(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３２のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する、
ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体。
【請求項２】
配列番号３５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する、
ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体。
【請求項３】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３６を有する細胞株１−２５５−７１３及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３９を有する細胞株２−８２６−３３５からなる群から選択されるマウスハイブリドーマ細胞株。
【請求項４】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３によって産生される抗体及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３９を有するマウスハイブリドーマ細胞株２−８２６−３３５によって産生される抗体からなる群から選択される抗体。
【請求項５】
検査試料中のヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の量を測定する方法であって、
（ａ）第一の捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片複合体を形成させるために、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片を含有すると疑われる検査試料を、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に結合する少なくとも１つの第一の捕捉抗体と接触させる工程；
（ｂ）第二の検出抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／第一の捕捉抗体複合体を形成させるために、前記抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片複合体を、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に結合し、検出可能な標識に連結されており、並びに前記第一の捕捉抗体と異なる少なくとも１つの第二の検出抗体と接触させる工程；並びに
（ｃ）工程（ｂ）において形成された第二の検出抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／第一の捕捉抗体複合体の量に基づいて、検査試料中に含有されるヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の量を測定する工程；
を含み、
少なくとも１つの第一の捕捉抗体又は少なくとも１つの第二の検出抗体がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３によって産生される抗体、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３９を有するマウスハイブリドーマ細胞株２−８２６−３３５によって産生される抗体及びこれらの組み合わせからなる群から選択される抗体である、
方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの第一の捕捉抗体が、前記検査試料との接触の前又は後の何れかで、固相上に固定化されている、請求項５の方法。
【請求項７】
前記検出可能な標識が、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、温度測定標識及び免疫−ポリメラーゼ連鎖反応標識からなる群から選択される、請求項５又は６の方法。
【請求項８】
検査試料中のヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の量が、対象が心血管疾患、鎌状赤血球病、慢性閉塞性肺疾患、加齢性黄斑変性症、末梢血管閉塞性疾患、炎症、子癇前症、乾癬、クローン病、子宮内膜症及び関節リウマチからなる群から選択される疾病、疾患又は症状に罹患しているかどうかの指標となる、請求項５から７の何れかの方法。
【請求項９】
評価されるヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の量が遊離のヒトＰｌＧＦ−１又は遊離のヒトＰｌＧＦ−１断片である、請求項５から８の何れかの方法。
【請求項１０】
検査試料中の遊離のヒトＰｌＧＦ−１又は遊離のヒトＰｌＧＦ−１断片の量を測定する方法であって、
（ａ）第一の捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片複合体を形成させるために、遊離のヒトＰｌＧＦ−１又は遊離のヒトＰｌＧＦ−１断片を含有すると疑われる検査試料を、遊離のヒトＰｌＧＦ−１又は遊離のヒトＰｌＧＦ−１断片に結合し、及び、ｓＦｌｔ−１に既に結合されているヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に実質的に結合しない少なくとも１つの第一の捕捉抗体と接触させる工程；
（ｂ）第二の検出抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／第一の捕捉抗体複合体を形成させるために、前記抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片複合体を、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に結合し、検出可能な標識に連結されており、並びに前記第一の捕捉抗体と異なる少なくとも１つの第二の検出抗体と接触させる工程；並びに
（ｃ）工程（ｂ）において形成された第二の検出抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／第一の捕捉抗体複合体の量に基づいて、検査試料中に含有される遊離のヒトＰｌＧＦ−１又は遊離のヒトＰｌＧＦ−１断片の量を測定する工程；
を含み、
少なくとも１つの第一の捕捉抗体が（ｉ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３９を有するマウスハイブリドーマ細胞株２−８２６−３３５によって産生される抗体、又は（ｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する抗体である、及び／又は
少なくとも１つの第二の検出抗体が（ｉ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３によって産生される抗体、又は（ｉｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する抗体である、
方法。
【請求項１１】
自動化された系又は半自動化された系での使用に対して適合されている、請求項１０の方法。
【請求項１２】
自動化された系又は半自動化された系が、自動化されていないＥＬＩＳＡより、遊離のＰｌＧＦ−１を検出する上で、１．５から２倍優れている、請求項１１の方法。
【請求項１３】
検査試料中のヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の存在を検出するための改良した方法であって、前記方法は、
（ａ）ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／抗体複合体の形成を可能とする時間及び条件下で、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片を含有すると疑われる検査試料を前記ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に対して特異的な少なくとも１つの抗体と接触させること；及び
（ｂ）前記ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の存在の指標として、形成された何れかの哺乳動物ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／抗体複合体を検出すること；
を含み、
前記改良は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるグリコシル化された又は脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又はグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片を含む検量物質又は対照を、検量物質又は対照として使用することを含み、ならびに前記抗体が請求項１、２および４のいずれか一項に記載の抗体又はその組み合わせである、前記方法。
【請求項１４】
（ａ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体；
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３によって産生される抗体；
（ｃ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体；並びに
（ｄ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３９を有するマウスハイブリドーマ細胞株２−８２６−３３５によって産生される抗体；
からなる群から選択される１つ又はそれ以上の抗体を含む免疫診断試薬。
【請求項１５】
（ａ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３によって産生される抗体及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３９を有するマウスハイブリドーマ細胞株２−８２６−３３５によって産生される抗体からなる群から選択される少なくとも１つの抗体；及び
（ｂ）キットを使用するための指示書、
を含む、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片を検出するための診断用キット。
【請求項１６】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるグリコシル化された若しくは脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又はグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片を含む検量物質又は対照をさらに含む、請求項１５のキット。
【請求項１７】
（ａ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３によって産生される抗体及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３９を有するマウスハイブリドーマ細胞株２−８２６−３３５によって産生される抗体からなる群から選択される少なくとも１つの抗体；
（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるグリコシル化された若しくは脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又はグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片を含む少なくとも１つの検量物質又は対照；並びに
（ｃ）キットを使用するための指示書、
を含む、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片を検出するための診断用キット。
【請求項１８】
配列番号２７及び配列番号３０のポリヌクレオチド配列を含む、単離された又は精製されたポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の情報
本願は、２００８年６月１８日に出願された米国特許出願６１／０７３，６２４号、２００８年８月１５日に出願された米国特許出願６１／０８９，１７２号及び２００９年６月１６日に出願された米国特許出願１２／４８５，１１４号（これらの各々の内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。）に対する優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本開示は、とりわけ、ヒトＰｌＧＦ−１（すなわち、グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１及び脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１の両方）及びヒトＰｌＧＦ−１を使用する方法に関する。本開示は、ヒトＰｌＧＦ−１に結合する抗体及びこれらの抗体を使用する方法にも関する。最後に、本開示は、ヒトＰｌＧＦ−１イムノアッセイ及びキット並びにイムノアッセイ及びキットにおいて、ヒトＰｌＧＦ−１及びヒトＰｌＧＦ−１に結合する抗体を使用する方法にさらに関する。
【背景技術】
【０００３】
(背景)
血管新生は、組織の正常な増殖及び発達のために必要とされる基本的なプロセスであり、既存の血管からの新たな毛細血管の増殖を伴う。血管新生は、胚の発達及び正常な組織の増殖、修復及び再生に関与するのみならず、雌の生殖サイクル、妊娠状態の確立及び維持並びに創傷及び骨折の修復にも関与している。健康な個体で起こる血管新生の他に、多数の病的なプロセスにおいて、特に、腫瘍の増殖及び転移並びに（特に、微小血管系の）血管増殖が増加する他の症状（糖尿病性網膜症、乾癬及び関節症など）に血管新生現象が関与している。血管新生の阻害は、これらの病的なプロセスを予防又は緩和する上で有用である。
【０００４】
極めて多くの生理的及び病的プロセスにおける血管新生の重要な役割の故に、血管新生の調節に関与する因子は、集中的に調べられてきた。多数の増殖因子が、血管新生の制御に関与していることが示されてきた。この増殖因子には、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が含まれる（Ｆｏｌｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１０９３１−１０９３４（１９９２）参照。）。
【０００５】
増殖因子のＰＤＧＦ及びＶＥＧＦファミリーは、それらの特異的な受容体と相互作用するために、何れも二量体形態として天然に存在する点で類似している。さらに、増殖因子のこれらのファミリー及びそれらの対応する受容体は、内皮細胞の増殖及び分化の刺激並びに分化した細胞のある種の機能に主として必要とされると考えられている。これらの因子は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を介して作用すると考えられている。
【０００６】
多数のＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの要素が同定されてきた。これらには、ＰＤＧＦ−Ａ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号Ｘ０６３７４参照）、ＰＤＧＦ−Ｂ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号Ｍ１２７８３参照）、ＰＤＧＦ−Ｃ（例えば、ＰＣＴ国際出願ＷＯ００／１８２１２参照）、ＰＤＧＦ−Ｄ（例えば、ＰＣＴ国際出願ＷＯ００／０２７８７９参照）、ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ−Ａとしても、又は特定のイソフォームによって知られる。）、胎盤増殖因子ＰｌＧＦ（例えば、米国特許第５，９１９，８９９号参照）、ＶＥＧＦ−Ｂ（ＶＥＧＦ関連因子（ＶＲＦ）としても知られる；例えば、ＰＣＴ国際出願ＷＯ９６／２６７３６及びＷＯ９６／２６７３６参照）、ＶＥＧＦ−Ｃ、（例えば、米国特許第６，２２１，８３９号及びＷＯ９８／３３９１７参照）、ＶＥＧＦ−Ｄ（ｃ−ｆｏｓ誘導性増殖因子（ＦＩＧＦ；ｃ−ｆｏｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒとしても知られる。）；例えば、米国特許第６，２３５，７１３号及びＰＣＴ国際出願ＷＯ９８／０７８３２参照）、ＶＥＧＦ−Ｅ（ＮＺ７ＶＥＧＦ又はＯＶＮＺ７としても知られる。；例えば、ＰＣＴ国際出願ＷＯ００／０２５８０５及び米国特許公開第２００３／０１１３８７０号）、ＮＺ２ＶＥＧＦ（ＯＶＮＺ２としても知られる；ＧｅｎＢａｎｋ受付番号Ｓ６７５２０参照）、Ｄ１７０１ＶＥＧＦ様タンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＡＦ１０６０２０；Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１８：３６３−３７４参照）及びＮＺ１０ＶＥＧＦ様タンパク質（例えば、ＰＣＴ国際出願ＷＯ００／２５８０５；Ｓｔａｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ａｃｈｅｎ，  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，１７：１−１１（１９９９）；Ｎｅｕｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，１３：９−２２（１９９９）；Ｆｅｒｒａｒａ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ７７：５２７−５４３（１９９９）参照）が含まれる。
【０００７】
胎盤増殖因子１型（ＰｌＧＦ−１）は、血管新生性のホモ二量体糖タンパク質である。二量体形態の場合、ＰｌＧＦ−１は血管新生活性を示す。単量体形態において、ＰｌＧＦ−１は非活性である。ＰｌＧＦ−１タンパク質をコードする完全なポリヌクレオチド配列が、そのポリペプチド配列とともに、欧州特許公開０５５０５１９及びＰＣＴ国際出願ＷＯ９２／０６１９４に記載されている。ＰｌＧＦ−１は、ホモ二量体としてその受容体（ｆｍｓ様チロシンキナーゼＦｌｔ−１受容体）に結合する。Ｆｌｔ−１受容体（ｓＦｌｔ−１）の可溶性形態が同定されている。ｓＦｌｔ−１は、Ｆｌｔ−１受容体の膜貫通及び細胞質ドメインを欠如するが、受容体の外側部分の７つのＩｇＧ様ドメインを含有するＦｌｔ−１受容体のスプライスバリアントである。ＰｌＧＦ−１は、ｓＦｌｔ−１受容体にも結合する。ＰｌＧＦ−１は、病的な血管新生においてこのような重要な役割を果たすので、ある種の疾病（例えば、心血管疾患及び妊娠時高血圧を含む高血圧性疾患）のリスクを同定又は予想する上で使用するための予後マーカーとなる可能性を秘めている。さらに、互いに結合されたＰｌＧＦ−１及びｓＦｌｔ−１タンパク質の循環複合体に対して報告された生物学的役割は存在しないので、これらのタンパク質の遊離の（複合体を形成していない）形態の検出は、（例えば、米国特許出願第２００７／０１１１３２６号に公開されている）より有用な臨床情報を提供できる可能性を秘めている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第００／１８２１２号
【特許文献２】国際公開第００／０２７８７９号
【特許文献３】米国特許第５，９１９，８９９号明細書
【特許文献４】国際公開第９６／２６７３６号
【特許文献５】米国特許第６，２２１，８３９号明細書
【特許文献６】国際公開第９８／３３９１７号
【特許文献７】米国特許第６，２３５，７１３号明細書
【特許文献８】国際公開第９８／０７８３２号
【特許文献９】国際公開第００／０２５８０５号
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００３／０１１３８７０号明細書
【特許文献１１】欧州特許出願公開第０５５０５１９号明細書
【特許文献１２】国際公開第９２／０６１９４号
【特許文献１３】米国特許出願公開第２００７／０１１１３２６号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｆｏｌｋｍａｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２年、２６７、ｐｐ．１０９３１−１０９３４
【非特許文献２】Ｓｔａｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ａｃｈｅｎ，  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，１９９９年、１７、ｐ．１−１１
【非特許文献３】Ｎｅｕｆｅｌｄ他、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、１９９９年、１３、ｐ．９−２２
【非特許文献４】Ｆｅｒｒａｒａ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、１９９９年、７７、ｐｐ．５２７−５４３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、ＰｌＧＦ−１をモニターするために使用することができる方法及びキット並びにこれらの成分に対する要望が本分野において存在する。さらに、遊離のＰｌＧＦ−１をモニターするために使用することができる方法及びキット並びにこれらの成分に対する要望も本分野において存在する。本開示のこれらの及び他の目的は、本明細書中の以下の記載から明らかとなる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
(要旨)
一実施形態において、本開示は、（ａ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域を有し、（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有し、又は（ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する、
ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体に関する。このような抗体には、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３によって産生される抗体が含まれ、本開示は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３をさらに提供する。
【００１２】
別の実施形態において、本開示は、（ａ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域を有し、（ｂ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有し、又は（ｃ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する、
ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体を提供する。このような抗体には、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３９を有するマウスハイブリドーマ細胞株２−８２６−３３５によって産生される抗体（及び連結体として使用することができるその断片、例えば、Ｆａｂ’２断片）が含まれ、本開示は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３９を有するマウスハイブリドーマ細胞株２−８２６−３３５をさらに提供する。
【００１３】
本開示は、
（ａ）第一の捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片複合体を形成させるために、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片を含有すると疑われる検査試料を少なくとも１つの第一の捕捉抗体と接触させる工程（前記少なくとも１つの第一の捕捉抗体は、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に結合する。）；
（ｂ）第二の検出抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／第一の捕捉抗体複合体を形成させるために、抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片複合体を、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に結合し、並びに検出可能な標識に連結されている少なくとも１つの第二の検出抗体と接触させる工程（少なくとも１つの第二の検出抗体は第一の捕捉抗体と異なる。）；及び
（ｃ）工程（ｂ）で形成された第二の検出抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／第一の捕捉抗体複合体の量に基づいて、検査試料中に含有されるヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の量を測定する工程
を含み、
前記少なくとも１つの第一の捕捉抗体又は前記少なくとも１つの検出抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３によって産生される抗体、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３９を有するマウスハイブリドーマ細胞株２−８２６−３３５によって産生される抗体及びこれらの組み合わせからなる群から選択される抗体である、
検査試料中のヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の量を測定する方法をさらに提供する。
【００１４】
本発明の一態様において、少なくとも１つの第一の捕捉抗体は、検査試料との接触の前又は後の何れかで、固相上に固定化される。あるいは、少なくとも１つの第一の捕捉抗体は、第二の検出抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／第一の捕捉抗体複合体の形成の前に、固相上に固定化される。場合によって、少なくとも１つの第一の捕捉抗体は、第一の捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片複合体の形成の前に、固相上に固定化される。さらに場合によって、少なくとも１つの第一の抗体は、第一の捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片複合体の形成の後に、固相上に固定化される。
【００１５】
このような方法において、場合によって、検出可能な標識は、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、温度測定標識及び免疫−ポリメラーゼ連鎖反応標識からなる群から選択される。一態様において、検出可能な標識はアクリジニウムである。
【００１６】
前記方法は、様々な疾病、疾患及び症状の評価において実施することができる。一態様において、前記方法は、対象が心血管疾患、鎌状赤血球病、慢性閉塞性肺疾患、加齢性黄斑変性症、末梢血管閉塞性疾患、炎症、子癇前症、乾癬、クローン病、子宮内膜症又は関節リウマチに罹患しているかどうかを評価するために実施される。別の態様において、前記方法は、対象が子癇前症又は心血管疾患に罹患しているかどうかを評価するために実施される。
【００１７】
一実施形態において、前記方法は、自動化された系又は半自動化された系において使用するために適合される。最適には、自動化又は半自動化された系は、特に、約２．５から約５０（例えば、約２．５、約５、約１０、約２０、約３０、約４０又は約５０）のｓ−Ｆｌｔ−１：ＰｌＧＦモル比の範囲内で、自動化されていないＥＬＩＳＡより、遊離のＰｌＧＦ−１を検出する上で、約１．５から約２倍優れている。
【００１８】
本明細書に記載されている方法において、場合によって、評価されるヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の量は、遊離のヒトＰｌＧＦ−１又は遊離のヒトＰｌＧＦ−１断片である。従って、本開示は、検査試料中の遊離のヒトＰｌＧＦ−１又は遊離のヒトＰｌＧＦ−１断片の量を測定するための方法を提供する。一実施形態において、この方法は、
（ａ）第一の捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片複合体を形成させるために、遊離のヒトＰｌＧＦ−１又は遊離のヒトＰｌＧＦ−１断片を含有すると疑われる検査試料を少なくとも１つの第一の捕捉抗体と接触させる工程（前記少なくとも１つの第一の捕捉抗体は、遊離のヒトＰｌＧＦ−１又は遊離のヒトＰｌＧＦ−１断片に結合し、及び、さらに、前記少なくとも１つの捕捉抗体は、ｓＦｌｔ−１に既に結合されているヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に実質的に結合しない。）；
（ｂ）第二の検出抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／第一の捕捉抗体複合体を形成させるために、抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片複合体を、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に結合し、並びに検出可能な標識に連結されている少なくとも１つの第二の検出抗体と接触させる工程（少なくとも１つの第二の検出抗体は第一の捕捉抗体と異なる。）；及び
（ｃ）工程（ｂ）において形成された第二の検出抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／第一の捕捉抗体複合体の量に基づいて、検査試料中に含有される遊離のヒトＰｌＧＦ−１又は遊離のヒトＰｌＧＦ−１断片の量を測定する工程；
を含む。
【００１９】
このような方法において、場合によって、少なくとも１つの第一の捕捉抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３９を有するマウスハイブリドーマ細胞株２−８２６−３３５によって産生される抗体であり、さらに、場合によって、少なくとも１つの第二の検出抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３によって産生される抗体並びにこれらの組み合わせである。あるいは、場合によって、少なくとも１つの第一の捕捉抗体はＭＡＢ２６４である。第二の検出抗体は、ＭＡＢ２６４と異なるあらゆる適切な抗体（ポリクローナルｐＢ２６４など）であり得る。さらに場合によって、前記方法は、自動化された系又は半自動化された系において使用するために適合される。最適には、自動化又は半自動化された系は、特に、約２．５から約５０（例えば、約２．５、約５、約１０、約２０、約３０、約４０又は約５０）のｓ−Ｆｌｔ−１：ＰｌＧＦモル比の範囲内で、自動化されていないＥＬＩＳＡより、遊離のＰｌＧＦ−１を検出する上で、約１．５から約２倍優れている。
【００２０】
従って、本開示は、とりわけ、
（ａ）ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体（該抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域を有する。）；
（ｂ）ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体（該抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する。）；
（ｃ）ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体（該抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する。）；
（ｄ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３によって産生された抗体；
（ｅ）ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体（該抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域を有する。）；
（ｆ）ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体（該抗体は、配列番号４３のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する。）；
（ｇ）ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体（該抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を有する。）；並びに
（ｈ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３９を有するマウスハイブリドーマ細胞株２−８２６−３３５によって産生された抗体；
からなる群から選択される１つ又はそれ以上の抗体を含む免疫診断試薬を提供する。
【００２１】
本開示は、グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又はグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片を産生する哺乳動物細胞株をさらに提供する。哺乳動物細胞株は、あらゆる細胞株であり得るが、場合によって、チャイニーズハムスター卵巣細胞株又はヒト胎児性腎臓細胞株である。従って、本開示は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３８、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５４６及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３７からなる群から選択されるチャイニーズハムスター卵巣細胞株も提供する。
【００２２】
一態様において、哺乳動物細胞株（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞株）は、１３１アミノ酸のアミノ酸配列を有する完全長ヒトＰｌＧＦ−１であるグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１を産生する。あるいは、哺乳動物細胞株（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞株）は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１を産生する。さらに、哺乳動物細胞株（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞株）は、１１５アミノ酸のアミノ酸配列を有するヒトＰｌＧＦ−１断片であるグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１を場合によって産生する。あるいは、グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片は、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
別の態様において、グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又は、グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片は、少なくとも１つの連結配列を場合によってさらに含む。とりわけ、少なくとも１つの連結配列は、ヒスチジンタグ、エンテロキナーゼ切断部位又はヒスチジンタグとエンテロキナーゼ切断部位の組み合わせからなる群から選択される。
【００２４】
さらに別の実施形態において、グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又はそのグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片を作製する方法が、本開示によって提供される。場合によって、前記方法は、
（ａ）グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又はグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片が産生されるような条件下で、ヒトＰｌＧＦ−１をコードする遺伝子で細胞株を形質移入する工程；及び
（ｂ）細胞株（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞株）によって産生されたグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又はグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片を回収する工程；
を含む。
【００２５】
この方法は、工程（ａ）において、細胞株を増幅遺伝子で形質移入すること、増幅された細胞に対する選択を実施すること、及び、次いで、工程（ｂ）を実施することを場合によってさらに含む。この方法の一態様において、増幅遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素又はグルタミン合成酵素を場合によってコードし、選択はメトトレキサート又はグルタミンを用いて行われる。別の態様において、グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１は、１３１アミノ酸のアミノ酸配列を有する完全長ヒトＰｌＧＦ−１である。場合によって、グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１は、少なくとも１つの連結配列をさらに含み、特に、少なくとも１つの連結配列は、ヒスチジンタグ、エンテロキナーゼ切断部位及びヒスチジンタグとエンテロキナーゼ切断部位の組み合わせからなる群から選択される。
【００２６】
この方法の別の態様において、グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及びこれらのあらゆる断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、又は１１５アミノ酸のアミノ酸配列を有するヒトＰｌＧＦ−１断片である。場合によって、グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片は、少なくとも１つの連結配列をさらに含み、特に、少なくとも１つの連結配列は、ヒスチジンタグ、エンテロキナーゼ切断部位及びヒスチジンタグとエンテロキナーゼ切断部位の組み合わせからなる群から選択される。
【００２７】
従って、本開示は、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択される配列を含む単離された又は精製されたグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又はグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片をさらに提供する。
【００２８】
さらに、本開示は、グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又はグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片の少なくとも１つのアミノ酸残基が脱グリコシル化の結果、異なるアミノ酸残基へ転化されている、単離された又は精製された脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又は脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片を提供する。例えば、少なくとも１つのアスパラギン残基が、脱グリコシル化の結果、アスパラギン酸残基へ転化され得る。
【００２９】
さらに、本開示は、前記脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又は脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片が配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０からなる群から選択される配列を含む、単離された又は精製された脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又は脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片も提供する。
【００３０】
さらに、本開示は、検査試料中のヒトＰｌＧＦ−１を検出するためのアッセイにおいて使用するための検量物質又は対照を提供し、前記検量物質又は対照はグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又はグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片を含み、特に、グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又はグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択される。
【００３１】
さらに、本開示は、検査試料中のヒトＰｌＧＦ−１を検出するためのアッセイにおいて使用するための検量物質又は対照を提供し、前記検量物質又は対照は脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１を含み、特に、脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０からなる群から選択される。
【００３２】
この開示によって、野生型配列と比べて、配列番号２のアミノ酸残基８９が平均約１００％グリコシル化されており、及び配列番号２の残基２１が平均約７０％グリコシル化されている、単離された又は精製されたグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又はグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片も提供される。
【００３３】
この開示によって、野生型配列と比べて、配列番号１のアミノ酸残基８３が平均約１００％グリコシル化されており、及び配列番号１の残基１５が平均約７０％グリコシル化されている、単離された又は精製されたグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又はグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片がさらに提供される。
【００３４】
本開示は、
（ａ）野生型配列と比べて、配列番号２のアミノ酸残基２１がアスパラギンからアスパラギン酸へ転化されているポリペプチド；及び
（ｂ）野生型配列と比べて、配列番号２のアミノ酸残基８９がアスパラギンからアスパラギン酸へ転化されているポリペプチド
からなる群から選択される配列を含む単離された又は精製されたヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片も提供する。
【００３５】
さらに、本開示は、
（ａ）野生型配列と比べて、配列番号１のアミノ酸残基１５がアスパラギンからアスパラギン酸へ転化されているポリペプチド；及び
（ｂ）野生型配列と比べて、配列番号１のアミノ酸残基８３がアスパラギンからアスパラギン酸へ転化されているポリペプチド
からなる群から選択される配列を含む単離された又は精製されたヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片を提供する。
【００３６】
本開示は、さらに、配列番号２の２１位、８９位又は２１位及び８９位の１つ又はそれ以上のアスパラギン残基が、（ａ）Ｎ−アセチルノイラミン酸（ガラクトース）２（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）４フコース、（ｂ）（Ｎ−アセチルノイラミン酸）２（ガラクトース）２（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）４フコース、（ｃ）（Ｎ−アセチルノイラミン酸）２（ガラクトースβ１−４Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）２（ガラクトース）２（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）４フコース又は（ガラクトースβ１−４Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）（ガラクトース）３（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）５フコース；（ｄ）（Ｎ−アセチルノイラミン酸）２（ガラクトース）２（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）５フコース、（ｅ）（Ｎ−アセチルノイラミン酸）３（ガラクトース）３（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）５フコース、（ｆ）（Ｎ−アセチルノイラミン酸）３（ガラクトースβ１−４Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）（ガラクトース）３（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）５フコース又は（Ｎ−アセチルノイラミン酸）３（ガラクトース）４（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）６フコース、（ｇ）（Ｎ−アセチルノイラミン酸）４（ガラクトース）４（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）６フコース及び（ｈ）（Ｎ−アセチルノイラミン酸）４（ガラクトースβ１−４Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）（ガラクトース）４（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）６フコースからなる群から選択される構造を有する少なくとも１つのＮ−グリカンでグリコシル化されている、単離された又は精製されたヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片を提供する。
【００３７】
さらに、本開示は、配列番号１の１５位、８３位又は１５位及び８３位の１つ又はそれ以上のアスパラギン残基が、（ａ）Ｎ−アセチルノイラミン酸（ガラクトース）２（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）４フコース、（ｂ）（Ｎ−アセチルノイラミン酸）２（ガラクトース）２（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）４フコース、（ｃ）（Ｎ−アセチルノイラミン酸）２（ガラクトースβ１−４Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）２（ガラクトース）２（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）４フコース又は（ガラクトースβ１−４Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）（ガラクトース）３（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）５フコース、（ｄ）（Ｎ−アセチルノイラミン酸）２（ガラクトース）３（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）５フコース、（ｅ）（Ｎ−アセチルノイラミン酸）３（ガラクトース）３（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）５フコース、（ｆ）（Ｎ−アセチルノイラミン酸）３（ガラクトースβ１−４Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）（ガラクトース）３（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）５フコース又は（Ｎ−アセチルノイラミン酸）３（ガラクトース）４（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）６フコース、（ｇ）（Ｎ−アセチルノイラミン酸）４（ガラクトース）４（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）６フコース及び（ｈ）（Ｎ−アセチルノイラミン酸）４（ガラクトースβ１−４Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）（ガラクトース）４（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）６フコースからなる群から選択される構造を有する少なくとも１つのＮ−グリカンでグリコシル化されている、単離された又は精製されたヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片を提供する。
【００３８】
さらに、検査試料中のヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の存在を検出するための方法の改良が本開示によって提供される。このような改良された方法は、
（ａ）ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／抗体複合体の形成を可能とする時間及び条件下で、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片を含有すると疑われる検査試料をヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に対して特異的な少なくとも１つの抗体と接触させること；及び
（ｂ）ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の存在の指標として、形成された何れかの哺乳動物ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／抗体複合体を検出すること；
を含み、
前記改良は、検量物質又は対照として、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるグリコシル化された又は脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又はグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片を含む検量物質又は対照を使用することを含む。
【００３９】
さらに、本開示は、
（ａ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３によって産生される抗体及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３９を有するマウスハイブリドーマ細胞株２−８２６−３３５によって産生される抗体からなる群から選択される少なくとも１つの抗体；及び
（ｂ）キットを使用するための指示書、
を含む、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片を検出するための診断用キットに関する。
【００４０】
一態様において、キットは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるグリコシル化された又は脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又はグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片を含む検量物質又は対照をさらに含む。
【００４１】
別の態様において、
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるグリコシル化された又は脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又はグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片を含む少なくとも１つの検量物質又は対照；並びに
（ｂ）キットを使用するための指示書、
を含む、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片を検出するための診断用キットが本明細書において提供される。場合によって、キットは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３によって産生される抗体及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３９を有するマウスハイブリドーマ細胞株２−８２６−３３５によって産生される抗体からなる群から選択される少なくとも１つの抗体をさらに含む。
【００４２】
さらなる実施形態において、本開示は、
（ａ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３によって産生される抗体及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３９を有するマウスハイブリドーマ細胞株２−８２６−３３５によって産生される抗体からなる群から選択される少なくとも１つの抗体；
（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるグリコシル化された又は脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又はグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片を含む少なくとも１つの検量物質又は対照；並びに
（ｃ）キットを使用するための指示書、
を含む、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片を検出するための診断用キットを提供する。
【００４３】
さらに、本開示によって、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０及び配列番号３１からなる群から選択される単離された又は精製されたポリヌクレオチドが本明細書において提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、ヒトＰｌＧＦ−１に対するポリヌクレオチド配列（配列番号２２）を示す。抗体κ軽鎖シグナル配列は斜字体で示されており、Ｈｉｓタグに下線が付されている。
【図２】図２は、ベクターｐＪＶ−Ｈｉｓ−ヒトＰｌＧＦ−１（１から１３１）を示している。
【図３】図３は、実施例２に記載されているβ−メルカプトエタノール含有搭載緩衝液中で、還元条件下において、二量体／四量体の形態のヒトＰｌＧＦ−１の単量体への転化を示すドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）である。レーン１は、タンパク質マーカーである。レーン２は、ブランクである。レーン３は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１−１３１）、ＧＰＣＧ３０００であり、ＯＤ２８０による評価で２μｇ。レーン４は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１−１３１）、ＧＰＣＳ１００であり、ＯＤ２８０による評価で２μｇ。レーン５は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，イー・コリ中で産生）であり、ＯＤ２８０による評価で２μｇ。レーン６は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１−１３１）、ＧＰＣＧ３０００であり、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによる測定で２μｇ。レーン７は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１−１３１）、ＧＰＣＳ１００であり、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによる測定で２μｇ。及び、レーン８は、ヒトＰｌＧＦ−１（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，イー・コリ中で産生）であり、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによる測定で２μｇ。
【図４Ａ】図４は、抗ヒトＰｌＧＦ−１モノクローナル抗体（すなわち、モノクローナル抗体１−２５５−７１３（２５５）又は２−８２６−３３５（８２６）の何れか）が非還元形態の組み換えヒトＰｌＧＦ−１抗原に結合することを示した実施例２に記載されているアッセイの結果を示すウェスタンブロットである。図４Ａ及び４Ｂにおいて、レーン１は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，イー・コリ中で産生）であり、ＯＤ２８０により２μｇ。レーン２は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１−１３１）、ＧＰＣＳ１００であり、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによる測定で２μｇ、非還元。レーン３は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１７−１３１）、ＧＰＣＳ３００であり、ＯＤ２８０により約２μｇ、非還元。レーン４は、ブランクである。レーン５は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，イー・コリ中で産生）であり、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによる測定で２μｇ、還元。レーン６は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１−１３１）、ＧＰＣＳ３０００であり、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによる測定で２μｇ、還元。レーン７は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１７−１３１）、ＧＰＣＳ３００であり、ＯＤ２８０により約２μｇ、還元。及びレーン８は、タンパク質マーカーである。図４Ｃにおいて、レーン１は、タンパク質マーカーである。レーン２は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（７−１３１）、ＧＰＣＳ３００であり、ＯＤ２８０により約２μｇ、還元。レーン３は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１−１３１）、ＧＰＣＳ３０００であり、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによる測定で２μｇ、還元。レーン４は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，イー・コリ中で産生）、ＧＰＣＧ３０００であり、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによる測定で２μｇ、還元。レーン５は、ブランクである。レーン６は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１７−１３１）、ＧＰＣＳ３００であり、ＯＤ２８０により約２μｇ、非還元。レーン７は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１−１３１）、ＧＰＣＳ１００であり、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによる測定で２μｇ、非還元。レーン８は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１−１３１）、ＧＰＣＳ１００であり、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによる測定で２μｇ、非還元。
【図４Ｂ】図４は、抗ヒトＰｌＧＦ−１モノクローナル抗体（すなわち、モノクローナル抗体１−２５５−７１３（２５５）又は２−８２６−３３５（８２６）の何れか）が非還元形態の組み換えヒトＰｌＧＦ−１抗原に結合することを示した実施例２に記載されているアッセイの結果を示すウェスタンブロットである。図４Ａ及び４Ｂにおいて、レーン１は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，イー・コリ中で産生）であり、ＯＤ２８０により２μｇ。レーン２は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１−１３１）、ＧＰＣＳ１００であり、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによる測定で２μｇ、非還元。レーン３は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１７−１３１）、ＧＰＣＳ３００であり、ＯＤ２８０により約２μｇ、非還元。レーン４は、ブランクである。レーン５は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，イー・コリ中で産生）であり、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによる測定で２μｇ、還元。レーン６は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１−１３１）、ＧＰＣＳ３０００であり、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによる測定で２μｇ、還元。レーン７は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１７−１３１）、ＧＰＣＳ３００であり、ＯＤ２８０により約２μｇ、還元。及びレーン８は、タンパク質マーカーである。図４Ｃにおいて、レーン１は、タンパク質マーカーである。レーン２は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（７−１３１）、ＧＰＣＳ３００であり、ＯＤ２８０により約２μｇ、還元。レーン３は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１−１３１）、ＧＰＣＳ３０００であり、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによる測定で２μｇ、還元。レーン４は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，イー・コリ中で産生）、ＧＰＣＧ３０００であり、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによる測定で２μｇ、還元。レーン５は、ブランクである。レーン６は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１７−１３１）、ＧＰＣＳ３００であり、ＯＤ２８０により約２μｇ、非還元。レーン７は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１−１３１）、ＧＰＣＳ１００であり、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによる測定で２μｇ、非還元。レーン８は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１−１３１）、ＧＰＣＳ１００であり、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによる測定で２μｇ、非還元。
【図４Ｃ】図４は、抗ヒトＰｌＧＦ−１モノクローナル抗体（すなわち、モノクローナル抗体１−２５５−７１３（２５５）又は２−８２６−３３５（８２６）の何れか）が非還元形態の組み換えヒトＰｌＧＦ−１抗原に結合することを示した実施例２に記載されているアッセイの結果を示すウェスタンブロットである。図４Ａ及び４Ｂにおいて、レーン１は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，イー・コリ中で産生）であり、ＯＤ２８０により２μｇ。レーン２は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１−１３１）、ＧＰＣＳ１００であり、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによる測定で２μｇ、非還元。レーン３は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１７−１３１）、ＧＰＣＳ３００であり、ＯＤ２８０により約２μｇ、非還元。レーン４は、ブランクである。レーン５は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，イー・コリ中で産生）であり、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによる測定で２μｇ、還元。レーン６は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１−１３１）、ＧＰＣＳ３０００であり、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによる測定で２μｇ、還元。レーン７は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１７−１３１）、ＧＰＣＳ３００であり、ＯＤ２８０により約２μｇ、還元。及びレーン８は、タンパク質マーカーである。図４Ｃにおいて、レーン１は、タンパク質マーカーである。レーン２は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（７−１３１）、ＧＰＣＳ３００であり、ＯＤ２８０により約２μｇ、還元。レーン３は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１−１３１）、ＧＰＣＳ３０００であり、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによる測定で２μｇ、還元。レーン４は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，イー・コリ中で産生）、ＧＰＣＧ３０００であり、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによる測定で２μｇ、還元。レーン５は、ブランクである。レーン６は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１７−１３１）、ＧＰＣＳ３００であり、ＯＤ２８０により約２μｇ、非還元。レーン７は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１−１３１）、ＧＰＣＳ１００であり、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによる測定で２μｇ、非還元。レーン８は、ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１−１３１）、ＧＰＣＳ１００であり、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによる測定で２μｇ、非還元。
【図５】図５は、ＥＳＩ−ＭＳを用いたヒトＰｌＧＦ−１のグリコシル化分析、具体的には、脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１の分子量を示している。分子量１５６４６が、最も量が多いピークであった。上のパネルの横軸：質量対電荷比（「ｍ／ｚ」）、原子質量単位（「ａｍｕ」）。下のパネルの横軸：分子量（「質量」）、原子質量単位（「ａｍｕ」）。
【図６】図６は、ヒトＰｌＧＦ−１断片に対するポリヌクレオチド配列（配列番号２３）を示す。抗体κ軽鎖シグナル配列は斜字体で示されており、Ｈｉｓタグに下線が付されている。
【図７】図７は、ベクターｐＪＶ−Ｈｉｓ−ヒトＰｌＧＦ−１（１７−１３１）を示している。
【図８】図８は、実施例４に記載されているように、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって産生された二量体の形態のヒトＰｌＧＦ−１断片（１７−１３１）の遊走を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動である。レーン１は、タンパク質マーカーである。レーン２は、ブランクである。レーン３は、ヒトＰｌＧＦ−１断片（１７−１３１）６μｇ、非還元である。レーン４は、ヒトＰｌＧＦ−１断片（１７−１３１）２μｇ、非還元である。
【図９】図９は、ヒトＰｌＧＦ−１に対するポリヌクレオチド配列（配列番号２６）を示す。抗体κ軽鎖シグナル配列は斜字体で示されており、Ｈｉｓタグには下線が付されており、エンテロキナーゼ切断部位（ＤＤＤＤＫ）が太字で示されている。
【図１０】図１０は、ベクターｐＪＶ−Ｈｉｓ−ヒトＰｌＧＦ−１（１−１３１）を示している。
【図１１】図１１は、実施例６に記載されているように、組み換えヒトＰｌＧＦ−１（１−１３１）エンテロキナーゼ抗原の遊走を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動である。レーン１は、タンパク質マーカーである。レーン２は、室温での、ヒトＰｌＧＦ−１−ＥＫ４０μＬ＋Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎエンテロキナーゼの３Ｕである。レーン３は、室温での、ヒトＰｌＧＦ−１−ＥＫ４０μＬ＋Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎエンテロキナーゼの０．５Ｕである。レーン４は、室温での、ヒトＰｌＧＦ−１−ＥＫ４０μＬ＋Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎエンテロキナーゼの０．０５Ｕである。レーン６は、室温での、エンテロキナーゼ対照なしのヒトＰｌＧＦ−１−ＥＫ４０μＬである。レーン７は、室温での、ヒトＰｌＧＦ−１−ＥＫ４０μＬ＋Ｎｏｖａｇｅｎエンテロキナーゼの２Ｕである。レーン８は、室温での、ヒトＰｌＧＦ−１−ＥＫ４０μＬ＋Ｎｏｖａｇｅｎエンテロキナーゼの０．２Ｕである。及びレーン９は、４℃での、エンテロキナーゼ対照なしのヒトＰｌＧＦ−１−ＥＫ４０μＬである。
【図１２】図１２は、上の配列において、モノクローナル抗体１−２５５−７１３に対する可変軽鎖ポリヌクレオチド配列（配列番号２７及び２８）を示している。下の配列は、上の配列の相補物を含有し、３’から５’の方向に示されている。
【図１３】図１３は、モノクローナル抗体１−２５５−７１３の軽鎖に対するアミノ酸配列を示し、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３は斜字体で、下線が付されている（配列番号２９）。
【図１４】図１４は、上の配列において、モノクローナル抗体１−２５５−７１３に対する可変重鎖ポリヌクレオチド配列（配列番号３０及び３１）を示している。下の配列は、上の配列の相補物を含有し、３’から５’の方向に示されている。
【図１５】図１５は、モノクローナル抗体１−２５５−７１３の重鎖に対するアミノ酸配列を示し、ＣＤＲ１、２及び３は斜字体で、下線が付されている（配列番号３２）。
【図１６】図１６は、上の配列において、モノクローナル抗体２−８２６−３３５に対する可変軽鎖ポリヌクレオチド配列（配列番号４１及び４２）を示している。下の配列は、上の配列の相補物を含有し、３’から５’の方向に示されている。
【図１７】図１７は、モノクローナル抗体２−８２６−３３５の軽鎖に対するアミノ酸配列を示し、ＣＤＲ１、２及び３は斜字体で、下線が付されている（配列番号４３）。
【図１８】図１８は、上の配列において、モノクローナル抗体２−８２６−３３５に対する可変重鎖ポリヌクレオチド配列（配列番号３３及び３４）を示している。下の配列は、上の配列の相補物を含有し、３’から５’の方向に示されている。
【図１９】図１９は、モノクローナル抗体２−８２６−３３５の重鎖に対するアミノ酸配列を示し、ＣＤＲ１、２及び３は斜字体で、下線が付されている（配列番号３５）。
【図２０】図２０は、トリプシン消化され、及び脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１（配列番号４０）を示す。アミノ酸位置２１で、脱グリコシル化の後に、アスパラギン（Ｎ）は、アスパラギン酸（Ｄ）（斜字体及び太字で示されている。）に転化された。８９位において、アスパラギン（Ｎ）とアスパラギン酸の両方が検出された（太字でのみ示されている。）。
【図２１】図２１は、実施例２においてさらに記載されているように、ヒトＰｌＧＦ−１Ｎ−グリカン１−８のＬＣ／ＭＳ分析の抽出されたイオンクロマトグラムを示している。
【図２２】図２２は、実施例１５に記載されているように、典型的なＰｌＧＦ−１イムノアッセイフォーマットに対する、ＰｌＧＦ濃度対妊娠期間のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
(詳細な記述)
本開示は、ヒトＰｌＧＦ−１タンパク質（すなわち、グリコシル化された及び脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１タンパク質）及びある種のヒトＰｌＧＦ−１タンパク質に結合する抗体に関する。ヒトＰｌＧＦ−１タンパク質単独又はヒトＰｌＧＦ−１タンパク質に対して誘導された抗体と組み合わせたヒトＰｌＧＦ−１タンパク質は、様々な用途（例えば、診断用アッセイの成分として、又はイムノアッセイキット中に存在して、又は改善されたイムノアッセイにおける抗体を作製するための免疫原として）を有する。
【００４６】
Ａ．定義
本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上明確に別段の記載がなければ、複数表記を包含する。本明細書の数的範囲の表記に関して、同じ精度を有するその間に介在するそれぞれの数字が明示的に意図される。例えば、６から９の範囲に関しては、６及び９の他に、数字７及び８が意図され、６．０から７．０の範囲に関しては、数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８．６．９及び７．０が明示的に意図される。
【００４７】
ａ）抗体
本明細書において使用される「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（完全に又は部分的にヒト化）、動物抗体（一態様において、トリ（例えば、アヒル又はガチョウ）、別の態様において、サメ又はクジラ、さらに別の態様において、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウスなど）及び非ヒト霊長類（サル、例えば、カニクイザル、チンパンジーなど）を含む哺乳動物）、組み換え抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合されたＦｖ（ｓｄＦｖ）及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本開示の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む。）及び上記の何れかの機能的に活性なエピトープ結合断片を表す。特に、抗体には、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片（すなわち、抗原結合部位を含有する分子）が含まれる。免疫グロブリン分子は、あらゆる種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、サブクラス、これらの断片又は誘導体のものであり得る。単純化のために、分析物に対する抗体は、「抗分析物抗体」又は単に「分析物抗体」（例えば、ヒトＰｌＧＦ−１抗体）としばしば称される。抗体は、本分野において公知の１つ又はそれ以上の化学的、ペプチド又はポリペプチド部分の付着によって誘導化され得る。抗体は、化学的部分と連結させ得る。
【００４８】
ｂ）結合定数（例えば、ＫＤ、ｋａ及びｋｄ）
本明細書において互換的に使用される「平衡解離定数」又は「ＫＤ」という用語は、平衡状態での滴定測定で得られた値又は解離速度定数（ｋｏｆｆ）を会合速度定数（ｋｏｎ）で割ることによって得られた値を表す。会合速度定数、解離速度定数及び平衡解離定数は、抗原への抗体の結合親和性を表すために使用される。
【００４９】
本明細書において互換的に使用される「会合速度定数」、「ｋｏｎ」又は「ｋａ」という用語は、以下の式によって示される、その標的抗原への抗体の結合速度又は抗体と抗原間での複合体形成の速度を示す値を表す。
抗体（「Ａｂ」）＋抗原（「Ａｇ」）−＞Ａｂ−Ａｇ
【００５０】
本明細書において互換的に使用される「解離速度定数」、「ｋｏｆｆ」又は「ｋｄ」という用語は、以下の式によって示される、その標的抗原からの抗体の解離速度又は遊離の抗体と抗原への経時的なＡｂ−Ａｇ複合体の分離を示す値を表す。
Ａｂ＋Ａｇ＜−Ａｂ−Ａｇ
【００５１】
会合及び解離速度定数を測定するための方法は、本分野において周知である。蛍光を基礎とする技術を使用することによって、平衡状態で生理的緩衝液中の試料を調べるための高い感度及び能力が得られる。他の実験的アプローチ及び装置（ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｒ）（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）アッセイなど）を使用することができる（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ，  ａ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎから入手可能な装置）。さらに、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ）から入手可能なＫｉｎＥｘＡ（Ｒ）（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）も使用することができる。
【００５２】
ｃ）心血管疾患
本明細書において使用される「心血管疾患」という用語は、心臓、血管又は循環を含む様々な臨床的疾病、疾患又は症状を表す。疾病、疾患又は症状は、冠動脈、脳又は末梢動脈のアテローム性動脈硬化性の障害によるものであり得る。心血管疾患には、冠動脈疾患、末梢血管疾患、高血圧、心筋梗塞、心不全などが含まれるが、これらに限定されない。例えば、心不全において、心血管疾患の「増加された重度」は、例えば、クラスＩＩＩ又はクラスＩＶへの増加したＮＹＨＡ分類によって表される疾病の悪化を表し、心血管疾患の「低下した重度」とは、例えば、クラスＩＩＩ又はＩＶからクラスＩＩ又はＩへの低下したＮＹＨＡ分類によって表される疾病の改善を表す。
【００５３】
ｄ）グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又はグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片
本明細書において使用される、本明細書において互換的に使用される「オリゴ糖部分」又は「オリゴ糖分子」という用語は、インビボ又はインビトロでのグリコシル化によって、（例えば、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片などのグリコシル化されたポリペプチドを産生するために）ポリペプチドに付着され得る、１つ又はそれ以上の単糖残基を含む炭水化物含有分子を表す。ポリペプチドに付着されているオリゴ糖部分の数が明示的に示されている場合を除いて、「本明細書において引用されている「オリゴ糖部分」という全ての表記は、ポリペプチドに付着された１つ又はそれ以上のこのような部分を表すものとする。好ましくは、前記炭水化物分子が付着され得るポリペプチドは、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片であり、すなわち、本明細書中でさらに記載されているような「グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１」又は「グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片」を与える。
【００５４】
「インビボグリコシル化」という用語は、例えば、Ｎ−結合型及びＯ−結合型グリコシル化によって、例えば、ポリペプチドの発現のために使用されるグリコシル化細胞中での翻訳後プロセッシングの間に、インビボで起こるオリゴ糖部分のあらゆる付着を意味するものとする。通常、Ｎ−グリコシル化されたオリゴ糖部分は、５つの単糖残基（すなわち、２つのＮ−アセチルグルコサミン残基及び３つのマンノース残基）から構成される共通の基本的コア構造を有する。正確なオリゴ糖構造は、問題のグリコシル化生物及び具体的なポリペプチドに大きく依存する。
【００５５】
「インビトログリコシル化」という用語は、場合によって架橋剤を用いて、ポリペプチドの付着基へオリゴ糖部分を共有結合することを通常含む、インビトロで行われる合成的グリコシル化を表す。インビトログリコシル化は、様々な異なる化学を用いて、ポリペプチド（例えば、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片など）への化学的に合成されたオリゴ糖構造を付着させることによって達成することができる。例えば、使用することができる化学は、場合によって短いスペーサーを介して、オリゴ糖が官能基に連結される、タンパク質へポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を付着させるために使用される化学である。インビトログリコシル化は、約０．０２から約２．０ｍＬの容量で、約０．５から約２．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、約４．０から約７．０のｐＨで、適切な緩衝液中で実施することができる。他のインビトログリコシル化法は、例えば、Ａｐｌｉｎ他によるＷＯ８７／０５３３０、Ｌｕｎｄｂｌａｄ他による、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ中のＣＲＣＣｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５９−３０６（１９８１）、Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２３：３７５９−３７６５（１９８２）及びＤｏｅｂｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２１９３−２１９９（１９８２）に記載されている。
【００５６】
ｅ）心不全
本明細書において使用される「心不全」という用語は、心臓が身体の残部に効率的に血液を拍出することができない症状を表す。心不全は、心臓に対する損傷又は梗塞、心筋症（原発性又は続発性）、高血圧、冠動脈疾病、弁の疾患、出生異常若しくは感染による動脈の狭窄によるものであり得る。さらに、心不全は、慢性、うっ血性、急性、非代償性、心臓収縮性又は心臓拡張性として記載することができる。ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）分類は、患者の機能的な能力に基づいて疾病の重度を記載している。ＮＹＨＡクラスは、治療又は治療に対する応答の欠如に基づいて、進行し及び／又は退行し得る。
【００５７】
ｆ）ヒトＰｌＧＦ−１断片
本明細書において使用される「ヒトＰｌＧＦ−１断片」という用語は、ヒトＰｌＧＦ−１の全体（１３１アミノ酸、成熟タンパク質と称される場合がある。）又はシグナルペプチドを含むＰｌＧＦ−１（１４９アミノ酸、非成熟タンパク質と称される場合がある。）より少ない（すなわち、非完全長）部分を含むポリペプチドを表す。特に、ヒトＰｌＧＦ−１断片は、配列番号１、２、３又は４の約５から約１３０の連続するアミノ酸を含む。特に、ヒトＰｌＧＦ−１断片は、配列番号１、２、３若しくは４の少なくとも約５の連続するアミノ酸、配列番号１、２、３若しくは４の少なくとも約１０の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３若しくは４のアミノ酸の少なくとも約１５の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３若しくは４の少なくとも約２０の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３若しくは４の少なくとも約２５の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３若しくは４のアミノ酸の少なくとも約３０の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３若しくは４の少なくとも約３５の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３若しくは４の少なくとも約４０の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３若しくは４の少なくとも約４５の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３若しくは４の少なくとも約５０の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３若しくは４の少なくとも約５５の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３若しくは４の少なくとも約６０の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３若しくは４の少なくとも約６５の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３若しくは４の少なくとも約７０の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３若しくは４の少なくとも約７５の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３若しくは４の少なくとも約８０の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３若しくは４の少なくとも約８５の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３若しくは４の少なくとも約９０の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３若しくは４の少なくとも約９５の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３若しくは４の少なくとも約１００の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３若しくは４の少なくとも約１０５の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３若しくは４の少なくとも約１１０の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３若しくは４の少なくとも約１１５の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３若しくは４の少なくとも約１２０の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、３若しくは４の少なくとも約１２５の連続するアミノ酸残基又は配列番号１、２、３若しくは４の１３０の連続するアミノ酸残基を含む。
【００５８】
本開示によって想定されるヒトＰｌＧＦ−１断片の例には、
（ａ）配列番号５に示されているアミノ酸配列を有する少なくとも約１１５の連続するアミノ酸のヒトＰｌＧＦ−１断片；
（ｂ）配列番号６に示されているアミノ酸配列を有する少なくとも約１２１の連続するアミノ酸のヒトＰｌＧＦ−１断片（配列番号５と同一であるが、連結配列、具体的には、Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１７）を含む。）；
（ｃ）配列番号７に示されているアミノ酸配列を有する少なくとも約１２２の連続するアミノ酸のヒトＰｌＧＦ−１断片（配列番号５と同一であるが、連結配列、具体的には、エンテロキナーゼ切断部位（ＤＤＤＤＫ（配列番号１８）を含む。）；並びに
（ｄ）配列番号７に示されているアミノ酸配列を有する少なくとも約１２８の連続するアミノ酸のヒトＰｌＧＦ−１断片（配列番号８は、配列番号５と同一であるが、２つの連結配列、具体的には、Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１７）及びエンテロキナーゼ切断部位（ＤＤＤＤＫ）（配列番号１８）を含む。）；
が含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
ｇ）ヒトＰｌＧＦ−１ポリヌクレオチド
本明細書において使用される「ヒトＰｌＧＦ−１ポリヌクレオチド」という用語は、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片をコードするポリヌクレオチドを表す。ヒトＰｌＧＦ−１ポリヌクレオチドは、単離され、精製され、又は単離及び精製されることができる。本開示のヒトＰｌＧＦ−１ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡ）の何れでもあり得る。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖の何れかであり、一本鎖の場合には、コード鎖又は非コード鎖（アンチセンス）鎖の何れかである。
【００６０】
本開示の典型的なヒトＰｌＧＦ−１ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２６及び（ｂ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２６の完全な配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含む又はこれらからなる単離された、精製された又は単離及び精製されたヒトＰｌＧＦ−１ポリヌクレオチドである。配列番号９は、配列番号１の完全長ヒトＰｌＧＦ−１配列のポリヌクレオチド配列である。配列番号１０は、Ｈｉｓタグを含有する配列番号２の完全長ヒトＰｌＧＦ−１配列のポリヌクレオチド配列である。配列番号１１は、エンテロキナーゼ切断部位を含有する配列番号３の完全長ヒトＰｌＧＦ−１配列のポリヌクレオチド配列である。配列番号１２は、Ｈｉｓタグ及びエンテロキナーゼ切断部位を含有する配列番号４の完全長ヒトＰｌＧＦ−１配列のポリヌクレオチド配列である。配列番号１３は、配列番号５の配列を有するヒトＰｌＧＦ−１断片のポリヌクレオチド配列である。配列番号１４は、Ｈｉｓタグを含有する、配列番号６の配列を有するヒトＰｌＧＦ−１断片のポリヌクレオチド配列である。配列番号１５は、エンテロキナーゼ切断部位を含有する、配列番号７の配列を有するヒトＰｌＧＦ−１断片のポリヌクレオチド配列である。配列番号１６は、Ｈｉｓタグ及びエンテロキナーゼ切断部位を含有する、配列番号８の配列を有するヒトＰｌＧＦ−１断片のポリヌクレオチド配列である。配列番号２２は、Ｈｉｓタグ及び抗体κ軽鎖シグナル配列を含有する、配列番号２の完全長ヒトＰｌＧＦ−１配列のポリヌクレオチド配列である。配列番号２３は、Ｈｉｓタグ及び抗体κ軽鎖シグナル配列を含有する、配列番号６の完全長ヒトＰｌＧＦ−１配列のポリヌクレオチド配列である。配列番号２６は、Ｈｉｓタグ、エンテロキナーゼ切断部位及び抗体κ軽鎖シグナル配列を含有する、配列番号８のポリヌクレオチド配列である。
【００６１】
ｈ）ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１ポリペプチド
本明細書において互換的に使用される「ヒトＰｌＧＦ−１」又は「ヒトＰｌＧＦ−１ポリペプチド」という用語は、シグナルペプチドあり又はなしの、あらゆる完全長（すなわち、その断片でない。）ヒトＰｌＧＦ−１配列を表す。例えば、完全長ヒトＰｌＧＦ−１は、システインノット構造を形成する８つの保存されたシステイン残基を有する中心に配置されたＰＤＧＦ様ドメインを有する１８アミノ酸のシグナル配列を有する１４９アミノ酸の非成熟ポリペプチドであり得る。あるいは、ヒトＰｌＧＦ−１は、１８アミノ酸シグナル配列を含有しない１３１アミノ酸の成熟ポリペプチドであり得る（配列番号１に示されているものなど）。ＰｌＧＦは、少なくとも４つの選択的にスプライシングされた形態（ＰｌＧＦ−１、ＰｌＧＦ−２、ＰｌＧＦ−３及びＰｌＧＦ−４）で存在し得る。ＰｌＧＦ−２及びＰｌＧＦ−４は、ＰｌＧＦ−２及びＰｌＧＦ−４中へへパリン結合ドメインが挿入されている（細胞膜との増加した会合又はＰｌＧＦ受容体に対する変化した親和性をもたらし得る。）点で、他の形態と異なり得る。ヒトＰｌＧＦ−１ポリヌクレオチド及びポリペプチド（例えば、ポリアミノ酸）配列は、天然に見出される配列を基本とすると、天然に見出されるとおりであり、単離され、合成、半合成、組み換え又はその他であり得る。
【００６２】
従って、本明細書中の開示は、原核生物及び／又は真核生物のバックグラウンド（例えば、その結果、コドン認識に対して最適化されている。）中に存在し及び／又は産生される多数の異なるヒトＰｌＧＦ−１ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を包含する。まとめると、ヒトＰｌＧＦ−１ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、（ａ）１つ又はそれ以上のシグナル配列（例えば、シグナルペプチド）；（ｂ）１つ又はそれ以上の連結配列；及び（ｃ）等業者に自明である他の変形を含んでもよく、又は含まなくてもよい。
【００６３】
典型的な配列には、本明細書中に記載されているもの、すなわち、（ａ）配列番号１（１３１アミノ酸を含み、及びシグナル配列又は一切の連結配列を含有しないヒトＰｌＧＦ−１である。）、配列番号２（配列番号２は、連結配列、具体的には、Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１７））を含むことを除き、配列番号１と同じである。）、配列番号３（配列番号３は、連結配列、具体的には、エンテロキナーゼ切断部位（ＤＤＤＤＫ（配列番号１８））を含むことを除き、配列番号１と同じである。）又は配列番号４（配列番号４は、２つの連結配列、具体的には、Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１７））及びエンテロキナーゼ切断部位（ＤＤＤＤＫ（配列番号１８））を含むことを除き、配列番号１と同じである。）、及び（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４の完全な配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％同一であるポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００６４】
ｉ）妊娠性高血圧性疾患
本明細書において、「妊娠性高血圧性疾患（ＨＤＰ；ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ｏｆ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）」は、「Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｒｔ，  Ｌｕｎｇ  ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  （ＮＨＬＢＩ）（Ｒｏｂｅｒｔｓ，  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ４１（３）：４３７−４５参照）によって定義された文脈で使用される。ＮＨＬＢＩは、ＨＤＰを４つのカテゴリーに分類する。
【００６５】
−子癇前症（ＰＥ）：妊娠２０週より後で、血圧（ＢＰ）＞１４０／９０；＞３００ｍｇ／２４時間タンパク尿として定義される。
【００６６】
−慢性高血圧（ＣＨＴＮ）：妊娠前又は妊娠２０週より前で、ＢＰ＞１４０／９０として定義される。
【００６７】
−慢性高血圧との混合型子癇前症（ＰＥ＋ＣＨＴＮ）：妊娠２０週より後に既存の慢性高血圧症を有する女性における、新たに増加したタンパク尿の発生として定義される。
【００６８】
−妊娠性高血圧（ＧＨ）：２０週より後にタンパク尿がない高血圧として定義される。
【００６９】
これらの測定を所定の値と比較することによって、例えば、子癇前症と慢性高血圧を区別するために、患者の高血圧状態を決定することが可能になる。
【００７０】
ｊ）高血圧状態
本明細書において使用される「高血圧状態」という用語は、高血圧性疾患（例えば、慢性高血圧、妊娠に関連する高血圧性疾患（ＨＤＰ）又は抗血管新生薬物治療に関連する高血圧性疾患）の存在又は不存在に関する対象の状態を表す。
【００７１】
ｋ）同一の
２つ又はそれ以上のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列に関して本明細書において使用される「同一の」又は「同一性」とは、当該配列が同一である残基の指定されたパーセントを指定された領域上に有することを意味し得る。パーセントは、２つの配列を最適に並置し、指定された領域にわたって２つの配列を比較し、両配列中に同一の残基が存在する位置の数を求めて、合致した位置の数を与え、指定された領域中の位置の総数で合致した位置の数を除し、結果に１００を乗じて、配列同一性のパーセントを得ることによって計算され得る。２つの配列が異なる長さであり又は並置が１つ又はそれ以上のずれた末端をもたらし、指定された比較の領域が単一の配列のみを含む場合には、単一の配列の残基は計算の分母に含められるが、分子には含められない。
【００７２】
ｌ）免疫診断試薬
本開示に係る「免疫診断試薬」は、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の領域に特異的に結合する１つ又はそれ以上の抗体を含む。例えば、イムノアッセイにおける並びに／又は検量物質、対照及び免疫診断剤としての本開示のこのような抗体の使用が、本明細書に記載されている。しかしながら、本発明の抗体は、本明細書に記載されているような改善されたヒトＰｌＧＦ−１アッセイにおいても、場合によって使用することができる。
【００７３】
ｍ）連結配列
本明細書において使用される「連結配列」という用語は、目的の１つ又はそれ以上のポリペプチド配列（例えば、完全長、断片など）に接続されている天然の又は人工のポリペプチド配列を表す。「接続する」という用語は、目的のポリペプチド配列への連結配列の連結を表す。このようなポリペプチド配列は、好ましくは、１つ又はそれ以上のペプチド結合によって連結される。
【００７４】
連結配列は、約４から約５０アミノ酸の長さを有し得る。好ましくは、連結配列の長さは、約６から約３０アミノ酸である。天然の連結配列は、人工の連結配列を作製するために、アミノ酸置換、付加又は欠失によって修飾され得る。
【００７５】
典型的な連結配列には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】
（ａ）ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１７）のアミノ酸配列を有する６×Ｈｉｓタグなどのヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ。ヒスチジンタグは、目的のポリペプチド及び抗体の単離及び精製を容易にするための連結配列として有用である。
【００７７】
（ｂ）エンテロキナーゼ切断部位。エンテロキナーゼ切断部位は、Ｈｉｓタグと同様、目的のポリペプチド及び抗体の単離及び精製において使用される。しばしば、エンテロキナーゼ切断部位は、目的のポリペプチド及び抗体の単離及び精製において、Ｈｉｓタグとともに使用される。様々なエンテロキナーゼ切断部位が本分野において公知である。エンテロキナーゼ切断部位の例には、ＤＤＤＤＫ（配列番号１８）のアミノ酸配列及びその誘導体（例えば、ＡＤＤＤＤＫなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７８】
（ｃ）分類不能の配列。このような配列には、一本鎖可変領域断片の軽及び／又は重鎖可変領域を連結又は接続するために使用することができるアミノ酸配列ＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ（配列番号１９）などの連結配列が含まれる。使用することができる他の連結配列の例は、「Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４２：４２３−４２６（１９８８）」、「Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３（１９８８）」及び「ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４８：５５２−５５４（１９９０）」に見出すことができる。連結配列は、さらなる機能（薬物の付着又は固体支持体への付着など）のために修飾することも可能である。
【００７９】
本開示において、目的のポリペプチド（例えば、ヒトＰｌＧＦ−１ポリペプチドのグリコシル化された及び脱グリコシル化された完全長及び断片形態）及び抗体は、１つ又はそれ以上の連結配列を含有し得る。例えば、本開示のポリペプチド及び抗体は、Ｈｉｓタグ、エンテロキナーゼ切断部位又はＨｉｓタグ及びエンテロキナーゼ切断部位の両方を含有し得る。
【００８０】
ｎ）平均
本明細書において使用される「平均」という用語は、検討又は調査されている値の群の典型的な例を代表する単一の値を表す。
【００８１】
ｏ）ＰｌＧＦ−１ハイブリッド
本明細書において使用される「ＰｌＧＦ−１ハイブリッド」又は「ＰｌＧＦ−１ハイブリドーマ」という用語は、目的の抗ＰｌＧＦ−１抗体を産生する（明記されているとおりの）特定のハイブリドーマクローン又はサブクローンを表す。一般に、同じ種類のサブクローンから得られた抗体と比べて、ハイブリドーマクローンによって産生される抗体の親和性には、幾らかの小さな変動が存在し得る（例えば、クローンの純度を反映する。）。比較すると、同じクローンに由来し、さらに、目的の抗ＰｌＧＦ−１抗体を産生する全てのハイブリドーマサブクローンは、同じ配列及び／又は同じ構造の抗体を産生することが十分に確立されている。
【００８２】
ｐ）子癇前症
本明細書において使用される「子癇前症」という用語は、妊娠中に観察される多臓器疾患（タンパク尿及び／又は子癇前症の他の症候（以下参照）の開始に伴う又は開始前の高血圧によって特徴付けられる。）及び抗血管新生治療（例えば、化学療法）に関連する「子癇前症様症候群」（ＰＬＳ）の両方を表す。「子癇前症」という用語は、「子癇前症／子癇」のＮＨＬＢＩＨＤＰ表記並びに軽度、中度及び重度の子癇前症を含む本疾患の様々な臨床形態を包含する。「子癇前症」は、溶血、上昇した肝臓酵素レベル及び低い血小板数を伴う重度の子癇前症の変形物であるＨＥＬＬＰ症候群も含む。
【００８３】
「子癇前症様症候群（ＰＬＳ）」という用語は、タンパク尿及び子癇前症の潜在的な他の症候（以下参照）を伴う又は伴わない高血圧の新たな開始によって特徴付けられる、抗血管新生治療（例えば、化学療法）の間に観察される多系疾患を表す。
【００８４】
「子癇前症の症候」という用語は、高血圧（妊娠２０週後での、１４０ｍｍＨｇ超の収縮期血圧（ＢＰ）及び９０ｍｍＨｇ超の拡張期ＢＰ）；新しいタンパク尿の開始（尿分析用の試験紙によって１＋、２４時間の尿収集中にタンパク質３００ｍｇ超又は０．３を超える無作為尿タンパク／クレアチニン比）及び出産後２６週までに、又は抗血管新生治療の中止に際して、高血圧とタンパク尿が分離するなど、患者の身体的及び分析的な所見及び病状の両方を表す。子癇前症の症候には、腎機能不全、糸球体内皮症、浮腫、神経障害、凝固障害及び／又は疲労も含まれ得る。
【００８５】
ｑ）前処理試薬（例えば、溶解、沈殿及び／又は可溶化試薬）
本明細書に記載されているような診断アッセイにおいて使用される前処理試薬は、検査試料中に存在する何れかの細胞を溶解する試薬及び／又は何れかの分析物を可溶化する試薬を表す。本明細書中にさらに記載されているように、前処理は全ての試料に対して必要なわけではない。とりわけ、分析物（すなわち、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片）の可溶化には、試料に存在するあらゆる内在性結合タンパク質から分析物を放出させることを含む。前処理試薬は、均質（分離工程を必要としない。）又は不均質（分離工程を必要とする。）であり得る。不均質な前処理試薬を用いる場合、アッセイの次の工程に進む前に、検査試料からの沈殿したあらゆる分析物結合タンパク質の除去が存在する。前処理試薬は、（ａ）１つ若しくはそれ以上の溶媒及び塩、（ｂ）１つ若しくはそれ以上の溶媒、塩及び変性剤、（ｃ）変性剤、（ｄ）変性剤び塩又は（ｅ）細胞溶解及び／若しくは分析物の可溶化に適したあらゆる試薬若しくは試薬の組み合わせを場合によって含むことができる。
【００８６】
ｒ）固相
本明細書において使用される「固相」は、不溶性である又はその後の反応によって不溶性にされ得るあらゆる物質を表す。固相は、捕捉剤を惹き付け及び固定化するその固有の能力のために選択され得る。あるいは、固相は、固相に付着された、捕捉剤を惹きつけ及び固定化する能力を有する連結剤を有することができる。連結剤には、例えば、捕捉剤自体と反対に帯電した帯電物質又は捕捉剤に連結された帯電物質と反対に帯電した帯電物質が含まれ得る。一般に、連結剤は、固相上に固定化されており（付着されており）、及び結合反応を通じて、捕捉剤を固定化する能力を有するあらゆる結合対（好ましくは、特異的な）であり得る。連結剤は、アッセイの実行前に又はアッセイの実行の間に、捕捉剤の固相材料への間接的な結合を可能にする。例えば、固相は、例えば、試験管、マイクロタイターのウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ及び当業者に公知の他の構成などの、プラスチック、誘導化されたプラスチック、磁性又は非磁性金属、ガラス又はシリコンであり得る。
【００８７】
ｓ）実質的に同一の
本明細書において使用される「実質的に同一の」とは、約８から約１００又はそれ以上の残基（特に、約８から約１００残基内のあらゆる範囲を含む。）の領域にわたって、第一及び第二の配列が少なくとも約５０％から約９９％同一であることを意味し得る。
【００８８】
ｔ）バリアント
本明細書において使用される「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失又は保存的置換によって、アミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持しているペプチド又はポリペプチドを意味し得る。本開示において、「生物活性」には、特異的抗体によって結合される能力が含まれる。アミノ酸の保存的置換（すなわち、あるアミノ酸を類似の特性（例えば、親水性、帯電した領域の程度及び分布）の異なるアミノ酸で置換すること）は、本分野において、典型的には僅かな変化を伴うものと認識されている。これらの僅かな変化は、本分野において理解されるように、１つには、アミノ酸のハイドロパチー指数を検討することによって同定することができる。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸のハイドロパチー指数は、アミノ酸の疎水性と電荷の検討に基づいている。類似のハイドロパチー指数のアミノ酸は置換すること可能であり、なおタンパク質を保持し得ることが本分野において知られている。一態様において、±２のハイドロパチー指数を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性は、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらす置換を明らかにするために使用することもできる。ペプチドに関してアミノ酸の親水性を検討することによって、そのペプチドの最大局所平均親水性（抗原性及び免疫原性とよく相関すると報告されている有用な指標）の計算が可能となる。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号。類似の親水性値を有するアミノ酸の置換は、本分野において理解されているように、生物学的活性、例えば、免疫原性を保持するペプチドをもたらし得る。一態様において、互いの±２内の親水性値を有するアミノ酸を用いて置換が行われる。アミノ酸の疎水性指数及び親水性値は何れも、そのアミノ酸の具体的な側鎖によって影響を受ける。その観察と合致して、生物学的機能と適合するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ及び他の特性によって明らかとされるように、アミノ酸（特に、アミノ酸の側鎖）の相対的類似性に依存すると理解されている。
【００８９】
バリアントは、（ｉ）約８から約１００若しくはそれ以上の（特に、約８から約１００残基内のあらゆる範囲を含む。）アミノ酸であり得る被参照タンパク質の一部又は（ｉｉ）被参照タンパク質と実質的に同一であるタンパク質であるタンパク質も表し得る。バリアントは、タンパク分解、リン酸化又は他の翻訳後修飾などによって、異なってプロセッシングされたタンパク質でもあり得る。
【００９０】
ｕ）対象
本明細書において使用される「対象」及び「患者」という用語は、その対象が治療の何れかの形態を受けた又は現在受けているかどうかとは無関係に、互換的に使用される。本明細書において使用される「対象」という用語は、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット及びマウス）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、チンパンジーなどのサル）及びヒトを含む哺乳動物を表す。好ましくは、対象はヒトである。
【００９１】
ｖ）検査試料
本明細書において使用される「検査試料」という用語は、ヒトＰｌＧＦ−１若しくはヒトＰｌＧＦ−１断片などの目的の分析物に関して検査されている及び／又は目的の分析物を含有すると疑われている生物学的材料を全般的に表す。検査試料は、全血、血清、血漿、間質液、唾液、眼のレンズ液、脳脊髄液、汗、尿、乳、腹水、粘液、鼻汁、痰、滑液、腹腔液、膣液、月経血、羊水、精液などの（但し、これらに限定されない。）生理学的液体などのあらゆる生物源に由来し得る。検査試料は、生物源から取得されたまま直接、又は試料の特性を改変するための前処理後に使用され得る。例えば、このような前処理には、血液から血漿を調製すること、粘性のある液体を希釈することなどが含まれ得る。前処理の方法は、ろ過、沈殿、希釈、蒸留、混合、濃縮、妨害成分の不活化、試薬の添加、溶解なども含み得る。さらに、液体溶媒を形成させるために、又は分析物を放出させるために、固体検査試料を改変することも有益であり得る。
【００９２】
本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記述することを目的とするものに過ぎず、その他の限定を意図するものではない。
【００９３】
Ｂ．グリコシル化された及び脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１及びヒトＰｌＧＦ−１断片
一態様において、本開示は、あらゆる種類のヒトＰｌＧＦ−１形態（例えば、単離された、組み換え、変異体、合成、半合成など）に関する。本開示のヒトＰｌＧＦ−１形態は、ヒトＰｌＧＦ−１、ヒトＰｌＧＦ−１断片又はヒトＰｌＧＦ−１の変異体形態又はヒトＰｌＧＦ−１断片であり得る。本明細書に記載されているヒトＰｌＧＦ−１及びヒトＰｌＧＦ−１断片は、それぞれ、場合によってグリコシル化され得る。さらに、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の脱グリコシル化された形態を作製するために、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片のグリコシル化された形態は、本分野において公知の１つ又はそれ以上の技術を用いて、場合によって脱グリコシル化させることができる。これらのヒトＰｌＧＦ−１形態の各々は、例えば、抗体を作製するための免疫原として、及び／又はこのような抗体の結合を評価する上で使用することができる。さらに、ヒトＰｌＧＦ−１断片（場合によってグリコシル化又は脱グリコシル化され得る全てを含む。）は、イムノアッセイにおいて、１つ又はそれ以上の検量物質又は対照として使用することができる。
【００９４】
一実施形態において、本開示は、単離されたグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１の使用に関する。より具体的には、本開示は、少なくとも１つのオリゴ糖分子又は部分及び最大約１０のオリゴ糖分子又は部分を含有するグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１に関する。例えば、本開示のグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１は、配列番号１に示されているものなどの、１３１アミノ酸のアミノ酸配列を有する完全長ヒトＰｌＧＦ−１であり得る。具体的には、配列番号１又は配列番号２に示されているアミノ酸配列を有する完全長ヒトＰｌＧＦ−１は、配列番号１のアミノ酸１５又は８３に示されているアスパラギンにおいて（Ｎ結合型グリコシル化をもたらす。）、配列番号２のアミノ酸２１又は８９に示されているアスパラギンにおいて（Ｎ結合型グリコシル化をもたらす。）、並びに配列番号１のアミノ酸１、１７、１８、３２、４５、４９、５６、５８、６１、９３、９８及び１０５に示されているセリン残基の何れか又は全てにおいて（Ｏ結合型グリコシル化をもたらす。）グリコシル化され得る。あるいは、本開示のグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１は、配列番号３又は配列番号４に示されているアミノ酸配列を有することができる。
【００９５】
本開示の単離された又は精製されたグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１は、あるアミノ酸残基に対するグリコシル化の異なるパーセントを含有し得る。例えば、野生型配列と比較すると、配列番号１のアミノ酸残基１５は、平均約７０％グリコシル化されており、配列番号１のアミノ酸残基８３は平均約１００％グリコシル化されている。あるいは、野生型配列と比較すると、配列番号２のアミノ酸残基アミノ酸残基２１は、平均約７０％グリコシル化されており、配列番号２のアミノ酸残基８９は平均約１００％グリコシル化されている。
【００９６】
配列番号１又は配列番号２に示されているアミノ酸配列を有する本開示の単離された又は精製されたヒトＰｌＧＦ−１形態は、配列番号１のアミノ酸１５、８３若しくは１５及び８３に示されている少なくとも１つのアスパラギン又は配列番号２のアミノ酸２１、８９若しくは２１及び８９に示されている少なくとも１つのアスパラギンにおいて、少なくとも１つのＮ−グリカンでグリコシル化され得る。少なくとも１つのグリカンは、（ａ）Ｎ−アセチルノイラミン酸（ガラクトース）２（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）４フコース、（ｂ）（Ｎ−アセチルノイラミン酸）２（ガラクトース）２（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）４フコース、（ｃ）（Ｎ−アセチルノイラミン酸）２（ガラクトースβ１−４Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）２（ガラクトース）２（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）４フコース又は（ガラクトースβ１−４Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）（ガラクトース）３（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）５フコース、（ｄ）（Ｎ−アセチルノイラミン酸）２（ガラクトース）３（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）５フコース、（ｅ）（Ｎ−アセチルノイラミン酸）３（ガラクトース）３（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）５フコース、（ｆ）（Ｎ−アセチルノイラミン酸）３（ガラクトースβ１−４Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）（ガラクトース）３（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）５フコース又は（Ｎ−アセチルノイラミン酸）３（ガラクトース）４（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）６フコース、（ｇ）（Ｎ−アセチルノイラミン酸）４（ガラクトース）４（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）６フコース及び（ｈ）（Ｎ−アセチルノイラミン酸）４（ガラクトースβ１−４Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）（ガラクトース）４（マンノース）３（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）６フコースからなる群から選択される構造を有する。
【００９７】
あるいは、本開示のグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１は、ヒトＰｌＧＦ−１断片であり得る。典型的なグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片は、配列番号５に示されているものなどの、１１５アミノ酸のアミノ酸配列を有するヒトＰｌＧＦ−１断片である。例えば、配列番号５に示されているアミノ酸配列を有するヒトＰｌＧＦ−１断片は、配列番号５のアミノ酸１、２、１６、２９、３３、４０、４２、４５、７７、８２又は８９に示されているセリン残基の何れか又は全てにおいてグリコシル化され得る（Ｏ結合型グリコシル化をもたらす。）。配列番号５のヒトＰｌＧＦ−１断片は配列番号１のアミノ酸１５にＮ末端アスパラギンを含有しないので、配列番号５の配列を有するヒトＰｌＧＦ−１断片は、配列番号１の完全長ヒトＰｌＧＦ−１のようなＮ結合型グリコシル化を示さない。本開示の他の典型的なグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片は、配列番号６、配列番号７又は配列番号８に示されているアミノ酸配列中に提供されている。
【００９８】
あるいは、グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１は、配列番号１から８の対応するアミノ酸配列と比較したときに、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は付加を含むアミノ酸配列を含むグリコシル化された変異体ヒトヒトＰｌＧＦ（例えば、配列番号１から４の何れか）又はグリコシル化された変異体ヒトＰｌＧＦ−１断片（例えば、配列番号５から８の何れか）であり得る。例えば、グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１は、ヒトＰｌＧＦ−１のアミノ酸配列（例えば、配列番号１から４参照）が少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失又は付加を含有するヒトＰｌＧＦ−１であり得る。場合によって、グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１は、ヒトＰｌＧＦ−１断片のアミノ酸配列（例えば、配列番号５から８参照）が少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失又は付加を含有するヒトＰｌＧＦ−１であり得る。このようなアミノ酸置換、欠失又は付加は、当業者に公知の定型的な技術を用いて作製することができる。
【００９９】
本開示のヒトＰｌＧＦ−１形態は、組み換えＤＮＡ技術を用いて、化学合成によって、又は化学合成と組み換えＤＮＡ技術の組み合わせによって作製することができる。具体的には、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片をコードするポリヌクレオチド配列は、目的のヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片をコードするポリヌクレオチド配列を単離又は合成することによって構築され得る。例えば、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２６のポリヌクレオチドの何れをも使用することができる。上に記載されているように、（例えば、場合によってグリコシル化された）ヒトＰｌＧＦ−１は、完全長ヒトＰｌＧＦ−１、ヒトＰｌＧＦ−１断片、変異体ヒトＰｌＧＦ−１又は１つ若しくはそれ以上のアミノ酸置換、欠失若しくは付加を含有する変異体ヒトＰｌＧＦ−１断片であり得る。このようなアミノ酸置換、欠失又は付加は、（例えば、例えば「Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇ，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８０：１４７−１５１（１９８９）」に記載されているような周知の方法に従う部位指定突然変異誘発、無作為突然変異誘発又はシャフリングを使用する）突然変異誘発によるなど、本分野において公知の定型的な技術を用いて作製することができる。
【０１００】
目的のヒトＰｌＧＦ−１形態の何れかをコードするポリヌクレオチド配列は、目的の所望されるヒトＰｌＧＦ−１形態（すなわち、完全長ヒトＰｌＧＦ−１、ヒトＰｌＧＦ−１断片、ヒトＰｌＧＦ−１の変異体形態又はヒトＰｌＧＦ−１断片の変異体形態）のアミノ酸配列に基づいて、及び好ましくは、目的の組み換えヒトＰｌＧＦ−１形態がその中で産生される宿主細胞中で好まれるコドンを選択することによってオリゴヌクレオチドが設計される化学的合成によって（例えば、オリゴヌクレオチド合成装置を使用することによって）調製され得る。例えば、目的の所望されるヒトＰｌＧＦ−１形態の一部をコードする幾つかの小さなオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、連結又は連結連鎖反応（ＬＣＲ）によって合成され及び組み立てられ得る。各オリゴヌクレオチドは、相補的な構造に対して５’又は３’突出部を通例含有する。
【０１０１】
（合成、部位指定突然変異誘発又は別の方法などによって）組み立てられたら、目的のヒトＰｌＧＦ−１形態をコードするポリヌクレオチド配列は、組み換えベクター中に挿入され、所望の形質転換された宿主細胞中でのポリヌクレオチド配列の発現に必要なあらゆる調節配列に作用可能に連結され得る。
【０１０２】
全てのベクター及び発現調節配列が、目的のポリヌクレオチド配列を発現するように等しく良好に機能するわけではなく、全ての宿主が同じ発現系とともに同様に良好に機能するわけではないが、当業者は、本開示において使用するために、過度な実験操作なしに、これらのベクター、発現調節配列、最適化されたコドン及び宿主の中から容易に選択を行うことができると考えられる。例えば、ベクターを選択する際には、宿主は、ベクターが宿主内で複製可能でなければならず、又は染色体中に組み込まれなければならないので、宿主を検討しなければならない。ベクターのコピー数、そのコピー数を調節する能力及びベクターによってコードされる何れかの他のタンパク質（抗生物質マーカーなど）の発現も検討すべきである。発現調節配列を選択する際には、様々な要素も検討することができる。これらには、配列の相対的な強度、その調節可能性及び目的のヒトＰｌＧＦ−１形態をコードするポリヌクレオチド配列とのその適合性（特に、潜在的な二次構造に関しての）が含まれるが、これらに限定されない。宿主は、選択されたベクターとの宿主の適合性、宿主のコドン使用、宿主の分泌特性、宿主がポリペプチドを正しく折り畳む能力、宿主の発酵又は培養の必要性、宿主がタンパク質をグリコシル化する能力（又は能力の欠如）及びヌクレオチド配列によってコードされる産物の精製の容易さなどを検討することによって選択すべきである。
【０１０３】
組み換えベクターは、自律的に複製するベクター（すなわち、染色体外の実体として存在し、その複製が染色体の複製とは独立しているベクター（プラスミドなど））であり得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞中に導入されたときに、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、ベクターがその中に組み込まれた染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。
【０１０４】
好ましくは、ベクターは、目的のヒトＰｌＧＦ−１形態をコードするポリヌクレオチド配列がポリヌクレオチド配列の転写のために必要とされる追加のセグメントに、その中で作用可能に連結されている発現ベクターである。ベクターは、典型的には、プラスミド又はウイルスＤＮＡに由来する。本明細書中に挙げられている宿主細胞中での発現のために適した多数の発現ベクターが市販されており、又は文献中に記載されている。真核生物宿主に関して有用な発現ベクターには、ＳＶ４０由来の発現調節配列を含むベクター、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルス及びサイトメガロウイルスが含まれるが、これらに限定されない。具体的なベクターには、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）＼Ｈｙｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）が含まれる。酵母細胞中で使用するための発現ベクターの例には、２μプラスミド及びその誘導体、ＰＯＴ１ベクター（米国特許第４，９３１，３７３号）、ｐＪＳＯ３７ベクター（Ｏｋｋｅｌｓ，Ａｎｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７８２：２０２−２０７，（１９９６）に記載されている。）及びｐＰＩＣＺＡ、Ｂ又はＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が含まれるが、これらに限定されない。昆虫細胞中で証するための発現ベクターの例には、ｐＶＬ９４１、ｐＢＧ３１１（Ｃａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｏｖｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ”Ｃｅｌｌ，  ４５：６８５−６９８（１９８６）、ｐＢｌｕｅｂａｃ４．５及びｐＭｅｌｂａｃ（これらの何れも、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．から入手可能である。）が含まれるが、これらに限定されない。本発明において使用するために好ましいベクターは、ｐＪＶ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡから入手可能）である。
【０１０５】
使用可能な他のベクターは、目的のヒトＰｌＧＦ−１形態をコードするポリヌクレオチド配列のコピー数を増幅することを可能にする。このような増幅可能なベクターは、本分野において周知である。これらのベクターには、ＤＨＦＲ増幅によって増幅され得るベクター（例えば、Ｋａｕｆｉｎａｎ、米国特許第４，４７０，４６１号、Ｋａｕｆｉｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃＤＮＡ  Ｇｅｎｅ：Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｏｆ  Ｓｉｇｎａｌｓ  Ｕｔｉｌｉｚｅｄ  Ｆｏｒ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，２：１３０４−１３１９（１９８２）参照）及びグルタミン合成酵素（ＧＳ）増幅（例えば、米国特許第５，１２２，４６４号及び欧州特許公開０３３８，８４１号参照）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
組み換えベクターは、問題の宿主細胞中でベクターを複製可能にするＤＮＡ配列をさらに含み得る。このような配列の例（宿主細胞が哺乳動物細胞である場合）は、ＳＶ４０の複製起点である。宿主細胞が酵母細胞である場合、ベクターの複製を可能にする適切な配列は、酵母プラスミド２μ複製遺伝子ＲＥＰ１から３及び複製起点である。
【０１０７】
ベクターは、選択可能なマーカー、すなわち、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子若しくはスキゾサッカロミセス・ポンベＴＰＩ遺伝子（Ｐ．Ｒ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｇｅｎｅ，４０：１２５−１３０（１９８５）参照）など、その産物が宿主細胞中での欠損を相補する遺伝子若しくはポリヌクレオチド、又はアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する遺伝子若しくはポリヌクレオチドも含み得る。糸状真菌に関しては、選択可能なマーカーには、ａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｃＢ、ｎｉａＤ及びｓＣが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０８】
本明細書において使用される「調節配列」という用語は、目的のヒトＰｌＧＦ−１形態の発現のために必要であり又は有利であるあらゆる成分を表す。各調節配列は、ヒトＰｌＧＦ−１をコードする核酸配列にとって固有又は外来であり得る。このような調節配列には、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、エンハンサー又は上流活性化配列、シグナルペプチド配列及び転写終結因子が含まれるが、これらに限定されない。最小限、調節配列は、目的のヒトＰｌＧＦ−１形態をコードするポリヌクレオチド配列へ作用可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む。
【０１０９】
本明細書において使用される「作用可能に連結された」という用語は、配列の正常な機能が実行され得るような互いに対する配置での、酵素的連結又はその他の手段による、２つ又はそれ以上のポリヌクレオチド配列の共有結合を表す。例えば、プレ配列又は分泌性リーダーをコードするポリヌクレオチド配列は、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されれば、ポリペプチドに対するポリヌクレオチド配列へ作用可能に連結されており、配列の転写に影響を与えれば、プロモーター又はエンハンサーはコード配列へ作用可能に連結されており、翻訳を促進するように配置されていれば、リボソーム結合部位はコード配列へ作用可能に連結されている。一般に、「作用可能に連結」とは、連結されているポリヌクレオチド配列が連続していることを意味し、分泌性リーダーの場合には、連続しており、及び読み取り相にあることを意味する。連結は、都合のよい制限部位での連結によって達成される。このような部位が存在しなければ、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーは、標準的な組み換えＤＮＡ法と組み合わせて使用される。
【０１１０】
多様な発現調節配列が、本開示において使用され得る。このような有用な発現調節配列には、前述の発現ベクターの構造遺伝子と会合された発現調節配列及び原核若しくは真核細胞又はこれらのウイルスの遺伝子の発現を調節することが知られたあらゆる配列並びに様々なこれらの組み合わせが含まれる。哺乳動物細胞中での転写を誘導するのに適切な調節配列の例には、ＳＶ４０及びアデノウイルスの初期及び後期プロモーター、例えば、アデノウイルス２主要後期プロモーター、ＭＴ−Ｉ（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、ヒト延長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター、ドロソフィラ最小熱ショックタンパク質７０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、ヒト成長ホルモン終結因子、ＳＶ４０又はアデノウイルスＥ１ｂ領域ポリアデニル化シグナル及びＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１９６：９４７−５０（１９８７））が含まれる。
【０１１１】
哺乳動物細胞中での発現を改善するために、目的のヒトＰｌＧＦ−１形態をコードするポリヌクレオチド配列の５’非翻訳領域中に、合成イントロンを挿入し得る。合成イントロンの例は、プラスミドｐＣＩ−Ｎｅｏから得られる合成イントロンである（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡから入手可能）。
【０１１２】
昆虫細胞中での転写を誘導するのに適した調節配列の例には、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター、バキュロウイルス前初期遺伝子１プロモーター及びバキュロウイルス３９Ｋ後初期遺伝子プロモーター及びＳＶ４０ポリアデニル化配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１３】
酵母宿主細胞中で使用するのに適した調節配列の例には、酵母α接合系のプロモーター、酵母トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーター、酵母解糖系遺伝子又はアルコール脱水素酵素遺伝子から得られるプロモーター、ＡＤＨ２−４ｃプロモーター及び誘導性ＧＡＬプロモーターが含まれる。
【０１１４】
糸状真菌宿主細胞において使用するのに適した調節配列の例には、ＡＤＨ３プロモーター及びターミネーター、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼトリオースリン酸イソメラーゼ又はアルカリプロテアーゼ、エー・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−アミラーゼ、エー・ニガー又はエー・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｓ）グルコアミラーゼ、エー・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ又はリパーゼをコードする遺伝子由来のプロモーター、ＴＰＩ１ターミネーター及びＡＤＨ３ターミネーターが含まれる。
【０１１５】
目的のヒトＰｌＧＦ−１形態をコードするポリヌクレオチド配列は、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよく、又は含まなくてもよい。その中で発現される細胞から目的のヒトＰｌＧＦ−１形態が分泌されるべき場合には、シグナルペプチドが存在する。存在する場合、このようなシグナルペプチドは、ポリペプチドの発現のために選択された細胞によって認識されるものであるべきである。シグナルペプチドは、目的のヒトＰｌＧＦ−１形態に対して相同（例えば、目的のヒトＰｌＧＦ−１形態に本来付随しているものであり得る。）若しくは異種（すなわち、目的のヒトＰｌＧＦ−１形態とは別の源に由来する。）であり得、又は宿主細胞に対して相同若しくは異種であり得る（すなわち、宿主細胞から本来発現されるシグナルペプチド又は宿主細胞から本来発現されないシグナルペプチド）。従って、シグナルペプチドは原核生物性であり得、例えば、細菌に由来し得、又は真核生物性であり得、例えば、哺乳動物若しくは昆虫、糸状真菌又は酵母細胞に由来し得る。
【０１１６】
シグナルペプチドの存在又は不存在は、例えば、目的のＰｌＧＦ−１形態の産生のために使用される発現宿主細胞に依存する。糸状真菌中で使用するために、シグナルペプチドは、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）アミラーゼ又はグルコアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ若しくはプロテアーゼ又はフミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼをコードする遺伝子に都合よく由来し得る。昆虫細胞中で使用するために、シグナルペプチドは、鱗翅目マンデュカ・セクスタ（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）脂質動員ホルモン前駆体（米国特許第５，０２３，３２８号参照）、ミツバチのメリチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）、エクジステロイドＵＤＰグルコシル転移酵素（ｅｇｔ）（Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４：３４９−３５７（１９９３）又はヒト膵臓リパーゼ（ｈｐｌ）（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２８４:２６２−２７２（１９９７））など、昆虫遺伝子に由来し得る（ＷＯ９０／０５７８３参照）。
【０１１７】
哺乳動物細胞中で使用するためのシグナルペプチドの具体例には、マウスＩｇκ軽鎖シグナルペプチドが含まれる（Ｃｏｌｏｍａ，Ｍ，Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１５２：８９−１０４（１９９２））。酵母細胞中での使用に関して、適切なシグナルペプチドには、エス・セレビシアエから得られるα因子シグナルペプチド（米国特許第４，８７０，００８号参照）、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド（Ｏ．Ｈａｇｅｎｂｕｃｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８９：６４３−６４６（１９８１）参照）、修飾されたカルボキシペプチダーゼシグナルペプチド（Ｌ．Ａ．Ｖａｉｌｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，４８：８８７−８９７（１９８７）参照）、酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド（ＷＯ８７／０２６７０参照）及び酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）シグナルペプチド（Ｍ．Ｅｇｅｌ−Ｍｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，６：１２７−１３７（１９９０）参照）が含まれる。
【０１１８】
本開示の目的のグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１形態（例えば、ヒトＰｌＧＦ−１、ヒトＰｌＧＦ−１断片、変異体ヒトＰｌＧＦ−１又は変異体ヒトＰｌＧＦ−１断片）を産生するために、細菌、真菌（酵母を含む。）、植物、昆虫、哺乳動物又は他の適切な動物細胞若しくは細胞株及びトランスジェニック動物又は植物を含むあらゆる適切な宿主が使用され得る。イー・コリなどの非グリコシル化生物が使用される場合、本開示の目的のグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１形態を産生するために、好ましくは、適切なインビトロでのグリコシル化がイー・コリ中での発現の後に続く。
【０１１９】
細菌の宿主細胞の例には、バチルス（例えば、ビー・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）又はビー・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）又はストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の株などのグラム陽性細菌又はイー・コリの株などのグラム陰性細菌が含まれるが、これらに限定されない。細菌宿主細胞中へのベクターの導入は、例えば、形質転換受容細胞（例えば、Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，８１：８２３−８２９（１９６１））又はＤｕｂｎａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５６：２０９−２２１（１９７１）参照）を用いるプロトプラスト形質転換（例えば、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８：１１１−１１５（１９７９）参照）、電気穿孔（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：７４２−７５１（１９８８）参照）又は連結（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１６９：５７７１−５２７８（１９８７）参照）によって実施され得る。
【０１２０】
適切な糸状真菌宿主細胞の例には、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、例えば、エー・オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、エー・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）又はエー・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の株が含まれるが、これらに限定されない。真菌細胞は、当業者に公知の技術を用いる、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換及び細胞壁の再生を伴う方法によって形質転換され得る。アスペルギルス宿主細胞の形質転換のための適切な操作は、欧州特許出願２３８０２３号及び米国特許第５，６７９，５４３号に記載されている。フサリウム種を形質転換するための適切な方法は、「Ｍａｌａｒｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，７８：１４７−１５６（１９８９）」及びＷＯ９６／００７８７によって記載されている。酵母は、「Ｂｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ  Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．  ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ１９４，ｐｐ１８２−１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３：１６３（１９８３）；及びＨｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，７５：１９２０（１９７８）」によって記載されている操作を用いて形質転換され得る。
【０１２１】
好ましくは、本開示の目的のヒトＰｌＧＦ−１形態はインビボでグリコシル化される。目的のヒトＰｌＧＦ−１形態がインビボでグリコシル化されるべき場合には、宿主細胞は、目的のヒトＰｌＧＦ−１形態の所望されるグリコシル化を作製することができる宿主細胞の群から選択される。従って、宿主細胞は、酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞から選択され得る。
【０１２２】
適切な酵母細胞宿主の例には、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、例えば、エス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、スキゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クライベロミセス（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピー・パストリス又はピー・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）などのピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、エイチ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）又はヤロウィア（ｙａｒｒｏｗｉａ）などのハンセニュラの株が含まれる。異種のポリヌクレオチドで酵母細胞を形質転換し、酵母細胞から異種のポリペプチドを産生するための方法は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ（ＹｅａｓｔｍａｋｅｒＴＭＹｅａｓｔ  Ｔｒａｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔに対する製品プロトコール中）によって、並びに「Ｒｅｅｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，９９：１９３−１９８（１９９２）」、「Ｍａｎｉｖａｓａｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２１：４４１４−４４１５（１９９３）」及び「Ｇａｎｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１２１：１５９−１６４（１９９４）」によって開示されている。
【０１２３】
適切な昆虫宿主細胞の例には、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９又はＳｆ２１）又はトリコプルシア・ニー細胞（ＨｉｇｈＦｉｖｅ）などの鱗翅目の細胞株が含まれるが、これらに限定されない（米国特許第５，０７７，２１４号参照）。昆虫細胞の形質転換及び異種のポリペプチドの作製は、当業者に周知である。
【０１２４】
適切な哺乳動物宿主細胞の例には、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ミドリザル細胞株（ＣＯＳ）、マウス細胞（例えば、ＮＳ／Ｏ）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株、ヒト細胞（ヒト胎児腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＣＲＬ−１５７３））など）及び組織培養中の植物細胞が含まれる。好ましくは、哺乳動物の宿主細胞は、ＣＨＯ細胞株及びＨＥＫ２９３細胞株である。別の好ましい宿主細胞は、Ｂ３．２細胞株（例えば、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）又は別のジヒドロ葉酸還元酵素欠損（ＤＨＦＲ−）ＣＨＯ細胞株（例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手可能）である。一態様において、本開示は、グリコシル化された完全長ヒトＰｌＧＦ−１及び少なくとも１つの連結配列（すなわち、（Ｈｉｓタグを含有する）配列番号２のアミノ酸配列を有するもの）を産生するＣＨＯ細胞株に関し、該ＣＨＯ細胞株は、２００７年７月１２日に、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３８を与えられた。別の態様において、本開示は、グリコシル化された完全長ヒトＰｌＧＦ−１及び少なくとも１つの連結配列（すなわち、（エンテロキナーゼ切断部位を含有する）配列番号３のアミノ酸配列を有するもの）を産生するＣＨＯ細胞株に関し、該ＣＨＯ細胞株は、２００７年７月１２日に、ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３７を与えられた。さらなる態様において、本開示は、グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片（すなわち、配列番号５のアミノ酸配列を有するもの）を産生するＣＨＯ細胞株に関し、該ＣＨＯ細胞株は、２００７年７月１２日に、ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５４０を与えられた。さらに別の態様において、本開示は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み又は配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる単離された、精製された又は単離及び精製されたヒトＰｌＧＦ−１に関する。さらに別の態様において、本開示は、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み又は配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる単離された、精製された又は単離及び精製されたヒトＰｌＧＦ−１断片に関する。
【０１２５】
哺乳動物の宿主細胞中に外来ポリヌクレオチドを導入するための方法には、リン酸カルシウムによって媒介される形質移入、電気穿孔、ＤＥＡＥ−デキストランによって媒介される形質移入、リポソームによって媒介される形質移入、ウイルスベクター及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００を用いるＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫによって記載される形質移入法が含まれる。これらの方法は本分野において周知であり、例えば、「Ａｕｓｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＵＳＡ（１９９６）」によって記載されている。哺乳動物細胞の培養は、例えば、「Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｅｄ．，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ（１９９９）」及び「Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒａｅ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）」に開示されているように、確立された方法に従って実施される。
【０１２６】
これらの作製方法では、本分野で公知の方法を用いて、目的のヒトＰｌＧＦ−１形態の産生に適した栄養素培地中で細胞が培養される。例えば、細胞は、目的のグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１形態の発現及び／又は単離を可能とするのに適した培地中及び条件下で行われる、研究用又は産業用発酵装置中での、振盪フラスコ培養、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、フェドバッチ又は固体状発酵を含む。）によって培養される。培養は、本分野で公知の操作を用いて、炭素及び窒素源並びに無機塩を含む適切な栄養素培地中で行われる。適切な溶媒は、市販の供給業者から入手され、又は（例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関のカタログ中の）公表された組成物に従って調製され得る。目的のグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１形態が栄養素培地中に分泌される場合、目的のヒトＰｌＧＦ−１形態は培地から直接回収することができる。目的のヒトＰｌＧＦ−１形態が分泌されなければ、細胞可溶化液から回収することができる。
【０１２７】
得られた目的のヒトＰｌＧＦ−１形態は、本分野において公知の方法によって回収され得る。例えば、目的のヒトＰｌＧＦ−１形態は、遠心、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発又は沈殿を含む（但し、これらに限定されない。）慣用の操作によって、栄養素培地から回収され得る。
【０１２８】
目的のヒトＰｌＧＦ−１形態は、クロマトグラフィー（イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除など、但し、これらに限定されない。）、電気泳動操作（調製用等電点電気泳動など、但し、これに限定されない。）、溶解度差（硫酸アンモニウム沈殿など、但し、これに限定されない。）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は抽出（例えば、Ｊ−Ｃ  Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）参照）。を含む（但し、これらに限定されない。）、本分野で公知の様々な操作によって精製され得る。
【０１２９】
目的のグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１形態は、本分野における定型的な技術を用いて、場合によって脱グリコシル化することができる。具体的には、Ｎ結合型グリコシル化（完全長ヒトＰｌＧＦ−１（例えば、配列番号１から４）の場合）、１つ若しくはそれ以上のＯ結合型グリコシル化（ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片形態（例えば、配列番号１から８）の場合）又はＮ結合型グリコシル化と１つ若しくはそれ以上のＯ結合型グリコシル化（ヒトＰｌＧＦ−１（例えば、配列番号１から４）の場合）を除去するために、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片は脱グリコシル化することができる。このようなＮ結合型、Ｏ結合型又はＮ結合型及びＯ結合型の両方のグリコシル化は、このようなヒトＰｌＧＦ−１形態を１つ又はそれ以上の酵素で処理することによるなどの、本分野において公知の定型的な技術を用いて実施することができる。
【０１３０】
脱グリコシル化のために使用することができる酵素の例には、Ｎ結合型脱グリコシル化（Ａｓｎ）のためのＰＮＧアーゼＦ及びＯ結合型部位（Ｓｅｒ及びＴｈｒ）から炭水化物を除去するためのＯ−グリカナーゼが含まれる。特殊な連結から炭水化物を切断する、シアリダーゼ、β（１−４）−ガラクトシダーゼ及びβ−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼなどの他の酵素も使用することができる。これらの酵素及びその他の酵素は、例えば、Ｐｒｏｚｙｍｅ（Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手することが可能であり、さらに、混合物又は「カクテル」の形態で購入し得る。例えば、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＥ−ＤＥＧＬＹキットは、ＰＮＧアーゼＦ、α−２（２，６，８，９）ノイラミニダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼ、β（１−４）−ガラクトシダーゼ及びβ−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼのカクテルを含み、ＰｒｏｚｙｍｅのＥｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔは、ＰＮＧアーゼＦ、Ｏ−グリコシダーゼ及びシアリダーゼを含む。
【０１３１】
本明細書中に記載されている方法を用いて脱グリコシル化された、目的のグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１形態（すなわち、ヒトＰｌＧＦ−１、ヒトＰｌＧＦ−１断片、ヒトＰｌＧＦ−１の変異体形態又はヒトＰｌＧＦ−１断片の変異体形態）は、脱グリコシル化の結果、異なるアミノ酸残基へ転化又は変化された少なくとも１つのアミノ酸残基を有する目的の脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１形態を産生し得る。脱グリコシル化の結果、２以上のアミノ酸残基が変化又は転化される場合、目的の脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１形態中の得られた変化又は転化されたアミノ酸残基の何れか又は全部が、同じアミノ酸残基又は異なるアミノ酸残基へ変化され得る。例えば、目的の脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１形態は、（そのグリコシル化された形態と比較されたときに）アスパラギン酸残基へ転化又は変化された少なくとも１つのアスパラギン残基を有し得る。別の例として、目的の脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１形態は、（そのグリコシル化された形態と比較されたときに）少なくともアスパラギン酸残基へ転化又は変化された第一のアスパラギン残基及びアスパラギン酸残基へ転化又は変化された第二のアスパラギン残基を有し得る。表Ａは、脱グリコシル化の結果、変化又は転化された少なくとも１つのアミノ酸残基を含有する、幾つかの典型的な単離された又は精製された、目的の脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１形態を提供する。
【０１３２】
【表１】
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【０１３３】
目的のグリコシル化された及び脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１形態（すなわち、ヒトＰｌＧＦ−１、ヒトＰｌＧＦ−１断片、ヒトＰｌＧＦ−１の変異体形態又はヒトＰｌＧＦ−１断片の変異体形態）は、様々な異なる目的のために、様々な異なる様式で使用することができる。具体的には、本明細書に記載されている目的のグリコシル化された及び脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１形態は、１つ若しくはそれ以上の検量物質、１つ若しくはそれ以上の対照又は１つ若しくはそれ以上の検量物質若しくは対照の組み合わせとして、検査試料中のヒトＰｌＧＦ−１を検出するためのアッセイ（好ましくは、イムノアッセイ）において使用することができる。好ましくは、グリコシル化された及び脱グリコシル化された完全なヒトＰｌＧＦ−１は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８又は配列番号３９の何れかのアミノ酸配列を含み又はこれらからなり、及びグリコシル化された及び脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片は、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８の何れかのアミノ酸配列を含み又はこれらからなる。
【０１３４】
さらに、及び本明細書中にさらに論述されているように、目的のヒトＰｌＧＦ−１形態は、抗体産生のために動物を免疫化するための免疫原として使用することが可能であり、例えば、動物は、マウス、ウサギ、ニワトリ、ラット、ヒツジ、ヤギ、サメ、ラクダ、ウマ、ネコ、イヌ、非ヒト霊長類、ヒト又は他の動物であり得る。一実施形態において、免疫原は、グリコシル化された又は脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１、特に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８若しくは配列番号３９の配列の何れかを含み若しくはこれらからなるグリコシル化された若しくは脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１、又はグリコシル化された若しくは脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片、特に、配列番号５から８の配列の何れかを含み又はこれらからなるグリコシル化された若しくは脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片を含む。別の実施形態において、本明細書中にさらに論述されているように、ヒトＰｌＧＦ−１断片（場合によってグリコシル化又は脱グリコシル化され得る全てを含む。）は、イムノアッセイにおいて、１つ又はそれ以上の検量物質又は対照として使用することができる。
【０１３５】
Ｃ．ヒトＰｌＧＦ−１抗体
本開示は、ＰｌＧＦ−２（例えば、配列番号１−４の何れか）又はヒトＰｌＧＦ−１断片（例えば配列番号５−８の何れか）に特異的に結合する抗体（これは、本明細書中で既に述べたように、場合によってはグリコシル化され得るか又はグリコシル化されている場合は、場合によっては脱グリコシル化され得る。）を提供する。
【０１３６】
特に、ある態様において、本開示は、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体（この抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン領域を有する。）に関する。
【０１３７】
別の態様において、本開示は、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体（この抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメイン領域を有する。）に関する。
【０１３８】
別の態様において、本開示は、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体（この抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン領域及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメイン領域を有する。）に関する。
【０１３９】
さらに別の態様において、本開示は、２００７年７月１２日に寄託された、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３に関する。さらに別の態様において、本開示は、２００７年７月１２日に寄託された、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３により産生される抗体に関する。マウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを有する。
【０１４０】
またさらに別の態様において、本発明は、マウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−２６７５に関する。マウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−２６７５は、マウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３のサブクローンである。マウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−２６７５は、ハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３により産生される抗体と同一である抗体を産生する。マウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−２６７５は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを有する。
【０１４１】
さらに別の態様において、本開示は、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体（この抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン領域を有する。）に関する。
【０１４２】
さらに別の態様において、本開示は、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体（この抗体は、配列番号４３ののアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメイン領域を有する。）に関する。
【０１４３】
別の態様において、本開示は、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体（この抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン領域及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメイン領域を有する。）に関する。
【０１４４】
さらに別の態様において、本開示は、２００７年７月１２日に寄託された、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３９を有するマウスハイブリドーマ細胞株２−８２６−３３５に関する。さらに別の態様において、本開示は、２００７年７月１２日に寄託された、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３９を有するマウスハイブリドーマ細胞株２−８２６−３３５により産生される抗体に関する。マウスハイブリドーマ細胞株２−８２６−３３５は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを有する。
【０１４５】
Ｄ．ＰｌＧＦ−１抗体を作製及び使用する方法
本開示の抗体は、当技術分野で公知の様々な異なる技術を用いて作製され得る。例えば、適切な免疫原を含有する免疫原性調製物で適切な対象（以下に限定されないが、ウサギ、ヤギ、マウス又はその他の哺乳動物など）に免疫付与することによって、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に対するポリクローナル及びモノクローナル抗体を生成させることができる。免疫付与のために使用することができる免疫原は、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片を発現することが知られている不死化細胞株ＮＳＯ由来の細胞などの細胞を含み得る。
【０１４６】
あるいは、この免疫原は、精製もしくは単離ヒトＰｌＧＦ−１タンパク質それ自身（即ち配列番号１−４の何れか）又はそのヒトＰｌＧＦ−１断片（即ち配列番号５−８の何れか）であり得る。例えば、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降又は当技術分野で周知であるその他の技術を用いてこのタンパク質を産生する細胞（ＮＳＯなど）から単離されたヒトＰｌＧＦ−１（配列番号１−４参照）を免疫原として使用することができる。あるいは、免疫原は、当技術分野で公知の通常技術を用いて化学合成を使用して調製することができる（以下に限定されないが合成装置など）。
【０１４７】
次に、対象において生成された抗体がヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に結合するか否かを判定するために、この抗体をスクリーニングすることができる。本明細書中に記載の方法を用いて、このような抗体をさらにスクリーニングすることができる（例えば実施例１参照）。所望の特徴を有する抗体を同定するための適切な方法は、本明細書中に記載されている（実施例１参照）。さらに、ヒトＰｌＧＦ−１断片（配列番号５−８参照）に結合する抗体を用いて得られる結果が、ヒトＰｌＧＦ−１の結合に完全に置き換え可能であり、その抗体がヒトＰｌＧＦ−１（配列番号１−４参照）の対応する残基に結合するであろうことは十分に予想される。従って、便宜上、及び、抗体の結合特性を評価するためにヒトＰｌＧＦ−１断片を使用しないことに対して特定の例において合理的根拠がない限り、抗体の結合特性を評価するために、ヒトＰｌＧＦ−１断片を使用することができる。
【０１４８】
免疫原の単位用量（即ち、本精製タンパク質、本タンパク質を発現する腫瘍細胞又は組み換え発現されるヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片）及び免疫付与方法は、免疫付与しようとする対象、その免疫状態及び対象の体重に依存する。対象における免疫反応を促進するために、フロイントの完全又は不完全アジュバントなどのアジュバントとともに免疫原を投与することができる。
【０１４９】
上述のような免疫原での対象の免疫付与により、ポリクローナル抗体反応が誘発される。固定化された抗原、即ち、本明細書中に記載のような、ヒトＰｌＧＦ−１（例えば、配列番号１−４）又はそのヒトＰｌＧＦ−１断片（例えば、配列番号５−８）を用いて、ＥＬＩＳＡなどの標準的技術により、免疫付与した対象における抗体力価を長期間にわたり監視することができる。
【０１５０】
ヒトＰｌＧＦ−１（例えば、配列番号１−４）又はそのヒトＰｌＧＦ−１断片（例えば、配列番号５−８）に対する抗体を生成させるその他の方法には、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを用いることが含まれる（例えばＰＣＴ国際出願ＷＯ９１／００９０６、ＷＯ９１／１０７４１又はＷＯ９２／０３９１８参照）。あるいは、ヒト抗体産生細胞又は組織（例えば、ヒト骨髄細胞、末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）、ヒト胎児リンパ節組織又は造血幹細胞）を移植された免疫欠損マウスに抗原を導入することによって、ヒトモノクローナル抗体を作製することができる。このような方法には、ＳＣＩＤ−ｈｕマウス（例えば、ＰＣＴ国際出願ＷＯ９３／０５７９６、米国特許第５，４１１，７４９号；又はＭｃＣｕｎｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：１６３２−１６３９（１９８８）参照）又はＲａｇ−１／Ｒａｇ−２欠損マウスにおける抗体の生成が含まれる。ヒト抗体−免疫不全マウスもまた市販されている。例えば、Ｒａｇ−２欠損マウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ）から入手可能である。
【０１５１】
免疫原で対象に免疫付与することによって、モノクローナル抗体を生成させることができる。免疫付与から適切な時間が経過した後、例えば、抗体力価が十分に高レベルとなった際に、免疫付与した動物から抗体産生細胞を回収し、標準的技術を用いてモノクローナル抗体を調製するために使用することができる。例えば、ハイブリドーマ細胞を得るために、骨髄腫細胞などの不死化細胞を用いて、標準的体細胞融合手順によって、抗体産生細胞を融合させることができる。このような技術は当技術分野で周知であり、これには、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５４９７（１９７５））により元来開発されたようなハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂａｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４：７２（１９８３））及びヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６（１９８５））が含まれる。モノクローナル抗体ハイブリドーマを作製するための技術は当業者にとって周知である。
【０１５２】
抗体産生細胞（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現し、ヒトＰｌＧＦ−１タンパク質で免疫付与されたトランスジェニックマウス由来の脾臓細胞）を回収することによって、モノクローナル抗体を作製することもできる。ヒト骨髄腫との融合を通じて、又はエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）での形質転換を通じて、脾臓細胞を不死化することができる。当技術分野で記載されるヒトＢ細胞又はＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（例えば、Ｂｏｙｌｅら、欧州特許公開第０  ６１４  ９８４号参照）を用いてこれらのハイブリドーマを作製することができる。
【０１５３】
ヒトＰｌＧＦ−１（例えば、配列番号１−４）又はそのヒトＰｌＧＦ−１断片（例えば、配列番号５−８）に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより、例えば、固定化されたヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する抗体を選択するためにスクリーニングすることにより、又は抗体が所望の特性、即ちヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片への結合能を有するか否かを判定するために本明細書中に記載のように抗体を試験することにより、検出される。所望の特異性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、例えば、限界希釈手順（例えばＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ８０：２２５−２３２（１９８１）により記載される手順）により、クローンをサブクローン化し、標準的方法によって増殖させることができる。
【０１５４】
ハイブリドーマ細胞がモノクローナル抗体を培地に分泌し、それにより全抗体の産生を可能にするために十分な条件下及び十分な時間にわたり、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイで試験結果が陽性となるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を栄養培地中で培養することができる。ハイブリドーマ細胞に適切な組織培養技術及び培地は全般的に、当技術分野で記載されている（例えば、Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８０）参照）。次に、抗体を含有する馴化ハイブリドーマ培養上清を回収することができる。サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、場合によっては、例えばプロテインＡクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培地から単離することができる。
【０１５５】
組み換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリを構築し、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片を用いてライブラリをスクリーニングすることによって、モノクローナル抗体を改変することができる。ファージディスプレイライブラリを作製し、スクリーニングするためのキットが市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２７−９４００−０１；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ、カタログ番号２４０６１２参照）。同様に、酵母ディスプレイベクターは当技術分野で公知であり、市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから入手可能なｐＹＤ１）。簡潔に述べると、ヒトＰｌＧＦ−１（例えば配列番号１−４）又はヒトＰｌＧＦ−１断片（配列番号５−８）に特異的に結合する抗体を発現するファージ又は酵母細胞を同定し、単離するために、抗体ライブラリをスクリーニングする。好ましくは、ライブラリの一次スクリーニングは、固定化されたヒトＰｌＧＦ−１又はそのヒトＰｌＧＦ−１断片によるスクリーニングを含む。
【０１５６】
スクリーニング後、ディスプレイファージ又は酵母を単離し、選択された抗体をコードするポリヌクレオチドをディスプレイファージ又は酵母から（例えば、ファージ又は酵母ゲノムから）回収し、周知の組み換えＤＮＡ技術により、その他の発現ベクター（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ（サッカロミセス・セレビシエ）細胞、例えばＥＢＹ１００細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ））へとサブクローニングすることができる。このポリヌクレオチドをさらに操作し（例えば、さらなる定常領域などのさらなる免疫グロブリンドメインをコードする核酸に連結）及び／又は宿主細胞で発現させることができる。
【０１５７】
あるいは、抗体に対するヒト患者による反応を最小化するために、キメラ及びヒト化抗体などの抗体の組み換え形態を調製することもできる。非ヒト対象で産生されるか又は、非ヒト抗体遺伝子の発現由来である抗体がヒトにおいて治療用として使用される場合、これらは、外来物として様々な程度認識され、免疫反応が患者において生じ得る。この免疫反応を最小化するか又は排除するためのあるアプローチは、キメラ抗体誘導体、即ち非ヒト動物可変領域及びヒト定常領域を組み合わせる抗体分子を作製することである。このような抗体は、元のモノクローナル抗体のエピトープ結合特異性を保持するが、ヒトに投与される場合、免疫原性が低くなり得、従って、患者にとって忍容性となる可能性がより高い。
【０１５８】
当技術分野で公知の組み換えＤＮＡ技術によって、キメラモノクローナル抗体を作製することができる。例えば、ヒト定常領域をコードする遺伝子で非ヒト抗体分子の定常領域をコードする遺伝子を置換する（例えば、ＰＣＴ特許公開ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９、欧州特許出願第１８４，１８７号又は欧州特許出願第１７１，４９６号参照）。
【０１５９】
キメラ抗体は、抗原結合に関与しない可変領域の一部を、ヒト可変領域由来の同等部分で置き換えることにより、さらにヒト化され得る。「ヒト化」キメラ抗体の一般的な総説は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓ．Ｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：１２０２−１２０７（１９８５）及びＯｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４−２１４（１９８６）で見出すことができる。このような方法には、重鎖又は軽鎖の少なくとも１つからの免疫グロブリン可変領域の全て又は一部をコードする核酸配列を、単離し、操作し、発現させることが含まれる。次に、ヒト化キメラ抗体をコードするｃＤＮＡ又はその断片を適切な発現ベクターにクローニングすることができる。適切な「ヒト化」抗体は、あるいは、相補性決定領域（ＣＤＲ）置換により生成させることができる（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５５２−５２５（１９８６）；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１．５３４（１９８８）；及びＢｅｉｄｌｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４１：４０５３−４０６０（１９８８）参照）。
【０１６０】
ヒトＰｌＧＦ−１（例えば配列番号１−４）又はヒトＰｌＧＦ−１断片（例えば配列番号５−８）に特異的な抗体（例えばハムスター抗体）の結合特異性を保持する「ヒト」抗体ポリペプチド二量体を作製するために、エピトープインプリンティングを使用することもできる。簡潔に述べると、抗原に対する特異的結合がある非ヒト可変領域（ＶＨ）及びヒト定常領域（ＣＨ１）をコードする遺伝子をＥ．コリで発現させ、ヒトＶλ．Ｃλ遺伝子のファージライブラリに感染させる。次に、ヒトＰｌＧＦ−１タンパク質への結合に対して、抗体断片を提示するファージをスクリーニングする。Ｖλ．Ｃλ．鎖の発現のために、選択されたヒトＶλ遺伝子を再クローニングし、これらの鎖を有するＥ．コリにヒトＶＨＣＨ１遺伝子のファージライブラリを感染させ、抗原被覆チューブを用いた一連のスクリーニングにこのライブラリを供する（ＷＯ９３／０６２１３参照）。
【０１６１】
別の態様において、本開示は、抗体が抗体断片であることを企図する。例えば、この抗体断片には、以下に限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、ジスルフィド結合Ｆｖ、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）及びＦ（ａｂ’）２断片が含まれ得る。抗体断片の作製のために、様々な技術が当業者にとって公知である。例えば、このような断片は、無傷の抗体のタンパク質分解性消化を介して得られ得るか（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４：１０７−１１７（１９９２）及びＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１（１９８５）参照）又は組み換え宿主細胞により直接産生され得る。例えば、Ｅ．コリからＦａｂ’−ＳＨ断片を直接回収し、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成させるために化学的にカップリングすることができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６３−１６７（１９９２）参照）。別の実施形態において、Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆ（ａｂ’）２分子の集合を促進するために、ロイシンジッパーＧＣＮ４を用いて形成される。あるいは、組み換え宿主細胞培養物からＦｖ、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片を直接単離することができる。短い連結ペプチド又は配列を用いることによって、軽及び／又は重鎖可変領域を連結することにより、１本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）が作製される（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３−４２６（１９９８）参照）。連結配列の例は、ＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ（配列番号１９）である。
【０１６２】
組み換え又は合成の何れかにより１本鎖変異体を作製することができる。合成によるｓｃＦｖの作製の場合、自動合成装置を使用することができる。ｓｃＦｖの組み換え産生の場合、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する適切なプラスミドを適切な宿主細胞、真核（酵母、植物、昆虫又は哺乳動物細胞など）又は原核細胞（Ｅ．コリなど）の何れかに導入することができる。ポリヌクレオチドの結合（ライゲーション）などの通常の操作によって、関心のあるｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを作製することができる。当技術分野で公知の標準的タンパク質精製技術を用いて、得られたｓｃＦｖを単離することができる。さらに、ダイアボディなどの１本鎖抗体のその他の形態も本開示により企図される。ダイアボディは、ＶＨ及びＶＬドメインが１つのポリペプチド鎖で発現される２価の２特異性抗体であるが、短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成することができないリンカーを用いており、それによりドメインは別の鎖の相補的ドメインと対形成させられ、２つの抗原結合部位が生じる。（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ、Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４−６４４８（１９９３）；Ｐｏｌｊａｋ、Ｒ．Ｊ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２：１１２１−１１２３（１９９４）参照）。
【０１６３】
さらに、本明細書中に記載のような本発明のいくつかの態様において（例えば対照としての使用）、市販の抗ＰｌＧＦ−１抗体又は文献に記載の抗ＰｌＧＦ−１抗体又はそれらの作製のための方法を使用することが可能であり得る。これらには、以下に限定されないが、（１）モノクローナル抗体２６４（「ＭＡＢ２６４」とも呼ばれる。）（これは、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ（カタログ番号ＭＡＢ２６４）から市販されているクローン３７２０３からの非結合の（ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）マウス抗ヒトＰｌＧＦ−１モノクローナル抗体である。）；（２）ポリクローナル抗体ｐＢ２６４（本明細書中で交換可能に使用されるように、「ｐＢ２６４」「ＡＦ−２６４−ＰＢ」、「ＰＡＢ２６４」又はＡＢ−２６４−ＰＢとも呼ばれる。）（これは、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ（カタログ番号ＡＦ−２６４−ＰＢ）から入手可能である非結合の（ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ヤギ抗ヒトＰｌＧＦ−１ポリクローナル抗体である。）；及び／又は（３）ラットモノクローナル抗体０４（ラット抗ヒトＰｌＧＦクローン番号３５８９３２としても知られ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａからの事前配布試薬として得られた。）が含まれる。
【０１６４】
本開示の抗体は、様々な用途がある。ある態様において、本開示の抗体は、１以上の免疫診断試薬として使用することができる。例えば、本開示の抗体は、試験試料中のヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の存在を検出するための１以上の方法において１以上の免疫診断試薬として使用することができる。より具体的には、試験試料中のヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の存在を検出するための免疫アッセイにおいて、１以上の捕捉抗体、１以上の連結体抗体又は１以上の捕捉抗体及び１以上の連結体抗体の両方として、本開示の抗体を使用することができる。
【０１６５】
Ｅ．試料回収及び調製
例えば、本発明に従う抗体が、免疫診断試薬として及び／又はＰＬＧＦ−１免疫アッセイキットにおいて使用される場合、尿、血液、血清及び血漿ならびにその他の体液を回収、操作及び処理するための当技術分野で周知の方法が、本開示の実施において使用される。
【０１６６】
試験試料は、関心のあるＰｌＧＦ−１検体に加えて、抗体、抗原、ハプテン、ホルモン、薬物、酵素、受容体、タンパク質ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドなど、さらなる部分が含まれ得る。例えば、この試料は、対象から得られた全血試料であり得る。試験試料、特に全血は、本明細書中に記載のような免疫アッセイ前に、例えば前処理試薬で処理することが必要であり得るか又は所望され得る。前処理が必要ではない場合（例えば殆どの尿試料）でも、前処理は、場合によっては、単なる便宜のために行われ得る（例えば、市販プラットフォームにおける方法の一部として）。前処理試薬は、不均一系試薬又は均一系試薬であり得る。
【０１６７】
本発明による１以上の不均一系前処理試薬の使用により、前処理試薬は、試料中に存在する検体結合タンパク質（例えばヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に結合可能なタンパク質）を沈殿させる。このような前処理段階は、試料への前処理試薬の添加により形成される混合物の上清を、沈殿した検体結合タンパク質から分離することによって、検体結合タンパク質を全て除去することを含む。このようなアッセイにおいて、結合タンパク質が存在しない混合物の上清は、アッセイにおいて、抗体捕捉段階に直接進み、使用される。
【０１６８】
均一系前処理試薬の使用ではこのような分離段階はない。抗体捕捉段階において、試験試料の混合物全体及び前処理試薬を捕捉抗体と接触させる。このようなアッセイのために使用される前処理試薬は、通常、抗体捕捉段階の前又は抗体捕捉段階での抗体との接触中に、前処理済み試験試料混合物中で希釈される。このような希釈にもかかわらず、抗体捕捉中、試験試料混合物中には、前処理試薬（例えば、５Ｍメタノール及び／又は０．６Ｍエチレングリコール）のある一定量が依然として存在（又は残存）する。
【０１６９】
前処理試薬は、本発明の免疫アッセイ及びキットとの使用に適切な何らかの試薬であり得る。前処理試薬は、場合によっては、（ａ）１以上の溶媒（例えばメタノール及びエチレングリコール）及び塩、（ｂ）１以上の溶媒、塩及び界面活性剤、（ｃ）界面活性剤又は（ｄ）界面活性剤及び塩を含む。前処理試薬は、当技術分野で公知であり、このような前処理は、文献に記載のような（例えば、Ｙａｔｓｃｏｆｆら、Ａｂｂｏｔｔ  ＴＤｘ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｓｓａｙ  Ｅｖａｌｕａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  ｉｎ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｌｏｏｄ、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、３６：１９６９−１９７３（１９９０）及びＷａｌｌｅｍａｃｑら、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  ＡｘＳＹＭ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａｓｓａｙ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ＴＤｘ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ＥＭＩＴ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａｓｓａｙｓ、ＣＨｎ．Ｃｈｅｍ．４５：４３２−４３５（１９９９）参照）及び／又は市販されているような、例えば、ＡｂｂｏｔｔＴＤｘ、ＡｘＳＹＭ（Ｒ）及びＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）分析装置（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）でのアッセイのために用いられるように、使用することができる。さらに、Ａｂｂｏｔｔの米国特許第５，１３５，８７５号、欧州特許公開第０  ４７１  ２９３号、米国特許出願第６０／８７８，０１７号（２００６年１２月２９日出願）；及び米国特許出願第ＵＳ２００８−００２０４０１号（前処理に関するその教示に対してその全体において参照により組み込まれる。）に記載のように前処理を行うことができる。
【０１７０】
Ｆ．ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片免疫アッセイ
本開示は、免疫アッセイにも関する。具体的には、ある態様において、本開示は、本明細書中、セクションＢに記載のヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片を用いる、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の検出のための、改善された免疫アッセイに関する。別の態様において、本開示は、本明細書中、セクションＣに記載の抗体を用いる免疫アッセイに関する。
【０１７１】
本開示の免疫アッセイは、以下に限定されないがサンドイッチ方式など、当技術分野で公知の何らかの方式を用いて行うことができる。例えば、試験試料中のヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片を分離し、定量するために、少なくとも２種類の抗体が使用され得る。具体的には、少なくとも２種類の抗体は、「サンドイッチ」と呼ばれる免疫複合体を形成するヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片のある一定のエピトープに結合する。一般に、この免疫アッセイにおいて、試験試料中のヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片を捕捉するために、１以上の抗体（これらの抗体は「捕捉」抗体と呼ばれることが多い。）が使用され得、検出可能な（即ち定量可能な）標識をサンドイッチに結合させるために１以上の抗体が使用され得る（これらの抗体は、「検出抗体」又は「連結体」）」と呼ばれることが多い。）。本開示の免疫アッセイは、心血管疾患、鎌状赤血球病、慢性閉塞性肺疾患、加齢黄斑変性症、末梢血管閉塞性疾患、炎症、子癇前症、乾癬、クローン病、子宮内膜症、関節リウマチ又はそれらの何らかの組み合わせに対象が罹患しているか否かを評価するために行うことができる。
【０１７２】
上記で簡潔に述べたことにおいて、ある態様において、本開示は、本明細書中セクションＢに記載のヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片を使用する、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の検出のための免疫アッセイの改善に関する。本明細書中に記載のようなこの特定の方法は、捕捉及び／又は検出のための何らかの抗体を用いて、あらゆるヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片免疫アッセイで使用することができる。ある実施形態において、従って、本開示は、試験試料中のヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の存在を検出するための方法の改善を提供し、この方法は、
（ａ）ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／抗体複合体の形成を可能にする時間及び条件下で、ヒトＰＬＧＦ−１又はヒトＰＬＧＦ−１断片が疑われる試験試料を前記ヒトＰＬＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的な少なくとも１つの抗体と接触させることと、
（ｂ）前記ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の存在を示すときに形成されるヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／抗体複合体を検出することと、を含み、
この方法の改善は、検量物質又は対照として、本明細書中セクションＢに記載のようなヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片（例えば、場合によっては、グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１、グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片、脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又は脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片であり得る。）である検量物質又は対照を使用することを含む。
【０１７３】
一般的に言って、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片（例えば含有する疑い）について試験されている試験試料を、少なくとも１つの捕捉抗体及び（第二の検出抗体又は第三の検出抗体の何れかである）少なくとも１つの検出抗体と、同時に、又は連続してあらゆる順番で、接触させることができる。例えば、試験試料を、最初に少なくとも１つの捕捉抗体と接触させ、次いで（連続して）少なくとも１つの検出抗体と接触させ得る。あるいは、試験試料を、最初に少なくとも１つの検出抗体と接触させ、次いで（連続して）少なくとも１つの捕捉抗体と接触させ得る。さらに別の代替法において、捕捉抗体及び検出抗体を同時に試験試料と接触させ得る。
【０１７４】
サンドイッチアッセイ方式において、第一の抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片複合体の形成を可能にする条件下で、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片を含有する疑いのある試験試料を、最初に、少なくとも１つの第一の捕捉抗体と接触させる。複数の捕捉抗体が使用される場合、第一の多重捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片複合体が形成される。サンドイッチアッセイにおいて、抗体、好ましくは、少なくとも１つの捕捉抗体は、試験試料中で予想されるヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の最大量のモル過剰量で使用される。例えば、緩衝液（例えば微小粒子コーティング緩衝液）１ｍＬあたり抗体約５μｇ／ｍＬから約１ｍｇ／ｍＬを使用することができる。
【０１７５】
場合によっては、少なくとも１つの捕捉抗体（例えば第一の捕捉抗体）と試験試料を接触させる前に、試験試料からの第一の抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片複合体の分離を促進する固体支持体に、少なくとも１つの捕捉抗体を結合させ得る。以下に限定されないが、ウェル、チューブ又はビーズの形態のポリマー材料製の固体支持体を含む、当技術分野で公知の何らかの固体支持体を使用することができる。吸着によって、化学カップリング剤を用いた共有結合によって又は当技術分野で公知のその他の手段によって、固体支持体に抗体を結合させることができる（ただし、このような結合は、抗体の、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片への結合能を妨害しない。）。あるいは、ストレプトアビジン又はビオチンで既に被覆された微小粒子と、抗体を結合させることができる（例えば、Ｓｅｒａｄｙｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａから入手可能な、Ｐｏｗｅｒ−ＢｉｎｄＴＭＳＡ−ＭＰストレプトアビジン被覆微小粒子を用いて）。あるいは、抗種特異的モノクローナル抗体で既に被覆されている微小粒子を用いて、抗体を結合させ得る。さらに、必要に応じて、抗体上での様々な官能基との反応を可能にするために、固体支持体を誘導体化することができる。このような誘導体化は、以下に限定されないが、無水マレイン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどのある種のカップリング剤の使用を必要とする。
【０１７６】
ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片を含有することについて試験される及び／又は含有する疑いがある試験試料を、少なくとも１つの捕捉抗体（例えば第一の捕捉抗体）と接触させた後、第一の抗体（又は多重抗体）−ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片複合体の形成を可能にするために、混合物を温置する。約４．５から約１０．０のｐＨで、約２℃から約４５℃の温度で、少なくとも１分間から約１８時間、好ましくは約１分間から２０分間、最も好ましくは約１８分間、温置することができる。１つの段階で（試験試料と、少なくとも１つの捕捉抗体と、少なくとも１つの検出抗体と、を全て連続的に又は同時に反応容器に添加することを意味する。）又は複数の段階（２段階、３段階など）で、本明細書中に記載の免疫アッセイを行うことができる。
【０１７７】
（第一又は多重）捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰＬＧＦ−１断片複合体の形成後、次に、（（第一又は多重）捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰＬＧＦ−１断片／第二の抗体検出複合体の形成を可能にする条件下で）この複合体を少なくとも１つの検出抗体と接触させる。少なくとも１つの検出抗体は、第二、第三、第四などの、免疫アッセイで使用される抗体であり得る。捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片複合体が複数の検出抗体と接触させられる場合、（第一又は多重）捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／（多重）検出抗体複合体が形成される。捕捉抗体（例えば第一の捕捉抗体）と同様に、少なくとも第二の（及び続く）検出抗体が捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片複合体と接触させられる場合、（第一又は多重）捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／（第二又は多重）検出抗体複合体の形成のために、上述の条件と同様の条件下での温置時間が必要とされる。好ましくは、少なくとも１つの検出抗体は検出可能な標識を含有する。（第一又は多重）捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／（第二又は多重）検出抗体複合体の形成前、それと同時又はその後に、少なくとも１つの検出抗体（例えば第二の検出抗体）に、検出可能な標識を結合させることができる。当技術分野で公知の何らかの検出可能な標識を使用することができる。例えば、検出可能な標識は、放射性標識、例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐなど、酵素標識、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼなど、化学発光標識、例えばアクリジニウムエステル（例えば、アクリジウムエステル、アクリジニウムＳＰＳＰ（Ｎ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−スルホプロピルなど）、ルミノール、イソルミノール、チオエステル、スルホンアミド、フェナントリジニウムエステルなど、蛍光標識、例えばフルオレセイン（５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロ−フルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートなど）、ローダミン、フィコビリタンパク質、Ｒ−フィコエリスリン、量子ドット（硫化亜鉛被覆セレン化カドミウム）、温度標識又は免疫ポリメラーゼ連鎖反応標識などであり得る。標識への導入、標識手順及び標識の検出は、Ｐｏｌａｋ及びＶａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９９７）及びＨａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９６）（これは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎにより刊行されているカタログ兼用ハンドブックである。）で見出される。
【０１７８】
直接又はカップリング剤を通じて、検出可能な標識を抗体に結合させることができる。使用することができるカップリング剤の例は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販されているＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、塩酸塩）である。使用することができるその他のカップリング剤は当技術分野で公知である。検出可能な標識を抗体に結合させるための方法は当技術分野で公知である。さらに、Ｎ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキサミド（あるいはＣＰＳＰ−アクリジニウムエステルとして知られる。）又はＮ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキサミド（あるいはＳＰＳＰ−アクリジニウムエステルとして知られる。）など、検出可能な標識の抗体へのカップリングを促進する末端基を既に含有する、多くの検出可能な標識を購入するか又は合成することができる。
【０１７９】
（第一又は多重）捕捉抗体／ヒトヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／（第二又は多重）検出抗体複合体は、標識の定量前に、試験試料の残りから分離することができる（しかし、分離しなければいけない訳ではない。）。例えば、少なくとも１つの捕捉抗体（例えば第一の捕捉抗体）は、以下に限定されないが、ウェル又はビーズなどの固体支持体に結合される場合、固体支持体と接触しないように（試験試料の）液体を除去することによって分離を行うことができる。あるいは、少なくとも第一の捕捉抗体が固体支持体に結合される場合、第一の（多重）抗体／ヒトヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／第二の（多重）抗体複合体を形成させるために、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片−含有試料及び少なくとも１つの第二の検出抗体にこれを同時に接触させ、次いで液体（試験試料）を固体支持体に接触しないように除去することができる。少なくとも１つの第一の捕捉抗体が固体支持体に結合されない場合、標識量の定量のために、（第一又は多重）捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／（第二又は多重）検出抗体複合体を試験試料から除去する必要はない。
【０１８０】
標識された捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／検出抗体複合体（例えば第一の捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／第二の検出抗体複合体）の形成後、当技術分野で公知の技術を用いて、複合体中の標識量を定量する。例えば、酵素標識が使用される場合、発色など、定量可能な反応をもたらす標識に対する基質と標識複合体を反応させる。標識が放射性標識である場合、シンチレーションカウンターを用いて標識を定量する。標識が蛍光標識である場合、ある色の光（「励起波長」として知られる。）で標識を刺激し、刺激に反応して標識により放射される別の色（「発光波長」として知られる。）を検出することにより、標識を定量する。標識が化学発光標識である場合、目視で、又は、照度計、Ｘ線フィルム、高速度撮影フィルム、ＣＣＤカメラなどを用いることによるかの何れかで、放射される光を検出し、標識を定量する。複合体中の標識の量を定量したら、既知の濃度のヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰＬＧＦ−１断片の連続希釈物を用いて作成された標準曲線を使用することにより試験試料中のヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰＬＧＦ−１断片の濃度を決定する。ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰＬＧＦ−１断片の連続希釈物を使用すること以外に、重量測定法で、質量分析により及び当技術分野で公知のその他の技術により、標準曲線を作成することができる。
【０１８１】
別の態様において、例えば、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片を含有する疑いのある試験試料中でのヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の存在を検出するための方法において、免疫診断試薬として、本明細書中セクションＣに記載の抗体を使用することができる。この方法は、
（ａ）ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／抗体複合体の形成を可能にする時間及び条件下で、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片を含有する疑いのある試料を本明細書中に記載のような免疫診断試薬と接触させ；
（ｂ）抗原、即ち、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の存在を示す場合に形成されるヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／抗体複合体を検出する、
工程を含む。
【０１８２】
一実施形態において、本免疫診断試薬は、次のものからなる群から選択される１以上の抗体を含む。
【０１８３】
（ａ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン領域を有する、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体；
（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメイン領域を有する、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体；
（ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン領域及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメイン領域を有する、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体；
（ｄ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３により産生される抗体；
（ｅ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン領域を有する、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体；
（ｆ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメイン領域を有する、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体；
（ｇ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン領域及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメイン領域を有する、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体；及び
（ｈ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３９を有するマウスハイブリドーマ細胞株２−８２６−３３５により産生される抗体。
【０１８４】
捕捉抗体、検出抗体として又は捕捉及び検出抗体として、本開示の抗体（例えば、即ちセクションＣに記載のもののような）を使用して、優れた免疫アッセイ、特にサンドイッチアッセイを行うことができる。例えば、捕捉抗体の少なくとも１つ、検出抗体の少なくとも１つ又は捕捉抗体もしくは検出抗体の両方が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３又はＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３９を有するマウスハイブリドーマ細胞株２−８２６−３３５により産生される抗体であり得る。
【０１８５】
またさらなる態様において、ヒトＰｌＧＦ−１アッセイは、遊離ヒトＰｌＧＦ−１にのみ結合し、ｓＦｌｔ−１に結合したヒトＰｌＧＦ−１を排除する捕捉抗体を利用するモノクローナル抗体サンドイッチを使用する。捕捉された遊離ヒトＰｌＧＦ−１の量は、アクリジニウム付加抗ヒトＰｌＧＦ−１モノクローナル抗体で検出する。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３９を有し、２００７年７月１２日に寄託されたマウスハイブリドーマ細胞株２−８２６−３３５により産生されるモノクローナル抗体は、遊離ヒトＰＬＧＦ−１にのみ結合し、ｓＦｌｔ−１に結合したヒトＰｌＧＦ−１を排除する捕捉抗体として使用することができる。場合によっては、使用することができる検出抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３により産生される抗体である。
【０１８６】
ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片（例えば含有する疑い）について試験されている試験試料を、少なくとも１つの捕捉抗体及び（第二の検出抗体又は第三の検出抗体の何れかである）少なくとも１つの検出抗体と、同時に、又は連続してあらゆる順番で、接触させることができる。例えば、試験試料は、少なくとも１つの捕捉抗体と最初に接触させ、次いで（連続して）少なくとも１つの検出抗体と接触させ得る。あるいは、試験試料を、最初に少なくとも１つの検出抗体と接触させ、次いで（連続して）少なくとも１つの捕捉抗体と接触させ得る。さらに別の代替法において、試験試料を、捕捉抗体及び検出抗体と同時に接触させ得る。
【０１８７】
サンドイッチアッセイ方式において、第一の抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片複合体の形成を可能にする条件下で、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片を含有する疑いのある試験試料を、少なくとも１つの第一の捕捉抗体と最初に接触させる。複数の捕捉抗体が使用される場合、第一の多重捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片複合体が形成される。サンドイッチアッセイにおいて、抗体、好ましくは少なくとも１つの捕捉抗体は、試験試料中で予想されるヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の最大量のモル過剰量で使用される。例えば、緩衝液（例えば微小粒子コーティング緩衝液）１ｍＬあたり抗体約５μｇ／ｍＬから約１ｍｇ／ｍＬを使用することができる。捕捉抗体として使用することができるその他の抗体の例には、以下に限定されないが、（１）モノクローナル抗体２６４；（２）ポリクローナル抗体ｐＢ２６４；及び／又は（３）ラットモノクローナル抗体０４が含まれる。
【０１８８】
場合によっては、少なくとも１つの捕捉抗体（例えば第一の捕捉抗体）と試験試料を接触させる前に、試験試料からの第一の抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片複合体の分離を促進する固体支持体に、少なくとも１つの捕捉抗体を結合させ得る。以下に限定されないが、ウェル、チューブ又はビーズの形態のポリマー材料製の固体支持体を含む、当技術分野で公知の何らかの固体支持体を使用することができる。吸着によるか、化学カップリング剤を用いた共有結合によるか、又は当技術分野で公知のその他の手段によって、固体支持体に抗体を結合させることができる（ただし、このような結合は、抗体の、ヒトＰＬＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片への結合能を妨害しない。）。あるいは、ストレプトアビジン又はビオチンで既に被覆した微小粒子と、抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ又はａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を結合させることができる（例えば、Ｓｅｒａｄｙｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａから入手可能な、Ｐｏｗｅｒ−ＢｉｎｄＴＭＳＡ−ＭＰストレプトアビジン被覆微小粒子を用いて）。あるいは、抗種特異的モノクローナル抗体で既に被覆されている微小粒子と、抗体を結合させることができる。さらに、必要に応じて、抗体上での様々な官能基との反応を可能にするために、固体支持体を誘導体化することができる。このような誘導体化は、以下に限定されないが、無水マレイン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどのある種のカップリング剤の使用を必要とする。
【０１８９】
ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片を含有することについて試験される、及び／又は含有する疑いがある試験試料を少なくとも１つの捕捉抗体（例えば第一の捕捉抗体）と接触させた後、第一の抗体（又は多重抗体）−ヒトＰＬＧＦ−１又はヒトＰＬＧＦ−１断片複合体の形成を可能にするために、混合物を温置する。約４．５から約１０．０のｐＨで、約２℃から約４５℃の温度にて、少なくとも１分間から約１８時間、好ましくは約１分間から２０分間、最も好ましくは約１８分間、温置することができる。１つの段階で（試験試料と、少なくとも１つの捕捉抗体と、少なくとも１つの検出抗体と、を全て連続的に又は同時に反応容器に添加することを意味する。）又は複数の段階（２段階、３段階など）で、本明細書中に記載の免疫アッセイを行うことができる。
【０１９０】
（第一又は多重）捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片複合体の形成後、次に、（（第一又は多重）捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／第二の抗体検出複合体の形成を可能にする条件下で）この複合体を少なくとも１つの検出抗体と接触させる。少なくとも１つの検出抗体は、第二、第三、第四など、免疫アッセイで使用される抗体であり得る。捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片複合体を複数の検出抗体と接触させる場合、（第一又は多重）捕捉抗体／ヒトＰＬＧＦ−１又はヒトＰＬＧＦ−１断片／（多重）検出抗体複合体が形成される。検出抗体として使用することができるその他の抗体の例には、以下に限定されないが、（１）モノクローナル抗体２６４；（２）ポリクローナル抗体ｐＢ２６４；及び／又は（２）ラットモノクローナル抗体０４が含まれる。
【０１９１】
捕捉抗体（例えば第一の捕捉抗体）と同様に、少なくとも第二の（及び続く）検出抗体を捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片複合体と接触させる場合、（第一又は多重）捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／（第二又は多重）検出抗体複合体の形成のために、上述の条件と同様の条件下での温置時間が必要とされる。好ましくは、少なくとも１つの検出抗体は検出可能な標識を含有する。（第一又は多重）捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／（第二又は多重）検出抗体複合体の形成前に、それと同時に又はその後に、少なくとも１つの検出抗体（例えば第二の検出抗体）に、検出可能な標識を結合させることができる。当技術分野で公知の何らかの検出可能な標識を使用することができる。例えば、検出可能な標識は、放射性標識、例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐなど、酵素標識、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼなど、化学発光標識、例えばアクリジニウムエステル、ルミノール、イソルミノール、チオエステル、スルホンアミド、フェナントリジニウムエステルなど、蛍光標識、例えばフルオレセイン（５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロ−フルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートなど）、ローダミン、フィコビリタンパク質、Ｒ−フィコエリスリン、量子ドット（硫化亜鉛被覆セレン化カドミウム）、温度標識又は免疫ポリメラーゼ連鎖反応標識などであり得る。標識への導入、標識手順及び標識の検出は、Ｐｏｌａｋ及びＶａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９９７）及びＨａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９６）（これは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎにより刊行されているカタログ兼用ハンドブックである。）で見出される。
【０１９２】
直接又はカップリング剤を通じて、検出可能な標識を抗体に結合させることができる。使用することができるカップリング剤の例は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販されているＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、塩酸塩）である。使用することができるその他のカップリング剤は当技術分野で公知である。検出可能な標識を抗体に結合させるための方法は当技術分野で公知である。さらに、Ｎ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキサミド（あるいはＣＰＳＰ−アクリジニウムエステルとして知られる。）又はＮ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキサミド（あるいはＳＰＳＰ−アクリジニウムエステルとして知られる。）など、抗体への検出可能な標識のカップリングを促進する末端基を既に含有する、多くの検出可能な標識を購入するか又は合成することができる。
【０１９３】
（第一又は多重）捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／（第二又は多重）検出抗体複合体は、標識の定量前に、試験試料の残りから分離することができる（しかし、分離しなければいけない訳ではない。）。例えば、少なくとも１つの捕捉抗体（例えば第一の捕捉抗体）は、ウェル又はビーズなどの固体支持体に結合される場合、固体支持体と接触しないように（試験試料の）液体を除去することによって分離を行うことができる。あるいは、少なくとも第一の捕捉抗体が固体支持体に結合される場合、第一の（多重）抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／第二の（多重）抗体複合体を形成させるために、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片含有試料及び少なくとも１つの第二の検出抗体とこれを同時に接触させ、次いで液体（試験試料）を固体支持体に接触しないように除去することができる。少なくとも１つの第一の捕捉抗体が固体支持体に結合されない場合、標識量の定量のために（第一又は多重）捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／（第二又は多重）検出抗体複合体を試験試料から除去する必要はない。
【０１９４】
標識された捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／検出抗体複合体（例えば第一の捕捉抗体／ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片／第二の検出抗体複合体）の形成後、当技術分野で公知の技術を用いて、複合体における標識量を定量する。例えば、酵素標識が使用される場合、発色など、定量可能な反応をもたらす標識に対する基質と、標識された複合体を反応させる。標識が放射性標識である場合、シンチレーションカウンターを用いて標識を定量する。標識が蛍光標識である場合、ある色の光（「励起波長」として知られる。）で標識を刺激し、刺激に反応して標識により放射される別の色（「発光波長」として知られる。）を検出することにより、標識を定量する。標識が化学発光標識である場合、視覚的に、又は、照度計、Ｘ線フィルム、高速度撮影フィルム、ＣＣＤカメラなどを用いることにより、放射される光を検出し、標識を定量する。複合体における標識量を定量したら、既知の濃度のヒトヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の連続希釈物を用いて作成された標準曲線を使用することにより、試験試料中のヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の濃度を決定する。ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰＬＧＦ−１断片の連続希釈物を使用すること以外に、重量測定法で、質量分析により及び当技術分野で公知のその他の技術により、標準曲線を作成することができる。
【０１９５】
ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片の量を測定するために試験されている試験試料を、少なくとも１つの捕捉抗体及び（第二の検出抗体又は第三の検出抗体の何れかである）少なくとも１つの検出抗体と、同時に、又は連続してあらゆる順番で、接触させることができる。例えば、試験試料を、少なくとも１つの捕捉抗体と最初に接触させ、次いで（連続して）少なくとも１つの検出抗体と接触させ得る。あるいは、試験試料を、最初に少なくとも１つの検出抗体と接触させ、次いで（連続して）少なくとも１つの捕捉抗体と接触させ得る。さらに別の代替法において、捕捉抗体及び検出抗体を同時に試験試料と接触させ得る。
【０１９６】
言うまでもないが、本明細書中に記載のような方法及びキットは、必ず、免疫アッセイを遂行するためのその他の試薬及び方法を包含する。例えば、当技術分野で公知のもの及び／又は、連結体希釈剤として及び／又は検量物質希釈剤として、例えば洗浄に対して使用されるために容易に調製され得るか又は最適化され得るものなどの様々な緩衝液が包含される。代表的な連結体希釈剤は、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、その他の塩、タンパク質阻害薬、抗菌剤及び界面活性剤を含有する、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ヒトＰｌＧＦ−１連結体希釈剤（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）である。代表的な検量物質希釈剤は、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ヒトＰｌＧＦ−１検量物質希釈剤（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）であり、これは、ＭＥＳ、その他の塩、タンパク質阻害薬及び抗菌剤を含有する緩衝液を含む。
【０１９７】
さらに、既に述べられているように、本方法及びキットは、場合によっては、自動又は半自動システムでの使用に適応する。非自動化システム（例えばＥＬＩＳＡ）と比較した場合の、自動又は半自動システムとの間の相違の一部には、捕捉抗体が連結される基質（サンドイッチ形成及び検体反応性に影響を与え得る。）及び、捕捉、検出及び／又は何らかの任意の洗浄段階の長さ及びタイミングが含まれる。ＥＬＩＳＡなどの非自動化方式が、試料及び捕捉試薬との比較的長い温置時間（例えば約２時間）を含み得る一方で、自動又は半自動方式（例えばＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ））の温置時間は比較的短いものであり得る（例えばＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）の場合、およそ１８分間）。同様に、ＥＬＩＳＡなどの非自動化方式では、連結体試薬（Ｐｂ２６４）などの検出抗体が比較的長い時間温置され得る一方で（例えば約２時間）、自動又は半自動方式（例えばＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ））の温置時間は比較的短いものであり得る（例えばＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）の場合、およそ４分間）。
【０１９８】
自動又は半自動アッセイ（例えば、本明細書中、実施例に記載のようなＡｂｂｏｔｔ  ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）アッセイ）を定量化し、比較するために（非自動化アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）と比較した場合）、様々なパラメータを使用することができる。しかし、ある態様において、本明細書中に包含されるような自動又は半自動アッセイが遊離ＰｌＧＦを検出することに関して、より感度が高いか又は潜在的により特異的であるという点で、本明細書中に包含されるような自動又は半自動アッセイは、非自動化アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）よりも「優れている」と考えることができる。これは、自動又は半自動アッセイが、ｓＦｌｔ−１に対してより大きい阻害又は感度を示し、従って、遊離ＰｌＧＦを検出する可能性がより高いという事実により裏付けられる。
【０１９９】
Ｇ．ヒトＰｌＧＦ−１免疫アッセイキット
本開示は、試験試料中の、抗原、即ち、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１の存在を検出するための診断キットも企図する。ある態様において、このようなキットは、本明細書中、セクションＣで既に記載の免疫診断試薬（例えば抗体）の１以上を含み得る。より具体的には、本キットが免疫アッセイを行うためのキットである場合、本キットは、場合によっては、本明細書中に記載の免疫診断試薬及び説明書を含み得る。別の態様において、このようなキットは、本明細書中、セクションＢで既に記載のような少なくとも１つの検量物質又は対照を含む。またさらに別の態様において、このようなキットは、本明細書中、セクションＣで既に記載の免疫診断試薬（例えば抗体）の１以上及び、本明細書中、セクションＢで既に記載のような少なくとも１つの検量物質又は対照を含む。さらに、及び場合によっては、これらの各キットは、市販のプラットフォームでの使用に対して最適化され得るか又は様々なその他の方式において（例えば、電気化学的又はその他の携帯用又はポイントオブケアアッセイシステムにおいて）採用され得る。
【０２００】
一態様において、本開示は、本明細書中、セクションＣに記載の抗体の１以上を含む、診断用及び品質管理キットをさらに提供する。例えば、このようなキットは、次のうち少なくとも1つを含有し得る。
【０２０１】
（ａ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン領域を有する、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体；
（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメイン領域を有する、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体；
（ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン領域及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメイン領域を有する、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体；
（ｄ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３６を有するマウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３により産生される抗体；
（ｅ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン領域を有する、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体；
（ｆ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメイン領域を有する、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体；
（ｇ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン領域及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメイン領域を有する、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する単離された抗体；
（ｈ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５３９を有するマウスハイブリドーマ細胞株２−８２６−３３５により産生される抗体；及び
（ｉ）（ａ）−（ｈ）の何れかの組み合わせ。
【０２０２】
場合によっては、これらのキットは、品質管理試薬を含む（例えば、感度パネル、検量物質及び陽性対照）。検量物質又は対照は、本明細書中、セクションＢで既に記載のような少なくとも１つの検量物質又は対照（即ち、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号１、２、３、４、５、６、７又は８の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１、グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片、脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又は脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片）であり得る。品質管理試薬の調製は、当技術分野で周知であり、例えば、様々な免疫診断用製品の挿入シートに記載されている。ＰｌＧＦ−１感度パネルメンバーは、場合によっては、例えば本発明によるＰｌＧＦ−１抗体の既知の量を適切なアッセイ緩衝液（例えばリン酸緩衝液）に添加することによって、例えば「低」から「高」の範囲のＰｌＧＦ−１抗体の既知の量を含有する様々な量で調製され得る。これらの感度パネルメンバーは、場合によっては、アッセイ性能特性を確立するために使用され、さらに、場合によっては、免疫アッセイキット試薬の完全性及びアッセイの標準化の有用な指標となる。
【０２０３】
別の実施形態において、本開示は、アッセイ性能特性を評価するための及び／又はこのアッセイで使用される抗原の完全性を定量及び監視するための、感度パネルとしての使用のための、１つ又はそれ以上の本開示の（例えば、即ち、本明細書中、セクションＣに記載の）抗体を含む、品質管理キットを提供する。
【０２０４】
これらのキットで提供される抗体は、フルオロフォア、放射性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識などの検出可能標識を組み込み得るか又は本キットは、抗体を標識するための試薬、又は抗体（例えば検出抗体）を検出するための及び／又は抗原を標識するための試薬、又は抗原を検出するための試薬を含み得る。この抗体、検量物質及び／又は対照は、個別の容器中で提供され得るか又は適切なアッセイ方式に、例えばマイクロタイタープレートに、予め分配され得る。
【０２０５】
別の態様において、本開示は、本明細書中、セクションＢで既に記載のような少なくとも１つの検量物質又は対照を含有する免疫アッセイを行うためのキットに関する。しかし、好ましくは、本明細書中に記載のような免疫アッセイキットの場合、検量物質又は対照は、ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片、特に、グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又はグリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片、脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又は脱グリコシル化されたヒトＰＬＧＦ−１断片である。
【０２０６】
従って、これらのキットは、少なくとも１つの検量物質又は少なくとも１つの対照又は少なくとも１つの検量物質及び少なくとも１つの対照の組み合わせを含み得、この場合、この検量物質又は対照は、本開示の、グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１、グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片、脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又は脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片を含む。好ましくは、この少なくとも１つの検量物質又は少なくとも１つの対照は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号１、２、３、４、５、６、７又は８の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１、グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片、脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１又は脱グリコシル化されたヒトＰｌＧＦ−１断片である。本キットが免疫アッセイを行うためのキットである場合、本キットは、場合によっては、（１）ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片に特異的に結合する少なくとも１つの捕捉抗体；（２）少なくとも１つの連結体；（３）免疫アッセイを行うための１以上の説明書；又は（４）又は項目（１）−（３）の何らかの組み合わせをさらに含む。項目（１）及び（２）は、本明細書中、セクションＣに記載の抗体の何れかであり得る。このようなキット中で提供される抗体は、何れも、フルオロフォア、放射性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識などの検出可能標識を組み込み得る。あるいは、本キットは、抗体を標識するための試薬、又は抗体（例えば検出抗体）を検出するための及び／又は抗原を標識するための試薬、又は抗原を検出するための試薬を含み得る。
【０２０７】
本明細書中に記載のような方法及びキットはまた、例えば米国特許第５，０８９，４２４号及び同第５，００６，３０９号に記載のような及び例えばＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）により市販されているような、様々な自動及び半自動システム（固相が微小粒子を含むものを含む。）での使用にも適応し得る。Ａｂｂｏｔｔのプラットフォームには、以下に限定されないが、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）、ＡｘＳＹＭ（Ｒ）、ＩＭｘ（Ｒ）（例えば、米国特許第５，２９４，４０４号（これは、その全体において参照により本明細書によって組み込まれる。）参照）、ＰＲＩＳＭ（Ｒ）、ＥＩＡ（ビーズ）及びＱｕａｎｔｕｍＴＭＩＩ機器ならびにその他のプラットフォームが含まれる。さらに、本開示は、場合によっては、サンドイッチ免疫アッセイを行うためのＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの市販のＰｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ポイントオブケア）（ｉ−ＳＴＡＴ（Ｒ）；Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）電気化学的免疫アッセイシステムに適応可能である。
【０２０８】
免疫センサー及び、使い捨て試験装置における、それらの製造及び操作の方法は、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号、米国特許出願第２００３／０１７０８８１号、米国特許出願第２００４／００１８５７７号、米国特許出願第２００５／００５４０７８号及び米国特許出願第２００６／０１６０１６４号（これらは、同上に関するそれらの教示に対して参照によりそれらの全体において組み込まれる。）に記載されている。
【０２０９】
特に、Ｉ−ＳＴＡＴ（Ｒ）システムへの本自己抗体アッセイの適応に関して、次の構成が好ましい。微細加工シリコンチップは、金アンペロメトリー作用電極及び銀−塩化銀参照電極のペアを用いて製造される。作用電極の一方において、捕捉抗体が固定化されたポリスチレンビーズ（０．２ｍｍ直径）を、電極上のパターン化されたポリビニルアルコールのポリマーコーティングに接着させる。このチップは、免疫アッセイに適切な流体光学方式でＩ−ＳＴＡＴ（Ｒ）カートリッジへと組み立てられる。カートリッジの試料保持チャンバーの壁の一部に、アルカリホスファターゼ（又はその他の標識）で標識された第二の検出抗体を含む層がある。カートリッジの流体ポーチ内には、ｐ−アミノフェノールホスフェートを含む水性試薬が入る。
【０２１０】
操作中、ＰｌＧＦ−１を含有する疑いがある試料が試験カートリッジの保持チャンバーに添加され、このカートリッジがＩ−ＳＴＡＴ（Ｒ）リーダーに挿入される。第二の抗体（検出抗体）を試料中へと溶解させた後、カートリッジ内のポンプ成分により、試料が、チップを含有するコンジットに入れられる。ここで、これを振動させて、第一の捕捉抗体と、ＰｌＧＦ−１と、標識された第二の検出抗体との間のサンドイッチの形成を促進する。アッセイの最後から２番目の段階で、液体をポーチからコンジットに流出させ、試料をチップから洗い流して廃液チャンバーに入れる。このアッセイの最終段階で、アルカリホスファターゼ標識が、ｐ−アミノフェノールホスフェートと反応して、リン酸基を切断し、遊離したＰ−アミノフェノールが作用電極において電気化学的に酸化されるようになる。測定される電流に基づき、読み取り装置は、内蔵アルゴリズム及び出荷時に測定された標準曲線により、試料中の検体ＰｌＧＦ−１の量を計算することができる。
【０２１１】
さらに言うまでもないが、本明細書中に記載のような方法及びキットは、必ず、免疫アッセイを行うための、その他の試薬及び方法を包含する。例えば、当技術分野で公知のもの及び／又は連結体希釈剤として及び／又は検量物質希釈剤として、例えば洗浄に対して使用されるために容易に調製され得るか又は最適化され得るものなどの様々な緩衝液が包含される。代表的な連結体希釈剤は、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、その他の塩、タンパク質阻害薬、抗菌剤及び界面活性剤を含有する、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ヒトＰｌＧＦ−１連結体希釈剤（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）である。代表的な検量物質希釈剤は、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ヒトＰｌＧＦ−１検量物質希釈剤（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）であり、これは、ＭＥＳ、その他の塩、タンパク質阻害薬及び抗菌剤を含有する緩衝液含む。
【０２１２】
さらに、既に述べられたように、本方法及びキットは、場合によっては、自動又は半自動システムでの使用に適応する。非自動化システム（例えばＥＬＩＳＡ）と比較した場合の、自動又は半自動システムとの間の相違の一部には、捕捉抗体が連結される基質（サンドイッチ形成及び検体反応性に影響を与え得る。）及び、捕捉、検出及び／又は何らかの任意の洗浄段階の長さ及びタイミングが含まれる。ＥＬＩＳＡなどの非自動化方式が、試料及び捕捉試薬との比較的長い温置時間（例えば約２時間）を含み得る一方で、自動又は半自動方式（例えばＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ））の温置時間は比較的短いものであり得る（例えばＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）の場合、およそ１８分間）。同様に、ＥＬＩＳＡなどの非自動化方式では、連結体試薬（Ｐｂ２６４）などの検出抗体が比較的長い時間温置され得る一方で（例えば約２時間）、自動又は半自動方式（例えばＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ））の温置時間は比較的短いものであり得る（例えばＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）の場合、およそ４分間）。
【０２１３】
例として、限定ではなく、本開示の実施例をここで与える。
【実施例１】
【０２１４】
ヒトＰｌＧＦ−１（１−１３１）野生型抗原
ヒトＰｌＧＦ−１（１−１３１）野生型遺伝子クローニング
ヒトＰｌＧＦ−１プラスミドクローンｐＣＭＶ６−ＸＬ４−ＰＬＧＦ１（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、カタログ番号ＴＣ１１８５１２、ＮＭ＿００２６３２）を鋳型として使用した。ヒト（野生型）ＰｌＧＦ−１遺伝子をクローニングするために、ＰＣＲプライマー対を設計した。５’末端プライマーは、κ軽鎖シグナル配列の部分配列、ＮｒｕＩ制限部位及び６ｘＨｉｓタグを含有し、３’末端プライマーは、ＮｏｔＩ制限部位及びヒトＰｌＧＦ−１のＣ末端の部分配列を含有した。５’及び３’末端プライマーを下記で示す。
【０２１５】
ヒトＰｌＧＦ−１  ５’末端プライマー（ＰＬ０１）
５’−ＣＣＧＧＣＴＣＧＣＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＴ−３’（配列番号２０）；
ヒトＰｌＧＦ−１  ３’−末端プライマー（Ｐｌｒｅｖ）
５’−ＣＣＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＣＡＧＣＡＴＣ−３’（配列番号２１）。
【０２１６】
５’及び３’プライマー及びＰｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の１．２５単位とともに、２ｘ反応緩衝液（ｄＮＴＰ）中でＰＣＲ反応を行った。９４℃で１５秒間、続いて６８℃で１分間  ３０サイクルで、このＰＣＲを行った。全部で３０サイクル行った。シグナルペプチドを含む野生型ヒトＰｌＧＦ−１抗原配列を図１で示す。
【０２１７】
４４０ｂｐのＰＣＲ産物をゲル精製し、ＮｒｕＩ及びＮｏｔＩによる制限酵素切り出しを行い、次いでｐＪＶベクターにクローニングし、Ｅ．コリＤＨ５αに形質転換した。Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）からｐＪＶベクターを得たが、これは、アンピシリン耐性遺伝子、ｐＵＣ複製起点、ＳＶ４０複製起点及びＥＦ−Ｉａプロモーターを含む。得られたｐＪＶに基づくベクターをｐＪＶ−Ｈｉｓ−ＰｌＧＦ−１（１−１３１）と名付けた（図２参照）。
【０２１８】
形質転換されたＥ．コリクローンを３７℃で振盪しながら一晩ＬＢブロス中で増殖させた。ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）により、個々のクローンからプラスミドＤＮＡを精製し、次いで、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて配列決定した。配列決定によりプラスミド  ｐＪＶ−Ｈｉｓ−ＰｌＧＦ−１（１−１３１）−Ｔ１を選択し、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ＡｄｖａｎｃｅＴＭソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により分析した。ｐＪＶクローンを同定したら、ｐＪＶクローンを維持するために、ｐＪＶ−Ｈｉｓ−ＰｌＧＦ−１（１−１３１）プラスミドを含有する個別のＥ．コリＤＨ５α細胞バンクを作製した。
【０２１９】
安定ＣＨＯ細胞株の確立及びヒトＰｌＧＦ−１の発現
下記のように、遺伝子移入及び安定したヒトＰｌＧＦ−１発現のために、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子が欠失したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（Ｂ３．２、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）を使用した。ＣＨＯ細胞を培養し、製造者の説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に従い、標準的リポフェクタミン２０００遺伝子移入により、ｐＪＶ−Ｈｉｓ−ＰｌＧＦ−１（１−１３１）プラスミドで遺伝子移入した。９６ウェルプレート中の、リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを欠き、５％透析済みＦＢＳ（ｄＦＢＳ）を含有するαＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で、ヒトＰｌＧＦ−１を遺伝子移入したＣＨＯ細胞を数週間にわたり選択した。ＣＨＯクローンが５０％密集度を超えて増殖したら、ＣＨＯクローンの性能を順位付けするために、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）により上清を試験した。抗ヒトＰｌＧＦ−１抗体で９６ウェルＥＩＡプレートを室温で少なくとも１時間被覆し、次いで、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液で３０分間、ブロッキング処理した。ＣＨＯ細胞９６ウェルプレートからの上清を被覆ウェルに添加し、室温で少なくとも１時間このプレートを温置した。温置後、このプレートを洗浄し、ビオチン標識ヒトＰｌＧＦ−１抗原とともに約１時間温置した。次に、このプレートを洗浄し、乾燥させ、アビジン−ＨＲＰとともに３０分間温置した。Ｏ−フェニレンジアミン−２ＨＣｌ（ＯＰＤ）を用いてこのプレートを発色させ、４９２ｎｍの光学密度で読み取りを行った。ＥＩＡにおいて最大シグナルを与えた１５個のＣＨＯクローンを増殖させ、再びアッセイした。次に、ＥＩＡ再アッセイで与えられる最大シグナルに基づき８個のクローンを選択し、ヒトＰｌＧＦ−１分泌を促進するためにメトトレキセート（ＭＴＸ）増幅を行った。
【０２２０】
ＣＨＯ細胞クローン＃６３０５のメトトレキセート増幅
遺伝子移入されたＣＨＯ細胞に対して、Ｌ−グルタミン及びＦＢＳを追加し、０．０２μＭ、０．１μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭから２５μＭにメトトレキセート（ＭＴＸ）濃度を漸増させたα−ＭＥＭの一連の培地交換を行った。８％ＣＯ２が供給された加湿培養器中で、３７℃にて、全てのＣＨＯ培養物を温置した。
【０２２１】
Ｃｌｏｎｅｐｉｘ  ＦＬでのコロニー選択のための、ＣＨＯ半固体増殖培地用のクローン培地（Ｃｌｏｎｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｇｅｎｅｔｉｘ  Ｌｔｄ．）に播種することにより、２５μＭ  ＭＴＸ上の形質転換ＣＨＯ細胞をクローン化した。細胞をこの半固体培地に播種し、加湿培養器中で３７℃にておよそ１５日間にわたり増殖させた。増殖コロニーを含有する半固体培地の表面に、Ａｌｅｘａ−４８８標識抗ヒトＰｌＧＦ−１−２５５−１８９を噴霧し、これをさらに２４時間温置した。ＣｌｏｎｅｐｉｘＦＬを用いて、コロニー周囲のＡＦ４８８標識１−２５５−１８９免疫−沈降から生じる蛍光強度により測定した場合にヒトＰｌＧＦ−１抗原の最大量を産生するものとして同定された半固体培地コロニーを、２５μＭ  ＭＴＸ、８ｍＭグルタミン及び５％透析済みＦＢＳが追加されたα−ＭＥＭが１ウェルあたり０．２ｍＬ入った９６ウェル組織培養プレートに移した。加湿培養器中、３７℃で、これらのプレートを１４−１５日間温置した。増殖が明らかとなったときに、マイクロタイターＥＩＡ中で、抗ＰｌＧＦ−１  ２−８２６−３３５及びビオチン標識ヤギ抗ＰｌＧＦ−１ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓからのｐＡｂ２６４）とのサンドイッチ形成能について上清を試験し、結果として、主要なクローンＣＨＯ６３０５を選択した。上述のＥＩＡで抗原分泌を監視しながら、このクローンを８ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び２５μＭ  ＭＴＸ入りのＣＨＯ  ＤＨＦＲ陰性培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に入れた。ＣＨＯサブクローン番号６３０５の細胞バンクを調製し、ＰｌＧＦ−１（１−１３１）組み換え抗原（ｒＡｇ）ＣＨＯ６３０５と名付けた。
【０２２２】
ヒトＰｌＧＦ−１（１−１３１）野生型抗原精製
４０００ｒｐｍでの２０分間の遠心により、ＣＨＯ細胞培養物を回収し、ヒトＰｌＧＦ−１が分泌された上清を回収した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２に緩衝液を交換するために、３回、Ｐｅｌｉｃｏｎ  ２  ｍｉｎｉ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ）を用いてこの上清をダイアフィルトレーション処理した。ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて、ダイアフィルトレーション処理済みヒトＰｌＧＦ−１溶液を精製した。基本的に、ＮＩ−ＮＴＡスーパーフローレジンをＦＰＬＣカラムに組み立て、３体積の蒸留水で洗浄し、洗浄緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０。６Ｎ  ＮａＯＨでｐＨを８．０に調整）で予め平衡化した。ダイアフィルトレーション処理済みヒトＰｌＧＦ−１試料を０．５ｍＬ／分の流速でカラムに載せ、洗浄緩衝液１０−２０体積で洗浄し、溶出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０。６Ｎ  ＮａＯＨでｐＨを８．０に調整）によりヒトＰｌＧＦ−１タンパク質をカラムから溶出させた。３−５リットルのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２を用いて、精製ヒトＰｌＧＦ−１タンパク質を３回透析した。
【０２２３】
ゲル浸透クロマトグラフィー
透析済みタンパク質試料を約５ｍＬに濃縮し、１０体積のＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．２でＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ１００又はＧ３０００サイズ分離カラム（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｃｎｃｃｓ、ＬＫＢ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を予め平衡化した。１ｍＬ／分の流速で試料をサイズ分離カラムに載せた。全ての分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分析した。ヒトＰｌＧＦ−１二量体分画を集め、凍結した。
【実施例２】
【０２２４】
組み換えヒトＰｌＧＦ−１抗原の特性評価
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動
還元条件又は非還元条件下で、ヒトＰｌＧＦ−１組み換え抗原を発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯクローン＃６３０５）において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を行った。組み換えヒトＰｌＧＦ−１抗原約３μｇを還元剤（β−メルカプトエタノール）含有又は不含ローディング緩衝液と混合し、１０分間沸騰させ、次いで４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに載せ、８０ボルトで１．５時間、電気泳動を行った。単量体ヒトＰｌＧＦ−１は、約２０ｋＤａに移動するはずであり（計算ＭＷ：１５．５ｋＤａ）、二量体ヒトＰｌＧＦ−１は約４０ｋＤａに移動するはずである。機能的ヒトＰｌＧＦ−１は二量体の形態である。ヒトＰｌＧＦ−１抗原を発現するＣＨＯ細胞は、発現されたヒトＰｌＧＦ−１の約〜６０−８０％が二量体であり、−２０〜４０％のヒトＰｌＧＦ−１が四量体であることを示した。β−メルカプトエタノール含有ローディング緩衝液中の還元条件下で、二量体／四量体の形態のヒトＰｌＧＦ−１を単量体に変換した（図３参照）。
【０２２５】
ウェスタンブロット分析
１００℃で、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールにより、精製ヒト組み換えヒトＰｌＧＦ−１タンパク質およそ０．５μｇを処理し、４−２０％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル（Ｌａｅｍｍｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ、２２７：６８０−６８５（１９７０））において電気泳動にかけた。２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、１９２ｍＭグリシン及び２．０％メタノール、ｐＨ８．３を含む標準的な転写用緩衝液（Ｔｏｗｂｉｎら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、７３：４３５０−４３５４（１９７９））中での１００ボルトでの１−２時間の電気泳動によって、このゲルからニトロセルロース膜にタンパク質を転写した。タンパク質を転写し、ＰＢＳ中の２％ＢＳＡでニトロセルロースをブロッキング処理した後、このニトロセルロースを使用して、ヒト組み換え抗原の存在を調べた。ＰＢＳ／２％ＢＳＡ緩衝液、ｐＨ７．２  １０ｍＬ中の抗ヒトＰｌＧＦ−１又は抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体（モノクローナル抗体１−２５５−７１３又は２−８２６−３３５の何れか）の適量とともにニトロセルロース膜を温置した。このニトロセルロース膜をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２で洗浄し、続いて、ＨＲＰに結合されたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を添加した。このニトロセルロース膜を室温で１から２時間温置し、続いてＰＢＳで洗浄した。最後に、用時調製した、安定過酸化物緩衝液中の金属増感型ＤＡＢ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）の添加によって、タンパク質に結合した抗体を視覚化した。このアッセイから、抗ヒトＰｌＧＦ−１モノクローナル抗体（即ち、モノクローナル抗体１−２５５−７１３又は２−８２６−３３５の何れか）が、非還元形態の組み換えヒトＰｌＧＦ−１抗原に結合し得ることが示された（図４Ａ、４Ｂ及び４Ｃ参照）。
【０２２６】
グリコシル化分析
ＰＬＧＦ−１グリコシル化を調べるために、ＥＳＩ−ＭＳにより、ＣＨＯ細胞で発現されたヒトＰｌＧＦ−１抗原を分析した。変性溶液２．２μＬ、界面活性剤２．２μＬ、Ｎ−グリカナーゼ、Ｏ−グリカナーゼ、シアリダーゼＡ、β（１−４）ガラクトシダーゼ及びβ−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼ各１μＬとともに３７℃で４８時間、ヒトＰｌＧＦ−１溶液（３０μＬ）を温置した。Ｎｏｒｇｅｎ界面活性剤除去装置を用いてこの溶液を浄化し、次いでＭｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−１０装置を用いて脱塩した。ＥＳＩ−ＭＳにより試料を分析した。１５６４６Ｄａのピークの出現により示されるように、ヒトＰｌＧＦ−１の脱グリコシル化形態が現れた。このことから、ＣＨＯで発現されたヒトＰｌＧＦ−１にグリカンが存在することが分かった（図５参照）。
【０２２７】
グリコシル化部位の決定
ＣＨＯ細胞で発現されたヒトＰｌＧＦ−１抗原のグリコシル化部位を調べるために、トリプシン消化、ＰＮＧａｓｅ脱グリコシル化及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行った。ヒトＰｌＧＦ−１  ２０μｇをＶａｃｕｆｕｇｅで乾燥させ、変性緩衝液（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２．７５ｍＭ  ＥＤＴＡ、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ。希ＨＣｌでｐＨ  ８．１＋／−０．１に調整）３０μＬで再構成した。次に、ヒトＰｌＧＦ−１をＤＴＴで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化した。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−１０遠心装置を用いて溶液を脱塩した。１：２５（ｗ／ｗ）トリプシンとともに、３７℃で一晩、脱塩溶液を温置した。トリプシン消化済みヒトＰｌＧＦ−１ペプチド２０μＬを微小遠心管に移した。次に、この溶液をＰＮＧａｓｅ１μＬとともに一晩温置した。Ｚｉｐｔｉｐ  Ｃ−１８を用いて脱グリコシル化ペプチドを脱塩し、Ｃ１８カラムを用いてＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの結果から、ＣＨＯ細胞により発現されたヒトＰｌＧＦ−１が２ヶ所のグリコシル化部位、Ｎ２１及びＮ８９を有することが明らかになった。Ｎ２１は完全にグリコシル化され、一方でＮ８９は一部グリコシル化されていた（図２０参照）。抽出されたイオンクロマトグラムから、Ｎ８９がグリコシル化されていないヒトＰｌＧＦ−１由来のペプチドに対する、化Ｎ８９がグリコシルされているヒトＰｌＧＦ−１由来のペプチドに関して、２．５：１前後のピーク面積比が示された。
【０２２８】
糖鎖構造の特性評価
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて、ＣＨＯ細胞で発現されたヒトＰｌＧＦ−１のＮ−グリカンを分析した。変性溶液２．５μＬ、界面活性剤２．５μＬ及びＰｒｏｚｙｍｅ  Ｎ−グリカナーゼ２μＬとともに、３７℃で７２時間、ヒトＰｌＧＦ−１溶液３５μＬを温置した。Ｃａｒｂｏｇｒａｐｈカラムを用いて、放出されたＮ−グリカンを回収した。Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラムを使用して、回収したＮ−グリカンをＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析した。この実験から、８個のＮ−グリカンの構造が明らかになった（図２１参照）。各ピークに対するデータ及び各Ｎ−グリカンに対する構造を下記表Ｂで提供する。
【０２２９】
【表２】
0005706320.tif 000003
【実施例３】
【０２３０】
ヒトＰｌＧＦ−１断片抗原１７−１３１
ヒトＰｌＧＦ−１プラスミドクローンｐＣＭＶ６−ＸＬ４−ヒトＰｌＧＦ−１（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、カタログ番号ＴＣ１１８５１２、ＮＭ＿００２６３２）を鋳型として使用した。ヒト（野生型）ＰｌＧＦ−１遺伝子をクローニングするために、ＰＣＲプライマー対を設計した。５’末端プライマーは、κ軽鎖シグナル配列の部分配列、ＮｒｕＩ制限部位及び６ｘＨｉｓタグを含有し、３’末端プライマーは、ＮｏｔＩ制限部位及びヒトＰｌＧＦ−１Ｃ末端の部分配列を含有した。５’及び３’末端プライマーを下記で示す。
【０２３１】
ヒトＰｌＧＦ−１断片（１７−１３１）５’末端プライマー（Ｐｌｆｏｒ）
５’−ＣＣＧＧＣＴＣＧＣＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＴＣＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＣＣＣＴＴＣＣＡＧ−３’（配列番号２４）；
ヒトＰｌＧＦ−１  ３’−末端プライマー（Ｐｌｒｅｖ）
５’−ＣＣＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＣＡＧＣＡＴＣ−３’（配列番号２１）。
【０２３２】
５’及び３’プライマー及びＰｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の１．２５単位とともに、２ｘ反応緩衝液（ｄＮＴＰ）中で、ＰＣＲ反応を行った。９４℃で１５秒、続いて６８℃で１分間  ３０サイクル、このＰＣＲを行った。全部で３０サイクル行った。シグナルペプチドを含む野生型ヒトＰｌＧＦ−１断片抗原配列を図６で示す。
【０２３３】
３９２ｂｐ  ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＮｒｕＩ及びＮｏｔＩによる制限酵素切り出しを行い、次いでｐＪＶベクターにクローニングし、Ｅ．コリＤＨ５αに形質転換した。Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）からｐＪＶベクターを得たが、これは、アンピシリン耐性遺伝子、ｐＵＣ複製起点、ＳＶ４０複製起点、ＥＦ−Ｉａプロモーターを含む。得られたｐＪＶに基づくベクターをｐＪＶ−Ｈｉｓ−ヒトＰｌＧＦ−１（１７−１３１）と呼ぶ。形質転換されたＥ．コリクローンを３７℃で振盪しながら一晩ＬＢブロス中で増殖させた。ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）により、プラスミドＤＮＡを個々のクローンから精製し、次いで、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて配列決定した。配列決定によりプラスミドｐＪＶ−Ｈｉｓ−ＰｌＧＦ−１（１７−１３１）−Ｔ１を選択し、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ＡｄｖａｎｃｅＴＭソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により分析した。ｐＪＶクローンを同定したら、ｐＪＶクローンを維持するために、ｐＪＶ−Ｈｉｓ−ＰｌＧＦ−１（１７−１３１）プラスミドを含有する個別のＥ．コリＤＨ５α細胞バンクを作製した。
【０２３４】
ＨＥＫ２９３細胞におけるヒトＰｌＧＦ−１（１７−１３１）突然変異抗原一過性発現
標準的技術により、ＥｎｄｏｆｒｅｅプラスミドＭａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて、ｐＪＶ−Ｈｉｓ−ヒトＰｌＧＦ−１（１７−１３１）−Ｔ１プラスミドＤＮＡを大量（Ｍａｘｉ）調製した。次に、２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって、得られた高純度プラスミドＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞に一過性に遺伝子移入した。一過性発現ヒトＰｌＧＦ−１抗原突然変異体を回収し、実施例１に記載のようにダイアフィルトレーション処理した。
【０２３５】
ヒトＰｌＧＦ−１（１７−１３１）突然変異抗原精製
実施例１に記載のように、ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）金属アフィニティークロマトグラフィー及びゲル浸透クロマトグラフィーを用いて、ダイアフィルトレーション処理済みＰｌＧＦ−１（１７−１３１）突然変異体の溶液を精製した。
【０２３６】
安定なヒトＰｌＧＦ−１（１７−１３１）突然変異体発現ＣＨＯ細胞株の確立及びメトトレキセート増幅
実施例１でのように、遺伝子移入及びヒトＰｌＧＦ−１安定発現のために、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子が欠失したチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ、Ｂ３．２）を使用した。ＣＨＯ細胞を培養し、標準的なリン酸カルシウム介在遺伝子移入によって、プラスミドｐＪＶ−Ｈｉｓ−ヒトＰｌＧＦ−１（１７−１３１）−Ｔ１で遺伝子移入した。１０ｃｍ組織培養プレート中の、リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを欠き、５％透析済みＦＢＳ（ｄＦＢＳ）を含有するαＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で、遺伝子移入されたヒトＰｌＧＦ−１（１７−１３１）ＣＨＯ細胞を数週間にわたり選択した。遺伝子移入されたＣＨＯ細胞に対して、Ｌ−グルタミン及びＦＢＳを追加し、０．０２μＭ、０．１μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭから５μＭにメトトレキセート（ＭＴＸ）濃度を漸増させたα−ＭＥＭの一連の培地交換を行った。８％ＣＯ２が供給された加湿培養器中で、３７℃にて、全てのＣＨＯ培養物を温置した。メトトレキセート増幅後、９６ウェルプレート中の５μＭ  ＭＴＸを追加したαＭＥＭ＋５％ｄＦＢＳ培地への希釈限界法（ｅｎｄ  ｐｏｉｎｔ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）によって、５μＭ  ＭＴＸ増幅ＣＨＯ細胞をサブクローン化した。抗ＰｌＧＦ−１マウスモノクローナル抗体でＥＩＡ９６ウェルプレートを被覆し、続いて洗浄し、次いで培養ＣＨＯ細胞クローンからの上清とともに温置し、次いで再び洗浄し、ビオチン標識ヒトＰｌＧＦ−１（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）とともに温置し、続いて再び洗浄し、ストレプトアビジン（ＳＡ）−ＨＲＰとともにさらに３０分から１時間温置して、ＥＩＡアッセイを行い、細胞クローンを順位付けした。Ｏ−フェニレンジアミン−２ＨＣｌ（ＯＰＤ）を用いてこのプレートを発色させ、４９２ｎｍの光学密度で読み取りを行った。ＥＩＡにおいて最大シグナルを与えた２個のＣＨＯクローンを同定した。ヒトＰｌＧＦ−１（１７−１３１）突然変異体ＣＨＯ細胞クローン＃７８６を同定し、血清不含培地、即ちＤＨＦＲ−ＣＨＯ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に入れた。ヒトＰｌＧＦ−１（１７−１３１）ｒＡｇ  ＣＨＯ細胞クローン＃７８６の細胞バンクを確立した。
【実施例４】
【０２３７】
組み換えヒトＰｌＧＦ−１（１７−１３１）抗原の特性評価
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動
非還元条件下で、ＣＨＯ細胞で発現されたヒトＰｌＧＦ−１断片（１７−１３１）組み換え抗原に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を行った。突然変異ヒトＰｌＧＦ−１断片（１７−１３１）抗原を還元剤不含ローディング緩衝液と混合し、１０分間沸騰させ、次いで４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに載せ、８０ボルトで１．５時間、電気泳動を行った。単量体ヒトＰｌＧＦ−１断片（１７−１３１）は約１８ｋＤａ（計算ＭＷ：１３．９ＫＤａ）に移動するはずである。二量体ヒトＰｌＧＦ−１断片（１７−１３１）は約３６ｋＤａに移動するはずである。ヒトＰｌＧＦ−１断片（１７−１３１）抗原を発現するＣＨＯ細胞は、約９５％を超えるヒトＰｌＧＦ−１断片（１７−１３１）が二量体形態であることを示した（図８参照）。ウエスタンブロット分析は実施例２で記載する。
【実施例５】
【０２３８】
エンテロキナーゼ切断部位を有するヒトＰｌＧＦ−１抗原１−１３１
ヒトＰｌＧＦ−１プラスミドクローンｐＣＭＶ６−ＸＬ４−ＰＬＧＦ１（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、カタログ番号ＴＣ１１８５１２、ＮＭ＿００２６３２）を鋳型として使用した。
【０２３９】
ヒト（野生型）ヒトＰｌＧＦ−１遺伝子をクローニングするために、ＰＣＲプライマー対を設計した。５’末端プライマーは、κ軽鎖シグナル配列の部分配列、ＮｒｕＩ制限部位及び６ｘＨｉｓタグを含有し、３’末端プライマーは、ＮｏｔＩ制限部位及びヒトＰｌＧＦ−１Ｃ末端の部分配列を含有した。５’及び３’末端プライマーを下記で示す。
【０２４０】
ＰｌＧＦ−１Ｈｉｓ−ＥＫ−（１−１３１）５’末端プライマー（Ｐｌ０３）
５’−ＧＧＣ  ＴＣＧ  ＣＧＡ  ＴＧＣ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＧＡＣ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＣＣＣ  ＣＡＧ  −３’（配列番号２５）；
ＰＬＧＦ−１  ３’−末端プライマー（Ｐｌｒｅｖ）
５’−ＣＣＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＣＡＧＣＡＴＣ−３’（配列番号２１）。
【０２４１】
５’及び３’プライマー及びＰｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の１．２５単位とともに、２ｘ反応緩衝液（ｄＮＴＰ）中で、ＰＣＲ反応を行った。９４℃で１５秒間、続いて６８℃で１分間  ３０サイクルで、このＰＣＲを行った。全部で３０サイクルを行った。シグナルペプチドを含む野生型ヒトＰｌＧＦ−１断片抗原配列を図９で示す。
【０２４２】
４６０ｂｐ  ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＮｒｕＩ及びＮｏｔＩによる制限酵素切り出しを行い、次いでｐＪＶベクターにクローニングし、Ｅ．コリＤＨ５αに形質転換した。Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）からｐＪＶベクターを得たが、これは、アンピシリン耐性遺伝子、ｐＵＣ複製起点、ＳＶ４０複製起点及びＥＦ−Ｉａプロモーターを含む。得られたｐＪＶに基づくベクターをｐＪＶ−Ｈｉｓ−ヒトＰｌＧＦ−１（１−１３１）と呼ぶ（図１０参照）。
【０２４３】
形質転換されたＥ．コリクローンを３７℃で振盪しながら一晩ＬＢブロス中で増殖させた。プラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）により個々のクローンから精製し、次いで、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて配列決定した。配列決定によりプラスミドｐＪＶ−Ｈｉｓ−ＥＫ−ＰｌＧＦ−１（１−１３１）−Ｔ３を選択し、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ＡｄｖａｎｃｅＴＭソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により分析した。ｐＪＶクローンを同定したら、ｐＪＶクローンを維持するために、ｐＪＶ−Ｈｉｓ−ＥＫ−ＰｌＧＦ−１（１−１３１）−Ｔ３プラスミドを含有する個別のＥ．コリＤＨ５α細胞バンクを作製した。
【０２４４】
安定したＰｌＧＦ−１（１−１３１）ＥＫ突然変異体発現ＣＨＯ細胞株の確立及びメトトレキセート増幅
実施例１におけるように、遺伝子移入及び安定したヒトＰｌＧＦ−１発現のために、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を欠失したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（ＣＨＯ、Ｂ３．２）を使用した。ＣＨＯ細胞を培養し、製造者の説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に従い、標準的リポフェクタミン２０００遺伝子移入により、ｐＪＶ−Ｈｉｓ−ヒトＰｌＧＦ−１（１−１３１）プラスミドを用いて遺伝子移入した。１０ｃｍ組織培養プレート中の、リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを欠き、５％透析済みＦＢＳ（ｄＦＢＳ）を含有するαＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で、遺伝子移入されたヒトＰｌＧＦ−１（１−１３１）ＥＫ  ＣＨＯ細胞を数週間にわたり選択した。ＣＨＯクローンが５０％密集度を超えて増殖したら、ＣＨＯクローンの性能を順位付けするために、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）により上清を試験した。抗ヒトＰｌＧＦ−１抗体で９６ウェルＥＩＡプレートを室温で少なくとも１時間被覆し、次いで、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液で３０分間、反応物をブロッキング処理した。９６ウェルプレートからの上清を被覆済みウェルに添加し、室温で少なくとも１時間このプレートを温置した。温置後、このプレートを洗浄し、ビオチン標識ヒトＰｌＧＦ−１抗原と約１時間温置した。次に、このプレートを洗浄し、乾燥させ、アビジン−ＨＲＰとともに３０分間温置した。Ｏ−フェニレンジアミン−２ＨＣｌ（ＯＰＤ）を用いてこのプレートを発色させ、４９２ｎｍの光学密度で読み取りを行った。ＥＩＡにおいて最大シグナルを与えた１８個のＣＨＯクローンを増殖させ、再びアッセイした。次に、ＥＩＡ再アッセイで与えられる最大シグナルに基づき、８個のクローンを選択し、ヒトＰｌＧＦ−１分泌を促進するためにメトトレキセート（ＭＴＸ）増幅を行った。
【０２４５】
ＣＨＯ細胞クローン＃３５０のメトトレキセート増幅
遺伝子移入されたＣＨＯ細胞に対して、Ｌ−グルタミン及びＦＢＳを追加し、０．０２μＭ、０．１μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭから２５μＭにメトトレキセート（ＭＴＸ）濃度を漸増させたα−ＭＥＭの一連の培地交換を行った。８％ＣＯ２が供給された加湿培養器中で、３７℃にて、全てのＣＨＯ培養物を温置した。Ｃｌｏｎｅｐｉｘ  ＦＬでのコロニー選択のための、ＣＨＯ半固体増殖培地用のクローン培地（Ｃｌｏｎｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｇｅｎｅｔｉｘ  Ｌｔｄ．）に播種することにより、２５μＭ  ＭＴＸにおける形質転換ＣＨＯ細胞をクローン化した。この細胞をこの半固体培地に播種し、３７℃の加湿培養器中でおよそ１５日間にわたり増殖させた。増殖コロニーを含有する半固体培地の表面に、Ａｌｅｘａ−４８８標識抗ヒトＰｌＧＦ−１  １−２５５−１８９を噴霧し、これをさらに２４時間温置した。ＣｌｏｎｅｐｉｘＦＬを用いて、コロニー周囲のＡＦ４８８標識１−２５５−１８９免疫−沈降から生じる蛍光強度により測定した場合にヒトＰｌＧＦ−１抗原の最大量を産生するものとして同定されたこの半固体培地コロニーを、２５μＭ  ＭＴＸ、８ｍＭグルタミン及び５％透析済みＦＢＳを追加したα−ＭＥＭが１ウェルあたり０．２ｍＬ入った９６ウェル組織培養プレートに移した。加湿培養器中、３７℃で、これらのプレートを１４−１５日間温置した。増殖が明らかとなったときに、マイクロタイターＥＩＡ中で、抗ヒトＰｌＧＦ−１  ２−８２６−３３５及びビオチン標識ヤギ抗ＰｌＧＦ−１ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓからのｐＡｂ２６４）とのサンドイッチ形成能について上清を試験し、結果として、主要なクローンＣＨＯ３５０を選択した。上述のＥＩＡで抗原分泌を監視しながら、このクローンを８ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び２５μＭ  ＭＴＸ入りのＣＨＯ  ＤＨＦＲ陰性培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に入れた。ＣＨＯサブクローン番号３５０の細胞バンクを調製し、ヒトＰｌＧＦ−１（１−１３１）ＥＫ  ｒＡｇ  ＣＨＯ３５０と名付けた。
【０２４６】
ヒトＰｌＧＦ−１（１−１３１）ＥＫ抗原精製
ＣＨＯ細胞培養物を回収し、実施例１のようにダイアフィルトレーション処理した。実施例１に記載のように、ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて、ダイアフィルトレーション処理済みヒトＰｌＧＦ−１（１−１３１）ＥＫ溶液を精製した。
【実施例６】
【０２４７】
組み換えヒトＰｌＧＦ−１（１−１３１）ＥＫ抗原の特性評価
ニッケルカラム−精製したヒトＰｌＧＦ−１−エンテロキナーゼ（ＥＫ）抗原を集め、試料の一部を室温でのエンテロキナーゼ切断に対して用いた。エンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ又はＮｏｖａｇｅｎ、ＣＡ）の様々な量をヒトＰｌＧＦ−１−ＥＫとともに室温で一晩温置し、次いで還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動で分析した。ヒトＰｌＧＦ−１−ＥＫ抗原試料を還元剤入りのローディング緩衝液と混合し、１０分間沸騰させ、次いで、４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに載せて、８０ボルトで１．５時間泳動した。単量体ヒトＰｌＧＦ−１−ＥＫ（１−１３１）は、約２０ｋＤａに移動するはずである（計算ＭＷ：１６．２ＫＤａ）。エンテロキナーゼ処理により、６ｘＨｉｓタグ及びエンテロキナーゼ切断部位が除去され、従って、処理済み抗原は、ヒトＰｌＧＦ−１−ＥＫより小さい１５５７ダルトンとなる（図１１参照）。
【実施例７】
【０２４８】
ＰｌＧＦ−１マウス細胞株の開発
マウスにおける免疫反応を刺激するために使用した抗原は、組み換えヒトＰｌＧＦ−１（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ＭＮ）であった（これは、Ｅ．コリで産生されたものとして報告されている。）。この試験では、Ｊａｘ  Ｌａｂｓ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥからのＲＢｆ／Ｄｎｊマウスを使用した。担体タンパク質とカップリングさせたヒトＰｌＧＦ−１  ５μｇで、隔週で５回の免疫付与をマウスに対して行い、続いて、担体タンパク質なしのヒトＰｌＧＦ−１  ２．５μｇで、隔週で３回の免疫付与を行った。これらの免疫付与では、フロイントのアジュバント（ＤＩＦＣＯ、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ＭＩ）と、ＲＩＢＩアジュバント（ＭＰＬ＋ＴＤＭ及びＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）（Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＯ）の２種類のバリエーションとを交互に繰り返した。酵素免疫測定法（ＥＩＡ）による評価のために、８回目の免疫付与から１４日後にマウスからの血清試料を採取した。ウサギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ  ＰＡ）５μｇ／ｍＬで９６ウェルマイクロタイターＥＩＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ  ＮＹ）を被覆した。捕捉試薬で固相を被覆した後、これを除去し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の２％ＢＳＡ溶液（ブロック溶液）を用いて、プレート上に残存する非占有結合部位を全てブロッキング処理した。このプレートを蒸留水で３回洗浄し、対照抗体のｌｏｇ４連続希釈液及びマウス血清試料を添加して１時間温置した。このプレートを蒸留水で４回洗浄し、ＰＢＳ中で希釈したビオチン標識ヒトＰｌＧＦ−１抗原１５００ｐｇ／ｍＬ溶液をプレートに添加し、６０分間にわたり温置した。この温置後、この抗原を蒸留水でプレートから洗い流し、ブロック溶液中で２００ｎｇ／ｍＬに希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰＯ（Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＣＡ）をプレートに添加し、３０分間温置した。この温置後、このプレートを蒸留水で４回洗浄し、シグナルを生成させるために、ｏ−フェニレンジアミン基質（ＯＰＤ；Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を発色団として使用した。４９２ｎｍでプレートの読み取りを行い、最大結合のおよそ５０％を生じさせる血清希釈液を決定するために結果をプロットした。次に、ヒトＰｌＧＦ−１抗原滴定ＥＩＡにおいて、各マウスに対して５０％結合を生じさせる血清希釈液を使用した。９６ウェルマイクロタイターＥＩＡプレートを５μｇ／ｍＬのウサギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃでもう一度被覆した。捕捉試薬で固相を被覆した後、これを除去し、プレートをブロッキング処理した。このプレートを蒸留水で３回洗浄した。各マウスに対して、最大結合の５０％を生じさせる希釈液を決定し、プレートに添加し、次いで６０分間温置した。温置後、このプレートを蒸留水で４回洗浄し、４０００ｐｇ／ｍＬから開始するビオチン標識ヒトＰＩＧＦ−１のｌｏｇ４希釈液を添加し、６０分間温置した。この温置後、この抗原を蒸留水でプレートから洗い流し、ブロック溶液中で２００ｎｇ／ｍＬに希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰＯをプレートに添加し、３０分間温���した。このプレートをもう一度蒸留水で４回洗浄し、シグナルを生成させるために、ＯＰＤを発色団として使用した。このアッセイからの結果より、マウス番号５２７、５２９及び５３０と比較して、マウス番号５２８、５３１及び５３２がヒトＰｌＧＦ−１抗原に対して高い力価及び親和性を示すことが分かった。
【０２４９】
ヒトＰｌＧＦ−１抗原に対する高い力価及び親和性を明らかにした後、マウス番号５２８、５３１及び５３２を抗原の融合前免疫促進の前に休ませた。第４５週に、融合の３日前に、マウスに麻酔し、切開して体腔を開き、脾臓を露出させた。０．９％食塩水で希釈した組み換えヒトＰｌＧＦ−１抗原１０μｇを各マウスの脾臓に直接注入し、さらなる１０μｇを脾臓周囲の体腔に注入した。外科ステープリングを用いて切開部を閉じ、融合前にマウスを休ませた。
【０２５０】
ヒトＰｌＧＦ−１融合＃１に対して、これらのマウスからの脾臓細胞を使用した。ヒトＰｌＧＦ−１融合＃２に対して、マウス番号５２７、５２９、５３０及び５３３からなる群からの２匹のマウスを使用した。これらの４匹のマウスは、血清採取後、認識タグを喪失したので、元の認識番号が不明であった。これらにマウス番号１及び２を割り当てた。第４７週、融合の３日前に、これらのマウスを麻酔し、切開して体腔を開き、脾臓を露出させた。０．９％食塩水で希釈した組み換えヒトＰｌＧＦ−１抗原１０μｇを各マウスの脾臓に直接注入し、さらなる１０μｇを脾臓周囲の体腔に注入した。外科ステープリングを用いて切開部を閉じ、融合前にマウスを休ませた。
【０２５１】
各融合日に、マウスを安楽死させ、抗ヒトＰｌＧＦ−１脾臓細胞を含有するそれらの脾臓を回収し、ハイブリドーマ血清不含培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＨＳＦＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ  ＮＹ）に入れた。Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−７（１９７５））により記載されるように、細胞融合を行った。ＨＳＦＭを含有する個別のペトリ皿に各マウスの脾臓を入れた。ＨＳＦＭを含有するシリンジ及び細胞スクレーパーを用いて、各脾臓から脾臓細胞に潅流液を送り、次いで血球計算盤を用いて数えた。ヒトＰｌＧＦ−１融合＃１の場合、マウス５３２からのおよそ３．０ｘ１０７個の脾臓細胞とともに、マウス番号５２８及び５３１から、およそ２．０ｘ１０７個の脾臓細胞を集めた。ヒトＰｌＧＦ−１融合＃２の場合、マウス２からのおよそ１．６ｘ１０７個の脾臓細胞とともに、マウス１からのおよそ３．５ｘ１０７個の脾臓細胞を集めた。遠心して細胞ペレットにして、ＨＳＦＭ中で再懸濁することにより、各融合に対するプール脾臓細胞を洗浄した。脾臓細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞の同数と混合し、遠心してペレットを得た。脾臓細胞及びＳＰ２／０細胞をＨＳＦＭ中の５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（ＡＴＣＣ分子量１３００−１６００、Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）に曝露することによって、融合を遂行した。ＰＥＧ溶液１ｍＬを３０秒かけて細胞ペレットに添加し、次いでさらに１分間温置した。ＨＳＦＭ３０ｍＬを３０秒以上かけてゆっくりと添加することによって、ＰＥＧ及び細胞ペレットを希釈した。次に、遠心によって懸濁液から融合細胞を取り出し、上清を傾瀉除去した。ハイブリドーマを選択するために、１５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｏｇａｎ  ＵＴ）、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）（Ｓｉｇｍａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ＨＴ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ  ＮＹ）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ（Ｂｉｏｖｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ  ＭＤ）及びＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ  ＮＹ）を追加したＨＳＦＭ中で、両融合物に対する細胞ペレットを再懸濁した。融合＃１の場合、１６枚の９６ウェル細胞培養プレートに、１ウェルあたり０．２ｍＬ、細胞を播種し、融合＃２の場合は、１３枚のプレートに播種した。融合＃１の場合、第５及び７日に、融合＃２の場合、第５、７及び１２日に、各ウェル中の培地の半分を吸引により除去し、１５％ＦＢＳ、ＨＴサプリメント及びＬ−グルタミンを追加したＨＳＦＭに交換した。ハイブリドーマを１０−１２日間増殖させ、その後、抗体産生について上清をスクリーニングした。
【０２５２】
ＥＩＡによって、抗ヒトＰｌＧＦ−１抗体について細胞上清試料を分析した。５μｇ／ｍＬのウサギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃで９６ウェルマイクロタイターＥＩＡプレート被覆した。捕捉試薬で固相を被覆した後、それを除去し、ブロック溶液を用いて、プレート上の非占有結合部位を全てブロッキング処理した。蒸留水でウェルを３回洗浄し、細胞上清をブロッキング処理済みプレートに添加し、室温で少なくとも１時間温置した。抗マウスＩｇＧ  Ｆｃは、上清から抗ヒトＰｌＧＦ−１マウス抗体を捕捉する。温置後、蒸留水を用いて上清を洗い流した。ビオチンで標識されたヒトＰｌＧＦ−１抗原を１５００ｐｇ／ｍＬになるようにプレートに添加し、６０分間温置する。この温置後、蒸留水を用いて抗原をプレートから洗い流す。ブロック溶液中でおよそ２００ｎｇ／ｍＬに希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰＯをプレートに添加し、３０分間温置する。このプレートを蒸留水で４回洗浄し、シグナルを生成させるためにｏ−フェニレンジアミン基質を発色団として使用した。４９２ｎｍでプレートの読み取りを行い、結果を分析した。バックグランドよりも少なくとも３倍大きいＥＩＡシグナルを有した場合、ハイブリッドを陽性とみなした。それぞれ、バックグランドよりも少なくとも３倍大きいＥＩＡシグナルを有したので、ハイブリッド番号１−２５５及び２−８２６を選択した。
【０２５３】
１０％ＦＢＳ及びＨｔサプリメントを追加したＨＳＦＭ中で、２４ウェルプレートに対して、陽性ハイブリッドを増殖させた。増殖４−１１日後、この実施例に記載のものと同様にして、ＥＩＡにより、２４ウェル培養物を評価し、もう一度、バックグランドよりも少なくとも３倍大きいシグナルを生じるハイブリッドを陽性とみなし、クローニング用に選択した（下記表２参照）。ハイブリッド番号１−２５５及び２−８２６の両方とも、それぞれ、バックグランドよりも少なくとも３倍大きいＥＩＡシグナルを有した。
【０２５４】
生存ハイブリッド細胞を分取するために、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いて、ハイブリッド１−２５５及び２−８２６をクローニングした。ＦＡＣＳによって個々の細胞の前方及び側方光散乱特性を監視することにより、細胞縣濁液から、死んだ細胞と分けて生存細胞を分取した。９６ウェル組織培養プレート内の１０％ＦＢＳ入りのＨＴ追加Ｈ−ＳＦＭ０．２ｍＬを含有するウェルに、１又は１０個の生存細胞を個別に入れた。加湿培養器中で、このプレートを３７℃にて７−１４日間温置した。増殖が明らかになったら、この実施例で既に記載のように、ヒトＰｌＧＦ−１に対する反応性について、抗ヒトＰｌＧＦ−１マイクロタイターＥＩＡによって細胞培養上清を試験した。これらのクローンのそれぞれがバックグランドよりも少なくとも３倍大きいＥＩＡシグナルを有したので、エピトープグループ化及び結合対評価のために、クローン１−２５５−１８９及び２−８２６−１２７を選択した。
【０２５５】
エピトープグループ化アッセイでの使用のために、サブクローン化抗ヒトＰｌＧＦ−１クローン（１−２５５−１８９及び２−８２６−１２７）からの抗体をビオチン標識した。簡潔に述べると、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を精製抗体に２０モル過剰量で添加し、３０分間温置した。ＰＢＳ中での透析を通じて非標識ビオチンを除去し、それらの標識化を確認するために、ＥＩＡによりモノクローナル抗体（ＭＡｂ）に対して試験を行った。組み換えヒトＰｌＧＦ−１抗原により５００ｎｇ／ｍＬで９６ウェルマイクロタイタープレートを被覆した。固相を抗原で被覆した後、２％ＢＳＡ／ＰＢＳブロック溶液で非占有結合部位をブロッキング処理した。このプレートを蒸留水で３回洗浄し、ブロック溶液又は５０μｇ／ｍＬの非標識ＭＡｂ溶液（即ち、ビオチン標識を欠く１−２５５−１８９又は２−８２６−１２７からの精製抗体）の何れかをプレートに添加し、およそ６０分間温置した。ビオチン標識ＭＡｂの希釈液をＢＳＡブロック溶液又は非標識ＭＡｂの上に重ね、１０−１５分間温置した。マイクロタイタープレートを蒸留水で４回洗浄した。ブロック溶液中でおよそ２００ｎｇ／ｍＬに希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰＯをプレートに添加し、３０分間温置した。このプレートを蒸留水で４回洗浄し、シグナルを生成させるために発色団としてｏ−フェニレンジアミン基質を使用した。４９２ｎｍでプレートの読み取りを行い、結果を分析した。このＭＡｂは、（ａ）固相を被覆するヒトＰｌＧＦ−１抗原に対する結合能及び、ＢＳＡブロック（１−２５５−１８９−Ｂｔ／ブロック及び２−８２６−１２７−Ｂｔ／ブロック）とともにウェルに添加される場合のアッセイシグナル生成能及び（ｂ）ＭＡｂの対応する非標識物（１−２５５−１８９−Ｂｔ／非標識物及び２−８２６−１２７−Ｂｔ／非標識物）によるこのシグナルの妨害に基づき、エピトープグループ化アッセイでの使用に対して適格であった。
【０２５６】
エピトープグループ化実験のために、競合物がない場合に最大結合シグナルのおよそ５０％を生成させ、ＭＡｂの対応する非標識物の５０μｇ／ｍＬ溶液により完全に阻害された、ビオチン標識ＭＡｂの希釈液を選択した。まさに記載したものと同じアッセイ方式を用いて、このエピトープグループ化アッセイを完遂した。この実験において、抗ヒトＰｌＧＦ−１ハイブリドーマ全てからの非標識精製抗体を、ヒトＰｌＧＦ−１抗原被覆プレートにおける結合スポットに対する各抗ヒトＰｌＧＦ−１ＭＡｂの標識型とのそれらの競合能について試験した。非標識ＭＡｂが標識ＭＡｂの結合を阻害した場合、これは、非標識ＭＡｂが同様の結合エピトープを共有することを示す。非標識ＭＡｂが結合に競合しない場合、非標識ＭＡｂは異なる領域に向けられている。これらのアッセイ結果に基づき、抗ヒトＰｌＧＦ−１ＭＡｂのパネルがエピトープグループ化され得、サンドイッチアッセイに対する良好な結合対を予測することができる。３２種類のＭＡｂでのエピトープグループ化の結果から、１−２５５−１８９及び２−８２６−１２７が、ヒトＰｌＧＦ−１抗原において個々に異なるエピトープに結合し（即ち、１−２５５−１８９は、いわゆる「エピトープグループ２」に結合し、２−８２６−１２７はいわゆる「エピトープグループ１」に結合する。）、サンドイッチアッセイに対して良好な結合対を形成することが分かった。
【０２５７】
ＥＩＡ形式においてＭＡｂ１−２５５−１８９及び２−８２６−１２７がヒトＰｌＧＦ−１とサンドイッチを形成する能力を調べた。ＰＢＳ中で調製した１−２５５−１８９の１μｇ／ｍＬ溶液で９６ウェルマイクロタイターアッセイプレートの固相を被覆し、２−８℃でおよそ１６時間温置した。捕捉試薬で固相を被覆した後、それを除去し、ＢＳＡ／ＰＢＳブロック溶液を用いて、プレート上の非占有結合部位全てをブロッキング処理した。０から１０００ｐｇ／ｍＬのヒトＰｌＧＦ−１抗原希釈液をマイクロタイタープレートに添加し、６０分間温置した。次に、この抗原溶液を除去し、このプレートを蒸留水で４回洗浄した。ブロッキング緩衝液中で調製された１２５ｎｇ／ｍＬ濃度のビオチン標識ヒトＰｌＧＦ−１  ＭＡｂ  ２−８２６−１２７を添加し、６０分間温置した。このプレートを蒸留水で４回洗浄し、ブロック溶液中でおよそ２００ｎｇ／ｍＬに希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰＯを添加し、３０分間温置した。このプレートを蒸留水で洗浄し、シグナルを生成させるために発色団としてｏ−フェニレンジアミン基質を使用した。プレートを４９２ｎｍで読み取り、得られた抗原滴定曲線をプロットした（データを示さず。）。得られたプロットから、これらの２種類のＭＡｂがヒトＰｌＧＦ−１とサンドイッチを形成する能力が確認される。
【０２５８】
クローン１−２５５−１８９を増殖のために血清不含培地（１．０ｍｇ／ｍＬ  Ａｌｂｕｍａｘ入りのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｈ−ＳＦＭ）中に入れた。入れた後、半固体組織培養培地中で細胞を増殖させ、ＣｌｏｎｅｐｉｘＦＬ装置（Ｇｅｎｅｔｉｘ  Ｌｔｄ．、Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、ＵＫ）での二次培養のためにコロニーを拾うことによって、細胞株をクローン化した。簡潔に述べると、１０％ＦＢＳを追加したＨＳＦＭの２ｘ濃縮液及びＣｌｏｎｅ  Ｍａｔｒｉｘメチルセルロース培地（Ｇｅｎｅｔｉｘ  Ｌｔｄ．）の等体積中で細胞縣濁液を希釈した。組織培養プレートに半固体細胞縣濁液を播種し、３７℃でおよそ７日間温置した。細胞播種時に、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ溶液（Ｃｌｏｎｅ  Ｄｅｔｅｃｔ、Ｇｅｎｅｔｉｘ  Ｌｔｄ．）の５μｇ／ｍＬ溶液を半固体培地に添加した。コロニーの起源となる単一細胞は移動できず、その他の細胞と混合できなかったので、半固体培地中で増殖させたコロニーをクローン性であるとみなした。このコロニーにより産生されている抗体と、蛍光を発するヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ−ＦＩＴＣとの間で免疫沈降反応が起こった。蛍光が強いほど、多くの抗体が産生されている。ＣｌｏｎｅｐｉｘＦＬで蛍光についてコロニーを分析し、最も強いシグナルがあるものを選択して、１０％ＦＢＳ入りのＨＳＦＭを含有する９６ウェル組織培養プレートに自動的に移した。これらのプレートを７−１０日間温置し、この実施例で既に記載したように、抗ヒトＰｌＧＦ−１力価についてクローン上清を試験した。この実施例で既に記載のように、生存ハイブリッド細胞を分取するために、（ＦＡＣＳ）を使用して、さらに２回、クローン１−２５５−７１３をクローン化した。９６−ウェル組織培養プレート中の、１０％ＦＢＳ入りのＨＴ追加Ｈ−ＳＦＭ０．２ｍＬを含有するウェルに１個の生存細胞を個別に入れた。このプレートを加湿培養器中、３７℃で７−１４日間温置した。増殖が明らかとなったときに、この実施例で既に記載のように、ヒトＰｌＧＦ−１に対する反応性について抗ヒトＰｌＧＦ−１マイクロタイターＥＩＡを用いて細胞培養上清を試験した。この細胞株（ここで、１−２５５−２６７５と呼ぶ。）をＦＢＳ不含ＨＳＦＭに入れた。スケールアップ及び細胞バンクの目的のために、細胞株１−２５５−２６７５を選択した。細胞バンクの長期保存のために液体窒素フリーザーを使用する。細胞株１−２５５−２６７５により産生される抗体は、その親クローンである１−２５５−７１３により産生されるものと同一である。
【０２５９】
Ｌ−グルタミン及びＡｌｂｕｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を追加したＨ−ＳＦＭにクローン２−８２６−１２７を入れ、次いで、個々の生存ハイブリドーマ細胞を分取するために蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いてクローン化した。ＦＡＣＳを用いて個々の細胞の前方及び側方光散乱特性を監視することにより、細胞縣濁液から、死んだ細胞と分けて生存細胞を分取した。９６−ウェル組織培養プレート中の、１０％ＦＢＳ追加Ｈ−ＳＦＭ０．２５ｍＬを含有するウェルに、１個の生存２−８２６−１２７細胞を個別に入れた。加湿培養器中、３７℃で、このプレートを７−１４日間温置した。増殖が明らかとなったときに、この実施例で既に記載のように、抗ヒトＰｌＧＦ−１力価について、細胞培養上清を試験した。さらなる評価のために、クローン２−８２６−３３５を選択した。この細胞株をＦＢＳ不含ＨＳＦＭに入れた。スケールアップ及び細胞バンクの目的のために、細胞株２−８２６−３３５を選択した。細胞バンクの長期保存のために液体窒素フリーザーを使用した。
【実施例８】
【０２６０】
抗体の特性評価
Ｉｓｏｓｔｒｉｐマウスモノクローナル抗体Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）により、１−２５５−２６７５及び２−８２６−３３５細胞株からの精製抗体を試験した。各試料の０．１５又は０．２μｇ／ｍＬの１５０μＬの一定分量を発色チューブに添加し、混合した。各チューブにＩｓｏｓｔｒｉｐを添加し、ストリップのバンド上で発色が起こるまで５−１０分間、温置した。この結果から、１−２５５−２６７５が、κ軽鎖を有するマウスＩｇＧ２ａサブタイプであり、２−８２６−３３５がκ軽鎖を有するマウスＩｇＧ１サブタイプであることの両方が示された。
【０２６１】
製造者の指示に従い、ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＩＥＦゲルにおいて精製抗体を評価した。０．１から０．４ｍｇ／ｍＬの濃度で、ＤＴＴ処理した試験試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーンに載せた。１−２５５−７１３ＭＡｂに対する銀染色による発色から、軽鎖分子量（ＭＷ）が〜２７ＫＤａであり、重鎖ＭＷが〜５０ＫＤａであることが示された。２−８２６−３３５ＭＡｂの発色から、軽鎖分子量（ＭＷ）が〜２８ＫＤａであり、重鎖ＭＷが〜５２ＫＤａであることが示された。０．２μｇ／ｍＬでＩＥＦ試験試料２５μＬをレーンに載せた。ＩＥＦ試験泳動の発色から、１−２５５−７１３ＭＡｂのｐＩ範囲が６．７８−７．８０であることが示された（８本のバンドが見られる。）。２−８２６−３３５ＭＡｂの発色から、ｐＩ範囲が５．９８−６．８７であることが示された（８本のバンドが見られる。）。
【実施例９】
【０２６２】
抗体産生及び精製
ＨＳＦＭ中で１−２５５−７１３及び２−８２６−３３５細胞株を増殖させ、およそ０．５ｘ１０５個の細胞／ｍＬになるようにローラーボトルに播種した。１０−１４日間にわたり、又は最終的培養物が得られるまで、１分間あたりおよそ１回転、回転させながら、この培養物を３７℃で温置した。最終的なローラーボトル上清を回収し、０．４５ミクロンフィルターで透明化した。Ｐｅｌｌｉｃｏｎシステムを用いて透明化上清を濃縮し、０．４５ミクロンフィルターでろ過した。ｐＨ８．９の１．５Ｍグリシン／３Ｎ  ＮａＣｌ緩衝液の等体積でＭＡｂ濃縮液を希釈し、次いで、ＡＫＴＡ自動精製システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、予め平衡化した５ｍＬプロテインＡカラムに載せた。次に、このカラムを結合緩衝液５カラム体積で洗浄し、安定なベースラインに到達したら、ｐＨ３．０クエン酸緩衝液でＭＡｂを溶出する。次に、ＰＢＳへの交換のために、このＭＡｂを７０ｍＬ  Ｇ２５カラムに移し、次いで、透析膜１０，０００分子量カットを用いて、さらにＰＢＳ中で透析した。この抗体を分注し、−７０℃で保存した。
【実施例１０】
【０２６３】
ヒトＰｌＧＦ−１抗原に対する抗ヒトＰｌＧＦ−１抗体の親和性／動力学的特性評価
ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｒ）２０００装置（ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｒ）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｃｏｍｐａｎｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）によるＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）技術を用いて、ヒトＰｌＧＦ−１（アミノ酸１−１３１を含む。）及びヒトＰｌＧＦ−１断片（アミノ酸１７−１３１を含む（例えば配列番号５参照）。）抗原に対するモノクローナル抗体１−２５５−７１３及び２−８２６−３５５の親和性／反応速度を調べた。最初に、アミンカップリングキット中で提供されるＥＤＣ／ＮＨＳ／エタノールアミン化学（ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｒ）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ、ａ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｃｏｍｐａｎｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を介して、ＣＭ４バイオセンサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｒ）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ、ａ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｃｏｍｐａｎｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）にウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｒ）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｃｏｍｐａｎｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）をアミンカップリングすることによって、〜５，５００ＲＵウサギ抗マウスＩｇＧ捕捉バイオセンサーを作製した。０．１％ＢＳＡ及び０．１％ＣＭ−デキストランを添加したＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｒ）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｃｏｍｐａｎｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から構成されるランニング緩衝液（本明細書中で以後、「ランニング緩衝液」と呼ぶ。）中でヒトＰｌＧＦ−１モノクローナル抗体及びヒトＰｌＧＦ−１抗原を希釈した。各ヒトＰｌＧＦ−１モノクローナル抗体を０．２μｇ／ｍＬに希釈し、３−倍希釈系列を用いて、各ヒトＰｌＧＦ−１抗原、即ち、ＣＨＯ−起源のヒトＰｌＧＦ−１（アミノ酸１−１３１を含む；配列番号１参照（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＰＴＡ−８５３７））及びヒトＰｌＧＦ−１断片（アミノ酸１７−１３１を含む（例えば、１１５アミノ酸；配列番号５参照）（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＰＴＡ−８５４０）。）（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）及びＥ．コリ起源のヒトＰｌＧＦ−１（１−１３１を含む（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａから購入）。）を０．０４５７から３００ｎＭの濃度の範囲に希釈した。
【０２６４】
ランニング緩衝液により、５μＬ／分で、ウサギ抗マウスＩｇＧ捕捉バイオセンサーを５分間平衡化した後、参照フローセルとして１個のセルを空のままにして、個々のフローセル全体にヒトＰｌＧＦ−１モノクローナル抗体５から１０μＬを注入した。ランニング緩衝液により５０μＬ／分でフローセルを６分間洗浄し、その後、バイオセンサー全域に、任意濃度のヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片抗原１５０μＬを注入し、その後すぐにランニング緩衝液を１５分間注入した。１０μＬ／分の流速で、１０ｍＭグリシンｐＨ１．７（ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｒ）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｃｏｍｐａｎｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を１回、３０μＬ注入することにより、バイオセンサーを再生した。各ヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片抗原の全濃度を２回ずつの測定で試験した。センサーグラムを介して、結合反応速度、会合及び解離を監視した。センサーグラムを二重参照（ｄｏｕｂｌｅ−ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄ）し、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ  ２．０ソフトウェア（ＢｉｏＬｏｇｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ．、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて、質量輸送による１：１結合モデルにフィットさせて、会合及び解離速度ならびに全体的なＫＤを調べた。この結果を下記表１で示す。
【０２６５】
【表３】
0005706320.tif 000004
【実施例１１】
【０２６６】
様々な代表的サンドイッチ免疫アッセイにおけるヒトＰｌＧＦ−１の測定
多くの抗体が、ヒトＰｌＧＦ−１抗原に対して惹起され、作製されたか（即ち、本明細書中実施例７−９に記載の、モノクローナル抗体１−２５５−７１３（本明細書中でＭＡｂ２５５と呼ぶ。）及び２−８２６−３３５（本明細書中でＭＡｂ８２６と呼ぶ。））又は、多くの様々な社外販売業者を通じて供給された。具体的には、社外販売業者から得た抗体は、ラットモノクローナル抗体０４（本明細書中でＭＡｂ０４とも呼ぶ。）、モノクローナル抗体２６４（本明細書中でＭＡｂ２６４とも呼ぶ。）、Ｅ．コリで発現される、アフィニティーカラム精製ヤギポリクローナル抗体ｐＡｂ２６４及び組み換えＰｌＧＦ−１（アミノ酸１−１３１を含む。）であった（これらは全て、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）から購入した。）。
【０２６７】
受動被覆とそれに続くＥＤＡＣ架橋によって、及び捕捉抗体としての使用のために、抗体ＭＡｂ０４、ＭＡｂ２５５、ＭＡｂ２６４及びＭＡｂ８２６を磁性微小粒子（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）に固定化した。アクリジニウムエステルで標識したヤギポリクローナル抗体又はアクリジニウムエステルで標識したＭＡｂ８２６を検出抗体として使用した。
【０２６８】
これらの実験に対して、ヒトＰｌＧＦ−１抗原の起源は、Ｅ．コリ（アミノ酸１−１３１を含むヒトＰｌＧＦ−１を産生）、ＣＨＯ（アミノ酸１−１３７（配列番号２）を含むヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片（アミノ酸１７−１３１を含む（配列番号５）。）を産生）又はヒト胚腎臓細胞（アミノ酸１−１３７（配列番号２）を含むヒトＰｌＧＦ−１又はヒトＰｌＧＦ−１断片（アミノ酸１７−１３１を含む（配列番号５）。）を産生）であった。
【０２６９】
各抗原コンストラクト（Ｅ．コリ、ヒト胚腎臓細胞及びＣＨＯ  ＰｌＧＦ−１）を最初に「検量物質希釈剤」と呼ばれる緩衝マトリクス（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、その他の塩、タンパク質阻害薬及び抗菌剤を含有する緩衝液）中で溶解し、濃縮中間保存溶液を得た。その後、化学てんびんにより測定された重量を用いて、中間保存溶液を検量物質希釈剤中で希釈することによって、６種類の検量物質（０．０から１，５００ｐｇ／ｍＬの濃度の、ＣａｌＡからＣａｌＦとした。）を調製した。
【０２７０】
自動ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ｉ２０００分析装置（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）によって、アッセイを行った。簡潔に述べると、このアッセイには、次の段階が含まれた：
１．抗ヒトＰｌＧＦ−１抗体（即ち、それぞれ、ＭＡｂ０４、ＭＡｂ２５５、ＭＡｂ２６４及びＭＡｂ８２６）で被覆された微小粒子５０μＬと、各ヒトＰｌＧＦ−１コンストラクト（Ｅ．コリ、ヒト胚腎臓細胞及びＣＨＯ）から調製した抗原検量物質（ＣａｌＡ、ＣａｌＢ、ＣａｌＣ、ＣａｌＤ、ＣａｌＥ及びＣａｌＦ）の７５μＬを混合。
【０２７１】
２．３３−３８℃の周囲温度に維持して、およそ１８分間、反応混合物を温置。試料中のヒトＰｌＧＦ−１抗原は、微小粒子上の抗ヒトＰＬＧＦ−１抗体に結合した。
【０２７２】
３．磁気拘束された微小粒子から未結合ヒトＰｌＧＦ−１を分離し、廃液入れに排出させた。微小粒子をリン酸緩衝液で洗浄した。
【０２７３】
４．アクリジニウムエステルで標識した検出抗体（ポリクローナルヤギ抗体ｐＡｂ２６４又はマウスモノクローナルＭＡｂ８２６）５０μＬを反応混合物に添加。
【０２７４】
５．３３−３８℃でおよそ４分間、反応混合物を温置。抗ヒトＰｌＧＦ−１抗体−アクリジニウム分子は、微小粒子上に固定化された抗体により捕捉されたヒトＰｌＧＦ−１とサンドイッチを形成する。
【０２７５】
６．微小粒子をリン酸緩衝液で洗浄。
【０２７６】
７．捕捉されたヒトＰｌＧＦ−１に光を放射させるために、プレトリガー（酸性溶液）及びトリガー（塩基性溶液）を添加（この光は、相対光単位（ＲＬＵ）として装置により測定された。）。ＲＬＵは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）システムにおいて利用される測定の光学単位を意味する。ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）光学システムは、基本的に、化学発光反応により放射される光において光子計数を行う光増幅管（ＰＭＴ）である。化学発光反応により生成される光の量は、反応混合物中に存在するアクリジニウムトレーサーの量に比例し、それにより、試料検体の定量が可能となる（これもまた、化学発光反応が起こったときにその反応混合物中に残存するアクリジニウムの量に比例する。）。「相対光単位」という用語は、ある一定のアクリジニウム量に対する光子計数の関係に由来する。各光学モジュールは、一連のアクリジニウム検量物質により較正される。化学発光反応が起きると、光が放射され、３秒間にわたり光子が測定される。ＰＭＴは、計数された光子をデジタルシグナルに変換し、次に、それが処理のための回路基板に送られる。光学回路基板は、ＰＭＴからのデジタルシグナルを、計数された光子に比例するアナログシグナルに変換し、これは同様に、存在するアクリジニウムの量に比例する。次に、このアナログシグナルがさらに処理され、ＲＬＵ値が得られる。この関係は、光学モジュールの較正のための標準を生成させるために確立され、この場合、異なるアクリジニウム標準は、それらに対して割り当てられたＲＬＵ値を有する。従って、ＲＬＵ単位それ自身が特定の値を表さない一方で、これはアクリジニウムのある一定量に比例（即ち相対）する。
【０２７７】
下記の表２は、捕捉抗体としてＭＡｂ０４を使用し、検出抗体としてポリクローナル抗体ｐＡＢ２６４を使用した、ヒトＰｌＧＦ−１免疫アッセイからの結果を示す。
【０２７８】
【表４】
0005706320.tif 000005
【０２７９】
下記表３は、捕捉抗体としてＭＡｂ２５５を使用し、検出抗体としてポリクローナル抗体ｐＡＢ２６４を使用した、ヒトＰｌＧＦ−１免疫アッセイからの結果を示す。
【０２８０】
【表５】
0005706320.tif 000006
【０２８１】
下記表４は、捕捉抗体としてＭＡｂ２６４を使用し、検出抗体としてポリクローナル抗体ｐＡＢ２６４を使用した、ヒトＰｌＧＦ−１免疫アッセイからの結果を示す。
【０２８２】
【表６】
0005706320.tif 000007
【０２８３】
下記表５は、捕捉抗体としてＭＡｂ８２６を使用し、検出抗体としてポリクローナル抗体ｐＡＢ２６４を使用した、ヒトＰｌＧＦ−１免疫アッセイからの結果を示す。
【０２８４】
【表７】
0005706320.tif 000008
【０２８５】
下記表６は、捕捉抗体としてＭＡｂ２５５を使用し、検出抗体としてモノクローナル抗体ＭＡｂ８２６を使用した、ヒトＰｌＧＦ−１免疫アッセイからの結果を示す。
【０２８６】
【表８】
0005706320.tif 000009
【０２８７】
上記表２−６で示されるように、ＨＥＫヒトＰｌＧＦ−１断片１７−１３１の結合は、全ての５種類の抗体サンドイッチ方式において、全長ＨＥＫヒトＰｌＧＦ−１（１−１３７）と同等であった。ＣＨＯヒトＰｌＧＦ−１断片１７−１３１及び全長ＣＨＯヒトＰＬＧＦ−１  １−１３１は、抗体に対する結合においてより弱かった。
【実施例１２】
【０２８８】
ハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３及び２−８２６−３３５により産生されたモノクローナル抗体を用いたサンドイッチアッセイ
５μｇ／ｍＬで精製ヒトＰｌＧＦ−１  ＭＡｂ  １−２５５−７１３により白色９６ウェルマイクロタイターＥＩＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ  ＮＹ）を被覆した。捕捉試薬で固相を被覆した後、それを除去し、ＰＢＳ中の２％Ｆｉｓｈ  Ｇｅｌ溶液を用いて、プレート上に残存する非占有結合部位を全てブロッキング処理した。このプレートを洗浄し、研究フェーズのＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ヒトＰｌＧＦ−１検量物質希釈剤（ＭＥＳ、その他の塩、タンパク質阻害薬及び抗菌剤を含有する緩衝液を含む；Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）中の１０，０００ｐｇ／ｍＬから始まる組み換え抗原（ｒＡｇ）ロットのｌｏｇ２連続希釈液をプレートに添加して１時間温置した。このアッセイにおいて、Ｅ．コリで産生された精製ヒトＰｌＧＦ−１ｒＡｇ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を陽性対照として使用し、精製ＮＧＡＬ）ｒＡｇを陰性対照として使用した。このアッセイにおいて、ＣＨＯ細胞において社内で作製された精製ヒトＰｌＧＦ−１−Ｈｉｓ（１−１３１）及び（１７−１３１）ｒＡｇも試験した。ヒトＰｌＧＦ−１  ２−８２６−３３５からの精製抗体を消化し、Ｆａｂ’２断片を形成させ、これをアクリジニウム標識した。ｒＡｇ溶液を洗い流した後、ＭＥＳ、その他の塩、タンパク質阻害薬、抗菌剤及び界面活性剤を含有する研究フェーズＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ｃヒトＰｌＧＦ−１連結体希釈剤（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）中で、５０ｎｇ／ｍＬに希釈した標識済みＦａｂ’２断片をプレートに添加し、３０分間温置した。この温置後、このプレートを蒸留水で４回洗浄し、紙タオル上で乾燥させた。Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｊｅｔ装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）上で１秒間あたりの発光カウント（ＬＣＰＳ）を測定した。このプレートを装置に載せ、ここで、Ａｒｃｈｉｔｅｃｔプレトリガー溶液（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）１００μＬを各ウェルに添加し、続いてＡｒｃｈｉｔｅｃｔトリガー溶液１００μＬを添加し、その後、フラッシュ化学発光を読み取り、記録する。各ｒＡｇを用いて標準曲線を作成し、次のグラフにおいて記録した。これらの２種類のＭＡｂ試薬は、全３種類のヒトＰＩＧＦ−１抗原と首尾よくサンドイッチを形成することができたが、一方で、陰性対照抗原の最大濃度では、僅かなサンドイッチ形成しか観察されなかった。
【実施例１３】
【０２８９】
遊離ＰｌＧＦに結合するアッセイ能力の確認
この実施例において、ｓＦｌｔ−１と複合体形成したヒトＰｌＧＦ−１に対立するものとして、マウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３及び２−８２６−３３５からの抗体を用いたアッセイの、遊離ヒトＰｌＧＦ−１への結合能を調べた。
【０２９０】
試薬は全て、先行する実施例に記載のとおりであった。ｓＦｌｔ−１較正抗原（ドメイン１−３を含むマウス骨髄腫組み換えＤＮＡヒトｓＦｌｔ−１）は、組み換えヒトＶＥＧＦ  Ｒ１／Ｆｌｔ−１（ａａ２７−３２８）／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから購入、カタログ番号３５１６−ＦＬ）であった。硫酸アンモニウム分画化及び、固定化ヘパリンカラム（Ｐａｌｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ）（Ｒｏｅｃｋｌら、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、２４１：１６１−１７０（１９９８））上でのアフィニティークロマトグラフィーを用いて、胎盤組織から、ネイティブｓＦｌｔ−１を単離した。
【０２９１】
１２ｎＭ以下の濃度のｓＦｌｔ−１とともに試料を温置することによって、ヒトＰｌＧＦ−１アッセイを行った。ヒトＰｌＧＦ−１  ５４ｐＭを含有する試料を２から８℃で１６時間温置し、その後、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）アッセイで分析した。
【０２９２】
１２ｎＭ  ｓＦｌｔ−１で最大９０％、ヒトＰｌＧＦ−１アッセイが阻害された（データを示さず。）。１０％の残存活性は、固相抗体に結合しているＰｌＧＦと可溶性ｓＦｌｔ−１との間の競合の結果であると思われる。ヒトＰｌＧＦ−１に関して、９０％最大阻害には、ヒトＰｌＧＦ−１よりも４０倍過剰であるｓＦｌｔ−１が必要であった。最初の温置における様々な結合反応は、最終的に、ｓＦｌｔ−１濃度を上昇させることにより影響を受けない、定常状態平衡に到達する。遊離ヒトＰｌＧＦ−１、ｓＦｌｔ−１及び複合体化ヒトＰｌＧＦ−１／ｓＦｌｔ−１の混合物を含有する試料を固定化捕捉ヒトＰｌＧＦ−１抗体としばらくの間温置する場合、測定されるｓＦｌｔ−１濃度が上昇する。このことから、ｓＦｌｔ−１に結合したヒトＰｌＧＦ−１の除去が起こったことが示唆される。
【０２９３】
下記の表７において、ヒトＰｌＧＦ−１アッセイの測定範囲内で、ｓＦｌｔ−の全ての濃度をアッセイした。阻害％を括弧内で示す。ヒトＰｌＧＦ−１におけるｓＦｌｔ−１の相対的影響を評価するために測定したレベルは、第二及び第三トリメスターの妊婦に対して予想され得るものと一致する（データを示さず。）。上述のように行われた滴定から、ｓＦｌｔ−１によるヒトＰｌＧＦ−１の最大で９０％の阻害が予想され得た。しかし、最大阻害は８０％であり、これは、ヒトＰｌＧＦ−１のより高い濃度に対して観察される。この最大阻害は、ヒトＰｌＧＦ−１に対して測定される最大濃度（２９のモル比）で起こり、ヒトＰｌＧＦ−１のより低い濃度（３３０のモル比）では起こらない。これらのデータは、アッセイの複雑性を反映する。固相上の抗体ならびに溶液中のｓＦｌｔ−１によるヒトＰｌＧＦ−１に対する競合がある。可溶性タンパク質の濃度は、解離定数の大きさと同じ桁である。粒子上の固定化抗ヒトＰｌＧＦ−１抗体の密度由来のアビジティーの影響がそこに加わる。
【０２９４】
【表９】
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【０２９５】
これらの結果から、ヒトＰｌＧＦ−１に対する本明細書中に記載のＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）アッセイが、主にタンパク質の非複合体形態を測定することが確認される。２種類のタンパク質（ヒトＰｌＧＦ−１及びｓＦｌｔ−１）の平衡は、インビボ及びインビトロの両方で（アッセイ中に）かき乱され得る。タンパク質を捕捉するために使用される抗体は、平衡に影響を及ぼし得、従って、最終的結果に影響し得る。より重要なこととして、ヒトＰｌＧＦ−１を封鎖することに対して、ｓＦｌｔ−１が「反応吸収物質」として作用し得ることは明らかである。ｓＦｌｔ−１の高濃度は、ヒトＰｌＧＦ−１の循環レベルに顕著な影響を有し得る。
【０２９６】
市販のモノクローナル抗体２６４（ＭＡＢ２６４）の結合がｓＦｌｔ−１により阻害され、ＰｌＧＦ−１における抗体の認識部位が、ｓＦｌｔ−１結合に関して刊行物に記載される領域と同様なので（データを示さず。）、市販のモノクローナル抗体２６４（ＭＡＢ２６４）の結合が遊離ＰｌＧＦ−１を認識することが同様に考えられる。
【実施例１４】
【０２９７】
遊離ヒトＰｌＧＦ−１を検出するための３種類のヒトＰｌＧＦ−１アッセイ方式の比較
ヒトＰｌＧＦ−１／ｓＦｌｔ−１複合体又は非複合体化ヒトＰｌＧＦ−１を検出する、各アッセイの相対的能力を調べるために、３種類のアッセイ方式において、ｓＦｌｔ−１による阻害を評価した。方式１は、パラ磁性微小粒子上の固定化捕捉試薬としてヒトＰｌＧＦ−１  ＭＡｂ  ２−８２６−３３５を使用し、アクリジニウム標識された検出試薬としてヒトＰｌＧＦ−１  ＭＡｂ  １−２５５−７１３を使用する。方式２は、パラ磁性微小粒子上の固定化捕捉試薬としてＰｌＧＦ−１  ＭＡｂ２６４を使用し、アクリジニウム標識された検出試薬としてヒトＰｌＧＦ−１  Ｐｂ２６４を使用する。実施例１１に記載のようなＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ｉ２０００アッセイ方式で、方式１及び２を試験する。方式３は、９６ウェルマイクロタイタープレート上の固定化捕捉試薬としてＰｌＧＦ−１  ＭＡｂ２６４を使用し、検出試薬としてＰｌＧＦ−１  Ｐｂ２６４を使用する、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから購入したＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（Ｒ）ヒトＰｌＧＦ  ＥＬＩＳＡである。Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから購入したＰｌＧＦ−１を検量物質として両アッセイ方式で使用した。
【０２９８】
ＨＥＫ細胞で発現されたおよそ９５０ｐｇ／ｍＬの精製ヒトＰｌＧＦ−１（１−１３１）を正常ヒト血漿に添加した。添加したヒトＰｌＧＦ−１血漿に、ヒトＰｌＧＦ−１に対する３００−倍モル過剰量まで、ヒト胎盤組織から単離されたネイティブｓＦｌｔ−１を添加した。ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）及びマイクロタイタープレートアッセイで試験する前に、ヒトＰｌＧＦ−１及びｓＦｌｔ−１添加血漿を周囲温度で１−２時間温置した。
【０２９９】
結果を下記表８で示す。個々のアッセイ方式に対して、ｓＦｌｔ−１非存在下での測定濃度に基づき、％阻害を計算する。両ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）アッセイ方式とも、ヒトＰｌＧＦ−１量の２０及び３０−倍モル過剰量の間のｓＦｌｔ−１量で、９０％阻害に達する。これらの結果から、両アッセイ方式が、ヒトＰｌＧＦ−１に対するｓＦｌｔ−１結合により阻害され、従って、遊離又は非複合体化ヒトＰｌＧＦ−１を検出することができることが示される。
【０３００】
【表１０】
0005706320.tif 000011
表８から見られ得るように、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ＥＬＩＳＡ方式では、ヒトＰｌＧＦ−１量の３００倍モル過剰量のｓＦｌｔ−１量で９０％阻害に達しない。方式２及び３で使用される抗体は同じであるが、この２つの方式は、表８で示されるものと同程度まで阻害されない。試料及び捕捉試薬（ＭＡｂ２６４）とともに２時間温置することを使用する挿入シートに従い、方式３のＥＬＩＳＡを行うが、一方で、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）の温置時間はおよそ１８分間である。同様に、方式３のＥＬＩＳＡは、検出試薬（Ｐｂ２６４）を約２時間温置し、一方で、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）の場合、この段階での温置はおよそ４分間である。方式２と３との間の阻害の相違は、この２種類のアッセイ方式におけるタイミングの相違によるものであると思われる。
【０３０１】
この相違の根底にある機構にかかわらず、約２．５から約５０のｓＦｌｔ−１：ＰＬＧＦモル比の範囲内（例えば、約２．５、約５、約１０、約２０、約３０、約４０又は約５０）で、自動／半自動方式１及び２は、非自動化ＥＬＩＳＡを用いて得られる測定ＰｌＧＦ−１の阻害よりも阻害が約１．５から約２倍大きい、測定ＰｌＧＦ−１の阻害を示す。このことから、本明細書中に記載のような自動アッセイ方式が、非自動化ＥＬＩＳＡよりも、遊離ＰｌＧＦ−１を検出することにおいて優れていることが示唆される。
【実施例１５】
【０３０２】
ヒトＰｌＧＦ−１に対する代替的免疫アッセイ方式
この実施例は、実施例１２で述べられるものに対する代替的免疫アッセイ方式について述べる。
【０３０３】
この実施例は、パラ磁性微小粒子上の固定化捕捉試薬としてＰｌＧＦ−１ＭＡｂ２−８２６−３３５を使用し、アクリジニウム標識された連結体試薬としてＰｌＧＦ−１  ＭＡｂ１−２５５−７１３又は１−２５５−２６７５を使用する、ヒトＰｌＧＦ−１の検出のための、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）免疫アッセイ方式を使用する。連結体試薬は、無傷のＩｇＧ  ＭＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦａｂ断片の何れかであり得る。実施例１１に記載のようにＡＲＣＨＩＴＥＣＴアッセイを行った。アッセイの最適化中に５０から１００マイクロリットルの試料体積の範囲を使用した。典型的な試料体積は５０から７５マイクロリットルであり、最適試料体積は５０マイクロリットルである。このアッセイに対する検量物質として、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから購入したＰｌＧＦ−１を使用した。０、１０、３０、６０、５００及び１，５００ｐｇ／ｍＬのＰｌＧＦ−１濃度になるように検量物質を調製する。
【０３０４】
この実施例に記載のような免疫アッセイ方式を使用して、４００名の外見上正常な個体においてＰｌＧＦ−１を測定した。ＰｒｏＭｅｄＤｘ、ＬＬＣ（Ｎｏｒｔｏｎ、ＭＡ）から検体を購入し、これは、２００名の男性及び２００名の女性から構成された。ＥＤＴＡ血漿又は血清回収チューブの何れかに検体を回収した。試験の結果を下記の表９で示す。
【０３０５】
【表１１】
0005706320.tif 000012
表９から見られ得るように、中央ＰＬＧＦ濃度は１６．０ｐｇ／ｍＬであり、上位９７．５パーセンタイルは２５．８ｐｇ／ｍＬである。最低試料は７．９ｐｇ／ｍＬであり最大値はこの試料セットにおいて２９．８ｐｇ／ｍＬである。
【０３０６】
４．５から３９週の範囲の妊娠持続期間の妊婦においてＰｌＧＦを測定するために、代表的な免疫アッセイ方式を使用した。ＥＤＴＡ血漿において検体を回収した。結果を図２２で示す（Ｎ＝１，４９０検体）。図２２から見られ得るように、およそ３０週まで、妊娠持続期間の進行に伴い、ＰｌＧＦ値の一定の上昇が観察される。およそ３２週後、ＰｌＧＦ値は広く分散する。これらの検体中のＰＬＧＦ濃度は、およそ７．０ｐｇ／ｍＬからおよそ４，５００ｐｇ／ｍＬの範囲である。較正範囲内の結果を得るために、１，５００ｐｇ／ｍＬより大きい初期値の検体は、４倍希釈後に再試験した。
【０３０７】
これらの結果から、本明細書中に記載のような代表的免疫アッセイ方式によって、妊婦においてヒトＰｌＧＦ−１が検出され得ることが確認される。子癇前症の者、心疾患症状がある患者及び腎細胞癌、肝細胞癌及び非小細胞癌などの悪性腫瘍のある患者においても、この免疫アッセイ方式を用いて、実験を行い、首尾よく結果が得られた（データを示さず。）。
【実施例１６】
【０３０８】
ＡＴＣＣ寄託情報
マウスハイブリドーマ細胞株１−２５５−７１３及び２−８２６−３３５は、２００７年７月１２日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（本明細書中で以後、「Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．」と呼ぶ。）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡに寄託した。細胞株１−２５５−７１３には、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＰＴＡ−８５３６が割り当てられた。細胞株２−８２６−３３５には、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＰＴＡ−８５３９が割り当てられた。
【０３０９】
ヒトＰｌＧＦ−１−エンテロキナーゼ（ＥＫ）（１−１３１）を発現するチャイニーズハムスター卵巣組み換え抗原細胞株（「ＣＨＯ３５０」）は、２００７年７月１２日にＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託し、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＰＴＡ−８５３７が割り当てられた（これは、ＥＫ切断部位で除去されるＨｉｓタグ付きの全長ヒトＰｌＧＦ−１  １−１３１である。）。
【０３１０】
ヒトＰｌＧＦ−１−ヒスチジンタグ（１−１３１）を含有するチャイニーズハムスター卵巣組み換え抗原細胞株（「ＣＨＯ６３０５」）は、２００７年７月１２日にＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託し、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＰＴＡ−８５３８が割り当てられた。
【０３１１】
チャイニーズハムスター卵巣組み換え抗原細胞株（「ＣＨＯ８８６」）ヒトＰｌＧＦ−１断片（１７−１３１）は、２００７年７月１２日にＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託し、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．．受託番号ＰＴＡ−８５４０が割り当てられた。
【０３１２】
当業者にとって当然のことながら、本開示は、目的を遂行し、言及した結果及び長所ならびに本発明において固有の結果及び長所を得るためによく適応する。本明細書中に記載の、分子複合体及び方法、手順、治療、分子、具体的な化合物は、現在、好ましい実施形態の代表であり、典型であって、本開示の範囲を限定するものではない。当業者にとって当然のことながら、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書中で開示される発明に対して様々な置換及び変更がなされ得る。
【０３１３】
本明細書で言及する全ての特許及び刊行物は、本開示が属する分野において当業者のレベルを示すものである。全ての特許及び刊行物は、個々の刊行物が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されるように、同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【０３１４】
本明細書中で具体的に開示されない何らかの要素や制限なく、本明細書中で例示的に記載される発明が適切に実施され得る。従って、例えば、本明細書中の各例において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「基本的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は何れも、他の２つの用語の何れかで置き換えられ得る。使用してきた用語及び表現は、説明の用語として使用され、限定の用語として使用されず、かかる用語及び表現の使用は、示され記載されている特性又はその一部の何らかの同等物を排除するものではないが、特許請求される本開示の範囲内で様々な変更が可能であることを認識されたい。このように、好ましい実施形態及び任意の特性により本開示を具体的に開示してきたが、本明細書中で開示される概念の変更及び改変が、当業者にとってなされ得、かかる変更及び改変が、添付の特許請求の範囲により定められる本発明の範囲内にあるとみなされることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
0005706320.tif 000019
【図６】
0005706320.tif 000020
【図７】
0005706320.tif 000021
【図８】
0005706320.tif 000022
【図９】
0005706320.tif 000023
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
0005706320.tif 000027
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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