(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド又はそのペプチド模倣体と、生物活性成分との複合体であって、
前記ペプチド又はそのペプチド模倣体は生物活性成分に結合しており、前記ペプチド又はそのペプチド模倣体は前記生物活性成分を筋肉細胞へ標的化するためのものであり、前記ペプチド又はそのペプチド模倣体はLGAQSNF（配列番号１００）、LYQDYSL（配列番号８５）、及びSPNSIGT（配列番号１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、又は前記アミノ酸配列からなる、複合体。
【請求項２】
ペプチド又はそのペプチド模倣体が、LGAQSNF（配列番号１００）で示されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
生物活性成分が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−Ｏ−アルケニルヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキニルヌクレオチド、固定化核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド、及び、モリホリノに基づくヌクレオチド、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項４】
生物活性成分が、２’−Ｏ−メトキシエチル−ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−Ｏ−アリルヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチルホスホロチオエートＲＮＡヌクレオチド、及び、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートＲＮＡヌクレオチド、並びにその組合せを含む化合物から選択される、請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
LGAQSNF（配列番号１００）、LYQDYSL（配列番号８５）、及びSPNSIGT（配列番号１）のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドと治療活性タンパク質との融合タンパク質である、請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
さらに核局在化シグナルを含む、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
生物活性成分を筋肉細胞に標的化させるための薬剤の調製における、請求項１〜６のいずれかに記載の複合体の使用。
【請求項８】
薬剤が、心臓疾患を含む筋細胞関連疾患の治療のためである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
薬剤が、ミオパシー、筋ジストロフィー、又は筋萎縮性疾患の治療のためである、請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
薬剤が、II型糖尿病又は肥満の治療のためである、請求項７に記載の使用。
【請求項１１】
ペプチド又はそのペプチド模倣体と、生物活性成分に分子を結合させるリンキング部であってペプチドではないリンキング部とを含む分子であって、
前記ペプチド又はそのペプチド模倣体は前記生物活性成分を筋肉細胞へ標的化するためのものであり、前記ペプチド又はそのペプチド模倣体はLGAQSNF（配列番号１００）、LYQDYSL（配列番号８５）、及びSPNSIGT（配列番号１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、又は前記アミノ酸配列からなる、分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボターゲッティング分野の発明であり、種々の臓器又は組織にホーミングし、結合し、取り込まれる分子を提供する。
【背景技術】
【０００２】
治療化合物の殆どは、血液循環を介して標的（target）臓器又は組織に送達される。しかし、殆どの場合、薬物又は他の療法は、疾患臓器又は組織だけを標的とするのではなく、体内の他の臓器及び組織にも取り込まれる。その結果、例えば患者の全身に及ぶ毒性効果といった望ましくない副作用が生じる場合がある。したがって、特定の臓器又は組織を選択的に標的化することが望ましい。また、治療化合物を標的化（targeting）分子とカップリングさせることにより、かかる化合物の標的組織又は細胞への取込み特性を向上させることができ、より効果的な分子が得られる。したがって、標的化分子とのカップリングにより、親化合物よりも効果的で毒性が低い化合物が得られる。Curnis et al., 2000, Nature Biotechnol. 18, 1185-1190を参照のこと。このことは、ペプチド、タンパク質、細胞増殖抑制剤、及び抗ウイルス剤等の広範な化合物に適用できる。
【０００３】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、筋硬直性ジストロフィー（ＭＤ）、又は脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）等の筋疾患の場合、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に筋特異的ペプチドを接合させる（conjugate）ことができる。ＡＯＮ及びｓｉＲＮＡは、望ましくない遺伝子転写を封じることにより、特定疾患の治療における新たな分類の薬剤となる可能性を高く有する。ＤＭＤの療法分野では、アンチセンスによって誘導されたエクソンスキッピングが、ジストロフィン転写産物の翻訳リーディングフレームを修正するための新規で有望なツールとして注目を集めてきている。その目的は、（ＡＯＮがｍＲＮＡ前駆体に結合することにより）標的とするエクソンがスキップされて僅かに短くなったもののインフレームの転写産物が生成されるようにスプライシングを操作することにある。これにより、翻訳リーディングフレームが修正され、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）様ジストロフィンタンパク質の合成が誘導されて疾患の進行が著しく軽減される可能性がある。
【０００４】
いくつかの報告により、患者に由来する筋細胞培養物を用いてインビトロで（van Deutekom et al., 2001, Hum. Mol. Geet. 10, 1547-1554）、また、ｈＤＭＤトランスジェニックマウスの筋肉組織に筋肉内注入することによりインビボで（Bremmer-Bout et al., 2004, Mol. Ther. 10, 232-240）、ジストロフィンの産生を復活させるエクソンスキッピングストラテジーの治療可能性が示されている。しかし、克服すべき最大のハードルは、特に筋硬直性ジストロフィー（ＭＤ）及び脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）等の全てのミオパシーにおいて、インビボにおけるＡＯＮの筋肉への取込みが悪いことである。
【０００５】
上記筋萎縮性疾患に対する効果的な療法には、腕及び脚の骨格筋を含む本質的に全ての骨格筋、呼吸関連筋肉、及び心筋を標的とすることが必要とされる。現在までに研究された機構のうち、同時に全身に本質的に全ての筋肉組織／細胞に（アンチセンス）オリゴヌクレオチドを特異的に送達する能力、ましてや遺伝子全体を特異的に送達する能力を有するものは一つもない。筋肉への遺伝子又は他の化合物のインビボでの送達方法として現在までに刊行されているものには、電気移動による場合とよらない場合にかかわらず裸ＤＮＡの注入、マイクロバブルの使用（Lu et al. 2003, Gene Ther. 10, 396-405）、並びにポロキサマー（ヒドロキシポリ（オキシ−エチレン）ポリ（オキシプロピレン））を使用する全身送達が含まれる。近年、モルホリノＡＯＮを全身に送達することにより数種の筋肉においてジストロフィンの発現が増加することが、ｍｄｘマウスにおいて示された（Alter et al., 2006, Nature Med. 12, 1-3）。しかし、反復投与後であっても、ジストロフィンの発現は横隔膜では殆ど検出されず、心筋では検出不可能だった。さらに、これらのｍｄｘマウスでは筋膜が損傷していたためにＡＯＮが比較的容易に筋肉内に取り込まれたが、例えばデュシェンヌ型ジストロフィー若年患者の筋肉の場合には当てはまらない。また、ＳＭＡ及びＭＤのような他の筋肉疾患では筋細胞壁が損傷されていないので、ＡＯＮの送達が障害される。
【０００６】
理想的には、全身筋肉療法では、細胞特異的な標的化能力を有する化合物を（例えば静脈内又は皮下により）全身に送達する。筋細胞を標的とする能力を有する分子がこれまでにいくつか記載されている。最初の報告は、ランダムファージディスプレイライブラリーをスクリーニングして同定された、インビボでの骨格筋や心筋との結合が強化されているペプチド配列に関するものである（Samoylova and Smith, 1999, Muscle Nerve 22, 460-466）。しかし、このペプチドを、コンジュゲート化合物に筋細胞をインビボで標的とさせることに使用できるか否かは未だ示されていない。また、ファージランダムペプチドライブラリーをインビボでスクリーニングした後にヒト骨格筋から回収した７−ｍｅｒのペプチド配列が多数記載されている（Arap et al., 2002, Nature Medicine 8, 121-127）。心筋細胞への結合に関する情報は示されていない。また、これらのペプチドを、コンジュゲート化合物による筋細胞へのインビボ標的化に使用できるか否かは未だ示されていない。別の分子として、インビボで骨格筋に選択的に輸送されるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＦｖ領域が記載されている（Weisbart et al., 2003, Mol. Immunol. 39, 783-789）。マウスｍＡｂの単鎖Ｆｖ断片をマウス尾静脈に注入した４時間後、かかる断片は骨格筋細胞の２０％で観察され、主に核に局在していた。このｍＡｂは、骨格筋細胞溶解物中のミオシンIIｂタンパク質に結合するが、心筋細胞溶解物中のいずれのタンパク質にも結合しなかったことが示された。したがって、この抗体は、骨格筋を標的とするには有用かもしれないが、心筋を標的とするには有用でないだろう。
【０００７】
リソソーム蓄積症における酵素補充療法（enzyme replacement therapy）の問題点は、治療用組換え酵素の筋細胞へのインビボでの取込みが悪いことである。例えば、ポンペ病（II型糖原病）では、臨床研究で必要とされる組換えヒト酸性αグルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）の投与量は非常に高かったが、これは骨格筋へのｒｈＧＡＡの取込が悪いためである（Winkel et al., 2004, Ann. Neurol. 55, 495-502）。上記より、ＡＯＮ等の薬剤のインビボでの特異的取込みを実現するには、送達系のさらなる向上が必要であることは極めて明らかである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Curins et al., 2000, Nature Biotechnol. 18, 1185-1190
【非特許文献２】van Deutekom et al., 2001, Hum. Mol. Geet. 10, 1547-1554）
【非特許文献３】Bremmer-Bout et al., 2004, Mol. Ther. 10, 232-240
【非特許文献４】Lu et al. 2003, Gene Ther. 10, 396-405
【非特許文献５】Alter et al., 2006, Nature Med. 12, 1-3
【非特許文献６】Samoylova and Smith, 1999, Muscle Nerve 22, 460-466
【非特許文献７】Arap et al., 2002, Nature Medicine 8, 121-127
【非特許文献８】Weisbart et al., 2003, Mol. Immunol. 39, 783-789
【非特許文献９】Winkel et al., 2004, Ann. Neurol. 55, 495-502
【非特許文献１０】Denti et al., 2006, Hum. Gene Ther. 17, 565-574
【非特許文献１１】Lu et al., 2003, Nature Med. 9, 1009-1014
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、目的の臓器、組織又は細胞型に、特に心臓を含む筋細胞にホーミングする化合物、好ましくはペプチド又はペプチド模倣体を提供することにある。かかるホーミング化合物に診断成分（diagnostic moiety）、又は生物活性を有する成分をカップリングさせることにより、これら成分が特定の臓器、組織、又は細胞を標的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは幅広く研究を行い、心臓を含む筋細胞に選択的に結合し、取り込まれる多数のペプチドを同定した。よって、本発明は、例えば治療用組換え酵素又は（アンチセンス）オリゴヌクレオチドのインビボでの取込みを向上させるという必要性を、かかる酵素又はオリゴヌクレオチドを筋特異的ペプチドに接合させることにより満たすものである。かかる分子は、ミオパシーを治療するためのアンチセンス療法、筋肉がタンパク質産生の貯蔵場所（reservoir）として潜在的に機能する疾患の遺伝子療法、並びに心臓細胞及び筋細胞への多種多様の診断薬又は薬剤の送達において際立って有用である。
【００１１】
したがって、本発明は、以下からなる群から選択される配列を含み、又は前記配列からなる、ペプチド又はペプチド模倣体に関する。
【００１２】
【表１】
0005706157.tif 000002
【００１３】
上記の群には配列番号１〜配列番号１００の配列識別番号がつけられている。
【００１４】
また、本発明は、以下からなる群から選択される配列を含む、又はかかる配列からなるペプチド又はペプチド模倣体と、生物活性成分及び診断成分から選択され、前記ペプチド又はペプチド模倣体に結合する成分とのコンジュゲートに関する。
【００１５】
【表２】
0005706157.tif 000003
【００１６】
薬剤として用いる上記コンジュゲートは、本発明の一態様である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、Ｃｙ５で標識したLGAQSNFペプチドをｍｄｘマウスに皮下注入した４８時間後の分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、診断成分又は生物活性成分に、目的とする臓器、組織又は細胞型、特に心臓を含む筋細胞を標的とさせるためのペプチド又はペプチド模倣体を提供する。
【００１９】
本発明におけるペプチドは、少なくとも７個のアミノ酸を有する。このペプチドは、天然型Ｌ−アミノ酸だけで構成することもでき、バックボーン及び／又は側鎖に１又は２以上の改変があってもよい。かかる改変は、天然型アミノ酸と類似性を示すアミノ酸模倣体を組み込むことにより導入できる。アミノ酸の１又は２以上の模倣体を含む上記ペプチド群のことをペプチド模倣体と言うこととする。本発明において、アミノ酸の模倣体には、β２−及びβ３−アミノ酸、β２，２−、β２，３−及びβ３，３−二置換アミノ酸、α，α−二置換アミノ酸、アミノ酸のスタチン誘導体、Ｄ−アミノ酸、α−ヒドロキシ酸、α−アミノニトリル、Ｎ−アルキルアミノ酸などが含まれるが、これらに限定されない。また、ペプチドのＣ末端は、カルボン酸若しくはカルボキサミドであり、又はこれ以外に上記アミノ酸模倣体のうちの一つを組み込むことにより得られる他のものであってもよい。さらに、上記のペプチドには、天然型のペプチド結合を、スルホンアミド、レトロアミド、アミノオキシ含有結合、エステル、アルキルケトン、α，α−ジフルオロケトン、α−フルオロケトン、ペプトイド結合（Ｎ−アルキル化グリシルアミド結合）を含む群（但しこれらに限定されない）に置き換える置換が１又は２以上含まれていてもよい。さらに、上記ペプチドには、アミノ酸側鎖（対応する天然型アミノ酸の側鎖のことを言う）に置換が含まれていてもよく、例えば４−フルオロフェニルアラニン、４−ヒドロキシリシン、３−アミノプロリン、２−ニトロチロシン、Ｎ−アルキルヒスチジン、又はβ−分枝アミノ酸若しくは天然キラリティーとは逆にβ−側鎖の炭素原子にキラリティーを有するβ−分枝アミノ酸模倣体（例えばアロトレオニン、アロイソロイシン及び誘導体）が挙げられる。別の一実施形態では上記のペプチド群に、アミノ酸又はアミノ酸模倣体の構造的に近いアナログが含まれていてもよく、例えば、リシンの代わりにオルニチン、フェニルアラニンの代わりにホモフェニルアラニン又はフェニルグリシン、グリシンの代わりにβ−アラニン、グルタミン酸の代わりにピログルタミン酸、ロイシンの代わりにノルロイシン、又はメチオニン及び／又はシステインの硫黄が酸化されたものが挙げられる。上記ペプチドの線状形態及び環状形態は、そのレトロアナログ、インベルソアナログ、及び／又はレトロインベルソアナログと共に本特許に包含される。当業者には、さらに近い変異体（variation）も知られているかもしれないが、それらについて本明細書で言及していないことにより、本発明の範囲が限定されることはない。一実施形態では、本発明のペプチド又はペプチド模倣体は、その長さが最大で３０アミノ酸であり、少なくとも２５アミノ酸長、又は２０アミノ酸長、又は１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８又は７アミノ酸長である。
【００２０】
生物活性成分は、生物機能、好ましくは治療機能を（直接又は間接に）呈する化合物であり、したがって、治療活性を有する化合物であることが好ましい。治療活性を有する化合物は当技術分野で周知の化合物であれば何れの化合物でもよく、細胞内プロセスを調節することにより治療効果を呈する化合物であることが好ましい。（直接的）調節効果又は（直接的）生物機能を有する治療活性化合物は、例えば、あらゆるタンパク質、酵素阻害剤、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、遺伝子、又は医薬であり得る。本発明のペプチド又はペプチド模倣体に結合できるもの、又は結合させるのに好適に作製されたものであれば、あらゆる生物活性化合物又は治療活性化合物を用いることができる。かかる生物活性化合物又は治療活性化合物は、このように本発明の化合物における成分となる。当業者であれば、好適な生物活性化合物又は治療活性化合物を特定することができるであろう。
【００２１】
一実施形態では、生物活性化合物又は治療活性化合物は、核酸若しくはそのアナログを含む、又は核酸若しくはそのアナログからなる化合物である。かかる化合物は、細胞内の遺伝機構、特にタンパク質産生レベルを調節することにより、（間接的に）生物機能、好ましくは治療機能を呈すると考えられる。かかる核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、或いはそれらのアナログ（例えば２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド又は２’−Ｏ−アルケニル（アリル）ヌクレオチド又は２’−Ｏ−アルキニルヌクレオチド（例えば２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＭＯＥ）及び２’−Ｏ−アリル−ヌクレオチド）を含む化合物）、固定化核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド（例えば２’−Ｏ−メトキシエチルホスホロチオエートＲＮＡヌクレオチド、又は２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートＲＮＡヌクレオチド）、モリホリノに基づくヌクレオチド、並びにその組合せ等であってよい。核酸は、遺伝子、ポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）等であってよい。
【００２２】
一実施形態において、診断成分は本発明のペプチド又はペプチド模倣体に結合している。この診断成分は、インビボ又はインビトロでの診断目的に用いられる。診断成分としては、一般的に用いられているイメージング標識、放射標識、又はＣｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５等の蛍光標識、又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）や他の診断用タンパク質をできれば組換え発現により診断成分として用いることができる。
【００２３】
本発明のコンジュゲートを調製するため、アミノ酸又はペプチドと化合物との公知のカップリング法により、生物活性成分又は診断成分と本発明のペプチド又はペプチド模倣体とをカップリングさせる。ペプチド又はペプチド模倣体における遊離アミノ基、遊離ヒドロキシル基、遊離カルボン酸基、又は遊離チオール基に成分を結合させる方法が一般的である。一般的なコンジュゲート法には、チオール／マレイミドカップリング、アミド結合若しくはエステル結合の形成、又は異種ジスルフィド形成が含まれる。当業者であれば、必要なカップリングを生じさせるための標準的化学の知識を十分に備えている。生物活性成分又は診断成分はペプチド又はペプチド模倣体に直接カップリングさせてもよく、スペーサー又はリンカー分子を介してカップリングさせてもよい。生物活性成分又は診断成分が、本発明のペプチド又はペプチド模倣体に共有結合している必要はない。生物活性成分又は診断成分は、静電相互作用を介して接合されてもよい。本発明の一実施形態は、本発明のペプチド又はペプチド模倣体を含む分子、及びかかる分子を生物活性成分又は診断成分に結合させるための（ペプチドではない）リンキング部にも関する。かかるリンキング部は例えば生物活性を有するポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと複合する（ポリ）カチオン性基であってもよい。かかる（ポリ）カチオン性基は、スペルミン、又はポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−リシン等であってよい。
【００２４】
一実施形態で述べたとおり、本発明のペプチド又はペプチド模倣体は生物学的に活性な成分に結合している。例えば、本発明のペプチド又はペプチド模倣体は、生物活性ペプチド又は治療ペプチドに結合させることができ、一実施形態では、かかるペプチド又はペプチド模倣体の基本構造の一部でもあり得る。例えば、治療ペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端は、上記のペプチドを含む、又は上記のペプチドからなる配列を使って延長させることができる。本発明のペプチド又はペプチド模倣体を使って延長させたペプチドは、本件コンジュゲートに包含されるものと理解されるべきである。このようなペプチドは、標準的なアミノ酸又はペプチドカップリング手法によって調製できる。
【００２５】
一実施形態では、本発明のペプチド又はペプチド模倣体を核局在化シグナル（ＮＬＳ）と結合する。一実施形態では、本発明のコンジュゲートをＮＬＳと結合する。本発明においてＮＬＳは、恐らく核細胞質輸送受容体によって認識されることにより、本件コンジュゲートを、例えば生物活性成分又は診断成分を細胞核に導くように機能する。ＮＬＳは、本発明のペプチド又はペプチド模倣体の一部でもあり得、例えば、上記のペプチドを含む、又は上記のペプチドからなる配列を使ってＮＬＳのアミノ酸末端又はカルボキシ末端を延長させることができる。また、ＮＬＳは、本発明のペプチド又はペプチド模倣体の位置とは別の位置において生物活性成分又は診断成分とカップリングさせてもよい。ＮＬＳ配列は当技術分野で公知である。通常、ＮＬＳシグナルは、正電荷をもつリシン及び／又はアルギニンの（いくつかの）短い配列を含む、又はかかる配列からなり、例えば、ＮＬＳは、(K)KKR(K)、(K)KRS(K)、(K)(S)RK(R)(K)からなり、又はこれらを含む。公知のＮＬＳは、PKKKRKV、GKKRSKV、KSRKRKLである。一実施形態では、本発明のペプチド又はペプチド模倣体を配列番号１０１〜１１５からなる群から選択されるＮＬＳと結合する。
【００２６】
一実施形態において、生物活性成分がタンパク質又はポリペプチドであって、ペプチド又はペプチド模倣体がタンパク質又はポリペプチドバックボーンに含まれている本発明のコンジュゲートは、ペプチド又はペプチド模倣体と生物活性タンパク質とを一緒に組換え発現させることにより調製される。本発明のペプチド又はペプチド模倣体が生物活性ペプチドの末端で発現されるように、好ましくは生物活性ペプチドのＣ末端で発現されるように、ＤＮＡ構築物を調製することが好ましい。このように、組換えＤＮＡ法によりＤＮＡ構築物を調製し、それを適切な宿主で発現させることは、当業者には通常の事柄である。したがって、本件コンジュゲートの一実施形態は、本発明のペプチド（例えば配列番号１〜１００のペプチド）と、治療活性タンパク質（例えば抗体又は診断タンパク質（例えば蛍光タンパク質）又はその両方）との融合タンパク質であり、任意にＮＬＳも含む融合タンパク質である。かかる融合タンパク質は、適切なＤＮＡ構築物を発現させることにより調製できる。
【００２７】
したがって、本発明は、オリゴヌクレオチド、遺伝子、タンパク質、医薬等の生物活性成分が種々の正常臓器又は組織、特に筋細胞及び心臓を標的とするためのペプチド又はペプチド模倣体を提供する。よって本発明は、生物活性成分又は診断成分に筋細胞を標的化する医薬の調製における本発明のコンジュゲートの使用にも関する。一実施形態では、かかる医薬は心臓障害を含む筋細胞関連障害の治療のためのものである。筋細胞関連障害には、ミオパシー、筋ジストロフィー、及び筋萎縮性疾患が含まれる。一実施形態では、かかる医薬はミオスタチン関連障害の治療のためのものである。ミオスタチンはII型糖尿病及び肥満にも関連している。したがって、一実施形態では、かかる医薬はII型糖尿病及び／又は肥満の治療のためのものである。別の実施形態では、かかる医薬は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、エメリ・ドレフュス（Emery-Dreifuss）型筋ジストロフィー、肢帯型（Limb-girdle）筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー、筋硬直性ジストロフィー、眼咽頭筋ジストロフィー、先天型筋ジストロフィー、遠位筋ジストロフィー、筋萎縮性側策硬化症、乳児脊髄性筋萎縮症、（若年型、間欠性、成人型）脊髄性筋萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、皮膚筋炎、多発性筋炎、封入体筋炎、重症筋無力症、ランバート・イートン（Lambert-Eaton）筋無力症候群、先天性筋無力症候群、甲状腺機能高進症性ミオパシー、甲状腺機能低下症性ミオパシー、シャルコー・マリー・トゥース病（Charcot-Marie-Tooth disease）、フリードライヒ運動失調症（Friedreich's ataxia）、デジュリーヌ・ソッタ病（Dejerine-Sottas disease）、先天性筋強直症（トムゼン(Thomsen's)病及びベッカー病の両方）、先天性パラミオトニア、セントラルコア病（Central core disease）、ネマリン（Nemaline）ミオパシー、ミオチュブラー（Myotubular）ミオパシー（中心核ミオパシー）、周期性四肢麻痺（低カリウム性及び高カリウム性の両方）、ミトコンドリアミオパシーや、カルニチン及び以下の酵素（すなわち、ホスホリラーゼ、酸性マルターゼ（ポンペ病）、ホスホフルクトキナーゼ、デブランチャー（Debrancher）酵素（アミロ−１，６−グルコシダーゼとしても周知；フォーブス（Forbes）病としても知られる糖原病）、カルニチン・パルミチルトランスフェラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、乳酸脱水素酵素、及びミオアデニル酸デアミナーゼ）の欠損に起因する筋肉疾患、からなる群から選択される心臓障害を含む筋細胞関連障害の治療のためである。
【００２８】
一実施形態において、本件コンジュゲートは、非ウイルス遺伝子送達又は非ウイルス遺伝子療法におけるツールとしても使用できる。本件ペプチド又はペプチド模倣体はコンジュゲートとして、遺伝子構築物を細胞、特に筋細胞に標的化することができる。一実施形態において、かかる遺伝子構築物は酵素補充療法において酵素を産生させ、又は、第VIII因子、第IX因子、第VII因子、ビリルビンＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼや、α−グルコシダーゼ、特にアルドラザイム(登録商標；Aldurazyme(R)）、セレザイム(登録商標；Cerezyme(R)）、ファブラザイム（登録商標；Fabrazyme(R)）若しくはマイオザイム(登録商標；Myozyme(R)）等の全てのリソソーム蓄積症タンパク質等によって例示される治療タンパク質を産生させる。
【００２９】
本発明の一実施形態は、ウイルス又はウイルス粒子を細胞に対して標的化することにある。本発明のコンジュゲートでは、ウイルス又はウイルス粒子は生物活性成分である。一実施形態において、ペプチド又はペプチド模倣体のＤＮＡ／ＲＮＡ配列をウイルスのゲノムに含めることにより本発明のペプチド又はペプチド模倣体をウイルスの生物活性成分と結合させ、これらペプチド又はペプチド模倣体がウイルス又はウイルス粒子の外表面で発現されるようにする。このような発現を起こす組換え法は当業者には周知の事柄である。このようにしてペプチド又はペプチド模倣体は、ウイルス又はウイルス粒子を特定の細胞／組織に標的化する。このことは、標的ワクチン接種、遺伝子療法、遺伝子置換、又はウイルスエクソンスキッピング構築物（AAV vectors expressing antisense sequences fused to either U1 or U7 small nuclear RNA; Denti et al., 2006, Hum. Gene Ther. 17, 565-574）に関して特に注目を集めている。
【００３０】
一実施形態において本発明のペプチド又はペプチド模倣体は、YQDSAKT、VTYKTAS、EPLQLKM、 WSLQASH、TLWVPSR、QGMHRGT、LYQDYSL、SESMSIK、LPWKPLG、QSPHTAP、TPAHPNY、SLLGSTP、TALPPSY、VNSATHS、LPLTPLP、NQLPLHA、GNTPSRA、TQTPLKQ、AMISAIH、NLTRLHT、HVIANAG、HAIYPRH、及びLGAQSNFからなる群から選択される。
【００３１】
さらに別の実施形態において本発明のペプチド又はペプチド模倣体は、SPNSIGT、STFTHPR、QLFTSAS、STIHGST、SAPRPLY、AAQTSTP、YQDSAKT、EPLQLKM、TLWVPSR、LYQDYSL、LPWKPLG、TPAHPNY、TALPPSY、LPLTPLP、HAIYPRH、及びGNTPSRAからなる群から選択される。
【００３２】
さらに別の実施形態において本発明のペプチド又はペプチド模倣体は、YQDSAKT、EPLQLKM、TLWVPSR、LYQDYSL、LPWKPLG、TPAHPNY、TALPPSY、LPLTPLP、HAIYPRH、及びGNTPSRAからなる群から選択される。
【００３３】
一実施形態において本発明のペプチド又はペプチド模倣体は、YQDSAKT、及び GNTPSRAからなる群から選択される。
【００３４】
一実施形態において本発明のペプチド又はペプチド模倣体は、QLFTSAS、LYQDYSL、及び LGAQSNFからなる群から選択される。
【００３５】
本発明のペプチドをコードする配列からなる、又はかかる配列を含むＤＮＡ、及びその相補的ＤＮＡ配列、並びに本発明のペプチドをコードする配列からなる、又はかかる配列を含むＤＮＡ配列のＲＮＡ転写産物及びその相補的ＲＮＡ配列もまた本発明に包含される。
【００３６】
本発明は、本発明のコンジュゲート及び薬学上許容される担体を含む医薬組成物にも関する。
［実施例］
【実施例１】
【００３７】
筋芽細胞及び筋管に対するペプチドのインビトロでの選択
７−ｍｅｒのランダムペプチドを発現する２０億個のファージを含む既製のファージペプチドライブラリー（New England Biolabs Inc.社製）をスクリーニングし、筋肉特異的ペプチドを同定した。すなわち、培養フラスコに入れた細胞と共にファージディスプレイペプチドのライブラリーをインキュベートした。未結合のファージを洗浄除去した後、特異的に結合したファージ又は内在化したファージを溶出し増幅させた。ヒト又はマウスの筋管及び線維芽細胞のそれぞれに対するポジティブ及びネガティブ選択ラウンドを含む一連の種々のバイオパニング工程をインビトロで行った後、ＤＮＡシークエンシングによる特徴付けを行うため、このプールをエンリッチして配列同士を結合させた。これにより、標的細胞に結合し、内在化するであろう筋肉特異的ペプチドを同定した。見い出された特異的ペプチド配列を表１に示す。
【００３８】
【表３】
0005706157.tif 000004
【００３９】
マウス及びヒト双方の筋管からの選択後に頻出する２種類のペプチド、SPNSIGT及びQLFTSASを、蛍光標識（ＦＡＭ）を用いて合成し、ヒト及びマウスの分化筋細胞（筋管）への取込みを試験した。筋管は、７〜１４日間血清枯渇させたヒトＫＭ１０９筋芽細胞のコンフルエントな培養物から得た。次に、この培養物をＦＡＭ標識ペプチドと共にインキュベートし、事前に固定化せずに、倒立蛍光顕微鏡で写真を撮影した。これらのペプチドが培養筋管に顕著に取り込まれていることが観察された。
【００４０】
蛍光標識（ＦＡＭ）を用いてQLFTSASペプチドを合成し、その後、２１−ｍｅｒの２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）と接合させた。筋管は、７〜１４日間血清枯渇させたヒトＫＭ１０９筋芽細胞のコンフルエントな培養物から得た。次に、この培養物をＦＡＭ標識コンジュゲートと共にインキュベートし、事前に固定化せずに、倒立蛍光顕微鏡で写真を撮影した。写真から、このコンジュゲートがヒト培養分化筋細胞（筋管）に取り込まれていることが示された。
【実施例２】
【００４１】
ｍｄｘマウスにおけるペプチド選択
ｍｄｘマウスを用いたパニング実験のために、前記ライブラリーを尾静脈から注入した。１０〜２０分後このマウスを屠殺し、灌流した後、心臓及び種々の筋肉群を分離した。組織ホモジネートから結合及び／又は内在化したファージを回収し、増幅し、ｍｄｘマウスに再投与した。エンリッチされた配列を選択し、さらに特徴付けした。見い出された特異的ペプチド配列を表２に示す。
【００４２】
【表４】
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【００４３】
インビボでの４回の選択ラウンド後に見い出されたペプチドのうち３種を、蛍光標識（ＦＡＭ）を用いて合成し、ヒト筋管への取込みを実施例１の記載のとおり細胞培養物で試験した。写真から、３種のペプチド全てがヒト培養筋管に取り込まれたことが示された。
【実施例３】
【００４４】
筋肉内注入後の筋肉繊維のインビボ染色
蛍光標識（ＦＡＭ）を用いてヒト培養筋芽細胞及び筋管に取り込まれたペプチドを合成し、４週齢のｍｄｘマウスの腓腹筋（子牛の筋肉）に注入した。ＦＡＭで標識した、QLFTSAS（５ｎｍｏｌを注入）、LYQDYSL（２．５ｎｍｌを注入）及び LGAQSNF（２．５ｎｍｏｌを注入）の各ペプチドを分析した。３日後にマウスを屠殺し、筋肉をスナップ凍結した。切片化し、アセトンで固定し、蛍光顕微鏡に載せて分析した。切片化し、蛍光顕微鏡（ＣＣＤカメラ）で写真撮影した。
【００４５】
写真から、QLFTSAS、LYQDYSL、及びLGAQSNFの各ペプチドが、筋肉繊維の広範囲に取り込まれ、３日後でも見えたことが示された。線維全体が均一に染色されていることが明らかに示され、より強く膜染色されている部分も観察される。
【００４６】
ＦＡＭで標識したQLFTSASペプチド及びLGAQSNFペプチドの取込みについても健常マウスの筋肉で試験した。各ペプチドを５ｎｍｏｌずつ腓腹筋に注入した。３日後にマウスを屠殺し、染色レベルの評価を行った。倒立蛍光顕微鏡を用いて試料の写真を撮影した。これらマウスの筋細胞では、ｍｄｘマウスの筋細胞で見られたような損傷膜は認められなかったが、写真からわかるように、注入を受けた筋肉の筋線維の広範囲にわたってQLFTSASペプチド及びLGAQSNFペプチドが取り込まれていた。
【実施例４】
【００４７】
ペプチド−ＡＯＮコンジュゲートによるインビボでのエクソンスキッピング
QLFTSASペプチド及びLGAQSNFペプチドを２０−ｍｅｒの２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）Ｍ２３と接合した。このＡＯＮは、細胞培養物とｍｄｘモデルマウスの両方においてエクソン２３のスキッピングを誘導できることが示された（Lu et al., 2003, Nature Med. 9, 1009-1014）。このコンジュゲートをｍｄｘマウスの腓腹筋に注入した。マウスには、コンジュゲート２．９ｎｍｏｌを２４時間の間隔をおいて２回注入し、１０日後に屠殺した。次に、その筋肉を用い、ジストロフィンｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。QLFTSASペプチド及びLGAQSNFペプチドに接合したＡＯＮ Ｍ２３の筋肉におけるスキッピングの割合を表３に示す。いずれのコンジュゲートも、オリゴヌクレオチド単独の場合と同じ程度で、ｍｄｘマウスの筋肉においてエクソン２３のスキッピングを誘導することができた。
【００４８】
【表５】
0005706157.tif 000006
【００４９】
両方のペプチド−ＡＯＮコンジュゲートを用い、健常マウスでも同じ実験を行った。これらのマウスの筋肉には、ｍｄｘマウスの筋肉におけるような損傷膜は認められない。表４に示すように、これらの健常マウスにおいても両方のコンジュゲートが筋肉内でエクソン２３のスキッピングを誘導できた。
【００５０】
【表６】
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【実施例５】
【００５１】
ペプチド−ＡＯＮコンジュゲートのインビボでの取込み
ＡＯＮ Ｍ２３単独、並びにQLFTSASペプチド及びLGAQSNFペプチドに接合したＡＯＮ Ｍ２３をｍｄｘマウスに静脈内注入した。これらのマウスに、ＡＯＮ単独又はコンジュゲートを５０ｍｇ／ｋｇで４８時間の間隔をおいて３回注入し、１０日後に屠殺した。次に、ＡＯＮ Ｍ２３に特異的なハイブリダイゼーション−ライゲーションＥＬＩＳＡにより、大腿四頭筋及び心筋におけるＡＯＮ Ｍ２３レベルを測定した。表５に、ＡＯＮ Ｍ２３−ペプチドコンジュゲートの大腿四頭筋及び心筋への取込みを、ＡＯＮ Ｍ２３単独の場合の取込みに対する割合として示す（ＡＯＮ Ｍ２３単独の場合の取込みを１００％とする）。ＡＯＮ Ｍ２３単独の場合と比べ、大腿四頭筋へのコンジュゲートの取込みは２倍以上であり、心筋へのコンジュゲートの取込みは３倍以上であることが示される。      
【００５２】
【表７】
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【実施例６】
【００５３】
全身送達後のインビボ標的化
蛍光標識Ｃｙ５を用いてLGAQSNFペプチドを合成した。この標識は、マウスに（静脈内又は皮下）を介して全身注入した後、蛍光画像システム（NightOWL、Berthold Technologies社製）により高感度で検出ができる。これにより、生きたマウスに化合物を注入した後、種々の臓器にわたる分布を観察することができる。このペプチド７１ｎｍｏｌをｍｄｘマウスの背中に皮下注入し、４８時間後に上記画像システムで写真を撮影した。
【００５４】
図１は、Ｃｙ５で標識したLGAQSNFペプチドをｍｄｘマウスに皮下注入した４８時間後の分布を示す。マウスを仰向け状態にし、皮膚上の体毛がシグナル検出の妨げとなるので、先ず後肢と腹部を剃毛した。背部、前肢、及び尾部に明確なシグナルが検出できた。腹部の剃毛部位におけるシグナルは腹筋からのものであると考えられる。この結果から、背部に注入されたペプチドが腹筋、並びに後肢、前肢及び尾部の筋肉に取り込まれることが示される。
【実施例７】
【００５５】
筋細胞へのタンパク質の標的化
LGAQSNF及びQLFTSASペプチドのタンパク質を筋細胞に輸送する能力を調べるため、これらペプチド配列をタンパク質配列と融合させてＤＮＡ構築物を調製した。以下の構築物を調製し、細菌発現ベクターを用いて発現させた。
LGAQSNF−ＮＬＳ−３Ｆ５−ＧＦＰ   
LGAQSNF−３Ｆ５−ＧＦＰ 
QLFTSAS−ＮＬＳ−３Ｆ５−ＧＦＰ
QLFTSAS−３Ｆ５−ＧＦＰ
ＮＬＳ：各局在化配列ＫＫＲＫ
ＶＨＨ ３Ｆ５：ラマ由来抗体
ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質
【００５６】
ImmortomouseのＩＭ２筋芽細胞を、ＬＧＡＱＳＮＦ−ＮＬＳ−３Ｆ５−ＧＦＰ精製タンパク質と共に一晩インキュベートした。その翌日、蛍光画像化を行い、かかるタンパク質構築物の細胞への取込みを評価した。画像から、かかるタンパク質が細胞の細胞質に取り込まれたことが示された。このことから、標的化ペプチドが大きなタンパク質を筋細胞に輸送できることが示される。
【図１】
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【配列表】
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