(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象における癌を治療するための医薬組成物であって、配列番号２で表される配列を有するペプチドを有効量含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記ペプチドの量が、前記対象における少なくとも１つの癌の症状を軽減するために有効な量である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ペプチドの量が、前記対象の癌細胞におけるＰＰ２Ａ活性を上昇させるために有効な量である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ペプチドの量が、前記対象の癌細胞におけるＡｋｔキナーゼ、ＩκＫキナーゼ、またはＮＦκＢの活性を低下させるために有効な量である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記癌が白血病である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記白血病が、慢性リンパ性白血病（CLL）である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ＡｐｏＥペプチドの量が、対象におけるＣＤ５＋Ｂ細胞の数を減少させるために有効な量である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記白血病が、慢性骨髄性白血病（CML）である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ペプチドの量が、対象におけるＢＣＲ／ＡＢＬ＋細胞の増殖を低下させるために有効な量である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ＢＣＲ／ＡＢＬ＋細胞が、イマチニブまたはダサチニブに対して耐性である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記白血病が、急性リンパ性白血病（ALL）である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記癌が乳癌である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記乳癌が、Ｈｅｒ２の発現を特徴とする、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記乳癌が、エストロゲン受容体の発現を特徴とする、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記癌が、前立腺癌である、請求項１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  本出願は、２００８年７月１日に出願され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国仮出願第６１／０７７，３１１号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
[0002]  本発明は、アポリポタンパク質Ｅ（ApoE）に由来する少なくとも１つのペプチドを投与することにより癌を治療する方法に関する。ＡｐｏＥペプチドの投与は、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、腫瘍の形成、腫瘍の増殖、および腫瘍細胞の広がりを抑制する。特に、各種の白血病および乳癌を治療する方法が説明される。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  癌とは、細胞群が、制御不能の増殖、隣接組織に対する浸潤および破壊、ならびに転移（体内の他の位置への異常な細胞の広がり）を示すか、または細胞が、適切な時点におけるプログラム細胞死（例えば、アポトーシス）を起こすことができなくなる疾患の種類である。癌は、すべての死亡のうち、約１３％の原因となり、米国癌協会によれば、２００７年には、世界中で７６０万人の人々が癌で死亡している。癌に対する最新の治療は、具体的な癌の種類、また、関与する組織に依存するが、これには、他の方法にもまして、手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、およびモノクローナル抗体療法が含まれる。これらの治療方法は、一部の場合には奏効しているが、有害な副作用または有効性の制約が妨げとなっている。例えば、手術による腫瘍の切除を介する癌性組織除去の有効性は、癌が隣接組織に浸潤し、体内の他の部位へと転移する傾向により制約されることが多い。放射線治療のほか、化学療法も、体内の他の組織への毒性または損傷により制約されることが多い。したがって、癌は、依然として主要な健康問題であり、癌を治療する方法の改善が必要とされている。
【０００４】
[0004]  米国で男性および女性において最も致死的で一般的な２つの癌は、それぞれ、白血病および乳癌である。白血病には４つの基本的な種類：急性リンパ性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ性白血病（CLL）、および慢性骨髄性白血病（CML）が存在する。ＣＬＬは、欧米諸国で最も高頻度の白血病であり、７大先進国でほぼ８４，０００例にのぼる。ＣＬＬは、主に、アポトーシスとして知られるプログラム細胞死過程の欠損により引き起こされる悪性状態である。アポトーシスの制御不全の結果として、血液塗抹標本の調製時に容易に破壊される成熟モノクローナルＢ細胞が、血中に蓄積される（Rozman et al.（1995）N. Engl. J. Med., Vol. 333: 1052-1057）。ＣＬＬにおいて、悪性細胞は、一部にわずかな異質性はあるが、成熟Ｂ細胞により提示される表面マーカーの大部分の発現を特徴とする、小型のＢリンパ球である（Caligaris-Cappio and Janossy（1985）Semin Hematol., Vol. 22: 1-12）。悪性ＣＬＬ細胞の最も顕著な表現型特徴は、表面のモノクローナル免疫グロブリンが事実上検出不可能な量であること、また、正常時には成熟Ｔ細胞上で見出され、成熟Ｂ細胞上では見出されない表面マーカーである、ＣＤ５の発現である（Boumsell et al.（1978）Eur. J. Immunol., Vol. 8: 900-904; Ternynck et al.（1974）Blood, Vol. 43: 789-795）。ＣＬＬの臨床経過は異質であり、一部の患者が、集中治療を必要とする侵襲性の経過を経験しうるのに対し、他の患者は、まったく治療を必要とすることなく、長期にわたる生存を経験しうる。この疾患は、悪性クローンがその悪性挙動を漸進的に増大させる、順次的な遺伝子異常を獲得するので進行性である。ＣＬＬは、老齢男性で最も罹患率が高く、診断時における中央値年齢は６４歳である。ＣＬＬが、イオン化照射または化学物質に対する曝露と関連しない唯一の成人白血病であり、免疫不全症候群を有する患者における発生が高頻度ではないことは注目に値する。
【０００５】
[0005]  ＣＭＬは、世界中でほぼ１５，０００人の患者がこれに罹患し、また、２つの異なる病期を有する、多能性造血幹細胞の障害である。持続的な骨髄増殖性の慢性期の後、急速な致死性の芽球発症が生じる。ＣＭＬでは、染色体の転座により、ＢＣＲタンパク質とＡｂｌキナーゼとの融合体が生成され、これにより、Ａｂｌの構成的活性化がもたらされる。Ａｂｌのこの構成的活性化が、慢性期ＣＭＬの誘導に十分であることが示されている。Ｇｌｅｅｖｅｃおよび他のＢＣＲ／Ａｂｌ阻害剤の導入により、ＣＭＬの治療には進展がなされているが、近年、Ｇｌｅｅｖｅｃ耐性ＣＭＬが報告されており、懸念が増大している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
[0006]  特定の種類の癌それぞれに対する個別の治療は多数存在すること、及び、かかる治療の副作用は潜在的に重度であることを踏まえて、健常な組織に対する望ましくない毒性または損傷を引き起こすことなく、複数種類の癌に対して有効な新規の癌治療剤を開発することが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
[0007]  本発明は、ＡｐｏＥペプチドを用いて癌を治療しうるという発見に基づく。したがって、本発明は、それを必要とする対象における癌を治療する方法であって、有効量の、少なくとも１つのＡｐｏＥペプチドを該対象に投与する工程を含む方法を提供する。一実施形態において、前記ＡｐｏＥペプチドの投与は、対象における腫瘍の形成を低下させる。別の実施形態において、前記ＡｐｏＥペプチドの投与は、対象における腫瘍サイズを縮小させる。別の実施形態において、前記ＡｐｏＥペプチドの投与は、対象における癌細胞のアポトーシスを誘導する。さらに別の実施形態において、前記ＡｐｏＥペプチドの投与は、対象における健全な組織に対する癌細胞の広がりを抑制する。
【０００８】
[0008]  ＡｐｏＥペプチドは、天然のＡｐｏＥホロタンパク質の１０以上の残基を含有しうる。本発明の一実施形態において、ＡｐｏＥペプチドは、ＣＯＧ１３３（配列番号１）である。別の実施形態において、ＡｐｏＥペプチドは、ＣＯＧ１１２（配列番号２）またはＣＯＧ０６８（配列番号８）である。さらに別の実施形態において、ＡｐｏＥペプチドは、ＣＯＧ１４１０（配列番号４）またはＣＯＧ３４５（配列番号６）など、ＣＯＧ１３３誘導体である。本発明において有用な他のＡｐｏＥペプチドは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国出願公開第２００９／００４２７８３Ａ１号において説明されている。
【０００９】
[0009]  一実施形態において、ＡｐｏＥペプチドは、配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号４、あるいはＮ末端もしくはＣ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方における１〜５のさらなるアミノ酸、またはアミノ酸類似体に連結され、このようなさらなるアミノ酸が、該ペプチドの活性に有害な影響を及ぼさない、米国出願公開第２００９／００４２７８３Ａ１号に記載の誘導体のいずれかを含有しうる。配列番号１もしくは配列番号２、または他のＡｐｏＥ由来ペプチドを含有するＡｐｏＥペプチドは、１２以上のアミノ酸、１３以上のアミノ酸、１４以上のアミノ酸、１５以上のアミノ酸、１６以上のアミノ酸、１７以上のアミノ酸、１８以上のアミノ酸、１９以上のアミノ酸、２０以上のアミノ酸、２５以上のアミノ酸、３０以上のアミノ酸、３５以上のアミノ酸、または４０以上のアミノ酸を含有しうる。一部の実施形態において、ＡｐｏＥペプチドは本質的に、配列番号１、配列番号２、または配列番号４からなる。他の実施形態において、ＡｐｏＥペプチドは、細胞の透過を容易にするため、タンパク質形質導入ドメインにコンジュゲートさせることができる。タンパク質形質導入ドメインには、アンテナペディア、ＴＡＴ、ＳｙｎＢ１、ＳｙｎＢ３、ＳｙｎＢ５、およびポリアルギニンに由来するペプチドが含まれうる。
【００１０】
[0010]  本発明はまた、有効量の、少なくとも１つのＡｐｏＥペプチドを投与することにより、それを必要とする対象における白血病を治療する方法も包含する。一実施形態において、前記白血病は、慢性リンパ性白血病（CLL）である。別の実施形態において、前記白血病は、慢性骨髄性白血病（CML）である。一部の実施形態において、ＡｐｏＥペプチドの投与は、対象におけるＣＤ５＋Ｂ細胞の数を減少させうる。他の実施形態において、ＡｐｏＥペプチドの投与は、対象におけるＢＣＲ／ＡＢＬ＋細胞の増殖を低下させうる。特定の実施形態において、ＡｐｏＥペプチドの投与は、対象におけるイマチニブ耐性ＢＣＲ／ＡＢＬ＋細胞またはダサチニブ耐性ＢＣＲ／ＡＢＬ＋細胞の増殖を低下させうる。
【００１１】
[0011]  本発明はまた、それを必要とする対象における乳癌を治療する方法も意図する。一実施形態において、該方法は、有効量の、少なくとも1つのＡｐｏＥペプチドを対象に投与する工程を含む。別の実施形態において、乳癌は、Ｈｅｒ２の発現を特徴とする。別の実施形態において、乳癌は、エストロゲン受容体の発現を特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】[0012]多様な形態の癌における異常なシグナル伝達カスケードの概略図である。（Ａ）ＰＩ−３キナーゼ−Ａｋｔシグナル伝達カスケードの過剰活性化が、慢性骨髄性白血病（CML）および乳癌において持続的な抗アポトーシス状態を引き起こすことを示す図である。ＢＣＲ／ＡｂｌおよびＨｅｒ２／Ｎｅｕなどの異常な受容体キナーゼによりもたらされるこの経路の構成的活性化は、Ａｋｔキナーゼのリン酸化および活性化を遷延させる。次いで、活性化したＡｋｔは、カスパーゼ９およびＢａｄを含めたアポトーシス促進性タンパク質（緑色で示す）をリン酸化し、それらの不活化をもたらす。活性化したＡｋｔはまた、ＩκＫも活性化し、これにより、ＮＦκＢ転写活性が活性化され、これにより、抗アポトーシスタンパク質であるＡ１、Ｂｃｌ−ｘＬ、および誘導性一酸化窒素シンターゼ（赤色で示す）が発現する。例えば、ＡｐｏＥペプチドによる治療を介するＰＰ２Ａの活性化は、Ａｋｔ、ＩκＫ、およびＢａｄを直接的に脱リン酸化することにより、このシグナル伝達経路の構成的活性化を可逆化する。（Ｂ）Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（CLL）におけるＴＣＬ１−Ａｋｔシグナル伝達経路を示す図である。増殖因子および生存因子は、それらの受容体を介してＰＩ−３キナーゼを活性化する。ＰＩ−３Ｋは、細胞膜に位置するリン脂質をリン酸化し、これにより、該膜へのＡｋｔキナーゼの転位を誘導し、そこで、Ａｋｔは、Ｔｈｒ３０８およびＳｅｒ４３７においてリン酸化し、これにより、該キナーゼを活性化させる。ＣＬＬの成熟Ｂ細胞において過剰発現するＴＣＬ１は、Ａｋｔキナーゼに結合し、そのキナーゼ活性をさらに上昇させる。ＴＣＬ１の過剰発現（CLLにおける）は、Ａｋｔ標的のリン酸化レベルを上昇させ、結果として、アポトーシスに対する耐性および細胞生存の延長をもたらす。
【図２】[0013]（Ａ）ＣＯＧペプチドがＡｋｔ／ＮＦκＢシグナル伝達カスケードの活性化を阻害することを示す図である。６ウェルプレート内のＢＶ２ミクログリア細胞を、５μＭ  ＣＯＧ１３３の存在下におけるＬＰＳ  １００ｎｇ／ｍＬにより処理した。細胞を回収し、Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で溶解させ、１０％のポリアクリルアミドゲル上で泳動させ、ニトロセルロースへとウェスタンブロットした。ブロットは、抗リン酸化ＩκＢα抗体、または同類の抗ＩκＢα抗体によりプローブした。（Ｂ）刺激されたＢＶ２ミクログリア細胞から単離された核を溶解させ、３２Ｐにより末端標識されたκＢ結合オリゴヌクレオチドと共にインキュベートすることにより、核内へのＮＦκＢの転位をモニタリングし、ポリアクリルアミドゲル上で泳動させた。ゲルは乾燥させ、Ｘ線フィルムに曝露した。矢印が、ＮＦκＢの位置を示す。（Ｃ）単独の、またはＣＯＧ１１２ペプチドの存在下におけるＬＰＳにより刺激されたミクログリアから単離されたリン酸化Ａｋｔキナーゼおよびアクチンについてプローブされたウェスタンブロットの濃度測定解析を示す図である。リン酸化したＡｋｔキナーゼからのシグナルは、アクチンからのシグナルにより標準化した。リン酸化Ａｋｔキナーゼについてプローブされた代表的なブロットを、棒グラフの下に示す。（Ｄ）ＣＯＧ１１２ペプチドの存在下（黒四角）または不在下（白四角）において、ＹＡＭＣ細胞をＣ．ローデンチウム（C.rodentium）に曝露したことを示す図である。表示される時点において、刺激された細胞溶解物中のＩκＫ活性をＥＬＩＳＡ法により測定した。時点０は、Ｃ．ローデンチウムにより刺激されていない細胞を示す。Ｃ．ローデンチウム単独との対比で、§：ｐ＜０．０５、§§：ｐ＜０．０１；ｎ＝３；個別の実験を２連で実施した。
【図３】[0014]ＣＯＧ１１２による処理を介するＰＰ２Ａの活性化を示す図である。ＲＡＷ細胞の培養物を、３０分間にわたり表示される化合物により処理した後で、ＮＰ４０溶解緩衝液中で溶解させた。ＰＰ２Ａを免疫沈降させ、活性についてアッセイした。
【図４】[0015]ヒト患者に由来するＣＬＬ細胞またはＰＢＭＣ細胞に対するＣＯＧ１１２についての用量反応曲線を示す図である。ＣＬＬ患者７例からＣＬＬ細胞を単離する一方で、健康な患者５例からＰＢＭＣ細胞を単離した。ヒトＣＬＬ細胞およびヒトＰＢＭＣを単離し、多様な濃度のＣＯＧ１１２に曝露したときの細胞傷害性についてアッセイした。
【図５】[0016]ＣＬＬ細胞のアポトーシスに対するＣＯＧ１１２についての用量反応曲線を示す図である。ヒトＣＬＬ細胞を単離し、ＣＯＧ１１２の濃度を上昇させながらこれに曝露した。該細胞をＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウムにより染色し、その後フローサイトメトリー解析を行うことにより、アポトーシスを解析した。Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ＋細胞／ヨウ化プロピジウム＋細胞の百分率を、ＣＯＧ１１２濃度に対してプロットする。陽性対照として、エトポシドを用いた。
【図６】[0017]ＣＬＬ細胞中ではＳＥＴが過剰発現することを示す図である。ＣＬＬ患者１２例（CLL）および正常患者５例（PBMC）に由来する細胞試料について測定された、ＳＥＴ／β−アクチン比の散布プロットを示す図であり、これにより、Ｂ−ＣＬＬ細胞内におけるＳＥＴ発現の著明な上昇が示される。ＳＥＴタンパク質およびβ−アクチンタンパク質を表わすウェスタンブロットを、プロットの下に示す。
【図７】[0018]ＢＣＲ／ＡＢＬ＋  Ｋ５６２  ＣＭＬ細胞に対するＣＯＧ１１２の効果を示す図である。（Ａ）Ｋ５６２  ＣＭＬ細胞に対するＣＯＧ１１２についての用量反応曲線を示す図である。陽性対照として、イマチニブを用いる。（Ｂ）ＣＯＧ１１２およびイマチニブが、Ｋ５６２  ＣＭＬ細胞の増殖に対して相乗効果を及ぼすことを示す図である。ＢＣＲ／Ａｂｌ＋  Ｋ５６２  ＣＭＬ細胞は、表示される化合物または化合物の組合せの存在下で増殖させ、トリパンブルーにより染色した。培養物中における、トリパンブルー染色された細胞の数をカウントし、時間に対してプロットした。
【図８】[0019]（Ａ）化合物により処理されないか、または２４時間にわたり用量０．５μＭもしくは１．０μＭのＣＯＧ１１２により処理された、Ｋ５６２細胞のリン酸化ＢＣＲ／ＡＢＬについてのウェスタンブロット解析を示す図である。（Ｂ）２４時間にわたり表示される用量のＣＯＧ１１２により処理されたＫ５６２細胞のＰＰ２Ａ活性を示す図である。
【図９】[0020]１μＭ  ＣＯＧ１１２ペプチドの不在下および存在下における、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞白血病細胞の増殖曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
[0021]  本発明は、ＡｐｏＥペプチドを用いて多様な形態の癌を治療しうるという発見に基づく。したがって、本発明は、それを必要とする対象に少なくとも１つのＡｐｏＥペプチドを投与することにより、該対象における癌を治療する方法を提供する。
【００１４】
[0022]  ＣＯＧペプチドとも呼ばれるＡｐｏＥペプチドは、天然のＡｐｏＥホロタンパク質に由来するペプチドである。本発明の一実施形態において、ＡｐｏＥペプチドは、ＡｐｏＥの残基１３３〜１４９を含みうる。別の実施形態において、ＡｐｏＥペプチドは、ＣＯＧ１３３（LRVRLASHLRKLRKRLL（配列番号１））である。ＣＯＧ１３３は、脳虚血または脳炎を治療または軽減するのに有用であることが既に分かっている。２００２年９月２３日に出願され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国出願公開第２００３／００７７６４１Ａ１号を参照されたい。ＡｐｏＥ  １３０〜１５０ペプチドの多数の類似体が既に作製され、炎症性サイトカインおよびフリーラジカルの放出に対する抑制についての細胞ベースのアッセイにおいて、また、受容体結合アッセイにおいて、それらの活性が既に調べられている（それらの各々の内容が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Lynch et al.（2003）J. Biol. Chem., Vol. 278（4）: 48529-33；また、2002年9月23日に出願された米国出願公開第２００３／００７７６４１Ａ１号；2007年4月17日に交付された米国特許第７，２０５，２８０号；および1999年3月1日に出願された米国出願第０９／２６０，４３０号）。本発明の方法において有用なＡｐｏＥペプチドは、アミノイソ酪酸およびアセチルリシンなど、非天然のアミノ酸置換、また、該ペプチドのアルファ螺旋含量を増大させる他の修飾を有する誘導体を含めた、天然のＡｐｏＥタンパク質に由来する１０以上の残基を含有するペプチドの誘導体でありうる。例えば、本発明の方法において用いるのに適するＡｐｏＥペプチド誘導体には、
【００１５】
【表１】
0005706818.tif 000002
【００１６】
【表２】
0005706818.tif 000003
［式中、（ＮＭｅ）−Ｌは、Ｎ−メチル化ロイシンであり、Ａｉｂは、アミノイソ酪酸であり、（orn）は、オルニチンであり、（narg）は、ニトロアルギニンであり、（NLe）は、ノルロイシンであり、（harg）はホモアルギニンであり、（dmarg）は、ジメチルアルギニンであり、（aclys）は、アセチルリシンであり、（azlys）は、アザリシンであり、Ａｃは、アセチル化されたカルボキシ末端である］が含まれるがこれらに限定されない。
【００１７】
[0023]  一部の実施形態において、ＡｐｏＥペプチドは、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００８／０８００８２において説明される通り、また、ＳＥＴとしても知られる、タンパク質ホスファターゼ２Ａ内因性阻害剤２（I2PP2A）に結合しうる。他の実施形態において、ＡｐｏＥペプチドは、配列ＬＲＶＲＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬ（配列番号１）を有するペプチドであるＣＯＧ１３３の類似体または誘導体である。別の実施形態において、ＡｐｏＥペプチドは、ＣＯＧ１４１０（Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-KRLL-ＮＨ２（配列番号４））である。別の実施形態において、ＡｐｏＥペプチドは、ＣＯＧ３４５（LRVRLAS-aib-LRKLRK（ac）RLL（配列番号６））である。
【００１８】
[0024]  本発明の別の実施形態において、ＣＯＧ１３３および他のＡｐｏＥペプチドの有効性は、２００５年９月２日に出願され、２００４年９月２日に出願された米国仮出願第６０／６０６，５０６号、２００４年９月９日に出願された同第６０／６０８，１４８号、２００４年９月２日に出願された同第６０／６０６，５０７号の優先権を主張し、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願第ＷＯ２００６／０２９０２８号において説明される通り、タンパク質形質導入ドメイン（PTD）へのコンジュゲーションにより改善することができる。ＰＴＤは、さもなくば細胞膜の横断が不可能であるか、または最小限度にとどまるであろうカーゴの細胞内送達を促進する、短鎖の塩基性ペプチドである。ＡｐｏＥペプチドにコンジュゲートしうるＰＴＤの非限定的な一部の例には、アンテナペディア、ＳｙｎＢ１、ＳｙｎＢ３、ＳｙｎＢ５、ＴＡＴ、およびポリアルギニンが含まれる。例えば、本発明のＡｐｏＥペプチドにコンジュゲートしうる例示的なＰＴＤ配列には、
【００１９】
【表３】
0005706818.tif 000004
が含まれる。
【００２０】
[0025]  他の適切な担体は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２０５，２８０号で開示されている。好ましい実施形態において、ＡｐｏＥペプチドは、アンテナペディアにコンジュゲートする。別の好ましい実施形態において、ＡｐｏＥペプチドは、ＣＯＧ１１２（RQIKIWFQNRRMKWKKCLRVRLASHLRKLRKRLL（配列番号２））である。一実施形態において、ＡｐｏＥペプチドは、ＳｙｎＢ３にコンジュゲートする。別の実施形態において、ＡｐｏＥペプチドは、ＣＯＧ０６８（RRLSYSRRRFLRVRLASHLRKLRKRLL（配列番号８））である。
【００２１】
[0026]  加えて、ＣＯＧ１４１０などの薬剤は、有効性が増強され、より高度の治療指数を示す。本明細書で用いられる「治療指数」とは、動物が死滅しない最大耐量を、傷害後における効能が生理食塩液対照より著明に良好である最小有効量で除した値を指す。
【００２２】
[0027]  理論に拘束されずに述べると、本発明の発明者らは、ＣＯＧ１３３およびその誘導体が、タンパク質ホスファターゼ２Ａ（PP2A）の活性化剤であると考える根拠を有する。したがって、本発明の一実施形態において、ＡｐｏＥペプチドは、治療される細胞におけるＰＰ２Ａ活性を上昇させる。ＡｐｏＥペプチドによるＰＰ２Ａの活性化はまた、Ａｋｔキナーゼ、ＩκＫキナーゼ、およびＮＦκＢの活性も低下させ、これによりアポトーシスの誘導を促進する。したがって、一部の実施形態において、ＡｐｏＥペプチドは、治療される細胞におけるＡｋｔキナーゼの活性を低下させる。他の実施形態において、ＡｐｏＥペプチドは、治療される細胞、すなわち、癌細胞のアポトーシスを誘導する。
【００２３】
[0028]  本発明のペプチドは、当技術分野で知られる標準的な技法により作製することができる。本発明のペプチドは、検出および追跡のために、放射性標識、重原子標識、および蛍光標識など、各種の標識部分に結合させる場合もある。蛍光標識には、ルシフェリン、フルオレセイン、エオシン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、ロダミンＧｒｅｅｎ、テトラメチルロダミン、ロダミンＲｅｄ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、クマリンおよびＮＢＤフルオロフォア、ＱＳＹ  ７、ダブシル（dabcylおよびdabsyl）発色団、ＢＯＤＩＰＹ、Ｃｙ５などが含まれるがこれらに限定されない。
【００２４】
[0029]  これらのペプチドに関連する機能的活性を増強する、本明細書で開示されるペプチドの修飾は、当業者によるならば容易に達成することができるであろう。例えば、機能的活性を保持しながら、可溶性、血清中における安定性などのパラメータを増強する目的で、本発明の方法で用いられるペプチドを、化学修飾することもでき、他の分子にコンジュゲートさせることもできる。特に、本発明のペプチドは、Ｎ末端においてアセチル化させ、かつ／またはＣ末端においてアミド化させることもでき、アルブミン、免疫グロブリンおよびそれらのフラグメント、トランスフェリン、リポタンパク質、リポソーム、α−２−マクログロブリン、α−１−糖タンパク質、ＰＥＧ、ならびにデキストランが含まれるがこれらに限定されない、血清中における安定性を増強する分子にコンジュゲート、複合体化、または融合させることもできる。このような分子は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＵＳ６，７６２，１６９において詳細に説明されている。
【００２５】
[0030]  本発明のペプチド剤の別の変異体は、治療用ペプチドのＮ末端アミノ酸またはＣ末端アミノ酸に対する、１〜１５アミノ酸または類似体の連結である。本発明のペプチドの類似体はまた、活性ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方に１〜１５のさらなるアミノ酸を付加することによっても調製することができ、この場合、このようなアミノ酸付加は、該ペプチドが、本発明のペプチドが結合する部位において、受容体に結合する能力に有害な影響を及ぼさない。例えば、ＣＯＧ１３３、ＣＯＧ１４１０、およびＣＯＧ３４５の変異体は、該活性ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方に１〜１５のさらなるアミノ酸を付加することにより作製することができる。
【００２６】
[0031]  本発明のＡｐｏＥペプチドには、本明細書で記載されるペプチドの保存的変異体がさらに含まれる。本明細書で用いられる保存的変異体とは、ペプチドの生物学的機能に有害な影響を及ぼさないアミノ酸配列の変化を指す。変化した配列が、ペプチドと関連する生物学的機能を阻止または破壊する場合、置換、挿入、または欠失は、該ペプチドに有害な影響を及ぼすと言う。例えば、ペプチドの全体的な電荷、構造、または疎水性／親水性特性は、生物学的活性に有害な影響を及ぼすことなく変化させることができる。したがって、ペプチドの生物学的活性に有害な影響を及ぼすことなく、該ペプチドを、例えば、より疎水性または親水性とするように、アミノ酸配列を変化させることができる。通常、ペプチドの保存的置換による変異体、類似体、および誘導体は、開示される配列である配列番号１、２、４、および６に対して、少なくとも約５５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％〜９９％のアミノ酸配列同一性を有する。本明細書において、このような配列に関する同一性または相同性とは、該配列を整列し、必要な場合、ギャップを導入して百分率による最大の相同性を達成し、また、保存的置換を配列同一性の一部としては考えずにおいた後で、候補配列中において、既知のペプチドと同一なアミノ酸残基の百分率として定義される。ペプチド配列中のＮ末端、Ｃ末端、または内部における伸長、欠失、または挿入は、相同性に影響を及ぼすとはみなさないものとする。
【００２７】
[0032]  したがって、本発明のペプチドには、配列番号１、２、４、および６で開示されるアミノ酸配列を有する分子；該治療用ペプチドのうち、少なくとも約３、４、５、６、１０、１５以上のアミノ酸残基に対する保存的配列を有するそれらのフラグメント；開示される配列のＮ末端もしくはＣ末端、またはその内部にアミノ酸残基が挿入される、このようなペプチドのアミノ酸配列変異体；別の残基により置換された、開示される配列、または上記で定義されたそれらのフラグメントのアミノ酸配列変異体が含まれる。本発明のペプチド配列を含むペプチド化合物は、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０以上のアミノ酸でありうる。意図される変異体には、例えば、相同組換え、部位指向性突然変異誘発、またはＰＣＲによる突然変異誘発を介する、所定の突然変異を含有する変異体、ならびにウサギ、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、および非ヒト霊長動物種が含まれるがこれらに限定されない他の動物種の対応するペプチド、ならびに天然のアミノ酸以外の部分を伴う置換、化学的手段、酵素的手段、または他の適切な手段（例えば、酵素または放射性同位体などの検出可能部分）を介して、ペプチドが共有結合により修飾されている誘導体がさらに含まれる。
【００２８】
[0033]  ＣＯＧ１３３、ＣＯＧ１１２、およびこれらの誘導体が含まれるがこれらに限定されないＡｐｏＥペプチドは、遊離形態の場合もあり、薬学的に許容される塩形態の場合もある。これらには、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガンなどの無機塩が含まれる。また、酢酸、プロピオン酸、ピルビン酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、サリチル酸などが含まれるがこれらに限定されない有機酸によって、ペプチドの各種の有機塩を作製することもできる。
【００２９】
[0034]  一実施形態において、本発明のペプチドは、薬学的に許容される担体と組み合わせて用いられる。したがって、本発明はまた、対象への投与に適する医薬組成物も提供する。このような組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせた、有効量の、本発明のＡｐｏＥペプチドを含む。担体は、組成物が非経口投与に適合するように液体の場合もあり、固体、すなわち、経口投与用に調合された錠剤または丸薬の場合もある。さらに、担体は、組成物が吸入用に適合するように、噴霧用液体または噴霧用固体の形態でもありうる。非経口投与される場合、組成物は、発熱物質を含まず、許容される非経口担体中にあるものとする。活性薬剤は、代替的に、既知の方法を用いて、リポソーム中に封入する形で調合することもできる。当技術分野で知られる技法を用いて、本発明のペプチドを鼻腔内投与用に調製することができる。本発明のペプチドは、例えば、クリームまたはゲルの形態における局所投与用に調合することもできる。局所用製剤は特に、皮膚癌を治療するのに有用である。他の実施形態では、ＡｐｏＥペプチドを、坐剤形態など、直腸内投与用に調合することもできる。一部の実施形態において、ＡｐｏＥペプチドの直腸内投与は、結腸直腸癌の治療に好ましい場合がある。
【００３０】
[0035]  本発明のペプチドの医薬調製物は、任意選択により、薬学的に許容される希釈剤または添加剤を包含しうる。
【００３１】
[0036]  本発明のＡｐｏＥペプチドの有効量とは、腫瘍のサイズ、腫瘍の増殖、癌細胞の広がり、癌細胞数、生存など、癌と関連する少なくとも１つの症状または病態を、該ペプチドの不在下において生じる症状または病態と比較して軽減する量である。一実施形態において、有効量のＡｐｏＥペプチドは、対象の細胞内におけるＡｋｔキナーゼ活性またはＰＰ２Ａ活性を調節する。有効量（および投与方式）は、個体ベースで決定され、用いられる具体的なペプチド、ならびに対象（体格、年齢、全般的な健康状態）、治療される具体的な癌（例えば、CLL、CML、乳癌）、治療される症状の重症度、求められる結果、用いられる具体的な担体または医薬製剤、投与経路、および当業者には明らかな他の因子の考慮に基づく。有効量は、当技術分野で知られる技法を用いて、当業者により決定されうる。本明細書で記載されるペプチドの治療有効量は、当技術分野で知られるｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験、動物モデル、または他の用量−反応試験を用いて決定することができる。
【００３２】
[0037]  本発明のペプチドを投与する代替的な方法は、対象に、該ペプチドをコードする核酸配列を保有するベクターを投与することによっても実施され、この場合、該ベクターは、該ペプチドが発現し、分泌されるように、体内の細胞に入ることが可能である。適切なベクターは、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、およびレトロウイルスを含めたウイルスベクターであることが典型的である。ベクター送達系を用い、遺伝子治療を実施する技法は、当技術分野で知られている。ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターが、本発明の化合物を投与する工程において用いうるベクターの具体的な種類である。
【００３３】
[0038]  本発明のペプチドは、癌を治療するのに単独で用いることもでき、例えば、化学療法剤（クロラムブシル、シクロホスファミド）、コルチコステロイド（プレドニゾン、プレドニゾロン）、フルダラビン、ペントスタチン、クラドリビン、イマチニブ（Gleevec）、ダサチニブ（Sprycel）、ホルモン療法（タモキシフェン、アロマターゼ阻害剤）、および放射線照射など、癌を治療するのに一般的に用いられる他の治療剤と組み合わせて用いることもできる。
【００３４】
[0039]  本発明のペプチドは、急速投与（すなわち、癌の診断をもたらす事象の発症時、またはその直後における投与）も可能であり、予防投与（例えば、予定される手術の前、または癌の徴候もしくは症状の出現前における）も可能であり、投与しなければ発生する症状の進行を抑制または改善するように、癌の経過中における投与も可能である。投与回数および投与間隔は対象の症状により変化し、当業者により決定される通り、数時間、数日間、数週間以上の時間経過にわたり、数時間から数日間の間隔投与することができる。
【００３５】
[0040]  毎日の典型的なレジメは、１日当たり約０．０１μｇ／体重ｋｇ、１日当たり約１ｍｇ／体重ｋｇ、１日当たり約１０ｍｇ／体重ｋｇ、１日当たり約１００ｍｇ／体重ｋｇ、１日当たり約１，０００ｍｇ／体重ｋｇでありうる。投与される具体的なＡｐｏＥペプチドに応じて、用量は、１日当たり約１ｍｇ／体重ｋｇ〜約５００ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは１日当たり約２５ｍｇ／体重ｋｇ〜約４００ｍｇ／体重ｋｇ、またはより好ましくは１日当たり約５０ｍｇ／体重ｋｇ〜約２５０ｍｇ／体重ｋｇでありうる。
【００３６】
[0041]  本発明は、有効量の、本明細書に記載の少なくとも１つのＡｐｏＥペプチドを投与することにより、それを必要とする哺乳動物対象における癌を治療する方法を提供する。ＡｐｏＥペプチドは、腫瘍の形成、腫瘍の増殖、癌性細胞の数、健全な組織への癌性細胞の広がり、および生存の短縮が含まれるがこれらに限定されない、癌と関連する１または複数の症状を軽減しうる。本発明のペプチドおよび方法により治療しうる癌には、多様な形態の白血病（CLL、CML、ALL、AML）、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、脳腫瘍、皮膚癌（黒色腫および非黒色腫）、頭頚部癌、膀胱癌、子宮内膜癌、腎細胞癌、甲状腺癌、胃癌、食道癌、胆嚢癌、肝臓癌、リンパ腫、および肉腫が含まれるがこれらに限定されない。一実施形態において、ＡｐｏＥペプチドは、多様な形態の癌において異常な形で活性化されるＡｋｔ／ＮＦκＢ経路など、シグナル伝達経路の活性化を低下させうる（実施例１を参照されたい）。ＡｐｏＥペプチドはまた、ＰＰ２Ａも活性化させうる（実施例２）。ＰＰ２Ａは、癌における血管新生および腫瘍転移に必要とされる内皮細胞運動性を負に調節することが報告されている（Gabel et al., 1999, Otolaryngol Head Neck Surg. 121: 463-468; Young, MR., 1997, Adv Exp Med Biol. 407: 311-318）。オカダ酸によるＰＰ２Ａの阻害は、細胞骨格ネットワークを破壊することにより細胞運動性を増大させ、これにより、腫瘍細胞の浸潤特性を増強する。したがって、本発明のペプチドは、ＰＰ２Ａを活性化させることにより、腫瘍細胞の転移、および癌に関連する血管新生を抑制する。本発明の一実施形態において、ＡｐｏＥペプチドの投与は、対象の癌細胞におけるＰＰ２Ａ活性を上昇させる。別の実施形態において、ＡｐｏＥペプチドの投与は、対象の癌細胞におけるＡｋｔキナーゼ活性を低下させる。別の実施形態において、ＡｐｏＥペプチドの投与は、対象の癌細胞におけるＩκＫキナーゼ活性を低下させる。別の実施形態において、ＡｐｏＥペプチドの投与は、対象の癌細胞におけるＮＦκＢキナーゼ活性を低下させる。さらに別の実施形態において、ＡｐｏＥペプチドの投与は、対象における癌細胞のアポトーシスを誘導する。
【００３７】
[0042]  本発明はまた、白血病の治療方法であって、少なくとも１つのＡｐｏＥペプチドを、該ペプチドの不在下において生じる症状と比較して、該疾患の症状を軽減する量で投与する工程を含む方法も提供する。一実施形態において、白血病は、慢性骨髄性白血病（CML）である。ＰＰ２Ａに対する負の内因性調節物質であるＳＥＴは、ＣＭＬにおいて過剰発現されており、ＰＰ２Ａを阻害し、したがって、発癌性のＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼ経路の活性化を維持する（Neviani et al.（2005）Cancer Cell. 8: 355-368）。したがって、ＣＯＧ１３３、ＣＯＧ１４１０、ＣＯＧ１１２などのＡｐｏＥペプチド、または他の任意のＡｐｏＥ類似体を投与すれば、ＰＰ２Ａが活性化され、次いで、これにより、細胞増殖および細胞生存の調節物質の脱リン酸化のほか、ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼの発癌活性の抑制が自由に行われ、したがって、白血病誘発が抑制される。一部の実施形態において、ＡｐｏＥペプチドの投与は、対象におけるＢＣＲ／ＡＢＬ＋細胞の増殖を低下させる。特定の実施形態において、ＢＣＲ／ＡＢＬ＋細胞はイマチニブ（Gleevec）および／またはダサチニブ（Sprycel）に対して耐性である、すなわち、このようなイマチニブおよび／またはダサチニブ耐性細胞の増殖は、これらいずれの化合物によっても阻害されない。理論に拘束されずに述べると、ＡｐｏＥペプチドは、細胞内におけるＰＰ２Ａ活性を上昇させることによりイマチニブ耐性細胞またはダサチニブ耐性細胞の増殖を有効に阻害することが可能であり、これにより、ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼが脱リン酸化および脱活性化されると考えられる。このような機構は、ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼに直接的に作用し、該キナーゼの突然変異により影響される、イマチニブまたはダサチニブの機構とは異なる。別の実施形態において、白血病は、慢性リンパ性白血病（CLL）である。好ましい実施形態において、ＡｐｏＥペプチドの投与は、対象におけるＣＤ５＋  Ｂ細胞の数を減少させる。別の実施形態において、白血病は、急性リンパ性白血病（ALL）である。
【００３８】
[0043]  本発明はまた、有効量の、少なくとも１つのＡｐｏＥペプチドを対象に投与することにより、該対象における乳癌を治療する方法も包含する。一実施形態において、乳癌は、Ｈｅｒ２の発現を特徴とする。別の実施形態において、乳癌は、エストロゲン受容体の発現を特徴とする。ＡｐｏＥペプチドの投与は、それらの投与後において、腫瘍の増殖を低下させることが好ましい。
【００３９】
[0044]  特定の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＡｐｏＥペプチドを含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、本発明は、癌を治療、予防、または改善するための別の薬物と共に、少なくとも１つのＡｐｏＥペプチドを含む医薬組成物を提供する。本発明のペプチドによる医薬組成物は、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、または経皮投与を含めた、それを必要とする対象への投与を容易にする形で提供することができる。参照により本明細書に組み込まれる、Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed. Remington and Gennaro, eds. Mack Publishing Co., Easton, PAを参照されたい。本発明の方法は、ＣＬＬ、ＣＭＬ、および乳癌などの癌を治療、予防、または改善するための各種の投与スケジュール、投与回数、投与間隔、および投与期間をさらに提供する。また、当技術分野で知られる通り、開示されるペプチドの機能的な変異体も包含される。これに符合して、本発明はまた、本明細書で論じられる多様な形態の癌を治療するための医薬を作製する方法における、開示されるペプチドおよびそれらの機能的変異体の使用も包含する。
【００４０】
[0045]  以下の実施例は、本発明を例示する目的で記載されるものであり、それを限定するものとみなすべきではない。
【実施例】
【００４１】
（実施例１）
ＣＯＧペプチドはＡｋｔ／ＮＦκＢ経路を調節する
[0046]  癌の多くの種類は、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（PI-3K）／Ａｋｔ経路の異常で構成的な活性化を特徴とし、この結果、転帰不良と相関する、癌細胞における抗アポトーシス環境の確立がもたらされる。インスリンなどの増殖因子が、細胞膜におけるＰ１３キナーゼを活性化すると、ホスホイノシチドがリン酸化され、細胞膜へのＡｋｔの転位がもたらされ、そこで、Ａｋｔは、Ｔｈｒ３０８およびＳｅｒ４７３におけるリン酸化により活性化される。活性化されると、Ａｋｔは、２つの機構を介して、細胞の生存にとって本質的なタンパク質を調節する（図１）。第１に、Ａｋｔは、キナーゼ媒介型の活性化または阻害を介してこれらの生存タンパク質の機能を制御することにより、生存タンパク質を調節しうる。活性化したＡｋｔは、カスパーゼ９およびＢａｄを直接的にリン酸化し、これによりこれらを不活化することが示された。カスパーゼ９が、正常なアポトーシスカスケードの早期において活性化するプロテアーゼであるのに対し、Ｂａｄは、Ｂｃｌ−ｘＬに結合し、その生存促進機能を阻害する、Ｂｃｌ−２ファミリーのアポトーシス促進タンパク質である。ＡｋｔによるＢａｄのリン酸化は、そのアポトーシス促進活性を阻害し、細胞における増殖促進性の癌性状態を増大させる。活性化されたＡｋｔが細胞を抗アポトーシス状態へとシフトさせる第２の機構は、生存タンパク質の転写および生成を増大させるシグナル伝達を介する。例えば、Ａｋｔの活性化は、ＩκＢキナーゼ（IκK）を活性化することによりＭｃｌ−１の発現を上昇させる。ＩκＢキナーゼは、ＮＦκＢの内因性阻害剤であるＩκＢをリン酸化し、ＮＦκＢの放出および活性化をもたらす。ＮＦκＢにより調節される他の抗アポトーシス遺伝子には、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＡ１のほか、誘導性一酸化窒素シンターゼ（iNOS）が含まれる。ｉＮＯＳの上方調節は、乳癌患者における急速な進行、再発の頻度、および死亡率と相関することが示されている。
【００４２】
[0047]  乳癌の約３０％では、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ遺伝子産物の発現増強まで、Ａｋｔの構成的活性化を追跡することができる。ＨＥＲ２／Ｎｅｕ遺伝子産物は、Ａｋｔを活性化して、ＰＩ−３キナーゼを活性化する、構成的に活性化された受容体チロシンキナーゼである。ＰＩ−３Ｋの同様の活性化は、ＢＣＲ／Ａｂｌ融合タンパク質による慢性骨髄性白血病の誘導の一因となる（図１Ａ）。Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（B-CLL）の発症機序に関与しているＴ細胞性白血病／リンパ腫１癌遺伝子（TCL1）は、Ａｋｔに直接結合し、Ａｋｔキナーゼ活性を増強することが判明した（Pekarsky et al.（2000）Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 97: 3028-3033）。したがって、成熟Ｂ細胞においてＴＣＬ１が発現すれば、Ａｋｔキナーゼ活性が増強され、ＣＬＬのアポトーシス特徴の破壊をもたらす、複数の抗アポトーシス因子の生成が増大するであろう（図１Ｂ）。
【００４３】
[0048]  ＣＯＧペプチドが、ＰＩ−３キナーゼ／Ａｋｔ経路、およびこれに続くＮＦκＢの活性化を調節したかどうかを決定するため、ＣＯＧペプチドの不在下および存在下にある、細菌または細菌抗原（リポ多糖）に曝露された細胞内において、該経路におけるタンパク質のリン酸化状態を解析した。第１のシリーズの実験では、６ウェルプレート内のマウスＢＶ２ミクログリアを、単独の、または５μＭ  ＣＯＧ１３３（配列番号１）ペプチドの存在下におけるＬＰＳ  １００ｎｇ／ｍＬと共にインキュベートした。細胞を溶解させ、遠心分離により清明な抽出物を調製した。ポリアクリルアミドゲルに、１レーン当たりの抽出物３０μｇずつを添加し、ＳＤＳ緩衝液中で泳動させた。ゲルからニトロセルロース膜へとタンパク質を転写した後で、これを、１０％の脱脂粉乳によりブロッキングした。次いで、抗リン酸化ＩκＢα抗体により膜をプローブした。Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ基質（GE healthcare社製）により膜を発光させ、フィルムへの曝露により可視化した。次いで、膜をストリッピングし、非リン酸化特異的抗ＩκＢα抗体を用いて、全ＩκＢについて再プローブした。抗ＧＡＰＤＨ抗体により、２連のブロットをプローブした。図２Ａに示す通り、ＣＯＧ１３３ペプチドは、ＬＰＳに誘導されるＩκＢのリン酸化を抑制した。
【００４４】
[0049]  脱リン酸化状態において、ＩκＢは転写因子ＮＦκＢに結合し、ＮＦκＢが核へと転位して生存促進タンパク質の転写を活性化することを阻止する。ＣＯＧ１３３がまた、核へのＮＦκＢの転位も抑制するかどうかを決定するため、単独の、またはＣＯＧ１３３存在下におけるＬＰＳによりＢＶ２ミクログリア細胞を刺激し、刺激された細胞からの核抽出物を調製した。核抽出物に由来するタンパク質に、ＮＦκＢ結合部位を含有する、放射性標識されたオリゴヌクレオチドを添加し、その後、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により該タンパク質を分離した。オートラジオグラフィーにより、核抽出物中に存在するＮＦκＢの量を検出した（図２Ｂ）。ＣＯＧ１３３の存在下において核内ＮＦκＢが減少したことは、このシグナル伝達カスケードが、ＡｐｏＥペプチドにより処理された細胞内において抑制されるというさらなる証拠をもたらす。
【００４５】
[0050]  ＣＯＧペプチドがまた、上流におけるＡｋｔキナーゼの活性化も抑制するかどうかを決定するため、単独の、または１μＭ  ＣＯＧ１１２（配列番号２）ペプチドの存在下におけるＬＰＳ  １０ｎｇ／ｍＬにより、ＢＶ２ミクログリア細胞を処理した。細胞溶解物を、１０％のポリアクリルアミドゲル上で泳動させた後、ニトロセルロース膜へと転写した。抗リン酸化Ａｋｔ抗体またはアクチンに対する抗体によりブロットをプローブした。ウェスタンブロットの濃度測定解析を実施し、リン酸化Ａｋｔキナーゼからのシグナルを、アクチンからのシグナルにより標準化した。濃度測定解析の結果を図２Ｃに示す。ＣＯＧ１１２は、ＬＰＳに誘導されるＡｋｔキナーゼのリン酸化を著明に低下させた。
【００４６】
[0051]  Ａｋｔキナーゼは、ＩκＢキナーゼ（IκK）をリン酸化および活性化することが可能であり、これにより、ＩκＢによるＮＦκＢの抑制が解除される。上記の通り、ＣＯＧペプチドは、ＩκＢのリン酸化と、その後Ｔｏｌｌ様受容体４アゴニスト（ＬＰＳ）により誘導される、ＮＦκＢの活性化とを抑制する。ＣＯＧペプチドがまた、ＩκＫ活性にも影響を及ぼすかどうかを決定するため、単独の、またはＣＯＧ１１２（配列番号２）の存在下におけるＣ．ローデンチウム菌に曝露された、若齢成体マウス結腸（YAMC）細胞内の細胞質溶解物中において、ＩκＫ活性を評価した。ＩκＫ活性は、特異的ＥＬＩＳＡアッセイ（K-LISATM検出キット、Calbiochem/EMD Biosciences社製）を用いて測定した。９６ウェルプレートのグルタチオニンでコーティングしたウェル内において、Ｓｅｒ３２およびＳｅｒ３６のＩκＢ−αキナーゼリン酸化部位を包含する、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）タグを付したＩκＢ−α融合ポリペプチド基質と共に、細胞質からの細胞抽出物をインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートさせた抗リン酸化ＩκＢ−α抗体を用いて、リン酸化したＧＳＴ−ＩκＢ−α基質を検出した。プレートリーダー内において、４５０ｎｍでキナーゼ活性に比例する光学濃度を測定した。ＣＯＧ１１２の存在下（黒四角）または不在下（白四角）において、Ｃ．ローデンチウムにより誘導されたＩκＫ活性化の時間経過を、図２Ｄに示す。時点０は、Ｃ．ローデンチウムにより刺激されなかった細胞を示す。ＣＯＧ１３３処理について観察された、ＩκＢのリン酸化およびＮＦκＢの活性化に対する抑制と同様に、ＣＯＧ１１２は、ＩκＫ活性を実質的に抑制した。
【００４７】
[0052]  これらの実験の結果は、ＣＯＧペプチドが、刺激により誘導されるＡｋｔキナーゼの活性化のほか、下流におけるシグナル伝達も抑制しうることを示し、これは、ＣＯＧペプチドが、Ａｋｔ／ＮＦκＢシグナル伝達経路の過剰活性化を有効に調節しうることを示唆する。
【００４８】
（実施例２）
ＣＯＧ１１２はＰＰ２Ａを活性化する
[0053]  マウスマクロファージＲＡＷ細胞を、２μＭ  ＣＯＧ１１２（配列番号２）、１０ｎＭオカダ酸（ＰＰ２Ａの阻害剤）、またはオカダ酸およびＣＯＧ１１２と共にインキュベートした。３０分後において、細胞を溶解させ、ＰＰ２Ａの触媒性Ｃサブユニットを標的とする抗体を添加することにより、ＰＰ２Ａを免疫沈降させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより免疫沈降物の半分を分離し、ニトロセルロース上へとブロットし、抗ＰＰ２ＡＣ抗体によりプローブした。免疫沈降した酵素に、ホスホトレオニン基質のペプチドを含有するアッセイカクテル１２５μＬを添加することにより、残りの部分の活性についてアッセイした。３７℃で振とうしながらインキュベートした後、アリコート２５μＬを取り出し、遊離リン酸をキレート化し、キレートが形成されると変色する、モリブデン酸アンモニウム溶液（Upstate社製）に添加した。様々な時間間隔でアリコートを取り出し、リン酸標準曲線との比較により、ペプチドから放出される遊離リン酸量を決定した。リン酸放出速度は、時間経過データへの直線近似により決定し、相対ＰＰ２Ａ濃度により標準化した。リン酸放出速度により測定されるＰＰ２Ａ活性が、ＣＯＧ１１２の存在下において上昇した（図３）ことは、ＡｐｏＥペプチドが、ベースラインにおけるＰＰ２Ａ活性の阻害を緩和することを示唆する。予測される通り、オカダ酸のみの存在下では、ＰＰ２Ａ活性が抑制された。しかし、オカダ酸の存在下においてＣＯＧ１１２がＰＰ２Ａ活性を上昇させたことは、細胞内における活性ＰＰ２Ａと不活性ＰＰ２Ａとの間に平衡が存在するが、ＣＯＧ１１２によりこの平衡をシフトさせ、活性ＰＰ２Ａ酵素の量を調節しうることを示唆する（図３）。したがって、ＡｐｏＥペプチドにより、細胞内における活性ＰＰ２Ａのプールを調節することができる。
【００４９】
（実施例３）
ＣＯＧ１１２はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＢ−ＣＬＬ細胞を死滅させる
[0054]  慢性リンパ性白血病（B-CLL）におけるＢ細胞の抗アポトーシス状態の遷延は、部分的に、Ａｋｔ／ＮＦκＢシグナル伝達カスケードの過剰活性化に起因すると考えられている。ＰＰ２Ａは、ＡｋｔキナーゼおよびＩκＫキナーゼの脱リン酸化および不活化により、このシグナル伝達経路に拮抗することが知られている（Kuo et al.（2008）J Biol Chem., Vol. 283: 1882-1892; Kray et al.（2005）J Biol Chem., Vol. 280: 35974-82）。ＰＰ２Ａはまた、カスパーゼの脱リン酸化および活性化によりアポトーシス経路も調節することが可能であり、これが、アポトーシスの誘導早期において役割を果たす。したがって、細胞においてＰＰ２Ａ活性が損なわれるなら、これは、抗アポトーシス状態を温存するＡｋｔ経路の構成的活性化に寄与するであろう。実際、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子の一部を包含する１１ｑ２２〜ｑ２３における欠失は、Ｂ−ＣＬＬにおいて２番目に一般的な染色体異常を表わす。ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子は、一般に腫瘍抑制因子として知られるＰＰ２ＡのＡβ定常調節サブユニットをコードする。これが欠失する結果、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂの発現が抑制され、これは、Ｂ−ＣＬＬ細胞におけるＰＰ２Ａ活性の低下と関連する（Kalla et al.（2007）Eur J Cancer, Vol. 43: 1328-35）。これらの患者は、生存率の低下を特徴とし、ＣＬＬの腫瘍細胞は、生存率の上昇を示す。
【００５０】
[0055]  実施例１および２に示した通り、ＣＯＧペプチドは、Ａｋｔ／ＮＦκＢシグナル伝達カスケードの活性化を抑制しうるほか、ＰＰ２Ａも活性化しうる。ＣＯＧペプチドが、Ｂ−ＣＬＬ細胞におけるＡｋｔ／ＮＦκＢ経路の過剰活性化に拮抗し、アポトーシスを有効な形で誘導しうるかどうかを決定するため、ＣＯＧペプチドにより、ＣＬＬ患者から新規に単離したＢ−ＣＬＬ細胞に対する細胞傷害性試験を実施した。ＣＬＬ患者から採血し、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）ヒトＢ細胞濃縮カクテルを用いて、ＣＤ５＋／ＣＤ１９＋  ＣＬＬ細胞を単離した。Ｔ細胞、単球、およびＮＫ細胞をそれぞれ除去する、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ２抗体、および抗ＣＤ１６抗体を含有する適切な抗体カクテルを用いるこの方法では、全血液から、Ｔ細胞、単球、およびＮＫ細胞を枯渇させる。抗体カクテルは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）など、浮遊密度勾配媒体により遠心分離するとき、ヒト全血液中における無用の細胞が、遊離ＲＢＣと共にペレットを形成するように、該細胞を、免疫ロゼットを形成する多数の赤血球へと架橋させ、これにより、ロゼット細胞の密度を増大させる。高度に濃縮されたＢ細胞またはＢ−ＣＬＬ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌと血漿との間の界面に残る。
【００５１】
[0056]  ７２時間にわたり、単離されたＢ−ＣＬＬ細胞（９６ウェルプレート内における細胞０．２５×１０６個／ウェル）にＣＯＧペプチドを適用した後で、ＭＴＳアッセイ（Pharmacia社製）を用いて生細胞を評価した。投入されたＣＬＬ細胞の５０％を死滅させるのに有効であるＣＯＧペプチド濃度（ED50）を決定した。表Ｉに示す通り、ＣＯＧ１３３（配列番号１）は、ＣＯＧ０５６（配列番号３）対照と比べて、活性が若干改善された。ＣＯＧ０５６は、ＣＯＧ１３３の変化形であり、これと同じアミノ酸組成物を含有するが、このペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける活性を消失させるスクランブル配列を有する。ＣＯＧ１３３の改変形であるＣＯＧ２４８（配列番号５）は、ＣＯＧ１３３と比較して活性の増強を示す。アンテナペディアホメオボックスドメインのタンパク質形質導入ドメインにより細胞透過が上昇する結果、ＣＯＧ１３３（ＣＯＧ１１２；配列番号２）のＥＣ５０は、２２４±１２０ｎＭへと頑健に改善される。ミクログリア細胞において、ＣＯＧ１３３と比べて、ＮＯ生成を抑制する効力の改善を示したＣＯＧ１４１０（配列番号４）が、Ｂ−ＣＬＬ細胞に対する細胞傷害性の効力では差違を示さなかったことは興味深い。
【００５２】
【表４】
0005706818.tif 000005
【００５３】
[0057]  ＣＬＬ細胞に対するＣＯＧ１１２の細胞傷害活性が強力であることを踏まえ、正常な単核細胞についての細胞傷害性試験を実施して、その効果が、一般的な細胞傷害効果に起因したのか、または選択的なＣＬＬ細胞傷害機構が生じたのかを決定した。白血病患者および正常なボランティア被験者から、それぞれ、さらなるＢ−ＣＬＬ細胞および末梢血単核細胞（PBMC；すなわち正常なＢ細胞）を単離し、ある濃度範囲のＣＯＧ１１２により処理した。図４に示す通り、ＣＯＧ１１２は、患者から単離されたＣＬＬ細胞において細胞傷害性であり、ＥＣ５０は、上記の表Ｉに示されるほぼ２２５ｎＭの濃度であった。正常なボランティア被験者に由来するＰＢＭＣにおける細胞傷害性のＥＣ５０は、約２０μＭで、ほぼ２ｌｏｇ単位高濃度であることが判明した。同様のデータは、老齢のＴＣＬ−１トランスジェニックマウス（ＣＬＬのマウスモデル）から単離された脾臓ＣＬＬ細胞からも得られた。トランスジェニックマウス細胞において、ＣＯＧ１１２が、約１．５μＭのＥＤ５０で細胞傷害性であったのに対し、対照化合物であるＣＯＧ０５６は、ＥＤ５０＞２５ｕＭを示した。これらのデータは、ＡｐｏＥペプチドが、Ｂ−ＣＬＬ細胞に対して強力で選択的な細胞傷害活性を示すことを裏付け、ＡｐｏＥペプチドが、Ｂ−ＣＬＬに有用な治療剤でありうることの証拠となる。
【００５４】
（実施例４）
ＣＯＧ１１２はヒトＢ−ＣＬＬ細胞におけるシグナル伝達カスケードを調節する
[0058]  既に論じた通り、Ａｋｔ／ＮＦκＢ経路を介する異常なシグナル伝達は、ＣＬＬ患者におけるＢ細胞の抗アポトーシス状態の遷延に寄与すると考えられる。ＣＬＬ患者におけるＰＰ２Ａの下方調節は、Ａｋｔ／ＮＦκＢ経路の構成的活性化に寄与し、増殖状態の維持を促進する。そこで、本発明者らは、ヒトＣＬＬ患者に由来するＢ細胞内における各種のシグナル伝達カスケードに対するＣＯＧ１１２の効果を示し、これらのカスケードにＣＯＧ１１２が影響を及ぼす機構を解明するための実験をデザインした。
【００５５】
[0059]  第１のシリーズの実験では、新規に単離されたＢ−ＣＬＬ細胞に対して、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ染色を用いるアポトーシスアッセイを実施し、ＣＯＧ１１２が、これらの細胞における抗アポトーシス状態を可逆化し、アポトーシスを誘導しうるかどうかを決定した。ＣＬＬ患者から採血し、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）ヒトＢ細胞濃縮カクテルを用いて、ＣＤ５＋／ＣＤ１９＋  ＣＬＬ細胞を単離し（実施例３を参照されたい）、ＣＯＧ１１２の濃度を上昇させながら、これにより処理した。アポトーシスは、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キット（BD Bioscinences-Pharmingen社製）を用いて測定した。１倍濃度の結合緩衝液（ｐＨ７．４の１０ｍＭ  HEPES、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）中で１５分間にわたり、ＣＯＧ処理細胞およびＣＯＧ非処理細胞を、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ染色およびヨウ化プロピジウム染色し、フローサイトメトリーにより解析した。アポトーシス誘導についての陽性対照として、エトポシド１００μｇ／ｍＬにより、１アリコートの細胞を処理した。図５に示す通り、ＣＯＧ１１２の濃度が上昇するにつれ、アポトーシスの用量依存的な増大が観察された。アポトーシス誘導のＥＤ５０は、ＣＬＬ癌細胞に対するＣＯＧ１１２による細胞傷害性のＥＤ５０（実施例３を参照されたい）を密接に反映した。これらの結果は、ＣＬＬ細胞に対するＣＯＧ１１２の細胞傷害性が、少なくとも部分的には、アポトーシスの誘導を介して生じることを示唆する。
【００５６】
[0060]  第２のシリーズの実験では、Ｂ−ＣＬＬ細胞におけるＳＥＴ（タンパク質ホスファターゼ２Ａ阻害剤２タンパク質（I2PP2A））の発現を評価して、ＳＥＴの過剰発現が、ＣＭＬについて報告される（Neviani et al.（2006）Cancer Cell, Vol. 8: 355-68）通りに、ＣＬＬにおける異常なシグナル伝達に寄与するかどうかを決定した。実施例３に記載の通り、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）ヒトＢ細胞濃縮カクテルを用いて、１２例の白血病患者からはＣＤ１９＋／ＣＤ５＋  ＣＬＬ細胞、また、５例の正常なボランティア被験者からはＣＤ１９＋  Ｂ細胞を、全血液から単離した。完全プロテアーゼ阻害剤の錠剤（Boehringer Ingelheim社製）およびホスファターゼ阻害剤（Roche社製）を溶解させたリン酸緩衝生理食塩液を含有する抽出緩衝液中において、単離された細胞を溶解させた。免疫ブロッティングを行うため、各試料につき、全タンパク質溶解物４０μｇずつを、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（SDS-PAGE）上に添加し、ニトロセルロース膜へと転写した。抗ＳＥＴ抗体を用いてＳＥＴタンパク質を検出し、これを、ＬｉＣｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ蛍光スキャナー上において、β−アクチンをローディング対照として用いて定量化および標準化した。図６に示す通り、ＰＢＭＣ対照群中におけるＳＥＴ／β−アクチン比（０．０１０±０．００３）と比べ、ＣＬＬ試料のＳＥＴ／β−アクチン比（０．０４８±０．００４）は、統計学的に有意な上昇（ｐ＜０．０００１）を示した。この過剰発現は、患者のａｐｏＥ遺伝子型の異常または細胞発生異常とは無関係であった。この４．８倍の過剰発現は、びまん性大型Ｂ細胞リンパ腫について報告されたＳＥＴレベル（Nenasheva et al.（2004）Mol Biol（Mosk）, Vol. 38: 265-75; Nenasheva et al.（2005）Int J Med Sci., Vol. 2: 122-128）と同等である。Ｂ−ＣＬＬ細胞においてＳＥＴがこのように過剰発現すれば、ＰＰ２Ａ活性を低下させるように作用し、Ａｋｔ経路およびＮＦκＢ経路を調節するＰＰ２Ａの能力を阻害し、これにより、癌細胞の抗アポトーシス状態を促進するであろう。
【００５７】
[0061]  以上の２つのシリーズの実験の結果は、ＣＬＬ細胞におけるＳＥＴ過剰発現の結果、ＰＰ２Ａ活性の低下がもたらされ、これが、これらの細胞における抗アポトーシス状態の遷延に寄与することを示す。ＣＯＧ１１２などのＣＯＧペプチドは、ＣＬＬ細胞におけるアポトーシスを誘導することが可能であり、これは、ＳＥＴタンパク質へのＣＯＧペプチドの結合を介して生じることが可能であり、これにより、ＰＰ２Ａ活性の抑制が緩和される。ＣＬＬ細胞に対するＣＯＧペプチドの細胞傷害効果の機構をさらに解明するため、重要なシグナル伝達タンパク質のリン酸化状態、およびＢ−ＣＬＬ細胞におけるＰＰ２Ａ活性に対するＣＯＧ１１２処理の効果を評価する。ＣＬＬ細胞では、Ｅｒｋ、Ａｋｔ、ＩκＫ、およびＮＦκＢが、活性化され、ｉＮＯＳ発現およびＮＯ生成が上昇することを、公表された研究は示している。ＮＯの生成は、ＣＬＬ細胞が正常なアポトーシスを受け損なう際に役割を果たすことが示唆されている。実施例３に記載の通り、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）ヒトＢ細胞濃縮カクテルを用いて、白血病患者からＢ−ＣＬＬ細胞を単離する。既に説明されている（Levesque et al.（2001）Leukemia, Vol. 15: 1307-1307; Levesque et al.（2003）Leukemia, Vol. 17: 442-450）通り、単離されたＢ細胞を、２４ウェルの組織培養プレート内のＨｙｂｒｉｄｏｍａ  ＳＦＭ（商標）１．５ｍＬ中にＣＬＬ細胞３×１０６個／ウェルで播種し、これを培養する。３７℃、空気中に５％のＣＯ２で、すべての培養物をインキュベートする。細胞を播種した後で、２μＭのＣＯＧ１１２（配列番号２）またはＣＯＧ０５６（不活性対照；配列番号３）を含有する培地を添加し、３時間にわたりインキュベートする。プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を含有するＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（NP40）溶解緩衝液中における溶解前に細胞を回収および洗浄し、清明な抽出物を調製する。
【００５８】
[0062]  ＣＯＧ１１２処理ＣＬＬ細胞およびＣＯＧ１１２非処理ＣＬＬ細胞からの抽出物に対して免疫ブロッティングを実施して、リン酸化ＥＲＫ、Ａｋｔ、ＩκＫ、およびＮＦκＢならびに全ＥＲＫ、Ａｋｔ、ＩκＫ、およびＮＦκＢ（リン酸化したＥＲＫ、Ａｋｔ、ＩκＫ、およびＮＦκＢ、ならびにリン酸化していないＥＲＫ、Ａｋｔ、ＩκＫ、およびＮＦκＢの和）を決定する。具体的に述べると、ＢＣＡアッセイキット（Pierce社製）を用いて、上記の方法により得られる細胞抽出物を解析して、各溶解物のタンパク質濃度を決定する。免疫ブロッティングを行うため、各試料につき、全タンパク質溶解物３０μｇずつを、１２．５％のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（SDS-PAGE）上に添加し、トリス−グリシンＳＤＳ緩衝液（Bio-Rad社製）を用いて電気泳動させる。電気泳動後、ＰＶＤＦ膜（Bio-Rad社製）上にタンパク質をエレクトロブロットする。３時間にわたり、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０（TBST）を含有するトリス緩衝生理食塩液中に５％の脱脂乳を用いて膜をブロッキングし、ＴＢＳＴで洗浄し、マウス抗Ａｋｔ抗体およびウサギ抗リン酸化Ａｋｔ抗体（Cell Signaling社製）中、４℃で一晩にわたりインキュベートする。洗浄液を３回交換しながら、ＴＢＳＴで１時間にわたり膜を洗浄し、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００で標識したロバ抗ウサギ抗体、およびＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０で標識したヤギ抗マウス抗体（LiCor社製）と共にインキュベートする。Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線スキャナー（LiCor社製）を用いて、タンパク質バンドを可視化および定量化する。この方法により、８００ｎｍチャネルの発光を用いるリン酸化Ａｋｔ、および６８０ｎｍチャネルの発光を用いる全Ａｋｔの同時的な定量化が可能となる。初回の読み取り後、１時間にわたりウサギ抗β−アクチン抗体を膜と共にインキュベートし、膜を洗浄する。８００ｎｍにおけるβ−アクチンシグナルを測定し、これを、ローディング対照として用いて、データを標準化しうるように、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００で標識したロバ抗ウサギ抗体を添加し、ブロットを読み取る。適切にマッチする抗体対による同様の方法を用いて、リン酸化ＥＲＫ、ＩκＫ、およびＮＦκＢ、ならびに全ＥＲＫ、ＩκＫ、およびＮＦκＢの免疫ブロットを実施および解析する。具体的なリン酸化したタンパク質の量を、具体的なリン酸化したタンパク質および具体的なリン酸化していないタンパク質の総和で除し、これに１００を乗じた比として計算され、これにより活性化の百分率を与える、具体的な各タンパク質の活性化指数を決定することにより、定量的解析を完了させる。Ｂ−ＣＬＬ細胞について、非処理試料、ＣＯＧ１１２により処理した試料、またはＣＯＧ０５６により処理した試料の３つを調べた。ＣＯＧ１１２処理ＣＬＬ細胞は、非処理細胞と比べて、リン酸化したタンパク質の量が著明に減少し、これらのシグナル伝達カスケード活性化の抑制を示すと予測される。
【００５９】
（実施例５）
Ｅμ−ＴＣＬ１トランスジェニックマウスにおけるＣＬＬに対するＣＯＧ１１２の効果
[0063]  ＣＯＧ１１２は、ヒト患者から単離されたＣＬＬ細胞に対して強力で選択的な細胞傷害活性を保有する（実施例３）。この例で概括される実験では、Ｅμ−ＴＣＬ１トランスジェニックマウスにおけるＣＬＬに対するＣＯＧ１１２の効果を評価して、ＣＯＧ１１２が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても同様の有効性を示すかどうかを決定する。ＴＣＬ１がＣＬＬ細胞では発現するが、正常な成熟Ｂ細胞では発現せず、また、ＴＣＬ１が、Ａｋｔと相互作用してその活性を増強するという証拠に基づき、ＴＣＬ１の発現を標的化することにより、著明なＣＬＬ病態を示すマウスモデルが開発されている。Ｅμ−ＴＣＬ１トランスジェニックマウスモデルでは、ＴＣＬ１遺伝子が、Ｂ細胞特異的なＩｇＶＨプロモーターおよびＩｇＨ−Ｅμエンハンサーの制御下に置かれる。これらのマウスは、成体へと正常に発育するが、後に、血中における高リンパ球カウントを伴う、脾臓、肝臓、およびリンパ節の肥大を発生させる。マウスは最終的に、進行性リンパ節腫脹の発生と共に白血球が蓄積されるため、若齢で死亡する。重要なことに、これらのトランスジェニックＴＣＬ１マウスにおける蓄積されたＢ細胞は、Ｇ０〜１期が停止され、ヒトＣＬＬ細胞とまったく同様に、ＣＤ１９＋／ＣＤ５＋／ＩｇＭ＋  ＣＬＬ細胞を発現する（Bichi et al.（2002）Proc Natl Acad Sci U S A, Vol. 99: 6955-6960）。ＴＣＬ１トランスジェニックマウスにおけるＣＬＬ症状が、臨床的に用いられる抗ＣＬＬ治療剤であるフルダラビンの投与後において改善されることは、これらのＥμ−ＴＣＬ１トランスジェニックマウスが、ヒトＣＬＬの有効なモデルとして有効であることをさらに検証する。フルダラビン治療は、生理食塩液を注射された非治療対照と比べ、マウスの生存を改善し、治療された動物における白血球カウントを低下させ、脾臓サイズを減少させた（Johnson et al.（2006）Blood, Vol. 108: 1334-1338）。ＣＬＬのＥμ−ＴＣＬ１トランスジェニックマウスモデルにおけるＣＬＬ細胞の生成および余命に対するＣＯＧ１１２の効果を評価する。
【００６０】
[0064]  第１のシリーズの実験では、各群の治療開始時における白血球カウントの平均および範囲が同等となるように、白血病の徴候を示す１２匹の老齢トランスジェニックＥμ−ＴＣＬ１マウス（９〜１２カ月齢）を、白血球カウントに基づいて２つの治療群（媒体対照群またはＣＯＧ１１２群）のうちの１つに割り当てる。皮下注射を介して、ＣＯＧ１１２または媒体対照１０ｍｇ／ｋｇにより、動物（ｎ＝６）を毎日治療する。治療の１５日後において、眼窩後出血により採血し、白血球を定量化する。白血球カウントは、媒体対照と比べて、ＣＯＧ１１２治療動物において低下すると予測される。
【００６１】
[0065]  第２のシリーズの実験では、白血病の徴候を示す老齢トランスジェニックＥμ−ＴＣＬ１マウス（９〜１２カ月齢）を、治療群（対照群、またはＣＯＧ１１２の３つの用量群のうちの１つ）へと無作為に割り当てた。治療の開始時に採血して、ベースラインのＣＤ５＋／ＣＤ１９＋  ＣＬＬ細胞カウントを決定し、媒体対照（乳化リンゲル液）、または用量４．０、１．０、もしくは０．２５ｍｇ／ｋｇのＣＯＧ１１２により、動物群（ｎ＝２０）を治療する。容量１０ｍＬ／ｋｇの腹腔内注射により、ＣＯＧ１１２または媒体対照を送達する。５週間（３５日間の総治療）にわたり、毎週５回ずつ投与するように、動物には、月曜日から金曜日まで毎日注射を施す。生存、総白血球カウントおよびリンパ球カウント、ならびにＣＤ１９＋／ＣＤ５＋細胞カウントにより、疾患経過を毎週モニタリングする。
【００６２】
[0066]  眼窩後出血により週ベースで各マウスから採血し、総白血球カウントおよびリンパ球カウントのほか、ＣＤ１９＋／ＣＤ５＋細胞カウントを決定して、白血病負荷を評価する。５週間（３５日間の治療）後において、マウスを安楽死させ、細胞カウント、脾臓重量、ならびに骨髄、脾臓、肝臓、およびリンパ節の組織学的解析により、治療後における白血病負荷を測定する。３５日以前に死亡するすべてのマウスも、同等の方法で解析する。ＣＯＧ１１２治療は、媒体で治療した動物と比較して、累積生存率の用量依存的な上昇、ならびに組織学的解析によるＣＤ１９＋／ＣＤ５＋細胞カウント、脾臓重量、およびＣＬＬ負荷の用量依存的な減少をもたらすことが予測される。
【００６３】
（実施例６）
乳癌細胞株に対するＣＯＧペプチドの効果
[0067]  実施例３に示した通り、ＡｐｏＥペプチドは、癌性Ｂ細胞に対して細胞傷害性である。そこで、本発明者らは、ＣＯＧペプチドが、乳癌など、異常な細胞シグナル伝達と関連する他の種類の癌において有効であることを示すための実験をデザインした。３つの異なる乳癌細胞におけるＰＩ−３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路、および細胞増殖に対するＣＯＧペプチドの効果を評価する。
【００６４】
[0068]  エストロゲン受容体の活性、Ａｋｔの活性化状態、Ｈｅｒ２の発現、およびＰＰ２Ａ活性について十分に記録された乳癌細胞株が多数存在する。ＥＲ陽性腫瘍およびＥＲ陰性腫瘍の両方のほか、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ陽性株およびＨｅｒ２／Ｎｅｕ陰性株を表わす、３つの細胞株を選択して解析した（表ＩＩ）。公表された研究は、Ａｋｔ、ＩκＫ、およびＮＦκＢが、乳癌細胞株において活性化し、抗アポトーシス状態をもたらすことを示している。これらの細胞株におけるシグナル伝達カスケードに対するＡｐｏＥペプチドの効果を探索するため、増殖曲線を解析し、免疫ブロッティングを用いて、シグナル伝達に関連するタンパク質を評価し、リン酸化Ａｋｔ、ＩκＫ、およびＮＦκＢならびに全Ａｋｔ、ＩκＫ、およびＮＦκＢ（リン酸化したＡｋｔ、ＩκＫ、およびＮＦκＢ、ならびにリン酸化していないＡｋｔ、ＩκＫ、およびＮＦκＢの和）の相対レベルを決定する。
【００６５】
【表５】
0005706818.tif 000006
【００６６】
[0069]  ４８ウェルプレート内のＡＴＣＣ推奨培地中において、上記の細胞株を培養する。細胞を播種した後で、以下のＣＯＧペプチドまたは不活性ペプチド対照のうちの１つを含有する培地を添加し、３７℃、空気中５％のＣＯ２で細胞をインキュベートする。ある範囲の濃度でＣＯＧペプチドを調べ、増殖阻害に関する用量力価を得る。テトラゾリウム化合物である３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩（MTS社製）、およびＰｒｏｍｅｇａ社（ウィスコンシン州、マジソン）製のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイを用いて、培養物を、増殖について毎日解析する。
【００６７】
【表６】
0005706818.tif 000007
【００６８】
[0070]  増殖曲線の決定後、新規の細胞バッチを播種し、上記で列挙したＣＯＧペプチド（COG133、COG112、COG1410、またはCOG345）、または不活性ペプチド対照（COG056またはCOG095）のうちの１つを含有する培地を添加し、様々な時間にわたり培養物と共にインキュベートする。細胞を回収し、洗浄し、完全プロテアーゼ阻害剤の錠剤（Boehringer Inglelheim社製）およびホスファターゼ阻害剤（Roche社製）を溶解させたリン酸緩衝生理食塩液を含有するＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０溶解緩衝液中において溶解させる。２０，０００ｇ、４℃で２０分間にわたり、溶解物を遠心分離する。上清を未使用の試験管に移し、ＢＣＡアッセイキット（Pierce社製）を用いて溶解物のタンパク質濃度を決定する。実施例４に記載の方法により、リン酸化Ａｋｔ、ＩκＫ、およびＮＦκＢならびに全Ａｋｔ、ＩκＫ、およびＮＦκＢについての免疫ブロットを実施する。活性ＣＯＧペプチドにより処理した乳癌細胞は、非処理細胞または不活性の対照ペプチドにより処理した細胞と比較して、増殖速度の低下、およびリン酸化タンパク質量の著明な減少を示すことが予測される。
【００６９】
（実施例７）
乳癌による腫瘍増殖に対するＡｐｏＥペプチドの効果
[0071]  乳癌の各細胞株（MDA-MB-231、MCF-7、またはBT-474）についての異種移植モデルを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＯＧペプチドによる腫瘍の治療効果を決定する。１腫瘍種類当たりの非近交系雌ヌードマウス（BT474細胞株の場合、NIHIII）１８０〜２４０匹の右腋窩上部に腫瘍断片（３０〜７０ｍｇ）を移植する。数日後、マウスのトリアージを定め、平均腫瘍負荷が約１２５ｍｇの場合、各群が、初期腫瘍負荷の総平均の１０％以内にあるように、治療群に分ける。媒体対照、陰性対照ペプチド（COG056）、陽性対照（パクリタキセル、ゲムシタビン、またはラパチニブ）、または３つの用量（０．２５、１．０、または４．０ｍｇ／ｋｇ）のＡｐｏＥペプチド（例えば、COG112、COG133、COG1410、およびCOG345）の１つによる腹腔内注射を介してマウス（ｎ＝２０）を毎日治療した。ＭＣＦ７細胞株に由来する細胞を移植したマウスには、エストラジオールペレットを毎週植え込む。体重および腫瘍サイズを毎週２回記録し、臨床徴候を毎日モニタリングする。腫瘍負荷が、腫瘍増殖遅延評価項目の１ｇ、また、完全寛解／部分寛解／腫瘍のない生存の決定に達するまで動物を治療する。ＡｐｏＥペプチド（例えば、COGペプチド）による治療は、媒体または陰性対照ペプチドによる治療と比較して、腫瘍増殖を著明に遅延させることが予測される。
【００７０】
（実施例８）
ＣＯＧ１１２はＫ５６２  ＣＭＬ細胞の増殖を阻害する
[0072]  慢性骨髄性白血病（CML）は、無痛性の慢性期（CP）から、急性白血病と生物学的に類似する、骨髄またはリンパ球による侵襲性の芽球期（BP）への進行を特徴とする（Faderl et al.（1999）N. Engl. J. Med., Vol. 341: 164-172）。発生および維持は、ＢＣＲ／ＡＢＬ癌タンパク質の抑制されないキナーゼ活性に依存する（Van Etten et al.（1989）Cell, Vol. 58: 669-678; McLaughlin et al.（1987）Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 84: 6558-6562）。これらの癌タンパク質のこうした構成的活性により、ＰＩ−３Ｋ／Ａｋｔ経路など、発癌性シグナルを伝達する複数の経路が動員および活性化され、造血性前駆細胞の生存延長、増殖増強、および分化停止がもたらされる（図１Ａ；Elefanty et al.（1990）EMBO J, Vol. 9:1069-1078を参照されたい）。
【００７１】
[0073]  ＡｐｏＥペプチドは、ＣＭＬにおいて構成的に活性化するＰＩ−３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路を調節すること可能であり（実施例１）、また、ＡｐｏＥペプチドは、ＣＬＬ細胞を効果的に死滅させた（実施例３）ので、本発明者らは、ＢＣＲ／Ａｂｌ＋  Ｋ５６２  ＣＭＬ細胞株に対するＣＯＧ１１２の効果を評価し、ＣＯＧ１１２が、Ｋ５６２細胞の増殖を遅延させうるかどうかを決定した。細胞（２０ｍＬ）を、細胞０．２５×１０６個／ｍＬの濃度で、Ｔ−７５フラスコ内に播種した。播種後毎日、細胞懸濁液０．２０ｍＬを取り出し、遠心分離して、細胞を回収した。無血清培地５００μＬ中に細胞ペレットを再懸濁させ、トリパンブルー色素１００μＬを添加し、５分間にわたりインキュベートした後で、血球計によりトリパンブルー陽性細胞をカウントした。ＣＯＧ１１２は、Ｋ５６２細胞増殖の用量依存的な阻害をもたらした（図７Ａ）。陽性対照として用いたイマチニブ（Gleevec；１μＭ）は、細胞数を著明に減少させた。ＣＯＧ１１２の特徴をさらに拡張し、ＣＯＧ１１２の活性がイマチニブの活性と相乗作用性であるか、またはアンタゴニスト性であるかを決定するため、ＣＯＧ１１２およびイマチニブの濃度を低下させて、同様の増殖解析を実施した。１μＭ  ＣＯＧ１１２または７５ｎＭイマチニブにより処理したところ、Ｋ５６２細胞増殖の阻害は、最適未満であった（図７Ｂ）。しかし、２つの処理を組み合わせたところ、いずれか単独の処理を上回る程度で細胞増殖が阻害されたことは、該処理により相加効果がもたらされたことを示す。これらのデータは、ＡｐｏＥペプチドが、ＣＭＬ癌細胞の増殖を効果的に抑制し、単独で、またはＣＭＬを治療するための他の薬物との組合せで、有効な治療剤をもたらしうることを示す。さらに、ＡｐｏＥペプチドは、イマチニブ／ダサチニブ耐性ＣＭＬ、ＣＭＬＢＣ、およびＰｈｌ（＋）ＡＬＬの治療のための新規の治療法も提供しうる。
【００７２】
[0074]  ＣＯＧ１１２がＢＣＲ／Ａｂｌ＋  Ｋ５６２  ＣＭＬ細胞に対する細胞傷害性をもたらす機構をさらに特徴づけるため、Ｋ５６２  ＣＭＬ細胞におけるリン酸化したＢＣＲ／ＡＢＬ融合タンパク質およびＰＰ２Ａの活性に対するＣＯＧ１１２の効果を決定した。上記で論じた通り、フィラデルフィア染色体（例えば、t（9;22）（q34;q11）転座の産物）により生成されるＢＣＲ／ＡＢＬ融合タンパク質の構成的活性化が、ＣＭＬにおける抑制されない細胞増殖および細胞生存をもたらすシグナル伝達の遷延における主要な原因因子である。ＣＯＧ１１２が、ＢＣＲ／ＡＢＬの活性化に対して効果を及ぼすかどうかを決定するため、２４時間にわたり、Ｋ５６２細胞を非処理のまま放置するか、または用量０．５μＭもしくは１．０μＭのＣＯＧ１１２により処理した。細胞溶解物を調製し、ウェスタンブロット解析にかけて、活性化したリン酸化ＢＣＲ／ＡＢＬを検出した。ＣＯＧ１１２によるＫ５６２細胞の処理は、リン酸化したＢＣＲ／ＡＢＬのレベルを用量依存的に低下させた（図８Ａ）。ＢＣＲ／ＡＢＬの活性化に対するＣＯＧ１１２の効果が、ＰＰ２Ａの活性化に起因しうるかどうかを調べるため、ＢＣＲ／ＡＢＬ＋  Ｋ５６２  ＣＭＬ細胞を、２４時間にわたり、ＣＯＧ１１２（０．５μＭまたは１μＭ）により処理し、既に説明されている（Neviani et al.（2007）J. Clin. Invest., Vol. 117: 2408-2421）通りに、免疫沈降／リン酸放出アッセイを用いて、ＰＰ２Ａ活性を測定した。ＣＯＧ１１２で処理すると、Ｋ５６２細胞において、ＰＰ２Ａの頑健な活性化が観察された（図８Ｂ）。まとめると、これらの結果は、ＣＯＧ１１２などのＡｐｏＥペプチドが、ＰＰ２Ａ活性の増強を介してＢＣＲ／ＡＢＬ癌遺伝子の活性化を抑制し、これにより、ＢＣＲ／ＡＢＬ＋  Ｋ５６２  ＣＭＬ細胞の増殖を抑制しうることを示唆する。このような作用機構であれば、ＰＰ２Ａの活性化による、イマチニブ／ダサチニブ耐性細胞株の増殖の阻害が報告されている（Neviani et al.（2007）J. Clin. Invest., Vol. 117: 2408-2421）、イマチニブ／ダサチニブ耐性ＢＣＲ／ＡＢＬ＋癌を治療するのに特に有用であろう。
【００７３】
（実施例９）
ＣＯＧ１１２はＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞白血病細胞の増殖を阻害する
[0075]  ＡｐｏＥペプチドが、Ｔ細胞白血病に対して治療的でありうるかどうかを決定するため、ヒト急性Ｔ細胞白血病細胞株であるＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の増殖速度に対するＣＯＧ１１２の効果を評価した。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の播種時に添加する１μＭ  ＣＯＧ１１２の不在下または存在下にある培地２ｍＬ中において、該細胞（６ウェルプレート内において、１ウェル当たりの細胞２×１０４個）を増殖させた。カウント用に毎日少量のアリコートを取り出した後で、血球計を用いて細胞増殖を測定した。図９に示す通り、ＣＯＧ１１２が、Ｔ細胞の増殖を著明に阻害したことは、ＡｐｏＥペプチドがまた、Ｂ細胞白血病のほか、Ｔ細胞白血病にも治療的でありうることを示唆する。
【００７４】
[0076]  記載される具体的な方法、プロトコール、および試薬は変化しうるので、開示される発明は、これらに限定されないことが理解される。また、本明細書で用いられる用語法は、具体的な実施形態を説明することだけを目的とするものであり、付属の特許請求の範囲だけによって限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解される。
【００７５】
[0077]  本明細書および付属の特許請求の範囲で用いられる単数形の「ある（a）」、「ある（an）」、および「その（the）」は、文脈による別段の指示が明確でない限り、複数の言及を包含することに留意されたい。したがって、例えば、「宿主細胞（a host cell）」に対する言及は、複数のこのような宿主細胞を包含し、「抗体（the antibody）」に対する言及は、当業者に知られる１または複数の抗体およびこれらの同等物に対する言及などである。
【００７６】
[0078]  別段に定義しない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語はすべて、開示される発明が帰属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試験では、本明細書に記載の方法および材料と類似または同等である任意の方法および材料を用いうるが、例示的な方法、デバイス、および材料が説明されている。本明細書で引用されるすべての特許、特許出願、および他の刊行物、ならびにそれらが引用される対象となる材料は、参照により、その全体において具体的に組み込まれる。
【００７７】
[0079]  当業者は、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの同等物である日常的な実験だけを用いることを認めるか、または確認することができる。このような同等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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