(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）配列番号２のアミノ酸配列を有するＧｎｔＫをコードする遺伝子を欠損させることによって、内在的活性に比べて弱化されたグルコン酸キナーゼ（ＧｎｔＫ）活性を有する、Ｌ−リシン生産コリネバクテリウム・グルタミクムを培養して細胞培養物を収得する段階：及び
２）前記細胞培養物または前記コリネバクテリウム・グルタミクムからＬ−リシンを回収する段階を含む、Ｌ−リシンの生産方法。
【請求項２】
前記コリネバクテリウム・グルタミクムが、配列番号１のアミノ酸配列を有するＧｎｔＫをコードする遺伝子を欠損させたＬ−リシン生産コリネバクテリウム・グルタミクムである、請求項１に記載のＬ−リシンの生産方法。
【請求項３】
前記コリネバクテリウム・グルタミクムが、グルコン酸キナーゼをエンコードする染色体遺伝子上の塩基配列全体または一部の欠損、一部の置換または挿入によって内在的グルコン酸キナーゼ活性が弱化されたＬ−リシン生産コリネバクテリウム・グルタミクムである、請求項１に記載のＬ−リシンの生産方法。
【請求項４】
前記コリネバクテリウム・グルタミクムが、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１から由来したものである、請求項１に記載のＬ−リシンの生産方法。
【請求項５】
前記コリネバクテリウム・グルタミクムが、受託番号ＫＣＣＭ１１０８５Ｐで寄託されたコリネバクテリウム・グルタミクムＣＡ０１−０８９２として識別されるものである、請求項１に記載のＬ−リシンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高いＬ−リシン生産能を有する微生物及びこれを用いたＬ−リシン生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−リシンは、オキサロ酢酸からリシン生合成経路を介して合成される。Ｌ−リシンの生合性に重要な酵素などは、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ及びジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼであって、それぞれ遺伝子ａｓｄ、ｄａｐＢ及びｄｄｈによってエンコードされ、リシン生合成経路の部分などを仲裁するＮＡＤＰＨ依存的レダクターゼなどである。この経路で１分子のＬ−リシン生産は、前記酵素などによって３分子のＮＡＤＰＨの消耗を直接的に要求し、１分子のＮＡＤＰＨは間接的に用いられる。コリネバクテリウム・グルタミクム細胞（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｃｅｌｌ）内でＮＡＤＰＨの再生とＬ−リシン生合成との間の直接的な連関性は既に報告されたことがある（Ｗｉｔｔｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｈｅｉｎｚｌｅ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６８：５８４３−５８４９，  ２００２；  Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０４：１８５−１９７，  ２００３；  Ｏｈｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  ２４２：２６５−２７４，  ２００５）。
【０００３】
コリネバクテリウムでＮＡＤＰＨの主要供給経路は、ＴＣＡサイクルとペントースリン酸経路である。Ｌ−リシン生産のために必要な還元力は、ペントースリン酸経路の酸化経路を介して供給されるのが好ましい。ペントースリン酸経路は、２つサイクルの作動が２つのＮＡＤＰＨ分子の伴われる生産とともに１つのＣＯ２分子を排出するので、炭素代謝効率面から経済的により有利である一方、１つのＴＣＡサイクル当り１つのＮＡＤＰＨ分子の伴われる生産とともに２つのＣＯ２分子が排出される。従って、Ｌ−リシンのより高い収率は、ＮＡＤＰＨのより多い供給を要求し、これによってペントースリン酸経路に対する依存度が高くなるようになる。
【０００４】
全てペントースリン酸経路に関与された、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）及び６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６ＰＧＤ）がＬ−リシンの生産と関連されていることが報告された（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ５６：１６８−１８０，  １９９７；  Ｗｉｔｔｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｈｅｉｎｚｌｅ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６８：５８４３−５８４９，  ２００２）。  
【０００５】
Ｌ−アミノ酸生産コリネバクテリウム菌株において、ペントースリン酸経路でＮＡＤＰＨ生成を果たす遺伝子発現酵素が強化された際に、または酵素が変異された際にＬ−アミノ酸生産能が増加されることが報告されたことがあった。例えば、Ｊ．Ｂｅｃｋｅｒらは、Ｌ−リシン生産コリネバクテリウム・グルタミクムでＧ６ＰＤＨをエンコードするｚｗｆ遺伝子のさらに強いプローモータの提供がリシン生産量で著しい増加を招くことを報告した（Ｊ．  Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １３２：  ９９−１０９，  ２００７）。ヨーロッパ特許第１３０２５３７号には、変異型６ＰＧＤをコード化する遺伝子が導入されたＬ−アミノ酸生産コリネバクテリアを培養してＬ−アミノ酸を生産する方法が開示されている。
【０００６】
しかし、コリネバクテリウムの内在的グルコン酸キナーゼ（ＧｎｔＫ）活性弱化を介してペントースリン酸経路におけるＮＡＤＰＨ生合成が増加されたコリネバクテリア属微生物に対しては、従来の文献などに開示されたところがない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｗｉｔｔｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｈｅｉｎｚｌｅ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６８：５８４３−５８４９，  ２００２
【非特許文献２】Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０４：１８５−１９７，  ２００３
【非特許文献３】Ｏｈｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  ２４２：２６５−２７４，  ２００５
【非特許文献４】Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ５６：１６８−１８０，  １９９７
【非特許文献５】Ｊ．  Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １３２：  ９９−１０９，  ２００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、Ｌ−リシンを高効率、高収率で生産するための方法を見つけるために鋭意努力した結果、酸化的ペントースリン酸経路での遺伝的変形によるＮＡＤＰＨ生産の増加がＬ−リシンの生産量を増加させ得ることを確認した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明の目的は、内在的活性に比べて弱化されたグルコン酸キナーゼ（ＧｎｔＫ）活性を有するＬ−リシン生産微生物を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、全体または部分的にポリヌクレオチドを変異させることによって弱化された活性を有するグルコン酸キナーゼ（ＧｎｔＫ）をエンコードするポリヌクレオチド断片を構成する段階；宿主細胞で染色体の相同組換えを行うことができるベクターに前記収得したポリヌクレオチド断片を挿入して組換えベクターを収得する段階；前記収得した組換えベクターをＬ−リシンを生産することができる宿主細胞に導入して相同組換え体を収得する段階；及び前記相同組換え体から内在的活性に比べて弱化されたＧｎｔＫの活性を有する菌株を選抜する段階を含む前記Ｌ−リシン生産微生物の製造方法を提供することである。
【００１１】
本発明のまた他の目的は、本発明の微生物を培養して細胞培養物を収得する段階；及び前記細胞培養物または微生物からＬ−リシンを回収する段階を含むＬ−リシンの生産方法を提供することである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、コリネバクテリウム菌株でＮＡＤＰＨの細胞内水準を増加させることによって、生合成のためにＮＡＤＰＨを必要とするＬ−アミノ酸、特に、Ｌ−リシンを高効率及び高収率で生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本発明の目的、特徴、局面、及び利点は、以下の詳細な説明と添付図面とによって、より明白となる。
【図１】図１は、コリネバクテリウム・グルタミクムのペントースリン酸経路を示した概略図である。
【図２】図２は、コリネバクテリウムの染色体ＮＣｇｌ２３９９遺伝子のマーカー−フリー欠損用ｐＤＺ−ΔＮＣｇｌ２３９９ベクターを示した概略図である。
【図３】図３は、コリネバクテリウムの染色体ＮＣｇｌ２９０５遺伝子のマーカー−フリー欠損用ｐＤＺ−ΔＮＣｇｌ２９０５ベクターを示した概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
前記目的を達成するための一つの態様として、本発明は、内在的活性に比べて弱化されたグルコン酸キナーゼ（ＧｎｔＫ）活性を有するＬ−リシン生産微生物を提供する。
【００１５】
用語“Ｌ−リシン”とは、ＮＨ２（ＣＨ２）  ４ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨの化学式を有する塩基性α−アミノ酸である。体内で合成できない必須アミノ酸である。Ｌ−リシンは、オキサロ酢酸から一部がＮＡＤＰＨ依存性還元酵素によって触媒されるリシン生合成経路を介して合成される。この経路を介して１分子のＬ−リシン生合成は、酵素による３分子のＮＡＤＰＨの直接的消耗と、１分子のＮＡＤＰＨの間接的使用を要求する。
【００１６】
本発明で使用された用語、“グルコン酸キナーゼ（ＧｎｔＫ）”とは、微生物のペントースリン酸経路の酸化過程中間体である６−ホスホグルコン酸を生産するＧｎｔＫ経路に関与する酵素を意味する。コリネバクテリウム属の微生物は、ペントースリン酸経路の酸化過程の中間体である６−ホスホグルコン酸を合成するために、２つの経路、すなわち、Ｇ６ＰＤＨ及びＧｎｔＫ経路の両方を運用し（図１）、これは、コリネバクテリウム属の微生物がＧｎｔＫ経路を介してグルコースを部分的に分解することができるということを意味する。前記ＧｎｔＫ経路の遮断が６−ホスホグルコン酸への炭素供給を遮断し、炭素フラックスを６−ホスホグルコン酸からペントースリン酸化過程に転換できるという仮定で、本発明者らはＧｎｔＫ経路の遮断が６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６ＰＧＤ）の活性で特異的増加を生じるから、よって、ＮＡＤＰＨの再生が増加することを提示する。そこで、微生物内でグルコン酸キナーゼ（ＧｎｔＫ）として作用するものとして推定される酵素の活性を弱化させる。
【００１７】
好ましくは、グルコン酸キナーゼ（ＧｎｔＫ）活性を有する酵素は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるＮＣｇｌ２３９９または配列番号２のアミノ酸配列で表されるＮＣｇｌ２９０５であり得る。
【００１８】
本発明で使用された用語、“内在的活性”とは、自然型微生物における酵素の活性を意味し、特に、ＧｎｔＫと組み合わせて使用される際に、自然型微生物が示すＧｎｔＫの活性を意味する。
【００１９】
用語、“内在的活性弱化”は、前記ポリヌクレオチド配列全体または一部の欠損、前記ポリヌクレオチド配列一部の置換または前記ポリヌクレオチド配列内へ少なくとも一つの塩基対の挿入から構成される群から選択される一つの方法で、微生物で内在的タンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを含む染色体上で達成することができる。また、発現調節要素の全体または一部の欠損、置換または挿入によって突然変異がなされる前記ポリヌクレオチド配列に対する調節要素を変異させることによって、内在的活性が弱化され得る。前記発現調節要素は、染色体上のポリヌクレオチド配列の上部または下部に位置することができ、好ましくは、調節要素はプローモーター、  エンハンサーなどであるが、本発明はこれに制限されない。前記ポリヌクレオチドの変異は、相同組換えのように周知の方法を使用して達成することができる。
【００２０】
本発明で使用された用語、“内在的活性に比べて弱化されたＧｎｔＫ活性”は、
破裂のような遺伝子変異によってＧｎｔＫ活性が下向調節され、よって、天然型微生物での酵素の内在的活性より低くなることを意味する。本発明の一例において、本発明は図２または図３の開裂地図で表される組換えベクターの導入を介してＧｎｔＫ活性を妨害することにより増加されたＬ−リシン生産能を有するコリネバクテリウム属の微生物を提供する。
【００２１】
グルコン酸キナーゼ活性を有し、互いに異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする２つまたはそれ以上の染色体遺伝子が存在する場合、内在的ＧｎｔＫ活性は、少なくとも１つの染色体遺伝子上で全体または一部の欠損、置換または挿入によって弱化され得る。また、少なくとも１つの染色体遺伝子に対する調節要素上で全体または一部の欠損、置換または挿入を介して内在的ＧｎｔＫ活性が弱化され得る。
【００２２】
好ましくは、ヌクレオチドの欠損、置換または挿入による変異がＮＣｇｌ２３９９またはＮＣｇｌ２９０５をエンコードする遺伝子、または、それぞれＮＣｇｌ２３９９とＮＣｇｌ２９０５をエンコードする配列番号３と４のヌクレオチド配列を有する遺伝子のうち、１つまたは２つのいずれで、またはそれらの調節要素上で生じるように許容され、ＧｎｔＫが正常的に機能しないこともある。
【００２３】
本発明において、グルコン酸キナーゼをエンコードする遺伝子の一部を含む組換えベクターを導入して内在的グルコン酸キナーゼ遺伝子を欠損または突然変異させることによって、内在的活性に比べて弱化されたグルコン酸キナーゼ活性を有する微生物を製造することができる。前記一部遺伝子の染色体内への挿入は、周知の方法、例えば、相同組換えによって達成することができる。
【００２４】
このような観点で、本発明は、１）ポリヌクレオチドの全体または一部の配列が変異されて弱化された活性を有するグルコン酸キナーゼ（ＧｎｔＫ）をエンコードするポリヌクレオチド断片を構成する段階；２）組換えベクターを提供するために宿主細胞で染色体と相同組換えできるベクターに前記収得したポリヌクレオチド断片を挿入する段階；３）相同組換え体を形成するために前記収得した組換えベクターをＬ−リシンを生産することができる宿主細胞に導入する段階；及び４）前記相同組換え体の中からＧｎｔＫの活性が内在的活性に比べて弱化された菌株を選抜する段階を含むＬ−リシン生産微生物の製造方法を提供する。
【００２５】
本発明で使用された用語、“組換えベクター”とは、宿主細胞の染色体から分離されて複製できないベクターであって、一般に、染色体と外部遺伝子との相同組換えを許容する必須的な要素を含む遺伝子構造物を意味する。組換えベクターは、抗生剤耐性遺伝子とレバンスクラーゼ（ｓａｃＢ）遺伝子のような選抜遺伝子を含むことができる。好ましくは、本発明では、図２または図３の開裂地図によって表される組換えベクターが使用され得る。
【００２６】
Ｌ−リシンが生産できる限り、どのような菌株でも組換えベクターを導入させる宿主細胞として制限なく使用され得る。好ましくは、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属の微生物である。本発明において有用な宿主細胞の例としては、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス（ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６７、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、及びそれらから誘導されたＬ−アミノ酸生産突然変異体または菌株、例えば、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１１００１、及びコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐが含まれることができる。好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１であり得る。本発明の具体的な実施態様では、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１が使用されたが、本発明がこれに制限されるのではない。
【００２７】
本発明の一実施態様では、コリネバクテリウム・グルタミクム内で複製することなく標的遺伝子のマーカー−フリー欠損を行うことができるｐＤＺベクター（韓国特許第０９２４０６５号に開示）を用いて前記遺伝子などを欠損させた。すなわち、前記ｐＤＺベクターにそれぞれＮＣｇｌ２３９９またはＮＣｇｌ２９０５をエンコードする遺伝子などの一部分を有した組換えベクターを構成した後、Ｌ−リシンを生産するコリネバクテリウムの菌株に形質転換させ、弱化されたグルコン酸キナーゼ活性を有するＬ−リシン生産用コリネバクテリウム菌株を製作するためにゲノムと相同組換えを行うように許容した。
【００２８】
本発明では、ＮＣｇｌ２３９９をエンコードする遺伝子の一部をｐＤＺベクターに挿入させて組換えベクター構成し、ｐＤＺ−ΔＮＣｇｌ２３９９と命名し、これをコリネバクテリウム菌株に形質転換させた。ＮＣｇｌ２３９９をエンコードする遺伝子が破壊された組換えコリネバクテリウム菌株をＫＦＣＣ１０８８１−ΔＮＣｇｌ２３９９と命名した。別に、ｐＤＺ−ΔＮＣｇｌ２９０５と命名したＮＣｇｌ２９０５をエンコードする遺伝子の一部を含む組換えｐＤＺベクターをコリネバクテリウム菌株に形質転換させた。ＮＣｇ１２９０５をエンコードする染色体遺伝子が破壊された組換え菌株をＫＦＣＣ１０８８１−ΔＮＣｇｌ２９０５と命名した。さらに、前記ＫＦＣＣ１０８８１−ΔＮＣｇｌ２３９９を組換えプラスミドｐＤＺ−ΔＮＣｇｌ２９０５を形質転換させてＮＣｇｌ２３９９及びＮＣｇｌ２９０５遺伝子が同時に欠損された変異菌株を提供した。これをコリネバクテリウム・グルタミクムＣＡ０１−０８９２と命名し、２０１０年６月２４日付で韓国微生物保存センターに寄託して受託番号ＫＣＣＭ１１０８５Ｐを受けた。
【００２９】
さらに、本発明の一実施態様では、前記組換えコリネバクテリウム・グルタミクム菌株を細胞内グルコン酸キナーゼ活性とＮＡＤＰＨ水準に対して評価した。ＮＣｇｌ２３９９遺伝子が欠損された菌株、及びＮＣｇｌ２３９９とＮＣｇｌ２９０５遺伝子とが同時に欠損された菌株の細胞内ＧｎｔＫの活性は、母菌株に比べて減少していることが観察された。なお、細胞内のＮＡＤＰＨ濃度水準及び６ＰＧＤ活性は、母菌株に比べて増加していることが観察された（表２）。結果的に、前記製作された菌株などのリシン生産量は母菌株に比較して増加していることが観察された（表３）。
【００３０】
前記の結果は、内在的活性以下のグルコン酸キナーゼ活性の弱化は、６ＰＧＤの活性を増加させ、これは、ＮＡＤＰＨ生産に肯定的効果を持つことによって、結果的に、Ｌ−リシンを高効率及び高収率で生産することができるということを意味する。また、グルコン酸キナーゼ活性を有するタンパク質が２つまたはそれ以上の異なる遺伝子によってエンコードされる場合、２つまたはそれ以上の遺伝子を欠損させることによって、より高いＬ−リシン生産能を得ることができる。従って、本発明のＬ−リシン生産微生物は、高効率及び高収率でＬ−リシンを生産するために使用することができる。
【００３１】
また他の一つの態様として、本発明は、１）本発明の微生物を培養して細胞培養物を収得する段階；及び２）前記細胞培養物または微生物からＬ−リシンを回収する段階を含むＬ−リシンの生産方法を提供する。
【００３２】
本発明で使用された用語、“培養”は、微生物を人工的に調節した条件下で生育させることを意味する。本発明の組換え体を培養することは、当業界の周知の様々な方法を用いて行うことができる。前記細胞は、バッチ工程または注入バッチまたは反復注入バッチ工程などの連続式工程で培養され得るが、本発明がこれに制限されるのではない。
【００３３】
培養に使用される培地は、適切な方式で使用される菌株の要件を満たさなければならない。コリネバックテリア菌株培養に使用するための適した培地は当業界で公知されている（例えば、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，  ＵＳＡ，  １９８１）。培養培地の炭素源は、例えばグルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、澱粉、及びセルロースのような糖類、及び炭水化物；大豆油、ヒマワリ種子油、落花生油、及びヤシ油などのようなオイル及び脂肪；パルミチン酸、ステアリン酸、及びリノール酸のような脂肪酸；グリセロール、及びエタノールのようなアルコール；酢酸のような有機酸であり得る。これらの物質は、個別的にまたは組み合わせて使用され得る。組換え体培養に有用な窒素源の例としては、ペプトン、酵母エキス、肉汁、麦芽エキス、トウモロコシ浸漬液、大豆粕及び尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムを含む。これらの窒素源も個別的にまたは組み合わせて使用され得る。培養培地に使用され得るリン源としては、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム及び相応するナトリウム塩がある。また、培養培地は、細胞成長に必要な金属塩を含むことができ、アミノ酸及びビタミンのような必須栄養素で補充することができる。また、培養培地に適切な前駆体などが添加され得る。栄養素または補充物は、培養過程の間に全て合わせて一回または分けて添加され得る。
【００３４】
培養培地のｐＨは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニアのような塩基性化合物、または、リン酸または硫酸のような酸性化合物で調節することができる。培養培地で気泡の生成は、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して抑制することができる。培養培地は、酸素または酸素を含有したガス（例えば、空気）を注入することにより好気条件下で維持され得る。培養温度は、普通２０℃〜４５℃、好ましくは、２５℃〜４０℃である。培養は、最大量のＬ−アミノ酸が生産されるまで継続される。これに関連して１０から１６０時間内に達成され得る。生産された後、Ｌ−リシンは、培養培地の中に排出されるか、または細胞内に含まれることがあり得る。
【００３５】
本発明によるＬ−リシンを生産する方法は、細胞または細胞培養物からリシンを回収する段階を含む。Ｌ−リシンは、公知の方法を使用して細胞培養物または細胞から分離され得る。本発明に有用な分離方法は、例えば、遠心分離、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが含まれることができるが、これらの例に限定されるのではない。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を下記の実施例によって詳細に説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するものだけであり、本発明の内容が下記実施例によって限定されるのではない。
【００３７】
実施例１：サイト（ｓｉｔｅ）特異的遺伝子破壊による変異株の作製
組換え菌株ＫＦＣＣ１０８８１−ΔＮＣｇｌ２３９９とＫＦＣＣ１０８８１−ΔＮＣｇｌ２９０５の製造に使用するためにプライマーをデザインした。まず、アメリカ国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ  Ｇｅｎｂａｎｋ）からＮＣｇｌ２３９９（配列番号１）及びＮＣｇｌ２９０５（配列番号２）の配列を確保した。前記配列などに基づいてＮＣｇｌ２３９９またはＮＣｇｌ２９０５の不活性化断片を構成するのに使用されるプライマー２３９９Ｆ１、２３９９Ｆ２、２３９９Ｒ１、２３９９Ｒ２、２９０５Ｆ１、２９０５Ｆ２、２９０５Ｒ１、及び２９０５Ｒ２を合成した（表１）。本発明で使用されたプライマーなどの塩基配列を配列番号と共に表１に要約した。制限サイトに下線を引いた。
【００３８】
【表１】
0005682072.tif 000002
【００３９】
コリネバクテリウム・グルタミクム内で複製が不可能なｐＤＺでサイト特異的遺伝子破壊を実施した。遺伝子破壊変異株を作るのに使用するために、ＮＣｇｌ２３９９とＮＣｇｌ２９０５のそれぞれ内部的に欠損されたオープンリーディングフレームを有するｐＤＺ誘導体を構成した。前記ｐＤＺ誘導体は、ｐＤＺ−ΔＮＣｇｌ２３９９（図２）とｐＤＺ−ΔＮＣｇｌ２９０５（図３）である。ｐＤＺ−ΔＮＣｇｌ２３９９は、ＸｂａＩ末端と２、２６７ｂｐの長さＮＣｇｌ２３９９のＫｐｎＩサイトに内部的遺伝子欠損を含む。前記ＮＣｇｌ２３９９の内部的遺伝子欠損は、鋳型として使用されるコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを有する２３９９Ｆ１−２３９９Ｒ１プライマー（配列番号５及び６）と２３９９Ｆ２−２３９９Ｒ２プライマー（配列番号７及び８）の存在下でオーバーラップ伸長ＰＣＲを使用して生成される。
【００４０】
ｐＤＺ−ΔＮＣｇｌ２９０５は、ＸｂａＩ末端と２、８１９ｂｐの長さＮＣｇｌ２９０５のＳｍａＩサイトに内部的遺伝子欠損を含む。前記ＮＣｇｌ２９０５の内部的遺伝子欠損は、鋳型として使用されるコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを有する２９０５Ｆ１−２９０５Ｒ１プライマー（配列番号９及び１０）と２９０５Ｆ２−２９０５Ｒ２プライマー（配列番号１１及び１２）の存在下でオーバーラップ伸長ＰＣＲを使用して生成される。
【００４１】
前記組換えプラスミドを野生型コリネバクテリウム・グルタミクムに電気穿孔法で形質転換させ（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｒｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５２：５４１−５４５，  １９９９）、１次組換え（交叉）によって染色体に組み込ませた。その後、１０％のスクロースを含む寒天平板で２次組換え（交叉）によって染色体からプラスミドを切除した。
【００４２】
遺伝子特異的プライマー対である２３９９Ｆ１−２３９９Ｒ２（配列番号５及び８）及び２９０５Ｆ１−２９０５Ｒ２（配列番号９及び１２）を使用して前記２次組換えが完了したコリネバクテリウム・グルタミクム組換え体のゲノムＤＮＡ上で診断（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）ＰＣＲを行ってコリネバクテリウム・グルタミクム組換え体がそれぞれ欠損されたＮＣｇｌ２３９９及びＮＣｇｌ２９０５遺伝子を有することを確認した。この組換え菌株などをそれぞれＫＦＣＣ１０８８１−ΔＮＣｇｌ２３９９及びＫＦＣＣ１０８８１−ΔＮＣｇｌ２９０５と命名した。前記ＮＣｇｌ２３９９及びＮＣｇｌ２９０５のオープンリーディングフレームＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３４５０を参考した。
【００４３】
実施例２：ＮＣｇｌ２３９９及びＮＣｇｌ２９０５遺伝子の両方で欠損された変異株の製作
組換え菌株ＫＦＣＣ１０８８１−ΔＮＣｇｌ２３９９を電気穿孔法を使用して組換えプラスミドｐＤＺ−ΔＮＣｇｌ２９０５と形質転換させ、前記示したものと同様な方法で処理してＮＣｇｌ２３９９及びＮＣｇｌ２９０５遺伝子の両方に欠損された新規な組換え菌株を得た。前記変異菌株をコリネバクテリウム・グルタミクムＣＡ０１−０８９２と命名し、２０１０年６月２４日付けで受託番号ＫＣＣＭ１１０８５Ｐで韓国微生物培養センターに寄託した。
【００４４】
実施例３：細胞内ＧｎｔＫと６ＰＧＤの活性及びＮＡＤＰＨの水準分析
前記実施例１と２で製作されたＬ−リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ−１０８８１−ΔＮＣｇｌ２３９９、ＫＦＣＣ−１０８８１−ΔＮＣｇｌ２９０５及びＣＡ０１−０８９２（ＫＦＣＣ−１０８８１−ΔＮＣｇｌ２３９９ΔＮＣｇｌ２９０５）の細胞内グルコン酸キナーゼ（ＧｎｔＫ）活性及びＮＡＤＰＨ水準を下記のような方法で分析した。
【００４５】
下記の複合培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに母菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ−１０８８１と、前記３種の組換え菌株などをそれぞれ接種し、３０℃で、２００ｒｐｍで振盪培養した。指数成長期の細胞などを遠心分離法を使用して収穫し、１００ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。ガラスビーズを使用して細胞を破壊した後、細胞ライセートを遠心分離して上澄液を確保した。
【００４６】
＜複合培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４８ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ１０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸溜水１リットル基準）
【００４７】
総タンパク質含量のためにブラッドフォード法によって上澄液を定量的に分析した。６ＰＧＤ活性は、３４０ｎｍでＮＡＤＰＨに対する吸光度を使用して測定した（Ｆｒｕｎｚｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６７：３０５−３２２，  ２００８）。ＧｎｔＫ活性は、６ＰＧＤに対する結合酵素アッセイ（ｃｏｕｐｌｅｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｓｓａｙ）で測定した（Ｆｒｕｎｚｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６７：３０５−３２２，  ２００８）。ＮＡＤＰＨの濃度は、ＥｎｚｙＣｈｒｏｍＴＭＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ分析キットを使用した酵素サイクリング反応（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）で決定した（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）。
【００４８】
表２に示されたように、ＮＣｇｌ２３９９遺伝子に欠損されたＫＦＣＣ−１０８８１−ΔＮＣｇｌ２３９９の細胞内ＧｎｔＫ（ＥＣ：２．７．１．１２）活性は、母菌株（ＫＦＣＣ１０８８１）と比較して約５８．７％減少したが、６ＰＧＤ活性で２．４倍の増加があった。ＮＣｇｌ２３９９及びＮＣｇｌ２９０５遺伝子が同時に欠損されたＣＡ０１−０８９２のＧｎｔＫ活性は、母菌株と比較して約７８．３％減少したが、６ＰＧＤ活性で５．１倍の増加があった（表２）。
【００４９】
また、前記酵素活性変化の結果として、ＣＡ０１−０８９２の細胞内ＮＡＤＰＨ水準は、１７０％まで増加されたことが観察された。これらのデータは、すべての場合において１０％以下の標準偏差を有する少なくとも３つの独立的な培養から測定した平均値である。前記の結果は、内在的活性以下へのグルコン酸キナーゼ活性の弱化が６ＰＧＤの活性を増加させ、これは、ＮＡＤＰＨ生産に肯定的な影響を持つ。
【００５０】
【表２】
0005682072.tif 000003
【００５１】
実施例４：ＮＣｇｌ２３９９及びＮＣｇｌ２９０５遺伝子欠損菌株でのリシン生産
Ｌ−リシン生産のために、前記実施例１と２で製作されたＬ−リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ−１０８８１−ΔＮＣｇｌ２３９９、ＫＦＣＣ−１０８８１−ΔＮＣｇｌ２９０５及びＣＡ０１−０８９２（ＫＦＣＣ−１０８８１−ΔＮＣｇｌ２３９９ΔＮＣｇｌ２９０５）を次のように培養した。
【００５２】
下記の種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナー−バッフルフラスコに母菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ−１０８８１と前記３種の組換え菌株などをそれぞれ接種し、３０℃で２０時間２００ｒｐｍで振盪培養した。その後、下記の生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナー−バッフルフラスコに前記培養された１ｍｌの種培養液をそれぞれ接種し、３０℃で１２０時間２００ｒｐｍで振盪培養した。前記鐘培地と生産培地は、次の組成で構成される。
【００５３】
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４８ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ１０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸溜水１リットル基準）
【００５４】
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース１００ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、トウモロコシ浸漬固形粉５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ１０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２０００μｇ、ニコチンアミド３０００μｇ、ＣａＣＯ３３０ｇ（蒸溜水１リットル基準）
【００５５】
培養終了後、菌株によって生産されたＬ−リシンの量を決定するためにＨＰＬＣ分析を行った。コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ−１０８８１、ＫＦＣＣ−１０８８１−ΔＮＣｇｌ２３９９、ＫＦＣＣ−１０８８１−ΔＮＣｇｌ２９０５及びＣＡ０１−０８９２（ＫＦＣＣ−１０８８１−ΔＮＣｇｌ２３９９ΔＮＣｇｌ２９０５）の培養液中のＬ−リシン濃度を表３に要約した。
【００５６】
【表３】
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【００５７】
表３に示されたように、ΔＮＣｇｌ２３９９遺伝子またはΔＮＣｇｌ２９０５遺伝子に欠損された組換え菌株は、母菌株ＫＦＣＣ−１０８８１と比較してリシン生産でそれぞれ約５．９％及び８．０％増加することを確認した。さらに、ΔＮＣｇｌ２３９９遺伝子とΔＮＣｇｌ２９０５遺伝子に同時に欠損されたＣＡ０１−０８９２菌株の場合には、リシン生産量で母菌株に対比して約１３．１％増加した（表３）。前記の結果は、グルコン酸キナーゼ活性を内在的活性以下への弱化は６ＰＧＤの活性を増加させることができ、これは、ＮＡＤＰＨ生産に肯定的な影響を持ち、よって、Ｌ−リシンを高効率及び高収率で生産することができることを示す。
【００５８】
本発明の好ましい実施態様が例示的な目的のために開示されたが、当業者は添付された請求項に開示されたような本発明のカテゴリーおよび趣旨を逸脱することなく、様々な変更、付加および代替が可能であることが理解されよう。
【００５９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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