(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液病治療用の薬剤の製造における、分離した抗体又は該抗体の機能的な断片の使用であって、前記血液病が多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病又は急性リンパ性白血病であり、前記抗体がＣＤ３８に特異的であり、および、前記分離した抗体又は該抗体の機能的な断片が、配列番号２１で表されるＨ−ＣＤＲ１部位、Ｈ−ＣＤＲ２部位、及びＨ−ＣＤＲ３部位と、配列番号５１で表されるＬ−ＣＤＲ１部位、Ｌ−ＣＤＲ２部位、及びＬ−ＣＤＲ３とを含むことを特徴とする使用。
【請求項２】
請求項１に記載の前記使用において、前記分離した抗体又は該抗体の機能的な断片が、配列番号２１を含む可変重鎖部位と配列番号５１を含む可変軽鎖部位とを含むことを特徴とする使用。
【請求項３】
請求項１または２に記載の前記使用において、前記血液病が多発性骨髄腫であることを特徴とする使用。
【請求項４】
ＣＤ３８を発現する腫瘍細胞の特異的死滅を誘発する薬剤の製造における、ＣＤ３８に特異的な、分離した抗体又は該抗体の機能的な断片の使用であって、前記腫瘍細胞が多発性骨髄腫細胞、慢性リンパ性白血病細胞、慢性骨髄性白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞又は急性リンパ性白血病細胞であり、前記抗体がＣＤ３８に特異的であり、および、前記分離した抗体又は該抗体の機能的な断片が、配列番号２１で表されるＨ−ＣＤＲ１部位、Ｈ−ＣＤＲ２部位、及びＨ−ＣＤＲ３部位と、配列番号５１で表されるＬ−ＣＤＲ１部位、Ｌ−ＣＤＲ２部位、及びＬ−ＣＤＲ３とを含むことを特徴とする使用。
【請求項５】
請求項４に記載の前記使用において、前記分離した抗体又は該抗体の機能的な断片が、配列番号２１を含む可変重鎖部位と配列番号５１を含む可変軽鎖部位とを含むことを特徴とする使用。
【請求項６】
請求項１，２，４または５の何れか１項に記載の使用において、前記抗体がＩｇＧ抗体であることを特徴とする使用。
【請求項７】
請求項１，２，４または５の何れか１項に記載の使用において、前記抗体がＩｇＧ１抗体であることを特徴とする使用。
【請求項８】
請求項１または２に記載の使用において、前記血液病が慢性リンパ性白血病であることを特徴とする使用。
【請求項９】
請求項１または２に記載の使用において、前記血液病が慢性骨髄性白血病であることを特徴とする使用。
【請求項１０】
請求項１または２に記載の使用において、前記血液病が急性骨髄性白血病であることを特徴とする使用。
【請求項１１】
請求項１または２に記載の使用において、前記血液病が急性リンパ性白血病であることを特徴とする使用。
【請求項１２】
請求項４または５に記載の使用において、前記腫瘍細胞が多発性骨髄腫細胞であることを特徴とする使用。
【請求項１３】
請求項４または５に記載の使用において、前記腫瘍細胞が慢性リンパ性白血病細胞であることを特徴とする使用。
【請求項１４】
請求項４または５に記載の使用において、前記腫瘍細胞が慢性骨髄性白血病細胞であることを特徴とする使用。
【請求項１５】
請求項４または５に記載の使用において、前記腫瘍細胞が急性骨髄性白血病細胞であることを特徴とする使用。
【請求項１６】
請求項４または５に記載の使用において、前記腫瘍細胞が急性リンパ性白血病細胞であることを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の概要
本発明は、ＣＤ３８に特異的である分離した抗原結合部位であって、（ｉ）配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５又は１０６に示されるＨ−ＣＤＲ３部位、又は（ｉｉ）配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５又は１０６に示されるＨ−ＣＤＲ３部位と少なくとも６０パーセント同一性があるＨ−ＣＤＲ３部位を、具える抗原結合部位に関する。
【０００２】
本発明は更に、ＣＤ３８に特異的である分離した抗体又はその機能的フラグメントであって、（ｉ）配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５又は１０６に示される可変重鎖、又は（ｉｉ）配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５又は１０６に示される可変重鎖と少なくとも６０パーセント同一性がある可変重鎖を、具える抗体又はその機能的なフラグメントに関する。
【０００３】
更に本発明は、ＣＤ３８に特異的である分離した抗原結合部位であって、（ｉ）配列番号４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、１０９又は１１０に示されるＬ−ＣＤＲ３部位、又は（ｉｉ）配列番号４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、１０９又は１１０に示されるＬ−ＣＤＲ３部位と少なくとも６０パーセント同一性があるＬ−ＣＤＲ３部位を、具える抗原結合部位に関する。
【０００４】
また、本発明は、ＣＤ３８に特異的である分離した抗体又はその機能的フラグメントであって、（ｉ）配列番号４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、１０９又は１１０に示される可変軽鎖、又は（ｉｉ）配列番号４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、１０９又は１１０に示される可変軽鎖と少なくとも６０パーセント同一性がある可変軽鎖を、具える前記抗体又はそれについての機能的フラグメントに関する。
【０００５】
本発明は更に、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０又は９１を具える核酸配列、又は（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０又は９１の相補的な鎖と高緊縮条件下でハイブリッド形成する核酸配列によりコード化した、分離した抗原結合部位の可変軽鎖であって、前記抗体結合部位がＣＤ３８に特異的である可変重鎖に関する。
【０００６】
本発明は更に、（ｉ）配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、１０７又は１０８を具える核酸配列、又は（ｉｉ）配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、１０７又は１０８の相補的鎖と高緊縮条件下でハイブリッド形成する核酸配列によりコード化した、分離した抗原結合部位の可変軽鎖であって、前記抗体又はその機能的なフラグメントがＣＤ３８に特異的である可変軽鎖に関する。
【０００７】
更に本発明は、ＣＤ３８に特異的であるヒトの抗体又はその機能的フラグメントの抗原結合部位をコード化する分離した核酸配列に関する。
【０００８】
更に本発明は、分離した抗体結合部位の可変重鎖をコード化する核酸配列であって、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０及び９１からなる群から選択される配列、又は（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０又は９１の相補的鎖と高緊縮条件下でハイブリッド形成する核酸配列を具え、前記抗原結合部位がＣＤ３８に特異的である、核酸配列に関する。
【０００９】
本発明はまた、分離した抗原結合部位の可変軽鎖をコード化する核酸配列であって、（ｉ）配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、１０７及び１０８からなる群から選択される配列、又は（ｉｉ）配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、１０７又は１０８の相補的鎖と高緊縮条件下でハイブリッド形成する核酸配列を具え、前記抗原結合部位がＣＤ３８に特異的である核酸配列に関する。
【００１０】
本発明は更にＣＤ３８を発現する腫瘍細胞の特異的死滅を誘発する方法であって、前記特異的死滅がＣＤ３８の架橋結合によって生じる方法において、十分な量の分離したヒトあるいはヒト化抗ＣＤ３８抗体又はその機能的フラグメントの存在下で、前記細胞をインキュベートするステップを具え、前記ヒト又はヒト化抗ＣＤ３８抗体は、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０又は９１に示される重鎖をコード化する核酸配列、又は（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０又は９１の相補的鎖と高緊縮条件下でハイブリッド形成する核酸配列を具え、前記抗体又はその機能的フラグメントがＣＤ３８に特異的である方法に関する。
【００１１】
更に本発明は、ＣＤ３８を発現する腫瘍細胞の特異的死滅を誘発する方法であって、前記特異的死滅がＣＤ３８の架橋結合によって生じる方法において、十分な量の分離したヒトあるいはヒト化抗ＣＤ３８抗体又はその機能的フラグメントの存在下で、前記細胞をインキュベートするステップを具え、前記ヒト又はヒト化抗ＣＤ３８抗体は、（ｉ）配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、１０７又は１０８に示される軽鎖をコード化する核酸配列、又は（ｉｉ）配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、１０７又は１０８の相補的な鎖と高緊縮条件下でハイブリッド形成する核酸配列を具え、前記抗体又はその機能的フラグメントがＣＤ３８に特異的である方法に関する。
【００１２】
また、本発明は、ＣＤ３８を発現する腫瘍細胞の特異的死滅を誘発する方法であって、前記特異的死滅がＣＤ３８の架橋結合によって生じる方法において、十分な量の分離したヒトあるいはヒト化抗ＣＤ３８抗体又はその機能的フラグメントの存在下で、前記細胞をインキュベートするステップを具え、前記ヒト又はヒト化抗ＣＤ３８抗体又はその機能的フラグメントが、（ｉ）配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５又は１０６に示される重鎖アミノ酸配列、又は（ｉｉ）配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５又は１０６に示される可変重鎖と少なくとも６０パーセント同一性がある可変重鎖を具える方法に関する。
【００１３】
また、本発明は、ＣＤ３８を発現する腫瘍細胞の特異的死滅を誘発する方法であって、前記特異的死滅がＣＤ３８の架橋結合によって生じる方法において、十分な量の分離したヒトあるいはヒト化抗ＣＤ３８抗体又はその機能的フラグメントの存在下で、前記細胞をインキュベートするステップを具え、前記ヒト又はヒト化抗ＣＤ３８抗体は、（ｉ）配列番号４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、１０９又は１１０に示される軽鎖アミノ酸配列、又は（ｉｉ）配列番号４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、１０９又は１１０に示される可変軽鎖と少なくとも６０パーセント同一性がある可変軽鎖を具える方法に関する。
【００１４】
更に本発明は、ＣＤ３８架橋結合により、ＣＤ３８を発現する腫瘍細胞の特異的死滅を検出する方法において：
（ｉ）有効量のヒト又はヒト化した抗ＣＤ３８抗体あるいはその機能的フラグメントを、その必要に応じて対象に投与するステップと、
（ｉｉ）前記ヒト又はヒト化した抗ＣＤ３８抗体あるいはその機能的フラグメントの前記特異的死滅活性を検出するステップと、
を具える方法に関する。
【００１５】
また本発明は、ミニブタ起源の組織又は細胞内のＣＤ３８の存在を検出する方法において：
（ｉ）ヒト又はヒト化した抗ＣＤ３８抗体あるいはその機能的フラグメントを、前記ＣＤ３８と接触させるステップと；
（ｉｉ）前記ヒト又はヒト化した抗ＣＤ３８抗体あるいはその機能的フラグメントの前記ＣＤ３８ミニブタ細胞への特異的結合を検出するステップであって、前記抗体又はその機能的フラグメントが、ヒト起源のＣＤ３８へ特異的に結合することもできるステップと；
を具える方法に関する。
【００１６】
更に本発明は、ＣＤ３８発現赤血球中のＣＤ３８を検出する方法において：
（ｉ）ヒト又はヒト化した抗ＣＤ３８抗体あるいはその機能的フラグメントを、前記ＣＤ３８発現赤血球と接触させるステップと；
（ｉｉ）前記ヒトの、ヒト化した抗ＣＤ３８抗体あるいはその機能的フラグメントの前記ＣＤ３８発現赤血球への特異的結合を検出するステップにおいて、前記抗体又はその機能的フラグメントが、ヒト赤血球以外の細胞又は組織のヒトＣＤ３８へ特異的に結合することもできるステップと；
を具える方法に関する。
【００１７】
本発明は、本発明によって分離した抗体又はその機能的フラグメントであって、（ｉ）配列番号２１又は２２に示されるＨ−ＣＤＲ３部位、あるいは（ｉｉ）それに対して少なくとも６０パーセントの同一性があるＨ−ＣＤＲ３部位を具え、ヒトＣＤ３８及びマーモセットＣＤ３８に特異的である前記抗体又はその機能的フラグメントに関する。
【００１８】
本発明の詳細な説明
本発明は、新しい抗体と、ＣＤ３８に特異的な又はＣＤ３８に対して高親和性を有する抗体を用いた新しい方法の発見に基づいて、実験対象に対し治療的な利点を与えることができる。ヒト又はヒト化抗体はたくさんのコンテキストで用いることができ、ここにも十分に述べられている。本発明において用いるのに適した抗体は、米国仮特許出願第６０／６１４，４７１号において開示されており、この結果は引用として参照されている。
【００１９】
「ヒト」抗体又は機能的ヒト化抗体フラグメントは、ここで、キメラではなく（例えば「ヒト化」ではなく）、非ヒト種の（全体、又は部分のいずれかにおいて）由来ではないものとして定義する。ヒト抗体あるいは機能的抗体フラグメントはヒト由来にすることができ、合成ヒト抗体にすることができる。「合成ヒト抗体」は、全体又は一部において、既知のヒト抗体配列分析に基づいた合成配列のインシリコに由来する配列を有する抗体として定義される。ヒト抗体配列あるいはそのフラグメントのインシリコ設計は、例えば、ヒト抗体データベース又は抗体フラグメント配列を分析し、そこから得られるデータを利用するポリペプチド配列を考案することによって実行できる。ヒト担体又は機能的抗体フラグメントの別の例は、ヒト起源の抗体配列ライブラリ（すなわち、ヒトの天然原料から取得された抗体に基づくそういったライブラリ）から分離した核酸によってコード化されたものである。
【００２０】
「ヒト化抗体」あるいは機能的ヒト化抗体フラグメントは、ここでは（ｉ）非ヒトの原料（例えば、異種の免疫系を有する遺伝子導入マウス）由来であり、抗体がヒト生殖細胞の配列に基づいているもの、又は（ｉｉ）キメラであるものにおいて、可変ドメインが非ヒト起源由来であり、定常ドメインがヒト起源由来であるもの、又は（ｉｉｉ）ＣＤＲ移植されたものにおいて、１又はそれ以上の可変ドメインのフレームワークがヒト起源であり、定常ドメインが（もしあれば）ヒト起源である一方で、可変ドメインのＣＤＲが非ヒト起源であるものとして定義されている。
【００２１】
ここで用いられるように、結合特異性が絶対的ではなく相対的な特性であるので、抗体が、抗原（ここではＣＤ３８）と「特異的に結合」し、抗原「に対して／にとって特異的」であり、あるいは、抗原を「特異的に認識」するのは、こういった抗体が、こういった抗原と１又はそれ以上の参照抗原とを識別することができる場合である。最も一般的な形では（及び、定義された参照なく述べられている場合）、「特異的な結合」は、例えば次の方法のうちの１つによって決定されるような、対象の抗原と無関係の抗原とを識別する抗体の能力である。このような方法は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡテスト、ＲＩＡテスト、ＥＣＬテスト、ＩＲＭＡテスト、ＦＡＣＳ、ＩＨＣ及びペプチドスキャンを具えるが限定はされない。例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを実行できる。例えば、スコアリングは標準的な発色（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼを有する第２の抗体、及び過酸化水素を有するテトラメチルベンジジン）によって実行することができる。あるウェル内の反応は、光学密度で、例えば４５０ｎｍとスコア化される。典型的なバックグラウンド（＝負の反応）は０．１  ＯＤにすることができ、典型的な正の反応は１  ＯＤにすることができる。このことは正／負の違いを１０倍以上にすることができることを意味している。典型的に結合特異性の決定は、単一の参照抗原ではなく、約３乃至５の粉乳、ＢＳＡ、トランスフェリン等のような無関係の抗原のセットによって行われる。抗体が、２又はそれ以上の細胞／組織、及び／又は２又はそれ以上の種の抗原「に対して特異的」又は「にとって特異的」であることが可能であるのは、例えば、抗体がこのような細胞／組織及び種の各々に対する結合判断基準に合致する場合である。よって、抗体は、様々な細胞型及び／又は組織、例えば、赤血球、末梢血から分離したリンパ球、脾臓、リンパ節上のターゲット抗原ＣＤ３８に特異的に結合することができる。更に抗体はある種のＣＤ３８と別種のＣＤ３８に特異的であることができる。
【００２２】
「特異的な結合」は、ターゲット抗原と１又はそれ以上の密接に関連する抗原とを識別する抗体の能力にも関連し、例えばＣＤ３８とＣＤ１５７の間のような基準点として使用する。更に「特異的な結合」は、ターゲット抗原の異なる部分、例えばＣＤ３８のＮ末端又はＣ末端部位内のエピトープのような、ＣＤ３８の異なるドメイン及び部位、又は１又はそれ以上の鍵アミノ酸残基、又はＣＤ３８のアミノ酸残基の進展を識別する抗体の能力に関連することもできる。
【００２３】
また、ここで用いられるように、ここでの「イムノグロブリン」（Ｉｇ）はクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ又はＩｇＤ（又はそれらのサブクラス）に属するタンパク質と定義され、全ての公知の抗体及びその機能的フラグメントを含有する。ここでの抗体／イムノグロブリンの「機能的フラグメント」は、抗原結合部位を保持する抗体／イムノグロブリン（例えば、ＩｇＧの変異部位）のフラグメントと定義される。抗体の「抗原結合部位」は、一般的には１又はそれ以上の抗体の高頻度可変部位、すなわち、ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、及び／又はＣＤＲ−３部位において見られるが、可変「フレームワーク」部位が、例えばＣＤＲ用の骨格を提供すること等により、抗原結合の重要な役割を果たすこともできる。好ましくは、「抗原結合部位」は少なくとも可変軽（ＶＬ）鎖について４乃至１０３及び、可変重（ＶＨ）鎖について５乃至１０９、より好ましくは、ＶＬについて３乃至１０７及びＶＨについて４乃至１１１のアミノ酸残基を具え、完全なＶＬ鎖及びＶＨ鎖（ＶＬについて１乃至１０９及びＶＨについて１乃至１１３のアミノ酸配置；ＷＯ９７／０８３２０による計数）が特に好ましい。本発明における使用に好ましいイムノグロブリンのクラスは、ＩｇＧである。本発明の「機能的フラグメント」は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖのドメインを含有している。Ｆ（ａｂ’）２あるいはＦａｂを操作し、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインの間に生じる分子内ジスルフィド相互作用を最小化又は完全に除去することができる。
【００２４】
本発明と関連して用いられる用語である「親結合剤」は、最適化プロセスを受けたことのない、いずれかの結合剤を意味する。最適化プロセスは本明細書中の他の場所で述べる。
【００２５】
本発明と関連して用いられる用語である「結合剤」は、「イムノグロブリン」又は「抗体」という用語と同義の方法で用いることができる。
【００２６】
本発明において用いる抗体は、インシリコで設計され、合成的に生成された核酸によりコード化されてきたアミノ酸配列に基づいた組換え型抗体ライブラリ由来にすることができる。抗体配列のインシリコ設計は、例えばヒト配列のデータベースを分析すること、及びそこから取得されるデータを利用するポリペプチド配列を考案することにより実行される。インシスコ生成の配列を設計し、取得する方法は、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）２９６：５７；Ｋｒｅｂｓら．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００１）２５４：６７；及びＫｎａｐｐｉｋら出願の米国特許第６，３００，０６４号に述べられており、これら全体を引用によりここに参照する。
【００２７】
本発明において用いる抗体
本文書を通して、参照は本発明において用いる次の代表的な抗体に対して生成される：「抗体番号」又は「ＬＡＣＳ」又は「ＭＯＲ」３０７６又は０３０７６、３０７８又は０３０７８、３０８１又は０３０８１、３０８５又は０３０８５、３０８６又は０３０８６、３０８７又は０３０８７、３０８８又は０３０８８、３０８９又は０３０８９、３１０１又は０３１０１、３１０２又は０３１０２、３１２７又は０３１２７、３１２８又は０３１２８、３１２９又は０３１２９、３１３０又は０３１３０、３１３１又は０３１３１、６１８３又は０６１８３、６１８４又は０６１８４、６１８５又は０６１８５、６１８６又は０６１８６、６１８７又は０６１８７、６１８８又は０６１８８、６１８９又は０６１８９、６１９０又は０６１９０、６１９２又は０６１９２、６１９５又は０６１９５、６１９７又は０６１９７、６２００又は０６２００、６２０１又は０６２０１、６２０４又は０６２０４、６２１４又は０６２１４、６２７８又は０６２７８、６２７９又は０６２７９。ＬＡＣ３０７６は、配列番号１（ＤＮＡ）／配列番号１６（タンパク質）に対応する可変重領域（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｒｅｇｉｏｎ）と配列番号３１（ＤＮＡ）／配列番号４６（タンパク質）に対応する可変軽領域（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｒｅｇｉｏｎ）を有する抗体を表す。ＬＡＣ３０７８は、配列番号２（ＤＮＡ）／配列番号１７（タンパク質）に対応する可変重領域と配列番号３２（ＤＮＡ）／配列番号４７（タンパク質）に対応する可変軽領域を有する抗体を表す。ＬＡＣ３０８１は、配列番号３（ＤＮＡ）／配列番号１８（タンパク質）に対応する可変重領域と配列番号３３（ＤＮＡ）／配列番号４８（タンパク質）に対応する可変軽領域を有する抗体を表す。ＬＡＣ３０８５は、配列番号４（ＤＮＡ）／配列番号１９（タンパク質）に対応する可変重領域と配列番号３４（ＤＮＡ）／配列番号４９（タンパク質）に対応する可変軽領域を有する抗体を表す。ＬＡＣ３０８６は、配列番号５（ＤＮＡ）／配列番号２０（タンパク質）に対応する可変重領域と配列番号３５（ＤＮＡ）／配列番号５０（タンパク質）に対応する可変軽領域を有する抗体を表す。ＬＡＣ３０８７は、配列番号６（ＤＮＡ）／配列番号２１（タンパク質）に対応する可変重領域と配列番号３６（ＤＮＡ）／配列番号５１（タンパク質）に対応する可変軽領域を有する抗体を表す。ＬＡＣ３０８８は、配列番号７（ＤＮＡ）／配列番号２２（タンパク質）に対応する可変重領域と配列番号３７（ＤＮＡ）／配列番号５２（タンパク質）に対応する可変軽領域を有する抗体を表す。ＬＡＣ３０８９は、配列番号８（ＤＮＡ）／配列番号２３（タンパク質）に対応する可変重領域と配列番号３８（ＤＮＡ）／配列番号５３（タンパク質）に対応する可変軽領域を有する抗体を表す。ＬＡＣ３１０１は、配列番号９（ＤＮＡ）／配列番号２４（タンパク質）に対応する可変重領域と配列番号３９（ＤＮＡ）／配列番号５４（タンパク質）に対応する可変軽領域を有する抗体を表す。ＬＡＣ３１０２は、配列番号１０（ＤＮＡ）／配列番号２５（タンパク質）に対応する可変重領域と配列番号４０（ＤＮＡ）／配列番号５５（タンパク質）に対応する���変軽領域を有する抗体を表す。ＬＡＣ３１２７は、配列番号１１（ＤＮＡ）／配列番号２６（タンパク質）に対応する可変重領域と配列番号４１（ＤＮＡ）／配列番号５６（タンパク質）に対応する可変軽領域を有する抗体を表す。ＬＡＣ３１２８は、配列番号１２（ＤＮＡ）／配列番号２７（タンパク質）に対応する可変重領域と配列番号４２（ＤＮＡ）／配列番号５７（タンパク質）に対応する可変軽領域を有する抗体を表す。ＬＡＣ３１２９は、配列番号１３（ＤＮＡ）／配列番号２８（タンパク質）に対応する可変重領域と配列番号４３（ＤＮＡ）／配列番号５８（タンパク質）に対応する可変軽領域を有する抗体を表す。ＬＡＣ３１３０は、配列番号１４（ＤＮＡ）／配列番号２９（タンパク質）に対応する可変重領域と配列番号４４（ＤＮＡ）／配列番号５９（タンパク質）に対応する可変軽領域を有する抗体を表す。ＬＡＣ３１３１は、配列番号１５（ＤＮＡ）／配列番号３０（タンパク質）に対応する可変重領域と配列番号４５（ＤＮＡ）／配列番号６０（タンパク質）に対応する可変軽領域を有する抗体を表す。更に、親結合剤ＭＯＲ０３０８７及びＭＯＲ０３０８８に由来した最適化クローンは、以下のものを具える：ＭＯＲ０６１８３は、配列番号７７（ＤＮＡ）／配列番号９２（タンパク質）に対応する可変重領域を有する抗体を表す。ＭＯＲ０６１８４は、配列番号７８（ＤＮＡ）／配列番号９３（タンパク質）に対応する可変重領域を有する抗体を表す。ＭＯＲ０６１８５は、配列番号７９（ＤＮＡ）／配列番号９４（タンパク質）に対応する可変重領域を有する抗体を表す。ＭＯＲ０６１８６は、配列番号８０（ＤＮＡ）／配列番号９５（タンパク質）に対応する可変重領域を有する抗体を表す。ＭＯＲ０６１８７は、配列番号８１（ＤＮＡ）／配列番号９６（タンパク質）に対応する可変重領域を有する抗体を表す。ＭＯＲ０６１８８は、配列番号８２（ＤＮＡ）／配列番号９７（タンパク質）に対応する可変重領域を有する抗体を表す。ＭＯＲ０６１８９は、配列番号８３（ＤＮＡ）／配列番号９８（タンパク質）に対応する可変重領域を有する抗体を表す。ＭＯＲ０６１９０は、配列番号８４（ＤＮＡ）／配列番号９９（タンパク質）に対応する可変重領域を有する抗体を表す。ＭＯＲ０６１９２は、配列番号８５（ＤＮＡ）／配列番号１００（タンパク質）に対応する可変重領域を有する抗体を表す。ＭＯＲ０６１９５は、配列番号８６（ＤＮＡ）／配列番号１０１（タンパク質）に対応する可変重領域を有する抗体を表す。ＭＯＲ０６１９７は、配列番号８７（ＤＮＡ）／配列番号１０２（タンパク質）に対応する可変重領域を有する抗体を表す。ＭＯＲ０６２００は、配列番号８８（ＤＮＡ）／配列番号１０３（タンパク質）に対応する可変重領域を有する抗体を表す。ＭＯＲ０６２０１は、配列番号８９（ＤＮＡ）／配列番号１０４（タンパク質）に対応する可変重領域を有する抗体を表す。ＭＯＲ０６２０４は、配列番号９０（ＤＮＡ）／配列番号１０５（タンパク質）に対応する可変重領域を有する抗体を表す。ＭＯＲ０６２１４は、配列番号９１（ＤＮＡ）／配列番号１０６（タンパク質）に対応する可変重領域を有する抗体を表す。ＭＯＲ０６２７８は、配列番号１０７（Ｄ���Ａ）／配列番号１０９（タンパク質）に対応する可変軽領域を有する抗体を表す。ＭＯＲ０６２７９は、配列番号１０８（ＤＮＡ）／配列番号１１０（タンパク質）に対応する可変軽領域を有する抗体を表す。
【００２８】
本発明の抗体は、Ｆａｂ及び／又はＩｇＧフォーマットにおいて特性づけられており、最適化結合剤及び親結合剤の軽鎖及び重鎖の様々な組合せを具える。図１０は、本発明と関連して用いることができるいくつかの限定されない組合せを示している。
【００２９】
ある態様では、本発明はＣＤ３８の１又はそれ以上の部位に特異的に結合でき、また、１又はそれ以上の部位と高親和性を有する抗原結合部位を有する抗体を用いた方法を提供し、そのアミノ酸配列は配列番号７１に示されている。親和性測定値が少なくとも１００ｎＭ（Ｆａｂフラグメントの一価の親和性）である場合、抗体は抗原に対して「高親和性」を有すると言われる。本発明において用いる抗体又は抗原結合部位は、約６００ｎＭ未満の親和性を有するＣＤ３８に結合できることが好ましい。本発明において用いる抗体又は抗原結合部位は、好ましくは約１００ｎＭ未満、より好ましくは６０ｎＭ未満、更により好ましくは３０ｎＭ未満の親和性を有するＣＤ３８に結合できる。１０ｎＭ未満、より好ましくは３ｎＭ未満の親和性を有するＣＤ３８へ結合する抗体の使用が更に好ましい。例えば、ＣＤ３８に対する本発明で用いる抗体の親和性は、約１０．０ｎＭ又は２．４ｎＭ（Ｆａｂフラグメントの一価の親和性）にすることができる。
【００３０】
表１は、表面プラズモン共鳴(Ｂｉａｃｏｒｅ）及びＦＡＣＳスキャッチャード分析により決定されるような、代表的な抗体の親和性の概略を提供する：
【表１】
0005752667.tif 000002
ａ：Ｆａｂフォーマット；ヒトＣＤ３８ＦＣ融合ａａ４５−３００
ｂ：ＩｇＧ１フォーマット；ラージ細胞での分析
ｃ：標準偏差（ｎ＝３）
ｄ：標準偏差（ｎ＝４）
ｎ．ｄ．：検出せず
【００３１】
表１を参照して、ＬＡＣの親和性はヒトＣＤ３８−Ｆｃ融合での表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）により、及びＣＤ３８発現のヒトラージ株細胞を利用するフローサイトメトリ手順により計測された。Ｂｉａｃｏｒｅの研究は直接的に固定化抗原（ＣＤ３８−Ｆｃ融合タンパク質）上で行われた。ＬＡＣのＦａｂフォーマットは、固定化ＣＤ３８−Ｆｃ融合タンパク質上で約３０乃至５９６の間の一価の親和性範囲で阻害される。
【００３２】
ＩｇＧ１フォーマットは、細胞ベースの親和性決定に（ＦＡＣＳスキャッチャード）用いた。表１の右の列はこのフォーマットにおけるＬＡＣＳの結合強度を表示している。
【００３３】
本発明において用いる好ましい抗体の好ましい特徴は、ＣＤ３８のＮ末端部位内の領域に対する特異性である。例えば、本発明のＬＡＣはＣＤ３８のＮ末端部位へ特異的に結合することができる。
【００３４】
本発明の最適化抗体は、表２と３に示すように更に特徴づけられた。表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）及びＦＡＣＳスキャッチャード分析によって決定されるような親和力の概略が提供されている。更に、ヒト赤血球へのＦＡＣＳ結合と研究対象をＣＤ３８−Ｆｃ融合タンパク質へ結合するＥＬＩＳＡも決定される。その評価は、いくつかの最適化結合剤が、ヒト赤血球への結合減少及び親クローンと比較したときにより高いＥＬＩＳＡ信号を示すことで与えられる。更に、ＭＯＲ０３０８８の派生体は、ＦＡＣＳスキャッチャード及び親和性決定によって示されるような改善された親和性を有している。
【００３５】
【表２】
0005752667.tif 000003
【表３】
0005752667.tif 000004
【００３６】
本発明において用いる抗体が結合するエピトープの型は、線形（すなわち、アミノ酸の連続した進展）又は立体構造的（すなわち、アミノ酸の複数の伸展）である。特定の抗体のエピトープが線形か立体構造的かどうかを決定するために、当業者はＣＤ３８の異なるドメインを覆うオーバラップペプチド（例えば、１１のアミノ酸の重複を伴う１３ｍｅｒのペプチド）への抗体の結合を分析することができる。ＬＡＣＳはＣＤ３８のＮ末端部位において、不連続又は線形エピトープを認識できる。ここで提供された知識と組合せると、当該技術分野の当業者は、１又はそれ以上の分離したＣＤ３８のエピトープの使い方を知り、前記エピトープに対して特異的な抗原結合部位を有する抗体を生成できるであろう（例えば、合成したＣＤ３８のエピトープペプチド又はＣＤ３８のエピトープを発現した細胞を用いて）。
【００３７】
本発明において用いる抗体は、ヒト種及び少なくとも１のその他の非ヒト種が有する交差反応種であることが好ましい。非ヒト種は非ヒト霊長類、例えば、アカゲザル、ヒヒ及び／又はカニクイザルにすることができる。その他の非ヒト種は、ミニブタ、ウサギ、ネズミ、ラット及び／又はハムスターであってもよい。ヒトと並んで少なくとも１のその他の種と交差反応する抗体は、同一抗体を有する複数種におけるインビボ研究を行う目的で、既知の抗ＣＤ３８抗体以上に大きな可動性と利益を提供できる。例えば、ミニブタ及び／又はウサギと交差反応する抗体は、毒物学及び安全な研究用の候補にすることができる。
【００３８】
好ましくは、本発明において用いる抗体は、ＣＤ３８へ結合することができるだけではなく、ＣＤ３８発現細胞の死滅を媒介することができる。より特異的には、本発明において用いる抗体は、抗体エフェクタ機能を介してＣＤ３８陽性（例えば、悪性）細胞を枯渇させることによって、治療的効果を媒介することができる。これらの機能は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を含有している。
【００３９】
しかし、ＣＤ３８発現は、骨髄（例えば、単球、顆粒球）とリンパ系列（例えば、活性Ｂ細胞及びＴ細胞；形質細胞）内の免疫細胞上に見られるだけではなく、それぞれの前駆細胞上にも見られる。それらの細胞は、抗体媒介の悪性細胞の死滅によって影響を及ぼされないことが重要であるので、本発明の抗体は、前駆細胞に対して細胞傷害性がないことが好ましい。
【００４０】
サイクリックＡＤＰリボースシクラーゼ及びヒドロラーゼのような触媒活性に加えて、ＣＤ３８は生物学的関係性の信号伝達能力を発揮する（Ｈｏｓｈｉｎｏら，１９９７；Ａｕｓｉｅｌｌｏら，２０００）。それらの機能は、例えばレセプタ−リガンド相互作用によって、又は、アゴニストの抗ＣＤ３８抗体と架橋結合し、例えばカルシウム動員、リンパ球増殖及びサイトカインの放出を導くことによって、インビボで誘発することができる。好ましくは、本発明の抗体はアゴニスト抗体ではないものである。
【００４１】
ペプチド変異体
本発明において用いる抗体は、ここに提供される特異的なペプチド配列に限定されない。むしろ、本発明は、これらのポリペプチド変異体の使用も具体化している。ＣＤ３８＋標的細胞の死滅を媒介する能力を有する変異体が本発明の範囲の中に含まれてるととき、本開示と従来の利用可能技術及び引用を参照して、当業者はここに開示された抗体の機能的な変異体を準備し、試験し、利用することができる一方、ＣＤ３８＋標的細胞の死滅を媒介する能力を有する変異体が本発明の範囲の中に含まれている。このコンテキストに用いられるように、「ＣＤ３８＋標的細胞の死滅を媒介する能力」は本発明において用いられる抗ＣＤ３８抗体に帰する機能的特徴を意味している。従って、ＣＤ３８＋標的細胞の死滅を媒介する能力は、例えば、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣによる、あるいは本発明において用いる抗体に抱合した毒素構造によるＣＤ３８＋標的細胞の死滅を媒介する能力を含有している。
【００４２】
例えば変異体は、ここに開示されたペプチド配列と相対する、少なくとも１の変化する相補性決定領域（ＣＤＲ）（高頻度可変性の）及び／又はフレームワーク（ＦＲ）（可変性の）ドメイン／状態を有する抗体を含むことができる。この概念をより良く示すように、抗体構造の簡潔な記載が後に続く。
【００４３】
抗体は、それぞれが１の（軽鎖）又は３の（重鎖）定常ドメインと可変部位（ＶＬ、ＶＨ）を含んでいる、２つのペプチド鎖からなり、後者は各々のケースで４つのＦＲ部位と３つの間の空いたＣＤＲで構成される。抗原結合部位は、１又はそれ以上のＣＤＲによって形成され、更にＦＲ部位はＣＤＲ用の構造フレームワーク（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）を提供し、それ故、抗原結合における重要な役割を果たす。ＣＤＲ部位又はＦＲ部位における１又はそれ以上のアミノ酸残基を変えることによって、当業者は常に突然変異した又は多様化した抗体配列を生成することができ、例えば新しい、又は改善した特性を求めて、抗原に対してスクリーニングすることができる。
【００４４】
図１４ａ（ＶＨ）及び１４ｂ（ＶＬ）は、本発明において用いるある抗体用のＣＤＲ及びＦＲ部位を描写し、既知の位置でのアミノ酸を、お互いと、及び対応するコンセンサス配列又は「主要な遺伝子」配列と比較している（米国特許第６，３００，０６４号に記載のように）。
【００４５】
当業者は、ペプチド変異体を設計することができ、その使用は、本発明の範囲内にある。変異体は、１又はそれ以上のＣＤＲ部位内にあるアミノ酸を変えることにより、構築されることが好ましく、ある変異体は１又はそれ以上の変質したフレームワーク部位も有してもよい。変質はまた、フレームワーク部位において作ることができる。例えば、ペプチドＦＲドメインは生殖系列配列と比較した残基のずれがある場所で変質させることができる。
【００４６】
更に、変異体は、ＬＡＣ中の１又はそれ以上のアミノ酸残基、好ましくは１又はそれ以上のＣＤＲ内のアミノ酸残基を多様化することによる、及び、改善した特性を有する変異体用の抗体変異体の結果としての収集物をスクリーニングすることによる最適化の出発点としてＬＡＣを用いることによって取得することができる。ＶＬのＣＤＲ−３、ＶＨのＣＤＲ−３、ＶＬのＣＤＲ−１、及び／又はＶＨのＣＤＲ−２中にある１又はそれ以上のアミノ酸残基の多様化が特に好ましい。多様化はトリヌクレオチドの突然変異誘発（ＴＲＩＭ）技術を用いたＤＮＡ分子の収集物を合成することによりすることができる（Ｖｉｒｎｅｃａｓ，Ｂ．，Ｇｅ，Ｌ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｍ，Ａ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｋ．Ｃ．，Ｗｅｌｌｎｈｏｆｅｒ，Ｇ．及びＭｏｒｏｎｅｙ  Ｓ．Ｅ．（１９９４）Ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ：ｉｄｅａｌ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍｉｘｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，５６００）。
【００４７】
保存されたアミノ酸変異体
ここに述べた抗体ペプチド配列の全体分子構造を保存するアミノ酸変異体を作ることができる。個々のアミノ酸の特性を与えられると、いくつかの合理的な置換が当業者によって認知される。アミノ酸の置換、すなわち「保存された置換」は、例えば、極性、変化、溶解度、親水性、及び／又は関与する残基の両親媒性の性質の類似性に基づいて作られる。
【００４８】
例えば、（ａ）非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンを含有し、（ｂ）極性天然アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンを含有し、（ｃ）正電荷（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リシン、及びヒスチジンを含有し、（ｄ）負電荷（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含有している。置換は一般的に群（ａ）−（ｄ）内で作ることができる。加えて、グリシン及びプロリンは、αへリックスを分裂する能力に基づき互いを置換することができる。同様に、アラニン、システイン、ロイシン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン及びリシンのような特定のアミノ酸は、αへリックス中にはより共通して見つけられる一方で、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びスレオニンはβプリーツシート中により共通して見つけられる。グリシン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、及びプロリンは、次々と見つけられる。いくつかの好ましい置換は、以下の群の間で作ることができる：（ｉ）ＳとＴ；（ｉｉ）ＰとＧ；（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、Ｌ及びＩ。既知の遺伝コードと組換え及び合成ＤＮＡ技術が与えられると、当業者の科学者たちは、保存されたアミノ酸変異体をコード化したＤＮＡを容易に構築することができる。ある特定の例においては、配列番号５、６、７、及び／又は８中のアミノ酸位置３はＱからＥへ変更することができる。
【００４９】
ここで用いられているように、２つのポリペプチドの「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸の割合で示す。「配列類似性」は、同一であるか、保存されたアミノ酸置換を表すかのいずれかのアミノ酸の割合を示す。本発明の好ましいポリペプチド配列は、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％又は８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のＣＤＲ部位における配列同一性を有している。好ましい抗体はまた、少なくとも８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％のＣＤＲ部位における配列類似性を有している。本発明の好ましいポリペプチド配列は、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％又は８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の可変部位における配列同一性を有している。好ましい抗体はまた、少なくとも８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の可変部位における配列類似性を有している。
【００５０】
本発明のＤＮＡ分子
本発明は、本発明において用いられる抗体をコード化するＤＮＡ分子の使用にも関する。これらの配列は図１ａ及び２ａに示したＤＮＡ分子を含むが、限定はされない。
【００５１】
本発明のＤＮＡ分子は、ここに開示した配列に限定されないだけではなく、それらの変異体も含んでいる。本発明内にあるＤＮＡ変異体は、ハイブリダイゼーションにおける物理的特性を参照することにより、説明することができる。当業者は、ＤＮＡを用いて、その補体、及び、ＤＮＡが二本鎖であることから、その等価物又は相同体を同定することができることを認識し、核酸ハイブリダイゼーション技術を用いている。ハイブリダイゼーションが１００％以下の相補性で生じることも認識されている。しかし、適切な条件選択を与えられれば、ハイブリダイゼーション技術を用いて、特定のプローブとの構造関連性に基づいてＤＮＡ配列を区別することができる。このような条件に関連するガイダンスとして、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＵＳＡ）と、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９５（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．，＆Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．ｅｄｓ．（１９９５）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）参照。
【００５２】
２つのポリヌクレオチド間の構造類似性は、２つの配列が互いとハイブリッド形成する条件下で「厳密性」のある機能として表現することができる。ここに用いられるように、「厳密性」という用語は、条件がハイブリダイゼーションを嫌う範囲のことである。厳密な条件は、ハイブリダイゼーションを強く嫌い、最も厳密に関連する分子のみが、このような条件の下、互いにハイブリッド形成することができる。逆に言えば、厳密でない条件は、わずかな程度の構造関連性を表示する分子のハイブリダイゼーションを好む。従って、ハイブリダイゼーションの厳密性は、２つの核酸配列の構造上の関係に直接的に対応している。以下の関係は、ハイブリダイゼーション及び関連性との相関において有用である（ここで、Ｔｍは核酸二本鎖の融解温度である）：
ａ．Ｔｍ＝６９．３＋０．４１（Ｇ＋Ｃ）％
ｂ．二本鎖ＤＮＡのＴｍは、不適正塩基対の数１％の増加ごとに１℃減少する。
ｃ．（Ｔｍ）μ２−（Ｔｍ）μ１＝１８．５ｌｏｇ１０μ２／μ１
ここでμ１とμ２は、２つの溶液中のイオン強度である。
【００５３】
ハイブリダイゼーション厳密性は多くのファクタの関数であり、全体のＤＮＡ濃度、イオン強度、温度、プローブサイズ及び水素結合を分裂させる薬剤の存在を含んでいる。ハイブリダイゼーションを促進するファクタは、高ＤＮＡ濃度、高イオン強度、低温度、より長いプローブサイズ及び水素結合を分裂させる薬剤の存在を含んでいる。ハイブリダイゼーションは一般的には、「結合」段階と「洗浄」段階の２段階で行われる。
【００５４】
第１に、結合段階においては、プローブはハイブリダイゼーションの好む条件下で、ターゲットに結合する。厳密性は通常、温度を変えることによってこの段階で制御される。高厳密度のためには、短い（＜２０ｎｔ）オリゴヌクレオチドプローブを用いていない場合は、温度は通常、６５℃と７０℃の間にある。代表的なハイブリダイゼーション溶液は、６倍濃度のＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、５倍濃度のデンハート液、及び非特異的なキャリアＤＮＡ１００μｇを具える。Ａｕｓｕｂｅｌら、ｓｅｃｔｉｏｎ２．９、ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ２７（１９９４）参照。もちろん、多くの異なる、更に機能的に等価なバッファ条件は既知である。関連性の程度がより低い場合、より低い温度が選択できる。低厳密度での結合温度は約２５℃と４０℃の間である。中厳密度では、少なくとも約４０℃乃至約６５℃未満の間である。高厳密度は少なくとも６５℃である。
【００５５】
第２に、洗浄により余分なプローブが除去される。より厳密な条件が通常適用されるのはこの段階である。それ故に、ハイブリダイゼーションを介した関連性を決定するのに最も重要なのがこの「洗浄」段階である。洗浄溶液は一般的に低濃度の塩を含んでいる。一例の中厳密度の溶液は、２倍濃度のＳＳＣと０．１％のＳＤＳを含んでいる。高厳密度での洗浄溶液は、約０．２倍濃度未満のＳＳＣの等価物（イオン強度において）を含んでおり、好ましい厳密度での溶液は約０．１倍濃度のＳＳＣを含んでいる。様々な厳密度に関連する温度は、「結合」用の上述と同じである。洗浄液はまた、一般的に洗浄中に多数回取り替えられる。例えば、典型的な高厳密度での洗浄条件は、５５℃で３０分間に２回、及び６０℃で１５分間に３回洗浄するステップを具える。
【００５６】
よって本発明は、高厳密度での結合及び洗浄条件下での、図１ａ及び２ａに示す分子をハイブリッド形成する核酸分子の使用を含んでおり、このような核酸分子はここに述べるように使用する抗体又はその機能的フラグメントをコード化する。好ましい分子（ｍＲＮＡの展望から）は、少なくとも７５％又は８０％（好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％及び最も好ましくは少なくとも９５％）の相同性又はここに述べたＤＮＡ分子のうちの１つと配列同一性を有している。
【００５７】
機能的に等価な変異体
更に、本発明の範囲内で用いる別種類のＤＮＡ変異体は、コード化した生成物を参照して説明することができる（図１ｂ及び２ｂにおいて収載したペプチドを参照）。これらの機能的に等価な遺伝子は、遺伝子コードの変質が原因の図１ｂ及び２ｂに見られる同一のペプチド配列をコード化する事実によって特徴付けられる。
【００５８】
ここに提供されるＤＮＡ分子の変異体は、いくつかの異なる方法で構築することができることは認識されている。例えば、完全な合成ＤＮＡとして構築することができる。２０乃至１５０個のヌクレオチドの範囲において、オリゴヌクレオチドを効率的に合成する方法は広く利用可能である。Ａｕｓｕｂｅｌら、ｓｅｃｔｉｏｎ２．１１、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ２１（１９９３）参照。重なるオリゴヌクレオチドは、Ｋｈｏｒａｎａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７２：２０９−２１７（１９７１）によって最初に報告された様式において、合成し構築することができる；Ａｕｓｕｂｅｌら、ｓｕｐｒａ、Ｓｅｃｔｉｏｎ８．２も参照。合成ＤＮＡは、好ましくは適切なベクタ内へのクローニングを促進するために、遺伝子の５’末端及び３’末端に設計された従来の制限酵素部位を伴い設計される。
【００５９】
示したように、変異体を生成する方法は、ここに開示したＤＮＡの１つで開始し、次いで部分特異的突然変異誘発を導くことである。Ａｕｓｕｂｅｌら、ｓｕｐｒａ、ｃｈａｐｔｅｒ８、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ３７（１９９７）参照。典型的な方法では、ターゲットＤＮＡは、単鎖ＤＮＡバクテリオファージの媒体中にクローン化される。単鎖ＤＮＡは、所望のヌクレオチド変質を含んでいるオリゴヌクレオチドで分離し、ハイブリッド形成する。相補性鎖は合成され、二本鎖ファージは宿主内に導入される。結果としての子孫のいくつかは、所望の突然変異体を含有し、ＤＮＡ配列決定を用いて確認することができる。更に、子孫ファージが所望の突然変異体である確率を増やす様々な方法が利用可能である。これらの方法は、当該技術分野の当業者には公知であり、キットはこのような突然変異体を生成するのに商業的に利用可能である。
【００６０】
組換え型ＤＮＡ構造及び発現
本発明は更に、１又はそれ以上の本発明のヌクレオチド配列を具える組換え型ＤＮＡ構造の使用に具える。組換え型構造は、プラスミド又はウイルスベクタといった、本発明において用いる抗体をコード化するＤＮＡ分子が挿入されるベクタと関連して用いられている。
【００６１】
コード化する遺伝子は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９及びＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９において述べられている技術によって、生成することができる。代替的に、ＤＮＡ配列は、例えばシンセサイザを用いて化学的に合成しても良い。例えば、全体においてここに引用によって参照されるＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（１９８４，Ｇａｉｔ，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）参照。本発明の組換え型構造を、ＲＮＡを発現することが可能な発現ベクタ及び／又はコード化ＤＮＡのタンパク質生成物と共に具えている。ベクタは更に制御配列を具え、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）へ実施可能に連結されたプロモータを含んでいる。ベクタは更に選択可能なマーカ配列を具えることができる。特異的な開始及び細菌性分泌信号を、挿入されたターゲット遺伝子コード配列の効果的な翻訳のために要求することもできる。
【００６２】
本発明は更に、ここに開示された少なくともＤＮＡのうちの１つを含む宿主細胞の使用のために提供することができる。宿主細胞は実質的には、発現ベクタが利用可能などんな細胞であってもよい。例えば、哺乳類細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような下等真核細胞等でも良いが、バクテリア細胞のような原核細胞が好ましい。組換え構造の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムの形質移入、ＤＥＡＥ、デキストラン媒介の形質移入、電気穿孔法、又はファージの形質移入によって果たすことができる。
【００６３】
細菌性発現
細菌使用に有用な発現ベクタは、機能的なプロモータを有する実施可能な読み取り段階において、適した翻訳開始及び終了信号と一緒に、所望のタンパク質をコード化する構造的なＤＮＡ配列を挿入することによって構築される。ベクタは、ベクタの維持を保証し、望ましくは、宿主内での増幅を提供するために、１又はそれ以上の表現型の選択可能マーカと、複製の起点を具える。形質転換に適した原核生物の宿主は、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌及びシュードモナス属、ストレプトマイセス、及びブドウ球菌内の様々な種を含んでいる。
【００６４】
細菌ベクタは、例えば、バクテリオファージベース、プラスミドベース又はファージミドベースにすることができる。これらのベクタは、公知のクローニングベクタｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の要素を典型的に含む商業的に利用可能なプラスミドに由来する選択可能マーカと細菌の複製開始点を含有することができる。適した宿主鎖（ｈｏｓｔ  ｓｔｒａｎｄ）の形質転換及び適切な細胞密度への宿主鎖の成長に続き、選択されたプロモータを、適切な手段によって（例えば、温度変化又は化学的誘導）抑制解除／誘導し、細胞は付加期間に培養される。細胞は一般的には遠心分離により収集され、物理的又は化学的手段によって破壊し、結果として生じた未精製抽出物は更なる精製のために保持される。
【００６５】
細菌系において、多数の発現ベクタは、発現されるタンパク質に意図された使用に依存して、有利に選択することができる。例えば、大量のこのようなタンパク質が、抗体の生成のために生成できる、又は、ペプチドライブラリをスクリーニングできる場合、例えば、容易に精製される高レベルの融合タンパク質生成物の発現を指示するベクタを所望することができる。
【００６６】
治療的手段
治療的手段は、本発明により熟考された治療に効果的な抗体の量を、治療を必要とする対象に投与することが必要である。「治療に効果的な」量は、ここでは対象の治療領域におけるＣＤ３８陽性細胞を枯渇するために十分な量の抗体量と定義され、単一投与としてか複数の投与計画か、単独か他の薬剤との組合せでかのいずれかで、有害状態の軽減に導き、更にその量は毒物学的に許容できる。対象は、ヒト又はヒトではない動物（例えば、ウサギ、ラット、ネズミ、サル及びその他の低次霊長類（ｌｏｗｅｒ−ｏｒｄｅｒ  ｐｒｉｍａｔｅ））であってもよい
【００６７】
本発明において用いる抗体は、既知の薬物と一緒に共同投与することができ、いくつかの場合には抗体そのものを修飾することができる。例えば、抗体は、更に強力に有効性を増すために、イムノトキシン又は放射性同位元素と接合することができる。
【００６８】
抗体で治療するのに特に適した障害及び状態は、多発性骨髄腫（ＭＭ）及び、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）のようなその他の血液病である。抗体を用いて、関節リウマチ（ＲＡ）又は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のような炎症性疾患を治療することもできる。
【００６９】
前述の障害のいずれかを治療するために本発明により用いる医薬組成物は、１又はそれ以上の生理学的に受容可能な担体又は賦形剤を用いて、従来の方法において処方することができる。本発明において用いる抗体は、いずれかの適した手段によって投与することができ、治療される障害の型によって変えることができる。可能な投与経路は、非経口（例えば、筋内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下など）、肺内、鼻腔内、及び局所免疫抑制治療が所望される場合、病巣内投与を含有する。更に、本発明で用いる抗体は、例えば、抗体の投薬量を減少しながら、脈点滴によって投与することもできる。好ましくは、投薬は注射、最も好ましくは静脈内又は皮下注射で与えられ、投与が手短か慢性かどうかに部分的に依存している。投与量は、臨床症状、個々の重量、その他の薬物が投与されているかどうか、のような多様なファクタに依存している。当業者は、投与の経路が、治療される障害又は状態によって変化することを認識するであろう。
【００７０】
本発明によると、新規ポリペプチドの治療に効果的な量を決定することは、特定の患者の特徴、投与の経路、及び治療される障害の性質に大いに依存している。一般的なガイダンスは例えば、ハーモナイゼーション国際会議の出版物において、及びＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，ｃｈａｐｔｅｒ２７及び２８，ｐｐ４８４−５２８，（１８ｔｈ  ｅｄ．，Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｒｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，１９９０）において、知ることができる。より特異的には、治療に効果的な量を決定することは、薬物の毒性及び効力のようなファクタに依存している。毒性は当該技術分野に公知の方法を用いて決定し、前述の引用において知ることができる。効用は、例において下記に述べる方法と組み合わせて同一のガイダンスを利用して決定することができる。
【００７１】
診断方法
ＣＤ３８は、特定の悪性疾患における血液細胞上に高く発現しており、従って、本発明において用いる抗ＣＤ３８抗体は、患者における悪性細胞の蓄積可能な部位を映すか可視化するために、使用することができる。これに関しては、抗体は、放射性同位元素の使用、親和標識（ビオチン、アビジン等のような）、蛍光標識、常磁性原子等を通じて、検出可能な程度に標識することができる。このような標識を成し遂げるための手順は、当該技術分野において公知である。画像診断における抗体の臨床応用は、Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｈ．Ｂ．，Ｕｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒ．１３：４６５−４７４（１９８６）、Ｕｎｇｅｒ，Ｅ．Ｃ．ら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｒａｄｉｏｌ．２０：６９３−７００（１９８５）、及びＫｈａｗ，Ｂ．Ａ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２０９：２９５−２９７（１９８０）によって見ることができる。診断化合物として用いる本発明の好ましい抗体又は抗原結合部位は、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、及び１０６からなる群から選択される可変重鎖配列、及び／又は配列番号４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、１０９及び１１０からなる群から選択される可変軽鎖配列を具えている。
【００７２】
検出可能な程度に標識された抗体の病巣の検出は、例えば、腫瘍の発生部位を示すこともできる。１の実施形態において、この試験は、組織又は血液のサンプルを除去し、検出可能な程度に標識された抗体の存在下でこれらのサンプルをインキュベーションすることによりなされる。好ましい実施形態においては、この技術は磁気画像、蛍光光度分析等の使用を通じて、非侵襲性の方法でなされる。このような診断テストは、病気の治療の成功をモニタリングする際に使用することができ、ＣＤ３８陽性細胞の存在及び非存在は、関連指標となる。本発明は、生体外設定における診断用にここに述べたように、抗ＣＤ３８抗体の使用も熟考している。
【００７３】
治療及び診断成分
本発明において用いる抗体は薬学的に有用な成分を調整するために、既知の方法によって処方することができ、本発明において用いる抗体（そのいずれかの機能的なフラグメントも含む）は、混合物中で薬学的に受容可能な担体媒体と結合する。適した担体及びその製剤は、例えばＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，１９９０）において述べられている。効率的な投与に適する薬学的に受容可能な成分を形成するために、このような成分は適量の担体媒体と一緒に、本発明において用いる１又はそれ以上の抗体の有効量を含有している。診断化合物として用いる本発明の好ましい抗体又は抗原結合部位は、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、及び１０６からなる群から選択される可変重鎖配列、及び／又は配列番号４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、１０９及び１１０からなる群から選択される可変軽鎖配列を具えている。
【００７４】
製剤は適切に処方し、活性化合物の徐放性を与えることができる。徐放性製剤は、抗ＣＤ３８抗体を合成し、又は吸収するポリマの使用を通じ、成し遂げられる。被制御の送達は、適切な高分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、又は硫酸プロタミン）及び高分子濃度、並びに放出を制御するための取り込み方法を選択することによって実行することができる。別の徐放性製剤による持続動作を制御できる方法は、抗ＣＤ３８抗体を、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ乳酸又はエチレンビニルアセテート共重合体のような重合体物質の粒子に取り込むことである。代替的に、これらの薬を重合体物質の中に取り込む代わりに、これらの物質を例えば、コアセルべーション技術により、又は、例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリメチルメタクリレートマイクロカプセルなどのメチル界面重合により、又は例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセルといったコロイド性の薬物送達系において、又はマクロエマルジョンにおいて作成されたマイクロカプセルに捕捉することが可能である。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）に開示されている。
【００７５】
化合物は、注射によって、例えば、ボーラス投与又は持続点滴によって非経口投与で処方することができる。注射用の製剤は、単位剤形の中に、例えばアンプル中に、又はマルチ投与容器中に、付加した保存剤と共存することができる。成分は、油性溶媒又は水性溶媒中で懸濁液、溶液、乳濁液のような形態を取ることができ、懸濁剤、安定化剤、分散剤のような処方薬を含むことができる。代替的に、活性成分は例えば無菌の発熱状態にない水などの適した溶媒を伴う構成では、使用前に粉末形態であっても良い。
【００７６】
成分は、所望された場合、パック又は調剤装置内にあってもよく、活性成分を含む１又はそれ以上の単位剤形を含有することができる。パックは、例えばブリスタ包装のような金属あるいはプラスチック箔を具えることができる。パック又は調剤装置は投薬指示を伴うことができる。
【００７７】
本発明は、以下の作用例を参照することによって更に理解されるが、説明を意図したものであり、故に発明を限定するものではない。
【００７８】
例
株細胞
下記の株細胞は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＤＳＭＺ）又はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から取得した：ＣＤ３８マウスＩｇＧ１モノクローナル抗体ＯＫＴ１０を生成するハイブリドーマ株細胞（ＥＣＡＣＣ、品番８７０２１９０３）、ジャーカット細胞（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ２８２）、ＬＰ−１（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ４１）、ＲＰＭＩ８２２６（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−１５５）、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５７３）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−６１）、ラージ（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−８６）、及びＯＰＭ２（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ５０）。
【００７９】
細胞及び培養条件
全ての細胞は加湿インキュベータ内で、３７℃及び５％のＣＯ２での標準化条件下で培養した。株細胞ＬＰ−１、ＲＰＭＩ８２２６、ジャーカット及びラージは、１０％のＦＣＳ（ＰＡＮ  ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ、品番Ｐ３０−３３０２）、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、品番１５１４０−１２２）及び２ｍＭのグルタミン（Ｇｉｂｃｏ、品番２５０３０−０２４）を追加したＲＰＭＩ１６４０（Ｐａｎ  ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ、品番Ｐ０４−１６５００）において培養され、ジャーカット及びラージ細胞の場合は、更に１０ｍＭのペペス（Ｐａｎ  ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ、品番Ｐ０５−０１１００）及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｐａｎ  ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ、品番Ｐ０４−４３１００）を添加しなければならなかった。
【００８０】
ＣＨＯ−Ｋ１及びＨＥＫ２９３は２ｍＭのグルタミンと１０％のＦＣＳを追加したＤＭＥＮ（Ｇｉｂｃｏ、品番１０９３８−０２５）において成長した。安定なＣＤ３８のＣＨＯ−Ｋ１形質移入体は、Ｇ４１８（ＰＡＡ  ＧｍｂＨ、Ｐ１１−０１２）の存在下で維持し、一方、ＨＥＫ２９３用に、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム追加が不可欠であった。ＨＥＫ２９３の一過性形質移入後に、１０％のＦＣＳをＵｌｔｒａ  ｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、品番１６２５０−０７８）に置換した。株細胞ＯＫＴ１０は、ＩＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、品番３１９８０−０２２）において培養し、２ｍＭのグルタミンと２０％のＦＣＳを追加した。
【００８１】
末梢血からの単一細胞懸濁液の準備
全ての血液サンプルはインフォームドコンセントの後に受け取った。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、健常ドナーから製造業者の指示によってＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）−１０７７（Ｓｉｇｍａ）により分離した。赤血球は、ＲＴ又は市販の誘導体（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、品番００−４３３３）で５分間、ＡＣＫ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ)におけるインキュベーションにより、これらの細胞懸濁液から枯渇させた。細胞はＰＢＳで２回洗浄し、次いで、更にフローサイトメトリ又はＡＤＣＣ（下記参照）用に処理された。
【００８２】
フローサイトメトリ（「ＦＡＣＳ」）
全ての染色は、穴につき２×１０５の細胞を有する９６穴丸底培養プレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）内で行われた。細胞は４℃で４０分間、５０μｌのＦＡＣＳバッファ（ＰＢＳ、３％ＦＣＳ、０．０２％ＮａＮ３）内で指示濃度のＦａｂ又はＩｇＧ抗体と共に細インキュベーションした。細胞は２回洗浄し、次いで４℃で３０分間、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）抱合型ヤギ抗ヒト又はヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と共にインキュベーションし、ＦＣＡバッファで１：２００に希釈した。細胞は再び洗浄し、０．３ｍｌのＦＡＣＳバッファで再懸濁し、次いで、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）において、フローサイトメトリによって分析した。
【００８３】
スキャッチャード分析に基づくＦＡＣＳと共に、ＲＰＭＩ８２２６細胞は、１２．５μｇ／ｍｌ（ＩｇＧ）最終濃度で開始する１２個の異なる希釈（１：２ｎ）で染色した。少なくとも２つの個々の測定を各濃度で用い、ＫＤ値はＣｈａｍｏｗら（１９９４）に従って中央値の蛍光強度から推定した。
【００８４】
表面プラズモン共鳴
動力学定数Ｋｏｎ及びＫｏｆｆは、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて共有結合的な固定化ＣＤ３８−Ｆｃ融合タンパク質に結合したそれぞれのＦａｂの希釈系列で決定した。共有結合的な抗原固定化のために、標準的なＥＤＣ−ＮＨＳアミノ共役の化学的性質を用いた。ＣＤ３８−Ｆｃ融合タンパクの直接的な共役のために、ＣＭ５センサチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）は、ｐＨ４．５の１０ｍＭアセテートバッファにおいて、〜６００−７００ＲＵでコーティングされる。基準のフローセルのために、それぞれのＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）量を用いた。動力学測定は、１．５−５００ｎＭのＦａｂ濃度範囲を用いて２０μｌ／ｍｉｎの流速で、ＰＢＳ（１３６ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）内でなされた。各濃度の注入時間は、１分間であり、その後、２分間の解離段階が続いた。５μｌの再生のために、１０ｍＭのＨＣｌを用いた。全てのセンサグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）は、ＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ３．１（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて局所的に適合させた。
【００８５】
例１：ＨｕＣＡＬライブラリからの抗体生成
ＣＤ３８に対抗する治療抗体を生成するために、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージディスプレイライブラリを有する選択を実行した。ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）は、ＨｕＣＡＬ（登録商標）の概念（Ｋｎａｐｐｉｋら、２０００；Ｋｒｅｂｓら、２００１）に基づいたＦａｂライブラリであり、６つのＣＤＲ全てが多様化され、ファージ表面へＦａｂフラグメントを連結するＣｙｓＤｉｓｐｌａｙＴＭ技術を使用している（Ｌｏｈｎｉｎｇ、２００１）。
【００８６】
Ａ．ファージミドレスキュ、ファージ増幅及び精製
ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージミドライブラリは、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールと１％のグルコース（２倍濃度のＴＹ−ＣＧ）を含む２倍濃度のＴＹ培地において増幅する。０．５のＯＤ６００でのヘルパファージ感染（ＶＣＳＭ１３）の後に（振盪なしで３７℃で３０分；２５０ｒｐｍで振盪して３７℃で３０分）、細胞は遠心沈殿し（４１２０ｇ、５分、４℃）、２倍濃度のＴＹ、又は３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、又は５０μｇ／ｍｌのカナマイシンにおいて再懸濁し、２２℃で一晩成長させた。ファージは上澄みからＰＥＧ沈殿させ、ＰＢＳ／２０％グリセロールで再懸濁し、−８０℃で保管した。２つのパンニングラウンド間のファージ増幅は、下記のように行われた：対数期の中間部のＴＧ１細胞は溶出ファージに感染させ、１％のグルコースと３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ＬＢ−ＣＧ）に追加されるＬＢ−ａｇｅｒ上に蒔いて培養する。３０℃での一晩のインキュベーション後に、コロニが削られ、０．５のＯＤ６００に調整され、ヘルパファージは上述のように添加される。
【００８７】
Ｂ．ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）を伴うパンニング
選択のために、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）抗体ファージは、異なるＶＨの主要な遺伝子に対応する３つのプールに分割した（プール１：ＶＨ１／５λκ、プール２：ＶＨ３  λκ、プール３：ＶＨ２／４／６  λκ）。これらのプールはＣＤ３８発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞上にパンニングする３ラウンドの細胞全体に個別に供し、その後に、不適切な抗体ファージの枯渇のために、ＣＤ３８陰性ＣＨＯ−Ｋ１細胞上のｐＨ溶出及び吸収後ステップが続く。最終的に、残りの抗体ファージは大腸菌ＴＧ１細胞を感染させるのに用いた。遠心分離の後に、細菌ペレットは２倍濃度のＴＹ培地において、再懸濁され、寒天プレートの上に蒔いて培養され、３０℃で一晩インキュベーションされる。選択されたクローンはその後プレートから削られ、ファージは救出され、増幅された。第２及び第３の選択ラウンドは、初期のものと同様に行われた。
【００８８】
選択されたＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージの挿入断片をコード化したＦａｂは、可溶Ｆａｂの迅速な発現を促進するために、発現ベクタｐＭＯＲＰＨ（登録商標）ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＳ（Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒら、２００３）内へサブクローニングした。選択されたクローンのＤＮＡは、挿入断片（ｏｍｐＡ−ＶＬＣＬ及びｐｈｏＡ−Ｆｄ）をコード化したＦａｂを切り離したことによるＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩと共に消化し、Ｘｂａｌ／ＥｃｏＲＩ切断ベクタのｐＭＯＲＰＨ（登録商標）ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＳ内へクローニングした。このベクタで発現したＦａｂは、検出及び精製用の２つのＣ−末端標識（ＦＬＡＧＴＭ及びＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）ＩＩ）を保有している。
【００８９】
例２：生理学アッセイ
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害は下記のように、フローサイトメトリ分析（Ｎａｕｎｄｏｒｆら、２００２）に基づき公表されたプロトコルに従って計測した：
ＡＤＣＣ：
ＡＤＣＣ計測のために、標的細胞（Ｔ）は、２．０Ｅ＋０５  ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整し、室温で２分間、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｐａｎ  ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）内で１００ｎｇ／ｍｌのカルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｃ−３０９９）を用いて標識した。残留したカルセインは、ＲＰＭＩ１６４０培地において３回の洗浄ステップにより除去された。平行して、ＰＭＢＣは（自然死滅）エフェクタ細胞（Ｅ）の源として準備し、１．０Ｅ＋０７へ調整し、アッセイの状態によって、５０：１又はそれ以下の最終的なＥ：Ｔの比率を与えるために、標識した標的細胞と混合した。細胞は一度洗浄し、細胞混合物は、それぞれの抗体を含む２００μｌのＲＰＭＩ１６４０培地において、異なる希釈で再懸濁される。プレートは加湿インキュベータにおいて、３７℃、５％ＣＯ２の標準化条件下で、４時間インキュベーションした。ＦＡＣＳ分析より前に、細胞はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で標識し、フローサイトメトリ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析した。５０，０００と１５０，０００の間の事象が、各アッセイで計数された。
【００９０】
下記の式で、死滅活性が起こった［％］：
0005752667.tif 000005
ここで、ＥＤＡ＝事象の死滅細胞（カルセイン＋ＰＩ染色細胞）、及び
ＥＬＡ＝事象の生存細胞（カルセイン染色細胞）である。
【００９１】
ＣＤＣ：
ＣＤＣ測定のために、５．０Ｅ＋０４のＣＤ３８  ＣＨＯ−Ｋ１形質移入は、１：４希釈のヒト血清（Ｓｉｇｍａ、品番Ｓ−１７６４）とそれぞれの抗体とを一緒にマイクロタイタウェルプレート（Ｎｕｎｃ）へ添加した。全ての試薬及び細胞は、１０％のＦＣＳを追加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｐａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）において希釈した。反応混合物は、加湿インキュベータにおいて、３７℃、５％ＣＯ２の標準化条件下で、２時間インキュベーションした。熱不活性化補体又は、抗体無しのＣＤ３８形質移入体は、負のコントロールとして役立った。細胞はＰＩで標識し、ＦＡＣＳ分析に供した。
【００９２】
全部で５０００の事象が計数され、異なる抗体濃度での死滅細胞の数は、ＥＣ５０の値の決定に用いられた。下記の式で、死滅活性が起こった［％］：
0005752667.tif 000006
ここで、ＥＤＣ＝事象の死滅細胞（ＰＩ染色細胞）、及び
ＥＬＣ＝事象の生存細胞（染色されない）である。
【００９３】
３組中の１２の異なる抗体希釈（１：２ｎ）全体の細胞毒性値は、標準分析ソフトウェア（ＰＲＩＳＭ（登録商標）、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いたＥＣ−５０値を得るために、ＡＤＣＣ、及び、各抗体に対するＣＤＣのうちの２組において用いられた。
【００９４】
例３：安定したＣＤ３８形質移入体及びＣＤ３８−Ｆｃ融合タンパク質の生成
パンニング及びスクリーニングでＣＤ３８タンパク質を生成するために、２つの異なる発現系を構築しなければならなかった。第１のストラテジは、ＣＤ３８−Ｆｃ融合タンパク質の生成を含み、ＨＫ２９３細胞の一過性の形質移入の後に上澄みから精製された。第２の戦略は、高いＣＤ３８の表面発現を全ての細胞パンニングを介して抗体ファージの選択に用いるための安定したＣＨＯ−Ｋ１株細胞の生成を含んでいた。
【００９５】
初期段階として、ジャーカット細胞（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ２８２）をｃＤＮＡ（Ｉｎｔｒｏｇｅｎ）の生成のために用い、続いて、全体のＣＤ３８コード配列の増幅に、それぞれ（プライマＭＴＥ００１＆ＭＴＥ００２ｒｅｖ；表４）ＣＤ３８の最初の７及び最後の９コドンと相補的なプライマを用いた。ＣＤ３８挿入の配列分析は、Ｎａｔａらによって述べられているように（１９９０）、チロシンの代わりにグルタミンを示す位置４９を除き、Ｊａｃｋｓｏｎらによって公表されたアミノ酸配列（１９９０）で確認した。制限エンドヌクレアーゼ部位の導入と、発現ベクタｐｃＤＮＡ３．１（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）の異なる誘導体内へのクローニングのために、精製ＰＣＲ生成物は、全体の遺伝子（プライマＭＴＥ００６＆ＭＴＥ００７ｒｅｖ、表４）又はその部分（プライマＭＴＥ００４＆ＭＴＥ００９ｒｅｖ）の再増幅用の鋳型として役に立った。後者の場合、細胞外領域（４５乃至３００）をコード化するフラグメントは、ヒトＶκリーダ配列とヒトＦｃ−λ１配列の間にあるフレーム内で増幅し、クローン化した。このベクタは、可溶性のＣＤ３８−Ｆｃ融合タンパク質の生成用の発現ベクタとして役に立った。別のリーダ配列のないｐｃＤＮＡ３．１誘導体は、ＣＤ３８全長遺伝子の挿入のために用いた。この場合において、Ｆｃコーディング領域の直前の終止コドン及び誤ったリーダ配列が、ＣＤ３８表面の発現を起こした。ＨＥＫ２９３細胞は、可溶性のＣＤ３８−Ｆｃ融合タンパク質の生成用のＦｃ融合タンパク質ベクタで一過性に形質移入され、全長誘導体の場合、ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、安定したＣＤ３８発現の株細胞の生成のために形質移入した。
【００９６】
【表４】
0005752667.tif 000007
【００９７】
例４：ＨｕＣＡＬ（登録商標）ＩｇＧ１のクローニング、発現及び精製
全長ＩｇＧを発現するために、重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインフラグメントは、Ｆａｂ発現ベクタから適切なｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈＩｇベクタへサブクローンされた（図７乃至９参照）。制限エンドヌクレアーゼの組合せＢｌｐＩ／Ｍｆｅｌ（挿入製剤）及びＢｌｐＩ／ＥｃｏＲＩ（ベクタ製剤）は、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈＩｇＧ１へのＶＨドメインフラグメントのサブクローニングに用いた。酵素の組合せＥｃｏＲＶ／ＨｐａＩ（λ挿入）及びＥｃｏＲＶ／ＢｓｉＷＩ（κ挿入）は、それぞれｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈＩｇκ＿１又はｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿Ｉｇλ＿１ベクタへのＶＬドメインフラグメントのサブクローニングに用いた。結果として生じたＩｇＧ構造物は、標準的なリン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈技術を用いた一過性の形質移入によって、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）において発現した。
【００９８】
ＩｇＧは、プロテインＡセファロースカラムを介して、アフィニティクロマトグラフィによって細胞培養上澄みから精製した。更に、ダウンストリームプロセシングは、精製ＩｇＧのゲル濾過及び無菌濾過によるバッファ交換を含んでいた。品質管理は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを減ずることによって、９０％より高純度を、及び、分析用サイズ排除クロマトグラフィにより決定されるような９０％より多い単一ＩｇＧを示した。物質の内毒素含量は、カイネティックＬＡＬに基づくアッセイ（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって決定した。
【００９９】
例５：キメラＯＫＴ１０（ｃｈＯＫＴ１０；配列番号７２及び７３）の発生及び生成
ｃｈＯＫＴ１０構築のためにマウスＶＨ及びＶＬ部位は、マウスＯＫＴ１０ハイブリドーマ株細胞（ＥＣＡＣＣ、品番８７０２１９０３）から用意されたｃＤＮＡを用いたＰＣＲによって増幅した。公表されているようにプライマのセットは用いた（Ｄａｔｔａｍａｊｕｍｄａｒら、１９９６；Ｚｈｏｕら、１９９４）。ＰＣＲ生成物はＴｏｐｏクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ｐＣＲＩＩ−ｖｅｃｔｏｒ）、及び２つの異なるκ軽鎖配列と１つの重鎖配列を示す配列分析（Ｍ１３逆プライマ）に供される単一コロニ用に用いられた。配列アライメント（ＥＭＢＬヌクレオチド配列データベース）及び文献（Ｋｒｅｂｂｅｒら、１９９７）に従って、κ配列のうちの１つは腫瘍細胞の融合パートナＸ６３Ａｇ８．６５３の内因性レパートリに属し、故にＯＫＴ１０抗体には属さない。従って、新しいκ配列及び単一のＶＨフラグメントのみが、更なるクローニングに用いられた。双方のフラグメントは、制限エンドヌクレアーゼ部位の添加で再増幅し、後にそれぞれのｐＭＯＲＰＨ（登録商標）ＩｇＧ１発現ベクタへのクローニングが続いた。重鎖（配列番号７２）及び軽鎖（配列番号７３）の配列は、図６に与えた。ＨＥＫ２９３細胞は一過性で形質移入し、上澄みはＣＤ３８過剰発現ラージ株細胞（ＡＴＣＣ）へ結合したキメラＯＫＴ１０抗体用のＦＡＣＳで分析した。
【０１００】
例６：ＦＡＣＳによる交差反応性分析（ＭＯＲ０３０８７及びＭＯＲ０３０８８）
１．材料と方法
図１１及び１２は、リンパ球と赤血球のＦＡＣＳ分析を示す：ＥＤＴＡ処理した血液サンプルは、健常なヒト（インフォームドコンセントを得た後で）から、及び非ヒト霊長類（アカゲザル、カニクイザル及びマーモセット）から取得し、補助説明書に従い、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ細胞分離システム（Ｓｉｇｍａ）を用いた密度勾配遠心法に供した。ＦＡＣＳ分析のために、間期（ＰＢＭＣ部分）又はペレット（赤血球部分）からの細胞は、異なるフォーマットの抗ＣＤ３８ＨｕＣＡＬ（登録商標）抗体と共にインキュベーションした。
【０１０１】
異なる抗ＣＤ３８抗体の交差反応特性の概要は図１３に示す。
【０１０２】
２．要旨及び結論
結果は、全てのＣＤ３８抗体間で、ＭＯＲ０３０８７及びＭＯＲ０３０８８のみがマーモセットＰＢＭＣへの交差反応性を呈したことを示している。驚くべきことに、マーモセット赤血球上のＣＤ３８発現は、カニクイザル及びアカゲザルの赤血球上の強い発現と比較すると、ほとんど検出できない。従って、マーモセットの赤血球及びＰＢＭＣ上のＣＤ３８発現は、ヒトの状態をより反映しており、ＣＤ３８発現は赤血球上で低く、ＰＢＭＣ上で中程度乃至高くなる。従って、マーモセットはＣＤ３８に結合する分子の毒性を研究するモデルとして適すると見なされる。
【０１０３】
上記の研究に基づき、本明細書に別記し、例えば「本発明において用いる抗体」に関する段落に示すように、更に結合剤ＭＯＲ０３０８７及びＭＯＲ０３０８８を最適化するように決定した。当該技術分野の当業者は、親の派生抗体が比較可能な交差反応特性をも示すことは予想するであろう。
【０１０４】
参考文献：
【特許文献１】Ｌｏｈｎｉｎｇ，Ｃ．（２００１）．Ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  （ｐｏｌｙ）ｐｅｐｔｉｄｅｓ／ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｖｉａ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ．ＷＯ０１／０５９５０．
【非特許文献１】Ａｎｔｏｎｅｌｌｉ，Ａ．，Ｂａｊ．，Ｇ．，Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ．，Ｐ．，Ｆａｌｌａｈｉ，Ｐ．，Ｓｕｒｉｃｏ，Ｎ．，Ｐｕｐｉｌｌｉ，Ｃ，Ｍａｌａｖａｓｉ，Ｆ．，Ｆｅｒｒａｎｎｉｎｉ，Ｐ．（２００１）．Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ３８  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｒａｉｓｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ５０：９８５−９９１
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【非特許文献５】Ｅｌｌｉｓ  Ｊ．Ｈ．，Ｂａｒｂｅｒ，Ｋ．Ａ．，Ｔｕｔｔ，Ａ．，Ｈａｌｅ，Ｃ．，Ｌｅｗｉｓ，Ａ．Ｐ．，Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｃｒｏｗｅ，Ｊ．（１９９５）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉ−ＣＤ３８  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：９２５−９３７．
【非特許文献６】Ｆｅｒｒｅｒｏ，Ｅ．，Ｏｒｃｉａｎｉ，Ｍ．，Ｖａｃｃａ，Ｐ．，Ｏｒｔｏｌａｎ，Ｅ．，Ｃｒｏｖｅｌｌａ，Ｓ．，Ｔｉｔｔｉ，Ｆ．，Ｓａｃｃｕｃｃｉ，Ｆ．，Ｍａｌａｖａｓｉ，Ｆ．（２００４）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ＣＤ３８  ＡＤＰＲ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ．ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ５：２１
【非特許文献７】Ｆｌａｖｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｂｏｅｈｍ，Ｄ．Ａ．，Ｎｏｓｓ，Ａ．，Ｗａｒｎｅｓ，Ｓ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｆｌａｖｅｌｌ，Ｓ．Ｕ．Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ７  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ＣＤ３８−ｓａｐｏｒｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｉｓ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｂｅｔｔｅｒ  ｔｈａｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｅａｃｈ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．８４：５７１−５７８（２００１）．
【非特許文献８】Ｆｕｎａｒｏ，Ａ．，Ｓｐａｇｎｏｌｉ，Ｇ．Ｃ．，Ａｕｓｉｅｌｌｏ，Ｃ．Ｍ．，Ａｌｅｓｓｉｏ，Ｍ．，Ｒｏｇｇｅｒｏ，Ｓ．，Ｄｅｌｉａ，Ｄ．，Ｚａｃｃｏｌｏ，Ｍ．，  ａｎｄ  Ｍａｌａｖａｓｉ，Ｆ．（１９９０）Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  ＣＤ３８  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５，２３９０−２３９６．
【非特許文献９】Ｇｏｌａｙ，Ｊ．，Ｚａｆｆａｒｏｎｉ，Ｌｕｉｓｅｌｌａ，Ｖａｃｃａｒｉ，Ｔ．，Ｌａｚｚａｒｉ，Ｍ．，Ｂｏｒｌｅｒｉ，Ｇ．−M，Ｂｅｍａｓｃｏｎｉ，Ｓ．，Ｔｅｄｅｓｃｏ，Ｆ．，Ｒａｍｂａｌｄｉ，Ａｌ，Ｉｎｔｒｏｎａ，Ｍ．（２０００）．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｔｏ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：ＣＤ５５  ａｎｄ  ＣＤ５９  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ  ９５：３９００−３９０８．
【非特許文献１０】Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．，Ｔｒｅｏｎ，Ｓ．Ｐ．，Ｈｉｄｅｓｈｉｍａ，Ｔ．，Ｔａｉ，Ｙ−Ｔ．，Ａｋｉｙａｍａ，Ｍ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｒ．，Ｃｈａｕｈａｎ，Ｄ．，Ｇｒｅｗａｌ，Ｉ．Ｓ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｃ．（２００３）．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉ−ＣＤ４０  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｒ．Ｊ．Ｈｅａｍａｔｏｌ．１２１，５９２−５９６．
【非特許文献１１】Ｈｏｓｈｉｎｏ  Ｓ．，Ｋｕｋｉｍｏｔｏ  Ｉ，Ｋｏｎｔａｎｉ  Ｋ．，Ｉｎｏｕｅ  Ｓ．，Ｋａｎｄａ  Ｙ．，Ｍａｌａｖａｓｉ  Ｆ．，Ｋａｔａｄａ  Ｔ．（１９９７）Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｐｉｔｏｐｉｃ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３８／ＮＡＤ＋  ｇｌｙｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｔｏ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８（２）：７４１−７．
【非特許文献１２】Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｄ．Ｇ．，Ｂｅｌｌ  Ｊ．Ｉ．（１９９０）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３８（Ｔ１０）  ｍｏｌｅｃｕｌｅ，ａ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４（７）：２８１１−５．
【非特許文献１３】Ｋｎａｐｐｉｋ，Ａ．，Ｇｅ，Ｌ．，Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，Ａ．，Ｐａｃｋ，Ｐ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｗｅｌｌｎｈｏｆｅｒ，Ｇ．，Ｈｏｅｓｓ，Ａ．，Ｗｏｌｌｅ，Ｊ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，ａｎｄ  Ｖｉｒｎｅｋａｓ，Ｂ．（２０００）．Ｆｕｌｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（ＨｕＣＡＬ）  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ  ａｎｄ  ＣＤＲｓ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６，５７−８６．
【非特許文献１４】Ｋｏｎｏ，Ｋ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ａ．，Ｉｃｈｉｈａｒａ，Ｆ．，Ｓｕｇａｉ，Ｈ．，Ｆｕｊｉｉ，Ｈ．，  ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｙ．（２００２）．Ｉｍｐａｉｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｇａｓｔｒｉｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２，５８１３−５８１７．
【非特許文献１５】Ｋｏｎｏｐｌｅｖａ  Ｍ．，Ｅｓｔｒｏｖ  Ｚ．，Ｚｈａｏ  Ｓ．，Ａｎｄｒｅｅｆｆ  Ｍ．，Ｍｅｈｔａ  Ｋ．（１９９８）Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ＣＤ３８  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｉｇｎａｌ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（９）：４７０２−８．
【非特許文献１６】Ｋｒｅｂｂｅｒ，Ａ．，Ｂｏｒｎｈａｕｓｅｒ，Ｓ．，Ｂｕｒｍｅｓｔｅｒ，Ｊ．，Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，Ａ．，Ｗｉｌｌｕｄａ，Ｊ．，Ｂｏｓｓａｒｄ，Ｈ．Ｒ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（１９９７）．Ｒｅｌｉａｂｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ａｎｄ  ｓｐｌｅｅｎ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  ａ  ｒｅｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．２０１，３５−５５．
【非特許文献１７】Ｋｒｅｂｓ，Ｂ．，Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｒ．，Ｒｅｉｆｆｅｒｔ，Ｓ．，Ｒｏｔｈｅ，Ｃ．，Ｔｅｓａｒ，Ｍ．，Ｔｈｏｍａｓｓｅｎ，Ｅ．，Ｃａｏ，Ｍ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｔ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．，Ｈｏｓｓ，Ａ．，Ｉｎｇｅ，Ｌ．，Ｋｎａｐｐｉｋ，Ａ．，Ｍａｒｇｅｔ，Ｍ．，Ｐａｃｋ，Ｐ．，Ｍｅｎｇ，Ｘ．Ｑ．，Ｓｃｈｉｅｒ，Ｒ．，Ｓｏｈｌｅｍａｎｎ，Ｐ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．，Ｗｏｌｌｅ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ，Ｔ．（２００１）．Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５４，６７−８４．
【非特許文献１８】Ｍａｌａｖａｓｉ，Ｆ．，Ｃａｌｉｇａｒｉｓ−Ｃａｐｐｉｏ，Ｆ．，Ｍｉｌａｎｅｓｅ，Ｃ．，Ｄｅｌｌａｂｏｎａ，Ｐ．，Ｒｉｃｈｉａｒｄｉ，Ｐ．，Ｃａｒｂｏｎａｒａ，Ａ．Ｏ．（１９８４）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｅａｒｌｙ  ｌｙｍｐｈｏｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：９−２０
【非特許文献１９】Ｍａｌｏｎｅｙ，Ｄ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｒｏｓｅ，Ａ．（２００２）．Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｓｅｍ．Ｏｎｃｏｌ．２９，２−９．
【非特許文献２０】Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ，Ｐ．，Ａｎｔｏｎｅｌｌｉ，Ａ．，Ｌｕｐｉ，Ｒ．，Ｍａｒｓｅｌｌｉ，Ｌ．，Ｆａｌｌａｈｉ，Ｐ．，Ｎｅｓｔｉ，Ｃ．，Ｂａｊ，Ｇ．，Ｆｅｒｒａｎｎｉｎｉ，Ｅ．（２００２）．Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＣＤ３８  ｉｍｐａｉｒｓ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５１，４７４−４７７．
【非特許文献２１】Ｍｅｈｔａ，Ｋ．，Ｏｃａｎａｓ，Ｌ．，Ｍａｌａｖａｓｉ，ｆ．，Ｍａｒｋｓ；Ｊ．Ｗ．，Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ，Ｍ．Ｇ（２００４）．Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＣＤ３８  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．３，３４５−３５２
【非特許文献２２】Ｎａｍｂａ，Ｍ．，Ｏｔｓｕｋｉ，Ｔ．，Ｍｏｒｉ，Ｍ．，Ｔｏｇａｗａ，Ａ．，Ｗａｄａ，Ｈ．，Ｓｕｇｉｈａｒａ，Ｔ．，Ｙａｗａｔａ，Ｙ．，Ｋｉｍｏｔｏ，Ｔ．（１９８９）．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：７２３．
【非特許文献２３】Ｎａｔａ  Ｋ．，Ｔａｋａｍｕｒａ  Ｔ．，Ｋａｒａｓａｗａ  Ｔ．，Ｋｕｍａｇａｉ  Ｔ．，Ｈａｓｈｉｏｋａ  Ｗ．，Ｔｏｈｇｏ  Ａ．，Ｙｏｎｅｋｕｒａ  Ｈ．，Ｔａｋａｓａｗａ  Ｓ．，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｓ．，Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｈ．（１９９７）．Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ＣＤ３８（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ／ｃｙｃｌｉｃ  ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）：ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ．Ｇｅｎｅ  １８６（２）：２８５−９２．
【非特許文献２４】Ｎａｕｎｄｏｒｆ，Ｓ．，Ｐｒｅｉｔｈｎｅｒ，Ｓ．，Ｍａｙｅｒ，Ｐ．，Ｌｉｐｐｏｌｄ，Ｓ．，Ｗｏｌｆ，Ａ．，Ｈａｎａｋａｍ，Ｆ．，Ｆｉｃｈｔｎｅｒ，Ｉ．，Ｋｕｆｅｒ，Ｐ．，Ｒａｕｍ，Ｔ．，Ｒｉｅｔｈｍｕｌｌｅｒ，Ｇ．，Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐ．Ａ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｔ．（２００２）．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １００，１０１−１１０．
【非特許文献２５】Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ，ａｎｄ  Ｐａｃｋ  Ｐ．（１９９７）Ｎｅｗ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３（２）：８３−１０５．
【非特許文献２６】Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｒ．，Ｂｏｒｇｅｓ  Ｅ．，Ｔｈｏｍａｓｓｅｎ−Ｗｏｌｆ  Ｅ．，Ｒｏｍ  Ｅ．，Ａｄａｒ  Ｒ．，Ｙａｎｉｖ  Ｙ．，Ｍａｌｋａ  Ｍ．，Ｃｈｕｍａｋｏｖ  Ｉ，Ｋｏｔｚｅｒ  Ｓ．，Ｒｅｓｎｉｔｚｋｙ  Ｄ．，Ｋｎａｐｐｉｋ  Ａ．，Ｒｅｉｆｆｅｒｔ  Ｓ．，Ｐｒａｓｓｌｅｒ  Ｊ．，Ｊｕｒｙ  Ｋ．，Ｗａｌｄｈｅｒｒ  Ｄ．，Ｂａｕｅｒ  Ｓ．，Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ  Ｔ．，Ｙａｙｏｎ  Ａ．，Ｒｏｔｈｅ  Ｃ．（２００３）．Ｈｕｍａｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｆａｂ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｙｉｅｌｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ． ２７８（４０）：３８１９４−２０５．
【非特許文献２７】Ｒｅｆｆ，Ｍ．Ｅ．，Ｃａｒｎｅｒ，Ｋ．，Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｋ．Ｓ．，Ｃｈｉｎｎ，Ｐ．Ｃ．，Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｊ．Ｅ．，Ｒａａｂ，Ｒ．，Ｎｅｗｍａｎ，Ｒ．Ａ．，Ｈａｎｎａ，Ｎ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｒ．（１９９４）．Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ＣＤ２０．Ｂｌｏｏｄ  ８３：４３５−４４５
【非特許文献２８】Ｓａｎｔｉｎ，Ａ．Ｄ．，Ｂｅｌｌｏｎｅ，Ｓ．，Ｇｏｋｄｅｎ，Ｍ．，Ｐａｌｍｉｅｒｉ，Ｍ．，Ｄｕｎｎ，Ｄ．，Ａｇｈａ，Ｊ．，Ｒｏｍａｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｈｕｔｃｈｉｎｓ，Ｌ．，Ｐｅｃｏｒｅｌｌｉ，Ｓ．，Ｏ’Ｂｒｉａｎ，Ｔ．，Ｃａｎｎｏｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｐａｒｈａｍ，Ｇ．Ｐ．（２００２）．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ  ｉｎ  Ｕｔｅｒｉｎｅ  ｓｅｒｏｕｓ  ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８：１２７１−１２７９．
【非特許文献２９】Ｓｈｉｎｋａｗａ，Ｔ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．，Ｙａｍａｎｅ，Ｎ．，Ｓｈｏｊｉ−Ｈｏｓａｋａ，Ｅ．，Ｋａｎｄａ，Ｙ．，Ｓａｋｕｒａｄａ，Ｍ．，Ｕｃｈｉｄａ，Ｋ．，Ａｎａｚａｗａ，Ｈ．，Ｓａｔｏｈ，Ｍ．，Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｍ．，Ｈａｎａｉ，Ｎ．，Ｓｈｉｔａｒａ，Ｋ．（２００３）．Ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｆｕｃｏｓｅ  ｂｕｔ  Ｎｏｔ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ｏｒ  ｂｉｓｅｃｔｉｎ  Ｎ−Ａｃｔｅｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  ｃｏｍｐｌｅｘ−ｔｙｐｅ  ｏｌｉｇｏｓｃａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｓｈｏｗｓ  ｔｈｅ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，３４６６−３４７３．
【非特許文献３０】Ｚｈｏｕ，Ｈ．，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｐａｐａｓ，Ｔ．Ｓ．（１９９４）．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｍｏｕｓｅ  ｓｃＦｖ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：８８８−８８９．
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１ａ−１】図１ａは、本発明において用いる様々な抗体の可変重鎖部位の核酸配列を提供している。
【図１ａ−２】図１ａは、本発明において用いる様々な抗体の可変重鎖部位の核酸配列を提供している。
【図１ａ−３】図１ａは、本発明において用いる様々な抗体の可変重鎖部位の核酸配列を提供している。
【図１ａ−４】図１ａは、本発明において用いる様々な抗体の可変重鎖部位の核酸配列を提供している。
【図１ａ−５】図１ａは、本発明において用いる様々な抗体の可変重鎖部位の核酸配列を提供している。
【図１ａ−６】図１ａは、本発明において用いる様々な抗体の可変重鎖部位の核酸配列を提供している。
【図１ｂ−１】図１ｂは、本発明において用いる様々な抗体の可変重鎖部位のアミノ酸配列を提供している。ＣＤＲ部位のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はＮ−末端乃至Ｃ−末端までの間にボールドフェースで示している。
【図１ｂ−２】図１ｂは、本発明において用いる様々な抗体の可変重鎖部位のアミノ酸配列を提供している。ＣＤＲ部位のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はＮ−末端乃至Ｃ−末端までの間にボールドフェースで示している。
【図１ｂ−３】図１ｂは、本発明において用いる様々な抗体の可変重鎖部位のアミノ酸配列を提供している。ＣＤＲ部位のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はＮ−末端乃至Ｃ−末端までの間にボールドフェースで示している。
【図１ｂ−４】図１ｂは、本発明において用いる様々な抗体の可変重鎖部位のアミノ酸配列を提供している。ＣＤＲ部位のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はＮ−末端乃至Ｃ−末端までの間にボールドフェースで示している。
【図２ａ−１】図２ａは、本発明において用いる様々な抗体の可変軽鎖部位の核酸配列を提供している。
【図２ａ−２】図２ａは、本発明において用いる様々な抗体の可変軽鎖部位の核酸配列を提供している。
【図２ａ−３】図２ａは、本発明において用いる様々な抗体の可変軽鎖部位の核酸配列を提供している。
【図２ａ−４】図２ａは、本発明において用いる様々な抗体の可変軽鎖部位の核酸配列を提供している。
【図２ｂ−１】図２ｂは、本発明において用いる様々な抗体の可変軽鎖部位のアミノ酸配列を提供している。ＣＤＲ部位のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はＮ−末端乃至Ｃ−末端までの間にボールドフェースで示している。
【図２ｂ−２】図２ｂは、本発明において用いる様々な抗体の可変軽鎖部位のアミノ酸配列を提供している。ＣＤＲ部位のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はＮ−末端乃至Ｃ−末端までの間にボールドフェースで示している。
【図３】図３は、様々なコンセンサスに基づくＨｕＣＡＬ抗体の主要な遺伝子配列の可変重鎖部位のアミノ酸配列を提供している。ＣＤＲ部位のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はＮ−末端乃至Ｃ−末端までの間にボールドフェースで示している。
【図４】図４は、様々なコンセンサスに基づくＨｕＣＡＬ抗体の主要な遺伝子配列の可変軽鎖部位のアミノ酸配列を提供している。ＣＤＲ部位のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はＮ−末端乃至Ｃ−末端までの間にボールドフェースで示している。
【図５】図５は、ＣＤ３８（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ一次受入れ番号Ｐ２８９０７）のアミノ酸配列を提供している。
【図６−１】図６は、キメラＯＫＴ１０の重鎖及び軽鎖ヌクレオチド配列を提供している。
【図６−２】図６は、キメラＯＫＴ１０の重鎖及び軽鎖ヌクレオチド配列を提供している。
【図７−１】図７は、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿ＩｇＧ１＿１（塩基対６０１−２１００）（配列番号７４）のＤＮＡ配列を提供し、ベクタはｐｃＤＮＡ３．１＋ベクタ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に基づいている。ＶＨ領域（ＶＨ−ｓｔｕｆｆｅｒ）配列のアミノ酸配列を太字で示し、ＶＨリーダ配列の最終解読フレームと定常部遺伝子は非太字で示している。制限酵素部位は配列の上方に示される。配列プライマのプライミング部位は下線で示す。
【図７−２】図７は、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿ＩｇＧ１＿１（塩基対６０１−２１００）（配列番号７４）のＤＮＡ配列を提供し、ベクタはｐｃＤＮＡ３．１＋ベクタ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に基づいている。ＶＨ領域（ＶＨ−ｓｔｕｆｆｅｒ）配列のアミノ酸配列を太字で示し、ＶＨリーダ配列の最終解読フレームと定常部遺伝子は非太字で示している。制限酵素部位は配列の上方に示される。配列プライマのプライミング部位は下線で示す。
【図７−３】図７は、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿ＩｇＧ１＿１（塩基対６０１−２１００）（配列番号７４）のＤＮＡ配列を提供し、ベクタはｐｃＤＮＡ３．１＋ベクタ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に基づいている。ＶＨ領域（ＶＨ−ｓｔｕｆｆｅｒ）配列のアミノ酸配列を太字で示し、ＶＨリーダ配列の最終解読フレームと定常部遺伝子は非太字で示している。制限酵素部位は配列の上方に示される。配列プライマのプライミング部位は下線で示す。
【図８−１】図８は、Ｉｇκ軽鎖発現ベクタｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿Ｉｇκ＿１（塩基対６０１−１４００）（配列番号７５）のＤＮＡ配列を提供し、ベクタはｐｃＤＮＡ３．１＋ベクタ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に基づいている。Ｖκ領域（Ｖκ−ｓｔｕｆｆｅｒ）配列のアミノ酸配列を太字で示し、Ｖκリーダ配列の、及び定常部遺伝子の最終解読フレームは非太字で示している。制限酵素部位は配列の上方に示される。配列プライマのプライミング部位は下線で示す。
【図８−２】図８は、Ｉｇκ軽鎖発現ベクタｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿Ｉｇκ＿１（塩基対６０１−１４００）（配列番号７５）のＤＮＡ配列を提供し、ベクタはｐｃＤＮＡ３．１＋ベクタ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に基づいている。Ｖκ領域（Ｖκ−ｓｔｕｆｆｅｒ）配列のアミノ酸配列を太字で示し、Ｖκリーダ配列の、及び定常部遺伝子の最終解読フレームは非太字で示している。制限酵素部位は配列の上方に示される。配列プライマのプライミング部位は下線で示す。
【図９−１】図９は、Ｉｇλ軽鎖ベクタｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿Ｉｇλ＿１（塩基対６０１−１４００）（配列番号７６）のＤＮＡ配列を提供し、Ｖλ領域（Ｖλ−ｓｔｕｆｆｅｒ）配列のアミノ酸配列を太字で示し、Ｖλリーダ配列の、及び定常部遺伝子の最終解読フレームは非太字で示している。制限酵素部位は配列の上方に示される。配列プライマのプライミング部位は下線で示す。
【図９−２】図９は、Ｉｇλ軽鎖ベクタｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿Ｉｇλ＿１（塩基対６０１−１４００）（配列番号７６）のＤＮＡ配列を提供し、Ｖλ領域（Ｖλ−ｓｔｕｆｆｅｒ）配列のアミノ酸配列を太字で示し、Ｖλリーダ配列の、及び定常部遺伝子の最終解読フレームは非太字で示している。制限酵素部位は配列の上方に示される。配列プライマのプライミング部位は下線で示す。
【図１０】図１０は、本発明で用いるＦａｂ／ＩｇＧフォーマットにおける重鎖及び軽鎖の種々の組み合わせを提供している。
【図１１】図１１は、ＦＡＣＳによって得られるリンパ球と赤血球のＣＤ３８発現分析を提供している。ＰＢＭＣ及び赤血球は、密度勾配遠心分離によりカニクイザル、アカゲザル及びマーモセットの血液全体から分離した後に、抗ＣＤ３８Ｆａｂ抗体のＭＯＲ０３０８７（Ａ、右のヒストグラム；白矢印）及びＭＯＲ０３０８８（Ｂ、右のヒストグラム；白矢印）を用いてＦＡＣＳ分析した。不適切なＦａｂ抗体（Ａ＆Ｂ、左のヒストグラム；黒矢印）は、負のコントロールとして用いた。
【図１２】図１２は、ＦＡＣＳによって得られるリンパ球と赤血球のＣＤ３８発現分析を提供している。ＰＢＭＣ及び赤血球は、密度勾配遠心分離によりヒト、カニクイザル及びマーモセットの血液全体から分離した後に、抗ＣＤ３８ＩｇＧ１のＭＯＲ０３０８７（右のヒストグラム；白矢印）を用いてＦＡＣＳ分析した。不適切なＩｇＧ１抗体（Ａ＆Ｂ、左のヒストグラム；黒矢印）は、負のコントロールとして用いた。
【図１３】図１３は、種々の抗ＣＤ３８抗体の交差反応性について比較した概要を提供している。
【図１４ａ−１】図１４ａは、本発明で用いるある抗体に対するＣＤＲ及びＦＲ部位を示し、既知配置のアミノ酸をお互いと、及び対応するコンセンサス配列と比較している。
【図１４ａ−２】図１４ａは、本発明で用いるある抗体に対するＣＤＲ及びＦＲ部位を示し、既知配置のアミノ酸をお互いと、及び対応するコンセンサス配列と比較している。
【図１４ｂ−１】図１４ｂは、本発明で用いるある抗体に対するＣＤＲ及びＦＲ部位を示し、既知配置のアミノ酸をお互いと、及び対応するコンセンサス配列と比較している。
【図１４ｂ−２】図１４ｂは、本発明で用いるある抗体に対するＣＤＲ及びＦＲ部位を示し、既知配置のアミノ酸をお互いと、及び対応するコンセンサス配列と比較している。
【図１ａ−１】
0005752667.tif 000008
【図１ａ−２】
0005752667.tif 000009
【図１ａ−３】
0005752667.tif 000010
【図１ａ−４】
0005752667.tif 000011
【図１ａ−５】
0005752667.tif 000012
【図１ａ−６】
0005752667.tif 000013
【図１ｂ−１】
0005752667.tif 000014
【図１ｂ−２】
0005752667.tif 000015
【図１ｂ−３】
0005752667.tif 000016
【図１ｂ−４】
0005752667.tif 000017
【図２ａ−１】
0005752667.tif 000018
【図２ａ−２】
0005752667.tif 000019
【図２ａ−３】
0005752667.tif 000020
【図２ａ−４】
0005752667.tif 000021
【図２ｂ−１】
0005752667.tif 000022
【図２ｂ−２】
0005752667.tif 000023
【図３】
0005752667.tif 000024
【図４】
0005752667.tif 000025
【図５】
0005752667.tif 000026
【図６−１】
0005752667.tif 000027
【図６−２】
0005752667.tif 000028
【図７−１】
0005752667.tif 000029
【図７−２】
0005752667.tif 000030
【図７−３】
0005752667.tif 000031
【図８−１】
0005752667.tif 000032
【図８−２】
0005752667.tif 000033
【図９−１】
0005752667.tif 000034
【図９−２】
0005752667.tif 000035
【図１０】
0005752667.tif 000036
【図１１】
0005752667.tif 000037
【図１２】
0005752667.tif 000038
【図１３】
0005752667.tif 000039
【図１４ａ−１】
0005752667.tif 000040
【図１４ａ−２】
0005752667.tif 000041
【図１４ｂ−１】
0005752667.tif 000042
【図１４ｂ−２】
0005752667.tif 000043