(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性抗ＣＤ８１抗体とＮＫ細胞との組み合わせを有効成分とする抗ＨＣＶ治療剤であって、ＮＫ細胞表面上に発現している膜糖タンパク質ＣＤ８１分子を介して、前記ＮＫ細胞と前記可溶性抗ＣＤ８１抗体とが結合している、抗ＨＣＶ治療剤。
【請求項２】
ＮＫ細胞が肝臓由来である、請求項１に記載のＨＣＶ治療剤。
【請求項３】
ＮＫ細胞が、肝移植のために摘出した肝臓から採取されたものである、請求項２に記載の抗ＨＣＶ治療剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか1項に記載の抗ＨＣＶ治療剤を製造するための、ＮＫ細胞及び可溶性抗ＣＤ８１抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス(以下「ＨＣＶ」と略す。)の有効な治療剤及び予防剤の提供に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）性の肝硬変は肝移植の高頻度な適応疾患である。ＨＣＶによる肝硬変の治療は、全世界的にみても患者数は多く、わが国においても、国民病と呼ばれるほど多い、さらに、治療が極めて困難な、難治性疾患である。ＨＣＶに感染し慢性型に移行すると、完治できるまでの回復は困難であり、一部は、肝癌を合併する経過をとる。
【０００３】
現在用いられているＨＣＶの抗ウイルス療法のうち、最も効果的とされているものは、インターフェロンと抗ウイルス剤、リバビリンの併用投与であるが、その奏効率は５０％程度である。また、重度の肝硬変患者は、肝臓の摘出後、健康な肝臓の移植手術が行われているが、肝移植手術においても、移植による拒絶反応を抑制するために、手術後に免疫抑制剤を投与することにより、抗ウイルスの免疫応答も抑制されるため、ＨＣＶのウイルスの複製を増長し、ＨＣＶ性肝炎の移植後再発や増悪が高率に起っているのが現況である。そこで、本発明は、このような状況にあって、自然免疫を担う、ＮＫ細胞を活性化して、移入するという新規な抗ウイルス療法の材料の提供に関するものである。  
【０００４】
従来、ＮＫ細胞は、抗ウイルス作用や抗がん作用、抗菌作用等を有する生体の有力な防御機構であるが、ＮＫ細胞の活性は、加齢とともに低下してゆくため、高齢者ほど活性が低く、また、慢性のウイルス感染症やがん疾患になると、ＮＫ活性が低下するといわれている。
本発明は、このような、ＨＣＶ性肝硬変患者の肝移植後ＨＣＶ感染による肝炎再発の予防となる有効な治療手段を提供するものである。
【０００５】
【非特許文献１】K.Ishiyama,H.Ohdan,  H.Mitsuya,K.Arihiro,and  T.Asahara,  Difference  in  cytotoxicity  against  cellular  carcinoma  between  liver  and  periphery  natural  killer  cells  in  human.  Hepatology,  2006,  362-372.
【非特許文献２】C.Gremion  and  A.  Cerny.  Hepatitis  C  vbirus  and  the  immune  system:  a  concise  review.  Rew,  Med.Virol.2005;15:235-268.
【非特許文献３】L.Golden-Mason  and  H.R.Rosen.  Natural  Killer  Cells:  Primary  Target  for  Hepatitis  C  Virus  Immune  Evasion  Strategies?    Liver  Transplantation  2006.12:363-3372.
【非特許文献４】Hugo  R.  Rosen.  Hepatitis  C  Pathogenesis:  Mechanisms  of  Viral  Clearance  and  Liver  Injury.2003,Vol9,  No11,  Suppl3  （November）。2-3,  S35-S43.
【非特許文献５】北所健悟、ＨＣＶワクチン開発のためのＣＤ８１の構造生物学的研究  ウイルス、第５４巻、第１号、３９−４７、２００４年。）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＨＣＶの感染防止及び感染後の治療について、有効な手段を提供することにある。特に、肝移植手術後のＨＣＶの再発防止に有効な手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の上記目的は、以下の（１）から（８）に記載することに関する。
（１）  ＮＫ細胞活性化剤により活性化されたＮＫ細胞を有効成分とする抗ＨＣＶ治療剤又は予防剤。
（２）  ＮＫ細胞活性化剤が、ＩＬ−２である前記項目（１）の抗ＨＣＶ治療剤又は予防剤。
【０００８】
（３）  ＩＬ−２で活性化したＮＫ細胞を含む細胞けん濁液を、さらに、抗ＣＤ３抗体を用いて所定の条件下で処理して、ＣＤ３陽性細胞を除去した、前記項目（１）又は（２）に記載の抗ＨＣＶ治療剤又は予防剤。
（４）  ＮＫ細胞活性化剤で処理したＮＫ細胞と抗ＣＤ８１抗体との組み合わせからなることを特徴とする抗ＨＣＶ治療剤又は予防剤。
（５）  抗ＣＤ８１抗体を有効成分とする、抗ＨＣＶ治療剤又は予防剤。
【０００９】
（６）  抗ＣＤ８１抗体とＮＫ細胞との組み合わせからなることを特徴とする抗ＨＣＶ治療剤又は予防剤。
（７）  ＮＫ細胞が肝臓由来である、前記項目（１）から４又は６のいずれかに記載のＨＣＶ治療剤又は予防剤。
（８）  ＮＫ細胞が、肝移植のために摘出した肝臓から採取されたものである、前記項目（７）に記載の抗ＨＣＶ治療剤又は予防剤。
【００１０】
（９）前記項目（１）から（４）、（７）又は（８）のいずれかに記載の抗ＨＣＶ治療剤又は予防剤を製造するための、ＩＬ−２の使用。
（１０）  前記項目（５）又は（６）に記載の抗ＨＣＶ治療剤又は予防剤を製造するための、抗ＣＤ８１抗体の使用。
（１１）前記項目（１）から（４）又は（６）から（８）のいずれかに記載の抗ＨＣＶ治療剤又は予防剤を製造するための、ＮＫ細胞又はＮＫ細胞活性化剤で活性化されたＮＫ細胞の使用。
以上のＨＣＶの治療剤又は予防剤およびそれらを製造する方法を提供することにより、本発明の目的が達成された。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、移植用肝臓片から採取した正常肝ＮＫ細胞をＩＬ−２存在下で培養することにより活性化したＮＫ細胞を含むＨＣＶ治療剤又は予防剤（以下、「本発明の治療剤等」と略す。）の提供によりＨＣＶ感染を予防又は治療することができる。また、抗ＣＤ８１抗体とＮＫ細胞からなるＨＣＶ治療剤等の提供により、肝移植後のＨＣＶ感染抵抗性を増強することができ、肝移植後のＨＣＶの再発防止に有用である。また、本発明の治療剤等は、抗ＣＤ３抗体処理により、移植片対宿主反応（graft-vs-host  disease）を起こすことなく、前記効果を得ることができる。本発明は、また、抗ＣＤ８１抗体、および、ＩＬ−２の、ＨＣＶの治療剤又は予防剤の製造に用いることができるという新しい使用の用途を提供するものである。抗ＣＤ８１抗体及びＩＬ−２は、単独で又は併用（所定の処理条件で用いるという併用）により、ＨＣＶ治療剤又は予防剤として用いることができ、また、ＨＣＶ治療剤又は予防剤の製造に、有効成分として又は、有用な処理剤として、用いることができる。また、ＩＬ−２を直接人体に投与することによっても、ＨＣＶに対する感染抵抗性の増強効果を発揮する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本発明を詳細に説明する。
（１）「ＮＫ細胞」
ＮＫ細胞は、ナチュラルキラーセル（細胞）と呼ばれ、リンパ球の1種であり、未感作の状態で種々の細胞障害性をもつエフェクター細胞として異物に対する生体の防御をつかさどる細胞である。本発明で用いるＮＫ細胞は、活性化処理した後、ヒトに移入するため、同種であるヒトから採取した細胞を用いることは、もちろんであり、かつ、臓器提供者（ドナー）又は被提供者（レシーピエント）と同一個体のＮＫ細胞を用いることが望ましい。また、末梢血液由来のＮＫ細胞を用いることもできるが、肝臓に由来するＮＫ細胞を用いることが好ましい。また、ヒトＨＣＶ患者において用いるＮＫ細胞は、患者に移植するための肝臓片を健常人提供者者（ドナー）の肝臓摘出手術において得た場合、その摘出された肝臓片を、細胞外液又は保存液等で、門脈から肝臓を灌流することにより、流出させて得た血液から、次に述べる分離方法にしたがい、ＮＫ細胞を得ることができる。
【００１３】
ＮＫ細胞の血液からの分離には、採取した血液から、比重遠心法で単核球を分離した分画を、次の工程である活性化処理の材料として用いる。また、ＮＫ細胞以外の細胞を認識する抗体を用いて、ＮＫ細胞以外の細胞群を除去することは、ＮＫ細胞の好ましい分離方法である。また、末梢血由来のＮＫ細胞を用いるときは、動物又はヒトの末梢血から得た血液を材料に、同様の手法により、ＮＫ細胞を分離・精製することができる。
また、血液からのＮＫ細胞を機器を用いて分離するには、フローサイトセルソーティング、又は、マグネティックソーティング（磁気分離）のネガティブセレクションにより行うことができる。フローサイトセルソーティング法を用いて行うと、分離用の表面抗体が接着した細胞が得られるのに対し、マグネティックソーティングのネガティブセレクションでは抗体非接触の細胞が分離できるという利点があるので、後者は、より好ましいＮＫ細胞の分離方法である。
【００１４】
（２）「ＮＫ細胞活性化剤」および「ＩＬ−２」
ＩＬ−２（インターロイキン２）は、サイトカインの1種であり、Ｔリンパ球が分泌する糖蛋白であって、Ｔ細胞を増殖させる働きがあるため、Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）とも呼ばれる。本発明で用いるＩＬ−２は、肝臓移植手術を行う宿主と同種類の宿主由来のものを用いることが好ましい態様であるため、ヒト肝移植の場合を想定している場合は、ヒト由来のＩＬ−２を用いることが望ましい。ヒトＩＬ−２は、遺伝子組み換えにより製造されたもので、既に市販されている、セルモロイキン（武田薬品工業社製）又はイムネース（シオノギ製薬社製）を用いることができる。
【００１５】
前述の手法により、採取したＮＫ細胞についてＩＬ−２を用いて活性化処理するときのＩＬ−２は、５０から２００JRU/mlの範囲の濃度を用いることができるが、好ましくは、１００から１５０JRU/mlの範囲である。その他の活性化の条件は、通常の細胞をインキュベーイションする条件に従い、５％炭酸ガス培養器で培地には通常の組織培養用培地を用いて、３７０Ｃ、２４〜９６時間、好ましくは、４８〜７２時間インキュべーションすることにより行うことができる。
【００１６】
ＮＫ細胞活性化剤としては、ＩＬ−２以外にも、ＮＫ細胞を活性化させるものを代替として用いることができる。例えば、ＩＬ−１２又はＩＬ−１５等の別種のインターロイキンもある程度ＮＫ細胞の活性化をもたらすとされているので、これらを用いることもできる。また、インターロイキン類以外でも、種々のバイオモジュレーターをＮＫ細胞の活性化剤として用いることができる。しかし、本発明者らは、ＮＫ細胞の活性化に適している物質を種々のサイトカインの中から検討し、ＩＬ−１２やＩＬ−１５等よりも、ＩＬ-２が強い活性化作用をもつことを見出し、本発明を完成させた。したがって、本発明では、ＮＫ細胞の活性化として最も好ましいものはＩＬ−２である。
【００１７】
末梢血由来のＮＫ細胞については、性状はよく研究されているが、肝臓由来のＮＫ細胞の性状については、ほとんど知られていない。そこで、ＨＣＶは肝臓に感染するウイルスであることから、肝臓における防御機構に基づいた、抗ウイルス作用を研究する必要があるため、本発明者は、肝臓由来のＮＫ細胞の性状を検討することとした。末梢血由来のＮＫ細胞は、前述のように、ＩＬ−２等のサイトカインにより活性化されること、または、ＩＬ−２等により活性化されたＮＫ細胞が抗がん効果を増強することはすでに報告されている。しかし、抗ウイルス効果、特に、抗ＨＣＶ効果については、ほとんど検討されていない。本発明におけるＮＫ細胞による抗ウイルス（特に、抗ＨＣＶ）効果は、抗がん効果とはその標的を異にするため、その作用のメカニズムにおいても異なることが考えられる。
また、末梢血由来のＮＫ細胞の抗がん作用については、前述のごとくよく研究されているが、それらの報告は、末梢血液由来のＮＫ細胞に関するものであり、肝臓由来のＮＫ細胞に関するものではない。  また、肝臓由来のＮＫ細胞については、抗がん作用だけでなく、抗ウイルス作用（特に、抗ＨＣＶ）作用についても報告されていない。したがって、末梢血由来であるか、肝由来であるかを問わず、活性化ＮＫ細胞が有用な抗ＨＣＶ作用するため、抗ＨＣＶ治療剤等になり得ることについては、本発明で開示するものである。
ＮＫ細胞とＩＬ−２等のサイトカインの関係は、末梢血由来のＮＫ細胞については、報告されているが、肝臓由来のＮＫ細胞については、未知である。免疫担当細胞が末梢血由来であるか、あるいは、肝臓由来であるかは、免疫細胞の性状を研究する上では、重要な問題である。例えば、マクロファージについては、骨髄幹細胞由来の単球として血中に存在する遊走性マクロファージと肝のクッパー細胞に代表される定着性マクロファージに分類できるとされている（日経バイオ  最新用語辞典第5版、806頁）。遊走性マクロファージ（末梢血由来）と肝のクッパー細胞の性状が著しく異なることは、周知の事実である。
したがって、ＮＫ細胞についても、肝臓中に存在するものと、末梢血中のものとは、かなり性質が異なると考えられるため、本発明者は、肝臓由来のＮＫ細胞とサイトカインの関係を検討する必要性があると考え、肝臓由来ＮＫ細胞のＩＬ−２処理による影響を検討した。
【００１８】
（３）「抗ＣＤ８１抗体」
ＣＤ８１は、236個のアミノ酸からなる4つの膜貫通型の膜タンパク質であり、ＣＤ８１は、数多く知られている細胞表面抗原のひとつであり、リンパ球の中ではＮＫ細胞の細胞表面に多く存在する抗原として知られている（J.  Chien-Te  K.  and  Kimpel  G.R.    Binding  of  the  hepatitis  C  virus  envelope  protein  E2  to  CD81  inhibits  natural  killer  cell  functions.  J.  Exp.  Med.  2002年;  195巻、43−49頁）。
本発明の抗ＣＤ８１抗体とは、ＣＤ８１抗原に対する抗体であって、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の別を問わないが、モノクローナル抗体がより好ましい。研究的、試験的な使用には、市販の抗ＣＤ８１モノクローナル抗体を用いることができるが、ヒト臨床上用いる場合は、ヒト抗体は、通常市販はされておらず、動物で作製した抗ＣＤ８１抗体を、そのままヒトに投与すると、異種抗体の強い抗原性が問題となる。これを解決するために、動物抗体をヒト抗体類似する構造に修飾した（キメラ）抗体の作製手法や、ヒト化抗体の作製手法を用いることができる（J.H.Ellis,  J.  Immunology.  155巻:925-937頁,  1995年）。キメラ抗体はマウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域に連結したもので、遺伝子組み換えにより構築できる。また、ヒト化抗体の作製は、マウス抗体の相補鎖決定領域をヒト抗体の可変領域に繋ぐことで構築できる。ヒト抗体はヒト抗体遺伝子移入マウスやファージを使う方法があり、抗ＣＤ８１抗体の作製にも応用可能であるので、動物で産生した当該抗体をこれら公知の手法を用いて、抗ＣＤ８１ヒト化抗体や、抗ＣＤ８１のキメラ抗体を作製することができる。
本発明の抗ＣＤ８１抗体は、単独でＨＣＶ感染の予防又は治療剤として用いることができる。抗ＣＤ８１単独でも、ＮＫ細胞と協力的に働き、ＮＫ細胞を活性化させるからである（図１、−■−可溶性抗ＣＤ８１抗体）。また、抗ＣＤ８１抗体は、ＮＫ細胞と共に投与するとより効果的に抗ＨＣＶ効果を発揮すると考えられる。ＮＫ細胞が予め活性化の有無を問わず、抗ＣＤ８１抗体と併用する場合は、ＨＣＶ感染に対して有効である。
【００１９】
（４）「架橋モデル」
通常、ウイルスが細胞に感染すると、生体の防御機構が働き、例えば、多形核白血球、マクロファージ、Ｔリンパ球、抗体、ＮＫ細胞等が、単独で又は互に協力して働き、非特異的な応答により、又は、感染後期間の経過後は、特異的な防御機構により、細菌、ウイルス等の排除が図られる。
しかし、ＨＣＶが肝臓感染した場合は、ウイルスの排除が何らかの原因により速やかに行われないため、自然回復が困難となり、また、ＨＣＶに対する化学療法によってもＨＣＶ感染の場合はウイルス排除が困難であり、慢性感染型となり、次第に肝硬変に変化し、最後に肝がんへ移行するといわれている。
本発明者らは、このような極めて治療困難な疾病であるＨＣＶ感染症の治療又は予防を解決するために、インビトロでのＨＣＶ感染モデルの作製を試みた。
【００２０】
ＨＣＶ感染の機構については、ＨＣＶの表面にあるスパイク状のエンベロープ糖タンパク質（Ｅ２）がヒトの細胞表面上の膜糖タンパク質であるＣＤ８１分子の細胞外ドメインに結合する（ピレリら、サイエンス、  Pileri  P,  Science,  282巻、938-941頁、1998年）。このためＨＣＶが感染すると、感染した肝細胞にＨＣＶのＥ２タンパク質が表出し、そのＥ２蛋白がＮＫ細胞に表出するＣＤ８１タンパク質との間で架橋を形成すると考えられる。一方、ＮＫ細胞はＥ２タンパク質がＮＫ細胞表面のＣＤ８１に結合すると、そのＮＫ細胞の活性が低下すると考えられている。このことは、ＮＫ細胞のＣＤ８１抗原がある種のタンパク質と結合すると、この結合が引き金となって、何らかの細胞内機構が働き、ＮＫ細胞の活性低下を誘発すると考えられる。そのため、結合タンパクがＥ２であっても、抗ＣＤ８１抗体であっても、同様な現象をＮＫ細胞内に誘発するであろうと考えられる。そこで、本発明者らは、かかるＨＣＶの感染におけるＥ２タンパク質と抗体の関係のモデルを仮説として提示した（図７）。そして、図７に示すモデルのように、ＮＫ細胞の活性を低下させるために、Ｅ２タンパク質の代わりに抗ＣＤ８１抗体が引き金となり、実際にこの現象が起こるか否かを試験した。
【００２１】
そこで、架橋形成によるＮＫ細胞の活性低下の具体的なモデルとして、培養容器壁面に抗ＣＤ８１抗体で被覆した容器をあらかじめ作製し、培養液とともにＮＫ細胞を入れて培養し、ＮＫ細胞の細胞傷害性試験を行った（図１、表１）。その結果、壁面の抗ＣＤ８１抗体と結合するＮＫ細胞の細胞傷害活性は、壁面を抗体処理して架橋形成させた場合（▲）には、無処置（◆）に比較して、ＮＫ細胞の活性の低下が確認できた（図１、表１）。これによりインビトロ架橋形成がＮＫ細胞におけるＨＣＶ感染モデルとして成立すると考えられた。
【００２２】
（５）「抑制状態のＮＫ細胞の回復」
このインビトロ  モデルを用いて本発明者らは、ＮＫ細胞の抑制状態を活性化させるために有効な手段を検討することにし、その一例として、本発明者らは、可溶性抗ＣＤ８１抗体処理が、ＮＫ細胞の活性回復ないし増強することを見出した。
培養液に添加した抗ＣＤ８１抗体（容器壁面に被覆した抗体に対して、この抗体を「可溶性抗ＣＤ８１抗体」又は略して「可溶性抗体」と呼ぶ。）をその培養容器の培地中に添加すると、この抑制状態に陥ったＮＫ細胞の活性が回復して、増強することは、肝移植を受けたＨＣＶ性肝硬変患者に可溶性抗ＣＤ８１抗体を投与すると、ＮＫ細胞の機能が亢進し、ＨＣＶの複製を抑制することにより、抗ウイルス効果発揮するであろうことを示唆している。本発明により、可溶性抗ＣＤ８１抗体を肝移植後の患者へ投与することで、ＨＣＶの感染抵抗性が増強する治療法につながることを見出した。
【００２３】
（６）「ＮＫ細胞と抗ＣＤ８１抗体の組み合わせによる治療剤又は予防剤」
本発明によるＨＣＶ治療剤等は、（ａ）活性化したＮＫ細胞を有効成分とする治療剤等、（ｂ）抗ＣＤ８１抗体を有効成分とする治療剤等、（ｃ）ＮＫ細胞と抗ＣＤ８１抗体の組み合わせからなる治療剤、（ｄ）活性化したＮＫ細胞と抗ＣＤ８１抗体の組み合わせからなる治療剤等、（ｅ）ＩＬ−２のインビボ投与、（ｆ）ＩＬ−２のインビボ投与と抗ＣＤ８１抗体の組み合わせ、及び（ｇ）抗ＣＤ８１抗体、ＩＬ−２及びＮＫ細胞からなるキット、又はそれらの２者からなるキットを提供するものである。
この中で、（ｃ）及び（ｄ）のＮＫ細胞又は活性化したＮＫ細胞と抗ＣＤ８１抗体の組み合わせからなる治療剤又は予防剤については、（イ）当初から該抗体とＮＫ細胞を混合した状態である場合、（ロ）別々の状態で投与する場合、があり得る。別々の状態で投与する場合は、ＮＫ細胞の投与と、抗ＣＤ８１の投与は、各々の効果を最大に発揮するため、投与スケジュールが異なる場合が考えられる。
（ｅ）については、ＮＫ細胞との組み合わせであるが、ＩＬ−２をインビトロではなく、直接インビボに投与する手法である。ＩＬ−２によりＮＫ細胞の活性化がインビトロで起こることが確認できたので、このことは、インビボにおいても効果が生じることが十分に考えられる。また、（ｇ）製剤として調製するには、抗ＣＤ８１抗体と活性化したＮＫ細胞の両材料を一つの治療用の又は予防剤用の「キット」として調製することは、ＨＣＶの治療にとって便利であるため、当該「キット」も本発明に含まれる。
【００２４】
（７）「肝臓由来活性化ＮＫ細胞の移入療法」
本発明は、ＨＣＶ性肝硬変患者に対する感染状態の肝臓摘出後の肝移植において、ＨＣＶ性肝炎の再発防止法の開発を目的として検討を行ったものである。しかし、このようなＨＣＶ感染患者の肝摘出後の肝移植における再発防止に限定されず、ＨＣＶ感染の可能性のある場合には、本発明を適時修正して適用できる。例えば、ＨＣＶ患者と接触した場合や、ＨＣＶ患者の血液、体液等と接触した場合等の、ＨＣＶ感染の可能性があると判断される場合には、ＨＣＶの初期感染防御手段として応用できる。その場合、摘出した肝臓を灌流して得たＮＫ細胞ではなく、末梢血から得たＮＫ細胞を用いることにすれば、本発明を応用することができる。
【００２５】
本発明者らは、生体肝移植の際に移植片（グラフト）用の肝から採取した正常肝ＮＫ細胞をＩＬ−２存在下で培養した場合にＨＣＶの感染抵抗性増強することを見出した。これは、ＨＣＶ肝硬変患者に肝摘出後の新しい肝を移植した後において、本発明の治療剤等を投与することにより、抗ＨＣＶ治療効果又は予防効果が得られることを意味し、また、ＨＣＶ肝硬変患者に肝摘出後の新しい肝を移植した後において、抗ＣＤ８１抗体を投与することにより、また、抗ＣＤ８１抗体又は／及びＩＬ−２で活性化したＮＫ細胞の投与は、抗ＨＣＶ治療効果又は予防効果が得られることを意味し、これは、ＨＣＶ肝硬変患者に対する肝移植後に、ＩＬ−２で活性化処理した肝臓由来ＮＫ細胞を、肝移植の後に、患者に移入することは、ＨＣＶ再発の予防法又は治療法となりうることを示唆する。
【００２６】
（８）「拒絶反応への対策」
ＣＤ８１分子は外来抗原に対する獲得免疫応答を司るＴ細胞上にも表出しているため、抗ＣＤ８１抗体を生体に使用する場合、獲得免疫応答に与える副作用のおそれがある。そこで、本発明者らは、このような危惧を検討するために、可溶性抗ＣＤ８１抗体が異系Ｔ細胞応答に及ぼす影響を検討したところ、可溶性抗ＣＤ８１抗体の処理の前後で、ヘルパーＴ細胞を示す抗原（ＣＤ４＋）及び細胞傷害性Ｔ細胞を示す抗原（ＣＤ８＋）の量に変化はなく、異系Ｔ細胞応答に影響を与えないことを確認した（図２）。本発明のＨＣＶ感染治療剤又は予防剤の一つである抗ＣＤ８１抗体は異系Ｔ細胞応答に影響を及ぼさず、移植後の拒絶反応を助長することはないと考えられる。
【００２７】
さらに、臨床応用の際には、肝臓移植における免疫反応への対策を万全とするために、移植片対宿主反応を引き起こす原因であると考えられているＣＤ５６陰性ＣＤ３陽性Ｔ細胞を、本発明の治療剤又は予防剤から、除去処理することを、人体への投与前に行う必要がある。そのためにＣＤ５６陰性ＣＤ３陽性Ｔ細胞除去するため抗ＣＤ３抗体で処理する操作により、本発明のＩＬ−２により活性化したＮＫ細胞の抗ＨＣＶ活性が失われないことが必要である。そこで、そのことを検討したところ、図４Ａの実験結果が示すように、抗ＣＤ３抗体処理により、混在するＣＤ３陽性細胞が除去できることを確認し、さらに、抗ＣＤ３抗体処理によりＩＬ−２により活性化したＮＫ細胞の抗ＨＣＶ効果を維持し、本発明の有効性に影響を与えないことが確認できた（図４Ｂ）。
【００２８】
ここで、抗ＣＤ３抗体としては、市販のオルソクローン（登録商標）（OKT3）（ヤンセン協和株式会社）を用いることができる。抗ＣＤ３抗体を用いた所定の処理について説明する。ＮＫ細胞を含むリンパ球けん濁液を抗ＣＤ３抗体（オルソクローン）での処理は、本発明のＨＣＶ治療剤又は予防剤の投与６時間前から４８時間前、好ましくは、１２時間から２４時間前から行うことが望ましい。このための抗ＣＤ３抗体の濃度は、0.5から2μg/mlの範囲、好ましくは1μg/mlであり、常法の組織培養の手法により培養することで処理できる。このような処理により、移植片対宿主反応（graft-vs-host  disease）を予防することができる。
【００２９】
（９）「本発明の治療剤又は予防剤の組成」  
本発明の治療剤又は予防剤は、前述した項目（６）に記載の「ＮＫ細胞と抗ＣＤ８１抗体の組み合わせによる治療剤又は予防剤」に示す種類があるが、それによれば、ＮＫ細胞活性化剤、活性化剤により活性化したＮＫ細胞、抗ＣＤ８１抗体からなるが、その中で「ＮＫ細胞」は、生きた細胞でなければならない。そのため、本発明の治療剤又は予防剤は、ＮＫ細胞を含む細胞けん濁液の状態又は細胞ペレットの状態が好ましく、その治療剤又は予防剤は、ＮＫ細胞が十分に活性化された後は、使用されるまでの間は、低温で保存されることが好ましい。低温とは、０℃から10℃、好ましくは、２から７℃の範囲である。
そして、本発明の治療剤等が、当該ＮＫ細胞を含む細胞けん濁液の場合は、有効成分の他に、ｐＨ調整剤、浸透圧調整剤、その他、薬学的に許容される成分を適宜含有することができるものである。
一方、抗ＣＤ８１抗体の投与は、前記の活性化したＮＫ細胞とは、別の溶液として投与されることが望ましいが、該ＮＫ細胞のけん濁液中に抗ＣＤ８１抗体を含んでいてもよい。また、抗ＣＤ3抗体でさらに処理する場合は、抗ＣＤ３抗体で処理後は、当該ＣＤ３抗体は、除去できるため、残余の該抗体をほぼ完全に除去することが好ましい。
【００３０】
（１０）「本発明の治療剤又は予防剤の投与経路、投与回数、投与量」  
本発明の治療剤又は予防剤は、注射又は点滴により人体の血管に投与することが好ましい。特に、活性化処理されたＮＫ細胞は、肝臓へ定着しやすい部位からの注射又は点滴により投与されることが好ましい。活性化処理したＮＫ細胞および抗ＣＤ８１抗体の投与は、１回投与に限られず、最大の効果を発揮させるためには、数回にわけて投与される場合もある。また、活性化処理したＮＫ細胞の投与と、抗ＣＤ８１抗体の投与は、同一の場合もあるが、各々別の投与スケジュールで投与する方がより優れた効果を発揮する場合もあり得るので、原則的には、各々別の投与スケジュールにより投与されるべきである。
これらの本発明の治療剤又は予防剤の投与は、ＨＣＶの感染が想定される前後に投与されることが望ましい。特に、本発明の治療剤又は予防剤の有効な投与法（使用法）は、ＨＣＶ感染患者の肝臓移植の後に本発明の治療剤又は予防剤を投与することである。かかる投与法により、ＨＣＶ感染の再発が、効果的に防止できるからである。
本発明の治療剤又は予防剤の投与量について、活性化したＮＫ細胞の場合は、一回の投与につき、１０６個から１０９個、好ましくは、１０７個から１０８個を静脈内注射又は点滴により投与することができる。抗ＣＤ８１抗体の場合は、抗体価により異なるが、１回つき、アルブミン量として１ｇ〜12．5ｇを、好ましくは、２〜６ｇを緩徐に投与する。抗ＣＤ８１抗体と活性化ＮＫ細胞を組み併せて投与する場合の各々の投与量は、単独の場合の投与量を基準にして、それに該抗体又は該ＮＫ細胞の投与量を追加する方式で投与することができる。
以下に、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
[実施例１]  [抗ＣＤ８１抗体の投与によるＮＫ活性の増強]（図１）
ヒト末梢血ＮＫ細胞（ｎ＝６）を抗ＣＤ８１抗体でコーティングしたフラスコを用い（Ｅ２蛋白によるＣＤ８１分子の架橋モデル）、可溶性抗ＣＤ８１抗体（５μg/ml）(抗ＣＤ８１可溶性抗体)  の存在・非存在下で培養し、ＮＫ活性をＫ５６２細胞株に対する傷害活性を測定することで評価した。
抗ＣＤ８１抗体は、マウスをヒトＣＤ８１分子で感作後、体内で当該抗体を生産するＢリンパ球をクローニングして作製されたモノクローナル抗体（Purified  mouse  anti-human  CD81  monoclonal  antibody）（BD  Pharmingen社製）を使用した。
【００３２】
フラスコ底面を抗ＣＤ８１抗体コーティングには、５μg/mlの濃度の抗CD81抗体を含んだ培養液を１２時間静置して行った。実験群は、コーティング無しのフラスコを用い、可溶性抗ＣＤ８１抗体の非存在下でＮＫ細胞を培養したもの（図１中、無処置（…◆…））、コーティングしていないフラスコを用いて可溶性抗ＣＤ８１分子抗体の存在下でＮＫ細胞を培養したもの（抗ＣＤ８１可溶性抗体（―■―））、抗ＣＤ81抗体でコーティングしたフラスコを用い、可溶性抗ＣＤ８１分子抗体の非存在下でＮＫ細胞を培養した場合（架橋（―▲―））、抗ＣＤ８１抗体でコーティングしたフラスコを用いて可溶性抗ＣＤ８１分子抗体の存在下でＮＫ細胞を培養した場合（抗ＣＤ８１可溶性抗体+架橋(―X―)）の各々示す。この試験の結果から、最も強いＮＫ活性は、抗ＣＤ８１抗体でコーティングしたフラスコを用いて、可溶性抗ＣＤ８１抗体の存在下でＮＫ細胞を培養した場合(抗ＣＤ８１可溶性抗体+架橋；―X―)で得られた。ＮＫ細胞上のＣＤ８１分子が架橋されるとＮＫ活性は減弱したが、可溶性抗ＣＤ８１抗体が結合すると、ＮＫ細胞機能は逆に増強した（図１）。可溶性抗ＣＤ８１抗体の作用は、架橋形成の初期に間に合うと効果が強いことがわかる。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
[試験例２]  [リンパ球混合培養試験における細胞傷害性T細胞（ＣＤ８＋T細胞）とヘルパーT細胞（ＣＤ４＋T細胞）に対する抗ＣＤ８１抗体の影響]
カルボキシフルオレッセイン  ジアセテイト  サクシニミジルエステル（Carboxyfluorescein  diacetate  succinimidyl  ester、以下、「ＣＦＳＥ」と略す。)で細胞質染色したヒト末梢血リンパ球を抗ＣＤ８１抗体でコーティングしたフラスコを用い（Ｅ２蛋白によるＣＤ８１の架橋を模倣したもの）可溶性抗ＣＤ８１抗体（５μg/ml）の存在下及び非存在下で放射線照射した異系リンパ球と共培養し、同種異系Ｔ細胞性免疫応答を評価した（リンパ球混合試験）（図２）。先ず、二人のボランティアからヒト末梢血リンパ球を採取し、一方の末梢血リンパ球に30Ｇｙの放射線照射を行い刺激細胞とした。他方の末梢血リンパ球は、ＣＳＦＥ(Molecular  Probes,  Inc.,  Eugene,  OR)を５μＭの濃度で染色し反応細胞（末梢血から採取したＮＫ細胞であって、CFSEで染色したものを「反応細胞」という。）とした。2×106  個/mlの刺激細胞と反応細胞を１：１の割合で、通常の細胞培養用培地を用いて５％炭酸ガス培養器を用い３７０Ｃで５日間培養した。この試験系では、細胞分裂が起きるとＣＦＳＥの蛍光強度が低下するため、ＣＦＳＥの蛍光強度によってＣＤ４＋Ｔ細胞（ヘルパーT細胞）あるいはＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞性）の免疫応答を定量的に評価することができる。この試験により、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）あるいはＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞傷害性T細胞）の活性を測定したところ、抗ＣＤ８１抗体の投与によりＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞の分裂・増殖の程度に変化はみられなかった。この場合は、ＣＤ８１分子の架橋と可溶性抗ＣＤ８１抗体が同時にＴ細胞に結合しても、同種異系Ｔ細胞性免疫応答を増強することはなく、かえってやや抑制した(図２)。この結果は、抗ＣＤ８１分子抗体の投与が肝移植後の拒絶反応を助長しないことを意味する。抗ＣＤ８１抗体の投与は移植後の獲得免疫応答に影響を与えないことがわかった（図２）。
【００３５】
[試験例３]  [IL-2により活性化したＮＫ細胞の細胞傷害性の増強]
Ｋ５６２を標的細胞としたＮＫ細胞の細胞傷害試験を行うために、ヒト末梢血ＮＫ細胞（n=6）をＩＬ−２（100  JRU/ml）存在下で３日間培養し（ここで、図３に示す試験において、無処理の場合も含めてすべてのものに、ＩＬ−２（100  JRU/ml）処理した。）、その後、抗ＣＤ８１抗体で被覆（コーティング）したフラスコを用い（Ｅ２蛋白によるＣＤ８１分子の架橋を模倣したモデル）、可溶性抗ＣＤ８１分子抗体（５μg/ml）の存在・非存在下で培養した。ＮＫ活性をＫ５６２細胞株に対する傷害活性として、測定した。その結果を図３に示した。
【００３６】
正常ＮＫ細胞をＩＬ−２存在下で培養した場合、Ｋ５６２細胞に対してＮＫ細胞の強い細胞傷害効果が確認された。このような結果は、ＣＤ８１分子の架橋に起因する機能抑制に対し抵抗性を獲得するものである。また、この結果は、ＩＬ−２非存在下で行った、図１に示す試験結果と比較すると、ＩＬ−２処理を行った場合（図２に示す各群）は、一様に高いＮＫ活性を示した。このことは、図１で示す試験では、架橋形成直前又は直後に抗ＣＤ８１抗体を用いた場合に、強いＮＫ活性の維持効果が得られたが、ＩＬ−２処理をすると、抗ＣＤ８１抗体処理しなくても、（抗ＣＤ８１抗体処理以上に）、強いＮＫ活性が得られたことを示した。すなわち、ＩＬ−２処理することにより、抗ＣＤ８１抗体を用いることなく、高いＮＫ活性を得ることが可能であることがわかった（図３）。
【００３７】
【表２】
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【００３８】
[試験例４][移植片対宿主反応（Graft-vs.-host  disease）を回避しうるドナー肝由来ＮＫ細胞の処理方法]（図４Ａ，Ｂ）
正常肝由来リンパ球をIL-2存在下で３日間培養し、次にオルソクローン（登録商標）（OKT3、ヤンセン協和社製）の存在下で１日間培養した。培養後ＣＤ３陽性Ｔ細胞の存在比率をフローサイトメーターで解析した。また、OKT３処理のＮＫ細胞活性に与える影響をHepG2細胞株を標的とした細胞傷害性試験によって評価した。ここで、NK細胞は、ＣＤ５６陽性ＣＤ３陰性であり、移植片対宿主反応（Graft-vs-host  Disease）の原因となるＴ細胞は、ＣＤ５６陰性ＣＤ３陽性細胞であるので、ＣＤ５６陽性細胞数及びＣＤ３陽性細胞数を測定した（図４）。OKT3処理後にはＣＤ３陽性Ｔ細胞をインビトロで消失させたことが確認できた（図４Ａ）。また、抗ＣＤ３抗体であるOKT3処理は、ＮＫ細胞の細胞傷害活性に影響を与えないことが確認できた（図４Ｂ）。
【００３９】
[試験例５]  [ＨＣＶ感染マウスに対する活性化ＮＫ細胞の治療効果]
ヒト肝細胞キメラマウスにＨＣＶ  RNA高値患者(genotype  Ib)の血清を移入し、ＨＣＶ持続感染モデルを作製した。摘出したヒト肝臓片から予め前述した方法に従って調整したＮＫ細胞を、IL-2（100JRU/ml）存在下で3日間処理することにより活性化したＮＫ細胞を準備した。このＨＣＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスに上記ヒト肝ＮＫ細胞2x107個を腹腔内に注入した。ＲＮＡの抽出をスミテスト（SMITEST  EX&D、  Genome  Science  Laboratories,  Tokyo,  Japan)を使用して行い、その後ライトサイクラー（Light  Cycler、  Roche  Diagnostic,  Japan,  Tokyo)を用いてPCRを行い血中ＨＣＶのｍＲＮＡ量の定量を行った。無治療対照群におけるヒト肝細胞キメラマウスの血中ＨＣＶ  ｍＲＮＡ量は持続高値を示したのに対して、ヒト肝活性化したＮＫ細胞移入１週間後から、血中ＨＣＶのｍＲＮＡ量が測定感度以下となった（表３、図５）。マウス血漿よりヒトアルブミン  エライザ測定キット（Human  Albumin  ELISA  Quantitation  Kit、  Bethyl  Laboratories  Inc.  Montgomery,  TX)を用いてヒトアルブミン量を測定した。ヒトアルブミン濃度とヒト肝細胞置換率・肝特異機能には、正の相関が認められるため、キメラマウスにおけるヒト肝細胞の機能・置換率を確認するためにアルブミン量の測定を行った。測定した結果、ヒト肝細胞由来のアルブミンは、無治療対照群ヒト肝細胞キメラマウスもヒト肝ＮＫ細胞移入マウスも同程度の量が検出され、このＨＣＶ感染マウスの治療試験において、血中アルブミン量については、変化は認められなかった（表４、図６）。
【００４０】
【表３】
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【００４１】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ＮＫ細胞の活性に及ぼす抗ＣＤ８１抗体の影響を示すグラフである。
【図２】リンパ球混合培養試験における細胞傷害性T細胞（ＣＤ８＋T細胞）とヘルパーT細胞（ＣＤ４＋T細胞）に及ぼす抗ＣＤ８１抗体の影響を示すグラフである。
【図３】肝臓由来ＮＫ細胞の細胞傷害活性に及ぼすＩＬ−２処理の影響を示すグラフである。縦軸はＮＫの細胞傷害活性を、横軸は、ＮＫ細胞と標的細胞（K562細胞）の比率を示す。
【図４】IL-2で活性化処理したリンパ球に対する抗ＣＤ3抗体処理の影響を示すグラフである。図４Ａは、ＣＤ５６陽性細胞とＣＤ３陽性細胞の比率を示し、図４Ｂは、IL-2活性化処理したＮＫ細胞を、さらに抗ＣＤ3抗体処理した場合と当該処理をしない場合におけるＮＫの細胞傷害性の比較した結果を示す。
【図５】ＨＣＶ感染マウスに対するIL-2で活性化したＮＫ細胞の治療効果を示す。ＨＣＶ量に相当するＨＣＶｍRNA量（縦軸）とＨＣＶ感染後の経過期間（週、横軸）の関係を示す。
【図６】ＨＣＶ感染マウスに対する活性化ＮＫ細胞の治療試験における血中アルブミン量の変化を示すグラフである。図５に示す試験で用いたマウスと同じ固体における血中アルブミン量を測定した結果を示す。
【図７】本発明における、ＨＣＶ由来Ｅ２タンパク質がＣＤ８１細胞表面抗原に結合する関係において、投与された抗ＣＤ８１抗体がそれを阻害する関係を示す説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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