(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体の肝臓におけるαvインテグリン発現の存在、場所及び／又は量を決定する方法に用いられる式Ｉの造影剤であって、該方法が、（ｉ）検出可能な量の式Ｉの造影剤を投与しておいた被検体を準備する段階と、（ｉｉ）肝臓中のαvインテグリン発現組織に式Ｉの造影剤を結合させる段階と、（ｉｉｉ）式Ｉの造影剤から放出される信号をインビボイメージング法で検出する段階と、（ｉｖ）信号の場所及び／又は量を表す画像を形成する段階とを含んでおり、式Ｉの造影剤は以下の通り定義される造影剤。【化１】
0005709522.tif 000040式中、Ｇはグリシンを表し、Ｄはアスパラギン酸を表し、Ｘ1は、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ホモリジン又はＣ3〜6ジアミノアルカン酸から選択されるアミノ酸を表し、Ｘ2及びＸ4は独立にジスルフィド又はチオエーテル結合を形成するシステイン又はホモシステイン或いは環化架橋を形成するアスパラギン酸又はリジンを表し、Ｘ3はアルギニン又はＮ−メチルアルギニンを表し、Ｘ5はチロシン、フェニルアラニン、３−ヨード−チロシン  Ｃ4〜6シクロアルキルアラニン又はナフチルアラニンを表し、Ｘ6はＸ6をＣ（＝Ｏ）基に連結するチオエーテル結合又はチオアセタール結合のいずれかを形成するチオール含有アミノ酸を表し、Ｗ1は任意要素としてのリンカー基であり、Ｚ1は水素であり、Ｗ2はリンカー基であり、Ｚ2はイメージング部分であり、上記リンカー基は式−（Ｌ）n−の基であって、ｎは１〜１５の整数であり、各Ｌは−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＨ2−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨ2ＯＣＨ2−、アミノ酸及びポリアルキレングリコールから選択される。
【請求項２】
Ｘ1がリジンであり、Ｘ2及びＸ4が共にシステインであり、Ｘ3がアルギニンであり、Ｘ5がフェニルアラニンであり、Ｘ6がシステインである、請求項１記載の造影剤。
【請求項３】
リンカー基が１〜１０単位の単分散ＰＥＧ構成単位を表す、請求項１又は請求項２記載の造影剤。
【請求項４】
リンカー基が１〜１０のアミノ酸残基を表す、請求項１又は請求項２記載の造影剤。
【請求項５】
前記イメージング部分が以下の（ｉ）〜（ｉｖ）から選択される、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の造影剤。
（ｉ）放射性金属イオン、
（ｉｉ）γ線放出型放射性ハロゲン、
（ｉｉｉ）陽電子放出型放射性非金属、及び
（ｉｖ）常磁性金属イオン。
【請求項６】
前記イメージング部分が前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択される、請求項５記載の造影剤。
【請求項７】
前記イメージング部分が99mＴｃ、123Ｉ、11Ｃ及び18Ｆから選択される、請求項６記載の造影剤。
【請求項８】
生体適合性担体と共に、哺乳類への投与に適した形態で調製される、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の造影剤。
【請求項９】
被検体がインビボでのインタクトな哺乳類の身体である、請求項８記載の造影剤。
【請求項１０】
被検体がヒトである、請求項８記載の造影剤。
【請求項１１】
被検体における肝星細胞（ＨＳＣ）の存在、場所及び／又は量を決定するための請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の式Ｉの造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボイメージング法、特に、ある種の公知のインビボイメージング剤の新規用途に関する。本発明の好ましいインビボイメージング法は単光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）及び陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）である。
【背景技術】
【０００２】
慢性ウイルス性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、寄生虫血症、先天性代謝異常及び飲酒による中毒性障害を始めとする肝線維症を引き起こす可能性のある傷害は地理的に広く分布し、有病率は高い。こうした要因はすべて、肝硬変と潜在的に肝癌を招く線維症が、依然として世界中での主な病因及び死因の一つであることを意味している。英国だけをとっても、肝疾患は現在５番目に多い死因であり、その発症率は増加しつつある（Ｉｒｅｄａｌｅ  ２００３  ＢＭＪ  Ｖｏｌ．  ３２７  ｐｐ  １４３−１４７）。
【０００３】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）とＮＡＳＨの２種類の脂肪肝疾患が存在する。米国の人口の約２４％がＮＡＦＬＤをもつと考えられており、これは低い頻度でＮＡＳＨへと進行する。ＮＡＦＬＤはメタボリックシンドロームに関連しており、肥満、高脂血症、高血圧及びＩＩ型糖尿病と関係がある。米国では約４７００万人がメタボリックシンドロームをもっていると考えられている。米国の人口のうち推定８６０万人がＮＡＳＨを有していて、線維症及び肝硬変に罹患するおそれがあり、ＮＡＳＨ患者の２０〜２８％が１０年間で肝硬変を発症すると考えられている。ＮＡＦＬＤはごく一般的で、ＮＡＳＨへ、ひいては肝硬変へと進行しかねないＮＡＦＬＤの範囲の重症度の低い端を表す。肝線維症はＮＡＳＨから肝硬変へと進行するリスクの指標である。
【０００４】
肝線維症の検出に現在用いられているアプローチは幾つかの重大な短所をもつ。コラーゲン沈着のパターンの組織学的分析による肝生検は、肝疾患ステージ及び肝線維症を評価するための最も信頼できる基準とみなされている。しかし、この方法には、若干の有病率、偶発的な死亡率、高いコスト、サンプリング誤差及び線維症の程度を分類する際の肝臓病理学者間での高い観察者間変動を伴う。生検での肝臓のサンプリングは、評価すべき肝臓の５万分の１にすぎず、ステージ診断の誤りを招くおそれがある。さらに、コラーゲンは繊維組織のマーカーであり、コラーゲンは活動性線維症の後期ステージにおいても、疾患プロセスが解消しつつある場所でも見つかるので、コラーゲンは活動性疾患の理想的標的ではない。現在、肝線維症を非侵襲的方法で有効に特徴付けてモニターすることができる手段はない。そのため、早期治療介入して肝線維症の進行を遅らせ停止させるのに悪影響がある。さらに、病気の進行を適宜モニターするには、３〜５年毎に繰返し生検を行うことが推奨されている。肝線維症の検出に利用できる血液検査の価値が限られているのは、線維症の程度又は線維症と肝硬変との区別に用いることができないからである。現在、ＮＡＳＨとＮＡＦＬＤを区別し、或いはＮＡＳＨにおける線維症を十分に定量化し特徴付けるのに利用できる方法はない。
【０００５】
肝星細胞（ＨＳＣ）は、肝臓における主要なフィブロコンピテント（fibrocompetent）細胞と広くみなされている。進行性肝線維症中に、ＨＳＣは活性化して増殖するが、線維症の解消中には、肝臓瘢痕の分解と同時に起こる広範囲のＨＳＣアポトーシスがある。線維症のプロセスのこの進行性ステージは、線維形成と呼ばれる。活性化ＨＳＣ上のインテグリン発現の上方制御が報告されている（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２００４；  ２７９（２３）：  ２３９９６−２４００６）。ＨＳＣの活性化は、線維形成及び、続く肝線維症の開始及び進行に不可欠である。従って、ＨＳＣ活性化のマーカーは、線維形成のイメージングにとっての標的機会である。この事に関して、最近になって顕著になってきたプロセスのマーカーはインテグリンである（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ  ２００４  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．；  ２７９：  ２３９９６−２４００６；  Ｐａｔｓｅｎｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２００７  Ｊ．  Ｈｅｐａｔｏｌ．；  ４６（５）：  ８７８−８８７；  Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ  ２００６  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．；  ２８１：  ３９７５７−３９７６５；  Ｃａｒｌｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ  １９９６  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ：  １１０：  １１２７−３６）。
【０００６】
インビボイメージング用途のための適当に標識されたインテグリン結合剤の使用についてこれまで記載されている。
【０００７】
国際公開第２００４／０２０４３５号は、αvインテグリン又はそのサブタイプの発現に起因する細胞増殖の病理学的な上方制御又は調整不全を伴う疾患の治療に有用であるインテグリン結合性ピペリジニル化合物を開示している。国際公開第２００４／０２０４３５号は、発明の化合物が、インビボイメージングに適している部分とコンジュゲートし、非侵襲的腫瘍イメージング剤として使用できることも開示している。
【０００８】
国際公開第２００７／０８８０４１号は、ある疾患の治療及び／又は予防に有用である、あるクラスの小分子インテグリン結合性化合物を開示しており、その疾患は好ましくはαvβ1インテグリンにより仲介される疾患である。肝線維症は、国際公開第２００７／０８８０４１号の化合物が使用される特定の疾患として包含されている。治療及び予防に加えて、国際公開第２００７／０８８０４１号には、開示された化合物がインビボイメージング部分を含んでいてインビボイメージングに使用することができることが教示している。
【０００９】
国際公開第２００３／００６４９１号、国際公開第２００５／０１２３３５号及び国際公開第２００５／１２３７６７号は、血管新生に関係する受容体に結合するＲＧＤペプチド系の化合物に関し、受容体は、インテグリンを包含する。開示されている化合物は、抗新生物剤又はインビボイメージング部分のいずれかを含み、血管新生に関係する疾患の治療及びインビボイメージングに有用であると教示されている。
【００１０】
国際公開第２００６／０５４９０４号は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）をターゲティングする造影剤としてのインビボイメージング部分で標識されたＲＧＤペプチドの使用を開示している。この造影剤は、肝線維症を始めとするコラーゲンの過剰な形成に関連する疾患を診断及びモニターする際に有用であると言われている。しかし、放射標識されたインテグリン結合性ＲＧＤペプチドの排泄が主に肝胆道系を介して起きることが知られていることから、肝線維症のインビボイメージングにＲＧＤペプチドを使用することへの阻害要因がある（Ｈａｕｂｎｅｒ  １９９９  Ｊ．  Ｎｕｃ．  Ｍｅｄ．；  ４０：  １０６１−７１）。さらに、上述のように、疾患プロセスが解消しつつある場合並びに活動性線維症の後期ステージの両方でコラーゲンが見いだされることがあるため、コラーゲンは、活動性線維症の理想的マーカーではない。治療レジメンの用途が、より適切であるかもしれず、肝硬変が発症する前の、例えば、ＮＡＳＨにおける線維症の早期ステージで臨床的により有効である可能性も高い、より早期の活動性ステージを標的とすることがより有利であろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００７／１４８０７４号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
そこで、肝線維症の早期状態（「線維形成」とも呼ばれる）を識別し、それによって、最も効果的に治療することができるステージで疾患プロセスへ介入するための方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、被検体の肝臓における線維形成の識別を容易にするのに有用な方法に関する。本発明は、被検体の肝臓における線維形成を識別するための方法に使用するための化合物も用意する。本発明の別の態様は、被検体の肝臓における線維形成を識別するための方法に使用するための医薬品の調製に使用するための化合物である。本発明は、ＲＧＤペプチド系の化合物が、活性化肝星細胞（ＨＳＣ）を検出し、それによって、肝線維症の早期診断に有用な方法を用意するために効果的に使用することができることを例証する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】活性化ヒト肝星細胞とＥＡ−Ｈｙ９２６膜の両方と特異的に結合する化合物６を示す図である。Ｋｉは、ＥＡ−Ｈｙ９２６膜アッセイで約１０ｎＭと決定され、ＥＣ５０は、ＬＸ−２細胞アッセイで約１ｎＭと決定された。ＬＸ−２アッセイにおける結合の特異性は、非放射性の化合物６による化合物６結合の特異的阻害によって示された。低親和性スクランブル陰性対照は、インテグリンとも活性化星細胞ともにも結合しない。
【図２】活性化ヒト肝星細胞とＥＡ−Ｈｙ９２６膜の両方と特異的に結合する化合物６を示す図である。Ｋｉは、ＥＡ−Ｈｙ９２６膜アッセイで約１０ｎＭと決定され、ＥＣ５０は、ＬＸ−２細胞アッセイで約１ｎＭと決定された。ＬＸ−２アッセイにおける結合の特異性は、非放射性の化合物６による化合物６結合の特異的阻害によって示された。低親和性スクランブル陰性対照は、インテグリンとも活性化星細胞とも結合しない。
【図３】活性化肝星細胞膜とＥＡ−Ｈｙ９２６膜の両方と特異的に結合する化合物３を示す図である。Ｋｉは、観察されたように、ＥＡ−Ｈｙ９２６膜アッセイで約１ｎＭと決定され、星細胞膜アッセイで５９ｎＭと決定された。化合物８は、親和性において化合物３に続くように見え、Ｋｉは、活性化星細胞膜アッセイで５６ｎＭと決定され、ＥＡ−Ｈｙ９２６膜アッセイで６ｎＭと決定された。陰性対照スクランブルＲＧＤペプチドは、どちらの細胞タイプともほとんど結合を示さない。
【図４】活性化肝星細胞膜とＥＡ−Ｈｙ９２６膜の両方と特異的に結合する化合物３を示す図である。Ｋｉは、観察されたように、ＥＡ−Ｈｙ９２６膜アッセイで約１ｎＭと決定され、星細胞膜アッセイで５９ｎＭと決定された。化合物８は、親和性において化合物３に続くように見え、Ｋｉは、活性化星細胞膜アッセイで５６ｎＭと決定され、ＥＡ−Ｈｙ９２６膜アッセイで６ｎＭと決定された。陰性対照スクランブルＲＧＤペプチドは、どちらの細胞タイプともほとんど結合を示さない。
【図５】肝臓取込みが観察されない陰性対照スクランブルＲＧＤペプチドと比較した、胆管結紮（ＢＤＬ）ラットからの肝臓による化合物８の特異的取込みを例証する図である。ＢＤＬ肝臓取込みは、線維形成の程度にも比例しており、最大取込みは、線維形成がその最高レベルである術後１０及び１５日目に観察された。
【図６】陰性対照化合物（ＲＧＤスクランブルペプチド）と対比した、ＢＤＬラット肝臓中へのＲＧＤペプチドの特異的取込み例示する図である。この実験からのデータは、化合物３と化合物８が共に、ＢＤＬとシャムの間の取込みの有意差が観察されない陰性対照と比較して、注射から１時間後にシャム動物と比較して、ＢＤＬの肝臓中に有意に保持されることを示した。
【図７】術後１５日目のＢＤＬにおける有意なαvインテグリン上方制御を示す図である。
【図８】図８は、図７との関連して、術後の全時点におけるＢＤＬ動物の肝臓におけるαvインテグリン発現と化合物取込みの相関関係を例証している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
一つの態様では、本発明は、被検体の肝臓における線維形成の存在、場所及び／又は量を決定する方法に用いられる式Ｉの化合物であって、該方法は、
（ｉ）検出可能な量の式Ｉの化合物を投与しておいた被検体を準備する段階と、
（ｉｉ）肝臓中の線維形成性組織に式Ｉの化合物を結合させる段階と、
（ｉｉｉ）式Ｉの化合物から放出される信号をインビボイメージング法で検出する段階と、
（ｉｖ）信号の場所及び／又は量を表す画像を形成する段階
とを含んでおり、式Ｉの化合物は以下の通り定義される。
【００１６】
【化１】
0005709522.tif 000002
【００１７】
式中、
Ｇはグリシンを表し、
Ｄはアスパラギン酸を表し、
Ｘ1は、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ホモリジンもしくはＣ3〜6ジアミノアルカン酸又はそれらの誘導体から選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ2及びＸ4は独立に側鎖同士が連結して環化架橋を形成するアミノ酸残基（例えばジスルフィド又はチオエーテル結合を形成するシステイン又はホモシステイン）又は環化架橋を形成し得る他のアミノ酸（例えばアスパラギン酸及びリジン）を表し、
Ｘ3はアルギニン、Ｎ−メチルアルギニン又はアルギニン模倣体を表し、
Ｘ5はチロシン、フェニルアラニン、３−ヨード−チロシン  Ｃ4〜6シクロアルキルアラニン、ナフチルアラニン又はそれらの誘導体を表し、
Ｘ6はＸ6をＣ（＝Ｏ）基に連結するチオエーテル結合又はチオアセタール結合のいずれかを形成するチオール含有アミノ酸を表し、
Ｗ1及びＷ2は独立に任意要素としてのリンカー基であって、Ｗ1が存在するときはＸ1のアミノ酸側鎖部分に連結し、Ｗ2が存在するときはＸ6のカルボキシ基に連結し、
Ｚ1及びＺ2は、Ｚ1とＺ2の少なくとも一方がイメージング部分であることを条件として、独立にイメージング部分、糖部分、有機色素基又は水素である。
【００１８】
式Ｉの化合物について、
Ｘ1は好ましくはリジンである。
Ｘ2及びＸ4は好ましくは独立にシステイン又はホモシステインであり、最も好ましくは共にシステインである。
Ｘ3は好ましくはアルギニンである。
Ｘ5は好ましくはシクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン又は３−ヨード−チロシンであり、最も好ましくはフェニルアラニンである。
Ｘ6は好ましくはシステイン又はホモシステインであり、最も好ましくはシステインである。
【００１９】
式Ｉの好ましい実施形態では、
Ｘ1はリジンであり、
Ｘ2及びＸ4は独立にシステイン又はホモシステインであり、
Ｘ3はアルギニンであり、
Ｘ5ハフェニルアラニン又は３−ヨード−チロシンであり、
Ｘ6ハシステイン又はホモシステインである。
【００２０】
式Ｉの最も好ましい実施形態では、
Ｘ1はリジンであり、
Ｘ2及びＸ4は共にシステインであり、
Ｘ3はアルギニンであり、
Ｘ5はフェニルアラニンであり、
Ｘ6はシステインである。
【００２１】
本発明において、「線維形成」という用語は、具体的に、とりわけ肝星細胞（ＨＳＣ）が活性化され、インテグリンを発現する、線維症の活動性の進行ステージをいう。ＨＳＣは、肝臓における主要なフィブロコンピテント細胞と広くみなされている。線維形成中に、ＨＳＣは活性化して増殖するが、線維症の解消中には、肝臓瘢痕の分解と同時に起こる広範囲のＨＳＣアポトーシスがある。さらに、線維形成の際には、コラーゲンなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の沈着は未だ起きていない。従って、ＥＣＭ成分の存在は、線維症の後期ステージ及び線維症の解消の特徴である。従って、線維形成中の疾患プロセスを標的にすることは、治療の用途が最も適切である活動性疾患のより良い指標を用意する。
【００２２】
本発明において、「アミノ酸」という用語は、アミノ基、カルボキシル基、水素原子及びアミノ酸側鎖基からなり、これらがすべて（αアミノ酸の場合）α炭素と呼ばれる１つの炭素に結合したものをいう。アミノ酸としては、特に限定されないが、天然アミノ酸が挙げられる。天然アミノ酸は、天然タンパク質のアミノ酸単位が誘導されるものであり、当業者に周知である。本明細書でアミノ酸に関して用いられる「それらの誘導体」という用語は、側鎖が天然アミノ酸の側鎖の誘導体であるものをいう（“Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ”  １９９９  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂａｒｒｅｔｔ，  Ｅｄ．参照）。
【００２３】
「アミノ酸模倣体」という用語は、天然アミノ酸の合成類似体であってアイソスターであるもの、つまり天然化合物の立体及び電子構造を模倣して設計されたものを意味する。かかるアイソスターは当業者に周知であり、特に限定されないが、デプシペプチド、レトロインベルソペプチド、チオアミド、シクロアルカン又は１，５−二置換テトラゾールなどが挙げられる（Ｍ．  Ｇｏｏｄｍａｎ，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，  ２４，  １３７，  （１９８５）参照）。
【００２４】
「環化架橋」という用語は、架橋を導入できる官能基をもつアミノ酸同士又はアミノ酸と−(ＣＨ2)O−もしくは−(ＣＨ2)O−Ｃ6Ｈ4−基の組合せをいう。ｏは１〜１０の正の整数を表す。好ましい例は、ジスルフィド、−(ＣＨ2)4−カルバ架橋のようなジスルフィド模倣体、チオアセタール架橋、チオエーテル架橋（シスタチオン又はランチオニン）、エステル及びエーテルを含有する架橋、並びにアミド架橋である。好ましくは、１つの架橋はジスルフィド結合を形成し、第二の架橋はチオエーテル（スルフィド）結合からなる。例えば、環化架橋がＸ2とＸ4のような２つのアミノ酸で形成されている場合、システイン又はホモシステインの側鎖がシステイン、ホモシステイン、セリン、スレオニン又はアルデヒド含有アミノ酸の側鎖と連結して環化架橋を形成する。
【００２５】
「アルギニン模倣体」という用語は、アミノ酸模倣体に関する上記の定義と同様に通り、天然アルギニンの合成類似体であるアイソスターである。
【００２６】
式Ｉの化合物のペプチドは、あらゆる公知の化学合成法で合成できるが、特に有用な方法は自動ペプチド合成装置を用いたＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法である（Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ８５：  ２１４９  （１９６４））。合成法の標準的手順は、Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ  ＆  Ｒ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ，  “Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，  １９８９，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄに記載されている。
【００２７】
酸不安定リンカー基を有する合成樹脂を用いて、これに、Ｃ末端を保護した所望のアミノ酸残基をアミド結合の形成によって結合させる。例えば、（ジメトキシフェニル−アミノメチル）−フェノキシ誘導リンカーを有するいわゆるＲｉｎｋアミドＡＭ樹脂を用いることができる（Ｒｉｎｋ，  Ｈ．  （１９８７），  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３０，  ｐ．３７８７）。この樹脂からペプチドを酸分解で開裂させると、ペプチドアミドが得られる。別法として、Ｏ−ビス−（アミノエチル）エチレングリコールトリチル樹脂（Ｋ．  Ｂａｒｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ  （１９８８），  Ｌｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎ．  Ｃｈｅｍ，  ｐ．１０７９）を用いると、酸分解開裂によって第一級アミンハンドルを有するペプチドを得ることができる。
【００２８】
イメージング部分での標識は好適には「前駆体化合物」によって実施されるが、前駆体化合物は、式Ｉの化合物の誘導体であって、適当な化学的形態の１以上のイメージング部分との化学反応が部位特異的に起こり、最小限の段階数（理想的には一段階）で実施でき、しかも多大な精製を行わずに（理想的にはそれ以上精製しなくても）所望の式Ｉの化合物が得られるように設計される。かかる前駆体化合物は合成品であり、良好な化学的純度で得ることができる。前駆体化合物は、任意には、式Ｉの化合物の官能基に対する保護基を含んでいてもよい。
【００２９】
「保護基」という用語は、不都合な化学反応は阻害又は抑制するが、分子の残りの部分を修飾しない十分穏和な条件下で当該官能基から脱離させることができる十分な反応性をもつように設計された基を意味する。脱保護後に、所望の生成物が得られる。保護基は当業者に周知であり、好適には、アミン基については、Ｂｏｃ（Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルである。）、Ｆｍｏｃ（Ｆｍｏｃはフルオレニルメトキシカルボニルである。）、トリフルオロアセチル、アリルオキシカルボニル、Ｄｄｅ［すなわち、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル］又はＮｐｙｓ（すなわち、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）から、カルボキシル基については、メチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル又はベンジルエステルから選択される。
ヒドロキシ基に対する適当な保護基は、メチル、エチル又はｔｅｒｔ−ブチル、アルコキシメチル又はアルコキシエチル、ベンジル、アセチル、ベンゾイル、トリチル（Ｔｒｔ）或いはテトラブチルジメチルシリルのようなトリアルキルシリルである。チオール基に対する適当な保護基は、トリチル及び４−メトキシベンジルである。その他の保護基の使用については、‘Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ’，Ｔｈｅｏｒｏｄｏｒａ  Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ（Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９）に記載されている。
【００３０】
本発明の「リンカー基」は式−（Ｌ）n−の基である。
式中、
各Ｌは独立に−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＲ′2−、−ＣＲ′＝ＣＲ′−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ′2ＣＯ2−、−ＣＯ2ＣＲ′2−、−ＮＲ′−、−ＮＲ′ＣＯ−、−ＣＯＮＲ′−、−ＮＲ′（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ′−、−ＮＲ′（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ′−、−ＳＯ2ＮＲ′−、−ＮＲ′ＳＯ2−、−ＣＲ′2ＯＣＲ′2−、−ＣＲ′2ＳＣＲ′2−、−ＣＲ′2ＮＲ′ ＣＲ′2−、Ｃ4-8シクロヘテロアルキレン基、Ｃ4-8シクロアルキレン基、Ｃ5-12アリーレン基、Ｃ3-12ヘテロアリーレン基、アミノ酸、ポリアルキレングリコール、ポリ乳酸又はポリグリコール酸部分であり、
ｎは１〜１５の整数であり、
各Ｒ′基は独立にＨ又はＣ1-10アルキル、Ｃ3-10アルキルアリール、Ｃ2-10アルコキシアルキル、Ｃ1-10ヒドロキシアルキル、Ｃ1-10フルオロアルキルであるか、或いは２以上のＲ′基がそれらに結合した原子と共に炭素環、複素環式、飽和又は不飽和環を形成したものである。
【００３１】
ただし、リンカー基は１００個以下の原子鎖、好ましくは５０個以下の原子鎖である。リンカー基は、最も好ましくは１０〜５０個の原子鎖、特に好ましくは、１０〜３０個の原子鎖である。好ましいＬ基は、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＨ2−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−及びアミノ酸である。
【００３２】
好ましくは、リンカーはバイオモディファイアー基としての機能する。「バイオモディファイヤー基」は式Ｉの化合物の薬物動態及び血中クリアランス速度を変化させる機能をもつ。適当なバイオモディファイヤー基の一例は、単分散ＰＥＧ構成単位を１〜１０単位含むものである。また、バイオモディファイアー基は１〜１０個のアミノ酸残基も表すものであってもよい。バイオモディファイアー基の好ましいアミノ酸残基はリジン及びグルタミン酸のような荷電アミノ酸、又はシステイン酸及びホスホノアラニンのような荷電非天然アミノ酸である。さらに、アミノ酸グリシン、アスパラギン酸及びセリンを含んでいてもよい。好ましい実施形態では、バイオモディファイアー基は単分散ＰＥＧ様構造の式（ＩＩ）の１７−アミノ−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸を含む表す。
【００３３】
【化２】
0005709522.tif 000003
【００３４】
式中、ｍは１〜１０の整数であり、Ｃ末端単位はアミド基である。バイオモディファイアー基は、化合物の薬物動態及び血中クリアランス速度を変化させる機能をもつ。本発明におけるバイオモディファイアーの機能は、組織中への取込みを減少させ、腎臓からの排泄を増大させ、もってバックグラウンド干渉を低減して優れたインビボ画像を与える。バイオモディファイアー基は、グルタル酸及び／又はコハク酸及び／又はポリエチレングリコール系単位及び／又は上記の式ＩＩの単位から誘導される部分を表すものであってもよい。リンカー基の性状は、式Ｉの化合物の標的受容体に対する親和性を損なうべきではない。さらに、リンカー基は、式Ｉの化合物のバックグラウンド肝臓取込みを増加させるべきではないが、これは、過度に大きなポリエチレングリコール系単位を使用した場合に起きりかねない。
【００３５】
Ｚ1又はＺ2のいずれかが糖部分である場合、それらもバイオモディファイアー基として機能し得る。「糖部分」は炭水化物基でり、通常は多価アルコールのアルデヒド又はケトン誘導体である。糖部分は、フルクトース又はグルコースのような単量体（単糖）であってもよいし、糖が２つ結合して二糖を形成したものであってもよい。二糖には、グルコースとフルクトースとで構成されたスクロースのような糖がある。糖という用語には、置換及び非置換糖並びに糖誘導体が包含する。好ましくは、糖は、グルコース、グルコサミン、ガラクトース、ガラクトサミン、マンノース、ラクトース、フコース及びそれらの誘導体、例えばシアル酸、グルコサミンの誘導体から選択される。糖は好ましくはα又はβである。糖は、特に、マンノピラノシド又はガラクトースピラノシドであってもよい。糖のヒドロキシル基は、例えば１以上のアセチル基で保護してもよい。糖部分は好ましくはＮ−アセチル化される。かかる糖の好ましい例としては、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸、ノイラミン酸、Ｎ−アセチルガラクトース及びＮ−アセチルグルコサミンが挙げられる。
【００３６】
「有機色素基」は、紫外乃至近赤外域の波長を有する電磁スペクトルの光と相互作用する有機色素であればよい。好ましい有機色素基としては、広範に非局在化した電子系を有する基が挙げられる。最も好ましい有機色素基はシアニン染料（ＣｙＤｙｅ（商標））である。シアニン色素は、奇数個の炭素原子が交互に炭素−炭素単結合と炭素−炭素多重（好ましくは二重）結合とで連結したポリエン連鎖であって、両端にアミノ基を有していてその一方が第四級化されているものとして定義される化合物である。シアニン及び類似のアリール−リンカー−アリール発色団は、任意にはペンダント置換基又は縮合環置換基を有する。シアニン染料及びその合成に関する一般的な説明は、米国特許第６０４８９８２号、同第５２６８４８６号及び欧州特許第１０３７９４７号に記載されている。本発明では、シアニン色素は好ましくはカルバシアニン、オキサシアニン、チアシアニン及びアザシアニンからなる群から選択される。
【００３７】
本明細書に記載した方法の「検出」段階は、式Ｉの「イメージング部分」から放出される信号を、信号の検出器によって検出することを含む。この検出段階は、信号データの取得として理解することもできる。本発明での使用に適したイメージング部分から放出される信号の例は、（ｉ）γ線のように人体の外部で検出できるもの、又は（ｉｉ）術中用に設計された放射線検出器のように、インビボ用に設計された検出器の使用によって検出できるものである。本明細書に記載された方法の「形成」段階は、コンピューターによって実施され、取得した信号データに再構成アルゴリズムを適用してデータセットを得る。このデータセットを操作して、被検体の関心領域を示す画像を形成する。
【００３８】
本発明の化合物のイメージング部分は、好ましくは以下の（ｉ）〜（ｉｖ）から選択される。
（ｉ）放射性金属イオン、
（ｉｉ）γ線放出型放射性ハロゲン、
（ｉｉｉ）陽電子放出型放射性非金属、及び
（ｉｖ）常磁性金属イオン。
【００３９】
イメージング部分が放射性金属イオンつまり放射性金属である場合、好適な放射性金属は、64Ｃｕ、48Ｖ、52Ｆｅ、55Ｃｏ、94mＴｃ又は68Ｇａのような陽電子放射体、或いは99mＴｃ、111Ｉｎ、113mＩｎ又は67Ｇａのようなγ線放射体である。好ましい放射性金属は99mＴｃ、64Ｃｕ、68Ｇａ及び111Ｉｎである。最も好ましい放射性金属はγ放射体、特に99mＴｃである。
【００４０】
イメージング部分が常磁性金属イオンである場合、かかる金属イオンの好適なものとして、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｃｒ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｅｒ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）又はＤｙ（ＩＩＩ）が挙げられる。好ましい常磁性金属イオンはＧｄ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）及びＦｅ（ＩＩＩ）であり、Ｇｄ（ＩＩＩ）が特に好ましい。
【００４１】
式Ｉの化合物のイメージング部分が金属イオンである場合、イメージング部分は好ましくは金属イオンと合成配位子との金属錯体として存在する。「金属鎖体」という用語は、金属イオンと１以上の配位子との配位鎖体を意味する。金属鎖体は「キレート交換耐性」、つまり金属の配位部位に対する他の潜在的な競合配位子との配位子交換を容易に起こさないものであるのが極めて好ましい。潜在的な競合配位子としては、インビトロ標品中の他の賦形剤（製剤に使用される例えば放射線防護剤又は抗菌保存剤）又は生体の内在性化合物（例えばグルタチオン、トランスフェリン又は血漿タンパク質）がある。「合成」という用語は、その通常の意味、つまり天然資源（例えば哺乳類の身体）から分離されたものではなく、人造のものを意味する。かかる化合物は、その製造並びに不純物プロファイルを十分に制御できるという利点がある。
【００４２】
キレート交換耐性の金属鎖体を形成する本発明の使用に適した配位子としては、（金属ドナー原子同士が炭素原子又は非配位ヘテロ原子の非配位骨格で連結されて）五又は六員キレート環が形成されるように２〜６、好ましくは２〜４個の金属ドナー原子が配列したキレート剤、或いはイソニトリル、ホスフィン又はジアゼニドのように金属イオンに強く結合するドナー原子を含む単座配位子が挙げられる。キレート剤の一部として金属によく結合するドナー原子の例は、アミン、チオール、アミド、オキシム及びホスフィンである。ホスフィン類は強固な金属鎖体を形成し、単座又は二座ホスフィンであっても適当な金属鎖体を形成する。イソニトリル及びジアゼニドの線状構造は、それらをキレート剤に導入するのが容易ではないので、通例、単座配位子として使用される。適当なイソニトリルの例としては、ｔｅｒｔ−ブチルイソニトリルのような単純なアルキルイソニトリル及びＭＩＢＩ（すなわち、１−イソシアノ−２−メトキシ−２−メチルプロパン）のようなエーテル置換イソニトリルが挙げられる。適当なホスフィンの例としては、テトロホスミン及び単座ホスフィン類、例えばトリス（３−メトキシプロピル）ホスフィンが挙げられる。適当なジアゼニドの例としては、配位子のＨＹＮＩＣ系配位子、すなわちヒドラジン置換ピリジン又はニコチンアミドが挙げられる。
【００４３】
金属イオンがテクネチウムである場合、キレート交換耐性の金属鎖体を形成するのに適したキレート剤の例としては、特に限定されないが、以下の（ｉ）〜（ｖ）が挙げられる。
（ｉ）ジアミンジオキシム；
（ｉｉ）チオールトリアミドドナーセットを有するＮ3Ｓ配位子、例えばＭＡＧ3（メルカプトアセチルトリグリシン）及び関連配位子、又はジアミドピリジンチオールドナーセットを有するもの、例えばＰｉｃａ；
（ｉｉｉ）ジアミンジチオールドナーセットを有するＮ2Ｓ2配位子、例えばＢＡＴ又はＥＣＤ（すなわちエチルシステイネート二量体）又はアミドアミンジチオールドナーセットを有するもの、例えばＭＡＭＡ；
（ｉｖ）テトラミン、アミドトリアミン又はジアミンジアミンドナーセットを有する開環又はマクロ環状配位子であるＮ4配位子、例えばサイクラム、モノオキシサイクラム又はジオキシサイクラム；或いは
（ｖ）ジアミンジフェノールドナーセットを有するＮ2Ｏ2配位子。
【００４４】
イメージング部分がテクネチウムである場合、本発明の好ましいキレート剤はジアミンジオキシム及びテトラアミンであり、それらの好ましいものについて以下で詳しく説明する。
【００４５】
好ましいジアミンジオキシムは、次の式ＶＩＩのものである。
【００４６】
【化３】
0005709522.tif 000004
【００４７】
式中、
Ｅ1〜Ｅ6は各々独立にＲ*基であり、
各Ｒ*はＨ、Ｃ1-10アルキル、Ｃ3-10アルキルアリール、Ｃ2-10アルコキシアルキル、Ｃ1-10ヒドロキシアルキル、Ｃ1-10フルオロアルキル、Ｃ2-10カルボキシアルキル又はＣ1-10アミノアルキルであるか、或いは２以上のＲ*基がそれらと結合した原子と共に飽和又は不飽和炭素環又は複素環を形成するもので、１以上のＲ*基がＣＢＰと結合しており、
Ｑ′は式−（Ｊ′）e−の架橋基であり、ｅは３、４又は５であり、各Ｊ′は独立に−Ｏ−、−ＮＲ*−又は−Ｃ（Ｒ*）2−であるが、−（Ｊ′）f−が、−Ｏ−又は−ＮＲ*−であるＪ′基を最大１個しか含まないことを条件とする。
【００４８】
好ましいＱ′基は以下のものである。
Ｑ′＝−（ＣＨ2）（ＣＨＲ*）（ＣＨ2）−、すなわちプロピレンアミンオキシムつまりＰｎＡＯ誘導体、
Ｑ′＝−（ＣＨ2）2（ＣＨＲ*）（ＣＨ2）2−、すなわちペンチレンアミンオキシムつまりＰｅｎｔＡＯ誘導体、
Ｑ′＝−（ＣＨ2）2ＮＲ*（ＣＨ2）2−。
【００４９】
Ｅ1〜Ｅ6は、好ましくは、Ｃ1-3アルキル、アルキルアリール、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、フルオロアルキル、カルボキシアルキル、アミノアルキルから選択される。最も好ましくは、各Ｅ1〜Ｅ6基はＣＨ3である。
【００５０】
ジアミンジオキシムは、好ましくは、Ｅ1もしくはＥ6のＲ*基又はＱ′部分のＲ*基で結合している。最も好ましくは、Ｑ′部分のＲ*基で結合する。Ｑ′部分のＲ*基で結合している場合、Ｒ*基は好ましくは橋頭位である。この場合、Ｑ′は、好ましくは、−（ＣＨ2）（ＣＨＲ*）（ＣＨ2）−、−（ＣＨ2）2（ＣＨＲ*）（ＣＨ2）2−、又は−（ＣＨ2）2ＮＲ*（ＣＨ2）2−であり、最も好ましくは−（ＣＨ2）2（ＣＨＲ*）（ＣＨ2）2−である。特に好ましい二官能性ジアミンジオキシムキレート剤は、次の式ＶＩＩａのものである。
【００５１】
【化４】
0005709522.tif 000005
【００５２】
式中、Ｅ7〜Ｅ20は各々独立に上記で定義したＲ*基であり、
ＧはＮ又はＣＲ*であり、
Ｙ′は式Ｉのペプチド部分との連結点である。
【００５３】
式ＶＩＩａの好ましいキレート剤は、次の式ＶＩＩｂのものである。
【００５４】
【化５】
0005709522.tif 000006
【００５５】
式中、Ｇは上記で定義した通りであり、好ましくはＣＨである。キレートＩの調製方法は、国際公開第０３／００６０７０号に開示されている。
【００５６】
好ましいテトラアミンキレート剤は、次の式ＶＩＩＩのものである。
【００５７】
【化６】
0005709522.tif 000007
【００５８】
式中、
Ｙ″は式Ｉの残りの部分との連結点であり、
Ｅ21〜Ｅ26は上記で定義したＲ*基である。
【００５９】
最も好ましいテトラアミンキレートは式ＶＩＩＩａであり、
【００６０】
【化７】
0005709522.tif 000008
【００６１】
式中、
Ｙ″は上記で定義した通りである。式ＶＩＩＩａのキレートの合成方法は国際公開第０６／００８４９６号に開示されている。
【００６２】
上述の配位子は、テクネチウム（例えば94mＴｃ又は99mＴｃ）の錯体の形成に特に適しており、Ｊｕｒｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，９９，２２０５−２２１８（１９９９）に詳細に記載されている。この配位子は、銅（64Ｃｕ又は67Ｃｕ）、バナジウム（例えば48Ｖ）、鉄（例えば52Ｆｅ）又はコバルト（例えば55Ｃｏ）のような他の金属にも有用である。
【００６３】
その他の適当な配位子については、インジウム、イットリウム及びガドリニウム、特に大環状アミノカルボキシレート及びアミノホスホン酸配位子に特に適した配位子を始めとして、Ｓａｎｄｏzの国際公開第９１／０１１４４号に記載されている。ガドリニウムの非イオン性（すなわち中性）の金属錯体を形成する配位子は公知であり、米国特許第４８８５３６３号に記載されている。
かかるドナー原子を有する好適なキレート剤の例としては、１、４、７、１０−テトラアザシクロデカン−１、４、７、１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）及びジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）が挙げられる。ガドリニウムに対して特に好ましいのは、ＤＴＰＡ、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１０−（２−ヒドロキシプロピル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−三酢酸（ＤＯ３Ａ）及びこれらの誘導体を始めとするキレートである。
【００６４】
イメージング部分が、金属錯体の一部として存在する金属イオンである場合、リンカー基が付随して存在するのが好ましい。こうした場合のリンカー基の役割は、金属の配位で得られる比較的嵩高い金属錯体を、ペプチドの活性部位から遠ざけることによって、例えば、基質の結合に支障をきたさないようにすることである。これは、嵩高い基が活性部位から遠ざかる自由度をもつようにするための柔軟性（例えば単純なアルキル鎖）及び／又は金属錯体を活性部位から遠ざけるシクロアルキル系もしくはアリール系スペーサーのような剛直性の組合せによって達成することができる。こうしたキレートに関して好ましいリンカー基は、原子数２〜１０、最も好ましくは原子数２〜５の骨格鎖を含むもので、原子数２又は３のものが特に好ましい。原子数２の最短のリンカー基骨格鎖であっても、ペプチドからキレーターが十分に離隔して相互反応が最小限になるという利点が得られる。さらに、ペプチドは、金属イオンへのキレーターの配位に有効に拮抗できなくなる。こうして、ペプチドの生物学的ターゲティング特性とキレーターの金属錯形成能が共に保持される。なお、金属錯体がペプチドにそれらの結合が血中で容易に代謝されないように結合していることが強く望まれる。かかる代謝によって、標識ペプチドがインビボで所望の標的部位に達する前に、イメージング金属錯体が開裂してしまうからである。そこで、ペプチドは、好ましくは、容易には代謝されない結合を含むリンカー基を介して金属錯体に共有結合させる。かかる好適な結合は、炭素−炭素結合、アミド結合、尿素もしくはチオ尿素結合又はエーテル結合である。
【００６５】
アルキレン基又はアリーレン基のような非ペプチド系リンカー基は、式Ｉのペプチドと有意の水素結合がないため、リンカーがペプチドと相互作用しないという利点を有する。好ましいアルキレンスペーサー基は−（ＣＨ2）q−であり、式中、ｑは２〜５の整数である。好ましくは、ｑは２又は３である。好ましいアリーレンスペーサーは次の式ＩＸのものである。
【００６６】
【化８】
0005709522.tif 000009
【００６７】
式中、ａ及びｂは各々独立に０、１又は２である。
【００６８】
好ましいリンカー基は−ＣＨ2ＣＨ2−（Ｌ）p−であり、Ｌは上記で定義した通りであり、ｐは０〜３の整数である。最も好ましくは、−（Ｌ）p−は−ＣＯ−又は−ＮＲ−である。式ＶＩＩｂについて、ＧがＮであって、−（Ｌ）p−が−ＮＨ−である場合、この組合せは市販の対称中間生成物Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2）3から誘導できるという追加の利点がある。
【００６９】
イメージング用金属がテクネチウムの場合、通常のテクネチウム出発原料は過テクネチウム酸塩、すなわちＴｃＯ4-つまり酸化状態がＴｃ（ＶＩＩ）のテクネチウムである。過テクネチウム酸塩自体は金属錯体を形成しにくいので、テクネチウム錯体の製造に際しては、テクネチウムの酸化状態を低酸化状態（Ｔｃ（Ｉ）〜Ｔｃ（Ｖ））に還元することによって錯形成を促進するため、第一スズイオンのような適当な還元剤を添加する必要がある。溶媒は有機溶媒でも、水性溶媒でも、それらの混合物でもよい。溶媒が有機溶媒を含む場合、有機溶媒は好ましくはエタノール又はＤＭＳＯのような生体適合性溶媒である。好ましくは、溶媒は水性溶媒であり、最も好ましくは等張塩類溶液である。
【００７０】
イメージング部分がγ線放出型放射性ハロゲンである場合、放射性ハロゲンは好適には123Ｉ、131Ｉ又は77Ｂｒから選択される。125Ｉは、外部からのインビボイメージング用のイメージング部分としての使用には適していないので、特に除外してある。インビボイメージングに好ましいγ線放出型放射性ハロゲンは123Ｉである。
【００７１】
イメージング部分が放射性ヨウ素である場合、式Ｉの化合物は、求電子又は求核ヨウ素化或いは標識アルデヒド又はケトンとの縮合を起こすような誘導体を含む前駆体化合物によって得ることができる。前者に属するものの例としては、以下の（ａ）〜（ｃ）が挙げられる。
（ａ）トリアルキルスタンナン（例えばトリメチルスタンニル又はトリブチルスタンニル）、トリアルキルシラン（例えばトリメチルシリル）又は有機ホウ素化合物（例えば、ボロン酸エステル又はオルガノトリフルオロボレート）のような有機金属誘導体、
（ｂ）ハロゲン交換のための非放射性臭化アルキル、或いは求核ヨウ素化のためのアルキルトシレート、メシレート又はトリフレート、
（ｃ）求電子ヨウ素化用の活性化芳香族環（例えばフェノール）及び求核ヨウ素化用の活性化芳香族環（例えばアリールヨードニウム、アリールジアゾニウム、アリールトリアルキルアンモニウム塩又はニトロアリール誘導体）。
【００７２】
かかる前駆体として好適なものは、ヨウ化又は臭化アリールのような非放射性ハロゲン原子（放射性ヨウ素交換を可能とするため）、有機金属前駆体化合物（例えばトリアルキルスズ、トリアルキルシリル又は有機ホウ素化合物）、トリアゼンのような有機前駆体、或いはヨードニウム塩のような求核置換反応のための良好な脱離基を含む。放射性ヨウ素化では、前駆体は好ましくは有機金属前駆体化合物を含み、最も好ましくはトリアルキルスズを含む。
【００７３】
前駆体及び放射性ヨウ素を有機分子に導入する方法は、Ｂｏｌｔｏｎ，  Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｏｍｐ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，４５，４８５−５２８（２００２）に記載されている。適当なボロン酸エステル有機ホウ素化合物及びその製造方法は、Ｋａｂａｌａｋａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，２９、８４１−８４３（２００２）及び３０，３６９−３７３（２００３）に記載されている。適当なオルガノトリフルオロホウ化物及びその製造方法は、Ｋａｂａｌａｋａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，３１、９３５−９３８（２００４）に記載されている。
【００７４】
放射性ヨウ素を結合させることのできるアリール基の例としては、以下のものがある。
【００７５】
【化９】
0005709522.tif 000010
【００７６】
これらはいずれも、芳香族環での放射性ヨウ素置換が容易な置換基を含んでいる。チロシン残基では、その内在フェノール基を利用して放射性ヨウ素化を実施できる。
【００７７】
放射性ヨウ素を含む他の置換基は、例えば以下のような放射性ハロゲン交換による直接ヨウ素化によって合成することができる。
【００７８】
【化１０】
0005709522.tif 000011
【００７９】
飽和脂肪族系に結合したヨウ素原子はインビボで代謝され易く、放射性ヨウ素が失われ易いことが知られているので、放射性ヨウ素原子は好ましくは芳香族環（ベンゼン環など）又はビニル基に直接共有結合で結合させる。
【００８０】
イメージング部分が陽電子放出型放射性非金属である場合、かかる陽電子放射体の好適なものとして、11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、17Ｆ、18Ｆ、75Ｂｒ、76Ｂｒ又は124Ｉが挙げられる。好ましい陽電子放出型放射性非金属は11Ｃ、13Ｎ、18Ｆ及び124Ｉであり、特に好ましくは11Ｃ及び18Ｆであり、最も好ましくは18Ｆである。
【００８１】
放射性フッ素化は、臭化アルキル、アルキルメシレート又はアルキルトシレートのような良好な脱離基を有する前駆体化合物の適当な化学基と18Ｆ−フッ化物との反応を用いた直接標識法で実施できる。18Ｆは、18Ｆ（ＣＨ2）3ＯＨ反応体を用いたＮ−ハロアセチル基のアルキル化によって導入することもでき、−ＮＨ（ＣＯ）ＣＨ2Ｏ（ＣＨ2）318Ｆ誘導体が得られる。アリール系については、アリールジアゾニウム塩、アリールニトロ化合物又はアリール第四級アンモニウム塩からの18Ｆ−フッ化物求核置換が、アリール−18Ｆ誘導体への好適な経路である。
【００８２】
本発明の18Ｆ−標識化合物は、18Ｆフルオロジアルキルアミンの形成後、18Ｆフルオロジアルキルアミンを、例えば塩素、Ｐ（Ｏ）Ｐｈ3又は活性化エステルを含む前駆体と反応させてアミドを形成することによって得ることができる。
【００８３】
ペプチドの放射性フッ素化に特に適した別の放射性フッ素化法は、国際公開第０３／０８０５４４号に記載されており、チオールカップリングを利用する。以下の置換基のいずれかを含む前駆体化合物を式Ｘの化合物と反応させて、それぞれ式（Ｘａ）又は（Ｘｂ）の放射性フッ素化イメージング剤を生成させる。
【００８４】
【化１１】
0005709522.tif 000012
【００８５】
18Ｆ−ＸX−ＳＨ                  （Ｘ）
式中、ＹXは式−（ＬY）w−のリンカーであって、適宜１〜６のヘテロ原子を含んでいてもよく（ＬYはＬについて上記で定義した通りであり、ｙは１〜１０である。）、
ＸXは、式−（ＬX）x−のリンカーであって、適宜１〜１０のヘテロ原子を含んでいてもよく（ＬXはＬについて上記で定義した通りであり、ｘは１〜３０である。）、
*は化合物の残りの部分との連結点である。
【００８６】
【化１２】
0005709522.tif 000013
【００８７】
式中、ＸX、ＹX及び*は、上記で定義した通りである。
【００８８】
ペプチドの放射性フッ素化に特に適した追加の方法は、国際公開第０４／０８０４９２号に記載されており、アミノキシカップリングを利用する。放射性フッ素化は、式（ＸＩ）の前駆体化合物を式（ＸＩａ）の化合物と反応させるか、或いは式（ＸＩＩ）の前駆体化合物を式（ＸＩＩａ）と反応させることによって実施され、それぞれ式（ＸＩＩＩ）又は（ＸＩＶ）のコンジュゲートが得られる。
【００８９】
【化１３】
0005709522.tif 000014
【００９０】
式中、ＸXI及びＸXIIは、リンカー基−（ＬXI）z−であって、適宜１〜６のヘテロ原子を含んでいてもよい（ＬXIは、Ｌについて上記で定義した通りであり、ｚは１〜１０である。）。
Ｒ1は、アルデヒド部分、ケトン部分、アセタールのような保護アルデヒド、ケタールのような保護ケトン、或いは酸化剤を用いてアルデヒド又はケトンへと迅速かつ効率的に酸化できるジオール又はＮ−末端セリン残基のような官能基である。
Ｒ2は、水性緩衝液のような穏和な条件下でＲ1と部位特異的に反応して安定なコンジュゲートを与える官能基である。Ｒ2は、第一級アミン、第二級アミン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ヒドラジド、アミノキシ、フェニルヒドラジン、セミカルバジド又はチオセミカルバジドのようなアンモニア誘導体であってもよく、好ましくは、ヒドラジン、ヒドラジド又はアミノキシ基である。
Ｒ3は、Ｒ4と部位特異的に反応する官能基である。Ｒ3は、第一級アミン、第二級アミン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ヒドラジド、アミノキシ、フェニルヒドラジン、セミカルバジド又はチオセミカルバジドなどのアンモニア誘導体であってもよく、好ましくは、ヒドラジン、ヒドラジド又はアミノキシ基である。
Ｒ4は、アルデヒド部分、ケトン部分、アセタールのような保護アルデヒド、ケタールのような保護ケトン、或いは酸化剤を用いてアルデヒド又はケトンへと迅速かつ効率的に酸化できるジオール又はＮ−末端セリン残基のような官能基である。
【００９１】
【化１４】
0005709522.tif 000015
【００９２】
式中、Ｗは−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＮＨＣＯＮＨ−又は−ＮＨＣＳＮＨ−であり、好ましくは−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−又は−Ｏ−であり、ＹはＨ、Ｃ1〜6アルキル又はＣ5〜6アリール置換基であり、ＸXI、ＸXII及び*は上記で定義した通りである。
【００９３】
18Ｆ−標識誘導体の合成経路についてのさらに詳しい内容は、Ｂｏｌｔｏｎ，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｏｍｐ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，４５，４８５−５２８（２００２）に記載されている。
【００９４】
好ましいイメージング部分は、生体に投与した後、単光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）及び磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）などの手段によって外部から非侵襲的に検出することができるものである。最も好ましいイメージング部分は、放射性、特に、放射性金属イオン、γ線放出型放射性ハロゲン及び陽電子放出型放射性非金属、特に、ＳＰＥＣＴ又はＰＥＴを用いたイメージングに適したもの、例えば、99mＴｃ、123Ｉ、11Ｃ及び18Ｆである。
【００９５】
好ましい一実施形態では、Ｗ1及びＷ2は共にリンカー基を表し、Ｚ1は有機色素基を表し、Ｚ2はイメージング部分を表す。これらの化合物及びその調製方法は、国際公開第２００６／０５４９０４号に記載されている。最も好ましくは、Ｚ2は放射性イメージング部分である。これらの好ましい化合物の例としては、以下のものが挙げられる。
【００９６】
【化１５】
0005709522.tif 000016
【００９７】
【化１６】
0005709522.tif 000017
【００９８】
化合物１〜４の調製方法は、国際公開第２００６／０５４９０４号に詳述されている。
【００９９】
別の好ましい実施形態では、Ｗ1はリンカー基を表し、Ｚ1はイメージング部分を表し、Ｗ2は任意要素としてのリンカー基を表し、Ｚ2は水素である。これらの化合物及びその調製方法は、国際公開第２００５／０１２３３５号に記載されている。これらの好ましい化合物の例としては、以下のものが挙げられる。
【０１００】
【化１７】
0005709522.tif 000018
【０１０１】
化合物５及び６の調製方法は、国際公開第２００５／０１２３３５号に詳述されている。
【０１０２】
別の好ましい実施形態では、Ｗ1は任意要素としてのリンカー基を表し、Ｚ1は水素を表し、Ｗ2はリンカー基を表し、Ｚ2はイメージング部分を表す。これらの化合物及びその調製方法は、国際公開第２００３／００６４９１号に記載されている。これらの好ましい化合物の例としては、以下のものが挙げられる。
【０１０３】
【化１８】
0005709522.tif 000019
【０１０４】
【化１９】
0005709522.tif 000020
【０１０５】
化合物７〜１０の調製方法は、国際公開第２００３／００６４９１号に詳述されている。
【０１０６】
化合物１〜４及び７〜１０について、別法として、ジアミンジオキシムキレート部分は、化合物１ａ〜４ａ及び７ａ〜１０ａを形成するためにテトラアミンキレート部分で置き換えられていることがさらに好ましい。
【０１０７】
【化２０】
0005709522.tif 000021
【０１０８】
【化２１】
0005709522.tif 000022
【０１０９】
【化２２】
0005709522.tif 000023
【０１１０】
【化２３】
0005709522.tif 000024
【０１１１】
化合物１ａ〜１０ａの調製方法は、化合物１〜１０のジアミンジオキシムキレートの代わりに化合物１ａ〜１０ａのテトラアミンキレートを用いる点を除いて、化合物１〜１０の方法と類似している。テトラアミンキレートの連結は、Ｂｏｃで保護された分子種との通常のペプチドカップリングを用いて達成される。
【０１１２】
生体分布を改善することを目的として、すなわち、主にバックグラウンド肝臓取込み低減するために、多くの追加の修飾化合物を合成した。化合物１１〜１５の合成の詳細を、以下の実施例８〜１２に示す。化合物１１は、ジアミンジオキシムキレートからテトラアミンキレートに変える効果を評価するために設計した。化合物１２では、システイン酸基を加えた。化合物１３は、ペプチドのＮ−末端側に追加のＰＥＧ部分を有する。化合物１４は、ペプチドのＣ−末端側に追加のＰＥＧ部分を有する。化合物１５では、テトラアミンキレートを、多くのグルタミン酸残基に加えて使用した。
【０１１３】
本明細書に記載されている方法は、検出可能な量の式Ｉの化合物を投与しておいた被検体を「準備」することから始める。本発明の方法の目的は、診断上有用な画像の用意である。従って、式Ｉの化合物の被検体への投与は、画像の形成を容易にするために必要な予備段階であると理解することができる。好ましくは、被検体は、哺乳類、最も好ましくはヒトである。最も好ましくは、被検体は、インビボでのインタクトな哺乳類の身体である。従って、好ましい実施形態では、式Ｉの化合物は、生体適合性担体と共に、哺乳類への投与に適した形態の化合物を含む医薬組成物として投与されてきた。投与の好ましい経路は、血管内投与である。代替実施形態では、検出可能な量の式Ｉの化合物の投与は、本方法の一部として行われる。
【０１１４】
用意する段階に続いて検出段階に先立って、式Ｉの化合物を、被検体における任意の線維形成性組織に結合させる。例えば、被検体がインタクトな哺乳類である場合、式Ｉの化合物は、哺乳類の身体を動的に進み、その中の様々な組織と接触する。化合物が、任意の線維形成性組織に接触するとすぐに、線維形成性組織からの化合物のクリアランスが、非線維形成性組織からより時間がかかるように、特異的相互作用が起きる。線維形成性組織と特異的に結合している化合物の検出が、線維形成性組織と結合している化合物と非線維形成性組織に結合している化合物の比の結果として可能になるある時点に到達する。理想的なそのような比は、２：１以上である。
【０１１５】
「生体適合性担体」とは、式Ｉの化合物を懸濁又は溶解できる流体、特に液体であって、組成物が生理学的に認容できるもの、つまり毒性も耐え難い不快感も伴わずに哺乳類の身体に投与することができるものである。生体適合性担体は好適には注射可能な担体液であり、例えば、発熱物質を含まない注射用の滅菌水、食塩液のような水溶液（これは注射用の最終製剤が等張性又は非低張性となるように調整するのに都合がよい）、１種以上の張度調節物質（例えば血漿陽イオンと生体適合性対イオンとの塩）、糖（例えばグルコース又はスクロース）、糖アルコール（例えばソルビトール又はマンニトール）、グリコール（例えばグリセロール）その他の非イオン性ポリオール材料（例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の水溶液である。生体適合性担体は、エタノールのような生体適合性の有機溶媒を含んでいてもよい。かかる有機溶媒は、親油性の高い化合物又は製剤の可溶化に有用である。好ましくは、生体適合性担体は発熱物質を含まない注射用水、等張塩類溶液又はエタノール水溶液である。静脈内注射用の生体適合性担体のｐＨは好適には４．０〜１０．５の範囲内である。
【０１１６】
かかる医薬組成物は、好適には、無菌状態を維持したまま皮下注射針で一回又は複数回穿刺するのに適したシール（例えばクリンプオン式セプタムシール蓋）を備えた容器に入れて供給される。かかる容器には、１回又は複数回分の患者用量を入れることができる。好ましい多用量容器は、複数回分の患者用量を収容した単一バルクバイアル（例えば容積１０〜３０ｃｍ3のもの）からなり、臨床症状に応じて製剤の有効期間中様々な時間間隔で１回分の患者用量を臨床グレードのシリンジに吸引することができる。プレフィルドシリンジは１回分の患者用量つまり「単位用量」を収容するように設計され、そのため好ましくは使い捨て又はその他臨床用に適したシリンジである。医薬組成物が放射性医薬組成物の場合、プレフィルドシリンジは、適宜、オペレーターを放射能被曝から保護するためのシリンジシールドを備えていてもよい。かかる適当な放射性医薬品シリンジシールドは当技術分野で公知であり、好ましくは鉛又はタングステンからなる。
【０１１７】
医薬組成物は、キットから調製することができる。或いは、医薬組成物は、所望の滅菌生成物が得られるような無菌製造条件下で製造してもよい。医薬組成物を非滅菌条件下で調製した後、例えばγ線照射、オートクレーブ処理、乾熱又は化学的処理（例えばエチレンオキサイドでの処理）を用いて最終的に滅菌してもよい。
【０１１８】
本発明の造影剤に関して上述した通り、放射性医薬組成物に対して最も好ましい本発明の放射性造影基は99mＴｃ、123Ｉ、11Ｃ及び18Ｆである。
【０１１９】
本発明の別の態様では、式Ｉの化合物は、被検体の器官又は身体領域における線維形成の存在、場所及び／又は量を決定するための医薬品の調製に用いることができる。式Ｉの好ましい及び最も好ましい実施形態、器官又は身体領域、被検体及び投与方法は、上記で定義した通りである。
【０１２０】
本発明は、活性化ＨＳＣの存在、場所及び／又は量を評価するのに有用であり、線維形成の指標を与える。これが特に有利であるのは、線維形成性組織が、線維性組織よりも早期活動性疾患の優れたマーカーであり、繊維性組織は、疾患プロセスが解消しつつある場所にも存在するからである。従って、疾患プロセスの識別を、治療の実施が最も有効であるステージで行うことができる。
【０１２１】
これらの利点を、下記の非限定的な実施例で例証する。
【０１２２】
実施例の簡単な説明
実施例１は、化合物６が、インビトロで活性化ヒトＨＳＣと特異的に結合することを例証する。
【０１２３】
実施例２は、化合物３及び化合物８の活性化ラットＨＳＣとの結合について記載する。
【０１２４】
実施例３は、ラット胆管結紮モデル及び関連する偽手術モデルを準備するのに使用される方法、並びに組織病理学的検証について記載する。
【０１２５】
実施例４は、化合物８の取込みと線維形成の相関関係を例証する。線維形成のマーカーは、術後１５日目で（実施例３に記載されている）ラット胆管結紮（ＢＤＬ）モデルにおいて高く、ラットＢＤＬモデルにおける線維形成性肝臓中への化合物８の取込みは、術後１５日目で最も高い。
【０１２６】
実施例５は、ＢＤＬモデルにおける術後１５日目に、化合物３及び化合物８が、シャム動物及び陰性対照との対比で、線維形成肝臓に取込まれることを例証する。
【０１２７】
実施例６は、ＢＤＬ線維形成性肝臓との化合物８の結合が、非放射性の化合物８により特異的に阻害されることを例証する。
【０１２８】
実施例７は、αv発現と化合物８の取込みの相関関係を例証する。
【０１２９】
実施例８〜１２は、化合物１１〜１５の合成について記載する。
【０１３０】
【表１】
0005709522.tif 000025
【実施例】
【０１３１】
実施例１：活性化ヒトＨＳＣへＴの化合物６の結合
１（ｉ） ＥＡ−Ｈｙ９２６細胞から調製した膜との結合
化合物６の阻害定数を、報文に記載された膜結合アッセイを使用して測定した（Ｉｎｄｒｅｖｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｏｒｇ  ＆  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ，  ２００６，  １６，  ６１９０−６１９３）。
【０１３２】
簡潔に述べると、ヒト内皮腺癌細胞系ＥＡ−Ｈｙ９２６からの膜を調製し、精製した膜画分についてＫdを計算した。次いで、競合的結合アッセイを確立し、非放射性の化合物６についての阻害定数を測定した。125Ｉ−エキスタチンを標識リガンドとして使用し、非放射性のエキスタチンを参照標準として使用した。
【０１３３】
非放射性の試験化合物（非放射性のエキスタチン又は非放射性の化合物６のいずれか）の合計１６通りの希釈液を調製し、125Ｉ−エキスタチンと膜の組合せと混合してから３７℃で１時間インキュベーションした。数回の洗浄後、結合した材料を、Ｓｋａｔｒｏｎマイクロハーベスターを使用してフィルター上に収集した。最後に、フィルタースポットを切り取り、Ｐａｃｋａｒｄ  γ−カウンター中でカウントした。
【０１３４】
図１は、ＥＡ−Ｈｙ９２６膜上の非放射性の化合物６及びエキスタチンと対比した125Ｉ−エキスタチンの結合を図示している。
【０１３５】
１（ｉｉ）  活性化ヒト肝星細胞との結合
活性化ヒト肝星細胞ＬＸ−２（Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（米国ニューヨーク）のＳｃｏｔｔ  Ｌ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ教授から提供されたもの）を、１０％ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン及びグルタミンを含有するダルベッコ変法イーグル培地中でコンフルエンスまで１２ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）において培養した。細胞を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｎＣｌ2、１ｍＭ  ＣａＣｌ2及び０，０１％  ＢＳＡを含有する冷緩衝液中で２回洗浄した。細胞を、攪拌しながら４℃で６０分間、様々な濃度の非放射性の化合物と一緒に、痕跡量の標識合物（０．１ｎＭ  125Ｉ化合物又は０．１ｎＭ  125Ｉ−エキスタチンのいずれか）を含有する緩衝液中でさらにインキュベートした。インキュベーション後、非結合材料を、冷緩衝液で３回細胞を洗浄することにより除去した。細胞を、０．１Ｍ  ＮａＯＨを添加することにより壁から引き離し、チューブに移し、γ−カウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）中でカウントした。図２は、観察された活性値を図示している。
【０１３６】
実施例２：化合物３及び化合物８の活性化ラットＨＳＣとの結合
２（ｉ）  ＥＡ−Ｈｙ９２６細胞から調製した膜との結合
化合物３及び化合物８についての阻害定数を、実施例１に記載されている方法を使用して決定した。図３は、ＥＡ−Ｈｙ９２６膜上の非放射性の化合物３、化合物８及びエキスタチンと対比した125Ｉ−エキスタチンの結合を図示している。
【０１３７】
２（ｉｉ）  細胞及び培養
活性化ラット肝星細胞系（不死化）は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＯｓｌｏのＴｒｏｎｄ  Ｂｅｒｇ教授から、そのご好意によって入手した。細胞を、１０％ＦＢＳ、グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンを含有するダルベッコ変法イーグル培地中でコンフルエンスまで１５０ｍｍの培養フラスコにおいて培養した。
【０１３８】
２（ｉｉｉ）  膜の調製
細胞を、氷冷ＰＢＳ、ｐＨ７．４中で２回洗浄し、ＰＢＳ１０ｍｌを添加し、ラバーポリスマンでこそぎ落とし、氷上の５０ｍｌバイアルに移した。別のＰＢＳ１０ｍｌをフラスコに添加し、こそぎ落とし、第一の細胞と混合した。細胞を４℃で２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を流し捨て、ペレットをＰＢＳ３ｍｌ中に再懸濁した。すべてのペレットを１つのチューブ中に混合し、上記のように遠心分離し、最終ペレットを直ちに−７０℃で冷凍した。
【０１３９】
細胞ペレットを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、ｐＨ７，４と、さらに、プロテアーゼ阻害剤、１０ｕｇ／ｍｌロイペプチン、１０ｕｇ／ｍｌペプスタチン、２００ｕｇ／ｍｌバシトラシン、０．５ｕｇ／ｍｌアプロチニン及び１００ｕＭ  ＰＭＳＦを含有する氷冷ホモジネーション緩衝液（細胞の１０倍量、例えば、ペレット２ｇにホモジネーション緩衝液２０ｍｌ）中に再懸濁した。細胞を、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー、ペストルＢ中で１０ストローク３回により氷上でホモジナイズした。ホモジネートを、４℃で２１００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を流し捨てた。ペレットを、ホモジネーション緩衝液１０ｍｌ中に再懸濁し、１０ストローク２回で再びホモジナイズした後、１０分間２１００ｒｐｍで遠心分離した。この上清を第一の上清と混合し、ＪＡ−１７ローター付きＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ中、１６５００ｒｐｍ（２９０００×ｇ）で遠心分離した。ペレットを、ホモジネーション緩衝液２０ｍＬ中に再懸濁し、遠心分離段階を繰り返した。
【０１４０】
上清を流し捨て、ペレットを、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、４，８ｍＭ  ＫＣｌ、１，７ｍＭ  ＭｇＳＯ4、２，５ｍＭ  ＣａＣｌ2、１．０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７，４を含有する結合緩衝液３ｍｌ中に再懸濁した。タンパク質測定のためのサンプルを取り除いた後、結合緩衝液さらに３ｍｌを添加した。３００ｕｌのアリコートを、直ちに−８０℃で冷凍した。
【０１４１】
２（ｉｖ）  タンパク質測定
十分に混合した膜調製物１００ｕｌを、１：１０に希釈し、段階希釈液及びタンパク質含量を、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｎｏ．２３２２５）中で取扱説明書に従って測定した。
【０１４２】
２（ｖ）  星細胞膜上のインテグリンとの結合を試験する実験設計
実験を９６ウェルプレート中で準備した。各ウェルに、緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｎＣｌ2、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、０，０１％  ＢＳＡ）６０ｕｌ、非放射性の化合物３、化合物８又は非放射性のエキスタチン２０ｕｌ、125−Ｉエキスタチン２０ｕｌ及び膜溶液（ウェル当たり膜約１ｕｇに相当するように緩衝液中で１：３０に希釈した）５０ｕｌを添加し、攪拌しながら６０分間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、非結合材料を、Ｓｋａｔｒｏｎ細胞ハーベスター中でＰＢＳにより洗い流し、結合材料をフィルタースポット中に濃縮した。このフィルタースポットを切り取り、チューブに添加し、最終的に、γ−カウンター中でカウントした。フィルターは、４時間以上水中０．３％ＰＥＩ中で予浸した。図４は、得られた結果を示している。
【０１４３】
実施例３：胆管結紮（ＢＤＬ）及びシャム動物
３（ｉ）  動物モデルの準備
非近交系雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（１８０〜２００ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を、すべての胆管結紮（ＢＤＬ）及びシャム試験に使用した。６日の馴化後、ラットを、２つの群（ＢＤＬ群及びシャム群）に分けた。
【０１４４】
ＢＤＬ動物については、腹部を剪毛し、ベタジン溶液と、続いて、皮下（ｓ．ｃ．）のカルプロフェン５ｍｇ／ｋｇ及びｓ．ｃ．のブプロノルフィン（ｂｕｐｒｏｎｏｒｐｈｉｎｅ）５ｍｇ／ｋｇで消毒し、イソフルラン麻酔下で、正中開腹術を実施し、総胆管の場所を見つけた。胆管を二重結紮し、第一の結紮は肝管の結合部の間で行い、第二の結紮は、膵管の入口の上で行った。
【０１４５】
第二の群（シャム動物）の腹部を剪毛し、ベタジン溶液と、続いて、ｓ．ｃ．のカルプロフェン５ｍｇ／ｋｇ及びｓ．ｃ．のブプロノルフィン５ｍｇ／ｋｇで消毒した。動物は、胆管を操作し、縫合糸を胆管の下に通す偽手術を受けた。
【０１４６】
閉じる前に、食塩水２〜３ｍｌを、各動物の腹膜中に投与した。筋膜及び皮膚を閉じ、動物にｓ．ｃ．のメタクロプロミド（ｍｅｔａｃｌｏｐｒｏｍｉｄｅ）２ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．のバイトリル（Ｂａｙｔｒｉｌ）５ｍｇ／ｋｇ、及びｓ．ｃ．の食塩水約２ｍｌを投与した。カルプロフェン（５ｍｇ／ｋｇ）を、必要に応じて、続く２、３日間与えた。動物を、実験の期間中厳重にモニターした。
【０１４７】
３（ｉｉ）  試験化合物の投与及び生体分布
術後の適切な日に、ＢＤＬ及びシャム動物を取り出し、イソフルラン麻酔下に置き、次いで、各動物に、尾静脈を介して静脈内（ｉ．ｖ．）に０．３ｍｌ（約３ＭＢｑ）を注射した。試験品目の注射後の適切な時点で、各動物をイソフルランで再麻酔し、頸椎脱臼により屠殺して秤量し、バーコード走査システムを介して重量を記録した。各動物を解剖し、下記の器官及び組織を摘出し、ＢＡＳＩＬカウンタープロトコル４０又は手動カウンティングを使用してカウントした。
【０１４８】
骨*                       筋肉*
血液*                     腎臓
膀胱及び尿（Ｂ／Ｕ）      肺
肝臓*                     脾臓
胃及び内容物              小腸及び大腸（ＳＩ及びＬＩ）
心臓                      甲状腺
皮膚*                     屠殺体
注射部位
*秤量したサンプル
全器官（例えば、肝臓）で記録された活性を、バックグラウンド放射能及び放射性崩壊に対して補正し、放射能の生体分布を、式Ｉを参照して計算した。
【０１４９】
【数１】
0005709522.tif 000026
【０１５０】
秤量した組織サンプル（例えば、血液）における注射した放射能に占める割合を計算すると、式２から、全組織における％ｉ．ｄ．を得た。
【０１５１】
【数２】
0005709522.tif 000027
【０１５２】
【表２】
0005709522.tif 000028
【０１５３】
３（ｉｉｉ）  組織病理学的評価
各動物の肝臓からの切片を、室温で１０％緩衝中性ホルマリン溶液中で固定し、パラフィンに包埋し、５μｍの薄い切片を調製した。切片を、胆管過形成、壊死及び炎症の評価についてはＭａｙｅｒ’ｓ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  Ｅｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）、及び線維症については報文に記載された標準染色プロトコル（Ｇｏｍｏｒｉ  １９５０  Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ２０：６６１−６６３）を使用するＧｏｍｏｒｉ’ｓトリクロム染色（コラーゲン染色）で染色した。
【０１５４】
肝臓損傷の組織学的グレーディングを、各病変の範囲及び重症度を評価し、次いで、病変を以下の通り、すなわち、病変なし＝０、最小＝１、軽度＝２、中等度＝３、顕著＝４、重度＝５と０〜５に点数化することにより半定量的に評価した。組織の組織形態学的評価を、術後の日数と、手順（すなわち、シャム対胆管結紮）の両方に関してブラインドベースで実施した。全データを追加の病理学者がピアレビューした。病理学的分析は、光学顕微鏡により実施した。切片を、４０倍、１００倍又は４００倍対物レンズを使用して明視野照明下で観察した。
【０１５５】
表４は、組織病理学的評価を要約している。
【０１５６】
【表３】
0005709522.tif 000029
【０１５７】
提示されているデータは、線維形成に関係する特異的取込み示す分子を識別するための肝線維症の適当なモデルとしての、特に、１５日目における、このモデルの使用を支持している。
【０１５８】
実施例４：シャムとラットＢＤＬモデル（線維形成のマーカーが高いときの１５日目）における線維形成性肝臓への化合物８の取込量の対比
ＢＤＬ及びシャムモデルを、実施例３に記載されているように準備した。化合物８の取込み、以下の通り、
【０１５９】
【数３】
0005709522.tif 000030
【０１６０】
屠殺体における放射能の割合を、解剖後の残留屠殺体における秒当たりカウントを参照し、屠殺体中に残っているサンプリング組織に対して補正することにより計算した。身体組成の生物学的変動は、組織値の推定におけるわずかな不正確さと、従って、屠殺体値の過度の補正又は補正不足をもたらしたかも知れない。屠殺体値が過度に補正された場合、これは、負の値をもたらすこともあった。
【０１６１】
図５は、術後２、５、１０、１５、２８日目のうちの１日における化合物８、及び術後２日目のスクランブル陰性対照（以下の構造）の尾静脈注射の１時間のＢＤＬ動物及び偽手術動物の肝臓におけるＳＵＶとして表される放射能の保持を要約している。
【０１６２】
【化２４】
0005709522.tif 000031
【０１６３】
結果は、試験されたすべての時点における偽手術動物と比較してＢＤＬにおける放射能の有意な保持を例証しており、放射能の最高保持は、術後１０及び１５日目にＢＤＬ動物からの肝臓において観察された。術後のいずれの時点においても偽手術動物における肝臓取込みに有意差はなかった。
【０１６４】
実施例５：ＢＤＬモデルにおける術後１５日目に、化合物３及び化合物８は、シャム動物及び陰性対照との対比で、線維形成肝臓に取込まれる
ＢＤＬ及びシャム動物モデルを、実施例３に記載されているように準備した。術後１５日目に、化合物３、化合物８又は陰性対照のうちの１つを各動物に投与し、肝臓取込み実施例３に記載されているように評価した。
【０１６５】
陰性対照の構造は以下の通りであった。
【０１６６】
【化２５】
0005709522.tif 000032
【０１６７】
図６は、偽手術動物と比較して、ＢＤＬモデルにおける化合物３及び８の有意に高い肝臓取込み図示している。
【０１６８】
実施例６：ＢＤＬ線維形成性肝臓との化合物８の結合は、非放射性の化合物８により特異的に阻害される
放射能の生体分布を、１：１００及び１：１００００倍過剰の非放射性の化合物８の添加前と添加後の両方で、化合物８約３ＭＢｑの尾静脈を介する静脈内注射から１時間後のＢＤＬ及び偽手術雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（実施例３に記載されている手順）において術後１５日目に検討した。試験品目の注射後の適切な時点で、各動物をイソフルランで再麻酔し、頸椎脱臼により屠殺して秤量した。各動物を解剖し、器官及び組織（以下の表５及び６を参照）を摘出し、ＢＡＳＩＬカウンタープロトコル４０又は手動カウンティングを使用してカウントした。
【０１６９】
ＢＤＬ動物における注射後１時間における活性の蓄積（％ｉ．ｄ．）の主要部位を以下の表５に要約する。
【０１７０】
【表４】
0005709522.tif 000033
【０１７１】
シャム動物における注射後１時間における活性の蓄積（％ｉ．ｄ．）の主要部位を以下の表６に要約する。
【０１７２】
【表５】
0005709522.tif 000034
【０１７３】
実施例７：１５日目のＢＤＬにおける化合物８の取込み及びα−ｖ上方制御
ＢＤＬ及びシャム動物モデルを、実施例３に記載されているように準備した。術後２、１５及び２８日目の各々で、化合物８約３ＭＢｑを動物に投与し、肝臓取込み実施例３に記載されているように評価した。
【０１７４】
動物の肝臓におけるαvインテグリンの発現を、ＢＤＬ及び偽手術動物のホモジナイズした肝臓において測定した。術後２、１５及び２８日目の各々で、動物を屠殺し、それらの肝臓を摘出し、−７０℃で保存した。
【０１７５】
予め秤量した肝臓を、−７０℃フリーザーから取り出し、少量の液体窒素の存在下で予冷した乳鉢及び乳棒中に入れた。肝臓を、ほぼ均一な粉末になるまで粉砕した（肝臓の粉砕中に、少量の液体窒素を加え、組織を常に冷凍状態に保った）。粉砕した肝臓を、予冷した医薬測定器具に入れ、さらに使用するまで−７０℃フリーザーに入れた。冷凍した粉砕組織１ｇを、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５Ｍスクロースを含有する氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０％  Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０（界面活性剤）、０．５％デオキシコール酸ナトリウム（陰イオン性界面活性剤）、０．１％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）１０ｍｌ中に直接加え、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）（溶解緩衝液ｍｌ当たりカクテル１０μｌ）を新たに加えた。混合物を、４℃でシャープブレードホモジナイザーでホモジナイズし、３０分間湿った氷上に保持した。
【０１７６】
ホモジネートを、予冷したガラス組織Ｄｏｕｎｃｅ中に移し、乳棒の３回の上下ストロークを４℃で適用した。次いで、組織ホモジネートを、予冷した遠心分離管中に移し、３００００ｒｐｍ及び４℃で３０分間遠心分離した。上清を取り出し（全細胞ライセート）、湿った氷上に置いた。相対的タンパク質濃度を、製造者の取扱説明書に従ってＢＳＡ標準品を含む市販のタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）を使用して各サンプルにおいて決定した（ＢＳＡアリコートは、ホモジネーションのために使用された変法ＲＩＰＡ緩衝液中で調製すべきである）。各サンプルからの上清を、Ｈ2Ｏ中で１：５０〜１：２００へさらに希釈し、タンパク質濃度を、９９マルチウェルＰｌａｔｅリーダー（ｉＥＭＳ）を使用して決定した。各サンプルを、１ｍｌアリコートに分け、さらなる使用まで−７０℃で保存した。
【０１７７】
抗α−ｖインテグリン捕捉抗体（ＢＤ；カタログ番号：６１１０１３）を、結合溶液（０．０５Ｍトリス、０．１３８Ｍ  ＮａＣｌ及び０．００２７Ｍ  ＫＣｌ）中で適切な濃度に希釈し、５０μｌ又は１００μｌのいずれかを、高タンパク質結合ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ（商標）プレート９６ウェルプレート、ＭａｘｉＳｏｒｐ）の各ウェルに添加した。使用される抗体の量は、２００ｎｇ／ウェルとした。プレートを密封し、３７℃で１時間又は４℃で一晩インキュベートした。プレートを空にして、マイクロタイタープレート上のタンパク質結合のための残った部位を、ブロッキング緩衝液（ウェル当たり０．０２％アジ化ナトリウム約３００μｌを含む３％  ＢＳＡ／ＴＢＳ）と共にインキュベートすることにより飽和させた。プレートを密封し、３７℃で１時間インキュベートし、次いで、ＴＢＳ／０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。ニートの肝臓ホモジネート上清及び／又は異なる濃度の精製α−ｖインテグリン標準品を、ブロッキング緩衝液中で調製し、コーティングしたプレート中に三つ組みで添加し（ウェル当たり１００μｌ）、次いで、密封し、３７℃で２時間インキュベートした。プレートを、ＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄し、ブロッキング緩衝液中で希釈された第二の抗インテグリン検出抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＡＢ１９３０）をウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを、ＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄し、検出抗体に特異的な二次抗体アルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号：Ａ７５３９）をウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを、ＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄し、ＮＰＰ基質溶液１００μｌを各ウェルに添加し、室温で２時間又は４℃で一晩インキュベートした。加水分解は、視覚的検査により定性的に又はマイクロタイタープレートリーダーで定量的にモニターした。ＮＰＰの加水分解は、推奨インキュベーション時間が経過した後に黄色に見え、標的波長（４０５ｎｍ）における光学密度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｍａｘ  Ｐｌｕｓ）で測定した。加水分解は、５Ｍ水酸化ナトリウムＮａＯＨ５０μｌを添加することにより停止させた。
【０１７８】
定量的結果については、未知サンプルの信号を、標準曲線の信号と比較した。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ、Ｖｅｒｓｉｏｎ４．０を使用して実施した。群間差は、ノンパラメトリックな一元配置ＡＮＯＶＡにより分析した。すべての統計分析において、０．０５未満の確率値（Ｐ＜０．０５）を有意と見なした。
【０１７９】
図７及び図８は、シャム動物と対比したＢＤＬ動物におけるαv発現を図示しており、αv発現と化合物８の取込みの相関関係を例証している。
【０１８０】
実施例８：化合物１１の合成
【０１８１】
【化２６】
0005709522.tif 000035
【０１８２】
Ｂｏｃ−テトラアミン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（国際公開第２００６／００８４９６号）（３６ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）を、１０分間ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のＨＯＡｔ（１．４ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）及びＮＭＭ（１７μＬ、０．１５ｍｍｏｌ）で予め活性化し、次いで、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のＣｙｓ２−６；ｃ［ＣＨ2ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−ＰＥＧ（４）−ジグリコロイル−ＮＨ2（国際公開第０３／００６４９１号）（１２．６ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応混合物を、３日間室温で撹拌し、次いで、真空中で濃縮した。Ｂｏｃ保護基を、９０分間ＴＦＡ／水／トリイソプロピルシラン（９５：２．５：２．５、１０ｍＬ）溶液の添加により除去した。混合物を濃縮し、粗生成物をエーテルから沈殿させ、調製用ＨＰＬＣ（カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２５０×２１．２ｍｍ、５μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％  ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ；４０分間勾配１０〜２０％Ｂ；流速１０ｍＬ／分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍにおけるＵＶ検出）により精製すると、凍結乾燥後に１０．４ｍｇが得られた。ＬＣ−ＭＳ（カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２０×２ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％  ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ；５分間勾配１０〜２０％Ｂ；流速０．６ｍＬ／分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍにおけるＵＶ検出、ＥＳＩ−ＭＳ）による分析ｔR＝２．０２分、ｍ／ｚ１４５８．７（ＭＨ）+は、構造を支持した。
【０１８３】
99mＴｃによる標識は、窒素でパージしたＰ４６バイアルに、下記の、ＭｅＯＨ中のＩＧＦ前駆体１又は２  １００μｇ、Ｎａ2ＣＯ3／ＮａＨＣＯ3緩衝液（ｐＨ９．２）０．５ｍｌ、Ｄｒｙｔｅｃ（商標）99mＴｃ発生剤からのＴｃＯ4-０．５ｍｌ、ＳｎＣｌ2／ＭＤＰ溶液（Ｎ2でパージした食塩水１００ｍｌ中にＳｎＣｌ2１０．２ｍｇ及びメチレンジホスホン酸１０１ｍｇを含有する）０．１ｍｌを加えることにより行った。
【０１８４】
実施例９：化合物１２の合成
【０１８５】
【化２７】
0005709522.tif 000036
【０１８６】
合成は、０．３ｍｍｏｌスケールで（ローディング量０．４３２ｇ、０．７１ｍｍｏｌ／ｇ）ＲｉｎｋアミドＡＭ樹脂上で実施した。最初の３つのカップリング段階は、手動窒素バブラー装置中で行った。樹脂上のＦｍｏｃ基は、標準プロトコル（ＤＭＦ中２０％ピペリジン）により切断した。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（トリチル）−ＯＨ（７０２ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）を、標準カップリング試薬ＨＡＴＵ及びＤＩＥＡによりＤＭＦ中の樹脂にカップリングさせた。カップリングの終了は、標準Ｋａｉｓｅｒ試験によりチェックした。Ｆｍｏｃ切断後、カップリングを繰り返し、第二のシステインを導入した。樹脂を、ジクロロメタン／ＴＦＡ／トリイソプロピルシラン（９４：５：１、１０ｍＬ）溶液中に懸濁した。３分後、黄色の溶液を流し出した。この段階を６回繰り返し、側鎖チオール機能の完全な脱保護を確保した。樹脂を、ジクロロメタンで洗浄し、乾燥した（３０分間窒素流）。２０％ギ酸（１８ｍＬ）と３５％過酸化水素（２ｍＬ）の混合物を、室温で１時間放置し、０℃まで冷却した。樹脂を、過ギ酸溶液のアリコート（２×４ｍＬ）で洗浄し、次いで、緩やかに攪拌しながら５℃で１２時間過ギ酸溶液（５ｍＬ）中に保持した。樹脂のアリコートを切断し（ＴＦＡ／水／トリイソプロピルシラン、９５：２．５：２．５）、ＬＣ−ＭＳ（カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）５０×２ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％  ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ；５分間勾配５〜５０％Ｂ；流速０．３ｍＬ／分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍにおけるＵＶ検出、ＥＳＩ−ＭＳ）により分析すると、ｔR＝２．４８分、ｍ／ｚ５６４．３（ＭＮａ）+は、構造を支持した。
【０１８７】
上記の樹脂のＦｍｏｃ除去（標準プロトコル）後、Ｆｍｏｃ−アミノ−ＰＥＧ（４）−ジグリコール酸（７９６ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）を、標準カップリング試薬（ＨＡＴＵ及びＤＩＥＡ）を使用してＤＭＦ中の樹脂にカップリングさせた。６時間後、アリコートを切断し（前の段落に記載されている）、ＬＣ−ＭＳ（カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）５０×２ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％  ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ；５分間勾配５〜５０％Ｂ；流速０．３ｍＬ／分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍにおけるＵＶ検出、ＥＳＩ−ＭＳ）により分析すると、ｔR＝３．２８分、ｍ／ｚ８３２．３（ＭＨ）+は、完全な変換を示した。
【０１８８】
すべての後続アミノ酸を、上記からの樹脂上約０．２５ｍｍｏｌ上でＳｌｏｗＭｏｃカップリングプロトコルを使用してＡＢ１４３３Ａ自動ペプチド合成機を使用してカップリングさせると、Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＰＥＧ４−ジグリコロイル−ＣｙＡ−ＣｙＡ−Ｒｉｎｋアミド樹脂が得られた。
【０１８９】
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中のクロロ酢酸（１４２ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）及びＤＣＣ（１５５ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）の溶液を、１５分間室温で撹拌し、次いで、濾過し、濃縮した。残渣をＤＭＦに取り、上記のペプチド樹脂に加えた。ペプチドを、２時間ＴＦＡ／水／トリイソプロピルシラン溶液（９５：２．５：２．５、１０ｍＬ）を使用して樹脂から切断した。溶液を濃縮し、粗ペプチドをエーテルから沈殿させ、真空中で乾燥すると、３４０ｍｇが得られた。ＬＣ−ＭＳ（カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）５０×２ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％  ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ；５分間勾配０〜５０％Ｂ；流速０．３ｍＬ／分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍにおけるＵＶ検出、ＥＳＩ−ＭＳ）による分析、ｔR＝３．０９分、ｍ／ｚ１７１０．６（ＭＨ）+は、クロロアセチル化ペプチドを支持した。
【０１９０】
５０％アセトニトリル（６４ｍＬ）中のペプチド（６８ｍｇ）の溶液に、ｐＨが８．５になるまで２．５％アンモニアを加えた。混合物を１６時間室温で撹拌した。ＬＣ−ＭＳ分析は、完全なチオエーテル環化を支持した。アセトニトリルを減圧下で除去し、水溶液を凍結乾燥した。単離した材料を、ＴＦＡ中ＤＭＳＯの５％溶液（１００ｍＬ）に取り、６０分間室温で撹拌した。混合物を濃縮し、粗生成物を、エーテルからの沈殿により単離し、続く、調製用ＨＰＬＣ（カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２５０×２１．２ｍｍ、５μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％  ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ；６０分間勾配５〜２０％Ｂ；流速１０ｍＬ／分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍにおけるＵＶ検出）により精製すると、固体材料４８ｍｇが得られた。ＬＣ−ＭＳ（カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）５０×２ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％  ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ；５分間勾配０〜３０％Ｂ；流速０．３ｍＬ／分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍにおけるＵＶ検出、ＥＳＩ−ＭＳ）による分析ｔR＝３．１８分、ｍ／ｚ１５６０．５（ＭＨ）+は、ジスルフィド架橋形成を支持した。
【０１９１】
ＮＭＰ（１．５ｍＬ）中のペプチド（５ｍｇ）、キレートＩ−グルタリル  テトラフルオロチオフェノールエステル（国際公開第０３／００６４９１号）（５ｍｇ）及びＤＩＥＡ（２．７μｌ）の部分的に溶けた混合物を、一晩４０℃で加熱した。混合物を、調製用ＨＰＬＣ（カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２５０×２１．２ｍｍ、５μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％  ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ；４０分間勾配０〜３０％Ｂ；流速１０ｍＬ／分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍにおけるＵＶ検出）により精製すると、純粋な生成物２．９ｍｇが得られた。ＬＣ−ＭＳ（カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２０×２ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％  ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ；５分間勾配０〜３０％Ｂ；流速０．６ｍＬ／分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍにおけるＵＶ検出、ＥＳＩ−ＭＳ）による分析ｔR＝３．８３分、ｍ／ｚ１０００．７（ＭＨ2）2+は、構造を支持した。
【０１９２】
99mＴｃによる標識は、国際公開第２００３／００６４９１号に記載の通り実施した。
【０１９３】
実施例１０：化合物１３の合成
【０１９４】
【化２８】
0005709522.tif 000037
【０１９５】
Ｂｏｃ−ＰＥＧ（６）−ジグリコール酸（５０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を、標準カップリング試薬（ＨＡＴＵ及びＮＭＭ）を使用し、ＤＭＦ中のＣｙｓ２−６；ｃ［ＣＨ2ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−ＰＥＧ（４）−ジグリコロイル−ＮＨ2（国際公開第０３／００６４９１号）（２５．２ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）にカップリングさせた。反応混合物を、一晩撹拌し、真空中で濃縮した。Ｂｏｃ保護基を、室温で４５分間ＴＦＡ／水／トリイソプロピルシラン（９５：２．５：２．５、１０ｍＬ）の添加により除去した。混合物を濃縮し、続いて、粗材料をエーテルから沈殿させた。生成物を、調製用ＨＰＬＣ（カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２５０×２１．２ｍｍ、５μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％  ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ；４０分間勾配１０〜３０％Ｂ；流速１０ｍＬ／分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍにおけるＵＶ検出）により精製すると、５．５ｍｇが得られた。ＬＣ−ＭＳ（カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２０×２ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％  ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ；５分間勾配１０〜２５％Ｂ；流速０．６ｍＬ／分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍにおけるＵＶ検出、ＥＳＩ−ＭＳ）による分析ｔR＝３．０１分、ｍ／ｚ１６３６．０（ＭＨ）+は、生成物を支持した。
【０１９６】
キレートＩ−グルタル酸（国際公開第０３／００６４９１号）（１５．６ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）を、標準カップリング試薬（ＰｙＡＯＰ（７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）及びＮＭＭ）を使用して、ＤＭＦ中のペプチド（５．５ｍｇ、０．００３４ｍｍｏｌ）にカップリングさせた。４時間後、混合物を、調製用ＨＰＬＣ（カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２５０×２１．２ｍｍ、５μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％  ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ；４０分間勾配１５〜３０％Ｂ；流速１０ｍＬ／分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍにおけるＵＶ検出）により精製すると、３．８ｍｇが得られた。ＬＣ−ＭＳ（カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２０×２ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％  ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ；５分間勾配１５〜３０％Ｂ；流速０．６ｍＬ／分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍにおけるＵＶ検出、ＥＳＩ−ＭＳ）による分析ｔR＝２．１３分、ｍ／ｚ１０３９．０（ＭＨ2）2+は、構造を支持した。
【０１９７】
99mＴｃによる標識は、国際公開第２００３／００６４９１号に記載の通り実施した。
【０１９８】
実施例１１：化合物１４の合成
【０１９９】
【化２９】
0005709522.tif 000038
【０２００】
合成は、０．８０ｍｍｏｌスケールでＲｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ樹脂（ローディング量０．７２ｍｍｏｌ／ｇ）上で手動窒素バブラー装置中で行った。樹脂上のＦｍｏｃ基は、標準プロトコルにより切断した。Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ（４）−ジグリコール酸（８５０ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ中で標準カップリング試薬（ＰｙＡＯＰ及びＮＭＭ）を使用して樹脂にカップリングさせた。コンジュゲーション反応と、続く、Ｆｍｏｃ脱保護を、５つのＰＥＧ（４）−ジグリコロイル基が樹脂上に導入されるまで繰り返した。
【０２０１】
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（１．０ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ／ジクロロメタン（１：１、６ｍＬ）中で標準カップリング試薬（ＰｙＡＯＰ及びＮＭＭ）を使用して、上記の樹脂（０．２ｍｍｏｌ）にカップリングさせた。２．５時間後、樹脂のアリコートを切断し（上記）、ＬＣ−ＭＳ（カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２０×２ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％  ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ；５分間勾配１０〜８０％Ｂ；流速０．６ｍＬ／分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍにおけるＵＶ検出、ＥＳＩ−ＭＳ）により分析すると、ｔR＝２．３分、ｍ／ｚ１７９４．１（ＭＨ）+は、完全な変換を示した。
【０２０２】
すべての後続アミノ酸を、上記からの樹脂上約０．１ｍｍｏｌ上でＳｌｏｗＭｏｃカップリングプロトコルを使用し、ＡＢ１４３３Ａ自動ペプチド合成機を使用してカップリングさせると、Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−（ＰＥＧ（４）−ジグリコロイル）5−Ｒｉｎｋアミド樹脂が得られた。
【０２０３】
クロロ酢酸無水物（２．００ｍｍｏｌ）を、１時間ジクロロメタン（１０ｍＬ）中のクロロ酢酸（３７８ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ）及びＤＣＣ（４１２ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）の溶液を撹拌し、続いて、濾過することによって合成した。溶液を濃縮し、残渣をＤＭＦ（３ｍＬ）に取り、上記のペプチド樹脂に加えた。ＮＭＭ（２２０μＬ、２．００ｍｍｏｌ）を加え、混合物を３時間放置した。樹脂のアリコートを切断し（上記）、ＬＣ−ＭＳにより分析すると、完全な変換を支持した。ペプチドを、３時間ＴＦＡ／水／トリイソプロピルシラン溶液（９５：２．５：２．５、１０ｍＬ）の添加により樹脂から切断した。溶液を濃縮した。
【０２０４】
上記からの残渣を、水（１００ｍＬ）に取り、エーテルで抽出した。水溶液にアセトニトリル（１００ｍＬ）を加え、ｐＨを、希アンモニアの添加により８に調整した。反応物を一晩放置した。アセトニトリルを蒸発させ、粗生成物を凍結乾燥により単離すると、１５４ｍｇが得られた。ＬＣ−ＭＳによる分析は、完全なチオエーテル環化を支持した。
【０２０５】
上記からの単離材料を、ＴＦＡ中ＤＭＳＯの５％溶液（８０ｍＬ）に取り、６０分間室温で撹拌した。混合物を濃縮し、粗生成物を、エーテルからの沈殿により単離し、続いて、調製用ＨＰＬＣ（カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２５０×２１．２ｍｍ、５μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％  ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ；６０分間勾配１５〜２５％Ｂ；流速１０ｍＬ／分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍにおけるＵＶ検出）により精製すると、純粋な材料５ｍｇが得られた。ＬＣ−ＭＳによる分析は、ジスルフィド架橋形成を支持した。
【０２０６】
キレートＩ−グルタル酸（国際公開第０３／００６４９１号）（９ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を、一晩ＤＭＦ中で標準カップリング試薬（ＰｙＡＯＰ及びＤＩＥＡ）を使用して上記のペプチドにカップリングさせた。生成物を、調製用ＨＰＬＣ（カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２５０×２１．２ｍｍ、５μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％  ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ；６０分間勾配１０〜３０％Ｂ；流速１０ｍＬ／分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍにおけるＵＶ検出）により精製すると、１．３ｍｇが得られた。ＬＣ−ＭＳ（カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２０×２ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％  ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ；５分間勾配１０〜６０％Ｂ；流速０．６ｍＬ／分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍにおけるＵＶ検出、ＥＳＩ−ＭＳ）による分析ｔR＝１．８分、ｍ／ｚ１４３０．１（ＭＨ2）2+は、構造を支持した。
【０２０７】
99mＴｃによる標識は、国際公開第２００３／００６４９１号に記載の通り実施した。
【０２０８】
実施例１２：化合物１５の合成
【０２０９】
【化３０】
0005709522.tif 000039
【０２１０】
ペプチド配列Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−［Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）］5−ＮＨ2を、ＳｌｏｗＭｏｃカップリング方法を使用してＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂（０．１ｍｍｏｌ）上でＡＢＩ４３３Ａ自動ペプチド合成機で組み立てた。
【０２１１】
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中のクロロ酢酸（３７８ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ）及びＤＣＣ（４１２ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）の溶液を、１時間室温で撹拌し、次いで、濾過し、濃縮した。残渣をＤＭＦに取り、上記のペプチド樹脂に加えた。ＮＭＭ（２２０μｌ、２．００ｍｍｏｌ）を加え、反応物を２時間放置した。樹脂のアリコートを切断し（上記）、ＬＣ−ＭＳ（カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２０×２ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％  ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ；５分間勾配２０〜３０％Ｂ；流速０．６ｍＬ／分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍにおけるＵＶ検出、ＥＳＩ−ＭＳ）により分析すると、ｔR＝２．２分、ｍ／ｚ１８２０．７（ＭＨ）+は、完全な変換を支持した。ペプチドを、２時間ＴＦＡ／水／トリイソプロピルシラン溶液（９５：２．５：２．５、１０ｍＬ）の添加により樹脂から切断した。溶液を濃縮し、粗生成物を、エーテルからの沈殿により単離し、続いて、調製用ＨＰＬＣ（カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２５０×２１．２ｍｍ、５μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％  ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ；６０分間勾配２０〜４０％Ｂ；流速１０ｍＬ／分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍにおけるＵＶ検出）により精製した。半純粋な生成物を凍結乾燥により単離し、５０％アセトニトリル／水（６ｍＬ）に取った。ｐＨを、希アンモニアの添加により８に調整し、反応物を一晩撹拌した。アセトニトリルを減圧下で蒸発させ、生成物を凍結乾燥により単離すると、１４．８ｍｇが得られた。ＬＣ−ＭＳ［カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２０×２ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％  ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ；５分間勾配１０〜６０％Ｂ；流速０．６ｍＬ／分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍにおけるＵＶ検出、ＥＳＩ−ＭＳ）による分析ｔR＝２．０分、ｍ／ｚ１７８５．０（ＭＨ）+は、完全なチオエーテル環化を支持した。
【０２１２】
上記の単離ペプチドを、ＴＦＡ中ＤＭＳＯの５％溶液（８ｍＬ）に取り、１５分間室温で撹拌した。混合物を濃縮し、粗生成物を、エーテルから沈殿させ、続いて、調製用ＨＰＬＣ（カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２５０×１０ｍｍ、１０μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％  ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ；６０分間勾配１０〜２０％Ｂ；流速５ｍＬ／分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍにおけるＵＶ検出）により精製すると、純粋な材料２ｍｇが得られた。ＬＣ−ＭＳ（カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２０×２ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％  ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ；５分間勾配１０〜６０％Ｂ；流速０．６ｍＬ／分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍにおけるＵＶ検出、ＥＳＩ−ＭＳ）による分析ｔR＝１．０分、ｍ／ｚ１６７０．８（ＭＨ）+は、ペプチドを支持した。
【０２１３】
ＤＭＦ中の上記からのペプチド（２ｍｇ、１μｍｏｌ）及びＢｏｃ−テトラアミン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（国際公開第２００６／００８４９６号）（８．６ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＥＡ（３μＬ、０．０２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を一晩撹拌し、調製用ＨＰＬＣ（カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２５０×２１．２ｍｍ、５μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％  ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ；６０分間勾配２０〜８０％Ｂ；流速１０ｍＬ／分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍにおけるＵＶ検出）による精製にかけた。純粋な生成物を凍結乾燥し、ＴＦＡとジクロロメタンの混合物（１：１、２ｍＬ）に溶かした。２時間後、溶媒を蒸発させ、残渣をアセトニトリル／水に取り、凍結乾燥すると、純粋な生成物１．０ｍｇが得られた。ＬＣ−ＭＳ（カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２０×２ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％  ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ；５分間勾配０〜２０％Ｂ；流速０．６ｍＬ／分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍにおけるＵＶ検出、ＥＳＩ−ＭＳ）による分析ｔR＝４．２分、ｍ／ｚ９３５．５（ＭＨ2）2+は、構造を支持した。
【０２１４】
99mＴｃによる標識は、上記の実施例８において化合物１１について記載されているように行った。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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