(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜６の何れか１つのアミノ酸配列からなり、かつカーボンナノチューブに対する結合能を有する、ペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドを含有している、カーボンナノチューブを標識するための組成物。
【請求項４】
前記ペプチドが標識化合物と結合している、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記カーボンナノチューブがマルチウオールカーボンナノチューブである、請求項３または４に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１に記載のペプチド、または請求項２に記載のポリヌクレオチド、および標識化合物を備えている、カーボンナノチューブを標識するためのキット。
【請求項７】
前記カーボンナノチューブがマルチウオールカーボンナノチューブである、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
請求項１に記載のペプチド、請求項２に記載のポリヌクレオチド、請求項３〜５の何れか１項に記載の組成物、あるいは請求項６または７に記載のキットを用いる、カーボンナノチューブを標識する方法。
【請求項９】
請求項４に記載の組成物をカーボンナノチューブとインキュベートする工程を包含する、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カーボンナノチューブに対して結合能を有するペプチド、および当該ペプチドの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
炭素の結晶構造体としてはダイヤモンドおよびグラファイトなどが古くから知られているが、近年の研究によって、フラーレン、カーボンナノホーンおよびカーボンナノチューブなどの新規な結晶構造体が見出されている。
【０００３】
フラーレン、カーボンナノホーンおよびカーボンナノチューブは、炭素原子の６員環または５員環によって形成されており、ナノメートルスケールの微細構造を有することから、ナノ黒鉛構造体と呼ばれている。ナノ黒鉛構造体は種々の性質を有しており、半導体装置、表示装置、燃料電池、化粧品、薬品送達システム、センサーなどを製造するための様々な分野で利用されている。
【０００４】
近年、ナノ黒鉛構造体の１つであるカーボンナノチューブ（以下、「ＣＮＴ（carbon nano tube）」ともいう。）が、アスベストと同様に発癌性を有していることが明らかになった。それ故に、カーボンナノチューブを簡便に検出する方法が求められている。
【０００５】
ＣＮＴは、単層の外層を有するシングルウオールカーボンナノチューブ（以下、「ＳＷＣＮＴ（single wall carbon nano tube）」ともいう。）と、複層の外層を有するマルチウオールカーボンナノチューブ（以下、「ＭＷＣＮＴ（multi wall carbon nano tube）」ともいう。）との２つのタイプに大別される。これらのＣＮＴを検出する方法としては、従来から顕微鏡によって検出する方法が用いられてきた。ＳＷＣＮＴは非常に小さいので、電子顕微鏡を用いなければ検出できない。しかしながら、電子顕微鏡による検出方法は、非常に煩雑であるという問題点を抱えていた。
【０００６】
このような状況下において、ＣＮＴに対して結合能を有するペプチドを用いてＣＮＴを検出する研究が進められている。例えば、特許文献１および非特許文献１には、カーボンナノホーンまたはカーボンナノチューブに結合するペプチドをスクリーニングする方法が開示されているとともに、カーボンナノホーンまたはカーボンナノチューブに結合する、２０種類のペプチドの具体的なアミノ酸配列が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−１２１１５４号公報（平成１８年４月２２日公開）
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】The journal of physical chemistry B (2006), 110, 23623−23627
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、現在までに見出されているペプチドの種類は少なく、より効果的にＣＮＴを検出するためには、上記ペプチドの種類を増加させる必要がある。
【００１０】
本発明は、カーボンナノチューブに対して結合能を有する新規のペプチドを見出すとともに、当該ペプチドの利用方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のペプチドは、上記課題を解決するために、５０個以下のアミノ酸からなり、アミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｎ／Ｔ−Ｐ／Ｒ−Ｗ（Ｘ１は０〜１個の任意のアミノ酸である。）を含むことを特徴としている。
【００１２】
本発明のペプチドは、アミノ酸配列Ｘ２−Ｗ−Ｘ１−Ｎ／Ｔ−Ｐ／Ｒ−Ｗ−Ｘ３（Ｘ１は０〜１個の任意のアミノ酸であり、Ｘ２は０〜３個の任意のアミノ酸であり、Ｘ３は０〜１２個の任意のアミノ酸であり、Ｘ２およびＸ３の少なくとも一方において、１個以上のＷが含まれている。）を含むことが好ましく、配列番号１〜１５の何れか１つのアミノ酸配列を含むことがより好ましい。
【００１３】
本発明のペプチドは、配列番号１〜１５のいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチドであっても、配列番号１〜６のいずれか１つのアミノ酸配列の部分配列からなり、配列番号７〜１５のアミノ酸配列を含むペプチドであってもよい。
【００１４】
また、本発明のペプチドは、配列番号１〜１２に示されたアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、付加または欠失されたアミノ酸配列からなってもよく、この場合、配列番号１３〜１５のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００１５】
本発明のポリヌクレオチドは、上記ペプチドをコードすることを特徴としている。
【００１６】
本発明の組成物は、カーボンナノチューブを標識するために、本発明のペプチドを含有していることを特徴としている。
【００１７】
本発明の組成物では、前記ペプチドが標識化合物と結合していてもよい。
【００１８】
本発明の組成物は、カーボンナノチューブを標識するために、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有していることを特徴としている。
【００１９】
本発明の組成物では、前記カーボンナノチューブがマルチウオールカーボンナノチューブであることが好ましい。
【００２０】
本発明のカーボンナノチューブを標識するためのキットは、本発明のペプチドまたは本発明のポリヌクレオチド、および標識化合物を備えていることを特徴としている。
【００２１】
本発明のカーボンナノチューブを標識するためのキットでは、前記カーボンナノチューブがマルチウオールカーボンナノチューブであることが好ましい。
【００２２】
本発明のカーボンナノチューブを標識する方法は、本発明のペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明の組成物、または本発明のキットを用いることを特徴としている。
【００２３】
本発明のカーボンナノチューブを標識する方法は、本発明のペプチドが標識化合物と結合している組成物を、カーボンナノチューブとインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、簡便かつ高感度にてＣＮＴを検出することができる。
【００２５】
本発明によれば、ＳＷＣＮＴおよびＭＷＣＮＴの両方を簡便かつ高感度にて検出することができるが、両方を比較した場合には、ＭＷＣＮＴをより高感度にて検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】パニング操作のインプット力価およびアウトプット力価の変化を示すグラフである。
【図２】実施例にてスクリーニングされたペプチドのアミノ酸配列を示す模式図である。
【図３】本発明のペプチドのＣＮＴ結合能と、公知のペプチドのＣＮＴ結合能とを比較したグラフである。
【図４】ペプチドを提示した、蛍光標識されたストレプトアビジンを用いてＭＷＣＮＴを検出した結果を示す顕微鏡写真である。
【図５】ペプチドを提示した、蛍光標識されたストレプトアビジンを用いてＳＷＣＮＴを検出した結果を示す顕微鏡写真である。
【図６】パニング操作の各工程を示す模式図である。
【図７】ペプチドを提示した、蛍光標識されたストレプトアビジンの作製方法を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２８】
〔１．ペプチド〕
本発明のペプチドは、ＣＮＴに対して結合能を有するものである。より詳細には、本発明のペプチドは、ＳＷＣＮＴおよびＭＷＣＮＴの両方に対して極めて高い結合能を有するものである。以下に、具体的な構成について説明する。
【００２９】
本発明のペプチドは、アミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｎ／Ｔ−Ｐ／Ｒ−Ｗ（Ｘ１は０〜１個の任意のアミノ酸である。）を含んでいることを特徴としている。Ｘ１は、任意のアミノ酸であり得、解離性のアミノ酸（Ｃ、Ｙ、Ｈ、Ｅ、Ｄ、ＫまたはＲ）であることが好ましく、Ｒがより好ましい。上記「Ｎ／Ｔ」にて示されるアミノ酸は、ＮまたはＴである。また、上記「Ｐ／Ｒ」にて示されるアミノ酸は、ＰまたはＲである。
【００３０】
本発明のペプチドは、アミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｎ／Ｔ−Ｐ／Ｒ−Ｗを含みかつＣＮＴに対する結合能が維持されている限り、その長さは特に限定されず、例えば、５０個以下、３０個以下、２０個以下、１５個以下、１２個以下、１０個以下、８個以下、７個以下、６個以下、または５個以下であり得る。
【００３１】
本発明のペプチドは、アミノ酸配列Ｘ２−Ｗ−Ｘ１−Ｎ／Ｔ−Ｐ／Ｒ−Ｗ−Ｘ３（Ｘ１は０〜１個の任意のアミノ酸であってもよい。本発明のペプチドのアミノ酸の数が３０個以下の場合には、例えば、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ０〜５個および０〜２０個の任意のアミノ酸であり得、あるいは、例えば、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ０〜１０個および０〜１５個の任意のアミノ酸であり得る。また、本発明のペプチドのアミノ酸の数が２０個以下の場合には、例えば、例えば、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ０〜３個および０〜１２個の任意のアミノ酸であり得、あるいは、例えば、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ０〜５個および０〜１０個の任意のアミノ酸であり得る。本発明のペプチドのアミノ酸の数が１５個以下の場合には、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ０〜３個および０〜７個の任意のアミノ酸であり得る。
【００３２】
本発明のペプチドのアミノ酸の数が２０個以下であることが好ましい。具体的には、Ｘ２は０〜３個の任意のアミノ酸であり、Ｘ３は０〜１２個の任意のアミノ酸であり、Ｘ２およびＸ３の少なくとも一方において、１個以上のＷが含まれている。）を含むペプチドであることが好ましい。
【００３３】
本発明のペプチドにおいて、Ｘ２およびＸ３の少なくとも一方に１個以上のＷが含まれている。Ｗの数は特に限定されないが、３個以下がより好ましく、１個でもよい。なお、Ｘ２またはＸ３に含まれるＷは、アミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｎ／Ｔ−Ｐ／Ｒ−Ｗと連続していてもよく、Ｘ２またはＸ３に含まれるＷとアミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｎ／Ｔ−Ｐ／Ｒ−Ｗとの間に１〜３個の任意のアミノ酸が含まれていてもよい。
【００３４】
Ｘ２に含まれるアミノ酸は任意のアミノ酸であり得、疎水性のアミノ酸を１〜３個含んでいることが好ましい。疎水性のアミノ酸としては、Ｗ、Ｉ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、ＡまたはＧが挙げられ、Ｗ、ＬまたはＰがより好ましい。Ｘ３に含まれるアミノ酸もまた任意のアミノ酸であり得、疎水性のアミノ酸（Ｗ、Ｉ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、ＡまたはＧ）を３個以上含んでいることが好ましい。
【００３５】
本発明のペプチドが、アミノ酸配列Ｘ２−Ｗ−Ｘ１−Ｎ／Ｔ−Ｐ／Ｒ−Ｗ−Ｘ３を含む場合もまた、ＣＮＴに対する結合能が維持されている限り、その長さは特に限定されず、例えば、２０個以下、１５個以下、１２個以下、１０個以下、８個以下、７個以下、６個以下、または５個であり得る。
【００３６】
本発明のペプチドは、以下に示す配列番号１〜１５の何れか１つのアミノ酸配列を含むペプチドであることがより好ましい。本発明のペプチドは、配列番号３，４，５，６，７９，１０，１１，１２および１５の何れか１つのアミノ酸配列を含むペプチドであることがさらに好ましく、配列番号３，４，５および６の何れか１つのアミノ酸配列を含むペプチドであることがなおさらに好ましい。
【００３７】
・ＬＰＷＷＮＲＷＰＰＶＥＴ    （配列番号１）
・ＷＷＲＴＰＷＴＥＰＴＰＡ    （配列番号２）
・ＷＷＮＰＷＴＰＱＳＴＰＳ    （配列番号３）
・ＷＮＰＷＮＳＷＳＮＭＲＭ    （配列番号４）
・ＷＮＰＷＷＲＡＰＬＴＧＡ    （配列番号５）
・ＷＮＰＷＡＧＷＴＭＧＨＬ    （配列番号６）
・ＷＷＮＲＷ                  （配列番号７）
・ＷＷＲＴＰＷ                （配列番号８）
・ＷＷＮＰＷ                  （配列番号９）
・ＷＮＰＷＮＳＷ              （配列番号１０）
・ＷＮＰＷＷ                  （配列番号１１）
・ＷＮＰＷＡＧＷ              （配列番号１２）
・ＷＮＲＷ                    （配列番号１３）
・ＷＲＴＰＷ                  （配列番号１４）
・ＷＮＰＷ                    （配列番号１５）
本発明のペプチドは、配列番号１〜１５の何れか１つのアミノ酸配列からなるペプチドであってもよく、上述したアミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｎ／Ｔ−Ｐ／Ｒ−Ｗを含みかつＣＮＴに対する結合能が維持されている限り、配列番号１〜１２に示されたアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、付加または欠失されたアミノ酸配列を含んでいてもよい。本明細書中において。アミノ酸の観点で使用される場合、「１または数個」は、当業者が試行錯誤することなくアミノ酸の置換、付加または欠失を行い得る程度の数が意図され、例えば、１〜３０個の範囲内であり得、１〜１５個が好ましく、１〜１０個が好ましく、１〜７個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましい、１〜３個がなおさらに好ましい。
【００３８】
また、本発明のペプチドは、配列番号１〜６のいずれか１つのアミノ酸配列またはその部分配列からなり、配列番号７〜１５のアミノ酸配列を含むペプチドであり得る。「配列番号１〜６のいずれか１つのアミノ酸配列またはその部分配列からなり、配列番号７〜１５のアミノ酸配列を含むペプチド」は、（１）配列番号１のアミノ酸配列の部分配列からなり、配列番号７または１３のアミノ酸配列を含むペプチド；（２）配列番号２のアミノ酸配列の部分配列からなり、配列番号８または１４のアミノ酸配列を含むペプチド；（３）配列番号３のアミノ酸配列の部分配列からなり、配列番号９または１５のアミノ酸配列を含むペプチド；（４）配列番号４のアミノ酸配列の部分配列からなり、配列番号１０または１５のアミノ酸配列を含むペプチド；（５）配列番号５のアミノ酸配列の部分配列からなり、配列番号１１または１５のアミノ酸配列を含むペプチド；および、（６）配列番号６のアミノ酸配列の部分配列からなり、配列番号１２または１５のアミノ酸配列を含むペプチド、からなる群より選択される。例えば、配列番号１のアミノ酸配列の部分配列からなり、配列番号７のアミノ酸配列を含むペプチドは、ＷＷＮＲＷ、ＷＷＮＲＷＰ、ＷＷＮＲＷＰＰ、ＷＷＮＲＷＰＰＶ、ＷＷＮＲＷＰＰＶＥ、ＷＷＮＲＷＰＰＶＥＴ、ＰＷＷＮＲＷ、ＰＷＷＮＲＷＰ、ＰＷＷＮＲＷＰＰ、ＰＷＷＮＲＷＰＰＶ、ＰＷＷＮＲＷＰＰＶＥ、ＰＷＷＮＲＷＰＰＶＥＴ、ＬＰＷＷＮＲＷ、ＬＰＷＷＮＲＷＰ、ＬＰＷＷＮＲＷＰＰ、ＬＰＷＷＮＲＷＰＰＶ、ＬＰＷＷＮＲＷＰＰＶＥおよびＬＰＷＷＮＲＷＰＰＶＥＴからなる群より選択される。このように、本願明細書を読んだ当業者は、具体的に例示されていなくても、配列番号１〜６のいずれか１つのアミノ酸配列またはその部分配列からなり、配列番号７〜１５のアミノ酸配列を含むペプチドを容易に認識し得る。
【００３９】
また、本発明のペプチドは、付加的なペプチドを含むものであってもよい。付加的なペプチドとしては特に限定されないが、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇなどのエピトープ標識ペプチドが挙げられる。
【００４０】
本発明のペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているものであればよいが、これに限定されるものではなく、糖鎖やイソプレノイド基などのペプチド以外の構造を含む複合ペプチドであってもよい。アミノ酸の官能基は修飾されていてもよい。アミノ酸はＬ型であることが好ましいが、これに限定されない。
【００４１】
本発明のペプチドは、当該分野において公知の任意の手法に従って容易に作製され得、例えば、組換え発現されても、化学合成されてもよい。すなわち、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明の範囲内である。化学合成法としては、固相法または液相法を挙げることができる。固相法において、例えば、市販の各種ペプチド合成装置（Model MultiPep RS（Intavis AG）など）を利用することができる。
【００４２】
〔２．組成物およびキット〕
本発明の組成物はＣＮＴを標識するための組成物である。より詳細には、本発明の組成物は、ＳＷＣＮＴおよびＭＷＣＮＴの両方を極めて効果的に標識することができる組成物である。以下に、具体的な構成について説明する。
【００４３】
本発明の組成物は、上述したペプチドを含有している。ＣＮＴを標識するための第一段階として、標識化合物と結合させるために用いられ、その結果、ＣＮＴを高感度かつ簡便に検出することができる。本発明の組成物において、上記ペプチドが標識化合物と結合していてもよい。
【００４４】
本発明に利用可能な標識化合物としては特に限定されず、適宜、公知の標識化合物を用いることが可能である。標識化合物としては、例えば、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、またはＡｌｅｘａ４８８）、放射性同位体、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ（例えばＨＲＰ）、アルカリホスファターゼなど）、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰなど）を用いることが可能である。
【００４５】
ペプチドと標識化合物とを結合させる方法は特に限定されず、適宜、周知の方法を用いることが可能である。また、ペプチドと標識化合物との結合は直接的であっても間接的であってもよい。例えば、ビオチンと結合したペプチドと、標識化合物と結合したストレプトアビジンとを混合することによって、ペプチドと標識化合物との間接的な結合が可能である（例えば、図７参照）。ストレプトアビジンは４量体を形成しているので、１つの「標識化合物と結合したストレプトアビジン」に対して４つの「ビオチンと結合したペプチド」が結合して複合体を形成する。１つの複合体は、４つのペプチドを介してＣＮＴに結合することができるので、複合体とＣＮＴとの間の結合力が極めて高くなる。当該複合体を用いれば、極めて高感度にてＣＮＴを検出することができる。
【００４６】
ビオチンと結合したペプチドを作製する方法は特に限定されない。例えば、ビオチンとペプチドとを直接結合させても間接的に結合させてもよい。ペプチドの構造をできるだけ正常に維持するという観点からは、ビオチンとペプチドとを間接的に結合させることが好ましいといえる。ビオチンとペプチドとを間接的に結合させる場合には、例えば、本発明のペプチドを任意のタンパク質と結合させた後に、ペプチドと結合させたタンパク質に対してビオチンを結合させるか、あるいは、任意のタンパク質にビオチンを結合させた後に、ビオチンと結合させたタンパク質に対して本発明のペプチドを結合させればよい。
【００４７】
上述したタンパク質としては特に限定されないが、例えば、Ｎ１ドメイン（実施例参照）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰなど）、標識タンパク質（例えば、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）など）を用いることが可能である。
【００４８】
標識化合物と結合したストレプトアビジンを作製する方法は特に限定されない。例えば、標識化合物とストレプトアビジンとを直接結合させてもよく、標識化合物とストレプトアビジンとを間接的に結合させてもよい。適宜、公知の手法に従って、標識化合物と結合したストレプトアビジンを作製すればよい。
【００４９】
上述した本発明のペプチドは、ＳＷＣＮＴおよびＭＷＣＮＴの両方に対して極めて高い結合能を示すが、ＭＷＣＮＴに対してより高い結合能を示す。それ故に、本発明の組成物は、ＣＮＴのなかでも特にＭＷＣＮＴの標識に用いることが好ましいといえる。
【００５０】
本発明のキットは、本発明のペプチド、および上述した標識化合物を備えている。本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図されるが、組成物としての一物質中に材料を含有している形態もまた、用語「キット」に包含される。キットは、各材料を使用するための指示書を備えていることが好ましい。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。本発明のキットはまた、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。
【００５１】
本発明のキットは、ＣＮＴを標識するためのキットであるが、特にＭＷＣＮＴを標識するためのキットであり得る。
【００５２】
〔３．カーボンナノチューブを標識する方法〕
本発明のＣＮＴを標識する方法は、標識化合物と結合している本発明のペプチドを、ＣＮＴとともにインキュベートする工程を包含すればよく、本発明のペプチドを標識化合物と直接的または間接的に結合させる工程をさらに包含してもよい。すなわち、本発明のＣＮＴを標識する方法は、本発明のペプチド、本発明の組成物、または本発明のキットを用いる方法といえる。
【００５３】
上記インキュベートする工程の具体的な構成は特に限定されず、例えば標識化合物と結合している本発明のペプチドをＣＮＴと混合し、目的の標識が行われるまで両者を十分に接触させる工程であり得る。
【００５４】
なお、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中にて参考として援用される。
【００５５】
本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これに限定されるべきではない。
【実施例】
【００５６】
（実施例１：ＭＷＣＮＴに結合するペプチドのスクリーニング）
ペプチド提示ファージライブラリーとしては、１２残基の直線状ランダムペプチドを提示するＰｈ．Ｄ．−１２ＴＭ  Ｐｈａｇｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いた。当該ライブラリーは、２．７×１０９種類の異なるペプチド配列を含むライブラリーである。
【００５７】
５００μＬの０．０２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む緩衝液Ａ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標））を用いてペプチド提示ファージライブラリーの原液を希釈し、ファージ力価が１．０×１０１０となるようにファージ溶液を調製した。
【００５８】
ファージ力価は、Ｐｈ．Ｄ．−１２ＴＭ  Ｐｈａｇｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）に付属のプロトコルに従って測定した。具体的には、以下の手順にてファージ力価を測定した。まず、ファージの希釈溶液の系列を作製した。対数増殖中のＥＲ２７３８菌の培養液２００μＬに、１０μＬの上記ファージの希釈系列溶液を添加して混合し、５分間静置した。当該混合溶液の全量を、５０℃に保温した３ｍＬのアガローストップ（ペプトン：１０ｇ／Ｌ、酵母エキス：５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ：１ｇ／Ｌ、精製寒天粉末：７ｇ／Ｌ、オートクレーブ処理済み）に添加して混合した後、ＬＢ寒天培地プレート（１．２５ｍｇ／ＬのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ-β-Ｄ-ｔｈｉｏｇｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）と、１ｍｇ／ＬのＸ-ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を含有）に加え、その後、室温にて１０分間静置した。アガローストップが固まった後で、３７℃にて一晩の培養を行なった。プレートに出現した青色のプラークの数を計数することによってファージ数を測定し、当該測定値に基づいてファージ力価を算出した。
【００５９】
１ｍｇのＭＷＣＮＴ（直径１４０ｎｍ、長さ７μｍ、ＡＴＲ社）を、０．０２％ウシ血清アルブミンを含んだ５００μＬの緩衝液Ａに分散させて、ＭＷＣＮＴの分散液を調製した。
【００６０】
上記分散液（５００μＬ）と上記ファージ溶液（５００μＬ）とを混合して、室温にて１０分間、混合した。遠心分離機による、４℃、５分間、１００００ｒｐｍの遠心分離操作によってＭＷＣＮＴを沈殿させた後、上清を取り除いた。沈殿したＭＷＣＮＴを緩衝液Ａにて５回洗浄した。最後の洗浄の後に、５００μＬの溶出液（６Ｍ  ウレア）を加え、室温で１０分インキュベートして、ＭＷＣＮＴに結合したファージを溶出させた。遠心分離機による４℃、５分間、１００００ｒｐｍの遠心分離操作によって、ＭＷＣＮＴを沈殿させて、溶出されたファージが含まれる上清を回収した。
【００６１】
上記ファージを含んだ上清を、２０ｍＬのＬＢ培地中で対数増殖中のＥＲ２７３８菌（Ｆ｀ｌａｃＩｑ△（ｌａｃＺ）Ｍ１５ｐｒｏＡ＋Ｂ＋ｚｚｆ：：Ｔｎ１０（ＴｅｔＲ）ｆｈｕＡ２ｓｕｐＥｔｈｉ△（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）  △（ｈｓｄＭＳ−ｍｃｒＢ）５（ｒｋ−ｍｋ−Ｍｃｒ  ＢＣ−）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社））に感染させ、振とう培養機を用いて３７℃で激しく撹拌しながら４時間３０分間培養した。
【００６２】
ファージが感染したＥＲ２７３８菌の培養液を遠心チューブ（内容量５０ｍＬ）に移し、４℃、５分間、１００００ｒｐｍの遠心分離操作によって、ＥＲ２７３８菌を取り除いた。当該操作を２回行った後に、上清のファージ含有液１６ｍＬを別のチューブに移した。ファージ含有液に、２．６７ｍＬ（１／６量）の２０％ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ８０００（以下ＰＥＧ８０００、Ｆｌｕｋａ社）、２．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液を加えて混和した後、４℃にて一晩静置して、ファージを沈殿させた。
【００６３】
沈殿したファージを、遠心分離機による４℃、２０分間、１００００ｒｐｍの遠心分離操作によって回収した。ファージの沈殿物を、更に４０００ｒｐｍ、１分間遠心分離して、残っている上清を完全に取り除いた。得られたファージの沈殿物を、１ｍＬのＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に懸濁して、当該懸濁液を１．５ｍＬのチューブに移した後に、遠心分離機によって４℃、５分間、１００００ｒｐｍにて遠心分離した。上清１ｍＬを新しい１．５ｍｌチューブに移して、１６７ｕＬの２０％ＰＥＧ８０００および２．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液を加えて混合した後、氷上で１時間静置してファージを沈殿させた。次に、遠心分離機によって４℃、１０分間、１００００ｒｐｍにて遠心分離してファージの沈殿物を回収した。得られたファージの沈殿物を２００μＬのＴＢＳに加えて懸濁させた。懸濁できない残渣を遠心分離機によって４℃、１分間、１００００ｒｐｍにて遠心分離して取り除いた後、上清に、更に２００μＬのグリセロールを添加して良く混和して濃縮されたファージ溶液を調製して、当該ファージ溶液のファージ力価を上述した方法によって測定した。
【００６４】
上述したような標的分子（具体的には、ＭＷＣＮＴ）へのファージの結合、洗浄、回収（溶出）、大腸菌によるファージの増殖といった一連の作業は、パニング操作（ファージディスプレイサイクル）と呼ばれている（図６参照）。パニング操作を繰り返すことによって、標的分子へ特異的に強く結合するファージクローンを濃縮していくことが可能である。
【００６５】
本実施例においても、一回目のパニング操作の後、大腸菌で増殖させたファージを用いてパニング操作を複数回繰り返した。
【００６６】
ＭＷＣＮＴへより強く結合するファージを取得するために、各パニング操作における結合条件をより厳しくした。具体的には、２回目以降のパニング操作では、緩衝液に含まれるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の濃度を０．０２％から０．１％へ増やし、４回目以降のパニング操作では、標的分子であるＭＷＣＮＴの量を１．０ｍｇから０．１ｍｇへ減らし、５回目以降のパニング操作では、緩衝液に含まれるＴｗｅｅｎ−２０を０．１％から０．５％へ増やした。Ｄ１２ライブラリーを用いたパニング操作のインプット力価（ＭＷＣＮＴへ加えたファージ力価）とアウトプット力価（洗浄後のＭＷＣＮＴから溶出されたファージ力価）の値の変化を図１に示す。
【００６７】
７回目のパニング操作の後に得られたファージをクローン化し、当該ファージが提示するペプチドの塩基配列を決定した。塩基配列の決定には提示ペプチド領域から９６塩基下流に位置する塩基配列の相補鎖に相当するプライマー（−９６ｇＩＩＩシーケンスプライマー（５’−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’（配列番号１６）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社）を用いて、ダイデオキシターミネイト法によって決定した（ＣＥＱ  ＤＴＣＳ  Ｑｕｉｃｋ  ｓｔａｒｔ  ｋｉｔ、ベックマン社）。反応産物の泳動とデータ解析にはキャピラリーシーケンサー（ＣＥＱ８０００、ベックマン社）を用いた。決定した塩基配列にコードされるペプチド配列を図２に示す。
【００６８】
（実施例２：ファージクローンのＭＷＣＮＴへの結合能の評価）
実施例１で得られたファージクローンについて、ＭＷＣＮＴに対する結合能力を以下の実験によって評価した。
【００６９】
クローン化したファージを５００μＬの０．１％ウシ血清アルブミンを含む緩衝液Ｂ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）に希釈し、ファージ力価が１．０×１０１０となるようにファージ溶液を調製した。
【００７０】
０．１ｍｇのＭＷＣＮＴ（直径１４０ｎｍ、長さ７μｍ、ＡＴＲ社）または０．１ｍｇのＳＷＣＮＴ（直径１〜２ｎｍ、長さ５〜３０μｍ、ＡＴＲ社）を５００μＬの０．１％ウシ血清アルブミンを含んだ緩衝液Ｂに分散させて、ＭＷＣＮＴまたはＳＷＣＮＴの分散液を調製した。各分散液（５００μＬ）とファージ溶液（５００μＬ）とを混合して、室温にて１０分間混和した。当該混合溶液を、遠心分離機によって４℃、５分間、１００００ｒｐｍにて遠心分離して、ＭＷＣＮＴまたはＳＷＣＮＴを沈殿させるとともに、上清を取り除いた。沈殿したＭＷＣＮＴまたはＳＷＣＮＴを緩衝液Ｂにて５回洗浄した。最後の洗浄の後に、沈殿したＭＷＣＮＴまたはＳＷＣＮＴに対して５００μＬの溶出液（６Ｍ  ウレア）を加えて室温にて１０分インキュベートした。これによって、ＭＷＣＮＴまたはＳＷＣＮＴに結合したファージを溶出させた。
【００７１】
遠心分離機によって、４℃、５分間、１００００ｒｐｍにて遠心分離してＭＷＣＮＴまたはＳＷＣＮＴを沈殿させて、溶出したファージが含まれる上清を回収した。回収した上清についてファージ力価を測定した。なお、ファージ力価の測定は、上述した方法にしたがった。結果を図３に示す。
【００７２】
ペプチド：ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ（配列番号１７）は、すでにＳＷＣＮＴに結合するペプチドとして報告されている（Ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂ（２００６），１１０，２３６２３-２３６２７参照）。
【００７３】
今回新たに見いだしたペプチド：ＬＰＷＷＮＲＷＰＰＶＥＴ、ペプチド：ＷＷＲＴＰＷＴＥＰＴＰＡ、ペプチド：ＷＷＮＰＷＴＰＱＳＴＰＳ、ペプチド：ＷＮＰＷＮＳＷＳＮＭＲＭ、ペプチド：ＷＮＰＷＷＲＡＰＬＴＧＡ、および、ペプチド：ＷＮＰＷＡＧＷＴＭＧＨＬを提示したファージクローンは、ペプチド：ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴを提示したファージクローンと比べて非常に強くＣＮＴに結合することが明らかになった。
【００７４】
具体的には、ペプチド：ＬＰＷＷＮＲＷＰＰＶＥＴを提示したファージクローンは、ペプチド：ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴを提示したファージクローンと比べて、ＳＷＣＮＴでは１１０倍、ＭＷＣＮＴでは２２００倍も多く結合した。ペプチド：ＷＷＲＴＰＷＴＥＰＴＰＡを提示したファージクローンは、ペプチド：ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴを提示したファージクローンと比べて、ＳＷＣＮＴでは１９０倍、ＭＷＣＮＴでは５２００倍も多く結合した。最も強い結合を示した、ペプチド：ＷＷＮＰＷＴＰＱＳＴＰＳを提示したファージクローンは、ペプチド：ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴを提示したファージクローンと比べて、ＳＷＣＮＴでは１５００倍、ＭＷＣＮＴでは２２０００倍も多く結合した。今回新たに見いだしたその他のペプチドも、略同程度の結合能力を示した。以上の事から、今回新たに得られたペプチドは、周知のペプチドよりも、非常に強くＣＮＴへ結合することが明らかになった。また、今回新たに得られたペプチドは、ＳＷＣＮＴよりもＭＷＣＮＴに対して、より強い結合能力を有することが明らかになった。
【００７５】
（実施例３：蛍光顕微鏡によるＣＮＴの検出）
＜Ａ：ペプチドが結合されたＮ１タンパク質の調製＞
今回新たに得られた１２残基のペプチド：ＬＰＷＷＮＲＷＰＰＶＥＴが、Ｎ１ドメインのＮ末端に結合しているＬＰＷＷＮＲＷＰＰＶＥＴ-Ｎ１タンパク質（配列番号２０）を作製した。なお、ｇＩＩＩタンパク質（Accession number:V00604, Protein ID: CAA23862.1）は、Ｎ末端側からＮ１、Ｎ２、Ｃ１という順序で３つのドメインを有しており、今回新たに得られた１２残基のペプチドは、当該ｇＩＩＩタンパク質のＮ１ドメインのＮ末端に結合している。以下に、作製方法について説明する。
【００７６】
上記ペプチドおよびＮ１ドメインの融合タンパク質をコードする遺伝子をＰＣＲによって増幅した。上記ペプチドを提示しているファージのＤＮＡを鋳型にして、オリゴヌクレオチドプライマーＰ１（５’−ＣＣＣＡＴＡＴＧＣＴＧＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＡＴＣＧＧＴＧ−３’（配列番号１８））とＰ２（５’−ＧＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＡＣＴＣＡＴＴＴＴＣＡＧＧＧＡＴＡＧＣＡＡＧ−３’（配列番号１９））を用いてＰＣＲを行なった。
【００７７】
ＰＣＲ反応は、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い同社のプロトコルに従って行なった。ＰＣＲの増幅産物および発現ベクターｐＥＴ２１−ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて３７℃で１時間処理した後、アガロースゲル電気泳動を行った。ゲルから切り出されたＤＮＡ断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて１６℃、３０分間、ｐＥＴ２１−ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）へライゲーションし、当該ベクターにて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られたコロニーから目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを抽出し、これを「ｐＥＴ−ＬＰＷ−Ｎ１」と命名した。
【００７８】
ｐＥＴ-ＬＰＷ-Ｎ１にて形質転換したＲｏｓｅｔｔａＴＭ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を２×ＹＴ培地で３７℃一晩培養し、新しい２×ＹＴ培地に１％（ｖ／ｖ）植菌した。ＯＤ６００が０．６になるまで３７℃で培養した後、終濃度が０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ-β-Ｄ-ｔｈｉｏｇｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、更に２８℃で４時間培養を行なった。
【００７９】
培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体に１０ｍLの緩衝液Ｃ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０５Ｍ  ＮａＣｌ、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を加えて懸濁し、超音波によって菌体を破砕した。得られた破砕液をＨｉｓｔｒａｐ  ＦＦ  ｃｏｌｕｍｎ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に供し、Ｃ末端にヒスチジンを有するＬＰＷＷＮＲＷＰＰＶＥＴ-Ｎ１タンパク質を当該カラムに吸着させた後、緩衝液Ｄ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０５Ｍ  ＮａＣｌ、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、  ０．５Ｍ  イミダゾール）を用いて、ＬＰＷＷＮＲＷＰＰＶＥＴ-Ｎ１タンパク質を溶出させた。取得したＬＰＷＷＮＲＷＰＰＶＥＴ-Ｎ１タンパク質についてポリアクリルアミド電気泳動により精製度を確認したところ、純度は９５％以上であった。
【００８０】
＜Ｂ：ペプチド（ＬＰＷＷＮＲＷＰＰＶＥＴ）を提示した蛍光標識されたストレプトアビジンの作製＞
本実施例では、ビオチンとストレプトアビジンとの間の相互作用を用いて、蛍光標識されたストレプトアビジンと、ビオチンにて修飾されたＬＰＷＷＮＲＷＰＰＶＥＴ-Ｎ１タンパク質とを結合させた。ストレプトアビジンは４量体のタンパク質であるため、ストレプトアビジン１分子に対して４分子のＬＰＷＷＮＲＷＰＰＶＥＴ-Ｎ１タンパク質を提示した複合体を作製することが可能になる（図７参照）。つまり、当該複合体であれば、複合体とＣＮＴとの結合力を増加させることができるので、ＣＮＴの検出感度を飛躍的に上昇させることができる。
【００８１】
まず、ＬＰＷＷＮＲＷＰＰＶＥＴ-Ｎ１タンパク質をビオチンにて修飾した。２３ｎｍｏｌのＬＰＷＷＮＲＷＰＰＶＥＴ-Ｎ１タンパク質を１００００μｌの０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。当該溶液に８３μＬの２．５ｍｇ／ｍｌビオチン−マレイミド／ジメチルフォルミアミドを添加した後、室温にて２時間静置した。反応後の溶液をゲルろ過して、未結合のビオチンーマレイミドを除去するとともに、ビオチンにて修飾されたＬＰＷＷＮＲＷＰＰＶＥＴ-Ｎ１タンパク質を精製した。
【００８２】
次いで、ビオチンにて修飾されたＬＰＷＷＮＲＷＰＰＶＥＴ-Ｎ１タンパク質（１０μＭ）を含む溶液４５μＬと、５μＬの蛍光標識されたストレプトアビジン（１７μＭ）とを混合し、室温で１時間インキュベートし、これによって、蛍光標識されたストレプトアビジンに、ビオチンにて修飾されたＬＰＷＷＮＲＷＰＰＶＥＴ-Ｎ１タンパク質を結合させた。この操作により作製された複合体を、蛍光色素フルオロセイン（ＦＩＴＣ）で標識したストレプトアビジン（和光純薬社）を使用した場合には、ＬＰＷ-Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ-ＦＩＴＣと命名し、蛍光色素Ｃｙ３で標識したストレプトアビジン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用した場合には、ＬＰＷ-Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ-Ｃｙ３と命名した。
【００８３】
＜Ｃ：ペプチドを提示した蛍光標識されたストレプトアビジンを用いたＭＷＣＮＴの蛍光検出＞
５μＬのＬＰＷ-Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ-ＦＩＴＣ（１．７μＭ）と、２μｌのＭＷＣＮＴ（直径１４０ｎｍ、長さ７μｍ、  ＡＴＲ社）懸濁液（１ｍｇ／ｍｌ  ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）と、１０μＬの緩衝液（０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０）とを混合した。
【００８４】
室温で１０分間インキュベートした後、３μＬの溶液をスライドグラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ製、ＭＩＣＲＯ  ＳＬＩＤＥ  ＧＬＡＳＳ  白縁磨  １ｍｍ厚）にスポットして、蛍光顕微鏡（落射蛍光顕微鏡ＢＸ-６０、オリンパス社製）および位相差顕微鏡にて観察した。蛍光観察にはＵ-ＮＩＢＡキューブ（ダイクロイックミラー：ＤＭ５０５、励起フィルター：ＢＰ４７０-４９０、吸収フィルター：ＢＡ５１５-５５０）を用い、画像の取り込みには顕微鏡デジタルカメラＤＰ-７０（オリンパス社製）を使用した。観察結果を図４に示す。図４に示すように、ＭＷＣＮＴを蛍光にて検出することができた。
【００８５】
＜Ｄ：ペプチドを提示した蛍光標識されたストレプトアビジンを用いたＳＷＣＮＴの蛍光検出＞
２μＬのＬＰＷ-Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ-Ｃｙ３（１．７μＭ）と、２μＬのＳＷＣＮＴ（直径１−２ｎｍ、長さ５−３０μｍ、ＡＴＲ社）懸濁液（１ｍｇ／ｍｌ  ０．１％Ｔｗｅｅｎ-２０）と、１０μＬの緩衝液（０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０）とを混合した。
【００８６】
室温で１０分間インキュベートした後、３μＬの溶液をスライドグラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ製、ＭＩＣＲＯ  ＳＬＩＤＥ  ＧＬＡＳＳ  白縁磨  １ｍｍ厚）にスポットして、蛍光顕微鏡（落射蛍光顕微鏡ＢＸ-６０、オリンパス社製）および位相差顕微鏡にて観察した。蛍光観察にはＵ-ＭＮＧキューブ（ダイクロイックミラー：ＤＭ５７０、励起フィルター：ＢＰ５３０-５５０、吸収フィルター：ＢＡ５９０）を用い、画像の取り込みには顕微鏡デジタルカメラＤＰ-７０（オリンパス社製）を使用した。観察結果を図５に示す。図５に示すように、ＳＷＣＮＴを蛍光にて検出することができた。
【００８７】
本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明は、半導体装置、表示装置、燃料電池、化粧品、薬品送達システム、センサー、または、ＣＮＴ検出剤などを製造する分野に利用することができる。
【図１】
0005800173.tif 000002
【図２】
0005800173.tif 000003
【図３】
0005800173.tif 000004
【図６】
0005800173.tif 000005
【図４】
0005800173.tif 000006
【図５】
0005800173.tif 000007
【図７】
0005800173.tif 000008
【配列表】
0005800173000001.app