(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（全ＡＣＥ２の重量％で）２０重量％以上の糖を含む組換えヒト水溶性ＡＣＥ２タンパク質を含んでなる、肝線維症、肺線維症、結合組織線維症、皮膚の線維症または腎線維症を含む線維症の治療または予防のための、全身的に投与される医薬組成物。
【請求項２】
線維症が肝線維症を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
線維症が発症する前の予防的適用のための請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
線維症が炎症を併発している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
炎症が肝炎である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
線維症もしくは炎症が感染または創傷を原因とするものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＡＣＥ２タンパク質が膜ドメインを有さない、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は線維症および肝疾患、特に炎症性肝疾患の治療の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維症は線維性組織または組織障害の形成を特徴とする疾患である。これは、結合組織自体または器官での結合組織細胞の病的な増殖を含む。それとともに問題となる器官の組織が硬化し、瘢痕状の異変が発生し、進行した段階でそれが当該の器官機能の制限をもたらす。
【０００３】
従って線維症とは、すべてのヒト器官の結合組織の過度の増殖を意味し、その原因は細胞外マトリックスタンパク質、主としてコラーゲンの過剰産生にある。この過剰産生をもたらす複雑な分子的調節過程は、手がかりが知られているにすぎない。しかし今日までに多数の誘発因子が明らかになっており、例えばマトリックスタンパク質の多量の形成の標的細胞として線維芽細胞、例えば筋線維芽細胞および星細胞を刺激する有毒物質、増殖因子、マトリックスタンパク質のペプチド断片、ホルモン等が挙げられる。
【０００４】
肝臓は極めて代謝活性が高く、再生力の高い臓器であって、高レベルの障害があってもなお新たな肝細胞を形成して再生することができる。肝疾患の場合、強さによっては強力な組織新生が起こり、その際、線維性組織の形成の大きなリスクもある。
【０００５】
Ｈｕｅｎｔｅｌｍａｎら（Ｅｘｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９０（５）（２００５）：７８３−７９０）はマウスＡＣＥ２をコードするレンチウイルス・ベクター（ｌｅｎｔｉ−ｍＡＣＥ２）を取り上げ、これを心線維症の研究に使用した。実験モデルは、埋め込んだポンプによりＡｎｇＩＩを投与したラットに基づいている。ＡｎｇＩＩ投与によって心臓に線維症が引き起こされ、かつコラーゲン産生が高められることが示された。２つの効果はＡＣＥ２ベクターによる形質転換で減衰された。
【０００６】
Ｈｅｒａｔｈら（Ｊｏｕｒｎ．ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４７（２００７）：３８７−３９５）は外科的処置により誘導された線維症を有する肝線維症モデル（ＢＤＬ［胆管結紮］ラット）の研究を取り上げる。この文献はこの線維症の治療、特にＡＣＥ２の投与に関するものでなく、ＡＣＥ２およびアンギオテンシン（１−７）値の観察を取り上げるにすぎない。
【０００７】
Ｗａｒｎｅｒら（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１３（２００７）：１０９−１１８）ではアンギオテンシンＩＩの効果、特に炎症および創傷治癒の制御に対する効果がまとめられている。慢性損傷、特に肝線維症の発症の場合、ＲＡＳ（レニン・アンギオテンシン系）のＡＣＥ２経路は当然にアップレギュレーションされる。
【０００８】
Ｄｉｅｚ−Ｆｒｅｉｒｅら（Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎ．２７（２００６）：１２−１９）はＨｕｅｎｔｅｌｍａｎらの結果についての予備研究を示す。Ｄｉｅｚ−Ｆｒｅｉｒｅらによれば、とりわけＡＣＥ２遺伝子導入の血圧に対する効果を研究するために、同じくＡＣＥ２レンチウイルス・トランスフェクション・ベクターが使用された。
【０００９】
Ｋａｔｏｖｉｃｈら（Ｅｘｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９０（３）（２００５）：２９９−３０５）は高血圧に対するＡＣＥ２の研究を示す。ＡＣＥ２を発現する動物（やはりレンチウイルス・ベクターで形質転換）はアンギオテンシンＩＩにより人為的に引き起こされる高血圧を予防できることが判明した。
【００１０】
Ｈｕｅｎｔｅｌｍａｎ  Ｍ．（“ＨＩＶ−１  ｂａｓｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ    ｔｈｅ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍ［心血管系への遺伝子導入のためのＨＩＶ−１ベースのウイルスベクターの開発］”（２００３）（学位論文））は心血管系への遺伝子導入のためのベクター系を示す。その１１および１２ページはＡＣＥ２を簡単に取り上げる。そこではＡＣＥ２ノックアウト・マウスに触れており、ＡＣＥ２系はＡＣＥ系に拮抗して働くもう１つの血圧調節系であることが確認されている。さらに７１ページでＨｕｅｎｔｅｌｍａｎらが説明したレンチウイルス・ベクターをＡＣＥ２トランスフェクションに使用することが提案される。
【００１１】
Ｋｕｂａら（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃ．６（２００６）：２７１−２７６）はＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）動物モデルおよびＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）コロナウイルス感染でのＡＣＥ２の保護機能を説明する。ＡＣＥ２は決定的なＳＡＲＳ受容体だからである。
【００１２】
Ｈｕｅｎｔｅｌｍａｎら（Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １２２（２００４）：６１−６７）は水溶性分泌形態のＡＣＥ２のクローニングを取り上げる。切断型ＡＣＥ２をトランスフェクションのためにレンチウイルス・ベクターにクローニングした（“Ｌｅｎｔｉ−ｓｈＡＣＥ２”）。標的として特に心臓細胞または冠動脈の内皮細胞が挙げられている。膜結合ＡＣＥ２と比較して、高い分泌および循環中の高いＡＣＥ２濃度が認められた。
【００１３】
国際公開ＷＯ２００４／０００３６７Ａ１は心臓、肺および腎疾患の治療のためのＡＣＥ２活性化を記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００４／０００３６７Ａ１
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｈｕｅｎｔｅｌｍａｎら、Ｅｘｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９０（５）（２００５）：７８３−７９０
【非特許文献２】Ｈｅｒａｔｈら、Ｊｏｕｒｎ．ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４７（２００７）：３８７−３９５
【非特許文献３】Ｗａｒｎｅｒら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１３（２００７）：１０９−１１８
【非特許文献４】Ｄｉｅｚ−Ｆｒｅｉｒｅら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎ．２７（２００６）：１２−１９
【非特許文献５】Ｋａｔｏｖｉｃｈら、Ｅｘｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９０（３）（２００５）：２９９−３０５
【非特許文献６】Ｈｕｅｎｔｅｌｍａｎ  Ｍ．“ＨＩＶ−１  ｂａｓｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ    ｔｈｅ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍ［心血管系への遺伝子導入のためのＨＩＶ−１ベースのウイルスベクターの開発］”（２００３）（学位論文）
【非特許文献７】Ｋｕｂａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃ．６（２００６）：２７１−２７６
【非特許文献８】Ｈｕｅｎｔｅｌｍａｎら、Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １２２（２００４）：６１−６７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目標は、線維症および肝疾患をもたらす発症を予防し、その進行を抑制し、線維症および肝疾患を治療することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
そこで本発明は、肝疾患もしくは線維症の治療または予防のためのタンパク質またはこのタンパク質をコードする核酸に関する。この場合、タンパク質はＡＣＥ２である。また本発明は肝疾患もしくは線維症の治療または予防のための医薬組成物を製造するためのＡＣＥ２タンパク質またはＡＣＥ２コード核酸の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＢＤＬ（胆管結紮）の２１日後にシリウスレッド染色（左）およびｍＲＮＡアッセイ（右）により測定された野生型およびＡＣＥ２ノックアウトマウスの肝臓のコラーゲン形成を対照群と比較して表す図である。
【図２】ＢＤＬの２１日後の野生型マウスおよびＡＣＥ２ノックアウトマウスの肝臓の肝組織のＳＭＡ（平滑筋アクチン）含量（Ａ）およびそのｍＲＮＡ（Ｂ）の測定を対照群と比較して表す図である。
【図３】ＢＤＬの２１日後の野生型マウスおよびＡＣＥ２ノックアウトマウスの肝臓の肝組織のＳＭＡ含量（Ａ）およびそのｍＲＮＡ（Ｂ）の測定を対照群と比較して表す図である。
【図４】野生型マウスのＢＤＬモデル：未処置の野生型マウスおよびＡＣＥ２処置を行った野生型マウスの血清試料中のＡＬＴ（アラニンアミノ基転移酵素）含量の測定を表す図である。
【図５】ＡＣＥ２処置による機能性ＲＡＳ（レニン・アンギオテンシン系）の回復の概略図である。赤い（＋）矢印は過度の免疫活性の効果を示し、青い（−）矢印はＡＣＥ２治療に基づく変化を表す。
【図６】１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（Ａ）、ＩＦＮ−γ（Ｂ）またはＴＮＦ−α（Ｃ）と共に４８時間のインキュベートした後のＶｅｒｏ  Ｅ６細胞調製物のＡＣＥ２特異的ＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取器）分析を無刺激の対照群（右側にピークがある赤い曲線）および対照系列（左側にピークがある黒い曲線）と比較して表す図である。
【図７】ＡＣＥ２なし（左側の黒いバー）またはＡＣＥ２（中央の灰色のバー）またはＡＣＥ２とＡｎｇＩＩ（右側の青いバー）の存在下でＬＰＳ、ＰＨＡおよびＬＰＳ＋ＰＨＡによる刺激の１６時間後のＰＢＭＣ培養上清中のＴＮＦ−αの測定を表す図である。
【図８】ブタのＬＰＳ（リポ多糖）誘導敗血症モデルで測定されたＡｎｇＩＩ濃度を表す図である。青い曲線：ＡＰＮ０１（ｒＡＣＥ２）処置動物、灰色の曲線：プラセボ処置動物、灰色の曲線（黒い点）：ＡＰＮ０１投与後の健康な動物。
【図９】マウス、ブタおよびアカゲザルで測定されたＡＣＥ２活性を表す図である。
【図１０】ブタのＬＰＳ誘導敗血症モデルでのＴＮＦ−α血清濃度を表す図である。ＡＣＥ２処置動物を青で、プラセボ処置動物を灰色で示した。ＴＮＦ−α濃度は処置開始時のそれぞれの出発値（１００％）に対して標準化した。
【図１１】ブタの胎便吸引誘導ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）モデルのＴＮＦ−α血清濃度を表す図である。ＡＣＥ２処置動物を青で、プラセボ処置動物を灰色で示した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、レニン・アンギオテンシン系が種々の器質病の病理的経過に対して決定的な影響を及ぼし、治療のためのＡＣＥ２投与によるこの系の不活性化は急性症状を緩和し、また慢性症状を治癒しうることを初めて示した。本発明によれば特に進行性の肝線維症モデルの場合に、線維症に起因する肝臓の臓器機能不全の発症に元来関与するとされた星細胞の活性化を完全に阻止できたことをここで特に強調しなければならない。こうして、発症を停止し、むしろ逆転することができた。本発明によれば、病理的経過の類似性に基づき、この知見は多数の線維性疾患に適用することができる。
【００２０】
アンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）は、膜結合糖タンパク質として種々の臓器、例えば心臓、腎臓、肝臓および肺、さらには血管にも発現されるレニン・アンギオテンシン・アルドステロン系の必須酵素である。ＡＣＥ２は１９９７年にＡＣＥ相同酵素として発見された（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＢＡＢ４０３７０、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＢ０４６５６９の配列を有する核酸によりコードされる）。当初はこれはＡＣＥと同じ酵素活性を有すると考えられた（米国特許ＵＳ６，９８９，３６３）。後に初めてＡＣＥ２がＡＣＥとまったく別の作用メカニズム、むしろ拮抗的な機能を有することが発見された（国際公開ＷＯ２００４／０００３６７）。ＡＣＥ２は著しく異なる選択性と活性を有する多数のペプチド基質を分解するカルボキシペプチダーゼである。またＡＣＥ２はＳＡＲＳコロナウイルスの細胞結合パートナーである。従ってＡＣＥ２のダウンレギュレーションまたはウイルス受容体をブロックするためのＡＣＥ２の投与はＡＣＥ２提示細胞の感受性を減少させる（国際公開ＷＯ２００６／１２２８１９）。ＡＣＥ２についての上記の機能はとりわけＡｎｇＩＩからＡｎｇ１−７への変換であり、その場合この反応の基質と生成物は拮抗的性質を有する。ＡｎｇＩＩは基本的に血管収縮および血圧上昇の作用がある。Ａｎｇ１−７は血管拡張の作用があり、腎臓、肺および心疾患で保護効果を有する（国際公開ＷＯ２００４／０００３６７）。さらにＡＣＥ２生成物であるＡｎｇ１−７はＡＣＥ、すなわちＡｎｇＩＩの産生に決定的に関与する酵素を相当程度に阻害する。レニン・アンギオテンシン系は肝疾患、特に肝線維症の病理において重要な役割を果たす。ＡｎｇＩＩの存在は肝臓の星細胞（ＨＳＣ、ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌ）での前線維原性効果に関与している。慢性ＨＣＶ（Ｃ形肝炎ウイルス）感染を患う患者でＡＣＥ２の発現と活性が増加することが示されている。これは一見したところ保護機構であるが、しかし臓器の再生を開始するには十分でない。従ってＡＣＥ２活性を高めることが望ましい。
【００２１】
本発明によれば、線維症の形成を阻止することにより線維症を予防し、または線維症の増悪を阻止することにより治癒過程を促進することができる。従ってＡＣＥ２またはＡＣＥ２コード核酸により予防的治療が可能である。但しこのような予防的治療は絶対的意味で解すべきでなく、単に線維症の発生の危険が低減され、または線維症の症状もしくは発症する線維症の強さが緩和されるにすぎないことを理解すべきである。特に本発明は線維症または肝疾患の進行の治療または予防に関する。予防的適用は特に高い確率で線維症または肝疾患が発症するリスクを抱えた患者（健康な個体と比較して）、例えばアルコール嗜癖者またはＣ型肝炎感染患者で有意義である。
【００２２】
好ましい実施形態では線維症は組織または器官の局所的線維症である。このような器官特異的線維症は肝線維症、肺線維症、結合組織線維症、特に筋隔膜の線維症、腎線維症および例えば炎症を併発した皮膚の線維症（強皮症）である。好ましくは、線維症は内臓、例えば肝臓、腎臓、肺臓、心臓、胃、腸、膵臓、腺、筋ならびに腱および靱帯または関節の軟骨の線維症である。線維症の特殊な形態は嚢胞性線維症またはリウマチ性線維症である。
【００２３】
好ましくは、線維症は細胞外マトリックスの成分、特にタンパク質、例えばコラーゲンの過度の沈着に原因があるとされる。コラーゲンは結合組織、特に細胞外マトリックスの構造タンパク質である。特にＳＭＡ（ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ［平滑筋アクチン］）マーカーを組み合わせたコラーゲン形成は線維症の進行と直接相関する。本発明に基づきＡＣＥ２によるコラーゲン沈着の特に効果的な阻止が観察された。
【００２４】
さらに、一般的メカニズムに基づき、慢性線維症の治療も可能である。特に機械的もしくは化学的細胞障害または組織障害もしくは創傷、癌または腫瘍、特に病原体、例えばウイルス、細菌または真菌の感染、臓器移植を含む移植物ならびに薬物により線維症を引き起こすことが可能である。感染は例えば臓器特異的であり、例えば肝炎ウイルス感染、特にＣ型肝炎ウイルスによる感染がある。本発明に基づきＡＣＥ２またはＡＣＥ２コード核酸で治療することができるその他の好ましい線維性の疾患は、例えば一次性または二次性線維症、特に自己免疫反応によって引き起こされる線維症、オーモンド病、後腹膜線維症である。
【００２５】
肝臓は極めて代謝活性の高い、再生力の高い臓器であって、高レベルの障害があってもなお新たな肝細胞を形成して再生することができる。肝疾患においては、強さによっては強力な組織新生が起こるが、その際、線維性組織の形成の大きなリスクもある。そこでＡＣＥ２またはＡＣＥ２コード核酸のこうした適用は、肝疾患の治療のため、特に副次的効果または主適応として線維性症状を予防または治療するために適している。さらに、肝機能の指標であるＡＬＴ（アラニンアミノ基転移酵素）がＡＣＥ２治療により著しく低められることを示すことができた。従って本発明は、特に肝疾患における肝機能の回復または保護に適している。具体的な実施形態では、肝疾患は肝障害または肝細胞障害に関連する。
【００２６】
特定の実施形態で、例えば肝炎（炎症性肝疾患）の場合、線維症または肝疾患は炎症を伴って現れる。種々の臓器もしくは組織の炎症または感染はしばしば、少なくとも一部分でよく治癒せず、線維性組織の形成をもたらすこともある。炎症反応は、防御細胞が感染源に向かっていき、そこで原因の除去を保証する過程である。この炎症は感染によって引き起こされることがある。この場合様々な中間物質が放出され、それが除去に寄与するが、炎症症状も生じる。反応の調節不全の場合はこの症状が重大な障害を引き起こし、または一般に疾病の発生源となる。例えば臓器移植の場合、炎症が人為的に引き起こされることもあり、それが結局外来性の臓器に対する拒絶反応を招くことになる。また炎症は特定の薬物により副作用として引き起こされることがある。
【００２７】
ＡＣＥ２の発現は種々の刺激によって制御される。ところがＡＣＥ２は炎症性サイトカイン、例えばＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−４の出現によりダウンレギュレーションされ、その結果種々の疾患と、対応する区画のＡｎｇＩＩの蓄積および開始された免疫応答の増強をもたらすことが判明した。サイトカインは基本的に免疫系の種々の細胞種の連絡に役立つ。通常、発生期の炎症の最初の段階の１つは、抗原物質が抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって受領され、異物として区分されることである。その結果、当該ＡＰＣによる炎症性サイトカインの最初の排除が起こり、ＡＰＣはこうして免疫系のその他の細胞に警告する。このメカニズムは免疫応答が実際に適正であるときだけこれを開始し、抗原物質が中和されたときは、遮断するように、高度に調節され制御されている。それでもこの開始された免疫応答が制御を失い、自分の生体に矛先を向けるようなことが起こることがある。例えば種々の腎臓、心臓および肺疾患でＡｎｇＩＩの蓄積は進行性の炎症、さらには免疫系の細胞による当該組織への浸潤の増大、その結果免疫応答の過剰をもたらす。ところがこの場合、キーポジションは常に刺激に対する反応としての細胞免疫応答であり、この免疫応答は増強される増幅カスケードで異物を中和するという基本目的をはるかに超過遂行し、その結果生体を損傷する。
【００２８】
初期の免疫応答の第１段階はサイトカインの形の炎症性シグナルの送出である。これらの主要な代表は例えばＩＬ−４、ＩＦＮ−γまたはＴＦＮ−αである。免疫細胞の刺激の後のこのサイトカイン発現を抑制しまたは弱める性質を有する物質は、過度の免疫応答の減衰のために役立つ治療薬である。ＡＣＥ２発現は細胞レベルでの炎症性サイトカインの存在下で著しく減少し、その結果とりわけＡｎｇＩＩが蓄積し、Ａｎｇ１−７が減少し、このためＡｎｇＩＩ新生の低下が起こらないことによって、炎症の増強をもたらす。こうして著しく増加するＡｎｇＩＩ濃度がＡｎｇＩＩの激しい炎症性に基づき炎症の一層の増強を促し、その結果ＡＣＥ２発現のさらに著しい減衰をもたらす。この悪循環を抜け出すために、本発明に基づきＡＣＥ２が治療薬として投与され、こうしてＡｎｇＩＩの蓄積が予防され、それとともに炎症が抑制される。すなわちＡＣＥ２は高いＡｎｇＩＩ力価を直接的に低下させ、それがＡｎｇＩＩにより持続的に昂進する炎症を弱める。Ａｎｇ１−７が再産生され、その抗炎症作用により同じく炎症を弱める。さらにＡｎｇ１−７は、ＡＣＥを阻害する性質により、続くＡｎｇＩＩの産生を制限する。炎症の減退は放出されたサイトカインを正常レベルに戻し、再び内因性ＡＣＥ２発現を生じさせ、それが持続的にＡｎｇＩＩの分解とＡｎｇ１−７の形成を引き起こし、再び安定した機能的ＲＡＳ（レニン・アンギオテンシン系）をもたらす。その結果、再びＲＡＳの作用成分の自己調節的な安定した平衡が生じる。そこで免疫系の原初的刺激が中和されたときは、再度のＡＣＥ２投与を完全に省略することができる。上記のメカニズムの概略図を図５に示す。ＡＣＥ２の投与によって、増強する炎症からの抜け道が作り出される。
【００２９】
実施例に示したデータから、免疫調節因子としてのＡＣＥ２の効果について次のように推論することができる。抗原刺激に基づき、炎症性サイトカインの放出が起こる。炎症性サイトカインの存在下でＡＣＥ２発現の欠失が起こる。ＡＣＥ２が不在であれば、ＡｎｇＩＩがＡＣＥ２によって分解されることがないため、前炎症性ペプチドＡｎｇＩＩが蓄積する。ＡＣＥ２の不在で、前炎症性サイトカイン、ＴＮＦ−αも蓄積する。ＡＣＥ２は抗炎症性を有し、リンパ球で炎症性サイトカインの発現を減少させる。従って治療のためのＡＣＥ２投与は失われた内因性ＡＣＥ２発現を補償し、ＡｎｇＩＩ力価の低下、Ａｎｇ１−７の形成およびその他の効果によって初期の炎症を阻止することができる。治療のためのＡＣＥ２投与は、連続的ＬＰＳ（リポ多糖）輸液による重症敗血症の場合でもＡｎｇＩＩ力価を再び健常者のレベルに引き下げ、それに応じてＲＡＳの調節を再び回復することを可能にする。また治療のためのＡＣＥ２投与は、連続的ＬＰＳ輸液による重症敗血症の場合にＴＮＦ−α力価を再び健常者のレベルに引き下げることを可能にする。胎便吸引による広範囲な機械的肺障害の場合にも、同じ効果を観察することができた。
【００３０】
好ましくはタンパク質は組換えＡＣＥ２である。ＡＣＥ２配列はよく知られており、ＡＣＥ２をコードする適当なベクターを発現系、特に真核生物発現系に導入することにより問題なく産生することができる。このような系は例えば哺乳動物細胞株、例えばＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞およびＮＳＯマウス細胞または昆虫細胞、例えばＳｆ９である。このようなベクターは発現のために特定の細胞特異的または一般的なプロモータを有することができる。
【００３１】
タンパク質（ＡＣＥ２核酸もコードする）は特に膜ドメインのない水溶性ＡＣＥ２であることが好ましい。ヒトＡＣＥ２配列は配列番号１によって示される。すなわち：
0005706163.tif 000002
その場合オートロガス・シグナル配列（下線を付す）が宿主細胞によって除去のために切断される。従って本発明に基づくＡＣＥ２タンパク質は好ましくは配列番号１の１８位以下に相当するＡＣＥ２配列を含む。別の実施形態ではＡＣＥ２ポリペプチドは膜貫通ドメインをもたない。この膜貫通ドメインは配列番号１のＣ末端にある。従ってその場合は可溶性ＡＣＥ２となる。特に好ましい実施形態は、アミノ酸からなるポリペプチド鎖がアミノ酸７４０位までの配列番号１またはその酵素活性フラグメントを含む可溶性ＡＣＥ２ポリペプチドを包含する。別の可溶性ＡＣＥ２タンパク質は配列番号１のアミノ酸１８〜６１５からなる。
【００３２】
タンパク質の可溶性はそのアミノ酸配列だけでなく、そのフォールディングおよび翻訳後修飾によっても決まる。タンパク質の可溶性を決定的に高め、その薬理的特性に影響するのはとりわけ荷電した糖構造である。ＡＣＥ２の可溶性断片は７個のＮ−グリコシル化部位を含む。可能なＮ−グリコシル化部位の少なくとも８０％がグリコシル化され、かつ／またはＡＣＥ２タンパク質が１０％以上（全ＡＣＥ２の重量％）または１１％、１２％、１３％、１４％、好ましくは１５％以上または１６％、１７％、１８％、１９％、特に２０％以上または２１％、２２％、２３％、２４％または２５％の糖分を有することが好ましい。
【００３３】
ヒトＡＣＥ２はたいていの実施形態に好ましいが、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、霊長類またはウシのＡＣＥ２も可能である。ＡＣＥ２は同じ基質ＡｎｇＩＩを持つすべての哺乳動物に普遍的な酵素である。従って異種の生体でも使用することができる。こうして本発明に基づくタンパク質（またはその核酸）によってＡＣＥ２の供給源に関係なく、例えばヒト、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、霊長類またはウシを治療することができる。
【００３４】
本発明に基づき、ＡＣＥ２タンパク質またはＡＣＥ２コード核酸を含む医薬組成物を提供することができる。このような組成物は製薬上好適なその塩、さらに緩衝剤、張性成分または製薬上好適なビヒクルを含むことができる。特にＡＣＥ２核酸を適当な治療用ベクター系に設けることができる。
【００３５】
製薬用ビヒクルは組成物の優れた適合性に役立ち、作用物質の良好な可溶性および良好なバイオアベイラビリティーを可能にする。その例は乳化剤、増粘剤、酸化還元成分、デンプン、アルコール溶液、ポリエチレングリコールまたは脂質である。適当な製薬用ビヒクルの選択は投与の仕方に大いに左右される。経口的投与には液体または固体のビヒクルを使用することができ、注射には液体の最終組成物が必要である。
【００３６】
本発明に基づき使用される薬物は、緩衝物質または張性物質を含むことが好ましい。緩衝剤によって薬物のｐＨ値を生理的条件に合わせて調整することができ、さらにｐＨの変動を弱めまたは緩衝することができる。その一例はリン酸緩衝剤である。張性物質は容量オスモル濃度の調整のために役立ち、イオン性物質、例えば無機塩、例えばＮａＣｌまたは非イオン性物質、例えばグリセリンまたは炭水化物を含むことができる。
【００３７】
本発明に基づき使用される組成物は全身的、局所的、経口的または鼻腔内投与に適合するように調製することが好ましい。本発明の薬物のこれらの投与形態は迅速かつ簡単な吸収を可能にする。経口的投与のために例えば固体または液体の薬物を直接に、または溶解または希釈して服用することができる。
【００３８】
本発明に基づき使用される薬物はとりわけ静脈内、動脈内、筋肉内、脈管内、腹腔内または皮下投与に適合するように調製される。このために例えば注射または輸液が適している。血行路への直接の投与は、薬物の作用物質が全身に配分され、目標組織に迅速に到達するという利点がある。
【００３９】
本発明を下記の図および実施例により説明する。但しこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
実施例１：肝線維症モデル、肝線維症でのＡＣＥ２の意義
ＡＣＥ２ノックアウトマウスおよびＡＣＥ２野生型マウスを胆管結紮（Ｂｉｌｅ  Ｄｕｃｔ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ，ＢＤＬ）の２１日後に評価し、偽処置対照群と比較した。肝臓の病理学的研究は、ＢＤＬを施した動物でコラーゲン沈着の著しい増加を示した（図１）。肝組織のコラーゲン沈着はシリウスレッドによる特異的染色で調べたが、驚くべきことにＡＣＥ２ノックアウト動物では野生型群の２．５倍であった（図１）。肝臓のコラーゲン産生細胞の数はＳＭＡ（活性化星細胞のマーカー）の測定であるウエスタンブロット法およびｍＲＮＡ測定により決定した。図２はＡＣＥ２活性の欠如と肝障害の関連を表し、コラーゲン産生細胞の数が著しく高くなっていることをはっきり示す。
【００４１】
この試験が示すところでは、損傷した肝臓ではＡＣＥ２の不在とコラーゲン沈着の間に相関がある。コラーゲン沈着は進行性肝障害の重要な病理的症状である。
【００４２】
実施例２：治療モデル
第２の試験では野生型マウスにＢＤＬを行った後、組換えＡＣＥ２を２ｍｇ／ｋｇのボーラス注射として毎日、１４日にわたり静脈内に投与した。これらの動物もやはり処置の終了後に、生理食塩液だけを投与された対照群と比較した。図３は、野生型動物の組織のＳＭＡ濃度および損傷した肝組織のコラーゲン産生細胞の数が極めて著しく増加するが、ＡＣＥ２処置マウスの肝臓のＳＭＡはウエスタンブロット法で検出不能であったことを非常に明瞭に示している。ＳＭＡのｍＲＮＡの分析はこの結果を確認する。図４に調べた各群の実験終了時のＡＬＴ血清濃度を示す。この場合もＡＣＥ２処置群のＡＬＴが低い濃度になっていることを示すことができた。
【００４３】
２つの研究は、ＡＣＥ２活性の減少が肝症状の増悪をもたらすことを非常に明瞭に示す。より高いＡＣＥ２活性はコラーゲン産生細胞の数と組織のコラーゲン蓄積を減少させる。また組換え可溶性ＡＣＥ２の全身投与による治療効果が確認された。
【００４４】
実施例３：炎症性サイトカインの存在下でのＡＣＥ２発現の欠失
腎細胞株（Ｃｅｒｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ）Ｖｅｒｏ  Ｅ６は通常の培養条件でＡＣＥ２を膜結合糖タンパク質として発現する。Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞を１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、ＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αと共に２４時間インキュベートし、ポリクロナールＡＣＥ２特異的ヤギ抗体およびヤギ特異的ＦＩＴＣ標識抗体を使用してＡＣＥ２表面発現に関する変化をＦＡＣＳ分析法により分析した。図６にそれぞれのヒストグラムを示す。当該分析を表１にまとめた。ＩＬ−４、ＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αとのインキュベートでＡＣＥ２発現が著しく低減された。刺激しない細胞で５１±３％のＡＣＥ２陽性が測定されたが、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α刺激の後にＡＣＥ２陽性がそれぞれ２８±２、２２±１および３９±２％に引き下げられた（図６）。
【表１】
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【００４５】
実施例４：ＰＢＭＣの免疫活性の減衰
本実施例では、刺激したＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）のサイトカイン発現に対するＡＣＥ２の効果を示す。種々のリンパ球の協動を可能にするために、ＰＢＭＣ調製物およびドナーの全リンパ球スペクトルを試験に使用した。健康なドナーから全血を採取し、それに含まれるＰＢＭＣを遠心して分離した。この細胞をその後、強力な免疫原性物質、例えばリポ多糖（ＬＰＳ、１００ｎｇ／ｍｌ）および植物性血球凝集素（ＰＨＡ、２０μｇ／ｍｌ）ならびに両物質の組合せを用いて、ＡｎｇＩＩ、ＡＣＥ２およびＡＣＥ２＋ＡｎｇＩＩの存在下で刺激し、３７℃で１６時間インキュベートした。上清をＴＮＦ−αについて調べ、ＡＣＥ２およびＲＡＳのペプチドの不在で行なった対照試験と比較した。この試験の結果を図７にグラフで示す。すなわちＬＰＳおよびＰＨＡとのインキュベーションはすべての場合にＴＮＦ−αの分泌を誘導した。ＡＣＥ２なしで共インキュベートした各対照試験は、それぞれＬＰＳ、ＰＨＡおよび組み合わせによる刺激の後に極めて高いＴＮＦ−α濃度を示した（２０３、３５２および２７８ｍＯＤ）。ＡＣＥ２の存在下では、すべてのグループで、測定されたシグナルが著しく小さく、各グループで１８１、２６６、２２３のｍＯＤ値にしかならなかった。ところがＡＣＥ２とＡｎｇＩＩの存在下では、測定されたＴＮＦ−α濃度が最小であり、ｍＯＤ１４４、２４７および１８７にしかならなかった。これらの結果が示すところでは、ＡＣＥ２の存在は、刺激のために特に免疫原性の物質、例えばＬＰＳまたはＰＨＡを使用しても、炎症性サイトカインの著しく弱められた産生をもたらす。このことはＡＣＥ２の抗炎症効果を実証する。意外なことにこのメカニズムはＡｎｇＩＩの存在なしですでに機能し、その存在下で強化される。このことは二重因子を示唆している。効果の一部分はＡｎｇＩＩおよびその分解産物Ａｎｇ１−７によってもたらされ、別の一部分は明らかに他のＡＣＥ２基質の１つの分解によって機能し、現存するＡｎｇＩＩには無関係である（図７）。
【００４６】
実施例５：健康な生体のＡｎｇＩＩ力価の回復
本実施例では、外因性ＡＣＥ２投与がいかにして脱調節ＲＡＳを再び制御のもとに置くかを示した。そのためにＡＰＮ０１（組換え可溶性ヒトＡＣＥ２）をＬＰＳ投与により誘導された敗血症モデルに投与した。−１２０分の時点から動物にＬＰＳを連続的に輸液し、それが広範囲な炎症とその結果敗血症をもたらした。炎症性サイトカインの大量の放出に基づき、ＡＣＥ２発現の遮断が起こり、その結果炎症性ペプチドＡｎｇＩＩの蓄積が生じた（図８を参照）。
【００４７】
０分の時点から４００μｇ／ｋｇの用量のＡＰＮ０１をボーラスとして静脈内に投与した。処置群で直ちにＡｎｇＩＩの減少が起こり、ＡｎｇＩＩ力価はその後の１時間の間に、健康な動物で測定されたのと同じレベルに再び納まった。また健康な動物で同じ用量のＡＰＮ０１投与はＡｎｇＩＩ力価の短時間の低下をもたらし、このＡｎｇＩＩ力価もその後の１時間の後に再び健康な動物の値に近づいた。これに対してプラセボ処置動物は実験の終りまでさらに上昇するＡｎｇＩＩ値を示した。この驚くべき現象はアップレギュレーションされたＲＡＳの回復によって説明するしかない。実験の終わりまで依然として活性酵素が動物に全身的に供給されたからである（図９を参照）。約８時間の半減期が測定された。
【００４８】
実施例６：敗血症での炎症性サイトカインの発現の減衰
以下の実施例では、ブタの敗血症モデルで炎症性サイトカインの濃度が急激に増加し、ＡＣＥ２投与の後に再び健康な動物のレベルに逆戻りすることを示す。−１２０分の時点から動物に高用量のＬＰＳを連続的に輸液した。このため広範囲な炎症とその結果敗血症が生じた。炎症性サイトカインの大量の放出に基づきＡＣＥ２発現の遮断が起こり、その結果炎症性ペプチドＡｎｇＩＩだけでなく、炎症性サイトカインＴＮＦ−αの蓄積も生じた（図１０）。０分の時点から動物（処置群の６頭、対照群の５頭）に０．４ｍｇ／ｋｇの用量のＡＣＥ２または緩衝溶液をボーラスとして静脈内に投与した。ＬＰＳを引き続き同じ高用量で連続的に投与する一方で、その後の３時間にわたり動物を観察し、血清試料を採取し、ＴＮＦ−αについて分析した。対照群ではＴＮＦ−α濃度が実験の終りまで引き続き高かったが、ＡＣＥ２処置群では連続的なＬＰＳ投与のもとで１回のＡＣＥ２投与の後にすでにＴＮＦ−α濃度の著しい低下（ｐ＜０．００１）が起こることを示すことができた。広範囲な敗血症にかかわらず、健康な動物で測定されたのとほぼ同じ値に再び到達した。従って非常に侵襲的な敗血症モデルでもＡＣＥ２投与によってＴＮＦ−α発現を健常者のレベルに急速に引き下げ、さらに増強する炎症に歯止めを掛けることができた（図１０）。
【００４９】
実施例７：局所的な機械的肺障害の後の全炎症性サイトカインの発現の減衰
本実施例ではブタの肺障害モデルにおいて炎症性サイトカインの発現に対する全身投与したＡＣＥ２の影響を示した。このプラセボ対照盲験試験で１４頭の動物が検討された。実験の第１段階ですべての動物に２０％胎便溶液の３回の吸引を施し、その際高い血行動態パラメーターに基づきすべての動物に同等な障害が誘導された。実験の第２段階、すなわち処置段階で動物の半数に組換え可溶性ヒトＡＣＥ２を０．４ｍｇ／ｋｇの用量のボーラスとして静脈内に投与した。他方の半数には生理食塩液を与えた。−３０、０、３０、６０、９０および１５０分の時点で血清試料を採取し、この血清試料で最重要の炎症性サイトカインの濃度を測定した。この場合、時点０は処置の開始点であり、このときすべての動物はすでにＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）の症状を示していた。図１１で明かなように、ＴＮＦ−αの血清濃度に対してＡＣＥ２投与の非常に顕著な影響がある。これはプラセボ群で２３０ｎｇ／ｍｌ超から大幅に上昇するが、処置群では投与後３０分以内に４０ｎｇ／ｍｌ以下に低下し、投与後９０分で２５ｎｇ／ｍｌに近づく。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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