(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）及び疎水性ユニットとを含む共重合ポリマーと、
ＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドとの複合体であって、
ＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドが、配列番号１（ＫＨＬＱＣＶＲＮＩＣＷＳ；Ｅｐ１１４）、又は配列番号２（ＥＨＬＨＣＬＧＳＬＣＷＰ；Ｅｐ１３３）に示されるアミノ酸配列からなるＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドであることを特徴とする複合体。
【請求項２】
請求項１記載の複合体を用いた複合素材であって、
担体に前記複合体が固相化されたことを特徴とするＥｐＣＡＭに親和性を有する複合素材。
【請求項３】
請求項２記載の複合素材を用いたＥｐＣＡＭ発現細胞、ＥｐＣＡＭ発現エクソソーム、ＥｐＣＡＭ発現マイクロベシクル、又はＥｐＣＡＭ分子を分離する分離装置であって、
ＥｐＣＡＭに親和性を有する複合体が固相化された複合素材を備えた分離ユニットを有することを特徴とする分離装置。
【請求項４】
請求項２記載の複合素材を用いた計測装置であって、
ＥｐＣＡＭ発現の程度を計測する計測ユニットを備えることを特徴とする計測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチド・アプタマーとホスホリルコリンポリマー共重合体との複合体の作成方法、該複合体によりペプチド・アプタマーを固相化し、ＥｐＣＡＭに親和性を有する材料表面を作成する方法、及び該複合体を用いた診断や治療のためのツールの提供に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮細胞接着因子（ＥｐＣＡＭ; Epithelial cell adhesion molecule, ＣＤ３２６、ＧＡ７３３−２、ＨＥＡ１２５、ＫＳ１／４、ＭＫ−１、ＭＨ９９、ＭＯＣ３１、３２３／Ａ３、１７−１Ａ、ＣＯ−１７Ａ、ＥＳＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ３４、ＥＧＰ４０、ＫＳＡ、ＫＳ１／４、ＴＲＯＰ−１、ＴＡＣＳＴ−１）は、大腸癌で発現している癌特異的細胞表面抗原として報告されたI型膜タンパク質である（非特許文献１）。ＥｐＣＡＭは正常組織では主として上皮細胞の基底膜に発現しているが、上皮由来のほとんどの癌細胞で発現が認められることから、いわゆる癌抗原として知られ、診断マーカーとして有用であることが示されている（非特許文献２）。【０００３】
上述のようにＥｐＣＡＭはほとんどの上皮由来の癌細胞で検出されることから、ＥｐＣＡＭ抗原を表面に有する細胞を抗体によって集め、これを解析し予後予測を行うことが試みられている。血液中を循環しているＥｐＣＡＭを表面抗原として発現している循環腫瘍細胞は、癌の転移と密接な関係にあることから、ＥｐＣＡＭを発現する循環腫瘍細胞の検出は予後予測に非常に重要である（特許文献１）。また、体液中のエクソソーム、マイクロベシクルなどの細胞外小胞を用いた診断法に注目が集まってきており、ここでも癌とＥｐＣＡＭ陽性の細胞外小胞との関連が報告されている（非特許文献３）。【０００４】
さらに、近年診断だけではなく、治療においてもＥｐＣＡＭの有用性が示されてきている。すでにＥｐＣＡＭを利用した癌ワクチンが開発されており、バキュロウイルス等による昆虫細胞発現系を利用して調製したＥｐＣＡＭタンパク質や抗ＥｐＣＡＭ抗体の抗原認識部位に結合する抗イディオタイプ抗体を用いたワクチン療法も報告されている。また、癌治療用抗ＥｐＣＡＭ抗体も開発され、Ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ（ＭＴ２０１）、ＩＮＧ−１等の抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いた治験が行われている。これらの抗体を用いた治療では、癌細胞表面上のＥｐＣＡＭに抗体が結合し、生体内の免疫系により細胞性免疫（細胞障害活性）を誘導することで癌を縮小させることを狙いとしている。さらに、抗ＥｐＣＡＭ抗体による細胞障害活性を高める目的で、抗ＥｐＣＡＭ抗体と緑膿菌外毒素を融合させたＰｒｏｘｉｎｉｕｍｓ  Ｖｉｖｅｎｄｉｕｍｓ (ＶＢ４−８４５)や、ＩＬ−２と融合させたＥＭＤ ２７３ ０６６(ｈｕＫＳ−ＩＬ２)や、抗ＣＤ３活性を併せ持つＥＵ承認薬であるカツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｉｍａｂ）等が開発されている（非特許文献４、５）。【０００５】
上述のように、ＥｐＣＡＭを標的とした治療や診断には、抗体分子が用いられてきた。しかしながら、抗体分子は、標的分子に強く結合するといったメリットをもつが、しばしばこの「強い結合」が欠点ともなる。例えば抗体が細胞表面の標的受容体に結合したことにより、受容体下流の信号伝達系が活性化したり、あるいは、結合した抗体を取り除くための酸処理などが細胞にダメージを与える。これらの欠点は、細胞を用いた治療や再生医療を考える場合、致命的ともいえる。【０００６】
そこで、抗体を用いた強い結合ではなく、特異的ではあるが弱い結合が、流体の動力学的な性質を利用した流路系、マクロ流路系での、細胞培養、細胞選別等を実現する上で求められている。このような特異的で弱い結合を実現するには、抗体の代わりに、ペプチド・アプタマーが有効な技術的手段の一つとなる。【０００７】
本発明者らは、すでに化学合成法や遺伝子工学的手法を用いて簡単に作製することができる、ＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドを開示している（特許文献２）。また、新たにＥｐＣＡＭに対して結合能を有するペプチドの開発を進めている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００８−５３３５８７号公報
【特許文献２】特開２０１１−１９３７２８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Herlyn M et al., Proc Natl Acad SciUSA, 1979, Vol.76, pp.1438-1442.
【非特許文献２】van der Gun BT., Br J Cancer. 2011, Vol.105(2), pp.312-319
【非特許文献３】Press, J.Z. et al., Int J Gynecol Cancer, 2012, Vol.22, pp.546-552 (2012).
【非特許文献４】Chaudry MA., Br J Cancer. 2007 , Vol.96(7), pp.1013-1019.
【非特許文献５】Linke R, MAbs. 2010, Vol.2(2), pp.129-136.
【非特許文献６】Rupp, A.K. et al. Gynecologic oncology 2011, Vol.122(2), pp.437-446.
【非特許文献７】Press, J.Z. et al., Int J Gynecol Cancer 2012, Vol.22, pp.546-552.
【非特許文献８】Maetzel, D.et al., Nat Cell Biol 2009, Vol.11, pp.162-71.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＥｐＣＡＭに対して結合能を有するペプチドを固相化して利用する場合、直接結合させる場合やリンカーを用いてリガンドの結合性を高める方法などが考えられる。ＥｐＣＡＭ結合ペプチドを固相化する方法として、多くの、しかも素材の異なる固体に結合させるための高収率で安定した結合方法を確立することが必須である。実際、対象となるデバイスの流路系には、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン（ＰＳ），ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ），エポキシ樹脂，ガラス、シリコンなどのいろいろな材料や素材が用いられている。また、素材の形状もビーズ、プレート、フィルム、フィラメント等、多様である。これらの材料表面に共有結合を利用してペプチドを固相化することも可能であるが、材料に合わせた反応系を考える必要があり、また、反応基をもたない材料表面への固相化が極めて難しくなる。【００１１】
一方で、物理的結合を利用した、「コート剤」的なアプローチは、材料選択性が広くなり、汎用性が高くなる利点をもつ。そこで、本発明はペプチド・アプタマーをコート剤と組み合わせて、特定の生体分子に親和性をもった材料表面、すなわち、バイオ界面、機能性バイオ表面として材料を機能化する方法の開発を課題としている。【００１２】
ここでは、ＥｐＣＡＭに親和性を有するペプチド・アプタマーを用いて機能性バイオ表面を作成しているが、他のアプタマー等を用いれば、ＥｐＣＡＭ以外の分子に親和性を備える機能性バイオ表面の作成にも応用することが可能である。【００１３】
本発明は、細胞治療や再生医療、診断等に用いるために、ＥｐＣＡＭに親和性を有する材料表面を作成することを課題とする。細胞治療や再生医療を行うための細胞分離には主としてプレート上の流路系やビーズを充填したカラムが、また、診断等に用いる担体としてはビーズやチップ等の固相が用いられていることから、開発されたＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチド・アプタマーを、固相に効率よく固定化する方法が強く求められている。本発明は、固相を簡便にＥｐＣＡＭ結合能を備えた機能性バイオ表面とする、ＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチド・アプタマーと高分子ポリマーとの複合体を提供することを課題とする。【００１４】
本発明によるバイオ界面、機能性バイオ表面といわれるような特定の生体分子に親和性をもった材料表面の実現は、バイオセンサーや細胞を用いた、診断や治療などの幅広い分野で利用される重要なツールとなる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、ホスホリルコリン基を含むポリマーとＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドとの複合体であることを特徴とする。【００１６】
ホスホリルコリン基は、生体膜構成成分であることから、ＥｐＣＡＭ分子やＥｐＣＡＭ発現エクソソーム等、生体成分の相互作用を検出するバイオ機能性表面を作成する際に非常に有用である。【００１７】
また、本発明の複合体は、ホスホリルコリン基を含むポリマーが、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）及び疎水性ユニットとを含む共重合ポリマーと、ＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドとの複合体であることを特徴とする。【００１８】
ＥｐＣＡＭ結合ペプチドを固定化する高分子ポリマーは、ホスホリルコリン基を有するポリマーの中でも、特に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）及び疎水性ユニットを含む共重合ポリマー（例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン／ｎ−ブチルメタクリレート共重合体、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン／アリルアミン塩酸塩共重合体など）が好ましく用いられる。ＭＰＣを含む高分子ポリマーは生体親和性が非常に良いからである。【００１９】
本発明の複合体によれば、ＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドを効率良く固相化することが可能となる。したがって、ＥｐＣＡＭを標的として用いた診断、治療への幅広い応用が可能となる。さらに、ＭＰＣ共重合体を用いることにより、ガラス、ポリカーボネート、シリカをはじめとする様々な材料をコーティングすることが可能となり、簡便にバイオ機能性表面を作成することが可能となる。【００２０】
また、本発明の複合体は、ＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドが、配列番号１（ＫＨＬＱＣＶＲＮＩＣＷＳ；Ｅｐ１１４）、配列番号２（ＥＨＬＨＣＬＧＳＬＣＷＰ；Ｅｐ１３３）に示されるアミノ酸配列からなるＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドであることを特徴とする。
【００２１】
本発明者らが、開示している配列番号１のペプチドＥｐ１１４、及び配列番号２のペプチドＥｐ１３３は、ＥｐＣＡＭに対して強い結合能を示す。これら２つのペプチドは、本発明者らが特許文献２で開示している配列番号３のペプチドＥｐ３０１と比較して、１０倍程度強く結合する。したがって、感度良くＥｐＣＡＭの検出を行うことができる。【００２３】
したがって、該ペプチド・アプタマーを用いた複合材料は、診断、治療面において様々な応用が期待される。特に合成ペプチドを用いれば、治療面においての安全性を担保することが容易となる。【００２４】
また、これらペプチドをコードするＤＮＡや組換えベクターを用い、公知の遺伝子工学の手法を用いたり、化学合成的手法で製造することにより、簡便に大量のＥｐＣＡＭ結合ペプチドを製造することが可能となることから、安価に診断材等を製造することが可能となる。【００２５】
本発明の複合素材は、本発明による複合体を担体に固相化することにより得られ、ＥｐＣＡＭ親和性を有することを特徴とする。【００２６】
本発明の複合体は、上述のように、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン（ＰＳ），ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ），エポキシ樹脂、ガラス、シリコンガラス等、様々な材料をスピンコートや静置によって簡便にコーティングすることが可能である。したがって、様々な材料からなる、ビーズ、プレート、フィルム、フィラメント、メンブレン、カラム担体、流路、医療材料等、様々な形状の担体をコーティングすることにより、機能化し、診断、治療等への応用が期待される。【００２７】
本発明の分離装置は、本発明のＥｐＣＡＭに親和性を有する複合素材を備え、ＥｐＣＡＭ発現細胞、ＥｐＣＡＭ発現エクソソーム、ＥｐＣＡＭ発現マイクロベシクル、又はＥｐＣＡＭ分子をＥｐＣＡＭの発現に基づいて分画することを特徴とする。【００２８】
例えば、本発明の複合体を流路系の担体にコーティングすることにより、ＥｐＣＡＭ発現細胞やエクソソーム、マイクロベシクルを効率良く分離する装置が作製可能となる。したがって、ＥｐＣＡＭを発現している循環腫瘍細胞、エクソソーム、マイクロベシクルの検出を感度良く行うことが可能となり、癌の診断を高精度で行うことができる。【００２９】
また、細胞の選別や、エクソソーム、マイクロベシクル、ＥｐＣＡＭの精製等、従来は抗体を用いて行ってきた分離を、本発明の分離装置により行うことができる。さらに、ペプチド・アプタマーとしてＥｐＣＡＭに対する親和性をデザインすることが可能であることから、所望の親和性を備えた分離装置を作成することが可能となる。すなわち、適度な親和性をもった材料表面を利用し、細胞やエクソソーム、マイクロベシクルを強く結合するのではなく、弱い相互作用で運動性を抑えながら、遅滞性のある移動（レターデーション・エフェクト）によって流路内でソートしていくようなデバイスが実現できる。また、このような弱い結合の場合、抗体などの強い結合で問題となる、必要以上の刺激が加わることにより細胞に与えていたダメージや、予期せぬ信号伝達系の活性化を回避することが可能となる。【００３０】
さらに、流量や流圧などの調整によってレターデーション・エフェクトを変えることができることから、多様なモードで選択的に目的物質を分離することができる。この利点は、従来的手法である、強固な抗原抗体を用いる方法、分子量によってふるいをかける方法、荷電や疎水性によって吸着分画する方法などとは質的に異なる手法である。【００３１】
本発明の診断装置は、本発明の複合素材を用い、ＥｐＣＡＭ発現の程度を計測する計測ユニットを備えることを特徴とする。【００３２】
循環腫瘍細胞、エクソソーム、マイクロベシクルの検出等により、ＥｐＣＡＭ発現の検出を行うことは、癌の診断、予後診断に非常に有用である。本発明の複合体を担体にコーティングすることにより、簡便に高精度の診断装置を作成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＭＰＣ共重合体と、ＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチド・アプタマーとの複合体の作成方法を模式的に示す図。
【図２】ペプチド・アプタマーのＭＰＣ共重合体への結合に用いるＰＥＧリンカーを示す。
【図３】リンカーの長さによりガラス表面に提示されるＥｐＣＡＭ結合ペプチド量を示す図。
【図４】Ｅｐ１１４ペプチドのＣ末端側にｄＰＥＧ２を２つ含むリンカー（以下、ＰＥＧ２リンカーと呼ぶ）構造。
【図５】ＰＥＧ２リンカーを用いた場合のガラス表面に提示されるＥｐＣＡＭ結合ペプチドの量を示す図。
【図６】ＰＥＧ２リンカーを用いたＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体でポリスチレンビーズをコートした結果を示す図。
【図７】ＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体をコートしたガラス表面のＸ線光電子分光（ＸＰＳ）による表面元素分析の結果を示す図。
【図８】ＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体により種々の固相をコーティングできることを示す図。
【図９】ＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体によりコートされた担体が抗ＥｐＣＡＭ抗体、ＥｐＣＡＭ、エクソソームによって認識されることを示す図。
【図１０】ＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体でシリカビーズをコートし、流路系に詰めた例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、実施例を示しながら、本発明を詳細に説明する。
［実施例１］
［ＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体の作成方法］
図１に本発明のＭＰＣ共重合体と、ＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドとの複合体の作成方法を模式的に示す。ＭＰＣと、疎水性ユニット、カルボキシル基を備えたユニットからなるＭＰＣ共重合体ポリマーにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを介して、ＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドとのコンジュゲート、すなわちＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体を作成する。
【００３５】
詳細なペプチド導入方法は以下のとおりである。ＭＰＣ共重合体（日油株式会社、ＭＰＣポリマー、リピジュア-５９０３Ｓ）エタノール溶液にＰＥＧリンカー（Quanta biodesign）を１０当量入れた後、トリアジン系縮合剤4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium Chloride n-Hydrate (ＤＭＴ−ＭＭ)を５０当量加え、室温で一晩反応させる。その後、溶液を透析チューブ(Spectra/Por（商） Dialysis Membrane MWCO: 8000)に入れ、外液をメタノールにして２日間透析を行う。透析チューブから回収後、溶液を元の反応液の体積までエバポレータを用いて濃縮する。
【００３６】
続いて、リンカーを導入したＭＰＣ共重合体のメタノール溶液０．５ｍｌに対し、２ｍｌのメタノールと２．５ｍｌのＨ２Ｏを加える。続いて、ＥｐＣＡＭ結合ペプチドのＣ末側にＧＧＫ（ＦＩＴＣ）ＧＧ（propargyl）を導入したものを１０当量加えた後、ソニケーションによりペプチドを溶解させる。
【００３７】
次に、０．５Ｍのアスコルビン酸ナトリウム水溶液（和光純薬）を加え、試験管内の黄色が濃くなったら、０．５Ｍの硫酸銅水溶液を加える。色が黄色から黒褐色に変化したら、試験管を密栓し、５０℃、３０分、加熱する。
【００３８】
反応終了後、０．５Ｍのエチレンジアミン四酢酸四ナトリウム（同仁化学）水溶液、ｐＨ８を加えながら、前出の透析チューブへと移し入れる。外液のメタノール／ミリＱ水混合溶液３Ｌに対し、３０ｍｌの０．５Ｍエチレンジアミン四酢酸四ナトリウム水溶液、ｐＨ８を加え１週間透析を行う。外液を、エチレンジアミン四酢酸水溶液を含まない溶液に換えて２日透析を行った後、外液をメタノールのみに変えて透析を２４時間行い、その後、透析チューブ内の溶液をエバポレータで濃縮し、ＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体を合成した。
【００３９】
［実施例２］
［ペプチド導入率に対するリンカーの長さの検討］
用いるＰＥＧリンカーの長さとペプチドの導入率について検討を行った。図２に示す鎖長の異なるＰＥＧリンカー（Quanta biodesign）を用い、Ｅｐ１１４のＭＰＣ共重合体への導入率を求めた。
【００４０】
ペプチドの導入率は以下のようにして測定した。Ｅｐ１１４ペプチドのＣ末にＦＩＴＣを付加したペプチド、ＧＧＫ（ＦＩＴＣ）ＧＧ(propargyl)を合成し、Ｅｐ１１４（ＦＩＴＣ）ペプチド−ＭＰＣ複合体におけるＦＩＴＣの吸光度を測定することにより、ＭＰＣ共重合体に対するペプチド導入率を求めた。
【００４１】
具体的には、紫外可視分光光度計(UV-2550、島津製作所）でスペクトルを測定し、ＦＩＴＣの４９５ｎｍにおける吸収極大値と、８００ｎｍの吸光度を測定し、予め作成しておいた検量線により、ペプチド濃度を測定し、ペプチド導入率を求めた。結果を表１に示す。
【００４２】
【表１】
0005824596.tif 000002
【００４３】
表１に示すように、用いるリンカーの長さによって、ＭＰＣ共重合体に導入されるペプチドの量は異なっている。鎖長の短いＰＥＧリンカー、ｄＰＥＧ３を用いた場合にはペプチド導入率が極端に低いが、他のリンカーを用いた場合は、すべて１０％以上の値となっている。鎖長の短いＰＥＧリンカーは導入率が低く、以下に示すように、ＥｐＣＡＭとの結合性も低いが、ｄＰＥＧ７以上の鎖長であれば、導入率も高く機能的な表面材料を形成することができる。
【００４４】
［実施例３］
［リンカーの長さと機能的分子として提示されるＥｐＣＡＭ結合ペプチド量の検討］
得られたＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体を固相に固定化し、提示される機能的なＥｐＣＡＭ結合ペプチド量の検討を行った。固相への固定化は、以下のスピンコーター法、静置法の２つの方法により行った。
【００４５】
（１）スピンコーター法
ガラス板を１０分間、紫外線オゾン処理した後、メタノールに浸漬し５分間ソニケーションし、洗浄を行う。ＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体溶液２０μｌを、スピンコーターにより回転塗布した。その後、３０分間風乾した後、２時間真空乾燥させる。その後、ＰＢＳ（Phosphate buffered saline）中、４℃で、１５時間静置する。
【００４６】
（２）静置法
ガラス板を上記と同様の方法で洗浄処理した後、ガラス板の表面にＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体溶液を５０μｌ載せ、４℃、一晩静置する。静置後、スピンコータにより余分なＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体溶液を除去し、上記と同様に乾燥、ＰＢＳで処理する。
【００４７】
コート後のＥｐＣＡＭ結合ペプチドの量を抗体染色により比較検討した。ここでは、ＥｐＣＡＭ結合ペプチドとして、Ｅｐ１１４を用いている。ＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体を固定したガラスをブロッキング剤(ナカライ、Blocking One)で、１時間ブロッキングし、０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（Tris buffered saline）で３回洗浄した。
【００４８】
ブロッキング後、一次抗体として、抗Ｅｐ１１４ウサギＩｇＧ、二次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧを使用した。各抗体との反応後は、０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳを用いて洗浄し、ＥＣＬ溶液により化学発光させ検出を行っている。結果を図３に示す。
【００４９】
（Ａ）はスピンコーター法、（Ｂ）は静置法による結果を示す。図中Ｂ−３、Ｂ−７，Ｂ−１１、Ｂ−２３、Ｂ−３５はペプチドとＭＰＣ共重合体を作成するときに用いたリンカーが、各々ｄＰＥＧ３、ｄＰＥＧ７、ｄＰＥＧ１１、ｄＰＥＧ２３、ｄＰＥＧ３５であることを示す。また、ＭＰＣは、ペプチドを結合していないＭＰＣ共重合体のみを固定したものを示す。
【００５０】
スピンコーター法（Ａ）、静置法（Ｂ）、どちらの固定化法を用いた場合でも、抗Ｅｐ１１４抗体との反応が認められることから、ＥｐＣＡＭ結合ペプチドがガラス担体に固定化されることが認められた。短いリンカー、ｄＰＥＧ３（Ｂ−３）は、ＭＰＣ共重合体への導入率が低いこともあり、ＥｐＣＡＭ結合が検出されなかった。
【００５１】
表１で示したように、Ｅｐ１１４ペプチドのＭＰＣ共重合体へのペプチド導入率は、ｄＰＥＧ２３をリンカーとして用いたときに最も高い値を示したが、抗体によって検出されるＥｐＣＡＭ結合ペプチドは、図３に示すようにｄＰＥＧ７、ｄＰＥＧ１１、ｄＰＥＧ２３、ｄＰＥＧ３５で大きな差は認められない。
【００５２】
図３に示したＥｐＣＡＭ結合ペプチドの抗体による検出は、表１に示したペプチド導入率と異なり、ペプチドは抗体で認識される状態、すなわち機能性分子として抗体に認識し得る状態として存在することを示している。導入されるペプチド量と、抗体により認識されるペプチド量との間に差が見られるのは、リンカーの鎖長によって、導入されたペプチド量と機能性分子として存在するペプチド量が異なるためだと思われる。リンカーの長さが３（ｄＰＥＧ３）のものに関しては、ペプチドのアクセス能が悪いため、低いペプチド導入率になり、結果として抗体で認識される機能的なペプチドの量も少ないものと考えられる。
【００５３】
以上の結果から、ＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体により、固相が機能的なＥｐ１１４により効率よく被覆されることが示された。
【００５４】
［実施例４］
導入するＥｐ１１４ペプチドのＣ末端側のリンカー構造について検討した。Ｅｐ１１４ペプチドのＣ末端に、Fmoc-N-amido-dPEG2-acid (Quanta biodesign社製）を用い、ＰＥＧを付加したＥｐ１１４ペプチドを、ペプチド合成装置を用いて合成した。
【００５５】
作製したＦＩＴＣを含んだペプチド、Ｅｐ１１４-ｄＰＥＧ２-Ｋ（ＦＩＴＣ）-ｄＰＥＧ２-Ｇ（propargyl）-ＮＨ２、及びＦＩＴＣを含まないペプチド、Ｅｐ１１４-ｄＰＥＧ２-Ｓ-ｄＰＥＧ２-Ｇ（propargyl）-ＮＨ２の構造を図４に示す。
【００５６】
［実施例５］
実施例４で作製したペプチド、Ｅｐ１１４-ｄＰＥＧ２-Ｋ（ＦＩＴＣ）-ｄＰＥＧ２-Ｇ（propargyl）-ＮＨ２を用いて作製したＥｐ１１４−ＭＰＣ複合体を実施例３と同様にガラス板にスピンコーター法でコートして、抗体染色により比較検討した。なお、ｄＰＥＧ７を介してＥｐ１１４ペプチドをＭＰＣに結合させている。結果を図５に示す。
【００５７】
ＧＧＫ（ＦＩＴＣ）は、実施例２で用いているＥｐ１１４-ＧＧＫ（ＦＩＴＣ）ＧＧ(propargyl)を、ＰＥＧ２（ＦＩＴＣ）は、実施例４で作製したＥｐ１１４-ｄＰＥＧ２-Ｋ（ＦＩＴＣ）-ｄＰＥＧ２-Ｇ（propargyl）-ＮＨ２を、ＰＥＧ２は、Ｅｐ１１４-ｄＰＥＧ２-Ｓ-ｄＰＥＧ２-Ｇ（propargyl）-ＮＨ２をそれぞれＭＰＣ共重合体と複合体を形成させたものを示し、ＭＰＣはペプチドを結合していないＭＰＣ共重合体のみを固定したもの、Ｒａｗ  ｇｌａｓｓは、何も固定していないものを示す。
【００５８】
図５に示すように、ＰＥＧ２（ＦＩＴＣ）で示すＥｐ１１４-ｄＰＥＧ２-Ｋ（ＦＩＴＣ）-ｄＰＥＧ２-Ｇ（propargyl）-ＮＨ２は、抗体に対する反応が特に良いこと、ＰＥＧ２で示す、Ｅｐ１１４-ｄＰＥＧ２-Ｓ-ｄＰＥＧ２-Ｇ（propargyl）-ＮＨ２は、ＧＧＫ（ＦＩＴＣ）（Ｅｐ１１４-ＧＧＫ（ＦＩＴＣ）ＧＧ(propargyl)とほぼ同等の反応性であることが示された。
【００５９】
さらに、ポリスチレンビーズにコートして共焦点顕微鏡(OLYMPUS FLUOVIEW 1000)を用い観察を行った。ＰＥＧ２（ＦＩＴＣ）、あるいはＧＧＫ（ＦＩＴＣ）とＭＰＣとの複合体をポリスチレンビーズに固定し、ウサギに免疫して作成した抗Ｅｐ１１４抗体を用い、Ｚｅｎｏｎ  Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ（Molecular Probes社）を用い、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商）５９４標識し、共焦点顕微鏡で観察を行った。なお、ＭＰＣとペプチドとの複合体を作製する際のリンカーとしては両者ともｄＰＥＧ７を用いている。また、コントロールとしてウサギＩｇＧ(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY社)を用いている。結果を図６に示す。
【００６０】
ＰＥＧ２（ＦＩＴＣ）をＧＧＫ（ＦＩＴＣ）と比較すると、抗Ｅｐ１１４抗体での染色性が非常に良く、ペプチドがＭＰＣ複合体の表面に効率良く現れていることを示している。
【００６１】
［実施例６］
［Ｘ線光電子分光（ＸＰＳ）を用いた表面元素分析］
ＸＰＳにより、ＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体をコートしたガラスの表面解析を行った。
【００６２】
Ｅｐ１１４ペプチド−ＭＰＣ複合体をコートしたガラス板を、ＸＰＳ(アルバックファイ PHI5000 VersaProbe)を用いて測定した。各サンプルは中央、両端の３箇所を、Pass Energy:117.4eV、Lower Energy:0eV、Range:1400eV、Energy step:1eV、Time/step:20ms、Total cycle:10、X-ray幅100μmの条件でスキャンした。
【００６３】
図７に結果を示す。測定を行った３箇所とも同様の結果を得たので、一例を示す。拡大部分に示すように、ガラス表面にはＭＰＣ由来のリン（Ｐ）が検出され、ＭＰＣが表面にコートされていることが確認された。しかしながら、リンカーとペプチドとの結合反応に用いた銅元素は検出されなかった。銅が不検出であることは、本発明のＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体を治療等、生体内で安全に用い得ることを示している。
【００６４】
また、拡大部分に示す２つの大きなピークはガラス由来のケイ素を示す。走査型電子顕微鏡による観察では、コートしたガラス表面は平滑であるが、ガラス表面が露出している部分が残存しているものと認められる。しかしながら、膜厚測定の結果、コートされたＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体の膜厚が３０ｎｍ程度であったことから、全体的に膜厚が薄いわけではなく、部分的にガラス表面が露出している部分があるものと考えられる。
【００６５】
［実施例７］
［ＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体による種々の固相のコーティング］
ＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドを診断、治療に用いる場合には、担体としてビーズ、流路等様々な材料を使用することが予想される。これらの担体として用いられている材料としては、ガラス以外にも、ポリプロピレン、ポリカーボネート等、種々の材料が知られている。そこで、作成したＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体により、これらの材料をコーティングできるか検討を行った。
【００６６】
実施例３で示したガラス担体の場合と同様に、静置法でポリプロピレン等の担体材料をＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体によりコートし、抗Ｅｐ１１４抗体を用いて検出を行った。
【００６７】
図８に結果を示す。担体としては、以下の材料を用いている；（Ａ）ポリプロピレン、（Ｂ）塩化ビニル、（Ｃ）ポリカーボネート、（Ｄ）ポリスチレン、（Ｅ）ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、（Ｆ）シリコン、（Ｇ）親水性ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、（Ｈ）疎水性ポリジメチルシロキサン。
【００６８】
また、図中＋はＥｐ１１４結合ペプチド−ＭＰＣ複合体を、ＭＰＣはＭＰＣ共重合体のみをコートし、−は何もコートしていない領域であることを示す。上段は抗Ｅｐ１１４抗体を、下段はコントロールであるウサギＩｇＧ抗体を一次抗体として用いたことを示している。
【００６９】
図８に示すように、担体として汎用されているこれら材料はいずれも本発明のＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体により、効率良くコートすることができた。また、ここでは示さないが、金も効率良くコートすることを確認している。さらに、いずれの担体もバックグラウンドがほとんどなく、特異的な結合のみが観察されている。
【００７０】
また、実際にシリコンゴム系の流路やポリジメチルシロキサン系の流路に、本発明の複合体を用いてコートしたところ、効率良く流路をコートできることを蛍光観察により確認している。
【００７１】
したがって、本発明のＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体は、流路系、ビーズ等、一般に計測、検査、治療に用いる担体材料のコート剤として非常に有用であることが示された。
［実施例８］
［ゲル担体を用いた応用、エクソソームとの結合］
ゲル担体をＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体でコートし、抗ＥｐＣＡＭ結合ペプチド抗体、ＥｐＣＡＭ、エクソソームと相互作用を行うか解析した。
【００７２】
具体的には、ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０（nacalai tesque）にＥｐ１１４ペプチド−ＭＰＣ複合体（リンカーはｄＰＥＧ７を使用）をコートした。このＥｐ１１４ペプチドを担持したゲル担体が、抗Ｅｐ１１４抗体、精製ＥｐＣＡＭ、エクソソームと相互作用を行うか解析した。
【００７３】
（１）抗Ｅｐ１１４抗体との相互作用
ゲル担体を２％ＢＳＡで３０分間ブロッキング後、ＰＢＳで３回洗浄し、ウサギに免疫して作成した抗Ｅｐ１１４抗体を、Ｚｅｎｏｎ  Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ（Molecular Probes社）を用い、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商）５９４標識し、この抗Ｅｐ１１４標識抗体を用いてゲル担体を標識し，共焦点顕微鏡で観察を行った。コントロールとしては、ウサギＩｇＧ(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY社）を用いた。結果を図９（Ｂ）（１）に示す。
【００７４】
（２）ＥｐＣＡＭとの相互作用
上記と同様にブロッキング、洗浄を行った後、精製ＥｐＣＡＭを加え、３０分間震盪、反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商）５９４  Ｚｅｎｏｎ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔｓで標識したマウス抗ＥｐＣＡＭ抗体（Gene Tex, VU-1D9）抗体で反応を行った。ＰＢＳで３回洗浄後、共焦点顕微鏡で観察した。結果を図９（Ｂ）（２）に示す。
【００７５】
（３）エクソソームとの相互作用
細胞は、細胞質内からタンパク質やアミノ酸等をエクソソームと呼ばれる小型膜小胞として放出している。エクソソームは細胞間の情報伝達に関与していることが明らかになっており、特に近年、癌細胞がエクソソームを多量に放出し、癌の転移や形成に深く関与していることが明らかにされてきている。この現象に基づいて、エクソソームを治療や診断に用いることが開示されている（例えば、非特許文献６、７参照）。そこで、本発明のＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体とエクソソームとが相互作用するか解析を行った。
【００７６】
エクソソームの単離、標識は以下の方法で行った。ＨＴ−２９細胞を培養し、培養上清を遠心（５，５００ｇ、１０分）、精密濾過膜Ｓｔｅｒｉｃｕｐフィルターユニット（Membrane Type Millipore Express(R) PLUS(PES)、Pore Size Rating 0.22μm）（Milliopore Corporation）により処理し、１６０，０００ｇ、７０分超遠心し、エクソソームを回収した。さらに、０．２５−２Ｍショ糖、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．２のショ糖密度勾配遠心（１００，０００ｇ、１７時間）を行い、エクソソーム分画を単離した。単離したエクソソーム分画は、ＰＢＳで洗浄し、超遠心（１６０，０００ｇ、２時間）を行い回収した。回収したエクソソームはＰＢＳに懸濁し、以下の方法により標識して用いた。
【００７７】
エクソソームの標識はＤｉＩ（invitrogen）を用いて行った。単離したエクソソーム２０μｌを９８０μｌのＰＢＳで希釈し，ＤｉＩ５μｌを加え、混和したのち、３７℃で１時間静置する。超遠心（１２０，０００ｇ、９０分）の後、上清を除き、１％  ＢＳＡ／ＰＢＳを加え、混和する。超遠心（１２０，０００ｇ、９０分）を２回繰り返し、標識化エクソソームを得た。
【００７８】
標識化エクソソームを（１）と同様にブロッキング、洗浄を行った後、担体と相互作用させ、共焦点顕微鏡で観察した。結果を図９（Ｂ）（３）に示す。
【００７９】
図９（Ｂ）に示すように、抗ＥｐＣＡＭ結合ペプチド抗体、ＥｐＣＡＭ、エクソソームと、いずれを用いた場合でも、担体上のＥｐＣＡＭ結合ペプチドとの相互作用が確認された。上記結果は、ＥｐＣＡＭ発現細胞や、エクソソームが、本発明の複合体でコートしたバイオ機能性表面と相互作用することを示すものである。特に、エクソソームとの相互作用が示されたことは、エクソソームを標的とした診断や治療への応用を考えるうえで、非常に重要である。
【００８０】
［実施例９］
［流路系への応用］
本発明のＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体でシリカビーズをコートし、流路系に詰めて用いる応用例を示す。
【００８１】
シリカゲルを１１５℃で１５分加熱する。その後、室温で１５分放冷した後、ゲルをメタノールで置換する。Ｅｐ１１４ペプチド-ＭＰＣ複合体を入れ、３７℃、２時間コートする。溶液を除いた後、３０分間自然乾燥し、ＰＢＳを用いて１５時間平衡化を行う。
【００８２】
マイクロ流路（microfluidic ChipShop社製）に、Ｅｐ１１４ペプチド-ＭＰＣ複合体をコートしたシリカビーズを詰めた。図１０に結果を示す。
【００８３】
図１０上段に、シリカビーズを流路に詰めた透過光写真を示す。中段、下段は蛍光顕微鏡によりＦＩＴＣを検出したものであるが、中段はＰＥＧ２（ＦＩＴＣ）でコートしたシリカビーズを詰めたもの、（Ｃ）は何もコートしていないシリカビーズを詰めたものである。
【００８４】
ＰＥＧ２（ＦＩＴＣ）でコートしたシリカビーズを詰めたものでは、蛍光が観察されることから、シリカビーズにＰＥＧ２（ＦＩＴＣ）が結合していることが示された。ビーズにコートして流路系に詰めることにより、ＥｐＣＡＭの精製や、患者検体を用いた診断等、幅広い応用に用いることができる。
【００８５】
また、ここでは示さないが、ＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体によりコートした担体表面上のペプチドが、機能性分子として存在することは、ＱＣＭ（水晶発振子マイクロバランス）センサー表面を本発明のＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体によりコートし、エクソソームと相互作用することによっても確認している。
【００８６】
本発明を応用した計測装置としては、上記のようなＱＣＭの他に、蛍光顕微鏡、マイクロプレートリーダーのような蛍光検出装置、暗視野照明顕微鏡のような光学検出装置、磁気分析装置、ゼータ電位測定計、原子間力顕微鏡等、公知の検出機器を計測ユニットとして用いることができる。
【００８７】
以上、ペプチド１１４とＭＰＣ複合体とを用いて検討を行ってきたが、ＥｐＣＡＭと結合強度の異なるペプチド、例えば、本発明者らがすでに開示しているＥｐＣＡＭに対する異なる親和性を備えたペプチドＥｐ１３３、Ｅｐ３０１を用いることにより、ＥｐＣＡＭに対して結合力の異なるＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体を作成することが可能である。結合能の異なるペプチドを用いることにより、細胞分離や診断等、用途に合わせたＥｐＣＡＭ結合ペプチド−ＭＰＣ複合体を作成することが可能となる。
【００８８】
本発明の方法によれば、ＥｐＣＡＭ結合ペプチドにより、簡便に種々の担体をＥｐＣＡＭ親和性を備えた機能化させた複合素材として形成することが可能となる。したがって、これらを流路系、カラムの担体、磁気ビーズ、メンブラン、フィルター等に金属チタンなどの医用材料等に用いることにより、医学研究、臨床計測、検査や治療器具開発等、様々な応用が可能となる。結合の対象はＥｐＣＡＭ分子が存在しているものすべてが含まれ、ＥｐＣＡＭ発現細胞のみならず、ＥｐＣＡＭ発現エクソソーム、マイクロベシクル、ＥｐＣＡＭ分子そのものが挙げられる。上記ＥｐＣＡＭ親和性を備えた機能化させた複合素材を流路系等に配置し、分離ユニットとして用いることにより、これらＥｐＣＡＭ分子を発現しているものを分離することができる。ＥｐＣＡＭ分子は、ある状況でその細胞外ドメインが血中に放出されることが分かっており（非特許文献８参照）、血中からこれら細胞外ドメインを除去するような治療装置の開発にも利用できる。
【００８９】
さらに、ここではＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドを用いて、ＭＰＣ共重合体を用いた複合材料の検討を行ってきたが、本発明の方法により様々なアプタマーをＭＰＣ共重合体に結合させることができる。それにより種々の生体分子に親和性を備えた機能性バイオ表面を作成することが可能であり、幅広い応用が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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