(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴを含有する水溶液（Ａ）の凍結乾燥方法であって、前記（Ａ）を３０〜５０℃で７２〜２４０時間加熱処理した後、硫酸エステル塩型アニオン界面活性剤（Ｂ２）の存在下に凍結乾燥させることを特徴とする凍結乾燥方法。
【請求項２】
前記硫酸エステル塩型アニオン界面活性剤（Ｂ２）が、炭素数８〜１８の高級アルコール硫酸エステル塩である請求項１記載の凍結乾燥方法。  
【請求項３】
前記水溶液（Ａ）が、更にウシ血清アルブミンを含有する請求項１又は２記載の凍結乾燥方法。
【請求項４】
前記水溶液（Ａ）が、更に非イオン界面活性剤を含有する請求項１〜３のいずれか記載の凍結乾燥方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はトロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴの活性を低下させることなく長期間安定性を維持させるための凍結乾燥方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫測定は、高い特異性及び感度のために医療診断目的で血清又は尿試料中のタンパク質を検出するのにしばしば使用される。そのような免疫測定には、測定試薬のほかに、患者の試料を定量化するための参照標準として使用される較正物質が必要である。通常この較正物質中に含まれる抗原は希薄であるため、抗原種によっては溶液中で著しく失活する場合がある。特にホルモンや酵素、不溶性タンパク質等の抗原溶液は失活が激しく、水溶液状の校正物質として用いるには困難な場合が多い。このような場合には、凍結乾燥等の方法で水分を除去した形態で保存し、使用時に水を加えて溶解する方法や、牛血清アルブミンや動物血清等のタンパク質を添加して水溶液中での安定性を確保する方策がとられてきた（例えば、非特許文献１及び２参照）。
しかしながら、トロポニンのような筋肉の収縮に関係するタンパク質は不溶性タンパク質複合体の一部であり、精製したトロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴは非常に不安定であるため、そのコンフォメーションの見掛けの変化又は容器表面への付着等が原因でその活性が著しく低下してしまい、従来の方法では安定性を確保することが困難であるという問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】佐々木  實、免疫化学的同定法（第３版）、東京化学同人、１９９３年
【非特許文献２】石川榮治、超高感度酵素免疫測定法、学会出版センター、１９９３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴの保存安定性に優れたトロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴを含有する水溶液の凍結乾燥方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴを含有する水溶液（Ａ）の凍結乾燥方法であって、前記（Ａ）を３０〜５０℃で７２〜２４０時間加熱処理した後、硫酸エステル塩型アニオン界面活性剤（Ｂ２）の存在下に凍結乾燥させることを特徴とする凍結乾燥方法である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の凍結乾燥方法により、活性が低下しやすいトロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴの保存安定性を向上し、長期間その活性を持続させることができる。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明におけるトロポニン複合体は、筋収縮及び弛緩のカルシウム依存性調節の役割を担っている。また、遊離型トロポニンＴはトロポニン複合体を構成する３つのサブユニットの１つであり、トロポミオシンとアクチンとの結合を調整することで、筋収縮調節作用に重要な役割を担っている。これらの成分は筋肉に損傷が無い場合は血中に出現しないため、血中に検出された場合は筋肉の損傷が存在していたと考えられる。したがってトロポニンの測定は、心筋に特異的であり、心筋梗塞の診断の有力な指標となっている。
【０００８】
トロポニン複合体及び遊離型トロポニンＴはヒト又は動物起源のものであり、より詳細には、心臓起源のものである。
トロポニン複合体は、心臓の摩砕調製物の抽出物から得られ、遊離型トロポニンＴは、精製されたトロポニン複合体から得られる。また、トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴの安定組成物は、アメリカン・ハート・ジャーナル（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ）、クリニカル・インベスティゲーションズ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ）、１９８７年６月、第１１３巻、第６号「カルディアック−スペシフィック・トロポニン−Ｉ・ラジオイムノアッセイ・イン・ザ・ディアグノシス・オブ・アキュート・マイオカルディアル・インファークション（Ｃａｒｄｉａｃ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ−Ｉ  ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）」、第１３３４頁に開示された方法を用いて、ヒト由来又は動物由来の心臓から製造したものでもよい。
市販の遊離型トロポニンＴとしては、ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ社製又はＦｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製のものが挙げられる。
【０００９】
トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴを含有する水溶液（Ａ）は、トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴ、及び水を含有する。
水としては、特に限定されないが、純度の観点から、脱イオン水が好ましい。
【００１０】
トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴを含有する水溶液（Ａ）中のトロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴの含有量は、保存安定性の観点から、水溶液（Ａ）の重量を基準として、１０ｍｇ／ｇ以下が好ましく、血液中のトロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴを定量する際に必要な濃度域の観点から、更に好ましくは１０ｐｇ／ｇ〜１μｇ／ｇ、特に好ましくは１０ｐｇ／ｇ〜１００ｎｇ／ｇ、最も好ましくは１０ｐｇ／ｇ〜２５ｎｇ／ｇである。
【００１１】
トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴを含有する水溶液（Ａ）には、トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴの容器への吸着等を防止させる目的で、タンパク質を含有させることが好ましい。タンパク質としては、例えば、ウシ血清アルブミンやそれ以外のタンパク質（ヒト血清アルブミン、ウシ胎仔血清、ウマ血清及びウシγグロブリン等）が挙げられる。
【００１２】
タンパク質を含有する場合、水溶液（Ａ）中のタンパク質の含有量はトロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴの安定性の観点から、水溶液（Ａ）の重量を基準として、好ましくは０．１〜５重量％、更に好ましくは０．３〜３重量％、特に好ましくは０．５〜３重量％である。
【００１３】
トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴを含有する水溶液（Ａ）のｐＨは、保存安定性の観点から、好ましくは６．０〜８．５、更に好ましくは６．５〜８．０、特に好ましくは６．５〜７．５である。ｐＨが６．０未満又は８．５を超えるとトロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴの安定性が悪くなる傾向にある。
尚、ｐＨは、ＪＩＳ  Ｋ０４００−１２−１０：２０００に基づいて測定される測定温度２５℃での値である。
【００１４】
トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴを含有する水溶液（Ａ）のｐＨを上記の好ましい範囲に調整するためには、公知の緩衝液、例えばリン酸緩衝液又はグッド緩衝液等を使用することができ、トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴの安定性の観点から、リン酸緩衝液が好ましい。
【００１５】
トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴを含有する水溶液（Ａ）は、トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴの安定化の目的で、更に非イオン界面活性剤を含有することができる。
【００１６】
非イオン界面活性剤としては、アルキレンオキサイド（以下、ＡＯと略記）付加型非イオン界面活性剤［高級アルコールのＡＯ付加物、アルキルフェノールのＡＯ付加物、ポリプロピレングリコールエチレンオキサイド付加物、ポリエチレングリコールプロピレンオキサイド付加物及び脂肪酸ＡＯ付加物］及び多価アルコール型非イオン界面活性剤等が挙げられる。
【００１７】
非イオン界面活性剤におけるＡＯとしては、エチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記）、プロピレンオキサイド（以下、ＰＯと略記）及びブチレンオキサイド等が挙げられる。
【００１８】
高級アルコールのＡＯ付加物としては、炭素数８〜２４の高級アルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコール及びオレイルアルコール等）のＥＯ１〜２０モル付加物等及び炭素数８〜２４の高級アルコールのＰＯ１〜４０モル付加物等が挙げられる。
【００１９】
アルキルフェノールのＡＯ付加物としては、炭素数７〜３６のアルキルフェノール（ノニルフェノール及びセチルフェノール等）のＥＯ１〜４０モル付加物等及び炭素数７〜３６のアルキルフェノールのＰＯ１〜４０モル付加物等が挙げられる。
【００２０】
ポリプロピレングリコールＥＯ付加物としては、プルロニック型界面活性剤が挙げられ、プロピレンオキシドの繰り返し単位が１０〜１００個のポリプロピレングリコールのＥＯ２〜４０モル付加物等が挙げられる。
【００２１】
ポリエチレングリコールＰＯ付加物としては、エチレンオキシドの繰り返し単位が１０〜１００個のポリエチレングリコールのＰＯ２〜２０モル付加物等が挙げられる。
【００２２】
脂肪酸ＡＯ付加物としては、炭素数８〜２４の高級脂肪酸（ラウリル酸、ステアリン酸及びオレイン酸等）のＥＯ１〜２５モル付加物等が挙げられる。
【００２３】
多価アルコール型非イオン界面活性剤としては、炭素数３〜３６の２〜８価の多価アルコール（グリセリン、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、ソルビット及びソルビタン等）の脂肪酸（炭素数８〜２４）エステル等、炭素数３〜３６の２〜８価の多価アルコールの脂肪酸（炭素数８〜２４）エステルのＥＯ及び／又はＰＯ付加物等並びに脂肪酸（炭素数１０〜１８）アルカノールアミド（ラウリン酸モノエタノールアミド及びラウリン酸ジエタノールアミド等）等が挙げられる。
【００２４】
これらの内、トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴの安定性の観点から、高級アルコールのＡＯ付加物並びに炭素数３〜３６の２〜８価の多価アルコールの脂肪酸（炭素数８〜２４）エステルのＥＯ及び／又はＰＯ付加物が好ましく、更に好ましいのは炭素数３〜３６の２〜８価の多価アルコールの脂肪酸（炭素数８〜２４）エステルのＥＯ及び／又はＰＯ付加物であり、特に好ましいのは、ソルビタン脂肪酸（炭素数８〜２４）エステルＥＯ６〜４０モル付加物である。特に好ましいものの具体例としては、ＴＷＥＥＮ８０等が挙げられる。
【００２５】
非イオン界面活性剤を含有する場合、その含有量は、水溶液（Ａ）の重量を基準として、トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴの安定性の観点から、好ましくは０．１〜１重量％、更に好ましくは０．１〜０．５重量％、特に好ましくは０．１〜０．３重量％である。
【００２６】
トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴを含有する水溶液（Ａ）は、トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴ、水、並びに必要により緩衝剤、タンパク質、非イオン界面活性剤及びその他の成分を混合することで容易に得られる。その他の成分として生理学的な血清環境を提供するために食塩を添加してもよい。
【００２７】
トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴを含有する水溶液（Ａ）を加熱処理後、アニオン界面活性剤（Ｂ）を添加して凍結乾燥することにより、トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴの保存安定性を向上させることができる。
【００２８】
加熱処理の温度は、３０〜５０℃であることが必要であり、加熱処理時間は７２〜２４０時間であることが必要である。
加熱処理の温度は、トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴの安定性の観点から、好ましくは３０〜４５℃、更に好ましくは３５〜４５℃、特に好ましくは３８〜４２℃である。
また、加熱処理時間は、トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴの安定性の観点から、好ましくは９６〜２２０時間、更に好ましくは１２０〜２００時間、特に好ましくは１５０〜１８０時間である。
３０℃未満の処理温度では、安定化効果が小さく、また、５０℃を越える処理温度では、トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴが変性してしまう。同様に７２時間未満の処理時間では、安定化効果が小さく、また、２４０時間を超える処理時間では、トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴが変性してしまう。
【００２９】
加熱する装置としては、上記処理温度及び時間に設定できるものであれば特に限定されないが、例えばインキュベーター等が挙げられる。
【００３０】
アニオン界面活性剤（Ｂ）としては、カルボン酸塩型アニオン界面活性剤（Ｂ１）、硫酸エステル塩型アニオン界面活性剤（Ｂ２）、スルホン酸塩型アニオン界面活性剤（Ｂ３）及びリン酸エステル塩型アニオン界面活性剤（Ｂ４）等が挙げられる。
【００３１】
カルボン酸塩型アニオン界面活性剤（Ｂ１）としては、炭素数８〜２２の飽和又は不飽和の脂肪酸（カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リシノール酸、ヤシ油、パーム核油、米ぬか油及び牛脂等）の塩、炭素数８〜１６の脂肪族アルコールのカルボキシメチル化物の塩及び炭素数８〜１６の脂肪族アルコールのＥＯ１〜１０モル付加物のカルボキシメチル化物の塩等が挙げられる。
【００３２】
硫酸エステル塩型アニオン界面活性剤（Ｂ２）としては、炭素数８〜１８の高級アルコール硫酸エステル塩、炭素数８〜１８の高級アルキルエーテル硫酸エステル塩、硫酸化油（天然の不飽和油脂又は不飽和のロウをそのまま硫酸化して中和したもの）、硫酸化脂肪酸エステル（不飽和脂肪酸の低級アルコールエステルを硫酸化して中和したもの）及び硫酸化オレフィン（炭素数１２〜１８のオレフィンを硫酸化して中和したもの）が挙げられる。
塩としては、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、アルカノールアミン等の塩が挙げられる。
【００３３】
スルホン酸塩型アニオン界面活性剤（Ｂ３）としては、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、スルホコハク酸ジエステル型、α−オレフィンスルホン酸塩、イゲポンＴ型が挙げられる。
【００３４】
リン酸エステル塩型アニオン界面活性剤（Ｂ４）としては、高級アルコールリン酸エステル塩及び高級アルコールＥＯ付加物リン酸エステル塩が挙げられる。
【００３５】
（Ｂ１）〜（Ｂ４）における塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩及びアルカノールアミン塩等が挙げられる。
【００３６】
これらの中で、トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴの安定性の観点から硫酸エステル塩型アニオン界面活性剤（Ｂ２）が好ましく、更に好ましいのは炭素数８〜１８の高級アルコール硫酸エステル塩であり、特に好ましいのはラウリルアルコール硫酸エステル塩である。
特に好ましいものの具体例として、ラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられる。
【００３７】
アニオン界面活性剤（Ｂ）の含有量は、水溶液（Ａ）の重量を基準として、トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴの安定性の観点から、好ましくは０．１〜０．５重量％、更に好ましくは０．１〜０．３重量％、特に好ましくは０.１５〜０．２５重量％である。
【００３８】
加熱処理後の水溶液（Ａ）とアニオン界面活性剤（Ｂ）を混合する際の温度は、１５〜３０℃であることが好ましい。また、（Ａ）と（Ｂ）の混合時間は、（Ｂ）が溶解できれば特に限定されないが１０分〜２時間であることが好ましい。
【００３９】
凍結乾燥方法としては、特に限定はないが、例えば加熱処理後の水溶液（Ａ）にアニオン界面活性剤（Ｂ）を添加した水溶液をガラス瓶に秤量し、凍結乾燥機（ＵＬＶＡＣ社製）に設置した後、−３０℃の棚温で３時間凍結させ、減圧下（０．０５ｍｍＨｇ）で２４時間乾燥させる方法等が挙げられる。これらの温度、時間及び減圧度の条件は適宜変更することができる。
【００４０】
本発明の凍結乾燥方法は、臨床検査の分野において酵素免疫測定法、放射線免疫測定法及び免疫比濁法等の免疫測定を行う際に用いることができる。特に、トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴの保存安定性が向上し、その活性が長期間維持できることから較正物質として好適に使用できる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例により、本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４２】
＜実施例１＞
脱イオン水１０ｍLにリン酸二水素カリウム８ｍｇ、リン酸水素二ナトリウム５０ｍｇ、塩化ナトリウム０．８５ｇを加えて攪拌を行った。更にウシ血清アルブミン０．１ｇ及び非イオン界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ８０）０．０３ｇを加えてよく攪拌した。その後遊離型トロポニンＴを１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加、攪拌して水溶液（Ａ−１）を得た。その後、水溶液（Ａ−１）を４０℃のインキュベータで１６８時間加熱処理を行った後、アニオン界面活性剤（Ｂ）としてのラウリル硫酸ナトリウムを０．０２ｇ添加して、２０℃で３０分攪拌して遊離型トロポニンＴを含有する水溶液を得た。この水溶液１．０５ｍＬをガラス瓶に秤量し、凍結乾燥機（ＵＬＶＡＣ社製）に設置した。凍結乾燥機の棚温を−３０℃に設定し３時間凍結させた後、減圧下（０．０５ｍｍＨｇ）で２４時間乾燥させた。
【００４３】
＜実施例２＞
水溶液（Ａ−１）の加熱処理の温度を４０℃から５０℃に変更した以外は実施例１と同様にして、凍結乾燥を行った。
【００４４】
＜実施例３＞
水溶液（Ａ−１）の加熱処理の温度を４０℃から３０℃に変更した以外は実施例１と同様にして、凍結乾燥を行った。
【００４５】
＜実施例４＞
水溶液（Ａ−１）の加熱処理の時間を１６８時間から２４０時間に変更した以外は実施例１と同様にして、凍結乾燥を行った。
【００４６】
＜実施例５＞
水溶液（Ａ−１）の加熱処理の時間を１６８時間から７２時間に変更した以外は実施例１と同様にして、凍結乾燥を行った。
【００４７】
＜実施例６＞
ラウリル硫酸ナトリウムの添加量を０．０２ｇから０．０５ｇに変更した以外は実施例１と同様にして、凍結乾燥を行った。
【００４８】
＜実施例７＞
ラウリル硫酸ナトリウムの添加量を０．０２ｇから０．０１ｇに変更した以外は実施例１と同様にして、凍結乾燥を行った。
【００４９】
＜実施例８＞
ラウリル硫酸ナトリウムをオレイル硫酸エステルナトリウム塩に変更した以外は実施例１と同様にして、凍結乾燥を行った。
【００５０】
＜実施例９＞
ウシ血清アルブミン及び非イオン界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ８０）を加えない以外は実施例１と同様にして、凍結乾燥を行った。
【００５１】
＜比較例１＞
水溶液（Ａ−１）の加熱処理を行わない以外は実施例１と同様にして、凍結乾燥を行った。
【００５２】
＜比較例２＞
水溶液（Ａ−１）の加熱処理の温度を４０℃から２５℃に変更した以外は実施例１と同様にして、凍結乾燥を行った。
【００５３】
＜比較例３＞
水溶液（Ａ−１）の加熱処理の温度を４０℃から５５℃に変更した以外は実施例１と同様にして、凍結乾燥を行った。
【００５４】
＜比較例４＞
水溶液（Ａ−１）の加熱処理の時間を１６８時間から３００時間に変更した以外は実施例１と同様にして、凍結乾燥を行った。
【００５５】
＜ 比較例５＞
水溶液（Ａ−１）の加熱処理の時間を１６８時間から４８時間に変更した以外は実施例１と同様にして、凍結乾燥を行った。
【００５６】
＜ 比較例６＞
ラウリル硫酸ナトリウムを使用しない以外は実施例１と同様にして、凍結乾燥を行った。
【００５７】
＜発光量の測定＞
実施例１〜９及び比較例１〜６で得られた凍結乾燥品に脱イオン水１．０ｍＬを添加し、ピペッティングで１０回攪拌して、１分間静置した後、全自動化学発光免疫測定装置［スフィアライト（登録商標）１８０、オリンパス株式会社製］により発光量（作製直後発光量）の測定を行った。凍結乾燥品を２〜１０℃の冷蔵で６ヶ月又は１３ヶ月間保存した後、同様の操作で発光量（６ヶ月後発光量又は１３ヶ月後発光量）を測定した。
各発光量の値と、凍結乾燥品作製直後の発光量を基準とする６ヶ月後発光量及び１３ヶ月後発光量の保持率（％）を表１に示す。
【００５８】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明の凍結乾燥方法は、トロポニン複合体又は遊離型トロポニンＴを長期間安定して保存することができることから、臨床検査の分野において酵素免疫測定法、放射線免疫測定法及び免疫比濁法等により免疫測定を行う際に有用である。特に、抗原を含有した溶液中の抗原の失活を防止し、安定して保存することができることから、標準液用として好適に使用できる。