(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象物質と、該検出対象物質と特異的に結合し得る特異的結合物質と、蛍光分子とを溶液中で結合させ、前記蛍光分子から発生する蛍光を検出して前記検出対象物質の検出または定量を行う生体分子検出装置であって、
特定方向の直線偏光成分を有し前記蛍光分子を励起する励起光を照射する光源と、
前記溶液中に分散している前記蛍光分子の配向方向を少なくとも２つの方向に切り換える配向制御手段と、
前記配向方向の切り換えに伴って変化する、前記蛍光分子から発せられた蛍光を検出する受光部と、
前記受光部で検出された蛍光に基づいて前記検出対象物質の検出または定量を行う演算部とを備えたことを特徴とする生体分子検出装置。
【請求項２】
前記配向制御手段は、前記蛍光分子の遷移モーメントの方向と前記励起光の振動方向とが互いに平行となる第１の方向、および、前記遷移モーメントの方向と前記励起光の振動方向とが互いに垂直となる第２の方向に、前記蛍光分子を切り換えて配向するものであることを特徴とする請求項１に記載の生体分子検出装置。
【請求項３】
前記配向制御手段は、前記蛍光分子を所定の時間間隔で切り替えて配向させるものであり、
前記受光部は、蛍光を複数回検出するものであり、
前記演算部は、検出した複数の蛍光強度の加算平均を行い、加算平均された蛍光強度に基づいて前記検出対象物質の検出または定量を行うものであることを特徴とする請求項１または２に記載の生体分子検出装置。
【請求項４】
前記所定の時間間隔は、前記検出対象物質、前記特異的結合物質および前記蛍光分子の質量または体積と、前記配向制御手段による配向制御の強度とに基づいて決定されることを特徴とする請求項３に記載の生体分子検出装置。
【請求項５】
前記配向制御手段は、前記励起光と波長が異なる光を照射して前記蛍光分子を配向させるものであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の生体分子検出装置。
【請求項６】
前記配向制御手段は、前記溶液に対し複数の位置から前記励起光と波長が異なる光を照射するものであることを特徴とする請求項５に記載の生体分子検出装置。
【請求項７】
前記溶液は、少なくとも一部に平面を有する溶液保持部に保持されたものであることを特徴とする請求項５または６に記載の生体分子検出装置。
【請求項８】
前記配向制御手段は、前記溶液を通って前記溶液保持部の平面から出射する方向に、前記励起光と波長が異なる光を照射し、かつ、前記溶液と前記平面との界面において、前記光源から照射される光と異なる光に焦点を結ばせるものであることを特徴とする請求項７に記載の生体分子検出装置。
【請求項９】
前記受光部は、光を分光する分光手段を備えることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載の生体分子検出装置。
【請求項１０】
前記分光手段は、特性の異なる複数のフィルタであり、
前記受光部は、前記蛍光分子の発光波長に応じて前記複数のフィルタを切り替えるものであることを特徴とする請求項９に記載の生体分子検出装置。
【請求項１１】
前記演算部は、前記配向制御手段によって所定の方向から他の方向へ配向が切り替えられる間における、前記特異的結合物質を介して前記検出対象物質に結合した前記蛍光分子から発生する蛍光の強度の時間変化と、前記検出対象物質に結合していない前記特異的結合物質に結合した前記蛍光分子から発生する蛍光の強度の時間変化とに差があることを利用して、前記検出対象物質の検出または定量を行うものであることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の生体分子検出装置。
【請求項１２】
検出対象物質と、該検出対象物質と特異的に結合し得る特異的結合物質と、蛍光分子とが溶液中で結合し、前記蛍光分子から発生する蛍光を検出して前記検出対象物質の検出または定量を行う生体分子検出方法であって、
特定方向の直線偏光成分を有し前記蛍光分子を励起する励起光を照射するステップと、
前記溶液中に分散している前記蛍光分子の配向方向を少なくとも２つの方向に切り換えるステップと、
前記配向方向の切り換えに伴って変化する、前記蛍光分子から発せられた蛍光を検出するステップと、
検出された蛍光に基づいて前記検出対象物質の検出または定量を行うステップとを備えたことを特徴とする生体分子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中の検出対象物質を検出する技術に係り、特に、検体内の生体分子、ウイルス、核酸、蛋白質および細菌等を検出可能な生体分子検出装置および生体分子検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医師や技師等が診療の現場で生体分子検出を行い、その場で測定結果を得て診断や治療に役立てる生体分子検出法が注目されている。生体分子検出法は、抗原抗体反応等の特異的な反応を利用した高い選択性により、血液、尿、汗といった複数成分を有する体液の中から、検出対象物質だけを選択的に検出する方法である。このような生体分子検出法は、特に、ウイルス、核酸、蛋白質および細菌等の生体分子の微量検出、検査、定量および分析などに広く用いられている。
【０００３】
生体分子検出法として、ラジオイムノアッセイが実用化されている。ラジオイムノアッセイは、アイソトープで標識された抗原または抗体を用い、その抗原または抗体と特異的に結合する抗体または抗原の有無を検出するものである。ラジオイムノアッセイは、アイソトープの放射線量を測定することにより検出対象物質を定量するもので、高感度な測定が可能である。
【０００４】
放射性物質を用いない生体分子検出法として蛍光イムノアッセイがある。蛍光イムノアッセイとしては、予め反応層に抗体を固定しておき（これを固相という）、当該反応層に、測定対象溶液および蛍光分子で標識された抗体を流し、反応層近傍の蛍光を測定することで、抗体に特異的に結合した抗原の濃度を測定する装置が知られている（例えば特許文献１参照）。
【０００５】
しかしながら、固相を利用した蛍光イムノアッセイは、固相を作成するのにコストがかかるという問題があった。固相を用いず液体中で生体分子検出を行う（これを液相という）方法として、蛍光偏光法を利用して抗原抗体反応を確認する方法がある。蛍光偏光法は、蛍光標識した分子に別の分子が結合し分子の大きさが変化することで生じる、ブラウン運動の変化に基づく蛍光偏光度の値の変化を検出する方法である。蛍光偏光法を利用した生体分子検出法は、検体中の検出対象物質の簡便かつ迅速な検知法として知られている（例えば特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平７−１２０３９７号公報
【特許文献２】特開２００８−２９８７４３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、蛍光偏光法は、ランダムな運動であるブラウン運動の変化を利用しているため、測定感度に限界があるという問題がある。また、蛍光偏光法を利用した生体分子の検出装置については考慮されていない。
【０００８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、高感度測定が可能な生体分子検出装置および生体分子検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明に係る生体分子検出装置は、検出対象物質と、検出対象物質と特異的に結合し得る特異的結合物質と、蛍光分子とが溶液中で結合させ、蛍光分子から発生する蛍光を検出して検出対象物質の検出または定量を行う生体分子検出装置であって、
特定方向の直線偏光成分を有し蛍光分子を励起する励起光を照射する光源と、
溶液中の蛍光分子を少なくとも２つの方向に切り換えて配向させる配向制御手段と、
蛍光分子から発せられた蛍光を検出する受光部と、
受光部で検出された蛍光に基づいて検出対象物質の検出または定量を行う演算部とを具備する構成を採る。
【００１０】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、配向制御手段は、蛍光分子の遷移モーメントの方向と励起光の振動方向とが互いに平行となる第１の方向、および、上記遷移モーメントの方向と励起光の振動方向とが互いに垂直となる第２の方向に、蛍光分子を切り換えて配向させるものとしてもよい。光の「振動方向」とは電場の振動方向を意味するものであり、光が偏光している場合にはその偏光方向と同義である。
【００１１】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、配向制御手段は、蛍光分子を所定の時間間隔で切り替えて配向させるものであり、
受光部は、蛍光を複数回検出するものであり、
演算部は、検出した複数の蛍光強度の加算平均を行い、加算平均された蛍光強度に基づいて検出対象物質の検出または定量を行うようにしてもよい。
【００１２】
このとき、所定の時間間隔は、検出対象物質、特異的結合物質および蛍光分子の質量または体積と、配向制御手段による配向制御の強度とに基づいて決定されることが好ましい。
【００１３】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、配向制御手段は、励起光と波長が異なる光を照射して前記蛍光分子を配向させるものであることが好ましい。この場合において、配向制御手段は、溶液に対し複数の位置から励起光と波長が異なる光を照射するものであることが好ましく、溶液は、少なくとも一部に平面を有する溶液保持部に保持されたものであることが好ましい。
【００１４】
さらに、溶液保持部が平面を有する場合において、配向制御手段は、溶液を通って溶液保持部の平面から出射する方向に、励起光と波長が異なる光を照射し、かつ、溶液と上記平面との界面において、励起光と波長が異なる光に焦点を結ばせるものであることが好ましい。
【００１５】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、受光部は、光を分光する分光手段を備えることが好ましい。この場合において、分光手段は特性の異なる複数のフィルタであり、受光部は蛍光分子の発光波長に応じて複数のフィルタを切り替えるものであることが好ましい。
【００１６】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、演算部は、配向制御手段によって所定の方向から他の方向へ配向が切り替えられる間における、特異的結合物質を介して検出対象物質に結合した蛍光分子から発生する蛍光の強度の時間変化と、検出対象物質に結合していない特異的結合物質に結合した蛍光分子から発生する蛍光の強度の時間変化とに差があることを利用して、検出対象物質の検出または定量を行うものであることが好ましい。
【００１７】
本発明に係る生体分子検出方法は、検出対象物質と、検出対象物質と特異的に結合し得る特異的結合物質と、蛍光分子とが溶液中で結合し、蛍光分子から発生する蛍光を検出して検出対象物質の検出または定量を行う生体分子検出方法であって、
特定方向の直線偏光成分を有し蛍光分子を励起する励起光を照射するステップと、
溶液中の蛍光分子を少なくとも２つの方向へ配向させるステップと、
蛍光分子から発せられた蛍光を検出するステップと、
検出された蛍光に基づいて検出対象物質の検出または定量を行うステップとを具備するようにした。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、高感度な生体分子検出をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】実施の形態１に係る生体分子検出装置の抗原抗体反応の概要を示した模式図（１）である。
【図１Ｂ】実施の形態１に係る生体分子検出装置の抗原抗体反応の概要を示した模式図（２）である。
【図２Ａ】励起光の振動方向と蛍光分子の遷移モーメントとが平行な場合を表した模式図である。
【図２Ｂ】励起光の振動方向と蛍光分子の遷移モーメントとが垂直な場合を表した模式図である。
【図３Ａ】フリー分子を表した模式図である。
【図３Ｂ】バインディング分子を表した模式図である。
【図４Ａ】実施の形態１に係る生体分子検出装置の外観斜視図である。
【図４Ｂ】実施の形態１に係る生体分子検出装置の開閉部を開けた図である。
【図５】生体分子検出装置の主要な構成を示すブロック図である。
【図６】配向制御光源部から照射されるレーザーの照射方向の切り替えを上面から見た模式図である。
【図７Ａ】レーザーの照射方向の一方と分子の配向方向との関係を表した模式図である。
【図７Ｂ】レーザーの照射方向のもう一方と分子の配向方向との関係を表した模式図である。
【図８Ａ】レーザーの照射方向の一方と複数の分子の配向方向との関係を表した模式図である。
【図８Ｂ】レーザーの照射方向のもう一方と複数の分子の配向方向との関係を表した模式図である。
【図９】実施の形態１に係る生体分子検出装置における受光部の詳細な構成を表した模式図である。
【図１０】検体の準備から廃棄までの流れを模式的に表した図である。
【図１１】実施の形態１に係る生体分子検出装置における１周期の配向制御信号、サンプリングクロック、ＰＤ出力およびＡ／Ｄ変換部出力を表したグラフである。
【図１２】実施の形態１に係る生体分子検出装置における配向制御信号を３周期に亘って示したグラフである。
【図１３Ａ】実施の形態２に係る生体分子検出装置の抗原抗体反応の概要を示した模式図（１）である。
【図１３Ｂ】実施の形態２に係る生体分子検出装置の抗原抗体反応の概要を示した模式図（２）である。
【図１４】実施の形態２に係る生体分子検出装置の主要な構成を示すブロック図である。
【図１５】実施の形態２に係る生体分子検出装置における受光部の詳細な構成を表した模式図である。
【図１６Ａ】実施の形態２に係る生体分子検出装置におけるＡ／Ｄ変換部出力を表したグラフ（１）である。
【図１６Ｂ】実施の形態２に係る生体分子検出装置におけるＡ／Ｄ変換部出力を表したグラフ（２）である。
【図１７Ａ】一方からレーザーを照射した場合における、蛍光分子の遷移モーメントの方向とランダム偏光した励起光の振動方向との関係を表す概念図である。
【図１７Ｂ】他方からレーザーを照射した場合における、蛍光分子の遷移モーメントの方向とランダム偏光した励起光の振動方向との関係を表す概念図である。
【図１８Ａ】一方からレーザーを照射した場合における、蛍光分子の遷移モーメントの方向と２方向に直線偏光した励起光の振動方向との関係を表す概念図である。
【図１８Ｂ】他方からレーザーを照射した場合における、蛍光分子の遷移モーメントの方向と２方向に直線偏光した励起光の振動方向との関係を表す概念図である。
【図１９】蛍光分子の遷移モーメントの方向の変化に伴うフォトダイオード出力の変化を表したグラフである。
【図２０Ａ】レーザーの偏光軸の変化に伴うバインディング分子の配向の変化を説明するための概念図（１）である。
【図２０Ｂ】レーザーの偏光軸の変化に伴うバインディング分子の配向の変化を説明するための概念図（２）である。
【図２０Ｃ】レーザーの偏光軸の変化に伴うバインディング分子の配向の変化を説明するための概念図（３）である。
【図２１】試薬カップの多点に直線偏光したレーザーを底面から入射させる場合を示す概念図である。
【図２２】直線偏光したレーザーを所定の方向から多点に入射させるための配向制御光源部の構造を示す概念図である。
【図２３】直線偏光したレーザーを所定の方向から多点に入射させるための光学系の一例を示す概念図である。
【図２４】直線偏光したレーザーを所定の方向から多点に入射させるための光学系の別の例を示す概念図である。
【図２５】マイクロレンズアレイを示す概念図である。
【図２６】試薬カップの形状の一例を示す概念図である。
【図２７】集光されたレーザーの焦点と試薬カップとの位置関係の一例を示す概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、添付図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。生体分子検出には様々な特異的な反応が利用されるが、ここでは抗原および抗体の特異的な反応を利用し、当該抗体に標識された蛍光分子から発生する蛍光を基に、抗体と反応した抗原を検出する装置を例にとって説明する。
【００２１】
（実施の形態１）
図１Ａおよび図１Ｂは、本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置における抗原抗体反応の概要を示した模式図である。図１Ａおよび１Ｂを用いて、液中での抗原抗体反応について説明する。ここでは、円筒形の試薬カップ１０の中に、蛍光分子１４が標識された抗体１２が入れられている場合を考える。生体分子検出をする検体は、全血から分離した血漿である。試薬カップ１０に血漿１６を分注して撹拌すると、抗体１２と特異的に結合する抗原１８が血漿１６中に存在する場合は、抗体１２と抗原１８との間で抗原抗体反応が起こり、図１Ｂに示すように抗原１２および抗体１８が特異的に結合して血漿１６中に存在する。抗体１２は、抗原１８に対して十分に多い量が入れられているが、抗原抗体反応は全量が反応しない場合があり、一部の抗体１２または抗原１８は、抗原抗体反応をしないまま血漿１６中に残る。以下、抗原抗体反応で結合した抗体１２、抗原１８および蛍光分子１４をバインディング分子、抗原抗体反応をせず液中に漂っている抗体１２および蛍光分子１４をフリー分子と呼ぶ。バインディング分子およびフリー分子は、血漿１６中に混在している。なお、血漿１６中には抗原１８以外の成分も存在するが、説明を簡単にするため、図１Ａおよび１Ｂでは抗原１８以外の成分は省略してある。
【００２２】
本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置は、フリー分子およびバインディング分子が混在している溶液に励起光を照射し、蛍光分子１４から発生する蛍光を受光した蛍光データから、抗原１８の検出または定量を行う。従って、抗原１８を含むバインディング分子から発生する蛍光のみを検出することが望ましいが、フリー分子およびバインディング分子は溶液中に混在しているため、溶液に励起光を照射すると、フリー分子に付随している蛍光分子１４も蛍光を発生して不要成分となる。そこで、本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置は、全蛍光データの中からバインディング分子に付随した蛍光分子から発生する蛍光の寄与分を算出する。
【００２３】
本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置１００において、バインディング分子から発生する蛍光の寄与分と、フリー分子から発生する蛍光の寄与分とを算出する原理を説明するために、直線偏光した励起光による蛍光分子１４の励起効率について図２Ａおよび２Ｂを用いて説明する。図２Ａは、励起光１９の振動方向と蛍光分子１４の遷移モーメントとが平行な場合を表した模式図、図２Ｂは、励起光１９の振動方向と蛍光分子１４の遷移モーメントとが垂直な場合を表した模式図である。ここでは、説明を分かりやすくするため、蛍光分子１４の長手方向と遷移モーメントの向きとが互いに平行である場合とした。
【００２４】
蛍光分子１４は、光エネルギーを吸収すると励起状態に遷移し、基底状態に戻る過程で蛍光を発生する。直線偏光した励起光１９で蛍光分子１４を励起すると、蛍光分子１４は励起光と同じ方向に偏光した蛍光を発生する。蛍光分子１４の発生する蛍光の偏光度は、蛍光分子１４の回転運動の速度に依存する。すなわち蛍光分子１４が回転運動していなければ、蛍光分子１４は励起光１９の振動方向と同じ方向に偏光した蛍光を発生し、蛍光分子１４が速い回転運動をしているほど、蛍光分子１４から発生する蛍光は偏光していない。蛍光分子１４が励起される場合、励起光１９と相互作用するものは、蛍光分子１４の分子構造によって決まる遷移モーメントという蛍光分子１４内のベクトルである。遷移モーメントは、蛍光分子１４内で、ある固有の方向を持っており、遷移モーメントの方向と励起光１９の振動方向との関係が蛍光分子１４の励起効率を決定する。具体的には、蛍光分子１４は、遷移モーメントと平行な方向に振動する光を選択的に吸収する。従って、図２Ａおよび２Ｂに示すように、励起光１９が紙面上下にわたって振動しながら紙面左から右に進行して蛍光分子１４に当たる場合、直線偏光した励起光１９の振動方向が蛍光分子１４の遷移モーメントと平行な場合（図２Ａ）に最も励起効率が高くなり、直線偏光した励起光１９の振動方向が蛍光分子１４の遷移モーメントと直行している場合（図２Ｂ）に励起効率が０となる。遷移モーメントの向きは、蛍光分子１４の向きによって変わるため、溶液中における蛍光分子１４の向きは、蛍光分子１４の励起効率に影響を与える。
【００２５】
溶液中における蛍光分子１４の向きを考えるため、図３Ａおよび３Ｂを用いて、溶液中におけるフリー分子およびバインディング分子の運動について説明する。図３Ａは、フリー分子である抗体１２および蛍光分子１４を示した模式図である。図３Ｂは、バインディング分子である抗体１２、抗原１８および蛍光分子１４を示した模式図である。フリー分子およびバインディング分子は、溶液中で不規則に運動（ブラウン運動）しており、溶液中の移動および回転運動を行っている。溶液中での分子のブラウン運動は、絶対温度、分子の体積および溶媒の粘度等の影響を受けることが知られている。バインディング分子は、抗原１８の分だけフリー分子より体積が大きく、溶液中でブラウン運動しにくい。溶液中でフリー分子およびバインディング分子のブラウン運動が違うことを利用して、ブラウン運動の変化からバインディング分子の検出を行う方法(蛍光偏光イムノアッセイ）が知られているが、ブラウン運動というランダムな運動を利用しているため、液中に多数存在するバインディング分子、フリー分子はランダムな配向状態にあり、それらからの信号が合算された信号を検出するため、Ｓ／Ｎが悪く検出感度に限界がある。
【００２６】
そこで、本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置は、レーザーを利用して溶液中の分子の配向を制御し、その制御への追従性の良否から、フリー分子、バインディング分子を切り分けることで、高感度化を実現する。溶液中のフリー分子およびバインディング分子にレーザーを照射すると、溶液中でランダムな運動をしていたフリー分子およびバインディング分子は、特定の一方向を向く（以下、このように外力の付加を受けて分子が特定の一方向を向いた状態を、分子の配向の完了という）。フリー分子およびバインディング分子は溶液中での移動および回転運動のしやすさが異なることから、レーザーで溶液中の分子の配向を制御した場合においても、フリー分子とバインディング分子とでは、レーザーを照射されてからこれらの分子が配向を完了するまでに要する時間に差が生じる。本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置は、フリー分子およびバインディング分子が配向を完了するまでに要する時間の差を利用して、それぞれの分子に付随した蛍光分子１４の励起効率に差を生じさせ、バインディング分子から発生する蛍光の寄与分の算出を行う。
【００２７】
続いて、本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置１００の構成について説明する。図４Ａは、生体分子検出装置１００の外観斜視図である。生体分子検出装置１００の側面には、表示部１０２、操作部１０４および開閉部１０６がある。表示部１０２は、測定結果等を表示する。操作部１０４は、モードの設定および検体情報の入力等を行う部分である。開閉部１０６は、上蓋の開閉が可能な構成となっており、検体のセット時には上蓋が開けられ、測定時には上蓋が閉じられる。この構成により、外部の光が測定に影響を与えることを防いでいる。
【００２８】
図４Ｂは、開閉部１０６を開いた場合における生体分子検出装置１００の外観斜視図である。開閉部１０６を開くと、中には試薬カップ１０８および保持台１１０がある。試薬カップ１０８は、保持台１１０に保持されており、保持台１１０から着脱可能となっている。試薬カップ１０８は、溶液を入れる円柱状の容器である。ユーザーは、試薬カップ１０８に検体を分注し、上蓋を閉じて測定を行う。図示しないが、生体分子検出装置１００内には試薬タンクおよび分注部があり、測定が開始されると、分注部は試薬タンク内から試薬を吸い上げて試薬カップ１０８内に分注する。
【００２９】
図５は、生体分子検出装置１００の主要な内部構成を説明するための機能ブロック図である。生体分子検出装置１００内には、試薬タンク１１２および分注部１１４がある。試薬タンク１１２は複数種類の試薬を貯めておくタンクであり、分注部１１４はピペットによって試薬タンク１１２から使用する試薬を吸い上げ、試薬カップ１０８へ分注する。また、生体分子検出装置１００内には、配向制御光源部１１６および励起光源部１１８がある。配向制御光源部１１６は、ＡＯＤ（Ａｃｏｕｓｔｏ  Ｏｐｔｉｃ  Ｄｅｆｌｅｃｔｏｒ）１２０に向けて配向制御用のレーザー１１７を照射し、試薬カップ１０８内の溶液中にある分子に外力を加えて分子の配向を制御する。
【００３０】
ＡＯＤ１２０は、音響光学効果を利用して、入力電圧に基づいて内部の屈折率を変化させることで、入射した光の進行方向を切り替える。すなわち、ＡＯＤ１２０は、ＦＧ（Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）１２２から出力された電圧信号（以下このＡＯＤ１２０への出力信号を配向制御信号という）によって入力される電圧に基づいて、内部の屈折率を変化させてレーザー１１７の進行方向を切り替える。換言すれば、レーザー１１７の進行方向は、ＦＧ１２２が発生する配向制御信号によって決まる。
【００３１】
ＦＧ１２２は、様々な周波数と波形をもった電圧信号を発生させることのできる装置で、ＣＰＵ１３２からの命令を受けて、ＡＯＤ１２０およびサンプリングクロック発生部１３０へ、それぞれ異なる電圧信号を出力する。
【００３２】
ＣＰＵ１３２は、出力する配向制御信号をＦＧ１２２に対して指定することで、ＡＯＤ１２０がレーザー１１７の進行方向を切り替えるタイミングを制御する。
【００３３】
励起光源部１１８は、内部に備えた偏光子によって直線偏光しかつ蛍光分子１４を励起する励起光１１９を試薬カップ１０８に向けて照射する。
【００３４】
受光部１２４は、試薬カップ１０８の下部に設けられている。受光部１２４は、試薬カップ１０８内の蛍光分子１４から発生する蛍光１２３を試薬カップ１０８の下部で受光し、当該受光信号をアナログ電気信号（アナログ蛍光データ）に変換して増幅部１２６へ出力する。
【００３５】
増幅部１２６は、受光部１２４から出力されたアナログ蛍光データを増幅してＡ／Ｄ変換部１２８へ出力する。
【００３６】
サンプリングクロック発生部１３０は、ＦＧ１２２から出力された電圧信号に基づいて、Ａ／Ｄ変換部１２８がアナログ蛍光データをサンプリングするタイミングを指定するサンプリングクロックをＡ／Ｄ変換部１２８に入力する。
【００３７】
Ａ／Ｄ変換部１２８は、サンプリングクロック発生部１３０から出力されたサンプリングクロックに基づいて、増幅部１２６から出力されたアナログ蛍光データのサンプリングを行い、サンプリングしたアナログ蛍光データをデジタルデータに変換して、ＣＰＵ１３２へ出力する。
【００３８】
ＣＰＵ１３２は、Ａ／Ｄ変換部１２８から出力されたデジタルデータの演算を行い、その結果を表示部１０２へ出力する。また、ＣＰＵ１３２は、操作部１０４から入力を受けて、配向制御光源部１１６、励起光源部１１８、分注部１１４およびＦＧ１２２の動作の指示命令を行う。具体的には、ＣＰＵ１３２は、配向制御光源部１１６および励起光源部１１８に対してはそのＯＮ／ＯＦＦ命令を行い、分注部１１４に対しては使用する試薬を指定する命令および分注動作開始命令を行い、ＦＧ１２２に対しては出力する電圧信号の波形の指示命令および出力命令を行う。
【００３９】
本実施の形態では、配向制御光源部１１６に、波長１．３μｍ、出力７００ｍＷのレーザーを用い、励起光源部１１８に、波長５３２ｎｍ、出力１０ｍＷの光を用いる。
【００４０】
図６は、配向制御光源部１１６から照射されるレーザーの照射方向の切り替えを説明するため、生体分子検出装置１００の内部を上面側から見た模式図である。図６を用いて、試薬カップ１０８に対するレーザーの照射方向の切り替えについて詳細に説明する。配向制御光源部１１６から照射されるレーザー１１７は、ＡＯＤ１２０を通って試薬カップ１０８へ照射される。レーザー１１７は、試薬カップ１０８の溶液全体を照らす程度の幅を持っている。ＡＯＤ１２０は、配向制御光源部１１６から照射されたレーザーの照射方向を２方向で交互に切り替える。具体的には、ＡＯＤ１２０は、ＦＧ１２２から５Ｖの配向制御信号が入力された場合には、レーザー１１７をレーザー１３４の方向へ進ませ、ＦＧ１２２から０Ｖの配向制御信号が入力された場合には、レーザー１１７をレーザー１３６の方向へ進ませる。レーザー１３４は、試薬カップ１０８の側面に入射する。レーザー１３６は、ダイクロイックミラー１３８によって反射され、レーザー１３４の進行方向と垂直な方向に進んで試薬カップ１０８の側面に入射する。上面から見た試薬カップ１０８を時計の文字盤に例えると、レーザー１３４は９時の位置から入射して３時の方向へ進行し、レーザー１３６は６時の位置から入射して１２時の方向へ進行する。すなわち、レーザー１３４の進行方向とレーザー１３６の進行方向とは互いに直交する。ダイクロイックミラー１３８は、レーザー１１７に用いた波長の光のみを反射し、その他の波長の光を透過させる。励起光源部１１８から照射された励起光１１９は、ダイクロイックミラー１３８を透過し、ダイクロイックミラー１３８で反射したレーザー１３６と同じ方向に進行して試薬カップ１０８の側面へ入射する。
【００４１】
このような構成により、生体分子検出装置１００は、ＦＧ１２２からの配向制御信号の入力によりＡＯＤ１２０を制御することで、レーザーが試薬カップ１０８へ入射する方向を、角度が互いに９０度異なる２つの方向で交互に切り替えることができる。ＡＯＤ１２０と試薬カップ１０８との間には遮光板１４０があり、生体分子検出装置１００は、レーザー１３４およびレーザー１３６が示す方向以外に進行するレーザーが試薬カップ１０８へ照射されないように構成されている。また、レーザーは、レーザー１３４およびレーザー１３６のいずれの方向に進行した場合においても、円柱状の試薬カップ１０８の側面へ入射する。試薬カップ１０８は円柱状であるため、レーザーの進行方向が切り替わっても、レーザーが入射する試薬カップ１０８の側面の形状は同じである。
【００４２】
レーザーの照射方向の切り替えに対する試薬カップ１０８内の蛍光分子の動きについて、図７Ａおよび７Ｂを用いて説明する。図７Ａは、一方のレーザーの照射方向と分子の配向方向との関係を表した模式図であり、図７Ｂは、もう一方のレーザーの照射方向と分子の配向方向との関係を表した模式図である。なお、本明細書において、フリー分子およびバインディング分子に関して「配向方向」とは、配向が完了した状態における抗体および蛍光分子が並んだ方向を意味するものとする。フリー分子およびバインディング分子は、溶液中でランダムな方向を向いて分散している。しかし、レーザーを照射された試薬カップ１０８内のフリー分子およびバインディング分子は、レーザーによって外力を受けて特定の方向に配向する。レーザーによる外力は、レーザーがフリー分子およびバインディング分子に当たって散乱する反作用生じるものであり、レーザーが進行する方向とフリー分子およびバインディング分子の向きによって力を及ぼす方向が決まる。ここではフリー分子を例にとって説明する。図７Ａのように、レーザー１３４を照射されたフリー分子は、レーザーによって回転方向の力を受け、レーザー内で、レーザーの外力がフリー分子に及ぼす回転方向の力が釣り合う方向（ここではレーザー１３４の進行方向と同じ方向）を向いて安定する。換言すれば、フリー分子は、レーザー１３４の進行方向と同じ方向を向いていない場合は、右回転または左回転の外力を受けるが、レーザー１３４の進行方向と同じ方向を向いている場合は、右回転および左回転の外力が釣り合うため、一の方向を向いて安定する。一方図７Ｂのように、レーザー１３６の方向に進行するレーザーを受けた抗体１２および蛍光分子１４は、レーザー１３４によって配向した方向に対して垂直な方向を向いて安定する。このように、レーザーの照射方向を変えることにより、溶液内での抗体１２および蛍光分子１４の配向方向を切り替えることができる。
【００４３】
図８Ａおよび８Ｂは、レーザーの照射方向と複数の分子の配向方向との関係を表した模式図である。図８Ａおよび８Ｂは、試薬カップ１０８を上面から見た図である。図８Ａは、紙面左から右に進行するレーザー１３４を受けたフリー分子およびバインディング分子が、レーザー１３４の進行方向と同方向に配向した場合の図である。レーザー１３４の照射を受けている溶液中のフリー分子およびバインディング分子は、同一方向に配向する。すなわち、全ての蛍光分子１４の遷移モーメントが同一方向に揃う。図８Ｂは、紙面下から上に進行するレーザー１３６を受けたフリー分子およびバインディング分子が、レーザー１３６の進行方向と同方向に配向した場合の図である。レーザー１３４からレーザー１３６に切り替わると、紙面右を向いて配向していたフリー分子およびバインディング分子は、左回転する方向の力を受ける。この場合、バインディング分子に対して体積が小さいフリー分子の方がバインディング分子よりも速く回転して、レーザー１３６の進行方向と同方向を向いて安定する。次に、フリー分子に対して回転速度が遅いバインディング分子が、レーザー１３６の進行方向と同方向を向いて安定する。すなわち、十分な時間が経過すれば、フリー分子およびバインディング分子は同一方向に配向するが、それぞれの分子が配向を完了するまでに要する時間には差がある。レーザー１３６を照射した場合も、全てのフリー分子およびバインディング分子が配向を完了すれば、全ての蛍光分子１４の遷移モーメントが同一方向に揃う。
【００４４】
本実施の形態では、レーザー１３４によって配向が完了した蛍光分子１４の遷移モーメントの方向は、直線偏光した励起光が振動する方向と平行であり、蛍光分子１４の励起効率が最大となる。また、レーザー１３６によって配向が完了した蛍光分子１４の遷移モーメントの方向は、直線偏光した励起光が振動する方向と垂直となり、蛍光分子１４の励起効率が０となる。従って、ＡＯＤ１２０によるレーザーの照射方向の切り替えは、直線偏光した励起光に対する蛍光分子１４の励起効率を最大と最小（励起できない場合）の間で切り替えることになる。
【００４５】
続いて図９を用いて受光部１２４の詳細な構成について説明する。図９は、受光部１２４の詳細な構成を表した模式図である。受光部１２４は、レンズ１４２、フィルタ１４４、偏光子１４６、レンズ１４８およびＰＤ（フォトダイオード）１５０を含む。受光部１２４は、試薬カップ１０８の底面側から蛍光を受光する。試薬カップ１０８内の蛍光分子１４から発生した蛍光１２３は、レンズ１４２によって集光され、フィルタ１４４、偏光子１４６およびレンズ１４８を通ってＰＤ１５０へ入射する。この図では、蛍光１２３の幅を、矢印１４７および矢印１４９を用いて表してある。フィルタ１４４は、蛍光分子１４から発生する蛍光以外の光をカットするバンドパスフィルタであり、励起光等の蛍光以外の光がＰＤ１５０へ入射することを防いでいる。偏光子１４６は、直線偏光した励起光１１９の振動方向と同じ方向に偏光した光のみを透過させる。一方で、試薬カップ１０８内で散乱された励起光や、フリー分子およびバインディング分子の配向方向を切り替えている途中で蛍光分子から発光した蛍光は、その振動方向が元々の励起光の振動方向と異なっているため、偏光子１４６を透過できない。ＰＤ１５０は、レンズ１４８によって集光された蛍光を受光し、蛍光の強度に応じた電荷を発生させて増幅部１２６へ出力する。このようにして受光部１２４は、配向の切り替えが完了した蛍光分子１４から発生した蛍光を電荷に変換する。また、受光部１２４は、試薬カップ１０８の底面側で蛍光を受光するため、レーザー１１７および励起光１１９の影響を受けにくい。
【００４６】
続いて生体分子検出装置１００の測定時における動作について説明する。図１０は、検体の準備から廃棄までの流れを模式的に表した図である。本実施の形態では、検体に全血を用い、検出対象物質である抗原１８としてＰ５３（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ５３）を検出する場合を考え、検出対象物質と特異的に結合する物質である抗体１２にＰ５３抗体を用いた場合について示す。蛍光分子１４には、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社の商品名）を用いた。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５は、５７０ｎｍ程度にピークを持ち、５５０ｎｍ−７００ｎｍ程度の波長を持った蛍光を発光する。蛍光分子としてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５を使用する場合、フィルタ１４４は、ＳｐＯr−Ａフィルタ（Ｓｅｍｒｏｃｋ社の商品名）セットの、受光側フィルタを用いる。このフィルタは、５７５ｎｍ−６００ｎｍ程度の波長を透過させるバンドパスフィルタであり、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ  ５５５から発生する蛍光の一部を透過する。試薬カップ１０８の容量は、約１２０μＬである。
【００４７】
測定の準備にあたり、まず患者から採集した全血１５６を５０μＬ遠心分離し、血漿１６を分離する。分離して取り出した血漿１６を、生体分子検出装置１００の検体セット部１５２にセットする。ここまでの作業はユーザーが行う。生体分子検出装置１００は、検体セット部１５２にセットされた血漿１６を、試薬カップストック部１６０にストックしてある未使用の試薬カップ１０８の中に分注する。続いて、生体分子検出装置１００は、試薬タンク１１２の中にあるＰ５３抗体をピペット１５８で吸い上げ、試薬カップ１０８の中に分注する。試薬カップ１０８内に血漿１６およびＰ５３抗体を入れた生体分子検出装置１００は、試薬カップ１０８を３７℃で温調しながら、内蔵したボルテックスミキサーによって振動させ、抗原抗体反応を起こさせる。その後、生体分子検出装置１００は、励起光の照射および蛍光の検出を行い、蛍光の検出終了後に試薬カップ１０８を内蔵のごみ箱１５４へ廃棄する。
【００４８】
測定の際にＦＧ１２２が出力する配向制御信号、サンプリングクロック発生部１３０が出すサンプリングクロック、ＰＤ１５０が出すＰＤ出力およびＡ／Ｄ変換部１２８が出すＡ／Ｄ変換部出力について、図１１を用いて説明する。図１１は、縦軸がそれぞれ生体分子検出装置１００における１周期の配向制御信号の電圧、サンプリングクロックの電圧、ＰＤ出力およびＡ／Ｄ変換部出力を表し、横軸が時間ｔを表したグラフである。なお、ここでは説明を容易にするため、ＰＤ出力およびＡ／Ｄ変換部出力については、グラフを模式的に示してある。
【００４９】
ＦＧ１２２から出力される配向制御信号は、測定前は０Ｖとなっている。配向制御信号が０Ｖの場合、サンプリングクロックも０Ｖとなりサンプリングは行われない。サンプリングクロックが入力されないため、Ａ／Ｄ変換部出力も０となる。ＰＤ出力では、初め装置に起因するノイズｉｚの値が出力される。このようにＰＤからノイズしか出力されない理由は、０Ｖの配向制御信号がＡＯＤ１２０に入力されることで、配向制御光源部１１６から照射されたレーザー１１７がレーザー１３６の方向に進み、溶液内の全ての蛍光分子１４の遷移モーメントが励起光の振動方向と垂直となる方向に配向したことで、励起光１１９が蛍光分子１４を励起不可能になるためである。
【００５０】
続いて、生体分子検出装置１００は、配向制御信号を５Ｖにすると共に、励起光を試薬カップ１０８に向けて照射する。配向制御信号を５Ｖとすると、サンプリングクロック発生部１３０は、サンプリングタイミングを表すサンプリングクロックとして５Ｖの信号を定期的に出力する。そしてＡ／Ｄ変換部１２８はサンプリングクロックに合わせたタイミングでアナログ蛍光データのサンプリングをしてＡ／Ｄ変換を行う。また、配向制御信号を５Ｖとすると、ＡＯＤ１２０がレーザーの進行方向を切り替え、レーザー１１７が進行する方向がレーザー１３６の方向からレーザー１３４の方向に切り替わる。レーザー１１７が進行する方向の切り替えに伴い、試薬カップ１０８に対するレーザーの照射方向も９０度切り替わるため、試薬カップ１０８内の蛍光分子１４は、配向方向が９０度切り替わる。
【００５１】
レーザーの照射方向が切り替わったことに伴い、バインディング分子に比べて体積の小さいフリー分子から配向方向が切り替わり、励起光の振動方向と蛍光分子の遷移モーメントとが垂直でなくなって蛍光分子から蛍光が発生する。配向が切り替わる途中のフリー分子に付随する蛍光分子１４から発生した蛍光は、大半が偏光していないため偏光子１４６によって遮断される。そして、配向が完了したフリー分子では、蛍光分子の遷移モーメントが励起光の振動方向と平行となるため励起効率が最大となる。配向が完了したフリー分子に付随する蛍光分子から発生する蛍光は、励起光の振動方向と同じ方向に偏光しているため、偏光子１４６によって遮断されずＰＤ１５０に到達する。配向が完了したフリー分子が増加することに伴い、ＰＤ出力もｉｚから増加していく。時刻Ｔ１で全てのフリー分子の配向が完了すると、ＰＤ出力は、値ｉｆで一旦飽和する。その後、時刻Ｔ２でバインディング分子の配向が完了し始めることに伴い、ＰＤ出力は再び増加していく。配向が切り替わる途中のバインディング分子に付随する蛍光分子１４から発生した蛍光は、大半が偏光していないため偏光子１４６によって遮断される。時刻Ｔ３で全てのバインディング分子の配向が完了すると、ＰＤ出力は値ｉｔで飽和する。
【００５２】
Ａ／Ｄ変換部出力は、ＰＤ出力と同様に初めＤｚの値を出力し、徐々に増加して値Ｄｆで一旦飽和する。ＰＤ出力がｉｆから増加することに伴い、Ａ／Ｄ変換部出力も徐々に増加してＤｔで飽和する。このように、配向制御信号を０Ｖとしておき、その後配向制御信号を５Ｖとすれば、フリー分子に付随する蛍光分子から発生した蛍光による寄与分と、バインディング分子に付随する蛍光分子から発生した蛍光による寄与分とが時間差を伴ってＡ／Ｄ変換部出力に表れる。
【００５３】
配向制御信号は、５Ｖの出力がＴ秒間続いた後０Ｖとなる。このＴ秒は、少なくともＰＤ出力がｉｔで２度目の飽和をする以上の期間を取る。配向制御信号が５Ｖから０Ｖに切り替わることに伴い、サンプリングクロックは０Ｖとなる。配向制御信号が５Ｖから０Ｖに切り替わると、ＰＤ出力は、しばらくｉｔの値を出力した後ｉｚの値まで減少する。このようにＰＤ出力が装置ノイズに起因するｉｚのみとなる理由は、配向制御信号が０Ｖに切り替わったことに伴い、蛍光分子１４の遷移モーメントと励起光の振動方向とが垂直となり、蛍光分子１４の励起効率が０となって蛍光が発生しないためである。ＰＤ出力がしばらくｉｔの値を出力する理由は、蛍光分子１４の配向方向の切り替えが、配向制御信号の切り替えに対して少し遅れるためである。ここで、配向制御信号を０Ｖとする期間は、配向制御信号を５Ｖとしていた期間と同じＴ秒とした。これは、レーザーの出力が一定という条件下では、溶液中のフリー分子およびバインディング分子の配向が完了するまでに要する時間は、配向制御信号を０Ｖから５Ｖにした場合と配向制御信号を５Ｖから０Ｖにした場合とで、ほぼ同じだからである。配向制御信号が０Ｖから５Ｖに変わって時間Ｔだけ経過し、配向制御信号が０Ｖに戻って時間Ｔだけ経過するまでが、生体分子検出装置１００における測定の１周期である。すなわち、生体分子検出装置１００における１周期の測定時間は２Ｔである。
【００５４】
図１２は、生体分子検出装置１００における配向制御信号を複数周期に亘って示したグラフである。生体分子検出装置１００は、図１２に示すように、配向制御信号を所定の時間間隔で切り替えて上記１周期の測定を複数回行い、得られた複数のＤｔ、ＤｆおよびＤｚの値についてそれぞれ加算平均を行って、Ｄｔ、ＤｆおよびＤｚの値の平均値を求める。本実施の形態では、上記１周期の測定を１０回行い、Ｄｔ、ＤｆおよびＤｚの値の平均値を求める。これにより、様々な要因により発生する測定結果のばらつきを平均化している。
【００５５】
ＣＰＵ１３２は、得られたＤｔ、Ｄｆ、Ｄｚの平均値から、バインディング分子の濃度を算出する。具体的には、初めに測定値Ｓを、次式（１）によって求める。
Ｓ＝（Ｄｔ−Ｄｆ）／（Ｄｔ−Ｄｚ）・・・（１）
【００５６】
式（１）において、（Ｄｔ−Ｄｆ）は、バインディング分子に付随した蛍光分子から発生した蛍光の強度を表している。（Ｄｔ−Ｄｚ）は、得られたデータの最大値から装置ノイズのデータを減ずることで装置ノイズの影響を排除した、バインディング分子およびフリー分子を合わせた蛍光の強度を表している。（Ｄｔ−Ｄｆ）を（Ｄｔ−Ｄｚ）で除算することで、光学系変動等の測定結果の再現性を悪化させる要因をキャンセルしている。
【００５７】
ＣＰＵ１３２は、ここで求めた測定値Ｓから、診断値Ｃ（検出対象物質の濃度）を求める。診断値Ｃは、次式によって求める。
Ｃ＝ｆ（Ｓ）・・・（２）
【００５８】
ここで、ｆ（Ｓ）は、検量線関数である。生体分子検出装置１００は、あらかじめ測定項目ごとに異なる検量線関数を持っておき、測定値Ｓを診断値Ｃに変換する。ＣＰＵ１３２は、得られた診断値Ｃを表示部１０２へ出力する。
【００５９】
以上説明したように、本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置１００によれば、レーザーの照射方向の切り替えにより、溶液中のフリー分子およびバインディング分子の配向方向を切り替えることが可能な構成とした。レーザーによるフリー分子およびバインディング分子の配向方向は、フリー分子およびバインディング分子に付随した蛍光分子の遷移モーメントと直線偏光した励起光の振動方向とが平行となる方向、またはフリー分子およびバインディング分子に付随した蛍光分子の遷移モーメントと直線偏光した励起光の振動方向とが垂直となる方向の２つである。すなわち生体分子検出装置１００は、レーザーの照射方向の切り替えにより、フリー分子およびバインディング分子に付随する蛍光分子が励起光により励起される場合と励起されない場合とを切り替えることが可能となる。また、フリー分子およびバインディング分子は、レーザーの照射方向の切り替えに伴う配向の完了までに要する時間に差が生じるため、それぞれの分子に付随した蛍光分子から発生する蛍光が受光されるタイミングが異なる。従って生体分子検出装置１００は、溶液中の全ての蛍光分子から蛍光が発生しても、フリー分子およびバインディング分子それぞれに付随した蛍光の寄与分を算出することができ、簡便な構成で検出対象物質の濃度を正確に測定することができる。
【００６０】
また、以上の構成において、生体分子検出装置１００は、レーザーによる外力によって、フリー分子およびバインディング分子の配向を全て同じ方向に切り替えるため、ブラウン運動というランダムな運動を利用して測定する場合に比べて、高感度な測定をすることができる。
【００６１】
なお、本実施の形態では、抗原抗体反応を利用する場合を例にとって説明したが、検出対象物質と検出対象物質に特異的に結合する物質との組み合わせは、ここで説明した場合に限られない。例えば本願発明は、抗原を用いて抗体を検出する場合や、特定の核酸を用いて当該核酸とハイブリダイゼーションをする核酸を検出する場合、核酸を用いて核酸結合性たんぱく質を結合する場合、リガンドを用いてレセプターを検出する場合、糖を用いてレクチンを検出する場合、プロテアーゼ検出を利用する場合、高次構造変化を用いる場合等にも適用することができる。
【００６２】
また、本実施の形態では、測定結果から検出対象物質の濃度の算出までの説明を容易にするため、測定結果のグラフを模式的な図とした場合における検出対象物質の算出の説明を行ったが、必ずしもこのように算出する必要はない。例えば、グラフ中の変曲点に基づいて、フリー分子による蛍光とバインディング分子による蛍光との境目の点を決めて算出を行っても良い。
【００６３】
また、配向制御信号を５Ｖまたは０Ｖとする期間は、フリー分子およびバインディング分子の体積や、溶媒の粘度、溶液の温度等に基づいて変化させることが望ましい。フリー分子およびバインディング分子に対するレーザーの照射方向が切り替わった時からこれらの分子の配向が完了するまでに要する時間は、フリー分子およびバインディング分子の体積や、溶媒の粘度、溶液の温度等に起因する、溶液中におけるフリー分子およびバインディング分子の回転しやすさによって決まる。フリー分子およびバインディング分子が溶液中で回転しにくい場合には、フリー分子およびバインディング分子の配向が完了するまでに要する時間が長くなるため、配向制御信号を５Ｖまたは０Ｖとする期間を、配向が完了する程度まで長くすることが望ましい。その場合、配向制御信号を５Ｖにする期間と０Ｖにする期間とは、必ずしも同じ長さの期間とする必要はない。
【００６４】
また、本実施の形態では、配向制御光源部１１６として波長１．３μｍ、出力７００ｍＷのレーザーを出力可能なレーザー光源を用いたが、配向制御光源部１１６として用いるレーザー光源はこれに限られない。レーザーの波長および出力は、フリー分子およびバインディング分子の体積、質量等起因する溶液中での回転しやすさに基づいて決定することが望ましく、特に、フリー分子とバインディング分子との間に、配向の完了までに要する時間に差が表れる程度の出力のレーザーを用いることが望ましい。
【００６５】
なお、本実施の形態では、繰り返し測定を行って測定結果の加算平均を求めたが、加算平均は必ずしも行う必要はなく、ユーザーが何を重視するかによって決定すれば良い。例えば、ユーザーが素早く測定を行いたい場合には、測定を１周期のみ行って結果を表示しても良いし、ユーザーがより高精度な測定を行いたい場合には、１周期の測定を何度も繰り返すことによって測定精度を向上させることもできる。
【００６６】
（実施の形態２）
図１３Ａおよび１３Ｂは、本発明の実施の形態２に係る生体分子検出装置の抗原抗体反応の概要を示した模式図である。実施の形態２では、２種類の抗体を使用し、２種類の抗原を検出する。以下、試薬カップ２０の中に抗体２２および抗体２６が入れられている場合を考える。
【００６７】
抗体２２および抗体２６は、それぞれ蛍光分子２４および蛍光分子２８で標識されている。試薬カップ２０の中に検体３０を入れて撹拌すると、抗体２２と特異的に結合する抗原３２が検体３０中に存在する場合には、抗体２２と抗原３２との間で抗原抗体反応が起こり、抗体２２および抗原３２が特異的に結合する。同様に抗体２６と特異的に結合する抗原３４が検体３０中に存在する場合には、抗体２６と抗原３４との間で抗原抗体反応が起こり、抗体２６および抗原３４が特異的に結合する。実施の形態１で説明した場合と同様に、一部の抗原および抗体は、抗原抗体反応をしないまま溶液中に存在する。以下、抗原抗体反応をした抗体２２、抗原３２および蛍光分子２４をバインディング分子１、抗原抗体反応をしなかった抗体２２および蛍光分子２４をフリー分子１と呼ぶ。さらに、抗原抗体反応をした抗体２６、抗原３４および蛍光分子２８をバインディング分子２、抗原抗体反応をしなかった抗体２６および蛍光分子２８をフリー分子２と呼ぶ。本実施の形態では、検出対象物質である抗原３２はＰ５３、抗原３４はＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ）とする。また、抗体２２としてＰ５３と特異的に結合するＰ５３抗体を用い、抗体２６としてＣＥＡと特異的に結合するＣＥＡ抗体を用いる。蛍光分子２４として、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社の商品名）を用い、蛍光分子２８として、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社の商品名）を用いた。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５８８は、５７５−７５０ｎｍ程度の波長を持った蛍光を発し、６１０ｎｍ程度の波長の蛍光を最も強く発する。
【００６８】
本発明の実施の形態２に係る生体分子検出装置は、２種類のフリー分子および２種類のバインディング分子が存在する溶液に励起光を照射し、目的のバインディング分子の検出または定量を行う。
【００６９】
図１４は、本発明の実施の形態２に係る生体分子検出装置２００の主要な構成を示すブロック図である。なお、実施の形態１で示した生体分子検出装置１００と同一の構成要素には同一の符号を付し、その説明を省略する。生体分子検出装置２００は、実施の形態１で示した生体分子検出装置１００の構成に対して、受光部２０２、分注部２０４、試薬タンク２０６およびＣＰＵ２０８が主に異なる。
分注部２０４は、複数の抗体がそれぞれ別の容器に入った試薬タンク２０６から２種類の抗体を吸い上げ、試薬カップ１０８内へ分注する。
受光部２０２は、試薬カップ１０８内の蛍光分子から発生した蛍光を検出するものであるが、ＣＰＵ２０８からの命令を受けて、蛍光分子２４から発生する蛍光と蛍光分子２８から発生する蛍光とを分けて受光できるように構成されている。
ＣＰＵ２０８は、Ａ／Ｄ変換部１２８から出力されたデジタルデータの演算を行い、その結果を表示部１０２へ出力する。また、ＣＰＵ２０８は、操作部１０４から入力を受けて、配向制御光源部１１６、励起光源部１１８、分注部２０４、ＦＧ１２２および受光部２０２の動作の指示命令を行う。具体的には、ＣＰＵ２０８は、配向制御光源部１１６および励起光源部１１８に対してはそのＯＮ／ＯＦＦ命令を行い、分注部２０４に対しては使用する試薬を指定する命令および分注動作開始命令を行い、ＦＧ１２２に対しては出力する配向制御信号の波形の指示命令および出力命令を行い、受光部２０２に対しはフィルタの切り替え命令を行う。
【００７０】
受光部２０２の構成について、図１５を用いて具体的に説明する。図１５は、実施の形態２に係る生体分子検出装置２００における受光部２０２の詳細な構成を表した模式図である。受光部２０２内のフィルタ切替部２１０は、フィルタ２１２およびフィルタ２１４の２種類のフィルタを備えている。２種類のフィルタは、可動式となっており、レンズ１４２によって集光された光が通るフィルタを切り替えることができる。ィルタ切替部２１０は、ＣＰＵ２０８からの命令を受けて、使用するフィルタを切り替える。例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５から発生する蛍光を検出する場合は、フィルタ２１２を使用し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５８８から発生する蛍光を検出する場合はフィルタ２１４を使用する。これにより、不要な蛍光がＰＤ１５０に到達することを防いでいる。本実施の形態では、フィルタ２１２としてＳｐＯr−Ａフィルタ（Ｓｅｍｒｏｃｋ社の商品名）セットの受光側フィルタを用い、フィルタ２１４としてＳｐＲｅｄ−Ａフィルタ（Ｓｅｍｒｏｃｋ社の商品名）セットの受光側フィルタを用いる。ＳｐＲｅｄ−Ａフィルタセットの受光側フィルタは、６０５ｎｍ−６５０ｎｍ程度の波長を透過させるバンドパスフィルタである。なお、本実施の形態では２種類のフィルタにより分光して不要な蛍光がＰＤ１５０に到達することを防いだが、必ずしもフィルタを用いて光を分光する必要はない。例えば、回折格子やプリズムを用いて光を分光して、特定の波長を有する光のみを受光してもよい。
【００７１】
続いて生体分子検出装置２００の測定動作について説明する。生体分子検出装置２００の測定動作は基本的には、実施の形態１で説明した生体分子検出装置１００の測定動作と同じであるが、細かな点で異なる。フリー分子とバインディング分子を分離して検出できる理由については、実施の形態１で説明したため、ここでは２種類のバインディング分子を、どのように分離して検出するかを説明する。生体分子検出装置２００は、まず２種類のバインディング分子のどちらを先に検出するか決定する。これは、ユーザーが、操作部１０４を通して入力する等して任意に決定することができる。ここでは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５を蛍光分子として持つバインディング分子１から先に検出する。ＣＰＵ２０８は、受光部２０２内のフィルタ切替部２１０に、フィルタ２１２の使用を指示する命令を出す。フィルタ切替部２１０は、ＣＰＵ２０８からの命令を受け、レンズ１４２で集光された光が通る位置にフィルタ２１２を移動させる。配向制御信号が５Ｖに変わり、試薬カップ１０８に向けて励起光が照射されると、溶液内の蛍光分子２４および蛍光分子２８からそれぞれ蛍光が発生する。蛍光分子２４および蛍光分子２８からそれぞれ発生した蛍光は、レンズ１４２によって集光され、フィルタ２１２へ入射する。フィルタ２１２は５７５ｎｍ−６００ｎｍ程度の波長の光のみを通すため、蛍光分子２４から発生した蛍光は当該フィルタを透過し、蛍光分子２８から発生した蛍光は当該フィルタによりほぼ全て遮断される。このようにして、蛍光分子２４から発生した蛍光のみを検出することができる。
【００７２】
実施の形態１と同様に、生体分子検出装置２００によって１周期の測定を行い、蛍光分子２４から発生した蛍光の検出を行った結果のＡ／Ｄ変換部出力を、図１６Ａに示す。なお、ここでは計算を容易にするため、グラフを模式的に示してある。Ａ／Ｄ変換部出力は、装置ノイズに起因する値Ｄ１ｚを出力し、徐々に増加し、時刻Ｔ１１で値Ｄ１ｆとなって一旦飽和する。続いてＡ／Ｄ変換部出力は、時刻Ｔ１２で再び増加し、時刻Ｔ１３で値Ｄ１ｔとなって再び飽和する。
【００７３】
生体分子検出装置２００は、配向制御信号を所定の時間間隔で切り替えて上記１周期の測定を複数回行い、得られた複数のＤ１ｔ、Ｄ１ｆおよびＤ１ｚの値についてそれぞれ加算平均を行って、Ｄ１ｔ、Ｄ１ｆおよびＤ１ｚの値の平均値を求める。
【００７４】
続いて、ＣＰＵ２０８は、得られたＤ１ｔ、Ｄ１ｆ、Ｄ１ｚの平均値から、バインディング分子１の濃度を算出する。具体的には、実施の形態１で測定値Ｓを求めた場合と同じ演算を行い、測定値Ｓ１を求める。そして、検量線関数ｆ１（Ｓ）を用いて、測定値Ｓ１から濃度Ｃ１に変換する。ＣＰＵ２０８は、得られた濃度Ｃ１を表示部１０２へ出力する。
【００７５】
次に、生体分子検出装置２００は、バインディング分子２の測定を行う。ＣＰＵ２０８は、受光部２０２内のフィルタ切替部２１０に、フィルタ２１４の使用を指示する命令を出す。フィルタ切替部２１０は、ＣＰＵ２０８からの命令を受け、レンズ１４２で集光された光が通る位置にフィルタ２１４を移動させる。フィルタ２１４は６１０ｎｍ−６５０ｎｍ程度の波長の光のみを通すため、蛍光分子２４から発生した蛍光は当該フィルタにより遮断され、蛍光分子２８から発生した蛍光は当該フィルタを透過する。このようにして、蛍光分子２８から発生した蛍光のみを検出することができる。
【００７６】
生体分子検出装置２００によって１周期の測定を行い、蛍光分子２８から発生した蛍光の検出を行った結果のＡ／Ｄ変換部出力を、図１６Ｂに示す。なお、ここでは計算を容易にするため、グラフを模式的に示してある。Ａ／Ｄ変換部出力は、装置ノイズに起因する値Ｄ２ｚを出力し、徐々に増加し、時刻Ｔ２１で値Ｄ２ｆとなって一旦飽和する。続いてＡ／Ｄ変換部出力は、時刻Ｔ２２で再び増加し、時刻Ｔ２３で値Ｄ２ｔとなって再び飽和する。
【００７７】
生体分子検出装置２００は、配向制御信号を所定の時間間隔で切り替えて上記１周期の測定を複数回行い、得られた複数のＤ２ｔ、Ｄ２ｆおよびＤ２ｚの値についてそれぞれ加算平均を行って、Ｄ２ｔ、Ｄ２ｆおよびＤ２ｚの値の平均値を求める。
【００７８】
バインディング分子２を測定する場合の配向制御信号の切り替えタイミングは、バインディング分子１を測定する場合と異なる。これは、バインディング分子１、フリー分子１、バインディング分子２およびフリー分子２それぞれの体積および質量が異なるため、それぞれの分子の配向が完了するまでに要する時間が異なるためである。
【００７９】
図１６Ａおよび１６Ｂに示したように、バインディング分子１を測定する場合とバインディング分子２を測定する場合とでは、ＰＤ出力が増加したり飽和したりするタイミングは異なる。これは、バインディング分子１の体積およびバインディング分子２の体積の違いによる溶液中での運動しやすさに起因する。
【００８０】
続いて、ＣＰＵ２０８は、得られたＤ２ｔ、Ｄ２ｆ、Ｄ２ｚの平均値から、バインディング分子２の濃度を算出する。具体的には、実施の形態１で測定値Ｓを求めた場合と同じ演算を行い、測定値Ｓ２を求める。そして、検量線関数ｆ２（Ｓ）を用いて、測定値Ｓ２から濃度Ｃ２に変換する。ＣＰＵ２０８は、得られた濃度Ｃ２を表示部１０２へ出力する。
【００８１】
以上説明したように、本発明の実施の形態２に係る生体分子検出装置２００によれば、実施の形態１で説明した生体分子検出装置１００の構成に加え、検出対象物質と特異的に結合する物質として２種類の抗体および蛍光分子を用い、フィルタ切替部２１０を２種類のフィルタの切り替えが可能な構成とした。そのため、検出対象物質を含むバインディング分子に付随した蛍光分子に対応したフィルタを使用することで、検出対象物質を含むバインディング分子に付随した蛍光分子から発生する蛍光のみを検出することができ、一の検体に含まれる２種類の検出対象物質の濃度を正確に測定することができる。
【００８２】
また、一の検体から同時に複数の検出対象物質を測定できることは、診断の精度を上げる上で重要である。例えば、本実施の形態で検出したＰ５３およびＣＥＡを併用して診断を行うと、それぞれを単独で検出して診断を行った場合に比べ、乳がんにおいては２倍程度の陽性率で診断をすることができる。
【００８３】
なお、本実施の形態では、蛍光分子をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５８８としたが、蛍光分子はこれに限られない。複数の検出対象物質のそれぞれとそれぞれ特異的に結合する複数の物質を、フィルタで分離できる程度に互いの蛍光波長が離れている複数の蛍光分子でそれぞれ標識すれば良い。
【００８４】
なお、本実施の形態では、抗原抗体反応を利用する場合を例にとって説明したが、検出対象物質と検出対象物質に特異的に結合する物質との組み合わせは、これに限られない。例えば、抗原を用いて抗体を検出する場合や、特定の核酸と当該核酸とハイブリダイゼーションをする核酸、核酸と核酸結合性たんぱく質、リガンドとレセプター、糖とレクチン、プロテアーゼ検出、高次構造変化等を用いても良い。
【００８５】
また、本実施の形態では検出対象物質が２種類の場合について説明したが、検出対象物質の種類は、それより多くても良い。その場合においても、複数の検出対象物質のそれぞれとそれぞれ特異的に結合する複数の物質を用い、それぞれ異なった複数の蛍光分子で標識し、それぞれの蛍光分子から発生する蛍光を、それぞれの蛍光に対応した複数のフィルタで分離して検出することで、それぞれの検出対象物質を互いに分離して検出することができる。
【００８６】
なお、検出対象物質の種類が増えるほど蛍光分子の種類も増え、複数の蛍光分子から発生する複数の蛍光が混在することになるため、フィルタのみで蛍光を分離することが困難となる場合がある。その場合は、励起光の種類を増やすことで蛍光の分離を容易にすることができる。蛍光分子の吸光度は励起光の波長に依存し、蛍光分子の種類ごとに吸収しやすい波長帯がある。そのため、励起光の波長を変えることで、一部の蛍光分子のみが蛍光を発生するようになり、フィルタでの蛍光の分離が容易となる。また、より狭い通過帯域を持つバンドパスフィルタを用いることで、目的の蛍光分子から発生する蛍光を検出しやすくすることができる。
【００８７】
（実施の形態１および実施の形態２の設計変更）
なお、以上説明した本発明に係る各実施の形態は、本発明の一例を示すものであり、本発明の構成を限定するものではない。本発明に係る生体分子検出装置は、上記各実施の形態に限定されず、本発明の目的を逸脱しない範囲で種々変更して実施することが可能である。
【００８８】
例えば、溶液中の分子への外力の付与は、レーザーによるものに限られず、フリー分子およびバインディング分子の配向が完了するまでに要する時間に差が生じる程度の外力を加えるものであれば、磁気的な方法や電気的な方法としても良い。
【００８９】
また、本発明に係る各実施の形態では、互いに直交する２つの方向、つまりフリー分子およびバインディング分子に付随した蛍光分子の遷移モーメントと直線偏光した励起光の振動方向とが平行となる方向、および、フリー分子およびバインディング分子に付随した蛍光分子の遷移モーメントと直線偏光した励起光の振動方向とが垂直となる方向の間で、レーザーの進行方向を切り替えたが、必ずしも互いに直行する２つの方向の間で切り替える必要はない。例えば、検出対象物質の定量を行いたい場合は、設定すべきレーザーの２つの進行方向のうち一方が、フリー分子およびバインディング分子に付随した蛍光分子の遷移モーメントと直線偏光した励起光の振動方向とが垂直となる方向、すなわち直線偏光した励起光が蛍光分子を励起不可能な方向であれば良い。励起光が蛍光分子を励起できない方向に蛍光分子を配向させれば、蛍光が発生しないためＰＤ出力はノイズのみとなる。すると、レーザーの照射をもう一方の方向に切り替えた時、配向が完了したフリー分子およびバインディング分子に付随した蛍光分子から発生する蛍光のみを受光することができる。換言すれば、蛍光の発生を一旦リセットすることができるため、不要な蛍光を受光することがなくなり、不要な蛍光によるノイズがなくなる。この場合、レーザーが進行する２つの方向が直交していれば、フリー分子およびバインディング分子の配向が完了するまでの時間差が最大となって、最もＳ／Ｎが良くなる。一方で、例えばレーザーが進行する２つの方向の成す角度が６０度であれば、レーザーの進行方向が直交する場合と比べ、フリー分子およびバインディング分子の配向が完了するまでに要する時間が短くなり、測定に要する時間も短くなる。このようにレーザーが進行する２つの方向の成す角度が０度に近づくほど、フリー分子およびバインディング分子の配向が完了するまでに要する時間が短くなり、測定時間も短くなる。
【００９０】
また、溶液中に検出対象物質が存在するか否か、すなわちバインディング分子が存在するかしないかのみを測定したい場合は、フリー分子およびバインディング分子の間で配向の完了までに時間差が生じる程度だけ角度をつけた２つの方向でレーザーの照射方向を交互に切り替えれば良く、必ずしもフリー分子およびバインディング分子に付随する蛍光分子の遷移モーメントの方向と直線偏光した励起光の振動方向とが互いに垂直となる方向が含まれていなくても良い。フリー分子およびバインディング分子の間で配向の完了までに時間差が生じれば、その差は蛍光データに表れるため、バインディング分子の存在を確認できる。
【００９１】
また、本発明に係る各実施の形態では、レーザーの照射方向の切り替えにＡＯＤ１２０を用いたが、レーザーを２方向から当てられるような構成であれば、ＡＯＤ１２０を用いなくても良い。例えばミラー等を使ってレーザーの照射方向を変える構成や、配向制御光源部１１６を２つ設けて２方向からレーザーを照射する構成等が考えられる。
【００９２】
また、本発明に係る各実施の形態では、生体分子検出装置内に試薬カップを１つ設ける場合を説明したが、必ずしも試薬カップは１つである必要はなく、装置内に複数の試薬カップを設けて複数の検体をセットできる構成としても良い。その場合は、装置が試薬カップを順に測定位置に移動させて測定を行う構成とすれば、自動で複数の検体を測定することができる。
【００９３】
なお、本発明に係る各実施の形態では、蛍光分子で標識化された抗体を用いた例を説明したが、必ずしも蛍光分子で標識済みの抗体を用いる必要はない。例えば、抗体および抗原の結合と、抗体および蛍光分子の結合とを同時に試薬カップ内で行っても良い。この場合、ユーザーが抗体および蛍光分子をそれぞれ別の試薬タンクに用意しておき、測定時に生体分子検出装置が、抗体、蛍光分子および検体をそれぞれ試薬カップへ分注して、反応させる。
【００９４】
また、配向制御光源部１１６や励起光源部１１８は、着脱可能な構成として、検出対象物質および蛍光分子等に応じて適切なものに交換できるような構成としても良い。
【００９５】
また、配向制御手段による配向制御の方向を所定の時間間隔で切り替え、得られた複数の蛍光データの加算平均を行って、前記検出対象物質の検出または定量を行うと、１周期の測定毎のノイズの影響を減少させることができ、より高精度な測定が可能となる。
【００９６】
配向制御の方向を切り替える所定の時間間隔は、検出対象物質、検出対象物質と特異的に結合する物質および蛍光分子それぞれの質量または体積と、前記配向制御手段の外力の強度とに基づいて、全てのフリー分子およびバインディング分子の配向が完了するまでに要する時間を求め、その時間を所定の時間間隔とすることが望ましい。この場合、全ての分子の配向が完了した後も同一方向にレーザーを照射することがなくなり、消費電力を削減することができる。また、不要な時まで測定を続けることがなくなり、測定時間を短くすることができる。
【００９７】
全てのフリー分子およびバインディング分子の配向が完了するまでに要する時間は、ＰＤ出力やＡ／Ｄ変換部出力に基づいて求めてもよい。例えば、測定を何周期か繰り返せば、それぞれの出力が飽和するまでにどのくらいの時間を要するかおおよそ分かるため、それぞれの出力が飽和するまでに要する時間を加算平均する等して、算出した時間を所定の時間間隔として決めれば良い。
【００９８】
レーザーによる分子の配向制御を行う場合には、磁力等によって分子の配向を制御する場合に比べ複雑な機構が必要ない。例えば、磁力を用いて分子の配向を制御するためには、それぞれの分子が磁性を持ったものであるか、磁性を持った分子を用意して配向を制御したい分子に結合させる必要があり、測定にあたって準備が煩雑となる。
【００９９】
なお、本発明に係る各実施の形態では、検体として全血を用いる場合を例にとって説明したが、検体は全血に限られず、検出対象物質が溶液中に分散していれば尿や隋液等の体液を検体とすることもできる。
【０１００】
また、本発明に係る各実施の形態では、抗原、抗体および蛍光分子が液体中に分散している液相で測定ができるため、抗原等を反応層に固定して測定を行う固相での測定に比べ、前処理が簡単であるという利点がある。
【０１０１】
また、本発明に係る各実施の形態では、配向制御光源部は必ずしも１つの照射方向に対して１つである必要はなく、複数の配向制御光源部を設けて、同一方向に複数のレーザーを照射しても良い。
【０１０２】
また、本発明に係る各実施の形態のように、レーザーを照射する方向を変えることにより蛍光分子の遷移モーメントの方向を制御する光学系においては、レーザーのビーム径を細長く絞った場合にレーザーで照射できる範囲が減少してしまうことを回避する観点から、レーザーをある方向から同時に多点に照射して照射範囲をより広くするために、光学系を複数段用意しても良い。複数段の光学系は、少なくとも試薬カップにレーザーが入射する前の段階で光路が複数存在していればよい。例えば、光源も含めた同様の光学系を３段重ねれば、３つの配向制御光源部からそれぞれレーザーが照射され、試薬カップへある方向から３点にレーザーを照射することができる。また例えば、光源が１つであっても２次元レーザーアレイやマイクロレンズアレイ等を用いてレーザーを分岐すれば、分岐した分だけの複数の点でレーザーを照射することができる。このような場合、レーザーを同時に多点に照射することができ、複数の箇所で蛍光分子の遷移モーメントを回転させることができる。
【０１０３】
また、本発明に係る各実施の形態では、一方向に直線偏光した励起光１１９を溶液に照射する場合、すなわち偏光面が単一の励起光１１９を溶液に照射する場合を例にとって説明したが、励起光１１９は必ずしも単一の偏光面を有する直線偏光した光である必要はない。実施の形態１および実施の形態２の効果と同様の効果を奏するためには、励起光１１９が特定方向の直線偏光成分を少なくとも１つ有していれば良い。ここで、特定方向の直線偏光成分を有する光とは、蛍光分子の配向方向の変化により、蛍光分子の遷移モーメントと励起光の当該直線偏光成分の振動方向との関係が変化して、当該直線偏光成分による蛍光分子の励起効率に変化が生じる光である。例えば、ランダム偏光した励起光を照射し、受光部の前に検光子を設けて、蛍光分子から発生した蛍光から特定方向の直線偏光成分のみを受光するように構成しても良い。ここでランダム偏光とは、光の振動方向がランダムであり、様々な方向に振動する直線偏光成分が存在することをいう。
【０１０４】
図１７Ａおよび図１７Ｂは、それぞれレーザー１３６、１３４を照射した際の蛍光分子１４の配向方向とランダム偏光した励起光２３０の振動方向とを表した概念図である。励起光２３０の振動方向２３２ａ〜２３２ｄは、励起光２３０の進行方向に対して垂直な平面内における光の振動方向を表す。図１７Ａおよび図１７Ｂでは、振動方向２３２ａ〜２３２ｄによって励起光２３０の振動方向が様々な方向であることを表しているが、実際は、図示した成分だけでなく、あらゆる角度方向のより多くの成分が含まれている。配向により溶液中で静止した蛍光分子を直線偏光した励起光で励起すると、蛍光分子は、励起光の振動方向と同一の方向に偏光した蛍光を発生する。ランダム偏光した励起光２３０によって励起されると、蛍光分子１４からもランダム偏光した蛍光２３４が発生する。
【０１０５】
検光子２３６は、蛍光分子１４から発生したランダム偏光した蛍光２３４のうち特定の方向に振動する成分を透過させ、それ以外の方向に振動する成分を遮断する。換言すれば、検光子２３６を透過した光は特定の方向にのみ振動する光となる。検光子２３６を透過可能な特定の方向に振動する蛍光２３４の成分とは、励起光２３０のうち振動方向２３２ａに直線偏光した励起光成分によって励起された成分である。これは、レーザー１３４によって配向が完了した蛍光分子１４の遷移モーメントの方向（楕円で示された蛍光分子１４の長軸方向）と一致し、また、レーザー１３６によって配向が完了した蛍光分子１４の遷移モーメントの方向に垂直な方向と一致する。したがって、検光子２３６を透過した蛍光２３４の振動方向は、図１７ＡおよびＢにおいてほぼ振動方向２３２ａのみとなる。これにより、蛍光分子１４から発生した蛍光２３４のうち、励起光２３０のうち振動方向２３２ａに直線偏光した励起光成分によって励起された成分のみをフォトダイオード２３８に到達させることができる。蛍光２３４に含まれる振動方向２３２ａの方向に振動する成分の発生に寄与するのは、励起光２３０に含まれる振動方向２３２ａの方向に振動する成分である。すなわち、励起光２３０に含まれる振動方向２３２ａの方向に振動する成分による蛍光分子１４の励起効率がフォトダイオード２３８によって検出される蛍光の強度となって表れる。つまり、このような構成にすることで、励起光２３０としてランダム偏光した光を用いても、特定の方向に振動する光に対して実施の形態１と同様の測定を行うことができる。なお、検光子２３６が透過させる特定の方向に振動する蛍光２３４の成分とは、必ずしもここで示した方向に振動する成分に限られず、蛍光分子１４の配向方向の変化に伴い蛍光分子１４に対する励起効率に差が生じる成分であれば何でも良い。
【０１０６】
また、図１７Ａおよび図１７Ｂでは励起光２３０がいずれの方向に振動する場合においても振幅が一定である例を示したが、必ずしも全ての方向において振幅が一定である必要はない。フォトダイオード２３８が受光する蛍光２３４の成分は、ランダム偏光した蛍光２３４のうち特定方向に振動する成分のみであるので、その他の方向に振動する成分は遮断される。
【０１０７】
図１７Ａに示すように、配向制御信号が０Ｖの場合、レーザー１３６により配向した蛍光分子１４の遷移モーメントの方向と検光子２３６を透過可能な光の振動方向２３２ａとは垂直となる。この場合、励起光２３０に含まれる振動方向２３２ａに振動する成分による蛍光分子１４の励起効率は最小となる。従って、蛍光分子１４から発生する蛍光２３４のうち、検光子２３６を通ってフォトダイオード２３８に到達する成分は最小となる。
【０１０８】
一方、図１７Ｂに示すように、配向制御信号が５Ｖの場合、レーザー１３４により配向した蛍光分子１４の遷移モーメントの方向と検光子２３６を透過可能な光の振動方向とは平行となる。この場合、励起光２３０に含まれる振動方向２３２ａに振動する成分による蛍光分子１４の励起効率は最大となる。従って、蛍光分子１４から発生する蛍光２３４のうち、検光子２３６を通ってフォトダイオード２３８に到達する成分は最大となる。
【０１０９】
このような構成とした場合においても、配向制御信号を０Ｖから５Ｖに変化させると、蛍光分子１４の配向方向が変化し、蛍光分子１４の遷移モーメントの方向と検光子２３６を透過可能な光の振動方向とが徐々に平行に近づく。それに伴い、励起光２３０に含まれる検光子２３６を透過可能な方向に振動する成分による蛍光分子１４の励起効率が増加し、蛍光分子１４から発生する蛍光２３４の成分であって検光子２３６を透過可能な方向に振動する成分が増加する。すなわち、フォトダイオード２３８において検出する蛍光強度は、実施の形態１と同様に徐々に増加する。この場合、フリー分子とバインディング分子とでは、配向が完了するまでに要する時間が互いに異なるため、フォトダイオード２３８が受光する蛍光強度が増加して飽和するタイミングも互いに異なる。そのため、このような構成とした場合においても、配向制御信号を０Ｖから５Ｖに変化させた際の、時間に対するフォトダイオード出力のグラフは、図１１と同様の形状となる。つまり、この場合においてもフォトダイオード出力のグラフについて実施の形態１と同様の計算を行うことにより、検出対象物質の濃度を測定することができる。
【０１１０】
また、図１８Ａおよび図１８Ｂに示す概念図のように、互いに直交する２つの方向にそれぞれ直線偏光した２つの成分のみを有する励起光２４０を用いてもよい。励起光２４０は、進行方向に対して垂直な平面内において振動方向２４２ａ、２４２ｂにそれぞれ直線偏光した２つの成分のみを有する。つまり、振動方向２４２ａと振動方向２４２ｂとは互いに直交している。このような励起光２４０によって励起された蛍光分子１４は、励起光２４０の振動方向と同一方向に振動する成分を有する蛍光２４４を発する。すなわち、蛍光２４４は振動方向２４２ａ、２４２ｂにそれぞれ直線偏光した２つの成分を有する。
【０１１１】
図１８Ａは、配向制御信号が０Ｖの場合の概念図である。配向制御信号が０Ｖの場合、レーザー１３６が照射される。レーザー１３６を照射された蛍光分子１４は、遷移モーメントの方向が振動方向２４２ｂと同一の方向となるように配向する。つまり、配向制御信号が０Ｖの場合の蛍光分子１４の遷移モーメントと、励起光２４０の一方の成分の振動方向２４２ｂとは互いに平行である。
【０１１２】
偏光ビームスプリッタ２４６は、蛍光２４４のうち振動方向２４２ａに振動する直線偏光成分２４４ａを透過させ、振動方向２４２ｂに振動する直線偏光成分２４４ｂを反射する。偏光ビームスプリッタ２４６を透過した蛍光２４４の直線偏光成分２４４ａは、フォトダイオード２４８に到達する。偏光ビームスプリッタ２４６で反射した蛍光２４４の直線偏光成分２４４ｂは、フォトダイオード２５０に到達する。
【０１１３】
図１８Ｂは、配向制御信号が５Ｖの場合の概念図である。配向制御信号が５Ｖの場合、レーザー１３４が照射される。レーザー１３４を照射された蛍光分子１４は、遷移モーメントの方向が振動方向２４２ａと同一の方向となるように配向する。つまり、配向制御信号が５Ｖの場合の蛍光分子１４の遷移モーメントと、励起光２４０の他方の成分の振動方向２４２ａとは互いに平行である。
【０１１４】
図１９は、縦軸がそれぞれ配向制御信号の電圧、フォトダイオード２４８の出力、フォトダイオード２５０の出力および正規化したフォトダイオードの出力を表し、横軸が時間ｔを表したグラフである。なお、ここでは説明を容易にするため、フォトダイオード出力については、グラフを模式的に示してある。
【０１１５】
図１９においては、実施の形態１と同様に測定前の配向制御信号は０Ｖとなっている。測定前においては、レーザー１３６を試薬カップ内の溶液中に照射して、フリー分子およびバインディング分子を同一方向に配向させておく。測定の開始に伴い、レーザーがレーザー１３６からレーザー１３４に切り替わる。
【０１１６】
偏光ビームスプリッタ２４６を透過した蛍光２４４の直線偏光成分２４４ａに着目する。この場合、励起光２４０の一方の成分の振動方向２４２ａと蛍光分子１４の遷移モーメントの方向との関係は実施の形態１の場合の関係と同様になる。そして、フォトダイオード２４８の出力の時間変化は、実施の形態１において説明した図１１に示したグラフと同様のグラフとなる。つまり、時刻Ｔ３１におけるレーザーの照射方向の切り替えに伴ってまずフリー分子の配向方向が切り替わり始め、フォトダイオード２４８の出力が当初の値ｉｚ３から増加する。フリー分子の配向が完了することによりフォトダイオード２４８の出力は、時刻Ｔ３２において値ｉｆ３となった後しばらく一定値となる。その後、バインディング分子の配向方向が切り替わり始めることに伴って時刻Ｔ３３でフォトダイオード２４８の出力は再び増加する。そして、全てのバインディング分子の配向が完了した時刻Ｔ３４において、フォトダイオード２４８の出力は値ｉｔ３で最大値となる。配向制御信号は５Ｖの出力がＴ秒間続いた後０Ｖとなる。配向制御信号が５Ｖから０Ｖに切り替わると、フォトダイオード２４８の出力は、しばらくｉｔ３の値であるが、その後ｉｚ３の値まで減少する。
【０１１７】
偏光ビームスプリッタ２４６で反射した蛍光２４４の直線偏光成分２４４ｂに着目する。この場合、励起光２４０の他方の成分の振動方向２４２ｂと蛍光分子１４の遷移モーメントの方向とが時刻Ｔ３１までは互いに平行であるため、励起光２４０の当該他方の成分による蛍光分子１４の励起効率は時刻Ｔ３１までは最大の状態である。すなわち、蛍光２４４の直線偏光成分２４４ｂの量が時刻Ｔ３１までは最大であるため、偏光ビームスプリッタ２４６で反射する蛍光２４４の直線偏光成分２４４ｂを受光するフォトダイオード２５０の出力も時刻Ｔ３１までは最大となる。時刻Ｔ３１におけるレーザーの照射方向の切り替えに伴ってまずフリー分子の配向方向が切り替わり始め、フォトダイオード２５０の出力が当初の値ｉｔ４から減少する。フリー分子の配向が完了することによりフォトダイオード２５０の出力は、時刻Ｔ３２において値ｉｆ４となった後しばらく一定値となる。その後、バインディング分子の配向方向が切り替わり始めることに伴って時刻Ｔ３３でフォトダイオード２５０の出力は再び減少する。そして、全てのバインディング分子の配向が完了した時刻Ｔ３４において、フォトダイオード２５０の出力は値ｉｚ４で最小値となる。配向制御信号は５Ｖの出力がＴ秒間続いた後０Ｖとなる。配向制御信号が５Ｖから０Ｖに切り替わると、フォトダイオード２５０の出力は、しばらくｉｚ４の値であるが、その後ｉｔ４の値まで増加する。これは、励起光２４０の当該他方の成分の振動方向２４２ｂと蛍光分子１４の遷移モーメントの方向とが互いに平行となる状態に戻るためである。
【０１１８】
そして、実施形態１と同様にＣＰＵは、フォトダイオード２４８の出力をＰｐ、フォトダイオード２５０の出力をＰｖとして、これらを次式（３）に従って正規化する。
Ｋ＝（Ｐｐ−Ｐｖ）／（Ｐｐ＋Ｐｖ）・・・（３）
【０１１９】
このように、２つのフォトダイオードの出力を正規化することで、フリー分子およびバインディング分子の濃度ばらつきや、光学系の励起パワー変動などの影響を低減させることができる。
【０１２０】
そして、正規化したフォトダイオード出力のグラフからバインディング分子の濃度を算出する。具体的には、測定値Ｓ３を次式（４）によって求める。
Ｓ３＝（ｉｔ５−ｉｆ５）／（ｉｔ５−ｉｚ５）・・・（４）
【０１２１】
ここで求めた測定値Ｓ３から、実施の形態１と同様に検量線関数を用いて診断値Ｃ３（検出対象物質の濃度）を求めることができる。
【０１２２】
また、本発明に係る各実施の形態では、レーザーを照射する方向を切り替えることにより蛍光分子の遷移モーメントの方向を制御する場合について説明したが、蛍光分子の遷移モーメントの方向を制御する方法はこれに限られない。例えば、蛍光分子の遷移モーメントが直線偏光した光の振動方向に追従する現象を利用して、直線偏光したレーザーの振動方向を制御することにより蛍光分子の遷移モーメントの方向を制御してもよい。
【０１２３】
直線偏光したレーザーの偏光方向を制御することにより蛍光分子の遷移モーメントの方向を制御する方法としては、例えば、一方向に直線偏光したレーザーを用い、当該レーザーの偏光軸を回動させてフリー分子およびバインディング分子の配向を制御し、蛍光分子の遷移モーメントの方向を制御する方法が挙げられる。直線偏光したレーザーを照射されたフリー分子またはバインディング分子は、レーザーの偏光軸によって決まる特定の方向に配向する。直線偏光したレーザーの偏光軸の制御は、λ／２波長板を用いることにより実施できる。λ／２波長板は、光の互いに直交する２成分間の光路差を１／２波長にする機能を有する位相板であり、光の偏光軸を回転操作するために用いられる。λ／２波長板の光学軸方向と平行な方向に直線偏光した光はλ／２波長板を素通りするが、λ／２波長板の光学軸方向と４５度の角度をなす方向に直線偏光した光は偏光軸が９０度回転された状態で透過する。つまり、直線偏光したレーザーに対するλ／２波長板の角度を切り替えることにより、レーザーを素通りさせる場合とレーザーの偏光軸を９０度回転させてレーザーを透過させる場合とを切り替えることができる。すなわち、λ／２波長板を用いて直線偏光したレーザーの偏光軸を回転させることにより、フリー分子およびバインディング分子を２つの方向へ配向させることができる。
【０１２４】
また、直線偏光したレーザーの振動方向を制御することにより蛍光分子の遷移モーメントの方向を制御する場合において、進行方向に垂直な平面でのレーザーの断面形状はどのようなものであっても良い。例えば、図２０Ａに示すように、偏光軸３５２を有する直線偏光したレーザー３５０が照射される場合を考える。この場合、レーザー３５０は、進行方向に垂直な方向の断面形状が略長方形である。このとき、レーザー３５０の中心に位置するバインディング分子３５４とレーザー３５０の周縁部に位置するバインディング分子３５６の挙動を考える。
【０１２５】
図２０Ｂに示すように、レーザー３５０を回転させると偏光軸３５２も回転し、回転軸（偏光軸３５２の回転中心）上に位置するバインディング分子３５４は、偏光軸３５２の回転にすぐに追従して回転する。一方、レーザー３５０の周縁部に位置するバインディング分子３５６は、偏光軸３５２の回転にすぐには追従できず、偏光軸３５２から離れることになる。その後しばらくすると、バインディング分子３５６も、レーザー３５０に引き込まれ、偏光軸３５２の回転に追従して回転を開始する。そして、図２０Ｃのように、レーザー３５０の偏光軸３５２を図２０Ａの場合における偏光軸３５２に対して９０度回転させた場合、偏光軸３５２の回転の終了と同時にバインディング分子３５４の配向は完了し、一方、バインディング分子３５６が偏光軸３５２の回転にすぐには追従できないためバインディング分子３５６の配向はバインディング分子３５４の配向の完了後しばらくしてから完了する。つまり、回転軸上に位置するバインディング分子３５４の動きは、レーザー３５０の偏光軸３５２の回転に同期して自転する挙動となるが、レーザー３５０の周縁部に位置するバインディング分子３５６の動きは、レーザー３５０の偏光軸３５２の回転に同期せずかつ回転軸を中心として公転するような動きとなる。
【０１２６】
このように、レーザー３５０の偏光軸３５２の回転に追従できないバインディング分子が存在すると測定に影響を与えることがある。そこで、このような影響を低減するため、レーザーを所定の方向から同時に多点に入射させることが好ましい。例えば図２１（試薬カップ１０８の上面図）に示すように、３６０ａ〜３６０ｉの９点にそれぞれ対応した９本のレーザーを試薬カップ１０８入射させるような態様でも良い。このようにすると、レーザーの偏光軸の中心に位置するバインディング分子の数が増えるため、測定への影響を低減することができる。なお、ここでは９点にレーザーを入射させる例を示したが、レーザーを入射させる点は９点に限られず、９点より多くても少なくても良い。レーザーを絞るほど、多くの点に入射させることが望ましい。これにより、複数箇所でレーザーの回転に同期してバインディング分子を回転させることができる。その結果、突発的な蛍光強度の変動を低下させることができ、相対的な散らばりを表す指標である変動係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を改善することができる。
【０１２７】
このように、レーザーを所定の方向から同時に多点に入射させるための配向制御光源部４０２の構造について図２２に示す。配向制御光源部４０２は、３×３の２次元レーザーアレイである。配向制御光源部４０２は、発光点４０４ａ〜４０４ｉの９点が発光する。発光点の大きさは縦が１μｍで横が１００μｍである。発光点の間の距離は約１００μｍである。
【０１２８】
図２２に示される配向制御光源部４０２を用いた光学系の一例を図２３に示す。なお図２３では、レーザーおよび励起光の光学系以外の構成要素は省略して描いてある。
【０１２９】
配向制御光源部４０２から出力された直線偏光したレーザー４２２は、コリメータレンズ４０６を通って焦点において平行光線となる。コリメータレンズ４０６を通ったレーザー４２２は、ビームエキスパンダ４０８およびビームエキスパンダ４１０を通ってλ／２波長板４１２に入射する。ビームエキスパンダ４０８およびビームエキスパンダ４１０を通ったレーザー４２２は、特定の倍率の平行光束に広げられる。λ／２波長板４１２は回転ステージ上にあり、回転可能となっている。これによりレーザー４２２の振動方向を回転することができる。λ／２波長板４１２を透過したレーザー４２２は、ダイクロイックミラー４１８で反射してレンズ４２０により集光されて試薬カップ１０８の底面から上方に向かって入射する。
【０１３０】
光源部４１４から出力された励起光４２４は、レンズ４２６を通ってダイクロイックミラー４１６により反射される。ダイクロイックミラー４１６により反射された励起光４２４は、ダイクロイックミラー４１８を透過してレンズ４２０により集光されて試薬カップ１０８の底面から上方に向かって入射する。
【０１３１】
図２３に示される光学系において、コリメータレンズ４０６の焦点距離を３．１ｍｍ、レンズ４２０の焦点距離を４ｍｍとすると、倍率は１．２９倍となる。そのため、試薬カップ１０８の底面において、レーザー４２２の大きさは約１．３μｍ×１３０μｍとなり、ピッチは約１２９μｍとなる。
【０１３２】
また、レーザーを所定の方向から同時に多点に入射させるための別の光学系の例について図２４を用いて説明する。なお図２４においても、レーザーおよび励起光の光学系以外は省略して描いてある。また、図２３と同一の構成要素には同一の符号を付し、その説明を省略する。
【０１３３】
図２４に示される光学系において、配向制御光源部１１６は実施の形態１と同様のものである。レーザー４３２は、コリメータレンズ４０６、ビームエキスパンダ４０８およびビームエキスパンダ４１０を通り、マイクロレンズアレイ４２８へ入射する。マイクロレンズアレイ４２８は、図２５に示されるように、複数のマイクロレンズ４２８ａを格子状に並べたものである。マイクロレンズアレイ４２８を通ったレーザー４３２は、複数の光源から照射された光のように、異なる位置で焦点を結ぶ複数の光束となる。レーザー４３２は、ピンホールアレイ４３０によって絞られ、ダイクロイックミラー４１８で反射し、レンズ４２０を通って試薬カップ１０８の底面から上方に向かって入射する。このようにマイクロレンズアレイを用いても、レーザーを所定の方向から同時に多点に入射させることができる。
【０１３４】
また、λ／２波長板４１２を用いて振動方向を変更する例を示したが、電気信号で制御可能な液晶位相変調デバイスを用いて振動方向を変更してもよい。
【０１３５】
また、上記各実施の形態では試薬カップを円柱状の形状としたが、試薬カップは必ずしも円柱状の形状とする必要は無い。例えば、図２６に示されるように、四角柱状の形状を有し、内部に四角柱状の溶液保持部を有する試薬カップ４３２を用いても良い。このような四角柱状の溶液保持部を有する試薬カップ４３２は、特に、レーザーの進行方向に働くレーザーによる圧力を利用してフリー分子およびバインディング分子を試薬カップ４３２の内部側壁面に押しつける場合に適している。これは、フリー分子およびバインディング分子の質量が軽い場合に起こる現象であり、レーザーによる圧力を受けてフリー分子およびバインディング分子が溶液中を移動することが原因である。この場合、溶液保持部が四角柱であると、フリー分子およびバインディング分子は溶液と試薬カップ４３２との界面に押しつけられながら配向する。当該界面が平面でありかつレーザーによる圧力が当該界面に垂直な方向に作用する場合には、フリー分子およびバインディング分子は当該界面に平行な方向に移動してレーザーの照射範囲の外に出ることがない。
【０１３６】
また、フリー分子およびバインディング分子を試薬カップ４３２の内部側壁面に押しつける場合には、レーザーの焦点の位置を工夫することによりこれらの分子をより容易に配向させることができる。図２７は、集光されたレーザーの焦点と試薬カップとの位置関係の一例を示す図である。レーザー４３４は、レンズ４３６に入射し、血漿１６と試薬カップの側壁部４３２ｂとの界面（側壁部４３２ｂの内部側壁面）において焦点４３４ａを結ぶ。レーザー４３４の焦点４３４ａの位置では、レーザー４３４の強度が最も強いため、より強い圧力でフリー分子およびバインディング分子を押しつけることができる。従って、図２７のようにレーザー４３４を入射させると、焦点４３４ａの位置においてフリー分子およびバインディング分子を側壁部４３２ｂの内部側壁面に押しつけつつ、より効率的にフリー分子およびバインディング分子を配向させることができる。この場合においても、直線偏光したレーザー４３４の振動方向を回転させることで、フリー分子およびバインディング分子の配向方向を焦点４３４ａの位置において変化させることができる。
【０１３７】
なお、溶液保持部は必ずしも四角柱状の形状を有している必要はなく、少なくとも一面に平面を有していれば良い。その平面において焦点を結ぶようにレーザーを照射すれば、フリー分子およびバインディング分子は、当該平面に平行な方向に移動してレーザーの照射範囲の外に出ることがなく平面に押しつけられながら配向する。
【産業上の利用可能性】
【０１３８】
本発明に係る生体分子検出装置および生体分子検出方法は、例えば、検出対象物質と、その検出対象物質に特異的に結合する物質との相互作用を利用して、検出対象物質の検出又は定量を行う装置に利用することができる。
【符号の説明】
【０１３９】
１２  抗体
１４  蛍光分子
１６  血漿
１８  抗原
１００  生体分子検出装置
１１６  配向制御光源部
１１７  レーザー
１１８  励起光源部
１１９  励起光
１２０  ＡＯＤ
１２３  蛍光
１２４  受光部
１４４  フィルタ
１４６  偏光子
１５０  ＰＤ
２００  生体分子検出装置
２０２  受光部
２１０  フィルタ切替部
２１２  フィルタ
２１４  フィルタ
【図１Ａ】
0005734091.tif 000002
【図１Ｂ】
0005734091.tif 000003
【図２Ａ】
0005734091.tif 000004
【図２Ｂ】
0005734091.tif 000005
【図３Ａ】
0005734091.tif 000006
【図３Ｂ】
0005734091.tif 000007
【図４Ａ】
0005734091.tif 000008
【図４Ｂ】
0005734091.tif 000009
【図５】
0005734091.tif 000010
【図６】
0005734091.tif 000011
【図７Ａ】
0005734091.tif 000012
【図７Ｂ】
0005734091.tif 000013
【図８Ａ】
0005734091.tif 000014
【図８Ｂ】
0005734091.tif 000015
【図９】
0005734091.tif 000016
【図１０】
0005734091.tif 000017
【図１１】
0005734091.tif 000018
【図１２】
0005734091.tif 000019
【図１３Ａ】
0005734091.tif 000020
【図１３Ｂ】
0005734091.tif 000021
【図１４】
0005734091.tif 000022
【図１５】
0005734091.tif 000023
【図１６Ａ】
0005734091.tif 000024
【図１６Ｂ】
0005734091.tif 000025
【図１７Ａ】
0005734091.tif 000026
【図１７Ｂ】
0005734091.tif 000027
【図１８Ａ】
0005734091.tif 000028
【図１８Ｂ】
0005734091.tif 000029
【図１９】
0005734091.tif 000030
【図２０Ａ】
0005734091.tif 000031
【図２０Ｂ】
0005734091.tif 000032
【図２０Ｃ】
0005734091.tif 000033
【図２１】
0005734091.tif 000034
【図２２】
0005734091.tif 000035
【図２３】
0005734091.tif 000036
【図２４】
0005734091.tif 000037
【図２５】
0005734091.tif 000038
【図２６】
0005734091.tif 000039
【図２７】
0005734091.tif 000040