(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファスシン１の遺伝子サイレンシング効果を有する配列番号１又は３に示される遺伝子サイレンシングｓｉＲＮＡの少なくとも１種を含有する、癌を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項２】
ファスシン１の遺伝子サイレンシング効果を有する配列番号１に示される遺伝子サイレンシングｓｉＲＮＡを含有する、請求項１に記載の癌を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項３】
ファスシン１の遺伝子サイレンシング効果を有する配列番号３に示される遺伝子サイレンシングｓｉＲＮＡを含有する、請求項１に記載の癌を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項４】
前記癌が悪性黒色腫又は膀胱癌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の癌を予防又は治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、ファスシン（Ｆascin）の遺伝子サイレンシング効果を有するｓｉＲＮＡを含有する癌の予防、治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
標的遺伝子と部分的配列相同性を有するsmall interfering RNA（siRNA）を使用して、遺伝子サイレンシングまたはRNAノックダウンのための方法、また、遺伝子を標的とする複数の異なるsiRNAに対する共通のおよび／または鑑別的応答を同定する方法、siRNAの2つの鎖の相対活性を評価する方法、遺伝子サイレンシングのためのsiRNAを設計する方法、および、疾患の治療のための治療薬としてsiRNAを使用する方法等が報告されている。
【０００３】
特許文献１の段落[００１６]には「真核細胞を小干渉性RNA（siRNA）の分子に付すことを含むRNA干渉により該細胞中の標的遺伝子をサイレンシングさせる方法であって、前記siRNAは、前記標的遺伝子の転写体の配列と同一の、センス鎖またはアンチセンス鎖の少なくとも9ヌクレオチドの連続的ヌクレオチド配列を含むが、前記siRNAは、前記転写体中のどの配列とも完全長のセンス鎖またはアンチセンス鎖配列の同一性を持たず、前記連続的ヌクレオチド配列は前記siRNAの3'末端にあることを特徴とする方法を提供する。本発明のある実施形態においてsiRNAは、前記標的遺伝子の前記転写体と同一の16、15、14、13、12、11、10、または9ヌクレオチドより大きいセンス鎖またはアンチセンス鎖の連続的ヌクレオチド配列を含ない。」siRNAが開示されている。
【０００４】
特許文献２の段落[０００９]に「本発明の1つの態様は、約15〜約30ヌクレオチド長の二本鎖領域、および標的配列の発現をサイレンシングし得る非修飾siRNA配列中の5'-GU-3'ジヌクレオチドに相当する5'-XX&apos;-3'ジヌクレオチド(式中、XおよびX'は、XがGである場合X'はUではなく、X'がUである場合XはGUでないという条件で、A、U、C、およびGからなる群より独立して選択される)からなる非免疫賦活性ミスマッチモチーフを含む、標的配列の発現をサイレンシングし得る修飾siRNAを提供する。修飾siRNAは、非免疫賦活性ミスマッチモチーフを含まないsiRNAよりも免疫原性が低い。いくつかの態様において、siRNAは、標的配列に対する1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のさらなる免疫賦活性ミスマッチモチーフを含む。免疫賦活性ミスマッチモチーフは相互に隣接していてもよいし、または1、2、4、6、8、10、もしくは12、またはそれ以上のヌクレオチドによって隔てられていてもよい。」siRNAが開示されている。
【０００５】
特許文献３の段落[０００８]においては、「本発明は、哺乳動物において、ＴＧＦβII型受容体（ＴＧＦβＲII）レベルを調整し、創傷反応および血管形成を調節するための、in vitroおよびin vivo両方でのｓｉＲＮＡの使用を対象とする。本発明のＲＮＡ干渉に基づいた方法は、目から全身の他の器官および組織に及ぶ多岐にわたる適用がある。」、及び段落[０００９]「ある態様において、本発明は、ＴＧＦβのII型受容体を標的とするｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を哺乳動物に投与することにより、哺乳動物における創傷治癒を促進するための、線維症を低減させるためのおよび／または血管形成を低減させるための方法および組成物を対象とする。」ｓｉＲＮＡ分子の利用が開示されている。
【０００６】
特許文献４の段落[０００７]には、「一つの態様において、物質は、Fas、FasL、IL-1、もしくはTNFα遺伝子またはその断片と相同なRNAである。もう一つの態様において、物質は、表1（下記）に記載される一つまたはそれ以上のアポトーシス関連遺伝子、またはその断片と相同なRNAである。もう一つの態様において、物質は、表1に記載される任意のアポトーシス関連遺伝子、例えばFas経路分子、例えばFasもしくはFasL、または前炎症性サイトカイン、例えばIL-1またはTNFαと相同である二本鎖の短い干渉RNA（siRNA）である。さらなる態様において、物質は、表1に記載される任意のアポトーシス関連遺伝子と相同である短いヘアピンRNA（shRNA）である。siRNAは、長さが約19ヌクレオチド〜約28ヌクレオチド、長さが約19ヌクレオチド〜約25ヌクレオチド、または例えば長さが約21ヌクレオチドであってもよい。一つの態様において、siRNAは二本鎖であり、かつそれぞれの鎖に3'突出末端を含む。突出末端は、それぞれの鎖に関して約1〜約6ヌクレオチドであってもよく、または例えばそれぞれの鎖に関して約2ヌクレオチドであってもよい。」siRNAが開示されている。
【０００７】
一方、ファスシン（Ｆascin）は、分子量55〜58Dのタンパク質で、βカテニンに結合し、上皮細胞や内皮細胞の運動先端部分や辺縁部分にβカテニンと共局在している。また、ファスシンはアクチン細胞骨格系タンパク質であり、ファスシンのアクチン結合活性阻害作用が、がん細胞転移阻害の分子メカニズムであり、ファスシンのアクチン結合部位の一つを構成する474番目のヒスチジンをアラニンに置き換えた変異ファスシンをもつ腫瘍は、マクロケトン耐性を示す。さらに、臨床的にも、ファスシン発現量の多い乳がんは、全体として生存率が低く、特に転移率が高く、ファスシン発現量とがん転移とがん死の強い関連を示唆している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−５２５８１１号公報
【特許文献２】特開２００８−５０４８２７号公報
【特許文献３】特開２００７−５０２２８４号公報
【特許文献４】特開２００６−５１７９１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本願発明は、上記事実に鑑みて、ファスシンの遺伝子に対して遺伝子サイレンシング効果を有するsiＲＮＡを含有する癌の予防、治療剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ファスシン（Fascin）は５４〜５８ｋDaのアクチンバンドリング蛋白（細胞骨格）で細胞の運動、特にがん細胞の浸潤、転移との関連が報告されている。この蛋白は一部のがん（大腸、胃、膀胱）では高発現しており、悪性度との関連が報告されている。このような事象から本願発明は、ファスシンの遺伝子に対してサイレンシング効果を有する遺伝子サイレンシングsiＲＮＡを含有する癌の予防、治療剤について鋭意検討を加えた結果、抗癌効果を有するファスシン遺伝子サイレンシングsiＲＮＡを発見した。これらsiＲＮＡは２本鎖で細胞内に入り、そのうち１本鎖（ガイド鎖）がファスシン遺伝子の特定の領域に相同的に結合する。ガイド鎖の塩基配列がそれぞれ配列番号１−３である。siＲＮＡは、この塩基配列を含み、長さが約１９ヌクレオチド〜２８ヌクレオチドであってもよい。一つの態様において、siＲＮＡは二本鎖であり、かつそれぞれの鎖に３’突出末端を含む。突出末端は、それぞれの鎖に関して約１〜約６ヌクレオチドであってもよく、または例えば、それぞれの鎖に関して約２ヌクレオチドであってもよい。
【００１１】
本願発明の特徴は、ファスシン１の遺伝子サイレンシング効果を有する配列番号１〜３に示される遺伝子サイレンシングsiＲＮＡの少なくとも１種を含有することを特徴とする医薬組成物である。すなわち、ファスシン１の遺伝子サイレンシング効果を有する配列番号１〜３に示される遺伝子サイレンシングsiＲＮＡが癌細胞の増殖を抑制する。特に、ファスシン１の遺伝子サイレンシング効果を有する配列番号３に示される遺伝子サイレンシングsiＲＮＡはアポトーシスを誘導することである。さらに、これらのsiＲＮＡの少なくとも１種を含有することを特徴とする医薬組成物である。
【００１２】
本願発明の別の特徴は、ファスシン１の遺伝子サイレンシング効果を有する配列番号１に示される遺伝子サイレンシングsiＲＮＡを含有することを特徴とする医薬組成物である。
【００１３】
本願発明の別の特徴は、ファスシン１の遺伝子サイレンシング効果を有する配列番号２に示される遺伝子サイレンシングsiＲＮＡを含有することを特徴とする医薬組成物である。
【００１４】
本願発明の別の特徴は、ファスシン１の遺伝子サイレンシング効果を有する配列番号３に示される遺伝子サイレンシングsiＲＮＡを含有することを特徴とする医薬組成物である。
【００１５】
本願発明の別の特徴は、ファスシン１の遺伝子サイレンシング効果を有する配列番号１〜３に示される遺伝子サイレンシングsiＲＮＡの少なくとも１種を含有する医薬組成物が癌の治療剤であることを特徴とする医薬組成物である。
【００１６】
本願発明の別の特徴は、前記癌が悪性黒色腫又は膀胱癌であることを特徴とする遺伝子サイレンシングsiＲＮＡを含有する医薬組成物である。
【００１７】
本願発明はまた、配列番号１〜３で示される遺伝子サイレンシングsiＲＮＡの薬学的に有効量と薬学的に許容しうる担体または希釈剤中に含む、保存または投与用に調製される組成物を含む。治療用途に用いるための許容しうる担体または希釈剤またはRNA分解酵素の働きを阻止できるsiＲＮＡの化学修飾またはナノ粒子に包埋することなどが考えられる。このような形態は医薬の技術分野においてよく用いられている。例えば、保存剤、安定剤、着色剤、滑沢剤、および風味剤に溶解することができる。これらには、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。さらに、抗酸化剤及び懸濁剤を用いてもよい。
【００１８】
薬学的に有効な用量とは、疾患状態の予防、発症の阻害、または治療（症状をある程度緩和し、好ましくはすべての症状を緩和する。）に必要な容量である。薬学的に有効な用量は、疾患の種類、用いる組成物、投与の経路、治療する哺乳動物の種類、考慮中の特定の哺乳動物の物理学的特性、同時に投与される薬剤、および医薬の分野の当業者が認識するであろう他の因子によって異なる。一般に負に荷電したポリマーの効力に依存して、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の活性成分を投与する。
【００１９】
本発明の配列番号１〜３で示される遺伝子サイレンシングsiＲＮＡおよびその処方は、慣用的な無毒性の薬学的に許容しうる担体、アジュバントおよびベヒクルを含む容量単位処方中で、経口的に、局所的に、非経口的に、吸入またはスプレーにより、または直腸に投与することができる。本明細書において用いる場合、非経口的との用語には、経皮、皮下、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、または髄腔内注射または注入の手法等が含まれる。さらに、本発明の配列番号１〜３で示される遺伝子サイレンシングsiＲＮＡおよび薬学的に許容しうる担体を含む医薬処方が提供される。１またはそれ以上の本発明の配列番号１〜３で示される遺伝子サイレンシングsiＲＮＡは、１またはそれ以上の無毒性の薬学的に許容しうる担体および／または希釈剤、および／またはアジュバント、および所望の場合には他の活性成分とともに存在することができる。本発明の配列番号１〜３で示される遺伝子サイレンシングsiＲＮＡを含有する医薬組成物は、経口使用に適した形、例えば、錠剤、トローチ剤、菱形剤、水性または油性懸濁液、分散可能な粉体または顆粒、乳剤、硬カプセルまたは軟カプセル、またはシロップまたはエリキシル剤の形であることができる。
【００２０】
経口で使用することが意図される組成物は、医薬組成物の製造について当該技術分野において知られる任意の方法にしたがって製造することができ、そのような組成物は、薬学的に洗練された口に合う製品を提供するために、１またはそれ以上のそのような甘味剤、芳香剤、着色剤または保存剤を含んでいてもよい。錠剤は、錠剤の製造に適した無毒性の薬学的に許容しうる賦形剤との混合物として活性成分を含む。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムあるいはリン酸ナトリウム；顆粒化剤および崩壊剤、例えばコーンスターチ、またはアルギン酸；結合剤、例えば、デンプン、ゼラチンまたはアラビアゴム、および潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクでありうる。錠剤は被覆しなくてもよく、既知の手法により被覆してもよい。場合によっては、既知の手法によりそのような被覆を調製して、胃腸管における崩壊および吸収を遅延させ、このことによりより長い期間の持続的な作用を与えることができる。例えば、遅延用材料、例えばグリセリンモノステアレートまたはグリセリンジステアレートを用いることができる。
【００２１】
経口使用のための処方は、活性成分が不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合されている硬ゼラチンカプセル、または活性成分が水または油状媒体、例えば、ピーナッツ油、液体パラフィンまたはオリーブ油と混合されている軟ゼラチンカプセルであってよい。
【発明の効果】
【００２２】
ファスシン１の遺伝子サイレンシング効果を有する配列番号１〜３に示される遺伝子サイレンシングsiＲＮＡは、癌細胞増殖抑制効果を有し、特に配列番号３を有するsiＲＮＡは、アポトーシスを誘導する。配列番号１〜３の少なくとも１種を含有する医薬組成物は、悪性黒色腫又は膀胱癌等の癌の治療剤として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、ファスシン１のｍＲＮＡ構造と遺伝子サイレンシングためのsiＲＮＡが結合する領域を示す。
【図２】図２は、siＲＮＡのヒトメラノーマ細胞（Ａ２０５８）に対する増殖抑制効果を示す。
【図３】図３は、siＲＮＡのヒトメラノーマ細胞（Ｍｅｗｏ）に対する増殖抑制効果を示す。
【図４】図４は、siＲＮＡのヒト膀胱癌細胞（Ｔ２４）に対する増殖抑制効果を示す。
【図５】図５は、図２に示すAKT、ERKが細胞増殖と生存シグナルであることを説明している。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下に本発明を実施するための方法について例を上げて述べるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２５】
ファスシン１のｍＲＮＡに対する遺伝子サイレンシングためのsiＲＮＡの結合領域と細胞に導入する方法
図１は、ファスシン１遺伝子に対する３種の遺伝子サイレンシングsiRNAがファスシン１遺伝子に結合する（図１；siR-F1、siR-F2、siR-F3）領域を示す。siR-F1、siR-F2は蛋白コード領域、siR-F3は３‘非翻訳領域に結合する。この３種のsiRNAをヒトメラノーマA2058細胞、ヒト膀胱癌T24細胞に対してリポソームに包埋して細胞に導入した。
以下、siR-F1のRNA塩基配列は配列番号−１で示し、siR-F2のRNA塩基配列は配列番号−２で示し、siR-F3のRNA塩基配列は配列番号−３で示す。
【実施例２】
【００２６】
（１）ヒト癌細胞は２mML-グルタミン、１０％の熱不活性化FBS（Sigma,St.
Louis,Mo,USA）を含むRPMI-1640培地中で、９５％空気と５％炭酸ガスのもと、３７度で培養した。生存細胞数の測定は、トリパンブルー染色法により行った。
【００２７】
図２はヒトメラノーマＡ２０５８細胞の増殖に対するファスシン１のノックダウン効果にについて調べた結果を示す。この結果、図２の上段に示すように、siRNA（siR-F1：配列番号−１、siR-F2：配列番号−２、siR-F3：配列番号−３）は、ヒトメラノーマＡ２０５８細胞の増殖に対してsiR-F1とsiR-F3のいずれもが、有意に細胞増殖を抑制していた。また、下段に示すようにsiR-F3はPARP1の分断を強く誘導していた。
【００２８】
図３はヒトメラノーマMevo細胞の増殖に対するファスシン１のノックダウン効果を調べた結果を示す。この細胞はファスシン１の発現がない細胞である。試験に用いたsiR-F1：配列番号−１、siR-F2：配列番号−２、siR-F3：配列番号−３siRNAのいずれも増殖抑制効果がなかった。
【００２９】
図４は膀胱癌Ｔ２４細胞の増殖におけるファスシン１に対するsiRNA（siR-F1：配列番号−１、siR-F2：配列番号−２、siR-F3：配列番号−３）の効果について調べた結果を示す。上段に示すようにsiR-F1とsiRF-3はＲＡＲＰ１の分断を強く誘導していた。また、下段に示すようにヒト膀胱癌Ｔ２４細胞の増殖に対して、siR-F1とsiRF-3は増殖抑制作用を示していた。
【００３０】
図５は、細胞増殖・生存サバイバルに係わるＥＲＫ経路と細胞増殖、Ａｋｔ経路と生存シグナルの模式図を示す。本願発明のsiR-F3（配列番号−３）はアポトーシスを誘導して殺細胞効果を発揮するものと推察される。
【図１】
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【図５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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