(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
回折限界の解像度を特徴とする顕微鏡であって、
異なる状態の間で切替可能な複数の色素分子（ＵＦ）で、少なくとも１つの状態が蛍光性であり、その蛍光が、対物レンズ（Ｏ）で集光され、光学系を用いて場所分解性検出器上に結像され、試料の少なくとも一部分が回折限界の解像度の逆数よりも大きな分布密度を有する、色素分子（ＵＦ）と、
該試料中の該ＵＦの第１部分集合を切り替えるために切替放射を発し、かつ、該ＵＦの第１部分集合を励起するために励起放射を発する１つまたは複数の光源とを備え、
検出光路内に、強め合う干渉の最大値で取り囲まれた弱め合う干渉によって少なくとも部分的に制限された局所的放射極小値を有する色依存の光分布（ＰＳＦ）を検出平面内に生成する、位相変化を有する位相マスクが設けられており、
前記位相マスクが、螺旋型位相マスク、半空間位相マスク、および連続的なまたは離散的な位相遅延変化を有する別のマスクのうちの少なくとも一つであり、
前記位相マスクが、少なくとも前記検出平面に沿ったＰＳＦの横方向の構造を変える、顕微鏡。
【請求項２】
前記切替えが、前記ＵＦの光活性化または光非活性化である、請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
蛍光性状態にある前記ＵＦの分布密度が、前記装置の前記回折限界の解像度の逆数よりも小さいことを保証するように、前記切替放射を制御する制御ユニットが設けられている、請求項１または２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
光分布から蛍光のスペクトル発光重心の決定、および１つまたは複数の高次回折次数の光分布の形状からスペクトル分布の決定のうちの少なくとも一つが行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
顕微鏡法において、アッベによる回折限界に対応する領域よりも小さい、蛍光により検出可能な領域が生じるように試料を照明する、解像度を向上させる方法が知られている。
【背景技術】
【０００２】
これは、さまざまな方法による非線形の相互作用によって成功する。
・予め励起された分子の誘導放出による脱励起（ＳＴＥＤ、クラーおよびヘル（Ｋｌａｒ  ａｎｄ  Ｈｅｌｌ）、Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．２４（１９９９）９５４−９５６頁参照）
・予め励起された分子の、さらなる励起による、蛍光能のないより高次の状態への脱励起（励起状態吸収（Ｅｘｃｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）、ワタナベら（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  １１（２００３）３２７１頁参照）
・三重項占有による基底状態の空乏化（基底状態の空乏化（Ｇｒｏｕｎｄ  Ｓｔａｔｅ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）、ヘルおよびクルーグ（Ｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｋｒｏｕｇ）、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｂ６０（１９９５）、４９５−４９７頁参照）
・蛍光性状態と、非蛍光性状態、僅かに蛍光性の状態または（他の発光波長、偏光など）別の特徴をもつ蛍光性状態との間での色素の切替え（ヘル、ヤコブス、およびカストラップ（Ｈｅｌｌ，Ｊａｋｏｂｓ，ａｎｄ  Ｋａｓｔｒｕｐ）、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ａ７７（２００３年）８５９−８６０参照）。
【０００３】
いわゆる光活性化局在顕微鏡（ＰＡＬ−Ｍ）は、すぐ近傍に別の発光性分子がない場合、点拡がり関数（ＰＳＦ）の半値幅よりも明らかに正確に分子の位置を定めることができることに基づく。光学的に切替可能な分子の場合、（分子を蛍光励起に適した状態に移す）活性化放射が適切な僅かな強度をもつことにより、これを保証する。励起放射は、密度の小さい分子のみを蛍光励起する。このとき、検出器上に結像される個々のＰＳＦから、分子の場所を、光子数とノイズによって制限された精度で定めることができる。励起不可能な状態に可逆的にまたは不可逆的に戻すことにより、出発状態に戻り、試料の画像が十分に高解像度になるまで、このプロセスを繰り返すことができる。
【０００４】
国際公開ＷＯ２００６／１２７６９２号には、いわゆるＰＡＬ−Ｍ法が記載されている。
この方法は、検出のＰＳＦの広がりに応じて互いに分離された個々の分子が光活性化されること、および蛍光検出によりそれらの分子の位置が高精度に決定されることに基づく。
【０００５】
国際公開ＷＯ２００６／１２７６９２号に記載されるようなＰＡＬＭ法は、基本的に、以下の第１工程を利用して、標準的な顕微鏡に比べて光学解像度が向上した顕微鏡画像を生成する。
１．）個々の分子を光活性化する：この活性化により、分子の蛍光特性が変化し（オン／オフ、発光スペクトルの変化、．．．）、この活性化は、活性化された分子間の間隔が、（アッベの解像限界によって与えられる）標準的な顕微鏡の光学解像度以上になるように行われる。
２．）活性化された分子を励起し、場所分解性検出器により分子の位置を定める。
３．）活性化された分子を非活性化する。
４．）工程１〜３を繰り返し、工程２．）からのさまざまな反復工程から得られた位置決め点を重ね合わせて、高解像度の画像を得る。
【０００６】
この活性化は、必須ではないが好ましくは広視野照明で、統計上分散させて行う。
不活性状態から活性状態に遷移し得る物質（「光学ラベル」と呼ぶ）を使用する。これらの「ＰＴＯＬ」と呼ばれる物質を、適切な活性化放射によって活性化させる。まず、試料内の標識分子の部分集合のみが活性化されて、蛍光放射を発光し得るように、試料を活性化させる。
【０００７】
次いで、励起放射を試料に充てて、蛍光性試料を結像させ、その際、蛍光放射は、活性化された部分集合にのみ由来し得る。
この蛍光が減衰した後に、新たな活性化を行うが、これは統計上の理由から、ＰＴＯＬの別の部分集合を捉える。
【０００８】
このように、全ての標識分子の量が、さまざまな部分集合に分割され、それらは次々に、蛍光に励起可能な状態に遷移する。
励起後に、蛍光放射の結像を、好ましくはセンサアレイを用いて行う。
【０００９】
対応する蛍光顕微鏡は、励起光源ならびに切替光源を備え、それらは対応する信号を試料に加える。
試料は、対物レンズによって、センサアレイ上に結像される。
【００１０】
制御配線を介して切替光源と励起光源を制御する、コンピュータが設けられている。
その場合、活性化および励起は、全反射で（図１、ＴＩＲＦ＝全内部反射蛍光）または広視野で（図２）行われる。
【００１１】
解像度は、この方法の場合、特に、分子の場所における局所的光子統計によって決まる。この解像度は、検出された蛍光光子の全数、局所強度およびバックグラウンドに関連している。
【００１２】
検出によるか、またはその後にこの統計を最適化することにより、直接に位置決め精度の向上が、したがって解像度の向上が得られる。
代わりに、このように最適化された統計により、解像度が同じ場合、より高速の画像受像が可能になり得る。
【００１３】
解像度に加えて、別の重要な特徴は、試料内のより多数の異なる分子を検出できることである。これにより、分子間の相関および試料内の構造を検査することができる。高い位置決め精度でこれらの相関を得るためには、１つの検出器上で信号を同時に検出することが、好ましい解決策である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、局所的統計（蛍光の光子およびバックグラウンドの光子）の最適化による分子の位置決めの向上と、１つの検出器での複数の分子の同時検出という前述の２つの問題に対して有利な解決策を示すことである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明によれば、この課題は有利には、光路内に、好ましくは検出光路内に、少なくとも部分的に制限された放射極小値を有する光分布（ＰＳＦ）を検出平面内で生成する、位相マスクを設けることにより、解決される。
【００１６】
好ましい使用可能な位相マスクは、螺旋型位相マスク、半空間位相マスク、ならびに、連続的または離散的な位相遅延変化を有する他のマスクである。
第２の有利な実施形態では、検出器平面内でベッセル分布（ＰＳＦ）を生成する位相マスクまたはアキシコンが、光路内に設けられている。
【００１７】
有利には、追加の環状の振幅マスクを、位相マスクと検出器との間に配置することができる。
本発明によれば、さらに、照明光路内に、照明分布をパターン化する手段が設けられるようになされている。
【００１８】
この手段は、対物面内での干渉によってこのパターンが生じるように、位相格子および／または振幅格子またはコヒーレント光の分割・重ね合わせ手段から構成することができる。
【００１９】
本発明による方法では、このパターンは、連続的にまたは離散的ステップで変位し、パターンの位置が異なる場合、少なくとも２回受像が行われ、断面像が計算される。
本発明によれば、さらに、検出光路内に、格子および／またはプリズムのような、試料光をスペクトル分割する手段が設けられるようになされている。
【００２０】
好ましい方法は、格子を用いて受像（検出）する際に、位置から、蛍光のスペクトル発光重心を求めること、および／または、１つのまたは複数の高次回折次元での光分布の形状から、スペクトル分布を求めることにある。
【００２１】
プリズムを用いた受像では、プリズムを用いた受像とプリズムを用いない受像を別々に行い、同じく、位置から蛍光のスペクトル発光重心を定める、および／または、光分布の形状からスペクトル分布を求める。
【００２２】
スペクトル分割によって重ね合わされた光分布の分離は、有利には、スペクトル分解によって行うことができる。
本発明によれば、さらに、色依存の光分布（ＰＳＦ）を検出平面内に生じさせる手段が、検出光路内に配置されるようになされている。
【００２３】
この手段は、色収差を有する光学部品、位相マスク、半空間位相マスク、振幅マスク、または、回折レンズでもよい。
本発明によれば、色依存のＰＳＦから、較正されたまたは波長の関数として計算された光分布を用いて、スペクトル発光重心を求めることができる。
【００２４】
本発明によれば、さらに、試料への照明が、試料平面と捕獲平面との間の光路の瞳平面内および／またはその近傍で集束され、この平面内に、検出光と照明光を空間的に分離する手段が設けられるようになされており、この空間的分離手段は、少なくとも反射性の第１部分と少なくとも透過性の第２部分とから構成され、反射性部分は、照明光を結合させるのに用いられ、透過性部分は、検出方向に検出光を通過させるのに用いられる、あるいは、透過性部分は、照明光を結合させるのに用いられ、反射性部分は、検出光を脱結合させるのに用いられる。
【００２５】
有利には、顕微鏡対物レンズの瞳平面内またはその近傍に、ビームスプリッタが設けられ、このビームスプリッタは、反射性にまたは透過性に形成されている小さな第１部分と、透過性にまたは反射性に形成されているそれより大きな第２部分とを有する。
【００２６】
本発明によれば、さらに、センサアレイが、位置感受性センサ（ｐｓｄ）から形成され、そのアレイの各要素ごとに、光分布の位置および位置精度が読み出されるようになされている。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＴＩＲＦ照明について２つの光線を示す図。
【図２】広視野照明における例示的光路を示す図。
【図３】例として、検出光路内で、検出器の方向でビームスプリッタの後に置かれている螺旋型位相マスクを示す図。
【図３ａ】発光点の位置に生じ、強度リングで取り囲まれているゼロ位置を示す図。
【図４】アキシコンＡＰＭが、検出側の中間像内に示されており、環状の振幅マスクＡＭが、検出器の前の２つの透過レンズの４ｆ構成内に示されている図。
【図５】位相格子または振幅格子が、励起光路内にある図。
【図６】スペクトル分割用の格子Ｇが、検出光路内に示されている図。
【図６ａ】格子によるスペクトル分解の場合の点画像を示す図。
【図７】スペクトル分割のために、分散プリズムが示されている図。
【図７ａ】プリズムによるスペクトル分解の場合の点画像を示す図。
【図８】２重のＰＳＦをもたらす、半空間内でπの位相ジャンプを伴うマスクを示す図。
【図８ａ】２重のＰＳＦを有する点画像を示す図。
【図９】アクロマチックビームスプリッタが、対物レンズの瞳内またはその近傍に示されている図。
【図１０】照明放射用の、縁部にある２つの小さな透過性領域を、または、ＴＩＲＦ照明用の、任意に方向付けられた照明放射がその上に集束できる環状の透過性領域を有するビームスプリッタを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本装置を、以下では、大抵は広視野照明で示す。同様の装置は、全反射（ＴＩＲＦ）に適用される。
後続の図面で共通の要素は、光源ＬＱ、照明側結像レンズＴＬＢ、対物レンズＯＬ、物体（試料）Ｏ、照明光と検出光とを分離するビームスプリッタＳＴ（主要色分割器）、検出側結像レンズＴＬＤ、発光フィルタＥＦおよび検出器Ｄである。
【００２９】
実線は、照明光路を表し、点線は、検出光路を表す。
図示された光路は、例示的なものであり、他の光路で置き換えて、当業者に周知のように、広視野照明および検出を、または、ニプコー円板を用いる場合のような、走査顕微鏡または平行な共焦点照明および検出を伴う顕微鏡の共焦点光路を表すようにしてもよい。
【００３０】
ＰＡＬ−Ｍ技術の場合、好ましい実施形態は、今のところ、広視野配置において見られる。
図１では、例として、ＴＩＲＦ照明について２つの光線が示され、それらの光線は、光軸に対し径方向の位置で、対物レンズの後方焦点面内に集束され、その結果、ＴＩＲＦ−角度（全反射）を超える角度でスライド（ここでは図示されず）内に集束されることになる。
【００３１】
図２は、広視野照明における例示的光路を示す。
図３では、例として、検出光路内で、検出器の方向でビームスプリッタの後に置かれている螺旋型位相マスクが示されている。
【００３２】
局所的統計を最適化するための有利な方策は、位置決めにおいて従来のＰＳＦに対して利点を有する、特殊なＰＳＦを使用することにある。この点で好ましいＰＳＦは、いわゆるドーナツ型ＰＳＦであり、横方向において、強度の中央ゼロ位置が、強度リングで取り囲まれる（図３ａは、発光点の位置に生じ、強度リングで取り囲まれているゼロ位置を示す）。
【００３３】
対応する構成の、位相変化を有する位相マスクにより、このＰＳＦは、有利に生成できる。
マスク上の位相ジャンプにより、強め合う干渉の最大値で取り囲まれている弱め合う干渉が生じる。これに加えて、ドイツ特許出願公開第１０２００６０４７９１２Ａ１号も援用する。
【００３４】
好ましくは、このＰＳＦは、螺旋型位相マスクにより、検出光路内で、位相挙動Ｓ（φ）＝ｅｘｐ（−ｊφ）で得られ、φは、方位角である。
螺旋型位相マスクは、ｐｓｆの横方向の構造に実質的に影響を与えるが、軸方向の構造は、実質的に変わらないままである。
【００３５】
ドーナツ型ＰＳＦは、これに関連して、以下の性質を特色とする。
・ドーナツ型ビームは、例えば、最適な光学系では浸液と物体との間の小さな屈折率の差によって常に存在する球状収差にあまり敏感ではなく、したがって、ほぼ常に、回折により制限される。
・ゼロ点の位置決めが、対称性により容易になる。
【００３６】
これらの性質は、光子数が同じ場合、より正確な位置決めを可能にする。ドーナツ型ＰＳＦ、または位置決め場所にゼロ位置を有する類似のＰＳＦは、本開示に取り入られている他のマスクによっても得られる。
【００３７】
マスクは、瞳の近傍にあってよいが、他の任意の場所にあってもよい（図３）。他の位相マスク（環状位相マスク）は、軸方向ならびに横方向の構造を変え、３次元のゼロ位置を生成する。
【００３８】
他の特殊なＰＳＦは、特殊なアキシシコン位相マスクによって得られる、いわゆるベッセルビームである（図４）。米国特許出願公開第２００５／００４６８１８Ａ１号を参照のこと。
【００３９】
そのようなマスクの例示的挙動Ｉは、Ｓ（ｒ）＝ｅｘｐ（−ｊｒ）＋ｅｘｐ（ｊｒ）であり、ｒは、ビームの動径座標である。このマスクは、中間像内またはその近傍にあり、瞳の環状の照明を生成する。
【００４０】
図４では、アキシコンＡＰＭが、検出側の中間像内に示されており、環状の振幅マスクＡＭが、検出器の前の２つの透過レンズの４ｆ構成内に示されている。
米国特許出願公開第２００５／００４６８１８Ａ１号とは異なり、位相マスクは、本明細書では、検出光路内にある。光損失を低減するために、ＰＳＦの軸方向の均一性を向上させるために使用され得る環状の光振幅マスク（米国特許出願公開第２００５／００４６８１８Ａ１号）が、位相マスクと検出器との間の光路内にある（図４）。
【００４１】
環状マスク（振幅マスク）を用いて分布の微調整が得られ、副次最大値を切り捨てることにより、軸方向において、特に均一な分布が得られる。
検出器上に結像されたＰＳＦは、次の有利な特徴を有する。
・結像の被写界深度が拡大され、それにより、比較的大きな被写界深度領域上に、高解像度の「投影画像」が生じる。
・分布の最大値が、従来のＰＳＦの場合よりも約３０％狭く、それは、最大値における減少した強度を少なくとも部分的に相殺する。
・ＰＳＦは、典型的な空間周波数スペクトル（低い空間周波数の抑制）を有し、このため、位置決めの前に、フーリエ領域内の画像の低周波数部分の適合したフィルタリングにより、有効なバックグラウンド抑制を得ることが可能になる。
【００４２】
また、別のＰＳＦの場合、低周波数の空間周波数の、ＰＳＦに最適に適合したフィルタリングによって、バックグラウンド抑制が得られ、これは、本発明出願の一部である。ＰＳＦの場合のこのフィルタリングは、ベッセルビームと同様に、高い空間周波数を大きな割合で有し、特に、効果的である。この最適なフィルタリングは、その場合、バックグラウンドの空間周波数スペクトルも考慮しなければならず、そのスペクトルは、画像内の適切な位置で（位置決めされる分子なしに）、または、受像され、場合により部分的に相殺された画像の部分集合から得ることができる。最も容易な場合、フィルタは、バックグラウンドの逆スペクトルである。
【００４３】
類似の原理に基づくバックグラウンドの抑制は、パターン化された照明によって得られる。この場合、例えば、位相格子または振幅格子が、励起光路内にある（図５）。
代わりに、対物面内でのコヒーレント光の分割および重ね合わせにより、干渉を利用して、分布がパターン化された照明を得ることもできる。
【００４４】
照明中にパターンが移動する場合、焦点にある分子の発光は変化する（「瞬く」）。
それとは異なり、焦点外の部分は、実質的に不変のままである。
したがって、活性化サイクルごとに少なくとも２つの画像を受像し、変調された信号部分を考慮することにより、効率的にバックグラウンドを抑制することができる。
【００４５】
個々の点が、変位の際に明るい色から暗い色に変調され、ＰＳＦの瞬きが、信号として受信される。
有利な１実施形態は、格子を連続的に変位させることである。
【００４６】
例えば、位相位置の異なる３つの画像を受像する場合（これについては、国際公開ＷＯ９７／０６５０９号、国際公開ＷＯ９８／４５７４５号、ドイツ特許出願公開第１０１５５００２Ａ１号を参照のこと）、個々の画像から周知の計算が行われる。
【００４７】
時間的に、格子の変位は、有利には、活性化サイクルと結合（同期化）され、活性化サイクル中に、変位される格子を用いて例えば２または３回受像がなされ、その後、新規の活性化サイクルが開始される。
【００４８】
潜在的な問題は、データ伝送によって制限されるカメラ読み出し速度であり得る。この問題は、従来のカメラで周知の画素数よりも明らかに少ない画素数を有するカメラによって回避することができる。各画像内で少ない数の発光分子のみが検出されるので、ＰＡＬ−Ｍの場合、原理的に、減少した画素数で間に合わせることができる。ただし、位置決めには、ＰＳＦの良好な走査を必要とする。代わりに、（少数の）画素の各々を、位置感知性センサとして設計してもよい。これは、例えば、従来技術で周知の位置感知性ダイオード（ＰＳＤ）の２次元アレイでよい。このようなＰＳＤの面積は、従来のカメラ画素に比べて大きいので、画面拡大率を、相応に大きく選択しなければならない。しかし、ＣＭＯＳ技術を利用して、小さな画素寸法の特定のアレイを作製することもできる。集積化された分析電子回路を用いて、データ伝送を、各分子ごとに、僅かなパラメータ（分布の重心、および位置精度の尺度＝３パラメータ）に制限し、それにより劇的に削減することができる。ただし、統計的平均で、各画素上に発光分子のみが結像されることがその前提である。ＰＡＬ−Ｍ撮像の前提は、２つの励起された分子が、従来のＰＳＦの半値全幅（ＦＷＨＭ）よりも互いに分離していることなので、ＦＷＨＭのほぼ２倍に相当する画素寸法が考えられる。従来技術によれば、少なくとも、ナイキスト理論に従って走査しなければならないので（即ち、両横方向にＦＷＨＭ当たり２つの画素）、上述の場合、少なくとも４×４＝１６分の１の画素数の削減、少なくとも１６／３＝５分の１のデータ量の削減、したがって少なくとも５倍の速度の向上を得ることができる。
【００４９】
最適なバックグラウンド抑制は、バックグラウンドの検出を防止するので、それに関連するノイズが画像中に全くなく、かつ、検出器のダイナミック・レンジが最適に利用できる。このような方策は、ニプコー円板走査または線形走査で得られるような、広視野での活性化と平行共焦点検出との組合せにある。
【００５０】
１つの検出器を用いた多数の異なる分子の同時検出は、さまざまな色素分子の蛍光のスペクトル差に基づく。特に、ＰＡＬ−Ｍの場合、分離された個々の分子を検出することを利用することができる。これから、検出器上で分子をスペクトル分離する可能性が得られる。
【００５１】
図６には、スペクトル分割用の格子Ｇが、検出光路内に示されている。
図７には、スペクトル分割のために、分散プリズムが示されている。
コリメートされた検出光路内でスペクトル分割要素（格子、プリズム）を用いて、検出器上にＰＳＦが結像され、その位置は、蛍光のスペクトル組成に依存する。
【００５２】
格子の場合、例えば、（格子のない位置に対応する）０次の場所でのＰＳＦと、±１次の場所での（容易に分割される）２つのさらなるＰＳＦとを検出する（図６、図６ａ）。
格子なしでのさらなる受像によって、０次を求め、１次から分離することができる。０次と±１次の間隔から、対応する較正の後に、スペクトル重心を求め、１次のスペクトルの形状から、スペクトル分布を求めることができる。
【００５３】
さらなる方策は、０次および２つの１次の対称的分布を検出器上で直接調べ、評価することにある。
蛍光スペクトルは、通常は広帯域スペクトルであり、受像された点を、したがってある広がりをもつので、一般に、やはり受像から、０次（広がりのない）を±１次から分離することができる。
【００５４】
好ましい格子は、この場合、０次および±１次において高効率で回折し、より高次については無視できる。
効率上の理由から有利であり得るプリズムを使用する場合、アプリオリに１つの次元のみが生じる（図７、図７ａ）。ここでは、画像点およびスペクトル分割を一意に対応させるために、プリズムの位置が異なる場合、少なくとも２つの測定（あるいは、好ましくは、プリズムの向きを変えたさらなる測定）が必要となる。また、ここでは、画像内のスペクトル分割された分布の形状から、スペクトルを得ることもできる。
【００５５】
スペクトル分割なしでは、２つの分子が空間的に十分に分離されていて、スペクトル分割により、重なり合いが生じることが起こり得る。ここでは、色素のスペクトル特性が分かっている場合、または、画像の他の領域から、例えば、また別の回折次元からスペクトル特性を求める場合、画像処理によるスペクトル分解によって分離を達成することができ、スペクトルを分子に一意に対応させることができる。
【００５６】
特別な場合は、アミチプリズムである。ここでは、同じく、光が、分子の名目位置の周りで対称的に、スペクトル分割される。有利なことに、この場合、大抵は１回の画像受像で十分である。
【００５７】
同様に、スペクトル分離を行うために、ＰＳＦの形態のスペクトル依存性を利用することができる。特に、位相マスクを用いて生成されたＰＳＦは、非常に強い依存性を有する。その１例は、螺旋型位相マスクを用いて生成されるドーナツ型ＰＳＦである。特別な利点は、横方向の分布の１次の波長依存性である。別の例は、２重のＰＳＦをもたらす、半空間内でπの位相ジャンプを伴うマスクである（図８）。
【００５８】
図８には、半空間マスクＨＰＭが、示されており、検出光路内でビームスプリッタの後に置かれている。
スペクトルの変化を較正し、評価の際に考慮することができる（図８ａ）。このマスクは、異なる波長に対して異なる作用を示すと考えられる。
【００５９】
設計された波長から遠く離れるにつれて、その作用は弱くなり、「正常な」ｐｓｆのみが生じる。
２重ｐｓｆから単一ｐｓｆへの移行は較正可能であり、既存の分布から、波長分布を求めることができる。
【００６０】
有利には、ｐｓｆの形態に波長に依存する影響を与える、回折要素のような他の要素も考えられる。
位相要素に加えて、振幅要素（または、位相変化および振幅変化を有する要素）も、上述の意味で利用できる波長依存性を導入することができる。その典型的な代表は、例えば、顕微鏡対物レンズ（ハイブリッド対物レンズ）とあいまって、スペクトルの符号化に使用できる色収差を導入する、回折レンズである。さまざまな分子を励起し検出するために、励起および検出の可能な限りアクロマチックなビーム分離が必要とされる。したがって、広視野での活性化および励起の故に、アクロゲート（Ａｃｈｒｏｇａｔｅ）ビームスプリッタ（ドイツ特許出願公開第１０２５７２３７Ａ１号）を使用するのが有利である。これにより、例えば、さまざまな波長を用いて同時に励起する場合でも（図９および図１０）、光路を高効率で完全にフレキシブルに分離することが可能となる。
【００６１】
図９および図１０では、ドイツ特許出願公開第１０２５７２３７Ａ１号によるアクロマチックビームスプリッタが、対物レンズの瞳内またはその近傍に示されている。
広視野照明のための実施形態では、図９の光分割器は、照明側でその上に光が集束される、中央の小さな透過領域と、検出器Ｄの方向にほぼ全ての検出光を伝達する、大きな反射領域とを備えている。
【００６２】
図１０には、ビームスプリッタは、代わりに、照明放射用の、縁部にある２つの小さな透過性領域を、または、ＴＩＲＦ照明用の、任意に方向付けられた照明放射がその上に集束できる環状の透過性領域を有する。
【００６３】
残りの反射領域は、やはり、検出器の方向に試料光を反射させるのに用いられる。
以下に、上記実施形態から把握できる技術思想を付記として記載する。
［付記１］
回折限界の解像度を特徴とする装置、特に顕微鏡であって、
異なる状態の間で切替可能な複数の色素分子（ＵＦ）で、少なくとも１つの状態が蛍光性であり、その蛍光が、対物レンズ（Ｏ）で集光され、光学系を用いて場所分解性検出器上に結像され、試料の少なくとも一部分が回折限界の解像度の逆数よりも大きな分布密度を有する、色素分子（ＵＦ）と、
該試料中の該ＵＦの第１部分集合を切り替えるために切替放射を発し、かつ、該ＵＦの第１部分集合を励起するために励起放射を発する１つまたは複数の光源とを備え、
光路内に、好ましくは検出光路内に、ベッセル分布（ＰＳＦ）を検出平面内に生成する位相マスクまたはアキシコンが設けられている、装置。
［付記２］
前記切替えが、前記ＵＦの光活性化または光非活性化である、付記１に記載の装置。
［付記３］
蛍光性状態にある前記ＵＦの分布密度が、前記装置の前記回折限界の解像度の逆数よりも小さいことを保証するように、前記切替放射を制御する制御ユニットが設けられている、付記１または２に記載の装置。
［付記４］
環状の振幅マスクが、位相マスクと検出器との間に設けられている、付記１に記載の装置。
［付記５］
回折限界の解像度を特徴とする装置、特に顕微鏡であって、
異なる状態の間で切替可能な複数の色素分子（ＵＦ）で、少なくとも１つの状態が蛍光性であり、その蛍光が、対物レンズ（Ｏ）で集光され、光学系を用いて場所分解性検出器上に結像され、試料の少なくとも一部分が回折限界の解像度の逆数よりも大きな分布密度を有する、色素分子（ＵＦ）と、
該試料中の該ＵＦの第１部分集合を切り替えるために切替放射を発し、かつ、該ＵＦの第１部分集合を励起するために励起放射を発する１つまたは複数の光源とを備え、
照明光路内に、照明分布をパターン化する手段が設けられている、装置。
［付記６］
前記切替えが、前記ＵＦの光活性化または光非活性化である、付記５に記載の装置。
［付記７］
蛍光性状態にある前記ＵＦの分布密度が、前記装置の前記回折限界の解像度の逆数よりも小さいことを保証するように、前記切替放射を制御する制御ユニットが設けられている、付記１乃至６のいずれか１項に記載の装置。
［付記８］
パターンが干渉により物体平面内で生じるように、コヒーレント光を分割し重ね合わせる手段が設けられている、付記５に記載の装置。
［付記９］
前記手段として、位相格子および／または振幅格子が設けられている、付記５または８に記載の装置。
［付記１０］
前記パターン化が、連続的にまたは離散的ステップで移動する、付記５、８または９に記載の装置を操作する方法。
［付記１１］
パターンの位置が異なる場合に、少なくとも２つの受像が行われ、断面像が計算される、付記１０に記載の方法。
［付記１２］
回折限界の解像度を特徴とする装置、特に顕微鏡であって、
異なる状態の間で切替可能な複数の色素分子（ＵＦ）で、少なくとも１つの状態が蛍光性であり、その蛍光が、対物レンズ（Ｏ）で集光され、光学系を用いて場所分解性検出器上に結像され、試料の少なくとも一部分が回折限界の解像度の逆数よりも大きな分布密度を有する、色素分子（ＵＦ）と、
該試料中の該ＵＦの第１部分集合を切り替えるために切替放射を発し、かつ、該ＵＦの第１部分集合を励起するために励起放射を発する１つまたは複数の光源とを備え、
検出光路内に、試料光をスペクトル分割する手段が設けられている、装置。
［付記１３］
前記切替えが、前記ＵＦの光活性化または光非活性化である、付記１２に記載の装置。
［付記１４］
蛍光性状態にある前記ＵＦの分布密度が、前記装置の前記回折限界の解像度の逆数よりも小さいことを保証するように、前記切替放射を制御する制御ユニットが設けられている、付記１乃至１３のいずれか１項に記載の装置。
［付記１５］
前記手段が、少なくとも格子および／またはプリズムである、付記１２に記載の装置。
［付記１６］
格子を用いて受像する際に、位置から前記蛍光のスペクトル発光重心が求められ、および／または、１つのまたは複数の高次の回折次数の光分布の形からスペクトル分布が決定される、付記１２または１５に記載の装置を操作する方法。
［付記１７］
プリズムを用いて受像する際に、位置から前記蛍光のスペクトル発光重心が求められ、および／または、前記検出光路内にプリズムを用いて受像する際の前記光分布の形からスペクトル分布が決定される、付記１２または１５に記載の装置を操作する方法。
［付記１８］
受像が、それぞれ、前記光路内にプリズムを用いて、およびプリズムを用いずに行われる、付記１７に記載の方法。
［付記１９］
スペクトル分割によって重ね合わされた光分布の分離が、スペクトル分解によって行われる、付記１２乃至１８のいずれか１項に記載の方法。
［付記２０］
回折限界の解像度を特徴とする装置、特に顕微鏡であって、
異なる状態の間で切替可能な複数の色素分子（ＵＦ）で、少なくとも１つの状態が蛍光性であり、その蛍光が、対物レンズ（Ｏ）で集光され、光学系を用いて場所分解性検出器上に結像され、試料の少なくとも一部分が回折限界の解像度の逆数よりも大きな分布密度を有する、色素分子（ＵＦ）と、
該試料中の該ＵＦの第１部分集合を切り替えるために切替放射を発し、かつ、該ＵＦの第１部分集合を励起するために励起放射を発する１つまたは複数の光源とを備え、
検出平面内で色依存の光分布（ＰＳＦ）を生じさせる手段が、検出光路内に設けられている、装置。
［付記２１］
前記切替えが、前記ＵＦの光活性化または光非活性化である、付記２０に記載の装置。
［付記２２］
蛍光性状態にある前記ＵＦの分布密度が、前記装置の前記回折限界の解像度の逆数よりも小さいことを保証するように、前記切替放射を制御する制御ユニットが設けられている、付記２０又は２１に記載の装置。
［付記２３］
色収差を有する光学部品および／または位相マスクおよび／または半空間位相マスクおよび／または振幅マスクおよび／または回折レンズが、検出光路内に設けられている、付記２０に記載の装置。
［付記２４］
色依存のＰＳＦから、波長の関数として較正または計算された光分布を利用して、発光のスペクトル重心が求められる、付記２０または２３に記載の装置を操作する方法。
［付記２５］
回折限界の解像度を特徴とする装置、特に顕微鏡であって、
異なる状態の間で切替可能な複数の色素分子（ＵＦ）で、少なくとも１つの状態が蛍光性であり、その蛍光が、対物レンズ（Ｏ）で集光され、光学系を用いて場所分解性検出器上に結像され、試料の少なくとも一部分が回折限界の解像度の逆数よりも大きな分布密度を有する、色素分子（ＵＦ）と、
該試料中の該ＵＦの第１部分集合を切り替えるために切替放射を発し、かつ、該ＵＦの第１部分集合を励起するために励起放射を発する１つまたは複数の光源とを備え、
該試料への照明が、試料平面と捕獲平面との間の光路の瞳平面内でおよび／または該瞳平面の近傍で集束され、この平面内に、検出光と照明光を空間的に分離する手段が設けられており、
該手段は、少なくとも反射性の第１部分と少なくとも透過性の第２部分とから構成され、該反射性部分が、該照明光を結合するのに用いられ、該透過性部分が、検出方向に該検出光を通過させるのに用いられるか、または、該透過性部分が、該照明光を結合するのに用いられ、該反射性部分が、該検出光を結合解除するのに用いられる、装置。
［付記２６］
前記切替えが、前記ＵＦの光活性化または光非活性化である、付記２５に記載の装置。
［付記２７］
蛍光性状態にある前記ＵＦの分布密度が、前記装置の前記回折限界の解像度の逆数よりも小さいことを保証するように、前記切替放射を制御する制御ユニットが設けられている、付記２５または２６に記載の装置。
［付記２８］
回折限界の解像度を特徴とする装置、特に顕微鏡であって、
異なる状態の間で切替可能な複数の色素分子（ＵＦ）で、少なくとも１つの状態が蛍光性であり、その蛍光が、対物レンズ（Ｏ）で集光され、光学系を用いて場所分解性検出器上に結像され、試料の少なくとも一部分が回折限界の解像度の逆数よりも大きな分布密度を有する、色素分子（ＵＦ）と、
該試料中の該ＵＦの第１部分集合を切り替えるために切替放射を発し、かつ、該ＵＦの第１部分集合を励起するために励起放射を発する１つまたは複数の光源とを備え、
検出のために、位置感知性のセンサ（ｐｓｄ）からなるセンサアレイが設けられている、装置。
［付記２９］
前記切替えが、前記ＵＦの光活性化または非活性化である、付記２８に記載の装置。
［付記３０］
蛍光性状態にある前記ＵＦの分布密度が、前記装置の前記回折限界の解像度の逆数よりも小さいことを保証するように、前記切替放射を制御する制御ユニットが設けられている、付記２８または２９に記載の装置。
［付記３１］
前記アレイの実質的に各々の要素に対して、光分布の位置および位置精度が読み出される、付記３０に記載の装置を操作する方法。
［付記３２］
試料の構造を空間的に高解像度で撮像するための方法であって、
切替信号を用いて、第１光学特性を有する第１状態から第２光学特性を有する第２状態へ少なくとも１回遷移可能である物質の群から、ある物質を選択する工程と、
該切替信号を用いて、物質の切替部分を該第２状態に遷移させる工程であって、切り替えられる分子間の間隔が、前記顕微鏡の前記回折限界の光学解像度以上になるように、切替えが行われる、工程と、
該第２状態に遷移された部分を励起し、場所分解性検出器を用いて分子の位置を決定する工程と、
該第２状態にある前記色素分子から発された、光学的測定信号を、対物レンズを介して検出器で空間的に分解して記録する工程と
を含む、付記３１に記載の方法。
［付記３３］
前記第２状態から前記第１状態への前記分子の非活性化が行われる、付記３２に記載の方法。
［付記３４］
付記１乃至３３のいずれか１項に記載の装置および方法の組合せ。
【符号の説明】
【００６４】
ＬＱ：光源
ＴＬＢ：照明側結像レンズ
ＯＬ：対物レンズ
Ｏ：物体
ＳＴ：ビームスプリッタ
ＴＬＤ：検出側結像レンズ
ＥＦ：発光フィルタ
Ｄ：検出器
【図１】
0005734191.tif 000002
【図２】
0005734191.tif 000003
【図３】
0005734191.tif 000004
【図３ａ】
0005734191.tif 000005
【図４】
0005734191.tif 000006
【図５】
0005734191.tif 000007
【図６】
0005734191.tif 000008
【図６ａ】
0005734191.tif 000009
【図７】
0005734191.tif 000010
【図７ａ】
0005734191.tif 000011
【図８】
0005734191.tif 000012
【図８ａ】
0005734191.tif 000013
【図９】
0005734191.tif 000014
【図１０】
0005734191.tif 000015