(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡに転写されたときにステムおよびループを形成するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物であって、ループをコードする部分のＤＮＡ配列がプロモーターおよび対象の遺伝子を含み、前記プロモーターと対象の遺伝子とが作動可能に連結されており、
ＲＮＡのステムが標的の発現を調節する第１のヌクレオチド配列を含む、
ＤＮＡ構築物。
【請求項２】
標的の発現を調節する第１のヌクレオチド配列が、ＲＮＡｉ経路を通じて標的の発現を調節する、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３】
前記対象の遺伝子が、発現のアンチセンス調節を介して標的の発現を調節する、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４】
ループのＤＮＡが、標的の発現を調節する第２のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項５】
ループ中に１つまたは複数のスプライス部位をさらに含む、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項６】
ループが、標的の発現を調節する２つ以上のヌクレオチド配列を含有する、請求項４に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項７】
標的の発現を調節する各ヌクレオチド配列が、同一標的の発現を調節してもよく、異なる標的の発現を調節してもよい、請求項６に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項８】
ステムが、標的の発現を調節する２つ以上のヌクレオチド配列を含有する、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項９】
標的の発現を調節する各ヌクレオチド配列が、同一標的の発現を調節してもよく、異なる標的の発現を調節してもよい、請求項８に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１０】
ステムが、１つまたは複数の標的の発現を調節する１つまたは複数のヌクレオチド配列を含有し、ループが、１つまたは複数の標的の発現を調節する１つまたは複数のヌクレオチド配列を含有する、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１１】
ヌクレオチド配列がＰＮＡを含む、請求項１に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項１２】
ＰＮＡが、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンＰＮＡ、シクロヘキシルＰＮＡ、レトロ−インベルソＰＮＡ、ホスホンＰＮＡ、プロピニルＰＮＡ、およびアミノプロリンＰＮＡからなる群から選択される、請求項１１に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項１３】
ヌクレオチド配列が、Ｆｍｏｃおよび／またはｔＢｏｃプロセスにより合成される、請求項１１に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項１４】
ヌクレオチド配列が合成塩基を含む、請求項１に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項１５】
合成塩基が、２’−Ｏ−メチル、モルフォリノ、ホスホロチオエート、および閉じ込め塩基からなる群から選択される、請求項１４に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項１６】
ヌクレオチド配列が改変された糖を含む、請求項１に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項１７】
改変された糖が、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−アルキルリボース、および２’−Ｏ−アリルリボースからなる群から選択される、請求項１６に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項１８】
標的が、遺伝子、オリゴヌクレオチド配列、および／またはタンパク質である、請求項１に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項１９】
プロモーターに作動可能に連結された請求項１に記載のヌクレオチド構築物を含むベクター。
【請求項２０】
プロモーターが、ウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、哺乳動物プロモーター、植物プロモーター、細菌プロモーター、構成的プロモーター、調節性プロモーター、真菌プロモーター、酵母プロモーター、および昆虫プロモーターからなる群から選択される、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２１】
植物プロモーターが、アラビドプシス、ヒマワリ、ワタ、ナタネ、トウモロコシ、コムギ、トウゴマ、ヤシ、タバコ、ピーナッツ、モロコシ、サトウキビ、およびダイズにおいて同定されるプロモーターからなる群から選択される、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
ベクターが、プラスミド、コスミド、レトロウイルスベクター、アグロバクテリウム、ウイルスベクター、細菌ベクター、酵母ベクター、真核生物ベクター、植物ベクター、および哺乳動物ベクターからなる群から選択される、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２３】
プロモーターに作動可能に連結された請求項１に記載のヌクレオチド構築物のゲノムへの組込みを促進する配列をさらに含む、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２４】
標的の発現を調節する方法であって、
請求項１に記載のヌクレオチド構築物を細胞に提供すること、および
前記細胞を培養することを含む方法。
【請求項２５】
細胞が、原核生物、真核生物、細菌、アグロバクテリウム、酵母、植物、哺乳動物、およびヒトの細胞からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
植物細胞が、アラビドプシス、ヒマワリ、ワタ、ナタネ、トウモロコシ、コムギ、トウゴマ、ヤシ、タバコ、ピーナッツ、モロコシ、サトウキビ、およびダイズの細胞において同定されるプロモーターからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
標的が、遺伝子、オリゴヌクレオチド配列、および／またはタンパク質である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
標的の発現を調節する方法であって、
請求項１９に記載のベクターを含むベクターをインビトロで細胞に提供すること、および
前記細胞中の前記ベクターから請求項１に記載のＤＮＡ構築物を発現することを含む方法。
【請求項２９】
標的が、遺伝子、オリゴヌクレオチド配列、および／またはタンパク質である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
細胞が、原核生物、真核生物、細菌、アグロバクテリウム、酵母、植物、哺乳動物、およびヒトの細胞からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
植物細胞が、アラビドプシス、ヒマワリ、ワタ、ナタネ、トウモロコシ、コムギ、トウゴマ、ヤシ、タバコ、ピーナッツ、モロコシ、サトウキビ、およびダイズの細胞からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１に記載のヌクレオチド構築物ならびに薬学的に許容できる担体、希釈剤、および／またはアジュバンドを含む薬物。
【請求項３３】
請求項１９に記載のベクターならびに薬学的に許容できる担体、希釈剤、および／またはアジュバンドを含む薬剤組成物。
【請求項３４】
請求項１に記載のヌクレオチド構築物を含む細胞。
【請求項３５】
細胞が、原核生物、真核生物、細菌、アグロバクテリウム、酵母、植物、哺乳動物、およびヒトの細胞からなる群から選択される、請求項３４に記載の細胞。
【請求項３６】
植物が、アラビドプシス、ヒマワリ、ワタ、ナタネ、トウモロコシ、コムギ、トウゴマ、ヤシ、タバコ、ピーナッツ、モロコシ、サトウキビ、およびダイズからなる群から選択される、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３７】
標的を調節するための構築物を作製する方法であって、
ＲＮＡに転写されたときに塩基対合して構築物中にステム−ループ構造を形成することができる第１と第２の配列と、第１と第２の配列の間に配置された第３の配列とを組み合わせて単一ＤＮＡ配列にすることを含み、
前記第１と第２の配列が塩基対合すると、ｓｉＲＮＡを生成することができ、前記第３の配列が、第１と第２の配列を互いに安定的に対合させるのに十分な長さであり、
前記第３の配列をコードする部分の配列が、プロモーターおよび対象の遺伝子を含み、前記プロモーターと対象の遺伝子とが作動可能に連結されている、方法。
【請求項３８】
アンチセンス抑制を通じて標的を調節することができる第４の配列を、第１と第２の配列と組み合わせることをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
第４の配列が第１と第２の配列の間に配置されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＲＮＡに転写されたときにステムおよびループを形成するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物であって、ループをコードする部分のヌクレオチド配列がプロモーターおよび対象の遺伝子ならびに１つまたは複数のスプライス部位を含み、前記プロモーターおよび対象の遺伝子が、標的の発現を調節する第１のヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、
ステムが標的の発現を調節する第２のヌクレオチド配列を含み、
第１のヌクレオチド配列により調節される標的と第２のヌクレオチド配列により調節される標的が同一であっても異なっていてもよいヌクレオチド構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国エネルギー省により授与された認可番号ＤＥ−ＡＣ０２−９８ＣＨ１０８８６の下で政府支援により実施されたものである。合衆国政府は本発明にある種の権利を有している。
【０００２】
（優先権の主張）
本出願は、「組み合わされたヘアピン−アンチセンス組成物および発現を調節するための方法」という、２００７年３月２１日出願の米国特許仮出願第６０／８９６２１２号明細書の出願日の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
アンチセンス抑制とは、核酸の「アンチセンス」鎖が遺伝子またはｍＲＮＡに結合し、それによって遺伝子の発現またはｍＲＮＡの翻訳を妨げることである。典型的には、アンチセンス抑制では、発現カセットは、標的をコードするｍＲＮＡのすべてまたは一部に相補的なＲＮＡ分子を発現するように設計されている。アンチセンスＲＮＡ分子が過剰発現すれば、その天然の遺伝子の発現が減少する可能性がある。
【０００４】
アンチセンス抑制において使用するためのポリヌクレオチドは、標的をコードしている配列の相補体のすべてまたは一部、標的転写物の５’および／もしくは３’非翻訳領域の相補体のすべてまたは一部、ならびに／あるいはコード配列と標的をコードする転写物の非翻訳領域の両方の相補体のすべてまたは一部に一致していてよい。さらに、アンチセンスポリヌクレオチドは、標的配列に対して完全に相補的（すなわち、標的配列の相補体に１００％同一）でも、部分的に相補的（すなわち、標的配列の相補体に１００％未満同一）でもよい。たとえば、米国特許第５９５２６５７号に記載のように、アンチセンス抑制を利用して、同一細胞または生物において複数のタンパク質の発現を阻害することができる。さらに、アンチセンスヌクレオチドの一部を使用して、標的遺伝子の発現を妨げることができる。通常、少なくとも５０、１００、２００、３００、５００または５５０ヌクレオチドの配列を使用することができる。アンチセンス抑制により植物における内在性遺伝子の発現を阻害するための方法は、たとえば、Ｌｉｕら（２００２年）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２９：１７３２〜１７５３頁ならびに米国特許第５７５９８２９号および米国特許第５９５２６５７号に記載されている。アンチセンス配列の３’方向およびポリアデニル化シグナルの５’の位置で発現カセット中にポリｄＴ領域を含むことにより、アンチセンス抑制の効率を増加させることができる。米国特許出願公開第２００２００５８８１５号を参照されたい。
【０００５】
ＲＮＡ干渉とは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスのことである（Ｆｉｒｅら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ、３９１、８０６頁；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８６、９５０〜９５１頁）。植物における相当するプロセスは、一般に、転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングと呼ばれ、真菌においてはクウェリング（quelling）とも呼ばれている。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来遺伝子の発現を妨げるために使われる進化的に保存された細胞防御機構だと考えられており、多様な植物相および門により広く共有されている（Ｆｉｒｅら、１９９９年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．、１５、３５８頁）。外来遺伝子発現に対するそのような防御は、ウイルス感染由来の、または相同の一本鎖ＲＮＡもしくはウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答を介した宿主ゲノムへのトランスポゾンエレメントの無作為な組込み由来の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の発現に応えて進化した可能性がある。細胞中にｄｓＲＮＡが存在すると、まだ完全には特徴づけられていない機構によりＲＮＡｉ応答を始動させる。この機構は、タンパク質キナーゼＰＫＲおよび２’，５’−オリゴアデニル酸シンセターゼがｄｓＲＮＡ媒介により活性化され、リボヌクレアーゼＬによりｍＲＮＡが非特異的に切断されることから生じるインターフェロン応答とは違っていると思われる。
【０００６】
細胞内に長いｄｓＲＮＡが存在すると、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される。ダイサーは、ｄｓＲＮＡを低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られるｄｓＲＮＡの短い断片にプロセッシングすることに関与している（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、上記を参照；Ｂｅｒｓｔｅｉｎら、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ、４０９、３６３頁）。ダイサー活性に由来する低分子干渉ＲＮＡは、典型的には約２１〜約２３ヌクレオチド長であり、約１９塩基対二重鎖を含む（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、上記を参照；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１５、１８８頁）。ダイサーは、保存された構造のＲＮＡ前駆体からの翻訳制御に関与している２１−および２２−ヌクレオチド小分子ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の切取りにも関係づけられてきた（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３、８３４頁）。ＲＮＡｉ応答は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と一般に呼ばれているエンドヌクレアーゼ複合体も特色としており、ＲＩＳＣはｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で行われる（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１５、１８８頁）。
【０００７】
ＲＮＡｉは種々の系において研究されてきた。Ｆｉｒｅら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ、３９１、８０６頁は、最初に線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）においてＲＮＡｉを観察した。ＢａｈｒａｍｉａｎとＺａｒｂｌ、１９９９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９、２７４〜２８３頁、およびＷｉａｎｎｙとＧｏｅｔｚ、１９９９年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２、７０頁は、哺乳動物系におけるｄｓＲＮＡにより媒介されたＲＮＡｉを記載している。Ｈａｍｍｏｎｄら、２０００年、Ｎａｔｕｒｅ、４０４、２９３頁は、ｄｓＲＮＡでトランスフェクトされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞におけるＲＮＡｉを記載している。Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ、４１１、４９４頁は、ヒト胚腎臓およびＨｅＬａ細胞を含む培養哺乳動物細胞における合成２１−ヌクレオチドＲＮＡの二重鎖の導入により誘導されるＲＮＡｉを記載している。ｄｓＲＮＡ干渉を利用して内在性植物遺伝子の発現を阻害するための方法は、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、（１９９８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３９５９〜１３９６５頁、Ｌｉｕら、（２００２年）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２９：１７３２〜１７５３頁、ならびにＷＯ９９／５９０２９、ＷＯ９９／５３０５０、ＷＯ９９／６１６３１、およびＷＯ００／５９０３５に記載されている。
【０００８】
ヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）干渉またはイントロン含有ヘアピンＲＮＡ（ｉｈｐＲＮＡ）干渉により得られる１つまたは複数の標的の発現の阻害に関係する追加のＲＮＡｉ方法はすでに記載されている。これらの方法は内在性遺伝子の発現を阻害するのに高度に効率的である。ＷａｔｅｒｈｏｕｓｅとＨｅｌｌｉｗｅｌｌ（２００３年）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．５：２９〜３８頁およびそこで引用されている参考文献を参照されたい。
【０００９】
ｈｐＲＮＡ干渉では、発現カセットは、分子内でハイブリダイズして、一本鎖ループ領域と塩基対合ステムを含むヘアピン構造を形成するＲＮＡ分子を発現するように設計されている。塩基対合ステム領域は、その発現が阻害されることになる遺伝子をコードする内在性メッセンジャーＲＮＡのすべてまたは一部に一致するセンス配列、およびそのセンス配列に完全にもしくは部分的に相補的なアンチセンス配列を含む。したがって、分子の塩基対合ステム領域は通常、ＲＮＡ干渉の特異性を決定する。ｈｐＲＮＡ分子は内在性遺伝子の発現を阻害するのに高度に効率的であり、この分子が誘導するＲＮＡ干渉はそれに続く世代により受け継がれる。たとえば、ＣｈｕａｎｇとＭｅｙｅｒｏｗｉｔｚ（２０００年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：５９８５〜５９９０頁；Ｓｔｏｕｔｊｅｓｄｉｊｋら、（２００２年）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２９：１７２３〜１７３１頁；およびＷａｔｅｒｈｏｕｓｅとＨｅｌｌｉｗｅｌｌ（２００３年）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．５：２９〜３８頁を参照されたい。ｈｐＲＮＡ干渉を利用して遺伝子の発現を阻害するまたは発現停止させるための方法は、たとえば、ＣｈｕａｎｇとＭｅｙｅｒｏｗｉｔｚ（２０００年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：５９８５〜５９９０頁；Ｓｔｏｕｔｊｅｓｄｉｊｋら、（２００２年）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２９：１７２３〜１７３１頁；ＷａｔｅｒｈｏｕｓｅとＨｅｌｌｉｗｅｌｌ（２００３年）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．５：２９〜３８頁；Ｐａｎｄｏｌｆｉｎｉら、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：７、および米国特許出願公開第２００３０１７５９６５号に記載されている。インビボで遺伝子発現を発現停止させるｈｐＲＮＡ構築物の効率に対する一過性アッセイは、Ｐａｎｓｔｒｕｇａら、（２００３年）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．３０：１３５〜１５０頁にすでに記載されている。
【００１０】
ｉｈｐＲＮＡでは、干渉する分子はｈｐＲＮＡの場合と同じ全体構造を有するが、そのＲＮＡ分子はそのｉｈｐＲＮＡが発現されている細胞でスプライスされることができるイントロンをさらに含んでいる。イントロンを利用すれば、スプライシングに続いてヘアピンＲＮＡ分子内でのループの大きさが最小化され、それにより干渉の効率は増加する。たとえば、Ｓｍｉｔｈら、（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ  ５０７：３１９〜３２０頁を参照されたい。実際、Ｓｍｉｔｈらは、ｉｈｐＲＮＡ媒介干渉による内在性遺伝子発現の１００％抑制を明らかにしている。ｉｈｐＲＮＡ干渉により遺伝子の発現を阻害するための方法は、たとえば、Ｓｍｉｔｈら、（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ  ５０７：３１９〜３２０頁；Ｗｅｓｌｅｙら、（２００１年）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２７：５８１〜５９０頁；ＷａｎｇとＷａｔｅｒｈｏｕｓｅ（２００１年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．５：１５６〜１５０頁；ＷａｔｅｒｈｏｕｓｅとＨｅｌｌｉｗｅｌｌ（２００３年）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．５：２９〜３８頁；ＨｅｌｌｉｗｅｌｌとＷａｔｅｒｈｏｕｓｅ（２００３年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３０：２８９〜２９５頁、および米国特許出願公開第２００３０１８０９５５号に記載されている。
【００１１】
種々のＲＮＡｉおよび遺伝子サイレンシングシステムに関する報告もある。たとえば、Ｐａｒｒｉｓｈら、２０００年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ、６、１０７７〜１０８７頁は、線虫のｕｎｃ−２２遺伝子を標的にする特定の化学的に改変されたｓｉＲＮＡ構築物を記載している。Ｇｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ、国際ＰＣＴ出願国際公開第０１／３８５５１号は、ある種のｄｓＲＮＡを使用して植物中でのポリコーム遺伝子発現を調節するためのある種の方法を記載している。Ｃｈｕｒｉｋｏｖら、国際ＰＣＴ出願国際公開第０１／４２４４３号は、ある種のｄｓＲＮＡを使用して生物の遺伝的特徴を改変するためのある種の方法を記載している。Ｃｏｇｏｎｉら、国際ＰＣＴ出願国際公開第０１／５３４７５号は、ニューロスポラサイレンシング遺伝子を単離するためのある種の方法とその使用を記載している。Ｒｅｅｄら、国際ＰＣＴ出願国際公開第０１／６８８３６号は、植物における遺伝子サイレンシングのためのある種の方法を記載している。Ｈｏｎｅｒら、国際ＰＣＴ出願国際公開第０１／７０９４４号は、ある種のｄｓＲＮＡを使用して、パーキンソン病モデルとしてトランスジェニック線虫（ｎｅｍａｔｏｄｅ）を利用する薬物スクリーニングのある種の方法を記載している。Ｄｅａｋら、国際ＰＣＴ出願国際公開第０１／７２７７４号は、ショウジョウバエにおいてＲＮＡｉに関係している可能性のあるある種のショウジョウバエ由来遺伝子産物を記載している。Ａｒｎｄｔら、国際ＰＣＴ出願国際公開第０１／９２５１３号は、ＲＮＡｉを増強する因子を使うことにより遺伝子抑制を媒介するためのある種の方法を記載している。Ｔｕｓｃｈｌら、国際ＰＣＴ出願国際公開第０２／４４３２１号は、ある種の合成ｓｉＲＮＡ構築物を記載している。Ｐａｃｈｕｋら、国際ＰＣＴ出願国際公開第００／６３３６４号、およびＳａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎら、国際ＰＣＴ出願国際公開第０１／０４３１３号は、ある種のｄｓＲＮＡを使用してある種のポリヌクレオチド配列の機能を阻害するためのある種の方法と組成物を記載している。Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉら、国際ＰＣＴ出願国際公開第０２／３８８０５号は、ＲＮＡｉを介して同定されるある種の線虫遺伝子を記載している。Ｋｒｅｕｔｚｅｒら、国際ＰＣＴ出願国際公開第０２／０５５６９２号、国際公開第０２／０５５６９３号、およびＥＰ１１４４６２３Ｂ１は、ＲＮＡｉを使用して遺伝子発現を阻害するためのある種の方法を記載している。Ｇｒａｈａｍら、国際ＰＣＴ出願国際公開第９９／４９０２９号および国際公開第０１／７０９４９号、ならびにＡＵ４０３７５０１は、ある種のベクター発現ｓｉＲＮＡ分子を記載している。Ｆｉｒｅら、米国特許第６，５０６，５５９号は、ＲＮＡｉを媒介するある種の長ｄｓＲＮＡ（２５ヌクレオチドより大きい）構築物を使用してインビトロで遺伝子発現を阻害するためのある種の方法を記載している。
【００１２】
ＲＮＡｉおよびアンチセンス技術を使用した遺伝子サイレンシングの分野では多くの研究が行われてきたが、ＲＮＡｉまたはアンチセンス技術を超える遺伝子発現の調節を増加させる改良は当技術分野における改良になると考えられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一実施形態は、ステムおよびループを形成するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物であって、ループが標的の発現を調節する第１のヌクレオチド配列を含み、ステムが標的の発現を調節する第２のヌクレオチド配列を含み、第１のヌクレオチド配列により調節される標的と第２のヌクレオチド配列により調節される標的が同一であっても異なっていてもよい、ヌクレオチド構築物を提供する。
【００１４】
追加の実施形態では、標的の発現を調節する第１のヌクレオチド配列は、ＲＮＡｉ経路を通じて標的の発現を調節する。追加の実施形態では、標的の発現を調節する第１のヌクレオチド配列は、発現のアンチセンス調節を介して標的の発現を調節する。
【００１５】
本発明の特定の実施形態は、ステムおよびループを形成するヌクレオチド配列ならびにプロモーターに作動可能に連結された対象の遺伝子を含むヌクレオチド構築物であって、ステムが標的の発現を調節する第２のヌクレオチド配列を含み、ループが標的の発現を調節しても調節しなくてもよい第１のヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド構築物を提供する。追加の実施形態では、プロモーターに作動可能に連結された対象の遺伝子はループ内に位置している。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、前述のヌクレオチド配列をコードする配列を含むベクターを提供する。代替の実施形態は、ステムおよびループを形成するヌクレオチド配列をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターであって、ループが標的の発現を調節する第１のヌクレオチド配列を含み、ステムが標的の発現を調節する第２のヌクレオチド配列を含む、ベクターを提供する。
【００１７】
本発明の実施形態は、標的の発現を調節する方法であって、ステムおよびループを形成するヌクレオチド配列を含む配列であって、ループが標的の発現を調節する第１のヌクレオチド配列を含み、ステムが標的の発現を調節する第２のヌクレオチド配列を含む、配列を細胞に提供すること、および前記細胞を培養することを含む方法を提供する。
【００１８】
本発明の実施形態は、標的の発現を調節する方法であって、ステムおよびループを形成するヌクレオチド配列をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターであって、ループが標的の発現を調節する第１のヌクレオチド配列を含み、ステムが標的の発現を調節する第２のヌクレオチド配列を含むベクターを細胞に提供すること、および前記細胞において前記ベクターからヌクレオチド配列を発現させることを含む方法を提供する。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、対象の状態を治療する方法であって、ステムおよびループを形成するヌクレオチド配列を含む前述の配列を対象に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態は、ステムおよびループを形成するヌクレオチド配列をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターを対象に投与することを含む。
【００２０】
本発明の特定の実施形態は、ステムおよびループを形成するヌクレオチド配列を含む配列であって、ループが標的の発現を調節する第１のヌクレオチド配列を含み、ステムが標的の発現を調節する第２のヌクレオチド配列を含む配列、ならびに薬学的に許容できる担体、希釈剤、および／またはアジュバンドを含む薬物を提供する。本発明の代替の実施形態は、ステムおよびループを形成するヌクレオチド配列をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターを含む配列を含む薬物を提供する。
【００２１】
本発明の実施形態は、ステムおよびループを形成する前述のヌクレオチド配列を含む細胞を提供する。代替の実施形態は、ステムおよびループを形成するヌクレオチド配列をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターを含む細胞を提供することを含む。
【００２２】
本発明の実施形態は、標的を調節するための構築物を作製する方法であって、塩基対合して構築物中にステム−ループ構造を形成することができる第１と第２の配列と、第１の配列と第２の配列の間に配置された第３の配列とを組み合わせて単一の核酸配列にすること含み、前記第１と第２配列が塩基対合すると、ｓｉＲＮＡを生成することができ、前記第３の配列が、第１と第２の配列を互いに安定的に対合させるのに十分な長さであり、前記第３の配列が、アンチセンス抑制を通じて標的を調節することができる配列を含む方法を提供する。
【００２３】
本発明の実施形態は、標的を調節するための構築物を作製する方法であって、塩基対合して構築物中にステム−ループ構造を形成することができる第１と第２の配列と、第１の配列と第２の配列の間に配置された第３の配列と、プロモーターに作動可能に連結された対象の遺伝子を含む第４の配列とを組み合わせて単一の核酸配列にすることを含み、前記第１および第２配列が塩基対合すると、ｓｉＲＮＡを生成することができ、前記第３の配列が、第１と第２の配列を互いに安定的に対合させるのに十分な長さであり、前記第３の配列がアンチセンス抑制を通じて標的を調節することができる配列を含んでも含まなくてもよい方法を提供する。
【００２４】
本発明の別の実施形態は、内在性成分脂肪酸のレベルが改変された植物を作製する方法を提供する。この方法は、脂肪酸合成遺伝子または脂質代謝遺伝子などの異種遺伝子のレベルを調節することを含む。
【００２５】
本発明は、ＲＮＡｉを使用した種々の遺伝子サイレンシング方法および当技術分野では公知のアンチセンス技術とさらに組み合わせて利用して、１つまたは複数の特定の遺伝子および／または遺伝経路に合わせた遺伝子発現の増加された調節を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】構築物のｐＰＨＡＳ−Ｆａｂ１−ＡＳ、ｐＰＨＡＳ−Ｆａｂ１−ＨＰ、およびｐＰＨＡＳ−Ｆａｂ１−ＨＰＡＳの説明図である。
【図２】構築物のｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ２−ＡＳ、ｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ２−ＨＰ、ｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ２−ＨＰＡＳ、およびｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ２−ＨＰ−ＧＵＳの説明図である。
【図３】構築物のｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ３−ＡＳ、ｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ３−ＨＰ、およびｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ３−ＨＰＡＳの説明図である。
【図４】構築物のｐＰＨＡＳ−Ｆａｂ１−ＨＰＡＳが細胞内でどのように処理されてＦａｂ１の発現を調節することができるかを示す図である。
【図５】アラビドプシスにおける脂肪酸産生の模式図である。
【図６】背景系統と比べた、ｐＰＨＡＳ−Ｆａｂ１−ＨＰおよびｐＰＨＡＳ−Ｆａｂ１−ＨＰＡＳを含有する種子中の種々の脂肪酸のレベルを示すガスクロマトグラフトレースを示す図である。
【図７】背景系統と比べた、ｐＰＨＡＳ−Ｆａｂ１−ＨＰおよびｐＰＨＡＳ−Ｆａｂ１−ＨＰＡＳを含有する種子中の種々の脂肪酸のレベルを示している要約図である。
【図８】野生型と比べた、ｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ２−ＡＳを含有する種子中の種々の脂肪酸レベルを示すガスクロマトグラフトレースを示す図である。
【図９】Ｆａｄ２−ＭＴ突然変異体と比べた、ｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ２−ＨＰおよびｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ２−ＨＰＡＳを含有する種子中の種々の脂肪酸のレベルを示すガスクロマトグラフトレースを示す図である。
【図１０】Ｆａｄ２−ＭＴ突然変異体および背景系統と比べた、ｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ２−ＡＳ、ｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ２−ＨＰ、およびｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ２−ＨＰＡＳを含有する種子中の種々の脂肪酸のレベルを示している要約図である。
【図１１】背景系統と比べた、ｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ２−ＨＰ−ＧＵＳを含有する種子中の種々の脂肪酸のレベルを示すガスクロマトグラフトレースを示す図である。
【図１２】野生型種子（明るいほうの種子）およびｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ２−ＨＰ−ＧＵＳからＧＵＳを発現している種子（暗いほうの種子）を含む写真である。
【図１３】野生型と比べた、ｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ３−ＡＳを含有する種子中の種々の脂肪酸のレベルを示すガスクロマトグラフトレースを示す図である。
【図１４】Ｆａｄ３−ＭＴ突然変異体と比べた、ｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ３−ＨＰおよびｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ３−ＨＰＡＳを含有する種子中の種々の脂肪酸のレベルを示すガスクロマトグラフトレースを示す図である。
【図１５】Ｆａｄ３−ＭＴ突然変異体および背景系統と比べた、ｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ３−ＡＳ、ｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ３−ＨＰ、およびｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ３−ＨＰＡＳを含有する種子中の種々の脂肪酸のレベルを示している要約図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の一態様は、細胞内で標的の発現を調節するのに有用な化合物、組成物、および方法に関する。具体的には、本発明の態様は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）および／またはアンチセンス抑制により、遺伝子、オリゴヌクレオチド配列、および／またはタンパク質などの標的の発現を調節することができるヌクレオチド配列に関する。一般的には、本発明の調節ヌクレオチド配列（ｍＮＳ）分子は、ステム−ループ構造であって、ステムがダイサーに基質を与えＲＮＡｉ経路を通じて標的を抑制するように働くことができ、構造のループ部分がアンチセンス抑制を通じて遺伝子を抑制するように働くことができる第１の配列を含んでいてよい、ステム−ループ構造を含んでいてよい。本発明のｍＮＳ分子は、全体的にまたは部分的に、化学的に改変されるおよび／または合成的に作製されてよい。化学的に改変されたｍＮＳを使用すれば、たとえば、インビボにおけるヌクレアーゼ分解に対する増加した耐性および／または改善された細胞取込みを通じて、ｍＮＳ分子の種々の特性が改善される可能性がある。本発明の化学的に改変されたｍＮＳ分子は、種々の治療、診断、農業、標的確認、ゲノム発見、遺伝子工学、および薬理ゲノミクスへの適用に有用な試薬および方法を提供する。
【００２８】
一特定の実施形態では、本発明のｍＮＳ分子は、ステムがダイサーにより切断されて、ＲＮＡｉ経路を通じてｍＲＮＡを抑制することができる少なくとも１つの低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を放出することが可能な二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）配列を含有するステム−ループ（ヘアピン）構造を含む。さらに、ｍＮＳ分子のループは、少なくとも１つのアンチセンス核酸（ａｓＮＡ）を含有する。一般的には、そのような分子は、本明細書では、ループアンチセンス付きのヘアピン形成核酸または「ｈｐＮＡａｓ」と呼ぶことにする。
【００２９】
ｓｉＮＡおよびｈｐＮＡａｓのａｓＮＡは、同一遺伝子および／またはｍＲＮＡにおける同一位置を標的にしてよい。追加の実施形態では、ｓｉＮＡおよびｈｐＮＡａｓのａｓＮＡは、同一遺伝子および／またはｍＲＮＡにおける異なった位置を標的にしてよい。ｓｉＮＡおよびｈｐＮＡａｓのａｓＮＡは、異なった遺伝子および／またはｍＲＮＡも標的にしてよい。
【００３０】
ｈｐＮＡａｓのステム部分は、ｓｉＮＡを生成することができる２つ以上の配列を含有していてよい。２つ以上のｓｉＮＡがｈｐＮＡａｓのステムから生成される場合は、これらのｓｉＮＡは同一ｍＲＮＡ上の同一部位を標的にしてよい。ｓｉＮＡは同一ｍＲＮＡ上の異なった部位を標的にしてよい。ｓｉＮＡは異なったｍＲＮＡも標的にしてよい。
【００３１】
ｈｐＮＡａｓのループ部分は、２つ以上のａｓＮＡ配列を含有していてよい。２つ以上のａｓＮＡがｈｐＮＡａｓのループ内に存在する場合、これらのａｓＮＡは同一遺伝子および／またはｍＲＮＡ上の同一部位を標的にしてよい。ａｓＮＡは同一遺伝子および／またはｍＲＮＡ上の異なった部位を標的にしてよい。ａｓＮＡは異なった遺伝子および／またはｍＲＮＡも標的にしてよい。
【００３２】
本発明の追加の実施形態では、ｈｐＮＡａｓのステム部分は、ｓｉＮＡを生成することができる２つ以上の配列を含有していてよく、ｈｐＮＡａｓのループ部分は２つ以上のａｓＮＡ配列を含有していてよい。これらのｓｉＮＡとａｓＮＡは、同一ｍＲＮＡ上の同一部位、同一ｍＲＮＡ上の異なった部位、異なったｍＲＮＡ、またはその任意の組合せを標的にしてよい。
【００３３】
一特定の実施形態では、本発明のｈｐＮＡａｓ由来の単一のｓｉＮＡおよび／またはａｓＮＡは、２つ以上の遺伝子、ヌクレオチド配列、および／またはタンパク質を標的にしてよい。多くの遺伝子が互いにある程度の配列相同性を共有していることがあるために、ｓｉＮＡおよび／またはａｓＮＡ分子は、一種類（class）の遺伝子（および関連するレセプターもしくはリガンド遺伝子）、あるいは、代わりに、異なった遺伝子標的間で共有されている配列、または、代わりに特定の遺伝子標的に特有である配列を選択することにより特定の遺伝子を標的にするよう設計されていてよい。一実施形態では、ｓｉＮＡおよび／またはａｓＮＡ分子は、たとえば、いくつかの遺伝子または遺伝子ファミリー（たとえば、異なった遺伝子アイソフォーム、スプライスバリアント、突然変異遺伝子等）を１つのｓｉＮＡおよび／またはａｓＮＡ分子を使用して標的にするために、いくつかの遺伝子間で相同性を有するＲＮＡ配列の保存領域を標的にするように設計されていてよい。別の実施形態では、ｓｉＮＡおよび／またはａｓＮＡ分子は、調節活性を媒介するためにｓｉＮＡおよび／またはａｓＮＡ分子が必要とする高度な特異性により、特定の遺伝子、ヌクレオチド配列、および／またはタンパク質に特有である配列を標的にするように設計されていてよい。
【００３４】
本発明の追加の実施形態では、ｈｐＮＡａｓ分子は、１つまたは複数のスプライス部位を含有していてよい。ｈｐＮＡａｓのステム部分からｈｐＮＡａｓのループ部分をあたかもそれがイントロンであるかのように切断するように、これらのスプライス部位は操作的に置かれ方向づけられていてよい。そのように操作的に方向づけられて置かれたスプライス部位を含有するｈｐＮＡａｓは、この後、「イントロン含有ｈｐＮＡａｓ」または「ｉｈｐＮＡａｓ」と呼ぶことにする。
【００３５】
別の実施形態では、ｍＮＳはプロモーターに作動可能に連結された対象の遺伝子を含有していてよい。ｍＮＳがヘアピンまたはループを含有している場合、本発明の特定の実施形態は、ループ内部にプロモーターおよび対象の遺伝子が存在することを可能にする。他の実施形態では、ａｓＮＡはプロモーターおよび対象の遺伝子を含有するループ内に存在していても不在でもよい。
【００３６】
対象の遺伝子は、使用者が発現させることを望むいかなる遺伝子でもよい。この遺伝子は、ｍＮＳの標的と同一でも関連していてもよい。非限定的例として、ｍＮＳは突然変異型の対象の遺伝子を標的にし、同時に置換体として正常なまたは工学的に処理されたコピーを提供することができるであろう。追加の実施形態では、プロモーターおよび対象の遺伝子を、ゲノムへの組込みを促進することになる１つもしくは複数の配列の近傍にまたは内部に置いてもよい。本発明において有用なプロモーターの例には、ウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、哺乳動物プロモーター、植物プロモーター、細菌プロモーター、構成的プロモーター、調節性プロモーター、真菌プロモーター、酵母プロモーター、藻類プロモーター、および昆虫プロモーターが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明において有用な植物プロモーターには、たとえば、アラビドプシス、ヒマワリ、ワタ、ナタネ（キャノーラを含む）、トウモロコシ、コムギ、トウゴマ、ヤシ、タバコ、ピーナッツ、モロコシ、サトウキビ、またはダイズにおいて同定されたプロモーターが挙げられる。本発明において有用な適切なプロモーターには、たとえば、２Ｓ−貯蔵タンパク質、ファゼオリン、ＣａＭＶ  ３５Ｓ、ナピン、クルシフェリン、ユビキチン、オレオシン、キャッサバ葉脈モザイクウイルス、プルニン、レグミン、およびオクトピンシンターゼを含むが、これらに限定されることはない、種子特異的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーターが挙げられる。
【００３７】
化学的に改変されたもしくは合成ヌクレオチドおよび／または糖類をｍＮＳ分子に導入すれば、外因的に送達される天然ＲＮＡ分子に固有のインビボ安定性およびバイオアベイラビリティの潜在的限界を克服するための強力な道具を提供することができる。たとえば、化学的に改変されたｍＮＳまたはｍＮＳ含有合成ヌクレオチドを使えば、これらの分子は血清中で比較的長い半減期を有する傾向があるために、所与の治療効果に対して比較的低用量の特定のｍＮＳが可能になる。さらに、ある種の化学的改変物は、特定の細胞もしくは組織を標的にし、および／または核酸分子の細胞取込みを改善することにより、核酸分子のバイオアベイラビリティを改善する可能性がある。したがって、化学的に改変されたまたは合成核酸分子の活性が、天然の核酸分子と比べて（たとえば、全ＲＮＡ核酸分子と比べたとき）低下するとしても、改変されたまたは合成核酸分子の活性全体は、前記分子の安定性および／または送達が改善されたことにより天然の分子よりも大きくなる可能性がある。天然の非改変のｓｉＲＮＡとは違って、化学的に改変されたｓｉＮＡは、ヒトにおいてインターフェロン活性を活性化する可能性を最小化する可能性もある。
【００３８】
一代表的実施形態では、ｍＮＳは１つもしくは複数の改変物および／または合成塩基を含んでいてよい。改変物および／または合成塩基の例には、２’−アミノ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−デオキシ、２’−メトキシエチル、４’−チオ、５−Ｃ−メチル、「ユニバーサル塩基」、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルフォリノ、および「非環式ヌクレオチド」ならびに、２’−Ｏまたは４’−Ｃメチレン架橋含有ヌクレオチド、末端グリセリルおよび／または逆位デオキシ脱塩基残基取込み、ホスホロチオエートヌクレオチド間連鎖、ならびにノーザンコンホメーションを有するヌクレオチド（たとえば、ノーザン擬回転サイクル、たとえば、Ｓａｅｎｇｅｒ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ編、１９８４年を参照）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ｍＮＳは、１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチドおよび／またはジデオキシリボヌクレオチドをさらに含んでいてよい。
【００３９】
本明細書で使用する用語「ユニバーサル塩基」とは、その間でほとんど区別なく天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基のそれぞれと塩基対を形成するヌクレオチド塩基類似物のことである。ユニバーサル塩基の非限定的例には、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチルおよび他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、ならびに当技術分野で公知の３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドールおよび６−ニトロインドールなどのニトロアゾール誘導体が挙げられる（たとえば、Ｌｏａｋｅｓ、２００１年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２９、２４３７〜２４４７頁を参照）。本明細書で使用する用語「非環式ヌクレオチド」とは、たとえば、リボース炭素（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、またはＣ５）のいずれでも、独立してまたは組み合わせてヌクレオチドに不在の所に、非環式リボース糖を有するあらゆるヌクレオチドのことである。
【００４０】
ｍＮＳの塩基は、たとえば、ピリミジンおよびプリン上の、１つまたは複数の位置での、たとえば、置換基の付加または改変により改変することができる。置換基の付加は、たとえば、ピリミジンおよびプリンの二重結合を飽和させてもさせなくてもよい。置換基の例には、アルキル基、ニトロ基、ハロゲン、および／または水素が挙げられるが、これらの限定されるものではない。アルキル基は、いかなる長さでもよく、好ましくは１〜６炭素でよい。アルキル基は飽和でも不飽和でもよく、直鎖でも、分岐でも、環状でもよい。ハロゲンは、臭素、ヨウ素、フッ素、および／または塩素を含むが、これらに限定されるものではないハロゲンのいずれでもよい。
【００４１】
塩基の追加の改変は、塩基中の原子を交換するおよび／または置換により実現してもよい。非限定的例には、塩基中の窒素原子と炭素原子の位置を交換する、炭素原子を窒素および／もしくはケイ素原子で置換する、硫黄原子を酸素原子で置換する、ならびに／または酸素原子を窒素原子で置換することが挙げられる。塩基の他の改変には、追加の五または六員環などの追加の環を塩基と融合させることが挙げられるがこれらに限定されるものではない。融合環は、種々の追加の基を有していてよい。
【００４２】
改変された塩基の具体的例には、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、シュードイソシトシン、Ｅ−塩基、チオウラシル、リボチミジン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、４−チオウリジン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、−メチルグアノシン、キューオシン、ウイオシン、エテノ−アデニン、エテノ−シトシン、５−メチルシトシン、ブロモチミン、アザアデニン、アザグアニン、２’−フルオロ−ウリジン、および２’−フルオロ−シチジンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
ｍＮＳは、ｍＮＳ分子に存在するヌクレオチドの総数のうちの一定の割合として改変されたヌクレオチドおよび／または合成ヌクレオチドを含んでいてよい。したがって、本発明のｍＮＳ分子は、通常、ヌクレオチド位置の約５％〜約１００％（たとえば、ヌクレオチド位置のうちの５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％）改変されたヌクレオチドおよび／または合成ヌクレオチドを含んでいてよい。所与のｍＮＳ分子に存在する改変されたヌクレオチドの実際の割合は、ｍＮＳに存在するヌクレオチドの総数に依拠する。
【００４４】
特定の実施形態では、本発明のｍＮＳは、種々のヌクレオチドを順々に結合させる分子骨格を含んでいる。ｍＮＳの実施形態は、リボース、２’−Ｏ−アルキルリボース、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−アリルリボース、デオキシリボース、２−デオキシリボース、モルフォリノ、および／またはペプチド骨格を含むが、これらに限定されることはない分子骨格を有していてよい。前記骨格は、糖および／または非糖ユニットを含んでいてよい。これらのユニットは、当技術分野で公知のいかなる方法によって互いに結合させてもよい。ヌクレオチドは連結基により結合させてよい。連結基の一部の例には、リン酸、チオリン酸、ジチオリン酸、メチルリン酸、アミデート、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸、ジチオリン酸、および／またはホスホロジアミデート基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。あるいは、ヌクレオチドは互いに直接結合されてもよい。
【００４５】
糖骨格は、天然に存在する任意の糖を含んでいてもよい。天然に存在する糖の例には、リボース、デオキシリボース、および／または２−デオキシリボースが挙げられるが、これらに限定されるものではない。骨格の糖ユニットは、改変された糖骨格が切断に対して耐性であるように改変してよい。骨格の糖は、たとえば、ヌクレアーゼ切断に対する耐性を得るように、当技術分野で公知の方法により改変してよい。改変された糖の例には、２’−Ｏ−メチルリボースなどの２’−Ｏ−アルキルリボースおよび２’−Ｏ−アリルリボースが挙げられるが、これらに限定されるものではない。糖ユニットは、リン酸リンカーにより結合してよい。本発明の典型的な糖ユニットは、３’−５’、３’−３’、または５’−５’連鎖により互いに連結してよい。さらに、２’ＯＨが他の方法で改変されなければ、２’−５’連鎖も可能である。
【００４６】
非糖骨格は、塩基が結合できる任意の非糖分子を含んでいてよい。非糖骨格は当技術分野では公知である。例には、モルフォリノおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。モルフォリノ骨格は、モルフォリノ環（テトラヒドロ−１，４−オキサジン）で構成されており、非イオン性ホスホロジアミデート基により結合してよい。当技術分野で公知の改変されたモルフォリノを本発明において使用してもよい。
【００４７】
塩基を分子連鎖によりアミノ酸骨格に結合させるとＰＮＡが生じる。そのような連鎖の例には、メチレンカルボニル、エチレンカルボニル、およびエチル連鎖が挙げられるが、これらに限定されるものではない。アミノ酸は、天然でも非天然でも、改変でも非改変でも、いかなるアミノ酸でもよく、好ましくはαアミノ酸である。アミノ酸は、互いに同一でも異なっていてもよい。適切なアミノ酸の１つの非限定的例には、（２−アミノエチル）−アミノ酸などのアミノアルキルアミノ酸が挙げられる。
【００４８】
ＰＮＡの例には、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン、シクロヘキシルＰＮＡ、レトロインベルソ（retro-inverso）、ホスホン（phosphone）、プロピニル、およびアミノプロリン−ＰＮＡが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＰＮＡは、当技術分野で公知の方法により化学的に合成されてもよい。例には、改変Ｆｍｏｃおよび／またはｔＢｏｃペプチド合成プロトコルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
上記の均一アンチセンスオリゴヌクレオチドに加えて、複数種類の骨格を単一のｍＮＳ分子中に混合してもよいことは当業者には明らかである。たとえば、単一ｍＮＳ分子は、１つまたは複数の２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、１つまたは複数のモルフォリノ、１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチド、および１つまたは複数のＰＮＡを含有していてよい。
【００５０】
本発明のｍＮＳがｈｐＡＮａｓを含む実施形態では、ｈｐＡＮａｓ中のｓｉＮＡおよび／またはａｓＮＡの長さは、その長さが標的と特異的にハイブリダイズするのに十分である限り、決定的に重要ではない。たとえば、塩基対合セグメントは、約２〜約１００塩基、約１０〜５０塩基、約２５塩基、または約１０と約７５塩基間の任意の個々の数を有していてよい。
【００５１】
ｓｉＮＡおよび／またはａｓＮＡセグメントの長さを決定するときには、標的特異性、結合安定性、細胞輸送および／またはインビボ送達などの種々の要因を検討してよい。ｓｉＮＡおよび／またはａｓＮＡセグメントは、対象の標的に安定的に結合するのに十分な長さであるべきである。その上、ｓｉＮＡおよび／またはａｓＮＡセグメントは、長い配列よりは短い配列ほどゲノム中の他の場所に存在する確率は高くなるので、妥当な結合特異性を可能にするのに十分な長さであるべきである。ｓｉＮＡおよび／もしくはａｓＮＡセグメントの長さに関連する追加の検討事項には、インビボもしくはエキソビボ送達の効率、インビボまたはインビトロにおけるｓｉＮＡおよび／もしくはａｓＮＡセグメントの安定性、ならびに／あるいはｓｉＮＡおよび／もしくはａｓＮＡセグメントが結合しているまたは結合していない対象の標的の安定性が挙げられる。
【００５２】
追加の実施形態では、ｍＮＳ分子は、種々の適用においてその使用を最適化するように改変してよい。最適化には、送達、細胞取込み、細胞内局在、および／または薬物動態を改善する１つまたは複数の改変を含んでよいが、これらに限定されるものではない。ｍＮＳ分子を改変してよい１つの方法は、特定のシグナル配列の付加による。例には、核内繋留シグナル、核移行シグナル、ならびに／または、細胞膜、血液脳関門、および／もしくは胎盤関門を通過する輸送を促進する配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。具体的例には、ポリリジン、ポリ（Ｅ−Ｋ）、ＳＶ４０Ｔ抗原核移行シグナル、ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質のＮ末端、ショウジョウバエアンテナペディアタンパク質由来ペプチド、たとえば、Ｃｈｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２４：４  ４５５〜４６０頁により記載されたペプチドなどの経皮送達ペプチド、および／またはダウディ（Dowdy）Ｔａｔペプチドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。アンチセンスオリゴヌクレオチドを特定の細胞型に局在させる配列も企図されている。一実施形態では、本発明は、本発明のｍＮＳ分子を含む活性成分を特徴とする。
【００５３】
追加の実施形態では、ｍＮＳは、１つまたは複数の担体、アジュバンド、および／または希釈剤と組み合わせて、生体のための薬物または化学的治療薬を形成してもよい。そのような担体、アジュバンド、および／または希釈剤の例には、水、生理食塩水、リンゲル液、コレステロールおよび／もしくはコレステロール誘導体、リポソーム、リポフェクチン、リポフェクタミン、脂質固定化ポリエチレングリコール、ブロック共重合体Ｆ１０８、ならびに／または、ジオレオオキシホスファチジルエタノールアミン（dioleooxyphosphatidylethanolamine）、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、α−トコフェロール、および／もしくはシクロスポリンなどのホスファチドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。多くの場合、ｍＮＳ分子は、１つまたは複数の担体、アジュバンド、および／または希釈剤と混合させて、疾患、感染、または状態を治療するのに使用することができる分散組成物または分散薬物を形成してよい。たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい。そのような分散組成物を使用して、疾患もしくは感染過程に、または動物もしくは植物産物の産生に関与する遺伝子、ヌクレオチド配列および／もしくはタンパク質の適切な発現を中断させてもよいことは当業者には明らかだと考えられる。たとえば、前記組成物を使用して、脂肪酸合成遺伝子または脂質代謝遺伝子の産物のレベルを増加させた植物を作製してもよい。
【００５４】
ｍＮＳ分子は、アジュバンドおよび／または担体を含んでも含まなくても、ｍＮＳ分子が標的の発現を調節することができる任意の形で生物または対象に投与してよい。例には、部位特異的注射、全身注射、ならびに／または静脈内に、経口的に、および／もしくは局所的に投与することが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明が企図する生物および対象には、細菌、細胞、細胞培養系、植物、真菌、動物、線虫、昆虫、および／またはヒトなどの哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明が企図とする植物には、たとえば、アラビドプシス、ヒマワリ、ワタ、ナタネ（キャノーラを含む）、トウモロコシ、コムギ、トウゴマ、ヤシ、タバコ、ピーナッツ、モロコシ、サトウキビ、およびダイズが挙げられる。
【００５５】
標的は、たとえば、哺乳動物遺伝子、植物遺伝子、ウイルス遺伝子、真菌遺伝子、細菌遺伝子、植物ウイルス遺伝子、もしくは哺乳動物ウイルス遺伝子などの、内在性遺伝子、外来遺伝子、ウイルス核酸またはＲＮＡでもよい核酸でよい。哺乳動物ウイルスの例には、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザウイルス、および重症急性呼吸器症候群ウイルス（ＳＡＲＳ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
当業者には明らかになるように、標的はヌクレオチド配列でもタンパク質でもよい。その上理解されることになるように、本発明のｍＮＳ分子はタンパク質それ自体を改変することはなく、むしろ、そのタンパク質の産生を制御する分子を標的にする。タンパク質の例には、内在性タンパク質、外来タンパク質、哺乳動物タンパク質、植物タンパク質、ウイルスタンパク質、真菌タンパク質、細菌タンパク質、植物ウイルスタンパク質、または哺乳動物ウイルスタンパク質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ヌクレオチド配列の例には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
一実施形態では、本発明のｍＮＳ分子は、センス領域およびアンチセンス領域を含み、前記センス領域には、５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端の両方に末端キャップ部分が含まれる。キャップ部分は、逆位デオキシ脱塩基部分でも、逆位デオキシチミジン部分でも、チミジン部分でもよい。
【００５８】
本発明の一特定の実施形態は、本発明の少なくとも１つのｍＮＳ分子をコードする核酸配列を、その核酸分子の発現を可能にする形で含むベクターを提供する。ベクターの例には、プラスミド、コスミド、レトロウイルスベクター、アグロバクテリウム、ウイルスベクター、細菌ベクター、酵母ベクター、真核生物ベクター、植物ベクター、および哺乳動物ベクターが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の他の実施形態は、そのようなベクターを含む哺乳動物細胞、植物細胞、またはアグロバクテリウムを提供する。細胞は、たとえば、ヒトの細胞などの天然の哺乳動物のものでよい。ベクターのｍＮＳ分子は、センス領域、アンチセンス領域、アンチセンス配列、および／または遺伝子を含んでよい。
【００５９】
一実施形態では、本発明のｍＮＳ分子は、細胞または再構成されたインビトロ系内部でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介することができる化学的に改変された低分子干渉核酸分子（ｓｉＮＡ）を特徴とし、前記化学的改変には、化学的に改変されたｓｉＮＡ分子に結合したコンジュゲートが含まれる。前記コンジュゲートは、共有結合を介して化学的に改変されたｓｉＮＡ分子に結合していてよい。特定の実施形態では、コンジュゲートは生分解性リンカーを介して化学的に改変されたｓｉＮＡ分子に結合している。コンジュゲート分子は、化学的に改変されたｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両鎖のいずれかの３’末端で結合することができる。コンジュゲート分子は、化学的に改変されたｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両鎖のいずれかの５’末端で結合することができる。コンジュゲート分子は、化学的に改変されたｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、もしくは両鎖のいずれかの、またはそのいかなる組合せでも、その３’末端と５’末端の両方で結合することもできる。本発明のコンジュゲート分子は、細胞などの生物系への化学的に改変されたｓｉＮＡ分子の送達を促進する分子を含むことができる。特定の実施形態では、化学的に改変されたｓｉＮＡ分子に結合しているコンジュゲート分子は、ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン、または細胞取込みを媒介する可能性のある細胞レセプターのリガンドである。本発明が企図していて、化学的に改変されたｓｉＮＡ分子に結合することができる特定のコンジュゲート分子の例は、Ｖａｒｇｅｅｓｅら、米国特許出願第１０／２０１，３９４号に記載されている。使用されるコンジュゲートの種類および本発明のｓｉＮＡ分子のコンジュゲーションの程度は、改善された薬物動態学的プロファイル、バイオアベイラビリティ、および／または、同時にＲＮＡｉ活性を媒介するｓｉＮＡの能力を維持しているｓｉＮＡ構築物の安定性について評価してよい。したがって、当業者は、種々のコンジュゲートで改変されるｓｉＮＡ構築物をスクリーニングして、ｓｉＮＡコンジュゲート複合体が、たとえば、当技術分野で一般に公知の動物モデルなどにおいて、ＲＮＡｉを媒介する能力を維持しつつ改善された特性を有しているかどうかを判定してよい。
【００６０】
別の実施形態では、本発明は、細胞内で遺伝子の発現を調節するための方法を特徴とする。この方法は、ｍＮＳ分子が遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含んでいる本発明のｍＮＳ分子を合成することを含み、この分子は化学的に改変してもよい。ｍＮＳ分子は、標的ＲＮＡの配列に実質的に類似の配列を含むことができる。次に、ｍＮＳ分子は、細胞内で遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、細胞に導入することができる。
【００６１】
別の実施形態では、本発明は、細胞内で２つ以上の遺伝子の発現を調節するための方法を特徴とする。この方法は、ｍＮＳ分子が遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含んでいる本発明のｍＮＳ分子を合成することを含み、この分子は化学的に改変してもよい。次に、ｍＮＳ分子は、細胞内で遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、細胞に導入することができる。
【００６２】
別の実施形態では、本発明は、細胞内で２つ以上の遺伝子の発現を調節するための方法を特徴とする。この方法は、ｍＮＳ分子が遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含んでおり、ｍＮＳ分子が標的ＲＮＡの配列に実質的に類似の配列を含んでいる本発明のｍＮＳ分子を合成することを含み、この分子は化学的に改変してもよい。次に、ｍＮＳ分子は、細胞内で遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、細胞に導入することができる。
【００６３】
特定の実施形態では、本発明のｍＮＳ分子は、エキソビボ適用において試薬として使用される。たとえば、ｍＮＳ分子は、治療効果のために生物または対象に移植されている組織または細胞に導入することができる。この細胞および／または組織は、後に外植をうける生物または対象に由来してよい。あるいは、この細胞および／または組織は、移植に先立って別の生物または対象に由来してよい。ｍＮＳ分子を使用して、細胞または組織が所望の表現型を獲得しインビボで移植されたときに機能を果たすことができるように、細胞または組織内で１つまたは複数の遺伝子の発現を調節してよい。一実施形態では、生物または対象由来のある種の標的細胞が抽出される。これらの抽出された細胞は、これらの細胞によるｍＮＳ分子の取込みに適した条件下で、細胞内で特定のヌクレオチド配列を標的にするｍＮＳ分子に接触させる（たとえば、ｍＮＳ分子の細胞内への送達を促進するために、陽イオン性脂質、リポソームおよび同類のものなどの送達試薬を使用して、またはエレクトロポレーションなどの技法を使用して）。次に、前記細胞は、同一の生物または他の生物に再導入されて戻される。エキソビボ適用の非限定的例には、器官／組織移植における、組織移植、もしくは肺疾患（たとえば、再狭窄）の治療における使用、または、静脈移植血管における新生内膜肥厚化およびアテローム硬化症を予防すること、が挙げられる。そのようなエキソビボ適用を利用して、冠動脈および末梢バイパス移植不全に付随する状態を治療してもよく、たとえば、そのような方法は、末梢血管バイパス移植手術および冠動脈バイパス移植手術と併用してよい。追加の適用には、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、認知症、ハンチントン病、または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性状態の治療における使用を含む、中枢神経系障害または損傷を治療するための移植における使用が挙げられる。
【００６４】
さらに別の実施形態では、本発明は、生物における遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。この方法には、ｍＮＳ分子が遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含む、本発明のｍＮＳ分子を合成することを含む。次に、ｍＮＳ分子は、生物中で遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、生物に導入することができる。
【００６５】
別の実施形態では、本発明は、生物における２つ以上の遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。この方法は、ｍＮＳ分子が遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含む、本発明のｍＮＳ分子を合成することを含む。次に、ｍＮＳ分子は、生物中で遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、生物に導入することができる。代替の実施形態では、本発明は、ｍＮＳ分子が遺伝子のＲＮＡに対する相補性を有する配列を含む、本発明のｍＮＳ分子を合成することにより細胞内で遺伝子の発現を調節するための方法を特徴とする。次に、ｍＮＳ分子は、細胞中で遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、細胞に導入することができる。
【００６６】
他の実施形態では、本発明は、細胞内で２つ以上の遺伝子の発現を調節するための方法であって、本発明のｍＮＳ分子を合成することを含み、ｍＮＳ分子が遺伝子のＲＮＡに対する相補性を有する配列を含む方法を特徴とする。次に、ｍＮＳ分子は、細胞内での遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、インビトロでまたはインビボで細胞に接触させることができる。別の実施形態では、本発明は生物内で遺伝子の発現を調節する方法を含む。遺伝子のＲＮＡに対する相補性を有するｍＮＳ分子は合成することができ、ｍＮＳ分子は、生物内で遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で生物に導入することができる。別の実施形態は、遺伝子のＲＮＡに対する相補性を有する配列を含むｍＮＳ分子を合成し、ｍＮＳ分子を、生物内で遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で生物に導入することにより、生物内で２つ以上の遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。別の実施形態は、生物内で遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で生物を本発明のｍＮＳ分子に接触させることにより、生物内で遺伝子の発現を調節する方法を含む。さらに別の代替の実施形態は、生物内で遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で生物を本発明の１つまたは複数のｍＮＳ分子に接触させることにより、生物内で２つ以上の遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。
【００６７】
本発明のｍＮＳ分子は、種々のＲＮＡ分子のＲＮＡｉターゲティングを通じて標的遺伝子発現を阻害するように設計してよい。一実施形態では、本発明のｍＮＳ分子を使用して、標的遺伝子に対応する種々のＲＮＡを標的にすることができる。そのようなＲＮＡの非限定的例には、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、標的遺伝子（複数可）の選択的ＲＮＡスプライスバリアント、標的遺伝子（複数可）の転写後修飾ＲＮＡ、標的遺伝子（複数可）のＲＮＡ前駆体、および／またはＲＮＡ鋳型が挙げられる。選択的スプライシングが、適切なエクソンの使用により区別される転写物ファミリーを作製する場合には、本発明を使用して、遺伝子ファミリーメンバーの機能を特異的に阻害するまたはその機能を区別するために、適切なエクソンを通じて遺伝子発現を阻害してよい。たとえば、選択的にスプライスされた膜貫通ドメインを含有するタンパク質を膜結合型と分泌型の両方で発現させてよい。膜貫通ドメインを含有するエクソンを標的にする本発明の使用により、分泌型のタンパク質と対照的に、膜結合型の薬剤ターゲティングの機能的結果を判定してよい。これらのＲＮＡ分子を標的にすることに関連する本発明の適用の非限定的例には、治療的薬剤適用、分子および薬剤発見適用、動物および植物産物／分子の改変、分子診断と遺伝子機能適用、ならびに遺伝子地図作製、たとえば、本発明のｓｉＮＡ分子での単一ヌクレオチド多型地図作製を使用したものが挙げられる。そのような適用は、既知の遺伝子配列を使用して、または発現配列タグ（ＥＳＴ）から入手可能な部分的配列から実行してよい。本発明の一実施形態では、改変は、植物中の脂肪酸合成遺伝子または脂質代謝遺伝子を含む。
【００６８】
別の実施形態では、本発明のｍＮＳ分子を使用して、遺伝子ファミリー（または複数可）に対応する保存配列を標的にすることができる。したがって、複数の遺伝子標的を標的にするｍＮＳ分子は、（植物または種子中の脂肪酸合成の生産などにおける）増加した生物学的効果または改変された効果を提供する可能性がある。さらに、ｍＮＳ分子を使用して、種々の適用における遺伝子機能の経路を特徴づけてよい。たとえば、本発明を使用して、経路中の標的遺伝子（複数可）の活性を阻害し、遺伝子機能分析、ｍＲＮＡ機能分析、または翻訳分析において特徴づけられていない遺伝子（複数可）の機能を決定することができる。本発明を使用して、産物、分子、または医薬品開発に向けて、種々の疾患および状態に関与する潜在的標的遺伝子経路を決定することができる。本発明を使用して、たとえば、出生前発育および出生後発育などの発育、ならびに／または、癌、感染症、自己免疫、炎症、内分泌障害、腎疾患、肺疾患、心血管疾患、先天性欠損、加齢、遺伝子発現に関連する他のあらゆる疾患または状態の進行および／もしくは維持に関与している遺伝子発現の経路を理解することができる。本発明を使用して、植物もしくは動物において遺伝子発現を改変してもよく、または本発明を使用して、たとえば、植物および植物種子における脂肪酸合成の改変などの動物もしくは植物産物の合成を改変してもよい。
【００６９】
別の実施形態では、本発明は、標的遺伝子を確認する方法を特徴とする。この方法は、化学的に改変されさらに標的遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含んでもよい、本発明のｍＮＳ分子を合成することを含む。次に、ｍＮＳ分子は、生物系において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で生物系に導入することができる。その後、前記遺伝子の機能は、生物系におけるあらゆる表現型の変化について評価することにより決定することができる。
【００７０】
「生物系」とは、ヒト、動物、植物、昆虫、細菌、ウイルスまたは他の供給源を含むが、これらに限定されることはない生物学的供給源由来の、精製されたまたは精製されていない形の物質のことであり、前記系はＲＮＡｉ活性に必要な成分を含む。用語「生物系」は、たとえば、細胞、組織、もしくは生物、またはその抽出物を含む。用語「生物系」は、インビトロ背景（setting）において使用してよい再構成されたＲＮＡｉシステムも含む。
【００７１】
「表現型の変化」とは、本発明の核酸分子（たとえば、ｍＮＳ）との接触、または、これによる治療に応えて生じる細胞にとってのあらゆる検出可能な変化のことである。そのような検出可能な変化には、形状、大きさ、増殖、運動性、タンパク質発現もしくはＲＮＡ発現、または、当技術分野で公知の方法により評価される他の物理的もしくは化学的変化が挙げられるが、これらに限定されるものではない。検出可能な変化は、発現されたタンパク質または評価される可能性のある他のあらゆる細胞成分を同定するために使用される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）もしくは種々のタグなどのレポーター遺伝子／分子の発現も含んでよい。
【００７２】
特定の実施形態では、本発明は、細胞、組織、または生物において標的の発現を調節するのに使用することができる本発明のｍＮＳ分子を含有するキットを特徴とする。別の実施形態では、化学的に改変してよく、細胞、組織、または生物において２つ以上の標的遺伝子の発現を調節するのに使用してよい本発明の２つ以上のｍＮＳ分子を含有するキットを、本発明は特徴とする。さらに別の実施形態では、本発明は、生物系において遺伝子の発現を調節するのに使用してよい本発明のｍＮＳ分子をコードするベクターを含有するキットを特徴とする。別の実施形態では、本発明は、生物系において２つ以上の標的遺伝子の発現を調節するのに使用してよい本発明の２つ以上のｍＮＳ分子をコードするベクターを含有するキットを特徴とする。
【００７３】
本発明の別の実施形態は、本発明の１つまたは複数のｍＮＳ分子を含有している細胞を特徴とする。一特定の実施形態では、本発明の１つまたは複数のｍＮＳ分子をコードするベクターを含有する細胞が提供される。本発明のｍＮＳ分子を含有する細胞は、哺乳動物細胞でも植物細胞でもよい。たとえば、ｍＮＳ分子を含有する細胞は、アラビドプシス、ヒマワリ、ワタ、ナタネ（キャノーラを含む）、トウモロコシ、コムギ、トウゴマ、ヤシ、タバコ、ピーナッツ、モロコシ、サトウキビ、またはダイズ由来でよい。
【００７４】
本発明は、細胞または再構成された系でＲＮＡｉを媒介するｍＮＳ分子も含み、ｍＮＳ分子は、化学的に改変されたｍＮＳ分子に対して配列相同性を有する追加の内在性ｓｉＲＮＡ分子を生成することができる細胞ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を調節する本明細書に記載の１つまたは複数の化学的改変物を含む。
【００７５】
本発明は、細胞または再構成された系でＲＮＡｉを媒介するｍＮＳ分子も含み、ｍＮＳ分子は、ｍＮＳ分子の細胞取込みを調節する本明細書に記載の１つまたは複数の化学的改変物を含む。一特定の実施形態では、本発明は、標的の発現を媒介するｍＮＳ分子を特徴とし、ｍＮＳ分子は、たとえば、ポリエチレングリコールなどのポリマーコンジュゲートもしくはｍＮＳ分子の薬物動態を改善する等価のコンジュゲートを結合させることにより、またはインビボで特定の組織型もしくは細胞型を標的にするコンジュゲートを結合させることにより、ｍＮＳ分子のバイオアベイラビリティを増加させる本明細書に記載の１つまたは複数の化学的改変物を含む。そのようなコンジュゲートの非限定的例は、Ｖａｒｇｅｅｓｅら、米国特許出願第１０／２０１，３９４号に記載されている。
【００７６】
一実施形態では、本発明は、（ａ）ｍＮＳ分子の構造にコンジュゲートを導入すること、および（ｂ）改善されたバイオアベイラビリティを有するｍＮＳ分子を単離するのに適した条件下で段階（ａ）のｍＮＳ分子を評価することを含む、バイオアベイラビリティが改善された本発明のｍＮＳ分子を作製するための方法を特徴とする。そのようなコンジュゲートには、天然に存在するタンパク質リガンド由来のペプチドなどの細胞レセプターのリガンド；細胞ＺＩＰコード配列を含むタンパク質局在配列；抗体；核酸アプタマー；葉酸およびＮ−アセチルガラクトサミンなどのビタミンおよび他の補因子；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー；リン脂質；コレステロール；スペルミンまたはスペルミジンなどのポリアミンなどが挙げられ得る。別の実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、本発明のｍＮＳ分子に共有結合してよい。結合したＰＥＧは、任意の分子量でよく、好ましくは約２０００〜約５００００ダルトン（Ｄａ）である。
【００７７】
本発明は、単独で使用してもよく、またはＲＮＡのインビトロもしくはインビボ導入を実施して試料もしくは対象を試験するのに必要な試薬の少なくとも１つを有するキットの成分として使用してもよい。たとえば、前記キットの適切な成分は、本発明のｍＮＳ分子および本明細書に記載の対象の細胞へのｍＮＳ分子の導入を促進する媒体を含むことができる（たとえば、脂質および当技術分野で公知の他のトランスフェクションの方法を使用して、たとえば、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、米国特許第６，３９５，７１３号を参照）。前記キットは、たとえば、遺伝子機能および／もしくは活性を決定する際の標的確認、または薬物最適化および創薬などにおける標的確認のために使用してよい（たとえば、Ｕｓｍａｎら、米国特許出願第６０／４０２，９９６号を参照）。そのようなキットは、キットの使用者に本発明を実行させる説明書も含まれていてよい。
【００７８】
本明細書で使用される用語「低分子干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」、「低分子干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「低分子干渉核酸分子」、「低分子干渉オリゴヌクレオチド分子」、または「化学的に改変された低分子干渉核酸分子」とは、たとえば、ＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」または遺伝子サイレンシングを配列特異的な形で媒介することにより、遺伝子発現もしくはウイルス複製を阻害するまたは下方調節することができるあらゆる核酸分子のことであり、たとえば、Ｂａｓｓ、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ、４１１、４２８〜４２９頁；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ、４１１、４９４〜４９８頁；ならびにＫｒｅｕｔｚｅｒら、国際ＰＣＴ出願国際公開第００／４４８９５号；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚら、国際ＰＣＴ出願国際公開第０１／３６６４６号；Ｆｉｒｅ、国際ＰＣＴ出願国際公開第９９／３２６１９号；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋら、国際ＰＣＴ出願国際公開第００／０１８４６号；ＭｅｌｌｏとＦｉｒｅ、国際ＰＣＴ出願国際公開第０１／２９０５８号；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ、国際ＰＣＴ出願国際公開第９９／０７４０９号；およびＬｉら、国際ＰＣＴ出願国際公開第００／４４９１４号；Ａｌｌｓｈｉｒｅ、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７、１８１８〜１８１９頁；Ｖｏｌｐｅら、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７、１８３３〜１８３７頁；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７、２２１５〜２２１８頁；およびＨａｌｌら、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７、２２３２〜２２３７頁；ＨｕｔｖａｇｎｅｒとＺａｍｏｒｅ、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７、２０５６〜６０頁；ＭｃＭａｎｕｓら，２００２年、ＲＮＡ、８、８４２〜８５０頁；Ｒｅｉｎｈａｒｔら、２０．０２年、Ｇｅｎｅ＆Ｄｅｖ．、１６、１６１６〜１６２６頁；およびＲｅｉｎｈａｒｔとＢａｒｔｅｌ、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７、１８３１頁を参照）。たとえば、前記ｓｉＮＡは、アンチセンス領域は標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列に一致するヌクレオチド配列またはその一部を有する、相補的なセンス領域とアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子でよい。
【００７９】
ｓｉＮＡは、一方の鎖がセンス鎖であり、他方がアンチセンス鎖であり、アンチセンス鎖とセンス鎖は相補的である（すなわち、アンチセンス鎖とセンス鎖で二重または二本鎖構造を形成する場合などの、各鎖がもう一方の鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、たとえば、二本鎖領域は約１９塩基対である）、２つの別々のオリゴヌクレオチドから構築してよい。前記アンチセンス鎖は標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖は標的核酸配列に一致するヌクレオチド配列またはその一部を含む。あるいは、ｓｉＮＡは、ｓｉＮＡの相補的なセンス領域とアンチセンス領域が、非核酸を基にするリンカー（複数可）に基づく核酸によって連結されている、単一オリゴヌクレオチドから構築することができる。ｓｉＮＡは、アンチセンス領域が別々の標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域が標的核酸配列に一致するヌクレオチド配列またはその一部を有する、相補的なセンス領域とアンチセンス領域を有する二重、非対称二重、ヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造のポリヌクレオチドでよい。ｓｉＮＡは、アンチセンス領域が標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域が標的核酸配列に一致するヌクレオチド配列またはその一部を有する、相補的なセンス領域とアンチセンス領域を含む２つ以上のループ構造およびステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドでよい。環状ポリヌクレオチドは、ＲＮＡｉを媒介することができる活性ｓｉＮＡ分子を生成するようにインビボでもインビトロでもプロセシングしてよい。ｓｉＮＡは、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含んでいてもよい（たとえば、そのようなｓｉＮＡ分子が、ｓｉＮＡ分子内における標的核酸配列に一致するヌクレオチド配列またはその一部の存在を必要としない場合）。一本鎖ポリヌクレオチドは、５’−リン酸（たとえば、Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００２年、Ｃｅｌｌ、１１０、５６３〜５７４頁およびＳｃｈｗａｒｚら、２００２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ、１０、５３７〜５６８頁を参照）または５’，３’−二リン酸などの末端リン酸基をさらに含んでいてよい。
【００８０】
ある種の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、センス領域とアンチセンス領域が当技術分野で公知のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー分子により共有結合している、別々のセンスおよびアンチセンス配列または領域を含むことができる。あるいは、センス領域とアンチセンス領域は、イオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、および／またはスタッキング相互作用により非共有結合することができる。ある種の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。本発明のｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子の発現を阻害する形で標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用をすることができる。本発明のｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含有する分子に限定される必要はなく、化学的に改変されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含してよい。ある種の実施形態では、本発明の低分子干渉核酸分子は、２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠く。特定の実施形態は、ＲＮＡｉを媒介するための２’−ヒドロキシ基を有するヌクレオチドの存在を必要としない低分子干渉核酸を含み、したがって、本発明の低分子干渉核酸分子は、場合により、リボヌクレオチド（すなわち、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を含まなくてもよい。しかし、ｓｉＮＡ分子内にＲＮＡｉを支持するリボヌクレオチドの存在を必要としないそのようなｓｉＮＡ分子は、２’−ＯＨ基のある１つまたは複数のヌクレオチドを含有する１つまたは複数の結合したリンカーあるいは他の結合したまたは会合した基、部分、もしくは鎖を有していてよい。場合によって、ｓｉＮＡ分子は、ヌクレオチド位置のうちの約５、１０、２０、３０、４０または５０％で、リボヌクレオチドを含んでいてよい。
【００８１】
本発明の改変された低分子干渉核酸分子は、低分子干渉改変オリゴヌクレオチド「ｓｉＭＯＮ」と呼んでもよい。本明細書で使用するように、用語ｓｉＮＡは、たとえば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉オリゴヌクレオチド、低分子干渉核酸、低分子干渉改変オリゴヌクレオチド、化学的改変ｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）などの、配列特異的ＲＮＡｉを媒介することができる核酸分子を記載するのに使われる他の用語と等価である。さらに、本明細書で使われるように、用語ＲＮＡｉは、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、またはエピジェネティクスなどの、配列特異的ＲＮＡ干渉を記載するのに使われる他の用語と等価である。たとえば、本発明のｓｉＮＡ分子を使用して、転写後レベルと転写前レベルの両方で遺伝子を後成的に発現停止させてよい。非限定的例として、本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の後成的調節は、遺伝子発現を改変するクロマチン構造のｓｉＮＡ媒介改変から生じることがある（たとえば、Ａｌｌｓｈｉｒｅ、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７、１８１８〜１８１９頁；Ｖｏｌｐｅら、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７、１８３３〜１８３７頁；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７、２２１５〜２２１８頁；およびＨａｌｌら、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７、２２３２〜２２３７頁を参照）。
【００８２】
用語「非対称的ヘアピン」は、アンチセンス領域、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含んでいてもよいループ部分、および含んでいるヌクレオチドがアンチセンス領域よりも少ないセンス領域（センス領域がアンチセンス領域と塩基対合してループのある二重鎖を形成するのに十分な相補的ヌクレオチドを有する程度に）を含む直鎖状ｓｉＮＡ分子を意味する。たとえば、本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、細胞またはインビトロ系においてＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さ（たとえば、約１９〜約２２ヌクレオチド）および約４〜約８ヌクレオチドを含むループ領域のあるアンチセンス領域、ならびにアンチセンス領域と相補的である約３〜約１８ヌクレオチドを有するセンス領域を含んでいてよい。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、化学的に改変してもよい５’−末端リン酸基も含んでいてよい。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子のループ部分は、本明細書に記載するヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子、またはコンジュゲート分子を含んでいてよい。
【００８３】
用語「調節する」は、遺伝子の発現、あるいは、ＲＮＡ分子または１つもしくは複数のタンパク質またはタンパク質サブユニットをコードする等価なＲＮＡ分子のレベル、あるいは１つもしくは複数のタンパク質またはタンパク質サブユニットの活性またはレベルが、発現、レベル、もしくは活性がモジュレーターの不在下で観察される発現、レベル、もしくは活性よりも大きくまたは低くなるように、上方調節または下方調節されることを意味する。たとえば、用語「調節する」は、「阻害する」を意味してもよいが、この定義に限定されるものではない。
【００８４】
用語「阻害する」、「下方調節する」または「減少させる」は、遺伝子の発現、あるいは、ＲＮＡ分子または１つもしくは複数のタンパク質またはタンパク質サブユニットをコードする等価なＲＮＡ分子のレベル、あるいは１つもしくは複数のタンパク質またはタンパク質サブユニットの活性が、本発明のｍＮＳ分子の不在下で観察される発現、レベル、もしくは活性よりも低く減少されることを意味する。特定の実施形態では、ｍＮＳ分子を使用した阻害、下方調節、または減少により、不活性または減弱された分子の存在下で観察されるレベルより低いレベルになる。同様に、ｍＮＳ分子を使用した阻害、下方調節、または減少により、たとえば、スクランブルされた配列のあるまたはミスマッチのあるｍＮＳ分子の存在下で観察されるレベルよりも低いレベルになる。別の実施例では、本発明の核酸分子を使用した遺伝子発現の阻害、下方調節、または減少は、前記核酸分子の存在下のほうがその不在下よりも大きくなる。
【００８５】
「遺伝子」または「標的遺伝子」とは、ＲＮＡをコードする核酸、たとえば、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含むが、これに限定されるものではない核酸配列のことである。標的遺伝子は、細胞に由来する遺伝子、内在性遺伝子、導入遺伝子、または、感染後に細胞に存在する病原体（たとえば、ウイルス）の遺伝子などの外来性遺伝子でもよい。標的遺伝子を含有する細胞は、植物、動物、原生動物、ウイルス、細菌、または真菌などのいかなる生物に由来するものでもよいし、そこに含有されるものでよい。植物の非限定的例には、単子葉植物、双子葉植物、または裸子植物、さらに具体的には、アラビドプシス、ヒマワリ、ワタ、ナタネ、トウモロコシ、ヤシ、タバコ、ピーナッツ、またはダイズが挙げられる。動物の非限定的例には、脊椎動物または無脊椎動物が挙げられる。真菌の非限定的例には、カビまたは酵母が挙げられる。
【００８６】
「高度に保存された配列領域」とは、標的遺伝子中の、一世代からもう１つの世代へまたは一生物系からもう１つの生物系へ著しく変化することのない１つまたは複数の領域のヌクレオチド配列を意味する。
【００８７】
「センス領域」とは、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域に対して相補性を有するｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。ｓｉＮＡ分子のセンス領域は、標的核酸配列と相同性（すなわち、配列同一性または部分的同一性）を有する核酸配列を含んでいてよい。
【００８８】
「アンチセンス領域」とは、標的核酸配列に対して相補性を有するｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、ｓｉＮＡ分子のセンス領域に対する相補性を有する核酸配列を場合により含んでもよい。
【００８９】
「標的核酸」とは、その発現または活性が調節されることになるあらゆる核酸配列を意味する。標的核酸は、内在性ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ウイルスＤＮＡもしくはウイルスＲＮＡ、またはウイルス、細菌、真菌、動物もしくは植物の遺伝子にコードされている他のＲＮＡなどの、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。
【００９０】
本出願で言及されるように、「治療すること」または「治療」は、表現型の完全な改変を必要としない。前記用語は、根底にある状態の症状が少なくとも減少されること、ならびに／あるいは、前記症状を引き起こしている１つまたは複数の根底にある細胞性、生理学的、または生化学的原因もしくは機序が減少されるおよび／または除去されることを意味する。この文脈で使用される「減少される」は、状態の生理学的状態だけではなく、状態の分子的状態を含む、状態（condition）の状態（state）に対するものであることを意味すると理解されている。
【００９１】
「状態」（condition）とは、対象または生物において、改変したいと願う可能性のあるあらゆる状態のことである。そのような状態は、遺伝子、ヌクレオチド配列、および／もしくはタンパク質の発現または発現の欠如に帰せられるはずである。状態の例には、疾病、遺伝的異常、感染、癌、突然変異、ならびに、脱毛症、肥満、および皮膚のしわを含むが、これらに限定されることはない美容上の状態が挙げられるが、これらに限定されることはない。状態の追加の非限定的例には、対象の正常状態である。たとえば、植物（たとえば、アラビドプシス、ヒマワリ、ワタ、ナタネ、トウモロコシ、ヤシ、タバコ、ピーナッツ、またはダイズ）における正常な脂肪酸産生は、本発明の組成物および方法を使用して改変することができる状態である。したがって、用語「状態」は、科学上、農業上、医療上、および／または個人上の理由で改変することができる任意の状態を含む。
【００９２】
「相補性」とは、従来のワトソン−クリック、フーグステイン（Hoogstein）塩基対合、および／もしくは逆フーグステイン塩基対合または他の従来と異なる種類のものいずれかにより、核酸が別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成する可能性があることを意味する。本発明の核酸分子に関しては、核酸分子とその相補的配列の結合自由エネルギーは、核酸の関連機能（たとえば、ＲＮＡｉ活性）を進行させるのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの決定は当技術分野では公知である（たとえば、Ｔｕｒｎｅｒら、１９８７年、ＣＳＨ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ  １２３〜１３３頁；Ｆｒｉｅｒら、１９８６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９３７３〜９３７７頁；Ｔｕｒｎｅｒら、１９８７年、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３〜３７８５頁を参照）。
【００９３】
パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合（たとえば、ワトソン−クリック塩基対合）を形成する可能性のある核酸分子中の近接残基の割合を示す（たとえば、１０のうちの５、６、７、８、９、１０は５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補性である）。「完璧な相補性」とは、核酸配列の近接残基すべてが、第２の核酸配列中の同数の近接残基と水素結合することを意味する。
【００９４】
本発明のｓｉＮＡ分子は、癌または癌性疾患、感染症、心血管疾患、神経性疾患、プリオン病、炎症性疾患、自己免疫疾患、肺疾患、腎疾患、肝疾患、ミトコンドリア病、内分泌疾患、生殖関連疾患および状態を含む広範囲の疾患および状態、動物または植物産物合成、ならびに、細胞または生物において発現された遺伝子産物のレベルに応答する可能性のある他のあらゆる徴候への新規の治療的アプローチを表す。
【００９５】
本明細書で使用するように、「細胞」はその通常の生物学的な意味で使われており、多細胞生物全体を指してはいない。細胞は生物（たとえば、植物および哺乳動物を含む動物）に存在していてよい。細胞は原核細胞（たとえば、細菌細胞）でも真核細胞（たとえば、哺乳動物または植物細胞）でもよい。細胞は、体細胞起源でも生殖細胞起源でも、全能性でも多能性でも、分裂性でも非分裂性でもよい。細胞は、たとえば、動物、細菌、植物、または種子由来などの、配偶子もしくは胚、幹細胞、または、完全に分化した細胞由来でも、含んでいてもよい。
【００９６】
本発明のｍＮＳ分子は、標的細胞もしくは組織に、直接添加することができる、あるいは陽イオン性脂質と複合体を形成しても、リポソーム内にパッケージングしても、または他の方法で送達してもよい。核酸または核酸複合体は、たとえば、生体高分子へ組み込んでもしくは組込みなしで、注射、遺伝子銃送達、輸液ポンプまたはステントを通して、エキソビボまたはインビボで関連する組織へ局所的に投与してよい。
【００９７】
別の態様では、本発明は、本発明の１つまたは複数のｍＮＳ分子を含有する細胞を提供する。１つまたは複数のｍＮＳ分子を、同一部位または異なる部位へ独立して標的してよい。
【００９８】
「ＲＮＡ」とは、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β−Ｄ−リボ−フラノース部分の２’位置にヒドロキシル基のあるヌクレオチドのことである。前記用語には、部分的に精製されたＲＮＡ、基本的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え的に作製されたＲＮＡなどの二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、ならびに、１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変により、天然に存在するＲＮＡとは異なっている改変ＲＮＡが含まれる。そのような改変には、例えば、ｓｉＮＡの末端（複数可）へのまたは内部的な（たとえば、ＲＮＡの１つまたは複数のヌクレオチドで）非ヌクレオチド物質の付加が挙げられる。本発明のＲＮＡ分子のヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学的に合成されるヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドなどの、非標準ヌクレオチドも含んでいてよい。これらの改変されたＲＮＡは類似物と、または天然に存在するＲＮＡの類似物と呼んでもよい。
【００９９】
「対象」とは、外植された細胞のドナーもしくはレシピエントである生物、または細胞自体のことである。「対象」は、本発明の核酸分子を投与してよい生物も指している。対象は、植物、植物細胞、哺乳動物、またはヒトの細胞を含む哺乳動物細胞でもよい。
【０１００】
本発明の別の実施形態は、内在性成分脂肪酸のレベルが改変された植物を作製する方法を提供する。この方法は、脂肪酸合成または脂質代謝遺伝子などの、異種遺伝子のレベルを調節することを含む。植物および種子中での脂肪酸産生は改変することができる。本発明を通じて改変することができる代表的植物には、たとえば、アラビドプシス、ヒマワリ、ワタ、ナタネ（キャノーラを含む）、トウモロコシ、コムギ、トウゴマ、ヤシ、タバコ、ピーナッツ、モロコシ、サトウキビ、およびダイズが挙げられる。
【０１０１】
本発明のｍＮＳは、単独で、他の化合物と組み合わせて、または他の化合物（たとえば、薬物）と連動させて使用して、本明細書で取り上げた疾病または状態（たとえば、癌および他の増殖状態、ウイルス感染、炎症性疾患、自己免疫、肺疾患、腎疾患、眼疾患、等）を治療してよい。たとえば、特定の疾患または状態を治療するために、ｍＮＳ分子を対象に投与してもよいし、単独で、または治療に適した条件下で１つまたは複数の薬物と組み合わせて、当業者にとって明白な他の適切な細胞に投与してもよい。
【０１０２】
追加の実施形態では、ｍＮＳ分子は、上記の状態または疾患を治療するために、他の既知の治療法と組み合わせて使用してよい。たとえば、記載された分子は、疾患または状態を治療するために、１つまたは複数の既知の治療薬と組み合わせて使うことができるであろう。本発明のｍＮＳ分子と容易に組み合わせられる他の治療薬の非限定的例には、酵素的核酸分子、アロステリック核酸分子、アンチセンス、デコイ、またはアプタマー核酸分子、（モノクロナール抗体などの）抗体、小分子、ならびに金属、塩、およびイオンを含む他の有機および／または無機化合物である。
【０１０３】
本発明の誘導体を予測する／評価するのに使用するためのコンピュータモデリング技術には、ジェネティクスコーポレイショングループ（Genetics Corporation Group）、マディソン、ウィスコンシン州から入手可能なＭＦｏｌｄ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．１が挙げられるが、これに限定されるものではない（Ｚｕｃｋｅｒら、Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅを参照）。Ｉｎ  ＲＮＡ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１〜４３頁、Ｊ．ＢａｒｃｉｓｚｅｗｓｋｉおよびＢ．Ｆ．Ｃ．Ｃｌａｒｋ編、ＮＡＴＯ  ＡＳＩ  Ｓｅｒｉｅｓ、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ、ＮＬ、（１９９９年）；Ｚｕｃｋｅｒら、Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２８８、９１１〜９４０頁（１９９９年）；Ｚｕｃｋｅｒら、ＲＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ。Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓ．Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｄ．Ｅ．Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ、Ｇ．Ｄ．Ｇｌｉｃｋ、およびＲ．Ａ．Ｊｏｎｅｓ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１１．２．１〜１１．２．１０、（２０００年）を参照、ＣＯＶＥ（ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｖａｒｉａｎｃｅ  ｍｏｄｅｌｓ（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  ｃｏｎｔｅｘｔ  ｆｒｅｅ  ｇｒａｍｍａｒ  ｍｅｔｈｏｄｓ））ｖ．２．４．２（ＥｄｄｙおよびＤｕｒｂｉｎ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９４年、２２：２０７９〜２０８８頁）、これはソースコードとして無料で配布されており、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｅｄｄｙ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／にアクセスすることによりダウンロードすることができ、ＦＯＬＤＡＬＩＧＮも無料で配布されており、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ａｕ．ｄｋ／ＦＯＬＤＡＬＩＧＮ／でのダウンロードで入手可能である（Ｆｉｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｏｓｔ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｃｏｍｍｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  ａ  ｓｅｔ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、Ｊ．Ｇｏｒｏｄｋｉｎ、Ｌ．Ｊ．ＨｅｙｅｒおよびＧ．Ｄ．Ｓｔｏｒｍｏ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２５巻、１８号、３７２４〜３７３２頁、１９９７年；Ｆｉｎｄｉｎｇ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  ａ  ｓｅｔ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、Ｊ．Ｇｏｒｏｄｋｉｎ、Ｌ．Ｊ．Ｈｅｙｅｒ、およびＧ．Ｄ．Ｓｔｏｒｍｏ、ＩＳＭＢ  ５；１２０〜１２３頁、１９９７年を参照）。
【０１０４】
本発明は以下の実施例によりさらに説明されるが、これは例証のために提供するものであって、いかなる形でも本発明を限定することを目的とするものではない。
【実施例１】
【０１０５】
プラスミド構築
ｐＰＨＡＳ−Ｆａｂ１−ＨＰ：ヘアピンＲＮＡｉを用いてＫＡＳＩＩのレベルを減少させた（本明細書では「Ｆａｂ１」としても知られ、多くの場合そう呼ばれる）。センス、アンチセンス、およびイントロンフラグメントを、ＰａｃＩ−ＸｈｏＩフラグメントとしてバイナリーベクターｐＤｓＲｅｄ−ＰＨＡＳにクローン化する前にプラスミドベクターｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に集合させた。Ａｔ１ｇ７４９６０のエクソン１の５’ＵＴＲ由来の１７８ｂｐフラグメント（ＦＡＢ１）（ＫＡＳＩまたはＫＡＳＩＩＩ酵素をコードする他のいかなるアラビドプシス配列とは相同ではない）を、オリゴヌクレオチドＴＴＡＡＴＴＡＡＣＧＣＡＴＣＧＡＡＧＣＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＣ（配列番号１）およびＧＣＴＡＧＣＧＧＣＴＴＴＧＡＧＡＡＧＡＡＣＣＣＡＧ（配列番号２）を使用してアラビドプシスゲノムＤＮＡから増幅し、続いて、前記挿入物のＮｈｅＩ部位がｐＧＥＭ−Ｔ−ＥａｓｙのＰｓｔＩ部位に隣接してｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ−ＨＴＭ１を作製するように、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクローン化した。
【０１０６】
次に、ＦＡＤ２の第１イントロンを、このフラグメントが１７ｂｐのエクソン１と４ｂｐのエクソン２を含有していて確実に５’と３’スプライス部位が含まれるように、オリゴヌクレオチドＧＣＴＡＧＣＧＴＣＡＧＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣ（配列番号３）およびＧＣＴＡＧＣＧＴＴＴＣＴＧＣＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＡＡＧＣ（配列番号４）を使用して増幅した。次に、このフラグメントをｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ−ＨＴＭ１のＰｓｔＩ／ＮｈｅＩ部位にクローン化して、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ−ＨＴＭ２を作製した。Ｆａｂ１ヘアピンのための逆方向反復を完成させるために、最初の１７８ｂｐ５’ＵＴＲフラグメントを、プライマーＣＴＧＣＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＧＣＡＴＣＧＡＡＧＣＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＣ（配列番号５）およびＧＡＧＣＴＣＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＴＧＡＧＡＡＧＡＡＣＣＣＡＧ（配列番号６）を使用して増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ−ＨＴＭ２のＳａｃＩ／ＰｓｔＩ部位にクローン化して、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ−ＨＴＭ３を得た。こうして得られたＦａｂ1ヘアピン配列をｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ−ＨＴＭ３から切り取り、ＰａｃＩ／ＸｈｏＩフラグメントとしてｐＤｓ−ｒｅｄ−ＰＨＡＳに挿入し、ｐＰＨＡＳ−ＦＡＢ１−ＨＰを作製した（図１）。
【０１０７】
ｐＰＨＡＳ−Ｆａｂ１−ＨＰＡＳ：Ｆａｂ１遺伝子の１０７ｂｐ第１エクソンを、プライマーＫａｓＩＩ−５’エクソン−ＢｇｌＩＩ（ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＣＴＡＴＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＡ（配列番号７）およびＫａｓＩＩ−３’エクソン−ＳｐｅＩ（ＧＧＧＡＣＴＡＧＴＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＡＴＧＣＣＡＴＧＧ（配列番号８））を使用してＤＮＡゲノムから増幅した。図１に示すように、前記フラグメントは、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ−ＨＴＭ３中のＳｐｅＩ−ＢｇｌＩＩのＦａｄ２−イントロンの一部で取り換え、次にＦＡＢ１ヘアピン、イントロンおよびＦａｂ１アンチセンスを含有するカセットをｐＰＨＡＳ−Ｆａｂ１−ＨＰの全ヘアピン−イントロンで取り換えた。
【０１０８】
ｐＰＨＡＳ−Ｆａｂ１−ＡＳ：上のＦＡＢ１遺伝子の１７８  ５’ＵＴＲを、プライマーＫａｓＩＩ−５ＵＴＲ−ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ（ＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＣＣＧＣＡＴＣＧＡＡＧＣＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＣ（配列番号９））およびＫａｓＩＩ−３ＵＴＲ−ＰａｃＩ（ＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＣＴＴＴＧＡＧＡＡＧＡＡＣＣＣＡＧ（配列番号１０））を使用して増幅した。図１に示すように、フラグメントは、ＰａｃＩ−ＸｈｏＩでｐＰＨＡＳ−Ｆａｂ１−ＨＰ中の全Ｆａｂ１ヘアピン−イントロンで取り換えた。
【０１０９】
ｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ２−ＨＰ：図２に示すように、Ｆａｄ２非コード配列の１１８ｂｐの５’ＵＴＲセンスとアンチセンスを、ゲノムＤＮＡから増幅し、ｐＰＨＡＳ−Ｆａｂ１−ＨＰ中のＫａｓＩＩの５’ＵＴＲセンスとアンチセンスで取り換えた。
【０１１０】
ｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ２−ＨＰＡＳ：１１５２ｂｐのＦａｄ２遺伝子を、プライマーＦＡＤ２−５’ＳｐｈＩ（ＣＧＣＡＴＧＣＡＴＧＧＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＡＴ（配列番号１１））およびＦＡＤ２−３’ＳｐｅＩ（ＣＣＡＣＴＡＧＴＴＣＡＴＡＡＣＴＴＡＴＴＧＴＴＧＴＡＣＣＡ（配列番号１２））で増幅し、図２に示すように、前記フラグメントはＳｐｅＩ−ＳｐｈＩでＦａｄ２イントロンの一部でアンチセンス方向に取り換えた。
【０１１１】
ｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ２−ＡＳ：Ｆａｄ２遺伝子を、プライマーＦＡＤ２−５’ＸｈｏＩ（ＣＣＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＡＴ（配列番号１３））およびＦＡＤ２−３’ＰａｃＩ（ＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＡＡＣＴＴＡＴＴＧＴＴＧＴＡＣＣＡ（配列番号１４））で増幅させ、次に、図３に示すように、アンチセンス方向としてＰａｃＩ−ＸｈｏＩでｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ２−ＨＰ中のＦａｄ２−ＨＰカセットで取り換えた。
【０１１２】
ｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ３−ＨＰ：Ｆａｄ３遺伝子の１３８ｂｐの３’ＵＴＲセンスとアンチセンスをゲノムＤＮＡから増幅した。図３に示すように、前記フラグメントはｐＰＨＡＳ−Ｆａｂ１−ＨＰ中のＦａｂ１の５’ＵＴＲセンスとアンチセンスで取り換えた。
【０１１３】
ｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ３−ＨＰＡＳ：Ｆａｄ３遺伝子の３０１ｂｐ第１エクソンを、プライマーＦａｄ３−アンチ−５’ＢｇｌＩＩ（ＧＧＡＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＧＣＣＣＧＴＧＧＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＡＧＡＴＧ（配列番号１５））およびＦａｄ３−アンチ−３’ＳｐｅＩ（ＧＧＧＡＣＴＡＧＴＧＴＴＧＴＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＣＡＡＣＧＣ（配列番号１６））で増幅し、次に、図３に示すように、アンチセンス方向にＢｇｌＩＩ−ＳｐｅＩでＦａｄ２−イントロンの一部で取り換えた。
【０１１４】
ｐＰＨＡＳ−Ｆａｄ３−ＡＳ：Ｆａｄ３遺伝子の３０１ｂｐ第１エクソンを、ＤＮＡゲノムから、プライマーＦａｄ３−アンチ−５’ＰａｃＩ（ＧＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＣＧＴＧＧＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＡＧＡＴＧ（配列番号１７））およびＦａｄ３−アンチ−３’ＸｈｏＩ（ＣＣＣＴＣＧＡＧＡＧＴＴＧＴＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＣＡＡＣＧＣ（配列番号１８））を使用して増幅した。図３に示すように、前記フラグメントはＰａｃＩ−ＸｈｏＩでＦａｄ３−ＨＰカセットで取り換えた。
【実施例２】
【０１１５】
アラビドプシス栽培および形質転換
アラビドプシスは、２０℃、明期１６／８時間（明／暗）で約２５０ｕＥの光下で栽培した。ベクターは、エレクトロポレーションによりアグロバクテリウムツメファシエンス系統ＧＶ３１０１ｐＭＰ９０に導入し、これを使用してフローラルディップ法（floral dip method）によりシロイヌナズナ植物体を形質転換した（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ，Ｎ．、Ｅｌｌｉｓ，Ｊ．、およびＰｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｇ．（１９９３年）Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ  ３１６、１１９４〜１１９８頁）。形質転換は、最初の開花の約５日後に実施した。
【実施例３】
【０１１６】
アラビドプシスの種子中の脂肪酸含有量の決定
脂肪酸分析：種子はメチル化し（１ｍｌの１Ｎ  ＨＣｌ、メタノール（Ｓｕｐｅｌｃｏ社製）、８０℃で１時間）、ヘキサンで抽出し、トリメチルシリル化した（１００μｌのＢＳＴＦＡ−ＴＭＣＳ（ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミドトリメチルシラン）（Ｓｕｐｅｌｃｏ社製）、９０℃で４５分間））。ＢＳＴＦＡ−ＴＭＣＳは蒸発により取り除き、試料はヘキサンに再懸濁した。試料は、５９７３質量選択検出器（ＧＣ／ＭＳ）およびＳＰ−２３４０シアノキャピラリーカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ社製）（６０ｍ×２５０μｍ×０．２５μｍ）が装備されたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ６８９０ガスクロマトグラフで分析した。注入器は２２５℃に保たれ、オーブン温度は変化させた（１５℃／分の割合で１００〜２４０℃に続き２４０℃で５分間）、ヘリウム流量は１．１ｍｌ／分であった。ピーク同一性の割り当ては、溶出時間対真正基準に基づいて実施し、その質量スペクトルに基づいて確認した。定量化はＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄケムステーションソフトウェアを使用して実施した。
【実施例４】
【０１１７】
アラビドプシスにおける脂肪酸合成の調節
イントロンにおける遺伝子の遺伝子抑制の３種類の方法（アンチセンス、ヘアピンＲＮＡｉ、およびアンチセンス付きヘアピンＲＮＡｉ）を比較した。理論に縛られることは望まないが、ヘアピンＲＮＡｉとアンチセンス配列を含有するｍＮＡのほうが、図４に描くモデルなどのモデルによる遺伝子サイレンシングでは強力である可能性がある。図４のモデルでは、イントロンをスプライスしてｓｉＲＮＡを作製すると、遺伝子のアンチセンス部分を含有するＤＮＡフラグメントが作り出され、したがって、生成されるダイサー基質であるＲＮＡｉに加えて、遺伝子発現を減少させる追加の潜在的方法を提供する。
【０１１８】
β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＡＳ）ＩＩだけではなく、遺伝子抑制の３種類の方法の比較のために３種類の遺伝子が選択された（容易に点数化できるという理由で、１２−デサチュラーゼＦＡＢ２および１５−デサチュラーゼＦＡＤ３、ならびに遺伝子発現の減少の評価のために以前使用されていたという理由で、ＦＡＤ２）。アラビドプシスにおけるこれらの酵素と脂肪酸合成の関係は図５に描かれている。
【０１１９】
油料種子作物の脂肪酸含有量の改変のための標的組織であることに加えて、種子は、実施例１において作製された構築物を使用して実施された形質転換の結果を再現性よく分析するための信頼できる材料の供給源を提供する。したがって、形質転換された植物由来の種子の脂肪酸含有量を、ガスクロマトグラフィーおよび質量分光測定分析により分析し、特定の脂肪酸としてのピークの割り当てを定性的に確認した。スチューデントｔ−検定を使用して、平均値間の差を意味づけた（平均値あたり１０以上の試料に基づいて）。実施例１で作製した構築物についての結果は、下の実施例５〜８に示している。
【実施例５】
【０１２０】
ＦＡＢ１発現の調節
ＦＡＢ１はプラスチド内で１６Ｃ原子（Ｃ１６）を１８Ｃ原子（Ｃ１８）脂肪酸に伸長している。ＦＡＢ１では、１６：０プラス１６：１脂肪酸（ＦＡＢ１の基質）のレベルを、その産物１８：０と１８：１プラス代謝物１８：２と１８：３のレベルと比較した。野生型アラビドプシスは、ｆａｂ１  ｆａｅ１突然変異体系統と、およびＦＡＢ１ヘアピン（Ｆａｂ１−ＨＰ）または組み合わせたヘアピンとアンチセンスを含むＦＡＢ１（ｆａｂ１−ＨＰＡＳ）のいずれかで形質転換したｆａｂ１  ｆａｅ１突然変異体系統と比較した。その結果は図６に示しており、図７にグラフを使用してまとめている。ｆａｂ１  ｆａｅ１系統は、２０Ｃレベルまでの追加の伸長を妨げるｆａｅ１突然変異により、Ｃ１８脂肪酸の著しい増加を示した。ｆａｂ１−ＨＰのｆａｂ１  ｆａｅ１突然変異体背景への導入により、Ｃ１８脂肪酸は７４．２％から５３．４％に減少し、ｆａｂ１−ＨＰＡＳ構築物の導入により４１．６％１８Ｃ脂肪酸まで減少した。
【実施例６】
【０１２１】
ＦＡＤ２発現の調節
ＦＡＤ２では、１８：１脂肪酸（ＦＡＤ２の基質）のレベルは、その産物１８：２と代謝物１８：３のレベルと比較した。分析のために、１８：２を１８：３と合わせて、ＦＡＤ２により不飽和化されていた全脂肪酸の割合を評価した。野生型アラビドプシスは、ＦＡＤ２−アンチセンス（Ｆａｄ２−ＡＳ）、ＦＡＤ２ヘアピンＲＮＡｉ（Ｆａｄ２−ＨＰ）と比較し、ＦＡＤ２は、組み合わせたヘアピンとアンチセンス（Ｆａｄ２−ＨＰＡＳ）と比較した。これらのそれぞれは、もっとも過酷なＦＡＤ２突然変異体、すなわちＦＡＤ２−２（Ｆａｄ２−ＭＴ）と比較した。その結果は、図８および図９に示しており、図１０には図を使用してまとめている。
【０１２２】
１８：２＋１８：３のＷＴレベルは４３％であり、これはＦａｄ２−ＡＳでは１８．９％に低下し、Ｆａｄ２−ＨＰ系統では９．４％に低下した。両変化は、Ｐ＜０．０１レベルでは有意であった。Ｆａｄ２−ＨＰ系統での９．４％からＦａｄ２−ＨＰＡＳ系統での７．２％への低下は、Ｐ＜０．０５レベルでは有意であった。Ｆａｄ２−ＨＰＡＳ系統での７．２％は、ｆａｄ２−ＭＴでのレベルの７．５％とは著しく違ってはいなかった。
【実施例７】
【０１２３】
ＧＵＳ発現の導入を使用したＦＡＤ２発現の調節
ＦＡＤ２では、１８：１脂肪酸（ＦＡＤ２の基質）レベルは、その産物１８：２と代謝物１８：３のレベルと比較した。分析のために、１８：２を１８：３と合わせて、ＦＡＤ２により不飽和化されていた全脂肪酸の割合を得た。野生型アラビドプシスは、イントロン中にＧＵＳ遺伝子を含有するＦＡＤ２ヘアピンＲＮＡｉ（Ｆａｄ２−ＨＰ−ＧＵＳ）と比較した。その結果は図１１および図１２に示している。
【０１２４】
１８：２＋１８：３のＷＴレベルは４９％であり、これはＦａｄ２−ＨＰ−ＧＵＳでは１２．３％に低下した。その変化は、Ｐ＜０．０１レベルでは有意であった。さらに、ＧＵＳの青色染色は形質転換された種子では明らかであり、その種子におけるＧＵＳの発現を示していた。
【実施例８】
【０１２５】
ＦＡＤ３発現の調節
ＦＡＤ３では、１８：１プラス１８：２脂肪酸（１８：２はＦＡＤ３の基質である）のレベルは、その産物１８：３のレベルと比較した。野生型アラビドプシスは、ＦＡＤ３−アンチセンス（Ｆａｄ３−ＡＳ）と、ＦＡＤ３ヘアピン（ＲＮＡｉ  Ｆａｄ３−ＨＰ）と、および組み合わせたヘアピンとアンチセンスを有するＦＡＤ３（Ｆａｄ３−ＨＰＡＳ）と比較した。その結果は、図１３および図１４に示しており、図１５ではグラフを使用してまとめている。
【０１２６】
１８：３のＷＴレベルは１７．０％であり、Ｆａｄ３−ＡＳでは１０．７％に、Ｆａｄ３−ＨＰ系統では４．５％に、Ｆａｄ３−ＨＰＡＳ系統では３．０％に低下した。Ｐ＜０．０１レベルでは、処置のすべてが他の処置すべてと有意な差があった。３．０％のＦａｄ３−ＨＰＡＳ系統では、２．８％でのもっとも強力な突然変異体Ｆａｄ３対立遺伝子、すなわちＦａｄ３−３と有意な差はなかった。
【０１２７】
本発明はある種の実施形態で説明してきたが、本発明は本開示の精神と範囲内でさらに改変することができる。したがって、本出願は、その一般原理を使用して本発明のいかなる変形、使用または適応をも網羅することを意図している。さらに、本出願は、本発明が関連し、添付された特許請求の範囲内にある技術分野における既知のまたは習慣的な慣行内に含まれるような本開示からの逸脱を網羅することを意図している。
【０１２８】
刊行物、特許、特許出願を含む、本明細書に引用したすべての参考文献は、各参考文献が、参照により組み込まれていることを個別に具体的に示されており、その全体が本明細書に記載されている場合と同じ程度にこれによって参照により組み込まれている。本明細書で取り上げた参考文献は、本出願の出願日に先立ってその開示のためだけに提供されている。本明細書においては、本発明者が先行発明によるそのような開示に先行する資格がないことを認めたものとして解釈すべきものは１つもない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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