(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を励起させる照明光を発振する光源と、
前記試料に前記照明光を照射したときに蛍光した戻り光を検出する検出部と、
前記照明光を前記検出部に通過させるピンホールを複数配列したピンホールディスクと、
前記ピンホールに前記照明光を集光させるための一の円形レンズと他の円形レンズとを仮想的に設定したときに前記一の円形レンズと前記他の円形レンズとを部分的に重複させて、
前記一の円形レンズと前記他の円形レンズとが重複する領域のうち、一部を前記一の円形レンズの集光部とし、前記領域の他の部分を前記他の円形レンズの集光部とするように前記ピンホールに対応して前記集光部を複数箇所に設けた集光部ディスクと、
前記ピンホールディスクと前記集光部ディスクとを一体的に回転させる回転部と、
を備え、
前記一の円形レンズの外縁と前記他の円形レンズの外縁とが交わる２つの交点を結ぶ直線を境界にして前記一の円形レンズの中心側の一部の領域であって、前記一の円形レンズと前記他の円形レンズのみが重複する領域を、前記直線について対称に折り返して得られる領域を前記一の円形レンズの集光部としたこと
を特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
前記一の円形レンズの領域であって、前記他の円形レンズと重複しない領域を前記一の円形レンズの集光部としたこと
を特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、照明光を照射して試料を蛍光させて、その戻り光を検出して試料の画像を観察する顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
顕微鏡装置は、蛍光色素や蛍光タンパク等を導入した試料に対して照明光を照射して蛍光を発生させ、発生した蛍光に基づいて試料の観察を行う。この顕微鏡装置として高速に照明光を走査することが可能なニポウディスク方式の共焦点顕微鏡が用いられる。ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡としては特許文献１に開示されている技術がある。
【０００３】
特許文献１の技術では、集光ディスクにフレネルレンズを複数配列し、ピンホールディスクにも複数のピンホールを配列している。そして、試料に対して照明光を照射するときには、集光ディスクとピンホールディスクとを一体的に回転させる。これにより、高速な走査が可能になる。特許文献２では、ピンホールの最適な配列が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平５−０６０９８０号公報
【特許文献２】特開平５−１２７０９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
試料に対して高速に照明光を走査して、試料の画像を高速に生成するためには、多数のピンホールを形成する必要がある。これに伴い、ピンホールディスクと一体的に回転するマイクロレンズディスク（特許文献１の集光ディスクに相当）にも多数のマイクロレンズ（特許文献１のフレネルレンズに相当）を配列する必要がある。
【０００６】
ピンホールを通過した照明光は対物レンズにより試料の焦点に結像される。試料の観察は多様に行われるため、倍率の低い対物レンズが用いられることがある。倍率の低い対物レンズは大きな瞳径を有するため、適切に照明光を走査させるために、マイクロレンズの開口数（ＮＡ）を大きくしなければならない。
【０００７】
マイクロレンズディスクには多数のマイクロレンズを配列するが、マイクロレンズの開口数を大きくすると、各マイクロレンズの物理的なサイズが大きくなる。これにより、マイクレンズディスクに配列可能なマイクロレンズの個数が少なくなり、またマイクロレンズとマイクロレンズとの間隔も広げる必要がある。
【０００８】
ピンホールディスクのピンホールもマイクロレンズに対応して設けているため、配列可能な個数が少なくなり、配列間隔が広がることは同様である。従って、マイクロレンズおよびピンホールの個数が少なくなり、高速な走査を実現することができなくなる。これにより、画像生成速度が低速になる。
【０００９】
また、ピンホールの開口領域を狭小化することにより、試料の焦点近傍に絞って集光させることができ、照明光の分解能を高くすることができる。これにより、生成される画像を高解像度にすることができる。ピンホールを狭小化すると、マイクロレンズの開口数を大きくしなければならない。このために、前述したように、ピンホールおよびマイクロレンズの配列数が少なくなり、画像生成速度が低速になる。
【００１０】
そこで、本発明は、対物レンズの倍率によらず高速且つ高分解能に試料の画像を生成することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
以上の課題を解決するため、本発明の顕微鏡装置は、試料を励起させる照明光を発振する光源と、前記試料に前記照明光を照射したときに蛍光した戻り光を検出する検出部と、前記照明光を前記検出部に通過させるピンホールを複数配列したピンホールディスクと、前記ピンホールに前記照明光を集光させるための一の円形レンズと他の円形レンズとを仮想的に設定したときに前記一の円形レンズと前記他の円形レンズとを部分的に重複させて、前記一の円形レンズと前記他の円形レンズとが重複する領域のうち、一部を前記一の円形レンズの集光部とし、前記領域の他の部分を前記他の円形レンズの集光部とするように前記ピンホールに対応して前記集光部を複数箇所に設けた集光部ディスクと、前記ピンホールディスクと前記集光部ディスクとを一体的に回転させる回転部と、を備え、前記一の円形レンズの外縁と前記他の円形レンズの外縁とが交わる２つの交点を結ぶ直線を境界にして前記一の円形レンズの中心側の一部の領域であって、前記一の円形レンズと前記他の円形レンズのみが重複する領域を、前記直線について対称に折り返して得られる領域を前記一の円形レンズの集光部としたことを特徴とする。
【００１２】
この顕微鏡装置によれば、仮想的に設定される円形レンズの中心部から集光部を広げた位置に形成することができる。これにより、集光部の開口数を大きくすることができる。顕微鏡の対物レンズが低倍率であっても、集光部の配列数を多くすることができ、高速に走査を行うことで、高速な画像生成を行うことができる。また、ピンホールを狭小化できるため、高分解能の画像生成を行うことができる。
【００１３】
また、前記集光部と前記集光部との間に間隙が生じないように前記一の円形レンズと前記他の円形レンズとを重複させて前記集光部を形成してもよい。集光部と集光部との間に間隙が生じないようにして仮想的な円形レンズを重複させることで、集光部の領域に無駄を生じることがなくなり、照明光の利用効率を向上させることができる。
【００１４】
また、前記一の円形レンズの周囲にあるＮ（Ｎは３以上の整数）個の前記他の円形レンズとの交点を結ぶ前記直線により形成される正Ｎ角形をＮ等分して生成されるＮ個の正三角形の領域を、前記直線を境界にして内側から外側に折り返して前記集光部を形成してもよい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、仮想的な円形レンズの中心から広げた位置に集光部を設けることができ、集光部の開口数を大きくすることができる。これにより、集光部の配列数を多くすることができ、高速に画像生成を行うことができる。また、ピンホールを狭小化することができることから、高分解能の画像生成を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】顕微鏡装置の全体構成図である。
【図２】顕微鏡装置の概念図である。
【図３】実施形態の仮想レンズおよび集光部を説明するための図である。
【図４】図３の他の例を説明するための図である。
【図５】変形例１の仮想レンズおよび集光部を説明するための図である。
【図６】変形例２の仮想レンズおよび集光部を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、図面を参照して、本発明の実施形態について説明する。図１は本発明の顕微鏡装置１を示している。この顕微鏡装置１は光源２とステージ３とスキャナユニット４と顕微鏡５とカメラ６とを備えている。光源２は照明光Ｌを発振するための光源であり、光ファイバの端面等の微細な点光源であることが望ましい。光源２が発振した照明光Ｌはスキャナユニット４に導かれる。
【００１８】
ステージ３は顕微鏡装置１の観察対象となる試料Ｓを搭載する。この試料Ｓに照明光Ｌの焦点を結ばせることで、試料Ｓに導入した蛍光色素や蛍光タンパク等が蛍光して戻り光Ｒが発生する。検出部としてのカメラ６が戻り光Ｒを観察することで、試料Ｓの画像を生成して観察を行う。
【００１９】
スキャナユニット４はコリメートレンズ１１と集光部ディスク１２とピンホールディスク１３と連結ドラム１４とモータ１５とダイクロイックミラー１６とカメラレンズ１７とを備えて構成している。コリメートレンズ１１は光源２が発振した照明光Ｌを平行光にする。
【００２０】
集光部ディスク１２は、図２に示すように、複数の集光部２１を有して構成している。集光部２１はコリメートレンズ１１により平行光にされた照明光Ｌを集光させるレンズ機能を有している。ピンホールディスク１３は、図２に示すように、複数のピンホール２２を有して構成している。
【００２１】
集光部２１とピンホール２２とは１対１の関係性を有している。つまり、照明光Ｌは各集光部２１により異なる光線に分割されて、分割された各照明光Ｌは対応するピンホール２２に集光する。ピンホール２２はピンホールディスク１３に設けた微小開口部であり、照明光Ｌおよび戻り光Ｒがピンホール２２を通過することで、試料Ｓの焦点近傍の光のみが通過する。これにより、分解能が高い共焦点顕微鏡として顕微鏡装置１を使用することができる。
【００２２】
集光部ディスク１２とピンホールディスク１３とは円盤状の回転ディスクであり、両者の外形を同一形状とすることができる。集光部ディスク１２とピンホールディスク１３とは連結ドラム１４により連結されており、連結ドラム１４はモータ１５により回転力が付与される。よって、モータ１５の回転力により連結ドラム１４が回転することで、集光部ディスク１２とピンホールディスク１３とは一体的に回転を行う。
【００２３】
集光部２１とピンホール２２との間にはダイクロイックミラー１６が配置されている。ダイクロイックミラー１６は照明光Ｌの波長の光を透過させ、試料Ｓの蛍光（戻り光Ｒ）の波長の光を反射させる特性を持つ光学部品である。従って、照明光Ｌはダイクロイックミラー１６を透過して、試料Ｓからの戻り光Ｒは反射する。
【００２４】
ダイクロイックミラー１６を透過した照明光Ｌはピンホール２２に集光されて、試料Ｓの焦点近傍の光のみが通過する。通過した照明光Ｌは顕微鏡５に入射される。顕微鏡５は結像レンズ３１と対物レンズ３２とを有して構成される。ピンホール２２を通過した照明光Ｌは結像レンズ３１によって所定傾きの平行光に変換される。この平行光が対物レンズ３２に入射する。対物レンズ３２は平行光となった照明光Ｌを入射すると、その傾きに応じて試料Ｓの焦点に結像する。照明光Ｌが試料Ｓで焦点を結ぶことにより、試料Ｓが励起されて蛍光が発生して戻り光Ｒが発生する。なお、図１では照明光Ｌの光路が２つ示されているが、このうち１つは光軸中心の照明光Ｌであり、もう１つは光軸中心からずれた照明光Ｌを示している。
【００２５】
試料Ｓに照明光Ｌを照射して発生した戻り光Ｒは対物レンズ３２、結像レンズ３１を介してピンホール２２を通過する。これにより、試料Ｓの焦点近傍で発生した蛍光のみがピンホール２２を通過する。ピンホール２２を通過した戻り光Ｒはダイクロイックミラー１６に入射する。そして、ダイクロイックミラー１６で反射して、カメラレンズ１７に入射する。
【００２６】
カメラレンズ１７は戻り光Ｒをカメラ６に結像させる。カメラ６は結像された戻り光Ｒの光量に基づいて、図示しないコンピュータ等で試料Ｓの画像を生成する。戻り光Ｒはピンホール２２を通過した光のみになるため、生成される画像は共焦点画像となる。なお、戻り光Ｒの光路においてカメラ６の前段側に蛍光成分のみを透過させる図示しない蛍光フィルタを配置することが望ましい。
【００２７】
次に、集光部ディスク１２について説明する。集光部ディスク１２には複数の集光部２１が設けられている。集光部２１は図３にハッチングで示している領域Ａ１〜Ａ７になる。従って、複数の領域Ａ１〜Ａ７により１つの集光部２１が構成される。１つの集光部２１は１つのピンホール２２に対応して設けられており、集光部２１により照明光Ｌがピンホール２２に集光される。
【００２８】
集光部ディスク１２には複数の集光部２１が設けられており、各集光部２１が照明光Ｌを集光する。よって、集光部２１の個数に応じて照明光Ｌが分割される。そして、集光部２１に対応したピンホール２２に対して照明光Ｌが集光される。ピンホール２２は断面が円形の微小開口部であり、試料Ｓの焦点近傍の光のみを通過させるようにピンホール２２の微小開口部が設けられている。このピンホール２２に照明光Ｌを集光させるために、通常は集光部２１には円形の球面レンズ（マイクロレンズ）が用いられる。
【００２９】
ここでは、集光部２１としては円形のマイクロレンズを使用しないが、このマイクロレンズを仮想的な円形レンズ（仮想レンズ３０）として設定する。なお、仮想レンズ３０は実際に集光部ディスク１２に形成されるものではなく、あくまでも仮想的に設定したレンズになる。この仮想レンズ３０を用いた場合には、仮想レンズ３０により照明光Ｌがピンホール２２に集光されて通過し、通過した照明光Ｌが対物レンズ３２により試料Ｓで焦点を結ぶことになる。
【００３０】
対物レンズ３２には高倍率から低倍率のレンズが用いられる。そして、対物レンズ３２の瞳径は対物レンズ３２の倍率によって変化し、顕微鏡５に要求される倍率によっては低倍率の対物レンズ３２が用いられることもある。仮想レンズ３０を用いた場合には、仮想レンズ３０の開口数（ＮＡ）を大きくしなければならない。このために、仮想レンズ３０の物理的なサイズが大きくなり、集光部ディスク１２に配置可能な仮想レンズ３０の個数が少なくなる。
【００３１】
図３に示すように、仮想レンズ３０の円は相互に重複するように設定している。これにより、１つの仮想レンズ３０の円と１つの仮想レンズ３０の円とが重複することにより２つの交点が発生する。そして、当該２つの交点を結ぶ直線ＬＮを設定する。なお、各仮想レンズ３０の半径は同一のものとして説明するが、半径は異なるものであってもよい。
【００３２】
仮想レンズ３０の円と仮想レンズ３０の円とが重複した領域は直線ＬＮにより分割される。つまり、仮想レンズ３０の中心に近い領域と中心から遠い領域との２つに分割される。そして、直線ＬＮを境界にして仮想レンズ３０の中心に近い領域の一部を遠い領域に折り返すようにする。これにより、図３のハッチングで示す輪帯状の領域Ａ１〜Ａ６が形成される。また、輪帯状の領域Ａ１〜Ａ６の中心（仮想レンズ３０の円の中心）には領域Ａ７が形成される。
【００３３】
これら領域Ａ１〜Ａ７により集光部２１が形成される。集光部２１の領域Ａ１〜Ａ７はレンズ機能を有しており、領域Ａ１〜Ａ７の全体でピンホール２２に照明光Ｌを集光させる。領域Ａ１〜Ａ７にレンズ機能を持たせるために、各領域Ａ１〜Ａ７に球面レンズの一部分を配置することができる。これにより、７つの領域Ａ１〜Ａ７が１つのレンズ機能を果たすことになり、照明光Ｌがピンホール２２に集光する。
【００３４】
領域Ａ１〜Ａ７には球面レンズの一部分を配置してもよいが、他に仮想レンズ３０の領域にフレネルレンズを用いることもできる。これによっても、同様に７つの領域Ａ１〜Ａ７に照明光Ｌを集光させる機能を持たせることができる。さらには、仮想レンズ３０の領域を回折格子として形成し、この回折格子の集光作用で照明光Ｌをピンホール２２に集光させることもできる。
【００３５】
図３は１つの仮想レンズ３０に着目して集光部２１を形成した場合を説明した。集光部ディスク１２には多数の集光部２１が配置されており、つまり仮想レンズ３０の個数も多数になる。図４は図３で着目した仮想レンズ３０の周囲の６つの仮想レンズ３０について示している。
【００３６】
各仮想レンズ３０は中心の仮想レンズ３０と部分的に重複している。そして、周囲の６つの仮想レンズ３０も同様に直線ＬＮを境界にして内側から外側に一部の領域を対称に折り返している。この折り返した領域をＢ１〜Ｂ６とする。領域Ｂ１〜Ｂ６は領域Ａ１〜Ａ６と直線ＬＮを挟んで対称になっている。従って、周囲の６つの仮想レンズ３０についての領域Ｂ１〜Ｂ６は中心の仮想レンズ３０の内側の領域を使用している。
【００３７】
つまり、図３の中心の仮想レンズ３０に着目したときには周囲の仮想レンズ３０の内側の領域を使用して集光部２１を形成しているが、周囲の他の仮想レンズ３０に着目したときには前記の中心の仮想レンズ３０の内側の領域を使用している。つまり、１つの仮想レンズ３０と周囲の仮想レンズ３０とは集光部２１の領域を相互に分配し合うようになっている。
【００３８】
従って、輪帯状に形成される集光部２１は１つの仮想レンズ３０と周囲の仮想レンズ３０との間で重なり合うことがなく配分がされる。これにより、集光部２１は所望のレンズ効果を持つことができ、且つ集光部ディスク１２において領域に無駄のない集光部２１の配置を実現することができる。
【００３９】
図３において、仮想レンズ３０を重ねるように配置しているが、仮想レンズ３０を実際に用いた場合（マイクロレンズ）には、マイクロレンズ（仮想レンズ３０）は円形の球面レンズになるため、マイクロレンズとマイクロレンズとの間に所定の間隙を設けなくてはならない。つまり、マイクロレンズ同士を重ねるようにすると、照明光Ｌの集光を行うことができなくなる。
【００４０】
一方、仮想レンズ３０を重ね合わせるようにして、円と円との交点を結ぶ直線ＬＮを境界にして内側の領域を外側に折り返して集光部２１を輪帯状に形成することで、輪帯状の領域Ａ１〜Ａ６はほぼ仮想レンズ３０の外周と同じ程度にすることができる。仮想レンズ３０を重複させる程度に大きくしたときには十分な開口数（ＮＡ）を確保することができる。このため、仮想レンズ３０同士を重複させないときの仮想レンズ３０と比較して集光部２１を大きくすることができる。これにより、対物レンズ３２が低倍率であったとしても十分な開口数を確保することができる。
【００４１】
つまり、マイクロレンズを重複しないように配置するときには、マイクロレンズの物理的なサイズを大きくすることができないために、十分な開口数を確保することができない。このために、集光部ディスク１２に配置可能なマイクロレンズの個数が少なくなり、高速な画像生成を行うことができない。
【００４２】
この点、図３に示すように、輪帯状の集光部２１は仮想レンズ３０同士を重複させたときの仮想レンズ３０のサイズにまで大きくすることができる。このため、十分な開口数を確保することができ、低倍率の対物レンズ３２を用いることができる。且つ、仮想レンズ３０の内側の領域を外側に広げるようにして他の仮想レンズ３０と集光部２１の領域Ａ１〜Ａ６を配分しているため、集光部２１の個数を少なくすることがない。
【００４３】
これにより、集光部２１の個数を多くすることができ、また集光部２１の個数に対応してピンホール２２を形成することができることから、集光部ディスク１２とピンホールディスク１３とを一体的に回転させることで、高速な画像生成を行うことができるようになる。
【００４４】
また、集光部２１の開口数を大きくしていることで、ピンホール２２のサイズ（微小開口部のサイズ）を小さくすることができる。ピンホール２２のサイズを小さくすることで、試料Ｓの焦点近傍の必要な光のみを通過させることができるため、照明光Ｌおよび戻り光Ｒの分解能を高くすることができる。これにより、生成される画像を共焦点画像とすることができ、高解像度化を実現することができる。
【００４５】
さらに、１つの仮想レンズ３０と周囲の仮想レンズ３０とで集光部２１の領域を分配しており、且つ集光部２１と集光部２１との間に間隙が生じないように仮想レンズ３０を重複させている。これにより、仮想レンズ３０の全ての領域を無駄なく集光部２１に割り当てることができるため、照明光Ｌの光の利用効率が向上する。
【００４６】
次に、変形例１について説明する。図５は変形例１の集光部２１を示している。同図に示すように、仮想レンズ３０の周囲に６つの仮想レンズ３０を設定している。そして、仮想レンズ３０と仮想レンズ３０との交点を結ぶ直線ＬＮを境界にして内側の領域を外側に折り返すようにしている。
【００４７】
このとき、仮想レンズ３０の周囲の６つの仮想レンズ３０により形成される６つの直線ＬＮを結ぶことにより、正６角形が形成される。この正６角形を６つに均等に分割（仮想レンズ３０の中心から６０度ずつに分割）すると、６つの正三角形が形成される。この正三角形を直線ＬＮに対して外側に折り返すことにより、６つの領域Ａ１〜Ａ６が形成される。これら領域Ａ１〜Ａ６は輪帯状に形成される。
【００４８】
図３の例では、中心に領域Ａ７が存在していたが、図５の例では中心に領域は存在せず、輪帯状の領域Ａ１〜Ａ６により集光部２１が形成される。従って、ピンホール２２に集光する照明光Ｌは輪帯状（リング状）の光として集光される。そして、ピンホール２２を通過した照明光Ｌが対物レンズ２３により試料Ｓで焦点を結ぶ。
【００４９】
このときの照明光Ｌは輪帯状になっており、円形の領域と比較して照射される領域が狭小になる。これにより、照明光Ｌ、そして蛍光により発生する戻り光Ｒの分解能が高くなる。従って、分解能が高くなるため、高解像度の画像生成を行うことができる。
【００５０】
且つ、集光部２１の６つの領域Ａ１〜Ａ７の外周は仮想レンズ３０よりも大きくなり、高い開口数（ＮＡ）を確保することができる。これにより、低倍率の対物レンズ２３を用いて試料Ｓに照明光Ｌの焦点を結ばせることができる。そして、正三角形の領域を他の仮想レンズ３０と分配しあうことで、集光部２１の個数を多くすることができる。これにより、高速な走査を実現することができる。
【００５１】
次に、変形例２について説明する。図６に示すように、本変形例２では仮想レンズ３０を密集させている。中心の仮想レンズ３０の周囲に仮想レンズ３０が多くの部分で重複しているが、さらにその周囲の仮想レンズ３０が中心の仮想レンズ３０と部分的に重複している。ここでは、中心の仮想レンズ３０およびこの中心の仮想レンズ３０に対して間に１つの仮想レンズ３０を挟んでさらにその周囲の仮想レンズ３０を実線で示し、それ以外を仮想線で示している。
【００５２】
中心の仮想レンズ３０と実線で示した６つの仮想レンズ３０とは部分的に重複しており、仮想レンズ３０と仮想レンズ３０との交点を結ぶ直線ＬＮを設定する。そして、直線ＬＮを境界にして内側の一部の領域を外側に折り返して形成される領域がＡ１〜Ａ６になる。
【００５３】
これにより、輪帯状の領域Ａ１〜Ａ６が形成され、これらは集光部２１を構成する。集光部２１の輪帯状の領域Ａ１〜Ａ６は開口数が大きくなるため、低倍率の対物レンズ３２に対応することができる。且つ、集光部２１の個数を少なくすることなく開口数を確保できるため、高速な走査を実現することができる。
【符号の説明】
【００５４】
１    顕微鏡装置
２    光源
４    スキャナユニット
５    顕微鏡
６    カメラ
１２    集光部ディスク
１３    ピンホールディスク
１４    連結ドラム
１５    モータ
１６    ダイクロイックミラー
１７    カメラレンズ
２１    集光部
２２    ピンホール
２３    対物レンズ
３０    仮想レンズ
３１    結像レンズ
３２    対物レンズ
Ｌ    照明光
Ｒ    戻り光
【図１】
0005682825.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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