(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＩＡＡ１５３０を特異的に認識する抗体、ＫＩＡＡ１５３０をコードする塩基配列もしくはＫＩＡＡ１５３０を特異的に認識するその一部、またはそれらに相補的な塩基配列を含む核酸を含有してなる、ヌクレオチド除去修復欠損を伴う疾患の診断剤。
【請求項２】
ヌクレオチド除去修復欠損を伴う疾患が、紫外線感受性症候群である、請求項１記載の診断剤。
【請求項３】
ＫＩＡＡ１５３０のＶＨＳ領域における変異を検出することを特徴とする、紫外線感受性症候群の診断を補助するための検査方法。
【請求項４】
下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ヌクレオチド除去修復欠損を改善する物質のスクリーニング方法：
（ａ）ＫＩＡＡ１５３０を産生する能力を有する細胞を試験化合物の存在下および非存在下に培養する工程、
（ｂ）両条件下における該蛋白質をコードするｍＲＮＡの量を、請求項１に記載される核酸を用いて測定、比較する工程、
（ｃ）試験化合物の存在下での該蛋白質をコードするｍＲＮＡの量が、試験化合物非存在下の場合と比較して有意に上昇した場合に、該試験化合物を、ヌクレオチド除去修復欠損を改善する物質として選択する工程。
【請求項５】
下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ヌクレオチド除去修復欠損を改善する物質のスクリーニング方法：
（ａ）ＫＩＡＡ１５３０を産生する能力を有する細胞を試験化合物の存在下および非存在下に培養する工程、
（ｂ）両条件下における該蛋白質の量を、請求項１に記載される抗体を用いて測定、比較する工程、
（ｃ）試験化合物の存在下での該蛋白質の量が、試験化合物非存在下の場合と比較して有意に上昇した場合に、該試験化合物を、ヌクレオチド除去修復欠損を改善する物質として選択する工程。
【請求項６】
ヌクレオチド除去修復欠損を改善する物質が、紫外線感受性症候群を改善する物質である、請求項４又は５記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
ヌクレオチド除去修復欠損を改善する物質が、日焼けを予防または改善する物質である、請求項４又は５記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
ＫＩＡＡ１５３０の発現もしくは活性を賦活化する物質を含有してなる、ヌクレオチド除去修復欠損の改善剤であって、該物質が、下記（ａ）〜（ｂ）から選ばれる、改善剤。
（ａ）ＫＩＡＡ１５３０蛋白質
（ｂ）ＫＩＡＡ１５３０をコードする核酸
【請求項９】
ヌクレオチド除去修復欠損が転写と共役したタイプのものである、請求項８記載の改善剤。
【請求項１０】
請求項８記載の改善剤を含む、ヌクレオチド除去修復欠損を伴う疾患の予防・治療剤。
【請求項１１】
ヌクレオチド除去修復欠損を伴う疾患が、紫外線感受性症候群である、請求項１０記載の剤。
【請求項１２】
ヌクレオチド除去修復欠損が、皮膚がんを後発しない、請求項８記載の剤。
【請求項１３】
請求項８記載の改善剤を含む、紫外線防護用の化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、紫外線感受性症候群、具体的には日焼けの原因遺伝子に関する。詳細には、ヌクレオチド除去修復欠損を伴う疾患の診断剤や検査・診断方法、ヌクレオチド除去修復欠損を改善する物質のスクリーニング方法、ヌクレオチド除去修復欠損の改善剤、並びにヌクレオチド除去修復欠損を伴う疾患の予防・治療剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）には、日光誘導性紫外線（ＵＶ）光傷害や種々の付加型ＤＮＡ損傷を取り除く働きがある。ＮＥＲ機構にはゲノム全体の損傷を修復するグローバルゲノムＮＥＲ（ＧＧ−ＮＥＲ）機構と、転写されている遺伝子の転写鎖上の損傷を効率良く修復する転写共役ＮＥＲ（ＴＣ−ＮＥＲ）機構の２つのサブパスウェイが存在する。
ヒトでは、ＮＥＲ機構の欠落は光線過敏症を招くことが知られている。未修復のＤＮＡ損傷はＲＮＡ転写を妨害し、また、調整された遺伝子発現を妨げ、色素性乾皮症（ＸＰ）やコケーン症候群（ＣＳ）等で観察されるような、発達異常や全身異常をもたらす。
一方、紫外線感受性症候群（ＵＶＳＳ）は、皮膚の光線過敏症及びしみ・そばかすによって特徴づけられる常染色体性劣性遺伝性皮膚疾患であるが、ＸＰで報告されているような、皮膚がん等の酷い症状は認められない（非特許文献１、及び２）。
臨床的特徴が極めて軽度であるにも関わらず、ＵＶＳＳ由来の線維芽細胞は重度のＵＶ感受性を示し、転写と共役したＮＥＲ（ＴＣ−ＮＥＲ）を欠いている（非特許文献２〜４）。ＵＶＳＳ患者の細胞で見られるＵＶ照射に対するこれらの応答は、ＴＣ−ＮＥＲ欠損したＣＳ患者の細胞で見られるものと区別がつかない（非特許文献２〜４）。
ＵＶＳＳは、臨床的徴候が軽度であるので、積極的な研究が為されておらず、信頼できる報告が極めて限られているのが現状である。従ってＵＶＳＳは過小診断されている傾向にある。１９９４年に初めて二人のＵＶＳＳ患者が報告され、確固たる根拠を持って報告されたものは世界中で７例のみである。
【０００３】
近年の研究から、７例の患者のうち３例で、ＵＶＳＳの原因となる変異が、コケーン症候群ＣＳＡ遺伝子又はＣＳＢ遺伝子において同定された。残りの４例は、ＸＰ又はＣＳの相補性群のいずれにも属していなかったが、別の相補性群（ＵＶSＳ−Ａ）を形成していた（非特許文献１、５及び６）。しかしながら、その原因遺伝子（ＵＶＳＳＡ）はいまだ同定されていない。
【０００４】
ＮＥＲ活性の測定には、核酸の取り込みを指標とした修復機能を測定する方法が開発されている（特許文献１、非特許文献７）。当該方法は、非放射性核酸を用いて放射性核酸を使用する従来法と同等の精度と感度を確保し、ＮＥＲのＵＤＳ（Unscheduled DNA Synthesis）及びＲＲＳ（Recovery RNA synthesis）活性の両方を測定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−２４４６８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Spivak, G. Mutat Res 577, 162-169 (2005).
【非特許文献２】Itoh, T. et al., AM J Hum Genet 56, 1267-1276 (1995)
【非特許文献３】Itoh, T. et al., Mutat Res 314, 233-248 (1994)
【非特許文献４】Spivak, G. et al., DNA Repair (Amst) 1, 629-643 (2002)
【非特許文献５】Cleaver, J. E. & Thomas, G. H., Arch Dermatol 129, 348-350 (1993)
【非特許文献６】Itoh, T. et al., J Invest Dermatol 114, 1022-1029 (2000)
【非特許文献７】Nakazawa, Y. et al., DNA Repair (Amst) 9, 506-516 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ＮＥＲ欠損、特に紫外線感受性症候群、具体的には日焼けの原因となる遺伝子異常を解明することにある。さらに本発明の目的は、紫外線感受性症候群等のＮＥＲ欠損を伴う疾患の診断剤や、検査・診断方法を提供することにある。さらに本発明の別の目的は、ＮＥＲ欠損の改善剤、ＮＥＲ欠損を伴う疾患の予防・治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、親族関係にない２名のＵＶＳＳ−Ａ患者の全エクソームの配列を決定し、ＵＶＳＳＡ遺伝子がＫＩＡＡ１５３０遺伝子（ＮＭ＿０２０８９４）であることを見出した。ＫＩＡＡ１５３０遺伝子は、ヒトｃＤＮＡを解析する過程で報告された遺伝子であり、染色座４ｐ１６に位置し、７０９アミノ酸（ＮＰ＿０６５９４５）をコードしている。本発明者らは、さらにＫＩＡＡ１５３０蛋白質の欠如／異常がＴＣ−ＮＥＲにおける欠陥をもたらすことを確認した。ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現抑制、疾患症例の検証、相補性試験、蛋白質発現解析等を行って、当該遺伝子の欠損／異常が紫外線感受性症候群の原因であることを証明し、本発明を完成するに至った。当該遺伝子は、「日焼け」の原因遺伝子であり、この遺伝子が欠損していると光線過敏症になるが、これまでにＸＰのように皮膚がんが発生した事象は報告がない。
本願発明は、以下に示す通りである。
【０００９】
［１］配列番号１の塩基配列からなる、紫外線感受性症候群の原因遺伝子。
［２］紫外線感受性症候群が日焼けである、上記［１］記載の原因遺伝子。
［３］配列番号２のアミノ酸配列からなる、紫外線感受性症候群の原因蛋白質。
［４］配列番号２の１〜１６３番目のアミノ酸配列を含む、紫外線感受性症候群の原因蛋白質。
［５］ＫＩＡＡ１５３０に対する抗体またはＫＩＡＡ１５３０をコードする塩基配列もしくはその一部を含む核酸を含有してなる、ヌクレオチド除去修復欠損を伴う疾患の診断剤。
［６］ヌクレオチド除去修復欠損を伴う疾患が、紫外線感受性症候群である、上記［５］記載の診断剤。
［７］ＫＩＡＡ１５３０のＶＨＳ領域における変異を検出することを特徴とする、紫外線感受性症候群の検査方法。
［８］ＫＩＡＡ１５３０を産生する能力を有する細胞における該蛋白質及び／又は遺伝子の発現を、試験化合物の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、ヌクレオチド除去修復欠損を改善する物質のスクリーニング方法。
［９］ヌクレオチド除去修復欠損を改善する物質が、紫外線感受性症候群を改善する物質である、上記［８］記載のスクリーニング方法。
［１０］ヌクレオチド除去修復欠損を改善する物質が、日焼けを予防または改善する物質である、上記［８］記載のスクリーニング方法。
［１１］下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、上記［８］〜［１０］のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）ＫＩＡＡ１５３０を産生する能力を有する細胞を試験化合物の存在下および非存在下に培養する工程、
（ｂ）両条件下における該蛋白質をコードするｍＲＮＡの量を、本発明の核酸を用いて測定、比較する工程、
（ｃ）試験化合物の存在下での該蛋白質をコードするｍＲＮＡの量が、試験化合物非存在下の場合と比較して有意に上昇した場合に、該試験化合物を、ヌクレオチド除去修復欠損を改善する物質として選択する工程。
［１２］下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、上記［８］〜［１０］のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）ＫＩＡＡ１５３０を産生する能力を有する細胞を試験化合物の存在下および非存在下に培養する工程、
（ｂ）両条件下における該蛋白質の量を、本発明の抗体を用いて測定、比較する工程、
（ｃ）試験化合物の存在下での該蛋白質の量が、試験化合物非存在下の場合と比較して有意に上昇した場合に、該試験化合物を、ヌクレオチド除去修復欠損を改善する物質として選択する工程。
［１３］ＫＩＡＡ１５３０の発現もしくは活性を賦活化する物質を含有してなる、ヌクレオチド除去修復欠損の改善剤。
［１４］ＫＩＡＡ１５３０の発現もしくは活性を賦活化する物質が、下記（ａ）〜（ｃ）から選ばれる、上記［１３］記載の改善剤。
（ａ）ＫＩＡＡ１５３０蛋白質
（ｂ）ＫＩＡＡ１５３０をコードする核酸
（ｃ）ＫＩＡＡ１５３０に対してアゴニスト活性を示す低分子化合物
［１５］ヌクレオチド除去修復欠損が転写と共役したタイプのものである、上記［１３］または［１４］記載の改善剤。
［１６］上記［１３］記載の改善剤を含む、ヌクレオチド除去修復欠損を伴う疾患の予防・治療剤。
［１７］ヌクレオチド除去修復欠損を伴う疾患が、紫外線感受性症候群である、上記［１６］記載の剤。
［１８］ヌクレオチド除去修復欠損が、皮膚がんを後発しない、上記［１３］記載の剤。
［１９］上記［１３］記載の改善剤を含む、紫外線防護用の化粧品。
【発明の効果】
【００１０】
日焼けの原因遺伝子が解明できたことにより、紫外線感受性症候群のような日焼けが症状として出る疾病の診断や日焼け予防薬のスクリーニングが可能になる。また、ＮＥＲ機構の解明の有力なツールを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１ａ】ｐ．Ｋ１２３Ｘ未成熟停止変異を引き起こす、ｃ．３６７Ａ＞Ｔ変異を図示したものである。この変異は、ＵＶＳＳ−Ａ患者（Ｋｐｓ３）で同定された。
【図１ｂ】キャピラリーサンガー配列解析の結果を図示したものである。アスタリスクは変異が生じた位置を示している。ＫＩＡＡ１５３０エクソン３におけるｃ．３６７Ａ＞Ｔの一塩基変異（ＳＮＶ）が、エクソーム配列解析を行ったＵＶＳＳ−Ａ患者（ＸＰ２４ＫＯ及びＫｐｓ３）においてホモ接合性であることがわかった。同じ変異がＫｐ３の兄弟（姉妹）であるＫｐｓ２にも見られた。
【図１ｃ】キャピラリーサンガー配列解析の結果を図示したものである。アスタリスクは変異が生じた位置を示している。ｃ．８７ｄｅｌＧフレームシフト変異が、ＵＶＳＳ−Ａ患者（ＵＶＳＳ２４ＴＡ）で同定された。リジンコドン２９の３番目の位置の欠失が未成熟停止（ｐ．Ｉ３１ＦｆｓＸ９）をもたらす。
【図１ｄ】ＫＩＡＡ１５３０遺伝子のゲノム構造及びＵＶＳＳ−Ａ患者における変異の位置を示している。
【図１ｅ】上段：ＵＶＳＳ−Ａ患者（ＸＰ２４ＫＯ、Ｋｐｓ３、Ｋｐｓ２、及びＵＶＳＳ２４ＴＡ）間で共有されているＲＯＨ（run of homozygous）セグメントを図示したものである。各患者で全ゲノムのＳＮＰ遺伝子型決定を行い、ＲＯＨ（＞１Ｍｂｐ）を抽出した。４名の患者全てで重複するＲＯＨ領域を緑色で、ＫＩＡＡ１５３０遺伝子を含む重複領域を赤色で示した。中段：各患者において同定されたＲＯＨを図示したものである。下段：染色体４で見られる重複領域を拡大した図である。ＡＡ：ホモ接合性、ＢＢ：ホモ接合性、ＡＢ：ヘテロ接合性、ＮＣ：ノーコール
【図１ｆ】正常細胞、ＣＳ患者由来細胞及びＵＶＳＳ−Ａ患者由来細胞におけるＫＩＡＡ１５３０蛋白質の発現の有無を調べた結果を図示したものである（ウェスタンブロット像）。正常細胞及びＣＳ患者由来細胞には、〜９０ｋＤａのＫＩＡＡ１５３０遺伝子産物が存在するが、ＵＶＳＳ−Ａ患者由来細胞にはＫＩＡＡ１５３０蛋白質が存在しない。正常細胞：１ＢＲ及び４８ＢＲ、ＣＳ−Ａ患者細胞：ＣＳ２ＡＷ、ＣＳ−Ｂ患者細胞：ＣＳ１０ＬＯ、ＵＶＳＳ−Ａ患者細胞：Ｋｐｓ２、Ｋｐｓ３、ＵＶＳＳ２４ＴＡ、及びＸＰ２４ＫＯ、アスタリスクは非特異的なバンドであることを示している。
【図２ａ】ＵＶＳＳ−Ａ患者由来細胞ではＵＶＣ照射後のＲＲＳレベルが低下していることを示したグラフである。細胞にＵＶＣ照射（■；１０Ｊ／ｍ２  ２５４ｎｍ  ＵＶＣ、□；ＵＶ照射せず）し、続いてＲＮＡ合成回復の為に１２時間インキュベートした。ＲＲＳレベルは、蛍光に基づくエチニルウリジン（ＥＵ）取り込みアッセイにより測定した。
【図２ｂ】ＵＶＣ照射したＵＶＳＳ−Ａ患者由来細胞のＵＤＳレベルは殆ど正常であった。細胞をＵＶＣ照射（■；２０Ｊ／ｍ２  ＵＶＣ、□；ＵＶ照射せず）し、続いて、デオキシチミジンアナログであるエチニルデオキシウリジン（ＥｄＵ）で４時間インキュベートした。ＥｄＵ取り込みレベルを、ＥＵに基づくＲＲＳアッセイと同様の蛍光に基づく検出システムによって測定した。
【図２ｃ】ＵＶＣ照射後のＲＮＡ合成回復は、ＫＩＡＡ１５３０遺伝子発現をｓｉＲＮＡ（small-RNA interference）で抑制することによって完全に消失した。４８ＢＲ細胞をｍｏｃｋ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトするか、あるいはＫＩＡＡ１５３０あるいはＸＰＡ遺伝子をターゲッティングしたｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ＲＲＳレベルは図２ａで述べたのと同様にして測定した（■；１０Ｊ／ｍ２  ＵＶＣ、□；ＵＶ照射せず）。
【図２ｄ】ＵＤＳレベルは、ＫＩＡＡ１５３０遺伝子発現をｓｉＲＮＡノックダウンしても影響を受けなかった。ＵＤＳレベルは図２ｂで述べたのと同様にして測定した（■；２０Ｊ／ｍ２  ＵＶＣ）。
【図２ｅ】ＫＩＡＡ１５３０遺伝子のノックダウン効率をウェスタンブロットで確認した図である。検出には、マウス抗ヒトＫＩＡＡ１５３０抗体を用いた。アスタリスクは非特異的なバンドであることを示している。
【図２ｆ】ＵＶＳＳ−Ａ患者細胞における、組換えレンチウイルス感染によるＫＩＡＡ１５３０ｃＤＮＡの異所性発現によってＲＲＳ欠如が完全に回復することを示したグラフである。ＬａｃＺ又はＶ５−タグされた野生型ＫＩＡＡ１５３０ｃＤＮＡを発現するレンチウイルス粒子を調製した。Ｍｏｃｋ感染（Ｗ／Ｏ）、又は表示のウイルスで感染させた細胞を４８時間培養し、続いてＵＶＣ照射した（■；１０Ｊ／ｍ２  ＵＶＣ、□；ＵＶ照射せず）。ＲＲＳレベルは図２ａで記載したようにして測定した。ＲＲＳレベルは、照射処理しなかった細胞のＲＲＳレベルに対して標準化した。ＵＤＳレベルは、正常な４８ＢＲ細胞に対して（図２ｂ参照）、あるいはｍｏｃｋ ｓｉＲＮＡで処理した細胞に対して（図２ｄ参照）標準化した。エラーバーは、５サンプルの平均値の標準誤差を示している。正常細胞：４８ＢＲ、ＵＶＳＳ−Ａ患者細胞：Ｋｐｓ２、Ｋｐｓ３、及びＸＰ２４ＫＯ、ＣＳ−Ａ患者細胞：ＣＳ２ＡＷ、ＣＳ−Ｂ患者細胞：ＣＳ１０ＬＯ
【図２ｇ】ＵＶＣ照射後のＲＮＡ合成回復は、ＫＩＡＡ１５３０遺伝子発現をｓｉＲＮＡ（small-RNA interference）で抑制することによって完全に消失した。４８ＢＲ細胞をｍｏｃｋ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトするか、あるいはＫＩＡＡ１５３０あるいはＸＰＡ遺伝子をターゲッティングしたｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ＲＲＳレベルは図２ａで述べたのと同様にして測定した（■；１０Ｊ／ｍ２  ＵＶＣ、□；ＵＶ照射せず）。
【図３ａ】ＫＩＡＡ１５３０蛋白質が核ＴＦＩＩＨ−ＣＡＫ複合体と相互作用することを示した図である。ｍｏｃｋでトランスフェクトした、あるいはＣ末端がＶ５−タグされたＫＩＡＡ１５３０ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から粗ライセートを調製した。アガロースをコンジュゲートしたウサギ抗Ｖ５タグ抗体で抽出物を免疫沈降した。相互作用をＶ５−タグ（ＫＩＡＡ１５３０）、核−ＴＦＩＩＨ構成要素（ＸＰＢ、ＸＰＤ、及びｐ６２）、及びＣＡＫ構成要素（ｃｄｋ７、ｃｙｃｌｉｎ  Ｈ、及びＭＡＴ１）に対する抗体で検出した。ＣＬ：粗ライセート（１０％ロード）、ＩＰ：免疫沈降
【図３ｂ】図３ｃのＲＲＳアッセイで用いるＫＩＡＡ１５３０のトランケーション変異体の配置図である。ＶＨＳ：ＶＨＳ（Ｖｐｓ−２７、Ｈｒｓ、及びＳＴＡＭ）ドメインとの相同性を有する、ＫＩＡＡ１５３０蛋白質のＮ末端部位の三次構造、ＤＵＦ２０４３：機能未知の保存されたドメイン
【図３ｃ】インタクト（フル）な、またはトランケートされた、Ｖ５−タグされたＫＩＡＡ１５３０ｃＤＮＡを発現するレンチウイルスをＫｐｓ３細胞に感染させた。感染後４８時間で、細胞にＵＶＣ照射し（■；１０Ｊ／ｍ２  ＵＶＣ、□；ＵＶ照射せず）、続いて回復させる為に１２時間インキュベートした。ＲＲＳレベルは図２ａで記載したのと同様にして測定した。
【図３ｄ】図３ｅ、図３ｆで使用するためのＫＩＡＡ１５３０アミノ酸置換変異体の配置図である。ＣＳ患者で同定されたヘテロ接合性の変異を緑色で示している。非同義ＳＮＰが正常なコントロール対象で認められた（オレンジ色）。黒及び赤で示された変異はヒト〜線虫で保存されている残基に対して設計されたアミノ酸置換である。赤色で示した２つの変異体はＫｐｓ３細胞におけるＲＲＳ欠如を相補することができなかった（図３ｅ参照）。
【図３ｅ】Ｖ５−タグされたＫＩＡＡ１５３０ｃＤＮＡのアミノ酸置換変異体を発現しているレンチウイルスをＫｐｓ３細胞に感染させた。感染４８時間後、細胞にＵＶＣ照射し（■；１０Ｊ／ｍ２  ＵＶＣ、□；ＵＶ照射せず）、続いて回復させる為に１２時間インキュベートした。ＲＲＳレベルは図２ａで記載したのと同様にして測定した。
【図３ｆ】Ｖ５−タグされたＫＩＡＡ１５３０ｃＤＮＡのアミノ酸置換変異体を発現しているレンチウイルスをＫｐｓ３細胞に感染させた。感染４８時間後、細胞にＵＶＣ照射し（■；１０Ｊ／ｍ２  ＵＶＣ、□；ＵＶ照射せず）、続いて回復させる為に１２時間インキュベートした。ＲＲＳレベルは図２ａで記載したのと同様にして測定した。
【図３ｇ】正常細胞（４８ＢＲ）、ＵＶＳＳ−Ａ（Ｋｐｓ３、ＸＰ２４ＫＯ、ＵＶＳＳ２４ＴＡ）、ＵＶＳＳ／ＣＳ−Ｂ（ＵＶＳ１ＫＯ）、及びＣＳ−Ｂ（ＣＳ１０ＬＯ）患者由来の細胞を、１００μＭのシクロヘキシミド（ＣＨＸ）を含む培地中で１時間前培養し、次いで１０Ｊ／ｍ２  ＵＶＣを照射した。次いで、細胞を表示の時間、ＣＨＸ含有培地中でインキュベートした。全細胞ライセートをＨ５（ＣＴＤ−Ｓｅｒ２／５−Ｐ）抗体を用いたイムノブロッティングに付した。これによりＲＮＡ  ｐｏｌＩＩの伸長型が検出される。
【図４】ＫＩＡＡ１５３０変異体蛋白質が、ｃｏｒｅ−ＴＨＩＩＨ及びＣＡＫ複合体と相互作用することを示した図（イムノブロット像）である。Ｗ１２０Ａ変異体（ａ）及びＶＨＳドメインのトランケーション変異体（図３ｂのtruncation 4）（ｂ）について調べた。ｍｏｃｋでトランスフェクトした細胞、野生型細胞、あるいは変異を有するＫＩＡＡ１５３０ｃＤＮＡ（Ｖ５−タグされている）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から粗ライセートを調製した。得られた抽出物を、アガロースをコンジュゲートしたウサギ抗Ｖ５タグ抗体で免疫沈降した。相互作用は、Ｖ５タグ（ＫＩＡＡ１５３０）、ｃｏｒｅ−ＴＨＩＩＨ構成要素（ＸＰＢ、ＸＰＤ、及びｐ６２）及びＣＡＫ構成要素（ｃｄｋ７、ｃｙｃｌｉｎ  Ｈ、及びＭＡＴ１）に対する抗体を用いてイムノブロッティングすることにより検出した。ＣＬ：粗ライセート（１０％ロード）、ＩＰ：免疫沈降
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［紫外線感受性症候群の原因遺伝子としてのＫＩＡＡ１５３０遺伝子］
本発明は、日焼けの原因遺伝子をＫＩＡＡ１５３０遺伝子であると同定したことに基づく。ＫＩＡＡ１５３０遺伝子は、ヒトｃＤＮＡ解析の過程で見出された遺伝子であり（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 202, 99(26): 16899-16903）、染色座４ｐ１６に位置し、７０９アミノ酸（ＮＰ＿０６５９４５）をコードしている。Ｎ．ｍｕｓｃｕｌｅｓ（ＮＰ＿００１０７４５７０）、Ｅ．ｃａｂａｌｌｕｓ（ＸＰ＿００１４８８３９４）、Ｂ．ｔａｕｒｕｓ（ＸＰ＿５８７７０３）、Ｘ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ（ＮＰ＿００１１０７３０６）、Ｇ．ｇａｌｌｕｓ（ＸＰ＿４２０８４５）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（ＮＰ＿５０５０１２）等がオルソログとして知られている。配列は確認されているもののその機能は未知であり、他の遺伝子との相同性は全くない。
本発明におけるＫＩＡＡ１５３０蛋白質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質である。
ＫＩＡＡ１５３０は、例えば、温血動物（例：ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、トリ等）の細胞［例：肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例：マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞等］、あるいはそれらの細胞が存在するあらゆる組織もしくは臓器［例えば、脳、脳の各部位（例：嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例：大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例：褐色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨格筋等］等から単離・精製される蛋白質であってもよい。また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成された蛋白質であってもよいし、あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を導入された形質転換体から産生される組換え蛋白質であってもよい。
【００１３】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列等が挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）等の同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら,Science, 247: 1306-1310 (1990）を参照）。
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschulら, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997))］、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48： 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている］、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
より好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００１４】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、前記の配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質等が好ましい。ここで「活性」とは、ＮＥＲ活性をいう。かかる活性の有無は、不定期ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）活性やＲＮＡ合成回復（ＲＲＳ）活性を測定することによって調べることができる。
ＵＤＳ活性の測定は、細胞周期に非依存的な微量のＤＮＡ合成を検出するもので、現在、ＵＤＳ量を測定する種々の方法が確立されている。ＮＥＲ活性の評価においては、一般的に、ＤＮＡ損傷を誘発するために波長２５４ｎｍの紫外線（ＵＶ）照射を行い、ヌクレオチド取り込みレベルの測定のために、ＤＮＡ損傷を誘導した細胞を放射性チミジン又はヌクレオシドアナログのいずれかの存在下で培養することによって行う。
ＲＲＳ活性の測定は、ＮＥＲのうちＲＮＡの転写と共役したＤＮＡ修復（ＴＣＲ）の活性のみを対象とした測定方法である。ＲＲＳの測定には、放射性ウリジン等が用いられ、ＤＮＡ損傷処理後にＲＮＡ合成がどの程度回復したかを、液体シンチレーションカウンターを用いたバッチアッセイにより測定することができる。
ＵＤＳ活性の測定やＲＲＳ活性の測定として、上記した従来の測定方法に加え、本発明者らが以前に開発した非放射性核酸を用いた測定方法（特許文献１）を用いることもできる。
【００１５】
「実質的に同質」とは、それらの活性が定性的（例えば、生理学的または薬理学的）に同じであることを示す。したがって、ＮＥＲ活性は同等であることが好ましいが、これらの活性の程度（例えば、約０．１〜約１０培、好ましくは約０．５〜約２倍）や蛋白質の分子量等の量的要素は異なっていてもよい。
【００１６】
また、本発明のＫＩＡＡ１５３０には、例えば、（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち１または２個以上（好ましくは、１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、特に好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、特に好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜５０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（４）配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち１または２個以上（好ましくは、１〜５０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（５）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質等も含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、蛋白質の活性が保持される限り特に限定されない。
【００１７】
本発明のＫＩＡＡ１５３０は、好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するヒトＫＩＡＡ１５３０蛋白質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０６５９４５）、あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログである。
【００１８】
本明細書において、蛋白質およびペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）で記載される。配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとする、本発明のＫＩＡＡ１５３０は、Ｃ末端がカルボキシル基、カルボキシレート、アミドまたはエステルの何れであってもよい。
【００１９】
ＫＩＡＡ１５３０の部分ペプチド（以下、単に「本発明の部分ペプチド」と略称する場合もある）は、上記したＫＩＡＡ１５３０の部分アミノ酸配列を有するペプチドであり、且つＫＩＡＡ１５３０と実質的に同質の活性を有する限り、何れのものであってもよい。ここで「実質的に同質の活性」とは上記と同意義を示す。また、「実質的に同質の活性」の測定はＫＩＡＡ１５３０の場合と同様に行なうことができる。
具体的には、本発明の部分ペプチドとして、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち、ＮＥＲ活性に重要と考えられる領域（例えばヒトＫＩＡＡ１５３０の場合、配列番号２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜１６３で示される、いわゆるＶＨＳ領域）を含む部分アミノ酸配列を有するもの等が用いられる。ここで、ＶＨＳ領域とはＶｐｓ−２７／Ｈｒｓ／ＳＴＡＭドメインの３Ｄ構造と顕著な相同性を有するモチーフを意図する。ＶＨＳは、ユビキチン結合及び一般的な細胞内膜輸送に関与していることが近年明らかになった。
本発明の部分ペプチドは、そのサイズに特に制限はないが、好ましくは上記のＶＨＳ領域を含む３００個以上の部分アミノ酸配列を含むもの、より好ましくは５００個以上の部分アミノ酸配列を含むものが挙げられる。該部分アミノ酸配列は一個の連続した部分アミノ酸配列であってもよく、あるいは不連続な複数の部分アミノ酸配列が連結されたものであってもよい。
【００２０】
また、本発明の部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基、カルボキシレート、アミドまたはエステルの何れであってもよい。
【００２１】
本発明で用いられるＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドは塩の形態であってもよい。例えば、生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩）等との塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例：塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例：酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が用いられる。
【００２２】
ＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドは、前述した哺乳動物の細胞または組織から自体公知の蛋白質の精製方法によって製造することができる。具体的には、哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズし、低速遠心により細胞デブリスを除去した後、上清を高速遠心して細胞膜含有画分を沈澱させ（必要に応じて密度勾配遠心等により細胞膜画分を精製し）、該画分を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等に付すことによりＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドを調製することができる。
【００２３】
ＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドは、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる（以下、これらの化学合成の説明においては、特にことわらない限り、ＫＩＡＡ１５３０およびその部分ペプチドを包括して、単にＫＩＡＡ１５３０という）。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。ＫＩＡＡ１５３０を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を製造することができる。
ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の(1)および(2)に記載された方法に従って行われる。
(1) M. BodanszkyおよびM.A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966年)
(2) SchroederおよびLuebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965年)
【００２４】
このようにして得られたＫＩＡＡ１５３０は、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせ等が挙げられる。
上記方法で得られるＫＩＡＡ１５３０が遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にＫＩＡＡ１５３０が塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００２５】
ＫＩＡＡ１５３０の合成には、通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。当該樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするＫＩＡＡ１５３０の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質等を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のＫＩＡＡ１５３０またはそのアミド体を取得する。
【００２６】
ＫＩＡＡ１５３０のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いた蛋白質（ペプチド）とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去した蛋白質（ペプチド）とを製造し、この両蛋白質（ペプチド）を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質（保護ペプチド）を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗蛋白質（粗ペプチド）を得ることができる。この粗蛋白質（粗ペプチド）は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のＫＩＡＡ１５３０のアミド体を得ることができる。
ＫＩＡＡ１５３０のエステル体は、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、上記ＫＩＡＡ１５３０のアミド体の場合と同様にして得ることができる。
【００２７】
本発明の部分ペプチドは、ＫＩＡＡ１５３０の全長蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによっても製造することができる。
【００２８】
さらに、ＫＩＡＡ１５３０は、それをコードする核酸を含有する形質転換体を培養し、得られる培養物からＫＩＡＡ１５３０を分離精製することによって製造することもできる。ＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドをコードする核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（即ち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（即ち、非コード鎖）であってもよい。
ＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、温血動物（例：ヒト、ウシ、サル、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター、トリ等）のあらゆる細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例：マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞等］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例：嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例：大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例：褐色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨格筋等］由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ等が挙げられる。
【００２９】
ＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製したゲノムＤＮＡ画分および全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分をそれぞれ鋳型として用い、Polymerase Chain Reaction（以下、「ＰＣＲ法」と略称する）およびReverse Transcriptase-PCR（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって直接増幅することもできる。あるいは、ＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製したゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法等により、それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド等いずれであってもよい。
【００３０】
ＫＩＡＡ１５３０をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記したＫＩＡＡ１５３０と実質的に同質の活性（例：ＮＥＲ活性）を有する蛋白質をコードするＤＮＡ等が挙げられる。
配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡ等が用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
【００３１】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法等に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（sodium chloride/sodium citrate）中４５℃でのハイブリダイゼーション反応の後、０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中６５℃での一回以上の洗浄等が挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。
【００３２】
ＫＩＡＡ１５３０をコードするＤＮＡは、好ましくは配列番号１で表される塩基配列で示されるヒトＫＩＡＡ１５３０蛋白質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２０８９４）、あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログである。
【００３３】
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の一部と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする塩基配列を含むものであればいかなるものであってもよい。具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（１）配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡ、または（２）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、前記したＫＩＡＡ１５３０と実質的に同質の活性（例：ＮＥＲ活性）を有するペプチドをコードするＤＮＡ等が用いられる。
【００３４】
ＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、該ＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドをコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込んだＤＮＡを、ＫＩＡＡ１５３０蛋白質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したものとハイブリダイゼーションすることによってクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（前述）に記載の方法等に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００３５】
ＤＮＡの塩基配列は、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ  ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することができる。
【００３６】
クローン化されたＤＮＡは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することができる。
【００３７】
ＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、例えば、ＫＩＡＡ１５３０をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例：ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）；枯草菌由来のプラスミド（例：ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）；酵母由来プラスミド（例：ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）；昆虫細胞発現プラスミド（例：ｐＦａｓｔ−Ｂａｃ）；動物細胞発現プラスミド（例：ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）；λファージ等のバクテリオファージ；バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクター（例：ＢｍＮＰＶ、ＡｃＮＰＶ）；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス等の動物ウイルスベクター等が用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
例えば、宿主が動物細胞である場合、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター等が用いられる。なかでも、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーター等が好ましい。
宿主がエシェリヒア属菌である場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター等が好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等が好ましい。
宿主が酵母である場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター等が好ましい。
【００３８】
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製起点（以下、ＳＶ４０  ｏｒｉと略称する場合がある）等を含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある、メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性）、アンピシリン耐性遺伝子（以下、ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によって目的遺伝子を選択することもできる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列（シグナルコドン）を、ＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの５’末端側に付加（またはネイティブなシグナルコドンと置換）してもよい。例えば、宿主がエシェリヒア属菌である場合、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列等が；宿主がバチルス属菌である場合、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列等が；宿主が酵母である場合、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列等が；宿主が動物細胞である場合、インスリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列等がそれぞれ用いられる。
【００３９】
上記したＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、ＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドを製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞等が用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、Escherichia coli K12・DH1、Escherichia coli JM103、Escherichia coli JA221、Escherichia coli HB101、Escherichia coli C600等が用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、Bacillus subtilis MI114、Bacillus subtilis 207-21等が用いられる。
酵母としては、例えば、Saccharomyces cerevisiae AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12、Schizosaccharomyces pombe NCYC1913、NCYC2036、Pichia pastoris KM71等が用いられる。
【００４０】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞、Estigmena acrea由来の細胞等が用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N細胞；BmN細胞）等が用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞等が用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫等が用いられる。
【００４１】
動物細胞としては、例えば、サルＣＯＳ−７細胞、サルＶｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０細胞、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞等が用いられる。
【００４２】
形質転換、それにより得られた形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
【００４３】
前記形質転換体を培養して得られる培養物からＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドを自体公知の方法に従って分離精製することができる。
例えば、ＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞の細胞質から抽出する場合、培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解等によって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離やろ過により可溶性蛋白質の粗抽出液を得る方法等が適宜用いられる。該緩衝液は、尿素や塩酸グアニジン等の蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭ等の界面活性剤を含んでいてもよい。一方、膜画分からＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドを抽出する場合は、上記と同様に菌体あるいは細胞を破壊した後、低速遠心で細胞デブリスを沈澱除去し、上清を高速遠心して細胞膜含有画分を沈澱させる（必要に応じて密度勾配遠心等により細胞膜画分を精製する）等の方法が用いられる。また、ＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドが菌体（細胞）外に分泌される場合には、培養物から遠心分離またはろ過等により培養上清を分取する等の方法が用いられる。
このようにして得られた可溶性画分、膜画分あるいは培養上清中に含まれるＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドの単離精製は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィー等の荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法；等が用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。
【００４４】
かくして得られる蛋白質またはペプチドが遊離体である場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって、該遊離体を塩に変換することができ、蛋白質またはペプチドが塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、形質転換体が産生するＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去したりすることもできる。該蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼ等が用いられる。
かくして得られるＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドの存在は、ＫＩＡＡ１５３０に対する抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウェスタンブロッティング等により確認することができる。
【００４５】
さらに、ＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドは、上記のＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡに対応するＲＮＡを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセート等からなる無細胞蛋白質翻訳系を用いてインビトロ合成することができる。あるいは、さらにＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞転写／翻訳系を用いて、ＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを鋳型としても合成することができる。無細胞蛋白質転写／翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法に準じて調製することもできる。
【００４６】
［ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）欠損を伴う疾患の診断剤］
紫外線感受性症候群の原因遺伝子がＫＩＡＡ１５３０遺伝子である、という本発明において得られた知見に基づいて、本発明は、ＮＥＲ欠損を伴う疾患の診断剤を提供する。
具体的には、本発明の診断剤は、ＫＩＡＡ１５３０に対する抗体、ＫＩＡＡ１５３０をコードする塩基配列もしくはその一部を含む核酸、またはＫＩＡＡ１５３０をコードする塩基配列もしくはその一部に相補的な塩基配列を含む核酸を含有してなる。
【００４７】
ＮＥＲ機構にはゲノム全体の損傷を修復するグローバルゲノムＮＥＲ（ＧＧ−ＮＥＲ）機構と、転写されている遺伝子の転写鎖上の損傷を効率良く修復する転写共役ＮＥＲ（ＴＣ−ＮＥＲ）機構の２つのサブパスウェイが存在する。本発明の診断剤が対象とするＮＥＲ欠損は、いずれの機構の欠損でもあり得るが、好ましくはＴＣ−ＮＥＲである。特に、紫外線感受性症候群（ＵＶＳＳ）、特に皮膚がんを後発しないような、日焼けを主たる特徴とするようなＵＶＳＳの診断に好適である。
【００４８】
本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等の天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、ヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒト抗体、ファージディスプレイによって作製された抗体およびこれらの結合性断片が含まれる。
【００４９】
結合性断片とは、前述した抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ（variable fragment of antibody）、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ（disulphide stabilised Fv）、ｄＡｂ（single domain antibody）等が挙げられる（Exp. Opin. Ther. Patents,Vol.6, No.5, p.441-456, 1996）。
【００５０】
抗体のクラスは、特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧまたはＩｇＭであり、精製の容易性等を考慮するとより好ましくはＩｇＧである。
【００５１】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、既知の一般的な製造方法によって製造することができる。即ち、例えば、免疫原を、必要に応じてフロイントアジュバントとともに、哺乳動物、例えばポリクローナル抗体の場合、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマまたはウシ等、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ウマまたはウサギに、モノクローナル抗体の場合、マウス、ラット、ハムスターに免疫する。
【００５２】
ポリクローナル抗体は、具体的には下記のようにして製造することができる。即ち、免疫原をマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ウマまたはウサギ、好ましくはヤギ、ウマまたはウサギ、より好ましくはウサギの皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１〜数回注射することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１〜１４日毎に１〜５回免疫を行って、最終免疫より約１〜５日後に免疫感作された該哺乳動物から血清が取得される。
【００５３】
血清をポリクローナル抗体として用いることも可能であるが、好ましくは、限外ろ過、硫安分画、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラムもしくはプロテインＡ／Ｇカラム、免疫原を架橋させたカラム等を用いたアフィニティカラムクロマトグラフィーにより単離および／または精製される。
【００５４】
モノクローナル抗体は、上記免疫感作動物から得た該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた免疫原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。
【００５５】
モノクローナル抗体は、具体的には下記のようにして製造することができる。即ち、免疫原を、マウス、ラットまたはハムスター（ヒト抗体産生トランスジェニックマウスのような他の動物由来の抗体を産生するように作出されたトランスジェニック動物を含む）の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内もしくは腹腔内に１〜数回注射するか、または移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１〜１４日毎に１〜４回免疫を行って、最終免疫より約１〜５日後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞を取得する。
【００５６】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ（融合細胞）の調製は、ケーラーおよびミルシュタインらの方法（Nature, Vol.256, p.495-497, 1975）およびそれに準じる修飾方法に従って行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄または扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞との細胞融合により調製される。
【００５７】
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマP3/X63-AG8.653（653；ATCC No.CRL1580）、P3/NSI/1-Ag4-1（NS-1）、P3/X63-Ag8.U1（P3U1）、SP2/0-Ag14（Sp2/0、Sp2）、PAI、F0またはBW5147、ラット由来ミエローマ210RCY3-Ag.2.3.、ヒト由来ミエローマU-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11またはCEM-T15を使用することができる。
【００５８】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の前述の免疫感作で用いた免疫原に対する反応性を、例えばＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法によって測定することにより行なうことができる。
【００５９】
前記ハイブリドーマは、培地（例：１０％牛胎仔血清を含むＤＭＥＭ）を用いて培養し、その培養液の遠心上清をモノクローナル抗体溶液とすることができる。また、本ハイブリドーマを由来する動物の腹腔に注入することにより、腹水を生成させ、得られた腹水をモノクローナル抗体溶液とすることができる。モノクローナル抗体は、上述のポリクローナル抗体と同様に、単離および／または精製されることが好ましい。
【００６０】
また、キメラ抗体は、例えば「実験医学（臨時増刊号）, Vol.6, No.10, 1988」、特公平3-73280号公報等を、ヒト化抗体は、例えば特表平4-506458号公報、特開昭62-296890号公報等を、ヒト抗体は、例えば「Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997」、「Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994」、特表平4-504365号公報、国際出願公開WO94/25585号公報、「日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年」、「Nature, Vol.368, p.856-859, 1994」、特表平6-500233号公報等を参考にそれぞれ製造することができる。
【００６１】
ファージディスプレイによる抗体作製は、抗体スクリーニング用に作製されたファージライブラリーから、例えば、バイオパニングにより抗原に親和性を有するファージを回収、濃縮することにより、Ｆａｂ等の抗体等を容易に得ることができる。ファージディスプレイによる抗体作製については、「Nature, Vol.348, p.552-554, 1990」、「“Phage display a laboratory manual” In cold spring harbor laboratory press, 2001」、「Antibody Engineering - a Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1996」を参照のこと。
【００６２】
Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂ’は、イムノグロブリンを、蛋白分解酵素であるペプシンまたはパパインで処理することによりそれぞれ製造することができる。Ｆａｂは、Ｆａｂ発現ファージライブラリーを上記ファージディスプレイによる抗体作製法と同様にスクリーニングすることにより、製造することができる。
【００６３】
本発明の抗体は、ＫＩＡＡ１５３０を特異的に認識することができるので、被験試料中のＫＩＡＡ１５３０の検出・定量に使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被験試料および標識化されたＫＩＡＡ１５３０とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたＫＩＡＡ１５３０の割合を測定することを特徴とする被験試料中のＫＩＡＡ１５３０の検出・定量法、および
（ｉｉ）被験試料と、担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された別の本発明の抗体とを、同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することを特徴とする被験試料中のＫＩＡＡ１５３０の検出・定量法を提供する。
【００６４】
上記（ｉｉ）の定量法においては、２種の抗体はＫＩＡＡ１５３０の異なる部分を認識するものであることが望ましい。例えば、一方の抗体がＫＩＡＡ１５３０のＮ端部を認識する抗体であれば、他方の抗体としてＫＩＡＡ１５３０のＣ端部と反応するものを用いることができる。
本発明の抗体を用いるＫＩＡＡ１５３０の検出・定量法は、特に制限されるべきものではなく、被験試料中の抗原量に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体を化学的または物理的手段により検出し得る方法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
【００６５】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質等が用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕等が用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等が用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等が用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−（ストレプト）アビジン系を用いることもできる。
【００６６】
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化・固定化するのに用いられる化学結合を用いてもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロース等の不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。
【００６７】
サンドイッチ法においては不溶化した本発明の抗体に被験試料を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明の抗体を反応させ（２次反応）た後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより被験試料中のＫＩＡＡ１５３０量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序で行っても、また、同時に行ってもよいし、時間をずらして行ってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相化抗体あるいは標識化抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
サンドイッチ法によるＫＩＡＡ１５３０の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明の抗体は、ＫＩＡＡ１５３０の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。例えば、上述のように、２次反応で用いられる抗体が、ＫＩＡＡ１５３０のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体としては、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
【００６８】
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、ＫＩＡＡ１５３０を感度よく検出することができる。
【００６９】
したがって、被験温血動物由来の生体試料（例：皮膚組織、血液、血漿、血清、リンパ液、脳脊髄液、関節液、精液、尿、生検サンプル等）を被験体とし、本発明の抗体を用いて該被験体中のＫＩＡＡ１５３０の有無を調べることによって、ＵＶＳＳを罹患しているか、あるいは将来罹患する可能性が高いか、さらには日焼けを起こしやすい体質であるかどうかを診断することができる。
例えばＫＩＡＡ１５３０が検出されない場合にはＫＩＡＡ１５３０欠損であると認定され、ＵＶＳＳを罹患しているか、あるいは将来罹患する可能性が高いか、さらには日焼けを起こしやすい体質であると判定され得る。
【００７０】
また、本発明の診断剤には、ＫＩＡＡ１５３０をコードする塩基配列もしくはその一部を含む核酸（以下、「本発明のセンス核酸」という場合がある）およびＫＩＡＡ１５３０をコードする塩基配列もしくはその一部に相補的な塩基配列を含む核酸（以下、「本発明のアンチセンス核酸」という場合がある）を含めることができる。これらの核酸をプローブやプライマーとして使用することにより、ヒトまたは他の温血動物（例：ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、トリ等）におけるＫＩＡＡ１５３０をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や機能欠損等の遺伝子診断剤として有用である。
実施例にて後述するが、紫外線感受性症候群におけるＴＣ−ＮＥＲ欠損の回復にはＵＶＳＳＡ遺伝子であるＫＩＡＡ１５３０遺伝子のＶＨＳ領域が重要であるので、かかる領域に対応するＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や機能欠損等を診断することがより好ましい。従って、本発明の診断剤において用いる核酸は、かかる部位を検出し得るものであることが好ましく、その設計は配列に基づき適宜行うことができる。
【００７１】
本発明のセンスまたはアンチセンス核酸を用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法等により実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーション等によりＫＩＡＡ１５３０の発現低下が検出された場合は、例えば、ＫＩＡＡ１５３０の機能不全が関与する疾患に罹患している可能性が高いか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。ＫＩＡＡ１５３０の機能不全が関与する疾患としては、例えば、ＵＶＳＳ等が挙げられる。
【００７２】
［ＮＥＲ欠損を改善する物質のスクリーニング方法］
本発明はまた、ＫＩＡＡ１５３０を産生する能力を有する細胞における該蛋白質（遺伝子）の発現を、試験化合物の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、ＮＥＲ欠損を改善する物質のスクリーニング方法を提供する。
【００７３】
ＫＩＡＡ１５３０の発現量は、前記した本発明のセンス核酸または本発明のアンチセンス核酸（以下、これらを包括して「本発明の核酸」という）を用いて、ＫＩＡＡ１５３０のｍＲＮＡを検出することにより、ＲＮＡレベルで測定することができる。あるいは、該発現量は、前記した本発明の抗体を用いて、ＫＩＡＡ１５３０蛋白質を検出することにより、蛋白質レベルで測定することもできる。
従って、より具体的には、本発明は、
（ａ）ＫＩＡＡ１５３０を産生する能力を有する細胞を試験化合物の存在下および非存在下に培養し、両条件下における該蛋白質をコードするｍＲＮＡの量を、本発明の核酸を用いて測定、比較することを特徴とする、ＮＥＲ欠損を改善する物質のスクリーニング方法、および
（ｂ）ＫＩＡＡ１５３０を産生する能力を有する細胞を試験化合物の存在下および非存在下に培養し、両条件下における該蛋白質の量を、本発明の抗体を用いて測定、比較することを特徴とする、ＮＥＲ欠損を改善する物質のスクリーニング方法を提供する。
【００７４】
ＫＩＡＡ１５３０のｍＲＮＡ量または蛋白質量の測定は、具体的には以下のようにして行うことができる。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例：マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）から採取した細胞を紫外線又は変異原（好適には紫外線）で処理する。
処理後の細胞等に含まれるＫＩＡＡ１５３０  ｍＲＮＡは、例えば、通常の方法により該細胞等からｍＲＮＡを抽出し、例えば、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ等の手法を用いることにより定量することができ、自体公知の手段によりノーザンブロットを行なうことにより解析することもできる。一方、ＫＩＡＡ１５３０蛋白質量は、ウェスタンブロット解析や以下に詳述する各種イムノアッセイ法を用いて定量することができる。
（ｉｉ）ＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドを発現する形質転換体を前述の方法に従って作製し、該形質転換体に含まれるＫＩＡＡ１５３０またはその部分ペプチドあるいはそれをコードするｍＲＮＡを同様にして定量、解析することができる。
【００７５】
試験化合物としては、例えば蛋白質、ペプチド、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿等が挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。
【００７６】
ＫＩＡＡ１５３０の発現量を変化させる物質のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、紫外線や変異原処理を施す一定時間前（３０分前ないし２４時間前、好ましくは３０分前ないし１２時間前、より好ましくは１時間前ないし６時間前）もしくは一定時間後（３０分後ないし３日後、好ましくは１時間後ないし２日後、より好ましくは１時間後ないし２４時間後）、または紫外線や変異原処理を施すと同時に試験化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後ないし３日後、好ましくは１時間後ないし２日後、より好ましくは１時間後ないし２４時間後）、該動物から単離した細胞に含まれるＫＩＡＡ１５３０をコードするｍＲＮＡ量、あるいはＫＩＡＡ１５３０蛋白質量を定量、解析することにより、あるいは
（ｉｉ）形質転換体を常法に従い培養する際に試験化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後ないし７日後、好ましくは１日後ないし３日後、より好ましくは２日後ないし３日後）、該形質転換体に含まれるＫＩＡＡ１５３０をコードするｍＲＮＡ量、あるいはＫＩＡＡ１５３０蛋白質量を定量、解析することにより行うことができる。
【００７７】
上記（ｂ）のスクリーニング方法におけるＫＩＡＡ１５３０蛋白質の量の測定は、具体的には、例えば、
（ｉ）本発明の抗体と、被験試料および標識化されたＫＩＡＡ１５３０蛋白質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された蛋白質を検出することにより該試料中のＫＩＡＡ１５３０蛋白質を定量する方法、
（ｉｉ）被験試料と、担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された別の本発明の抗体とを、同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより、該試料中のＫＩＡＡ１５３０蛋白質を定量する方法等が挙げられる。
具体的な測定は、前記した本発明の抗体を用いた診断剤と同様にして行うことができる。
【００７８】
例えば、上記のスクリーニング方法において、試験化合物の存在下におけるＫＩＡＡ１５３０の発現量が、試験化合物の非存在下における発現量に比べて、約２０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上増大した場合に、該試験化合物を、ＫＩＡＡ１５３０の発現を増強する物質として選択することができる。
【００７９】
［ＮＥＲ欠損の改善剤］
紫外線感受性症候群の原因遺伝子がＫＩＡＡ１５３０遺伝子である、という本発明において得られた知見に基づいて、本発明は、ＮＥＲ欠損の改善剤を提供する。本発明の改善剤は、ＫＩＡＡ１５３０の発現もしくは活性を賦活化する物質を含有してなる。
【００８０】
本発明において「ＫＩＡＡ１５３０の発現もしくは活性を賦活化する物質」は、ＫＩＡＡ１５３０遺伝子の転写レベル、転写後調節のレベル、蛋白質への翻訳レベル、翻訳後修飾のレベル等のいかなる段階で作用するものであってもよい。従って、ＫＩＡＡ１５３０の発現もしくは活性を賦活化する物質としては、例えば、ＫＩＡＡ１５３０蛋白質、ＫＩＡＡ１５３０をコードする核酸、ＫＩＡＡ１５３０に対してアゴニスト活性を示す低分子化合物等が挙げられる。
【００８１】
ＫＩＡＡ１５３０蛋白質及びＫＩＡＡ１５３０をコードする核酸は上述の通りである。ＫＩＡＡ１５３０に対してアゴニスト活性を示す低分子化合物は、上記本発明のスクリーニング方法によって得られる種々の化合物が挙げられる。
【００８２】
これらの物質のＫＩＡＡ１５３０蛋白質の発現もしくは活性を賦活化する作用は、ＫＩＡＡ１５３０遺伝子欠損株、ＫＩＡＡ１５３０遺伝子を欠失させた形質転換体、生体内や生体外のＫＩＡＡ１５３０遺伝子発現系、または生体内や生体外のＫＩＡＡ１５３０蛋白質翻訳系を用いて調べることができる。ＫＩＡＡ１５３０遺伝子を欠失させた形質転換体は、ＫＩＡＡ１５３０遺伝子のｓｉＲＮＡによるＫＩＡＡ１５３０ノックダウン等の手法によって得ることができる。
前記ｓｉＲＮＡは、ＫＩＡＡ１５３０の遺伝子発現抑制に使用するため、ＫＩＡＡ１５３０遺伝子から転写されるｍＲＮＡの分解（ＲＮＡ干渉）を引き起こすようにその塩基配列に基づいて人工的に合成された二本鎖ＲＮＡ、または当該二本鎖ＲＮＡを生体内で供給することのできるベクターをいう。本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ発現ベクターを使用することにより、ＫＩＡＡ１５３０の発現を低下させ、ＵＶ感受性を高めることができる。ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ発現ベクターの構築方法については、公知の方法を使用することができる（Ui-Tei K, et al., Nucleic Acids Res. 2004; 32: 936-948 ; Miyagishi M, and Taira K, Nature biotechnology 2002; 20: 497-500）。ｓｉＲＮＡの長さは、１９〜２７ｂｐが好ましく、２１〜２５ｂｐがより好ましい。
【００８３】
本発明の改善剤は、ＮＥＲ欠損、特にＴＣ−ＮＥＲ欠損を改善するので、ＮＥＲ欠損を伴う疾患の予防・治療剤として用いることができる。ＮＥＲ欠損を伴う疾患としては、例えば紫外線感受性症候群（ＵＶＳＳ）、特に皮膚がんを後発しないような、日焼けを主たる特徴とするようなＵＶＳＳが挙げられる。
本発明の改善剤は日焼けが主たる症状となるＵＶＳＳの原因遺伝子であるＫＩＡＡ１５３０の発現もしくは活性を賦活化する物質を含有するので、ＮＥＲ欠損を伴う疾患の予防・治療剤（以下、本発明の医薬とも称する）や日焼けを防ぐ、いわゆる紫外線防護用の化粧品等として提供され得る。
【００８４】
本発明の改善剤を含有する医薬は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは他の温血動物（例：マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、トリ等）に対して経口的または非経口的（例：血管内投与、皮下投与等）に投与することができる。
【００８５】
本発明の改善剤を医薬として使用する場合、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。例えば、本発明の改善剤として、ＫＩＡＡ１５３０をコードする核酸を用いる場合には、該核酸を、単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター、レンチウイルスベクター等の適当な哺乳動物細胞用の発現ベクターに機能可能な態様で挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記核酸を単独またはリポソーム等の担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下等に投与してもよい。
【００８６】
本発明の改善剤は、それ自体を投与してもよいし、または適当な医薬組成物として投与してもよい。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の改善剤と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
【００８７】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の改善剤を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例：エタノール）、ポリアルコール（例：プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例：ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記アンチセンス核酸を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されてもよい。
【００８８】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
【００８９】
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。本発明の医薬組成物は、例えば、投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇ含有されていることが好ましい。
【００９０】
本発明の改善剤を含有する上記医薬の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルート等によっても異なるが、例えば、成人のＵＶＳＳの治療・予防のために使用する場合には、本発明の改善剤を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
【００９１】
なお、前記した各組成物は、本発明の改善剤との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００９２】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例】
【００９３】
（材料と方法）
１．ヒトでの研究
患者およびコントロール対象のサンプルは機関内での倫理認可を受けて得られたものである（長崎大学ＥＬＳＩ委員会）。
【００９４】
２．エクソーム解析
親族関係にない２名のＵＶＳＳ−Ａ患者（Ｋｐｓ３及びＸＰ２４ＫＯ）のゲノムＤＮＡを断片化し（１５０〜２００ｂｐ）、アダプターをライゲートした。次いで、断片をＰＣＲで増幅し、SureSelect Human All Exon Kit (Agilent Technologies)を用いて濃縮した。捕捉されたゲノム断片についてIllumina GAII sequencerで配列解析した。各サンプルについて、１レーン、75bp pair-end readsで行った。
【００９５】
３．バイオインフォマティック解析
解読した配列をｈｇ１８リファレンスゲノムにＭＡＱソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ  ０．７．１）(http://maq.sourceforge.net/)を用いてアラインした。一塩基変異（ＳＮＶｓ）及びsmall insertion deletions（ｉｎｄｅｌｓ）をＮＡＱによって同定した。read coverage ＜８×及びphred-like consensus quality ＜２０を有する全てのベースコールをフィルタリングアウトした。アラインしたデータをｄｂＳＮＰ１３０、1000 Genomes SNP calls (March 2010)、及び自家データベースと比較して、ＡＮＮＯＶＡＲソフトウェア(http://www.openbioinformatics.org/annovar/)を用いて、新規なＳＮＶｓ及びｉｎｄｅｌｓを拾い出した。ｃＳＮＰｓにおける注釈は、ＮＣＢＩ及びＵＣＳＣデータベースに基づいたものであり、非同義ＳＮＰｓについてのＳＩＦＴ予測で補足した。
【００９６】
４．ＲＯＨ解析
ＵＶＳＳ−Ａ患者の全ゲノムＳＮＰ遺伝子型決定をGenome-Wide Human SNP Array 6.0 (Affymetrix)を用いて行った。遺伝子型データをGenotyping Console 4.0 (Affymetrix)から作成した。ホモ接合性マッピング及びコピー数の解析はPartek Genomics Suite v6.5 (Partek)を用いて行った。同定されたＳＮＰのゲノム位置はヒトゲノム（ｈｇ１８）に基づいている。
【００９７】
５．高解像度融解曲線解析（ＨＲＭＡ）
親族関係にない５７６人のコントロール対象（日本人）についてＫＩＡＡ１５３０のエクソン２及びエクソン３のＨＲＭＡを行い、ＵＶＳＳ−Ａ患者で同定されたstop-gain ＳＮＶである、ｐ．Ｋ１２３Ｘ及びｐ．Ｉ３１ＦｆｓＸ９のアレル頻度を求めた。ＨＲＭＡプロファイルをLightCycler 480 Real-Time PCR system (Roche)により回収した。融解曲線はLightCycler 480 Gene Scanning software (Roche)により解析した。
【００９８】
６．ＲＲＳアッセイ
既報に従って行った（特許文献１、非特許文献７参照）。細胞をプラスチック製の９６ウェルプレートに播種した。ｓｉＲＮＡトランスフェクション又はウイルス感染を行い、４８時間後にアッセイを行った。細胞にＵＶ照射（１０Ｊ／ｍ２、２５４ｎｍ  ＵＶＣ）し、ＲＮＡ合成回復の為に１２時間インキュベートした。ＲＲＳレベルは蛍光標識したエチニルウリジン（ＥＵ）取り込みアッセイによって測定した。回収した細胞を５−ＥＵ（１００μＭ）含有培養液中で２時間インキュベートし、蛍光アジド（Alexa Fluor 488-azide）を用いてＥＵを検出した。蛍光像とそのデータ処理はIn-Cell-Analyzerシステム（GE）を用いて行った。
【００９９】
７．ＵＤＳアッセイ
既報に従って行った（特許文献１、非特許文献７参照）。細胞をプラスチック製の９６ウェルプレートに播種した。ｓｉＲＮＡトランスフェクション又はウイルス感染を行い、７２時間後にアッセイを行った。ＵＤＳレベルは蛍光標識したエチニルデオキシウリジン（ＥｄＵ）取り込みアッセイによって測定した。細胞にＵＶ照射（２０Ｊ／ｍ２、２５４ｎｍ  ＵＶＣ）し、４時間インキュベートした。回収した細胞を５−ＥｄＵ（１００μＭ）含有培養液中で２時間インキュベートし、蛍光アジド（Alexa Fluor 488-azide）を用いてＥｄＵを検出した。蛍光像とそのデータ処理はIn-Cell-Analyzerシステム（GE）を用いて行った。
【０１００】
８．共免疫沈降
ＫＩＡＡ１５３０蛋白質とＴＣ−ＮＥＲ要素との相互作用を調べる為に、Ｖ５タグされたＫＩＡＡ１５３０ｃＤＮＡ発現プラスミド（野生型、Ｗ１２０Ａ変異体、ＶＨＳドメインのトランケーション変異体）で２９３細胞をトランスフェクトし、次いで２４時間インキュベートした。全細胞ライセートをCelLytic Nuclear Extraction Kit (Sigma)を用いて調製した。共免疫沈降を、ウサギ抗Ｖ５抗体をコンジュゲートしたアガロースビーズ（MBL）を用いて行った。
【０１０１】
９．イムノブロッティング
全細胞ライセート（ＣＬ）及び免疫沈降したサンプル（ＩＰ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５〜２０％勾配ゲル）で展開した。展開した蛋白質サンプルをＰＶＤＦ膜に転写して免疫検出した。
【０１０２】
１０．抗体
本実施例では以下の抗体を用いた。
・抗ＫＩＡＡ１５３０抗体（ウサギポリクローナル抗体）：ヒトＫＩＡＡ１５３０蛋白質のＮ末端ＶＨＳドメインに対する抗体
・抗ＫＩＡＡ１５３０抗体（マウスポリクローナル抗体）：ヒトＫＩＡＡ１５３０蛋白質の全長に対する抗体
・抗Ｖ５タグ抗体（マウスモノクローナル抗体）：１Ｈ６（MBL）
・抗Ｖ５タグ抗体（ウサギポリクローナル抗体）：ＰＭ００３（MBL）
・抗ｐ８９／ＸＰＢ抗体（マウスモノクローナル抗体）：ＡＢ３（CRUK）
・抗ｐ８９／ＸＰＢ抗体（ウサギポリクローナル抗体）：Ｓ−１９（Santa Cruz）
・抗ＸＰＤ抗体（マウスモノクローナル抗体）：２Ｆ６（CRUK）
・抗ｐ６２抗体（マウスモノクローナル抗体）：Ｇ１０（Santa Cruz）
・抗ｃｄｋ７抗体（マウスモノクローナル抗体）：ＭＯ１（MBL）
・抗ＭＡＴ１抗体（ウサギポリクローナル抗体）：ＦＬ−３０９（Santa Cruz）
・抗ｃｙｃｌｉｎ  Ｈ抗体（マウスモノクローナル抗体）：１Ｂ８（Abnova）
・抗ＣＳＢ抗体（マウスモノクローナル抗体）：５５３Ｃ５ａ（BMR）
・抗ＸＡＢ２抗体（マウスモノクローナル抗体）：５−１７（Santa Cruz）
・抗ＸＰＧ抗体（マウスモノクローナル抗体）：８Ｈ７（CRUK）
・抗ＲＮＡポリメラーゼＩＩラージサブユニットＣ末端ドメイン（Ｓｅｒ−２リン酸化）（マウスモノクローナル抗体）：Ｈ５（Covance）
【０１０３】
１１．ＵＶ照射後のＲＮＡポリメラーゼＩＩの伸長型の検出
細胞を１００μＭのシクロヘキシミド（ＣＨＸ）を含有する培地中で１時間培養した後、ＵＶ照射した。細胞に１０Ｊ／ｍ２のＵＶＣを照射し、次いで、ＣＨＸ含有培地中で所定時間インキュベートした。全細胞ライセートを６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開しＰＶＤＦ膜に転写した。伸長モードにあるＲＮＡポリメラーゼＩＩは、Ｈ５抗体によって検出した。
【０１０４】
１２．細胞及び培養
本実施例では以下の細胞を用いた。
・４８ＢＲ及び１ＢＲ：正常なヒトの初代線維芽細胞
・Ｋｐｓ２、Ｋｐｓ３、ＸＰ２４ＫＯ、ＵＶＳＳ２４ＴＡ：ＵＶＳＳ−Ａ患者由来の初代線維芽細胞
・ＵＶＳ１ＫＯ：ＵＶＳＳ／ＣＳ−Ｂ患者由来の初代線維芽細胞
・ＣＳ２ＡＷ：ＣＳ−Ａ患者由来の初代線維芽細胞
・ＣＳ１０ＬＯ：ＣＳ−Ｂ患者由来の初代線維芽細胞
・ＸＰ１５ＢＲ：ＸＰ−Ａ患者由来の初代線維芽細胞
・２９３Ｔ及び２９３ＦＴ：ヒト胚性腎ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系
特に断りのない限り、いずれの細胞も、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Hyclone）及び抗生物質を補充したＤＭＥＭ（WAKO）中で維持した。
【０１０５】
１３．ＲＮＡ干渉
ＫＩＡＡ１５３０及びＸＰＡをターゲッティングするｓｉＲＮＡオリゴ（Nippon EGTにて作製）を準備した。各遺伝子について３つの異なるｓiＲＮＡオリゴを設計した。特に断りのない限り、それら３つのｓｉＲＮＡオリゴの混合物を実験には用いた。ｓｉＲＮＡトランスフェクションはX-tremeGENE（Roche）トランスフェクション試薬を用い、マニュアルに従って行った。典型的な実験では、５ｎＭのｓｉＲＮＡオリゴを懸濁液中でトランスフェクトし、続いて最初のトランスフェクションの２４時間後にもう一度トランスフェクトした。最初にｓｉＲＮＡトランスフェクションをしてから７２時間後に実験を行った。ノックダウン効率はウェスタンブロットによって行った。
【０１０６】
１４．レンチウイルスの作製
ヒトＫＩＡＡ１５３０ｃＤＮＡをｃ末端にＶ５タグを有したフレームで、pLenti6/V5-D-TOPO（Invitrogen）にクローニングし、pLenti6/KIAA1530-V5を作成した。同様にしてトランケーション変異体やアミノ酸置換変異体も作成した。レンチウイルスを産生させるには、２９３ＦＴ細胞をpLP1、pLP2及びPLP/VSVGを含有するViraPower Packaging Mix（Invitrogen）とともにＫＩＡＡ１５３０プラスミドでリポフェクトアミン２０００（Invitrogen）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間でウイルス粒子を回収し、PEG-it Virus Precipitation Solution （System Biosciences）を用いて濃縮した。
【０１０７】
実施例１：ＵＶＳＳ−Ａ患者におけるＫＩＡＡ１５３０遺伝子のトランケーション変異体の特徴づけ
親族関係にない２名のＵＶＳＳ−Ａ患者（Ｋｐｓ３及びＸＰ２４ＫＯ）の全エクソームの配列決定を、Agilent SureSelect Target Enrichment System及びIllumina GAIIx sequencerを用いて行った（Ｋｐｓ３及びＸＰ２４ＫＯの両方において、平均５４倍のカバレージを達成し、ターゲット塩基の９５％を４回以上測定した）。各患者について６万を超えるＳＮＶｓ及びＩｎｄｅｌｓが同定された。さらにフィルタリングを繰り返した結果、新規且つ機能的に顕著なＳＮＶｓ及びＩｎｄｅｌｓを見出した。患者間で共通している、潜在的な機能欠損(loss-of-function)を有する１２遺伝子を同定した（表１）。
【０１０８】
【表１】
0005800180.tif 000002
【０１０９】
Ｃｈｒ；クロモソーム（染色体）、ＳＮＶ；一塩基変異、ｈｏｍ；アレルに対してホモ接合性、ｈｅｔ；アレルに対してヘテロ接合性
Ｋｐｓ３及びＸＰ２４ＫＯで共通している変異体は、ｄｂＳＮＰ１３０、1000 Genomes SNP calls (March 2010)、及び６例（日本人）の自家エクソームデータには存在しなかった。
マッピングを精密化し、適当なフィルタリング方法と組み合わせてアッセンブリすることにより、染色体４ｐ１６に位置し、７０９アミノ酸をコードするＫＩＡＡ１５３０（ＮＭ＿０２０８９４）を同定した。かかる遺伝子のＵＶＳＳＡ遺伝子の第一候補としての機能は知られていない。両患者のゲノムはエクソン３にホモ接合ｃ．３６７Ａ＞Ｔ変異を有し、中途終止となるｐ．Ｌｙｓ１２３Ｘをもたらした（図１ａ〜ｃ）。
続いて、本発明者らは、４名のＵＶＳＳ−Ａ患者全てのＫＩＡＡ１５３０遺伝子の全１４エクソンについてＰＣＲを用いたキャピラリー内でのサンガー配列決定法を実施した。結果、本発明者らは、さらに、Ｋｐｓ２とＫｐｓ３の兄弟（姉妹）に同じホモ接合変異を認め、さらにエクソン２に別の新規なホモ接合ｃ．８７ｄｅｌＧフレームシフト変異を認めた。かかる変異は親族関係にないイスラエル人の患者（ＵＶＳ２４ＴＡ）において中途終止となるｐ．Ｉｌｅ３１ＰｈｅｆｓＸ９をもたらした（図１ｂ及びｃ）。ＵＶＳ２４ＴＡは、ＵＤＳ活性は正常であるが、生存レベル及びＲＲＳ活性は顕著に低下（減少）するという、ＵＶＳＳの細胞に典型的な表現型を示す。直接的な配列決定又は高分解融解曲線解析（ＨＲＭＡ）によって評価したところ、ヘテロ接合ｐ．Ｌｙｓ１２３Ｘ変異は、５７６名の親族関係にないコントロール対象のうち、一名に（アレル頻度０．０９％）観察された。一方、ｐ．Ｉｌｅ３１ＰｈｅｆｓＸ９変異はこれらのコントロール対象からは検出されなかった。Ｋｐｓ２及びＫｐｓ３の両親には臨床的徴候は認められなかったので、ＫＩＡＡ１５３０に対するハプロ不全はほとんど問題にならないと考えられる。
ＫＩＡＡ１５３０遺伝子のゲノム構造及びＵＶＳＳ−Ａ患者における変異（ｐ．Ｌｙｓ１２３Ｘ、ｐ．Ｉｌｅ３１ＰｈｅｆｓＸ９）の位置を図１ｄに示す。
いずれの患者にも、２つの非同義一塩基多型（ＳＮＰ）（Ｒ３９１Ｈ、ｒｓ２２７６９０４；Ｐ６２０Ｌ、ｒｓ７７７３１３０９）以外のさらなる一塩基変異（ＳＮＶ）も挿入も欠失（ｉｎｄｅｌ）も認められなかった。同定された変異及びエクソンをコードするＫＩＡＡ１５３０遺伝子の残りの部分について全ての患者が同型であったので患者のうち何名かは近親結婚の末に生まれたものと推測した。本発明者らは、患者間で共通しているホモ接合領域（ＲＯＨ）（＞１．０Ｍｂｐｓ）を同定するために全ゲノムＳＮＰ遺伝子型決定を行った。患者のエクソーム配列決定データの同型接合性と合致して、本発明者らは常染色体上に９つの重複するＲＯＨを同定し、そのうちの１つにＫＩＡＡ１５３０遺伝子座が含まれていた（図１ｅ、表２及び３）。
【０１１０】
【表２】
0005800180.tif 000003
【０１１１】
【表３】
0005800180.tif 000004
【０１１２】
染色体コピー数多型がＫＩＡＡ１５３０遺伝子座に検出された（データ示さず）。ＵＶＳＳ−Ａ患者では、８０ｋＤａ程度のＫＩＡＡ１５３０遺伝子産物をイムノブロッティングによって検出することはできなかった（図１ｆ）。
【０１１３】
実施例２：ＵＶＣ照射後のＲＮＡ合成の回復におけるＫＩＡＡ１５３０遺伝子の有用性
実施例１の結果はＵＶＳＳ−Ａ患者におけるＫＩＡＡ１５３０遺伝子の停止変異がこの疾患の原因であることを強く示唆している。そこで、さらなる証拠を得るために、ＵＶＳＳ−Ａ患者の細胞、ＫＩＡＡ１５３０が発現していない正常な細胞、及び異所性にＫＩＡＡ１５３０ｃＤＮＡを発現しているＵＶＳＳ−Ａ患者の細胞を用いてＮＥＲ活性を調べた（図２）。
ＮＥＲには２つのサブパスウェイが存在する。１つはゲノム全体の修復（ＧＧＲ）であり、ダメージを受けたＤＮＡの除去が比較的遅い工程である。もう１つは、転写共役修復（ＴＣＲ）であり、活発に転写される遺伝子の転写された鎖上で排他的に排除される迅速な工程である。ＧＧＲはＮＥＲ活性のおよそ９０％を占め、非Ｓ期の修復ＤＮＡ合成である「不定期ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）」の程度を測定することによって評価することができる。ＸＰやＣＳを併発しているＸＰ（ＸＰ／ＣＳ）患者の多くはＧＧＲを欠いている。対照的に、ＵＶＳＳ患者とＣＳのみの患者（ＣＳ−Ａ、ＣＳ−Ｂ）では、ＧＧＲ活性はほぼ正常であるが、ＴＣＲが著しく損なわれている。未修復のＤＮＡ損傷はＲＮＡポリメラーゼの進行を妨害するので、ＤＮＡ損傷後のＲＮＡ合成のレベルは低下する。ＴＣＲ活性は、ＵＶ照射後の「ＲＮＡ合成の回復（ＲＲＳ）」率により評価することができる。ＵＤＳ及びＲＲＳを本発明者らが最近開発した迅速且つ非放射性のシステム（特許文献１参照）で測定した。結果、全てのＵＶＳＳ−Ａ患者の細胞及びＲＲＳを欠いたコントロール対象となるＣＳ患者の細胞では、ＵＶ照射後にＲＲＳ率の低下が認められ（図２ａ）、一方ＵＤＳレベルはかなり正常に維持されていた（図２ｂ）。そこで、本発明者らは、正常なヒト初代線維芽細胞においてｓｉＲＮＡを用いたノックダウンによりＫＩＡＡ１５３０遺伝子発現の排除効果を調べた。ＫＩＡＡ１５３０ノックダウン細胞におけるＲＲＳレベルはＸＰＡノックダウン細胞と同程度に低かった（図２ｃ、ｇ）。一方、同じＫＩＡＡ１５３０ノックダウン細胞でもＵＤＳレベルの顕著な低減は観察されなかった（図２ｄ）。ノックダウン効率はイムノブロットにより確認した（図２ｅ）。ＵＶＳＳ−Ａ患者の細胞においてＫＩＡＡ１５３０ｃＤＮＡの異所性に発現させると、ＲＲＳは正常な状態に戻った（図２ｆ）。正常な細胞、あるいはＣＳ細胞にＫＩＡＡ１５３０を発現させてもそれらのＲＲＳレベルに影響はなかった。以上の結果より、ＫＩＡＡ１５３０がＵＶＳＳＡであり、ＵＶＳＳ−Ａの原因遺伝子であることが示された。
【０１１４】
実施例３：Ｎ末端のＶＨＳドメインはＫＩＡＡ１５３０蛋白質に必須である
ＫＩＡＡ１５３０蛋白質の役割を研究するため、まず、ＫＩＡＡ１５３０のＴＣ−ＮＥＲファクターとの関連性を調べた。Ｖ５−タグされたＫＩＡＡ１５３０蛋白質を免疫沈降し、各ファクターとの相互作用をイムノブロットを用いて調べた。ＫＩＡＡ１５３０は、ｃｏｒｅ−ＴＦＩＩＨ複合体の幾つかのサブユニット（ＸＰＢ、ＸＰＤ、ｐ６２）、ＣＡＫ複合体の幾つかのサブユニット（ｃｄｋ７、ｃｙｃｌｉｎ  Ｈ、ＭＡＴ１）、コケーン症候群タンパク質（ＣＳＢ）、及びＸＰＡ結合蛋白質（ＸＡＢ２）と相互作用したが、ＸＰＧに対しては明確な相互作用は認められなかった（図３ａ）。ＵＶ照射によって相互作用に顕著な変化は生じなかった。以上の結果より、ＫＩＡＡ１５３０が、ＴＦＩＩＨ／ＣＡＫ複合体と関連した新規なＴＣ−ＮＥＲファクターであることが示唆された。さらに、免疫沈降物の質量分析によって多機能シャペロン／シャトルタンパク質（該タンパク質はまた、ＤＮＡ修復の制御においても機能する）であるヌクレオフォスミン２３を同定した。
ヒトＫＩＡＡ１５３０のアミノ酸配列及びそのオルソログに、他のタンパク質ファミリーとの顕著な相同性はない。ＫＩＡＡ１５３０ファミリータンパク質に保存されている、機能が不明なドメインＤＵＦ２０４３（IPR018610, EMBL-EBI database）は、ＫＩＡＡ１５３０タンパク質のＣ末端に位置している。ＫＩＡＡ１５３０タンパク質の他の潜在的に機能性を有するモチーフを同定するために、ＰＨＹＲＥプログラムを用いて３Ｄ構造データベースをスクリーニングすることによって３次元構造予測を行った。ＶＨＳ（Ｖｐｓ−２７、Ｈｒｓ、ａｎｄ  ＳＴＡＭ）ドメインの３Ｄ構造と顕著な相同性を有する、ＫＩＡＡ１５３０タンパク質のＮ末端に位置する１４３〜１６３個のアミノ酸のモチーフを同定した。ＶＨＳは、ユビキチン結合及び一般的な細胞内膜輸送に関与していることが近年明らかになっている。同様のＶＨＳドメインがＲＮＡポリメラーゼＩＩラージサブユニットのＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）にも同定されている。これら２つのドメインのＴＣ−ＮＥＲにおける重要性を調べるために、トランケーション変異体をＵＶＳＳ−Ａ細胞に導入し、ＲＲＳ相補性をアッセイした（図３ｂ）。ＶＨＳドメインあるいはＤＵＦ２０４３のいずれかを欠いた切断変異体では、ＵＶＳＳ−Ａ患者由来細胞のＲＲＳ活性を回復させることはできなかった（図３ｃ）。次に、ヒト〜線虫で保存されている残基（ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアラインメントにより予測）を変異させ（図３ｄ）、ＵＶＳＳ−Ａ細胞でＲＲＳ欠損を相補できない変異体をスクリーニングした。１８ある変異体のうち、Ｗ１２０Ａ及びＲ１５７Ｋ１５８Ｒ１５９ＥＥＥの２つ（両変異体とも変異位置がＶＨＳドメイン中に存在する）のみが、ＲＲＳ活性を回復することができなかった。一方、変異位置がＤＵＦ２０４３ドメイン中に存在する変異体や、潜在的な核局在シグナル（ＮＬＳ）変異体（Ｒ３７６Ｋ３７７ＡＡ、Ｒ６８３Ｒ６８４ＡＡ、及びＫ６９５Ｋ６９６ＶＡ）等の他の全ての変異体はＲＲＳ活性を回復した（図３ｅ）。これらの知見は、ＫＩＡＡ１５３０蛋白質のＶＨＳドメインがＴＣ−ＮＥＲ活性に極めて重要であるということを示している。本発明者らは、ＶＨＳドメイン変異体（Ｗ１２０Ａ）についてｃｏｒｅ−ＴＦＩＩＨ構成要素（ＸＰＢ、ＸＰＤ）との相互作用における効果を調べた。変異体蛋白質はＴＦＩＩＨとの相互作用を保持していた。このことは、ＶＨＳドメインの機能がＴＦＩＩＨ複合体との相互作用とは異なることを示唆している（図４）。
【０１１５】
実施例４：コケーン症候群（ＣＳ）患者におけるＫＩＡＡ１５３０遺伝子における変異
最近の研究で、コケーン症候群におけるＵＶＳＳの原因となる変異が同定された。ＣＳＢ遺伝子において、２例（ＵＶＳ１ＫＯ及びＣＳ３ＡＭ）は、同じホモ接合性の停止変異（ｃ．３０８Ｃ＞Ｔ）を有していた。この変異により１４０ＫＤａのＣＳＢタンパク質のＮ末端付近で幾つかの切断が起こる（ｐ．Ａｒｇ７７Ｘ）。このことは、ＣＳＢ遺伝子における他の変異がより深刻なＣＳの特徴を引き起こし得るにもかかわらず、ＣＳＢタンパク質のヌル変異を有する個体は、ＵＶＳＳの徴候を有し得ることを示している。ＣＳＡ遺伝子にホモ接合性変異を有する別の例（ｃ．１０８３Ｘ＞Ｘ）では、４０ＫＤａのＣＳＡタンパク質のＣ末端にミスセンスの変化（ｐ．Ｔｒｐ３６１Ｃｙｓ）をもたらす。
これらの知見より、ＫＩＡＡ１５３０蛋白質の中ほど、あるいはＣ末端部分で起こる有害なアミノ酸置換、あるいは切断変異がＵＶＳＳよりもより深刻な臨床上の徴候を示す疾患を引き起こすかもしれないと考えた。この可能性を確かめる為に、本発明者らは、まだその相補群が割り当てられていない６１名のコケーン症候群の患者のＫＩＡＡ１５３０遺伝子のコーディングエキソンの配列決定を行った。
【０１１６】
【表４】
0005800180.tif 000005
【０１１７】
どの患者においても、ＫＩＡＡ１５３０遺伝子においてホモ接合性のアミノ酸変化も複合ヘテロ接合性の新規なアミノ酸変化も観察されなかった。しかしながら、６１名のＣＳ患者のうち４名に新規なヘテロ接合性のアミノ酸変化が確認された。これらの変化及びＳＮＰ（Ｒ３９１Ｈ及びＰ６２０Ｌ、及び新しい変化でＲ３３０Ｈ）の効果を、コントロール個体及びＵＶＳＳ−Ａ個体の細胞で調べた。ＲＲＳ活性に影響するアミノ酸変化はなかった（図３ｆ）。
総合すれば、これらの結果は、ＫＩＡＡ１５３０蛋白質における変異がＣＳの臨床所見をもたらすわけではなさそうであり、ＣＳＡ／ＣＳＢ又はＸＰＢ／ＸＰＤ／ＸＰＧの機能とは異なる（しかし重複する）機能を暗示している。重要なことは、６１名のＣＳ患者由来の細胞をスクリーニングしたところ、ＣＳＡ遺伝子、ＣＳＢ遺伝子、あるいはＫＩＡＡ１５３０遺伝子に原因変異を有さない患者が５名いたことであり（データ示さず）、このことは、ＴＣＲにかかわるさらに１以上の遺伝子がまだ発見されずに残っている可能性を暗示している。
【０１１８】
実施例５：ＲＮＡポリメラーゼに対するＫＩＡＡ１５３０の役割
ＫＩＡＡ１５３０の、ＮＥＲ機構におけるＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡｐｏｌＩＩ）の作用にどのような役割を有するのか調べた。ＮＥＲの過程で、伸長型のＲＮＡｐｏｌＩＩがユビキチン化されることが知られているので、正常な細胞、ＣＳ患者由来の細胞、及びＵＶＳＳ患者由来の細胞におけるＵＶ照射後のＲＮＡポリメラーゼＩＩの動態を比較した（図３ｇ）。ＵＶ照射後は、新しいＲＮＡｐｏｌＩＩ分子が合成されるのを阻害するためにシクロヘキシミドを培地中に添加した。正常細胞とＣＳＢに変異を有するＵＶＳＳ細胞では、ＵＶ照射後、ＲＮＡｐｏｌＩＩはユビキチン化され、ユビキチン化ＲＮＡｐｏｌＩＩのバンドが次第に減少した。一方、ＫＩＡ１５３０を欠損するＵＶＳＳ細胞では、ユビキチン化ＲＮＡｐｏｌＩＩは殆ど検出されず、ユビキチン化されていないＲＮＡｐｏｌＩＩ自体も６時間にわたって次第に減少していった（ＣＳ−Ｂ細胞ではこのような減少は観察されなかった）。
これらの結果よりＫＩＡＡ１５３０は、ＵＶ損傷を受けた部位でのＲＮＡポリメラーゼ分子の働きに重要な役割を担っていることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
日焼けの原因遺伝子が解明できたことにより、紫外線感受性症候群のような日焼けが症状として出る疾病の診断や日焼け予防薬のスクリーニングが可能になる。また、ＮＥＲ機構の解明の有力なツールを提供することができる。
【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ｃ】
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【図３ｆ】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図２ｇ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｇ】
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【図４】
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【配列表】
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