(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺炎球菌表面抗原Ａ（ＰｓａＡ）と結合した髄膜炎菌に由来する莢膜多糖類を含むワクチンであって、該ＰｓａＡは組み換えＰｓａＡであって、少なくとも配列番号１の２１位〜３１９位におけるアミノ酸残基を含む、該ワクチン。
【請求項２】
前記ＰｓａＡが組み換えＰｓａＡであって、配列番号１の２１位〜３１９位におけるアミノ酸残基からなる、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記ワクチンは、被験体に投与したときに前記莢膜多糖類及びＰｓａＡに対しそれぞれ免疫応答を生じさせ、該免疫応答は該莢膜多糖類及びＰｓａＡを結合していない形態で個々に投与した場合よりも増大している、請求項１又は２に記載のワクチン。
【請求項４】
前記莢膜多糖類が、血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、２９Ｅ、Ｗ−１３５及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１つの髄膜炎菌血清群に由来する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項５】
前記莢膜多糖類が髄膜炎菌血清群Ｃに由来する、請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
さらに、薬学的に許容可能な希釈剤、キャリア、アジュバント及び／又は緩衝剤を含む請求項１に記載のワクチン。
【請求項７】
肺炎球菌表面抗原Ａ（ＰｓａＡ）と結合した髄膜炎菌血清群Ｃに由来する莢膜多糖類を含む医薬組成物であって、該ＰｓａＡは組み換えＰｓａＡであって、少なくとも配列番号１の２１位〜３１９位におけるアミノ酸残基を含む、該医薬組成物。
【請求項８】
前記ＰｓａＡが組み換えＰｓａＡであって、配列番号１の２１位〜３１９位におけるアミノ酸残基からなる、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記医薬組成物は、マウスに投与したときに前記莢膜多糖類及びＰｓａＡに対しそれぞれマウスの血清ＩｇＧ免疫応答を生じさせ、該免疫応答は該莢膜多糖類及びＰｓａＡを結合していない形態で個々に投与した場合よりも増大している、請求項７又は８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
さらに、薬学的に許容可能な希釈剤、キャリア、アジュバント及び／又は緩衝剤を含む請求項７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、肺炎球菌（S. pneumoniae）のＰｓａＡタンパク質及び髄膜炎菌（N. meningitidis）の莢膜多糖類に対する抗体を誘導する免疫原性組成物を含むワクチン製剤に関する。本開示はさらに、該免疫原性組成物を作製する方法及びそれを使用する方法に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は２００９年４月１６日付けで出願された米国特許出願第１２／４２５，２３２号（その内容が参照により本明細書中に完全に援用される）の継続出願であり、その利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
現在の肺炎球菌ワクチンの状況
肺炎球菌は被包性のグラム陽性双球菌である。細菌細胞を取り囲む多糖類（ＰＳ）の層である莢膜は、肺炎球菌の主要な病原性因子である。肺炎球菌は、その構造及び莢膜多糖類に対する免疫応答の違いに基づき、９０種を超える異なる血清型に分類することができる。莢膜多糖類は現在使用されているワクチンのベースとなっている。ＦＤＡはヒトへの使用に対して２つのタイプの肺炎球菌ワクチン（２３価ＰＳワクチン及び７価ＰＳ／タンパク質結合型ワクチン）を認可している。２３価ＰＳワクチンは、肺炎球菌の２３種の異なる血清型（疾患の症例のほぼ８９％を占める）から精製された莢膜多糖類からなる。ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ（登録商標）（Merck）は、このワクチン群の一例である。しかしながら、ＰＳは型特異性抗体を惹起する。或る血清型に対して産生された抗体は、他の血清型の感染に対する保護をもたらさない。この２３価ワクチンの効力は制限されている。さらに、ＰＳは免疫記憶を伴わない短期免疫を誘導するため、２歳未満の小児においては有効でないＴ細胞非依存性抗原である（非特許文献１）。このワクチンは、高齢者及び基礎疾患を有する患者等といった高リスク群にしか推奨されていない。最近認可された肺炎球菌ワクチンは、ジフテリア毒素の非毒性かつ免疫学的に交差反応性の突然変異体であり（非特許文献２）、小児用ＤＰＴ（ジフテリア・破傷風・百日咳毒素）ワクチンの成分であるキャリアタンパク質ＣＲＭ197と共有結合した、個々に調製した７種の異なる莢膜多糖類の結合体の混合物である。キャリアタンパク質と結合すると、そうでなければＴ細胞非依存性であるＰＳは、このタンパク質の免疫学的特性を得ることでＴ細胞依存性の抗原となる（非特許文献３）。この結合体は免疫記憶を伴う長期にわたる免疫を誘導し、年少乳児において有効である。この７種の血清型は小児科疾患におけるそれらの罹患率から選択された。ＣＲＭ197（Wyeth）との７種の肺炎球菌莢膜ＰＳの結合型ワクチン（ＰＣＶ７）は、唯一市販されているこの種のワクチンである。このワクチンは、その高いコスト及び限られた供給量から、小児侵襲性肺炎球菌疾患の予防に使用するためにしか処方されない。これら２種類のワクチンの欠点は、それぞれのワクチン製剤中に含まれる肺炎球菌の特異的な血清型による感染に対する保護しかもたらさないということである。
【０００４】
現在の髄膜炎菌ワクチンの状況
髄膜炎菌は被包性のグラム陰性双球菌である。少なくとも１３種の異なる血清群が莢膜ＰＳの構造に基づいて同定されているが、血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ及びＷ−１３５が疾患の症例のほとんどを占める。血清群Ｂの細菌（organisms）が全症例の４６％を、血清群Ｃが全症例の４５％を占め、血清群Ｗ−１３５及びＹ、並びに血清群に分類されない菌株が残りの症例の大半を占める。肺炎球菌と同様、髄膜炎菌ワクチンの主成分は莢膜ＰＳである。そのワクチンは、莢膜ＰＳワクチン及びＰＳ−タンパク質結合型ワクチンという２種類に分類することができる。３つのバージョンのＰＳワクチンが市販されている。
【０００５】
４価ＰＳワクチン（GlaxoSmithKline及びSanofi-Pasteur）は血清群Ａ、Ｃ、Ｙ及びＷ−１３５から精製された莢膜ＰＳからなる。このワクチンは高価であり、開発途上国にとって手頃な価格のものではない。２価ＰＳワクチン（GlaxoSmithKline及びSanofi-Pasteur）は血清群Ａ及びＣから精製された莢膜ＰＳからなる。３価ＰＳワクチン（GlaxoSmithKline）は血清群Ａ、Ｃ及びＷ−１３５から精製された莢膜ＰＳからなる。このワクチンはアフリカの「髄膜炎地帯」の国々における流行期に使用されている。肺炎球菌ワクチンと同様、ＰＳワクチンは２歳未満の小児には効果的でない。かかる欠陥はＰＳ−タンパク質結合体によって克服することができる。
【０００６】
２つのタイプの髄膜炎菌ワクチン結合体が市販されているか、又は開発中である。ＭＥＮＡＣＴＲＡ（登録商標）（Sanofi-Pasteur）は最初の４価結合型髄膜炎菌ワクチンである。このワクチンは、ジフテリアトキソイドと結合した髄膜炎菌多糖類（血清群Ａ、Ｃ、Ｙ及びＷ１３５）の混合物である。現在開発中の１価髄膜炎菌結合型ワクチンは、血清群Ｃ多糖類−ジフテリアトキソイド（Chiron及びWyeth）、血清群Ｃ  ＰＳ−破傷風トキソイド（Chiron、Baxter）及び血清群Ａ  ＰＳ−破傷風トキソイド（PATH-SII）の結合体である。臨床試験の暫定的結果は、これらのワクチンが効果的であることを示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Greenwood BM et al., Trans R Soc Trop Med Hyg, 1980, 74:756-760
【非特許文献２】Uchida et al, J. Biol. Chem. 248:3838-3844, 1973
【非特許文献３】Schneerson R et al., J Exp Med 1980, 152:361-376
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
世界規模の公衆衛生システムに対する肺炎球菌感染及び髄膜炎菌感染の負担を考えると、両病原菌の感染によって生じる疾患を予防するのに有効な単独ワクチンを得ることが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、２種の異なる微生物（肺炎球菌及び髄膜炎菌）に対する免疫応答を誘導する免疫原性組成物を提供する。本開示はさらに、薬学的に許容可能な希釈剤中に分散及び／又は溶解した上記免疫原性組成物を含む接種材料及び／又はワクチンを提供する。該ワクチンは、肺炎球菌タンパク質と結合した少なくとも１つの髄膜炎菌の莢膜多糖類を含む。好ましい態様では、免疫原性組成物は、肺炎球菌に由来する組み換えＰｓａＡ（「ｒＰｓａＡ」）及び髄膜炎菌血清群Ｃに由来する莢膜多糖類を含む。肺炎球菌タンパク質は、ワクチンにおいて抗原として、また髄膜炎菌の莢膜多糖類に対するキャリアタンパク質として働く。したがって、上記ワクチンは、肺炎球菌及び髄膜炎菌の両方の感染に対する二重の保護をもたらすのに有効である。
【００１０】
肺炎球菌表面抗原Ａ（ＰｓａＡ）、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌表面タンパク質Ｃ（ＰｓｐＣ）、ニューモリシン及びヒスチジントライアドタンパク質等といった幾つかの肺炎球菌タンパク質が、試験された全ての肺炎球菌血清型に広く認められる。これらのタンパク質が実験動物において防御抗体を惹起可能であることが研究により示されている。特に、ＰｓａＡは免疫学的方法及びＰＣＲ法によって、２３種のワクチン血清型及び様々な国々からの臨床分離株を含む、試験された全ての肺炎球菌に認められた。ＰｓａＡは３０９アミノ酸残基長を有する。重要な態様では、本明細書に記載の免疫原性組成物中に使用されるｒＰｓａＡは、少なくとも配列番号１の２１位〜３１９位におけるアミノ酸残基を含む。
【００１１】
髄膜炎菌血清群Ｃの莢膜多糖類（約３０００００Ｄａ）は、α（２→９）グリコシド結合を有し、約８０％がＣ７又はＣ８でＯ−アセチル化した約８５０個のシアル酸反復単位を含む。髄膜炎菌血清群Ｃの莢膜多糖類及びＰｓａＡは結合形態で提供される。好ましい態様では、莢膜多糖類及びＰｓａＡは共有結合によって結合している。
【００１２】
別の態様では、被験体において肺炎球菌表面抗原Ａ（ＰｓａＡ）及び髄膜炎菌血清群Ｃに由来する莢膜多糖類に対する免疫応答を生じさせる方法が提供される。該方法は、ｒＰｓａＡ及び髄膜炎菌血清群Ｃに由来する莢膜多糖類に特異的な抗体の産生を誘導するのに有効な量のｒＰｓａＡと髄膜炎菌血清群Ｃに由来する莢膜多糖類との組み合わせを、被験体に投与することを含む。共有結合形態でのｒＰｓａＡと髄膜炎菌血清群Ｃに由来する莢膜多糖類との組み合わせを被験体に投与することは、被験体において免疫応答を生じさせるのに有効である。重要な態様では、結合した肺炎球菌表面抗原Ａ（ＰｓａＡ）及び莢膜多糖類の免疫原性は、抗原を個々に投与した場合に観察される免疫応答と比較して有意に増大している。この態様では、結合したＰｓａＡについて、結合していないＰｓａＡと比較して４０倍を超える免疫原性の増大が見られ、結合した莢膜多糖類について、結合していない莢膜多糖類と比較して１７０倍を超える免疫原性の増大が見られる。
【００１３】
免疫原性組成物は筋肉内投与、鼻腔内投与、経口投与、皮下投与、経皮投与及び経粘膜投与を含む、多数の異なる経路によって被験体に投与することができる。
【００１４】
本明細書に記載の免疫原性組成物は、組み換えＰｓａＡ（「ｒＰｓａＡ」）を調製すること、及びｒＰｓａＡと髄膜炎菌血清群Ｃに由来する莢膜多糖類とを結合することを含む方法によって調製される。ｒＰｓａＡは既知の組み換え技法を用いて調製することができる。莢膜多糖類は天然源から単離しても、又は当該技術分野で既知の多数の技法を用いて合成してもよい。
【００１５】
本明細書に記載の免疫原性組成物は、肺炎球菌感染及び髄膜炎菌感染に対する二重の保護を有利にもたらす。本明細書に記載の免疫原性組成物は、ＰｓａＡを多糖類に対するタンパク質キャリアとしても利用する。
【００１６】
有利には、本明細書で提供される結合した免疫原性組成物は、ワクチンを調製し、投与するコストを削減することができる。このワクチンは肺炎球菌疾患及び髄膜炎菌疾患の割合の高い開発途上国及び低開発国に対する経済的負担及び医学的負担を軽減するため、このことは、それらの国々にとって特に重要な利点である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例に従って作製された、５’末端及び３’末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を含むクローン化ｐｓａＡ断片のヌクレオチド配列（配列番号２）を示す図である。
【図２】実施例に従って作製された組み換えＰｓａＡタンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。
【図３】実施例によるｒＰｓａＡのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウエスタンブロット分析の写真を示す図である。
【図４】実施例に従って作製された結合体について、タンパク質シグナルが低分子量位置から高分子量位置へシフトしたことを実証するクロマトグラムである。
【図５Ａ】実施例による免疫ドットブロットの写真を示す図である。
【図５Ｂ】実施例によるウエスタンブロットの写真を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本開示は、髄膜炎菌に由来する莢膜多糖類及び肺炎球菌に由来するタンパク質を含む免疫原性組成物（「Ｐｎ−Ｍｎ」ワクチンと称する）を提供する。好ましい態様では、肺炎球菌のタンパク質は組み換え肺炎球菌表面抗原Ａ（「ｒＰｓａＡ」）であり、髄膜炎菌の莢膜多糖類は血清群Ｃの莢膜多糖類である。ＰｓａＡは、試験した全ての肺炎球菌血清型において広く認められる。上記免疫原性組成物は、診断目的及び治療目的の抗体の産生を誘導するのに有用である。本開示はさらに、薬学的に許容可能な希釈剤中に分散又は溶解した上記免疫原性組成物を含む接種材料及びワクチンを提供する。肺炎球菌に由来するｒＰｓａＡが、髄膜炎菌血清群Ｃに由来する莢膜多糖類と共有結合していることが特に好ましい。
【００１９】
「抗体」という用語は、抗原に特異的に結合することのできる、免疫グロブリンと呼ばれるグリコシル化タンパク質ファミリーの成員である分子を指す。「抗原」という語は、抗体によって結合される実体を指す。「免疫原」又は「免疫原性組成物」は、抗体産生を誘導するか、又はその受容体に結合する実体を指す。
【００２０】
「タンパク質」及び「ポリペプチド」という語は、本明細書全体を通して区別なく使用され、ペプチド結合によって結合した一連のアミノ酸残基を意味する。
【００２１】
髄膜炎菌血清群Ｃに由来する莢膜多糖類
多糖類は、免疫記憶をほとんど伴わない短期免疫を誘導するため、２歳未満の乳児においては有効でないＴ細胞非依存性（ＴＩ）抗原である。キャリアタンパク質と共有結合すると、得られる結合型ワクチン中のＰＳ成分は、乳児及び若年小児においても免疫記憶を伴う長期の免疫を誘導するＴ細胞依存性（ＴＤ）抗原となる。
【００２２】
髄膜炎菌血清群Ｃの莢膜多糖類は、α（２→９）グリコシド結合を有し、約８０％がＣ７又はＣ８でＯ−アセチル化したシアル酸反復単位を含む。髄膜炎菌血清群Ｃの多糖類のサイズは、シアル酸反復単位の分子量を３４０ダルトンと仮定すると、約５９０個〜約１０３０個のシアル酸反復単位である。本発明において特に有用な髄膜炎菌血清群Ｃの莢膜多糖類のサイズは、約２００ｋＤａ〜約３５０ｋＤａ、好ましくは約２５０ｋＤａ〜約３００ｋＤａであるが、必要に応じて他のサイズを使用してもよい。ただし、選択される多糖類のサイズは、キャリアタンパク質との結合後も被験体における抗体の産生を誘導するのに有効であるものとする。
【００２３】
莢膜多糖類は、当該技術分野で既知の多数の技法を用いて天然源から単離することができる。例えば、髄膜炎菌血清群Ｃ株を規定の培地中で１８時間培養し、０．５％ホルムアルデヒドで不活性化することができる。遠心分離して細胞を沈殿させた後、取り出した上清中の多糖類を０．１％セタブロンで沈殿させることができる。次いで、不溶性のセタブロン複合体を０．９Ｍ塩化カルシウム中に溶解し、粗多糖類を５倍容量のエタノールで沈殿させる。沈殿をリン酸緩衝液中にさらに溶解する。フェノール抽出及びリボヌクレアーゼ処理の後、サンプルを水に対して透析し、濃縮する（Bundle et al, J. Biol. Chem. 249:4797-4801, 1974（参照により本明細書中に援用される））。
【００２４】
別の態様では、本明細書に記載のＰｎ−Ｍｎ結合体において、髄膜炎菌血清群Ｃに由来する莢膜多糖類を、髄膜炎菌血清群Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、２９Ｅ、Ｗ−１３５又はそれらの組み合わせに由来する莢膜多糖類に置き換えてもよい。髄膜炎菌血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、２９Ｅ及びＷ−１３５は疾患の症例のほとんどを占める。かかる結合体は、これらの血清群の感染に対する保護をもたらすために、抗原に対する免疫応答を誘導することが可能な被験体に投与することができる。髄膜炎菌血清群Ａの多糖類（約３００ｋＤａ）は、α（１→リン酸）グリコシド結合を有し、約７０％〜９０％がＣ３でＯ−アセチル化したＮ−アセチルマンノサミン６−リン酸反復単位からなる。髄膜炎菌血清群Ｗ１３５の多糖類（約３０００００ダルトン）は、約７０％がシアル酸残基のＣ７又はＣ９でＯ−アセチル化した（２→６）α−Ｄ−ガラクトース（１→４）α−Ｄ−シアル酸反復単位からなる。髄膜炎菌血清群Ｙの多糖類（約３００ｋＤａ）は、約７０％がシアル酸残基のＣ７又はＣ９でＯ−アセチル化した（２→６）α−Ｄ−ガラクトース（１→４）α−Ｄ−シアル酸反復単位からなる。本発明において特に有用な髄膜炎菌の莢膜多糖類のサイズは、約２００ｋＤａ〜約３５０ｋＤａ、好ましくは約２５０ｋＤａ〜約３００ｋＤａであるが、必要に応じて他のサイズを使用してもよい。ただし、選択される多糖類のサイズは、キャリアタンパク質との結合後も被験体における抗体の産生を誘導するのに有効であるものとする。これらの多糖類の活性化条件は、それらの構造の違いのために血清群Ｃの多糖類のものとは異なる場合がある。
【００２５】
肺炎球菌タンパク質
ＰｓａＡは３０９アミノ酸残基長を有する。免疫原性組成物中に使用されるｒＰｓａＡは、少なくとも配列番号１の２１位〜３１９位におけるアミノ酸残基を含むことが好ましい。
【００２６】
肺炎球菌に由来する組み換えＰｓａＡは、従来の組み換え技法を用いて調製することができる。所望のタンパク質をコードするＤＮＡを作製するのに必要とされる組み換え手順は既知であり、当業者にとって日常的である。本発明を実施するために使用される核酸配列は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ベクター等のいずれであっても、様々な供給源から単離し、遺伝子操作し、増幅し、かつ／又は組み換え発現することができる。ｐｓａＡのヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド位置６〜８６７で与えられる。所望のタンパク質のコード配列をベクターにクローン化することができる。
【００２７】
細菌細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は植物細胞の発現系を含む任意の組み換え発現系を使用することができる。代替的には、これらの核酸は既知の化学合成法によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することができる。次いで、相補鎖を合成し、適切な条件下で鎖を共にアニーリングするか、又は適切なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を付加することによって二本鎖ＤＮＡ断片を得ることができる。
【００２８】
核酸増幅方法は当該技術分野で既知である。核酸を増幅し、組み換えＰｓａＡの調製に使用されるｐｓａＡコード配列を生成するために、オリゴヌクレオチドプライマーを使用することができる。このコード配列はプラスミド、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に感染又はトランスフェクトすることのできる組み換えウイルス、並びにＰｓａＡポリペプチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで発現させるために使用することのできる他のベクター等といった発現カセット中にクローン化することができる。抗生物質耐性等の選択可能な表現型を形質転換細胞に与えるために、選択マーカーを組み込むことができる。発現させたｒＰｓａＡは従来の技法を用いて回収し、精製することができる。
【００２９】
別の態様では、ＰｓａＡに加えて、本明細書で提供されるＰｎ−Ｍｎ結合型ワクチンの成分として他の肺炎球菌タンパク質を使用することができる。使用することのできる他の肺炎球菌タンパク質としては、ニューモリシン、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌表面タンパク質Ｃ（ＰｓｐＣ又はＣｂｐＡ）、ＰｈｔＡ又はＢＶＨ１１−３、ＰｈｔＢ又はＰｈｐＡ又はＢＶＨ−１１、ＰｈｔＥ又はＢＶＨ−３）、ＰｈｔＤ又はＢＶＨ−１１−２等、異なる命名法による肺炎球菌ヒスチジントライアドタンパク質又は類似のタンパク質、並びに肺炎球菌コリン結合タンパク質Ａ（ＰｃｐＡ）、非ヘム鉄含有フェリチン又は肺炎球菌防御タンパク質（ＰｐｐＡ、Ｄｐｒ）、ノイラミニダーゼＡ（ＮａｎＡ）、ノイラミニダーゼＢ（ＮａｎＢ）、鉄輸送タンパク質又は鉄化合物結合タンパク質ＰｉｕＡ及びＰｉａＡ、Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ又は自己溶菌酵素（ＬｙｔＡ）、エンド−β−アセチルグルコサミニダーゼ（ＬｙｔＢ）、１，４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼ（acetylmuranminidase）（ＬｙｔＣ）、カゼイン分解プロテアーゼ又はセリンプロテアーゼ（ＣｌｐＰ）、並びに接着病原性タンパク質Ａ（adherence and virulence protein A）（ＰａｖＡ）が挙げられる。
【００３０】
結合体の調製
多糖類はヒドロキシル基、場合によってはカルボキシル基及びアミノ基を含有し、タンパク質はアミノ基及びカルボキシル基を含有する。多糖類及びタンパク質はどちらも、天然型では互いに対する化学反応に活性を有しない。多糖類−タンパク質結合体を作製するためには、多糖類及びタンパク質の一方又は両方の適当な前処理又は活性化が、そうでなければ非反応性である分子を反応型に変換するのに必要とされる。タンパク質と多糖類とを結合する多くの方法が当該技術分野で既知である。多糖類を臭化シアンによって活性化して、ヒドラジド活性化タンパク質と反応するシアネート基を与えることができる（非特許文献３）。多糖類を臭化シアンによって活性化して、シアネート基を与えることができ、さらにジヒドラジドと反応し、その後ＥＤＣの存在下でタンパク質と結合する（Chu et al., Infect. Immun 1983; 40:245-256）。多糖類を部分的に加水分解し、還元末端にアミノ基を付加してもよい。二官能性リンカーをアミノ基に付加した後、活性化した多糖類をキャリアタンパク質と結合する（Costantino et al., Vaccine 1992; 10:691-8）。多糖類を１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレートで活性化して、キャリアタンパク質と反応するシアネート基を与えることができる（Lees A, Nelson BL, Mond JJ. Vaccine 1996; 14:190-198）。
【００３１】
好ましい態様では、ｒＰｓａＡを使用前に、例えば約４℃で約１８時間〜約２４時間、３０ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析する。次いで、透析したｒＰｓａＡを例えば生理食塩水中の０．１Ｍ  ＭＥＳ（ｐＨ６．５）、０．５Ｍヒドラジン（ｐＨ７．０）及び２０ｍＭ  １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド−ＨＣｌ（Sigma-Aldrichの「ＥＤＣ」）で処理してタンパク質を活性化し、４時間インキュベートする。次いで、処理したｒＰｓａＡを例えば１Ｍ  ＮａＯＨで中和した後、例えば３ｍＭ  Ｎａ2ＣＯ3及び３０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液に対して４℃で透析することでタンパク質を透析する。活性化し、透析したｒＰｓａＡは即座に使用しても、又は４℃で保管してもよい。
【００３２】
好ましい態様では、莢膜多糖類を６ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムで処理して、室温で４時間インキュベートし、莢膜多糖類を活性化する。次いで、活性化した莢膜多糖類を、例えば４℃で約１８時間〜約２４時間脱イオン水に対して透析する。活性化し、透析した莢膜多糖類は即座に使用しても、又は４℃で保管してもよい。
【００３３】
活性化したｒＰｓａＡを凍結乾燥し、水に再溶解する。活性化し、透析した莢膜多糖類（を凍結乾燥し、０．２Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、３０ｍＭ  ＥＤＴＡに再溶解する。このタンパク質溶液を多糖類溶液に添加し、一晩インキュベートする。ＮａＢＨ4を５０ｍＭの最終濃度まで添加し、約４時間〜約６時間インキュベートして、多糖類−タンパク質結合体中のＣ＝Ｎ二重結合をＣ−Ｎ単結合に還元し、未反応のアルデヒドをアルコールに還元する。結合体を１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）、１ｍＭ  ＥＤＴＡに対して４℃で透析する。次いで、透析した結合体を例えばＨＰＬＣによって、結合時の１９分の位置から１８分の位置までのタンパク質シグナル（２８０ｎｍ）のシフトについて評価することができる。
【００３４】
結合体を使用する方法
本明細書で提供されるｒＰｓａＡ／莢膜多糖類結合体は、抗原に対する免疫応答を誘導することが可能な被験体に投与することができる。ｒＰｓａＡ／莢膜多糖類結合体は、抗体反応を誘導するのに有効な量で被験体に投与される。「有効な量」とは、被験体が抗ｒＰｓａＡ抗体及び抗莢膜多糖類抗体の両方を産生するのを助けるｒＰｓａＡ／莢膜多糖類結合体の量である。かかる抗体は肺炎球菌及び髄膜炎菌血清型Ｃによる感染を予防し得る。
【００３５】
当業者は当該技術分野で既知の常法を用いて、或る量のｒＰｓａＡ／莢膜多糖類結合体が被験体において免疫を誘導するのに有効であるか否かを判断することができる。例えば、被験体において抗体を産生する抗原の能力は、別個の被覆抗原ｒＰｓａＡ及び莢膜多糖類を用いて、それぞれのＥＬＩＳＡアッセイにおいて抗体についてスクリーニングすることによって決定することができる。
【００３６】
一態様では、髄膜炎菌血清群Ｃ及び肺炎球菌に対するワクチン製剤が提供される。このワクチン製剤は、被験体において髄膜炎菌血清群Ｃ及び肺炎球菌の両方に対する免疫応答を生じさせるのに有効である。ワクチン製剤は、肺炎球菌に由来するｒＰｓａＡ及び髄膜炎菌血清群Ｃに由来する莢膜多糖類を含む。結合型免疫原性組成物は、薬学的に許容可能な希釈剤、キャリア、アジュバント及び／又は緩衝剤等の１つ又は複数のさらなる成分と共に与えることができる。例えば、結合体は希釈剤中に分散又は溶解してもよい。
【００３７】
免疫原性組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、持続放出製剤、粉末等として調製することができる。抗原及び免疫原性組成物は、それと混合可能な生理学的に許容可能なキャリアと混合してもよい。キャリアとしては、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、それらの組み合わせ等を挙げることができる。ワクチンは有効性をさらに高めるために、湿潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝剤等の補助物質をさらに含有してもよい。ワクチン製剤中の結合体の投与としては、例えば経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、経鼻投与、皮下投与及び腹腔内投与等の様々な経路による送達を挙げることができる。
【００３８】
免疫原性組成物は投与製剤に適合する形で、治療的に有効で、保護性かつ免疫原性となるような量で投与される。投与すべき量は、例えば抗体を合成し、必要に応じて細胞性免疫応答を生じさせる被験体の免疫系の能力等、免疫される被験体によって異なる。投与すべき抗原及び免疫原性組成物の正確な量は、実践者の判断によって決まる。しかしながら、当業者は好適な投与量範囲を容易に決定することができ、これは数マイクログラムから数ミリグラム程度であり得る。初回投与及び追加抗原投与の好適な計画は同様に変化し得るが、初回投与に続く後続投与を挙げることができる。ワクチンの投与量は同様に投与経路によって異なり、被験体の体格に応じて変化する。
【００３９】
重要な態様では、本明細書で提供されるｒＰｓａＡ／莢膜多糖類Ｐｎ−Ｍｎ結合体は、若年小児における中耳炎及び髄膜炎の主な原因である、肺炎球菌及び髄膜炎菌血清型Ｃの両方の感染を予防するために使用することができる。さらに、本明細書で提供されるｒＰｓａＡ／莢膜多糖類結合体は、他の年齢層の集団における菌血症、肺炎及び髄膜炎等の他の肺炎球菌疾患及び髄膜炎菌疾患の予防にも使用することができる。  
【００４０】
以下の実施例は本発明を説明するが、本発明を限定しないことが意図される。本明細書中で使用される全ての百分率は、特に指定のない限り重量によるものである。本明細書に引用される全ての特許、特許出願及び参考文献は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【実施例】
【００４１】
本明細書で提供されるワクチン及びその多くの利点のさらなる理解は、以下の実施例によって与えられる。
【００４２】
Ａ．精製ｒＰｓａＡの調製
ｐｓａＡ遺伝子のクローン化及び発現
組み換え肺炎球菌ＰｓａＡ（ｒＰｓａＡ）タンパク質を調製するために、大腸菌における肺炎球菌ｐｓａＡ遺伝子のコード配列を、発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）（Novagen，Madison，WI）にクローン化した。配列分析により、ｐｓａＡのコード配列がＢａｍＨＩ制限部位及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含まないことが明らかになった。ｒＰｓａＡタンパク質のクローン化、発現及び精製を目的として、ＰＣＲ増幅用のプライマー対を以下のようにして設計した：１）ＰＣＲ産物が５’末端及び３’末端にそれぞれＢａｍＨＩ部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する；２）クローン化ｐｓａＡのリーディングフレームがベクターのリーディングフレームとインフレームとなる；及び３）作製されたｒＰｓａＡタンパク質がそのＣ末端にＨｉｓタグを有する。フォワードプライマー及びリバースプライマー（５’−ＧＧＧＡＴＣＣＴＡＧＣＧＧＡＡＡＡＡＡＡＧＡＴＡＣＡ−３’（配列番号３）、５’−ＧＣＡＡＧＣＴＴＴＧＣＣＡＡＴＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＴＣ−３’（配列番号４））はそれぞれ、ｐｓａＡコード配列のヌクレオチド番号４２からヌクレオチド番号９２１までの８６８ｂｐの断片を増幅することを目的としていた。下線部のヌクレオチドは、これらのプライマーにおけるＢａｍＨＩ部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を示している。コードされたｒＰｓａＡタンパク質のアミノ残基数は３３１、予測分子量は３６９４０ダルトンである。クローン化断片のヌクレオチド配列を図１に、ｒＰｓａＡの予測アミノ酸配列を図２に示す。
【００４３】
典型的なＰＣＲ混合物は、５μｍｏｌのプライマー、２０ｎｇの肺炎球菌血清型４の染色体ＤＮＡ及びＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Life Technologies，Rockville，MD）を含有するものであった。ＰＣＲ条件は以下の通りである：９５℃で４０秒間のＤＮＡ変性、４２℃で１分間のプライマーアニーリング、及び７２℃で１．５分間のＤＮＡ合成。３０サイクルの合成の後、７２℃で５分間の伸長で反応を終結させた。ＰＣＲ産物をＧｅｎｅＣｌｅａｎキット（Qbiogen，Carlsbad，CA）を用いて精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクター（Promega，Madison，WI）にクローン化し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。挿入断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでの二重消化の後、得られたプラスミドから単離し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）の適合部位にクローン化してプラスミドｐＳＴ６４８を生成し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。ｐＳＴ６４８上のｐｓａＡ遺伝子が計画通りにクローン化されたことを確認するために、クローン化ＰＣＲ産物の制限地図を決定した。結果は公開されているｐｓａＡ遺伝子のものと一致していた。ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片のｐＥＴ２２ｂ（＋）への適当なクローン化を、組み換えタンパク質の誘導及びカルボキシル末端でのＨｉｓタグの存在によってさらに確認した。
【００４４】
組み換えタンパク質の合成を誘導するために、イソプロピル−１３−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）保有ｐＳＴ６４８の対数期培養物（Ａ６００ｎｍ=0.6）に添加し、培養をさらに２時間継続した。細胞を採取し、洗浄し、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）（ＴＮバッファー；１／１０容量）中に４℃で懸濁し、超音波処理によって破壊した。未破壊の細胞を遠心分離によって除去した後、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。組み換えタンパク質がＨｉｓタグを有することを確認するために、ＳＤＳゲル上のタンパク質をマウスモノクローナル抗ポリヒスチジン抗体（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO）に対するウエスタンブロットによって分析した。ゲル上のタンパク質をニトロセルロース紙に転写し、紙をｂｌｏｔｔｏ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１．５％脱脂乳）で洗浄し、ｂｌｏｔｔｏ中のモノクローナル抗ポリヒスチジン抗体（２００倍希釈）と共に２時間インキュベートし、ｂｌｏｔｔｏで３回洗浄し、ｂｌｏｔｔｏ中のアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウス抗体（５０００倍希釈）と共にインキュベートし、ｂｌｏｔｔｏ及びＡＰバッファー（０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ９．５）で洗浄した。０．１％ナフトール及び１％ファストブルー（Sigma-Aldrich）と共にインキュベートすることによって抗体−抗原相互作用を可視化した。結果を図３に示す。この結果から、過剰産生されたタンパク質が実際にｒＰｓａＡであり、大腸菌ＢＬ２Ｉ（ＤＥ３）（ｐＳＴ６４８）の粗細胞溶解物をタンパク質精製におけるｒＰｓａＡの供給源として使用することができることが示される。
【００４５】
ｒＰｓａＡタンパク質の精製
ｒＰｓａＡタンパク質を精製するために、粗細胞溶解物をＨｉｓ−Ｂｉｎｄ  Ｃｏｌｕｍｎ（Novagen，Madison，WI）にロードした。樹脂を結合バッファー（５０ｍＭイミダゾールを含有するＴＮバッファー）及び洗浄バッファー（２００ｍＭイミダゾールを含有するＴＮバッファー）で洗浄して、過剰のタンパク質及び非特異的に結合したタンパク質を除去した。結合したタンパク質を溶出バッファー（１Ｍイミダゾールを含有するＴＮバッファー）で溶出し、上記に記載されるようなＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びモノクローナル抗ポリヒスチジン抗体に対するウエスタンブロットによって分析した。抗ポリヒスチジンモノクローナル抗体と反応するタンパク質を含有する画分を、精製ｒＰｓａＡタンパク質として回収した（図３）。
【００４６】
Ｂ．ｒＰｓａＡ−ＭＣＰＳ結合体の調製
ｒＰｓａＡの活性化
ｒＰｓａＡを使用前に３０ｍＭ  ＮａＣｌに対して４℃で一晩透析した。透析したｒＰｓａＡを生理食塩水中の１Ｍ  ＭＥＳ（ｐＨ６．５）、５Ｍヒドラジン（ｐＨ７．０）、１Ｍ  ＥＤＣ（Sigma-Aldrich）と、０．１Ｍ、０．５Ｍ及び２０ｍＭのそれぞれの最終濃度で混合した。室温で４時間インキュベートした後、１Ｍ  ＮａＯＨ（０．０５ｍＬ）を添加して反応を中和し、その後３ｍＭ  Ｎａ2ＣＯ3及び３０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液に対して４℃で透析した。このタンパク質溶液を４℃で保管した。
【００４７】
ＭＣＰＳの活性化
髄膜炎菌血清型Ｃの莢膜ＰＳ（ＭＣＰＳ、１０ｍｇ／ＭＬ）を、過ヨウ素酸ナトリウムと６ｍＭの最終濃度で混合した。室温で４時間インキュベートした後、反応混合物を脱イオン水に対して一晩透析し、４℃で保管した。
【００４８】
ＰｓａＡ−ＭＣＰＳの結合
一定分量の活性化ｒＰｓａＡ（０．２５ｍｇ）を凍結乾燥し、２５μｌの水に再溶解した。一定分量の活性化ＭＣＰＳ（０．２５ｍｇ）を凍結乾燥し、３０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する２５μｌの０．２Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）に再溶解した。これら２つの溶液を合わせた。室温で一晩インキュベートした後、５μｌの１Ｍ  ＮａＢＨ4を添加し、さらに６時間継続してインキュベートした。１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）、１ｍＭ  ＥＤＴＡに対して４℃で透析した後、結合体生成物を４℃で保管した。ＭＣＰＳとｒＰｓａＡとの結合体を、WatersのＵｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ  Ｌｉｎｅａｒサイズ排除カラムを用いたＨＰＬＣ分析によって評価し、２０６ｎｍ及び２８０ｎｍの波長でモニタリングした。図４に示されているように、結合すると、タンパク質シグナルはクロマトグラムにおいて低分子量位置から高分子量位置までシフトした。
【００４９】
Ｃ．ｒＰｓａＡ−ＭＣＰＳ結合体の特性化
免疫原性
マウス（ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓ）に、マウス１匹当たり１μｇの用量のｒＰｓａＡ、ＭＣＰＳ又はＰｓａＡ−ＭＣＰＳ結合体のそれぞれで２週間毎に皮下免疫した。３回目の免疫の２週間後に血液を眼の静脈から採取し、抗体の力価を酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって求めた。簡潔に述べると、マイクロタイタープレート（Dynatec、ｎｏ．１）を、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中の抗原、０．５μｇ／ｍＬのｒＰｓａＡ又は５μｇ／ｍＬの天然ＭＣＰＳ及び５ｍｇ／ｍｌのメチル化ヒト血清アルブミンからなる溶液１００μｌを添加することによってＭＣＰＳで被覆し、室温で少なくとも４時間インキュベートした。ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０及び０．０２％ＮａＮ3を含有するＰＢＳで３回洗浄した（１５０μｌ／ウェル）。１００μＬの希釈剤（ＰＢＳ中の５％ウシ血清及び０．０２％ＮａＮ3）を各ウェルに添加し、希釈した（１００倍）抗血清の２倍段階希釈物を調製した。標準血清（ＭＣＰＳ又はｒＰｓａＡに対するＩｇＧ  ３２００単位／ｍＬと指定した）を同じプレート内で同様に処理した。室温で一晩インキュベートし、３回洗浄した後、１００μｌのアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ（３０００倍希釈）を添加し、室温で３時間インキュベートした。ウェルを３回洗浄し、１００μｌの基質（０．３ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含有するＩＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．８）中１ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロフェニルリン酸）を添加した。プレートを室温で２０分間（サンプル及び標準血清の発色に応じて異なる場合がある）インキュベートし、吸光度を４０５ｎｍで測定した。ＭＣＰＳ及びｒＰｓａＡに対するそれぞれの標準血清を研究室で調製し、サンプル血清の抗体レベルを求めるために標準として使用した。結果を下記表Ｉに示す。
【００５０】
【表１】
0005744842.tif 000002
【００５１】
ｒＰｓａＡ及びＭＣＰＳはどちらも、マウスにおいてアジュバントの非存在下で免疫原性であった。それらの免疫原性は結合後に有意に増大した。各々の個別成分と比較したところ、免疫原性はｒＰｓａＡ及びＭＣＰＳに対してそれぞれおよそ４１倍及び１７０倍増大していた。
【００５２】
抗ｒＰｓａＡ抗体の反応性
ＰｓａＡの能動免疫が、肺炎球菌感染から実験動物を保護するのに有効であることが実証された。保護をもたらすには、抗ＰｓａＡは全ての肺炎球菌細胞と相互作用する必要がある。生成した抗ｒＰｓａＡ抗体の交差反応性を、肺炎球菌の臨床分離株（血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｃ、８、９Ａ、１０Ａ、１０Ｂ、１１Ａ、１２Ａ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１８Ａ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２４、２２Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２３Ｃ及び３５を含む）に対する免疫ドットブロット及びウエスタンブロットによって調べた。肺炎球菌の細胞を１５ｍＬのトッドヘヴィットブロス中、５％ＣＯ2の存在下で３７℃で一晩培養し、遠心分離によって採取し、２ｍＬのＴＮバッファー中に懸濁した。氷浴中でエネルギーレベル７、５０％サイクル、５分間の超音波処理によって細胞を破壊した。１００００×ｇで１０分間の遠心分離の後、上清を回収し、肺炎球菌タンパク質の供給源として使用した。免疫ドットブロットについては、５μｌの細胞溶解物をニトロセルロース紙にスポットした。ウエスタンブロットについては、無作為に選択した肺炎球菌細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、ニトロセルロース紙に転写した。抗ｒＰｓａＡ抗体を使用した以外は上記に記載されるようにして紙を処理した。結果を図５Ａ及び図５Ｂに示す。抗ｒＰｓａＡ抗体は試験した全ての血清型の細胞と交差反応し、ＰｓａＡの分子量に相当する見掛けの分子量を有する単一タンパク質と反応した。
【００５３】
抗ＭＣＰＳ抗体の殺菌活性
誘導されたＭＣＰＳ特異的抗体の生物学的機能を、髄膜炎菌血清群Ｃ（Ｃ１１株）に対する殺菌アッセイによって決定した。簡潔に述べると、５％正常ウマ血清（ＮＨＳ）を含有するブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）寒天プレート上で細菌を一晩培養し、２日目に新たなプレートに移し、５時間培養した。この５時間培養物からの細菌を、５３０ｎｍでの透過率が６５％〜６６％となるまでＤＰＢＳＧ（１×ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．９ｍＭ  ＣａＣｌ2及び０．０１％ゼラチン）中に懸濁した後、およそ４０００ｃｆｕ／ｍＬの細菌を含有するように同じバッファーで１００００倍に希釈した。マイクロタイタープレートのウェルに、試験血清及び対照血清の２倍希釈物をＤＰＢＳＧで５０μｌ調製し、２５μｌの細菌懸濁液及び２５μｌの幼齢ウサギ補体（Pel-Freez，Rogers，Arkansas）と混合した。３７℃で６０分間インキュベートした後、１０μｌの細菌懸濁液を各々のウェルから取り出し、ＢＨＩ／ＮＨＳプレート上に塗り広げた。３７℃、５％ＣＯ2で一晩インキュベートした後、コロニーを計数した。殺菌力価は、抗血清を含まず、補体を含有する対照ウェルと比較して５０％のＣＦＵの低下を生じたサンプルの最大希釈率の逆数とした。各々のマウス群の力価の幾何平均を算出した。結果は下記表ＩＩに示す。
【００５４】
【表２】
0005744842.tif 000003
【００５５】
血清はＭＣＰＳ及びｒＰｓａＡ−ＭＣＰＳ結合体の両方について殺菌活性を有していたが、結合体に対する力価の方が有意に高かった（およそ４６倍）。
【００５６】
本発明を特定のプロセス及び生成物の実施形態を特に参照して、詳細に説明したが、様々な変更、修正及び適合を本開示をもとに行ってもよく、それらが添付の特許請求の範囲に規定される本発明の精神及び範囲に含まれるように意図されることを理解されたい。
【図１】
0005744842.tif 000004
【図２】
0005744842.tif 000005
【図３】
0005744842.tif 000006
【図４】
0005744842.tif 000007
【図５Ａ】
0005744842.tif 000008
【図５Ｂ】
0005744842.tif 000009
【配列表】
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