受精の後に得られる幼生を培養し、
c) 工程b)で培養された幼生の集団から、少なくとも20%の4倍体幼生を含む、4倍体に富む亜集団を単離し、
d) 工程c)で単離された幼生の亜集団を培養する
ことを含むことを特徴とする、4倍体の2枚貝軟体動物を生産する方法。
【請求項２】
第1極体の放出阻止が、受精後5分と25分の間に、10〜20分間行われるサイトカラシンBでの処理により誘導されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項３】
サイトカラシンBが、処理媒体1リットル当たり0.3 mgと0.7 mgの間の最終濃度で用いられることを特徴とする請求項2に記載の方法。
【請求項４】
工程b)の培養が、6〜8日間行われることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
工程d)の培養が、2〜3日間行われることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
以下の：
e) 前の工程において培養された幼生の亜集団から、少なくとも20%の4倍体幼生を含む、4倍体に富む亜集団を単離し、
f) 工程e)で単離された幼生の亜集団を培養する、
さらなる工程を含むことを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
工程f)の培養が、2〜3日間行われることを特徴とする請求項6に記載の方法。
【請求項８】
4倍体に富む亜集団の単離が、幼生をそれらのサイズに基づいて選別することにより行われることを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
4倍体に富む亜集団の単離が、適切なメッシュのふるいを通過させること、及びふるいに保持されない幼生を選択することにより行われることを特徴とする請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記2枚貝軟体動物が牡蠣である請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記2枚貝軟体動物がイガイである請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生存可能な4倍体の2枚貝軟体動物の生産に関する。
【背景技術】
【０００２】
多倍数体の2枚貝の生産は、現在、特に牡蠣に関して著しい興味の対象である。
実際に、「フォーシーズンオイスター」とも呼ばれる3倍体の牡蠣は、いくつかの利点を有する。これらは、奇数の染色体を有するので、通常、生殖不能であり、このことは、これらがより早く成長できる(それらのエネルギーは、生殖よりもむしろ成長のために用いられる)ことと、夏の間に生殖器官(milt)を作り出さないこととを意味し、後者は、1年を通してこれらの品質が一定であることを意味する。
【０００３】
3倍体の牡蠣は、2倍体の親を交配させ、その後、化学処理により、通常、サイトカラシンB (CB)又は任意に6-ジメチル-アミノプリン(6-DMAP)を用いて、又は物理的処理(特に熱ショック又は圧力)により第1又は第2極体を放出阻止(retention)することにより得ることができる。しかし、これらの2つの方法は、いくつかの問題点を有する。特に、倍数性のレベルの均質性の欠如が挙げられる。実際に、極体の放出阻止を誘導する処理により、種々のレベルの倍数性を有する混合した幼生の集団が得られる。幼生の成育の最後に、得られた集団は、通常、最大で90%の3倍体個体を含有し、集団の残りは2倍体で構成される。さらに、化学処理の場合、非常に毒性が高い物質を用いるものは、公的にほとんど了承されず、取り扱う人に対するいずれの危険性も回避するように厳密な対策を定常的に施す必要がある。
【０００４】
これらの理由により、3倍体の牡蠣の生産に現在好まれる方法が、4倍体の牡蠣を2倍体の牡蠣と交配させることからなっているのである。化学処理を繰り返し用いることを必要としないというその利点とは別に、この方法は、全ての個体が3倍体である均質な集団を得るという利点を有する。この方法の主な問題点は、生存可能な4倍体の親を得ることが困難である点にある。
【０００５】
種々の割合での4倍体の幼生の生成が、2倍体の親の交配、及びサイトカラシンB (CB)での処理による第1極体の放出の維持による3倍体の生成の実験の経過で観察されている。しかし、この4倍体の幼生の生成は、一過的であるようである。これは、受精後の最初の24時間の間と記述されているのみである(STEPHENS及びDOWNING, J. Shellfish Res, 7, 550〜51, 1988; GUOら, Biol. Bull., 183, 381〜93, 1992)。検出された4倍体の幼生の割合は劇的に低下するので、残りの幼生繁殖の間、又は微小規模養殖場(micronursery)若しくは養殖場への定着の時点及び特に繁殖の間には、4倍体の幼生は検出されない。
【０００６】
2倍体の親から生存可能な4倍体を直接得るために用いた全てのアプローチが失敗したことを説明する2つの仮説が提唱されている。
第1の仮説によると、4倍性は、そのコピー数が4倍体化の後に変化するある種の劣性致死対立遺伝子の発現により、幼生の生存とは適合しない遺伝的負荷を含むのであろう(劣性致死対立遺伝子の仮説)。しかし、近親及び野生型の系統を用いる雌性発生の実験は、劣性致死対立遺伝子の発現が、それら自体では、幼生段階の間の4倍体の死滅の全てを説明できないことを示す傾向にある(GUO, PhD学位論文: 太平洋牡蠣クラッソストレア・ギガスでの4倍体の誘導についての研究(Studies on tetrapliod induction in the Pacific oyster, Crassostrea gigas.), University of Washington, Seattle 1991)。
【０００７】
第2の仮説(核-細胞質比率の仮説)によると、2倍体の雌の親により生成される卵母細胞は、その遺伝物質が4倍体化の後に2倍になる核を支持するには小さすぎる。この第2の仮説は好まれており、生存可能な4倍体の牡蠣を得るために現在までに提案された方法を開発する基礎となった。
【０００８】
成功して用いられている第1の方法は、3倍体の雌の親を2倍体の雄の親と交配させ、減数分裂(MI)の第1期を、第1極体の放出阻止を誘発することにより遮断することからなる(PCT出願WO 95/19703; GUO及びALLEN, Mol Mar Biol Biotechnol 3, 42〜50, 1994)。この方法は、生殖不能でないいくつかの希な3倍体の雌が、2倍体の雌により生成される卵母細胞よりもかなり大きい卵母細胞を生成するので、4倍体の核を支持できるという事実に基づく。
【０００９】
最近、4倍体の雄を、それらの卵母細胞のサイズが大きいことで以前は選択されていた2倍体の雌と交配させることにより生存可能な4倍体の牡蠣を生成し、その後、第2極体を放出阻止することも記載されている(MCCOMBIEら, Mar Biotechnol (NY), 7, 318〜30, 2005)。しかし、現在唯一用いられている4倍体の生産方法では、3倍体の雌を2倍体の雄と交配させる。しかし、この方法は、2つの主な問題点を有する。
【００１０】
1) これらの4倍体は、明らかな生殖能を有する3倍体から得られるので、これらの同じ4倍体を、3倍体の新しい世代を生産するために用いることは、継続する世代から得られる3倍体の生殖能の増大を導き得る。よって、平均の生殖能は、第1世代の3倍体(CBでの処理の後の第2 PBの放出阻止の後に得られた「化学的」3倍体)の2%から、4倍体の雄の親を2倍体の雌と交配させて得られた第2世代の3倍体の13.4%に増大したことが観察された(GUO及びALLEN, Biol. Bull., 187, 309〜18, 1994)。世代を超えてのこの生殖能の増大は、その生殖能が増大するであろう3倍体の集団が長期間又は短期間で出現することを導く危険性があるので、環境を徐々に不毛化し、子孫が主に異数体である3倍体の牡蠣の生殖の結果として土着の2倍体の牡蠣の株を汚染する危険を冒している。
【００１１】
2) 3倍体を経る必要性があるので、2倍体のレベルで通常は一般的に達成されるいずれの遺伝的進歩を4倍体のレベルで導入することが特に困難で、面倒になる。実際に、遺伝的選択のプログラムの結果として改良された2倍体系統は、まず、化学的誘発の伝統的な方法により、3倍体を生産するために用いられなければならない。成熟に到達でき、卵母細胞を生成できるいくらかの3倍体を、4倍体を生産するための雌の親として用いることができるのは、後になってからだけである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
よって、3倍体の段階を経ることなく、2倍体の段階から4倍体の段階へ直接移行できる、4倍体の牡蠣を生産する方法が、特に望ましいようである。
本発明者らは、2倍体の親を交配させることにより生成される4倍体が幼生段階を超えて生存できないことは、2倍体の卵母細胞が4倍体の核に対して小さすぎること以外に原因があり、それらの原因は、4倍性に起因する適応値(すなわち、生存のための全体的な能力)の通常の減退を特に含むであろうという仮説を提唱する。この適応値の減退は、2倍体及び3倍体では通常抑制されているが、4倍体では抑制されないか又は部分的にしか抑制されないある負の対立遺伝子の発現によるのであろう。
【００１３】
このことは、4倍体の幼生の競争力の低さをもたらし、よって、これらを、2倍体の親の交配及びその後の第1極体の放出阻止により得られる幼生集団にも存在する2倍体及び3倍体の幼生と混合繁殖させたときに、4倍体の幼生は迅速に消滅する。
この仮説に基づいて、本発明者らは、4倍体を単離し、2倍体及び3倍体の幼生により奏される非常に強い競争から逃れさせるために、幼生の選別が、野生型の２倍体の親のみを含む交配から出発して生存可能な4倍体を得ることを可能にすると提案する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
よって、本発明者らは、4倍体の幼生の検出と、高いパーセンテージで4倍体幼生を含有する幼生亜集団の単離と、この亜集団の繁殖とに基づき、これらの段階が、成育の経過において必要な限り何回でも反復される方法を開発した。
よって、本発明者らは、4倍体の幼生は、より遅い成育と、それにより成育の同じ段階の2倍体及び3倍体の幼生と比較してより小さいサイズを特に特徴とすることを見出した。この観察は、本発明者らによる4倍体幼生の適応値の減退の仮説を確実にする。さらに、このことは、4倍体幼生に富む集団を得るための幼生の選別を単純化することを可能にする。なぜなら、この選別は、幼生のサイズに基づいて行うことができるからである。
【００１５】
本発明は、よって、
a) 2倍体の雄からの精子により2倍体の雌からの卵母細胞を受精させ、その後、受精卵の第1極体の放出阻止を誘導し、
b) 前記受精の後に得られる幼生を培養し、
c) 工程b)で培養された幼生の集団から、少なくとも20%、好ましくは少なくとも30%の4倍体幼生を含む、4倍体に富む亜集団を単離し、
d) 工程c)で単離された幼生の亜集団を培養する
ことを含むことを特徴とする、4倍体の2枚貝を生産する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【発明を実施するための形態】
【００１７】
第1極体の放出阻止は、伝統的に、受精後5分と25分の間に通常行われる微小管の組み立ての阻害を誘導する任意の処理(この処理の期間は10分間〜20分間で変動できる)により誘導できる。これは、例えば、コルヒチン、カフェイン、ノコダゾール、サイトカラシンB若しくは6-DMAPのような化学薬品での処理、又は穏やかな熱ショック若しくは高圧ショックのような物理的処理であり得る。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態によると、第1極体の放出阻止は、サイトカラシンBでの処理により誘発される。サイトカラシンBでの処理は、受精後5分と25分の間に、10〜20分間行うことができる。好ましくは、これは、受精後10分に開始して、約15分間行うことができる。特に有利には、サイトカラシンBは、処理媒体1リットルあたりの最終濃度で0.3 mgと0.7 mgの間、好ましくは0.5 mg程度で用いられる。3倍体の牡蠣の生産において第1極体の放出阻止の誘導のために通常用いられるものの強さの半分であるこれらの濃度は、誘導の有効性を消去することなく、サイトカラシンBの毒性効果を制限することを可能にする。
【００１９】
サイトカラシンBの代わりに、コルヒチン、カフェイン、ノコダゾール若しくは6-DMAP (300〜500μm)のようなその他の化学薬品、又は穏やかな熱ショック(30〜40℃)若しくは高圧ショックのような物理的処理を用いることもできる。これらの処理のそれぞれについて、選択される条件は、3倍体の牡蠣の生産において第1極体の放出阻止を誘導するために同じ処理が用いられる場合よりも、より穏やかであることが好ましい。
【００２０】
特に有利には、本発明による方法は、以下のさらなる工程を含む：
e) 前の工程において培養された幼生の亜集団から、少なくとも20%、有利には少なくとも30%の4倍体の幼生を含む、4倍体に富む亜集団を単離し、
f) 工程e)で単離された幼生の亜集団を培養する。
【００２１】
通常、工程b)の培養は、6〜10日間、好ましくは約8日間行われ、工程d)及びf)の培養は、2〜3日間行われる。
4倍体に富む亜集団の単離及び単離された亜集団の培養のこれらの工程は、幼生が成熟幼生(pediveliger)段階(220μmと250μmの間のサイズ)に達するまで数回反復できる。有利には、これらの工程は、少なくとも3回、好ましくは少なくとも4回、2〜3日の間隔で反復される。
【００２２】
本発明による方法の特に好ましい実施形態によると、4倍体に富む亜集団を単離するための幼生の選別は、それらのサイズに基づいて行われる。
実際に、上記のように、4倍体幼生は、成育の同じ段階の2倍体及び3倍体の幼生よりも小さい。一般に、4倍体幼生の平均サイズは、成育の同じ段階で、同じ条件下で培養された2倍体幼生の平均サイズより20〜30%小さく、3倍体幼生の平均サイズより25〜35%小さい。
このことは、幼生が、問題の種、幼生の成育段階及び培養条件に関して選択された適切なメッシュのふるいに通過させることにより、簡便で単純に選別できることを意味する。
【００２３】
有利には、4倍体に富む亜集団の単離及び単離された亜集団の培養のさらなる工程は、定着した稚貝(settled spats)に対して、成熟幼生段階の後に行うことができる。この段階から始まって、これらの工程は、好ましくは、前よりもより長い間隔、例えば8〜15日ごとに反復される。
この場合、ふるい分けにより選別を行うために、成熟幼生のために供給される付着基体は、定着の間の幼生のサイズとほぼ等しいサイズの粒子からなり、このことにより、粒子あたり1つの幼生の付着が可能になる。用いられる基体は、特に、牡蠣の殻を粉砕することにより得られる微小砕片粒子であり得る。
【００２４】
亜集団の単離のそれぞれの工程の後に、選択された亜集団中の4倍体のパーセンテージは、必要であれば、倍数性のレベルを決定する通常の方法により確認することができる。例えば、該亜集団から採取した少なくとも100個体のサンプルに対して、フローサイトメトリーを用いることができる。
【００２５】
本発明による方法は、(特にそれらを3倍体の生産のために用いるという観点で)4倍体を生産したい2枚貝の全ての種(例えばイタヤガイ科(Pectinidae) (イタヤガイ)、イガイ(ミティルス・エデュリス(Mytilus edulis)及びミティルス・ガロプロビンシアリス(Mytilus galloprovincialis))、クラムなど)のために用いることができる。4倍体の牡蠣を生産することが特に興味深く、以下の実施例に記載されるクラッソストレア・ギガス(Crassostrea gigas)の種の牡蠣だけでなく、クラッソストレア属(特にクラッソストレア・バージニカ(Crassostrea virginica))、サッコストレア(Saccostrea)属(例えばサッコストレア・コマーシャリス(Saccostrea commercialis))の任意のその他の種、又はオストレア(Ostrea)属の種、例えばオストレア・エデュリス(Ostrea edulis)にも用いることができる。
【００２６】
本発明による方法は、生存可能な4倍体の2枚貝、特に牡蠣を、任意の2倍体の親から出発して得ることを可能にする。特に、この方法は、それらの卵母細胞のサイズに関して雌の親を選択する必要がない。
これは、2倍体の野生型の親から直接、3倍体の段階を経ることなく、4倍体の親を生産することを可能にする。これらの4倍体の親は、次いで、世代を超えた3倍体の生殖能の増大につながる上記のような危険を冒すことなく3倍体の生産のために用いることができる。
【００２７】
本発明による方法は、2倍体で得られた遺伝的改良を4倍体に直接導入することを可能にする。このために、本発明を用いるための出発原料として、選択された2倍体系統の動物から得られる卵母細胞及び精子を用いることで充分である。得られた4倍体は、次いで、これもまた同じ改良を組み込んだ3倍体の生産のために用いることができる。
【実施例】
【００２８】
本発明は、生存可能な4倍体の牡蠣を生産するために本発明を用いることについて説明する実施例に言及する以下のさらなる記載から、よりよく理解される。
実施例1：多倍数性の誘導及び幼生の繁殖
実験に用いた2倍体の親は、マレンヌオレロン(Marennes Oleron)湾の野生型2倍体稚貝の天然の回収領域からである。6つの雌の親と4つの雄の親を、生殖巣の乱切による配偶子の回収のために用いた。10個の親から得られた15百万個の卵母細胞と、30億個の精子とを、25℃の1 Lのろ過海水中で交配を行うために用いた。第1極体の放出阻止は、0.5 mg/lの最終濃度までDMSO中に溶解したサイトカラシンB (CB)を用いて行った。CBは、受精後10分から開始して、15分間適用した。
【００２９】
多倍数性を誘導するためのこのプロトコルは、3倍体の生成のために文献中に既に発表されたものと類似する(GUOら, Biol. Bull., 183, 381〜93, 1992; GERARDら, Aquaculture, 174, 229〜42 1999)。しかし、CBの最終濃度(1 mg/lの代わりに0.5 mg/l)を、多倍数性の誘導の程度を低減することなく、この物質の毒性の影響を制限するために低減した。
次いで、10μmメッシュのナイロンフィルタを通して胚をふるい分けし、0.1% DMSOを含有するろ過海水中で15分間洗浄した後に、CBを除去する。
対照として、同じ親から得られた15百万個の卵母細胞と、50億個の精子を、CBでの処理をしない以外は同じ条件下で交配を行うために用いた。
【００３０】
次いで、2つの群(対照群及びCB処理群)のそれぞれからの胚を、22℃の150 Lのろ過海水を含有する円柱-円錐形のタンク内での培養に戻し、繁殖タンク内に組み込まれたバブラーにより曝気した。
幼生の孵化及び可能性のある死亡の割合を評価可能とするために、後者を、受精後24時間で45μm径のフィルタを通してふるい分けし、1〜2 Lのろ過海水を含有するメスシリンダーに回収し、幼生の合計数を、50μlサンプル中の計数から見積もる。
【００３１】
さらに、幼生の倍数性を、フローサイトメトリーにより決定する。それぞれのふるい分けの後に、幼生のサンプル(少なくとも100個の幼生)を採取し、1.5 mlチューブに入れる。短い遠心分離により海水を除去した後に、幼生を1 mlの溶解バッファー(5 mM MgCl2、85 mM NaCl、10 mM Tris、0.1% Triton X-100、pH7)に入れる。次いで、幼生を、プラスチックのプランジャーにより破砕し、遊離された核を、30μmメッシュのナイロンフィルタ(Partec Celltrics)を通してろ過し、サイトメトリー分析管に回収し、次いで、DAPI (4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール 二塩酸塩)を2μg/mlで含有する溶解バッファー1 ml及び倍数性の内部対照2μl (マスの赤血球、TRBC, Coulter DNA Reference Calibrator, 629972)を加えることにより、1μg/mlの最終濃度のDAPIで標識する。
【００３２】
氷上及び暗所で30分の最小限のインキュベーション時間の後に、サイトメトリー分析を、Partec PAIIサイトメーターを用いて行う。各分析(チャネルFL4、1024チャネルの線形スケール)は、最小で2000個の粒子に対して行う。得られた結果は、各ピーク内の事象のガウス分布を用いた頻度分布図の形で示す。ピークは、それらがFloMaxTMソフトウェアにより自動的に同定された場合は「ピークx」として、又はオペレーターにより手動で同定された場合は「RN/PK x」として記録する(xはピークの番号である)。
【００３３】
CB処理群では、D1での幼生Dの割合は、16.5%と見積もられ(未処理対照の42%に対して)、これは、約2.5百万個の幼生Dの集団を表す。
受精後2日目から開始して、水を、ふるい分けした後に1日おきに新しく交換する。受精後D6まで、幼生を、45μmのフィルタに通してふるい分けした。水の交換のたびに、幼生を計数し、その倍数性のレベルを、上記のようにしてフローサイトメトリーにより決定する。
【００３４】
次いで、幼生を、それぞれの円筒-円錐形繁殖タンクに戻し、受精後D4に10000個の幼生/L及び受精後D6に6500個の幼生/Lの最大密度を観察する。
幼生に、実験室で養殖され、かつ70%のIsochrysis galbanaタヒチ株と、30%のChaetoceros gracilisを含有する食用藻を、25細胞/μl/日の濃度で毎日供給する。
【００３５】
繁殖の初めの日々の間の生存率の監視により、受精後D1とD6の間の幼生の生存の明確な減少が示される(図1)。この減少は、CBでの処理の有害な影響と、特に繁殖タンク内の幼生の高い密度の影響との両方により説明できる。
受精後D1とD6の間に、未処理の幼生及びCB処理の幼生のサイトメトリー分析により、以下のことがわかる。
- 対照交配は、2倍体の核のみの集団を有する(図2、「ピーク1」)、
- GPIの放出阻止の誘導から得られた幼生のサンプルは(図3及び4)、以下のレベルの倍数性に相当する3つのタイプの核集団を示す：2倍体(平均約20%、「ピーク1」)、3倍体(平均約40%、「ピーク2」)及び4倍体(平均約40%、「ピーク3」)。
【００３６】
受精後D6の後に、幼生の個体群は安定し、幼生の定着まで著しい死亡なしに、幼生の繁殖が継続される。
2〜3日ごとに、朝にふるい分けを行う。受精後6日目まで、45μmのふるいを通して非選択的に幼生をふるい分けした。
次いで、幼生の目的集団にふるいのサイズを適合させて、選択的ふるい分けを行い、幼生の種々の集団を、それらの成長速度(ふるいの異なるサイズから見積もる)、及びそれらの倍数性のレベル(フローサイトメトリーにより確認する)に基づいて構成した。
このようにして、「バッチの先頭(head of batch)」とよばれる強い成育の集団、「バッチの胴体(body of batch)」とよばれる中程度の成育の集団、及び「バッチの末尾(tail of batch)」とよばれる遅い成育の集団を、これらの2つの基準との相関として構成し、それぞれ別個のタンクに保管した。サイズ及び倍数性の関数としての選択的選別のこの方法の最終目的は、繁殖バッチの異なる部分の中で、2倍体及び3倍体の幼生に対する4倍体幼生の割合を最大限にすることにより、4倍体幼生の成長及び生存に最も好ましくすることである。
【００３７】
*よって、受精後D8に、幼生のサイズについて選択的な第1のふるい分けを行い、幼生の2つの集団を別々に繁殖させた：成長が通常で、80μmの最小サイズの「バッチIの先頭」集団と、成長がより遅く、65μmと80μmの間のサイズの「バッチIの末尾」。
その後のふるい分けを、受精後D11、D13、D15、D18、D20、D23、D25、D27及びD29に行った。
【００３８】
*受精後D11に、対照群及びCBで処理した2つの幼生集団に対して行ったサイトメトリー分析は、以下のことを示す。
- 対照の交配は、まだ、核の2倍体集団のみを有する(図5、「ピーク1」と、内部対照TRBCに相当するピーク「ピーク2」)、
- 80μmの最小サイズ(T≧80μm)の「バッチIの先頭」集団から得られた処理幼生のサンプルは、この集団が、2倍体幼生(57%、「PK1」)及び3倍体幼生(43%、「PK2」)のみで構成されることを示す。4倍体幼生の集団は、ここでは検出されなかった(図6、内部対照TRBCに相当するピーク「PK 3」)。
- 80μm未満のサイズ(65μm＜T＜80μm)の「バッチIの末尾」集団から得られた処理幼生のサンプルは、この集団が、倍数性のクラスの点、又はこれらの倍数性のクラスの割合の点でも根本的に異なる構成であることを示す。サイトメトリー分析は、この集団が、15%の2倍体幼生(ピーク1)、40%の3倍体幼生(ピーク2)及び特に45%の4倍体幼生(ピーク3)で構成されることを示す(図7、ピーク「ピーク4」は、内部対照TRBCに相当する)。
【００３９】
この結果は、繁殖された幼生の集団全体の4倍体のフラクションが、幼生の繁殖における「バッチの末尾」の部分に限定されることを示し、よって、異なるレベルの倍数性を有する幼生が、それらを混合して繁殖させたときに、異なる成育をするという我々の仮説が確認される。つまり、倍数性の4倍体のレベルは、2倍体及び3倍体のレベルと競合下にあるときに、最も遅い成長速度を示すものであることがわかる。
【００４０】
繁殖の後に、4倍体を含有する唯一の集団である「バッチIの末尾」に特に注目して、この「バッチIの末尾」集団に対して、60及び80μmのふるいを通してふるい分けを行った後に4倍体幼生に漸増的に富む2つの亜集団を単離可能とするように、2回の選択的ふるい分けを行った。
つまり、第1の亜集団(「バッチIの末尾」とよばれる)は、サイズが65μmより大きく80μmより小さい幼生で構成され、第2の亜集団(「バッチIの胴体」とよばれる)は、サイズが80μm以上であり、通常、100μmまでの幼生で構成される。
【００４１】
*受精後D13に、未処理幼生及びCBで処理した幼生に対して行ったサイトメトリー分析は、以下のことを示す。
- 未処理の対照は、まだ、2倍体の核のみを示す(図8中のピーク「RN 1」、内部対照TRBCに相当するピークである「RN 2」)。
- 処理幼生の集団「バッチIの先頭」は、引き続き、2倍体幼生(45%、ピーク1)及び3倍体幼生(55%、ピーク2)のみで構成される(図9、「ピーク3」は、内部対照TRBCに相当する)。この集団は、通常の成長を示し、100μmの最小サイズに到達した幼生で構成される。
- 処理幼生の集団「バッチIの胴体」及び「バッチIの末尾」は、4倍体幼生の高い割合をまだ示すただ2つの集団である(図10の「ピーク3」及び図11の「RN 3」のピークで表される40〜50%)。図10及び図11のピーク「ピーク1-2-4」及び「RN 1-2-4」は、それぞれ、2倍体の核、3倍体の核及び内部対照TRBCに相当する。
【００４２】
*受精後D15に、処理幼生の集団「バッチIの胴体」及び「バッチIの末尾」(4倍体を含有するもの)の繁殖の条件に焦点を合わせて研究した。これらの集団に対して、メッシュ65、100及び125μmのふるいを用いて、以下の新しい亜集団を構成するために選択的ふるい分けを行う。
- 強い成長を示し、125μmと150μmの間のサイズの「バッチIIの先頭」とよばれる集団；
- 中程度の成長を示し、100μmと125μmの間のサイズの「バッチIIの胴体」とよばれる集団；
- 弱い成長を示し、65μmと100μmの間のサイズの「バッチIIの末尾」とよばれる集団。
【００４３】
未処理の幼生及びCBで処理された幼生を用いて行ったサイトメトリー分析は、以下のことを示す。
- 未処理対照は、まだ、2倍体の核のみを示す(「ピーク1」図12；「ピーク2」は、内部対照TRBCに相当する)。
- 処理された幼生の集団「バッチIの先頭」は、まだ、2倍体幼生(45%のレベル)及び3倍体幼生(55%のレベル)のみからなる。
- CBで処理した幼生の集団「バッチIIの先頭」(150μm＞T≧125μm)、「バッチIIの胴体」(125μm＞T≧100μm)、及び「バッチIIの末尾」(100μm＞T≧65μm)は、引き続き、著しい割合の4倍体幼生を示す(図13、14、15、ピーク「RN 1-2-3-4」は、それぞれ、2倍体、3倍体、4倍体の核及び内部対照TRBCに相当する)。しかし、この4倍体の集団のサイズは、繁殖バッチの部分ごとに非常に異なる。4倍体幼生の割合は、「バッチIIの先頭」において最も低く(15%) (図13、ピーク「RN3」)、「バッチIIの末尾」において最も高い(50%) (図15、ピーク「RN3」)。「バッチIIの胴体」の部分では、4倍体幼生の割合は、中間の値である(28%、図14、ピーク「RN3」)。よって、最大量の4倍体幼生を有する繁殖バッチは、最も遅く交配するものであり、このことは、倍数性の3つのレベルの全体的な適応値の違いと、4倍体幼生を維持するための選択的選別を行う必要性とを強調する。
【００４４】
*受精後D18に、「バッチIの先頭」(T≧250μm)の集団中の処理された幼生のいくつかは、未処理対照幼生より2日前に、成熟幼生であり、定着し始める。D18に行ったサイトメトリー分析は、引き続き、対照での2倍体の独占的なレベル(図16、「ピーク1」、「ピーク2」は内部対照TRBCに相当する)と、「バッチIの先頭」集団での2倍体(30%、「ピーク1」)及び3倍体(70%、「ピーク2」)の混合を示す(図17、「ピーク3」は内部対照TRBCに相当する)。
【００４５】
*受精後D20及びD23では、未処理対照が2倍体の独占的なレベルを引き続き示す(図18及び22、「ピーク1」)が、4倍体幼生を含有する繁殖バッチ(バッチIIの先頭(T≧180μm)；バッチIIの胴体(180μm＞T≧150μm)及びバッチIIの末尾(150μm＞T≧100μm))は、受精後D15とほぼ同等の割合の4倍体幼生を示す(図19〜21及び23〜25のピーク「RN/ピーク3」により示される、それぞれ20、35及び45%の4倍体、ここで、他のピーク「ピーク/RN1-2-4」は、それぞれ、2倍体、3倍体及び内部対照TRBCに相当する)。さらに、それらの成長は、未処理対照のものよりも明らかに遅いようであるが、これらの幼生は、それにもかかわらず、それらの最小限のサイズの増加を示した(それぞれの最小サイズは、受精後D23の180、150及び100μmに対して、D15の125、100及び65μm)。
【００４６】
*受精後D25に、30%の4倍体幼生を含有する成熟幼生の第1コホート(T≧250μm) (図26のピーク「RN3」、他のピーク「RN1-2-4」は、それぞれ、2倍体、3倍体及び内部対照TRBCに相当する))は、牡蠣の殻の微小砕片に定着した。4倍体幼生のこの最初の定着に続いて、D27及びD29に、20〜40%の変動可能な割合で4倍体幼生を含有する成熟幼生の3つが定着した(図27、28及び29のピーク「ピーク3」；他のピーク「ピーク1-2-4」は、それぞれ、2倍体及び3倍体の核、並びに内部対照TRBCに相当する)。
【００４７】
実施例2：4倍体の稚貝の定着及び成育
定着後1ヵ月
変態及び定着に成功した幼生の集団中の4倍体の稚貝の存在を、フローサイトメトリーにより、定着後1ヵ月で確認した。この段階での稚貝のサイズが小さいので、この制御は、一度にいくつかの稚貝のサンプルに対して破壊的に行った。稚貝を、1.5 mlチューブに入れる。次いで、これらを、1 mlの溶解バッファー中でインキュベートし、プラスチックのプランジャーを用いて粉砕する。最後に、遊離された核を、30μmメッシュのナイロンフィルタ(Partec Celltrics)を通してろ過し、サイトメトリー分析チューブに回収し、DAPIで標識し、上記の実施例1に記載されるようにして分析する。
【００４８】
サイトメトリーの結果により、3倍体及び2倍体の集団に加えて、4倍体の稚貝の著しい集団(29%)が存在することができた(図30の「ピーク3」；ピーク「ピーク1-2-4」は、それぞれ、2倍体及び3倍体の核、並びに内部対照TRBCに相当する)。この4倍体の稚貝の集団は、よって、定着及び微小規模養殖場でのその成育の継続に成功した。
この結果は、幼生繁殖段階及び変態を許容する定着まで生存する4倍体稚貝が、2倍体の親から直接作製されることを証明する。さらに、得られた4倍体の稚貝は、定着の後でさえも成育し続ける。
【００４９】
定着後2ヵ月
定着の2ヵ月後に、これもまた破壊的モードのフローサイトメトリーによるが、個別の稚貝に対して、3ヵ月齢の稚貝の集団内の4倍体の稚貝の存在について確認した。
我々の結果により、3ヵ月齢の4倍体稚貝の存在を示すことができた(図31)。幼生の繁殖の間に示されたように、微小規模養殖場での繁殖の間の個体の倍数性のレベルをそのサイズと関連づけることによっても、差異的な成育が明らかになる。実際に、成長が遅い4倍体稚貝の集団は、むしろ、繁殖の「バッチの末尾」及び「バッチの胴体」部分に制限されるようであるが、「バッチの先頭」部分は、より迅速に成育する2倍体及び3倍体の稚貝で構成されるようである。
【００５０】
その後、4倍体の成長を促進させる目的で、幼生の繁殖の間に採用したのと同じアプローチ、すなわち、4倍体稚貝の量が可能な限り最大になり、かつ3倍体及び2倍体の稚貝からの競争の可能性を最小限にする繁殖バッチを構成するように、それらのサイズ及び倍数性のレベルに関連して稚貝を選別するシステムを採用した。
実際には、個別化した稚貝は、150μm〜2 mmの範囲のメッシュを有する方形のふるい(45×35×12 cm)を通し、350、500及び1000μmの中間サイズを通す連続的な選択的ふるい分けを受けた。
これらの選択的ふるい分けは、15日間の一定の間隔で行った。幼生の繁殖段階の間に行ったのと同様のアプローチに従って、「バッチの先頭」、「バッチの胴体」及び「バッチの末尾」の集団を構成し、別々に繁殖させた。
【００５１】
定着後6ヵ月
定着後6ヵ月にて、7ヵ月齢の稚貝は、個別に標識することができ、鰓生検から倍数性のレベルを非破壊的に試験することができるようになる。よって、それぞれの個体を、エポキシ接着剤を用いてその殻に接着したプラスチックラベルにより同定した。次いで、分析すべき個体を、150 gのMgCl2を含有する3リットルの海水のバッチ中で麻酔にかけ、動物の倍数性の測定を行うための鰓生検を得ることができるようにする。この段階で、合計で600個の個体に対して行ったサイトメトリー分析により、野生型2倍体の親から直接誘導した4倍体の牡蠣の平均で15%の割合で、90個を超える確立された若い4倍体の牡蠣を選別することができた(図32)。
【００５２】
定着後8〜9ヵ月
定着後8ヵ月にて、サイトメトリー分析により、特に「バッチの末尾」及び「バッチの胴体」集団で見出される200個を超える4倍体個体の選別を行うことが可能になった。
利用可能な空間の理由から、個体の選別はこの段階で停止した。
【００５３】
定着後9ヵ月で、平均サイズ6 cmの約20個の個体を、成熟の開始及び配偶子の生成を可能にするために馴化した。これらの将来の親は、1日あたり及び1個体あたり2.109細胞の植物プランクトンを含有する20℃の海水中で馴化した。成熟のためのこの馴化期間の後に、4倍体の親を、産卵を誘引するために、いくつかのショックに供した(熱及びエキソンデーション(exondation))。成熟のために馴化した30個の親のうち、18個が産卵し、性比は、明らかに雄が多く(17個の雄及び1個の雌)、このことは、太平洋牡蠣であるシー・ギガスの雄性先熟の性質と完全に一致する。これらの4倍体の親から生成した配偶子を試験するために、2つのタイプの交配を行った：
第1は、唯一の4倍体の雌から得た4倍体の卵母細胞を、17個の4倍体の雄により生成された4倍体の精子と混合することによる受精。
第2は、6個の野生型2倍体の雌から得た卵母細胞の、17個の4倍体の雄から得た精子との受精。
【００５４】
我々の結果は、試験した親から生成した配偶子が完全に生存可能であり、生殖能があることを明確に示す。よって、これらの間の交配により、新しい4倍体は、4倍体の幼生のみを作り出し(図33、ピーク「RN1」により表される100%の4倍体、ピーク「RN2」は内部対照TRBCを表す)、2倍体の雌との交配により、4倍体の雄は3倍体の子孫のみを生成する(図34、ピーク「ピーク1」により表される100%の3倍体、ピーク「ピーク2」は、内部対照TRBCを表す)。現在、これらの新しい4倍体及び3倍体の世代は、変態し、定着し、微小規模養殖場で繁殖されている(500と1000μmの間のサイズ)。
【００５５】
結論として、2倍体の親から4倍体の牡蠣を生産することに成功した。配偶子成熟のための馴化処理の後のこれらの同じ4倍体は、配偶子形成に成功し、完全に生存可能であり生殖能を有する4倍体の雄及び雌の配偶子を生成できる。これらの4倍体を互いに交配させたときに、これらは、完全に生存可能な4倍体の新しい世代を生成できた。最後に、これらを、2倍体の雌の受精のための雄の親として用いたときに、これらの同じ4倍体は、これもまた完全に生存可能な3倍体の新しい世代を生成し、このことは、よって、これらの4倍体を、3倍体系統を供給するために用い得る親として用いるための道を開く。
【００５６】
定着後9ヵ月目以降(2007年2月〜2008年3月)
2倍体の雄と雌との交配により得られた第1世代の4倍体牡蠣(直系4倍体牡蠣、以下、「TM1」という)の倍数性のレベルは、サイトメトリー分析により、及び伝統的な核型技術を用いて鰓組織から染色体を計数した後に、確認される。同じ齢で同じ条件で繁殖させた従来の4倍体牡蠣(すなわち、3倍体の雌から得られたもの)と比較すると、第1世代の直系4倍体牡蠣「TM1」が、より大きい強壮性(hardiness)及び重量増加を示した(図35)。よって、20ヶ月の繁殖の後に、第1世代の4倍体(TM1)は、通常の4倍体(2006-01)よりも1.86倍重い。さらに、TM1株は、特に夏にいくらかの死亡があった従来の4倍体株(2006-01)とは対照的に、死亡が生じなかったので、特に耐性があることが示された。
【００５７】
2007年の初めに、天然の産卵の後に、直系4倍体牡蠣の第2世代(以下、「G2TM1」という)を生産するために、第1世代直系4倍体牡蠣「TM1」を雄及び雌の親として用いた。G2TM1幼生及び稚貝の4倍性は、サイトメトリー分析及び伝統的な核型技術を用いる染色体の計数の両方によっても確認した。G2TM1稚貝は、全て4倍体であり、それらの繁殖は、幼生期、微小規模養殖場又は養殖場のいずれの段階でも、従来の繁殖とは全く異ならない。繁殖の間に、G2TM1稚貝は、特に、強壮性、成長及び4倍性のレベルの安定性の点で、良好な挙動を示した。よって、同じ齢であり、同じ条件下で繁殖させた従来の(すなわち3倍体の雌から得られる)4倍体稚貝(2007-01)と比較すると、より低いレベルの倍数性へのそれらの復帰は、従来の4倍体稚貝により示されるものと異なるようには見えなくても、G2TM1稚貝は、はるかに良好な成長及び強壮性を示す。実際に、繁殖9ヵ月後に、G2TM1株は、その平均合計重量が約75グラムの4倍体の個体から構成されるが、従来の4倍体は、27グラム程度しかなく、このことは、G2TM1個体が、同じ齢の従来の4倍体よりも平均で2.7倍重いことを意味する(図36)。さらに、G2TM1株は、2007-01株とは対照的に、死亡が生じなかったので、特に強壮であることが示された。
【００５８】
2007年11月から開始して、定着後9ヵ月齢のG2TM1の4倍体を、成熟のために馴化し、2ヵ月半後に、これらを親として用いて、誘導産卵により、配偶子を作製して、これらを、2008年2月に、直系4倍体の第3世代(以下、「G3TM1」という)を作製するために用いた。G2TM1の4倍体の親の性比及びそれらの生殖能は、2倍体の親のものと変わらなかった。生成されたG3TM1幼生は、確かに4倍体である。並行して、G2TM1の雄は、3倍体を生成する目的で、2倍体の雌から生成された卵母細胞を受精するために有効に用いられた。
【００５９】
上記の結果は、本発明により得られた4倍体が、3倍体を生成するのに非常に有効であることを示す。2倍体とちょうど同じように、4倍体の牡蠣は、その1年目の間に成熟に到達する。これらの成熟4倍体牡蠣(クラッソストレア・ギガス・ツンベルク(Thunberg))は、通常の性比を有し、2倍体のものと同等の生殖能を有する。4倍体と2倍体との間の交配は、容易にかつ通常と同様に行うことができる。全ての4倍体×2倍体交配(及びその逆)は、フローサイトメトリーによる倍数性の確認によると、3倍体の稚貝のみを生成する。
【００６０】
実施例3：イガイでの4倍体の生産
実施例1及び2に詳細に記載する手順を用いて、イガイ(エム・エデュリス及びミティルス・ガロプロビンシアリス)において、効率的に4倍体を得た。
イガイでは、サイトメトリーの結果により、3倍体及び2倍体の集団とともに、圧倒的な4倍体集団の存在が確認された。よって、以下のことがいえる：
- 対照交配は、2倍体核のみの集団を与える(図37、ピーク「RN1」)、
- GPIの放出阻止の誘導により得られるサンプルは、以下のレベルの倍数性に相当する3つの型の核の集団を示す(図38)：2倍体(平均で約10%、ピーク「RN1」)、3倍体(平均で約20%、ピーク「RN2」)及び4倍体(平均で約70%、ピーク「RN3」)。得られた4倍体の個体は、繁殖の経過にある。
【００６１】
一般に、そして太平洋牡蠣及びイガイと同様にして、生存可能な4倍体は、全ての2枚貝軟体動物から、上記の実施例に詳細に説明する手順を用いて生産できる。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３７】
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【図３８】
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【図１】
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【図３５】
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【図３６】
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