(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩素化エチレンで汚染された土壌及び／又は地下水のバイオオーグメンテーションに用いるデハロコッコイデス属細菌の培養方法において、
発酵槽に培地とデハロコッコイデス属細菌を含むコンソーシアを添加し、クエン酸塩濃縮液を添加してデハロコッコイデス属細菌を培養する方法であって、
該培地は酵母エキスを含んでおらず、
０．１〜１Ｍのクエン酸塩、０．１〜１ｍＭの硫化ナトリウム９水和物および３〜３０ｍＭのリン酸水素二アンモニウムを含み、酵母エキスを含まないクエン酸塩濃縮液を、クエン酸塩の供給量として０．１〜１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液／ｄａｙとなるように連続供給して嫌気条件下で培養することにより、デハロコッコイデス属細菌を１６Ｓ  ｒＤＮＡコピー数として１０の８乗ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ以上に培養することを特徴とするデハロコッコイデス属細菌の培養方法。
【請求項２】
請求項１において、塩化ビニル分解能を有しており、かつランダムクローニング法により、病原菌の属する微生物が検出されていない、デハロコッコイデス属細菌を含むコンソーシアを微生物源とすることを特徴とするデハロコッコイデス属細菌の培養方法。
【請求項３】
請求項１又は２において、塩素化エチレンが、シス−ジクロロエチレン及び／又は塩化ビニルモノマーであることを特徴とするデハロコッコイデス属細菌の培養方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、前記培地は、塩素化エチレン、クエン酸塩、無機塩及びビタミンを含むことを特徴とするデハロコッコイデス属細菌の培養方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、培地中の塩化ビニルモノマーガス残量を定期的に計測し、０．０１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液未満であれば、０．１〜１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液の割合で塩化ビニルモノマーガスを添加することを特徴とするデハロコッコイデス属細菌の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は塩素化エチレンで汚染された土壌及び／又は地下水のバイオオーグメンテーションに用いるデハロコッコイデス属細菌の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオオーグメンテーションでは、培養した（ＶＣで止まるのではなく、ＶＣからエチレンまで浄化する能力を持つ）デハロコッコイデス属細菌を注入して汚染地下水中の初期の菌濃度を高めることが浄化期間短縮のために重要である。予めできるだけ高濃度に培養できれば、注入量も少なくてすみコスト的にも有利になる。
【０００３】
デハロコッコイデスは塩素化エチレンと分子状水素を用いて増殖することが知られている。また、分子状水素の添加方法については、水素ガスをそのまま添加する場合と、クエン酸等の有機物を添加して別の微生物（共生微生物）によって水素を生成させる方法がある。
【０００４】
特許文献１，２の各実施例には、クエン酸、硫化ナトリウム、酵母エキス等を含む培地を用いてデハロコッコイデス属細菌を培養する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−１３１８７９
【特許文献２】特開２００９−２１３４２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１，２では酵母エキスを培地添加しているが、酵母エキスは病原性微生物を増加させる可能性がある。
【０００７】
本発明は、病原性微生物を増殖させることなく、デハロコッコイデス属細菌を１６Ｓ  ｒＤＮＡコピー数として１０の８乗ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ以上に培養することができるデハロコッコイデス属細菌の培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
請求項１のデハロコッコイデス属細菌の培養方法は、塩素化エチレンで汚染された土壌及び／又は地下水のバイオオーグメンテーションに用いるデハロコッコイデス属細菌の培養方法において、発酵槽に培地とデハロコッコイデス属細菌を含むコンソーシアを添加し、クエン酸塩濃縮液を添加してデハロコッコイデス属細菌を培養する方法であって、該培地は酵母エキスを含んでおらず、０．１〜１Ｍのクエン酸塩、０．１〜１ｍＭの硫化ナトリウム９水和物および３〜３０ｍＭのリン酸水素二アンモニウムを含み、酵母エキスを含まないクエン酸塩濃縮液を、クエン酸塩の供給量として０．１〜１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液／ｄａｙとなるように連続供給して嫌気条件下で培養することにより、デハロコッコイデス属細菌を１６Ｓ  ｒＤＮＡコピー数として１０の８乗ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ以上に培養することを特徴とするものである。
【０００９】
請求項２のデハロコッコイデス属細菌の培養方法は、請求項１において、塩化ビニル分解能を有しており、かつランダムクローニング法により、病原菌の属する微生物が検出されていない、デハロコッコイデス属細菌を含むコンソーシアを微生物源とすることを特徴とするものである。
【００１０】
請求項３のデハロコッコイデス属細菌の培養方法は、請求項１又は２において、塩素化エチレンが、シス−ジクロロエチレン及び／又は塩化ビニルモノマーであることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、クエン酸塩濃縮液を連続添加することにより、水素ガスのような危険物を使用せず、かつ病原性菌を増殖させることなく、デハロコッコイデス属細菌を活性化し、短期間でデハロコッコイデス属細菌を１６Ｓ  ｒＤＮＡコピー数として１０の８乗ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ以上に培養することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例に用いた装置のブロック図である。
【図２】実験結果を示すグラフである。
【図３】実験結果を示すグラフである。
【図４】実験結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のデハロコッコイデス属細菌の培養方法は、塩素化エチレンで汚染された土壌及び／又は地下水のバイオオーグメンテーションに用いるデハロコッコイデス属細菌の培養方法であって、０．１〜１Ｍのクエン酸塩、０．１〜１ｍＭの硫化ナトリウム９水和物および３〜３０ｍＭのリン酸水素二アンモニウムを含むクエン酸塩濃縮液を、クエン酸塩の供給量として０．１〜１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液／ｄａｙとなるように連続供給して嫌気条件下で培養することにより、デハロコッコイデス属細菌を１６Ｓ  ｒＤＮＡコピー数として１０の８乗ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ以上に培養することを特徴とするものであり、具体的には、図１に示す装置を用い、次の（１）〜（６）の手順に従ってデハロコッコイデス属細菌を培養するのが好ましい。
【００１４】
図１では、発酵槽１に培養液採取口２、ガス採取・注入口３、撹拌機４及びｐＨ計５が設けられている。この発酵槽１の上部には、発酵槽１内の圧力を調整するためのガスパック６が接続されている。発酵槽１に対し、クエン酸塩濃縮液が容器７からポンプ８を介して供給される。容器７の上部には、圧力調整用のガスパック９が接続されている。ガスパック６，９内にはＮ２ガスが充填されている。培養液採取口２は、１６Ｓ  ｒＤＮＡ測定のためのサンプリング口である。ガス採取・注入口３は、塩素化エチレン、ＶＣ、エチレンなどの測定のためのサンプリングを行ったり、発酵槽のｐＨ調整のためのガス注入を行ったりするためのものである。ｐＨが設定値より低い場合は、ガス採取・注入口からＮ２ガスを注入して液中のＣＯ２ガスをパージし、ｐＨが設定値より高い場合は、Ｎ２−ＣＯ２ガスを注入する。
【００１５】
（１）密閉された発酵槽に培地とデハロコッコイデス属細菌を含むコンソーシアを添加する。培地は塩素化エチレン、クエン酸塩、無機塩（例えば（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）、ビタミンからなる。塩素化エチレンは塩化ビニルモノマー（ＶＣ）ガスを０．１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液の割合で添加する。クエン酸塩は１〜１０ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液の割合で添加する。無機塩とビタミンについては一般の嫌気性菌培養用に用いられる組成でよく、例えばメタン菌培養に用いられるＷｏｌｉｎ培地（Ｗｏｌｉｎら、１９６３、Formation  of  methane  by  bacterial  extracts.  The  journal  of  Biological  Chemistry,  236.  2882-2886）でも良い。
【００１６】
（２）デハロコッコイデス属細菌を含むコンソーシアはＶＣ分解能を有しており、かつランダムクローニング法（少なくとも４８クローン）により、病原性菌の属する微生物が検出されていない培養液を使用する。
【００１７】
（３）培養開始後は、クエン酸塩濃縮液を一定の割合で添加する。具体的には、０．１〜１Ｍのクエン酸塩、０．１〜１ｍＭの硫化ナトリウム９水和物および３〜３０ｍＭのリン酸水素二アンモニウムを含むクエン酸塩濃縮液を、クエン酸塩として０．１〜１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液／ｄａｙとなるように発酵槽へ連続供給する。例えば１０Ｌ培養液に０．１Ｍのクエン酸塩濃縮液を添加する場合、１０ｍＬ／ｄａｙの流量で供給すれば０．１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液／ｄａｙとなる。クエン酸添加量が少ないと、クエン酸からの水素供給が不足して、デハロコッコイデス属細菌を活性化できない。また、クエン酸塩濃縮液を高濃度に添加しすぎると塩阻害が起きると共に、大量に添加すると培地容量が増大するため、１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液／ｄａｙを上限としている。
【００１８】
クエン酸塩濃縮液を入れた容器には窒素ガスを封じたガスパックを接続する。ガスパックに封じる窒素ガスの容量は容器と同じ容量で良い。
【００１９】
（４）２０℃〜３０℃で培養する。撹拌速度は５０〜５００ｒｐｍ程度で良い。発酵槽にはクエン酸塩濃縮液が流入するので、発酵槽にもガスパックを接続する。このガスパックは窒素ガスで洗浄後、ガスを抜いたものを使用する。ガスパックの容量はクエン酸塩濃縮液の容器容量の２倍程度で良い。
【００２０】
（５）培地中のＶＣガス残量を定期的に計測し、０．０１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液未満であれば、０．１〜１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液の割合でバッチ添加する。
【００２１】
（６）培地のｐＨを適宜あるいは常時測定し、７．０以下であれば窒素ガスを、８．０以上であれば窒素＋炭酸ガス（８０：２０）を注入してｐＨを７．０〜８．０に維持する。
【実施例】
【００２２】
＜実施例１＞
次の手順でデハロコッコイデス属細菌を培養した。
【００２３】
（１）１０Ｌの発酵槽に無機培地（（ＮＨ４）２ＨＰＯ４１００ｍｇ／Ｌ，Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ４８０ｍｇ／Ｌ，ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ２００ｍｇ／Ｌ）及びビタミン（ビタミンＢ１２）１．５ｍｇ／Ｌと、クエン酸三ナトリウム二水和物を２．５ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液、塩化ビニルモノマーを０．１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液になるように添加して密閉した。
【００２４】
（２）塩化ビニルモノマー分解能を有しており、かつランダムクローニング法（４８クローン）により、４８クローン全てが非病原性のＴｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属細菌で占められている培養液を１％植菌した。
【００２５】
（３）さらに１Ｌ容のガラス瓶に入れたクエン酸塩濃縮液（０．１Ｍのクエン酸三ナトリウム二水和物、０．４ｍＭの硫化ナトリウム９水和物および３ｍＭのリン酸水素二アンモニウムからなる）を、１０ｍＬ／ｄａｙの流量となるように連続供給した。なお、ガラス瓶には１Ｌの窒素ガスを封じたガスパックを接続した。
【００２６】
（４）培養は３０℃、５０ｒｐｍでおこない、１０Ｌ発酵槽には２Ｌ容の窒素ガスで洗浄したガスパックを接続し、常時密閉条件でおこなった。
【００２７】
（５）培養中は、ヘッドスペースのガスを採取してＧＣ−ＦＩＤでＶＣ及びエチレン濃度を、培養液を１０ｍＬ程度採取して定量ＰＣＲ法によりデハロコッコイデス属細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡ（ＤＨＣ−１６Ｓ  ｒＤＮＡ）のコピー数を測定した。
【００２８】
（６）ＶＣが０．０１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液以下の場合には再度塩化ビニルモノマーを約０．１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液になるように添加した。
【００２９】
（７）ＤＨＣ−１６Ｓ  ｒＤＮＡが１０の８乗ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ以上に到達した時点で、ランダムクローニング法（４８クローン）を実施し、病原性菌の有無を評価した。
【００３０】
（８）ＶＣ、エチレン、及びＤＨＣ−１６Ｓ  ｒＤＮＡの測定結果を図２に示す。ＶＣを２回追加添加した後、培養２６日目でＤＨＣ−１６Ｓ  ｒＤＮＡは１０の８乗ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬに到達した。
【００３１】
（９）培養２６日目の培養液についてランダムクローニングを実施した結果、１クローンはＳｅｄｉｍｎｔｂａｃｔｅｒ属細菌であったが、４７クローンはＴｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属細菌であり、共に非病原性であった。
【００３２】
＜比較例１＞
クエン酸塩濃縮液を使用しなかったこと以外は実施例と同様に培養おこなった。ＶＣ、エチレン、及びＤＨＣ−１６Ｓ  ｒＤＮＡの測定結果を図３に示す。ＶＣを２回追加添加したものの、培養２７日目でＤＨＣ−１６Ｓ  ｒＤＮＡは１０の７乗ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬまでしか増加せず、培養６０日目でようやく１０の８乗ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬに到達した。
【００３３】
＜比較例２＞
クエン酸塩濃縮液を使用しなかったこと及びＶＣを３回添加したこと以外は実施例と同様に培養おこなった。ＶＣ、エチレン、及びＤＨＣ−１６Ｓ  ｒＤＮＡの測定結果を図４に示す。ＶＣを３回追加添加したものの、培養２９日目でＤＨＣ−１６Ｓ  ｒＤＮＡは２×１０の７乗ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬまでしか増加しなかった。
【００３４】
そこで、培養３０日目に酵母エキスを０．１％（ｗ／ｖ）添加した結果、培養４０日目には１０の８乗ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬに到達した。
【００３５】
培養４０日目の培養液についてランダムクローニングを実施した結果、１２クローンはＴｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属細菌であったものの、１５クローンは病原性菌が含まれるＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属細菌であった。なお、残りの２１クローンは非病原性であった。
【００３６】
＜考察＞
実施例１の方法は、比較例１と比較して半分の期間で培養が可能であり、比較例２と比較した場合でも病原性の微生物が検出されないことが確認された。
【符号の説明】
【００３７】
１  発酵槽
６，９  ガスパック
【図１】
0005821231.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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