(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の進化を方向づける方法であって、
ミューテーター遺伝子を前記ＣＨＯ細胞に導入する工程であって、
前記ミューテーター遺伝子は、低忠実度突然変異およびエキソヌクレアーゼ欠損突然変異を含み、前記少なくとも１つのミューテーター遺伝子の導入は、前記少なくとも１つのＣＨＯ細胞の突然変異率増加を生じさせるものである工程と；
前記ミューテーター遺伝子が導入されている前記ＣＨＯ細胞を成長させて、成長ＣＨＯ細胞を得る工程と；
所望の遺伝形質を有する少なくとも１つの突然変異ＣＨＯ細胞を前記成長ＣＨＯ細胞から選択して、選択されたＣＨＯ細胞を得る工程と；
を含み，
前記低忠実度突然変異が、ＣＨＯ細胞のＤＮＡポリメラーゼデルタ遺伝子（Ｐｏｌｄ１）の触媒性サブユニットにおける６２０番目のアミノ酸残基におけるロイシンをメチオニンに変化させるアミノ酸置換であるＬ６２０Ｍアミノ酸置換を含み、
前記エキソヌクレアーゼ欠損突然変異が、前記ＣＨＯ細胞のＤＮＡポリメラーゼデルタ遺伝子（Ｐｏｌｄ１）の触媒性サブユニットにおける３９８番目のアミノ酸残基におけるアスパラギン酸をアラニンに変化させるアミノ酸置換であるＤ３９８Ａアミノ酸置換を含む，
方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって，
前記成長ＣＨＯ細胞の野生型突然変異率を回復させて、回復された成長ＣＨＯ細胞を得る工程をさらに含み、所望の遺伝形質を有する前記少なくとも１つの突然変異ＣＨＯ細胞が、前記回復された成長ＣＨＯ細胞から選択される、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって，
前記選択されたＣＨＯ細胞の野生型突然変異率を回復させる工程をさらに含む、方法。
【請求項４】
所望の遺伝形質を有するＣＨＯ細胞であって、請求項１に記載の方法に従って得られたものである、または請求項１に記載の方法に従って得られたＣＨＯ細胞の子孫である細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、生物の進化を方向づける方法に関する。より詳細には、本開示は、生物の突然変異率を修飾することによって生物の進化を方向づける方法に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
ＤＮＡ複製中の突然変異率を修飾することで、集団内の個々の生物中および間の遺伝的多様性を増すことができる。遺伝的多様性の増加を利用して、生物における所望の遺伝形質の選択を助長することができる。突然変異率が修飾された生物を選択条件下で成長させること、および所望の遺伝形質を有する個体を単離することによって、所望の形質を選択することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本明細書に記載するように、１つ以上のミューテーター遺伝子またはタンパク質を生物に導入することによって生物の進化を方向づけることができる。１つのそのような実施形態では、ＤＮＡ複製を、少なくとも一部は、制御する遺伝子またはタンパク質を生物に導入して、野生型突然変異率より高い突然変異率を達成する。例えば、生物体内で、その生物のＤＮＡの突然変異率増加を生じさせるように、１つ以上のミューテーター遺伝子を発現させることができる。１つのそのような実施形態において、１つ以上のミューテーター遺伝子は、野生型対立遺伝子を基準にしてプルーフリーディングまたはエキソヌクレアーゼ欠損がある１つ以上の突然変異ＤＮＡポリメラーゼを含む場合がある。もう１つのそのような実施形態において、１つ以上のミューテーター遺伝子は、野生型対立遺伝子を基準にして低減されたポリメラーゼ忠実度を示す１つ以上の突然変異ＤＮＡポリメラーゼを含む場合がある。さらにもう１つの実施形態において、生物体内で発現される１つ以上のミューテーター遺伝子は、野生型対立遺伝子を基準にして、エキソヌクレアーゼ欠損がある少なくとも１つの突然変異ＤＮＡポリメラーゼおよび低減されたポリメラーゼ忠実度を示す少なくとも１つの突然変異ＤＮＡポリメラーゼを含む。さらにもう１つの実施形態において、生物体内で発現される１つ以上のミューテーター遺伝子は、野生型対立遺伝子を基準にして、エキソヌクレアーゼ欠損もあり、低減されたポリメラーゼ忠実度も示す、少なくとも１つの突然変異ＤＮＡポリメラーゼを含む。
【０００４】
本明細書に記載するような１つ以上のミューテーター遺伝子の導入は、生物の内在性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の１つ以上を突然変異コピーで置換する必要がない。１つ以上のミューテーター遺伝子の導入が、生物ゲノムへのそのような１つ以上の遺伝子の組み込みを含む場合であっても、ＤＮＡポリメラーゼを発現する生物の内在性遺伝子のいずれかを置換するかまたはいずれかに影響を及ぼすことはその導入のターゲットにならない。
【０００５】
本明細書に記載する生物の定方向突然変異のための方法は、選択圧を加える条件下で突然変異率増加を有する生物を成長させること、および１つ以上の所望の形質を有する生物を選択することも含む場合がある。例えば、例えば一定の化学物質、栄養素、溶媒または任意の他の環境条件の存在または不在をはじめとする所望の条件下で成長することができる生物の選択を助長するように、生物の突然変異率を修飾することができる。もう１つの実施形態では、別の生物による、例えば細菌または病原体による、攻撃または感染に耐性である進化した生物を生じさせる結果となる条件下で、本明細書に記載するような突然変異率増加を有する生物を成長させることができる。本明細書に記載するような定方向進化法に関するさらにもう１つのそのような実施形態では、例えば特定の油、タンパク質、アルコールまたは任意の他の所望の化学製品をはじめとする所望の産物をより効率的にまたは所望の量で生産するかまたはプロセッシングする進化した生物を生じさせる結果となる選択圧を加える条件下で、突然変異率増加を有する生物を成長させることができる。
【０００６】
さらに、本明細書に記載するような定方向進化法は、突然変異率修飾を有する生物によって示される突然変異率を野生型突然変異率に回復させることを含む場合がある。１つのそのような実施形態では、所望の形質を有する生物を獲得し、選択したら、その進化した生物の１つ以上のミューテーター遺伝子をキュアリングすることによって野生型突然変異率を回復させることができる。あるいは、特定の条件下で１つ以上のミューテーター遺伝子が誘導性である場合があり、およびミューテーター遺伝子産物の転写または翻訳を生じさせる結果とならない条件に生物を付すことによって野生型突然変異率の回復を達成することができる。尚、さらに、進化したおよび選択された生物に含まれている１つ以上のミューテーター遺伝子が、その進化した生物のゲノムに組み込まれている場合、ミューテーター遺伝子のそのゲノムからの切除もしくは除去、またはミューテーター遺伝子の機能性（非ミューテーター）対立遺伝子での置換によって、野生型突然変異率の回復を達成することができる。
【０００７】
以下の詳細な説明は、本明細書に提供する定方向進化法の実施に有用な材料および生物も示す。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】野生型Ｔａｉｋｅｎ  ３９６親酵母細胞および形質転換クロトリマゾール（ＣＴＺ）耐性酵母細胞の相対的エタノール生産力を示す図である。
【図１Ｂ】野生型Ｔａｉｋｅｎ  ３９６親酵母株のエタノール耐性と形質転換ＣＴＺ耐性酵母細胞のエタノール耐性を比較する図である。
【図２】ＤＢＮ除草剤増殖培地での形質転換タバコ細胞の増殖を示す図である。
【図３】多数の種にわたるＤＮＡポリメラーゼの保存エキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼモチーフのアラインメントを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
定義
本明細書において用いる場合の用語「進化」は、１つの個体からその子孫に伝えられる遺伝情報のランダムな変異の発生を指し、この遺伝的変異は、その生物の生き残りおよび／または繁殖にとって有利である場合もあり、ない場合もある。生物の遺伝情報のランダムな変異の発生を増加させることによって、生物の進化を加速することができる。個体の中および間でより多くの遺伝的変異を有する集団は、変化する条件、例えば、環境条件および病原性生物の脅威に対する増加された適応能力を有し得る。
【００１０】
本明細書において用いる場合の用語「生物」は、様々な特性、例えば、典型的には、細胞構造、増殖（自己再生）、成長、調節、代謝、修復能力などを有する、生命のプロセスを遂行する体を指す。概して、生物は、核酸によって制御される遺伝、およびタンパク質によって制御される代謝が関与する増殖などの、基本的な特質を有する。生物は、天然、野生型、人工操作、遺伝子修飾、交雑または他の変種または離隔集団を含み得る。生物は、ウイルス、原核生物、真核生物（例えば、単細胞生物、例えば酵母など）、および多細胞生物（例えば、植物、動物など）を含む。本明細書においてこの用語を用いる場合、「生物」は、本明細書において定義するような細胞も指し、かつ包含すること、ならびに本開示の方法を任意のそのような細胞（単数または複数）に適用できることは、理解されるであろう。
【００１１】
本明細書において用いる場合の用語「真核生物」は、核エンベロープを伴う明確な核構造を有する生物を指す。真核生物の例としては、単細胞生物（例えば、酵母など）、植物（例えば、コメ、コムギ、トウモロコシ、ダイズなど）、動物（例えば、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、サルなど）、昆虫（例えば、ハエ、カイコなど）などが挙げられるが、それらに限定されない。
【００１２】
用語「単細胞生物」は、その通常の意味で本明細書において使用され、１つの細胞から成る生物を指す。単細胞生物は、真核生物を含む。単核生物の例としては、酵母、哺乳動物細胞、細胞培養物などが挙げられるが、それらに限定されない。
【００１３】
本明細書において用いる場合、用語「多細胞生物」は、多数の細胞（概して、異なるタイプの多数の細胞）から成る個々の生物を指す。多細胞生物としては、動物、植物、昆虫などが挙げられる。
【００１４】
用語「動物」は、その最も広い意味で本明細書において使用され、脊椎動物および無脊椎動物を指す。
【００１５】
本明細書において用いる場合、用語「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれのものも含む、植物界に属する任意の生物を指す。植物の例としては、コメ科の単子葉植物（例えば、コムギ、トウモロコシ、コメ、オオムギ、モロコシ属など）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい植物の例としては、タバコ、ピーマン、ナス、メロン、トマト、サツマイモ、キャベツ、ニラ、ブロッコリー、ニンジン、キュウリ、柑橘類、ハクサイ、レタス、モモ、ジャガイモおよびリンゴが挙げられる。好ましい植物は作物に限定されず、顕花植物、樹木、芝生、雑草などを含む。さらに、別の指定がない限り、用語「植物」は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞および種子のいずれもを指す。植物器官の例としては、根、葉、幹、花などが挙げられる。植物細胞の例としては、カルス、浮遊培養細胞などが挙げられるが、それらに限定されない。
【００１６】
本明細書において用いる場合、用語「遺伝形質」は、遺伝子型とも呼ばれるものであり、遺伝子によって制御される生物の形質を指す。
【００１７】
本明細書において用いる場合、用語「遺伝子」は、所定の長さの配列を有する、細胞内に存在する核酸を指す。遺伝子は、遺伝形質を規定する場合もあり、しない場合もある。本明細書において用いる場合、用語「遺伝子」は、ゲノム内に存在する配列を概して指し、染色体外の配列、ミトコンドリア内の配列またはこれらに類するものを指す場合もある。遺伝子は、染色体上に所与の配列で配置されている。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子は、構造遺伝子と呼ばれる。構造遺伝子の発現を調節する遺伝子は、調節遺伝子（例えば、プロモーター）と呼ばれる。本明細書における遺伝子は、別の指定がない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を含む。従って、例えば、用語「ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子」は、ＤＮＡポリメラーゼの構造遺伝子ならびにその転写および／または翻訳調節配列（例えば、プロモーター）を概して指す。構造遺伝子ばかりでなく、転写および／または翻訳のための調節配列も、本開示の対象となる遺伝子として有用であり得る。本明細書において用いる場合、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オレゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」、ならびに／または「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を指すことがある。本明細書において用いる場合、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現される、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」、ならびに／または「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を含む。
【００１８】
本明細書において用いる場合、遺伝子に関しての用語「複製」は、親核酸鎖（ＤＮＡまたはＲＮＡ）をテンプレートとして使用して、その親核酸と同じ構造および機能を有する新たな核酸分子（それぞれ、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を形成する、遺伝物質、ＤＮＡまたはＲＮＡ、によるそれ自体のコピーの再生を意味する。真核細胞の場合、複製酵素（ＤＮＡポリメラーゼアルファ）を含む複製開始複合体が形成されて、二本鎖ＤＮＡ分子上の多数の複製起点で複製を開始し、複製反応は、その複製起点から反対方向に進行する。複製の開始は、細胞周期に従って制御される。例えば、酵母の場合、自律複製配列を複製起点と考えることができる。複製開始複合体は、複製起点で形成される場合がある。１つの実施形態において、複製開始複合体は、複製酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）を含む１つ以上のタンパク質要素を含む複合構造を含む場合がある。複製反応では、二本鎖ＤＮＡのらせん構造が部分的に巻き戻されることがある；短鎖ＤＮＡプライマーが合成される；そのプライマーの３’−ＯＨ基からＤＮＡ鎖が伸長される；相補鎖テンプレートで岡崎（Ｏｋａｚａｋｉ）フラグメントが合成される；それらの岡崎フラグメントがライゲートされる；新たに複製された鎖とテンプレート鎖を比較するためのプルーフリーディングが行われる；など。このように、複製反応は、多数の反応段階によって行われるだろう。
【００１９】
生物の遺伝情報を記憶するゲノムＤＮＡの複製メカニズムは、例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  Ａ．  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ  Ｔ．，「ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｆｒｅｅｍａｎ，１９９２に詳細に記載されている。概して、二本鎖ＤＮＡを形成するためにＤＮＡの一方の鎖をテンプレートとして使用して相補鎖を合成する酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ複製酵素）と呼ばれる。ＤＮＡ複製は、少なくとも２種類のＤＮＡポリメラーゼを必要とする。これは、概して、リーディング鎖とラギング鎖を同時に合成するためである。ＤＮＡ複製は、複製起点（Ｏｒｉ）と呼ばれる、ＤＮＡの所定の位置から開始される。例えば、細菌は、それらの環状ゲノムＤＮＡ上に少なくとも１つの二方向性複製起点を有する。従って、概して、１つのゲノムＤＮＡに対してその複製中に４つのＤＮＡポリメラーゼが同時に作用する必要がある。１つの実施形態では、都合のよいことに、リーディング鎖およびラギング鎖の一方のみの複製の誤りを調節することができ、または代替的に、都合のよいことに、それら２本の鎖の間に複製の誤りまたは突然変異率の差がある場合がある。
【００２０】
本明細書において用いる場合、用語「複製の誤り」は、遺伝子（ＤＮＡなど）の複製中の誤ったヌクレオチドの導入を指す。概して、複製の誤りの頻度は、１０８から１０１２対合に１回ほども低い。複製の誤りが少ない理由は、１）ＤＮＡポリメラーゼによってなされるヌクレオチド付加が、テンプレートＤＮＡと複製中に導入されるヌクレオチドとの相補的塩基対合によって決まる；および２）ＤＮＡポリメラーゼの、３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性、またはプルーフリーディング機能が、テンプレートに相補的でない誤対合ヌクレオチドを特定し、除去する、という少なくとも２つの部分から成る。従って、生物における突然変異率またはＤＮＡ複製の誤り率の調節は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼが核酸塩基対合を形成する忠実度を改変もしくは妨害することによって、および／またはＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ機能を改変することによって、行うことができる。
【００２１】
本明細書において用いる場合、用語「ＤＮＡポリメラーゼ」または「Ｐｏｌ」は、ＤＮＡを重合するためにデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸からピロリン酸を放出させる酵素を指す。ＤＮＡポリメラーゼ反応は、テンプレートＤＮＡ、プライマー分子、Ｍｇ２＋などを必要とする。相補ヌクレオチドがプライマーの３’−ＯＨに逐次的に付加されて分子鎖を伸長する。
【００２２】
本明細書において用いる場合、用語「プルーフリーディング機能」は、細胞のＤＮＡにおける損傷および／または誤りを検出し、修復する機能を指す。そのような機能は、アプリン酸部位もしくはアピリミジン酸部位に塩基を挿入することによって、または代替的に、アプリン酸−アピリミジン酸（Ａ−Ｐ）エキソヌクレアーゼで一方の鎖を切断し、その後、５’〜３’エキソヌクレアーゼでその部位を除去することによって、遂行することができる。除去された部分では、ＤＮＡポリメラーゼでＤＮＡが合成されて補足され、その合成されたＤＮＡがＤＮＡリガーゼによって正常なＤＮＡとライゲートされる。この反応は、除去修復と呼ばれる。アルキル化剤、異常塩基、放射線、紫外線、またはこれらに類するものによる化学的修飾に起因して損傷したＤＮＡについては、損傷した部分がＤＮＡグリコシダーゼによって除去され、その後、上で説明した反応によって修復が行われる（不定期ＤＮＡ合成）。そのようなエキソヌクレアーゼ機能を有するＤＮＡポリメラーゼの例としては、ＤＮＡポリメラーゼデルタ、ＤＮＡポリメラーゼエプシロン、ＤＮＡポリメラーゼガンマなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
本明細書において用いる場合の「プルーフリーディング欠損突然変異体」または「エキソヌクレアーゼ欠損突然変異体」は、そのエキソヌクレアーゼ欠損突然変異体が由来する選択された親ポリメラーゼの３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性より低い３’〜５’ヌクレオチド鎖末端加水分解（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼ突然変異体を指すと解釈する。
【００２４】
本明細書において用いる場合の「エキソヌクレアーゼ機能」は、プルーフリーディング、ミスマッチ修復、岡崎フラグメント突然変異および組換えを含む、エキソヌクレアーゼ機能のいずれか少なくとも１つを指す。従って、本明細書において用いる場合の「エキソヌクレアーゼ欠損変異体」は、これらのエキソヌクレアーゼ機能のいずれか少なくとも１つに関する活性減損を有する突然変異体を指す。
【００２５】
本明細書において用いる場合、ＤＮＡポリメラーゼに関して用いるときの用語「忠実度」は、テンプレート鎖を基準にして合成ＤＮＡ鎖における相補塩基のヌクレオチドテンプレート指向性組み込みの精度を指すと解釈する。忠実度は、新たに合成された核酸鎖への正しい塩基の組み込みの頻度に基づいて測定される。正しい塩基の組み込みは、結果として点突然変異、組み込みおよび欠失を生じさせることができる。ポリメラーゼ忠実突然変異体は、高忠実度を示す場合もあり、または低忠実度を示す場合もある。用語「低忠実度」は、所定の値より低い正確な塩基組み込みの頻度を意味すると解釈する。この所定の値は、例えば、正確な塩基組み込みの所望の頻度である場合もあり、または公知ポリメラーゼの頻度である場合もある。
【００２６】
本明細書において用いる場合、用語「低忠実度突然変異体」は、その低忠実度突然変異体が由来する選択された親ポリメラーゼの複製忠実度より低いＤＮＡ複製忠実度を有するポリメラーゼ突然変異体を指す。改変された忠実度は、相補塩基のテンプレート指向性組み込みの精度を測定する任意のアッセイを用いて親および突然変異ポリメラーゼをアッセイしてそれらの活性を比較することにより決定することができる。
【００２７】
本明細書において用いる場合、用語「突然変異」は、ヌクレオチド配列、例えば遺伝子のヌクレオチド配列、が改変されることを意味し、または遺伝子の改変された核酸または結果として生ずるアミノ酸配列の状態を指す。例えば、用語「突然変異」は、結果として生ずるタンパク質の機能の変化、例えばポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ機能の変化、につながる遺伝子のヌクレオチド配列の変化を本明細書では指す。
【００２８】
用語「突然変異」は、本明細書では広く使用され、例えば、点突然変異、ミスセンス突然変異、サイレント突然変異、フレームシフト突然変異、ナンセンス突然変異、ヌクレオチドの挿入または欠失、機能喪失突然変異、機能獲得突然変異、およびドミナントネガティブ突然変異を指す。突然変異は、Ａ）生物の成長および代謝に限られた影響しか及ぼさないだろう天然突然変異；Ｂ）生物の成長および代謝を阻害し得る有害突然変異；ならびにＣ）生物の繁殖に有益であり得る有益突然変異として特徴づけることができる。
【００２９】
本明細書において用いる場合、一定の生物に関する用語「成長」は、個々の生物の定量的増加を指す。生物の成長は、体のサイズ（体長）、体重またはこれらに類するものなどの測定値の定量的増加によって認識することができる。個体の定量的増加は、それぞれの細胞の増加、および細胞数の増加に依存する。
【００３０】
本明細書において用いる場合、用語「野生型突然変異」および「偶発突然変異」は、交換可能に用いる。偶発突然変異率は、ゲノムが複製されるかまたは倍加されるたびの突然変異の確率と定義する。本明細書において用いる場合、「突然変異率」は、「頻度」と同義であり、突然変異／倍加／塩基対の絶対数を指す。本明細書において用いる場合、用語「相対比」は、２つの生物の突然変異率の比を指し、これらの生物の一方は、通常、野生型生物である。相対比は、ミューテーター遺伝子を発現する生物が野生型生物と比較して突然変異を受ける可能性がどれほど高いかを示す。例えば、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（この大腸菌ゲノムは、おおよそ４．６×１０６の塩基対を有する）の偶発突然変異の頻度は、倍加あたり、塩基対につき、おおよそ５×１０−１０の突然変異である。
【００３１】
本明細書において用いる場合、「ミューテーター遺伝子」は、生物の突然変異率を修飾する、突然変異を含む遺伝子を指す。本明細書において用いる場合、用語「ミューテータープラスミド」は、ミューテーター遺伝子を含むプラスミドまたは発現ベクターもしくはカセットを指す。ミューテーター遺伝子を含む生物の培養は、ゲノム複製中に突然変異事象を生じさせる場合がある。ミューテーター遺伝子またはミューテータープラスミドは、突然変異したＤＮＡ複製および／またはＤＮＡ修復遺伝子を含む場合がある。ＤＮＡ複製および修復遺伝子としては、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、Ｅｘｏ  Ｉ、Ｅｘｏ  ＩＩ、Ｅｘｏ  ＩＩＩ、Ｅｘｏ  Ｖ、Ｅｘｏ  ＶＩＩ、Ｅｘｏ  ＩＸ、Ｅｘｏ  Ｘ、ＲｅｃＪ、ＲＮアーゼＴ、ＲＮアーゼＨ、およびこれらの遺伝子の相同体が挙げられるが、それらに限定されない。他のミューテーター遺伝子としては、ヌクレアーゼ、３’−５’エキソヌクレアーゼ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼデルタ、ＤＮＡポリメラーゼエプシロン、ウェルナー（Ｗｅｒｎｅｒ）タンパク質（ＷＲＮ）、ｐ５３、ＴＲＥＸ１、ＴＲＥＸ２、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ１、ＲＡＤ９、ＡＰＥ１、ＶＤＪＰ、ＦＥＮ１、およびＥＸＯ１を挙げることができる。本明細書において用いる場合の相同体は、機能的に関連した遺伝子を指す。
【００３２】
本明細書において用いる場合の用語「選択された突然変異」は、条件の所与のセットのもとで進化した株の表現型と関連づけられる突然変異を指す。「関係づけられる」は、その突然変異が、改善されか、または改変された表現型の直接的または間接的原因となることを意味する。
【００３３】
宿主細胞または生物における突然変異または遺伝子変化に参照するとき、用語「非特異的」は、すべてのヌクレオチド塩基に影響を及ぼし得る可能性を秘めているおよびフレームシフトを含む、ゲノム全体にわたってランダムに発生する宿主細胞ゲノムの変化を指す。非特異的突然変異は、単一ヌクレオチド塩基対の変化、ならびに多数のヌクレオチド塩基対の変化、ならびにＤＮＡの大領域の変化を包含する。例えば、ポリメラーゼエキソヌクレアーゼ機能または忠実度を損なわせる突然変異を含む遺伝子に暴露された生物は、野生型より増加された率で非特異的、ランダム突然変異を含むだろう。
【００３４】
宿主細胞における遺伝子変化に参照するとき、特異的突然変異は、定義可能な遺伝子変化、例えば、限定ではないが、Ａ：ＴからＣ：Ｇへの塩基転換；Ｇ：ＣからＴ：Ａへの塩基転換；Ａ：ＴからＧ：ＣへのおよびＧ：ＣからＡ：Ｔへの塩基転位およびフレームシフト；ならびにＧ：ＣからＴ：Ａへの塩基転換（Ｍｉｌｌｅｒら，Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ）によって特徴づけることができる突然変異を指す。
【００３５】
ミューテーター遺伝子に参照するとき、「異種の」は、その遺伝子が、当分野において公知の組み換え法によって細胞に導入されることを意味する。例えば、プラスミドを使用してミューテーター遺伝子を導入することができ、微生物ゲノムにミューテーター遺伝子を導入することもできる。生物に導入されるミューテーター遺伝子は、細胞内で自然に発生する内在性ＤＮＡ複製および修復の突然変異体である場合があり、または宿主微生物にとって異質である場合がある。微生物に「導入される」との核酸についての参照は、標準的な分子生物学的技術を用いてその核酸が微生物に挿入されることを意味する。導入される核酸は、その微生物において自然に発生する核酸と同じ場合もあり、異なる場合もある。
【００３６】
本明細書において用いる場合、用語「野生型突然変異率に回復する」は、ミューテーター遺伝子を生物から除去しまたは不能にし、それによってその野生型突然変異率を回復するプロセスを指す。本開示は、進化した生物からミューテーター遺伝子を除去するための任意のプロセスを包含し、正常なＤＮＡ複製および修復機能を回復させるように生物のミューテーター遺伝子を含む内在プラスミドをキュアリングするプロセスまたは宿主ゲノムからミューテーターを切除もしくは別様に除去することによるプロセスを含むが、これらに限定されない。キュアリングは、ミューテーター遺伝子を含むプラスミドまたは他のベクターが無い細胞を生産するための方法を指す。当業者に公知の技術を用いて、生物の任意の内在プラスミドまたは他のベクターをキュアリングすることができる。
【００３７】
本明細書において用いる場合、生物に関する用語「再生」は、次世代の新たな個体が親個体から生産されることを意味する。再生は、自然増倍、増殖およびこれらに類するもの；クローニング技術（核移植など）などの人工技術による人工増倍、増殖およびこれらに類するものを含むが、それらに限定されない。再生のための技術の例としては、植物の場合、単個細胞の培養、挿し木の接ぎ木、挿し木の根付けなどが挙げられるが、それらに限定されない。再生生物は、それらの親に由来する遺伝形質を概して有する。有性再生生物は、概して２つの性に由来する遺伝形質を有する。概して、これらの遺伝形質は、実質的に等比率で２つの性に由来する。無性再生生物は、それらの親に由来する遺伝形質を有する。
【００３８】
用語「細胞」は、本明細書ではその最も広い意味で用いる。細胞は、自然に発生する細胞である場合もあり、または人工的に修飾された細胞（例えば、融合細胞（ｆｕｓｉｏｎ  ｃａｌｌｅｓ）、遺伝子修飾細胞など）である場合もある。細胞は、任意の生物（例えば、任意の単細胞生物、例えば細菌、酵母、動物細胞、植物細胞、細胞培養物など）または任意の多細胞生物（例えば、動物、植物など）に由来する場合がある。細胞源の例としては、単個細胞培養物、正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液または体組織、細胞混合物、例えば正常に成長した細胞系からの細胞などが挙げられるが、それらに限定されない。
【００３９】
本明細書において用いる場合の「細胞」は、細胞の少なくとも１つの所望の形質について選択した後、成長させ、１つ以上の多細胞生物を形成するように分化させることができる。細胞から成長させたそのような多細胞生物は、その細胞と比較したとき、全体として同じ所望の形質を有するだろう。
【００４０】
本明細書において用いる場合、用語「単離された」は、典型的な環境において少なくとも１つの自然に付随する物質が減少され、好ましくは実質的に排除されることを示す。従って、用語「単離された細胞」は、典型的な環境において自然に付随する物質（例えば、他の細胞、タンパク質、核酸など）を実質的に含有しない細胞を指す。核酸またはポリペプチドに関しての用語「単離された」は、例えば、組換えＤＮＡ技術によって生産されるときの細胞物質もしくは培養基を実質的に含有しない、または化学合成されるときの前駆体化学物質もしくは他の化学物質を実質的に含有しない、核酸またはポリペプチドを指す。好ましくは、単離された核酸は、生物においてその核酸に自然に隣接する配列（核酸の５’または３’末端）を含有しない。
【００４１】
本明細書において用いる場合、用語「分化細胞」は、特殊機能および形態を有する細胞（例えば、筋肉細胞、ニューロンなど）を指す。幹細胞とは異なり、分化細胞は、多能性をまったくまたは殆ど有さない。分化細胞の例としては、上皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血球、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、ニューロン、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞が挙げられる。
【００４２】
本明細書において用いる場合、用語「分化」または「細胞分化」は、形態および／または機能の質的相違を有する１つ以上の細胞タイプが、単個細胞の分裂に由来する娘細胞集団において発生する現象を指す。従って、「分化」は、特定の検出可能な特徴を初めは有さない細胞の集団（系統樹）が、特定のタンパク質の生産などの特徴を獲得するプロセスを含む。
【００４３】
本明細書において用いる場合、用語「組織」は、多細胞生物における実質的に同じ機能および／または形態を有する細胞の集合体を指す。組織は、概して同じ起源の細胞の集合体であるが、それらの細胞が同じ機能および／または形状を有するのであれば異なる起源の細胞の集合体であってもよい。概して、組織は、器官の一部を構成する。
【００４４】
本開示の様々な態様において任意の器官またはその一部を用いることができる。同様に、組織または細胞は、任意の器官に由来するものであり得る。本明細書において用いる場合、用語「器官」は、一定の機能が果たされる、個々の生物の特定部分に局在している形態学的に独立した構造を指す。多細胞生物（例えば、動物、植物）の場合、器官は、特別な様式で空間的に配列された幾つかの組織から成り、それぞれの組織は、多数の細胞から成る。そのような器官の一例としては、血管系に関する器官が挙げられる。１つの実施形態において、本開示の対象となる器官としては、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、脳、末梢四肢、網膜などを挙げることができるが、それらに限定されない。
【００４５】
本明細書において用いる場合、用語「産物」は、対象となる生物またはその一部によって生産される物質を指す。そのような生産物質の例としては、遺伝子の発現産物、代謝産物、排泄物、タンパク質、化学物質、抗体、アルコール、酵素などが挙げられるが、それらに限定されない。遺伝形質の突然変異率を調節する１つの実施形態に従って、対象となる生物に産物のタイプおよび／または量を変更させることができる。
【００４６】
本明細書において用いる場合の用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、同じ意味を有するものであり、任意の長さを有するアミノ酸ポリマーを指す。このポリマーは、直鎖である場合もあり、分岐鎖である場合もあり、または環状鎖である場合もある。アミノ酸は、自然に発生するアミノ酸である場合もあり、または自然に発生しないアミノ酸である場合もあり、または変異アミノ酸である場合もある。この用語は、多数のポリペプチド鎖の複合体に組み立てられたものを含む場合がある。この用語は、自然に発生したか、または人工的に修飾されたポリマーも含む。そのような修飾としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾（例えば、標識部分とのコンジュゲーション）が挙げられる。この定義は、例えば、少なくとも１つのアミノ酸類似体（例えば、自然に発生しないアミノ酸など）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）、および当分野において公知の他の変異体を包含する。１つの実施形態において、遺伝子産物は、ポリペプチドの形態である場合があり、医薬組成物として有用である場合がある。
【００４７】
本明細書において用いる場合の用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、同じ意味を有するものであり、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびゲノムＤＮＡをはじめとする任意の長さを有するヌクレオチドポリマーを指す。本明細書において用いる場合、核酸および核酸分子は、用語「遺伝子」の概念に含めることができる。所与の遺伝子の配列をコードする核酸分子は、「スプライス突然変異体（変異体）」を含む。類似して、核酸によってコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス変異体によってコードされた任意のタンパク質を包含する。「スプライス変異体」は、名前が示唆するように、遺伝子の選択的スプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写産物は、異なる（代替）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされるだろう。スプライス変異体の生産についてのメカニズムは様々であるが、エキソンの選択的スプライシングを含む。リードスルー転写による同じ核酸に由来する代替ポリペプチドもこの定義に包含される。スプライス産物の組み換え形態をはじめとするスプライシング反応の任意の産物をこの定義に含めることができる。従って、遺伝子は、本明細書ではスプライス突然変異体を含む場合がある。
【００４８】
別の指示がない限り、特定の核酸配列は、明確に示す配列ばかりでなく、その保存修飾変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補配列も暗黙のうちに含む。具体的には、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの三番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって、縮重コドン置換を生じさせることができる（Ｂａｔｚｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【００４９】
本明細書において用いる場合、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列、またはこれらに類するもの）の「相同性」は、２つ以上の遺伝子配列間での同一率を指す。本明細書において用いる場合、配列（核酸配列、アミノ酸配列）の同一性は、２つ以上の比較対象となる配列間での同一配列（個々の核酸、アミノ酸）の率を指す。従って、２つの所与の遺伝子間の相同性が大きいほど、それらの配列間の同一性または類似性も大きい。２つの遺伝子が相同性を有するかどうかは、それらの配列を直接比較することによって、またはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって決定される。２つの遺伝子配列を互いに直接比較するとき、これらの遺伝子は、それらの遺伝子のＤＮＡ配列が互いとの少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を典型的に有する場合、相同性を有する。本明細書において用いる場合、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列、またはこれらに類するもの）の「類似性」は、上で説明した相同性に関して保存的置換が陽性（同一）とみなされるときの２つ以上の配列間の同一率を指す。従って、相同性と類似性は、保存的置換の存在の点で互いに異なる。保存的置換が存在しない場合、相同性と類似性は、同じ値を有する。
【００５０】
本明細書において用いる場合、用語「プライマー」は、高分子合成酵素反応において、高分子化合物を合成する反応の開始に必要な物質を指す。核酸分子を合成するための反応では、合成することとなる高分子化合物の一部に相補的である核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらに類するもの）を用いることができる。
【００５１】
プライマーとして通常用いられる核酸分子としては、対象となる遺伝子の核酸配列に相補的である、少なくとも８連続ヌクレオチド長を有する核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９連続ヌクレオチド長、さらに好ましくは、少なくとも１０連続ヌクレオチド長、さらにいっそう好ましくは、少なくとも１１連続ヌクレオチド長、少なくとも１２連続ヌクレオチド長、少なくとも１３連続ヌクレオチド長、少なくとも１４連続ヌクレオチド長、少なくとも１５連続ヌクレオチド長、少なくとも１６連続ヌクレオチド長、少なくとも１７連続ヌクレオチド長、少なくとも１８連続ヌクレオチド長、少なくとも１９連続ヌクレオチド長、少なくとも２０連続ヌクレオチド長、少なくとも２５連続ヌクレオチド長、少なくとも３０連続ヌクレオチド長、少なくとも４０連続ヌクレオチド長、および少なくとも５０連続ヌクレオチド長を有する。プライマーとして使用される核酸配列としては、上で説明した配列との少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらにいっそう好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％相同性を有する核酸配列が挙げられる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）されることとなる配列の特性に依存して変わるだろう。当業者は、対象となる配列に依存して適切なプライマーを設計することができる。そのようなプライマー設計は、当分野において周知であり、手作業で行われる場合もあり、またはコンピュータプログラムを用いて行われる場合もある。
【００５２】
本明細書において用いる場合、用語「変異体」は、元の物質とは部分的に異なる物質、例えばポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。そのような変異体の例としては、置換変異体、付加変異体、欠失変異体、トランケート型変異体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。そのような変異体の例としては、１つもしくは幾つかの置換、付加および／もしくは欠失を有するヌクレオチドもしくはポリペプチド、または基準核酸分子もしくはポリペプチドに関して少なくとも１つの置換、付加および／もしくは欠失を有するヌクレオチドもしくはポリペプチドが挙げられるが、それらに限定されない。変異体は、基準分子（例えば、野生型分子など）の生物活性を有する場合もあり、または有さない場合もある。目的に依存して、変異体に追加の生物活性が付与される場合もあり、または生物活性の一部がない場合もある。そのような設計は、当分野において周知の技術を用いて行うことができる。あるいは、その特性が既知である変異体を、それらの変異体を生産する生物から単離することによって得ることができ、その変異体の核酸配列を増幅して、配列情報を得ることができる。従って、宿主細胞については、異種に由来する対応遺伝子またはそれらの産物を「変異体」とみなす。
【００５３】
本明細書において用いる場合の用語「核酸分子」は、その核酸によって発現されるポリペプチドが、上で説明したような自然に発生するポリペプチドのものと実質的に同じ活性を有するならば、自然に発生する核酸配列の一部分が欠失されている、または他の塩基（単数もしくは複数）で置換されている、または追加の核酸配列が挿入されているものを含む。あるいは、追加の核酸をその核酸の５’末端および／または３’末端に連結させることができる。核酸分子は、ストリンジェントな条件下でポリペプチドをコードする遺伝子にハイブリダイズすることができるもの、および実質的に同じ機能を有するポリペプチドをコードするものを包含し得る。核酸は、周知のＰＣＲ法、すなわち化学合成、によって得ることができる。この方法を、例えば、部位特異的突然変異誘発およびハイブリダイゼーションと併用することができる。
【００５４】
本明細書において用いる場合、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドについての用語「置換」、「付加」または「欠失」は、それぞれ、元のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関するアミノ酸もしくはその代用品またはヌクレオチドもしくはその代用品の置換、付加または欠失を指す。これは、部位特異的突然変異誘発技術をはじめとする当分野において周知の技術によって達成することができる。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、任意の数（＞０）の置換、付加または欠失を有してもよい。この数は、意図した機能（例えば、ホルモンおよびサイトカインの情報伝達機能など）を維持する変異体が有するそのような置換、付加または欠失数と同じほども大きい場合がある。例えば、そのような数は、１である場合もあり、または幾つかである場合もあり、好ましくは、完全長の２０％もしくは１０％の範囲内、または１００以下、５０以下、または２５以下である場合がある。
【００５５】
用語「ベクター」または「組換えベクター」または「発現ベクター」または「ミューテーターベクター」は、対象となるポリヌクレオチド配列をターゲット細胞に移入することができるベクターを指す。そのようなベクターは、または自己複製できる場合もあり、宿主細胞（例えば、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、個々の動物、および個々の植物など）の染色体に組み込むことができる場合もあり、およびポリヌクレオチドの転写に適する部位にプロモーターを含有する。クローニングに適するベクターは、「クローニングベクター」と呼ばれる。そのようなクローニングベクターは、多数の制限部位を含有する多数のクローニング部位を通常は含有する。制限部位および多数のクローニング部位は、当分野において周知であり、および目的に依存して適切にまたは任意に使用することができる。そのようなベクターとしては、例えば、プラスミドおよびウイルスベクターが挙げられる。生物（例えば、植物）発現ベクターのタイプおよび調節要素のタイプが宿主細胞に依存して変わり得ることは、当業者には周知である。
【００５６】
ベクターは、部位特異的組換えまたはランダム挿入によって宿主のゲノムにヌクレオチド配列を導入することができる組み込みタイプのベクターを包含し得る。組み込みタイプのベクターは、相同組み換えを用いてミューテーター遺伝子をゲノムターゲット部位、例えばＤＮＡポリメラーゼ遺伝子、に挿入することができる。組換えタイプのベクターとしては、全ミューテーター遺伝子、ミューテーター遺伝子フラグメント、および相同組み換えを可能にするために用いることができる隣接ヌクレオチドを有するミューテーター遺伝子を挙げることができる。
【００５７】
他のベクターは、宿主生物におけるトランスジーンの発現を調節することができる誘導性の系を含む誘導性ベクターであり得る。誘導性ベクターとしては、ガラクトース誘導性ＧＡＬ１：ＵＲＡ３発現系、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系またはテトラサイクリン誘導性発現系を挙げることができる。
【００５８】
本明細書において用いる場合、用語「プラスミド」は、染色体から離れて存在し、自律複製する、遺伝因子を指す。具体的に述べると、ミトコンドリアおよび細胞核の葉緑体に含まれているＤＮＡは、一般に、オルガネラＤＮＡと考えられ、プラスミドとは区別される、すなわち、本明細書において用いる場合の用語「プラスミド」の定義の中に含まれない。プラスミドベクターは、宿主においてプラスミドの半独立複製を可能にする複製起点から成る場合がある。プラスミドは、それらのコピー数の点で様々であり得、該コピー数は、それらが緩い条件下にあるのか、またはストリンジェントな条件下にあるのかを決めるそれらが含有する複製起点に依存する。一部のプラスミドは、高コピープラスミドであり、それらを宿主細胞内で非常に高いコピー数に到達させる突然変異を有する。他のプラスミドは、低コピープラスミドである場合があり、細胞あたり非常に低いコピー数で維持されることが多い。
【００５９】
本明細書において用いる場合、用語「プロモーター」は、遺伝子の転写の開始部位を決める塩基配列であって、転写頻度を直接調節するＤＮＡ領域である塩基配列を指す。転写は、プロモーターに結合しているＲＮＡポリメラーゼによって開始される。従って、プロモーターとして機能する所与の遺伝子の部分を本明細書では「プロモーター部分」と呼ぶ。プロモーター領域は、通常、推定タンパク質コーディング領域の第一エキソンの約２ｋｂｐ上流の範囲内に位置する。従って、ＤＮＡ分析ソフトウェアを使用してゲノム塩基配列内のタンパク質コーディング領域を予測することにより、プロモーター領域を推定することができる。推定プロモーター領域は、通常、構造遺伝子の上流に位置するが、その構造遺伝子、すなわち推定プロモーター領域に依存して、構造遺伝子の下流に位置する場合もある。特定のプロモーターの制御下に遺伝子を置くことによって、一定の条件下でのそのような遺伝子の発現を調節することができる。
【００６０】
本明細書において用いるような分子生物学技術、生化学技術、微生物技術、および細胞生物学技術は、当分野において周知であり、一般に使用されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、およびその第３版（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９），Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０），ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２），Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５），Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ら（１９９５），ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９），Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ら（１９９９），ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；別冊実験医学、遺伝子導入＆発現解析実験法、羊土社（Ｓｐｅｃｉａｌ  ｉｓｓｕｅ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ＆  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｙｏｄｏ−ｓｈａ）（１９９７）に記載されている。これらの出版物それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６１】
人工合成遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学は、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ら（１９９２），Ｔｈｅ  Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ  Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ら（１９９４），Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ら（１９９６），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【００６２】
進化を方向づけるための方法
本明細書による生物の進化を方向づけるための方法は、生物の突然変異率の修飾を含む。詳細には、本明細書に記載するような生物の突然変異率の修飾は、１つ以上のミューテーター遺伝子を生物に、それら１つ以上のミューテーター遺伝子の発現を生じさせる結果となるように、およびその親生物を基準にしてそのＤＮＡ突然変異率の増加を生じさせる結果となるように、導入することを含む。１つの実施形態において、１つ以上のミューテーター遺伝子は、その発現がその生物のＤＮＡポリメラーゼ機能を改変する、突然変異ＤＮＡポリメラーゼを含む。１つのそのような実施形態において、突然変異ＤＮＡポリメラーゼは、低忠実度突然変異体である。もう１つのそのような実施形態において、突然変異ＤＮＡポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ欠損突然変異体である。さらにもう１つのそのような実施形態において、１つ以上のミューテーター遺伝子は、低忠実度突然変異体である少なくとも１つの突然変異ＤＮＡポリメラーゼと、エキソヌクレアーゼ欠損突然変異体である少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼとを含む。尚、さらなる実施形態において、生物への１つ以上のミューテーター遺伝子の導入は、低忠実度突然変異体とでもありエキソヌクレアーゼ欠損突然変異体でもある少なくとも１つの突然変異ＤＮＡポリメラーゼの誘導を含む。
【００６３】
さまざまな異なるＤＮＡポリメラーゼが当分野において公知である。それらの触媒性サブユニットの一次構造の相違に基づき、ＤＮＡポリメラーゼは、幾つかの異なるファミリーに分類される。ファミリーＡは、Ｐｏｌ  Ｉをコードする大腸菌ｐｏｌＡにちなんで名づけられている。ファミリーＡメンバーとしては、バクテリオファージＴ７複製ポリメラーゼおよび真核細胞ミトコンドリアポリメラーゼガンマ、ならびにヒトポリメラーゼＰｏｌシータおよびＰｏｌニューも挙げられる。ファミリーＢポリメラーゼとしては、大腸菌Ｐｏｌ  ＩＩ、ｐｏｌＢ遺伝子の産物、および真核細胞ポリメラーゼアルファ、デルタ、エプシロン、ゼータが挙げられる。ファミリーＣポリメラーゼとしては、触媒性サブユニットがｐｏｌＣ遺伝子によってコードされる大腸菌複製ポリメラーゼＰｏｌ  ＩＩＩが挙げられる。
【００６４】
大腸菌は、少なくとも３つのＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩ、を有する。ＤＮＡポリメラーゼＩは、ＤＮＡ修復、組換え、および岡崎フラグメント突然変異に関与する。ＤＮＡポリメラーゼＩＩは、ＤＮＡ修復に関与する。ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩは、染色体ＤＮＡ複製および修復に関与する。これらのポリメラーゼ酵素は、それぞれ、幾つかのタンパク質を含むサブユニット構造を有し、その構造に従ってコア酵素またはホロ酵素に類別される。コアポリメラーゼ酵素は、アルファ、エプシロンおよびシータサブユニットから成る。ホロ酵素は、アルファ、エプシロンおよびシータサブユニットに加えてタウ、ガンマ、デルタおよびベータ成分を含む。
【００６５】
真核細胞は、ＤＮＡポリメラーゼアルファ、ベータ、デルタ、ガンマおよびエプシロンをはじめとする（しかし、これらに限定されない）多数のＤＮＡポリメラーゼを有する。動物における公知ポリメラーゼとしてはＤＮＡポリメラーゼアルファが挙げられ、これは、核ＤＮＡの複製に関与する場合があり、および細胞増殖期のＤＮＡ複製に一定の役割を果たす場合がある。ＤＮＡポリメラーゼベータは、増殖期および静止期における核内ＤＮＡ修復および損傷ＤＮＡの修復に関与する場合がある。ＤＮＡポリメラーゼガンマは、ミトコンドリアＤＮＡの複製および修復に関与する場合があり、エキソヌクレアーゼ活性を有する。ＤＮＡポリメラーゼデルタは、核ＤＮＡの複製に関与する場合があり、およびラギング鎖のＤＮＡ伸長に一定の役割を果たす場合があり、およびエキソヌクレアーゼ活性も含む。ＤＮＡポリメラーゼエプシロンは、核ＤＮＡの複製に関与する場合があり、およびリーディング鎖のＤＮＡ伸長に一定の役割を果たす場合があり、およびエキソヌクレアーゼ活性を有する。
【００６６】
グラム陽性菌、グラム陰性菌、および真核生物におけるＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ機能は、エキソヌクレアーゼ機能の精度に対して影響を及ぼし得る３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性中心に一定の役割を有するＥｘｏ  Ｉモチーフを有するアミノ酸配列を含む可能性が高い。大腸菌などのグラム陰性菌には、２つのポリメラーゼタンパク質、すなわち、エキソヌクレアーゼ活性を有する分子とＤＮＡ合成活性を有する分子、がある。しかし、グラム陽性菌および真核生物の場合、単一のＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡ合成活性とエキソヌクレアーゼ活性の両方を有する。
【００６７】
ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ複製中に正しいヌクレオチドを選択するポリメラーゼの能力を含むポリメラーゼ活性部位の忠実機能も含む場合がある。ＤＮＡポリメラーゼ活性部位としては、例えば、Ｐｏｌデルタ触媒性サブユニットの領域が挙げられる。
【００６８】
ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、原核および真核生物において見つけられている。多数の複製ＤＮＡポリメラーゼは、プルーフリーディングまたはエキソヌクレアーゼ機能を有する、すなわち、３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性によって誤りを除去して無謬性（ｅｒｒｏｒ−ｆｒｅｅ）複製を行う。誤りがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、複製中にヌクレオチド配列突然変異を生じさせる結果となり得る、損傷したか、または誤動作するエキソヌクレアーゼ機能を有する場合がある。あるいは、誤りがちなＤＮＡポリメラーゼ変異体は、同じく複製中にヌクレオチド配列突然変異を生じさせる結果となり得る、野生型より低い複製忠実度を示す低忠実度突然変異体である場合がある。相補ヌクレオチド塩基対を生じさせるそのエキソヌクレアーゼ機能および／または忠実度のいずれかまたは両方を修飾することによって誤りがちになり得る任意のＤＮＡポリメラーゼを、本明細書に記載する定方向進化のための方法では、ミューテーター遺伝子として使用することができる。本明細書に従って生物に導入される突然変異ＤＮＡポリメラーゼは、異種ＤＮＡポリメラーゼである場合もあり、またはその生物に内在するＤＮＡポリメラーゼＤＮＡポリメラーゼの突然変異変種である場合もある。さらに、本明細書に記載するような突然変異ＤＮＡポリメラーゼを獲得するために必要な修飾は、当分野において周知の生物学的技術によって行うことができる。
【００６９】
エキソヌクレアーゼ欠損突然変異ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、例えばＰｏｌデルタ、Ｐｏｌエプシロンおよび／またはＰｏｌガンマＤＮＡポリメラーゼのＥｘｏ  Ｉ、Ｅｘｏ  ＩＩおよび／もしくはＥｘｏ  ＩＩＩモチーフまたは他のエキソヌクレアーゼ機能活性部位を修飾することなどによりポリメラーゼの３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を修飾するＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子に１つ以上の突然変異を導入することによって、生成することができる。エキソヌクレアーゼ欠損突然変異ＤＮＡポリメラーゼを生じさせる結果となる例示的突然変異は、本明細書に提供する実験例に関連して詳細に説明する。エキソヌクレアーゼ欠損突然変異ＤＮＡポリメラーゼをもたらす追加の突然変異は、例えば、Ｓｈｅｖｅｌｅｖ，ＩＶ  ａｎｄ  Ｕ．Ｈｕｂｓｃｈｅｒ，「Ｔｈｅ  ３’５’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ」，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２００２  Ｍａｙ；３（５）：３６４−７６に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。さらに、図３に示すように、矢印によって示すものなどのＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼドメインＥｘｏ  Ｉ、Ｅｘｏ  ＩＩおよびＥｘｏ  ＩＩＩは、酵母Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｓｃ）、酵母ピチア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）（Ｐｓ）、酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（Ｓｐ）、真菌トリポクラジウム・インフラタム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ  ｉｎｆｌａｔｕｍ）（Ｔｃ）、タバコ植物タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔｏｂａｃｕｍ）（Ｎｔ）、植物シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（Ａｔ）、チャイニーズハムスター・チャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）（Ｃｇ）、マウス・ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（Ｍｍ）、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）（Ｈｓ）および細菌大腸菌（Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｅｃ）などの多数の種にわたって保存される。
【００７０】
低忠実度ＤＮＡポリメラーゼを生じさせる結果となる例示的突然変異は、本明細書に提供する実験例に関連して詳細に説明する。１つの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼによる基質認識増加を生じさせる結果となる突然変異をポリメラーゼ低忠実度突然変異とみなす場合がある。より詳細には、基質認識部位および／または活性部位での１つ以上の突然変異がポリメラーゼ低忠実度突然変異の例である場合がある。ＤＮＡポリメラーゼの基質認識部位は、例えば、Ｒｅｈａ−Ｋｒａｎｔｚ  ａｎｄ  Ｎｏｎａｙ，「Ｍｏｔｉｆ  Ａ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４  Ｆｅｂ．２５；２６９（８）：５６３５−４３、Ｌｉら，「Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  Ｐｈｏｓｐｈｏｎｏａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｂｅ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｄｅｌｔａ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５  Ｊｕｎ．；１７０：５６９−５８０、Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎら，「Ｍｕｔａｔｏｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ａｔ  ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｍｏｔｉｆ  Ａ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｄｅｌｔａ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００６  Ｆｅｂ．１７；２８１（７）：４４８６−９４、Ｐｕｒｓｅｌｌら，「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ  ｆａｍｉｌｙ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｂｙ  ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｒｅｓｉｄｕｅ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍ６４４Ｗ，Ｍ６４４Ｌ  ａｎｄ  Ｍ６４４Ｆ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｅｐｓｉｌｏｎ」，Ｎ．Ａ．Ｒ．２００７  Ａｐｒ．２２；３５（９）：３０７６−８６、ＭｃＥｌｈｉｎｎｙら，「Ｉｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｉａｓｅｄ  Ｅｒｒｏｒ  Ｒａｔｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｉｎａｃｃｕｒａｔｅ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ａ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｄｅｌｔａ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００７  Ｊａｎ．２６；２８２（４）：２３２４−３２に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【００７１】
１つの実施形態において、ミューテーター遺伝子は、３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を減少させることにより酵母におけるＤＮＡポリメラーゼのＥｘｏ  ＩモチーフまたはＣＨＯ細胞におけるＤＮＡポリメラーゼのＥｘｏ  ＩＩモチーフのエキソヌクレアーゼ機能を損なわせる突然変異を含む。もう１つの実施形態において、ミューテーター遺伝子は、ＤＮＡポリメラーゼのＭｏｔｉｆ  ＡサブユニットまたはＭｏｔｉｆ  Ｂサブユニットの塩基対整合忠実度を損なわせる突然変異を含む。さらにもう１つの実施形態において、ミューテーター遺伝子は、大腸菌におけるＤＮＡポリメラーゼＢ遺伝子（ＰｏｌＩＩ）の機能を操作することができる１つ以上の突然変異を含む場合がある。さらにもう１つの実施形態において、ミューテーター遺伝子は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ遺伝子の機能を改変し得る１つ以上の突然変異を含む場合がある。これらの例から明らかであるように、３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性にとっておよびポリメラーゼ忠実度にとって不可欠であり、それらの原因となるアミノ酸残基は、異なるファミリーに属するポリメラーゼにわたって保存される。従って、本発明の範囲としては、特定のポリメラーゼファミリーに限定されない。
【００７２】
１つの実施形態において、本明細書に記載するような方法においてミューテーター遺伝子として使用される突然変異ＤＮＡポリメラーゼは、ターゲット生物において特定の突然変異率を生じさせる。例えば、本明細書に記載するような定方向進化のための方法において使用されるミューテーター遺伝子は、１世代または１細胞分裂につき１より多くの突然変異を生じさせる、低忠実度突然変異体でもありエキソヌクレアーゼ欠損突然変異体でもある、ＤＮＡポリメラーゼである場合がある。１つのそのような実施形態において、ミューテーター遺伝子は、ＤＮＡ複製１回につき、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０のミスマッチ塩基、または少なくとも１５、２０、２５、５０および１００のミスマッチ塩基を生じさせる。あるいは、本明細書に記載するような定方向進化のための方法において使用されるミューテーター遺伝子は、生物においてその親株を基準にして突然変異率のおおよそ２倍増加から最大で１００，０００倍増加にわたる突然変異率をもたらす、低忠実度突然変異体でもありエキソヌクレアーゼ欠損突然変異体でもある、ＤＮＡポリメラーゼである場合がある。１つのそのような実施形態において、ミューテーター遺伝子は、その親株の突然変異率よりおおよそ２倍からおおよそ１，０００倍にわたって大きい突然変異率増加をもたらす。もう１つの実施形態において、ミューテータープラスミドは、その親株の突然変異率よりおおよそ１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１７０、１９０、２００、２５０、３００、３５０および４００倍大きい増加された突然変異率をもたらす。
【００７３】
１つの実施形態では、例えば薬物耐性を指標として用いるインビボ正突然変異アッセイを用いて、突然変異率を計算することができる。このアッセイでは、該当遺伝子が機能不全または突然変異を有するとき、突然変異体、すなわち薬物耐性、が出現し得る。もう１つの実施形態では、インビボ復帰突然変異アッセイを用いて突然変異率を計算することができる。復帰突然変異アッセイでは、該当遺伝子が、ヌクレオチド配列の突然変異に起因して機能を回復したとき、突然変異体が出現し得る。正突然変異アッセイは、復帰突然変異アッセイより高い感度を有するだろう。
【００７４】
本発明の方法を実施する際、従来の技術を用いて、１つ以上のミューテーター遺伝子の導入を行うことができる。生物への外来遺伝子の導入および発現のための任意の適する技術、例えば、十分に確立されている形質転換、形質導入およびトランスフェクション法を用いて、本明細書に記載する１つ以上のミューテーター遺伝子をターゲット生物に一過的にまたは安定的に導入することができる。そのような核酸分子導入技術は、当業者には容易に利用でき、および例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ａ．ら，ｅｄｉｔｏｒｓ，（１９８８），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら  （１９８７），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、およびその第３版（２００１），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社（Ｓｐｅｃｉａｌ  ｉｓｓｕｅ，「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ＆  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」，Ｙｏｄｏ−ｓｈａ）（１９９７）に記載されている。さらに、１つ以上のミューテーター遺伝子の導入は、同じく十分に確立されている方法によって、例えば、ノーザンブロッティング分析、ウエスタンブロッティング分析、または他の周知の一般的技術によって、確認することができる。形質転換植物を生産するように細胞を分化させるための技術、およびそのような形質転換植物から種子を得るための方法も、本明細書に引用する文献に記載されている。
【００７５】
１つの実施形態において、一過性ミューテーター遺伝子発現系を用いてミューテーター遺伝子を宿主細胞において発現させることができる。この系を用いると、ミューテーター遺伝子は、生物のゲノムに導入されることなく、ミューテーターベクターから発現される。一過性ミューテーター遺伝子発現系の一部として、ミューテーター遺伝子、またはミューテーター遺伝子フラグメントは、プロモーター配列を含む場合がある。野生型プロモーター、構成的発現プロモーター、誘導性プロモーター、または当業者に公知の他のプロモーターをはじめとする種々のプロモーターを使用することができる。特定の実施形態において、ポリメラーゼは、ガラクトースの存在または不在によって制御されるＧＡＬ１誘導性プロモーターである場合がある。
【００７６】
プロモーターの選択は、発現ベクターからのミューテーター遺伝子の発現レベルに影響を及ぼすだろう。１つの特定の実施形態では、弱いまたは強いプロモーターを中等度のミューテーター遺伝子と併用して、より弱いまたはより強いミューテーター表現型を得ることができる。さらにもう１つの実施形態では、弱いプロモーターを強いまたは弱いミューテーター遺伝子と併用する場合がある。
【００７７】
ミューテーターベクターは、そのミューテーターベクターで首尾よく形質転換された生物を選択するために、ミューテーター遺伝子と共に選択マーカーも含む場合がある。１つの実施形態において、選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子、例えば、アンピシリン耐性遺伝子またはゲネチシン耐性遺伝子である場合がある。もう１つの実施形態において、選択マーカーは、例えばＵＲＡ３またはＬＥＵ２などの、栄養要求性マーカー遺伝子である場合がある。
【００７８】
もう１つの実施形態において、ミューテーターベクターは、宿主生物におけるそのミューテーターベクターの安定性の一助となる複製起点を含む場合がある。複製起点は、宿主生物に由来する場合もあり、近縁種に由来する場合もあり、または他の適する源に由来する場合もある。１つの特定の例では、ＡＲＳ１低コピー、または２ｕｍ  ｏｒｉ高コピー複製起点配列を有するミューテーターベクターで、酵母細胞を形質転換することができる。もう１つのそのような実施形態において、ミューテーターベクターは、ＣｏｌＥ１中等度コピーまたはｐＵＣ高コピー複製起点配列を含む場合がある。ミューテーターベクターは、細胞分裂中に宿主生物集団においてベクターを維持するのに役立つセントロメア配列を含む場合もある。
【００７９】
ミューテーターベクターおよびその特定の特性、例えば所望のプロモーター、複製起点、選択マーカーなど、の選択は、宿主細胞の形質転換法、宿主細胞の倍数性、宿主細胞のゲノムサイズ、ならびに／または宿主細胞が用いるＤＮＡ複製および修復メカニズムに依存するだろう。このように、宿主生物において所望の突然変異率を最高に支持するようにミューテーターベクターを個別修正することができる。
【００８０】
所望の形質を発現するように生物の進化を方向づける１つの実施形態では、突然変異生物を特定の選択条件なしで成長させる。特定の選択条件がないと、ミューテーター遺伝子を有する生物は、促進突然変異率のため遺伝的変異を積み重ね、その促進突然変異率が、所望の形質を有する生物をもたらす。その後、それらの突然変異生物を所望の形質についてスクリーニングし、所望の形質を明示する生物（単数または複数）を選択する。１つのそのような実施形態では、ミューテーター遺伝子で形質転換させた生物を選択条件なしで成長させ、その後、より効率的に成長する能力、または所望の産物もしくは新たな産物をより良好に生産する能力について選択する。
【００８１】
所望の形質を有する突然変異生物のスクリーニングおよび選択は、様々な周知の方法によって遂行することができる。１つの実施形態では、１つ以上のミューテーター遺伝子を有するターゲット生物を選択条件に暴露する場合があり、該選択条件を用いて、所望の形質を有する生物をスクリーニングおよび単離することができる。選択条件は、例えば、所望の物理的成長条件、一定の化学物質の存在、特定の生物学的条件、またはそれらの組み合わせから選択することができる。選択条件を用いる生物のスクリーニングは、独立して用いることができ、または他のスクリーニング法と併用することができる。
【００８２】
１つの実施形態において、所望の物理的成長条件としては、特定のｐＨまたは所望のｐＨ値範囲を挙げることができる。もう１つの実施形態において、物理的成長条件は、生物の成長中に経験される、特定の温度もしくは温度範囲、所望の気圧、または他の物理的条件およびそれらの組み合わせを挙げることができる。
【００８３】
１つの実施形態では、化学物質の存在下または不在下で、生物のスクリーニングおよび選択を行うことができる。１つの実施形態において、化学的選択条件は、１つ以上の栄養素もしくは他の選択成長培地であり、ならびに／またはホルモン、成長因子、有機溶媒、抗体、ハロゲン化化合物、芳香族化合物、除草剤、類似体もしくは他の適する化学的条件の存在もしくは不在である。
【００８４】
もう１つの実施形態では、所望の生物学的形質を有する突然変異生物を、それらの生物を生物学的選択条件、例えばその生物の高い個体群密度、に暴露すること、またはそれらの生物を他の種もしくはタイプの生物の存在に暴露することによってスクリーニングすることができる。生物を、高い個体群密度に耐えるそれらの能力に従って選択してもよいし、または医薬化合物などの所望の産物を生産するそれらの能力に従って選択してもよい。これらの生物学的選択条件下で生き残る生物は、限られた資源に対する競争に勝つそれらの能力のため、および／またはそれらが周囲の生物と相互依存的にもしくは協力して成長するため、生き残ることができる。所望の形質を明示する突然変異生物をさらなる研究および／または使用のために選択し、単離することができる。
【００８５】
１つの実施形態において、１つ以上のミューテーター遺伝子の導入には、ターゲット生物のゲノムの追加の突然変異または遺伝子修飾も付随する場合がある。例えば、ターゲット生物をミューテーター遺伝子で形質転換すると共に、ターゲット生物のゲノム上の所望の位置で遺伝子修飾することもできる。遺伝子修飾としては、ノックダウン突然変異、点突然変異、ミスセンス突然変異、サイレント突然変異、フレームシフト突然変異、ナンセンス突然変異、ヌクレオチドの挿入または欠失、機能喪失突然変に、機能獲得突然変異、およびドミナントネガティブ突然変異を挙げることができる。より効率的な成長および所望の産物または化合物の生産をはじめとする所望の形質について遺伝子修飾生物をスクリーニングすることができる。
【００８６】
ベクターを使用してターゲット生物に１つ以上のミューテーター遺伝子を導入する場合、当業者に利用可能な標準的な技術、方法およびツールを用いてそのベクターを構築することができる。構築されたベクターの導入に適する任意の方法を用いて、１つ以上のミューテーター遺伝子をその生物に導入することができる。例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＤデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）法、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０））、リポフェクション法、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８））、または酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３））を用いることができる。
【００８７】
加えて、当分野において周知の方法によって、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を使用する方法および直接挿入法によって、植物発現ベクターを植物細胞に導入することができる。アグロバクテリウムを使用する方法の例は、例えば、Ｎａｇｅｌら（１９９０）．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６７，３２５に記載されている。そのような方法では、植物に適する発現ベクターをエレクトロポレーションによってアグロバクテリウムに挿入し、その形質転換アグロバクテリウムを、例えば、Ｇｉｌｖｉｎら，ｅｄｓ，（１９９４），Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載されている方法によって植物細胞に導入する。１つの実施形態では、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ  ３５Ｓ：ＣａＭＶ３５Ｓ）プロモーターを含有するｐＢＬ１２１ベクターを用いてミューテーター遺伝子を植物に導入することができる。植物細胞に植物発現ベクターを直接導入するための方法の例としては、エレクトロポレーション（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら（１９８９），Ｎａｔｕｒｅ，３３８：２７４−２７６；およびＲｈｏｄｅｓら（１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：２０４−２０７）、パーティクルガン法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９９１），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９５７−９６２）、ならびにポリエチレングリコール法（ＰＥＧ）法（Ｄａｔｔａら（１９９０），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：７３６−７４０）が挙げられる。これらの方法は、当分野において周知であり、それらの中で、形質転換するべき植物に適する方法を適切に選択することができる。
【００８８】
当分野において周知のものに従って適切なベクターを、所望の宿主および複製または組み込み方法に応じて選択することができる。例えば、所望の酵母株において自己複製ベクターを使用することができる。もう１つの実施形態では、複製起点が不明の生物において組み込みタイプのベクターを使用することができる。１つのそのような実施形態では、組み込みタイプのベクターを部位特異的相同組み換えに用いることができる。もう１つのそのような実施形態では、組み込みタイプのベクターを非特異的ランダム組み込みに用いることができる。さらにもう１つの実施形態では、ｌｏｘＰ配列を含むベクターを使用して、宿主生物からの組換えＤＮＡ配列の切除を助長することができる。
【００８９】
もう１つの実施形態では、ベクタータイプの１つ以上の組み合わせを選択することにより、生物の突然変異率を適度にすることができる。１つのそのような実施形態では、宿主細胞生物および成長条件に依存して、１つ以上のベクターおよびプロモーターを選択することができる。もう１つのそのような実施形態では、低コピー・プラスミド・ベクターを使用する場合がある。低コピープラスミドは、高コピープラスミドと比較して、より安定な表現型および効率的なキュアリング速度を有するだろう。従って、なるべく低コピープラスミドを選択するようが好ましいだろう。他の実施形態では、宿主細胞生物および成長条件に依存して、異なる強度のプロモーターを選択してミューテーター表現型の強度を調節することができる。
【００９０】
本明細書に記載するような１つ以上のミューテーター遺伝子の導入は、生物の内在性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の１つ以上を突然変異コピーで置換する必要がない。１つ以上のミューテーター遺伝子の導入が、生物ゲノムへの１つ以上のミューテーター遺伝子の組み込みを含む場合であっても、ＤＮＡポリメラーゼを発現する生物の内在性遺伝子を置換するかまたはそれらに影響を及ぼすことはその導入のターゲットにならない。それにもかかわらず、本明細書に提供する実験例によって裏付けられるように、ターゲット生物の定方向進化を助長する有意に増加された突然変異率が、本明細書に記載する１つ以上のミューテーター遺伝子の導入によって達成される。本明細書において詳述する方法は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードする生物の内在性遺伝子の改変を必要としない定方向進化のための方法を提供する。結果として、本明細書に記載する方法は、１つ以上の所望の形質を有する生物の定方向進化および選択を可能にするばかりでなく、その生物の野生型突然変異率への回復も助長する。
【００９１】
その進化した生物において修飾された突然変異率がもはや望まれない場合、野生型突然変異率を回復させることができる。野生型突然変異率の回復は、１つ以上のミューテーター遺伝子を生物から除去する、不活性化するかまたは不能にする任意のプロセスによって遂行することができる。例えば、生物のミューテーター遺伝子を含む内在プラスミドをキュアリングするためのまたは宿主ゲノムからミューテーター遺伝子を別様に除去することによる十分に確立されているプロセスを用いて、野生型突然変異率を回復させることができる。あるいは、１つ以上のミューテーター遺伝子を導入するために使用するベクターを、それら１つ以上のミューテーター遺伝子の発現を特定の条件下で誘導できるように、構築することができる。そのような場合、ミューテーター遺伝子産物の転写または翻訳を生じさせる結果とならない条件に生物を付すことによって、野生型突然変異率の回復を達成することができる。
【００９２】
本明細書に記載する方法は、例えば、真核多細胞および単細胞生物、植物ならびに原核生物をはじめとする様々な生物に適用することができる。本明細書に提供する方法を適用することができる真核細胞の具体的な例としては、マウス骨髄腫細胞、ラット骨髄腫細胞、マウスハイブリドーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎細胞、ヒト白血病細胞、ヒト大腸癌細胞、タバコ植物細胞、真菌、および他の真核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。真核細胞および細胞系の追加の例としては、ヒト胎児腎細胞系ＨＥＫ２９３、ヒーラ細胞系、ヒトリンパ球（Ｂ細胞およびＴ細胞を含む）、ヒトハイブリドーマ細胞、ヒト骨髄腫細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞などが挙げられる。代替実施形態では、Ｓｆ９（ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））細胞およびＳ２（キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））細胞などの昆虫細胞を使用する場合がある。
【００９３】
以下の実施例において使用する細胞についての株の名称、例えばＳＹＤ６２Ｄ−１Ａ、は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を指すものである。
【実施例】
【００９４】
実施例１
サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））ｐｏｌ３ミューテーターベクターの生成
Ｓ．セレビジエにおけるＰＯＬ３遺伝子は、２つの機能性ドメイン、３’〜５’エキソヌクレアーゼおよび５’〜３’ポリメラーゼドメイン、を含有する酵母ＤＮＡポリメラーゼデルタの触媒性サブユニットをコードする（参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｕｌｅｔら，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＤＣ２  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌａｒｇｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩＩ」，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９８９  Ｊｕｎ；８（６）：１８４９−５４）。これらのエキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ活性は、染色体複製、修復および組換えに必要とされる。さらに、ＰＯＬ３の３’〜５’エキソヌクレアーゼは、ミスマッチ修復および岡崎フラグメント突然変異ならびにＤＮＡ合成中のプルーフリーディングに関与する（参照により本明細書に組み込まれる、Ｊｉｎら，「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ３’ｔｏ  ５’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｄｅｌｔａ  Ｒｅｑｕｉｒｅ  Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｎｄ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ」，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２００５  Ｊａｎ．，２５（１）：４６１−４７１）。
【００９５】
以前の研究において、エキソヌクレアーゼモチーフＥＸＯ  Ｉ、ＥＸＯ  ＩＩ、およびＥＸＯ  ＩＩＩの予測活性部位で部位特異的突然変異誘発により突然変異が引き起こされ、Ｓ．セレビジエに導入された。野生型ＰＯＬ３を有さずＤ３２１Ａ（アミノ酸３２１でのアスパラギン酸からアラニンへの変化）またはＥ３２３Ａ（アミノ酸３２３でのグルタミン酸からアラニンへの変化）アミノ酸置換を有する突然変異体株は、野生型株よりおおよそ３７０倍高い突然変異率を示した。一方、野生型ＰＯＬ３を有するエキソヌクレアーゼ欠損突然変異体は、野生型株より５倍突然変異率しか示さなかった。これらの結果は、ＤＮＡ複製および修復中、野生型ＰＯＬ３が優性に機能し、突然変異を制限することを示唆している（参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｉｍｏｎら，「Ｔｈｅ  ３’ｔｏ  ５’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｌｏｃａｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＰＯＬ３  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９１，１０（８）：２１６５−７０、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，「Ｐａｔｈｗａｙ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｅｒｒｏｒｓ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９３  Ａｐｒ；１２（４）：１４６７−７３、Ｍｕｒｐｈｙら，「Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｓｅｌｅｃｔ  ｆｏｒ  ｍｕｔａｔｏｒ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｄｅｌｔａｓ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」，Ｇｅｎｏｍｅ，２００６，４９：４０３−４１０）。
【００９６】
Ｄ３２１ＡおよびＥ３２３Ａ突然変異は、エキソヌクレアーゼ機能の金属結合能力の欠損の一因となると考えられる。酵母におけるＤ３２１ＡおよびＥ３２３Ａ突然変異がヒトＰｏｌデルタにおけるＤ３１６ＡおよびＥ３１８Ａアミノ酸置換に対応することも特に参照しておく（Ｓｈｅｖｅｌｅｖ，ＩＶ  ａｎｄ  Ｕ．Ｈｕｂｓｃｈｅｒ，「Ｔｈｅ  ３’−５’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ」，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２００２  Ｍａｙ；３（５）：３６４−７６）。
【００９７】
以前の研究において説明されたもう１つのｐｏｌ３突然変異体酵母株、ｐｏｌ３−Ｌ６１２Ｍは、アミノ酸６１２でのロイシンからメチオニンの変化を含み、およびＤＮＡポリメラーゼ忠実度に影響を及ぼすと考えられる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｉら，「Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  Ｐｈｏｓｐｈｏｎｏａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｂｅ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｄｅｌｔａ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５  Ｊｕｎ．；１７０：５６９−５８０、Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎら，「Ｍｕｔａｔｏｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ａｔ  ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｍｏｔｉｆ  Ａ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｄｅｌｔａ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００６  Ｆｅｂ．１７；２８１（７）：４４８６−９４）。ＬｉｅらおよびＶｅｎｋａｔｅｓａｎらの実験において、ｐｏｌ３−Ｌ６１２Ｍ突然変異体株は、野生型酵母株を基準にしておおよそ１．６から７．０倍高い突然変異率を示した。
【００９８】
以前の研究におけるｐｏｌ３−Ｌ６１２Ｍ突然変異体株は、部位特異的組み込み法（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）によりまたはプラスミドシャッフリング法により染色体ＰＯＬ３遺伝子にｐｏｌ３−Ｌ６１２Ｍ対立遺伝子を組み込み、それにより内在性ＰＯＬ３遺伝子を破壊することによって構築された。突然変異体株を野生型突然変異率に回復させるには、その内在性野生型ＰＯＬ３を別のオレゴヌクレオチド媒介突然変異誘発によって回復させる必要があるだろう。ミューテータープラスミドの使用は、内在性野生型ＰＯＬ３の連続発現を可能にし、およびそのミューテータープラスミドからのその酵母株のキュアリングにより野生型突然変異率の効率的な回復に備える。このようにして、所望の形質を獲得したら生物の突然変異率増加を停止して、他の形質の望ましくない突然変異を防止する。
【００９９】
Ａ．ＹＣｐｌａｃ１１１ミューテーター・プラスミド・ベクターの構築
コーディング配列（３２９１ｂｐ）および非コーディング配列（１０００ｂｐ上流で５００ｂｐ下流）を含む野生型ゲノムＰＯＬ３遺伝子のＤＮＡフラグメント（配列番号：１）を、プライマー、ＳｃＰＯＬ３ｐｒｏ−Ｓ：５’−ＡＧＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＴＧＴＴＴＴＣＣＴＴＧＡＴＧＧＣＡＣＧＧＴ（配列番号：２）、およびＳｃＰＯＬ３ｔｅｒ−ＡＳ：５’−ＡＧＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＴＧＧＡＧＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＡＴＡＴＴＡ（配列番号：３）を使用するＰＣＲ法によって、Ｓ．セレビジエゲノムＤＮＡからクローニングした。増幅されたＤＮＡフラグメントを、ＹＣｐｌａｃ１１１のマルチクローニング部位（ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ）に挿入して、ＹＣｐｌａｃ１１１／ＰＯＬ３プラスミドベクターを構築した。エキソヌクレアーゼ欠損ｐｏｌ３（ｐｏｌ３−０１）プラスミドベクターについては、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とプライマー、Ｓｃｐｏｌ３−０１：５’−ＧＣＧＴＡＴＣＡＴＧＴＣＣＴＴＴＧＣＴＡＴＣＧＣＧＴＧＴＧＣＴＧＧＴＡＧＧＡＴＴＧ（配列番号：４）を使用してＹＣｐｌａｃ３３／ＰＯＬ３プラスミドにおいてＤ３２１Ａ置換（アミノ酸３２１でのアスパラギン酸からアラニンアミノ酸への変化）およびＥ３２３Ａ置換（アミノ酸３２３でのグルタミン酸からアラニンへの置換）を生じさせ、結果として、ＹＣｐｌａｃ１１１／ｐｏｌ３−０１プラスミドベクターを得た。
【０１００】
ＹＣｐｌａｃ１１１／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｘプラスミドベクターの構築については、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）および以下のプライマーを使用することにより、ＹＣｐｌａｃ１１１／ｐｏｌ３−０１プラスミドにおいてアミノ酸６１２におけるロイシンを、表１に示すように、所望のアミノ酸に変化させ、生成した：
Ｓｃｐｏｌ３Ｌ６１２Ａ：
５’−ＧＣＡＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴＧＣＴＴＡＴＣＣＡＡＧＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＧ（配列番号：５）、
Ｓｃｐｏｌ３Ｌ６１２Ｃ：
５’−ＧＣＡＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴＴＧＴＴＡＴＣＣＡＡＧＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＧ（配列番号：６）、
Ｓｃｐｏｌ３Ｌ６１２Ｄ：
５’−ＧＣＡＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴＧＡＴＴＡＴＣＣＡＡＧＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＧ（配列番号：７）、
Ｓｃｐｏｌ３Ｌ６１２Ｅ：
５’−ＧＣＡＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴＧＡＧＴＡＴＣＣＡＡＧＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＧ（配列番号：８）、
Ｓｃｐｏｌ３Ｌ６１２Ｆ：
５’−ＧＣＡＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴＴＴＣＴＡＴＣＣＡＡＧＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＧ（配列番号：９）、
Ｓｃｐｏｌ３Ｌ６１２Ｇ：
５’−ＧＣＡＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴＧＧＡＴＡＴＣＣＡＡＧＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＧ（配列番号：１０）、
Ｓｃｐｏｌ３Ｌ６１２Ｈ：
５’−ＧＣＡＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＡＴＣＣＡＡＧＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＧ（配列番号：１１）、
Ｓｃｐｏｌ３Ｌ６１２Ｉ：
５’−ＧＣＡＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴＡＴＡＴＡＴＣＣＡＡＧＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＧ（配列番号：１２）、
Ｓｃｐｏｌ３Ｌ６１２Ｋ：
５’−ＧＣＡＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴＡＡＧＴＡＴＣＣＡＡＧＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＧ（配列番号：１３）、
Ｓｃｐｏｌ３Ｌ６１２Ｍ：
５’−ＧＣＡＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴＡＴＧＴＡＴＣＣＡＡＧＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＧ（配列番号：１４）、
Ｓｃｐｏｌ３Ｌ６１２Ｎ：
５’−ＧＣＡＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴＡＡＴＴＡＴＣＣＡＡＧＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＧ（配列番号：１５）、
Ｓｃｐｏｌ３Ｌ６１２Ｐ：
５’−ＧＣＡＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴＣＣＡＴＡＴＣＣＡＡＧＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＧ（配列番号：１６）、
Ｓｃｐｏｌ３Ｌ６１２Ｑ：
５’−ＧＣＡＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴＣＡＧＴＡＴＣＣＡＡＧＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＧ（配列番号：１７）、
Ｓｃｐｏｌ３Ｌ６１２Ｒ：
５’−ＧＣＡＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴＣＧＴＴＡＴＣＣＡＡＧＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＧ（配列番号：１８）、
Ｓｃｐｏｌ３Ｌ６１２Ｓ：
５’−ＧＣＡＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴＴＣＴＴＡＴＣＣＡＡＧＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＧ（配列番号：１９）、
Ｓｃｐｏｌ３Ｌ６１２Ｔ：
５’−ＧＣＡＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴＡＣＴＴＡＴＣＣＡＡＧＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＧ（配列番号：２０）、
Ｓｃｐｏｌ３Ｌ６１２Ｖ：
５’−ＧＣＡＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴＧＴＴＴＡＴＣＣＡＡＧＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＧ（配列番号：２１）、
Ｓｃｐｏｌ３Ｌ６１２Ｗ：
５’−ＧＣＡＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴＴＧＧＴＡＴＣＣＡＡＧＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＧ（配列番号：２２）、
Ｓｃｐｏｌ３Ｌ６１２Ｙ：
５’−ＧＣＡＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＡＴＣＣＡＡＧＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＧ（配列番号：２３）
【０１０１】
Ｂ．ＹＣｐｌａｃ３３ミューテーター・プラスミド・ベクターの構築
ＹＣｐｌａｃ１１１／ｐｏｌ３−０１またはＹＣｐｌａｃ１１１／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｍプラスミドのそれぞれを２つの制限酵素、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ、で消化した。ゲノムｐｏｌ３突然変異遺伝子のＤＮＡフラグメントを精製し、その後、ＹＣｐｌａｃ３３プラスミドのマルチクローニング部位（ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ）に挿入して、ＹＣｐｌａｃ３３／ｐｏｌ３−０１およびＹＣｐｌａｃ３３／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｍプラスミドベクターを構築した。
【０１０２】
Ｃ．ＹＥｐｌａｃ１９５ミューテーター・プラスミド・ベクターの構築
ＹＣｐｌａｃ１１１／ｐｏｌ３−０１またはＹＣｐｌａｃ１１１／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｍプラスミドのそれぞれを２つの制限酵素、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ、で消化した。ゲノムｐｏｌ３突然変異遺伝子のＤＮＡフラグメントを精製し、その後、ＹＥｐｌａｃ１９５プラスミドのマルチクローニング部位（ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ）に挿入して、ＹＥｐｌａｃ１９５／ｐｏｌ３−０１およびＹＥｐｌａｃ１９５／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｍプラスミドベクターを構築した。
【０１０３】
ＹＩｐｌａｃ３３ミューテーターベクターの構築
ＹＣｐｌａｃ３３ベクターを２つの制限酵素、ＳｐｅＩおよびＮｈｅＩ、で消化し、その後、それらのＤＮＡフラグメントをＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理してそれらのＤＮＡフラグメントに平滑末端を生じさせた。それらの平滑末端ＤＮＡフラグメントをＴ４  ＤＮＡリガーゼでライゲートして、ＹＩｐｌａｃ３３ベクターを生じさせた。ＹＣｐｌａｃ１１１／ｐｏｌ３−０１またはＹＣｐｌａｃ１１１／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｍプラスミドのそれぞれを２つの制限酵素、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ、で消化した。ゲノムｐｏｌ３突然変異遺伝子のＤＮＡフラグメントを精製し、その後、ＹＩｐｌａｃ３３プラスミドのマルチクローニング部位（ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ）に挿入して、ＹＩｐｌａｃ３３／ｐｏｌ３−０１およびＹＩｐｌａｃ３３／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｍプラスミドベクターを構築した。
【０１０４】
Ｅ．ＹＣｐｌａｃ３３／Ｇａｌ１ｐガラクトース誘導性ミューテーター・プラスミド・ベクターの構築
プライマー、ＧＡＬ１Ｕ１：５’−ＡＴＡＣＴＧＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＧＡＴＴＡＧＡＡＧＣＣＧＣＣＧＡＧ（配列番号：２４）およびＧＡＬｌＤｌ：５’−ＣＣＣＴＡＴＣＴＧＣＡＧＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＧＡＣＧ（配列番号：２５）を使用するＰＣＲにより、Ｓ．セレビジエゲノムＤＮＡからＧＡＬ１プロモーター領域（４５０ｂｐ）をクローニングした。増幅されたＤＮＡフラグメントを２つの制限酵素、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩ、で消化し、その後、ＹＣｐｌａｃ３３プラスミドのマルチクローニング部位（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩ）に挿入して、ＹＣｐｌａｃ３３／Ｇａｌ１ｐプラスミドベクターを構築した。プライマー、ＳＣＰＤ  ＡＥＳＡＬ１：５’−ＡＴＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＴＣＣＣＴＴＣ（配列番号：２６）およびＳＣＰＤ  ＡＩＳＡＣ１：５’−ＧＣＣＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＧＧＡＡＣＡＧＡＴＣＴＴＡＣＡＡＧＣ（配列番号：２７）を使用するＰＣＲによって、ＹＣｐｌａｃ１１１／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｍプラスミドからｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｍコーディング配列のＤＮＡフラグメントを増幅した。増幅されたＤＮＡフラグメントを２つの制限酵素、ＳａｌＩおよびＳａｃＩ、によって消化し、その後、ＹＣｐｌａｃ３３／Ｇａｌ１ｐプラスミドのマルチクローニング部位（ＳａｌＩおよびＳａｃＩ）に挿入して、ＹＣｐｌａｃ３３／Ｇａｌ１ｐ／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｍプラスミドベクターを構築した。
【０１０５】
実施例２
ミューテーター株を生成するためのＳ．セレビジエの形質転換
この実施例では２つの酵母株を使用した：ＳＹＤ６２Ｄ−１Ａ（ＭＡＴａｌｐｈａ、ｕｒａ３−５２、ｈｉｓ３−デルタ３００、ｔｒｐ１−デルタ９０、ｌｅｕ２−３、１１２、ｌｙｓ２−８０１、ａｄｅ２−２）および２倍体株、ＹＰＨ５０１（ＭＡＴａ／ａｌｐｈａ  ｕｒａ３−５２／ｕｒａ３−５２  ｌｙｓ２−８０１／ｌｙｓ２−８０１  ａｄｅ２−１０１／ａｄｅ２−１０１  ｔｒｐ１−デルタ６３／ｔｒｐ１−デルタ６３  ｈｉｓ３−デルタ２００／ｈｉｓ３−デルタ２００  ｌｅｕ２−デルタ／ｌｅｕ２−デルタ１）。これらの酵母株のそれぞれをＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）で成長させ、Ｆｒｏｚｅｎ  ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用することによりコンピテント細胞を調製した。
【０１０６】
Ａ．ＹＣｐｌａｃ１１１ミューテーター株
ＹＣｐｌａｃ１１１／ｐｏｌ３−０１またはＹＣｐｌａｃ１１１／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｘミューテーター・プラスミド・ベクター（２００ｎｇ  ＤＮＡ）のそれぞれを、Ｆｒｏｚｅｎ  ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用することにより１０ｕＬのＳＹＤ６２Ｄ−１Ａコンピテント細胞に導入した。それらの細胞を合成完全培地、ロイシン削除、寒天プレート（ＳＣ／−Ｌｅｕ：０．６７％イースト・ナイトロジェン・ベース（アミノ酸不含）、０．６９ｇ／Ｌ  ＣＳＭ−Ｌｅｕ（ＦＯＲＭＥＤＩＵＭ（商標））、２％グルコース、２％寒天）に塗布し、３日間、摂氏３０度でインキュベートした。それらの形質転換体それぞれを単離し、ＹＣｐｌａｃ１１１／ｐｏｌ３−０１またはＹＣｐｌａｃ１１１／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｘミューテーター株（Ｘは、所望のアミノ酸残基を表す）と呼んだ。これらの形質転換体の内在性野生型ＰＯＬ３遺伝子は、無傷および活性のままであった。
【０１０７】
Ｂ．ＹＣｐｌａｃ３３ミューテーター株
ＹＣｐｌａｃ３３／ｐｏｌ３−０１またはＹＣｐｌａｃ３３／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｍミューテーター・プラスミド・ベクター（２００ｎｇ  ＤＮＡ）のそれぞれを、Ｆｒｏｚｅｎ  ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用することにより１０ｕＬのＳＹＤ６２Ｄ−１Ａコンピテント細胞に導入した。それらの細胞を合成完全培地、ウラシル削除、寒天プレート（ＳＣ／−Ｌｅｕ：０．６７％イースト・ナイトロジェン・ベース（アミノ酸不含）、０．７７ｇ／Ｌ  ＣＳＭ−Ｕｒａ（ＦＯＲＭＥＤＩＵＭ（商標））、２％グルコース、２％寒天）に塗布し、３日間、摂氏３０度でインキュベートした。それらの形質転換体それぞれを単離し、ＹＣｐｌａｃ３３／ｐｏｌ３−０１またはＹＣｐｌａｃ３３／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｍミューテーター株と呼んだ。これらの形質転換体の内在性野生型ＰＯＬ３遺伝子は、無傷および活性のままであった。
【０１０８】
Ｃ．ＹＥｐｌａｃ１９５ミューテーター株
ＹＥｐｌａｃ１９５／ｐｏｌ３−０１またはＹＥｐｌａｃ１９５／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｍミューテーター・プラスミド・ベクター（２００ｎｇ  ＤＮＡ）のそれぞれを、Ｆｒｏｚｅｎ  ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用することにより１０ｕＬのＳＹＤ６２Ｄ−１Ａコンピテント細胞に導入した。それらの細胞をＳＣ／−Ｕｒａに塗布し、３日間、摂氏３０度でインキュベートした。それらの形質転換体それぞれを単離し、ＹＥｐｌａｃ１９５／ｐｏｌ３−０１またはＹＥｐｌａｃ１９５／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｍミューテーター株と呼んだ。これらの形質転換体の内在性野生型ＰＯＬ３遺伝子は、無傷および活性のままであった。
【０１０９】
Ｄ．ＹＩｐｌａｃ３３ミューテーター株
ＹＩｐｌａｃ１９５／ｐｏｌ３−０１またはＹＥｐｌａｃ１９５／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｍミューテーター・プラスミド・ベクターのそれぞれを制限酵素、ＫｐｎＩ、で消化してそれらのベクターを線形化した。それらの線形化ベクター（１０００ｎｇ）のそれぞれを、Ｆｒｏｚｅｎ  ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用することにより、１００ｕＬのＳＹＤ６２Ｄ−１Ａコンピテント細胞に導入した。それらの細胞をＳＣ／−Ｕｒａに塗布し、３日間、摂氏３０度でインキュベートした。それらの形質転換体それぞれを単離し、プライマー、Ｍ１３ＹＣｐ：５’−ＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ（配列番号：２８）およびＳｃＰＯＬ３ＩＣ１：５’−ＴＴＴＡＣＧＧＴＧＡＣＡＣＴＧＡＴＴＣＣＧ（配列番号：２９）を使用するＰＣＲによって遺伝子型を判定して、ミューテーターベクターがＰＯＬ３遺伝子座に組み込まれていることを確認した。陽性形質転換体のそれぞれをＹＩｐｌａｃ３３／ｐｏｌ３−０１またはＹＩｐｌａｃ３３／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｍミューテーター株と呼んだ。これらの形質転換体の内在性野生型ＰＯＬ３遺伝子は、無傷および活性のままであった。
【０１１０】
Ｅ．ＹＣｐｌａｃ３３／Ｇａｌ１ｐミューテーター株
ＹＣｐｌａｃ３３／Ｇａｌ１ｐ／ｐｏｌ３−０１またはＹＣｐｌａｃ３３／Ｇａｌ１ｐ／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｍミューテーター・プラスミド・ベクター（２００ｎｇ  ＤＮＡ）のそれぞれを、Ｆｒｏｚｅｎ  ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用することにより１０ｕＬのＹＰＨ５０１コンピテント細胞に導入した。それらの細胞をＳＣ／−Ｕｒａに塗布し、３日間、摂氏３０度でインキュベートした。それらの形質転換体それぞれを単離し、ＹＣｐｌａｃ３３／Ｇａｌ１ｐ／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｍミューテーター株と呼んだ。ミューテーターｐｏｌ３遺伝子を発現させるために、それらの形質転換体をＳＣ／−Ｕｒａ／ガラクトース（２％グルコースの代わりに２％ガラクトースに）寒天プレートに移し、５から数日間、摂氏３０度で培養した。それらの形質転換体の内在性野生型ＰＯＬ３遺伝子は、無傷および活性のままであった。
【０１１１】
Ｓ．セレビジエにおけるＣＡＮ１遺伝子座での突然変異率のゆらぎ解析
カナバニン耐性（ＣａｎＲ）正突然変異に対して感受性のカナバニン（ＣａｎＳ）を検出するように設計されたＣＡＮ１正突然変異アッセイを、それぞれのプレートからの５つの独立したコロニーに対して行った。
【０１１２】
突然変異率、すなわち１分裂（または世代）あたりの細胞ごとの突然変異の確率、を研究する実験的方法をゆらぎ解析と呼ぶ。ゆらぎ解析において培養あたりの突然変異数から突然変異率を推定するための当業者に公知の様々な数学的手法がある。これらの数学的手法は、多数の並行培養において観察された分布を用いて培養あたりの突然変異の推定数を推定すること、およびその突然変異の推定数を用いて突然変異率を計算することを含む。
【０１１３】
この実施例では、ＣＡＮ１遺伝子座での突然変異率（ＭＲ）は、培養（Ｎ）における総細胞数で割った突然変異係数（ｍ）に等しい、すなわち、ＭＲ＝ｍ／Ｎ。突然変異係数は、ｍ＝ｒ０／（ｒ０／ｍ）と定義することができ、この式中のｒ０は、それぞれのクローンについてのＣａｎＲ耐性コロニー数である。量ｒ０／ｍの値は、ＬｅａおよびＣｏｕｌｓｏｎ，「Ｔｈｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ」Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．１９４８，ｖｏｌ．４９，２６４−２８５に記載されているようなＬｅａ−Ｃｏｕｌｓｏｎ指数を用いて見いだせる。
【０１１４】
ＣＡＮ１正突然変異アッセイをそれぞれのプレートについて３回繰り返し、平均突然変異率を決定した。結果を表１、２および３に示す。
【表１】
0005696042.tif 000002
【表２】
0005696042.tif 000003
【表３】
0005696042.tif 000004
【０１１５】
表１を参照して、野生型突然変異率、すなわち、ミューテータープラスミドを有さない１倍体酵母株（ＳＹＤ６２Ｄ−１Ａ）のＣＡＮ１突然変異率は、おおよそ２．４×１０−７であった。ＹＣｐｌａｃ１１１／ｐｏｌ３−０１ミューテーター株のＣＡＮ１遺伝子座での突然変異率は、平均しておおよそ１．５×１０−６であり、野生型より６．３倍しか大きくなかった。一方、ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｘミューテーター株Ｌ６１２Ａ、Ｌ６１２Ｇ、Ｌ６１２Ｍ、Ｌ６１２Ｑ、Ｌ６１２ＶおよびＬ６１２Ｗのサブセットは、野生型株より５８倍から２３０にわって大きい増加された突然変異率を示した。ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｘミューテーター株Ｌ６１２Ｃ、Ｌ６１２ＦおよびＬ６１２Ｙは、致死性表現型を示した。ミューテーター・プラスミド・ベクターＹＣｐｌａｃ１１１／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｃ、Ｌ６１２ＦおよびＬ６１２Ｙを２倍体酵母株（ＹＰＨ５０１）に導入して、それらの突然変異体株が生存可能であるのかないのかを確認した。結果は、ＹＣｐｌａｃ１１１／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｃ、Ｌ６１２ＦおよびＬ６１２Ｙ  ２倍体株が生存可能であることを示した（データは示さない）。これは、これらの突然変異体がＹＣｐｌａｃ１１１／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｑのものより強いミューテーター表現型を有するようであることを示唆している。さらに、突然変異体株ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｈ、Ｌ６１２Ｉ、Ｌ６１２Ｋ、Ｌ６１２ＲおよびＬ６１２Ｔのサブセットは、ｐｏｌ３−０１単一突然変異体を基準にして同様のまたはより少ない突然変異率を示した。これらの結果は、ＹＣｐｌａｃ１１１／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｘミューテーターベクターが、野生型株を基準にして２倍から２３０倍を超える範囲にわたる様々な突然変異率をもたらすことができることを示している。
【０１１６】
従って、単一ミューテーターベクターにおけるｐｏｌ３−０１とＬ６１２Ｘ（Ａ、Ｇ、Ｍ、Ｑ、ＶおよびＷ）突然変異体のサブセットとの組み合わせ（表１）は、個々にｐｏｌ３−０１またはＬ６１２Ｘ（Ａ、Ｇ、Ｍ、Ｑ、ＶおよびＷ）突然変異のものの突然変異率より相乗的に高い突然変異率を生じさせた。さらに、ミューテータープラスミド上のｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｘ（Ａ、Ｇ、Ｍ、Ｑ、ＶおよびＷ）遺伝子型は、野生型ＰＯＬ３発現に対してドミナントネガティブに作用するようである。すなわち、野生型ＰＯＬ３は、依然として無傷であり、発現されるが、ミューテーターベクターから発現されるｐｏｌ３突然変異体は、内在性ＤＮＡポリメラーゼデルタの競合的阻害剤である可能性が高く、その結果、全ＤＮＡ複製忠実度を低下させる。
【０１１７】
表２を参照して、様々なタイプのミューテーターベクター、例えば、ＹＣｐｌａｃ３３、ＹＥｐｌａｃ１９５およびＹＩｐｌａｃ３３は、１倍体または２倍体酵母株に強いミューテーター表現型をもたらすことができる。これらのベクターは、細胞をそれらのミューテーターベクターのキュアリング（実施例３において詳細に説明する）後に単離するために有用であるＵＲＡ３選択マーカーを含有する。野生型突然変異率、すなわち、ミューテータープラスミドを有さないＳＹＤ６２Ｄ−１Ａ酵母クローンのＣＡＮ１突然変異率は、おおよそ２．４×１０−７であった。ｐｏｌ３−０１株のＣＡＮ１遺伝子座での突然変異率は、平均しておおよそ９．６×１０−７であり、野生型より４．０倍しか大きくなかった。しかし、ゆらぎ解析により、ＹＣｐｌａｃ３３およびＹＥｐｌａｃ１９５プラスミドベクターと共に用いるｐｏｌ３−０１突然変異とＬ６１２Ｍ突然変異の組み合わせが、単独のｐｏｌ３−０１突然変異を基準してＣＡＮ１遺伝子座での突然変異率のおおよそ１０倍増加を生じさせることが明らかになった。ＹＩｐｌａｃ３３ベクターを使用すると、ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｍの組み合わせは、単独のｐｏｌ３−０１突然変異の使用より５０倍を超えて大きい突然変異率を示す。
【０１１８】
加えて、野生型突然変異率と比較したとき、ＹＣｐｌａｃ３３／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｍミューテータープラスミドの突然変異率は、７１倍高かった。ＹＥｐｌａｃ１９５／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｍミューテータープラスミドについては、突然変異率が野生型のものの１２０倍であった。ＹＩｐｌａｃ３３／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｍミューテータープラスミドについては、突然変異率が野生型のものの２２０倍であった。
【０１１９】
表３に示したように、ガラクトース誘導性ミューテーターベクターＹＣｐｌａｃ３３／Ｇａｌ１ｐ／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｍは、酵母株に強い一過性ミューテーター表現型をもたらすことができる。野生型突然変異率、すなわち、ミューテーター・プラスミド・ベクターを有さない２倍体酵母株ＹＰＨ５０１のＣＡＮ１突然変異率は、おおよそ５．２×１０−８であった。対照的に、ＹＰＨ５０１酵母株におけるＹＣｐｌａｃ３３／Ｇａｌ１ｐ／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｍミューテーターベクターは、野生型株のものよりおおよそ３３０倍大きい突然変異率を示した。
【０１２０】
実施例３
酵母における野生型突然変異率の回復
突然変異酵母において所望の形質が達成されたら、ＹＣｐｌａｃ３３およびＹＥｐｌａｃ１９５タイプのプラスミドで形質転換されたその酵母の突然変異率を野生型突然変異率に回復させることができる。突然変異酵母において所望の形質を遺伝的に固定するために、および望ましくない場合があるその酵母におけるさらなる突然変異を回避するために、野生型突然変異率を回復させる。１ｇ／Ｌの５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）を含有するＳＣ培地（機能性ＵＲＡ３遺伝子を一切発現しない細胞の成長のみを可能にする選択培養基）でその酵母を培養することによりＹＣｐｌａｃ３３およびＹＥｐｌａｃ１９５ミューテーター・プラスミド・ベクターから形質転換酵母細胞をキュアリングすることによって、野生型突然変異率を回復させる。
【０１２１】
ＹＩｐｌａｃ３３組み込みタイプのミューテーターベクターで形質転換された酵母細胞の場合、そのミューテーターベクターを相同組み換えによりその酵母のゲノムのＰＯＬ３遺伝子座から切除し、それによってそれらの細胞を野生型突然変異率に戻すことができる。ＹＩｐｌａｃ３３ミューテーターベクターをその形質転換体からキュアリングするために、少なくとも１０７の細胞をＳＣ／５−ＦＯＡに塗布し、生存酵母コロニーの遺伝子型を判定して野生型ＰＯＬ３の回復を確認する。
【０１２２】
実施例４
Ｐｏｌｄ１突然変異体発現ベクターの生成
ＤＮＡポリメラーゼデルタの触媒性サブユニットは、Ｐｏｌｄ１遺伝子によってコードされる。この実施形態では、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞ｃＤＮＡライブラリーを作製し、Ｐｏｌｄ１  ｃＤＮＡを単離した（配列番号：８７）。Ｄ３９８Ａ（アミノ酸３９８でのアスパラギン酸からアラニンへの変化）突然変異をＰｏｌ１  ３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性部位に導入し、Ｌ６０２Ｍ（アミノ酸６０２でのロイシンからメチオニンへの変化）突然変異をＰｏｌｄ１ポリメラーゼドメインに導入した（参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｌｄｓｂｙら，「Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｄｅｌｔａ  ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ  ｃａｕｓｅｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ」，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．，２００１  Ｊｕｎ：７（６），６３８−９、Ｇｏｌｄｓｂｙら，「Ｈｉｇｈ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ」，ＰＮＡＳ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２６，２００２，ｖｏｌ．９９（２４），１５５６０−１５５６５、Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎら，「Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｄｅｌｔａ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ」，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００７  Ｎｏｖ；２７（２１）：７６６９−８２）。オレゴヌクレオチド５’−ＧＧＣＴＡＴＡＡＴＡＴＴＣＡＧＡＡＣＴＴＴＧＣＣＣＴＣＣＣＡＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＣＧＣＧＣ（配列番号：３０（アラニンアンチコドンにアンダーラインを引く）および５’−ＣＣＣＴＧＧＡＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＡＴＧＴＡＣＣＣＡＴＣＣＡＴＣＡＴＧ（配列番号：３１）（メチオニンアンチコドンにアンダーラインを引く）、それぞれ（Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、を使用して突然変異を導入し、それによってＰｏｌｄ１＋Ｄ３９８Ａ突然変異体およびＰｏｌｄ１＋Ｄ３９８Ａ＋Ｌ６０２Ｍ突然変異体を得た。Ｄ３９８Ａ突然変異は、Ｓｈｅｖｅｌｅｖ，ＩＶ  ａｎｄ  Ｕ．Ｈｕｂｓｃｈｅｒ，「Ｔｈｅ  ３’５’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ」，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２００２  Ｍａｙ；３（５）：３６４−７６において論じられているようなヒトＰｏｌデルタにおけるＤ４０１Ａアミノ酸置換に対応する。
【０１２３】
Ｐｏｌｄ１突然変異体のクローニングおよび発現には、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）哺乳動物発現ベクターを使用した。Ｐｏｌｄ１＋Ｄ３９８Ａ突然変異体およびＰｏｌｄ１＋Ｄ３９８Ａ＋Ｌ６０２Ｍをその発現ベクターのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（Ｇ４１８耐性）の後に挿入して、Ｐｏｌ１＋Ｄ３９８ＡおよびＰｏｄｌ１＋Ｄ３９８Ａ＋Ｌ６０２Ｍ発現ベクターを構築した。２つのｌｏｘＰ部位をその構築物に挿入し、それによって、ＣｒｅリコンビナーゼでのＣＨＯ細胞ゲノムからのＰｏｌｄ１突然変異体の切除を可能にした。
【０１２４】
実施例５
ＣＨＯ細胞におけるＯｕａＲ遺伝子座での突然変異率のゆらぎ解析
標準的なトランスフェクション法を用いて、Ｐｏｌｄ１＋Ｄ３９８Ａ突然変異体発現ベクターおよびＰｏｌｄ１＋Ｄ３９８Ａ＋Ｌ６０２Ｍ突然変異体発現ベクターをＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後、安定なＰｌｄ１突然変異体発現細胞系、ＤＸＢ１１／Ｐｏｌｄ１＋Ｄ３９８ＡおよびＤＸＢ１１／Ｐｏｌｄ１＋Ｄ３９８Ａ＋Ｌ６０２Ｍを得た。ＣＨＯ−ＤＸＢ１１（ベクター不含）、ＣＸＢ１１／Ｐｏｌｄ１＋Ｄ３９８Ａ、およびＤＸＢ１１／Ｐｏｌｄ１＋Ｄ３９８Ａ＋Ｌ６０２Ｍ細胞を、２ｍＭのウアバインを含む標準培養基内に配置した。既存のウアバイン耐性細胞を除去するために、細胞数１，０００から細胞数５×１０７に成長させた細胞集団を使用した。
【０１２５】
１４日の培養後に出現したウアバイン耐性（ＯｕａＲ）コロニーの数および播種した細胞の総数（１〜３×１０７）を用いて、前に論じたようなＬｅａ  Ｃｏｕｌｓｏｎ指数に従って突然変異率を決定した。それぞれの細胞培養物についてゆらぎ解析を３回繰り返し、平均突然変異率を決定した。ＣＨＯ細胞におけるＯｕａＲ遺伝子座での突然変異率のゆらぎ解析の結果を表４に示す。
【表４】
0005696042.tif 000005
【０１２６】
ベクターを有さないＣＨＯ細胞におけるＯｕａＲ遺伝子座での野生型突然変異率は、平均しておおよそ３．６×１０−８であった。Ｐｏｌｄ１＋Ｄ３９８Ａ突然変異を有するＣＨＯ細胞は、野生型突然変異率より１．６倍大きい、おおよそ５．８×１０−８の突然変異率を明示した。しかし、Ｐｏｌｄ１＋Ｄ３９８Ａ＋Ｌ６０２Ｍ突然変異を有するＣＨＯ細胞は、おおよそ１．３×１０−６の突然変異率、すなわち、野生型突然変異率の３６倍を有した。
【０１２７】
実施例６
ＣＨＯ細胞における野生型突然変異率の回復
ｌｏｘＰ部位の２つのコピー間の領域を、Ｃｒｅ−リコンビナーゼにより触媒される部位特異的組換えによって切除する。野生型突然変異率を回復させるために、ＣＨＯミューテーター細胞をＣｒｅ−リコンビナーゼ発現ベクター（ピューロマイシン耐性）でトランスフェクトする。ピューロマイシンの存在下で選択されるこれらのＣＨＯ細胞は、回復された野生型突然変異率を有する細胞である。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ部位特異的組換えによってゲノムからＰｏｌｄ１突然変異体を切除して、その野生型突然変異率を回復させる。
【０１２８】
実施例７
クロトリマゾール（ＣＴＺ）耐性酵母の生成
Ｔａｉｋｅｎ  ３９６のｕｒａ３欠失突然変異体（Ｔａｉｋｅｎ  ３９６  ｕｒａ３−）であるＳ．セレビジエ株にＹＣｐｌａｃ３３／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｍベクターを導入して、Ｔａｉｋｅｎ３９６ミューテーター酵母株を生じさせた。そのＴａｉｋｅｎ  ３９６ミューテーター株をＳＤ培地（０．６７％イースト・ナイトロジェン・ベース（アミノ酸不含）、２％グルコール）で成長させ、振盪しながら（１８０ｒｐｍ）２４時間、摂氏３０度で培養した。その後、２５ｍｇ／Ｌのクロトリマゾール（ＣＴＺ）を含有するＳＤ寒天培地にその培養物をプレーティングし、３日間、摂氏３０度で培養した。親酵母株Ｔａｉｋｅｎ  ３９６は、２５ｍｇ／ＬのＣＴＺを含有するＳＤ寒天培地では通常、生き残れない。所望の生存形質、すなわち、２５ｍｇ／ＬのＣＴＺの存在下で生き残る形質、を有する突然変異酵母コロニーを単離した。
【０１２９】
酵母ゲノムにおいてそのクロトリマゾール耐性形質を固定し、ＹＣｐｌａｃ３３／ｐｏｌ３−０１＋Ｌ６１２Ｍベクターを除去するために、１ｇ／Ｌの５−フルオロオロチン酸を含有するＳＣ寒天培地（０．６７％イースト・ナイトロジェン・ベース（アミノ酸不含）、０．０７９％完全サプリメントミックス、２％グルコール、２％寒天）に、単離した酵母クローンをプレーティングし、３日間、摂氏３０度で培養した。生存クローンを単離し、ＣＴＺ耐性形質について固定し、ミューテーターベクターは固定しなかった。ＣＴＺ耐性株のｕｒａ３欠失を奪回するために、コンピテント細胞を相同組み換えによって無傷ＵＲＡ３遺伝子のＤＮＡフラグメントで形質転換し、３日間、摂氏３０度でＳＤ寒天培地にプレーティングした。陽性クローンを単離し、ＣＴＺ耐性および非栄養要求性を確認した。
【０１３０】
実施例８
発酵能力試験
野生型株およびＴａｉｋｅｎ  ３９６のＣＴＺ耐性株をＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）に接種し、振盪しながら（１８０ｒｐｍ）２４時間、摂氏３０度で培養した。
【０１３１】
培養した細胞のそれぞれをＹＰＤ培地から回収し、蒸留水ですすぎ、その後、２×１０６細胞／ｍＬの最終濃度で２０ｍＬのＹＰＳ培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％スクロース）に接種した。それらの細胞のそれぞれをＹＰＳ培地において摂氏３０度で１日２回攪拌しながら成長させた。ＹＰＳ培地中のエタノール濃度および野生型株またはＣＴＺ耐性株の細胞生存率を接種後３日および４日の時点で測定した。
【０１３２】
ＣＴＺ耐性株は、３および４日の培養後に野生型株のものより高いエタノール耐性を示した（図１Ａ）。ＣＴＺ耐性株は、３日後、野生型株のものよりおおよそ２０％高い生存率、および４日後、おおよそ１０％高い生存率も示した（図１Ｂ）。
【０１３３】
実施例９
タバコ植物への除草剤耐性の付与
Ａ．タバコＤＮＡポリメラーゼデルタ遺伝子の単離
タバコ植物タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔｏｂａｃｕｍ）ｃｖ．株Ｂｒｉｇｈｔ  Ｙｅｌｌｏｗ２（「タバコＢＹ−２」）を使用して、植物の進化を方向づけるミューテーター遺伝子の能力を調査した。
【０１３４】
タバコＢＹ−２のＤＮＡポリメラーゼデルタ（Ｐｏｌｄ１）遺伝子の触媒性サブユニットを単離するために、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）およびダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（双子葉植物）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）（単子葉植物）、ならびにクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）（青緑色細菌）のＰｏｌｄ遺伝子配列を入手し、多数の配列アラインメントをそれらのｐｏｌｄアミノ酸配列で行った。この配列アラインメントは、Ｓ．セレビジエのＰＯＬ３のアミノ酸との比較も含んだ（すなわち、図３参照）。配列アラインメント後、それらのｐｏｌｄ配列の高保存領域を特定し、ＰＣＲプライマー、ＰＢＯＸｌ−Ｆｗ：５’−ＧＴ（Ｇ／Ｔ）ＣＡ（Ｃ／Ｔ）ＧＧ（Ａ／Ｃ／Ｇ）ＴＴＧＡ（Ａ／Ｇ）ＣＣ（Ａ／Ｃ）ＴＡ（Ｃ／Ｔ）ＴＴ（Ｃ／Ｔ）ＴＡＣ（配列番号：３２）およびＰＢＯＸ９−Ｒｖ：５’−ＣＡ（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｇ）ＣＣ（Ａ／Ｃ）ＧＣ（Ａ／Ｇ）ＴＡ（Ｃ／Ｇ／Ｔ）Ｃ（Ｇ／Ｔ）ＣＴＴＣＴＴ（配列番号：３３）の設計に用いて、タバコＢＹ−２Ｐｏｌｄ遺伝子配列（配列番号：８８）を単離した。
【０１３５】
ＲｅｖｅＴｒａＡｃｅ（日本、大阪の東洋紡績株式会社（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ））とオリゴ（ｄＴ）プライマー、およびタバコＢＹ−２から精製した全ＲＮＡを使用して、逆転写（ＲＴ）によってＢＹ−２細胞のｃＤＮＡを調製した。Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＦＩＮＺＹＭＥ（商標））、プライマー（ＰＢＯＸ１−ＦｗおよびＰＢＯＸ９−Ｒｖ）、ならびにテンプレートとしてＢＹ−２  ＲＮＡを使用してＲＴ−ＰＣＲにより、ＢＹ−２  ｐｏｌｄ１  ｃＤＮＡの部分フラグメントをクローニングした。３’−ＲＡＣＥおよび５’−ＲＡＣＥを使用して全タバコＢＹ−２  Ｐｏｌｄ１遺伝子を単離するためのプライマーを構築するために、そのｃＤＮＡ配列を使用した。
【０１３６】
Ｂ．３’〜５’エキソヌクレアーゼ領域およびポリメラーゼ忠実領域の修飾
タバコＢＹ−２  ＤＮＡポリメラーゼの３’〜５’エキソヌクレアーゼ領域および／またはポリメラーゼ忠実領域において１つ以上の突然変異を生じさせるように、タバコＢＹ−２遺伝子のヌクレオチド配列を修飾した。より詳細には、Ｎｔｐｏｌｄ１ｅｘｏ−と称する、Ｄ２７５Ａ（アミノ酸２７５でのアスパラギン酸からアラニンへの変化）およびＥ２７７Ａ（アミノ酸２７７でのグルタミン酸からアラニンへの変化）アミノ酸変化を含むエキソヌクレアーゼ欠損突然変異を生じさせるように、Ｐｏｌｄ１遺伝子の３’〜５’エキソヌクレアーゼ領域を修飾した。Ｎｔｐｏｌｄ１ｅｘｏ−＋Ｌ５６７Ｍと称する、Ｌ５６７Ｄ（アミノ酸５６７でのロイシンからアスパラギン酸への変化）アミノ酸変化と共にＤ２７５ＡおよびＥ２７７Ａアミノ酸変化を含むエキソヌクレアーゼ欠損突然変異および低忠実度突然変異を生じさせるように、Ｐｏｌｄ１遺伝子の３’〜５’エキソヌクレアーゼ領域およびポリメラーゼ忠実領域を修飾した。タバコＰｏｌｄ１のエキソヌクレアーゼ領域におけるＤ２５７ＡおよびＥ２７７Ａ突然変異は、ヒトＰｏｌデルタにおけるＤ３１６ＡおよびＥ３１８アミノ酸置換に対応する（Ｓｈｅｖｅｌｅｖ，ＩＶ  ａｎｄ  Ｕ．Ｈｕｂｓｃｈｅｒ，「Ｔｈｅ  ３’  ５’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ」，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２００２  Ｍａｙ；３（５）：３６４−７６）。
【０１３７】
Ｃ．タバコ細胞の形質転換
Ｎｔｐｏｌｄ１ｅｘｏ−突然変異体遺伝子をｐＢＩ１２１植物形質転換ベクターに挿入して、ｐＢＩ／Ｎｔｐｏｌｄ１ｅｘｏ−突然変異体ベクターを生成した。Ｎｔｐｏｌｄ１ｅｘｏ−＋Ｌ５６７Ｍ突然変異体遺伝子をｐＢＩ１２１ベクターに挿入して、ｐＢＩ／Ｎｔｐｏｌｄ１ｅｘｏ−＋Ｌ５６７Ｍ突然変異体ベクターも作った。ｐＢＩ／Ｎｔｐｏｌｄ１ｅｘｏ−突然変異体ベクターおよびｐＢＩ／Ｎｔｐｏｌｄ１ｅｘｏ−＋Ｌ５６７Ｍ突然変異体ベクターをアグロバクテリウムＧＶ３１０１に導入し、アグロバクテリウムとタバコＢＹ−２細胞の同時培養によってタバコＢＹ−２培養細胞への形質転換を行った。同時培養後、カナマイシンおよびクラフォランを含有する選択培地において形質転換体を選択した。
【０１３８】
対照として、ｐＢＩ１２１のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下流への遺伝子挿入を有さない、Ｐｏｌｄ１ミューテーター遺伝子を含有しないｐＢＩ１２１ベクター、ｐＢＩ／空、をタバコＢＹ−２細胞に形質転換させた。
【０１３９】
Ｄ．除草剤耐性タバコ株の獲得
３００ｍＬフラスコを用いて１３０ｒｐｍで振盪しながら摂氏２７度で１００ｍＬの液体懸濁培地（ＮＨ４ＮＯ３  １，６５０ｍｇ／Ｌ、ＫＮＯ３  １，９００ｍｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏ  ４４０ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ  ３７０ｍｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３  ６．２ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４−４Ｈ２Ｏ  ２２．３ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ  ８．６ｍｇ／Ｌ、ＫＩ  ０．８３ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４−２Ｈ２Ｏ  ０．２５ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏ  ０．０２５ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２−６Ｈ２Ｏ  ０．０２５ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２−ＥＤＴＡ  ３７．３ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ  ２７．８ｍｇ／Ｌ、チアミンＨＣｌ  １．０ｍｇ／Ｌ、ミオイノシトール  １００ｍｇ／Ｌ、スクロース  ３０ｇ／Ｌ、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸  ０．２ｍｇ／Ｌ）においてそれぞれのタイプの形質転換ＢＹ−２細胞（ｐＢＩ／空、ｐＢＩ／Ｎｔｐｏｌｄ１ｅｘｏ−およびｐＢＩ／Ｎｔｐｏｌｄ１ｅｘｏ−＋Ｌ５６７Ｍ）をそれぞれ別々に培養した。活発に成長している細胞を新鮮な液体培地に接種した。４日成長させた後、おおよそ５０ｍＬの形質転換細胞懸濁液を試験管に写し、２００×ｇで５分間、室温で遠心分離した。上清を除去し、ペレット化した細胞を新たな液体培地に再び懸濁させて細胞をすすいだ。それらの細胞を３回遠心分離してすすいだ。
【０１４０】
すすいだ後、その液体培地中の形質転換細胞の濃度を、ｐＢＩ／空、ｐＢＩ／Ｎｔｐｏｌｄ１ｅｘｏ−およびｐＢＩ／Ｎｔｐｏｌｄ１ｅｘｏ−＋Ｌ５６７Ｍ突然変異体細胞系のそれぞれにわたって等しくした。それらの細胞懸濁液のそれぞれについて、２．５ｕＭの２，６−ジクロロベンゾニトリル（ＤＢＮ）除草剤を有する固体培養基の８つのプレートを作製し、２ｍＬの細胞懸濁液を接種した。それらのＤＢＮ培養プレートを摂氏２７度の暗所に放置して成長させた。１か月の細胞培養の後、形質転換タバコ細胞がＤＢＮに対する耐性を獲得したことを示す生長タバコカルスの存在について、それらのＤＢＮプレートをスクリーニングした。
【０１４１】
図２を参照して、１カ月の培養後、ｐＢＩ／空対照ベクター（対照としてのＥＭ）およびｐＢＩ／Ｎｔｐｏｌｄ１ｅｘｏ−突然変異体ベクターで形質転換させたタバコ細胞は、ＤＢＮプレート上でタバコカルスを発生させなかった。しかし、ｐＢＩ／Ｎｔｐｏｌｄ１ｅｘｏ−＋Ｌ５６７Ｍ突然変異体ベクター（Ｄ２７５Ａ、Ｅ２７７ＡおよびＬ５６７Ｍアミノ酸変化）で形質転換させたタバコ細胞を接種したＤＢＮプレートのうちの２つは、生長タバコカルスを含有した（矢印はプレート上のタバコカルスを示す）。従って、Ｐｏｌｄ１ミューテーター遺伝子の使用は、ＤＢＮ除草剤に対して耐性の所望の形質を発生させるように植物細胞の進化を方向づけることに成功した。
【０１４２】
実施例１０
所望の形質を有する生物の選択
ミューテーター遺伝子で突然変異させた生物を、当分野において公知であるものなどのスクリーニング法を用いて、所望の形質についてスクリーニングする。所望の形質についてスクリーニングする１つの方法では、突然変異させた生物を特定の選択条件なしで成長させる。特定の選択条件がないと、ミューテーター遺伝子を有する生物は、遺伝的変異を積み重ね、その結果、所望の形質を有する生物を生じさせる。その後、生物がより効率的に成長するかまたは所望の産物もしくは新たな産物をより良好に生産することなどの所望の形質を明示する生物を選択する。
【０１４３】
所望の形質を有する生物を選択条件下での成長によっても選択する。選択条件は、物理的成長条件、一定の化学物質の存在、特定の生物学的条件、またはこれらの組み合わせから選択する。
【０１４４】
物理的成長条件は、その生物の成長中に経験される、特定のｐＨ条件、一定の温度、所望の気圧、または他の物理的条件およびそれらの組み合わせから選択する。
【０１４５】
化学物質、例えば有機溶媒、抗生物質、ハロゲン化化合物、芳香族化合物、類似体、または他の化合物もしくは化学的調合物（ｆｏｒｍｕｌａｓ）、の存在をはじめとする化学的選択条件を用いる。
【０１４６】
高い生物密度をはじめとする生物学的選択条件に生物を暴露することにより、または生物を他の種もしくはタイプの生物の存在に暴露することにより、所望の生物学的形質を有する突然変異生物を選択する。その後、高い個体群密度に耐えるそれらの能力または高い個体群密度にもかかわらず医薬化合物などの所望の産物を生産するそれらの能力に従って生物を選択する。
【０１４７】
突然変異生物を、異なる種の生物または病原体の存在下で生き残るかまたは医薬化合物などの所望の産物を生産する能力についてもスクリーニングする。これらの生物学的選択条件下で生き残る生物は、限られた資源に対する競争に勝つことができるため、および／または周囲の生物と相互依存的にもしくは協力して成長するため、生き残る。所望の形質を明示する突然変異生物をさらなる研究および使用のために選択し、単離することができる。
【０１４８】
突然変異生物の遺伝子修飾とミューテーター遺伝子の併用により、所望の形質の選択が可能となる。ミューテーター遺伝子で形質転換された生物をそれらの生物のゲノムにおける所望の位置で遺伝子修飾する。それらの遺伝子修飾された生物を、より効率的な成長および所望の産物または化合物の生産をはじめとする所望の形質についてスクリーニングする。
【０１４９】
実施例１１
大腸菌ミューテーターベクターの構築
大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰＯＬＩＩ）は、ｐｏｌＢ遺伝子（配列番号：８４）の産物である。ＰＯＬＩＩエキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼドメインの構造は、真核生物ＰＯＬデルタのエキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼドメインに似ている。ｐＵＣ／ｐｏｌＩＩプラスミドを含む大腸菌ミューテーターベクターの構築のために、野生型ＰＯＬＩＩコーディング領域およびプロモーターのＰＣＲ産物をｐＵＣ−ｏｒｉベクターのマルチクローニング部位に挿入した。ＰＣＲプライマーの設計に用いたｐｏｌＢ配列は、ＥｃｐｏｌＢＥｃｏＵ１：ＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＧＣＧＣＧＡＡＧＧＣＡＴＡＴＴＡＣＧＧＧＣ（配列番号：８５）およびＥｃｐｏｌＢＤ１：ＴＣＡＡＧＣＡＴＧＣＧＴＡＣＴＧＧＡＴＧＧＣＡＡＡＧＣＡＴＴＣＧＴＣ（配列番号：８６）であった。エキソヌクレアーゼ欠損ｐｏｌＩＩプラスミドについては、Ｄ１５５Ａ（アミノ酸１５５でのアスパラギン酸からアラニンへの変化）およびＥ１５７Ａ（アミノ酸１５７でのグルタミン酸からアラインへの変化）突然変異を生じさせた。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してｐｏｌ３−０１タイプの突然変異をＰＯＬＩＩコーディング配列内で生じさせ、その結果、ｐｏｌＩＩｅｘｏ−コーディング配列を得た。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してそのｐｏｌＩＩｅｘｏ−コーディング配列にＬ４２２Ｇ（アミノ酸４２２でのロイシンからグリシンへの変化）を含むミューテーター遺伝子を作るようにｐｏｌＩＩ遺伝子の３’〜５’エキソヌクレアーゼ領域およびポリメラーゼ忠実領域を修飾し、その結果、ｐｏｌＩＩｅｘｏ−＋Ｌ４２２Ｇミューテーター遺伝子コーディング配列を得た。標準的な方法を用いて、コンピテント大腸菌細胞（ＭＧ１６５５株）を成長させ、調製した。それらのコンピテント細胞をｐＵＣ／ｐｏｌＩＩｅｘｏ−またはｐＵＣ／ｐｏｌＩＩｅｘｏ−＋Ｌ４２２Ｇプラスミドで形質転換させて、ｐＵＣ／ｐｏｌＩＩｅｘｏ−またはｐＵＣ／ｐｏｌＩＩｅｘｏ−＋Ｌ４２２Ｇ大腸菌株を生じさせた。それらの形質転換体の内在性野生型ＰＯＬＩＩ遺伝子は、無傷および活性のままであった。
【０１５０】
大腸菌におけるリファンピシン耐性遺伝子座での突然変異率のゆらぎ解析
ｐＵＣ／ｐｏｌＩＩ野生型またはｐＵＣ／ｐｏｌＩＩｅｘｏ−もしくはｐＵＣ／ｐｏｌＩＩｅｘｏ−＋Ｌ４２２Ｇを有する大腸菌形質転換体をアッセイして、リファンピシン耐性の獲得により測定して突然変異率を決定した。それらの形質転換体のそれぞれをＬＢ液体培地において定常期まで成長させた。その後、１００ｕｇ／ｍＬのリファンピシンを含むＬＢ固体培地上にそれぞれの培養物の５０から１００ｕＬを配置し、摂氏３７度で１８時間インキュベートした。前に説明したとおりＬｅａ  Ｃｏｕｌｓｏｎ指数に従って、発生したリファンピシン耐性（リファンピシンＲ）コロニーの数から突然変異率を決定した。それぞれの細胞培養物についてゆらぎ解析を５回繰り返し、最高数および最低数を除外して平均突然変異率を決定した。結果を表５に示す。
【表５】
0005696042.tif 000006
ベクターを有さない大腸菌におけるリファンピシンＲでの野生型突然変異率は、平均しておおよそ１．５×１０−８であった。ベクターを用いる野生型ＰＯＬＩＩを有する大腸菌におけるリファンピシンＲでの突然変異率は、平均しておおよそ２．２×１０−８であり、ベクターのない野生型より１．４倍しか大きくなかった。野生型の突然変異率および野生型ＰＯＬＩＩベクターの突然変異率は、ほぼ同じであった。ｐｏｌＩＩｅｘｏ−ミューテーターの突然変異率は、おおよそ２．９×１０−７であった。これもまた、ベクターのない野生型の突然変異率より１９倍しか大きくなかった。しかし、ｐｏｌＩＩｅｘｏ−＋Ｌ４２２Ｇミューテーター株は、おおよそ５．５×１０−５であり、ベクターのない野生型より３５００倍を超えて大きかった。
【０１５１】
実施例１２
グラム陽性菌ミューテーターベクターの構築
グラム陽性菌、例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰＯＬＩＩＩ）は、ｐｏｌＣ遺伝子の産物である（配列番号：８９）。グラム陽性菌ミューテーターベクターの構築のために、野生型ＰＯＬＩＩＩコーディング領域およびプロモーターのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを、グラム陽性菌における複製起点活性を有するプラスミドのマルチクローニング部位：例えばｐＵＢ１１０、ｐＡＭａｌｐｈａ１、ｐＣ１９４またはｐＢＣ１６、に挿入する。エキソヌクレアーゼ欠損ｐｏｌＣプラスミドについては、例えばｐＡＭａｌｐｈａ１プラスミドを用いて、３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性の原因となるアミノ酸残基の１つ以上を不活化アミノ酸残基に変えることができる。３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性の原因となるアミノ酸残基は、例えば、ＥｘｏＩ領域内のＤ４２５、Ｅ４２７、Ｇ４３０、およびＥｘｏＩＩ領域内のＤ５１０である。３’〜５’エキソヌクレアーゼ欠損を生じさせる結果となるこれらのアミノ酸残基の変化は、例えば、非酸性アミノ酸へのＤ（酸性アミノ酸）４２５の変化、例えば、Ｄ４２５Ａ（アミノ酸４２５でのアスパラギン酸からアラニンへの変化）である。エキソヌクレアーゼ欠損を生じさせる結果となるもう１つのアミノ酸変化は、例えば、非酸性アミノ酸へのＥ（酸性アミノ酸）４２７の変化、例えばＥ４２７Ａ（アミノ酸４２７でのグルタミン酸からアラニンへの変化）またはＥ４２７Ｑ（アミノ酸４２７におけるグルタミン酸からグルタミンへの変化）である。３’〜５’エキソヌクレアーゼ欠損を生じさせる結果となるさらにもう１つのアミノ酸変化は、例えば、非天然アミノ酸へのＧ（天然アミノ酸）４３０の変化、例えば、Ｇ４３０Ｅ（アミノ酸４３０でのグリシンからグルタミン酸への変化）である。３’〜５’エキソヌクレアーゼ欠損を生じさせる結果となるさらにもう１つのアミノ酸変化は、例えば、非酸性アミノ酸へのＤ（酸性アミノ酸）５１０の変化、例えば、Ｄ５１０Ｎ（アミノ酸５１０でのアスパラギン酸からアスパラギンへの変化）、Ｄ５１０Ａ（アミノ酸５１０でのアスパラギン酸からアラインへの変化）、またはＤ５１０Ｇ（アミノ酸５１０でのアスパラギン酸からグリシンへの変化）である。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して上のＰＯＬＩＩＩコーディング配列において突然変異を果たして、ｐＡＭａｌｐｈａ１／ｐｏｌＣｅｘｏ−を生じさせる。エキソヌクレアーゼ欠損活性と低減された忠実活性の両方を有するｐｏｌＣプラスミドを得るために、上記３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性の修飾に加えて、ポリメラーゼ忠実度の原因となるアミノ酸の１つ以上の変化を不活性化する。ポリメラーゼ忠実度を生じさせる結果となるアミノ酸残基の変化は、例えば、非天然アミノ酸へのＳ（天然アミノ酸）９７２の変化、例えば、Ｓ９７２Ｐ（アミノ酸９７２でのセリンからプロリンへの変化）である。低減されたポリメラーゼ忠実度を生じさせる結果となるもう１つのアミノ酸変化は、例えば、非天然アミノ酸へのＬ（天然アミノ酸）１１７７の変化、例えば、Ｌ１１７７Ｗ（アミノ酸１１７７でのロイシンからトリプトファンの変化���である。低減されたポリメラーゼ忠実度を生じさせる結果となるさらにもう１つのアミノ酸変化は、例えば、非芳香族アミノ酸へのＦ（芳香族アミノ酸）１２６４の変化、例えば、Ｆ１２６４Ｓ（アミノ酸１２６４でのフェニルアラニンからセリンへの変化）である。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して突然変異（単数または複数）を果たし、結果として、ｐＡＭａｌｐｈａ１／ｐｏｌＣｅｘｏ−＆忠実度−を生じさせることができる。標準的な方法を用いて、枯草菌を成長させ、コンピテント細胞用に調製する。それらのコンピテント細胞をｐＡＭａｌｐｈａ１／ｐｏｌＣｅｘｏ−またはｐＡＭａｌｐｈａ１／ｐｏｌＣｅｘｏ−＆忠実度−プラスミドで形質転換させて、ｐＡＭａｌｐｈａ１／ｐｏｌＣｅｘｏ−またはｐＡＭａｌｐｈａ１／ｐｏｌＣｅｘｏ−＆忠実度−枯草菌細胞を生じさせる。それらの形質転換体の内在性野生型ＰＯＬＩＩＩ遺伝子は、無傷および活性のままである。
【０１５２】
枯草菌におけるリファンピシン耐性遺伝子座での突然変異頻度
ｐＡＭａｌｐｈａ１／ｐｏｌＣｅｘｏ−またはｐＡＭａｌｐｈａ１／ｐｏｌＣｅｘｏ−＆忠実度−を有する形質転換体をアッセイして、リファンピシン耐性の獲得により測定して突然変異率頻度を決定する。それらの形質転換体のそれぞれの５つのコロニーをＬＢ液体培地において定常期まで成長させる。その後、１０ｕｇ／ｍＬのリファンピシンを含むＬＢ固体培地上にそれらの培養物のそれぞれの１０ｕＬを配置し、摂氏３７度で１８時間インキュベートする。発生したリファンピシン耐性コロニーの数から突然変異頻度を決定する。
【０１５３】
形質転換体は、その親株を基準にして突然変異率のおおよそ２倍増加から最大で１００，０００倍の増加にわたる突然変異頻度を有する。より具体的には、ミューテータープラスミドは、その親株の突然変異率よりおおよそ１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０，８０、１００、１２０、１４０、１６０、１７０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、および４００倍大きく増加された突然変異率をもたらす。他の形質転換体の場合、ミューテーター遺伝子は、ＤＮＡ複製あたり、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０のミスマッチ塩基、または少なくとも１５、２０、２５、５０および１００のミスマッチ塩基を生じさせる。
【０１５４】
通常の当業者には明らかであろうように、上で説明した実施形態の詳細に、本発明の基礎原理を逸脱することなく、多くの変更を加えることができる。従って、本発明の範囲は、唯一以下の特許請求の範囲によって決定されるべきものである。
【図１Ａ】
0005696042.tif 000007
【図１Ｂ】
0005696042.tif 000008
【図２】
0005696042.tif 000009
【図３】
0005696042.tif 000010
【配列表】
0005696042000001.app