(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含んでなる、単離された抗ＣＸＣＲ４抗体、またはその一つの機能的フラグメント：
−配列番号１、２、および３のアミノ酸配列をそれぞれ含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖と、配列番４、５、および６のアミノ酸配列をそれぞれ含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖、または
−配列番号１、２、および３０のアミノ酸配列をそれぞれ含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖と、配列番３１、３２、および３３のアミノ酸配列をそれぞれ含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖、
ここで、該機能的フラグメントが、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、およびダイアボディーからなる群から選択される。
【請求項２】
以下である請求項１に記載の抗体、またはその機能的フラグメント：
−抗体が配列番号７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖および配列番号８のアミノ酸配列を含んでなる重鎖を含んでなり、または
−抗体が配列番号３４のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖および配列番号３５のアミノ酸配列を含んでなる重鎖を含んでなる。
【請求項３】
キメラ抗体であり、かつ配列番号５６、５７、および５８からなる群から選択される配列の重鎖および配列番号５９の配列の軽鎖を含んでなる、請求項１に記載の抗体、またはその機能的フラグメント。
【請求項４】
ヒト化抗体であり、かつ配列番号６４からなる配列の重鎖可変領域および配列番号６５、６６、８２、および８３からなる群から選択される配列の軽鎖可変領域を含んでなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
ヒト化抗体であり、かつ配列番号６７、６８、および６９からなる群から選択される配列の重鎖および配列番号７０、７１、８４、および８５からなる群から選択される配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその機能的フラグメントを含んでなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
機能的フラグメントがフラグメントｓｃＦｖからなり、該ｓｃＦｖが配列番号５４のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
以下である、単離核酸：
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体、またはその機能的フラグメントの一つをコードする核酸、ＤＮＡ、またはＲＮＡ。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸を含んでなる、ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体、またはその機能的フラグメントの一つを作製する方法であって、以下の工程を含んでなる、方法：
ａ）請求項９に記載の細胞の、培地および適当な培養条件での培養工程、および
ｂ）このようにして生産された該抗体、またはそれらの機能的フラグメントの一つの、該培養培地または該培養細胞からの回収工程。
【請求項１１】
薬剤としての、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１  ＫＯＮ一次単離物の複製を、ＩＣ９０少なくとも５μｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１０μｇ／ｍｌで阻害する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体、またはその一つの機能的フラグメント。
【請求項１３】
請求項１〜６および１２のいずれか一項に記載の抗体、またはその一つの機能的フラグメントからなる化合物を有効成分として含んでなる、医薬組成物。
【請求項１４】
ＨＩＶ感染の予防または治療のための、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ＨＩＶ感染がＸ４指向性ＨＩＶ感染および／またはＸ４／Ｒ５指向性ＨＩＶ感染である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）、ヌクレオシド／ヌクレオチドＨＩＶ逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ／ＮｔＲＴＩ）、非ヌクレオシドＨＩＶ逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、ＨＩＶ侵入阻害剤、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤等の抗レトロウイルス剤からなる群から選択される少なくとも一つの第二の抗ＨＩＶ化合物を含んでなる、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記の少なくとも第二の抗ＨＩＶ化合物がマラビロクである、請求項１５または１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ＣＸＣＲ４アンタゴニスト抗ウイルス薬としての分子をスクリーニングおよび／または同定する方法であって、以下の工程を含んでなる方法：
ａ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞を選択する工程、
ｂ）前記細胞を、請求項１〜６および１２のいずれか一項に記載の抗体、またはその一つの機能的フラグメントとともに培養する工程、
ｃ）抗体、またはその一つの機能的フラグメントと、ＣＸＣＲ４との間の結合の潜在的な阻害のための供試分子を評価する工程、および
ｄ）前記阻害が可能な分子を選択する工程。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ケモカイン受容体（ＣＸＣＲ）と特異的に結合することができる新規な抗体、特に、ネズミモノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体、ならびにこのような抗体をコードするアミノ酸配列および核酸配列に関する。一つの態様から、本発明は、ＣＸＣＲ４と特異的に結合することができ、かつ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染に対して強い活性を有する新規な抗体、機能的フラグメントまたは誘導体に関する。本発明はまた、このような抗体、機能的フラグメントまたは誘導体の、ＨＩＶ感染の予防的治療および／または治療的治療のための薬剤としての使用も含んでなる。
【０００２】
背景技術
ケモカインは、特に免疫反応中に、ケモカイン勾配として知られるリガンドの化学的勾配によって白血球の移動を制御する小型の分泌型ペプチドである(Zlotnick A. et al., 2000)。ケモカインは、それらのＮＨ２末端システイン残基の位置に基づいてＣＣおよびＣＸＣという二つの主要なサブファミリーに分かれ、Ｇタンパク質共役型受容体と結合し、その受容体の二つの主要なサブファミリーはＣＣＲおよびＣＸＣＲと呼ばれている。これまでに５０を超えるヒトケモカインと１８のケモカイン受容体が見出されている。
【０００３】
ケモカイン受容体ファミリーのいくつかのメンバーは、主要受容体ＣＤ４とともに共受容体として働き、種々の１型ＨＩＶ株を細胞へ侵入させるが、この主要な共受容体がＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４である。Ｔ細胞指向性（T-cell tropic）Ｘ４  ＨＩＶ−１は細胞への侵入にＣＤ４とＣＸＣＲ４を用いるが、マクロファージ指向性(macrophage-tropic)Ｒ５  ＨＩＶ−１はＣＤ４とＣＣＲ５を用いる。二重指向性株は、ＣＸＣＲ４とＣＣＲ５の双方を共受容体として使用することができる。他のケモカイン受容体の中でも、ＣＣＲ３、ＣＣＲ２、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７、ＣＸ３ＣＲ１は、ＨＩＶ株のより限られたサブセットにより、共受容体として機能する。
【０００４】
ＣＸＣＲ４の天然リガンドであるＳＤＦ−１、ならびにＣＣＲ５の天然リガンドであるＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４−Ｌ１およびＣＣＬ５リガンドは、種々のＨＩＶ−１株による細胞融合および感染を阻害することができる。これらの知見は、ケモカイン受容体を標的とする抗ＨＩＶ治療薬の開発を促し、ＣＣＲ５指向性ＨＩＶ−１に感染した患者において、ＣＣＲ５の小分子アンタゴニストであるマラビロク(maraviroc)（CELSENTRI（商標））と、他の抗ＨＩＶ−１薬との併用の認可に至らせた。しかしながらやはり、二重指向性ＨＩＶ−１に感染した患者にも、ＣＸＣＲ４指向性ＨＩＶ−１に感染した患者にもマラビロクは使用されない(VIDAL 2009)。従って、Ｘ４指向性ＨＩＶ複製を阻害することができるＣＸＣＲ４アンタゴニストを同定することにより、Ｘ４指向性感染患者および二重指向性ＨＩＶ感染患者の双方にこの種の療法を拡張するという明確な医学的必要がある。
【０００５】
ケモカイン受容体４（フーシン、ＣＤ１８４、ＬＥＳＴＲ、またはＨＵＭＳＴＲとしても知られる）は、３５２または３６０個のアミノ酸を含んでなる二つのイソ型として存在する。残基Ａｓｎ１１はグリコシル化され、残基Ｔｙｒ２１は硫酸基の付加によって修飾され、Ｃｙｓ１０９および１８６は、受容体の細胞外部分でジスルフィド架橋によって結合されている(Juarez J.ら、2004)。
【０００６】
この受容体は、様々な種の正常組織、ナイーブ、非メモリーＴ細胞、調節Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、内皮細胞、一次単球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、ＣＤ３４＋造血幹細胞、また、低レベルではあるが、心臓、結腸、肝臓、腎臓、および脳によって発現される。ＣＸＣＲ４は、白血球輸送、Ｂ細胞のリンパ球生成、および骨髄造血に重要な役割を果たす。
【０００７】
これまでに記載されているＣＸＣＲ４受容体のリガンドの独特なリガンドは、ストロマ細胞由来因子（ＳＤＦ−１）またはＣＸＣＬ１２である。ＳＤＦ−１は、リンパ節、骨髄、肝臓、肺において多量に、また、程度は少ないが、腎臓、脳、および皮膚によっても分泌される。ＣＸＣＲ４はまた、ＩＩＩ型ヒトヘルペスウイルスによってコードされているウイルスマクロファージ炎症性タンパク質ＩＩ（ｖＭＩＰ−ＩＩ）であるアンタゴニストケモカインによっても認識される。
【０００８】
従前に記載されているように、ＣＸＣＲ４受容体は、Ｔ細胞指向性ＨＩＶ−１単離物（Ｘ４ウイルス）に対する主要な共受容体である。この受容体に干渉すれば、極めて効率的にＸ４ウイルスの複製を阻害できるはずである。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の発明態様の一つは、ＨＩＶ複製を阻害するマウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を作製することである。本発明は、ＣＸＣＲ４ホモ二量体と結合することができ、かつ、ＨＩＶ感染に対して強い活性を有するＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ５１５Ｈ７（またはそのフラグメント）を包含する。本発明はまた、ＣＸＣＲ４ホモ二量体と結合することができ、かつ、ＨＩＶ感染に対して強い活性を有するＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ３０１ａＥ５（またはそのフラグメント）を包含する。
【００１０】
驚くべきことに、本発明者らは、ＣＸＣＲ４と結合することができるだけでなく、ＣＸＣＲ４ホモ二量体のコンフォメーション変化を誘導することができ、かつ、ＰＢＭＣにおけるＸ４−ＨＩＶ−１一次単離物の複製を阻害することができるモノクローナル抗体の作製を成し遂げた。より詳細には、本発明の抗体は、ＰＢＭＣにおけるＸ４／Ｒ５−ＨＩＶ−１一次単離物の複製を阻害することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、単球およびリンパ球におけるＣＸＣＲ４発現のゲーティング戦略を示す図である。図１Ａ：ＣＤ３−ＰＥ抗体によるＴ細胞の染色、図１Ｂ：ＣＤ１４−ＰＥ抗体による単球の染色
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、単球およびＴリンパ球に対する抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ５１５Ｈ７および３０１ａＥ５の結合を示す図である。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞における生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）アプローチによる、それぞれＳＤＦ−１ならびに抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ５１５Ｈ７および３０１ａＥ５によるＣＸＣＲ４受容体二量体の調節を示す図である。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ５１５Ｈ７および３０１ａＥ５の、ヒトＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１単離物ＫＯＮ（Ｘ４ウイルス）の複製を阻害する能力を示す図である。
【図５】図５は、抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ５１５Ｈ７および３０１ａＥ５の、ヒトＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１単離物ＫＯＮ（Ｘ４ウイルス）の複製を阻害する能力を示す図である。
【図６】図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、ＣＨＯ−ＣＸＣＲ４細胞におけるＳＤＦ−１により誘発されたカルシウム放出の、Ｍａｂ  ５１５Ｈ７（図６Ａ）、３０１ａＥ５（図６Ｂ）およびｃ５１５Ｈ７（図６Ｃ）による阻害を示す図である。
【図７】図７は、抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ５１５Ｈ７、ｃ５１５Ｈ７、および３０１ａＥ５の、ヒトＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１  Ｘ４ウイルス一次単離物ＭＮ（図７）および９２ＵＧ０２４（図８）の複製を阻害する能力を示す図である。
【図８】図８は、抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ５１５Ｈ７、ｃ５１５Ｈ７、および３０１ａＥ５の、ヒトＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１  Ｘ４ウイルス一次単離物ＭＮ（図７）および９２ＵＧ０２４（図８）の複製を阻害する能力を示す図である。
【図９】図９は、抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ５１５Ｈ７、ｃ５１５Ｈ７、および３０１ａＥ５の、ヒトＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１  Ｘ４ウイルス一次単離物ＫＯＮ、ＭＮ、および９２ＵＧ０２４の複製を阻害する能力を示す図である。
【図１０】図１０は、抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ５１５Ｈ７、ｃ５１５Ｈ７、および３０１ａＥ５の、ヒトＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１  Ｘ４／Ｒ５二重ウイルス一次単離物８９．６の複製を阻害する能力を示す図である。
【図１１】図１１は、抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ５１５Ｈ７、ｃ５１５Ｈ７および３０１ａＥ５の、ヒトＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１  Ｘ４／Ｒ５二重ウイルス一次単離物８９．６の複製を阻害する能力を示す図である。
【図１２】図１２は、Ｍａｂ  ｃ５１５Ｈ７とマラビロクの併用の、ヒトＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１一次単離物８９．６（Ｘ４／Ｒ５二重ウイルス）の複製を阻害する有益な効果を示す図である。
【図１３】図１３は、Ｍａｂ  ｃ５１５Ｈ７とマラビロクの併用の、ヒトＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１一次単離物ＵＧ９３０６７（Ｘ４／Ｒ５二重ウイルス）の複製を阻害する有益な効果を示す図である。
【図１４】図１４は、抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ５１５Ｈ７、ｃ５１５Ｈ７、および３０１ａＥ５の、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１  Ｘ４ウイルス一次単離物ＫＯＮの複製を阻害する能力を示す図である。
【図１５】図１５は、ＦＡＣＳ分析によるｃ５１５Ｈ７  Ｍａｂの結合特異性を示す図である。
【図１６】図１６は、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）アプローチによる、ＣＸＣＲ４ホモ二量体に対するｃ５１５Ｈ７  Ｍａｂの効果を示す図である。
【図１７】図１７は、５１５Ｈ７重鎖可変ドメインとヒト生殖細胞系ＩＧＨＶ３−４９＊０４およびＩＧＨＪ４＊０１とのアミノ酸配列アライメント。５１５Ｈ７  ＶＨアミノ酸配列が、選択されたヒトアクセプターフレームワーク配列とアラインされている。ＶＨ  Ｖａｒ１  （ＶＨ１）配列は、５１５Ｈ７  ＶＨドメインのヒト化変異体に相当する。７６番の位置の一つの逆突然変異が太字で示されている。
【図１８】図１８は、５１５Ｈ７軽鎖と、ヒト生殖細胞系ＩＧＫＶ４−ｌ＊０１およびＩＧＫＪ１＊０１とのアミノ酸配列アライメント。５１５Ｈ７  ＶＬアミノ酸配列が、選択されたヒトアクセプターフレームワーク配列とアラインされている。ＶＬ  Ｖａｒ２．１、Ｖａｒ２．２、およびＶａｒ２．３配列は、ヒト化５１５Ｈ７  ＶＬ  Ｖａｒ２の実施されたヒト化変異体に相当する（変異残基を太字で示す）。Ｖａｒ２．１およびＶａｒ２．２はさらに四つのヒト化残基を持ち、Ｖａｒ２．３はさらに五つのヒト残基を含む。
【図１９】図１９は、キメラ５１５Ｈ７およびヒト化５１５Ｈ７の種々の変異体による、ビオチン化ネズミ抗体５１５Ｈ７の交差遮断。５１５Ｈ７のヒト化変異体（ｈｚ５１５Ｈ７）の、親ネズミ抗体５１５Ｈ７を交差遮断する活性を、ＣＸＣＲ４トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いたフローサイトメトリーによって評価した。ヒト化変異体の活性をキメラ５１５Ｈ７と比較した。変異体ＶＨ１とキメラＶＬ（ｃＶＬ）併用の交差遮断活性は、キメラ（Ａ）の場合と極めてよく似ていた。ＶＬの変異体２と併用した場合（Ｂ）には、ＶＨ変異体１（ＶＨ１、逆突然変異の無い変異体）の活性の低下は見られなかった。
【図２０】図２０は、キメラ５１５Ｈ７およびヒト化５１５Ｈ７の種々の変異体による、ビオチン化ＳＤＦ−１結合の阻害。５１５Ｈ７のヒト化変異体（ｈｚ５１５Ｈ７）の、ＳＤＦ−１結合を阻害する能力を、細胞系統ＲＡＭＯＳを用いたフローサイトメトリーによって評価した。ヒト化変異体の阻害能をキメラ５１５Ｈ７と比較した。ヒト化変異体ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ  ＶＬ２は、キメラ抗体と同等のＳＤＦ−１結合阻害能を有する。ヒト化抗体フラグメントｈｚ５１５  ＶＨ１  ＶＬ２は、ＲＡＭＯＳ細胞に対するＳＤＦ−１の結合阻害に完全な活性を示した。
【図２１】図２１は、ＮＩＨ３Ｔ３−ＣＸＣＲ４においてＣＸＣＲ４と特異的に結合するヒト化５１５Ｈ７  Ｍａｂ（ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ  ＶＬ２、ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ  ＶＬ２．１、ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ  ＶＬ２．２、およびｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ  ＶＬ２．３）を示す図である。
【図２２】図２２は、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）アプローチによる、ＣＸＣＲ４ホモ二量体に対するヒト化５１５Ｈ７  Ｍａｂ（ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ  ＶＬ２、ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ  ＶＬ２．１、ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ  ＶＬ２．２およびｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ  ＶＬ２．３）の効果を示す図である。
【発明の具体的説明】
【００１２】
好ましくは、ＣＸＣＲ４化合物は、
Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３４５８配列番号２７：
MEGISIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGIVGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGNFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWIPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQHIMVGLILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFENTVHKWISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSSFHSS、
として表される配列を有するケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４イソ型ｂ［ホモ・サピエンス］、
Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１００８５４０配列番号２８：
MSIPLPLLQIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGIVGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGNFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWIPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQHIMVGLILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFENTVHKWISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILS KGKRGGHSSVSTESESSSFHSS、
として表される配列を有するケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４イソ型ａ［ホモ・サピエンス］、
配列番号２７または２８を有するこれらのｂまたはａイソ型の一つと少なくとも９５％の同一性を有する選択的転写スプライス変異体またはその天然変異体、および
その天然リガンドであるストロマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）によって特異的に認識されることができ、かつ好ましくは、少なくとも１００、１５０、および２００のアミノ酸長を有するそのフラグメント
からなる群から選択される、二つのヒトＣＸＣＲ４イソ型のうちの一つである。
【００１３】
ＣＸＣＲ２は、
Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１５４８配列番号２９：
MEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIYALVFLLSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVNGWIFGTFLCKVVSLLKEVNFYSGILLLACISVDRYLAIVHATRTLTQKRYLVKFICLSIWGLSLLLALPVLLFRRTVYSSNVSPACYEDMGNNTANWRMLLRILPQSFGFIVPLLIMLFCYGFTLRTLFKAHMGQKHRAMRVIFAVVLIFLLCWLPYNLVLLADTLMRTQVIQETCERRNHIDRALDATEILGILHSCLNPLIYAFIGQKFRHGLLKILAIHGLISKDSLPKDSRPSFVGSSSGHTSTTL、
として表される配列を有するインターロイキン８受容体β［ホモ・サピエンス］、
配列番号２９を有するこのインターロイキン８受容体βと少なくとも９５％の同一性を有する、選択的転写スプライス変異体またはその天然変異体、および
ＩＬ−８によって特異的に認識されることができ、かつ、好ましくは、少なくとも１００、１５０、および２００のアミノ酸長を有するそのフラグメント
からなる群から選択される。
【００１４】
本発明はまた、抗ＨＩＶ活性を有するか、またはＨＩＶ感染の治療のための組成物の製造のために使用することができる化合物を選択する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法も含む。
【００１５】
第１の態様において、本発明の主題は、本発明による抗体を作製および選択する方法である。
【００１６】
より詳細には、本発明は、ＨＩＶ複製を阻害することができる抗ＣＸＣＲ４抗体、またはその一つの機能的フラグメントもしくは誘導体を選択する方法であって、
ｉ）作製された抗体をスクリーニングし、ＣＸＣＲ４と特異的に結合することができる抗体を選択する工程、
ｉｉ）工程ｉ）の選択抗体を検定し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と結合できる抗体を選択する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の選択抗体を検定し、ＣＸＣＲ４ホモ二量体と結合することができる抗体を選択する工程、および次いで
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の選択抗体を検定し、ＰＢＭＣにおけるＸ４指向性ＨＩＶ−１一次単離物の複製を阻害することができる抗体を選択する工程
を含んでなる方法に関する。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、ＨＩＶ複製を阻害することができる抗ＣＸＣＲ４抗体、またはその一つの機能的フラグメントもしくは誘導体を選択する方法であって、
ｉ）作製された抗体をスクリーニングし、ＣＸＣＲ４と特異的に結合することができる抗体を選択する工程、
ｉｉ）工程ｉ）の選択抗体を検定し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と結合できる抗体を選択する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の選択抗体を検定し、ＣＸＣＲ４ホモ二量体と結合することができる抗体を選択する工程、および次いで
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の選択抗体を検定し、ＰＢＭＣにおけるＸ４指向性ＨＩＶ−１一次単離物の複製を阻害することができ、および／またはＰＢＭＣにおいてＸ４／Ｒ５指向性ＨＩＶ−１一次単離物の複製を阻害することができる抗体を選択する工程
を含んでなる方法に関する。
【００１８】
抗体の作製は、例えば、骨髄腫細胞と免疫マウスまたは選択された骨髄腫細胞と適合する他の種に由来する脾臓細胞との融合などの、当業者に公知の方法[Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497]によって実現することができる。この免疫動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有し、その後、直接ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスを含み得る。もう一つの可能性のある実施形態は、ライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレー技術の使用からなるものであり得る。
【００１９】
スクリーニング工程ｉ）およびｉｉ）は、当業者に公知のいずれの方法または工程によっても実現可能である。限定されない例として、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ、免疫組織化学、ＣＸＣＲ４発現細胞膜抽出物、または精製ＣＸＣＲ４を用いたウエスタンブロット解析、ＦＡＣＳ分析、および機能的スクリーニングが挙げられる。好ましい方法は、産生された抗体が、標的細胞表面において天然ＣＸＣＲ４受容体のコンフォメーションも認識できることを確認するための、ＣＸＣＲ４形質転換体（工程１）および少なくともＰＢＭＣ（工程２）に対するＦＡＣＳ分析によるスクリーニングからなる。この方法を以下の例にさらに厳密に記載する。
【００２０】
スクリーニング工程ｉｉｉ）は、当業者に公知のいずれの方法または方法によっても実現可能である。限定されるものではないが、好ましい例として、ＣＸＣＲ４トランスフェクト細胞またはＰＢＭＣ由来の膜抽出物に対して着目する抗体を用いるウエスタンブロット法および／または免疫沈降法が挙げられる。
【００２１】
スクリーニング工程ｉｖ）は、当業者に公知のいずれの方法または方法によっても実現可能である。限定されるものではないが、好ましい例として、Hollら(J. Immunol. 2004, 173, 6274-83)において記載されているプロトコールを用いることにより、ＰＢＭＣにおけるＸ４一次ＨＩＶ−１単離物および／またはＸ４／Ｒ５一次ＨＩＶ−１単離物の複製を阻害することができるか否かに関し、抗体をスクリーニングすることからなる方法が挙げられる。
【００２２】
本発明の方法の選択の工程ｉｉｉ）の好ましい実施形態では、この工程ｉｉｉ）は、ＣＸＣＲ４−ＲＬｕｃ／ＣＸＣＲ４−ＹＦＰを発現する細胞に対するＢＲＥＴ分析によって抗体を評価すること、およびＢＲＥＴシグナルの少なくとも４０％、好ましくは４５％、５０％、５５％、最も好ましくは６０％を阻害することができる抗体を選択することからなる。
【００２３】
ＢＲＥＴ法は、タンパク質二量体形成の代表例として知られている技術である[Angers et al., PNAS, 2000, 97:3684-89]。
【００２４】
本方法の工程ｉｉｉ）に用いられるＢＲＥＴ法は当業者によく知られており、以下の例に記載する。より詳細には、ＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー移動）は、生物発光ドナー（ウミシイタケ・ルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ））と、蛍光アクセプターであるＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）またはＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）突然変異体との間で起こる非放射性のエネルギー移動である。本ケースでは、ＥＹＦＰ（増強黄色蛍光タンパク質）を用いた。移動の有効性は、ドナーとアクセプターの配向および距離に依存する。そして、エネルギー移動は、この二つの分子が近接している（１〜１０ｎｍ）場合にのみ起こり得る。この特性を用いて、タンパク質−タンパク質相互作用アッセイを作り出す。実際に、二つのパートナー間の相互作用を検討するために、第一のものをウミシイタケ・ルシフェラーゼと、そして、第二のものをＧＦＰの黄色突然変異体と遺伝子融合する。融合タンパク質は、必須ではないが一般に、哺乳類細胞で発現される。その膜透過基質（セレンテラジン）の存在下で、Ｒｌｕｃは青色の光を放出する。ＧＦＰ突然変異体がＲｌｕｃから１０ｎｍより近ければエネルギー移動が起こり、さらに黄色シグナルが検出できる。ＢＲＥＴシグナルは、アクセプターによって放出された光とドナーによって放出された光の間の比として測定される。従って、ＢＲＥＴシグナルは二つの融合タンパク質が近接するほど、またはコンフォメーション変化がＲｌｕｃと、ＧＦＰ突然変異体とを近接させるほど増大する。
【００２５】
ＢＲＥＴ分析が好ましい実施形態からなる場合、ＣＸＣＲ４二量体のコンフォメーション変化を測定するために、当業者に公知のいずれの方法も使用可能である。限定されるものではないが、以下の技術が挙げられる：ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）、ＨＴＲＦ（均一時間分解蛍光）、ＦＬＩＭ（蛍光寿命画像測定法）またはＳＷ−ＦＣＣＳ（単波長蛍光相関分光法）。
【００２６】
共免疫沈降法、アルファースクリーン、化学架橋、二重ハイブリッド、アフィニティークロマトグラフィー、ＥＬＩＳＡ、またはファーウエスタンブロットなどの他の従来法も使用可能である。
【００２７】
本発明による方法の特定の態様では、工程ｉｉｉ）は、ＣＸＣＲ４−ＲＬｕｃ／ＣＸＣＲ４−ＹＦＰの双方を発現する細胞に対するＢＲＥＴ分析によって抗体を評価すること、およびＢＲＥＴシグナルの少なくとも４０％を阻害することができる抗体を選択することからなる。
【００２８】
第２の態様において、本発明の主題は、該方法によって得られる単離された抗体、またはそれらの一つの機能的フラグメントもしくは誘導体である。該抗体またはそれらの一つのフラグメントもしくは誘導体は、ヒトＣＸＣＲ４と特異的に結合することができ、該抗体はまた、ＣＸＣＲ４ホモ二量体のコンフォメーション変化を誘導することもできる。
【００２９】
例えばクローンＡ１２０のようなＣＸＣＲ４  ＭａｂがＨＩＶ−１実験株（Ｘ４ＨＩＶ−１ＮＬ４−３）のＰＢＭＣへの侵入を阻害することができることが文献から知られている(Tanaka R. et al, J. Virol. 2001, 75, 11534-11543)。さらに、ＣＸＣＲ４  Ｍａｂが、ＨＩＶ−１  Ｘ４一次単離物の、ＣＸＣＲ４を発現する細胞系統への侵入を阻害することができることも知られている。これに対し、このようなウイルスをそれらの天然環境において、すなわち、実験的ウイルスまたは細胞系統に対してだけでなく、阻害することができる抗体は開示されていない。しかしながらやはり、ＣＸＣＲ４  ＭａｂがＰＢＭＣへのＨＩＶ−１  Ｘ４一次単離物の侵入を阻害することができるということは新規であり、本発明の自明の態様ではない。
【００３０】
「機能的フラグメントおよび誘導体」という表現は、本明細書の後段で詳細に定義される。
ここで、本発明は天然型の抗体に関するものではなく、すなわち、それらはそれらの天然環境になく、単離可能であったか、もしくは天然源から精製によって得られたものであるか、またはさらには遺伝子組換えもしくは化学合成によって得られたものであり、また、それらは、さらに記載されるように、非天然アミノ酸を含むことができることを理解しなければならない。
【００３１】
より詳細には、本発明の別の態様によれば、単離された抗体、またはそれらの一つの機能的フラグメントもしくは誘導体が記載され、該抗体は、ＩＭＧＴナンバリングシステムによって定義される配列番号１〜６および３０〜３３のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲから選択される少なくとも一つの相補性決定領域(complementary determining region)ＣＤＲを含んでなることを特徴とする。
【００３２】
第一の態様によれば、本発明は、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って定義される配列番号１〜６の配列のＣＤＲの中から選択される少なくとも一つのＣＤＲ、または配列が最適なアライメントの後に配列番号１〜６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する少なくとも一つのＣＤＲを含んでなる、単離された抗体、またはその機能的フラグメント、もしくは誘導体に関する。
【００３３】
第二の態様によれば、本発明は、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って定義される配列番号１、２および３０〜３３の配列のＣＤＲの中から選択される少なくとも一つのＣＤＲ、または配列が最適なアライメントの後に配列番号１、２、および３０〜３３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する少なくとも一つのＣＤＲを含んでなる、単離された抗体、またはその機能的フラグメントまたは誘導体に関する。
【００３４】
抗体の「機能的フラグメント」とは、特に、フラグメントＦｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃ＝一本鎖）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、もしくはダイアボディー(diabody)、または半減期が延長された任意のフラグメントなどの抗体フラグメントを意味する。このような機能的フラグメントは本明細書の後段で詳細に記載される。
【００３５】
抗体の「誘導化合物」または「誘導体」とは、特に、ペプチド骨格(peptide scaffold)と、ＣＸＣＲ４を認識する能力を保持するための原抗体の少なくとも一つのＣＤＲとから構成される結合タンパク質を意味する。当業者に周知のこのような誘導化合物は、本明細書の後段でさらに詳細に記載される。
【００３６】
より好ましくは、本発明は、本発明による抗体、それらの誘導化合物またはそれらの機能的フラグメント、特に、キメラまたはヒト化抗体、遺伝子組換え、または化学合成によって得られる抗体を含んでなる。
【００３７】
好ましい実施形態によれば、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、モノクローナル抗体からなることを特徴とする。
【００３８】
「モノクローナル抗体」とは、ほぼ均質な抗体集団から生じる抗体を意味すると理解される。より詳細には、集団の個々の抗体は、最小の割合で見られる少数の潜在的に自然に生じる突然変異以外は同一である。言い換えれば、モノクローナル抗体は、単細胞クローン（例えば、ハイブリドーマ、その均質な抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた真核生物宿主細胞、その均質な抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた原核生物宿主細胞など）の増殖から生じる均質な抗体からなり、一般に、一つおよびただ一つのクラスおよびサブクラスの重鎖と、ただ一つの種類の軽鎖を特徴とする。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原に対するものである。加えて、種々の決定基またはエピトープに対する種々の抗体を一般に含むポリクローナル抗体の作製とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原の単一のエピトープに対するものである。
【００３９】
より詳細には、本発明の第一の好ましい実施形態によれば、抗体、またはその誘導化合物、もしくは機能的フラグメントは、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＣＤＲを含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とし、ここで、
ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号１のアミノ酸配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号２のアミノ酸配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号３のアミノ酸配列を含んでなる。
【００４０】
別の実施形態によれば、本発明の抗体、またはそれらの誘導化合物もしくは機能的フラグメントの一つは、配列番号１、２、もしくは３の配列の三つのＣＤＲのうち少なくとも一つ、または最適なアライメントの後に配列番号１、２、または３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する少なくとも一つの配列を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする。
【００４１】
本発明の抗体、またはその一つの機能的フラグメントもしくは誘導体はまた、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とし、ここで、ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号１のアミノ酸配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号２のアミノ酸配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号３のアミノ酸配列を含んでなる。
【００４２】
別の実施形態では、本発明の抗体、またはその一つの機能的フラグメントもしくは誘導体は、配列番号７のアミノ酸配列、または最適なアライメントの後に配列番号７の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する少なくとも一つの配列を含んでなる配列の軽鎖を含んでなることを特徴とする。
【００４３】
本発明の第二の好ましい実施形態によれば、抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＣＤＲを含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とし、ここで、
ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号１のアミノ酸配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号２のアミノ酸配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号３０のアミノ酸配列を含んでなる。
【００４４】
別の実施形態によれば、本発明の抗体、またはそれらの一つの誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号１、２、もしくは３０の配列の三つのＣＤＲのうち少なくとも一つ、または最適なアライメントの後に配列番号１、２、もしくは３０の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する少なくとも一つの配列を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする。
【００４５】
本発明の抗体、またはその一つの機能的フラグメントもしくは誘導体は、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とし、ここで、ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号１のアミノ酸配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号２のアミノ酸配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号３０のアミノ酸配列を含んでなる。
【００４６】
別の実施形態では、本発明の抗体、またはその一つの機能的フラグメントもしくは誘導体は、配列番号３４のアミノ酸配列、または最適なアライメントの後に配列番号３４の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する少なくとも一つの配列を含んでなる配列の軽鎖を含んでなることを特徴とする。
【００４７】
より詳細には、本発明の抗体、またはそれらの一つの誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とし、ここで、
ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号４のアミノ酸配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号５のアミノ酸配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる。
【００４８】
別の実施形態によれば、本発明の抗体、またはそれらの一つの誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号４、５、もしくは６の配列の三つのＣＤＲのうち少なくとも一つ、または最適なアライメントの後に配列番号４、５、もしくは６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する少なくとも一つの配列を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。
【００４９】
別の特定の実施形態によれば、抗体、またはそれらの一つの誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とし、ここで、ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号４のアミノ酸配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号５のアミノ酸配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる。
【００５０】
別の実施形態では、本発明の抗体、またはその一つの機能的フラグメントもしくは誘導体は、配列番号８のアミノ酸配列、または最適なアライメントの後に配列番号８の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する少なくとも一つの配列を含んでなる配列の重鎖を含んでなることを特徴とする。
【００５１】
より詳細には、本発明の抗体、またはそれらの一つの誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とし、ここで、
ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号３１のアミノ酸配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号３２のアミノ酸配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号３３のアミノ酸配列を含んでなる。
【００５２】
別の実施形態によれば、本発明の抗体、またはそれらの一つの誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号３１、３２、もしくは３３の配列の三つのＣＤＲのうち少なくとも一つ、または最適なアライメントの後に配列番号３１、３２、もしくは３３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する少なくとも一つの配列を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。
【００５３】
別の特定の実施形態によれば、抗体、またはそれらの一つの誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とし、ここで、ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号３１のアミノ酸配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号３２のアミノ酸配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号３３のアミノ酸配列を含んでなる。
【００５４】
別の実施形態では、本発明の抗体、またはその一つの機能的フラグメントもしくは誘導体は、配列番号３５のアミノ酸配列、または最適なアライメントの後に配列番号３５の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する少なくとも一つの配列を含んでなる配列の重鎖を含んでなることを特徴とする。
【００５５】
本発明の抗体、またはその一つの機能的フラグメントもしくは誘導体は、配列番号１、２、および３のアミノ酸配列をそれぞれ含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖と、配列番４、５、および６のアミノ酸配列をそれぞれ含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。
【００５６】
最後に、本発明の抗体、またはその一つの機能的フラグメントもしくは誘導体はまた、配列番号７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖と、配列番号８のアミノ酸配列を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴としうる。
【００５７】
本発明の抗体、またはその一つの機能的フラグメントもしくは誘導体は、配列番号１、２、および３０のアミノ酸配列をそれぞれ含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖と、配列番号３１、３２、および３３のアミノ酸配列をそれぞれ含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。
【００５８】
最後に、本発明の抗体、またはその一つの機能的フラグメントもしくは誘導体はまた、配列番号３４のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖と、配列番号３５のアミノ酸配列とを含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とし得る。
【００５９】
本明細書において「ポリペプチド」、「ポリペプチド配列」、「ペプチド」、および「抗体化合物またはそれらの配列と結合しているタンパク質」は互換的である。ここで、本発明は天然型の抗体に関するものではなく、すなわち、それらはそれらの天然環境から採取されたものではなく、単離されているか、または天然源から精製によって得られたものであるか、または遺伝子組換えもしくは化学合成によって得られたものであり、従って、それらは、以下に記載されるように、非天然アミノ酸を含むことができることを理解しなければならない。
【００６０】
第一の実施形態において、相補性決定領域、またはＣＤＲは、Kabatら(Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 第５版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991および後続版)によって定義される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を意味する。三つの重鎖ＣＤＲと、三つの軽鎖ＣＤＲとが存在する。ここで、「ＣＤＲ」とは、抗体が認識する抗原またはエピトープに対する抗体の結合親和性を担うアミノ酸残基の大部分を含む領域のうち１以上、またはさらには総てを示すのに用いられる。
【００６１】
第二の実施形態において、ＣＤＲ領域またはＣＤＲにより、ＩＭＧＴによって定義される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を示すものとする。
【００６２】
ＩＭＧＴユニークナンバリングは、どんな抗原受容体、鎖の種類、または種であれ、可変ドメインを比較するために定義されたものである[Lefranc M. -P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol, 27, 55-77 (2003)]。ＩＭＧＴユニークナンバリングでは、例えば、システイン２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニン、またはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）など、保存されているアミノ酸は常に同じ位置を持つ。ＩＭＧＴユニークナンバリングでは、フレームワーク領域（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１〜２６番、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５番、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４番およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８番）および相補性決定領域：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８番、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５番およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７番の標準化された画定が得られる。ギャップは占有されていない位置を表すので、ＣＤＲ−ＩＭＧＴ長（例えば、［８．８．１３］などと括弧の中に点で区切って示される）は重要な情報となる。ＩＭＧＴユニークナンバリングは、IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)]として表される２Ｄグラフ、およびIMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]に用いられる。
【００６３】
三つの重鎖ＣＤＲと、三つの軽鎖ＣＤＲとが存在する。ここで、ＣＤＲは、場合によって、抗体が認識する抗原またはエピトープに対する抗体の親和性による結合を担うアミノ酸残基の大部分を含む、これらの領域の一つまたはいくつか、またはさらにはこれらの領域の全部を示すために用いられる。
【００６４】
より明瞭にするために、以下の説明およびより詳細には表２および３では、ＣＤＲはＩＭＧＴナンバリングシステムおよびＫａｂａｔナンバリングシステムによって定義されていることを理解しなければならない。
【００６５】
ＩＭＧＴナンバリングシステムは、上記で定義されたＩＭＧＴシステムに従ってＣＤＲを定義し、Ｋａｂａｔナンバリングシステムは、上記で定義されたＫａｂａｔシステムに従ってＣＤＲを定義する。
【００６６】
より詳細には、５１５Ｈ７と呼ばれる抗体に関しては、ＣＤＲ−Ｌ１はＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号１からなり、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号９からなる。ＣＤＲ−Ｌ２に関しては、ＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号２からなり、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号１０からなる。ＣＤＲ−Ｌ３は、この二つのナンバリングシステムのそれぞれで配列番号３からなる。重鎖について、ＣＤＲ−Ｈ１は、ＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号４からなり、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号１１からなる。ＣＤＲ−Ｈ２は、ＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号５からなり、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号１２からなる。最後に、ＣＤＲ−Ｈ３は、ＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号６からなり、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号１３からなる。
【００６７】
そして、３０１ａＥ５と呼ばれる抗体に関しては、ＣＤＲ−Ｌ１は、ＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号１からなり、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号９からなる。ＣＤＲ−Ｌ２に関しては、ＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号２からなり、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号３６からなる。ＣＤＲ−Ｌ３は、ＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号３０からなり、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号３７からなる。重鎖について、ＣＤＲ−Ｈ１は、ＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号３１からなり、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号３８からなる。ＣＤＲ−Ｈ２は、ＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号３２からなり、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号３９からなる。最後に、ＣＤＲ−Ｈ３は、ＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号３３からなり、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号４０からなる。
【００６８】
本発明の意味において、二つの核酸配列またはアミノ酸配列間の「同一性割合」とは、最適なアライメントの後に得られる、比較する二つの配列間で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合を意味し、この割合は純粋に統計学的なものであり、その２配列間の違いはそれらの長さに沿ってランダムに分布している。二つの核酸配列またはアミノ酸配列の比較は従来から、それらを最適にアラインした後に配列を比較することによって行われ、この比較はセグメントによって、または「アライメントウインドウ」の使用によって行うことができる。比較のための配列の最適なアライメントは、手による比較の他、Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482]のローカル・ホモロジー・アルゴリズム、Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443]のローカル・ホモロジー・アルゴリズム、Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]またはこれらのアルゴリズムを用いたコンピューターソフトウエア（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、または匹敵するソフトウエアＢＬＡＳＴ  ＮＲもしくはＢＬＡＳＴ  Ｐによる）によって行うことができる。
【００６９】
二つの核酸配列またはアミノ酸配列間の同一性割合は、二つの最適にアラインされた配列を比較することにより決定され、ここで、比較する核酸配列またはアミノ酸配列はその二つの配列間の最適なアライメントのために参照配列に対して付加または欠失を持ちうる。同一性割合は、アミノ酸ヌクレオチドまたは残基がその二つの配列間、好ましくは二つの全配列間で同一である位置の数を求め、その同一の位置の数をアライメントウインドウの位置の総数で割り、その商に１００をかけて、その二つの配列間の同一性割合を得ることによって計算される。
【００７０】
例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlのサイトで利用可能なＢＬＡＳＴプログラム、「ＢＬＡＳＴ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」(Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol, 1999, Lett. 174:247-250)をデフォルトパラメーター（特に、パラメーターとして、「オープンギャップペナルティー」：５、および「エクステンションギャップペナルティー」：２、選択マトリックスは、例えば、このプログラムによって提案される「ＢＬＯＳＵＭ  ６２」である）とともに使用することができ、この２配列間の同一性割合は、このプログラムによって直接計算される。
【００７１】
参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を示すアミノ酸配列として、好ましい例には、参照配列、ある特定の修飾、特に、少なくとも一つのアミノ酸の欠失、付加、もしくは置換、末端切断または延長を含むものが含まれる。１以上の保存的または非保存的アミノ酸の置換の場合、置換されるアミノ酸が「等価な」アミノ酸に置き換わる置換が好ましい。ここで、「等価なアミノ酸」とは、対応する抗体および以下に定義される具体例の生物活性にいかなる修飾も与えずに構造アミノ酸の一つの取って代わり得るアミノ酸を示すものとする。
【００７２】
等価なアミノ酸は、置換されるアミノ酸との構造的相同性または生成され得る種々の抗体間の生物活性の比較試験の結果に基づいて決定される。限定されない例として、下記表１に、対応する修飾抗体の生物活性の有意な修飾をもたらさずに行い得る置換をまとめる。なお、逆の置換も同じ条件下で本来可能である。
【００７３】
【表１】
0005800802.tif 000002
【００７４】
特定の実施形態において、本発明は、ネズミ抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
【００７５】
上記に見られるように、本発明はまた、本明細書に記載される抗体に由来する化合物に関する。
【００７６】
より詳細には、本発明の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、該誘導化合物が、最初の抗体のパラトープ認識特性の総てまたは一部を保存するように、少なくとも一つのＣＤＲがグラフトされているペプチド骨格を含んでなる結合タンパク質からなることを特徴とする。
【００７７】
また、本発明に記載されるＣＤＲ配列のうち１以上の配列が種々の免疫グロブリンタンパク質骨格(scaffolding)に存在してもよい。この場合、このタンパク質配列によって、グラフトされたＣＤＲの折りたたみに有利なペプチド骨格を再び作り出して、それらのパラトープ抗原認識特性を保存可能とすることができる。
【００７８】
一般に、当業者は、元の抗体に由来するＣＤＲの少なくとも一つをグラフトするためのタンパク質骨格(scaffolding)の種類をどのように決めればよいかを知っている。より詳細には、選択されたこのような骨格は次のような基準の最大数を満たさなければならないことが知られている(Skerra A., J. Mol. Recogn., 2000, 13:167-187)：
−系統発生的保存が良好であること、
−三次元構造が既知であること（例えば、結晶学、ＮＭＲ分光法または当業者に公知の他のいずれかの方法による）、
−小型であること、
−転写後修飾が少ないか、または全く無いこと、および／または
−産生、発現、および精製が容易なこと。
【００７９】
このようなタンパク質骨格の起源は、限定されるものではないが、フィブロネクチンおよび優先的にはフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１０、リポカリン、アンチカリン(Skerra A., J. Biotechnol., 2001, 74(4):257-75)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)のタンパク質ＡのドメインＢに由来するタンパク質Ｚ、チオレドキシンＡまたは「アンキリンリピート」(Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705)、「アルマジロリピート」、「ロイシンリッチリピート」および「テトラトリコペプチドリピート」などの繰り返しモチーフを有するタンパク質の中から選択される構造物であり得る。
【００８０】
例えば、サソリ、昆虫、植物、軟体動物などの毒素、およびニューロンＮＯシンターゼ（ＰＩＮ）のタンパク質阻害剤といった毒素に由来する骨格も挙げておくべきであろう。
限定されるものではないが、このようなハイブリッド構築物の例として、ＰＩＮのループの一つにおける抗ＣＤ４抗体、すなわち１３Ｂ８．２のＣＤＲ−Ｈ１（重鎖）挿入があり、このようにして得られた新たな結合タンパク質は元の抗体と同じ結合特性を保存している(Bes et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006, 343(1), 334-344)。単に例示であるが、ネオカルチノスタチンのループの一つに抗リゾチームＶＨＨ抗体のＣＤＲ−Ｈ３（重鎖）をグラフトすることも挙げられる。
【００８１】
最後に、上記のように、このようなペプチド骨格は、元の抗体に由来するＣＤＲの少なくとも一つを含んでなり得る。必ずしも必要というわけではないが、好ましくは、当業者は重鎖由来の少なくとも一つのＣＤＲを選択することができ、これは抗体の特異性を主として担うことが知られている。１以上の適切なＣＤＲを選択することは当業者には自明であり、当業者ならば、次に好適な既知技術を選択することができる(Bes et al., FEBS letters 508, 2001, 67-74)。
【００８２】
本発明の特定の態様は、本発明による抗体に由来する化合物を選択する方法に関し、該誘導化合物はin vitroおよび／またはin vivoにおいてＨＩＶの細胞侵入を阻害することができ、該誘導化合物は、少なくとも一つの抗体ＣＤＲがグラフトされているペプチド骨格を含んでなり、該方法は、
ａ）少なくとも一つの抗体ＣＤＲがグラフトされているペプチド骨格ペプチド骨格から構成される化合物を、ＨＩＶ  １型とＰＢＭＣを含有する生体サンプルと接触させる工程、および
ｂ）該化合物がＨＩＶ−１複製を阻害することができる場合、その化合物を選択する工程
を含んでなり、
少なくとも一つのグラフトされるＣＤＲが、配列番号１〜６および３０〜３３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号１〜６および３０〜３３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲの中から選択されることを特徴とする。
【００８３】
好ましい様式によれば、該方法は、工程ａ）において、少なくとも二つまたは三つの抗体ＣＤＲがグラフトされているペプチド骨格を含んでなる化合物をin vitroで接触させることを含み得る。
【００８４】
この方法のさらに好ましい様式によれば、ペプチド骨格は、構造が上記された骨格または結合タンパク質の中から選択される。
【００８５】
明らかに、これらの例は何ら限定されず、当業者に既知または自明の他のいずれの構造も、本特許出願によって付与される保護に包含されるものと考えるべきである。
【００８６】
よって、本発明は、ペプチド骨格が、ａ）系統発生的によく保存されているタンパク質、ｂ）ロバストな(robust)構造のタンパク質、ｃ）周知の３Ｄ分子構成を有するタンパク質、ｄ）小型のタンパク質、および／またはｅ）安定性を変化させずに欠失および／または挿入によって改変することができる領域を含んでなるタンパク質の中から選択されることを特徴とする抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
【００８７】
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、該ペプチド骨格が、ｉ）フィブロネクチンに由来する骨格、優先的にはフィブロネクチン３型ドメイン１０、リポカリン、アンチカリン、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)のタンパク質ＡのドメインＢに由来するタンパク質Ｚ、チオレドキシンＡまたは「アンキリンリピート」(Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705)、「アルマジロリピート」、「ロイシンリッチリピート」および「テトラトリコペプチドリピート」などの繰り返しモチーフを有するタンパク質、またはｉｉｉ）ニューロンＮＯシンターゼ（ＰＩＮ）タンパク質阻害剤の中から選択されることを特徴とする。
【００８８】
本発明の別の態様は、上記抗体の機能的フラグメントに関する。
【００８９】
より詳細には、本発明は、機能的フラグメントがフラグメントＦｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、およびダイアボディー、またはＰＥＧ化フラグメントなどの半減期が延長された任意のフラグメントの中から選択されることを特徴とする抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを対象とする。
【００９０】
本発明による抗体のこのような機能的フラグメントは、例えば、フラグメントＦｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃ＝一本鎖）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃまたはダイアボディー、またはポリエチレングリコール（ペグ化）などのポリアルキレングリコールの付加といった化学修飾によって（ＰＥＧ化フラグメントはＦｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧおよびＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれる）、またはリポソーム、ミロスフェア、またはＰＬＧＡに組み込むことによって半減期が延長された任意のフラグメントからなり、該フラグメントは、特に、それが由来する抗体の全般的活性、さらには部分的活性であっても示し得る本発明の特徴的なＣＤＲの少なくとも一つを有する。
【００９１】
好ましくは、該機能的フラグメントは、それらが由来する抗体の可変重鎖または軽鎖の部分的配列を含んでなるか、または含み、該部分的配列は、それが由来する抗体と同様の結合特異性および十分な親和性、好ましくはそれが由来する抗体の親和性の少なくとも１／１００、より好ましくは少なくとも１／１０の親和性を保持するのに十分なものである。
【００９２】
このような機能的フラグメントは、それが由来する抗体の配列の少なくとも５つのアミノ酸、好ましくは、６、７、８、１０、１５、２５、５０、または１００個の連続するアミノ酸を含む。
好ましくは、これらの機能的フラグメントは、それらが由来する抗体と一般に同様の結合特異性を有する、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、またはダイアボディータイプのものである。本発明によれば、本発明の抗体のフラグメントは、上記の抗体からペプシンもしくはパパインを含む酵素消化、および／または化学的還元によるジスルフィド結合の切断などの方法によって得ることができる。該抗体フラグメントはまた、これもまた当業者に公知の組換え遺伝子技術によって、または例えば、Applied BioSystemsなどによって販売されているものなどの自動ペプチド合成装置の手段によるペプチド合成によって得ることができる。
さらに明確にするために、下表２に、本発明の抗体に相当する種々のアミノ酸配列をまとめる。
【００９３】
【表２】
0005800802.tif 000003
【００９４】
本発明の抗体対象の特に重要な付加的態様は、それらが抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）などのエフェクター機能を示さないことを特徴とする。
【００９５】
より詳細には、一つの例として、本発明の抗体、またはそれらの一つの機能的フラグメントもしくは誘導体は、ＦｃγＲ（Ｉ、ＩＩ、もしくはＩＩＩ）に対して、またはＣ１ｑに対して、またはその双方に対して親和性を持たない。
【００９６】
構造的に、これは、当業者にとって、本発明の抗体、またはそれらの一つの機能的フラグメントもしくは誘導体が、Ｆｃ部分を欠いていること、またはそれらのＦｃ部分がエフェクター機能を付与し得る適切なグリコシル化を与えないことを意味する。
【００９７】
この結果が、本発明の抗体は好ましくはＩｇＧ４またはＩｇＧ２イソ型、最も好ましくはＩｇＧ４イソ型から選択されるということである。
【００９８】
同様に、好ましいフラグメントは、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは一本鎖）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメントもしくはダイアボディー、またはポリ（エチレン）グリコール（「ペグ化」）（ペグ化フラグメントはＦｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧ、またはＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれる）（「ＰＥＧ」はポリ（エチレン）グリコール）などのポリ（アルキレン）グリコールの付加のような化学的修飾によって、またはリポソームへの組み込みによって半減期が延長された任意のフラグメントといった、ＡＤＣＣを欠いているフラグメントである。
【００９９】
より詳細には、抗体５１５Ｈ７由来の本発明の好ましい機能的フラグメントはｓｃＦｖであり、以下、５１５Ｈ７  ｓｃＦｖ−Ｃｋフラグメントと呼ばれ、配列番号５４のアミノ酸配列を含んでなる。
【０１００】
該ｓｃＦｖに相当するヌクレオチド配列は、配列番号５５の配列を含んでなる。
【０１０１】
本発明の別の特定の態様は、抗体がまたマウスとは異種の、特にヒトの抗体に由来する軽鎖および重鎖定常領域も含んでなることを特徴とする、キメラ抗体、またはそれらの誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
【０１０２】
本発明のさらに別の態様は、ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域がそれぞれλまたはκ領域およびγ−２または好ましくはγ−４領域であることを特徴とする、ヒト化抗体、またはそれらの誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
【０１０３】
本発明の抗体はまた、キメラ抗体またはヒト化抗体も含んでなる。
【０１０４】
キメラ抗体は、所与の種に由来する天然可変領域（軽鎖および重鎖）を所与の種とは異種の抗体の軽鎖および重鎖の定常領域と組み合わせて含むものである。
【０１０５】
抗体、またはそのキメラフラグメントは、組換え遺伝子技術を用いて作製することができる。例えば、該キメラ抗体は、プロモーターと、本発明の非ヒト、特にネズミモノクローナル抗体の可変領域をコードする配列、およびヒト抗体定常領域をコードする配列を含む組換えＤＮＡをクローニングすることによって作製することができる。このような組換え遺伝子の一つによってコードされる本発明によるキメラ抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラであってよく、この抗体の特異性はネズミＤＮＡに由来する可変領域によって決定され、そのイソ型はヒトＤＮＡに由来する定常領域によって決定される。キメラ抗体の作製方法については、Verhoeynら(BioEssays, 8:74, 1988)を参照。
【０１０６】
以下の表３に、本発明によるキメラ抗体５１５Ｈ７（ｃ５１５Ｈ７またはＣ５１５Ｈ７と呼ばれる）の種々の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列をまとめる。
【０１０７】
【表３】
0005800802.tif 000004
【０１０８】
この抗体ｃ５１５Ｈ７重鎖配列番号５６〜５８および軽鎖配列番号５９に相当するヌクレオチド配列はそれぞれ、配列番号６０〜６３（重鎖）および配列番号６４（軽鎖）の配列に相当する。
【０１０９】
好ましい実施形態では、これらの重鎖配列はそれらのＣ末端からリシン残基（ＬｏｎｚａからのｐＣｏｎＰｌｕｓベクター系統原株：ｐＣｏｎＰｌｕｓγ４ΔＫ、ｐＣｏｎＰｌｕｓγ４ＰＲＯΔＫ、およびｐＣｏｎＰｌｕｓγ２ΔＫに見られる）が欠失されている。
【０１１０】
さらに、Ｇ４ＰＲＯ重鎖は、半抗体の形成を避けるためにヒンジ領域に突然変異を有するヒトＩｇＧ４イソ型に相当する。この突然変異は、Ｌｏｎｚａからの親株ｐＣｏｎＰｌｕｓγ４ＰＲＯΔＫに見られる[Angal S, King DJ, Bodmer MW, Turner A, Lawson AD, Roberts G, Pedley B, Adair JR. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody. Mol Immunol. (1993);30(1):105-108]。
【０１１１】
より詳細には、本発明は、種々の哺乳類種に由来する抗体の対応するＣＤＲに相同なＣＤＲを含んでなることを特徴とするキメラ抗体重鎖に関し、ここで、該ＣＤＲは、ＩＭＧＴによれば、配列番号４、５、および６の配列をそれぞれ含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３からなる。
【０１１２】
より詳細には、本発明は、種々の哺乳類種に由来する抗体の対応するＣＤＲに相同なＣＤＲを含んでなることを特徴とするキメラ抗体軽鎖に関し、ここで、該ＣＤＲは、ＩＭＧＴによれば、配列番号１、２、および３の配列をそれぞれ含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３からなる。
【０１１３】
より詳細には、本発明は、種々の哺乳類種に由来する抗体の対応するＣＤＲに相同なＣＤＲをそれぞれ有する重鎖および軽鎖を含んでなることを特徴とするキメラ抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関し、ここで、該ＣＤＲは、ＩＭＧＴによれば、配列番号４、５、および６の配列をそれぞれ含んでなる重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３と、配列番号１、２、および３の配列をそれぞれ含んでなる軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３からなる。
【０１１４】
別の実施形態では、本発明は、配列番号８からなる配列の重鎖可変領域と、配列番号７の配列の軽鎖可変領域とを含んでなるキメラ抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
【０１１５】
さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号５６、５７、または５８からなる群から選択される配列の重鎖と、配列番号５９の配列の軽鎖とを含んでなるキメラ抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
【０１１６】
好ましい実施形態では、本発明によるキメラ抗体ｃ５１５Ｈ７  ＶＨ（Ｇ４ｗｔ）／ＶＬ−Ｃｋ、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号５６の配列の重鎖可変領域と、配列番号５９の配列の軽鎖可変領域とを含んでなる。
【０１１７】
好ましい実施形態では、本発明によるキメラ抗体ｃ５１５Ｈ７  ＶＨ（Ｇ４ＰＲＯ）／ＶＬ−Ｃｋ、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号５７の配列の重鎖可変領域と、配列番号５９の配列の軽鎖可変領域とを含んでなる。
【０１１８】
好ましい実施形態では、本発明によるキメラ抗体ｃ５１５Ｈ７  ＶＨ（Ｇ２ｗｔ）／ＶＬ−Ｃｋ、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号５８の配列の重鎖可変領域と、配列番号５９の配列の軽鎖可変領域とを含んでなる。
【０１１９】
「ヒト化抗体」とは、非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲ領域を含み、その抗体分子の他の部分が一つの（または複数の）ヒト抗体に由来する抗体を意味する。さらに、骨格セグメント残基（ＦＲと呼ばれる）のいくつかは、結合親和性を保存するように改変することができる(Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986、 Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988、 Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988)。
【０１２０】
本発明のヒト化抗体またはそのフラグメントは、当業者に公知の技術（例えば、Singer et al., J. Immun., 150:2844-2857, 1992、 Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992、およびBebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992の文献に記載されているもの）によって作製することができる。このようなヒト化抗体は、in vitro診断を含む方法またはin vivoにおける予防的および／もしくは治療的処置における使用に好ましい。他のヒト化技術も当業者に公知であり、例えば、欧州特許第０４５１２６１号公報、同第０６８２０４０号公報、同第０９３９１２７号公報、同第０５６６６４７号公報、または米国特許第５，５３０，１０１号公報、同第６，１８，３７０号公報、同第５，５８５，０８９号公報、および同第５，６９３，７６１号公報においてＰＤＬが記載している「ＣＤＲグラフト」法がある。米国特許第５，６３９，６４１号公報または同第６，０５４，２９７号公報、同第５，８８６，１５２号公報、および同第５，８７７，２９３号公報も引用することができる。
【０１２１】
さらに、本発明はまた、上記のネズミ抗体に由来するヒト化抗体に関する。
好ましい様式では、ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域はそれぞれ、λまたはκおよびγ−２または好ましくはγ−４領域である。
【０１２２】
より詳細には、本発明は、ｉ）対応するヒト抗体重鎖のフレームワーク領域に相同なフレームワーク領域と、ｉｉ）種々の哺乳類種に由来する抗体の対応するＣＤＲに相同なＣＤＲとを含んでなることを特徴とするヒト化抗体重鎖に関し、ここで、該ＣＤＲは、ＩＭＧＴによれば、配列番号４、５、および６の配列をそれぞれ含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３からなる。
【０１２３】
別の実施形態では、本発明は、配列番号６４からなる配列の可変領域を含んでなるヒト化抗体重鎖に関する。
さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号６７、６８、および６９からなる群から選択される完全な配列を含んでなるヒト化抗体重鎖に関する。より詳細には、本発明は、ヒト抗体軽鎖の対応するフレームワーク領域に相同なフレームワーク領域と、ｉｉ）種々の哺乳類種に由来する抗体の対応するＣＤＲに相同なＣＤＲとを含んでなることを特徴とするヒト化抗体軽鎖に関し、ここで、該ＣＤＲは、ＩＭＧＴによれば、配列番号１、２、および３の配列をそれぞれ含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３からなる。
【０１２４】
別の実施形態では、本発明は、配列番号６５、６６、８２、または８３からなる群から選択される配列の可変領域を含んでなるヒト化抗体軽鎖に関する。
【０１２５】
さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号７０、７１、８４、または８５のからなる群から選択される完全な配列を含んでなるヒト化抗体軽鎖に関する。
【０１２６】
より詳細には、本発明は、ｉ）ヒト抗体の対応するフレームワーク領域に相同なフレームワーク領域と、ｉｉ）種々の哺乳類種に由来する抗体の対応するＣＤＲに相同なＣＤＲをそれぞれ有する重鎖および軽鎖を含んでなることを特徴とするヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関し、ここで、該ＣＤＲは、ＩＭＧＴによれば、配列番号４、５、および６の配列をそれぞれ含んでなる重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３と、配列番号１、２、および３の配列をそれぞれ含んでなる軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３からなる。
【０１２７】
別の実施形態では、本発明は、配列番号６４からなる配列の重鎖可変領域と、配列番号６５、６６、８２、または８３からなる群から選択される配列の軽鎖可変領域とを含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
【０１２８】
さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号６７、６８、または６９からなる群から選択される配列の重鎖と、配列番号７０、７１、８４または８５からなる群から選択される配列の軽鎖とを含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
好ましい実施形態では、本発明によるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ（Ｇ４ｗｔ）／ＶＬ２−Ｃｋ、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号６７の配列の重鎖と、配列番号７０の配列の軽鎖とを含んでなる。
【０１２９】
別の好ましい実施形態では、本発明によるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ（Ｇ４ＰＲＯ）／ＶＬ２−Ｃｋ、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号６８の配列の重鎖と、配列番号７０の配列の軽鎖とを含んでなる。
【０１３０】
別の好ましい実施形態では、本発明によるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ（Ｇ２ｗｔ）／ＶＬ２−Ｃｋ、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号６９の配列の重鎖と、配列番号７０の配列の軽鎖とを含んでなる。
【０１３１】
別の好ましい実施形態では、本発明によるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ（Ｇ４ｗｔ）／ＶＬ２．１−Ｃｋ、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号６７の配列の重鎖と配列番号７１の配列の軽鎖とを含んでなる。
【０１３２】
別の好ましい実施形態では、本発明によるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ（Ｇ４ＰＲＯ）／ＶＬ２．１−Ｃｋ、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号６８の配列の重鎖と配列番号７１の配列の軽鎖とを含んでなる。
【０１３３】
別の好ましい実施形態では、本発明によるヒト化抗体  Ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ（Ｇ２ｗｔ）／ＶＬ２．１−Ｃｋ、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号６９の配列の重鎖と、配列番号７１の配列の軽鎖とを含んでなる。
【０１３４】
別の好ましい実施形態では、本発明によるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ（Ｇ４ｗｔ）／ＶＬ２．２−Ｃｋ、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号６７の配列の重鎖と、配列番号８４の配列の軽鎖とを含んでなる。
【０１３５】
別の好ましい実施形態では、本発明によるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ（Ｇ４ＰＲＯ）／ＶＬ２．２−Ｃｋ、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号６８の配列の重鎖と、配列番号８４の配列の軽鎖とを含んでなる。
【０１３６】
別の好ましい実施形態では、本発明によるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ（Ｇ２ｗｔ）／ＶＬ２．２−Ｃｋ、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号６９の配列の重鎖と、配列番号８４の配列の軽鎖とを含んでなる。
【０１３７】
別の好ましい実施形態では、本発明によるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ（Ｇ４ｗｔ）／ＶＬ２．３−Ｃｋ、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号６７の配列重鎖と、配列番号８５の配列の軽鎖とを含んでなる。
【０１３８】
別の好ましい実施形態では、本発明によるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ（Ｇ４ＰＲＯ）／ＶＬ２．３−Ｃｋ、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号６８の配列の重鎖と、配列番号８５の配列の軽鎖とを含んでなる。
【０１３９】
別の好ましい実施形態では、本発明によるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ（Ｇ２ｗｔ）／ＶＬ２．３−Ｃｋ、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号６９の配列の重鎖と、配列番号８５の配列の軽鎖とを含んでなる。
【０１４０】
以下の表４に、本発明によるヒト化抗体５１５Ｈ７の、それぞれ種々の重鎖および軽鎖可変ドメインおよび全長（または完全）アミノ酸配列をまとめる。
【０１４１】
【表４】
0005800802.tif 000005
【０１４２】
好ましい実施形態では、これらの重鎖配列はそれらのＣ末端からリシン残基（ＬｏｎｚａからのｐＣｏｎＰｌｕｓベクター系統原株：ｐＣｏｎＰｌｕｓγ４ΔＫ、ｐＣｏｎＰｌｕｓγ４ＰＲＯΔＫ、およびｐＣｏｎＰｌｕｓγ２ΔＫに見られる）が欠失されている。
【０１４３】
さらに、Ｇ４ＰＲＯ重鎖は、半抗体の形成を避けるためにヒンジ領域に突然変異を有するヒトＩｇＧ４イソ型に相当する。この突然変異は、Ｌｏｎｚａからの親株ｐＣｏｎＰｌｕｓγ４ＰＲＯΔＫに見られる[Angal S, King DJ, Bodmer MW, Turner A, Lawson AD, Roberts G, Pedley B, Adair JR. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody. Mol Immunol. (1993);30(1):105-108]。
【０１４４】
一例として、疑念を避けるため、「ＶＨ１」は、「ＶＨ  Ｖａｒｉａｎｔ  １」、「ＶＨ  ｖａｒｉａｎｔ  １」、「ＶＨ  Ｖａｒ  １」、または「ＶＨ  ｖａｒ  １」と同様である。
【０１４５】
上記で例示されたＶＨ／ＶＬの組合せに限定されないと理解すべきである。当業者は、当然のことながら、過度な負担無く、また、発明性のある技術を用いずに、本明細書で開示されたＶＨおよびＶＬを総て再配列することができるであろう。
【０１４６】
本発明の新規な態様は、以下の核酸（縮重遺伝コードを含む）：
ａ）本発明による抗体、またはその一つの機能的フラグメントもしくは誘導体をコードする核酸、ＤＮＡ、またはＲＮＡ、
ｂ）配列番号１４〜１９および４１〜４５からなる配列群から選択されるＤＮＡ配列を含んでなる核酸、
ｃ）配列番号２０、２１、４６、および４７からなる配列群から選択されるＤＮＡ配列を含んでなる核酸、
ｄ）ｂ）またはｃ）に定義される核酸の、対応するＲＮＡ核酸、
ｅ）ａ）、ｂ）およびｃ）に定義される核酸の相補的核酸、および
ｆ）配列番号１４〜１９および４１〜４５の配列のＣＤＲの少なくとも一つと高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる少なくとも１８ヌクレオチドの核酸
から選択されることを特徴とする単離された核酸に関する。
【０１４７】
下表５に、本発明の抗体に関する種々のヌクレオチド配列をまとめる。
【０１４８】
【表５】
0005800802.tif 000006
【０１４９】
本明細書において互換的に用いられる「核酸」、「核配列」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、および「ヌクレオチド配列」は、非天然ヌクレオチドを含む、または含まない、また二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、またはこれらのＤＮＡの転写産物のいずれかである核酸のフラグメントまたは領域を規定する、修飾または非修飾のヌクレオチドの正確な配列を意味する。
【０１５０】
ここでまた、本発明はそれらの天然の染色体環境の、すなわち天然状態のヌクレオチド配列には関しないということを含めておくべきである。本発明の配列は単離および／または精製されており、すなわち、それらは直接、または例えばコピーによって間接的にサンプリングされており、それらの環境は少なくとも部分的に改変されている。例えば宿主細胞の手段による組換え遺伝子技術によって得られた、または化学合成によって得られた単離された核酸もここに挙げておくべきであろう。
【０１５１】
「最適なアライメントの後に好ましい配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性割合を示す核配列」とは、参照核配列に比べて、特に、欠失、末端切断、延長、キメラ融合、および／または置換、特に規則的なものなどの、ある種の改変を示す核配列を意味する。好ましくは、これらは参照配列と同じアミノ酸配列をコードする配列であり、これは遺伝コードの縮重、または好ましくは高ストリンジェント条件（特に以下に定義されるもの）下で参照配列と特異的にハイブリダイズし得る相補的配列に関連づけられる。
【０１５２】
高ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションとは、温度およびイオン強度に関する条件が、相補的ＤＮＡフラグメントの間でハイブリダイゼーションの維持を可能となるように選択される。単に例として、上記のポリヌクレオチドフラグメントを定義する目的でのハイブリダイゼーション工程の高ストリンジェント条件は有利には次の通りである。ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは、（１）５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムの溶液に相当する）、５０％ホルムアミド、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０×デンハート溶液、５％デキストラン硫酸、および１％サケ精子ＤＮＡを含むリン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）中、４２℃で３時間のプレハイブリダイゼーション、（２）プローブの長さに応じた温度（すなわち、プローブ＞１００ヌクレオチド長では４２℃）で２０時間の主ハイブリダイゼーションと、その後の２×ＳＳＣ＋２％ＳＤＳ中、２０℃での２０分の洗浄２回、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中、２０℃での２０分の洗浄１回という２段階で行う。最後の洗浄は、プローブ＞１００ヌクレオチド長では６０℃で、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中、３０分間行う。大きさの定義されたポリヌクレオチドに対する上記の高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、それより長いまたは短いオリゴヌクレオチドに関しては、Sambrookら(Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory、第3版, 2001)に記載されている手順に従い、当業者によって適合させることができる。
【０１５３】
本発明はまた、以下の核酸：
ａ）本発明によるヒト化抗体重鎖、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントをコードする核酸、ＤＮＡ、またはＲＮＡ、
ｂ）本発明によるヒト化抗体軽鎖、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントをコードする核酸、ＤＮＡ、またはＲＮＡ、
ｃ）本発明によるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメンをコードする核酸、ＤＮＡ、またはＲＮＡ、
ｄ）ａ）、ｂ）、またはｃ）に定義される核酸と相補的な核酸、
ｅ）高ストリンジェント条件下で配列番号７２または７５〜７７の核酸配列を含んでなる少なくとも重鎖とハイブリダイズすることができる少なくとも１８ヌクレオチドの核酸、
ｆ）高ストリンジェント条件下で配列番号７３、７４、８６、８７、または７８、７９、８８、８９の核酸配列を含んでなる少なくとも軽鎖とハイブリダイズすることができる少なくとも１８ヌクレオチドの核酸、
の中から選択されることを特徴とする、単離された核酸分子を包含する。
【０１５４】
以下の表６に、本発明によるヒト化抗体５１５Ｈ７のそれぞれ種々の重鎖および軽鎖可変ドメインおよび全長（または完全）ヌクレオチド配列をまとめる。
【０１５５】
【表６】
0005800802.tif 000007
【０１５６】
以下の表７に、本発明によるキメラ抗体５１５Ｈ７の種々の重鎖および軽鎖のヌクレオチド配列をまとめる。
【０１５７】
【表７】
0005800802.tif 000008
【０１５８】
言い換えれば、本発明は、以下の核酸：
ａ）本発明による抗体、またはその一つの機能的フラグメントもしくは誘導体をコードする核酸、ＤＮＡ、またはＲＮＡ、
ｂ）配列番号１４〜１９および４１〜４５からなるＣＤＲ配列群から選択されるＤＮＡ配列を含んでなる核酸、
ｃ）配列番号２０、２１、４６、４７、７２、７３、７４、８６、および８７からなる重鎖および軽鎖可変ドメイン配列群から選択されるＤＮＡ配列を含んでなる核酸、
ｄ）配列番号６０〜６３、７５〜７９、８８、および８９からなる重鎖および軽鎖配列群から選択されるＤＮＡ配列を含んでなる核酸、
ｅ）配列番号５５からなるＤＮＡ配列を含んでなる核酸、
ｆ）ｂ）、ｃ）、ｄ）、またはｅ）に定義される核酸の、対応するＲＮＡ核酸、
ｇ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、およびｅ）に定義される核酸の相補的核酸、および
ｈ）高ストリンジェンシー条件下で配列番号１４〜１９および４１〜４５の配列のＣＤＲの少なくとも一つとハイブリダイズすることができる少なくとも１８のヌクレオチドの核酸
から選択されることを特徴とする、単離された核酸を取り扱う。
【０１５９】
本発明はまた、本明細書に記載される核酸を含んでなるベクターに関する。
本発明は特に、このようなヌクレオチド配列を含むクローニングおよび／または発現ベクターを対象とする。
【０１６０】
本発明のベクターは、好ましくは、所与の宿主細胞においてヌクレオチド配列の発現および／または分泌を可能とするエレメントを含む。よって、このベクターは、プロモーター、翻訳開始、および終結シグナル、ならびに好適な転写調節領域を含まなければならない。ベクターは宿主細胞において安定な様式で維持可能でなければならず、所望により、翻訳されたタンパク質の分泌を条件として指定する特異的シグナルを有してもよい。これらの種々のエレメントは、使用する宿主細胞に応じて、当業者により選択され、至適化される。この目的で、これらのヌクレオチド配列は、選択された宿主内で自己複製するベクターに挿入することもできるし、または選択された宿主の組込型ベクターであってもよい。
【０１６１】
このようなベクターは、当業者により一般に用いられる方法によって作製され、得られたクローンは、リポフェクション、エレクトロポレーション、熱ショック、また化学法などの標準的な方法によって好適な宿主に導入することができる。これらのベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルス起源のベクターである。それらを用いて、本発明のヌクレオチド配列をクローニングする、または発現させるために宿主細胞を形質転換することができる。
【０１６２】
本発明はまた、本発明に記載されているベクターにより形質転換された、または本発明に記載されているベクターを含んでなる宿主細胞も含んでなる。
【０１６３】
宿主細胞は、細菌細胞、例えば、酵母細胞または動物細胞、特に、哺乳類細胞などの原核生物系、または真核生物系の中から選択することができる。また、昆虫または植物細胞も使用可能である。
【０１６４】
本発明はまた、本発明による形質転換細胞を有するヒト以外の動物に関する。
【０１６５】
本発明の別の態様は、本発明による抗体、またはその一つの機能的フラグメントの作製方法であって、以下の工程を含んでなることを特徴とする方法に関する：
ａ）本発明による宿主細胞の培地および好適な培養条件での培養工程、および
ｂ）このようにして生産された該抗体、またはその一つの機能的フラグメントの、該培養培地からの、または該培養細胞からの回収工程。
【０１６６】
本発明による形質転換細胞は、本発明による組換えポリペプチドの作製方法に用いられる。また、本発明によるベクターおよび／またはベクターによって形質転換された細胞を使用することを特徴とする、本発明によるポリペプチドの組換え型での作製方法も本発明に含まれる。好ましくは、本発明によるベクターによって形質転換された細胞は、上記のポリペプチドの発現および該組換えペプチドの回収を可能とする条件下で培養される。
【０１６７】
すでに述べたように、宿主細胞は原核生物系または真核生物系の中から選択することができる。特に、このような原核生物系または真核生物系において分泌を助ける本発明のヌクレオチド配列を同定することが可能である。よって、このような配列を有する本発明によるベクターは、有利には分泌させる組換えタンパク質の生産のために使用することができる。実際、これらの着目する組換えタンパク質の精製は、宿主細胞内ではなく細胞培養の上清に存在するということによって容易となる。
【０１６８】
本発明のポリペプチドはまた、化学合成によっても製造することができる。このような製造方法の一つも本発明の目的である。当業者は、固相技術（特に、Steward et al., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111,第2版参照）または部分固相技術、フラグメントの縮合または溶液中での従来の合成などの化学合成法を知る。化学合成によって得られ、対応する非天然アミノ酸を含み得るポリペプチドもまた、本発明に含まれる。
【０１６９】
本発明の方法によって得られる可能性のある抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントも本発明に含まれる。
【０１７０】
さらに別の態様によれば、本発明は、ヒトケモカインファミリー受容体と特異的に結合することができ、および／またはＸ４指向性ＨＩＶ複製を特異的に阻害することができることをさらに特徴とする、上記のような抗体に関する。
【０１７１】
さらに別の態様によれば、本発明は、ヒトケモカインファミリー受容体と特異的に結合することができ、および／またはＸ４／Ｒ５指向性ＨＩＶ複製を特異的に阻害することができることを特徴とする、上記のような抗体に関する。
【０１７２】
新規な実施形態によれば、本発明は、例えば、ＣＣＲ５、ＣＤ４、ＣＸＣＲ４（本発明の抗体以外の、すなわち、別のエピトープを標的とする）またはＣＣＲ３、ＣＣＲ２、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７、ＣＸ３ＣＲ１などのＨＩＶの細胞侵入に関与する受容体と相互作用することができる第二のモチーフを含んでなるという意味で二重特異性である抗体からなる抗体、またはそれらの誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
【０１７３】
二重特異性または二官能性抗体は、二つの異なる可変領域が同じ分子において組み合わされている第二世代のモノクローナル抗体を構成する(Hollinger and Bohlen, 1999, Cancer and metastasis, rev. 18:411-419)。それらの有用性は、細胞表面のいくつかの分子を標的とするそれらの能力に関して診断用ドメインおよび治療用ドメインの双方で実証されており、このような抗体は化学法(Glennie MJ et al., 1987, J. Immunol. 139, 2367-2375、 Repp R. et al., 1995, J. Hemat., 377-382)または体細胞法(Staerz U.D. and Bevan M.J., 1986, PNAS 83, 1453-1457、 Suresh M.R. et al., 1986, Method Enzymol, 121:210-228)によるだけでなく、優先的には、求める抗体にヘテロ二量体形成を課し、従ってその抗体の精製を容易にすることを可能とする遺伝子操作技術(Merchand et al., 1998, Nature Biotech., 16:677-681)によって得ることができる。
【０１７４】
これらの二重特異性抗体は、完全なＩｇＧ、二重特異性Ｆａｂ’２、Ｆａｂ’ＰＥＧ、ダイアボディー、または二重特異性ｓｃＦｖとして構築できるだけではなく、標的とされる各抗原に対して二つの結合部位が存在する四価二重特異性抗体(Park et al, 2000, Mol. Immunol, 37(18):1123-30)または上記のようなそのフラグメントとしても構築できる。
【０１７５】
一つの二重特異性抗体の製造および投与が、二つの特異的抗体の製造よりも安くつくことを考えた場合の経済的利点に加え、このような二重特異性抗体の使用は処置の毒性を軽減するという利点も持つ。実際、二重特異性抗体を使用すると、循環する抗体の総量を減らすことができ、結果として毒性が軽減される。
【０１７６】
本発明の好ましい実施形態においては、二重特異性抗体は二価または四価抗体である。
【０１７７】
最後に、本発明は、薬剤としての上記の抗体、またはそれらの一つの機能的フラグメントもしくは誘導体に関する。
【０１７８】
本発明はまた、本発明の抗体、またはその一つの機能的フラグメントもしくは誘導体からなる化合物を有効成分として含んでなる医薬組成物に関する。好ましくは、該抗体は賦形剤および／または薬学上許容される担体を追加する。
【０１７９】
本発明はまた、薬剤としての上記のような組成物に関する。
本発明の特定の態様では、抗体、またはその一つの機能的フラグメントもしくは誘導体、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１  ＫＯＮ一次単離物の複製を、少なくとも５μｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１０μｇ／ｍｌのＩＣ９０で阻害する。
【０１８０】
本発明はまた、ＨＩＶ感染の予防または治療のための薬物および／または薬剤の製造のための本発明による抗体または組成物の使用を含んでなる。
【０１８１】
より詳細には、限定されるものではないが、該ＨＩＶ感染はＸ４指向性ＨＩＶ感染である。
【０１８２】
別の実施形態では、限定されるものではないが、該ＨＩＶ感染はＸ４／Ｒ５指向性ＨＩＶ感染である。
【０１８３】
本発明はまた、ＨＩＶ複製を阻害するための薬物の製造のための、本発明による抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体、好ましくは、ヒト化されたもの、および／または組成物の使用に関する。一般に、本発明は、ＨＩＶ疾患の予防または治療のための薬物の製造のための、抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体、好ましくは、ヒト化されたもの、および／または組成物の使用に関する。
【０１８４】
本明細書において、「医薬ビヒクル」とは、二次反応を引き起こさず、かつ、例えば、有効化合物の投与を容易にするか、生物内でのその寿命を延長し、および／または有効性を高めるか、溶液中でのその溶解度を高めるか、またはその貯蔵性を高める化合物、または化合物の組合せ（医薬組成物を含む）を意味する。このような医薬担体は周知であり、当業者により、選択される有効化合物の性質および投与経路に応じて適合される。
【０１８５】
好ましくは、このような化合物は、全身経路、特に、静脈内経路、筋肉内経路、皮内経路、腹腔内経路、皮下経路、腟内経路、または経口経路によって投与される。より好ましくは、本発明による抗体から構成される組成物は、一定時間あけた数回の投与で投与される。
【０１８６】
それらの投与経路、投与計画および最適な剤形は、例えば、患者の年齢または体重、患者の健康状態の重篤度、患者の処置に対する耐性および受ける副作用など、患者に適合する処置を確立する際に一般に考慮される基準に従って決定することができる。
【０１８７】
本発明はまた、同時、個別または延長様式で用いるための組合せ製剤として、ＣＸＣＲ４に対する抗体以外の抗ＨＩＶ抗体または抗ＨＩＶ細胞侵入抗体または抗ＨＩＶ複製抗体をさらに含んでなる組成物に関する。
【０１８８】
さらに別の実施形態によれば、本発明はまた、本発明に記載されているもの以外の抗ＣＣＲ５、抗ＣＤ４化合物、および抗ＣＸＣＲ４化合物などの、ＨＩＶの侵入および／または複製を特異的に阻害することができる化合物、または当業者に知られている他のいずれかの抗ＨＩＶ化合物の中から選択される少なくとも一つの第二の抗ＨＩＶ化合物を含んでなる上記のような医薬組成物に関する。
【０１８９】
本発明の補足的な別の実施形態は、同時、個別、または延長使用のための組合せまたは複合製剤として抗ＨＩＶ化合物をさらに含んでなる上記のような組成物からなる。
【０１９０】
「同時使用」とは、単一の投与形に含まれる組成物に含まれる両化合物を投与することを意味する。
【０１９１】
「個別使用」とは、異なる投与形に含まれる組成物の両化合物を同時に投与することを意味する。
【０１９２】
「延長使用」とは、異なる投与形にそれぞれ含まれる組成物の両化合物の連続的投与を意味する。
【０１９３】
一般に、本発明による組成物は、ＨＩＶ処置の有効性を著しく高める。言い換えれば、本発明の抗体の治療効果は、抗ＨＩＶ剤の投与によって予期されないほど増強される。本発明の組成物によってもたらされる別の大きな二次的利点は、有効成分のより低量の有効用量を使用できる可能性に関し、従って、特に抗ＨＩＶ剤の作用である副作用の出現の危険を回避または軽減することが可能となる。さらに、この組成物は、予想される治療効果をより迅速に達成することを可能とする。
【０１９４】
「治療用抗ＨＩＶ剤」とは、患者に投与した際に、患者におけるＨＩＶの複製を治療または予防する物質を意味する。このような薬剤の限定されない例としては、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）、ヌクレオシド／ヌクレオチドＨＩＶ逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ／ＮｔＲＴＩ）、非ヌクレオシドＨＩＶ逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、ＨＩＶ侵入阻害剤、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤等の「抗レトロウイルス剤」が挙げられる。
【０１９５】
このような薬剤は、例えば、ＶＩＤＡＬの、「抗ＨＩＶ化合物」に関する化合物のために費やされた頁に挙げられており、この文献の参照文献によって挙げられている抗ＨＩＶ化合物は、本明細書において、限定的されない好ましい抗ＨＩＶ剤として挙げられる。
【０１９６】
ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤は、ＨＩＶプロテアーゼ活性を阻害することができるいずれの物質も表す。このようなＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の例としては、限定されるものではないが、メシル酸サキナビルまたはＳＱＶ（Invirase（商標））、インジナビルまたはＩＤＶ（Crixivan（商標））、リトナビルまたはＲＴＶ（Norvir（商標））、ネルフィナビルまたはＮＦＶ（Viracept（商標））、アンプレナビル（Agenerase（商標）、Prozei（商標））、ロピナビル／リトナビルまたはＬＰＶ／ｒ（Kaletra（商標）、Aluvia（商標））、アタザナビルまたはＡＴＶ（Reyataz（商標）、Zrivada（商標））、ホスアンプレナビルまたはＦＰＶ（Lexiva（商標）、Telzir（商標））、チプラナビルまたはＴＰＶ（Aptivus（商標））、ダルナビルまたはＤＲＶ（Prezista（商標））が挙げられる。
【０１９７】
ＨＩＶヌクレオシドまたはヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）は、ＨＩＶ  ＲＮＡの逆転写を遮断するヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体である物質を表す。ＮＲＴＩの例としては、限定されるものではないが、ジドブジンまたはＡＺＴ，ＺＤＶ（Retrovir/combivir/trixivir（商標））、ジダノシンまたはｄｄｉ（Videx（商標））、ザルシタビン（HIVID（商標））、スタブジンまたはｄ４Ｔ（Zerit（商標））、ラミブジンまたは３ＴＣ（Epivir/combivir/epzicom/trixivir（商標））、アバカビルまたはＡＢＣ（Ziagen/trixivir/epzicom（商標））、フマル酸テノホビルジソプロキシルまたはＴＤＦ（Viread/atripla/truvada（商標））、エムトリシタビンまたはＦＴＣ（Emtriva/atripla/truvada（商標））が挙げられる。
【０１９８】
非ヌクレオシドＨＩＶ逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）は、ＨＩＶ  ＲＮＡの逆転写を遮断するヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体ではない物質を表す。ＮＮＲＴＩの例としては、限定されるものではないが、ネビラピンまたはＮＶＰ（Viramune（商標））、エファビレンツまたはＥＦＶ（Sustiva/atripla（商標）、Stocrin（商標））、デラビルジンまたはＤＬＶ（Rescriptor（商標））、およびエトラビリンまたはＥＴＲ（Intelence（商標））が挙げられる。
【０１９９】
ＨＩＶ侵入阻害剤は、ＨＩＶの細胞侵入を遮断する物質を表す。ＨＩＶ侵入阻害剤の例としては、限定されるものではないが、エンフビルチドまたはＴ２０（Fuzeon（商標））、マラビロクまたはＭＶＣ（Celsentri（商標）、Celzentry（商標））が挙げられる。
【０２００】
ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤は、ＨＩＶインテグラーゼ活性を阻害する物質を表す。インテグラーゼ阻害剤の例としては、限定されるものではないが、ラルテグラビルまたはＲＡＬ（Isentress（商標））が挙げられる。
【０２０１】
このような薬剤はまた、例えば、限定されるものではないが、ビクリビロク、ＰＲＯ１４０、ＴＮＸ−３５５、ＡＭＤ０７０、ラシビル、アプリシタビン、エルブシタビン、フロサルブジン(Flosalvudine)、リルピビリン、エルビテグラビルなど、現在臨床試験中の、ＶＩＤＡＬに記載されている同種の薬物に属する化合物である。
【０２０２】
このような薬剤はまた、例えば、限定されるものではないが、成熟阻害剤（ベビリマット）、β−ガラクトシル−セラミドのグリコシド類似体、炭水化物結合剤、ＲＮアーゼＨ阻害剤、ＨＩＶ遺伝子発現阻害剤、潜在型Ｔ細胞からのＨＩＶ放出の刺激剤（バルプロ酸など）など、他の可能性のある種の薬物に属する化合物である。
【０２０３】
特に好ましい実施形態においては、組合せ製剤としての本発明の組成物は、前記抗ＨＩＶ剤が同時使用のための前記抗体に化学的に結合されていることを特徴とする。
【０２０４】
前記抗ＨＩＶ剤と本発明による抗体の間の結合を容易にするために、結合する二つの化合物の間にポリ（アルキレン）グリコール、ポリエチレングリコール、またはアミノ酸などのスペーサー分子を導入することができ、あるいは、別の実施形態においては、前記抗体と反応することができる官能基を導入されている前記抗ＨＩＶ剤の活性誘導体を使用することもできる。これらの結合技術は当業者によく知られており、本明細書ではこれ以上詳細には述べない。
【０２０５】
また、好ましくは、前記の複合体を形成する本発明の抗体は、その機能的フラグメント、特に、それらのＦｃ成分が欠失されたフラグメント、例えばｓｃＦｖフラグメントの中から選択される。
【０２０６】
本発明はまた、薬物として用いられる、本発明による、組合せ製剤としての組成物、または抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ／抗ＨＩＶ薬物複合体に関する。
【０２０７】
好ましくは、組合せ製剤としての前記組成物または前記複合体には、賦形剤および／または医薬ビヒクルが添加される。
【０２０８】
よって、本発明は、ＨＩＶ複製に対して生物的に活性な化合物の特異的標的化のための薬物の製造のための、抗体、またはその一つの機能的フラグメントもしくは誘導体の使用に関する。
【０２０９】
従前に示したように、ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ５１５Ｈ７および３０１ａＥ５は、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１複製に対して強い活性を有し、従って、このような抗体は、ＨＩＶ−１感染を処置するためのＣＸＣＲ４アンタゴニスト抗ウイルス薬の同定のためのスクリーニングアッセイに使用することができる。これらのアッセイの第一の工程では、ＣＸＣＲ４を発現する細胞をＭａｂ  ５１５Ｈ７および／または３０１ａＥ５とともに培養し、その後、Ｍａｂ  ５１５Ｈ７および／または３０１ａＥ５との結合の潜在的な阻害のための分子を評価することができる。この種のアッセイで用いられる細胞は、ＣＨＯ−ＣＸＣＲ４、ＮＩＨ３Ｔ３−ＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ４トランスフェクトヒト細胞系統（例えば、Ｕ３７３−ＭＡＧＩ−ＣＸＣＲ４）などのトランスフェクト細胞系統、ＮＡＬＭ６などのＣＸＣＲ４を発現するヒト細胞系統またはＰＢＭＣなどの一次細胞であり得る。ＣＸＣＲ４発現細胞に対するＭａｂ  ５１５Ｈ７および／または３０１ａＥ５の結合を阻害するＣＸＣＲ４のアンタゴニストをスクリーニングするために使用される方法は、Zhao Q.ら(AIDS Research And Human Retroviruses, 2003, 19, pp947-955)によって記載されている細胞に基づく競合的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはJuarez J.ら(Leukemia 2003, 17, ppl294-1300)によって記載されている蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）を用いるプロトコールであり得る。
【０２１０】
よって、本発明の特定の態様では、ＣＸＣＲ４アンタゴニスト抗ウイルス薬としての分子をスクリーニングおよび／または同定する方法であって、以下の工程を含んでなる方法が考えられる：
ａ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞を選択する工程、
ｂ）該細胞を、本発明の抗体、またはその一つの機能的フラグメントもしくは誘導体とともに培養する工程、
ｃ）抗体、またはその一つの機能的フラグメントもしくは誘導体と、ＣＸＣＲ４との間の結合の潜在的な阻害のための供試分子を評価する工程、および
ｄ）該阻害が可能な分子を選択する工程。
【０２１１】
別の特定の実施形態では、
ｅ）これらの分子をＨＩＶ−１複製アッセイで試験する工程
を追加することができる。
【０２１２】
本発明の他の特徴および利点は、実施例および図面（凡例は下記に示される）とともに説明を読めばさらに明らかになる。
【実施例】
【０２１３】
実施例１：ヒトＣＸＣＲ４に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の作製
ＣＸＣＲ４に対するモノクローナル抗体を作製するため、Ｂａｌｂ／ｃマウスに組換えＮＩＨ３Ｔ３−ＣＸＣＲ４細胞および／またはＣＸＣＲ４細胞外Ｎ末端およびループに相当するペプチドを感作させた。６〜１６週齢のマウスに、完全フロイントアジュバントにて抗原を１回、皮下（ｓ．ｃ．）感作させた後、フロイントの不完全アジュバントにて抗原を２〜６回ｓ．ｃ．感作させた。免疫応答を眼窩後方採血によって測定した。血清をＥＬＩＳＡによりスクリーニングし（下記の通り）、抗ＣＸＣＲ４抗体力価が高いマウスを融合に用いた。屠殺および脾臓摘出の２日前にマウスの静脈内に抗原を追加投与した。
【０２１４】
ＥＬＩＳＡ
抗ＣＸＣＲ４抗体を産生するマウスを選択するため、免疫マウスからの血清をＥＬＩＳＡによって調べた。要するに、マイクロタイタープレートを、ＢＳＡと結合された精製［１−４１］Ｎ末端ペプチドで５μｇ相当量のペプチド／ｍＬ、１００μＬ／ウェルにてコーティングし、４℃での一晩培養した後、ＰＢＳ中０．５％ゼラチン２５０μＬ／ウェルでブロックした。ＣＸＣＲ４免疫マウスからの血漿希釈液を各ウェルに加え、３７℃で２時間培養した。これらのプレートをＰＢＳで洗浄した後、ＨＲＰ(Jackson Laboratories)と結合されたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とともに３７℃で１時間培養した。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で現像し、５分後に１００μＬ／ウェルの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることによって反応を停止させた。最高力価の抗ＣＸＣＲ４抗体を生じたマウスを抗体作製に用いた。
【０２１５】
ＣＸＣＲ４に対するＭａｂを産生するハイブリドーマの作製
最高力価の抗ＣＸＣＲ４抗体を生じたＢａｌｂ／ｃマウスから単離したマウス脾細胞を、ＰＥＧを用いてマウス骨髄腫細胞系統Ｓｐ２／Ｏと融合させた。細胞をマイクロタイタープレートにおよそ１×１０５／ウェルで播種した後、ウルトラカルチャー培地＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム＋１×ＨＡＴを含有する選択培地で２週間インキュべートした。次に、ウェルをＥＬＩＳＡによって、抗ＣＸＣＲ４モノクローナルＩｇＧ抗体に関してスクリーニングした。その後、抗体を分泌するハイブリドーマを制限希釈により少なくとも２回サブクローニングし、in vitroで培養し、さらなる分析のための抗体を作製した。
【０２１６】
実施例２：ＦＡＣＳ分析による抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ５１５Ｈ７および３０１ａＥ５結合特異性（ＮＩＨ３Ｔ３−ＣＸＣＲ４形質転換体）の特性決定
この実験では、抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ５１５Ｈ７および３０１ａＥ５のヒトＣＸＣＲ４（ｈＣＸＣＲ４）への特異的結合をＦＡＣＳ分析によって調べた。ＮＩＨ３Ｔ３およびＮＩＨ３Ｔ３−ｈＣＸＣＲ４トランスフェクト細胞を、１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体５１５Ｈ７および３０１ａＥ５とともに培養した。その後、これらの細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０１％ＮａＮ３で洗浄した。次に、Ａｌｅｘａ標識された二次抗体をこれらの細胞に加え、４℃で２０分間培養した。その後、細胞を再び２回洗浄した。２回目の洗浄後、ＦＡＣＳ分析を行った。これらの結合試験の結果を、［ＦＡＣＳによって得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）］を示す下表８に示す。抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ５１５Ｈ７および３０１ａＥ５はヒトＣＸＣＲ４−ＮＩＨ３Ｔ３トランスフェクト細胞系統と特異的に結合するが、親ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する認識は見られなかった。
【０２１７】
【表８】
0005800802.tif 000009
【０２１８】
実施例３：ＦＡＣＳ分析による末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対する抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ５１５Ｈ７および３０１ａＥ５の結合の特性決定
健康なドナーから血液をバフィーコートとして採取した。１００μｌの全血を示された濃度の抗ヒトＣＸＣＲ４抗体（クローン５１５Ｈ７および３０１ａＥ５）とともに４℃で２０分間培養した。血液をＰＢＳ−ＢＳＡ  １％−ＮａＮ３  ０．０１％中で３回洗浄し、１：５００希釈のヤギ抗ヒトＡｌｅｘａ  ４８８  ＩｇＧ(Invitrogen)とともに４℃で２０分間培養した。その後、細胞を洗浄し、ＣＤ１４−ＰＥ(Caltag)またはＣＤ３−ＰＥ(Caltag)とともに４℃で１０分間培養し、３回洗浄した。赤血球をHigh-Yield溶解液(Caltag)で室温にて１０分間溶解させた。すぐにFacscalibur (Becton-Dickinson)を用いて細胞を分析した。単球でのＣＸＣＲ４発現はＣＤ１４陽性細胞で行い、Ｔ細胞でのＣＸＣＲ４発現はＣＤ３陽性細胞で行った（図１）。結果は抗原結合能（ＡＢＣ）で表す。
【０２１９】
図２Ａおよび２Ｂに示されるように、抗ヒトＣＸＣＲ４クローン５１５Ｈ７および３０１ａＥ５はＴリンパ球（図２Ａ）および単球（図２Ｂ）の双方を染色したが、このことは、５１５Ｈ７および３０１ａＥ５  Ｍａｂが単球およびＴリンパ球の細胞表面で発現された天然型のＣＸＣＲ４を認識可能であることを示している。
【０２２０】
実施例４：生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）アプローチによるＣＸＣＲ４ホモ二量体に対する５１５Ｈ７および３０１ａＥ５  Ｍａｂの効果
この機能的アッセイは、ＳＤＦ−１および／または５１５Ｈ７  ＭａｂがＣＸＣＲ４受容体に結合した際に誘発されるコンフォメーション変化をＣＸＣＲ４ホモ二量体のレベルで評価することができる。
【０２２１】
検討する相互作用相手の発現ベクターを、従来の分子生物学的技術を適用することにより、対応する色素（ウミシイタケ(Renilla reniformis)ルシフェラーゼＲｌｕｃおよび黄色蛍光タンパク質ＹＦＰ）との融合タンパク質として構築した。ＢＲＥＴ試験を行う２日前に、ＨＥＫ２９３細胞を、対応するＢＲＥＴ相手：［ＣＸＣＲ４／Ｒｌｕｃ＋ＣＸＣＲ４／ＹＦＰ］をコードする発現ベクターで一時的にトランスフェクトし、ＣＸＣＲ４ホモ二量体形成を調べた。翌日、細胞を、ポリリシンをプレコーティングした白色９６ＭＷプレートの完全培養培地［１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ］に分注した。まず、細胞をプレートに接着させるために、ＣＯ２  ５％、３７℃で培養した。その後、２００μｌ  ＤＭＥＭ／ウェルで一晩、細胞を飢餓状態にした。ＢＲＥＴ試験の直前に、ＤＭＥＭを除去し、細胞を手早くＰＢＳで洗浄した。その後、細胞をＰＢＳ中、抗体の存在下または非存在下、３７℃にて１０分間培養した後、最終量５０μｌ中、ＳＤＦ−１  ３００ｎＭとともに、または伴わずにセレンテラジンＨ  ５μＭを添加した。３７℃でさらに１０分間培養した後、Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０マルチラベルリーダー(Berthold)（１ｓ／波長／ウェル、室温で１５反復）を用い、４８５ｎｍおよび５３０ｎｍでの発光獲得を誘導した。
ＢＲＥＴ比の計算は従前に記載されているように行った(Angersら、2000)：［（発光５３０ｎｍ）−（発光４８５ｎｍ）×Ｃｆ］／（発光４８５ｎｍ）、式中、Ｃｆ＝同じ試験条件下でＲｌｕｃ融合タンパク質単独を発現する細胞の（発光５３０ｎｍ）／（発光４８５ｎｍ）。この式を簡単にすると、ＢＲＥＴ比が、二つのＢＲＥＴ相手が存在する場合に得られる５３０／４８５ｎｍ比を、同じ試験条件下で、Ｒｌｕｃと融合された相手だけがアッセイ中に存在する場合に得られる５３０／４８５ｎｍ比により補正したものに相当することが示される。読み取りやすいように、結果はミリＢＲＥＴ単位（ｍＢＵ）で表すが、ｍＢＵはＢＲＥＴ比に１０００を掛けたものである。
【０２２２】
ＳＤＦ１（３００ｎＭ）は、ＣＸＣＲ４受容体と融合されたアダプタータンパク質とアクセプタータンパク質が空間的に近接していることから生じるＢＲＥＴシグナルを約２０％増強したが、それはおそらくＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４ホモ二量体形成または既存の二量体のコンフォメーション変化を示唆する（図３ＡおよびＢ）。５１５Ｈ７および３０１ａＥ５  Ｍａｂは、ＣＸＣＲ４ホモ二量体に関してＳＤＦ−１により誘発されるコンフォメーション変化を調節することができた（５１５Ｈ７および３０１ａＥ５に関して、ＳＤＦ−１により誘発されるＢＲＥＴ増強の６９％阻害、図３ＡおよびＢ）。５１５Ｈ７および３０１ａＥ５  Ｍａｂはまた、それ自体、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４の空間的近接を調節することもできたが、このことはＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４ホモ二量体コンフォメーションに対する５１５Ｈ７および３０１ａＥ５  Ｍａｂの影響を示唆する（図３Ａおよび３Ｂ）。
【０２２３】
実施例５：抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ５１５Ｈ７および３０１ａＥ５による、ヒトＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１一次単離物ＫＯＮ（Ｘ４ウイルス）複製の阻害
ＨＩＶ−１に対して血清反応陰性の健康なドナーからのＰＢＭＣをバフィーコートから、またはフィコール−ハイパーク勾配遠心分離による血球成分分離法(cytapheresis)から単離した。ＰＢＭＣを、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍｌペニシリン（１００００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００００μｇ／ｍｌ）２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有し、１０％熱不活性化ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ  １６４０細胞培養培地中、ＰＨＡの存在下で活性化し、１サイクルの中和アッセイで細胞標的として用いた。一次ヒトＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１複製は、ウイルスｐ２４抗原の細胞内染色をＦＡＣＳ分析によって分析することにより行った。要するに、２５μｌ／ウェルの、種々の希釈率のＭａｂ  ５１５Ｈ７、３０１ａＥ５および１２Ｇ５(R&D Systems)または対照として培養培地（ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ＦＣＳ、０．１％ＩＬ−２）を、２５μｌ／ウェルのＨＩＶ−１  ＫＯＮ  Ｘ４一次単離物希釈液とともに３７℃で１時間、二反復で培養した。ＰＨＡ活性化ヒトＰＢＭＣ（２５μｌ／ウェル）を９６ウェルプレート（Ｕ底、Ｃｏｓｔａｒ  ３５９９）中のＭａｂ／ウイルス混合物に２０×１０６細胞／ｍｌで加え、ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ＦＣＳおよび０．１％ＩＬ−２中、３７℃で２４〜３６時間培養した。Ｍａｂを含まない培地中、非感染ＰＢＭＣからなる対照を導入した。ＨＩＶ感染ＰＢＭＣを検出するために、ウイルスｐ２４抗原の細胞内染色を行い、フローサイトメトリーによって分析した。細胞を固定し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット(Becton Dickinson)を製造者のプロトコールに従って用いて透過処理を施し、１／１６０希釈で用い、暗所にて４℃で１０分間培養した蛍光抗ｐ２４  Ｍａｂ（クローンＫＣ５７−Coulter Beckman）で染色した。ＰＢＳ−３％ＦＣＳ培地で洗浄した後、フローサイトメトリー分析前にＰＢＭＣをＰＢＳで希釈した。種々のサンプルにおけるｐ２４陽性細胞の割合を、生細胞集団に対する２０，０００事象をゲートすることにより決定した。この生細胞のサブセットのｐ２４発現を、非感染細胞のバックグラウンド染色と比べて分析した。ｐ２４抗原陽性値は、ｍｏｃｋ感染細胞におけるバックグラウンド事象を差し引いた後に得た。中和の割合は、Ｍａｂを含まない対照感染ウェルと比べてのｐ２４陽性細胞の減少と定義した。中和力価は、感染細胞の割合を９０％低下させるＭａｂの希釈率と定義した。抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ５１５Ｈ７および３０１ａＥ５を、ＨＩＶ適用の参照の抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂとして知られる１２Ｇ５  Ｍａｂと比較した。図４ＡおよびＢおよび５に示されるように、抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ５１５Ｈ７および３０１ａＥ５は、それぞれＩＣ９０  １０μｇ／ｍｌ（６６ｎＭ）および１５０μｇ／ｍｌ（１μＭ）で、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１  ＫＯＮ一次単離物の複製を阻害することができるが、１２Ｇ５  ＭａｂはＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１  ＫＯＮ一次単離物の複製を阻害することができなかった（図４Ａ）。
【０２２４】
実施例６：  ＣＸＣＲ４受容体により媒介される細胞内カルシウム貯蔵の動員
この機能的アッセイは、小胞体の細胞内貯蔵からのカルシウム遊離を誘導するホスホリパーゼＣ経路の刺激を介したＣＸＣＲ４受容体シグナル伝達を測定するように設計された。
【０２２５】
ヒトＣＸＣＲ４受容体を安定的かつ構成的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ナイーブＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）は、ヒトＣＸＣＲ４受容体の全コード配列を含む哺乳類発現ベクター（ＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿００３４６７）でトランスフェクトした際に得られたものである。細胞を完全培養培地［５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および５００μｇ／ｍｌのゲネチシンを添加したＤＭＥＭ−ハムＦ１２培地］で増殖させた。細胞を黒色９６ＭＷプレートに適当な培養培地中１００，０００細胞／ウェルで播種した。試験前に細胞を一晩飢餓状態にした。細胞にローディングバッファー［ＨＢＳＳ  １×、ＨＥＰＥＳ  ２０ｍＭ、プロベネシド酸(Probenicid acid)２５ｍＭ］中、蛍光カルシウム色素(Fluo-4 No Wash, Invitrogen US)を、３７℃で３０分間、その後、２５℃で３０分間負荷した。ＳＤＦ−１による刺激は、各ウェルに直接注入することにより行った。拮抗作用試験では、１０μｌのＭａｂ溶液をＳＤＦ−１の少なくとも１０分前にローディングバッファーに直接添加する。動的蛍光測定は、マルチモード蛍光マイクロプレートリーダーＭｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０(Berthold)にて、以下の設定で行う：４８５ｎｍでの励起、５３５ｎｍでの発光、１００００任意単位での励起エネルギー。各ウェルの蛍光をＳＤＦ−１注入前に毎秒０．１秒、２０秒間記録する（基底シグナル）。その後、２０μｌのＳＤＦ−１を注入し、データ記録を２分間続ける。各試験条件を２反復で行う。各ウェルの値をまず、基底蛍光と細胞を含まない対照ウェルによって発せられた蛍光を差し引くことによって補正する。相対的データをＳＤＦ−１（１００ｎＭ）によって得られた最大刺激の割合として表す。
【０２２６】
ＳＤＦ１（１００ｎＭ）は、組換えＣＨＯ／ＣＸＣＲ４において細胞内カルシウムの迅速かつ強い放出を誘導したが、ナイーブＣＨＯ−Ｋ１細胞では蛍光シグナルは検出されなかった。最大強度は基底蛍光の１４０％超に達し、ＳＤＦ−１による刺激時に約４０秒で見られた（図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃ）。Ｍａｂ  ５１５Ｈ７（１３３ｎＭ）（図６Ａ）およびｃ５１５Ｈ７（１３３ｎＭ）（図６Ｃ）は、ＳＤＦ−１（１００ｎＭ）により誘発されたカルシウムシグナルの強い阻害をもたらした。Ｍａｂ  ３０１ａＥ５（１３３ｎＭ）（図６Ｂ）は、ＳＤＦ−１（１００ｎＭ）により誘発されたカルシウムシグナルの部分的阻害をもたらした。
【０２２７】
実施例７：抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ５１５Ｈ７、ｃ５１５Ｈ７および３０１ａＥ５による、ヒトＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１一次単離物ＫＯＮ、ＭＮ、および９２ＵＧ０２４（Ｘ４ウイルス）の複製の阻害
１サイクル中和アッセイ
このアッセイは、一次単離物ＫＯＮ、ＭＮ、および９２ＵＧ０２４を用いて３６時間行い、感染２日後に２％の感染ＣＤ４  Ｔリンパ球の検出を可能とするように相応に濃縮および希釈する。
【０２２８】
種々の希釈率のＭａｂ  ５１５Ｈ７、ｃ５１５Ｈ７および３０１ａＥ５  ２５マイクロリットルを、２５μｌのウイルスとともに３７℃で１時間培養した。２０×１０６細胞／ｍｌのヒトＰＢＭＣ（２５μｌ）を９６ウェルプレート（Ｕ底、Ｃｏｓｔａｒ  ３５９９）中のＭａｂ／ウイルス混合物に加え、ＲＰＭＩ  １６４０  １０％ＦＣＳおよび２０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２(R&D Systems, Minneapolis, MN)中で３６時間培養した。
【０２２９】
２日間の培養後、ＨＩＶ感染リンパ球を、ウイルスｐ２４  Ａｇの細胞内染色により検出した。細胞を固定し、製造者に従いＣｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏｐｅｒｍおよびＰｅｒｍ／Ｗａｓｈキット(BD Biosciences)の双方を用いて透過処理を施し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液中１／１６０希釈で用い、４℃で１５分間加える蛍光抗ｐ２４  Ｍａｂ（ＦＩＴＣ−またはＰＥ−抗ｐ２４、クローンＫＣ５７、Beckman Coulter/Immunotech, Hialeah, FL）で染色した。３％ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＭＣを３００μｌのＰＢＳに希釈した後、ＤＩＶＡソフトウエア(BD Biosciences)を用いてフローサイトメトリー分析(LSRII、 BD Biosciences)を行った。種々のサンプル中のｐ２４陽性細胞の割合を、前方および側方散乱パラメーターによって同定された生細胞集団に対する２０，０００事象をゲートすることにより決定した。これらの生細胞のサブセットは、live/dead solution kit (Invitrogen)を用いて分析した。ｐ２４  Ａｇ陽性値は、ｍｏｃｋ感染細胞におけるバックグラウンド事象を差し引いた後に得た。
【０２３０】
中和パーセントは、Ｍａｂを含まない対照感染ウェルと比べてのｐ２４陽性細胞の減少と定義した。中和力価は、感染細胞の割合を９０％低下させる抗体の濃度（３反復で行った連続希釈率の間に挿入）と定義した。
【０２３１】
図７、８および９に示されるように、抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ５１５Ｈ７、ｃ５１５Ｈ７、および３０１ａＥ５は、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１  Ｘ４  ＭＮ、ＫＯＮ、および９２ＵＧ０２４一次単離物の複製を阻害することができる。ＩＣｓ（μｇ／ｍｌにおいて）の結果を表９にまとめる。
【０２３２】
【表９】
0005800802.tif 000010
【０２３３】
実施例８：抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ５１５Ｈ７、ｃ５１５Ｈ７および３０１ａＥ５による、ヒトＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１一次単離物８９．６（Ｘ４／Ｒ５二重ウイルス）の複製の阻害
１サイクル中和アッセイ
このアッセイは、一次単離物８９．６を用いて３６時間行い、感染２日後に２％の感染ＣＤ４  Ｔリンパ球の検出を可能とするように相応に濃縮および希釈する。
【０２３４】
種々の希釈率のＭａｂ  ５１５Ｈ７、ｃ５１５Ｈ７および３０１ａＥ５  ２５マイクロリットルを、２５μｌのウイルスとともに３７℃で１時間培養した。２０×１０６細胞／ｍｌのヒトＰＢＭＣ（２５μｌ）を９６ウェルプレート（Ｕ底、Ｃｏｓｔａｒ  ３５９９）中のＭａｂ／ウイルス混合物に加え、ＲＰＭＩ  １６４０  １０％ＦＣＳおよび２０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２(R&D Systems, Minneapolis, MN)中で３６時間培養した。
【０２３５】
２日間の培養後、ＨＩＶ感染リンパ球を、ウイルスｐ２４  Ａｇの細胞内染色により検出した。細胞を固定し、製造者に従いＣｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏｐｅｒｍおよびＰｅｒｍ／Ｗａｓｈキット(BD Biosciences)の双方を用いて透過処理を施し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液中１／１６０希釈で用い、４℃で１５分間加える蛍光抗ｐ２４  Ｍａｂ（ＦＩＴＣ−またはＰＥ−抗ｐ２４、クローンＫＣ５７、Beckman Coulter/Immunotech, Hialeah, FL）で染色した。３％ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＭＣを３００μｌのＰＢＳに希釈した後、ＤＩＶＡソフトウエア(BD Biosciences)を用いてフローサイトメトリー分析(LSRII、 BD Biosciences)を行った。種々のサンプル中のｐ２４陽性細胞の割合を、前方および側方散乱パラメーターによって同定された生細胞集団に対する２０，０００事象をゲートすることにより決定した。これらの生細胞のサブセットは、live/dead solution kit (Invitrogen)を用いて分析した。ｐ２４  Ａｇ陽性値は、ｍｏｃｋ感染細胞におけるバックグラウンド事象を差し引いた後に得た。
【０２３６】
中和パーセントは、Ｍａｂを含まない対照感染ウェルと比べてのｐ２４陽性細胞の減少と定義した。中和力価は、感染細胞の割合を９０％低下させる抗体の濃度（３反復で行った連続希釈率の間に挿入）と定義した。
【０２３７】
図１０および１１に示されるように、抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ５１５Ｈ７、ｃ５１５Ｈ７、および３０１ａＥ５は、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１  ８９．６一次単離物の複製を阻害することができる。ＩＣｓ（μｇ／ｍｌ）の結果を表１０にまとめる。
【０２３８】
【表１０】
0005800802.tif 000011
【０２３９】
実施例９：抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ｃ５１５Ｈ７と抗ＣＣＲ５分子マラビロクの併用による、ヒトＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１一次単離物８９．６およびＵＧ９３０６７（Ｘ４／Ｒ５二重ウイルス）の複製の阻害
中和アッセイ、一次ＰＢＭＣにおける複数回のＨＩＶ一次単離物複製の分析：
ｃ５１５Ｈ７  Ｍａｂまたはマラビロクの連続希釈液を併用する、または両者とウイルスの連続希釈液を併用するこのアッセイは、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）に対する複数回の感染を分析する。要するに、ｃ５１５Ｈ７  Ｍａｂまたはマラビロクまたは両者の組合せの連続希釈液（２倍）の２５μｌアリコート四つをそれぞれ、予め含水させた９６ウェルフィルタープレート（孔径１．２５μｍ、Durapor Dv、 Millipore, Molsheim, France）にて、ウイルスの連続希釈液２５μｌとともに培養した。ウイルスの対照滴定（希釈ｃ５１５Ｈ７  Ｍａｂまたはマラビロクの代わりに２５μｌのＲＰＭＩ）を、ｃ５１５Ｈ７  Ｍａｂまたはマラビロクまたは両者の組合せの希釈液の存在下での滴定と同じプレートで行った。３７℃で１時間後、４×１０６細胞／ｍｌの濃度のＰＨＡ刺激ＰＢＭＣ  ２５μｌ（５人の健康なドナーからのＰＨＡ活性化ＰＢＭＣのプール）を、ＲＰＭＩの最終培養容量７５μｌ、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および２０ＩＵのインターロイキン−２（ＩＬ−２）／ｍｌ(R&D System)となるように加えた。３７℃で２４時間後、１００μｌの同じ培養培地を加えた。４日目に濾過により２回の洗浄（各２００μｌのＲＰＭＩ）を行ってｃ５１５Ｈ７  Ｍａｂおよびマラビロクを除去し、２００μｌの新鮮培養培地を加えた。７日目に、培養上清におけるｐ２４の存在をＥＬＩＳＡにより測定し、陰性対照（ウイルス希釈液を感染させ、１０−６Ｍジドブジン［ＡＺＴ］の存在下で維持した培養物）の場合と比べ、陽性ウェルを判定した。４反復のウェルを用い、各希釈率のｃ５１５Ｈ７  Ｍａｂまたはマラビロクまたは両者の組合せの不在下（Ｆ０）および存在下（Ｖｎ）でウイルス力価（５０％組織培養感染量［ＴＣＩＤ５０］）を決定した。中和力価は、ウイルス力価の９０％低下をもたらす（Ｖｎ／Ｖ０＝０．１）ｃ５１５Ｈ７  Ｍａｂまたはマラビロクまたは両者の組合せの希釈率として定義した。
【０２４０】
図１２に示されるように、二重指向性Ｘ４Ｒ５ウイルス８９．６の複製は、ｃ５１５Ｈ７  Ｍａｂにより、ＩＣ９０  ２μｇ／ｍｌで阻害された（図１２）。マラビロク５０μｇ／ｍｌでは、ＩＣ９０阻害活性に達しなかった（図１２）。さらに、２μｇ／ｍｌのマラビロクを抗体５１５Ｈ７に添加したところ、ＩＣ９０  ０．２μｇ／ｍｌでｃ５１５Ｈ７  Ｍａｂの阻害活性を増強した（図１２）。
【０２４１】
ｃ５１５Ｈ７  Ｍａｂとおよびマラビロクの組合せの有益な効果を、種々の希釈率のこれらの２分子および別の二重指向性ウイルスＵＧ９３０６７を用いて評価した。図１３に示されるように、Ｍａｂ  ｃ５１５Ｈ７およびマラビロクの阻害活性は同等であった。これらの結果は、ウイルスＵＧ９３０６７の、ＣＣＲ５受容体またはＣＸＣＲ４受容体のいずれかを用いる能力が匹敵していたことを示唆する。ＵＧ９３０６７ウイルスを用いると、より良い活性を証明することができ、これらのＸ４（ｃ５１５Ｈ７  Ｍａｂ）とＲ５（マラビロク）阻害剤（各１０μｇ／ｍｌ）の組合せだけが、ウイルス力価の９０％低下を可能とした（図１３）。
【０２４２】
実施例１０：抗ＣＸＣＲ４キメラＭａｂ  ｃ５１５Ｈ７の生産
ネズミ５１５Ｈ７  Ｍａｂのキメラ形式を設計した。これは、着目するネズミ抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインを、ヒトＣκおよびＩｇＧ１／ＩｇＧ２／ＩｇＧ４定常ドメインと遺伝的に融合したものに相当する。この組換えＭａｂは、ＨＥＫ２９３／ＥＢＮＡ系をｐＣＥＰ４発現ベクター(InVitrogen, US)とともに使用することによって、一時的トランスフェクション時に作製されたものである。
【０２４３】
個々のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は本明細書に上記した。さらに、上記の表３にＩｇＧ２および４イソ型（好ましいイソ型）の配列が開示されているため、ここでも、ＩｇＧ１イソ型の重鎖、すなわち、配列番号８０のアミノ酸配列および配列番号８１のヌクレオチド配列に相当するｃ５１５Ｈ７  ＶＨ（Ｇ１ｗｔ）の配列を記載することができる。
【０２４４】
５１５Ｈ７  Ｍａｂ軽鎖および重鎖の可変ドメインに相当する全ヌクレオチド配列は、グローバル遺伝子合成(Genecust, Luxembourg)によって合成されたものである。それらを、ヒトＩｇＧ１／ＩｇＧ２／ＩｇＧ４免疫グロブリンの軽鎖［Ｃκ］または重鎖［ＣＨ１−Ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３］のいずれかの定常ドメインの全コード配列を有するｐＣＥＰ４ベクター(InVitrogen, US)にサブクローニングした。全クローニング工程は、the Laboratory manual (Sambrook and Russel, 2001)に記載されている従来の分子生物学的技術に従って、または供給者の説明書に従って行った。各遺伝子構築物を、Ｂｉｇ  Ｄｙｅターミネーター・サイクル・シーケンシング・キット(Applied Biosystems, US)を用いたヌクレオチド配列決定によって完全にバリデートし、３１００ジェネティック・アナライザー(Applied Biosystems, US)を用いて分析した。
【０２４５】
懸濁適合ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞(InVitrogen, US)を通常、オービタルシェーカー（回転速度１１０ｒｐｍ）上、２５０ｍｌフラスコにて、６ｍＭグルタミンを添加した血清不含培地Ｅｘｃｅｌｌ  ２９３(SAFC Biosciences)５０ｍｌ中で増殖させた。一時的トランスフェクションは、水中終濃度１ｍｇ／ｍｌで調製した直鎖２５ｋＤａポリエチレンイミン（ＰＥＩ）(Polysciences)、混合およびプラスミドＤＮＡ（重鎖：軽鎖プラスミド比１：１で、終濃度１．２５μｇ／ｍｌ）を用い、２．１０６細胞／ｍｌで行った。トランスフェクション４時間後に、培養物を１容量の新鮮培養培地で希釈して、最終細胞密度を１０６細胞／ｍｌとした。培養方法を細胞の生存率およびＭａｂ生産に関して測定した。一般に、培養は４〜５日間測定した。Ｍａｂは、プロテインＡ樹脂(GE Healthcare, US)での従来のクロマトグラフィーアプローチを用いて精製した。Ｍａｂは機能的評価に好適なレベルで生産された。生産性レベルは一般に、精製Ｍａｂ  ６〜１５ｍｇ／ｌの範囲である。
【０２４６】
実施例１１：ＦＡＣＳ分析による抗ＣＸＣＲ４キメラＭａｂ  ｃ５１５Ｈ７結合特異性の特性決定
この試験では、抗ＣＸＣＲ４キメラＭａｂ  ｃ５１５Ｈ７のヒトＣＸＣＲ４に対する特異的結合をＦＡＣＳ分析によって調べた。
【０２４７】
ＮＩＨ３Ｔ３−ｈＣＸＣＲ４トランスフェクト細胞を０μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの用量範囲のモノクローナル抗体ｃ５１５Ｈ７とともに培養した。その後、これらの細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０１％ＮａＮ３で洗浄した。次に、Ａｌｅｘａで標識した二次抗体をこれらの細胞に加え、４℃で２０分間インキュベートした。その後、これらの細胞を再び２回洗浄した。２回目の洗浄後に、ＦＡＣＳ分析を行った。この結合試験の結果を図１５に示すが、これは、抗ＣＸＣＲ４キメラＭａｂ  Ｃ５１５Ｈ７がヒトＣＸＣＲ４−ＮＩＨ３Ｔ３トランスフェクト細胞系統と特異的に結合することを示す。ＮＩＨ３Ｔ３ｗｔ細胞との結合は検出されなかった（データは示されていない）。
【０２４８】
実施例１２：生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）アプローチによるＣＸＣＲ４ホモ二量体に対するｃ５１５Ｈ７  Ｍａｂの効果
この機能的アッセイは、ＳＤＦ−１および／またはｃ５１５Ｈ７  ＭａｂがＣＸＣＲ４受容体に結合した際に誘発されるコンフォメーション変化をＣＸＣＲ４ホモ二量体のレベルで評価することができる。
【０２４９】
検討する相互作用相手の発現ベクターを、従来の分子生物学的技術を適用することにより、対応する色素（ウミシイタケ(Renilla reniformis)ルシフェラーゼＲｌｕｃおよび黄色蛍光タンパク質ＹＦＰ）との融合タンパク質として構築した。ＢＲＥＴ試験を行う２日前に、ＨＥＫ２９３細胞を、対応するＢＲＥＴ相手：［ＣＸＣＲ４／Ｒｌｕｃ＋ＣＸＣＲ４／ＹＦＰ］をコードする発現ベクターで一時的にトランスフェクトし、ＣＸＣＲ４ホモ二量体形成を調べた。翌日、細胞を、ポリリシンをプレコーティングした白色９６ＭＷプレートの完全培養培地［１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ］に分注した。まず、細胞をプレートに接着させるために、ＣＯ２  ５％、３７℃で培養した。その後、２００μｌ  ＤＭＥＭ／ウェルで一晩、細胞を飢餓状態にした。ＢＲＥＴ試験の直前に、ＤＭＥＭを除去し、細胞を手早くＰＢＳで洗浄した。その後、細胞をＰＢＳ中、抗体の存在下または非存在下、３７℃にて１０分間インキュベートした後、最終量５０μｌ中、ＳＤＦ−１  １００ｎＭとともに、または伴わずにセレンテラジンＨ  ５μＭを添加した。３７℃でさらに１０分間インキュベートした後、Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０マルチラベルリーダー(Berthold)（１ｓ／波長／ウェル、室温で１５反復）を用い、４８５ｎｍおよび５３０ｎｍでの発光獲得を誘導した。
【０２５０】
ＢＲＥＴ比の計算は従前に記載されているように行った(Angersら 2000)：［（発光５３０ｎｍ）−（発光４８５ｎｍ）×Ｃｆ］／（発光４８５ｎｍ）、式中、Ｃｆ＝同じ試験条件下でＲｌｕｃ融合タンパク質単独を発現する細胞の（発光５３０ｎｍ）／（発光４８５ｎｍ）。この式を簡単にすると、ＢＲＥＴ比が、二つのＢＲＥＴ相手が存在する場合に得られる５３０／４８５ｎｍ比を、同じ試験条件下で、Ｒｌｕｃと融合された相手だけがアッセイ中に存在する場合に得られる５３０／４８５ｎｍ比により補正したものに相当することが示される。読み取りやすいように、結果はミリＢＲＥＴ単位（ｍＢＵ）で表すが、ｍＢＵはＢＲＥＴ比に１０００を掛けたものである。
【０２５１】
ＳＤＦ１（１００ｎＭ）は、ＣＸＣＲ４受容体と融合されたドナータンパク質と、アクセプタータンパク質とが空間的に近接していることから生じるＢＲＥＴシグナルを約１０％増強したが、それはおそらくＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４ホモ二量体形成または既存の二量体のコンフォメーション変化を示唆する（図１６）。Ｍａｂ  ｃ５１５Ｈ７は、ＣＸＣＲ４ホモ二量体に関して、ＳＤＦ−１により誘発されるコンフォメーション変化を調節することができた（ＳＤＦ−１により誘発されるＢＲＥＴ増強の９６％阻害、図１６）。Ｍａｂ  ｃ５１５Ｈ７はまた、それ自体、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４の空間的近接を調節することもできたが、このことはＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４ホモ二量体コンフォメーションに対するこのＭａｂの影響を示唆する（図１６）。
【０２５２】
実施例１３：ＣＤ４およびＣＸＣＲ４またはＣＣＲ５を発現するＧＦＰ形質導入ヒト骨肉腫（ＧＨＯＳＴ）細胞を用いたＭａｂ  ５１５Ｈ７抗ＨＩＶ−１活性のin vitro評価
ＣＸＣＲ４  ５１５Ｈ７  Ｍａｂの特異性を判定するために、本発明者らは、ＣＤ４およびＣＸＣＲ４またはＣＣＲ５を発現するＧＨＯＳＴを用い、このＭａｂの抗ＨＩＶ−１活性を評価した。
【０２５３】
このアッセイは、Ｘ４  ＨＩＶ−１  ＬＡＩウイルス（ＣＸＣＲ４を発現するＧｈｏｓｔ細胞を持つ）またはＲ５  ＨＩＶ−１  ＢａＬウイルス（ＣＣＲ５を発現するＧｈｏｓｔ細胞を持つ）のいずれかを用いて４８時間行う。５００μｌのＧｈｏｓｔ細胞を、１０％ＦＣＳを添加したダルベッコの培養培地で２４時間平板培養した（２．５  １０５細胞／ｍｌ）。種々の希釈率のＭａｂ  ５１５Ｈ７を３７℃で１時間インキュベートした後、これらの細胞に希釈したＨＩＶ−１  ＬＡＩウイルス（１／１０）およびＨＩＶ−１  ＢａＬウイルス（１／７）を４８時間加えた。細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳ  １×で洗浄した。細胞を固定し、また、ウイルスを不活性化するために、この細胞ペレットに３００μＬの１．５％パラホルムアルデヒドを暗所、＋４℃で２時間加えた。ＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリーにより分析し、ＨＩＶ−１感染の阻害を算出した。
感染細胞の阻害パーセントは、Ｍａｂを含まない対照感染ウェルと比較して定義した。ＩＣｓ（μｇ／ｍｌ）の結果を表１１にまとめる。抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  ５１５Ｈ７は、Ｇｈｏｓｔ細胞を発現するＣＸＣＲ４においてＨＩＶ−１  Ｘ４  Ｌａｉウイルスの感染を阻害することができたが、Ｇｈｏｓｔ細胞を発現するＣＣＲ５においてＨＩＶ−１  Ｒ５  ＢａＬウイルスの感染阻害には全く不活性であった。
【０２５４】
【表１１】
0005800802.tif 000012
【０２５５】
実施例１４：５１５Ｈ７抗ＣＸＣＲ４ネズミ抗体のヒト化および該ｈ５１５Ｈ７のフラグメントの作製
一般手順
５１５Ｈ７抗ＣＸＣＲ４抗体のヒト化は、ＣＤＲグラフト法のグローバルルールを適用することで行った。免疫原性分析ならびにＣＤＲおよびフレームワーク（ＦＲ）領域の定義は、ＩＭＧＴユニークナンバリングスキームならびにＩＭＧＴライブラリーおよびツール(Lefranc, 1997 - www.imgt.org)を適用することで行った。
【０２５６】
５１５Ｈ７のヒト化変異体の結合は、ヒトＣＸＣＲ４で安定的にトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞系統にて判定した。結合活性は、ビオチン化マウス抗体を用いた競合アッセイによって評価した。第二の試みにおいて、ヒト化抗体を、ビオチン化ＳＤＦ−１のＲＡＭＯＳ細胞との結合を阻害する能力に関して評価した。ＲＡＭＯＳ細胞は、ＣＸＣＲ４の発現が高く、ＣＸＣＲ７およびＳＤＦ−１の発現が低いために選択された。
【０２５７】
これらのアッセイを用いて、抗ＣＸＣＲ４抗体の組換えヒト化型を特性決定した。可変ドメインをヒトＩｇＧ１／ｋ定常ドメインでフォーマットし、哺乳類発現ベクターｐＣＥＰにクローニングした。組換えＩｇＧ１／κ由来抗体をＨＥＫ２９３細胞で一時的に発現させた。発現培養上清を濾過し、プロテインＡセファロースを用いて抗体を精製した。精製抗体に再びＰＢＳバッファーを加え、抗体濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。
【０２５８】
組換え抗体フラグメントを、ヒト化抗体の可変ドメインに特異的なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって作製し、これらを大腸菌系にサブクローニングした。抗体フラグメントの精製は、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって行った。
【０２５９】
５１５Ｈ７可変ドメインのヒト化
重鎖および軽鎖可変ドメインの種々の配列アライメントを図１７および１８に示す。
【０２６０】
最初の一連の試験では、三つの第一のヒト化変異体の抗ＣＸＣＲ４結合活性を分析した。ＶＨ変異体１（ＶＨ１）をネズミＶＬと組合せ、これらの構築物の、ビオチン化ネズミ５１５Ｈ７親抗体の結合を阻害する能力を評価した。ＶＨ１の可変ドメインのアミノ酸配列は配列番号９０を含んでなり、ヌクレオチド配列は配列番号９１を含んでなる。全長ＶＨ１のアミノ酸配列は配列番号９２を含んでなり、ヌクレオチド配列は配列番号９３を含んでなる。この構築物は、キメラ抗体と同等の、ネズミ抗体との競合能を示した（図１９Ａ）。このことは、ほとんどのヒトＶＨ変異体がキメラと同等の結合能を有することを示唆する。よって、ＶＨ１をＶＬの変異体２と組み合わせた（図１９Ｂ）。
【０２６１】
さらなる試験では、抗体５１５Ｈ７のヒト化変異体がＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４発現細胞への結合を阻害するか否かを判定した（図２０）。このｈｚ５１５Ｈ７のヒト化変異体の阻害能は、フローサイトメトリーにおいてビオチン化ＳＤＦ−１を検出することによって評価した。ヒト化抗体ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ  ＶＬ２は、キメラｃ５１５Ｈ７と同等のＳＤＦ−１結合阻害能を有する。
【０２６２】
また、ヒト化変異体ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  ＶＬ２の抗体フラグメントも試験したところ、この抗体フラグメントがＳＤＦ−１の結合を完全に阻害することができることが分かった（図２０）。
【０２６３】
実施例１５：ＦＡＣＳ分析による抗ＣＸＣＲ４ヒト化Ｍａｂ  ５１５Ｈ７結合特異性の特性決定
この試験では、抗ＣＸＣＲ４ヒト化Ｍａｂ  ５１５Ｈ７の、ヒトＣＸＣＲ４に対する特異的結合をＦＡＣＳ分析により調べた。
【０２６４】
ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３−ｈＣＸＣＲ４トランスフェクト体を、１００μｌのＦａｃｓバッファー中、暗所、４℃にて２０分間、０〜１０μｇ／ｍＬのヒト化  Ｍａｂ  ５１５Ｈ７（ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ  ＶＬ２、ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ  ＶＬ２．１、ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ  ＶＬ２．２、ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ  ＶＬ２．３）とともにインキュベートした。Ｆａｃｓバッファー中で３回洗浄した後、細胞を、暗所、４℃にて２０分間、二次抗体であるヤギ抗ヒトＡｌｅｘａ  ４８８（１／５００希釈）とともにインキュベートした。Ｆａｃｓバッファー中で３回洗浄した後、各ウェルにヨウ化プロピジウムを加え、生存細胞のみをＦａｃｓにより分析した。少なくとも５０００の生存細胞を評価し、各条件について蛍光強度の平均値を見積もった。
【０２６５】
これらの結合試験の結果を、［ＦＡＣＳによって得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）］を示す図２１に示す。抗ＣＸＣＲ４ヒト化Ｍａｂ  ｈｚ５１５Ｈ７は、ヒトＣＸＣＲ４−ＮＩＨ３Ｔ３トランスフェクト細胞系統と特異的に結合した（ＮＩＨ３Ｔ３親細胞ではＭＦＩ＝２．２）。
【０２６６】
実施例１６：生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）アプローチによるＣＸＣＲ４ホモ二量体に対するｈｚ５１５Ｈ７  Ｍａｂの効果
この機能的アッセイは、ＳＤＦ−１および／またはｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ  ＶＬ２、ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ  ＶＬ２．１、ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ  ＶＬ２．２、ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１  Ｄ７６Ｎ  ＶＬ２．３がＣＸＣＲ４受容体に結合した際に誘発されるコンフォメーション変化をＣＸＣＲ４ホモ二量体のレベルで評価することができる。
【０２６７】
検討する相互作用相手の発現ベクターを、従来の分子生物学的技術を適用することにより、対応する色素（ウミシイタケ(Renilla reniformis)ルシフェラーゼＲｌｕｃおよび黄色蛍光タンパク質ＹＦＰ）との融合タンパク質として構築した。ＢＲＥＴ試験を行う２日前に、ＨＥＫ２９３細胞を、対応するＢＲＥＴ相手：［ＣＸＣＲ４／Ｒｌｕｃ＋ＣＸＣＲ４／ＹＦＰ］をコードする発現ベクターで一時的にトランスフェクトし、ＣＸＣＲ４ホモ二量体形成を調べた。翌日、細胞を、ポリリシンをプレコーティングした白色９６ＭＷプレートの完全培養培地［１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ］に分注した。まず、細胞をプレートに接着させるために、ＣＯ２  ５％、３７℃で培養した。その後、２００μｌ  ＤＭＥＭ／ウェルで一晩、細胞を飢餓状態にした。ＢＲＥＴ試験の直前に、ＤＭＥＭを除去し、細胞を手早くＰＢＳで洗浄した。その後、細胞をＰＢＳ中、抗体の存在下または非存在下、３７℃にて１０分間インキュベートした後、最終量５０μｌ中、ＳＤＦ−１  １００ｎＭとともに、または伴わずにセレンテラジンＨ  ５μＭを添加した。３７℃でさらに１０分間インキュベートした後、Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０マルチラベルリーダー(Berthold)（１ｓ／波長／ウェル、室温で１５反復）を用い、４８５ｎｍおよび５３０ｎｍでの発光獲得を誘導した。
【０２６８】
ＢＲＥＴ比の計算は従前に記載されているように行った(Angersら、2000)：［（発光５３０ｎｍ）−（発光４８５ｎｍ）×Ｃｆ］／（発光４８５ｎｍ）、式中、Ｃｆ＝同じ試験条件下でＲｌｕｃ融合タンパク質単独を発現する細胞の（発光５３０ｎｍ）／（発光４８５ｎｍ）。この式を簡単にすると、ＢＲＥＴ比が、二つのＢＲＥＴ相手が存在する場合に得られる５３０／４８５ｎｍ比を、同じ試験条件下で、Ｒｌｕｃと融合された相手だけがアッセイ中に存在する場合に得られる５３０／４８５ｎｍ比により補正したものに相当することが示される。読み取りやすいように、結果はミリＢＲＥＴ単位（ｍＢＵ）で表すが、ｍＢＵはＢＲＥＴ比に１０００を掛けたものである。
【０２６９】
ＳＤＦ１（１００ｎＭ）は、ＣＸＣＲ４受容体と融合されたドナータンパク質と、アクセプタータンパク質とが、空間的に近接していることから生じるＢＲＥＴシグナルを約１２％増強したが、それはおそらくＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４ホモ二量体形成または既存の二量体のコンフォメーション変化を示唆する（図２２）。
【０２７０】
５１５Ｈ７ヒト化Ｍａｂは、ＣＸＣＲ４ホモ二量体に関してＳＤＦ−１により誘発されるコンフォメーション変化を調節することができ、ＳＤＦ−１により誘発されるＢＲＥＴ増強の阻害割合は、ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１Ｄ７６Ｎ−ＶＬ２  Ｍａｂで約８８％、ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１Ｄ７６Ｎ−ＶＬ２．１  Ｍａｂで６５％、ｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１Ｄ７６Ｎ−ＶＬ２．２  Ｍａｂで３３％およびｈｚ５１５Ｈ７  ＶＨ１Ｄ７６Ｎ−ＶＬ２．３  Ｍａｂで２１％であった（図２２）。
【図１】
0005800802.tif 000013
【図２】
0005800802.tif 000014
【図３】
0005800802.tif 000015
【図４】
0005800802.tif 000016
【図５】
0005800802.tif 000017
【図６Ａ】
0005800802.tif 000018
【図６Ｂ】
0005800802.tif 000019
【図６Ｃ】
0005800802.tif 000020
【図７】
0005800802.tif 000021
【図８】
0005800802.tif 000022
【図９】
0005800802.tif 000023
【図１０】
0005800802.tif 000024
【図１１】
0005800802.tif 000025
【図１２】
0005800802.tif 000026
【図１３】
0005800802.tif 000027
【図１４】
0005800802.tif 000028
【図１５】
0005800802.tif 000029
【図１６】
0005800802.tif 000030
【図１７】
0005800802.tif 000031
【図１８】
0005800802.tif 000032
【図１９】
0005800802.tif 000033
【図２０】
0005800802.tif 000034
【図２１】
0005800802.tif 000035
【図２２】
0005800802.tif 000036
【配列表】
0005800802000001.app