(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素源を含んでなる適当な培養培地中で改変微生物を培養すること、およびその培養培地からグリコール酸を回収すること、によるグリコール酸、その誘導体または前駆体の発酵生産方法であって、該改変微生物が、グリコール酸を生産するために遺伝的に改変されたグラム陰性菌であって、遺伝子ｍｇｓＡの減衰および遺伝子ｌｄｈＡの減衰をさらに含んでなる、方法。
【請求項２】
初めにグリコール酸を生産するために改変された微生物が、以下の改変：
−遺伝子ａｒｃＡの減衰
−遺伝子ｇｌｃＡ、ｌｌｄＰおよびｙｊｃＧの少なくとも１つの減衰
およびそれらの組合せ
の少なくとも１つをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
初めにグリコール酸を生産するために改変された微生物が、以下の改変：
−グリオキシレートのグリコレート以外の産物への変換の減衰（ａｃｅＢ、ｇｌｃＢ、ｇｃｌ、ｅｄａの減衰）
−実質的にグリコレートを代謝することができない（ｇｌｃＤＥＦＧ、ａｌｄＡの減衰）−グリオキシレート経路フラックスの増大（ｉｃｄ、ａｃｅＫ、ｐｔａ、ａｃｋＡ、ｐｏｘＢ、ｉｃｌＲもしくはｆａｄＲの減衰および／またはａｃｅＡの過剰発現）
−グリオキシレートのグリコレートへの変換の増大（ｙｃｄＷの過剰発現）
−ＮＡＤＰＨのアベイラビリティの増大（ｐｇｉ、ｕｄｈＡ、ｅｄｄの減衰）
の少なくとも１つを含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
初めにグリコール酸を生産するために改変された微生物が、遺伝子ａｒｃＡの減衰をさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
初めにグリコール酸を生産するために改変された微生物が、遺伝子ｇｌｃＡ、ｌｌｄＰおよびｙｊｃＧの少なくとも１つの減衰をさらに含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
３つの遺伝子ｇｌｃＡ、ｌｌｄＰおよびｙｊｃＧが減衰された、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
炭素源が、以下：グルコース、スクロース、単糖もしくはオリゴ糖、デンプンもしくはその誘導体、またはグリセロールの少なくとも１つである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のグリコレートの発酵生産方法であって、以下の工程：
ａ）初めにグリコレートを生産するために改変された改変微生物の発酵、
ｂ）細菌中または培地中におけるグリコレートの濃縮、および
ｃ）発酵培養液および／またはバイオマスからの、場合により最終産物中に一部または全量（０〜１００％）残留するグリコール酸の単離
を含んでなる、方法。
【請求項９】
グリコレートが、少なくともグリコレート二量体へ重合する工程を通して単離される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
グリコレートが、グリコレート二量体、オリゴマーおよび／またはポリマーからの脱重合によって回収される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項で定義される改変微生物。
【請求項１２】
腸内細菌科に属する、請求項１１に記載の微生物。
【請求項１３】
エシェリキア属に属する、請求項１２に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、より高い収率、力価および生産性での生産を可能とする、ΔｌｄｈＡ、ΔｍｇｓＡ、ΔａｒｃＡおよびΔｌｌｄＰ、ΔｇｌｃＡ、ΔｙｊｃＧ、ならびにそれらの組合せなどの新たな遺伝子改変を有する組換え微生物によって、発酵性炭素源をグリコール酸へ生物変換する改良された方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
グリコール酸（ＨＯＣＨ２ＣＯＯＨ）は、カルボン酸のα−ヒドロキシ酸ファミリーの最も単純なメンバーである。グリコール酸は、極めて小さい分子に、アルコールとやや強酸の両官能基を有する二機能性を持つ。これは、典型的な酸およびアルコール化学とともに独特の化学的性質をもたらす。
【０００３】
グリコール酸はヒドロキシ基とカルボン酸基の双方を用い、多価金属と五員環錯体（キレート）を形成する。この金属イオン錯化能は強固な水垢の溶解および腐敗の防止、特に優れたすすぎ性が重要な要素である酸洗浄の用途において有用である。その特性により、これはウォーターウェルリハビリテーション、皮革工業、石油ガス工業、クリーニングおよび繊維工業で、およびパーソナルケア製品の構成要素としての使用を含む広範囲の消費者および産業用途に理想的なものとなる。グリコール酸は有機アルコールおよび酸と反応してエステルを生成する。低分子量アルキルグリコール酸エステルは独特の溶媒特性を有し、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール、エチレンジアミン、フェノール、ｍ−クレゾール、酢酸２−エトキシエチル、および乳酸エチルおよび乳酸メチルの代替品として使用され得る。高分子量アルキルエステルは、パーソナルケア製品の処方に使用することができる。
【０００４】
グリコール酸はまた、ポリグリコール酸を含んでなる熱可塑性樹脂をはじめとする多様なポリマー材料を製造するために使用することができる。ポリグリコール酸を含んでなる樹脂は優れた気体遮断特性を持ち、このようなポリグリコール酸を含んでなる熱可塑性樹脂は、同じ特性を持つ包装材料（例えば、飲料容器など）を作製するためにも使用可能である。ポリエステルポリマーは水性環境中で、制御可能な速度で徐々に加水分解する。この特性によりそれらは可溶性縫合糸などの生物医学用途およびｐＨを下げるために酸の徐放性が必要とされる用途に有用なものとなる。現在、米国では、年間１５，０００トンを超えるグリコール酸が消費されている。
【０００５】
図１に示される、グルコースまたは他の糖などの安価な炭素基質からのグリコール酸の生物生産はそれぞれＷＯ２００７／１４０８１６およびＷＯ２００７／１４１３１６に開示されており、その内容は引用することにより本明細書の一部とされる。これらの用途に記載されている微生物は種々のレベルで
−グリオキシレート経路のフラックス(flux)を増強し、
−グリオキシレートのグリコレートへの変換を増大させ、かつ
−グリコレートおよびその中間体であるグリオキシレートの代謝を低減する
ように遺伝的に改変されている。
【０００６】
これらの改変はグリコレート合成経路の最終反応に、またはグリコレートの近縁中間体に直接的な影響を持つ。それらは総て、炭素フラックスをグリコール酸の生産に向ける、およびその異化作用を防ぐという同じ目的を持つ。
【０００７】
グリコール酸の生物生産には、遺伝子ｙｃｄＷによりコードされるＮＡＤＰＨ依存性オキシドレダクターゼによってグリコレートへ還元される中間体としてのグリオキシレートの生成が必要とされる(Nunez et al, (2001) Biochemistry, 354, 707-715)。グリオキシレートは、ＴＣＡ回路のシャントであるグリオキシレート回路の中間体である（Neidhardt, F. C. (Ed. in Chief), R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter、およびH. E. Umbarger (eds). 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. American Society for Microbiologyに総説されている（三カルボン酸回路およびグリオキシレートバイパス）。ＴＣＡ回路に至る前に、炭素フラックスは解糖を通り、そこでいくつかの反応が起こり、所望の化合物の生産を向上されるために至適化され得る。
【０００８】
解糖は、グルコースをピルベートに変換する１０の中間化合物が関わる一連の１０の反応である。これらの中間体は解糖への流入点となり、これらもまた直接的または間接的に有用であり得る。例えば、中間体ジヒドロキシアセトンホスフェート（ＤＨＡＰ）はタンパク質ＭｇｓＡを介した乳酸源である。それは乳酸デヒドロゲナーゼＬｄｈＡによって乳酸に変換されるピルビン酸分子の場合と同じである。両酵素とも、この場合には望ましくない副産物である乳酸を生産するための炭素フラックスの一部を意味する解糖経路の分子を消費する。遺伝子ｌｄｈＡは、ルーメン細菌株（ＷＯ２００８／０１３４０５１Ａ１）または高収率コハク酸生産のための大腸菌などの、コハク酸生産のプロセスで減衰される。これに対し、乳酸合成を目的とするプロセスではｌｄｈＡは過剰発現される（ＵＳ２００７／１１６８５２Ａ１）。同様のことがｍｇｓＡでも見出され、この遺伝子は１，３−プロパンジオールの生産のための他の遺伝子改変では欠失されるが（ＷＯ２００４／０３３６４６Ａ２）、１，２−プロパンジオール合成のためには過剰発現される（ＷＯ２００８／１１６８５２Ａ１）。双方の活性を減衰することによってグリコール酸の生産は改善されると同時に、乳酸合成が軽減されるはずである。
【０００９】
同様に、解糖フラックスおよびＴＣＡフラックス、グルコース輸送または解糖酵素およびＴＣＡ酵素の触媒活性を高めるどの遺伝子改変もグリコレートの生産を改善する。ＡｒｃＡ活性の減衰はこのような突然変異の１つである。実際、このタンパク質は、上述の酵素をコードする遺伝子の抑制に関わっていることが示されている。
【００１０】
Ａｒｃ系による包括的調節の理解は、大腸菌(E.coli)におけるａｒｃＡ遺伝子の同定および好気性代謝に対するその突然変異の影響を記載しているIuchi and Lin in 1988 (Iuchi and Lin, 1988, PNAS; 85: 1888-1892)による論文をもって始まった。二成分シグナル伝達系ＡｒｃＡＢ（好気呼吸制御）は、エネルギー代謝、輸送、生存、異化作用および細胞の酸化還元状態に関わる１００〜１５０の間のオペロンの発現を転写レベルで調節する(Liu and DeWuIf 2004, J Biol Chem, 279:12588-12597; Lynch and Lin, 1996 Responses to molecular oxygen; in Neidhardt FC, Curtiss III RJ, Ingraham L, Lin ECC, Low KB, Magasanik BW, Zeznikoff S, Riley M, Schaechter M, Umbarger HE (eds) Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, ed 2. Washington, American Society for Microbiology, 1996, vol 1, pp 1526-1538)。ＡｒｃＡＢシグナル伝達対の主要な機能は、大腸菌において好気性経路から嫌気性経路への遷移を調節することである。好気生活レベルと包括的調節によって行使される制御の間の相関に関するさらなる理解が、Shalel- Levanonおよび共同研究者ら(Biotechnol. Bioeng. 2005a; 89:556-564およびBiotechnol. Bioeng. 2005b; 92:147-159)から得られた。これらの研究は、ＡｒｃＡによるＴＣＡ遺伝子の抑制を示した。これらの結果は、様々な条件の酸素アベイラビリティにおける大腸菌でのグルコース異化作用に対するＡｒｃＡの影響に対する競合生理学的研究によって確認された。ΔａｒｃＡ突然変異体において、および微小好気生活下では、呼吸の増加、シトクロムｏ−およびｄ−末端オキシダーゼ上の電子フラックス分布の変化、ならびに細胞内酸化還元状態の改変などのいくつかの変化が観察されている(Aleexeva et al., 2003, J. Bacteriol. 185:204-209)。２００５年のPerrenoudおよびSauerの研究からＡｒｃＡＢ調節に対する新たな洞察が得られ、好気性および完全嫌気性ＴＣＡ回路フラックスの制御がその同族センサーキナーゼであるＡｒｃＢとは独立にＡｒｃＡによって発揮されたことが実証している(J. Bacteriol. 2005, 187:3171-3179)。
【００１１】
それらは総て、大腸菌においてＡｒｃＡを包括的レギュレーターとする。その欠失は、所望の分子の好気生活または嫌気生活生産を特許請求しているいくつかの特許に記載されている。例えば、ΔａｒｃＡは、嫌気生活と同様に好気生活においてコハク酸および１，２−プロパンジオールの生産を改善する（ＵＳ２００６／００７３５７７Ａ１；ＷＯ２００６／０２０６６３およびＷＯ２００８／１１６８４８）。他の遺伝子改変でのＡｒｃＡ活性の低下も、味の素（ＥＰ１３８２６８６Ａ１）によるＬ−リシンおよびＬ−グルタミン酸などのＬ−アミノ酸の生産に関する特許、およびDuPont de Nemoursおよび共同研究者らによる１，３−プロパンジオール（ＷＯ２００４／０３３６４６）の生産に関する特許で開示されている。
【００１２】
ＧｌｃＡ、ＬｌｄＰおよびＹｊｃＧと呼ばれる３つのタンパク質がグリコレートおよびラクテートの輸送体として文献で特徴付けられている(Nunez, F. et al., 2001 Microbiology, 147, 1069-1077; Nunez, F. et al., 2002 Biochem. And Biophysical research communications 290, 824-829; Gimenez, R. et al., 2003 J. of Bacteriol. 185, 21, 6448-6455)。上述の刊行物によれば、ＧｌｃＡはグリコレートに特異性が高いと思われ、Ｌｌｄｐは乳酸分子に親和性が高い。これらの３つのグリコレートパーミアーゼが欠失されている系統は外来グリコレートを全く輸送することができない(Gimenez, R. et al., 2003 J. of Bacteriol. 185, 21, 6448-6455)。このグリコレート生産株のグリコレート輸送の減衰は、細胞の、高濃度のグリコレートに耐える、従って生産力価を改善する能力を改善する。
【００１３】
本発明により解決すべき問題は、グルコースまたは他の糖類などの安価な炭素基質からの、グリコール酸の生物生産の改良である。本明細書では、発酵によるグリコール酸生産のはるかに良い収率および力価を得るためのさらなる遺伝子改変および特にそれらの組合せが記載される。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、発酵性炭素源を高い収率および力価で直接グリコール酸に生物変換するための改良された方法を提供する。
【００１５】
本発明の一態様では、グリコール酸を生産するために事前に改変された組換え微生物は、
−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）および／またはメチルグリオキサールシンターゼをコードする遺伝子（ｍｇｓＡ）の減衰、
−好気呼吸制御レギュレーター（ａｒｃＡ）の減衰、
−グリコレート輸送体タンパク質をコードする遺伝子ｇｌｃＡ、ｌｌｄＰおよびｙｊｃＧの少なくとも１つの減衰
などのいくつかの改変をさらに含んでなる。
【００１６】
本発明によれば、本方法に用いられる微生物は、グリコール酸を生産するために事前に遺伝的に操作されていた。該微生物には、いくつかの改変、特に以下の代謝変化：
ｉ）該微生物は、リンゴ酸シンターゼ（ａｃｅＢおよびｇｌｃＢ）、グリオキシレートカルボリガーゼ（ｇｃｌ）および２−ケト−３−デオキシグルコン酸６リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）をコードする遺伝子を不活性化することによって、グリオキシレートをグリコレート以外の化合物へ代謝することができない、
ｉｉ）該微生物は遺伝子ｇｌｃＤＥＦＧおよびａｌｄＡを減衰することによって、グリコレートを代謝することができない、
ｉｉｉ）グリオキシレート経路フラックスがｉｃｄ、ａｃｅｋ、ｐｔａ、ａｃｋＡ、ｐｏｘＢ、ｉｃｌＲまたはｆａｄＲの減衰および／またはａｃｅＡの過剰発現によって増大される、
ｉｖ）ｙｃｄＷのような内在コード遺伝子を用いることによってグリオキシレートのグリコレートへの変換が増強される、
ｖ）遺伝子ｐｇｉ、ｕｄｈＡおよびｅｄｄの減衰によってＮＡＤＰＨのアベイラビリティが増大される、
のいずれかを可能とする改変が事前に導入されていた。
【００１７】
別の実施形態では、本発明はまた、組換え微生物からのグリコール酸の生産方法であって、
（ａ）本発明の組換え微生物を、単糖類、オリゴ糖類、多糖および単一炭素基質からなる群から選択される少なくとも１つの炭素源と接触させ、それにより、グリコレートを生産すること；場合により
（ｂ）生産されたグリコール酸を少なくともグリコール酸二量体への重合工程を介して回収すること、および
（ｃ）グリコール酸二量体、オリゴマーおよび／またはポリマーから脱重合によってグリコール酸を回収すること
を含んでなる方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【００１８】
本明細書において特に断りのない限り、本明細書で用いられる総ての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野の熟練者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。
【００１９】
本発明において「微生物」および「細菌」は互換的に用いられ、グラム陰性菌を意味する。本発明の好ましい実施形態では、微生物は腸内細菌科(Enterobacteriaceae)に属する。腸内細菌科は、他を排除するものではないが、特に、エシェリキア属(Escherichia)、クレブシェラ属(Klebsiella)、サルモネラ菌属(Salmonella)およびパンテア属を含んでなる。
【００２０】
「変異株」とは、非野生型株を意味する。
【００２１】
本明細書において「組換え体」または「遺伝的に改変された」または「改変微生物」とは、例えば、その生物中に天然には存在しない核酸の付加または宿主細胞中に天然に存在する核酸の改変により、そのゲノムの改変を有する宿主細胞を表す。「形質転換」または「トランスフェクション」とは、外来核酸の組み込み後の、細胞における新たな遺伝子の獲得を意味する。「形質転換体」とは、形質転換の産物を意味する。
【００２２】
宿主細胞により生産されるタンパク質または酵素活性のレベルの「改変」または「改変する」とは、所望によりそれらのレベルが増大または低減されるように、培養中に生産されるタンパク質または酵素活性のレベルを制御することを意味する。核酸またはポリヌクレオチドに対していう場合の「改変された」とは、その核酸が、突然変異；置換、挿入、その核酸の一部または総ての欠失により；または転写制御領域と機能的に連結されることによるなどして、野生型核酸と比較して何らかの変更が行われていることを意味する。突然変異の例としては、限定されるものではないが、点突然変異、フレームシフト突然変異および記載の遺伝子の一部または総ての欠失が挙げられる。
【００２３】
「遺伝子」とは、コード領域、コード領域の前の非コード領域（「リーダー」）およびコード領域の後の非コード領域（「テーラー」）、ならびに介在する個々のコードセグメント（「イントロン」）の間に介在する非コード配列（「エキソン」）を含む、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と機能的に連結された調節ＲＮＡの、トランスファーＲＮＡの、リボソームＲＮＡのプロモーター領域のコードに関与するＤＮＡのセグメントを意味する。コードとは、３塩基「トリプレット」コードでのアミノ酸、開始および停止シグナルの提示を意味する。
【００２４】
「機能的に連結される」とは、エレメントが、それらを機能的に関連付け得る配置にある並列を意味する。プロモーターがあるコード配列の転写を制御するならば、そのプロモーターはその配列と機能的に連結されており、また、リボソーム結合部位があるコード配列のｍＲＮＡの翻訳を可能とするように配置されていれば、そのリボソーム結合部位はその配列に機能的に連結されている。
【００２５】
「不活性化」または「減衰(attenuation)」とは、遺伝子の発現の減少またはその遺伝子の産物であるタンパク質の活性の低下を意味する。当業者ならば、この結果を得るための多くの手段を知っており、例えば、
−この遺伝子への、この遺伝子の発現レベルまたはコードされているタンパク質の活性レベルを低下させる突然変異の導入、
−遺伝子の天然プロモーターの、低い発現をもたらす低強度プロモーターでの置換、
−対応するメッセンジャーＲＮＡまたはタンパク質を脱安定化させるエレメントの使用、
−発現が必要とされない場合には、遺伝子の欠失
が挙げられる。
【００２６】
「発現」とは、遺伝子から、その遺伝子の産物であるタンパク質への転写および翻訳を意味する。
【００２７】
「過剰発現」または「過剰発現された」とは、本明細書では、適当な対照種に比べての少なくとも１５０％のタンパク質活性であると定義される。過剰発現は、より活性の高い形態または阻害に対して耐性のある形態が得られるようにタンパク質を突然変異させること、インヒビターを除去すること、またはアクチベーターを付加することなどによって達成することができる。過剰発現はまた、レプレッサーを除去すること、細胞にその遺伝子の多重コピーを付加すること、または、内在遺伝子をアップレギュレートすることなどによっても達成することができる。
【００２８】
本明細書において「プラスミド」または「ベクター」とは、多くの場合、細胞の中枢代謝の一部ではない、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態の遺伝子を有する染色体外エレメントを意味する。
【００２９】
「炭素基質」、「炭素源」または「発酵性炭素源」とは、微生物によって代謝され得る任意の炭素源を意味し、その基質は少なくとも１つの炭素原子を含む。
【００３０】
「ＡＴＣＣ」とは、American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852, U.S.A.を意味する。
【００３１】
「グリオキシレート」と「グリオキシル酸」は互換的に用いられる。
【００３２】
「グリコレート(glycolate)」と「グリコール酸(glycolic acid)」は互換的に用いられる。「グリコール酸、その誘導体または前駆体」とは、グリコール酸の形成および分解の代謝経路における総ての中間化合物を表す。グリコール酸の前駆体は特に、シトレート、イソシトレート、グリオキシレート、および一般にグリオキシレート回路の総ての化合物である（図１参照）。グリコール酸の誘導体は特に、グリコール酸エステル（グリコール酸エチルエステル、グリコール酸メチルエステルなど）、およびポリグリコール酸などのグリコレートを含むポリマーである。
【００３３】
本発明の記載において、酵素はそれらの比活性によって同定される。よって、この定義には、他の生物、より詳しくは他の微生物にも存在する定義された比活性を有する総てのポリペプチドが含まれる。多くの場合、同様の活性を有する酵素は、ＰＦＡＭまたはＣＯＧとして定義される特定のファミリーに分類されることで特定することができる。
【００３４】
ＰＦＡＭ(protein families database of alignments and hidden Markov models; http://www.sanger.ac.uk/Softwarc/Pfara/)は、タンパク質配列アラインメントの大きなコレクションである。各ＰＦＡＭによって複数のアライメントの表示、タンパク質ドメインの閲覧、生物間での分布の評価、他のデータベースへのアクセス、および既知のタンパク質構造の表示が可能となる。
【００３５】
ＣＯＧ(clusters of orthologous groups of proteins; http://www.ncbi.nlm.nih. gov/COG/)は、３０の主要な系統学的系列に相当する、完全配列決定された４３のゲノムのタンパク質配列を比較することによって得られる。各ＣＯＧは、少なくとも３つの系統から定義され、前に保存されているドメインの同定を可能にする。
【００３６】
相同配列およびそれらの相同性パーセントを同定する手段は当業者に周知であり、特に、ＢＬＡＳＴプログラムが含まれ、このプログラムは、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BTAST/からそのウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターを用いて利用することができる。得られた配列は、次に、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)またはＭＵＬＴＡＬＩＮ(http://prodes.toulousc.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)をそれらのウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに用いて活用（例えば、アライン）することができる。
【００３７】
当業者ならば、既知の遺伝子に対してＧｅｎＢａｎｋで得られる参照を用い、他の生物、細菌株、酵母、真菌、哺乳類、植物などにおいて等価な遺伝子を決定することができる。この慣例の作業は、他の微生物由来の遺伝子との配列アライメントを実行し、他の生物中の対応遺伝子をクローニングするための縮重プローブを設計することによって決定することができるコンセンサス配列を用い有利に行われる。分子生物学のこれら慣例の方法は当業者に周知であり、例えば、Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York)に記載されている。
【００３８】
大腸菌を参照して本願で確認される遺伝子は、総てのグラム陰性菌に見出すことができる。
【００３９】
本発明は、グリコール酸を生産するために予め改変され、かつ、以下の改変：
−遺伝子ｌｄｈＡおよびｍｇｓＡの減衰
−遺伝子ａｒｃＡの減衰
−グリコレートの膜輸送を減衰するための遺伝子ｇｌｃＡ、ｌｌｄＰおよびｙｊｃＧの少なくとも１つの減衰
およびそれらの組合せ
の少なくとも１つを含むようにさらに遺伝的に操作された単一の組換えグラム陰性菌を用いて、発酵性炭素源を直接グリコール酸に生物変換する改良された方法を提供する。
【００４０】
これらの改変のあらゆる組合せが可能であり、特に、
−遺伝子ｌｄｈＡおよびｍｇｓＡの減衰と遺伝子ａｒｃＡの減衰；
−遺伝子ｌｄｈＡおよびｍｇｓＡの減衰とグリコレートの膜輸の減衰；
−遺伝子ａｒｃＡの減衰とグリコレートの膜輸送の減衰；
−遺伝子ｌｄｈＡおよびｍｇｓＡの減衰と遺伝子ａｒｃＡの減衰とグリコレートの膜輸送の減衰
が挙げられる。
【００４１】
遺伝子は次のように省略される：乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）、メチルグリオキサールレダクターゼ（ｍｇｓＡ）、好気呼吸制御レギュレーターＡ（ａｒｃＡ）、Ｌ−乳酸パーミアーゼ（ｌｌｄＰ）、グリコール酸パーミアーゼ（ｇｌｃＡ）および酢酸輸送体（ｙｊｃＧ）。
【００４２】
これらの付加的改変の主な利点は、操作された微生物によるグリコール酸生産の改良である。実際、これらの改変は総て、２％〜３６％（０．３８ｇ／ｇに対して０．３９ｇ／ｇ〜０．５２ｇ／ｇ）の間の生産収率の改良ならびに／または９％〜２８％（４．０ｇ／Ｌに対して４．３６ｇ／Ｌ〜５．１４ｇ／Ｌ）の間のグリコレート力価の改良をもたらす。
【００４３】
発酵によりグリコール酸を生産するためにすでに改変された微生物は、特許出願ＷＯ２００７／１４０８１６およびＷＯ２００７／１４１３１６に記載されている。
【００４４】
本発明の一実施形態では、グリコール酸を生産するために予め改変された微生物は以下の遺伝子改変のうち少なくとも１つを含んでなる。
−グリコレートの重要な前駆体であるグリオキシレートを消費する酵素をコードする遺伝子、すなわち、マレート酸シンターゼをコードするａｃｅＢおよびｇｃｌＢ遺伝子、グリオキシレートカルボリガーゼをコードするｇｃｌ、および２−ケト−３−デオキシグルコン酸６リン酸アルドラーゼをコードするｅｄａの減衰による、グリコレートを生産する以外のグリオキシレート変換能力の低減。
−微生物が実質的にグリコレートを代謝することができないような改変。この結果は、グリコレートを消費する酵素をコードする遺伝子（グリコール酸オキシダーゼをコードするｇｌｃＤＥＦＧおよびグリコアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするａｌｄＡ）の少なくとも１つの減衰によって達成することができる。遺伝子の減衰は、天然プロモーターを低強度プロモーターに置換することによるか、または対応するメッセンジャーＲＮＡもしくはタンパク質を脱安定化するエレメントによって行うことができる。必要であれば、対応するＤＮＡ配列の欠失によって、遺伝子の完全な減衰も行うことができる。
【００４５】
−種々の手段、特に、
ｉ）酵素イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ）の活性を低減すること、
ｉｉ）遺伝子の減衰による以下の酵素：
・ｐｔａ遺伝子によりコードされているホスホトランスアセチラーゼ
・ａｃｋＡ遺伝子によりコードされている酢酸キナーゼ
・ｐｏｘＢ遺伝子によりコードされているピルビン酸オキシダーゼ
の少なくとも１つの活性を低減すること、
ｉｉｉ）ａｃｅＡ遺伝子によりコードされている酵素イソクエン酸リアーゼの活性を増強すること、
ｉｖ）酵素イソクエン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスファターゼＡｃｅＫの活性を低減することによる
グリオキシル酸経路のフラックスの増強。
【００４６】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼレベルの低減は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼをコードするｉｃｄ遺伝子の発現を駆動する人工プロモーターを導入することによるか、またはｉｃｄ遺伝子にこのタンパク質の酵素活性を低減する突然変異を導入することによって行うことができる。
【００４７】
タンパク質ＩＣＤＨの活性はリン酸化によって低減されることから、それはまた、野生型ＡｃｅＫ酵素に比べて高いキナーゼ活性または低いホスファターゼ活性を有する突然変異ａｃｅＫ遺伝子を導入することによって制御することもできる。
【００４８】
イソクエン酸リアーゼ活性の増強は、ａｃｅＡ遺伝子の発現を刺激する（例えば、その遺伝子の発現を駆動する人工プロモーターを導入することによる）か、またはａｃｅＡ遺伝子へコードされているタンパク質の活性を増強する突然変異を導入するかのいずれかにより、グリオキル酸経路のレプレッサーをコードするｉｃｌＲまたはｆａｄＲ遺伝子を減衰することによって行うことができる。
−反応を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を発現させることによる、グリオキシレートのグリコレートへの変換を触媒する活性の増強。特に、ＮＡＤＰＨ依存性グリオキシル酸レダクターゼ酵素をコードする遺伝子は、好気条件下で、有毒なグリオキシル酸中間体を毒性の低い最終産物であるグリコレートに変換するために存在する。該遺伝子は、外来のものでも内在するものでもよく、染色体上でも、あるいは染色体外でも発現することができる。ＮＡＤＰＨ依存性グリオキシル酸レダクターゼをコードする遺伝子は、大腸ＭＧ１６５５のゲノムからｙｃｄＷまたはｙｉａＥ遺伝子で取り出すことができる。好ましい実施形態では、該遺伝子の少なくとも１つの発現が増強される。必要であれば、高レベルのＮＡＤＰＨ依存性グリオキシル酸レダクターゼ活性は、当業者に知られている組換えの方法によって導入され得るゲノム上の１コピーまたは数コピーを用いることによって、染色体に位置する遺伝子から取得することができる。染色体外遺伝子については、それらの複製起点および従って細胞内でのそれらのコピー数が異なる種々のタイプのプラスミドが使用可能である。それらは、厳格な複製の低コピー数プラスミド（ｐＳＣ１０１、ＲＫ２）、低コピー数プラスミド（ｐＡＣＹＣ、ｐＲＳＦ１０１０）または高コピー数プラスミド（ｐＳＫ  ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ）に対応する、１〜５コピー、およそ２０コピー、最高５００コピーとして存在し得る。ｙｃｄＷまたはｙｉａＥ遺伝子は、インデューサー分子によって誘発される必要があるまたはその必要がない強度の異なるプロモーターを用いて発現させることができる。例えば、プロモーターＰｔｒｃ、Ｐｔａｃ、Ｐｌａｃ、ラムダプロモーターｃＩまたは当業者に知られている他のプロモーターが挙げられる。遺伝子の発現は、対応するメッセンジャーＲＮＡ(Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64)またはタンパク質（例えば、ＧＳＴタグ、Amersham Biosciences）を安定化するエレメントによってもまた増強され得る。
−ＮＡＤＰＨ依存性グリオキシル酸レダクターゼに対するＮＡＤＰＨアベイラビリティの増強。この微生物の特徴の改変は、以下：グルコース−６−リン酸イソメラーゼをコードするｐｇｉ、可溶性トランスヒドロゲナーゼをコードするｕｄｈＡおよび６−ホスホグルコン酸デヒドレート活性をコードするｅｄｄの中から選択される少なくとも１つの遺伝子の減衰によって得ることができる。このような遺伝子改変がある場合には、グルコース−６−リン酸は総てペントースリン酸経路を介して解糖に入らなければならず、グルコース−６−リン酸が代謝されるたびに２つのＮＡＤＰＨが生産される。
【００４９】
本発明の別の実施形態では、グリコール酸を生産するために予め改変された微生物は特に遺伝子ａｃｅＫの減衰を含む。グリオキシル酸迂回酵素ＩＣＬは、それらの共通基質をめぐってクレブス回路酵素イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ）と直接競合し、ＩＣＤＨはイソシトレートに対してずっと高い親和性を有するが、ＩＣＬを介する炭素フラックスは、イソシトレートの高い細胞内レベルと大部分のＩＣＤＨの可逆的リン酸化／不活性化によって保証される。可逆的不活性化は、同じポリペプチド上に両触媒活性を備えた、ＡｃｅＫと呼ばれるＩＣＤＨキナーゼ／ホスファターゼによる可逆的リン酸化によるものである(Laporte DC 1989, Biochimie Sep-Oct; 71(9-10):1051-7; Ikeda TP, 1992, J Bacteriol Feb;174(4):1414-6; Cozzone AJ, El-Mansi M. 2005, J Mol Microbiol Biotechnol. 9(3-4): 132-46)。
【００５０】
本発明のプロセスにとって、ａｃｅＫを含むあらゆる既知の調節を細胞から除去することによってＩＣＤＨの活性を完全に制御することが有利である。ａｃｅＫの欠失はＩＣＤＨ活性の増強をもたらし得る。しかしながらはやり、そのプロモーターの遺伝子改変によってｉｃｄ遺伝子の発現を人為的に低くすることで、定義された低レベルＩＣＤＨを有する生産株の構築が可能となり、それにより、グリオキシレート、従ってΔａｃｅＫのバックグラウンドでグリコレートの生産が可能となる。
【００５１】
本発明の特定の実施形態では、初めに(initially)グリコール酸を生産するために改変された微生物は、遺伝子ｌｄｈＡおよびｍｇｓＡの減衰をさらに含んでなる。遺伝子ｌｄｈＡは、解糖の最終産物であるピルベートを乳酸に変換する乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２７）をコードする。遺伝子ｍｇｓＡは、ジヒドロキシアセトンホスフェート（ＤＨＡＰ）をメチルグリオキサールに変換するメチルグリオキサールシンターゼ（ＥＣ４．２．３．３）をコードする。
【００５２】
両酵素とも、解糖代謝経路に主要な生化学的役割を有する分子を消費し、ラクテートの生産をもたらす。グリコレートの生産のための炭素を節約し、副産物としてのラクテートの蓄積を避けるために、本発明の方法で用いる株ではｌｄｈＡおよびｍｇｓＡの欠失を行った。このような欠失の目的はグリコレート生産の収率を向上させること、および本発明者らの生成物の精製を容易にすることである。
【００５３】
本発明のさらなる実施形態は、初めにグリコール酸を生産するために改変された微生物が、遺伝子ａｒｃＡの減衰をさらに含んでなる方法を提供する。本明細書において「ＡｒｃＡ」および「ａｒｃＡ」とは、それぞれポリペプチドおよびコード領域を意味する。
【００５４】
ＡｒｃＡは二成分調節ＡｒｃＡＢ系の１つのポリペプチドである。二成分シグナル伝達系により、細菌は広範な環境、ストレスおよび増殖条件に対する感受、応答および適応が可能となる。原型の二成分系では、センサーヒスチジンキナーゼはその自己リン酸化を触媒し、次に、ホスホリル基を応答レギュレーターに転移させ、このようにして多くの場合には遺伝子発現を調節することによって細胞生理に変化を及ぼし得る。例えば、ＡｒｃＢは膜結合型ヒスチジンキナーゼであり、ＡｒｃＡは応答レギュレーターである(Georgellis et al, 1999)。この調節系によって、大腸菌は、完全好気条件から微小好気条件、そして完全嫌気条件まで、広範な酸素濃度に応答可能となる。
【００５５】
ＡｒｃＡは、大腸菌および他のグラム陰性菌で多くのオペロンの発現を制御する。ＡｒｃＡレギュロンには主として、糖基質から細胞エネルギーを生成する経路に含まれる因子、すなわち、フラボタンパク質種のいくつかのデヒドロゲナーゼ、ターミナルオキシダーゼ、三カルボン酸回路酵素、グリオキシレートシャントの酵素、発酵性代謝に含まれる酵素が含まれる(Iuchi, S., and Lin, E. C. C. (1993) Mol. Microbiol. 9, 9-15; Bauer, C. E., Elsen, S., and Bird, T. H. (1999) Annu. Rev. Microbiol. 53, 495-523)。ＡｒｃＡは、嫌気的増殖中および高成長率（例えば、対数増殖）での好気条件中にこれらのオペロンの多くの発現低下を生じる(S. Iuchi et al., Cell, 66, 5-7 (1991))。ＡｒｃＡタンパク質は三カルボン酸回路（ＴＣＡ）の酵素の遺伝子の発現に負の制御を行うことが知られている。ａｒｃＡが破壊された株では、ＴＣＡ回路の遺伝子の発現が増強される(http://www. genome.ad.jp/dbget-bin/get_htext?Exp_DB+-n+Bget-bin/get htext?Exp DB+-n+B)。
【００５６】
グリコレート合成の生産性および収率を向上させるために、本発明の方法で用いる株では遺伝子ａｒｃＡが欠失される。実際、予めその株に行われていた遺伝子改変とΔａｒｃＡが組み合わさると、ＴＣＡ回路、また、グリコレートの生産に向かうグリオキシレート分流のフラックスが増すはずである。
【００５７】
さらに、ＡｒｃＡは、細胞の酸化還元現状に応答してＰＴＳ発現の調節に関与することが実証されている(Jeong, J-Y. et al, 2004, Journal of Bio. Chem.)。リン酸化型のＡｒｃＡはＰ１プロモーターからのｐｔｓＧ転写を抑制する。ＡｒｃＡが主として嫌気条件でリン酸化され、ＡｒｃＢは酸素の不在下では自己リン酸化されるとしても、本発明者らは、ＡｒｃＡが好気条件で別の二成分系のキナーゼによってリン酸化される（交差反応）ということが排除できない(Laub, M. T. and Goulian, M. Annu. Rev. Genet. (2007); 41:121-45)。従って、本発明者らは、好気条件でのＡｒｃＡ−ＰによるｐｔｓＧ発現の抑制を排除できない。これが、本発明に記載のプロセスにおいて用いるグリコレート生産株のａｒｃＡ遺伝子を欠失させるもう１つの理由である。
【００５８】
本発明の別の実施形態では、初めにグリコール酸を生産するために改変された微生物は、グリコレート膜輸送の減衰をさらに含んでなる。特に、グリコレート輸送体をコードする遺伝子ｇｌｃＡ、ｌｌｄＰおよびｙｊｃＧの少なくとも１つが減衰される。
【００５９】
膜輸送タンパク質（または単に輸送体）は、イオン、小分子、または別のタンパク質などの高分子の生体膜間移動に関与するタンパク質である。輸送タンパク質は内在性膜タンパク質であり、すなわち、輸送タンパク質はそれらがそれを通って物質を輸送する膜の内部に存在し、膜を貫通している。これらのタンパク質は拡散または能動輸送の助長によって物質の移動を補助することができる。上記の３つのタンパク質は総て、グリコレートおよびラクテートの輸送体として同定されている(Nunez, F. et al, 2001 Microbiology, 147, 1069-1077; Nunez, F. et al., 2002 Biochem. And Biophysical research communications 290, 824-829; Gimenez, R. et al., 2003 J. of Bacteriol. 185, 21, 6448-6455)。各グリコール酸パーミアーゼで突然変異誘発された株は炭素源としてのグリコレート上で増殖することができず、このことは、この株はグリコレートを輸送することができないことを示している(Gimenez, R. et al., 2003)。この目的は、グリコール酸を生産するのに用いられる細胞へのグリコレート輸送を減衰することで、この株のグリコール酸に耐え、グリコール酸を蓄積する能力を改良し、生産力価を向上させることである。
【００６０】
本発明の特定の実施形態では、３つの遺伝子ｇｌｃＡ、ｌｌｄＰおよびｙｊｃＧが減衰される。
【００６１】
また、グリコール酸生産微生物からのグリコール酸輸出を増大させることも有利となる。当業者はこのように特定の代謝産物の輸出の増大を得るための多くの手段を知っており、特に、輸出タンパク質の活性および／または発現を増強すると、微生物から培地へグリコール酸を輸出することができる。
【００６２】
本発明の特定の実施形態は、組換え生物からのグリコール酸の発酵生産方法であって、
（ａ）本発明の組換え生物を、グルコース、スクロース、単糖類（フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノースなど）、オリゴ糖類（ガラクトース、セロビオースなど）、多糖類（セルロースなど）、デンプンもしくはその誘導体、グリセロールおよび単一炭素基質からなる群から選択される少なくとも１つの炭素源と接触させ、それにより、グリオキシル酸を生産すること、
（ｂ）場合により、該プロセスは細菌中または培地中においてグリコレートを濃縮する工程、ならびに発酵培養液および／またはバイオマスから、場合により最終産物中に一部または全量（０〜１００％）残留するグリコール酸を単離する工程を含んでもよく、
場合により、該プロセスは工程（ａ）で生産されたグリコール酸を少なくともグリコール酸二量体への重合工程を通して回収する工程を含んでなってもよく、
（ｃ）発酵培養液および／またはバイオマスから、場合により最終産物中に一部または全量残留するグリコール酸を、グリコール酸二量体、オリゴマーおよび／またはポリマーからの脱重合によって単離および回収すること
を含む方法を提供する。
【００６３】
当業者ならば、本発明に従う微生物の培養条件を定義することができる。特に、グラム陰性菌は２０℃〜５５℃、好ましくは２５℃〜４０℃の間の温度、より具体的には大腸菌では約３７℃で発酵される。
【００６４】
発酵は一般に、発酵槽にて、少なくとも１つの単一炭素源および必要であれば代謝産物の生産に必要な補助基質を含み、使用する細菌に適合した既知の定義された組成の無機培養培地を用いて行われる。
【００６５】
本発明はまた、これまでに記載されたような微生物に関する。好ましくは、該微生物は腸内細菌科に属する。より好ましくは、該微生物はエシェリキア属に由来し、いっそうより好ましくは大腸菌(Escherichia coli)である。
【実施例】
【００６６】
いくつかのプロトコールを用いて、以下の実施例に記載されるグリコール酸生産株を構築した。これらのプロトコールを以下に詳説する。
【００６７】
プロトコール１：組換えのためのＰＣＲ産物の導入と組換え体の選択（ＦＲＴ系）
遺伝子または遺伝子間領域の置換のために選択され、表１に示されたオリゴヌクレオチドを用いて、プラスミドｐＫＤ３由来のクロラムフェニコール耐性カセットまたはプラスミドｐＫＤ４由来のカナマイシン耐性カセットのいずれかを増幅した(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000))。次に、得られたＰＣＲ産物をエレクトロポレーションによって、発現されるλ  Ｒｅｄ系（γ、β、ｅｘｏ）が相同組換えに極めて好都合であるプラスミドｐＫＤ４６を担持するレシピエント株に導入した。その後、抗生物質耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、表２に示される適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって確認した。
【００６８】
プロトコール２：耐性カセットの除去（ＦＲＴ系）
クロラムフェニコールおよび／またはカナマイシン耐性カセットを以下の技術に従って除去した。クロラムフェニコールおよび／またはカナマイシン耐性カセットのＦＲＴ部位に作用するＦＬＰレコンビナーゼを有するプラスミドｐＣＰ２０をエレクトロポレーションによってこの株に導入した。４２℃で連続培養を行った後、抗生物質耐性カセットの欠失を表２に示されるオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって確認した。
【００６９】
プロトコール３：遺伝子欠失のためのＰ１ファージを用いた形質導入
レシピエント大腸菌株における遺伝子を耐性カセット（カナマイシンまたはクロラムフェニコール）で置換することによる選択遺伝子の欠失を、Ｐ１ファージを用いた形質導入法によって行った。このプロトコールは、（ｉ）一遺伝子欠失を有するドナー株でのファージライゼートの調製と（ｉｉ）このファージライゼートによるレシピエント株の形質導入の二段階であった。
【００７０】
ファージライゼートの調製
１０ｍｌのＬＢ＋Ｃｍ３０μｇ／ｍｌ＋グルコース０．２％＋ＣａＣｌ２  ５ｍＭに、一遺伝子欠失を有するＭＧ１６５５株の一晩培養物１００μｌを播種する。
振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートする。
ドナー株ＭＧ１６５５で調製したＰ１ファージライゼート１００μｌを加える（およそ１×１０９ファージ／ｍｌ）。
３７℃で３時間、総ての細胞が溶解するまで振盪する。
２００μｌのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける。
４５００ｇで１０分間遠心分離して細胞残渣を除去する。
上清を無菌試験管に移し、２００μｌのクロロホルムを加える。
ライゼートを４℃で保存する。
【００７１】
形質導入
ＬＢ培地中、大腸菌レシピエント株の一晩培養物５ｍｌを１５００ｇで１０分間遠心分離する。
細胞ペレットを２．５ｍｌのＭｇＳＯ４  １０ｍＭ、ＣａＣｌ２  ５ｍＭに懸濁させる。
対照試験管：細胞１００μｌ
一遺伝子欠失を有するＭＧ１６５５株のＰ１ファージ１００μｌ
供試試験管：細胞１００μｌ＋一遺伝子欠失を有するＭＧ１６５５株のＰ１ファージ１００μｌ
振盪しながら３０℃で３０分間インキュベートする。
各試験間に１Ｍクエン酸ナトリウム１００μｌを加え、ボルテックスにかける。
１ｍｌのＬＢを加える。
振盪しながら３７℃で１時間インキュベートする。
７０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後にＬＢ＋Ｃｍ３０μｇ／ｍｌのディッシュにプレーティングする。
３７℃で一晩インキュベートする。
次に、抗生物質耐性形質転換体を選択し、欠失の挿入を、表２に示される適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって確認した。
【００７２】
プロトコール４：組換えのためのＰＣＲ産物の導入と組換え体の選択（Ｃｒｅ−ＬＯＸ系）
遺伝子または遺伝子間領域の置換のために選択され、表１に示されたオリゴヌクレオチドを用いて、プラスミドｌｏｘＰ−ｃｍ−ｌｏｘＰ(Gene Bridges)由来のクロラムフェニコール耐性カセットまたはプラスミドｌｏｘＰ−ＰＧＫ−ｇｂ２−ｎｅｏ−ｌｏｘＰ(Gene Bridges)由来のネオマイシン耐性カセットのいずれかを増幅した。次に、得られたＰＣＲ産物をエレクトロポレーションによって、発現されるλ  Ｒｅｄ系（γ、β、ｅｘｏ）が相同組換えに極めて好都合であるプラスミドｐＫＤ４６を担持するレシピエント株に導入した。その後、抗生物質耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、表２に示される適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって確認した。
【００７３】
プロトコール５：耐性カセットの除去（Ｃｒｅ−ＬＯＸ系）
クロラムフェニコールおよび／またはカナマイシン耐性カセットを以下の技術に従って除去した。クロラムフェニコールおよび／またはカナマイシン耐性カセットのＣｒｅ−ＬＯＸ部位に作用するＣｒｅレコンビナーゼを有するプラスミドｐＪＷ１６８(Palmeros B. et al (2000), Gene 247:255-264)をエレクトロポレーションによってこの株に導入した。４２℃で連続培養を行った後、抗生物質耐性カセットの欠失を表２に示されるオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって確認した。
【００７４】
【表１】
0005800795.tif 000002
0005800795.tif 000003
【００７５】
【表２】
0005800795.tif 000004
【００７６】
実施例１
プラスミドｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１（図２）の構築
プラスミドｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１をプラスミドｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ（特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６３０４６およびＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５５６２５に記載がある）およびプラスミドｐＪＢ１３７−ａｃｅＡから３段階で構築した。
【００７７】
最初の工程は、ｙｃｄＷの終端にターミネーターを付加することによってプラスミドｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７を構築することであった。この遺伝子ｙｃｄＷの終端を、それらの配列にＴＴ０７を含み、表１に示されるオリゴヌクレオチドを用いてゲノムＤＮＡに対して行われたＰＣＲによって増幅した。Ａｇｃｌ／ＳｍａＩで消化したＰＣＲ断片を同じ制限酵素で切断したプラスミドｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷにクローニングし、プラスミドｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ７を得た。
【００７８】
プラスミドｐＪＢ１３７−ａｃｅＡは、ＰＣＲ断片をＳｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＪＢ１３７（ＥＭＢＬ受託番号Ｕ７５３２６）にクローニングすることによって構築した。このＰＣＲ断片は、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６３０４６およびＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５５６２５に記載されているＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ株から精製されたゲノムＤＮＡと表１に記載されるオリゴヌクレオチド（Ｏａｇ００３７およびＯａｇ００３８）で得たものである。プラスミドにクローニングする前にその固有のプロモーターとしての遺伝子ａｃｅ  Ａを増幅した。
【００７９】
最後の工程はプラスミドｐＪＢ１３７−ａｃｅＡを切断して断片ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１（ＴＴ０１はｐＪＢ１３７のターミネーターである）を得ることであった。プラスミドｐＪＢ１３７−ａｃｅＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、クレノウ酵素で処理し、最後にＰｓｔＩ制限酵素で消化した。得られたＤＮＡ断片を次に、ＳｍａＩおよびＰｓｔＩ）で順次開環したプラスミドｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７にクローニングした。得られたプラスミドはｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１であり、ｐＡＧ０２５と呼称した。
【００８０】
実施例２
発酵によってグリコール酸を生産することができる株：ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０１−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）の構築
大腸菌ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ株を、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６３０４６およびＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５５６２５に示されている記載に従って構築した。
【００８１】
ｉｃｄ転写の減衰は、大腸菌ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ株において、天然ｉｃｄプロモーターを、クロラムフェニコール耐性カセットを有するＰｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧと呼ばれる人工プロモーターに置換することによって得た。構築は、プロトコール１に記載されている技術に従い、表１に示されるオリゴヌクレオチド（配列番号１および２）を用いて行う。クロラムフェニコールカセットを除去する。
【００８２】
まず、ＰＣＲ断片Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：ＣｍをエレクトロポレーションによってＭＧ１６５５株（ｐＫＤ４６）に導入し、ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ株を得、配列決定によってバリデートした。
【００８３】
第二段階で、この減衰ｉｃｄ構築物を形質導入によってＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ株に導入し（プロトコール３参照）、ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ株を得た。
【００８４】
次に、この株にプラスミドｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１（実施例１）を導入し、ＡＧ０６６２と呼称されるＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）を得た。
【００８５】
実施例３
発酵によるグリコール酸生産を改良するための株：ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｌｄｈＡ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）の構築
大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ（ｐＫＤ４６）株において遺伝子ｌｄｈＡを、表１に示されるオリゴ番号３および４を用いて行ったＰＣＲ産物による組換えによって不活性化した（プロトコール１参照）。得られた株は、ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｌｄｈＡ：：Ｋｍであり、これに最終段階でプラスミドｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１（実施例１）を導入した。
【００８６】
実施例４
発酵によるグリコール酸生産を改良するための株：ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｍｇｓＡ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０１−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）の築物
大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ株において遺伝子ｍｇｓＡを、プロトコール３に記載されているＰ１ファージによる形質導入法によって不活性化した。ドナー株ＭＧ１６５５  ΔｍｇｓＡ：：Ｋｍは、ＭＧ１６５５（ｐＫＤ４６）株にＰＣＲ断片を導入することによって構築した。この構築に用いたオリゴヌクレオチドを表１に示す。この株を配列決定によって確認した。
【００８７】
次に、このプラスミドｐＡＧ０２５を大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｍｇｓＡ：：Ｋｍ株に導入し、ＡＧ０８１９と呼称される最終株：ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｍｇｓＡ：：Ｋｍ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）を得た。
【００８８】
実施例５
発酵によるグリコール酸生産を改良するための株：ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔａｒｃＡ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）の構築
大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ株において遺伝子ａｒｃＡを、プロトコール３に記載されているＰ１ファージによる形質導入法によって不活性化した。ドナー株ＭＧ１６５５  ΔａｒｃＡ：：Ｋｍは、ＭＧ１６５５（ｐＫＤ４６）株にＰＣＲ断片を導入することによって構築した。この構築に用いたオリゴヌクレオチドを表１に示す。この株を配列決定によって確認した。
【００８９】
次に、このプラスミドｐＡＧ０２５を大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔａｒｃＡ：：Ｋｍ株に導入し、ＡＧ０９５６と呼称される最終株：ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔａｒｃＡ：：Ｋｍ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）を得た。
【００９０】
実施例６
発酵によるグリコール酸生産を改良するための株：ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｌｄｈＡ  ΔｍｇｓＡ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）の構築
第一段階において、欠失ΔｍｇｓＡ：：Ｃｍは、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ株へのファージ形質導入（プロトコール３）によって行い、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ株  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｍｇｓＡ：：Ｃｍ株を得た。ドナー株ＭＧ１６５５  ΔｍｇｓＡ：：Ｃｍは、ＭＧ１６５５（ｐＫＤ４６）株にＰＣＲ断片を導入することによって構築した。この構築に用いたオリゴヌクレオチドを表１に示す。この株を配列決定によって確認した。
【００９１】
第二段階において、ドナー株ＭＧ１６５５  ΔｌｄｈＡ：：Ｋｍからの形質導入（実施例３に記載）によってＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｍｇｓＡ：：Ｃｍ株に欠失ΔｌｄｈＡ：：Ｋｍを導入し、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｍｇｓＡ：：Ｃｍ  ΔｌｄｈＡ：：Ｋｍ株を得た。これらのクロラムフェニコールおよびカナマイシン耐性カセットをプロトコール２に記載されている技術に従って除去した。ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｍｇｓＡ  ΔｌｄｈＡ株を、表２に示されるオリゴを用いたＰＣＲによってバリデートした。
【００９２】
第三段階において、実施例２に記載されているＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ株からの形質導入によって、構築物Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍを導入した。得られた株はＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｍｇｓＡ  ΔｌｄｈＡであった。
【００９３】
最後に、プラスミドｐＡＧ２５（実施例１）をＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｍｇｓＡ  ΔｌｄｈＡ株に導入し、ＡＧ０８７３と呼称されるＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｍｇｓＡ  ΔｌｄｈＡ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）株を得た。
【００９４】
実施例７
発酵によるグリコール酸生産を改良するための株：ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｌｄｈＡ  ΔｍｇｓＡ  ΔａｒｃＡ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）の構築
実施例６に記載されている株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｍｇｓＡ  ΔｌｄｈＡへの形質導入によって、欠失ΔａｒｃＡ：：Ｋｍを導入し、ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｍｇｓＡ  ΔｌｄｈＡ  ΔａｒｃＡ：：Ｋｍ株を得た。この形質導入実験に用いたドナー株ＭＧ１６５５  ΔａｒｃＡ：：Ｋｍは実施例５に記載されている。
【００９５】
次に、この株にプラスミドｐＡＧ２５を導入し、ＡＧ１０９９と呼称されるＭ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｍｇｓＡ  ΔｌｄｈＡ  ΔａｒｃＡ：：Ｋｍ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）株を得た。
【００９６】
実施例８
グリコレートを輸送することができない株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｇｌｃＡ  ΔｌｌｄＰ  ΔｙｊｃＧ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０１−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）の構築
第一段階において、構築物ΔｙｊｃＧ：：Ｎｍ（Ｃｒｅ／Ｌｏｘ）を、ＰＣＲ産物（プロトコール４参照）によって、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ（ｐＫＤ４６）株に導入し、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｙｊｃＧ：：Ｎｍ株を得た。用いたオリゴヌクレオチドを表１に示す。得られた株を配列決定によって確認した。
ネオマイシン耐性カセットをプロトコール５に記載されている技術に従って除去し、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｙｊｃＧ株を得た。
【００９７】
第二段階において、構築物ΔｇｌｃＡ：：Ｎｍを、ＰＣＲ産物（プロトコール４参照）によって、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｙｊｃＧ（ｐＫＤ４６）株に導入し、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｙｊｃＧ  ΔｇｌｃＡ：：Ｎｍ株を得た。用いたオリゴヌクレオチドを表１に示す。得られた株を配列決定によって確認した。
ネオマイシン耐性カセットをプロトコール５に記載されている技術に従って除去し、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｙｊｃＧ  ΔｇｌｃＡ株を得た。
【００９８】
第三段階において、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｙｊｃＧ  ΔｇｌｃＡ株に形質導入によって欠失ΔｌｌｄＰ：：Ｋｍを導入し、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｙｊｃＧ  ΔｇｌｃＡ  ΔｌｌｄＰ：：Ｋｍ株を得た。この形質導入実験に用いたドナー株ＭＧ１６５５  ΔｌｌｄＰ：：Ｋｍは、ＭＧ１６５５（ｐＫＤ４６）に導入されたＰＣＲ断片の組換えによって構築した。オリゴヌクレオチドを表１に示す。ＭＧ１６５５  ΔｌｌｄＰ：：Ｋｍ株を配列決定によって確認した。
【００９９】
次の段階は、実施例２に記載されているＭ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ株からの形質導入によって、減衰Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：ＣｍをＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｙｊｃＧ  ΔｇｌｃＡ  ΔｌｌｄＰ：：Ｋｍ株に形質導入してＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｙｊｃＧ  ΔｇｌｃＡ  ΔｌｌｄＰ：：Ｋｍ株を得ることであった。
【０１００】
最後の段階は、プラスミドｐＡＧ２５の導入（実施例１）によって、ＡＧ１０５６と呼称されるＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｙｊｃＧ  ΔｇｌｃＡ  ΔｌｌｄＰ：：Ｋｍ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）株を得ることであった。
【０１０１】
実施例９
発酵によるグリコール酸生産を改良し、かつ、グリコレートを輸送することができない株：ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｌｄｈＡ  ΔｍｇｓＡ  ΔｇｌｃＡ  ΔｌｌｄＰ  ΔｙｊｃＧ  （ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０１−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）の構築
第一段階において、構築物ΔｙｊｃＧ：：Ｎｍを、ＰＣＲ産物（プロトコール４）によって、実施例６に記載されているＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｍｇｓＡ  ΔｌｄｈＡ（ｐＫＤ４６）株に導入し、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｍｇｓＡ  ΔｌｄｈＡ  ΔｙｊｃＧ：：Ｎｍ株を得た。
【０１０２】
耐性カセットをプロトコール５に従って除去し、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｍｇｓＡ  ΔｌｄｈＡ  ΔｙｊｃＧ株を得た。
【０１０３】
第二段階において、欠失ΔｇｌｃＡ：：Ｎｍ（Ｃｒｅ／Ｌｏｘ）を、ＰＣＲ産物によって、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｍｇｓＡ  ΔｌｄｈＡ  ΔｙｊｃＧ（ｐＫＤ４６）株に導入し、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｍｇｓＡ  ΔｌｄｈＡ  ΔｙｊｃＧ  ΔｇｌｃＡ：：Ｎｍ株を得た。
【０１０４】
耐性カセットをプロトコール５に従って除去し、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｍｇｓＡ  ΔｌｄｈＡ  ΔｙｊｃＧ  ΔｇｌｃＡ株を得た。
【０１０５】
第三段階は、実施例８に記載されているＭＧ１６５５  ΔｌｌｄＰ：：Ｋｍ株からの形質導入によって、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｍｇｓＡ  ΔｌｄｈＡ  ΔｙｊｃＧ  ΔｇｌｃＡ株にΔｌｌｄＰ：：Ｋｍを導入してＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｍｇｓＡ  ΔｌｄｈＡ  ΔｙｊｃＧ  ΔｇｌｃＡ  ΔｌｌｄＰ：：Ｋｍ株を得ることであった。
【０１０６】
次に、断片Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：ＣｍをＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｍｇｓＡ  ΔｌｄｈＡ  ΔｙｊｃＧ  ΔｇｌｃＡ  ΔｌｌｄＰ：：Ｋｍ株に形質導入し、ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｍｇｓＡ  ΔｌｄｈＡ  ΔｙｊｃＧ  ΔｇｌｃＡ  ΔｌｌｄＰ：：Ｋｍ株を得た。実施例２に記載されているＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ株がこの形質導入実験のドナー株であった。
【０１０７】
最後に、この株にエレクトロポレーションによってプラスミドｐＡＧ２５を導入し、ＡＧ０９６０と呼称されるＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔｍｇｓＡ  ΔｌｄｈＡ  ΔｙｊｃＧ  ΔｇｌｃＡ  ΔｌｌｄＰ：：Ｋｍ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）株を得た。
【０１０８】
当業者には微生物を遺伝的に操作するために用いられる技術が分かり、欠失を得るために種々の方法が存在することが分かるであろう。
【０１０９】
実施例１０
エルレンマイヤーフラスコでのグリコール酸生産株の発酵
まず、株の性能を、４０ｇ／ｌのＭＯＰＳおよび１０ｇ／ｌのグルコースを添加し、ｐＨ６．８に調整した改変Ｍ９培地(Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128)を用いた２５０ｍｌバッフルエルレンマイヤーフラスコ培養にて評価した。必要であれば、スペクチノマイシンを５０ｍｇ／ｌの濃度で加えた。７２時間前培養物を用いて、５０ｍｌ培養物にＯＤ６００ｎｍが約０．３となるまで接種した。培養物を３０℃にて２００ｒｐｍのシェーカー上で培養培地中のグルコースが消耗するまで維持した。培養の終了時に、分離用にＢｉｏｒａｄ  ＨＰＸ  ９７Ｈカラム、検出用に屈折計を用いたＨＰＬＣによって、グルコースおよびグリコール酸を分析した。
【０１１０】
種々の株の性能の比較を下表３に示す。実施例２に記載されている株を参照とした。各値はｎ回の繰り返し（ｎ＝１〜ｎ＝６）の平均値である。
【０１１１】
【表３】
0005800795.tif 000005
【０１１２】
実施例１１
流加発酵槽でのグリコール酸生産株の発酵
上記の実施例に記載されている株を、流加プロトコールを用いる６００ｍｌ発酵槽での生産条件下で評価した。
【０１１３】
４０ｇ／ｌのＭＯＰＳ、１０ｇ／ｌのグルコース（フラスコ培養に用いたものと同じ培地）および１０％のＬＢ培地を添加した５０ｍｌの合成培地を充填した５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコにて３０℃で３日間、独自の前培養を行った。この前培養物を発酵槽の接種に用いた。
【０１１４】
２０ｇ／ｌのグルコース、５０ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを添加した２００ｍｌの合成培地を充填した発酵槽に初期光学密度約２で接種した。培養は３７℃にて、溶存酸素が３０％超の飽和を維持するように振盪および曝気を調整して行った。ｐＨは塩基の添加により６．８に調整した。培養は回分様式でグルコースの消耗まで行った。その時、硫酸マグネシウム、オリゴ要素およびスペクチノマイシンを添加した７００ｇ／ｌのグルコース溶液を加え（グルコースパルス）、培地中２０ｇ／ｌのグルコース濃度に戻した。５回目の流加パルスの後、培養が終了するまでｐＨを７．４に調整した。
【０１１５】
通常、実施例５に記載の株は実施例２に記載の参照株よりも発酵槽で良好な生産性能を示した。
【０１１６】
実施例５の株（ＡＧ０９５６）を用いたグリコール酸生産の代表的な経時的発酵を以下に示す。
【０１１７】
【表４】
0005800795.tif 000006
【０１１８】
得られた最終力価は５２．２ｇ／ｌグリコール酸であり、グルコースからの収率は０．３８ｇ／ｇ、生産性は１．３３ｇ／ｌ／時であった。
【参考文献】
【０１１９】
0005800795.tif 000007
0005800795.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部となっている添付図面は本発明を例示し、記述とともに本発明の原理を説明するのに役立つ。
【図１】炭水化物からのグリコール酸生産系の進展における解糖、ＴＣＡ回路およびグリオキシレート経路の遺伝子工学を示す。
【図２】ｐＡＧ２５と呼ばれるベクターｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１の構築を示す図である。
【図３】乳酸および酢酸経路を拡大表示したものである。これらの経路に含まれる遺伝子のいくつかが本発明において改変される。
【図１】
0005800795.tif 000009
【図２】
0005800795.tif 000010
【図３】
0005800795.tif 000011
【配列表】
0005800795000001.app