(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アジュバントおよび１つまたはそれより多い抗原を含む医薬組成物であって、該アジュバントが少なくとも一部は活性化Ｔ細胞である生きた免疫細胞を含み、該組成物の宿主への投与はＴｈ−１応答を生じる、医薬組成物であって、該１つまたはそれより多い抗原は、腫瘍由来シャペロンリッチ細胞溶解物（ＣＲＣＬ）由来の抗原を含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記Ｔ細胞が、前記Ｔｈ−１表現型のメモリーＴ細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｔ細胞が、該Ｔ細胞上のＣＤ３およびＣＤ２８表面分子の架橋によって活性化される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記活性化Ｔ細胞が、ＣＤ４０Ｌを発現する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記Ｔ細胞が、前記宿主に対して同種異系である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
少なくとも２つの抗原が、前記アジュバントと組み合わせられる、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記１つまたはそれより多い抗原が、細胞全体、生物、細胞全体または生物の溶解物、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ、核の物質、ペプチドまたはタンパク質、および抗体から選択される抗原供給源由来の抗原をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記１つまたはそれより多い抗原が、１つまたはそれより多い熱ショックタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記１つまたはそれより多い抗原の供給源が、悪性腫瘍である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
生きた免疫細胞を含むアジュバントを調製する工程であって、該免疫細胞はＴ細胞を含む、工程；および１つまたはそれより多い抗原を該アジュバントと組み合わせる工程を含む、医薬組成物を作製する方法であって、該医薬組成物は、宿主への投与に際し該宿主において免疫応答を刺激する、方法であって、該１つまたはそれより多い抗原は、腫瘍由来シャペロンリッチ細胞溶解物（ＣＲＣＬ）由来の抗原を含む、方法。
【請求項１１】
前記アジュバントと前記１つまたはそれより多い抗原とが前記宿主への投与前に組み合わせられる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
生じた前記免疫応答が、Ｔｈ１応答である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｔ細胞が、前記Ｔｈ−１表現型のメモリーＴ細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｔ細胞が、活性化Ｔ細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｔ細胞が、該Ｔ細胞上のＣＤ３およびＣＤ２８表面分子の架橋によって活性化される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記活性化Ｔ細胞が、ＣＤ４０Ｌを発現する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｔ細胞が、前記宿主に対して同種異系である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも２つの抗原が、前記アジュバントと組み合わせられる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つまたはそれより多い抗原は、細胞全体、生物、細胞全体または生物の溶解物、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ、核の物質、および抗体から選択される抗原供給源からの抗原をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つまたはそれより多い抗原が、熱ショックタンパク質である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つまたはそれより多い抗原が、悪性腫瘍由来である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２２】
宿主において疾患に関連するかまたは疾患を引き起こす抗原を低減するための組合せ物であって、該組合せ物は、アジュバントおよび１つまたはそれより多い抗原を含み、該アジュバントは生きた免疫細胞を含み、該免疫細胞はＴ細胞を含み、該組合せ物は、該宿主への投与に際し該宿主において免疫応答を刺激する、組合せ物であって、該１つまたはそれより多い抗原は、腫瘍由来シャペロンリッチ細胞溶解物（ＣＲＣＬ）由来の抗原を含む、組合せ物。
【請求項２３】
前記Ｔ細胞が、活性化Ｔ細胞である、請求項２２に記載の組合せ物。
【請求項２４】
前記活性化Ｔ細胞が、ＣＤ４０Ｌを発現する、請求項２２に記載の組合せ物。
【請求項２５】
前記Ｔ細胞が、前記宿主に対して同種異系である、請求項２２に記載の組合せ物。
【請求項２６】
前記組合せ物が、少なくとも２つの抗原を含む、請求項２２に記載の組合せ物。
【請求項２７】
前記１つまたはそれより多い抗原が、熱ショックタンパク質である、請求項２２に記載の組合せ物。
【請求項２８】
前記１つまたはそれより多い抗原が、悪性腫瘍由来である、請求項２２に記載の組合せ物。
【請求項２９】
前記組合せ物が、追加免疫組成物と組み合わせて投与されるものであることを特徴とする、請求項２２に記載の組合せ物。
【請求項３０】
前記追加免疫が、少なくとも一部が活性化Ｔ細胞である生きた免疫細胞を含む、請求項２９に記載の組合せ物。
【請求項３１】
前記追加免疫が、少なくとも一部が活性化Ｔ細胞である生きた免疫細胞および１つまたはそれより多い抗原を含む、請求項２９に記載の組合せ物。
【請求項３２】
前記アジュバントと前記１つまたはそれより多い抗原とが前記宿主への投与前に組み合わせられる、請求項２２に記載の組合せ物。
【請求項３３】
前記アジュバントおよび前記１つまたはそれより多い抗原が、前記宿主へ逐次的に投与されることを特徴とする、請求項２２に記載の組合せ物。
【請求項３４】
患者の疾患を処置するための医薬組成物であって、該医薬組成物は、アジュバントおよび１つまたはそれより多い抗原を含み、該アジュバントは生きた免疫細胞を含み、該免疫細胞はＴ細胞を含み、該医薬組成物は、該患者への投与に際し該宿主において免疫応答を刺激する、医薬組成物であって、該１つまたはそれより多い抗原は、腫瘍由来シャペロンリッチ細胞溶解物（ＣＲＣＬ）由来の抗原を含む、医薬組成物。
【請求項３５】
前記Ｔ細胞が、活性化Ｔ細胞である、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記疾患が、がんである、請求項３４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
この出願は、２００８年５月５日に出願された米国仮特許出願番号第６１／０５０，２９４号および２００９年５月２日に出願された同第６１／０４９，９９０号に基づき、これらの利益を主張し、上記米国仮特許出願の内容は、その全容が参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ワクチンの分野、そしてより具体的にはアジュバント添加（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）ワクチン組成物に関連する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
慢性感染性疾患またはがんを処置するために、免疫系の力を利用することが、免疫療法の主な目的である。ワクチン接種（能動免疫療法としても知られる）を、侵入病原体を特異的に認識し侵入病原体から保護するための免疫系を活性化するためにデザインする。２００年以上にわたって、天然痘、狂犬病、腸チフス、コレラ、ペスト、麻疹、水痘、耳下腺炎、ポリオ、Ｂ型肝炎および破傷風およびジフテリア毒素を含む、多くの感染性疾患を予防するために、能動免疫療法アプローチが使われてきた。
【０００４】
能動免疫療法のコンセプトは、現在、既存の腫瘍を処置する意図かまたは腫瘍の再発を予防する意図で、治療的がんワクチンを開発するために適用されており、ならびに、慢性ウイルス感染の処置および予防にも適用されている。しかし、既存の能動免疫療法技術は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、Ｂ型肝炎およびがんのような、多くの現代のワクチン標的からの保護において、成功していない。これは、一つには、現在のワクチン接種技術が、正確な型の免疫応答を誘発することができないためである。
【０００５】
感染または他の抗原性チャレンジに対して生じる免疫応答の型は、一般的に、その応答に関与する、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞のサブセットによって区別し得る。免疫応答を、大雑把に２つの型：Ｔｈ１およびＴｈ２に分け得る。Ｔｈ１免疫活性化は、ウイルスのような細胞内感染に最適化され、そして感染細胞を溶解し得るナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ（ＣＴＬ））の活性化を含み、一方Ｔｈ２免疫応答は、体液性（抗体）応答に最適化される。Ｔｈ１免疫活性化は、がん治療のために最も高度に望ましく、そしてＴｈ２免疫応答は、特異的抗体の分泌により向けられ、そして腫瘍治療での重要性は相対的に低い。先行技術のワクチン組成物は、Ｔｈ２または体液性免疫応答の誘発に専門化され、それはがんおよびほとんどのウイルス性疾患に対して有効でない。
【０００６】
アジュバントの使用は、ワクチン組成物において、抗原に対する免疫応答に影響を与えるための戦略である。アルミニウム塩、およびスクアレン水中油型エマルション（ＭＦ５９）が、ヒトワクチンにおいて最も広く使用されるアジュバントである。これらのアジュバントは主に、抗原に対するＴｈ２体液性（抗体）応答を促進し、そして血清抗体価の上昇に有効であるが、有意なＴｈ１応答またはＣＴＬを誘発しない。しかし、慢性感染（例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、結核、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ））およびがん細胞に対するワクチンは、保護および治療的効果のために、Ｔｈ１細胞性免疫応答を生じる必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
先行技術におけるいくつかの実験的な能動免疫療法技術およびプロトコールは、選んだ患者における腫瘍抗原に対して首尾よくＴｈ１応答を誘発し、腫瘍または病原体感染細胞を特異的に殺す能力を有する、循環中のＣＴＬ免疫細胞の出現率の増加を引き起こすことが証明された。しかし、Ｔｈ１応答を誘発する能力にも関わらず、腫瘍の回避メカニズムはこの免疫応答に勝り得、結果として腫瘍の進行を引き起こし得る。ウイルスも、免疫攻撃を回避するために多くの対策を展開し、免疫系の移動標的のままである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の概要）
１つの局面において、本発明は医薬品組成物を含む。その組成物は、アジュバントおよび１つまたはそれより多い抗原を含み、ここでそのアジュバントは、少なくとも一部は活性化Ｔ細胞である、生きた免疫細胞を含む。組成物の宿主への投与は、Ｔｈ−１応答を生じる。
【０００９】
別の局面において、本発明は、生きた免疫細胞を含むアジュバント組成物を含み、ここで免疫細胞の少なくとも一部は活性化Ｔ細胞である。そのアジュバント組成物の宿主への投与は、Ｔｈ−１免疫応答を誘発する。
【００１０】
さらに別の局面において、本発明は、医薬品組成物を作製する方法を含む。その方法は、Ｔ細胞の少なくとも一部を含む生きた免疫細胞を含むアジュバントを調製すること、および１つまたはそれより多い抗原をアジュバントと組み合わせることを含み、ここでその医薬品組成物は、宿主への投与に際し、宿主において免疫応答を刺激する。
【００１１】
さらなる局面において、本発明は、宿主において疾患に関連するかまたは疾患を引き起こす抗原を低減する方法を含む。その方法は、アジュバントおよび１つまたはそれより多い抗原を含む医薬品組成物を投与することを含む。そのアジュバントは、Ｔ細胞の少なくとも一部を含む生きた免疫細胞を含み、ここでその医薬品組成物は、宿主への投与に際し、宿主において免疫応答を刺激する。
【００１２】
さらに別の局面において、本発明は、患者において疾患を処置する方法を含む。その方法は、アジュバントおよび１つまたはそれより多い抗原を含む医薬品組成物を投与することを含む。そのアジュバントは、Ｔ細胞の少なくとも一部を含む生きた免疫細胞を含み、ここでその医薬品組成物は、患者への投与に際し、宿主において免疫応答を刺激する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
アジュバントおよび１つまたはそれより多い抗原を含む医薬品組成物であって、該アジュバントが少なくとも一部は活性化Ｔ細胞である生きた免疫細胞を含み、該組成物の宿主への投与はＴｈ−１応答を生じる、医薬品組成物。
（項目２）
前記Ｔ細胞が、前記Ｔｈ−１表現型のメモリーＴ細胞である、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記Ｔ細胞が、該Ｔ細胞上のＣＤ３およびＣＤ２８表面分子の架橋によって活性化される、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記活性化Ｔ細胞が、ＣＤ４０Ｌを発現する、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記Ｔ細胞が、前記宿主に対して同種異系である、項目１に記載の組成物。
（項目６）
少なくとも２つの抗原が、前記アジュバントと組み合わせられる、項目１に記載の組成物。
（項目７）
前記１つまたはそれより多い抗原が、細胞全体、生物、細胞全体または生物の溶解物、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ、核の物質、ペプチドまたはタンパク質、抗体、抗原パルスまたはトランスフェクトされた樹状細胞から選択される抗原供給源由来である、項目１に記載の組成物。
（項目８）
前記１つまたはそれより多い抗原が、１つまたはそれより多い腫瘍関連抗原を含む、項目１に記載の組成物。
（項目９）
前記１つまたはそれより多い抗原が、１つまたはそれより多い熱ショックタンパク質を含む、項目１に記載の組成物。
（項目１０）
前記１つまたはそれより多い抗原の供給源が、悪性腫瘍である、項目１に記載の組成物。
（項目１１）
前記１つまたはそれより多い抗原の前記供給源が、病原体由来である、項目１に記載の組成物。
（項目１２）
生きた免疫細胞を含むアジュバント組成物であって、該免疫細胞の少なくとも一部は活性化Ｔ細胞であり、該アジュバント組成物の宿主への投与はＴｈ−１免疫応答を誘発する、アジュバント組成物。
（項目１３）
前記Ｔ細胞が、該Ｔ細胞上のＣＤ３およびＣＤ２８表面分子の架橋によって活性化される、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
前記Ｔ細胞が、ＣＤ４０Ｌを発現する、項目１２に記載の組成物。
（項目１５）
生きた免疫細胞を含むアジュバントを調製する工程であって、該免疫細胞はＴ細胞の少なくとも一部を含む、工程；および１つまたはそれより多い抗原を該アジュバントと組み合わせる工程を含む、医薬品組成物を作製する方法であって、該医薬品組成物は、宿主への投与に際し該宿主において免疫応答を刺激する、方法。
（項目１６）
前記アジュバントと前記１つまたはそれより多い抗原とが前記宿主への投与前に組み合わせられる、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
生じた前記免疫応答が、Ｔｈ１応答である、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記Ｔ細胞が、前記Ｔｈ−１表現型のメモリーＴ細胞である、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
前記Ｔ細胞が、活性化Ｔ細胞である、項目１５に記載の方法。
（項目２０）
前記Ｔ細胞が、該Ｔ細胞上のＣＤ３およびＣＤ２８表面分子の架橋によって活性化される、項目１５に記載の方法。
（項目２１）
前記活性化Ｔ細胞が、ＣＤ４０Ｌを発現する、項目１５に記載の方法。
（項目２２）
前記Ｔ細胞が、前記宿主に対して同種異系である、項目１５に記載の方法。
（項目２３）
少なくとも２つの抗原が、前記アジュバントと組み合わせられる、項目１５に記載の方法。
（項目２４）
前記１つまたはそれより多い抗原が、１つまたはそれより多い抗原供給源から選択される、項目１５に記載の方法。
（項目２５）
前記抗原供給源が、細胞全体、生物、細胞全体または生物の溶解物、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ、核の物質、抗体、抗原パルスまたはトランスフェクトされた樹状細胞から選択される、項目１５に記載の方法。
（項目２６）
前記１つまたはそれより多い抗原が、腫瘍関連抗原である、項目１５に記載の方法。
（項目２７）
前記１つまたはそれより多い抗原が、熱ショックタンパク質である、項目１５に記載の方法。
（項目２８）
前記１つまたはそれより多い抗原が、悪性腫瘍由来である、項目１５に記載の方法。
（項目２９）
前記１つまたはそれより多い抗原が、疾患を引き起こす因子由来である、項目１５に記載の方法。
（項目３０）
アジュバントおよび１つまたはそれより多い抗原を含む医薬品組成物を投与する工程であって、該アジュバントは生きた免疫細胞を含み、該免疫細胞はＴ細胞の少なくとも一部を含む、工程を含む、宿主において疾患に関連するかまたは疾患を引き起こす抗原を低減する方法であって、該医薬品組成物は、該宿主への投与に際し該宿主において免疫応答を刺激する、方法。
（項目３１）
前記Ｔ細胞が、活性化Ｔ細胞である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記活性化Ｔ細胞が、ＣＤ４０Ｌを発現する、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記Ｔ細胞が、前記宿主に対して同種異系である、項目３０に記載の方法。
（項目３４）
前記医薬品組成物が、少なくとも２つの抗原を含む、項目３０に記載の方法。
（項目３５）
前記１つまたはそれより多い抗原が、腫瘍関連抗原である、項目３０に記載の方法。
（項目３６）
前記１つまたはそれより多い抗原が、熱ショックタンパク質である、項目３０に記載の方法。
（項目３７）
前記１つまたはそれより多い抗原が、悪性腫瘍由来である、項目３０に記載の方法。
（項目３８）
前記１つまたはそれより多い抗原が、疾患を引き起こす抗原由来である、項目３０に記載の方法。
（項目３９）
追加免疫組成物を投与する工程をさらに含む、項目３０に記載の方法。
（項目４０）
前記追加免疫が、少なくとも一部が活性化Ｔ細胞である生きた免疫細胞を含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記追加免疫が、少なくとも一部が活性化Ｔ細胞である生きた免疫細胞および１つまたはそれより多い抗原を含む、項目３９に記載の方法。
（項目４２）
前記アジュバントと前記１つまたはそれより多い抗原とが前記宿主への投与前に組み合わせられる、項目３０に記載の方法。
（項目４３）
前記アジュバントおよび前記１つまたはそれより多い抗原が、前記宿主へ連続的に投与される、項目３０に記載の方法。
（項目４４）
アジュバントおよび１つまたはそれより多い抗原を含む医薬品組成物を投与する工程であって、該アジュバントは生きた免疫細胞を含み、該免疫細胞はＴ細胞の少なくとも一部を含む、工程を含む、患者の疾患を処置する方法であって、該医薬品組成物は、該患者への投与に際し該宿主において免疫応答を刺激する、方法。
（項目４５）
前記Ｔ細胞が、活性化Ｔ細胞である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記疾患が、がんである、項目４４に記載の方法。
（項目４７）
前記疾患が、感染性病原体によって引き起こされる、項目４４に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１ａは、規定組成物の投与後の、マウスの生存のグラフである。図１ｂは、規定組成物の投与後の、マウスの生存のグラフである。
【図２】図２ａは、表示組成物の投与後の、マウスの生存のグラフである。図２ｂは、表示組成物の投与後の、マウスの生存のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
本発明は、医薬品ワクチン組成物、および患者において疾患に対する予防的および治療的Ｔｈ１免疫を誘発し得る能動免疫療法の方法を提供し、同時に、疾患病原体および腫瘍の免疫回避メカニズムに打ち勝つ手段も提供する。本発明の医薬品組成物は一般的に：（１）１つまたはそれより多い抗原供給源；および（２）少なくとも一部がＴ細胞である、生きた活性化免疫細胞を含む。
【００１５】
本発明において、患者のための新規ワクチンアジュバントが記載される。そのアジュバントを、１つまたはそれより多いワクチン抗原と混合して、医薬品組成物を形成し得る。いくつかの実施態様において、そのアジュバントを、免疫刺激薬として単独で使用し得る。その新規アジュバントは、生きた免疫細胞を含み、ここで少なくとも一部はＴ細胞である。そのＴ細胞は、好ましくは、Ｔｈ１表現型（ＩＦＮ−γを産生するがＩＬ−４を産生しないＣＤ４＋  Ｔ細胞）のメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２ＬＬｏ）である。メモリーＴｈ１細胞は、処方および患者への導入のときに活性化される。好ましい活性化方法は、Ｔ細胞上のＣＤ３およびＣＤ２８表面分子の架橋による。他の活性化方法も、本発明の範囲内である。活性化メモリーＴ細胞は、好ましくは、活性化されたときにＣＤ４０Ｌを発現し、そして大量の炎症性サイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＴＮＦ−αなど）を産生する。これらの活性化Ｔｈ１メモリー細胞は、好ましくは、患者に対して同種異系である。
【００１６】
医薬品ワクチン組成物は、一般的に、アジュバントと混合した少なくとも１つの抗原を含む。先行技術によると、アジュバントによって、ワクチンに存在する抗原によって誘発される免疫応答を増加させることは公知の行為である。本明細書中で言及されるようなアジュバントは、抗原の内因性の免疫原性を増加させ得る化合物である。「アジュバント」という用語はまた多くの場合、「免疫刺激薬」と同義語として使用される。
【００１７】
がんおよび感染性疾患のような新しいワクチン標的のためのアジュバントは、ワクチン抗原に対し免疫原性を増加させるために必要とされるだけでなく、しばしばワクチン抗原に対する既存の免疫応答のＴｈ２からＴｈ１への偏向のためにも必要とされる。さらに、ワクチンの効能は、多くの場合この偏向した免疫応答の増幅を必要とする。本発明のワクチンアジュバント組成物は、これらの免疫調節性および免疫増強の性質を提供する。
【００１８】
以下のものを含むいくつかのアジュバントは、抗原に対するＴｈ１免疫を促進することが公知である：サポニン、ＢＣＧ、リポソームおよび微粒子、ポリＩ：Ｃ、抗ＣＤ４０ｍＡｂ、同時刺激（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）分子、ＩＣ３１、ＴＬＲ９リガンド、ＫＬＨ、ＣｐＧ、α−ガラクトシルセラミド、ＴＬＲ４アゴニスト、コレラ毒素、サイトカイン、ケモカイン、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、ＬＰＳ、分子アゴニスト（例えばＮＡＩＰ、ＣＩＩＴＡ、ＨＥＴ−Ｅ、ＴＰ−１−ロイシンリッチリピート経路受容体のアゴニスト）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）アゴニスト、アラルミンならびに免疫低減サイトカインおよびＴｒｅｇの遮断薬。これらのアジュバントはそれぞれ、免疫調節もしくは免疫刺激のために、または免疫回避を無効にするために、必要な免疫学的イベントのカスケードの１レベルにおいて作用する能力を有する。しかし、上記アジュバントのうち、これらの全ての効果を有するために必要な性質を有するアジュバントは無い。
【００１９】
本発明は、活性化免疫細胞、好ましくは、炎症性サイトカインを産生し、ＣＤ４０Ｌを発現する、ＣＤ３およびＣＤ２８抗原の架橋によって活性化される同種異系Ｔｈ１メモリー細胞が、強力な免疫調節物質および免疫刺激物質として作用するために必要な免疫カスケードにおける全ての成分を誘発し得るという発見に関連する。それに加えて、これらの活性化免疫細胞は、病理学的生物の能力およびがんの免疫攻撃を回避する能力に打ち勝つために、抑制性調節メカニズムに干渉し得る。これは、これらの細胞を理想的なアジュバントにする。
【００２０】
活性化Ｔ細胞を伴なう１つまたはそれより多いワクチン抗原の医薬品組成物を、予防目的もしくは治療目的、またはその両方のために使用し得る。その組成物を、非経口経路、皮内経路、筋肉内経路、皮下経路、または粘膜経路を含む、ワクチンのために慣習的に使用されるかまたは推奨される全ての経路によって投与し得る。ある実施態様において、その組成物をまた、節内または腫瘍内に投与し得る。
【００２１】
医薬品組成物の抗原成分は、１つまたはそれより多い抗原を含む。１つより多い抗原が医薬品組成物に含まれる場合、その抗原は同じ抗原供給源、または異なる抗原供給源由来であり得る。任意の抗原供給源を、その処方において使用し得、例えば、これらの抗原は、生きた細胞または生物から供給され得、その供給源物質は、細胞全体もしくは生物またはそれら由来の溶解物として使用され、照射不活性化された（または他の不活性化方法で不活性化された）、凍結／解凍溶解物であり得る。いくつかの好ましい実施態様において、腫瘍細胞または腫瘍細胞溶解物が、抗原の細胞供給源物質として役立ち得る。その細胞供給源物質は、自己もしくは同種異系細胞供給源由来、または細胞系統由来であり得る。抗原はまた、抗原をコードする裸のＤＮＡまたはＲＮＡから供給され得る。核の物質を、単独で使用してもよく、またはウイルスベクターへ組み込んでもよい。抗原供給源の別の例は、抗原を模倣する抗イディオタイプ抗体もしくはその部分、または抗原の構造を模倣する他の方法である。抗原パルスされた（ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｕｌｓｅｄ）、またはトランスフェクトされた樹状細胞（ＤＣ）も、その医薬品組成物における抗原供給源であり得る。ＤＣを、ペプチドもしくはタンパク質全体、組換え型タンパク質、または抗原をコードするｍＲＮＡもしくはＤＮＡでパルスし得、またはＤＣを、抗原を含む細胞と融合させ得、またはＤＣを、抗原を含むレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスのようなウイルスベクターでトランスフェクトし得、またはこれらの抗原供給源成分を、ＤＣ無しで単独で使用し得る。
【００２２】
１つまたはそれより多い腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）も、その医薬品組成物において使用し得、ＴＡＡの例としては：ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＭｅｌａｎＡ、ＴＲＰ−１、ＣＤＫ−４のような腫瘍特異的変異遺伝子産物、β−カテニン、ＭＵＭ−１、ｐ５３およびｒａｓ（Ｋ−およびＨ−ｒａｓ）のようながん遺伝子、ＭＡＧＥ、ＧＡＧＥ、およびＮＹ−ＥＳＯ１のようながん精巣抗原、ＭＵＣ１のような過剰発現自己抗原、サイクリンＢ１、Ｈｅｒ２−ｎｅｕ、ＣＥＡ、ＷＴ、ｐ５３、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、ｐ１５、およびＨＰＶ  Ｅ７のようなウイルス抗原、ＥＢＶ由来抗原およびテロメラーゼが挙げられる。
【００２３】
好ましい実施態様において、抗原性成分は、死んだ感染組織または腫瘍から単離された、１つまたはそれより多いシャペロンタンパク質（熱ショックタンパク質としても公知である）を含み得る。熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）は、細菌性、真菌性、および寄生虫性病原体に対する免疫応答の主な標的に含まれる。腫瘍由来熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）−ペプチド複合体（特にｈｓｐ７０およびｇｒｐ９４／ｇｐ９６）は、有効なワクチンとして役立つことが示され、動物およびヒトにおいて抗腫瘍免疫応答を生じる。このアプローチは、多くの細胞プロセスにおける分子シャペロンとしてのその機能を司る、ストレスタンパク質のペプチド結合性質を利用する。
【００２４】
細胞外環境におけるあるシャペロンも、ポリペプチドに付き添うその能力、および宿主の免疫系、特にプロフェッショナル抗原提示細胞と相互作用するその能力のために、先天免疫および適応免疫を調節し得る。腫瘍由来のＨＳＰによるワクチン接種は、抗腫瘍応答を誘発し得、そして免疫抑制メカニズムをダウンレギュレートし得る。ＨＳＰの免疫原性は、それらが結合する抗原性ペプチド由来であり得る。
【００２５】
抗原供給源として使用するためのシャペロンタンパク質の単離の好ましい方法が、米国特許第６，８７５，８４９号においてＫａｔｓａｎｔｉｓによって記載される。さらなる方法が、米国特許第６，７９７，４８０号；同第６，１８７，３１２号；同第６，１６２，４３６号；同第６，１３９，８４１号；同第６，１３６，３１５号；および同第５，８３７，２５１号においてＳｒｉｖａｓｔａｖａによって記載される。ＨＳＰをまた、ペプチド、細胞全体、または細胞溶解物を含む抗原でパルスし得る。
【００２６】
１つの実施態様において、腫瘍由来シャペロンリッチ細胞溶解物（ＣＲＣＬ）を抗原供給源として使用し、そして下記の実施例において記載されたフリー溶液等電点電気泳動（ｆｒｅｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ−ｉｓｏｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ（ＦＳ−ＩＥＦ））技術を用いて、腫瘍溶解物から主なシャペロンタンパク質を濃縮することによって得る。この技術は、従来の技術と比較して、最大５倍から２０倍多い抗原性物質をより短い時間で得るための迅速および効率的な手順である。潜在的に限られた腫瘍供給源からの高い収率に関して、および腫瘍の採取から患者の処置までの迅速な回転時間に関して、臨床的な観点から、複数のシャペロン複合体濃縮のＦＳ−ＩＥＦ法が望ましくあり得る。
【００２７】
腫瘍抗原の供給源としてＣＲＣＬ関連ペプチドを用いることに多くの利点が存在する。最初に、それらは腫瘍特異的ペプチドの同定を必要としない。２番目に、それらは免疫後にポリクローナルＴリンパ球応答を誘発し、免疫学的回避変異体の増殖を防ぐ。３番目に、それらは、一緒により強力かつ永続的な免疫応答を誘発する、ＭＨＣクラスＩ関連ペプチドおよびＭＨＣクラスＩＩの両方またはヘルパーエピトープから成る。マウス１２Ｂ１白血病およびＡ２０Ｂ細胞白血病／リンパ腫を含む多くの動物モデルにおいて、ＣＲＣＬワクチンは、明らかな抗腫瘍効果を示した。
【００２８】
それに加えて、単独で、または担体タンパク質のような担体要素に結合体化して使用される、生きた弱毒化微生物全体、不活性化微生物、組換え型ペプチドおよびタンパク質、糖タンパク質、糖脂質、リポペプチド、合成ペプチド、または破裂した微生物、多糖類のような、微生物全体または微生物の一部を含む、ワクチンにおいて慣例的に使用される抗原も、本発明の医薬品組成物において使用し得る。
【００２９】
一般的に、疾患の処置または予防のために使用し得る任意の抗原または抗原の組み合わせを、その医薬品組成物において使用し得る。感染性病原体由来の抗原も、抗原供給源として役立ち得、そして本明細書中で疾患を引き起こす抗原と呼ばれ得る。抗原が供給され得る疾患の例は：ジフテリア、破傷風、ポリオ、狂犬病、百日咳、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、およびＣ型肝炎、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ヘルペス１および２、黄熱、腸チフス、水疱、痘瘡（天然痘）、麻疹、耳下腺炎、風疹、日本脳炎、髄膜炎、インフルエンザ、肺炎球菌感染、ロタウイルス感染、ＡＩＤＳ（ＨＩＶ１および２）、がん、ＨＴＬＶ１および２、梅毒、ＨＰＶ、結核、ライム病、ＲＳＶ感染、トリパノソーマ症、デング熱、マラリア、炭疽、エボラウイルス、野兎病、エルシニア、西ナイルウイルス、クラミジア、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、またはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａＢ型によって引き起こされる細菌性の病気、マラリア、リーシュマニア症、リステリア症等である。
【００３０】
本発明の医薬品組成物において使用される活性化Ｔｈ１メモリー細胞は、好ましくは正常なドナー血液由来である。本発明において使用するために適当な細胞の処理および産生のために好ましい方法が、Ｈａｒ−Ｎｏｙによって、米国特許第７，４３５，５９２号および同第７，４０２，４３１号、ならびに係属中の米国特許第２００５０１９１２９１号において記載され、それらは本明細書中にその全容が参照によって援用される。
【００３１】
本発明による医薬品組成物は、単一の病原体またはがんに対する免疫を意図した組成物であり得、すなわちそれは単一の病原体またはがん由来の１つまたはそれより多い抗原を含む。あるいは、それはいくつかの異なる病原体またはがんに対する免疫を意図した組成物であり得、本明細書中でワクチンコンビネーションと呼ばれる。
【００３２】
本発明はまた、医薬品組成物を作製する方法を含む。その方法は、Ｔ細胞、好ましくは本明細書中で記載された活性化Ｔ細胞を含むアジュバントを調製することを含む。１つまたはそれより多い抗原を、アジュバントと組み合わせて、医薬品組成物を形成し得る。１つより多い抗原が組成物中に含まれる場合、その抗原は同じ抗原供給源、または異なる抗原供給源由来であり得る。医薬品組成物の投与は、宿主において、免疫応答、好ましくはＴｈ−１応答を刺激し得る。
【００３３】
投与前に活性化Ｔ細胞を医薬品組成物の抗原と組み合わせる場合、すなわちそれが医薬品組成物中に直接的に存在する場合、活性化Ｔ細胞のアジュバント作用を得ることができる。あるいは、アジュバントおよび抗原を、連続的な工程で、別々に投与し得る。例えば、まずアジュバントを、上で記載した技術のうちの任意の１つを用いて宿主へ投与し得る。アジュバントの投与後、宿主に抗原を投与し得る。好ましくは、そのアジュバントおよび抗原を、宿主へ投与する前に、組み合わせて１つの医薬品組成物へ形成する。
【００３４】
本発明の医薬品組成物を、組成物中の抗原に対する適応性Ｔｈ１免疫を生じるようデザインする。本発明の医薬品組成物を、既存の疾患を有する患者へ投与する場合、適応免疫応答が治療効果を有するために十分強力になるまで疾患をコントロールするために、強力な先天免疫応答を刺激することが望ましくあり得る。これを達成するために、アジュバント免疫細胞単独を、ワクチン組成物を投与するのと同時に、または投与後いつでも、静脈内投与し得る。
【００３５】
組成物中のワクチン抗原に対する免疫応答が十分強力でない場合、さらなる追加免疫注射を施し得る。好ましくは、追加免疫注射は少なくとも３〜７日間離して、そしてより好ましくは７〜１４日間離して行い得る。さらなる追加免疫注射を、月単位または年単位で必要に応じて施し得る。
【００３６】
腫瘍および疾患生物の免疫破壊を回避する能力を無能力化し得る炎症性環境を維持するために、単独または抗原と共に処方された活性化Ｔｈ１メモリー細胞のさらなる追加免疫注射を施し得る。同種異系Ｔｈ１メモリー細胞を含む組成物で前もってワクチン接種した患者は、抗同種異系抗原免疫を発生し得る。続く同種異系細胞の注射は、抗同種異系抗原細胞のプールを活性化し得、それは免疫回避メカニズムを無能力化にするために必要な炎症性サイトカインを放出し得る。
【実施例】
【００３７】
（実施例１）
（マウス）
雌性ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）マウスを、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）から得て、そして７週齢で使用した。
【００３８】
（Ｔｈ１細胞（ＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１細胞）の調製）
Ｂａｌｂ／ｃマウスから脾臓細胞を採取し、そして赤血球の溶解のために塩化アンモニウム−カリウム（ＡＣＫ）緩衝液で処理した。脾臓あたり約７千万−１億個の細胞を単離した。次いでＣＤ４＋  Ｔ細胞を、ＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上のＣＤ４免疫磁気粒子を用いて、ポジティブセレクションによって精製し（純度＞９８％）、約８００万−１２００万個のＣＤ４細胞を、５０〜６０％の収率で単離した。Ｔｈ１メモリー細胞を、３：１の、最初のビーズ：ＣＤ４細胞比で、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８コーティング常磁性ビーズ（ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ細胞エキスパンダー（ｅｘｐａｎｄｅｒ）ビーズ、Ｄｙｎａｌ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた増殖によって産生した。精製したＣＤ４細胞を、１０％ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）および３．３ｍＭのＮ−アセチル−システイン（ＮＡＣ、Ｓｉｇｍａ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（完全培地）中で、２０ＩＵ／ｍＬの組換え型マウス（ｒｍ）ＩＬ−２、２０ｎｇ／ｍＬのｒｍＩＬ−７、および１０ｎｇ／ｍＬのｒｍＩＬ−１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）ならびに１０μｇ／ｍＬの抗マウスＩＬ−４  ｍＡｂ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）とインキュベートした。ｒｍＩＬ−２およびｒｍＩＬ−７を含むさらなるサイトカインを含む完全培地を、３日目から６日目まで毎日ＣＤ４培地へ加え、細胞濃度を０．５〜１×１０６細胞／ｍＬの間に維持した。さらなるＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを、３日目から６日目まで毎日加えた。加えたビーズの数を計算して、細胞が増殖する間１：１のビーズ：細胞比を維持した。培養６日後、ＣＤ４細胞は約８０から１００倍に増殖し、そして物理的破壊および磁石上を通過させることによって、ＣＤ４細胞を採取および脱ビーズ化した（ｄｅｂｅａｄ）。実験で使用した、採取した細胞の表現型は、＞９５％  ＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＢｌｏ、ＣＤ６２Ｌｌｏ、ＣＤ４４ｈｉであり、従って「メモリー細胞」と呼ぶ。
【００３９】
（ＣＤ３／ＣＤ２８架橋）
採取後および注射の前に、脱ビーズ化したＴｈ１メモリー細胞を、２：１のビーズ：細胞比で、ＣＤ３／ＣＤ２８  ｍＡｂ結合体化微粒子（Ｔ細胞エキスパンダー、Ｄｙｎａｌ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、５％ＣＯ２中で、３７℃で４〜６時間、ｃＲＰＭＩ中２×１０６細胞／ｍｌの密度で培養した。４時間後、その細胞はＩＦＮ−γを産生し、そして細胞表面上のＣＤ４０ＬおよびＦａｓＬの発現をアップレギュレートした。これらの実験で使用した架橋Ｔｈ１メモリー細胞は、細胞表面上にＦａｓＬおよびＣＤ４０Ｌを発現し、そして２０００ｎｇ／ｍｌ／１０６細胞／６ｈを超えるＩＦＮ−γおよび２０ｐｇ／ｍｌ／１０６細胞／６ｈより少ないＩＬ−４を産生した。
【００４０】
（１２Ｂ１細胞系統）
マウス白血病細胞系統１２Ｂ１を、ヒトｂｃｒ−ａｂｌ（ｂ３ａ２）融合遺伝子によるＢＡＬＢ／ｃ骨髄細胞のレトロウイルス形質転換によって得た。これらの細胞は、ｐ２１０ｂｃｒ−ａｂｌタンパク質を発現する。その細胞を、１０％の熱不活性化胎仔ウシ血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｏｏｄｌａｎｄ、ＣＡ）を添加したＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中で、３７℃および５％ＣＯ２で培養した。細胞を通常通りに試験し、そしてマイコプラズマの混入が無いことを見出した。
【００４１】
（１２Ｂ１腫瘍の産生）
注射のために、１２Ｂ１細胞をまずＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）で３回洗浄し、次いで計測して５×１０４細胞／ｍＬの濃度に調整した。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０．１ｍＬ（５×１０３細胞）を、右鼡径部に皮下注射し、そして腫瘍の発症に関してモニターした。
【００４２】
（１２Ｂ１腫瘍溶解物の調製）
１２Ｂ１細胞培養からの腫瘍細胞ペレットを、液体窒素／３７℃水浴槽における６回の凍結／解凍サイクルに供した。トリパンブルー排除を用いて、細胞の溶解を確認した。ＢＣＡアッセイを用いて、タンパク質濃度を決定した。タンパク質を、マウスの免疫のために滅菌ＰＢＳ中で２５μｇ／１００μｌに希釈した。
【００４３】
（１２Ｂ１シャペロンリッチ細胞溶解物（ＣＲＣＬ）の調製）
１２Ｂ１を有するマウス由来の腫瘍を、ガラス−テフロン（登録商標）ホモジナイザーで、１ｇの腫瘍／５ｍｌの緩衝液の比で、２μｇ／ｍｌのロイペプチン、０．１ｍｇ／ｍｌのＰｅｒｆａｂｌｏｃ、０．５ｍＭのフェニルメチルスルホネートおよび１つの完全プロテアーゼインヒビターカクテル錠（全てＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．から）を含む、１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４）／１０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％の界面活性剤（等量のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４およびＩｇｅｐａｌ  ＣＡ−６００、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）中でホモジナイズした。ホモジネートを１０，０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、そして「溶解物」と呼ばれるサンプルを得た。その「溶解物」（上清）を、続いて１００，０００ｇ、４℃で６０分間遠心分離した。「高速」上清を、連続的に濃度を下げたホモジネーション緩衝液（これは、水で終わる）中に透析した。比色定量ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ試薬、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）を用いて、タンパク質濃度を決定し、そしてフリー溶液等電点電気泳動（ＦＳ−ＩＥＦ）開始材料を、２５ｍｇのアリコートで凍結した。ＦＳ−ＩＥＦを、以下の修飾と共に実施した：発明者らは、両性電解質をＲｏｔｏｌｙｔｅｓ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．）で置換し、そして３．９〜５．６、４．５〜６．１、および５．１〜６．８のｐＨ範囲を使用した（全部で３０ｍｌで、各ｐＨ範囲についてＡおよびＢ試薬それぞれ５ｍｌ）；発明者らは界面活性剤濃度を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４、およびＩｇｅｐａｌ  ＣＡ−６００に関してそれぞれ０．１％まで低減した；発明者らは、５０ｍｇ／６０ｍｌではなく、６０ｍｌの全量の等電点泳動（ｉｓｏｆｏｃｕｓｉｎｇ）混合物あたり、２５ｍｇの開始材料のみを添加した。尿素濃度（６Ｍ）は同じにし、そして等電点泳動条件も同じにしたが（１５Ｗ定電力）、ＩＥＦの長さは５ｈに延長した。画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を行い、そして４つの主な免疫原性シャペロン（ＧＲＰ９４／ｇｐ９６、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０およびカルレティキュリン）を全て含む画分をプールし、そして０．１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４中で２Ｍの尿素に対して透析し、続いて０．１×ＰＢＳ中に透析した。標準物質としてウシ血清アルブミンを用いたＢＣＡアッセイを用いて、タンパク質濃度を決定し、そしてマウスの免疫のために、滅菌ＰＢＳ中でタンパク質を２５μｇ／１００μｌに希釈した。
【００４４】
（肝臓ＣＲＣＬの調製）
上記で記載した手順を用いて、無処置のＢａｌｂ／ｃマウスの肝臓から肝臓ＣＲＣＬを調製した。マウスの免疫のために、滅菌ＰＢＳ中でタンパク質を２５μｇ／１００μｌに希釈した。
【００４５】
（ＴｕＬｙ  ＣＲＣＬ（１２Ｂ１腫瘍溶解物／肝臓ＣＲＣＬ）の調製）
１２Ｂ１腫瘍溶解物および肝臓ＣＲＣＬを、１：１μｇの比で混合し、そしてその混合物を４℃で一晩インキュベートした。マウスの免疫のために、滅菌ＰＢＳ中でタンパク質を５０μｇ／１００μｌに希釈した。
【００４６】
（マウスの予防ワクチン接種）
８０匹のＢａｌｂ／ｃマウス（グループあたり８匹のマウス、１０グループ）を使用した。腫瘍細胞接種の１４および７日前に、マウスの足蹠の皮内（ｉ．ｄ．）にワクチン接種した。そのグループは以下の通りであった：
・コントロール：ＰＢＳ１００μｌ  ｉ．ｄ．
・１２Ｂ１溶解物：マウスあたり２５μｇ／１００μｌ  ｉ．ｄ．
・肝臓ＣＲＣＬ：マウスあたり２５μｇ／１００μｌ  ｉ．ｄ．
・１２Ｂ１  ＣＲＣＬ：マウスあたり２５μｇ／１００μｌ  ｉ．ｄ．
・ＴｕＬｙ  ＣＲＣＬ（１２Ｂ１腫瘍溶解物／肝臓ＣＲＣＬ）：マウスあたり５０μｇ／１００μｌ  ｉ．ｄ．
・活性化Ｔｈ−１細胞：マウスあたり１００μｌのＰＢＳ中１×１０５細胞  ｉ．ｄ．
・活性化Ｔｈ−１細胞＋１２Ｂ１溶解物：マウスあたり１００μｌのＰＢＳ中１×１０５細胞＋２５μｇの溶解物  ｉ．ｄ．
・活性化Ｔｈ−１細胞＋肝臓ＣＲＣＬ：マウスあたり１００μｌのＰＢＳ中１×１０５細胞＋２５μｇの肝臓ＣＲＣＬ  ｉ．ｄ．
・活性化Ｔｈ−１細胞＋１２Ｂ１  ＣＲＣＬ：マウスあたり１００μｌのＰＢＳ中１×１０５細胞＋２５μｇの１２Ｂ１  ＣＲＣＬ  ｉ．ｄ．
・活性化Ｔｈ−１細胞＋ＴｕＬｙ  ＣＲＣＬ−マウスあたり１００μｌのＰＢＳ中１×１０５細胞＋５０μｇのＴｕＬｙ  ＣＲＣＬ  ｉ．ｄ．。
【００４７】
（腫瘍細胞の接種および腫瘍体積のモニタリング）
１０個のグループ全てからのマウスの右鼡径部に、０日目に、５０００個の１２Ｂ１細胞／マウスをｓ．ｃ．接種した。腫瘍体積を、２日ごとに決定した。腫瘍体積が４０００ｍｍ３に達した場合、マウスを安楽死させた。
【００４８】
（結果）
腫瘍は、コントロールグループにおいて１２日目に触知できるようになった。様々な治療の結果を、図１ａおよび図１ｂに示す。
【００４９】
６週後、コントロール、ＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１細胞、１２Ｂ１  ＣＲＣＬ、肝臓ＣＲＣＬ、１２Ｂ１溶解物／肝臓ＣＲＣＬおよびＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１細胞＋１２Ｂ１溶解物／肝臓ＣＲＣＬグループにおいて、全てのマウスが死亡した。ＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１細胞＋１２Ｂ１  ＣＲＣＬの組み合わせのグループ（最も良いグループ）において５０％のマウスが、ＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１細胞＋１２Ｂ１溶解物グループにおいて２５％が、１２Ｂ１溶解物グループにおいて１２．５％、およびＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１細胞＋肝臓ＣＲＣＬグループにおいて１２．５％が、腫瘍を有さなかった。
【００５０】
従って、ＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１細胞および腫瘍由来ＣＲＣＬを関連させることに明らかな利点が存在する。
【００５１】
（実施例２）
この実施例において、腫瘍由来ＣＲＣＬを、腫瘍特異的抗原の供給源として使用し、そしてアジュバントとして活性化ＣＤ４＋Ｔｈ−１細胞と組み合わせて、樹立した白血病を処置する。その方法は、上記（実施例１における）の方法と同様である。動物（グループあたり８匹のマウス）に、表示の処置を与えた。
【００５２】
（予防的設定）
無処置のＢａｌｂ／ｃマウスを、１４および７日前に、ＰＢＳ（コントロール）または１２Ｂ１由来ＣＲＣＬ（１２Ｂ１  ＣＲＣＬ、２５μｇ／マウス）、またはＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１細胞、または１２Ｂ１  ＣＲＣＬプラスＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１細胞で、足蹠（皮内）注射によって処置した。０日目に、マウスに１２Ｂ１白血病細胞（５，０００細胞／マウス、左鼠径部へのｓ．ｃ．注射）を接種した。生存パーセントを、図２Ａに示す。
【００５３】
（治療的設定）
ＣＲＣＬプラスＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１細胞の組み合わせの治療的効能を規定するために、１２Ｂ１腫瘍（０日目における左鼡径部への５０００個の１２Ｂ１細胞／マウスの接種）を樹立した。マウスを３、７、および１４日目に、ＰＢＳ、１２Ｂ１  ＣＲＣＬ、ＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１細胞単独またはＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１細胞プラスＣＲＣＬによって処置した。マウスの生存パーセントを図２Ｂに示す。
【００５４】
その結果は、両方の設定において、ＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１細胞プラスＣＲＣＬの組み合わせが、ＣＲＣＬまたはＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１細胞の単独療法と比較して、マウスの生存を有意に改善することを示した。
【００５５】
本発明は、好ましい実施態様を参照して記載されたが、当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、形態および詳細において変化させ得ることを認識する。
【図１】
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【図２】
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