(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明な第１のパネルと透明な第２のパネルとを有すると共に前記第１のパネルの内表面と前記第２のパネルの内表面とが対面して画定される分析チャンバ内に静止状態で存在する生体体液試料の面積を測定するための方法であって、
前記分析チャンバ内に静止状態で存在する前記生体体液試料とその周囲の空気とを含む前記分析チャンバ内の照明領域を第１の波長の光と第２の波長の光とで照明するステップであって、前記第１の波長の光が前記生体体液試料と前記空気との間の界面を前記照明領域中の他のものに対して強調するように機能すると共に前記第２の波長の光が前記生体体液試料中の少なくとも１種類の構成成分を前記照明領域中の他のものに対して強調するように機能する、ステップと、
前記照明領域を前記第１の波長の光と前記第２の波長の光とで撮像して画像信号を生成するステップと、
前記画像信号を用いて前記生体体液試料と前記空気との間の界面の位置を決定するステップと、
前記画像信号を用いて前記生体体液試料と前記空気との間の界面に対する前記少なくとも１種類の構成成分の位置を決定するステップと、
前記生体体液試料と前記空気との間の界面の位置と前記少なくとも１種類の構成成分の位置とを用いて、前記生体体液試料と前記空気との間の界面で区切られる領域のうち前記少なくとも１種類の構成成分が存在する領域を前記生体体液試料と判別すると共に前記少なくとも１種類の構成成分が存在しない領域を前記空気と判別し、前記少なくとも１種類の構成成分が存在する領域の面積を計算することにより、前記分析チャンバ内に静止状態で存在する前記生体体液試料の面積を決定するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１種類の構成成分が存在する領域又は前記少なくとも１種類の構成成分が存在しない領域のいずれかをマスキングするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１種類の構成成分が存在する領域又は前記少なくとも１種類の構成成分が存在しない領域のいずれかをマスキングするステップが、前記少なくとも１種類の構成成分が存在する領域又は前記少なくとも１種類の構成成分が存在しない領域における画像ユニットのデジタルバイナリマスキングを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記分析チャンバ内に静止状態で存在する前記生体体液試料の面積が、前記少なくとも１種類の構成成分が存在する領域における画像ユニット毎の面積を合計することにより決定される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記分析チャンバ内に静止状態で存在する前記生体体液試料の面積が、前記少なくとも１種類の構成成分が存在しない領域における画像ユニット毎の面積を合計し、その合計の面積を既知の前記分析チャンバの面積から減じることにより決定される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１種類の構成成分が存在する領域又は前記少なくとも１種類の構成成分が存在しない領域のいずれかをマスキングするステップが、前記少なくとも１種類の構成成分と整列した画像ユニットから外側に延在する画像ユニットを、マスキング済みの画像ユニット、前記生体体液試料と前記空気との間の界面、又は前記分析チャンバ側方の隔壁のいずれかに突き当たるまで反復してマスキングすることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１種類の構成成分が存在する領域又は前記少なくとも１種類の構成成分が存在しない領域のいずれかをマスキングするステップが、前記生体体液試料と前記空気との間の界面と整列した画像ユニットから外側に延在する画像ユニットを、マスキング済みの画像ユニット又は前記分析チャンバ側方の隔壁のいずれかに突き当たるまで反復してマスキングすることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記生体体液試料と前記空気との間の界面の位置と前記少なくとも１種類の構成成分の位置とを用いて、前記生体体液試料と前記空気との間の界面で区切られる領域のうち前記少なくとも１種類の構成成分が存在する領域を前記生体体液試料と判別すると共に前記少なくとも１種類の構成成分が存在しない領域を前記空気と判別し、前記少なくとも１種類の構成成分が存在する領域の面積を計算することにより、前記分析チャンバ内に静止状態で存在する前記生体体液試料の面積を決定するステップが、前記少なくとも１種類の構成成分が存在する１つ又は複数の領域と前記少なくとも１種類の構成成分が存在しない１つ又は複数の領域とを定義することを含み、前記生体体液試料と前記空気との間の界面が、前記少なくとも１種類の構成成分が存在する１つ又は複数の領域のいずれかと前記少なくとも１種類の構成成分が存在しない１つ又は複数の領域のいずれかとの間に配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１種類の構成成分が存在する１つ又は複数の領域と前記少なくとも１種類の構成成分が存在しない１つ又は複数の領域のいずれかをマスキングするステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記分析チャンバ内に静止状態で存在する前記生体体液試料の面積が、前記少なくとも１種類の構成成分が存在する１つ又は複数の領域のそれぞれにおける画像ユニット毎の面積を合計することにより決定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記分析チャンバ内に静止状態で存在する前記生体体液試料の面積が、前記少なくとも１種類の構成成分が存在しない１つ又は複数の領域のそれぞれにおける画像ユニット毎の面積を合計し、その合計の面積を既知の前記分析チャンバの面積から減じることにより決定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１種類の構成成分が存在する１つ又は複数の領域と前記少なくとも１種類の構成成分が存在しない１つ又は複数の領域のいずれかをマスキングするステップが、前記少なくとも１種類の構成成分が存在する１つ又は複数の領域と前記少なくとも１種類の構成成分が存在しない１つ又は複数の領域における画像ユニットのデジタルバイナリマスキングを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１種類の構成成分が、赤血球である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の波長の光と前記第２の波長の光とが異なる波長の光である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記分析チャンバ内に静止状態で存在する前記生体体液試料とその周囲の空気とを含む前記分析チャンバ内の照明領域を前記第１の波長の光で照明することにより、前記生体体液試料と前記空気との間の界面が画像内で前記照明領域中の他のものに対して強調される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の波長の光が、ヘモグロビンにより吸収される波長の光である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１種類の構成成分が、感知可能な着色剤により着色された白血球及び血小板の一方又は双方である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記分析チャンバ側方の隔壁が、感知可能な着色剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記分析チャンバ内に静止状態で存在する前記生体体液試料の決定された面積と既知の前記分析チャンバの高さとを用いて、前記分析チャンバ内に静止状態で存在する前記生体体液試料の容積を決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
分析チャンバ内に静止状態で存在する生体体液試料の面積を測定するための方法であって、
透明な第１のパネルと透明な第２のパネルとを有すると共に前記第１のパネルの内表面と前記第２のパネルの内表面とが対面して画定される分析チャンバに前記生体体液試料を入れるステップと、
前記分析チャンバ内に静止状態で存在する前記生体体液試料とその周囲の空気とを含む前記分析チャンバ内の照明領域を第１の波長の光と第２の波長の光とで照明するステップであって、前記第１の波長の光が前記生体体液試料と前記空気との間の界面を前記照明領域中の他のものに対して強調するように機能すると共に前記第２の波長の光が前記生体体液試料中の少なくとも１種類の構成成分を前記照明領域中の他のものに対して強調するように機能する、ステップと、
前記照明領域を前記第１の波長の光と前記第２の波長の光とで撮像して画像信号を生成するステップと、
前記画像信号を用いて前記生体体液試料と前記空気との間の界面の位置を決定するステップと、
前記画像信号を用いて前記生体体液試料と前記空気との間の界面に対する前記少なくとも１種類の構成成分の位置を決定するステップと、
前記少なくとも１種類の構成成分が存在する領域又は前記少なくとも１種類の構成成分が存在しない領域のいずれかをマスキングするステップと、
前記生体体液試料と前記空気との間の界面の位置と前記少なくとも１種類の構成成分の位置とを用いて、前記生体体液試料と前記空気との間の界面で区切られる領域のうち前記少なくとも１種類の構成成分が存在する領域を前記生体体液試料と判別すると共に前記少なくとも１種類の構成成分が存在しない領域を前記空気と判別し、前記少なくとも１種類の構成成分が存在するマスキングされた領域及び前記少なくとも１種類の構成成分が存在しないマスキングされた領域の一方又は双方を用いて、前記少なくとも１種類の構成成分が存在する領域の面積を計算することにより、前記分析チャンバ内に静止状態で存在する前記生体体液試料の面積を決定するステップと、
を含む、方法。
【請求項２１】
前記分析チャンバが、１つ又は複数の隔壁であって、それらの間に配置された既知の面積を形成する隔壁により画定された部分を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
透明な第１のパネルと透明な第２のパネルとを有すると共に前記第１のパネルの内表面と前記第２のパネルの内表面とが既知の又は特定可能な高さで対面して画定される分析チャンバ内に静止状態で存在する生体体液試料の容積を決定するための方法であって、
前記分析チャンバ内に静止状態で存在する前記生体体液試料とその周囲の空気とを含む前記分析チャンバ内の照明領域を第１の波長の光と第２の波長の光とで照明するステップであって、前記第１の波長の光が前記生体体液試料と前記空気との間の界面を前記照明領域中の他のものに対して強調するように機能すると共に前記第２の波長の光が前記生体体液試料中の少なくとも１種類の構成成分を前記照明領域中の他のものに対して強調するように機能する、ステップと、
前記照明領域を前記第１の波長の光と前記第２の波長の光とで撮像して画像信号を生成するステップと、
前記画像信号を用いて前記生体体液試料と前記空気との間の界面の位置を決定するステップと、
前記画像信号を用いて前記生体体液試料と前記空気との間の界面に対する前記少なくとも１種類の構成成分の位置を決定するステップと、
前記生体体液試料と前記空気との間の界面の位置と前記少なくとも１種類の構成成分の位置とを用いて、前記生体体液試料と前記空気との間の界面で区切られる領域のうち前記少なくとも１種類の構成成分が存在する領域を前記生体体液試料と判別すると共に前記少なくとも１種類の構成成分が存在しない領域を前記空気と判別し、前記少なくとも１種類の構成成分が存在する領域の面積を計算することにより、前記分析チャンバ内に静止状態で存在する前記生体体液試料の面積を決定するステップと、
前記分析チャンバ内に静止状態で存在する前記生体体液試料の決定された面積と既知の又は特定可能な前記分析チャンバの高さとを用いて、前記分析チャンバ内に静止状態で存在する前記生体体液試料の容積を決定するステップと、
を含む、方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１種類の構成成分が、赤血球である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の波長の光と前記第２の波長の光とが異なる波長の光である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記分析チャンバ内に静止状態で存在する前記生体体液試料とその周囲の空気とを含む前記分析チャンバ内の照明領域を前記第１の波長の光で照明することにより、前記生体体液試料と前記空気との間の界面が画像内で前記照明領域中の他のものに対して強調される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２の波長の光が、ヘモグロビンにより吸収される波長の光である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１種類の構成成分が、感知可能な着色剤により着色された白血球及び血小板の一方又は双方である、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００８年４月９日に出願された米国仮特許出願第６１／０４３，５６７号明細書に開示される本質的主題の利益を享受し、それを参照により援用する。
【０００２】
本発明は、概して、生体体液試料の分析方法に関し、特に、分析チャンバにおいて試料により充填された面積を測定するための装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
医師、獣医師及び科学者は、構成成分の量を決定し、さらに健常な被験体には見られない異常な粒状物質の存在を同定するため、ヒト及び動物の生体体液、特に血液を調べている。一般に計測、定量及び同定される構成成分としては、赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）、及び血小板が挙げられる。
【０００４】
「Ｗｉｎｔｒｏｂｅ’ｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ」第１２版などの医学テキストに詳細に記載されている公知の血液検査手法では、概して検査方法は、手動、遠心、及びインピーダンスを用いるタイプの方法に分けられる。手動で行う方法には、典型的には、正確に測定された容積の血液又は体液試料を作成し、それを定量的に希釈して、計数チャンバにおいて目視で数をカウントすることが関わる。手動での検査方法には、末梢血スメアを調べることが含まれ、そこでは目視検査により各粒状物質タイプの相対量が決定される。遠心による検査方法には、試料を遠心し、試料を構成成分の相対密度に従う構成成分層に分離させることが関わる。成分層は染色して、可視性又は検出を高めることができる。インピーダンスによる方法には、計測対象の粒状物質に従い処理された血液の正確な容積を調べることが関わる；例えば、有核細胞を計数するためＲＢＣを溶解し、容積測定に基づき試料を導電性流体中に希釈する。この過程には、典型的には、狭小な通路を通る試料に印加される電流又は電圧をモニタすることにより、粒状物質が一列で通過するときの電流／電圧に対する粒状物質の影響を決定することが関わる。他の手法では、光線の中を一列に通過する粒状物質に入射する光の散乱の強度及び角度を分析することが関わる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前述の方法は全て、末梢血スメア又は遠心分離を除き、正確な容積の試料を計量分配する必要がある。試料容積が不正確であると、関連する分析において同じ規模の定量誤差が生じ得る。遠心による方法を除き、前述の方法は全て、試料を１つ又は複数の液体試薬又は希釈剤と混合することも必要で、且つ正確な結果を得るために器具のキャリブレーションも必要となる。末梢血スメアの場合、スメアを正しく検査するには高度な訓練が必要とされる。前述の方法の多くは、処理費用が高額な大量の汚染廃棄物が発生する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のある態様に従えば、チャンバ内に静止状態で存在する生体体液試料によって被覆された分析チャンバの面積を測定するための方法が提供される。チャンバは、内表面を備える第１のパネルと、内表面を備える第２のパネルとを有し、それらのパネルは双方とも透明である。この方法は、ａ）分析チャンバ内に存在する試料を、試料と空気との間の界面を強調し、且つ試料中の構成成分を強調するように機能する１つ又は複数の波長で照明するステップと；ｂ）１つ又は複数の波長に従い試料を撮像し、１つ又は複数の波長の試料との相互作用を表す画像信号を生成するステップと；ｃ）それらの画像信号を用いて、試料と空気との間の少なくとも１つの界面の位置を決定するステップと；ｄ）それらの画像信号を用いて、少なくとも１つの試料−空気界面に対する試料中の１つ又は複数の構成成分の位置を決定するステップと；ｅ）１つ又は複数の構成成分と少なくとも１つの試料−空気界面との位置を用いて、試料を含むチャンバの面積を決定するステップとを含む。
【０００７】
一様な高さにより分離された一対の透明パネルを有する分析チャンバが、試料の分析に好都合な媒体を提供する。多くの分析について、分析する試料の容積は既知であることが有用である（又は要求される）が、正確な既知量の試料を計量分配することは困難である。正確な既知量の試料を計量分配する問題を回避するため、前記分析チャンバに生じた膜の面積を計測し、その面積にチャンバ高さを乗じて添加された試料容積を決定するならば、有用であろう。血液（又は他の生体体液）が幾何学的に完全な形状で分散するならば、これは比較的容易であろうが、試料は、それを加えた点からチャンバを通じて拡がるときに、気泡を取り込んだり、又は蛇行した輪郭を有したりすることが多い。チャンバ内の試料の面積を測定する作業は、赤血球の数が少ない血液試料について特に問題となり、ここでその面積計算に使用される基準が試料範囲の色のみである場合、比較的透明な血漿が試料の大部分と分離され、その比較的無色の範囲が面積計算に含まれないこともある。本方法は、試料面積、従って一様な高さのチャンバにおける容積の正確な測定方法を提供し、従って正確な試料容積の計量分配に伴う問題に対して解決策を提供する。
【０００８】
本方法及びそれに関連する利点が、添付の図面を含め、以下に提供される詳細な説明を考慮することでさらに容易に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】血液試料を含む分析チャンバの図式的な断面図である。
【図２】分析チャンバの実施形態の図式的な断面図である。
【図３】分析チャンバの実施形態の図式的な断面図である。
【図４】分析チャンバの実施形態の図式的な断面図である。
【図５】分析チャンバの図式的な平面図である。
【図６】チャンバ内に置かれた血液試料の図式的な画像であり、照明することにより試料中に含まれる赤血球が強調されている。
【図７】図６に示されるとおりのチャンバ内に置かれた血液試料の図式的な画像であり、照明することにより試料内の試料と空気との間の界面が強調されている。
【図８】図６及び図７に示されるとおりのチャンバ内に置かれた試料の図式的な画像であり、試料を含む領域がデジタル処理でマスキングされている。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、分析チャンバ内に静止状態で存在する生体液試料の面積を測定するための１つ又は複数の方法を提供する。分析によっては、試料面積それ自体が望ましい有用な情報を提供することができる。他の分析では、面積を用いてチャンバ内の試料の容積を決定することができる；例えばチャンバ高さが既知であるか、又は特定可能である場合、面積と、チャンバの既知の、又は特定可能な高さとを用いて、試料の容積を決定することができる。
【００１１】
１つ又は複数の本方法は、分析される生体液試料（例えば、実質的に無希釈の抗凝固処理された全血の試料）を静止状態に保つように機能する分析チャンバにより実施することができる。このチャンバは、典型的には約０．２μｌ〜１．０μｌの試料を保持するサイズであるが、この方法はいかなる特定のチャンバ容積での使用にも限定されず、チャンバ容積は分析用途に合わせて変更することができる。これらの例において、本方法がチャンバ内に置かれた全血の試料に対して実施されるとき、試料は典型的には「実質的に無希釈」であり、つまりこれは、血液試料が全く希釈されていないか、又は意図的に希釈されたわけではないが、分析のためにそこに何らかの試薬が添加されていることを意味する。試薬の添加により試料が希釈される程度では、あったとしても、かかる希釈は実施される分析に対して何ら臨床的に有意な影響をもたない。血液試料と共に用いられ得る試薬の例は抗凝固薬（例えば、ＥＤＴＡ、ヘパリン）であり、これは典型的には乾燥形態で添加され、試料の希釈を目的とするものではない。しかしながら、抗凝固薬が全ての血液分析に必要なわけではない。ある状況下では（例えば、超高速分析−血液が患者のフィンガースティック又は新生児のヒールスティックにより採取されるときに発生し得るものなど）、抗凝固剤の添加は必要でないこともあり得る。用語「静止状態」は、本明細書では、試料が分析用チャンバの中に入れられ、分析中、チャンバに対して意図的に動かされることがないことを表すために用いられる。血液試料中に存在する運動の程度では、それは主に血液試料の有形の構成成分のブラウン運動によるもので、そうした運動によってこの発明の機器が使用不能になることはない。
【００１２】
ここで図１〜３を参照すると、許容可能な分析チャンバ１０の例は、内表面１４を有する第１のパネル１２と、内表面１８を有する第２のパネル１６とを含むものである。パネル１２、１６は双方とも十分に透明なため、以下に記載される分析の実施に十分な量の所定波長に従う光を透過させることが可能である。好ましい実施形態において、パネル１２、１６の少なくとも一部分は互いに平行であり、その部分の範囲内で内表面１４、１８は高さ２０だけ互いに隔たり、この高さは既知であり得るか、又は計測可能であり得る。平行なパネル１２、１６を有する分析チャンバは、少なくとも、一様なチャンバ高さが試料容積の決定を促進するという理由から好ましい。しかしながら、平行なチャンバパネルは、試料面積の決定、又は試料容積の決定に必須ではない；例えば、一方のパネルが他方のパネルに対して既知の非平行な角度で配置されたチャンバを使用してもよい。
【００１３】
図１〜３に示されるチャンバ１０は、パネル１２、１６の間に配置された少なくとも３つのセパレータ２６を含む。セパレータ２６は、パネル１２、１６の間に配置可能な、パネル１２、１６を互いに離間させるように機能する任意の構造であってよい。セパレータ２６の高さ２８は、典型的には互いに正確に等しいわけではないが（例えば、製造公差）、同様の分析装置に使用される間隔保持手段についての商業的に許容可能な公差の範囲内である。球形ビーズは許容可能なセパレータ２６の一例であり、例えば、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｆｉｓｈｅｒｓ、米国Ｉｎｄｉａｎａから市販されている。
【００１４】
図２に示されるチャンバの実施形態では、セパレータ２６は、第１のパネル１２及び第２のパネル１６の一方又は双方と比べて可撓性が高い材料からなる。図２で分かるとおり、より大きいセパレータ２６は、ほとんどのセパレータ２６がパネル１２、１６の内表面に接触している点まで圧縮され、そのためチャンバ高さはセパレータ２６の平均直径よりほんの僅かに小さくなる。図３に示されるチャンバの実施形態では、セパレータ２６は、第１のパネル１２及び第２のパネル１６の一方又は双方と比べて可撓性が低い材料からなる。図３では、第１のパネル１２は球形セパレータ２６及び第２のパネル１６より可撓性の高い材料によって形成され、テントのような形でセパレータ２６に被さる。この実施形態において、チャンバ１０の局所的な小さい領域は所望のチャンバ高さ２０から逸脱し得るが、チャンバ１０の平均高さ２０は、セパレータ２６の平均直径の高さに極めて近似する。分析では、平均チャンバ高さ２０は、この実施形態を使用する４μｍ未満のチャンバ高さにおいて１パーセント（１％）又はそれ以上まで制御され得ることが示されている。上記の可撓性を有するという特性を前提として、セパレータ２６及びパネル１２、１６は様々な材料で作製することができ、但し、パネル１２、１６は十分に透明であるものとする。アクリル又はポリスチレンからなる透明プラスチックフィルムが、許容可能なパネル１２、１６の例であり、ポリスチレン、ポリカーボネート、シリコーンなどから作製される球形ビーズが、許容可能なセパレータ２６である。図４を参照すると、他方の上側に垂直方向に配置されるパネル１２が、等間隔に配置された複数のポート３０（例えば、その少なくとも一部は通気孔として働くことができる）を含み、パネル１２、１６は所定箇所で互いに結合される。いくつかの実施形態では、結合材料３２がチャンバ外壁を形成し、試料３４を分析チャンバ１０内に横方向に収容するように機能する。他の実施形態では、一方又は双方のパネル１２、１６が、試料を分析チャンバ１０内に横方向に収容するチャンバ壁のように機能する疎水性に修飾された表面を有し得る。結合材料又は疎水性に修飾された表面は、チャンバの外周の位置を特定するために使用することのできる感知可能な着色剤を含み得る。許容可能な分析チャンバの例は、米国特許出願公開第２００７／０２４３１１７号明細書、米国特許出願公開第２００７／００８７４４２号明細書、及び米国特許第６，７２３，２９０号明細書（これらは全て、全体として参照により本明細書に援用される）にさらに詳細に記載されている。しかしながら、本方法はこれらの特定のチャンバの実施形態に限定されるものではない。
【００１５】
チャンバ１０内に静止状態で配置された試料の分析は、試料の少なくとも一部分を照明して撮像し、画像に関する分析を実施するように機能する分析機器を使用して実施される。画像は、試料の少なくとも一部分を通じた吸光度、及びそこからの蛍光発光のうちの一方又は双方を、画像ユニット毎ベースで決定することが可能な形で生成される。用語「画像ユニット毎ベース」は、試料の画像を解像することのできる増分単位を意味する。一般に、特定の撮像システムにおいて個々に処理することのできる画像の最小要素として定義される画素は、画像ユニットの一例であり、画像ユニットとしては、集合的な単位としての少数の画素も含まれ得る。撮像機器の拡大率は、線形的な関係（例えば、焦点面におけるマイクロメートル毎画素）として表すこともでき、この場合、線の寸法は、画像に適用される直交格子の特定の軸に従う。そのため、焦点面においてセンサの画素により捕捉される実際の試料面積は、撮像機器が適用する拡大倍率に従い変わる。従って、撮像機器の拡大率は既知であるか又は決定可能であるべきである。従って、当該の画素に関連する容積は、画素毎の画像の面積に既知のチャンバ高さを掛けたものである。例えば、拡大率が０．５μｍ毎画素であったならば、２００画素を占有する画像の面積は５０平方μｍとなり、容積は５０平方μｍ×チャンバ高さとなる。
【００１６】
ここで図５を参照すると、本方法での使用向けに構成することのできる分析機器４４の例であり、これは、試料照明器４６と、解像装置４８と、プログラム可能分析器５０とを含む。試料照明器４６は、特定の所望の波長に従う光を発する光源（例えば、ＬＥＤ）か、又は広い波長範囲に従う光を発する光源のいずれかを使用して、特定の所望の波長に従う光を選択的に発生する。約４１３ｎｍ及び約５４０ｎｍの光を発生するように機能する照明器４６が血液試料の分析には特に有用であり、これは、ヘモグロビン内ではこうした波長において実質的な光吸収が起こる（すなわち、前記波長ではモル吸収係数（ε）が高い）ことが理由である。光の吸収は、光の波長と試料との間のある種の「相互作用」である。試料照明器４６は、チャンバ１０に対して透過モード又は落射モード又はその双方の光を発生するように構成することができ、試料照明器４６は、チャンバ１０内に存在する試料の一部又は全てを照明するように機能する。透過モードでは、試料照明器４６の光源部は、チャンバ１０内に存在する試料の片側に位置決めされ、チャンバパネル間に静止状態で置かれた試料を通じて、その後解像装置４８まで光を送る。
【００１７】
許容可能な解像装置４８の一例は、試料を通過する光の像を電子データ形式（すなわち、信号）に変換する電荷結合素子（ＣＣＤ）である。相補型金属酸化膜半導体（「ＣＭＯＳ」）型画像センサは、使用することのできる画像センサの別の例であり、本発明はこれらの例のいずれにも限定されない。
【００１８】
プログラム可能分析器５０は中央演算処理装置（ＣＰＵ）を含み、試料照明器４６及び解像装置４８に（少なくとも電子的に及び／又は光学的に）接続される。ＣＰＵは、本方法を行うのに必要な機能を選択的に実行するように構成される（例えば、プログラムされる）。プログラム可能分析器５０の機能は、ハードウェア、ソフトウェア、ファームウェア、又はそれらの組み合わせを用いて実装され得ることに留意しなければならない。当業者であれば、必要以上に実験を行うことなく、本明細書に記載される機能を実行させるように処理装置をプログラムすることができるであろう；全体として参照により本明細書に援用される、「Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｆｌｕｉｄｓ」と題される２００５年３月１５日に発行された米国特許第６，８６６，８２３号明細書が、かかる分析機器を開示している。
【００１９】
分析機器４４は、１）分析チャンバ内に置かれた試料を、試料と空気との間の界面と、試料中の少なくとも１つの構成成分とを強調するように機能する１つ又は複数の波長で照明し；２）その波長に従い試料を撮像して、その波長の試料との相互作用を表す画像信号を生成し；及び３）それらの画像信号を用いて、試料と空気との間の少なくとも１つの界面を決定するように構成される。
【００２０】
いくつかの実施形態において、分析機器４４は、さらに、１つ又は複数の試料−空気界面により互いに分離された少なくとも１つの試料領域と少なくとも１つの非試料領域とを決定するように構成される。各試料領域は、試料からの少なくとも１つの構成成分を含む。各非試料領域は、試料からの構成成分を含まない。試料領域と、非試料領域と、試料−空気界面との関わる空間的な関係は、試料領域が試料−空気界面の第１の側に配置され、且つ非試料領域が同じ試料−空気界面の第２の側に配置され、第１の側と第２の側とは互いに「向かい合って」いるものとして表すことができる。また、試料領域及び非試料領域の幾何形状は幅広く異なり得るとともに、例えば、試料は気泡を含むことが多い等、単一の境界線に限定されることはほとんどないことが注目されなければならない。結果的に、試料領域及び非試料領域は分析チャンバ内で互いに相補的なものとしても表され得る。上記に指摘されるとおり、血液試料中の構成成分としては、限定はされないが、赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）、及び血小板が挙げられる。血漿と感知可能色素が混和される場合、その色素により血漿の存在は容易に認識できるようになり、ひいては血漿もまた血液試料の構成成分と見なされ得る。これらの実施形態において、分析機器４４は、さらに、試料領域及び非試料領域の少なくとも一方を用いて試料を含むチャンバの面積を決定するように構成される。
【００２１】
他の実施形態において、分析機器は、１）試料中の構成成分の位置を特定して、試料領域又は非試料領域の一方をマスキングするデジタルマスキングを提供し；及び２）マスキングされた面積を用いて、試料を含むチャンバの面積を決定するように構成される。デジタルマスキングという用語は、本明細書で使用されるとき、特定された範囲（例えば、試料領域）にある画像ユニット（例えば、画素）の全てに特定の値を与え、それによりそれらの画像ユニットを、照明された撮像試料を表す画像値を含む画像ユニットと識別するバイナリ画像処理を指す。次に、容易に識別可能なマスキングされた画像ユニットをさらに処理し、例えば、面積を決定するために合計することができる。
【００２２】
他の実施形態において、本発明は、チャンバの少なくとも１つの内表面に堆積させた着色剤を含む。試料と混和された着色剤（例えば、アクリジンオレンジなどの蛍光色素）は、照明を用いて感知することができ、試料−空気界面を決定するために用いることができる。蛍光着色剤が使用される例では、感知可能な信号は、光源により生じる特定の波長の蛍光発光であり、この光源は別の波長で蛍光着色剤を励起する。蛍光発光の発生は、試料を照明するために用いられた光が「相互作用」する結果として表され得る。
【００２３】
本方法の以下の例は、チャンバの２枚の透明パネルであって、一様な高さにより分離されたパネルの間に置かれた抗凝固処理済みの全血の試料に適用される本方法に関連して記載される。これらの例は本方法の有用性を示すために提供され、本方法がそれらに限定されるものと解釈されてはならず、特に、全血試料の面積決定に限定されるものと解釈されてはならない。
【００２４】
本方法の一実施形態において、試料は複数の光の波長を使用して照明及び撮像される。選択された波長の１つ又は複数が、試料の画像内にある１つ又は複数の標的構成成分を強調する。全血について、約４１５ｎｍ又は約５４０ｎｍのいずれかの波長を使用すると、これらの波長の光は赤血球中に含まれるヘモグロビンにより吸収されやすいため、ＲＢＣを効果的に強調することができる。「強調される」ＲＢＣは、ヘモグロビンに関連した光吸収を示す光学濃度の閾値を使用して特定することができる。所定の光学濃度値を満足する、又はそれを超過する（若しくは除外手法が用いられる場合には、閾値未満の）画像ユニットが、ＲＢＣと整列しているものとして特定される。ヘモグロビンの光吸収を利用する代替例として、試料と混和された蛍光着色剤（例えば、アクリジンオレンジ）又は他の感知可能着色剤により特定のＲＢＣ及び他の構成成分（例えば、ＷＢＣ及び血小板）を強調することができる。血液試料内でＲＢＣを「標的」構成成分として使用する利点は、相対的に見て、ＲＢＣは血液試料内で最も数の多い構成成分であり、結果的に任意の特定の領域を含む試料において見つかる可能性がより高いことである。図６は、チャンバ内に置かれた血液試料５２の画像であり、ここではＲＢＣ２２が強調されている。この画像は、一対のセパレータ粒子２６と、ＲＢＣ２２と、複数のエアポケット５４とを含む。
【００２５】
この実施形態において、試料５２はまた、試料５２と空気との間の界面５６を強調するために選択された１つ又は複数の波長で照明される。この波長で試料５２が照明されると、試料５２の内容物は典型的には比較的無色でありながら、試料−空気界面５６で生じるその波長における光の屈折により、試料と空気との界面は明確に特定される。幅広い波長を使用して試料−空気界面を特定することができる。分析される生体体液が全血のとき、試料−空気界面の強調には、６００ｎｍ以上、より好ましくは約７００ｎｍの波長が好都合に働く。図７は、図６に示される血液試料画像であり、ここでは試料−空気界面５６が強調されている。
【００２６】
上述したとおり、幅広い波長を使用して試料−空気界面５６を特定することができる。場合によっては、界面５６を強調するために使用される波長は、試料５２内の標的構成成分（例えば、ＲＢＣ２２）を強調するためにも使用することができる。結果として、試料５２は単一の波長の光で撮像することができ、従って２つの異なる波長の光を提供する必要がなくなる。
【００２７】
分析チャンバに入れられる生体体液試料は、完全な直線又は曲線の試料−空気界面５６を有することはほとんどない。試料５２は、不規則で一様ではない幾何形状の試料−空気界面を有することのほうが、はるかに典型的である。様々な手法を用いてチャンバ内の試料−空気界面の位置を特定することができ、本発明はいかなる特定の手法にも限定されない。例えば、セグメント化の手法を用いて、１つ又は複数の特定の特性を有する画像内の画像ユニット（例えば、画素）（例えば、Ｘ％の光強度を有する画像ユニット）を特定することができ；すなわち、そうした特性を特定用の特徴として使用することができる。試料−空気界面５６の指標となる所定の特性を有する画素は、特定されたうえ試料チャンバに対する位置が決定され、それにより画像内でのその位置が特定される。標的構成成分（例えば、ＲＢＣ２２）を示す特性を有する画素もまた特定され、位置が決定される。
【００２８】
１つ又は複数の試料−空気界面５６と標的構成成分（例えば、ＲＢＣ２２）との相対位置は、試料５２が位置するところと、それが位置しないところとを定義する。１つ又は複数の試料領域５８と１つ又は複数の非試料領域６０との境界が定義されると、当該の特定の領域５８、６０内に位置する各画像ユニットに関連する面積を合計することにより、各領域５８、６０の面積を決定することができる。１つ又は複数の試料領域５８内の画像ユニット面積が合計される場合、試料領域５８の総面積は、チャンバ内に置かれた試料５２の総面積を表す。図６〜図８では、単一の試料領域５８を占有している試料が示されるが、多くの場合、体液試料は特定のチャンバ内で複数の独立した試料領域５８を占め得ることが注目される。
【００２９】
別の実施形態において、試料−空気界面５６及び標的構成成分の位置が決定されると、その面積を、試料領域内の画像ユニットを反復してデジタル処理でマスキングするデジタルバイナリマスキング手法を用いて決定することができる。デジタルバイナリマスキング処理手順の一例では、構成成分と隣接する画像ユニットが、既にマスキングされた画像ユニット、又はチャンバの境界に突き当たるまで、構成成分から外側に延在する方向に反復法でマスキングされる。加えて、界面の構成成分側にある試料−空気界面５６と隣接する画像ユニットもまた、既にマスキングされた画像ユニット、又はチャンバ境界に突き当たるまで、界面５６から外側に延在する方向に反復法でマスキングされる。当該のそれぞれの試料領域内にある全ての、又は実質的に全ての画像ユニットがマスキングされるまで、このプロセスが反復して続けられる。図８は、図６及び図７に示される血液試料のマスキングされたバージョンを示す。
【００３０】
本発明は、上述されるデジタルバイナリマスキング処理手順のマスキングの例に限定されるものではない。マスキング処理手順は、或いはエッジ位置特定アルゴリズムなどの画像処理操作を用いて領域をマスキングすることもできる。
【００３１】
続いて、マスキングされた各画像ユニットに関連する面積を合計して特定の試料領域の総面積を求めることにより、試料領域の面積を決定することができる。試料領域の総面積は、チャンバ内に置かれた試料の総面積を表す。試料領域の面積はまた、撮像されたチャンバの総面積が既知であるか、又は特定可能である場合、対比法を用いて決定することもできる。かかる例では、非試料領域の面積をマスキングして決定し、次に総撮像面積から減じることにより、試料領域面積を求めることができる。総撮像面積は、画像全体の画像ユニット毎の面積を合計することにより決定することができる。総撮像面積が対称形状の場合、総撮像面積の一部分の面積を決定することができ、続いて適切な乗式を適用して総撮像面積を求めることができる。
【００３２】
いくつかの実施形態において、試料−空気界面の特定は、チャンバ内に乾燥した層状の感知可能な着色剤を加えることにより促進することができる。チャンバ内に入って進む試料は、試料−空気界面において不均衡な量の感知可能な着色剤（すなわち、アクリジンオレンジ）を取り込む。試料−空気界面における感知可能な着色剤の濃度が界面を強調し、それにより界面の特定が容易となる。
【００３３】
上記に指摘されるとおり、一部の分析チャンバはセパレータ粒子２６を含み、一様なチャンバ高さ２０を維持する。かかる粒子は、試料画像内でそれらを容易に識別可能とする特性を伴い形成（例えば、着色）され得る。試料領域内にかかる粒子が配置される場合、各々の面積は試料領域面積の計算において考慮され得る（例えば、図８に示されるマスキングされた領域において、セパレータ粒子２６に関連する面積は、試料のマスキングされた面積には含まれない）。マスキングされた面積内の粒子２６の容積もまた、セパレータの容積が既知であることを所与として考慮され得る。
【００３４】
代替的実施形態において、１つ又は複数の隔壁であって、それらの間に配置された既知の面積を形成する隔壁により画定された部分を有するチャンバを使用することができる。隔壁は、既知の面積が試料で充填される可能性が高まるようにある距離だけ離間してチャンバ内に位置決めされる。
【００３５】
本発明は、その詳細な実施形態に関して図示及び説明されているが、当業者は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な形態及び詳細の変更が行われ得ることを理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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