(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
i) 細胞毒性保護薬を投与する前の対象から抽出された標的細胞を細胞毒性物質に曝露するステップと、
ii) 前記細胞毒性保護薬を投与した後の前記対象から抽出された標的細胞を前記細胞毒性物質に曝露するステップと、
iii) ステップi)およびステップii)の標的細胞において生存能力および増殖条件を示す1つまたは複数のパラメーターを分析および比較するステップと
を含む、細胞毒性物質に曝露した後の細胞の生存能力および増殖条件を調べる方法。
【請求項２】
細胞毒性物質への曝露の前、間、または後の細胞毒性保護薬のin vitro添加をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
標的細胞が、曝露時に細胞毒性物質により特異的に影響を受ける細胞を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
標的細胞が、上皮組織、結合組織(血液、骨、軟骨)、筋組織、神経組織、幹組織および幹細胞、始原細胞、ならびにこれらの組織および細胞のサブクラスおよびカテゴリーを含む、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
標的細胞が、造血系の幹細胞、胃腸管の上皮粘膜、皮膚の真皮、生殖器官の生殖細胞、角膜の上皮、またはそれらの組合せを含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
造血系の幹細胞が、骨髄の幹細胞および始原細胞を含む、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
細胞毒性物質が、化学細胞毒性物質、放射線細胞毒性物質、電離放射線、生物細胞毒性物質、生物兵器剤、化学兵器剤、ヒトにおいて有害な副作用を有する薬剤、またはそれらの組合せを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
細胞毒性保護薬が、小分子化合物、ペプチド、遺伝子発現産物、化学保護薬、放射線防護薬、抗ウイルスまたは抗菌薬、血管新生または抗血管新生薬、抗炎症薬を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
放射線防護薬が、化学療法薬または放射線と共に投与すると癌患者の腫瘍細胞において相乗的な抗細胞増殖活性を示す、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
放射線防護薬が、α、β不飽和アリールスルホンの化合物を含む非毒性放射線防護薬である、請求項8に記載の方法。
【請求項１１】
α、β不飽和アリールスルホンの化合物が、E-4-カルボキシスチリル-4-クロロベンジルスルホンナトリウム塩を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
細胞毒性保護薬が、放射線感受性遺伝子の活性を抑制すること、アポトーシスの抑制、およびDNAを放射線誘発損傷から保護すること、またはそれらの組合せにより放射線防護を発揮する、請求項8に記載の方法。
【請求項１３】
標的細胞の生存能力および増殖条件が、細胞毒性物質への曝露時に標的細胞においてアップレギュレートした、ダウンレギュレートした、または異常に発現した1つまたは複数のパラメーターまたはバイオマーカーを分析することにより決定される、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
1つまたは複数のパラメーターまたはバイオマーカーが、1つもしくは複数の細胞応答を制御する遺伝子の活性を調節する細胞内経路と関係している核酸またはペプチド分子、遺伝子発現産物、生化学経路、タンパク質カスケード、細胞受容体、プレアポトーシスシグナル伝達経路および分子、抗原もしくは抗体断片、ペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニスト、細胞遺伝学的マーカー、またはそれらの組合せである、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
1つまたは複数のパラメーターが、造血調節メッセンジャーバイオマーカーを含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
細胞内経路が、アポトーシス、細胞周期停止もしくは修復、増殖、老化、または標的細胞の分化に関与している、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
細胞内経路が、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼスーパーファミリーに属する、請求項14に記載の方法。
【請求項１８】
i) 細胞毒性保護試験化合物を投与する前の対象から抽出された標的細胞を細胞毒性物質に曝露するステップと、
ii) 前記細胞毒性保護試験化合物を投与した後の前記対象から抽出された標的細胞を前記細胞毒性物質に曝露するステップと、
iii) ステップi)およびステップii)の標的細胞において生存能力および増殖条件を示す1つまたは複数のパラメーターを分析および比較するステップと
を含む細胞毒性保護薬のスクリーニング方法であって、ステップi)の標的細胞と比較してステップii)の標的細胞の好適な生存能力および増殖条件が細胞毒性保護薬として開発するための細胞毒性保護試験化合物の可能性を示す、細胞毒性保護薬のスクリーニング方法。
【請求項１９】
対象からの標的細胞の抽出のための溶液および装置、潜在的な細胞毒性保護薬としての1つまたは複数の試験化合物、細胞および組織の培地およびプレート、1つまたは複数の細胞毒性物質、標的細胞において生存能力および増殖条件を示すパラメーターを分析するためのバイオマーカー、前記パラメーターを分析するためのアッセイを実施するために必要な試薬ミックスを含有する1つまたは複数の容器、およびその使用説明書を含む、請求項１に記載の方法を実施して候補細胞毒性保護薬をスクリーニングするためまたは細胞毒性保護薬の有効性を決定するための試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、2008年12月16日に出願した仮特許出願第61/122,970号、および2009年1月22日に出願した仮特許出願第61/146,391号の優先権を主張し、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、細胞毒性物質に曝露されたまたは曝露される危険性のあるヒト対象における治療レジメンの有効性を決定する方法に関する。本発明は、さらに、ヒトにおける細胞保護薬の有効性を識別および評価するための薬剤スクリーニング方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
治療レジメンの有効性についてFDAの承認を得るためには、その治療法は、臨床試験においてヒト対象に適用しなければならない。臨床的失敗を回避するために、薬品産業全般にわたって、創薬プロセスの早期に薬剤の薬物動態および安全性プロフィールをヒト対象において検査することが重要視されている。特に試験の一部として細胞毒性薬を使用する場合、自発的に臨床試験に参加するヒト対象を見つけることは困難な場合が多い。腫瘍学は大部分の治療領域より送達および副作用の複雑事象がもたらされることを許容するが、癌発見プログラムはこの傾向と無縁ではない。正常なヒト対象に電離放射線などの細胞毒性物質の使用を必要とする臨床試験を受けさせることも非倫理的である。
【０００４】
薬剤開発における2つの主要な関心事は、臨床試験の開始前に潜在的な薬剤候補の有効性および安全性を予測する必要性ならびにいずれのケースが特定の処置に応答することになるかを予測する方法である。したがって、開発プロセスの間、薬剤候補は、一般に、様々な細胞株についてバッチ試験される。次いで、細胞株に対して所望の効果を有すると考えられるものは、前臨床段階の間に動物において試験する。しかし、いずれのプロセスも本当の臨床的状況を再現していない。
【０００５】
具体的には、電離放射線に対処することができ、特に都市の核テロ行為の影響に対処することができる放射線防護剤および治療法を開発する必要性がある。近年、米国政府は、電離放射線に対処し、都市の核テロ行為の影響に対処するプロジェクトに何億ドルも投資してきた。最も放射線の影響を受けやすい身体の主要組織は、骨髄、特に新しい血液細胞を生み出す造血幹細胞である。幹細胞は、0.5グレイという低い放射線量で障害され、通常5グレイ超で完全および永久に破壊される。幹細胞が死亡すると、血球数、最も重大なことには好中球および血小板の数が減少し始め、最終的には数日または数週間後に0まで落ち込む。免疫系の第1の応答者である好中球が存在しないと、被曝者(radiation victim)は日和見感染の危険性が高く、血小板が存在しないと血液は凝固することができず、非常に小さい創傷からでも潜在的に致命的な出血につながる。5グレイを上回ると、胃腸管も影響を受ける。放射線は、腸管の内側を覆っているものなどのあらゆる急速に分裂する細胞を死滅させる。結果として生じる損傷は、腸由来の細菌を血流に漏出させ、そこで細菌が既に損なわれた免疫系を圧倒し、敗血症性ショックを引き起こす恐れがある。10グレイ超の曝露時には中枢神経系も損傷し、処置しようがしまいが確実に死亡する。
【０００６】
2007年に、米国政府は、血小板の重要性も二次的に強調しながら、放射線症候群において好中球数を維持および回復する薬剤を開発するインセンティブを企業に与えた。政府の使命は、放射線損傷の生態のより良好な知識を獲得すること、放射線曝露レベルをより早く診断する方法を見つけること、およびより良好な薬剤を発見することである。今までのところ、そのような薬剤は米国において承認されていないが、いくつかの候補が開発中である。
【０００７】
これらの欠点を克服するために、薬剤開発の発見段階の間に製造した多数の潜在的な薬剤候補をスクリーニングし、細胞毒性から保護する見込みを示しているものをさらに研究および開発するためのハイスループットアッセイが必要である。この必要性に対処するために、薬剤開発の様々な段階の間に高度の予測性を示すin vitroの細胞ベースのアッセイが開発されてきた。細胞ベースのアッセイが臨床設定をより予測できるようにするために、研究者らは、ハイスループットコンポーネントと合わせると薬剤開発プロセスに対して顕著な影響および価値を有することができる、高度の予測性を示す初代細胞(primary cell)を使用してきた。
【０００８】
したがって、細胞毒性に曝露された対象による忍容性が良好であり、幹細胞および/または始原細胞補充の刺激をもたらす潜在力が高い物質に強い関心が寄せられている。幹細胞は、培養液中で不確定の期間分裂する能力および特殊化した細胞を生み出す能力を有する。一般に、幹細胞は、2種の主要な群:成体幹細胞および胚性幹細胞に分類される。幹細胞は、人工的な手段、例えば、核移植、細胞質移植、細胞融合、単為生殖および再プログラミングなどを通して産生することもできる。単離した幹細胞は、多くのタイプの分化細胞を生み出すことができ、多くのタイプの疾患を治療するために使用することができる。
【０００９】
成体幹細胞は未分化であるが分化組織中に存在し、成体幹細胞の起源となる組織に由来する細胞型に分化することができる。成体幹細胞は様々な源、例えば、神経系(McKay、1997、Science 276:66〜71、Shihabuddinら、1999、Mol. Med Today 5:474〜480)、骨髄(Pittengerら、1999、Science 284:143〜147、Pittenger, M. F.およびMarshak, D. R.(2001)In:Mesenchymal stem cells of human adult bone marrow. Marshak, D. R.、Gardner, D. K.、およびGottlieb, D.編(Cold Spring Harbor、N.Y.:Cold Spring Harbor Laboratory Press)349〜374)、脂肪組織(Gronthosら、2001、J. Cell. Physiol. 189:54〜63)、真皮(Tomaら、2001、Nature Cell Biol. 3:778〜784)、膵臓および肝臓(Deutschら、2001、Development 128:871〜881)などに由来している。幹細胞は、臍帯(Rogersら、2004、Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 18(6):893〜908、Wangら、2004、Stem Cells 22(7):1330〜1337、Surbekら、2002、Ther Umsch. 59(11):577〜582、および胎盤(Yenら、2005、Stem Cells 23(1):3〜9)からも単離されてきており、各文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。成体型の幹細胞は、平滑筋組織、横紋筋組織、心筋組織、骨組織、骨海綿状組織、軟骨組織、膵管組織、脾臓組織、胸腺組織、扁桃腺組織、パイエル板組織、リンパ節組織、甲状腺組織、表皮組織、真皮組織、皮下組織、心臓組織、肺組織、血管組織、内皮組織、血液細胞、膀胱組織、腎臓組織、消化管組織、食道組織、胃組織、小腸組織、大腸組織、脂肪組織、子宮組織、眼組織、肺組織、精巣組織、卵巣組織、前立腺組織、結合組織、内分泌組織、および腸間膜組織中にも存在する。
【００１０】
複数の特許が成体幹細胞の様々な態様を開示している。例えば、米国特許第5,556,783号は、毛包幹細胞を培養する方法を開示しており、一方、米国特許第5,486,359号は、ヒト間葉幹細胞を単離する方法を開示している。米国特許第4,714,680号、同第5,061,620号、および同第5,087,570号は、造血幹細胞の例を示している。米国特許第6,242,252号は、肝臓幹細胞の例を示している。これらの特許は、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。造血細胞は、身体における多数の異なるプロセスで非常に重要な役割を有している。例えば、白血球造血細胞は、疾患に対する身体の防御機能を維持するために重要であり、単球、マクロファージおよびリンパ球は感染および腫瘍に対する身体の応答を強化することに関与しており、一方、顆粒球は感染、寄生生物および腫瘍を克服することに関与している。別の造血細胞である血小板は、互いにおよび損傷表面に付着すること、ならびにフィブリン凝塊の形成を促進する因子の放出により血栓形成を開始することを通して止血機構における重要な要素を形成する。赤血球は、主に酸素の運搬に関与している。これらの血液細胞の全ては、造血幹細胞と呼ばれている単一の始原細胞に由来する。
【００１１】
造血幹細胞は、骨髄細胞のわずかな割合しか占めず、通常は休止している。しかし、分裂するように刺激されると、これらの幹細胞は、強力な増殖能を有する分化した娘細胞を産生する。連続的な一連の分裂および分化により、成熟血液細胞の産生に必要な細胞数の莫大な増幅が生じる。分裂および分化のこのプロセスは、細胞産生を制御するために様々なレベルで調節される。
【００１２】
細胞毒性および/または細胞保護薬の試験は、そのような試験の結果生じる潜在的な有害作用が原因で、ヒト対象において試験することが困難である。毒物への曝露の結果生じる細胞毒性、所与の臨床設定および特定の投与量での薬剤、放射線、生物、もしくは化学兵器剤、および他の有害物質の有害な副作用を検出するための特定のバイオマーカーを使用して細胞保護薬の有効性をin vitroで決定するためにバイオアッセイが開発されてきた。多数の研究が、異常に発現した(例えば、ダウンレギュレートした、アップレギュレートした、突然変異した等)複数の造血調節メッセンジャーバイオマーカー(hematopoietic regulatory messengers biomarker)の機能の定義ならびに細胞毒性試験のためのそれらの同定および単離に至った。これらの生体分子は、刺激因子、例えば、コロニー刺激因子(CSF)およびインターロイキン(IL-1、IL-3、IL-5、IL-8およびIL-9)、抑制因子、例えば、トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)、インターフェロン、プロスタグランジンE、腫瘍壊死因子、マクロファージ炎症性タンパク質-1(MIP-1)、ラクトフェリン、酸性イソフェリチン、AcSKDP、およびpEEDCK(合成HP5Bモノマー)、または増強因子、例えば、TGF  β、IL-6、IL-4、IL-9、IL-11、MIP-1、MIP-2、白血病抑制因子およびスチール因子(steel factor)として特徴付けされている。Pelusら、Experimental Hematology 1994、22:239〜247。刺激生体分子は、特定の細胞系統の分裂を促進することが分かった。例えば、G-CSFは好中球産生を誘導し、一方、エリスロポエチンは赤血球の形成を促進する。
【００１３】
幹細胞および/または始原細胞の補充は、様々なアッセイの適用において重要である。内皮始原細胞に由来する血管の増殖を伴う血管発生(vasculogenesis)は、そのようなプロセスの例である。それにより現存の毛細管から新しい血管が形成するプロセスである血管発生ならびに血管新生(angiogenesis)、ならびにこれらのプロセスを制御する因子は、胚発生、炎症、および創傷治癒において重要であり、病態、例えば、腫瘍増殖、糖尿病網膜症、関節リウマチ、および慢性炎症性疾患などの一因となる(例えば、米国特許第5,318,957号、Yancopoulosら(1998) Cell 93:661〜4、Folkmanら(1996) Cell 87、1153〜5、およびHanahanら(1996) Cell 86:353〜64を参照のこと)。
【００１４】
異なる特性および作用機構を有する複数の血管新生および/または血管発生剤が当技術分野においてよく知られている。例えば、酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF)、トランスフォーミング増殖因子アルファ(TGF-α)およびベータ(TGFβ)、腫瘍壊死因子(TNF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、およびアンジオゲニンは、強力でよく特徴付けされた血管新生促進剤である。さらに、一酸化窒素およびプロスタグランジン(プロスタサイクリンアゴニスト)はいずれも、VEGFおよびbFGFなどの様々な血管新生増殖因子のメディエーターであることが示されてきた。しかし、特に全身性薬剤(systemic agent)としてのこれらの化合物の一部の治療適応性は、in vitroでの様々な細胞型に対するその強力な多面発現効果により制限される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第5,556,783号
【特許文献２】米国特許第5,486,359号
【特許文献３】米国特許第4,714,680号
【特許文献４】米国特許第5,061,620号
【特許文献５】米国特許第5,087,570号
【特許文献６】米国特許第6,242,252号
【特許文献７】米国特許第5,318,957号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】McKay、1997、Science 276:66〜71
【非特許文献２】Shihabuddinら、1999、Mol. Med Today 5:474〜480
【非特許文献３】Pittengerら、1999、Science 284:143〜147
【非特許文献４】Pittenger, M. F.およびMarshak, D. R.(2001)In:Mesenchymal stem cells of human adult bone marrow. Marshak, D. R.、Gardner, D. K.、およびGottlieb, D.編(Cold Spring Harbor、N.Y.:Cold Spring Harbor Laboratory Press)349〜374
【非特許文献５】Gronthosら、2001、J. Cell. Physiol. 189:54〜63
【非特許文献６】Tomaら、2001、Nature Cell Biol. 3:778〜784
【非特許文献７】Deutschら、2001、Development 128:871〜881
【非特許文献８】Rogersら、2004、Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 18(6):893〜908
【非特許文献９】Wangら、2004、Stem Cells 22(7):1330〜1337
【非特許文献１０】Surbekら、2002、Ther Umsch. 59(11):577〜582
【非特許文献１１】Yenら、2005、Stem Cells 23(1):3〜9
【非特許文献１２】PelusらExperimental Hematology 1994、22:239〜247
【非特許文献１３】Yancopoulosら(1998) Cell 93:661〜4
【非特許文献１４】Folkmanら(1996) Cell 87、1153〜5
【非特許文献１５】Hanahanら(1996) Cell 86:353〜64
【非特許文献１６】Mosmann、J. Immunol. Meth. 65、666(1983)
【非特許文献１７】HorowitzおよびKing、J. Immunol. Meth. 244、49〜58(2000)
【非特許文献１８】Bradley & Metcalf、Aust. J. Exp. Biol. Med 44、287〜287(1987)
【非特許文献１９】Pluznik & Sachs、Exp. Cell Res. 43、553〜553(1966)
【非特許文献２０】McLeodら、Blood 44、617〜534(1974)
【非特許文献２１】Iscoveら、J. CELL Phyisol. 2〜23(1974)
【非特許文献２２】Axelradら、Haemopiesis in Culture 226〜223(1974)
【非特許文献２３】Hodgsonら、Exp. Hemat. 10、26〜36(1982)
【非特許文献２４】Rosendaalら、Nature 264、68〜69(1976)
【非特許文献２５】Fodorら、Science 251:767〜773(1991)
【非特許文献２６】Houghtenら、Nature 354:84〜86(1991)
【非特許文献２７】BrennerおよびLemer、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381〜5383(1992)
【非特許文献２８】Buninら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708〜4712(1994)
【非特許文献２９】Simonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367〜9371(1992)
【非特許文献３０】Ostreshら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138〜11142(1994)
【非特許文献３１】EckerおよびCrooke、Bio/Technology 13:351〜360(1995)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
今日、細胞毒性保護治療法および細胞毒性保護薬が欠如しているか、または不十分であり、非毒性で有効な放射線防護薬および細胞毒性保護治療法を同定および開発する必要性が依然としてある。欠如している1つの理由は、上で説明したように、これらの化合物をヒト対象において試験する難しさである。FDA規制は、現在、動物モデルにおける有効性および生物薬物動態(biopharmacokinetic)決定からヒトの場合を推定することを許可している。しかし、そのような動物モデルのデータからヒトのデータを推定すると、薬物動態パラメーターを正確に同定し、ヒトにおけるその治療法の有効性を検討することができない可能性がある。本発明による治療法の薬剤スクリーニングおよび有効性決定は、細胞毒性に曝露されたまたは曝露される危険性のあるヒトに対する細胞毒性を防止するために使用する治療法の効果を分析および決定するためのプラットフォームを提供することにより、これらのおよび他の長年にわたる切実な必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、薬剤スクリーニング方法および治療方法ならびに細胞毒性物質の有害作用から対象を保護するための治療レジメンの有効性をスクリーニングおよび決定するためのキットを提供する。
【００１９】
一態様において、本発明は、i)対象から標的細胞を抽出するステップと、ii)対象に細胞毒性保護薬を投与するステップと、iii)ステップii)の細胞毒性保護薬による処置後に対象から標的細胞を抽出するステップと、iv)ステップi)およびiii)の標的細胞を細胞毒性物質に曝露するステップと、v)ステップi)およびステップiii)の標的細胞において生存能力および増殖条件を示す1つまたは複数のパラメーターを分析および比較するステップとを含む、細胞毒性物質の有害作用からヒト対象を保護するための治療レジメンの有効性を決定する方法であって、ステップi)の標的細胞と比較してステップiii)の標的細胞の好適な生存能力および増殖条件が対象における治療レジメンの有効性を示す方法を提供する。
【００２０】
一実施形態において、細胞毒性保護薬の対象への投与はin vivo投与である。in vivo投与は、細胞毒性物質の投与と同時、またはその前もしくは後の、細胞毒性保護化合物の対象への直接投与を含む。別の実施形態において、in vivo投与には細胞毒性保護薬のex-vivo投与が伴い、ex vivo投与は、有効濃度の細胞毒性保護薬を先に投与していたex-vivo細胞の移植を含む。
【００２１】
細胞毒性保護薬の直接in vivo投与は、(頬側および舌下を含めた)局所投与は除くが経皮、腹腔内、頭蓋内、脳室内、脳内、膣内、子宮内、経口、直腸、(硝子体内または前房内を含めた)眼、経鼻、(皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮内、頭蓋内、気管内、および硬膜外を含めた)非経口を含めた様々な種類の経路を介したものであるが、ただし、直接局所投与は実施すべきではない。(頬側および舌下を含めた)局所経路を介した細胞毒性保護薬の直接in vivo投与は、本明細書において明白に否定している。
【００２２】
別の実施形態において、細胞毒性保護薬は、また、細胞毒性物質への曝露の前、間、または後に、in vivo、in vitro、またはその両方で対象に投与する。哺乳動物またはヒト対象に対する細胞毒性物質への直接曝露またはその投与は、本明細書において明白に否定している。
【００２３】
本発明の範囲内の標的細胞は、曝露時に細胞毒性物質により直接的、間接的、または特異的に影響を受ける細胞を含む。これらの細胞としては、上皮組織、結合組織(血液、骨、軟骨)、筋組織、神経組織、幹組織および細胞、始原細胞、ならびにこれらの組織および細胞のサブクラスおよびカテゴリーが挙げられる。
【００２４】
一実施形態において、標的細胞は、造血系由来の幹細胞、胃腸管の上皮粘膜、皮膚の真皮、生殖器官の生殖細胞、角膜の上皮、またはそれらの組合せを含む。造血系由来の幹細胞は、骨髄由来の幹細胞および始原細胞を含む。
【００２５】
細胞毒性物質は、化学細胞毒性物質、放射線細胞毒性物質、電離放射線、生物細胞毒性物質、生物兵器剤、化学兵器剤、ヒトにおいて有害な副作用を有する薬剤、またはそれらの組合せを含む。
【００２６】
一実施形態において、細胞毒性保護薬は、とりわけ、小分子化合物、ペプチド、遺伝子発現産物、化学保護薬(chemoprotective drug)、放射線防護薬、抗ウイルスもしくは抗菌薬、血管新生もしくは抗血管新生薬、または抗炎症薬を含む。
【００２７】
別の実施形態において、放射線防護薬は、化学療法剤または放射線と共に投与すると癌患者の腫瘍細胞において相乗的な抗細胞増殖活性を示す。
【００２８】
さらに別の実施形態において、放射線防護薬は、E-4-カルボキシスチリル-4-クロロベンジルスルホンナトリウム塩を含めたα、β不飽和アリールスルホンの化合物を含む非毒性放射線防護薬である。
【００２９】
放射線防護薬は、限定ではなく一例として、放射線感受性遺伝子の活性の抑制、アポトーシスの抑制、および放射線誘発損傷からのDNAの保護、またはそれらの組合せを含めた様々な種類の細胞および生化学機構および経路を通してその活性を発揮する。
【００３０】
標的細胞の生存能力および増殖条件は、細胞毒性物質への曝露時に標的細胞においてアップレギュレートした、ダウンレギュレートした、または異常に発現した1つまたは複数のパラメーターまたはバイオマーカーを分析することにより決定する。バイオマーカーとしては、アポトーシス、細胞周期停止もしくは修復、増殖、老化、または標的細胞の分化、1つもしくは複数の細胞応答を制御する遺伝子の活性の調節に関与する細胞内経路と関係している核酸もしくはペプチドもしくはタンパク質分子、遺伝子発現産物、特定の生化学経路およびタンパク質カスケードの酵素および産物、細胞受容体、プレアポトーシスシグナル伝達経路(pre-apoptosis signaling pathway)および分子、抗原もしくは抗体断片、ペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニスト、細胞遺伝学的マーカー、またはそれらの組合せが挙げられる。
【００３１】
一実施形態において、細胞内経路は造血調節経路を含み、1つまたは複数のパラメーターは造血調節メッセンジャーバイオマーカーを含む。
【００３２】
別の実施形態において、細胞内経路はマイトジェン活性化タンパク質キナーゼスーパーファミリーの1つまたは複数の経路を含む。
【００３３】
別の態様において、本発明は、i)対象から標的細胞を抽出するステップと、ii)対象に細胞毒性保護試験化合物を投与するステップと、iii)ステップii)の細胞毒性保護試験化合物による処置後に対象から標的細胞を抽出するステップと、iv)ステップi)およびiii)の標的細胞を細胞毒性物質に曝露するステップと、v)ステップi)およびステップiii)の標的細胞において生存能力および増殖条件を示す1つまたは複数のパラメーターを分析および比較するステップとを含む細胞毒性保護薬のスクリーニング方法であって、ステップi)の標的細胞と比較してステップiii)の標的細胞の好適な生存能力および増殖条件が細胞毒性保護薬として開発するための細胞毒性保護試験化合物の可能性を示す方法を提供する。
【００３４】
一実施形態において、該薬剤スクリーニング方法は、細胞毒性保護薬の薬効をさらに決定し、投与量、投与時間、細胞毒性の投与と細胞毒性予防薬の投与の間の時間間隔、投与頻度、ならびに細胞毒性保護薬および細胞毒性物質の投与順序、細胞毒性保護薬のバイオアベイラビリティー、またはそれらの組合せの決定を含む。
【００３５】
さらに別の実施形態において、細胞毒性保護化合物は、とりわけ、小分子化合物、ペプチド、遺伝子発現産物、化学保護薬、放射線防護薬、抗ウイルスまたは抗菌薬、血管新生または抗血管新生薬、または抗炎症薬を含む。
【００３６】
さらに別の態様において、本発明は、(i)対象の骨髄細胞の一部を取り出すステップと、(ii)E-4-カルボキシスチリル-4-クロロベンジルスルホンナトリウムを含む少なくとも1種の放射線防護α、β不飽和アリールスルホンの有効量を対象に投与するステップと、(iii)骨髄細胞に有効量の電離放射線を照射するステップと、iv)放射線を受けた骨髄細胞を対象に移植するステップとを含む、放射線療法の細胞毒性から対象を保護するためのex-vivo治療レジメンを提供する。骨髄細胞は幹細胞および/または始原細胞を含む。
【００３７】
一実施形態において、細胞毒性保護薬はE-4-カルボキシスチリル-4-クロロベンジルスルホンナトリウムであり、骨髄細胞の再移植の前、間および/または後に投与する。
【００３８】
別の実施形態において、細胞毒性保護薬は、細胞毒性への曝露の前、間、および/または後に治療有効量で対象に投与する。一実施形態において、細胞毒性保護薬は、細胞毒性物質への曝露の前または後に少なくとも数時間または最長で1週間投与する。例えば、細胞毒性保護薬は、細胞毒性への曝露の前もしくは後、またはその両方に約1週間、72〜48時間、24〜18時間、12〜6時間以下投与する。
【００３９】
本明細書において、そのような特定の範囲を詳述することにより、列挙する範囲が、列挙する範囲の間の全ての特定の整数量も含むことを意図している。例えば、約72〜48時間の範囲では、その間の各特定の範囲を実際に列挙しなくても、71〜65、64〜55、54〜49等も含むことを意図している。
【００４０】
別の実施形態において、細胞毒性保護薬(例えば放射線防護または化学保護薬)は、正常細胞に対する細胞毒性保護効果を発揮するために、化学療法または放射線療法への曝露の前に治療有効濃度で癌患者に投与する。細胞毒性保護薬は、例えば、化学療法または放射線の投与の前に約24時間、18時間、12時間、または6時間投与する。
【００４１】
別の実施形態において、ex vivo治療レジメンは、対象の骨髄における悪性細胞の破壊または悪性細胞の数の低減をもたらす。
【００４２】
さらに別の態様において、本発明は、対象からの標的細胞の抽出のための溶液および装置、潜在的な細胞毒性保護薬としての1つまたは複数の試験化合物、細胞および組織の培地およびプレート、1つまたは複数の細胞毒性物質、標的細胞において生存能力および増殖条件を示すパラメーターを分析するためのバイオマーカーおよびアッセイ、アッセイを実施するために必要な試薬ミックスならびにその使用説明書を含有する1つまたは複数の容器を含む、候補細胞毒性保護薬をスクリーニングするためまたは細胞毒性保護薬の有効性を決定するための試験キットを提供する。
【００４３】
本発明のこれらのおよび他の態様、特徴および利点は、以下に開示している実施形態の詳細な説明および添付の特許請求の範囲を読むことにより明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ON 01210.Naによる電離放射線(IR)からのHFL-1細胞の保護を示す図である。薬剤処理および放射線曝露の後、該細胞を再び平板培養し、各プレートのコロニーの数を3週間後に数えた。A.ON 01210.Naの濃度と生存するコロニーの数の関係。B.染色したクローン原性アッセイプレート。
【図２】ON 01210.Naがin vitroでヒト骨髄細胞に対して細胞毒性ではないことを示す図である。ヒト骨髄細胞を様々な濃度のON 01210.Naで(A)2時間または(B)24時間処理した。次いで、該細胞をmethocult培地に平板培養した。総コロニー形成単位数を14日後に決定した。ON 01210.Naは、高濃度での長期間の曝露後でさえヒト骨髄細胞の増殖または分化を妨げなかった。
【図３】ヒト骨髄細胞のin vitro放射線防護を示す図である。ヒト骨髄細胞を、ON 01210.Naの濃度を増加させながら3時間処理し、次いで、線量を増加させながら電離放射線を照射した。該細胞をmethocultに平板培養し、CFUの総数を14日後に決定した。放射線なしのON 01210.Na処理は試験した全ての濃度で非毒性であった(A)。ON 01210.Naは用量応答的にヒト骨髄細胞を保護した(B)。生存曲線を最適なON 01210.Na濃度(10μM)でプロットすると、ON 01210.Na(C)は1.6というDRF値を有していたが、アミホスチンの最適な用量(0.25mM)(D)は1.5というDRF値を有していた。
【図４】ON 01210.Naが照射マウスの骨髄を保護することを示す図である。A.1%ポリソルベート80/K-ホスフェート緩衝液中で製剤化した500mg/kgのON 01210.Naまたはビヒクル単独を、マウスに皮下注射により5.5Gyの全身電離放射線処理の24時間前および15分前に注射した。指示した日に全血を採取し、RBC溶解の後にWBCの計測を実施した。そのデータは、1群当たり3匹のマウスの平均+/-SEM(N:3×3=9プレート)としてプロットする。B.代表プレートの写真。ON 01210.Naは、骨髄を幹細胞の完全な剥離から保護し、骨髄の回復を有意に促進した。C.白血球数。指示した日に全血を採取し、RBC溶解の後にWBCの計測を実施した。そのデータは、1群当たり3匹のマウスの平均±SEM(N=3)としてプロットする。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
定義
本明細書で使用する場合、「細胞毒性物質」は広く定義され、一部または全ての細胞または組織に対して毒性を示す物質および元素を含む。本発明の範囲内の細胞毒性物質は、特定の濃度、投与量、程度または規模でヒトに害を及ぼす様々な種類の化学、物理および生物学的物質を含む。細胞毒性物質としては、限定ではなく一例として、正常な組織に対して有害な副作用および毒性を有する、疾患または障害を治療するために使用される一般的種類の医薬品が挙げられる。一実施形態において、細胞毒性薬としては、化学療法剤、放射線療法剤、抗増殖剤、抗血管新生剤を含めた癌関連治療薬、または非癌治療薬(non-cancer drug)が挙げられる。本発明の範囲内の細胞毒性物質としては、電離放射線、生物または化学兵器剤の物質、軍人または宇宙飛行士を訓練するために使用し得る極端な物理および/または環境条件、例えば、高強度光、放射線、オゾン、超音波、乱流、極端な高温または低温などへの曝露により生じる物質または元素も挙げられる
【００４６】
本明細書で使用する場合、「対象」は、広く動物およびヒトと定義する。「動物」という用語は、本明細書で使用する場合、任意の脊椎動物、具体的には、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ種、類人猿およびサルを含めた非ヒト霊長類、ラットおよびマウスなどの齧歯類、ならびに家ウサギおよび野ウサギなどのウサギ類が挙げられるがこれらに限定されない哺乳動物を指す。一実施形態において、対象は、細胞毒性を受けたまたは細胞毒性を被るもしくは細胞毒性への曝露の危険性がある健康な個体である。別の実施形態において、対象は、細胞毒性を有する薬剤または放射線に曝露されたまたは曝露される危険性のある無症状または症状のある患者である。さらに別の実施形態において、対象は、電離放射線、生物兵器剤、化学兵器剤または有害な環境条件、例えば、極端な温度、冷気、撹拌、乱流などにより生じる細胞毒性を含めた細胞毒性物質および元素に曝露されたまたは曝露される危険性のある軍人または民間人である。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「細胞毒性保護薬」としては、小分子化合物、生物学的分子ならびに多様な構造および機能の物質が挙げられる。細胞毒性保護薬は、小分子、炭水化物、脂質、またはそれらの組合せを含めたポリペプチドもしくはヌクレオチドベースの分子または非ポリペプチドもしくはヌクレオチドベースの分子でもよい。ポリペプチドおよびヌクレオチドベースの分子としては、転写、逆転写、重合、翻訳、翻訳後および/または核酸分子の発現の過程で産生した任意のタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチド断片、またはそれらの生物活性断片が挙げられる。細胞毒性保護薬の範囲内にやはり含まれるのは、とりわけ、天然、組換え、および/または合成源に由来する、実質的に相同性のポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、またはポリペプチドの抗体である。核酸分子としては、とりわけ、cDNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、アンチセンスRNA、mRNA、iRNA、Si RNA、リボザイム、およびゲノムDNAが挙げられる。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「小分子化合物」としては、これらに限定されないが、炭水化物、炭水化物模倣体(carbohydratemimetic)、ペプチド模倣体、(例えばヘテロ有機および有機金属化合物を含めた)有機または無機化合物ならびにそのような化合物の塩、エステル、および薬剤として許容される他の形態が挙げられる。好ましい実施形態において、本発明の小分子化合物は、(E)-スチリルベンジルスルホンを含めたα、β不飽和アリールスルホンのファミリーの化合物(例えば、E-4-カルボキシスチリル-4-クロロベンジルスルホンナトリウム塩(ON 01210.Na))を含む。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「生物活性断片」とは、本発明の細胞毒性保護薬の活性と同様であるが必ずしも同じではない活性を示す断片を指す。生物活性断片は、所望の活性が改善しているか、または望ましくない活性が低下している可能性がある。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」としては、ペプチド結合により互いに結合した2つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が挙げられる。本明細書で使用する場合、該用語は、当技術分野において一般に、例えば、ペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも呼ばれる短鎖、ならびに当技術分野において一般にタンパク質と呼ばれる、多くのタイプが存在する長鎖の両方を指す。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「副作用」とは、有害であろうと有益であろうと、細胞毒性物質または薬剤を摂取した結果生じる、意図したものではない事象を指す。副作用は、処置が所望の効果を超えると発生する問題、または所望の治療効果に加えて発生し、有益な場合もあるが通常は不必要で有害な問題を指す。癌治療の一般的副作用は、深刻な疲労、吐き気、嘔吐、血液細胞数の低下、脱毛、および口腔内痛(mouth sore)等を引き起こす正常細胞のアポトーシスである。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「組織」とは、類似した細胞の群または集団および特定の機能の実施において共に作用するそれらの細胞間基質を指す。主要な組織は、上皮、(血液を含めた)結合、骨格、筋、腺および神経組織である。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「標的細胞」とは、正常もしくは悪性の上皮、結合、骨格、筋、腺および神経組織またはそれらの組合せに由来し得る任意の細胞集団を指す。特に、標的細胞は、造血幹細胞および始原細胞、またはそれらの亜集団に由来する。標的細胞は、末梢血細胞集団、骨髄、臍帯血、胎児肝臓細胞、卵黄嚢を含めた造血細胞および分化胚性幹細胞または分化始原生殖細胞または胚性生殖細胞が挙げられるがこれらに限定されない固形または非固形組織の任意の細胞集団も指す。該細胞は、また、白血病細胞株が挙げられるがこれに限定されない初代細胞株集団でもよい。白血病細胞株の例としては、これらに限定されないが、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病およびプレB急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性T細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、急性単球性白血病およびB細胞白血病が挙げられる。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「細胞株」とは、血液を含めたヒトまたは動物の成体または胎児の組織から採取し、in vitroで平板培養した、初代細胞株、有限細胞株(finite cell line)、連続細胞株、および形質転換細胞株を含めた細胞を指す。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「細胞系統」とは、造血系の成熟細胞が挙げられるがこれらに限定されない特定の機能細胞の産生に関係する幹細胞または始原細胞に由来する細胞株を指す。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「初代細胞」とは、血液を含めたヒトまたは動物の成体または胎児の組織から直接得られる細胞を指す。「初代細胞」または「細胞株」は、造血細胞集団を含んでも含まなくてもよい固形の腫瘍または組織にも由来することができ、支持培地中に懸濁することができる。初代細胞は初代細胞株を含み得る。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「造血幹細胞」とは、適切なサイトカインまたは複数のサイトカインへの曝露時に、リンパ性または骨髄性細胞系統の始原細胞に分化し得るか、またはさらなる分化を開始することなく幹細胞集団として増殖し得る、多能性幹細胞またはリンパ性もしくは骨髄性(骨髄に由来する)幹細胞を指す。「造血幹細胞」としては、これらに限定されないが、とりわけ、芽球コロニー形成細胞(colony-forming cell-blast)(芽球CFC)、高増殖能コロニー形成細胞(high proliferative potential colony forming cell)(MT-CPC)、顆粒球・赤芽球・マクロファージ・巨核球コロニー形成単位(colony-forming unit-granulocyte, erythroid, macrophage, and megakaryocyte)(CFU-GEMM)細胞が挙げられる。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「前駆体」および「始原細胞」とは、細胞がサイトカインまたはサイトカインの群にさらに曝露されるとさらに分化して造血細胞系統となる発達段階まで分化した未分化造血細胞(primitive hematopoietic cell)を指す。本明細書で使用する場合、「前駆体」および「始原細胞」は、いくつかのタイプの始原細胞に由来し、いくつかの成熟分化造血細胞(mature differentiated hematopoietic cell)の直接の前駆細胞である「前駆」細胞も含む。本明細書で使用する場合、「前駆体」、および「始原細胞」という用語は、これらに限定されないが、顆粒球マクロファージコロニー形成細胞(GM-CFC)、巨核球コロニー形成細胞(Mk-CFC)、赤芽球バースト形成単位(BFU-E)、B細胞コロニー形成細胞(B-CFC)およびT細胞コロニー形成細胞(T-CFC)を含む。「前駆細胞」としては、これらに限定されないが、赤血球コロニー形成単位(CFU-E)、顆粒球コロニー形成細胞(G-CFC)、好塩基球コロニー形成細胞(CFC-Bas)、好酸球コロニー形成細胞(CPC-Bo)およびマクロファージコロニー形成細胞(M-CFC)が挙げられる。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「細胞周期」とは、真核細胞の複製の段階の周期を指す。該周期は、4つの段階G1、S、G2およびMを含み、S期は、細胞の核酸が複製される該周期の部分である。したがって、細胞周期のS期にあると同定される細胞は、増殖細胞であるとも同定される。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「増殖を調節する」とは、一般に細胞の集団、特に血管細胞、造血幹細胞または始原細胞の増殖速度を変える化合物の能力を指す。化合物は毒でもよく、その場合、細胞の増殖は、例えば、細胞へのサイトカインまたは増殖因子の添加などにより異常に遅くなる、停止する、または促進される。
【００６１】
本明細書に開示および記載の本発明は、一般に、哺乳動物、特にヒト対象を細胞毒性の有害作用から保護するための治療レジメンの有効性を決定する方法に関する。本発明は、新しい潜在的細胞保護化合物の同定および/または細胞毒性から保護することが知られている細胞保護化合物である鉛の最適化の両方のための、細胞ベースおよびin vivoのアッセイならびに/あるいはex-vivoアッセイの組合せをさらに提供する。
【００６２】
細胞毒性保護薬の薬物動態を決定するための方法およびキットも本発明の範囲内に含む。これらの方法は、細胞毒性物質の作用に対する最大の有効性を実現するための細胞保護化合物の最適化に有効である。例えば、細胞保護薬の投与量、その投与時間、細胞毒性保護薬のバイオアベイラビリティーの決定、およびこれらの薬剤の有効性の一般的分析は、臨床試験設定において対象に細胞毒性物質を投与する必要なく試験することができる。このように、本発明のキットおよび方法は、知られている薬剤または他のタイプの細胞毒性の潜在的に有害な副作用の可能性を低減する。
【００６３】
一態様において、本発明は、試験化合物による任意の効果または傷害を患者の血液循環中で観察される前に検出することを可能にするために必要な予測性および感受性をもたらす幹細胞または始原細胞を使用するin vitro、ex vivoアッセイの組合せを使用する薬剤スクリーニング方法を提供する。本発明は、最終段階の血液パラメーターに依存することなく十分な予測性および感受性を有する、様々な細胞および組織、特に、リンパ球造血系統に対する薬剤の分化作用を試験するための方法および戦略を提供する。in vivoでは、幹細胞または初期始原細胞レベルでの傷害は、末梢血レベルで該作用を検出するために一定の時間を必要とし、該作用が観察されるまでに、患者による有害な反応は既に発生していると考えられる。
【００６４】
本明細書に開示の発明は、ex-vivoまたは自家移植技法を使用する治療方法も提供する。一態様において、本発明は、細胞毒性物質を患者への移植の前に自家細胞に投与するex-vivo治療方法を提供する。一実施形態において、悪性細胞および非悪性細胞を含有する幹細胞の集団を患者から単離した。癌患者の場合、正常な幹細胞および腫瘍形成性幹細胞(tumorigenic stem cell)を単離し、次いで、知られている方法に従って分離した。患者に移植して戻す前に、細胞毒性物質(例えば、放射線)を正常な幹細胞に適用した。
【００６５】
本発明の範囲内の細胞毒性は、とりわけ、疾患、薬剤および治療レジメン、環境ハザード、電離放射線、生物、化学および放射線兵器を含めた広範囲の要素および条件の結果である。生物兵器剤としては、限定ではなく一例として、とりわけ、炭疽菌(Bacillus anthracis)(炭疽)、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)毒素(ボツリヌス中毒)、ペスト菌(Yersinia pestis)(ペスト)、大痘瘡(天然痘)、野兎病菌(Francisella tularensis)(野兎病)、ブルセラ症、コレラ、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)毒素、クリミア-コンゴ出血熱、エボラ出血熱、類鼻疽、Q熱、リシン、リフトバレー熱、サキシトキシン、ブドウ球菌エンテロトキシンB、トリコテセン系マイコトキシン、およびベネズエラウマ脳炎が挙げられる。化学兵器剤としては、限定ではなく一例として、とりわけ、神経剤、血液剤、発疱剤(blister agent)(ルイサイト、ナイトロジェンマスタード、サルファマスタード等)、肺剤(pulmonary agent)、無力化剤(incapacitating agent)(例えば、催涙剤)、および毒素が挙げられる。臨床設定における、高用量の薬剤の投与により生じる細胞毒性および/または薬剤の有害な副作用も本発明の範囲内に含む。
【００６６】
細胞毒性物質は、本明細書において、限定ではなく一例として、とりわけ、化学療法薬、放射線療法薬、アドレナリン作動薬、抗喘息薬、抗不整脈薬、抗癌薬、抗AIDS薬、抗パーキンソン病薬、アルツハイマー病薬、ソマトメジン、心血管および高血圧薬、糖尿病薬、抗ウイルス剤、アンチセンスペプチド、抗潰瘍薬、睡眠薬、PMS治療薬、鎮痛薬、内分泌/生殖器治療薬(endocrine/reproductive therapeutic)、避妊薬(birth control medicament)、総合ホルモン補充療法薬、鎮痛薬、NSAID、てんかん薬、片頭痛薬、発作薬(stroke medication)、抗生物質、免疫薬(immunization)、中毒治療薬(addiction treatment)、抗不安薬、抗炎症薬、血管新生もしくは抗血管新生薬、またはそれらの組合せを含めた幅広い種類の薬剤を含むように広く定義する。
【００６７】
本発明の範囲内の細胞毒性としては、炎症に関連した組織損傷、細胞増殖の調節能力の欠如、アポトーシス、または他の細胞損傷および細胞死を含めた様々な種類の毒性が挙げられる。
【００６８】
細胞毒性に曝露されたまたは細胞の毒性への曝露の危険性がある対象は、哺乳動物、特にヒトである。一実施形態において、対象は、細胞毒性を受けたまたは細胞毒性を被るもしくは細胞毒性への曝露の危険性がある健康な個体である。別の実施形態において、対象は、細胞毒性を有する薬剤または放射線に曝露されたまたは曝露される危険性のある無症状または症状のある患者である。さらに別の実施形態において、対象は、電離放射線、生物兵器剤、化学兵器剤または有害な環境条件、例えば、極端な温度、冷気、撹拌、乱流などにより生じる細胞毒性を含めた細胞毒性物質および元素に曝露されたまたは曝露される危険性のある軍人または民間人である。
【００６９】
細胞毒性保護化合物は、細胞毒性から保護するためまたは1つもしくは複数の細胞毒性の症状を寛解もしくは治療するために使用する。一実施形態において、本発明の細胞毒性保護薬は、抗癌、抗血管新生、もしくは有糸分裂阻害薬または放射線防護剤である。本発明による放射線防護剤は、治療上の放射線の抗腫瘍効果を低減することも放射線誘発癌(radiation-induced carcinogenicity)を促進することもなく放射線毒性を低減する。本発明の治療方法は、正常な細胞および組織を電離放射線への急性および慢性曝露の影響から保護する。
【００７０】
一実施形態において、本発明は、放射線誘発細胞毒性の有害作用から個体を保護するための治療方法を提供する。本発明の方法は、ex vivo細胞の毒性元素への曝露を必要とし、その結果から推定してin vivoでの放射線防護薬の有効性を決定するアッセイを提供する。毒性元素への曝露の前後および/またはその間の細胞毒性保護薬の投与の最適な時間は、ヒトの命を危険に曝すことなく最大の正確度および精度で測定することができる。本発明の方法は、放射線防護薬によりヒト対象にもたらされる保護の程度およびタイミングを較正することにより有効性決定を可能にし、薬剤投与の用量および時間に関係する生存率を測定して、有効性を証明し、最適な保護期間を推論する。
【００７１】
ヒトを危険に曝すことなく細胞毒性保護薬の有効性の本当のヒトの読取り値(readout)を得るために、細胞保護薬の有効性は、照射後に細胞保護薬で処理した細胞におけるバイオマーカーおよび生存パラメーターを分析することにより測定することができる。放射線応答の分子バイオマーカーは、放射線療法の進行をモニタするため、さらには処置レジメンの初期に成果を予測するために潜在的に役立つことができる。放射線曝露のバイオマーカーは、放射線事故または「汚い爆弾」事件後に曝露された可能性のある集団における個体のトリアージのための重要な手段であることもできる。マイクロアレイハイブリッド形成分析は、潜在的に有効な候補放射線防護薬の発見のための魅力的な手段を提供する。一旦検証されると、一連のバイオマーカーは、高感度リアルタイム定量多重プラットフォーム(sensitive quantitative real-time multiplex platform)での単純な迅速アッセイへと発展させることができる。ex vivoで照射したヒト末梢白血球の初期の研究は、そのようなアプローチを支持し、多数の遺伝子についてドナー間のばらつきがほとんどない線量-応答関係を実証しており、多重システムの実行可能性を確認している。
【００７２】
細胞は、DNAおよび膜脂質に対する放射線損傷を認識する複合シグナル伝達系を使用することにより電離放射線に応答する。損傷が見つかると、これによって、細胞応答、例えば、アポトーシス、細胞周期停止または修復などを制御する遺伝子の活性を調節する様々な細胞内経路の活性化がもたらされる。これらの経路の多くは、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)スーパーファミリーに属する。これらの経路は、多様な細胞事象、例えば、増殖、老化、分化およびアポトーシスなどの、増殖因子を介した調節と関連づけられてきた。電離放射線および様々な他の毒性ストレスへの細胞の曝露により、多数のMAPK経路の代償的な同時活性化が誘発される。これらのシグナルは、細胞型依存的な照射後の細胞生存率および再増殖の制御において重要な役割を果たす。タンパク質キナーゼのカスケードにおけるバイオマーカーは、電離放射線への曝露後の細胞生存率および再増殖の制御において重要な役割を果たす。これらのバイオマーカーの研究により、細胞保護薬を用いたin vivoおよびex vivo処理の間の顕著な差異は明らかにならなかった。
【００７３】
本明細書に開示の本発明は、平板培養して細胞毒性物質を受けることができる広範囲の標的細胞集団におけるバイオマーカーおよびパラメーターの異常な発現を評価することができるバイオアッセイ系を提供する。本発明の細胞ベースのアプローチは、バイオアッセイを利用して、対象の全身の生理機能または病状を模倣し、in vivoで身体内で完全に機能する細胞に相当する標的細胞における生物パラメーターを測定する。一実施形態において、本発明の細胞ベースのアッセイは細胞増殖アッセイである。従来の細胞増殖アッセイは、3H-チミジンまたは5-ブロモ-デオキシウリジン(BrdU)取込みを測定してきた。BrdUアッセイは、顕微鏡検査法、フローサイトメトリーまたは吸光度を使用することができる。比色法のためのテトラゾリウム化合物、特に3[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MIT)、(Mosmann、J. Immunol. Meth. 65、666(1983))も使用されてきた。HorowitzおよびKing、J. Immunol. Meth. 244、49〜58(2000)は、軟らかい寒天におけるマルチウェルのマウスコロニー形成アッセイを開発し、それによりMIT比色測定法を使用して細胞増殖の計数または阻害を測定した。結果は、該コロニー形成アッセイと等しかった。標的細胞の数は1.25×104細胞/mlまで低減したが、顆粒球/マクロファージ始原細胞のみを試験し、幹細胞、赤血球形成または巨核球形成始原細胞は試験しなかった。
【００７４】
別の実施形態において、本発明の細胞ベースのアッセイは、in vitroコロニー形成アッセイを含む。これらのアッセイは、血液悪性腫瘍における幹細胞移植片の増殖能を検出するための特定の潜在能力を有する。末梢血、骨髄および臍帯血を使用する幹細胞移植片の使用は、最近劇的に増加してきた。in vitroコロニー形成アッセイについては、分析する細胞の増殖能、および増殖因子によりin vitroで刺激されるその能力が必要な因子である。造血系に固有の増幅コンパートメントに対するこの依存性は見過ごされている場合が多いが、このコンポーネントがないと、一般的にコロニー形成アッセイ、特に血液毒性予測試験は実施が困難となるであろう。定常状態条件下では、未分化幹細胞の増殖状態は休止状態であると見なされるが、細胞周期中の細胞の割合は幹細胞成熟と共に増加する。幹細胞は、一旦ある細胞系統について決定されると、多数および一定数の成熟細胞を産生するために増幅コンパートメントに入る。しかし、細胞周期に入ると共に、該細胞は、一般に腫瘍学において使用される細胞毒性物質を含めた外因性物質に対して脆弱になる。細胞毒性物質試験の場合、標的細胞は、細胞周期に入っていなければならない。
【００７５】
細胞増殖に依存する任意の薬剤については、毒性により最も影響を受けるまたは損傷する組織は、細胞増殖に積極的に関与しているものであり、他の組織の中でも、とりわけ、骨髄および胃腸管が挙げられる。したがって、血液毒性試験は、また、他の増殖組織に対する潜在的薬剤の効果を有用に推定および予測できることになる。したがって、例えばGM-CPCアッセイは、骨髄抑制を予測するために使用することができる。このアッセイの予測の質は、アルキル化剤を用いた検証試験により証明されてきた。しかし、さらに、本発明により示しているように造血細胞の薬剤の最大許容濃度を予測することができるならば、血液毒性研究は、毒/治療指数ベースのアッセイにおけるその使用を通して創薬に役立つようになることができる。
【００７６】
線維芽細胞により放出される可溶性因子が細胞を刺激して軟らかい寒天中に顆粒球マクロファージコロニーを形成できることが示されると、in vitro造血アッセイの広範な使用が開始された(Bradley & Metcalf、Aust. J. Exp. Biol. Med 44、287〜287(1987)、Pluznik & Sachs、Exp. Cell Res. 43、553〜553(1966))。他の造血系統と共に、赤血球形成始原細胞のコロニー形成アッセイ(CFA)(McLeodら、Blood 44、617〜534(1974)、Iscoveら、J. CELL Phyisol. 2〜23(1974)、Axelradら、Haemopiesis in Culture 226〜223(1974))(参照により本明細書に組み込まれている)が開発された。5-フルオロラウシル-(Hodgsonら、Exp. Hemat. 10、26〜36(1982)およびヒドロキシ尿素(Rosendaalら、Nature 264、68〜69(1976)(参照により本明細書に組み込まれている)などの細胞毒性物質の使用により、幹細胞コンパートメント内の階層の解明および未分化幹細胞集団のin vitroアッセイの開発が可能となった。
【００７７】
これらの古典的アッセイにおいて、標的細胞が未分化であるほど、コロニーの形態のその子孫を検出するために時間がかかる。これらのアッセイは、単離して造血状態モニタリングおよび血液毒性試験に使用することができる、末梢血中で循環している幹細胞および始原細胞の集団に依存する。例えば、顆粒球マクロファージコロニー形成細胞(GM-CFC)アッセイおよびCD34+細胞(幹細胞および初期始原細胞)の計数は、現在、造血幹細胞移植の基礎を形成している。白血病細胞のコロニー形成アッセイも利用可能である。
【００７８】
一実施形態において、本発明は、本発明のin vitroおよびex-vivoアッセイの組合せを通して薬剤のヒトにおける有害な副作用を決定する方法を提供する。本発明の方法は、細胞毒性を早期に検出すると、医師は急速に問題を検出し、入院が金銭面および健康面に及ぼす影響ならびに薬剤費を低下させ、患者の快適さおよび回復を改善する代替療法を提供することができるため、著しく患者のためになろう。その薬剤は、承認薬、治験薬、または潜在的な新しい薬剤候補でもよい。
【００７９】
承認薬の休薬の理由として挙げられる最も多い理由は薬剤毒性(特に肝毒性)であるが、そのような有害な事象を適切に予測するための単純な解決法は存在していない。HepG2細胞における単純な細胞毒性アッセイは、市販の医薬品の遡及的分析においてヒトの肝毒性薬に対して比較的非感受性である。一実施形態において、より感受性の高いアプローチを実行するために前致死機構の細胞アッセイ(pre-lethal mechanistic cellular assay)のパネルを使用して、エンドポイント別の薬剤毒性(endpoint-specific drug toxicity)を検出する。該アッセイのパネルとしては、限定ではなく一例として、脂肪症、胆汁うっ滞、リン脂質症、反応性中間体、ミトコンドリア膜機能、酸化ストレス、および薬剤相互作用が挙げられる。個人間の治療指数(TI)は患者によって異なる可能性があるため、本発明によるこれらの細胞アッセイおよび標的としたin vitro曝露データの1つまたは複数の合理的な使用により、製薬科学者らは、ヒト対象をこれらの薬剤の有害な(deleterious sand adverse)副作用に曝す必要なく、創薬段階においてより高い潜在的TIを有する薬剤候補を選択することができる。
【００８０】
例えば、リン脂質症、細胞におけるリン脂質の蓄積は、カチオン性両親媒性薬剤の比較的多い副作用である。in vitro薬剤スクリーニングアッセイは、薬剤候補のリン脂質症誘発能の予測に基づいて開発することができる。短鎖酸性リン脂質の臨界ミセル濃度(CMC)に対するその効果により観察される薬剤-リン脂質複合体形成の測定に基づいたハイスループットな物理化学アプローチを使用することができる。
【００８１】
何百種類もの薬剤のヒトデータ、動物試験、細胞培養アッセイ、および他のスクリーニング方法に関する結果の比較により、それらのリン脂質症誘発能との非常に良好な相関が明らかとなる。該方法は、リン脂質症の有害な副作用からヒトを保護する細胞毒性保護薬を開発するための薬剤スクリーニングおよび治療レジメンによく適している。そのような細胞毒性保護薬は、カチオン性両親媒性薬剤と組み合わせて投与してもよく、それ自体を有害な副作用のないカチオン性両親媒性薬剤として使用してもよい。
【００８２】
カチオン性両親媒性薬剤としては、限定ではなく一例として、とりわけ、抗菌剤、抗真菌剤、細胞毒性物質、抗悪性腫瘍剤、抗増殖剤、免疫抑制剤、殺菌剤、消毒剤、抗精神病剤および心血管疾患の処置において使用する薬剤が挙げられる。カチオン性両親媒性薬剤のいくつかの非限定的な例は、ミトキサントロン、アントラサイクリン系薬剤(例えばダウノルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ドキソルビシン)、DNAトポイソメラーゼI酵素を阻害するカンプトセシン類似体(例えばトポテカン、イリノテカン)、向精神薬、例えば、デシプラミン、ピペリジンおよびピペラジンタイプの神経遮断薬、プロマジン、イミプラミン、アミトリプチリン、フルオキセチン、セルトラリンなど、心血管剤(例えばベラパミルまたはカルシウムチャネル遮断薬)である。
【００８３】
さらに別の実施形態において、本発明のアッセイは、化学療法誘発性末梢神経毒性(CIPN)により発生した細胞毒性を検出する。CIPNは、かなりの数の抗悪性腫瘍薬の用量制限副作用であるため、臨床上の主要な問題である。CIPNの発生率は条件に応じて変動するが、多剤化学療法レジメンを受ける患者の最大で40%において深刻な神経障害が発生する恐れがある。さらに、CIPNが用量制限副作用ではない場合でさえ、その発生は癌患者の生活の質に深刻な影響を及ぼし、慢性的な不快感を引き起こすことがある。近年、神経保護薬として新しい薬剤が提供され、それらの一部はCIPNについてより具体的に研究されてきた。前臨床試験において、特定のサイトカインおよび増殖因子が選択した神経標的に対して保護的役割を有することが示されてきた。本発明のアッセイ系は、CIPN毒性に対する細胞毒性保護薬の開発を促進し、化学療法の開始前の所与の患者におけるCIPNの発生の可能性を決定する。
【００８４】
本発明によるin vitro、in vivoおよびex vivoアッセイは、標的細胞について実施する。標的細胞とは、正常または悪性組織に由来し得る任意の細胞集団を指す。一実施形態において、標的細胞は、造血幹細胞および始原細胞、またはそれらの亜集団に由来する。本発明の標的細胞は、標的検証およびその後の創薬にも利用する。標的検証は、生理学的および/または疾患表現型あるいは他の病態生理学的表現型を有する潜在的な標的の今まで知られていなかった機能および/または機能的会合の実験的同定を伴う。標的または検証済みの標的は、その機能および/または機能的会合が検証プロセスにおいて同定/確認された生体分子である。
【００８５】
一実施形態において、本発明の方法は、末梢血細胞もしくは骨髄細胞から単離した初代細胞を含めた未分化造血細胞の集団または造血幹細胞および始原細胞に適用する。別の実施形態において、本発明の方法は、組織および固形腫瘍から単離した細胞に適用する。しかし、本発明の方法は、任意の増殖または非増殖細胞の集団に適用し得る。本発明の方法は、さらに細胞毒性物質に対する応答が異なっている可能性がある細胞の亜集団を区別するために使用し得る。
【００８６】
別の実施形態において、本発明の標的細胞としては、標的生体分子をコードするヌクレオチドの配列を含む核酸分子を含有する遺伝子組換え細胞を有する細胞集団が挙げられ、標的生体分子は、生理学的および/または疾患プロセスあるいは他の病態生理学的プロセスを有する確認済みの機能的会合を有する。
【００８７】
さらに別の実施形態において、該治療レジメンは、損傷した組織部位への標的幹細胞および/または始原細胞の動員、輸送の促進、ならびに/あるいは補充、ならびに様々な疾患ならびに生物、化学および放射線兵器により生じる炎症を伴う疾患の処置に影響を及ぼすために使用する。
【００８８】
造血系は、身体の5つの連続的増殖系の1つであり、その他のものは、胃腸管の上皮粘膜、皮膚の真皮、生殖器官の生殖細胞および角膜の上皮である。5つ全ての増殖系は一般的特徴を共有し、最も重要なものは、幹細胞の小集団が成熟終末細胞の連続的産生を維持することである。それら全ては、同じ4つの塩基性コンパートメント、すなわち幹細胞、増幅および分化、成熟ならびに成熟細胞コンパートメントの構造機構を有する。
【００８９】
しかし、造血系は、いくつかの点で独特である。造血系は、1種の多能性幹細胞から少なくとも8種の機能的に異なる細胞系統を産生することができる唯一の系である。第2に、腫瘍の発生の間に細胞の産生部位が変化する。第3に、成体における産生部位は、末梢循環の機能部位とは著しく異なる組織である骨髄である。第4に、他の増殖系および身体のほとんど全ての他の系と比較して、成体造血幹細胞および始原細胞が容易に利用できる。
【００９０】
以前は、造血幹細胞は、骨髄増殖因子動員末梢血(bone marrow growth factor mobilized peripheral blood)または臍帯血(胎盤)からの単離により抽出された。最近では、造血幹細胞は、in vitro受精技法を使用して得た胚から抽出する胚性幹細胞から調製されてきた。これらの未分化細胞は、全ての身体組織の多系列分化および再構成ができ、すなわち、全能性である。
【００９１】
造血系統の多数の未分化幹細胞が存在している。これらとしては、まとめてリンパ造血始原細胞(LPC)として知られている多能性幹細胞(PSC)、リンパ性幹細胞(LSC)および骨髄性幹細胞(MSC)が挙げられる。LSCおよびMSCは、それぞれPSCの分化により形成する。それ故、LSCおよびMSCは、PSCより関与している。造血系統の分化細胞の例としては、T細胞、B細胞、好酸球、好塩基球、好中球、巨核球、単球、赤血球、顆粒球、肥満細胞、およびリンパ球が挙げられる。T細胞およびB細胞は、LSCの分化により形成する。それ故、T細胞およびB細胞は、LSCより関与している。より詳細には、一連の分化は、LSC、プロB細胞または前胸腺細胞、プロB細胞、プレB細胞、成熟B細胞、血漿細胞、共通胸腺細胞(common thymocyte)、成熟胸腺細胞(ヘルパー/インデューサーまたは細胞毒性/サプレッサー系統)である。好酸球、好塩基球、好中球、巨核球、単球、赤血球、顆粒球、肥満細胞、NK、およびリンパ球は、MSCの分化により形成する。それ故、これらの細胞のそれぞれは、MSCより関与している。より詳細には、一連の分化は、MSC未成熟巨核芽球、巨核球、または前赤芽球(赤芽球、網状赤血球、赤血球)または骨髄単球性幹細胞、骨髄芽球(前骨髄球、骨髄球、顆粒球)または単芽球(前単球、単球、マクロファージ)に分化する二分化能幹細胞(bipotent stem cell)である。
【００９２】
したがって、造血の分化の経路は広範囲にわたって特徴付けされており、様々な細胞期は、形態および系統に特異的な細胞表面マーカーに従って容易に識別可能である。さらに、様々な細胞期への分化を誘発するために必要な増殖因子もよく特徴付けされている。
【００９３】
造血系の一意性は、化合物の毒性スクリーニングにとって重要な意味を有する。例えば、造血幹細胞の多能性により、試験する様々なリンパ球造血系統に対する薬剤の分化作用および感受性がもたらされる。さらに、末梢血は、赤血球および白血球数、分化数ならびに他の最終段階の血液パラメーターを測定するために容易に得ることができる成熟終末細胞を含有する。このような従来のパラメーターは、一般に前臨床薬剤試験において使用され、臨床試験の間の血液毒性試験に関する国立癌研究所(NCI)ガイドラインの基礎を形成する。
【００９４】
一般的に毒性、特に血液毒性は、薬剤投与の時間と相関させることができる。薬剤の治療指数、それ故その毒性は、造血細胞分裂の日内変動にある程度依存している。同様に、腸粘膜および眼の角膜上皮の細胞は、概日機構を示す。ヒト骨髄および胃腸組織については、例えば、S期DNA合成は、夕方または夜間よりむしろ朝に優先的に発生する。このことは、これらの組織において細胞の増殖状態が最低であるときに投与すると、細胞毒性物質の毒性が低く、高い有効性を示す可能性があることを意味する。
【００９５】
本発明の細胞毒性保護薬の治療有効量または投与量は、処置する病態または病状および他の臨床上の要因、例えば、ヒトまたは動物の体重および状態ならびに化合物の投与の経路など次第である。したがって、製剤において使用する正確な用量は、開業医の判断および各患者の状況に従って決定するべきである。有効用量は、in vitroまたは動物モデル試験系に由来する用量-応答曲線から推定し得る。
【００９６】
ヒトまたは動物を処置するためには、約0.5〜500mg/キログラムの間が本発明の細胞毒性保護薬を投与する一般的な広さの範囲である。一実施形態において、例えば、致死量の放射線の24時間および15分前での120mg/kgのON 01210.Naによる前処置により、ビヒクルで処理した動物に対する延命効果が証拠された。
【００９７】
本発明の方法は、同時にまたは長期間にわたって投与する単回ならびに多回投与を企図している。本発明がヒトおよび動物用の両方の用途を有することを理解されたい。
【００９８】
好ましい単位投与製剤(unit dosage formulation)は、投与する成分の、本明細書において上で列挙した1日用量もしくは単位、1日用量以下(daily sub-dose)、またはそれらの適当な画分を含有するものである。特に上で述べた各成分の他に、細胞毒性保護薬の製剤は、当該製剤のタイプを考慮して、当技術分野において従来の他の物質を含み得ることが理解されるべきである。
【００９９】
一態様において、本明細書に開示の発明は、新しい細胞毒性保護薬を発見するためまたは新しい作用機構を発見するためまたは知られている市販の細胞毒性保護薬を使用した新しい方法を発見するための創薬および方法論において使用する。薬剤の標的は、今までのところ、分子または細胞の特徴に基づいて、例えば、細胞株全体の化学構造または活性の類似性を利用することにより予測されてきた。2種の薬剤がin vivoで標的を共有するかどうかを推測するためにin vitroで表現型副作用の類似性を比較するための方法も本明細書において企図している。今日、(化学、放射線、または外科を含めた)多くの治療法の有効性は、その有害な(harmful and hazardous)副作用により深刻に制限されている。薬剤の臨床的価値を最大化するために、正常な組織に対するその副作用を低減または排除する努力をしなければならない。本発明の薬剤スクリーニング方法は、根底にある疾患または障害による影響を受けていない正常な細胞、組織および器官に対する主要な薬剤の副作用を低減または排除する候補細胞毒性保護薬を見出すために有用である。
【０１００】
in vitroおよびex vivoアッセイの組合せならびに本発明の治療関連または疾患関連のバイオマーカーでのターゲティングは、標的検証を実現し、最終的にはその結果としての創薬のためのアッセイを提供する。創薬努力を成功させるための、関連する全身の生理機能または病状を模倣する細胞状況における新規の細胞毒性保護薬候補の機能的同定ならびに既存の細胞毒性保護薬の機能的特徴付け/検証も本発明の範囲内に含む。
【０１０１】
一実施形態において、細胞毒性保護薬のスクリーニングは、造血バイオマーカー、またはその結合断片を使用することにより実施する。別の実施形態において、該スクリーニング方法は、バイオマーカーに結合するポリペプチド、ヌクレオチドおよび/または小分子を含む候補化合物を同定するために使用する。そのような薬剤スクリーニング方法は、例えば、毒性に曝露された標的細胞において異常に発現する疑いがある選択したバイオマーカーと本発明の候補化合物を接触させること、および結合後のこれらの化合物の活性をアッセイすることを含む。これらの結合分子または化合物は、例えば、バイオマーカーのアゴニストおよびアンタゴニストとして有用である。そのようなアゴニストおよびアンタゴニストは、本発明によって、以下で詳細に記載している治療実施形態で使用することができる。
【０１０２】
そのような試験において利用する化合物は、固体支持体に固定していてもよく、細胞表面上に発現していてもよく、溶液中で遊離していてもよく、細胞内に位置していてもよい。薬剤スクリーニングの1つの方法では、バイオマーカーまたはそれらの断片を発現する組換え核酸により安定に形質転換した真核または原核宿主細胞を利用する。競合結合アッセイにおいてそのような形質転換細胞に対して薬剤をスクリーニングする。例えば、試験する物質と本発明によるバイオマーカーの間の複合体の形成を測定し得る。
【０１０３】
薬剤スクリーニングのための別の技法は、1つまたは複数のバイオマーカーに対して好適な結合親和性を有する化合物のためのハイスループットスクリーニングを提供する。要するに、多数の様々な小分子またはペプチド試験化合物を、プラスチックピンまたはいくつかの他の表面などの固体基体上で合成する。小分子またはペプチド試験化合物は、細胞毒性物質に曝露された標的細胞において発現するバイオマーカーと反応させる。結合小分子および/またはポリペプチドは、次いで、当技術分野においてよく知られている方法により検出する。
【０１０４】
本発明は、バイオマーカーを結合することができ、バイオマーカーと結合するために試験化合物と特異的に競合する中和抗体を使用する競合薬剤スクリーニングアッセイの使用も企図する。このように、該抗体は、1つまたは複数の抗原性エピトープを特定のバイオマーカーと共有する任意のペプチドの存在を検出するために使用する。
【０１０５】
あるバイオマーカーと特異的に結合する分子についてスクリーニングすることができるランダムまたはコンビナトリアルペプチドまたは非ペプチドライブラリーなどの多様性ライブラリーにより複数の候補化合物を提供し得る。使用することができる多くのライブラリー、すなわち、化学合成ライブラリー、組換え(すなわち、ファージディスプレイライブラリー)、およびin vitro翻訳ベースライブラリーが当技術分野において知られている。化学合成ライブラリーの例は、とりわけ、Fodorら、Science 251:767〜773(1991)、Houghtenら、Nature 354:84〜86(1991)、ならびにBrennerおよびLemer、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381〜5383(1992)に記載されている。非ペプチドライブラリーの例として、ベンゾジアゼピンライブラリー(すなわち、Buninら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708〜4712(1994)参照)を適合させて使用することができる。ペプトイドライブラリー(Simonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367〜9371(1992))も使用することができる。使用することができるライブラリーの別の例であって、ペプチド中のアミド官能基を完全メチル化して化学的に形質転換したコンビナトリアルライブラリーを生成するものは、Ostreshら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138〜11142(1994)により記載されている。
【０１０６】
本発明において有用な非ペプチドライブラリーは、例えば、EckerおよびCrooke、Bio/Technology 13:351〜360(1995)により記載されているライブラリーである。これらのライブラリーは、化合物、例えば、とりわけ、ベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ピペラジンジオン、ビフェニル、糖類似体、ベータ-メルカプトケトン、アリール酢酸、アシルピペリジン、ベンゾピラン、クバン、キサンチン、アミンイミド、およびオキサゾロンなどを使用して、様々なライブラリーの基礎を形成する。非ペプチドライブラリーは、2つのタイプ:修飾モノマー(decorated monomer)およびオリゴマーに大別することができる。修飾モノマーライブラリーは、その上に様々な官能基が添加される比較的単純な骨格構造を利用する。骨格は、知られている有用な薬理活性を有する分子である場合が多い。例えば、骨格は、α、β不飽和アリールスルホンベンゾジアゼピンでもよい。
【０１０７】
本発明は、候補細胞毒性保護薬についてスクリーニングするため、または臨床設定において知られている細胞保護薬の有効性を決定するために使用する試験キットも提供する。該試験キットは、対象からの標的細胞の抽出のための溶液および装置、潜在的な細胞毒性保護薬としての1つまたは複数の試験化合物、細胞および組織の培地およびプレート、1つまたは複数の細胞毒性物質、標的細胞において生存能力および増殖条件を示すパラメーターを分析するためのバイオマーカーおよびアッセイ、候補薬剤の細胞毒性保護の可能性を検出および測定するためのハイスループットアッセイを実施するために必要な試薬ミックスならびにその使用に関する説明書を含有する1つまたは複数の容器を含む。本発明の試験キットは、候補化合物の細胞毒性予防の可能性を決定するためのハイスループットアッセイを実施するために使用し得る。
【０１０８】
別の実施形態において、本発明は、細胞毒性物質の有害作用から対象を保護するための治療レジメンの有効性および薬効をスクリーニングおよび決定するための試験キットであって、ハイスループットアッセイを実施するための試薬ミックスおよび説明書、標的細胞を対象から抽出するための溶液および装置、細胞毒性物質を含有するバイアル、細胞毒性保護化合物を含有するバイアル、細胞および組織の培地およびプレート、in vitroでの標的細胞の生存能力および増殖条件の決定のためのアッセイコンポーネント、ならびに該キットの様々なコンポーネントを使用するための説明書を含むキットを提供する。
【実施例】
【０１０９】
本発明について一般的に記載しているが、特許請求する本発明の範囲から逸脱することなく他のDNAマイクロアレイ、神経学的状態、認知治療法またはデータ分析方法を全て制限なく利用することができることを当業者が本明細書の上記教示および以下の実施例から認識するように、本発明の特定の態様および実施形態の例示の目的でのみ含まれ、本発明を制限することを意図するものではない以下の実施例を参照することによって本発明はより容易に理解されよう。本出願のどこかで参照しているあらゆる特許、特許出願、特許公報、または科学論文の内容は、その全体が本明細書に組み込まれている。
【０１１０】
(実施例1)
主要な薬効:in vitroでの正常なヒト線維芽細胞におけるON 01210.Naによる用量依存的な放射線防護
平板培養したヒト細胞に対するON 01210.Naの放射線防護を測定するためにクローン原性アッセイを使用した。細胞毒性レベル(10Gy)の電離放射線照射(IR)の前に24時間、2〜20μMのON 01210.NaでHFL-1(正常な二倍体肺線維芽細胞)細胞を処理すると、3.3〜4.7倍の保護が用量依存的にもたらされた(図1A参照)。HFL-1細胞を2.0〜20.0μMの範囲の最終濃度のON 01210.Naで処理した。2回目の実験において、やはり該細胞を該薬剤で24時間処理したが、該薬剤は照射の4時間後に適用した。
【０１１１】
図1は、ON 01210.NaによるHFL-1細胞のIRからの保護を実証する。薬剤処理および放射線曝露後、細胞を再び平板培養し、各プレートのコロニーの数を3週間後に数えた。A.ON 01210.Naの濃度と生存するコロニーの数の関係。B.染色したクローン原性アッセイプレート。
【０１１２】
放射線曝露後シナリオにおける現場使用に関する重要な観察は、該細胞を放射線曝露の4時間後にON 01210.Naで処理すると顕著な防護がもたらされたことであった。ON 01210.Na処理によりもたらされた生存するコロニーの総数の増加の他に、一貫して、コロニー1つ当たりの細胞の数もON 01210.Na処理群において有意に大きかった(図2B参照)。このことは、ON 01210.Naで処理した細胞におけるIR後の修復機構が、生存細胞の数だけではなく保護された細胞の増殖能も増加したことを示唆していた。
【０１１３】
(実施例2)
ヒト骨髄細胞のin vitro放射線防護
初代ヒト骨髄細胞を細胞毒性線量の放射線から保護するON 01210.Naの能力をin vitroアッセイにおいて試験した。最初に、細胞毒性試験を実施した。健康なボランティアから単離したヒト骨髄細胞を、ON 01210.Naの濃度を増加させながら2および24時間処理し、methocultに平板培養した。これらの試験は、ON 01210.Na処理が、高濃度(20μM)で24時間の処理期間にわたっても非細胞毒性であったことを明らかに示した(図2)。
【０１１４】
次いで、放射線防護アッセイを実施した(図3)。細胞をON 01210.Naで3時間処理し、照射し、methocultで平板培養した。コロニー形成単位の総数を14日後に決定した。ON 01210.Naがヒト骨髄細胞を用量依存的に保護し、1.6という最適なDRFを有することが分かった。このことは、陽性対照としてアミホスチンを使用する保護試験について分析した場合と、非常に好適に比較した。これらの試験は、ON 01210.Naがヒト骨髄細胞に対して非毒性であり、初代ヒト骨髄細胞について放射線防護活性であったことを示した。
【０１１５】
図2. ON 01210.Naはin vitroでヒト骨髄細胞に対して細胞毒性ではなかった。ヒト骨髄細胞を様々な濃度のON 01210.Naで(A)2時間または(B)24時間処理した。次いで、該細胞をmethocult培地に平板培養した。総コロニー形成単位数を14日後に決定した。ON 01210.Naは、高濃度での長期間の曝露後でさえヒト骨髄細胞の増殖または分化を妨げなかった。
【０１１６】
図3は、ヒト骨髄細胞のin vitro放射線防護を示す。ヒト骨髄細胞を、ON 01210.Naの濃度を増加させながら3時間処理し、次いで、線量を増加させながら電離放射線を照射した。該細胞をmethocultに平板培養し、CFUの総数を14日後に決定した。放射線なしのON 01210.Na処理は試験した全ての濃度で非毒性であった(A)。ON 01210.Naは用量応答的にヒト骨髄細胞を保護した(B)。生存曲線を最適なON 01210.Na濃度(10μM)でプロットすると、ON 01210.Na(C)は1.6というDRF値を有していたが、アミホスチンの最適な用量(0.25mM)は1.5というDRF値を有していた。
【０１１７】
図3において示したように、ON 01210.Naは、ヒト骨髄細胞を放射線曝露から保護するために非常に有効である。3時間のON 01210.Na処理はヒト骨髄細胞に対して完全に安全であった(図3A)。ON 01210.N放射線防護が用量依存的であることが分かった(図3B)。その防護データは、3時間の10μM超のON 01210.Naの濃度により放射線防護の量が増加しなかったことを示し、これらのアッセイ条件下では10μMが放射線防護に最適な濃度であったことを示唆していた。本発明者らが生存曲線をON 01210.Naの最適な濃度でプロットする(図3C)と、本発明者らは、1.6という線量減少係数(DRF)を算出することができた。本発明者らは、アミホスチンの放射線防護活性も試験した。治療血漿濃度をよく模倣したアミホスチン濃度を選択した。ON 01210.Naは広範囲の濃度(10倍)の細胞を保護したが、アミホスチンは狭い範囲の濃度のヒト骨髄細胞のみを保護し、最適な濃度は0.25mMであった(データ図示せず)。間葉および造血細胞を使用した以前の試験において、この濃度が最適であることが分かった。図3Dは、ヒト骨髄細胞をアミホスチンで処理したときの生存曲線を示す。算出した1.5というDRF値はこれらの実験から決定した。このデータは、ON 01210.Naがヒト骨髄細胞を放射線曝露から保護することについてはアミホスチンと同様に有効であったが、より広範囲の安全濃度で有効であったことを明らかに示す。
【０１１８】
(実施例3)
マウス造血細胞のON 01210.Na保護(in vivo放射線防護アッセイ)
放射線曝露後の動物の生存率は造血系の保護に大きく依存するため、放射線曝露前の様々なスケジュールを使用して造血細胞生存率に対するON 01210.Na処理の効果を調査した。ON 01210.Naによる造血細胞の放射線防護を、準致死量(sub lethal dose)の放射線を使用するin vivoアッセイにおいて試験した。マウスにおける造血系の最大限の保護に最適なON 01210.Naの用量およびスケジュールを決定するために、C3H/HEJマウスを様々なスケジュールに従ってON 01210.Naで処理した。先の生存率試験は、電離放射線の致死的曝露の24時間前および15分前のON 01210.Naの2回の注射、ならびに15分前の単回注射により100%のマウスが保護されたことを示した。以下の造血試験は、生存率試験が造血細胞の保護と密接に相関していたことを示した。ON 01210.Naの24時間前および15分前の2回の注射、ならびに15分前の単回注射は、照射マウスのコロニー形成単位および白血球の両方の顕著な回復をもたらした。放射線曝露の4時間前の単回注射により、マウスは骨髄コンパートメントの完全な剥離から保護されたが、回復時間においてビヒクル単独より顕著な利点は示されなかった。
【０１１９】
ON 01210.Naは、放射線曝露後の骨髄コンパートメントおよび末梢血コンパートメントの両方の回復に対して顕著な保護効果を有していた。その結果は、100%の生存率を実現したON 01210.Na処理のスケジュールが造血系の回復と非常に密接に相関していたことも示した。図4は、ON 01210.Naが照射マウスの骨髄を保護することを実証した。A.1%ポリソルベート80/K-ホスフェート緩衝液中で製剤化した500mg/kgのON 01210.Naまたはビヒクル単独を、マウスに皮下注射により5.5Gyの全身電離放射線処理の24時間前および15分前に注射した。指示した日に全血を採取し、RBC溶解の後にWBCの計測を実施した。そのデータは、1群当たり3匹のマウスの平均+/-SEM(N:3×3=9プレート)としてプロットする。B.代表プレートの写真。ON 01210.Naは、骨髄を幹細胞の完全な剥離から保護し、骨髄の回復を有意に促進した。C.白血球数。指示した日に全血を採取し、RBC溶解の後にWBCの計測を実施した。そのデータは、1群当たり3匹のマウスの平均±SEM(N=3)としてプロットする。3種の系統、顆粒球、マクロファージおよび顆粒球マクロファージ(GM)を同定し、一覧表にすることにより系統別の保護を試験した。Table 1(表1)は、放射線曝露後の各系統の細胞の数を示す。
【０１２０】
【表１】
0005734869.tif 000002
【０１２１】
マクロファージ系統へのわずかな偏りと共に3つ全ての系統において回復が観察された。放射線曝露なしでマウスにON 01210.Naを注射するとマクロファージコロニー数がわずかに増加した。これらの結果は、ON 01210.Naが骨髄始原細胞の回復の速度を有意に増加することができただけではなく、細胞の既存の画分を保護することもできたことを示す。骨髄細胞を保護するON 01210.Naの能力を検査することに加えて、末梢白血球の保護も試験した。放射線曝露後の様々な時間に全血を採取し、白血球の総数を決定した。図4Cは、ON 01210.Naが白血球を放射線曝露から有意に保護したことを示す。ON 01210.Naで処理したマウスは、18日までに白血球数のより急速な回復も示した。
【０１２２】
骨髄の最大限の保護に最適なON 01210.Na処理のスケジュールを決定するために、15分前または4時間前に1回量のON 01210.Naを注射したマウスの骨髄保護を、上記の2回量を注射したマウスと比較した。これらの実験の結果はTable 2(表2)に示している。最も有効な骨髄の保護は、放射線曝露の24時間前および15分前にマウスに注射したときに見られた。曝露の直前の単回注射は、骨髄細胞を保護し放射線曝露後の骨髄細胞の回復を誘発するために非常に有効であった。ON 01210.Naを1回量として放射線曝露の4時間前に注射すると、骨髄細胞の保護が観察されたが、回復速度はビヒクルで処理したマウスと比較して有意に増加しなかった。これらの実験は、曝露の直前の単回注射が骨髄細胞を保護し、放射線曝露後の骨髄細胞の回復を促進することを意味する。
【０１２３】
【表２】
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【０１２４】
皮下注射によるマウスのON 01210.Na処理により、照射マウスの骨髄および白血球が有意に保護された。造血細胞の保護に加えて、骨髄コンパートメントの回復の速度が劇的に増加した。造血細胞の保護に最適な用量(500mg/kg)およびスケジュール(放射線処理の24時間前および15分前の2回の注射または15分前の単回注射)は、致死量の放射線への曝露後の最適な生存率について見出した用量およびスケジュールと相関していた。したがって、ON 01210.Naによる放射線防護の1つの重要な機構は造血系の保護である。
【０１２５】
(実施例4)
薬理試験
細胞毒性保護薬の有効性を決定するために試験を実施した。1つの試験において、EX-RAD(商標)という別名で知られている細胞毒性/放射線防護薬ON 1210.Naを、in vitroおよびin vivoモデル系の両方を使用して調査した。in vitro試験は、複数の樹立細胞株および新たに単離したヒト骨髄細胞を使用した。in vivo有効性試験は、照射後の生存率に対するON 01210.Na処理の効果ならびに血液系および胃腸系の回復を促進する能力に着目した。2種の動物種、マウスおよび家ウサギを試験した。有効性試験の他に、細胞下レベルおよび分子レベルでの保護の潜在的機構を調査するための複数の実験を設計した。
【０１２６】
有効性試験は、in vitroクローン原性生存アッセイを使用して、ON 01210.Naがヒトの肺および皮膚線維芽細胞ならびにヒト臍静脈内皮細胞を放射線曝露から保護したことを細胞ベースの試験が示したことを実証した。さらに、ON 01210.Naは非毒性であり、新たに単離したヒトドナー骨髄細胞を高線量の放射線から再現性よく保護することができた。ON 01210.Naの保護活性は、ヒト骨髄細胞の同じ分離株のアミホスチン処理と等しかった。
【０１２７】
マウスにおけるin vivo生存率試験は、十分に確立された30日生存モデルに基づいて、生存率に対する用量およびスケジュールの効果を調査するために設計し、ON 01210.Naの線量減少係数(DRF)を確立し、ON 01210.Naの2種の異なる製剤(懸濁液vs.溶液)を比較し、処理マウスの造血系および胃腸管に対するON 01210.Naの保護および回復利益を示す。
【０１２８】
マウスにおいて、ON 01210.Naは、50mg/kg〜500mg/kgの範囲の用量で放射線致死に対する用量依存的な保護を実証した(ビヒクルに対してp<0.05)。500mg/kgでは、LD50/30全身放射線量を使用した生存率試験は、ON 01210.Na前処理が完全におよび再現性よくマウスを曝露から保護したことを示した。用量-応答試験は、放射線曝露の24時間および15分前に懸濁液として皮下投与した500mg/kg用量が、ON 01210.Na処理の最適な用量およびスケジュールであったことを示した。2つの線量減少係数(DRF)試験は、ON 01210.NaのDRFが1.14〜1.16であったと判断した。溶液製剤を使用するこの投与レジメンは、マウスにおいて同様に有効であることが示された。
【０１２９】
準致死量の電離放射線の前にON 01210.Naで処理したマウスの造血系の分析は、ON 01210.Na処理により前駆骨髄幹細胞および末梢血細胞の両方が急性放射線曝露から保護されたことを示した。さらに、照射の前にON 01210.Naで前処理したマウスの胃腸(GI)組織が、空腸腺窩幹細胞に対する損傷が有意に少ないことを示した。
【０１３０】
ニュージーランド産の白ウサギを用いた3つの生存率試験において、致死量の放射線の24時間および15分前の120mg/kgのON 01210.Naによる前処理により、ビヒクルで処理した動物に対する延命効果の証拠がもたらされた。白血球、血小板、ヘマトクリットおよびヘモグロビンレベルについて全体的な保護傾向が観察された。マウスにおける試験とは異なり、これらの予備試験において、様々な血液細胞系統の再増殖の改善の確実な証拠は明白ではなかった。溶液および懸濁液製剤の両方を試験した。
【０１３１】
これらの有効性試験は、総合すると、ON 01210.Naが、in vitroで多数の細胞株にわたって、および初代ヒト骨髄細胞において有意なin vitro放射線防護活性を有することを示した。ON 01210.Naは、致死量の全身電離放射線に曝露されたマウスに対する延命効果を用量依存的および処理時間依存的にもたらした。ON 01210.Naは、全身放射線に曝露されたマウスにおける末梢造血および前駆腺窩幹細胞の生存を促進し、その回復を促進することが示された。大きい動物モデルにおいて、本発明者らは、ON 01210.Naを放射線曝露の前に投与すると家ウサギを致死量の全身放射線から保護できたことを示した。さらに、ON 01210.Naはフリーラジカル捕捉剤または抗酸化剤としての有意な活性を全く示さず、ON 01210.Na処理は細胞毒性ではなく、細胞周期停止を引き起こさず、「コメット」アッセイにより評価したところON 01210.Na処理は細胞の照射により生じるDNA損傷の量を低減した。
【０１３２】
(実施例5)
バイオアッセイの開発
細胞毒性保護薬の有効性を分析し、調査するために、細胞内レベルでのこれらの薬剤の作用機構の決定に役立つバイオアッセイを開発した。ON 01210.Naの場合、細胞およびDNA損傷の感知、修復、およびアポトーシス経路の特定のコンポーネントをより詳細に試験した。放射線曝露の前のON 01210.Na処理が、細胞のIR曝露に対する初期応答に悪影響を及ぼさなかったが、放射線への曝露時に活性化したシグナル伝達カスケードに起因する細胞アポトーシスの低減に寄与する後のトランスデューサーシグナル伝達事象に影響したことを見出した。シグナル伝達試験は、放射線への曝露後24時間までのDNA損傷の減少に加えて、ON 01210.Na処理がアポトーシスに特異的なシグナル伝達事象のレベルも低減し、それ故、細胞死の代わりに細胞の回復が促進したことを示唆した。
【０１３３】
さらに、ON 01210.Naが放射線曝露に応答して、細胞におけるp53、p21、bax、c-ablおよびp73のタンパク質レベルを有意に低減することが分かった。この低減は、ON 01210.Naで前処理した照射細胞における細胞死の低下および細胞回復の促進に役立つ可能性がある。
【０１３４】
潜在的な二次的または非特異的活性についてスクリーニングするためにさらなる生化学試験を実施した。ON 01210.Naに、67種の放射性リガンド受容体結合アッセイおよび5種のシトクロムP450酵素:1A2、2C9、2C19、3A4、および2D6の広範なパネルにわたってin vitro一次スクリーニングを実施した。受容体結合の有意な抑制または刺激は検出されなかった。活性が98%刺激された1つのシトクロムアッセイ、CYP450 2C9のみが応答を得て、それは有意であると見なされた。したがって、安全性および選択性プロファイリングについての予備スクリーンとしては、標的は同定されなかった。