(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(１) 配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチドを合成する段階と、
(２) (１)のポリヌクレオチドをピキアパストリス(Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ)由来の発現ベクターに導入する段階と、
(３) 前記組換え発現ベクターで形質転換させた酵母形質転換体を培養する段階と、
(４) 前記(３)段階から培養液を収得する段階と、を含むこと
を特徴とするグリコシル化された活性型の極地酵母由来の結氷防止タンパク質またはこれを含む培養液の生産方法。
【請求項２】
前記(２)段階でピキアパストリス(Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ)由来の発現ベクターは、ｐＰＩＣＺαＡであることを特徴とする請求項１に記載の生産方法。
【請求項３】
前記(３)段階の組換え発現ベクターは、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｘ３３／Ｍｕｔ＋／ｐＰＩＣＺａＡ−ＡＹ３０株（受託番号：ＫＣＴＣ１１９１７ＢＰ）が有するｐＰＩＣＺαＡ−ＡＹ３０であることを特徴とする請求項１に記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、北極酵母由来の結氷防止タンパク質の大量生産方法に関し、より詳しくは、ロイコスポリジウム属(Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐ.)の極地酵母由来の結氷防止タンパク質をコードする遺伝子を酵母発現システムに最適化して変形させた組換えポリヌクレオチドを合成し、これを酵母発現システムを利用して発現させる結氷防止タンパク質の大量生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
極地生物体は、低温の極地環境で生きて行くために、減った酵素活性、減った生体膜流動性、タンパク質の不活性化及び誤った折り畳み、細胞内での氷結晶形成などのような問題点を克服しなければならない。この中でも氷結晶の生成は、氷結晶の成長による物理的な損傷と組職の脱水現象を誘発して極地生物体に深刻な損傷を与える。極地生物体は、低い温度で生きて行くために、多様な結氷防止タンパク質(Ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ ｐｒｏｔｅｉｎ：以下、「ＡＦＰ」という)を生産する。ＡＦＰは、生体内での氷結晶の成長及び再結晶を抑制する機能を通じて零下の温度でも極地の生物体を保護して生きて行くことができるようにする(Ｄａｖｉｅｓ, Ｐ. Ｌ. ａｎｄ Ｓｙｋｅｓ, Ｂ. Ｄ., Ｃｕｒｒ.Ｏｐｉｎ.Ｓｔｒｕｃｔ.Ｂｉｏｌ.７, １９９７, ８２８−８３４; Ｄａｖｉｅｓ,Ｐ. Ｌ. ｅｔ ａｌ., Ｐｈｉｌｏｓ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄ Ｂ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ.３５７, ２００２, ９２７−９３５; Ｄ'Ａｍｉｃｏ, Ｓ. ｅｔａｌ., ＥＭＢＯ Ｒｅｐ.７, ２００６, ３８５−３８９)。
【０００３】
一般的に、ＡＦＰは平たい氷結合部位を有して氷結晶の特定面に結合して氷結晶の成長と再結晶化を抑制する特徴を有するタンパク質として、氷に結合して融点と氷点の差を作る。これを温度｛おんど｝ヒステリシス(ＴＨ：ｔｈｅｒｍａｌｈｙｓｔｅｒｅｓｉｓ)と言い、ナノリットル浸透圧計(ｎａｎｏｌｉｔｅｒｏｓｍｏｍｅｔｅｒ)を用いて測定することができ、ＡＦＰの活性を測定する指標で使われる。ＡＦＰのまた他の特徴は、自動車に使われる一般不凍液とは異なり濃度に比例して氷点を低めない。すなわち、ＡＦＰは、氷との直接的な相互作用を通じてとても低い濃度でも効果的に氷点を低めることができ、これにより、生体内で凍結過程中に発生する浸透圧による損傷を最小化することができる(Ｊｉａ, Ｚ. ａｎｄＤａｖｉｅｓ Ｐ.Ｌ., Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｓｃｉ. ２７, ２００２,１０１−１０６)。
【０００４】
氷結晶の成長を防止して再結晶化を抑制するＡＦＰの独特の特性は、商業的な分野で多様に利用されている。例えば、農業分野では、作物の冷害を防止する目的で作物内でのＡＦＰ発現を試みており、漁業分野では、商業的に有用な大西洋サケ(Ａｔｌａｎｔｉｃ ｓａｌｍｏｎ：Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ)あるいは金魚(ｇｏｌｄｆｉｓｈ：Ｃａｒａｓｓｉｕｓ ａｕｒａｔｕｓ)のような魚にＡＦＰを発現させた形質転換魚を作って寒い地域でも養殖ができるようにする試みが進行されている。また、医学分野では、凍結手術(ｃｒｙｏｓｕｒｇｅｒｙ)と血液、幹細胞、臍帯血、臓器、生殖細胞の冷凍保存液の添加物としてＡＦＰ使用に対する研究が進行されている。そして、食品分野でも一層ソフトな質感のアイスクリーム冷凍保管のための製品生産に使われている。化粧品分野では、凍傷予防のためにＡＦＰが添加された機能性化粧品がもう販売されている。このように商業的な活用度が高くて有用なＡＦＰであるが、低い発現水準と折り畳み問題のため、今までは組換えＡＦＰの大量生産には限界があった。その主な理由は、大部分のＡＦＰがジスルフィド結合｛けつごう｝(ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏｎｄ)を有し、ジスルフィド結合｛けつごう｝により安定化されるので、組換えタンパク質の発現が難しくて、また、発現されたタンパク質の正確な折り畳みを探しにくいからである。
【０００５】
最初で冷たい海に生息する魚からＡＦＰが発見された以後、昆虫、植物、かび類、微生物から多様な種類の新しいＡＦＰが発見されている。最近には、ロイコスポリジウム属の極地酵母由来の新しいＡＹ３０ＡＦＰが発見された。ＡＹ３０ ＡＦＰは、一つのシステイン(ｃｙｓｔｅｉｎｅ)アミノ酸残基も有していないので、組換えタンパク質を製作したとき、タンパク質の発現量が多くて誤形成されたジスルフィド結合による折り畳み問題が発生しない長所があって組換えＡＦＰの大量生産に適する。
それで、本発明者らは、極地酵母から由来したＡＦＰを活性型のタンパク質形態で過発見させて大量で生産するために、酵母発現システムに最適化されたコドン(ｃｏｄｏｎ)で発現されるようにＡＦＰ遺伝子を変形させた組換えヌクレオチドを合成しこれを酵母由来の発現ベクターに挿入して培養した結果、過量の組換えＡＦＰを収得した。このようなＡＦＰは、グリコシル化(ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ)されている事実を確認して、本発明を完成した。本明細書に記載された参照文献は、その全体として本明細書に含まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明は上述したような従来技術の問題点を解決するためになされたもので、その目的は、産業的に有用な活性型のＡＦＰを大量に収得することができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述の目的を達成するために本発明は、ロイコスポリジウム属の極地酵母由来のＡＦＰをコードする遺伝子を酵母発現システムに最適化して変形させた組換えポリヌクレオチドを合成し、これを酵母発現システムを利用して発現させるＡＦＰの大量生産方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明による組換えＡＹ３０ＡＦＰの生産方法によれば、自然型ＡＦＰと類似な活性を有するＡＦＰを大量に収得することができ、このような組換えＡＹ３０ ＡＦＰまたはこれを含む培養液は、医療、軍需、冷凍食品産業及び冷害防止農作物貯蔵法などの産業で非常に多様に結氷防止用添加剤で有用に利用されることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明による組換え極地酵母由来の結氷防止タンパク質を発現する組換えベクターの制限酵素地図である。
【図２】図２は、ロイコスポリジウム属(Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐ.)のＡＹ３０結氷防止タンパク質のＤＮＡ配列と本発明によるコドン最適化作業の結果から得られた組換えポリヌクレオチド配列(Ｓｙｎ＿ＡＹ３０)との対応(ａｌｉｇｎｍｅｎｔ)配列を示す。
【図３】図３は、本発明による形質転換体を培養した結果で培養された細胞の量を示したグラフとして、培養時間の経過による光学密度(ＯＤ)を示す。
【図４】図４は、本発明による形質転換体を培養した結果で培養された細胞の量を示したグラフとして、細胞乾燥重量(ＤＣＷ)を示す。
【図５】図５は、本発明による形質転換体を培養した結果で得られた培養液の総タンパク質含量を測定した結果を示したグラフである。
【図６】図６は、培養温度による組換えＡＹ３０結氷防止タンパク質の発現様相を比較した写真として、３０℃での発現様相を示す。
【図７】図７は、培養温度による組換えＡＹ３０結氷防止タンパク質の発現様相を比較した写真として、２５℃での発現様相を示す。
【図８】図８は、培養温度による組換えＡＹ３０結氷防止タンパク質の発現様相を比較した写真として、２０℃での発現様相を示す。
【図９】図９は、組換えＡＹ３０結氷防止タンパク質がクマシー染色(ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ)を通じてグリコシル化されたか否かを確認した写真である。
【図１０】図１０は、 組換えＡＹ３０結氷防止タンパク質がＰＡＳ染色(ＰＡＳ ｓｔａｉｎｉｎｇ)を通じてグリコシル化されたか否かを確認した写真である。(１：自然型(ｎａｔｉｖｅ)ＡＹ３０結氷防止タンパク質; ２及び３：バクテリア発現システムで生産された(Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ)組換えＡＹ３０結氷防止タンパク質;  ４：ピキアパストリス(Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ)発現システムで生産された組換えＡＹ３０結氷防止タンパク質)
【図１１】図１１は、ＡＦＰの抗体(ａｎｔｉｂｏｄｙ)を利用したウェスタンブロット(ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ)実験結果を示す(１：自然型ＡＹ３０結氷防止タンパク質；２及び３：バクテリア発現システムで生産された組換えＡＹ３０結氷防止タンパク質；４：ピキアパストリス(Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ)発現システムで生産された組換えＡＹ３０結氷防止タンパク質)
【図１２】図１２は、本発明による組換えＡＹ３０結氷防止タンパク質が氷結晶の成長を抑制している形態をオスモメターナノメートル機器で観察した写真として、３０℃で培養して収得した組換えＡＹ３０結氷防止タンパク質である。
【図１３】図１３は、本発明による組換えＡＹ３０結氷防止タンパク質が氷結晶の成長を抑制している形態をオスモメターナノメートル機器で観察した写真として、２５℃で培養して収得した組換えＡＹ３０結氷防止タンパク質である。
【図１４】図１４は、培養温度条件別に結氷防止活性を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、ロイコスポリジウム属の極地酵母由来のＡＹ３０ ＡＦＰまたはこれを含む培養液を大量で生産する方法を提供する。前記方法は、(１) ロイコスポリジウム属の極地酵母由来ＡＹ３０ ＡＦＰをコードする遺伝子を酵母発現システムに最適化して変形させた組換えポリヌクレオチドを合成する段階; (２) (１)の組換えポリヌクレオチドを酵母由来の発現ベクターに導入する段階；(３) 前記組換え発現ベクターを含む形質転換体を培養する段階; 及び(４) 前記(３)段階から培養液を収得する段階を含む。
【００１１】
この時、前記(１)段階のロイコスポリジウム属の極地酵母由来のＡＹ３０ ＡＦＰをコードするＤＮＡ配列に対する情報は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ/ＴｒＥＭＢＬ(ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｃ７Ｆ６１０３)に示されており、これを利用して酵母発現システムにあわせるコドンで最適化させた配列番号１の塩基配列を合成する。 
【００１２】
配列番号１の塩基配列は、真核細胞、特に、酵母から発現される場合、グリコシル化されたタンパク質を生産する特徴があるので、活性型のＡＹ３０ＡＦＰを収得することができる。
【００１３】
また、前記(２)段階の酵母由来の発現ベクターは、本発明の技術分野において公知されている酵母由来の発現ベクターを全て利用可能であるが、本発明ではピキアパストリス(Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ)由来の発現ベクターを利用することが好ましくて、より好ましくは、ｐＰＩＣＺαＡを利用する。
【００１４】
具体的に、ｐＰＩＣＺαＡは、アルコール酸化酵素プローモーター(ＡＯＸ：ａｌｃｏｈｏｌｏｘｉｄａｓｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ)を利用して発現を誘導し、培養液で分泌を誘導する信号配列であるα−因子交配信号配列(α−ｆａｃｔｏｒ ｍａｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ)を有しているので、組換えポリヌクレオチドの発現時にＮ−末端に信号配列が連結されるようにして組換えＡＦＰが培養液で分泌する効果がある(図１参照)。
【００１５】
本発明では、配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチをｐＰＩＣＺαＡに挿入して組換え発現ベクターのｐＰＩＣＺαＡ−ＡＹ３０を製作し、これを次のように寄託した。
寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１１９１７ＢＰ
受託日付：２０１１.０４.１５
【００１６】
以後、組換え発現ベクターのｐＰＩＣＺαＡ−ＡＹ３０で酵母菌株を形質変換させた形質変換体を培養して組換えＡＹ３０ ＡＦＰを収得する。この時、宿主酵母では、ピキアパストリスを利用することが好ましくて、具体的には、ｐＰＩＣＺαＡ−ＡＹ３０でピキアパストリス１０３３を形質変換させた形質変換体Ｐ. ｐａｓｔｏｒｉｓ １０３３/Ｍｕｔ＋/ｐＰＩＣＺαＡ−ＡＹ３０を提供する。宿主細胞を形質変換させる方法は、本発明が属する分野において公知されている方法を全て利用することができ、本発明では電気穿孔法を利用する。
【００１７】
形質転換体の培養方法は、本発明が属する分野において通常の知識を有した当業者に公知されている酵母培養方法を全て利用可能である。
本発明では、形質転換体を大量で増殖させた後、組換えＡＹ３０ ＡＦＰの発現を誘導する。
【００１８】
まず、形質転換体を大量で増殖させるために、種培養する段階と、 種培養して得た培養液を醗酵培養のシード(ｓｅｅｄ)で使用する段階と、に分けて細胞培養を進行する。 
具体的に、種培養は、ＹＰＤ培地で振蕩培養し、醗酵培養は、形質転換体の大量増殖のために、グリセロール、ＰＴＭ１Ｔｒａｃｅ Ｓａｌｔｓなどの栄養分を含んだ培地を使用することが好ましい。
【００１９】
培養温度は、１５℃〜３５℃範囲を維持することが好ましくて、２０℃以上の温度を維持するとき培養が最大に進行される。
【００２０】
次に、本発明による形質転換体Ｐ. ｐａｓｔｏｒｉｓ１０３３/Ｍｕｔ＋/ｐＰＩＣＺαＡ−ＡＹ３０は、メタノールにより組換えＡＹ３０ ＡＦＰの発現を始めるので、メタノール流加式培養でＡＦＰの発現を誘導する。
【００２１】
すなわち、醗酵培養で利用された栄養成分であるグリセロールの供給を終了し、グリセロールが全て消耗されて溶存酸素量の水準が増加する時点でメタノールを供給して組換えＡＹ３０ＡＦＰの発現誘導を始める。溶存酸素量の水準を２０％で維持することができない時は、メタノールの供給を中断し、溶存酸素量の水準が増加する時点でメタノールを更に供給する方式で発現誘導を進行する。
【００２２】
本発明による組換えＡＹ３０ ＡＦＰは、Ｎ−末端の信号配列により細胞外に分泌されるので、特に形質転換体を破砕しないで連続培養しながら組換えＡＹ３０ＡＦＰが含有された培養液を継続的に収得することができる長所がある。
【００２３】
また、本発明は、形質転換体Ｐ. ｐａｓｔｏｒｉｓ１０３３/Ｍｕｔ＋/ｐＰＩＣＺαＡ−ＡＹ３０培養液またはそれから分離した組換えＡＹ３０ＡＦＰを添加して一定温度で試料の結氷を防止する方法を提供する。
【００２４】
この時、前記一定温度は、試料あるいは試料を保管するための溶液の氷点より０〜１０℃低い温度を意味し、０〜４℃の低温で試料の結氷が効果的に阻害される。このような温度では、組換えＡＹ３０ＡＦＰが氷の再結晶化とを阻害して試料及び試料保管液の結氷を阻害する。
【００２５】
前記試料は、冷凍食品、薬品、濃化学剤、色素及び生物学的材料などを含む。
この時、冷凍食品では、アイスクリーム、冷凍果物、精肉など低い温度で保管する必要のある全ての冷凍あるいは低温保管食品を含む。
具体的には、アイスクリーム、凍して食べるヨーグルト、アイスブランド、スラリーなどの冷凍デザート類において、ＡＦＰｓは試料の氷点以下の温度で氷再結晶により大きい結晶が生成されることを防止することで、冷凍食品の氷結晶構造を微細に維持して冷凍食品の味と質を向上させる。
【００２６】
また、冷凍果物、冷凍野菜及び精肉などの冷凍あるいは低温保管食品において、ＡＦＰｓは、氷再結晶活性を通じて食品の冷凍時に大きい結晶が形成されて食品の元の状態が破壊されることで冷凍状態であるいは解凍後に摂取する場合食品の味と質が顕著に損傷されることを防止する。
【００２７】
治療薬物、血漿及び組職培養のための哺乳動物細胞などのような生物学的材料では、冷凍と解凍過程により細胞の生存能を大きく減少され、臓器移植時に組職を冷凍させることは、生きている細胞の機能を深刻に損傷させるようになり、植物の冷害は、農業に深刻な問題を発生させるだけではなく、薬物は、厳格な温度条件で保存しなければ、薬効が破壊されるかむしろ危なくなることがある。このような場合、ＡＦＰｓは、氷再結晶阻害活性を通じて生物学的試料が急激な温度変化に抵抗できるようにする。
【００２８】
以下、実施例を通じて本発明を詳しく説明する。しかし、下記実施例は本発明を例示することで、本発明の範囲がこれに限定されなるものではない。
【００２９】
＜実施例１＞組換えポリヌクレオチドの合成及び形質転換体の製作
１−１. 組換えポリヌクレオチドの合成
本発明に使われた極地酵母は、ロイコスポリジウム属のＡＹ３０(Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐ. ＡＹ３０)として、韓国海洋研究院敷設極地研究所(ＫＯＰＲＩ：Ｋｏｒｅａ ＯｃｅａｎＰｏｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ)で北極スヴァールバル群島のＴｖｉｌｌｉｎｇｂｅｎｅｔ湖で分離したものである。
ＡＹ３０ ＡＦＰの全体遺伝子配列(Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ/ＴｒＥＭＢＬ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｃ７Ｆ６１０３)を利用して組換えＡＹ３０ＡＦＰのパキアパストリス(Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ)での円滑な発現のために、ＡＹ３０遺伝子をパキアのコドンで最適化作業を実行した。人工遺伝子合成は、鋳型ＤＮＡなしに人工的に遺伝子を合成する方法として、化学的に合成が可能なオリゴヌクレオチドを利用してこれらの間の配列相同性に基礎した結合で希望するサイズのｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄ ＤＮＡを製造した。具体的には、オーバーラップ延長ＰＣＲ(Ｏｖｅｒｌａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ)方法で人工遺伝子を合成した。基本的な合成手続きは、オリゴヌクレオチドのデザイン及び合成、そしてオーバーラップ延長ＰＣＲを実行した後、クローニングとシークエンシング段階を経て行われた。
その結果、配列目録１の塩基配列を含む組換えポリヌクレオチ配列を製作した。
ＡＹ３０ ＡＦＰ(Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ/ＴｒＥＭＢＬ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｃ７Ｆ６Ｘ３)のＤＮＡ配列と組換えタンパク質発現のためにコドン最適化作業を実行したＤＮＡ配列(Ｓｙｎ＿ＡＹ３０)との対応配列を、図２に示した。
【００３０】
１−２. 組換え発現ベクターの製作
パキアパストリス(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ, Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ, ＣＡ)は、メタノールを栄養分で摂取する酵母菌株Ｘ３３であり、組換えＰ. ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｘ３３/Ｍｕｔ＋(ｍｅｔｈａｎｏｌ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｌｕｓ)菌株のａｌｃｏｈｏｌｏｘｉｄａｓｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ(ＡＯＸ１)を利用してＡＦＰＡＹ３０を大量生産した。
前記１−１で合成した組換えポリヌクレオチド配列をＡＯＸ１(ａｌｃｏｈｏｌｏｘｉｄａｓｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ)を利用するｐＰＩＣＺαＡの制限酵素サイトに挿入して組換え発現ベクターのｐＰＩＣＺαＡ−ＡＹ３０を製作した。
このような組換え発現ベクターは、２０１１年４月１５日に韓国生命工学研究院の微生物資源センターに寄託した(受託番号：ＫＣＴＣ １１９１７ＢＰ)。
【００３１】
１−３. 形質変換体の製作
組換え発現ベクターのｐＰＩＣＺαＡ−ＡＹ３０でＰ. ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｘ３３/Ｍｕｔ＋を形質変換させるために電気穿孔法(ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ)を利用した。
ｐＰＩＣＺαＡにＡＹ３０ＡＦＰが挿入されたプラスミドＤＮＡは、制限酵素ＳａｃΙを処理して菌株のｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡに挿入できる直鎖(ｌｉｎｅａｒ)形態で準備した。
形質転換のための菌株Ｐ. ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｘ３３/Ｍｕｔ＋は、ＹＰＤに菌株を接種して３０℃で２００ｒｐｍで１８時間培養し、遠心分離(５０００ｒｐｍ、２５℃、２分)を通じて細胞のみ分離した。分離された菌株は、ｉｃｅ−ｃｏｌｄＤＷと１Ｍソルビトール(Ｓｏｒｂｉｔｏｌ)に再懸濁した後、更に遠心分離する過程を各々２回ずつ実行して準備した。
準備されたセルにプラスミドＤＮＡ３μｇをよく交ぜて、アイス(ｉｃｅ)で１０分間インキュベーション(ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ)した。これをあらかじめ冷たく準備した０.１cmのエレクトロポレーションキュベッド(ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎｃｕｖｅｔｔｅ)に移してパルス(ｐｕｌｓｅ)を(キャパシタンス２５μＦ、電圧９００Ｖ)進行した後、すぐアイス(ｉｃｅ)に移した。ｉｃｅ−ｃｏｌｄ １Ｍソルビトールを入れて培養チューブに入れた後、ＹＰＤとともに３０℃で２００ｒｐｍで１時間の間培養した。培養液を分株したＹＰＤ固体培地は、３０℃で３日間インキュベーション(ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ)した。
前記過程で形質転換体のＰ. ｐａｓｔｏｒｉｓＸ３３/Ｍｕｔ＋/ｐＰＩＣＺαＡ−ＡＹ３０を収得した。
【００３２】
＜実施例２＞酵母菌株の培養
２−１. 種培養
ロイコスポリジウム属ＡＹ３０の培養は、ＮＢ培地(５ｇ/ｌのペプトン、３ｇ/ｌの牛肉｛ぎゅうにく｝エキス)で、２℃の条件で７日間振蕩培養した。
組換えＡＹ３０ポリヌクレオシドが発現される組換え形質転換体のＰ. ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｘ３３/Ｍｕｔ＋/ｐＰＩＣＺαＡ−ＡＹ３０の種培養は、ＹＰＤ培地(１０ｇ/ｌの酵母｛こうぼ｝エキス 、２０ｇ/ｌのペプトン、２０ｇ/ｌのデキストロース)で、３０℃を維持する振蕩培養器で２５０ｒｐｍの条件で一晩の間振蕩培養した。これを醗酵培養のシード(ｓｅｅｄ)で使用した。
【００３３】
２−２. 醗酵培養
組換え形質転換体のＰ. ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｘ３３/Ｍｕｔ＋/ｐＰＩＣＺαＡ−ＡＹ３０の大量培養は、最大容量が７Ｌであるｊａｒ ｂｏｔｔｏｍ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｄｒｉｖｅ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ(ＫｏＢｉｏＴｅｃｈ、Ｋｏｒｅａ)と最大容量５０Ｌの種菌発酵器がある最大容量５００Ｌの発酵器(ＫＦ−５００ ＫｏＢｉｏＴｅｃｈ、Ｋｏｒｅａ)を使用した。温度の測定記録は、発酵器の内部管部位の熱電対を利用した。溶存酸素量の測定は、滅菌されたｐｏｌａｒｏｇｒａｐｈｉｃｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｏｘｙｇｅｎ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ＩｎＰｒｏＯ２ Ｓｅｎｓｏｒｓ(Ｍｅｔｔｌｅｒ−ＴｏｌｅｄｏＧｍｂＨ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ)を使用した。
醗酵培地は、Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｓａｌｔｓ Ｍｅｄｉｕｍ(２６.７ｍｌ/ｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃａｃｉｄ ８５％、０.９３ｇ/ｌ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ、１８.２ｇ/ｌ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ、１４.９ｇ/ｌ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ−７Ｈ２Ｏ、４.１３ｇ/ｌ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ、４０ｇ/ｌ ｇｌｙｃｅｒｏｌ)に、４.３５ｍｌ/ｌ ＰＴＭ１ Ｔｒａｃｅ Ｓａｌｔｓ(６ｇ/ｌ ｃｕｐｒｉｃ ｓｕｌｆａｔｅ−５Ｈ２Ｏ、０.０８ｇ/ｌ ｓｏｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ、３ｇ/ｌ ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｓｕｌｆａｔｅ−Ｈ２Ｏ、０.２ｇ/ｌ ｓｏｄｉｕｍ ｍｏｌｙｂｄａｔｅ−２Ｈ２Ｏ、０.０２ｇ/ｌ ｂｏｒｉｃ ａｃｉｄ、０.５ｇ/ｌ ｃｏｂａｌｔ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、２０ｇ/ｌ ｚｉｎｃ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、６５ｇ/ｌ ｆｅｒｒｏｕｓ ｓｕｌｆａｔｅ−７Ｈ２Ｏ、０.２ｇ/ｌ ｂｉｏｔｉｎ、５ｍｌ/ｌ ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ)を添加して使用した。ｐＨの調節は、蠕動ポンプ(ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃｐｕｍｐ)を利用して酸と塩基を添加し、ＩｎＰｒｏｐＨ ｓｅｎｓｏｒ(Ｍｅｔｔｌｅｒ−ＴｏｌｅｄｏＧｍｂＨ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ)を使用してｐＨを測定した。
培養条件は、３０℃で１５Ｌ/ｍｉｎで空気を供給し、６００ｒｐｍで振蕩培養し、飽和溶存酸素量は２０〜３０％水準を維持した。ｐＨ条件は、アンモニア水を利用してｐＨ５を維持した。
醗酵培地にＰ. ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｘ３３/Ｍｕｔ＋/ｐＰＩＣＺαＡ−ＡＹ３０を接種する前に消泡剤を少量添加し、培養のうち泡沫が発生すると、消泡剤を利用して泡沫を除去した。
【００３４】
２−３. グリセロール回分式及び流加式培養
持続的に正常的な醗酵は、前記２−２で初期に添加されたグリセロールを消耗して菌体が育つ間進行されたし、急に溶存酸素量の水準が増加する時点を分析して初期グリセロールが全て消耗されたことを確認した。
菌体濃度及びＡＦＰの生産を増大させるためにグリセロール流加式培養を実施した。この時、１２ｍｌ/ｌ ＰＴＭ１ ｔｒａｃｅ ｓａｌｔｓが含まれた５０％ｗ/ｖグリセロールを使用し、供給は、１８.１５ｍｌ/ｈｒ/Ｌの初期醗酵液の割合で設定した。グリセロール供給は、９時間の間進行し、細胞の量をＯＤ６００で測定したとき、グリセロール供給前の細胞濃度の３〜４倍が増加する時点まで供給した。
【００３５】
２−４. メタノール流加式培養
組換えＡＦＰの発現誘導のために、グリセロールの供給を終了してグリセロールが全て消耗されて溶存酸素量の水準が増加する時点で、１２ｍｌ/ｌ ＰＴＭ１ ｔｒａｃｅ ｓａｌｔｓが含まれた１００％メタノールを３.６ｍｌ/ｈｒ/Ｌの初期醗酵液の割合で供給した。また、温度条件を３０℃、２５℃、２０℃、１５℃の条件で進行した。溶存酸素量の水準が２０％を維持することができない時はメタノールの供給を中断し、溶存酸素量の水準が増加する時点では前記の割合でメタノールを供給した。
その結果、培養液で分泌された組換えＡＦＰが含有された細胞培養液を収得した。
【００３６】
＜実施例３＞細胞含量の測定
細胞含量の測定は、ＵＶ分光光度計(Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ ｐｒｏ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｓｗｅｄｅｎ)を利用して６００ｎｍでの光学濃度(ＯＤ：ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ)を測定した。細胞乾燥重量(ＤＣＷ：Ｄｒｙ ｃｅｌｌ ｗｅｉｇｈｔ)は、１ｍｌの培養液を遠心分離して０.９％のＮａＣｌ溶液を利用して洗浄した後、８０℃の乾燥器で４８時間の間乾かした後に測定した。各々の温度別に醗酵培養したＯＤ値とＤＣＷ値を利用して醗酵条件の温度による相関関係を求めた。
その結果、図３に示したように、時間の経過によるＯＤ６００値の変化は、初期は類似に始めて７日の経過した後には２０℃で一層よく培養された。３０℃と２５℃は、７日経過後に類似な傾向を示した。そして、４日が経過した時点から２０℃での成長曲線が２５℃、３０℃を追い越す傾向を示した。また、図４に示したセル(Ｃｅｌｌ)のＤＣＷ(ＤｒｙＣｅｌｌ Ｗｅｉｇｈｔ)結果もＯＤ６００の結果と同様に２０℃での細胞量が一層多かった。
【００３７】
＜実施例４＞総タンパク質含量の測定
培養液の総タンパク質含量は、ウシ血清｛けっせい｝アルブミン(ＢＳＡ：ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ)を標準含量で設定してブラッドフォードタンパク質分析法を利用して測定した。
具体的には、試料は、培養中に２４時間単位で１５ｍｌの培養液を採取し、その中で１ｍｌを使用して４℃、４５００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離して細胞と上清液を分離した。タンパク質標準含量の設定は、ＢＳＡを０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、５００μｇ、１０００μｇ、２０００μｇで希釈したＢＳＡ溶液２０μｌをＢｒａｄｆｏｒｄｒｅａｇｅｎｔ(ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ、ＵＳＡ)１ｍｌを添加して交ぜた後、５分間反応時間を与えてＵＶ分光光度計を利用して５９５ｎｍでの波長値を測定した後、タンパク質標準含量の関係式を求めた。試料も上の方法と同様な方法で、試料２０μｌを用いて、測定値をＢＳＡを利用したタンパク質標準含量式に代入して全体タンパク質含量を求めた。
その結果、図５に示したように、３０℃で培養したとき培養液の総タンパク質含量が高いことで確認された。
【００３８】
＜実施例５＞ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
培養中に２４時間単位で培養液の上清液を採取して同量の２ｘ ＳＤＳ ｇｅｌ ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ(１２６ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ６.８、４％ ＳＤＳ、０.０２％ Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ Ｂｌｕｅ、２０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、５％ β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ)を混合して９５℃で試料を変性(ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ)させた後、Ｌａｅｍｍｌｉ法によってＳＤＳ−ＰＡＧＥ(ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ)を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、１ｘ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ(２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｂａｓｅ、１９２ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ、１％ ＳＤＳ)と１２％のｓｅｐａｒａｔｉｎｇｇｅｌ(４０％ Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ、１.５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８.８、１０％ ＳＤＳ、１０％ ＡＰＳ、Ｔｅｍｅｄ)、ｓｔａｃｋｉｎｇ ｇｅｌ(４０％ Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ、１.５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ６.８、１０％ ＳＤＳ、１０％ ＡＰＳ、Ｔｅｍｅｄ)を使用した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを前記のような方法で実行した後、ゲルを固定液(ｆｉｘ ｓｏｌｕｔｉｏｎ)(４０％ エタノール、７０％酢酸)を使用して固定し、酸化液(ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ)(１％過ヨウ素酸 、３％酢酸)を使用して酸化させた後、Ｓｃｈｉｆｆ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ(ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ、ＵＳＡ)を使用して染色し、還元液(ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ)(０.５８％ ポロ亜硫酸カリウム、３％酢酸)を使用して還元させた後、確認した。 その結果、図６乃至図８に示したように、３０℃の温度条件で培養した試料に組換えＡＹ３０ＡＦＰが比較的多量で含有されていることを確認した。
組換えＡＦＰのグリコシル化を確認するために、組換えＡＦＰ発現の確認は、ＣＢＢ(Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ)染色液(ｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ)(０.２５％クマシーブリリアントブルーＲ２５０、４５％メタノール、１０％氷酢酸)を使用して染色し、ＡＦＰのグリコシル化の確認は、過ヨウ素酸シッフ試薬(ＰＡＳ：Ｐｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ Ｓｃｈｉｆｆ ｒｅａｇｅｎｔ)を利用して確認した。
この時、バクテリア発現システムで生産された組換えＡＹ３０ ＡＦＰは、ｐＣｏｌｄ Iベクターを利用して大膓菌(Ｅ.ｃｏｌｉ Ｂｌ２１(ＤＥ３)から発現したものである。
その結果、図９及び図１０に示したように、本発明によるＰ. ｐａｓｔｏｒｉｓ１０３３/Ｍｕｔ＋/ｐＰＩＣＺαＡ−ＡＹ３０から発現された組換えＡＹ３０ ＡＦＰは、本来のＡＦＰ(ｎａｔｉｖｅ ＡＦＰ)のようにグリコシル化された活性型であることが確認された。
【００３９】
＜実施例６＞ウェスタンブロット分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実行した後、ゲル状のＡＦＰをＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅ(ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＵＳＡ)にトランスファーした。Ｔｔｒａｎｓｆｅｒｂｕｆｆｅｒ(５.１ｇ/ｌｂｉｃｉｎｅ、６.５５ｇ/ｌ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、０.２７５ｇ/ｌ ＥＤＴＡ、１０％ ｍｅｔｈａｎｏｌ、ｐＨ７.２)を使用して１０００ｍＭで１時間３０分間トランスファーした。実行後、メンブレイン(ｍｅｍｂｒａｎｅ)をＴＢＳ ｂｕｆｆｅｒ(２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.５)で２回洗浄した後、ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ(３％ ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.５)に１時間の間培養し、ＴＢＳＴＴ ｂｕｆｆｅｒ(０.１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０.２％ Ｔｒｉｔｏｎ １０−１００、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７.５)に２回洗浄した後、ＴＢＳ ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄して１/８０００で希釈された１次抗体(Ａｎｔｉ−ｒＩＡＹ３０ ｐｏｌｙ. Ａｂ. Ｒａｂｂｉｔ、Ｃｏｓｍｏ ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈ、ｋｏｒｅａ)が含有されたｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒに１時間培養した。その後、ＴＢＳＴＴ ｂｕｆｆｅｒで２回、ＴＢＳ ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄した後、１/９００００で希釈された２次抗体(Ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ)が含有されたｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで１時間培養し、ＴＢＳＴＴ ｂｕｆｆｅｒで４回洗浄して、ＢＣＩＰ/ＮＢＴ−ｐｕｒｐｌｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ(Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ)で確認した。
その結果、図１１に示したように、ウェスタンブロット実験を通じて本発明のＰ. ｐａｓｔｏｒｉｓ １０３３/Ｍｕｔ＋/ｐＰＩＣＺαＡ−ＡＹ３０から発現された組換えＡＦＰとバクテリアから発現された組換えＡＦＰのタンパク質が、ｎａｔｉｖｅ ＡＦＰとアミノ酸配列が同一なタンパク質である事実を確認した。
【００４０】
＜実施例７＞ ＡＦＰ ＡＹ３０の結氷防止活性分析
ＡＦＰ ＡＹ３０による氷結晶形態の変化を観察するために、ナノリットル浸透圧計(ｎａｎｏｌｉｔｒｅ ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ、Ｏｔａｇｏ Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒｓ Ｌｔｄ、ＮｅｗＺｅａｌａｎｄ)を使用した。具体的に、サンプルチャンバ内に液浸油(ｉｍｍｅｒｓｉｏｎｏｉｌ) を満たした後、測定試料をオイル上に載せた。サンプルチャンバをステージに乗せて−２０℃に急速冷凍させてから温度をゆっくり上昇させて氷結晶が大部分とけて観察対象結晶のみを残した。また、ステージの温度をゆっくり下りながら氷結晶の形成と温度(ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ)を観察及び測定した。温度が降りても氷結晶が大きくならないで維持してから急激に結晶が成長する温度を(ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ)測定して結氷防止活性(ｔｈｅｒｍａｌ ｈｙｓｔｅｒｅｓｉｓ)を分析した。
その結果、下記表１及び図１２乃至図１４のグラフに示したように、二つ異なる培養温度で生産された組換えＡＹ３０ＡＦＰは、結氷防止活性を有する活性型である事実を確認した。
【００４１】
【表１】
0005824139.tif 000002
【００４２】
寄託情報
【表２】
0005824139.tif 000003
【配列表フリーテキスト】
【００４３】
配列番号１の塩基配列は、ロイコスポリジウム属(Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐ.)ＡＹ３０のＤＮＡを変形させた配列である。
【図１】
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【図２】
0005824139.tif 000005
【図３】
0005824139.tif 000006
【図４】
0005824139.tif 000007
【図５】
0005824139.tif 000008
【図６】
0005824139.tif 000009
【図７】
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【図８】
0005824139.tif 000011
【図９】
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【図１０】
0005824139.tif 000013
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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