(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０〜２０００ｍｇのザクロエキス及び３５〜２００ｍｇのブドウの種エキスの組み合わせを含む骨再吸収を阻害するための組成物。
【請求項２】
上記組み合わせは４００〜７００ｍｇのイプリフラボンをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上記組み合わせは１２５０ｍｇのザクロエキス及び１２５ｍｇのブドウの種エキスを含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
上記ザクロエキスは少なくとも１のプニカラジンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
上記組成物はＲＡＮＫ−Ｌの放出又は発現を阻害する、妨げる又は減少させる、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
３００〜２０００ｍｇのザクロエキス、３５〜１５０ｍｇのブドウの種エキス、及び４００〜７００ｍｇのイプリフラボンの組み合わせを含む骨再吸収を阻害するための組成物。
【請求項７】
５００ｍｇのザクロエキス、５０ｍｇのブドウの種エキス、及び６００ｍｇのイプリフラボンの組み合わせを含む骨再吸収を阻害するための組成物。
【請求項８】
３００〜７００ｍｇの緑茶エキスをさらに含む、請求項１、２、６又は７に記載の組成物。
【請求項９】
５００ｍｇの緑茶エキスをさらに含む、請求項１、２、６又は７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、その全内容を本明細書中に援用する、２００６年１０月２４日出願の米国仮出願シリアル番号６０／８５４，３１２及び２００７年４月２３日出願の米国仮出願シリアル番号６０／９２５，９１４の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
背景
健康な骨は、活性骨細胞、すなわち、骨形成骨芽細胞及び骨再吸収破骨細胞の協調した活動をとおして骨再吸収及び骨形成の間に平衡が達せられるリモデリングプロセスを連続的に経験する。骨リモデリングプロセスは鉱化されていない骨を覆う細胞、すなわち、内層細胞の活性化で始まる。内層細胞は鉱化されていない骨を再吸収し、その後引っ込み、及び古い鉱化された骨を再吸収する破骨細胞のために場所を空け、及び同じ部位へ骨芽細胞を誘引する環境を作出する。骨芽細胞はその後有機マトリックスを敷設し、その有機マトリックスは続いて新しい骨を形成するよう鉱化されるようになる。したがって、骨マスは破骨細胞による骨再吸収及び骨芽細胞による骨形成の間の平衡により決定される。
【０００３】
骨中の鉱物質の量はその硬さの大きな原因であり、一方構造タンパク質コラーゲンのような物質はまた骨の機械的強さに寄与する。密集した最も外側の骨は皮質骨として知られ、一方よりスポンジ状の内部の形態は海綿質又は小柱骨として知られる。
【０００４】
ほとんどの骨疾患は骨リモデリングプロセスの平衡における破壊のためである。一般的に、上記破壊は骨再吸収における増加である。例えば、最も一般的な骨疾患の一つである骨粗しょう症は骨における微小構造変化を伴う骨マスにおける減少により特徴付けられるが、骨折しやすさを増加させる骨自体の化学組成に対する影響はない。特に、皮質骨は薄く及び多孔性になり、一方で小柱骨は薄くなり、穴があき、及びばらばらになる。骨粗しょう症は骨リモデリング周期における負のバランスの結果、すなわち、再吸収される骨より形成される骨が少ないと考えられうる。
【０００５】
したがって、骨障害を治療するための治療用剤は骨再吸収の阻害及び骨形成の増加に方向付けられる。骨リモデリングプロセスに関連する多くの異なる分子及び経路があり、及び現在入手可能なさまざまな治療用剤は異なる分子及び経路を標的にする。例えば、（アレドロネート及びリセドロネートの如き）ビスフォスフォネートは破骨細胞活性をブロックすることにより骨再吸収を阻害する。他の治療用剤は、骨再吸収に関連する細胞である破骨細胞を活性化するサイトカインである核因子κＢリガンドの受容体アクチベーター（ＲＡＮＫ−Ｌ）の如き、ＴＮＦ受容体／リガンドファミリーのメンバーへの結合をブロックすることにより骨再吸収を阻害することを探す。ＲＡＮＫ−Ｌの放出の阻害は骨鉱物質損失を妨げる。
【０００６】
さらに他の治療用剤は骨形成を増加させることを標的にする。例えば、活性化された骨形態形成タンパク質遺伝子は骨芽細胞分化を誘発すること及び骨形成を促進することに対して直接的な効果を有することが知られる。組換え骨形態形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）のデリバリーは骨又は軟骨形成を誘発することが示されている。しかしながら、組換えＢＭＰ−２の如き医薬及び生物剤の体系的投与は小腸及び他の組織に対して有害な影響を有しうる。それゆえ、骨再吸収を阻害すること及び／又は骨形成を増加することにより骨障害を予防する及び／又は治療するための食事サプリメント介入において使用されうる、天然及び植物由来抽出物について本分野において要求がある。
【発明の概要】
【０００７】
簡単な要約
本発明はさまざまな天然及び植物由来抽出物の新規組み合わせは（１）ＲＡＮＫ−Ｌの発現及び／又は放出を阻害する、減少させる又は妨げることにより、及び／又は骨からのカルシウム放出を妨げることにより骨再吸収を阻害し；（２）ＢＭＰ−２の遺伝子及び／又はタンパク質発現を増加させる又は刺激することにより骨成長を増加させ、及び（３）骨強度を改善し又は維持しうるという発見に基づく。
【０００８】
１の例において、本発明は少なくとも２の以下のもの：クェルセチン二水和物、クェルセチン無水物、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．エキス、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．根エキス、シベリア・チョウセンニンジンエキス、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｆｒｕｃｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃａエキス、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキス、カンゾウエキス、及びイプリフラボンの組み合わせを含む、天然、植物由来抽出物を含む骨成長を増加させる又は刺激するための組成物であり、ここで上記組み合わせはＢＭＰ−２遺伝子又はタンパク質発現を増加させる。
【０００９】
他の例において、本発明はクェルセチン無水物又は二水和物、シベリア・チョウセンニンジンエキス、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキス、及びカンゾウエキスの組み合わせを含む骨成長を増加させる又は刺激するための組成物であり、ここで上記組み合わせはＢＭＰ−２遺伝子又はタンパク質発現を増加させる。
【００１０】
他の例において、本発明は約１０〜１０００ｍｇのクェルセチン無水物又は二水和物、約１００〜８００ｍｇのシベリア・チョウセンニンジンエキス、及び約１０〜５００ｍｇのカンゾウエキスの組み合わせを含む骨成長を増加させる又は刺激するための組成物であり、ここで上記組み合わせはＢＭＰ−２遺伝子又はタンパク質発現を増加させる。
【００１１】
さらなる例において、本発明は約１０〜１０００ｍｇのクェルセチン無水物又は二水和物、及び約１０〜５００ｍｇのカンゾウエキスの組み合わせを含む骨成長を増加させる又は刺激するための組成物であり、ここで上記組み合わせはＢＭＰ−２遺伝子又はタンパク質発現を増加させる。
【００１２】
他の例において、本発明は約１０〜１０００ｍｇのクェルセチン無水物又は二水和物、及び約１００〜８００ｍｇのシベリア・チョウセンニンジンエキスの組み合わせを含む骨成長を増加させる又は刺激するための組成物であり、ここで上記組み合わせはＢＭＰ−２遺伝子又はタンパク質発現を増加させる。
【００１３】
さらなる例において、本発明は、少なくとも２の以下のもの：クェルセチン無水物、クェルセチン二水和物、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．エキス、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．根エキス、シベリア・チョウセンニンジンエキス、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキス、カンゾウエキス、及びイプリフラボンの組み合わせを含む組成物を患者に投与することを含む、患者において骨成長を増加させる又は刺激する方法であり、ここで上記組み合わせは上記患者においてＢＭＰ−２遺伝子又はタンパク質発現を増加させる。
【００１４】
本発明のさらなる例は約１０〜１０００ｍｇのクェルセチン無水物又は二水和物、約１００〜８００ｍｇのシベリア・チョウセンニンジンエキス、及び約１０〜５００ｍｇのカンゾウエキスの組み合わせを含む組成物を患者に投与することを含む、患者において骨成長を増加させる又は刺激する方法であり、ここで上記組み合わせは上記患者においてＢＭＰ−２遺伝子又はタンパク質発現を増加させる。
【００１５】
本発明の他の例は約１０〜１０００ｍｇのクェルセチン無水物又は二水和物、及び約１０〜５００ｍｇのカンゾウエキスの組み合わせを含む組成物を患者に投与することを含む、患者において骨成長を増加させる又は刺激する方法であり、ここで上記組み合わせは上記患者においてＢＭＰ−２遺伝子又はタンパク質発現を増加させる。
【００１６】
本発明の他の例は約１０〜１０００ｍｇのクェルセチン無水物又は二水和物、及び約１００〜８００ｍｇのシベリア・チョウセンニンジンエキスの組み合わせを含む組成物を患者に投与することを含む、患者において骨成長を増加させる又は刺激する方法であり、ここで上記組み合わせは上記患者においてＢＭＰ−２遺伝子又はタンパク質を増加させる。
【００１７】
他の例において、本発明は１以上の以下のもの：クェルセチン二水和物、クェルセチン無水物、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．エキス、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．根エキス、シベリア・チョウセンニンジンエキス、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｆｒｕｃｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃａエキス、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキス、カンゾウエキス、及びイプリフラボンを伴う、ザクロエキス、プニカラジン又は両方を含む骨再吸収を阻害する、減少させる又は妨げるための組成物でありうる、ここで上記ザクロエキス、プニカラジン又は両方はＲＡＮＫ−Ｌの発現、生成、及び／又は放出を阻害する。
【００１８】
１の例において、本発明に係る組成物及び方法は骨再吸収を阻害する又は減少させるために、プニカラジンとして知られる化合物を含むザクロ（Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ）果実及び果皮の抽出物を利用する。本発明において有用なザクロエキス、例えば、プニカラジンから成るザクロエキスは骨再吸収を阻害する、減少させる又は妨げるための組成物及び方法において使用されうる、ここで上記ザクロエキスはＲＡＮＫ−Ｌの発現、生成、及び／又は放出を阻害する、減少させる又は妨げる。したがって、１の例において、本発明はザクロエキス、少なくとも１のプニカラジン又は両方を含む骨再吸収を阻害する、減少させる又は妨げるための組成物である。あるいは、本発明はザクロエキス、少なくとも１のプニカラジン又は両方を含む組成物を投与することを含む骨再吸収を阻害する、減少させる又は妨げる方法を企図し、ここで上記組成物はＲＡＮＫ−Ｌの発現、生成、及び／又は放出の１を阻害する。
【００１９】
また他の例において、本発明は少なくとも２の以下のもの：好ましくはプニカラジンを含むザクロエキス、オリーブエキス、シベリア・チョウセンニンジンエキス、イチョウエキス、緑茶エキス、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキス、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．エキス、ブドウの種エキス、トウキエキス、及びイプリフラボンの組み合わせを含む、天然、植物由来抽出物を含む骨再吸収を阻害する、減少させる又は妨げるための組成物であり、ここで上記組み合わせはＲＡＮＫ−Ｌの発現、生成、及び／又は放出を阻害する。
【００２０】
さらなる例において、本発明はザクロエキス、ブドウの種エキス、イプリフラボン、及び緑茶エキスの組み合わせを含む骨再吸収を阻害する、減少させる又は妨げるための組成物であり、ここで上記組み合わせはＲＡＮＫ−Ｌの発現、生成、及び／又は放出を阻害する。
【００２１】
他の例において、本発明は約１０〜２０００ｍｇのザクロエキス、約３５〜２５０ｍｇのブドウの種エキス、及び約４００〜７００ｍｇのイプリフラボンの組み合わせを含む骨再吸収を阻害する、減少させる又は妨げるための組成物であり、ここで上記組み合わせはＲＡＮＫ−Ｌの発現、生成、及び／又は放出を阻害する。
【００２２】
また他の例において、本発明は約１０〜２０００ｍｇのザクロエキス、約３５〜２５０ｍｇのブドウの種エキス、及び約４００〜７００ｍｇのイプリフラボンを含む骨再吸収を阻害する、減少させる又は妨げるための組成物であり、ここで上記組成物は骨からのカルシウム放出を阻害する。
【００２３】
本発明の他の例は少なくとも２の以下の抽出物：ザクロエキス、オリーブエキス、シベリア・チョウセンニンジンエキス、イチョウエキス、緑茶エキス、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキス、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．エキス、ブドウの種エキス、トウキエキス、及びイプリフラボンの組み合わせを含む、天然、植物由来抽出物を含む組成物を患者に投与することを含む患者において骨再吸収を阻害する、減少させる又は妨げる方法であり、ここで上記組み合わせはＲＡＮＫ−Ｌの発現、生成、及び／又は放出を阻害する。
【００２４】
さらなる例において、本発明はザクロエキス、ブドウの種エキス、イプリフラボン、及び緑茶エキスの組み合わせを含む組成物を患者に投与することを含む患者において骨再吸収を阻害する、減少させる又は妨げる方法であり、ここで上記組み合わせはＲＡＮＫ−Ｌの発現、生成、及び／又は放出を阻害する。
【００２５】
さらなる例において、本発明は約１０〜２０００ｍｇのザクロエキス、約３５〜２５０ｍｇのブドウの種エキス、及び約４００〜７００ｍｇのイプリフラボンの組み合わせを含む組成物を患者に投与することを含む患者において骨再吸収を阻害する、減少させる又は妨げる方法であり、ここで上記組み合わせはＲＡＮＫ−Ｌの発現、生成、及び／又は放出を阻害する。
【００２６】
また他の例において、本発明は約１０〜２０００ｍｇのザクロエキス、約３５〜２５０ｍｇのブドウの種エキス、及び約４００〜７００ｍｇのイプリフラボンの組み合わせを含む組成物を患者に投与することを含む患者において骨再吸収を阻害する、減少させる又は妨げる方法であり、ここで上記組み合わせは骨からのカルシウム放出を阻害する。
【００２７】
さらなる例において、本発明は少なくとも２のクェルセチン二水和物、クェルセチン無水物、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．エキス、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．根エキス、シベリア・チョウセンニンジンエキス、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキス、カンゾウエキス、及びイプリフラボンの組み合わせを含む第一の組成物；及び少なくとも２のザクロエキス、オリーブエキス、シベリア・チョウセンニンジンエキス、イチョウエキス、緑茶エキス、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキス、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．エキス、ブドウの種エキス、トウキエキス、及びイプリフラボンの組み合わせを含む第二の組成物を含む骨成長を増加させる又は刺激する及び骨再吸収を阻害する、減少させる又は妨げるための食事サプリメント管理であり、ここで上記第一の組成物の組み合わせはＢＭＰ−２の発現及び／又は活性を増加させ、及びここで上記第二の組成物の組み合わせはＲＡＮＫ−Ｌの発現を阻害する。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
本発明は本明細書中に示される特定の組成物、方法又はプロトコールに限定されないことが理解されるべきである。さらに、別段の定めなき限り、本明細書中で使用される全ての技術及び科学用語は本発明が属する分野における当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で使用される用語法は特定の態様を記述する目的のためのみであり、及び本発明の範囲を限定すると意図されず、本発明の範囲は請求項によってのみ限定されるであろうこともまた理解されるべきである。
【００２９】
本発明は以下により完全に示される２以上の以下のもの：クェルセチン無水物、クェルセチン二水和物、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．エキス、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．根エキス、シベリア・チョウセンニンジンエキス、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキス、カンゾウエキス、イプリフラボンのエキス、ザクロエキス、オリーブエキス、イチョウエキス、緑茶エキス、ブドウの種エキス、及びトウキエキスを含む成分の独特の組み合わせはＢＭＰ−２プロモーター、遺伝子、及び／又はタンパク質の発現及び／又は活性を増加させる又は刺激することにより骨成長を増加させる又はＲＡＮＫ−Ｌ発現、生成又は放出を阻害する、減少させる又は妨げることにより又は骨からのカルシウム放出を阻害する、減少させる又は妨げることにより骨再吸収を阻害するという驚くべき発見に基づく。
【００３０】
ＢＭＰ−２は広範なトランスフォーミング成長因子Ｂスーパーファミリーにおける新規因子である骨形態形成タンパク質のファミリーのメンバーである。組換えＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４はラットの皮下組織に局所注入されたとき新規骨形成を誘発しうる（Ｗｏｚｎｅｙ  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ（１９９２）３２：１６０−６７）。ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４は正常な骨芽細胞が分化するとき正常な骨芽細胞により発現され、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨芽細胞分化及び骨小節形成及びｉｎ  ｖｉｖｏで骨形成を刺激することが示されている。したがって、ＢＭＰ−２プロモーター活性、遺伝子発現、及び／又はタンパク質発現を増加させる又は刺激することにより、本発明に係る独特の組成物は骨成長を増加させる又は刺激する及びさまざまな骨障害を治療する又は予防するために有用である。
【００３１】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーのメンバーであるＲＡＮＫ−Ｌ、核因子（ＮＦ）−κＢリガンドの受容体アクチベーター（また：オステオプロテジェリンリガンド、ＯＰＧＬ）は骨再吸収において助けとなる骨細胞である成熟破骨細胞の形成のための主要な刺激因子であり、及びそれらの生存のために必須である。ＲＡＮＫ−Ｌは骨芽細胞系統細胞及び活性化されたＴリンパ球により生成される。それは破骨細胞及び樹状細胞に位置される特定の受容体ＲＡＮＫを活性化する。本発明に係る調合物のための１の策はＩＬ−１により刺激されるときＲＡＮＫ−Ｌ発現を直接的に阻害することである。ＩＬ−１で刺激されるときのＲＡＮＫ−Ｌの活性化は破骨細胞形成（及びしたがって骨再吸収）を直接的に誘発しうる。したがって、ＲＡＮＫ−Ｌ発現、生成又は放出を阻害する、減少させる又は妨げることにより、本発明に係る独特の組成物は骨再吸収を阻害する、減少させる又は妨げる及び骨損失、骨粗しょう症、骨溶解性骨等を含むさまざまな骨障害を治療する又は予防するために有用である。
【００３２】
クェルセチン抽出物（単数又は複数）及びクェルセチン二水和物、クェルセチン無水物等の如き、さまざまな形態のクェルセチンをいうクェルセチンは本発明に係る独特の組成物において有用な１の化合物である。クェルセチンはカンキツ属のフラボノイド、ルチン、ヘスペリヂン、ナリンジン及びタンジェリチンを含む多くの他のフラボノイドの「骨格」を形成するフラボノイドである。クェルセチンは研究において最も活性なフラボノイドであることがわかっており、及び多くの薬効植物のそれらの活性の多くはそれらの高いクェルセチン内容量のためである。クェルセチンはいくつかの炎症開始プロセスの直接的な阻害のために顕著な抗炎症活性を示した。例えば、それはヒスタミン及び他のアレルギー／炎症仲介物質の製造及び放出の両方を阻害する。さらに、それは強い抗酸化活性及びビタミンＣ−節約活性を発揮する。
【００３３】
クェルセチンはまた癌、前立腺炎、心臓疾患、白内障、アレルギー、炎症、及び気管支炎及び喘息の如き呼吸器疾患を妨げるために闘う又は助けとなることにおいて正の効果を有しうる。さらに、米国特許第５，４７８，５７９号にしたがって、５０〜１５００ｍｇ／日に及ぶ量で使用されるとき、クェルセチン無水物及び／又はクェルセチン二水和物は骨組織へのカルシウム吸収を高めうる。
【００３４】
クェルセチンが豊富な食物はリンゴ、紅茶及び緑茶、タマネギ、ラズベリー、赤ワイン、赤ブドウ、カンキツ属果実、ブロッコリー、ソラマメ、他の葉物緑色野菜、及びサクランボを含む。
【００３５】
以下により完全に議論されるように、本発明は一部には、クェルセチンがＢＭＰ−２プロモーター活性及びタンパク質発現の強いアクチベーターであるという発見に基づく。さらに、以下に議論されるアッセイ結果は、クェルセチン二水和物がシベリア・チョウセンニンジン、カンゾウ又は両方と共に投与されるとき、上記組み合わせはいずれかの成分単独で達成されるものを超えるＢＭＰ−２プロモーター活性及びタンパク質発現をもたらす驚くべき相乗効果を達成することを示す。
【００３６】
本発明において使用されるクェルセチン成分は例えば、Ｔｗｉｎｌａｂ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｏｒｋ，  Ｕｔａｈ）、Ｊａｒｒｏｗ  Ｆｏｒｍｕｌａｓ（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｎａｔｕｒａｌ  Ｆａｃｔｏｒｓ（Ｃｏｑｕｉｔｌａｍ，  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，  Ｃａｎａｄａ）、及びＮＯＷ  Ｆｏｏｄｓ（Ｂｌｏｏｍｉｎｇｄａｌｅ，  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を含むさまざまな源から商業的に得られうる。さらに、クェルセチンは以下により完全に議論される又は本分野において示される又は知られる抽出法のいずれかにより得られうる。
【００３７】
本発明に係る独特の組成物において有用な他の植物であるＲｅｈｍａｎｎｉａは中国に固有のＬａｍｉａｌｅｓ目における６種の花を咲かせる植物の属である。中国語でディフアン（地黄）として知られ、この薬草は貧血、めまい及び便秘の如きさまざまな病気のために使用される。ＲｅｈｍａｎｎｉａはビタミンＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤ、並びに他の有用な化合物を含む。
【００３８】
Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．根のエキス又はＲｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．根エキスを含むＲｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．エキス又はＲｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．のエキスはＥＵＬ  Ｈｅｒｂ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ（Ｌａ  Ｖｅｒｎｅ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）及びＮｕＰｈａｒｍａ  Ｎｅｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｍｉａｍｉ  Ｂｅａｃｈ，  Ｆｌｏｒｉｄａ）を含むさまざまな源から商業的に得られうる。さらに、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．エキスは以下により完全に議論される又は本分野において知られる又は示される抽出法のいずれかにより得られうる。
【００３９】
Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓとしても知られる、本発明に係る独特の組成物において有用な化合物の１であるシベリア・チョウセンニンジンは北東アジアが産地のＡｒａｌｉａｃｅａｅ科の小さな木のような低木の種類である。シベリア・チョウセンニンジンは広い範囲の健康利点を有する強い強壮薬草である。例えば、シベリア・チョウセンニンジンは乳（乳腺）癌、胃癌、口腔癌、皮膚黒色腫及び卵巣癌に対して免疫保護効果を有する。それは主にヘルパー／インヂューサー型のＴリンパ球に対して著しい効果を有することがわかったが、また細胞毒性及びナチュラルキラー細胞に対しても著しい効果を有することがわかった。さらに、シベリア・チョウセンニンジンは骨粗しょう症に対して保護効果を有することが知られる。例えば、Ｋｒｏｐｏｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｓｉｂｅｒｉａｎ  ｇｉｎｓｅｎｇ  ｅｘｔｒａｃｔ  ａｎｄ  ｉｐｒｉｆｌａｖｏｎｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ．”  Ｂｕｌｌ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．，  ２００２．  １３３（３）：２５２−４を参照のこと。
【００４０】
以下により完全に議論されるように、本発明は一部には、シベリア・チョウセンニンジンのエキス（又はシベリア・チョウセンニンジンエキス）がＢＭＰ−２プロモーター活性、ＢＭＰ−２遺伝子発現及びＢＭＰ−２タンパク質発現の強いアクチベーターであるという発見に基づく。さらに、以下に議論されるアッセイ結果は、シベリア・チョウセンニンジンエキスがクェルセチン二水和物と共に投与されるとき、上記組み合わせはいずれかの成分単独で達成されるものを超えるＢＭＰ−２プロモーター活性、遺伝子発現及びタンパク質発現をもたらす驚くべき相乗効果を達成することを示す。
【００４１】
シベリア・チョウセンニンジンエキスはＸｉ’ａｎ  Ｔｉａｎｘｉｎｇｊｉａｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｇｒｏｕｐ（Ｘｉ’ａｎ，  Ｓｈａａｎｘｉ，  Ｃｈｉｎａ）の如きさまざまな供給者から商業的に得られうる。さらに、シベリア・チョウセンニンジンエキスは以下により完全に議論される又は本分野において知られる抽出技術のいずれかを用いて得られうる。１の例において、シベリア・チョウセンニンジンエキスはシベリア・チョウセンニンジンの根及び／又は根茎のアルコール流体抽出物として得られうる。
【００４２】
本発明に係る独特の組成物において有用なもう一つの化合物であるＳｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ又はＳｏｐｈｏｒａ  ｆｒｕｃｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃａはまたＰａｇｏｄａ  Ｔｒｅｅとも呼ばれ、東アジアが産地である。Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキス中に見つけられうる活性化合物であるルチンは毛細血管の浸透性（例えば、消散及び拡張の多孔性）を増加させるために使用されうる。ルチンに加えて、クェルセチン無水物及びクェルセチン二水和物は葉、茎、花、種、根等からを含むＳｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ植物から抽出されうる。
【００４３】
以下により完全に議論されるように、本発明は一部には、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａのエキス（又はＳｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキス）はＢＭＰ−２プロモーター活性、遺伝子発現及びタンパク質発現の強いアクチベーターであるという発見に基づく。
Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキスはＮｕＰｈａｒｍａ  Ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｍｉａｍｉ  Ｂｅａｃｈ，  Ｆｌｏｒｉｄａ）の如きさまざまな供給者から商業的に得られうる。さらに、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキスは以下により完全に議論される又は本分野において知られる抽出技術のいずれかを用いて得られうる。１の例において、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａの熟した種は本発明において有用なＳｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキスを得るために使用されうる。
【００４４】
本発明に係る独特の組成物において有用なカンゾウエキスは一般的にカタル、気管支炎及び咳の如き気管支の問題の治療において広く使用される。カンゾウはまた消化性潰瘍、胃炎及び潰瘍の制御において重要な成分を形成する。ＪＰ  ２００２  １７９５８５及びＵＳ  ２００２０００９５０６にしたがって、１日当たり５０〜１００ｍｇに及ぶ量で投与されるとき、カンゾウは骨粗しょう症を治療する、骨代謝を改善する、及び石灰化を促進するために使用されうる。
【００４５】
以下により完全に議論されるように、本発明は一部には、カンゾウエキス（又はカンゾウのエキス）、例えば、カンゾウのエタノール及びエタノール−水抽出物はＢＭＰ−２プロモーター活性、遺伝子発現及びタンパク質発現の強いアクチベーターであるという発見に基づく。さらに、以下に議論されるアッセイ結果は、カンゾウエキスがクェルセチン二水和物と共に投与されるとき、上記組み合わせはいずれかの成分単独で達成されるものを超えるＢＭＰ−２プロモーター活性、遺伝子発現及びタンパク質発現をもたらす驚くべき相乗効果を達成することを示す。
【００４６】
カンゾウエキスはＨｅｒｂｓ  Ｆｏｒｅｖｅｒ，  Ｉｎｃ．（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の如きさまざまな供給者から商業的に得られうる。さらに、カンゾウエキスは以下により完全に議論される又は本分野において知られる抽出技術のいずれかを用いて得られうる。１の例において、カンゾウエキスはＧｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｇｌａｂｒａの根、ほふく枝、及び／又は根茎から得られるカンゾウのエタノール抽出物でありうる。
【００４７】
本発明に係る独特の組成物において有用なもう一つの化合物であるイプリフラボンはイソフラボンである。イプリフラボンはアルファルファの如きマメ科植物において少量で見つけられうるが、イプリフラボンは一般的に出発物質としてポリフェノールを用いて、７−イソプロポキシイソフラボンとして合成的に製造される。
【００４８】
以下により完全に議論されるように、本発明は一部には、イプリフラボンがＲＡＮＫ−Ｌ発現の強い阻害剤であるという発見に基づく。イプリフラボンはさまざまな源から商業的に得られうる。例えば、Ｏｓｔｉｖｏｎｅ（商標）はＴｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｓｏｕｒｃｉｎｇ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．（Ｍｉｓｓｏｕｌａ，  Ｍｏｎｔａｎａ）から入手可能な合成イプリフラボン化合物である。
【００４９】
ザクロは本発明に係る独特の組成物において有用なザクロのエキス（ザクロエキス）を産生するために抽出されうる。抽出されるとき、Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍとして知られるザクロは一般的にエラグ酸又はプニカラジン内容量について標準化される。プニカラジンは２，３，ヘキサヒドロキシヂフェノイル−ガラジル−Ｄ−グルコースのアイソマーとして存在する。例示的な構造は以下に示される：
【化１】
0005706467.tif 000002
【００５０】
ザクロエキスはまたザクロジュースのフリーラヂカルスカベンジャー能の原因でありうる加水分解可能なタンニン、及び特にプニカラジンの如きポリフェノールが多い場合がある。
【００５１】
日本において、ザクロは骨量減少を阻害するために使用されてきた。ＪＰ  １９９９  ００４９８８４を参照のこと。本発明は一部には、ザクロエキスがＲＡＮＫ−Ｌ発現、生成又は放出の強い阻害剤であるという発見に基づく。１の例において、ザクロエキス中に存在するプニカラジンはＲＡＮＫ−Ｌ発現を阻害する又は減少させる。それゆえ、プニカラジン、エラグ酸又は両方を含むザクロエキスはＲＡＮＫ−Ｌの生成、放出、及び／又は発現を阻害する、減少させる又は妨げるための組成物及び方法において有用である。
【００５２】
ザクロエキスはＮａｔｕｒｅ’ｓ  Ｗａｙ（Ｓｐｒｉｎｇｖｉｌｌｅ，  Ｕｔａｈ）、Ｎａｔｕｒｅ’ｓ  Ｈｅｒｂｓ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｏｒｋ，  Ｕｔａｈ）、Ｓｗａｎｓｅｎ’ｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｆａｒｇｏ，  Ｎｏｒｔｈ  Ｄａｋｏｔａ）及びＤｏｃｔｏｒ’ｓ  Ｔｒｕｓｔ  Ｖｉｔａｍｉｎｓ（Ｏｒｌａｎｄｏ，  Ｆｌｏｒｉｄａ）を含むさまざまな源から商業的に得られうる。さらに、ザクロエキスは以下により完全に議論される又は本分野において知られる抽出技術のいずれかを用いて得られうる。
【００５３】
本発明に係る独特の組成物において有用なもう一つの抽出物であるイチョウのエキス（又はイチョウエキス）は３の効果を有することが知られる：（１）ほとんどの組織及び器官への（小さな毛細血管中の微小循環を含む）血流を改善する；（２）フリーラヂカルからの酸化的細胞損傷に対して保護する（抗酸化剤）；及び（３）血小板凝集及び血液凝固の効果をブロックする。
【００５４】
イチョウエキスはＰｕｒｉｔａｎ’ｓ  Ｐｒｉｄｅ（Ｌｏｎｇ  Ｉｓｌａｎｄ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を含むさまざまな源から商業的に得られうる。さらに、イチョウエキスは本明細書中に開示される又は本分野において知られる抽出プロセスのいずれかを用いて得られうる。例えば、イチョウエキスはイチョウの乾燥した又は新鮮な葉又は種を抽出するための本明細書中に開示される又は本分野において知られる抽出プロセスのいずれかを用いて得られうる。
【００５５】
本発明に係る独特の組成物において有用な化合物の１を産生するために抽出されうる緑茶は頭痛、体の痛み、乏しい消化を治療する、及び状態及び生活の見込みを改善するための医薬として中国人により長く使用されている。緑茶エキスは抗酸化エピガロカテキン没食子酸塩（ＥＧＣＧ）を含む、ビオフラボノイドを多く含む。緑茶エキス中のＥＧＣＧは消化器官及び呼吸器感染に対して保護し、発癌物質の活性をブロックし、抗生物質として機能しうる、及びまたより低いコレステロール値の助けとなりうる。
【００５６】
以下により完全に議論されるように、本発明は一部には、緑茶エキス（又は緑茶のエキス）がＲＡＮＫ−Ｌ発現の強い阻害剤であるという発見に基づく。緑茶エキスはＬｉｆｅ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（Ｆｏｒｔ  Ｌａｕｄｅｒｄａｌｅ，  Ｆｌｏｒｉｄａ）を含むさまざまな源から商業的に得られうる。さらに、緑茶エキスは以下により完全に議論される又は本分野において知られる抽出技術のいずれかを用いて得られうる。
【００５７】
本発明に係る独特の組成物において有用なもう一つの化合物であるブドウの種エキス（又はブドウの種のエキス）はヒトの体内で抗酸化剤（フリーラヂカルスカベンジャー）としてはたらくオリゴマーのプロアントシアニヂン又はＯＰＣｓとして知られる１のクラスのフラボノイド複合体を含む。ＯＰＣｓは内部及び環境ストレスの効果（すなわち、タバコ喫煙、汚染、及び正常な体の代謝プロセスを支持すること）に対して保護する助けとなりうる。
【００５８】
本発明において使用されるブドウの種エキスは商業的に入手可能な源から得られうる。例えば、ブドウの種エキスはＫｉｋｋｏｍａｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）、Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｉｃｓ，  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｅｒａ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｂｉｏ  Ｓｅｒａｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＳＡ（Ｂｒａｍ，  Ｆｒａｎｃｅ）、ＯｐｔｉＰｕｒｅ（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｄｒｙ  Ｃｒｅｅｋ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，  Ｉｎｃ．（Ｍｏｄｅｓｔｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）又は他の好適な源から得られうる。さらに、以下により完全に議論される抽出技術又は本分野において知られる又は示される抽出技術は本発明において使用されるブドウの種エキスを生成するために使用されうる。
【００５９】
本発明に係る独特の組成物において有用な抽出物の１であるトウキはまたＡｎｇｅｌｉｃａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ又は「女性チョウセンニンジン」としても知られ、及び中国原産のＡｐｉａｃｅａｅファミリーからの薬草である。その根はトウキ又はダングイ（中国語：当き；発音：ｄａｎｇｇｕｉ）として中国語で通常知られ、及び婦人科の病気、疲労、中程度の貧血及び高血圧を治療するための中国伝統の医薬において広く使用される。トウキは鎮痛、抗炎症、抗痙攣及び鎮静効果を有する。上記植物の植物化学はクマリン、フィトステロール、多糖、フェルレート、及びフラボノイドから成る。
トウキエキス（又はトウキのエキス）はＣａｐｒｉｃｏｒｎｓ  Ｌａｉｒ（Ｏｇｄｅｎ，  Ｕｔａｈ）を含む、さまざまな異なる源から商業的に得られうる。さらに、トウキは以下により完全に示される抽出技術のいずれか又は本分野において知られるいずれかの抽出技術を用いて抽出されうる。
【００６０】
本発明において使用される各抽出物は商業的に入手可能であるが、上記抽出物を商業的に購入することなく、本発明において使用される抽出物を生成するために使用されうる多くの抽出法がある。本発明において使用される抽出物を生成するために使用されうる抽出法のいくつかの例は以下に示される。他の例はさまざまな出版物及び特許中を含んで、本分野において知られ、及び示される。以下により完全に示される抽出法は例示的であり、及び当業者は他の抽出技術及び方法が本発明において有用な抽出物を得るために使用されうることを理解するであろう。
【００６１】
本発明において使用される抽出物は異なる品種及び種類を含む、さまざまな源からでありうる。例えば、どんな色又は品種のブドウからのブドウの種もブドウの種エキスを得るために使用されうる。さらに、果実、果皮、種、茎、葉、根、樹皮、根茎、ほふく枝等を含む、植物のいずれの部分も抽出されうる。
【００６２】
１の例において、本発明に係る独特の組成物において有用な抽出物は有機溶媒抽出技術を用いて得られうる。より詳細には、カンゾウエキス又はカンゾウ根エキスの如き、本発明において有用な抽出物は有機溶媒、例えば、ヘキサン、酢酸エチル、エタノール又はヒドロエタノールでカンゾウ又はカンゾウ根を抽出することにより生成されうる。
【００６３】
他の例において、溶媒連続画分化は本発明に係る独特の組成物において有用な抽出物を得るために使用されうる。例えば、この技術を用いて、ブドウの種エキスはヘキサン、酢酸エチル、エタノール、及びヒドロエタノールでブドウの種を連続的に抽出することにより得られうる。上記連続の各段階（画分）後に得られる抽出物はそれらを抽出するために使用された溶媒と同様の増加する順の極性で化学化合物を含むであろう。上記画分は上記溶媒を蒸発させるために乾燥され、ブドウの種エキスをもたらす。当業者は、多くの他の溶媒が溶媒連続画分化抽出の実施において使用されうることを理解するであろう。
【００６４】
トータルヒドロエタノール抽出技術もまた本発明に係る独特の組成物において有用な抽出物を得るために使用されうる。一般的に、これは一括抽出と呼ばれる。このプロセスにおいて作出される抽出物は脂肪及び水溶解物質を含む抽出された材料中に存在する広くさまざまな植物化学物質を含むであろう。抽出溶液の回収後、上記溶媒は蒸発され、抽出物をもたらすであろう。１の例において、ザクロはこの技術を用いて抽出されうる。
【００６５】
トータルエタノール抽出もまた本発明において使用されうる。この技術は溶媒としてヒドロエタノールではなくエタノールを使用する。この抽出技術は水溶性化合物に加えて脂肪溶解性及び／又は脂肪親和性化合物を含みうる抽出物を作出する。緑茶エキスはこの技術を用いて得られうる。
【００６６】
本発明において有用な抽出物を得るために使用されうる抽出技術の他の例は超臨界流体二酸化炭素抽出（ＳＦＥ）である。この抽出手順において、抽出される材料はどんな有機溶媒にも暴露されない。むしろ、上記抽出溶媒は超臨界状態（＞３１．３℃及び＞７３．８バール）における、緩和剤を伴う又は伴わない二酸化炭素である。当業者は温度及び圧力条件は抽出物の最も良い収率を得るために変化されうることを理解するであろう。この技術は上記に示されるトータルヘキサン及び酢酸エチル抽出技術と同様に、脂肪溶解性及び／又は脂肪親和性化合物の抽出物を作出する。
【００６７】
当業者は、本発明の実施において使用される抽出物を得るために使用されうる本分野において知られる及びさまざまな特許及び出版物中に示される多くの他の抽出プロセスがあることを理解するであろう。例えば、本明細書中に援用する、以下のリファレンス中に示される抽出手順は本発明の実施において使用されうる：Ｍｕｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐｈｅｎｏｌｓ  ａｎｄ  ｔａｎｎｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｇｒａｐｅ  ｓｅｅｄｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｎ  ｄｉｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ａｌｃｏｈｏｌ．”  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ２０００  Ａｕｇ：４８（８）：３４０８−１２；  Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｅｎｏｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｒｏｍ  ｇｒａｐｅ  ｓｅｅｄ．”  Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ  Ｌｅｔｔ．  ２００１；１５（３）：１９７−２０４；  Ａｓｈｒａｆ−Ｋｈｏｒａｓｓａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒａｐｅ  ｓｅｅｄｓ  ｉｎｔｏ  ｏｉｌｓ，  ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ，  ａｎｄ  ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ  ｖｉａ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  ＣＯ2−ｂａｓｅｄ  ｆｌｕｉｄｓ．”  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，  ２００４  Ｍａｙ  ５；５２（９）：２４４０−４。
【００６８】
本発明に係る組成物
本発明に係る組成物は許容される担体中に調合されうる、及び骨成長を増加させる又は刺激する、骨再吸収を阻害する、減少させる又は妨げる、骨強度を増加させる、骨構造を改善する、骨構成を改善する又は非限定的に、骨折、骨粗しょう症、歯周病、遷移性骨疾患、及び骨溶解性骨疾患を含むさまざまな骨障害の治療、予防又は管理のために調製され、包装され、及び標識化されうる。
【００６９】
１の例において、本発明は少なくとも２の以下のもの：クェルセチン無水物、クェルセチン二水和物、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．エキス、シベリア・チョウセンニンジンエキス、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキス、カンゾウエキス、及びイプリフラボンの組み合わせを含む、骨成長を増加させる又は刺激するための組成物であり、ここで上記組み合わせはＢＭＰ−２遺伝子又はタンパク質発現を増加させる。
【００７０】
他の例において、本発明は少なくとも２の以下のもの：クェルセチン無水物、クェルセチン二水和物、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．エキス、シベリア・チョウセンニンジンエキス、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキス、カンゾウエキス、及びイプリフラボンの組み合わせを含む、骨成長を増加させるための組成物であり、ここで上記組み合わせはＢＭＰ−２遺伝子又はタンパク質発現を増加させ、及びさらにここで、存在する場合：クェルセチン無水物又はクェルセチン二水和物は約１０〜１０００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約２００〜７５０ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約３００〜７００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約４００〜６００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約５００ｍｇの量で存在する；Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．エキスは約１０〜１０００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約１００〜９００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約２００〜８００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約３００〜７００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約４００〜６００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約５００ｍｇの量で存在する；シベリア・チョウセンニンジンエキスは１００〜８００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約２００〜７５０ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約３００〜７００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約４００〜６００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約５００ｍｇの量で存在する；Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキスは１０〜１０００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約１００〜９００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約２００〜８００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約３００〜７００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約４００〜６００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約５００ｍｇの量で存在する；カンゾウエキスは約１０〜５００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約２５〜４５０ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約５０〜４００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約７５〜３５０ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約１００〜３００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約１２５〜２５０ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約２５〜１７５ｍｇに及ぶ量で存在する；及びイプリフラボンは２００〜７００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約２５０〜６５０ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約３００〜６００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約４００〜５００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約６００ｍｇの量で存在する。
【００７１】
他の例において、本発明はクェルセチン無水物、クェルセチン二水和物、シベリア・チョウセンニンジンエキス、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキス、及びカンゾウエキスの組み合わせを含む骨成長を増加させる又は刺激するための組成物であり、ここで上記組み合わせはＢＭＰ−２遺伝子又はタンパク質発現を増加させ、及びさらにここで上記クェルセチン無水物又はクェルセチン二水和物は約１０〜１０００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約２００〜７５０ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約３００〜７００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約４００〜６００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約５００ｍｇの量で存在する；シベリア・チョウセンニンジンエキスは約１００〜８００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約２００〜７５０ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約３００〜７００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約４００〜６００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約５００ｍｇの量で存在する；Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキスは約１０〜１０００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約１００〜９００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約２００〜８００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約３００〜７００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約４００〜６００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約５００ｍｇの量で存在する；及びカンゾウエキスは１０〜５００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約２５〜４５０ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約５０〜４００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約７５〜３５０ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約１００〜３００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約１２５〜２５０ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約２５〜１７５ｍｇに及ぶ量で存在する。
【００７２】
他の例において、本発明は約１０〜１０００ｍｇ、より好ましくは約２５０〜７５０ｍｇ、より好ましくは約３００〜７００ｍｇ、より好ましくは約４００〜６００ｍｇ、より好ましくは約５００ｍｇのクェルセチン無水物、クェルセチン二水和物；約１００〜８００ｍｇ、より好ましくは約２００〜７５０ｍｇ、より好ましくは約３００〜７００ｍｇ、より好ましくは約４００〜６００ｍｇ、より好ましくは約５００ｍｇのシベリア・チョウセンニンジン；及び約１０〜５００ｍｇ、より好ましくは約２５〜４５０ｍｇ、より好ましくは約５０〜４００ｍｇ、より好ましくは約７５〜３５０ｍｇ、より好ましくは約１００〜３００ｍｇ、より好ましくは約１２５〜２５０ｍｇ、より好ましくは約２５〜１７５ｍｇのカンゾウエキスの組み合わせを含む骨成長を増加させる又は刺激するための組成物であり、ここで上記組み合わせはＢＭＰ−２遺伝子又はタンパク質発現を増加させる。
【００７３】
さらなる例において、本発明はクェルセチン無水物又はクェルセチン二水和物、シベリア・チョウセンニンジンエキス、及びカンゾウエキスの組み合わせを含む骨成長を増加させる又は刺激するための組成物であり、ここで上記組み合わせはＢＭＰ−２遺伝子又はタンパク質発現を増加させ、及びさらにここで上記クェルセチン無水物又はクェルセチン二水和物、シベリア・チョウセンニンジンエキス、及びカンゾウエキスは等しい量で存在し、より好ましくはシベリア・チョウセンニンジンエキスはクェルセチン無水物又はクェルセチン二水和物の１／２の量である量で存在し、及びカンゾウエキスはクェルセチン無水物又はクェルセチン二水和物の１／１０の量である量で存在する。
【００７４】
他の例において、本発明はクェルセチン無水物又はクェルセチン二水和物、及びシベリア・チョウセンニンジンエキスの組み合わせを含む、骨成長を増加させる又は刺激するための組成物であり、ここでクェルセチン無水物又はクェルセチン二水和物は上記組成物の約１０〜７５％  ｗ／ｗ、より好ましくは上記組成物の約５０％  ｗ／ｗを形成し、及びシベリア・チョウセンニンジンエキスは上記組成物の約１０〜７５％  ｗ／ｗ、より好ましくは上記組成物の約５０％  ｗ／ｗを形成し、ここでクェルセチン無水物又はクェルセチン二水和物及びシベリア・チョウセンニンジンエキスの組み合わせはＢＭＰ−２遺伝子又はタンパク質発現を増加させる。
【００７５】
また他の例において、本発明は少なくとも２の：クェルセチン無水物、クェルセチン二水和物、シベリア・チョウセンニンジンエキス、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキス、及びカンゾウエキスの組み合わせを含む骨成長を増加させる又は刺激するための組成物であり、ここで存在する場合、クェルセチン無水物又はクェルセチン二水和物は上記組成物の約１０〜７５％  ｗ／ｗ、より好ましくは上記組成物の約５０％  ｗ／ｗを形成し；シベリア・チョウセンニンジンエキスは上記組成物の約１０〜７５％  ｗ／ｗ、より好ましくは上記組成物の約５０％  ｗ／ｗを形成し；Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキスは上記組成物の約１〜５０％  ｗ／ｗ、より好ましくは上記組成物の約２〜１５％  ｗ／ｗ、より好ましくは上記組成物の約５〜１０％  ｗ／ｗを形成し；及びカンゾウエキスは上記組成物の約１〜５０％  ｗ／ｗ、より好ましくは上記組成物の約２〜１５％  ｗ／ｗ、より好ましくは上記組成物の約５〜１０％  ｗ／ｗを形成し、さらにここで上記組み合わせはＢＭＰ−２遺伝子又はタンパク質発現を増加させる。
【００７６】
さらなる例において、本発明は約１０〜１０００ｍｇ、より好ましくは約２５０〜７５０ｍｇ、より好ましくは約３００〜７００ｍｇ、より好ましくは約４００〜６００ｍｇ、より好ましくは約５００ｍｇのクェルセチン無水物又はクェルセチン二水和物；及び約１０〜５００ｍｇ、より好ましくは約２０〜１２５ｍｇ、より好ましくは約２０〜１００ｍｇ、より好ましくは約２５〜７５ｍｇ、より好ましくは約５０ｍｇのカンゾウエキスの組み合わせを含む骨成長を増加させる又は刺激するための組成物であり、ここで上記組み合わせはＢＭＰ−２遺伝子又はタンパク質発現を増加させる。
【００７７】
他の例において、本発明は約１０〜１０００ｍｇ、より好ましくは約２５０〜７５０ｍｇ、より好ましくは約３００〜７００ｍｇ、より好ましくは約４００〜６００ｍｇ、より好ましくは約５００ｍｇのクェルセチン無水物又はクェルセチン二水和物；及び約１００〜８００ｍｇ、より好ましくは約２００〜７５０ｍｇ、より好ましくは約３００〜７００ｍｇ、より好ましくは約４００〜６００ｍｇ、より好ましくは約５００ｍｇのシベリア・チョウセンニンジンエキスの組み合わせを含む骨成長を増加させる又は刺激するための組成物であり、ここでクェルセチン無水物又はクェルセチン二水和物、及びシベリア・チョウセンニンジンエキスの上記組み合わせはＢＭＰ−２遺伝子又はタンパク質発現を増加させる。
【００７８】
さらなる例において、本発明は少なくとも２の以下のもの：クェルセチン無水物、クェルセチン二水和物、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．エキス、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．根エキス、シベリア・チョウセンニンジンエキス、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキス、カンゾウエキス、及びイプリフラボンの組み合わせを含む組成物を患者に投与することを含む、患者において骨成長を増加させる又は刺激する方法であり、ここで上記組み合わせは上記患者においてＢＭＰ−２遺伝子又はタンパク質発現を増加させる。
【００７９】
本発明のさらなる例は約１０〜１０００ｍｇ、より好ましくは約２５０〜７５０ｍｇ、より好ましくは約３００〜７００ｍｇ、より好ましくは約４００〜６００ｍｇ、より好ましくは約５００ｍｇのクェルセチン無水物又はクェルセチン二水和物；約１００〜８００ｍｇ、より好ましくは約２００〜７５０ｍｇ、より好ましくは約３００〜７００ｍｇ、より好ましくは約４００〜６００ｍｇ、より好ましくは約５００ｍｇのシベリア・チョウセンニンジンエキス；及び約１０〜５００ｍｇ、より好ましくは約２５〜４５０ｍｇ、より好ましくは約５０〜４００ｍｇ、より好ましくは約７５〜３５０ｍｇ、より好ましくは約１００〜３００ｍｇ、より好ましくは約１２５〜２５０ｍｇ、より好ましくは約２５〜７５ｍｇのカンゾウエキスの組み合わせを含む組成物を患者に投与することを含む、患者において骨成長を増加させる又は刺激する方法であり、ここで上記組み合わせはＢＭＰ−２遺伝子又はタンパク質発現を増加させる。
【００８０】
本発明の他の例は約１０〜１０００ｍｇ、より好ましくは約２５０〜７５０ｍｇ、より好ましくは約３００〜７００ｍｇ、より好ましくは約４００〜６００ｍｇ、より好ましくは約５００ｍｇのクェルセチン無水物又はクェルセチン二水和物；及び約１０〜５００ｍｇ、より好ましくは約２０〜１２５ｍｇ、より好ましくは約２０〜１００ｍｇ、より好ましくは約２５〜７５ｍｇ、より好ましくは約５０ｍｇのカンゾウエキスの組み合わせを含む組成物を患者に投与することを含む、患者において骨成長を増加させる又は刺激する方法であり、ここで上記組み合わせはＢＭＰ−２遺伝子又はタンパク質発現を増加させる。
【００８１】
本発明のさらなる例は約１０〜１０００ｍｇ、より好ましくは約２５０〜７５０ｍｇ、より好ましくは約３００〜７００ｍｇ、より好ましくは約４００〜６００ｍｇ、より好ましくは約５００ｍｇのクェルセチン無水物又はクェルセチン二水和物；及び約１００〜８００ｍｇ、より好ましくは約２００〜７５０ｍｇ、より好ましくは約３００〜７００ｍｇ、より好ましくは約４００〜６００ｍｇ、より好ましくは約５００ｍｇのシベリア・チョウセンニンジンエキスの組み合わせを含む組成物を患者に投与することを含む、患者において骨成長を増加させる又は刺激する方法であり、ここでクェルセチン無水物又はクェルセチン二水和物、及びシベリア・チョウセンニンジンエキスの上記組み合わせは上記患者においてＢＭＰ−２遺伝子又はタンパク質の発現及び／又は活性を増加させる。
【００８２】
他の例において、本発明はザクロエキス及び少なくとも１の以下の天然、植物由来抽出物：シベリア・チョウセンニンジンエキス、イチョウエキス、緑茶エキス、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキス、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．エキス、ブドウの種エキス、トウキエキス、及びイプリフラボンを含む骨再吸収を阻害する、減少させる又は妨げるための組成物であり、ここで上記組成物はＲＡＮＫ−Ｌの発現、生成、及び／又は放出を阻害し、及びさらにここで上記ザクロエキスは約１０〜２０００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約３００〜１７００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約４００〜１５００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約５００〜１２５０ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約６００〜１０００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約７００〜９００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約５００ｍｇの量で存在し；及び存在する場合、シベリア・チョウセンニンジンエキスは約１００〜２０００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約３００〜１７００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約４００〜１５００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約５００〜１２５０ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約６００〜１０００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約７００〜９００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約５００ｍｇの量で存在し；イチョウエキスは約１０〜１０００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約１００〜９００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約２００〜８００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約３００〜７００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約４００〜６００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約５００ｍｇの量で存在し；緑茶エキスは約３００〜７００に及ぶ量で、より好ましくは約３５０〜６５０ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約４００〜６００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約５００ｍｇの量で存在し；Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキスは１０〜１０００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約１００〜９００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約２００〜８００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは３００〜７００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約４００〜６００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約５００ｍｇの量で存在し；Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．エキスは約１０〜１０００ｍｇ、より好ましくは約１００〜９００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約２００〜８００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約３００〜７００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約４００〜６００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約５００ｍｇの量で存在し；ブドウの種エキスは３５〜２５０ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約５０〜１５０ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約７５〜１２５ｍｇに及ぶ量で存在し；トウキエキスは約１０〜１０００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約１００〜９００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約２００〜８００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約３００〜７００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約４００〜６００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約５００ｍｇの量で存在し；及びイプリフラボンは約４００〜７００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約４５０〜６５０ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約５００〜６００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約６００ｍｇの量で存在し；ここで上���組み合わせはＲＡＮＫ−Ｌ発現、生成及び／又は放出を阻害し又は骨からのカルシウム放出を阻害する。
【００８３】
さらなる例において、本発明は約１０〜２０００ｍｇ、より好ましくは約４００〜１７００ｍｇ、より好ましくは約５００〜１５００ｍｇ、より好ましくは約６００〜１２５０ｍｇ、より好ましくは約７００〜１０００ｍｇ、より好ましくは約８００〜９００ｍｇのザクロエキス；約３５〜２５０ｍｇ、より好ましくは約５０〜１５０ｍｇ、より好ましくは約７５〜１２５ｍｇのブドウの種エキス；約４００〜７００ｍｇ、より好ましくは約４５０〜６５０ｍｇ、より好ましくは約５００〜６００ｍｇ、より好ましくは約６００ｍｇのイプリフラボン；及び約３００〜７００ｍｇ、より好ましくは約３５０〜６５０ｍｇ、より好ましくは約４００〜６００ｍｇ、より好ましくは約５００ｍｇの緑茶エキスの組み合わせを含む骨再吸収を阻害する、減少させる又は妨げるための組成物であり、ここで上記組み合わせはＲＡＮＫ−Ｌの発現、生成、及び／又は放出を阻害する又は骨からのカルシウム放出を阻害する。
【００８４】
他の例において、本発明は約１０〜２０００ｍｇ、より好ましくは約４００〜１７００ｍｇ、より好ましくは約５００〜１５００ｍｇ、より好ましくは６００〜１２５０ｍｇ、より好ましくは約７００〜１０００ｍｇ、より好ましくは約８００〜９００ｍｇのザクロエキス；約３５〜２５０ｍｇ、より好ましくは約５０〜１５０ｍｇ、より好ましくは約７５〜１２５ｍｇのブドウの種エキス；及び約４００〜７００ｍｇ、より好ましくは約４５０〜６５０ｍｇ、より好ましくは約５００〜６００ｍｇ、より好ましくは約６００ｍｇのイプリフラボンの組み合わせを含む骨再吸収を阻害する、減少させる又は妨げるための組成物であり、ここで上記組み合わせはＲＡＮＫ−Ｌの発現、生成、及び／又は放出を阻害する又は骨からのカルシウム放出を阻害する。
【００８５】
他の例において、本発明はザクロエキス、ブドウの種エキス、及びイプリフラボンの組み合わせを含む骨再吸収を阻害する、減少させる又は妨げるための組成物であり、ここで上記ブドウの種エキスはザクロエキスの約１／１０の量で存在し、及び上記イプリフラボンは約４００〜７００ｍｇ、より好ましくは約４５０〜６５０ｍｇ、より好ましくは約５００〜６００ｍｇ、より好ましくは約６００ｍｇの量で存在し、ここで上記組み合わせはＲＡＮＫ−Ｌの発現、生成、及び／又は放出を阻害する又は骨からのカルシウム放出を阻害する。
【００８６】
さらなる例において、本発明は少なくとも２のザクロエキス、ブドウの種エキス、イプリフラボン、及び緑茶エキスの組み合わせを含む骨再吸収を阻害する、減少させる又は妨げるための組成物であり、ここで、存在する場合、上記ザクロエキスは上記組成物の約２５〜１００％  ｗ／ｗに、より好ましくは上記組成物の約３０〜９０％  ｗ／ｗに、より好ましくは上記組成物の約４０〜８０％  ｗ／ｗに、より好ましくは上記組成物の約４５〜６０％  ｗ／ｗに、より好ましくは上記組成物の約５０％  ｗ／ｗに及ぶ量で存在し；上記ブドウの種エキスは上記組成物の約１〜２５％  ｗ／ｗに、より好ましくは上記組成物の約２〜１５％  ｗ／ｗに、より好ましくは上記組成物の約５〜１０％  ｗ／ｗに及ぶ量で存在し；上記イプリフラボンは上記組成物の約２５〜１００％  ｗ／ｗに、より好ましくは上記組成物の約３０〜９０％  ｗ／ｗに、より好ましくは上記組成物の約４０〜８０％  ｗ／ｗに、より好ましくは上記組成物の約４５〜６０％  ｗ／ｗに、より好ましくは上記組成物の約５０％  ｗ／ｗに及ぶ量で存在し；及び上記緑茶エキスは上記組成物の約１〜２５％  ｗ／ｗに、より好ましくは上記組成物の約２〜１５％  ｗ／ｗに、より好ましくは上記組成物の約５〜１０％  ｗ／ｗに及ぶ量で存在し、さらにここで上記組み合わせはＲＡＮＫ−Ｌの発現、生成、及び／又は放出を阻害する又は骨からのカルシウム放出を阻害する。
【００８７】
本発明に係る他の例は少なくとも１の以下の抽出物：ザクロ、シベリア・チョウセンニンジン、イチョウ、緑茶、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．、ブドウの種、トウキ、及びイプリフラボンを含む、天然、植物由来抽出物を含む組成物を患者に投与することを含む、患者において骨再吸収を阻害する、減少させる又は妨げる方法であり、ここで上記組成物はＲＡＮＫ−Ｌの発現、生成、及び／又は放出を阻害する又は骨からのカルシウム放出を阻害する。
【００８８】
さらなる例において、本発明は約１０〜２０００ｍｇ、より好ましくは約４００〜１７００ｍｇ、より好ましくは約５００〜１５００ｍｇ、より好ましくは約６００〜１２５０ｍｇ、より好ましくは約７００〜１０００ｍｇ、より好ましくは約８００〜９００ｍｇのザクロエキス；約３５〜２５０ｍｇ、より好ましくは約５０〜１５０ｍｇ、より好ましくは約７５〜１２５ｍｇのブドウの種エキス；約４００〜７００ｍｇ、より好ましくは約４５０〜６５０ｍｇ、より好ましくは約５００〜６００ｍｇ、より好ましくは約６００ｍｇのイプリフラボン；及び約３００〜７００ｍｇ、より好ましくは約３５０〜６５０ｍｇ、より好ましくは約４００〜６００ｍｇ、より好ましくは約５００ｍｇの緑茶エキスの組み合わせを含む組成物を患者に投与することを含む、患者において骨再吸収を阻害する、減少させる又は妨げる方法であり、ここで上記組み合わせはＲＡＮＫ−Ｌの発現、生成、及び／又は放出を阻害する又は骨からのカルシウム放出を阻害する。
【００８９】
さらなる例において、本発明は約１０〜２０００ｍｇ、より好ましくは約４００〜７００ｍｇ、より好ましくは約５００〜１５００ｍｇ、より好ましくは約６００〜１２５０ｍｇ、より好ましくは約７００〜１０００ｍｇ、より好ましくは約８００〜９００ｍｇのザクロエキス；約３５〜２５０ｍｇ、より好ましくは約５０〜１２５ｍｇ、より好ましくは約７５〜１００ｍｇのブドウの種エキス；及び約４００〜７００ｍｇ、より好ましくは約４５０〜６５０ｍｇ、より好ましくは約５００〜６００ｍｇ、より好ましくは約６００ｍｇのイプリフラボンの組み合わせを含む組成物を患者に投与することを含む、患者において骨再吸収を阻害する、減少させる又は妨げる方法であり、ここで上記組み合わせはＲＡＮＫ−Ｌの発現、生成、及び／又は放出を阻害する又は骨からのカルシウム放出を阻害する。
【００９０】
さらなる例において、本発明は少なくとも２の：クェルセチン二水和物、クェルセチン無水物、シベリア・チョウセンニンジンエキス、カンゾウエキス、及びＳｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキスの組み合わせを含む第一の組成物；及び少なくとも２の：ザクロエキス、ブドウの種エキス、イプリフラボン、及び緑茶エキスの組み合わせを含む第二の組成物を含む骨成長を増加させる又は刺激する及び骨再吸収を阻害する、減少させる又は妨げるための食事サプリメント管理であり、ここで上記第一の組成物の組み合わせはＢＭＰ−２の発現及び／又は活性を増加させ、及びここで上記第二の組成物の組み合わせはＲＡＮＫ−Ｌの発現を阻害する又は骨からのカルシウム放出を阻害する。
【００９１】
さらなる例において、本発明は少なくとも２の：クェルセチン無水物、クェルセチン二水和物、シベリア・チョウセンニンジンエキス、カンゾウエキス、及びＳｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキスの組み合わせを含む第一の組成物；及び少なくとも２の：ザクロエキス、ブドウの種エキス、イプリフラボン、及び緑茶エキスの組み合わせを含む第二の組成物を含む骨成長を増加させる又は刺激する及び骨再吸収を阻害する、減少させる又は妨げるための食事サプリメント管理であり、ここで、存在する場合、クェルセチン無水物又はクェルセチン二水和物は約１０〜１０００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約２００〜７５０ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約３００〜７００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約４００〜６００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約５００ｍｇの量で存在し；ここで、存在する場合、シベリア・チョウセンニンジンエキスは約１００〜８００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約２００〜７５０ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約３００〜７００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約４００〜６００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約５００ｍｇの量で存在し；ここで、存在する場合、カンゾウエキスは１０〜５００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約２５〜４５０ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約５０〜４００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約７５〜３５０ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約１００〜３００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約１２５〜２５０ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約２５〜１７５ｍｇに及ぶ量で存在し；及びここで、存在する場合、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキスは約１０〜１０００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約１００〜９００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約２００〜８００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約３００〜７００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約４００〜６００ｍｇに及ぶ量で、より好ましくは約５００ｍｇの量で存在し、及びさらにここで上記第一の組成物の組み合わせはＢＭＰ−２の発現及び／又は活性を増加させ；ここで、存在する場合、ザクロエキスは約１０〜２０００ｍｇ、より好ましくは約４００〜１７００ｍｇ、より好ましくは約５００〜１５００ｍｇ、より好ましくは約６００〜１２５０ｍｇ、より好ましくは約７００〜１０００ｍｇ、より好ましくは約８００〜９００ｍｇに及ぶ量で存在し；ここで、存在する場合、ブドウの種エキスは約３５〜２５０ｍｇ、より好ましくは約５０〜１５０ｍｇ、より好ましくは約７５〜１２５ｍｇに及ぶ量で存在し；ここで、存在する場合、イプリフラボンは約４００〜７００ｍｇ、より好ましくは約４５０〜６５０ｍｇ、より好ましくは約５００〜６００ｍｇ、より好ましくは約６００ｍｇに及ぶ量で存在し；及びここで、存在する場合、緑茶エキスは約３００〜７００ｍｇ、より好ましくは約３５０〜６５０ｍｇ、より好ましくは約４００〜６００ｍｇ、より好ましくは約５００ｍｇに及ぶ量で存在し、及びさらにここで上記第二の組成物の組み合わせはＲＡＮＫ−Ｌの発現を阻害する又は骨からのカルシウム放出を阻害する。
【００９２】
投与様式
本発明に係る組成物は体系的に又は局所的に投与されうる。体系的使用のために、本発明に係る組成物は慣用の方法にしたがって、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋内、腹腔内、鼻内又は経皮）又は腸溶性（例えば、経口又は直腸）デリバリーのために調合される。静脈内投与は一連の注入により又は延長された期間にわたる連続的な点滴によりうる。注入による投与又は別々に間隔をあけられた投与の他の経路は毎週から毎日１〜３回までの範囲の間隔で行われうる。あるいは、本明細書中に開示される組成物は周期的な様式で投与されうる（開示された組成物の投与；続いて投与なし；続いて開示された組成物の投与；等）。治療は所望の結果が達成されるまで続きうる。あるいは、本発明に係る組成物の投与は連続的であり、及びそれゆえ治療のための投与よりむしろ、予防的投与でありうる。
【００９３】
一般的に、本発明に係る組成物は塩水、緩衝塩水、水中の５％デキストロース、微少金属を含むホウ酸緩衝塩水等の如き、化粧品として又は医薬として許容される媒体を含みうる。本発明に係る組成物は１以上の賦形剤、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＤ又はカルシウム；保存剤；溶解剤；緩衝剤；バイアル表面上でのタンパク質損失を避けるためのアルブミン；潤滑剤；充填剤；安定化剤等をさらに含みうる。調合方法は本分野において周知であり、及び例えば、本明細書中に援用する、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ，  １９９０中に開示される。
【００９４】
本発明内での使用のための組成物は滅菌、非発熱性液体溶液又は懸濁物、コーティングされたカプセル、坐剤、凍結乾燥粉末、経皮パッチの形態又は本分野において既知の他の形態でありうる。局所投与は怪我又は欠損の部位での注入により又は上記部位での固体担体の挿入又は取付けにより又は粘性液体の直接的な局所適用等によりうる。局所投与のために、上記デリバリー媒体は好ましくは成長する骨又は軟骨のためのマトリックスを提供し、及びより好ましくは悪い効果なしに患者により吸収されうる媒体である。
【００９５】
水性懸濁物は、ビタミンＡ、ビタミンＤ、及びカルシウムの如き薬理学的に許容される賦形剤、メチルセルロースの如き懸濁剤；及びレシチン、リソレシチン又は長鎖脂肪アルコールの如き浸潤剤を伴う本発明に係る抽出成分を含みうる。前記水性懸濁物はまた産業標準にしたがって保存剤、着色剤、香味剤、甘味剤等をも含みうる。
【００９６】
好ましくは、本発明に係る組成物はピル、錠剤、粉末、棒、食物、飲料、ロゼンジ等の形態で経口投与される。さらに、本発明に係る組成物は使用前の水又は他の好適な媒体での再構成のための乾燥又は粉末化製品として提示されうる。液体調製物は懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素化食用油）；乳化剤（例えば、レシチン又はアカシア）；非水性媒体（例えば、アーモンド油、油性エステル又は画分化植物油）；及び保存剤（例えば、メチル又はプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）の如き医薬として許容される添加物を伴って慣用の手段により調製されうる。
飲料の形態で投与されるとき、本発明に係る組成物は水ベース、牛乳ベース、茶ベース、果物ジュースベース又はそれらのいくつかの組み合わせでありうる。
【００９７】
本発明に係る組成物はまた結合剤（例えば、事前にゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピローリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微晶質セルロース又はリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン又はグリコール酸ナトリウムデンプン）；又は浸潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）の如き医薬として許容される賦形剤を伴って慣用の手段により調製される固体の形態で経口投与されうる。上記固体は本分野において周知の方法によりコーティングされうる。好ましい態様において、本発明に係る組成物は経口消費のための２ピースの硬い殻のカプセル、柔らかいゼラチンカプセル又は液体中に溶解されるべき粉末の形態をとりうる。経口投与のための調製物は上記活性化合物の制御された放出を与えるよう好適に調合されうる。
【００９８】
経口投与される本発明に係る組成物はキサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、デンプン、デキストリン、発酵ホエイ、豆腐、マルトデキストリン、糖アルコール（例えば、ソルビトール及びマンニトール）を含むポリオール、炭水化物（例えば、ラクトース）、プロピレングリコールアルギン酸塩、ジェランガム、グアール、ぺクチン、トラガカントガム、アカシアガム、イナゴマメガム、アラビアガム、ゼラチン、及びこれらの濃化剤の混合物を含む濃化剤をさらに含みうる。これらの濃化剤は典型的に関連する特定の濃化剤及び所望の粘性効果に因り、約０．１％までの値で本発明に係る調合物中に含まれる。
【００９９】
本発明に係る経口で投与される組成物は炭水化物甘味剤及び天然及び／又は人工ゼロ／低カロリー甘味剤を含む、有効な量の１以上の甘味剤を含みうる、及び典型的に含むであろう。本発明に係る調合物中で使用される甘味剤の量は変化するであろうが、典型的に使用される甘味剤の型及び所望される甘味強度に因る。
【０１００】
以前に示される調合物に加えて、上記化合物はまた維持される及び／又は時を設定される放出調合物としても調合されうる。通常の時を設定される及び／又は制御される放出デリバリーシステムは、非限定的に、デンプン、浸透ポンプ又はゼラチン微小カプセルを含む。
【０１０１】
上記組成物は、所望の場合、本発明に係る組成物を含む１以上の単位投与形態を含みうるパック又はディスペンサー装置中で提示されうる。上記パックは例えば、ブリスターパックの如き、金属又はプラスティックホイルを含みうる。上記パック又はディスペンサー装置は投与のための教示を伴いうる。
【０１０２】
局所（ｔｏｐｉｃａｌ）及び局所（ｌｏｃａｌ）適用のための本発明に係る組成物の調製物は低脂肪族アルコール、グリセロール、ポリエチレングリコールの如きポリグリコール、脂肪酸のエステル、油及び脂肪、及びシリコンを含みうる化粧品として又は医薬として適切な媒体中のエーロゾルスプレイ、ローション、ジェル及び軟膏を含む。上記調製物はアスコルビン酸又はトコフェロールの如き抗酸化剤、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルの如き保存剤をさらに含みうる。
非経口調製物は特に滅菌製品又は滅菌された製品を含む。
【０１０３】
注入可能組成物は本発明に係る抽出物及び周知の注入可能担体のいずれかの組み合わせを含んで提供されうる。これらは浸透圧を調節するための塩を含みうる。
他の有用な投与形態は当業者により十分に理解されるであろう方法及び技術により調製されうる、及び錠剤、カプセル又は液体投与形態の作出における追加の成分の使用を含みうる。例示的な投与量、投与頻度、及び投与方法は本明細書中で議論されるが、これらは単に例示であり、及び用量、投与頻度、及び投与様式は個々の消費者又は患者の年齢、体重、状態及び応答、及び使用される本発明に係る特定の組成物にしたがって変化しうることが理解される。
【実施例】
【０１０４】
実施例
動物試験に従事することは出願者の方針ではない。しかしながら、出願者は本発明に係る組成物及び方法において使用される可能性のある成分のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験をとおして顕著な結果を得、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は有用な情報を提供しうるが、器官を制御する複雑な機構を伴う器官としての骨を研究室で真似ることはできないので、上記試験は動物研究に置き換えることはできない。それゆえ、出願者は本発明において有用な組成物の活性及び方法を確認するために、以下に示されるいくつかの動物研究を行った。全ての動物研究を行うことにおいて、出願者は例えば、その全内容を本明細書中に援用する、Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓにより１９９４年４月に出版されたｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｕｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ中に概略される動物の取り扱い及び人道にかなった処置についてのガイダンスにしたがった。また、その全内容を本明細書中に援用する、１９９８年にＷｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎにより出版されたＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  ｉｎ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ（ＩＳＢＮ番号９７８９２４１５４５２２８）及びｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｅｎｔｉｔｙ／ａｇｅｉｎｇ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｎｏｎｃｏｍｍｕｎｉｃａｂｌｅ／ａｌｃ ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ ｂｒｉｅｆ．ｐｄｆで入手可能なＷａｒｋ，  Ｊｏｈｎ  Ｄ．  ａｎｄ  Ｗｅｓｔｍｏｒｅ，  Ａｎｎ，  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｍｅａｓｕｒｅｓ  ｔｏ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ；  ａ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｎｏｎ−ｅｘｐｅｒｔｓ（最後に２００７年１０月２１日に参照した）も参照のこと。
【０１０５】
実施例１：ＢＭＰ−２プロモーター、遺伝子、及びタンパク質の発現／活性
レポーター遺伝子ルシフェラーゼに結合されたＢＭＰ−２プロモーターでトランスフェクトされたマウス線維芽細胞である２Ｔ３−ＢＭＰ２−ルシフェラーゼ細胞を１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１％グルタミンを含むアルファ−ＭＥＭ  １０％ＦＣＳを用いて培養し、及び１週間に１回１／５に分ける。上記細胞を５×１０3細胞／１００μｌ／ウェルの細胞密度でマイクロタイタープレート中にまく。上記細胞を３７℃で５％ＣＯ2で２４時間の事前インキュベーション期間を用いて接着させ及び安定化させる。上記培地を除去し、及び５０μｌのアルファ−ＭＥＭ  ４％ＦＣＳで置き換える。試験されるべき化合物又は因子（２×）を含む５０μｌのＳｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ（０．１％ＢＳＡ）を各ウェルに添加する。最終体積は１００μｌであり、及び最終血清濃度は２％ＦＣＳである。使用されるルーチンのポジティブコントロールは組換えヒトＢＭＰ２（「ｒｈＢＭＰ２」）又はチャイニーズハムスター卵巣−ＢＭＰ２（「ＣＨＯ−ＢＭＰ２」）調製培地である。処理された細胞をその後３７℃、５％ＣＯ2で４８時間インキュベートする。培地をその後除去し、及び上記細胞をＰＢＳで３回すすぐ。過剰のＰＢＳを上記ウェルから除去し、及び１００μｌの細胞培養物溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｅ１５３Ａ）を各ウェルに添加し、及び少なくとも１０分間インキュベートする。１０μｌの上記細胞溶解物を基質（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｅ１５２Ａ）を伴う１００μｌのルシフェラーゼアッセイ緩衝液を含む９６ウェル白色ルミノメトリックプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ＃００１０１０７１００）に添加する。上記ルシフェラーゼ活性をＤｙｎａｔｅｃｈ  ＭＬ２２５０自動化９６ウェルルミノメーターを用いて読む。上記データをその後ルシフェラーゼ活性／ウェルの割合又はルシフェラーゼ活性／μｇタンパク質の割合のいずれかとして表す。
【０１０６】
以下の化合物をＢＭＰ−２プロモーターを活性化するそれらの能力について試験した：クェルセチン、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．エキス、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．根エキス、シベリア・チョウセンニンジンエキス、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキス、カンゾウエキス、イプリフラボン、及びｃａｌ−ｚ−ｂｏｎｅ。結果及び試験された濃度は表１で以下に報告される：
【０１０７】
【表１】
0005706467.tif 000003
【０１０８】
表１において、Ｒ−１＝Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．エキス（ＥＵＬ）、Ｒ−２＝Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．エキス（Ｄｒａｃｏ）、Ｒ−３＝Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．根（ＮｕＰｈａｒｍａ）、ＳＦＪ＝Ｓｏｐｈｏｒａ  ｆｒｕｃｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ、ＳＪ＝Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ（ＮｕＰｈａｒｍａ）、ＳＧ＝シベリア・チョウセンニンジン、Ｑ＝クェルセチン、Ｉ＝イプリフラボン、Ｌ＝カンゾウ、ＣＺＢ＝Ｃａｌ−Ｚ−ｂｏｎｅ。*注意：倍の値が２以上である場合、上記処理はＢＭＰ−２プロモーターを顕著に活性化した。倍の値が２未満である場合、上記処理はＢＭＰ−２プロモーターに対して効果を有しなかった。したがって、このアッセイにしたがって、クェルセチン二水和物及びイプリフラボンはＢＭＰ−２プロモーターの最も強いアクチベーターであった。
【０１０９】
ＢＭＰ−２プロモーター活性を試験するための上記に示されるアッセイと同様のアッセイを用いてＢＭＰ−２遺伝子発現及びタンパク質発現について試験することもまた可能である。詳細には、遺伝子発現のために、ヒト骨肉腫細胞系、ＭＧ−６３（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１４２７）を３７℃及び５％ＣＯ2で（ＡＴＣＣにより推奨される）ＭＥＭを含むフェノールレッド中で維持する。実験前２４時間、３×１０5細胞をフェノールレッドなしＭＥＭ中の１２−ウェルプレート中にまく。各実験のために、細胞を１０、１、及び０．１μｇ／ｍｌの処理濃度の試験抽出物で処理する。一晩のインキュベーション後、ＲＮＡを慣用のトリゾール／グアニヂンイソチオシアネートに基づいた溶解を用いて抽出する。単離されたＲＮＡをＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｉで消化してＤＮＡ汚染を除去し、及びその後製造業者の教示（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にしたがってランダムヘキサマー及びオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いてｃＤＮＡに逆転写した。定量的リアルタイムＰＣＲをＢＭＰ−２についてのＦＡＭ−標識特異的プライマー及び１８Ｓ  ｒＲＮＡについてのＨＥＸ−標識特異的プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行う。全ての反応を三重で行い、及び処理されたサンプル対処理されなかったサンプル中のｍＲＮＡの相対量をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより確率された比較ＣT法（２００１）を用いて計算する。２倍以上の遺伝子発現変化は有意と考えられる。
【０１１０】
ＢＭＰ−２タンパク質発現を計測するために、Ｈｕ０９細胞を１×１０4細胞／ウェルの密度で９６−ウェル培養プレート中にまき、及び１０％ＦＣＳで補充されたアルファ−ＭＥＭで２４時間培養する。上記細胞を異なるプロテアソーム阻害剤で２４時間処理する。インキュベーション後、上記調製された培地を微小遠心分離管に移し、及び１４，０００ｒｐｍで２〜３分間遠心分離して細胞くずを除去する。上清中のＢＭＰ−２タンパク質濃度をその後標準のＢＭＰ−２Ｅｌｉｓａ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴ  ＤＢＰ２００）を用いて決定する。組換えｈＢＭＰ−２（Ｒ＆Ｄ）を標準として使用する。
以下の化合物をＢＭＰ−２遺伝子発現及びタンパク質発現を増加させるそれらの能力について試験した：クェルセチン、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．エキス、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．根エキス、シベリア・チョウセンニンジンエキス、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａエキス、カンゾウエキス、イプリフラボン、及びｃａｌ−ｚ−ｂｏｎｅ。結果及び上記タンパク質発現アッセイにおいて試験された濃度は表２中以下に報告される。
【０１１１】
【表２】
0005706467.tif 000004
【０１１２】
表２において、Ｒ−１＝Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．エキス（ＥＵＬ）、Ｒ−２＝Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．エキス（Ｄｒａｃｏ）、Ｒ−３＝Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．根（ＮｕＰｈａｒｍａ）、ＳＦＪ＝Ｓｏｐｈｏｒａ  ｆｒｕｃｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ、ＳＪ＝Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ（ＮｕＰｈａｒｍａ）、ＳＧ＝シベリア・チョウセンニンジン、Ｑ＝クェルセチン、Ｉ＝イプリフラボン、Ｌ＝カンゾウ、及びＣＺＢ＝Ｃａｌ−Ｚ−ｂｏｎｅ。*注意：倍の値が２以上である場合、上記処理はＢＭＰ−２タンパク質発現を顕著に活性化した。倍の値が２未満である場合、上記処理はＢＭＰ−２タンパク質発現に対して効果を有しなかった。
【０１１３】
結果及び上記遺伝子発現アッセイにおいて試験された濃度は表３中以下に列挙される。２倍以上の変化である遺伝子発現における増加は有意と考えられる。
【０１１４】
【表３】
0005706467.tif 000005
【０１１５】
遺伝子発現アッセイの追加の結果は表４中以下に列挙される。表４において、Ｑ＝クェルセチン、ＳＧ＝シベリア・チョウセンニンジン、ＳＪ＝Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ、及びＬ＝カンゾウ。２倍以上である遺伝子発現における増加は有意と考えられる。相乗効果はクェルセチン単独に優って１０：５又は２：１及び１０：１０又は１：１の割合のクェルセチン対カンゾウで見られた。
【０１１６】
【表４】
0005706467.tif 000006
【０１１７】
【表５】
0005706467.tif 000007
【０１１８】
実施例２：骨成長を計測するための頭蓋冠アッセイ
４日齢のＳｗｉｓｓ白色マウスからの新生児マウス頭蓋冠を摘出し、ＢＧＪ培地（Ｓｉｇｍａ）に入れ、及び中線縫合に沿って半分に切る。０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で補充した１ミリリットルのＢＧＪ培地を１２ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）の各ウェルに添加し、そこに関連因子又は媒体を添加する。各半分の頭蓋冠を培地／空気界面で上記培地中のステンレススチール格子上に置く。通常、実験群当たり４の骨が使用される。組換えＢＭＰ−２（５μｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）又はインスリン（１０μｇ／ｍｌ）は骨形成の正の刺激剤として使用されうる。試験されるべき因子を０日目（解剖の日）に添加し、及び培地を２４及び９６時間（７日アッセイが必要とされる場合）で変える。頭蓋冠を加湿された空気（５％ＣＯ2）中で３７℃で維持する。インキュベーション期間後、上記頭蓋冠をその後除去し、及び１０％ホルマリン中で一晩固定した。上記頭蓋冠をその後１４％ＥＤＴＡ中で一晩脱石灰し、及びその後パラフィンワックス中に埋め込む。節をその後中線縫合に沿って標準のミクロトームを用いて切って冠状縫合点及びこの縫合点の後方領域を暴露する。４ミクロメーターの節をはじめに及び２の連続した４００ｎｍの深さで取った。節をコーティングされたガラススライド（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  ｐｌｕｓ，  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，  ＰＡ）上に置き、及びヘマトキシリン及びエオシンで染色する。矢状縫合点の後方の節中の全体及び新規骨領域（ｍｍ2として表される）、縫合点の厚み（ｍｍ）、及び骨表面に沿って並ぶ細胞数を決定する。組織形態計測分析をＯｓｔｅｏｍｅａｓｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｏｓｔｅｏｍｅｔｒｉｃｓ  ＩＮＣ，  Ａｔｌａｎｔａ，  ＧＡ）を用いて行う。
【０１１９】
このアッセイにおいて試験される抽出物はＳｏｐｈｏｒａ  ｆｒｕｃｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃａエキス、シベリア・チョウセンニンジンエキス、クェルセチン二水和物、クェルセチン無水物、イプリフラボン、カンゾウ、及びＣａｌ−Ｚ−ｂｏｎｅを含む。頭蓋冠アッセイにおけるこれらの抽出物の試験結果は表５及び６中以下に報告される。表５において、ＳＪ＝Ｓｏｐｈｏｒａ  ｆｒｕｃｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ、ＳＧ＝シベリア・チョウセンニンジン、Ｑ＝クェルセチン、Ｉ＝イプリフラボン、Ｌ＝カンゾウ、及びＣＺＢ＝Ｃａｌ−Ｚ−Ｂｏｎｅ。ＢＭＰ−２及びＳｉｍｖａｓｔａｔｉｎをポジティブコントロールとして使用した。以下の表中で、上付き文字ａ（a）は、結果がブランクサンプル（０μｇ／ｍｌの濃度）とは顕著に異なる（ｐ＜０．０５）ことを意味する。ｐ≦０．０５の差（すなわち、誤差が５％以下である場合）は有意と考えられる。表５上のデータのはじめの４列はさまざまな割合の成分の混合物に基づく、例えば、「Ｑ：ＳＧ」の下の１：１は、クェルセチン二水和物及びシベリア・チョウセンニンジン成分が同じ量でその混合物中に存在することを示す。
【０１２０】
【表６】
0005706467.tif 000008
【０１２１】
顕著に、上記結果は、クェルセチン及びシベリア・チョウセンニンジンエキスの間の相乗効果は相加より大きいことを示す。特に、相加効果を想定して、１μｇ／ｍｌで約１２ｍｍ2×１０ｍｍ-3の新規骨形成が期待されうる。それゆえ、クェルセチン及びシベリア・チョウセンニンジンエキスの５０％濃度で、期待される結果は約６ｍｍ2×１０-3であろうが、上記結果はクェルセチン及びシベリア・チョウセンニンジンエキスの組み合わせは約１３ｍｍ2×１０-3の新規骨形成を達成したことを示す。
【０１２２】
上記に示される頭蓋冠アッセイを本発明に係る組成物中で有用な抽出物のさまざまな組み合わせで繰り返した。表６について、Ｑ＝クェルセチン、ＳＧ＝シベリア・チョウセンニンジン、Ｌ＝カンゾウ。以下の表において、上付き文字ａ（a）は、結果がブランクサンプル（０μｇ／ｍｌの濃度）と顕著に異なる（ｐ＜０．０５）ことを意味する。ｐ＜０．０５の差は有意と考えられる。各調合物についての結果は表６中以下に報告される。
【０１２３】
【表７】
0005706467.tif 000009
【０１２４】
実施例３：骨成長を計測するためのｉｎ  ｖｉｖｏ研究
３の異なる処方を２００〜２５０グラムのおよその体重の約１２〜１４週齢の雌の無傷のラットに関するｉｎ  ｖｉｖｏ研究において試験した。処方１は２５０ｍｇクェルセチン：２５０ｍｇカンゾウエタノール抽出物及び５００ｍｇクェルセチン：５００ｍｇカンゾウエタノール抽出物でクェルセチン無水物及びカンゾウの用量を含んだ。処方２は２５０ｍｇクェルセチン：１２５ｍｇカンゾウエタノール抽出物；５００ｍｇクェルセチン：２５０ｍｇカンゾウエタノール抽出物；及び１０００ｍｇクェルセチン：５００ｍｇカンゾウエタノール抽出物でクェルセチン無水物及びカンゾウの用量を含んだ。処方３は１０００ｍｇクェルセチン：２００ｍｇカンゾウエタノール抽出物でクェルセチン及びカンゾウの用量を含んだ。研究は３５日間続いた。ラットの８の別々の群を各群中１５のラットで試験した。試験されたラットの８群のうちの２はコントロール群であった。１はプラシーボコントロール群であり、及び他の群は１週間当たり５０μｇ／ｋｇ（１０μｇ／２００ｇ）／３×副甲状腺ホルモンを受けた。同化作用剤として知られる副甲状腺ホルモンはポジティブコントロールとしてはたらいた。例えば、その全内容を本明細書中に援用する、Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｉｓｕｓｅ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｍａｌｅ  ｒａｔｓ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ａｎａｂｏｌｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｏｓｅ  ｏｆ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ．”  Ｊ．  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２００６．  Ｖｏｌ．  １０１：８８１−８８６を参照のこと。
【０１２５】
以下の表７は８の試験群それぞれに与えられる処方を示す。表７中の投与量は推奨されるヒト日投与量に基づく。ＦＤＡ用量変換式（ヒトと同等の用量（ＨＥＤ，ｍｇ／ｋｇ）＝ｍｇ／ｋｇのラット用量×（ｋｇのラット体重／ｋｇのヒト体重）0.33）をヒト用量をラット用量に変換するために使用した。
ＨＥＤ＝ラットＮＯＡＥＬ×（Ｗ−ラット／Ｗ−ヒト）(1-b)、ｂ＝０．６７。
表７において、Ｑ＝クェルセチン及びＬ＝カンゾウ。
【０１２６】
【表８】
0005706467.tif 000010
【０１２７】
雌のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを使用した（各２００〜２５０ｇｍ、約１２〜１４週齢）。動物に実験開始から３５日間、プラシーボ食餌又は上記に列挙される処方の１のいずれかを含む１５ｇｍ／日で給餌した。食餌を１５グラム／ラット／日の割合でラットに各朝与えた。上記ラットに水を自由に取らせ、及び全実験のために適切なケージ内で飼った。制限なしの活動を３５日間続く全実験中に許容した。
【０１２８】
骨形成に対する上記処方の効果を（骨強度及び機能情報を評価するための）生体力学的計測、（仮想骨質及び機能情報を分析するための）ミクロ−ＣＴ、及び（骨質及び機能情報を分析するための）組織形態学的計測を含む結果計測により評価した。組織形態学的計測を行う方法は、その全内容を本明細書中に援用する、Ｐａ  Ｒｅｖｅｌｌ，  “Ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ，”  Ｊ．  Ｃｌｉｎｅ．  Ｐａｔｈｏｌ．，  １９８３．  Ｖｏｌ．３６：１３２１−１３３１により示される。使用される用語及び単位はＨｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈにより推奨されるものである。ミクロ−ＣＴ計測を行う方法は、その全内容を本明細書中に援用する、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｍｉｃｒｏ  ＣＴ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏ  ＭＲ  ｉｍａｇｉｎｉｎｇ  ｏｆ  ３Ｄ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｓｋｅｌｅｔｏｎ．”  Ｊ．  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌ  Ｎｅｕｒｏｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．  ２０００．  Ｖｏｌ．１：４５−５１で示される。これらの計測を３５日間の処置後に決定した。
【０１２９】
各群からの６の動物を処置後３５日目に殺した。大腿骨を組織形態学的分析に使用した。骨形成に対する異なる処方の効果を決定するために、小柱骨体積、小柱細胞数及び小柱分離を組織形態学的技術により評価した。以下の表、表８において、上付き文字ａ（a）は、結果がプラシーボ群（処置なし）と顕著に異なる（ｐ＜０．０５）ことを意味する。ｐ＜０．０５の差は有意と考えられる。表８中以下に示されるように、ポジティブコントロール群、ＰＴＨはプラシーボ群と比較してＰＴＨでの処置後、骨体積における顕著な増加（５５．８３％）、小柱細胞数における顕著な増加（１９．５７％）、及び小柱分離における減少（３８．３０％）を示した。同様に、群３に投与された処方はプラシーボ群に比較して骨体積における顕著な増加（４７．５９％）、小柱細胞数における顕著な増加（２４．１９％）、及び小柱分離における減少（２３．５２％）を示し、及びその効果はＰＴＨ処置に匹敵した。
【０１３０】
【表９】
0005706467.tif 000011
【０１３１】
表８は、群５に投与された処方がプラシーボに比較して小柱骨体積における顕著な差を示した（Ｐ＜０．０５）ことを示す。
さらに、表８は小柱骨厚の計測を報告する。骨厚のより高い値は骨マスにおける増加をもたらしうる、骨中のより大量の鉱物質沈積を示す。群３に投与された処方はプラシーボ群に比較して小柱骨厚を顕著に増加させ（１３．０４％）、及びその効果はＰＴＨ処置（７．３５％）に匹敵した。
【０１３２】
また表８により報告される骨鉱物質付加率（ＭＡＲｓ）を、投与された２の蛍光色素の間の時間間隔（５日間）で割った平均標識間距離を計測することにより決定した。より大きな骨鉱物質付加率（又は鉱化表面）は、沈積されたより多くの新規骨があることを意味する。この結果は小柱骨厚結果に対応するはずである。本当に、処置３５日後、群３に投与された処方はプラシーボ群に比較して骨鉱物質付加率における顕著な増加（２６．６０％）を示し、及びその効果はＰＴＨ処置（２８．５１％）に匹敵した。
【０１３３】
表８は骨形成率（ＢＦＲｓ）についての値をさらに提供する。ＢＦＲｓを（エピフルオレセンを用いて見られる）テトラサイクリンで標識化された骨表面の大きさ及び２の標識（カルセイン及びテトラサイクリン）が存在する領域における標識間の距離から計測し、及びそれをマイクロメーター２乗／マイクロメーター３乗／日（μｍ2／ｍｍ3／日）として表した。より大きな骨形成率は、より多くの新規骨組織が形成されうることを意味する。骨形成率の結果は骨鉱物質付加率の観察された変化と一致した。群３に投与された処方はプラシーボ群に比較して骨形成率における顕著な増加を示し（５１．３７％）、及びその効果はＰＴＨ処置（４５．８３％）に匹敵した。
【０１３４】
この研究において使用された他の効力決定技術は仮想骨質、構造及び機能情報を提供しうるミクロ−ＣＴ計測であった。この分析結果は表９中以下に報告される。
骨鉱物質密度（ＢＭＤ）、骨体積（％骨体積／全体積）、小柱数、及び小柱分離の如き広い範囲のパラメーターからの情報を得ることは定量的な及び定性的な骨構造評価のために重要である。これらのパラメーターのうち、骨体積、小柱数、及び小柱分離の結果は骨の健康と相関する。
【０１３５】
表９中に報告される結果は、群２及び５に投与された処方がプラシーボ群に比較して骨芽細胞形成を効果的に高め、及び骨鉱物質密度（ＢＭＤ）を顕著に増加させたこと、及びそれらの有効性はＰＴＨ処置に匹敵したことを示す。結果はまた、群１、２、及び５に投与された処方がプラシーボ群に比較して骨体積及び小柱細胞数を顕著に増加させ、及び小柱分離を減少させたこと、及びそれらの有効性はＰＴＨ処置に匹敵したことをも示す。表９において、上付き文字ａ（a）は結果がプラシーボ群とは顕著に異なる（ｐ＜０．０５）ことを示す。ｐ＜０．０５の差は有意と考えられる。
【０１３６】
【表１０】
0005706467.tif 000012
【０１３７】
骨マス及び骨体積評価に加えて、骨強度を２の異なるパラメーターを用いて機械的に調べた。１のパラメーターは骨折に要する最大力を計測し、及び他方は骨剛性（弾性）を決定した。骨強度及び剛性の決定方法は、その全内容を本明細書中に援用する、Ｓｔｕｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  Ｂｅｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｒｅａｋｉｎｇ  Ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｔｉｃ  Ｍｅｔａｐｈｙｓｅａｌ  Ｔｉｂｉａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒａｔ：  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ，  Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ，  ａｎｄ  Ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ，”  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００６．  Ｖｏｌ．２１（１）：８９−９６により示される。
【０１３８】
表１０において、結果はポジティブコントロール群（ＰＴＨ）及びプラシーボ群を含むどの処置群の間でも骨折に要する最大力及び骨剛性において統計的な差はなかったことを示す。ポジティブコントロール群からの効果がなかったことは１週間当たり３回のみの頻度で使用されたＰＴＨの比較的低い用量のためでありうる。ＰＴＨは強力な同化作用剤であるが、ＰＴＨ用量は悪い効果を誘発することなく骨形成に中程度の効果を提供するよう特に選択された。
【０１３９】
【表１１】
0005706467.tif 000013
【０１４０】
実施例４：ＲＡＮＫ−Ｌの阻害研究
１５０〜２５０ｍｇの各成分を計って１５ｍｌ円錐形底管に入れる。５０μｇ／ｍｌの最終ストック溶液で終わるように、５０％ＤＭＳＯ：３０％エタノール：２０％水の溶液中に溶解する。溶媒コントロールのために、１．５ｍｌ  ＤＭＳＯ、０．９ｍｌエタノール、及び０．６ｍｌ水を混合する。激しくボルテックスする。水浴、室温中で１０分間超音波処理する。再び激しくボルテックスする。新しいフェノールレッドなし培地中に成分ストックを希釈する。
【０１４１】
ヒト骨肉腫細胞系、ＭＧ−６３（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１４２７）を３７℃及び５％ＣＯ2で（ＡＴＣＣにより推奨される）ＭＥＭを含むフェノールレッド中で維持する。実験前２４時間、３×１０5細胞をフェノールレッドなしＭＥＭ中の１２ウェルプレート中にまく。消費された培地をウェルから除去し、及びＭＧ−６３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１４２７）を１、０．１、０．０１μｇ／ｍｌの各試験成分又は３０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−ベータ（＋コントロール）で３７℃、５％ＣＯ2で４時間前処理する。（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  ｃａｔ＃１００−Ｂ−００１からの）ＴＧＦ−ベータのストック溶液は３０μｇ／ｍｌである。
【０１４２】
前処理インキュベーション期間後、１０μｇ／ｍｌ  ＩＬ−１ｂ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（カタログ＃４０７６１５）及び１０μｇ／ｍｌのストック溶液、カタログ＃４０７６１５）を３７℃で１８時間、上記細胞培養物に添加した。上記処理された及び刺激された細胞からの上清培地を除去し、及び総ＲＡＮＫ−Ｌタンパク質を製造業者（ＡＰＯＴＥＣＨから、カタログ＃ＡＰＯ−５４Ｎ−０１６−ｋ１０１）により示されるように（三重で）ＲＡＮＫ−Ｌ  ＥＬＩＳＡを用いて計測した。生ずるタンパク質量を培地処理（処理なし）刺激細胞のそれと比較して総ＲＡＮＫ−Ｌタンパク質におけるパーセント減少を決定した。
【０１４３】
上記に示されるアッセイ手順をＲＡＮＫ−Ｌ発現、生成又は放出を阻害する、イチョウ、緑茶、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｆｒｕｃｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．、ザクロ、シベリア・チョウセンニンジン、イプリフラボン、ブドウの種、トウキ、及びＳｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａの抽出物の能力を決定するために使用した。このアッセイ結果は表１１中以下に報告される。１０％以上の減少は有意と考えられる。
【０１４４】
【表１２】
0005706467.tif 000014
【０１４５】
表１１で報告される結果に基づいて、ザクロエキス、イプリフラボン（Ｏｓｔｉｖｏｎｅ）、ブドウの種エキス（４０％プロアントシアニヂン）及び緑茶エキス（４０％ＥＧＣＧ）はＲＡＮＫ−Ｌ生成／放出の阻害に対して正の効果を示したことが決定された。それゆえ、これらの成分のさまざまな組み合わせを上記に示されるＲＡＮＫ−Ｌ阻害アッセイを用いて試験してどんなレベルのＲＡＮＫ−Ｌ生成／放出の阻害が達成されうるかを決定した。結果は表１２中以下に報告される。これらの報告が示すように、１０μｇ／ｍｌのザクロ、１０μｇ／ｍｌのイプリフラボン、１μｇ／ｍｌのブドウの種エキス、及び１μｇ／ｍｌの緑茶の組み合わせは骨芽細胞のＩＬ−１Ｂタンパク質刺激に応答したＲＡＮＫ−Ｌ合成の阻害を最大限にする処方であることがわかった。上記結果はまたザクロを伴ういずれも一般的に優れたふるまいをすることを示す。さらに、主な障害は上記成分中に見られなかった。
【０１４６】
【表１３】
0005706467.tif 000015
【０１４７】
【表１４】
0005706467.tif 000016
【０１４８】
実施例５：ザクロからのプニカラジンの単離
新鮮なザクロの皮をむいて皮から種を分離した。上記種、皮、及び果実果肉を水及びアルコールの組み合わせ（８０：２０）を用いて別々に抽出した。上記皮、種、及び果肉のそれぞれはプニカラジンを含む抽出物を産生したが、ザクロの皮エキスは最も高い値のプニカラジンを産生した。さらに、水はプニカラジンを抽出するための最も優れた抽出溶媒であることが示された。
【０１４９】
実施例６：プニカラジンによるＲＡＮＫ−Ｌの阻害
プニカラジン試験サンプルを１００ｍｇ／ｍｌの１００％ＤＭＳＯを用いてザクロの皮、薄皮、果肉果実、及び種からを含むザクロから抽出する。上記抽出中の粒子物質は除去されない。上記プニカラジン試験サンプルを１０倍最終濃度までバックグランドシグナルを下げるためにフェノールレッド（エストロゲン様）及び０．１％ＦＢＳを含まないＭＥＭ中に希釈する。最終ＤＭＳＯ濃度を０．２％未満に維持し、及び処理間で一定に維持する。ＤＭＳＯ溶媒コントロールを非処理群において使用する。
【０１５０】
ＭＧ６３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１４７２）、ヒト由来骨肉腫細胞系を１０％ＦＢＳでフェノールレッドなしＭＥＭを含む１２ウェルプレート中に１ウェル当たり２００，０００細胞でまく。次の日、上記培地を０．１％ＦＢＳでフェノールレッドなしＭＥＭに変える。上記細胞を４時間インキュベートし、及びその後１、１０、及び１００μｇ／ｍｌの濃度のプニカラジン試験サンプルで処理する。
【０１５１】
４時間の処理後、ＩＬ−１ｂ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（カタログ＃４０７６１５）、１０μｇ／ｍｌのストック溶液、カタログ＃４０７６１５）を３ｎｇ／ｍＬの最終濃度添加する。上記処理された細胞、刺激物質ＩＬ−１ｂをその後３７℃で１６時間インキュベートする。
【０１５２】
１６時間後、上記細胞を溶解し、及びＲＮＡをＲＮａｓｙ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で上記細胞から抽出する。ＲＮＡを２段階ｑＲＴ−ＰＣＲ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び４μＬの精製ＲＮＡを用いてｃＤＮＡに逆転写し、及びｑＰＣＲにより定量する。アニーリング温度は５０μＬ反応中で１μＬのＲＡＮＫ−Ｌ遺伝子特異的プライマー（１０μＭ開始濃度；ＨＬＵＸ３０１３９２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を伴ってＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ４０００中で５７℃である。
【０１５３】
ＲＡＮＫ−Ｌ及びＧＡＰＤＨ遺伝子発現Ｃｔデータを得る。ＲＮＡをＧＡＰＤＨ発現についての調節を伴って定量する。ＲＡＮＫ−Ｌ発現についての非処理コントロール値は処理影響を評価するために使用される。結果は表１３中以下に報告される。
【０１５４】
【表１５】
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【０１５５】
表１３中に示されるように、ザクロから精製されたプニカラジンは用量依存的な様式でＩＬ−１ｂで刺激されたＲＡＮＫ−Ｌ遺伝子発現を阻害し、及び１００μｇ／ｍＬでＲＡＮＫ−Ｌ発現を完全に阻害する。
【０１５６】
実施例７：ザクロからのプニカラジンによるＩＶ型コラゲナーゼ（ＭＭＰ９）タンパク質発現の阻害
ケラチン生成細胞及び線維芽細胞を０．５％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ中で共培養した。共培養物をザクロから抽出したさまざまな濃度のプニカラジン（０．１％〜１０％に及ぶ）に暴露した。特に、１．０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、及び１００μｇ／ｍｌの濃度でＩＶ型コラゲナーゼタンパク質（マトリックスメタロプロテイナーゼ−９／ＭＭＰ９）発現を阻害するザクロエキスの能力を試験した。ザクロエキスへの暴露後、上記共培養細胞を１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１Ｂで１８時間刺激した。ＩＬ−１Ｂでの１８時間の刺激後、及びＭＭＰ９濃度を表１４中以下に示されるように培地中で決定した。
【０１５７】
【表１６】
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【０１５８】
表１４で報告された結果は、ザクロからのプニカラジンはｉｎ  ｖｉｔｒｏでケラチン生成細胞からのＩＬ−１Ｂで刺激されたコラゲナーゼ放出（ＭＭＰ９）を阻害することを示す。これらの結果は、プニカラジンが細胞外マトリックスの炎症刺激された破壊を阻害することを示す。活性化された破骨細胞は骨のコラーゲン／リン酸カルシウム骨組を破壊するマトリックス消化酵素（ＭＭＰｓ）を分泌することにより骨強度を減少させ、及び骨損失を増加させる。骨のコラーゲン／カルシウム骨組の破壊をブロックすることは骨強度及び骨構造を維持する／改善すると期待されるであろう。増加された骨強度及び骨構造は増加された骨鉱物質密度、増加された骨体積、増加された小柱細胞数、減少された小柱分離、改善された骨構成、骨折に要する最大力における増加、及び骨剛性における増加により特徴付けられる。
【０１５９】
実施例８：ブドウの種及びザクロエキスによるＣ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍコラゲナーゼ活性の阻害
サンプルを１００ｍｇの粉末を計測することにより調製した。上記サンプルの５０ｍｇ／ｍｌの全抽出物をその後５：３：２の割合のＤＭＳＯ：エタノール：水の連続添加により調製する。それゆえ、１００ｍｇの粉末について、１ｍｌ  ＤＭＳＯ、０．６ｍｌエタノール、及び０．４ｍｌ水が使用されるであろう。上記溶液をボルテックスにより激しく混合し、及びその後超音波水浴中で１０分間インキュベートする。上記サンプルを濃度を試験するために５０ｍｇ／ｍｌのストック濃度から希釈する。
【０１６０】
コラゲナーゼ活性の阻害を商業的に入手可能なキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ）を用いて分析する。上記キットは蛍光タグで標識化されたコラーゲン基質を消化する能力に基づく。消化前に、上記基質の蛍光を消す。コラゲナーゼへの暴露後、蛍光が増加するように、上記基質を切断して消光効果を廃止する。（上記手順にしたがって調製される）サンプルを上記キットで提供されるコラゲナーゼ（０．２ユニット／ｍｌ）にはじめに添加する。上記蛍光基質（５０μｇ／ｍｌ）をその後添加し、及び上記反応を環境温度で１時間インキュベートする。蛍光を４９５／５１５ｎｍの励起／発光でプレートリーダーで読む。データを添加された阻害剤なしのＭＭＰに比較される％コントロールとして表す。１００％全酵素活性からの減少は正の応答と考えられる。
【０１６１】
コラゲナーゼ活性の減少へ向かう用量依存的応答はザクロエキス及びブドウの種エキスの両方について観察された（表１５）。
活性化された破骨細胞は骨のコラーゲン／リン酸カルシウム骨組を破壊するマトリックス消化酵素（ＭＭＰ’ｓ）を分泌することにより骨強度を減少させ、及び骨損失を増加させる。ここで提案される機構により、ブドウの種及びザクロエキスは特にコラゲナーゼ活性の強い阻害剤であることがわかる。この活性により、コラーゲン生成の正味の正のバランスは達成され、骨強度及び骨の健全の維持又は改善をもたらしうる。
【０１６２】
【表１７】
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【０１６３】
実施例９：骨再吸収の阻害を計測するための頭蓋冠アッセイ
ｉｎ  ｕｔｅｒｏの新生マウスの細胞を標識化するために、（１５日目の）妊娠ＣＤ−１雌マウスに45Ｃａ（２５ｕＣｉ／マウス）を注入した。４日齢の子からの頭蓋冠（頭蓋骨）を切開し、及び半分に切った。摘出された半分の頭蓋冠をグルタミン及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを添加した０．１％ＢＳＡを含む１ｍｌのＢＧＪ成長培地（Ｓｉｇｍａ）中の金属格子上に（表面で）置いた。上記骨を３７℃で５％ＣＯ2で加湿されたインキュベーター中で２４時間インキュベートし、その後それらを添加された因子（ＩＬ−１、ＰＴＨ及び／又は化合物）を伴う１ｍｌ培地を含むウェルに移した。処理された骨を上記条件下でさらなる７２時間インキュベートした。このインキュベーション期間後、上記骨を除去し、及び（上記骨中に保持される標識化カルシウムを計測するために）シンチレーションバイアル中の２０％ＴＣＡに１．５時間入れ、及びその後シンチレーション液体を伴ってカウントした。さらに、０．４ｍｌの培地をまた（上記骨から放出された標識化カルシウムの量を決定するために）カウントした。上記結果は％45Ｃａ放出として表され、及びＴ／Ｃ率としてさらに報告されうる。
【０１６４】
いくつかの因子及び化合物について、この手順の改変が使用されうる。ほとんどの破骨細胞は事前インキュベーション期間後に頭蓋冠中で形成されるので、破骨細胞形成に影響する因子は事前インキュベーション期間中により大きな効果を有しうる。したがって、いくつかの化合物について、それらは事前インキュベーション培地中に含まれた。
【０１６５】
このアッセイにおいて試験された抽出物はイチョウエキス、緑茶エキス、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｆｒｕｃｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃａエキス、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．エキス、ザクロエキス、シベリア・チョウセンニンジン、イプリフラボン、ブドウの種エキス、及びトウキエキスを含む。頭蓋冠におけるこれらの抽出物の試験結果は表１６中以下に報告される。
【０１６６】
表１６において、Ｒ−１＝Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  ｓｐ．（ＥＵＬ）、ＳＦＪ＝Ｓｏｐｈｏｒａ  Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｊａｐｏｎｉｃａ、ＳＧ＝シベリア・チョウセンニンジン、ＳＪ＝Ｓｏｐｈｏｒａ  Ｊａｐｏｎｉｃａ（ＮｕＰｈａｒｍａ）、Ｉ＝イプリフラボン、ＧＢ＝イチョウ、ＧＴ＝緑茶、Ｐ−１＝ザクロエキス、Ｐ−２＝ザクロエキス（Ｎａｔｕｒｅｘ）、ＧＳ＝ブドウの種、ＤＱ＝トウキエキス。以下の表において、上付き文字ａ（a）は、結果がブランクサンプル（０μｇ／ｍｌの濃度）結果とは顕著に異なる（ｐ＜０．０５）ことを意味する。ｐ≦０．０５の差（すなわち、誤差が５％以下である場合）は有意と考えられる。表１６中に示されるように、ザクロ、イプリフラボン、緑茶エキス、及びブドウの種エキスはＩＬ−１ｂ誘発カルシウム骨再吸収／放出を阻害した。
【０１６７】
【表１８】
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【０１６８】
上記に示される頭蓋冠アッセイを本発明に係る組成物において有用な抽出物のさまざまな組み合わせで繰り返した。それぞれの調合物についての結果は表１６中以下に報告される。
【０１６９】
表１７において、Ｐ＝ザクロ、Ｉ＝イプリフラボン、ＧＳ＝ブドウの種、ＧＴ＝緑茶。アレンドロネートをポジティブコントロールとして使用した。以下の表において、上付き文字ａ（a）は、結果がブランクサンプル（０μｇ／ｍｌの濃度）結果とは顕著に異なる（ｐ＜０．０５）ことを意味する。ｐ≦０．０５の差（すなわち、誤差が５％以下である場合）は有意と考えられる。表１７中に示されるように、全ての試験された組み合わせはＩＬ−１ｂ誘発カルシウム骨再吸収／放出を阻害した。
【０１７０】
【表１９】
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【０１７１】
実施例１０：ＲＡＮＫ−Ｌの阻害及び骨再吸収の阻害を計測するためのｉｎ  ｖｉｖｏ研究
２の異なる処方を２００〜２５０グラムのおよその体重の約１２〜１４週齢の雌の無傷のラットに関するｉｎ  ｖｉｖｏ研究において試験した。処方１は表１８中に報告されるように変化する投与量のイプリフラボン、ザクロエキス、及びブドウの種エキスを含んだ。処方２は表１８中に報告されるように変化する投与量のザクロエキス及びブドウの種エキス及び固定された投与量のイプリフラボンを含んだ。３の投与量を各処方について試験した。上記研究は各群に１５ラットの８群のラットを利用し、及び約３５日間続いた。
【０１７２】
以下の表１８は８試験群のそれぞれに与えられる処方を示す。表１８中の投与量は推奨されるヒト投与量に基づき、及びＦＤＡ変換式：ヒト同等用量（ＨＥＤ、ｍｇ／ｋｇ）＝ｍｇ／ｋｇのラット用量×（ｋｇのラット体重／ｋｇのヒト体重）0.33、ＨＥＤ＝ラットＮＯＡＥＬ×（Ｗ−ラット／Ｗ−ヒト）(1-b)、ｂ＝０．６７を用いて適切な対応するラット用量に変換された。
表１８において、Ｉ＝イプリフラボン、Ｐ＝ザクロエキス、及びＧＳ＝ブドウの種エキス。
【０１７３】
【表２０】
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【０１７４】
エストロゲン離脱により引き起こされる速い骨再吸収を導入するために、卵巣摘出された（ＯＶＸ）ラットモデルをこの研究において使用した。例えば、その内容を本明細書中に援用する、Ａｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｓａｆｆｌｏｗｅｒ  Ｓｅｅｄ  Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄ  Ｒａｔｓ，”  Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ２００６．  Ｖｏｌ．３４（４）：６０１−６１２を参照のこと。卵巣摘出手順により引き起こされる骨再吸収の効果を評価することが重要であったので、シャムコントロール（ｎ＝６）、卵巣摘出手順を経験しない雌ラットの１群もまた上記研究に含まれた。
【０１７５】
この研究はランダム化プラシーボ制御用量応答設計を使用した。約２００〜２５０グラムの体重の、約１２〜１４週齢の全部で１２０の卵巣摘出ラット（１群当たりｎ＝１５）を３５日間、群にランダムに割り当てた。動物に実験開始から３５日間、プラシーボ食餌又は上記に列挙される処方の１のいずれかを含む１５グラム／日で給餌した。食餌を１５グラム／ラット／日の割合で上記ラットに毎朝入手可能にした。上記ラットに水を自由に取らせ、及び全実験のために適切なケージ内で飼った。制限なしの活動を全実験中に許容した。
【０１７６】
抗再吸収に対する上記処方の有効性を（骨鉱物質密度を決定するための）ＤＥＸＡスキャン、（骨強度及び機能情報を集めるための）生体力学的計測、（仮想骨質及び機能情報を評価するための）ミクロ−ＣＴ計測、及び（骨質及び機能情報を評価するための）組織形態学的計測を含む結果計測により評価した。組織形態学的計測を行う方法は、その全内容を本明細書中に援用する、Ｐａ  Ｒｅｖｅｌｌ，  “Ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ，”  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐａｔｈｏｌ．，  １９８３．  Ｖｏｌ．３６：１３２１−１３３１により示される。使用される用語及び単位はｔｈｅ  Ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈにより推奨されるものである。ミクロ−ＣＴ計測を行う方法は、その全内容を本明細書中に援用する、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｍｉｃｒｏ  ＣＴ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏ  ＭＲ  ｉｍａｇｉｎｉｎｇ  ｏｆ  ３Ｄ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｓｋｅｌｅｔｏｎ．”  Ｊ．  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌ  Ｎｅｕｒｏｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．  ２０００．  Ｖｏｌ．１：４５−５１で示される。これらの計測を３５日間の処置後に決定した。
【０１７７】
ＤＥＸＡスキャン及びミクロ−ＣＴ計測結果の両方はシャムコントロール（非卵巣摘出）ラットに比較して卵巣摘出（ＯＶＸ）ラットにおける骨鉱物質密度の実質的な損失を示した。骨強度もまたＯＶＸラットにおける骨折に要する最大力及び骨剛性計測、並びに％骨体積／全体積及び小柱細胞数により示されるように顕著に減少された。さらに、小柱分離（小柱が互いにどのくらい離れているかの平均）における顕著な増加もまたＯＶＸラットにおいて観察された。ポジティブコントロール群、ＡＬＤを破骨細胞形成を減少させることが知られる有効な抗再吸収剤であるアレンドロネート薬で処置した。例えば、その全内容を本明細書中に援用する、Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｌｆａｃａｌｃｉｄｏｌ  ｏｎ  ｃａｎｃｅｌｌｏｕｓ  ａｎｄ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｂｏｎｅ  ｍａｓｓ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎ  ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄ  ｒａｔｓ．”  Ｅｘｐ．  Ａｎｉｍ．  ２００６．  ｖｏｌ．  ５５（４）：３５７−６７を参照のこと。ポジティブコントロール群（ＡＬＤ）は骨鉱物質密度、％骨体積／全体積、及び小柱数における増加を経験し、及び小柱分離における顕著な減少を経験した。
【０１７８】
この研究において使用される効力決定技術の１は仮想骨質、構造及び機能情報を提供するミクロ−ＣＴ計測であった。表１９中以下に示されるように、３５日間の処置後、群２、３、４、５、及び６に投与された処方は骨再吸収を妨げることにおいてプラシーボ（処置なし）より有効であった。骨鉱物質密度（ＢＭＤ）、骨体積、小柱細胞数及び小柱分離の結果は骨の健康と相関する。上付き文字ａ（a）は、結果がプラシーボ群とは顕著に異なることを意味する。ｐ＜０．０５の差は有意と考えられる。
【０１７９】
【表２１】
0005706467.tif 000023
【０１８０】
表２０において、骨鉱物質密度からの結果は、群２、３、及び４に投与された処方が破骨細胞形成を有効に減少させ、及び骨鉱物質密度を増加させたことを示した。結果はまた、群１、２、３、及び４に投与された処方は破骨細胞形成を有効に減少させ、骨体積を増加させ、小柱細胞数を増加させ、及び小柱細胞分離を減少させたことを示した。上付き文字ａ（a）は、結果がプラシーボ群とは顕著に異なることを意味する。ｐ＜０．０５の差は有意と考えられる。
【０１８１】
【表２２】
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【０１８２】
各群からの小柱骨体積が定量された組織形態学的計測もまた処方１及び２の効力を決定するためのツールとして使用された。この分析からの結果は表２１中に報告される。上付き文字ａ（a）は、結果がプラシーボ群とは顕著に異なることを示す。ｐ＜０．０５の差は有意と考えられる。
【０１８３】
表２１中に示されるように、処方１はプラシーボ群に比較して小柱骨体積における顕著な増加（６１．４％）を引き起こした。小柱骨体積における増加は観察されたが、その強さは群２（１３．５％）及び３（１３．１％）においてはより小さかった。
【０１８４】
【表２３】
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【０１８５】
骨マス及び骨体積評価に加えて、骨強度を２の異なるパラメーターにより機械的に調べた。１の試験は骨折に要する最大力を決定するために行われ、及び他方は骨剛性（弾性）を決定するためであった。骨強度及び剛性の決定方法は、その全内容を本明細書中に援用する、Ｓｔｕｒｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  Ｂｅｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｒｅａｋｉｎｇ  Ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｔｉｃ  Ｍｅｔａｐｈｙｓｅａｌ  Ｔｉｂｉａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒａｔ：  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ，  Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ，  ａｎｄ  Ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ，”  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００６．  Ｖｏｌ．２１（１）：８９−９６により示される。この分析結果は表２２中以下に報告される。上付き文字ａ（a）は、結果がプラシーボ群とは顕著に異なることを意味する。ｐ＜０．０５の差は有意と考えられる。
【０１８６】
表２２中に列挙される結果は、処方１は群２及び３に投与されたときプラシーボ群に比較して骨折に要する最大力における８．３％及び８．１％増加をもたらしたことを示す。処方１は群３に投与されたときプラシーボ処置に比較して骨剛性における１６．０％増加をもたらした。
【０１８７】
【表２４】
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【０１８８】
ＤＥＸＡスキャン、生体力学的計測、ミクロ−ＣＴ計測、及び組織形態学的計測からの結果は、ザクロ及びブドウの種エキスから成る処方１はエストロゲン離脱中の骨構造及び構成を改善する及び骨強度を増加させる能力を示したことを明らかに示した。
【０１８９】
上記詳細な説明は限定ではなく例示としてみなされること、及び本発明の本質及び範囲を定義すると意図されるのは全ての同等物を含む以下の請求項であることが理解されるべきであることが意図される。