(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸配列中のヌクレオチドを特徴づける方法であって、前記方法は、
（ａ）核酸を、該核酸の一部と混成可能なペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーと接触させ、核酸／ＰＮＡ二本鎖を形成する工程であり、ここで、前記ペプチド核酸（ＰＮＡ）は特徴づけられるヌクレオチドの塩基に相補的な塩基を欠いており、  （ｂ）前記核酸／ＰＮＡ二本鎖を、
【化１】
0005759723.tif 000046
【化２】
0005759723.tif 000047
【化３】
0005759723.tif 000048
及び
【化４】
0005759723.tif 000049
からなる群から選択された修飾塩基であって、
Ｙは、可逆的な共有結合反応が可能な官能基であり、
Ｘ１〜Ｘ４は、検出可能なタグ、スペーサ−タグの組み合わせ又は水素であり、
Ｚは、炭素又は窒素である修飾塩基と接触させる工程と
を含み、ここで、前記ＰＮＡオリゴマーが、官能基Ｙと可逆的に反応することが可能な部分を備え、前記核酸／ＰＮＡ二本鎖と統合する前記修飾塩基が、特徴づけられる前記ヌクレオチドの塩基に相補的であり、前記ヌクレオチドは、質量分析によるか又は前記修飾塩基の検出可能なタグを用いて特性づけられることを特徴とする方法。
【請求項２】
Ｙが、アルデヒド及びケトンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヌクレオチドを特徴づける方法が、一塩基多型を特徴づけるのに使用されることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヌクレオチドを特徴づける方法が、核酸を配列決定するのに使用されることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記検出可能なタグが、質量分析又は顕微鏡観察方法によって同定されることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記核酸及び／又はＰＮＡは、支持体上に固定化されるか又は支持体に結合されることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記核酸及び／又はＰＮＡは、アレイ又はマイクロアレイとして固定化されるか又は結合されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾核酸塩基化合物、修飾核酸模倣剤および様々な用途に関連する。より具体的には、本発明は、核酸塩基の特性評価、ＳＮＰ特性評価および核酸配列の方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡの配列決定を可能にする二つの原法−Ｍａｘｉｍ及びＧｉｌｂｅｒｔの化学的アプローチ（非特許文献１）並びにＳａｎｇｅｒの酵素に基づいた方法（非特許文献２）−が開示されるが、現在使われている有力な方法は、Ｓａｎｇｅｒのアプローチ、いわゆる終結又はジデオキシ配列決定に基づいている。この基本的な方法論は、標識化した終結フラグメントのラダーを作るための成長ＤＮＡ鎖の部分終結に基づいており、配列分析を行うためにサイズ分離を必要とする。明らかなことには、その発端以来、様々な改良がされ、そのため、標識は、従来の放射性ヌクレオチドから蛍光色素に転換され、平坦ゲル電気泳動よりもキャピラリーが（しばしば重合体を充填するが）多く用いられている。その結果として、９６キャピラリーの同時走行、４つの色素の使用、単一チャンネルにおける分析等、並列処理への大きな流れがあり、一方、蛍光感度の増強及びより効率的なポリメラーゼは、より長い配列決定の走行を可能にした。しかしながら、この方法が固有の限界を有するという事実が、ヒトゲノムの配列を決定するのに必要な途方もない苦労によってわかる。
【０００３】
多くのより新しいアプローチがここ数年で報告されており、実際には三つのカテゴリー：（ｉ）反復単一塩基付加による配列決定、（ｉｉ）ピロシーケンス法、（ｉｉｉ）解析／解読を用いた制限酵素媒介開裂又はキナーゼ連結に分類される。
【０００４】
（ｉ）反復単一塩基付加による配列決定
この範囲には多くの報告がある（非特許文献３，４，５）。このアプローチは、成長プライムドＤＮＡ鎖への単一塩基の酵素媒介付加に対応する。単一塩基の付加は、三リン酸塩の一部の修飾によって制御され、複数の付加が不可能である。これは、ヌクレオチド上の物理的遮断又は化学的遮断（例えば、３'ＯＨ基上のエステル）である可能性がある。このアプローチは、蛍光標識化したビルディングブロックに依存し、典型的には遮断基の除去の後に、蛍光発生的なレポーターも開裂することになり、他の反応サイクルを受け入れることが可能となる。このアプローチに関しては、多くの問題があるため、酵素及び複合三リン酸を必要とする。また、適度に長さを読み込めるように本質的に定量的であることが必要である開裂及び終結化学に関する問題もある。
【０００５】
（ｉｉ）ピロシーケンス法（非特許文献６）
このアプローチでは、成長プライムドＤＮＡ鎖が、酵素及び四つの三リン酸塩の内の一つで処理される。塩基が組み込まれたら、ピロリン酸塩が遊離し、組み込みがない場合は、そのときピロリン酸塩は生成しない。ピロリン酸塩は、ＡＰＳ（アデノシン−５'−ホスホ硫酸）の存在下ＡＴＰに転換するスルフリラーゼと反応する。その後、これは他の酵素（ルシフェラーゼ）で処理され、光を発生する。この光は、特定塩基の成長ＤＮＡ鎖への付加か又はその反対を決定するのに使用される。同じ種類の二種以上の塩基を一度に付加すると、より多くの光が発生し、これを定量化することができる。次いで、このプロセスは、次の種類の三リン酸塩が配列を形成する場合、繰り返される。多くの問題があり、発光の定量化はいつも可能ではなく、単一塩基のやや長い広がりは、基本的には読み込めないという事実もある（例えば、発光の変化のため、１種類の内の１４又は１５個の塩基を見分けられない）。これは、マイクロウェルにおいて配列した何百万ものビーズからの配列決定を開示した最近の論文において用いられるアプローチであった（非特許文献７）。
【０００６】
（ｉｉｉ）解析／解読を用いた制限酵素媒介開裂又は連結（非特許文献８）
このアプローチでは、配列が制限酵素によって開裂し、張り出した配列を与える。その後、１６個のコード化したアダプターを用いて解読する。次いで、アダプターそれ自体を開裂し、解読される次の組の塩基をさらす。同様のアプローチが、連結を用いてなし得る。再び多くの問題があり、解析ごとの複数の工程、標識化したプローブ及び様々な酵素が依然として必要であること、不完全開裂又は不必要な開裂等である。これは、Ｂｒｅｎｎｅｒによって用いられたアプローチ（非特許文献９）であり、超並列チップベースの配列決定においてＳｈｅｎｄｕｒｅ及びＣｈｕｒｃｈによって用いられたアプローチ（ポリアクリルアミドゲルに閉じ込められたビーズ、非特許文献１０，１１）であった。
【０００７】
一塩基多型
他の領域であるが配列決定に関連した領域は、一塩基多型のアプローチである（非特許文献１２）。実際、ＳＮＰ分析は、単一塩基を配列決定するものとみなすことができる。一塩基多型（ＳＮＰｓ）は、平均してヒトの３００〜１０００個の塩基毎に見られ、個人間での全遺伝的変異の９０％も示す。ＳＮＰは、特異的疾患の病状に対する遺伝子的な危険因子（又は実際には利点）、並びに多くの物理的特徴を構成することができる。ＳＮＰ分析方法は、多く、変化に富む。しかしながら、捕捉及び分析の方法はかなり異なるものの、概して、ポリメラーゼ及び蛍光標識された三リン酸塩を用いてプライマー伸長反応からなる。ＳＮＰ分析は、単一塩基の同一性が主要な関心事であるから（当然、その前後関係は重大であるが）、いくつかの点でＤＮＡ配列決定の単純な形である。
【０００８】
ＤＮＡ依存性連結及び反応
ＤＮＡ及びペプチド核酸（ＰＮＡ）は、多くの連結ベースの合成する化学的アプローチにおいて使用されている（非特許文献１３，１４）。非酵素連結反応も、Ｋｏｏｌ及びＲｉｃｈｅｒｔによってＤＮＡ−ＤＮＡセンスにおいて達成されており（非特許文献１５及びその参考文献（例えば、非特許文献１６）−彼らは、ＤＮＡ鎖（例えば、５'−ヨードチミジンと反応する３'−ホスホチオエート）又は単量体（例えば、活性リン酸塩と反応する３'アミノヌクレオチド）を連結するために、古典的な求核付加化学を使用した。最初のアプローチは、ＲＮＡ及びＤＮＡの点異変の色検出に使用できるが、求核性試薬及び求電子試薬の両方で大きなプライマーが必要となる。Ｒｉｃｈｅｒｔｓのアプローチは、単量体ベースであるが、いわゆるヘルパープライマーを必要とするため、単一塩基の隙間をまたがる２つのプライマーが直接的な取り込みに必要である。Ｌｉｕは、ＤＮＡテンプレートを用いてＰＮＡの重合体を作るために動的化学を使用した（非特許文献１７）。
【０００９】
ＰＮＡは、相補的なＤＮＡ又はＲＮＡ配列を正確に認識するため、遺伝子プローヴとして以前用いられていたが（非特許文献１８参照）、ポリメラーゼによる認識の欠如のために、遺伝分析に対する道具としての使用が非常に限定される。
【００１０】
動的化学
過去１０年の間、動的（組む合わせの）ライブラリの範囲において熱心な活動がある（非特許文献１９，２０，２１）。「動的ライブラリ」は、相補的な２つの成分を溶液において混合することで準備でき、テンプレート存在下でのアルデヒド及びアミン、又はジオール及びボロン酸、又はチオール及びジスルフィド等がある。該系（アミン／アルデヒド／イミン）にセットされた動的平衡のため、最も強く結合した配位子が優位になり、このため、本質的には、テンプレートが、それ特有のパートナーを「構築」及び「集中」させる。最近、Ｄａｗｓｏｎらは、動的過程の平行動力学もまた、アニリン等の触媒によって加速できることを示した（非特許文献２２）。
【００１１】
上述したように、ＤＮＡ分析の新しい全ての方法（及び古い方法）は、それらの用途、特に酵素及び多くの場合高価な三リン酸塩の使用に関連して様々な課題及び問題を有する。
【００１２】
本発明の目的は、前述の問題の少なくとも一つを取り除くか又は緩和することである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】A.M. Maxam and W. Gilbert, PNAS, 1977, 74, 560-564
【非特許文献２】F. Sangeret al.., PNAS, 1976, 5463-5467
【非特許文献３】Z.M. Li et al, PNAS, 2003, 100, 414-419
【非特許文献４】T.S. Seo et.al, PNAS, 2005, 102, 5926-5931
【非特許文献５】L.R. Bi et al, J. Am. Chem. Soc, 2006, 128, 2542
【非特許文献６】P. Nyren et.al., Anal. Biochem., 1996, 242, 84-89
【非特許文献７】M. Margulies et al., Nature, 2005, 437, 376-380
【非特許文献８】S. Brenner et al., Nature Biotech., 2000, 18, 630-634
【非特許文献９】S. Brenner et al., Nature Biotech., 2000, 18, 630-634
【非特許文献１０】J. Shendure et.al., Science, 2005, 308, 1728-1732
【非特許文献１１】R. D. Mitra et al., PNAS, 2003, 100, 5926-5931
【非特許文献１２】A-C. Syvanen et al., Nature Genetics, 2005, 37, S5-S10
【非特許文献１３】D. R. Liu and O. Seitz -X. Li and D.R. Liu, Angew, Chem. Int. Ed., 2004, 43, 4848-4870
【非特許文献１４】S. Ficht et al., ChemBioChem, 2005, 6, 2098-2103
【非特許文献１５】N. Griesang et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 6144-6148
【非特許文献１６】P. Hagenbuch et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 6588-6592
【非特許文献１７】D.R. Liu et al. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 13924-13925
【非特許文献１８】P. Paulosova and F. Pellestor Ann. Genetique, 2004, 47, 349-358
【非特許文献１９】P. T. Corbett et al.. Chem. Rev., 2006, 106, 3652-3711
【非特許文献２０】J.M. Lehn, Chem. Eur. J, 1999, 5, 2455-2463
【非特許文献２１】O. Ramstroem and J.M. Lehn, Nat. Rev. Drug Discov., ,2002 1, 26-36
【非特許文献２２】Dawson et al. J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 15602-15603
【発明の概要】
【００１４】
ここで説明する本発明は、様々な核酸の配列決定及び／又はＳＮＰキャラクタリゼーション法で使用できる修飾塩基、修飾核酸塩基及びＤＮＡ模倣化合物を提供する。本発明は、ここで説明する各方法が化学ベースであり酵素の使用を必要としないため、従来技術を越えて明確な利点を提供する。
【００１５】
したがって、第１態様において、本発明は、可逆的な共有結合反応が可能な部分及び検出可能なタグを備える修飾塩基を提供する。
【００１６】
当業者は、塩基（さもなければ「核酸塩基」として知られるか又はここでは「核酸塩基」といわれる）が、プリン及びピリミジンを有し、それらは、例えば、特定の塩基アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシルを含むことを理解することになる。このように、一つの実施形態において、本発明は、修飾されたアデニン、グアニン、チミン、シトシン及び／又はウラシル塩基に関する。加えて、本発明は、例えば、キサンチン、ヒポキサンチン、イソグアニン及び尿酸等の変種を包含する。
【００１７】
用語「修飾塩基」は、アルキル鎖を備え、更には可逆的な共有結合反応が可能な官能基を備える塩基／核酸塩基を包含することを理解されたい。好ましくは、該塩基の複素環を修飾して、アルキル鎖及び官能基を備えるようにすることができる。より詳細には、複素環のヘテロ原子又は炭素原子が、アルキル鎖及び官能基を備えるように修飾できる。
【００１８】
「可逆的な共有結合反応」が可能な官能基は、例えば、アルデヒド及び／又はケトンを備える基とすることができ、一つの実施形態において、可逆的な共有結合反応は、修飾塩基のアルデヒド／ケトン基と、アミン、ヒドラジド及びヒドラジド類（A. Dirksen, et al., J. Am. Chem. Soc, 2006, 128, 15602-15603）、アルコキシアミン（V.A. Polyakov et al., J. Phys. Org. Chem. 1999, 12, 357-363）、又はアルコール、ジオール及び／若しくはボロン酸（O. Abed et at.. Chem. Mater., 2006, 18, 1247 -1260）との間の反応を含むことができることを理解されたい。一つの実施形態において、可逆的な共有結合反応が可能な基はアルコールではない。
【００１９】
用語「検出可能なタグ」は、例えば、光学的に又は他の方法で相互に区別できるタグ又は標識を含む。かかるタグ又は標識の多くは、当業者に知られているが、一例として、本発明での使用に適切なタグとしては、例えば、蛍光又は質量−タグ化合物が挙げられる。より詳細には、一つの実施形態において、本発明の修飾塩基／核酸塩基は、例えば、青から遠赤外スペクトルの範囲の光学的に検出可能な色素を有するタグの群から選択される一つ又はそれ以上の検出可能なタグ（例えば、フルオロフォア等）を備えることができる。適切となり得るタグの例としては、例えば、ダンシル、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、シアニン色素（Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７）、ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）色素（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社）及び／又はアレクサフルオロ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）色素（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社）が挙げられる。一つの実施形態において、検出可能なタグはフェロセンではない。
【００２０】
適切な「質量−タグ」化合物には、例えば、臭化物部分又は他の化合物、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ等の質量分析技術において明確な同位体パターンを示すことができる分子又は部分を備えるタグを挙げることができる。
【００２１】
したがって、当業者は、ここで説明する修飾核酸塩基のいずれも、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ等の蛍光顕微鏡又は質量分析技術によって検出できることを理解することになる。
【００２２】
有利には、ここで説明する各修飾塩基／核酸塩基の複素環は、例えば、ヘテロ原子又は炭素原子を介していずれかの位置で結合した検出可能なタグを備えることができる。一つの実施形態においては、ヘテロ原子を修飾して、さらに、例えば、上述した検出可能なタグの内の一つ又はそれ以上で独立して置換され得るアルキン、アルケニレン又はアルキニレン部分等の適切なスペーサ／炭素スペーサ部分を備えるようにすることができる。一例として、複素環のヘテロ原子及び／又は修飾ヘテロ原子は、一つ又はそれ以上のフルオロフォア（T.S. Seo et al., PNAS, 2004, 101, 5488-5493; Z. Li et al., PNAS, 2003, 100, 414-419; L. Thoresen et al., Chem. Eur. J. 2003, 9, 4603- 4610）及び／又は質量タグ、すなわち臭化物、塩化物（C. Portal et al., J. Comb. Chem., 2005, 7, 554-560）を備えることができる。一つの実施形態において、プリン及び／又はピリミジン複素環は、例えば、パラジウム触媒を用いたクロスカップリング反応によって修飾できる（L. Thoresen et at., Chem. Eur. J. 2003, 9, 4603-4610; N.K. Garg et al. Chem. Commun., 2005, 4551-4553）。
【００２３】
有利には、各修飾塩基／核酸塩基は、異なる検出可能なタグを備えることができる。このように、検出可能なタグによって、例えば、修飾アデニン核酸塩基を他の修飾核酸塩基と区別することが可能となる。
【００２４】
一つの実施形態において、本発明は、
【化１】
0005759723.tif 000002
【化２】
0005759723.tif 000003
【化３】
0005759723.tif 000004
【化４】
0005759723.tif 000005
からなる群から選択される修飾塩基を提供する。
【００２５】
ここで、Ｙは、可逆的な共有結合反応が可能な官能基を備えることができる。適切な官能基には、例えば、アルデヒド、ケトン及び／又はジオールが含まれ得る。
【００２６】
Ｘ１〜Ｘ４は、異なる検出可能なタグ若しくはスペーサ−タグの組み合わせ又は水素とすることができる。
【００２７】
Ｚは、炭素、窒素、酸素及び硫黄とすることができる。
【００２８】
上記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の場合、Ｘは、Ｚが炭素であるＺ又は位置８での炭素部分を介して複素環に結合できる。
【００２９】
更なる実施形態において、本発明は、
【化５】
0005759723.tif 000006
【化６】
0005759723.tif 000007
【化７】
0005759723.tif 000008
及び
【化８】
0005759723.tif 000009
からなる群から選択される修飾塩基を提供するものであり、
ここで、Ｘ及びＹは、水素又は炭化水素鎖とすることができ、ｎは１，２又は３と等しく、色素１〜色素４は、上述した検出可能なタグの一つ又はそれ以上とすることができる。好ましくは、各色素１〜色素４は、異なる検出可能なタグを示すため、例えば、式５の修飾核酸塩基は、式６〜８に示したものと区別できる。
【００３０】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、自然発生の核酸−デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）に類似している。ＤＮＡ及びＲＮＡは、それぞれデオキシリボース又はリボース糖骨格を有するが、ＰＮＡの骨格は、ペプチド結合によって結合したＮ−（２−アミノエチル）−グリシン繰り返し単位を備える。ＰＮＡの様々なピリミジン及び／又はプリン塩基（又は核酸塩基）は、アミド結合の形成によってペプチド骨格に結合される。当業者が理解することには、アミド結合を介して単一のＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位に結合した単一の核酸塩基は、ＰＮＡ単量体として説明できるが、他のＰＮＡには、例えば、ピロリジン系（R. J. Worthington et al. Org. Biomol. Chem., 2007, 5, 249-259）及びインドール系ＤＮＡ模倣物（式９）等の修飾アミノエチル−グリシン骨格を含有するものが含まれる。当業者は、他の適切なオリゴマーを認識することになる。
【化９】
0005759723.tif 000010
【００３１】
第２態様において、本発明は、下記一般式：
【化１０】
0005759723.tif 000011
を有する修飾ＰＮＡ単量体を提供するものであり、
ここで、「複素環」は、検出可能なタグを備え得る修飾塩基（例えば、シトシン、アデニン、グアニン又はチミン／ウラシル等）であり、ｎは１，２又は３と等しく、更には、Ｘは、複素環とＲ１及びＹを備える骨格との間の結合の手段を示す。Ｒ１は、可逆的な共有結合反応が可能な基を示す。一例として、Ｒ１は、アミン、ヒドラジド、アルコキシミン（alkoxymine）、ボロン酸、ジオール及び／又はチオール等の基を備えることができる。
【００３２】
Ｙは、例えば、アルデヒド、ケトン、ジオール、ボロン酸及びチオール等の可逆的な共有結合反応が可能な官能基とすることができる。
【００３３】
更なる実施形態において、本発明は、下記一般式：
【化１１】
0005759723.tif 000012
を有する修飾ＰＮＡ単量体を提供するものであり、
ここで、「複素環」は、上述した検出可能なタグを備え得る修飾塩基（例えば、シトシン、アデニン、グアニン又はチミン／ウラシル）であり、ｎは１，２又は３と等しく、更には、Ｒ１は、可逆的な共有結合反応が可能な基を示す。一例として、Ｒ１は、アミン、ヒドラジド、アルコキシミン、ボロン酸、ジオール及び／又はチオール等の基を備えることができる。
【００３４】
Ｙは、例えば、アルデヒド、ケトン、ジオール、ボロン酸及びチオール等の可逆的な共有結合反応が可能な官能基とすることができる。
【００３５】
Ｒ１は、上述した検出可能なタグの一つ又はそれ以上を備える（例えば、共有結合した）保護基又は任意には保護基を備えるように誘導体化できる。
【００３６】
更にＲ１の誘導体化での使用に適切な保護基には、例えば、アセチル、Ｎ−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシ−１−イリデン）エチル］（Ｄｄｅ）、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、トリチル基、ジスルフィド（Ａｒｄｅｃ（アリールジチオエチルオキシカルボニル））光開裂保護基（ニトロベラチル系）、ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、トリフルオロアセチル（Ｔｆａ）、フタルイミド、ベンジル、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、トルエンスルホニル（Ｔｓ）、メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）、テトラヒドロピラニルエーテル（ＴＨＰ）、アリルエーテル、ブチルエーテル、ベンジリデンアセタール等の保護基が含まれ得る（Ｇｒｅｅｎ，Wiley-Interscience, New York, 1999）。
【００３７】
一つの実施形態において、修飾ＰＮＡ単量体は、
【化１２】
0005759723.tif 000013
【化１３】
0005759723.tif 000014
【化１４】
0005759723.tif 000015
及び
【化１５】
0005759723.tif 000016
からなる群から選択でき、
ここで、Ｒ１〜Ｒ４は、（上述した）保護基で任意に保護される可逆的な共有結合反応が可能な基（上記参照）を備えることができる。加えて、代案として、Ｒ１〜Ｒ４は、更に上述の検出可能なタグを一つ又はそれ以上を備える（例えば、共有結合した）保護基を備えることができる。
【００３８】
Ｘ１〜Ｘ４は、ここで説明した検出可能なタグの一つ又はそれ以上とすることができ、ヘテロ原子又は炭素原子を介していずれかの位置で複素環に結合され得る。一つの実施形態において、ヘテロ原子を修飾して、さらに、例えば、上述した検出可能なタグの一つ又はそれ以上で独立して置換され得るアルキン、アルケニレン又はアルキニレン部分等の適切なスペーサ／炭素スペーサ部分を備えるようにすることができる。
【００３９】
Ｘ１〜Ｘ４は、開裂可能なリンカーによって複素環に結合した検出可能なタグ又は水素である。Ｚは、炭素、窒素、酸素及び硫黄とすることができ、上記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の場合、Ｘは、Ｚが炭素であるＺ又は位置８での炭素を介して複素環に結合され得る。
【００４０】
Ｙは、例えば、アルデヒド、ケトン、ジオール、ボロン酸及びチオール等の可逆的な共有結合反応が可能な官能基とすることができる。
【００４１】
更なる実施形態において、本発明は、
【化１６】
0005759723.tif 000017
【化１７】
0005759723.tif 000018
【化１８】
0005759723.tif 000019
及び
【化１９】
0005759723.tif 000020
からなる群から選択される修飾ＰＮＡ単量体を提供するものであり、
ここで、Ｒ１は、炭化水素鎖及びアリール環とすることができ、Ｘは、炭化水素鎖とすることができ、Ｙは、炭化水素鎖又は水素とすることができる。
【００４２】
更なる実施形態において、本発明は、
【化２０】
0005759723.tif 000021
【化２１】
0005759723.tif 000022
【化２２】
0005759723.tif 000023
及び
【化２３】
0005759723.tif 000024
からなる群から選択される修飾塩基を提供するものであり、
ここで、Ｙは、水素又は炭化水素鎖とすることができる。
【００４３】
当業者は、ＰＮＡ単量体を提供することに加えて、本発明が、ＰＮＡ二量体又は三量体に関することを理解することになる。本発明に従う用語「ＰＮＡ二量体」は、共有結合した二つの（又はＰＮＡ「三量体」の場合は３つの）ＰＮＡ単量体に関するものとして理解されるべきである。一つの実施形態において、ＰＮＡ二量体は、ここで説明する検出可能なタグのいずれかを含むように修飾された少なくとも一つの核酸塩基を備えることができる。他の実施形態において、ＰＮＡ二量体は、そのＮ又はＣ末端にて、ここで説明する検出可能なタグのいずれか一つを備えることができる。
【００４４】
ＰＮＡ二量体のＮ又はＣ末端が検出可能なタグを含むように修飾した場合、他のＮ又はＣ末端は、可逆的な共有結合反応が可能な部分を含むことができる。このように、一つの実施形態において、本発明は、Ｎ末端で検出可能なタグと、Ｃ末端で可逆的な共有結合反応が可能な部分とを備えるＰＮＡ二量体（又は三量体）を提供する。その上、ある実施形態においては、ＰＮＡ単量体の核酸塩基のうち少なくとも一つが、更に検出可能なタグを備え得る。
【００４５】
以下、本発明に包含されるＰＮＡ二量体（又は三量体）を生成する例示的な方法及びＰＮＡ二量体の特定の形態の例を更に詳細に説明する。
【００４６】
本発明はまた、ＰＮＡオリゴマーにも関連しており、当業者は、用語「オリゴマー」が、例えばペプチド結合によって結合した少なくとも２つのＰＮＡ単量体を備える分子を指すことを容易に理解することになる。また、本発明は、上述した他のＤＮＡ模倣物にも関連する。
【化２４】
0005759723.tif 000025
ここで、ＮＢは、核酸塩基（例えば本発明に従う修飾核酸塩基）であり、ｎは、少なくとも２である。
【００４７】
上述のことを考慮すると、当業者は、ＰＮＡオリゴマーが、典型的に、ペプチド骨格の各第２級アミンが（上述の修飾核酸塩基等の）核酸塩基を備えるように更に誘導体化された連続ペプチド骨格を備えることを理解することになる。更なる実施形態において、本発明は、連続ペプチド骨格の第２級アミンの一部が核酸塩基を備えるように誘導体化されずカップリングしないままであるＰＮＡオリゴマーを提供することができる。それらオリゴマーは、「空白位置」を備えるオリゴマーと称されることがある。以下の式２４は、空白位置を備えるＰＮＡ単量体の例を提供する（すなわち、第２級アミンＮｏ：３は、核酸塩基（ＮＢ）を備えるように誘導体化されていない）。
【化２５】
0005759723.tif 000026
【００４８】
一つの実施形態において、本発明のＰＮＡオリゴマーは、さらに、Ｎ又はＣ末端位置にて、可逆的な共有結合反応が可能な基を備えることができる。例えば、Ｎ末端位置は、遊離アミン基、アルデヒド／ケトンヒドラジド、ヒドラジン、アルコキシアミン、アルコール、ジオール及び／又はボロン酸を備えることができ、また、Ｃ末端位置は、Ｎ末端位置の該基と可逆的な共有結合反応を形成することが可能な基を備えることができる。一つの実施形態において、Ｎ末端及び／又はＣ末端位置のいずれかは、誘導体化され、更に（上述した）保護基を備えるようにすることができる。
【００４９】
ここで説明する方法で用いるＰＮＡオリゴマーは、直交する保護基で保護したＮ−２アミノエチル−グリシン単位を用いて合成され得る。かかる単位は、下記一般式：
【化２６】
0005759723.tif 000027
を有することができ、
ここで、Ｐ１及びＰ２は、ジスルフィド（Ａｒｄｅｃ（アリールジチオエチルオキシカルボニル））、光開裂保護基（ニトロベラチル系）、ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、トリフルオロアセチル（Ｔｆａ）、フタルイミド、ベンジル、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、Ｎ−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシ−１−イリデン）エチル］（Ｄｄｅ）、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）及びトリチル基とすることができる（Ｇｒｅｅｎ，Wiley-Interscience, New York, 1999）。
【００５０】
上述したＰＮＡオリゴマーは、遺伝子分析方法において特定の用途を見出すことができる。
【００５１】
そのようなものとして、第３態様においては、本発明が、遺伝子分析方法における、本発明の第１態様によって提供される修飾塩基／核酸塩基及び／又はここで説明したＰＮＡ単量体／オリゴマーの一つ又はそれ以上の使用を提供する。「遺伝子分析」には、例えば、核酸の核酸塩基の特徴づけ、同定及び／又は配列決定が含まれ得ることを理解されたい。一つの実施形態において、該方法は、一塩基多型を特徴づけしたり及び／又は核酸を配列決定するのに使用できる。
【００５２】
当業者は、用語「一塩基多型」又は「ＳＮＰ」をよく知っている。簡単に言えば、「ＳＮＰ」は、ゲノムの変化の形を示すものであり、ここで、該ゲノムの特定のヌクレオチドが、集団のメンバーの間で変化する。一例として、ＳＮＰは、２つの対立遺伝子（すなわち、特定の座位にて考えられる２つのヌクレオチドの内の１つ）を備えることができ、また、かかる場合においては、集団内の個体の一部が、特定の座位で１つのＳＮＰ対立遺伝子を保有するが、他の個体は、同じ座位で他の対立遺伝子を保有する。
【００５３】
したがって、「核酸塩基を特徴づける」という語句は、核酸配列の特定の核酸塩基を同定し又は決定する行為を包含しており、言い換えれば、特定のヌクレオチドがどんな核酸塩基を備えるのかを同定する。この方法を用いてＳＮＰを特徴づける場合、「特徴づける」の語は、どの特定のＳＮＰ対立遺伝子（又は核酸塩基）が特定の核酸配列に存在するかを決定する行為を包含する。
【００５４】
したがって、第４態様において、本発明は、核酸の配列におけるヌクレオチドを特徴づける方法を提供するものであり、前記方法は、
（ａ）核酸を、該核酸の一部と混成し、該核酸の核酸塩基に相補的な核酸塩基を欠くことが可能なペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーと接触させ、核酸／ＰＮＡ二本鎖を形成する工程と、
（ｂ）核酸／ＰＮＡ二本鎖を、本発明の第１態様に従う修飾核酸と接触させる工程と、
を含み、
ここで、上記核酸／ＰＮＡ二本鎖と統合する修飾核酸が、核酸の核酸塩基に相補的であり、ヌクレオチドが、ＰＮＡ単量体の検出可能なタグを用いて特徴づけられる。
【００５５】
当業者が理解することには、核酸配列の核酸塩基と相補的な塩基を欠くＰＮＡオリゴマー部分は、上述した修飾塩基の部分と可逆的に反応することが可能な部分、例えば第２級アミンを与えることができる。そのようなものとして、核酸／ＰＮＡ二本鎖との接触時に、核酸の核酸塩基と相補的な（又は適合した）修飾塩基は、例えば、（ｉ）ＰＮＡオリゴマーの第２級アミンと修飾核酸塩基の反応部位（アルデヒド基）との間の可逆的なイミニウム種の形成、また、（ｉｉ）修飾核酸塩基と核酸の核酸塩基との間の水素結合の形成によって、核酸／ＰＮＡ二本鎖に組み込まれ得る。
【００５６】
一つの実施形態において、上記方法は、更に、核酸／ＰＮＡ二本鎖と統合された、核酸のヌクレオチドと相補的な（すなわち、一組になった）塩基を捕捉する工程を備えることができる。例えば、ＰＮＡオリゴマーの第２級アミンと修飾核酸塩基の可逆的な共有結合反応が可能な基との間の可逆反応を停止することができる。例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤を用いて、イミニウム種を還元して第３級アミンを安定化させる。
【００５７】
「核酸配列の一部と混成することが可能な」という語句は、ＰＮＡオリゴマーは、核酸配列の一部と相補的であるか又は核酸配列の一部とある程度の相同性を共有することを意味すると理解できる。
【００５８】
当業者は、核酸／ＰＮＡ二本鎖と接触した各修飾核酸塩基上に存在する検出可能なタグを用いて、どの修飾核酸が核酸／ＰＮＡ二本鎖に組み込まれたか検出できることを容易に理解することになる。このように、核酸のヌクレオチドの特徴づけは、容易に達成できる。例えば、核酸／ＰＮＡ二本鎖と統合していることが分かった修飾核酸塩基が、チミン核酸塩基を備えることを示すタグを備える場合、標準的な相補的核酸の対形成に従って、核酸のヌクレオチドは、アデニン核酸塩基を備えることが必要である。
【００５９】
理論に束縛されることを望むものではないが、核酸の核酸塩基と相補的な修飾核酸塩基の統合は、相補的な（適合した）及び不適合の核酸塩基の様々な相互作用の強さと、４つの修飾核酸塩基の相対的濃度とに関連する動的選択過程の例を示すことができ、緩衝液濃度、ｐＨ、温度の変化及び異なる触媒の使用によって制御できる。動的選択過程は、当業者によく知られており、多くの相補的成分がテンプレートの存在下で一緒に混合される系を包含する（J.M. Lehn, Nat. Rev. Drug Disc, 2002 1, 26-36）。このような系において設定する動的平衡によって、最も強く結合した配位子が優位となるため、テンプレートは、付加した様々な成分から、それ特有の「配位子」又は「パートナー」を「構築」又は選択する。
【００６０】
有利には、核酸／ＰＮＡ二本鎖は、上述した修飾核酸塩基のそれぞれと接触する。典型的には、核酸／ＰＮＡ二本鎖は、核酸サンプルに存在し得る核酸塩基のそれぞれと相補的な核酸塩基を備える修飾核酸塩基と接触することになる。例えば、一つの実施形態において、核酸／ＰＮＡ二本鎖は、上述した修飾アデノシン、グアニン、シトシン、及びチミン塩基と接触し得る。更に、ここで説明する方法で用いた各種の修飾塩基が、他の修飾塩基と個別に区別できるタグを備えることを確保することで、核酸サンプルにおけるヌクレオチドの特徴づけを容易に達成できる。
【００６１】
ここで説明する方法を溶液中で行う間においては、核酸又はＰＮＡオリゴマーを、何らかの形の支持体、好ましくは固体の支持体に固定化するか又は結合することが有利となり得る。一つの実施形態において、支持体は、ガラス、ニトロセルロース、セルロース、プラスチック、アガロース、ビーズ、金属（例えば金等）等を備えることができる。ビーズの場合、約１ｎｍから約２ｍｍの大きさが好ましい。
【００６２】
第５態様において、本発明は、核酸のヌクレオチドを特徴づける代替方法を提供する。上述したように、「特徴づける」という語は、ヌクレオチドの特定の核酸塩基を同定する行為を包含する。先に与えた定義の全てを本発明のこの態様に適用できることに留意されたい。第５態様に従う方法は、
（ａ）核酸配列を、特徴づけられるヌクレオチドの核酸配列上流の一部に相補的で、更に可逆的な共有結合反応が可能な官能基を備えるＰＮＡオリゴマーと混成させ、核酸／ＰＮＡ二本鎖を形成する工程と、
（ｂ）核酸／ＰＮＡ二本鎖を、本発明の第２態様に従う修飾ＰＮＡ単量体と接触させる工程と、
を含み、
ここで、核酸／ＰＮＡ二本鎖と統合する修飾ＰＮＡ単量体は、ヌクレオチドの核酸塩基に相補的であり、前記ヌクレオチドは、ＰＮＡ単量体の検出可能なタグを用いて特徴づけられる。
【００６３】
好ましくは、ＰＮＡオリゴマーは、特徴づけられるヌクレオチドのすぐ上流に位置する核酸の配列と混成し又は相補的である。言い換えれば、ＰＮＡオリゴマーは、核酸のヌクレオチドに対して位置３'での核酸配列と混成又は結合し、ＰＮＡオリゴマーの末端（又はＮ-ｅｎｄ）残基が、特徴づけられるヌクレオチドのすぐ近くに位置するようにする。
【００６４】
有利には、核酸／ＰＮＡ二本鎖は、核酸サンプルに存在し得る核酸塩基のそれぞれと相補的な核酸塩基を備える修飾ＰＮＡ単量体（本発明の第２態様によって与えられるもの等）と接触する。例えば、一つの実施形態において、核酸／ＰＮＡ二本鎖は、上述したアデノシン、グアニン、シトシン及びチミン核酸塩基を備える修飾ＰＮＡ単量体と接触し得る。
【００６５】
当業者が理解することには、ＰＮＡ単量体が核酸／ＰＮＡ二本鎖と接触するとき、核酸の核酸塩基と相補的な修飾核酸塩基を備えるＰＮＡ単量体は、（上述の）動的選択によって、核酸／ＰＮＡ二本鎖中に組み込まれることになる。
【００６６】
ここで説明する方法、特には本発明の第５態様によって与えられる方法は、本発明によって与えられるＰＮＡ二量体を利用することができる。かかる場合、例えば上記工程（ｂ）において説明するようにＰＮＡ単量体を用いるのではなく、第５態様によって与えられる方法は、ここで説明するＰＮＡ二量体（又は三量体）を利用することになる。更に、特徴づけられるヌクレオチドを備える核酸配列と混成したＰＮＡオリゴマーは、特徴づけられるヌクレオチドの上流で、ＰＮＡ二量体の末端（又はＮ-ｅｎｄ）残基が、特徴づけられるヌクレオチドのすぐ近くに位置するヌクレオチドに隣接するようにして混成できる。このようにして、特徴づけられるヌクレオチドを含有する核酸ストランドと正しく混成させるため、ＰＮＡ二量体は、２つの相補的な核酸塩基を備えることが必要であり、一方は、特徴づけられるヌクレオチドに相補的で、他方は、それらのすぐ上流のヌクレオチドに相補的である。
【００６７】
当業者が理解することには、ＰＮＡ単量体又は二量体ではなくＰＮＡ三量体を用いる場合、ＰＮＡオリゴマーは、特徴づけられるヌクレオチドを備える核酸配列に混成することができ、ＰＮＡオリゴマーのＮ-末端と配列決定されるヌクレオチドとの間に核酸配列の２つのヌクレオチドがあるようにする。このようにして、ＰＮＡ三量体の正しい組み込みは、３つの相補的な核酸塩基を所有することが必要であり、２つは、特徴づけられるヌクレオチドのすぐ上流のヌクレオチドに相補的で、１つは、特徴づけられるヌクレオチドに相補的である。
【００６８】
一つの実施形態において、本発明の第５態様によって与えられる方法は、更に、例えば可逆反応を停止することで、核酸の核酸塩基に相補的な核酸塩基を備える修飾ＰＮＡ単量体（又はＰＮＡ二量体／三量体）を捕捉する工程を含むことができる。例えば、イミン種は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤を用いた還元的アミノ化として知られる過程において還元できる。
【００６９】
有利には、修飾ＰＮＡ単量体（又はＰＮＡ二量体／三量体）のそれぞれが、他の種類のＰＮＡ単量体（二量体又は三量体）上の検出可能なタグと区別できる少なくとも１つの検出可能なタグで標識化されるため、統合された特定の単量体（二量体又は三量体）の検出は容易に達成できる。
【００７０】
当業者が容易に理解することには、ＰＮＡ二量体を用いる場合、考慮される必要がある４つの標準的なヌクレオチド（Ａ，Ｇ，Ｔ及びＧ）の考えられる１６個の組み合わせがある。このように、ＰＮＡ二量体を用いる場合、ここで説明する方法は、１６個の可能性のあるＰＮＡ二量体全部の付加を必要とすることがある。同様に、ＰＮＡ三量体を用いる場合、４つの標準的なヌクレオチドの考えられる６４個の組み合わせがあり、このようにしてＰＮＡ三量体を用いる場合、ここで説明する方法は、６４個のＰＮＡ三量体全部の付加を必要とすることがある。
【００７１】
上述のように、上述の方法のそれぞれは、核酸配列の特定の核酸塩基／ヌクレオチドの特徴づけを参照しながら説明されたが、該方法によって、使用者が、核酸サンプルに存在するＳＮＰを特徴づけできることも理解されたい。例えば、ＳＮＰが遺伝子内の特定の座位で起こることが分かれば、ＳＮＰ座位の側部又は（上述の）ＳＮＰ座位のすぐ上流で混成するＰＮＡオリゴマーを設計することによって、ＳＮＰを特徴づける（すなわち、どの特定のＳＮＰ対立遺伝子が該座位に存在するかを同定する）ことが可能になる。かかる方法は、特定の遺伝子疾患に関連する変異を検出するのに特に有用となり得る。
【００７２】
第６態様において、本発明は、核酸を配列決定する方法を提供するものであり、前記方法は、
（ａ）核酸配列を、前記核酸配列の一部と混成して、本発明の第２態様に従うＰＮＡ単量体と相互作用することが可能な官能基をＮ-末端位置にて有するＰＮＡオリゴマーと、核酸／ＰＮＡ二本鎖を形成できる条件下で混成させる工程と、
（ｂ）核酸／ＰＮＡ二本鎖を、本発明の第２態様に従うＰＮＡ単量体に接触させる工程と、
を含み、
ここで、核酸／ＰＮＡ二本鎖と統合するＰＮＡ単量体は、その後にＰＮＡ単量体の検出可能なタグを用いて同定できる核酸配列の核酸塩基に相補的である。
【００７３】
各ＰＮＡ単量体は、他の核酸塩基を備えるＰＮＡ単量体の検出可能なタグと区別できる検出可能なタグで標識化できるため、核酸／ＰＮＡ二本鎖内に組み込まれるか又は核酸／ＰＮＡ二本鎖と統合されるＰＮＡ単量体のタグを検出することで、核酸を配列決定することができる。
【００７４】
加えて、上述したように、本発明の第６態様によって与えられる方法は、工程（ｂ）においてＰＮＡ単量体を用いるよりも、本発明によって与えられるＰＮＡ二量体及び／又は三量体を用いることができる。
【００７５】
好ましくは、核酸／ＰＮＡ二本鎖と接触したＰＮＡ単量体（又は二量体若しくは三量体）のそれぞれは、（上述したように）そのＮ-末端位置に遮断基を備えることができる。かかるＰＮＡ単量体（又は二量体若しくは三量体）は、以下「ブロックトＰＮＡ単量体（二量体／三量体）」と呼ばれる。ブロックトＰＮＡ単量体（二量体／三量体）を用いる方法は、特に、一つのＰＮＡ単量体のみが１回に核酸／ＰＮＡ二本鎖と統合できるので有利である。その後に統合される更なるＰＮＡ単量体（二量体又は三量体）のため、統合したＰＮＡ単量体（二量体又は三量体）の遮断基を（任意には、いずれかの検出可能なタグと共に）まず除去しなければならない。このようにして、更なるＰＮＡ単量体（二量体又は三量体：ブロックト又はそうでないもの）を付加する前に、統合した修飾核酸塩基の検出可能なタグを同定でき、対応する核酸の核酸塩基を決定できる。
【００７６】
保護基を（存在するいずれかのタグと共に）除去するのに使用できる技術は、当業者に知られており、例えば、塩基性系開裂、酸性系開裂、ジスルフィド還元、金属系触媒反応、光系開裂反応を含むことができる（Ｇｒｅｅｎ，Wiley-Interscience, New York, 1999）。
【００７７】
統合した修飾核酸塩基上に存在する保護基及びいずれかのタグの除去は、遊離アミン、アルデヒド／ケトン、ヒドラジド、ヒドラジン、アルコキシアミン、アルコール、ジオール及び／又はボロン酸等、他のＰＮＡ単量体と可逆的に反応することが可能な部分を露出するか又は得ることができる。加えて、該方法は、更に、更なる可逆的な反応を防ぐために統合したＰＮＡ単量体を捕捉する工程を備えることができる。例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムによるイミン種の還元と、更には、例えば塩化アセチルを用いたアミド化によって生成した第２級アミンの捕捉である。核酸／ＰＮＡ二本鎖と統合するための各修飾核酸塩基は、核酸の相補的な核酸塩基に結合するため、ここで説明する方法は、その後に核酸の配列を決定することを可能にする。
【００７８】
ここで説明する各方法は、従来技術を越えて多くの利点を提供する。特に、酵素を必要とせず、標識化された三リン酸塩を必要とせず、標識化されたＰＮＡ単量体、二量体又は三量体のみを使用する。加えて、例えば、酵素の要求によってのみ使用されるアルキンの使用等の既存の戦略のような、現在のフルオロフォア付着戦略を使用する必要がない（Q. Meng et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 3248-3252）。
【００７９】
当業者が理解することには、本発明によって与えられるいずれかの方法、特には本発明の第４態様、第５態様及び第６態様によって与えられる方法は、マイクロアレイ技術の使用を必要とする場合がある。例えば、特徴づけられるヌクレオチドを備える核酸は、例えば、マイクロプリンティングシステム等を用いて、何らかの形の適切な支持体上に固定化され得る。このように、多くの異なる核酸は、このような離れた場所の支持体上に固定化できる。
【００８０】
他の実施形態において、特徴づけられるヌクレオチドを備える核酸は、他の成分と共に溶液中に入れられる場合があり、すなわち、ＰＮＡオリゴマー、修飾核酸塩基等も溶液中に加えられる。
【００８１】
更なる実施形態において、特徴づけられるヌクレオチドを備える核酸は、例えば、質量分析に適切な金表面等の支持体上に固定化できる。
【００８２】
本発明の第７態様において、本発明の第４態様、第５態様及び第６態様によって与えられる方法に必要な試薬及び要素を備えるキットを提供する。一つの実施形態において、キットは、核酸のヌクレオチドを特徴づける方法及び／又は核酸を配列決定する方法に有用な試薬及び要素を提供し、前記キットは、
（ａ）核酸の一部と混成して、特徴づけられるヌクレオチドの核酸塩基に相補的な核酸塩基を欠くことが可能なペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマー、
（ｂ）本発明に従う修飾核酸塩基、
（ｃ）ここで説明されるＰＮＡ単量体、二量体、三量体及び／又はオリゴマー、及び
（ｄ）特徴づけられるヌクレオチドの核酸配列上流の一部に相補的で、更に可逆的な共有結合反応が可能な官能基を備えるＰＮＡオリゴマー
からなる群から選択される要素を備える。
【００８３】
当業者が理解することには、本発明は、ＤＮＡ模倣のＰＮＡを参照しながら説明されたが、他のＤＮＡ模倣物もまた、核酸塩基の動的な組み込みが可能であるとすれば使用できる。かかる代替の模倣物には、R. J. Worthington et al., Org. Biomol. Chem.,2007, 5, 249-259によって開示されるものが含まれる。加えて、本発明の第４態様、第５態様、第６態様及び第７態様によって与えられる方法において、修飾ＤＮＡ二量体、三量体及び／又はオリゴマーを用いることが可能となる。より詳細には、配列決定される核酸配列と混成し又は特徴づけられるヌクレオチドを備えることが可能なＰＮＡオリゴマーの使用を必要とするこれらの工程は、代案の実施形態において、可逆反応が可能な必須の官能基及び／又は特徴づけられるヌクレオチドに対応する空白位置を含むように修飾した、ＤＮＡ二量体、三量体及び／又はオリゴマーを利用する。
【００８４】
図を参照しながら、本発明を詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】ＰＮＡ−ＤＮＡ混成を示すＰＮＡ及びＤＮＡの構造である。
【図２】動的系ＳＮＰ分析である。ＳＮＰ位置と反対の塩基を欠いている相補的ＰＮＡ配列は、ＳＮＰを備える核酸配列と混成し、核酸／ＰＮＡ二本鎖を形成する。動的付着によって、ＳＮＰヌクレオチドに相補的な塩基は、核酸／ＰＮＡ二本鎖と統合する。各修飾塩基は、フルオロフォアとなり得る特定のタグで標識化できる（図１参照）。
【図３】図２に示す動的系ＳＮＰ分析の説明図である。
【図４】動的系ＳＮＰ分析の代替方法である。ＤＮＡオリゴマーは、Ｎ末端で遊離アミノ基を有する相補的ＰＮＡオリゴマーと混成し、ＳＮＰ核酸塩基に相補的な塩基の動的付着を可能とする。
【図５】図４に示す動的系ＳＮＰ分析の説明図である。
【図６】動的系ＤＮＡ配列決定の説明図である。（ａ）表面上に付着するか又は溶液中にある、Ｎ末端位置で遊離アミノ基を含有するＰＮＡオリゴマー、（ｂ）対応する「ＰＮＡプライマー」に対するＤＮＡテンプレート混成、（ｃ）４つのＮ-保護アルデヒドＰＮＡ単量体の付加、（ｄ）対応する核酸塩基の動的付着、（ｅ）保護基とタグの双方の除去、還元過程による成長ストランドの「固定」、及び（ｆ）繰り返しである。
【図７】動的系ＤＮＡ配列決定の説明図である。（ａ）表面上に付着するか又は溶液中にある、ＤＮＡオリゴマー、（ｂ）Ｎ末端位置で遊離アミノ基を有する「ＰＮＡプライマー」が対応するＤＮＡテンプレートと混成すること、（ｃ）４つのＮ-保護アルデヒドＰＮＡ単量体の付加、（ｄ）対応する核酸塩基の動的付着、（ｅ）保護基とタグの双方の除去、還元過程による成長ストランドの「固定」、及び（ｆ）繰り返しである。
【図８】図６及び図７の動的系ＤＮＡ配列決定である。
【図９】アルデヒド塩基の合成：（ｉ）ブロモアルキルアセタールを用いた核酸塩基のＮ-アルキル化、（ｉｉ）Ｓｏｎｏｇａｓｈｉｒａ反応を介した核酸塩基の標識化、（ｉｉｉ）アセタール保護基の脱保護である。
【図１０】保護した／タグを付けたＰＮＡ-アルデヒドの合成：（ｉ）プライマーの保護、（ｉｉ）CMmtCH2COOH、AMmtCH2COOH又はGMmtCH2COOH又はT-CH2COOH、DCC、HOBt；NB＝核酸塩基である。
【図１１】８のＤＮＡオリゴマー（表１）及び蛍光標識マーカーをプリントした後のパターンの配置図である。
【図１２】空白位置を含有するＰＮＡ１３と混成した蛍光ＤＮＡマーカーをプラスした、８のＤＮＡオリゴマー（表１）を含有するスライドのＦＩＴＣチャンネルイメージである。ＤＮＡマーカーのみを検出する。
【図１３】空白位置を含有するＰＮＡ１３と混成した蛍光ＤＮＡマーカーをプラスした、８のＤＮＡオリゴマー（表１）を含有するスライドのＣｙ５チャンネルイメージであり、ＰＮＡ−ＤＮＡの逆平行二本鎖を混成することができる。
【図１４Ａ】（Ａ）圧電ピペットを設けたＭｉｃｒｏｄｒｏｐロボットを用いてアルデヒドスライド上にプリントしたアミノ修飾オリゴヌクレオチド（表２）のパターンを示す（３×８パターン）。
【図１４Ｂ】（Ｂ）ＰＮＡ１３及び表２で見られるＤＮＡオリゴヌクレオチドによって形成された逆平行二本鎖の略図である。
【図１４Ｃ】（Ｃ）オリゴ１及び２（表２）と混成したＰＮＡ１３を示す蛍光イメージ（Ｃｙ５チャンネル）である。
【図１４Ｄ】（Ｄ）ＤＮＡ−ＰＮＡの１３の二本鎖を含有するアレイのアルデヒド９及び１０でのインキュベーション後の蛍光標識シトシンアルデヒド１０の動的組み込みを示すＦＩＴＣチャンネルイメージである。蛍光シグナルは、Ｇ-逆平行オリゴ２（表２，図１４Ａ及び１４Ｂ）をプリントした場所のみで検出された。
【図１４Ｅ】（Ｅ）インサイチューでのアプローチの結果と、蛍光標識シトシンアルデヒドの動的組み込みとを示す更なるＦＩＴＣチャンネルのイメージである。蛍光シグナルは、Ｇ-逆平行オリゴ２（表２，図１４Ａ及び１４Ｂ）をプリントした場所のみで検出された。
【図１５】（Ａ）第２核酸塩基が色素によって画定された場所を動的配列決定するためのアルデヒドの合成である。（Ｂ）第１核酸塩基が色素によって画定されたＰＮＡ二量体である。
【図１６】（Ａ）二量体の第２核酸塩基が検出可能なタグで標識化されたＰＮＡ二量体を用いたヌクレオチド特徴づけの方法である。（Ｂ）第１核酸塩基が検出可能なタグで標識化されたＰＮＡ二量体を利用したヌクレオチド特徴づけの代替方法である。
【図１７】質量分析を基にしたＳＮＰ分析の方法を示す概略図である。
【図１８】質量分析を基にしたＳＮＰ分析で用いる修飾核酸塩基の一般的な構造を示す。
【図１９】質量分析を基にした核酸配列決定方法に有用な修飾核酸塩基の一般的な構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
方法
標識化塩基、ビルディングブロック及びプライマーの合成
（ｉ）ＰＮＡ−アルデヒド単量体及びアルデヒド塩基。図９及び１０において示されるように用意した。この方法は、多くの保護基に適用でき、これには、Ｄｄｅ基、Ｆｍｏｃ基、開裂可能なチオール保護基（Ａｒｄｅｃ（アリールジチオエチルオキシカルボニル）光開裂保護基（ニトロベラチル系）及びフルオロフォアが含まれる。
【００８７】
上述の詳細な方法は、ブロモ及びヨード-ピリミジン及びプリン誘導体のプロパルギルアミンへの典型的なＳｏｎｏｇａｓｈｉｒａカップリングと、各種フルオロフォアでの蛍光標識化によって、蛍光標識物質を与えるのに適用できる（スキーム３参照）。このアプローチはまた、蛍光標識した「アルデヒド塩基」の合成にも適用できる（図６）。フルオロフォアの選択は、塩基の個々の検出を可能にする必要性によって決定することになる。
【００８８】
保護及びタグを付けたＰＮＡ−アルデヒドの合成：
標準的な化学に従って、ＰＮＡカルボン酸、ＰＮＡエステル又はＰＮＡアルコールからＰＮＡ−アルデヒド２を用意した（スキーム１）。１は、開示された方法に従って用意された（L. Bialy et al.. Tetrahedron 2005, 61, 8295-8305）。
【００８９】
【化２７】
0005759723.tif 000028
スキーム１．標的の合成．
【００９０】
例３をＷｅｉｎｒｅｂアミド４に転換しながら（スキーム２）、その後、標的アルデヒド２を与えるように還元した。４の過剰な還元を防ぐため、より軽度の還元剤リチウムトリ-tert-ブトキシアルミニウムヒドリド（ＬｉＡｌＨ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）３）をＬｉＡｌＨ４の代わりに用いた（M. Paris et al. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 1341-1344）。
【００９１】
【化２８】
0005759723.tif 000029
スキーム２．Ｗｅｉｎｒｅｂアミドの還元を経た標的アルデヒドの合成：（ａ）ＭｅＯＮＨＭｅ．ＨＣｌ，ＥＤＣ．ＨＣｌ，ＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ，Ｅｔ３Ｎ，ＤＭＦ，室温；（ｂ）ＬｉＡｌＨ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）３），ＴＨＦ，室温，収率６５％（ＨＰＬＣ）．
【００９２】
アルデヒドは、トレオニル樹脂上でのキャッチ・アンド・リリースストラテジーを用いて精製した（D.R. Liu et al. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 13924-13925）。
（ａ）樹脂の準備：アミノメチルＮｏｖａＧｅｌ  ＨＬをＤＭＦで約１０分かけて膨潤させた。その間、ＤＩＰＥＡをＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ及びＴＢＴＵのＤＭＦ溶液に加え、反応混合物を５分間振った。次いで、膨潤した樹脂を濾過し、活性化した保護トレオニンの溶液を加えた。得られた縣濁液を室温で２時間振った。次いで、樹脂を反応混合物から濾過し、ＤＭＦ（５回）、ＴＨＦ（５回）及びＤＣＭ（５回）で洗浄し、その後、４０℃の真空内で一晩乾燥させた。次に、該樹脂を約１０分間ＤＭＦ中で膨潤させて濾過し、その後、ＤＭＦ中の２０％ｖ／ｖピぺリジンで２回振った。その後、樹脂をＤＣＭ中の８０％ｖ／ｖＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）で振って、濾過し、ＤＣＭで１回洗浄し、再びＤＣＭ中の８０％ｖ／ｖＴＦＡで振った。樹脂を濾過し、ＤＣＭで（５回）洗浄し、４０℃の真空内で乾燥させた。
【００９３】
（ｂ）キャッチアンドリリースによるアルデヒドの精製
捕獲：脱保護したトレオニル除去樹脂に粗アルデヒドの溶液に加えた。混合物を室温で１時間振り、次いで樹脂を濾過及び洗浄した。放出：樹脂をＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ／ＤＣＭ／ＭｅＯＨの混合物（１０／５／５／８０，２ｍｌ×５）で２０分間振って洗浄し、洗浄物を真空で濃縮してアルデヒドを得た。
【００９４】
【化２９】
0005759723.tif 000030
スキーム３．不純アルデヒドのトレオニン修飾樹脂での縮合は、支持オキサゾリジンを生じる。洗浄後、開裂によって純アルデヒドを与える。
【００９５】
１．アルデヒド２への代替経路は、スキーム４に示されるようにＳ−ベンジルチオエステル５を経由するものである（P.T. Ho, et al. J. Org. Chem. 1993, 58, 2313-2316）。
【化３０】
0005759723.tif 000031
スキーム４：標的アルデヒドのＳ−ベンジルチオエステルを介した合成：（ａ）ベンジルメルカプタン，ＤＭＡＰ，ＤＣＣ，ＤＭＦ，室温，（ｂ）トリエチルシラン，Ｐｄ／Ｃ，ＴＨＦ，室温，２０時間，収率９５％（ＨＰＬＣ）．
【００９６】
代替経路は、メチルエステルを対応する第一級アルコールへの還元及びその後の酸化又はＰＮＡアルコールの直接合成及び酸化が含まれる。
【００９７】
ＳＮＰ分析のためのタグを付けた核酸塩基−アルデヒドの合成（方法１）：市販のハロ−核酸塩基から、マイクロ波照射下で２−（ブロモメチル）−１，３−ジオキソラン（スキーム５）でのアルキル化、その後のＴｆａ保護プロパルギルアミンでのＳｏｎｏｇａｓｈｉｒａ反応、Ｔｆａ保護基の脱保護、及びカルボン酸誘導体化色素とのカップリングによって、核酸塩基−アルデヒド６を用意した。
【００９８】
【化３１】
0005759723.tif 000032
スキーム５．核酸塩基−アルデヒドを合成するための一般的な戦略
【００９９】
例として、チミン及びシトシン誘導体をスキーム６及び７で説明したように合成した。
【０１００】
【化３２】
0005759723.tif 000033
スキーム６：ローダミン標識化シトシン−アルデヒド７の合成
【０１０１】
【化３３】
0005759723.tif 000034
スキーム７：フルオレセイン標識化チミン−アルデヒド８の合成
【０１０２】
核酸塩基のアセタールでのアルキル化
この過程は、ＴＨＦ中１００℃にて３０分間のマイクロ波放射を用いて最適化された。ＮＥｔ３と共に１．２当量の２−（ブロモメチル）−１，３−ジオキソランの使用によって、モノ−アルキル化生成物を４：１の比で生じさせた。
【０１０３】
核酸塩基の標識化は、アミノメチルアセチレンを用いたＳｏｎｏｇａｓｈｉｒａクロスカップリング反応を介して達成された。
（ａ）アンモニアでＴｆａ基を脱保護する前のＴｆａ保護アミノメチルアセチレンとのＳｏｎｏｇａｓｈｉｒａ反応。ＰｙＢＯＰは、カップリング剤である。
（ｂ）第２に研究された経路は、既に色素を有するアセチレン基とのＳｏｎｏｇａｓｈｉｒａ反応を行うことであった。この反応は、ヒドロキシニトロベンゾイック樹脂を用いた支持された活性化色素とアミノメチルアセチレンを反応させることによって行われた（スキーム８）。
【０１０４】
【化３４】
0005759723.tif 000035
スキーム８：支持された活性化色素を用いた標識化アセチレンの合成
【０１０５】
最後に、Ｈ２Ｏ中２ＮのＨＣｌを用いてアセタールを脱保護し、生成物７及び８を与えた。
【０１０６】
「クランプ」ＳＮＰ分析のための蛍光標識アルデヒド塩基の合成
核酸塩基のアルキル化は、L. Christensen et al., Nucl. Acids Res., 1998, 26, 2735-2739によって説明された修飾手順を用いて達成された。１当量のハロゲン化核酸塩基をＮａＨ（１．２当量）と共にＤＭＦ中に溶解し、その後３０分間室温で撹拌した。次いで、１．１２当量のブロモアセトアルデヒドジエチルアセタールを加えて、マイクロ波放射下で３０分間１２０℃にて溶液を撹拌した。
【０１０７】
アルキル化ハロ塩基は、N.K. Garg et al. Chem. Commun., 2005, 4551-4553に記載の手順に従い、Ｔｆａ保護アミノメチルアセチレンを用いたＳｏｎｏｇａｓｈｉｒａクロスカップリングを受けた。ＭｅＯＨ中、Ｔｆａ基をアンモニアで脱保護し、カルボキシル基を含有する色素をカップリングするのに用いる遊離第１級アミンを与えた。アミドカップリングは、ＨＯＢｔ／ＥＤＣｌ  ＨＣｌカップリング剤を用いて達成された。
【０１０８】
アセタール脱保護は、２４時間室温での７５％ＴＦＡ／１２．５％Ｈ２Ｏ／１２．５％ＣＨ３ＣＮによる処理によって達成された。或いは、６０℃にてマイクロ波放射下で２時間加熱する。アセタールは、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製された。ＲＰ−ＨＰＬＣは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｐｒｏｄｉｇｙ  Ｃ１８逆相カラム（２５０ｍｍ×１０ｍｍ×５ｍｍ）を設けたＨＰ１１００システム上で、２．５ｍＬ／ｍｉｎの流速にて行われ、（Ａ）Ｈ２Ｏ中０．１％ＴＦＡ及び（Ｂ）アセトニトリル中０．０４２％ＴＦＡで溶出し、０％（Ｂ）での４分の初期均一溶媒期間、その後の２５分間で０〜５０％（Ｂ）の勾配、１０分間で５０〜１００％（Ｂ）の勾配で、５分間１００％（Ｂ）で保持した。ＥＳＩ−／ＭＳ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＬＣ／ＭＳＤシリーズ１１００四重極質量分析計（ＱＭＳ）上、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）モードにて行われた。最終アルデヒドは、ＮＭＲ及びＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）によって同定された。
【０１０９】
例として、ローダミン標識化チミンアルデヒド（スキーム９）及びフルオレセイン標識化シトシンアルデヒド（スキーム１０）を上述のように生成した。このようにして修飾した核酸塩基は、ここで説明するいずれかの方法、特にＳＮＰ特徴づけ及び／又は分析の方法において使用できる。
【０１１０】
【化３５】
0005759723.tif 000036
スキーム９：「クランプ」アプローチを用いたＳＮＰ分析のためのローダミン標識化チミン９アルデヒドの合成
【０１１１】
【化３６】
0005759723.tif 000037
スキーム１０：「クランプ」アプローチを用いたＳＮＰ分析のためのフルオレセイン標識化シトシンアルデヒド１０の合成
【０１１２】
当業者が理解することには、ＢＯＤＩＰＹ色素を用いたアデニン及びグアニン誘導体は、同様の方法において準備することになる。かかる場合、ハロ核酸塩基は、以下のものである。
【化３７】
0005759723.tif 000038
【０１１３】
Ｎ−２（Ｄｄｅ−アミノ）エチル−Ｎ−ｂｏｃ−グリシン１１の合成
【化３８】
0005759723.tif 000039
メチルＮ−２（Ｄｄｅ−アミノ）エチル−グリシンンエステル（１ｍｍｏｌ）（L. Bialy et al.., Tetrahedron, 2005, 61, 8295-8305）の乾燥ＴＨＦ溶液（１０ｍＬ，０．１Ｍ）に、Ｂｏｃ２Ｏ（１．１ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１．１ｍｍｏｌ）を加え、反応を５時間撹拌し、ＴＬＣによって追跡した。溶媒を除去した後、クルードをＤＣＭ中に溶解し、ＮａＨＣＯ３，ＫＨＳＯ４及び塩水で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４ａｎｈで乾燥し、濃縮して黄色の固体を得た。更なる精製をせず、クルードをＭｅＯＨ中に溶解し、２ＭのＣｓ２ＣＯ３水溶液を加えた。１．５時間後、反応をＫＨＳＯ４でｐＨ３まで酸性化した。酸は沈殿し、濾過及び乾燥して、白色の固体としての酸１１を得た。
【０１１４】
ＰＮＡオリゴマー１２及び１３の合成
ＰＮＡオリゴマー１２（Ｈ２Ｎ−ＴＡＣＴＡＣＡＴＣ ＣＴＴＣＣ−ＣＯＮＨ２）及び１３（Ｃｙ５ＣＯＨＮ−ＴＡＣＴＡＣＡＴＣ ＣＴＴＣＣ−ＣＯＮＨ２） ＝ｂｏｃ脱保護した空白単量体９をＤｄｅ保護単量体（Bradley et al., Tetrahedron, 2005, 61, 8295-8305）を用いて固相上で（JJ. Diaz-Mochon et al., Org. Lett. 2004, 6, 1127-1129）合成した。空白単量体を挿入するため、Ｎ−２（Ｄｄｅ−アミノ）エチル−Ｎ−ｂｏｃ−グリシン１１を用いた。
【０１１５】
ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
ＰＮＡ１２（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ；理論質量：３７８０，観測質量：３７８１（Ｍ＋１）．
ＰＮＡ１３（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ；理論質量：４２４４，観測質量：４２４６（Ｍ＋１）．
【０１１６】
アレイベースのスクリーニング
８−アミノ修飾オリゴヌクレオチド（表１）を、ＳＮＰ分析のためのＣｏｄｅ−ｌｉｎｋ（Ａｍｅｒｓａｈｍ）スライド上に接触プリントした。それらのオリゴは、ＰＮＡ１３と混成した場合の平行配向（ＤＮＡ３'末端に面するＰＮＡのＣ末端）又は逆平行（ＤＮＡ３'末端に面するＰＮＡのＮ末端）のいずれかを有するように設計された。
【０１１７】
【表１】
0005759723.tif 000040
【０１１８】
スライドは、Ｇｅｎｅｔｉｘ  Ｑｍｉｎｉ  Ａｒｒａｙｅｒ及び固体ピンを用いてプリントされた。ＦＩＴＣ標識化ＤＮＡオリゴは、マーカーとして使用され、図１１に示す以下のパターンを用いた。
【０１１９】
ＨｙｂＧｅｎ緩衝液（Ｇｅｎｅｔｉｘ）中のＰＮＡ１３の２μＭ溶液を、スライド上でＨｙｂ４混成ステーションを用いて混成した（６時間に亘って６５℃〜４０℃、その後の２時間４０℃）。洗浄後、スライドをＬａｖｉｓｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ＦＩＴＣ及びＣｙ５フィルターセットを用いてスキャンした（図１２及び１３）。図１２は、ＦＩＴＣチャンネルを示し、マーカーのみを検出しており、図１３（Ｃｙ５チャンネル）では、逆平行配向のオリゴのみが、修飾ＰＮＡ１３を混成することができた。
【０１２０】
ＳＮＰ分析
アミノ修飾オリゴヌクレオチド（表２）をＳＮＰ分析のためのアルデヒドスライド（Ｇｅｎｅｔｉｘ）上にインクジェットプリントした。それらのオリゴは、ＰＮＡ１３と混成する場合の逆平行（ＤＮＡ３'末端に面するＰＮＡのＮ末端）配向に従って混成するように設計された。
【０１２１】
【表２】
0005759723.tif 000041
【０１２２】
スライドは、Ｍｉｃｒｏｄｒｏｐロボット及び圧電ピペットを用いてプリントされた。図１４Ａは、用いたパターンを示す。
【０１２３】
ＨｙｂＧｅｎ緩衝液（Ｇｅｎｅｔｉｘ）中のＰＮＡ１３の２μＭ溶液を、５５℃〜３０℃で１２時間以上のＨｙｂ４混成ステーションを用いてスライド上で混成した。洗浄後、スライドをＬａｖｉｓｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓｃａｎｎｅｒを用いてスキャンした。図１４Ｂは、形成された二本鎖を示す。図１４Ｃ（Ｃｙ５チャンネル）は、逆平行配向を有するオリゴが修飾ＰＮＡ１３を混成できたことを示す。
【０１２４】
アレイを混成した時点で、アルデヒド塩基９及び１０をアレイでインキュベートした。アレイが、各アルデヒド５μＭで、１ｍＭのＮａＢＣＮＨ３と共に室温で１６時間（図１４Ｄ参照）、ｐＨ６（０．１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ）及びｐＨ８．５（０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３；０．３Ｍ  ＮａＣｌ）の両方でインキュベートした場合に、動的組み込みが観察された。フルオレセインチャンネル（ＦＩＴＣチャンネル）を用いて得た画像は、ＤＮＡオリゴ２（Ｇ逆平行）を検出する（図１４Ｄ）。このシグナルは、フルオレセイン色素を有する塩基−アルデヒドに由来し、この場合、シトシンアルデヒド１０は、Ｇに完全に一致する。
【０１２５】
また、第２のアプローチを使用した。ＨｙｂＧｅｎ緩衝液（Ｇｅｎｅｔｉｘ）中のＰＮＡ１３の２μＭ溶液に、アルデヒド９及び１０を２μＭの濃度で１ｍＭのＮａＢＣＮＨ３と共に加えた。この溶液を用いて、表２に示すＤＮＡオリゴを含有するスライドを混成した。５５℃〜３０℃で１２時間混成した。これらの条件下、フルオレスセインチャンネル（ＦＩＴＣチャンネル）を用いて得た画像は、ＤＮＡオリゴ２（Ｇ逆平行；図１４Ｅ参照）を検出する。このシグナルは、フルオレスセイン色素を有する塩基−アルデヒドに由来し、この場合、シトシンアルデヒド１０は、Ｇに完全に一致する。
【０１２６】
溶液ベースのスクリーニング
ＰＮＡオリゴマー１２の合成
ＰＮＡオリゴマー１４（ＮＨ２−ＣＡＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴ−ＣＯＮＨ２）は、Ｄｄｅ保護単量体（L. Bialy et al., Tetrahedron, 2005, 61, 8295-8305)を用いて固相上で合成した（J.J. Diaz-Mochon et al., Org. Lett. 2004, 6, 1127-1129）。
ＰＮＡ１４（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ；理論質量：３３４５，観測質量：３３４８（Ｍ＋１）．
ＰＮＡ１４に相補的な２つのアミノ修飾オリゴヌクレオチドは、質量分析及び固相分析を用いて溶液中のＤＮＡ分析に使用された。
【０１２７】
【表３】
0005759723.tif 000042
【０１２８】
ＨｙｂＧｅｎ緩衝液中のＰＮＡ１４の１μＭ溶液に、ＴＥ緩衝液中のＤＮＡオリゴマーの１．２μＭ溶液を加えた（表３）。この混合物を６５℃まで加熱し、その後ゆっくり４０℃まで冷却した。この段階で、ＰＮＡ単量体アルデヒド２を加える前に、異なるｐＨの変更を行った。延長反応は、逆相カラム及びアンモニア緩衝液を用いたＨＰＬＣ及び質量分析によって行った。
【０１２９】
動的延長のための蛍光標識したＰＮＡアルデヒド単量体の合成
これらの化合物は、ＰＮＡ単量体の合成のためのL. Bialy et al. Tetrahedron, 2006, 61, 8295-8305によって開発された修飾プロトコルに従って合成された。主な違いは、マイクロ波を用いたエチレンジアミンのブロモアセトアルデヒドジエチルアセタールによる最初のアルキル化である（スキーム１１参照）。
【０１３０】
溶液中のＤｄｅ脱保護は、ヒドラジン及び水を用いて室温で１６時間かけて達成された。色素カップリングは、ＥＤＣＩ及びＨＯＢｔを用いて行った。最後の脱保護は、３０分間かけてアセトニトリル中のＴＦＡを用いて達成された。精製及び分析は、上述のように行われた。
【０１３１】
【化３９】
0005759723.tif 000043
【０１３２】
例として、フルオレセイン標識化ＰＮＡ−アルデヒドチミン及びローダミン標識化ＰＮＡ−アルデヒドシトシンを準備した−スキーム１２参照。
【０１３３】
【化４０】
0005759723.tif 000044
【０１３４】
当業者は、ＢＯＤＩＰＹ色素を用いたアデニン及びグアニン誘導体が同様の方法で準備できることを理解することになる。
【０１３５】
配列決定のための二量体の使用
アルデヒドを、追加のＰＮＡビルディングブロックへの付着によって準備した。これは、分裂及び混合戦略を用いた固相法によって達成した１６の化合物の混合物の準備を必要とする。この場合、４のＮ−保護アルデヒド（Ａ，Ｔ，Ｃ及びＧ）は、ヒドラジンリンカー（A. Lee et. al., J. Am. Chem. Soc, 1999, 121, 9907-9914参照）又はトレオニル除去樹脂（D.M. Rosenbaum and D.R. Liu, J. Am. Chem. Soc, 2003 125, 13924-13925）上に固定化される。その後、保護基を開裂し、４つの樹脂を混合して、４つのプールに分けて、標準的な保護ＰＮＡ単量体をカップリングする。最後の核酸塩基に従う特定の色素を含有する活性化ジスルフィド（スキーム１３）を用いた脱保護及び標識化に続いて、樹脂の全体的な混合及び開裂により、１６のＰＮＡ二量体を与える（図１５Ａ）。
【０１３６】
【化４１】
0005759723.tif 000045
【０１３７】
図１６（Ａ及びＢ）は、本発明によって与えられるＰＮＡ二量体／三量体を利用するＳＮＰｓ／ヌクレオチドの特徴づけ方法及び／又は配列決定方法について詳しく述べる。４つのＤＮＡオリゴマーは、１つの位置においてのみ変えてスライドに付着させた（簡単に示すため６つの塩基のみを示す）。単一の相補的なＰＮＡ配列をアレイに混成させる（再び示すが、ＰＮＡは１２塩基長さで、明確のため２つのみ示す）。１６のＰＮＡ−二量体アルデヒドのすべてを加えて、対応する二量体の動的付着させる。この場合、二量体の第２塩基を、検出可能なタグを用いて同定することになる。
【０１３８】
代わりの実施形態においては、第１核酸塩基を検出可能なタグを用いて同定し、第２核酸塩基がランダムとなるように、二量体を作る。この場合、第１核酸塩基は、環中に色素を有するが、その保護基は、いずれの色素も有しない。図１５Ｂは、この形の二量体の例を示す。
【０１３９】
金−アレイ上での質量分析に基づいた検出のためのスキーム
金−チオール自己組織化した単層（ＳＡＭ）を通してＤＮＡオリゴが付着した金表面は、遺伝物質の分析に使用できる。例えば、金表面上でのチオール修飾ＤＮＡオリゴを用いたＳＡＭの形成及びＰＮＡオリゴマーの混成に続いて、アルデヒド修飾核酸塩基を用いた動的組み込みを用いて、ＳＮＰｓ／ヌクレオチドを特徴づけしたり及び／又は核酸を配列決定したりすることができる。上述したように、ＰＮＡストランドに組み込んだ塩基は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって検出できる（金表面の使用及びＰＮＡ−ＤＮＡ混成の検出、Brandt et al/ Nucleic Acid Research, 2003, 31, e119参照）。
【０１４０】
ＳＮＰ分析を行うとき、核酸塩基は、実質的に上述した修飾核酸塩基、即ちそれらに付着した色素を有する修飾核酸塩基、未修飾核酸塩基、又は臭化物タグ等の質量−タグを含むように修飾した核酸塩基とすることができ、明確な同位体パターンを与える（図１７）。
【０１４１】
質量に基づいたＳＮＰ分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ等の関連技術等）で用いる修飾核酸塩基の一般的な構造を図１８に与える。
【０１４２】
当業者は、同様の「質量に基づいた」分析アプローチが配列決定に使用でき、かかる方法に有用な修飾核酸塩基が図１９で詳しく述べられることを理解する。
【図１】
0005759723.tif 000050
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0005759723.tif 000057
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
0005759723.tif 000062
【図１４Ａ】
0005759723.tif 000063
【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
0005759723.tif 000066
【図１４Ｅ】
0005759723.tif 000067
【図１５】
0005759723.tif 000068
【図１６】
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【図１７】
0005759723.tif 000070
【図１８】
0005759723.tif 000071
【図１９】
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