(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
0005759448.tif 000012
の化合物、そのヒドロキシ酸形態、上記ヒドロキシ酸の薬学上許容可能な塩、並びに該化合物およびそのヒドロキシ酸形態の薬学上許容可能な溶媒和物。
【請求項２】
請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物および／またはそのヒドロキシ酸形態および／または上記ヒドロキシ酸の薬学上許容可能な塩および／または該化合物もしくはそのヒドロキシ酸形態の薬学上許容可能な溶媒和物と、少なくとも１種類の薬学上許容可能なアジュバント、キャリヤーおよび／またはビヒクルとを含んでなる、医薬組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸形態または上記ヒドロキシ酸の薬学上許容可能な塩および／または該化合物もしくはそのヒドロキシ酸形態の薬学上許容可能な溶媒和物を含んでなる、医薬組成物。
【請求項４】
ａ．    神経変性疾患、
ｂ．    認知衰退、
ｃ．    望ましくない酸化に関連した疾患、
ｄ．    年齢に関連した病理過程および早老症、
ｅ．    癲癇、癲癇発作および痙攣、
ｆ．    循環器疾患、または
ｇ．    真菌またはウイルス感染症
の予防および／または治療に使用するための、請求項２または３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
循環器疾患が、アテローム性動脈硬化症、心房細動、脂質異常症（ｄｙｓｌｉｐｅｍｉａ）、高コレステロール血症、高脂血症または高トリグリセリド血症から選択される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
神経変性疾患が、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または多発性硬化症である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
薬剤の製造における、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸形態、上記ヒドロキシ酸の薬学上許容可能な塩および／または該化合物もしくはそのヒドロキシ酸形態の薬学上許容可能な溶媒和物の使用。
【請求項８】
該薬剤を、
ａ．神経変性疾患、
ｂ．認知衰退、
ｃ．望ましくない酸化に関連した疾患、
ｄ．年齢に関連した病理過程および早老症、
ｅ．癲癇、癲癇発作および痙攣、
ｆ．循環器疾患、または
ｇ．真菌またはウイルス感染症
の予防および／または治療に用いる、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
循環器疾患が、アテローム性動脈硬化症、心房細動、脂質異常症、高コレステロール血症、高脂血症または高トリグリセリド血症から選択される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
セラジン−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現を増加するために使用するための、請求項２または３に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
セラジン−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子に関係する疾患の予防および／または治療のために使用するための、請求項２または３に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
神経変性疾患に関連した神経細胞死、望ましくない酸化に関連した疾患または年齢に関連した病理過程を予防しおよび／または治療する、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
セラジン−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現を増加させる薬剤の製造における、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸形態、上記ヒドロキシ酸の薬学上許容可能な塩および／または該化合物もしくはそのヒドロキシ酸形態の薬学上許容可能な溶媒和物の使用。
【請求項１４】
セラジン−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子に関連した疾患の予防および／または治療のための薬剤の製造における、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸形態、上記ヒドロキシ酸の薬学上許容可能な塩および／または該化合物もしくはそのヒドロキシ酸形態の薬学上許容可能な溶媒和物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、神経変性疾患または望ましくない酸化に関連した疾患または年齢に関連した病理過程の予防および／または治療、並びに癲癇、癲癇発作または痙攣の予防および／または治療、脂質異常症（ｄｙｓｌｉｐｅｍｉａ）および循環器疾患の予防のためのＬＤＬコレステロールレベルの減少、および酵素３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼの阻害に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
神経変性疾患や年齢に関連した疾患の発生率が高いことは、世界的な最重要問題である。従って、上記疾患を緩和しまたは予防する神経保護化合物を検索する必要がある。それら総ての疾患の中、アルツハイマー病（ＡＤ）は最も流行しているものであり、８１百万人が２０４０年にこの疾患に罹ると予測されている（Blennow et al., Lancet 2006; 368: 387-403）。スペインだけでも、現在５０万人がＡＤに罹っていると推定されている。この疾患に関連した費用は比較的高く、アルツハイマー病患者の看護に由来する総費用は、米国および英国でそれぞれ８１，０００および２２，０００百万ユーロであると計算されている。この疾患を予防しまたは進行を遅らせる有効な薬剤は現在のところはないので、神経細胞の損傷を防止する新規な神経保護化合物を求めて検証する必要がある。
【０００３】
現在用いられている薬剤は患者にとってほとんど利益とならないことが分かっているので、新規な化合物を得るために様々な方策が現在続けられている。これらの薬剤は、病気の症状を一時的に遅らせる（せいぜい１年）が、その進展は防止しない。現在用いられている治療オプションは、ドネペジル、ガランタミンまたはリバスチグミンのような薬剤によるアセチルコリンエステラーゼの阻害、またはグルタメート受容体であるＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）に拮抗するメマンチンの能力に基づいている。
【０００４】
これらの薬剤ではかんばしい成功が見られなかったため、新たな研究の道筋が開かれており、中でも、治療薬としての３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼ（ＨＭＧＲ）酵素（スタチン類として知られる）の阻害薬の研究が、近年際立っている。ＨＭＧＲは、コレステロール生合成の限定的段階を触媒する酵素であり、従って、スタチン類によるその阻害は低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に関連した高コレステロールレベルを減少させる通常の治療法である。これらの薬剤は心筋梗塞や冠状動脈死の危険性を減少させ、安全であると考えられている。更に、高コレステロール血症（高血中コレステロールレベルと定義される）は、アテローム性動脈硬化症のような虚血性循環器疾患の主要な危険因子である。
【０００５】
コレステロール代謝に影響を及ぼすいくつかの遺伝および環境因子は、ＡＤと関連している。例えば、アポリポタンパク質Ｅε４（ａｐｏＥ４）アイソフォームはＡＤの危険因子であり、コレステロールレベルの増加に関連している。主要危険因子として高コレステロール血症を有するアテローム性動脈硬化症も、ＡＤと関連していると思われる。更に、疫学的研究は、高血清コレステロールレベルはＡＤの危険性を増加させ、コレステロール代謝のホメオスタシス調節がアルツハイマー病では変更される可能性があることが提案されている。一方、スタチン類を投与された患者におけるアルツハイマー病の危険性は有意に減少することが、報告されている。これら総ての研究は、コレステロールレベルを減少することによって、アルツハイマー病の発症を阻害することができることを、共同して示唆している（Cole & Vassar; Neurobiol Dis 2006; 22[2]:209-22）。
【０００６】
コレステロールは、様々な種類のリポタンパク質によって血液中を輸送され、主要なコレステロールキャリヤーは低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）である。ＬＤＬは、コレステロールとトリグリセリドを肝臓から末梢組織への輸送に専門化したリポタンパク質であり、それらは、細胞膜のＬＤＬ受容体（ＬＤＬ−Ｒ）を介して細胞によって取り込まれる。ＬＤＬはコレステロール合成も調節し、高ＬＤＬコレステロールレベルは、循環器疾患（ＣＶＤ）に罹る危険性に結びつけられている。次に、ＨＤＬは、コレステロールを様々な組織から肝臓へ輸送するリポタンパク質である。ＨＤＬはコレステロールを動脈から除去して、これを肝臓に運び戻して排出することができるという事実により、それらは、循環器疾患に対して保護的役割を与えられている。ＨＭＧＲ阻害薬は、歴史的に最も有効な抗高脂血症薬であり、ＨＤＬコレステロールレベルを変化させることなくＬＤＬコレステロールレベルの減少に基づく総コレステロールレベルを減少させることができる。
【０００７】
スタチン類の新規な特性が最近報告されており、特に外傷によって引き起こされまたは痴呆における脳損傷のレベルにおいて、新たな酸化防止剤および抗炎症性活性が提案されており（Pahan, Cell Mol Life Sci. 2006; 63[10]:1165-78）、ある種のスタチン類（例えば、シンバスタチン）は、マウスにおける学習および記憶能力を強化し（Ling et al., Ann Neurol. 2006; 60[6]:729-39）、または癲癇徴候に関連した痙攣性発作から保護する（Lee et al., Neurosci Lett. 2008; 440: 260-4）ことが立証されている。更に、スタチン類はまた、フェーズ２臨床試験においてそれらの有効性を証明しており、大脳血管攣縮の治療（Fandino et al., Neurocirugia. 2007; 18: 16-27）、並びに網膜の虚血性損傷によって引き起こされる神経細胞死（Honjo et al., Arch. Ophthalmol. 2002; 120: 1707-13）に対して明確な結果を示唆している。それにも拘わらず、様々な市販のスタチン類（例えば、アトルバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチンなど）の神経保護効果は脂質代謝に対する直接効果によるものであるかどうか、または対照的に、それらは代替経路の結果であるかどうかが現在論議されている。
【０００８】
特許出願ＷＯ９９／１１２５８号明細書には、本発明の化合物と同様な構造を有する化合物が記載されている。しかしながら、この文献には、この化合物に存在する様々な不斉中心の立体配置が詳細に記載されていない。
【発明の概要】
【０００９】
スタチン類の潜在的神経保護効果に関する文献はあるが、本発明者らは、未発売のモナコリンＪの誘導体、具体的には、（１Ｓ，２Ｓ，６Ｒ，８Ｓ，８ａＲ）−１，２，６，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−３，７−ジメチル−８−［２−［（２Ｒ，４Ｒ）−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−６−オキソ−２Ｈ−ピラン−２−イル］エチル］−１−ナフタレニル−２−エチル−ブチレート（本特許出願明細書ではＮＳＴ００３７とも呼ばれることがある）は、血中脂質（コレステロールおよびトリグリセリド）レベルを減少させ、ＨＭＧＲをきわめて効果的に阻害し、癲癇、癲癇発作および痙攣から保護する高い能力を有することに加えて、驚くほどの神経保護の潜在能力を有する薬剤であることを見出した。更に、驚くべきことには、この化合物は、市販のスタチン類より安全であり、最高レベルの生物安全性を示すスタチンであるシンバスタチンより低いレベルの毒性を示す。その上、それは、モナコリンＪ分子に付加される側鎖の費用が低いため、合成のための費用が余りかからない化合物に関連している。
【００１０】
上記化合物の神経保護活性は、酸化ストレス、網様ストレス（ｒｅｔｉｃｕｌａｒ  ｓｔｒｅｓｓ）またはアポトーシスを引き起こす様々な種類の攻撃によるコリン作動性起源のヒト細胞系における神経死を引き起こす様々な攻撃に対して明確に示されている（例２、図１〜４）。上記例は、神経変性疾患に関連した神経細胞死（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、癲癇重積持続状態、ハンチントン病など）または望ましくない酸化に関連した疾患または年齢に関連した病理過程の予防および／または治療における上記化合物の使用可能性を明確に示している。
【００１１】
上記化合物の神経保護活性はアルツハイマー病のマウスモデルで確認されており、この化合物は、興奮毒性物質によって引き起こされる海馬における神経細胞死に対する神経保護効果を発揮する（例３、図５）。更に、上記物質は、興奮毒性物質の投与によって引き起こされる動物の死の予防（例３、図８）に加えて、神経変性を生じたマウスの一時的および空間的記憶を回復させる（例３、図６および７）ことが見出されている。上記例は、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、癲癇重積持続状態、ハンチントン病など）に関連した神経細胞死および認識欠損、または望ましくない酸化に関連した疾患または年齢に関連した病理過程の予防および／または治療におけるこの化合物の使用可能性を明確に示している。
【００１２】
上記化合物の抗癲癇および抗痙攣活性は、マウスの癲癇モデルにおける癲癇発作および痙攣からの防護の測定によって明らかに示されている（例４、図９および１０）。上記例は、癲癇および痙攣性発作または痙攣の予防および／または治療におけるこの化合物の使用可能性を明確に示している。
【００１３】
上記化合物の抗高脂血症活性は、２種類の市販スタチン類であるシンバスタチンおよびアトルバスタチンに比較してＨＭＧＲ阻害の測定によって明確に示されている（例５、図１１）。
【００１４】
上記化合物の抗高脂血症能は、マウスにおける内因性高脂血症モデルでも明らかにされており、総血漿コレステロールレベル、ＬＤＬコレステロールレベル、ＶＬＤＬコレステロールレベルおよびエステル化コレステロール画分レベルの減少においてシンバスタチンと類似の効果が観察されている。対照的にかつシンバスタチンと同様に、上記化合物は、ＨＤＬコレステロールレベルも遊離コレステロール画分レベルも変更せず、循環器疾患（ＣＶＤ）に対する保護的役割を与える（例５、図１２〜１７）。上記例は、循環器疾患（例えば、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、先天性心臓障害、後天性心臓障害、虚血性心臓障害、高血圧性心臓障害、弁膜症、心筋症、血液疾患など）に関連した高コレステロール血症の予防および／または治療における上記化合物の使用可能性を明確に示している。
【００１５】
上記化合物の抗高脂血症活性は、マウスにおいて誘発された高脂血症モデルで確かめられており（例６、図１８〜２３）、総血漿コレステロールレベル、ＬＤＬコレステロールレベルおよび遊離およびエステル化コレステロール画分レベルの減少においてシンバスタチンより大きな効果が観察されている。対照的に、この化合物はＨＤＬコレステロールレベルもＶＬＤＬコレステロールレベルも変更せず、循環器疾患（ＣＶＤ）に対する保護的役割を与える。上記例は、循環器疾患（例えば、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、先天性心臓障害、後天性心臓障害、虚血性心臓障害、高血圧性心臓障害、弁膜症、心筋症、血液疾患など）に関連した高コレステロール血症の予防および／または治療における上記化合物の使用可能性を明確に示している。
【００１６】
上記化合物の生物安全性は、市販のスタチンであるシンバスタチンと比較してゼブラフィッシュ胚モデルにおけるその毒性を評価することによって明確に示されており、死亡率が低いため、様々な濃度でシンバスタチンより毒性が弱いことが観察されている（例７、図２４および２５）。その上、半数致死量（ＬＤ５０）は、総ての評価時点において化合物ＮＳＴ００３７の場合にはシンバスタチンの場合より高いことが明らかにされており、上記化合物の生物安全性が一層高いことを示している（例７、図２６）。その上、この化合物では、実験の終了時には健康な幼生の割合が高くなり、同時に奇形または異常外観を有する幼生の割合が低くなることが明らかにされている（例７、図２７および２８）。その上、この化合物は、高濃度で心臓律動の有意な減少を引き起こすシンバスタチンとは異なり、高濃度で心拍数の有意な変動を引き起こさない（例７、図２９）。
【００１７】
従って、本発明の一態様は、式（Ｉ）：
【化１】
0005759448.tif 000002
の化合物（本特許出願明細書では、ＮＳＴ００３７とも呼ばれることがある）、そのヒドロキシ酸形態、上記ヒドロキシ酸の薬学上許容可能な塩、並びに該化合物およびそのヒドロキシ酸形態の薬学上許容可能なプロドラッグおよび溶媒和物に関する。
【００１８】
本発明のもう一つの態様は、式（Ｉ）の化合物および／またはそのヒドロキシ酸形態および／または上記ヒドロキシ酸の薬学上許容可能な塩および／または該化合物もしくはそのヒドロキシ酸形態の薬学上許容可能なプロドラッグもしくは溶媒和物と、少なくとも１種類の薬学上許容可能なアジュバント、キャリヤーおよび／またはビヒクルとを含んでなる医薬組成物である。
【００１９】
本発明のもう一つの態様は、薬剤としての使用するための、式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸形態または上記ヒドロキシ酸の薬学上許容可能な塩および／または該化合物もしくはそのヒドロキシ酸形態の薬学上許容可能なプロドラッグもしくは溶媒和物に関する。
【００２０】
もう一つの態様によれば、本発明は、詳細には
ａ．  神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、癲癇重積持続状態、ハンチントン病など）、更に具体的には、上記慢性神経変性疾患に関連したアポトーシス過程、酸化ストレスまたは小胞体ストレス、
ｂ．  認知衰退、
ｃ．  望ましくない酸化に関連した疾患、
ｄ．  年齢に関連した病理過程および早老症、
ｅ．  癲癇、癲癇発作および痙攣、
ｆ．  アテローム性動脈硬化症、心房細動、脂質異常症（ｄｙｓｌｉｐｅｍｉａ）、高コレステロール血症、高脂血症および高トリグリセリド血症のような循環器疾患、または
ｇ．  真菌またはウイルス感染症
の予防および／または治療において神経保護薬として使用するための、式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸形態または上記ヒドロキシ酸の薬学上許容可能な塩および／または該化合物もしくはそのヒドロキシ酸形態の薬学上許容可能なプロドラッグもしくは溶媒和物に関する。
【００２１】
本発明の一態様は、薬剤の製造における、式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸形態、上記ヒドロキシ酸の薬学上許容可能な塩および／または該化合物もしくはそのヒドロキシ酸形態の薬学上許容可能なプロドラッグもしくは溶媒和物の使用に関する。特定態様によれば、この薬剤は神経保護薬、詳細には
ａ．  神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、癲癇重積持続状態、ハンチントン病など）、更に具体的には、上記慢性神経変性疾患に関連したアポトーシス過程、酸化ストレスまたは小胞体ストレス、
ｂ．  認知衰退、
ｃ．  望ましくない酸化に関連した疾患、
ｄ．  年齢に関連した病理過程および早老症、
ｅ．  癲癇、癲癇発作および痙攣、
ｆ．  アテローム性動脈硬化症、心房細動、脂質異常症（ｄｙｓｌｉｐｅｍｉａ）、高コレステロール血症、高脂血症および高トリグリセリド血症のような循環器疾患、または
ｇ．  真菌またはウイルス感染症
の予防および／または治療において神経保護薬として使用するためのものである。
【００２２】
本発明のもう一つの態様は、セラジン−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現の増加において使用するための、式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸形態または上記ヒドロキシ酸の薬学上許容可能な塩および／または該化合物もしくはそのヒドロキシ酸形態の薬学上許容可能なプロドラッグもしくは溶媒和物である。
【００２３】
本発明のもう一つの態様は、セラジン−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子に関係した疾患の予防および／または治療において使用するための、式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸形態または上記ヒドロキシ酸の薬学上許容可能な塩および／または該化合物もしくはそのヒドロキシ酸形態の薬学上許容可能なプロドラッグもしくは溶媒和物である。
【００２４】
本発明のもう一つの態様は、薬剤の製造におけるセラジン−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現の増加を特徴とする、式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸形態、上記ヒドロキシ酸の薬学上許容可能な塩および／または該化合物もしくはそのヒドロキシ酸形態の薬学上許容可能なプロドラッグもしくは溶媒和物の使用に関する。
【００２５】
もう一つの態様では、本発明は、治療を必要とする患者の神経変性疾患、認知衰退、望ましくない酸化に関連した疾患、年齢に関連した病理過程および早老症、癲癇、癲癇発作および痙攣、アテローム性動脈硬化症、心房細動、脂質異常症（ｄｙｓｌｉｐｅｍｉａ）、高コレステロール血症、高脂血症および高トリグリセリド血症などの循環器疾患、または真菌もしくはウイルス感染症の予防および／または治療方法であって、上記患者に式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸形態または上記ヒドロキシ酸の薬学上許容可能な塩および／または該化合物もしくはそのヒドロキシ酸形態の薬学上許容可能なプロドラッグもしくは溶媒和物の治療上有効量を投与することを含んでなる、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ）によって引き起こされる死に対する化合物ＮＳＴ００３７の防護効果を表すＸＹ散乱チャートである。この図は、１０μＭキサンチン（Ｘ）、６０ｍＵ／ｍｌキサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）および様々な濃度のＮＳＴ００３７で処理した培養物の細胞死（ＸＸＯによって引き起こされる細胞死を１００％とする）の割合を示し、３回ずつ行った３つの独立した実験の平均値±ＳＤ（標準偏差）を表す。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）によるＸＸＯのみの処理に対する有意差。
【図２】図２はツニカマイシン（Ｔｍ）によって引き起こされる死に対する化合物ＮＳＴ００３７の防護効果を表すＸＹ散乱チャートである。この図は、２４μＭ  Ｔｍおよび様々な濃度のＮＳＴ００３７で処理した培養物の細胞死（Ｔｍによって引き起こされる細胞死を１００％とする）の割合を示し、３回ずつ行った３つの独立した実験の平均値±ＳＤを表す。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）によるＴｍのみの処理に対する有意差。
【図３】図３はカンプトテシン（ＣＰＴ）によって引き起こされる細胞死に対する化合物ＮＳＴ００３７の防護効果を表すＸＹ散乱チャートである。この図は、２０ｎｍ  ＣＰＴおよび様々な濃度のＮＳＴ００３７で処理した培養物細胞死（ＣＰＴによって引き起こされる細胞死を１００％とする）の割合を示し、３回ずつ行った３つの独立した実験の平均値±ＳＤを表す。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）によるＣＰＴのみの処理に対する有意差。
【図４】図４はフローサイトメトリーによって測定したカンプトテシン（ＣＰＴ）によって引き起こされるアポトーシスに対する化合物ＮＳＴ００３７の防護効果を表す２つの棒グラフである。図４Ａは、阻害コントロールである５０μＭのＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋと比較した５０μＭ  ＣＰＴおよび１０、４０および１００μＭのＮＳＴ００３７によって引き起こされるアポトーシスの阻害率を示し、３つの独立した実験の平均値±ＳＤを表す。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）によるＣＰＴのみの処理に対する有意差。図４Ｂは、ＮＳＴ００３７で前処理すると化合物の抗アポトーシス効果が高まり（４０μＭ  ＮＳＴ００３７およびアポトーシスインデューサーとしての５０μＭ  ＣＰＴで２４時間処理）、この防護は、コレステロール生合成経路の前駆体でありかつＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ酵素によって触媒される酵素反応の生成物であるメバロン酸塩（ＭＥＶ）を添加することによって部分的に阻害されることを示している。図４Ｂは、４０μＭ  ＮＳＴ００３７のみでまたは１００μＭメバロン酸塩（ＭＥＶ）と共に２４時間前処理をした５０μＭ  ＣＰＴによって引き起こされるアポトーシスの阻害率、およびコントロールとしての５０μＭの阻害薬Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋの効果を示しており、３つの独立した実験の平均値±ＳＤを表す。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）による、ＣＰＴのみの処理に対する有意差。＃：ＣＰＴおよびＮＳＴ００３７の処理に対する有意差。
【図５】図５は、マウスの海馬のＣＡ１およびＣＡ２領域を示す顕微鏡写真であって、試料はヘマトキシリンおよびエオシンで染色されている。この図は、前処理（興奮毒性物質［カイニン酸またはカイネートまたはＫＡ］の接種の２４および０．５時間前）、興奮毒性物質の接種（接種後０日［ｄ．ｐ．ｉ．］）および後処理（７ｄ．ｐ．ｉ．まで）に準じたこれらの領域の細胞構造の組織病理学的分析を表している。
【図６】図６は、一時性記憶の状態をＤｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．のプロトコル(Dere, E., Huston,J.P.& De Souza Silva,m.A.Neurobiol Learnmem 2005; 84:214-21)に準じて分析した棒グラフである。棒は、前処理（興奮毒性物質［カイニン酸またはカイネートまたはＫＡ］の接種の２４および０．５時間前）、興奮毒性物質の接種（接種後０日［ｄ．ｐ．ｉ．］）および後処理（７ｄ．ｐ．ｉ．まで）に準じて任意単位（ｙ−軸）で表した一時性記憶の平均値±ＳＥＭを表す。
【図７】図７は、空間的記憶の状態をＤｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．のプロトコル(Dere, E., Huston,J.P.& De Souza Silva,m.A.Neurobiol Learnmem 2005; 84:214-21)に準じて分析した棒グラフである。棒は、前処理（興奮毒性物質［カイニン酸またはカイネートまたはＫＡ］の接種の２４および０．５時間前）、興奮毒性物質の接種（接種後０日［ｄ．ｐ．ｉ．］）および後処理（７ｄ．ｐ．ｉ．まで）に準じて任意単位（ｙ−軸）で表した一時性記憶の平均値±ＳＥＭを表す。
【図８】図８は、前処理（興奮毒性物質［カイニン酸またはカイネートまたはＫＡ］の接種の２４および０．５時間前）、興奮毒性物質の接種（接種後０日［ｄ．ｐ．ｉ．］）および後処理（７ｄ．ｐ．ｉ．まで）に準じてマウスの生存率を表すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒグラフである。
【図９】図９は、受けた前処理（ｘ−軸）に従って最初の痙攣が起こる時間の平均値±ＳＥＭをＫＡの接種後の分（ｙ−軸）で表した棒グラフである。ＰＢＳによる前処理の群は黒色で表し、重量が５０ｍｇ／ｋｇのＮＳＴ００３７による処理の群は灰色で表している。
【図１０】図１０は、癲癇誘発物質（カイニン酸またはカイネートまたはＫＡ）の接種後時間に対してＲａｃｉｎｅスケール（Racine, Electroencephalogr Clin Neurophysiol 1972; 32[3]:281-94)に従って観察した癲癇重積持続状態の重篤度レベルを表すＸＹ散乱チャートである。このチャートは、受けた処理に従って動物の癲癇誘発状態の進展を示し、ＰＢＳは黒丸および線で表され、重量が５０ｍｇ／ｋｇのＮＳＴ００３７による処理の群は灰色四角および線で表している。
【図１１】図１１は、インビトロ（in vitro）でのＨＭＧＲ酵素活性に対する２種類の市販スタチン類（シンバスタチンおよびアトルバスタチン）と比較した化合物ＮＳＴ００３７の用量−応答曲線を表すＸＹ散乱チャートである。このチャートは、様々な用量の化合物のコントロールに対するＨＭＧＲ酵素活性の割合を示し、少なくとも４回の独立した分析の平均値±ＳＤを表している。
【図１２】図１２は、ＮＳＴ００３７またはシンバスタチン５０ｍｇ／ｋｇの投与１２時間後の雄ＡｐｏＢ１００マウスの総血漿コレステロールレベルを表す棒ダイアグラムであり、それぞれの群の平均値±ＳＤを表している。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）による時間０時間に対する有意差。
【図１３】図１３は、ＮＳＴ００３７またはシンバスタチン５０ｍｇ／ｋｇの投与１２時間後の雄ＡｐｏＢ１００マウスの血漿ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ−ｃ）レベルを表す棒ダイアグラムであり、それぞれの群の平均値±ＳＤを表している。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）による時間０時間に対する有意差。
【図１４】図１４は、ＮＳＴ００３７またはシンバスタチン５０ｍｇ／ｋｇの投与１２時間後の雄ＡｐｏＢ１００マウスの血漿ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ−ｃ）レベルを表す棒ダイアグラムであり、それぞれの群の平均値±ＳＤを表している。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）による時間０時間に対する有意差。
【図１５】図１５は、ＮＳＴ００３７またはシンバスタチン５０ｍｇ／ｋｇの投与１２時間後の雄ＡｐｏＢ１００マウスの血漿ＶＬＤＬコレステロール（ＶＬＤＬ−ｃ）レベルを表す棒ダイアグラムであり、それぞれの群の平均値±ＳＤを表している。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）による時間０時間に対する有意差。
【図１６】図１６は、ＮＳＴ００３７またはシンバスタチン５０ｍｇ／ｋｇの投与１２時間後の雄ＡｐｏＢ１００マウスの血漿エステル化コレステロール（ＥＣ）レベルを表す棒ダイアグラムであり、それぞれの群の平均値±ＳＤを表している。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）による時間０時間に対する有意差。
【図１７】図１７は、ＮＳＴ００３７またはシンバスタチン５０ｍｇ／ｋｇの投与１２時間後の雄ＡｐｏＢ１００マウスの血漿遊離コレステロール（ＦＣ）レベルを表す棒ダイアグラムであり、それぞれの群の平均値±ＳＤを表している。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）による時間０時間に対する有意差。
【図１８】図１８は、雄Ｃ５７ＢＬ６マウスの総コレステロール（ＴＣ）が、Ｔｒｉｔｏｎ１３３９（Ｔｙｌｏｘａｐｏｌ）５００ｍｇ／ｋｇおよびＮＳＴ００３７またはシンバスタチン５０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．投与２４時間後に増加する倍数を表す棒ダイアグラムであり、それぞれの群の平均値±ＳＤを表している。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）によるコントロール群に対する有意差。
【図１９】図１９は、雄Ｃ５７ＢＬ６マウスのＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ−ｃ）が、Ｔｒｉｔｏｎ１３３９（Ｔｙｌｏｘａｐｏｌ）５００ｍｇ／ｋｇおよびＮＳＴ００３７またはシンバスタチン５０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．投与２４時間後に増加する倍数を表す棒ダイアグラムであり、それぞれの群の平均値±ＳＤを表している。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）によるコントロール群に対する有意差。
【図２０】図２０は、雄Ｃ５７ＢＬ６マウスのＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ−ｃ）が、Ｔｒｉｔｏｎ１３３９（Ｔｙｌｏｘａｐｏｌ）５００ｍｇ／ｋｇおよびＮＳＴ００３７またはシンバスタチン５０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．投与２４時間後に増加する倍数を表す棒ダイアグラムであり、それぞれの群の平均値±ＳＤを表している。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）によるコントロール群に対する有意差。
【図２１】Ｔｒｉｔｏｎ１３３９（Ｔｙｌｏｘａｐｏｌ）５００ｍｇ／ｋｇおよびＮＳＴ００３７またはシンバスタチン５０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．投与２４時間後の雄Ｃ５７ＢＬ６マウスのＶＬＤＬコレステロール（ＶＬＤＬ−ｃ）レベルを表す棒ダイアグラムであり、それぞれの群の平均値±ＳＤを表している。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）によるコントロール群に対する有意差。
【図２２】図２２は、雄Ｃ５７ＢＬ６マウスのエステル化コレステロール（ＥＣ）が、Ｔｒｉｔｏｎ１３３９（Ｔｙｌｏｘａｐｏｌ）５００ｍｇ／ｋｇおよびＮＳＴ００３７またはシンバスタチン５０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．投与２４時間後に増加する倍数を表す棒ダイアグラムであり、それぞれの群の平均値±ＳＤを表している。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）によるコントロール群に対する有意差。
【図２３】図２３は、雄Ｃ５７ＢＬ６マウスの遊離コレステロール（ＦＣ）が、Ｔｒｉｔｏｎ１３３９（Ｔｙｌｏｘａｐｏｌ）５００ｍｇ／ｋｇおよびＮＳＴ００３７またはシンバスタチン５０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．投与２４時間後に増加する倍数を表す棒ダイアグラムであり、それぞれの群の平均値±ＳＤを表している。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）によるコントロール群に対する有意差。
【図２４】図２４は、受けた処理、すなわちコントロール、ＮＳＴ００３７（２ｍｇ／ｌの用量）またはシンバスタチン（２ｍｇ／ｌの用量）による胚−幼生の生存率を表すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒグラフである。＊：χ２検定（ｐ＜０．０１）によるコントロールに対する有意差。
【図２５】図２５は、受けた処理、すなわちコントロール、ＮＳＴ００３７（２ｍｇ／ｌの用量）またはシンバスタチン（２ｍｇ／ｌの用量）による胚−幼生の生存率を表すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒグラフ。＊：χ２検定（ｐ＜０．０１）によるコントロールに対する有意差。
【図２６】図２６は、処理の時間に対する２種類の化合物（ＮＳＴ００３７またはシンバスタチン）の半数致死量（ＬＤ５０）を表すＸＹ散乱チャートである。
【図２７】図２７は、受けた処理（ＮＳＴ００３７またはシンバスタチン）および使用用量（０．０２、０．０６または０．２ｍｇ／ｌ）による実験の終了時に得られる健康な幼生の割合を表す棒グラフであり、平均値±ＳＤが表されている。
【図２８】図２８は、受けた処理（ＮＳＴ００３７またはシンバスタチン）による奇形または異常外観を有する胚−幼生の割合を表すＸＹ散乱チャートである。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）による２つの処理間の有意差。
【図２９】図２９は、後処理７２時間後に化合物ＮＳＴ００３７またはシンバスタチンの増加用量を投与した胚−幼生の心臓律動の割合を表す棒グラフであり、平均値±ＳＤを表す。水平な黒色破線は、コントロールに対応する心臓律動の平均値である。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）によるコントロールに対する処理の有意差。
【図３０】図３０は、化合物ＮＳＴ００３７およびシンバスタチンの抗真菌活性を示すチャートである。分析した濃度（ｍＭ）の対数を、阻止円の直径（ｃｍ）に対して表す。
【図３１】図３１は、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞においてＮＳＴ００３７を用いて処理することによるセラジン−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現の増加を示す棒グラフである。１８Ｓによって規格化しかつ未処理細胞（コントロール）の値に関連しているセラジン−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現の相対定量（ＲＱ）を、１、４、１０および４０μＭのＮＳＴ００３７による２４時間処理について示す。３回ずつ行った２つの独立した分析の結果を示す。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）によるコントロールに対する有意差。
【図３２】図３２は、オカダ酸（ＯＡ）によって引き起こされる死に対する化合物ＮＳＴ００３７の防護効果を表すＸＹ散乱チャートである。この図は、２０ｎＭＯＡおよび様々な濃度のＮＳＴ００３７で処理した培養物の細胞死（ＯＡによって引き起こされる細胞死を１００％とする）の割合を示し、３回ずつ行った３つの独立した実験の平均値±ＳＤを表す。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）によるＯＡのみの処理に対する有意差。
【図３３】図３３は、３−ニトロプロピオン（３−ＮＰ）酸によって引き起こされる死に対する化合物ＮＳＴ００３７の防護効果を表すＸＹ散乱チャートである。この図は、３０μＭ３−ＮＰおよび様々な濃度のＮＳＴ００３７をで処理した培養物の細胞死（３−ＮＰによって引き起こされる細胞死を１００％とする）の割合を示し、３回ずつ行った３つの独立した実験の平均値±ＳＤを表す。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）による３−ＮＰのみの処理に対する有意差。
【図３４】図３４は、カンプトテシン（ＣＰＴ）によって誘発されるカスパーゼ３／７の活性化に対する化合物ＮＳＴ００３７の前処理の阻害効果を表す棒チャートである。この図は、処理なし、５０μＭＣＰＴと、１０および４０μＭのＮＳＴ００３７、１００μＭのメバロン酸塩、ならびに両化合物の組み合わせによる前処理とによって産生したコントロール細胞に対する活性カスパーゼ３／７の割合を示し、更に、５０μＭの阻害薬Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋは阻害コントロールとして用いられ、３つの独立した実験の平均値±ＳＤを表す。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）による、ＣＰＴのみの処理に対する有意差、＃：ＣＰＴおよびＮＳＴ００３７の処理に対する有意差。
【図３５】図３５は、分泌されかつＥＬＩＳＡ法によって定量されかつ４８時間後のコントロール細胞に対するＡβ（１−４０）（Ａ）およびＡβ（１−４２）（Ｂ）の割合を示す２つの棒グラフである。２回ずつ行った典型的な分析の結果（平均値±ＳＤ）を示す。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）によるコントロールに対する有意差。
【図３６】図３６は、ＸＸＯによって引き起こされる細胞死に対するＮＳＴ００３７による防護に対するメバロン酸塩の効果を表す棒グラフである。この図は、１０μＭキサンチン（Ｘ）、６０ｍＵ／ｍｌキサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）および４０μＭＮＳＴ００３７および１０、４０および１００μＭのメバロン酸塩で処理した培養物の細胞死（ＸＸＯによって引き起こされる細胞死を１００％とする）の割合を示し、３回ずつ行った３つの独立した実験の平均値±ＳＤを表している。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）による、ＸＸＯのみの処理に対する有意差、＃ＸＸＯおよびＮＳＴ００３７の処理に対する有意差。
【図３７】図３７は、マウスの海馬における倍率が１２．５ＸのＭＡＰ２および更に詳細には倍率が２００ＸのＣＡ１およびＣＡ２−ＣＡ３領域の免疫組織化学を示す顕微鏡写真である。この図は、前処理（興奮毒性物質［カイニン酸またはカイネートまたはＫＡ］の接種の２４および０．５時間前）、興奮毒性物質の接種（接種後０日［ｄ．ｐ．ｉ．］）および後処理（７ｄ．ｐ．ｉ．まで）による神経炎性ジストロフィーの組織病理学的分析を表している。
【図３８】図３８は、（Ａ）マウスの海馬のＣＡ２およびＣＡ３領域を示す顕微鏡写真であって、ＨＮＥ免疫組織化学、Ｔ．Ｕ．Ｎ．Ｅ．Ｌ．法およびＧＦＡＰ免疫組織化学を試料に行っており、総ての画像の倍率は１００Ｘである。この図は、前処理（興奮毒性物質［カイニン酸またはカイネートまたはＫＡ］の接種の２４および０．５時間前）、興奮毒性物質の接種（接種後０日［ｄ．ｐ．ｉ．］）および後処理（７ｄ．ｐ．ｉ．まで）による海馬の酸化的損傷、アポトーシスおよびアストログリオーシスの組織病理学的分析を表している。
【図３９】図３９は、処理（神経毒性物質［ＭＰＴＰ］の接種の２４および０．５時間前）、神経毒性物質の接種（接種後０日［ｄ．ｐ．ｉ．］）および後処理（７ｄ．ｐ．ｉ．まで）によるマウスの生存率を表すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒグラフである。
【図４０】図４０は、動物の耐性を分析する棒グラフである。これらの棒は、処理（神経毒性物質［ＭＰＴＰ］の接種の２４および０．５時間前）、神経毒性物質の接種（接種後０日［ｄ．ｐ．ｉ．］）および後処理（７ｄ．ｐ．ｉ．まで）によるベースライン状態（Ｙ軸）に対する７ｄ．ｐ．ｉ．における動物の円筒の滞在時間の比の平均値±ＳＥＭを表す。
【図４１】図４１は、動物の前肢の強さを分析する棒グラフである。これらの棒は、処理（神経毒性物質［ＭＰＴＰ］の接種の２４および０．５時間前）、神経毒性物質の接種（接種後０日［ｄ．ｐ．ｉ．］）および後処理（７ｄ．ｐ．ｉ．まで）によるベースライン状態（Ｙ軸）に対する７ｄ．ｐ．ｉ．における５回ずつ行ったグラム数での動物の強さの比の平均値±ＳＥＭを表す。
【図４２】図４２は、試料がＦｌｕｏｒｏＪａｄｅ  Ｂで染色されており、倍率が１００Ｘであるマウスの黒質および線条領域を示す顕微鏡写真である。この図は、処理（神経毒性物質［ＭＰＴＰ］の接種の２４および０．５時間前）、神経毒性物質の接種（接種後０日［ｄ．ｐ．ｉ．］）および後処理（７ｄ．ｐ．ｉ．まで）による神経変性の組織病理学的分析を表している。
【図４３】図４３は、マウスの黒質および線条領域を示す顕微鏡写真であって、チロシン−ヒドロキシラーゼに対する免疫組織化学を試料について行い、倍率は１００Ｘである。この図は、処理（神経毒性物質［ＭＰＴＰ］の接種の２４および０．５時間前）、神経毒性物質の接種（接種後０日［ｄ．ｐ．ｉ．］）および後処理（７ｄ．ｐ．ｉ．まで）による黒質のドーパミン作動性ニューロンの死および線条の神経伸張の消失の組織病理学的分析を表す。
【図４４】図４４は、動物の耐性を分析するＸＹ散乱チャートである。これらの棒は、処理（神経毒性物質［ＭＰＴＰ］の接種の２４および０．５時間前）、神経毒性物質の接種（接種後０日［ｄ．ｐ．ｉ．］）および後処理（２１ｄ．ｐ．ｉ．まで）によるベースライン状態（Ｙ軸）に対する７、１４および２１ｄ．ｐ．ｉ．における動物の円筒の滞在時間の比の平均値±ＳＥＭを表す。
【図４５】図４５は、マウスの黒質領域を示す顕微鏡写真であって、チロシン−ヒドロキシラーゼおよびＨＮＥに対する免疫組織化学を試料について行い、倍率は１００Ｘである。この図は、処理（神経毒性物質［ＭＰＴＰ］の接種の２４および０．５時間前）、神経毒性物質の接種（接種後０日［ｄ．ｐ．ｉ．］）および後処理（２１ｄ．ｐ．ｉ．まで）による黒質のドーパミン作動性ニューロンの死および脂質過酸化反応の組織病理学的分析を表す。
【図４６】図４６は、ＰＡＭＰＡ法によるインビトロ測定によるアトルバスタチン、シンバスタチンおよびＮＳＴ００３７のＢＢＢ通過（％）に対するＰｅ（ｃｍ／ｓ）として表される有効透過性を表すＸＹ散乱チャートである。それぞれ、ベラパミルおよびテオフィリンを、ポジティブおよびネガティブコントロールとして用いた。
【図４７】図４７は、ヒト細胞系ＨｅｐＧ２およびＳＫ−Ｎ−ＭＣにおけるコレステロールレベルに対するシンバスタチンおよびＮＳＴ００３７の効果を表している棒ダイアグラムである。結果は、ＦＢＳの非存在下で酸化合物を２０時間インキュベーションした後にそれぞれの細胞系におけるコントロールに対するコレステロールの減少率として表される。測定は酵素および蛍光測定手段によって行い、結果は平均値±ＳＤである。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）による、未処理細胞に対する有意差。ＨｅｐＧ２の場合には、２つの独立した分析を３回ずつ行い、ＳＫ−Ｎ−ＭＣの場合には、３つの独立した分析を３回ずつ行った。
【図４８】図４８は、１２週齢の雌ａｐｏＢ１００マウスにＮＳＴ００３７またはシンバスタチン５０ｍｇ／ｋｇの経口投与の７、２１および２８日後のａｐｏＢ濃度に加えてコレステロールおよびその様々な画分の血漿濃度を表すＸＹ散布図の組であり、群および時間のそれぞれの平均値±ＳＥＭを表している。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）によるコントロールに対する有意差。＋：その同一群の開始時に対する有意差。
【図４９】図４９は、ＮＳＴ００３７またはシンバスタチン５０ｍｇ／ｋｇの投与の７、２１および２８日後に１２週齢の雌ａｐｏＢ１００マウスで遊離およびエステル化コレステロールが増加する倍数を表す棒ダイアグラムであり、それぞれの群の平均値±ＳＥＭを表している。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）によるコントロール群に対する有意差。
【図５０】図５０は、ＮＳＴ００３７またはシンバスタチン５０ｍｇ／ｋｇの投与の７、２１および２８日後に１２週齢の雌ａｐｏＢ１００マウスの血漿で酸化状態が増加する倍数を表す棒ダイアグラムであり、それぞれの群の平均値±ＳＥＭを表している。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）によるコントロール群に対する有意差。
【図５１】図５１は、ＮＳＴ００３７またはシンバスタチン５０ｍｇ／ｋｇの経口投与の１、２および３ヶ月後の６月齢の雌ａｐｏＢ１００マウスにおけるコレステロールおよびその様々な画分の血漿濃度を表すＸＹ散布図の組であり、それぞれの群の平均値±ＳＥＭを表している。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）によるコントロール群に対する有意差。＋：その同一群の開始時に対する有意差。
【図５２】図５２は、ＮＳＴ００３７またはシンバスタチン５０ｍｇ／ｋｇの経口投与の１、２および３ヶ月後の６月齢の雌ａｐｏＢ１００マウスにおける遊離およびエステル化コレステロールが増加する倍数を表す棒ダイアグラムであり、それぞれの群の平均値±ＳＥＭを表している。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）によるコントロール群に対する有意差。
【図５３】図５３は、ＮＳＴ００３７またはシンバスタチン３０ｍｇ／ｋｇの経口投与の７日後の１１週齢の雄Ｚｕｃｋｅｒラットにおけるコレステロールおよびその様々な画分が増加する倍数を表す棒ダイアグラムであり、それぞれの群の平均値±ＳＥＭを表している。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）によるコントロール群に対する有意差。
【図５４】図５４は、ＮＳＴ００３７またはシンバスタチン３０ｍｇ／ｋｇの経口投与の７日後の１１週齢の雄Ｚｕｃｋｅｒラットにおける血漿トリグリセリドが増加する倍数を表す棒ダイアグラムであり、それぞれの群の平均値±ＳＥＭを表している。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）によるコントロール群に対する有意差。
【図５５】図５５は、ＮＳＴ００３７またはシンバスタチン３０ｍｇ／ｋｇの経口投与の７日後の１１週齢の雄Ｚｕｃｋｅｒラットにおける血漿レドックス状態が増加する倍数を表す棒ダイアグラムであり、それぞれの群の平均値±ＳＥＭを表している。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）によるコントロール群に対する有意差。
【図５６】図５６は、ＮＳＴ００３７またはシンバスタチン５０ｍｇ／ｋｇの経口投与の４時間後に野生型Ｃ５７ＢＬ６マウスの脳におけるセラジン−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現が増加する倍数を表す棒ダイアグラムであり、それぞれの群の平均値±ＳＥＭを表している。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｐ＜０．０５）によるコントロール群に対する有意差。
【図５７】図５７は、シンバスタチンと比較して化合物ＮＳＴ００３７の暴露後の健康な幼生（毒物学上の問題のない）の割合を表す棒ダイアグラムであって、様々な用量のＮＳＴ００３７またはシンバスタチンの投与後の健康な動物の割合±ＳＥＭの平均値を表している。Ｙ軸は健康な幼生の割合を決定し、Ｘ軸は両化合物の使用濃度を決定する。灰色の棒はＮＳＴ００３７を投与した動物の群を表し、黒色の棒はシンバスタチンを投与した動物の群を表す。
【図５８】図５８は、シンバスタチンと比較して化合物ＮＳＴ００３７の暴露後の異常外観（総合的症状）を有する幼生の割合を表す棒ダイアグラムであって、様々な用量のＮＳＴ００３７またはシンバスタチンの投与後の変形または異常外観を有する幼生の割合±ＳＥＭの平均値を表している。Ｙ軸は異常外観を有する幼生の割合を決定し、Ｘ軸は総合的症状の様々な変化を決定する。灰色の棒はＮＳＴ００３７を投与した動物の群を表し、黒色の棒はシンバスタチンを投与した動物の群を表す。
【図５９】図５９は、シンバスタチンと比較して化合物ＮＳＴ００３７の水中での暴露による単回用量毒性分析（２４時間）における成熟ゼブラフィッシュの重量の変化を表す棒ダイアグラムである。データは、検討時間および投与群に従って動物の平均重量±ＳＤとして示される。白色の棒は、ベースライン検討（０ｄｐｔ）に関連する投与による動物の重量を示す。灰色のグラフは、７ｄｐｔ検討に関連する投与による動物の重量を示す。黒色のグラフは、１４ｄｐｔ検討に関連する投与による動物の重量を示す。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ法との統計学的比較であって、１および同一群の動物の重量のベースライン時間に対する有意差を測定する（ｐ＜０．０５）。
【図６０】図６０は、シンバスタチンと比較して化合物ＮＳＴ００３７の水中での暴露による単回用量毒性分析（２４時間）後の様々な成熟ゼブラフィッシュ器官の組織病理学的検討を示す顕微鏡写真である。動物に２０００ｍｇ／ｋｇの用量を投与し、投与後１４日目に屠殺し、様々な検討群の典型的な組織切片を作成し、ヘマトキシリン−エオシンで染色した。示されている検討を行った器官は、脳、腎臓、膵臓、腸、目、鰓、卵巣、精巣、筋肉および肝臓である。
【図６１】図６１は、シンバスタチンと比較して化合物ＮＳＴ００３７の水中での恒常的暴露（４日間）による死亡率分析後の成熟ゼブラフィッシュの卵巣における組織病理学的検討を示す顕微鏡写真である。動物に３２および１００ｍｇ／ｋｇの二つの用量を投与し、投与後４日目に屠殺し、様々な検討群の典型的組織切片を作成し、ヘマトキシリン−エオシンで染色した。卵巣は、病理学的変化を経験した唯一の検討した器官であった。コントロール群由来の雌の卵巣の組織切片、および用量に従ってＮＳＴ００３７およびシンバスタチンを投与した群由来の卵巣を示す。
【発明の具体的説明】
【００２７】
定義
本特許出願明細書の発明の目的の理解を促進するために、本発明の文脈において用いられるいくつかの用語および表現の意味を以下に説明する。
【００２８】
本明細書で用いられる「神経保護薬」という用語は、例えば、壊死、アポトーシス、自己消耗、酸化的損傷、興奮毒性、小胞体損傷、副生成物の沈着、細胞構造の喪失などの既知または知られていない任意の機構によるニューロン変性または死の効果を弱めまたは消失させることができる任意の物質、またはそれらの副作用の減少または消失に関する。
【００２９】
本明細書で用いられる「スタチン」という用語は、コレステロール生合成の限定的段階を触媒する３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼ（ＨＭＧＲ）酵素の阻害薬に関し、任意の天然、合成または半合成スタチンが挙げられる。幾つかのスタチン類は閉鎖形態（ラクトン）または開環形態（ヒドロキシ酸）であることができる。ヒドロキシ酸（開環形態）は、例えば、メタノール中で水酸化ナトリウム、テトラヒドロフラン−水中で水酸化ナトリウムなど通常の加水分解によって対応するラクトンから調製することができる。開環形態（ヒドロキシ酸）では、スタチン類は、薬学上許容可能な金属と、有機または無機塩基から形成されたアミンカチオンと、反応して塩を形成する。スタチン類の薬学上許容可能な塩は、溶解度および融点のような幾つかの物理特性において対応する遊離酸と異なる可能性があるが、本発明の目的にはそれらは遊離酸形態であると考えられる。スタチン類の遊離開環形態（ヒドロキシ酸）は、所望ならば、塩を塩酸などのような酸の希釈した水溶液と接触させることによって塩形態から再生させることができる。スタチン類の閉鎖形態（ラクトン）は、例えば、トルエン、ベンゼン、酢酸エチルなどの不活性溶媒に約０°Ｃ〜溶媒の沸点付近の温度で開環形態（ヒドロキシ酸）を溶解し、典型的には（必ずしも必要ではないが）生成する水を同時に分離し、強酸、例えば、塩酸などを用いる触媒反応によって再生させることができる。同様に、スタチン類は、溶媒和または非溶媒和形態で存在することができ、このような形態は、本発明の目的には非溶媒和形態である。
【００３０】
本明細書で用いられる「心臓保護」という用語は、例えば、壊死、アポトーシス、虚血、不整脈、副生成物の沈着、細胞構造の喪失など既知または知られていない任意の機構による循環器疾患または心臓障害または心臓損傷の元となる効果を弱めまたは消失させることができる任意の物質、またはそれらの副作用の減少または消失に関する。
【００３１】
本明細書で用いられる「抗高脂血症」という用語は、血中脂質レベルまたは他の組織の脂質レベルを減少させる特性を有する任意の薬理活性物質に関する。これらの物質の重要性は、幾つかの種類の脂質（コレステロールまたはトリグリセリド）またはリポタンパク質が過剰であることが循環器疾患の主要な危険因子の１つであることによるものである。
【００３２】
本明細書で用いられる「低コレステロール血症」という用語は、血中コレステロールレベルまたは他の組織のコレステロールレベルを減少させる特性を有する任意の薬理活性物質に関する。
【００３３】
本明細書で用いられる「低トリグリセリド血症」という用語は、血中トリグリセリドレベルまたは他の組織のトリグリセリドレベルを減少させる特性を有する任意の薬理活性物質に関する。
【００３４】
本明細書で用いられる「抗癲癇または抗痙攣」という用語は、癲癇または痙攣発作を、例えば期間および／または強度において弱めること、または癲癇または痙攣発作の消失、またはその副作用の減少または消失に関する。
【００３５】
本明細書で用いられる「生物安全性」という用語は、毒性効果、腫瘍発生、発生学的展開の変化（奇形発生）または他の有害効果の非存在に関する。
【００３６】
本明細書で用いられる「神経変性疾患」という用語は、神経組織、特にニューロンの変性または劣化によって生じ、経時的に機能不全または障害を生じる疾患が挙げられ、変性という用語は、細胞生育力の喪失、細胞機能の喪失および／または細胞（ニューロンなど）の数の喪失を包含する。神経変性疾患の非制限的例としては、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症などが挙げられる。特定態様では、上記神経変性疾患は、例えば、一般的に酸化ストレス、小胞体ストレス、アポトーシス、興奮毒性または神経細胞死を引き起こす物質によって引き起こされる神経細胞死に関する疾患である。
【００３７】
本明細書で用いられる「望ましくない酸化に関連した疾患」という用語は、望ましくない酸化（例えば、過度の酸化）によって引き起こされるまたは上記望ましくない酸化が症状である疾患に関する。上記の望ましくない酸化は、含まれる特定のフリーラジカルまたはターゲットから独立しているタンパク質、ＤＮＡおよび／または脂質に対してフリーラジカルによって引き起こされる損傷の結果である可能性がある。望ましくない酸化は、細胞、組織または器官の機能不全を引き起こす可能性があるフリーラジカルの過剰な生成を伴い、従って疾患の潜在的機構を形成する可能性がある。特定態様では、上記の望ましくない酸化は、年齢（老化）または神経変性過程によって引き起こされる可能性があり、単独でまたは他の要因と組み合わせて幾つかの疾患の開始を引き起こすことができる。特定態様では、上記の望ましくない酸化は、酸化ストレスを引き起こす物質によって引き起こされる酸化的損傷に関する。
【００３８】
本明細書で用いられる「年齢に関連した病理過程」という用語は、任意の年齢に関係した事象、または神経組織の細胞生育力または神経組織の細胞感作の喪失、細胞機能の喪失および／または細胞（ニューロンなど）の数の喪失を引き起こす事象の組み合わせに関し、細胞代謝機能不全、ストレス過程、病原体による感染症、遺伝子変異、遺伝子感受性、外傷、虚血、癲癇などが挙げられる。
【００３９】
本明細書で用いられる「循環器疾患」という用語は、心臓もしくは循環器系の残りの部分または血液の任意の疾患、機能不全または変調に関する。
【００４０】
本明細書で用いられる「癲癇」という用語は、最終的には幾つかの臨床および臨床関連領域の発現と関連した脳ニューロンによる神経インパルスの過度の超共時的（ｈｙｐｅｒｓｙｎｃｈｒｏｎｉｃ）放出による再発性発作を特徴とする、様々な原因を有する慢性脳症候群に関する。これらの発作は、痙攣性であることもまたは非痙攣性であることもある。癲癇は多くの原因を有することがあり、幾つかの場合には、様々な種類の脳創傷（例えば、脳外傷、髄膜炎の後遺症、腫瘍など）による可能性があり、他の場合には、創傷はないが、発作の遺伝的素因があり、他の場合には、癲癇の病因は、環境的、薬理学的処理による、興奮毒性、外傷、ストレス過程、老化、発生問題、神経疾患、精神病発症、妊娠中の問題、労働中の問題によるものなど可能性がある。
【００４１】
本明細書で用いられる「癲癇性または痙攣性」という用語は、任意の病因の任意の癲癇発作または痙攣、例えば、遺伝的、環境的、薬理学的処理による、興奮毒性による、外傷による、ストレス過程による、老化による、発生問題による、神経疾患による、精神病発症による、妊娠中の問題による、労働中の問題によるものなど可能性がある。癲癇発作は、脳の異常な電気活性が敏捷であることの能力または行動において身体運動または機能、感覚の不随意変化を引き起こすときに起こり、部分的または全身性（痙攣性または非痙攣性）であることがある。
【００４２】
本明細書で用いられる「認知衰退」という用語は、持続的かつ経時的に冒されているヒトの社会活動および相互作用を妨げる記憶、方向定位、言語、視覚認識または行為のような精神的機能の喪失または変調に関する。
【００４３】
本明細書で用いられる「真菌またはウイルス感染症」という用語は、コロニー形成した生物または宿主の正常な機能または生存にとって有害な微細な真菌またはウイルスの任意のコロニー形成に関する。
【００４４】
本明細書で用いられる「患者」という用語は、哺乳動物種の一員に関し、家畜、霊長類およびヒトが挙げられるが、これらに限定されず、好ましくは、患者は任意の年齢または人種の雄または雌のヒトである。特定態様では、上記患者は、老化のような年齢に関連した病理過程または慢性神経変性疾患のような神経変性疾患に罹っているまたは罹り易い哺乳動物である。
【００４５】
本明細書で用いられる「薬学上許容可能な」という用語は、化合物が生理学的に許容可能でありかつ患者に投与したときに、総体的にアレルギー反応または胃障害、眩暈などのようなアレルギー反応と同様な好ましくない反応を引き起こさないという事実に関し、上記の用語「薬学上許容可能な」は、好ましくは政府規制官庁によって承認されておりまたは米国薬局方または動物での使用を目的とする別の一般に認められている薬局方（例えば、欧州薬局方など）に記載されていることを意味する。
【００４６】
本明細書で用いられる「薬学上許容可能な塩」という用語は、「薬学上許容可能な金属塩」並びに「薬学上許容可能なアミン塩」を包含する。「薬学上許容可能な金属塩」という用語としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、鉄または亜鉛イオンで形成された塩が考えられる。「薬学上許容可能なアミン塩」という用語は、アンモニアやカルボン酸と塩を形成するのに十分な強度の有機窒素塩基との塩が考えられる。上記の薬学上許容可能な塩は、当業者に知られている通常の方法によって得ることかできる。
【００４７】
化合物（１Ｓ，２Ｓ，６Ｒ，８Ｓ，８ａＲ）−１，２，６，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−３，７−ジメチル−８−［２−［（２Ｒ，４Ｒ）−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−６−オキソ−２Ｈ−ピラン−２−イル］エチル］−１−ナフタレニル−２−エチル−ブチレートは、米国特許ＵＳ４８６６０９０号明細書に同一ファミリーの他の化合物について記載した方法のような半合成法によって得ることができる。
【００４８】
本発明者らが行った多数の分析は、酸化ストレスを引き起こす物質の作用に対する化合物ＮＳＴ００３７の神経保護効果、並びに小胞体ストレスを引き起こす物質の作用に対するその神経保護効果、およびヒトのコリン作動性ニューロンにアポトーシスを引き起こす物質の作用に対するその神経保護効果、並びに興奮毒性、酸化的損傷、アポトーシス、海馬萎縮、神経細胞死、認知衰退、一時性記憶喪失、空間的記憶喪失などを引き起こす物質に対するその神経保護効果を明らかに示している。
【００４９】
キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ）のような酸化ストレスを引き起こす物質の作用に対する神経保護効果は、例２に記載されている。上記例では、化合物ＮＳＴ００３７が酸化ストレスによって引き起こされる神経細胞死を有意かつ定量的に減少させることができることが観察され、この化合物の神経保護能を明確に示している（図１）。この化合物の神経保護効果を一層効果的に定義するために、本発明者らは、小胞体ストレスを引き起こす物質（ツニカマイシン）の作用によって引き起こされる神経細胞死の分析によって一層詳細に神経変性過程を分析し、化合物ＮＳＴ００３７が小胞体ストレスによって引き起こされる神経細胞死を有意かつ定量的に減少させることができることを確認し、これは上記化合物の神経保護能を明確に示している（図２）。この化合物の神経保護効果を一層効果的に定義するために、本発明者らは、アポトーシスを引き起こす物質（カンプトテシン）の作用によって引き起こされる神経細胞死の分析によって一層詳細に神経変性過程を分析し、化合物ＮＳＴ００３７がアポトーシスによって引き起こされる神経細胞死を有意かつ定量的に減少させることができることを確認し、これは上記化合物の神経保護能を明確に示している（図３）。同様に、この化合物の神経保護効果を一層効果的に定義するため、本発明者らは、アポトーシスによって引き起こされる神経細胞死およびアポトーシスによる神経細胞死の特定の阻害薬であるＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋと比較して上記化合物によるその阻害をフローサイトメトリー分析によって一層詳細に神経変性過程を分析し、化合物ＮＳＴ００３７は、アポトーシスによって引き起こされる神経細胞死を有意かつ定量的に阻害することができ、かつこの神経保護効果は化合物ＮＳＴ００３７の前投与によって高められ、かつそれは部分的にコレステロール生合成に依存していることを確認した（図４）。
【００５０】
この化合物の神経保護効果を一層効果的に定義するため、本発明者らは、例３に記載の通りマウスの海馬ニューロンにおいて興奮毒性物質（カイネート）によって引き起こされる神経細胞死の分析によって一層詳細に神経変性過程を分析した。上記例では、化合物ＮＳＴ００３７が、興奮毒性物質によって引き起こされる神経細胞死を有意かつ定量的に減少させることができ、これは上記化合物の神経保護能を明確に示していることが観察される（図５）。上記チャートでは、カイネートの投与の前および後または後のみに投与されるＮＳＴ００３７による処理は海馬ニューロンの保護を引き起こし、ＣＡ１およびＣＡ２領域における神経細胞死を阻害することが明らかされている。対照的に、化合物ＮＳＴ００３７のみの投与は著しい組織病理学的変化を引き起こさず、コントロール群との顕著な差を示さない。同様に、知られているように、海馬ニューロンの死は、幾つかの場合には動物の認知衰退を誘発し、記憶過程に影響するので、本発明者らは、この化合物の神経保護効果が興奮毒性物質によって引き起こされる一時性および空間的記憶喪失の減少を伴うかどうかを分析した。一時性記憶について得られた結果では（図６）、カイネートの投与の前および後または後のみに投与したＮＳＴ００３７による処理は、このタイプの記憶の喪失から保護することが明らかされている。空間的記憶について得られた結果では（図７）、カイネートの投与の前および後または後のみに投与したＮＳＴ００３７による処理は、このタイプの記憶の喪失から保護することが明らかされている。対照的に、化合物ＮＳＴ００３７のみの投与は動物の認識状態に著しい変化を引き起こさず、コントロール群との顕著な差を示さない。同様に、知られているように、興奮毒性物質の投与および神経細胞死は、幾つかの場合には動物の死を誘発するので、本発明者らは、化合物ＮＳＴ００３７の神経保護効果が興奮毒性物質によって引き起こされる死亡率の減少を伴うかどうかを分析した。得られた結果では（図８）、カイネートの投与の前および後または後のみに投与したＮＳＴ００３７によって処理すると、生存率が高くなり、上記化合物による処理は動物を死および興奮毒性物質によって引き起こされる有機効果（ｏｒｇａｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ）の残りから保護することを示唆している。対照的に、化合物ＮＳＴ００３７のみの投与は、動物の生存率に何ら顕著な変化を引き起こさず、コントロール群との顕著な差を示さない。
【００５１】
同様に、知られているように、興奮毒性物質の投与は幾つかの場合には動物に痙攣発作および癲癇誘発するので、本発明者らは、化合物ＮＳＴ００３７の神経保護効果が興奮毒性物質によって引き起こされる抗癲癇および抗痙攣効果を伴うかどうかを分析し（例４）、ＮＳＴ００３７の投与が最初の痙攣の開始を遅らせ（潜伏期）（図９）、更に癲癇症状の重篤度および頻度を減少させることが認められ（図１０）、これは化合物ＮＳＴ００３７の抗癲癇または抗痙攣効果を明らかにしている。
【００５２】
更に、化合物ＮＳＴ００３７の性質により、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼ（ＨＭＧＲ）酵素の阻害能を検討した。驚くべきことには、かつ例５に示されるように、結果は、化合物ＮＳＴ００３７は明らかな低コレステロール血症効果を有することを示している。得られた結果および図１１に示されるように、ＨＭＧＲ酵素に対する化合物ＮＳＴ００３７の阻害活性は、ヒト母集団においてコレステロールレベルを減少させるのに一般に用いられる２種類の市販スタチン類（アトルバスタチンおよびシンバスタチン）の範囲内であることが分かる。ここでは、化合物ＮＳＴ００３７は、証明された一層高い活性を有するスタチン（アトルバスタチン）ときわめて類似した上記酵素に対する阻害効果を示し、最も安全なスタチン（シンバスタチン）の７．５倍以上ＨＭＧＲ酵素を阻害することが明らかされている。
【００５３】
化合物の低コレステロール血症効果を一層効果的に定義するために、本発明者らは、例５に記載されているように、内因性高コレステロール血症のマウスにおける血漿コレステロール画分の変動を分析することによって低コレステロール血症活性を一層詳細に分析した。そのために、化合物ＮＳＴ００３７およびシンバスタチンの効果を２群のマウスで比較し、総コレステロールレベルを化合物の投与後に測定したところ（図１２）、驚くべきことには、両化合物が同様な低コレステロール血症効果を生じることを観察した。化合物の低コレステロール血症効果を一層効果的に定義するために、ＬＤＬ、ＨＤＬおよびＶＬＤＬ画分におけるコレステロールレベルを分析し、両化合物は同様にＬＤＬおよびＶＬＤＬ画分のコレステロールレベルを減少させるが、ＨＤＬ画分では減少させず（図１３〜１５）、低コレステロール血症および心臓保護効果を明らかにしている。化合物の低コレステロール血症効果を一層効果的に定義するために、遊離およびエステル化コレステロールレベルを分析し、両化合物が同様にエステル化コレステロールレベルを減少させるが、遊離コレステロールレベルは減少させず（図１６〜１７）、低コレステロール血症および心臓保護効果を示している。
【００５４】
化合物の低コレステロール血症効果を一層効果的に定義するために、本発明者らは、例６に記載されているように、誘発高コレステロール血症のマウスにおける血漿コレステロール画分の変動を分析することによって低コレステロール血症活性を一層詳細に分析した。そのために、化合物ＮＳＴ００３７およびシンバスタチンの効果を２群のマウスで比較し、総コレステロールレベルを化合物の投与後に測定したところ（図１８）、驚くべきことには、化合物ＮＳＴ００３７がシンバスタチンより高い低コレステロール血症効果を有することを観察した。この化合物の低コレステロール血症効果を一層効果的に定義するために、ＬＤＬ、ＨＤＬおよびＶＬＤＬ画分におけるコレステロールレベルを分析し、化合物ＮＳＴ００３７はＬＤＬ画分のコレステロールレベルをシンバスタチンより効果的に減少させるが、ＨＤＬ画分（シンバスタチンに類似）またはＶＬＤＬ画分（シンバスタチンに非類似）ではコレステロールレベルが変化せず（図１９〜２１）、低コレステロール血症および心臓保護効果を明らかにしている。化合物の低コレステロール血症効果を一層効果的に定義するために、遊離およびエステル化コレステロールレベルを分析し、いずれの場合にもＮＳＴ００３７はシンバスタチンより効果的に両コレステロール画分を減少させ（図２２〜２３）、低コレステロール血症および心臓保護効果を示している。
【００５５】
化合物をヒト母集団に投与するには、それが無害であり安全であることを明らかにする必要がある。このために、本発明者らは、広く用いられている毒物学モデルであるゼブラフィッシュ胚における化合物ＮＳＴ００３７の生物安全性を例７に記載されているようにＯＥＣＤ  Ｃ１５プロトコルに記載の方法に従って分析した。このモデルでは、本発明者らは、化合物の有害効果を一層効果的に定義するために、胚に明らかな損傷を生じさせる臨床実施で用いられる用量より高濃度で、化合物とシンバスタチンの効果を比較した。従って、ＮＳＴ００３７を高用量で投与したところ、生存率の減少は時間的に早期に始まったので毒性が一層高いシンバスタチンの同じ用量で見られたように、分析を行った胚は総て死亡した（図２４）。使用した１０分の１の用量を用いたところ、シンバスタチンではコントロールと比較して生存率が有意に減少したが、ＮＳＴ００３７では胚の生存率が統計学的に有意な減少を示さず、その安全性が高いことを示唆した（図２５）。化合物の生物安全性を一層効果的に定義するために、半数致死量（ＬＤ５０）を半静止法でＮＳＴ００３７またはシンバスタチンの投与により様々な時点で検討し、総ての時間において、シンバスタチンのＬＤ５０はＮＳＴ００３７より低く、後者の化合物の方が、生物安全性が高いことを示唆していた（図２６）。化合物の生物安全性を一層効果的に定義するために、実験の終了時における健康な幼生の割合をシンバスタチンと比較検討したところ、健康な幼生の数はシンバスタチンに比較してＮＳＴ００３７を投与したもので一層高くなった（図２７）。化合物の生物安全性を一層効果的に定義するために、奇形または異常外観を有する幼生の経時的割合をシンバスタチンと比較して検討したところ、シンバスタチンと比較してＮＳＴ００３７の投与では、奇形または異常外観を有する幼生の数が低かった（図２８）。化合物の生物安全性を一層効果的に定義するために、用いた用量による心拍数を検討してＮＳＴ００３７をシンバスタチンと比較したところ、シンバスタチンの最高と評価された用量で心臓律動がＮＳＴ００３７より大きく減少したが、低用量では、シンバスタチンのみが心臓律動の統計学的に有意な減少を引き起こし（図２９）、化合物ＮＳＴ００３７の生物安全性が一層高いことを示唆していた。
【００５６】
化合物ＮＳＴ００３７の抗真菌活性も、スタチン類（ロバスタチン、アトルバスタチンおよびシンバスタチン）に対するバイオアッセイによって検討した。得られた結果は、化合物ＮＳＴ００３７が、全アッセイ濃度範囲において最低濃度であっても阻止円を生じることができる唯一のものであることを示しており（図３０）、一層高い抗真菌活性を示唆していた。
【００５７】
更に、アルツハイマー病に対するこの遺伝子の増加発現の神経保護効果が明らかにされているので（Cechi et al.,J. Cell. Mol. Med. 2008; 12: 1990-2002）、化合物ＮＳＴ００３７がセラジン−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現を増加させる能力を検討した。セラジン−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子の生成物は、カスパーゼ−３の阻害による抗アポトーシス効果によってその神経保護力を発揮し、デスモステロールからのコレステロール合成を調節し、これにより神経毒性創傷に対するバリヤーの生成が確認され、β−アミロイド産生を防止することが記載されている（Greeve et al.,J. Neurosci. 2000; 20: 7345-52）。これらの作用機構は、セラジン−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現の増加が総体的神経保護効果を有し、従ってこの遺伝子の発現増加を引き起こす薬剤は、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、癲癇重積持続状態、ハンチントン病など）に関連した神経細胞死、望ましくない酸化に関連した疾患、または年齢に関連した病理過程の予防および／または治療に潜在的に用いることができることを示唆している。ＮＳＴ００３７の投与によるセラジン−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現を増加させる能力は、例９にメマンチン（ＡＤの治療に普通に用いられる薬剤の１つ）と比較して記載されている。上記例では、化合物ＮＳＴ００３７が定量的に有意にかつ用量依存的にセラジン−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現を増加させることができることが観察され、これはマイクロアレイ技術を用いる遺伝子発現分析およびリアルタイム定量ＰＣＲを用いる相対発現分析によって明らかにされている。上記結果は、化合物ＮＳＴ００３７の神経保護能を明らかに示している（図３１）。その上、セラジン−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現の増加およびこの遺伝子によってコードされるタンパク質の量の増加も、シンバスタチンを用いる平行する研究で確認されている。この結果は、このスタチンがこの遺伝子の発現を増加させることもでき、従ってその神経保護能を説明できることを示唆しており、セラジン−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現を増加させることができるスタチンファミリーの一般的機構に関連していることを示唆している。
【００５８】
また、プロテインホスファターゼ１の阻害によるＡＤ（図３２）またはスクシネートデヒドロゲナーゼの阻害によるハンチントン病（図３３）のような幾つかの神経変性疾患を模倣した攻撃に対する化合物ＮＳＴ００３７のヒトニューロン培養物における神経保護効果を検討した。更に、エフェクターカスパーゼ３／７の調整に対する効果を検討し、化合物ＮＳＴ００３７がその活性化を防止し、この効果はコレステロール生合成経路に関係していることが確認された（図３４）。更に、化合物ＮＳＴ００３７は、ＡＰＰタンパク質を過剰発現するヒトニューロン細胞モデルにおけるＡβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）レベルを減少させることができることを確認した（図３５）。更に、酸化ストレスによって引き起こされる死に対するＮＳＴ００３７の神経保護効果は、コレステロール生合成経路の前駆体でありかつＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ酵素によって触媒される酵素反応の生成物であるメバロン酸塩によって調節されることが確認された（図３６）。
【００５９】
この化合物の神経保護効果を一層効果的に定義するために、本発明者らは、例１５に記載されているように、マウスの海馬ニューロンにおける興奮毒性物質（カイネート）によって引き起こされる神経細胞死と関連した組織病理学的徴候の分析によって更に詳細に神経変性過程を分析した。上記例では、化合物ＮＳＴ００３７が、神経炎性ジストロフィー（図３７）並びに興奮毒性物質の投与によって引き起こされる酸化的損傷、アポトーシスおよびアストログリオーシス（図３８）を予防または改善することができることが観察されている。
【００６０】
この化合物の神経保護効果を一層効果的に定義するために、本発明者らは、例１６に記載されているように、マウスの急性パーキンソン病モデルにおけるＮＳＴ００３７投与の潜在的治療効果を分析した。このために、ドーパミン作動性のニューロン特異性パーキンソン症候群神経毒（ＭＰＴＰ）の急性投与後に、ＮＳＴ００３７は、死亡率（図３９）、黒質または線条のようなパーキンソン病に関連した領域におけるドーパミン作動性ニューロンの喪失（図４３）に加えて、耐性（図４０）および強度（図４１）、神経変性（図４２）のパラメーターに関する運動欠損のような神経毒によって引き起こされる有害効果を変更することができることが観察された。
【００６１】
この化合物の神経保護効果を一層効果的に定義するために、本発明者らは、例１７に記載されているように、マウスの亜慢性パーキンソン病のモデルにおけるＮＳＴ００３７の投与の潜在的治療効果を分析した。このために、ドーパミン作動性ニューロン特異性パーキンソン症候群神経毒（ＭＰＴＰ）の亜慢性投与の後に、ＮＳＴ００３７は運動耐性（ｍｏｔｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）に関する運動欠損（図４４）、黒質における脂質過酸化に関連した神経細胞死または酸化的損傷（図４５）のような神経毒によって引き起こされる有害効果を変更することができることが観察された。
【００６２】
化合物ＮＳＴ００３７の血液−脳関門通過を一層効果的に定義するために、本発明者らは、例１８に記載されているように、理論的親油性、通過率および有効透過率（図４６、表Ｉ）のような様々なパラメーターを分析した。
【００６３】
化合物の低コレステロール血症効果を一層効果的に定義するために、本発明者らは、例１９に記載されているように、肝臓およびニューロン起源の２種類のヒト細胞系におけるコレステロールの減少を分析することによって低コレステロール血症活性を一層詳細に分析した（図４７）。更に、家族性高脂血症のマウスにおいて化合物ＮＳＴ００３７を２８日間経口投与することによって、例２０に記載されているように、総コレステロール、ＡｐｏＢ、ＬＤＬ−ｃ、ＶＬＤＬ−ｃ、ＨＤＬ−ｃ（図４８）、遊離およびエステル化コレステロール（図４９）レベルおよび血漿酸化状態（図５０）が減少した。更に、家族性高脂血症マウスにおいて化合物ＮＳＴ００３７を３ヶ月間経口投与することによって、例２１に記載されているように、総コレステロール、ＬＤＬ−ｃレベルが減少し、ＨＤＬ−ｃが増加し（図５１）、遊離およびエステル化コレステロールレベルが減少した（図５２）。
【００６４】
化合物の低コレステロール血症効果を一層効果的に定義するために、本発明者らは、低コレステロール血症活性を、例２２に記載されているように内因性高脂血症のＺｕｃｋｅｒラットにおけるコレステロールおよび関連画分（図５３）、トリグリセリド（図５４）、および血漿レドックス状態（図５５）の減少によって更に詳細に分析した。
【００６５】
化合物ＮＳＴ００３７によるセラジン−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子の調整を一層効果的に定義するために、本発明者らは、例１８に記載されているようにＮＳＴ００３７を経口投与したマウスの脳におけるその調節を分析し（図５６）、ＮＳＴ００３７の投与の４時間後にこの神経保護遺伝子の発現が増加することを確認した。
【００６６】
化合物ＮＳＴ００３７の無害および安全性を一層効果的に定義しかつ例７でゼブラフィッシュ胚を用いて行った検討を確認するために、本発明者らは、例２４に記載されている幼生における化合物ＮＳＴ００３７の生物安全性を分析することに決定した。このモデルにおいて、本発明者らは、増加濃度曲線を作成することによってシンバスタチンと比較したこの化合物の効果を比較し、２種類の投与のいずれでも死亡率は見られず（表ＩＩ）、またシンバスタチンでは健康な幼生の割合はＮＳＴ００３７より小さく（図５７）かつ異常外観を有する幼生の割合が大きくなった（図５８）ので、この化合物の高い安全性を明らかにした。
【００６７】
化合物ＮＳＴ００３７の無害および安全性を一層効果的に定義しかつ上記例行った検討を確認するために、本発明者らは、例２５に記載されているように成熟魚に投与後の化合物ＮＳＴ００３７の生物安全性をシンバスタチンと比較して分析することに決定した。結果は、シンバスタチンでは動物の体重が有意に減少したが、ＮＳＴ００３７では上記パラメーターは有意に変化しないことを示していた（図５９）。更に、シンバスタチンでは組織病理学的変化が投与した動物に生じたが、ＮＳＴ００３７では有害効果はほとんどなかった（図６０）。
【００６８】
化合物ＮＳＴ００３７の無害および安全性を一層効果的に定義しかつ上記例で行った検討を確認するために、本発明者らは、例２６に記載されているように成熟魚に投与後の化合物ＮＳＴ００３７の生物安全性をシンバスタチンと比較して分析することに決定した。結果は、シンバスタチンでは投与の４日後に死亡率が有意になったが、ＮＳＴ００３７に関連した死亡率は誤差範囲であった（表ＩＩＩ）。更に、シンバスタチンでは１００ｍｇ／ｋｇを投与した動物の卵巣に明らかな組織病理学的変化が生じたが、ＮＳＴ００３７ではこの用量では有害効果を全く生じなかった（図６１）。
【００６９】
本発明によって提供される医薬組成物は、化合物ＮＳＴ００３７、および／またはそのヒドロキシ酸形態および／または上記ヒドロキシ酸の薬学上許容可能な塩および／または該化合物またはそのヒドロキシ酸形態の薬学上許容可能なプロドラッグまたは溶媒和物を、１種類以上の薬学上許容可能なアジュバント、ビヒクルまたは賦形剤と共に含むことができる。
【００７０】
薬学上許容可能な「塩、プロドラッグまたは溶媒和物」という用語は、受容者への投与において本発明で記載した通りの化合物を（直接または間接的に）提供することができる任意の薬学上許容可能な塩、溶媒和物または任意の他の化合物に関する。しかしながら、薬学上許容不可能な塩は、薬学上許容可能な塩の調製に有用である可能性があるので、これも本発明の範囲内に含まれる。塩およびプロドラッグは、当該技術分野の状態において知られている方法によって調製することができる。
【００７１】
式（Ｉ）の化合物またはそのヒドロキシ酸形態のプロドラッグである任意の化合物は、本発明の範囲内にある。「プロドラッグ」という用語は、その最も広い意味で用いられ、本発明の化合物にインビボ（in  vivo）で転換されるこれらの誘導体を包含する。このような誘導体は、当業者には明らかであり、本発明の化合物の下記の誘導体、すなわちエステル、アミノ酸エステル、リン酸エステル、金属スルホン酸塩エステル、カルバメートおよびアミドが挙げられる。本発明による化合物は結晶形態、遊離化合物または溶媒和物（例えば、水和物）として存在することができ、両形態が本発明の範囲内にあると解釈される。溶媒和法は、当該技術分野の状態において一般に知られている。特定の態様では、溶媒和物は水和物である。
【００７２】
化合物ＮＳＴ００３７、またはそのヒドロキシ酸形態または上記ヒドロキシ酸の薬学上許容可能な塩を含む医薬組成物は、選択された投与経路、例えば、経口、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内経路など）、局所、直腸経路などによる投与に適する任意の製剤投与形態に処方することができる。非制限的実例としては、本発明によって提供される医薬組成物は、経口経路によって投与される固形製剤投与形態（例えば、顆粒剤、錠剤、カプセルなど）、経口経路によって投与される液状製剤投与形態（例えば、溶液、懸濁液、エマルションなど）、非経口経路によって投与される製剤投与形態（例えば、溶液、懸濁液、エマルションなど）に処方することができる。その目的のために、それぞれの場合に、適当な薬学上許容可能なビヒクルおよび賦形剤が、選択された製剤投与形態および投与経路について選択され、例えば、固形製剤投与形態の処方には結合剤、希釈剤、崩壊剤、滑沢剤、湿潤剤など、および液状製剤投与形態の処方には緩衝液、界面活性剤などが選択される。上記ビヒクルおよび賦形剤は、薬学上許容可能かつ薬理学的に許容性でなければならず、また治療を受ける患者に対して任意の有害効果を発揮することなく処方物の他成分と組み合わせることかできるものでなければならない。上記ビヒクルおよび賦形剤、並びに上記活性成分の上記製剤投与形態についての情報は、生薬調剤学（Galenic Pharmacy）の論文に見出すことかできる。一般的に、薬剤の様々な製剤投与形態およびそれらの製造方法の総説は、”Treated de Farmacia Galenica”（「生薬調剤学論文」）、C. Fauli i Trillo著、第１版、1993、Luzan 5, S.A. de Edicionesという書物に見出すことができる。
【００７３】
本発明によって提供される医薬組成物は、化合物ＮＳＴ００３７、またはそのヒドロキシ酸形態または上記ヒドロキシ酸の薬学上許容可能な塩を治療上有効量で含んでなる。本明細書の説明に用いられる方法では、「治療上有効量」という表現は、所望の効果を生じるように計算された化合物の量に関する。患者に投与される化合物ＮＳＴ００３７、またはそのヒドロキシ酸形態または上記ヒドロキシ酸の薬学上許容可能な塩の用量は、用いられる化合物の特徴、例えば、その生物学的半減期および活性、医薬組成物中の化合物の濃度、患者の臨床状態、病状の重篤度、選択された製剤投与形態など多数の要因に依存する広範囲内で変化することができる。本発明によって提供される医薬組成物は、１日１回以上予防または治療目的で投与することができ、あるいは必ずしも毎日ではないが、毎週正確な時間などの他の投与方式を行うことができる。
【００７４】
所望ならば、本発明によって提供される医薬組成物は、他の薬剤、例えば、神経変性疾患、認知衰退、望ましくない酸化に関連した疾患、年齢に関連した病理過程および早老症、癲癇、癲癇発作、痙攣、循環器疾患、または真菌またはウイルス感染症の治療に有用な薬剤と共に用いて、本発明によって提供される医薬組成物の効能を増加させることができ、このようにして併用療法が生じる。上記の追加薬剤は、同じ医薬組成物の一部を形成することができ、あるいは本発明によって提供される医薬組成物と同一時間に投与される（同時投与）または本発明によって提供される医薬組成物の投与とは異なる時間に投与される（逐次投与）別々の医薬組成物として提供することができる。
【００７５】
下記の実施例は、本発明を例示するためのものであり、発明を制限するものと考えるべきではない。
【実施例】
【００７６】
例１
（１Ｓ，２Ｓ，６Ｒ，８Ｓ，８ａＲ）−１，２，６，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−３，７−ジメチル−８−［２−［（２Ｒ，４Ｒ）−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−６−オキソ−２Ｈ−ピラン−２−イル］エチル］−１−ナフタレニル−２−エチル−ブチレートの合成
ＮＳＴ００３７として同定される化合物は、類似化合物についてのHoffman, et al. (J. Med. Chem., 1986, 29, 849-852)の方法に従って調製した。
【００７７】
１．１．ロバスタチンの精製
ロバスタチンは、天然起源の抽出物からヘキサンと酢酸エチルのグラディエントを溶離剤として用いるカラムクロマトグラフィーによって精製した。
【００７８】
１．２．モナコリンＪの取得
【化２】
0005759448.tif 000003
水酸化カリウム０．７ｇを水０．５ｍｌに溶解したものを調製し、メタノール３ｍｌを少しずつ加える。次いで、ロバスタチン０．５ｇを加え、溶液を２１時間還流させる。反応の処理後、モナコリンＪと開環生成物の５０％混合物が得られる。
【００７９】
１．３．保護誘導体の調製
【化３】
0005759448.tif 000004
モナコリンＪ  ０．５ｇをジクロロメタン１０ｍｌに溶解したものを調製する。イミダゾール０．４３４５ｇを加え、溶解するまで撹拌する。次いで、ジクロロメタン５ｍｌに溶解した塩化第三ブチルジメチルシラン０．４８３５ｇを加え、撹拌を２４時間継続する。反応を、ジクロロメタン−メタノール（１０：１）を溶離剤として用いてＴＬＣによって追跡する。収率：９６％。
【００８０】
１．４．アセチル化誘導体の調製
【化４】
0005759448.tif 000005
上記で得られた保護誘導体０．３ｇを、不活性雰囲気のフラスコ中ピリジン２ｍｌに溶解させる。次いで、ピリジン２ｍｌに溶解したＤＭＡＰ０．０６ｇを加える。反応フラスコを氷浴に入れ、２−エチルブチリルクロライド０．３７８ｍｌを加える。次いで、それを０℃で１時間および室温で１８時間撹拌する。反応を、ヘキサン−酢酸エチル（２：１）を溶離剤として用いてＴＬＣによって追跡する。収率：９５％。
【００８１】
１．５．最終化合物の合成
【化５】
0005759448.tif 000006
上記で得た誘導体０．３６８ｇを、ＴＨＦ２ｍｌに溶解させる。次いで、酢酸０．１６ｍｌと１Ｍフッ化テトラブチルアンモニウム２．１６ｍｌの溶液を反応培地に加える。反応混合物を、室温で１６時間撹拌する。反応を、ジクロロメタン−アセトン（６：１）を溶離剤として用いてＴＬＣによって追跡する。収率：７５％。
【００８２】
例２
様々な攻撃、すなわち酸化ストレス、小胞体ストレスおよびアポトーシスによって誘発される神経細胞死に対するＮＳＴ００３７による保護
２．１．酸化ストレスによって誘発される神経細胞死に対するＮＳＴ００３７による保護
アッセイは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から培養したヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞で行い、総ての場合に、無菌の厳格な規則に従い、操作は欧州スタンダードＥＮ１２４６９に従ってクラスＩＩの生物学的安全キャビネットで行った。細胞は、以下の培地、すなわち１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．０５ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１０％ウシ胎仔血清を補足した最小必須イーグル培地（ＭＥＭ）に保持した。
【００８３】
酸化的損傷を生じ（過酸化水素、スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシルラジカルのようなフリーラジカルを生じ）、これが細胞死を誘発するキサンチン／キサンチンオキシダーゼの投与によって引き起こされる細胞死の化合物ＮＳＴ００３７によって引き起こされる阻害を分析した。１５継代を超過しないこれらの細胞を、接着細胞用に処理した９６ウェルプレートに５ｘ１０４個／ウェルの細胞濃度で播種し、プレートの３ウェルをアッセイのそれぞれの条件について播種した。
【００８４】
３７℃および５％ＣＯ２で２４時間細胞インキュベーションした後、細胞処理を総容積１００μｌで、下記の条件について行った：
コントロール：培養基（培地）
キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ）：培地＋１０μＭキサンチン／６０ｍＵ／ｍｌキサンチンオキシダーゼ、細胞の５０％の死を引き起こす。
ＸＸＯ＋ＮＳＴ００３７：培地＋ＸＸＯ（１０μＭ／６０ｍＵ／ｍｌ）＋１、４、１０、２０、４０または１００μＭのＮＳＴ００３７。
【００８５】
細胞を、これらの処理と共に（３７℃および５％ＣＯ２で）２２時間インキュベーションした後、ＷＳＴ−１試薬(Roche)を加えた。ＷＳＴ−１試験は、代謝活性の測定に基づいている。細胞損傷は、その代謝機能および細胞増殖の維持に必要なエネルギーを得るための細胞の能力の喪失を引き起こすので、代謝活性（生）細胞は、（ミトコンドリア呼吸鎖の）スクシネート−テトラゾリウムレダクターゼ系によりテトラゾリウム塩をホルマザンへ還元する。形成されるホルマザンは４４０ｎｍに吸光度を有するので、比色法によって検出することができる。読み取りは、試薬を加えてから２時間後に４４０ｎｍでプレートリーダーを用いて行った。
【００８６】
得られた結果は、図１に示されるように、ＸＸＯによって引き起こされる死に関係するそれぞれの処理についての細胞死の割合として示される。死からの保護は、１〜１００μＭＮＳＴ００３７で観察され、ＸＸＯに関する差はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定によれば評価した総ての濃度について統計学的に有意であり、２０μＭでは７８％の最大保護に達した。これらの結果は、化合物ＮＳＴ００３７が、酸化ストレスによって引き起こされるニューロン起源のヒト細胞の死からの保護効果を示すことを示唆している。
【００８７】
２．２．小胞体ストレスによって誘発される神経細胞死からのＮＳＴ００３７による保護
アッセイは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から培養したヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞で行い、総ての場合に、無菌の厳格な規則に従い、操作は欧州スタンダードＥＮ１２４６９に従ってクラスＩＩの生物学的安全キャビネットで行った。細胞は、以下の培地、すなわち１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．０５ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１０％ウシ胎仔血清を補足した最小必須イーグル培地（ＭＥＭ）に保持した。
【００８８】
網様ストレス（ｒｅｔｉｃｕｌａｒ  ｓｔｒｅｓｓ）を生じるツニカマイシンの投与によって引き起こされる細胞死の化合物ＮＳＴ００３７によって引き起こされる阻害を分析した。ツニカマイシンはタンパク質Ｎ−グリコシル化の阻害薬であり、小胞体で折り重なる異常タンパク質を生じるので、上記タンパク質が蓄積してストレスを引き起こし、細胞死を生じるのである。１５継代を超過しないこれらの細胞を、接着細胞用に処理した９６ウェルプレートに５ｘ１０４個／ウェルの細胞濃度で播種し、プレートの３ウェルをアッセイのそれぞれの条件について播種した。
【００８９】
３７℃および５％ＣＯ２で２４時間細胞インキュベーションした後、細胞処理を総容積１００μｌで、下記の条件について行った：
コントロール：培養基（培地）
ツニカマイシン（Ｔｍ）：培地＋２４μＭツニカマイシン、細胞の５０％の死を引き起こす。
Ｔｍ＋ＮＳＴ００３７：培地＋Ｔｍ（２４μＭ）＋１、４、１０、２０、４０または１００μＭのＮＳＴ００３７。
【００９０】
細胞を、これらの処理と共に（３７℃および５％ＣＯ２で）２２時間インキュベーションした後、ＷＳＴ−１試薬（Roche）を加えた。ＷＳＴ−１試験は、代謝活性の測定に基づいている。細胞損傷は、その代謝機能および細胞増殖の維持に必要なエネルギーを得るための細胞の能力の喪失を引き起こすので、代謝活性（生）細胞は、（ミトコンドリア呼吸鎖の）スクシネート−テトラゾリウムレダクターゼ系によりテトラゾリウム塩をホルマザンへ還元する。形成されるホルマザンは４４０ｎｍに吸光度を有するので、比色法によって検出することができる。読み取りは、試薬を加えてから２時間後に４４０ｎｍでプレートリーダーを用いて行った。
【００９１】
得られた結果は、図２に示されるように、Ｔｍによって引き起こされる死に関係するそれぞれの処理についての細胞死の割合として示される。死からの保護は、１〜１００μＭＮＳＴ００３７で観察され、４０μＭでは５５％に達した。これらの結果は、化合物ＮＳＴ００３７が、小胞体ストレスによって引き起こされるニューロン起源のヒト細胞の死からの保護効果を示すことを示唆している。
【００９２】
２．３．アポトーシスによって誘発される神経細胞死からのＮＳＴ００３７による保護
アッセイは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から培養したヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞で行い、総ての場合に、無菌の厳格な規則に従い、操作は欧州スタンダードＥＮ１２４６９に従ってクラスＩＩの生物学的安全キャビネットで行った。細胞は、以下の培地、すなわち１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．０５ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１０％ウシ胎仔血清を補足した最小必須イーグル培地（ＭＥＭ）に保持した。
【００９３】
細胞周期停止を生じるカンプトテシンの投与によって引き起こされる細胞死の化合物ＮＳＴ００３７によって引き起こされる阻害を分析した。カンプトテシンはトポイソメラーゼＩの阻害薬であるので、ＤＮＡ複製を妨げ、細胞周期停止を引き起こし、アポトーシスによる死を生じるのである。１５継代を超過しないこれらの細胞を、接着細胞用に処理した９６ウェルプレートに５ｘ１０４個／ウェルの細胞濃度で播種し、プレートの３ウェルをアッセイのそれぞれの条件について播種した。
【００９４】
３７℃および５％ＣＯ２で２４時間細胞インキュベーションした後、細胞処理を総容積１００μｌで、下記の条件について行った：
コントロール：培養基（培地）
カンプトテシン（ＣＰＴ）：培地＋２０ｎｍカンプトテシン、細胞の５０％の死を引き起こす。
カンプトテシン＋ＮＳＴ００３７：培地＋カンプトテシン（２０ｎｍ）＋１、４、１０、２０、４０または１００μＭのＮＳＴ００３７。
【００９５】
細胞を、これらの処理と共に（３７℃および５％ＣＯ２で）２２時間インキュベーションした後、ＷＳＴ−１試薬（Roche）を加えた。ＷＳＴ−１試験は、代謝活性の測定に基づいている。細胞損傷は、その代謝機能および細胞増殖の維持に必要なエネルギーを得るための細胞の能力の喪失を引き起こすので、代謝活性（生）細胞は、（ミトコンドリア呼吸鎖の）スクシネート−テトラゾリウムレダクターゼ系によりテトラゾリウム塩をホルマザンへ還元する。形成されるホルマザンは４４０ｎｍに吸光度を有するので、比色法によって検出することができる。読み取りは、試薬を加えてから２時間後に４４０ｎｍでプレートリーダーを用いて行った。
【００９６】
得られた結果は、図３に示されるように、カンプトテシンによって引き起こされる死に関係するそれぞれの処理についての細胞死の割合として示される。死からの保護は、４〜１００μＭＮＳＴ００３７で観察され、４、１０、４０および１００μＭではそれぞれ１８％、２８％、２７％および２７％％に達した。これらの結果は、化合物ＮＳＴ００３７が、細胞周期停止によって引き起こされるニューロン起源のヒト細胞の死からの保護効果を示すことを示唆している。
【００９７】
２．４．フローサイトメトリーによるアポトーシスの阻害の測定
アッセイは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から培養したヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞で行い、総ての場合に、無菌の厳格な規則に従い、操作は欧州スタンダードＥＮ１２４６９に従ってクラスＩＩの生物学的安全キャビネットで行った。細胞は、以下の培地、すなわち１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．０５ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１０％ウシ胎仔血清を補足した最小必須イーグル培地（ＭＥＭ）に保持した。
【００９８】
ＤＮＡ複製を妨げアポトーシスによる細胞死を誘発する酵素トポイソメラーゼＩを阻害するカンプトテシンの投与によって引き起こされるアポトーシス（プログラミングされた細胞死）からの化合物ＮＳＴ００３７によって引き起こされる阻害を分析した。１５継代を超過しないこれらの細胞を、接着細胞用に処理した６ウェルプレートに８ｘ１０５個／ウェルおよび７ｘ１０５個／ウェルの細胞濃度で前処理を有するアッセイのために播種し、プレートの２ウェルをアッセイのそれぞれの条件について播種した。
【００９９】
３７℃および５％ＣＯ２で２４時間細胞インキュベーションした後、細胞処理を総容積２ｍｌで、下記の条件について行った：
コントロール：培養基（培地）
カンプトテシン：培地＋５０μＭカンプトテシン。
カンプトテシン＋Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ：培地＋５０μＭカンプトテシン＋５０μＭＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、ポジティブ阻害コントロール。
カンプトテシン＋ＮＳＴ００３７：培地＋５０μＭカンプトテシン＋１０、４０または１００μＭのＮＳＴ００３７。
【０１００】
前処理を有するアッセイでは、細胞を予め４０μＭＮＳＴ００３７、１００μＭメバロン酸塩または両方一緒で２４時間処理した後、５０μＭカンプトテシンで処理し、手順の残りは、前処理なしのアッセイと同様であった。
【０１０１】
細胞を、これらの処理を用いて（３７℃および５％ＣＯ２で）６時間インキュベーションした後、培地と共に回収して、３００ｘｇで５分間遠心分離した。培地を除去し、ＰＢＳで洗浄し、細胞を７０％エタノール５００μｌで−２０℃にて２分間固定した。固定の後、細胞を４００ｘｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、サイクリング用緩衝液（０．１％クエン酸ナトリウム、０．３％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０および０．０２ｍｇ／ｍｌＲＮアーゼ）で希釈した０．０５ｍｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムを加え、３７℃で１時間インキュベーションした。次いで、ヨウ化プロピジウムの蛍光をＤＮＡの量に対して比較して、フローサイトメトリーによって分析した。アポトーシスの割合を、それぞれの条件のサブＧ１領域について測定した。
【０１０２】
得られた結果は、図４ＡおよびＢに見られるように、カンプトテシンによって引き起こされるアポトーシスに関するそれぞれの処理のアポトーシスの阻害率として示される。４０および１００μＭＮＳＴ００３７では、１８％の最大保護が観察されたので（図４Ａ）、この化合物は、ニューロン起源のヒト細胞におけるアポトーシスの保護効果を示す。特定のカスパーゼ阻害薬であるＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋは、カンプトテシンによって引き起こされるアポトーシスを特異的に阻害した。これらの結果は、保護率を増加させる（４５％にまで達する）４０μＭＮＳＴ００３７の前処理の実験によって確認された（図４Ｂ）。その上、ＮＳＴ００３７によって発揮される保護は、メバロン酸塩を培地に加えることによって部分的に阻害されるのであり、これはＮＳＴ００３７の神経保護効果がコレステロール生合成またはその経路の前駆体の１つに関係していることを示している。
【０１０３】
例３
興奮毒性物質によって引き起こされる海馬における神経細胞死、認識欠損および死に対するＮＳＴ００３７による保護
３．１．興奮毒性物質によって引き起こされる海馬の神経細胞死に対するＮＳＴ００３７の保護効果
例２の結果に基づいて、本発明者らは、ヒトコリン作動性ニューロンで明らかにされたＮＳＴ００３７の神経保護効果がカイネート（ＫＡ）の投与によるマウスの散発性アルツハイマー病のモデルで確認されるかどうかを検討することにした。
【０１０４】
実験過程に含まれる総ての動物は、１２週齢の雄ＦＶＢ／ＮＨａｎ系であった。実験は、動物の操作指針（the Guidance on the Operarion of Animals）(Scientific Procedures, Act.1986)に厳密に従って行った。動物はそれぞれの検疫期間を有し、接種および取り扱いには汚染の可能性を最小限にするために最大限の注意を持って処理した。
【０１０５】
このアッセイには２８匹の動物を用い、投与は総て下記の方式に従って１００μｌの容量の腹腔内（ｉ．ｐ．）経路によって行った：
ｉ）  ＰＢＳ＋ＰＢＳ＋ＰＢＳ方式：４匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間投与し、２日目に動物に新たな用量のＰＢＳを接種し、次の７日間はＰＢＳの１日量を接種した。
ｉｉ）  ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＰＢＳ方式：６匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間投与し、２日目に動物にカイネート２５ｍｇ／ｋｇを接種し、次の７日間はＰＢＳの１日量を接種した。
ｉｉｉ）  ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７方式：７匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間投与し、２日目に動物にカイネート２５ｍｇ／ｋｇを接種し、次の７日間はＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量を接種した。
ｉｖ）  ＮＳＴ００３７＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７方式：６匹の動物に最初にＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇを１日量で２日間投与し、２日目に動物にカイネート２５ｍｇ／ｋｇを接種し、次の７日間はＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量を接種した。
ｖ）  ＮＳＴ００３７＋ＰＢＳ＋ＮＳＴ００３７方式：５匹の動物に最初にＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇを１日量で２日間投与し、２日目に動物にＰＢＳの用量を接種し、次の７日間はＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量を接種した。
【０１０６】
７日間の処理時間が終了した後、動物を屠殺し、脳を切開した。脳試料を処理し、パラフィンで包んだ。ヘマトキシリンおよびエオシン染色を５μｍ厚さの切片に用いて、海馬の細胞構造を分析した。
【０１０７】
図５に示されるように、ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＰＢＳ投与方式は、マウスの海馬のＣＡ１およびＣＡ２領域に重篤なニューロン損傷を生じた。上記群の試料では、ニューロンの非存在、壊死の証拠および多数の核濃縮が観察され、神経細胞死を示している。しかしながら、ＮＳＴ００３７＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７群の試料は、コントロール（ＰＢＳ＋ＰＢＳ＋ＰＢＳ群）と同じ細胞構造を示し、ＣＡ１およびＣＡ２領域における細胞損傷の証拠はなかった。更に、驚くべきことには、ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７群の試料は、海馬における損傷と神経細胞死の幾つかの徴候を示した。しかしながら、ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＰＢＳ群の試料をＰＢＳ＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７群の試料と視覚的に比較したところ、損傷のない海馬のニューロンが多数ＮＳＴ００３７投与群に観察され、その神経保護効果を示していた。最後に、ＮＳＴ００３７＋ＰＢＳ＋ＮＳＴ００３７群の試料は、ＰＢＳ＋ＰＢＳ＋ＰＢＳ群の動物で観察されたのと同じパターンを示した。
【０１０８】
要約すれば、ＮＳＴ００３７（ＮＳＴ００３７＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７群）による前処理は、海馬のＣＡ１およびＣＡ２領域におけるＫＡによって引き起こされる神経細胞死から完全に保護した。更に、ＫＡを接種した後のＮＳＴ００３７の投与開始は、この領域における神経細胞死および損傷を定性的に減少した。また、ＮＳＴ００３７の８日間毎日投与はマウスにとって神経毒性を示さないことも明らかになった。
【０１０９】
３．２．興奮毒性物質によって引き起こされるマウスのエピソードタイプの記憶劣化に対するＮＳＴ００３７の保護効果
ＫＡによって引き起こされる興奮毒性は、マウスにそれを接種してから数日後にエピソードタイプ記憶劣化を誘発し、一時性記憶に影響を及ぼし、重篤な空間的記憶欠損を引き起こす。その結果として、本発明者らは、ＮＳＴ００３７の神経保護効果が興奮毒性物質の効果によって劣化する記憶の保護を伴うかどうかを検討することにした。
【０１１０】
実験過程に含まれる総ての動物は、１２週齢の雄ＦＶＢ／ＮＨａｎ系であった。実験は、動物の操作指針(Scientific Procedures, Act.1986)に厳密に従って行った。動物はそれぞれの検疫期間を有し、接種および取り扱いには汚染の可能性を最小限にするために最大限の注意を持って処理した。
【０１１１】
このアッセイには２８匹の動物を用い、投与は総て下記の方式に従って１００μｌの容量の腹腔内（ｉ．ｐ．）経路によって行った：
ｉ）  ＰＢＳ＋ＰＢＳ＋ＰＢＳ方式：４匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間投与し、２日目に動物に新たな用量のＰＢＳを接種し、次の３日間はＰＢＳの１日量を接種した。
ｉｉ）  ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＰＢＳ方式：６匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間投与し、２日目に動物にカイネート２５ｍｇ／ｋｇを接種し、次の３日間はＰＢＳの１日量を接種した。
ｉｉｉ）  ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７方式：７匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間投与し、２日目に動物にカイネート２５ｍｇ／ｋｇを接種し、次の３日間はＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量を接種した。
ｉｖ）  ＮＳＴ００３７＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７方式：６匹の動物に最初にＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇを１日量で２日間投与し、２日目に動物にカイネート２５ｍｇ／ｋｇを接種し、次の３日間はＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量を接種した。
ｖ）  ＮＳＴ００３７＋ＰＢＳ＋ＮＳＴ００３７方式：５匹の動物に最初にＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇを１日量で２日間投与し、２日目に動物にＰＢＳの用量を接種し、次の３日間はＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量を接種した。
【０１１２】
ＫＡの接種３日後、一体化記憶試験（ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｍｅｍｏｒｙ  ｔｅｓｔ）と呼ばれる対象認識試験を動物について行った。図６は、新しい対象（一時性記憶）に比較した古い対象の検査時の関係の結果を示す。ＮＳＴ００３７＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７投与方式による群は、ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＰＢＳ群のマウスと比較して一時性記憶容量の減少を防止することが観察された。更に、ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７群の動物は、ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＰＢＳ群を投与した動物と比較して一時性記憶の状態の改善も示した。これらのデーターは、ＮＳＴ００３７＋ＰＢＳ＋ＮＳＴ００３７方式によるマウスの群はＰＢＳ＋ＰＢＳ＋ＰＢＳ群と比較して一時性記憶の改善も示した。
【０１１３】
図７は、非置換の古い対象（空間的記憶）と比較して置換された古い対象の検査の経時的関係の結果を示している。ＮＳＴ００３７＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７またはＮＳＴ００３７＋ＰＢＳ＋ＮＳＴ００３７投与方式のマウスの群は、ＰＢＳ＋ＰＢＳ＋ＰＢＳ群に対して差は見られなかったので、空間的記憶は損なわれていないことを示す対象の検査の関係を示した。しかしながら、ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＰＢＳ群のマウスは、空間的記憶の重篤な劣化を示した。ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７投与群は、ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＰＢＳ群を投与したものに比較してこのタイプの記憶の改善を示した。
【０１１４】
これらの検討は、興奮毒性物質による損傷の前および後（または後のみ）の化合物ＮＳＴ００３７の投与は、興奮毒性物質の投与後に劣化するエピソード性（一時性および空間的）記憶に対して保護効果を有することを示している。
【０１１５】
３．３．興奮毒性物質によって引き起こされる死に対するＮＳＴ００３７の保護効果
動物へ興奮毒性物質を投与すると、幾つかの場合には、動物の死が誘発されることが知られている。その結果として、本発明者らは、ＮＳＴ００３７の神経保護効果が興奮毒性物質によって引き起こされる死亡率の減少を伴うかどうかを検討することにした。
【０１１６】
実験過程に含まれる総ての動物は、１２週齢の雄ＦＶＢ／ＮＨａｎ系であった。実験は、動物の操作指針(Scientific Procedures, Act.1986)に厳密に従って行った。動物はそれぞれの検疫期間を有し、接種および取り扱いには汚染の可能性を最小限にするために最大限の注意を持って処理した。
【０１１７】
このアッセイには２８匹の動物を用い、投与は総て下記の方式に従って１００μｌの容量の腹腔内（ｉ．ｐ．）経路によって行った：
ｖｉ）  ＰＢＳ＋ＰＢＳ＋ＰＢＳ方式：４匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間投与し、２日目に動物に新たな用量のＰＢＳを接種し、次の３日間はＰＢＳの１日量を接種した。
ｖｉｉ）  ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＰＢＳ方式：６匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間投与し、２日目に動物にカイネート２５ｍｇ／ｋｇを接種し、次の３日間はＰＢＳの１日量を接種した。
ｖｉｉｉ）  ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７方式：７匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間投与し、２日目に動物にカイネート２５ｍｇ／ｋｇを接種し、次の３日間はＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量を接種した。
ｉｘ）  ＮＳＴ００３７＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７方式：６匹の動物に最初にＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇを１日量で２日間投与し、２日目に動物にカイネート２５ｍｇ／ｋｇを接種し、次の３日間はＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量を接種した。
ｘ）  ＮＳＴ００３７＋ＰＢＳ＋ＮＳＴ００３７方式：５匹の動物に最初にＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇを１日量で２日間投与し、２日目に動物にＰＢＳの用量を接種し、次の３日間はＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量を接種した。
【０１１８】
死を、継続したアッセイの全時間にわたって記録し、結果をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線によって図８に示す。ＫＡによって引き起こされる死亡率の検討の結果は、ＮＳＴ００３７＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７投与方式による群は、興奮毒性物質によって引き起こされる損傷に関連した死から保護されることを示した。更に、一層重要なことには、ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７投与方式による群の動物の生存は、ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＰＢＳ方式による群と比較して増加する。
【０１１９】
これらの検討は、興奮毒性物質による損傷の前および後（または後のみ）の化合物ＮＳＴ００３７の投与は、興奮毒性物質の投与によって引き起こされる死亡率に対して保護効果を有することを示している。  
【０１２０】
例４
興奮毒性物質の作用に対するＮＳＴ００３７の抗癲癇性効果
動物へ興奮毒性物質を投与すると、幾つかの場合には、動物に癲癇発作および痙攣が誘発されることが知られている。その結果として、本発明者らは、ＮＳＴ００３７の神経保護効果が興奮毒性物質によって引き起こされる死亡率の減少を伴うかどうかを検討することにした。
【０１２１】
実験過程に含まれる総ての動物は、１２週齢の雄ＦＶＢ／ＮＨａｎ系であった。実験は、動物の操作指針(Scientific Procedures, Act.1986)に厳密に従って行った。動物はそれぞれの検疫期間を有し、接種および取り扱いには汚染の可能性を最小限にするために最大限の注意を持って処理した。
【０１２２】
動物に、カイネート（ＫＡ）２５ｍｇ／ｋｇをＰＢＳに溶解したものを腹腔内接種した。１３匹の動物にＫＡ接種の２４および０．５時間前に、ＰＢＳ（ＰＢＳ＋ＫＡ投与方式）を腹腔内投与によって前投与し、６匹にＫＡ接種の２４および０．５時間前に、ＮＳＴ００３７を５０ｍｇ／ｋｇの用量（ＮＳＴ００３７＋ＫＡ投与方式）で腹腔内投与によって前投与した。接種後、動物をトレイに１匹ずつ収容して観察した。動物の最大癲癇レベルを、Ｒａｃｉｎｅスケールに従って観察中１０分毎にかつ少なくとも接種後１２０分間（ｍ．ｐ．ｉ．）記録した。
【０１２３】
次に、ＰＢＳ（ＰＢＳ＋ＫＡ）とＮＳＴ００３７（ＮＳＴ００３７＋ＫＡ）の投与の間の癲癇誘発徴候の比較検討を行った。癲癇重積持続状態、すなわち、強直性間代性発作に入った動物の割合には差が見られ、ＰＢＳ＋ＫＡ投与方式群では７６．９％（１３匹中１０匹）であったのと比較してＮＳＴ００３７＋ＫＡ群では３３．３％（６匹中２匹）であり、化合物ＮＳＴ００３７は抗癲癇性かつ抗痙攣性であることを示している。最初の痙攣が起きた時間（潜伏期）にも差が見られ、ＮＳＴ００３７＋ＫＡ群の潜伏期（１０３．３±１３．１分間）は、図９に示されるように、ＰＢＳ＋ＫＡ投与方式によるものより大きく（７４．６±８．６分間）、これは化合物ＮＳＴ００３７の抗癲癇および抗痙攣効果を示している。これらの結果に基づいて、本発明者らは、抗癲癇および抗痙攣効果が癲癇レベルおよび症状の重篤度によって確かめられるかどうかを検討することにして、ＰＢＳ＋ＫＡ方式による群の動物がＲａｃｉｎｅスケールで癲癇レベル４に達したのに対して、ＮＳＴ００３７＋ＫＡ方式ではいずれの時間にも上記スケールで癲癇レベル３を生じないことが観察され、化合物ＮＳＴ００３７が抗癲癇性および抗痙攣性であることを示していた。更に、１００ｍ．ｐ．ｉ．に基づいて、ＮＳＴ００３７＋ＫＡ方式は癲癇誘発症状を消失させたのに対して、ＰＢＳ＋ＫＡ方式は重篤な発作および痙縮を示した。
【０１２４】
これらの検討は、化合物ＮＳＴ００３７が興奮毒性物質の投与による抗癲癇および抗痙攣効果を有することを示している。
【０１２５】
例５
マウスの内因性高脂血症モデルにおけるＮＳＴ００３７のＨＭＧＲの阻害活性および低コレステロール血症効果
５．１．ＮＳＴ００３７のＨＭＧＲ酵素活性に対する阻害効果
化合物の性質により、ＨＭＧＲ酵素は細胞のコレステロール合成および上記合成の生理学的調節に重要であるので、化合物ＮＳＴ００３７によるＨＭＧＲ酵素の阻害の程度を測定した。この化合物の効果を、ＨＭＧＲに対する強力な阻害効果が既に報告されている２種類の既知スタチン類であるアトルバスタチンおよびシンバスタチンの効果と比較した。反応のため、ＨＭＧＲはＮＡＤＰＨを還元剤として、および３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧＣｏＡ）を基質として用い、メバロン酸、ＣｏＡＳＨおよびＮＡＤＰ＋を生成する。ＮＡＤＰＨ（３４０ｎｍ）が吸収される吸光度の減少は、ＨＭＧＲの触媒活性を直接測定するものであり、様々な化合物の阻害率の計算に役立つ。ＨＭＧＲ阻害を測定するため、アッセイを９６−ウェルプレートで総反応容量が２００μｌで行った。反応緩衝液（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４、１ｍＫＣｌ、２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］および５ｍＭＤＴＴ、ｐＨ＝７．３）は、反応を行うときに調製し、３７℃に保持した。下記のものが、アッセイに含まれた：
ブランク：反応についてＮＡＤＰＨの安定性について報告するＨＭＧＲを欠く。
コントロール：反応の総ての成分を含むが、試験化合物を欠く。
試験化合物：幾つかの濃度のＮＳＴ００３７、アトルバスタチン、およびシンバスタチン。この化合物の酸形態を、総ての場合に用いる。
【０１２６】
５つの独立した分析をＮＳＴ００３７で行い、４つの独立した分析をアトルバスタチンで、また６つの独立した分析をシンバスタチンで行い、阻害力をＮＡＤＰＨの低下の３７℃における分光光度測定による５０％阻害定数（ＩＣ５０）を確定できる、図１１に示される濃度範囲で測定した。３４０ｎｍの吸光度の減少により、コントロールに対するＨＭＧＲ酵素活性の割合を計算できる。ＩＣ５０は、Ｔｒｉｍｍｅｄ  Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法（Ｖｅｒｓｉｏｎ１．５）によって測定した。これらの結果は、ＮＳＴ００３７の阻害力がより強力なスタチンであるアトルバスタチンの阻害力に驚くほど近く、シンバスタチンの７．５倍の強さであり、ＨＭＧＲの明らかな阻害効果を示している。
【０１２７】
５．２．内因性高脂血症モデル（家族性）におけるＮＳＴ００３７の低コレステロール血症効果
上記点の結果に基づいて、本発明者らは、化合物ＮＳＴ００３７によるＨＭＧＲ酵素の阻害活性が、マウスの内因性高脂血症モデルにおける総コレステロールおよびその画分の変化に対応するかどうかを検討することにした。
【０１２８】
実験過程に含まれる総ての動物は、４６週齢の雄ＡｐｏＢ１００系であり、この系は血液からのコレステロールの除去に欠損を有し、血漿コレステロールの異常に高い増加を引き起こすものであった。実験は、動物の操作指針(Scientific Procedures, Act.1986)に厳密に従って行った。動物はそれぞれの検疫期間を有し、接種および取り扱いには汚染の可能性を最小限にするために最大限の注意を持って処理した。
【０１２９】
絶食動物について実験を行うため、血液は眼穿刺によって抜き取った。血漿を上記血液から得て、検討中の物質を投与する前に血漿総コレステロールレベルおよびその画分のレベルを測定した。その直後に、動物に、それぞれの試験化合物５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内に接種した。４匹の動物にビヒクルを投与して、コントロール群とした。第二群の５匹のマウスには、シンバスタチン５０ｍｇ／ｋｇを投与した。最後に、第三群の５匹のマウスに、ＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇを投与した。投与の１２時間後に、血液を絶食動物から採取し、上記血液から血漿を得た。図１２は、初期時間（ｔ０）および様々なマウス群へのビヒクル、シンバスタチンまたはＮＳＴ００３７の投与の１２時間後（ｔ１２）の血漿コレステロールレベルを示しており、両化合物は有意な低コレステロール血症効果を示している。様々なコレステロール画分に関して、両化合物は、図１３〜１５に示されるように、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−ｃ）および極低密度リポタンパク質コレステロール（ＶＬＤＬ−ｃ）レベルをかなり減少させたが、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−ｃ）レベルを変化させなかった。遊離コレステロール（ＦＣ）およびエステル化コレステロール（ＥＣ）レベルに関しては、両化合物は、図１６および１７に示されるように、ＥＣレベルを同様に減少させたが、ＦＣレベルは変化させなかった。
【０１３０】
この節に示されている結果は、化合物ＮＳＴ００３７が、驚くべきことにはシンバスタチンと同様の効果を示し、ＴＣ、ＬＤＬ−ｃ、ＶＬＤＬ−ｃおよびＥＣレベルを有意に減少させるが、ＨＤＬ−ｃまたはＦＣレベルは変化させないことを示している。
【０１３１】
例６
マウスの誘発高脂血症モデルにおけるＮＳＴ００３７の低コレステロール血症効果
ＡｐｏＢ１００動物を用いた実験で得られた結果に基づいて、本発明者らは、化合物ＮＳＴ００３７が誘発急性高脂血症モデルにおいても低コレステロール血症効果を示すかどうかを検討することにした。
【０１３２】
実験過程に含まれる総ての動物は、野生型の６週齢のＣ５７ＢＬ６系マウスであった。実験は、動物の操作指針(Scientific Procedures, Act.1986)に厳密に従って行った。動物はそれぞれの検疫期間を有し、接種および取り扱いには汚染の可能性を最小限にするために最大限の注意を持って処理した。
【０１３３】
絶食動物について実験を行うため、血液は眼穿刺によって抜き取った。血漿を上記血液から得て、検討中の物質を投与する前に血漿総コレステロールレベルおよびその画分のレベルを測定した。その直後に、動物に、Ｔｙｌｏｘａｐｏｌとしても知られているＴｒｉｔｏｎ１３３９  ５００ｍｇ／ｋｇを腹腔内に接種した。３０分後に、動物に、それぞれの試験化合物５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内に接種した。７匹の動物にビヒクルのみを投与して、コントロール群とした。第二群の６匹のマウスには、シンバスタチン５０ｍｇ／ｋｇを投与した。最後に、第三群の７匹のマウスに、ＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇを投与した。投与の２４時間後に、血液を絶食動物から採取し、上記血液から血漿を得た。図１８は、総コレステロールが様々な群のマウスにおいて、Ｔｒｉｔｏｎ１３３９に続いてビヒクル、シンバスタチンまたはＮＳＴ００３７の投与の２４時間後に増加する倍数を示し、両試験化合物が低コレステロール血症効果を有するが、ＮＳＴ００３７の投与の場合にのみ統計学的に有意であることを示している。様々なコレステロール画分に関しては、両化合物は低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−ｃ）レベルを減少させたが、上記減少はＮＳＴ００３７の場合にのみ統計学的に有意であった。シンバスタチンだけは、図１９〜２１に示されるように、極低密度リポタンパク質コレステロール（ＶＬＤＬ−ｃ）レベルを減少させたが、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−ｃ）レベルはこれらの２化合物のいずれでも変化しなかった。シンバスタチンと異なり、ＮＳＴ００３７は、図２２に示されるように、エステル化コレステロール（ＥＣ）レベルを減少させた。遊離コレステロール（ＦＣ）レベルに関しては、両化合物は、図２３に示されるように、この画分のレベルを同様に減少させた。  
【０１３４】
この節で示された結果は、驚くべきことには化合物ＮＳＴ００３７がシンバスタチンと同じかまたはより大きい低コレステロール血症効果を有し、ＴＣおよびＬＤＬ−ｃレベル統計学的に有意に減少させることを示している。これらの結果から、ａｐｏＢ１００マウスモデルで観察されたＮＳＴ００３７の低コレステロール血症効果が確かめられる。
【０１３５】
例７
ゼブラフィッシュ胚におけるＮＳＴ００３７の生物安全性
７．１．シンバスタチンと比較した化合物ＮＳＴ００３７の生存率の分析
化合物ＮＳＴ００３７の生物安全性を評価するため、ゼブラフィッシュ胚モデルについてのその毒物学的効果をＯＥＣＤ  Ｃ１５プロトコルの安全性パラメーターを測定することによって分析した。
【０１３６】
受精卵を、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ，ＡＢ系）の自然交配によって得た。それぞれの交配には全部で８〜１０対を用い、総数が２００〜２５０個の卵が対当たり平均して生まれた。卵を産卵直後に集め、EC Regulation 440/2008、方法Ｃ．１に従って、ｐＨを７．８±０．２に調整した希釈水（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ２  ０．２９ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２  ０．１２ｇ／ｌ、ＮａＨＣＯ３  ０．０６５ｇ／ｌ、ＫＣｌ  ０．００６ｇ／ｌ）で洗浄し、ペトリ皿に置いた。
【０１３７】
発生の最初期段階で確実に暴露するため、卵（条件当たり最低５０個）を、試験を行う化合物の溶液を入れた別のペトリ皿に速やかに移した。続いて、受精卵のみ（実験条件当たり１０個）を、ピペットでペトリ皿から暴露チャンバー（Ｍ２４マイクロタイタープレート）へ移し、試験を行う物質（ＮＳＴ００３７またはシンバスタチン）に希釈水（コントロール）または様々な濃度の投与物と共に暴露した。胚を、更にエアレーションすることなく、適当な温度（２５±１℃）、および１２時間明／１２時間暗の方式でインキュベーションした。それぞれの実験は、３回ずつ行った。
【０１３８】
検討は、受精後全部で９日間行い、処理は毎日更新し、半静的アッセイを行った。処理は、下記の方式に従って行った：
希釈水を、アッセイが継続した９日間毎日取り替えながら投与した１０匹のコントロール動物。
希釈水で希釈した化合物ＮＳＴ００３７を、アッセイが継続した９日間毎日取り替えながら投与した３０匹の動物（１０個の胚、３組）。
希釈水で希釈した化合物シンバスタチンを、アッセイが継続した９日間毎日取り替えながら投与した３０匹の動物（１０個の胚、３組）。
【０１３９】
胚−幼生の死亡率をアッセイの全期間について記録し、結果をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線によって図２４および２５に示した。検討中の２種類の物質によって誘発された死亡率の検討結果は、化合物ＮＳＴ００３７が、評価した用量ではシンバスタチンより驚くほど安全であり、生存率曲線は両処理を比較したところ、統計学的に異なっていた。
【０１４０】
７．２．シンバスタチンと比較した化合物ＮＳＴ００３７の経時的半数致死量の分析
前節の結果に基づいて、本発明者らは、シンバスタチンと比較して化合物ＮＳＴ００３７の一層高い生物安全性が半数致死量（ＬＤ５０）の経時的分析によって確認されるかどうかを検討することにした。
【０１４１】
受精卵を、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ，ＡＢ系）の自然交配によって得た。それぞれの交配には全部で８〜１０対を用い、総数が２００〜２５０個の卵が対当たり平均して生まれた。卵を産卵直後に集め、EC Regulation 440/2008、方法Ｃ．１に従って、ｐＨを７．８±０．２に調整した希釈水（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ２  ０．２９ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２  ０．１２ｇ／ｌ、ＮａＨＣＯ３  ０．０６５ｇ／ｌ、ＫＣｌ  ０．００６ｇ／ｌ）で洗浄し、ペトリ皿に置いた。
【０１４２】
発生の最初期段階で確実に暴露するため、卵（条件当たり最低５０個）を、試験を行う化合物の溶液を入れた別のペトリ皿に速やかに移した。続いて、受精卵のみ（実験条件当たり１０個）を、ピペットでペトリ皿から暴露チャンバー（Ｍ２４マイクロタイタープレート）へ移し、試験を行う物質（ＮＳＴ００３７またはシンバスタチン）に希釈水（コントロール）または様々な濃度の投与物と共に暴露した。胚を、更にエアレーションすることなく、適当な温度（２５±１℃）、および１２時間明／１２時間暗の方式でインキュベーションした。それぞれの実験は、３回ずつ行った。
【０１４３】
検討は、受精後全部で９日間行い、処理は毎日更新し、半静的アッセイを行った。処理は、下記の方式に従って行った：
希釈水を、アッセイが継続した９日間毎日取り替えながら投与した１０匹のコントロール動物。
希釈水で希釈した化合物ＮＳＴ００３７を、アッセイが継続した９日間毎日取り替えながら投与した３０匹の動物（１０個の胚、３組）。
希釈水で希釈した化合物シンバスタチンを、アッセイが継続した９日間毎日取り替えながら投与した３０匹の動物（１０個の胚、３組）。
【０１４４】
検討の期間中、死亡した胚／幼生の数を２４時間間隔で記録し、図２６に示されるように、ＬＤ５０を実験の各時点で計算した。結果は、投与後の最初の数日間（２日まで）に、両化合物のＬＤ５０は評価した最大用量を上回ることを示している。しかしながら、３日目から実験の終了まで、シンバスタチンは化合物ＮＳＴ００３７より低いＬＤ５０を示し、その毒性が一層高いことを示している。投与の２日後には、両化合物のＬＤ５０は実験全体を通じて次第に減少したが、シンバスタチンのＬＤ５０は常に化合物ＮＳＴ００３７より低く、ＮＳＴ００３７はシンバスタチンより高い生物安全性を有することを示していた。
【０１４５】
７．３．シンバスタチンと経時的に比較した化合物ＮＳＴ００３７の実験終了時の健康な幼生の割合の分析
前節の結果に基づいて、本発明者らは、シンバスタチンと比較して化合物ＮＳＴ００３７の一層高い生物安全性が実験の終了時の健康な幼生の割合の分析によって確認されるかどうかを検討することにした。
【０１４６】
受精卵を、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ，ＡＢ系）の自然交配によって得た。それぞれの交配には全部で８〜１０対を用い、総数が２００〜２５０個の卵が対当たり平均して生まれた。卵を産卵直後に集め、EC Regulation 440/2008、方法Ｃ．１に従って、ｐＨを７．８±０．２に調整した希釈水（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ２  ０．２９ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２  ０．１２ｇ／ｌ、ＮａＨＣＯ３  ０．０６５ｇ／ｌ、ＫＣｌ  ０．００６ｇ／ｌ）で洗浄し、ペトリ皿に置いた。
【０１４７】
発生の最初期段階で確実に暴露するため、卵（条件当たり最低５０個）を、試験を行う化合物の溶液を入れた別のペトリ皿に速やかに移した。続いて、受精卵のみ（実験条件当たり１０個）を、ピペットでペトリ皿から暴露チャンバー（Ｍ２４マイクロタイタープレート）へ移し、試験を行う物質（ＮＳＴ００３７またはシンバスタチン）に希釈水（コントロール）または様々な濃度の投与物と共に暴露した。胚を、更にエアレーションすることなく、適当な温度（２５±１℃）、および１２時間明／１２時間暗の方式でインキュベーションした。それぞれの実験は、３回ずつ行った。
【０１４８】
検討は、受精後全部で９日間行い、処理は毎日更新し、半静的アッセイを行った。処理は、下記の方式に従って行った：
希釈水を、アッセイが継続した９日間毎日取り替えながら投与した１０匹のコントロール動物。
希釈水で希釈した化合物ＮＳＴ００３７を、アッセイが継続した９日間毎日取り替えながら投与した３０匹の動物（１０個の胚、３組）。
希釈水で希釈した化合物シンバスタチンを、アッセイが継続した９日間毎日取り替えながら投与した３０匹の動物（１０個の胚、３組）。
【０１４９】
実験終了時の結果により、実験の終点に達し、生きている幼生の数として定義され、かつ外部の生理病理学的異常（形態学的および／または行動的）の症状がない健康な幼生の割合であって、検討中の物質の生物安全性を測定するパラメーターであるものを集めることができ、生存率およびＬＤ５０にとって補完的なものである。図２７に示されるように、検討中の一層高い用量（０．０６および０．２ｍｇ／ｌ）で評価される２種類の投与の間の健康な幼生の割合には明らかな差が見られ、一層健康な幼生はＮＳＴ００３７投与により実験の終点に達し、その生物安全性が一層高いことを示している。
【０１５０】
７．４．シンバスタチンと経時的に比較した化合物ＮＳＴ００３７の実験終了時の奇形または異常外観を有する幼生の割合の分析
前節の結果に基づいて、本発明者らは、シンバスタチンと比較して化合物ＮＳＴ００３７の一層高い生物安全性が、奇形または異常外観を有する幼生の割合を分析し、身体的および／または色素異常並びに卵黄嚢再吸収期を示す幼生の数を適当な間隔（２４時間毎）で集めることによって確認されるかどうかを検討することにした。検討で記録された異常を、以下に示す。
頭蓋内血栓症：血管、この場合には任意の大脳血管内部の血塊。
心臓血栓症：心臓血管に発生。
心臓浮腫（または水腫）：細胞内組織空間および臓器の腔部における流体の蓄積。心臓の場合には、心膜における流体の蓄積を引き起こす。
奇形：問題になっている部分の平均形状と比較して、身体または身体の一部または身体（内部または外部）の器官の形状における顕著な差。この検討で見られる奇形は、通常は卵黄嚢のものである。
【０１５１】
受精卵を、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ，ＡＢ系）の自然交配によって得た。それぞれの交配には全部で８〜１０対を用い、総数が２００〜２５０個の卵が対当たり平均して生まれた。卵を産卵直後に集め、EC Regulation 440/2008、方法Ｃ．１に従って、ｐＨを７．８±０．２に調整した希釈水（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ２  ０．２９ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２  ０．１２ｇ／ｌ、ＮａＨＣＯ３  ０．０６５ｇ／ｌ、ＫＣｌ  ０．００６ｇ／ｌ）で洗浄し、ペトリ皿に置いた。
【０１５２】
発生の最初期段階で確実に暴露するため、卵（条件当たり最低５０個）を、試験を行う化合物の溶液を入れた別のペトリ皿に速やかに移した。続いて、受精卵のみ（実験条件当たり１０個）を、ピペットでペトリ皿から暴露チャンバー（Ｍ２４マイクロタイタープレート）へ移し、試験を行う物質（ＮＳＴ００３７またはシンバスタチン）に希釈水（コントロール）または様々な濃度の投与物と共に暴露した。胚を、更にエアレーションすることなく、適当な温度（２５±１℃）、および１２時間明／１２時間暗の方式でインキュベーションした。それぞれの実験は、３回ずつ行った。
【０１５３】
検討は、受精後全部で９日間行い、処理は毎日更新し、半静的アッセイを行った。処理は、下記の方式に従って行った：
希釈水を、アッセイが継続した９日間毎日取り替えながら投与した１０匹のコントロール動物。
希釈水で希釈した化合物ＮＳＴ００３７を、アッセイが継続した９日間毎日取り替えながら投与した３０匹の動物（１０個の胚、３組）。
希釈水で希釈した化合物シンバスタチンを、アッセイが継続した９日間毎日取り替えながら投与した３０匹の動物（１０個の胚、３組）。
【０１５４】
結果は、奇形または異常外観を有する幼生の割合が、図２８に示されるように、時間および処理によって変化し、評価用量（０．２ｍｇ／ｌ）では、シンバスタチンは胚−幼生に有意な割合の異常または毒物学的問題を引き起こすが、化合物ＮＳＴ００３７は有意な毒物学的効果を示さず、生物安全性が一層高いことを示している。シンバスタチンの投与は、頭蓋内および心臓血栓症および心膜浮腫を引き起こした。チャートのデータは、動物がシンバスタチンによって誘発された問題から経時的に回復したことも示しており、この物質０．２ｍｇ／ｌの投与は動物の死を誘発するのに十分なほどの毒性ではなく、上記動物はその後改善することを示している。
【０１５５】
これらの結果は、シンバスタチンが有意に高い割合の更に重篤な毒物学的問題を引き起こすので、化合物ＮＳＴ００３７がシンバスタチンより安全であることを示している。
【０１５６】
７．５．用量によって変化するシンバスタチンと比較した化合物ＮＳＴ００３７の心臓毒性の変化の分析
前節の結果に基づいて、本発明者らは、シンバスタチンと比較して化合物ＮＳＴ００３７の一層高い生物安全性が様々な化合物を様々な用量で投与した後の心臓毒性の分析によって確認されるかどうかを検討することにした。このパラメーター（心臓毒性）の検討は、動物の心臓律動を決定するだけでなく、心拍数の変調（頻脈、徐脈など）または心臓発達異常（心膜炎、萎縮、肥大など）を観察することもできる。
【０１５７】
受精卵を、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ，ＡＢ系）の自然交配によって得た。それぞれの交配には全部で８〜１０対を用い、総数が２００〜２５０個の卵が対当たり平均して生まれた。卵を産卵直後に集め、EC Regulation 440/2008、方法Ｃ．１に従って、ｐＨを７．８±０．２に調整した希釈水（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ２  ０．２９ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２  ０．１２ｇ／ｌ、ＮａＨＣＯ３  ０．０６５ｇ／ｌ、ＫＣｌ  ０．００６ｇ／ｌ）で洗浄し、ペトリ皿に置いた。
【０１５８】
発生の最初期段階で確実に暴露するため、卵（条件当たり最低５０個）を、試験を行う化合物の溶液を入れた別のペトリ皿に速やかに移した。続いて、受精卵のみ（実験条件当たり１０個）を、ピペットでペトリ皿から暴露チャンバー（Ｍ２４マイクロタイタープレート）へ移し、試験を行う物質（ＮＳＴ００３７またはシンバスタチン）に希釈水（コントロール）または様々な濃度の投与物と共に暴露した。胚を、更にエアレーションすることなく、適当な温度（２５±１℃）、および１２時間明／１２時間暗の方式でインキュベーションした。それぞれの実験は、３回ずつ行った。
【０１５９】
検討は、受精後全部で９日間行い、処理は毎日更新し、半静的アッセイを行った。処理は、下記の方式に従って行った：
希釈水を、アッセイが継続した９日間毎日取り替えながら投与した１０匹のコントロール動物。
希釈水で希釈した化合物ＮＳＴ００３７を、アッセイが継続した９日間毎日取り替えながら投与した３０匹の動物（１０個の胚、３組）。
希釈水で希釈した化合物シンバスタチンを、アッセイが継続した９日間毎日取り替えながら投与した３０匹の動物（１０個の胚、３組）。
【０１６０】
ゼブラフィッシュ胚−幼生の心臓律動は、立体顕微鏡での視覚分析によって測定し、心拍数を手動カウンターによって１分間について測定した。投与量が異なると、図２９に示されるように、動物の心臓律動が変化し、シンバスタチンを投与した幼生は、コントロールに対して０．０６ｍｇ／ｌを投与した後には統計学的に有意な減少を示し、これは２ｍｇ／ｌの投与したときにはきわめて明確になった。対照的に、化合物ＮＳＴ００３７による心臓律動の減少は、コントロールと比較して２ｍｇ／ｌの用量のときのみ統計学的に有意であったが、低めの濃度では、コントロールとの差は見られなかった。更に、両化合物の最大使用用量（２ｍｇ／ｌ）では、シンバスタチンを投与した動物の心臓律動はＮＳＴ００３７を投与したものより統計学的に低く、これもまた化合物ＮＳＴ００３７がシンバスタチンより高い生物安全性を有することを示していた。従って、ＮＳＴ００３７はシンバスタチンより心臓に安全な化合物である。
【０１６１】
例８
ＮＳＴ００３７の殺菌活性
ＮＳＴ００３７の殺菌活性を、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓに対するバイオアッセイによって分析した。ＮＳＴ００３７のβ−ヒドロキシ酸形態、ロバスタチン、アトルバスタチンおよびシンバスタチンの溶液を、この目的のために調製した。アッセイ濃度は、以下の通りであった：２、１．５、１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６、０．０２５および０．０１ｍＭ。Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ  ＣＥＣＴ（スパニッシュ・タイプ−カルチャー・コレクション）１００２の培養物を予め接種したＭＡ培地のプレート（１リットル当たり、２０ｇ麦芽エキス、２０ｇグルコース、１ｇマイコペプトンおよび１０ｇ寒天を含む）を調製した。ダイ（直径６ｍｍ）の助けによって、上記溶液４０μｌを入れた様々なウェルを調製した。検討は３回行い、それぞれのプレートに、それぞれの化合物および濃度について３つずつ含まれていた。プレートを４℃に１時間保持した後、２８℃で一晩インキュベーションした。抗真菌活性の存在は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖阻止円の形成によって測定した。
【０１６２】
得られた結果は、化合物ＮＳＴ００３７が、アッセイに含まれていたスタチン類より高い抗真菌活性を有することを示していた。図３０に示されるように、この挙動は、全濃度範囲に対して観察された。一層高い濃度（２〜０．２５ｍＭ）の場合には、化合物ＮＳＴ００３７は、最高の殺菌活性を示したスタチンであるシンバスタチンより若干大きな値を示した。しかしながら、低めの濃度（０．０６および０．０２５ｍＭ）を用いたときには、化合物ＮＳＴ００３７は、阻止円を生じ得る唯一のものであった。  
【０１６３】
例９
ＮＳＴ００３７の投与による２４−デヒドロコレステロールレダクターゼ遺伝子（セラジン−１／ＤＨＣＲ２４）の細胞発現の誘発
アッセイは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から培養したヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞で行い、総ての場合に、無菌の厳格な規則に従い、操作は欧州スタンダードＥＮ１２４６９に従ってクラスＩＩの生物学的安全キャビネットで行った。細胞は、以下の培地、すなわち１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．０５ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１０％ウシ胎仔血清を補足した最小必須イーグル培地（ＭＥＭ）に保持した。
【０１６４】
セラジン−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿０１４７６２．３）を、メマンチン（アルツハイマー病の治療に普通に用いられる薬剤）と比較してリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を、１、４、１０または４０μＭのＮＳＴ００３７またはメマンチンの非存在下（コントロール）または存在下にて２４時間処理した。総ＲＮＡをＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Roche）によって抽出し、ＲＮＡの量および質を分光光度法（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００  ＮａｎｏＱｕａｎｔ、Tecan）および電気泳動による１８Ｓおよび２８Ｓバンドの観察によって分析した。ＲＴ−ＰＣＲは２段階で行い、最初にｍＲＮＡをＲＮＡ  ｔｏ  ｃＤＮＡキット（Applied Biosystem）を用いてｃＤＮＡに変化させ、次いで、遺伝子発現を７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ装置（Applied Biosystem）で検証済プローブであるセラジン−１／ＤＨＣＲ２４についてのＨｓ００２０７３８８＿ｍ１および１８Ｓ（結果の規格化に使用）についてのＨｓ９９９９９９０１＿ｓ１を用いるＴａｑＭａｎプローブによって分析した。２つの独立した分析は、３回ずつ行った。遺伝子発現の相対量を、ＳＤＳ  ｖ２．１．１ソフトウェア（Applied Biosystem）を用いるΔΔＣｔ法によって測定し、１８Ｓの発現を用いて測定を規格化した。
【０１６５】
得られた結果は、図３１に示されるように、ＮＳＴ００３７の投与では分析した濃度でセラジン−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現の増加を示したが、メマンチンの投与では増加を示さず、これは、ＮＳＴ００３７の投与が、コレステロール生合成およびカスパーゼ３の阻害による抗アポトーシス能に関係しているセラジン−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現の特定な増加を引き起こすことを示している。
【０１６６】
例１０
プロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）の阻害によって誘発される神経細胞死からのＮＳＴ００３７による保護
アッセイは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から培養したヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞で行い、総ての場合に、無菌の厳格な規則に従い、操作は欧州スタンダードＥＮ１２４６９に従ってクラスＩＩの生物学的安全キャビネットで行った。細胞は、以下の培地、すなわち１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．０５ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１０％ウシ胎仔血清を補足した最小必須イーグル培地（ＭＥＭ）に保持した。
【０１６７】
プロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）の活性を阻害するオカダ酸（ＯＡ）の投与によって引き起こされる細胞死の化合物ＮＳＴ００３７によって引き起こされる阻害を分析した。ＯＡは、ＡＤの病因および進行に関与しているτタンパク質のホスホリル化機構の検討に最も多く用いられる薬剤の１つである。ＰＰ１の阻害は、細胞骨格の変質とミトコンドリアの損傷を生じる。１５継代を超過しないこれらの細胞を、接着細胞用に処理した９６ウェルプレートに５ｘ１０４個／ウェルの細胞濃度で播種し、プレートの３ウェルをアッセイのそれぞれの条件について播種した。
【０１６８】
３７℃および５％ＣＯ２で２４時間細胞インキュベーションした後、細胞処理を総容積１００μｌで、下記の条件について行った：
コントロール：培養基（培地）
オカダ酸（ＯＡ）：培地＋２０μＭＯＡ、細胞の５０％の死を引き起こす。
ＯＡ＋ＮＳＴ００３７：培地＋ＯＡ（２０μＭ）＋１、４、１０、４０または１００μＭのＮＳＴ００３７。
【０１６９】
細胞を、これらの処理と共に（３７℃および５％ＣＯ２で）２２時間インキュベーションした後、ＷＳＴ−１試薬（Roche）を加えた。ＷＳＴ−１試験は、代謝活性の測定に基づいている。細胞損傷は、その代謝機能および細胞増殖の維持に必要なエネルギーを得るための細胞の能力の喪失を引き起こすので、代謝活性（生）細胞は、（ミトコンドリア呼吸鎖の）スクシネート−テトラゾリウムレダクターゼ系によりテトラゾリウム塩をホルマザンへ還元する。形成されるホルマザンは４４０ｎｍに吸光度を有するので、比色法によって検出することができる。読み取りは、試薬を加えてから２時間後に４４０ｎｍでプレートリーダーを用いて行った。
【０１７０】
得られた結果は、図３２に示されるように、ＯＡによって引き起こされる死に関係するそれぞれの処理についての細胞死の割合として示される。死からの保護は、ＮＳＴ００３７  ４−４０μＭで観察され、４０μＭでは５７％に達した。これらの結果は、化合物ＮＳＴ００３７が、ＰＰ１の阻害によって引き起こされるニューロン起源のヒト細胞の死からの保護効果を示すことを示唆している。
【０１７１】
例１１
スクシネートデヒドロゲナーゼの阻害によって誘発される神経細胞死からのＮＳＴ００３７による保護
アッセイは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から培養したヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞で行い、総ての場合に、無菌の厳格な規則に従い、操作は欧州スタンダードＥＮ１２４６９に従ってクラスＩＩの生物学的安全キャビネットで行った。細胞は、以下の培地、すなわち１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．０５ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１０％ウシ胎仔血清を補足した最小必須イーグル培地（ＭＥＭ）に保持した。
【０１７２】
３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰ）の投与によって引き起こされる細胞死の化合物ＮＳＴ００３７によって引き起こされる阻害を分析した。３−ＮＰは、動物モデルで線条における酸化ストレスとアポトーシスによる細胞死を引き起こす、ハンチントン病（ＨＤ）に関連した神経化学的および解剖学的変化を模倣するスクシネートデヒドロゲナーゼ酵素の不可逆性阻害薬である。１５継代を超過しないこれらの細胞を、接着細胞用に処理した９６ウェルプレートに５ｘ１０４個／ウェルの細胞濃度で播種し、プレートの３ウェルをアッセイのそれぞれの条件について播種した。
【０１７３】
３７℃および５％ＣＯ２で２４時間細胞インキュベーションした後、細胞処理を総容積１００μｌで、下記の条件について行った：
コントロール：培養基（培地）
３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰ）：培地＋３０μＭ３−ＮＰ、細胞の５０％の死を引き起こす。
３−ＮＰ＋ＮＳＴ００３７：培地＋３−ＮＰ（３０μＭ）＋０．１、１、４、１０、４０、１００または２００μＭのＮＳＴ００３７。
【０１７４】
細胞を、これらの処理と共に（３７℃および５％ＣＯ２で）２２時間インキュベーションした後、ＷＳＴ−１試薬（Roche）を加えた。ＷＳＴ−１試験は、代謝活性の測定に基づいている。細胞損傷は、その代謝機能および細胞増殖の維持に必要なエネルギーを得るための細胞の能力の喪失を引き起こすので、代謝活性（生）細胞は、（ミトコンドリア呼吸鎖の）スクシネート−テトラゾリウムレダクターゼ系によりテトラゾリウム塩をホルマザンへ還元する。形成されるホルマザンは４４０ｎｍに吸光度を有するので、比色法によって検出することができる。読み取りは、試薬を加えてから２時間後に４４０ｎｍでプレートリーダーを用いて行った。
【０１７５】
得られた結果は、図３３に示されるように、３−ＮＰによって引き起こされる死に関係するそれぞれの処理についての細胞死の割合として示される。死からの保護は、ＮＳＴ００３７  １〜１００μＭで観察され、４０μＭでは４１％に達した。これらの結果は、化合物ＮＳＴ００３７が、スクシネートデヒドロゲナーゼ酵素の阻害によって引き起こされるニューロン起源のヒト細胞の死からの保護効果を示すことを示唆している。
【０１７６】
例１２
細胞アポトーシスモデルにおけるカスパーゼ３／７の活性化のＮＳＴ００３７による阻害
アッセイは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から培養したヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞で行い、総ての場合に、無菌の厳格な規則に従い、操作は欧州スタンダードＥＮ１２４６９に従ってクラスＩＩの生物学的安全キャビネットで行った。細胞は、以下の培地、すなわち１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．０５ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１０％ウシ胎仔血清を補足した最小必須イーグル培地（ＭＥＭ）に保持した。
【０１７７】
培養細胞についてのアポトーシスは、細胞アポトーシスを活性化するカンプトテシン（ＣＰＴ）とインキュベーションすることによって誘発される。アポトーシスは、エフェクターカスパーゼであるカスパーゼ３またはカスパーゼ７の活性化の測定によって決定され、これには、活性カスパーゼ３／７の蛍光検出用キット（Ａｐｏ−ＯＮＥ（商標）  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｃａｓｐａｓｅ−３／７， Promega）を用いた。細胞の活性カスパーゼ３または７は基質の破断を引き起こし、これによって蛍光が放出され、フルオロメーターによって読み取られる。ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞でカンプトテシン（ＣＰＴ）５０μＭによって引き起こされるカスパーゼ３／７の活性化に対する１０および４０μＭの化合物ＮＳＴ００３７の前処理の効果を、このようにして分析した。１５継代を超過しないこれらの細胞を、接着細胞用に処理した９６ウェルプレートに５ｘ１０４個／ウェルの細胞濃度で播種し、プレートの３ウェルをアッセイのそれぞれの条件について播種した。３７℃および５％ＣＯ２で２４時間細胞インキュベーションした後、１０および４０μＭのＮＳＴ００３７による前処理を行った。
【０１７８】
２４時間後に、細胞処理を総容積１００μｌで下記の条件について行った：
コントロール：培養基（培地）
カンプトテシン（ＣＰＴ）：５０μＭのＣＰＴを含む培地
カンプトテシン（ＣＰＴ）：ＮＳＴ００３７（１０または４０μＭ）および／またはメバロン酸塩（ＭＥＶ；１００μＭ）またはＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（５０μＭ）による様々な前処理を行った５０μＭのＣＰＴを含む培地。
【０１７９】
細胞をこれらの処理と共に（３７℃および５％ＣＯ２で）６時間インキュベーションした後、細胞溶解緩衝液およびカスパーゼ基質を製造業者が指定した濃度で加え、それらを室温で３０分間インキュベーションした後、−２０℃で一晩冷凍した。翌日、蛍光を測定した（４９９／５２１ｎｍ，Ｅｘｃｉ／Ｅｍｉ）。
【０１８０】
図３４は、様々な処理のコントロール細胞に対するカスパーゼ３／７の活性化率を示す。ＮＳＴ００３７  １０および４０μＭでは、カンプトテシンに関するカスパーゼ３／７の阻害はそれぞれ２６および３３％であり、この化合物の機能的な抗アポトーシス効果を示している。その上、メバロン酸塩はこの阻害を逆戻りさせ、従ってＮＳＴ００３７のカスパーゼ３／７に対する効果はコレステロール生合成またはその生合成経路の前駆体の１つの生合成に関係することを示している。カスパーゼ阻害薬としてのＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋは、カスパーゼ３／７の活性化を完全に阻害した。
【０１８１】
例１３
化合物ＮＳＴ００３７は細胞モデルにおけるβ−アミロイドペプチドの産生を減少させる
アッセイは、ニューロンで発現される最もよくみられる変異体であるアイソフォーム６９５のＡＰＰ遺伝子（β−アミロイド前駆体タンパク質、ＧｅｎｅＩＤ：３５１）により保持されている構築体で安定にトランスフェクションされた、ＡＰＰタンパク質が過剰発現されるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から培養したヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞で行った。総ての場合に、無菌の厳格な規則に従い、操作は欧州スタンダードＥＮ１２４６９に従ってクラスＩＩの生物学的安全キャビネットで行った。細胞は、以下の培地、すなわち１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．０５ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１０％ウシ胎仔血清を補足した最小必須イーグル培地（ＭＥＭ）に保持し、ＡＰＰの発現は、０．１６ｍｇ／ｍｌ抗生物質ハイグロマイシンＢを添加して選択した。
【０１８２】
１５継代を超過しないこれらの細胞を、接着細胞用に処理した６ウェルプレートに８ｘ１０５個／ウェルの細胞濃度で播種し、プレートの２ウェルをアッセイのそれぞれの条件について播種した。３７℃および５％ＣＯ２で２４時間細胞インキュベーションした後、細胞処理を総容積２ｍｌで、下記の条件について行った：
コントロール：培養基（培地）
ＮＳＴ００３７：培地＋１、４、１０または４０μＭのＮＳＴ００３７。
【０１８３】
これらの細胞を、これらの処理を行いながら（３７℃および５％ＣＯ２にて）４８時間インキュベーションした後、条件培地５００μｌを回収して測定を行った。細胞残渣を条件培地から３００ｘｇにて遠心分離によって取り除いた後、プロテアーゼ阻害薬（Ｍｉｎｉ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ， Roche）を加えた。２種類の最もよく見られるＡβ種である１−４０および１−４２を測定した。Ａβ（１−４２）については、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ濾過装置（Millipore）を用いて培地を５倍に濃縮して測定する必要があった。条件培地のＡβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）の量は、それぞれの処理について「βアミロイド４０  ＥＬＩＳＡ」および「βアミロイド４２  ＥＬＩＳＡ」キット(Biosource)を用いるＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）によって製造業者の推奨に従って分析した。結果は、合成ペプチドを用いる増加濃度曲線を用いて定量した。これらの細胞における分泌されたＡβのベースライン値は、Ａβ（１−４０）については１３４０±１４１ｐｇ／ｍｌであり、Ａβ（１−４２）については２０＋３ｐｇ／ｍｌである。
【０１８４】
処理について得られた結果は、図３５に示されており、４８時間後のコントロール細胞に関するＡβ（１−４０）（Ａ）およびＡβ（１−４２）（Ｂ）の割合を示している。Ａβ（１−４０）については、１０、４０および１００μＭのＮＳＴ００３７の投与後に減少が見られる。Ａβ（１−４２）については、１０および４０μＭのＮＳＴ００３７のいずれでも減少が見られる。
【０１８５】
これらの結果から、ＮＳＴ００３７は、ＡＰＰを過剰発現するヒト神経芽細胞腫細胞におけるＡβの分泌を減少させると結論される。Ａβの産生はインビトロおよびインビボのいずれでも細胞死に関係しており、更にアルツハイマー病の患者に見られる老人斑とも関連している。
【０１８６】
例１４
酸化ストレスによって誘発される神経細胞死からのＮＳＴ００３７による保護に対するメバロン酸塩の効果
アッセイは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から培養したヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞で行い、総ての場合に、無菌の厳格な規則に従い、操作は欧州スタンダードＥＮ１２４６９に従ってクラスＩＩの生物学的安全キャビネットで行った。細胞は、以下の培地、すなわち１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．０５ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１０％ウシ胎仔血清を補足した最小必須イーグル培地（ＭＥＭ）に保持した。
【０１８７】
酸化的損傷および細胞死を生じるキサンチン／キサンチンオキシダーゼでの処理によって引き起こされる細胞死から化合物ＮＳＴ００３７による保護についてのメバロン酸塩の効果を分析した。１５継代を超過しないこれらの細胞を、接着細胞用に処理した９６ウェルプレートに５ｘ１０４個／ウェルの細胞濃度で播種し、プレートの３ウェルをアッセイのそれぞれの条件について播種した。
【０１８８】
３７℃および５％ＣＯ２で２４時間細胞インキュベーションした後、細胞処理を総容積１００μｌで、下記の条件について行った：
コントロール：培養基（培地）
キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ）：培地＋１０μＭキサンチン／６０ｍＵ／ｍｌキサンチンオキシダーゼ、細胞の５０％の死を引き起こす。
ＸＸＯ＋ＮＳＴ００３７：培地＋ＸＸＯ（１０μＭ／６０ｍＵ／ｍｌ）＋４０μＭのＮＳＴ００３７。
ＸＸＯ＋メバロン酸塩：培地＋ＸＸＯ（１０μＭ／６０ｍＵ／ｍｌ）＋１０、４０または１００μＭのメバロン酸塩。
ＸＸＯ＋ＮＳＴ００３７＋メバロン酸塩：培地＋ＸＸＯ（１０μＭ／６０ｍＵ／ｍｌ）＋４０μＭのＮＳＴ００３７＋１０、４０または１００ｎｍのメバロン酸塩。
【０１８９】
細胞を、処理を行いながら（３７℃および５％ＣＯ２にて）２２時間インキュベーションした後、ＷＳＴ−１試薬(Roche)を加えた。ＷＳＴ−１試験は、代謝活性の測定に基づいている。細胞損傷は、細胞の代謝機能および細胞増殖を維持するのに必要なエネルギーを得る能力の喪失を引き起こすので、代謝活性（生）細胞は、（ミトコンドリア呼吸鎖の）スクシネート−テトラゾリウムレダクターゼ系によりテトラゾリウム塩をホルマザンへ還元する。形成されるホルマザンは４４０ｎｍに吸光度を有するので、比色法によって検出することができる。読み取りは、試薬を加えてから２時間後に４４０ｎｍでプレートリーダーを用いて行った。
【０１９０】
得られた結果は、図３６に示されるように、ＸＸＯによって引き起こされる死に関係するそれぞれの処理についての細胞死の割合として示される。メバロン酸塩のみでは、ＸＸＯによる死から保護せず、また毒性増加も引き起こさないことが観察されたが、４０μＭのＮＳＴ００３７は死から５７％保護し、この効果は１０、４０および１００μＭのメバロン酸塩を加えることによって阻害され、１０および１００μＭについては、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によれば、差は統計学的に有意であった。これらの結果は、化合物ＮＳＴ００３７で観察された保護は、コレステロール生合成またはその経路の前駆体の１つの生合成に関係していることを示唆している。
【０１９１】
例１５
海馬における神経細胞死に関連した神経病理学的徴候のＮＳＴ００３７による保護
１５．１．海馬における興奮毒性物質によって引き起こされる神経炎性ジストロフィーからのＮＳＴ００３７の保護効果
神経保護の結果に基づいて、本発明者らは、カイネート（ＫＡ）の投与によるマウスの散発性アルツハイマー病のモデルで示された海馬におけるＮＳＴ００３７の神経保護効果が、神経炎性ジストロフィーのようなニューロン損傷のもう一つの徴候の保護を伴うかどうかを検討することにした。
【０１９２】
実験過程に含まれる総ての動物は、１２週齢の雄ＦＶＢ／ＮＨａｎ系であった。実験は、動物の操作指針(Scientific Procedures, Act.1986)に厳密に従って行った。動物はそれぞれの検疫期間を有し、接種および取り扱いには汚染の可能性を最小限にするために最大限の注意を持って処理した。
【０１９３】
このアッセイには２５匹の動物を用い、投与は総て下記の方式に従って１００μｌの容量の腹腔内（ｉ．ｐ．）経路によって行った：
ｉ）  ＰＢＳ＋ＰＢＳ＋ＰＢＳ方式：４匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間投与し、２日目に動物に新たな用量のＰＢＳを接種し、次の７日間はＰＢＳの１日量を接種した。
ｉｉ）  ＮＳＴ００３７＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７方式：７匹の動物に最初にＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇを１日量で２日間投与し、２日目に動物にカイネートを２５ｍｇ／ｋｇの用量で接種し、次の７日間はＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量を接種した。
ｉｉｉ）  ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＰＢＳ方式：７匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間投与し、２日目に動物にカイネートを２５ｍｇ／ｋｇの用量で接種し、次の７日間はＰＢＳの１日量を接種した。
ｉｖ）  ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７方式：７匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間投与し、２日目に動物にカイネートを２５ｍｇ／ｋｇの用量で接種し、次の７日間はＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量を接種した。
【０１９４】
７日間の処理時間が終了した後、動物を屠殺し、脳を切開した。脳試料を処理し、パラフィンで包んだ。海馬における神経炎性ジストロフィーの分析のため、微小管結合タンパク質２型（ＭＡＰ２）に対する明視野免疫化学（ｂｒｉｇｈｔ  ｆｉｅｌｄ  ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を５μｍ厚さの冠状切片で行った。
【０１９５】
図３７に示されるように、ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＰＢＳ投与方式は、均一なラベリングを示すＰＢＳ＋ＰＢＳ＋ＰＢＳ投与方式と比較して、特に海馬のＣＡ１、ＣＡ３および歯状回領域のＭＡＰ２ラベリングの減少を生じる。しかしながら、ＮＳＴ００３７＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７群の試料は、コントロール（ＰＢＳ＋ＰＢＳ＋ＰＢＳ群）と同じ染色パターンを示し、海馬のこれらの領域における神経炎性ジストロフィーの証拠は見られなかった。更に、驚くべきことには、ＰＢＳによる前処理およびＫＡの接種後にＮＳＴ００３７を投与したところ、海馬におけるＭＡＰ２ラベリングの喪失が明らかに減少することが観察されている。
【０１９６】
要約すれば、ＫＡの接種の前および後のいずれにおいても、ＮＳＴ００３７を投与することによって、海馬においてＫＡによって引き起こされる神経炎性ジストロフィーから保護される。
【０１９７】
１５．２．海馬において興奮毒性物質によって引き起こされる酸化的損傷からのＮＳＴ００３７の保護効果
神経変性および神経炎性ジストロフィーからの保護の結果に基づいて、本発明者らは、カイネート（ＫＡ）の投与によるマウスの散発性アルツハイマー病のモデルで示される海馬におけるＮＳＴ００３７の神経保護効果が、酸化的損傷のようなニューロン損傷のもう一つの徴候からの保護を伴うかどうかを検討することにした。
【０１９８】
実験過程に含まれる総ての動物は、１２週齢の雄ＦＶＢ／ＮＨａｎ系であった。実験は、動物の操作指針(Scientific Procedures, Act.1986)に厳密に従って行った。動物はそれぞれの検疫期間を有し、接種および取り扱いには汚染の可能性を最小限にするために最大限の注意を持って処理した。
【０１９９】
このアッセイには２５匹の動物を用い、投与は総て下記の方式に従って１００μｌの容量の腹腔内（ｉ．ｐ．）経路によって行った：
ｉ）  ＰＢＳ＋ＰＢＳ＋ＰＢＳ方式：４匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間投与し、２日目に動物に新たな用量のＰＢＳを接種し、次の７日間はＰＢＳの１日量を接種した。
ｉｉ）  ＮＳＴ００３７＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７方式：７匹の動物に最初にＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇを１日量で２日間投与し、２日目に動物にカイネートを２５ｍｇ／ｋｇの用量で接種し、次の７日間はＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量を接種した。
ｉｉｉ）  ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＰＢＳ方式：７匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間投与し、２日目に動物にカイネートを２５ｍｇ／ｋｇの用量で接種し、次の７日間はＰＢＳの１日量を接種した。
ｉｖ）  ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７方式：７匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間投与し、２日目に動物にカイネートを２５ｍｇ／ｋｇの用量で接種し、次の７日間はＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量を接種した。
【０２００】
７日間の処理時間が終了した後、動物を屠殺し、脳を切開した。脳試料を処理し、パラフィンで包んだ。海馬における脂質過酸化による酸化的損傷の分析のため、４−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ）に対する明視野免疫化学（ｂｒｉｇｈｔ  ｆｉｅｌｄ  ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を５μｍ厚さの冠状切片で行った。
【０２０１】
図３８に示されるように、ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＰＢＳ投与方式は、この脂質過酸化ラベリングを示さないＰＢＳ＋ＰＢＳ＋ＰＢＳ投与方式と比較して、海馬のＣＡ３領域におけるＨＮＥシグナルを増加させる。しかしながら、ＮＳＴ００３７＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７群の試料は、コントロール（ＰＢＳ＋ＰＢＳ＋ＰＢＳ群）と同じ染色パターンを示し、海馬のこれらの領域におけるＨＮＥ標識ニューロンは見られなかった。更に、驚くべきことには、ＰＢＳによる前処理およびＫＡの接種後にＮＳＴ００３７を投与したところ、海馬におけるＨＮＥ標識ニューロンの数が減少することが観察されている。
【０２０２】
要約すれば、ＫＡの接種の前および後のいずれにおいても、ＮＳＴ００３７を投与することによって、海馬においてＫＡによって引き起こされる酸化的損傷から保護される。
【０２０３】
１５．３．海馬において興奮毒性物質によって引き起こされるアポトーシスからのＮＳＴ００３７の保護効果
上記結果に基づいて、本発明者らは、カイネート（ＫＡ）の投与によるマウスの散発性アルツハイマー病のモデルで示される海馬におけるＮＳＴ００３７の神経保護効果が、この疾患と関連している機構であるアポトーシスによる死からの保護を伴うかどうかを検討することにした。
【０２０４】
実験過程に含まれる総ての動物は、１２週齢の雄ＦＶＢ／ＮＨａｎ系であった。実験は、動物の操作指針（Scientific Procedures, Act.1986）に厳密に従って行った。動物はそれぞれの検疫期間を有し、接種および取り扱いには汚染の可能性を最小限にするために最大限の注意を持って処理した。
【０２０５】
このアッセイには２５匹の動物を用い、投与は総て下記の方式に従って１００μｌの容量の腹腔内（ｉ．ｐ．）経路によって行った：
ｉ）  ＰＢＳ＋ＰＢＳ＋ＰＢＳ方式：４匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間投与し、２日目に動物に新たな用量のＰＢＳを接種し、次の７日間はＰＢＳの１日量を接種した。
ｉｉ）  ＮＳＴ００３７＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７方式：７匹の動物に最初にＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇを１日量で２日間投与し、２日目に動物にカイネートを２５ｍｇ／ｋｇの用量で接種し、次の７日間はＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量を接種した。
ｉｉｉ）  ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＰＢＳ方式：７匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間投与し、２日目に動物にカイネートを２５ｍｇ／ｋｇの用量で接種し、次の７日間はＰＢＳの１日量を接種した。
ｉｖ）  ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７方式：７匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間投与し、２日目に動物にカイネートを２５ｍｇ／ｋｇの用量で接種し、次の７日間はＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量を接種した。
【０２０６】
７日間の処理時間が終了した後、動物を屠殺し、脳を切開した。脳試料を処理し、パラフィンで包んだ。海馬のアポトーシスにおけるニューロンの存在を分析のため、Ｔ．Ｕ．Ｎ．Ｅ．Ｌ．（ＴｄＴ依存性ｄＵＴＰニック末端ラベリング）蛍光法５μｍ厚さの冠状切片で行った。
【０２０７】
ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＰＢＳ投与方式は、海馬、特にＣＡ１、ＣＡ３（図３８）および歯状回領域のアポトーシスによる神経細胞死を引き起こす。しかしながら、ＮＳＴ００３７＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７群の試料はＴ．Ｕ．Ｎ．Ｅ．Ｌ．に対してポジティブなニューロンを示さず、コントロール（ＰＢＳ＋ＰＢＳ＋ＰＢＳ群）と同じパターンを示した。更に、ＰＢＳによる前処理およびＫＡの接種の後にＮＳＴ００３７を投与したところ、アポトーシスにおけるニューロンの数が海馬ＣＡ３領域では数個の単離細胞にまで減少することが観察されている。
【０２０８】
要約すれば、ＫＡの接種の前および後のいずれにおいても、ＮＳＴ００３７を投与することによって、海馬においてＫＡによって引き起こされる酸化的損傷およびアポトーシスから保護される。
【０２０９】
１５．４．海馬で興奮毒性物質によって引き起こされるアストログリオーシスからのＮＳＴ００３７による保護効果
上記結果に基づいて、本発明者らは、カイネート（ＫＡ）の投与によるマウスの散発性アルツハイマー病のモデルで示される海馬におけるＮＳＴ００３７の酸化防止および抗アポトーシス効果が、アルツハイマー病患者の脳で検出される別の組織病理学的徴候である反応性アストログリオーシスの減少を伴うかどうかを検討することにした。
【０２１０】
実験過程に含まれる総ての動物は、１２週齢の雄ＦＶＢ／ＮＨａｎ系であった。実験は、動物の操作指針（Scientific Procedures, Act.1986）に厳密に従って行った。動物はそれぞれの検疫期間を有し、接種および取り扱いには汚染の可能性を最小限にするために最大限の注意を持って処理した。
【０２１１】
このアッセイには２５匹の動物を用い、投与は総て下記の方式に従って１００μｌの容量の腹腔内（ｉ．ｐ．）経路によって行った：
ｉ）  ＰＢＳ＋ＰＢＳ＋ＰＢＳ方式：４匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間投与し、２日目に動物に新たな用量のＰＢＳを接種し、次の７日間はＰＢＳの１日量を接種した。
ｉｉ）  ＮＳＴ００３７＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７方式：７匹の動物に最初にＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇを１日量で２日間投与し、２日目に動物にカイネートを２５ｍｇ／ｋｇの用量で接種し、次の７日間はＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量を接種した。
ｉｉｉ）  ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＰＢＳ方式：７匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間投与し、２日目に動物にカイネートを２５ｍｇ／ｋｇの用量で接種し、次の７日間はＰＢＳの１日量を接種した。
ｉｖ）  ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７方式：７匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間投与し、２日目に動物にカイネートを２５ｍｇ／ｋｇの用量で接種し、次の７日間はＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量を接種した。
【０２１２】
７日間の処理時間が終了した後、動物を屠殺し、脳を切開した。脳試料を処理し、パラフィンで包んだ。反応性アストログリオーシスの分析は、星状細胞に含まれているグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の５μｍの厚さの冠状切片に対する明視野免疫化学によって行った。
【０２１３】
ＰＢＳ＋ＫＡ＋ＰＢＳ投与方式は、海馬の神経網における星状細胞の活性化および増殖の有意な増加を引き起こす（図３８）。対照的に、ＮＳＴ００３７＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７群の試料は、コントロール（ＰＢＳ＋ＰＢＳ＋ＰＢＳ群）ときわめて類似した星状細胞パターンを示した。驚くべきことには、ＰＢＳによる前処理およびＫＡの接種の後にＮＳＴ００３７を投与したところ、海馬における星状細胞の数とＧＦＡＰラベリングの強度は減少することも観察されている。
【０２１４】
要約すれば、ＫＡの接種の前および後のいずれにおいても、ＮＳＴ００３７の投与は、酸化的損傷、アポトーシスから保護し、海馬領域でＫＡによって誘発される反応性アストログリオーシスを防止する。
【０２１５】
例１６
急性的に投与されるパーキンソン神経毒によって引き起こされる臨床症状、運動欠損、神経変性および神経細胞死からのＮＳＴ００３７による保護
マウスの散発性アルツハイマー病モデルにおける化合物ＮＳＴ００３７によって示される神経保護の結果に基づいて、研究者らは、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）のような神経毒性物質によって誘発されるドーパミン作動性ニューロンの死に基づくパーキンソン病のモデルにおける化合物の神経保護能を評価することにした。マウスでのＭＰＴＰの全身投与は、黒質のドーパミン作動性ニューロンの大量死を誘発し、この領域およびヒトの運動活性に高度に関連づけられている線条のような他の領域におけるドーパミンの濃度を減少させる。これらの徴候により、このモデルは、運動劣化のようなパーキンソン病の中心的事象の１つを導入するので、パーキンソン病の研究に広く用いられてきた。この例では、急性投与でのＭＰＴＰによって誘発される神経変性および症状に対するＮＳＴ００３７の効果の分析結果を提供する。
【０２１６】
１６．１．ドーパミン作動性ニューロンの死を誘発する神経毒性物質の急性投与によって引き起こされる死からのＮＳＴ００３７の保護効果
実験過程に含まれる総ての動物は、１２週齢の雄ＣＤ１系であった。実験は、動物の操作指針（Scientific Procedures, Act.1986）に厳密に従って行った。動物はそれぞれの検疫期間を有し、接種および取り扱いには汚染の可能性を最小限にするために最大限の注意を持って処理した。
【０２１７】
このアッセイには４０匹の動物を用い、投与は下記の方式に従って１００μｌの容量で行った：
ｉ）  ＰＢＳ＋ＰＢＳ＋ＰＢＳ方式：１０匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間皮下（ｓ．ｃ．）経路によって投与し、２日目に動物に４用量のＰＢＳを２時間間隔で腹腔内（ｉ．ｐ．）経路によって接種した。次の７日間はＰＢＳの１日量をｓ．ｃ．経路によって投与した。
ｉｉ）  ＰＢＳ＋ＭＰＴＰ＋ＰＢＳ方式：１０匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間ｓ．ｃ．経路によって投与し、２日目に動物に４用量のＭＰＴＰ  ２０ｍｇ／ｋｇを２時間間隔でｉ．ｐ．経路によって接種した。次の７日間はＰＢＳの１日量をｓ．ｃ．経路によって投与した。
ｉｉｉ）  ＮＳＴ００３７＋ＭＰＴＰ＋ＮＳＴ００３７方式：１０匹の動物に最初にＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量を２日間投与し、２日目に動物に４用量のＭＰＴＰ  ２０ｍｇ／ｋｇを２時間間隔でｉ．ｐ．経路によって接種した。次の７日間はＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量をｓ．ｃ．経路で投与した。
【０２１８】
様々な投与群における死を全実験処置中記録し、これらのデータを用いて図３９に示される対応する生存曲線を作成した。
【０２１９】
ＰＢＳ＋ＭＰＴＰ＋ＰＢＳ投与方式は、マウスの死亡率に統計学的に有意な増加（ｐ＜０．０５）を引き起こす。しかしながら、ＮＳＴ００３７＋ＭＰＴＰ＋ＮＳＴ００３７群とＰＢＳ＋ＰＢＳ＋ＰＢＳ群（ｐ＞０．０５）の間には有意差が見られなかったので、ＮＳＴ００３７の投与によりＭＰＴＰの急性投与後の動物の生存率は驚くほど増進する。
【０２２０】
１６．２．ドーパミン作動性ニューロンの死を誘発する神経毒性物質の急性投与によって引き起こされる運動耐性の減退に対するＮＳＴ００３７の保護効果
実験過程に含まれる総ての動物は、１２週齢の雄ＣＤ１系であった。実験は、動物の操作指針（Scientific Procedures, Act.1986）に厳密に従って行った。動物はそれぞれの検疫期間を有し、接種および取り扱いには汚染の可能性を最小限にするために最大限の注意を持って処理した。
【０２２１】
このアッセイには４０匹の動物を用い、投与は下記の方式に従って１００μｌの容量で行った：
ｉ）  ＰＢＳ＋ＰＢＳ＋ＰＢＳ方式：１０匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間皮下（ｓ．ｃ．）経路によって投与し、２日目に動物に４用量のＰＢＳを２時間間隔で腹腔内（ｉ．ｐ．）経路によって接種した。次の７日間はＰＢＳの１日量をｓ．ｃ．経路によって投与した。
ｉｉ）  ＰＢＳ＋ＭＰＴＰ＋ＰＢＳ方式：１０匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間ｓ．ｃ．経路によって投与し、２日目に動物に４用量のＭＰＴＰ２０ｍｇ／ｋｇを２時間間隔でｉ．ｐ．経路によって接種した。次の７日間はＰＢＳの１日量をｓ．ｃ．経路によって投与した。
ｉｉｉ）  ＮＳＴ００３７＋ＭＰＴＰ＋ＮＳＴ００３７方式：１０匹の動物に最初にＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量を２日間投与し、２日目に動物に４用量のＭＰＴＰ  ２０ｍｇ／ｋｇを２時間間隔でｉ．ｐ．経路によって接種した。次の７日間はＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量をｓ．ｃ．経路で投与した。
【０２２２】
投与開始前および７日間の投与時間の終了時に、動物をローターロッド試験と呼ばれる運動耐性試験に２分間かけ、速度が４〜４０ｒ．ｐ．ｍ．まで増加する円筒上の歩行に動物が耐える時間を記録した。図４０は、様々な群の動物が円筒上を歩き続ける時間のアッセイ終了時とベースライン状態との間の比を示す。
【０２２３】
ＰＢＳ＋ＭＰＴＰ＋ＰＢＳ投与方式は、ベースライン状態からＭＰＴＰの急性投与の７日後までのマウスの運動耐性の統計学的に有意な減少を引き起こす（ｐ＜０．０５）。しかしながら、ＮＳＴ００３７の投与により、動物の運動劣化は驚くほど防止され、マウスがＭＰＴＰの投与前に示したレベル（ｐ＞０．０５）の耐性を維持し、パターンはＭＰＴＰを投与せずかつＰＢＳを投与したマウスのパターンと同じである（ｐ＞０．０５）。
【０２２４】
要約すれば、ＮＳＴ００３７を投与すると、ＭＰＴＰの急性投与によって誘発される耐性の喪失から保護される。
【０２２５】
１６．２．ドーパミン作動性ニューロンの死を誘発する神経毒性物質の急性投与によって引き起こされる強度の減少に対するＮＳＴ００３７の保護効果
実験過程に含まれる総ての動物は、１２週齢の雄ＣＤ１系であった。実験は、動物の操作指針（Scientific Procedures, Act.1986）に厳密に従って行った。動物はそれぞれの検疫期間を有し、接種および取り扱いには汚染の可能性を最小限にするために最大限の注意を持って処理した。
【０２２６】
このアッセイには４０匹の動物を用い、投与は下記の方式に従って１００μｌの容量で行った：
ｉ）  ＰＢＳ＋ＰＢＳ＋ＰＢＳ方式：１０匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間皮下（ｓ．ｃ．）経路によって投与し、２日目に動物に４用量のＰＢＳを２時間間隔で腹腔内（ｉ．ｐ．）経路によって接種した。次の７日間はＰＢＳの１日量をｓ．ｃ．経路によって投与した。
ｉｉ）  ＰＢＳ＋ＭＰＴＰ＋ＰＢＳ方式：１０匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間ｓ．ｃ．経路によって投与し、２日目に動物に４用量のＭＰＴＰ  ２０ｍｇ／ｋｇを２時間間隔でｉ．ｐ．経路によって接種した。次の７日間はＰＢＳの１日量をｓ．ｃ．経路によって投与した。
ｉｉｉ）  ＮＳＴ００３７＋ＭＰＴＰ＋ＮＳＴ００３７方式：１０匹の動物に最初にＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量を２日間投与し、２日目に動物に４用量のＭＰＴＰ  ２０ｍｇ／ｋｇを２時間間隔でｉ．ｐ．経路によって接種した。次の７日間はＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量をｓ．ｃ．経路で投与した。
【０２２７】
投与開始前および７日間の投与時間の終了時に、動物をいわゆる握力試験における強度試験にかけ、動物が前肢で加えるバーを握る力をグラム数で表したものを、３回ずつ記録した。図４１は、ベースライン状態の動物によって示される力に対するアッセイ終了時の力との間の比を示す。
【０２２８】
ＰＢＳ＋ＭＰＴＰ＋ＰＢＳ投与方式は、ベースライン状態からＭＰＴＰの急性投与の７日後までのマウスの前肢で握るときに加えられる力の統計学的に有意な減少を引き起こす（ｐ＜０．０５）。更に、ＮＳＴ００３７の投与により、ＭＰＴＰによって誘発される力の喪失は防止され、投与の７日後には、ＮＳＴ００３７＋ＭＰＴＰ＋ＮＳＴ００３７群のマウスはＭＰＴＰの投与前と同じレベルの力を示し（ｐ＞０．０５）、パターンはＭＰＴＰを投与せずかつＰＢＳを投与したマウスのパターンときわめて類似している（ｐ＞０．０５）。
【０２２９】
要約すれば、ＮＳＴ００３７を投与すると、ＭＰＴＰの急性投与によって誘発される耐性および力の喪失から保護される。
【０２３０】
１６．３．ドーパミン作動性ニューロンの死を誘発する神経毒性物質の急性投与によって引き起こされる神経変性に対するＮＳＴ００３７の保護効果
上記結果に基づいて、本発明者らは、ＭＰＴＰによって引き起こされる精神運動状態の劣化に対する化合物ＮＳＴ００３７によって示される保護は、運動活性に関与しかつ黒質および線条のようなパーキンソン病に関係した脳領域の神経変性を伴うかどうかを決定しようとした。
【０２３１】
実験過程に含まれる総ての動物は、１２週齢の雄ＣＤ１系であった。実験は、動物の操作指針（Scientific Procedures, Act.1986）に厳密に従って行った。動物はそれぞれの検疫期間を有し、接種および取り扱いには汚染の可能性を最小限にするために最大限の注意を持って処理した。
【０２３２】
このアッセイには４０匹の動物を用い、投与は下記の方式に従って１００μｌの容量で行った：
ｉ）  ＰＢＳ＋ＰＢＳ＋ＰＢＳ方式：１０匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間皮下（ｓ．ｃ．）経路によって投与し、２日目に動物に４用量のＰＢＳを２時間間隔で腹腔内（ｉ．ｐ．）経路によって接種した。次の７日間はＰＢＳの１日量をｓ．ｃ．経路によって投与した。
ｉｉ）  ＰＢＳ＋ＭＰＴＰ＋ＰＢＳ方式：１０匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間ｓ．ｃ．経路によって投与し、２日目に動物に４用量のＭＰＴＰ２０ｍｇ／ｋｇを２時間間隔でｉ．ｐ．経路によって接種した。次の７日間はＰＢＳの１日量をｓ．ｃ．経路によって投与した。
ｉｉｉ）  ＮＳＴ００３７＋ＭＰＴＰ＋ＮＳＴ００３７方式：１０匹の動物に最初にＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量を２日間投与し、２日目に動物に４用量のＭＰＴＰ２０ｍｇ／ｋｇを２時間間隔でｉ．ｐ．経路によって接種した。次の７日間はＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量をｓ．ｃ．経路で投与した。
【０２３３】
７日間の処理時間が終了した後、動物を屠殺し、脳を切開した。脳試料を処理し、パラフィンで包んだ。黒質および線条の神経変性の分析のため、蛍光性のＦｌｕｏｒｏＪａｄｅ  Ｂ（ＦＪＢ）染色を、５μｍの厚さの矢状切片で行った。図４２は、それぞれの群および検討中の両領域の典型的な写真を示す。
【０２３４】
ＰＢＳ＋ＭＰＴＰ＋ＰＢＳ投与方式は、ＰＢＳ＋ＰＢＳ＋ＰＢＳ群の試料と比較して黒質および線条のいずれにおいてもＦＪＢにポジティブな細胞の明らかな増加を引き起こす。対照的に、ＮＳＴ００３７＋ＭＰＴＰ＋ＮＳＴ００３７群の試料は、変性しかつＦＪＢについてＰＢＳ＋ＭＰＴＰ＋ＰＢＳ群より有意に低いポジティブの多数の細胞を有していた。
【０２３５】
要約すれば、ＮＳＴ００３７を投与すると、黒質並びに線条を活性化する神経末端のドーパミン作動性ニューロンにおけるＭＰＴＰの急性投与によって誘発される精神運動劣化および神経変性から保護される。
【０２３６】
１６．４．神経毒性物質の急性投与によるドーパミン作動性ニューロンの喪失に対するＮＳＴ００３７の保護効果
上記結果に基づいて、本発明者らは、ＭＰＴＰによって引き起こされる神経変性に対する化合物ＮＳＴ００３７によって示される保護は、黒質および線条のようなパーキンソン病における劣化した脳領域におけるドーパミン作動性ニューロンの保護を伴うかどうかを決定しようとした。
【０２３７】
実験過程に含まれる総ての動物は、１２週齢の雄ＣＤ１系であった。実験は、動物の操作指針（Scientific Procedures, Act.1986）に厳密に従って行った。動物はそれぞれの検疫期間を有し、接種および取り扱いには汚染の可能性を最小限にするために最大限の注意を持って処理した。
【０２３８】
このアッセイには４０匹の動物を用い、投与は下記の方式に従って１００μｌの容量で行った：
ｉ）  ＰＢＳ＋ＰＢＳ＋ＰＢＳ方式：１０匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間皮下（ｓ．ｃ．）経路によって投与し、２日目に動物に４用量のＰＢＳを２時間間隔で腹腔内（ｉ．ｐ．）経路によって接種した。次の７日間はＰＢＳの１日量をｓ．ｃ．経路によって投与した。
ｉｉ）  ＰＢＳ＋ＭＰＴＰ＋ＰＢＳ方式：１０匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間ｓ．ｃ．経路によって投与し、２日目に動物に４用量のＭＰＴＰ２０ｍｇ／ｋｇを２時間間隔でｉ．ｐ．経路によって接種した。次の７日間はＰＢＳの１日量をｓ．ｃ．経路によって投与した。
ｉｉｉ）  ＮＳＴ００３７＋ＭＰＴＰ＋ＮＳＴ００３７方式：１０匹の動物に最初にＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量を２日間投与し、２日目に動物に４用量のＭＰＴＰ２０ｍｇ／ｋｇを２時間間隔でｉ．ｐ．経路によって接種した。次の７日間はＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量をｓ．ｃ．経路で投与した。
【０２３９】
７日間の処理時間が終了した後、動物を屠殺し、脳を切開した。脳試料を処理し、パラフィンで包んだ。黒質および線条のドーパミン作動性ニューロンの存在を分析するため、チロシン−ヒドロキシラーゼ（ＴＨ）タンパク質に対する免疫組織化学を、５μｍの厚さの矢状切片で行った。図４３は、それぞれの群および検討中の両領域の典型的な写真を示す。
【０２４０】
ＰＢＳ＋ＭＰＴＰ＋ＰＢＳ投与方式は、黒質のニューロン体（ｎｅｕｒｏｎ  ｂｏｄｉｅｓ）および線条の神経伸張部のいずれにおいても、ＰＢＳ＋ＰＢＳ＋ＰＢＳ群と比較してＴＨラベリングが存在しないことが明らかに観察されているので、ドーパミン作動性ニューロンの量の明らかな減少を引き起こす。対照的に、ＮＳＴ００３７＋ＭＰＴＰ＋ＮＳＴ００３７群の試料は、ＰＢＳ＋ＭＰＴＰ＋ＰＢＳ群の試料よりも多数の黒質におけるＴＨポジティブ細胞並びに線条における一層高いラベリング強度を有していた。
【０２４１】
要約すれば、ＮＳＴ００３７の投与は、黒質および線条における神経変性およびＭＰＴＰの急性投与によって誘発される神経細胞死の他にマウスの精神運動劣化から保護する。  
【０２４２】
例１７
亜慢性的に投与されたパーキンソン症候群神経毒によって引き起こされる運動欠損、神経細胞死および酸化的損傷からのＮＳＴ００３７による保護
例１６で得られて提示された結果により、本発明者らは、マウスでのＭＰＴＰの亜慢性投与により黒質に誘発される臨床症状および神経病理学に対するＮＳＴ００３７の効果を分析することにした。
【０２４３】
１７．１．ドーパミン作動性ニューロンの死を誘発する神経毒性物質の亜慢性投与によって引き起こされる運動耐性の低下に対するＮＳＴ００３７の保護効果
実験過程に含まれる総ての動物は、１２週齢の雄ＣＤ１系であった。実験は、動物の操作指針（Scientific Procedures, Act.1986）に厳密に従って行った。動物はそれぞれの検疫期間を有し、接種および取り扱いには汚染の可能性を最小限にするために最大限の注意を持って処理した。
【０２４４】
このアッセイには２０匹の動物を用い、投与は下記の方式に従って腹腔内（ｉ．ｐ．）経路で１００μｌの容量で行った：
ｉ）  ＰＢＳ＋ＭＰＴＰ＋ＰＢＳ方式：１０匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間投与し、２日目以降は動物にＭＰＴＰ３０ｍｇ／ｋｇの１日量を５日間２時間間隔でｉ．ｐ．経路によって接種した。次の２１日間はＰＢＳの３週間量を投与した。
ｉｉ）  ＮＳＴ００３７＋ＭＰＴＰ＋ＮＳＴ００３７方式：１０匹の動物に最初にＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量を２日間投与し、２日目以降は動物にＭＰＴＰ３０ｍｇ／ｋｇの１日量を５日間２時間間隔でｉ．ｐ．経路によって接種した。次の２１日間はＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの３週間量を投与した。
【０２４５】
投与開始の７日前、およびＭＰＴＰの接種の７、１４および２１日後に、動物をローターロッド試験と呼ばれる運動耐性試験に２分間かけ、速度が４〜４０ｒ．ｐ．ｍ．まで増加する円筒上の歩行に動物が耐える時間を記録した。図４４は、様々な群の動物が円筒上を歩き続ける時間のアッセイの様々な時点とベースライン状態との間の比を示す。
【０２４６】
ＰＢＳ＋ＭＰＴＰ＋ＰＢＳ投与方式は、ＭＰＴＰの亜慢性投与の１４日後から開始するベースライン状態からマウスの運動耐性の統計学的に有意な減少を引き起こす（ｐ＜０．０５）。しかしながら、ＮＳＴ００３７の投与により、動物の運動劣化は驚くほど防止され、マウスがＭＰＴＰの投与前に示したレベル（ｐ＞０．０５）の耐性を維持している（ｐ＞０．０５）。
【０２４７】
要約すれば、ＮＳＴ００３７の投与により、ＭＰＴＰの亜慢性投与によって誘発される耐性の喪失から保護される。
【０２４８】
１７．２．神経毒性物質の亜慢性投与によるドーパミン作動性ニューロンの喪失に対するＮＳＴ００３７の保護効果
上記結果に基づいて、本発明者らは、ＭＰＴＰによって引き起こされる精神運動状態の劣化に対して化合物ＮＳＴ００３７によって示される保護は、黒質のようなパーキンソン病に関与するきわめて重要な脳領域の１つにおける神経変性を伴うかどうかを決定しようとした。
【０２４９】
実験過程に含まれる総ての動物は、１２週齢の雄ＣＤ１系であった。実験は、動物の操作指針（Scientific Procedures, Act.1986）に厳密に従って行った。動物はそれぞれの検疫期間を有し、接種および取り扱いには汚染の可能性を最小限にするために最大限の注意を持って処理した。
【０２５０】
このアッセイには２０匹の動物を用い、投与は下記の方式に従って腹腔内（ｉ．ｐ．）経路で１００μｌの容量で行った：
ｉ）  ＰＢＳ＋ＭＰＴＰ＋ＰＢＳ方式：１０匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間投与し、２日目以降は動物にＭＰＴＰ３０ｍｇ／ｋｇの１日量を５日間２時間間隔でｉ．ｐ．経路によって接種した。次の２１日間はＰＢＳの３週間量を投与した。
ｉｉ）  ＮＳＴ００３７＋ＭＰＴＰ＋ＮＳＴ００３７方式：１０匹の動物に最初にＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量を２日間投与し、２日目以降は動物にＭＰＴＰ３０ｍｇ／ｋｇの１日量を５日間２時間間隔でｉ．ｐ．経路によって接種した。次の２１日間はＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの３週間量を投与した。
【０２５１】
２１日間の投与時間の終了後、動物を屠殺し、脳を切開した。脳試料を処理し、パラフィンで包んだ。黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの存在を分析するため、チロシン−ヒドロキシラーゼ（ＴＨ）タンパク質に対する免疫組織化学を５μｍの厚さの矢状切片で行った。図４５は、それぞれの群の典型的な写真を示す。
【０２５２】
ＰＢＳ＋ＭＰＴＰ＋ＰＢＳ投与方式は、幾つかの黒質領域においてＴＨラベリングが存在しないことが明らかに観察されているので、ドーパミン作動性ニューロンの明らかな喪失を引き起こす。対照的に、ＮＳＴ００３７＋ＭＰＴＰ＋ＮＳＴ００３７群の試料は、同じ黒質領域に一層多数のＴＨポジティブ細胞を有していた。
【０２５３】
要約すれば、ＮＳＴ００３７の投与により、ＭＰＴＰの亜慢性投与によって黒質に誘発された神経細胞死の他にマウスの精神運動劣化から保護される。
【０２５４】
１７．３．ドーパミン作動性ニューロンへの神経毒性物質の亜慢性投与によって誘発される酸化的損傷に対するＮＳＴ００３７の保護効果
上記結果に基づいて、本発明者らは、黒質でＭＰＴＰによって引き起こされる神経変性に対して化合物ＮＳＴ００３７によって示される神経保護は、酸化的損傷のようなニューロン損傷のもう一つの組織病理学的徴候の減少を伴うかどうかを決定しようとした。
【０２５５】
実験過程に含まれる総ての動物は、１２週齢の雄ＣＤ１系であった。実験は、動物の操作指針（Scientific Procedures, Act.1986）に厳密に従って行った。動物はそれぞれの検疫期間を有し、接種および取り扱いには汚染の可能性を最小限にするために最大限の注意を持って処理した。
【０２５６】
このアッセイには２０匹の動物を用い、投与は下記の方式に従って腹腔内（ｉ．ｐ．）経路で１００μｌの容量で行った：
ｉ）  ＰＢＳ＋ＭＰＴＰ＋ＰＢＳ方式：１０匹の動物に最初にＰＢＳを１日量で２日間投与し、２日目以降は動物にＭＰＴＰ３０ｍｇ／ｋｇの１日量を５日間２時間間隔でｉ．ｐ．経路によって接種した。次の２１日間はＰＢＳの３週間量を投与した。
ｉｉ）  ＮＳＴ００３７＋ＭＰＴＰ＋ＮＳＴ００３７方式：１０匹の動物に最初にＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの１日量を２日間投与し、２日目以降は動物にＭＰＴＰ３０ｍｇ／ｋｇの１日量を５日間２時間間隔でｉ．ｐ．経路によって接種した。次の２１日間はＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇの３週間量を投与した。
【０２５７】
２１日間の投与時間の終了後、動物を屠殺し、脳を切開した。脳試料を処理し、パラフィンで包んだ。黒質のニューロンにおける脂質過酸化の分析のため、４−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ）に対する明視野免疫組織化学を５μｍの厚さの矢状切片で行った。図４５は、それぞれの群の写真を示す。
【０２５８】
ＰＢＳ＋ＭＰＴＰ＋ＰＢＳ投与方式は、黒質の多数のニューロンにおけるＨＮＥに対するラベリングの存在を誘発する。対照的に、ＮＳＴ００３７＋ＭＰＴＰ＋ＮＳＴ００３７群の試料は、黒質にＨＮＥポジティブラベリングを有する余り多くない数の単離ニューロンを有する。
【０２５９】
要約すれば、ＮＳＴ００３７の投与は、ＭＰＴＰの亜慢性投与による黒質に誘発された脂質過酸化による神経細胞死および酸化的損傷の他に、マウスの精神運動劣化から保護する。
【０２６０】
例１８
インビトロアッセイ（ＰＡＭＰＡ）におけるＮＳＴ００３７の酸形態の血液−脳関門通過の研究
このアッセイの目的は、化合物ＮＳＴ００３７が、シンバスタチンおよびアトルバスタチンと比較して、その活性形態で血液−脳関門（ＢＢＢ）であって、細胞を用いることなく化合物を評価することができるインビトロシステムで模した上記関門を通過することができるかどうかを予測することであった。その目的のため、ＰＡＭＰＡ（平行人工膜透過分析法）と呼ばれ、受動拡散により化合物を通過させるサンドイッチシステムを用いるアッセイを行った。高透過性を有する化合物であるベラパミルをポジティブコントロールとして用い、ＢＢＢを通過しない化合物であるテオフィリンをネガティブコントロールとして用いた。
【０２６１】
ＢＢＢを模倣するため、関門を形成するものに非常に類似しているリン脂質の組成を有するブタ脳由来でありかつＰＢＬ（ブタ極性脳脂質）と呼ばれる市販の脂質混合物を用いた。ベラパミル、テオフィリンおよびアトルバスタチンをＤＭＳＯ中で１０ｍＭに調製し、ＮＳＴ００３７およびシンバスタチンは水で調製して、０．１Ｎ  ＮａＯＨで４℃にて１２時間活性化した。
【０２６２】
アッセイ時に、評価を行う化合物およびコントロール１．５ｍｌを、総ての場合に、一塩基性リン酸ナトリウム（０．４１ｍ）と二塩基性リン酸カリウム（０．２８７ｍ）とを含むリン酸緩衝液、ｐＨ７．４のストックから１００μＭに調製した。その目的のため、化合物の１００倍希釈を、総ての場合にＤＭＳＯ含量を１％と等しくして行った。
【０２６３】
ＰＶＤＦ膜を有し、細孔径が４５μｍの９６−ウェルフィルタープレート（ＭＡＩＰＮ４５５０、Millipore）に、２０μｇ／ｍｌのＰＢＬ５μｌを加えた。２分後、化合物の希釈に用いるリン酸緩衝液３００μｌを加えた。このプレートをアクセプタープレートと考え、サンドイッチの上部に置いた。前記のもので完全に組み立てたもう一つの９６−ウェルプレート（ＭＡＴＲＮＰ５５０、Millipore）に、１００μＭの化合物３００μｌを３個ずつ加えた。更に、使用したリン酸緩衝液に１％ＤＭＳＯのみを含むブランクを含めた。このプレートをドナープレートと読んだ。アクセプタープレートを注意しながらドナープレート上に置き、サンドイッチシステムを形成した。検討目的の化合物は、ドナープレートのウェルからアクセプタープレートの対応するウェルへ、システムが完全なままの１８時間中に拡散した。調製した残っている化合物は、プレートによって形成されたサンドイッチシステムと同じ湿度、温度および暗さの条件で保存した。ドナープレートとアクセプタープレートのウェルの１００μｌを、ＵＶ読み取りのための特殊な９６−ウェルプレートに移した。更に、アッセイを行う目的で調製した化合物１００μｌを３つずつ、プレートと同じ方法で移して保存した（ベースラインウェル）。ＵＶプレートを分光光度計に導入して、走査を２３０〜４９８ｎｍのＵＶで行い、４ｎｍ毎に読み取った。分光光度計のデータに基づいて、関門通過率並びに有効透過率（Ｐｅ）を計算した。下式をＰｅの計算に用いた：
【数１】
0005759448.tif 000007
上記式中、
【数２】
0005759448.tif 000008
［薬剤］アクセプター＝アクセプターウェルの吸光度
［薬剤］平衡＝ベースラインウェル／２の平均値の吸光度
ＶＡ＝アクセプターウェルの体積＝０．３ｃｍ３
ＶＤ＝ドナーウェルの体積＝０．３ｃｍ３
面積＝０．２４ｃｍ２
時間＝６４．０００秒
【０２６４】
化合物の親油性の理論的計算は、ｃＬｏｇＰによって与えられるオクタノール／水分配係数の対数を計算することによって得ることができる。ｃＬｏｇＰは、化学構造をソフトウェアに入れたＣＬＯＧＰプログラム（OSIRIS Property Explorer）によって理論的に計算した。それぞれの化合物についてのｎは、アッセイで得られた値の平均値±ＳＤの計算結果と共に表に示されている。
【０２６５】
【表１】
0005759448.tif 000009
【０２６６】
表Ｉおよび図４６で見られるように、両シンバスタチンおよびＮＳＴ００３７はきわめて類似したＢＢＢ通過レベルを有していた。いずれの場合にも、これらの化合物には、ベラパミル（Ｐｅ＝１０±２ｘ１０−６ｃｍ／ｓ）とテオフィリン（Ｐｅ＝０．２±０．１ｘ１０−６ｃｍ／ｓ）との中間のＢＢＢ通過が予想される。これらのＢＢＢ通過データは、両化合物によって示されかつきわめて類似したｃＬｏｇＰを有する親油性範囲によって確かめられる。しかしながら、アトルバスタチンは、ｃＬｏｇＰが高いにも拘わらず、ほとんどＢＢＢを通過せず、ネガティブコントロールのテオフィリンと同じ範囲である。
【０２６７】
例１９
ヒト肝臓およびニューロン細胞系における細胞内総コレステロールレベルに対するＮＳＴ００３７の効果
このアッセイの目的は、化合物ＮＳＴ００３７がシンバスタチンと比較して、ニューロンおよび肝臓由来の細胞系における総コレステロールレベルをどの程度まで変更することができるかを決定することであった。このアッセイを行うため、ラクトン形態が完全に開くまで化合物をＮａＯＨで活性化した。
【０２６８】
ＨｅｐＧ２（ヒト肝癌）系およびＳＫ−Ｎ−ＭＣ（ヒト神経芽細胞腫）系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得た（それぞれ、ＡＴＣＣｎｏ．ＨＢ−８０６５およびＨＴＢ−１０）。総ての場合に、無菌の厳格な規則に従い、操作は欧州スタンダードＥＮ１２４６９に従ってクラスＩＩの生物学的安全キャビネットで行った。継代保持した（ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ  ｉｎ  ｐａｓｓａｇｅ）細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸および０．０５ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンを補足したＭＥＭ中で９６−ウェルプレートに播種した。ＨｅｐＧ２の場合には、４ｘ１０４個／ウェル、ＳＫ−Ｎ−ＭＣの場合には、５ｘ１０４個／ウェルを播種した。播種から２４時間経過後、細胞にＦＢＳを８時間与えなかった。次いで、細胞を様々な濃度の投与と共に２０時間インキュベーションした。インキュベーション期間の後、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むリン酸緩衝液で溶解した。溶解（ｌｙｓｉｓ）は、２回の凍結−融解によって完了した。
【０２６９】
総コレステロールは、酵素および蛍光法によって定量した。それぞれの溶解生成物２５μｌを、１０μｇ／ｍｌ〜０．０８μｇ／ｍｌまでの標準コレステロール曲線と共に９６−ウェルプレートに移した。コレステロールオキシダーゼ（０．５Ｕ／ｍｌ）、コレステロールエステラーゼ（０．８Ｕ／ｍｌ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（４Ｕ／ｍｌ）およびａｍｐｌｉｆｌｕ  ｒｅｄ（２０μｇ／ｍｌ）を含む０．０５Ｍ  ＭＥＳ（ｐＨ６．５）を基剤として調製した反応性混合物７５μｌを試料に加え、インキュベーションを３７℃で１５分間行った。蛍光強度を、フルオロメーターによって励起を５３０ｎｍおよび放射の５８０ｎｍで測定した。結果をＢＣＡ法によって測定されたタンパク質によって規格化した。
【０２７０】
図４７は、ＮＳＴ００３７が両細胞型でどのような低コレステロール血症効果を有するかを示しているが、これはニューロン細胞においてであり、コレステロールの減少は一層劇的であった。ＨｅｐＧ２の場合には、ＮＳＴ００３７はシンバスタチンより強力であったが、ＳＫ−Ｎ−ＭＣでは、両化合物によるコレステロールの減少は同様であった。
【０２７１】
例２０
内因性高脂血症モデル（家族性）に２８日間経口投与したＮＳＴ００３７の低コレステロール血症効果
化合物ＮＳＴ００３７の低コレステロール血症特性について上記で示された結果に基づいて、研究者らは、例５．２．で用いた家族性内因性高脂血症モデル（ａｐｏＢ１００マウス）におけるＮＳＴ００３７の経時的経口投与の効果を評価することにした。この新たな研究の目的は、長期間の経口投与がコレステロールレベル経時的に減少させるのに有効であるかどうかを分析することであった。
【０２７２】
実験過程に含まれる総ての動物は、１２週齢の雌マウスであった。実験は、動物の操作指針（Scientific Procedures, Act.1986）に厳密に従って行った。動物はそれぞれの検疫期間を有し、接種および取り扱いには汚染の可能性を最小限にするために最大限の注意を持って処理した。
【０２７３】
マウスを、コントロール群（ｎ＝８）、シンバスタチン群（ｎ＝８）、ＮＳＴ００３７群（ｎ＝８）の３群に分けた。食餌に対するコンディショニングの後、シンバスタチンまたはＮＳＴ００３７（そのラクトン形態）５０ｍｇ／ｋｇをマウスに同じ時間（１５．００〜１８．００時）に２８日間連続して、いずれの場合にも０．２５％カルボキシメチルセルロース水溶液をビヒクルとして用いて投与した。コントロール群には、この同じビヒクルを投与した。投与開始前、および投与開始の７、２１および２８日後に、１６時間の絶食の後に後眼窩から採血を行った。血漿を上記血液から得て、総コレステロール（ＴＣ）、遊離コレステロール（ＦＣ）、コレステロール（ＥＣ）、ＨＤＬ−ｃ、ＬＤＬ−ｃ、ＶＬＤＬ−ｃおよびａｐｏＢ１００レベルを酵素および分光光度法によって評価した。酸化ストレスの変化に関与する脂質レベルの効果をチェックするため、得られた血漿のレドックス状態を更にＴＥＡＣ（トロロックス抗酸化能アッセイ）法によって評価した。この手法は、インビトロでの酸化防止能を決定するものであり、電子移動による吸収能力によって分析された試料のレドックス状態の観念を与える。反応の様々な成分であるミオグロビン、ＡＢＴＳ（２，２−アジノ−ビス−（３−エチルベンズチアゾリン−スルホン酸））、過酸化水素およびＨ２Ｏ２を、９６−ウェルプレートにてＰＢＳ（１０μｌ）で１０倍に希釈した血漿に加えた。３分間インキュベーションの後、吸光度を４０５ｎｍで（６００ｎｍの参照波長で）測定した。
【０２７４】
図４８は、いずれの投与も血漿総コレステロールレベルを有意に減少させることができることを示している。この事実は、ＬＤＬの僅かな増加に加えて、ＶＬＤＬおよびＨＤＬの減少によって主として示される。更に、アポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）レベルは、投与によって明らかに減少した。図４９は、更にシンバスタチンと比較して化合物ＮＳＴ００３７の投与後のＦＣおよびＥＣレベルの減少も示しており、この減少は、投与の２１日後に一層顕著となった。図５０に示されるように、ＮＳＴ００３７およびシンバスタチンの投与は、動物の血漿のレドックス状態を減少させることも明らかになった。
【０２７５】
要約すれば、ＮＳＴ００３７を先天性高脂血症マウスに２８日間経口投与すると、動物の総コレステロール、エステル化コレステロール、遊離コレステロールレベル、コレステロールと関連したリポタンパク質画分、ＡｐｏＢレベルおよびレドックス状態が減少する。
【０２７６】
例２１
内因性高脂血症モデル（家族性）で３ヶ月間経口投与したＮＳＴ００３７の低コレステロール血症効果
化合物ＮＳＴ００３７の低コレステロール血症特性について上記で示された結果に基づいて、研究者らは、同じ家族性内因性高脂血症モデル（ａｐｏＢ１００マウス）におけるＮＳＴ００３７の３ヶ月間の経口投与の効果を評価することにした。
【０２７７】
実験過程に含まれる総ての動物は、６月齢の雌マウスであった。実験は、動物の操作指針（Scientific Procedures, Act.1986）に厳密に従って行った。動物はそれぞれの検疫期間を有し、接種および取り扱いには汚染の可能性を最小限にするために最大限の注意を持って処理した。
【０２７８】
マウスを、コントロール群（ｎ＝８）、シンバスタチン群（ｎ＝６）、ＮＳＴ００３７群（ｎ＝８）の３群に分けた。食餌に対するコンディショニングの後、ＮＳＴ００２１またはＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇをマウスに週３回で３ヶ月間、いずれの場合にも０．２５％カルボキシメチルセルロースの生理食塩水をビヒクルとして用いて経口投与した。コントロール群には、この同じビヒクルを投与した。投与開始前、および投与開始の１、２および３ヶ月後に、１６時間の絶食の後に後眼窩から採血を行った。血漿を上記血液から得て、総コレステロール（ＴＣ）、遊離コレステロール（ＦＣ）、コレステロール（ＥＣ）、ＨＤＬ−ｃ、ＬＤＬ−ｃ、ＶＬＤＬ−ｃレベルを酵素および分光光度法によって評価した。
【０２７９】
図５１は、両方の投与物がどのように様々なコレステロール画分を減少させるのかを示している。しかしながら、ＮＳＴ００３７は驚くべきことにはＬＤＬ−ｃレベルを大幅に減少させ、ＨＤＬ−ｃレベルを増加させ、これによりシンバスタチンより良好な心保臓護プロフィールを示している。これらの結果は、ＦＣおよびＥＣレベルに対する投与の効果と相関しており（図５２）、ＮＳＴ００３７はＦＣおよびＥＣのいずれをも有意に減少させることが分かった。
【０２８０】
要約すれば、先天性高脂血症マウスにＮＳＴ００３７を３ヶ月間経口投与すると、総コレステロール、エステル化コレステロール、遊離コレステロールレベルの減少を引き起こし、並びにＬＤＬ−ｃレベルの減少およびＨＤＬ−ｃの増加を引き起こし、このことは、その心臓保護力を明らかにしている。
【０２８１】
例２２
遺伝的肥満ＺｕｃｋｅｒラットにおけるＮＳＴ００３７の脂質低下効果
マウスにおける化合物ＮＳＴ００３７の低コレステロール血症特性について上記で示された結果に基づいて、研究者らは、異常に高い脂質レベルを有する遺伝的肥満Ｚｕｃｋｅｒラットの内因性高脂血症モデルにおけるＮＳＴ００３７の７日間の経口投与の効果を評価することにした。
【０２８２】
実験過程に含まれる総ての動物は、１１週齢の雄Ｚｕｃｋｅｒラットであった。実験は、動物の操作指針（Scientific Procedures, Act.1986）に厳密に従って行った。動物はそれぞれの検疫期間を有し、接種および取り扱いには汚染の可能性を最小限にするために最大限の注意を持って処理した。
【０２８３】
マウスを、コントロール群（ｎ＝７）、シンバスタチン群（ｎ＝７）、ＮＳＴ００３７群（ｎ＝７）の３群に分けた。食餌に対するコンディショニングの後、ＮＳＴ００２１またはＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇをマウスに同じ時間（１５．００〜１８．００時）に連続７日間、いずれの場合にも０．５％カルボキシメチルセルロースの水溶液をビヒクルとして用いて経口投与した。コントロール群には、この同じビヒクルを投与した。投与開始前、および投与開始の７日後に、１６時間の絶食の後に麻酔下にて舌穿刺によって採血を行った。血漿を上記血液から得て、総コレステロール、ＨＤＬ−ｃ、ＬＤＬ−ｃ、ＶＬＤＬ−ｃおよびトリグリセリド（ＴＧ）レベルを酵素および分光光度法によって評価した。酸化ストレスの変化に関与する脂質レベルの効果をチェックするため、得られた血漿のレドックス状態を更にＴＥＡＣ（トロロックス抗酸化能アッセイ）法によって評価した。この手法は、インビトロでの酸化防止能を決定するものであり、電子移動による吸収能力によって分析された試料のレドックス状態の観念を与える。反応の様々な成分であるミオグロビン、ＡＢＴＳ（２，２−アジノ−ビス−（３−エチルベンズチアゾリン−スルホン酸））および過酸化水素を、９６−ウェルプレートにてＰＢＳ（１０μｌ）で１０倍に希釈した血漿に加えた。３分間インキュベーションの後、吸光度を４０５ｎｍで（６００ｎｍの参照波長で）測定した。
【０２８４】
図５３は、シンバスタチンおよびＮＳＴ００３７はいずれも血漿ＬＤＬレベルを同等に減少させることができることを示しており、この事実は、ＬＤＬ受容体発現の増加を生じるＨＭＧＲ活性の阻害に直接関係していた。この場合には、ＮＳＴ００３７の効果は、統計学的有意性に達した。更に、両化合物は、ＨＤＬの増加を引き起こし、心臓保護効果を伴っている。図５４は、化合物が低トリグリセリド血症効果を示唆する血漿トリグリセリドレベルを減少させるやり方を示している。更に、コントロールラットでは、ＴＥＡＣによる血漿中のレドックス状態によって測定された酸化ストレスが増加したが（図５５）、シンバスタチンおよびＮＳＴ００３７を投与したラットでは、劇的な減少が見られ、酸化防止効果を示唆していた。この場合には、結果は、ＮＳＴ００３７の場合にのみ統計学的に有意であった。
【０２８５】
要約すれば、ＮＳＴ００３７を内因性高脂血症の遺伝的肥満Ｚｕｃｋｅｒラットに７日間経口投与したところ、ＬＤＬ−ｃレベル、トリグリセリドおよびレドックス状態が減少し、これは、その心臓保護力を示していた。
【０２８６】
例２３
野生型マウスにおける２４−デヒドロコレステロールレダクターゼ（セラジン−１／ＤＨＣＲ２４）遺伝子の発現に対するＮＳＴ００３７の効果
ヒトニューロン系におけるセラジン−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子の誘発についての例９に示された結果に基づいて、研究者らは、ＮＳＴ００３７が、この化合物を投与したマウスの脳における上記遺伝子を変更するかどうかを分析することにした。
【０２８７】
この検討を行うため、３月齢の雄Ｃ５７ＢＬ６マウス（ｎ＝３／群）にシンバスタチンまたはＮＳＴ００３７  ５０ｍｇ／ｋｇを経口投与した。コントロール群には、０．２５％カルボキシメチルセルロースの生理食塩水溶液からなるビヒクルのみを投与した。経口投与の４時間後、動物をイソフルランによるガス麻酔下で屠殺し、ＰＢＳを予め灌流させた脳を取り出した直後、液体窒素で凍結させた。その後、脳の総ＲＮＡをＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット(Roche)によって抽出し、ＲＮＡの量および質を分光光度法（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００  ｗｉｔｈ  ＮａｎｏＱｕａｎｔ， Tecan）によって分析し、電気泳動法によって１８Ｓおよび２８Ｓバンドを検査した。ＲＴ−ＰＣＲを、最初にＲＮＡ  ｔｏ  ｃＤＮＡキット（Applied Biosystem）を用いてｍＲＮＡをｃＤＮＡに変化させ、次いで遺伝子発現を、７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ装置（Applied Biosystem）でセラジン−１／ＤＨＣＲ２４についてはＭｎ００５１９０７１＿ｍ１および１８Ｓ（結果の規格化に使用）についてはＨｓ９９９９９９０１＿ｓ１の検証済プローブを用いるＴａｑＭａｎプローブによって分析した。遺伝子発現の相対量を、ＳＤＳｖ２．１．１ソフトウェア（Applied Biosystem）を用いるΔΔＣｔ法によって測定し、１８Ｓの発現を用いて測定を規格化した。
【０２８８】
図５６は、シンバスタチンおよびＮＳＴ００３７がいずれもその投与の４時間後に遺伝子発現を同程度まで増加したことを示している。これらの結果はヒトニューロンにおける上記データを確認するものであり、ＮＳＴ００３７の神経保護機構としてのセラジン−１発現の増加が観察された。更に、これらの結果から、上記例において示された血液−脳関門通過が確かめられた。
【０２８９】
要約すれば、野生型マウスにおけるＮＳＴ００３７の経口投与は、セラジン−１／ＤＨＣＲ２４神経保護遺伝子を増加させ、更にこの化合物が血液−脳関門を通過することが確かめられる。
【０２９０】
例２４
ゼブラフィッシュ幼生での２種類の化合物の生存率の比較分析
２４．１．ゼブラフィッシュ幼生でのシンバスタチンと比較した化合物ＮＳＴ００３７の生存率の分析。急性毒性分析
化合物ＮＳＴ００３７の生物安全性を評価するため、ゼブラフィッシュ幼生モデルに対するその毒物学的効果を、ＯＥＣＤ  Ｃ１５プロトコルの安全性パラメーターを測定することによって分析した。
【０２９１】
受精卵を、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ，ＡＢ系）の自然交配によって得た。それぞれの交配には全部で８〜１０対を用い、総数が２００〜２５０個の卵が対当たり平均して生まれた。卵を産卵直後に集め、EC Regulation 440/2008、方法Ｃ．１に従ってｐＨを７．８±０．２に調整した希釈水（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ２  ０．２９ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２  ０．１２ｇ／ｌ、ＮａＨＣＯ３  ０．０６５ｇ／ｌ、ＫＣｌ  ０．００６ｇ／ｌ）で洗浄し、ペトリ皿に置いた。
【０２９２】
胚は、受精後９６時間までそれらの増殖培地で普通に発育させた。上記時点で、幼生をペトリ皿から暴露チャンバー（Ｍ２４マイクロタイタープレート）にピペットで移し、試験を行う物質（ＮＳＴ００３７またはシンバスタチン）に希釈水（コントロール）または様々な濃度の投与物と共に暴露した。幼生を更にエアレーションすることなく、適当な温度（２５±１℃）および１２時間明／１２時間暗の方式でインキュベーションした。それぞれの実験は、３回ずつ行った。
【０２９３】
検討は、２４時間投与を行うことによって、急性毒性分析を行った。処理は、下記の方式に従って行った：
希釈水を２４時間投与した１０匹のコントロール動物。
２４時間希釈水中で希釈した化合物ＮＳＴ００３７を投与した３０匹の動物（１０個の胚、３組）。
２４時間希釈水中で希釈した化合物シンバスタチンを投与した３０匹の動物（１０個の胚、３組）。
【０２９４】
検討中の物質の暴露時間の後、幼生の死亡率の記録を測定した。表ＩＩは、ゼブラフィッシュ幼生におけるシンバスタチンと比較した化合物ＮＳＴ００３７の生存率の分析を示す。この表は、実験に用いた幼生の数、ｍｇ／ｋｇ（動物の体重）での用量、処理時間、および総数に対する死亡した幼生の数を示す。
【０２９５】
【表２】
0005759448.tif 000010
【０２９６】
検討の結果は、両化合物は、ゼブラフィッシュ幼生の死亡を誘発するパラメーターに関して同様の毒物学的プロフィールを有し、用いた用量のいずれにおいても死は観察されないことを示していた。
【０２９７】
２４．２．幼生におけるシンバスタチンと比較した化合物ＮＳＴ００３７の暴露後の健康な幼生の割合の分析。急性毒性アッセイ
上記結果に基づいて、本発明者らは、化合物ＮＳＴ００３７によって記録された死亡率が見られないことが、シンバスタチンによる処理と同じまたはそれ未満の健康な幼生の割合と関連しているかどうかを決定しようとした。健康な幼生の割合は、外部の生理病理学的異常（形態および／または行動）の症状のない、生きている幼生の数として定義され、後者は検討中の物質の生物安全性を決定するパラメーターであり、生存率およびＬＤ５０に相補的である。図５８に示されるように、最高の検討用量（１０００ｍｇ／ｋｇ）で評価した２つの処理の間には、健康な幼生の割合の差が観察され、化合物ＮＳＴ００３７については６７．９±３．３に達し、シンバスタチンについては５３．３±８．８であり、これは、驚くべきことにはゼブラフィッシュ幼生モデルでの化合物ＮＳＴ００３７の生物安全性が一層高いことを示している。
【０２９８】
２４．３．幼生におけるシンバスタチンと比較した化合物ＮＳＴ００３７の暴露後の異常外観（総合的症状）を有する幼生の割合の分析。急性毒性アッセイ
上記節の結果に基づいて、本発明者らは、シンバスタチンと比較して化合物ＮＳＴ００３７の一層高い生物安全性が、奇形または異常外観を有する幼生の割合の分析によって身体的および／または色素異常を示す幼生の割合を集めて確認されるかどうかを検討することにした。この検討で記録された異常は、下記の通りである：
卵黄嚢における血栓症：血管、この場合には卵黄を灌注する任意の血管内の凝塊。
心臓血栓症：心臓血管で起こる。
心臓浮腫（または水症）：細胞内組織空間および臓器の腔部における流体の蓄積。心臓の場合には、心膜での流体の蓄積を生じる。
【０２９９】
結果は、奇形または異常外観を有する幼生の割合が両化合物間できわめて類似しているが、図５８に示されるように、驚くべきことには、シンバスタチンは化合物ＮＳＴ００３７より高い毒物学的総合的症状を有する幼生の割合を誘発することを明らかにし、これは、後者の生物安全性の方が高いことを示している。
【０３００】
要約すれば、ゼブラフィッシュ幼生にＮＳＴ００３７を広い濃度範囲で投与しても、死亡率は全く生ぜず、その上、シンバスタチンより高い割合の健康な幼生および少数の奇形または異常外観を有する幼生を提供する。
【０３０１】
例２５
２５．１．シンバスタチンと比較して化合物ＮＳＴ００３７を水中で暴露することによる単回投与の毒性分析（２４時間）における成熟ゼブラフィッシュの体重の変化の検討
上記例の結果に基づいて、本発明者らは、シンバスタチンと比較して化合物ＮＳＴ００３７の一層高い生物安全性が、欧州医薬品庁（ＥＭＥＡ）に包含される単回投与分析による成熟ゼブラフィッシュの体重変化の分析によって確認されるかどうかを検討することにした。このＥＭＥＡの検討は、時間に関する、物質または物質の組み合わせの単回投与によって引き起こされる毒性現象の性質および量についてである。これらの検討は、ヒトで起こる過量の可能な効果の情報について記載しており、治療薬の投与の繰り返し投与が必要な毒性研究のデザインに用いることができる。
【０３０２】
実験は、動物の操作指針（Scientific Procedures, Act.1986）に厳密に従って行った。展開したアッセイは、下記の検討パラメーターを有する：
投与期間：水中で暴露により２４時間。
投与後時間：１４日間。
動物数：濃度当たり７匹。
アッセイ容器：９リットルの容積を有する魚用タンクであって、濾過ラック再循環水５リットルでその容積を満たす。
動物荷重：魚の平均重量、０．５４〜０．６０ｇ。
アッセイ濃度：２０００ｍｇ／ｋｇ。
明るさ：１２／１２時間の明／暗の光周期。
温度：２５±１℃。
食物：動物には、投与前２４時間またはアッセイを継続する２４時間は食物を与えなかった。その後、動物の休養のように食物を与えた。
動物の重量：時間０（投与前）、投与の７および１４日後に体重測定した。
【０３０３】
この場合には、投与開始前（０ｄｐｔ）、投与の７日後および投与の１４日後の３つの確定時間の様々な検討群の動物の重量を、毒性パラメーターとして用いた。図５９は、投与および物質の暴露後時間による動物の重量の平均値を示す。この結果は、投与なしの魚の重量は検討を通して増加したが、シンバスタチンを投与した魚の重量は有意に減少することを示していた。次には、ＮＳＴ００３７の投与は、驚くべきことには、アッセイ中重量を変更せず、これはシンバスタチンより良好な安全性プロフィールを有することを示している。
【０３０４】
２５．２．シンバスタチンと比較した化合物ＮＳＴ００３７の水中での暴露による単回投与による毒性分析（２４時間）後の成熟ゼブラフィッシュでの組織病理学的検討
上記検討の結果に基づいて、本発明者らは、ヘマトキシリン−エオシンで試料を染色することによって様々な投与群の組織病理学的検討に差があるかどうかを検討することにし、これは、検討を行っている動物の臓器または組織における病理学的徴候を識別することができる。その目的のため、魚を、投与１４日後に（予め麻酔して）屠殺し、試料（魚全体）をパラフィンで包んだ。次いで、ヘマトキシリン−エオシン染色を行い、組織病理学的検討を行い、動物当たり最低６枚の縦断面を得て、同一臓器の様々な検討領域を集めた。下記の臓器を検討した：脳、腎臓、膵臓、腸、目、鰓、卵巣、精巣、筋肉および肝臓。図６０は、２０００ｍｇ／ｋｇの用量を投与した動物で行った組織病理学的検討の典型的な画像を示す。検討を行った総ての臓器の中で、識別可能な病理学的特徴を有するものは、腸および卵巣であった。腸絨毛での萎縮の徴候は腸で検出されるが、ＮＳＴ００３７を投与した動物よりはシンバスタチンを投与したもので一層顕著であった。シンバスタチンを投与した雌の卵巣では、萎縮は第三次卵母細胞で検出された。更に、両化合物を投与した動物の肝臓は、離散性炎症（ｄｉｓｃｒｅｔｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）領域を有していた。
【０３０５】
要約すれば、成熟ゼブラフィッシュでのＮＳＴ００３７の投与は、１４日の実験中その重量を変化させなかったが、シンバスタチンの投与は、動物の重量の有意な減少を検出させた。更に、シンバスタチンはＮＳＴ００３７より大きな組織病理学的効果を生じ、後者の化合物が一層安全であることを示している。
【０３０６】
例２６
２６．１．成熟ゼブラフィッシュにおいて、シンバスタチンと比較してＮＳＴ００３７の水中での恒常的暴露（４日間）による致死率の検討
上記例の結果に基づいて、本発明者らは、シンバスタチンと比較して化合物ＮＳＴ００３７の一層高い生物安全性が、ＯＥＣＤの魚についての急性毒性試験（改訂指針案２０３）に従って４日間水中での恒常的暴露による致死率の分析によって確認されるかどうかを検討することにした。このアッセイの目的は、淡水魚についての物質の急性致死毒性を決定することである。急性毒性は、所定の物質に短期間（数日間）暴露した結果として生体に誘発される識別可能な有害効果である。本アッセイでは、急性毒性は、平均致死用量（ＬＤ５０）、すなわち、水中で継続的暴露期間アッセイに付されたバッチの魚の５０％に死を引き起こす用量として表される。
【０３０７】
実験は、動物の操作指針（Scientific Procedures, Act.1986）に厳密に従って行った。展開したアッセイは、下記の検討パラメーターを有する：
静的方法：毒性分析は、その間分析溶液を取り替えることなく、行った。
コントロール（またはチェック試料）は、実際の分析濃度の他に分析物質なしで作成する。
期間：４日間。
投与後時間：１４日間。
動物数：濃度当たり７匹。
容器：９リットルタンクであって、濾過ラック再循環水５リットルでその容積を満たす。
荷重：魚の平均重量、０．４６ｇ±０．０３、荷重は０．４９ｇ／リットル。
アッセイ濃度：５段階濃度（１、３．２、１０、３２および１００ｍｇ／ｋｇ）。
明るさ：１２／１２時間の明／暗の光周期。
温度：２５±１℃。
食物：なし。
【０３０８】
全分析時間中の検討を行っている動物の死は、毒性パラメーターとして記録した。
【０３０９】
表ＩＩＩは、水中で化合物を４日間投与した成熟ゼブラフィッシュでシンバスタチンと比較した化合物ＮＳＴ００３７の生存率の分析を示す。この表は、実験に用いた動物数、ｍｇ／ｋｇ（動物の体重）での用量、処理時間、および総数に対する死亡した動物数を示す。
【０３１０】
【表３】
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【０３１１】
表ＩＩＩに示されるように、この急性毒性アッセイにおいて両化合物によって引き起こされる死亡率は、驚くべきことには、投与４日後には、ＮＳＴ００３７を投与した動物の１４％（１／７）が死亡し、シンバスタチンを投与した群について観察された死亡率は８６％（６／７）であったので、シンバスタチンは化合物ＮＳＴ００３７より毒性が有意に高かった（χ２、ｐ値＜０．００１）。この検討で観察されることによれば、化合物ＮＳＴ００３７のＬＤ５０は、この化合物の連続投与の４日後には１００ｍｇ／ｋｇより高かった。シンバスタチンのＬＤ５０は、４ｄｐｔ後には６０．５５ｍｇ／ｋｇであり、シンバスタチンはＮＳＴ００３７より少ない用量でかつ同じ時間でＬＤ５０に達したので、化合物ＮＳＴ００３７より毒性が驚くほど高かった。
【０３１２】
２６．２．成熟ゼブラフィッシュにおいてシンバスタチンと比較したＮＳＴ００３７の水中での恒常的暴露（４日間）による致死率分析後の成熟ゼブラフィッシュの組織病理学的検討
上記検討の結果に基づいて、本発明者らは、様々な投与群の試料をヘマトキシリン−エオシンで染色することによって組織病理学的検討に差があるかどうかを検討することにより、検討を行っている動物の臓器または組織における病理学的徴候を識別できるかどうかを検討することにした。その目的のため、投与の後に生き残った魚を、投与の４日後に（予め麻酔して）屠殺し、試料（魚全体）をパラフィンで包んだ。次いで、ヘマトキシリン−エオシン染色を行い、組織病理学的検討を行い、動物当たり最低６枚の縦断面を得て、同一臓器の様々な検討領域を集めた。下記の臓器を検討した：脳、腎臓、膵臓、腸、目、鰓、卵巣、精巣、筋肉および肝臓。
【０３１３】
図６１は、投与した動物で行った組織病理学的検討の典型的な画像を示す。それは、検討を行った病理学的研究の典型的な画像を示している。毒性学的問題を誘発した用量は、３２および１００ｍｇ／ｋｇの用量のみであり、病理学的変化は卵巣に限定されていた。雌のコントロールは様々な成熟段階で正常な卵胞を示し、両化合物を１００ｍｇ／ｋｇ投与した雌は卵巣の損傷を示し、間質変化に加えて第二次および第三次卵母細胞のかなりの変性が観察された。更に、シンバスタチンを投与した雌の群でも、卵巣に組織病理学的損傷を示したが、驚くべきことには、これは、同じ用量の化合物ＮＳＴ００３７を投与した雌の群では観察されず、化合物ＮＳＴ００３７はこの実験モデルではシンバスタチンより安全であることを示している。
【０３１４】
要約すれば、成熟ゼブラフィッシュでのＮＳＴ００３７  １００ｍｇ／ｋｇの４日間の投与は、残留死亡（ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ）を示し、これは同一条件ではシンバスタチンにもみられた。さらに、見出された組織病理学的損傷は動物の卵巣に限定されており、シンバスタチンの３２および１００ｍｇ／ｋｇの用量では検出されたが、ＮＳＴ００３７では、卵巣損傷は最高用量で検出されただけであり、このことは、後者の化合物が一層安全であることを示している。
【図５】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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