(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−β-ヒドロキシ酪酸及びＤ−β-ヒドロキシ酪酸の代謝前駆体、並びに、これらの生理的に許容される塩、から選択される化合物の、インスリン耐性ＩＩ型糖尿病を治療するための薬若しくは栄養製品の製造における、有効成分としての使用であって、
前記代謝前駆体が、
（ｉ）Ｄ−β-ヒドロキシ酪酸の２ないし１００の繰り返しのオリゴマー、
（ｉｉ）Ｄ−β-ヒドロキシ酪酸若しくはＤ−β-ヒドロキシ酪酸の２ないし１００の繰り返しのオリゴマーのいずれかの、アセト酢酸エステル、又は、これらの一価、二価、若しくは三価のアルコールエステル、及び
（ｉｉｉ）Ｄ−β-ヒドロキシ酪酸若しくはＤ−β-ヒドロキシ酪酸の２ないし１００の繰り返しのオリゴマーのいずれかの、アセト酢酸エステル、であってかつ、これらの一価、二価、若しくは三価のアルコールエステル
から選択される、前記使用。
【請求項２】
化合物が以下の式：
【化１】
0005800453.tif 000023
（ここにおいて、ｎは０ないし９８の整数である）
又は、
【化２】
0005800453.tif 000024
（ここにおいて、ｎは０ないし９９の整数である）
あるいは、これらの生理的に許容される塩又はエステルである、
ここにおいて、エステルは、
（ｉ）Ｄ−β-ヒドロキシ酪酸若しくはＤ−β-ヒドロキシ酪酸の２ないし１００の繰り返しのオリゴマーのいずれかの、アセト酢酸エステル、又は、これらの一価、二価、若しくは三価のアルコールエステル、及び
（ｉｉ）Ｄ−β-ヒドロキシ酪酸若しくはＤ−β-ヒドロキシ酪酸の２ないし１００の繰り返しのオリゴマーのいずれかの、アセト酢酸エステル、であってかつ、これらの一価、二価、若しくは三価のアルコールエステル
から選択される、
請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ｎが３ないし５の整数である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸の代謝前駆体の化合物が、Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸塩とアセト酢酸塩を１：１ないし２０：１の割合で提供する請求項１に記載の使用。
【請求項５】
エステルが（Ｒ）−１，３−ブタンジオ−ルのものである、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
ヒト又は動物のインスリン耐性ＩＩ型糖尿病の治療ための医薬組成物であって、
Ｄ−β-ヒドロキシ酪酸及びＤ−β-ヒドロキシ酪酸の代謝前駆体、並びに、これらの生理的に許容される塩、から選択される化合物であって、
前記代謝前駆体が、
（ｉ）Ｄ−β-ヒドロキシ酪酸の２ないし１００の繰り返しのオリゴマー、
（ｉｉ）Ｄ−β-ヒドロキシ酪酸若しくはＤ−β-ヒドロキシ酪酸の２ないし１００の繰り返しのオリゴマーのいずれかの、アセト酢酸エステル、又は、これらの一価、二価、若しくは三価のアルコールエステル、及び
（ｉｉｉ）Ｄ−β-ヒドロキシ酪酸若しくはＤ−β-ヒドロキシ酪酸の２ないし１００の繰り返しのオリゴマーのいずれかの、アセト酢酸エステル、であってかつ、これらの一価、二価、若しくは三価のアルコールエステル
から選択される化合物、を含む、前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、とりわけ、（ｉ）心臓の効率、特にグルコース使用効率の増加、（ｉｉ）特に糖尿病及びインスリン耐性状態における、エネルギー源の供給、及び（ｉｉｉ）脳細胞の損傷によって引き起こされる疾患の治療、特に例えばアルツハイマー病及び類似の病気に見られるように、記憶関連脳領域の脳の損傷の遅延若しくは予防、といった特徴を持つ、人間や動物への投与に適した組成物に関する。これらの組成物は、例えば運動選手が栄養補助剤として、あるいは医学的病気、特に低い心臓効率、インスリン耐性、及び記憶力低下に関する病気、の治療のために摂取されても良い。本発明はさらに治療方法と、新規エステル及びポリマーを、発明の組成物に包含して提供する。
【背景技術】
【０００２】
血糖値の異常な上昇は、インスリン欠乏症及び非インスリン依存型糖尿病だけでなく、様々な他の病気でも起こる。糖尿病の高血糖症はグルコースの代謝不能と過剰生産の結果である。どちらの型の糖尿病も食事療法で治療される；Ｉ型糖尿病はたいてい常に追加のインスリンを必要とし、非インスリン依存型糖尿病、例えば老年開始糖尿病は、インスリンを高血糖症を制御するためにますます用いられているが、食事療法と体重減少で治療することが可能である。
【０００３】
肝臓におけるグリコーゲン分解の増加に加えて、交感神経の刺激の増加若しくはグルカゴンレベルの上昇は、脂肪細胞からの遊離脂肪酸の放出も刺激する。急性心筋梗塞の後、若しくは心臓麻痺の間、交感神経の神経活性の増加若しくは交感神経作用剤の投与がグリコーゲン分解を加速し、膵臓のＰ細胞からのインスリンの放出を減少し、相対的なインスリン耐性を引き起こす。食事療法の重要性、若しくは基質有効性、が糖尿病の治療に既知の事実として用いられているが、インスリン耐性状態における基質選択性の決定的な効果は、まだ広く評価されているわけではなく、臨床実施に応用されてもいない。その代わりに、現代の興味は、インスリンがレセプターに結合した後の複雑なシグナルカスケードに集中している。タンパク質チロシンキナーゼとタンパク質ホスファターゼ、イノシトール、及び他のリン脂質を含む、メッセージの次第に複雑になるカスケードは、非インスリン依存型糖尿病の究極的な理解を約束する一方で、まだ糖尿病若しくはインスリン耐性の両方に、重要な新しい治療法を提供していない。
【０００４】
成長に対するインスリンの長期効果を別にして、インスリンの急性代謝効果は、グルコースからＣＯ２への変換における３つの主要酵素段階における作用により説明できると考えられてきた。第１に、インスリンはグルコース輸送体、Ｇｌｕｔ４の、小胞体から原形質膜への移動を促進し、細胞外から細胞内層へのグルコースの移動を増加する（参考文献１及び２参照）。第２にインスリンはグリコーゲンの蓄積を増加する。その結果、タンパク質ホスファターゼ１によってグリコーゲン合成酵素の脱リン酸化（３）がおこった。第３に、インスリンは、Ｃａ２＋感受性（６）ミトコンドリア内タンパク質ホスファターゼによる脱リン酸化を通して、ミトコンドリアのピルビン酸デヒドロゲナーゼ多酵素複合体（４及び５）の活性を刺激する。
【０００５】
重要であるがほとんど理解されていないインスリンの効果は、心臓病における使用であり、ここにおいては、グルコース、塩化カリウム、及びＧＩＫと一緒になって、心筋梗塞に関連する心電図の異常を改善し（７及び８）、また心臓停止（ｐｏｓｔ  ｐｕｍｐ  ｓｔｕｎｎｉｎｇ）の後の心臓動作を改善する（９）。この治療は最近多くの他の重要な心臓病に対して提唱（ａｄｖｏｃａｔｅ）されてきた。（１０及び１１）。ＧＩＫ注入の有益な効果は遊離脂肪酸の放出の減少させ、膜安定性を改善する能力に帰因してきた（１２）。しかし、他のさらに最近の研究は、より基本的な∵を示唆している。無酸素状態である心臓細胞では、グルコースだけが生存力を維持するのに必要なＡＴＰを供給することができるエネルギー源である（１３）。
【０００６】
グルコースとインスリンを投与することが、Ｏ２非存在下でＡＴＰを生産する源を供給するという、細胞内のグルコースの有効性を増加するであろう。これはある種の有益な効果を説明するかもしれないが、ＥＫＧ異常の矯正やＧＩＫで治療された心臓における心指数の改善を説明することはできない。なぜなら、電気的な活性や心臓の仕事は活発に呼吸している心臓細胞を必要としており、完全に無酸素状態でそれゆえ電気的活性若しくは機械的な仕事を示す能力のない細胞を必要とはしていないからである。
【０００７】
インスリンの作用の酵素的な面を理解することは、細胞の代謝や生理学的機能に対するインスリン欠乏の効果を単独で定義することではない。このより大きなレベルでいかにインスリンが作用するかは、自然がインスリン欠乏を取り扱う方法を見ることによって最も善く理解できる。絶食の間のインスリンの減少を自然が埋め合わせる方法は、遊離脂肪酸のケトン体への肝臓での変換を加速し、血中Ｄ−β―ヒドロキシ酪酸塩及びアセト酢酸塩を約６ｍＭにあげることである。これらのレベルでは、グルコースよりもケトン類が、脳さえも含む殆どの器官における基質となる（１４）。軽いケトン症が、インスリン減少に対する正常の反応だが、糖尿病ケトアシドーシスではケトン体の大量な過剰生産が命を脅かしうるので、医師はケトン体を恐れている。
【０００８】
先行技術文献
【０００９】
【表１−１】
0005800453.tif 000002
【００１０】
【表１−２】
0005800453.tif 000003
【００１１】
【表１−３】
0005800453.tif 000004
【００１２】
【表１−４】
0005800453.tif 000005
【００１３】
【表１−５】
0005800453.tif 000006
【００１４】
【表１−６】
0005800453.tif 000007
【００１５】
【表１−７】
0005800453.tif 000008
【００１６】
【表１−８】
0005800453.tif 000009
【００１７】
【表１−９】
0005800453.tif 000010
【００１８】
【表１−１０】
0005800453.tif 000011
【００１９】
【表１−１１】
0005800453.tif 000012
【発明の概要】
【００２０】
本発明者は以前、ケトン体の生理学的レベルの効果をインスリンの代謝及び生理学的効果と比較し、とくにグルコースのみを灌流しているインスリン欠乏状態で働いているラットの心臓と、心臓に４ｍＭＤ−β−ヒドロキシ酪酸塩／１ｍＭアセト酢酸塩、飽和投与量のインスリン若しくはその組み合わせのいずれかを加えたものを比較し、解糖とＴＣＡサイクルの両方の中間体の濃度を変化させ、それによってこの非常に特殊化された組織におけるグルコースの流れを制御する場合に、単純な基質の供給がいかにインスリンの効果を模倣することができるかを示した。さらに、最初の、そして以前には認識されていなかったインスリンの効果、若しくはケトンの割合は、△ＧＡＴＰ加水分解と、それに伴って様々な細胞層と心臓の生理学的振る舞いの間の無機イオンの勾配を増加するように、ミトコンドリアの酸化還元状態を変化させることであることを決定した。
【００２１】
本発明は、そのようなケトン体が、正常なインスリンシグナル伝達経路画商外を起こし、心臓の圧力の機能の効率が代謝上の理由で減少している状態である、インスリン耐性の治療への治療学的アプローチを供給することもまた、可能であることを教えている。発明者は、以下に記載のことより明らかになるであろうが、決して、そうしないと必要になる炭水化物摂取制限を除けるという最小限の理由から、ケトン体の使用はインスリン自体の使用よりもはるかに利点があることを明らかにした。
【００２２】
本発明はさらに神経変性病、とくにニューロンがタンパク質プラークのような病原性薬品の神経毒効果にさらされる様な病気の問題も扱っており、さらにこれら及び前述の疾患の治療に使用する組成物を提供する。
【００２３】
アルツハイマー病は進行性の致死的な神経病の遺伝的に異成分からなるグループで、病理学的には脳にアミロイドプラークが蓄積し、臨床上は記銘力（ｒｅｃｅｎｔｍｅｍｏｒｙ）が欠損し、痴呆及び死に至る特徴を有する。遺伝的原因に関係しているアルツハイマー病のケースに加えて、その病気の明らかな家族歴がない、散発性のケースもまたある。例えば、アルツハイマー病に特徴的な病理学的変化が、頭の外傷（７３）若しくはサイトカインインターロイキン−１の生成を刺激する炎症性の病気（９７）の後に起こる。
【００２４】
この病気の初期症状は、記銘力の早い損失の原因である海馬の細胞の損傷及び死に関連する、記銘力の損失である。磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を用いた海馬の体積の測定は、海馬の萎縮が記憶損失の臨床学的開始に先立って起こり、１年に約８％の体積損失が２年間進行して初めて、症状が現れる（７０）。
【００２５】
アルツハイマー病の診断は、側頭葉の海馬部分の障害と関連して、この記銘力の喪失により臨床的に下される。神経病理学的には、診断は細胞中に神経原繊維錯綜、細胞外空間にアミロイド若しくは老年性プラーク、及びニューロン数の減少の発見に依存する（６１）。神経原繊維錯綜は一組の過剰リン酸化されたタウタンパク質から成っており、細胞中でのその通常の役割は、リン酸化されていない場合、細胞内の微小官の形成においてチューブリンに結合し安定化する事である。タウの過剰リン酸化は、他のキナーゼの中でグリコーゲン合成酵素キナーゼ３βによって触媒され、タンパク質ホスファターゼ２Ａ−１、２Ｂ、若しくは１によって脱リン酸化された（１０８）。
【００２６】
しかし、アルツハイマー病の早期に起こる病理学的な脳の変化及び記憶障害と、“正常な”老齢世代に見られる脳の解剖学的構造と記憶機能の病理学的変化の間に明確にはっきりと線を引くことは必ずしもできない。むしろその差は程度に依存した量的なものである（９４）。正常の老化における記憶機能のそのような変化は、グルコース代謝が不可能なことを意味する、グルコース耐性の減少とも関連している。そのような状況では、アルツハイマー病の病態生理学的な変化の過程を直すことを目的とした治療は、正常の老化に関する代謝効果の矯正にも応用できることが期待されるであろう。
【００２７】
家族性若しくは散発性の型のアルツハイマー病は、老齢世代に見られる主な痴呆であるが、他のタイプの痴呆もまた見られる。これらには、ピック病に伴う前頭葉−側頭の変性、血管性痴呆（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｍｅｎｔｉａ）、Ｌｅｗｙ体型老人性痴呆、前頭萎縮を伴うパーキンソン病の痴呆、進行性核上性麻痺、皮質基底変性及びダウン症関連アルツハイマー病、等を含むが、これらに限られるわけではない。プラーク形成は、ＣＪＤ、スクレイピー、及びＢＳＥのような海綿状脳症にもまた見られる。本発明はこのような、特に神経毒タンパク質プラーク、すなわちアミロイドプラークを含むような神経変性病の治療を目的としている。
【００２８】
前述の明らかに無関係な状態の多くは、アルツハイマー病に見られる過剰リン酸化されたタウタンパク質を含み（６９）、タウをリン酸化したのと同じキナーゼがＰＤＨ複合体もリン酸化し、脳の他の領域を含む以外は、アルツハイマー病に見られたのと同様な、ミトコンドリアのエネルギー生成とアセチルコリン合成の欠乏を引き起こす可能性を開いた。本発明者は、この点から、アルツハイマー病に適用できる治療はこれらの病気にも同様に適用できるであろうと結論づけた。さらに本発明者は、そのような治療は、例えば重症筋無力症及び筋ジストロフィーのような末梢神経消耗病にも適用できると結論した。
【００２９】
現在、アルツハイマー病の効果的な治療法は存在しない。研究上の努力はその遺伝的な原因を決定することに集中しているが、今のところ遺伝子治療は成功していない。遺伝的研究はアルツハイマー病を蒙古症と関連づけ、その早い発病形態を、８アイソフォームで存在する経膜的糖タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）（７３）の蓄積を引き起こす第２１番染色体の座に関連づけた。このタンパク質の非常に多くのフラグメントがタンパク質分解により得られ、アルツハイマー病に特徴的なプラークはβアミロイドタンパク質（Ａβ１−４２）のオリゴマーの集積を含んでいることが示された。アルツハイマー病の早期発病常染色体性優性型は、また、第１４番染色体のプレセニリン１座と関連している。
【００３０】
アルツハイマー病の後期発現型は、第１９番染色体のアポリポタンパク質Ｅ（６９，９８）の４型アリルと関連しているが、他の研究者はこの明らかな相関はそれよりも、α１アンチキモトリプシン座の代わりに関連しているかもしれないと示唆している（１００）。月齢１８ヶ月にわたって、増量しているアミロイド前駆体タンパク質を発現しているすべてのトランスジェニックマウスは、アルツハイマー病の病理学的特徴の多くを伴う海馬の変性を示した（９０）。
【００３１】
アルツハイマー病における欠陥遺伝子と遺伝子生成物に関する知識の現状が最近まとめられた（参考文献９６の表１）。
【００３２】
【表２】
0005800453.tif 000013
【００３３】
上の表から明らかなように、アルツハイマー病の遺伝子型に関連した共通の表現型はアミロイドペプチドＡβ１−４２の蓄積である（９６）。このＡβ１−４２がＰＤＨを不活性化し、その結果通常必須のグルコース消費組織においてミトコンドリアエネルギーとクエン酸生産を害し（９５）、同時に重要な神経伝達物質であるアセチルコリンの合成を害する（６７，６８）。Ａβ１−４２の神経細胞への適用は抗−アポトーシスタンパク質であるｂｃｌ−１の負の調節（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に関連しており、細胞死と関連することが知られているタンパク質、ｂａｘのレベルが上昇する（９２）。Ａβ１−４２を含むアミロイドプラーク、過剰リン酸化されたタウタンパク質を含む神経原繊維錯綜、及び脳のアセチルコリンレベルの減少に加えて、細胞死がアルツハイマー病の４つ目の病理学的特徴である。これらの病理学的な特徴は少なくとも部分的には過剰のＡβ１−４２とそのＰＤＨ阻害に関連づけることが可能である。
【００３４】
症状を適切な臨床的改善は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤で治療することにより可能である（５７）が、おそらく中隔の核に生じたコリン作用性の遠心性神経を増加し、大脳辺縁系の前方部分にある海馬へブローカ対角バンドを通って働きかけるのであろう。しかし、アルツハイマー病の分子生物学の進歩により４つの主要分野に集中する新しい治療方法の探索がなされた（９６）：（ｉ）βＡＰＰ（βアミロイド前駆体タンパク質）からＡβ（βアミロイドフラグメント）を切り取り、酵素（β及びγセクレターゼ）の活性を部分的に減少するプロテアーゼ阻害剤；（ｉｉ）細胞外Ａβに結合してその細胞毒効果を防ぐ化合物；（ｉｉｉ）小膠細胞（脳マクロファージ）活性化、サイトカイン放出、及び冒された脳領域に起こる急性相反応を阻害する脳特異的な抗炎症性薬；（ｉｖ）Ａβが引き起こす神経毒性のメカニズムを妨げる抗酸化剤、神経カルシウムチャンネル阻害剤、若しくは抗アポトーシス剤のような化合物である。
【００３５】
本発明者が提案する治療法は、ケトン体若しくはその前駆体を投与することで、結果としてＡβ１−４２によるＰＤＨの阻害を生じる、代謝エネルギー生成におけるブロックを迂回する点で、上記４方法とは異なる。神経細胞は、脳の正常なエネルギー基質であるグルコースが不足している状態でもそのような化合物を代謝することができる（６３）。ケトンはＡＴＰ加水分解の△Ｇを増加することができるので、細胞内Ｎａ＋及びＣａ２＋両方の勾配が増加し、細胞内Ｃａ２＋の増加に伴う細胞死を防ぐ。さらに、クレブス回路よるクエン酸生産の増加は、細胞内に移ったときアルツハイマー病の脳に特徴的なアセチルコリンの不足を治療するのに必要な細胞質アセチルＣｏＡの原料を供給しうる。
これらの代謝における欠陥を直すのに必要な血中ケトンの上昇は、非経口、腸溶性手段、若しくは食事療法的手段により達成されうるが潜在的に毒性のある薬理学的剤の投与を必要としない。
【００３６】
てんかんの治療をしている子供たちのケトン食療法の長い経験がある。しかしそのような食事療法は循環系に有害な効果があるので成人での使用には適さない。本発明ではケトン体の適用は、それ自体子供に対して毒性が見つかっておらず、使用していない成人に毒性を引き起こす副作用も持たないような食事療法の、治療における効果すべてを提供すべきである。さらに発明者は、上記の代謝における欠陥を訂正することにより、神経細胞のエネルギー状態の上昇とアセチルコリン合成の増加を生ずる、栄養性刺激の増加によって、変性細胞におけるサイトカイン反応、及びアポトーシス性ペプチドの増加が減少するであろうと決定した。
【００３７】
本発明の優先日後、アセト酢酸、β−ヒドロキシ酪酸塩、これらの一価、二価、若しくは三価アルコールエステル、あるいはβ−ヒドロキシ酪酸塩のオリゴマーの、大脳浮腫の抑制、大脳機能の保護、大脳エネルギー代謝の停止、及び大脳梗塞の範囲の縮小に対する使用に関するＥＰ０７８０１２３Ａ１が出願された。しかし、１９７９年以来ヒドロキシ酪酸ナトリウムが最大４０％大脳循環と局所的な血管運動反射を増加することが知られていたことに注意すべきである（Ｂｉｕｌｌ．Ｅｋｓｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．８８  １１，ｐｐ５５５−５５７）。本発明者がここで提供する治療法は、循環におけるそのような効果を越えて、例えばペプチド及びタンパク質のような神経毒剤、及び遺伝的異常によって引き起こされる神経変性のために、機能できない細胞の治療を提供する。治療はケトン体の細胞自体への作用を含むが、血流の細胞への作用ではない。
【００３８】
この発明を臨床に移すにあたり、発明者はさらに、血中全ケトン体濃度を上昇レベルにまで引き上げるのに十分な量で直接投与あるいは代謝前駆体を投与すると、ケトン体を、単に細胞生存率を維持するだけでなく、実際に細胞の機能と成長を通常以上に改善し、例えば血流や栄養とは無関係にそのレベルを制御するという結果を得た。この点に関して、本発明はさらに、神経刺激因子、例えば神経成長因子として及び、例えば代謝速度の増加や軸索や樹状突起などの機能的な特徴の程度を増加するような高められた神経機能を刺激することができる因子、としてケトン体を使用することを提供する。本発明のこの点は、単なる変性の阻止と同様に神経機能の改善のメカニズムを与える。
【００３９】
Ｈｏｓｈｉ及び共同研究者の最近の研究（７７，７８）では、その蓄積がアルツハイマー病の証明となっているアミロイドタンパク質の一部であるＡβ１−４２が、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ多酵素複合体をリン酸化、及び不活性化している、ミトコンドリアヒスチジンプロテインキナーゼとして働いていることが強く示唆されている。ＰＤＨ複合体は、細胞質の解糖で作られたピルビン酸からのアセチルＣｏＡとＮＡＤＨの生成を担うミトコンドリアの酵素である。形成されたミトコンドリアアセチルＣｏＡはオキザロ酢酸と縮合してクレブスＴＣＡ回路を開始し、ピルビン酸をＣＯ２に完全に消費すると同時に、ミトコンドリアのＡＴＰ合成に必要なエネルギーが作られる電子伝達系の基質となる還元力をミトコンドリアに与える。ＰＤＨはこのように、細胞の２つの主要なエネルギー生成経路、解糖とクレブス回路、の交差点に位置し、明らかに生きている細胞の重要な機能に貢献している。
【００４０】
ＰＤＨの阻害には２つの重要な影響がある。一つは、正常の代謝条件ではエネルギー生成においてグルコースに完全に依存している神経組織において、ＰＤＨ阻害によりエネルギー生成の効率低下、ＡＴＰ加水分解のエネルギー低下、アセチルＣｏＡ及びＴＣＡ回路の初めの１／３からの代謝産物の減少、及びミトコンドリアＮＡＤＨの減少、が起きる（９５）。ＡＴＰ加水分解のエネルギー減少は細胞内Ｎａ＋及びＣａ２＋の増加と細胞のＫ＋の損失、及び結果的に細胞死を引き起こす（８６）。海馬の細胞は記銘力の固定化に重要であるが、特にたくさんの形態の傷に感受性であり、これらの細胞死が、臨床的にも病理学的にもアルツハイマー病の証明である。
ＰＤＨの二つ目の主な影響は、ミトコンドリアクエン酸の欠乏である（９５）。
【００４１】
クエン酸、あるいはその代謝産物の一つは、ミトコンドリアから細胞質に送られ、ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＥＣ４．１．３．８）により、サイトゾルアセチルＣｏＡに次の反応で変換される：
クエン酸３−＋ＡＴＰ４−＋ＣｏＡＳＨ＞
アセチルＣｏＡ＋オキザロ酢酸２−＋ＡＤＰ３−＋ＨＰＯ４２−
アセチルＣｏＡは次にコリンと結合し、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．６）の作用により、次の反応でアセチルコリンを形成する：
コリン＋＋アセチルＣｏＡ―＞ＣｏＡＳＨ＋アセチルコリン−
１μｍＡβ１−４２に２４時間さらされた中隔細胞の神経培養は、コリンアセチルトランスフェラーゼの活性の減少なしに、アセチルコリンの生成が５倍以上減少した（７８）。この生成の減少についての推測される原因は、ＴＰＫＩ／ＧＳＫ−３βタンパク質キナーゼの活性化とそれに続くＰＤＨのリン酸化によって引き起こされるＰＤＨ複合体の阻害による、アセチルＣｏＡの減少によるものである（７７）。
【００４２】
上で説明したように、インスリンなしで１０ｍＭグルコースのみで灌流している、単離された動いている心臓は、能率が悪くミトコンドリアエネルギー生成が損傷している。細胞エネルギー生成におけるこの欠陥は、４ｍＭＤ−βヒドロキシ酪酸塩と１ｍＭアセチル酢酸塩からなる生理学的割合のケトン体を供給することにより完全に回復できる（９５）。脳は代謝エネルギー源としてグルコースのみを使用することができ、インスリンの作用には反応しないと考えられていた。しかし、１９６７年に行われた注目すべき臨床研究により、Ｇｅｏｒｇｅ  Ｃａｈｉｌｌ及び共同研究者（４７）は長期の絶食に耐えている肥満患者では、脳が必要とする代謝エネルギーの最大６０％までをケトン体で置き換えられることを示した。さらに注目すべきことに、Ｃａｈｉｌｌは、これらの患者に対して血糖を４から２ｍＭ以下に落とすのに十分な投与量のインスリンを投与しても、血中Ｄ−βヒドロキシ酪酸塩が５．５ｍＭ、アセト酢酸塩が２ｍＭのこれらの患者において精神機能の損傷とは関係しないことを示した（参考文献６３の図３参照）。明らかに、ケトン体が血中に５ｍＭ以上の濃度で存在するときには、それらが脳の通常の糖の必要性に置き換わり、血中グルコースレベルが１．５ｍＭで予想される低血糖症状を阻止することができる。
【００４３】
脳におけるケトン体の利用は輸送によって制限され、血中レベル１ｍＭ以下の際に脳幹神経節において利用の減少が起こる（７６）。しかし、長引く絶食によって通常の人間で達成される７．５ｍＭのレベルでは、脳へのケトン体の取り込み速度は大脳のエネルギー必要量の大部分と置き換わり、通常痙攣や昏睡を引き起こす血中糖レベルにおいてさえ、低血糖症状を防ぐのに十分である（６３）。
【００４４】
グルコースからの通常のエネルギー生成を妨げるＰＤＨのブロックがあるようなアルツハイマー病においては、上昇した、例えば通常の断食におけるケトンレベルを提供することができる場合には、これらの患者に存在するＰＤＨ阻害を迂回することができ、それによってエネルギーの枯渇やコリン作用性刺激の欠如による細胞死を妨げ、その結果記憶損失や痴呆の進行を遅らせることができる、というのが発明者の仮説である。
さらに、ケトン体、特にＤ−β−ヒドロキシ酪酸塩若しくはこのアセト酢酸塩との生理的割合、の神経成長／刺激効果を利用すると、まだ生存可能な細胞が変性された状態を越えて改善されることも可能であり、その結果患者にいくらかの機能の回復が見られるであろう。
【００４５】
給餌された動物と人間とにおいて、アセト酢酸塩の肝臓における含有量、本質的には血液における含有量であるが、は大変低く０．０９ｍＭであり及びＤ−βヒドロキシ酪酸塩は０．１２３ｍＭであるが、４８時間の絶食後は０．６５ｍＭアセト酢酸塩及び１．８ｍＭＤ−βヒドロキシ酪酸塩に増加する（８４）。飢餓においては、インスリンの減少が、脂肪組織における脂肪酸のトリグリセリドへの再エステル化を減少させ、血流中への遊離脂肪酸の放出を引き起こすので、ケトン体が上昇する。放出された遊離脂肪酸は筋肉、心臓、腎臓、及び肝臓でβ酸化の過程において、エネルギー源として取り込み使用することができる。肝臓は、しかし、絶食中グルコースの代わりに脳を含む肝臓以外の器官で使用するために、遊離脂肪酸を代謝燃料、ケトンに変換する能力がある。肝臓におけるケトン体の合成は、以下の一連の反応に従って、肝臓で脂肪酸のβ酸化の間に作られたミトコンドリアアセチルＣｏＡから起こる。
【００４６】
【化１】
0005800453.tif 000014
【００４７】
いったん肝臓中で作られると、以下の反応に従って、モノカルボン酸塩―Ｈ’共輸送体（ｃｏ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）により、ケトン体は肝臓から血流中へ輸送される（２０）：
【００４８】
【化２】
0005800453.tif 000015
【００４９】
ケトン体は同じ担体により肝外組織に入るが、そこにおいてはほかのモノカルボン酸塩が競争阻害剤として作用しうる。Ｄ−乳酸塩若しくはＬ−β−ヒドロキシ酪酸塩のように非生理学的異性体もまた、ケトン体輸送の競争阻害剤として作用することが可能である。血液脳関門を通してのケトン体の輸送が脳におけるケトン体利用の制限因子なので（７６）、ケトン療法の間中、これらの非生理学的異性体の血中濃度が低く保つようにあらゆる努力を払うべきである。血中ケトン体濃度が飢餓に見られるのと同レベルまで上昇するとき、心臓、筋肉、腎臓及び脳はケトン体を好ましいエネルギー基質として利用する：
【００５０】
【化３】
0005800453.tif 000016
【００５１】
本発明者は、このように、代謝エネルギーの供給をグルコース代謝に依存している組織において、ＰＤＨ多酵素複合体の阻害の間に起こるアセチルＣｏＡの不足を、ケトン体からのミトコンドリアアセチルＣｏＡによってこのように置き換えることができることを決定した。供給されるミトコンドリアクエン酸はトリカルボン酸若しくはジカルボン酸輸送体によって細胞質に輸送されることも可能であり、そこにおいてアセチルコリンの合成に必要な細胞質アセチルＣｏＡに変換されることが可能である。これらの概念をさらに説明するのを助けるために、スキーム１にクレブス回路の反応を示した。
【００５２】
アセトアセチルＣｏＡの形成に必要な３オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼが欠けているので肝臓はケトン体を利用することができない。ケトン体は、遊離脂肪酸と異なり肝臓でアセチルＣｏＡを作ることができない。アセチルＣｏＡはマロニルＣｏＡを介する脂肪酸合成の、サイトゾルＨＭＧＣｏＡを介するコレステロール合成の重要な前駆体なので、体の半分以上では通常この２つの潜在的病原性物質の合成を説明するのだが、肝臓においてはケトン体は脂肪酸増加若しくはコレステロール合成のどちらにも帰結することができない。肝臓はβ−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３０）によって確立された近似平衡のため、それに提示されるアセト酢酸塩／Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸塩の割合に敏感で、ミトコンドリアの遊離［ＮＡＤ＋］／［ＮＡＤＨ］を変化させうる（５５）。
【００５３】
【化４】
0005800453.tif 000017
【００５４】
血中ケトンを増加させる最も簡単な方法は飢餓である。長引く絶食の間に、血中ケトンは７．５ｍＭのレベルに到達する（６２，６３）。しかし、６０日の絶食後は必ず死ぬので、この選択肢は長期にわたって選ぶことはできない。
【００５５】
主に脂質を含むケトン食療法は、子供のてんかん、特に筋間代及び無動発作（１０９）の治療のために１９２１年から用いられており、通常の薬理学的方法では不応性の場合に効果的であることが証明された（７１）。脂肪組織における再エステル化を防ぐためには炭水化物とインスリンが低い場合には、遊離脂肪酸若しくはトリグリセリドの、経口若しくは非経口投与のいずれかにより、血中ケトンを増加する事が可能である。７０％コーン油、２０％カゼイン加水分解物、５％セルロース、５％ＭｃＣｏｌｌｕｍｓ塩混合物を含む餌を与えられたラットは約２ｍＭの血中ケトンを形成した。コーン油をラードに置き換えると血中ケトンがほぼ５ｍＭまで上昇した（Ｖｅｅｃｈ、未発表）。
【００５６】
Ｍａｒｒｉｏｔｔ  Ｃｏｒｐ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｅｄｉａｔｉｃ  Ｄｉｅｔ  Ｍａｎｕａｌ，Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ａｕｇｕｓｔ  １９８７により奨励されている、４−６歳のてんかんの子供に適した、伝統的な１日あたり１５００カロリーのケトン食療法の例は、炭水化物とタンパク質を合わせたもの１ｇ毎に対し、３：１ないし４：１ｇの脂肪を含んでいた。３回の食事のそれぞれにおいて患者は４８から５０ｇの脂肪、たった６ｇのタンパク質及び１０ないし６．５ｇの炭水化物を食べなければならない。実際にはこれはそれぞれの食事で子供は１日あたり３２ｇのマーガリン（約１／４本）を食べ、主に中間の鎖長のトリグリセリドを含む、濃いクリームを９２ｇ（約１００ｍｌ）を飲まなければいけないということである。
【００５７】
炭水化物とタンパク質の組合せに対して３：１の割合で脂肪を摂取するための食事の例が下の表１に示されている。
【００５８】
【表３】
0005800453.tif 000018
【００５９】
一般にこのような食事で達成されるケトン体のレベルは、約２ｍＭＤ−ヒドロキシ酪酸塩及び１ｍＭアセト酢酸塩であるが、遊離脂肪酸のレベルは約１ｍＭである。中間鎖長のトリグリセリドを含む、他の様々な組成が検討された。一般にそのまずさのためにこのような制限食が守られることは稀である（５６）。糖尿病のある患者とない患者（７４，１１２）における運動耐性を改善するための（８３）減量食としてと同様に、高脂質、低炭水化物食は、癌患者においてもまた腫瘍へのグルコース供給を減らすための治療剤として（８８）、検討されてきた。
【００６０】
血中ケトンを神経学的に効果的なレベルにまで上げるのを脂質に頼る食事療法の限界は多くある。まず、脂質を基礎とする食事療法に対するケトン体のレベルは３ｍＭより低くなる傾向があり、通常の肥満の人間が長期にわたって絶食する場合に達成される７．５ｍＭよりかなり低い。２つ目に、炭水化物の認められていない摂食はインスリン分泌を増加させ、遊離脂肪酸からケトンへの肝臓における変換がすぐに減少し、その結果血中ケトンが減少し、脂肪組織において脂質がトリグリセリドへエステル化されることにより迂回される。数多くの不確かな報告が‘食事療法を誕生ケーキで中断した’子供の再発に関する。３つ目に、伝統的に精製糖、パン、パスタ、米、及びジャガイモの高い摂取が行われる社会では、特に、味のまずさとケトン体レベルを高く維持するためには炭水化物をさける必要があるために、外部の患者環境で成人がそのような高脂質食事療法を使用するのを難しくしている。現実には、すべての食べ物が長期間家庭で厳しい管理下で用意される予供を除いて、伝統的高ケトン食事療法を患者に強制することはできない。４つ目に、成人集団がそのように大量の脂質を摂食すると、血管の病気や散発的な肝臓や膵臓の病気の増加といった病理学的な余病を伴う、重大な高トリグリセリド血症を引き起こし、したがって医学的見地から処方できない。高脂質低炭水化物食は高カロリー摂取にも関わらず、炭水化物摂取を低くするという条件で、１９７０年代に減量については一般的であった。しかし、血中脂質の増加とアテローム性動脈硬化症の関係が次第に明らかになるにつれ、この食事療法の割合は急速に減少した。
【００６１】
カロリー量の４７％がグルコース若しくは１，３−ブタンジオールラセミ体である液状食を追加すると、血中ケトン濃度は１０倍の０．９８ｍＭＤ−βヒドロキシ酪酸塩及び０．３３ｍＭアセト酢酸塩に上昇する（１０７）。これらの値は４８時間の絶食で通常得られる値よりわずかに低く、絶食している人で得られる７．５ｍＭのレベルよりはるかに低い。１，３ブタンジオールラセミ体は肝臓で、アセト酢酸と、自然に存在しないＬ−β及び自然に存在するＤ−βヒドロキシ酪酸（それぞれ（Ｓ）３−ヒドロキシブタノン酸塩及び（Ｒ）３−ヒドロキシブタノン酸塩）の両方に変換される。１，３ブタンジオールラセミ体は動物の餌における安価なカロリー源として徹底的に研究され、試験的に人間の食事療法でさえ使用されてきたが（８１，１０１）、自然界に存在しないＬ−異性体の生成が、自然界に存在しないＤ−乳酸塩の人間における使用で見られたように（６４）、長期使用においては重大な毒性を示す可能性がある。自然界に存在しないＬ異性体を投与する場合の不利な点の一つは、輸送において自然に存在するＤ−βヒドロキシ酪酸塩と競争する点である。このように（Ｒ）１，３ブタンジオールをケトン体の前駆体として供給することは、自然界に存在しない異性体の不必要な投与若しくは生成を避ける、一つの可能性である。
【００６２】
１，３ブタンジオールラセミ体のモノエステル及びジエステルはカロリー源として提案され、ブタで試験されてきた（６７）。カロリーの３０％をそのエステルとして含む一塊の餌を経口投与すると、血中ケトンが５ｍＭに短期間上昇した。しかし、上に述べた理由から、異常（Ｓ）３−ヒドロキシブタノン酸塩の生成を伴う１，３ブタンジオールラセミ体の使用は薦められない。
【００６３】
そのような組成における１，３ブタンジオールラセミ体の使用は推奨できないが、（Ｒ）１，３ブタンジオールのエステルは単独で若しくはアセト酢酸エステルとして使用することができる。（Ｒ）１，３ブタンジオールは例えばＬｉＡｌＨ４を用いてＤ−β−ヒドロキシ酪酸塩モノマーを還元することにより容易に合成することが可能である。（Ｒ）１，３ブタンジオールは肝臓の酸化還元状態を著しくゆがめることなしに、肝臓で酸化されてＤ−β−ヒドロキシ酪酸塩を形成しやすい。ラットにおける研究により、１，３ブタンジオールラセミ体を食べさせると、肝臓のサイトゾル［ＮＡＤ−］／［ＮＡＤＨ］が１５００から約１０００に減少することが明らかになった（８７）。比較して、エタノールの投与は肝臓の［ＮＡＤ−］／［ＮＡＤＨ］を約２００に減少する（１０６）。
【００６４】
アセト酢酸塩は、新しく製造されると、最高の効果を与えるような生理学的に通常の濃度で、点滴溶液中で使用することが可能である（９５）。現在、貯蔵期間が長く加熱滅菌された液体であることが必要とされる製造面からの要求のため、アセト酢酸塩はしばしばエステルの形で与えられる。これは貯蔵期間を長くし、滅菌中の熱に対する安定性を増加するためになされてきた。血流中では、エステラーゼの活性は約０．１ｍｍｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ、肝臓中では約１５ｍｍｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇと見積もられてきた（６８）。１，３ブタンジオールとアセト酢酸塩を組み合わせたエステルに加えて、非経口（５９）及び腸溶栄養（８２）ではアセト酢酸のグリセロールエステルもまた、徹底的に研究されてきた。そのような製剤は、消化管細胞によるアセト酢酸の高い吸収によってを消化管の萎縮を減少し、やけどの治療に有効であると報告されている（８５）。
【００６５】
しかしアセト酢酸塩を形成する１，３ブタンジオールも、グルコースの前駆体であるグリセロールも、通常の酸化還元対、Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸塩／アセト酢酸塩の一部ではない。本発明では、最適条件下で生理学的割合のケトンが与えられるべきである。もしそうでない場合には、丸ごとの動物で、肝臓が自らのミトコンドリア遊離［ＮＡＤ−］／［ＮＡＤＨ］に従ってケトンの割合を調節するであろう。もし異常な割合のケトンが与えられるならば病理学的な結果は明瞭に見込まれる。生理学的割合のケトン体によって心臓効率が上昇した（９５）、グルコース、アセト酢酸塩、及びＤ−β−ヒドロキシ酪酸塩の混合物を灌流されたラットの心臓と比較して、動いている心臓では、アセト酢酸を唯一の基質として灌流するとすぐに心臓発作を引き起こす（９９）。
【００６６】
大量の脂質の注入も、生理学的に矛盾する異性体Ｌ−βヒドロキシ酪酸を生成する物質の使用も必要としない最良の外来性ケトン体源は、ケトン体そのものである。しかしながら本発明は治療における投与ために代替品も提供する。
【００６７】
最初の代替品はＤ−βヒドロキシ酪酸塩のポリエステルである。Ｄ−βヒドロキシ酪酸塩の天然のポリエステルは、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｎｔｒｏｐｈｕｓ由来の５３０，０００ＭＷのポリマー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ）として若しくは砂糖大根の２５０，０００ＭＷのポリマー（Ｆｌｕｋａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）として商業製品として売られている。
【００６８】
バクテリアはそのポリマーを貯蔵栄養源として生成する。バクテリアによるこれらのポリマーの発酵は、止血栓カバー及び他の使用をのための潜在的生物分解性プラスチックとして、ＵＫのＩＣＩ及びベルギーのＳｏｌｖａｙ  ｅｔ  Ｃｉｅにより１９７０年代に開発された。ポリＤ−β−ヒドロキシ酪酸塩の合成の確実な系がいまやクローン化され、例示されたバクテリアに与えられる基質によって、このポリマーの組成物の変種が生成されている。しかし、これらのポリマーは、石油ベースのプラスチックと競争することができなかった。それにも関わらず、ポリアルカノエイトの合成を担う遺伝子はクローン化され、おおくの微生物で発現され（９３，１０２，１１３）、この物質を様々な生物で非常に様々な条件下で生産することができるようになった。
【００６９】
ポリＤ−β−ヒドロキシ酪酸塩はいろいろな生物源由来の多くの形態で、殆ど無味且つ無臭の不溶性白色粉末として得られ、経口若しくは他の投与手段のために組成物中に組み込むのに適している。この物質のエステル結合を切ることができるエステラーゼは、血漿と殆どの細胞に広く存在する。これらのポリマーはまた簡単にｉｎ  ｖｉｔｒｏでアルカリ加水分解により切れ、通常のモノカルボン酸輸送体によって消化管から門脈へ輸送されるＭＷ１０４のモノマーを最終的に生成する、一連のポリマーを作る。あるいは酸加水分解が、Ｆｌｕｋａの宣伝用資料において参照された発行された方法を用いて行われることも可能である。
【００７０】
Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸ポリマーの好ましい形態は、人間若しくは動物によって容易に消化可能でありおよび／または代謝されるように設計された、ケトン体のオリゴマーである。これらは好ましくは２ないし１００の繰返しの長さであり、典型的には２ないし２０であり、もっとも便利なのは３ないし１０の繰返し長さである。ある範囲の摂取特性を得ることができるという利点を伴って、そのようなオリゴマーの混合物が用いられる可能性がある、ということが認識されるであろう。
【００７１】
いったんモノマーが血流中にはいると、肝臓はケトン体を代謝することができず、Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸塩／アセト酢酸塩の割合を変えることだけができるので、ケトン体はそれらを利用することができる肝外組織に輸送される。達成されるケトンの血中レベルは、現在のケトン食療法の場合にあることだが、炭水化物の摂食を守らないことにより引き起こされる変化の影響は受けない。むしろ、治療される状態によって、持続的な血中レベルを生成するのに十分な量、典型的には０．３ないし２０ｍＭ、より好ましくは２ないし７．５ｍＭ、で２４時間にわたって、通常の食事療法へ単に加えらるであろう。抵抗力のある小児期てんかんの場合、２ｍＭの血中レベルで十分であると現在は考えられている。アルツハイマー病の場合、過剰量のＡβ１−４２アミロイドペプチドのためＰＤＨ容量が減少しているアルツハイマー病患者の脳組織に、代替エネルギー及びアセチルＣｏＡ補給を供給する努力の中で、絶食している人の研究で得られた７．５ｍＭのレベルを維持する試みを行うことができた（７７，７８）。
【００７２】
Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸塩及びそのアセト酢酸塩との混合物が神経刺激物質、すなわち神経成長刺激剤および／または軸索及び樹状突起成長の刺激剤として作用することが、本発明者により決定され、これによりケトン体レベルを上げ、神経変性の治療のために栄養学的に要求されるよりも低い程度にするという選択肢を開いた。
【００７３】
本発明の組成物は好ましくは滅菌及び発熱源フリーであり、特にエンドトキシンフリーである。第２に、それらは患者が栄養補助食品を摂取する際の適応性を改善するために、通常の食事に添加剤として加える際に味がよいことが可能なように処方されることが好ましい。オリゴマーとポリマーは一般に無味無臭である。Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸塩及びそのアセト酢酸塩との混合物がマスキング剤で覆われても良いし、或いは腸溶性コーティングにより腸を標的にするか若しくはそうでなければ薬理学の技術でよく理解されているようにそれらをカプセルに入れても良い。
【００７４】
ケトン体は約６カロリー／ｇを含んでいるので、肥満を防ぐためには他の栄養量を代償的に減少させることが望ましい。
【００７５】
ケトン体或いはポリ若しくはオリゴ−Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸塩若しくはアセト酢酸エステルを使用する特筆すべき利点は
１）  それらをその効果を損なわずに、炭水化物の通常食の量とともに食べても良い点、
２）  現在のクリームやマーガリンを含む食事のように血中ＶＬＤＬを上げないので血管の病気、脂肪肝、及び膵炎を加速する危険性を避けることができる点、
３）  ＩＩ型糖尿病については低血糖発作と昏睡を防ぐため、アルツハイマー病及び他の神経変性状態については神経細胞、すなわち海馬細胞死を防ぐため、及び大脳のグルコース運搬体の減少、解糖の欠陥、若しくは先天的ＰＤＨ欠損を伴ういわゆるＬｅｉｇｈ症候群のいずれかに帰因する難治のてんかん、を含むさらに様々の患者で、広い範囲で使用することができる点である。
【００７６】
特筆すべき代替品の２番目のグループはＤ−β−ヒドロキシ酪酸のアセト酢酸エステルである。Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸に対するアセト酢酸の生理的な割合を提供するエステルは好ましく例えば１：１ないし１：２０であり、より好ましくは１：１ないし１：１０である。末端にアセト酢酸残基を持つＤ−β−ヒドロキシ酪酸の４量体は特に望ましい。このような物質は生理的割合のＤ−β−ヒドロキシ酪酸塩／アセト酢酸塩部分を持つという追加の長所を持ち、したがって過度のアルコール消費でおこるような肝臓の［ＮＡＤ＋］／［ＮＡＤＨ］の異常還元を引き起こさずに、投与された栄養の酸化還元状態を調整しなくていはいけないという肝臓の役割を免除する。エステル重合体は、その長さに依存して水溶解性が減少するが熱には安定になる。そのようなポリマーは例えば乳濁液として経口及び非経口使用することができ、一方アセト酢酸塩はエステル化されていない状態では、室温で半減期約３０日でアセトンへ自発的に脱炭酸されやすいのでそれほど好ましくない。
【００７７】
ケトン体前駆体として使用可能なポリＤ−β−ヒドロキシ酪酸若しくは末端が酸化されたポリＤ−β−ヒドロキシ酪酸エステルの例を下に示す。
【００７８】
【化５】
0005800453.tif 000019
【００７９】
【化６】
0005800453.tif 000020
【００８０】
それぞれのケースで、ポリマー若しくはオリゴマーが、人間若しくは動物の体に投与される場合に容易に代謝され、血中ケトン体レベルがあがるように、ｎは選択されている。ｎの好ましい値は０ないし１０００の整数であり、より好ましくは０ないし２００であり、さらにまだ好ましくは１ないし５０であり、最も好ましくは１ないし２０、特に便利なのは３ないし５である。
【００８１】
Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸ポリエステル自体を含む、この物質の多くの変形体もまた、適した製造特性を持つため試みることが可能である。物質は無味の白色粉末である。部分的アルカリ加水分解の後、さまざまな鎖長のポリマーの混合物が提供され、消化管吸収を円滑にし、２４時間にわたりケトンを高い持続的レベルに維持する傾向がある。
【００８２】
治療は、血中ケトンが２４時間にわたって上昇した範囲、たとえば０．５ないし２０ｍＭ、好ましくは２−７．５ｍＭに維持するように、放出を遅らせるために処方されたＤ−β−ヒドロキシ酪酸ポリエステルにより、患者のカロリー摂取の重要な部分を供給することを含む場合がある。血液中へのケトン体の放出は、マイクロカプセル化、吸着など多くの薬剤の経口投与で現在実施されている様々な技術を応用することによって制限される可能性がある。胃以降への送達を標的とする腸溶性コーティングされた形態が特に用いられ、その場合物質は、酸性環境下での加水分解を必要としない。そのようないくらかの加水分解が望ましいときには、コートされていない形態を用いても良い。いくつかの形態は、Ｄｏｉ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓ中で言及されているもののように、エステルを分解してケトン体を放出することができる酵素を含んでいても良い。
【００８３】
Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸のナトリウム塩の静脈注射が通常の人間の患者及び多くの状態の患者、例えば集中治療室内の重い敗血症の治療を行っている患者に施した。それは、毒性がなく、グルコース遊離脂肪酸及びグリセロール濃度を減少することができるが、ロイシンの酸化を減少することには効果がないことが明らかとなった。
【００８４】
Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸塩のモノマーは白く無臭の結晶で、酢やレモンジュースと比較すると強度的にはそれほど強くないが、わずかに酸っぱいもしくは酸味がある。それはほとんどの食べ物、例えば飲み物、プディング、つぶした野菜、もしくは不活性な増量剤に処方することができる。Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸の酸の形態はｐＫａが４．４なので経口使用に適している。これは３．１のｐＫａ１、及び４．８のｐＫａ２、のクエン酸より酸性度が低く、ｐＫａ４．７の酢酸よりわずかに酸性である。
【００８５】
自然界に存在するＤ−もしくは（Ｒ）異性体のみがこの組成体の中で使用されるのが望ましい。実際には完全に純粋な異性体を得ることは不可能なので、現在Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｉｕｓ  ＭＯもしくはＦｌｕｋａ  Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ、ＮＹで売られている商業製品が、この目的のためには最も適している。商業的に手に入るＤ−β−ヒドロキシ酪酸の旋光度はＮａの波長で−２５°±１であり、融点は４３−４６℃である。Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸のＮａ塩の旋光度は−１４．５°であり、その融点は１４９−１５３℃である。両方ともＤ−β−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．３０）を用いて標準的な酵素分析により評価することが可能である（５）。アセト酢酸は同じ酵素を用いて決定することができる（５６）。非生理的な（Ｓ）異性体は酵素分析で測定することはできないが、ＧＣマススペクトロメトリーを用いて測定する事が可能である（１３）。
【００８６】
１５００カロリー食事療法の場合、人間の成人患者は１日あたり１９８ｇのケトンを消費しても良い。同じ割合の２０００カロリー食事療法の場合、１日あたり２６４ｇのケトンを消費しても良い。ケトン脂質食事療法の場合血中ケトンは約２ｍＭまで上昇する。ケトン食事療法では、ケトンが脂質のカロリー等量で、すなわち１．５ｇケトン／１ｇ脂肪で置き換えられているので、ケトンレベルはもっと高いはずである。その結果血中ケトンはおよそ３ｍＭであるが、まだ絶食している人で達成されるレベル７．５ｍＭには届かない。
【００８７】
ケトン体そのものを使う利点はいくつかある。第１に、ケトン体そのものの供給は炭水化物の制限を必要としないので、特に高い炭水化物食が普通の文化で、規定食の処方の嗜好性が増加する。第２にケトン体は筋肉、心臓、及び脳組織で代謝することが可能であるが、肝臓ではできない。それ故、ケトン食療法の厄介な副作用となるかもしれない脂肪肝を避けられる。第３に、炭水化物を規定食処方の中に含むことが可能であることから適応性が向上し、インスリンが高く、既知のケトン食療法を用いることができない、ＩＩ型糖尿病への実質的な治療アプローチの可能性をひらく。
【００８８】
本発明者は、ケトン体の上昇はいかなる場合も望ましいが、特にアルツハイマーの様な病気で脳細胞死を阻止する目的の場合は、投与されるべきケトン体の好ましい量は、血中レベルを０．５ないし２０ｍＭレベルまで、好ましくは２ｍＭないし７．５ｍＭレベル及びそれ以上まで上昇するのに十分な量である事を決定した。死んだ細胞を元に戻すことはできないが、更なる悪化を防いだり、少なくとも機能のいくらかの回復を期待することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩、実施例１で合成されたこのオリゴマー及び実施例２で合成されたそのアセトアセチルモノマーの胃管栄養後に経時的に生成された血中（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩レベルを示すグラフである。
【発明を実施するための態様】
【００９０】
このように本発明の第一の態様では、（ｉ）心臓効率、特にグルコースの使用における効率を増加するため、（ｉｉ）特に糖尿病及びインスリン耐性状態の治療したり、または体のインスリンに対する反応を増加することによって、エネルギー源を供給するため、（ｉｉｉ）神経細胞の損傷若しくは死に関連した疾患、特に、例えばアルツハイマー病、発作、そしてＣＪＤ及びＢＳＥのような脳障害のように関連した状態、のような記憶関連疾患などの神経変性疾患を後退させ、遅らせ、若しくは防ぐために、薬若しくは栄養摂取補助の製造のいずれかにおけるアセト酢酸塩、Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸塩、もしくはその代謝前駆体の使用を提供する。
【００９１】
ここにおいてその代謝前駆体という語は特に、アセトアセチル−１，３−ブタンジオール、アセトアセチル−Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸、及びアセトアセチルグリセロールのような１，３−ブタンジオール、アセトアセチル、若しくはＤ−β−ヒドロキシ酪酸部分を含む化合物に関する。そのような化合物のいずれの一価、二価、若しくは三価アルコールとのエステルもまた構想されている。
【００９２】
この態様は、特に神経生成が深刻な臨床の結果をもたらすような病気において、神経細胞の例えば海馬若しくは黒質における軸索および／または樹状突起の成長を刺激することができるような神経刺激物質としての使用を含む。
【００９３】
糖尿病の患者では、これらの化合物のこの使用により低血糖合併症の恐れなく低い血中糖レベルを維持できる。正常な非−糖尿病患者では絶食血中糖は食後に８０ないし９０ｍｇ％（４．４−５ｍＭ）から１３０ｍｇ％（７．２ｍＭ）に上がる。糖尿病では、糖尿病の‘厳しいコントロール’が血管の合併症を防ぐための方法として推奨されてきたが、実際には、食後に血中糖を１５０ｍｇ％（８．３ｍＭ）以下に厳しく制限して保つことは、低血糖症の発現のために困難であることを医師は見いだしてきた。血中糖が２ｍＭまで下がった普通の患者では低血糖症昏睡が一様に起こる。先に議論されたように（６２、６３）、５ｍＭ血中ケトン存在下では、血中糖が１ｍＭ以下に下がったときも、神経学的症状は起こらない。
【００９４】
本発明者は、ＩＩ型糖尿病患者にケトン体を追加すると、血中糖をよりよく制御することができ、現在は糖尿病にかかって２０年後におこり、糖尿病の病的状態と死亡率の主な原因である、目及び腎臓の血管の変化を防いている。
【００９５】
例えば難治のてんかんがケトン食療法で治療されるように、治療が疾患に関連した発作を目標として行われる場合、ケトン体、そのポリマー若しくはエステル若しくはブタンジオール化合物のような前駆体の使用することにより、高脂質及び炭水化物含有量の減少若しくは削除のために、改良される。そのような患者は、脳のグルコース輸送システム、解糖、若しくはＬｅｉｇｈ症候群のようにＰＤＨ自体に遺伝的欠陥がある者を含む。
【００９６】
これらの薬で治療する事ができる特定の疾患は、頭部外傷の後に起こるすべての状態を含むＰＤＨブロック、若しくは例えばインスリン昏睡及び低血糖症、脳のグルコース輸送体若しくは解糖酵素ステップ、若しくはピルビン酸輸送における疾患のようなミトコンドリアに対するアセチルＣｏＡの供給の減少若しくは削除を含む、あらゆる状態に応用できる。
【００９７】
好ましくはヒドロキシ酪酸塩は非−ラセミ体のＤ−β−ヒドロキシ酪酸塩の形であり、アセト酢酸もまた供給するような形で投与されるのがより好ましい。好ましくは代謝前駆体は人間若しくは動物の体に投与された時に例えば肝臓により代謝され、Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸塩及びアセト酢酸塩の一つ若しくは両方を、より好ましくは生理学的割合で生成する。特に好ましいのはポリ−Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸若しくはアセトアセチル−β−ヒドロキシ酪酸オリゴマー若しくはこれらの一方若しくは両方のエステルである。Ｃ１−４アルキルエステルのような低級アルキルエステルが用いられても良いが、それぞれの１，３−ブタンジオールエステルのようにより生理学的に受け入れられるエステルがより好ましく、特に（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを使用する。最も好ましいのは、アセトアセチル−トリ−、テトラ−、及びペンタ−Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸エステルである。エステル前駆体は１，３−ブタンジオールのエステル、好ましくは（Ｒ）体、及び特にアセトアセチルグリセロールのようなアセト酢酸エステルを含む。
【００９８】
好ましいポリ−Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸エステルは、好ましくは２−１００繰返し、例えば２−２０繰返し、最も好ましくは２−１０繰返しのオリゴマーのエステルである。
【００９９】
本発明の薬若しくは栄養製品が長期貯蔵を必要としない使用を目的とするならば、水酸基置換カルボン酸および／またはケトン、好ましくは両方を含む液体若しくは固体組成物の形態で使用し、ここにおいてこれらがＤ−β−ヒドロキシ酪酸塩及びアセト酢酸塩が一緒になって、好ましくは３：１ないし５：１の割合、より好ましくは約４：１の割合であると、便利である。
【０１００】
薬若しくは補助剤がアセト酢酸塩を含む場合、好ましくは長期にわたって保存されず、若しくは４０度を超える温度にさらされない方がよい。アセト酢酸塩は加熱に不安定で、１００℃でアセトンとＣＯ２に激しく分解する。そのような状況では、体の代謝過程と接することにより組成物によりアセト酢酸塩が生成するのが望ましい。好ましくは組成物はアセト酢酸のエステル前駆体を含む。例えば、アセト酢酸のエチルエステルは比較的安定で１８０．８℃の沸点を持つ。
【０１０１】
さらにより好ましくは、記述されているように、薬若しくは補助剤はＤ−β−ヒドロキシ酪酸のアセト酢酸エステル若しくはＤ−β−ヒドロキシ酪酸のオリゴマーのそのようなエステルを含む。これは、二つの成分をおよそ好ましい割合にするために、Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸もしくはＤ−β−ヒドロキシ酪酸のポリマーのひとつ、例えばオリゴ−Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸を添加しても良い。このような組成物は、エステル及びポリマーがそれらを消費した人間若しくは動物の胃若しくは血漿で代謝されると２つの好ましい成分を供給するであろう。さらに、代謝されるか若しくはそうでなければ脱エステル化されるまでは、より脂溶性で、その成分のすべてが望ましいケトン体に変換されるので、アセトアセチル−Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸の（Ｒ）１，３−ブタンジオールエステルが、最も好ましい可能性がある。
【０１０２】
本発明の２番目の態様は、治療若しくは栄養補助剤としての使用のために、アセト酢酸の新規エステルを提供する。そのようなエステルはＣ１−４アルキルエステルを含んでもよいが、最も好ましくは、上に記載したＤ−β−ヒドロキシブチリル−アセト酢酸である。
【０１０３】
本発明の３番目の態様は、治療における使用を目的としたポリ−Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸塩を、特に胃の酸性条件下若しくはｉｎ  ｖｉｖｏのエステラーゼにより分解する事ができるような形態で、提供する。
【０１０４】
本発明の４番目の態様は、アセト酢酸ハロゲン化物、例えばアセトアセチルクロライドとＤ−β−ヒドロキシ酪酸塩の反応を含む、Ｄ−β−ヒドロキシブチリル−アセト酢酸エステルの合成法を提供する。好ましくはこれはアセト酢酸をチオニルクロライドのような活性化剤と反応させて、酸クロライドを生成することにより、達成される。
【０１０５】
本発明の５番目の態様は、Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸塩若しくはそのオリゴマーをアセト酢酸、その活性化状態、若しくはジケテンと反応させることを含む、Ｄ−β−ヒドロキシブチリル−アセト酢酸エステルの合成法を提供する。
【０１０６】
本発明の６番目の態様は、Ｄ−β−ヒドロキシブチリルアセト酢酸エステルそれ自体、それらの生理学的に許容される塩、或いは短鎖若しくは中鎖の一価、二価、若しくは三価アルコール若しくはその１−３−ブタンジオールエステルを提供する。
【０１０７】
本発明の７番目の態様は、ポリ−Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸塩を、薬理学的若しくは生理学的に許容される担体とともに提供する。
【０１０８】
本発明の８番目の態様は、１：１ないし２０：１、より好ましくは２：１なし１０：１、最も好ましくは３：１ないし５：１の割合のＤ−β−ヒドロキシ酪酸塩及びアセト酢酸を含む組成物を、薬理学的若しくは生理学的に許容される担体とともに提供する。好ましくはこれらの成分の割合は約４：１である。このような組成物は、薬若しくは食料として既に使用された血漿、血清、或いは動物若しくは植物の組織を含まないので、好ましくは滅菌若しくは発熱物質フリーであることが好ましい。特にケトン体は重量にして少なくとも組成物の５％を含み、より好ましくは２０％以上、及び最も好ましくは５０％ないし１００％を含む。組成物は経口、非経口、若しくは他のいかなる慣用の投与形態によって投与されても良い。
【０１０９】
本発明の９番目の態様は、本発明の第１ないし第８の態様で使用するための物質のうちの少なくとも一つを投与する事を含む、人間若しくは動物の心臓効率を上げるための、その治療方法を含む。
【０１１０】
本発明の１０番目の態様は、本発明の第１ないし第８の態様で使用するための物質のうちの少なくとも一つを投与する事を含む、人間若しくは動物のインスリンへの応答を増加するための、その治療方法を含む。
【０１１１】
本発明の１１番目の態様は、本発明の第１ないし第８の態様で使用するための物質のうちの少なくとも一つを投与する事を含む、人間若しくは動物のインスリン耐性を治療するための、その治療方法を含む。
【０１１２】
ここにおけるインスリン耐性状態は、糖尿病の形態、特にインスリンに完全には反応しないものを含む。
【０１１３】
本発明の１２番目の態様は、本発明の第１ないし第８の態様で使用するための物質のうちの少なくとも一つを投与する事を含む、第１の態様で言及されている疾患、特に例えばアミロイドタンパク質の存在のような神経毒状態に関連した神経変性疾患、例えばアルツハイマー病のように記憶に関する疾患、若しくはてんかんの発病、に関連する、神経細胞、例えば、脳細胞の死若しくはダメージを治療するための、人間若しくは動物の治療方法を含む。
【０１１４】
本発明の９番目ないし１２番目の好ましい方法は、本発明の好ましいケトン及びポリ酸及び酸エステルを使用する。
【０１１５】
ポリＤ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法は既に既知なので特に請求しない（例えばＳｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，（１９９４）Ａｐｐｌｉ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：１１９８−１２０５）。このポリマーはＦｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｐ１０８２，ｃａｔ＃８１３２９，１９９３−９４，９８０．ｓｅｃｏｎｄ  Ｓｔ．Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ  ＮＹ  １１７７９−７２３８，８００  ３５８  ５２８７から商業的に入手可能である。
【０１１６】
本発明の生物的に入手可能なポリマーを使用することの特筆すべき利点には、それらと一緒に投与しなければならない、ナトリウムのようなカウンターイオンの量を減らす事が含まれる。このナトリウム負荷の減少は特に病気の人に利点がある。生物的に入手可能という語により、体によって使用され、これらの物質が上に記載されているように、Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸塩、アセト酢酸塩、及びこれらの生理学的割合の混合物のいずれか一つを生成する事を意味する。
【０１１７】
アルツハイマー病及びパーキンソン病のような神経変性病の治療に用いられるケトン体の量は、好ましくは上に記載されているように血中レベルを０．５ないし２０ｍＭに、例えば２ｍＭなし７．５ｍＭにあげる。本発明者は患者１日あたり、ケトン体２００ないし３００ｇ（０．５ポンド）がこれを達成するのに必要だろうと見積もる。治療が神経毒の効果に対する細胞の維持による場合、これはより高いレベル、すなわち血中２ないし７．５ｍＭも可能である。そのように生成されたＤ−β−ヒドロキシ酪酸の神経刺激因子効果に依存している場合、ここにおいて投与量がより低く、例えば０．２ないし４ｍＭを提供するものであるが、しかし、もちろん、これ若しくは他の病気のためにはより多いことも可能である。
【０１１８】
アルツハイマー病のような神経変性病の治療は、患者が病気を発生する素因を有することを同定した直後に最も効果的に与えることができることが認識されるであろう。このようにアルツハイマー病の治療の後、最も効果的には以下の、（ｉ）第２１番染色体上のアミロイド前駆体タンパク質の突然変異、（ｉｉ）第１４番染色体上のプレセニリン遺伝子の突然変異、（ｉｉｉ）アポリポタンパク質Ｅのアイソフォームの存在、から成る群から選択された一つ以上の状態についての陽性の試験結果が生じる。アルツハイマー病の指標となる他の試験ももちろん適用することができる。
【０１１９】
そのような陽性の試験結果に基づいて、患者の血中もしくは血漿中のケトン体Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸塩及びアセト酢酸塩の濃度の総量を例えば、１．５ないし１０ｍＭ、より好ましくは２ないし８ｍＭに、いくつかの方法の一つにより上昇することによって、記憶損失および／または他の神経学的機能不全の発生を、防ぐのはふさわしいであろう。好ましくは、十分な量のＤ−β−ヒドロキシ酪酸、その代謝可能なポリマー、そのアセト酢酸エステル、若しくはそれらの前駆体（Ｒ）−１，３−ブタンジオール及びそのアセト酢酸エステル、例えばアセトアセチルグリセロールを含んでいる食事を患者に与えるか、或いは静脈内若しくは動脈内にＤ−β−ヒドロキシ酪酸塩及びアセト酢酸のケトン体を投与した。上に記載の有機物質はすべて、場合によっては塩若しくはエステルの形でも良い。典型的な生理学的に許容される塩の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、Ｌ−リジン及びＬ−アルギニン若しくは、例えばメチルグルカミン塩のようにより複雑な塩から選択される。エステルは本発明の他の態様で以前に記述されたようなものであろう。
【０１２０】
本発明のさらなる態様は、食事療法の適切な制御により本発明のケトン体を提供する。このように本態様は、人間若しくは動物の、（ｉ）個体の全絶食、及び（ｉｉ）個体に、重量にして例えば６０ないし８０％の脂質と炭水化物含有量２０％以下のケトン食療法を食べさせることの、いずれか１つを含む、本発明の９番目ないし１２番目の態様の１つ以上の疾患について人間若しくは動物を治療する方法を提供する。
【０１２１】
発作の治療を目的とする場合、例えばてんかんにおいては、食事療法は、経口若しくは腸溶性経路による炭水化物の、或いは上に特定した化合物の自由な摂食を含んでも良い。
【０１２２】
ケトン食療法以外のこれらの治療法すべてにおいて、過剰の炭水化物の摂取に関する血中ケトンの低下を抑える方法、及び肝臓による脂肪酸とコレステロールの合成を加速するか、さもなければ血管の疾患に寄与する過剰の脂質の給餌を避ける方法という改良点が存在する。
【０１２３】
低血糖症の脳機能不全もまた、本発明の治療及び組成物及び化合物を用いて治療可能なことが明らかになるであろう。本治療に関連するさらなる特性は、筋肉の能力における一般的な改良であろう。
【０１２４】
（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を誘導することが可能な多くの比較的安価な、若しくは潜在的に安価な、出発物質が容易に入手可能なことにより、本発明のケトン体を基盤とした食物及び薬の供給は、促進されている（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓ  Ｙｏｓｈｉｈａｒｕ  Ｄｏｉ．ＩＳＢＮ  ０−８９５７３−７４６−９  Ｃｈａｐｔｅｒｓｌ．１、３．２、及び８参照）。食物を作る生物に挿入することが可能な遺伝子の入手可能性はは、ポリ−（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩、若しくはそのようなポリマーを切る事ができる酵素による切断の後にモノマーの基質自体のいずれかを豊富に含む、ヨーグルト及びチーズのような製品を作成する手段を提供する（Ｄｏｉ．Ｃｈａｐｔｅｒ８参照）。
【実施例】
【０１２５】
本発明はここで以下の図及び実施例を参照することによってのみ例証される方法でさらに記述される。本発明の範囲に含まれるさらなる態様はこれらに照らして当業者が気づくであろう。
【０１２６】
実施例１
（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸（Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸）のオリゴマーの調製
（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸（Ｆｌｕｋａ−５．０ｇ：０．０４８モル）、ｐ−トルエンスルホン酸（０．０２５ｇ）及びベンゼン（１００ｍｌ）をＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラップ装置内で２４時間環流下、撹拌した。反応混合物を冷却し、ベンゼンを真空下で（０．５ｍｍＨｇ）蒸発した。４．４ｇの無色のオイルが得られ、そのうち２０ｍｇのサンプルを、ＮＭＲを用いてモノマー繰返しの数を分析するためにメチルエステルに変換した。これらの研究から、生成物は平均繰返し回数３．７５、主として三量体、四量体、及び五量体の混合物であり、単一で最も豊富な物質は四量体である、Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸オリゴマーの混合物であることが示された。生成混合物は１等量の水酸化ナトリウムに可溶であった。
【０１２７】
実施例２
（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸のオリゴマーのアセトアセチルエステルの調製
実施例１の無色オイル化合物の残りのバッチ（４．５ｇ）をジケテン（３．８ｇ）及び酢酸ナトリウム（０．０４５ｇ）とともに窒素下で１時間６０℃で加熱した。ジケテン（３．８ｇ）をさらに加え反応をさらに１時間加熱し、冷却、エーテルで希釈し、水で洗い、その後飽和重炭酸ナトリウム（５ｘ１００ｍｌ）で抽出した。合わせた抽出液をエーテルで洗い、濃塩酸（滴加）で酸性にした。酢酸エチル抽出（３ｘ５０ｍｌ）の後、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧溜去した。黄色い個体／オイルの混合物（７．６ｇ）が得られ、ジクロロメタン／メタノール（９８：２）を用いてシリカカラムでクロマトグラフすると淡琥珀色オイル生成物が得られた。先に流出する不純物が単離され（１．６ｇ）、四塩化炭素／メタノール（９９：１）で再カラムすると０．８ｇのオイルが回収され、ＮＭＲとマススペクトリメトリーで、Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸のアセトアセチル化されたオリゴマーの目的とする混合物であることが示された。生成混合物はジクロロメタン／メタノール（９０：１）でＲｆ値０．４４であり、１等量の水酸化ナトリウムに可溶であった。実施例１および実施例２の生成物はともに、予備的ＨＰＬＣにより個々の成分を分離する事が可能である。
【０１２８】
実施例３
Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸オリゴマー及びアセト酢酸Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸オリゴマーのラットへの経口投与
血中ケトン体レベルを上昇するために経口投与されたＤ−β−ヒドロキシ酪酸および実施例１及び２のオリゴマーの能力は以下のように調べられた。ラットは一晩飢えさせ、メチルグルカミンを用いてｐＨ７．７４にした４ＭＤ−β−ヒドロキシ酪酸塩を体重１００ｇにつき１００μｌ用いて胃管栄養を施した。Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸の血中レベルはＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３１．ｐ４７８−４８２（１９８３）のＮＡＤ＋／ＥＤＴＡ分析を用いて測定された。２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（１００ｍＭ、ｐＨ９．９、０．０９４ｇ／１０ｍｌ）、ＮＡＤ＋（３０ｍＭ、０．１９９ｇ、１０ｍｌ）及びＥＤＴＡ（４ｍＭ、０．０１５ｇ／１０ｍｌ）から作られた１．０ｍｌ溶液をたくさんのキュベットのそれぞれ及び４μｌサンプルに加え、若しくはＤ−β−ヒドロキシ酪酸をコントロールとした。
【０１２９】
ラットが絶食しているとき、Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸の初期レベルは０．１ｍＭの給餌状態から上昇させた。しかし、それぞれのケースで１から３．２ｍＭの増加の範囲で、Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸の確実な血清の増加が提供された。
【０１３０】
この手順はＤ−β−ヒドロキシ酪酸オリゴマー及び実施例１及び２に記載されたそれらのアセト酢酸エステルの混合物の２Ｍ溶液で繰り返された。Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸オリゴマー（図１において１９／１）およびアセト酢酸エステル（図１において２０／４）はメチルグルカミンによってともにｐＨ７．６に調整され、血中Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸塩レベルは先に述べた分析手法を用いて観測された。血清Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸塩の増加は胃管栄養の後、６０及び１２０分で０．５から１．２ｍＭであることが示された。これらの結果は、経口投与された本発明のＤ−β−ヒドロキシ酪酸及びその代謝前駆体が、摂取後数時間の内に血中レベルを有意に上昇させる効力を示した。
【０１３１】
１９／１及び２０／４のオリゴマーエステルはモノマー自体ほどは血中ケトン体レベルを上げないが、はるかに長期間、結果として上昇させ、それ故モノマーほど頻繁に投与しないのに適していることが注目された。
【０１３２】
実施例４
【０１３３】
【表４−１】
0005800453.tif 000021
【０１３４】
【表４−２】
0005800453.tif 000022
【０１３５】
実施例５
全脳ＧＡＢＡレベルにおける血中Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸塩レベルの増加の効果
全脳ＧＡＢＡレベルにおけるＤ−β−ヒドロキシ酪酸塩の効果を調べ、血中ケトン体レベルの増加をねらったケトン体若しくは前駆体治療の抗てんかん性効果の指標を提供するために、実施例３で記載されたようにＤ−β−ヒドロキシ酪酸塩の投与後決められた時間にラットの脳全体を凍らせた。ＧＡＢＡは標準的なＨＰＬＣ技術で分析し、標準タンパク質分析を用いてタンパク質含有量に関連づけた。ｔ＝０の時ＧＡＢＡレベルは１９１ｐモル／μｇタンパク質だったが、１２０分後には４６６ｐモル／μｇタンパク質に上昇し、抗てんかん性潜在能力を示した。
【０１３６】
実施例６
方法
培養液及び化学薬品
０から４日目までに用いた血清フリー培地は５０倍に希釈したＢ２７添加物を加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を含み（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、そこに０．５ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２５μＭ  Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを加えた。４日後に、５μＭインスリン、３０ｎＭｌ−チロキシン、２０ｎＭプロゲステロン、３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２を用いた。
【０１３７】
海馬微少細胞群（ｍｉｃｒｏｉｓｌａｎｄ）培養
初代海馬培養は日齢１８日のＷｉｓｔｅｒ胚から回収し、ピペット内で穏やかに揺り動かして分散した。懸濁液を１５００ｘｇで１０分間遠心分離し、上澄み液を捨てた。新しい媒質を０．４−０．５ｘ１０６細胞／ｍｌに作成した。この懸濁液の１０μｌを、ポリＤ−リジンでコートした培養ウェルにピペットでいれ、プレートを３８℃４時間インキュベーションし、その後新しいＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を４００μｌ加えた。２日間インキュベーションした後、培地の半分を新しい培地に変え、さらに２日間インキュベーションを続けた。４日後に培地を、５μＭのインスリン、３０ｎＭｌ−チロキン、２０ｎＭプロゲステロン、３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に変えた。ウェルを４つのグループに分け、ウェルの半分にはＤ−βヒドロキシ酪酸ナトリウムが最終濃度８ｍＭになるように加え、ウェルの半分には５ｎＭアミロイドβ１−４２（Ｓｉｇｍａ）
を加えた。これらの培地は２日後に交換し（８日目）細胞を１０日目に固定化し、抗ＭＡＰ２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ  ＩＮ）でニューロンとビメンチンを視覚化し、ＧＦＡＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で膠細胞を視覚化するよう染色した。
【０１３８】
結果
細胞カウント
Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸塩を培養に加えると微少細胞群あたりの神経細胞の数が微少細胞群あたり平均３０から平均７０細胞へ増加した。５ｎＭアミロイドβ１−４２を培地に加えると、微少細胞群あたり７０から３０細胞に減少し、Ｈｏｓｈｉらによる、アミロイドβ１−４２が海馬ニューロンに対して毒性があるという以前の所見を確認した。アミロイドβ１−４２を含む培地にＤ−β−ヒドロキシ酪酸塩を加えると、細胞数が微少細胞群あたり平均３０から７０細胞へ増加した。これらのデータから、基質レベルの量のＤ−β−ヒドロキシ酪酸塩を、主な栄養分がグルコース、ピルビン酸、及びＬ−グルタミンである培地に加えると、培地における細胞死亡速度が遅くなると結論づけた。さらに、培地におけるアミロイドβ１−４２の添加によって引き起こされる海馬の細胞死の増加速度を、Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸塩により遅らせることが可能であることを結論づけた。
【０１３９】
樹状突起の成長の数と軸索の長さはともに、β１−４２の存在の有無に関わらず、Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸塩の存在下で増加することが観測された。これらは神経成長因子様作用を暗示するものである。
【図１】
0005800453.tif 000025