(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複製開始領域として配列番号１８で示される配列を含み、ｍｏｂ遺伝子群およびｏｒｉＴ配列を有さず、ベクターを安定化するｐａｒ領域として、配列番号１９で示される配列を含むＤＮＡ断片を含む組換えベクターによって、前記ｐａｒ領域の本来の宿主とは異なるＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒである宿主細菌に遺伝子導入された形質転換体。
【請求項２】
宿主細菌が、前記組換えベクターとは異なるベクターをさらに有する、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
宿主細菌が、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ−４株、又はＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株である、請求項１または２に記載の形質転換体。
【請求項４】
組換えベクターが、チオラーゼ、レダクターゼ、ポリヒドロキシ酪酸シンターゼ、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ及びアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼから成る遺伝子群より選択されるポリヒドロキシアルカノエート合成に関わる遺伝子を少なくとも１つ導入してなる請求項１〜３のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の形質転換体を培養し、該培養物からポリヒドロキシアルカノエートを抽出精製することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項６】
ポリヒドロキシアルカノエートが３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシへキサン酸のモノマーユニットで構成される共重合ポリエステルであることを特徴とする請求項５記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ベクターに関する。また、本発明はプラスミドの安定化の分野にあり、より詳細には、水素細菌であり、ＰＨＢ合成菌として知られるＲａｌｓｔｏｎｉａ属細菌、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌又はＷａｕｔｅｒｓｉａ属細菌にて安定に保持される組換えベクター、該ベクターによって形質転換された菌株、及び該菌株によるポリヒドロキシアルカノエートの商業生産に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えＤＮＡの技術を微生物による目的物質の生産に実際に適用してみると、一般に組換えプラスミドが不安定であるという問題がある。
実験室で通常用いられるクローニング及び発現ベクターは、通常マルチコピープラスミドであり、それらの後代への安定した伝達は、細胞ゲノム１つあたりに多数のプラスミドを導入することにより確保される（非特許文献１参照）。しかし、プラスミドを使用して外来遺伝子を導入すると、バクテリアの増殖サイクルの期間にプラスミドが欠失する事によって、導入した遺伝子の不安定性が生じてしまう。従って、工業的生産工程では、醗酵器内での培養が終了するまでバクテリア中のプラスミドを安定化させることが必須である。【０００３】
これまで、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ属及びＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌への遺伝子導入用プラスミドベクターとして、主にｐＪＲＤ２１５系ベクターや、ｐＢＢＲ系ベクターが使用されてきた（非特許文献２及び非特許文献３参照）。しかし、これらのプラスミドベクターは、宿主細菌がポリヒドロキシアルカノエートなどを細胞内に蓄積させた際に非常に不安定になるという事が我々の研究で明らかとなった。例えば、ｐＪＲＤ２１５系のベクターについて、ポリヒドロキシアルカノエートを多量に蓄積させない条件での培養では、抗生物質による選択圧を掛けなくとも４回植え継いだ時に約８０％の細胞がプラスミドを保持しているにも関わらず、ポリエステルを多量に蓄積させる条件での培養では、同じく４回植え継いだ時に３０％しかプラスミドを保持していない。また、ｐＢＢＲ系のベクターも同様の特徴を示す。【０００４】
これらプラスミドベクターは広域宿主用に開発された広域宿主ベクターであるが（非特許文献４及び非特許文献５参照）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌などを宿主として工業的に物質生産を行う際には、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ属及びＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌に適した遺伝子導入用プラスミドベクターを開発する事が必要である。【０００５】
これまでプラスミドを安定化させる為に様々な手法が考案されて来たが、今までＲａｌｓｔｏｎｉａ属において使用可能なプラスミドベクターは、クロラムフェニコール、カナマイシン、アンピシリンなどの薬剤耐性によってプラスミドを保持した形質転換体を選択するものしかなかった。抗生物質による選択圧をかけて培養を行うと、（１）抗生物質耐性菌株の使用は、環境に対して危険を呈する可能性がある、（２）培養中に必要な抗生物質の量は生産コストを有意に増加させる、（３）抗生物質は、ヒト及び動物の治療で用いられる物質の生産においては望ましくない、という問題があり、薬剤耐性によってプラスミドを保持した形質転換体は、工業生産には適用できない。【０００６】
プラスミドを安定に保持させるシステムとしては、抗生物質により選択圧をかける方法の他にｐａｒシステムが知られている（非特許文献６、７参照）。ｐａｒシステムが働くと、複製したプラスミドが娘細胞に分配される為、抗生物質耐性による選択圧を掛けなくても安定にプラスミドを保持した菌株が得られる。これまでに大腸菌にて使用可能なＲＰ４プラスミドのｐａｒシステムを組み込んだベクター（特許文献１参照）や、Ｒ１プラスミドのｐａｒ領域を使用したベクター（特許文献２参照）が開発されている。また、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ  ＣＨ３４株が保有するメガプラスミドｐＭＯＬ２８のｐａｒ領域には、プロモーターであるｐａｒＰ、プラスミドの安定化因子であるｐａｒＡ２８、ｐａｒＢ２８及び認識配列ｐａｒＳが存在する事が知られており、これらの遺伝子は、プラスミドｐＳＵＰ２０２中に既にクローン化されており、そのヌクレオチド配列はすでに公表されている（非特許文献８参照）。【０００７】
前述したように、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属細菌、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ属細菌、特にＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒはしばしばポリヒドロキシアルカノエート生産やタンパク質生産菌として使用されており(非特許文献９参照)、これらの細菌で特に使用可能であり、接合伝達性が無く、かつ抗生物質による選択圧をかけなくても安定に保持されるプラスミドベクターを開発することが求められている。しかしながら、前述したようなｐａｒ領域の利用によるプラスミドの安定化は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属細菌、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ属細菌に関しては行われておらず、これまでそのシステム構築やシステムが実際にプラスミドの安定化に有効に働くかは分かっていない。
【特許文献１】米国特許第６１４３５１８号明細書
【特許文献２】米国特許第４７６００２２号明細書
【非特許文献１】Ｊｏｎｅｓ  ＩＭ等、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．  １８０（３）：５７９‐８４．（１９８０）
【非特許文献２】Ｔ．Ｆｕｋｕｉ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．１１，Ｎｏｖ  １９９７：１０９３−９７
【非特許文献３】ＳＴＥＶＥＮ  ＳＬＡＴＥＲ等、ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，Ａｐｒ．１９９８：１９７９−１９８７
【非特許文献４】Ｌｕａｎ  Ｔａｏ等、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏｌｕｍｅ  ７，Ｉｓｓｕｅ  １、Ｊａｎｕａｒｙ  ２００５：１０−１７
【非特許文献５】Ｄａｖｉｓｏｎ  Ｊ等、Ｇｅｎｅ．１９８７；５１（２−３）：２７５−８０．
【非特許文献６】Ｍ．Ｇｅｒｌｉｔｚ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、Ｎｏｖ：６１９４−６２０３（１９９０）
【非特許文献７】Ｂ．Ｙｏｕｎｇｒｅｎ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、Ｊｕｌｙ：３９２４−３９２８（２０００）
【非特許文献８】Ｓａｆｉｅｈ  Ｔａｇｈａｖｉ等、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ、２５０：１６９−１７９（１９９６）
【非特許文献９】Ｇｒａｖｉｎ  Ｃ．等、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＆  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｄｅｃ；３８（２）：６４−７１（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、新規ベクターを開発する事を目的とする。好ましくは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属又はＷａｕｔｅｒｓｉａ属の細菌を宿主として使用可能であり、抗生物質による選択圧がなくても細菌中に安定に保持されるベクターを開発する事を目的とする。また、その形質転換体が、ポリヒドロキシアルカノエートを生産し、さらにはその生産性を安定化することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
目的とするＲａｌｓｔｏｎｉａ属細菌等の形質転換に用い得るベクターを作製する為には、宿主細菌にてベクターを複製するためのＤＮＡ配列（ｏｒｉ）が必須である事から、本発明では、まずＲａｌｓｔｏｎｉａ属細菌等にて機能するＤＮＡ複製開始領域（ｏｒｉ）を含有したベクターを開発する事で、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ属細菌を宿主として使用可能な新規ベクターを作製することができるのではないかと考えた。また、工業生産規模での物質生産に使用するためのベクターとしては、宿主細菌内部でベクターが複製されるだけではなく、１）簡便に扱えるためのＤＮＡ塩基対数、２）形質転換体を選択するための薬剤耐性遺伝子、３）接合伝達性がない、等の種々の特徴を備えていることが必須である。
更に、ベクターを安定化させる手段として、抗生物質を添加しなくても良い、宿主細菌の染色体に変異を入れる必要がない等の理由から、前述したｐａｒシステムが非常に有効であると考えられる。しかし、上述したメガプラスミドｐＭＯＬ２８は、ｐａｒシステムを保有しているため宿主細菌にて安定に保持されるが、２８０ｋと非常に塩基対数が多く、薬剤耐性遺伝子も保有していないため、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属細菌、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌及びＷａｕｔｅｒｓｉａ属細菌用のベクターとしては使えないと考えられていた。【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ  ＣＨ３４株が有するメガプラスミドｐＭＯＬ２８の複製開始領域およびｐａｒシステムを、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ  ＣＨ３４株とは異なる宿主、例えばＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ（旧名：Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、或いはＷａｕｔｅｒｓｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）にて機能させたら、抗生物質耐性による選択圧を掛けなくてもプラスミドが安定に保持されることを見出し、新規のプラスミドベクターを開発する事ができた。【００１１】
即ち、第一の本発明は、配列番号１８で示される配列を含み、かつＲａｌｓｔｏｎｉａ属細菌、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌又はＷａｕｔｅｒｓｉａ属細菌を宿主として機能する複製開始領域を導入してなる組換えベクターに関する。好ましくは、ｍｏｂ遺伝子群およびｏｒｉＴ配列を有さない、すなわち接合伝達性を有さない組換えベクターであり、より好ましくは、プラスミドを安定化する機構であるｐａｒシステムとして機能するＤＮＡ領域であるｐａｒ領域を導入してなる組換えベクターであり、更に好ましくは、ｐａｒ領域として配列番号１９で示されるＤＮＡ断片を含有する組換えベクター、特に好ましくは、上記組換えベクターに３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）の供給系であるチオラーゼ、レダクターゼ、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）合成酵素であるＰＨＢシンターゼ、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素であるＰＨＡシンターゼ、β酸化経路の酵素であるアシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ及びアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼから成る遺伝子群より選択されるＰＨＡ合成に関わる遺伝子を少なくとも１つ導入してなる組換えベクターに関する。
第二の本発明は、上記した組換えベクターによって宿主細菌に遺伝子導入された形質転換体であり、好ましくは宿主細菌がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒである形質転換体に関する。
第三の本発明は、上記形質転換体を培養し、該培養物からのＰＨＡの製造方法に関する。【００１２】
以下に本発明を詳細に説明する。
第一の本発明の組換えベクターは、配列番号１８で示される配列を含み、かつＲａｌｓｔｏｎｉａ属細菌、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌又はＷａｕｔｅｒｓｉａ属細菌を宿主として機能する複製開始領域を導入してなるものである。
上記複製開始領域とは、組換えベクターを複製する複製起点として機能する配列である。配列番号１８で示される配列は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ  ＣＨ３４株が保有するメガプラスミドｐＭＯＬ２８中の、配列番号７で示される複製開始領域（ｏｒｉ領域）の一部である。本発明でベクターに導入する複製開始領域は、配列番号１８の配列を含み、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属細菌、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌又はＷａｕｔｅｒｓｉａ属細菌を宿主として機能するものであればどのようなものを用いてもよい。上記複製開始領域としては、配列番号７で示される配列を用いてもよい。【００１３】
本発明の組換えベクターは、ｍｏｂ遺伝子群およびｏｒｉＴ配列を有さない方が好ましい。当該ベクターがｍｏｂ遺伝子群やｏｒｉＴ配列を有すると、他の微生物と接触した際、接合伝達が生じる可能性があり、組換え体の封じ込めといった安全面での課題を有してしまう為である。ここで、ｍｏｂ遺伝子群とはＤＮＡを運ぶ機能をコードする遺伝子群の事であり、ｍｏｂ遺伝子群がコードするタンパク質はｏｒｉＴ配列にニックを入れる機能、さらに一本鎖となったＤＮＡを安定に運ぶ機能を有する。ｏｒｉＴ配列とは、ニックサイトとニックが入るための認識配列のことである。【００１４】
また、本発明の組換えベクターは、ｐａｒシステムとして機能する、ベクターを安定化する領域（ｐａｒ領域）を導入してなるものが好ましい。前記ｐａｒ領域としては、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属細菌、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌又はＷａｕｔｅｒｓｉａ属細菌にて機能するｐａｒシステムであればどの様な配列であってもかまわないが、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属細菌、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌又はＷａｕｔｅｒｓｉａ属細菌が保有するプラスミド中のｐａｒ領域が好ましく、メガプラスミド中のｐａｒ領域がより好ましい。本発明においては、配列番号１９で示される配列を含むＤＮＡ断片を用いることが特に好ましい。上記配列番号１９で示される配列は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ  ＣＨ３４株が保有するメガプラスミドｐＭＯＬ２８中の、配列番号８で示されるｐａｒ領域の一部であり、ｐａｒＡ遺伝子、ｐａｒＢ遺伝子及び認識配列ｐａｒＳを含んでいる。【００１５】
配列番号１９で示される配列は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ  ＣＨ３４株が保有するメガプラスミドｐＭＯＬ２８中のｐａｒ領域の一部であるので、この配列を含むＤＮＡ断片をｐａｒシステムとして機能させるには、配列番号１９で示される配列の他に、プロモーターやターミネーターを含む必要がある。
上記プロモーターとしては、上記メガプラスミドｐＭＯＬ２８中のｐａｒＰを用いてもよいし、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属細菌、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌又はＷａｕｔｅｒｓｉａ属細菌を宿主として機能すれば、他の生物由来のプロモーターを用いることもできる。メガプラスミドｐＭＯＬ２８中のプロモーターｐａｒＰは、配列番号８の２３８８番目から２８４８番目の塩基配列にほぼ相当する。
上記ターミネーターとしては、上記メガプラスミドｐＭＯＬ２８中のターミネーターを用いてもよいし、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属細菌、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌又はＷａｕｔｅｒｓｉａ属細菌を宿主として機能すれば、他の生物由来のターミネーターを用いることもできる。メガプラスミドｐＭＯＬ２８中のターミネーターは、配列番号８の６１番目から２０２番目の塩基配列中に含まれる。
本発明の組換えベクターに導入するｐａｒ領域としては、配列番号８で示される配列を用いてもよい。【００１６】
また、本発明の組換えベクターは、ＰＨＡ合成に関わる遺伝子を少なくとも１つ導入してなることが好ましい。そうすれば、該組換えベクターの形質転換体は、全遺伝子が有効に働けば、ＰＨＡをより効率的に合成することができる。そしてこのＰＨＡを合成することができる形質転換体は、多コピー型のプラスミドとは異なって、安定的にプラスミドが複製するので、宿主にＰＨＡ合成に関わる遺伝子を安定に供給する事が可能であり、商業的に有意な量のＰＨＡを蓄積することができる。【００１７】
前記ＰＨＡ合成に関わる遺伝子としては、３ＨＢの供給系であるチオラーゼ、レダクターゼ、ＰＨＢ合成酵素であるＰＨＢシンターゼ、ＰＨＡ合成酵素であるＰＨＡシンターゼ、β酸化の酵素であるアシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ等が挙げられ、それらの群より選択される少なくとも１つが導入されてなる組換えベクターが好ましい。チオラーゼとしては、β−ケトチオラーゼ等が挙げられ、レダクターゼとしては、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ等が挙げられ、ＰＨＡシンターゼとしては、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＡシンターゼ変異体遺伝子であるＮ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体等が挙げられ、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼとしては、３−ヒドロキシアシルＡＣＰ−ＣｏＡトランスフェラーゼ等が挙げられる。
なお、本発明の組換えベクターにＰＨＡ合成に関わる遺伝子を導入する場合、あらかじめベクターに制限酵素サイトを導入しておくと、当該遺伝子を導入しやすくなる。【００１８】
更に、本発明の組換えベクターは、選択マーカーを含有するものが好ましい。本発明では、組換えベクターにｐａｒ領域を導入するとベクターの安定性に優れるため、抗生物質等による選択圧は必要ないが、後述のように、本発明の組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換する際、組換え株の選択にこの選択マーカーを用いることができる。
選択マーカーとしては特に限定されず、例えば、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質耐性遺伝子等が挙げられる。本発明の組換えベクターにおいて、上記選択マーカーとしては、配列番号１４で示されるカナマイシン耐性遺伝子が好ましい。【００１９】
本発明の組換えベクターは、また、上述の遺伝子を導入して得られた組換えベクターを小型化してもよい。
組換えベクターを小型化するには、複製開始領域、ｐａｒ領域、選択マーカー及びＰＨＡ合成酵素遺伝子の発現に不要な部分を欠失させることにより行える。例えば、本発明の組換えベクターは、ｍｏｂ遺伝子群およびｏｒｉＴ配列を有さない方が好ましいので、これらの遺伝子群や配列を欠失させて小型化することができる。本発明の組換えベクターは、小型化することにより、宿主に導入する際、形質転換率を向上させることができる。【００２０】
本発明の組換えベクターは、配列番号１８で示される配列を含み、かつＲａｌｓｔｏｎｉａ属細菌、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌又はＷａｕｔｅｒｓｉａ属細菌を宿主として機能する複製開始領域、及び、配列番号１４で示されるカナマイシン耐性遺伝子を含有することが更に好ましい。
本発明の組換えベクターは、メガプラスミドに由来する複製開始領域を含有することで、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ以外の宿主においても機能することができる組換えベクターとなる。【００２１】
本発明の組換えベクター作製に用いるベクターとしては特に限定されず、各種のプラスミドやファージ等を用いることができるが、得られる組換えベクターを大腸菌とのシャトルベクターとすることが可能であることから、大腸菌由来のプラスミドを用いることが好ましい。【００２２】
本発明の組換えベクターの作製は、特に限定されず、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属細菌、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌又はＷａｕｔｅｒｓｉａ属細菌にて機能する複製開始領域、並びに、必要に応じて抗生物質耐性能力付与遺伝子等の選択マーカー（カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン耐性付与遺伝子等）、組換えベクターを安定化するｐａｒシステムとして機能するｐａｒ領域を組み込む事で、どの様なプラスミドベクターからでも製作ができる。【００２３】
第二の本発明の形質転換体は、上記の組換えベクターによって形質転換されたものである。つまり、本発明の形質転換体は、上記で得られた組換えベクターを、当該ベクターに適合する宿主細菌中に導入することにより得られる。【００２４】
本発明における宿主としては、上記組換えベクターを用いて形質転換できれば特に制限はないが、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ以外の、天然から単離された微生物や、菌株の寄託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣなど）に寄託されている微生物等を使用できる。具体的にはラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等の細菌類を使用することができる。安全性及び生産性の観点から、好ましくはラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属であり、さらに好ましくはＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒである。このＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒは、分類学上、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａと同一である〔Ｖａｎｅｅｃｈｏｕｔｔｅ  Ｍ  等、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｅｖｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｍａｒ、５４（Ｐｔ２）：３１７−３２７（２００４）、Ｖａｄａｍｍｅ  Ｐ  等、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｅｖｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、ＮｏＶ、５４（Ｐｔ６）：２２８５−２５８９（２００４）〕。【００２５】
本発明の形質転換体は、上記組換えベクターにより、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ  ＣＨ３４株が保有するメガプラスミドｐＭＯＬ２８のｏｒｉ領域やｐａｒ領域の一部が導入される。通常、メガプラスミドを有する微生物に、当該メガプラスミドに由来する遺伝子を導入すると、相同的組換えが生じたり、同じ遺伝子を有するプラスミドが導入されるのを拒絶したりすることから、その微生物が有するメガプラスミド中の遺伝子を更に導入することは困難である。しかしながら、本発明では、上記組換えベクターを用いてＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ以外の宿主に形質転換を行うと、宿主が元来有するメガプラスミド中の複製開始領域と当該組換えベクターにより導入された複製開始領域等が競合することなく、両者が有する複製能や安定性の効果が相乗して、非常に高い複製能や安定性が発現すると考えられる。【００２６】
本発明の形質転換体の作製方法は特に限定されず、宿主細菌への組換えベクターの導入は、公知の方法により行うことができる。例えば、エレクトロポレーション法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、１．８．４頁、１９９４年）や、カルシウム法（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ．Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１９．１０７２（１９７４））などを用いることができる。形質転換体の選択には、カナマイシン耐性の表現系等の選択マーカーを用いることができる。なお、本発明では、宿主としてＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ以外の微生物を用いるため、あらかじめ宿主のメガプラスミドを除去する操作は不要である。【００２７】
次に、第三の本発明のＰＨＡの製造方法について説明する。
本発明におけるＰＨＡは以下の一般式（１）で表される。【００２８】
【化１】
0005650368.tif 000002
【００２９】
（式中のＲは炭素数１〜１３のアルキル基、ｍは２以上の整数を表す。ｍ個のＲは同一であってもよいし、異なっていてもよい。）
上記ＰＨＡとしては、一般式（２）【００３０】
【化２】
0005650368.tif 000003
【００３１】
（式中、ｎ、ｐは１以上の整数を表す）で示される、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシへキサン酸のモノマーユニットで構成される共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が好ましい。【００３２】
本発明のＰＨＡの製造方法は、上記形質転換体を培養し、該培養物からＰＨＡを抽出精製することからなる。その方法は特に限定するわけではないが、以下のようにして行う事ができる。
ポリヒドロキシアルカノエートの生産においては、糖、油脂または脂肪酸を炭素源として与え、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を含む培地を用いて、上記形質転換体を培養することができる。例えば、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地として、微生物が資化し得る炭素源を与え、場合によっては、窒素源、無機塩類および有機栄養源のうちのいずれかを制限した培地、例えば窒素源を０．０１から０．１％に制限した培地等を用いることができる。【００３３】
糖としては、例えばグルコース、フラクトース等の炭水化物が挙げられる。油脂としては、炭素数が１０以上である飽和・不飽和脂肪酸を多く含む油脂、例えばヤシ油、パーム油、パーム核油等が挙げられる。脂肪酸としては、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸等の飽和・不飽和脂肪酸、あるいはこれら脂肪酸のエステルや塩等の脂肪酸誘導体が挙げられる。【００３４】
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。そのほかの有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。また、培養液中に、発現ベクターに存在する薬剤耐性遺伝子に対応する抗生物質（カナマイシン等）を添加しても良い。【００３５】
培養温度は、その菌が生育可能な温度であればよいが、２０℃から４０℃が好ましい。培養時間は、特に制限はないが、１から１０日間程度で良い。その後、得られた該培養菌体からＰＨＡを回収すればよい。【００３６】
本発明において、菌体からのＰＨＡの回収は、例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離器等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出する。このＰＨＡを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収する。【００３７】
得られたＰＨＡの重量平均分子量（Ｍｗ）や３ＨＨ組成（ｍｏｌ％）の分析は、例えば、ガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等により行うことができる。あるいは、ＰＨＡ生産確認の簡易法としては、Ｎｉｌｅｒｅｄを用いた染色法を利用できる。すなわち、組換え菌が生育する寒天培地にＮｉｌｅｒｅｄを加え、組換え菌を１〜７日間培養し、組換え菌が赤変するか否かを観察することにより、ポリエステル生産の有無を確認できる。
【発明の効果】
【００３８】
本発明の組換えベクターは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ属の細菌を宿主として使用可能であり、なかでもｍｏｂ遺伝子群およびｏｒｉＴ配列を有さないものは接合伝達性がなく、更にｐａｒ領域を導入したのものは、細菌中にて抗生物質による選択圧がなくても安定に保持される。また、その形質転換体が、ＰＨＡを安定的に生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお全体的な遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８９））に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。
また、以下の実施例では大腸菌由来のプラスミドを用いており、このプラスミドは配列番号１４で示されるカナマイシン耐性遺伝子を含有している。【００４０】
（実施例１）プラスミドベクターｐＣＵＰの作製
本実施例において複製開始領域及びｐａｒ領域を導入するプラスミドベクターとしては、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属細菌にて使用可能なものであれば特に制限はない。本実施例にて作製したプラスミドベクターは、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ  ＣＨ３４株が保有するメガプラスミド（ｐＭＯＬ２８）の複製開始領域（配列番号７）及び配列番号８に記載のｐａｒ領域を用いている。
具体的な作製手順としては、まず、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ  ＣＨ３４株からＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用し、メガプラスミドを含むＤＮＡを調製、このＤＮＡを鋳型に、配列番号１及び２に記載のプライマーを用いてＰＣＲ法によって約４ｋｂｐの配列番号７及び８の配列を含むＤＮＡ領域を増幅した。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で３０秒、（３）５５℃で３０秒、（４）７２℃で５分、（２）から（４）を３０サイクル、（５）７２℃で５分であり、ポリメラーゼとしてはＴａＫａＲａ  Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いた。増幅断片を大腸菌用のクローニングベクターＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔ２−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。
次に、配列番号３及び４に記載のプライマーを用いてＰＣＲ法によってＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔ２−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）ベクターの２０６１ｂｐ−２７０２ｂｐ領域の両端より外側に向かって増幅反応を行い、ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））によって繋ぐ事により６４１ｂｐを欠失させた図１によって示されるベクターｐＣＵＰを作製した。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で３０秒、（３）５５℃で３０秒、（４）７２℃で７分、（２）から（４）を３０サイクル、（５）７２℃で７分であり、ポリメラーゼとしてはＴａＫａＲａ  Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いた。【００４１】
（実施例２）プラスミドベクターｐＣＵＰ２の作製
本発明のプラスミドベクターに遺伝子導入をしやすくするため、さらに実施例１で得られたｐＣＵＰに制限酵素ＭｕｎＩサイトを導入した。具体的な作製手順としては、まず配列番号５及び６に記載のプライマーを用いてＰＣＲ法によって実施例１にて作製したｐＣＵＰを鋳型にしてＰＣＲを行い、増幅断片をＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））によって繋ぐ事により、ＭｕｎＩサイトを導入し、図２に示されるｐＣＵＰ２を作製した。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で３０秒、（３）５５℃で３０秒、（４）７２℃で５分、（２）から（４）を３０サイクル、である。ポリメラーゼとしてはＴａＫａＲａ  Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いた。
このようにして、配列番号１８で示されるＤＮＡ領域及び配列番号１９で示されるＤＮＡ領域を含有し、ｍｏｂ遺伝子群及びｏｒｉＴ配列など接合伝達に関与する遺伝子を含有しないプラスミドベクターを作製した。【００４２】
（実施例３）プラスミドベクターｐＣＵＰ２を用いた形質転換体の作製
エレクトロポレーション法による形質転換は、次のように実施した。エレクトロポレーションに使用する遺伝子導入装置としてはＢｉｏｒａｄ社製のジーンパルサーを用い、キュベットは同じくＢｉｏｒａｄ社製のｇａｐ０．２ｃｍのものを用いた。キュベットに、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株のコンピテント細胞４００μｌとプラスミドｐＣＵＰ２調製液５μｌを注入してパルス装置にセットし、静電容量２５μＦ、電圧１．５ｋＶ、抵抗値８００Ωの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベット内の菌液をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ社製）で３０℃、３時間振とう培養し、選択プレート（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ）で、３０℃にて２日間培養して、形質転換体を取得した。【００４３】
（比較例１）プラスミドベクターｐＪＲＤ２１５を用いた形質転換体の作製
プラスミドとして、配列番号１８の配列やｐａｒ領域を有さないｐＪＲＤ２１５を用いた以外は、実施例３と同様にしてプラスミドベクターｐＪＲＤ２１５を用いた形質転換体を取得した。【００４４】
（実施例４）プラスミドベクターｐＣＵＰ２を用いた形質転換体の保持率
実施例３で得られた形質転換体のプラスミドの保持率を試験した。試験は１ｗ／ｖ％  Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％  Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２ｗ／ｖ％  Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＰＯ４／１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．８から成るカナマイシン添加（５０ｍｇ／Ｌ）のＭＢ＋肉培地にて、実施例３で得たプラスミドベクターｐＣＵＰ２を用いた形質転換体を２４時間培養した培養液を、１．１ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、１．２９ｗ／ｖ％  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％  ＭｇＳＯ４／７Ｈ２Ｏ、２．５ｗ／ｖ％  パームＷオレイン油、０．５ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）からなるカナマイシン無添加のＭＢ＋油培地に１％（ｖ／ｖ）にて植え換え、２４時間振とう培養した。この培養を２４時間毎に３回継代し、４回目の培養の２４時間時にプラスミドの保持率を下記のように測定した。
まず、培養液を滅菌水によって１０の８乗分の１に希釈し、カナマイシン無添加のプレート（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製））に１０から１００μｌ蒔き、得られたコロニーをさらにカナマイシン添加（１００ｍｇ／Ｌ）の選択プレート（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製））にランダムに１００コロニーレプリカし、生育してきたコロニーの数を数えた。プラスミドを保持している細菌のみがプレート上にコロニーを形成する事ができる事から得られた薬剤耐性コロニーの数を安定性とした。結果を表１に示す。【００４５】
（比較例２）プラスミドベクターｐＪＲＤ２１５を用いた形質転換体の保持率
形質転換体として実施例３で得たプラスミドベクターｐＣＵＰ２を用いた形質転換体の代わりに、比較例１で得た形質転換体を用いた以外は、実施例４と同様にしてプラスミドの保持率を試験した。結果を表１に示す。【００４６】
【表１】
0005650368.tif 000004
【００４７】
（実施例５）ＰＨＡ合成遺伝子導入プラスミドベクターの作製
実施例２で得たプラスミドベクター（ｐＣＵＰ２）に、ＥｃｏＲＩ処理によって調製した配列番号１３で示すＡｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＡシンターゼ変異体遺伝子であるＮ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体をｐＣＵＰ２の制限酵素ＭｕｎＩ部位に組み込んだ発現プラスミドベクター（ｐＣＵＰ２ＥＥＡＣＰ１４９ＮＳ／１７１ＤＧ）を作製した（図３）。
Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＡシンターゼ変異体遺伝子であるＮ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体は、次のように作製した。まず、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）（東洋紡社製）をＰｓｔＩ処理し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いて平滑末端化しライゲーションすることによりＰｓｔＩサイトを欠失したプラスミドｐＢｌｕｅ−Ｎｅｗを作製した。このプラスミドのＥｃｏＲＩサイトにｐＪＲＤ２１５−ＥＥ３２ｄ１３（特開平５−９３０４９号公報）より同酵素で切り出したｄ１３断片をクローニングした（ｐＢｌｕｅ−ｄ１３）。次に、クローンＥ２−５０由来のプラスミド（Ｋｉｃｈｉｓｅ等、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６８：２４１１−２４１９（２００２））を鋳型とし、配列番号９及び１０に記載のプライマーのセット、及び、配列番号１１及び１２に記載のプライマーのセットを用いてそれぞれＰＣＲ法により増幅、２断片を得た。その条件は（１）９４℃で２分、（２）９４℃で３０秒、（３）５５℃で３０秒、（４）７２℃で２分、（２）から（４）を２５サイクル、（５）７２℃で５分である。増幅された２断片を等モル混合し再びＰＣＲ反応を行い２断片を結合させた。その条件は（１）９６℃で５分、（２）９５℃で２分、（３）７２℃で１分、（２）から（３）を１２サイクルであり、ポリメラーゼとしてはＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ製）を用いた。目的サイズのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動ゲルより切り出しＰｓｔＩとＸｈｏＩで処理し、同酵素で処理したｐＢｌｕｅ−ｄ１３に断片を入れ替える形でクローニングした（ｐＢｌｕｅ−Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ）。塩基配列決定を、ＰＥＲＩＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行い、ＰＨＡ合成酵素の１４９番目のアミノ酸であるアスパラギンがセリンに、１７１番目のアミノ酸であるアスパラギン酸がグリシンに置換された変異遺伝子であることを確認した。
以上のように調製したｐＢｌｕｅ−Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇを制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し、制限酵素ＭｕｎＩで処理したｐＣＵＰ２とをＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ、東洋紡社製）によって繋ぐ事で、ＰＨＡ合成酵素を含有したプラスミドベクターｐＣＵＰ２ＥＥＡＣＰ１４９ＮＳ／１７１ＤＧを作製した。【００４８】
（実施例６）エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子導入プラスミドベクターの作製
実施例２で得たプラスミドベクター（ｐＣＵＰ２）に、ＥｃｏＲＩ処理によって調製した配列番号１７で示すＡｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ由来のエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子をｐＣＵＰ２の制限酵素ＭｕｎＩ部位に組み込んだ発現プラスミドベクター（ｐＣＵＰ２ＥＥｐｈａＪ）を作製した（図４）。このベクターは次のようにして作製した。
まず、本発明で使用するエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を含有しているｐＪＲＤ２１５−ＥＥ３２（特開平５−９３０４９号公報）を鋳型に配列番号１５及び１６に記載のプライマーセットを用いてＰＣＲ法によって増幅、配列番号１７に記載のエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を含む増幅断片を得た。その条件は（１）９４℃で２分、（２）９８℃で１０秒、（３）６０℃で１０秒、（４）６８℃で１分、（２）から（４）を３０サイクル、（５）６８℃で３分である。ポリメラーゼとしてはＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を使用した。次にこの増幅断片をＢｇｌＩＩ及びＡｆｌＩＩによって処理し、同じくＢｇｌＩＩ及びＡｆｌＩＩで処理した後、アルカリホスファターゼ処理を行いＤＮＡを脱リン酸化処理したｐＪＲＤ２１５−ＥＥ３２ｄ１３とライゲーション処理を行い、ｐＪＲＤ２１５−ＥＥ３２ｄ１３のＢｇｌＩＩとＡｆｌＩＩの間のＤＮＡ断片と入れ替える形でクローニングを行った（ｐＪＲＤ２１５−ＥＥｐｈａＪ）。ライゲーションにはＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を用いた。この様にして作製したｐＪＲＤ２１５−ＥＥｐｈａＪからＥｃｏＲＩにてエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を調整し、ＭｕｎＩ処理したｐＣＵＰ２とライゲーションを行う事で、ｐＣＵＰ２ＥＥｐｈａＪ（図４）を作製した。ライゲーションにはＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を使用した。【００４９】
（実施例７）ＰＨＡ合成遺伝子導入プラスミドベクターを用いた形質転換体の作製
プラスミドｐＣＵＰ２調製液の代わりに、実施例５で得たＰＨＡ合成遺伝子導入プラスミドベクター調製液（ｐＣＵＰ２ＥＥＡＣＰ１４９ＮＳ／１７１ＤＧ）を用いた以外は、実施例３と同様にして、ＰＨＡ合成遺伝子導入プラスミドベクターを用いた形質転換体を作製した。形質転換にはＰＨＡ合成不能株であるＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ−４株（Ｔｓｕｇｅ  Ｔ等、Ｍａｃｒｏｍｏｌ  Ｂｉｏｓｃｉ、Ｏｃｔ  ２０；４（１０）：９６３−７０．（２００４））を用いた。【００５０】
（実施例８）エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子導入プラスミドベクターを用いた形質転換体の作製
プラスミドｐＣＵＰ２調製液の代わりに、実施例６で得たエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子導入プラスミドベクター（ｐＣＵＰ２ＥＥｐｈａＪ）調製液を用いた以外は実施例３と同様にして、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子導入プラスミドベクターを用いた形質転換体を作製した。形質転換にはＰＨＡ合成不能株であるＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ−４株を用いた。【００５１】
（実施例９）プラスミドベクターｐＣＵＰ２ＥＥＡＣＰ１４９ＮＳ／１７１ＤＧを用いた形質転換体の保持率
形質転換体として、実施例３で得たプラスミドベクターｐＣＵＰ２を用いた形質転換体の代わりに、実施例７で得た形質転換体を用いた以外は、実施例４と同様にしてプラスミドの保持率を試験した。結果を表２に示す。【００５２】
【表２】
0005650368.tif 000005
【００５３】
（実施例１０）プラスミドベクターｐＣＵＰ２ＥＥｐｈａＪを用いた形質転換体の保持率
形質転換体として、実施例３で得たプラスミドベクターｐＣＵＰ２を用いた形質転換体の代わりに、実施例８で得た形質転換体を用いた以外は、実施例４と同様にしてプラスミドの保持率を試験した。結果を表２に示す。【００５４】
（比較例３）Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  Ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ−４株を宿主としたプラスミドベクターｐＪＲＤ２１５を用いた形質転換体の作製
プラスミドとして配列番号１８の配列やｐａｒ領域を有さないｐＪＲＤ２１５を用い、宿主としてＲａｌｓｔｏｎｉａ  Ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ−４株を用いた以外は、実施例３と同様にしてプラスミドベクターｐＪＲＤ２１５を用いた形質転換体を取得した。【００５５】
（比較例４）Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  Ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ−４株を宿主としたプラスミドベクターｐＪＲＤ２１５を用いた形質転換体の保持率
形質転換体として、実施例３で得たプラスミドベクターｐＣＵＰ２を用いた形質転換体の代わりに、比較例３で得た形質転換体を用いた以外は、実施例４と同様にしてプラスミドの保持率を試験した。結果を表２に示す。【００５６】
（実施例１１）実施例７で得た形質転換体におけるポリエステル生産
実施例７で得られた形質転換体を、Ｎｉｌｅｒｅｄ含有培地（リン酸水素２ナトリウム・１２水塩  ９ｇ、リン酸２水素カリウム  １．５ｇ、塩化アンモニウム  ０．０５ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩  ０．０２ｇ、フルクトース  ０．５ｇ、塩化コバルト・６水塩  ０．２５ｐｐｍ、塩化鉄（ＩＩＩ）・６水塩  １６ｐｐｍ、塩化カルシウム・２水塩  １０．３ｐｐｍ、塩化ニッケル・６水塩  ０．１２ｐｐｍ、硫酸銅・５水塩  ０．１６ｐｐｍ、Ｎｉｌｅｒｅｄ  ０．５ｍｇ、寒天１５ｇ／Ｌ）に播種し、３０℃で２日培養した。その結果、コロニーが赤変したことから菌体内にポリエステルが蓄積していることを確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明のプラスミドベクターは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ属の細菌を宿主として使用可能であり、なかでもｍｏｂ遺伝子群およびｏｒｉＴ配列を有さないものは接合伝達性がなく、更にｐａｒ領域を導入したのものは、細菌中にて抗生物質による選択圧がなくても安定に保持される。また、その形質転換体が、ＰＨＡを安定的に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ｐＣＵＰの遺伝子及び制限酵素地図。
【図２】ｐＣＵＰ２の遺伝子及び制限酵素地図。
【図３】ｐＣＵＰ２ＥＥＡＣＰ１４９ＮＳ／１７１ＤＧの遺伝子及び制限酵素地図。
【図４】ｐＣＵＰ２ＥＥｐｈａＪの遺伝子及び制限酵素地図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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