(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ぺルオキシカルボン酸を生産させる方法であって、該方法は
ａ）以下を含む反応成分一式を提供すること：
１）以下からなる群より選択される少なくとも１つの基質：
ｉ）次式の構造を有するエステル：
［Ｘ］mＲ5
［式中、Ｘ＝式Ｒ6Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ6＝Ｃ１〜Ｃ７の直鎖、分枝鎖または環状のヒドロカルビル部分（該ヒドロカルビル部分は、場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換されており、Ｒ6は場合によりＲ6＝Ｃ２〜Ｃ７に関して１つまたはそれ以上のエーテル結合を含んでいる）であり；
Ｒ5＝Ｃ１〜Ｃ６の直鎖、分枝鎖または環状のヒドロカルビル部分（該ヒドロカルビル部分は、場合によりヒドロキシル基で置換されており；ここで、Ｒ5中の各炭素原子はただ１つのヒドロキシル基またはただ１つのエステル基を個々に含んでおり；Ｒ5は場合により１つまたはそれ以上のエーテル結合を含んでいる）であり；
ｍ＝１〜Ｒ5中の炭素原子数であり；かつ
該エステルは２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水溶解度を有している］；および
ii）以下の構造を有するグリセリド：
【化１】
0005677091.tif 000049
［式中、Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ7の直鎖または分枝鎖のアルキル（該アルキルは、場合により、ヒドロキシルまたはＣ1〜Ｃ4アルコキシ基で置換される）であり、Ｒ3およびＲ4はそれぞれ、ＨまたはＲ1Ｃ（Ｏ）である］；
iii）アセチル化単糖、アセチル化二糖およびアセチル化多糖からなる群より選択されるアセチル化糖；
２）過酸素源；および
３）酵素を含む酵素触媒（該酵素触媒は過加水分解活性を有し、そして配列番号８２に記載されたアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチドを含む）；ならびに
ｂ）該反応成分を適切な水性反応条件下で組み合わせることによって、ぺルオキシカルボン酸を生産させること、
を含む、方法。
【請求項２】
酵素的に生産されたぺルオキシカルボン酸組成物を用いて硬い表面または無生物を消毒する方法であって、該方法は以下：
ａ）以下を含む反応成分一式を提供すること：
１）以下からなる群より選択される少なくとも１つの基質：
ｉ）次式の構造を有するエステル：
［Ｘ］mＲ5
［式中、Ｘ＝式Ｒ6Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ6＝Ｃ１〜Ｃ７の直鎖、分枝鎖または環状のヒドロカルビル部分（該ヒドロカルビル部分は、場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換されており、Ｒ6は場合によりＲ6＝Ｃ２〜Ｃ７に関して１つまたはそれ以上のエーテル結合を含んでいる）であり；
Ｒ5＝Ｃ１〜Ｃ６の直鎖、分枝鎖または環状のヒドロカルビル部分（該ヒドロカルビル部分は、場合によりヒドロキシル基で置換されており；ここで、Ｒ5中の各炭素原子はただ１つのヒドロキシル基またはただ１つのエステル基を個々に含んでおり；Ｒ5は場合により１つまたはそれ以上のエーテル結合を含んでいる）であり；
ｍ＝１〜Ｒ5中の炭素原子数であり；かつ
該エステルは２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水溶解度を有している］；
ii）以下の構造を有するグリセリド：
【化２】
0005677091.tif 000050
［式中、Ｒ1は、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖または分枝鎖のアルキル（該アルキルは、場合により、ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されている）であり、Ｒ3およびＲ4はそれぞれ、ＨまたはＲ1Ｃ（Ｏ）である］；および
iii）アセチル化単糖、アセチル化二糖およびアセチル化多糖からなる群より選択されるアセチル化糖；
２）過酸素源；および
３）酵素を含む酵素触媒（該酵素触媒は過加水分解活性を有し、そして配列番号８２に記載されたアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチドを含む）；
ｂ）該反応成分を適切な水性反応条件下で合わせることによってぺルオキシカルボン酸を生産させること；ならびに
ｃ）該硬い表面または無生物を該ぺルオキシカルボン酸と接触させることによって該表面または該無生物を消毒すること
を含む、方法。
【請求項３】
反応成分を合わせることによって生産されたぺルオキシカルボン酸を希釈することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
硬い表面または無生物を、反応成分を合わせてから５分〜１６８時間以内に、好ましくは反応成分を合わせてから５分〜４８時間以内に、より好ましくは反応成分を合わせてから５分〜２時間以内にぺルオキシカルボン酸と接触させる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
硬い表面または無生物上において、生存可能な生物学的汚染物質の濃度の対数値が少なくとも３、好ましくは少なくとも５減少する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
酵素的に生産されたぺルオキシカルボン酸組成物を用いて硬い表面または無生物を消毒する方法であって、該方法は以下：
１）以下からなる群より選択される少なくとも１つの基質：
ｉ）次式の構造を有するエステル：
［Ｘ］mＲ5
［式中、Ｘ＝式Ｒ6Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ6＝Ｃ１〜Ｃ７の直鎖、分枝鎖または環状のヒドロカルビル部分（該ヒドロカルビル部分は、場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換されており、Ｒ6は場合によりＲ6＝Ｃ２〜Ｃ７に関して１つまたはそれ以上のエーテル結合を含んでいる）であり；
Ｒ5＝Ｃ１〜Ｃ６の直鎖、分枝鎖または環状のヒドロカルビル部分（該ヒドロカルビル部分は、場合によりヒドロキシル基で置換されており；ここで、Ｒ5中の各炭素原子はただ１つのヒドロキシル基またはただ１つのエステル基を個々に含んでおり；Ｒ5は場合により１つまたはそれ以上のエーテル結合を含んでいる）であり；
ｍ＝１〜Ｒ5中の炭素原子数であり；かつ
該エステルは２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水溶解度を有している］；
ii）以下の構造を有するグリセリド：
【化３】
0005677091.tif 000051
［式中、Ｒ1は、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖または分枝鎖のアルキル（該アルキルは、場合により、ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されている）であり、Ｒ3およびＲ4はそれぞれ、ＨまたはＲ1Ｃ（Ｏ）である］；および
ｉｉｉ）アセチル化単糖、アセチル化二糖およびアセチル化多糖からなる群より選択されるアセチル化糖；
２）過酸素源；および
３）酵素を含む酵素触媒（該酵素触媒は過加水分解活性を有し、そして配列番号８２に記載されたアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチドを含む）；
を含む一式の反応成分を適切な水性反応条件下で該硬い表面または無生物上で合わせ、
それによってぺルオキシカルボン酸を発生させることで該硬い表面または無生物を消毒することを含む、方法。
【請求項７】
ぺルオキシカルボン酸を希釈する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素が、配列番号８２に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
基質が、モノアセチン；ジアセチン；トリアセチン；モノプロピオニン；ジプロピオニン；トリプロピオニン；モノブチリン；ジブチリン；トリブチリン；グルコースペンタア
セタート；キシローステトラアセタート；アセチル化キシラン；アセチル化キシランフラグメント；β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート；トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール；トリ−Ｏ−アセチル−グルカール；１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオールのモノエステルまたはジエステル；およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
酵素が、ストリンジェントな条件下で配列番号８０、または配列番号８１にハイブリッド形成する核酸分子によってコードされる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ぺルオキシカルボン酸が、反応成分を合わせて５分〜２時間以内に少なくとも２０ｐｐｍの濃度で生産される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
生産されたペルオキシカルボン酸が、過酢酸、過プロピオン酸、過酪酸、過乳酸、過グリコール酸、過メトキシ酢酸、過β−ヒドロキシ酪酸、またはそれらの混合物である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
生産されたぺルオキシカルボン酸が過酢酸である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
酵素触媒が、微生物細胞、透過性を上げた微生物細胞、微生物細胞抽出物、部分精製酵素、または精製した酵素の形態である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
酵素触媒はカタラーゼ活性を欠失している、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００７年１１月２１日付で出願された米国特許出願第１１／９４３８７２号の一部継続出願であり、この全体的な内容は参考として本明細書中に組み込まれている。本願は、２００７年５月２日付で出願された米国特許出願第１１／７４３３５４号、２００６年１２月１２日付で出願された米国特許出願第１１／６３８，６３５号、２００５年１２月１３日付で出願された米国特許仮出願第６０／７５０，０９２号、および２００６年１０月２０日付で出願された米国特許仮出願第６０／８５３，０６５に関連し、これらの全体が参考として本明細書中に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、過酸の生合成、およびその場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）での酵素触媒作用の分野に関する。具体的には、構造的にセファロスポリンアセチル加水分解酵素（ＣＡＨ；Ｅ．Ｃ．３．１．１．４１）、およびアセチルキシランエステラーゼ（ＡＸＥ；Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２）などを含む炭水化物エステラーゼのＣＥ−７ファミリーに属するものとして同定されている酵素の過加水分解（ｐｅｒｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）活性を用いた過酸の生産方法を提供する。酵素的なプロセスによって、カルボン酸エステル基質から過カルボン酸が生産される。さらに、本明細書で説明される方法によって生産された過酸を含む消毒製剤を提供する。
【背景技術】
【０００３】
過酸組成物は、有効な抗菌剤であることが報告されている。硬い表面、肉製品、生きた植物組織、および医療用デバイスを、望ましくない微生物の増殖に関して清浄にする、消毒する、および／または衛生的にする方法が説明されている（特許文献１、２、３、４および５）。また過酸は、洗濯用洗剤用途用の漂白組成物を製造することにおいて有用であることも報告されている（特許文献６、７および８）。
【０００４】
過酸は、カルボン酸と過酸化水素との化学反応によって製造することができる（非特許文献１を参照）。この反応は通常、濃硫酸のような強い無機酸によって触媒される。過酸化水素とカルボン酸との反応は平衡反応であり、過酸の生産では、過剰な濃度の過酸化物および／またはカルボン酸の使用、または水の除去が好ましい。この過酸を生産する化学反応には、以下のような数々の不利益がある：ａ）過酸を含む溶液を用いた場合、過酸の生産で好んで用いられる高濃度のカルボン酸が、望ましくない悪臭を発生させる可能性があること、２）過酸は、溶液中で経時的に不安定であることが多く、使用前の貯蔵中に溶液中の過酸の濃度が減少すること、および３）触媒として濃硫酸を使用するためにその製剤は強い酸性であることが多いこと。
【０００５】
化学的な過酸の生産の上記不利益を克服する１つの方法は、強酸触媒の代わりに酵素触媒を用いることである。酵素触媒を使用ことによって、使用時および／または適用時の迅速な過酸の生産を可能にし、長期にわたる過酸溶液の貯蔵に伴う問題、および過酸濃度の変化を回避することができる。過酸化水素との直接的な化学反応によって過酸を生産するのに一般的に用いられる高濃度のカルボン酸は酵素的な過酸の生産では、必要ではなく、酵素触媒による反応は、このような化学反応で一般的に用いられる濃度よりもよりかなり低い濃度でカルボン酸エステルを基質として使用することができる。このような酵素反応は広範なｐＨにわたり行うことができるが、所定ｐＨでの酵素活性および安定性、ならびに、所定ｐＨでの過加水分解に対する基質特異性に依存する。
【０００６】
いくつかのエステラーゼ、リパーゼおよびプロテアーゼは、アルキルエステルの加水分解を触媒してそれに対応するカルボン酸を生産する能力を有する（式１）。
【化１】
0005677091.tif 000002
【０００７】
またいくつかのエステラーゼ、リパーゼおよびプロテアーゼは過加水分解活性も示し、アルキルエステルからの過酸の合成を触媒する（式２）。
【化２】
0005677091.tif 000003
【０００８】
非特許文献２は、過酸化水素によってアシル基質の過加水分解を触媒し、ペルオキシカルボン酸を形成する加水分解酵素（リパーゼ、エステラーゼおよびプロテアーゼ）の能力を調査し、水系中では、過加水分解は極めて低い効率でしか進行しないことを報告している。さらに彼等は、リパーゼおよびエステラーゼは、過カルボン酸をそれに対応するカルボン酸および過酸化水素に分解することを見出した。さらに彼等は、プロテアーゼは、水中でカルボン酸エステルを分解しないばかりか、その過加水分解も触媒しないことも見出した。著者らは、エステラーゼ、リパーゼおよびプロテアーゼは、一般に、水性環境中で、オクタン酸メチル、およびトリオクタノインのような単純エステルの過加水分解を触媒するのに適していないと結論付けている。
【０００９】
特許文献６は、漂白しようとする材料を、酸素を放出する無機過酸素化合物、アシルアルキルエステル、およびエステルを加水分解することができるエステラーゼまたはリパーゼを含む水溶液と接触させることによる、洗濯用洗剤用途のための漂白組成物の生産を説明している。
【００１０】
特許文献７は、プロテアーゼ酵素、過酸化水素源、および好ましくは化学的に過加水分解されないエステル基質を用いた、水溶液中過酸のその場生成のための活性化された酸化剤系を説明している。さらに漂白方法および過酸の形成方法も開示されている。
【００１１】
特許文献８は、１種またはそれ以上の特定のエステラーゼおよびリパーゼ、過酸化水素源、および漂白組成物に使用するのに適した官能化したエステル基質を含む水溶液中での過酸の生産を説明している。しかしながら、生産された過酸の濃度が、多くの商業的な消毒剤用途に使用するには不十分であることが多い。
【００１２】
酵素触媒を用いて過酸をそれに対応するカルボン酸エステルから製造するためのよく知られた方法のほとんどが、様々な用途において有効な消毒作用を示す程十分に高い濃度で過酸を生産し、それらを蓄積するものではない。近年、消毒剤および／または商業的な漂白剤として使用するのに適した濃度で過酸（例えば過酢酸）をその場生成する数種のプロテアーゼおよびリパーゼの組み合わせが報告されている（共同所有の特許文献９および１０を参照；参照により本明細書に組込まれる）。しかしながら、過酸をその場生産することができるさらなるペルヒドロラーゼ触媒を確認する必要が未だある。
【００１３】
特許文献１１は、２〜８個の炭素原子を有するアシル基を有するグリセロールエステルを加水分解することに対して高い特異性を有するエステルの加水分解酵素（「ジアセチナーゼ（ｄｉａｃｅｔｉｎａｓｅ）」として説明されている）活性を有するバチルス・ズブチリス株（ＡＴＣＣ３１９５４TM）を説明している。特許文献１１には、この株のエステルの加水分解酵素活性が、グリセロールエステルを含めてカルボン酸エステルに対して加水分解酵素活性を有するということについて記載されていないし、考察も予測もされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第６，５４５，０４７号
【特許文献２】米国特許第６，１８３，８０７号
【特許文献３】米国特許第６，５１８，３０７号
【特許文献４】米国公開特許公報第２００３００２６８４６号
【特許文献５】米国特許第５，６８３，７２４号
【特許文献６】米国特許第３，９７４，０８２号
【特許文献７】米国特許第５，３６４，５５４号
【特許文献８】米国特許第５，２９６，１６１号
【特許文献９】米国特許出願第１１／４１３，２４６号
【特許文献１０】米国特許出願第１１／５８８，５２３号
【特許文献１１】米国特許第４，４４４，８８６号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｅｒｏｘｉｄｅｓ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｓｗｅｒｎ編集，Ｖｏｌ．１，３１３〜５１６頁；Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７１
【非特許文献２】Ｏ．Ｋｉｒｋ等（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ，１１：６５−７７（１９９４））
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
解決すべき課題は、過酸を様々な消毒剤用途および／または漂白用途に使用するのに適した濃度で酵素的にその場（in situ）生産させる方法を提供することである。好ましくは、過酸組成物を生産するのに用いられる基質は、比較的非毒性であり、且つ廉価のものであり、例えば、カルボン酸エステル、特にモノ、ジおよびトリアシルグリセロール（ここにおいてアシル基は１〜８個の炭素原子を有する）、加えてアセチル化糖およびＣ１〜Ｃ６のポリオールエステルである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上述した課題は、ＣＥ−７エステラーゼの構造的なファミリーに属する酵素（例えば、セファロスポリンＣデアセチラーゼ［ＣＡＨ］、およびアセチルキシランエステラーゼ［ＡＸＥ］）が、本発明のカルボン酸エステルを、（無機の過酸素源、例えば過酸化水素の存在下で）消毒剤および／または漂白剤として使用するのに十分な濃度で過酸に変換するために有意な過加水分解活性を示すという発見によって解決した。このような系は、高濃度の過酸素を必要とすることなく過酸を高濃度で生成するために効率性を達成している。
【００１８】
ペルヒドロラーゼの具体的な例としては、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ３１９５４TM）、Ｂ．ズブチリスＢＥ１０１０（ＰａｙｎｅおよびＪａｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：２２７８−２２８２（１９９１））、Ｂ．ズブチリスＡＴＣＣ６６３３TM（米国特許第６，４６５，２３３号）、Ｂ．ズブチリスＡＴＣＣ２９２３３TM；Ｂ．リケニフォルミスＡＴＣＣ１４５８０TM（Ｒｅｙ等，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．，５（１０）：ａｒｔｉｃｌｅ  ７７（２００４））、クロストリジウム・テルモセルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＡＴＣＣ２７４０５TM（Ｃｏｐｅｌａｎｄ等，ＧＥＮＢＡＮＫ(R)ＺＰ＿００５０４９９１）、Ｂ．プミルスＰＳ２１３（Ｄｅｇｒａｓｓｉ等，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４６：１５８５−１５９１（２０００））、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)ＡＡＢ７０８６９．１）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭ−Ｋ１６（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)ＹＰ＿１７５２６５）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)ＮＰ＿２２７８９３．１）、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)Ｓ４１８５８）、サーモトガ・レティンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)ＣＰ０００８１２）、サーモトガ・ペトロフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ）（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)ＣＰ０００７０２）、およびサーモトガ種（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｓｐ．）ＲＱ２（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)ＣＰ０００９６９）が挙げられる。
【００１９】
本明細書において説明されるそれぞれの本発明のペルヒドロラーゼは、保存された構造的特徴（すなわち保存されたシグネチャーモチーフ）を共通して保持しており、それに加えて、他のα／β−加水分解酵素（例えば市販のリパーゼ；比較例２６および２８を参照）と比較した場合、優れた過加水分解活性も保持しており、このために、この特有の酵素ファミリーは、過酸を消毒剤および／または漂白剤として使用するのに十分な濃度でその場生成するのに特に適したものとなっている。本発明の方法において有用な適切なペルヒドロラーゼは、炭水化物エステラーゼのＣＥ−７ファミリー内で見出された保存されたシグネチャーモチーフによって同定することができる。
【００２０】
本発明の一側面において、カルボン酸エステルからペルオキシカルボン酸を生産する方法が提供され、該方法は
ａ）以下を含む反応成分一式を提供すること：
１）以下からなる群より選択される少なくとも１つの基質：
ｉ）次式の構造を有するエステル：
［Ｘ］mＲ5
［式中、Ｘ＝式Ｒ6Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ6＝Ｃ１〜Ｃ７の直鎖、分枝鎖または環状のヒドロカルビル部分（該ヒドロカルビル部分は、場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換されており、Ｒ6は場合によりＲ6＝Ｃ２〜Ｃ７に関して１つまたはそれ以上のエーテル結合を含んでいる）であり；
Ｒ5＝Ｃ１〜Ｃ６の直鎖、分枝鎖または環状のヒドロカルビル部分（該ヒドロカルビル部分は、場合によりヒドロキシル基で置換されており；ここで、Ｒ5中の各炭素原子はただ１つのヒドロキシル基またはただ１つのエステル基を個々に含んでおり；Ｒ5は場合により１つまたはそれ以上のエーテル結合を含んでいる）であり；
ｍ＝１〜Ｒ5中の炭素原子数であり；かつ
該エステルは２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水溶解度を有している］；
【００２１】
ｉｉ）以下の構造を有するグリセリド：
【化３】
0005677091.tif 000004
［式中、Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ7の直鎖または分枝鎖のアルキル（該アルキルは、場合により、ヒドロキシルまたはＣ1〜Ｃ4アルコキシ基で置換される）であり、Ｒ3およびＲ4はそれぞれ、ＨまたはＲ1Ｃ（Ｏ）である］；および
ｉｉｉ）アセチル化単糖、アセチル化二糖およびアセチル化多糖からなる群より選択されるアセチル化糖；
２）過酸素源；ならびに
３）過加水分解活性を有するペルヒドロラーゼ触媒（該酵素触媒はＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて参照配列の配列番号２にアラインしたＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、該シグネチャーモチーフは、以下を含む：
i）アミノ酸残基１１８〜１２０としてＲＧＱモチーフ；
ii）アミノ酸残基１７９〜１８３としてＧＸＳＱＧモチーフ；および
iii）アミノ酸残基２９８〜２９９としてＨＥモチーフ
ここでこの酵素もまた配列番号２と少なくとも３０％のアミノ酸同一性を含む；ならびに
ｂ）該反応成分を適切な水性反応条件下で組み合わせることによって、ぺルオキシカルボン酸を生産させること、
を含む。
【００２２】
別の実施態様において、適切な基質は以下の式のエステル：
【化４】
0005677091.tif 000005
［式中、Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ7の直鎖または分枝鎖のアルキル（該アルキルは、場合により、ヒドロキシル、またはＣ1〜Ｃ4アルコキシ基で置換される）であり、Ｒ2は、Ｃ1〜Ｃ10の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ）nＨ、または（ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ）nＨであり、
そしてｎは、１〜１０である］
も含む。
【００２３】
別の側面において、表面または無生物を消毒する方法が提供され、該方法は上記の方法に加えて以下の工程を含む：
ｃ）表面または無生物を工程（ｂ）にて生産されたぺルオキシカルボン酸と接触させることによって該表面または該無生物を消毒する工程。
【００２４】
別の側面において、酵素的に生産されたぺルオキシカルボン酸組成物を用いて硬い表面または無生物を消毒する方法が提供され、該方法は以下：
（ａ）該硬い表面または無生物を適切な水性反応条件下で以下を含む反応成分一式と合わせる工程：
１）以下からなる群より選択される少なくとも１つの基質：
ｉ）次式の構造を有するエステル：
［Ｘ］mＲ5
［式中、Ｘ＝式Ｒ6Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ6＝Ｃ１〜Ｃ７の直鎖、分枝鎖または環状のヒドロカルビル部分（該ヒドロカルビル部分は、場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換されており、Ｒ6は場合によりＲ6＝Ｃ２〜Ｃ７に関して１つまたはそれ以上のエーテル結合を含んでいる）であり；
Ｒ5＝Ｃ１〜Ｃ６の直鎖、分枝鎖または環状のヒドロカルビル部分（該ヒドロカルビル部分は、場合によりヒドロキシル基で置換されており；ここで、Ｒ5中の各炭素原子はただ１つのヒドロキシル基またはただ１つのエステル基を個々に含んでおり；Ｒ5は場合により１つまたはそれ以上のエーテル結合を含んでいる）であり；
ｍ＝１〜Ｒ5中の炭素原子数であり；かつ
該エステルは２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水溶解度を有している］；
【００２５】
ｉｉ）以下の構造を有するグリセリド：
【化５】
0005677091.tif 000006
［式中、Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ7の直鎖または分枝鎖のアルキル（該アルキルは、場合により、ヒドロキシルまたはＣ1〜Ｃ4アルコキシ基で置換される）であり、Ｒ3およびＲ4はそれぞれ、ＨまたはＲ1Ｃ（Ｏ）である］；および
ｉｉｉ）アセチル化単糖、アセチル化二糖およびアセチル化多糖からなる群より選択されるアセチル化糖；
２）過酸素源；および
３）過加水分解活性を有する酵素触媒（該酵素触媒は配列番号８２、配列番号９０、配列番号９８、および配列番号１０６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたは前記アミノ酸配列に１個またはそれ以上のアミノ酸を置換、欠失または付加することによって誘導されたペルヒドロラーゼ活性を有する実質的に類似した酵素である）；を含み、
それによってぺルオキシカルボン酸を発生させることで該硬い表面または無生物を消毒する、方法。
【００２６】
いくつかの実施態様において、生産されたぺルオキシカルボン酸は希釈される。
【００２７】
さらなる実施態様において、上記方法は、配列番号１８、配列番号２６、配列番号７０、配列番号８２、配列番号９０、配列番号９８および配列番号１０６または前記アミノ酸配列に１個またはそれ以上のアミノ酸を置換、欠失または付加することによって誘導されたペルヒドロラーゼ活性を有する実質的に類似した酵素からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む酵素触媒を含む。
【００２８】
さらなる実施態様において、前記ペルヒドロラーゼ活性を有する実質的に類似した酵素は、配列番号８２、配列番号９０、配列番号９８、および配列番号１０６からなる群より選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。
【００２９】
好ましい実施態様において、前記基質は、モノアセチン；ジアセチン；トリアセチン；モノプロピオニン；ジプロピオニン；トリプロピオニン；モノブチリン；ジブチリン；トリブチリン；グルコースペンタアセタート；キシローステトラアセタート；アセチル化キシラン；アセチル化キシランフラグメント；β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート；トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール；トリ−Ｏ−アセチル−グルカール；１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオールのモノエステルまたはジエステル；およびこれらの混合物からなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】本発明のペルヒドロラーゼのＣＬＵＳＴＡＬＷアライメントである。これらペルヒドロラーゼはそれぞれ、構造的に炭水化物エステラーゼファミリー７（ＣＥ−７）に属するものと分類されており、一定の保存されたドメインを共有する。いくつかの保存されたモチーフ（下線で示した）は、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼについてのシグネチャーモチーフを一緒になって形成することが確認されている。また、さらなるモチーフ（ＬＸＤ；配列番号２のアミノ酸残基２６７〜２６９）も下線で示したが、これはシグネチャーモチーフをさらに特徴付けるのに用いてもよい。
【図１Ｂ】本発明のペルヒドロラーゼのＣＬＵＳＴＡＬＷアライメントである。これらペルヒドロラーゼはそれぞれ、構造的に炭水化物エステラーゼファミリー７（ＣＥ−７）に属するものと分類されており、一定の保存されたドメインを共有する。いくつかの保存されたモチーフ（下線で示した）は、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼについてのシグネチャーモチーフを一緒になって形成することが確認されている。また、さらなるモチーフ（ＬＸＤ；配列番号２のアミノ酸残基２６７〜２６９）も下線で示したが、これはシグネチャーモチーフをさらに特徴付けるのに用いてもよい。
【図１Ｃ】本発明のペルヒドロラーゼのＣＬＵＳＴＡＬＷアライメントである。これらペルヒドロラーゼはそれぞれ、構造的に炭水化物エステラーゼファミリー７（ＣＥ−７）に属するものと分類されており、一定の保存されたドメインを共有する。いくつかの保存されたモチーフ（下線で示した）は、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼについてのシグネチャーモチーフを一緒になって形成することが確認されている。また、さらなるモチーフ（ＬＸＤ；配列番号２のアミノ酸残基２６７〜２６９）も下線で示したが、これはシグネチャーモチーフをさらに特徴付けるのに用いてもよい。
【００３１】
生物学的な配列の簡単な説明
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に準拠し、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）、ならびに、欧州特許条約（ＥＰＣ）および特許協力条約（ＰＣＴ）の規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）ならびに細則２０８および実施細則の付属書Ｃに記載の配列表の要件に従う。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データで用いられる記号および様式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載されている規則に準拠する。
【００３２】
配列番号１は、バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TM由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼ（ｃａｈ）のコード領域の核酸配列である。
【００３３】
配列番号２は、バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TM由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００３４】
配列番号３および４は、ｐＳＷ１８６、ｐＳＷ１８７、ｐＳＷ１８８およびｐＳＷ１９０を構築するためにバチルス・ズブチリス種由来のペルヒドロラーゼ遺伝子をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマーである。
【００３５】
配列番号５は、Ｂ．ズブチリス亜種のズブチリス株１６８由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００３６】
配列番号６は、Ｂ．ズブチリス亜種のズブチリス株１６８由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列であり、Ｂ．ズブチリスＢＥ１０１０由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列と同一である。
【００３７】
配列番号７は、Ｂ．ズブチリスＡＴＣＣ６６３３TM由来のセファロスポリンアセチルエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００３８】
配列番号８は、Ｂ．ズブチリスＡＴＣＣ６６３３TM由来のセファロスポリンアセチルエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号９は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ１４５８０TM由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００４０】
配列番号１０は、Ｂ．リケニフォルミスＡＴＣＣ１４５８０TM由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号１１は、Ｂ．プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）ＰＳ２１３由来のアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００４２】
配列番号１２は、Ｂ．プミルスＰＳ２１３由来のアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号１３は、クロストリジウム・テルモセルムＡＴＣＣ２７４０５TM由来のアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００４４】
配列番号１４は、クロストリジウム・テルモセルムＡＴＣＣ２７４０５TM由来のアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号１５は、サーモトガ・ネアポリタナ由来のアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００４６】
配列番号１６は、サーモトガ・ネアポリタナ由来のアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００４７】
配列番号１７は、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍｅ）ＭＳＢ８由来のアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００４８】
配列番号１８は、サーモトガ・マリティマＭＳＢ８由来のアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００４９】
配列番号１９は、サーモアナエロバクテリウム属のＪＷ／ＳＬ  ＹＳ４８５由来のアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００５０】
配列番号２０は、サーモアナエロバクテリウム属のＪＷ／ＳＬ  ＹＳ４８５由来のアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号２１は、バチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−１４９１１由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００５２】
配列番号２２は、バチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−１４９１１由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００５３】
配列番号２３は、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）Ｃ−１２５由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００５４】
配列番号２４は、バチルス・ハロデュランスＣ−１２５由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００５５】
配列番号２５は、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭ−Ｋ１６由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００５６】
配列番号２６は、バチルス・クラウシイＫＳＭ−Ｋ１６由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００５７】
配列番号２７および２８は、ｐＳＷ１９４およびｐＳＷ１８９を構築するためにバチルス・ズブチリス種由来のペルヒドロラーゼ遺伝子をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマーである。
【００５８】
配列番号２９は、ｐＳＷ１９４にクローニングしたＰＣＲ産物の核酸配列である。
【００５９】
配列番号３０は、ｐＳＷ１８９にクローニングしたＰＣＲ産物の核酸配列である。
【００６０】
配列番号３１は、ｐＳＷ１９０にクローニングしたバチルス・ズブチリスＡＴＣＣ２９２３３TMのセファロスポリンＣデアセチラーゼ（ｃａｈ）遺伝子の核酸配列である。
【００６１】
配列番号３２は、バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ２９２３３TMのセファロスポリンＣデアセチラーゼ（ＣＡＨ）の推定アミノ酸配列である。
【００６２】
配列番号３３および３４は、ｐＳＷ１９１を構築するために、バチルス・リケニフォルミスＡＴＣＣ１４５８０TMのセファロスポリンＣデアセチラーゼ遺伝子をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマーである。
【００６３】
配列番号３５および３６は、ｐＳＷ１９３を構築するために、クロストリジウム・テルモセルムＡＴＣＣ２７４０５TMのアセチルキシランエステラーゼ遺伝子をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマーである。
【００６４】
配列番号３７および３８は、ｐＳＷ１９５を構築するために、バチルス・プミルスＰＳ２１３のアセチルキシランエステラーゼのコード配列（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)ＡＪ２４９９５７）をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマーである。
【００６５】
配列番号３９および４０は、ｐＳＷ１９６を構築するために、サーモトガ・ネアポリタナのアセチルキシランエステラーゼ遺伝子（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)５８６３２）をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマーである。
【００６６】
配列番号４１は、プラスミドｐＳＷ１９６中のサーモトガ・ネアポリタナのアセチルキシランエステラーゼ遺伝子のコドンが最適化された型の核酸配列である。
【００６７】
配列番号４２は、カナマイシン耐性遺伝子の核酸配列である。
【００６８】
配列番号４３は、プラスミドｐＫＤ１３の核酸配列である。
【００６９】
配列番号４４および４５は、Ｅ．コリＭＧ１６５５中で、ｋａｔＧカタラーゼ遺伝子に相同性を有する領域に隣接したカナマイシン遺伝子をコードするＰＣＲ産物を生成するのに用いられるプライマーである。この産物は、内因性ｋａｔＧ遺伝子を破壊するために用いられた。
【００７０】
配列番号４６は、Ｅ．コリＭＧ１６５５中でｋａｔＧカタラーゼ遺伝子に相同性を有する領域に隣接したカナマイシン耐性遺伝子をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。この産物は、内因性ｋａｔＧ遺伝子を破壊するために用いられた。
【００７１】
配列番号４７は、Ｅ．コリＭＧ１６５５中におけるｋａｔＧカタラーゼ遺伝子の核酸配列である。
【００７２】
配列番号４８は、Ｅ．コリＭＧ１６５５におけるＫａｔＧカタラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００７３】
配列番号４９は、プラスミドｐＫＤ４６の核酸配列である。
【００７４】
配列番号５０および５１は、ｋａｔＧ遺伝子の破壊を確認するのに用いられるプライマーである。
【００７５】
配列番号５２は、プラスミドｐＣＰ２０の核酸配列である。
【００７６】
配列番号５３および５４は、Ｅ．コリＭＧ１６５５中でｋａｔＥカタラーゼ遺伝子に相同性を有する領域に隣接したカナマイシン遺伝子をコードするＰＣＲ産物を生成するのに用いられるプライマーである。この産物は、内因性ｋａｔＥ遺伝子を破壊するために用いられた。
【００７７】
配列番号５５は、Ｅ．コリＭＧ１６５５中で、ｋａｔＥカタラーゼ遺伝子に相同性を有する領域に隣接したカナマイシン耐性遺伝子をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。この産物は、内因性ｋａｔＥ遺伝子を破壊するために用いられた。
【００７８】
配列番号５６は、Ｅ．コリＭＧ１６５５中でのｋａｔＥカタラーゼ遺伝子の核酸配列である。
【００７９】
配列番号５７は、Ｅ．コリＭＧ１６５５中でのｋａｔＥカタラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００８０】
配列番号５８および５９は、１回のノックアウト株Ｅ．コリＭＧ１６５５ΔｋａｔＥ、および二重のノックアウト株Ｅ．コリＭＧ１６５５ΔｋａｔＧΔｋａｔＥにおけるｋａｔＥ遺伝子の破壊を確認するのに用いられるプライマーである（本明細書においてＥ．コリＫＬＰ１８と称される）。
【００８１】
配列番号６０は、配列番号１２のアミノ酸配列をコードするバチルス・プミルスＰＳ２１３のコドンが最適化された型の核酸配列である。
【００８２】
配列番号６１は、配列番号２のアミノ酸残基１１８〜２９９を取り囲む領域のアミノ酸配列である。
【００８３】
配列番号６２および６３は、バチルス・クラウシイ  ＫＳＭ−Ｋ１６  セファロスポリン−Ｃデアセチラーゼのコドンが最適化された型をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマーの核酸配列である。
【００８４】
配列番号６４は、バチルス・クラウシイ  ＫＳＭ−Ｋ１６  セファロスポリン−Ｃデアセチラーゼのコード配列のコドンが最適化された型をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。
【００８５】
配列番号６５は、コドンが最適化されたバチルス・クラウシイ  ＫＳＭ−Ｋ１６  セファロスポリン−Ｃデアセチラーゼのコード配列の核酸配列である。
【００８６】
配列番号６６および６７は、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカムアセチルキシランエステラーゼのコード領域のコドンが最適化された型（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)登録番号Ｓ４１８５８）をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマーの核酸配列である。
【００８７】
配列番号６８は、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカムアセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドンが最適化された型をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。
【００８８】
配列番号６９は、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカムアセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドンが最適化された型の核酸配列である。
【００８９】
配列番号７０は、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム由来のアセチルキシランエステラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)登録番号Ｓ４１８５８）の推定アミノ酸配列である。
【００９０】
配列番号７１および７２は、サーモトガ・マリティマ  ＭＳＢ８（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)登録番号ＮＰ＿２２７８９３．１）アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドンが最適化された型をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマーの核酸配列である。
【００９１】
配列番号７３は、サーモトガ・マリティマ  ＭＳＢ８アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドンが最適化された型をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。
【００９２】
配列番号７４は、サーモトガ・マリティマ  ＭＳＢ８アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドンが最適化された型の核酸配列である。
【００９３】
配列番号７５および７６は、サーモトガ・レティンガエ（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)登録番号ＣＰ０００８１２）アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドンが最適化された型をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマーの核酸配列である。
【００９４】
配列番号７７は、サーモトガ・レティンガエアセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドンが最適化された型をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。
【００９５】
配列番号７８および７９は、サーモトガ・レティンガエ  （ＧＥＮＢＡＮＫ(R)登録番号ＣＰ０００８１２）アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドンが最適化された型をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマーの核酸配列である。
【００９６】
配列番号８０は、サーモトガ・レティンガエアセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドンが最適化された型をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。
【００９７】
配列番号８１は、サーモトガ・レティンガエ由来のアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００９８】
配列番号８２は、サーモトガ・レティンガエ由来のアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００９９】
配列番号８３および８４は、サーモトガ・ペトロフィラ  （ＧＥＮＢＡＮＫ(R)登録番号ＣＰ０００７０２）アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドンが最適化された型をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマーの核酸配列である。
【０１００】
配列番号８５は、サーモトガ・ペトロフィラアセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドンが最適化された型をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。
【０１０１】
配列番号８６および８７は、サーモトガ・ペトロフィラ  （ＧＥＮＢＡＮＫ(R)登録番号ＣＰ０００７０２）アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドンが最適化された型をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマーの核酸配列である。
【０１０２】
配列番号８８は、サーモトガ・ペトロフィラアセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドンが最適化された型をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。
【０１０３】
配列番号８９は、サーモトガ・ペトロフィラ由来のアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【０１０４】
配列番号９０は、サーモトガ・ペトロフィラ由来のアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【０１０５】
配列番号９１および９２は、サーモトガ種  ＲＱ２「ＲＱ２（ａ）」（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)登録番号ＣＰ０００９６９）アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドンが最適化された型をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマーの核酸配列である。
【０１０６】
配列番号９３は、サーモトガ種  ＲＱ２「ＲＱ２（ａ）」アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドンが最適化された型をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。
【０１０７】
配列番号９４および９５は、サーモトガ種  ＲＱ２「ＲＱ２（ａ）」（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)登録番号ＣＰ０００９６９）アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドンが
最適化された型をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマーの核酸配列である。
【０１０８】
配列番号９６は、サーモトガ種  ＲＱ２「ＲＱ２（ａ）」アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドンが最適化された型をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。
【０１０９】
配列番号９７は、「ＲＱ２（ａ）」として本明細書中で同定されているサーモトガ種ＲＱ２由来のアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【０１１０】
配列番号９８は、「ＲＱ２（ａ）」として本明細書中で同定されているサーモトガ種  ＲＱ２由来のアセチルキシランエステラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)登録番号ＡＣＢ０９２２２）の推定アミノ酸配列である。
【０１１１】
配列番号９９および１００は、サーモトガ種  ＲＱ２「ＲＱ２（ｂ）」  （ＧＥＮＢＡＮＫ(R)登録番号ＣＰ０００９６９）アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドンが最適化された型をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマーの核酸配列である。
【０１１２】
配列番号１０１は、サーモトガ種  ＲＱ２「ＲＱ２（ｂ）」アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドンが最適化された型をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。
【０１１３】
配列番号１０２および１０３は、サーモトガ種  ＲＱ２「ＲＱ２（ｂ）」（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)登録番号ＣＰ０００９６９）アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドンが最適化された型をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマーの核酸配列である。
【０１１４】
配列番号１０４は、サーモトガ種  ＲＱ２「ＲＱ２（ｂ）」アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドンが最適化された型をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。
【０１１５】
配列番号１０５は、「ＲＱ２（ｂ）」として本明細書中で同定されているサーモトガ種ＲＱ２由来のアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【０１１６】
配列番号１０６は、「ＲＱ２（ｂ）」として本明細書中で同定されているサーモトガ種ＲＱ２由来のアセチルキシランエステラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)登録番号ＡＣＢ０８８６０）の推定アミノ酸配列である。
【０１１７】
発明の詳細な説明
上述した課題は、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属する酵素が、カルボン酸エステル基質を過酸に変換するのに有意な過加水分解活性を示すという発見によって解決した。消毒および／または漂白用途のために、この構造的に関連する酵素ファミリーを用いて、高い効率で過酸濃度を生成させることができる。
【０１１８】
この開示において、多数の用語および略語が用いられる。特に他の規定がない限り、以下の定義が適用される。
【０１１９】
本明細書で用いられる用語「〜を含む」は、述べられた特徴、整数、工程または構成要素が請求項で述べられるように存在することを意味するが、１つまたはそれ以上の他の特徴、整数、工程、構成要素またはそれらの群の存在もしくは付加を排除するものではない。
【０１２０】
本明細書で用いられる、用いられた成分もしくは反応物の量を修飾する「約」という用語は、例えば、現実での濃縮物または使用溶液を作製するのに用いられる典型的な測定手順および液体の取り扱い手順を通して；これらの手順中での意図しないエラーを通して；
本組成物を作製したり、または本方法を実施したりするのに用いられる成分の製造、供給源または純度の相違を通して発生し得る数量の変動を意味する。また用語「約」は、特定の最初の混合物から得られた組成物の種々の平衡状態に起因して相違する量も包含する。用語「約」で修飾されているかどうかにかかわらず、請求項は、その量の均等も含む。
【０１２１】
本明細書で用いられる用語「過酸」は、ペルオキシ酸（ｐｅｒｏｘｙａｃｉｄ）、ペルオキシカルボン酸、ペルオキシ酸（ｐｅｒｏｘｙ  ａｃｉｄ）、過カルボン酸、およびペルオキソ酸（ｐｅｒｏｘｏｉｃ  ａｃｉｄ）と同義である。
【０１２２】
本明細書で用いられる用語「過酢酸」は「ＰＡＡ」のように略記され、ペルオキシ酢酸、エタンペルオキシ酸、およびＣＡＳレジストリ番号７９−２１−０の全てのその他の同義語と同義である。
【０１２３】
本明細書で用いられる用語「モノアセチン」は、グリセロールモノアセテート、グリセリンモノアセテート、およびグリセリルモノアセテートと同義である。
【０１２４】
本明細書で用いられる用語「ジアセチン」は、グリセロールジアセテート；グリセリンジアセテート、グリセリルジアセテート、およびＣＡＳレジストリ番号２５３９５−３１−７の全てのその他の同義語と同義である。
【０１２５】
本明細書で用いられる用語「トリアセチン」は、グリセリントリアセテート；グリセロールトリアセテート；グリセリルトリアセテート、１，２，３−トリアセトキシプロパン、１，２，３−プロパントリオールトリアセテート、およびＣＡＳレジストリ番号１０２−７６−１の全てのその他の同義語と同義である。
【０１２６】
本明細書で用いられる用語「モノブチリン」は、グリセロールモノブチラート、グリセリンモノブチラート、およびグリセリルモノブチラートと同義である。
【０１２７】
本明細書で用いられる用語「ジブチリン」は、グリセロールジブチラート、およびグリセリルジブチラートと同義である。
【０１２８】
本明細書で用いられる用語「トリブチリン」は、グリセロールトリブチラート、１，２，３−トリブチリルグリセロール、およびＣＡＳレジストリ番号６０−０１−５の全てのその他の同義語と同義である。
【０１２９】
本明細書で用いられる用語「モノプロピオニン」は、グリセロールモノプロピオナート、グリセリンモノプロピオナート、およびグリセリルモノプロピオナートと同義である。
【０１３０】
本明細書で用いられる用語「ジプロピオニン」は、グリセロールジプロピオナート、およびグリセリルジプロピオナートと同義である。
【０１３１】
本明細書で用いられる用語「トリプロピオニン」は、グリセリルトリプロピオナート、グリセロールトリプロピオナート、１，２，３−トリプロピオニルグリセロール、およびＣＡＳレジストリ番号１３９−４５−７の全てのその他の同義語と同義である。
【０１３２】
本明細書で用いられる用語「酢酸エチル」は、酢酸エーテル、アセトキシエタン、エチルエタノアート、酢酸エチルエステル、エタン酸エチルエステル、エチル酢酸エステル、およびＣＡＳレジストリ番号１４１−７８−６の全てのその他の同義語と同義である。
【０１３３】
本明細書で用いられる用語「乳酸エチル」は、乳酸エチルエステル、およびＣＡＳレジストリ番号９７−６４−３の全てのその他の同義語と同義である。
【０１３４】
本明細書で用いられる用語「アセチル化糖」および「アセチル化糖」は、少なくとも１個のアセチル基を含む単糖、二糖および多糖を意味する。例えば、このようなものとして、これらに限定されないが、グルコースペンタアセテート、キシローステトラアセテート、アセチル化キシラン、アセチル化キシランフラグメント、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、およびトリ−Ｏ−アセチル−グルカールが挙げられる。
【０１３５】
本明細書で用いられる用語「ヒドロカルビル」、「ヒドロカルビル基」および「ヒドロカルビル部分」は、単結合、二重結合もしくは三重結合の炭素−炭素結合および／またはエーテル結合によって結合され、水素原子によって置換されている直鎖、分枝鎖または環状配置の炭素原子を意味する。このようなヒドロカルビル基は脂肪族化合物および／または芳香族化合物であってもよい。ヒドロカルビル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、ペンチル、シクロペンチル、メチルシクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、ベンジルおよびフェニルが挙げられる。好ましい実施態様において、このヒドロカルビル部分は炭素−炭素単結合および／またはエーテル結合によって結合されており、水素原子によって置換されている直鎖、分枝鎖または環状配置の炭素原子である。
【０１３６】
本明細書で用いられる用語１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオールの「モノエステル」および「ジエステル」は、式がＲＣ（Ｏ）Ｏ（式中ＲはＣ１〜Ｃ７の線形ヒドロカルビル部分である）である少なくとも１つのエステル基を含む化合物を意味する。
【０１３７】
本明細書で用いられる用語「適切な酵素反応混合物」、「過酸のその場生成に適した成分」、「適切な反応成分」および「適切な反応混合物水溶液」は、反応物および酵素触媒が接触するようになる材料および水を意味する。本発明により適切な反応混合物水溶液の成分が提供されており、当業者であれば当然ながら、本方法に適した成分の変動範囲について理解する。一実施態様において、適切な酵素反応混合物は、反応成分を組合わせた際に過酸をその場生産するものである。そのようなものとして、反応成分は、反応成分の１種またはそれ以上が使用まで別々になったままの多成分系として提供されてもよい。複数の活性成分を分離し、それらを組み合わせるための系および手段の設計は該分野でよく知られており、一般的には、個々の反応成分の物理的形状に依存することになる。例えば、複数の活性な流体（液体−液体）系は、典型的には、マルチチャンバー式のディスペンサーボトル、または２相系（米国特許公報第２００５／０１３９６０８号；米国特許第５，３９８，８４６号；米国特許第５，６２４，６３４号；米国特許第６，３９１，８４０号；欧州特許第０８０７１５６号Ｂ１；米国特許公報第２００５／０００８５２６号；およびＰＣＴ公報番号ＷＯ００／１１７１３Ａ１）を使用しており、これらは例えば、反応性の流体を混合した際に望ましい漂白剤が生産されるようなある種の漂白用途で見られる。過酸を生成するのに用いられる多成分系のその他の形態としては、これらに限定されないが、１種またはそれ以上の固形成分、または固体−液体成分の組み合わせ、例えば粉末（例えば、多くの市販の漂白組成物、米国特許第５，１１６，５７５号）、多層錠（米国特許第６，２１０，６３９号）、複数のコンパートメントを有する水溶性のパケット（米国特許第６，９９５，１２５号）、および水を添加すると反応する固体の凝集体（米国特許第６，３１９，８８８号）として設計されたものが挙げられる。
【０１３８】
一実施態様において、製剤は、２種の別々の混合物として提供され、この場合、これら２種の混合物を組み合わせるとペルオキシカルボン酸消毒剤が生成する。
【０１３９】
別の実施態様において、以下を含む製剤が提供される：
ａ）以下を含む第一の混合物：
ｉ）ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素触媒（該酵素触媒は、ＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を含む）；および
ｉｉ）カルボン酸エステル基質（上記第一の混合物は、場合により、無機または有機緩衝液、腐食抑制剤、浸潤剤およびそれらの組み合わせからなる群より選択される成分を含む）；ならびに
ｂ）過酸素源および水を含む第二の混合物（該第二の混合物は、場合により、キレート剤を含む）。
【０１４０】
さらなる関連する実施態様において、この式の第一混合物中のカルボン酸エステル基質は、以下からなる群より選択される：
ｉ）次式の構造を有するエステル：
［Ｘ］mＲ5
［式中、Ｘ＝式Ｒ6Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ6＝Ｃ１〜Ｃ７の直鎖、分枝鎖または環状のヒドロカルビル部分（該ヒドロカルビル部分は、場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換されており、Ｒ6は場合によりＲ6＝Ｃ２〜Ｃ７に関して１つまたはそれ以上のエーテル結合を含んでいる）であり；
Ｒ5＝Ｃ１〜Ｃ６の直鎖、分枝鎖または環状のヒドロカルビル部分（該ヒドロカルビル部分は、場合によりヒドロキシル基で置換されており；ここで、Ｒ5中の各炭素原子はただ１つのヒドロキシル基またはただ１つのエステル基を個々に含んでおり；Ｒ5は場合により１つまたはそれ以上のエーテル結合を含んでいる）であり；
ｍ＝１〜Ｒ5中の炭素原子数であり；かつ
該エステルは２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水溶解度を有している］；および
【０１４１】
ｉｉ）以下の構造を有するグリセリド：
【化６】
0005677091.tif 000007
［式中、Ｒ1は、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖または分枝鎖のアルキル（該アルキルは、場合により、ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換される）であり、Ｒ3およびＲ4はそれぞれ、ＨまたはＲ1Ｃ（Ｏ）である］
ｉｉｉ）アセチル化単糖、アセチル化二糖およびアセチル化多糖からなる群より選択されるアセチル化糖。
【０１４２】
別の実施態様において、この式の第一混合物中のカルボン酸エステル基質は以下の式：
【化７】
0005677091.tif 000008
［式中、Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ7の直鎖または分枝鎖のアルキル（該アルキルは、場合により、ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換される）であり、Ｒ2は、Ｃ１〜Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ）nＨまたは（ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ）nＨであり、ｎは１〜１０である］
によって定義される。
【０１４３】
好ましい実施態様において、Ｒ6は、Ｃ１〜Ｃ７の線形ヒドロカルビル部分であって、場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換されており、場合により１つまたはそれ以上のエーテル結合を含む。さらに好ましい実施態様において、Ｒ6は、Ｃ２〜Ｃ７の線形ヒドロカルビル部分であって、場合によりヒドロキシル基で置換されており、および／または場合により１つまたはそれ以上のエーテル結合を含む。
【０１４４】
別の実施態様において、このカルボン酸エステル基質は、以下からなる群より選択される：モノアセチン；ジアセチン；トリアセチン；モノプロピオニン；ジプロピオニン；トリプロピオニン；モノブチリン；ジブチリン；トリブチリン；グルコースペンタアセタート；キシローステトラアセタート；アセチル化キシラン；アセチル化キシランフラグメント；β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート；トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール；トリ−Ｏ−アセチル−グルカール；１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオールのモノエステルまたはジエステル；およびこれらの混合物。
【０１４５】
別の実施態様において、このカルボン酸エステルは、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。別の実施態様において、このカルボン酸エステルは、アセチル化糖である。別の実施態様において、この基質は１つまたはそれ以上のエステル基を含むＣ１〜Ｃ６のポリオールである。好ましい実施態様において、このＣ１〜Ｃ６のポリオール上の１つまたはそれ以上のヒドロキシル基は、１つまたはそれ以上のアセトキシ基（例えば、１，３−プロパンジオールジアセテート、１，４−ブタンジオールジアセテートなど）で置換される。別の実施態様において、上記の第一の混合物中のこのような酵素触媒は、粒子状の固体である。別の実施態様において、第一の反応混合物は、固形錠剤または粉末である。
【０１４６】
本明細書で用いられる用語「過加水分解」は、過酸を形成することができる選択された基質と過酸化物との反応と定義される。典型的には、無機過酸化物は、触媒の存在下で選択された基質と反応して、過酸を生産する。本明細書で用いられる用語「化学的な過加水分解」は、基質（過酸前駆体）を過酸化水素源とを組合わせる過加水分解反応を含み、ここで過酸は酵素触媒の非存在下で生成される。
【０１４７】
本明細書で用いられる用語「ペルヒドロラーゼ活性」は、タンパク質の単位質量（例えばミリグラム）、乾燥細胞質量、または固定化触媒質量あたりの触媒活性を意味する。
【０１４８】
本明細書で用いられる「酵素活性の１単位」または「活性の１単位」または「Ｕ」は、特定の温度での１分あたりの１μｍｏｌの過酸生成物の生産に必要なペルヒドロラーゼ活性の量と定義される。
【０１４９】
本明細書で用いられる用語「酵素触媒」および「ペルヒドロラーゼ触媒」は、過加水分解活性を有する酵素を含む触媒を意味し、これは、微生物の全細胞、透過性を上げた微生物細胞、微生物細胞抽出物、一部精製した酵素または精製酵素の１種またはそれ以上の細胞の成分の形態であってもよい。またこのような酵素触媒は、化学修飾されていてもよい（例えば、ペグ化、または架橋試薬との反応による）。またペルヒドロラーゼ触媒は、当業者によく知られた方法を用いて可溶性または不溶性支持体に固定化されていてもよい；例えば、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ；Ｇｏｒｄｏｎ  Ｆ．Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ，編集者；ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ），トトワ，ニュージャージー州，米国；１９９７を参照。本明細書において説明されているように、本発明の過加水分解活性を有する酵素はいずれも、構造的に酵素の炭水化物ファミリーのうちエステラーゼファミリー７（ＣＥ−７ファミリー）に属するものである（Ｃｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．，Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ａｃｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ：ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ”  ｉｎ  Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈ．Ｊ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｇ．Ｄａｖｉｅｓ，Ｂ．ＨｅｎｒｉｓｓａｔおよびＢ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ編集（１９９９）Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，３〜１２頁を参照）。
【０１５０】
ＣＥ−７ファミリーに属するものとしては、セファロスポリンＣデアセチラーゼ（ＣＡＨ；Ｅ．Ｃ．３．１．１．４１）、およびアセチルキシランエステラーゼ（ＡＸＥ；Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２）が挙げられる。ＣＥ−７エステラーゼファミリーに属するものは、保存されたシグネチャーモチーフを共有する（Ｖｉｎｃｅｎｔ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３０：５９３−６０６（２００３））。ＣＥ−７シグネチャーモチーフおよび／または実質的に類似の構造を含むペルヒドロラーゼは、本発明で使用するのに適している。実質的に類似した生体分子を同定する手段は当該分野で公知である（例えば、配列アライメントプロトコール、核酸ハイブリダイゼーション、保存されたシグネチャーモチーフの存在など）。一側面において、このような本発明の方法における酵素触媒は、本明細書で示された配列と、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３３％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、その上さらにより好ましくは少なくとも７０％、その上さらにより好ましくは少なくとも８０％、その上さらにより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有する実質的に類似した酵素を含む。また本発明は、本発明のＣＥ−７炭水化物エステラーゼをコードする核酸分子も提供する。さらなる実施態様において、本発明の方法において有用なペルヒドロラーゼ触媒は、ストリンジェントな条件下で本発明の核酸分子のいずれか１種にハイブリッド形成する核酸分子によってコードされている。
【０１５１】
本明細書で用いられる用語「セファロスポリンＣデアセチラーゼ」および「セファロスポリンＣアセチルヒドロラーゼ」は、セファロスポリンＣや７−アミノセファロスポラン酸のようなセファロスポリンの脱アセチル化を触媒する酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４１）を意味する（Ｍｉｔｓｕｓｈｉｍａ等，上記）。本明細書において説明されているように、有意な過加水分解活性を有するセファロスポリンＣデアセチラーゼが数種提供される。
【０１５２】
本明細書で用いられる「アセチルキシランエステラーゼ」は、アセチル化キシランおよびその他のアセチル化糖の脱アセチル化を触媒する酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２；ＡＸＥ）を意味する。本明細書において説明されているように、有意なペルヒドロラーゼ活性を有するアセチルキシランエステラーゼとして分類される数種の酵素が提供される。
【０１５３】
本明細書で用いられる用語「バチルス・ズブチリス（ＡＴＣＣ３１９５４TM）」は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ）に寄託された、国際寄託の受託番号ＡＴＣＣ３１９５４TMを有する細菌細胞を意味する。バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TMは、２〜８個の炭素−アシル基を有するグリセロールエステル、特にジアセチンを加水分解することができるエステルヒドロラーゼ（「ジアセチナーゼ」）活性を有することが報告されている（米国特許第４，４４４，８８６号；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本明細書において説明されているように、有意なペルヒドロラーゼ活性を有する酵素はすでにＢ．ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TMから単離されており、これは、配列番号２として示される。このようにして単離された酵素のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ(R)受託番号ＢＡＡ０１７２９．１によって提供されたセファロスポリンＣデアセチラーゼと１００％のアミノ酸同一性を有する。
【０１５４】
本明細書で用いられる用語「バチルス・ズブチリスＢＥ１０１０」は、ＰａｙｎｅおよびＪａｃｋｓｏｎ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：２２７８−２２８２（１９９１））によって報告されているようなバチルス・ズブチリス株を意味する。バチルス・ズブチリスＢＥ１０１０は、ズブチリシンおよび中性プロテアーゼをコードする遺伝子に染色体の欠失を有する、派生的なバチルス・ズブチリス亜種のズブチリス株ＢＲ１５１（ＡＴＣＣ３３６７７TM）である。本明細書において説明されているように、有意なペルヒドロラーゼ活性を有する酵素はすでにＢ．ズブチリスＢＥ１０１０から単離されており、これは、配列番号６として示される。このようにして単離された酵素のアミノ酸配列は、バチルス・ズブチリス亜種のズブチリス株１６８で報告されているセファロスポリンＣデアセチラーゼと１００％のアミノ酸同一性を有する（Ｋｕｎｓｔ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３９０：２４９−２５６  （１９９７））。
【０１５５】
本明細書で用いられる用語「バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ２９２３３TM」は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された、国際寄託の受託番号ＡＴＣＣ３１９５４TMを有するバチルス・ズブチリス株を意味する。本明細書において説明されているように、有意なペルヒドロラーゼ活性を有する酵素が単離され、Ｂ．ズブチリスＡＴＣＣ２９２３３TMから配列が決定されており、これは、配列番号３２として示される。
【０１５６】
本明細書で用いられる用語「クロストリジウム・テルモセルムＡＴＣＣ２７４０５TM」は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された、国際寄託の受託番号ＡＴＣＣ２７４０５TMを有するクロストリジウム・テルモセルム株を意味する。Ｃ．テルモセルムＡＴＣＣ２７４０５TM由来のペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号１４として示される。
【０１５７】
本明細書で用いられる用語「バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ６６３３TM」は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された、国際寄託の受託番号ＡＴＣＣ６６３３TMを有する細菌細胞を意味する。バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ６６３３TMは、セファロスポリンのアセチルヒドロラーゼ活性を有することが報告されている（米国特許第６，４６５，２３３号）。Ｂ．ズブチリスＡＴＣＣ６６３３TM由来のペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号８として示される。
【０１５８】
本明細書で用いられる用語「バチルス・リケニフォルミスＡＴＣＣ１４５８０TM」は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された、国際寄託の受託番号ＡＴＣＣ１４５８０TMを有する細菌細胞を意味する。バチルス・リケニフォルミスＡＴＣＣ１４５８０TMは、セファロスポリンのアセチルヒドロラーゼ活性を有することが報告されている（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)ＹＰ＿０７７６２１）。Ｂ．リケニフォルミスＡＴＣＣ１４５８０TM由来のペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号１０として示される。
【０１５９】
本明細書で用いられる用語「バチルス・プミルスＰＳ２１３」は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告されている細菌細胞を意味する（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)ＡＪ２４９９５７）。バチルス・プミルスＰＳ２１３由来のペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号１２として示される。
【０１６０】
本明細書で用いられる用語「サーモトガ・ネアポリタナ」は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告されているサーモトガ・ネアポリタナ株を意味する（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)＿ＹＰ１７５２０５）。サーモトガ・ネアポリタナ由来のペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号１６として示される。
【０１６１】
本明細書で用いられる用語「サーモトガ・マリティマ  ＭＳＢ８」は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告されている細菌細胞を意味する（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)ＮＰ＿２２７８９３．１）。サーモトガ・マリティマ  ＭＳＢ８由来のペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号１８として示される。
【０１６２】
本明細書で用いられる用語「バチルス・クラウシイ  ＫＳＭ−Ｋ１６」は、セファロスポリン−Ｃデアセチラーゼ活性を有することが報告されている細菌細胞を意味する（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)５８６３２）。バチルス・クラウシイ  ＫＳＭ−Ｋ１６由来のペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号２６として示される。
【０１６３】
本明細書で用いられる用語「サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム」は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告されている細菌細胞を意味する（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)Ｓ４１８５８）。サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム由来のペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号７０として示される。
【０１６４】
本明細書で用いられる用語「サーモトガ・レティンガエ」は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告されている細菌細胞を意味する（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)ＣＰ０００８１２）。サーモトガ・レティンガエ由来のペルヒドロラーゼ活性を有する酵素の推定アミノ酸配列は、配列番号８２として示される。
【０１６５】
本明細書で用いられる用語「サーモトガ・ペトロフィラ」は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告されている細菌細胞を意味する（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)ＣＰ０００８１２）。サーモトガ・ペトロフィラ由来のペルヒドロラーゼ活性を有する酵素の推定アミノ酸配列は、配列番号９０として示される。
【０１６６】
本明細書で用いられる用語「サーモトガ種  ＲＱ２」は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告されている細菌細胞を意味する（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)ＣＰ０００９６９）。２つの異なるアセチルキシランエステラーゼは、サーモトガ種ＲＱ２由来であると確認されており、本明細書で「ＲＱ２（ａ）」（配列番号９８として提供される推定アミノ酸配列）および「ＲＱ２（ｂ）」（配列番号１０６として提供される推定アミノ酸配列）と呼ばれる。
【０１６７】
本明細書で用いられる「単離された核酸分子」および「単離された核酸フラグメント」は交換可能に用いられることになり、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡの高分子を意味し、場合により合成、非天然または改変されたヌクレオチド塩基を含む。ＤＮＡの高分子の形態の単離された核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成ＤＮＡの１種またはそれ以上のセグメントで構成されていてもよい。
【０１６８】
用語「アミノ酸」は、タンパク質またはポリペプチドの基礎となる化学的な構造単位を意味する。本明細書において、特定のアミノ酸を示すのに以下の略語が用いられる：
【表１】
0005677091.tif 000009
【０１６９】
本明細書で用いられる「実質的に類似した」は、核酸分子において、１個またはそれ以上のヌクレオチド塩基における変化によって１個またはそれ以上のアミノ酸の付加、置換または欠失が起こるが、そのＤＮＡ配列によってコードされたタンパク質の機能特性（すなわち過加水分解活性）に影響を与えないことを意味する。また本明細書で用いられる「実質的に類似した」は、本明細書において報告された配列に対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３３％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、その上さらにより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を有する酵素も意味しており、ここで、生じた酵素は本発明の機能特性（すなわち過加水分解活性）を保持する。また「実質的に類似した」は、ストリンジェントな条件下で本明細書において報告された核酸分子にハイブリッド形成する核酸分子によってコードされた過加水分解活性を有する酵素を意味する場合もある。従って、当然ながら、本発明は、特定の例示された配列よりも多くのものを包含する。
【０１７０】
例えば、当該分野でよく知られているように、所定の部位で化学的に等価なアミノ酸の生産をもたらすが、コードされたタンパク質の機能特性に影響を与えない遺伝子の変更は一般的である。本発明の目的にとって、置換は、以下の５グループのうちいずれか１つの範囲内の変換と定義される：
１．小さい脂肪族の非極性またはわずかに極性を有する残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；
２．極性の負電荷を有する残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
３．極性の正電荷を有する残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
４．大きい脂肪族の非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）；および
５．大きい芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【０１７１】
従って、疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンに対応するコドンが、別のより低い疎水性の残基（例えば、グリシン）、またはより高い疎水性の残基（例えば、バリン、ロイシンまたはイソロイシン）をコードするコドンで置換されていてもよい。同様に、ある負電荷を有する残基の別の残基での置換（例えば、アスパラギン酸のグルタミン酸での置換）、またはある正電荷を有する残基の別の残基での置換（例えば、リシンのアルギニンでの置換）が起こる変化もまた、機能的に等価な生成物を生産することが予測され得る。多くの場合において、タンパク質分子のＮ末端およびＣ末端部分の変更をもたらすヌクレオチドの変化もまた、タンパク質活性を変更しないと予測される。
【０１７２】
上記で提案の改変はそれぞれ、十分に当該分野における型どおりの技術の範囲内であり、コードされた生成物の生物活性が保持されているかどうかの決定も同様である。さらに当業者であれば当然ながら、実質的に類似した配列も本発明に包含される。一実施態様において、実質的に類似した配列は、ストリンジェントな条件下（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄、続いて０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で洗浄）で本明細書において例示された配列とハイブリッド形成するそれらの能力によって定義される。一実施態様において、本発明は、ストリンジェントな条件下で本明細書において報告された核酸分子にハイブリッド形成する単離された核酸分子によってコードされた、ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素を含む。その他の好ましい実施態様において、本発明は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１７、配列番号２５、配列番号６９、配列番号７４、配列番号７７、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８５、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９３、配列番号９６、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１０４および配列番号１０５からなる群より選択される核酸配列を有する核酸分子にハイブリッド形成する単離された核酸分子によってコードされたペルヒドロラーゼ活性を有する酵素を含む。
【０１７３】
本明細書で用いられるように、温度および溶液のイオン強度の適切な条件下で、第一の核酸分子の一本鎖が別の核酸分子にアニールすることができる場合、その核酸分子はその他の核酸分子（例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ）に「ハイブリダイゼーション可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）（２００１）で例が示されている。ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定するのは、温度およびイオン強度の条件である。ストリンジェンシー条件を調節して、中程度に類似した分子（例えば関連性の遠い生物由来の相同配列）から、高度に類似した分子（例えば密接に関連した生物由来の機能的な酵素を複製する遺伝子）をスクリーニングすることができる。典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄がストリンジェンシー条件を決定する。好ましい条件の構成は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを用いた室温で１５分間の洗浄から開始して、続いて、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを用いた４５℃で３０分間の洗浄を繰り返し、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを用いた５０℃で３０分間の洗浄を２回繰り返す一連の洗浄を使用するものである。より好ましい条件の構成は、より高い温度を使用するものであり、この場合、ただし、最後の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを用いた２回の３０分間の洗浄の温度が、６０℃に高められていることを除いて、洗浄が上記の洗浄と同一である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の好ましい構成は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄、続いて最後に本明細書において例示された配列を用いた０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃での洗浄である。
【０１７４】
ハイブリダイゼーションは、２種の核酸が相補配列を含むことが必要であるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが生じる可能性がある。ハイブリダイゼーションする核酸にとって適切なストリンジェンシーは、核酸の長さ、および相補性の程度、当該分野で公知の可変値に依存する。２種のヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのためのＴｍ値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（より高いＴｍに対応する）は、以下の順番で低くなる：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００個より長いヌクレオチドのハイブリッドのために、Ｔｍを計算する方程式が導かれている（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，上記）。比較的短い核酸（すなわちオリゴヌクレオチド）とのハイブリダイゼーションのために、ミスマッチの位置がより高い重要性を持つようにになり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，上記）。一形態において、ハイブリダイゼーション可能な核酸は、少なくとも約１０個ヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、ハイブリダイゼーション可能な核酸の最短の長さは、少なくとも約１５個のヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも約２０個のヌクレオチドの長さ、さらにより好ましくは少なくとも３０個のヌクレオチドの長さ、さらにより好ましくは少なくとも３００個のヌクレオチドの長さ、および最も好ましくは少なくとも８００個のヌクレオチドの長さである。さらに当業者であれば、当然ながら、プローブの長さのような要素に応じて温度および洗浄溶液の塩濃度を調節することが可能である。
【０１７５】
本明細書で用いられる用語「同一性（％）」は、２種またはそれ以上のポリペプチド配列間、または２種またはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係であり、例えば配列を比較することによって決定される。当業界において、「同一性」はまた、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列の関連性の程度も意味し、これは、場合によっては、このような配列のストリング間のマッチングによって決定されることもある。「同一性」および「類似性」は既知の方法によって容易に計算することができ、このような方法としては、これらに限定されないが、以下で説明されているものが挙げられる：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編集）オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編集）アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編集）ヒューマナ・プレス，ニュージャージー州（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編集）アカデミックプレス（１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編集）ストックトン・プレス（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州（１９９１）。同一性および類似性を決定する方法は、公に利用可能なコンピュータープログラムにおいて体系化されている。配列アライメントおよび同一性（％）の計算は、レーザージーンバイオインフォマティクスコンピューティングスィート（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｓｕｉｔｅ）のメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ社（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．），ウィスコンシン州マディソン）、ベクターＮＴＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ）バージョン７．０のアラインＸ（ＡｌｉｇｎＸ）プログラム（インフォマックス社（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ．），メリーランド州ベセスダ）、またはエンボス・オープン（ＥＭＢＯＳＳ  Ｏｐｅｎ）ソフトウェアスィート（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ；Ｒｉｃｅ等，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６（６）ｐｐ２７６−２７７（２０００））を用いて行ってもよい。配列のマルチプルアライメントを用いて、アライメントのクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法（すなわち、ＣＬＵＳＴＡＬＷ；例えばバージョン１．８３）（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０（１９９４）；およびＣｈｅｎｎａ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１（１３）：３４９７−５００（２００３）、これは、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉ��ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を介して欧州分子生物学研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）より入手可能）をデフォルトパラメーターを用いて行うことができる。ＣＬＵＳＴＡＬＷタンパク質アライメントにとって適切なパラメーターは、ＧＡＰ存在ペナルティー＝１５、ＧＡＰ伸長＝０．２、マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ（例えば、Ｇｏｎｎｅｔ２５０）、タンパク質ＥＮＤＧＡＰ＝−１、タンパク質ＧＡＰＤＩＳＴ＝４、およびＫＴＵＰＬＥ＝１を含む。一実施態様において、迅速または遅いアライメントがデフォルト設定で用いられ、ここにおいて好ましくは遅いアライメントである。あるいは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰペナルティー＝１０、ＧＡＰ伸長＝１、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ（例えばＢＬＯＳＵＭ６４）、ウィンドウ＝５、および保存された上の対角（ＴＯＰ  ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ）＝５も使用できるように、ＣＬＵＳＴＡＬＷ法（バージョン１．８３）を用いるパラメーターを改変してもよい。
【０１７６】
本発明の一形態において、適切な単離された核酸分子（本発明の単離されたポリヌクレオチド）は、本明細書において報告されたアミノ酸配列に、少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも３３％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。本発明の適切な核酸分子は、上記の相同性を有するだけでなく、典型的には、約３００〜約３４０個のアミノ酸、より好ましくは約３１０〜約３３０個のアミノ酸、および最も好ましくは約３１８個のアミノ酸を有するポリペプチドもコードする。
【０１７７】
本明細書で用いられる用語「シグネチャーモチーフ」、「ＣＥ−７シグネチャーモチーフ」および「診断モチーフ」は、定義された活性を有する酵素ファミリーの間で共通の保存された構造を意味する。このようなシグネチャーモチーフを用いて、定義された基質群に対して類似した酵素活性を有する構造的に関連する酵素のファミリーを特徴付けおよび／または同定することができる。シグネチャーモチーフは、単一の連続したアミノ酸配列でもよし、または一緒になってシグネチャーモチーフを形成する隣接していない保存されたモチーフのコレクションであってもよい。典型的には、保存されたモチーフは、アミノ酸配列で示される。本明細書において説明されているように、本発明のペルヒドロラーゼは、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属する。この酵素ファミリーは、シグネチャーモチーフの存在によって特徴付けることができる（Ｖｉｎｃｅｎｔ等，上記）。
【０１７８】
本明細書で用いられる「コドンの縮重」は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えることなくヌクレオチド配列の変化が可能な遺伝子コードの性質を意味する。従って、本発明は、本発明の微生物のポリペプチドをコードするアミノ酸配列の全部または相当部分をコードするあらゆる核酸分子に関する。当業者であれば、所定のアミノ酸を指定するためのヌクレオチドコドンの使用において特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」のことをよく認識している。従って、宿主細胞における発現を改善するための遺伝子を合成する場合、そのコドンの使用頻度が宿主細胞の好ましいコドンの使用頻度に近くなるように遺伝子を設計することが望ましい。
【０１７９】
本明細書で用いられる「合成遺伝子」は、当業者によく知られた手法を用いて化学合成されたオリゴヌクレオチドのビルディングブロックから構築することができる。これらのビルディングブロックをライゲーションし、アニールして遺伝子のセグメントを形成することができ、続いてこれを酵素的に組み立てて遺伝子全体を構築することができる。「化学合成された」は、ＤＮＡ配列に関する場合、ヌクレオチド成分がインビトロで構築されたことを意味する。十分に確立された手法を用いてＤＮＡの手作業による化学合成を達成してもよいし、または多数の市販の機械のいずれか１種を用いて自動化学合成を行ってもよい。従って、このような遺伝子は、宿主細胞のコドンバイアスを反映するためのヌクレオチド配列の最適化に基づいて最適な遺伝子発現がなされるように適合させることができる。当業者であれば当然ながら、コドンの使用が、宿主にとって好ましいコドンに偏っている場合、成功する遺伝子発現の見込みについてよく理解している。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手可能な宿主細胞から誘導された遺伝子の調査に基づいて行うことができる。
【０１８０】
本明細書で用いられる「遺伝子」は、特定のタンパク質を発現する核酸分子を意味し、これには、コード配列の前に存在する調節配列（５’の非コード配列）、およびコード配列の後に存在する調節配列（３’の非コード配列）も含まれる。「天然型の遺伝子」は、天然に見出されるような遺伝子（それら自身の調節配列も共に含む）を意味する。「キメラ遺伝子」は、天然に一緒に見出されない調節およびコード配列を含む非天然型遺伝子であるあらゆる遺伝子を意味する。従って、キメラ遺伝子は、異なる源から誘導された調節配列およびコード配列を含んでもよいし、または同じ源から誘導されたが、天然に見出されるものとは異なる形態で配置された調節配列およびコード配列を含んでもよい。「内因性遺伝子」は、生物のゲノム中でそれらの天然の位置に存在する天然型遺伝子を意味する。「外来」遺伝子は、通常では宿主生物中で見出されないが、遺伝子移入によって宿主生物に導入される遺伝子を意味する。外来遺伝子は、非天然型の生物に挿入された天然型遺伝子を含んでいてもよいし、またはキメラ遺伝子を含んでいてもよい。「導入遺伝子」は、形質転換法によってゲノムに導入された遺伝子である。
【０１８１】
本明細書で用いられる「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を意味する。「適切な調節配列」は、コード配列の上流（５’の非コード配列）、コード配列内、またはその下流（３’の非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシング、または連結したコード配列の安定性もしくは翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を意味する。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステム−ループ構造を含んでいてもよい。
【０１８２】
本明細書で用いられる「プロモーター」は、コード配列または機能的なＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を意味する。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、それらの全体が天然型遺伝子から誘導されたものでもよいし、または天然にに見出される異なるプロモーターから誘導された異なる要素で構成されていてもよいし、または合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当業者であれば当然ながら、様々なプロモーターが、発生の様々な段階で、または様々な環境または生理学的条件に応答して、遺伝子の発現を指示する可能性がある。最も多くの場合遺伝子を発現させるプロモーターは、一般的に「構成的プロモーター」と称される。さらに、ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全に決められていないため、異なる長さのＤＮＡフラグメントが、同一なプロモーター活性を有する可能性があることが認識されている。
【０１８３】
本明細書で用いられるように、「３’の非コード配列」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を意味し、このような配列としては、ポリアデニル化認識配列（一般的には、真核生物に限定される）、およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を与えることができる調節シグナルをコードするその他の配列が挙げられる。ポリアデニル化シグナルは、一般的には、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸領域の付加（一般的には、真核生物に限定される）に影響を与えることを特徴とする。
【０１８４】
本明細書で用いられる用語「機能するように連結した」は、一方の機能が他方の影響を受けるように、単一の核酸分子へ核酸配列が連結していることを意味する。例えば、プロモーターがそのコード配列の発現に影響を与えることができる場合、そのプロモーターはコード配列と機能するように連結しており、すなわち、そのコード配列は、プロモーターの転写制御下にある。コード配列は、センス方向で調節配列に機能するように連結していてもよいし、またはアンチセンス方向で連結していてもよい。
【０１８５】
本明細書で用いられる用語「発現」は、本発明の核酸分子から誘導されたセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を意味する。また発現は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も意味することもある。
【０１８６】
本明細書で用いられる「形質転換」は、宿主生物のゲノムに核酸分子が移入することによって、遺伝学的に安定な遺伝が起こることを意味する。本発明において、宿主細胞のゲノムは、染色体遺伝子、および染色体外（例えばプラスミド）遺伝子を含む。形質転換した核酸分子を含む宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換した」生物と称される。
【０１８７】
本明細書で用いられる用語「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」は、多くの場合において細胞の中心的な代謝の一部ではない遺伝子を有する染色体外因子を意味し、一般的には環状の二本鎖ＤＮＡ分子の形態である。このような要素は、自律複製型の配列、ゲノムを統合させる配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよく、直鎖状または環状でもよく、あらゆる源から誘導された一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡでもよく、ここにおいて多数のヌクレオチド配列が結合するか、または組換えられて、選択された遺伝子産物のためのプロモーターフラグメントおよびＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と共に細胞に導入することができる特有の構造になる。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にするエレメントを有する特定のベクターを意味する。「発現カセット」は、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えてその遺伝子の外来宿主中での発現を強化することができるエレメントを有する特定のベクターを意味する。
【０１８８】
本明細書で用いられる用語「配列解析ソフトウェア」は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の解析に有用なあらゆるコンピューターアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを意味する。「配列解析ソフトウェア」は、市販のものでもよいし、または個別に開発したものでもよい。典型的な配列解析ソフトウェアとしては、これらに限定されないが、一連のＧＣＧプログラム（ウィスコンシン・パッケージ・バージョン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ）９．０、ジェネティックス・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ），ウィスコンシン州マディソン）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）、およびＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８  Ｓ．Ｐａｒｋ  Ｓｔ．マディソン，ウィスコンシン州５３７１５米国）、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（例えば、バージョン１．８３；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２）：４６７３−４６８０（１９９４）、およびスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムを内包したＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，１１１−２０．編集者：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ），ニューヨーク州ニューヨーク）、ベクターＮＴＩ（インフォマックス社，メリーランド州ベセスダ）、およびシーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）ｖ．４．０５が挙げられる。本願に関して、解析に配列解析ソフトウェアが用いられる場合、解析結果は、特に他の規定がない限り指定されたプログラムの「デフォルト値」に基づくこととする。本明細書で用いられる「デフォルト値」は、ソフトウェアの製造元によって設定されたあらゆる値またはパラメーターのセットを意味することとし、このようなデフォルト値は、最初に初期設定した際にソフトウェアでもともとローディングされるものである。
【０１８９】
本明細書で用いられる用語「生物学的な汚染物質」は、１種またはそれ以上の不要な、および／または病原性の生物学的な物体を意味し、例えば、これらに限定されないが、微生物、胞子、ウイルス、プリオン、およびそれらの混合物が挙げられる。本方法は、生存可能な生物学的な汚染物質の存在を減少および／または除去するのに有用な有効濃度の少なくとも１種の過カルボン酸を生産する。別の好ましい実施態様において、微生物汚染物質は、生存可能な病原性の微生物である。
【０１９０】
本明細書で用いられる用語「〜を消毒する」は、生物学的な汚染物質を破壊したり、またはその増殖を予防したりするプロセスを意味する。本明細書で用いられる用語「消毒剤」は、生物学的な汚染物質を破壊したり、中和したり、またはその増殖を阻害することによって消毒作用を示す物質を意味する。典型的には、消毒剤は、無生物または表面を処理するのに用いられる。本明細書で用いられる用語「防腐剤」は、病気を運搬する微生物の増殖を阻害する化学物質を意味する。実施態様の一形態において、生物学的な汚染物質は、病原微生物である。
【０１９１】
本明細書で用いられる用語「抗ウイルス剤（ｖｉｒｕｃｉｄｅ）」は、ウイルスを阻害または破壊する物質を意味し、「ｖｉｒｉｃｉｄｅ」と同義である。ウイルスを阻害または破壊する能力を示す物質は、「抗ウイルス」活性を有すると説明される。過酸は、抗ウイルス活性を有する可能性がある。本発明との使用に適する可能性がある当該分野で既知の典型的な代替の抗ウイルス剤としては、例えば、アルコール、エーテル、クロロホルム、ホルムアルデヒド、フェノール、ベータ−プロピオラクトン、ヨウ素、塩素、水銀塩、ヒドロキシルアミン、エチレンオキシド、エチレングリコール、第四級アンモニウム化合物、酵素、および洗剤が挙げられる。
【０１９２】
本明細書で用いられる用語「殺生物剤」は、微生物を不活性化したり、または破壊する化学物質を意味し、典型的には広範囲抗菌スペクトルを有するものである。微生物を不活性化または破壊する能力を示す化学物質は、「殺菌」活性を有すると説明される。過酸は、殺菌活性を有する可能性がある。本発明で使用するのに適する可能性がある当業界既知の典型的な代替の殺生物剤としては、例えば、塩素、二酸化塩素、クロロイソシアヌレート、次亜塩素酸塩、オゾン、アクロレイン、アミン、塩素化フェノール類、銅塩、有機硫黄化合物、および第四アンモニウム塩が挙げられる。
【０１９３】
本明細書で用いられる語句「最少殺生物濃度」は、特定の接触時間で、標的微生物の生存可能な集団において所望の致死的な回復不能の減少を引き起こす殺菌性の物質の最少濃度を意味する。この有効性は、処理後の生存可能な微生物におけるｌｏｇ10の減少によって測定することができる。一側面において、標的とする生存可能な微生物における処理後の減少は、少なくとも３の対数減少値、より好ましくは少なくとも４の対数減少値、および最も好ましくは少なくとも５の対数減少値である。別の形態において、この最小殺菌濃度は、生存可能な微生物細胞において少なくとも６の対数減少値である。
【０１９４】
本明細書で用いられる用語「過酸素源」および「過酸素の源」は、水溶液中に入れた場合、約１ｍＭまたはそれより高い濃度で過酸化水素を提供することができる化合物を意味し、例えば、これらに限定されないが、過酸化水素、過酸化水素付加物（例えば、尿素の過酸化水素付加物（カルバミドペルオキシド））、ペルボレート、およびペルカルボネートが挙げられる。本明細書において説明されているように、反応混合物水溶液中で過酸素化合物によって提供される過酸化水素の濃度は、反応成分を合わせた際に、最初のうちは少なくとも１ｍＭまたはそれより高い濃度である。一実施態様において、反応混合物水溶液中の過酸化水素の濃度は、少なくとも１０ｍＭである。別の実施態様において、反応混合物水溶液中の過酸化水素の濃度は、少なくとも１００ｍＭである。別の実施態様において、反応混合物水溶液中の過酸化水素の濃度は、少なくとも２００ｍＭである。別の実施態様において、反応混合物水溶液中の過酸化水素の濃度は、５００ｍＭまたはそれより高い濃度である。さらに別の実施態様において、反応混合物水溶液中の過酸化水素の濃度は、１０００ｍＭまたはそれより高い濃度である。反応混合物水溶液中での過酸化水素と酵素基質（例えばトリグリセリド）とのモル比（Ｈ2Ｏ2：基質）は、約０．００２〜２０であってもよく、好ましくは約０．１〜１０、最も好ましくは約０．５〜５である。
【０１９５】
酵素触媒によるカルボン酸エステルおよび過酸化水素からの過酸の製造に適した反応条件
本発明の一形態において、過加水分解活性を有する酵素触媒の存在下で、カルボン酸エステルと、無機過酸化物、これらに限定されないが過酸化水素、過ホウ酸ナトリウムまたは過炭酸ナトリウムとを反応させることによる過酸を含む水性混合物の製造方法を提供する。一実施態様において、このような酵素触媒は、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属する構造を有するペルヒドロラーゼを含む。別の実施態様において、ペルヒドロラーゼ触媒は、構造的にセファロスポリンＣデアセチラーゼと分類される。別の実施態様において、ペルヒドロラーゼ触媒は、構造的にアセチルキシランエステラーゼと分類される。
【０１９６】
一実施態様において、ペルヒドロラーゼ触媒は、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて参照配列の配列番号２にアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、このシグネチャーモチーフは、以下を含む：
ｉ）配列番号２のアミノ酸残基１１８〜１２０にＲＧＱモチーフ；
ii）配列番号２のアミノ酸残基１７９〜１８３にＧＸＳＱＧモチーフ；および
iii）配列番号２のアミノ酸残基２９８〜２９９にＨＥモチーフ
ここでこの酵素もまた配列番号２と少なくとも３０％のアミノ酸同一性を含む。
【０１９７】
さらなる実施態様において、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて参照配列の配列番号２にアラインした場合このシグネチャーモチーフはアミノ酸残基２６７〜２６９でＬＸＤモチーフと定義される第４の保存モチーフを含む。
【０１９８】
別の実施態様において、ペルヒドロラーゼ触媒は、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、お配列番号１８、配列番号２６、および配列番号３２、配列番号７０、配列番号８２、配列番号：９０、配列番号９８、および配列番号１０６からなる群より選択されるペルヒドロラーゼ活性を有する酵素を含む。
【０１９９】
別の実施態様において、この酵素触媒は配列番号８２、配列番号９０、配列番号９８および配列番号１０６またはからなる群より選択されるアミノ酸配列またはこれらのアミノ酸配列に１個またはそれ以上のアミノ酸を置換、欠失または付加することによって誘導されたペルヒドロラーゼ活性を有する実質的に類似した酵素を含む。
【０２００】
別の実施態様において、ペルヒドロラーゼ活性を有する実質的に類似した酵素は、配列番号１８、配列番号２６、配列番号７０、配列番号８２、配列番号９０、配列番号９８、および配列番号１０６からなる群より選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。
【０２０１】
さらなる実施態様において、ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素は、配列番号８２、配列番号９０、配列番号９８、および配列番号１０６からなる群より選択される。
【０２０２】
別の実施態様において、ペルヒドロラーゼ触媒は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１７、配列番号２５、配列番号６９、配列番号７４、配列番号７７、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８５、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９３、配列番号９６、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１０４、および配列番号１０５からなる群より選択される核酸配列にハイブリッド形成する核酸分子によってコードされたアミノ酸配列を有する酵素を含む。
【０２０３】
別の実施態様において、ペルヒドロラーゼ触媒は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号７７、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８５、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９３、配列番号９６、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１０４、および配列番号１０５からなる群より選択される核酸配列にハイブリッド形成する核酸分子によってコードされたアミノ酸配列を有する酵素を含む。
【０２０４】
別の実施態様において、ペルヒドロラーゼ触媒は、配列番号６１と定義された連続したシグネチャーモチーフに対して少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３６％のアミノ酸同一性を有する酵素を含み、ここで、上述の保存されたモチーフ（例えばＲＧＱ、ＧＸＳＱＧおよびＨＥ、ならびに場合によりＬＸＤ）が保存されている。
【０２０５】
１つの実施態様において、適切な基質としては、以下の式：
［Ｘ］mＲ5
［式中、Ｘ＝式Ｒ6Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ6＝Ｃ１〜Ｃ７の直鎖、分枝鎖または環状のヒドロカルビル部分（該ヒドロカルビル部分は、場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換されており、Ｒ6は場合によりＲ6＝Ｃ２〜Ｃ７に関して１つまたはそれ以上のエーテル結合を含んでいる）であり；
Ｒ5＝Ｃ１〜Ｃ６の直鎖、分枝鎖または環状のヒドロカルビル部分（該ヒドロカルビル部分は、場合によりヒドロキシル基で置換されており；ここで、Ｒ5中の各炭素原子はただ１つのヒドロキシル基またはただ１つのエステル基を個々に含んでおり；Ｒ5は場合により１つまたはそれ以上のエーテル結合を含んでいる）であり；
ｍ＝１〜Ｒ5中の炭素原子数であり；かつ
該エステルは２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水溶解度を有している］
により提供されるエステルが挙げられる。
【０２０６】
別の実施態様において、適切な基質としてはまた、以下の式：
【化８】
0005677091.tif 000010
式中、Ｒ1は、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖または分枝鎖のアルキル（該アルキルは、場合により、ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換される）であり、Ｒ2は、Ｃ１〜Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ）nＨまたは  （ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ）nＨであり、ｎは１〜１０である］
のエステルが挙げられる。
【０２０７】
別の実施態様において、適切な基質としては以下の式：
【化９】
0005677091.tif 000011
［式中、Ｒ1は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基によって置換されているＣ１〜Ｃ７の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、Ｒ3およびＲ4は、独立してＨまたはＲ1Ｃ（Ｏ）である］
グリセリドが挙げられる。
【０２０８】
別の実施態様において、Ｒ6は、場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換されているＣ１〜Ｃ７の線形ヒドロカルビル部分であり、場合により１つまたはそれ以上のエーテル結合を含んでいる。さらに好ましい実施態様において、Ｒ6は、場合によりヒドロキシル基で置換されており、および／または場合により１つまたはそれ以上のエーテル結合を含むＣ２〜Ｃ７の線形ヒドロカルビル部分である。
【０２０９】
別の実施態様において、アセチル化単糖、二糖および多糖からなる群から選択されるアセチル化糖が挙げられる。好ましい実施態様において、アセチル化糖としては、アセチル化単糖、二糖および多糖が挙げられる。別の実施態様において、アセチル化糖は、アセチル化キシラン、アセチル化キシランのフラグメント、アセチル化キシロース（例えば、キシローステトラアセテート）、アセチル化グルコース（例えば、グルコースペンタアセテート）、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、およびトリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカール、およびアセチル化セルロースからなる群より選択される。別の好ましい実施態様において、アセチル化糖は、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、およびトリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカール、およびアセチル化セルロースからなる群より選択される。そのようなものとして、アセチル化炭水化物は、本発明の方法を用いて（すなわち、過酸素源の存在下で）過カルボン酸を生成するのに適した基質の可能性がある。
【０２１０】
一実施態様において、基質は以下：モノアセチン；ジアセチン；トリアセチン；モノプロピオニン；ジプロピオニン；トリプロピオニン；モノブチリン；ジブチリン；トリブチリン；グルコースペンタアセタート；キシローステトラアセタート；アセチル化キシラン；アセチル化キシランフラグメント；β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート；トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール；トリ−Ｏ−アセチル−グルカール；１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオールのモノエステルまたはジエステル；およびこれらの混合物からなる群より選択される。
【０２１１】
好ましい実施態様において、この基質は、酢酸エチル、乳酸メチル、乳酸エチル、グリコール酸メチル、グリコール酸エチル、メトキシ酢酸メチル、メトキシ酢酸エチル、３−ヒドロキシ酪酸メチル、３−ヒドロキシ酪酸エチル、２−アセチルクエン酸トリエチル、グルコースペンタアセテート、グルコノラクトン、グリセリド（モノ、ジおよびトリグリセリド）、例えばモノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、モノプロピオニン、ジプロピオニン（グリセリルジプロピオナート）、トリプロピオニン（１，２，３−トリプロピオニルグリセロール）、モノブチリン、ジブチリン（グリセリルジブチラート）、トリブチリン（１，２，３−トリブチリルグリセロール）、アセチル化糖、およびそれらの混合物からなる群より選択される。
【０２１２】
さらに好ましい形態において、カルボン酸エステル基質は、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、モノプロピオニン、ジプロピオニン、トリプロピオニン、モノブチリン、ジブチリン、トリブチリン、酢酸エチル、および乳酸エチルからなる群より選択される。さらにその他の形態において、カルボン酸エステル基質は、ジアセチン、トリアセチン、酢酸エチル、および乳酸エチルからなる群より選択される。好ましい形態において、カルボン酸エステルは、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチンおよびそれらの混合物からなる群より選択されるグリセリドである。
【０２１３】
カルボン酸エステルは、酵素触媒による過加水分解の際に所望の濃度の過酸を生産するのに十分な濃度で反応混合物中に存在する。カルボン酸エステルは反応混合物中において完全に可溶性でなくてもよいが、ペルヒドロラーゼ触媒によるエステルのそれに対応する過酸への変換を許容する程度の溶解性を有する。カルボン酸エステルは、反応混合物の０．０５質量％〜４０質量％の濃度で、好ましくは反応混合物の０．１質量％〜２０質量％の濃度で、およびより好ましくは反応混合物の０．５質量％〜１０質量％の濃度で反応混合物中に存在する。このカルボン酸エステルの質量％は、場合によりカルボン酸エステルの溶解限度よりも大きい場合がある（例えば水、酵素触媒、およびペルオキシドの原料からなる反応混合物中のカルボン酸エステルの濃度は少なくとも０．０００５質量％であり、残りのカルボン酸エステルは、２層の水／有機反応混合物の２番目の分離層として残っている場合）。添加されたカルボン酸エステルの全てが水性の反応混合物に迅速に溶解しなければならないわけではなく、全ての反応成分を最初に混合した後にさらに、連続的であるかまたは断続的な混合をすることも可能である。
【０２１４】
過酸素源としては、これらに限定されないが、過酸化水素、過酸化水素付加物（例えば、尿素の過酸化水素付加物（カルバミドペルオキシド））、ペルボレート塩、およびペルカルボネート塩が挙げられる。反応混合物中の過酸素化合物の濃度は、０．００３３質量％〜約５０質量％の範囲であってもよい、好ましくは０．０３３質量％〜約４０質量％、より好ましくは０．３３質量％〜約３０質量％である。
【０２１５】
多くのペルヒドロラーゼ触媒（全細胞、透過性の全細胞、および部分精製した全細胞抽出物）は、カタラーゼ活性を有することが報告されている（ＥＣ１．１１．１．６）。カタラーゼは、過酸化水素の酸素および水への変換を触媒する。一側面において、過加水分解触媒は、カタラーゼ活性がない。別の側面において、カタラーゼ阻害剤は、反応混合物に添加される。カタラーゼ阻害剤の例としては、これらに限定されないが、アジ化ナトリウム、および硫酸ヒドロキシルアミンが挙げられる。当業者であれば、必要に応じてカタラーゼ阻害剤の濃度調節することができる。カタラーゼ阻害剤の濃度は、典型的には０．１ｍＭ〜約１Ｍ；好ましくは約１ｍＭ〜約５０ｍＭ；より好ましくは約１ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲である。一側面において、アジ化ナトリウム濃度は、典型的には約２０ｍＭ〜約６０ｍＭの範囲であり、硫酸ヒドロキシルアミンの濃度は、典型的には約０．５ｍＭ〜約３０ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭである。
【０２１６】
別の実施態様において、このような酵素触媒は、有意なカタラーゼ活性がないか、もしくはカタラーゼ活性が減少しているか、または除去されるように操作される。宿主細胞中でのカタラーゼ活性は、よく知られた技術を用いてカタラーゼ活性に反応可能な遺伝子の発現を破壊することによってダウンレギュレートしてもよいし、または除去してもよく、このような技術としては、これらに限定されないが、トランスポゾン変異誘発、ＲＮＡアンチセンス発現、標的化変異誘発、およびランダム変異誘発が挙げられる。別の好ましい実施態様において、内因性カタラーゼ活性をコードする遺伝子は、ダウンレギュレートされるか、または破壊される（すなわちノックアウトされる）。本明細書で用いられるように、「破壊された」遺伝子は、そのように改変された遺伝子によってコードされたタンパク質の活性および／または機能がなくなってしまう遺伝子である。遺伝子を破壊する手段は当該分野で公知であり、例えば、これらに限定されないが、対応するタンパク質の活性および／または機能がなくなってしまうような遺伝子への挿入、欠失または突然変異が挙げられる。さらに好ましい実施態様において、生産宿主は、ｋａｔＧ（配列番号４７）、およびｋａｔＥ（配列番号５６）からなる群より選択される破壊されたカタラーゼ遺伝子を含むＥ．コリ生産宿主である。別の実施態様において、生産宿主は、ｋａｔｇ１およびｋａｔＥカタラーゼ遺伝子の両方のダウンレギュレーションおよび／または破壊を含むＥ．コリ株である。本発明においてｋａｔＧおよびｋａｔＥの二重のノックアウトを含むＥ．コリ株が提供される（実施例１５を参照；Ｅ．コリ株ＫＬＰ１８）。
【０２１７】
構築されたカタラーゼ陰性のＥ．コリ株ＫＬＰ１８（ｋａｔＧおよびｋａｔＥの二重のノックアウト）（実施例１５）は、発酵槽条件下で増殖させることによって決定したカタラーゼ陰性株ＵＭ２（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  ＃７１５６，イェール大学（Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ），コネチカット州ニューヘブン）と比較して（実施例１７〜１９）、ラージスケール（１０Ｌおよびそれより大規模）でのペルヒドロラーゼ酵素の生産のための優れた宿主であることが示された。ＫＬＰ１８およびＵＭ２の両方はカタラーゼ陰性株であるにもかかわらず、ＵＭ２は、多数の栄養要求を示すことがわかっており、従って高濃度の酵母抽出物およびペプトンを含む培地を必要とする。たとえ発酵のための強化培地を用いても、ＵＭ２の増殖は不十分であり、限定的な最大細胞密度（ＯＤ）にしかならない。それに対してＫＬＰ１８は特殊な栄養必要条件を有さず、無機培地単独、または追加の酵母抽出物を含む培地でも高い細胞密度に増殖した（実施例２０）。
【０２１８】
反応混合物水溶液中の触媒濃度は、触媒の特定の触媒活性に依存し、所望の反応速度が得られるように選択される。過加水分解反応中の触媒の質量は、典型的には、０．０００５ｍｇ〜１０ｍｇ／ｍＬ（総反応体積）の範囲であり、好ましくは０．０１０ｍｇ〜２．０ｍｇ／ｍＬの範囲である。またこのような触媒は、当業者によく知られた方法を用いて、可溶性または不溶性支持体に固定化されていてもよい；例えば、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ；Ｇｏｒｄｏｎ  Ｆ．Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ，編集者；ヒューマナ・プレス，トトワ，ニュージャージー州，米国；１９９７を参照。固定化触媒の使用により、その後の反応において触媒の回収および再利用が可能になる。このような酵素触媒は、微生物全細胞、透過性の微生物細胞、微生物細胞抽出物、部分精製した、または精製した酵素、およびそれらの混合物の形態であってもよい。
【０２１９】
一側面において、カルボン酸エステルの化学的な過加水分解と酵素的な過加水分解との組み合わせによって生成した過酸の濃度は、望ましいｐＨでの漂白または消毒にとって有効な濃度の過酸を提供するのに十分な濃度である。別の側面において、本発明の方法は、所望の有効な濃度の過酸を生産するための酵素と酵素基質との組み合わせを提供し、ここにおいて、添加された酵素が存在しない場合、それよりも有意に低い濃度の過酸しか生産されない。場合によっては無機過酸化物と酵素基質との直接的な化学反応によって実質的な酵素基質の化学的な過加水分解が起こり得るが、望ましい用途において有効な濃度の過酸を提供し、さらに、反応混合物へ適切なペルヒドロラーゼ触媒を添加することによって達成される総過酸濃度の有意な増加を提供するのに十分な濃度の過酸が生成しない可能性がある。
【０２２０】
少なくとも１種のカルボン酸エステルの過加水分解によって生成した過酸の濃度（例えば過酢酸）は、過加水分解反応が開始してから１０分以内、好ましくは５分以内、最も好ましくは１分以内に、少なくとも２ｐｐｍ、好ましくは少なくとも約２０ｐｐｍ、好ましくは少なくとも１００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約２００ｐｐｍの過酸、より好ましくは少なくとも３００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも５００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも７００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約１０００ｐｐｍの過酸、最も好ましくは少なくとも２０００ｐｐｍの過酸の濃度である。過酸を含む生成物混合物は、場合により、水または主に水で構成される溶液で希釈してもよく、それにより所望のより低い濃度の過酸を含む混合物を生産することができる。一側面において、所望の濃度の過酸を生産するのに必要な反応時間は、約２時間以下、好ましくは約３０分以下、より好ましくは約１０分以下、さらにより好ましくは約５分以下、および最も好ましくは約１分またはそれ未満である。別の形態において、所定濃度の微生物集団で汚染された硬い表面または無生物は、前記反応成分を約１分〜約１６８時間で組合わせること、または前記反応成分を約１分〜約４８時間、または約１分間〜２時間で組合わせること、またはこれらの範囲に含まれるあらゆる時間間隔で組合わせることによって本明細書で説明される方法に従って形成された過酸と接触させる。
【０２２１】
反応温度は、このような酵素触媒活性の反応速度と安定性の両方が制御されるように選択される。反応温度は、反応混合物の凝固点（約０℃）のすぐ上の温度から、約７５℃までの範囲であってよく、好ましい反応温度の範囲は約５℃〜約５５℃である。
【０２２２】
過酸を含む最終的な反応混合物のｐＨは、約２〜約９、好ましくは約３〜約８、より好ましくは約５〜約８、さらにより好ましくは約６〜約８、およびその上さらにより好ましくは約６．５〜約７．５である。別の実施態様において、反応混合物のｐＨは、酸性（ｐＨが７未満）である。反応および最終的な反応混合物のｐＨは、場合により適切な緩衝剤の添加によって制御してもよく、このような緩衝剤としては、これらに限定されないが、ホスフェート、ピロホスフェート、ビカルボネート、アセテートまたはシトレートが挙げられる。緩衝剤の濃度は、用いられる場合、典型的には０．１ｍＭ〜１．０Ｍ、好ましくは１ｍＭ〜３００ｍＭ、最も好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭである。
【０２２３】
別の側面において、酵素的な過加水分解反応混合物は、その反応混合物中にカルボン酸エステルの溶解速度を速めるための分散剤として作用する有機溶媒を含んでいてもよい。このような溶媒としては、これらに限定されないが、プロピレングリコールメチルエーテル、アセトン、シクロヘキサノン、ジエチレングリコールブチルエーテル、トリプロピレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールブチルエーテル、次プロピレングリコールメチルエーテル、シクロヘキサノール、ベンジルアルコール、イソプロパノール、エタノール、プロピレングリコール、およびこれらの混合物が挙げられる。
【０２２４】
別の側面において、酵素的な過加水分解生成物は、所望の機能を提供するさらなる構成要素を含んでいてもよい。これらのさらなる成分としては、これらに限定されないが、緩衝剤、洗剤ビルダー、増粘剤、乳化剤、界面活性剤、浸潤剤、腐食抑制剤（例えば、ベンゾトリアゾール）、酵素安定剤、および過酸化物安定剤（例えば、金属イオンキレート剤）が挙げられる。さらなる成分の多くは洗剤産業においてよく知られている（例えば米国特許第５，９３２，５３２号を参照；参照により本発明に包含させる）。乳化剤の例としては、これらに限定されないが、ポリビニルアルコール、またはポリビニルピロリドンが挙げられる。増粘剤の例としては、これらに限定されないが、ラポナイト（ＬＡＰＯＮＩＴＥ(R)）ＲＤ、コーンスターチ、ＰＶＰ、カーボワックス（ＣＡＲＢＯＷＡＸ(R)）、カーボポール（ＣＡＲＢＯＰＯＬ(R)）、カボシル（ＣＡＢＯＳＩＬ(R)）、ポリソルベート２０、ＰＶＡ、およびレシチンが挙げられる。緩衝系の例としては、これらに限定されないが、一塩基性リン酸ナトリウム／二塩基性リン酸ナトリウム；スルファミド酸／トリエタノールアミン；クエン酸／トリエタノールアミン；酒石酸／トリエタノールアミン；コハク酸／トリエタノールアミン；および酢酸／トリエタノールアミンが挙げられる。界面活性剤の例としては、これらに限定されないが、ａ）非イオン界面活性剤、例えばエチレンオキシドまたはプロピレンオキシドのブロックコポリマー、エトキシ化またはプロポキシル化された直鎖状および分枝鎖状の第一および第二アルコール、および脂肪族ホスフィン酸化物、ｂ）カチオン性界面活性剤、例えば第四級アンモニウム化合物、具体的には、３個のＣ1〜Ｃ2アルキル基と結合した窒素原子にさらにＣ8〜Ｃ20アルキル基が結合した第四級アンモニウム化合物、ｃ）アニオン性界面活性剤、例えばアルカンカルボン酸（例えば、Ｃ8〜Ｃ20脂肪酸）、アルキルホスホネート、アルカンスルホネート（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム「ＳＤＳ」）、または直鎖状または分枝鎖状のアルキルベンゼンスルホネート、アルケンスルホネート、およびｄ）両性および双極性イオン性界面活性剤、例えばアミノカルボン酸、アミノジカルボン酸、アルキルベタイン、およびそれらの混合物が挙げられる。さらなる成分として、芳香剤、色素、過酸化水素の安定剤（例えば、金属キレート化剤、例えば１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸（デクエスト（ＤＥＱＵＥＳＴ(R)）２０１０、ソルティア社（Ｓｏｌｕｔｉａ  Ｉｎｃ．，ミズーリ州セントルイス）、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、ターピナル（ＴＵＲＰＩＮＡＬ(R)）ＳＬ、デクエスト(R)０５２０、デクエスト(R)０５３１、酵素活性の安定剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、および洗剤ビルダーを含んでいてもよい。
【０２２５】
別の側面において、酵素的な過加水分解生成物は、消毒される表面または無生物と接触する前に、所望のペルオキシカルボン酸濃度とするように事前に混合されていてもよい。
【０２２６】
別の側面において、酵素的な過加水分解生成物は、消毒される表面または無生物と接触する前に事前に混合せずに所望の濃度のペルオキシカルボン酸を発生させるが、そのかわりに所望のペルオキシカルボン酸濃度を生成する反応混合物の成分が、消毒する表面または無生物と接触することで所望の濃度のペルオキシカルボン酸濃度を発生させる。いくつかの実施態様において、この反応混合物の成分はその場で（ａｔ  ｔｈｅ  ｌｏｃｕｓ）合わせられるかまたは混合される。いくつかの実施態様において、この反応成分はその場所に送達されるかまたは適用され、その後混合されるかまたは合わせられて所望の濃度のペルオキシカルボン酸を発生させる。
【０２２７】
ペルヒドロラーゼ触媒を用いた過酸のその場生産
セファロスポリンＣデアセチラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４１；分類名は、ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ｃ  ａｃｅｔｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ；ＣＡＨ）は、セファロスポリンＣ、７−アミノセファロスポラン酸、および７−（チオフェン−２−アセトアミド）セファロスポラン酸のようなセファロスポリンに結合したアセチルエステルを加水分解する能力を有する酵素である（Ａｂｂｏｔｔ，Ｂ．ａｎｄ  Ｆｕｋｕｄａ，Ｄ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０（３）：４１３−４１９（１９７５）。ＣＡＨは、炭水化物エステラーゼファミリー７と称されるより大きい構造的に関連する酵素のファミリーに属する（ＣＥ−７；Ｃｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．，Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ａｃｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ：ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ”  ｉｎ  Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈ．Ｊ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｇ．Ｄａｖｉｅｓ，Ｂ．ＨｅｎｒｉｓｓａｔおよびＢ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ編集（１９９９）Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，３〜１２頁を参照）。
【０２２８】
ＣＥ−７ファミリーは、ＣＡＨ、およびアセチルキシランエステラーゼ（ＡＸＥ；Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２）の両方を含む。ＣＥ−７ファミリーは、共通の構造的なモチーフを共有しており、これらは典型的には、アセチル化キシロオリゴ糖およびセファロスポリンＣの両方にエステル加水分解活性を示すという点で極めて珍しく、これから、ＣＥ−７ファミリーは、各種の小さい基質に対して多機能のデアセチラーゼ活性を有する単一のタンパク質クラスを示すことがわかる（Ｖｉｎｃｅｎｔ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３０：５９３−６０６（２００３））。Ｖｉｎｃｅｎｔ等は、このファミリーに属するもののなかでも構造的な類似性を説明しており、ＣＥ−７ファミリーに特徴的なシグネチャーの配列モチーフを定義している。
【０２２９】
ＣＥ−７ファミリーに属するものは、植物、菌類（例えば、セファロスポリジウム・アクレモニウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ））、酵母（例えば、ロドスポリディウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、ロドトルラ・グルティニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ））、および細菌、例えばサーモアナエロバクテリウム属；ノルカルディア・ラクタムデュランス（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ  ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ）、および様々な種類のバチルス属に見出される（Ｐｏｌｉｔｉｎｏ等，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３（１２）：４８０７−４８１１（１９９７）；Ｓａｋａｉ等，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．８５：５３−５７（１９９８）；Ｌｏｒｅｎｚ，Ｗ．ａｎｄ  Ｗｉｅｇｅｌ，Ｊ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７９：５４３６−５４４１（１９９７）；Ｃａｒｄｏｚａ等，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５４（３）：４０６−４１２（２０００）；Ｍｉｔｓｈｕｓｈｉｍａ等，ｓｕｐｒａ，Ａｂｂｏｔｔ，Ｂ．ａｎｄ  Ｆｕｋｕｄａ，Ｄ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０（３）：４１３−４１９（１９７５）；Ｖｉｎｃｅｎｔ等，ｓｕｐｒａ，Ｔａｋａｍｉ等，ＮＡＲ，２８（２１）：４３１７−４３３１（２０００）；Ｒｅｙ等，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．，５（１０）：ａｒｔｉｃｌｅ  ７７（２００４）；Ｄｅｇｒａｓｓｉ等，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．，１４６：１５８５−１５９１（２０００）；米国特許第６，６４５，２３３号；米国特許第５，２８１，５２５号；米国特許第５，３３８，６７６号；およびＷＯ９９／０３９８４。表１に、配列番号２に有意な相同性を有するＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーの非包括的な一覧を示す。
【０２３０】
【表２】
0005677091.tif 000012
【０２３１】
【表３】
0005677091.tif 000013
【０２３２】
【表４】
0005677091.tif 000014
【０２３３】
本発明のペルヒドロラーゼは、全てＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属するものである。Ｖｉｎｃｅｎｔ等（上記）によって説明されているように、上記ファミリーに属するものは、このファミリーに特徴的な共通のシグネチャーモチーフを共有する。本発明のペルヒドロラーゼのＣＬＵＳＴＡＬＷアライメントから、これらのものはいずれもＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属することがわかる（図１Ａ〜Ｃ）。表２に、本発明のペルヒドロラーゼの総体的なアミノ酸同一性（％）の量の比較を示す。
【０２３４】
【表５】
0005677091.tif 000015
【０２３５】
総体的なアミノ酸同一性（％）に関してバリエーションが観察されるが（すなわち、クロストリジウム・テルモセルムＡＴＣＣ２７４０５TMのペルヒドロラーゼ；配列番号１４は、バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TMのペルヒドロラーゼ；配列番号２と５７％のアミノ酸同一性しか有さないが、バチルス・クラウシイのペルヒドロラーゼ（配列番号２６）は、配列番号２と３３％の同一性しか有さない）、本発明のペルヒドロラーゼ酵素はそれぞれ、ＣＥ−７シグネチャーモチーフを共有する。従って、本発明のペルヒドロラーゼ触媒は、構造的にＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属するものとして分類される酵素である。本発明のペルヒドロラーゼ酵素はそれぞれ、ＣＥ−７シグネチャー（診断）モチーフを含む。
【０２３６】
Ｖｉｎｃｅｎｔ等（上記）がＣＥ−７エステラーゼの構造を解析したところ、そのファミリーの診断要素である数種の高度に保存されたモチーフが同定された。図１で示されるように、高度に保存されたモチーフ（図１で下線で示した；配列番号２に対して位置を番号付けた）は、Ａｒｇ１１８−Ｇｌｙ１１９−Ｇｌｎ１２０（ＲＧＱ）、Ｇｌｙ１７９−Ｘａａ１８０−Ｓｅｒ１８１−Ｇｌｎ１８２−Ｇｌｙ１８３（ＧＸＳＱＧ）、およびＨｉｓ２９８−Ｇｌｕ２９９（ＨＥ）を含む。加えて、図１は、シグネチャーモチーフをさらに特徴付けることに使用可能なさらなる高度に保存されたＬｙｓ２６７−Ｘａａ２６８−Ａｓｐ２６９（ＬＸＤ）モチーフも記載している。全ての番号付けは、参照配列（Ｂ．ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TMのペルヒドロラーゼ；配列番号２）の番号付けに対してなされている。
【０２３７】
一実施態様において、適切な過加水分解酵素は、ＣＥ−７シグネチャーモチーフの存在によって同定することができる（Ｖｉｎｃｅｎｔ等，上記）。別の好ましい実施態様において、ＣＥ−７シグネチャーモチーフを含むペルヒドロラーゼは、バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TMのペルヒドロラーゼ（配列番号２；すなわち、相対的なアミノ酸位置の番号付けに用いられる参照配列）に対してＣＬＵＳＴＡＬＷアライメントを用いて同定される。配列番号２のアミノ酸残基の番号付けのように、ＣＥ−７シグネチャーモチーフは、以下のように定義される３種の保存されたモチーフを含む：
ａ）Ａｒｇ１１８−Ｇｌｙ１１９−Ｇｌｎ１２０；
ｂ）Ｇｌｙ１７９−Ｘａａ１８０−Ｓｅｒ１８１−Ｇｌｎ１８２−Ｇｌｙ１８３；および
ｃ）Ｈｉｓ２９８−Ｇｌｕ２９９。
【０２３８】
典型的には、アミノ酸残基１８０位におけるＸａａは、グリシンまたはアラニン、プロリン、トリプトファン、またはトレオニンである。触媒性の三つ組に属する３つのアミノ酸残基のうちの２つを太字で示す。一実施態様において、アミノ酸残基１８０位におけるＸａａは、グリシン、アラニン、プロリン、トリプトファン、およびトレオニンからなる群より選択される。
【０２３９】
ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリー内の保存されたモチーフのさらなる解析から、さらにＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属するペルヒドロラーゼを特徴付ける可能性がある、さらなる保存されたモチーフ（配列番号２のアミノ酸２６７〜２６９位におけるＬＸＤ）の存在が示される（図１ａ〜ｃ）。さらなる実施態様において、上記で特徴付けられたシグネチャーモチーフは、以下のように定義された第四の保存されたモチーフを含む：
Ｌｅｕ２６７−Ｘａａ２６８−Ａｓｐ２６９．
【０２４０】
アミノ酸残基２６８位におけるＸａａは、典型的には、イソロイシン、バリン、またはメチオニンである。第四のモチーフは、触媒性の三つ組の第三のメンバーであるアスパラギン酸残基（太字）を含む（Ｓｅｒ１８１−Ａｓｐ２６９−Ｈｉｓ２９８）。
【０２４１】
多数のよく知られたグローバルアライメントのアルゴリズム（すなわち配列解析ソフトウェア）を用いて、２種またはそれ以上のアミノ酸配列（ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素を示す）をアラインしてもよく、それにより、本発明のシグネチャーモチーフの存在を決定することができる（例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、またはＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５）。アラインした配列は、参照配列（配列番号２）と比較される。一実施態様において、参照アミノ酸配列（本明細書で用いられるように、バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TM由来のＣＡＨ配列（配列番号２））を用いた  ＣＬＵＳＴＡＬアライメント（ＣＬＵＳＴＡＬＷ）を用いて、ＣＥ−７エステラーゼファミリーに属するペルヒドロラーゼを同定することができる。保存されたアミノ酸残基の相対的な番号付けは、並べられた配列内のわずかな挿入または欠失（５個またはそれ未満のアミノ酸）を考慮に入れるために、参照アミノ酸配列における残基の番号付けに基づく。
【０２４２】
本明細書において例示されたペルヒドロラーゼ間での全体の同一性（％）の比較から、配列番号２に対してわずか３３％の同一性しか有さない酵素（シグネチャーモチーフを保持しているものの）は、有意なペルヒドロラーゼ活性を示し、構造的にＣＥ−７炭水化物エステラーゼと分類されることが示される。一実施態様において、本発明のペルヒドロラーゼとしては、本発明のシグネチャーモチーフを含む酵素であって、配列番号２に対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３３％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも４２％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸同一性を有するものが挙げられる。
【０２４３】
全ての本発明のペルヒドロラーゼは、表３で示したような上記のシグネチャーモチーフで構成される。
【表６】
0005677091.tif 000016
【０２４４】
あるいは、４種の保存されたモチーフ（ＲＧＱ、ＧＸＳＱＧ、ＬＸＤおよびＨＥ；配列番号２のアミノ酸残基１１８〜２９９）を含む連続したシグネチャーモチーフ（配列番号６１）も、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼを同定するための連続したシグネチャーモチーフとして使用できる（図１ａ〜ｃ）。そのようなものとして、適切な酵素はペルヒドロラーゼ活性を有すると予想され、さらに、配列番号６１に対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有すると同定されたものでもよい（ＣＥ−７炭水化物エステラーゼに見出される４種の保存されたモチーフは、下線で示される）。
ＲＧＱＱＳＳＥＤＴＳＩＳＬＨＧＨＡＬＧＷＭＴＫＧＩＬＤＫＤＴＹＹＹＲＧＶＹＬＤＡＶＲＡＬＥＶＩＳＳＦＤＥＶＤＥＴＲＩＧＶＴＧＧＳＱＧＧＧＬＴＩＡＡＡＡＬＳＤＩＰＫＡＡＶＡＤＹＰＹＬＳＮＦＥＲＡＩＤＶＡＬＥＱＰＹＬＥＩＮＳＦＦＲＲＮＧＳＰＥＴＥＶＱＡＭＫＴＬＳＹＦＤＩＭＮＬＡＤＲＶＫＶＰＶＬＭＳＩＧＬＩＤＫＶＴＰＰＳＴＶＦＡＡＹＮＨＬＥＴＥＫＥＬＫＶＹＲＹＦＧＨＥ        （配列番号６１）
【０２４５】
表４に、連続したシグネチャー配列を用いた本発明のペルヒドロラーゼ活性を有するＣＥ−７エステラーゼとの比較を示す。デフォルトパラメーターを用いたＢＬＡＳＴＰを用いた。
【０２４６】
【表７】
0005677091.tif 000017
【０２４７】
あるいは、１種またはそれ以上の本発明のペルヒドロラーゼの完全長に対するアミノ酸同一性（％）も使用可能である。従って、適切なペルヒドロラーゼ活性を有する酵素は、配列番号２に対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３３％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、その上さらにより好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有する。さらなる実施態様において、適切なペルヒドロラーゼ触媒は、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２６、配列番号３２、配列番号７０、配列番号８２、配列番号９０、配列番号９８、および配列番号１０６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。好ましい実施態様に置いて、ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素は、配列番号８２、配列番号９０、配列番号９８または配列番号１０６と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有する。
【０２４８】
また適切なペルヒドロラーゼ酵素は、本発明のペルヒドロラーゼ酵素（例えば、配列番号８２、９０、９８および１０６）のいずれか１つに１個またはそれ以上の欠失、置換および／または挿入を有する酵素を含んでいてもよい。表２で示されるように、ペルヒドロラーゼ活性を有するＣＥ−７炭水化物エステラーゼは、わずか３２％の総体的なアミノ酸同一性しか共有しない。本発明の実施例で提供されたデータによれば、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属するペルヒドロラーゼ活性を有する追加の酵素は、酵素が保存されたシグネチャーモチーフを保持してさえいれば、それより低い同一性（％）しか有さないものでもよい。そのようなものとして、酵素内の相対的な位置に保存されたシグネチャーモチーフ（表３を参照）が存在してさえいれば、様々な多数の欠失、置換および／または挿入が存在していてもよい。
【０２４９】
加えて、それに対応する核酸配列内で見出された構造的な類似性に従って適切な酵素を同定することは、十分に当業者の技術的範囲内である。ハイブリダイゼーション技術を用いて、類似した遺伝子配列を同定することができる。従って、本発明の適切なペルヒドロラーゼ触媒は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２５、配列番号３１、配列番号４１、配列番号６０、配列番号６５、配列番号６９、配列番号７４、配列番号７７、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８５、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９３、配列番号９６、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１０４、および配列番号１０５からなる群より選択される核酸配列を有する核酸分子にハイブリッド形成する核酸分子によってコードされたアミノ酸配列を含む。
【０２５０】
別の実施態様において、ペルヒドロラーゼ触媒は、配列番号７７、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８５、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９３、配列番号９６、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１０４、および配列番号１０５からなる群より選択される核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸分子によってコードされたアミノ酸配列を有する酵素を含む。
【０２５１】
本発明の方法によれば、水性反応条件下で、炭水化物エステラーゼのＣＥ−７ファミリーに属する酵素のペルヒドロラーゼ活性を用いて、工業的に有用な、効果的な濃度の過酸がその場生産される。一実施態様において、ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素はまた、構造的および機能的にセファロスポリンＣデアセチラーゼ（ＣＡＨ）にも分類される。別の実施態様において、ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素は、構造的および機能的にアセチルキシランエステラーゼ（ＡＸＥ）と分類される。
【０２５２】
このようにして生産された過酸はかなりの反応性を有しており、これらに限定されるわけではないが、温度やｐＨを含む変数に依存して経時的に濃度が減少することがある。そのようなものとして、特に液体製剤の場合、様々な反応成分を分離した状態に維持することが望ましい場合がある。一形態において、過酸化水素源は、基質またはペルヒドロラーゼ触媒のいずれかから分離されており、好ましくはその両方から分離されている。これは、様々な技術を用いて達成することができ、このような技術としては、これらに限定されないが、多数のコンパートメントを有するディスペンサーの使用（米国特許第４，５８５，１５０号）、および使用時にペルヒドロラーゼ触媒と無機過酸化物および本発明の基質とを物理的に合わせることによって、水性で酵素的な過加水分解反応を開始させることが挙げられる。ペルヒドロラーゼ触媒は、場合により、反応チャンバー本体内に固定化されていてもよいし、または処理の標的となる表面および／または物体と接触させる前に、過酸を含む反応生成物から分離（例えば、ろ過等）させてもよい。ペルヒドロラーゼ触媒は、液体マトリックス中に存在していてもよいし、または固体の形態（すなわち粉末化、錠剤）でもよいし、または固体マトリックス内に埋め込まれていてもよい（その後、酵素的な過加水分解反応を開始させるために基質と混合される）。さらなる側面において、ペルヒドロラーゼ触媒を、溶解可能な、または多孔性のパウチ内に収容してもよく、続いてこのパウチを、酵素的な過加水分解を開始させるために水性の基質マトリックスに添加してもよい。追加のさらなる側面において、このような酵素触媒を含む粉末を基質（例えばトリアセチン）に懸濁して、使用時に水中で過酸素源と混合する。
【０２５３】
過酸および過酸化水素の濃度を決定するためのＨＰＬＣ分析方法  
反応物および生産物を解析するために、本発明の方法において様々な分析方法を用いることができ、このような分析方法としては、これらに限定されないが、滴定、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、マススペクトロスコピー（ＭＳ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、Ｕ．Ｋａｒｓｔ等（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６９（１７）：３６２３−３６２７（１９９７））によって説明されている分析法、および本発明の実施例で説明されるような２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン）−６−スルホネート（ＡＢＴＳ）分析（Ｓ．Ｍｉｎｎｉｎｇ等，Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３７８：２９３−２９８（１９９９）、およびＷＯ２００４／０５８９６１Ａ１）が挙げられる。
【０２５４】
過酸の最少殺生物濃度の決定
Ｊ．Ｇａｂｒｉｅｌｓｏｎ等（Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５０：６３−７３（２００２））によって説明されている方法を用いて、過酸または過酸化水素、および酵素基質の最少殺生物濃度（ＭＢＣ）を決定することができる。この分析方法はＸＴＴ還元の阻害に基づいており、ここでＸＴＴ（（２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−５−［（フェニルアミノ）カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウム、分子内塩、モノナトリウム塩）は、４９０ｎｍまたは４５０ｎｍで測定された光学密度（ＯＤ）の変化によって微生物の呼吸活性を指示する酸化還元色素である。しかしながら、消毒剤および防腐剤の活性の試験に利用可能な様々なその他の方法があり、例えば、これらに限定されないが、生存可能なプレートの計数、直接的な顕微鏡による計数、乾燥質量、濁度測定、吸光度および生物発光（例えば、Ｂｒｏｃｋ，Ｓｅｍｏｕｒ  Ｓ．，Ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ，第５版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，フィラデルフィア，ペンシルベニア州，米国；２００１を参照）が挙げられる。
【０２５５】
酵素的に製造された過酸組成物の使用
本発明に係る方法に従って製造した酵素触媒により生成した過酸は、様々な硬い表面／無生物への用途において、微生物、真菌、プリオン関連およびウイルス汚染の濃度を減少させるために用いることができ、例えば、医療機器（例えば内視鏡）、テクスタイル（例えば、衣服、カーペット）、調理用の表面、食品保存および食品包装器具、食品の包装に用いられる材料、ニワトリの孵化場、および飼育施設、動物の囲い、および微生物および／または殺ウイルス活性を有する使用済みのプロセス水の汚染除去に用いることができる。酵素により生成した過酸をプリオンを不活性化するように設計された製剤（例えば、所定のプロテアーゼ）に用いて、追加の殺菌活性を提供してもよい。好ましい形態において、本発明の過酸組成物は、特に、オートクレーブ不可能な医療機器や食品包装装置のための消毒剤として有用である。過酸を含む製剤は、ＧＲＡＳまたは食品グレードの成分（酵素、酵素基質、過酸化水素、および緩衝液）を用いて調製してもよいために、酵素により生成した過酸はさらに、動物の死体、肉、果物および野菜の汚染除去のために、または加工食品の汚染除去のために用いてもよい。酵素により生成した過酸は、最終的な形態が、粉末、液体、ゲル、フィルム、固体またはエアロゾルである製品に組み込んでもよい。酵素により生成した過酸は、なお有効な汚染除去効果を示すような濃度に希釈してもよい。
【０２５６】
有効な濃度の過酸を含む組成物を用いて、生存可能な病原性の微生物汚染物質で汚染された（または汚染された疑いのある）表面および／または物体を、表面または物体と本発明の方法によって生産された生成物とを接触させることによって消毒することができる。本明細書で用いられる「〜を接触させること」は、病気を引き起こす物体での汚染の疑いのある表面または無生物を、有効な濃度の過酸を含む消毒組成物に洗浄し消毒するのに十分な期間接触させた状態に置くことを意味する。「〜接触させること」は、噴霧すること、処理すること、浸漬すること、フラッシングすること、その上またはその中に流し込むこと、混合すること、組み合わせること、ペイントすること、コーティングすること、塗布すること、付着させることによって、およびその他の方法で、有効な濃度の過酸を含む過酸溶液もしくは組成物、または有効な濃度の過酸を形成する溶液もしくは組成物と、ある濃度の微生物集団で汚染されている疑いのある表面または無生物とが接触するようにすることを含む。本消毒剤組成物は、洗浄および消毒作用の両方を提供するために、洗浄用組成物と組み合わせてもよい。あるいは、一つの組成物で洗浄および消毒作用の両方を提供するために、本製剤に洗剤（例えば、界面活性剤または洗剤）が含有されていてもよい。
【０２５７】
また、有効な濃度の過酸を含む組成物は、少なくとも１種の追加の抗菌剤、プリオン分解プロテアーゼ、殺ウイルス剤、殺胞子剤、または殺生物剤の組み合わせを含んでいてもよい。これらの物質と特許請求された方法によって生産された過酸とを組み合わせることによって、病原微生物、胞子、ウイルス、菌類および／またはプリオンで汚染された（または汚染された疑いのある）表面および／または物体を洗浄および消毒するのに用いられる場合、効果向上および／または相乗効果を提供することができる。適切な抗菌剤としては、カルボン酸エステル（例えば、ｐ−ヒドロキシアルキルベンゾエート、およびアルキルシンナメート）、スルホン酸（例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸）、ヨード化合物もしくは活性なハロゲン化合物（例えば、元素のハロゲン、ハロゲン酸化物（例えば、ＮａＯＣｌ、ＨＯＣｌ、ＨＯＢｒ、ＣｌＯ2）、ヨウ素、インターハロゲン化物（ｉｎｔｅｒｈａｌｉｄｅ）（例えば、一塩化ヨウ素、二塩化ヨウ素、三塩化ヨウ素、四塩化ヨウ素、塩化臭素、一臭化ヨウ素、または二臭化ヨウ素）、ポリハロゲン化物、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸、次亜臭素酸塩、次亜臭素酸、クロロおよびブロモヒダントイン、二酸化塩素、および亜塩素酸ナトリウム）、有機過酸化物、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化アルキルベンゾイル、オゾン、一重項酸素発生剤、およびそれらの混合物、フェノール誘導体（例えば、ｏ−フェニルフェノール、ｏ−ベンジル−ｐ−クロロフェノール、ｔｅｒｔ−アミルフェノール、およびＣ1〜Ｃ6アルキルヒドロキシベンゾエート）、第四級アンモニウム化合物（例えば、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、およびそれらの混合物）、およびこのような抗菌剤の混合物が挙げられ、これらは、所望の程度の微生物からの保護を提供するのに十分な量である。抗菌剤の有効量としては、約０．００１質量％〜約６０質量％の抗菌剤、約０．０１質量％〜約１５質量％の抗菌剤、または約０．０８質量％〜約２．５質量％の抗菌剤が挙げられる。
【０２５８】
一側面において、本発明の方法によって形成された過酸を用いて、それらをある場所の上に、および／またはその地点に塗布すると、生存可能な微生物汚染物質（例えば、生存可能な微生物集団）の濃度を減少させることができる。本明細書で用いられるように、本発明の「場所」は、消毒または漂白に適した標的の表面の一部または全部を含む。標的の表面としては、潜在的に微生物、ウイルス、菌類、プリオンまたはそれらの組み合わせで汚染される可能性があるあらゆる表面が挙げられる。非限定的な例としては、食品または飲料産業で見られる器具の表面（例えば、タンク、コンベヤー、床、ドレーン、クーラー、冷凍庫、器具の表面、壁、バルブ、ベルト、パイプ、ドレーン、ジョイント、裂け目、それらの組み合わせなど）；建築物の表面（例えば、壁、床、および窓）；食品以外の業界に関連するパイプおよびドレーン、例えば、水処理施設、プールおよび温泉場、ならびに発酵タンク；病院または動物病院の表面（例えば、壁、床、ベッド、器具（例えば、内視鏡）病院／動物病院またはその他の医療の場で着用される衣類、例えば衣類、洗浄具（ｓｃｒｕｂ）、靴、およびその他の病院または動物病院の表面）；レストランの表面；浴室の表面；トイレ；衣服、および靴；家禽、ウシ、乳牛、ヤギ、ウマおよびブタのような家畜のための納屋または家畜小屋の表面；家禽またはエビのための孵化場；および薬剤または生物薬剤の表面（例えば、薬剤または生物薬剤の製造器具、薬剤または生物薬剤の成分、薬剤または生物薬剤の賦形剤）が挙げられる。また、さらなる硬い表面としては、食品、例えば牛肉、鶏肉、豚肉、野菜、果物、海産食物、それらの組み合わせなども挙げられる。また上記場所としては、水を吸収する材料、例えば感染したリネンまたはその他の布地も挙げられる。また上記場所としては、収穫された植物または植物製品も挙げられ、例えば、種、球茎、塊茎、果実および野菜、発芽させた植物、および特に作物の発芽させた植物、例えば、穀草、葉菜、およびサラダ用作物、根菜、豆類、ベリー系の果物、柑橘系の果物、および硬い果物が挙げられる。
【０２５９】
硬い表面を有する材料の非限定的な例は、金属（例えば、鋼、ステンレス鋼、クロム、チタン、鉄、銅、真鍮、アルミニウムおよびそれらの合金）、無機物質（例えば、コンクリート）、ポリマーおよびプラスチック（例えば、ポリオレフィン、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリラート、ポリアクリロニトリル、ポリブタジエン、ポリ（アクリロニトリル、ブタジエン、スチレン）、ポリ（アクリロニトリル、ブタジエン）、アクリロニトリルブタジエン；ポリエステル、例えばポリエチレンテレフタラート；ならびに、ポリアミド、例えばナイロン）である。さらなる表面としては、レンガ、タイル、セラミック、磁器、木材、ビニル、リノリウム、およびカーペットが挙げられる。
【０２６０】
組換え微生物の発現
本発明の配列の遺伝子および遺伝子産物は、異種宿主細胞中で、具体的には微生物宿主の細胞中で生産してもよい。本発明の遺伝子および核酸分子を発現させるための好ましい異種宿主細胞は、真菌または細菌属内で見出すことができ、広範な温度、ｐＨ値および溶媒耐性にわたり成長する微生物宿主である。例えば、細菌、酵母および糸状菌のいずれかが、適切に本発明の核酸分子の発現の宿主となり得ることが考えられる。ペルヒドロラーゼは、細胞内、細胞外または細胞内と細胞外の両方の組み合わせで発現される可能性があり、ここにおいて細胞外で発現させる方が、細胞内発現によって生産されたタンパク質を回収する方法よりも、発酵産物からの所望のタンパク質の回収が容易になる。転写、翻訳およびタンパク質生合成装置は、細胞のバイオマスを生成するのに用いられる細胞供給材料と比較して不変のままであり；それにもかかわらず機能的な遺伝子は発現する。宿主株の例としては、これらに限定されないが、細菌、真菌または酵母種が挙げられ、例えば、アスペルギルス属、トリコデルマ属、サッカロミセス属、ピチア属、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属、カンジダ、ハンセヌラ属、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、サルモネラ属、バチルス属、アシネトバクター属、ジモモナス属、アグロバクテリウム属、エリスロバクター属（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム属、クロマチウム属、フラボバクテリウム属、キトファガ属、ロドバクター属、ロドコッカス属、ストレプトマイセス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリア属、マイコバクテリウム属、デイノコッカス属、エシェリキア属、エルウィニア属、パントエア属、シュードモナス属、スフィンゴモナス属、メチロモナス属、メチロバクター属、メチロコッカス属、メチロサイナス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロマイクロビウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス属、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ属、チオバチルス属、メタノバクテリウム属、クレブシエラ属、およびミクソコッカス属が挙げられる。一実施態様において、細菌の宿主株としては、エシェリキア属、バチルス属、およびシュードモナス属が挙げられる。その他の好ましい実施態様において、細菌の宿主細胞は、エシェリキア・コリである。
【０２６１】
大規模な微生物の増殖、および機能的な遺伝子の発現は、多様な簡単または複雑な炭水化物、有機酸、およびアルコール、または飽和炭化水素、例えばメタンまたは二酸化炭素を使用する可能性があり、光合成または化学的独立栄養の宿主の場合、窒素、リン、硫黄、酸素、炭素またはあらゆる微量栄養素（例えば低分子量の無機物質イオンなど）の形態および量を使用する可能性がある。増殖速度の調節は、特定の調節分子を培養に添加すること、または添加しないことによって影響を受ける可能性があり、これらは、典型的には栄養素またはエネルギー源とはされない。
【０２６２】
適切な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは当該分野で公知である。典型的には、ベクターまたはカセットは、関連する遺伝子の転写および翻訳を作動させる配列、選択マーカー、および自律増殖させたり、または染色体を統合させたりする配列を含む。適切なベクターは、転写開始の制御を担う遺伝子の５’領域、および転写終結を制御するＤＮＡフラグメントの３’領域を含む。両方の制御領域が、形質転換宿主細胞に相同な遺伝子、および／または生産宿主に対して天然型の遺伝子から誘導される場合が最も好ましいが、このような制御領域は、必ずしもそのようにして誘導されていなくてもよい。
【０２６３】
所望の宿主細胞中で本発明のセファロスポリンＣデアセチラーゼのコード領域を発現させるのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者によく知られている。実質的には、これらの遺伝子を稼働させることができればどのようなプロモーターでも本発明に適しており、例えば、これらに限定されないが、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセスにおける発現に有用）；ＡＯＸ１（ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）における発現に有用）；およびｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰL、ｌＰR、Ｔ７、ｔａｃおよびｔｒｃ（エシェリキア・コリにおける発現に有用）、加えて、ａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーター、およびバチルスにおける発現に有用な様々なファージプロモーターが挙げられる。
【０２６４】
また、終結制御領域も、好ましい宿主細胞にとって天然型の様々な遺伝子から誘導することができる。一実施態様において、終結制御領域の含有は任意である。別の実施態様において、キメラ遺伝子は、好ましい宿主細胞から誘導された終結制御領域を含む。
【０２６５】
工業的な生産
本発明のペルヒドロラーゼ触媒を生産するのに様々な培養方法を適用することができる。例えば、組換え微生物宿主からの過剰発現させた特定の遺伝子産物の大規模な生産は、バッチ式および連続培養法のどちらによっても生産することができる。
【０２６６】
典型的なバッチ式培養法は閉鎖系であり、ここで、培地組成は培養の開始時に設定され、培養工程中に人為的な変更を受けることはない。従って、培養工程の開始時に、培地に所望の生物または生物群を播種し、増殖させるか、または系に追加で何も添加しないで代謝活性を起こさせてもよい。しかしながら、「バッチ式」培養は、典型的には炭素源の添加に関してバッチ式なのであって、ｐＨおよび酸素濃度のような要因を制御する試みがなされること多い。バッチ系において、系の代謝産物およびバイオマス組成は、培養が終わる時間まで絶えず変化する。バッチ内で、培養細胞は穏やかに静止状態のラグフェーズを経て高い対数増殖期になり、最終的に定常期になり、ここにおいて増殖速度は減少するか、または停止する。未処理の場合、定常期中の細胞は最終的には死滅すると予想される。いくつかの系において、対数期中の細胞が最終産物または中間体の生産の大部分を担うことが多い。その他の系において、静止または対数期後も生産が起こる可能性がある。
【０２６７】
標準的なバッチ系における変化形は、流加培養系である。本発明において、流加培養プロセスも適切であり、これは典型的なバッチ系を含むが、基質が培養が進行するにつれて段階的に添加される。流加培養系は、異化代謝産物の抑制が細胞の代謝を阻害しやすい場合に有用であり、ここにおいて、培地中に限定的な量の基質しか含まれていないことが望ましい。流加培養系における実際の基質濃度の測定は難しいため、ｐＨ、溶存酸素および排ガス（例えばＣＯ2）の分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチ式および流加培養法は一般的で当業界公知であり、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９）、およびＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６：２２７（１９９２）においてその例が見出される。
【０２６８】
また、連続培養を用いて、望ましいペルヒドロラーゼ触媒の生産も達成することができる。連続培養は開放系であり、ここにおいてバイオリアクターに規定された培地が連続的に添加され、同時に等量の調整培地が処理のために除去される。一般的に、連続培養では、細胞が一定の高い液相密度に維持され、ここにおいて細胞は主として対数増殖期にある。あるいは、固定化細胞を用いて連続培養を実施してもよく、ここにおいて炭素および栄養素は連続的に添加され、有用な生成物、副産物または廃棄物は、細胞塊から連続的に除去される。細胞の固定化は、天然および／または合成材料で構成される多様な固体支持体を用いて行うことができる。
【０２６９】
連続または半連続培養によって、細胞増殖または最終産物の濃度に影響を与える１つの因子または多数の因子の調節が可能になる。例えば、１つ方法によれば、炭素源または窒素レベルのような制限される栄養素を固定化の比率で維持し、その他の全てのパラメーターの調節を可能にすると予想される。その他の系において、増殖に影響を与える多数の因子の連続的な変更が可能であり、一方で、細胞濃度（培地の濁度によって測定される）は一定に維持される。連続的な系では、定常状態での増殖状態が維持されるような努力がなされるため、培養中に培地が取り出されることによる細胞の損失は、細胞増殖速度に応じてバランスをとらなければならない。連続培養プロセスのための栄養素および増殖因子を調節する方法、加えて、生成物の生成速度を最大化する技術は、工業的な微生物学の業界においてよく知られており、上記のＢｒｏｃｋによって様々な方法が詳述されている。
【０２７０】
本発明における発酵培地は、適切な炭素基質を含んでいなければならない。適切な基質としては、これらに限定されないが、単糖（例えばグルコース、およびフルクトース）、二糖（例えばラクトース、またはスクロース）、多糖（例えばスターチ、またはセルロース）、またはそれらの混合物、および例えばチーズ乳清の浸透液、コーンスティープリカー、砂糖大根の糖蜜、および大麦の麦芽のような再生可能な供給材料由来の未精製の混合物が挙げられる。加えて、炭素基質は１個の炭素を含む基質であってもよく、例えば二酸化炭素、メタンまたはメタノール（例えば、宿主細胞がメチロトローフィックな微生物である場合）である。同様に、様々なカンジダ種がアラニンまたはオレイン酸を代謝する（Ｓｕｌｔｅｒ等，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１５３：４８５−４８９（１９９０））。従って、本発明において利用される炭素源は多種多様の炭素を含む基質を包含し得ることが考えられ、生物の選択によってのみ限定されると予想される。
【０２７１】
回分発酵法もしくは流加発酵法または連続培養からの所望のペルヒドロラーゼ触媒の回収は、当業者に公知の任意の方法によってなされてもよい。例えば、ペルヒドロラーゼ触媒が細胞内に生成された場合、その細胞ペーストを遠心分離または膜ろ過によって培養培地から分離し、場合により水または望ましいｐＨの水性緩衝液で洗浄し、その後望ましいｐＨの水性緩衝液中の細胞ペースト懸濁液をホモジナイズして所望のペルヒドロラーゼ触媒を含む細胞抽出物を生成する。この細胞抽出物を場合によりセライトまたはシリカなどの適切なフィルターを通して濾過し、加熱固処理工程の前に細胞の細片を除去してペルヒドロラーゼ触媒溶液から望まざるタンパク質を沈殿させる。次いで所望のペルヒドロラーゼ触媒を含む溶液を、膜ろ過または遠心分離によって沈殿した細胞細片およびタンパク質から分離し、得られた部分精製ペルヒドロラーゼ触媒溶液をさらに膜ろ過することで濃縮し、その後場合により適切な担体（例えば、マルトデキストリン、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液またはこれらの混合物）と混合し、噴霧乾燥させて所望のペルヒドロラーゼ触媒を含む固体粉末を生成する。
【０２７２】
本発明者らは、特に、引用した全ての参考文献の全内容を本開示に組み込む。さらに、量、濃度またはその他の値もしくはパラメーターが、範囲、好ましい範囲、または好ましい上限値および好ましい下限値の列挙のいずれかとして与えられている場合、これは、あらゆる上限の範囲の限定もしくは好ましい値と、あらゆる下限の範囲の限定もしくは好ましい値とのあらゆる対から形成された全ての範囲を、範囲が別々に開示されているかどうかに関係なく具体的に開示しているものとする。本明細書において各種の数値が列挙されている場合、特に他の指定がない限り、その範囲は、それらの両端の値ならびに範囲内の全ての整数および分数を含むものとする。範囲が定義されている場合、本発明の範囲を列挙された特定の値に限定することは目的としない。
【実施例】
【０２７３】
一般的な方法
本発明の好ましい実施態様を実証するために、以下の実施例を示す。当業者であれば当然ながら、以下の実施例で開示された技術は、本発明者らによって本発明の実施において十分に機能することが発見された技術を示しており、従って、その実施にとって好ましいモードを構成するものとすることができる。しかしながら、当業者であれば当然ながら、本発明の開示に照して、開示された特定の実施態様に多くの変更をなすことができ、それでもなお本発明の本質および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似した結果が得ることができる。
【０２７４】
全ての試薬および材料は、特に他の規定がない限り、ディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ミシガン州デトロイト）、ギブコ（ＧＩＢＣＯ）／ＢＲＬ（メリーランド州ゲイザースバーグ）、ＴＣＩアメリカ（ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ，オレゴン州ポートランド）、ロシュ・ダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，インディアナ州インディアナポリス）、またはシグマ／アルドリッチ・ケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ミズーリ州セントルイス）から得た。
【０２７５】
本明細書に記載の以下の略語は、以下に示すように測定、技術、特性または化合物の単位に相当する：「ｓｅｃ」または「ｓ」は、秒を意味し、「ｍｉｎ」は、分を意味し、「ｈ」または「ｈｒ」は、時間を意味し、「μＬ」は、マイクロリットルを意味し、「ｍＬ」は、ミリリットルを意味し、「Ｌ」は、リットルを意味し、「ｍＭ」は、ミリモル濃度を意味し、「Ｍ」は、モル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」は、ミリモルを意味し、「ｐｐｍ」は、百万分率を意味し、「ｗｔ」は、質量を意味し、「ｗｔ％」は、質量パーセントを意味し、「ｇ」は、グラムを意味し、「μｇ」は、マイクログラムを意味し、「ｇ」は、重力を意味し、「ＨＰＬＣ」は、高速液体クロマトグラフィーを意味し、「ｄｄＨ2Ｏ」は、蒸留して脱イオンした水を意味し、「ｄｃｗ」は、乾燥細胞質量を意味し、「ＡＴＣＣ」または「ＡＴＣＣ(R)」は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（バージニア州マナサス）を意味し、「Ｕ」は、ペルヒドロラーゼ活性の単位を意味し、「ｒｐｍ」は、毎分回転数を意味し、および「ＥＤＴＡ」は、エチレンジアミン四酢酸を意味する。
【０２７６】
実施例１
バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TMの増殖および細胞抽出物の調製
５ｍＬの栄養液体培地（ディフコ；０００３−０１−６）中にバチルス・ズブチリス（ＡＴＣＣ３１９５４TM）の乾燥させた培養物を懸濁し、３０℃で３日間インキュベートすることによって培養物を復活させた。インキュベートしてから３日目に、培養液のアリコートをトリプチケースソイ寒天培養プレート（ベクトン，ディッキンソン・アンド・カンパニー（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）；ニュージャージー州フランクリンレイクス）上に線状に塗布し、３５℃で２４時間インキュベートした。１マイクロリットルの植菌ループ（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）；カタログ番号２２０２１５）に数個のシングルコロニーを掻き取り、５０ｍＬのラクトバチルスＭＲＳブロス（ハーディ・ダイアグノスティクス（Ｈａｒｄｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ），カリフォルニア州サンタマリア；カタログ番号Ｃ５９３１）に移した。次に、この培養物を、３０℃で、２００ｒｐｍの撹拌速度で１２時間増殖させた。増殖させてから１２時間後に、２ｍＬの培養液を、１００ｍＬのＭＲＳブロスを含む５００ｍＬのバッフルなしの振盪フラスコに移し、３０℃および２００ｒｐｍで１２〜１４時間撹拌することによって増殖させた。その後細胞を、１５，０００×ｇで２５分間、５℃での遠心分離によって採取し、得られた細胞のペーストを−８０℃で保存した。
【０２７７】
細胞抽出物を調製するために、細胞のペースト０．９ｇを、ジチオスレイトール（１ｍＭ）およびＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に２５質量％（湿った細胞の質量）で懸濁した。細胞懸濁液を、１６，０００ｐｓｉの作動圧力を有するフレンチプレスに２回通過させた。続いて未精製の抽出物を、２０，０００×ｇで遠心分離し、残滓を除去し、透明な細胞抽出物を作製し、これを総可溶性タンパク質について分析し（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，シグマ・アルドリッチ，シグマカタログ番号ＢＣＡ１−ＫＴ）、続いて凍結させ、−８０℃で保存した。
【０２７８】
実施例２
バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TMの半精製した細胞抽出物の過加水分解活性の決定
バチルス・ズブチリス（ＡＴＣＣ３１９５４TM）細胞抽出物（１ｍＬあたり１０ｍｇのタンパク質総量、実施例１で説明されているようにして調製した）の１．０ｍＬのアリコートを、等しい体積の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、１００，０００分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）のセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）メンブレンユニット（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ），マサチューセッツ州ベッドフォード）を通過させてろ過した。得られた１ｍＬあたり１．５ｍｇのタンパク質総量を含むろ液（半精製した細胞抽出物）を、総可溶性タンパク質（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ、シグマカタログ番号ＢＣＡ１−ＫＴ）について分析したところ、このろ液の分析は測定可能なカタラーゼ活性を示さなかった。
【０２７９】
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中にトリアセチン（２５０ｍＭ）、過酸化水素（２．５Ｍ）、および０．１００ｍＬの半精製した細胞抽出物（０．１５ｍｇの総抽出物タンパク質）を含む１ｍＬの反応混合物を２５℃で混合した。添加された半精製した細胞抽出物の非存在下で、過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、半精製した細胞抽出物の代わりに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用いることによってコントロール反応を行った。
【０２８０】
反応混合物中の過酢酸の濃度の決定を、Ｋａｒｓｔ等によって説明されている方法に従って行った。反応混合物のアリコート（０．２５０ｍＬ）を１０分間および３０分間で取り出し、ウルトラフリー（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ(R)）ＭＣ−フィルターユニット（３０，０００の分画分子量（Ｎｏｒｍａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｌｉｍｉｔ；ＮＭＷＬ）、ミリポアカタログ番号ＵＦＣ３ＬＫＴ  ００）を用いて、１２，０００ｒｐｍ２分間遠心分離することによってろ過した；ろ過によってアリコートのタンパク質成分を除去して反応を止めた。得られたろ液のアリコート（０．１００ｍＬ）を、０．３００ｍＬの脱イオン水を含む１．５ｍＬのねじ蓋を有するＨＰＬＣバイアル（アジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），カリフォルニア州パロアルト；番号５１８２−０７１５）に移し、続いて、アセトニトリル中の２０ｍＭのＭＴＳ（メチル−ｐ−トリル−硫化物）０．１００ｍＬを添加し、バイアルの蓋を閉め、内容物を短時間で混合し、その後、遮光しながら約２５℃で１０分間インキュベートした。続いて各バイアルに、０．４００ｍＬのアセトニトリル、および０．１００ｍＬのトリフェニルホスフィンのアセトニトリル溶液（ＴＰＰ、４０ｍＭ）を添加し、バイアルの蓋を再度閉め、得られた溶液を混合し、遮光しながら約２５℃で３０分間インキュベートした。続いて各バイアルに、０．１００ｍＬの１０ｍＭのＮ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド（ＤＥＥＴ；ＨＰＬＣの外部標準）を添加し、以下で説明されているようにして得られた溶液をＨＰＬＣで分析した。表５に、１０分間および３０分間で生産された過酢酸濃度を掲記した。
【０２８１】
ＨＰＬＣ方法：
スペルコ・ディスカバリー（Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）Ｃ８カラム（１０ｃｍ×４．０ｍｍ、５μｍ）（カタログ番号５６９４２２−Ｕ）ｗ／プレカラムは、スペルコ・スペルガード・ディスカバリー（Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）Ｃ８（シグマ−アルドリッチ；カタログ番号５９５９０−Ｕ）；１０マイクロリットルの注入体積；ＣＨ3ＣＮ（シグマ−アルドリッチ；番号２７０７１７）および脱イオンＨ2Ｏを、１．０ｍＬ／分および周囲温度で用いた勾配法：
【表８】
0005677091.tif 000018
【０２８２】
【表９】
0005677091.tif 000019
【０２８３】
実施例３
バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TM細胞抽出物の半精製した酵素の過加水分解活性
バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TMの増殖および抽出物製造を実施例１で説明されているようにして行った（ただし未精製の抽出物は遠心分離しなかった）。未精製の抽出物を冷たい  ｎ−プロパノール（−２０℃）を用いて分画した。氷浴中で無細胞抽出物を含むフラスコを１５分間撹拌し、続いてｎ−プロパノール（−２０℃）を４０％（ｖ／ｖ）の濃度まで滴下して添加した（抽出物の凍結を防ぐため）。得られた抽出物／プロパノール混合物を氷浴中で３０分間撹拌し、続いて、５℃で、１２，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清をフラスコに戻し、氷浴に置いた。追加のｎ−プロパノール（−２０℃）を上清に、６０％（ｖ／ｖ）の濃度まで撹拌しながらゆっくり添加し、得られた混合物を氷浴中で３０分間撹拌し、続いて、前述の通りに遠心分離した。この第二の分画からのペレットを  氷上で保存し、上清をフラスコに戻し、氷浴に置いた。冷たい  ｎ−プロパノールを上清に、８０％（ｖ／ｖ）の濃度まで撹拌しながらゆっくり添加し、この混合物を３０分間撹拌し、前述の通りに遠心分離した。６０〜８０％分画からのペレットを氷上で保存した。４０〜６０％（ｖ／ｖ）ｎ−プロパノール分画および６０〜８０％（ｖ／ｖ）ｎ−プロパノール分画からのペレットを、最小量の０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中に溶解させ、得られた溶液を総可溶性タンパク質（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ、カタログ番号ＢＣＡ１−ＫＴ）について分析し、続いて凍結させ、−８０℃で保存した。
【０２８４】
トリアセチン（２５０ｍＭ）、過酸化水素（１．０Ｍ）、および５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中の細胞抽出物の４０〜６０％（ｖ／ｖ）または６０〜８０％（ｖ／ｖ）ｎ−プロパノール分画（上述の通りに製造された）のいずれかからの０．１０ｍｇ／ｍＬの可溶性タンパク質総量を含む１ｍＬの反応混合物を２５℃で混合した。添加された半精製した酵素の非存在下で、過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、半精製した酵素を含む細胞抽出物のｎ−プロパノール分画の代わりに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用いることによってコントロール反応を行った。この反応混合物を、実施例２で説明した手順を用いて５分間および３０分間で過酢酸について分析し、表６に、添加された酵素によって生産された過酢酸の濃度を掲記した。
【０２８５】
【表１０】
0005677091.tif 000020
【０２８６】
実施例４
バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TM細胞抽出物由来の過加水分解活性を有するセファロスポリンＣデアセチラーゼの同定
実施例３で説明した４０〜６０％のｎ−プロパノール分画の０．１ｍＬサンプル（総タンパク質５００μｇ）を、等しい体積の２Ｘ非変性（天然型）サンプル緩衝液（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））と共に室温で混合し、１．５ｍｍの８〜１６％トリス−グリシンポリアクリルアミドミニゲル（２Ｄゲル；インビトロジェン）の調製用サンプルウェルにローディングした。トリス−グリシンランニング緩衝液（インビトロジェン）を用いて天然型ゲル電気泳動を１２５Ｖで９０分間稼働させた。電気泳動の後、ゲルをその場でのエステラーゼ活性分析用にｐＨインジケーター、ブロモチモールブルーを用いて調製した。
【０２８７】
ゲルを脱イオン水で１０分間で２回洗浄し、機械的にゆっくり混合した。続いてゲルを１０ｍＭリン酸緩衝液を用いて１０分間洗浄した。リン酸緩衝液を除去した後、６６５μＬの飽和ブロモチモールブルー（水中）を含む１０ｍＭリン酸緩衝液５０ｍＬを、ゲルと１０分間インキュベートし、続いて１ｍＬの未希釈のトリアセチン（シグマ・アルドリッチ）を添加した。インキュベートから１０分以内に、ゲル上にエステラーゼ活性を示す１４６ｋＤａの位置に１つの黄色のバンドが現れた。
【０２８８】
エステラーゼ陽性のバンドをゲルから切り出し、５０ｍＬのポリプロピレン製のコニカルチューブ（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））に移した。２５ｍＬの脱イオン水で穏やかに混合しながら洗浄した後、ゲル切片から黄色のブロモチモールブルー色素を除去した。続いてゲル切片を、穏やかに混合しながら、０．９ｍＬの２Ｘノヴェックス（Ｎｏｖｅｘ）トリス−グリシンＳＤＳサンプル緩衝液＋１００μＬの１０Ｘ  ＮｕＰＡＧＥ還元剤（インビトロジェン）で３０分間処理した。サンプル処理後、ゲル切片およびサンプル緩衝液を、湯浴を用いて８５℃で５分間インキュベートした。続いてゲル切片をインキュベートチューブから取り出し、１．５ｍｍの８〜１６％トリス−グリシンミニゲルの単一の調製用ウェルに慎重に置いた。慎重に気泡を取り除き、スタッキングゲルと直接接触するようにした。続いてゲル切片を所定位置に固定し、続いて調製用ウェルに脱イオン水で調製した２５０〜３００μＬの温０．５％アガロース溶液を添加した。単一の分子マーカーレーンに、１５μＬのシーブルー（ＳｅｅＢｌｕｅ(R)）プラス２で予備染色した分子量マーカー（インビトロジェン）をローディングした。
【０２８９】
タンパク質がゲル切片からスラブゲルに電気溶離するように、ゲル切片の電気泳動を３０Ｖで３０分間稼働させた。続いて電圧を１０分間にわたり３０Ｖから１２５Ｖに徐々に上げ、引き続き１２５Ｖで９０分間稼働させた。電気泳動の後、ＸＣｅｌｌ  ＩＩTMのブロッティングマニュアル（インビトロジェン）で説明されているようにしてゲル上で分解したタンパク質バンドをＰＶＤＦメンブレンにブロットし、ブロッティング緩衝液は、１０ｍＭのＣＡＰＳ（ｐＨ１１．０）であった。室温で、トランスファー装置のジャケット内で氷水を用いて、エレクトロブロッティング法を２５Ｖで２時間行った。
【０２９０】
トランスファー後、プロブロット（ＰｒｏＢｌｏｔ）染色溶液（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），カリフォルニア州フォスターシティー）でＰＶＤＦメンブレンを１分間染色し、続いてメタノール：水（５０：５０）で脱色した。６種のタンパク質バンドを同定し、それぞれのＮ末端を配列解析した。ＧｅｎＢａｎｋ(R)アミノ酸配列データベースのＢｌａｓｔ検索後、エステラーゼ関連の配列相同性を有するバンドだけがバンド１と同定され、１７のＮ末端アミノ酸のコールは、バチルス・ズブチリスのセファロスポリンＣデアセチラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)ＢＡＡ０１７２９；Ｍｉｔｓｕｓｈｉｍａ等，上記；米国特許第５，５２８，１５２号；および米国特許第５，３３８，６７６号）に１００％のアミノ酸同一性を示した。
【０２９１】
実施例５
バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TMからのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ゲノムＤＮＡを、ＰＵＲＥＧＥＮＥ(R)ＤＮＡ精製システムを用いて（ジェントラ・システムズ，ミネソタ州ミネアポリス）バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TMから単離した。配列番号３および配列番号４と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によってそのゲノムＤＮＡからペルヒドロラーゼ遺伝子を増幅した。ｐＳＷ１８６と同定されたプラスミドを作製するために、得られた核酸生成物（配列番号１）を、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ(R)にサブクローニングした（インビトロジェン，カリフォルニア州カールスバッド）。さらにペルヒドロラーゼ遺伝子も、配列番号２７および配列番号２８と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によってゲノムＤＮＡから増幅した。得られた核酸生成物（配列番号２９）を制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩで切断し、ｐＵＣ１９中のＰｓｔＩとＸｂａＩ部位との間にサブクローニングしてｐＳＷ１９４として固定されたプラスミドを作成した。それぞれＴＯＰ１０／ｐＳＷ１８６、ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１８６、ＵＭ２／ｐＳＷ１８６、ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１８６、ＴＯＰ１０／ｐＳＷ１９４、ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１９４、ＵＭ２／ｐＳＷ１９４、およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９４と同定された株を作製するために、プラスミドｐＳＷ１８６およびｐＳＷ１９４を用いて、Ｅ．コリＴＯＰ１０（インビトロジェン，カリフォルニア州カールスバッド）、Ｅ．コリＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ４７０７６TM）、Ｅ．コリＵＭ２（Ｅ．ＣＯＬＩ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＳＴＯＣＫ  ＣＥＮＴＥＲ番号７１５６，イェール大学，コネチカット州ニューヘブン）、およびＥ．コリＫＬＰ１８（実施例１５を参照）を形質転換した。ＴＯＰ１０／ｐＳＷ１８６、ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１８６、ＵＭ２／ｐＳＷ１８６、ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１８６、ＴＯＰ１０／ｐＳＷ１９４、ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１９４、ＵＭ２／ｐＳＷ１９４、およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９４を、ＬＢ培地中で３７℃で振盪しながら、ＯＤ600nm＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点でＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで添加し、インキュベートを２〜３時間続けた。細胞を遠心分離によって採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ペルヒドロラーゼの発現を、２０〜４０％の総可溶性タンパク質で確認した。
【０２９２】
実施例６
バチルス・ズブチリスＢＥ１０１０からのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ゲノムＤＮＡを、ＰＵＲＥＧＥＮＥ(R)ＤＮＡ精製システムを用いて（ジェントラ・システムズ）バチルス・ズブチリスＢＥ１０１０（ＰａｙｎｅおよびＪａｃｋｓｏｎ  １９９１  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：２２７８−２２８２）から単離した。配列番号３および配列番号４と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によってそのゲノムＤＮＡからペルヒドロラーゼ遺伝子を増幅した。ｐＳＷ１８７と同定されたプラスミドを作製するために、得られた核酸生成物（配列番号５）を、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ(R)（インビトロジェン）にサブクローニングした。さらにペルヒドロラーゼ遺伝子も、配列番号２７および配列番号２８と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によってゲノムＤＮＡから増幅した。ｐＳＷ１８９と同定されたプラスミドを作製するために、得られた核酸生成物（配列番号３０）を制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩで切断し、ｐＵＣ１９中のＰｓｔＩとＸｂａＩ部位との間にサブクローニングした。それぞれＴＯＰ１０／ｐＳＷ１８７、ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１８７、ＵＭ２／ｐＳＷ１８７、ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１８７、ＴＯＰ１０／ｐＳＷ１８９、ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１８９、ＵＭ２／ｐＳＷ１８９、およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９と同定された株を作製するために、プラスミドｐＳＷ１８７およびｐＳＷ１８９を用いて、Ｅ．コリＴＯＰ１０（インビトロジェン）、Ｅ．コリＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ４７０７６TM）、Ｅ．コリＵＭ２（Ｅ．ＣＯＬＩ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＳＴＯＣＫ  ＣＥＮＴＥＲ番号７１５６，イェール大学，コネチカット州ニューヘブン）、およびＥ．コリＫＬＰ１８（実施例１５を参照）を形質転換した。ＴＯＰ１０／ｐＳＷ１８７、ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１８７、ＵＭ２／ｐＳＷ１８７、ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１８７、ＴＯＰ１０／ｐＳＷ１８９、ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１８９、ＵＭ２／ｐＳＷ１８９、およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ１８９を、ＬＢ培地中で３７℃で振盪しながら、ＯＤ600nm＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点でＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度まで添加し、インキュベートを２〜３時間続けた。細胞を遠心分離によって採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ペルヒドロラーゼの発現を、２０〜４０％の総可溶性タンパク質で確認した。
【０２９３】
実施例７
バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ６６３３TMからのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ゲノムＤＮＡを、ＰＵＲＥＧＥＮＥ(R)ＤＮＡ精製システムを用いてバチルス・ズブチリスＡＴＣＣ６６３３TMから単離した。配列番号３および配列番号４と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によってそのゲノムＤＮＡからペルヒドロラーゼ遺伝子を増幅した。得られた核酸生成物（配列番号７）を、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ(R)にサブクローニングして、ｐＳＷ１８８と同定されたプラスミドを作製した。それぞれＭＧ１６５５／ｐＳＷ１８８、およびＵＭ２／ｐＳＷ１８８と同定された株を作製するために、プラスミドｐＳＷ１８８を用いて、Ｅ．コリＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ４７０７６TM）、およびＥ．コリＵＭ２（Ｅ．ＣＯＬＩ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＳＴＯＣＫ  ＣＥＮＴＥＲ番号７１５６，イェール大学，コネチカット州ニューヘブン）を形質転換した。ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１８８、およびＵＭ２／ｐＳＷ１８８を、ＬＢ培地中で３７℃で振盪しながら、ＯＤ600nm＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点でＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度まで添加し、インキュベートを２〜３時間続けた。細胞を遠心分離によって採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ペルヒドロラーゼの発現を、２０〜４０％の総可溶性タンパク質で確認した。
【０２９４】
実施例８
バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ２９２３３TMからのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ゲノムＤＮＡを、ＰＵＲＥＧＥＮＥ(R)ＤＮＡ精製システムを用いてバチルス・ズブチリスＡＴＣＣ２９２３３TMから単離した。配列番号３および配列番号４と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によってそのゲノムＤＮＡからペルヒドロラーゼ遺伝子を増幅した。得られた核酸生成物（配列番号３１）を、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ(R)にサブクローニングして、ｐＳＷ１９０と同定されたプラスミドを作製した。それぞれＭＧ１６５５／ｐＳＷ１９０、ＵＭ２／ｐＳＷ１９０、およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９０と同定された株を作製するために、プラスミドｐＳＷ１９０を用いて、Ｅ．コリＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ４７０７６TM）、Ｅ．コリＵＭ２（Ｅ．ＣＯＬＩ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＳＴＯＣＫ  ＣＥＮＴＥＲ番号７１５６，イェール大学，コネチカット州ニューヘブン）、およびＥ．コリＫＬＰ１８（実施例１５を参照）を形質転換した。ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１９０、ＵＭ２／ｐＳＷ１９０、およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９０を、ＬＢ培地中で３７℃で振盪しながら、ＯＤ600nm＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点でＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度まで添加し、インキュベートを２〜３時間続けた。細胞を遠心分離によって採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ペルヒドロラーゼの発現を、２０〜４０％の総可溶性タンパク質で確認した。
【０２９５】
実施例９
バチルス・リケニフォルミスＡＴＣＣ１４５８０TMからのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ゲノムＤＮＡを、ＰＵＲＥＧＥＮＥ(R)ＤＮＡ精製システムを用いてバチルス・リケニフォルミスＡＴＣＣ１４５８０TMから単離した。配列番号３３および配列番号３４と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によってそのゲノムＤＮＡからペルヒドロラーゼ遺伝子を増幅した。得られた核酸生成物（配列番号９）を、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ(R)にサブクローニングして、ｐＳＷ１９１と同定されたプラスミドを作製した。それぞれＭＧ１６５５／ｐＳＷ１９１、ＵＭ２／ｐＳＷ１９１、ＰＩＲ１／ｐＳＷ１９１、およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９１と同定された株を作製するために、プラスミドｐＳＷ１９１を用いて、Ｅ．コリＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ４７０７６TM）、Ｅ．コリＵＭ２（Ｅ．ＣＯＬＩ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＳＴＯＣＫ  ＣＥＮＴＥＲ番号７１５６，イェール大学，コネチカット州ニューヘブン）、Ｅ．コリＰＩＲ１（インビトロジェン，カリフォルニア州カールスバッド）、およびＥ．コリＫＬＰ１８（実施例１５を参照）を形質転換した。ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１９１、ＵＭ２／ｐＳＷ１９１、ＰＩＲ１／ｐＳＷ１９１、およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９１を、ＬＢ培地中で３７℃で振盪しながら、ＯＤ600nm＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点でＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで添加し、インキュベートを２〜３時間続けた。細胞を遠心分離によって採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ペルヒドロラーゼの発現を、２０〜４０％の総可溶性タンパク質で確認した。
【０２９６】
実施例１０
クロストリジウム・テルモセルムＡＴＣＣ２７４０５TMからのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ゲノムＤＮＡを、ＰＵＲＥＧＥＮＥ(R)ＤＮＡ精製システムを用いてクロストリジウム・テルモセルムＡＴＣＣ２７４０５TMから単離した。配列番号３５および配列番号３６と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によってそのゲノムＤＮＡからペルヒドロラーゼ遺伝子を増幅した。得られた核酸生成物（配列番号１３）を、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ(R)にサブクローニングして、ｐＳＷ１９３と同定されたプラスミドを作製した。それぞれＭＧ１６５５／ｐＳＷ１９３、ＵＭ２／ｐＳＷ１９３、およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９３と同定された株を作製するために、プラスミドｐＳＷ１９３を用いて、Ｅ．コリＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ４７０７６TM）、Ｅ．コリＵＭ２（Ｅ．ＣＯＬＩ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＳＴＯＣＫ  ＣＥＮＴＥＲ番号７１５６，イェール大学，コネチカット州ニューヘブン）、およびＥ．コリＫＬＰ１８（実施例１５を参照）を形質転換した。ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１９３、ＵＭ２／ｐＳＷ１９３、およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９３を、ＬＢ培地中で３７℃で振盪しながら、ＯＤ600nm＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点でＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで添加し、インキュベートを２〜３時間続けた。細胞を遠心分離によって採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ペルヒドロラーゼの発現を、２０〜４０％の総可溶性タンパク質で確認した。
【０２９７】
実施例１１
バチルス・プミルスＰＳ２１３からのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ＧＥＮＢＡＮＫ(R)で報告されているようなＢ．プミルスＰＳ２１３由来のアセチルキシランエステラーゼ（ａｘｅ１）をコードする遺伝子（受託番号ＡＪ２４９９５７）を、Ｅ．コリ（ＤＮＡ２．０，カリフォルニア州メンローパーク）中での発現に関して最適化されたコドンを用いて合成した。続いて配列番号３７および配列番号３８と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によってその遺伝子を増幅した。ｐＳＷ１９５と同定されたプラスミドを作製するために、得られた核酸生成物（配列番号６０）を、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ(R)にサブクローニングした（インビトロジェン，カリフォルニア州カールスバッド）。それぞれＭＧ１６５５／ｐＳＷ１９５、ＵＭ２／ｐＳＷ１９５、およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９５と同定された株を作製するために、プラスミドｐＳＷ１９５を用いて、Ｅ．コリＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ４７０７６TM）、Ｅ．コリＵＭ２（Ｅ．ＣＯＬＩ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＳＴＯＣＫ  ＣＥＮＴＥＲ番号７１５６，イェール大学，コネチカット州ニューヘブン）、およびＥ．コリＫＬＰ１８（実施例１５を参照）を形質転換した。ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１９５、ＵＭ２／ｐＳＷ１９５、およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９５を、ＬＢ培地中で３７℃で振盪しながら、ＯＤ６００ｎｍ＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点でＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度まで添加し、インキュベートを２〜３時間続けた。細胞を遠心分離によって採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ペルヒドロラーゼの発現を、２０〜４０％の総可溶性タンパク質で確認した。
【０２９８】
実施例１２
サーモトガ・ネアポリタナからのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ＧＥＮＢＡＮＫ(R)で報告されているようなサーモトガ・ネアポリタナ由来のアセチルキシランエステラーゼをコードする遺伝子（受託番号５８６３２）を、Ｅ．コリ（ＤＮＡ２．０，カリフォルニア州メンローパーク）中での発現に関して最適化されたコドンを用いて合成した。続いて配列番号３９および配列番号４０と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によってその遺伝子を増幅した。得られた核酸生成物（配列番号４１）を、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ(R)にサブクローニングして、ｐＳＷ１９６と同定されたプラスミドを作製した。それぞれＭＧ１６５５／ｐＳＷ１９６、ＵＭ２／ｐＳＷ１９６、およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６と同定された株を作製するために、プラスミドｐＳＷ１９６を用いて、Ｅ．コリＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ４７０７６TM）、Ｅ．コリＵＭ２（Ｅ．ＣＯＬＩ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＳＴＯＣＫ  ＣＥＮＴＥＲ番号７１５６，イェール大学，コネチカット州ニューヘブン）、およびＥ．コリＫＬＰ１８（実施例１５を参照）を形質転換した。ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１９６、ＵＭ２／ｐＳＷ１９６、およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６を、ＬＢ培地中で３７℃で振盪しながら、ＯＤ６００ｎｍ＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点でＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度まで添加し、インキュベートを２〜３時間続けた。細胞を遠心分離によって採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ペルヒドロラーゼの発現を、２０〜４０％の総可溶性タンパク質で確認した。
【０２９９】
実施例１３
ｋａｔＧカタラーゼが破壊されたＥ．コリ株の構築
配列番号４６と同定されたＰＣＲ産物を作製するために、配列番号４４および配列番号４５と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によってカナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎ；配列番号４２）をプラスミドｐＫＤ１３（配列番号４３）から増幅した。ｋａｔＧ核酸配列は配列番号４７として示され、それに対応するアミノ酸配列は配列番号４８である。Ｅ．コリＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ４７０７６TM）を、λ−レッドリコンビナーゼ遺伝子（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ，２０００，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９７：６６４０−６６４５）を含む温度感受性プラスミドｐＫＤ４６（配列番号４９）で形質転換し、ＬＢ−ａｍｐプレート上で３０℃で２４時間選択した。ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６を、ＰＣＲ産物５０〜５００ｎｇでエレクトロポレーション（バイオラッド・ジーン・パルサー（ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ）、０．２ｃｍキュベット、２．５ｋＶ、２００Ｗ、２５ｕＦ）によって形質転換し、ＬＢ−ｋａｎプレート上で３７℃で２４時間選択した。数個のコロニーを、ＬＢ−ｋａｎプレート上に線状に塗布し、４２℃で一晩インキュベートしてｐＫＤ４６プラスミドを処理した。コロニーをチェックして、ｋａｎＲ／ａｍｐＳの表現型を確認した。ゲノムＤＮＡを、ＰＵＲＥＧＥＮＥ(R)ＤＮＡ精製システムを用いて数個のコロニーから単離し、配列番号５０および配列番号５１と同定されたプライマーを用いたＰＣＲによってチェックし、ｋａｔＧ遺伝子の破壊を確認した。数種のｋａｔＧが破壊された株を、ＦＬＰリコンビナーゼを含む温度感受性プラスミドｐＣＰ２０（配列番号５２）で形質転換し、これを用いて、ｋａｎ遺伝子を切り出し、ＬＢ−ａｍｐプレート上で３７℃で２４時間選択した。数個のコロニーを、ＬＢプレート上に線状に塗布し、４２℃で一晩インキュベートして、ｐＣＰ２０プラスミドを処理した。２つのコロニーをチェックして、ｋａｎＳ／ａｍｐＳの表現型を確認し、ＭＧ１６５５ＫａｔＧ１、およびＭＧ１６５５ＫａｔＧ２と命名した。
【０３００】
実施例１４
ｋａｔＥカタラーゼが破壊されたＥ．コリ株の構築
配列番号５５と同定されたＰＣＲ産物を作製するために、配列番号５３および配列番号５４と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によってカナマイシン耐性遺伝子（配列番号４２）をプラスミドｐＫＤ１３（配列番号４３）から増幅した。ｋａｔＥ  核酸配列は、配列番号５６として与えられ、それに対応するアミノ酸配列は配列番号５７である。Ｅ．コリＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ４７０７６TM）を、λ−レッドリコンビナーゼ遺伝子を含む温度感受性プラスミドｐＫＤ４６（配列番号４９）で形質転換し、ＬＢ−ａｍｐプレート上で３０℃で２４時間選択した。ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６を、ＰＣＲ産物５０〜５００ｎｇでエレクトロポレーション（バイオラッド・ジーン・パルサー、０．２ｃｍキュベット、２．５ｋＶ、２００Ｗ、２５ｕＦ）によって形質転換し、ＬＢ−ｋａｎプレート上で３７℃で２４時間選択した。数個のコロニーを、ＬＢ−ｋａｎプレート上に線状に塗布し、４２℃で一晩インキュベートしてｐＫＤ４６プラスミドをキュアした（ｃｕｒｅ）。コロニーをチェックして、ｋａｎＲ／ａｍｐＳの表現型を確認した。ゲノムＤＮＡを、ＰＵＲＥＧＥＮＥ  ＤＮＡ精製システムを用いて数個のコロニーから単離し、配列番号５８および配列番号５９と同定されたプライマーを用いたＰＣＲによってチェックし、ｋａｔＥ遺伝子の破壊を確認した。数個のｋａｔＥが破壊された株を、ＦＬＰリコンビナーゼを含む温度感受性プラスミドｐＣＰ２０（配列番号５２）で形質転換し、これを用いて、ｋａｎ遺伝子を切り出し、ＬＢ−ａｍｐプレート上で３７℃で２４時間選択した。数個のコロニーを、ＬＢプレート上に線状に塗布し、４２℃で一晩インキュベートして、ｐＣＰ２０プラスミドをキュアした。２つのコロニーをチェックして、ｋａｎＳ／ａｍｐＳの表現型を確認し、ＭＧ１６５５  ＫａｔＥ１、およびＭＧ１６５５  ＫａｔＥ２と命名した。
【０３０１】
実施例１５
ｋａｔＧカタラーゼおよびｋａｔＥ  カタラーゼが破壊されたＥ．コリ株（ＫＬＰ１８）の構築
配列番号５５と同定されたＰＣＲ産物を作製するために、配列番号５３および配列番号５４と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によってカナマイシン耐性遺伝子（配列番号４２）をプラスミドｐＫＤ１３（配列番号４３）から増幅した。Ｅ．コリＭＧ１６５５ＫａｔＧ１（実施例１３）を、λ−レッドリコンビナーゼ遺伝子を含む温度感受性プラスミドｐＫＤ４６（配列番号４９）で形質転換し、ＬＢ−ａｍｐプレート上で３０℃で２４時間選択した。ＭＧ１６５５ＫａｔＧ１／ｐＫＤ４６を、ＰＣＲ産物５０〜５００ｎｇでエレクトロポレーション（バイオラッド・ジーン・パルサー、０．２ｃｍキュベット、２．５ｋＶ、２００Ｗ、２５ｕＦ）によって形質転換し、ＬＢ−ｋａｎプレート上で３７℃で２４時間選択した。数個のコロニーを、ＬＢ−ｋａｎプレート上に線状に塗布し、４２℃で一晩インキュベートしてｐＫＤ４６プラスミドをキュアした。コロニーをチェックして、ｋａｎＲ／ａｍｐＳの表現型を確認した。ゲノムＤＮＡを、ＰＵＲＥＧＥＮＥ(R)ＤＮＡ精製システムを用いて数個のコロニーから単離し、配列番号５８および配列番号５９と同定されたプライマーを用いたＰＣＲによってチェックし、ｋａｔＥ遺伝子の破壊を確認した。数種のｋａｔＥが破壊された株（ΔｋａｔＥ）を、ＦＬＰリコンビナーゼを含む温度感受性プラスミドｐＣＰ２０（配列番号５２）で形質転換し、これを用いて、ｋａｎ遺伝子を切り出し、ＬＢ−ａｍｐプレート上で３７℃で２４時間選択した。数個のコロニーを、ＬＢプレート上に線状に塗布し、４２℃で一晩インキュベートして、ｐＣＰ２０プラスミドをキュアした。２つのコロニーをチェックして、ｋａｎＳ／ａｍｐＳの表現型を確認し、ＭＧ１６５５ＫａｔＧ１ＫａｔＥ１８．１、およびＭＧ１６５５ＫａｔＧ１ＫａｔＥ２３と命名した。ＭＧ１６５５ＫａｔＧ１ＫａｔＥ１８．１をＥ．コリＫＬＰ１８と命名した。
【０３０２】
実施例１６
ペルヒドロラーゼの分子量の推定
振盪フラスコでのＥ．コリＫＬＰ１８、バチルス・ズブチリス、バチルス・リケニフォルミス、およびクロストリジウム・テルモセルム由来のペルヒドロラーゼ遺伝子を発現するＥ．コリＭＧ１６５５のカタラーゼ二重ノックアウトの増殖によって得られた細胞ペレットを、ジチオスレイトール（１ｍＭ）を含む２．２ｍＬの０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。各細胞懸濁液を、１６，０００ｐｓｉ（〜１１０．３ＭＰａ）の作動圧力を有するフレンチプレスに２回通過させた。未精製の抽出物を、２０，０００×ｇで遠心分離し、細胞片を除去し、透明な未精製の抽出物を作成し、これを総可溶性タンパク質について分析した（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔ  ［ＢＣＡ］  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ、シグマ・アルドリッチ、ＢＣＡ１−ＫＴ）。
【０３０３】
総タンパク質２０μｇを含む透明化した未精製の抽出物（５μＬ）を、等しい体積の２Ｘ非変性（天然型）サンプル緩衝液（インビトロジェン）と共に室温で混合し、１．５ｍｍ×１０ウェルの４〜１２％トリス−グリシンポリアクリルアミドミニゲル（インビトロジェン）のサンプルウェルにローディングし、７．５μＬのＮＡＴＩＶＥＭＡＲＫTM未染色タンパク質標準（インビトロジェン）を、２つの別のウェルにローディングした。トリス−グリシンランニング緩衝液（インビトロジェン）を用いて天然型ゲル電気泳動を１２５Ｖで１０５分間行った。電気泳動の後、ゲルをその場エステラーゼ活性分析用にｐＨインジケーター、ブロモチモールブルーを用いて調製した。
【０３０４】
ゲルを脱イオン水で１０分間で２回洗浄し、機械的にゆっくり混合した。続いてゲルを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて１０分間洗浄し、機械的にゆっくり混合した。リン酸緩衝液を除去した後、４００μＬの飽和ブロモチモールブルー水溶液を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３０ｍＬを、ゲルと１０分間インキュベートし、続いて１ｍＬの未希釈のトリアセチン（テッセンデルロ・ファイン・ケミカルズ（Ｔｅｓｓｅｎｄｅｒｌｏ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）；英国スタッフォードシャー州）を添加した。インキュベートの２分以内に、活性なペルヒドロラーゼ酵素の部位において黄色のバンドが発現した。全てのＢ．ズブチリス種およびＢ．リケニフォルミスは、分子量２１６ｋＤａの周辺に濃いバンドを示した。Ｃ．テルモセルムは、約４３２ｋＤａに濃い主要な第一のバンド、および約５７６ｋＤａに主要な第二のバンドを示し、これは、エステラーゼ活性を示す。ゲル中でバンドに隣接した位置にパンチで小さい穴を開けることによって全てのバンドをマークした。ゲルを脱イオン水で１０分間で２回洗浄し、機械的にゆっくり混合し、エステラーゼ活性の色素を除去した。続いてゲルを機械的にゆっくり混合しながら１０ｍＭリン酸緩衝液を用いて１０分間洗浄し、タンパク質の染色を行った。ゲルを覆うようにしてクーマシーブルー色素を添加した。５分間機械的にゆっくり混合した後、クーマシーブルーをデカントし、４０ｍＬの脱色剤（１０％酢酸、３０％メタノール、６０％脱イオン水）で交換した。脱色後、活性な領域の分子量を推定した。表７に結果を要約する。
【０３０５】
【表１１】
0005677091.tif 000021
【０３０６】
実施例１７
Ｂ．ズブチリスＢＥ１０１０のペルヒドロラーゼを発現するＥ．コリＵＭ２／ｐＳＷ１８７の発酵
発酵槽用の種培養を、２Ｌの振盪フラスコにＬＢミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）培地（ディフコ）を含む種培地０．５Ｌを入れることによって調製した。培地のｐＨを６．８に調整し、フラスコ中で滅菌した。滅菌後、アンピシリンストック溶液（２５ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを添加した。種培地に、２０％グリセロール中のＥ．コリＵＭ２／ｐＳＷ１８７培養物１ｍＬを植え付け、３６℃、および３００ｒｐｍで培養した。ＯＤ550が約１〜２になったら、種培養を、３５℃で、ＫＨ2ＰＯ4（３．５０ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ4七水和物（０．０５ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ4七水和物（２．０ｇ／Ｌ）、クエン酸ナトリウム二水和物（１．９０ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（アンブレックス（Ａｍｂｒｅｘ）６９５、５．０ｇ／Ｌ）、バイオスプメックス（Ｂｉｏｓｐｕｍｅｘ）１５３Ｋ消泡剤（０．２５ｍＬ／Ｌ，コグニス社（Ｃｏｇｎｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））、ＮａＣｌ（１．０ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ2二水和物（１０ｇ／Ｌ）、およびＮＩＴ微量元素溶液（１０ｍＬ／Ｌ）を含む培地８Ｌと共に、１４Ｌの発酵槽（ブラウン（Ｂｒａｕｎ））に移した。微量元素溶液は、クエン酸一水和物（１０ｇ／Ｌ）、ＭｎＳＯ4水和物（２ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（２ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ4七水和物（０．５ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ4七水和物（０．２ｇ／Ｌ）、ＣｕＳＯ4五水和物（０．０２ｇ／Ｌ）、およびＮａＭｏＯ4二水和物（０．０２ｇ／Ｌ）を含む。滅菌後の添加物は、流加培養溶液６０ｇ（以下を参照）、およびアンピシリンストック溶液（２５ｍｇ／ｍＬ）１６．０ｍＬを含む。流加培養溶液は、６０％ｗ／ｗグルコース２．４ｋｇ、２５ｇ／Ｌの酵母抽出物０．６Ｌ、および５０ｇ／Ｌのバクト（Ｂａｃｔｏ）ペプトン（ディフコ）を含む。グルコース濃度が０．５ｇ／Ｌ未満に減少したらグルコース供給を、最初は０．３ｇ／分で開始して、次第に、毎時それぞれ０．３５、０．４０、０．４７および０．５３ｇ／分に増加させた；その後速度を一定に保った。培地中のグルコース濃度をモニターし、濃度が０．１ｇ／Ｌを超えたら、添加速度を低くするか、または一時的に止めた。ＯＤ550＝７で、ＩＰＴＧ（０．５Ｍ）１６ｍＬを添加することによって誘導を開始した。温度を３６℃に制御し、通気を２ｓｌｐｍ（標準リットル／分）に４００ｒｐｍで撹拌しながら固定した。ｐＨを６．８に制御した；ＮＨ4ＯＨ（２９％ｗ／ｗ）、およびＨ2ＳＯ4（２０％ｗ／ｖ）をｐＨコントロールに用いた。ヘッドの圧力は、０．５ｂａｒとした。ＩＰＴＧを添加してから８時間後に細胞を遠心分離によって採取した。
【０３０７】
実施例１８
Ｂ．ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TMのペルヒドロラーゼを発現するＥ．コリＵＭ２／ｐＳＷ１８６、またはＢ．リケニフォルミスＡＴＣＣ１４５８０TMのペルヒドロラーゼを発現するＥ．コリＵＭ２／ｐＳＷ１９１の発酵
実施例１７で説明されているようにして、Ｂ．ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TMのペルヒドロラーゼを発現するＥ．コリＵＭ２／ｐＳＷ１８６、またはＢ．リケニフォルミスＡＴＣＣ１４５８０TMのペルヒドロラーゼを発現するＥ．コリＵＭ２／ｐＳＷ１９１を用いて種培養を製造した。発酵培地は、ＬＢミラー（２５ｇ／Ｌ，ディフコ）であった。滅菌後の添加物は、グルコース溶液５０ｇ（５０％ｗ／ｗ）、およびアンピシリンストック溶液（２５ｍｇ／ｍＬ）１６．０ｍＬを含む。流加培養発酵のために、グルコース（５０％ｗ／ｗ）を用いた。グルコース濃度が０．５ｇ／Ｌ未満に減少したらグルコース供給を０．３ｇ／分の一定速度で開始させた。培地中のグルコース濃度をモニターし、濃度が０．１ｇ／Ｌを超えたら、添加速度を低くするか、または一時的に止めた。ＯＤ550＝２で、ＩＰＴＧ（０．５Ｍ）１６ｍＬを添加することによって誘導を開始した。温度を３６℃に制御し、通気を２ｓｌｐｍに４００ｒｐｍで撹拌しながら固定した。ｐＨを６．８に制御した；ＮＨ4ＯＨ（２９％ｗ／ｗ）、およびＨ2ＳＯ4（２０％ｗ／ｖ）をｐＨコントロールに用いた。ヘッドの圧力は、０．５ｂａｒとした。ＩＰＴＧを添加してから８時間後に細胞を遠心分離によって採取した。
【０３０８】
実施例１９
Ｂ．ズブチリスＢＥ１０１０のペルヒドロラーゼを発現するＥ．コリＫＬＰ１８／ＰＳＷ１８９、またはＢ．リケニフォルミスＡＴＣＣ１４５８０TMのペルヒドロラーゼを発現するＥ．コリＫＬＰ１８／ＰＳＷ１９１の発酵
発酵槽用の種培養を、２Ｌの振盪フラスコに酵母抽出物（アンブレックス６９５、５．０ｇ／Ｌ）、Ｋ2ＨＰＯ4（１０．０ｇ／Ｌ）、ＫＨ2ＰＯ4（７．０ｇ／Ｌ）、クエン酸ナトリウム二水和物（１．０ｇ／Ｌ）、（ＮＨ4）2ＳＯ4（４．０ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ4七水和物（１．０ｇ／Ｌ）、およびクエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム（０．１０ｇ／Ｌ）を含む種培地０．５Ｌを入れることによって製造した。培地のｐＨを６．８に調整し、培地をフラスコ中で滅菌した。滅菌後の添加物は、グルコース（５０質量％、１０．０ｍＬ）、およびアンピシリン（２５ｍｇ／ｍＬ）ストック溶液１ｍＬを含む。種培地に、２０％グリセロール中のＥ．コリＫＬＰ１８／ＰＳＷ１８９、またはＫＬＰ１８／ＰＳＷ１９１の培養物１ｍＬを植え付け、３５℃および３００ｒｐｍで培養した。ＯＤ550が約１〜２になったら、種培養を、３５℃で、ＫＨ2ＰＯ4（３．５０ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ4七水和物（０．０５ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ4七水和物（２．０ｇ／Ｌ）、クエン酸ナトリウム二水和物（１．９０ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（アンブレックス６９５、５．０ｇ／Ｌ）、バイオスプメックス（Ｂｉｏｓｐｕｍｅｘ）１５３Ｋ消泡剤（０．２５ｍＬ／Ｌ，コグニス社）、ＮａＣｌ（１．０ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ2二水和物（１０ｇ／Ｌ）、およびＮＩＴ微量元素溶液（１０ｍＬ／Ｌ）を含む培地８Ｌと共に１４Ｌの発酵槽（ブラウン）に移した。微量元素溶液は、クエン酸一水和物（１０ｇ／Ｌ）、ＭｎＳＯ4水和物（２ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（２ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ4七水和物（０．５ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ4七水和物（０．２ｇ／Ｌ）、ＣｕＳＯ4五水和物（０．０２ｇ／Ｌ）、およびＮａＭｏＯ4二水和物（０．０２ｇ／Ｌ）を含む。滅菌後の添加物は、グルコース溶液（５０％ｗ／ｗ、８０．０ｇ）、およびアンピシリン（２５ｍｇ／ｍＬ）ストック溶液（１６．００ｍＬ）を含む。グルコース溶液（５０％ｗ／ｗ）を流加培養のために用いた。グルコース濃度が０．５ｇ／Ｌに減少したら、グルコース供給を初めは１分あたり０．３１ｇの供給量で開始させ、次第に、毎時それぞれ０．３６、０．４２、０．４９、０．５７、０．６６、０．７７、０．９０、１．０４、１．２１、１．４１１．６３ｇ／分に増加させた；その後速度を一定に保った。培地中のグルコース濃度をモニターし、濃度が０．１ｇ／Ｌを超えたら、供給速度を低くするか、または一時的に止めた。Ｅ．コリＫＬＰ１８／ＰＳＷ１９１の場合、ＯＤ550＝８０で、ＩＰＴＧ（０．５Ｍ）１６ｍＬを添加することによって誘導を開始し、一方で、Ｅ．コリＫＬＰ１８／ＰＳＷ１８９の場合、増殖がそれより遅く、ＯＤ550＝５６で誘導を開始した。溶存酸素（ＤＯ）濃度を２５％の空気飽和状態に制御した。ＤＯをまずはインペラーの撹拌速度によって（４００〜１４００ｒｐｍ）制御し、その後は通気速度（２〜１０ｓｌｐｍ）によって制御した。ｐＨを６．８に制御した。ＮＨ4ＯＨ（２９％ｗ／ｗ）、およびＨ2ＳＯ4（２０％ｗ／ｖ）をｐＨコントロールに用いた。ヘッドの圧力は、０．５ｂａｒとした。ＩＰＴＧを添加してから１６時間後に細胞を遠心分離によって採取した。
【０３０９】
実施例２０
ペルヒドロラーゼ生産の発酵宿主としてのＥ．コリＫＬＰ１８、およびＥ．コリＵＭ２
Ｅ．コリＫＬＰ１８（実施例１５）を用いて、実施例１９で説明されている方法に従って複数の発酵液１０Ｌ中で増殖させた形質転換体（実施例５、８、９および１０）を作製した。これらの実験の最終的なＯＤを、実施例１７および１８で説明されている発酵方法に従って行われた、これらの同じペルヒドロラーゼを発現するＥ．コリＵＭ２形質転換体（実施例５、８、９および１０）を生産した発酵液と比較した。表８に、宿主としてＵＭ２およびＫＬＰ１８の両方を用いた１０Ｌの発酵実験が要約されており、ＵＭ２と比較してＫＬＰ１８の優れた性能が実証された。
【０３１０】
【表１２】
0005677091.tif 000022
【０３１１】
実施例２１
Ｅ．コリ形質転換体で発現されたバチルス・ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TMのペルヒドロラーゼの評価
実施例５で説明した３種の形質転換体Ｅ．コリＴＯＰ１０／ｐＳＷ１８６、Ｅ．コリＭＧ１６５５／ｐＳＷ１８６、およびＥ．コリＵＭ２／ｐＳＷ１８６を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むミラーＬＢ液体培地（５０ｍＬ；メディアテック社（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ），バージニア州ハーンドン）を含むバッフルなしの振盪フラスコ中で、１４〜１６時間、３５〜３７℃、２００ｒｐｍの撹拌で増殖させた。３種の形質転換体を一晩増殖させた後、それぞれの培養液を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む新しいミラーＬＢ液体培地でそれぞれの培養液の１：１００希釈液を調製することによって再度培養した。３５〜３７℃で３時間、２００ｒｐｍの撹拌で増殖させた後、それぞれの培養を、最終濃度１ｍＭにＩＰＴＧを添加することによって誘導した。同じ条件下でさらに３時間増殖させた後、それぞれの培養からの細胞のペーストを、５℃で、２６，０００×ｇで２０分間遠心分離することによって採取した。それぞれの形質転換体の細胞抽出物を、実施例１で説明した手順に従って調製した（ただし、２５質量％の湿潤した細胞懸濁液を製造するために用いた抽出緩衝液は、０．０５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、および１ｍＭのジチオスレイトールで構成された）。
【０３１２】
トリアセチン（２５０ｍＭ）、過酸化水素（１．０Ｍ）、および３種の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中の細胞抽出物（上述の通りに調製された）のいずれか１つからの総抽出物タンパク質５０μｇを含む別個の１ｍＬの反応を２５℃で行った。添加された抽出タンパク質の非存在下で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、総抽出タンパク質溶液の代わりに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用いることによってコントロール反応を行った。発現されたペルヒドロラーゼの非存在下でそれぞれの株によって生産された過酸のバックグラウンドレベルを決定するために、形質転換されていないＥ．コリＴＯＰ１０、Ｅ．コリＭＧ１６５５、およびＥ．コリＵＭ２の抽出物から調製された総抽出物タンパク質５０μｇを用いて、コントロール反応の第二のセットを行った。実施例２で説明したＫａｒｓｔ等の方法に従って反応混合物中の過酢酸の濃度を決定した（表９）。
【０３１３】
【表１３】
0005677091.tif 000023
【０３１４】
実施例２２
バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TMのペルヒドロラーゼを発現するＥ．コリＴＯＰ１０／ｐＳＷ１８６抽出物のの過加水分解活性
別々の１．０ｍＬのトリアセチン過加水分解反応を、実施例２１で説明されているようにしてＥ．コリＴＯＰ１０／ｐＳＷ１８６形質転換体抽出物を用いて行って、各反応で以下の反応物中の総タンパク質濃度：１９６μｇ／ｍＬ、９８μｇ／ｍＬ、４９μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ、３．０μｇ／ｍＬ、または１．５μｇ／ｍＬの総タンパク質濃度（表１０）の１つが与えられた。
【０３１５】
【表１４】
0005677091.tif 000024
【０３１６】
実施例２３
バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TMのペルヒドロラーゼを発現するＥ．コリＵＭ２／ｐＳＷ１８６抽出物の過加水分解活性
Ｅ．コリＵＭ２／ｐＳＷ１８６形質転換体の抽出物（抽出物１ｍＬあたり２０ｍｇのタンパク質総量、実施例２１で説明されているようにして調製した）を、ｐＨ６．５または７．５で、各反応において２５℃で、トリアセチン（４０ｍＭ、または１００ｍＭ）、過酸化水素（４０ｍＭ、または１００ｍＭ）、およびリン酸緩衝液（Ｐｉ、１００ｍＭ、２００ｍＭまたは３００ｍＭ）中の総抽出物タンパク質（０．１ｍｇ／ｍＬ、または１．０ｍｇ／ｍＬ）を含む１．０ｍＬの過加水分解反応で用いた（実施例２１で説明されているようにして反応を行った）（表１１）。
【０３１７】
【表１５】
0005677091.tif 000025
【０３１８】
実施例２４
バチルス・ズブチリスＢＥ１０１０から誘導されたＥ．コリ形質転換体で発現されたペルヒドロラーゼの評価
実施例６で説明したＥ．コリＴＯＰ１０／ｐＳＷ１８７、Ｅ．コリＭＧ１６５５／ｐＳＷ１８７、およびＥ．コリＵＭ２／ｐＳＷ１８７形質転換体を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むミラーＬＢ液体培地（５０ｍＬ；メディアテック社，バージニア州ハーンドン）を含むバッフルなしの振盪フラスコ中で、１４〜１６時間、３５〜３７℃で、２００ｒｐｍの撹拌で増殖させた。３種の形質転換体を一晩増殖させた後、それぞれの培養液を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む新しいミラーＬＢ液体培地でそれぞれの培養液の１：１００希釈液を調製することによって再度培養した。３５〜３７℃で３時間、２００ｒｐｍの撹拌で増殖させた後、それぞれの培養を、最終濃度１ｍＭにＩＰＴＧを添加することによって誘導した。同じ条件下でさらに３時間増殖させた後、それぞれの培養からの細胞のペーストを、５℃で、２６，０００×ｇで２０分間遠心分離することによって採取した。細胞抽出物を調製するために、実施例１で説明した手順を繰り返した（ただし、２５質量％の湿潤した細胞懸濁液を調製するために用いた抽出緩衝液は、０．０５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、および１ｍＭのジチオスレイトールで構成された）。
【０３１９】
トリアセチン（２５０ｍＭ）、過酸化水素（１．０Ｍ）、および５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中の総抽出物タンパク質５０μｇを含む別々の１．０ｍＬの反応を、２５℃で、各形質転換体抽出物を用いて行った。過酸化水素を用いてトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、総抽出物タンパク質溶液
の代わりに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用いることによってコントロール反応を行った。発現されたペルヒドロラーゼの非存在下でそれぞれの株によって生産された過酸のバックグラウンドレベルを決定するために、形質転換されていないＥ．コリＴＯＰ１０、Ｅ．コリＭＧ１６５５、およびＥ．コリＵＭ２の抽出物から製造された総抽出物タンパク質５０μｇを用いて、コントロール反応の第二のセットを行った。反応混合物中の過酢酸の濃度（表１２）を、実施例２で説明されているようにしてＫａｒｓｔ等の方法に従って決定した。
【０３２０】
【表１６】
0005677091.tif 000026
【０３２１】
実施例２５
Ｅ．コリ形質転換体で発現されたペルヒドロラーゼの評価
実施例５、６、７、８、９、１０、１８および１９で説明されているようにして形質転換体を調製した。それぞれの形質転換体の細胞抽出物を、実施例１で説明した手順に従って調製した（ただし、２５質量％の湿潤した細胞懸濁液を調製するために用いた抽出緩衝液は、０．０５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、および１ｍＭのジチオスレイトールで構成された）。
【０３２２】
トリアセチン（２５０ｍＭ）、過酸化水素（１．０Ｍ）、および５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中の細胞抽出物（上述の通りに製造された）からの総抽出物タンパク質５０μｇを含む別個の１ｍＬの反応を２５℃で行った。添加された抽出物タンパク質の非存在下で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、総抽出物タンパク質溶液の代わりに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用いることによってコントロール反応を行った。発現されたペルヒドロラーゼの非存在下でそれぞれの株によって生産された過酸のバックグラウンドレベルを決定するために、形質転換されていないＥ．コリＴＯＰ１０、Ｅ．コリＭＧ１６５５、Ｅ．コリＵＭ２、およびＥ．コリＫＬＰ１８の抽出物から調製された総抽出物タンパク質５０μｇを用いて、コントロール反応の第二のセットを行った。反応混合物中の過酢酸の濃度（表１３）を、実施例２で説明したＫａｒｓｔ等の方法に従って決定した。
【０３２３】
【表１７】
0005677091.tif 000027
【０３２４】
【表１８】
0005677091.tif 000028
【０３２５】
実施例２６（比較例）
市販のリパーゼの過加水分解に関する評価
トリアセチン（２５０ｍＭ）、過酸化水素（１．０Ｍ）、および５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中の市販のリパーゼ５０μｇを含む別個の１ｍＬの反応を２５℃で行った。添加されたリパーゼの非存在下で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、コントロール反応を市販のリパーゼを用いずに行った。反応混合物中の過酢酸の濃度（表１４）を、実施例２で説明したＫａｒｓｔ等の方法に従って決定した。市販のリパーゼは、シグマ／アルドリッチ・ケミカル社（ミズーリ州セントルイス）、バイオカタリティクス（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ，カリフォルニア州パサデナ）、名糖産業株式会社（Ｍｅｉｔｏ  Ｓａｎｇｙｏ  Ｃｏ．）（日本国名古屋）、天野エンザイム（Ａｍａｎｏ  Ｅｎｚｙｍｅｓ）（イリノイ州ロンバード）、ノボザイムズ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）（ノースカロライナ州フランクリントン）、バレー・サーチ（Ｖａｌｌｅｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（インディアナ州サウスベンド）、およびエンザイム・デベロップメント・コーポレーション（エンゼコ（ＥＮＺＥＣＯ(R)）；ニューヨーク州ニューヨーク）から得た。
【０３２６】
【表１９】
0005677091.tif 000029
【０３２７】
【表２０】
0005677091.tif 000030
【０３２８】
実施例２７
Ｅ．コリ形質転換体で発現されたペルヒドロラーゼの評価
ペルヒドロラーゼを発現する形質転換体の細胞抽出物を実施例２１で説明した手順に従って製造した。トリアセチン（１０５ｍＭ）、過酸化水素（７８ｍＭ）、および５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中の細胞抽出物（上述の通りに製造された）からの総抽出物タンパク質１ｍｇまたは２ｍｇを含む別個の１ｍＬの反応を２５℃で行った。添加された抽出物タンパク質の非存在下で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、総抽出物タンパク質溶液の代わりに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用いることによってコントロール反応を行った。反応混合物中の過酢酸の濃度（表１５）を、実施例２で説明されているＫａｒｓｔ等の方法に従って決定した。
【０３２９】
【表２１】
0005677091.tif 000031
【０３３０】
【表２２】
0005677091.tif 000032
【０３３１】
実施例２８（比較例）
市販のリパーゼの過加水分解に関する評価
トリアセチン（１０５ｍＭ）、過酸化水素（７８ｍＭ）および５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中の市販のリパーゼ１ｍｇを含む別個の１ｍＬの反応を２５℃で行った。添加されたリパーゼの非存在下で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、コントロール反応を市販のリパーゼを用いずに行った。反応混合物中の過酢酸の濃度（表１６）を、実施例２で説明したＫａｒｓｔ等の方法に従って決定した。
【０３３２】
【表２３】
0005677091.tif 000033
【０３３３】
実施例２９
湿潤剤を用いた場合のＢ．ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TMのペルヒドロラーゼ活性
Ｂ．ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TMのペルヒドロラーゼを発現するＥ．コリＵＭ２／ｐＳＷ１８６形質転換体の細胞抽出物を実施例２１で説明した手順に従って調製した。トリアセチン（１０５ｍＭ）、過酸化水素（７８ｍＭ）、浸潤剤  ＣＯＬＡＴＥＲＩＣ(R)ＭＳＣ−ＮＡ（混合型の短鎖ナトリウムジプロピオナート；コロニアル・ケミカル社（Ｃｏｌｏｎｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））、スルフィノール（ＳＵＲＦＹＮＯＬ(R)）２５０２（エトキシ化／プロポキシル化されたアセチレンベースの界面活性剤；エアープロダクツ・アンド・ケミカルズ（Ａｉｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）；ユトレヒト，オランダ）、スルフィノール(R)ＭＤ−２０、シルウェット（ＳＩＬＷＥＴ(R)）Ｌ７６５０（ポリアルキレンオキシドで改変されたポリジメチルシロキサン；ケムチュラ社（Ｃｈｅｍｔｕｒａ  Ｃｏｒｐ），コネチカット州ミドルバリー）、またはシルウェット(R)Ｌ８６２０；シロキサンベースの界面活性剤）、および５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中の総抽出物タンパク質１ｍｇを含む別個の１ｍＬの反応を２５℃で行った。添加された抽出物タンパク質の非存在下で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、総抽出物タンパク質溶液の代わりに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用いることによってコントロール反応を行った。反応混合物中の過酢酸の濃度（表１７）を、実施例２で説明したＫａｒｓｔ等の方法に従って決定した。
【０３３４】
【表２４】
0005677091.tif 000034
【０３３５】
実施例３０
浸潤剤を用いた場合のＢ．ズブチリスＢＥ１０１０のペルヒドロラーゼ活性
Ｂ．ズブチリスＢＥ１０１０のペルヒドロラーゼを発現するＥ．コリＵＭ２／ｐＳＷ１８７形質転換体の細胞抽出物を実施例２１で説明した手順に従って調製した。トリアセチン（１０５ｍＭ）、過酸化水素（７８ｍＭ）、浸潤剤（プルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣ(R)）１７Ｒ４（ポリオキシアルキレンエーテル界面活性剤；ＢＡＳＦ、ニュージャージー州マウントオリーブ）、プルロニック(R)Ｌ４３（二官能性のブロックコポリマー界面活性剤）、またはシルウェット(R)Ｌ７６５０）、および５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中の総抽出物タンパク質１ｍｇを含む別個の１ｍＬの反応を２５℃で行った。添加された抽出物タンパク質の非存在下で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、総抽出物タンパク質溶液の代わりに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用いることによってコントロール反応を行った。反応混合物中の過酢酸の濃度（表１８）を、実施例２で説明したＫａｒｓｔ等の方法に従って決定した。
【０３３６】
【表２５】
0005677091.tif 000035
【０３３７】
実施例３１
浸潤剤およびキレート剤を用いた場合のペルヒドロラーゼ活性
Ｂ．ズブチリスＢＥ１０１０のペルヒドロラーゼを発現するＥ．コリＵＭ２／ｐＳＷ１８７形質転換体の細胞抽出物を実施例２１で説明した手順に従って調製した。トリアセチン（１０５ｍＭ）、過酸化水素（７８ｍＭ）、浸潤剤（シルウェット(R)Ｌ７６５０）、キレート剤（ターピナル(R)ＳＬ；エチドロン酸；ソルティア社，ミズーリ州セントルイス）、および５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中の総抽出物タンパク質１ｍｇを含む別個の１ｍＬの反応を２５℃で行った。添加された抽出物タンパク質の非存在下で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、総抽出物タンパク質溶液の代わりに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用いることによってコントロール反応を行った。反応混合物中の過酢酸の濃度（表１９）を、実施例２で説明したＫａｒｓｔ等の方法に従って決定した。
【０３３８】
【表２６】
0005677091.tif 000036
【０３３９】
実施例３２
浸潤剤、キレート剤、および腐食抑制剤を用いた場合のペルヒドロラーゼ活性
Ｂ．ズブチリスＢＥ１０１０のペルヒドロラーゼを発現するＥ．コリＵＭ２／ｐＳＷ１８７形質転換体の細胞抽出物を実施例２１で説明した手順に従って調製した。トリアセチン（１０５ｍＭ）過酸化水素（７８ｍＭ）、浸潤剤（シルウェット(R)Ｌ７６５０）、キレート剤（ターピナル(R)ＳＬ）、腐食抑制剤（ベンゾトリアゾール）、および５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中の総抽出物タンパク質１ｍｇを含む別個の１ｍＬの反応を２５℃で行った。添加された抽出物タンパク質の非存在下で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、総抽出物タンパク質溶液の代わりに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用いることによってコントロール反応を行った。反応混合物中の過酢酸の濃度（表２０）を、実施例２で説明したＫａｒｓｔ等の方法に従って決定した。
【０３４０】
【表２７】
0005677091.tif 000037
【０３４１】
実施例３３
固定化されたＢ．ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TM、またはＢＥ１０１０のペルヒドロラーゼを用いた過酢酸の生産
Ｅ．コリＫＭＰ／ｐＳＷ１８９（Ｂ．ズブチリスＢＥ１０１０のペルヒドロラーゼを発現する）、またはＥ．コリＵＭ２／ｐＳＷ１８６（Ｂ．ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TMのペルヒドロラーゼを発現する）のいずれかの抽出物（実施例２１で説明されているようにして調製した）からの１０ｍｇ／ｍＬの総可溶性タンパク質を含む５．０ｍＬの０．２２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中のＡＭＢＥＲＺＹＭＥ(R)オキシラン酵素固定化用高分子支持体（ローム・アンド・ハース（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ），ペンシルベニア州フィラデルフィア）０．５０ｇの懸濁液を、回転式プラットフォームで室温で２４時間混合した。続いて上清を固定化酵素からデカントし、酵素を４４０ｍＬ量のリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．５）で洗浄し、これと同じ緩衝液中で５℃で保管した。使用前に、この固定化酵素を真空ろ過で乾燥させた。
【０３４２】
トリアセチン（２５０ｍＭ）、過酸化水素（１．０Ｍ）、および５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中の１．５ｍｇ／ｍＬまたは５．０ｍｇ／ｍｌのいずれかの固定化されたペルヒドロラーゼ（上述の通りに製造された）を含む別個の１ｍＬの反応を２５℃で行った。添加された固定化酵素の非存在下で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、コントロール反応を行った。反応混合物中の過酢酸の濃度（表２１）を、実施例２で説明したＫａｒｓｔ等の方法に従って決定した。
【０３４３】
【表２８】
0005677091.tif 000038
【０３４４】
実施例３４
Ｂ．ズブチリス、Ｂ．リケニフォルミスおよびＣ．テルモセルム由来のペルヒドロラーゼを用いた、ジアセチン、トリアセチンおよびモノアセチンの混合物の過加水分解
ジアセチン（１１８ｍＭ）、トリアセチン（４２ｍＭ）、およびモノアセチン（９０ｍＭ）、過酸化水素（１．０Ｍ）、および５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中のＢ．ズブチリス、Ｂ．リケニフォルミスおよびＣ．テルモセルム由来のペルヒドロラーゼを含むＥ．コリＵＭ２細胞抽出物（実施例２１で説明されているようにして調製された）からの総抽出物タンパク質５０μｇの混合物を含む別個の１ｍＬの反応を２５℃で行った。添加された抽出物タンパク質の非存在下で過酸化水素によるジアセチン（１１８ｍＭ）、トリアセチン（４２ｍＭ）およびモノアセチン（９０ｍＭ）の混合物の化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、総抽出物タンパク質溶液の代わりに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用いることによってコントロール反応を行った。発現されたペルヒドロラーゼの非存在下でＥ．コリ株によって生産された過酸のバックグラウンドレベルを決定するために、形質転換されていないＥ．コリＵＭ２の抽出物から製造された総抽出物タンパク質５０μｇを用いて、第二のコントロール反応を行った。反応混合物中の過酢酸の濃度（表２２）を、実施例２で説明したＫａｒｓｔ等の方法に従って決定した。
【０３４５】
【表２９】
0005677091.tif 000039
【０３４６】
実施例３５
Ｂ．ズブチリスＢＥ１０１０由来のペルヒドロラーゼを用いたジアセチン、トリアセチンおよびモノアセチンの混合物の過加水分解
ジアセチン（４９．６ｍＭ）、トリアセチン（１７．６ｍＭ）、およびモノアセチン（３７．８ｍＭ）の混合物、過酸化水素（７８ｍＭ）、および５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中のE.コリ  ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１８９細胞抽出物（実施例２１で説明されているようにして調製された）からの総抽出物タンパク質１ｍｇまたは２ｍｇの混合物を含む別個の１ｍＬの反応を２５℃で行った。添加された抽出物タンパク質の非存在下で過酸化水素によるジアセチン（４９．６ｍＭ）、トリアセチン（１７．６ｍＭ）、およびモノアセチン（３７．８ｍＭ）の混合物の化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、総抽出物タンパク質溶液の代わりに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用いることによってコントロール反応を行った。反応混合物中の過酢酸の濃度（表２３）を、実施例２で説明したＫａｒｓｔ等の方法に従って決定した。
【０３４７】
【表３０】
0005677091.tif 000040
【０３４８】
実施例３６
Ｂ．ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TMのペルヒドロラーゼによるアセチル化糖の過加水分解
Ｂ．ズブチリスＡＴＣＣ３１９５４TMのペルヒドロラーゼを発現するＥ．コリＵＭ２／ｐＳＷ１８６形質転換体の細胞抽出物を実施例２１で説明した手順に従って調製した。０．１Ｍのアセチル化糖（β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、またはトリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカール（アルドリッチ））、過酸化水素（１００または５００ｍＭ）、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中の総抽出物タンパク質２ｍｇを含む別個の１ｍＬの反応を２５℃で行った。添加された抽出物タンパク質の非存在下で過酸化水素による０．１Ｍのアセチル化糖（β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、またはトリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカールの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、総抽出物タンパク質溶液の代わりに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用いることによってコントロール反応を行った。反応混合物中の過酢酸の濃度（表２４）を、実施例２で説明したＫａｒｓｔ等の方法に従って決定した。
【０３４９】
【表３１】
0005677091.tif 000041
【０３５０】
実施例３７
Ｂ．ズブチリスＢＥ１０１０のペルヒドロラーゼによるアセチル化糖の過加水分解
Ｂ．ズブチリスＢＥ１０１０のペルヒドロラーゼを発現するＥ．コリＫＬＰ１８／ｐＳＷ１８９形質転換体の細胞抽出物を実施例２１で説明した手順に従って調製した。０．１Ｍのアセチル化糖（β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、またはトリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカール（アルドリッチ））、過酸化水素（１００、または５００ｍＭ）、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中の総抽出物タンパク質２ｍｇを含む別個の１ｍＬの反応を２５℃で行った。添加された抽出物タンパク質の非存在下で過酸化水素による０．１Ｍのアセチル化糖（β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、またはトリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカールの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、総抽出物タンパク質溶液の代わりに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用いることによってコントロール反応を行った。反応混合物中の過酢酸の濃度（表２５）を、実施例２で説明したＫａｒｓｔ等の方法に従って決定した。
【０３５１】
【表３２】
0005677091.tif 000042
【０３５２】
実施例３８
バチルス・クラウシイ  ＫＳＭ−Ｋ１６由来のペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ＧＥＮＢＡＮＫ(R)で報告されているようなＢ．クラウシイ  ＫＳＭ−Ｋ１６由来のセファロスポリン−Ｃ  ヒドロラーゼをコードする遺伝子（受託番号ＹＰ＿１７５２６５、配列番号２６）を、Ｅ．コリ（ＤＮＡ２．０，カリフォルニア州メンローパーク）中での発現に関して最適化されたコドンを用いて合成した。続いて配列番号６６および配列番号６７と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）（配列番号６５）によってその遺伝子を増幅した。得られた核酸生成物（配列番号６４）を、制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩで切断し、ｐＵＣ１９のＰｓｔＩ部位とＸｂａＩ部位の間でサブクローニングして、ｐＳＷ２００と同定されたプラスミドを作製した。ＵＭ２／ｐＳＷ２００と同定された株を作製するために、プラスミドｐＳＷ２００を用いて、Ｅ．コリＵＭ２（Ｅ．ＣＯＬＩ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＳＴＯＣＫ  ＣＥＮＴＥＲ番号７１５６，イェール大学，コネチカット州ニューヘブン）を形質転換し、ＵＭ２／ｐＳＷ２００を、ＬＢ培地中で３７℃で振盪しながら、ＯＤ600nm＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点でＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度まで添加し、インキュベートを２〜３時間続けた。細胞を遠心分離によって採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ペルヒドロラーゼの発現を、２０〜４０％の総可溶性タンパク質で確認した。細胞ペーストを−８０℃で凍結保存した。
【０３５３】
実施例３９
サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム由来のペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ＧＥＮＢＡＮＫ(R)で報告されているようなサーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム由来のアセチルキシランエステラーゼをコードする遺伝子（受託番号Ｓ４１８５８、配列番号７０）を、Ｅ．コリ（ＤＮＡ２．０，カリフォルニア州メンローパーク）中での発現に関して最適化されたコドンを用いて合成した。続いて配列番号７１および配列番号７２と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によってその遺伝子（配列番号６９）を増幅した。得られた核酸生成物（配列番号６８）を、制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩで切断し、ｐＵＣ１９のＰｓｔＩ部位とＸｂａＩ部位の間でサブクローニングして、ｐＳＷ２０１と同定されたプラスミドを作製した。ＵＭ２／ｐＳＷ２０１と同定された株を作製するために、プラスミドｐＳＷ２０１を用いて、Ｅ．コリＵＭ２（Ｅ．ＣＯＬＩ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＳＴＯＣＫ  ＣＥＮＴＥＲ番号７１５６，イェール大学，コネチカット州ニューヘブン）を形質転換し、ＵＭ２／ｐＳＷ２０１を、ＬＢ培地中で３７℃で振盪しながら、ＯＤ600nm＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点でＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度まで添加し、インキュベートを２〜３時間続けた。細胞を遠心分離によって採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ペルヒドロラーゼの発現を、２０〜４０％の総可溶性タンパク質で確認した。細胞ペーストを−８０℃で凍結保存した。
【０３５４】
実施例４０
サーモトガ・マリティマ  ＭＳＢ８由来のペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ＧＥＮＢＡＮＫ(R)で報告されているようなＴ．マリティマ  ＭＳＢ８由来のアセチルキシランエステラーゼをコードする遺伝子（受託番号ＮＰ＿２２７８９３．１、配列番号１８）を、Ｅ．コリ（ＤＮＡ２．０，カリフォルニア州メンローパーク）中での発現に関して最適化されたコドンを用いて合成した。続いて配列番号７１および配列番号７２と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によってその遺伝子（配列番号７４）を増幅した。得られた核酸生成物（配列番号７３）を、制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩで切断し、ｐＵＣ１９のＰｓｔＩ部位とＸｂａＩ部位の間でサブクローニングして、ｐＳＷ２０２と同定されたプラスミドを作製した。ＵＭ２／ｐＳＷ２０２と同定された株を作製するために、プラスミドｐＳＷ２０２を用いて、Ｅ．コリＵＭ２（Ｅ．ＣＯＬＩ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＳＴＯＣＫ  ＣＥＮＴＥＲ番号７１５６，イェール大学，コネチカット州ニューヘブン）を形質転換し、ＵＭ２／ｐＳＷ２０２を、ＬＢ培地中で３７℃で振盪しながら、ＯＤ600nm＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点でＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度まで添加し、インキュベートを２〜３時間続けた。細胞を遠心分離によって採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ペルヒドロラーゼの発現を、２０〜４０％の総可溶性タンパク質で確認した。細胞ペーストを−８０℃で凍結保存した。
【０３５５】
実施例４１
Ｂ．クラウシイ  ＫＳＭ−Ｋ１６、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカムおよびＴ．マリティマ  ＭＳＢ８由来のペルヒドロラーゼを用いた過酢酸の生産
Ｂ．クラウシイ  ＫＳＭ−Ｋ１６由来のペルヒドロラーゼ（Ｅ．コリＵＭ２／ｐＳＷ２００、実施例３８）、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム由来のペルヒドロラーゼ（Ｅ．コリＵＭ２／ｐＳＷ２０１、実施例３９）、およびＴ．マリティマ  ＭＳＢ８由来のペルヒドロラーゼ（Ｅ．コリＵＭ２／ｐＳＷ２０２、実施例４０）を発現する形質転換体の細胞抽出物を、差動圧１６，０００ｐｓｉ（約１１０．３２  ＭＰａ）のフレンチプレスによってジチオトレイトール（１ｍＭ）を含む０．０５Ｍのリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の細胞ペースト懸濁液（２５質量％湿潤細胞重量）に２度通過させることにより作製した。この次いで未精製の抽出物を２０，０００×ｇで遠心分離して細胞の破片を除去して清澄化された細胞抽出物とし、総可溶性タンパク質を調べ（タンパク定量用のビシンコニン酸キット、シグマ（Ｓｉｇｍａ）カタログ番号ＢＣＡ１−ＫＴ）、その後−８０℃で凍結貯蔵した。
【０３５６】
トリアセチン、過酸化水素、および５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中の抽出総タンパク質（上記のとおりに製造されたもの）を含む反応物（５ｍＬ）を２５℃で反応させた。最初の一連の複製反応において、これらの反応物（および対応する濃縮物）はトリアセチン（２５０ｍＭ）、過酸化水素（１．０Ｍ）および抽出総タンパク質（５０  μｇ／ｍＬ）であった。第２の一連の複製反応において、これらの反応物（および対応する濃縮物）はトリアセチン（１００ｍＭ）、過酸化水素（２５０ｍＭ）および抽出総タンパク質（１．０ｍｇ／ｍＬ）であった。５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を抽出総タンパク質溶液に置きかえることによってコントロール反応を起こし、添加された抽出タンパク質が存在しない状態で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を測定した。全ての反応物は５００ｐｐｍのＴｕｒｐｉｎａｌ(R)ＳＬ（エチドロン酸；Ｓｏｌｕｔｉａ  Ｉｎｃ．，  ミズーリ州、セントルイス）をさらに含んでおり、もとはそれらの反応物を使用前に安定化剤として過酸化水素水溶液に加えた。
【０３５７】
反応混合物中の過酢酸の濃度（表２１）を、Ｋａｒｓｔ等（前出）によって説明される方法に従って決定した。５分と３０分に生産された過酢酸濃縮物を表２６に列挙した。
【０３５８】
【表３３】
0005677091.tif 000043
【０３５９】
実施例４２
サーモトガ・レティンガエ由来のペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ＧＥＮＢＡＮＫ(R)で報告されているようなサーモトガ・レティンガエ由来のアセチルキシランエステラーゼ（配列番号８２）をコードする遺伝子（受託番号ＣＰ０００８１２）を、Ｅ．コリ（ＤＮＡ２．０，カリフォルニア州メンローパーク）中での発現に関して最適化されたコドンを用いて合成した。続いて配列番号７５および配列番号７６と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によってその遺伝子を増幅した。得られた核酸生成物（配列番号７７）を、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールズバッド）中にサブクローニングして、ｐＳＷ２１９と同定されたプラスミドを作製した。この遺伝子も配列番号７８および配列番号７９と同定されたプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によって増幅した。得られた核酸生成物（配列番号８０）を、制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩで切断し、ＰｓｔＩ部位とＸｂａＩ部位を用いてｐＵＣ１９にサブクローニングして、ｐＳＷ２２０を作製した。このプラスミドｐＳＷ２１９およびｐＳＷ２２０を用いてＥ．コリＫＬＰ１８（二重カタラーゼノックアウト（ｄｏｕｂｌｅ  ｃａｔａｌａｓｅ  ｋｎｏｃ
ｋｏｕｔ））を形質転換してそれぞれＫＬＰ１８／ＰＳＷ２１９およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２０と同定された株を作製した。ＫＬＰ１８／ＰＳＷ２１９およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２０を、ＬＢ培地中で３７℃で振盪しながら、ＯＤ600nm＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点でＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度まで添加し、インキュベートを２〜３時間続けた。細胞を遠心分離によって採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ペルヒドロラーゼの発現を、１０〜２０％の総可溶性タンパク質で確認した。
【０３６０】
実施例４３
サーモトガ・ペトロフィラ由来のペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ＧＥＮＢＡＮＫ(R)で報告されているようなサーモトガ・ペトロフィラ由来のアセチルキシランエステラーゼ（配列番号９０）をコードする遺伝子（受託番号ＣＰ０００７０２）を、Ｅ．コリ（ＤＮＡ２．０，カリフォルニア州メンローパーク）中での発現に関して最適化されたコドンを用いて合成した。続いて配列番号８３および配列番号８４と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によってその遺伝子を増幅した。得られた核酸生成物（配列番号８５）を、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールズバッド）中にサブクローニングして、ｐＳＷ２２１と同定されたプラスミドを作製した。この遺伝子も配列番号８６および配列番号８７と同定されたプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によって増幅した。得られた核酸生成物（配列番号８８）を、制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩで切断し、ｐＵＣ１９のＰｓｔＩ部位とＸｂａＩ部位との間にサブクローニングして、ｐＳＷ２２２と同定されたプラスミドを作製した。このプラスミドｐＳＷ２２１およびｐＳＷ２２２を用いてＥ．コリＫＬＰ１８（二重カタラーゼノックアウト（ｄｏｕｂｌｅ  ｃａｔａｌａｓｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ））を形質転換してそれぞれＫＬＰ１８／ＰＳＷ２２１およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２２と同定された株を作製した。ＫＬＰ１８／ＰＳＷ２２１およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２２を、ＬＢ培地中で３７℃で振盪しながら、ＯＤ600nm＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点でＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度まで添加し、インキュベートを２〜３時間続けた。細胞を遠心分離によって採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ペルヒドロラーゼの発現を、１０〜２０％の総可溶性タンパク質で確認した。
【０３６１】
実施例４４
サーモトガ・レティンガエ由来のペルヒドロラーゼを用いた過酢酸の生産
サーモトガ・レティンガエ由来のペルヒドロラーゼ（配列番号８２）を発現する形質転換体（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２０、実施例４２）の細胞抽出物を、差動圧１６，０００ｐｓｉ（約１１０．３２  ＭＰａ）のフレンチプレスによってジチオトレイトール（１ｍＭ）を含む０．０５Ｍのリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の細胞ペースト懸濁液（２０質量％湿潤細胞重量）に２度通過させることにより作製した。この次いで未精製の抽出物を２０，０００×ｇで遠心分離して細胞の破片を除去して清澄化された細胞抽出物とし、総可溶性タンパク質を調べ（タンパク定量用のビシンコニン酸キット、シグマ（Ｓｉｇｍａ）カタログ番号ＢＣＡ１−ＫＴ）た。この清澄化抽出物を７５℃で２０分間加熱し、その後すぐに氷／水浴中で冷却した。得られた混合物を遠心分離して沈殿したタンパク質を除去し、上清を回収し、前記のとおり総可溶性タンパク質を調べた。上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ペルヒドロラーゼが少なくとも８５〜９５％純粋であることを示した。この上清をドライアイス中で凍結し、−８０℃で貯蔵した。
【０３６２】
トリアセチン、過酸化水素、および５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）または５０ｍＭの重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）中の、加熱処理され遠心分離された細胞抽出物上清（上記のとおりに製造されたもの）を含む反応物（１０ｍＬ総容量）を２４℃または１０℃で反応させた。各反応条件ごとにコントロール反応を起こし、添加された抽出タンパク質が存在しない状態で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を測定した。反応混合物中の過酢酸の濃度（表２１）を、実施例２で説明したＫａｒｓｔ等の方法に従って決定した。１分、５分および３０分に生産された過酢酸濃縮物を表２７に列挙した。
【０３６３】
【表３４】
0005677091.tif 000044
【０３６４】
実施例４５
サーモトガ・ペトロフィラ由来のペルヒドロラーゼを用いた過酢酸の生産
サーモトガ・ペトロフィラ由来のペルヒドロラーゼ（配列番号９０）を発現する形質転換体（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２１、実施例４３）の細胞抽出物を、差動圧１６，０００ｐｓｉ（約１１０．３２  ＭＰａ）のフレンチプレスによってジチオトレイトール（１ｍＭ）を含む０．０５Ｍのリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の細胞ペースト懸濁液（２０質量％湿潤細胞重量）に２度通過させることにより作製した。この次いで未精製の抽出物を２０，０００×ｇで遠心分離して細胞の破片を除去して清澄化された細胞抽出物とし、総可溶性タンパク質を調べた（タンパク定量用のビシンコニン酸キット、シグマ（Ｓｉｇｍａ）カタログ番号ＢＣＡ１−ＫＴ）。この清澄化抽出物を７５℃で２０分間加熱し、その後すぐに氷／水浴中で冷却した。得られた混合物を遠心分離して沈殿したタンパク質を除去し、上清を回収し、前記のとおり総可溶性タンパク質を調べた。上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ペルヒドロラーゼが少なくとも８５〜９０％純粋であることを示した。この上清をドライアイス中で凍結し、−８０℃で貯蔵した。
【０３６５】
トリアセチン、過酸化水素、および５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）または５０ｍＭの重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）中の、加熱処理され遠心分離された細胞抽出物上清（上記のとおりに製造されたもの）を含む反応物（２ｍＬ総容量）を２４℃または１０℃で反応させた。反応条件ごとにコントロール反応を起こし、添加された抽出タンパク質が存在しない状態で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を測定した。反応混合物中の過酢酸の濃度を、実施例２で説明したＫａｒｓｔ等の方法に従って決定した。１分、５分および３０分に生産された過酢酸濃縮物を表２８に列挙した。
【０３６６】
【表３５】
0005677091.tif 000045
【０３６７】
実施例４６
サーモトガ種  ＲＱ２由来の第１ペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ＧＥＮＢＡＮＫ(R)で報告されているようなサーモトガ種  ＲＱ２由来の第１アセチルキシランエステラーゼ  （配列番号９８）をコードする遺伝子（受託番号ＣＰ０００９６９）を、Ｅ．コリ（ＤＮＡ２．０，カリフォルニア州メンローパーク）中での発現に関し
て最適化されたコドンを用いて合成した。この第１ペルヒドロラーゼは、本明細書中で「ＲＱ２（ａ）」として述べられている。続いて配列番号９１および配列番号９２と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によってその遺伝子を増幅した。得られた核酸生成物（配列番号９３）を、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  カリフォルニア州カールズバッド）中にサブクローニングして、ｐＳＷ２２３と同定されたプラスミドを作製した。この遺伝子も配列番号９４および配列番号９５と同定されたプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によって増幅した。得られた核酸生成物（配列番号９６）を、制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩで切断し、ｐＵＣ１９のＰｓｔＩ部位とＸｂａＩ部位との間にサブクローニングして、ｐＳＷ２２４と同定されたプラスミドを作製した。このプラスミドｐＳＷ２２３およびｐＳＷ２２４を用いてＥ．コリＫＬＰ１８（二重カタラーゼノックアウト（ｄｏｕｂｌｅ  ｃａｔａｌａｓｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ））を形質転換してそれぞれＫＬＰ１８／ＰＳＷ２２３およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２４と同定された株を作製した。ＫＬＰ１８／ＰＳＷ２２３およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２４を、ＬＢ培地中で３７℃で振盪しながら、ＯＤ600nm＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点でＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度まで添加し、インキュベートを２〜３時間続けた。細胞を遠心分離によって採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ペルヒドロラーゼの発現を、１０〜２０％の総可溶性タンパク質で確認した。
【０３６８】
実施例４７
サーモトガ種  ＲＱ２由来の第２ペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ＧＥＮＢＡＮＫ(R)で報告されているようなサーモトガ種  ＲＱ２由来の第２アセチルキシランエステラーゼ  （配列番号１０６）をコードする遺伝子（受託番号ＣＰ０００９６９）を、Ｅ．コリ（ＤＮＡ２．０，カリフォルニア州メンローパーク）中での発現に関して最適化されたコドンを用いて合成した。この第２ペルヒドロラーゼは、本明細書中で「ＲＱ２（ｂ）」として述べられている。続いて配列番号９９および配列番号１００と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によってその遺伝子を増幅した。得られた核酸生成物（配列番号１０１）を、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  カリフォルニア州カールズバッド）中にサブクローニングして、ｐＳＷ２２５と同定されたプラスミドを作製した。この遺伝子も配列番号１０２および配列番号１０３と同定されたプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によって増幅した。得られた核酸生成物（配列番号１０４）を、制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩで切断し、ｐＵＣ１９のＰｓｔＩ部位とＸｂａＩ部位との間にサブクローニングして、ｐＳＷ２２６と同定されたプラスミドを作製した。このプラスミドｐＳＷ２２５およびｐＳＷ２２６を用いてＥ．コリＫＬＰ１８（二重カタラーゼノックアウト（ｄｏｕｂｌｅ  ｃａｔａｌａｓｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ））を形質転換してそれぞれＫＬＰ１８／ＰＳＷ２２５およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２６と同定された株を作製した。ＫＬＰ１８／ＰＳＷ２２５およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２６を、ＬＢ培地中で３７℃で振盪しながら、ＯＤ600nm＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点でＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度まで添加し、インキュベートを２〜３時間続けた。細胞を遠心分離によって採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ペルヒドロラーゼの発現を、１０〜２０％の総可溶性タンパク質で確認した。
【０３６９】
実施例４８
サーモトガ種  ＲＱ２由来の第一ペルヒドロラーゼ由来のペルヒドロラーゼ活性を用いた過酢酸の生産
本明細書中で「ＲＱ２（ａ）」と呼ばれるサーモトガ種  ＲＱ２由来の第一アセチルキシランエステラーゼ  （配列番号９８）を発現する形質転換体（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２３、実施例４６）の細胞抽出物を、差動圧１６，０００ｐｓｉ（約１１０．３２  ＭＰａ）のフレンチプレスによってジチオトレイトール（１ｍＭ）を含む０．０５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の細胞ペースト懸濁液（２０質量％湿潤細胞重量）に２度通過させることにより作製した。この次いで未精製の抽出物を２０，０００×ｇで遠心分離して細胞の破片を除去して清澄化された細胞抽出物とし、総可溶性タンパク質を調べた（タンパク定量用のビシンコニン酸キット、シグマ（Ｓｉｇｍａ）カタログ番号ＢＣＡ１−ＫＴ）。この清澄化抽出物を７５℃で２０分間加熱し、その後すぐに氷／水浴中で冷却した。得られた混合物を遠心分離して沈殿したタンパク質を除去し、上清を回収し、前記のとおり総可溶性タンパク質を調べた。上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ペルヒドロラーゼが少なくとも８５〜９０％純粋であることを示した。この上清をドライアイス中で凍結し、−８０℃で貯蔵した。
【０３７０】
トリアセチン、過酸化水素、および５０ｍＭ重炭酸ナトリウム（１０ｍＬ総容量、ｐＨ８．１）中または５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（２ｍＬ総容量、ｐＨ７．２）中の加熱処理され、遠心分離された細胞抽出物上清からの総タンパク質を含む反応物を２５℃で反応させた。反応条件ごとにコントロール反応を起こし、添加された抽出タンパク質が存在しない状態で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を測定した。反応混合物中の過酢酸の濃度を、実施例２で説明したＫａｒｓｔ等の方法に従って決定した。１分、５分および３０分に生産された過酢酸濃縮物を表２９に列挙した。
【０３７１】
【表３６】
0005677091.tif 000046
【０３７２】
実施例４９
サーモトガ種  ＲＱ２由来の第二ペルヒドロラーゼ由来のペルヒドロラーゼ活性を用いた過酢酸の生産
本明細書中で「ＲＱ２（ｂ）」と呼ばれるサーモトガ種  ＲＱ２由来の第二アセチルキシランエステラーゼ（配列番号１０６）由来のペルヒドロラーゼを発現する形質転換体（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２６、実施例４７）の細胞抽出物を、差動圧１６，０００ｐｓｉ（約１１０．３２  ＭＰａ）のフレンチプレスによってジチオトレイトール（１ｍＭ）を含む０．０５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の細胞ペースト懸濁液（２０質量％湿潤細胞重量）に２度通過させることにより作製した。この次いで未精製の抽出物を２０，０００×ｇで遠心分離して細胞の破片を除去して清澄化された細胞抽出物とし、総可溶性タンパク質を調べた（タンパク定量用のビシンコニン酸キット、シグマ（Ｓｉｇｍａ）カタログ番号ＢＣＡ１−ＫＴ）。この清澄化抽出物を７５℃で２０分間加熱し、その後すぐに氷／水浴中で冷却した。得られた混合物を遠心分離して沈殿したタンパク質を除去し、上清を回収し、前記のとおり総可溶性タンパク質を調べた。上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ペルヒドロラーゼが少なくとも８５〜９０％純粋であることを示した。この上清をドライアイス中で凍結し、−８０℃で貯蔵した。
【０３７３】
トリアセチン、過酸化水素、および５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＬ総容量、ｐＨ８．１）中または５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（２ｍＬ総容量、ｐＨ７．２）中の加熱処理され、遠心分離された細胞抽出物上清からの総タンパク質を含む反応物を２５℃で反応させた。反応条件ごとにコントロール反応を起こし、添加された抽出タンパク質が存在しない状態で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を測定した。反応混合物中の過酢酸の濃度を、実施例２で説明したＫａｒｓｔ等の方法に従って決定した。１分、５分および３０分に生産された過酢酸濃縮物を表３０に列挙した。
【０３７４】
【表３７】
0005677091.tif 000047
【０３７５】
実施例５０
過炭酸ナトリウムおよびサーモトガ・レティンガエまたはサーモトガ・ペトロフィラ由来のペルヒドロラーゼを用いた過酢酸の生産
過炭酸ナトリウム（約２５質量％Ｈ2Ｏ2）を過酸化水素水に置換して１００ｍＭまたは２５０ｍＭのいずれかの過酸化水素初期濃度としたこと以外は、サーモトガ・レティンガエ由来のペルヒドロラーゼ（配列番号８２）を発現する形質転換体（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２０、実施例４２）またはサーモトガ・ペトロフィラ由来のペルヒドロラーゼ（配列番号９０）を発現する形質転換体（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２２、実施例４３）由来の加熱処理し、遠心分離にかけた細胞抽出物上清からの総タンパク質を用いて、実施例４４および実施例４５に記載した方法を繰り返した。トリアセチン、過炭酸ナトリウム、および５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（２ｍＬ総容量、ｐＨ８．１）中の、加熱処理され遠心分離された細胞抽出物上清を含む反応物を２４℃で反応させた。反応条件ごとにコントロール反応を起こし、添加された抽出タンパク質が存在しない状態で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を測定した。反応混合物中の過酢酸の濃度を、実施例２で説明したＫａｒｓｔ等の方法に従って決定した。１分、５分および３０分に生産された過酢酸濃度を表３１に列挙した。
【０３７６】
【表３８】
0005677091.tif 000048
【図１Ａ】
0005677091.tif 000052
【図１Ｂ】
0005677091.tif 000053
【図１Ｃ】
0005677091.tif 000054
【配列表】
0005677091000001.app