(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）下記の方法１及び方法２のいずれかで、脱水生体試料を準備する工程と；
方法１：組織器官を、ホルムアミドと3M〜13.5M一価陽イオン塩水溶液との混合液（ホルムアミドと3M〜13.5M一価陽イオン塩水溶液との体積比1000：0〜1000（ただし、体積比1000:0を含まない））に入れて、0〜25℃で5s〜20minホモジネートして、脱水生体試料を得る方法であって、前記組織器官と前記混合液の比率は0.5〜200ｍｇ：1ｍｌであり、前記組織器官は動物、植物又は真菌の組織器官である方法；
方法２：単細胞沈殿物を、ホルムアミドと3M〜13.5Mの一価陽イオン塩水溶液との混合液（ホルムアルデヒドとM〜13.5Mの一価陽イオン塩水溶液との体積比1000：0〜1000（ただし、体積比1000:0を含まない））に入れて、0〜25℃で懸濁するか、或いは0〜37℃で20s〜20minホモジネートして、脱水生体試料を得る方法であって、前記単細胞沈殿物はグラム陽性菌培養細胞、グラム陰性菌培養細胞、真菌培養細胞、動物培養細胞、植物培養細胞、血液細胞又は精液細胞によるものである方法；
（２）前記脱水生体試料と3M〜13.5Mの一価陽イオン塩水溶液とを、前記脱水生体試料と前記3M〜13.5Mの一価陽イオン塩水溶液との体積比を200：0〜200として混合するか、或いは、前記脱水生体試料と、3M〜13.5Mの一価陽イオン塩水溶液と、質量濃度が5%〜40%のドデシル硫酸ナトリウムのホルムアミド溶液とを、前記脱水生体試料と、前記3M〜13.5Mの一価陽イオン塩水溶液と、前記ホルムアミド溶液との体積比を160：50：40として混合して、0〜95℃で0.5〜120minインキュベートし、次いで0〜40℃で0〜10min放置する工程と；
（３）前記工程（２）で得られた生成物中に、タンパク質を含む細胞残渣の沈殿機能をする3.3M〜5Mの一価陽イオン塩水溶液を、前記生成物と前記3.3M〜5Mの一価陽イオン塩水溶液との体積比を200：400〜1000として入れてミックスして、4〜25℃で、2000〜16000gで0.15〜30min遠心した後、得られた上清澄液を別の遠心管に移す工程と；
（４）前記上清澄液中にイソプロパノールを、前記上清澄液と前記イソプロパノールの体積比を900：300〜800として入れてミックスして、4〜37℃で、2000〜16000gで1〜30min遠心し、上層液、下層液及び両層間にある可視残余不純物固体を捨て、遠心管底にある白いRNA沈殿物を得る工程と、
を含む、生体試料からRNAを分離精製する方法。
【請求項２】
体積パーセント濃度が70%〜80%のエタノール水溶液で前記白いRNA沈殿物を洗浄し、4〜37℃で、2000〜16000gで10〜60s遠心し、洗浄液を捨て、前記沈殿物を乾燥する工程を更に含む、請求項１に記載の生体試料からRNAを分離精製する方法。
【請求項３】
前記組織器官と前記混合液との比率は5〜100mg:1mlである、請求項１に記載の生体試料からRNAを分離精製する方法。
【請求項４】
前記一価陽イオン塩は、塩化リチウム、塩化ナトリウム、及び、塩化カリウムから選ばれる少なくとも一種である、請求項１に記載の生体試料からRNAを分離精製する方法。
【請求項５】
前記一価陽イオン塩は、塩化ナトリウム又は塩化リチウムである、請求項４に記載の生体試料からRNAを分離精製する方法。
【請求項６】
前記沈殿機能をする一価陽イオン塩は、塩化リチウム、塩化ナトリウム、及び、塩化カリウムから選ばれる少なくとも一種である、請求項１に記載の生体試料からRNAを分離精製する方法。
【請求項７】
前記沈殿機能をする一価陽イオン塩は、塩化ナトリウム又は塩化カリウムである、請求項６に記載の生体試料からRNAを分離精製する方法。
【請求項８】
前記工程（４）は、前記上清澄液の中にイソプロパノールを、前記上清澄液とイソプロパノールの体積比を700：400〜600として入れて、ミックスし、20〜25℃で、8000〜12000gで2min遠心し、上層液、下層液及び両層間にある可視残余不純物固体を捨て、遠心管底にある白いRNA沈殿物を得る工程である、請求項１に記載の生体試料からRNAを分離精製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はRNAの分離精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸はデオキシリボ核酸（DNA）とリボ核酸（RNA）を含み、すべての活性細胞の中に存在する。DNAは細胞の遺伝物質であり、その遺伝子はメッセンジャーRNA（ｍRNA）への転写が可能であり、後者が所持する遺伝情報は活性タンパク質に翻訳され得る。mRNAのほかに、運搬RNA（tRNA）, リボソームRNA（rRNA），干渉RNA(iRNA)，マイクロRNA(miRNA)、及び、ヘテロRNA（hnRNA）等のRNAが存在する。組織や細胞の中のmRNA，iRNA，及び、miRNAの検査を通じた遺伝子の発現と制御の分析は生命科学分野において極めて重要な手段であり、細胞に極めて大量の生理指標を提供することもできる。PCR検査法、qPCR 、リアルタイムPCR（Real−Time PCR）、ノーザンブロット法（Northern Blotting）、バイオチップトランスクリプトームなどがあり、mRNA，iRNA，及び、miRNAレベルの検査技術は多種多様である。いずれの技術方法も分離したRNAサンプルを使用するが、当該RNAサンプルは、ゲノムDNA，タンパク質，脂質，ポリフェノール，多糖、及び、その他の生物分子といった活性細胞に存在する汚染物質を一切含んではならない（非特許文献１）。
【０００３】
生体試料からRNAを分離する際には、必ずRNAをDNAやその他の生物標本を構成する成分から分離させる。RNAを精製するポイントは以下のとおりである。（1）RNAを分解させないように、操作過程中、RNaseを含め、すべてのヌクレアーゼ活性を有する酵素を不活性化させること。（2）天然RNAに付着したタンパク質を完全に引き剥がして、ネイキッドDNAを溶液に放出すること。これにより、RNAが付着タンパク質と一緒に不純物とされて取り外されることはなく、RNAの抽出収率を高めることもできる。そして、得られたRNAサンプルは微量残存タンパク質により分解されることなく、その質量と純度を高めることができる。（3）得られたRNAサンプル中に微量残存タンパク質が一切存在しないこと。それらの微量タンパク質は常にRNases活性の酵素を含み、RNAを分解する可能性があるからである。
【０００４】
細胞の中では、ヌクレアーゼのほかにも多くの酵素がRNase活性を有している。例えば、真核・原核細胞中に存在する多種類のDNAポリメラーゼ、転写酵素、逆転写酵素は全てRNase活性を有している。このため、RNAの抽出前に徹底的にRNasesを含む酵素の活性を抑制することはRNA分解防止のポイントである。そして、得られたRNAサンプル中にも、微量タンパク質が残存してはならない。残存微量タンパク質の中に存在しうるRNase活性を有する酵素が、得られたRNAを分解するからである。
【０００５】
数多くの科学者が各種類のRNA分離方法を発見して発表していた。その大部分は塩化セシウム密度勾配遠心分離法によるものであったり、またはフェノール・クロロホルムによる抽出法であるので、時間がかかったり、利用する試薬は毒性があって、環境や人間の体に害をもたらしたり、サンプルが外因性の核酸やタンパク質に汚染されたりする欠点がある（特許文献１〜１３，非特許文献２〜４）。
【０００６】
早期のRNA抽出法は、フェノール・クロロホルムを利用してタンパク質を抽出した（非特許文献５）。かかる方法では、タンパク質を完全に引きはがせなかった相当量のRNA分子が引きはがされたタンパク質と共に異物として除去され、また、取得したRNAサンプルの一部分のRNAにまだ少量のタンパク質が付着しているので、繰り返してフェノール・クロロホルム抽出を行って残存タンパク質を除去しなければならない。このように、RNAの収率は極めて低く、抽出過程も複雑で長い。そして、抽出RNAが残留した微量タンパク質によって分解されることも多い（非特許文献６）。
【０００７】
フェノール・クロロホルム抽出法で抽出したRNAの各欠陥をなくすために、ある科学者は塩化セシウム密度勾配遠心分離法を利用して選択的にRNAを沈殿させて、純度の極めて高い核酸を得ている。フェノール・クロロホルム抽出法の代替となる方法であるが、設備が極めて高価であり、また、操作訓練が厳格、操作過程が面倒であるため、一般的な実験室で応用される可能性はほぼなく、普及させる価値もない（非特許文献７）。
【０００８】
現在、最も広く利用されている技術は特許文献１４（Chomczynski, P.）及び論文で公開された技術である（非特許文献８〜９）。
【０００９】
Chomczynski, P.はその特許でRNA、DNAとタンパク質を同時に分離する溶液を公表した。かかる溶液は、チオシアン酸グアニジン、40〜60％のフェノール、フェノールのスタビライザー（安定剤）としてのグリセリン、溶液ｐH値を４に維持するための緩衝液（バッファー）を含む。この溶液は均一な混合物（すなわち、単相液体）であり、10％クロロホルムを入れて有効的に分相をさせて、水相にRNAを導入する。そして、タンパク質及びDNAを有機相と両相の間に集中させる。等量のイソプロパノールを水相に加えてRNAを沈殿させる。遠心分離をして生じたRNA沈殿は70％エタノールで洗浄し、乾燥することができる。
【００１０】
前記方法の長所としては、従来の技術と比べると、操作時間が１時間未満になり、操作も遥かに楽になったことである。製品の純度も収率も高まった。しかしながら、依然として下記のような問題点があるので、実験室でしか使えなく、広く普及させることができない。
【００１１】
高価な実験室設備が必要である（例えば、高速冷却遠心機、液体窒素、低温フリーザー、ドラフトなど）。
【００１２】
熟練したスタッフが必要である。すなわち、この方法を利用するためには、実験作業経験と専門人員の養成が必要である。
【００１３】
RNasesのRNAに対する強い分解作用を防ぐためには、必要品である遠心管、マイクロピペットチップ、ガラス器具や試薬などの消耗品を、DEPC水処理、または高温長時間加熱する必要がある。これには極めて時間と労力が必要である。
【００１４】
毒性の高い化合物フェノールとクロロホルムを使用するだけではなく、毒性が高くて高濃度（2〜5M）のグアニジン溶液も必要であり、これは体に有害である。チオシアン酸グアニジンと塩酸グアニジンはCHIP（イギリス連邦科学製剤危険情報）によって有害品とされ、HCS（アメリカ危険交通設備標準）によっても有毒試薬とされている。
【００１５】
高濃度のグアニジンとフェノール、クロロホルムでRNAからタンパク質を引きはがす効率が大きく高められたものの、未だに完全に引きはがせないため、所定の生体試料からのRNAの収率が低下する。得られたRNAサンプル中に微量タンパク質が残存するため、RNasesがRNAの分解を引き起こすことが多い。
【００１６】
なお、グアニジンに溶解しない組織、特に植物の大多数の組織に対しては、高濃度グアニジンではRNAが得られない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許第５，０７５，４３０号明細書
【特許文献２】米国特許第５，２３４，８０９号明細書
【特許文献３】米国特許第５，１５５，０１８号明細書
【特許文献４】米国特許第６，２７７，６４８号明細書
【特許文献５】米国特許第６，８７５，８５７号明細書
【特許文献６】米国特許第６，９５８，３９２号明細書
【特許文献７】米国特許第６，９５３，６８６号明細書
【特許文献８】米国特許第６，３１０，１９９号明細書
【特許文献９】米国特許第６，９９２，１８２号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，４７５，３８８号明細書
【特許文献１１】米国特許第７，０７４，９１６号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００６／００２４７０号明細書
【特許文献１３】欧州特許第０７６５３３５号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，９４５，５１５号明細書
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Wyatt, J. R, and Tinoco, I.J.(1993) RNA structure and RNA function, in The RNA World(Gesteland, R.F and Atkins, J. F., eds.), Cold Spring Harbore Laboratory Press, Cold Sring Harbor, NY,pp.465-496
【非特許文献２】Boom et al. 1990, J. Clinical Microbiology 28:495
【非特許文献３】Cox, R. A. (1968) The use of guanidinium chloride in the isolation of nucleic acids Methods Enzymol 12, Part B, 120-129
【非特許文献４】Chirgwin, J, M., Przybyka, A. E., Mac Donald, R.J., Rutter, W. J. (1979) Isolation of biologically active ribonucliec acid from sources inriched in ribonuclease. Biochemistry 18(24), 5294-5299
【非特許文献５】Kirby，K. S. (1968)Isolation of nucleicacids with phenolic solutions, Methods Enzymol 12, part B, 87-99.
【非特許文献６】Ingle, J. and Burns, R.G.(1968) The loss of ribosomal ribonucleic acid during the preparation of nucleic acid from certain plant tissues by the detergent-pjenol method, Biochem J.110,605,606
【非特許文献７】Glisin, V., Crkvenjakov，R., and Byus, C (1974) Ribonucleic anid isolated by cesium chloride centrifugation. Biochemistry 13, 2633-2637
【非特許文献８】Chomczynski, P. and Sacchi, N,(1987) Single-step method of RNA siolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biocemistry 18, 5294-5299
【非特許文献９】Sacchi, N,(1987) Single-step method of RNA siolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction  Anal Bilchem 162(1), 156-159
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は現技術の欠点を克服して、安全、安易、高速、高率的な、一般的な実験室に向いている工業生産できる生体試料からRNAを分離精製する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の技術方案の概略は下記のとおりである。
【００２１】
生物材料からRNAを分離精製する方法は、次のとおりである。
（1）下記の二つの方法のいずれかで、脱水生体試料を準備する。
【００２２】
方法１：組織器官を体積比1000：0-1000のホルムアミドと3M-13.5M一価カチオン塩水溶液との混合液にいれて、0〜25℃で5s〜20minホモジネートして、生体試料を得る方法であって、前述組織器官と前述混合液の比率は0.5〜200mg：1mlで，前述組織器官は動物、植物又は真菌の組織器官である；
方法２：単細胞沈殿物を体積比1000：0-1000のホルムアミドと3M-13.5M一価カチオン塩水溶液との混合液に加えて、0〜25℃で懸濁させるか、あるいは、0〜37℃で20s〜20minホモジネートして，脱水生体試料を得る方法であって、前述の単細胞沈殿はグラム陽性菌培養細胞、グラム陰性菌培養細胞、真菌培養細胞、動物培養細胞、植物培養細胞、血液細胞又は精子細胞によるものである；
（2）200：0〜200の体積比で、前述の脱水生体試料を3M-13.5M一価カチオン塩水溶液と混合するか、或いは、体積比160：50：40で、前述の脱水生体試料、3M-13.5M一価カチオン塩水溶液、質量濃度が5%-40%のドデシル硫酸ナトリウムホルムアミドを混合して， 0〜95℃で0.5〜120minインキュベートし、0〜40℃で0〜10min放置する；
（3）200：400〜1000の体積比で工程（2）において得られたものの中に沈殿機能をする3M-13.5M一価カチオン塩水溶液を加えて、ミックスして、4〜25℃で0.15〜30min、2000〜16000gで遠心分離する。上清澄液を別の遠心管に移す；
（4）900：300〜800の体積比で、前述の上清澄液にイソプロパノールを加え、ミックスして、4〜37℃で1〜30min、2000〜16000gで遠心分離する。上相液、下相液及び両相の間の可視残余不純物固体を捨てて、遠心管底にある白いRNA沈殿物を得る。
【００２３】
前述の生物材料からRNAを分離精製する方法は以下の工程も含む：70％-80％の体積パーセント濃度のエタノール水溶液で白いRNA沈殿物を洗浄し、4〜37℃で10〜60s、2000〜16000gで遠心し、洗浄液を除去し、沈殿物を乾燥する。
【００２４】
前述の組織器官と混合液の比率は5〜100mg:1mlである。
【００２５】
前述の一価カチオン塩は、塩化リチウム、塩化ナトリウム又は塩化カリウムの一種以上である。
【００２６】
前述の一価カチオン塩は、塩化ナトリウム又は塩化リチウムである。
【００２７】
前述の沈殿機能をする一価カチオン塩は、塩化リチウム、塩化ナトリウム又は塩化カリウムの一種以上である。
【００２８】
前述の沈殿機能をする一価カチオン塩は、塩化ナトリウム又は塩化カリウムである。
【００２９】
前述の工程（4）は、700：400〜600の体積比で、上清澄液にイソプロパノールを加え、ミックスして、20〜25℃で２min遠心分離して、上相液体、下相液体、両相の間にある可視残余不純物固体を除去して、遠心管底にあるRNA沈殿物を得る。
【００３０】
本発明の方法を利用して、効率的に生体試料のRNAのタンパク質を引きはがし、純粋なRNAを得られるほかに、現技術を利用して得られた製品の中に残存したタンパク質によるRNA分解作用を防ぐことは実験を通してすでに実証された。本発明で使う試薬は毒性の低い化合物であり、環境や人間への損害が低い。また分解されにくいため、得られた製品は長距離運送、室温保存できる。本発明は簡単に操作でき、また、作業員は専門技術がなくても操作できる。さらに、コストが低く、設備が簡単である割に、RNAの収率と純度が極めて高い。
【発明の効果】
【００３１】
本発明は一般の実験室応用及び工業化生産に向いている。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例１と実施例２で取れたものの電気泳動図を示す図である。
【図２−１】実施例３製品の電気泳動図、収率及び純度比率を示す図である。
【図２−２】実施例３製品の電気泳動図、収率及び純度比率を示す図である。
【図２−３】実施例３製品の電気泳動図、収率及び純度比率を示す図である。
【図３−１】実施例４製品の電気泳動図、収率及び純度比率を示す図である。
【図３−２】実施例４製品の電気泳動図、収率及び純度比率を示す図である。
【図３−３】実施例４製品の電気泳動図、収率及び純度比率を示す図である。
【図４−１】実施例５製品の電気泳動図、収率及び純度比率を示す図である。
【図４−２】実施例５製品の電気泳動図、収率及び純度比率を示す図である。
【図４−３】実施例５製品の電気泳動図、収率及び純度比率を示す図である。
【図５】実施例１０の５M NaCl水溶液の解離時間と油菜若葉RNA収率との関係。
【図６】実施例１１の解離機能をした13.5M LiCl水溶液の体積とサンザシ若葉RNA収率との関係を示す図である。
【図７】実施例１２の13.5M LiCl水溶液を使う場合、解離時間とサンザシ若葉RNA収率との関係を示す図である。
【図８】実施例１３の13.5M LiCl水溶液を使う場合、解離温度とポプラ若葉RNA収率との関係。
【図９】実施例１４の油菜若葉ホモジネート液の解離機能を利用した場合、冷却時間とRNA収率との関係を示す図である。
【図１０】実施例１５の本発明方法により、Trizol試薬法で抽出したマウス肝臓RNAサンプルの中のβ-actin mRNAとRT-PCRの増幅比較を示す図である。
【図１１】実施例１６の本発明方法により、Trizol試薬法で抽出した油菜若葉RNAサンプルの中のβ-actin mRNAとRT-PCRの増幅比較を示す図である。
【図１２】実施例１８のマウス肝臓質量がホルムアミド体積との比率及びRNAサンプル収率との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００３３】
下記の実施例は、本技術分野の技術者に本発明を理解してもらうことを目的としており、本発明を制限するものではない。
【００３４】
実施例１：ホルムアミドで懸濁された大腸菌細胞のRNAは高温分解しない。
【００３５】
生体試料からRNAを分離精製する方法は、下の工程を含む：
（1）大腸菌JM109株（北京鼎国昌盛生物技術有限責任会社より購入）を接種したLB培地を37℃でシェーカ（180回転／分）で一晩培養する。1.5ml遠心管に本大腸菌培養菌液を１ml入れて、室温で、8000gで以上1分間遠心してから、液体を除去する。再度前述の遠心分離を行う。その後、マイクロピペットで残液を吸って出して、大腸菌JM109株細胞沈殿を得る。この大腸菌JM109株細胞沈殿に、ホルムアミドを160μl加えて、25℃で15ｓ懸濁させてから、脱水生体試料を得る。大腸菌JM109株細胞沈殿とホルムアミドの比率は5mg：160μlである； 
（2）160μl脱水生体試料に、質量パーセント濃度20％のSodium Dodecyl Sulfate（SDS）のホルムアミド溶液40μlを加えて、撹拌後、80℃で10minインキュベートして、細菌細胞を破裂させ、0℃で５min置く；
（3）工程（2）で得られたものに、沈殿機能を有する600μlの3.3M NaCl水溶液を加えて、ボルテックスして、5分間氷浴する。4℃で、8000ｇで１min遠心分離してから、上清澄液を別の遠心管に移す；
（4）上清澄液の中に600μlのイソプロパノールを加えて、ミックスして、4℃で8000ｇで２min遠心分離してから、液体を捨てて遠心管底にある白いRNA沈殿物を得る。
【００３６】
体積パーセント濃度70％のエタノール水溶液で遠心管底の沈殿物を洗う。４℃で、8000ｇで30秒遠心分離して、洗浄液を捨ててから、遠心管を濾紙に倒置して沈殿を乾かす。検測のために150μlの注射用水を加えて沈殿を溶かす。
【００３７】
アガロースシロップ電気泳動テスト：0.4μlの前記のRNA水溶液サンプルを取って、1.2％非変性アガロースシロップ（1xTAE電気泳動緩衝液）に電気泳動させる。4V/cmの電圧で30分間電気泳動を行う。
【００３８】
アガロースシロップ電気泳動結果
電気泳動図譜は図１の第１レーンに示されるように、本大腸菌RNA溶液サンプルの16s rRNA、23s rRNAのエッジが整然している。これにより抽出した大腸菌RNA溶液中のRNA分子が分解されていないことが実証された。
【００３９】
まとめ
ホルムアミドで懸濁した大腸菌細胞は、80℃で当該細胞をインキュベートしても、ホルムアミド溶液中のRNases活性を有する全ての酵素を完全に抑制でき、RNA分子の分解を防ぐことができる。このことは実施例１の結果で実証された。
【００４０】
実施例２ではイソプロパノールで不純物を抽出し、RNA遠心沈殿方法でRNAサンプル中の核酸酵素を除去する。
【００４１】
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む：
（1）-（2）は実施例１と同様である；
（3）工程（2）で得られた200μlの物質に沈殿機能をする3.57M NaCl、1.14M KCl水溶液を700μl加えて、ボルテックスしてミックスする。室温で、16000gで5min遠心する。上清澄液を別の遠心管に移す；
（4）上清澄液にイソプロパノールを500μl加えてミックスする。25℃で、16000gで5 min遠心する。上層液、下層液及び上下両層の間の可視残存不純物を除去して、遠心管底にあるRNA沈殿物を取る。
【００４２】
体積パーセント濃度80％のエタノール水溶液で白いRNA沈殿を洗い、室温で、16000ｇで10ｓ遠心して、洗浄液を除去して、沈殿物を乾燥する。
150μlの注射用水（RNases汚染なし）を注入して沈殿物を溶かす。RNAサンプルを2本の遠心管にそれぞれ50μl入れ、70℃で5分、60分インキュベートする。最後は、この二つの遠心管を室温で冷却する。
【００４３】
アガロースシロップ電気泳動テスト
実施例１の方法と同じである。
【００４４】
アガロースシロップ電気泳動結果
電気泳動図譜は図１の第２レーン及び第３レーンのごとく、RNAサンプルはそれぞれ５分、60分間70℃保温されたものである。本大腸菌RNA溶液に２種のインキュベ―ト処理をしたサンプルは全く同じである。つまりそれらの16s rRNA、23s rRNAのエッジがきちんとしている。これにより抽出した大腸菌RNA溶液中のRNA分子が長時間保温テストをしても分解されていないことが実証された。
【００４５】
実施例２のまとめ
イソプロパノールで不純物を抽出し、RNA遠心沈殿方法で抽出した大腸菌RNAで得られたRNA溶液サンプルはRNAを分解させる核酸酵素を一切含まない。
【００４６】
実施例３：ホルムアミド中のSDSでタンパク質−RNA複合物の分離を促進する
生体試料からRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む：
それぞれ一定質量のSDS固体を量りとって、1.5ml遠心管に入れて、1mlホルムアミド液を注入して、70℃で10分間保温して、SDS固体を溶かす。1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%SDSのホルムアミド溶液を得る。大腸菌JM109株を接種したLB培地を37℃で180回転シェーカーで培養する。一晩培養した菌液を2ml取って、３７℃で保温した100mlLB培地に入れて、37℃180回転シェーカーで3〜4時間培養する、その600nmにおける吸光度は0.8に達する。1.5ml遠心管を10個取って、一つずつ1mlの本大腸菌培養菌液を注入して、室温で、8000ｇ以上で1分間遠心する。遠心管から液体を除去する。前記の遠心を再度繰り返して、残余液体を吸って出す。ぞれぞれ、200μlの0.00%（対照群）、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%SDSホルムアミド溶液で本遠心管中の細胞沈殿物を懸濁させる。
【００４７】
遠心管を80℃で10分間インキュベートして、細菌細胞を破裂させる。その後、遠心管を5分以上氷浴する。
【００４８】
（3）〜（4）は実施例２と同様である。
【００４９】
体積パーセント濃度が80％のエタノール水溶液で白いRNA沈殿物を洗い、室温で、16000ｇで10ｓ遠心して、洗浄液を除去して乾燥する。150μlの注射用水（RNases汚染なし）を入れて沈殿物を溶かす。
【００５０】
アガロースシロップ電気泳動
実施例１のアガロースシロップ電気泳動方法と同じである。
【００５１】
アガロースシロップ電気泳動分析結果
図２−１で示したように、取得したRNAサンプルの23s rRNA、16s rRNAバンドエッジがはっきりしているので、RNAは分解されていないことがわかる。ほかに、第４レーンのRNAバンドが一番明るい。細胞分離を行う場合、4％SDS−ホルムアミド懸濁液の場合、収率が最も大きいことがわかる。
【００５２】
分光光度計測定
RNA溶液サンプルを75μl取って、石英キュベットの中の2mlのTE溶液（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH8.0）に入れてミックスする。そしてTE溶液（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH8.0）を対照して、UV分光光度計で260nm，280nmにおける吸光度測定を行う。
【００５３】
分光光度計分析結果
図２−２で示したように、SDSがない場合でも、RNAが得られる。二価陽イオンSDS濃度が高くなるにしたがって、解離作用がますます強くなるが、4.00%SDSの細胞溶解液の解離効果が一番高い。すべてのRNAサンプルのOD260/OD280が2.1−2.25の間にある。タンパク質汚染なし、DNA汚染なし或いは極微量あることが図２−３で示されている。
【００５４】
実施例３のまとめ
本実施例は異なった濃度のSDSホルムアミド溶液による、80℃での大腸菌細胞の分解効果、タンパク質−RNA複合物を分離する効果を説明した。大腸菌を懸濁させるホルムアミド溶液が80℃で大腸菌細胞を分解させ、タンパク質−RNA複合物を分離させること（即ち解離作用）ができるが、SDSは解離作用を促進する働きがある。80℃で10分間解離する場合、4％SDS-ホルムアミド溶液で大腸菌細胞を懸濁させるとき、RNA収率が最大である。
【００５５】
実施例４：ホルムアミドの中のナトリウムイオン（Na+）がタンパク質−RNA複合物の分離を促進する
生体試料大腸菌ATCC27853株からRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む：
（1）大腸菌ATCC27853株（北京鼎国昌盛生物技術有限責任会社より購入）を接種したLB培地をシェーカー（37℃180回転／分）で一晩培養する。一晩培養した菌液を2ml取って、37℃保温の100mlLB基地に入れて、37℃180回転／分のシェーカーで3〜4時間培養する。その600 nmにおける吸光度が0.8に達する。1.5ml遠心管を10個取って、一つずつ1mlの本大腸菌培養菌液を注入して、室温で、8000ｇ以上で1分間遠心する。その後液体を除去する。前記の遠心を再度繰り返して、残余液体を吸って出す。大腸菌単細胞沈殿物を得る。
0℃で各単細胞沈殿物のある遠心管にそれぞれ200μlのホルムアミドを入れて懸濁させる。
（2）各遠心管にそれぞれ0μl 5M NaCl（対照群）、5μl 5M NaCl、10μl 5M NaCl、15μl 5M NaCl、20μl 5M NaCl、25μl 5M NaCl、30μl 5M NaCl、40μl 5M NaCl、50μl 5M NaCl、75μl 5M NaClを入れ、ミックスして、80℃で10分間インキュベートして、細菌細胞を破裂させる。その後、遠心管を室温で2分間置く；
（3）工程（2）で得られた物の中に沈殿作用をする3.57M NaCl，1.14M KClを含む水溶液を700μl入れて、ボルテックス混合して、室温で、16000gで１min遠心して、上清澄液を別の遠心管に移す；
（4）上清澄液にイソプロパノールを500μl加えてミックスする。25℃で、12000gで2min遠心分離する。上層液、下層液及び上下両層の間の可視残余不純物固体を除去して、遠心管底にあるRNA沈殿物を得る。
【００５６】
体積パーセント濃度70％のエタノール水溶液1mlで白いRNA沈殿物を洗い、室温で、16000ｇで10ｓ遠心して、洗浄液を除去して、沈殿物を乾燥する。150μlの注射用水（RNases汚染なし）を注入して沈殿物を溶かす。
【００５７】
アガロースシロップ電気泳動
実施例１のアガロースシロップ電気泳動方法と同じである。
【００５８】
アガロースシロップ電気泳動分析結果
図３−１のとおり、200μlホルムアミド溶液と10〜50μl 5M NaCl溶液で細胞沈殿を懸濁させて取れたRNAサンプルの23s rRNA、16s rRNAバンドエッジがはっきりしている。そして、200μlホルムアミド溶液と20〜30μl 5M NaCl溶液で細胞沈殿を懸濁させる場合、RNAの収率が高い。
【００５９】
分光光度計測定
実施例３の分光光度計測定方法と同じである。
【００６０】
分光光度計分析結果
図３−２で示したように、NaClがない場合でも少量のRNAが得られる。５M NaCl水溶液の体積が増えるにしたがって、取れた大腸菌のRNAの産量も大きくなる。200μlホルムアミド溶液と20μl 5M NaCl溶液で細胞沈殿を懸濁する場合の収率は最大である。200μlホルムアミド溶液と10〜50μl 5M NaCl溶液で細胞沈殿物を懸濁する場合、得られたすべてのRNAサンプルのOD260/OD280が2.1−2.25の間にある（図３−３）。タンパク質汚染なし、DNA汚染がなし或いは極微量あることを実証した。
【００６１】
実施例５のまとめ
本実施例は200μlホルムアミド溶液と10〜50μl 5M NaCl溶液で細胞沈殿物を懸濁して、80℃でインキュベートして、大腸菌細胞を分解でき、有効的にタンパク質−RNA複合物を分離してネイキッドRNA分子が得られることを実証した。200μlホルムアミド溶液と20μlの5M NaCl溶液で細胞沈殿を懸濁する場合、RNAの収率が最も高く、タンパク質汚染とRNases汚染がない。前記の結果と実施例３とを帰納比較すれば、次のような結論が出る：加熱作用を通して、ホルムアミド中のNa+が有効的に細菌のタンパク質―RNA複合物を分離でき、ネイキッドインタクトなRNA分子が得られる。
【００６２】
実施例５：白菜若葉のホルムアミドホモジネート液と異なった体積の５M NaClの混合液でRNAを抽出する
生体試料からRNAを分離純化する方法は、次の工程を含む：
（1）氷上ダウンス型ホモジナイザーの中に4℃保存のホルムアミドを３mlと白菜若葉（市場より購入）を300mg入れて、20ｓホモジネートする；
（2）室温で、1.5ml遠心管を6本取って、1本ずつ200μlの白菜若葉ホルムアミドホモジネート液を入れて、それぞれ20μl、30μl、40μl、50μl、60μl、75μlの5M NaCl水溶液を注入して、ボルテックスミックスする；
遠心管を90℃で10分間インキュベートする。その後遠心管を室温で5分間置く；
(3)〜(4)は実施例２と同じである。
【００６３】
体積パーセント濃度が70％のエタノール水溶液1mlで白いRNA沈殿物を洗い、室温で、16000gで10ｓ遠心して、洗浄液を除去してから、沈殿物を乾燥する。150μlの注射用水（RNases汚染なし）を注入して沈殿物を溶かす。
【００６４】
アガロースシロップ電気泳動
実施例１のアガロースシロップ電気泳動方法と同じである。
【００６５】
アガロースシロップ電気泳動分析結果
図４−１で示したように、200μl白菜若葉のホルムアミドホモジネート液と20−75μl 5M NaCl水溶液で細胞沈殿を懸濁して取れたRNAサンプルの26s rRNA、18s rRNAバンドエッジがはっきりしている。そして両者の輝度比は2：1に近い。そして、200μl白菜若葉ホルムアミドホモジネート液と40〜60μl 5M NaCl溶液をミックスして取れたRNA溶液は18s rRNAと26s rRNA電気泳動帯スペクトルが最も明るい。つまり、RNA収率が最も高い。
【００６６】
分光光度計測定
実施例３の分光光度計測定方法と同じである。
【００６７】
分光光度計分析結果
図４−２で示したように、200μl白菜若葉のホルムアミドホモジネート液に入れた５M NaClが多くなるにつれて、取れた白菜若葉RNAの収率も高くなる。200μlホルムアミドホモジネート液と50μl 5M NaCl溶液で90℃インキュベートする場合、RNAの収率が最大である。すべてのRNAサンプルのOD260/OD280が2.1−2.25の間にある。図４−３はタンパク質汚染なし、DNA汚染なし或いは極微量あることを示した。
【００６８】
実施例５のまとめ
本実施例は200μl白菜若葉ホルムアミドホモジネート液と10〜50μl 5M NaCl溶液で細胞沈殿物を懸濁して、90℃でインキュベートすれば、有効的に真核細胞のタンパク質−RNA複合物を分離し、ネイキッドRNA分子が得られることを実証した。200μl白菜若葉ホルムアミドホモジネート液と50μl 5M NaCl水溶液で90℃インキュベートする場合、RNA収量が一番高く、タンパク質汚染もRNases汚染もない。
【００６９】
実施例６：マウス肝臓よりRNAを抽出する（１）
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む。
（1）氷上でダウンス型ホモジナイザーの中に2mlの4℃保存されたホルムアミド溶液と200mgの新鮮マウス（京白1号、中国医学科学院血液学研究所より購入）肝臓を入れて、20ｓホモジネートする；
（2）室温で、1.5ml遠心管に、工程（1）で取れたマウスン肝臓ホルムアミドホモジネート液200μlと5M NaCl水溶液50μlを入れて、ボルテックスミックスする。その後、遠心管を90℃で10分間インキュベートして、遠心管を室温で2分間放置する；
（3）工程（2）で得られたもの200μlに、沈殿機能をする700μlの3.57M NaCl、1.14M KClを含む水溶液を入れて、ボルテックスミックスして、室温で、16000gで5min遠心する。上清澄液を別の遠心管に移す；
（4）上清澄液の中に500μlのイソプロパノールを入れてミックスして、25℃で、16000gで10min遠心する。上層液、下層液と両層の間にある可視残余不純物固体を除去して、遠心管底にあるRNA沈殿物を得る。
【００７０】
体積パーセント濃度が70％のエタノール水溶液1mlで、白いRNA沈殿物を洗って、室温で、16000gで10s遠心する。洗浄液を除去して、沈殿物を乾燥する。150μlの注射用水（RNases汚染なし）で沈殿物を溶かす。
【００７１】
アガロースシロップ電気泳動
実施例１のアガロースシロップ電気泳動方法と同じである。
【００７２】
アガロースシロップ電気泳動分析結果
取れたRNAサンプルの28s rRNAと18s rRNAバンドエッジがはっきりしていて、両者の輝度比が２：１に近い。
【００７３】
分光光度計測定
実施例３の分光光度計測定方法と同じである。
【００７４】
分光光度計分析結果
抽出したマウス肝臓RNAの収率は5.2μg/mg，得られたRNA溶液の260nmにおける吸光度の280nmにおける吸光度に対する比率は2.22である。
【００７５】
実施例６のまとめ
本発明の方法で、効率的に動物組織RNAを抽出できる。
【００７６】
実施例７：マウス肝臓RNAの抽出（２）
生体試料からRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む
(1)〜(4)は実施例６と同じである。
【００７７】
体積パーセント濃度が70％のエタノール水溶液1mlで、白いRNA沈殿物を洗い、室温で、16000ｇで10ｓ遠心して、洗浄液を除去してから、遠心管を逆さまにして濾紙において、沈殿物を乾燥する。体積パーセント濃度95％のエタノール水溶液を1ml入れてRNA沈殿物を浸す。その遠心管に蓋を閉めてから、室温で30日間浸し、遠心して、95％エタノール水溶液を除去して、遠心管を逆さまに濾紙に置いて、RNA沈殿物を乾燥する。最後は150μlの注射用水（RNases汚染なし）を入れて沈殿物を溶かす。
【００７８】
アガロースシロップ電気泳動
実施例１のアガロースシロップ電気泳動方法と同じである。
【００７９】
アガロースシロップ電気泳動分析結果
取れたRNAサンプルの28s rRNAと18s rRNAのバンドエッジがはっきりしている。そして、両者の輝度比が2：1に近い。この結果は実施例6の分光光度計分析結果に近い。
【００８０】
分光光度計測定
実施例３の分光光度計測定方法と同じである。
【００８１】
分光光度計分析結果
取れたマウス肝臓RNAの収率は5.4μg/mgで、RNA溶液の260nmにおける吸光度の280nmにおける吸光度に対する比率は2.24である。本結果は実施例６の分光光度計分析結果に近い。
【００８２】
実施例７のまとめ
本発明の方法で取れたRNA沈殿物は、室温、体積パーセント濃度が95％のエタノール水溶液で浸されても、分離されていない。
【００８３】
実施例8：マウス肝臓RNAの抽出（3）
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む。
（1）氷上でダウンス型ホモジナイザーの中に2mlの4℃保存されたホルムアミド溶液と0.5mlの5MNaCl水溶液を入れてミックスして、200mgの新鮮マウス（京白1号）肝臓を入れて、1minホモジネートする；
（2）室温で、1.5ml遠心管に、工程（1）で取れたマウスン肝臓ホルムアミドホモジネート液を250μl入れて、遠心管を90℃で10分間インキュベートして、遠心管を室温で2分間放置する；
（3）〜（4）は実施例６と同様である。
【００８４】
体積パーセント濃度が70％のエタノール水溶液1mlで、白いRNA沈殿物を洗い、室温で16000gで10ｓ遠心して、洗浄液を除去して、沈殿物を乾燥する。150μlの注射用水（RNases）汚染なし）を入れて沈殿物を溶かす。
【００８５】
分光光度計測定
実施例３の分光光度計測定方法と同じである。
【００８６】
分光光度計分析結果
取れたマウス肝臓RNAの収率は4.95μg/mgで、RNA溶液の260nmにおける吸光度の280nmにおける吸光度に対する比率は2.15である。本結果は実施例6の分光光度計分析結果に近い。
【００８７】
アガロースシロップ電気泳動
実施例１のアガロースシロップ電気泳動方法と同じである。
【００８８】
アガロースシロップ電気泳動分析結果
取れたRNAサンプルの28s rRNAと18s rRNAのバンドエッジがはっきりしている。そして、両者の輝度比が2：1に近い。この結果は実施例6の分光光度計分析結果に近い。
【００８９】
実施例８のまとめ
ホルムアミドと5M NaCl水溶液を4：1の体積比でマウス肝臓をホモジネートしてRNAを抽出する場合も、高品質で、高収率でRNAサンプルが得られる。
【００９０】
実施例９：マウス小腸RNAの抽出
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む
（1）4℃で保存されたホルムアミドを1ml、100mgの生理食塩水で洗浄したマウス（京白1号）の新鮮小腸を、1.5mlの遠心管に入れて、37℃で電気泳動ホモジナイザーで３回ホモジネートする（20000rpm、20秒ホモジネートする）；
（2）実施例６と同じである；
（3）200μlの工程（2）で得られた物の中に沈殿機能をする700μlの3.57 M NaCl、1.14 M KClを含めた水溶液を入れて、ボルテックスミックスして、室温で、2000ｇで30min遠心して、上清澄液を別の遠心管に移す；
（4）実施例６と同じである。
【００９１】
体積パーセント濃度70％のエタノール水溶液1mlで、白いRNA沈殿物を洗い、室温で、16000gで10ｓ遠心して、洗浄液を除去して、沈殿物を乾燥する。100μlの注射用水（RNases汚染なし）で沈殿物を溶かす。
【００９２】
アガロースシロップ電気泳動
実施例１のアガロースシロップ電気泳動方法と同じである。
【００９３】
アガロースシロップ電気泳動分析結果
取れたRNAサンプルの28s rRNAと18s rRNAのバンドエッジがはっきりしている。そして、両者の輝度比が2：1に近い。
【００９４】
分光光度計測定
実施例３の分光光度計測定方法と同じ。
【００９５】
分光光度計分析結果
取れたマウス小腸RNAの収率は1.21μg/mgで、RNA溶液の260nmにおける吸光度の280nmにおける吸光度に対する比率は2.22である。
【００９６】
実施例９のまとめ
本発明の方法で、高率的にマウス小腸RNAを抽出できる。
【００９７】
実施例１０：5M NaCl水溶液を使う場合の解離時間と油菜若葉RNA収率との関係
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む。
（1）氷上でダウンス型ホモジナイザーの中に5mlの4℃保存のホルムアミドと500mgの新鮮油菜（Brassica campestris L.）若葉を入れて、十分にホモジネートする。
（2）室温で、7つの1.5ml遠心管に200μlの油菜若葉のホルムアミドホモジネート液と50μl 5M NaClの水溶液を入れて、ボルテックスミックスして、遠心管を1、2、5、10、15、20、30分間で、87.5℃でインキュベートしてから、遠心管を室温で2分間置く；
（3）〜（4）実施例６と同じである。
【００９８】
体積パーセント濃度70％のエタノール水溶液1mlで、白いRNA沈殿物を洗い、室温で、16000gで10ｓ遠心して、洗浄液を除去して、沈殿物を乾燥する。100μlの注射用水（RNases汚染なし）で沈殿物を溶かす。
【００９９】
分光光度計測定
実施例３の分光光度計測定方法と同じである。
【０１００】
分光光度計分析結果
図５で示したように、抽出した油菜若葉のRNAの収率はインキュベート時間の増加に従って増大する。しかし、インキュベート時間が10分のときのRNAの収率は最大に近い。
【０１０１】
実施例１０のまとめ
5M NaCl水溶液を解離剤としてRNAを抽出する場合、インキュベート（解離）時間が10分のとき、取れたRNAの収率は最大収率に近い。
【０１０２】
実施例１１：解離機能をする13.5M LiCl水溶液の体積とサンザシ若葉RNA収率との関係。
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む：
（1）氷上でダウンス型ホモジナイザーの中に7mlの4℃保存のホルムアミドと700mgの新鮮サンザシ（Crataegus pinnatifida）若葉を入れて、充分にホモジネートする。
（2）1組9本ずつ、3組の1.5mlの遠心管を用意する；室温で、毎組の9本の遠心管に、それぞれ、200μl のサンザシ若葉のホルムアミドホモジネート液と0、4、7、9、10、11、15、20、25μlの13.5M  LiCl水溶液を入れて、ボルテックスミックスする；この３組の遠心管をそれぞれ55、75、85℃で2分間インキュベートしてから、遠心管を室温で2分間放置する；
（3）〜（4）は実施例６と同じである。
【０１０３】
体積パーセント濃度が70％のエタノール水溶液1mlで、白いRNA沈殿物を洗い、室温で、16000gで10ｓ遠心して、洗浄液を除去して、沈殿物を乾燥する。100μlの注射用水（RNases汚染なし）で沈殿物を溶かす。
【０１０４】
分光光度計測定
実施例３の分光光度計測定方法と同じである。
【０１０５】
分光光度計分析結果
図６で示したように、違ったインキュベート（解離）温度でサンザシ若葉RNAを抽出する場合、10μlの13.5M LiCl水溶液と200μlの若葉ホモジネート液の混合液を解離作用に使うとき、RNAの収率は最大。
【０１０６】
実施例１１のまとめ
1体積の13.5M LiCl水溶液と20体積のサンザシ若葉ホモジネート液の混合液を使って、ある特定の温度でインキュベート（解離）作用を行うとき、収率が最大である。
【０１０７】
実施例１２：13.5M LiCl水溶液を使う場合の、解離時間とサンザシ若葉RNA収率との関係
（1）氷上でダウンス型ホモジナイザーの中に7mlの4℃保存のホルムアミドと700mgの新鮮サンザシ（Crataegus pinnatifida）若葉を入れて、充分にホモジネートする；
（2）３組の1.5mlの遠心管を用意する；室温で、毎組の6本の1.5ml遠心管に、それぞれ、200μlのサンザシ若葉のホルムアミドホモジネート液と10μlの13.5M LiCl（解離剤）を入れて、ボルテックスミックスしてから、この３組の遠心管をそれぞれ55、75、85℃で0、1、2、5、10、20分間インキュベートする。その後、遠心管を室温で2分間放置する；
（3）〜（4）は実施例６と同じである。
【０１０８】
体積パーセント濃度70％のエタノール水溶液1mlで、白いRNA沈殿物を洗い、室温で、16000gで10ｓ遠心して、洗浄液を除去して、沈殿物を乾燥する。100μlの注射用水（RNases汚染なし）で沈殿物を溶かす。
【０１０９】
分光光度計測定
実施例３の分光光度計測定方法と同じである。
【０１１０】
分光光度計分析結果
図７で示したように、インキュベート（解離）温度が違うと、サンザシ若葉RNAの収率はインキュベート時間の延長に従って大きくなる。インキュベート時間が2分のとき、RNAの収率は最大に近い。
【０１１１】
実施例１２のまとめ
異なったインキュベート（解離）温度で13.5M LiCl水溶液でRNAを抽出する場合、インキュベート（解離）時間が2分間のときから、RNAの収率が最大に近い。
【０１１２】
実施例１３：
13.5M LiCl水溶液を使う場合の、解離温度とポプラ若葉RNA収率との関係
（1）氷上でダウンス型ホモジナイザーの中に7mlの 4℃保存のホルムアミドと700mgの新鮮ポプラ（（Populus bonatii Levl)）若葉を入れて、充分にホモジネートする。
（2）室温で、8本の1.5ml遠心管に、200μl のポプラ若葉のホルムアミドホモジネート液と10μl 13.5M LiCl水溶液を入れて、ボルテックスミックスする；遠心管を29、37、45、55、65、75、85、95℃で2分間インキュベートする；
（3）〜（4）は実施例６と同じである。
【０１１３】
体積パーセント濃度70％のエタノール水溶液1mlで、白いRNA沈殿物を洗い、室温で、16000gで10ｓ遠心して、洗浄液を除去して、沈殿物を乾燥する。100μlの注射用水（RNases汚染なし）で沈殿物を溶かす。
【０１１４】
アガロースシロップ電気泳動
実施例１のアガロースシロップ電気泳動方法と同じである。
【０１１５】
アガロースシロップ電気泳動分析結果
29〜85℃でインキュベート（解離）されたRNAの26s rRNAと18s rRNAのバンドエッジははっきりしており、分解されていない。95℃でインキュベート（解離）作用を受けたRNAの26s rRNAと18s rRNAのバンドエッジがはっきりしていない。RNAサンプルが分解されたことが分かった。
【０１１６】
分光光度計測定
実施例３の分光光度計測定方法と同じである。
【０１１７】
分光光度計分析結果
図８で示したように、異なったインキュベート（解離）温度でポプラ若葉RNAを抽出する場合、若葉RNAの収率はインキュベート温度が高くなるにしたがって大きくなる。85℃でインキュベート（解離）するとき、RNAの収率が最大に近い。
【０１１８】
実施例１３のまとめ
異なったインキュベート（解離）温度で13.5M LiCl水溶液でRNAを抽出する場合、インキュベート（解離）が85℃のとき、RNAの収率が最大である。そして、分解されていない。
【０１１９】
実施例１４：油菜若葉ホモジネート液が解離作用後の、冷却時間とRNA収率との関係
（1）氷上でダウンス型ホモジナイザーの中に7mlの 4℃保存のホルムアミドと700mgの新鮮油菜（Brassica campestris L.）若葉を入れて、充分にホモジネートする。
（2）1.5mlの遠心管を1組4本ずつ、2組用意する。毎組4本の1.5ml遠心管に200μl の油菜若葉のホルムアミドホモジネート液と50μl 5M NaCl水溶液を入れて、ボルテックスミックスする；この2組の遠心管を90℃でインキュベートする；その後、遠心管を室温又は氷浴で0、2、5、10分間置く。
（3）〜（4）は実施例６と同じである。
【０１２０】
体積パーセント濃度70％のエタノール水溶液1mlで、白いRNA沈殿物を洗い、室温で、16000gで10ｓ遠心して、洗浄液を除去して、沈殿物を乾燥する。100μlの注射用水（RNases汚染なし）で沈殿物を溶かす。
【０１２１】
分光光度計測定
実施例３の分光光度計測定方法と同じである。
【０１２２】
分光光度計分析結果
図９で示したように、ホモジネート混合液が解離作用をしてから、あまり長時間置くと、RNAの収率が低くなる。解離作用をしてから5分間以内置く場合、RNA収率の低下がわずかだけである。低温（0℃）で解離してから冷却する場合、RNA収率の低下が起こりやすい。
【０１２３】
実施例１４のまとめ
解離作用を行ってから、ホモジネート混合液が5分間以内に置くのに限る。室温（25℃）で置くほうがいい。
【０１２４】
実施例１５：本発明方法により、Trizol試薬法で抽出したマウス肝臓RNAサンプルの中のβ-actin mRNAのRT-PCRの増幅比較
1．実施例６の工程（1）〜（4）のとおり、マウス（京白1号）の肝臓よりRNAを抽出する；1ml体積パーセント濃度が70％のエタノール水溶液で白いRNA沈殿物を洗い、室温で、16000ｇで10s遠心して、洗浄液を捨てて、沈殿物を乾燥する。50μlの注射用水（RNases汚染なし）で20mgほどのマウス肝臓より取れたRNA沈殿物を溶かす。
2.Invitrogen会社のTrizol説明書のとおり、50mgのマウス肝臓RNAを抽出する。取れたRNA沈殿物を50μlのRNasesに汚染されていない水で溶かす。
3. KaTaRa会社の説明書のとおり、AMV逆転写酵素で前記の2つのRNAサンプルの第一鎖cDNAを合成する。
4. 下の表のとおりに、合成したcDNA溶液と各種の溶液を入れる。その中のprimer f とprimer rはβ-actin のcDNAを増幅させるための一対のプライマーである。それぞれ：
β-actin F 5’atcatgtttgagaccttcaaca 3’
β-actin R5’catctcttgctcgaagtcca 3’
増幅したDNA製品の長さは318bpである。
【０１２５】
増幅条件は次のとおりである。94℃2分間初期変性を行う；35サイクルの94℃30秒変性、62℃30秒クエンチ、72℃30秒伸長反応を行う；72℃2分間最終伸長反応を行う。
【表１】
0005824141.tif 000002
【０１２６】
アガロースシロップ電気泳動
前記のRT-PCR増幅製品を1μl取って、1.2％の非変性アガロースシロップ（1xTAE電気泳動緩衝液）の中で電気泳動させる。
【０１２７】
アガロースシロップ電気泳動分析結果
図１０に示したように、本発明方法で約20mgのマウス肝臓より取れたRNAサンプルにβ-actin mRNA増幅をして得られたDNA製品断片を、Trizol試薬方法で50mgのマウス肝臓より取れたRNAサンプルのDNA製品断片と比較した場合、前者の輝度は後者の2倍である。
【０１２８】
実施例１５のまとめ
本発明方法で取れたマウス肝臓RNAは、Trizol試薬法で取れたRNAサンプルと比べて、酵素効果がより良い。
【０１２９】
実施例１６：本発明方法で取れた油菜若葉RNAサンプルのβ-actin mRNAとTrizol試薬法で取れたそれのRT-PCR増幅を比較する
1．実施例１４の工程（1）−（4）のとおり、油菜（Brassica campestris L.）若葉のRNAを抽出する；体積パーセント濃度が70％のエタノール水溶液1mlで、白いRNA沈殿物を洗い、室温で、16000ｇで10ｓ遠心して、洗浄液を捨ててから、沈殿物を乾燥する。50μlの注射用水（RNases汚染なし）で、約20mgの油菜若葉より取れたRNA沈殿物を溶かす；
2.Invitrogen会社の Trizol説明書のとおり、50mgの油菜若葉のRNAを抽出する。取れたRNA沈殿物を50μlのRNasesに汚染されていない水で溶かす。
3. KaTaRa会社の説明書のとおり、AMV逆転写酵素で前記の2つのRNAサンプルの第一鎖cDNAを合成する；
4.下の表のとおりに、合成したcDNA溶液と各種の溶液を入れる。その中のprimer f とprimer rはβ-actinのcDNAを増幅させるための一対のプライマーである。それぞれ：
β-actin F5’ ggaatggtgaaggctggtt 3’
β-actin R5’ tcccgttctgcggtagtg 3’
増幅したDNA製品の長さは578bpである。
【０１３０】
増幅条件は次のようである。94℃2分間初期変性を行う；35サイクルの94℃30秒変性、62℃30秒クエンチ、72℃30秒伸長反応を行う；72℃2分間最終伸長反応を行う。
【０１３１】
【表２】
0005824141.tif 000003
【０１３２】
アガロースシロップ電気泳動
前記のRT-PCR増幅製品を1μl取って、1.2％の非変性アガロースシロップ（1xTAE電気泳動緩衝液）の中で電気泳動させる。
【０１３３】
アガロースシロップ電気泳動分析結果
図１１に示したように、本発明方法で約20mgの油菜若葉より取れたRNAサンプルにβ-actin mRNA増幅をして得られたDNA製品断片を、Trizol試薬方法で50mgの油菜若葉より取れたRNAサンプルのDNA製品断片と比較した場合、前者の輝度は後者の数倍である。
【０１３４】
実施例１６のまとめ
本発明方法で取れた油菜若葉RNAは、Trizol試薬法で取れたRNAサンプルと比べては、酵素効果がより良い。
【０１３５】
本発明では、方法として、一価カチオン塩として優先的にNaCl、LiClを選んだが、塩化ルビジウム、塩化セシウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、ルビジウムアセテート、酢酸セシウム、塩酸グアニジンチオシアン酸グアニジン、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの一価カチオン塩の１種（以上）を利用してRNAを抽出できることは、すでに実験で証明された。
【０１３６】
沈殿剤としては、塩化ルビジウム、塩化セシウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、ルビジウムアセテート、酢酸セシウム、塩酸グアニジンチオシアン酸グアニジン、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの１種（以上）を利用できることも、実験で実証された。
【０１３７】
実施例１７：多種の動植物組織の抽出
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む。
（1）氷上で4つの1.5ml遠心管に4℃保存のホルムアミドを1ml入れて、それぞれ、100mgの新鮮ポプラ成熟葉、マウス（京白1号、中国医学科学院血液学研究所より購入）心臓、マウス肺臓、マウス太もも筋肉を入れて、26500rpmで20s電動ホモジネートをして処理する；
（2）室温で、4つの1.5ml遠心管にみんな50μlの5M NaCl水溶液を入れてから、それぞれ200μlの工程（1）で取れた4つの脱水生体試料を入れて、ボルテックスミックスする；遠心管を90℃で10分間インキュベート（解離）して、室温で2分間置く。
（3）〜（4）は実施例６と同じである；
体積パーセント濃度が70％のエタノール水溶液1mlで、白いRNA沈殿物を洗い、室温で、16000gで10ｓ遠心して、洗浄液を除去して、沈殿物を乾燥する。50μlの注射用水（RNases汚染なし）で沈殿物を溶かす。
【０１３８】
アガロースシロップ電気泳動
実施例１のアガロースシロップ電気泳動方法と同じである。
【０１３９】
アガロースシロップ電気泳動分析結果
取れたRNAサンプルの28s rRNA（或いは26s rRNA）と18s rRNAのバンドエッジがはっきりしている。輝度比は2：1に近い。
【０１４０】
分光光度計測定
実施例３の分光光度計測定方法と同じである。
【０１４１】
分光光度計分析結果
各組織より取れたRNAサンプルの収率と純度分析は表３で示したとおりである。
【０１４２】
【表３】
0005824141.tif 000004
【０１４３】
実施例１７のまとめ
本発明方法で、よりよく多種類の動植物の組織RNAを抽出できる。
【０１４４】
実施例１８：脱水生体試料の中のマウス肝臓質量とホルムアミド体積比及びRNAサンプルの収率との関係
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む：
（1）氷上で7つの1.5ml遠心管の中に4℃保存のホルムアミド1mlを入れてから、それぞれ、10mg、25mg、50mg、100mg、200mg、400mg、800mgの新鮮マウス（京白1号、中国医学科学院血液学研究所より購入）肝臓組織を入れて、26500rpmで20s電動ホモジネートする。800mgマウス肝臓を処理して得られた液体は粘性が高いので、捨てた；
（2）室温で、6本の1.5ml遠心管にそれぞれ50μlの5M NaCl水溶液を入れてから、それぞれ工程（1）で取れた6つの脱水生体試料を200μl入れる。その後、ボルテックスミックスする；遠心管を90℃で10分間インキュベートして、室温で2分置く。
（3）〜（4）は実施例６と同じである；
【０１４５】
体積パーセント濃度が70％のエタノール水溶液1mlで、白いRNA沈殿物を洗い、室温で、16000gで10ｓ遠心して、洗浄液を除去して、沈殿物を乾燥する。150μlの注射用水（RNases汚染なし）で沈殿物を溶かす。
【０１４６】
アガロースシロップ電気泳動
実施例１のアガロースシロップ電気泳動方法と同じである。
【０１４７】
アガロースシロップ電気泳動分析結果：400mgマウス肝臓組織＋1mlホルムアミドをホモジネートして得られたRNAの帯スペクトルが分散しているのを除いて、取れたほかのRNAサンプルの28s rRNAと18s rRNAのバンドエッジがはっきりしていて、両者の輝度比は2：1に近い。
【０１４８】
分光光度計測定
実施例３の分光光度計測定方法と同じである。
【０１４９】
分光光度計分析結果
各組織より取れたRNAサンプルの収率分析は図12で示したとおりである。
【０１５０】
実施例１８のまとめ
本発明では、ホルムアミドを1mlとマウス肝臓組織を≦20mgの比率でホモジネートしてRNAを抽出する際、取れたRNAサンプルは分解されなかった。ホルムアミド1mlとマウス肝臓組織5mgの比率でホモジネートするときのRNA収率が一番高い。
【０１５１】
実施例１９：本発明の中の沈殿剤容量、イソプロパノール体積用量、生じた塩粒子析出及び液相との関係
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む：
（1）氷上で10mlの遠心管1本に4mlの4℃保存のホルムアミドと0.4ｇ新鮮ポプラ若葉を入れて、26500rpmで20s電動ホモジネートを3回行う；
（2）室温で、表4、表５のとおり、1.5ml遠心管を15個取って、全ての中に50μl 5M NaCl水溶液と200μlの工程（1）で取れた脱水生体試料を入れてから、ボルテックスミックスする；遠心管を90℃で10分間インキュベートしてから、室温で2分置く；
（3）表４、表５のとおり、工程（2）で得られた250μlの製品の中に沈殿機能をする3.57M NaCl水、1.14M KClを含んでいる水溶液（沈殿剤）を注入して、ボルテックスミックスする。室温で、16000gで5min遠心する。上清澄液を別の遠心管に移す；
（4）表４、表５のとおり、工程（3）で生じた上清澄液の中にイソプロパノールを入れて、ボルテックスミックスして、室温で放置して、遠心管中の液体は上下両層液に分けるかどうか、そして塩粒子が沈殿するかどうかを観察する。結果は表4表5のようである；25℃で、16000gで10 min遠心して、液体と中に懸濁した可視残余不純物固定を捨てると、遠心管底にある白いRNA沈殿物が得られる。
【０１５２】
体積パーセント濃度が70％のエタノール水溶液1mlで、白いRNA沈殿物を洗い、室温で16000gで10ｓ遠心する。洗浄液を捨ててから、沈殿物を乾燥する。150μlの注射用水（RNases汚染なし）を入れて沈殿物を溶かす。塩粒子析出沈殿がある遠心管に、1mlのエタノール水溶液を入れて激しく振動すると、沈殿析出塩粒子が溶けて除去された。
【０１５３】
アガロースシロップ電気泳動
実施例１のアガロースシロップ電気泳動方法とは同じである。
【０１５４】
アガロースシロップ電気泳動分析結果
RNAサンプルの電気泳動帯スペクトルの26s rRNAと18s rRNAのバンドエッジがはっきりしているかどうかで、RNAが分解されたかどうかを判断する。その結果は表４、表５のとおりである。
【０１５５】
実施例１９まとめ
表４、表５からわかるように、イソプロパノールを入れて生じた両層液体を処理して、分解できないRNA製品が得られる；その原因としては、RNase活性のある酵素を含むすべてのタンパク質は両層の間にあるので、除去されたと考えられる。
【０１５６】
【表４】
0005824141.tif 000005
【表５】
0005824141.tif 000006
【０１５７】
実施例２０
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む：
（1）実施例６の工程（1）と同じである；
（2）室温で、5本の1.5ml遠心管にそれぞれ200μlの工程（1）で取れたマウスン肝臓の脱水生体試料及び50μl、100μl、150μl 、200μl、250μlの3M NaCl水溶液を入れて、ボルテックスミックスする；その後、遠心管を90℃で10分間インキュベートして、室温で2分間置く；
（3）-（4）は実施例６の（3）-（4）と同じである；
体積パーセント濃度が70％のエタノール水溶液1mlで、白いRNA沈殿物を洗い、室温で16000gで10ｓ遠心する。洗浄液を捨ててから、沈殿物を乾燥する。150μlの注射用水（RNases汚染なし）を入れて沈殿物を溶かす。
【０１５８】
アガロースシロップ電気泳動
実施例１のアガロースシロップ電気泳動方法と同じである。
【０１５９】
アガロースシロップ電気泳動分析結果
50μl-200μlの3M NaCl水溶液と200μlの脱水生体試料とを混合して生じたRNAサンプルの28s rRNAと18s rRNAのバンドエッジがはっきりしている。そして、両者の輝度比は2：１に近い。
【０１６０】
実施例２０まとめ
本発明方法は動物組織RNAの抽出にとても良い方法である。
【０１６１】
実施例２１
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む：
（1）氷上でダウンス型ホモジナイザーの中に1ml の4℃保存のホルムアミドと新鮮マウス脾臓（京白1号、中国医学科学院血液学研究所より購入）を入れて、20ｓホモジネートする；
（2）室温で、4つの1.5ml遠心管に160μlの工程（1）で取れたマウスン脾臓脱水生体試料と40μlの質量体積比が10%、20%、30%、40%のドデシル硫酸ナトリウムホルムアミド溶液、50μlの5ＭNaClス溶液を入れて、ボルテックスミックスする；その後、遠心管を90℃で10分間インキュベート（解離）して、室温で2分間置く。
（3）〜（4）は実施例６の工程（3）−（4）と同じである；
【０１６２】
体積パーセント濃度が70％のエタノール水溶液1mlで、白いRNA沈殿物を洗い、室温で、16000gで10ｓ遠心して、洗浄液を除去して、沈殿物を乾燥する。150μlの注射用水（RNases汚染なし）で沈殿物を溶かす。
【０１６３】
アガロースシロップ電気泳動
実施例１のアガロースシロップ電気泳動方法とは同じである。
【０１６４】
アガロースシロップ電気泳動分析結果
取れた４つのRNAサンプルは、その28s rRNAと18s rRNAのバンドエッジがはっきりしていて、両者の輝度比は2：1に近い。
【０１６５】
実施例２１のまとめ
本発明方法は、動物組織RNAの抽出にとても良い方法である。
【０１６６】
本実施例の中の5MNaCl水溶液の代わりに、10M LiCl水溶液或いは13.5M LiCl水溶液を利用しても、高品質のRNAが取れることは、実験で実証された。
【０１６７】
実施例２２
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む：
（1）新鮮マウス脾臓（京白1号、中国医学科学院血液学研究所より購入）を生理食塩水で10mlの遠心管に洗い流す。そして、とれた細胞懸濁液を均一的に5つの1.5ml遠心管に入れて、室温で5000ｇで10min遠心する。その後、液体を吸い出して、再び遠心する。遠心管の中の残余液体を吸い出して、単細胞沈殿物が得られる；室温で、5本の1.5ml遠心管の中に160μlのホルムアミドを入れて懸濁させる；
（2）室温で、前記の5本の1.5ml遠心管の中に40μlの質量濃度比が5%、10%、20%、30%、40%のドデシル硫酸ナトリウムホルムアミド溶液を注入して、懸濁してから、それぞれ50μlの 5M NaCl水溶液を入れてボルテックスミックスする；その後、遠心管を90℃で10分間インキュベートして、室温で2分間置く；
（3）〜（4）は実施例６の工程（3）−（4）と同じである；
【０１６８】
体積パーセント濃度が70％のエタノール水溶液1mlで、白いRNA沈殿物を洗い、室温で、16000gで10ｓ遠心して、洗浄液を除去して、沈殿物を乾燥する。150μlの注射用水（RNases汚染なし）で沈殿物を溶かす。
【０１６９】
アガロースシロップ電気泳動
実施例１のアガロースシロップ電気泳動方法とは同じ。
【０１７０】
アガロースシロップ電気泳動分析結果
取れた5つのRNAサンプルは、その28s rRNAと18s rRNAのバンドエッジがはっきりしていて、両者の輝度比は2：1に近い。
【０１７１】
実施例２２のまとめ
本発明方法は、動物単細胞RNAの抽出にとても良い方法である。
【０１７２】
本実施例の中の工程（1）と（2）でのホルムアミドとドデシル硫酸ナトリウムの溶液を１回の200μlのホルムアミドに替えて、ドデシル硫酸ナトリウムの濃度をそれなりに替えることでも高品質のRNAが取れることが実験で実証された。
【０１７３】
本発明方法と、電動ホモジナイザーで細胞を破壊する方法を利用して、植物組織器官、真菌組織器官、グラム陽性菌培養細胞、真菌培養細胞、植物培養細胞、血液細胞或いは精液細胞から高品質のRNAが得られることは、実験で実証された。
【０１７４】
本発明方法及びその派生方法を利用して取れたRNAも本発明の保護範囲に属すことは実験で実証された。
【０１７５】
実施例２３
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む：
（1）氷上で5つのダウンス型ホモジナイザーの中にそれぞれ2mlの4℃保存のホルムアミド溶液と200mgの新鮮ポプラ若葉を入れて、20s、1min、5min 、10min、20minホモジネートする；
（2）-（4）は実施例６と同じである；
体積パーセント濃度が70％のエタノール水溶液1mlで、白いRNA沈殿物を洗い、室温で、16000gで10ｓ遠心して、洗浄液を除去して、沈殿物を乾燥する。150μlの注射用水（RNases汚染なし）で沈殿物を溶かす。
【０１７６】
分光光度計測定
実施例３の分光光度測定方法と同じである。
【０１７７】
分光光度計分析結果
20s、1min、5min、10min、20minホモジネートして得られたRNAの収率はそれぞれ1.2μg/mg，2.2μg/mg，2.8μg/mg，3.1μg/mg，3.2μg/mgである。
【０１７８】
まとめ：ホモジネートを充分すればするほど、RNAの収率が高くなる。
【０１７９】
実施例２４
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む：
（1）氷上で1つのダウンス型ホモジナイザーの中にそれぞれ2mlの４℃保存のホルムアミド溶液と200mgの新鮮ポプラ若葉を入れて、5minホモジネートする；
（2）氷浴中の1.5ml遠心管の中に、30μlの13.5M LiCl水溶液と200μlの工程（1）で取れた脱水生体試料を入れて、ボルテックスミックスする；その後遠心管を0℃氷浴で12時間インキュベートする；
（3）-（4）は実施例６の（3）−（4）と同じである；
体積パーセント濃度が70％のエタノール水溶液1mlで、白いRNA沈殿物を洗い、室温で、16000gで10ｓ遠心して、洗浄液を除去して、沈殿物を乾燥する。150μlの注射用水（RNases汚染なし）で沈殿物を溶かす。
【０１８０】
アガロースシロップ電気泳動
実施例１のアガロースシロップ電気泳動方法とは同じ。
【０１８１】
アガロースシロップ電気泳動分析結果
取れたRNAサンプルは、その26ss rRNAと18s rRNAのバンドエッジがはっきりしていて、両者の輝度比は2：1に近い。
【０１８２】
まとめ
低温長時間インキュベートすれば、高品質のRNAが得られる。
【図１】
0005824141.tif 000007
【図２−１】
0005824141.tif 000008
【図２−２】
0005824141.tif 000009
【図２−３】
0005824141.tif 000010
【図３−１】
0005824141.tif 000011
【図３−２】
0005824141.tif 000012
【図３−３】
0005824141.tif 000013
【図４−１】
0005824141.tif 000014
【図４−２】
0005824141.tif 000015
【図４−３】
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【図５】
0005824141.tif 000017
【図６】
0005824141.tif 000018
【図７】
0005824141.tif 000019
【図８】
0005824141.tif 000020
【図９】
0005824141.tif 000021
【図１０】
0005824141.tif 000022
【図１１】
0005824141.tif 000023
【図１２】
0005824141.tif 000024