(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のDNAからなるプロモーター、以下の（ｃ）又は（ｄ）のDNAからなるペプチダーゼ遺伝子、及びアスペルギルス属糸状菌体内で機能するターミネーターを有するアスペルギルス属糸状菌用遺伝子発現カセット：
（ａ）配列番号１に記載される塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列番号１に記載される塩基配列と90%以上の同一性を有し、且つアスペルギルス属糸状菌体内でプロモーターとして機能するDNA
（ｃ）配列番号６に記載される塩基配列からなるDNA
（ｄ）配列番号６に記載される塩基配列と90%以上の同一性を有し、且つペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項２】
アスペルギルス属糸状菌体内で機能する選択マーカー遺伝子、及び請求項１に記載の遺伝子発現カセットを有するアスペルギルス属糸状菌用発現ベクター。
【請求項３】
実質的にアスペルギルス属糸状菌に由来するヌクレオチドだけからなるセルフクローニングベクターである、請求項２に記載のアスペルギルス属糸状菌用発現ベクター。
【請求項４】
直鎖状であることを特徴とする、請求項２又は３に記載のアスペルギルス属糸状菌用発現ベクター。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか一項に記載のアスペルギルス属糸状菌用発現ベクターで形質転換されてなるアスペルギルス属糸状菌。
【請求項６】
請求項５に記載のアスペルギルス属糸状菌を培地で培養し、当該培地からペプチダーゼを回収する工程を含む、ペプチダーゼの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状菌ペプチダーゼの生産方法、並びに当該方法の実施に有用な糸状菌用遺伝子発現カセット、糸状菌用発現ベクター及び形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチダーゼは、衣料用洗剤をはじめとする各種洗浄剤、化粧料、浴用剤、食品改質剤、消化補助剤或いは消炎剤といった様々な用途、分野で利用され、工業用酵素の中で最も生産量が多い。食品工業においても、食品タンパク質からの調味料としてのアミノ酸製造、食品の苦味や雑味の低減、食品へのコクや濃厚感付与のためのペプチド製造、栄養源の高い腸吸収の良いペプチド製造、血圧降下活性などの機能性食品素材としてのペプチド製造、食品に混濁する不要タンパク質の除去などにおいて、ペプチダーゼは重大な働きを有する。食品工業で使用されるペプチダーゼは、微生物由来のものが多く、アスペルギルス(Aspergillus)属、バシラス(Bacillus)属、リゾプス(Rhizopus)属のものが多い。特に、アスペルギルス属の麹菌（アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)）由来のペプチダーゼは、幅広いpHに対応できるものが多く、また液体培養や固体培養などの培養条件の違いで種々のタイプの分子種を有するペプチダーゼ酵素剤を提供できることから、食品業界で最も汎用されている。
【０００３】
なかでも血圧降下活性を有する乳たんぱく質由来のVPP, IPPなどのラクトトリペプチドは、麹菌由来のペプチダーゼ酵素剤で有利に生産できることから、機能性食品材料としてのペプチド生産にも麹菌由来のペプチダーゼは非常に有用である（非特許文献１）。
【０００４】
ただ、機能性ペプチド製造においては、現状の麹菌由来のペプチダーゼ酵素剤にも弱点がある。具体的には、かかる酵素剤は、麹菌の培養抽出物を組成とするため、特性が不明な複数のペプチダーゼを含んでおり、そのため、食品タンパク質に作用させた場合、目的の機能性ペプチドが過分解され、アミノ酸にまで変換されてしまう。
【０００５】
上記課題を解決するために、反応時間、反応pH、反応温度、食品タンパク質と酵素剤の量比、酵素剤の併用など、ケースバイケースで対応せざるを得ないのが現状である。
【０００６】
かかる課題を解決するためには、分子種が明らかなペプチダーゼ酵素剤を、安全性が高く古くから清酒や醤油などの醸造食品の製造に利用されてきた糸状菌、特に麹菌により提供できることが望ましい。しかしながら、ペプチダーゼは細胞毒性を有するため、遺伝子を導入してペプチダーゼを細胞内で高発現させること、即ち分子種が明らかなペプチダーゼを糸状菌で成功して発現させることは困難と考えられていた。また、ペプチダーゼの基質特異性は、その一次構造から推測できず、分子ごとに細胞毒性が異なることが予測され、分子ごとに高発現系を工夫しなければならない困難性があった。
【０００７】
最近、麹菌由来の10種類のペプチダーゼを麹菌を用いたセルフクローニング法によって発現させ産生させたことが報告されている(特許文献１)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１０−４７６０号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】British Journal of Nutrition, 94, 84-91(2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、特許文献１では10種類のペプチダーゼを麹菌を用いて産生させたことが記載されているだけであり、それ以外のペプチダーゼの産生については何ら開示がされていない。
【００１１】
そこで、本発明は、特許文献１で生産が報告されているペプチダーゼ以外の、糸状菌に由来し、分子種が明らかなペプチダーゼを、糸状菌を宿主として生産する方法、特にセルフクローニング法により生産する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、当該ペプチダーゼの生産に用いるための材料、すなわち糸状菌用遺伝子発現カセット、糸状菌用発現ベクター及び形質転換体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、配列番号１６〜２５のいずれかに記載するアミノ酸配列を有する糸状菌由来のペプチダーゼを、特定のプロモーターと組み合わせることにより、糸状菌を宿主とするセルフクローニング法を用いて効率よく生産することができるという知見を得た。本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次の糸状菌用遺伝子発現カセット、糸状菌用発現ベクター、糸状菌及びペプチダーゼの生産方法を提供するものである。
【００１３】
(I)糸状菌用遺伝子発現カセット
(I-1)  以下の（ａ）又は（ｂ）のDNAからなるプロモーター、以下の（ｃ）又は（ｄ）のDNAからなるペプチダーゼ遺伝子、及び糸状菌体内で機能するターミネーターを有する糸状菌用遺伝子発現カセット：
（ａ）配列番号１〜５に記載される塩基配列からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列番号１〜５に記載される塩基配列からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ糸状菌体内でプロモーターとして機能するDNA
（ｃ）配列番号６〜１５に記載される塩基配列からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなるDNA
（ｄ）配列番号６〜１５に記載される塩基配列からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【００１４】
(I-2)  前記プロモーターが以下の（ａ１）又は（ｂ１）のDNAからなり、前記ペプチダーゼ遺伝子が以下の（ｃ１）又は（ｄ１）のDNAからなることを特徴とする、(I-1)に記載の糸状菌用遺伝子発現カセット：
（ａ１）配列番号１及び２に記載される塩基配列からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなるDNA
（ｂ１）配列番号１及び２に記載される塩基配列からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ糸状菌体内でプロモーターとして機能するDNA
（ｃ１）配列番号６に記載される塩基配列からなるDNA
（ｄ１）配列番号６に記載される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【００１５】
(I-3)  前記プロモーターが以下の（ａ２）又は（ｂ２）のDNAからなり、前記ペプチダーゼ遺伝子が以下の（ｃ２）又は（ｄ２）のDNAからなることを特徴とする、(I-1)に記載の糸状菌用遺伝子発現カセット：
（ａ２）配列番号３に記載される塩基配列からなるDNA
（ｂ２）配列番号３に記載される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ糸状菌体内でプロモーターとして機能するDNA
（ｃ２）配列番号６、７、８、１２、１３及び１４に記載される塩基配列からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなるDNA
（ｄ２）配列番号６、７、８、１２、１３及び１４に記載される塩基配列からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【００１６】
(I-4)  前記プロモーターが以下の（ａ３）又は（ｂ３）のDNAからなり、前記ペプチダーゼ遺伝子が以下の（ｃ３）又は（ｄ３）のDNAからなることを特徴とする、(I-1)に記載の糸状菌用遺伝子発現カセット：
（ａ３）配列番号４に記載される塩基配列からなるDNA
（ｂ３）配列番号４に記載される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ糸状菌体内でプロモーターとして機能するDNA
（ｃ３）配列番号６〜１１に記載される塩基配列からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなるDNA
（ｄ３）配列番号６〜１１に記載される塩基配列からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【００１７】
(I-5)  前記プロモーターが以下の（ａ４）又は（ｂ４）のDNAからなり、前記ペプチダーゼ遺伝子が以下の（ｃ４）又は（ｄ４）のDNAからなることを特徴とする、(I-1)に記載の糸状菌用遺伝子発現カセット：
（ａ４）配列番号５に記載される塩基配列からなるDNA
（ｂ４）配列番号５に記載される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ糸状菌体内でプロモーターとして機能するDNA
（ｃ４）配列番号１５に記載される塩基配列からなるDNA
（ｄ４）配列番号１５に記載される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【００１８】
(II)糸状菌用発現ベクター
(II-1)  糸状菌体内で機能する選択マーカー遺伝子、及び(I-1)〜(I-5)のいずれか一項に記載の遺伝子発現カセットを有する糸状菌用発現ベクター。
【００１９】
(II-2)  実質的に糸状菌に由来するヌクレオチドだけからなるセルフクローニングベクターである、(II-1)に記載の糸状菌用発現ベクター。
【００２０】
(II-3)  直鎖状であることを特徴とする、(II-1)又は(II-2)に記載の糸状菌用発現ベクター。
【００２１】
(II-4)  糸状菌がアスペルギルス属に属する糸状菌である、(II-1)〜(II-3)のいずれか一項に記載の糸状菌用発現ベクター。
【００２２】
(III)形質転換体
(III-1)  (II-1)〜(II-3)のいずれか一項に記載の糸状菌用発現ベクターで形質転換されてなる糸状菌。
【００２３】
(III-2)  アスペルギルス属に属する糸状菌である、(III-1)に記載の糸状菌。
【００２４】
(IV)ペプチダーゼの生産方法
(IV-1)  (III-1)に記載の糸状菌を培地で培養し、当該培地からペプチダーゼを回収する工程を含む、ペプチダーゼの生産方法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の糸状菌用遺伝子発現カセット及び生産方法によれば、分子種の明らかな糸状菌由来のペプチダーゼを、糸状菌を宿主として用いて効率よく製造することができる。このため、本発明の方法によれば、分子種の明らかな所望のペプチダーゼを工業的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ペプチダーゼ１生産株をMPYで30℃、64時間、液体培養後に培養液上清の酵素活性を測定した結果を示すグラフである。
【図２】ペプチダーゼ１生産株をMPYで30℃、64時間、液体培養後に培養液上清のSDS-PAGEを行った結果を示す図である。１：コントロール、２及び３： PsodM、４及び５：PamyA、６：PglaA、７及び８：Phly、１−８：MPY
【図３】ペプチダーゼ２生産株をGPY又はMPYで30℃、64時間、液体培養後に培養液上清の酵素活性を測定した結果を示すグラフである。
【図４】ペプチダーゼ２生産株をGPY又はMPYで30℃、64時間、液体培養後に培養液上清のSDS-PAGEを行った結果を示す図である。１：コントロール、２：PsodM、３及び４：PamyA、５及び６：PglaA、７及び８：Phly、１、２、７及び８：GPY、３−６： MPY
【図５】ペプチダーゼ３生産株をGPY又はMPYで30℃、40又は64時間、液体培養後に培養液上清又は菌体破砕液の酵素活性を測定した結果を示すグラフである。
【図６】ペプチダーゼ３生産株をGPY又はMPYで30℃、40又は64時間、液体培養後に培養液上清又は菌体破砕液のSDS-PAGEを行った結果を示す図である。１：マーカー、２：PsodM 40 hr、３：PsodM 64 hr、４：PamyA 40 hr、５：PamyA 64 hr、６：PglaA 40 hr、７：PglaA 64 hr、８：Phly 40 hr、９：Phly 64 hr、１０：コントロール 40 hr、１１：コントロール 64 hr.
【図７】ペプチダーゼ４生産株をGPYで30℃、64時間、液体培養後に培養液上清又は菌体破砕液の酵素活性を測定した結果を示すグラフである。
【図８】ペプチダーゼ４生産株をGPYで30℃、64時間、液体培養後に培養液上清のSDS-PAGEを行った結果を示す図である。１：マーカー、２：コントロール、３、４：ペプチダーゼ４生産株
【図９】ペプチダーゼ５生産株を小麦フスマ培養(30℃、40時間)、GPY液体培養(3 ml、30℃、40時間又は10日間)、又はそれらに1 mM CoCl2を添加した培地での培養後に、小麦フスマ培養は菌体外のみ、液体培養は菌体内外の酵素活性を測定した結果を示すグラフである。
【図１０】ペプチダーゼ６生産株を小麦フスマ培養(30℃、40時間)、又はGPY液体培養(3 ml、30℃、40時間又は10日間)を行った後に、小麦フスマ培養は菌体外のみ、液体培養は菌体内外の酵素活性を測定した結果を示すグラフである。
【図１１】ペプチダーゼ５生産株とペプチダーゼ６生産株を100 ml GPY(ペプチダーゼ５は+1 ml CoCl2)で液体培養(30℃、150 rpm、5又は10日間)を行った後に、培養液上清のSDS-PAGEを行った結果を示す図である。１：マーカー、２及び３：コントロール、４及び５：ペプチダーゼ５生産株、６及び７：コントロール、８及び９：ペプチダーゼ６生産株、２、４、６及び８：5日間培養、３、５、７及び９：10日間培養
【図１２】ペプチダーゼ７生産株をGPYで液体培養(3 ml、30℃、40、64又は88時間)を行った後に、培養液上清の酵素活性を測定した結果を示すグラフである。
【図１３】ペプチダーゼ７生産株をGPYで液体培養(100 ml、30℃、150 rpm、88時間)を行った後に、培養液上清のSDS-PAGEを行った結果を示す図である。１：マーカー、２：コントロール、３：ペプチダーゼ７生産株
【図１４】ペプチダーゼ８生産株とペプチダーゼ９生産株をGPY液体培養(3 ml、30℃、200 rpm、40時間)を行った後に、培養液上清のSDS-PAGEを行った結果を示す図である。１：マーカー、２：コントロール、３：ペプチダーゼ８生産菌、４及び５：ペプチダーゼ９生産菌
【図１５】ペプチダーゼ１０生産株をGPYで液体培養(5 ml、30℃、250 rpm、3日間)を行った後に、培養液上清のSDS-PAGEを行った結果を示す図である。M：マーカー、１：コントロール、２−８：ペプチダーゼ１０生産菌
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００２８】
本発明が対象とする糸状菌としては、麹菌、及び麹菌が属する糸状不完全菌類を挙げることができる。なかでも好ましくはアスペルギルス属（Aspergillus）、ムコール属（Mucor）、カンジダ属（Candida）、トリコデルマ属（Trichoderma）、及びノイロスポラ属（Neurospora）に属する糸状菌であり、より好ましくはアスペルギルス属（Aspergillus）に属する糸状菌である。アスペルギルス属糸状菌としては、特に制限されないが、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamarii）、アスペルギルス・グラウカス（Aspergillus glaucus）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terrus）、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）などを挙げることができる。なかでも、長年清酒、醤油、味噌、みりんなどの醸造食品に利用されてきた安全な微生物であり、わが国の産業において利用頻度の高い宿主である点で、麹菌アスペルギルス・オリゼが好ましい。
【００２９】
（１）糸状菌用遺伝子発現カセット
本発明の糸状菌用遺伝子発現カセットは、以下の（ａ）又は（ｂ）のDNAからなるプロモーター、以下の（ｃ）又は（ｄ）のDNAからなるペプチダーゼ遺伝子、及び糸状菌体内で機能するターミネーターを有する：
（ａ）配列番号１〜５に記載される塩基配列からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列番号１〜５に記載される塩基配列からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ糸状菌体内でプロモーターとして機能するDNA
（ｃ）配列番号６〜１５に記載される塩基配列からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなるDNA
（ｄ）配列番号６〜１５に記載される塩基配列からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【００３０】
本明細書において、上記（ｂ）のDNAからなるプロモーター、（ｄ）のDNAからなるペプチダーゼ遺伝子をそれぞれ改変体と呼ぶことがある。
【００３１】
（1-1）糸状菌ペプチダーゼ
本発明が対象とするペプチダーゼは、配列番号１６〜２６に記載するいずれかのアミノ酸配列を有する糸状菌由来、特に麹菌由来のペプチダーゼ又はその改変体である。これらのペプチダーゼのうち、配列番号１６〜２１に示すペプチダーゼはエキソペプチダーゼ、配列番号２２〜２５に示すペプチダーゼはエンドペプチダーゼに分類することができる。
【００３２】
なお、これらの各ペプチダーゼのアミノ酸配列とこれらをコードする遺伝子（ペプチダーゼ遺伝子）の塩基配列との対応関係を、下表に記載する：
【００３３】
【表１】
0005759132.tif 000002
【００３４】
また、本発明におけるペプチダーゼ遺伝子は、配列番号６〜１５に記載される塩基配列からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAからなるものであっても良い。
【００３５】
ここで、上記のストリンジェントな条件とは、例えば、65℃で5×SSC溶液（１倍濃度のSSC溶液の組成は、150 mM塩化ナトリウム、15 mMクエン酸ナトリウム）中でハイブリダイズさせ、更に0.1％のSDSを含有する0.5×SSC溶液で65℃で洗浄する条件を意味する。ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションの各操作は、「Molecular Cloning (Third Edition)」 (J. Sambrook & D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる。
【００３６】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAは、通常、プローブとして使用するDNAの塩基配列と一定以上の同一性を有し、その同一性は、例えば70％以上、好ましくは80％以上、更に好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上が挙げられる。塩基配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。塩基配列の同一性（％）は、当該分野で慣用のプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等）を初期設定で用いて決定することができる。
【００３７】
このような改変されたペプチダーゼ遺伝子の製造は常法に従って行うことができる。
【００３８】
（1-3）プロモーター
プロモーターは、配列番号１〜５に記載するいずれかの塩基配列を有する糸状菌、特にアスペルギルス属糸状菌に由来するプロモーターである。これら配列番号１〜５に示すプロモーターは、それぞれ配列番号１：α−アミラーゼ遺伝子プロモーターａｍｙＡ（特許第3005618号）、配列番号２：グルコアミラーゼ遺伝子プロモーターｇｌａＡ（Gene，108，145-150，(1992)）、配列番号３：マンガンＳＯＤ遺伝子プロモーターｓｏｄＭ（特開2000-224381号公報）、配列番号４：ｈｌｙ（特開2009-296958号公報）、配列番号５：ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ遺伝子プロモーターｐｄｉＡ（特開2002-320477号公報）である。
【００３９】
また、本発明におけるプロモーターは、配列番号１−５に記載される塩基配列からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ糸状菌体内でプロモーターとして機能するDNAからなるものであっても良い。
【００４０】
ここでのストリンジェントな条件とは、上記と同様である。また、このような改変されたプロモーターの製造は常法に従って行うことができる。
【００４１】
遺伝子発現カセットにおけるプロモーターの位置は、糸状菌体内でプロモーターが機能し、所望のペプチダーゼが発現し産生できる位置であれば、特に限定されないが、通常、ペプチダーゼ遺伝子配列の上流域に配置される。
【００４２】
（1-4）ターミネーター
ターミネーターは、糸状菌体内、特にアスペルギルス属糸状菌体内でターミネーターとして機能するものであればよいが、好ましくは糸状菌、特にアスペルギルス属糸状菌に由来するターミネーターである。好ましくはアスペルギルス属、より好ましくはアスペルギルス・オリゼに由来する、例えばα−アミラーゼ遺伝子のターミネーター、又はグルコアミラーゼ（glaB）ターミネーター（Gene. 207, 127-134,(1998））等を挙げることができる。
【００４３】
（1-5）糸状菌用遺伝子発現カセット
本発明の糸状菌用遺伝子発現カセットにおけるペプチダーゼ遺伝子とプロモーターとの好ましい組み合わせを以下に示す。
・配列番号６に記載する塩基配列を有するペプチダーゼ遺伝子及びその改変体は、配列番号１〜４に記載する塩基配列を有するプロモーター及びその改変体が好ましく、配列番号１及び２に記載する塩基配列を有するプロモーター及びその改変体が更に好ましく、配列番号１に記載する塩基配列を有するプロモーター及びその改変体が特に好ましい。
・配列番号７に記載する塩基配列を有するペプチダーゼ遺伝子及びその改変体は、配列番号３及び４に記載する塩基配列を有するプロモーター及びその改変体が好ましく、配列番号３に記載する塩基配列を有するプロモーター及びその改変体が特に好ましい。
・配列番号８に記載する塩基配列を有するペプチダーゼ遺伝子及びその改変体は、配列番号１、３及び４に記載する塩基配列を有するプロモーター及びその改変体が好ましく、配列番号３及び４に記載する塩基配列を有するプロモーター及びその改変体が更に好ましく、配列番号３に記載する塩基配列を有するプロモーター及びその改変体が更に好ましい。
・配列番号９〜１１に記載する塩基配列を有するペプチダーゼ遺伝子及びその改変体は、配列番号４に記載する塩基配列を有するプロモーター及びその改変体が好ましい。
・配列番号１２〜１４に記載する塩基配列を有するペプチダーゼ遺伝子及びその改変体は、配列番号３に記載する塩基配列を有するプロモーター及びその改変体が好ましい。
・配列番号１５に記載する塩基配列を有するペプチダーゼ遺伝子及びその改変体は、配列番号５に記載する塩基配列を有するプロモーター及びその改変体が好ましい。
【００４４】
本発明の糸状菌用遺伝子発現カセットは、これらのプロモーター、ペプチダーゼ遺伝子、及びターミネーターが、直接連結されてなるものであってもよいが、それらの間に１〜２０００塩基程度のヌクレオチドが挟まれていてもよい。但し、これらのヌクレオチドの配列は糸状菌由来、好ましくはアスペルギルス属糸状菌に由来する配列であることが望ましい。例えば、目的とするペプチダーゼが菌体内タンパク質として生産されるものである場合は、目的とするペプチダーゼの遺伝子のオープンリーディングフレームに隣接して、上流に糸状菌、好ましくはアスペルギルス属糸状菌の既知分泌タンパク質の遺伝子を配置してもよく、こうすることにより、目的とするペプチダーゼは、上記分泌タンパク質との融合タンパク質として発現産生され、斯くして産生された融合タンパク質は菌体外に分泌される。また、その他のヌクレオチドとして、通常ベクターが備える制限酵素切断部位などを備えていてもよい。
【００４５】
なお、アスペルギルス属糸状菌の分泌タンパク質としては、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオハイドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、キシラナーゼ、ガラクトシダーゼ、フラクトフラノシダーゼ、キシロシダーゼ、ペクチンリアーゼ、フィターゼなどが知られている。
【００４６】
（２）糸状菌用発現ベクター
本発明の糸状菌用発現ベクターは、糸状菌体内で機能する選択マーカー遺伝子、及び上記遺伝子発現カセットを有する。
【００４７】
（2-1）選択マーカー遺伝子
選択マーカー遺伝子は、糸状菌体内、特にアスペルギルス属糸状菌体内で選択マーカーとして機能するもの、すなわち発現できるものであればよいが、好ましくは糸状菌、特にアスペルギルス属糸状菌に由来する選択マーカー遺伝子である。かかる選択マーカー遺伝子として、例えば、ｎｉａＤ（Biosci. Biotechnol. Biochem., 59, 1795-1797(1995))、ａｒｇＢ(Enzyme Microbiol Technol, 6, 386-389, (1984))、ｓＣ(Gene, 84, 329-334, (1989))、ｐｔｒＡ(Biosci Biotechnol Biochem, 64, 1416-1421, (2000))、ｐｙｒＧ(Biochem Biophys Res Commun, 112, 284-289, (1983))、ａｍｄＳ(Gene, 26, 205-221, (1983))、オーレオバシジン耐性遺伝子(Mol Gen Genet, 261, 290-296, (1999))、ベノミル耐性遺伝子（Proc Natl Acad Sci USA, 83, 4869-4873, (1986))、及びハイグロマイシン耐性遺伝子(Gene, 57, 21-26, (1987))から選ばれるマーカー遺伝子を挙げることができる。
【００４８】
これらの選択マーカー遺伝子は、上記文献に記載された配列に基づいて設計されたプライマーを用いて、アスペルギルス属糸状菌の染色体DNAを鋳型としてPCRを行う方法、上記文献に記載された配列に基づいて設計されたプローブを用いてアスペルギルス属糸状菌の染色体DNAライブラリーからハイブリダイゼーションにより取得する方法などにより容易に入手することができる。また、宿主の糸状菌として、例えばロイシン要求性などの栄養要求性変異株を用いる場合、選択マーカー遺伝子として当該栄養要求性を相補する野生型遺伝子を用いることもできる。例えば、宿主がロイシン要求性変異株である場合、そのロイシン要求性を相補できる選択マーカー遺伝子を用いることができ、かかる遺伝子としてはβ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするアスペルギルス・ニジュランス由来の遺伝子ＡＮｌｅｕ２及びアスペルギルス・オリゼ由来の遺伝子ｌｅｕ２を挙げることができる。なお、これらの場合、宿主として用いる糸状菌は、選定された選択マーカーについての機能的遺伝子を有していない株を用いる必要がある。
【００４９】
（2-2）糸状菌用発現ベクター
本発明の糸状菌用発現ベクターは、これらの選択マーカー遺伝子、及び遺伝子発現カセットが、直接連結されてなるものであってもよいが、それらの間に１〜２０００塩基程度のヌクレオチドが挟まれていてもよい。但し、これらのヌクレオチドの配列は糸状菌由来、好ましくはアスペルギルス属糸状菌に由来する配列であることが望ましい。
【００５０】
また本発明には、直鎖状の糸状菌用発現ベクター及び環状の糸状菌用発現ベクターの両者が含まれるが、(1)構築したプラスミドから１ステップのPCRで取得できるなど、環状の発現ベクターと比べて少ないステップで調製することができること、(2)宿主としてロイシン要求性変異株を使用する場合に、当該変異を直接相補することができること、及び(3)形質転換効率が環状の発現ベクターと比べて高いという点から、好ましくは直鎖状の糸状菌用発現ベクターである。
【００５１】
（３）形質転換体
本発明の形質転換体は、前述する本発明の糸状菌用発現ベクターで糸状菌を形質転換したものである。
【００５２】
宿主は糸状菌であればよいが、高いプロモーター活性を発現させるためには、アスペルギルス属の菌株が好ましく、特にアスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・サイトイ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・グラウカス、アスペルギルス・フミガタス、アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・テレウス、アスペルギルス・ニジュランス等のアスペルギルス属糸状菌が好ましい。これらの中では、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・サイトイ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・グラウカスなどが食品産業において有用な菌種である。高いタンパク質生産能及び醸造微生物としての安全性の点で、特にアスペルギルス・オリゼを宿主とすることが好ましい。なお、宿主として用いる糸状菌は、野生株に限らず、糸状菌に由来するものであれば、その変異株であってもよい。かかる変異株としては、前述する選択マーカーに関する機能的遺伝子を有さないように変異してなる株を挙げることができ、具体的には正常にロイシンの生合成ができないようにロイシン生合成を担う遺伝子が変異又は欠失しているロイシン要求性変異株：正常にアルギニンの生合成ができないようにアルギニン生合成を担う遺伝子が変異又は欠失しているアルギニン要求性変異株：正常にメチオニンの生合成ができないようにメチオニン生合成を担う遺伝子が変異又は欠失しているメチオニン要求性変異株：正常にヒスチジンの生合成ができないようにヒスチジン生合成を担う遺伝子が変異又は欠失しているヒスチジン要求性変異株：正常に硝酸が資化できないように硝酸資化性遺伝子が変異又は欠失しているniaＤ変異株：正常に硝酸イオンが資化できないように硝酸イオン資化性遺伝子が欠失しているｓＣ変異株などを挙げることができる。
【００５３】
宿主の形質転換方法は、特に限定されず、従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、Cohenらの方法（塩化カルシウム法）（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:2110 (1972)）、プロトプラスト法（Mol. Gen. Genet., 168:111 (1979)）、コンピテント法（J. Mol. Biol., 56:209 (1971)）、エレクトロポレーション法等を挙げることができる。
【００５４】
（４）ペプチダーゼの生産方法
本発明のペプチダーゼの生産方法は、前述した本発明の糸状菌の形質転換体を培養する工程と、培養物から目的タンパク質を回収する工程を含む。
【００５５】
培養工程は、固体培地を用いる固体培養、又は液体培地を用いる液体培養のいずれでも行うことができる。好ましくは液体培地を用いた液体培養である。
【００５６】
固体培地としては、糸状菌の培養に使用される公知の固体培地を制限なく使用することができる。固体培地とはその固形の支持担体が栄養源を含むか、又は固形の支持担体に栄養源が添加されものであり、そこに糸状菌が生育できる固形培地を指し示す。このような固体培地として主に、フスマ（小麦などの穀物の殻）、デンプン粉末、米・小麦・大豆の生あるいは蒸したもの、更にはメンブレンや多孔質の人工物（例えば園芸に使われるバーミキュライト）等に栄養源を添加したもの等が挙げられる。特にフスマ、蒸した米が好ましい。
【００５７】
また、液体培地は、糸状菌の培養に使用される公知の液体培地を制限なく使用できる。例えば、用いられる培地としては、炭素源としてグルコース、マルトース、フルクトース、グリセロール、スターチなどの炭水化物を含有するものが挙げられる。また無機もしくは有機窒素源（例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、カゼインの加水分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプトン、ビーフ抽出物等）が挙げられる。これらの炭素源及び窒素源は、純粋な形で使用する必要はなく、純度の低いものも微量の生育因子や無機栄養素を豊富に含んでいるので有利である。さらに所望により、他の栄養源［例えば、無機塩（例えば、二リン酸ナトリウム、二リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム）、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ１）、抗生物質（例えば、アンピシリン、カナマイシン）など］を培地中に添加してもよい。具体的な液体培地としては、例えば、ポテトデキストロース培地（ニッスイ社）、最少培地（2%グルコース（又はスターチ）、0.3％ NaNO3、0.2％ KCl、0.1％ KH2PO4、0.05％ MgSO4、0.002％ FeSO4、pH6.0）等を挙げることができる。なお、これらは1.5%程度の寒天を添加することで、固体培地として調製することもできる。
【００５８】
形質転換体の培養は、通常ｐＨ５．５〜８．５、好ましくはｐＨ６〜８のｐＨ条件；通常２５〜４２℃、好適には３０〜３７℃の温度条件で行うことができる。培養時間は、その他の条件によって異なるが、通常２〜７日間程度、好ましくは３〜５日間程度を挙げることができる。
【００５９】
本発明の方法によれば、実施例で示すように目的とするペプチダーゼ（配列番号１６〜２５）を菌体外に生成することもできる。このため、ペプチダーゼの取得に際しては、培養上清を回収すればよい。また寒天培地などのように固体培地を使用する場合も培養上清としての寒天培地を回収すればよい。さらに、これらの上清を、公知のタンパク質精製方法、例えばイオン交換、疎水、ゲルろ過、アフィニティなどの各種クロマトグラフィーに供することにより目的とするペプチダーゼを単離し回収することができる。
【００６０】
（５）セルフクローニングベクター及びセルフクローニング株
本発明において、好ましい糸状菌発現ベクターは、糸状菌に由来する選択マーカー遺伝子、糸状菌に由来するプロモーター、糸状菌に由来するペプチダーゼ遺伝子、及び糸状菌に由来するターミネーターを含む、実質的に糸状菌に由来するヌクレオチドだけからなるセルフクローニングベクターである。また本発明において、好ましい形質転換体は、上記セルフクローニングベクターで形質転換してなる糸状菌である。糸状菌のなかでも好ましくは麹菌であり、麹菌のなかでも好ましくはアスペルギルス属に属する麹菌である。
【００６１】
なお、本発明において「セルフクローニング株」とは、前述するように実質的に宿主糸状菌種と同種の生物由来のヌクレオチドから構成される株をいう。また糸状菌に由来しないヌクレオチドが含まれる場合も、せいぜい１〜１０塩基程度、特に６〜１０塩基程度である。この程度の大きさの挿入配列は、例えば制限酵素部位を導入するために挿入される場合がある。
【００６２】
宿主の糸状菌としては、マーカー遺伝子、プロモーター、ターミネーター及び発現させるペプチダーゼ遺伝子が由来する糸状菌、好ましくはアスペルギルス属糸状菌と同種の菌株が用いられる。形質転換株が容易に選択できるように、導入するマーカー遺伝子と同一又はそれと同機能の遺伝子が欠失又は変異した変異株を用いることが好ましい。この場合は、上記で説明した糸状菌用発現ベクターを用いて上記変異株を形質転換した後、導入されたマーカー遺伝子の発現を指標とすることによって、糸状菌用発現ベクター中の目的ペプチダーゼ遺伝子が導入された形質転換体を選択することができる。
【００６３】
また、導入するマーカー遺伝子と同一又はそれと同機能の遺伝子が欠失又は変異していないアスペルギルス属糸状菌を宿主として用いることもできる。この場合は、目的とするペプチダーゼ遺伝子の発現又はその発現量の増大などを指標とすることによって形質転換体を選択することができる。形質転換方法は、特に限定されず、ＰＥＧ−カルシウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法などの公知の方法を制限なく採用できる。
【００６４】
斯くして得られるセルフクローニング株は、糸状菌、好ましくはアスペルギルス属糸状菌の染色体ＤＮＡ中に、前述する本発明の糸状菌用発現ベクターが組み込まれた状態で存在し、大腸菌などの異種生物由来のヌクレオチドは実質的に存在しない。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、一般的な実験方法は、実験書（サムブルックら(Sambrook, J.)のMolecular Cloning：A Laboratory Manual 第３版）に従った。また、下記の実施例において、すべてのPCRは、PrimeSTAR(登録商標) HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社）を用いて行った。なお、下記実施例において、麹菌（アスペルギルス・オリゼ）として、OSI 1013株を使用した。
【００６６】
実施例では、以下の表に示す１０種類のペプチダーゼ(ペプチダーゼ１〜１０)を使用した。
【００６７】
【表２】
0005759132.tif 000003
【００６８】
エキソペプチダーゼ活性測定方法
以下の組成の溶液を37℃で反応させ、各反応時間毎(20分まで5分間隔)に405 nmにおける吸光度を測定した。１分間に1μmolのpNA(p-ニトロアニリド)を遊離する酵素活性を1 unitとした。
20 mM 基質/sH2O      5μl (終濃度 0.5mM)
1M バッファー       10μl (終濃度 50mM)
酵素* + sH2O       185μl
合計200μl
*培養液上清又は菌体破砕液
基質及びバッファーは測定する酵素の種類に従い以下の表に示すものを使用した。
【００６９】
【表３】
0005759132.tif 000004
【００７０】
エンドペプチダーゼ活性測定方法
以下の組成の溶液を37℃で1時間反応させ、10%(w/v)TCA 1 mlを添加し、ボルテックス、遠心後、上清の325 nmにおける吸光度を測定した。１分間に吸光度を1上昇させる酵素活性を1 unitとした。
2% アゾカセイン(Azocasein)/sH2O  250μl (終濃度 1%)
1M バッファー                     50μl (終濃度 100mM)
酵素* + sH2O                     200μl
合計500μl
*培養液上清
バッファーは測定する酵素の種類に従い以下の表に示すものを使用した。
【００７１】
【表４】
0005759132.tif 000005
【００７２】
実施例１  糸状菌用発現ベクターカセット及び形質転換体の構築
特許文献１(特開2010-4760号公報)に記載のプラスミドベクターIE-232を使用し、以下のプラスミドベクターの構築を行った。
【００７３】
（１）ペプチダーゼ１発現プラスミドの構築
（a）sodMプロモーター(配列番号３)制御下ペプチダーゼ１発現プラスミドの構築
IE-232のプラスミドDNAを鋳型として、下記プライマーを使用して下記条件でPCRによりベクター側を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー１：5’- TTTGGGTGGTTTGGTTGGTATTCTGGTTGA -3’(配列番号２６)
プライマー２：5’- ATGTACTTTCCAGTGCGTGTAGTCTACTCT -3’(配列番号２７)
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（９分）を３０サイクル
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）のゲノムDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いて下記条件でPCRによりペプチダーゼ１遺伝子を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー３：5’- ACCAAACCACCCAAAATGAAGGTACGTCAATTCCACTGAT -3’(配列番号２８)
プライマー４：5’- CACTGGAAAGTACATCTACTCCTCCAAGTCCTTCTTAGTC -3’(配列番号２９)
プライマー３の5’末端１５塩基はsodMプロモーター(配列番号３)の3’末端と相同の配列で、プライマー４の5’末端１５塩基はglaBターミネーター(配列番号３０)の５’末端と相同の配列である。
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（２分３０秒）を３０サイクル
上記２個のPCR増幅産物を各末端１５塩基の相同領域を介して、In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を用いて融合し、得られたプラスミドをIE-300とした。
【００７４】
（b）amyAプロモーター(配列番号１)制御下ペプチダーゼ１発現プラスミドの構築
IE-300のプラスミドDNAを鋳型として、下記プライマーを使用して下記条件でPCRによりベクター側を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー５：5’- CCGTACGCGGGGAGTGTGCTTAAGG -3’(配列番号３１)
プライマー６：5’- ATGAAGGTACGTCAATTCCACTGAT -3’(配列番号３２)
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（１０分３０秒）を３０サイクル
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）のゲノムDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いて下記条件でPCRによりamyAプロモーター(配列番号１)を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー７：5’- ACACTCCCCGCGTACGGTACGCCTCCGGGTAGTAG -3’(配列番号３３)
プライマー８：5’- AATTGACGTACCTTCATAAATGCCTTCTGTGGGGT -3’(配列番号３４)
プライマー７の5’末端１７塩基はleuAマーカー(配列番号３５)の3’末端と相同の配列で、プライマー８の5’末端１７塩基はペプチダーゼ１遺伝子の５’末端と相同の配列である。
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（１分３０秒）を３０サイクル
上記２個のPCR増幅産物を各末端１７塩基の相同領域を介して、In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を用いて融合し、得られたプラスミドをpBaAiP014とした。
【００７５】
（c）glaAプロモーター(配列番号２)制御下ペプチダーゼ１発現プラスミドの構築
IE-300のプラスミドDNAを鋳型として、下記プライマーを使用して下記条件でPCRによりベクター側を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー５：5’- CCGTACGCGGGGAGTGTGCTTAAGG -3’(配列番号３１)
プライマー６：5’- ATGAAGGTACGTCAATTCCACTGAT -3’(配列番号３２)
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（１０分３０秒）を３０サイクル
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）のゲノムDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いて下記条件でPCRによりglaAプロモーター(配列番号２)を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー９：5’- ACACTCCCCGCGTACGGGAATTCTGTAGCTGCTCT -3’(配列番号３６)
プライマー１０：5’- TTGACGTACCTTCATCTTGCTTCGACTTCGTTTGCTGATG -3’(配列番号３７)
プライマー９の5’末端１７塩基はleuAマーカー(配列番号３５)の3’末端と相同の配列で、プライマー１０の5’末端１５塩基はペプチダーゼ１遺伝子の５’末端と相同の配列である。
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（１分３０秒）を３０サイクル
上記２個のPCR増幅産物を各末端の相同領域を介して、In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を用いて融合し、得られたプラスミドをIE-324とした。
【００７６】
（d）hlyプロモーター(配列番号４)制御下ペプチダーゼ１発現プラスミドの構築
IE-300のプラスミドDNAを鋳型として、下記プライマーを使用して下記条件でPCRによりベクター側を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー５：5’- CCGTACGCGGGGAGTGTGCTTAAGG -3’(配列番号３１)
プライマー６：5’- ATGAAGGTACGTCAATTCCACTGAT -3’(配列番号３２)
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（１０分３０秒）を３０サイクル
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）のゲノムDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いて下記条件でPCRによりhlyプロモーター(配列番号４)を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー１１：5’- ACACTCCCCGCGTACGGCTACAGCATGGTCTGGAT -3’(配列番号３８)
プライマー１２：5’- AATTGACGTACCTTCATGGTGTTGTGGTGTGAAGG -3’(配列番号３９)
プライマー１１の5’末端１７塩基はleuAマーカー(配列番号３５)の3’末端と相同の配列で、プライマー１２の5’末端１７塩基はペプチダーゼ１遺伝子の５’末端と相同の配列である。
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（１分３０秒）を３０サイクル
上記２個のPCR増幅産物を各末端１７塩基の相同領域を介して、In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を用いて融合し、得られたプラスミドをpBhiP014とした。
【００７７】
（２）ペプチダーゼ２発現プラスミドの構築
（a）sodMプロモーター(配列番号３)制御下ペプチダーゼ２発現プラスミドの構築
IE-232のプラスミドDNAを鋳型として、下記プライマーを使用して下記条件でPCRによりベクター側を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー１：5’- TTTGGGTGGTTTGGTTGGTATTCTGGTTGA -3’(配列番号２６)
プライマー２：5’- ATGTACTTTCCAGTGCGTGTAGTCTACTCT -3’(配列番号２７)
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（９分）を３０サイクル
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）のゲノムDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いて下記条件でPCRによりペプチダーゼ２遺伝子を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー１３：5’- TACCAACCAAACCACCCAAAATGAAGTCGGTACTCAACAT -3’(配列番号４０)
プライマー１４：5’- ACACGCACTGGAAAGTACATTCACGGGTTATAATCCACAA -3’(配列番号４１)
プライマー１３の5’末端２０塩基はsodMプロモーター(配列番号３)の3’末端と相同の配列で、プライマー１４の5’末端２０塩基はglaBターミネーター(配列番号３０)の５’末端と相同の配列である。
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（３分）を３０サイクル
上記２個のPCR増幅産物を各末端２０塩基の相同領域を介して、In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を用いて融合し、得られたプラスミドをpBsP002とした。
【００７８】
（b）amyAプロモーター(配列番号１)制御下ペプチダーゼ２発現プラスミドの構築
pBsP002のプラスミドDNAを鋳型として、下記プライマーを使用して下記条件でPCRによりベクター側を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー５：5’- CCGTACGCGGGGAGTGTGCTTAAGG -3’(配列番号３１)
プライマー１５：5’- ATGAAGTCGGTACTCAACATGGGAG -3’(配列番号４２)
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（１０分３０秒）を３０サイクル
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）のゲノムDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いて下記条件でPCRによりamyAプロモーター(配列番号１)を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー７：5’- ACACTCCCCGCGTACGGTACGCCTCCGGGTAGTAG -3’ (配列番号３３)
プライマー１６：5’- TTGAGTACCGACTTCATAAATGCCTTCTGTGGGGT -3’ (配列番号４３)
プライマー７の5’末端１７塩基はleuAマーカー(配列番号３５)の3’末端と相同の配列で、プライマー１６の5’末端１７塩基はペプチダーゼ２遺伝子の５’末端と相同の配列である。
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（１分３０秒）を３０サイクル
上記２個のPCR増幅産物を各末端１７塩基の相同領域を介して、In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を用いて融合し、得られたプラスミドをpBaAP002とした。
【００７９】
（c）glaAプロモーター(配列番号２)制御下ペプチダーゼ２発現プラスミドの構築
pBsP002のプラスミドDNAを鋳型として、下記プライマーを使用して下記条件でPCRによりベクター側を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー５：5’- CCGTACGCGGGGAGTGTGCTTAAGG -3’(配列番号３１)
プライマー１５：5’- ATGAAGTCGGTACTCAACATGGGAG -3’(配列番号４２)
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（１０分３０秒）を３０サイクル
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）のゲノムDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いて下記条件でPCRによりglaAプロモーター(配列番号２)を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー９：5’- ACACTCCCCGCGTACGGGAATTCTGTAGCTGCTCT -3’ (配列番号３６)
プライマー１７：5’- TTGAGTACCGACTTCATCTTGCTTCGACTTCGTTT -3’ (配列番号４４)
プライマー９の5’末端１７塩基はleuAマーカー(配列番号３５)の3’末端と相同の配列で、プライマー１７の5’末端１７塩基はペプチダーゼ２遺伝子の５’末端と相同の配列である。
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（１分３０秒）を３０サイクル
上記２個のPCR増幅産物を各末端１７塩基の相同領域を介して、In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を用いて融合し、得られたプラスミドをpBgAP002とした。
【００８０】
（d）hlyプロモーター(配列番号４)制御下ペプチダーゼ２発現プラスミドの構築
pBsP002のプラスミドDNAを鋳型として、下記プライマーを使用して下記条件でPCRによりベクター側を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー５：5’- CCGTACGCGGGGAGTGTGCTTAAGG -3’(配列番号３１)
プライマー１５：5’- ATGAAGTCGGTACTCAACATGGGAG -3’(配列番号４２)
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（１０分３０秒）を３０サイクル
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）のゲノムDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いて下記条件でPCRによりhlyプロモーター(配列番号４)を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー１１：5’- ACACTCCCCGCGTACGGCTACAGCATGGTCTGGAT -3’(配列番号３８)
プライマー１８：5’- TTGAGTACCGACTTCATGGTGTTGTGGTGTGAAGG -3’(配列番号４５)
プライマー１１の5’末端１７塩基はleuAマーカー(配列番号３５)の3’末端と相同の配列で、プライマー１８の5’末端１７塩基はペプチダーゼ２遺伝子の５’末端と相同の配列である。
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（１分３０秒）を３０サイクル
上記２個のPCR増幅産物を各末端１７塩基の相同領域を介して、In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を用いて融合し、得られたプラスミドをpBhP002とした。
【００８１】
（３）ペプチダーゼ３発現プラスミドの構築
（a）sodMプロモーター(配列番号３)制御下ペプチダーゼ３発現プラスミドの構築
IE-232のプラスミドDNAを鋳型として、下記プライマーを使用して下記条件でPCRによりベクター側を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー１：5’- TTTGGGTGGTTTGGTTGGTATTCTGGTTGA -3’(配列番号２６)
プライマー２：5’- ATGTACTTTCCAGTGCGTGTAGTCTACTCT -3’(配列番号２７)
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（９分）を３０サイクル
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）のゲノムDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いて下記条件でPCRによりペプチダーゼ３遺伝子を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー１９：5’- TACCAACCAAACCACCCAAAATGACCATTCGTCCAATGAA -3’(配列番号４６)
プライマー２０：5’- ACACGCACTGGAAAGTACATTTATAGAGACATATTAGCCA -3’(配列番号４７)
プライマー１９の5’末端２０塩基はsodMプロモーター(配列番号３)の3’末端と相同の配列で、プライマー２０の5’末端２０塩基はglaBターミネーター(配列番号３０)の５’末端と相同の配列である。
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（２分３０秒）を３０サイクル
上記２個のPCR増幅産物を各末端２０塩基の相同領域を介して、In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を用いて融合し、得られたプラスミドをpBsP003とした。
【００８２】
（b）amyAプロモーター(配列番号１)制御下ペプチダーゼ３発現プラスミドの構築
pBsP003のプラスミドDNAを鋳型として、下記プライマーを使用して下記条件でPCRによりベクター側を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー５：5’- CCGTACGCGGGGAGTGTGCTTAAGG -3’(配列番号３１)
プライマー２１：5’- ATGACCATTCGTCCAATGAAGTTCA -3’(配列番号４８)
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（１０分３０秒）を３０サイクル
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）のゲノムDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いて下記条件でPCRによりamyAプロモーター(配列番号１)を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー７：5’- ACACTCCCCGCGTACGGTACGCCTCCGGGTAGTAG -3’(配列番号３３)
プライマー２２：5’- ATTGGACGAATGGTCATAAATGCCTTCTGTGGGGT -3’(配列番号４９)
プライマー７の5’末端１７塩基はleuAマーカー(配列番号３５)の3’末端と相同の配列で、プライマー２２の5’末端１７塩基はペプチダーゼ３遺伝子の５’末端と相同の配列である。
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（１分３０秒）を３０サイクル
上記２個のPCR増幅産物を各末端１７塩基の相同領域を介して、In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を用いて融合し、得られたプラスミドをpBaAP003とした。
【００８３】
（c）glaAプロモーター(配列番号２)制御下ペプチダーゼ３発現プラスミドの構築
pBsP003のプラスミドDNAを鋳型として、下記プライマーを使用して下記条件でPCRによりベクター側を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー５：5’- CCGTACGCGGGGAGTGTGCTTAAGG -3’ (配列番号３１)
プライマー２１：5’- ATGACCATTCGTCCAATGAAGTTCA -3’ (配列番号４８)
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（１０分３０秒）を３０サイクル
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）のゲノムDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いて下記条件でPCRによりglaAプロモーター(配列番号２)を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー９：5’- ACACTCCCCGCGTACGGGAATTCTGTAGCTGCTCT -3’(配列番号３６)
プライマー２３：5’- ATTGGACGAATGGTCATCTTGCTTCGACTTCGTTT -3’(配列番号５０)
プライマー９の5’末端１７塩基はleuAマーカー(配列番号３５)の3’末端と相同の配列で、プライマー２３の5’末端１７塩基はペプチダーゼ３遺伝子の５’末端と相同の配列である。
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（１分３０秒）を３０サイクル
上記２個のPCR増幅産物を各末端１７塩基の相同領域を介して、In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を用いて融合し、得られたプラスミドをpBgAP003とした。
【００８４】
（d）hlyプロモーター(配列番号４)制御下ペプチダーゼ３発現プラスミドの構築
pBsP003のプラスミドDNAを鋳型として、下記プライマーを使用して下記条件でPCRによりベクター側を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー５：5’- CCGTACGCGGGGAGTGTGCTTAAGG -3’(配列番号３１)
プライマー２１：5’- ATGACCATTCGTCCAATGAAGTTCA -3’(配列番号４８)
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（１０分３０秒）を３０サイクル
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）のゲノムDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いて下記条件でPCRによりhlyプロモーター(配列番号４)を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー１１：5’- ACACTCCCCGCGTACGGCTACAGCATGGTCTGGAT -3’(配列番号３８)
プライマー２４：5’- ATTGGACGAATGGTCATGGTGTTGTGGTGTGAAGG -3’(配列番号５１)
プライマー１１の5’末端１７塩基はleuAマーカー(配列番号３５)の3’末端と相同の配列で、プライマー２４の5’末端１７塩基はペプチダーゼ３遺伝子の５’末端と相同の配列である。
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（１分３０秒）を３０サイクル
上記２個のPCR増幅産物を各末端１７塩基の相同領域を介して、In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を用いて融合し、得られたプラスミドをpBhP003とした。
【００８５】
（４）ペプチダーゼ７発現プラスミドの構築
IE-232のプラスミドDNAを鋳型として、下記プライマーを使用して下記条件でPCRによりベクター側を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー１：5’- TTTGGGTGGTTTGGTTGGTATTCTGGTTGA -3’(配列番号２６)
プライマー２：5’- ATGTACTTTCCAGTGCGTGTAGTCTACTCT -3’(配列番号２７)
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（９分）を３０サイクル
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）のゲノムDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いて下記条件でPCRによりペプチダーゼ７遺伝子を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー２５：5’- TACCAACCAAACCACCCAAAATGCATATGCTCTTATTTAT -3’(配列番号５２)
プライマー２６：5’- ACACGCACTGGAAAGTACATTTAGATCTTCTTCTGGCACA -3’(配列番号５３)
プライマー２５の5’末端２０塩基はsodMプロモーター(配列番号３)の3’末端と相同の配列で、プライマー２６の5’末端２０塩基はglaBターミネーター(配列番号３０)の５’末端と相同の配列である。
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（２分３０秒）を３０サイクル
上記２個のPCR増幅産物を各末端２０塩基の相同領域を介して、In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を用いて融合し、得られたプラスミドをpBsP004とした。
【００８６】
（５）ペプチダーゼ９発現プラスミドの構築
IE-232のプラスミドDNAを鋳型として、下記プライマーを使用して下記条件でPCRによりベクター側を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー１：5’- TTTGGGTGGTTTGGTTGGTATTCTGGTTGA -3’(配列番号２６)
プライマー２：5’- ATGTACTTTCCAGTGCGTGTAGTCTACTCT -3’(配列番号２７)
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（９分）を３０サイクル
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）のゲノムDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いて下記条件でPCRによりペプチダーゼ９遺伝子を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー２７：5’- TACCAACCAAACCACCCAAAATGCGGGGCGCATCTCTCCT -3’(配列番号５４)
プライマー２８：5’- ACACGCACTGGAAAGTACATTTACAAAGCAAGAAGAAGAC -3’(配列番号５５)
プライマー２７の5’末端２０塩基はsodMプロモーター(配列番号３)の3’末端と相同の配列で、プライマー２８の5’末端２０塩基はglaBターミネーター(配列番号３０)の５’末端と相同の配列である。
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（２分）を３０サイクル
上記２個のPCR増幅産物を各末端２０塩基の相同領域を介して、In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を用いて融合し、得られたプラスミドをpBsiP020とした。
【００８７】
（６）ペプチダーゼ８発現プラスミドの構築
IE-232のプラスミドDNAを鋳型として、下記プライマーを使用して下記条件でPCRによりベクター側を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー１：5’- TTTGGGTGGTTTGGTTGGTATTCTGGTTGA -3’(配列番号２６)
プライマー２：5’- ATGTACTTTCCAGTGCGTGTAGTCTACTCT -3’(配列番号２７)
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（９分）を３０サイクル
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）のゲノムDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いて下記条件でPCRによりペプチダーゼ８遺伝子を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー２９：5’- TACCAACCAAACCACCCAAAATGAGATTTCTTCTGTCTTT -3’(配列番号５６)
プライマー３０：5’- ACACGCACTGGAAAGTACATCTATTTGGGGGATGCAACTC -3’(配列番号５７)
プライマー２９の5’末端２０塩基はsodMプロモーター(配列番号３)の3’末端と相同の配列で、プライマー３０の5’末端２０塩基はglaBターミネーター(配列番号３０)の５’末端と相同の配列である。
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（１分３０秒）を３０サイクル
上記２個のPCR増幅産物を各末端２０塩基の相同領域を介して、In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を用いて融合し、得られたプラスミドをpBsP005とした。
【００８８】
（７）ペプチダーゼ４発現プラスミドの構築
pBhiP014のプラスミドDNAを鋳型として、下記プライマーを使用して下記条件でPCRによりベクター側を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー３１：5’- GGTGTTGTGGTGTGAAGGGTGATTGATGTG -3’(配列番号５８)
プライマー２：5’- ATGTACTTTCCAGTGCGTGTAGTCTACTCT -3’(配列番号２７)
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（９分）を３０サイクル
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）のゲノムDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いて下記条件でPCRによりペプチダーゼ４遺伝子を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー３２：5’- ACCCTTCACACCACAACACCATGCGTTTCCTCCCCTGCAT -3’(配列番号５９)
プライマー３３：5’- ACACGCACTGGAAAGTACATTTACAGCGAATCTGCGAAGG -3’(配列番号６０)
プライマー３２の5’末端２０塩基はhlyプロモーター(配列番号４)の3’末端と相同の配列で、プライマー３３の5’末端２０塩基はglaBターミネーター(配列番号３０)の５’末端と相同の配列である。
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（１分３０秒）を３０サイクル
上記２個のPCR増幅産物を各末端２０塩基の相同領域を介して、In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を用いて融合し、得られたプラスミドをpBhP006とした。
【００８９】
（８）ペプチダーゼ６発現プラスミドの構築
pBhiP014のプラスミドDNAを鋳型として、下記プライマーを使用して下記条件でPCRによりベクター側を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー３１：5’- GGTGTTGTGGTGTGAAGGGTGATTGATGTG -3’ (配列番号５８)
プライマー２：5’- ATGTACTTTCCAGTGCGTGTAGTCTACTCT -3’ (配列番号２７)
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（９分）を３０サイクル
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）のゲノムDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いて下記条件でPCRによりペプチダーゼ６遺伝子を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー３４：5’- ACCCTTCACACCACAACACCATGGCTGCCAAACTAGTAGA -3’(配列番号６１)
プライマー３５：5’- ACACGCACTGGAAAGTACATCTAATCAATAGAGTCGTCCC -3’(配列番号６２)
プライマー３４の5’末端２０塩基はhlyプロモーター(配列番号４)の3’末端と相同の配列で、プライマー３５の5’末端２０塩基はglaBターミネーター(配列番号３０)の５’末端と相同の配列である。
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（２分）を３０サイクル
上記２個のPCR増幅産物を各末端２０塩基の相同領域を介して、In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を用いて融合し、得られたプラスミドをpBhiP021とした。
【００９０】
（９）ペプチダーゼ５発現プラスミドの構築
pBhiP014のプラスミドDNAを鋳型として、下記プライマーを使用して下記条件でPCRによりベクター側を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー３１：5’- GGTGTTGTGGTGTGAAGGGTGATTGATGTG -3’(配列番号５８)
プライマー２：5’- ATGTACTTTCCAGTGCGTGTAGTCTACTCT -3’(配列番号２７)
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（９分）を３０サイクル
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）のゲノムDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いて下記条件でPCRによりペプチダーゼ５遺伝子を増幅した。得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的のDNA断片を切り出し、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製を行った。
＜プライマー＞
プライマー３６：5’- ACCCTTCACACCACAACACCATGACTTCGAAAATCGCCCA -3’(配列番号６３)
プライマー３７：5’- ACACGCACTGGAAAGTACATTCAGTCAACAAAGATTGTCT -3’(配列番号６４)
プライマー３６の5’末端２０塩基はhlyプロモーター(配列番号４)の3’末端と相同の配列で、プライマー３７の5’末端２０塩基はglaBターミネーター(配列番号３０)の５’末端と相同の配列である。
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（２分）を３０サイクル
上記２個のPCR増幅産物を各末端２０塩基の相同領域を介して、In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を用いて融合し、得られたプラスミドをpBhiP007とした。
【００９１】
（１０）各種ペプチダーゼ高生産形質転換株の取得
上記で構築した各プラスミドDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いて下記条件でPCRにより麹菌へ導入するDNA断片を増幅した。また、コントロールとしてIE-232のプラスミドDNAを鋳型としてプライマー３８とプライマー５を用いて下記条件でPCRによりleuAマーカーを増幅した。得られたPCR増幅産物をWizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いた精製、エタノール沈殿を行った。得られたDNA断片で麹菌を形質転換した。
＜プライマー＞
プライマー３８：5’- GCGTGGTTTACTAGCTTTAGTGCTA -3’(配列番号６５)
プライマー３９：5’- ATCGGCTGAAGTTAGGAGCGGCCATTG -3’(配列番号６６)
＜PCR条件＞
９８℃（１０秒）、５８℃（５秒）、７２℃（８分３０秒）を３０サイクル
【００９２】
（１１）形質転換体の調製
定法であるＰＥＧ−カルシウム法（Mol Gen Genet，218，99-104，(1989)）に従って、上記で調製したセルフクローニングベクターをそれぞれ用いて、ロイシン要求性変異麹菌株を形質転換した。なお、当該ロイシン要求性変異麹菌株は、麹菌（アスペルギルス・オリゼ）のロイシンをコードする遺伝子を変異させて正常なロイシンが合成できないようにした菌株であり、ロイシン要求性を相補する選択マーカー遺伝子が組み込まれなければ、通常、ロイシンを含まない培地では増殖することができない。当該ロイシン要求性変異麹菌株は、アスペルギルス・オリゼleu-5として、茨城県つくば市東１−１−１つくばセンター中央第６に住所を有する独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている（寄託番号FERM P-20079）。
【００９３】
次いで形質転換処理した菌株を、硝酸を単一窒素源とするツアペクドックス（Czapek-Dox）培地（2％グルコース、0.1％リン酸１水素２カリウム、0.05％塩化カリウム、0.05％硫酸マグネシウム、0.001％硫酸鉄、0.3％硝酸ナトリウム）で培養し、かかる培地で生育できる菌株を選択することにより、セルフクローニングベクターそれぞれについて形質転換体を得た。
【００９４】
実施例２  セルフクローニングによるペプチダーゼ１の産生
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）に由来するペプチダーゼ１(推定分子量86.9 kDa)を、麹菌を用いたセルフクローニング法によって発現させ、産生させた。
【００９５】
上記で調製した各形質転換体を、３０℃で６４時間、MPY液体培地（2％マルトース、1％ペプトン、0.5％酵母エキス）で培養した。培養後に培養液上清の酵素活性測定とSDS-PAGEを行った。酵素活性測定の結果を図１に、SDS-PAGEの結果を図２に示す。sodM、amyA、glaA、hlyの各プロモーターで発現がみられ、特にamyAプロモーターを使用した場合に最も多くの分泌生産が確認された。
【００９６】
実施例３  セルフクローニングによるペプチダーゼ２の産生
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）に由来するペプチダーゼ２(推定分子量81.1 kDa)を、麹菌を用いたセルフクローニング法によって発現させ、産生させた。
【００９７】
上記で調製した各形質転換体を、３０℃で６４時間、GPY液体培地（2％グルコース、1％ペプトン、0.5％酵母エキス）(PsodM、Phly)、又はMPY液体培地(PamyA、PglaA)で培養した。培養後に培養液上清の酵素活性測定とSDS-PAGEを行った。酵素活性測定の結果を図３に、SDS-PAGEの結果を図４に示す。sodM、hlyのプロモーターで発現が確認でき、特にsodMプロモーターを使用することで最も多くの分泌生産が確認された。
【００９８】
実施例４  セルフクローニングによるペプチダーゼ３の産生
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）に由来するペプチダーゼ３(推定分子量78.9 kDa)を、麹菌を用いたセルフクローニング法によって発現させ、産生させた。
【００９９】
上記で調製した各形質転換体を、３０℃で４０又は６４時間、GPY液体培地又はMPY液体培地で培養した。培養後に培養液上清及び菌体破砕液の酵素活性測定とSDS-PAGEを行った。酵素活性測定の結果を図５に、SDS-PAGEの結果を図６に示す。sodM、hlyプロモーターを使用することで、ペプチダーゼ３の菌体内での生産を、さらに、６４時間培養することで菌体外での生産も確認でき、特にsodMプロモーターを使用した場合に最も多くの分泌生産が確認できた。
【０１００】
実施例５  hlyプロモーターを用いた種々のペプチダーゼ遺伝子のセルフクローニング発現
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）に由来するペプチダーゼ３種類（ペプチダーゼ４、ペプチダーゼ５及びペプチダーゼ６）を、麹菌を用いたセルフクローニング法によって発現させ産生させた（hlyプロモーター使用）。
【０１０１】
（1）セルフクローニング株（ペプチダーゼ４）
上記で調製したペプチダーゼ４生産株を、３０℃で６４時間、GPY液体培地で培養した。培養後に培養液上清の酵素活性測定とSDS-PAGEを行った。酵素活性測定の結果を図７に、SDS-PAGEの結果を図８に示す。hlyプロモーターを使用することにより、菌体外と菌体内にペプチダーゼ４発現が確認でき、特に菌体内で著量の生産性が確認できた。
【０１０２】
（2）セルフクローニング株（ペプチダーゼ５）
上記で調製したペプチダーゼ５生産株を、小麦フスマ培養(30℃、40時間)、GPY液体培養(3 ml、30℃、40時間又は10日間)、又はそれらに1 mM CoCl2を添加した培地での培養を行った。培養後に小麦フスマ培養では菌体外のみ、液体培養は菌体内外の酵素活性測定を行った。酵素活性測定の結果を図９に示す。GPYを用いた液体培地では、菌体内で著量の生産を確認でき、さらに、塩化コバルトを培地に添加することでその菌体内での生産量は、3-4倍に増加した。また、小麦フスマの固体培養、及び10日間の液体培養を行うことで、菌体外への分泌発現にも成功した。
【０１０３】
（3）セルフクローニング株（ペプチダーゼ６）
上記で調製したペプチダーゼ６生産を、小麦フスマ培養(30℃、40時間)、又はGPY液体培養(3 ml、30℃、40時間又は10日間)を行った。培養後に小麦フスマ培養では菌体外のみ、液体培養は菌体内外の酵素活性測定を行った。酵素活性測定の結果を図１０に示す。GPYを用いた液体培地では、菌体内で著量の生産を確認でき、更に、培養時間を40時間から、10日間にすることでその菌体内での生産量は、約30%増加するとともに、菌体外への分泌生産も確認できた。また、小麦フスマの固体培養を行うことで、菌体外への分泌発現にも成功した。
【０１０４】
（4）セルフクローニング株（ペプチダーゼ５及びペプチダーゼ６の100 ml培養）
上記で調製したペプチダーゼ５生産株とペプチダーゼ６生産株のプレートから分生子をマイクロプレート等でかきとり、3 ml GPY培地へ植菌した。30℃、200 rpm、24時間の前培養後、培養液を100 ml GPY(ペプチダーゼ５は+1 ml CoCl2)/300 ml三角フラスコへ移し、30℃、150 rpmで5日間又は10日間培養を行った。培養液上清を0.45μmフィルターで濾過後、酵素活性測定及び150μlずつ濃縮後にSDS-PAGEを行った。酵素活性測定の結果を表５及び６に、SDS-PAGEの結果を図１１に示す。
【０１０５】
【表５】
0005759132.tif 000006
【０１０６】
【表６】
0005759132.tif 000007
【０１０７】
表５から、ペプチダーゼ５については、培養時間を5日間から10日間にすることで、菌体外への分泌生産量は、約4倍に増加した。さらに、表６から、ペプチダーゼ６については、培養時間を5日間から10日間にすることで、菌体外への分泌生産量は、約６倍に増加した。また、図１１から、ペプチダーゼ５、ペプチダーゼ６ともに、培養時間を5日間から10日間にすることで菌体内での生産量が著量増加していることが明らかとなった。この結果から、培養を3 mlから100 mlにスケールアップしても10日間の培養で菌体外にペプチダーゼ５及びペプチダーゼ６を生産させることができることが確認できた。
【０１０８】
実施例６  sodMプロモーターを用いた種々のペプチダーゼ遺伝子のセルフクローニング発現
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）に由来するペプチダーゼ３種類（ペプチダーゼ７、ペプチダーゼ８及びペプチダーゼ９）を、麹菌を用いたセルフクローニング法によって発現させ産生させた（sodM-プロモーター使用）。
【０１０９】
（1）セルフクローニング株（ペプチダーゼ７）
上記で調製したペプチダーゼ７生産株をGPY液体培養(3 ml、３０℃、４０、６４又は８８時間)した。培養後、培養液上清の酵素活性測定を行った。酵素活性測定の結果を図１２に示す。その結果、sodMプロモーターを使用することにより、菌体外に著量の分泌生産が確認できた。さらに、培養時間を88時間にすることで、24時間に比べて20倍以上の生産量の増加に成功した。
【０１１０】
（2）セルフクローニング株（ペプチダーゼ７の100 ml培養）
上記で調製したペプチダーゼ７生産株のプレートから分生子をマイクロプレート等でかきとり、3 ml GPY培地へ植菌した。30℃、200 rpm、24時間の前培養後、培養液を100 ml GPY/300 ml三角フラスコへ移し、30℃、150 rpmで88時間培養を行った。培養液上清を0.45μmフィルターで濾過後、酵素活性測定及び150μlずつ濃縮後にSDS-PAGEを行った。酵素活性測定の結果を表７に、SDS-PAGEの結果を図１３に示す。
【０１１１】
【表７】
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【０１１２】
その結果、培養を3 mlから100 mlにスケールアップしても菌体外にペプチダーゼ７を生産させることができることが確認できた。
【０１１３】
（3）セルフクローニング株（ペプチダーゼ８及びペプチダーゼ９）
上記で調製したペプチダーゼ８生産株とペプチダーゼ９生産株のプレートから分生子をマイクロプレート等でかきとり、3 ml GPY培地へ植菌し、30℃、200 rpm、40時間培養を行った。培養液上清を0.45μmフィルターで濾過後、酵素活性測定及び150μlずつ濃縮後にSDS-PAGEを行った。酵素活性測定の結果を表８及び９に、SDS-PAGEの結果を図１４に示す。
【０１１４】
【表８】
0005759132.tif 000009
【０１１５】
【表９】
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【０１１６】
その結果、sodMプロモーターを使用することにより、菌体外に、ペプチダーゼ８、ペプチダーゼ９の著量の分泌生産が確認できた。
【０１１７】
実施例７  糸状菌用発現ベクターの調製及びセルフクローニングによるペプチダーゼ１０の産生
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）に由来するペプチダーゼ１０遺伝子を、麹菌を用いたセルフクローニング法によって発現させ、産生させた(トランスイソメラーゼ(pdiA)プロモーター使用)。
【０１１８】
（１）糸状菌用発現ベクターの調製
（1-1）プラスミドベクター
（a）pdiAプロモーターとペプチダーゼ１０遺伝子の融合遺伝子の調製
pdiAプロモーターについては、麹菌ゲノムDNAを鋳型として、プライマー４０(5'-cctttttgaccttggtggttgatagaacgg-3'(配列番号６７))とプライマー４１（5'-agggtcgcattttgagatgctgaatcggataa-3'(配列番号６８)）を用いて、KODプラスDNAポリメラーゼ（東洋紡、日本）により下記PCR条件で増幅させた。
＜ＰＣＲ条件＞
・９６℃（５分）を１サイクル
・９６℃（２０秒）、６０℃（３０秒）、７２℃（１分）を３０サイクル
・７２℃（７分）を１サイクル。
【０１１９】
ペプチダーゼ１０遺伝子については、麹菌ゲノムDNAを鋳型として、プライマー４２(5'-gattcagcatctcaaaatgcgacccttgtctcatctttc-3'(配列番号６９))とプライマー４３（5'-ctaaggcagatcaagccacaacttcaacatc-3'(配列番号７０)）を用いて、KODプラスDNAポリメラーゼ（東洋紡、日本）により下記PCR条件で増幅させた。
＜ＰＣＲ条件＞
・９６℃（５分）を１サイクル
・９６℃（２０秒）、６０℃（３０秒）、７２℃（２分）を３０サイクル
・７２℃（７分）を１サイクル。
【０１２０】
上記pdiAプロモーターPCR増幅産物と、上記ペプチダーゼ１０遺伝子PCR増幅産物を混合し、下記PCR条件で、5'-末端がリン酸化されたプライマー４０と5'-末端がリン酸化されたプライマー４３を用いて、KODプラスDNAポリメラーゼ（東洋紡、日本）によりPCRを行った。
＜ＰＣＲ条件＞
・９６℃（５分）を１サイクル
・９６℃（２０秒）、６８℃（３分）を３０サイクル
・７２℃（７分）を１サイクル。
【０１２１】
得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、QIAquick Gel Extraction kit（QIAGEN）を用いて目的断片を切り出し、インサートを調製した。
【０１２２】
（b）上記融合遺伝子のサブクローニング
特開2010-4760号公報(［００５５］)に記載のpUCLT1に、上記で調製した融合遺伝子をサブクローニングした。具体的には、上記pUCLT1を鋳型として、プライマー４４（5'-ccgtacgcgg ggagtgtgct taaggcgatg-3'(配列番号７１)）とプライマー４５（5'-atgtactttc cagtgcgtgt agtctactc -3'(配列番号７２)）を用いてKODプラスDNAポリメラーゼ（東洋紡、日本）によりPCRを行い、得られたPCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、QIAquick Gel Extraction kit（QIAGEN）を用いて目的断片を切り出し、ベクターを調製した。
＜ＰＣＲ条件＞
・９６℃（５分）を１サイクル
・９６℃（２０秒）、６０℃（３０秒）、７２℃（８分）を３０サイクル
・７２℃（７分）を１サイクル。
【０１２３】
上記ベクターと上記融合遺伝子を、DNA Ligation Kit ver.1（タカラバイオ、日本）によりサブクローニングし、得られたプラスミドをpUCLTPA1とした。
【０１２４】
（1-2）セルフクローニングベクター
上記で得られたプラスミドベクターpUCLTPA1を鋳型として、プライマー４６（5’-gcgtggttta ctagctttag tgctaccaaa-3'(配列番号７３)）とプライマー４７（5’-ctgcagatcg gctgaagtta ggagcggcca ttgtc-3'(配列番号７４)）を用いてPCRを行い、得られたPCR増幅産物をQIAquick Gel Extraction kit（QIAGEN）を用いて精製し、これをセルフクローニングベクターPUCLTPA1とした。
＜ＰＣＲ条件＞
・９６℃（５分）を１サイクル
・９６℃（２０秒）、６０℃（３０秒）、７２℃（９分）を３０サイクル
・７２℃（７分）を１サイクル。
【０１２５】
（２）形質転換体の調製
定法であるＰＥＧ−カルシウム法（Mol Gen Genet，218，99-104，(1989)）に従って、上記で調製したセルフクローニングベクターPUCLTPA1を用いて、ロイシン要求性変異麹菌株(アスペルギルス・オリゼleu-5(寄託番号：FERM P-20079))を形質転換した。
【０１２６】
次いで形質転換処理した菌株を、硝酸を単一窒素源とするツアペクドックス（Czapek-Dox）培地（2％グルコース、0.1％リン酸１水素２カリウム、0.05％塩化カリウム、0.05％硫酸マグネシウム、0.001％硫酸鉄、0.3％硝酸ナトリウム）で培養し、かかる培地で生育できる菌株を選択することにより、セルフクローニングベクターPUCLTPA1について形質転換体を得た。
【０１２７】
（３）ペプチダーゼ１０の産生
上記で調製したペプチダーゼ１０生産菌を5 mlのGPY液体培地に植菌後、30℃、250 rpmで3日間ディスポの試験管で培養した。培養後、100μlの培養液上清を遠心濃縮し、20μlのサンプルバッファーに懸濁し、100℃で3分間煮沸後、20μlをアプライし、SDS-PAGEを行った。コントロールは、特開2010-4760号公報(［００５５］)に記載のプラスミドpUCLT1を用いて、OSI1013Leu要求性変異株を形質転換した株を用いた。SDS-PAGEの結果を図１５に示す。その結果、pdiAプロモーターを使用することにより、N結合型糖鎖が付加されたブロードなバンドとして、菌体外にg/L-brothレベルの著量のペプチダーゼ１０が分泌生産された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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