(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粉末状のメソ多孔性シリカを電極に電着することによって、前記電極上にメソ多孔性シリカ層を形成するシリカ層形成工程と、
前記シリカ層形成工程により形成された前記メソ多孔性シリカ層の細孔の内部に酵素を固定する酵素固定工程と、を有し、
前記酵素固定工程では、真空吸引することによって、前記シリカ層形成工程により形成された前記メソ多孔性シリカ層の細孔の内部に酵素を導入して固定することを特徴とする酵素電極の製造方法。
【請求項２】
前記メソ多孔性シリカ層の細孔のサイズは、前記酵素のサイズの０．５〜２．０倍であることを特徴とする請求項１に記載の酵素電極の製造方法。
【請求項３】
さらに、前記メソ多孔性シリカ層の細孔の内部に、前記酵素と前記電極との間の電子移動を媒介する媒介物質を導入する媒介物質導入工程を有することを特徴とする請求項１または２に記載の酵素電極の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素電極の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、電極と、当該電極上に取り付けられたシリカ系メソ多孔体と、当該シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定された酵素と、を備え、細孔のサイズが酵素のサイズの０．５〜２．０倍である酵素電極及び当該酵素電極を用いた酵素センサが知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
この特許文献１に記載の酵素電極及び当該酵素電極を用いた酵素センサによれば、細孔のサイズが酵素のサイズの０．５〜２．０倍に設定されているため、シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に酵素をしっかりと固定できる。そのため、優れた安定性を有し、かつ、長寿命化が可能となる。
さらに、シリカ系メソ多孔体は多孔質であり比表面積が非常に大きく、また、細孔のサイズが酵素のサイズの０．５〜２．０倍に設定されているため、より大きな吸着量でより高濃度に酵素を固定できるとともに、酵素が凝集を起こして失活してしまうこと等を抑制できる。そのため、優れた感度を有する。
【０００４】
このような酵素電極が備えるシリカ系メソ多孔体（メソ多孔性シリカ）としては、製造が容易で大量生産がたやすく、実用に適している等の観点から、粉末状のメソ多孔性シリカが好ましい。
しかし、粉末状のメソ多孔性シリカは、電極上に取り付け難い。電極が微小である場合は特に取り付け難く、信頼性のある取り付けが難しいため、粉末状のメソ多孔性シリカを用いた酵素電極は小型化及び低コスト化が困難である。
【０００５】
ところで、粉末状のメソ多孔性シリカを泳動電着させることによって形成された１０μｍ〜１ｍｍの厚さのシリカ厚膜が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−２００８７号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／１１２５０５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献２に記載のシリカ厚膜には、酵素が固定されていない。また、電着によって形成されたメソ多孔性シリカの層に酵素が固定された酵素電極等も提案されていない。
【０００８】
本発明の課題は、粉末状のメソ多孔性シリカを用いた場合でも小型化及び低コスト化が容易であり、かつ、高性能な酵素電極を製造することが可能な酵素電極の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、請求項１に記載の発明は、酵素電極の製造方法において、
粉末状のメソ多孔性シリカを電極に電着することによって、前記電極上にメソ多孔性シリカ層を形成するシリカ層形成工程と、
前記シリカ層形成工程により形成された前記メソ多孔性シリカ層の細孔の内部に酵素を固定する酵素固定工程と、を有し、
前記酵素固定工程では、真空吸引することによって、前記シリカ層形成工程により形成された前記メソ多孔性シリカ層の細孔の内部に酵素を導入して固定することを特徴とする。
【００１０】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の酵素電極の製造方法において、
前記メソ多孔性シリカ層の細孔のサイズは、前記酵素のサイズの０．５〜２．０倍であることを特徴とする。
【００１２】
請求項３に記載の発明は、請求項１または２に記載の酵素電極の製造方法において、
さらに、前記メソ多孔性シリカ層の細孔の内部に、前記酵素と前記電極との間の電子移動を媒介する媒介物質を導入する媒介物質導入工程を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、メソ多孔性シリカ層は、粉末状のメソ多孔性シリカを電極に電着することによって形成されているので、メソ多孔性シリカが粉末状であり、電極が微小である場合であっても、容易に再現性よく電極上にメソ多孔性シリカ層を形成することができる。したがって、粉末状のメソ多孔性シリカを用いた場合でも、小型化及び低コスト化が容易になる。また、容易に再現性よく電極上のメソ多孔性シリカ層を形成できるため、高性能な酵素電極を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本実施形態の酵素電極及び当該酵素電極を用いた酵素センサを模式的に示す図である
【図２】本実施形態の酵素電極及び当該酵素電極を用いた酵素センサによって、電気化学的計測法により電解液中の検出対象物質（フェノール系物質）の濃度を測定する原理について説明するための図である。
【図３】メソ多孔性シリカ層を形成する際に使用する電着装置を模式的に示す図である。
【図４】実施例におけるカテコールの検出実験で得られた図である。
【図５】実施例における応答電流値のカテコール濃度依存性の評価実験で得られた図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、図を参照して、本発明の実施の形態を詳細に説明する。ただし、発明の範囲は、図示例に限定されない。
【００１７】
本実施形態の酵素電極１０は、例えば、図１に示すように、電極としての作用電極１１と、作用電極１１上に形成されたメソ多孔性シリカ層１２と、メソ多孔性シリカ層１２の細孔の内部に固定された酵素１３と、を備えて構成される。
また、メソ多孔性シリカ層１２の細孔の内部には、酵素１３の他に、電子伝達物質や補酵素などの、酵素１３と作用電極１１との間の電子移動を媒介する媒介物質が導入されている。
【００１８】
また、本実施形態の酵素センサ１００は、酵素電極１０を用いて電気化学的計測法により検出対象物質を検出するセンサである。
酵素センサ１００は、例えば、図１に示すように、検出対象物質を検出する検出部１と、検出部１が備える電極（酵素電極１０（作用電極１１）、対照電極２０及び参照電極３０）において発生した電流値を測定するためのポテンショスタット２と、などを備えて構成される。
【００１９】
検出部１は、例えば、反応器４０ａに導入された所定の電解液４０と、電解液４０内に配置された酵素電極１０（作用電極１１）、対照電極２０及び参照電極３０と、からなる。
ポテンショスタット２は、例えば、定電圧計２ａと、電流計測器２ｂと、などを有しており、検出部１が備える各電極（酵素電極１０（作用電極１１）、対照電極２０及び参照電極３０）にリード線を介して接続されている。
【００２０】
ここで、本実施形態の酵素電極１０及びそれを用いた酵素センサ１００によって、電気化学的計測法により電解液４０中の検出対象物質の濃度を測定する原理について、図２を参照して説明する。
図２には、検出対象物質が、フェノール系物質であり、酵素が、フェノール系物質に選択的に作用するラッカーゼである場合の原理が例示されている。
【００２１】
図２に示すように、まず、酸化型のラッカーゼ（Ｅox）は、選択的触媒作用により基質（すなわち、電解液４０中のフェノール系物質（ＰＣred））を酸化して、還元型のラッカーゼ（Ｅred）となる。そして、この還元型のラッカーゼ（Ｅred）は、電解液４０中の酸素と反応して酸化型のラッカーゼ（Ｅox）に戻る。また、酵素電極１０（作用電極１１）を正にして、作用電極１１と参照電極３０との間に電圧を印加することにより電解液４０に対して電圧を印加すると、酸化型のフェノール系物質（ＰＣox）はメディエータとして機能し、作用電極１１上で電子（ｅ−）を受け取って還元型のフェノール系物質（ＰＣred）に戻る。この際、作用電極１１と参照電極３０との間には、酸化型のフェノール系物質（ＰＣox）を再還元する電流が流れる。当該電流の値（応答電流値）は、電解液４０における基質の濃度に比例するため、当該電流の値を測定することにより、その測定された値から電解液４０における基質（すなわち、検出対象物質）の濃度を求めることができる。
【００２２】
（メソ多孔性シリカ層）
メソ多孔性シリカ層１２は、電着装置３００を用いて、粉末状のメソ多孔性シリカを作用電極１１に電着することによって形成される。
具体的には、電着装置３００は、例えば、図３に示すように、電着槽３０１と、電極板３０２と、直流電源３０３と、を備えて構成される。
【００２３】
電着槽３０１には、メソ多孔性シリカ分散液（アセトン水溶液等の所定の溶液に粉末状のメソ多孔性シリカを分散させたもの）が収容され、電着槽３０１の下部には、電極板３０２が配置されている。作用電極１１を、電着槽３０１に収容されたメソ多孔性シリカ分散液に浸し、電着槽３０１の下部に配置された対電極となる電極板３０２に対向するように配置する。その状態で、作用電極１１と電極板３０２との間に直流電源３０３により電圧を印加すると、作用電極１１上（作用電極１１の表面）にメソ多孔性シリカが電着されて、メソ多孔性シリカ層１２が形成される。
なお、メソ多孔性シリカ分散液には、粉末状のメソ多孔性シリカの他に、バインダー等が含有されていても良い。
【００２４】
メソ多孔性シリカ層１２を形成するメソ多孔性シリカは、粉末状であり、例えば、ケイ酸やアルミナなどの各種金属酸化物、ケイ酸と他種の金属との複合酸化物等によって構成することができる。
例えば、ケイ酸により構成されるメソ多孔性シリカの作製においては、例えば、カネマイトのような層状シリケート、アルコキシシラン、シリカゲル、水ガラス、ケイ酸ソーダ等を好ましく用いることができる。
具体的には、メソ多孔性シリカは、例えば、無機材料を界面活性剤と混合反応させて、界面活性剤のミセルの周りに無機の骨格が形成された界面活性剤／無機複合体を形成させた後、例えば、４００℃〜６００℃で焼成したり有機溶剤で抽出したりする等して界面活性剤を除去することにより作製される。これにより、メソ多孔性シリカは、無機骨格中に、界面活性剤のミセルと同じ形状のメソポア細孔を有するものとなる。
【００２５】
メソ多孔性シリカの作製において、ケイ酸等のケイ素含有化合物を出発材料とする場合には、例えば、カネマイトのような層状シリケートを形成して、この層間にミセルを挿入し、そして、ミセルが存在しない層間をシリケート分子でつなぎ、その後、ミセルを除去することによって細孔を形成することができる。
また、メソ多孔性シリカの作製において、水ガラス等のケイ素含有物質を出発材料とする場合には、例えば、ミセルの周囲にシリケート分子を集合させて重合させることによりシリカを形成し、その後、ミセルを除去することによって細孔を形成することができる。この場合、通常、ミセルの形状は柱状となり、その結果、メソ多孔性シリカに、柱状の細孔が形成されることになる。
メソ多孔性シリカは、作製段階で、界面活性剤のアルキル鎖の長さを変えてミセルの径を変化させることによって、細孔の内径を制御することができる。また、界面活性剤と併せて、トリメチルベンゼン、トリプロピルベンゼン等の比較的疎水性の分子を添加することによって、ミセルを膨潤させ、さらに大きな内径の細孔を形成することもできる。
【００２６】
メソ多孔性シリカにおける細孔の配向は、ランダムであっても、一次元シリカナノチャンネルの集合体のように方向性が制御されたものであっても良い。
メソ多孔性シリカの種類としては、細孔のサイズが均一であり、且つ、大きな空隙率を持つという特徴を有する、例えば、ＫＳＷ、ＦＳＭ、ＳＢＡ、ＭＣＭ、ＨＯＭ等の公知の種類を採用することができる。
【００２７】
メソ多孔性シリカの細孔のサイズは、当該メソ多孔性シリカにより形成されるメソ多孔性シリカ層１２に固定する酵素１３の立体構造の変化を防止可能な程度に設定されている。これにより、酵素１３の立体構造を維持することができ、メソ多孔性シリカ層１２の細孔の内部に固定された酵素１３を安定化することができる。
具体的には、メソ多孔性シリカ層１２の細孔のサイズ（すなわち、メソ多孔性シリカ層１２を形成する粉末状のメソ多孔性シリカの細孔のサイズ）は、酵素１３（酵素分子又は活性部位を含む酵素の断片）のサイズの０．５〜２．０倍程度であることが好ましく、酵素１３のサイズの０．７〜１．４倍程度であることがより好ましく、酵素１３のサイズとほぼ同等であることが最も好ましい。すなわち、メソ多孔性シリカ層１２の細孔の直径（中心細孔直径）は、酵素１３の直径の０．５〜２．０倍程度であることが好ましく、酵素１３の直径の０．７〜１．４倍程度であることがより好ましく、酵素１３の直径とほぼ同等であることが最も好ましい。なお、具体的な中心細孔直径の値は、酵素１３の直径との関係で決定されるので一律には規定できないが、例えば、１〜５０ｎｍ程度とすることができる。
【００２８】
ここで、酵素１３が多量体を形成する場合には、酵素１３のサイズ（径）は、多量体のサイズ（径）とすることができる。ここで、多量体とは、２以上の酵素（タンパク質）が、直接に、又は水などの低分子を介して結合してなる化合物をいい、結合には、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合が含まれる。しかし、これらの結合の種類は、特に制限されない。
【００２９】
メソ多孔性シリカの比表面積は、例えば、２００〜１５００ｍ２程度である。
メソ多孔性シリカの細孔の深さは、２ｎｍ以上である。具体的には、好ましい深さの範囲は２０〜１０００ｎｍであり、より好ましい深さの範囲は５０〜５００ｎｍであり、最も好ましい深さの範囲は５０〜１５０ｎｍである。
メソ多孔性シリカの細孔のピッチは、細孔のピッチを細孔の中心間の距離と定義すると、好ましいピッチは２〜５００ｎｍであり、より好ましいピッチは２〜１００ｎｍであり、最も好ましいピッチは２〜５０ｎｍである。
【００３０】
（酵素）
酵素１３は、作用電極１１上に形成されたメソ多孔性シリカ層１２の細孔の内部に固定されている。
酵素１３をメソ多孔性シリカ層１２に固定する方法としては、例えば、メソ多孔性シリカ層１２に酵素１３を含む溶液（酵素溶液）を滴下するディップ法、酵素溶液にメソ多孔性シリカ層１２を浸漬する浸漬法などが挙げられるが、特に限定されるものではない。これにより、高次構造と活性を保持したまま、酵素１３をメソ多孔性シリカ層１２の細孔の内部に導入して固定することができる。なお、高速かつ確実に酵素１３をメソ多孔性シリカ層１２の細孔の内部に導入して固定するには、ディップ法や浸漬法などによりメソ多孔性シリカ層１２に酵素溶液を付着させ、その状態のまま真空デシケータ等の中で真空吸引することが好ましい。
さらに、必要に応じて、公知の酵素固定化法（例えば、導電性高分子、グルタルアルデヒド、光架橋性樹脂等を用いる固定化法等）と併用することもできる。
【００３１】
酵素１３は、検出対象物質と選択的に反応する酵素であれば任意であり、検出対象物質の種類によって適宜変更可能である。
具体的には、酵素１３は、例えば、酸化還元酵素、加水分解酵素、転移酵素、異性化酵素などの酵素（酵素タンパク質）である。
また、酵素１３は、例えば、生来の酵素分子であっても、活性部位を含む酵素の断片であっても良い。当該酵素分子又は当該活性部位を含む酵素の断片は、例えば、動植物や微生物から抽出したものであっても良いし、所望によりそれを切断したものであっても良いし、遺伝子工学的に又は化学的に合成したものであっても良い。
【００３２】
酸化還元酵素としては、例えば、ラッカーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ホルムアルデヒドオキシダーゼ、ソルビトールオキシダーゼ、フルクトースオキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、グルタメートデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ等を用いることができる。この他に、コレステロールエステラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ブチリルコリンエステラーゼ、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、さらにこれら酵素のミュータント等を用いることができる。
【００３３】
加水分解酵素としては、例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、インベルターゼ、マルターゼ、β−ガラクトシダーゼ、リゾチーム、ウレアーゼ、エステラーゼ、ヌクレアーゼ群、ホスファターゼ群等を用いることができる。
【００３４】
転移酵素としては、例えば、各種アシル転移酵素、キナーゼ群、アミノトランスフェラーゼ群等を用いることができる。
【００３５】
異性化酵素としては、例えば、ラセマーゼ群、ホスホグリセリン酸ホスホムターゼ、グルコース６−リン酸イソメラーゼ等を用いることができる。
【００３６】
メソ多孔性シリカ層１２に固定する酵素１３は、１種類の酵素であっても、２種類以上の酵素であっても良い。
具体的には、メソ多孔性シリカ層１２に固定する酵素１３は、例えば、１種類の酵素であっても、分子量及び／又はサイズ（径）が略同一の２種類以上の酵素であっても、分子量及び／又はサイズが異なる２種類以上の酵素であっても良い。また、メソ多孔性シリカ層１２に固定する酵素１３が２種類以上である場合、酵素１３は、例えば、同種の検出対象物質（基質）に作用する２種類以上の酵素であっても、異種の検出対象物質に作用する２種類以上の酵素であっても、同種及び／又は異種の検出対象物質に作用する２種類以上の酵素であっても良い。
【００３７】
また、メソ多孔性シリカ層１２に固定する酵素１３が２種類以上である場合、その２種類以上の酵素は、メソ多孔性シリカ層１２における別々の細孔の内部に固定されていても、同一の細孔の内部に固定されていても良い。
ここで、特に、メソ多孔性シリカ層１２に固定する酵素１３が２種類以上であって、その２種類以上の酵素が異種の検出対象物質に作用する場合、酵素センサ１００は、その異種の検出対象物質（２種類以上の検出対象物質）を同時に検出することができる。
【００３８】
（電子伝達物質）
電子伝達物質は、酵素１３と作用電極１１との間の電子の受け渡しを促進するためのものであり、酵素１３と作用電極１１との間の電子移動を媒介する媒介物質として機能する。
なお、本実施形態では、電子伝達物質を、メソ多孔性シリカ層１２の細孔の内部に導入した状態で、電解液４０中に含有させることとするが、これに限ることはなく、電子伝達物質は、電解液４０中に含有されていれば任意であり、例えば、反応器４０ａに導入された電解液４０に溶解した状態で電解液４０中に含有されていても良いし、メソ多孔性シリカ層１２以外の担体に担持された状態で電解液４０中に含有されていても良いし、例えば、酵素電極１０（作用電極１１）等の電極に直接固定された状態で電解液４０中に含有されていても良い。また、検出対象物質がフェノール系物質である場合、当該フェノール系物質自体が電子伝達物質の役割を兼ねるが、この場合、その他の電子伝達物質を別途、電解液４０中に含有させることとしても良い。
具体的には、電子伝達物質としては、例えば、フェリシアン化カリウム、フェロセン、フェロセン誘導体、ベンゾキノン、キノン誘導体、オスミウム錯体、ＨＢＴ、ＡＢＴＳ、ビオルリン酸（violuric acid、Ｖｉｏ）、ＮＮＳ、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、４−アミノアンチピリン等を用いることができる。
【００３９】
酵素１３は、細孔のサイズが酵素１３のサイズの０．５〜２．０倍程度である、メソ多孔性シリカ層１２の細孔の内部に安定的に固定されているため、生成物が直接作用電極１１で酸化又は還元される場合を除き、酵素分子内の活性中心が作用電極１１と電子移動を行うことが難しい。また、酵素１３が、一次元シリカナノチャンネルの集合体のように方向性が制御されたアスペクト比の大きな細孔を有する粉末状のメソ多孔性シリカにより形成されメソ多孔性シリカ層１２の細孔の内部に固定されている場合には、生成物が直接作用電極１１で酸化又は還元される場合においても応答が非常に遅くなる。したがって、電解液４０中に、電子伝達物質を含有させることが好ましい。
また、作用電極１１として酸素電極、過酸化水素電極等を利用した場合、反応が溶存酸素濃度に律速されて低濃度の試料しか測定できない、アスコルビン酸等の酸化物質の影響を受けやすく選択性が悪い等の問題が生じる。この場合にも、検出範囲の拡大、選択性の向上を目的として酵素１３とともに電子伝達物質を使用することが効果的である。
【００４０】
（補酵素）
補酵素は、酵素１３の活性の発現を触媒するためのものであり、酵素１３と作用電極１１との間の電子移動を媒介する媒介物質として機能する。
なお、本実施形態では、補酵素を、メソ多孔性シリカ層１２の細孔の内部に導入した状態で、電解液４０中に含有させることとするが、これに限ることはなく、補酵素は、電解液４０中に含有されていれば任意であり、例えば、反応器４０ａに導入された電解液４０に溶解した状態で電解液４０に含有されていても良いし、メソ多孔性シリカ層１２以外の担体に担持された状態で電解液４０中に含有されていても良いし、例えば、酵素電極１０（作用電極１１）等の電極に直接固定された状態で電解液４０中に含有されていても良い。
また、補酵素は、例えば、補因子としての各種金属原子や金属イオン、金属錯体、各種色素など（例えば、Ｆｅ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ３＋等）とともに電解液４０中に含有されていても良い。
【００４１】
例えば、不安定中間体を経由する反応等、酵素１３のアミノ酸側鎖の触媒作用では容易に進まない反応の場合、適当な構造を有し、酵素反応の発現に関与する低分子量の有機小分子や金属イオン、金属錯体などを補因子（cofactor）として使用することが多い。補因子の中でも有機小分子や金属錯体を補酵素と呼ぶ。特に、酵素１３として、補酵素依存型酵素を用いた場合、電解液４０中に補酵素を導入することによって、酵素反応を効率よく行わせることができる。
【００４２】
補酵素は、酵素１３（補酵素依存型酵素）の種類に応じて、適宜選択することができる。具体的には、補酵素としては、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）、補酵素Ｉ、補酵素ＩＩ、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、リポ酸、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、ピリドキサルリン酸（ＰＡＬＰ）、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ,Coenzyme F）、ＵＤＰグルコース（ＵＤＰＧ）、補酵素Ａ、補酵素Ｑ、ビオチン、補酵素Ｂ12(コバラミン)、Ｓ−アデノシルメチオニン等の１種又は２種以上の組み合わせが挙げられる。
【００４３】
ここで、ＮＡＤ＋などの補酵素を使用すると、メソ多孔性シリカ層１２の細孔の内部に固定された酵素１３の活性が低下する場合があることが分かっている。これは、ＮＡＤ＋などの補酵素が、メソ多孔性シリカ層１２表面のシラノール基と反応して、酵素１３の活性に影響を与えるためであると考えられる。
そこで、電解液４０中に、補酵素を使用した際に生じる酵素１３の活性の低下を抑制するための補酵素用活性低下抑制物質を添加するのが好ましい。
補酵素用活性低下抑制物質としては、例えば、生体高分子や、合成高分子、電解質などが挙げられる。
なお、補酵素用活性低下抑制物質は、電解液４０中に含有されていれば任意であり、例えば、反応器４０ａに導入された電解液４０に溶解した状態で電解液４０に含有されていても良いし、例えば、メソ多孔性シリカ層１２やその他の担体に担持された状態で電解液４０に含有されていても良い。
【００４４】
生体高分子は、分子量１０００以上の生体高分子であれば任意であり、具体的には、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、セルロース、デンプン等である。
【００４５】
また、合成高分子は、分子量１０００以上の合成高分子であれば任意であり、具体的には、例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン等である。
【００４６】
また、電解質は、反応器４０ａに導入された電解液４０に溶解して、陽イオンと陰イオンとに電離する物質であれば任意であり、具体的には、例えば、塩化カリウム等である。
【００４７】
なお、電解液４０には、補酵素用活性低下抑制物質として、分子量１０００以上の生体高分子、分子量１０００以上の合成高分子及び電解質のうちの少なくとも何れか１つが添加されていれば良い。
また、電解液４０に添加される分子量１０００以上の生体高分子の種類は、１種類であっても複数種類であっても良い。電解液４０に添加される分子量１０００以上の合成高分子の種類は、１種類であっても複数種類であっても良い。電解液４０に添加される電解質の種類は、１種類であっても複数種類であっても良い。
【００４８】
（電極）
酵素センサ１００の電極方式として、図１では、酵素電極１０（作用電極１１）と対照電極２０と参照電極３０との三極方式を示しているが、これに限ることはなく、作用電極と対照電極との二極方式、作用電極と対照電極と参照電極との三極方式の何れを採用しても良い。
作用電極１１としては、例えば、金、白金、銅、アルミニウム等の貴金属や、ＳｎＯ２、Ｉｎ２Ｏ３、ＷＯ３、ＴｉＯ２、グラファイト、グラフェン、グラッシカーボンなどを用いることができる。
対照電極２０としては、例えば、二極方式の場合は銀、三極方式の場合は銀やその他の金属を用いることができる。
参照電極３０としては、例えば、カロメル電極、銀/塩化銀等を用いることができる。
【００４９】
酵素電極１０（作用電極１１）、対照電極２０及び参照電極３０の一例として、例えば、図１に示すように、電解セルで使用する電極を挙げることができるが、これらの電極は、その大きさ、形状、構成に特に制限はない。
具体的には、例えば、これらの電極は、市販の電解セル、測定セル等で使用する大きな電極であっても良いし、ディスク電極、回転リングディスク電極、ファイバー電極等であっても良いし、例えば、フォトリソグラフィー等の公知の微細加工技術により作製した微小電極（円盤電極、円筒電極、帯状電極、配列帯状電極、配列円盤電極、リング電極、球状電極、櫛型電極、ペア電極等）であっても良い。
【００５０】
また、これらの電極は、所定の絶縁性基板上に設けることもできる。
具体的には、絶縁性基板上に、各電極を、公知の方法、例えば、スクリーン印刷法、蒸着法、スパッタリング法等によって形成することができる。なお、各電極は、全て同一基板上に形成して一体型の酵素センサ１００として作製しても良いし、複数の基板上に形成して酵素センサ１００を構成しても良いし、別々の電極として作製して酵素センサ１００を構成しても良い。
絶縁性基板としては、例えば、シリコン、セラミックス、ガラス、プラスチック、紙、生分解性材料（例えば、微生物生産ポリエステル等）等を用いることができる。
【００５１】
（センシング方法）
酵素センサ１００によるセンシング方法としては、例えば、電気化学的計測法を用いることができる。すなわち、酸化電流又は還元電流を測定するクロノアンペロメトリー法、クーロメトリー法、サイクリックボルタンメトリー法等の公知の計測法を適用することが可能である。測定方式としては、デスポーザブル方式、バッチ方式、フローインジェクション方式等、何れであっても良い。
【００５２】
また、電気化学的計測法において、色源体を酸化又は還元した色変化を検出する光検出測定法を適用することも可能である。
具体的には、例えば、グルコースセンサでは、グルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼの２種類の酵素を固定して、酵素反応（“グルコース＋Ｏ２  ―(グルコースオキシダーゼ)→  グルコン酸＋Ｈ２Ｏ２”、“Ｈ２Ｏ２＋色源体  ―(ペルオキシダーゼ)→  
赤紫色素”）により生成又は消費される過酸化水素と色源体（例えば、４−アミノアンチピリンとＮ−エチル−Ｎ（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジンとの混合物）がペルオキシダーゼを触媒として赤紫色になる色変化を検出することによって、グルコース濃度を測定することができる。
【００５３】
測定の際に酵素センサ１００を取り付ける測定器本体は、例えば、データをパソコンに有線又は無線で送信できる機能を有し、リアルタイムで測定値を確認できることが好ましい。また、複数種類の酵素センサ１００を取り付け可能に構成され、複数種類の酵素センサ１００による検出結果を同時に計測して、データを相互比較したり検討したりできる機能を有することが望ましい。
【実施例１】
【００５４】
以下、具体的な実施例によって本発明を説明するが、発明はこれらに限定されるものではない。
本実施例では、検出対象物質としてフェノール系物質であるカテコールを採用し、メソ多孔性シリカ層１２の細孔の内部に酵素１３としてラッカーゼが固定された酵素電極１０を備える酵素センサ１００を作成して、カテコールを検出した。
【００５５】
（１）メソ多孔性シリカ層１２の形成
まず、作用電極１１上にメソ多孔性シリカ層１２を形成した。
具体的には、まず、サイズ（径）が７ｎｍよりも若干小さいラッカーゼを固定するので、細孔径が７ｎｍである粉末状のメソ多孔性シリカを準備した。
次いで、準備した粉末状のメソ多孔性シリカ５０ｍｇをアセトン水溶液１０ｍｌに添加し、５分間超音波にかけて、粉末状のメソ多孔性シリカが十分に分散されたメソ多孔性シリカ分散液を作成した。
次いで、図３に示すような電着装置３００に備えられている電着槽３０１に、作成したメソ多孔性シリカ分散液を収容し、作用電極１１（カーボン電極）を、電着槽３０１に収容されたメソ多孔性シリカ分散液に浸して、電着槽３０１の下部に配置された対電極となる電極板３０２（ステンレス板）に対向するように配置した。その状態で、作用電極１１を正にして、作用電極１１と電極板３０２との間に直流電源３０３により＋３０Ｖの電圧を１分間印加することにより、作用電極１１上にメソ多孔性シリカを電着した。そして、これを、１５０℃で７２時間焼成することによって、メソ多孔性シリカ層１２を形成した。なお、当該形成されたメソ多孔性シリカ層１２は、８０μｇであった。
【００５６】
（２）酵素電極１０の作成
次に、作用電極１１上に形成されたメソ多孔性シリカ層１２の細孔の内部に酵素１３（ラッカーゼ）を固定して、酵素電極１０を作成した。
具体的には、まず、ラッカーゼ１０ｍｇをクエン酸バッファ（ｐＨ４．０）１ｍｌに溶解させて、酵素溶液を作成した。
次いで、作成した酵素溶液１０μｌを作用電極１１上に形成されたメソ多孔性シリカ層１２上に滴下し、これを真空デシケータ内に配置して、２時間真空吸引することにより乾燥させた。
次いで、乾燥させた作用電極１１を真空デシケータから取り出して、クエン酸バッファ（ｐＨ４．０）を用いて十分に洗浄し、メソ多孔性シリカ層１２の細孔の内部以外に固定（吸着）されたラッカーゼを除去することによって、酵素電極１０を作成した。
【００５７】
（３）酵素センサ１００の作成
次に、作成した酵素電極１０を用いて酵素センサ１００を作成した。
具体的には、反応器４０ａに電解液４０としてクエン酸バッファ（ｐＨ４．０）を収容して、当該電解液４０内に酵素電極１０（作用電極１１）と対照電極２０と参照電極３０とを配置し、酵素センサ１００として、図１に示すような三極方式の酵素センサを作成した。
【００５８】
（４）カテコールの検出及び応答電流値のカテコール濃度依存性の評価
次に、作成した酵素センサ１００を用いて検出対象物質（カテコール）を検出し、応答電流値の検出対象物質（カテコール）濃度依存性を評価した。
具体的には、カテコールを添加していない電解液４０に、電極（酵素電極１０（作用電極１１）、対照電極２０、参照電極３０）を用いて電圧を印加し、出力電流値の取得を開始した。次いで、出力電流値の取得中に、電解液４０におけるカテコールの濃度が所定の濃度となるように電解液４０にカテコールを添加し、当該添加から所定時間経過後に、出力電流値の取得を終了した。そして、電解液４０に添加するカテコールの量を調整することにより電解液４０におけるカテコールの濃度を変化させて、この一連の操作を繰り返し行った。その結果を図４に示す。
【００５９】
図４に示す結果から、カテコールを添加すると出力電流値が低下し、当該添加から約１２０秒後に出力電流値が一定値で飽和することが分かった。また、カテコールの濃度が増加するに従って、出力電流値の低下の度合いが大きくなることが分かった。
【００６０】
次に、図４に示す結果に基づいて、校正曲線を作成し、応答電流値のカテコール濃度依存性を評価した。その結果を図５に示す。
また、比較のために、ラッカーゼが電解液に溶解された遊離酵素の状態で電解液に含有されている酵素センサについても同様にして、応答電流値のカテコール濃度依存性を評価した。その結果も図５に示す。
【００６１】
図５に示す結果から、作成した酵素センサ１００を用いた場合（実施例（□））と比較して、遊離酵素の場合（比較例（△））の方が、応答電流値が小さいことが分かった。これは、比較例の酵素センサにおける酵素量は、実施例の酵素センサ（作成した酵素センサ１００）における酵素量と略同一であるが、比較例の酵素センサの場合、酵素（ラッカーゼ）が、作用電極１１上に形成されたメソ多孔性シリカ層１２に固定されておらず、電解液中に溶存して希薄なため、検出対象物質（カテコール）と効率よく接触できず、応答電流値が小さくなったと考えられる。
また、作成した酵素センサ１００を用いた場合（実施例）は、電解液４０におけるカテコールの濃度が２μｍｏｌ／ｌ未満だと、カテコールを検出できないことが分かった。そして、図５に示す結果から、カテコールの濃度が２〜１００μｍｏｌ／ｌの範囲で線形応答を示すことが分かった。
【００６２】
また、作成した酵素センサ１００を用いた場合（実施例）において、繰り返し再現性を評価したところ、１０回繰り返して使用しても、応答電流値のばらつきが５％以下であることが分かった。
また、酵素センサ１００を５つ作成して、各々を用いてカテコールを検出したところ、応答電流値のばらつきが１０％以下であることが分かった。
以上の結果から、作成した酵素センサ１００は、カテコールを検出するための酵素センサとして、十分に実用的であることが分かった。
【００６３】
以上説明した本実施形態の酵素電極１０及び酵素センサ１００によれば、電極（作用電極１１）と、電極（作用電極１１）上に形成されたメソ多孔性シリカ層１２と、メソ多孔性シリカ層１２の細孔の内部に固定された酵素１３と、を備え、メソ多孔性シリカ層１２は、粉末状のメソ多孔性シリカを電極（作用電極１１）に電着することによって形成されているので、メソ多孔性シリカが粉末状であり、電極（作用電極１１）が微小である場合であっても、容易に再現性よく電極（作用電極１１）上にメソ多孔性シリカ層１２を形成することができる。したがって、粉末状のメソ多孔性シリカを用いた場合でも小型化及び低コスト化が容易になる。また、容易に再現性よく電極（作用電極１１）上にメソ多孔性シリカ層１２を形成できるため、高性能な酵素電極１０及び酵素センサ１００を提供することができる。
【００６４】
また、以上説明した本実施形態の酵素電極１０及び酵素センサ１００によれば、メソ多孔性シリカ層１２は、細孔の内部に酵素１３が固定されていない粉末状のメソ多孔性シリカを電極（作用電極１１）に電着することによって形成され、酵素１３は、真空吸引することによって、電着することにより形成されたメソ多孔性シリカ層１２の細孔の内部に導入されて固定されている。
すなわち、真空吸引することによって、酵素１３をメソ多孔性シリカ層１２の細孔の内部に導入して固定しているので、高速かつ確実に酵素１３をメソ多孔性シリカ層１２の細孔の内部に導入して固定することができる。
【００６５】
また、以上説明した本実施形態の酵素電極１０及び酵素センサ１００によれば、メソ多孔性シリカ層１２の細孔の内部に導入され、酵素１３と電極（作用電極１１）との間の電子移動を媒介する媒介物質（電子伝達物質や補酵素などのうちの少なくとも何れか１つ）を備えるので、より高性能な酵素電極１０及び酵素センサ１００を提供することができる。
【００６６】
なお、本発明は、上記した実施の形態のものに限るものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で適宜変更可能である。
【００６７】
上記実施形態では、電極（作用電極１１）上にメソ多孔性シリカ層１２を形成した後に、酵素１３を固定するようにしたが、これに限ることはなく、例えば、真空吸引等によって粉末状のメソ多孔性シリカの細孔の内部に酵素１３を導入して固定した後に、当該粉末状のメソ多孔性シリカ（すなわち、真空吸引することにより固定された酵素１３を細孔の内部に有する粉末状のメソ多孔性シリカ）を電極（作用電極１１）に電着することによってメソ多孔性シリカ層１２を形成しても良い。
【００６８】
酵素センサ１００にポテンショスタット２を含むよう構成したが、これに限ることはなく、酵素センサ１００とポテンショスタット２とは別体であっても良い。
【００６９】
酵素センサ１００による電気化学的計測は、一つの基板上に形成した二極構造（酵素電極１０（作用電極１１）と対照電極２０）又は三極構造（酵素電極１０（作用電極１１）と対照電極２０と参照電極３０）の電極を用いても良いし、独立した各電極（酵素電極１０（作用電極１１）、対照電極２０、参照電極３０）を組み合わせて用いても良い。
【００７０】
二極構造（酵素電極１０（作用電極１１）と対照電極２０）又は三極構造（酵素電極１０（作用電極１１）と対照電極２０と参照電極３０）の各電極を、所定の絶縁性基板上に形成した場合、例えば、この絶縁性基板上における酵素電極１０が形成された領域を含む領域（以下、「分析領域」という。）上に所定の電解液を滴下して、この分析領域上を検出部１としても良いし、例えば、分析領域上に所定の電解液で満たされた液相室を設けて、この分析領域上（液相室内）を検出部１としても良い。
【符号の説明】
【００７１】
１０  酵素電極
１１  作用電極（電極）
１２  メソ多孔性シリカ層
１３  酵素
１００  酵素センサ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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