(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｈＴＲＡＩＬタンパク質配列（配列番号１６）の機能的断片であって、ｈＴＲＡＩＬ９５からｈＴＲＡＩＬ１２２までの範囲（両端を含む）のアミノ酸で始まり、ｈＴＲＡＩＬ２８１のアミノ酸で終わる断片、ｈＴＲＡＩＬ１３１、１４９、１５９、１９３、１９９、２０１、２０４、２１２、２１５、２１８および２５１からなる群もしくはｈＴＲＡＩＬ１９５，２６９および２１４からなる群から選択された位置での１つ以上の変異を有する前記機能的断片のホモログ、またはＤ２１８Ｈ変異体もしくはＹ１８９Ｎ−Ｒ１９１Ｋ−Ｑ１９３Ｒ−Ｈ２６４Ｒ−Ｉ２６６Ｒ−Ｄ２６９Ｈ変異体から選択される前記機能的断片のホモログであるドメイン（ａ）；ならびに
―  配列番号１９のインターフェロン  ガンマの偽二量体；および
―  配列番号４６のインターフェロン  アルファ２ｂの偽二量体；
からなる群から選択される免疫賦活性エフェクターペプチド配列であるドメイン（ｂ）を含み、
ドメイン（ｂ）の配列が、ドメイン（ａ）のＣ末端またはＮ末端に付加している、融合タンパク質。
【請求項２】
ドメイン（ａ）が、９５、１１６、１２０、１２１または１２２の位置のアミノ酸で始まる断片からなる群から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
融合タンパク質が、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）との間に、メタロプロテアーゼＭＭＰにより認識される配列、ウロキナーゼｕＰＡにより認識される配列およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、プロテアーゼ切断部位を含むドメイン（ｃ）を少なくとも１つ包含する、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
メタロプロテアーゼＭＭＰにより認識される配列が配列番号２０であり、ウロキナーゼｕＰＡにより認識される配列が配列番号２１である、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
ドメイン（ｃ）が、相互に隣接する、メタロプロテアーゼＭＭＰにより認識される配列とウロキナーゼｕＰＡにより認識される配列との組み合わせである、請求項３または４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
融合タンパク質が、２つのドメイン（ｃ）の間に、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５からなる群から選択される、ＰＥＧ分子を付加するためのリンカーのドメイン（ｄ）を含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
融合タンパク質が、ドメイン（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および／または（ｄ）の間に、フレキシブルなグリシン−セリン立体リンカーをさらに含む、請求項３〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
グリシン−セリンリンカーが、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号５０からなる群から選択される、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
アミノ酸配列が、配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；および配列番号４４からなる群から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
融合タンパク質が、組換えタンパク質である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
ポリヌクレオチド配列が、E. coliの遺伝子発現に最適化される、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
ポリヌクレオチド配列が、配列番号４０；配列番号４１；配列番号４２；配列番号４３；および配列番号４８からなる群から選択される、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
宿主細胞が、E. coli細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
薬学的に許容し得る担体とともに、有効成分として請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項１８】
非経口投与のための形態にある、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ヒトを含む哺乳動物におけるがん疾患の処置のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、処置用融合タンパク質の分野、特に組換え融合タンパク質に関する。より詳しくは、本発明は、免疫賦活ペプチドの配列とヒト可溶型ＴＲＡＩＬ５タンパク質配列断片とを有する融合タンパク質、それを含有する医薬組成物、それらの処置での、特に抗がん剤としての使用、該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、該ポリヌクレオチド配列を有する発現ベクター、および該発現ベクターを含有する宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ａｐｏ２Ｌ（Ａｐｏ２リガンド）としても知られる、サイトカインファミリーに属するＴＲＡＩＬタンパク質（腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド）は、腫瘍細胞およびウィルス感染細胞における強力なアポトーシス賦活剤である。ＴＲＡＩＬは、身体で自然発生するリガンドである。ＴＲＡＩＬタンパク質、そのアミノ酸配列、ＤＮＡコード配列、およびタンパク質発現系は、欧州特許出願公開第０８３５３０５号において初めて開示された。
【０００３】
ＴＲＡＩＬタンパク質は、アポトーシス促進性のＴＲＡＩＬ表面レセプター１および２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１／Ｒ２）に結合した後、これらのレセプターを活性化することで抗がん活性を発揮する。ＤＲ４およびＤＲ５（デスレセプター４およびデスレセプター５）としても知られるこれらのレセプターは、ＴＮＦレセプターファミリーに属し、様々なタイプのがん細胞により過剰発現される。これらレセプターの活性化により、抑制遺伝子ｐ５３とは独立したアポトーシスの外部シグナル伝達経路を誘発が可能であり、活性化されたカスパーゼ−８により、エグゼクティブカスパーゼを活性化し、それにより核酸を分解する。ＴＲＡＩＬの活性化により放出されたカスパーゼ−８により、Ｂｉｄタンパク質の放出、それによるミトコンドリア経路の間接的な活性化も引き起こすこともができ、Ｂｉｄタンパク質はミトコンドリアへ移動し、そこでシトクロムｃの放出を刺激し、このようにデスレセプターからのアポトーシス誘導シグナルを間接的に増幅する。
【０００４】
ＴＲＡＩＬは、このタンパク質に耐性のある健常な細胞におけるアポトーシスを実質的に誘発せずに、腫瘍細胞に選択的に作用する。従って、ＴＲＡＩＬは、血液系腫瘍および固形腫瘍などを含む広範囲な異なるタイプの腫瘍細胞に作用するが、正常細胞には影響を与えずに副作用がおそらく比較的少ないと抗がん剤として、その有用性が非常に高いと認識された。
【０００５】
ＴＲＡＩＬタンパク質は、２８１個のアミノ酸からなる２型膜タンパク質であり、その１１４−２８１のアミノ酸残基からなる細胞外領域は、プロテアーゼにより切断されて、生理活性のあるサイズが２０ｋＤａの可溶型ｓＴＲＡＩＬ分子を生成する。ＴＲＡＩＬおよびｓＴＲＡＩＬの両方の形態とも、標的細胞上にあるＴＲＡＩＬレセプターとの相互作用によりアポトーシスを誘引することが可能である。ＴＲＡＩＬ分子の可溶部分の強力な抗腫瘍活性および非常に低い全身毒性が、細胞株を用いた実験により実証されている。
【０００６】
国際一般名ｄｕｌａｎｅｒｍｉｎで知られる、ｈＴＲＡＩＬのアミノ酸１１４−２８１に対応するアミノ酸配列を有する可溶型組換えヒトＴＲＡＩＬ（ｒｈＴＲＡＩＬ）を用いたヒト臨床研究により、耐性が良いことおよび用量規制毒性がないことも示された。
【０００７】
１１４−２８１よりも短いＴＲＡＩＬの断片も、膜デスレセプターに結合し、これらのレセプターによりアポトーシスを誘発可能であることが知られており、例えば欧州特許第１６８８４９８号に１２２−２８１ｈＴＲＡＩＬの組換え円順列変異体が近年報告されている。
【０００８】
現在までに報告された組換えＴＲＡＩＬタンパク質の肝細胞への毒作用は、変性の存在、すなわちポリヒスチジンタグと関連していると考えられ、一方、タグをつけていないＴＲＡＩＬは全身毒性を示さなかった。
【０００９】
しかしながら、更なる研究と開発の過程において、多くのがん細胞もまたＴＲＡＩＬに初回または獲得耐性を示すことがわかった（例えば国際特許第２００７／０２２２１４号参照）。ＴＲＡＩＬに対する耐性の機構は完全に理解されているわけではないが、細胞表面レセプターのレベルからシグナル伝達経路内のエグゼクティブカスパーゼへ及ぶ、ＴＲＡＩＬ誘発アポトーシス経路の様々なレベルで発揮されると考えられる。この耐性により、ＴＲＡＩＬの抗がん剤としての有用性が限定されている。
【００１０】
また、患者での臨床治験では、単独療法としてのＴＲＡＩＬの実際の有効性は低いことが示されている。この低い有効性および腫瘍のＴＲＡＩＬへの耐性を克服するために、放射線および化学療法薬との様々な併用療法をデザインし、相乗的なアポトーシス誘導効果が得られている（国際特許第２００９/００２９４７号；A．Almasan and A．Ashkenazi, Cytokine Growth Factor Reviews 14 (2003), 337-348; RK Srivastava, Neoplasis, Vol. 3, No. 6, 2001, 535-546, Soria J C et al.,J. Clin. Oncology, Vol. 28, No.9 (2010), p.1527-1533）。選択された一般的な化学療法薬（パクリタキセル、カルボプラチン）およびモノクロナール抗ＶＥＧＦ抗体とを併用した、がん処置のためのｒｈＴＲＡＩＬの使用が国際特許第２００９／１４０４６９号に記載されている。しかしながら、そのような併用は必然的に従来の化学療法または放射線療法の公知の欠点が問題となるであろう。
【００１１】
メタロプロテアーゼ切断部位リンカーを連結したＴＲＡＩＬおよび血管新生阻害剤バソスタチンの配列を有する融合タンパク質の構築物が、腫瘍細胞におけるアポトーシス誘発効果を発揮すると、A.I. Guo et al., Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology 2008, vol. 24 (10), 925-930に記載されている。血管新生阻害剤タムスタチンのＴｕｍｓｔａｔｉｎ１８３−２３０およびＴＲＡＩＬ１１４−２８１の配列を有する融合タンパク質の構築物、膵がん細胞のアポトーシスを誘発すると、N. Ren et al., Academic Journal of Second Military Medical University 2008, vol. 28 (5), 676-478に記載されている。
【００１２】
米国特許第２００５／２４４３７０号および対応する国際特許第２００４／０３５７９４号には、エフェクタードメインとしてのＴＲＡＩＬ９５−２８１が、細胞表面結合ドメインとしてのＴＮＦファミリーリガンドＣＤ４０の他のメンバーの細胞外部分とペプチドリンカーにより連結した構築物が開示されている。この構築物は、ＣＤ４０部分の結合を介して活性化されると記載されている。
【００１３】
更に、ＴＲＡＩＬ療法に関する問題点は、安定性が低いこと、および投与後に身体から急速に消失することである。
【００１４】
がん治療におけるサイトカインの有利な効果も知られている。サイトカインファミリーのメンバーとしては、免疫系を刺激するタンパク質であるインターフェロンがある。インターフェロンは、抗がん剤または補助抗がん治療薬として重要である（Borden and Williams, Interferons, Cancer Medicine, 5th edition, 815-824, 2000）。インターフェロンの効果の１つとして、ＴＲＡＩＬリガンドを含む複数のアポトーシス促進性因子を強く刺激することが示されている。
【００１５】
ＩＩ型インターフェロン群として代表的なものに、可溶性ダイマーサイトカインであるインターフェロン  ガンマ（ＩＦＮ−γ）がある。ＩＦＮ−γは、ＮＫ、ＮＫＴ、Ｔｈ１、Ｔｃ、および樹状細胞により分泌される。ＩＦＮ−γリガンドは２種類のレセプターＩＦＮ−γＲαおよびＩＦＮ−γＲβ１に結合し、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を活性化する。その効果の１つは、ヒト単球を強く刺激してＴＲＡＩＬタンパク質を生成することであり、それによりがん細胞を除去する能力に重大な影響を与える（Griffith et al., J. Exp. Med., 189: 1343-1353, 1999）。
【００１６】
インターフェロン  ガンマは、ＩＦＮガンマレセプターを活性化して抗体依存性毒性を刺激し、細胞を腫瘍細胞に結合するプロセスを強化する。更に、ＩＦＮガンマはカスパーゼを活性化し、がん細胞におけるアポトーシスを誘発する。更に、ＴＲＡＩＬにより刺激されたアポトーシスに耐性を示す多くの腫瘍系統において、インターフェロン  ガンマが相乗的に作用して、ＴＲＡＩＬへの感受性に貢献することが示されている（Wang et al., Oncogene, 23: 928-935, 2004）。しかしながら、ＩＦＮガンマを使用した既存の治療法は、がんの処置に使用するには十分な効果を示すものではない。
【００１７】
また、インターフェロン  アルファが骨髄腫、リンパ腫および肝がん細胞においてＴＲＡＩＬの過剰生産を誘発する有益な効果を有することも示されている（Chen and et al., Blood, 98: 2183-21192; Herzer et al., Cancer Res. 69(3): 855-862, 2009）。インターフェロン  アルファは、生物体の疾患への自然応答を強化させる生体応答修飾物質とみなされており、細胞性および体液性免疫の両方に影響し、抗がん抗体の生産を刺激し、マクロファージ、ＮＫ細胞およびリンパ球の細胞毒性を活性化する。ＩＮＦアルファはがん細胞上でのＨＬＡ組織適合抗原の発現も増加させ、免疫細胞によるそれらの認識を容易にし、がん細胞の増殖および分裂の減速、その結果それらの死を仲介する。
【００１８】
インターフェロン  アルファは、有毛細胞白血病、黒色腫、腎がん、骨髄芽球性および骨髄球性白血病、リンパ腫、カポジ肉腫および他の血液の腫瘍性疾患などの種々のがんの処置に使用されてきた（Folkman J., N. Engl. J. Med. 1995, 333: 1757-1763; Sidky YA, Borden EC. Cancer Res. 1987. 47: 5155-5161; Iwagak H, Hizuta A, Yoshino T et al., Anticancer Res. 1993, 13: 13-15; Rubinger M, Plenderleith IH, Lertzman,M et al., Chest. 1995, 108: 281-282）。しかしながら、患者において治療効果を得るために必要な用量では、好中球減少、インフルエンザ様症状、倦怠感、食欲不振および肝機能障害などの毒作用が観察された。これらの副作用のため、インターフェロン  アルファ療法はしばしば中断され、この療法を無効としている。更に、インターフェロン  アルファをはじめ大部分のサイトカインの生物学的半減期は短く数時間程度であり、そのために頻繁に投与する必要がある。様々な理由により、薬剤を頻繁に使用することは患者にとって（特に長期処置においては）不便である。このため、インターフェロン−アルファの徐放製剤の設計が必要とされている。
【００１９】
インターフェロン  アルファの特性を改良するためのいくつかの試みがなされている。発現した融合タンパク質の正しい折り畳みを可能とするリンカーを備える担体タンパク質とのヘテロ二量体融合化により、インターフェロンの生物学的半減期を延長するための試みが、例えば米国特許第７９４３７３３号に開示されている。他の試みは、インターフェロンの生物活性型、すなわち、レセプター部位の亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）で２つのモノマーが逆平行に連結して生成された、自然に生成した非共有結合性ホモ二量体の分解構造に基づくものである（R. Radhakrishnan, Structure 1996, Vol. 4, No. 12, 1453-1463）。グリシン‐セリンリンカーを介して連結したインターフェロン  アルファのホモ二量体の構築物が、リトアニア特許出願第２０１００１２号に記載されているが、活性データは提示されていない。
【００２０】
ＩＦＮｙもまた、２つの同一なポリペプチド鎖が逆平行の態様で配向して対称分子を生成した、非共有結合的に会合したホモ二量体として作用することが知られている（Ealick S. E., Science (1991) 262, 698-702）。従って、ＩＦＮｙ二量体がレセプター結合部位をより効率的に占有できる可能性があるが、この仮説は臨床的に確認されていない。
【００２１】
上記した副作用のないアルファ  インターフェロンの誘導体を開発する試みにより、持続性を有するペグアルファ  インターフェロンが処置に使用されるようになった。ペグ化は、哺乳動物の体内へタンパク質を投与するための一般的な方法の１つであり、活性物質の副作用の抑制または排除を目的とする。ペグ化の原理は、修飾した分子の回りに保護障壁を形成することであり、該物質を所望の濃度に長時間保つことが可能となる（薬物動態学および薬力学的特性の変化による）。吸収時間が延長され、体内からの消失に時間がかかることになる。
【００２２】
これらのパラメータ値は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子の構造：結合部位の鎖長、直線性、分岐度、種類および数、および付加したグリコール分子の数に依存する［Delgado C, Francis GE, Fisher D., ＰＥＧ連結タンパク質の使用および特性, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1992; 9 (3-4): 249-304］。
【００２３】
ペグ化がインターフェロンのレセプターへの結合様式に影響を与えることはない。前臨床研究により、ペグ化インターフェロン  アルファが、ＩＦＮα−２ａレセプターに結合し、腫瘍細胞培養物およびヒト腎がん細胞を移植したマウスでの試験により確認されたものと同様またはそれ以上の生体外での生物活性を発揮することが実証されている［Nieforth K, Nadeau R, Patel IH, Mould D. 健常な対象におけるインターフェロンα−２ａおよびポリエチレングリコール修飾誘導体の生体内活性の比較のためＭＸタンパク質誘発の間接薬力学的刺激モデルの使用、Clin. Pharmacol. Ther. 1996; 59: 636-46; Paul G et al．ペグ化インターフェロンα−２ｂ：薬物動態学、薬力学、安全性および予備的な効能データ．Clin. Pharmacol. Ther. 2000; 68: 556-67］。
【００２４】
動物モデル実験で有望なデータが得られたにもかかわらず、それぞれ４０ｋＤａの分岐および１２ｋＤａの直鎖ＰＥＧ鎖がＩＦＮαに付加している、市販のペグ化インターフェロン含有製剤であるペグイントロン（登録商標）およびペガシス（登録商標）（G. Pasut, F. M. Veronese, Prog. Polym. Sci. 32 (2007) 933-961）は、対応する未修飾インターフェロン分子と定性的に類似あるいはより劣悪な安全プロフィールを示した(Bukowski R. M. et al., Cancer, 95 (2): 389-96 (200.2); Bukowski R.M. et al., Journal of Clinical Oncology, 20 (18): 3841-3949 (200.2); Motzer, R.J. et al., J. Clin. Oncol., 19 (5): 1312-9 (2001); Tong M.J., Journal of Interferon and Cytokine Research, 18: 81-86 (1998); Yao G.Βl., Journal of Gastroenterology and Hepatolog., 15: 1165-1170 (2000); Heathcote E.J. et al, N. Engl. J. Med., 343 (23): 1673-80 (2000); Tong M.J. et al., Hepatology; 26 (3): 747-54 (1997))。
【００２５】
ペグ化ＩＦＮα療法の最も頻繁に観察された副作用としては、用量依存的悪心、食欲不振、筋肉の硬化が挙げられる。更に、より長期の療法では、重篤な疲労、神経毒性、肝臓の機能不全および骨髄機能の抑制などの用量規制を示した（７．５μｇ／ｋｇ以上の用量のペグイントロン（登録商標））（Bukowski R.M. et al., Cancer; 95 (2): 389-96 (2002)）。
【００２６】
従って、ＴＲＡＩＬタンパク質あるいはインターフェロンファミリーのタンパク質（特にペグ化により修飾されたものも含めて）に基づく抗がん療法がともに臨床的に採用されているにもかかわらず、それらは十分に効果的ではなく、多数の公知の問題点があり、最も深刻で制限を課すものの１つは、処置の有効性が限定されていること、がん細胞に対する選択性の欠如、副作用および初回または獲得耐性があることである。がん細胞に対して生体内で効果的かつ選択的であるような、インターフェロンおよびＴＲＡＩＬタンパク質のそれぞれの活性に基づいたがん療法の改良が依然必要とされている。使用可能な薬剤の種類を広げかつより効果的（細胞障害性）かつ選択的である薬剤を見出すことを可能とする新しい抗がん剤が、喫緊に必要とされている。また、安全性が向上し、薬物動態学が改良された新しい選択的薬剤が要望されている。
【００２７】
この問題を解決するために、本発明は、ＴＲＡＩＬから誘導したドメインと免疫系刺激活性を有する短いエフェクターペプチドドメインとを取り込んだ融合タンパク質であって、エフェクターペプチドがＴＲＡＩＬ断片を含まず、エフェクターペプチドがＴＲＡＩＬの作用を強化または補完する、新規の融合タンパク質を提供する。更に、多くの場合に、本発明の融合タンパク質が、可溶型ＴＲＡＩＬおよびその配列の断片からなる変異体よりも有力であり、同様にそれぞれのエフェクターペプチドよりも有力であることがわかった。多くの場合に、新規融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬへの耐性の問題も解決する。更に、エフェクターペプチドの取り込みにより、腫瘍におけるタンパク質の半減期を延長し、保持時間を増加させ、効率を向上させる。更に、いくつかの変異体では、新規融合タンパク質はＰＥＧに連結することが可能であり、それによって、非特異的プロテアーゼに対する保護作用を発揮させ、かつ、特に生物学的半減期の延長に関して、薬物動態学および薬力学特性を改善する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
図の説明
次に、本発明を図面を参照して詳細に説明する。
【００２９】
【図１】図１は、例１、例２、例３および例４による本発明の融合タンパク質の構造を模式的に示す。
【００３０】
【図２】図２は、例５、例６、例７、例８、例９、例１０および例１１による本発明の融合タンパク質の構造を模式的に示す。
【００３１】
【図３】図３は、例１２、例１３、例１４および例１５による本発明の融合タンパク質の構造を模式的に示す。
【００３２】
【図４】図４は、例１６および例１７による本発明の融合タンパク質の構造を模式的に示す。
【００３３】
【図５】図５は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１、ｒｈＴＲＡＩＬ９５−２８１および例１２、例５、例３および例１４の融合タンパク質の、比楕円率で表した円二色性スペクトルを示す。
【００３４】
【図６】図６は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較して、例３、例１２および例１４の本発明の融合タンパク質で処置した、結腸がんＨＣＴ１１６を負荷したＣｒｌ：ＣＤ１−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウスにおける腫瘍体積変化（初期値の％）を示す。
【００３５】
【図７】図７は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較して、例３、例１２および例１４の本発明の融合タンパク質で処置した、結腸がんＨＣＴ１１６を負荷したＣｒｌ：ＣＤ１−Ｆｏｘｎ１ｎｕ１マウスにおける、腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）を示す。
【００３６】
【図８】図８は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較して、例１４の本発明の融合タンパク質で処置した、結腸がんＨＣＴ１１６を負荷したＣｒｌ：ＳＨＯ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＨｒｈｒマウスにおける腫瘍体積変化（初期値の％）を示す。
【００３７】
【図９】図９は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較して、例１４の本発明の融合タンパク質で処置した、結腸がんＨＣＴ１１６を負荷したＣｒｌ：ＳＨＯ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＨｒｈｒマウスにおける腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）を示す。
【００３８】
【図１０】図１０は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較して、例１４の本発明の融合タンパク質で処置した、肝がんＰＬＣ／ＰＲＦ／５を負荷したＣｒｌ：ＳＨＯ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＨｒｈｒマウスにおける腫瘍体積変化（初期値の％）を示す。
【００３９】
【図１１】図１１は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較して、例１４の本発明の融合タンパク質で処置した、肝がんＰＬＣ／ＰＲＦ／５を負荷したＣｒｌ：ＳＨＯ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＨｒｈｒマウスにおける腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）を示す。
【００４０】
【図１２】図１２は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較して、例１４の本発明の融合タンパク質で処置した、肝がんＨｅｐＧ２を負荷したＣｒｌ：ＳＨＯ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＨｒｈｒマウスにおける腫瘍体積変化（初期値の％）を示す。
【００４１】
【図１３】図１３は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較して、例１４の本発明の融合タンパク質で処置した、肝がんＨｅｐＧ２を負荷したＣｒｌ：ＳＨＯ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＨｒｈｒマウスにおける腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）を示す。
【発明の概要】
【００４２】
発明の詳細な説明
本発明は、
可溶型ｈＴＲＡＩＬタンパク質配列の機能的断片であって、ｈＴＲＡＩＬ９５より小さくない位置にあるアミノ酸で始まる断片、または７０％以上の配列同一性を有する該機能的断片のホモログであるドメイン（ａ）；および
免疫賦活性エフェクターペプチド配列であるをドメイン（ｂ）を含み、
ドメイン（ｂ）の配列が、ドメイン（ａ）のＣ末端および／またはＮ末端に付加している融合タンパク質に関する。
【００４３】
「可溶型ｈＴＲＡＩＬ配列の機能的可溶性断片」とは、哺乳動物の細胞において細胞の表面上のレセプターに結合することでアポトーシス誘導シグナルを誘発可能な、可溶型ｈＴＲＡＩＬの任意の断片を意味するものとして理解されるべきである。
【００４４】
ＴＲＡＩＬ配列の少なくとも７０％ホモログが存在することは、当該分野では公知であることは当業者には理解されよう。
【００４５】
本発明の融合タンパク質におけるエフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ｈＴＲＡＩＬタンパク質でも、ｈＴＲＡＩＬタンパク質の断片の一部でもないことを理解されたい。
【００４６】
本発明において「ペプチド」とは、ペプチド結合により互いに連結した複数のアミノ酸からなる分子であると理解されたい。従って、本発明による「ペプチド」という用語には、オリゴペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質が含まれる。
【００４７】
本発明において、ペプチドのアミノ酸配列は、当該分野で採用されている通常の方法、すなわちペプチドのＮ末端（Ｎ終末端）からＣ末端（Ｃ終末端）の方向で表示する。従って、すべての配列は、直線状の左側にＮ末端を右側にＣ末端を示している。
【００４８】
本発明の融合タンパク質は、ドメイン（ａ）のＣ末端またはＮ末端に付加したエフェクターペプチドの単一のドメイン（ｂ）を含むことができる。
【００４９】
ある実施態様では、ドメイン（ａ）は、ｈＴＲＡＩＬ９５からｈＴＲＡＩＬ１２２までの範囲（両端を含む）のアミノ酸から、ｈＴＲＡＩＬ２８１のアミノ酸までを含むｈＴＲＡＩＬ配列の断片である。
【００５０】
特に、ドメイン（ａ）は、ｈＴＲＡＩＬ９５−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１６−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１２０−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１２１−２８１およびｈＴＲＡＩＬ１２２−２８１に対応する配列からなる群から選択することができる。ｈＴＲＡＩＬ９５−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１６−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１２０−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１２１−２８１およびｈＴＲＡＩＬ１２２−２８１が、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号Ｐ５０５９１のｈＴＲＡＩＬの公知の配列において、それぞれ番号９５、１１４、１１６、１２０、１２１および１２２で印されたアミノ酸で始まるヒトＴＲＡＩＬタンパク質の断片を示すことは当業者には明らかであろう。
【００５１】
他の実施態様では、ドメイン（ａ）は、ｈＴＲＡＩＬ９５より小さくないアミノ酸位置で始まりアミノ酸ｈＴＲＡＩＬ２８１で終わる可溶型ｈＴＲＡＩＬタンパク質配列の機能的断片のホモログであり、その配列の７０％以上、好ましくは８５％が元の配列と同等である。
【００５２】
この実施態様の特定の変異体では、ドメイン（ａ）は、ｈＴＲＡＩＬ９５−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１６−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１２０−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１２１−２８１およびｈＴＲＡＩＬ１２２−２８１に対応する配列からなる群から選択された断片のホモログである。
【００５３】
ｈＴＲＡＩＬ断片のホモログは、この断片のアミノ酸配列の変異／修飾物であり、１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、および１５％以下のアミノ酸など、少なくとも１つのアミノ酸が変更されており、修飾された配列の断片がｈＴＲＡＩＬ配列の機能性、すなわち細胞表面デスレセプターに結合して哺乳動物の細胞におけるアポトーシスを誘発する能力を保持するものであることを理解されたい。アミノ酸配列の修飾には、例えばアミノ酸の置換、欠質、切断および／または付加が含まれる。
【００５４】
好ましくは、修飾した配列を有するｈＴＲＡＩＬ断片のホモログは、ｈＴＲＡＩＬの未変性断片と比較して、デスレセプターＤＲ４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）またはＤＲ５（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）に対して改良された親和性を示す。
【００５５】
「改良された親和性」という用語は、向上した親和性および／またはレセプター選択性を変更した親和性を意味する。
【００５６】
好ましくは、修飾した配列を有するｈＴＲＡＩＬ断片のホモログは、ｈＴＲＡＩＬの未変性の断片と比べて、デスレセプターＤＲ４およびＤＲ５に対して向上した親和性を示す。
【００５７】
特に好ましくは、修飾した配列を有するｈＴＲＡＩＬ断片のホモログは、デスレセプターＤＲ４と比較して、デスレセプターＤＲ５に対して向上した親和性を示す、すなわち選択性ＤＲ５／ＤＲ４が向上している。
【００５８】
また好ましくは、修飾した配列を有するｈＴＲＡＩＬ断片のホモログは、レセプターＤＲ１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ３）および／またはＤＲ２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ４）への親和性に対して、デスレセプターＤＲ４および／またはＤＲ５へ向上した選択性を示す。
【００５９】
ｈＴＲＡＩＬの修飾がデスレセプターＤＲ４およびＤＲ５に対する親和性および／または選択性を増加させることは、例えば下記の刊行物により当業者には公知である；Tur V，van der Sloot AM，Reis CR，Szegezdi E，Cool RH，Samali A，Serrano L，Quax WJ「構造に基づく設計により得たＤＲ４選択的腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）変異体」J. Biol. Chem. 2008 Jul 18; 283 (29): 20560-8（ＤＲ４に対する選択性を向上させたＤ２１８Ｈ変異について記載）、またはGasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP「デスレセプター５への選択性を向上した新たなＴＲＡＩＬ変異体ＤＲ５−ＡおよびＤＲ５−Ｂの生成」Apoptosis, 2009 Jun; 14 (6): 778-87（ＤＲ４に対する親和性が減少したＤ２６９Ｈ変異を記載）。また、ＤＲ１およびＤＲ２レセプターに比べて、ＤＲ４およびＤＲ５から選択された１つのレセプターに対する親和性を向上させたｈＴＲＡＩＬ変異体およびＤＲ４に比べてレセプターＤＲ５への親和性を向上させたｈＴＲＡＩＬ変異体が、国際特許第２００９０７７８５７号および国際特許第２００９０６６１７４号に記載されている。
【００６０】
好適な変異は、１３１，１４９，１５９，１９３，１９９，２０１，２０４，２０４，２１２，２１５，２１８および２５１からなる群から選択された未変性ｈＴＲＡＩＬの位置での１つ以上の変異であり、アミノ酸を、特にリジン、ヒスチジンまたはアルギニンなどの塩基性アミノ酸またはグルタミン酸またはアスパラギン酸などのアミノ酸で置換することを含む変異である。特に、国際特許第２００９０６６１７４号に記載されるように、Ｇ１３１Ｒ，Ｇ１３１Ｋ，Ｒ１４９Ｉ，Ｒ１４９Ｍ，Ｒ１４９Ｎ，Ｒ１４９Ｋ，Ｓ１５９Ｒ，Ｑ１９３Ｈ，Ｑ１９３Ｋ，Ｎ１９９Ｈ，Ｎ１９９Ｒ，Ｋ２０１Ｈ，Ｋ２０１Ｒ，Ｋ２０４Ｅ，Ｋ２０４Ｄ，Ｋ２０４Ｌ，Ｋ２０４Ｙ，Ｋ２１２Ｒ，Ｓ２１５Ｅ，Ｓ２１５Ｈ，Ｓ２１５Ｋ，Ｓ２１５Ｄ，Ｄ２１８Ｙ，Ｄ２１８Ｈ，Ｋ２５１Ｄ，Ｋ２５１ＥおよびＫ２５１Ｑからなる群から選択された１つ以上の変異が挙げられる。
【００６１】
また、好適な変異は、１９５，２６９および２１４からなる群から選択された未変性ｈＴＲＡＩＬの位置での１つ以上の変異であり，アミノ酸を、特にリジン、ヒスチジンまたはアルギニンなどの塩基性アミノ酸で置換することを含む変異である。特に、国際特許第２００９０７７８５７号に記載されるように、Ｄ２６９Ｈ，Ｅ１９５Ｒ，およびＴ２１４Ｒからなる群から選択された１つ以上の変異が挙げられる。
【００６２】
ある実施態様では、ｈＴＲＡＩＬ断片のホモログであるドメイン（ａ）は、国際特許第２００９０６６１７４号に記載されるように未変性のＴＲＡＩＬ配列のＤ２１８Ｈ変異体、またはGasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP, Apoptosis 2009 Jun; 14 (6): 778-87に記載されるように未変性ＴＲＡＩＬ配列のＹ１８９Ｎ−Ｒ１９１Ｋ−Ｑ１９３Ｒ−Ｈ２６４Ｒ−Ｉ２６６Ｒ−Ｄ２６９Ｈ変異体から選択される。
【００６３】
ドメイン（ｂ）の免疫賦活性のエフェクターペプチドは、特にヒト単球を強く刺激してＴＲＡＩＬタンパク質を生成するサイトカインペプチドであることができ、がん細胞を排除する能力に重要な影響を与える。
【００６４】
本発明の融合タンパク質のある実施態様では、エフェクターペプチドは、配列番号１７（ＩＮＦアルファ２ｂ由来）、配列番号１８（ＩＮＦ  ガンマ由来）、配列番号１９（ＩＮＦ  ガンマの偽二量体(pseudodimer)）、配列番号４６（インターフェロン  アルファ２ｂの偽二量体）および配列番号４７（インターフェロン  アルファのコンセンサス配列）からなる群から選択された免疫賦活性作用を有するペプチドである。
【００６５】
上記群のエフェクターペプチドはＴＲＡＩＬの過剰発現を刺激するペプチドであり、具体例として配列番号１７で示されるインターフェロン  アルファ−サブユニット  ベータの１６５アミノ酸断片が挙げられる。
【００６６】
本発明の融合タンパク質に取り込まれたインターフェロン  アルファ  ベータ  サブユニットの配列を含むペプチドは、効果的にがん細胞を排除すると考えられる。
【００６７】
他のエフェクターペプチドは、配列番号１８で示されるインターフェロン  ガンマの１２４アミノ酸断片である。
本発明の融合タンパク質に取り込まれたインターフェロン  ガンマの配列を含むペプチドは、効果的にがん細胞を排除すると考えられる。
【００６８】
上記群のエフェクターペプチドは、２つのヒトインターフェロン  ガンマ  サブユニットの融合物をなす２６３アミノ酸ペプチドであり、Landar’a et al.により報告されたＩＮＦ  ガンマの単鎖の偽二量体を形成する（J. Mol. Biol. 299: 169-179, 2000）。得られる単鎖のタンパク質変異体は、インターフェロン−ガンマに期待される生理活性および好適なレセプターに結合する能力を保持している。このエフェクターペプチドは、配列番号１９で示される。
【００６９】
上記群の他のエフェクターペプチドは３５１アミノ酸ペプチドであり、ＩＮＦアルファ２ｂの単鎖の偽二量体を形成する２つのヒトインターフェロン  アルファ２ｂサブユニットの融合物であり、ＩＦＮアルファ２ｂサブユニット配列の第二の鎖は未変性の配列に対して逆方向となっている（すなわちＣ末端からＮ末端まで）。得られるエフェクターペプチドは、インターフェロン  アルファ２ｂの２つの「未変性の」Ｃ−末端同士が結合していることに特徴付けられる。自然に存在するＩＦＮ  アルファダイマーにおけるモノマーはそれらのＣ末端により連結されている。一方、Ｎ末端はレセプターとの相互作用に係っており、亜鉛イオンの二量体化プロセスでの配位のために適切な環境を提供する（グルタミン酸残基４１および４２）。得られる単鎖のタンパク質変異体は、インターフェロン  アルファに期待される生理活性および好適なレセプターに結合する能力を保持する。このエフェクターペプチドは配列番号４６で示される。
【００７０】
他のエフェクターペプチドは配列番号４７で示されるインターフェロン  アルファの１６６アミノ酸コンセンサス配列である。このコンセンサス配列は米国特許第４，６９５，６２３号に開示されている。
【００７１】
本発明の融合タンパク質に取り込まれたインターフェロン  アルファのコンセンサス配列を含むペプチドは、効果的にがん細胞を排除すると考えられる。
【００７２】
がん細胞の表面に存在するＴＲＡＩＬレセプターに結合した際に、融合タンパク質はダブル効果を発揮するであろう。ドメイン（ａ）、すなわちＴＲＡＩＬの機能的断片または機能性を保持しているホモログは、その公知の拮抗活性、すなわち細胞表面上のデスレセプターへの結合およびアポトーシスの外的経路の活性化を実行する。免疫賦活性のペプチドを含む融合タンパク質の内部移行の後に、ドメイン（ｂ）は、ＴＲＡＩＬドメインの活性と並行して細胞内でその作用を発揮することが可能となる。このようにして、ＴＲＡＩＬの抗がん活性が、抗体を産出するＢ細胞の刺激、カスパーゼ７および８発現の刺激、またはＴＲＡＩＬの過剰発現の刺激などの他の要素および機構の活性化により増強される。
【００７３】
本発明の実施態様の１つでは、ドメイン（ａ）およびドメイン（ｂ）は、細胞環境、特に腫瘍細胞環境に存在するプロテアーゼにより認識されるプロテアーゼ切断部位の配列を含むドメイン（ｃ）の少なくとも１つにより連結されている。ドメイン（ｃ）の少なくとも１つによるドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）との連結とは、ドメイン（ａ）と（ｂ）との間に１つより多いドメイン（ｃ）、特に１つまたは２つのドメイン（ｃ）が存在できることを意味する。
【００７４】
プロテアーゼ切断部位は、以下から選択可能である：
―  メタロプロテアーゼＭＭＰにより認識される配列、特に配列番号２０により示されるＰｒｏ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｙ（一文字表示ではＰＬＧＬＡＧ）、
―  ウロキナーゼｕＰＡにより認識される配列、特に配列番号２１により示されるＡｒｇ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ａｒｇ（一文字表示ではＲＶＶＲ）、および
それらの組み合わせ。
【００７５】
本発明の実施態様の１つでは、プロテアーゼ切断部位は、任意の順番で相互に隣接する、メタロプロテアーゼＭＭＰにより認識される配列とウロキナーゼｕＰＡにより認識される配列との組み合わせである。
【００７６】
ある実施態様では、ドメイン（ｃ）は、ＭＭＰ／ｕＰＡ（配列番号２０／配列番号２１）の組み合わせ、すなわち配列Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ａｒｇ（一文字表示ではＰＬＧＬＡＧＲＶＶＲ）、またはｕＰＡ／ＭＭＰ（配列番号２１／配列番号２０）の組み合わせ、すなわち配列Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｙ（一文字表示ではＲＶＶＲＰＬＧＬＡＧ）である。そのような組み合わせは、繰り返すことができ、好ましくは２回繰り返される。
【００７７】
プロテアーゼであるメタロプロテアーゼＭＭＰおよびウロキナーゼｕＰＡは、腫瘍環境において過剰発現される。これらのプロテアーゼにより認識される配列の存在により、構築物の内部移行の際にドメイン（ａ）をドメイン（ｂ）から切断することが可能となり、すなわち機能性ドメイン（ｂ）の放出、従ってその活性化が可能となる。
【００７８】
プロテアーゼ切断部位の存在は、エフェクターペプチドの急速な放出を可能とすることにより、細胞に存在するプロテアーゼによる融合タンパク質のランダムな分解が起こる前に、ペプチドがその作用箇所へ移動される確率を増加する。
【００７９】
他の実施態様では、ドメイン（ａ）および（ｂ）の間に、本発明の融合タンパク質にＰＥＧ分子が付加するのに好適な配列であるドメイン（ｄ）（ＰＥＧリンカー）が更に取り込まれている。
【００８０】
そのようなＰＥＧリンカーは、例えば配列番号２２で示される公知の配列Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ（一文字表示ではＡＳＧＣＧＰＥ）である。ＰＥＧリンカーは、それぞれ配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５で示すＡｌａ  Ａｌａ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ（一文字表示ではＡＡＣＡＡ）、Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ（一文字表示ではＳＧＧＣＧＧＳ）およびＳｅｒ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ（一文字表示ではＳＧＣＧＳ）の中から選ぶことも可能である。
【００８１】
実施態様の１つでは、本発明のタンパク質はドメイン（ｃ）およびドメイン（ｄ）の両方を含む。
【００８２】
好ましい実施態様では、ドメイン（ｄ）は２つのドメイン（ｃ）の間、特にプロテアーゼ切断部位およびプロテアーゼ切断部位の組み合わせ、特にメタロプロテアーゼＭＭＰにより認識される配列（配列番号２０）、ウロキナーゼｕＰＡにより認識される配列（配列番号２１）、および組み合わせＭＭＰ／ｕＰＡ（配列番号２０／配列番号２１）またはｕＰＡ／ＭＭＰ（配列番号２１／配列番号２０）から選択された２つのドメイン（ｃ）の間に位置している。
【００８３】
従って、本発明の融合タンパク質のある実施態様では、プロテアーゼ切断部位は、上記のＰＥＧリンカー配列により分離された、メタロプロテアーゼＭＭＰにより認識される配列とウロキナーゼｕＰＡにより認識される配列との任意の順番での組み合わせである。
【００８４】
融合タンパク質がドメイン（ａ）および（ｂ）の間に、ＰＥＧリンカーのドメイン（ｄ）および切断部位のドメイン（ｃ）を有する場合には、ドメイン（ｃ）は、構築物の切断後ドメイン（ｄ）がドメイン（ａ）および（ｂ）から分離するような仕方で配置されることを理解すべきである。これらの２つのドメイン（ｃ）は、上記したように単一のプロテアーゼ切断部位およびその組み合わせの両方を含むことができる。換言すれば、もし融合タンパク質がＰＥＧリンカーを備えるドメイン（ｄ）および切断部位ドメイン（ｃ）の両方を含む場合、ドメイン（ｄ）はドメイン（ｃ）同士の間に配置される。本発明は、ドメイン（ｄ）がドメイン（ｃ）およびドメイン（ａ）の間またはドメイン（ｃ）およびドメイン（ｂ）の間に配置されるような変異体、すなわち構築物の切断後に、ＰＥＧ分子が本発明の融合タンパク質へ付加するのに好適な配列（ｄ）が、ドメイン（ａ）またはドメイン（ｂ）に付加したままであるような変異体を含まない。
【００８５】
融合タンパク質への付加に有益なＰＥＧ分子は、直鎖および分岐ＰＥＧ分子から選択することができる。分子量が４０００から２００００までの直鎖ＰＥＧ分子が特に有益である。
【００８６】
融合タンパク質の主要な機能性要素、切断部位ドメインおよびＰＥＧリンカー配列とは別に、本発明の融合タンパク質は、フレキシブルな立体グリシン−セリンリンカー（スペーサー）の中性の配列を含有してもよい。そのようなリンカー／スペーサーは公知であり文献に記載されている。融合タンパク質の配列へそれらを取り込むことは、宿主細胞における過剰発現のプロセスにより産出されたタンパク質を適切に折り畳む目的のためである。
【００８７】
フレキシブルな立体リンカーは、グリシンおよびセリン残基の任意の組み合わせから選択することができる。特に、フレキシブルなリンカーは、それぞれ配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８および配列番号５０で示される、Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ（一文字表示ではＧＳＧＧＧ）、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ（一文字表示ではＧＧＧＳ）、Ｘａａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ（一文字表示ではＸＧＧＳ）（Ｘａａは任意のアミノ酸または存在しないことを意味する）、およびＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（一文字表示ではＧＧＳＧ）からなる群から選択することができる。
【００８８】
本発明の融合タンパク質の具体的な実施態様は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号４５で示されるタンパク質からなる群から選択された、免疫賦活性のペプチドを含む融合タンパク質である。
【００８９】
本発明の融合タンパク質の他の具体的な実施態様は、配列番号４４で示される、免疫賦活性のペプチドを含む融合タンパク質である。
【００９０】
本発明の融合タンパク質の他の具体的な実施態様は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１で示されるタンパク質からなる群から選択された、免疫賦活性のペプチドを含む融合タンパク質である。
【００９１】
本発明の融合タンパク質の他の具体的な実施態様は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５で示されるタンパク質からなる群から選択された、免疫賦活性のペプチドを含む融合タンパク質である。
【００９２】
上記した代表的な融合タンパク質の構造の詳細は、図１〜図３および図４および下記の例に示される。
【００９３】
本発明によれば、「融合タンパク質」は、２つ以上のタンパク質またはそれらの断片を含有し、さらなる化学リンカーを有さずに各ペプチド鎖内でペプチド結合により共有結合されている、単一のタンパク質分子を意味する。
【００９４】
融合タンパク質は、あるいはタンパク質構築物またはキメラタンパク質と呼ぶことも可能である。本発明によれば、「構築物」または「キメラタンパク質」の用語が使用される場合は、上記で定義された融合タンパク質を指すものと理解されたい。
【００９５】
このように定義される融合タンパク質が、ペプチドおよびタンパク質の公知の化学合成法により合成できることは、当業者にとっては明らかであろう。
【００９６】
融合タンパク質は、特に好適な樹脂を担体として使用した固相でペプチド合成の技術を使用して、ペプチドの化学合成法により合成することが可能である。そのような技術は当該分野で従来公知であり、特に例えばBodanszky and Bodanszky「ペプチド合成の原理」1984，シュプリンガー・フェアラーク，ニューヨーク，Stewart et al.「固相ペプチド合成」第２版，1984，Pierce Chemical Companyなどの研究論文に記載されている。
【００９７】
融合タンパク質は、連続したタンパク質としてペプチドの化学合成法により合成することが可能である。あるいは、タンパク質の個々の断片（ドメイン）を別々に合成した後、１つのペプチド断片のアミノ末端と他のペプチドのカルボキシ末端の縮合によるペプチド結合により１つの連続したペプチドに結合することができる。そのような技術は従来公知である。
【００９８】
得られたペプチドの構造を確認するために、ペプチドの分子量を決定する高分解能質量分析法などの、公知のペプチドのアミノ酸組成分析法が使用できる。ペプチド配列を確定するために、ペプチドを逐次分解してアミノ酸の配列を特定するプロテインシーケンサーも使用可能である。
【００９９】
しかしながら、本発明の融合タンパク質は、宿主細胞において、融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列の遺伝子発現の方法により生成された組換えタンパク質であることが好ましい。
【０１００】
本発明の更なる側面は、上記に定義した融合タンパク質をコードしている、ポリヌクレオチド配列、特にＤＮＡ配列である。
【０１０１】
本発明による、上記に定義した融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列、特にＤＮＡは、好ましくは大腸菌における発現に最適化された配列である。
【０１０２】
また、本発明の他の側面は、上記に定義した、本発明のポリヌクレオチド配列、特にＤＮＡ配列を有する発現ベクターである。
【０１０３】
また、本発明の他の側面は、上記に定義した発現ベクターを含む宿主細胞である。
本発明の融合タンパク質の発現のために好ましい宿主細胞は大腸菌細胞である。
【０１０４】
融合タンパク質などの組換えタンパク質の生成方法はよく知られている。簡単に言えば、この手法は、標的タンパク質のアミノ酸配列をコードし、宿主における標的タンパク質の発現を指示するポリヌクレオチド分子、例えばＤＮＡ分子の生成からなる。その後、標的タンパク質をコードしているポリヌクレオチド分子を、ポリペプチドの効率的な発現を確実にする適切な発現ベクターに組み込む。組換え発現ベクターはその後形質移入／形質転換用の宿主細胞に導入し、その結果形質転換された宿主細胞が生成される。その後、標的タンパク質を過剰発現するために形質転換された細胞を培養し、得られたタンパク質を精製し、必要に応じて、タンパク質の発現または精製に使用したタグ配列を切断により削除する。
【０１０５】
発現および精製の好適な手法は、例えば研究論文Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990),およびA.Staron et al., Advances Mikrobiol., 2008, 47, 2, 1983-1995に記載されている。
【０１０６】
コスミド、プラスミドまたは修飾したウイルスが、宿主細胞におけるＤＮＡ配列の導入・複製用の発現ベクターとして使用可能である。典型的には、プラスミドが発現ベクターとして使用される。好適なプラスミドは公知であり市販されている。
【０１０７】
本発明の発現ベクターは、本発明の融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド分子と、好適な宿主細胞に取り込まれたコード配列の転写・翻訳に必要な制御配列とを含む。制御配列の選択は、宿主細胞のタイプに依存しており、当業者により容易に行うことが可能である。そのような制御配列の例としては、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、コードする配列の前に挿入された転写開始シグナルを含むリボソーム結合配列、コードする配列の後に挿入された転写ターミネーター配列が挙げられる。更に、使用する宿主細胞およびベクターに拠るが、複製起点、更なるＤＮＡ制限部位、エンハンサー、および転写の誘導を可能とする配列などの他の配列を発現ベクターに導入することができる。
【０１０８】
また、発現ベクターは、限定された表現型を形質転換細胞に付与し、形質転換細胞の特異的選択を可能とするマーカー遺伝子配列を含むであろう。更に、ベクターは、標的タンパク質をコードする配列が挿入された組換えプラスミドで形質転換された細胞を、挿入のないプラスミドを取り込んだものから区別することを可能とする第二のマーカー配列を含んでも良い。典型的な抗生物質抵抗性マーカーが最も頻繁に使用されるが、当該分野で公知の他の任意のレポーター遺伝子を使用することができ、細胞内（生体内）にそれらが存在することはオートラジオグラフィー法、分光光度法または生物および化学発光によって容易に判断可能である。例えば、宿主細胞に拠るが、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子を使用することもできる。
【０１０９】
更に、発現ベクターは、例えば折り畳みを促進する周辺質などの適切な細胞コンパートメントへタンパク質を輸送するシグナル配列を含むことができる。更に、Ｎ末端に付加したＨｉｓタグまたはＣ末端に付加したＧＳＴなどのラベル／タグをコードしている配列が存在してもよく、それらにより、ニッケルカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーにより親和性の原理を用いた産出タンパク質の精製が促進される。宿主細胞におけるタンパク質分解に対してタンパク質を保護する配列や溶解性を向上する配列が更に存在しても良い。
【０１１０】
標的タンパク質の配列に付加した補助的な要素はその活性を阻害したり、あるいは例えば毒性などの他の理由により有害でありうる。そのような要素は除去すべきであり、除去は酵素または化学的切断により可能である。特に、アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質精製を可能とするために付加された６ｘヒスチジンタグであるＨｉｓタグまたはこのタイプの他のマーカーは、可溶型ＴＲＡＩＬタンパク質の肝毒性に対する既述の作用のため除去しなくてはならない。大腸菌またはバチルス・スブチリスなどの細菌、サッカロマイセス・セレビシエまたはピキア・パストリスなどの酵母菌などの原核生物の細胞および真核生物の細胞株（昆虫、哺乳動物、植物）などの、様々な公知の宿主細胞に基づいた異種発現系が使用できる。
【０１１１】
好ましくは、培養および遺伝子操作の容易性および大量の産出物が得られることから、大腸菌発現系が使用される。従って、本発明の融合タンパク質をコードしている標的配列を含むポリヌクレオチド配列は、大腸菌における発現に最適化されるものであり、すなわちコード配列中に、最先端レベルで公知の使用可能な配列変異体から選択される大腸菌における発現に最適なコドンを含むものである。更に、発現ベクターは、コード配列に付加した、大腸菌に好適な上記記載の要素を含むであろう。
【０１１２】
従って、本発明の好ましい実施態様では、大腸菌における発現に最適化された、本発明の融合タンパク質をコードしている配列を含むポリヌクレオチド配列は、以下のポリヌクレオチド配列からなる群から選択される：
【０１１３】
配列番号２９配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；配列番号３４；配列番号３５；配列番号３６；配列番号３７；配列番号３８；配列番号３９；配列番号４０；配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４８および配列番号４９、
【０１１４】
それらは、それぞれ以下のアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードする：
【０１１５】
配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４および配列番号１５、配列番号４４および配列番号４５。好ましい実施態様では、本発明は、上記の配列番号２９から配列番号４３、配列番号４８および配列番号４９のポリヌクレオチド配列からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列を含む大腸菌の形質転換に好適な発現ベクター、およびそのような発現ベクターにより形質転換された大腸菌細胞を提供する。
【０１１６】
形質転換、すなわちＤＮＡ配列の細菌宿主細胞、特に大腸菌への導入は、通常、例えば低温（４°Ｃ）にてカルシウムイオンで処理した後、熱ショック（３７〜４２°Ｃ）に供することにより、または電気穿孔法によりＤＮＡを取り込むように調製されたコンピテント細胞で行わる。そのような技術は公知であり、通常発現系の製造者により決定されるか、あるいはManiatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982などの文献や実験操作マニュアルに記載されている。
【０１１７】
以下、大腸菌発現系における本発明の融合タンパク質の過剰発現の手順を更に説明する。
【０１１８】
本発明は、また、有効成分として上記に定義した本発明の融合タンパク質、好適な薬学的に許容し得る担体、希釈剤および従来の補助成分を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、担体または希釈剤に溶解または分散した有効量の本発明の融合タンパク質と薬学的に許容し得る補助成分とを含むものであり、好ましくは単位剤形に調剤された医薬組成物または複数の用量を含む製剤の形態である。剤形および調製方法は、その他の成分、担体および希釈剤と同様に当業者に公知であり、文献に記載されている。例えば、それらは研究論文Remington's Pharmaceutical Sciences, ed. 20, 2000, Mack Publishing Company, Easton, USAに記載されている。
【０１１９】
「薬学的に許容し得る担体、希釈剤、および補助成分」という用語は、当該分野で公知の、任意の溶媒、分散媒、界面活性剤、抗酸化剤、安定剤、保存剤（例えば抗細菌剤、抗真菌薬）、等張剤を含むものである。本発明の医薬組成物は、様々なタイプの担体、希釈剤および賦形剤を含むことができ、それは、経口、非経口、吸入、局所投与用の液体、固体およびエアロゾル形状などの特定の投与経路および所望の剤形や、注射によるなどの投与経路のために無菌でなくてはならないかなどに依存する。本発明による医薬組成物の好ましい投与経路は、非経口であり、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、腫瘍内などの注射経路、または単一のまたは連続した点滴静注が挙げられる。
【０１２０】
ある実施態様では、本発明の医薬組成物は、注射により直接腫瘍に投与することができる。他の実施態様では、本発明の医薬組成物は、静脈内投与することができる。更に他の実施態様では、本発明の医薬組成物は、皮下または腹腔内投与することが可能である。非経口投与用の医薬組成物は、必要に応じて適切なｐＨでありかつ体液と等張であるように緩衝させた薬学的に許容し得る水性または非水性媒体中の溶液または分散液であってもよく、組成物をレシピエントの組織または血液に適合させるための抗酸化剤、緩衝液、静菌剤および可溶性物質を含むことができる。組成物に含むことができる他の成分としては、例えば水、エタノールなどのアルコール、グリセリン、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなどのポリオール、トリグリセリド、植物油、リポソームなどのなどの脂質が挙げられる。物質の適切な流動性および粒径は、ヒドロキシプロピルセルロース・ポリソルベートなどの界面活性剤やレシチン等の被覆物質により達成できる。
【０１２１】
液体非経口組成物用の好適な等張剤としては、例えば、グルコースなどの糖類、および塩化ナトリウム、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１２２】
あるいは、注射または点滴による投与用の医薬組成物は、例えば発熱性物質除去蒸留水などの好適な担体で使用する直前に再構成する凍結乾燥した粉体などの粉体の形態であってもよい。
【０１２３】
また、非経口投与用の本発明の医薬組成物は、溶液、噴霧剤またはエアロゾルなどの経鼻投与の形態であってもよい。好ましくは、鼻腔内投与の形態は、水性溶液であり、鼻漏と類似の性質を保持するように、等張性であるか、ｐＨが約５．５〜６．５を保つように緩衝されている。更に、公知の鼻腔内投与用製剤に使用されるような保存剤または安定剤を含むであろう。
【０１２４】
組成物は、１つ以上の成分の酸化を遅延させる様々な抗酸化剤を含むことができる。更に、微生物の作用を阻止するために、組成物は、例えば、それらに限定されるものではないが、パラベン類、クロロブタノール、チメロサール、ソルビン酸、およびこのタイプの類似の公知の物質などの様々な抗細菌および抗真菌剤を含むことができる。一般に、本発明の医薬組成物は、例えば少なくとも約０．０１ｗｔ％の有効成分を含むことが可能である。より具体的には、組成物は、組成物単位の１重量％〜７５重量％、または表示された値に限定されるものではないが、例えば２５重量％〜６０重量％の有効成分を含むことができる。本発明による組成物の、ヒトを含む患者に投与される用量の実際の量は、体重、症状の重症度、処置する疾患のタイプ、以前のまたは併用の治療介入、患者および投与経路などの身体的および生理的因子により決定されるであろう。好適な単位用量、総用量および組成物における有効成分の濃度は、処置を行う医師により決定されるものである。
【０１２５】
組成物は、例えば患者の体重１キログラム当り約１マイクログラム〜１０００ミリグラムの用量、例えば５ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲または５ｍｇ／ｋｇ体重〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で投与することができる。融合タンパク質およびそれを含む組成物は抗がん性または抗腫瘍性を示し、がん疾患の処置に使用可能である。また、本発明は、ヒトなどの哺乳動物におけるがん疾患の処置用に上記に定義した本発明の融合タンパク質の使用を提供する。また、本発明は、ヒトなどの哺乳動物におけるがん疾患の処置方法を提供し、該方法は、そのような処置を必要とする対象に上記に定義した本発明の融合タンパク質の抗がん有効量を、必要に応じて適切な医薬組成物の形態で投与することを含むものである。
【０１２６】
本発明の融合タンパク質は、白血病、肉芽腫症、骨髄腫および他の血液系腫瘍などの血液系腫瘍の処置に使用可能である。融合タンパク質は、また、乳がん、非小細胞肺がんなどの肺がん、結腸がん、膵がん、卵巣がん、膀胱がん、前立腺がん、腎がん、脳がん等の固形腫瘍処置に使用可能である。がんの処置における融合タンパク質の投与経路としては、非経口経路が特に適切であり、例えば注射または点滴の形態、組成物、およびこの投与経路に適切な形態で本発明の融合タンパク質を投与することが含まれる。本発明を、以下に示す一般的な手順および具体的な融合タンパク質の例により、より詳細に説明する。
【０１２７】
融合タンパク質の過剰発現の一般的な手順
プラスミドの調製
標的融合タンパク質のアミノ酸配列を鋳型として使用して、それをコードしていおり、大腸菌における発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡ配列を生成した。そのような手順により、大腸菌における標的タンパク質合成のその後の工程の効率を向上することができる。その後、得られたヌクレオチド配列を自動合成した。更に、制限酵素ＮｄｅＩ（リーディング鎖の５’末端）およびＸｈｏＩ（リーディング鎖の３’末端）の切断部位を、標的タンパク質をコードしている得られた遺伝子に付加した。これらは、遺伝子をベクターｐＥＴ２８ａ（ノバジェン社）へクローン化するために使用した。それらは、タンパク質をコードしている遺伝子を他のベクターへクローン化するためにも使用できる。この構築物から発現された標的タンパク質は、Ｎ末端において、トロンビンにより認識される部位の後にポリヒスチジンタグ（６ヒスチジン）を有しており、これはその後のアフィニティークロマトグラフィーによる精製に利用される。
【０１２８】
得られた構築物の精度は、まず酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを使用した、単離したプラスミドの制限酵素分析により確認し、その後、標的タンパク質の全リーディングフレームの自動配列決定を行った。配列決定に使用したプライマーは、ベクターに存在するＴ７プロモーター（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’）およびＴ７ターミネーター（５’−ＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ−３’）配列に相補的である。得られたプラスミドは、製造者の推奨に従って形質転換された市販のE. coli株における標的融合タンパク質の過剰発現に使用した。選択培地（ＬＢ寒天、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ、１％グルコース）上に得られたコロニーを、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）および１％グルコースを添加したＬＢ液体培地での一夜培養物を調製するために使用した。振盪培養器中で約１５時間増殖後、培養物を適切な培養の接種のために使用した。
【０１２９】
融合タンパク質の過剰発現および精製−一般的手順Ａ
カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）および１００μＭ硫酸亜鉛を添加したＬＢ培地に、一夜培養物を接種した。培養物を、６００ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）が０．６０〜０．８０になるまで３７°Ｃで培養した。その後、ＩＰＴＧを０．２５〜１ｍＭの範囲の最終濃度で添加した。２５°Ｃで振盪しながら培養（３．５〜２０時間）後、培養物を６、０００ｇで２５分間遠心分離した。細菌ペレットを、５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾールを含むｐＨ７．４の緩衝液中に再懸濁した。懸濁液を、氷上で８分間超音波処理した（４０％振幅、１５秒パルス、１０秒間隔）。得られた抽出物を、２００００ｇ、４°Ｃで４０分間遠心分離して清澄化した。Ｎｉ−セルファロース（ＧＥヘルスケア社）樹脂を、細菌細胞抽出物の調製に使用した緩衝液で平衡化して前処理した。
【０１３０】
その後、樹脂を、抽出物の遠心分離で得た上澄み液と共に４°Ｃにて一晩培養した。その後、クロマトグラフ用カラムに充填し、５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールを含むｐＨ７．４の緩衝液１５〜５０容積で洗浄した。得られたタンパク質を、０．５ＭＮａＣｌを含むｐＨ７．４の５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４緩衝液中で、イミダゾール勾配によりカラムから溶出した。得られた画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。適切な画分を合わせて、１５０ｍＭＮａＣｌ、５００ｍＭＬ−アルギニン、０．１ｍＭＺｎＳＯ４、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むｐＨ７．２の５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液に対して４°Ｃで一晩透析し、同時に１０Ｈｉｓタグをトロンビン（１：５０）で切断した。切断後、ベンズアミジン・セファロースＴＭ樹脂を使用してトロンビンを標的融合タンパク質から分離した。生成物の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法（Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, NY, 1982）により分析した。
【０１３１】
融合タンパク質の過剰発現および精製−一般的手順Ｂ
カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）および１００μＭ硫酸亜鉛を添加したＬＢ培地に、一夜培養物を接種した。培養物を、６００ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）が０．６０〜０．８０になるまで３７°Ｃで培養した。その後、ＩＰＴＧを０．５〜１ｍＭの範囲の最終濃度で添加した。２５°Ｃで振盪しながら２０時間培養した後、培養物を６、０００ｇで２５分間遠心分離した。過剰発現後の細菌細胞は、５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、５ｍＭβ−メルカプトエタノール、０．５ｍＭＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）を含むｐＨ７．８の緩衝液中フレンチプレスで破壊した。得られた抽出物を、８０００ｇで５０分間遠心分離して清澄化した。得られた上澄み液を、Ｎｉ−セルファロース樹脂と共に一晩培養した。その後、タンパク質が結合した樹脂を、クロマトグラフ用カラムに充填した。
【０１３２】
結合していないタンパク質を含む画分を洗い流すために、カラムを、５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、５ｍＭベータ−メルカプトエタノール、０．５ｍＭＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）を含むｐＨ７．８の緩衝液１５〜５０容積で洗浄した。その後、ベッドに特異的に結合しているタンパク質の大部分を洗い流すために、カラムを、５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、１０％グリセリン、０．５ｍＭＰＭＳＦを含むｐＨ７．５の緩衝液で洗浄した。得られた画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, NY, 1982）により分析した。標的タンパク質を含む画分を合わせて、トロンビン（タンパク質４ｍｇに対して１Ｕ、８時間、１６oＣ）で切断しポリヒスチジンタグを除去した。その後、画分を製剤用緩衝液（５００ｍＭＬ−アルギニン、５０ｍＭＴｒｉｓ、２．５ｍＭＺｎＳＯ４、ｐＨ７．４）で透析した。
【実施例】
【０１３３】
例１．配列番号１の融合タンパク質  
【０１３４】
配列番号１のタンパク質は、３４５アミノ酸長および質量３９．８ｋＤａを有する融合タンパク質であり、ＴＲＡＩＬ配列１２２−２８１のＮ末端でヒトインターフェロン  アルファ（配列番号１７）の１６５アミノ酸サブユニット２ｂがエフェクターペプチドとして付加している。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列との間に、メタロプロテアーゼＭＭＰ（配列番号２０）およびウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２１）により認識されるプロテアーゼ切断部位の配列が順次相互に隣接して組み込まれており、そのために、エフェクターペプチドが、融合タンパク質の内部移行の際に腫瘍環境で切断される。
【０１３５】
この融合タンパク質の構造を図１に模式的に示す。そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ添付の配列表に示す配列番号１および配列番号２９である。
【０１３６】
上記構造を有する配列番号１のアミノ酸配列を鋳型として使用して、それをコードする配列番号２９のＤＮＡ配列を作製した。上記の一般的手順に従って、ＤＮＡコード配列を含むプラスミドを作製し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現は、ノバジェン社から入手した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を使用して一般的手順Ａに従って行った。タンパク質は、上記一般的手順に従って電気泳動により分離した。
【０１３７】
例２．配列番号２の融合タンパク質
配列番号２のタンパク質は、３４７アミノ酸長および質量４０ｋＤａを有する融合タンパク質であり、ＴＲＡＩＬ配列１２０−２８１のＣ末端でヒトインターフェロン  アルファ（配列番号１７）の１６５アミノ酸サブユニット２ｂがエフェクターペプチドとして付加している。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列との間に、メタロプロテアーゼＭＭＰ（配列番号２０）およびウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２１）により認識されるプロテアーゼ切断部位の配列が順次相互に隣接して組み込まれており、そのために、エフェクターペプチドが、融合タンパク質の内部移行の際に腫瘍環境で切断される。
【０１３８】
融合タンパク質の構造を図１に模式的に示す。そのアミノ酸配列、および大腸菌における発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ添付の配列表に示す配列番号２および配列番号３０である。
【０１３９】
上記構造を有する配列番号２のアミノ酸配列を鋳型として使用して、それをコードする配列番号３０のＤＮＡ配列を作製した。上記の一般的手順に従って、ＤＮＡコード配列を含むプラスミドを作製し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現は、ノバジェン社から入手した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を使用して一般的手順Ａに従って行った。タンパク質は、上記一般的手順に従って電気泳動により分離した。
【０１４０】
例３．配列番号３の融合タンパク質
配列番号３のタンパク質は、３５２アミノ酸長および質量４０．４ｋＤａを有する融合タンパク質であり、ＴＲＡＩＬ配列１２２−２８１のＮ末端でヒトインターフェロン  アルファ（配列番号１７）の１６５アミノ酸サブユニット２ｂがエフェクターペプチドとして付加している。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列との間に、メタロプロテアーゼＭＭＰ（配列番号２０）およびウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２１）により認識されるプロテアーゼ切断部位の配列の組み合わせが２つ組み込まれており、そのために、エフェクターペプチドが、融合タンパク質の内部移行の際に腫瘍環境で切断される。これら配列番号２０および配列番号２１の２つの組み合わせの間で、融合タンパク質には、ペグ化用リンカー（配列番号２２）が付加されている。
【０１４１】
融合タンパク質の構造を図１に模式的に示す。そのアミノ酸配列、および大腸菌における発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ添付の配列表に示す配列番号３および配列番号３１である。
【０１４２】
上記配列番号３のアミノ酸配列を鋳型として使用して、それをコードする配列番号３１のＤＮＡ配列を作製した。上記の一般的手順に従って、ＤＮＡコード配列を含むプラスミドを作製し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現は、ノバジェン社から入手した大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を使用して一般的手順Ｂに従って行った。タンパク質は、上記一般的手順に従って電気泳動により分離した。
【０１４３】
例４．配列番号４の融合タンパク質
配列番号４のタンパク質は、３５３アミノ酸長および質量４０．５ｋＤａを有する融合タンパク質であり、ＴＲＡＩＬ配列１２１−２８１のＣ末端でヒトインターフェロン  アルファ（配列番号１７）の１６５アミノ酸サブユニット２ｂがエフェクターペプチドとして付加している。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列との間に、メタロプロテアーゼＭＭＰ（配列番号２０）およびウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２１）により認識されるプロテアーゼ切断部位の配列の組み合わせが２つ組み込まれており、そのために、エフェクターペプチドが、融合タンパク質の内部移行の際に腫瘍環境で切断される。これら配列番号２０および配列番号２１の２つの組み合わせの間で、融合タンパク質には、ペグ化用リンカー（配列番号２２）が付加されている。
【０１４４】
融合タンパク質の構造を図１に模式的に示す。そのアミノ酸配列、および大腸菌における発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ添付の配列表に示す配列番号４および配列番号３２である。
【０１４５】
上記配列番号４のアミノ酸配列を鋳型として使用して、それをコードする配列番号３２のＤＮＡ配列を作製した。上記の一般的手順に従って、ＤＮＡコード配列を含むプラスミドを作製し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現は、ストラタジーン社から入手した大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３ｐＬｙｓＳＲＩＬ株およびノバジェン社から入手した大腸菌Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｚを使用して一般的手順Ｂに従って行った。タンパク質は、上記一般的手順に従って電気泳動により分離した。
【０１４６】
例５．配列番号５の融合タンパク質
配列番号５のタンパク質は、３００アミノ酸長および質量３４．７ｋＤａを有する融合タンパク質であり、ＴＲＡＩＬ配列１１６−２８１のＮ末端でヒトインターフェロン  ガンマの断片（配列番号１８）がエフェクターペプチドとして付加している。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列との間で、タンパク質は、メタロプロテアーゼＭＭＰ（配列番号２０）およびウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２１）により認識されるプロテアーゼ切断部位の配列を含む。
【０１４７】
融合タンパク質の構造を図２に模式的に示す。そのアミノ酸配列、および大腸菌における発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ添付の配列表に示す配列番号５および配列番号３３である。
【０１４８】
上記構造を有する配列番号５のアミノ酸配列を鋳型として使用して、それをコードする配列番号３３のＤＮＡ配列を作製した。上記の一般的手順に従って、ＤＮＡコード配列を含むプラスミドを作製し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現は、ノバジェン社から入手した大腸菌Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）株を使用して一般的手順Ａに従って行った。タンパク質は、上記一般的手順に従って電気泳動により分離した。
【０１４９】
例６．配列番号６の融合タンパク質
配列番号６のタンパク質は、３０７アミノ酸長および質量３５．１ｋＤａを有する融合タンパク質であり、ＴＲＡＩＬ配列１１６−２８１のＣ末端でヒトインターフェロン  ガンマの断片（配列番号１８）がエフェクターペプチドとして付加している。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列との間で、タンパク質は、メタロプロテアーゼＭＭＰ（配列番号２０）およびウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２１）により認識されるプロテアーゼ切断部位の配列を含む。
【０１５０】
タンパク質は、更にフレキシブルなリンカー、すなわち、ＴＲＡＩＬ配列とメタロプロテアーゼＭＭＰ切断部位との間にフレキシブルなグリシン−セリンリンカー（配列番号２７）を、ウロキナーゼｕＰａ切断部位とエフェクター配列との間にフレキシブルなグリシン‐セリンリンカー（配列番号２８）を含む。
【０１５１】
融合タンパク質の構造を図２に模式的に示す。そのアミノ酸配列、および大腸菌における発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ添付の配列表に示す配列番号６および配列番号３４である。
【０１５２】
上記構造を有する配列番号６のアミノ酸配列を鋳型として使用して、それをコードする配列番号３４のＤＮＡ配列を作製した。上記の一般的手順に従って、ＤＮＡコード配列を含むプラスミドを作製し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現は、ノバジェン社から入手した大腸菌Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）株を使用して一般的手順Ａに従って行った。タンパク質は、上記一般的手順に従って電気泳動により分離した。
【０１５３】
例７．配列番号７の融合タンパク質
配列番号７のタンパク質は、３１０アミノ酸長および質量３５．５ｋＤａを有する融合タンパク質であり、ＴＲＡＩＬ配列１１６−２８１のＮ末端でヒトインターフェロン  ガンマの断片（配列番号１８）がエフェクターペプチドとして付加している。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列との間で、タンパク質は、メタロプロテアーゼＭＭＰ（配列番号２０）およびウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２１）により認識されるプロテアーゼ切断部位の配列を含む。
【０１５４】
タンパク質は、更にフレキシブルなリンカー、すなわち、エフェクターペプチド配列とメタロプロテアーゼＭＭＰ切断部位との間に配列番号２６のフレキシブルなグリシン−セリンリンカーを、ウロキナーゼｕＰａ切断部位とＴＲＡＩＬ配列との間に配列番号２６のフレキシブルなグリシン‐セリンリンカーを含む。
【０１５５】
融合タンパク質の構造を図２に模式的に示す。そのアミノ酸配列、および大腸菌における発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ添付の配列表に示す配列番号７および配列番号３５である。
【０１５６】
上記構造を有する配列番号７のアミノ酸配列を鋳型として使用して、それをコードする配列番号３５のＤＮＡ配列を作製した。上記の一般的手順に従って、ＤＮＡコード配列を含むプラスミドを作製し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現は、ノバジェン社から入手した大腸菌Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）株を使用して一般的手順Ａに従って行った。タンパク質は、上記一般的手順に従って電気泳動により分離した。
【０１５７】
例８．配列番号８の融合タンパク質
配列番号８のタンパク質は、３１０アミノ酸長および質量３５．３ｋＤａを有する融合タンパク質であり、ＴＲＡＩＬ配列１１６−２８１のＣ末端でヒトインターフェロン  ガンマの断片（配列番号１８）がエフェクターペプチドとして付加している。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列との間で、タンパク質は、メタロプロテアーゼＭＭＰ（配列番号２０）およびウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２１）により認識されるプロテアーゼ切断部位の配列を含む。
【０１５８】
タンパク質は、更にフレキシブルなリンカー、すなわち、エフェクターペプチド配列とメタロプロテアーゼＭＭＰ切断部位との間にフレキシブルなグリシン−セリンリンカーＧＳＧＧＧ（配列番号２６）を、ウロキナーゼｕＰａ切断部位とＴＲＡＩＬ配列との間にフレキシブルなグリシン‐セリンリンカーＧＳＧＧＧ（配列番号２６）を含む。
【０１５９】
融合タンパク質の構造を図２に模式的に示す。そのアミノ酸配列、および大腸菌における発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ添付の配列表に示す配列番号８および配列番号３６である。
【０１６０】
上記構造を有する配列番号８のアミノ酸配列を鋳型として使用して、それをコードする配列番号３６のＤＮＡ配列を作製した。上記の一般的手順に従って、ＤＮＡコード配列を含むプラスミドを作製し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現は、ノバジェン社から入手した大腸菌Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）株を使用して一般的手順Ａに従って行った。タンパク質は、上記一般的手順に従って電気泳動により分離した。
【０１６１】
例９．配列番号９の融合タンパク質
配列番号９のタンパク質は、３１７アミノ酸長および質量３５．９ｋＤａを有する融合タンパク質であり、ＴＲＡＩＬ配列１１６−２８１のＮ末端でヒトインターフェロン  ガンマの断片（配列番号１８）がエフェクターペプチドとして付加している。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列との間に、メタロプロテアーゼＭＭＰ（配列番号２０）およびウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２１）により認識されるプロテアーゼ切断部位の組み合わせが組み込まれており、そのために、エフェクターペプチドが、融合タンパク質の内部移行の際に腫瘍環境で切断される。配列番号２０および配列番号２１の間で、融合タンパク質には、ペグ化用リンカー（配列番号２２）が付加されている。
【０１６２】
タンパク質は、更にフレキシブルなリンカー、すなわち、エフェクターペプチド配列とメタロプロテアーゼＭＭＰ切断部位との間にフレキシブルなグリシン−セリンリンカーＧＳＧＧＧ（配列番号２６）を、ウロキナーゼｕＰａ切断部位とＴＲＡＩＬ配列との間にフレキシブルなグリシン‐セリンリンカーＧＳＧＧＧ（配列番号２６）を含む。
【０１６３】
融合タンパク質の構造を図２に模式的に示す。そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ添付の配列表に示す配列番号９および配列番号３７である。
【０１６４】
上記構造を有する配列番号９のアミノ酸配列を鋳型として使用して、それをコードする配列番号３７のＤＮＡ配列を作製した。上記の一般的手順に従って、ＤＮＡコード配列を含むプラスミドを作製し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現は、ノバジェン社から入手したE. coliＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）株を使用して一般的手順Ａに従って行った。タンパク質は、上記一般的手順に従って電気泳動により分離した。
【０１６５】
例１０．配列番号１０の融合タンパク質
配列番号１０のタンパク質は、３３８アミノ酸長および質量３８．３ｋＤａを有する融合タンパク質であり、ＴＲＡＩＬ配列９５−２８１のＮ末端でヒトインターフェロン  ガンマの断片（配列番号１８）がエフェクターペプチドとして付加している。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列との間で、融合タンパク質はメタロプロテアーゼＭＭＰ（配列番号２０）およびウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２１）により認識されるプロテアーゼ切断部位の配列を含み、そのために、エフェクターペプチドが、融合タンパク質の内部移行の際に腫瘍環境で切断される。配列番号２１に隣接して、融合タンパク質には、ペグ化用リンカー（配列番号２２）が付加されている。
【０１６６】
タンパク質は、更にフレキシブルなリンカー、すなわち、エフェクターペプチド配列とメタロプロテアーゼＭＭＰ切断部位との間にフレキシブルなグリシン−セリンリンカーＧＳＧＧＧ（配列番号２６）を、ペグ化用リンカーとＴＲＡＩＬ配列との間にフレキシブルなグリシン‐セリンリンカーＧＳＧＧＧ（配列番号２６）を含む。
【０１６７】
融合タンパク質の構造を図２に模式的に示す。そのアミノ酸配列、および大腸菌における発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ添付の配列表に示す配列番号１０および配列番号３８である。
【０１６８】
上記構造を有する配列番号１０のアミノ酸配列を鋳型として使用して、それをコードする配列番号の３８ＤＮＡ配列を作製した。上記の一般的手順に従って、ＤＮＡコード配列を含むプラスミドを作製し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現は、ノバジェン社から入手したE. coliＢＬ２１（ＤＥ３）およびＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を使用して一般的手順Ａに従って行った。タンパク質は、上記一般的手順に従って電気泳動により分離した。
【０１６９】
例１１．配列番号１１の融合タンパク質
配列番号１１のタンパク質は、３１７アミノ酸長および質量３５．９ｋＤａを有する融合タンパク質であり、ＴＲＡＩＬ配列１１６−２８１のＣ末端でヒトインターフェロン  ガンマの断片（配列番号１８）がエフェクターペプチドとして付加している。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列との間で、融合タンパク質は、メタロプロテアーゼＭＭＰ（配列番号２０）およびウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２１）により認識されるプロテアーゼ切断部位の配列を含み、そのために、エフェクターペプチドが、融合タンパク質の内部移行の際に腫瘍環境で切断される。配列番号２０および配列番号２１の間で、融合タンパク質には、ペグ化用リンカー（配列番号２２）が付加されている。
【０１７０】
タンパク質は、更にフレキシブルなリンカー、すなわち、エフェクターペプチド配列とメタロプロテアーゼＭＭＰ切断部位との間にフレキシブルなグリシン−セリンリンカーＧＳＧＧＧ（配列番号２６）を、ウロキナーゼｕＰａ切断部位とＴＲＡＩＬ配列との間にフレキシブルなグリシン‐セリンリンカーＧＳＧＧＧ（配列番号２６）を含む。
【０１７１】
融合タンパク質の構造を図２に模式的に示す。そのアミノ酸配列、および大腸菌における発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ添付の配列表に示す配列番号１１および配列番号３９である。
【０１７２】
上記構造を有する配列番号１１のアミノ酸配列を鋳型として使用して、それをコードする配列番号３９のＤＮＡ配列を作製した。上記の一般的手順に従って、ＤＮＡコード配列を含むプラスミドを作製し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現は、ノバジェン社から入手したE. coliＢＬ２１（ＤＥ３）およびE. coliＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を使用して一般的手順Ａに従って行った。タンパク質は、上記一般的手順に従って電気泳動により分離した。
【０１７３】
例１２．配列番号１２の融合タンパク質
配列番号１２のタンパク質は、４４９アミノ酸長および質量５１．８ｋＤａを有する融合タンパク質であり、ＴＲＡＩＬ配列１１６−２８１のＮ末端でヒトインターフェロン  ガンマの一本鎖擬似ダイマー（配列番号１９）がエフェクターペプチドとして付加している。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列との間で、融合タンパク質は、メタロプロテアーゼＭＭＰ（配列番号２０）およびウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２１）により認識されるプロテアーゼ切断部位の配列を含み、そのために、エフェクターペプチドが、融合タンパク質の内部移行の際に腫瘍環境で切断される。
【０１７４】
タンパク質は、更にフレキシブルなリンカー、すなわち、エフェクターペプチド配列とメタロプロテアーゼＭＭＰ切断部位との間にフレキシブルなグリシン−セリンリンカーＧＳＧＧＧ（配列番号２６）を、ウロキナーゼｕＰａ切断部位とＴＲＡＩＬ配列との間にフレキシブルなグリシン‐セリンリンカーＧＳＧＧＧ（配列番号２６）を含む。
【０１７５】
融合タンパク質の構造を図３に模式的に示す。そのアミノ酸配列、および大腸菌における発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ添付の配列表に示す配列番号１２および配列番号４０である。
【０１７６】
上記構造を有する配列番号１２のアミノ酸配列を鋳型として使用して、それをコードする配列番号４０のＤＮＡ配列を作製した。上記の一般的手順に従って、ＤＮＡコード配列を含むプラスミドを作製し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現は、ノバジェン社から入手したE. coliＢＬ２１（ＤＥ３）およびE. coliＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を使用して一般的手順Ａに従って行った。タンパク質は、上記一般的手順に従って電気泳動により分離した。
【０１７７】
例１３．配列番号１３の融合タンパク質
配列番号１３のタンパク質は、４４９アミノ酸長および質量５１．８ｋＤａを有する融合タンパク質であり、ＴＲＡＩＬ配列１１６−２８１のＣ末端でヒトインターフェロン  ガンマの一本鎖擬似ダイマー（配列番号１９）がエフェクターペプチドとして付加している。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列との間に、メタロプロテアーゼＭＭＰ（配列番号２０）およびウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２１）により認識されるプロテアーゼ切断部位の配列が順次取り込まれており、そのために、エフェクターペプチドが、融合タンパク質の内部移行の際に腫瘍環境で切断される。
【０１７８】
タンパク質は、更にフレキシブルなリンカー、すなわち、エフェクターペプチド配列とウロキナーゼｕＰａ切断部位との間にフレキシブルなグリシン−セリンリンカーＧＳＧＧＧ（配列番号２６）を、メタロプロテアーゼＭＭＰ切断部位とＴＲＡＩＬ配列との間にフレキシブルなグリシン‐セリンリンカーＧＳＧＧＧ（配列番号２６）を含む。
【０１７９】
融合タンパク質の構造を図３に模式的に示す。そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ添付の配列表に示す配列番号１３および配列番号４１である。
【０１８０】
上記配列番号１３のアミノ酸配列を鋳型として使用して、それをコードする配列番号４１のＤＮＡ配列を作製した。上記の一般的手順に従って、ＤＮＡコード配列を含むプラスミドを作製し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現は、ノバジェン社から入手したE. coliＢ．２１（ＤＥ３）株およびストラタジーン社から入手したE. coliＬ２１ＤＥ３ｐＬｙｓＳＲＩＬ株を使用して一般的手順Ｂに従って行った。タンパク質は、上記一般的手順に従って電気泳動により分離した。
【０１８１】
例１４．配列番号１４の融合タンパク質
配列番号１４のタンパク質は、４５６アミノ酸長および質量５２．４ｋＤａを有する融合タンパク質であり、ＴＲＡＩＬ配列１１６−２８１のＮ末端でヒトインターフェロン  ガンマの一本鎖擬似ダイマー（配列番号１９）がエフェクターペプチドとして付加している。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列との間に、メタロプロテアーゼＭＭＰ（配列番号２０）およびウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２１）により認識されるプロテアーゼ切断部位の配列が組み込まれており、そのために、エフェクターペプチドが、融合タンパク質の内部移行の際に腫瘍環境で切断される。配列番号２０および配列番号２１の間で、融合タンパク質には、ペグ化用リンカー（配列番号２２）が付加されている。
【０１８２】
タンパク質は、更にフレキシブルなリンカー、すなわち、エフェクターペプチド配列とウロキナーゼｕＰａ切断部位との間にフレキシブルなグリシン−セリンリンカーＧＳＧＧＧ（配列番号２６）を、メタロプロテアーゼＭＭＰ切断部位とＴＲＡＩＬ配列との間にフレキシブルなグリシン‐セリンリンカーＧＳＧＧＧ（配列番号２６）を含む。
【０１８３】
融合タンパク質の構造を図３に模式的に示す。そのアミノ酸配列、および大腸菌における発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ添付の配列表に示す配列番号１４および配列番号４２である。
【０１８４】
上記の配列番号１４のアミノ酸配列を鋳型として使用して、それをコードする配列番号４２のＤＮＡ配列を作製した。上記の一般的手順に従って、ＤＮＡコード配列を含むプラスミドを作製し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現は、ノバジェン社から入手した大腸菌Ｂ．２１（ＤＥ３）株およびストラタジーン社から入手した大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３ｐＬｙｓＳＲＩＬ株を使用して一般的手順Ｂに従って行った。タンパク質は、上記一般的手順に従って電気泳動により分離した。
【０１８５】
例１５．配列番号１５の融合タンパク質
配列番号１５のタンパク質は、４５６アミノ酸長および質量５２．４ｋＤａを有する融合タンパク質であり、ＴＲＡＩＬ配列１１６−２８１のＣ末端でヒトインターフェロン  ガンマの一本鎖擬似ダイマー（配列番号１９）がエフェクターペプチドとして付加している。ＴＲＡＩＬ配列とエフェクターペプチドとの間で、融合タンパク質は、メタロプロテアーゼＭＭＰ（配列番号２０）およびウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２１）により認識されるプロテアーゼ切断部位の配列を含み、そのために、エフェクターペプチドが、融合タンパク質の内部移行の際に腫瘍環境で切断される。配列番号２０および配列番号２１の間で、融合タンパク質には、ペグ化用リンカー（配列番号２２）が付加されている。
【０１８６】
タンパク質は、更にフレキシブルなリンカー、すなわち、エフェクターペプチド配列とウロキナーゼｕＰａ切断部位との間にフレキシブルなグリシン−セリンリンカーＧＳＧＧＧ（配列番号２６）を、ＴＲＡＩＬ配列とメタロプロテアーゼＭＭＰ切断部位との間にフレキシブルなグリシン‐セリンリンカーＧＳＧＧＧ（配列番号２６）を含む。
【０１８７】
融合タンパク質の構造を図３に模式的に示す。そのアミノ酸配列、および大腸菌における発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ添付の配列表に示す配列番号１５および配列番号４３である。
【０１８８】
上記の配列番号１５のアミノ酸配列を鋳型として使用して、それをコードする配列番号４３のＤＮＡ配列を作製した。上記の一般的手順に従って、ＤＮＡコード配列を含むプラスミドを作製し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現は、ノバジェン社から入手した大腸菌Ｂ．２１（ＤＥ３）株およびストラタジーン社から入手した大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３ｐＬｙｓＳＲＩＬ株を使用して一般的手順Ｂに従って行った。タンパク質は、上記一般的手順に従って電気泳動により分離した。
【０１８９】
例１６．配列番号４４の融合タンパク質
配列番号４４のタンパク質は、５３８アミノ酸長および質量６２．４ｋＤａを有する融合タンパク質であり、ＴＲＡＩＬ配列１２２−２８１のＮ末端でヒトインターフェロン  アルファ２ｂの一本鎖擬似ダイマー（配列番号４６）がエフェクターペプチドとして付加している。エフェクターペプチド配列とＴＲＡＩＬ配列との間に、メタロプロテアーゼＭＭＰ（配列番号２０）およびウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２１）により認識されるプロテアーゼ切断部位の配列の組み合わせが２つ組み込まれており、そのために、エフェクターペプチドが、融合タンパク質の内部移行の際に腫瘍環境で切断される。配列番号２０および配列番号２１の２つの組み合わせの間で、融合タンパク質には、ペグ化用リンカー（配列番号２２）が付加されている。
【０１９０】
融合タンパク質の構造を図４に模式的に示す。そのアミノ酸配列、および大腸菌における発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ添付の配列表に示す配列番号４４および配列番号４８である。
【０１９１】
上記の配列番号４４のアミノ酸配列を鋳型として使用して、それをコードする配列番号４８のＤＮＡ配列を作製する。上記の一般的手順に従って、ＤＮＡコード配列を含むプラスミドを作製し、融合タンパク質の過剰発現をすることが可能である。過剰発現は、ノバジェン社から入手した大腸菌Ｂ．２１（ＤＥ３）株およびストラタジーン社から入手した大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３ｐＬｙｓＳＲＩＬ株を使用して一般的手順Ｂに従って行うことが可能である。タンパク質は、上記一般的手順に従って電気泳動により分離可能である。
【０１９２】
例１７．配列番号４５の融合タンパク質
配列番号４５のタンパク質は、３８４アミノ酸長および質量４４ｋＤａを有する融合タンパク質であり、ＴＲＡＩＬ配列９５−２８１のＮ末端でヒトインターフェロン  アルファのコンセンサス配列（配列番号４７）がエフェクターペプチドとして付加している。エフェクターペプチド配列とＴＲＡＩＬ配列との間に、メタロプロテアーゼＭＭＰ（配列番号２０）およびウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２１）により認識されるプロテアーゼ切断部位の配列の組み合わせが２つ組み込まれており、そのために、エフェクターペプチドが、融合タンパク質の内部移行の際に腫瘍環境で切断される。配列番号２０および配列番号２１の組み合わせの間で、融合タンパク質には、ペグ化用リンカー（配列番号２２）が付加されている。タンパク質は、更にエフェクターペプチド配列とメタロプロテアーゼＭＭＰ切断部位との間にフレキシブルなグリシン−セリンリンカーＧＧＳＧ（配列番号５０）を含む。
【０１９３】
融合タンパク質の構造を図４に模式的に示す。そのアミノ酸配列、および大腸菌における発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ添付の配列表に示す配列番号４５および配列番号４９である。
【０１９４】
上記のアミノ酸配列の配列番号４５を鋳型として使用して、それをコードする配列番号４９のＤＮＡ配列を作製する。上記の一般的手順に従って、ＤＮＡコード配列を含むプラスミドを作製し、融合タンパク質の過剰発現をすることが可能である。過剰発現は、ノバジェン社から入手した大腸菌Ｂ．２１（ＤＥ３）株およびストラタジーン社から入手した大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３ｐＬｙｓＳＲＩＬ株を使用して一般的手順Ｂに従って行うことが可能である。タンパク質は、上記一般的手順に従って電気泳動により分離可能である。
【０１９５】
例１８．融合タンパク質の抗腫瘍活性試験
融合タンパク質の抗腫瘍活性試験は、試験管テストとして腫瘍細胞株の細胞毒性試験を行い、生体内テストとしてマウスを使用して行った。比較の目的で、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１タンパク質およびプラセボを使用した。
【０１９６】
１．円二色性の測定
例３、例５、例１２および例１４の融合タンパク質の調製物の構造品質を、円二色性（ＣＤ）により決定した。
【０１９７】
円二色性は、タンパク質の二次構造および高次構造の決定のために使用される。ＣＤ法は、タンパク質構造の光学活性を利用しており、光の偏光面の回転や楕円偏光として観察される。遠紫外（ＵＶ）におけるタンパク質のＣＤスペクトルにより、ポリペプチド主鎖の高次構造に関する正確なデータが得られる。
【０１９８】
５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセリン、０．１ｍＭＺｎＣｌ２、８０ｍＭショ糖、および５ｍＭＤＴＴを含むｐＨ８．０の緩衝液中で製剤したタンパク質の分析試料は、カットオフ値１２ｋＤａの透析バッグ（シグマ・アルドリッチ社）中で透析した。透析は、タンパク質調製物に対して１００倍量（ｖ／ｖ）過剰の緩衝液中で４°Ｃで数時間撹拌しながら行った。透析が完了した後、各調製物は遠心分離（２５０００ｒｐｍ、１０分間、４°Ｃ）し、適切な上澄み液を採取した。このようにして得た試料中のタンパク質濃度は、ブラッドフォード法により決定した。
【０１９９】
濃度範囲が０．１〜２．７ｍｇ／ｍＬのタンパク質の円二色性は、ジャスコＪ−７１０分光偏光計で光路長０．２ｍｍまたは１ｍｍの石英キュベットを使用して測定した。測定は７Ｌ／分で窒素を流しながら行ったので、波長範囲１９５〜２５０ｎｍにおける測定が可能であった。測定のパラメーター：スペクトル分解能１ｎｍ；光線の半値幅１ｎｍ；感度２０ｍｄｅｇ、１つの波長での平均時間８秒、スキャン速度１０ｎｍ／分。
【０２００】
結果は、３回の測定の平均として示した。ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１、ｒｈＴＲＡＩＬ９５−２８１、および例１２、例５、例３、例１４のタンパク質の円二色性スペクトルを図５に示す。
【０２０１】
得られたスペクトルは、ＣＤＰｒｏソフトウェアを使用して１９３〜２５０ｎｍの範囲で数値解析した。光電子倍増管での電圧が７００Ｖを超える点は、この波長範囲でのシグナル・ノイズ比が小さすぎるため排除した。
【０２０２】
得られたデータを使用して、タンパク質分析試料における個々の二次構造の含有率をＣＤＰｒｏソフトウェアにより計算した（表１）。
【０２０３】
【表１】
0005759557.tif 000002
【０２０４】
対照サンプル（ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１およびｒｈＴＲＡＩＬ９５−２８１）は、大多数がβシート構造型（波長２２０ｎｍでの楕円率が明らかに最小となる）であるタンパク質に特有のＣＤスペクトルを示した。これは、二次構造成分の計算と一致しており、αへリックス要素が極少ないことを示唆している。
【０２０５】
また、得られた結果は、β要素が組成物の半数以上を構成しているＴＲＡＩＬタンパク質の結晶構造から得たデータとも一致している。
【０２０６】
例３、例５、例１２および例１４の融合タンパク質の場合、二色性スペクトルは、アルファ／ベータ混合型二次構造を有するタンパク質に特有の、波長２０８および２２０ｎｍにおける２つの極小値により特徴付けられる。
【０２０７】
融合タンパク質におけるＴＲＡＩＬに付加したインターフェロン分子の大多数がアルファ−へリックス構造を形成しており、それゆえ、分析したキメラタンパク質における二次構造の混合した特性により、ＴＲＡＩＬおよびインターフェロンの両者の適切に折り畳まれた要素が存在することが確認できる。
【０２０８】
例３および例１４による調製物の場合、ほぼ１００％がアルファ型構造であった。アルファ型構造のこの含有率は、分析に使用した波長の範囲が狭いことに因り、方法および材料に最適な処方を選択した結果である（遠紫外での大量のノイズ）。スペクトルの分析した領域において１８０〜２００ｎｍの範囲に明白な形状が存在しないことにより、αへリックス構造の含有量が過大評価されている。
【０２０９】
【表２】
0005759557.tif 000003
【０２１０】
【表３】
0005759557.tif 000004
【０２１１】
ＭＴＴ細胞毒性テスト
ＭＴＴ試験は、細胞の増殖、生存能力および細胞毒性を測定するために使用される比色定量試験である。ミトコンドリア酵素であるコハク酸塩テトラゾリウム還元酵素１による、黄色いテトラゾリウム塩ＭＴＴ（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２、５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）の非水溶性紫染料ホルマザンへの分解を利用する。ＭＴＴの還元は、生細胞においてのみ進行する。データ解析には、対照細胞と比較して処理された集団の細胞数の５０％で還元が進行する濃度である、タンパク質のＩＣ５０濃度（単位ｎｇ／ｍＬ）の決定が含まれる。結果は、グラフパッド・プリズム５．０ソフトウェアを使用して解析した。テストは、文献の記載に基づいて行った（Celis JE, (1998), Cell Biology, a Laboratory Handbook, second edition,  Academic Press, San Diego; Yang Y., Koh LW, Tsai JH., (2004) "Involvement of viral and chemical factors with oral cancer in Taiwan" Jpn J Clin Oncol, 34 (4), 176-183）。
【０２１２】
細胞培養培地を、所定の密度（１００μＬあたりの細胞数１０４〜１０５）に希釈した。その後、適切に希釈された細胞懸濁液１００μＬを、９６ウェルプレートに３ウェルずつ添加した。このように調製した細胞を、使用した培地に応じて５％または１０％ＣＯ２中３７°Ｃで２４時間培養し、その後、細胞（１００μＬ培地中）に、様々な濃度のタンパク質試料を含んだ１００μＬの培地を更に添加した。細胞分裂３〜４回分に相当する７２時間、タンパク質被検体と共に細胞を培養した後、タンパク質被検体を含む培地に２０ｍＬのＭＴＴ標準溶液［５ｍｇ／ｍＬ］を添加し、さらに５％ＣＯ２中３７°Ｃで３時間培養を続けた。その後、ＭＴＴ溶液を含む培地を除去し、１００μＬのＤＭＳＯを添加してホルマザン結晶を溶解した。撹拌後、５７０ｎｍでの吸光度を測定した（参照フィルター６９０ｎｍ）。
【０２１３】
ＥＺ４Ｕ細胞毒性テスト
ＥＺ４Ｕ（バイオメディカ社）テストを使用して、非接着性細胞株におけるタンパク質の細胞障害活性をテストした。このテストは、テトラゾリウム塩の還元で生成されるホルマザンが水に可溶であるようにＭＴＴを改変したものである。細胞生存能力の試験は、タンパク質（タンパク質を７つの濃度で各３ウェルずつ）と共に細胞を連続７２時間培養した後に行った。これに基づいて、グラフパッド・プリズム５ソフトウェアによりＩＣ５０値（２回の独立した実験の平均値として）を決定した。
【０２１４】
試験管内細胞毒性テストの結果は、ＩＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ）として表４および表５にまとめて示してあり、溶媒のみで処理した対照細胞に対して融合タンパク質の細胞障害効果が５０％のレベルで観察されたタンパク質濃度に対応する。各実験は、３ウェルずつで行った少なくとも２つの独立した実験の平均値を示す。タンパク質調製物に活性が無いと判断する基準としては、ＩＣ５０限度値２０００ｎｇ／ｍＬを採用した。ＩＣ５０値が２０００を超える融合タンパク質は不活性とみなした。
【０２１５】
このテストに使用した細胞は、ＴＲＡＩＬタンパク質に対して自然耐性のある腫瘍細胞株（ＴＲＡＩＬに対する自然耐性の基準：ＴＲＡＩＬタンパク質のＩＣ５０＞２０００）、従来の抗がん薬物耐性がん系統として、ＴＲＡＩＬタンパク質感受性、ドキソルビシンＭＥＳ−ＳＡ／ＤＸ５系統耐性の腫瘍細胞株含むように選択された。
【０２１６】
未分化ＨＵＶＥＣ細胞株を、非がん性細胞における融合タンパク質の効能／毒性の評価用の健常な対照細胞株として使用した。
【０２１７】
得られた結果により、本発明の特定の融合タンパク質をＴＲＡＩＬ自然耐性細胞に投与することにより、細胞株のＴＲＡＩＬ耐性を克服できる可能性が確認された。ＴＲＡＩＬ感受性細胞へ本発明の融合タンパク質を投与した時、いくつかのケースでは、ＴＲＡＩＬのみの場合のＩＣ５０値と比べて融合タンパク質のＩＣ５０値が減少し、作用効力が明白に相乗強化されたことが観察された。更に、一般的な抗がん薬物であるドキソルビシン耐性細胞においても、本発明の融合タンパク質の細胞障害活性が得られており、いくつかのケースでは、ＴＲＡＩＬのみの活性よりも高い活性となっている。
【０２１８】
非がん性細胞株で得られた２０００を超えるＩＣ５０値は、健常な細胞に対しては本発明のタンパク質の使用に関連する毒性作用が無いこと示しており、本タンパク質の全身毒性の可能性が低いことを示唆している。
【０２１９】
広範な腫瘍細胞株パネルに対する選択されたタンパク質調製物の細胞障害活性の決定
表５は、広範囲の最も一般的ながんに対応している様々な臓器由来の広範な腫瘍細胞パネルに対する、本発明の選択された融合タンパク質の試験管内での細胞障害活性テストの結果を示すものある。得られたＩＣ５０値により、融合タンパク質の高い細胞障害活性と、従ってがんの処置における潜在的な有用性が確認された。
【０２２０】
【表４】
0005759557.tif 000005
【０２２１】
【表５】
0005759557.tif 000006
【０２２２】
２．異種移植における生体内融合タンパク質抗腫瘍有効性
タンパク質調製物の抗腫瘍活性を、ヒト結腸がんＨＣＴ１１６のマウスモデルにおいてテストした。
【０２２３】
細胞
ＨＣＴ１１６細胞は、１０％ウシ胎児血清および２ｍＭグルタミンを補充したＯｐｔｉ−ＭＥＭ（インビトロジェン社、カタログ番号２２６００−１３４）を１：１の比率で添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン社、ローガン、ユタ州、米国）中で維持した。マウスへの移植の日に、トリプシン（インビトロジェン社）で細胞を洗浄して、細胞をサポートから剥離し、その後、細胞を１３００ｒｐｍ，４°Ｃで８分間遠心分離し、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ培地）に懸濁し、カウントし、細胞数を２５ｘ１０６個／ｍＬに希釈した。
【０２２４】
ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（ＣＬＳ）細胞は、１０％ウシ胎児血清および２ｍＭグルタミンを補充したＤＭＥＭ（ハイクローン社、ローガン、ユタ州、米国）中で維持した。マウスへの移植の日に、トリプシン（インビトロジェン社）で細胞を洗浄して、細胞をサポートから剥離し、その後、細胞を１３００ｒｐｍ，４°Ｃで８分間遠心分離し、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ培地）に懸濁し、カウントし、細胞数を２５ｘ１０６個／ｍＬに希釈した。
【０２２５】
ＨｅｐＧ２細胞は、１０％ウシ胎児血清および２ｍＭグルタミンを補充したＭＥＭ（ハイクローン社、ローガン、ユタ州、米国）中で維持した。マウスへの移植の日に、トリプシン（インビトロジェン社）で細胞を洗浄して、細胞をサポートから剥離し、その後、細胞を１３００ｒｐｍ，４°Ｃで８分間遠心分離し、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ培地）に懸濁し、カウントし、細胞数を２５ｘ１０６個／ｍＬに希釈した。
【０２２６】
マウス
本発明のタンパク質の抗腫瘍活性は、チャールス・リバー社（独国）から入手した７〜９週齢ＣＤヌード（Ｃｒｌ：ＣＤ１−Ｆｏｘｎ１ｎｕ１）または４〜５週齢Ｃｒｌ：ＳＨＯ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＨｒｈｒマウスを使用して試験した。マウスは、食糧および蒸留水は（適宜）自由摂取として、特定病原体感染防止条件下で保持した。動物を使用したすべての実験は、「Interdisciplinary Principles and Guidelines for the Use of Animals in Research, Marketing and Education」 issued by the New York Academy of Sciences' Ad Hoc Committee on Animal Research and were approved by the IV Local Ethics Committee on Animal Experimentation in Warsaw （No.71/2009） のガイドラインに従って行った。
【０２２７】
実験の過程および評価
ヒト結腸がんモデル
Ｃｒｌ：ＣＤ１−Ｆｏｘｎ１ｎｕ１マウス
０日目に、０．２ｍＬのＨＢＳＳ緩衝液に懸濁した５ｘ１０６個のＨＣＴ１１６細胞を０．５ｘ２５ｍｍ針付きシリンジ（ＢｏｇＭａｒｋ社）を使用して、Ｃｒｌ：ＣＤ１−Ｆｏｘｎ１ｎｕ１マウスの右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍の大きさが約 ５０〜１４０ ｍｍ３となったとき（１４日目）、処置群の平均腫瘍サイズが約 ７０ ｍｍ３となるようにマウスをランダムに分別した。処置群には、例３、例１２および例１４の本発明の融合タンパク質調製物（１０ｍｇ／ｋｇ）、比較参照としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（１０ｍｇ／ｋｇ）、対照として製剤用緩衝液（５ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、９５ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、２００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭグルタチオン、０．１ｍＭＺｎＣｌ２、１０％グリセリン、８０ｍＭショ糖、ｐＨ８．０）を投与した。調製物は８〜１２日目および１５〜１９日目の１０日間毎日静脈内投与した（ｉ．ｖ．）。治療群の平均腫瘍サイズが約１０００ｍｍ３となったとき、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。対照群には、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を与えた。
【０２２８】
Ｃｒｌ：ＳＨＯ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＨｒｈｒマウス
０日目に、０．１ｍＬのＨＢＳＳ緩衝液に懸濁した５×１０６個のＨＣＴ１１６細胞を０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（ＢｏｇＭａｒｋ社）を使用して、Ｃｒｌ：ＳＨＯ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＨｒｈｒマウスの右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍の大きさが２００〜７００ｍｍ３となったとき（１８日目）、処置群の平均腫瘍サイズが約４００ｍｍ３となるようにマウスをランダムに分別した。処置群には、例１４の本発明の融合タンパク質調製物（５０ｍｇ／ｋｇ）、比較参照としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（２０ｍｇ／ｋｇ）、対照として製剤用緩衝液（５ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、９５ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、２００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭグルタチオン、０．１ｍＭＺｎＣｌ２、１０％グリセリン、８０ｍＭショ糖、ｐＨ８．０）を投与した。調製物は２日毎に６回静脈内投与した（ｉ．ｖ．）。実験の３２日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
【０２２９】
ヒト肝がんモデル
ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞
０日目に、ＨＢＳＳ：マトリゲル（３：１）混合物の緩衝液０．１ｍＬに懸濁した７ｘ１０６個のＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（ＢｏｇＭａｒｋ社）を使用して、Ｃｒｌ：ＳＨＯ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＨｒｈｒマウスの右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍の大きさが１４０〜３００ｍｍ３となったとき（３１日目）、処置群の平均腫瘍サイズが約２００ｍｍ３となるようにマウスをランダムに分別した。処置群には、例１４の本発明の融合タンパク質調製物（２０ｍｇ／ｋｇ）、比較参照としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（３０ｍｇ／ｋｇ）、対照として製剤用緩衝液（５ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、９５ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、２００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭグルタチオン、０．１ｍＭＺｎＣｌ２、１０％グリセリン、８０ｍＭショ糖、ｐＨ８．０）を投与した。調製物は３日毎に４回、その後２日毎に（ｑ３ｄｘ４およびｑ２ｄｘ２）２回静脈内投与した（ｉ．ｖ．）。実験の３２日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
【０２３０】
ＨｅｐＧ２細胞
０日目に、ＨＢＳＳ：マトリゲル（３：１）混合物の緩衝液０．１ｍＬに懸濁した７ｘ１０６個のＨｅｐＧ２細胞を０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（ＢｏｇＭａｒｋ社）を使用して、Ｃｒｌ：ＳＨＯ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＨｒｈｒマウスの右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍の大きさが２５０〜３９０ｍｍ３となったとき（１９日目）、処置群の平均腫瘍サイズが約３３０ｍｍ３となるようにマウスをランダムに分別した。処置群には、例１４の本発明の融合タンパク質調製物（５０ｍｇ／ｋｇ）、比較参照としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（３０ｍｇ／ｋｇ）、対照として製剤用緩衝液（５ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、９５ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、２００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭグルタチオン、０．１ｍＭＺｎＣｌ２、１０％グリセリン、８０ｍＭショ糖、ｐＨ８．０）を投与した。調製物は２日毎に６回静脈内投与した（ｉ．ｖ．）。実験の３１日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
【０２３１】
腫瘍サイズは電子カリパスを使用して測定し、腫瘍体積を、２５腫瘍の短径（ｍｍ）をａ、腫瘍の長径（ｍｍ）をｂとして式（ａ２×ｂ）／２により計算した。腫瘍増殖阻害率は下記の式により計算した：
ＴＧＩ［％］（腫瘍増殖阻害率）＝（ＷＴ／ＷＣ）×１００  −１００％
【０２３２】
ここで、ＷＴは処置群の平均腫瘍体積であり、ＷＣは対照群の平均腫瘍体積である。
実験結果は、平均値±標準偏差（ＳＤ）で示した。すべての計算およびグラフ作成は、グラフパッド・プリズム５．０ソフトウェアを使用して行った。
【０２３３】
ＨＣＴ１１６結腸がんを負荷したＣｒｌ：ＣＤ１−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウスを、例３、例１２および例１４の本発明の融合タンパク質および比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置して得た実験結果を、腫瘍体積の変化図として図６に、対照に対する百分率として腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）を図７に示す。
【０２３４】
図６および図７のグラフに示す実験結果は、例３、例１２および例１４の本発明の融合タンパク質の投与により、実験の２８日目に対照に対してそれぞれ７１％、６７％および７５％のＴＧＩで腫瘍ＨＣＴ１１６の増殖が阻害されることを示している。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１では、ＴＧＩが４４％のレベルで、対照と比して腫瘍細胞増殖に僅かな阻害効果が得られた。従って、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独と比較して、はるかに強力な効果を示している。
【０２３５】
ＨＣＴ１１６結腸がんを負荷したＣｒｌ：ＳＨＯ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＨｒｈｒマウスを、例１４の本発明の融合タンパク質（２０ｍｇ／ｋｇ)および比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置した実験結果を、腫瘍体積の変化図として図８に、対照に対する百分率として腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）を図９に示す。
【０２３６】
図８および図９のグラフに示す実験結果は、例１４の本発明の融合タンパク質の投与により、実験の３２日目に対照に対して２２．５％のＴＧＩで腫瘍ＨＣＴ１１６の増殖が阻害されることを示している。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１では、ＴＧＩが５．６％のレベルで、対照と比して腫瘍細胞増殖に僅かな阻害効果が得られた。従って、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬと比較して、はるかに強力な効果を示している。
【０２３７】
ＰＬＣ／ＰＲＦ／５肝がんを負荷したＣｒｌ：ＳＨＯ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＨｒｈｒマウスを、例１４の本発明の融合タンパク質および比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置した実験結果を、腫瘍体積の変化図として図１０、対照に対する百分率として腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）を図１１に示す。
【０２３８】
図１０および図１１のグラフに示す実験結果は、例１４の本発明の融合タンパク質の投与により、実験の４９日目に対照に対して３４％のＴＧＩでＰＬＣ／ＰＲＦ／５腫瘍の増殖が阻害されることを示している。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１では、ＴＧＩが１８％のレベルで、対照と比して腫瘍細胞増殖に僅かな阻害効果が得られた。従って、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬと比較して、はるかに強力な効果を示している。
【０２３９】
ＨｅｐＧ２肝がんを負荷したＣｒｌ：ＳＨＯ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＨｒｈｒマウスを、例１４の本発明の融合タンパク質および比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置した実験結果を、腫瘍体積の変化図として図１２、対照に対する百分率として腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）を図１３に示す。
【０２４０】
図１２および図１３のグラフに示す実験結果は、例１４の本発明の融合タンパク質の投与により、実験の３１日目に対照に対して３３．６％のＴＧＩでＨｅｐＧ２腫瘍の増殖が阻害されることを示している。参照調製物として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１では、ＴＧＩが７％のレベルで、対照と比して腫瘍細胞増殖に僅かな阻害効果が得られた。従って、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬと比較して、はるかに強力な効果を示している。
【０２４１】
テストした融合タンパク質は、マウスの体重減少（すなわち、基準体重の１０％より低い）に現れるような有意な副作用は起さなかった。これは、タンパク質の全身毒性が低いことを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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