(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリリン酸キナーゼ２型と、ポリリン酸と、ＡＭＰとを反応させる工程を含み、
上記ポリリン酸キナーゼ２型は、単一の酵素でＡＭＰからＡＴＰの合成を可能とする酵素であることを特徴とする、ＡＴＰの製造方法。
【請求項２】
上記ポリリン酸キナーゼ２型が、好熱菌のポリリン酸キナーゼ２型であることを特徴とする、請求項１に記載のＡＴＰの製造方法。
【請求項３】
上記好熱菌のポリリン酸キナーゼ２型が、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドであることを特徴とする、請求項２に記載のＡＴＰの製造方法：
（ａ）配列番号１、２、３または４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１、２、３または４に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ＡＭＰからＡＴＰを生成する活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
上記好熱菌のポリリン酸キナーゼ２型が、以下の（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドであることを特徴とする、請求項３に記載のＡＴＰの製造方法：
（ｃ）配列番号６、７、８または９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号６、７、８または９の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＡＭＰからＡＴＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＡＭＰからＡＴＰを製造するためのキットであって、
ポリリン酸キナーゼ２型と、ポリリン酸と、ＡＭＰとを少なくとも備え、
上記ポリリン酸キナーゼ２型は、単一の酵素でＡＭＰからＡＴＰの合成を可能とする酵素であることを特徴とするキット。
【請求項６】
ＡＴＰを利用して物質を製造する方法であって、
上記製造方法によってＡＴＰから生成されたＡＭＰに、ポリリン酸キナーゼ２型と、ポリリン酸とを反応させてＡＴＰを再生するＡＴＰ再生反応と、当該製造方法とが共役しており、
上記製造方法が利用するＡＴＰは、当該製造方法と共役している上記ＡＴＰ再生反応によって再生されたＡＴＰであり、
上記ポリリン酸キナーゼ２型は、単一の酵素でＡＭＰからＡＴＰの合成を可能とする酵素であることを特徴とする物質の製造方法。
【請求項７】
上記物質は、アセチル−ＣｏＡであることを特徴とする、請求項６に記載の物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＴＰの製造方法およびその利用に関し、より具体的には、ＡＭＰからＡＴＰを製造するＡＴＰの製造方法およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内では、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）をエネルギー源として利用して種々の生体化合物を合成しているが、その消費されたＡＴＰを別途再生するために、共役した反応系、例えばアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）からＡＴＰを合成する反応系がある。その一つとして、ポリリン酸とポリリン酸キナーゼとをＡＤＰと反応させることによる、安定なＡＴＰ再生系が知られている（特許文献１〜５）。
【０００３】
ポリリン酸は、数十〜数百の無機リン酸が高エネルギーであるリン酸結合によって直鎖状につながった無機ポリマーである。ポリリン酸キナーゼは、ポリリン酸とＡＤＰとからＡＴＰを合成する酵素である。ポリリン酸キナーゼとしては、ポリリン酸キナーゼ１型（ＰＰＫ１）が知られている。特に、特許文献５に開示された、好熱菌Thermus thermophilus由来のポリリン酸キナーゼ１型（ＰＰＫ１）は、耐熱性を有しているため、安定的にＡＴＰを合成することができる。また、ポリリン酸キナーゼとしては、上述したＰＰＫ１の他に、ポリリン酸キナーゼ２型（ＰＰＫ２）も報告されている（非特許文献１）。非特許文献１によれば、ＰＰＫ１およびＰＰＫ２は、どちらも、ポリリン酸とＡＤＰとからＡＴＰを生成する反応に関与し、ＰＰＫ２は、ＰＰＫ１と比較して、上記反応を触媒する活性が１０００倍程度高いことが報告されている。
【０００４】
このように、ポリリン酸とポリリン酸キナーゼとによるＡＤＰからのＡＴＰ再生系は、安価で実用的なＡＴＰ再生系として知られている。
【０００５】
ところで、ＡＴＰからＡＤＰへの分解を利用して反応する酵素の他に、ＡＴＰからＡＭＰ（アデノシン一リン酸）への分解を利用して反応する酵素がある（例えば、アセチルＣｏＡ合成酵素等は、より大きい自由エネルギー変化が得られるＡＴＰからＡＭＰへの分解と共役する。）。このため、このような酵素を利用して物質を生産する際には、ＡＴＰを絶えず反応系に供給する必要があるが、ＡＭＰからＡＴＰへの再生系と共役させることができれば酵素を連続的に反応させることが容易になる。特許文献１〜４には、ＡＭＰからＡＴＰを合成する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−２９９３９０公報（２００１年１０月３０日公開）
【特許文献２】特開２００５−４６０１０公報（２００５年  ２月２４日公開）
【特許文献３】特開２００６−８１５０６公報（２００６年  ３月３０日公開）
【特許文献４】国際公開第９８／４８０３１号パンフレット（１９９８年１０月２９日公開）
【特許文献５】特開２００７−１４３４６３号公報（２００７年  ６月１４日公開）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Zhang et. al.， PNAS， 2002， vol. 99, no. 26, p.16678-16683
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、特許文献１〜４に開示された方法は、単一の酵素を用いてＡＭＰから直接ＡＴＰを合成する方法ではない。
【０００９】
具体的には、特許文献１〜４に開示された方法では、まず、第１段階の反応として、ＡＴＰを利用して、アデニレートキナーゼによってＡＭＰからＡＤＰを合成する。次いで、第２段階の反応として、第１段階で合成したＡＤＰを基質として、ポリリン酸キナーゼによってＡＴＰを合成するものである。このため、ＡＭＰからＡＴＰを合成するためには、アデニレートキナーゼおよびポリリン酸キナーゼの２種類の酵素を利用する必要がある。２種類の酵素を利用する反応系は、単一の酵素のみを利用する反応系と比較すると、反応系の制御が複雑になるという問題を有している。
【００１０】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、より簡便にＡＭＰからＡＴＰを合成することができる手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、既にＡＤＰを基質としてＡＴＰを合成する酵素として知られていたポリリン酸キナーゼ２型（ＰＰＫ２）が、ＡＭＰを基質としてＡＴＰを合成する活性を有していることを初めて見出し、かかる新規知見に基づいて本発明を完成させるに至った。
【００１２】
これまでに、ＰＰＫ２が、ＡＭＰを基質としてＡＴＰを合成する活性を有しているという知見は、一切報告されていない。そもそも、ポリリン酸キナーゼに関わらず、単一の酵素のみで、ＡＭＰからＡＴＰを合成（再生）し得るという知見自体がない。従って、ＰＰＫ２を用いることによって、単一の酵素のみで、ＡＭＰからＡＴＰを合成し得ることは、本発明者らが初めて見出し、ここに開示するものである。
【００１３】
すなわち、本発明に係るＡＴＰの製造方法は、ポリリン酸キナーゼ２型と、ポリリン酸と、ＡＭＰとを反応させる工程を含み、
上記ポリリン酸キナーゼ２型は、単一の酵素でＡＭＰからＡＴＰの合成を可能とする酵素であることを特徴としている。
【００１４】
上記構成であれば、単一の酵素のみでＡＭＰからＡＴＰを合成し得るので、より簡便にＡＭＰからＡＴＰを製造することができる。
【００１５】
本発明に係るＡＴＰの製造方法では、上記ポリリン酸キナーゼ２型が、好熱菌のポリリン酸キナーゼ２型であることが好ましい。
【００１６】
好熱菌のポリリン酸キナーゼ２型は、耐熱性を有しているので、より安定的にＡＭＰからＡＴＰを製造することができる。
【００１７】
本発明に係るＡＴＰの製造方法では、上記好熱菌のポリリン酸キナーゼ２型が、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドであり得る：
（ａ）配列番号１、２、３、４または５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１、２、３、４または５に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ＡＭＰからＡＴＰを生成する活性を有するポリペプチド。
【００１８】
上記の好熱菌のポリリン酸キナーゼ２型は、耐熱性を有しているので、より安定的にＡＭＰからＡＴＰを製造することができる。
【００１９】
本発明に係るＡＴＰの製造方法では、上記好熱菌のポリリン酸キナーゼ２型が、以下の（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドであり得る：
（ｃ）配列番号６、７、８、９または１０の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号６、７、８、９または１０の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＡＭＰからＡＴＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００２０】
上記の好熱菌のポリリン酸キナーゼ２型は、耐熱性を有しているので、より安定的にＡＭＰからＡＴＰを製造することができる。
【００２１】
本発明に係るキットは、ＡＭＰからＡＴＰを製造するためのキットであって、ポリリン酸キナーゼ２型と、ポリリン酸と、ＡＭＰとを少なくとも備え、
上記ポリリン酸キナーゼ２型は、単一の酵素でＡＭＰからＡＴＰの合成を可能とする酵素であることを特徴としている。
【００２２】
かかる構成のキットを用いれば、単一の酵素のみでＡＭＰからＡＴＰを合成し得るので、より簡便にＡＭＰからＡＴＰを製造することができる。
【００２３】
本発明に係る物質の製造方法は、ＡＴＰを利用して物質を製造する方法であって、上記製造方法によってＡＴＰから生成されたＡＭＰに、ポリリン酸キナーゼ２型と、ポリリン酸とを反応させてＡＴＰを再生するＡＴＰ再生反応と、当該製造方法とが共役しており、上記製造方法が利用するＡＴＰは、当該製造方法と共役している上記ＡＴＰ再生反応によって再生されたＡＴＰであり、上記ポリリン酸キナーゼ２型は、単一の酵素でＡＭＰからＡＴＰの合成を可能とする酵素であることを特徴としている。
【００２４】
上記構成であれば、ＡＴＰを消費する物質の生成系に、ＡＴＰ再生系を共役させるので、ＡＴＰを供給する必要がなく、コストを抑えることができる。また、副反応が起こらない高効率の反応系を構築することができる。このため、より安価にかつより効率よく物質を製造することができる。
【００２５】
本発明に係る物質の製造方法では、上記物質は、アセチル−ＣｏＡであることが好ましい。
【００２６】
上記構成であれば、ＡＴＰを消費するアセチル−ＣｏＡの生成系に、ＡＴＰ再生系を共役させるので、ＡＴＰを供給する必要がなく、コストを抑えることができる。また、副反応が起こらない高効率の反応系を構築することができる。このため、より安価にかつより効率よくアセチル−ＣｏＡを製造することができる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明に係るＡＴＰの製造方法は、ポリリン酸キナーゼ２型と、ポリリン酸と、ＡＭＰとを反応させる工程を含み、上記ポリリン酸キナーゼ２型は、単一の酵素でＡＭＰからＡＴＰの合成を可能とする酵素である構成である。また、本発明に係るキットは、ＡＭＰからＡＴＰを製造するためのキットであって、ポリリン酸キナーゼ２型と、ポリリン酸と、ＡＭＰとを少なくとも備え、上記ポリリン酸キナーゼ２型は、単一の酵素でＡＭＰからＡＴＰの合成を可能とする酵素である構成である。従って、本発明によれば、単一の酵素のみでＡＭＰからＡＴＰを合成し得るので、より簡便にＡＭＰからＡＴＰを製造することができるという効果を奏する。
【００２８】
さらには、本発明に係る物質の製造方法は、ＡＴＰを利用して物質を製造する方法であって、上記製造方法によってＡＴＰから生成されたＡＭＰに、ポリリン酸キナーゼ２型と、ポリリン酸とを反応させてＡＴＰを再生するＡＴＰ再生反応と、当該製造方法とが共役しており、上記製造方法が利用するＡＴＰは、当該製造方法と共役している上記ＡＴＰ再生反応によって再生されたＡＴＰであり、上記ポリリン酸キナーゼ２型は、単一の酵素でＡＭＰからＡＴＰの合成を可能とする酵素である構成である。従って、本発明によれば、ＡＴＰを消費する物質の生成系に、ＡＴＰ再生系を共役させるので、ＡＴＰを供給する必要がなく、コストを抑えることができる。また、副反応が起こらない高効率の反応系を構築することができる。このため、より安価にかつより効率よく物質を製造することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明に係る物質の製造方法の概略を示す図である。
【図２】薄層クロマトグラフィーの結果を表す図である。
【図３】耐熱性ポリリン酸キナーゼ２型のＡＴＰ合成活性を測定した結果を表すグラフである。
【図４】耐熱性ポリリン酸キナーゼ２型のＡＴＰ合成活性を測定した結果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではなく、記述した範囲内で種々の変形を加えた態様で実施できるものである。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。
【００３１】
〔１．ＡＴＰの製造方法〕
本発明に係るＡＴＰの製造方法は、ポリリン酸キナーゼ２型と、ポリリン酸と、ＡＭＰとを反応させる工程を含み、上記ポリリン酸キナーゼ２型は、単一の酵素でＡＭＰからＡＴＰの合成を可能とする酵素であることを特徴としている。
【００３２】
本発明に係るＡＴＰの製造方法では、下記の反応式（１）に示すように、ＡＭＰは、ポリリン酸キナーゼ２型（以下、「ＰＰＫ２」と略記する。）の触媒作用によりポリリン酸（ｐｏｌｙＰｎ）からリン酸基を受け取り、ＡＴＰを生じる。
【００３３】
【化１】
0005800218.tif 000002
【００３４】
（式中、ｎは、ポリリン酸におけるリン酸の数を表す。）
ＰＰＫ２と、ポリリン酸と、ＡＭＰとの反応条件は、ＡＭＰからＡＴＰが合成される条件であれば特に限定されず、適切な緩衝液中で、適切な温度で、適切な時間にわたって、ポリリン酸キナーゼ２型と、ポリリン酸と、ＡＭＰとを反応させればよい。
【００３５】
緩衝液としては、例えば、ＰＰＫ緩衝液（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨバッファ、４０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、ｐＨ７．０）、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液等を挙げることができる。緩衝液には、例えば、Ｍｇイオンなどの二価金属イオンが含まれていることが好ましい。
【００３６】
反応温度は特に限定されず、用いるＰＰＫ２に応じて適宜選択することができる。例えば、２０〜４０℃であってもよく、２５〜３０℃であってもよい。反応温度が２０℃より低いと、一般的にＰＰＫ２の酵素活性が低くＡＴＰが充分に合成されないおそれがある。また、反応温度が４０℃を超えると、一般的にＰＰＫ２が失活することによりＡＴＰが充分に合成されないおそれがある。
【００３７】
なお、好熱菌由来のＰＰＫ２を用いる場合は、反応温度の好ましい範囲は上記の限りではない。好熱菌由来のＰＰＫ２は、耐熱性を有しているので、好ましくは、３０〜８０℃、より好ましくは５０〜７０℃の反応温度にて、安定的にＡＴＰを合成することができる。
【００３８】
高熱菌由来のＰＰＫ２は、高温条件下であっても失活し難い。そのため、高温条件下での反応系においても安定にＡＴＰを生産することができる。よって、高熱菌由来のＰＰＫ２を用いれば、高温での物質生産反応系とＡＴＰ生産反応系とを共役させることが可能となる。
【００３９】
また、ＰＰＫ２を用いたＡＴＰ生産反応系と、当該ＡＴＰを用いた物質生産反応系がカップリングしている反応システムについて考える。このとき、ＡＴＰを用いた物質生産反応系が発熱反応である場合、上記反応システム自体が高温になり易い。しかしながら、高熱菌由来のＰＰＫ２を用いれば、たとえ反応システムが高温条件になったとしても、安定に所望の物質を生産することができる。
【００４０】
反応時間は、特に限定されないが、１分〜７２０分が好ましく、１０分〜１２０分がより好ましい。
【００４１】
ＡＴＰ合成反応溶液中のＰＰＫ２は、最終濃度が１〜５００μｇ／ｍｌとなるように含有されていることが好ましく、最終濃度が５０〜２００μｇ／ｍｌとなるように含有されていることがより好ましい。反応溶液中に含まれているＰＰＫ２の濃度が最終濃度で１μｇ／ｍｌより低いと、再生されるＡＴＰ量が少なくなるおそれがある。また、反応溶液中に含まれているＰＰＫ２の濃度が最終濃度で５００μｇ／ｍｌを超えると、反応あたりのコストが高くなるおそれがある。
【００４２】
また、ＡＴＰ合成反応溶液中のポリリン酸は、最終濃度が０．５〜２００ｍＭとなるように含有されていることが好ましく、最終濃度が１〜１００ｍＭとなるように含有されていることがより好ましい。反応溶液中に含まれているポリリン酸の濃度が最終濃度で０．５ｍＭより少ないと、再生されるＡＴＰ量が少なくなるおそれがある。また、反応溶液中に含まれているポリリン酸の濃度が最終濃度で５００ｍＭを超えると、反応液中の金属イオンがキレートされるおそれがある。
【００４３】
また、ＡＴＰ合成反応溶液中のＡＭＰは、最終濃度が０．１〜５００ｍＭとなるように含有されていることが好ましく、最終濃度が０．２〜２ｍＭとなるように含有されていることがより好ましい。反応溶液中に含まれているＡＭＰの濃度が最終濃度で０．１ｍＭより少ないと、再生されるＡＴＰ量が少なくなるおそれがある。また、反応溶液中に含まれているＡＭＰの濃度が最終濃度で５００ｍＭを超えると、反応あたりのコストが高くなるおそれがある。
【００４４】
本発明に係るＡＴＰの製造方法によってＡＴＰが製造されたことは、後述する実施例に示した薄層クロマトグラフィー法の他に、液体クロマトグラフィー法、ルシフェラーゼ法等によって確認することができる。
【００４５】
以下に、「ＰＰＫ２」、「ポリリン酸」および「ＡＭＰ」について、それぞれ説明する。
【００４６】
（１−１）ＰＰＫ２
本明細書において、「ＰＰＫ２」は、ポリリン酸キナーゼの内、ＰＰＫ２ドメインを有しているポリリン酸キナーゼが意図される（例えば、非特許文献１等を参照）。ＰＰＫ２ドメインのアミノ酸配列は、ＰＰＫ１と同じ部分は全くなく、ＰＰＫ１とは明確に区別されている。
【００４７】
さらに、本明細書において、「ＰＰＫ２」は、ＰＰＫ２ドメインを有しているポリリン酸キナーゼの中でも、単一の酵素でＡＭＰからＡＴＰの合成を可能とする酵素が意図される。このような「ＰＰＫ２」を、当業者は、ＰＰＫ２ドメインを有している周知のポリリン酸キナーゼの中から、単一の酵素でＡＭＰからＡＴＰを合成する活性を指標として検索することによって、明確に確定し得る。
【００４８】
ＰＰＫ２は、その由来は特に限定されず、細菌、酵母、動物、植物等、いずれの生物由来であってもよい。
【００４９】
耐熱性を有しており、より安定的にＡＴＰを合成できることから、本発明に係るＡＴＰの製造方法では、ＰＰＫ２が、好熱菌由来のＰＰＫ２であることが好ましい。上記好熱菌としては、例えば、Thermosynechococcus elongatus、Meiothermus ruber、Meiothermus silvanus、Deinococcus geothermalis、Thermanaerovibrio acidaminovorans、Thermus thermophilus等を挙げることができるが、本発明はこれらに限定されない。
【００５０】
このような好熱菌のＰＰＫ２としては、例えば、ＰＰＫ２ドメインを有し、さらに、公知のThermosynechococcus elongatus BP-1由来のＰＰＫ２（ＴｅＰＰＫ２Ｔ）のアミノ酸配列（配列番号１）（Ｇｅｎｂａｎｋ、アクセッションＮｏ．ＡＡＮ８７３３７．１）に対して、約３５％以上の同一性を有しているアミノ酸配列からなり、且つＡＭＰからＡＴＰを生成する活性を有するポリペプチドが意図される。なお、アミノ酸配列の同一性は、ＢＬＡＳＴの方法によって決定することができる。
【００５１】
上記好熱菌のＰＰＫ２としては、例えば、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドであり得るが、本発明はこれらに限定されない：
（ａ）配列番号１、２、３、４または５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１、２、３、４または５に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ＡＭＰからＡＴＰを生成する活性を有するポリペプチド。
【００５２】
上記（ａ）〜（ｂ）以外の好熱菌由来のＰＰＫ２については、公知のPseudomonas aeruginosa由来のＰＰＫ２の塩基配列の情報を元にデータベースにアクセスすることによって、その具体的な塩基配列およびアミノ酸配列の情報を、簡単かつ十分に取得し得る。
【００５３】
なお、本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。
【００５４】
ここで、上記「１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換および／または付加できる程度の数（例えば２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下、特に好ましくは３個以下）のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されることを意味する。１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加される部位は、アミノ酸が欠失、置換および／または付加された後のタンパク質が、ＡＭＰからＡＴＰを生成する活性を有していれば、当該アミノ酸配列中のどの部位であってもよい。
【００５５】
このような変異ポリペプチドは、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在する同様の変異ポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
【００５６】
タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このタンパク質の構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけでなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００５７】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または付加を有する。好ましくは、サイレント置換、付加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチド活性を変化させない。
【００５８】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【００５９】
上記好熱菌のＰＰＫ２としては、以下の（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドであってもよい。つまり、
（ｃ）配列番号６、７、８、９または１０の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号６、７、８、９または１０の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＡＭＰからＡＴＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００６０】
なお、配列番号６、７、８、９または１０の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、各々、配列番号１、２、３、４または５に示されるアミノ酸配列からなるポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」は、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。具体的には、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルタを洗浄することが意図されるが、ハイブリダイゼーションさせるポリヌクレオチドによって、高ストリンジェンシーでの洗浄条件は適宜変更され、例えば、哺乳類由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％  ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ中にて６５℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、ＲＮＡを用いる場合は、０．１％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、オリゴヌクレオチドを用いる場合は、０．１％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にてハイブリダイゼーション温度での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましい。また、上記ハイブリダイゼーションは、Sambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同性の高いポリヌクレオチドを取得することができる。なお、塩基配列の同一性は、サンガー法によって決定することができる。
【００６２】
ＰＰＫ２は、例えば、遺伝子組み換え技術を用いて生産されたものであってもよく、アミノ酸合成機などを用いて化学合成されたものであってもよい。
【００６３】
例えば、大腸菌などの宿主にてＰＰＫ２を強制発現することによってＰＰＫ２を生産することができる。好熱菌のＰＰＫ２を用いる場合には、ＰＰＫ２を強制発現した宿主、または、当該宿主から粗精製したＰＰＫ２を加熱することによって、ＰＰＫ２以外の酵素を失活させることが可能であるので、より簡便に、純粋なＰＰＫ２を入手することができる。
【００６４】
（１−２）ポリリン酸
ポリリン酸（ｐｏｌｙＰ）としては、好ましくは３〜１０００個、より好ましくは１０〜７００個の無機リン酸が、高エネルギーであるリン酸結合によって直鎖状に重合したものであれば特に限定されない。また、ポリリン酸は、生体（例えば、細菌）由来のものであってもよく、化学合成によって得られたものであってもよく、ポリリン酸合成酵素を用いてＡＴＰから合成されたものであってもよい。ポリリン酸合成酵素を用いてＡＴＰからポリリン酸を合成する場合には、例えば、特開平５−１５３９９３号公報等に開示された従来公知のポリリン酸の製造方法を利用すればよい。
【００６５】
また、ポリリン酸は、ポリリン酸の塩の形態であってもよい。
【００６６】
（１−３）ＡＭＰ
ＡＭＰとしては、特に限定されず、生体（例えば、細菌）由来のものであってもよく、化学合成によって得られたものであってもよい。
【００６７】
本発明に係るＡＴＰの製造方法によれば、単一の酵素のみでＡＭＰからＡＴＰを合成し得るので、従来の方法と比較して、より簡便にＡＭＰからＡＴＰを製造することができる。
【００６８】
〔２．キット〕
本発明に係るキットは、ＡＭＰからＡＴＰを製造するためのキットであって、ポリリン酸キナーゼ２型と、ポリリン酸と、ＡＭＰとを少なくとも備えていることを特徴としている。「ＰＰＫ２」、「ポリリン酸」および「ＡＭＰ」については、上記「１．ＡＴＰの製造方法」の項で説明したとおりであるので、説明を省略する。
【００６９】
本発明に係るキットでは、上記「ＰＰＫ２」をポリペプチドの形態として備えていてもよいし、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの形態（例えば、当該ポリヌクレオチドを含む形質転換ベクター等）として備えていてもよい。
【００７０】
なお、本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「核酸」または「核酸分子」とも換言でき、ヌクレオチドの重合体が意図される。また、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」とも換言でき、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴと省略される）の配列として示される。
【００７１】
本発明にかかるキットは、上記「ＰＰＫ２」、「ポリリン酸」および「ＡＭＰ」以外の成分を備えていてもよい。例えば、ＰＰＫ２、ポリリン酸およびＡＭＰを反応させるための緩衝液を備えていてもよい。適切な緩衝液については、上記「１．ＡＴＰの製造方法」の項で説明したとおりである。また、上記キットを構成する成分を格納するための１つ以上の容器（例えば、バイアル、管、アンプル、ビン等）を含んでいてもよく、本発明にかかるキットを使用するための指示書を備えていてもよい。
【００７２】
本発明に係るキットを用いれば、単一の酵素のみでＡＭＰからＡＴＰを合成し得るので、従来の方法と比較して、より簡便にＡＭＰからＡＴＰを製造することができる。
【００７３】
〔３．物質の製造方法〕
本発明に係る物質の製造方法は、ＡＴＰを利用して物質を製造する方法であって、上記製造方法によってＡＴＰから生成されたＡＭＰに、ポリリン酸キナーゼ２型と、ポリリン酸とを反応させてＡＴＰを再生するＡＴＰ再生反応と、当該製造方法とが共役しており、上記製造方法が利用するＡＴＰは、当該製造方法と共役している上記ＡＴＰ再生反応によって再生されたＡＴＰであり、上記ポリリン酸キナーゼ２型は、単一の酵素でＡＭＰからＡＴＰの合成を可能とする酵素であることを特徴としている。
【００７４】
本発明に係る物質の製造方法は、以下のように言い換えることもできる。すなわち、本発明に係る物質の製造方法は、ＡＴＰを利用して物質を生成する反応を用いた、物質の製造方法であって、上記反応によってＡＴＰから生成されたＡＭＰに、ポリリン酸キナーゼ２型と、ポリリン酸とを反応させてＡＴＰを再生する工程を含み、上記反応が利用するＡＴＰは、上記再生工程によって再生されたＡＴＰであり、上記ポリリン酸キナーゼ２型は、単一の酵素でＡＭＰからＡＴＰの合成を可能とする酵素であることを特徴としている。本発明に係る物質の製造方法では、上記物質は、アセチル−ＣｏＡであることが好ましい。すなわち、上記反応は、アセチル−ＣｏＡ合成酵素によってアセチル−ＣｏＡを生成する反応であり得る。「ＰＰＫ２」、「ポリリン酸」および「ＡＭＰ」については、上記「１．ＡＴＰの製造方法」の項で説明したとおりであるので、説明を省略する。
【００７５】
なお、上記「物質」は、特に限定された物質ではなく、ＡＴＰ再合成反応と共役している製造方法に係る物質であればよい。すなわち、ＡＴＰ再生反応（ＡＴＰ再生系）と共役して生成される物質であれば特に限定されるものではない。例えば、アセチル−ＣｏＡ等の生理活性物質等のあらゆる物質が含まれる。
【００７６】
ここで、アセチル−ＣｏＡ合成酵素によってアセチル−ＣｏＡを生成する反応を用いてアセチル−ＣｏＡを製造する場合を例として、本発明の概略を図１に示す。図１に示すように、アセチル−ＣｏＡ合成酵素は、ＡＴＰを利用してアセチル−ＣｏＡを生成し、ＡＭＰを生成する酵素である。アセチル−ＣｏＡ合成酵素によってＡＴＰから生成されたＡＭＰは、ＰＰＫ２とポリリン酸とによってＡＴＰへと再生される。これによて、効率よくアセチル−ＣｏＡを製造することが可能となる。
【００７７】
ＡＴＰを利用して物質を生成する反応としては、例えば、ＡＴＰを利用して物質を生成する酵素を用いて物質を生成する反応が含まれ、その一例として、アセチル−ＣｏＡ合成酵素によってアセチル−ＣｏＡを生成する反応を挙げたが、本発明はこれに限定されない。ＡＴＰを利用して物質を生成する反応としては、ＡＴＰを利用して物質を生成するとともにＡＭＰを生成する反応であればよい。このような反応としては、例えば、プロパノイル−ＣｏＡ合成酵素による反応（この場合、生成される物質はプロパノイルＣｏＡ）、ホタルルシフェリン−４−モノオキシゲナーゼによる反応（この場合、生成される物質はオキシルシフェリン）、ＡＴＰ−ＧＴＰ  ３’−ジホスホトランスフェラーゼによる反応（この場合、生成される物質はグアノシン３’−二リン酸５’−三リン酸）、ホスホリボシルピロリン酸シンテターゼによる反応（この場合、生成される物質は５−ホスホリボシル１−ピロリン酸）、アシル−ＣｏＡシンテターゼによる反応（この場合、生成される物質はアシル−ＣｏＡ）、ビオチン−ＣｏＡリガーゼによる反応（この場合、生成される物質はビオチン−ＣｏＡ）、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによる反応（この場合、生成される物質はアミノアシル−ｔＲＮＡ）、ポリリボヌクレオチドリガーゼによる反応（ＥＣ６．５．１．３）（この場合、生成される物質は環状ＲＮＡ）、Ｌ−アスパルテートアンモニアリガーゼ（ＥＣ６．３．１．１）による反応（この場合、生成される物質はＬ−アスパラギンまたはＬ−アスパラギン酸）等を挙げることができる。なお、ＡＴＰを利用して物質を生成する反応は、上記の例示に限定されない。当業者であれば、例えば、ＡＭＰあるいはピロリン酸を生成する酵素反応に関してKEGG: 生命システム情報統合データベース（http://www.genome.jp/kegg/kegg_ja.html）〔２０１１年  ７月１９日検索〕を検索することによって、上述した以外の反応も容易に理解することができる。
【００７８】
本発明に係る物質の製造方法によれば、ＡＴＰを消費する物質の生成系に、ＡＴＰ再生系を共役させるので、ＡＴＰを供給する必要がなく、コストを抑えることができる。また、副反応が起こらない高効率の反応系を構築することができる。このため、より安価にかつより効率よく物質（具体的には、例えば、アセチル−ＣｏＡ、プロパノイルＣｏＡ、Ｌ−アスパラギン、グアノシン３’−二リン酸５’−三リン酸、５−ホスホリボシル１−ピロリン酸、アシル−ＣｏＡ、ビオチン−ＣｏＡ、アミノアシル−ｔＲＮＡ、環状ＲＮＡ、Ｌ−アスパラギンまたはＬ−アスパラギン酸等）を製造することができる。
【００７９】
また、上述のホタルルシフェリン−４−モノオキシゲナーゼの生物発光反応においては、物質の生産ではなく、反応そのものを効率良く進めることにより発光強度の増強が期待される。この様に、ＡＴＰ再生系を共役させることによって酵素反応の効率を向上させる効果も期待される。すなわち、本発明に係るＡＴＰ再生系と共役させる反応は、上述したような物質の生成反応のみに限定されず、生物発光反応等とも共役させることができる。
【００８０】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００８１】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００８２】
（１．耐熱性ポリリン酸キナーゼ２型（ＰＰＫ２Ｔ）の取得）
微生物ゲノムを対象としたＢＬＡＳＴ解析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi）〔２０１１年  ７月１２日検索〕によって、Thermosynechococcus elongatus BP-1のＰＰＫ２アミノ酸配列を用いてＴＢＬＡＳＴＮプログラムモードでホモログ検索を行った。
【００８３】
具体的には、公知のThermosynechococcus elongatus BP-1由来のＰＰＫ２（ＴｅＰＰＫ２Ｔ）の塩基配列（配列番号６）を元に、データベース（ＴＢＬＡＳＴＮ）の検索を行い、その結果、好熱菌であるMeiothermus ruber DSM 1279において、Pseudomonas aeruginosa由来のＰＰＫ２とアミノ酸配列において４２％の同一性を有する遺伝子を見出した。そして、ＰＣＲによって、Meiothermus ruber DSM 1279由来のＰＰＫ２Ｔ（ＭｒＰＰＫ２Ｔ）を取得した。ＭｒＰＰＫ２Ｔのアミノ酸配列を配列番号２に、塩基配列を配列番号７に示す。
【００８４】
また、好熱菌であるMeiothermus silvanus DSM 9946において、Thermosynechococcus elongatus BP-1由来のＰＰＫ２とアミノ酸配列において４３％の同一性を有する遺伝子を見出した。そして、ＰＣＲによって、Meiothermus silvanus DSM 9946由来のＰＰＫ２Ｔ（ＭｓＰＰＫ２Ｔ）を取得した。ＭｓＰＰＫ２Ｔのアミノ酸配列を配列番号３に、塩基配列を配列番号８に示す。
【００８５】
同様にしてデータベースサーチを行い、好熱菌であるDeinococcus geothermalis DSM11300において、Thermosynechococcus elongatus BP-1由来のＰＰＫ２とアミノ酸配列において４５％の同一性を有する遺伝子を見出した。Deinococcus geothermalis DSM11300由来のＰＰＫ２Ｔ（ＤｇＰＰＫ２Ｔ）のアミノ酸配列を配列番号４に、塩基配列を配列番号９に示す。
【００８６】
また、好熱菌であるThermanaerovibrio acidaminovorans DSM6589において、Thermosynechococcus elongatus BP-1由来のＰＰＫ２とアミノ酸配列において３６％の同一性を有する遺伝子を見出した。Thermanaerovibrio acidaminovorans DSM6589由来のＰＰＫ２Ｔ（ＴａＰＰＫ２Ｔ）のアミノ酸配列を配列番号５に、塩基配列を配列番号１０に示す。
【００８７】
（２．ＰＰＫ２Ｔの生化学的性質の測定）
得られたＰＰＫ２Ｔの生化学的性質を確認した。具体的には、ＴｅＰＰＫ２Ｔ、ＭｒＰＰＫ２ＴおよびＭｓＰＰＫ２Ｔについて、「Ｖｍａｘ」、「Ｋｍ」、「至適温度」、「至適ｐＨ」および「コファクターの要求性」について確認した。
【００８８】
「Ｖｍａｘ」は、以下の方法によって測定した。
【００８９】
「Ｋｍ」は、以下の方法によって測定した。
【００９０】
「Ｖｍａｘ」および「Ｋｍ」は、ＰＰＫ２によるＡＴＰ合成速度のミカエリス・メンテン式を用いた反応速度論的解析によって測定した。すなわち異なるＡＤＰ濃度において、ＰＰＫ２とポリリン酸によるＡＴＰ合成速度を測定し、ラインウィーバー・バーク・プロットを作成してＶｍａｘおよびＫｍを求めた。ＡＴＰ合成反応は、以下の組成の反応液中で行った。ＡＤＰ（０．１，０．２，０．５，１．０，２．０，５．０ｍＭ（終濃度）），５ｍＭ  ポリリン酸ｐｏｌｙＰ６５（Sigma社製，型番：015K012）、ＰＰＫ緩衝液（４０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２）、精製酵素４μｇ／ｍｌ。反応液のｐＨ、温度はそれぞれの酵素の至適条件に調整して行った（後述）。
【００９１】
「至適温度」は、以下の反応液中で温度を変化させて一定時間反応させ、生成したＡＴＰ量を比較することによって測定した。０．２５ｍＭのＡＤＰ，５ｍＭのポリリン酸ｐｏｌｙＰ６５（Sigma社製，型番：015K012）、ＰＰＫ緩衝液（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨバッファ（ｐＨ７．０）、４０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２）、精製酵素４μｇ／ｍｌ。反応温度は３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃の間で測定した。
【００９２】
「至適ｐＨ」は、前述の反応液に用いる緩衝液を以下の緩衝液に変え、ｐＨ６．０〜１０の範囲でＡＴＰ合成活性を測定することで解析した。ＭＥＳ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０〜７．０），ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０〜８．０），Ｔｒｉｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０〜９．０），ＣＨＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ９．０〜１０）。
【００９３】
「コファクターの要求性」は、前述の反応液中にＭｎＣｌ２（終濃度０〜２０ｍＭ）を添加し、ＡＴＰ合成活性を測定することにより解析した。
【００９４】
比較対象として、Thermus thermophilius由来のＰＰＫ１Ｔの「Ｖｍａｘ」、「Ｋｍ」、「至適温度」、「至適ｐＨ」および「コファクターの要求性」を同様に測定した。
【００９５】
結果を表１に示す。
【００９６】
【表１】
0005800218.tif 000003
【００９７】
（３．耐熱性ポリリン酸キナーゼ２型（ＰＰＫ２Ｔ）の活性測定（１））
得られた耐熱性ポリリン酸キナーゼ２型（ＰＰＫ２Ｔ）のＡＴＰ合成活性を確認した。
【００９８】
ＰＰＫバッファ（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨバッファ、４０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、ｐＨ７．０）３０μｌ中に、平均鎖長７５のポリリン酸ｐｏｌｙＰ７５＋（Sigma社製，型番：S-8262）を最終濃度１０ｍＭ、ＡＭＰ（オリエンタル酵母，４５１０２０００）を最終濃度１０ｍＭとなるように添加し、ＭｒＰＰＫ２Ｔを最終濃度８μｇ／ｍｌとなるように添加して、７０℃にて２０分間反応させた。反応後のサンプル１μｌをＰＥＩ−セルロース（Merck社製，型番：1055790001）にスポットし、展開液（１Ｍ  ギ酸＋０．６Ｍ  ＬｉＣｌ）を用いて展開した。なお、１０ｍＭ  ＡＭＰ、１０ｍＭ  ＡＤＰおよび１０ｍＭ  ＡＴＰの標準品、並びに反応時間０分のサンプルについても、同時にスポットし、比較対象とした。
【００９９】
図２は、薄層クロマトグラフィーの結果を表す図である。図２に示したように、反応時間０分のサンプルでは、基質として加えたＡＭＰのみしか確認されないのに対して、反応時間２０分のサンプルでは、基質として加えたＡＭＰが減少し、代わりにＡＴＰが生成されていることが確認された。また、ＡＤＰの生成も認められた。
【０１００】
（３．耐熱性ポリリン酸キナーゼ２型（ＰＰＫ２Ｔ）の活性測定（２））
得られた耐熱性ポリリン酸キナーゼ２型（ＰＰＫ２Ｔ）のＡＴＰ合成活性を確認した。
【０１０１】
ＰＰＫバッファ（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨバッファ、４０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、ｐＨ７．０）５０μｌ中に、平均鎖長６５のポリリン酸ｐｏｌｙＰ６５（ＳＩＧＭＡ，０１５Ｋ５０１２）を最終濃度５ｍＭ、ＡＤＰ（ＳＩＧＭＡ，Ａ−４３８６）またはＡＭＰ（オリエンタル酵母，４５１０２０００）を最終濃度０．２５ｍＭとなるように添加し、酵素を１０μｇ（濃度２００μｇ／ｍｌ）を用いて反応させた。反応温度は、ＴｅＰＰＫ２Ｔでは６０℃に設定し、ＭｒＰＰＫ２ＴおよびＭｓＰＰＫ２Ｔでは７０℃に設定した。一定時間ごとにサンプルを採取し、氷上で反応を停止させたサンプルのＡＴＰ濃度を測定した。
【０１０２】
ＡＴＰの測定は、サンプル５μｌに対し、４０μｌのATP Bioluminescence Assay Kit CLS II（Ｒｏｃｈｅ）を反応させ、ＡＲＶＯ（Ｗａｌｌａｃ）を用いて発光量を検出した。ＰＰＫ２Ｔの酵素活性は、検出された発光量から算出した。
【０１０３】
反応液中に基質として０．２５ｍＭのＡＤＰを加えたサンプルと、０．２５ｍＭのＡＭＰを加えたサンプルとで、ＡＴＰ合成活性を比較した。
【０１０４】
コントロールの酵素として、Thermus thermophilius由来のＰＰＫ１Ｔ（ＴＰＰＫ１Ｔ）（配列番号１１）を用いて同様に実験を行なった。
【０１０５】
図３は、耐熱性ポリリン酸キナーゼ２型のＡＴＰ合成活性を測定した結果を表すグラフである。グラフ中、四角は、基質としてＡＤＰを用いた場合のＡＴＰ合成活性を表し、三角は、基質としてＡＭＰを用いた場合のＡＴＰ合成活性を表す。図３に示したように、ＴｅＰＰＫ２Ｔ、ＭｒＰＰＫ２ＴおよびＭｓＰＰＫ２Ｔは、それぞれ、ＡＭＰを基質としてＡＴＰを合成し得ることが確認された（図３の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ））。なお、ＴｅＰＰＫ２Ｔ、ＭｒＰＰＫ２ＴおよびＭｓＰＰＫ２Ｔでは、ＡＭＰを基質とした場合の反応率は、ＡＤＰを基質とした場合の反応率と比較して、７０％程度であった。
【０１０６】
これに対して、コントロールの酵素であるＰＰＫ１Ｔは、ＡＤＰを基質としてＡＴＰを合成することができなかった（図３の（Ｄ））。
【０１０７】
以上のことから、ポリリン酸キナーゼ２型を用いることによって、単一の酵素のみで、より簡便に且つ効率よくＡＭＰからＡＴＰを製造し得ることが確認された。
【０１０８】
（４．耐熱性ポリリン酸キナーゼ２型（ＰＰＫ２Ｔ）の活性測定（３））
ＤｇＰＰＫ２ＴとＴａＰＰＫ２ＴのＡＴＰ合成活性を測定した。具体的には、ＤｇＰＰＫ２Ｔを発現している大腸菌ｐＣｏｌｄ−ＤｇＰＰＫ２（Deinococcus geothermalis DSM11300由来）と、ＴａＰＰＫ２Ｔを発現している大腸菌ｐＣｏｌｄ−ＴａＰＰＫ２（Thermanaerovibrio acidaminovorans DSM6589由来）の前培養液を新しいＬＢ培地に１％稙菌し、ＯＤ６００＝０．５になるまで３７℃で振とう培養を行なった。
【０１０９】
ＩＰＴＧを終濃度０．２５ｍＭになるよう添加し、１５℃で３０分静置した後、１５℃で２４時間振とう培養した。菌体０．６ｍＬを集菌し、沈殿を０．２ｍｌのＰＰＫバッファ（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨバッファ、４０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．０）に再懸濁し、７０℃、１０分間の熱処理を行なった。熱処理後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）により上清と沈殿物に分離した。沈殿物は０．２ｍｌの同バッファに再懸濁した。反応液５０ｍｌ中に０．２５ｍＭ  ＡＤＰおよび５ｍＭ  ｐｏｌｙＰ６５を加え、さらに懸濁液と上清とをそれぞれ１０ｍｌ用いて、混合し、７０℃にてＡＴＰ合成活性を調べた。サンプリングとＡＴＰ合成活性の測定は並行して経時的に行なった。ＡＴＰの測定方法は、上記「３．耐熱性ポリリン酸キナーゼ２型（ＰＰＫ２Ｔ）の活性測定（１）」の項で説明した方法に同じ。
【０１１０】
図４は、耐熱性ポリリン酸キナーゼ２型のＡＴＰ合成活性を測定した結果を表すグラフである。図４の（Ａ）および（Ｃ）は、ｐＣｏｌｄ−ＤｇＰＰＫ２およびｐＣｏｌｄ−ＴａＰＰＫ２が、それぞれＤｇＰＰＫ２ＴおよびＴａＰＰＫ２Ｔを発現していることＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認した図である。図４の（Ｂ）および（Ｄ）に示したように、ＤｇＰＰＫ２ＴおよびＴａＰＰＫ２Ｔは、それぞれ、ＡＤＰを基質としてＡＴＰを合成し得ることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明に係るＡＴＰの製造方法または本発明に係るキットによれば、単一の酵素のみでＡＭＰからＡＴＰを合成し得るので、より簡便にＡＭＰからＡＴＰを製造することができる。さらに、本発明に係る物質の製造方法によれば、ＡＴＰを消費する物質の生成系に、ＡＴＰ再生系を共役させるので、より効率よく物質を製造することができる。したがって、本発明は、物質を合成する際のエネルギー源としてＡＴＰを消費するバイオプロセスを利用する産業分野（例えば、医薬品産業、食品産業等）において利用可能である。
【図１】
0005800218.tif 000004
【図３】
0005800218.tif 000005
【図２】
0005800218.tif 000006
【図４】
0005800218.tif 000007
【配列表】
0005800218000001.app