(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
揮発性有機塩素化合物で汚染された廃水、汚染土壌、汚染地下水等の浄化対象を微生物を用いて浄化するに際し、前記浄化対象に対して浄化促進材料を添加して微生物による浄化を促進する浄化促進方法において、
前記浄化促進材料として、ホップ、乾燥ホップ、ホップ抽出成分、又はホップを含む材料を添加することを特徴とする浄化促進方法。
【請求項２】
前記微生物が、デハロコッコイデス属細菌であることを特徴とする請求項１に記載された浄化促進方法。
【請求項３】
前記微生物が、vcrA遺伝子を有する細菌であることを特徴とする請求項１に記載された浄化促進方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いて有害化学物質を浄化する有害化学物質浄化技術において、浄化対象とする廃水、汚染土壌、汚染地下水等に対して供給する浄化促進材料及び微生物による浄化促進方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物を用いる浄化技術は、排水処理における活性汚泥法や嫌気処理法などに広く利用されている。
また、近年では、有害化学物質で汚染された土壌および地下水を微生物により浄化する技術(バイオレメディエーション)も、環境負荷および浄化コストの小さい浄化方法として着目されている。
【０００３】
このような微生物を用いる浄化技術は、二次的汚染が生じにくく、使用エネルギー量が少ないなどの長所が有る一方で、物理・化学的な浄化方法と比較すると、浄化に適した状態を維持・管理する方法に不確定要素が多くある点に問題がある。
【０００４】
例えば、上記活性汚泥法によるバルキングは、曝気槽中に糸状菌が大量発生することにより活性汚泥の沈降性が阻害される現象であるが、このように処理効率の低下や阻害が生じる要因として、処理環境中の微生物群衆構造が影響していることが示されている。
すなわち、処理環境中には、有用な微生物だけでなく、浄化を阻害する微生物も同時に増殖して、影響を与えるとしている（非特許文献１）。
【０００５】
ところが、廃水処理やバイオレメディエーションの分野において存在する微生物種は、多岐にわたると同時に、その微生物群衆構造は処理を行っている場所、時間によって絶えず変化しているものである。
このため、浄化環境を適切な微生物群衆構造にリアルタイムでコントロールすることは極めて難しいと考えられている。
【０００６】
このような背景から、有用微生物を浄化対象とする場所に導入する方法が、微生物群衆構造を安定させて浄化効率を高めたり、特定の有害化学物質を浄化したりする方法として用いられている（非特許文献２．３）。
【０００７】
しかしながら、有用微生物は複雑な微生物群衆構造内で長期的に効果を発揮することが難しく、導入した微生物が十分に効果を発揮できない場合もある（非特許文献４）。また、微生物の導入は、培養等に多大なコストが必要であるため、浄化コストが大きくなることも課題となっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】加藤史子、飯泉太郎、中村寛治:食品工場排水処理施設における活性汚泥の細菌群構造と汚泥沈降性の関連性、日本水環境学会誌,vo1.30，N0.7，pp377-385，2007.
【非特許文献２】H.  Van Limbergen， E.M.Top and W. Verstraete, Bioaugmentation in activated sludge: current features and future perspectives, Appl. Microbiol. and Biotechnol.,50:16-23，1998.
【非特許文献３】T. M. Vogel, Bioaugmentation as a soil  bioremediation approach，Current Opinion in Biotechnology，7:311-316,1996.
【非特許文献４】T. Bouchez，D. Patureau, P. Dabert，S.Juretschko，J. Dore, P. Delgenes, R.Moletta and M. Wagner, Ecological study of a bioaugmentation failure,Environmental Microbiology, 2:179-190, 2000.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、微生物を用いて有害化学物質を浄化する技術分野において、浄化に関わりの無い微生物の活動を抑制することにより浄化に関わる有用徹生物の活動を速やかに促進させる環境を形成することにより、浄化効率を高めて浄化期間を短縮することが可能な浄化促進材料及び浄化促進方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
請求項１に係る発明は、微生物を用いて有害化学物質を浄化するに際し、廃水、汚染土壌、汚染地下水等の浄化対象に対して供給する浄化促進材料において、該材料が、浄化に関わりの無い微生物の活動を抑制し、浄化に必要な有用微生物を優占化して活動を促進させるものから構成されている浄化促進材料とした。
【００１１】
請求項２に係る発明は、微生物を用いて有害化学物質を浄化するに際し、廃水、汚染土壌、汚染地下水等の浄化対象に対して供給する浄化促進材料おいて、該材料が、ホップ、ホップ抽出成分、又はホップを含む材料である浄化促進材料とした。
【００１２】
請求項３に係る発明は、有害化学物質で汚染された廃水、汚染土壌、汚染地下水等の浄化対象を微生物を用いて浄化するに際し、前記浄化対象に対して浄化促進材料を添加して微生物による浄化を促進する浄化促進方法において、前記浄化促進材料として、浄化に関わりの無い微生物の活動を抑制し、浄化に必要な有用微生物を優占化して活動を促進させるもの、あるいはホップ、ホップ抽出成分、又はホップを含む材料を添加する浄化促進方法とした。
【００１３】
請求項４に係る発明は、請求項３に記載された浄化促進方法において利用する微生物が、デハロコッコイデス属細菌であることを特徴としている。
【００１４】
請求項５に係る発明は、請求項３に記載された浄化促進方法において利用する微生物が、vcrA遺伝子を有する細菌であることを特徴としている。
【００１５】
請求項６に係る発明は、請求項３に記載された浄化促進方法において浄化する有害化学物質が、揮発性有機塩素化合物であることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１６】
請求項１に係る発明によれば、微生物を用いて有害化学物質を浄化するに際し、廃水、汚染土壌、汚染地下水等の浄化対象に対して供給する浄化促進材料において、該材料を浄化に関わりの無い微生物の活動を抑制し、浄化に必要な有用微生物を優占化して活動を促進させるものとしたので、浄化を阻害する微生物の増殖を抑制してその影響を極力低減し、有害化学物質を短時間に浄化して浄化効率を高めて、浄化期間を短縮して浄化コストを下げることができる。
また、浄化に必要な有機資材等の微生物活性資材の投入量を低減できることから、この面でも浄化コストを低減可能な浄化促進材料を提供することができる。
【００１７】
請求項２に係る発明によれば、微生物を用いて有害化学物質を浄化するに際し、廃水、汚染土壌、汚染地下水等の浄化対象に対して供給する浄化促進材料おいて、該材料をホップ、ホップ抽出成分、又はホップを含む材料としたので、請求項１に記載された発明の効果に加えて、原料が入手しやすく浄化促進材料の取り扱いが容易である。
【００１８】
請求項３に係る発明によれば、汚染土壌や汚染地下水中に浄化に関わりの無い微生物の活動を抑制し、浄化に必要な有用微生物を優占化して活動を促進させるもの、あるいはホップ、ホップ抽出成分、又はホップを含む材料を添加するのみで、請求項１、２に記載された発明の効果に加えて、浄化環境を長期間に亘って適切な微生物群衆構造に制御することができ、また、有用微生物を導入することなく浄化に必要な有用微生物を優占化して活動を促進させることができるから、培養等に多大なコストを要することもない。
【００１９】
請求項４乃至請求項６に係る発明よれば、デハロコッコイデス属細菌あるいはvcrＡ遺伝子を有する細菌は、ホップ、ホップ抽出成分、又はホップを含む材料の存在下においても増殖が抑制されることなく、その活動が速やかに促進されて有用な脱塩素化作用を呈し、有害な揮発性有機塩素化合物を塩素が存在しない無害な化合物まで変換することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、人工地下水中のトリクロロエチレン、シス-1,2-ジクロロエチレンおよび塩化ビニルモノマーの経時変化を示す図である。
【図２】図２は、４３日目のガラスバイアル瓶中の気相中のエチレン濃度を示す図である。
【図３】図３は、４３日目の脱塩素化細菌の遺伝子数及び脱塩素化に関わる機能遺伝子数を示す図である。
【図４】図４は、４３日目の人工地下水中の有機物消費率を示す図である。
【図５】図５は、４３日目の人工地下水中のATP活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、抗菌材料であるホップ、又はホップの抽出成分を浄化環境に導入することにより、浄化に関わりの無い微生物の活動を抑制して環境中の有用微生物が従来方法に比較して短時間で優占化され、その有用微生物の活動を促進させて、浄化期間を短縮するものであり、この点に特徴がある。
【００２２】
本発明では、微生物を用いて浄化する場合に、ホップ、ホップ抽出液、または、ホップ成分を含む材料からなる浄化促進材料を浄化対象とする水、土壌、地下水に導入するものである。
【００２３】
以下、塩素化エチレン汚染地下水を嫌気微生物により浄化（脱塩素化）する方法について、上記した浄化促進材料を用いた場合と用いない場合の浄化促進効果を比較した実施例について説明する。
一般的に、テトラクロロエチレンやトリクロロエチレンは還元的環境下で、微生物の働きによりエチレン、エタンにまで脱塩素化される。
この浄化方法では、汚染地下水中の有用な脱塩素化菌が、トリクロロエチレンをシス-1,2-ジクロロエチレンに、シス-1,2-ジクロロエチレンを塩化ビニルモノマーに、塩化ビニルモノマーをエチレンに順次脱塩素していく。脱塩素化菌の活動により、最終的には全ての塩素化エチレンが無害なエチレンまで変換される。
還元的環境下でテトラクロロエチレンやトリクロロエチレンを脱塩素化する微生物種のうち、エチレン、エタンまでの還元脱塩素化の反応に関与する微生物種として、いくつかのデハロコッコイデス（Dehalococcoides）属細菌が特定されている（参考文献１〜２）。
【実施例】
【００２４】
本試験では、トリクロロエチレンおよびシス-1,2-ジクロロエチレンで汚染された人工地下水を作成し、ホップ抽出成分を添加して、ホップ抽出成分が微生物浄化に与える影響を把握することを目的とした室内培養試験を実施した。人工地下水の組成を表１に示す。
【００２５】
【表１】
0005706134.tif 000002
【００２６】
120mLのガラスバイアル瓶に上記人工地下水を90mL、トリクロロエチレンを10μmol/L、シス-1,2-ジクロロエチレンを30μmol/L、乳酸ナトリウムを400mg/L(有機物濃度で150mg/L)、塩素化エチレン汚染地下水から採取した土壌1gと蒸留水10gを混合後に得られた土壌上澄み液を1mL、をそれぞれ添加してテフロンコーティング処理済みのブチルゴム栓とアルミシール栓を用いて密栓した。
【００２７】
次に、乾燥ホップ(粉末)を1%(w/v)で蒸留水に混合して作成したホップ成分抽出水を、個々のガラスバイアル瓶に、O%(v/v)(コントロール)、3％(v/v)、1％(v/v)、0.1％(v/v)添加して、20℃の恒温室内で82日間振とう培養した。
【００２８】
人工地下水中のトリクロロエチレン、シス-1,2-ジクロロエチレン、および塩化ビニルモノマーの培養期間中の経時変化を図１に、43日目におけるガラスバイアル瓶中の気相中のエチレン濃度を図２に、それぞれ示す。
この結果、全ての培養条件で浄化（脱塩素化）の傾向が確認されたが、培養開始から約1ヶ月後（36日目、43日目）では、浄化傾向に大きな差があることが確認できた。
培養開始から43日目の時点では、ホップ成分抽出水を添加していない条件と0.1％添加した条件ではシス-1,2-ジクロロエチレンの脱塩素化は確認されず、最終生成物であるエチレンの気相への生成も確認されなかった。
一方、ホップ成分抽出水を3％、および1％添加した条件では、脱塩素化傾向と最終生成物であるエチレンの気相への生成が確認され、ホップ成分抽出水の添加量の多い条件で脱塩素化が速く進行することが示された。
【００２９】
浄化に関わる細菌の増加傾向を把握するため、デハロコッコイデス属（Dehalococcoides属、参考文献１〜２）の16S rRNA遺伝子コピー数、およびシス-1,2-ジクロロエチレン以降の脱塩素化に関わる公知の機能遺伝子（参考文献３〜６）であるvcrA遺伝子コピー数をリアルタイムPCR法により求めた。
培養試料からのゲノムDNAの取得方法、およびデハロコッコイデス属の16S rRNA遺伝子数のリアルタイムPCRによる決定方法については、次に示すとおりである。
【００３０】
ゲノムDNAを取得するため、培養試料5mlを濾過したポリカーボネート製メンブレンフィルター（孔径0.2 mm）を20mg/ml-プロテナーゼK（3μL）、10％-Sodium  dodecyl sulfate（30μL）、TEバッファー（567μL）を含む溶液内において50℃で1時間静置して、続いて5M-NaCl(100μL)、CATB/NaCl溶液（80μL）を加えて、65℃で10分間静置培養した。
【００３１】
次に、クロロホルム/イソアミルアルコール（800μL）を加えて混合後、15000rpm、5分間の遠心分離後に上清液600μLを回収し、フェノール（300μL）、クロロホルム/イソアミルアルコール（24：1，300μL）を加えて、15000rpm、5分間の遠心分離後、上清550μLを回収した。そこに、3M-酢酸ナトリウム（55μL）、イソプロピルアルコール（550μL）を加え、15000rpm、10分間の遠心分離後に上精液を捨て、70％エタノール（1mL）を加え、15000rpm、10分間の遠心分離後に上精液を捨て、DNAを回収した。
【００３２】
続いて、リアルタイムPCR法により、デハロコッコイデス属16S rRNA遺伝子コピー数を以下の方法で定量した。リアルタイムPCR法により増幅させる遺伝子領域は、デハロコッコイデス属細菌に共通する配列となる16S rDNA上の特異的領域を増幅させるプライマーとして「5’-CAGCAGGAGAAAACGGAATT-3’」と「5’-GACAGCTTTGGGGATTAGC-3’」を用い、リアルタイムPCRでの遺伝子断片検出法はSYBR  Green  Iを使用したインターカレーター方式とした。
【００３３】
以下に1検体当たりのPCR反応組成を示す。上記方法で抽出したゲノムDNAは50μlのTEバッファーに溶解して使用した。なお、本試験ではブランクを設け、PCRの反応液にはDNA抽出物の代わりに滅菌蒸留水を混合した。
【００３４】
2×SYBR Premix（タカラバイオ社製）        12.5μl
100μM 624-Fw                              0.1μl
100μM 1232-Rv                             0.1μl
50×ROX Dye（タカラバイオ社製）            0.5μl
DNA  抽出物                                1.0μl
滅菌超純水                                10.8μl
計                                        25.0μl
【００３５】
リアルタイムPCR反応は、初期変性（95℃、30秒）の後、変性（95℃、5秒）・アニーリング（54℃、30秒）・伸長反応（72℃、45秒）を40回繰り返し、最後に60℃から95℃まで段階的に温度を上昇させる条件とした。地下水中のデハロコッコイデス属細菌のコピー数を定量するために、既知のデハロコッコイデス属細菌の16S rDNA領域をpGEM  T-Easyベクター（Promega社製）にクローニングしたプラスミドDNAをスタンダードとして使用し、102〜108copiesの検出値について検量線を作成した。
【００３６】
＜参考文献＞
［参考文献１］X.Maymo−Gatell,Y.-T. Chien,J.M.Gossett,and S.H.Zinder,Sience,276:1568-1571,1997.
［参考文献２］D.E.Fennell,I.Nijenhuis,S.F.Wilson,S.H.Zinder,and M.M.Haggblom,Environ.Sci.Technol.,38:2075-2081,2004.
［参考文献３］J.He,K.M.Ritalahti,M.R.Aiello,and F.E.Loffler,Appl.Environ.Microbiol.,69:996-1003,2003.
［参考文献４］M.Duhamel,K.Mo,and E.A.Edwards,Appl.Environ.Microbiol.,70:5538-5545,2004.
［参考文献５］J.A.Muller,B.M.Rosner,G.von Abendroth,G.Meshulam-Simon,P.L.McCarty,and  A.M.Spormann.,Appl.Environ.Microbiol.,70:4880-4888,2004.
［参考文献６］K.M.Ritalahti,B.K.Amos,Y.Sung,Q.Wu,S.S.Koenigsberg,and F.E.Loffler,Appl.Environ.Microbiol.72:2765-2774,2006.
【００３７】
vcrA遺伝子コピー数は、ゲノムDNAの採取後にリアルタイムPCR法により以下の方法で定量した。リアルタイムPCR法により機能遺伝子vcrAの特異的領域を増幅させるプライマーとして「5’-CGGGCGGATGCACTATTTT-3’」、および「5’-GAATAGTCCGTGCCCTTCCTC-3’」を用い、5’末端を蛍光物質（FAM）で、3’末端をクエンチャー物質（TAMRA）で修飾したオリゴヌクレオチド「5’-CGCAGTAACTCAACCATTTCCTGGTAGTGG-3’」をプローブとして用いた。
リアルタイムPCR法での遺伝子断片検出方法は、蛍光プローブ法とした。
【００３８】
以下に1検体辺りのPCR反応組成を示す。上記方法で抽出したDNAは50μlのTEバッファーに溶解して使用した。なお、本試験ではブランクを設け、PCRの反応液にはDNA抽出物の代わりに滅菌蒸留水を混合した。
【００３９】
2×Premix EX Tag（タカラバイオ社製）     12.5μl
100μM 1022-Fw                            0.1μl
100μM 1093-Rv                            0.1μl
100μM1042-Probe                          0.1μl
50×ROX  Dye（２）（タカラバイオ社製）    0.5μl
DNA 抽出物                                1.0μl
滅菌超純水                               10.7μl
計                                       25.0μl
【００４０】
リアルタイムPCR反応は、初期変性（95℃、10秒）の後、変性（95℃、15秒）、アニーリング（58℃、1分）を40サイクル行い、特定遺伝子のコピー数を求めた。地下水中の機能遺伝子を保有する微生物種を定量するために、完全脱塩素化の培養系から既知のvcrA遺伝子領域をpGEM  T-Easyベクター（Promega社製）にクローニングしたプラスミドDNAをスタンダードとして使用し、102〜108 copiesの検出値について検量線を作成した。
【００４１】
本方法により、培養開始から43日目におけるデハロコッコイデス属細菌の16S rRNA遺伝子コピー数、およびvcrA遺伝子コピー数を定量した結果、両遺伝子数は図３に示されるように同様の傾向を示した。
【００４２】
デハロコッコイデス属細菌の16S rRNA遺伝子コピー数、およびvcrA遺伝子コピー数は、いずれも脱塩素化がみられたホップ成分抽出水を3％、および1％添加した条件で顕著に増加していることが確認できた。
【００４３】
一方、培養開始から43日目における添加した有機物（乳酸）量に対して培養後に消費された有機物の割合を示す消費率は、図４に示されるように、ホップ成分抽出水の添加量が多いほど小さかった。
【００４４】
さらに、培養開始から43日目における人工地下水中に存在する微生物全体の増殖活性を示す指標となるATPは、図５に示されるように、ホップ成分抽出水を添加すると低くなり、特に添加量が多くなるほどATP活性が低くなった。
【００４５】
以上の試験結果から、以下の４点が明らかとなった。
（１）ホップ成分抽出水の添加量の多い条件で脱塩素化が速く進行すること。
（２）脱塩素化菌数の指標となる遺伝子コピー数は、ホップ成分抽出水を所定量以上添加した条件で顕著に増加すること。
（３）有機物の消費率は、ホップ成分抽出水の添加量が多いほど小さいこと。
（４）人工地下水中に存在する微生物全体の増殖活性を示す指標となるATPは、ホップ成分抽出水の添加量が多くなるほど活性が低くなること。
【００４６】
上記(１)と（２）から、ホップ成分抽出水の添加が、脱塩素化に関わる有用細菌数を増加させ、脱塩素化を速く進行させることが明らかである。
逆に上記（２）(３)及び（４）からは、ホップ成分抽出水の添加が、浄化に関係しない細菌の増殖は抑制されることを窺い知ることができる。
【００４７】
以上の結果を総合すると、ホップ抽出成分を存在させることにより、浄化に無関係な細菌の増殖は抑制され、脱塩素化に関わる有用細菌数を増加させて脱塩素化を促進させる作用効果があることが明らかとなった。
【００４８】
本発明は、浄化促進材料はホップ抽出成分を添加した上記実施例に限られず、ホップまたは乾燥ホップそのものを添加してもよい。
要するに、浄化対象に対しホップ中に含有される成分を添加できる材料であれば浄化促進材料とすることができる。
また、浄化に必要な有用微生物はデハロコッコイデス属細菌あるいはvcrA遺伝子をもつ細菌に限定されず、ホップ、ホップ抽出成分、又はホップを含む材料を添加することにより、活性化する微生物であればなんでもよい。
【図１】
0005706134.tif 000003
【図２】
0005706134.tif 000004
【図３】
0005706134.tif 000005
【図４】
0005706134.tif 000006
【図５】
0005706134.tif 000007