(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コムギ属の植物の種子のアルコール抽出物の分配クロマトグラフィーのピーク成分を有効成分として含有し、
前記アルコール抽出物のアルコールは、エタノールのみ又はエタノール含有量が９０体積％以上の含水エタノールであり、
前記ピーク成分が、担体としてシリカゲル及び移動相としてヘキサン−酢酸エチル混合溶媒を用いた際のピーク成分である抗肥満剤。
【請求項２】
脂肪蓄積抑制作用を有するものである請求項１記載の抗肥満剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イネ科植物種子のアルコール抽出物に対し特定の精製処理をすることによって得られた、脂肪細胞分化抑制作用および脂肪蓄積抑制作用を高めた抗肥満剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、日本および欧米諸国では、糖尿病、高血圧、動脈硬化などの症状が重複するメタボリックシンドロームとよばれる病態をもつ患者が増加している。メタボリックシンドロームには肥満が深く関わっていると考えられている。肥満は、過食によるエネルギーの過剰摂取や運動不足による消費エネルギー低下などにより、脂肪細胞数の増加や脂肪細胞自身の肥大化が起こり、脂肪が過剰に蓄積した状態をいう。脂肪を過剰に蓄積した肥大脂肪細胞からは各種のアディポサイトカインが分泌され、その結果、インスリン抵抗性や高血圧、高脂血症などが誘導される。肥満やメタボリックシンドロームを制御するためには脂肪前駆細胞の肥大脂肪細胞への分化および脂肪蓄積の機構を解明することが重要な課題であり、この肥大脂肪細胞への分化および脂肪蓄積を抑制することが肥満の予防にも繋がる。
【０００３】
従来、肥満の予防に有用な物質としては、ベルベリンなどの物質が知られているが、それらの物質は医薬品であり、医師の処方なしに、効果を示す量を継続して摂取することはできない。
【０００４】
特許文献１には、イネ科植物の抽出物を有効成分とするＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体）リガンド剤が開示されており、該リガンド剤によるＰＰＡＲαのリガンド活性やＰＰＡＲγのリガンド活性が見出されている。ＰＰＡＲαのリガンド活性は脂質代謝に影響を及ぼすものであり、ＰＰＡＲγのリガンド活性は脂肪細胞の分化に関与するものである。しかしながら、特許文献１には、同文献に記載のＰＰＡＲリガンド剤が、実際に脂肪細胞が脂肪を蓄積することを抑制するかについては示されていない。
【０００５】
特許文献２には、イネ科植物の種子や地上部茎葉の抽出物を有効成分とする脂肪細胞の分化抑制剤が開示されている。しかしながら、その分化抑制作用には用量依存性が認められず、また糖尿病マウスに高脂肪食を与えた試験において、内臓脂肪量を低下させたものの、血中脂質には何ら影響しなかったことから、その効果は弱いか限定的なものと考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−１６１６５６号公報
【特許文献２】特開２００５−２４７６９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、日常的に摂取しやすく、抗肥満効果が高く、しかも、用量と活性に相関性があって効果が実感しやすく、かつ安全性が高い抗肥満剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意検討の結果、後述する試験例で示すように、イネ科植物種子の単なる抽出物中には、脂肪蓄積抑制作用を有する成分とともに、これを阻害する成分も含まれているため、抽出物の適用量を増加させると、逆に脂肪蓄積が増加することを見出した。そのため、例えば特許文献１に記載のイネ科植物の抽出物を有効成分とするＰＰＡＲリガンド剤は、ＰＰＡＲリガンド活性を示したとしても、脂肪蓄積抑制活性は示さないと考えられる。
【０００９】
そして、本発明者らはさらに検討を進めた結果、分配クロマトグラフィーを用いてイネ科植物種子の抽出物の精製処理を行って有効成分を濃縮することにより、極めて効果の高い脂肪蓄積抑制剤を得ることに成功し、本発明に到達した。
【００１０】
即ち、本発明は、イネ科植物種子のアルコール抽出物の分配クロマトグラフィーのピーク成分を有効成分として含有する抗肥満剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、日常的に摂取しやすく、抗肥満効果が高く、しかも、用量と活性に相関性があって効果が実感しやすく、かつ安全性が高い抗肥満剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施例１の抗肥満剤を得た際の分配クロマトグラフィーのクロマトグラムである。
【図２−１】図２−１は、実施例１の抗肥満剤を添加した培地でマウス前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１細胞）を分化誘導し培養したときの、抗肥満剤添加量と細胞内トリグリセライド量との関係を示したグラフである。
【図２−２】図２−２は、比較例１又は２の組成物を添加した培地で３Ｔ３−Ｌ１細胞を分化誘導し培養したときの、組成物添加量と細胞内トリグリセライド量との関係を示したグラフである。
【図３】図３は、(a)コントロールの分化誘導後の３Ｔ３−Ｌ１細胞、(b)分化誘導の際に実施例１の抗肥満剤を添加した３Ｔ３−Ｌ１細胞、及び(c)分化誘導の際に比較例１の組成物を添加した３Ｔ３−Ｌ１細胞をそれぞれ示した光学顕微鏡写真（いずれも４００倍）である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の抗肥満剤について、好ましい実施形態に基づき詳細に説明する。
【００１４】
本発明の抗肥満剤に用いるイネ科植物としては、特に制限されないが、例えば、小麦、デュラム小麦、ライ麦、ライ小麦、大麦、オーツ麦、はと麦、トウモロコシ、イネ、ヒエ、アワ、キビなどが挙げられ、高い活性が得られる点から、小麦、デュラム小麦等のコムギ属の植物が好ましく、小麦がさらに好ましい。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。イネ科植物種子としては、任意の形態のイネ科植物種子でよく、例えば、イネ科植物種子（好ましくは種子外皮；糟糠類）そのもの；当該イネ科植物種子を切断、粉砕若しくは粉末化したもの；当該イネ科植物種子を乾燥したもの；当該イネ科植物種子を乾燥後粉砕若しくは粉末化したものなどでもよい。イネ科植物種子外皮を含む好適な例としては、ふすま、末粉、籾殻、ぬかなどが挙げられるほか、外皮を伴った種子も挙げられる。
【００１５】
アルコールによる抽出方法は特に制限されないが、上記各種形態のイネ科植物種子を、アルコール中に浸漬、攪拌または還流などする方法、ならびに超臨界流体抽出法などが挙げられる。アルコール中に浸漬、攪拌または還流などする方法の場合、抽出温度は２〜１００℃が好ましく、抽出時間は３０分〜７２時間が好ましく、アルコール使用量は、イネ科植物種子１００質量部に対し５０〜２０００質量部が好ましい。
【００１６】
抽出に用いることができるアルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノールなどの１価の低級アルコール（好ましくは炭素原子数１〜４のもの）、および１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどの多価アルコールなどの室温（２５℃）で液体であるアルコールが挙げられ、操作性や環境性の点から、エタノールが好ましい。また、上記アルコールには、さらに水性成分（水、純水、蒸留水、水道水、酸性水、アルカリ水、中性水など）が含まれている含水アルコールも包含される。含水アルコール中のアルコール含有量は、通常７０体積％以上、好ましくは８０体積％以上、より好ましくは９０体積％以上であるのが望ましい。
【００１７】
本発明において、分配クロマトグラフィーは、本発明に係る有効成分が得られる手法であればその種類は問わないが、移動相として非水系溶媒を用いる順相クロマトグラフィー法が好ましく、オープンカラム法、中圧カラム法、高速液体クロマトグラフィーなどの方法を適宜選択することができる。
【００１８】
移動相としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノールなどの１価の低級アルコール（好ましくは炭素原子数１〜４のもの）、および１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどの多価アルコールなどの室温（２５℃）で液体であるアルコール；ジエチルエーテル、プロピルエーテルなどのエーテル；酢酸ブチル、酢酸エチルなどのエステル；アセトン、エチルメチルケトンなどのケトン；ヘキサン；塩化メチレン；アセトニトリル；ならびにクロロホルムなどを挙げることができる。これらを単独で又は複数組み合わせて用いる。複数を組み合わせる場合、混合比を一定にするイソクラクティックモード及び混合比を変化させるグラジエントモードいずれも採用できる。
【００１９】
担体としては、目的とする有効成分を担持−放出できる担体であればいずれも用いることができるが、一般的にはシリカゲル、ポリアクリルアミドゲル、デキストランゲルなどを挙げることができる。
【００２０】
検出波長は、１７０〜３２０ｎｍであればよく、好ましくは１９０〜２８０ｎｍである。
【００２１】
以上の中でも、担体としてシリカゲル、移動相としてヘキサン−酢酸エチル混合溶媒を用いた際のピーク成分を分取することが好ましく、特に、担体としてシリカゲル、移動相としてヘキサン−酢酸エチル混合溶媒をヘキサン大−少へのグラジエントモードで用い、検出波長２５４ｎｍでのピーク成分を分取するのが、本発明に係る有効成分を効率よく得られるため、好ましい。
【００２２】
本発明の抗肥満剤は、本発明に係る有効成分、ならびに必要に応じて薬学的に許容される種々の担体、賦形剤、その他の添加剤、その他の成分を含有するものである。本発明の抗肥満剤は、常法により製剤化することができ、その場合、本発明の抗肥満剤の剤型は、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などの経口剤である。また、その他の成分としては、その他の薬効作用を有する成分、抗炎症薬、各種ビタミン類、生薬、ミネラル類を適宜配合することができる。
【００２３】
本発明の抗肥満剤中の有効成分の含有量は、特に制限されるものではなく、抗肥満剤の剤型、投与または摂取する者の症状や年齢性別などによって適宜変化させることができ、ヒトを対象とする場合、通常、本発明の抗肥満剤の有効成分の投与量または摂取量が１人１日当たり０．０１〜１０ｇとなるように含有させることが好ましい。
【００２４】
本発明の抗肥満剤は、そのまま投与または摂取してもよいし、本発明の抗肥満剤を、飲食品または動物用飼料に添加して投与または摂取してもよい。添加対象の飲食品としては、パン類、麺類、タブレット、キャンディーなどの菓子類、清涼飲料、ジュース、栄養ドリンクなどの飲料などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。飲食品への添加時機も、特に制限されるものではなく、飲食品の製造工程中に添加してもよく、製造された飲食品に添加してもよく、また動物用飼料の場合も同様である。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【００２６】
〔実施例１〕
小麦種子２ｇを、マルチビーズショッカー（多検体細胞破砕機／ＭＢ３０１（Ｓ）：安井器械株式会社製）で粉砕した後、５倍量のエタノールを添加して、１５０ｒｐｍ、室温の条件で、２時間振とう抽出した。次いで、３５００ｒｐｍ、室温の条件で、１５分間遠心分離して、上清を遠心濃縮機で乾燥して、小麦エタノール抽出物を得た。
次いで、この小麦エタノール抽出物を中圧クロマトグラフィーによって精製した。中圧クロマトグラフィー条件は下記の通りである。溶出開始後１２〜１４分に出現するピーク成分を回収して、溶媒留去し、本発明の抗肥満剤３ｍｇを得た。このときのクロマトグラムを図１に示す。なお、クロマトグラムの横軸は溶出開始からの時間（分）を表す。
【００２７】
＜中圧クロマトグラフィー条件＞
カラム：  シリカゲル（インジェクトカラムＳ、ハイフラッシュカラムＭ、６０Å、４０μｍ、山善株式会社）
移動相：  ヘキサン／酢酸エチル（体積比）＝９０／１０にて３分、８０／２０にて５分、６０／４０にて１０分
検出波長：２５４ｎｍ
【００２８】
〔比較例１〕
小麦種子２００ｍｇを、マルチビーズショッカー（多検体細胞破砕機／ＭＢ３０１（Ｓ）：安井器械株式会社製）で粉砕した後、５倍量のエタノールを添加して、１５０ｒｐｍ、室温の条件で、２時間振とう抽出した。次いで、３５００ｒｐｍ、室温の条件で、１５分間遠心分離して、上清を遠心濃縮機で乾燥した。得られた濃縮物の重量を測定して、１６０ｍｇ／ｍＬとなるようにエタノールに溶解して、比較例組成物４．８ｍｇを得た。
【００２９】
〔比較例２〕
小麦種子２００ｍｇを、マルチビーズショッカー（多検体細胞破砕機／ＭＢ３０１（Ｓ）：安井器械株式会社製）で粉砕した後、５倍量のヘキサンを添加して、１５０ｒｐｍ、室温の条件で、２時間振とうして脱脂後、ヘキサンを除去した。５倍量のエタノールを添加して、１５０ｒｐｍ、室温の条件で、２時間振とう抽出した。次いで、３５００ｒｐｍ、室温の条件で、１５分間遠心分離して、上清を遠心濃縮機で乾燥した。得られた濃縮物の重量を測定して、８７ｍｇ／ｍＬとなるようにエタノールに溶解して、比較例組成物２．６ｍｇを得た。
【００３０】
〔試験例〕
マウス前駆脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１を、１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、１０Ｕ／ｍＬ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１０μｇ／ｍＬ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むダルベッコ変法イーグル培地（グルコース４．５ｇ／Ｌ、ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に、４×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で浮遊させ、２４ウェルプレートに１ｍＬずつ播種した。次いで、５％ＣＯ2存在下、３７℃で、３日間の培養後、コンフルエントになったことを顕微鏡下で確認してから、脂肪細胞への分化を誘導するため、培地を１０μｇ／ｍＬインスリン（ヒト由来）、２５０ｎＭデキサメタゾン、５００μＭ ３−イソブチル−１−メチルキサンチンを含む１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ（分化誘導培地）に置換し、分化誘導２日後、培地を１０μｇ／ｍＬインスリンを含む１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ（維持培地）に置換して、さらに、６日間培養した。
【００３１】
以上の培養において、実施例１の抗肥満剤または比較例１もしくは２の組成物を適宜エタノールに溶解し、乾燥固形分としての添加量が所定量（図２−１および２−２の記載参照）となるように、分化誘導培地および維持培地に添加して培養を行なった。なお、コントロールとして、実施例１の抗肥満剤ならびに比較例１および２の組成物をいずれも添加しない系での培養も行なった。
【００３２】
脂肪細胞分化抑制作用の評価のため、分化誘導２日後の各培養細胞を光学顕微鏡下で観察した。その際の光学顕微鏡写真を図３に示す。なお、図３（ａ）は、コントロールの光学顕微鏡写真であり、図３（ｂ）は、実施例１の抗肥満剤を０．０４ｍｇ添加したときの光学顕微鏡写真であり、図３（ｃ）は、比較例１の組成物を１．６ｍｇ添加したときの光学顕微鏡写真である。
また、細胞内の脂肪蓄積抑制性の評価のため、維持培地での培養終了後の培養細胞内のトリグリセライド（ＴＧ）量を下記測定方法に従って測定した。実施例１の抗肥満剤を用いた場合の結果を図２−１に、比較例１または２の組成物を用いた場合の結果を図２−２に示す。なお、図２−１および２−２において、結果は、無添加（コントロール）におけるトリグリセライド産生量を１００％とした相対値で表す。
【００３３】
（トリグリセライド量の測定方法）
培養後の３Ｔ３−Ｌ１細胞をＰＢＳ（−）５００μＬ／ｗｅｌｌで２回洗浄した後、２−プロパノール３００μＬを加えて、８０ｒｐｍで２０分間振とうして、細胞内のトリグリセライドを抽出した。抽出したトリグリセライド量を、トリグリセライドＥ−テストワコー（和光純薬工業製）を用いて定量した。
【００３４】
図２−１から、本発明の抗肥満剤は、細胞内に蓄積するトリグリセライド量を減少させることができ、その効果は、添加量の増加に伴って大きくなることが明らかである。一方、図２−２から明らかな通り、比較例１または２の組成物、すなわち単なる抽出物では、本発明の抗肥満剤のような効果は認められず、むしろ、添加量の増加に伴って細胞内に蓄積するトリグリセライド量が増加してしまった。
また、分化誘導によって脂肪細胞となった図３（ａ）の顕微鏡写真、および比較例１の組成物を添加した図３（ｃ）の顕微鏡写真では、細胞内に多数の脂肪滴の蓄積が認められるが、本発明の抗肥満剤を添加した図３（ｂ）の顕微鏡写真では、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化が抑制され、細胞内に蓄積される脂肪滴が少ないことが明らかである。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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