(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
作物の、草高、容積、分げつ、収量、花器サイズまたは種子サイズを調節するためのポリヌクレオチドを含む植物であって、
前記ポリヌクレオチドは、外因的に導入されており、かつ、以下の（Ａ）または（Ｂ）：
（Ａ）以下の（Ａ１）または（Ａ２）に記載の草高調節ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（Ａ１）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または
（Ａ２）配列番号３に記載のアミノ酸配列中の１〜５０アミノ酸残基の置換、欠失または付加を含み、かつ草高調節機能を有する、（Ａ１）のポリペプチドの変異体、
または
（Ｂ）（Ａ）に記載のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
であり、
前記植物は、イネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）植物、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）植物および木本植物（ｘｙｌｏｐｈｙｔａ）からなる群より選択される１種である、
植物。
【請求項２】
請求項１に記載の植物であって、
前記ポリヌクレオチドは（Ａ１）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、
植物。
【請求項３】
請求項１に記載の植物であって、
前記ポリヌクレオチドは、
（ｉ）配列番号２に記載のヌクレオチド配列、または
（ｉｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列
を含む、
植物。
【請求項４】
請求項１に記載の植物であって、
前記植物は、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、およびソルガムからよりなる群から選択される、
植物。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の植物の子孫。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝技術および植物学の分野に関する。詳細には、本発明は草高調節遺伝子およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、高収量の作物の育種についての研究は、主に草型および穂形質を改良することに集中している。品種改良の進歩により、多くの高収量作物品種がこれまでに開発されている。
【０００３】
しかし、高収量イネ品種（とりわけスーパーハイブリッドイネ品種）などの多くの高収量作物に存在する１つの大きな問題は、それらの植物が高くなりすぎることである。高すぎることは、倒伏（地面に平らに倒されること）の傾向をより高くし、より高い収量の可能性を制限する結果となりうる。この問題は、高収量品種の作物収量のさらなる増大および広範な採用にかなりの影響を与える。
【０００４】
したがって、当技術分野では、作物の形質をさらに改良し、かつ作物収量を増大させるために、作物植物の草高を調節する方法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、草高調節遺伝子およびその使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第１の態様では、本発明は、（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列中に１つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を含み、かつ草高調節機能を有する、（ａ）に由来するポリペプチドからなる群から選択される、単離された草高調節ポリペプチドを提供する。
【０００７】
好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０００８】
第２の態様では、本発明は、それぞれが、（ａ）上述のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および（ｂ）（ａ）に記載のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドからなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０００９】
好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列有するポリペプチドをコードする。
【００１０】
別の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドの配列は、配列番号２に記載のヌクレオチド配列、または配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する。
【００１１】
第３の態様では、本発明は、それぞれが上述のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００１２】
第４の態様では、本発明は、それぞれが上述のベクターを含む遺伝子操作された宿主細胞を提供する。
【００１３】
第５の態様では、本発明は、それぞれが上述のポリヌクレオチドを含む植物を提供する。
【００１４】
第６の態様では、本発明は、上述の植物を生産する方法であって、上述のポリヌクレオチドを植物に導入するステップを含む方法を提供する。
【００１５】
好ましい実施形態では、上述の方法は、（１）上述のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを保有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞を用意するステップと、（２）植物の細胞、組織または器官をステップ（１）に記載のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞と接触させて、前記ポリヌクレオチドを植物細胞に導入し、ポリヌクレオチドが植物細胞の染色体に組み込まれることを可能にするステップと、（３）前記ポリヌクレオチドを含有する植物細胞、組織または器官を選択するステップと、（４）ステップ（３）に記載の植物細胞、組織または器官が新規な植物を再生することを可能にするステップとを含む。
【００１６】
第７の態様では、本発明は、植物を生産する方法を提供する。それぞれの方法は、導入されたポリヌクレオチドを有する植物を非トランスジェニック植物と交雑し、それによって、前記ポリヌクレオチドを含有するハイブリッド子孫を得るステップを含む。
【００１７】
第８の態様では、本発明は、上述のポリペプチドを生産する方法を提供する。１つの方法は、（ａ）発現に適した条件下で前記ポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を培養するステップと、（ｂ）培養物から前記ポリペプチドを単離するステップとを含む。
【００１８】
第９の態様では、本発明は、作物の草高、容積、分げつ、収量、花器サイズもしくは種子サイズの調節、または  作物の草高、容積、分げつ、収量、花器サイズもしくは種子サイズを調節する物質の調製における、上述のポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。
【００１９】
第１０の態様では、本発明は、作物の草高、容積、分げつ、収量、花器サイズまたは種子サイズを調節する方法を提供する。１つの方法は、作物における草高調節遺伝子の発現または活性を調節するステップを含む。
【００２０】
別の好ましい実施形態では、作物における、草高調節遺伝子の活性または発現の亢進によって、草高および容積の低減ならびに分げつおよび収量の増大を実現でき、作物における、草高調節遺伝子の発現または活性の阻害によって、花器サイズ、種子サイズ、草高または容積の増大を実現できる。
【００２１】
第１１の態様では、本発明は、上述の草高調節ポリペプチドまたはそれをコードする遺伝子のアゴニストもしくはアンタゴニストを提供する。
【００２２】
第１２の態様では、本発明は、植物の茎または葉における特異的発現のためのプロモーターを提供する。１つのプロモーターは、（１）配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（２）（１）に記載のポリヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき、かつ植物の茎または葉における標的遺伝子の特異的発現を誘導できるポリヌクレオチド、（３）配列番号１３に記載のヌクレオチド配列と７０％超（好ましくは８０％超、より好ましくは９０％超、最も好ましくは９８％、９９％など９５％超）の同一性を有し、かつ植物の茎または葉における標的遺伝子の特異的発現を誘導できるポリヌクレオチドからなる群から選択される。
【００２３】
第１３の態様では、本発明は、植物の茎または葉における標的遺伝子の特異的発現を誘導するための前記プロモーターの使用に関する。
【００２４】
第１４の態様では、本発明は、それぞれが、植物の茎または葉における特異的発現のための上述のプロモーターを含む構築物を提供する。
【００２５】
別の好ましい実施形態では、上述の構築物が、植物の茎または葉における特異的発現のためのプロモーターの下流にあり、かつそれに作動可能に連結している、標的遺伝子を挿入するための少なくとも１箇所のポリクローナルな部位（制限部位など）を含む。
【００２６】
別の好ましい実施形態では、前記構築物が発現ベクターである。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、前記構築物が、相互に作動可能に連結している以下のエレメント：前記プロモーターと標的遺伝子とを含む。
【００２８】
別の好ましい実施形態では、前記標的遺伝子が外因性遺伝子である。
【００２９】
別の好ましい実施形態では、前記標的遺伝子が構造遺伝子である。
【００３０】
別の好ましい実施形態では、前記標的遺伝子が、特定の機能を有するタンパク質をコードしうる。
【００３１】
別の好ましい実施形態では、前記標的遺伝子が、前記プロモーターの下流２０００ｂｐ未満（好ましくは１０００ｂｐ未満、より好ましくは５００ｂｐ未満、最も好ましくは３００ｂｐ未満）に位置している。
【００３２】
例えば、本発明は、以下の態様であってよい。
［態様１］
（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を含み、かつ草高調節機能を有する、（ａ）に由来するポリペプチド
からなる群から選択される、単離された草高調節ポリペプチド。
［態様２］
配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、態様１に記載のポリペプチド。
［態様３］
（ａ）態様１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
（ｂ）（ａ）に記載のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
［態様４］
配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、態様３に記載のポリヌクレオチド。
［態様５］
（ｉ）配列番号２に記載のヌクレオチド配列、または
（ｉｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列
を含む、態様３に記載のポリヌクレオチド。
［態様６］
態様３から５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［態様７］
態様６に記載のベクターを含む遺伝子操作された宿主細胞。
［態様８］
態様３から５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む植物。
［態様９］
植物を生産する方法であって、態様３から５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを植物内に導入するステップを含む方法。
［態様１０］
（１）態様３から５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを保有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用意するステップと、
（２）前記植物の細胞、組織または器官を、ステップ（１）に記載のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と接触させて、態様３から５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを前記植物細胞に導入し、それらが前記植物細胞の染色体に組み込まれることを可能にするステップと、
（３）態様３から５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含有する植物の細胞、組織または器官を選択するステップと、
（４）ステップ（３）に記載の植物の細胞、組織または器官が新規な植物を再生することを可能にするステップと
を含む、態様９に記載の方法。
［態様１１］
植物を生産する方法であって、態様３から５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを有する植物を非トランスジェニック植物と交雑し、それによって、態様３から５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含有するハイブリッド子孫を得るステップを含む方法。
［態様１２］
態様１に記載の単離されたポリペプチドを生産する方法であって、
（１）発現に適した条件下で態様７に記載の宿主細胞を培養するステップと、
（２）培養物から態様１に記載のポリペプチドを単離するステップと
を含む方法。
［態様１３］
作物の草高、容積、分げつ、収量、花器サイズもしくは種子サイズの調節、または
作物の草高、容積、分げつ、収量、花器サイズ、もしくは種子サイズを調節する物質の調製
における、態様１または２に記載のポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドの使用。
［態様１４］
作物の草高、容積、分げつ、収量、花器サイズまたは種子サイズを調節する方法であって、作物における草高調節遺伝子の発現または活性を調節するステップを含む方法。
［態様１５］
態様１に記載の草高調節ポリペプチドまたはそれをコードする遺伝子のアゴニストもしくはアンタゴニスト。
［態様１６］
植物の茎および葉における特異的発現のためのプロモーターであって、
（１）配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
（２）（１）に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の茎または葉における標的遺伝子の特異的発現を誘導するポリヌクレオチド、および
（３）配列番号１３に記載のヌクレオチド配列と７０％超の同一性を有し、かつ植物の茎または葉における標的遺伝子の特異的発現を誘導するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるプロモーター。
［態様１７］
植物の茎または葉における標的遺伝子の特異的発現の誘導における、態様１６に記載のプロモーターの使用。
［態様１８］
態様１６に記載の、植物の茎または葉における特異的発現のためのプロモーターを含む構築物。
［態様１９］
相互に作動可能に連結した以下のエレメント：
態様１６に記載のプロモーターと
標的遺伝子と
を含む、態様１８に記載の構築物。
【００３３】
本明細書に示す記述に照らして、本発明の他の態様は、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】野生型（Ｗｔ）シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物およびＥＬｂ（Ｅｕｉ様タンパク質ｂ）過剰発現トランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（ＥＬｂ−ＯＥ）植物の上面図である。ＥＬａ（Ｅｕｉ様タンパク質ａ）過剰発現トランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（ＥＬａ−ＯＥ）植物およびイネＯｓＥｕｉ過剰発現トランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（ＯｓＥｕｉ−ＯＥ）は対照として働く。
【図２】野生型（ＷＴ）シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物とＥＬｂ  ＲＮＡｉ／ｅｌａシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物との間における、成長プロファイルの比較を示す図である。
【図３】Ｅｌｂ  ＲＮＡｉ／ｅｌａシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物と野生型（ＷＴ）シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物との間における、花器および種子の成長プロファイルの比較を示す図である。
【図４】ＥＬｂプロモーターによって開始される、レポーター遺伝子ＧＵＳの組織特異的発現を示す図である。矢印は青色を呈している領域を示す。
【図５】野生型イネ（ＴＰ３０９）植物とＥｌｂ過剰発現イネ（ＥＬｂ−ＯＥ）植物との間における、成長プロファイルの比較を示す図である。
【図６】野生型イネ（ＴＰ３０９）植物およびＥｌｂ過剰発現イネ（ＥＬｂ−ＯＥ）植物の草高の統計的分析を示す図である。
【図７】野生型イネ（ＴＰ３０９）植物およびＥｌｂ過剰発現イネ（ＥＬｂ−ＯＥ）植物の有効な分げつ数の統計的分析を示す図である。
【図８】野生型イネ（ＴＰ３０９）植物とＥｌｂ過剰発現イネ（ＥＬｂ−ＯＥ）植物との間における、単一植物からの粒重の比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
広範な研究によって、本発明者らは、作物の草高、容積、分げつ、収量、花器サイズおよび種子サイズを調節するのに有用なＥＬｂ遺伝子を発見した。この遺伝子の発現を亢進することによって、作物の草高および容積を低減し、かつ有効分げつ数および収量を増大させることが可能である。この遺伝子の発現を低減することによって、花器サイズおよび種子サイズを増大させることも可能である。本発明はこれらの新知見に基づいている。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「作物（単数）」または「作物（複数）」という用語には、イネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）および木本植物（ｘｙｌｏｐｈｙｔａ）などが含まれるが、これらに限定されない。限定されるものではないが、イネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）にイネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシおよびソルガムなどが含まれるか、限定されるものではないが、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）にシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）が含まれることがより好ましい。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「単離された」とは、その元の環境から単離されている物質を指す（元の環境とは天然物質の天然の環境である）。例えば、生細胞内の天然のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、単離されても、精製されてもいないが、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドが、天然の状態で通常それらに随伴している他の物質から分離されている場合には、それらは単離または精製されている。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「単離された草高調節ポリペプチド」、「単離されたＥＬｂタンパク質」または「単離されたＥＬｂポリペプチド」とは、天然な状態でＥＬｂタンパク質に随伴する他のタンパク質、脂質、糖またはその他の物質を実質的に伴わないＥＬｂタンパク質を指す。当業者ならば、標準的なタンパク質精製技術を用いて、ＥＬｂタンパク質を精製することができる。実質的に純粋なポリペプチドは、非還元ポリアクリルアミドゲル中で単一の主要バンドを形成する。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「含有する」、「有する」または「含む」という用語には、「含まれる」、「から主に構成される」、「から実質的に構成される」および「から構成される」の意味が含まれ、「から主に構成される」、「から実質的に構成される」および「から構成される」は、「含有する」、「有すること」または「含む」の特定的用語である。
【００４０】
ＥＬｂポリペプチドおよびその使用
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドでありえ、組換えポリペプチドであることが好ましい。本発明のポリペプチドは、精製された天然産物、もしくは化学合成産物、または原核細胞宿主もしくは真核細胞宿主（細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞など）から組換え技術を用いて得られる産物でありうる。本発明のポリペプチドは、組換え産生に使用される宿主細胞に応じて、グリコシル化されている可能性も、グリコシル化されていない可能性もある。本発明のポリペプチドは、開始部位にメチオニン残基を含むものでもよく、含まないものでもよい。
【００４１】
本発明は、ＥＬｂタンパク質の断片、誘導体および類似体をさらに含む。本明細書で使用される場合、「断片」、「誘導体」および「類似体」という用語は、本発明のＥＬｂポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドを指す。本発明の断片、誘導体および類似体は、（ｉ）１つもしくは複数の保存もしくは非保存アミノ酸残基（好ましくは保存残基）の置換を有するポリペプチドであって、前記置換されている残基が遺伝暗号によってコードされるものでもよく、コードされないものでもよいポリペプチド、または（ｉｉ）１つもしくは複数のアミノ酸残基内に置換基（単数または複数）を有するポリペプチド、または（ｉｉｉ）別の化合物（ポリペプチドの半減期を延長できる化合物など、例えばポリエチレングリコール）に結合した成熟ポリペプチド由来のポリペプチド、または（ｉｖ）追加のアミノ酸配列（例えば、先導配列、分泌配列、前記ポリペプチドを精製するのに使用される配列、タンパク新生（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎ）配列または融合タンパク質）に結合した前記ポリペプチド由来のポリペプチドでありうる。本明細書における定義では、これらの断片、誘導体および類似体は当業者によく知られている。
【００４２】
本発明において、「ＥＬｂタンパク質」という用語は、ＥＬｂタンパク質の活性を有する、配列番号３に記載のポリペプチドを意味する。この用語には、ＥＬｂタンパク質と同じ機能を有する、配列番号３のポリペプチドの変異体も含まれる。これらの変異体には、数アミノ酸（通常１〜５０、好ましくは１〜３０、より好ましくは１〜２０、最も好ましくは１〜１０、さらにより好ましくは１〜８または１〜５アミノ酸）の欠失、挿入および／または置換、ならびにＣ末端および／またはＮ末端への１または複数のアミノ酸（通常２０未満、好ましくは１０未満、より好ましくは５未満のアミノ酸）の付加が含まれる（但しこれらに限定されない）。例えば、タンパク質の機能は通常、同じ特性または類似の特性を有する別のアミノ酸で１アミノ酸を置換することによって変化しない。別の例として、タンパク質の機能は通常、Ｃ末端および／またはＮ末端への１または数アミノ酸の付加によっても変化しない。この用語ＥＬｂタンパク質には、ＥＬｂタンパク質の活性な断片および誘導体も含まれる。
【００４３】
ポリペプチドの変異体には、相同配列、保存的変異体、対立遺伝子変異体、自然変異体、誘発変異体、高ストリンジェントまたは低ストリンジェント条件下でＥＬｂタンパク質コードＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列によってコードされているタンパク質、およびＥＬｂタンパク質に対する抗体を用いて得られるポリペプチドまたはタンパク質が含まれる。本発明は、ＥＬｂタンパク質またはその断片を含む融合タンパク質などの他のポリペプチドも提供する。ほぼ完全長のポリペプチドに加えて、本発明は、ＥＬｂタンパク質の可溶性断片をさらに含む。これらの断片は、ＥＬｂタンパク質配列における、通常少なくとも約２０の連続したアミノ酸、典型的には少なくとも約３０の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも約５０の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約８０の連続したアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約１００の連続したアミノ酸を含む。
【００４４】
本発明は、ＥＬｂタンパク質またはポリペプチドの類似体をさらに提供する。これらの類似体と天然ＥＬｂタンパク質との相違は、アミノ酸配列の相違、いかなる配列変化ももたらさない修飾パターンの相違、またはこれらの両方でありうる。これらのポリペプチドには、天然の変異体も、誘発された遺伝変異体も含まれる。誘発変異体は、放射線照射または変異原への曝露によるランダム変異導入に加えて、部位特異的変異導入または他の知られている分子生物学技術などの様々な技術によって得ることができる。これらの類似体には、天然のＬ−アミノ酸残基とは異なる残基（例えばＤ−アミノ酸）を含有する類似体、および天然には存在しないアミノ酸または合成アミノ酸（例えばβ、γ−アミノ酸）を含有する類似体が含まれる。本発明のポリペプチドは上述の代表的ポリペプチドに限定されないことを理解するべきである。
【００４５】
修飾（通常は一次構造変化をもたらさない）形態には、アセチル化またはカルボキシ化形態など、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるペプチドの化学的に誘導された形態が含まれる。修飾にはグリコシル化も含まれる。修飾形態には、リン酸化アミノ酸（例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、ホスホトレオニン）を含有する配列、またはタンパク質分解に対する耐性を亢進するか、溶解性を最適化するように修飾されているポリペプチドも含まれる。
【００４６】
本発明では、「ＥＬｂタンパク質の保存的変異ポリペプチド」とは、配列番号３に記載のアミノ酸配列と比較して、類似または匹敵する特性を有する他のアミノ酸によって置換されている最大２０アミノ酸まで、好ましくは最大でも１０、より好ましくは最大でも５、最も好ましくは最大でも３アミノ酸を含有するポリペプチドを指す。これらの保存的変異ペプチドは、表１に記載のアミノ酸の置換によって生成されることが好ましい。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
本発明は、本発明のＥＬｂタンパク質またはその保存的変異ポリペプチドとコードするポリヌクレオチド配列をさらに提供する。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡでもよく、ＲＮＡでもよい。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは人工的合成ＤＮＡが含まれる。ＤＮＡは、一本鎖でもよく、２本鎖でもよい。ＤＮＡは、コード鎖でもよく、非コード鎖でもよい。成熟ポリペプチドをコードするコード領域配列は、配列番号２に記載のコード領域配列と同じものでもよく、その縮重変異体でもよい。本明細書で使用される場合、「縮重変異体」とは、配列番号３に記載の配列を有するタンパク質をコードしているが、配列番号２に記載のコード領域配列とは異なっているポリヌクレオチド配列を意味する。
【００５０】
配列番号３に記載の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、成熟ポリペプチドのみをコードするコード配列、成熟ポリペプチドと様々な追加コード配列とをコードする配列、成熟ポリペプチドをコードする配列（および任意の追加コード配列）および非コード配列が含まれる。
【００５１】
「ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド」という用語は、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または追加のコード配列および／もしくは非コード配列をさらに含有するポリヌクレオチドを指す。
【００５２】
本発明は、本明細書に記載のものと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその断片、類似体および誘導体をコードする、上記ポリヌクレオチドの変異体にも関する。このポリヌクレオチドの変異体は、天然に存在する対立遺伝子変異体でもよく、天然に存在しない変異体でもよい。これらのヌクレオチド変異体には、置換変異体、欠失変異体および挿入変異体が含まれる。当技術分野で知られている通り、対立遺伝子変異体は、あるポリヌクレオチドの代替物であり、それは、この変異体によってコードされているポリペプチドにおいて実質的な機能変化をもたらさない１つまたは複数の、置換、欠失または挿入されたヌクレオチドを含有しうる。
【００５３】
本発明は、上述の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、上述の配列と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドにも関する。本発明はとりわけ、本明細書に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明では、「ストリンジェントな条件」とは、（１）０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃など、より低イオン強度かつ高温下でのハイブリダイゼーションおよび洗浄、または（２）５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清／０．１％フィコール、４２℃など、変成剤存在下でのハイブリダイゼーション、または（３）少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％超の同一性を有する２つの配列間のみで起こるハイブリダイゼーションを指す。さらに、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチドの生物学的機能および活性は、配列番号３に記載の成熟ポリペプチドのものと同じである。
【００５４】
本発明は、上述の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド断片にも関する。本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド断片」は、長さが少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド超を含む。ポリヌクレオチド断片は、ＥＬｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドを決定および／または単離するための核酸増幅技術（例えばＰＣＲ）で使用できる。
【００５５】
本発明の実施形態によれば、ＥＬｂ遺伝子はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来のものが好ましいと理解するべきである。しかし、本発明の実施形態には、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＥＬｂ遺伝子と高い相同性（例えば、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、さらには９８％など６０％超の配列同一性）を有し、かつ他の植物に由来する他の遺伝子も含まれる。配列の同一性または相同性を決定するアラインメント方法および手段（ＢＬＡＳＴなど）は当技術分野でよく知られている。
【００５６】
本発明のＥＬｂタンパク質をコードする完全長ヌクレオチド配列またはその断片は、ＰＣＲ増幅、組換え技術または化学合成を用いて生成できる。ＰＣＲ増幅には、関連のヌクレオチド配列、詳細には、開示されているオープンリーディングフレームの配列に従ってプライマーを設計することができ、市販のｃＤＮＡライブラリーまたは当業者に知られている日常的方法で作製されたｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用いることができる。これらのプライマーおよびライブラリーを用いて、ＰＣＲ増幅を行って、所望の配列を得ることができる。配列が長い場合には、通常、２回または複数回のＰＣＲを行って、その後増幅された断片を正しい順序に連結する必要がある。
【００５７】
ひとたび所望の配列が得られたならば、組換え技術によって、多量の所望の配列を得ることができる。通常、所望の配列をベクター内にクローニングし、そのベクターを細胞内に導入し、その後、増殖した宿主細胞から日常的方法によって所望の配列を単離する。
【００５８】
加えて、所望の配列、とりわけ短い断片を化学合成で生成させることができる。一般的には、複数の小断片が最初に合成され、その後、一緒に連結されて、長い断片を生成する。
【００５９】
現在では、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列（またはその断片もしくは誘導体）を専ら化学合成のみで得ることが可能である。その後、このＤＮＡを様々な既存のＤＮＡ分子（例えばベクター）および当技術分野で知られている細胞に導入できる。加えて、化学合成によっても、本発明のタンパク質になんらかの変異を導入することができる。
【００６０】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクター、これらのベクターを用いた遺伝子操作の結果から生じた宿主細胞、またはＥＬｂタンパク質コード配列、ならびに組換え技術によって本発明のポリペプチドを調製する方法に関する。
【００６１】
従来のＤＮＡ組換え技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８４；２２４：１４３１ページ）を用いて、本発明のポリヌクレオチド配列を使用して、組換えＥＬｂタンパク質を発現または生成することができる。これは通常、
（１）ＥＬｂタンパク質をコードしているポリヌクレオチド（もしくはその変異体）または前記ポリヌクレオチドを含有する組換え発現ベクターで、適した宿主細胞を形質転換または形質導入するステップと、
（２）適切な培地中で宿主細胞を培養するステップと、
（３）培地または細胞からタンパク質を単離および精製するステップと
を含む。
【００６２】
本発明では、ＥＬｂタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を組換え発現ベクター内に挿入できる。「組換え発現ベクター」という用語は、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳類細胞ウイルスまたは他のベクターを意味する。併せて、いかなるプラスミドおよびベクターも、それらが宿主内で複製および安定化できるという条件で使用できる。発現ベクターの重要な特徴は、複製開始点、プロモーター、マーカー遺伝子および翻訳制御エレメントを有することである。
【００６３】
ＥＬｂタンパク質コードＤＮＡ配列および適切な転写／翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターは、当業者によく知られている方法を用いて構築できる。これらの方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術およびｉｎ  ｖｉｖｏ組換え技術などが含まれる。ｍＲＮＡ合成を誘導するために、前記ＤＮＡ配列を発現ベクター内の適切なプロモーターに効果的に連結することができる。発現ベクターは、翻訳開始部位であるリボソーム結合部位、および転写ターミネーターも含みうる。
【００６４】
加えて、発現ベクターは、形質転換宿主細胞を選択するのに有用な表現型を与えるために、真核細胞培養で有用なジヒドロ葉酸リダクターゼ、ネオマイシン耐性もしくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養で有用なカナマイシン耐性もしくはアンピシリン耐性など、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子を含むことが好ましい。
【００６５】
上述の適切なＤＮＡ配列および上述の適切なプロモーターまたは制御配列を含有するベクターを使用して、そのタンパク質の発現に適した宿主細胞を形質転換することができる。
【００６６】
宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞、または酵母細胞などの下等真核細胞、または植物細胞などの高等真核細胞でありうる。代表例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ならびに真菌細胞、例えば酵母、ならびに植物細胞などである。
【００６７】
ベクター内に挿入されるエンハンサー配列は、本発明のポリヌクレオチドが高等真核細胞内で発現される場合に、転写を亢進する。ＤＮＡシス作用因子であるエンハンサーは、通常約１０〜３００塩基対を含み、遺伝子転写を亢進するようにプロモーターに作用する。
【００６８】
当業者ならば、適切なベクター、プロモーター、エンハンサーおよび宿主細胞をどのようにして選択するか理解しているであろう。
【００６９】
組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者によく知られている日常的技術を用いて実施できる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核細胞宿主については、指数増殖期の後に細胞を採取し、それらの細胞をＣａＣｌ２で処理することによって、ＤＮＡを吸収できるコンピテント細胞を得ることができる。これらの調製方法は当技術分野でよく知られている。別の方法はＭｇＣｌ２処理を用いる。形質転換は、必要に応じて、エレクトロポレーションによって行うこともできる。真核細胞宿主については、任意の適したＤＮＡ形質移入法、例えば、リン酸カルシウム共沈、微量注入などの日常的な機械的方法、エレクトロポレーションおよびリポソーム封入などを使用できる。植物細胞は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換または遺伝子銃形質転換などの方法、ならびにリーフディッシュ（ｌｅａｆ  ｄｉｓｈ）法およびイネ未熟胚の変換などの他の技術を用いて形質転換できる。従来の方法によって、形質転換された植物細胞、組織または器官が新規植物を再生することを可能にして、改変された形質を有する植物を得る。
【００７０】
この結果得られた形質転換体を通常通りに成長させて、本発明の遺伝子によってコードされているポリペプチドを発現させることができる。培養培地は、使用される宿主細胞に応じて、様々な従来培地から選択できる。培養は、宿主細胞の増殖に適した条件下で行う。宿主細胞が適切な密度まで増殖し、その後さらに追加の期間、細胞が培養されているときに、選択されたプロモーターを、適切な方法（例えば温度変化または化学誘導）を用いて誘導できる。
【００７１】
上述の組換えポリペプチドは、細胞内または細胞膜上に発現されるものでもよく、細胞によって分泌されるものでもよい。必要に応じて、組換えタンパク質の物理的特性、化学的特性および他の特性を利用して、それらを様々な単離法によって単離および精製することができる。これら方法は当業者にはよく知られている。そのような方法の例には、従来の再生処理、タンパク質沈殿剤（塩析）での処理、遠心分離、浸透圧による細菌の破壊、超処理（ｕｌｔｒａｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、超遠心分離、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および他の液体クロマトグラフィー、ならびにこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【００７２】
組換えＥＬｂタンパク質を使用して、例えば、ＥＬｂタンパク質機能を亢進または阻害できる抗体、ポリペプチドまたは他のリガンドを得るためのスクリーニングを行うことができる。発現された組換えＥＬｂタンパク質を用いたポリペプチドライブラリーのスクリーニングを使用して、ＥＬｂタンパク質機能を阻害または刺激する、価値あるポリペプチド分子を探索することができる。
【００７３】
本発明のポリヌクレオチドの一部または全体は、組織における示差的遺伝子発現を分析するプローブとして、マイクロアレイまたはＤＮＡチップ（「遺伝子チップ」）上に固定することができる。ＥＬｂタンパク質の転写産物は、ＲＮＡポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）およびＥＬｂタンパク質に特異的なプライマーを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅によって検出できる。
【００７４】
本発明は、作物改良の方法であって、植物におけるＥＬｂ遺伝子またはその相同遺伝子の発現または活性の調節を含む方法にも関する。ＥＬｂの発現または活性を亢進するか、または阻害するかは、改良される植物形質に依存するであろう。草高および容積の低減、または植物の分げつおよび収量の増大の必要は、作物におけるＥＬｂの発現または活性を増大させることによって満たされ、一方、花器サイズ、種子サイズ、草高または容積の増大の必要は、作物における草高調節遺伝子の発現または活性を阻害することによって満たされる。
【００７５】
ＥＬｂ遺伝子またはその相同遺伝子の発現を増大させる方法は当技術分野でよく知られている。例えば、ＥＬｂコード遺伝子を含有する発現構築物を植物内に導入して、ＥＬｂを過剰発現させることができ、または強力なプロモーターによって、ＥＬｂ遺伝子またはその相同遺伝子の発現の亢進を引き起こすことができ、またはエンハンサー（例えばイネｗａｘｙ遺伝子の第一イントロン、アクチン遺伝子の第一イントロンなど）によって、ＥＬｂ遺伝子の発現を亢進することができる。これらの方法に適した強力なプロモーターには、３５ｓプロモーター、イネおよびトウモロコシのＵｂｉプロモーターなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】
ＥＬｂ遺伝子またはその相同遺伝子の発現を阻害する方法は当技術分野でよく知られている。例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）または遺伝子サイレンシング（ノックアウト）技術によって、阻害を実現できる。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態として、ＥＬｂの高発現を有する植物を得る方法は、
（１）ＥＬｂタンパク質の配列をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを保有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞を用意するステップと、
（２）植物の細胞、組織または器官を、ステップ（１）に記載のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞と接触させて、ＥＬｂタンパク質の配列をコードする前記ＤＮＡを植物細胞、組織または器官に導入し、それらが植物細胞の染色体に組み込まれることを可能にするステップと、
（３）ＥＬｂタンパク質の配列をコードする前記ＤＮＡを含有する植物細胞、組織または器官を選択するステップと、
（４）ステップ（３）に記載の植物細胞、組織または器官が新規な植物を再生することを可能にするステップと
を含む。
【００７８】
試薬、温度、圧力などを含めた、任意の適切な日常的手段を、この方法を実施するのに使用できる。
【００７９】
本発明は、ＥＬｂタンパク質またはそれをコードする遺伝子のアゴニストもしくはアンタゴニストにさらに関する。アゴニストまたはアンタゴニストは、ＥＬｂの活性または発現を調節でき、それゆえ、形質改良の目標を実現するために、ＥＬｂ機能へのそれらの影響によって作物の草高、容積、分げつ、収量、花器サイズまたは種子サイズなどを調節するのに使用できる。
【００８０】
ＥＬｂアンタゴニストとは、ＥＬｂの活性および安定性の低減、ＥＬｂ発現の下方制御、ＥＬｂの有効作用時間の低減、またはＥＬｂの転写もしくは翻訳の阻害ができる薬剤を指す。本発明によれば、これらの薬剤は、作物の花器サイズ、種子サイズ、草高または容積を増大させるのに有用な薬剤として使用できる。
【００８１】
ＥＬｂアゴニストとは、ＥＬｂ活性の増大、ＥＬｂ安定性の維持、ＥＬｂ発現の亢進、ＥＬｂの有効作用時間の増大またはＥＬｂの転写もしくは翻訳の増大ができる薬剤を指す。本発明によれば、これらの薬剤は、作物の草高および容積の低減、ならびに分げつおよび収量の増大に有用な薬剤として使用できる。
【００８２】
一実施形態では、本発明は、配列番号１に記載のゲノム配列を有するＥＬｂ遺伝子に関し、配列中、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は６１〜３５３、１３６３〜１５８５、１６９０〜１９４３、２０２８〜２４１４および２５５９〜２９７９の領域に位置し、完全長ｃＤＮＡ（配列番号１）は、５２５アミノ酸（配列番号３）を含むタンパク質をコードする１５７８ｂｐを有する。ＥＬｂ遺伝子は、作物の草高、容積、収量および分げつなどを改良する新規手段を提供し、それゆえ、有望な見通しを有する。
【００８３】
植物の茎または葉における特異的発現のためのプロモーターおよび遺伝子発現の誘導
本明細書で使用される場合、「プロモーター」または「プロモーター領域」とは、通常、標的遺伝子のコード配列の上流（５’側）に見出され、ｍＲＮＡへのポリヌクレオチド配列の転写を開始するヌクレオチド配列を意味する。通常、プロモーターまたはプロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼ、および転写の正しい開始に必要な他の因子の認識部位を提供できる。本明細書では、プロモーターまたはプロモーター領域は、置換変異体、欠失変異体および挿入変異体を含めたプロモーター変異体、すなわち、天然に存在する対立遺伝子変異体または天然に存在しない変異体が含まれる。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「組織特異的プロモーター」または「器官特異的プロモーター」とは、これらのプロモーターの制御下において、通常は遺伝子発現が特定の指定された器官または組織のみで起こることを意味する。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結している」とは、２つ以上の核酸領域または核酸配列の機能的空間配置を意味する。例えば、プロモーター領域は、標的遺伝子の核酸配列の転写がプロモーター領域の制御下に入るように、この核酸配列と比較して特定の位置にあり、したがって、プロモーター領域はこの核酸配列に「作動可能に連結し」うる。
【００８６】
通常、プロモーターは、ある組織または器官のｍＲＮＡ発現が他の組織または器官より少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも２５倍、より好ましくは少なくとも５０倍、さらにより好ましくは少なくとも１００倍、最も好ましくは少なくとも１０００倍高い場合に、組織特異的または器官特異的であると考えられる。
【００８７】
本発明は、
（１）配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、または
（２）ストリンジェントな条件下で（１）に記載のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、かつ植物の茎もしくは葉における標的遺伝子の特異的発現を誘導するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるプロモーターに関する。
【００８８】
本発明では、「ストリンジェントな条件」とは、（１）０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳおよび６０℃など、より低イオン強度かつ高温下でのハイブリダイゼーションおよび洗浄、または（２）５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清／０．１％フィコールおよび４２℃など、変成剤存在下でのハイブリダイゼーション、または（３）少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％超の同一性を有する２つの配列間のみで起こるハイブリダイゼーションを指す。さらに、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、植物の茎または葉における、標的遺伝子の特異的発現を誘導できる。
【００８９】
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションは、当業者によく知られている技術であり、１対の特定のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションプロファイルは、それらの類似性または同一性を示す。したがって、本発明は、配列番号１３に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズし、かつ配列番号１３に記載のヌクレオチド配列と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するポリヌクレオチドにさらに関する。
【００９０】
本発明のプロモーターは、植物の組織または器官に特異的であり、とりわけ植物の茎または葉に特異的である。本発明の一部の実施形態において、本発明者らは、本発明のプロモーターの制御下で、ＥＬｂ遺伝子またはＧＵＳ遺伝子が植物の茎および葉では特異的に発現されうるが、他の組織または器官では実質的に発現されないことを発見した。
【００９１】
本発明のプロモーターは、標的遺伝子に作動可能に連結でき、この標的遺伝子は、そのプロモーターにとって外因性（異質性）でありうる。本発明の実施形態によれば、標的遺伝子は通常、ヌクレオチド配列（好ましくは構造ヌクレオチド配列）であり、好ましくは、植物の茎および葉の成長を調節する特定のタンパク質など、特定の機能を有するタンパク質、とりわけ草高に関連するタンパク質をコードする。
【００９２】
本発明のプロモーターは、そのプロモーターにとって外因性（異質性）である改良された標的遺伝子にも作動可能に連結できる。亢進された発現、改変された翻訳後修飾（例えばリン酸化部位）、細胞からの翻訳産物の送出、改良された安定性および細胞シグナルの挿入または欠失など、様々な望ましい特性を有するように標的遺伝子を改良できる。
【００９３】
加えて、特定の遺伝子を下方制御するように、プロモーターおよび標的遺伝子を設計することができ、これは通常、逆方向かつアンチセンス様式で、標的遺伝子配列にプロモーターを連結し、配列を開始させることによって実現される。アンチセンス技術は当業者によく知られている。いかなるヌクレオチド配列も、この方法で調節できる。
【００９４】
上述したいかなるプロモーターおよび標的遺伝子配列も、構築物、とりわけ組換えベクター内に含有させることができる。
【００９５】
組換えベクターは通常、標的遺伝子の転写を開始させるための、作動可能に連結している（通常５’→３’）プロモーターと、標的遺伝子とを含む。必要に応じて、組換えベクターは、３’転写ターミネーター、３’ポリアデニル化シグナル、他の非翻訳ヌクレオチド配列、輸送配列もしくはターゲッティングヌクレオチド配列、耐性選択マーカー、エンハンサーまたはオペロンをさらに含みうる。
【００９６】
通常、標的遺伝子は、植物の茎または葉における特異的発現のためのプロモーターの下流２０００ｂｐ未満（好ましくは１０００ｂｐ未満、より好ましくは５００ｂｐ未満、最も好ましくは３００ｂｐ未満）にある。
【００９７】
本発明のプロモーターに加えて、組換えベクターは、組織特異的、構成的または誘導性プロモーターなど、他の１つまたは複数のプロモーターをさらに含みうる。
【００９８】
上述の適切なプロモーターおよび標的遺伝子を含有するベクターを使用して、タンパク質発現に適した宿主細胞を形質転換することができる。
【００９９】
本発明の利点は以下の通りである。
（１）作物の草高、容積、分げつ、収量、花器サイズまたは種子サイズを調節できる新規な単離された草高調節遺伝子を提供する。したがって、それらを使用して、作物栽培品種を改良することができる。
（２）草高を低減させるために、本発明の調節遺伝子で作物を形質転換させることができ、草高の中程度な低減および有効な分げつ数の増加は高収量育種の理想型であるので、これは、矮小植物型を得るための育種に有用でありうる。例えば、イネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）作物における様々な発現レベルを使用して、様々な程度まで草高を低減させて、有効分げつ数および収量を増大させることができる。
（３）草高調節遺伝子のプロモーターは、初めて単離されたものであり、植物の茎または葉における特異的発現を誘導し、これを使用して、植物の茎または葉における標的遺伝子の特異的発現を調節することができる。
【０１００】
これよりさらに、以下の実施例と併せて、本発明をさらに詳細に記載する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、例示のためのみに提供されることを理解するべきである。以下の実施例で特に記載されていないアッセイは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１）または「ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｃａｒｌ  Ｗ．ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＧａｂｒｉｅｌａ  Ｓ．Ｄｅｖｋｓｌｅｒ編集、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５）に記載の通り、または製造業者の推奨の通りに、従来の手順で実施できる。
【実施例】
【０１０１】
物質
１．１植物物質
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、生態型はコロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）（Ｃｏｌ−０）。
Ｔ−ＤＮＡ挿入変異体：ＥＬａ（ＳＡＬＫ＿０１６０８９）
イネ栽培品種：台北３０９（Ｔａｉｐｅｉ  ３０９）（イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）ジャポニカ種（ｓｓｐ  Ｊａｐｏｎｉｃａ）栽培品種台北３０９（ｃｖ  Ｔａｉｐｅｉ３０９）、ＴＰ３０９）。
【０１０２】
１．２細菌株およびプラスミドベクター
アグロバクテリウム−ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）：ＧＶ３１０１（Ｎａｒａｓｉｍｈｕｌｕ、Ｓ．Ｂら、Ｇｅｌｖｉｎ、１９９６、「Ｅａｒｌｙ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔ−ＤＮＡ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｏｂａｃｃｏ  ａｎｄ  ｍａｉｚｅ．」、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８：８７３〜８６ページ参照）、ＥＨＡ１０５（Ｈｏｏｄ，Ｅ．Ｅ．ら、１９９３、「Ｎｅｗ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｌｐｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｐｌａｎｔｓ．」、Ｔｒａｎｓｇｅｎ．Ｒｅｓ．２：２０８〜２１８ページ参照）。
プラスミドベクター：
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（ｐＳＫ）：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．から購入。
ｐＣａｍｂｉａ１３００Ｓ：ｐＣａｍｂｉａ１３００ＲＳ、ＣＡＭＢＩＡから購入。
ｐＢＩ１０１．１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．から購入。
ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター：Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃ．から購入。
ＲＮＡｉベクター１３００ＲＳ：Ａｒｋａｎｓａｓ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＵＳＡから入手可能。
【０１０３】
１．３試薬および酵素
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、様々な制限エンドヌクレアーゼおよびＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔ、ＴａＫａＲａ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓまたはＰｒｏｍｅｇａから購入する。ゲル中ＤＮＡ断片の回収キットはＯｍｅｇａ  Ｉｎｃ．から購入した。逆転写システムはＧＩＢＣＯＢＲＬから購入した。核酸の分子量マーカーはＭＢＩ製品である。ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクターは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）から購入した。（α−３２Ｐ）ｄＣＴＰは、ＹａＨｕｉ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）から購入した。ＲＴ−ＰＣＲ用ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ第１鎖合成システムを使用する逆転写キット（＃１１９０４−０１８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。他の従来の化学試薬は、輸入されたか、中国で製造された分析用純度の製品である。様々なデオキシヌクレオチドプライマーは、Ｓａｎｇｏｎ  Ｉｎｃ（Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）によって合成された。ＤＮＡ配列の決定は、ＪｉＫａｎｇ  Ｉｎｃ．、ＳｈａｎｇｈａｉまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｓｈａｎｇｈａｉが行った。配列分析は、ＧｅｎｅｄｏｃおよびＤＮＡＳｔａｒソフトウェアなどを用いて完成させた。
【０１０４】
方法
１．シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の培養および形質転換
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の無菌培養には、種子の表面殺菌（７０％エタノール３０秒間、その後滅菌水で４回の洗浄による）および内部殺菌（７％次亜塩素酸ナトリウム１０分間、その後滅菌水で３回の洗浄による）を行い、その後、１／２ＭＳ（１／２Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ&Ｓｋｏｏｇ基本培地、０．８％寒天、ｐＨ５．８）固体培地上に播種し、４℃で７２時間置き、続いて２２℃に移した。１週間後に、栄養溶液（ＨｕａＷｕＱｕｅ  ３ｇ／１０Ｌ、ＹｏｎｇＴｏｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｔｄ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）に浸漬した人工土壌（バーミキュライト：黒色土壌：パーライト＝３：１：０．５）中に実生を移植し、続いて、１４／１０（明／暗）の概日周期を有する人工気候室に移した。
【０１０５】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の形質転換には、好ましい成長状態にある４〜５週齢の植物（より多くの側花茎およびより多くの花の発生を促進し、それによって形質転換効率を増大させるために、形質転換の１週間前に、主花茎を切り取る）を散布（ｓｐｒｉｎｋｌｅ）によって処理した。トランスジェニックベクターを含有するアグロバクテリウム−ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）細胞を２８℃でＯＤ６００約２．０まで増殖させ、その後、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心処理し、新たに調製した形質転換溶液（５％ショ糖および０．０２％Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７を含有する１／２ＭＳ液体培地）中にペレットを再懸濁し、ＯＤ６００約０．６〜０．８の最終濃度まで増殖させた。形質転換の前に、受粉している花および果実を除去し、次に、土壌に十分な水を吸収させた。形質転換中、数滴の懸濁液が葉から落ちるまで、細菌懸濁液をシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）植物表面に散布した。これらの植物を黒い袋で被覆し、暗中で終夜、高湿度に維持した。２４時間後に、植物を標準条件に移した。７日後に、上述の手順に従って、形質転換を１回反復した。種子が成熟した後に、それらの植物を紙袋内に収集し、混合した。収集した植物を７日間デシケーター内に配置し、その後脱穀した。Ｔ１世代の滅菌種子を、５０μｇ／ｍｌ  Ｋａｎまたはハイグロマイシンを含有する１／２×ＭＳ培地上に播種し、４℃に７２時間置き、その後、通常光条件下に置いた。
【０１０６】
２．アグロバクテリウム−ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）によって媒介された成熟イネ胚カルスの遺伝子形質転換
（１）成熟イネ胚カルスの誘導
イネ３０７Ｔの種子から籾殻を取り除き、その後、７０％エタノール中に１分間浸漬し、２０％（ｖ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウム中に持続的に振盪しながら２０〜３０分間浸漬した。これらの種子を５〜６回、滅菌水ですすいだ。滅菌濾紙による吸引乾燥後、イネの種子をＭＳＤ培地上に播種し、暗中２６℃で増殖させ、カルスを誘導した。１週間後に、胚乳、幼芽、および小根を除去してカルスを得、この結果得られたカルスを暗中、ＭＳＤ上で継代培養した。それらは、２〜３週間毎に継代した。ＴＰ３０９種子のカルスについては、使用された培地がＮＢＤであった。
【０１０７】
（２）形質変換に有用な細菌懸濁液の調製
１日目の朝に：−７０℃に保存された細菌の小部分を５ｍｌのＹＥＢ（Ｒｉｆ  ２０ｍｇ／Ｌ＋Ｋａｎ  ５０ｍｇ／Ｌ）液体培地中に接種し、２８℃で終夜、振盪培養した。
【０１０８】
２日目の朝に：細菌を含有する１〜２ｍｌのＹＥＢ培地を収集し、２５〜５０ｍｌのＡＢ（２０ｍｇ／Ｌ  Ｒｉｆ＋５０ｍｇ／Ｌ  Ｋａｎ）液体培地中に移し、その後約４時間２８℃で、ＯＤ６００約０．５まで増殖させた。
【０１０９】
（３）共培養
２日目の午後に：ＯＤ６００値の検出後、細菌懸濁液を５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、ペレットをＡＡＭ（ＡＳ１００含有）中に再懸濁し、ＯＤ６００＝０．４〜０．６まで培養した。この細菌懸濁液を、イネカルスを含有する三角フラスコ中に注ぎ、時々振盪しながら２０分間カルスを浸漬させ、滅菌濾紙（またはピペット）によって細菌懸濁液を吸引乾燥させた後に、その上に１層の滅菌濾紙を有する２．５％Ｐｈｙｔａｇｅｌ含有ＮＢＤ（ＡＳ１００）培地上に浸漬されたカルスを移し、２〜３日間共培養し、その後、滅菌濾紙を十分に濡らすために、それぞれのディッシュに１ｍｌのＡＡＭ（＋ＡＳ１００）培地を添加した。
【０１１０】
（４）スクリーニング
滅菌濾紙（別の濾紙）による吸引乾燥の後、耐性を有するカルスをスクリーニングするためにハイグロマイシン（Ｈｙｇ）を含有するスクリーニング培地中にカルスを移した。暗中で約３０日間、カルスを培養し、その間、１回スクリーニング培地を交換した。
【０１１１】
使用されるスクリーニング培地は以下の通りである。
０．２６％Ｐｈｙｔａｇｅｌ  ＭＳ＋チメンチン１００ｍｇ／Ｌ＋Ｈｙｇ３０ｍｇ／Ｌを含有する、第１スクリーニング用の培地
０．２６％Ｐｈｙｔａｇｅｌ  ＮＢＤ＋チメンチン１００ｍｇ／Ｌ＋Ｈｙｇ５０ｍｇ／Ｌを含有する、第２スクリーニング用の培地
０．２６％Ｐｈｙｔａｇｅｌ  ＭＳ＋チメンチン１００ｍｇ／Ｌ＋Ｈｙｇ５０ｍｇ／Ｌを含有する、第３スクリーニング用の培地
【０１１２】
（５）前分化
スクリーニングされたイネカルスを前分化培地に移し、１０日間増殖させた。
【０１１３】
前分化培地：０．４５％Ｐｈｙｔａｇｅｌ  ＭＳ＋ＢＡＰ  ２ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ  １ｍｇ／Ｌ＋ＡＢＡ  ５ｍｇ／Ｌ＋Ｈｙｇ  ５０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ５．７を含有し、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を含有しない。
【０１１４】
（６）分化
前分化しているイネカルスを分化培地に移し、培養して幼植物に分化させた（明条件、１５〜３０日間）。
【０１１５】
分化培地：０．４５％Ｐｈｙｔａｇｅｌ  ＮＢ＋ＢＡＰ  ３ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ  ０．５ｍｇ／Ｌ、ｐＨ５．７を含有し、２，４−Ｄを含有しない。
【０１１６】
（７）発根
緑色の幼植物を発根用の発根培地に移した。
【０１１７】
発根培地：０．４５％Ｐｈｙｔａｇｅｌ  １／２ＭＳ＋Ｈｙｇ  ５０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ５．７を含有し、２，４−Ｄを含有しない。
【０１１８】
３．ベクター構築
ｐ３５Ｓ：：ＥＬｂベクター構築
ＥＬｂタンパク質のｃＤＮＡコード領域配列をＲＴ−ＰＣＲによって増幅させた。ステップは以下の通り。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）植物の全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって、製造業者提供の説明書に従って抽出し、その結果得られた全ＲＮＡを次にＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）で逆転写させて、ＥＬｂ  ｃＤＮＡを生成させた。Ｔａｋａｒａ  Ｐｅｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼと、鋳型として用いられる上記ｃＤＮＡとを使用するＰＣＲ反応によって、ＥＬｂタンパク質のｃＤＮＡコード領域配列を増幅させた。使用したプライマーは以下の通りである。
上流プライマー（配列番号７）：５’−ＴＧＡＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＧ−３’（下線部：ＢａｍＨＩ部位）、
下流プライマー（配列番号８）：５’−ＡＡＡＧＴＣＧＡＣＣＡＣＡＣＡＣＡＡＡＧＣＡＡＡ−３’（下線部：ＣｌａＩ部位）。
ＰＣＲ条件：９４℃３分間；９４℃３０秒間、５８℃３０秒間および７２℃２分間を３５サイクル；７２℃１０分間。産物は１６℃で保存した。
【０１１９】
ＰＣＲ産物を回収し、ＢａｍＨ１およびＣｌａＩの両方によって消化した。産物を回収し、次に、同じく上述の通りに消化および回収されたｐＳＫベクターに連結した。この結果得られたベクターを用いて、ＤＨ５α細胞を形質転換させた。制限切断によって確認された正しいクローンを配列決定用に選択した。配列決定によって確認された正しい配列を有するクローンについて、ＥＬｂ  ｃＤＮＡコード領域をＢａｍＨＩ／ＣｌａＩによって切断し、ＢａｍＨＩ／ＣｌａＩで切断された二重発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１３００Ｓに連結し、ＤＨ５αを形質転換させて、トランスジェニッククローンを得た。抽出の後、制限切断によって確認された正しいプラスミドで、アグロバクテリウム−ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＶ３１０１細胞およびＥＨＡ１０５細胞を形質転換させた。アグロバクテリウム−ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）細胞からプラスミドを抽出し、ＤＨ５α細胞を再形質転換させた。このプラスミドをＤＨ５αから抽出し、制限酵素によって切断して、アグロバクテリウム−ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）細胞が正しいプラスミドで形質転換されていることを確認した。散布法（ｓｐｒｉｎｋｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ）によるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）細胞の形質転換によって、トランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）植物を得、成熟イネ胚カルスのアグロバクテリウム−ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）媒介遺伝的形質転換によって、トランスジェニックイネ植物を得た。
【０１２０】
ｐＥＬｂプロモーター：：ＧＵＳベクター構築
ＧｅｎＢａｎｋから利用可能な配列（ＧｅｎｅＩＤ：８３２５５９）に基づいて、上流および下流プライマーを設計した。これらのプライマーは、ＥＬｂ遺伝子の翻訳開始部位の１．４ｋｂ上流の領域内にあった。野生型シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）コロンビアの幼植物（７日齢）から抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行った。前記プライマーは以下の通りである。
上流プライマー（配列番号９）：５’−ＣＴＧＣＴＧＣＡＧＡＣＴＣＴＡＴＴＴＣＣＡ−３’（下線部：ＰｓｔＩ部位）；
下流プライマー（配列番号１０）：５’−ＴＴＣＡＧＧＡＴＣＣＴＴＴＡＣＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴ−３’（下線部：ＢａｍＨＩ部位）。
増幅条件：９４℃３分間；９４℃３０秒間、５８℃３０秒間および７２℃２分間を３５サイクル；７２℃１０分間。産物は１６℃で保存した。
【０１２１】
ＰＣＲ産物をＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ酵素によって切断し、次に、ｐＳＫベクター内の対応するＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ部位に連結した。制限切断によって確認された正しいクローンを配列決定用に選択した。配列決定によって確認された正しい配列を有するクローンについて、ＥＬｂプロモーター領域（配列番号１３に記載の通り）をＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩによって切断し、ＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩによって切断された二重発現ベクターｐＢＩ１０１．１に連結し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞を形質転換させた。抽出の後、制限切断によって確認された正しいプラスミドで、アグロバクテリウム−ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＶ３１０１細胞を形質転換させた。アグロバクテリウム−ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）細胞からプラスミドを抽出し、ＤＨ５α細胞を再形質転換させた。このプラスミドをＤＨ５αから抽出し、制限酵素によって切断して、アグロバクテリウム−ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）細胞が正しいプラスミドで形質転換されていることを確認した。その間にｐＢＩ１０１．１ベクターでＧＶ３１０１細胞を形質転換させ、それぞれ陰性対照および陽性対照とした。
【０１２２】
ＥＬａ  Ｔ−ＤＮＡ挿入突然変異株をバックグラウンドとしたＥＬｂトランスジェニックＲＮＡｉ植物の構築
下記の通りのＲＮＡｉベクター１３００ＲＳを用いてトランスジェニッククローンを構築した。ＥＬｂ遺伝子の第４エキソン内にある約５００ｂｐの配列を増幅するために、野生型シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）コロンビアの幼植物（７日齢）のゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行った。前記プライマーは以下の通り。
上流プライマー（配列番号１１）：５’−ＡＡＴＧＧＴＡＣＣＡＣＡＡＧＡＡＡＣＡＡ−３’（下線部：ＫｐｎＩ部位）；
下流プライマー（配列番号１２）：５’−ＴＣＴＡＧＡＴＴＴＧＡＧＣＴＧＡＡＡＡＡＡ−３’（下線部：ＸｂａＩ部位）。
増幅条件：９４℃３分間；９４℃３０秒間、５０℃３０秒間および７２℃３０秒間を３５サイクル；７２℃１０分間。産物は１６℃で保存した。
【０１２３】
ＰＣＲ産物をＫｐｎＩ／ＸｂａＩ酵素によって切断し、次にｐＳＫベクター内の対応するＫｐｎＩ／ＸｂａＩ部位に連結した。制限切断によって確認された正しいクローンを配列決定用に選択した。配列決定によって確認された正しい配列を有するクローンについて、ＥＬｂの部分断片をＫｐｎＩ／ＸｂａＩによって切断し、ＫｐｎＩ／ＸｂａＩによって切断された二重発現ベクター１３００ＲＳに連結させ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞を形質転換させた。抽出の後、制限切断によって確認された正しいプラスミドで、アグロバクテリウム−ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＶ３１０１細胞を形質転換させた。アグロバクテリウム−ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）細胞からプラスミドを抽出し、ＤＨ５α細胞を再形質転換させた。このプラスミドをＤＨ５αから抽出し、制限酵素によって切断して、アグロバクテリウム−ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）細胞が正しいプラスミドで形質転換されていることを確認した。
【０１２４】
散布法によって、ＥＬａ  Ｔ−ＤＮＡ挿入突然変異株を形質転換して、ＥＬａ  Ｔ−ＤＮＡ挿入突然変異株をバックグラウンドとした、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＥＬｂ  ＲＮＡｉトランスジェニック植物（ＥＬｂ  ＲＮＡｉ／ｅＬａ）を得た。
【０１２５】
（実施例１）
ＥＬｂ遺伝子のクローニング
本発明者は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のゲノム配列を探索し、バイオインフォマティクス研究を行うことによって、２つのｐ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子、すなわち７１４Ａ１および７１４Ａ２を発見した。それらは当初、植物成長およびジベレリンの制御下における発生に関与すると予測され、本発明者によって、ＥＬａ（またはＡｔＥｕｉｌａ）およびＥＬｂ（またはＡｔＥｕｉｌｂ）と命名された。
【０１２６】
ＥＬｂ遺伝子コード領域のゲノムＤＮＡ配列を配列番号１に記載し、ＥＬｂ遺伝子のコード領域のｃＤＮＡ配列を配列番号２に記載し、ＥＬｂタンパク質配列を配列番号３に記載した。ＥＬａ遺伝子コード領域のゲノム配列を配列番号４に記載し、ＥＬａ遺伝子のコード領域のｃＤＮＡ配列を配列番号５に記載し、ＥＬａタンパク質配列を配列番号６に記載した。
【０１２７】
（実施例２）
ＥＬｂ遺伝子を過剰発現するトランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）植物における草高および容積の低減
この実施例において、本発明者は、それぞれＥＬｂ、ＥＬａまたはＯｓＥｕｉを過剰発現するトランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）植物を調製した。野生型（ＷＴ）植物、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＥＬａを過剰発現するトランスジェニック植物（ＥＬａ−ＯＥ）、イネＯｓＥｕｉを過剰発現するトランスジェニック植物を対照として用いた。
【０１２８】
４週間の成長の後に成長プロファイルを観察した。これらの結果を図１に示す。図に示す通り、野生型シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）植物が最も大きく、ＥＬｂ過剰発現植物は野生型植物より実質的に小さく、ＥＬａ過剰発現植物およびＯｓＥｕｉ過剰発現植物が最も小さかった。
【０１２９】
７週間の成長の後に、本発明者は、野生型植物、ならびにＥＬｂ、ＥＬａおよびイネＯｓＥｕｉの過剰発現植物の草高を決定した。平均草高値はそれぞれ、２６．２ｃｍ、１４．２ｃｍ、９．６３ｃｍおよび３．７ｃｍであった。したがって、ＥＬｂを過剰発現するトランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）植物の草高は、野生型植物より劇的に低かった。
【０１３０】
（実施例３）
ＥＬｂ  ＲＮＡｉまたはノックアウト変異は草高および容積を増大させる
この実施例において、本発明者らは、ＥＬａ  Ｔ−ＤＮＡ挿入突然変異株である植物変異体から開始して、ＥＬｂ  ＲＮＡｉトランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）植物（ＥＬｂ  ＲＮＡｉ／ｅＬａ）およびＥＬｂ遺伝子ノックアウトを有するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）変異植物を調製した。両植物の成長１０日後に、草高および容積へのＥＬｂ  ＲＮＡｉまたはノックアウト変異の影響を観察し、対照として同一条件下で培養された野生型植物と比較した。
【０１３１】
ＥＬｂ  ＲＮＡｉ／ｅＬａ植物および野生型植物の成長プロファイルを図２に示した。野生型植物と比較して、ＥＬｂ  ＲＮＡｉ／ｅＬａ植物の葉面積、草高および容積は劇的に増大した。
【０１３２】
さらに、野生型植物と比較して、ＥＬｂノックアウト変異体（ＥＬａ  Ｔ−ＤＮＡ挿入をバックグラウンドとしたもの）の葉領域、草高および容積も劇的に増大した。
【０１３３】
したがって、ＥＬｂ発現の低減またはサイレンシングは草高および容積の増大をもたらすこと、すなわち、ＥＬｂは草高および容積の低減に関連する遺伝子であることが結論できる。
【０１３４】
（実施例４）
ＥＬｂ  ＲＮＡｉ／ｅｌａまたはノックアウト変異は花器サイズおよび種子サイズを増大させる。
この実施例において、本発明者は、ＥＬｂ  ＲＮＡｉ／ｅＬａシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）植物またはＥＬｂノックアウトシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）植物（実施例３で産出したもの）の花器および種子の成長プロファイルを観察した。対照として、野生型シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）植物の花器および種子と比較する。
【０１３５】
ＥＬｂ  ＲＮＡｉ／ｅＬａシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）植物および野生型シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）植物の花器および種子の成長プロファイルを図３に示した。ＥＬｂ  ＲＮＡｉ／ｅＬａシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）植物の花器および種子は、野生型植物のものより実質的に大きかった。
【０１３６】
さらに、ＥＬｂノックアウト変異体の花器および種子も野生型植物のものより実質的に大きかった。
【０１３７】
したがって、ＥＬｂ発現の低減またはサイレンシングは植物の花器サイズおよび種子サイズの増大をもたらすこと、すなわち、ＥＬｂは花器サイズおよび種子サイズの低減に関連する遺伝子であることが結論できる。
【０１３８】
（実施例５）
ＥＬｂプロモーターによって開始されたＧＵＳレポーター遺伝子の組織特異的発現
この実施例において、本発明者は、ｐＥＬｂプロモーター：：ＧＵＳベクターを構築した。このベクターは、トランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）植物を調製するためのアグロバクテリウム−ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）細胞を形質転換することができた。ＧＵＳレポーター遺伝子を検出する従来のアッセイによって、植物におけるＧＵＳレポーター遺伝子の発現が観察された。
【０１３９】
結果を図４に示した。ＧＵＳレポーター遺伝子は、植物の茎および葉の発育良好部位で発現されたが、本質的に根では発現されなかった。したがって、ＥＬｂ遺伝子は組織特異的遺伝子である。
【０１４０】
（実施例６）
ＥＬｂ過剰発現トランスジェニックイネの草高の低減
この実施例において、本発明者は、ＥＬｂ過剰発現トランスジェニックイネ植物（ＥＬｂ−ＯＥ）を調製し、イネ植物へのＥＬｂ過剰発現の影響を観察した。同一生育条件で培養された野生型イネＴＰ３０９を対照として用いた。
【０１４１】
１１０日間の成長の後における、植物の成長プロファイルを図５に示した。ＥＬｂ過剰発現トランスジェニックイネ植物の草高は、野生型植物より劇的に低かったことを認めることができた。図６は、ＥＬｂ過剰発現植物および野生型植物の草高を示す統計的ヒストグラムである。
【０１４２】
（実施例７）
ＥＬｂ過剰発現トランスジェニックイネの有効分げつ数および収量の増大
この実施例において、本発明者は、イネ植物の分げつおよび収量へのＥＬｂ過剰発現の影響を実証するために、ＥＬｂ過剰発現トランスジェニックイネ植物（ＥＬｂ−ＯＥ）および野生型イネ植物ＴＰ３０９の分げつ数および収量を検出した。
【０１４３】
培養した植物が穂を付けた後に有効分げつを計数し、統計的結果を図７に示した。野生型植物の分げつ数は約１０であったが、ＥＬｂ過剰発現植物の分げつ数は約２０〜２２であった。ＥＬｂ過剰発現は植物の有効分げつ数を劇的に増大できると結論できる。
【０１４４】
植物が成熟した後に、ＥＬｂ過剰発現植物および野生型植物の収量を分析した。結果を図８に示した。ＥＬｂ過剰発現トランスジェニックイネ植物における単一植物の粒重は劇的に増大したと結論できる。
【０１４５】
（実施例８）
ＥＬｂ変異体の機能
配列番号３に類似した配列を有するタンパク質をコードするコード配列で、ｐ３５Ｓ：：ＥＬｂベクター内のＥＬｂ  ｃＤＮＡコード領域を置換した。唯一の相違は、この配列の位置５２２はＬｅｕであるが、それに対して、野生型ＥＬｂタンパク質の同一の位置はＩｌｅであることである。このベクターでアグロバクテリウム−ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）細胞を上述の通りに形質転換して、トランスジェニック植物を調製した。結果は、トランスジェニック植物の草高が野生型植物より低いことを示した。
【０１４６】
本明細書に引用したすべての刊行物、特許および特許出願を、個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれを参照により本明細書に組み込むと個別に示したのと同じように、参照によりその全体を本明細書に組み込む。加えて、当業者ならば、本明細書に記載の内容に照らして、様々な修正または改変を加えることができ、これらの等価物も、本出願に添付されている特許請求の範囲によって定義される範囲に包含されるべきであると理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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