(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
0005749130.tif 000017
（式中、Ａｒは、ハロゲン原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数１から４のハロアルキル基、炭素数１から４のアルコキシ基、炭素数１から４のハロアルコキシ基、炭素数１から４のアルキルチオ基、炭素数１から４のアルキルスルホニル基、炭素数１から４のアルキルアミノ基、ジ（炭素数１から４のアルキル）アミノ基、アミノ基、水酸基、シアノ基、トリ（炭素数１から３のアルキル）シリル基、フェニル基、炭素数１から５のアシル基、（炭素数１から４のアルコキシ）カルボニル基およびニトロ基からなる群より選択される１つ以上の基で置換されていてもよいフェニル基；または炭素数１から４のアルキル基、炭素数１から４のハロアルキル基、炭素数１から４のアルコキシ基、炭素数１から４のアルキルアミノ基、ジ（炭素数１から４のアルキル）アミノ基、アミノ基、水酸基およびニトロ基からなる群より選択される１つ以上の基で置換されていてもよいピリジル基を表し、Ｘは、単結合、カルボニル基、スルホニル基、または炭素数１もしくは２のアルキレン基を表す。ｎは１または２を表す。）で表される、ピペラジニル基または１，４−ジアゼパニル基を、カルボニル基を介して不溶性担体に固定化して得られる、タンパク質分離・精製用吸着剤。
【請求項２】
不溶性担体とカルボニル基導入剤と反応させ、次いで一般式（１ａ）
【化２】
0005749130.tif 000018
（式中、Ａｒは、ハロゲン原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数１から４のハロアルキル基、炭素数１から４のアルコキシ基、炭素数１から４のハロアルコキシ基、炭素数１から４のアルキルチオ基、炭素数１から４のアルキルスルホニル基、炭素数１から４のアルキルアミノ基、ジ（炭素数１から４のアルキル）アミノ基、アミノ基、水酸基、シアノ基、トリ（炭素数１から３のアルキル）シリル基、フェニル基、炭素数１から５のアシル基、（炭素数１から４のアルコキシ）カルボニル基およびニトロ基からなる群より選択される１つ以上の基で置換されていてもよいフェニル基；または炭素数１から４のアルキル基、炭素数１から４のハロアルキル基、炭素数１から４のアルコキシ基、炭素数１から４のアルキルアミノ基、ジ（炭素数１から４のアルキル）アミノ基、アミノ基、水酸基およびニトロ基からなる群より選択される１つ以上の基で置換されていてもよいピリジル基を表し、Ｘは、単結合、カルボニル基、スルホニル基、または炭素数１もしくは２のアルキレン基を表す。ｎは１または２を表す。）で表される、ピペラジンまたは１，４−ジアゼパン誘導体を反応させて得られる、請求項１に記載のタンパク質分離・精製用吸着剤。
【請求項３】
カルボニル基導入剤が１，１’−カルボニルジイミダゾールである請求項２に記載のタンパク質分離・精製用吸着剤。
【請求項４】
Ａｒがアミノ基で置換されていてもよいフェニル基またはアミノ基もしくはメチル基で置換されていてもよいピリジル基であり、Ｘが単結合であり、ｎが１である、請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質分離・精製用吸着剤。
【請求項５】
Ａｒが４−アミノフェニル基、２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、４−メチルピリジン−２−イル基または５−アミノピリジン−２−イル基である、請求項４記載のタンパク質分離・精製用吸着剤。
【請求項６】
不溶性担体がアガロース、セルロースまたは水酸基を導入したポリメタクリレートである、請求項１から５のいずれかに記載のタンパク質分離・精製用吸着剤。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載のタンパク質分離・精製用吸着剤を用いた、タンパク質の分離・精製法。
【請求項８】
タンパク質が、免疫グロブリン、またはその類縁体、フラグメントもしくは融合体である請求項７に記載の分離・精製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピペラジン誘導体を不溶性担体に固定化して得られる、各種タンパク質、特に免疫グロブリンの分離・精製に有用な吸着剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療用タンパク質の需要は拡大しつつあり、該タンパク質の精製を工業的に簡便かつ大規模に実施できる技術の確立が切望されている。一般にタンパク質精製技術には、ゲル透過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー分離技術がある。しかしながら現状、これらの技術で医療用タンパク質の精製を工業的に実施する場合、経済性に乏しく、実用的とは言い難い。また、医療用タンパク質を工業的に製造する過程では多種類のタンパク質が混在しているため、これらの技術単独で目的とするタンパク質を純粋に得ることは困難である。そのため通常はいくつかの技術を複合させた精製プロセスが採用されている（特許文献１）。
【０００３】
近年、医療用タンパク質の一つである免疫グロブリンを精製するためのクロマトグラフィー用吸着剤として、有機化合物を不溶性担体に固定化して得られる吸着剤が注目されている。例えば、スルホン誘導体（特許文献２）、トリアジン誘導体（特許文献３）、メルカプト複素環式化合物（特許文献４）、４−（アルキルチオエチル）ピリジン誘導体（非特許文献１）を不溶性担体に固定化して得られるタンパク質分離・精製用吸着剤が開示されている。一方、ピペラジン誘導体を不溶性担体に固定化して得られる本発明の吸着剤についての報告例はこれまでない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０８７７６１号
【特許文献２】米国特許４６９６９８０号公報
【特許文献３】米国特許６１１７９９６号公報
【特許文献４】特許第３８４４４９６号公報
【特許文献５】ＷＯ９６／０９１１６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，９（４），２１１−２２１，２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、タンパク質、特に免疫グロブリンの分離・精製に有用な、ピペラジン誘導体を不溶性担体に固定化して得られる吸着剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、本発明の下記一般式（１）で表されるピペラジン誘導体を不溶性担体に固定化して得られる吸着剤が、タンパク質、特に免疫グロブリンの簡便な分離・精製に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、一般式（１）
一般式（１）
【０００９】
【化１】
0005749130.tif 000002
（式中、Ａｒは、ハロゲン原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数１から４のハロアルキル基、炭素数１から４のアルコキシ基、炭素数１から４のハロアルコキシ基、炭素数１から４のアルキルチオ基、炭素数１から４のアルキルスルホニル基、炭素数１から４のアルキルアミノ基、ジ（炭素数１から４のアルキル）アミノ基、アミノ基、水酸基、シアノ基、トリ（炭素数１から３のアルキル）シリル基、フェニル基、炭素数１から５のアシル基、（炭素数１から４のアルコキシ）カルボニル基およびニトロ基からなる群より選択される１つ以上の基で置換されていてもよいフェニル基；または炭素数１から４のアルキル基、炭素数１から４のハロアルキル基、炭素数１から４のアルコキシ基、炭素数１から４のアルキルアミノ基、ジ（炭素数１から４のアルキル）アミノ基、アミノ基、水酸基およびニトロ基からなる群より選択される１つ以上の基で置換されていてもよいピリジル基を表し、Ｘは、単結合、カルボニル基、スルホニル基、または炭素数１もしくは２のアルキレン基を表す。ｎは１または２を表す。）で表される、ピペラジニル基または１，４−ジアゼパニル基を、カルボニル基を介して不溶性担体に固定化して得られる、タンパク質分離・精製用吸着剤に関するものである。
【００１０】
その具体例として、不溶性担体とカルボニル基導入剤と反応させ、次いで一般式（１ａ）
【００１１】
【化２】
0005749130.tif 000003
（式中、Ａｒは、ハロゲン原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数１から４のハロアルキル基、炭素数１から４のアルコキシ基、炭素数１から４のハロアルコキシ基、炭素数１から４のアルキルチオ基、炭素数１から４のアルキルスルホニル基、炭素数１から４のアルキルアミノ基、ジ（炭素数１から４のアルキル）アミノ基、アミノ基、水酸基、シアノ基、トリ（炭素数１から３のアルキル）シリル基、フェニル基、炭素数１から５のアシル基、（炭素数１から４のアルコキシ）カルボニル基およびニトロ基からなる群より選択される１つ以上の基で置換されていてもよいフェニル基；または炭素数１から４のアルキル基、炭素数１から４のハロアルキル基、炭素数１から４のアルコキシ基、炭素数１から４のアルキルアミノ基、ジ（炭素数１から４のアルキル）アミノ基、アミノ基、水酸基およびニトロ基からなる群より選択される１つ以上の基で置換されていてもよいピリジル基を表し、Ｘは、単結合、カルボニル基、スルホニル基、または炭素数１もしくは２のアルキレン基を表す。ｎは１または２を表す。）で表される、ピペラジンまたは１，４−ジアゼパン誘導体を反応させて得られる、タンパク質分離・精製用吸着剤がある。
【００１２】
また本発明は、本発明のタンパク質分離・精製用吸着剤を用いた、タンパク質の分離・精製法に関する。
【００１３】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１４】
はじめに本発明のタンパク質分離・精製用吸着剤（１）およびピペラジンまたは１，４−ジアゼパン誘導体（１ａ）における、Ａｒについて説明する。
【００１５】
Ａｒで表される、ハロゲン原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数１から４のハロアルキル基、炭素数１から４のアルコキシ基、炭素数１から４のハロアルコキシ基、炭素数１から４のアルキルチオ基、炭素数１から４のアルキルスルホニル基、炭素数１から４のアルキルアミノ基、ジ（炭素数１から４のアルキル）アミノ基、アミノ基、水酸基、シアノ基、トリ（炭素数１から３のアルキル）シリル基、フェニル基、炭素数１から５のアシル基、（炭素数１から４のアルコキシ）カルボニル基およびニトロ基からなる群より選択される１つ以上の基で置換されていてもよいフェニル基としては、フェニル基、２−フルオロフェニル基、３−フルオロフェニル基、４−フルオロフェニル基、２，４−ジフルオロフェニル基、２−クロロフェニル基、３−クロロフェニル基、４−クロロフェニル基、２，３−ジクロロフェニル基、３，４−ジクロロフェニル基、３，５−ジクロロフェニル基、２−ブロモフェニル基、３−ブロモフェニル基、４−ブロモフェニル基、３−ヨードフェニル基、４−ヨードフェニル基、２−メチルフェニル基、３−メチルフェニル基、４−メチルフェニル基、２，３−ジメチルフェニル基、３，４−ジメチルフェニル基、２，５−ジメチルフェニル基、５−クロロ−２−メトキシフェニル基、５−ブロモ−２−メトキシフェニル基、５−ヨード−２−メトキシフェニル基、３−エチルフェニル基、４−エチルフェニル基、３−プロピルフェニル基、４−プロピルフェニル基、３−イソプロピルフェニル基、４−イソプロピルフェニル基、３−シクロプロピルフェニル基、４−シクロプロピルフェニル基、３−ブチルフェニル基、４−ブチルフェニル基、２−ヒドロキシフェニル基、３−ヒドロキシフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、２−メトキシフェニル基、３−メトキシフェニル基、４−メトキシフェニル基、２−エトキシフェニル基、３−エトキシフェニル基、４−エトキシフェニル基、３−プロピルオキシフェニル基、４−プロピルオキシフェニル基、３−イソプロピルオキシフェニル基、４−イソプロピルオキシフェニル基、３−シクロプロピルオキシフェニル基、４−シクロプロピルオキシフェニル基、３−ブトキシフェニル基、４−ブトキシフェニル基、２−トリフルオロメトキシフェニル基、３−トリフルオロメトキシフェニル基、４−トリフルオロメトキシフェニル基、２−メチルチオフェニル基、４−メチルチオフェニル基、２−メチルスルホニルフェニル基、４−メチルスルホニルフェニル基、４−アミノフェニル基、４−アミノ−２−クロロフェニル基、４−アミノ−２−トリフルオロメチルフェニル基、４−アミノ−３−トリフルオロメチルフェニル基、２−アミノ−４−トリフルオロメチルフェニル基、４−メチルアミノフェニル基、４−エチルアミノフェニル基、４−ジメチルアミノフェニル基、４−ジエチルアミノフェニル基、４−エチルメチルアミノフェニル基、４−トリメチルシリルフェニル基、４−ニトロフェニル基、２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル基、４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル基、４−ニトロ−３−トリフルオロメチルフェニル基、２−クロロ−４−ニトロフェニル基、２−シアノフェニル基、４−シアノフェニル基、２−トリフルオロメチルフェニル基、４−トリフルオロメチルフェニル基、３，５−ビストリフルオロメチルフェニル基、４−アセチルフェニル基、４−メトキシカルボニルフェニル基、ビフェニル−４−イル基が例示できる。
【００１６】
Ａｒで表される、炭素数１から４のアルキル基、炭素数１から４のハロアルキル基、炭素数１から４のアルコキシ基、炭素数１から４のアルキルアミノ基、ジ（炭素数１から４のアルキル）アミノ基、アミノ基、水酸基およびニトロ基からなる群より選択される１つ以上の基で置換されていてもよいピリジル基としては、２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、５−トリフルオロメチルピリジン−２−イル基、３−シアノピリジン−２−イル基、５−シアノピリジン−２−イル基、３−メチルピリジン−２−イル基、４−メチルピリジン−２−イル基、５−メチルピリジン−２−イル基、６−メチルピリジン−２−イル基、４−エチルピリジン−２−イル基、４−プロピルピリジン−２−イル基、４−ブチルピリジン−２−イル基、４−メトキシピリジン−２−イル基、４−ヒドロキシピリジン−２−イル基、４−ニトロピリジン−２−イル基、４−アミノピリジン−２−イル基、５−アミノ−４−メチルピリジン−２−イル基、５−アミノピリジン−２−イル基、３−トリフルオロメチルピリジン−２−イル基が例示できる。
【００１７】
Ａｒ、Ｘおよびｎの組み合わせは、タンパク質の分離・精製性能が良い点で、Ａｒがアミノ基で置換されていてもよいフェニル基またはアミノ基もしくはメチル基で置換されていてもよいピリジル基であり、Ｘが単結合であり、ｎが１であると好ましく、Ａｒが４−アミノフェニル基、２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、４−メチルピリジン−２−イル基、５−メチルピリジン−２−イル基のいずれかであり、Ｘが単結合であり、ｎが１であるとさらに好ましい。
【００１８】
本発明のタンパク質分離・精製用吸着剤（１）の製造原料であるピペラジンおよび１，４−ジアゼパン誘導体（１ａ）は、市販品として入手可能な化合物や、既知の方法で合成できる化合物を用いることができる。また、必要に応じて、例えばこれらのアンモニウム塩等を用いてもよい。なおピペラジンおよび１，４−ジアゼパン誘導体（１ａ）として、１−（４−アミノフェニル）ピペラジン、１−（ピリジン−２−イル）ピペラジン、１−（ピリジン−３−イル）ピペラジン、１−（ピリジン−４−イル）ピペラジン、１−（４−メチルピリジン−２−イル）ピペラジン、１−（５−アミノピリジン−２−イル）ピペラジン、１−（ピリジン−２−イル）ジアゼパンのいずれかを用いると、該誘導体により得られる、本発明の分離・精製用吸着剤（１）のタンパク質の分離・精製性能が向上する点で好ましい。ピペラジンおよび１，４−ジアゼパン誘導体（１ａ）の不溶性担体（ｇｅｌ）に対する固定化量は、タンパク質の分離・精製性能がよい点で、１００μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）以上が好ましい。
【００１９】
本発明のタンパク質の分離・精製用吸着剤（１）の製造原料である不溶性担体に特に限定はなく、アガロース、アルギネート、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプンなどの多糖類、ポリビニルアルコール、水酸基を導入したポリメタクレート、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタンなどの合成高分子が例示できる。中でもタンパク質の分離・精製性能がよい点で、トヨパール（商品名、東ソー製）等の水酸基を導入したポリメタクリレート、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（商品名、ＧＥヘルスケア製）等のアガロース、セルファインＧＣＬ−２０００（商品名、チッソ製）等のセルロースが、不溶性担体として好ましい。不溶性担体の形状、表面構造、細孔構造、重合度については、特に限定はないが、オープンカラムに充填して使用する態様では、微粒子状とすると、タンパク質の分離・精製の性能が向上する点で好ましい。圧力損失を抑えながらタンパク質吸着量を上げる目的で、粒子径は１から１０００μｍの範囲にあることが好ましい。また、ピペラジンおよび１，４−ジアゼパン誘導体（１ａ）の固定化量を多くすることができる点で、４００μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）以上の水酸基を含有することが好ましい。
【００２０】
本発明のタンパク質分離・精製用吸着剤（１）の製造方法に特に限定はなく、例えばＷＯ９６／０９１１６号に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、不溶性担体上の水酸基をカルボニル基導入剤で処理し、次いでピペラジンまたは１，４−ジアゼパン誘導体（１ａ）と反応させることにより製造することができる。用いることのできるカルボニル基導入剤としては、１，１’−カルボニルジイミダゾール、クロロギ酸エチル、クロロギ酸−ｐ−ニトロフェニルエステル、炭酸ビス（トリクロロメチル）、トリクロロメチルクロロホルメート、ホスゲンダイマーが例示できる。この中で、１，１’−カルボニルジイミダゾールが固定化量が多い点で好ましい。
【００２１】
次に、本発明のタンパク質分離・精製用吸着剤（１）を用いたタンパク質の分離・精製法について説明する。
【００２２】
本発明のタンパク質分離・精製用吸着剤（１）を用いて、分離・精製することができるタンパク質としては、血漿タンパク質成分（例えば血漿中の免疫グロブリン）、血清アルブミン、血液凝固因子、ラクトアルブミンやラクトフェリン等の乳タンパク質成分や、天然には微量しか存在しないペプチドホルモン、インターフェロン、インターロイキン、成長因子、成長抑制因子、ワクチン等を例示できる。また、人工的に設計された遺伝子組換えタンパク質も含まれる。中でも、免疫グロブリンが本発明のタンパク質分離・精製用吸着剤（１）の特徴を活かせる点で好ましい。なお、ここでいう免疫グロブリンは、その類縁体、フラグメントまたは融合体を含んでもよい。ここでいう類縁体とは、免疫グロブリンの構造や機能が少なくとも部分的に保持された、天然もしくは人工的に作られたタンパク質またはタンパク質コンジュゲートを指し、ここでいうフラグメントとは、酵素的な処理または遺伝子工学的な設計によって作製された、免疫グロブリンの部分構造を有したタンパク質を指し、ここでいう融合体とは各種サイトカインやサイトカイン受容体等の生物活性を有したタンパク質の機能部分を、免疫グロブリンの全部または一部と遺伝子工学的に融合させて作製したものを指す。
【００２３】
本発明のタンパク質分離・精製用吸着剤（１）をオープンカラムに充填し、緩衝液、金属塩溶液、アミノ酸溶液、アルコール溶液等の溶離液を通液することで、タンパク質の分離・精製を行なうことができる。本発明のタンパク質分離・精製用吸着剤（１）を充填したカラムの溶離液として用いる緩衝液としては、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、Ｃｈｏｌａｍｉｎｅ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳが例示できる。溶離液として用いる金属塩溶液に含まれる金属塩としては、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸リチウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムが例示できる。溶離液として用いるアミノ酸溶液に含まれるアミノ酸としては、グリシン、アルギニン、ベータアラニン、ガンマアミノ酪酸が例示できる。溶離液として用いるアルコール溶液に含まれるアルコールとしてはエタノール、イソプロピルアルコール、グリセロール、エチレングリコールが例示できる。なお、前述した溶液を混合した溶液も混合溶媒として用いることもできる。ｐＨは３から１１の範囲内であれば、目的とするタンパク質を分離・精製できる。本発明のタンパク質分離・精製用吸着剤（１）を用いて、免疫グロブリン、またはその類縁体、フラグメントもしくは融合体を分離・精製する場合、例えば、ｐＨ３から８に調整した塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液を通液するクロマトグラフィーを実施すればよい。
【００２４】
本発明のタンパク質分離・精製用吸着剤（１）は、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液等のアルカリ性水溶液、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸の水溶液、塩酸グアニジン水溶液、尿素水溶液等のタンパク変性剤水溶液、アルギニンやヒスチジン等のアミノ酸を含んだ水溶液、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ（商品名）等の界面活性剤水溶液、メタノール、エタノール、イソプロパノール、グリセロール、エチレングリコール等のアルコール、またはこれら溶液を混合した溶液を用いて洗浄することによって、初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用することができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明のタンパク質分離・精製用吸着剤（１）は、有用なタンパク質、特に免疫グロブリンの分離・精製に有用である。そのため、医療用タンパク質、特に免疫グロブリンの工業的な精製において極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】固定化ゲル３６を用いたタンパク質の分離・精製結果を示すクロマトグラム。（Ａ）は素通り画分を、（Ｂ）は回収画分１を、（Ｃ）はＨＣＰ（チャイニーズハムスター卵巣細胞を培養した培養液から細胞を取り除いた液）を、それぞれ液体クロマトグラフィーで分析して得られたクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がこれらに限定されるものではない。
【００２８】
実施例１  ポリメタクリレートゲルのイミダゾリルカルボニル化
（１）不溶性担体として、ポリメタクリレートゲルであるＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＨＷ−６５Ｆ（商品名、東ソー製）を用いた。まず、該ゲルを遠沈管に充填し、１００×ｇで遠心分離することで、沈降ゲル（１０ｍＬ）を得た。
（２）吸引濾過により溶媒を除去し、沈降ゲルを１，４−ジオキサン（５０ｍＬ×５）で洗浄した。
（３）洗浄後のゲルに１，４−ジオキサン（１０ｍＬ）と１，１’−カルボニルジイミダゾール（１．０ｇ，６．１７ｍｍｏｌ）を加え、４０℃で１時間、１５０ｒｐｍでレシプロ振とうし、反応させた。
（４）１００×ｇでゲルを遠心分離し、反応液を吸引濾過した。
（５）得られたゲルを１，４−ジオキサン（２０ｍＬ×４）で洗浄することで、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したポリメタクリレートゲルを得た。
【００２９】
実施例２  フェニルピペラジンのポリメタクリレートゲルへの固定化
（１）実施例１に記載の方法で製造した、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したポリメタクリレートゲル（２ｍＬ）に、フェニルピペラジンの１，４−ジオキサン溶液（１．２３ｍｏｌ／Ｌ，１．９ｍＬ）を加え、４５℃で一晩、１５０ｒｐｍでレシプロ振とうし、反応させた。
（２）反応終了後、得られたゲルを１，４−ジオキサン（４ｍＬ×５）で洗浄した。
（３）さらに水（１０ｍＬ×１０）で洗浄後、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（１０ｍＬ）を加え２５℃で１５分間、１５０ｒｐｍでロータリー振とうした。
（４）反応液を濾過し、水（１０ｍＬ×１０）で洗浄した。
（５）０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）を加え、２５℃で１５分間、１５０ｒｐｍでロータリー振とうした。
（６）反応液を濾過後、さらに水（１０ｍＬ×１０）で洗浄することで、フェニルピペラジン固定化トヨパールゲル（固定化ゲル１８）を得た。
【００３０】
反応終了後のゲルを洗浄した、１，４−ジオキサン洗浄液中の未反応のフェニルピペラジンの量を、液体クロマトグラフィーで分析し、固定化ゲル１８に固定化されたフェニルピペラジンの量を算出したところ、固定化量は３４０μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００３１】
実施例３  フェニルピペラジン固定化ポリメタクリレートゲル（固定化ゲル１８）のタンパク質結合量測定
（１）実施例２に記載の方法で製造した固定化ゲル１８を、オープンカラム（バイオスピンエンプティーカラム、商品名、ＢｉｏＲａｄ製）に充填し、１００×ｇで１分間遠心分離し、沈降ゲル（０．５ｍＬ）を得た。
（２）ヒト免疫グロブリン溶液（１５０ｍｇ／ｍＬ，化血研製）３ｍＬを、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）（緩衝液Ａ）１０．５ｍＬで希釈することでタンパク質溶液（１．５ｍＬ，免疫グロブリン５０ｍｇを含む）を調製し、これを固定化ゲル１８を充填したカラムに添加した。
（３）マイクロチューブローテーター（アズワン製ＭＴＲ１０３）を用いて２５℃で一晩回転した後、４０×ｇで２分間遠心濾過した。
（４）カラムに緩衝液Ａ（１．５ｍＬ）を加え、４０×ｇで２分間遠心濾過する洗浄操作を、計４回繰り返した。
（５）洗浄後のカラムに１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）１．５ｍＬを加え、４０×ｇで２分間遠心濾過するタンパク質回収操作を、計４回繰り返した。
【００３２】
それぞれのタンパク質回収液の２８０ｎｍにおける吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し、それぞれの回収液に含まれる免疫グロブリンの総量から結合量を算出した。その結果、タンパク質の結合量は５ｍｇ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００３３】
実施例４  １−（４−ニトロフェニル）ピペラジンのポリメタクリレートゲルへの固定化
（１）実施例１に記載の方法で製造した、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したポリメタクリレートゲル（２ｍＬ）に、１−（４−ニトロフェニル）ピペラジンのＤＭＳＯ溶液（１．２３ｍｏｌ／Ｌ，１．９ｍＬ）を加え、４５℃で一晩、１５０ｒｐｍでレシプロ振とうし、反応させた。
（２）反応終了後、得られたゲルをＤＭＳＯ（４ｍＬ×５）で洗浄した。
（３）さらに水（１０ｍＬ×１０）で洗浄した後、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（１０ｍＬ）を加え、２５℃で１５分間、１５０ｒｐｍでロータリー振とうした。
（４）反応液を濾過後、水（１０ｍＬ×１０）で洗浄した。
（５）０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）を加え、２５℃で１５分間、１５０ｒｐｍでロータリー振とうした。
（６）反応液を濾過後、さらに水（１０ｍＬ×１０）で洗浄することで、１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン固定化ポリメタクリレートゲル（固定化ゲル１１）を得た。
【００３４】
洗浄したＤＭＳＯ（濾液）中に含まれる未反応の１−（４−ニトロフェニル）ピペラジンの量を液体クロマトグラフィーで分析し、固定化ゲル１１に固定化された１−（４−ニトロフェニル）ピペラジンの量を算出した。その結果、固定化量は１５０μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００３５】
実施例５  １−（４−ニトロフェニル）ピペラジン固定化ポリメタクリレート（固定化ゲル１１）のタンパク質結合量測定
実施例３に記載の方法と同様で、固定化ゲル１１のタンパク質結合量を測定した。結果、タンパク質の結合量は１０ｍｇ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００３６】
実施例６  １−（４−フルオロフェニル）ピペラジンのポリメタクリレートゲルへの固定化
（１）実施例１に記載の方法で製造した、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したポリメタクリレートゲル（２ｍＬ）に、１−（４−フルオロフェニル）ピペラジン二塩酸塩の（１，４−ジオキサン：水＝１：１）溶液（１．２３ｍｏｌ／Ｌ，１．９ｍＬ）を加え、４５℃で一晩、１５０ｒｐｍでレシプロ振とうし、反応させた。
（２）反応終了後、得られたゲルを（１，４−ジオキサン：水＝１：１）溶液（４ｍＬ×５）で洗浄した。
（３）さらに水（１０ｍＬ×１０）で洗浄後、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（１０ｍＬ）を加え、２５℃で１５分間、１５０ｒｐｍでロータリー振とうした。
（４）反応液を濾過後、水（１０ｍＬ×１０）で洗浄した。
（５）０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）を加え、２５℃で１５分間、１５０ｒｐｍでロータリー振とうした。
（６）反応液を濾過後、さらに水（１０ｍＬ×１０）で洗浄することで、１−（４−フルオロフェニル）ピペラジン固定化ポリメタクリレートゲル（固定化ゲル３）を得た。
【００３７】
洗浄した（１，４−ジオキサン：水＝１：１）溶液（濾液）中に含まれる未反応の１−（４−フルオロフェニル）ピペラジンの量を液体クロマトグラフィーで分析し、固定化ゲル３に固定化された１−（４−フルオロフェニル）ピペラジンの量を算出した結果、固定化量は３５０μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００３８】
実施例７  １−（４−フルオロフェニル）ピペラジン固定化ポリメタクリレートゲル（固定化ゲル３）のタンパク質結合量測定
実施例３に記載の方法と同様な方法で、固定化ゲル３のタンパク質結合量を分析した。結果、タンパク質の結合量は６ｍｇ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００３９】
実施例８  １−（４−ピリジル）ピペラジンのポリメタクリレートゲルへの固定化
（１）実施例１に記載の方法で製造した、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したポリメタクリレートゲル（２ｍＬ）に、１−（４−ピリジル）ピペラジン二塩酸塩の（１，４−ジオキサン：水＝１：１）溶液（１．２３ｍｏｌ／Ｌ，１．９ｍＬ）を加え、４５℃で一晩、１５０ｒｐｍでレシプロ振とうし、反応させた。
（２）反応終了後、（１，４−ジオキサン：水＝１：１）溶液（４ｍＬ×５）で洗浄し、さらに水（１０ｍＬ×１０）で洗浄した後、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（１０ｍＬ）を加え、２５℃で１５分間、１５０ｒｐｍでロータリー振とうした。
（３）反応液を濾過後、水（１０ｍＬ×１０）で洗浄した。
（４）０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）を加え、２５℃で１５分間、１５０ｒｐｍでロータリー振とうした。
（５）反応液を濾過後、さらに水（１０ｍＬ×１０）で洗浄することで、１−（４−ピリジル）ピペラジン固定化ポリメタクリレートゲル（固定化ゲル３９）を得た。
【００４０】
洗浄した（１，４−ジオキサン：水＝１：１）溶液（濾液）中に含まれる１−（４−ピリジル）ピペラジンの量を液体クロマトグラフィーで分析し、固定化ゲル３９に固定化された１−（４−ピリジル）ピペラジンの量を算出した。その結果、固定化量は４００μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００４１】
実施例９  １−（４−ピリジル）ピペラジン固定化ポリメタクリレートゲル（固定化ゲル３９）のタンパク質結合量測定
実施例３に記載の方法と同様な方法で、固定化ゲル３９のタンパク質結合量を測定した。結果、タンパク質の結合量は２４ｍｇ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００４２】
実施例１０  １−（４−アミノフェニル）ピペラジンのポリメタクリレートゲルへの固定化
（１）実施例１に記載の方法で製造した、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したポリメタクリレートゲル（２ｍＬ）に、１−（４−アミノフェニル）ピペラジンの（１，４−ジオキサン：水＝１：１）溶液（１．２３ｍｏｌ／Ｌ，１．９ｍＬ）を加え、４５℃で一晩、１５０ｒｐｍでレシプロ振とうし、反応させた。
（２）反応終了後、得られたゲルを（１，４−ジオキサン：水＝１：１）溶液（４ｍＬ×５）で洗浄し、さらに水（１０ｍＬ×１０）で洗浄後、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（１０ｍＬ）を加え、２５℃で１５分間、１５０ｒｐｍでロータリー振とうした。
（３）反応液を濾過後、水（１０ｍＬ×１０）で洗浄した。
（４）０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）を加え、２５℃で１５分間、１５０ｒｐｍでロータリー振とうした。
（５）反応液を濾過後、さらに水（１０ｍＬ×１０）で洗浄することによって、１−（４−アミノフェニル）ピペラジン固定化ポリメタクリレートゲル（固定化ゲル３６）を得た。
【００４３】
洗浄した（１，４−ジオキサン：水＝１：１）溶液（濾液）中の１−（４−アミノフェニル）ピペラジンの量を液体クロマトグラフィーで分析し、固定化された１−（４−アミノフェニル）ピペラジンの量を算出した。その結果、固定化量は４２０μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００４４】
実施例１１  １−（４−アミノフェニル）ピペラジン固定化ポリメタクリレートゲル（固定化ゲル３６）のタンパク質結合量測定
実施例３に記載の方法と同様な方法で、固定化ゲル３６のタンパク質結合量を測定した。結果、タンパク質の結合量は２８ｍｇ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００４５】
実施例１２  アガロースゲルのイミダゾリルカルボニル化
不溶性担体としてアガロースゲルであるＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（商品名、ＧＥヘルスケア製）を用い、この水酸基を実施例１に記載の方法と同様な方法でイミダゾリルカルボニル化した。
【００４６】
実施例１３  １−（２−ピリジル）ピペラジンのアガロースゲルへの固定化
実施例１２に記載の方法で製造した、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したアガロースゲル（２ｍＬ）への１−（２−ピリジル）ピペラジンの固定化を、実施例８の記載と同様な方法で行ない、１−（２−ピリジル）ピペラジン固定化アガロースゲル（固定化ゲル７１）を得た。実施例８に記載の方法と同様に分析した結果、１−（２−ピリジル）ピペラジンの固定化量は１７０μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００４７】
実施例１４  １−（２−ピリジル）ピペラジン固定化アガロースゲル（固定化ゲル７１）のタンパク質結合量測定
実施例３に記載の方法と同様な方法で、固定化ゲル７１のタンパク質結合量を測定した。結果、タンパク質の結合量は５０ｍｇ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００４８】
実施例１５  セルロースゲルのイミダゾリルカルボニル化
不溶性担体としてセルロースゲルであるセルファインＧＣＬ−２０００（商品名、ＪＮＣ製）を用い、この水酸基を実施例１に記載の方法と同様な方法でイミダゾリルカルボニル化した。
【００４９】
実施例１６  １−（２−ピリジル）ピペラジンのセルロースゲルへの固定化
実施例１５に記載の方法で調製した、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したセルロースゲル（２ｍＬ）への１−（２−ピリジル）ピペラジンの固定化を、実施例８の記載と同様な方法で行ない、１−（２−ピリジル）ピペラジン固定化セルロースゲル（固定化ゲル７２）を得た。実施例８に記載の方法と同様にして分析した結果、１−（２−ピリジル）ピペラジンの固定化量は１７０μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００５０】
実施例１７  １−（２−ピリジル）ピペラジン固定化セルロースゲル（固定化ゲル７２）のタンパク質結合量測定
実施例３に記載の方法と同様な方法で、固定化ゲル７２のタンパク質結合量を測定した結果、タンパク質の結合量は３２ｍｇ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００５１】
実施例１８  １−（４−アミノフェニル）ピペラジン固定化トヨパールゲル（固定化ゲル３６）を用いたタンパク質の分離・精製
（１）実施例１０に記載の方法で調製した固定化ゲル３６を、オープンカラム（バイオスピンエンプティーカラム、商品名、ＢｉｏＲａｄ製）に充填し、１００×ｇで１分間遠心分離し、沈降ゲル（０．５ｍＬ）を得た。
（２）ヒト免疫グロブリン溶液（１５０ｍｇ／ｍＬ  ヒト血漿由来免疫グロブリンＧ製剤、化血研製）１３３μＬを、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）（緩衝液Ａ）５．２７ｍＬで希釈し、さらに、１０倍濃縮のＨＣＰ溶液（ＨＣＰとはチャイニーズハムスター卵巣細胞を培養した後に、この培養液から細胞を取り除いたものである）６００μＬを加え、試料溶液を調製した。
（３）（２）の試料溶液１．５ｍＬ（免疫グロブリン５ｍｇを含む）を、（１）で調製した沈降ゲルに添加し、マイクロチューブローテーター（アズワン製ＭＴＲ１０３）を用いてインキュベーター中で、２５℃で一晩回転した後、４０×ｇで２分間遠心濾過することにより素通り画分を得た。
（４）カラムに緩衝液Ａ（１．５ｍＬ）を加え、４０×ｇで２分間遠心濾過する洗浄操作を計４回繰り返し、洗浄画分１から４を得た。
（５）洗浄後のカラムに１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）１．５ｍＬを加え、４０×ｇで２分間遠心濾過するタンパク質回収する操作を計４回繰り返し、回収画分１から４を得た。
（６）得られた素通り画分、洗浄画分および回収画分の２８０ｎｍにおける吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し、各画分に含まれるタンパク質の量を分析した。
【００５２】
結果、素通り画分と回収画分１以外の画分のみタンパク質を含んでいた。そこで、タンパク質を含む画分である、素通り画分および回収画分１について、それぞれの画分１０μＬを高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー製  ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷＸＬ（商品名）（内径７．８ｍｍ×長さ３０ｃｍ）、溶離液：０．１Ｍ  Ｎａ２ＳＯ４を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ  ２８０ｎｍ）にて分析した。結果を図１に示す。図１（Ａ）は素通り画分の分析結果（クロマトグラム）であり、図１（Ｂ）は回収画分１の分析結果（クロマトグラム）であり、図１（Ｃ）はＨＣＰの分析結果（クロマトグラム）である。図１（Ａ）ではＨＣＰ（図１（Ｃ））に由来するピークのみ確認され、免疫グロブリンに由来するピークが確認されなかったことから、素通り画分には免疫グロブリンがほとんど含まれていないことがわかる。一方、図１（Ｂ）では免疫グロブリンに由来するピーク１（保持時間１６．４分）が確認され、ＨＣＰ（図１（Ｃ））に由来するピークが確認されなかったことから、回収画分１に含まれるタンパク質の主成分は免疫グロブリンであり、ＨＣＰをほとんど含んでいないことがわかる。なお、図１（Ｂ）のピーク２（保持時間２３．２分）は溶出に用いた１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）の成分に由来したピークである。
【００５３】
図１より、本発明のタンパク質分離・精製用吸着剤の一態様である、固定化ゲル３６が、免疫グロブリンを特異的に分離・精製できることがわかる。
【００５４】
参考例１
【００５５】
【化３】
0005749130.tif 000004
ステンレス製オートクレーブに、１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン（２．３ｇ，１１．１ｍｍｏｌ）、エタノール（２０ｍＬ）および１０％パラジウムカーボン（７０ｍｇ）を加え、４気圧の水素ガスを封入し８０℃で６時間反応させた。反応終了後、触媒をろ過によって除去し、溶媒を減圧留去することによって、黒色固体の４−アミノフェニルピペラジン（１．８ｇ，９１．５％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：δ  ２．９８−３．０４（ｍ，８Ｈ），３．３７−３．４２（ｂｒｓ，２Ｈ），６．６４−６．６８（ｍ，２Ｈ），６．７９−６．８３（ｍ，２Ｈ）。ＮＨのプロトンは帰属できなかった。
【００５６】
参考例２
【００５７】
【化４】
0005749130.tif 000005
１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペラジン（２．００ｇ，１０．７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３０ｍＬ）溶液に、２−クロロ−４−ニトロピリジン（１．７０ｇ，１０．７ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（１．４８ｇ，１０．７ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で６時間反応させた。反応終了後、反応混合物に水（９０ｍＬ）を加え酢酸エチル（６０ｍＬ）で抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。得られた混合物を自動設定中圧カラムクロマトグラフィーシステム（山善製）で精製することで、黄色固体の１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−（４−ニトロピリジン−２−イル）ピペラジン（５４８ｍｇ，１６．６％）と淡黄色固体の１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−（４−ヒドロキシピリジン−２−イル）ピペラジン（１５３ｍｇ，５．１％）を得た。
１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−（４−ニトロピリジン−２−イル）ピペラジン；１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：δ  １．４９（ｓ，９Ｈ），３．５６−３．５８（ｍ，４Ｈ），３．６４−３．６７（ｍ，４Ｈ），７．２７（ｄｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ  ａｎｄ  ５．４Ｈｚ，１Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），８．３８（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ）。
１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−（４−ヒドロキシピリジン−２−イル）ピペラジン；１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：δ１．４８（ｓ，９Ｈ），３．３４（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，４Ｈ），３．５７（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，４Ｈ），６．５７（ｄｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ  ａｎｄ  ６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．６５（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ）。水酸基のプロトンは帰属できなかった。
【００５８】
参考例３
【００５９】
【化５】
0005749130.tif 000006
１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−（４−ニトロピリジン−２−イル）ピペラジン（２００ｍｇ，０．６５ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１０ｍＬ）溶液に、トリフルオロ酢酸（０．２３ｍＬ，３．２４ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。反応終了後、反応混合物に飽和重曹水（４０ｍＬ）を加え酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去し、橙色固体の１−（４−ニトロピリジン−２−イル）ピペラジン（５２ｍｇ，３８．６％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：δ  ３．０８（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，４Ｈ），３．７２（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，４Ｈ），４．４９（ｂｒｓ，１Ｈ），７．２８（ｄｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ  ａｎｄ  ５．５Ｈｚ，１Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），８．３８（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ）。
【００６０】
参考例４
【００６１】
【化６】
0005749130.tif 000007
１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−（４−ヒドロキシピリジン−２−イル）ピペラジン（３１３ｍｇ，１．１２ｍｍｏｌ）のエタノール（１０ｍＬ）溶液に３６％塩酸（１ｍＬ，１１ｍｍｏｌ）を加え、１時間加熱還流した。反応終了後、溶媒を減圧留去後、トルエン（２０ｍＬ）を加え共沸し、水分を除去した。得られた固体をエーテルで洗浄することによって、黒色固体の１−（４−ヒドロキシピリジン−２−イル）ピペラジン塩酸塩（２７０ｍｇ，９６．０％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：δ  ３．８１（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，４Ｈ），３．８８−３．９７（ｍ，４Ｈ），７．００（ｄｄ，Ｊ＝２．４  ａｎｄ  ６．６Ｈｚ，１Ｈ），  ７．２０（ｄ，Ｊ＝２，４Ｈｚ，１Ｈ），８．１３（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），９．７２（ｂｒｓ，２Ｈ）。水酸基のプロトンは帰属できなかった。
【００６２】
参考例５
【００６３】
【化７】
0005749130.tif 000008
ステンレス製オートクレーブにトルエン（１０ｍＬ）、１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−（４−ニトロピリジン−２−イル）ピペラジン（２００ｍｇ，０．６５ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Ａ（２ｇ）、１０％パラジウムカーボン（５０ｍｇ）を順次加え、４気圧の水素ガスを封入し１１０℃で６時間反応させた。反応終了後、触媒をろ過によって除去し、溶媒を減圧留去することによって、褐色固体の４−（４−アミノピリジン−２−イル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペラジン（４７８ｍｇ，８１．４％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：δ  １．４８（ｓ，９Ｈ），３．４４−３．４６（ｍ，４Ｈ），３．５１−３．５３（ｍ，４Ｈ），３．９９（ｂｒｓ，２Ｈ），５．８６（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），６．０２（ｄｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ  ａｎｄ  ５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ）。
【００６４】
参考例６
【００６５】
【化８】
0005749130.tif 000009
４−（４−アミノピリジン−２−イル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペラジン（４７０ｍｇ，１．６９ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１０ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（０．６３ｍＬ，８．４５ｍｍｏｌ）を加え、１時間加熱還流させた。反応終了後、反応混合物に飽和重曹水（５０ｍＬ）を加え酢酸エチル（４０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去し、赤色液体の１−（４−アミノピリジン−２−イル）ピペラジン（８０ｍｇ，２６．６％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：δ  ３．０５（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，４Ｈ），３．５３（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，４Ｈ），４．２８（ｂｒｓ，２Ｈ），５．８８−５．８９（ｍ，１Ｈ），６．０４−６．０８（ｍ，１Ｈ），７．８５−７．８７（ｍ，１Ｈ）。ＮＨのプロトンは帰属できなかった。
【００６６】
実施例および参考例に記載の方法に基づき製造可能な、ピペラジンおよび１，４−ジアゼパン誘導体と、該誘導体を固定化した不溶性担体（固定化ゲル）、ならびに該固定化ゲルのピペラジンおよび１，４−ジアゼパン誘導体固定化量と、該固定化ゲルによるタンパク質（ヒト免疫グロブリン）結合量をまとめた表を表１から６に示す。
【００６７】
【化９】
0005749130.tif 000010
【００６８】
【表１】
0005749130.tif 000011
【００６９】
【表２】
0005749130.tif 000012
【００７０】
【表３】
0005749130.tif 000013
【００７１】
【表４】
0005749130.tif 000014
【００７２】
【表５】
0005749130.tif 000015
【００７３】
【表６】
0005749130.tif 000016
【図１】
0005749130.tif 000019