(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
ａ）  未成熟樹状細胞若しくはその前駆細胞、又は未成熟樹状細胞を少なくとも１種の樹状細胞成熟因子と２〜２４時間接触させて得られる、それらのＩＬ−１２分泌能によって規定されるような部分的に成熟した樹状細胞（半成熟ＤＣ、ｓｍＤＣ）を準備すること；
ｂ）  工程ａ）の細胞を、成熟因子に曝露した樹状細胞内で作用するか又は該樹状細胞から放出され、そしてインターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インドールアミン  ２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ＭＡＰＫＡＰＫ２、ＩＲＦ２、ＰＨＦ１１、ＩＲＦ４、ＪＡＫ１、ＣＥＢＰＢ、ＥＴＶ６、ＲＧＳ１６、ＫＩＡＡ１６５９、ＲＥＬＡ、及びＪＵＮＢから成る群より選択される少なくとも１つのＴリンパ球抑制分子の発現を阻害又は阻止するために、該少なくとも１つのＴリンパ球抑制分子に特異的な阻害性のリボ核酸分子を導入することにより操作すること；及び
ｃ）  工程ｂ）で前駆細胞を操作する場合は、前駆細胞を樹状細胞へ形質転換させる物質を加えること、
を含む方法によって得ることが可能な、部分的に成熟した樹状細胞を含む医薬品。
【請求項２】
未成熟樹状細胞の前駆体、又は未成熟樹状細胞を、皮膚、脾臓、骨髄、胸腺、リンパ節、臍帯血、又は末梢血から得ることを特徴とする、請求項１に記載の医薬品。
【請求項３】
少なくとも１つの樹状細胞成熟因子が、加熱不活性化若しくはホルマリン処理したカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、大腸菌由来リポ多糖（ＬＰＳ）、又は不活性化グラム陽性菌若しくはグラム陰性菌などのＴＬＲのアゴニスト；イミダゾキノリン化合物又はそれらの誘導体；合成２本鎖ポリリボヌクレオチド；天然２本鎖ＲＮＡ若しくはＲＮＡウイルス若しくはＲＮＡの断片、又は合成類似体；又は非メチル化ＣｐＧモチーフを含む合成若しくは天然の核酸分子；サイトカインの組み合わせ；ＣＤ４０Ｌ、又はＣＤ４０Ｌを発現するように遺伝子操作された初代細胞若しくは細胞株、又はＣＤ４０Ｌの発現を生理的に上方制御する活性化Ｔリンパ球から成る群より選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の医薬品。
【請求項４】
操作工程ｂ）の前に、未成熟樹状細胞を少なくとも１つの樹状細胞成熟因子と少なくとも４時間接触させ、部分的に成熟した樹状細胞を生じさせることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬品。
【請求項５】
未成熟又は部分的に成熟した樹状細胞に少なくとも１つの抗原を負荷することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬品。
【請求項６】
少なくとも１つの抗原が、以下の群：
ａ）  腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、又は他のヒト微生物病原体若しくは寄生性病原体から成る群；あるいは
ｂ）  アレルギーを引き起こす環境抗原、疾患を引き起こす免疫応答を開始させる自己抗原、又は移植抗原から成る群、
から選択されることを特徴とする、請求項５に記載の医薬品。
【請求項７】
成熟因子が、ＬＰＳ及び／又はＩＦＮ−γである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬品。
【請求項８】
以下の工程：
ａ）  未成熟樹状細胞を少なくとも１つの樹状細胞成熟因子と２〜２４時間接触させて、それらのＩＬ−１２分泌能によって規定されるような部分的に成熟した樹状細胞（半成熟ＤＣ、ｓｍＤＣ）を作製すること；及び
ｂ）  工程ａ）のＩＬ−１２を放出する部分的に成熟した樹状細胞（半成熟ＤＣ、ｓｍＤＣ）を、成熟因子に曝露した樹状細胞内で作用するか又は該樹状細胞から放出され、そしてインターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インドールアミン  ２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ＭＡＰＫＡＰＫ２、ＩＲＦ２、ＰＨＦ１１、ＩＲＦ４、ＪＡＫ１、ＣＥＢＰＢ、ＥＴＶ６、ＲＧＳ１６、ＫＩＡＡ１６５９、ＲＥＬＡ、及びＪＵＮＢから成る群より選択される少なくとも１つのＴリンパ球抑制性分子の発現を阻害又は阻止するために、該少なくとも１つのＴリンパ球抑制分子に特異的な阻害性のリボ核酸分子を導入することにより操作すること、
を含む樹状細胞作製方法。
【請求項９】
未成熟樹状細胞の前駆体又は未成熟樹状細胞又は部分的に成熟した樹状細胞を、皮膚、脾臓、骨髄、胸腺、リンパ節、臍帯血、又は末梢血から得ることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの樹状細胞成熟因子が、加熱不活性化若しくはホルマリン処理されたカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、大腸菌由来リポ多糖（ＬＰＳ）、又は不活性化グラム陽性菌若しくはグラム陰性菌のようなＴＬＲのアゴニスト；イミダゾキノリン化合物又はそれらの誘導体；合成２本鎖ポリリボヌクレオチド；天然２本鎖ＲＮＡ若しくはＲＮＡウイルス若しくはＲＮＡ断片、又は合成類似体；又は非メチル化ＣｐＧモチーフを含む合成若しくは天然核酸分子；サイトカインの組み合わせ；ＣＤ４０Ｌ、又はＣＤ４０Ｌを発現するように遺伝子操作された初代細胞若しくは細胞株、又はＣＤ４０Ｌの発現を生理的に上方制御する活性化Ｔリンパ球から成る群より選択されることを特徴とする、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
操作工程ｂ）の前に、未成熟樹状細胞を少なくとも１つの樹状細胞成熟因子と少なくとも４時間接触させることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
未成熟又は部分的に成熟した樹状細胞に少なくとも１種の抗原を負荷することを特徴とする、請求項８〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの抗原が以下の群：
ａ）  腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、又は他のヒト微生物病原体若しくは寄生性病原体から成る群；あるいは
ｂ）  アレルギーを引き起こす環境抗原、疾患を引き起こす免疫応答を開始させる自己抗原、又は移植抗原から成る群、
から選択されることを特徴とする、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
成熟因子が、ＬＰＳ及び／又はＩＦＮ−γである、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項８〜１４のいずれか１項記載の方法によって得ることが可能な樹状細胞。
【請求項１６】
請求項１５記載の樹状細胞を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１５記載の樹状細胞又は請求項１〜７のいずれか１項記載の医薬品の、がん及び／又は微生物若しくは寄生虫感染を治療及び／又は予防するため；あるいはアレルギー、自己免疫疾患、又は幹細胞若しくは臓器移植拒絶を治療及び／又は予防するための医薬を製造するための使用。
【請求項１８】
医薬が、放射線療法及び／又は抗腫瘍若しくは抗微生物化学療法、あるいはアレルギー、自己免疫疾患、又は幹細胞若しくは臓器移植拒絶の治療を目的とした療法の前に、同時に、又は後に個体へ投与されることを特徴とする、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
請求項１５記載の樹状細胞又は請求項１〜７のいずれか１項記載の医薬品の、アレルゲンのような環境抗原に対する免疫系、又は自己免疫疾患における自己抗原に対する免疫系の病的過剰反応によって引き起こされる免疫疾患を治療及び／又は予防するための医薬を製造するための使用。
【請求項２０】
医薬が、アレルギー又は自己免疫疾患の治療又は予防を目的とした他のモダリティの前に、同時に、又は後に個体へ投与されることを特徴とする、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
請求項１５記載の樹状細胞又は請求項１〜７のいずれか１項記載の医薬品の、同種異系幹細胞移植の免疫学的拒絶を治療及び／又は予防するため、又は同種異系臓器移植の拒絶を治療及び／又は予防するための医薬を製造するための使用。
【請求項２２】
医薬が、同種異系幹細胞移植又は臓器移植の拒絶の治療又は予防を目的とした他のモダリティの前に、同時に、又は後に個体へ投与されることを特徴とする、請求項２１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹状細胞（ＤＣ）を作製及び遺伝子操作するための方法、並びにその使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、樹状細胞（ＤＣ）は、免疫の中心的調節因子として認識されている。ヒトＤＣは、成長因子、典型的にはインターロイキン（ＩＬ）４及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の存在下、造血幹細胞又は末梢血単球から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化によって産生される。最近の証拠は、ＤＣが微生物によるストレス、心的外傷性ストレス、又は代謝性ストレスとの遭遇に対して柔軟に反応する能力を有することを示唆している。このように、ＤＣは、特定機能、例えば活性化又は寛容化、１型又は２型Ｔヘルパーリンパ球（Ｔｈ１、Ｔｈ２）分極を果たす１つのサブタイプへ分化するだけでなく、所定の環境で遭遇する挑戦に対して好適な時間−動態様式で異なる機能状態もとる（図１）。
【０００３】
単球は血流から離れて各種組織に入り、慣用的に未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）と称するものになる。これらのｉＤＣは、細胞外液からの物質、及び生理学的死滅細胞、プロセスからのアポトーシス小体をとることによって、それらの環境の見本をとり、共刺激なしでＴリンパ球に対する寛容誘導型でこの物質を提示する前哨である。寛容を誘導するｉＤＣ表現型は、ＤＣの初期設定状態と考えることができる。ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、炎症性サイトカイン、又はＴリンパ球由来シグナル伝達によって伝達され、最も顕著にはＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用によって介在される病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）であり得る危険なシグナルにｉＤＣが遭遇するまで、この状態は維持される。このプロセスはＤＣ成熟と称し、一連の機能変化と同時に起こる。これらの機能変化はおよそ２日間にわたって起こり、その後、ＤＣは成熟ＤＣ（ｍＤＣ）と称する状態に達する。最も顕著なのは、ＤＣは、Ｂ７ファミリーメンバーＣＤ８０及びＣＤ８６のような共刺激分子を上方制御し始める。これは、ＤＣに、抑制性シグナルよりもむしろ活性化シグナルを、ＤＣ膜上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子との複合体で抗原性ペプチドと相互作用可能なＴ細胞受容体を有するＴリンパ球へ送達させる。この段階で、刺激依存性分極も生じ、ＤＣは、1型免疫応答を好むＩＬ−１２及びＩＬ−１２ファミリーサイトカインを分泌し、その後、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって介在される細胞性免疫を支持する。ＩＬ−１２分泌は、ＴＬＲとそれらのリガンドとの連結、例えばＴＬＲ４のＬＰＳとの連結によって一般的に誘発されるが、可溶性又は細胞膜結合性のＣＤ４０Ｌ分子とＤＣ上のＣＤ４との相互作用によっても誘導される。逆に、ＩＬ−１２放出の欠如は、Ｂリンパ球を支持することにより、液性免疫応答を開始する２型分極を誘発する。ＩＬ−１２分泌のないＤＣ成熟の開始は、ＴＮＦ−α及びＰＧ−Ｅ２、並びに限定されるものではないが、Ｉ型及びＩＩ型インターフェロン、ＩＬ−１、又はＩＬ−６を含めた各種炎症性サイトカインを典型的には含有するサイトカインカクテルへのｉＤＣの曝露によって達成される。
【０００４】
ＩＬ−１２放出は約２４時間後に停止し、ＤＣとＴリンパ球との遭遇がその時間ウィンドウ内で生じ、有効な１型分極及びＣＴＬ活性化を可能にすることが必要であることを示している。逆に、共刺激性分子の発現は２日後にその最大に達する。定義によって成熟ＤＣは、機能的にではなく表現型の上で共刺激性分子の最大発現のみを特徴とするため、ＩＬ−１２を放出する１型分極ＤＣは半成熟（ｓｍ）ＤＣと称する。
【０００５】
およそ２日後、ＤＣはいわゆる成熟期に達する。その分化の第２日目に、ＤＣは免疫刺激能を喪失し、負の調節フィードバックループを介在する分子の上方制御によって免疫抑制性を獲得する（図１）。この分化期の生物学的意義は、厳密な制御下で免疫応答を維持することの必要性である。活性化免疫細胞、特に他の細胞を死滅させるＣＴＬは、生物に対してかなりの脅威をもたらす。これは、対照を避けた免疫応答の病的な結果：Ｉ型糖尿病又は多発性硬化症のような自己免疫疾患によって例示される。したがって、成熟シグナルに遭遇後第１日目に免疫応答を準備する同一ＤＣは、分化プロセスの第２日目にこの同一免疫応答を弱めるであろう。したがって、成熟ＤＣは、実際、元々考えられていた免疫刺激性細胞ではなく、むしろ免疫抑制性細胞であり、したがって、がん免疫療法又は微生物疾患の治療における使用のような、免疫刺激を目的とした治療的介入には不適切である。
【０００６】
未成熟（寛容維持）ＤＣ、半成熟（免疫刺激性）ＤＣ、及び成熟（免疫抑制性）ＤＣを区別することが重要である（図１）。先に概説したようなｉＤＣは自己抗原に対して寛容を維持する。ｓｍＤＣは上記成熟刺激のうち１つに遭遇し、およそ２日以内にｍＤＣへの分化を不可逆的にコミットされている。重要なことは、それら２日間のうち最初の１日目にのみ、ＩＬ−１２放出、Ｉ型免疫分極の開始、及びその結果としてＣＴＬ介在免疫応答の支持を可能にする。いったん成熟ＤＣが１日後に分化の第２期に入ると、免疫抑制性を獲得する。ｍＤＣをＣＤ８０、ＣＤ８３、又はＣＤ８６のような膜分子の発現によって特徴付けることは免疫学者のあいだでは慣例的なことである。しかしながら、２、３時間以内に最大発現に達し、２４時間後に消失するＩＬ−１２とは異なり、これらの膜分子は４８時間後にのみ最大発現に達する。本明細書に記載のＩＬ−１２分泌ＤＣを、成熟ＤＣという名称によって慣用的に理解されているものと明確に区別するために、半成熟ＤＣという用語を選択した。非常に重要なことは、これは、ある種の機能的欠損ではなく、図１における時間−動態スケールで特定の分化期のみを暗示する。ｓｍＤＣは機能的にｉＤＣともｍＤＣとも異なる。
【０００７】
特許文献１は、ＣＤ４０ＬをコードするｍＲＮＡ分子でトランスフェクトされた成熟樹状細胞に関するものである。
非特許文献１は、ＣＤ４０Ｌをコードするウイルスによる未成熟樹状細胞のトランスフェクションについて記載している。ＣＤ４０Ｌはこれらの樹状細胞を成熟させるために必要である。
【０００８】
非特許文献２には、ＣＤ４０Ｌをコードするウイルスによる未成熟樹状細胞のトランスフェクションが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ２００７／１１７６８２号
【特許文献２】ＷＯ００／４７７１９号
【特許文献３】ＷＯ９９／０３４９９号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｋｏｙａ  Ｒ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈ．２６（２００３）：４５１−４６０
【非特許文献２】Ｌｉｕ  Ｙ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９（２００２）：２０２−２０８
【非特許文献３】Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３（１９９２）
【非特許文献４】Ｎａｂｅｌ及びＦｅｌｇｎｅｒ、ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：２１１−２１７（１９９３）
【非特許文献５】Ｍｉｔａｎｉ及びＣａｓｋｅｙ、ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６２−１６６（１９９３）
【非特許文献６】Ｄｉｌｌｏｎ、ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６７−１７５（１９９３）
【非特許文献７】Ｍｉｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０（１９９２）
【非特許文献８】Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）
【非特許文献９】Ｖｉｇｎｅ、Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８：３５−３６（１９９５）
【非特許文献１０】Ｋｒｅｍｅｒ及びＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５１（１）：３１−４４（１９９５）
【非特許文献１１】Ｈａｄｄａｄａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｄｏｅｒｆｌｅｒ及びＢｏｈｍ（編）（１９９５）
【非特許文献１２】Ｙｕら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１３−２６（１９９４）
【非特許文献１３】Ｂａｓｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４２８−２９（２００１）
【非特許文献１４】Ｅｌｂａｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−９８（２００１）
【非特許文献１５】Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６−１１（１９９８）
【非特許文献６】ＲＭ  Ｓｔｅｉｎｍａｎ及びＪ  Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ、Ｎａｔｕｒｅ、第４４９／２７巻、２００７年９月、第４１９−４２６頁
【発明の概要】
【００１１】
本発明の目的は、遺伝子操作に基づいた樹状細胞の作製方法を提供することである。これらの樹状細胞は、医薬品の調製に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ＤＣ分化プロセス動態の略図におけるＤＣの発達可塑性を示す。
【図２】図２は、ｓｍＤＣ１の基本的デザインの品質管理を示す。
【図３】図３は、ＣＤ４０Ｌ遺伝子導入の結果を示す。
【図４】図４は、ＩＬ−１２及びＩＬ−１０の分泌の量及び質を示す。
【図５】図５は、細胞溶解活性のポテンシャル（四角、ＣＤ４０ＬトランスジェニックＤＣ；菱形、ＧＦＰトランスジェニックＤＣ；三角、対照ＤＣ）を示す。
【図６】図６は、ＩＬ−１０発現をブロックされたＬＰＳ活性化ＤＣの免疫刺激能を示す。
【図７】図７は、ＩＤＯ発現を沈黙させたＬＰＳ活性化ＤＣの免疫刺激能を示す。
【図８】図８は、ＤＣ発現プロファイリング実験の実験計画を示す。
【図９ａ】図９ａは、ＲＮＡ干渉を用いた発現プロファイリング実験において同定されたＤＣにおいて標的分子の発現をノックダウンさせた後の増殖性応答の改善例を示す。
【図９ｂ】図９ｂは、ＤＣ中のそれらの発現をｓｉＲＮＡでノックダウンさせた後、そのように遺伝子操作されたＤＣの、表示の対照ｓｉＲＮＡトランスフェクション又は非トランスフェクトＤＣと比較した、表示の同種異系リンパ球に対する刺激能を改善させる遺伝子の更なる例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、以下の工程：
ａ）  未成熟樹状細胞を少なくとも１種の樹状細胞成熟因子と接触させて、それらのＩＬ−１２分泌能によって規定されるような部分的に成熟した樹状細胞（半成熟ＤＣ、ｓｍＤＣ）を作製することによって得ることが可能な未成熟樹状細胞若しくはその前駆細胞又は部分的に成熟した樹状細胞を準備すること；
ｂ）  工程ａ）の細胞、特に工程ａ）のＩＬ−１２を放出する部分的に成熟した樹状細胞（半成熟ＤＣ、ｓｍＤＣ）を、
（ｉ）  少なくとも２４時間、好ましくは少なくとも４８時間の継続ＩＬ−１２分泌を特徴とする樹状細胞のＴリンパ球刺激能を維持可能な、ＣＤ４０Ｌから成る群より選択される少なくとも１つの免疫分子を、該少なくとも１つの分子をコードする核酸分子を導入することにより過剰発現させるために；及び／又は
（ｉｉ）  樹状細胞内で活性であるか又は樹状細胞からＴ細胞へ送達される、少なくとも１つのＴリンパ球抑制分子の発現を阻害又は阻止するために、該少なくとも１つのＴリンパ球抑制分子をコードする遺伝子又はその断片をノックアウトすることにより、又は核酸分子、好ましくはリボ核酸分子を導入することにより、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γのような第１の成熟因子に曝露した樹状細胞内で作用するか又はＬＰＳ／ＩＦＮ−γのような第１の成熟因子に曝露した樹状細胞から放出され、そしてインターロイキン１０（ＩＬ−１０）及びインドールアミン  ２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）から成る群より選択される、表３、表４及び／又は表５に提示される遺伝子のうち少なくとも１つのような該少なくとも１つのＴリンパ球抑制性分子の発現を阻害又は阻止するために、
操作すること；及び
c)  場合により、物質を加えて樹状細胞の前駆細胞を樹状細胞へ形質転換させること、
を含む方法によって得ることが可能な、部分的に成熟した樹状細胞を含む医薬品に関するものである。
【００１４】
本発明による医薬品は、本明細書に開示の方法によって得ることが可能な樹状細胞を含む。樹状細胞は、ＣＤ４０Ｌのような免疫刺激に寄与する分子の過剰発現を目的とした遺伝子操作、又はＩＬ−１０若しくはＩＤＯのような免疫抑制分子、及びＤＣにおいてＩＬ−１０及びＩＤＯに類似した発現動態を示す、以下の表３、表４、及び表５に列挙した新たに同定された分子の発現をノックダウンすることを目的とした遺伝子操作に付される。遺伝子操作は、造血幹細胞などのいかなるＤＣ又は前駆細胞に実施してもよく、これらの樹状細胞は、ＴＬＲリガンド、炎症性サイトカインカクテルのような成熟因子に曝露するか、又はＣＤ４０Ｌ介在シグナルのようなＴ細胞由来シグナルに曝露するかは問題ではなく、あるいは未成熟ＤＣから成熟ＤＣへの表現型の転換を誘発することを目的とした他の手順に付されてもよく、あるいはそれらは未成熟期にあってもよい。（遺伝子）操作は、成熟刺激への曝露前に実施しても、後に実施してもよい。成熟刺激（又は成熟刺激の組み合わせ）は短時間のみ適用することが好ましく、例えば２４時間以内、１２時間、特に好ましくは６時間であるが、６時間未満でもよい。ＤＣへの短い（少なくとも２時間）成熟刺激の好適な適用は、ＤＣ免疫医薬が患者への接種後Ｔ細胞刺激開始能を高率で保持することを保証する。ＤＣの遺伝子操作は、基本的な免疫刺激能の改善を目的としており、それを置き換えることを意図するものではない。
【００１５】
本発明の医薬品の樹状細胞の作製に使用される樹状細胞の前駆細胞は、樹状細胞へ形質転換される必要がある。これを達成するための手段及び方法は、当該技術分野において公知である。
【００１６】
「樹状細胞の前駆細胞」は、単球、造血細胞などを包含する。
本発明の他の側面は、以下の工程を含む、樹状細胞作製方法に関するものである：
ａ）  未成熟樹状細胞を準備すること：
ｂ）  未成熟樹状細胞を少なくとも１つの樹状細胞成熟因子と接触させて、それらのＩＬ−１２分泌能によって規定されるような部分的に成熟した樹状細胞（半成熟ＤＣ、ｓｍＤＣ）を作製すること：及び
ｃ）  工程ｂ）のＩＬ−１２を放出する部分的に成熟した樹状細胞（半成熟ＤＣ、ｓｍＤＣ）を、
（ｉ）  少なくとも２４時間、好ましくは少なくとも４８時間、又はそれより長い継続ＩＬ−１２分泌を特徴とする樹状細胞のＴリンパ球刺激能を維持可能な、ＣＤ４０Ｌから成る群より選択される少なくとも１つの免疫分子を、該少なくとも１つの分子をコードする核酸分子を導入することにより過剰発現させるために、；及び／又は
（ｉｉ）  ＬＰＳ／ＩＦＮ−γのような第１の成熟因子に曝露した樹状細胞内で作用するか、又はＬＰＳ／ＩＦＮ−γのような第１の成熟因子に曝露した樹状細胞から放出される、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）及びインドールアミン  ２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）から成る群より選択される、表３及び表４に提示された遺伝子のうち少なくとも１つのような少なくとも１つのＴリンパ球抑制分子の発現を阻害又は阻止するため、該少なくとも１つのＴリンパ球抑制分子をコードする遺伝子又はその断片をノックアウトすることにより、又は核酸分子、好ましくはリボ核酸分子を導入することにより、樹状細胞内で活性であるか又は樹状細胞からＴ細胞へ送達される、少なくとも１つのＴリンパ球抑制分子の発現を阻害又は阻止するために、
操作すること。
【００１７】
上記方法の工程ｂ）の遺伝子操作されたＩＬ−１２放出ＤＣは、該少なくとも１つの免疫刺激分子をコードする核酸分子を導入することにより２４時間以上維持された分泌を特徴とする、Ｔリンパ球刺激時間ウィンドウを延長すること及び／又は２４時間後その終了を完全に阻止することが可能な少なくとも１つの分子を過剰発現し；又は成熟後２４時間の開放を開始するＴリンパ球抑制時間ウィンドウに刺激性のＴリンパ球からの有効な成熟刺激への曝露後、ＤＣの正常な発達の進行に関与する少なくとも１つの分子の阻害又は下方制御された発現を示し；及び／又は発達して免疫抑制表現型をとるＤＣによるＴリンパ球抑制を介在する機能を果たす少なくとも１つの分子の発現を阻害又は阻止する。これは、該少なくとも１つの分子をコードする遺伝子若しくはその断片をノックアウトすることによって；及び／又は核酸分子、好ましくはリボ核酸分子を導入することにより、免疫刺激性から免疫抑制性の表現型への、成熟刺激への曝露後ＤＣの正常な発達を妨げる少なくとも１つの分子の発現を阻害又は阻止することによって；及び／又はこのＴ細胞の活性の抑制、そして免疫応答の抑制を引き起こす、ＤＣからＴ細胞へ送達されるシグナルを妨げることによって、達成される。本発明の樹状細胞は、遺伝子操作を用いることによりＴリンパ球刺激、特にＣＴＬ活性化を最大にしておよそ２４時間の刺激性時間ウィンドウを広げ、又は２４時間後のこの刺激性時間ウィンドウの終了を完全に阻止する。ＩＬ−１０又はＩＤＯの代わりに、成熟刺激への曝露後およそ２４時間に開始されるＤＣの免疫抑制機能に関与する他の分子を用いてもよい（表３、表４、及び表５）。遺伝子操作された免疫刺激性ＤＣの製造において標的とされるのはこれらの分子であることが好ましい。提示したＤＮＡマイクロアレイデータ（表３及び表４）において２倍の過剰発現を示す分子を用いることが特に好ましく、少なくとも６倍の過剰発現を示す分子を用いることがより好ましい。表３及び表４に提示した数は、各欄の見出しに示すように、倍数過剰発現を示す。図９に表した例において立証されるように、ＤＣ免疫医薬において免疫抑制に関与すると思われる分子の発現をノックダウンさせることが特に好ましい。
【００１８】
先に概説した戦略を逆転させることにより、遺伝子操作されたＴリンパ球抑制性ＤＣ免疫医薬を設計して、免疫系の病理学的に過剰な活性、例えばアレルギー又は自己免疫疾患、並びに幹細胞移植及び臓器移植を治療することが可能である。免疫抑制は、成熟刺激への曝露後２４時間以上の分化したＤＣにより生理学的に介在される。そのようなＤＣの免疫抑制能は、先に概説した戦略に従いＤＣを遺伝子操作することによって、ＤＣ分化の最初の２４時間Ｔリンパ球刺激分子の発現を妨げることにより；及び／又はＴリンパ球抑制を付与する分子を過剰発現させることにより、促進される。
【００１９】
遺伝子操作の標的としてのｓｍＤＣの使用は、本発明の中心となる重要な部分である。過去に発表されたｍＤＣの免疫刺激効果は、主に、これらの実験の多くが実施された非常に人工的な実験設定、例えばＤＣの実際の標的の代わりに自然に存在しない合成ペプチドを使用すること：ＤＣによる取り込み及びプロセシングとは全く異なるメカニズムを必要とする天然タンパク質抗原分子又は全細胞でさえ使用すること、によるものである。多くの他の研究者達は、研究にマウス系を用いており、ヒトとマウスには多くの混乱を引き起こす重大な相違が存在している。しかしながら、今では、ｍＤＣには免疫抑制性があることが一般に受け入れられている。驚くべきことに、本発明による方法を用いて得た樹状細胞は、より広い刺激性ウィンドウ（即ちＩＬ−１２発現の増加及び延長）を示すことが分かった。ＣＤ４０Ｌ分子を過剰発現させるための半成熟（ｓｍ）ＤＣ−生理学的分化工程がＤＣからのＩＬ−１２分泌を誘発可能な成熟刺激への曝露により開始されるが、好ましくは２〜１２時間後、より好ましくは６時間後に終了するＤＣ−の遺伝子操作は、そのＴリンパ球刺激能を少なくとも２４時間、好ましくは４８時間、５日間又は１０日間でさえ維持する能力があることがわかった。そのように遺伝子操作されたＤＣをＩＦＮ−γ含有培地中で培養することが更に好ましい。そのようなＤＣは、典型的にはＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドへの６時間曝露、好ましくは単独ではないがリポ多糖（ＬＰＳ）への曝露により、好ましくはＩＦＮ−γ存在下での曝露により−表１を参照されたい−そしてＣＤ４０Ｌを過剰発現させるための遺伝子操作により、ｓｍＤＣにし、少なくとも１日、好ましくは３日、最大５日のＩＬ−１２継続分泌、及び少なくとも２４時間、好ましくは４８時間、最大５日の同種異系混合白血球反応（アロＭＬＲ）における免疫刺激能の維持を特徴とする表現型をとる。ＤＣ免疫医薬の設計に適用することにより、これは、ＤＣ分化の初期免疫刺激ウィンドウ及び後期免疫抑制ウィンドウの存在、並びに関連する機能を確認する。したがって、刺激性ＤＣ免疫医薬の開発における一般原則は、初期免疫刺激ウィンドウを広げてより有効に免疫活性化を誘発し、後期免疫抑制ウィンドウを縮小又は閉じ、その逆で抑制性ＤＣ免疫医薬を設計することであり得る（図１）。
【００２０】
一般に、例えばがん又は感染症を治療するための免疫刺激性ＤＣ医薬（「ＤＣ免疫医薬」；「免疫医薬」）を作製するために、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γのような初期成熟刺激をＤＣへ適用してｉＤＣからｓｍＤＣへの生理学的分化を開始する必要がある。他のＴＬＲリガンド（表１）は、ＬＰＳと同一の目的を果たし得る；ＴＬＲリガンドの組み合わせは、より強力であるが質的に異なるシグナルを与え得る。Ｔリンパ球刺激性ＤＣ免疫医薬の刺激ポテンシャルが、ＴＬＲリガンド介在成熟刺激へ初期曝露することなく、遺伝子導入の人工的操作のみに基づいている場合（例えば未成熟ＤＣの直接遺伝子操作による）、ＤＣ機能への重要な寄与は失われ、Ｔリンパ球刺激性ＤＣ免疫医薬はその完全なポテンシャルに到達することができない。本発明の遺伝子操作されたＤＣ免疫医薬と、成熟因子又はその組み合わせ、例えばＬＰＳ／ＩＦＮ−γへの曝露のみで製造されたＤＣ免疫医薬（ｓｍＤＣ）との重大な相違点は、後者に関し、ｓｍＤＣ免疫医薬はＤＣ分化の対応する短いウィンドウのあいだに適用されることが重要であるということである。したがって、そのような刺激性ＤＣ免疫医薬は成熟刺激への曝露後すぐに適用する必要があり、一方、例えばＣＤ４０Ｌの過剰発現による遺伝子操作は、ＤＣ分化の免疫刺激性時間ウィンドウを広げることを目的とし、より短時間の重大な適用を可能にするが、最も重要なことは、免疫刺激性表現型から免疫抑制性表現型へのＤＣの発達を妨げることである（図１）。ＤＣの免疫刺激能の同程度の改善は、公知の免疫抑制性分子ＩＬ−１０又はＩＤＯの発現（図３、図４及び図５に列挙）に類似する発現プロファイルによって示されるような、免疫抑制に決定的に関与することが疑われる分子；又は免疫抑制に関与することが既に示されている分子をノックダウンさせることにより達成することができる。ＤＣにおいてそれらをノックダウンさせることは操作されたＤＣのＴ細胞刺激能を改善するからである（図９）。また、旧来のｓｍＤＣ免疫医薬の免疫刺激性時間ウィンドウは、２４時間後に閉じ、一方、新規の遺伝子操作されたＤＣ免疫医薬は、そのＴリンパ球刺激性ポテンシャルを少なくとも１日、好ましくは３日、最大５日以上維持する。同程度の概念がＴリンパ球抑制性ＤＣ免疫医薬にもあてはまる。ＤＣ分化のＴリンパ球抑制性ウィンドウに対応するｍＤＣ表現型への分化を開始するには、未成熟ＤＣを最初にＬＰＳ／ＩＦＮ−γのような慣用の成熟刺激へ曝露する必要がある。ＤＣ免疫医薬からＴリンパ球抑制性分子を過剰発現させるための遺伝子操作は、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γのような成熟刺激による未成熟ＤＣの成熟前に行うことができるだけでなく、末梢血由来の単球、又は造血幹細胞及び前駆細胞のようなＤＣの前駆細胞を標的にする場合、特に、排他的ではないが、レトロウイルス遺伝子導入のようなゲノムへの安定な組み込みをもたらす遺伝子導入法を用いる場合にも行うことができる。成熟刺激への曝露前の遺伝子操作に加えて、遺伝子操作は、例えばＬＰＳ／ＩＦＮ−γによる成熟開始後６時間、最大４８時間に行うことができる。未成熟ＤＣを遺伝子操作して免疫抑制性分子を過剰発現させる場合、成熟刺激への曝露後２４時間を超えるＤＣの生理学的Ｔリン��球抑制活性による重大な寄与は失われ、この理由のため、遺伝子操作の前（前駆細胞レベルであっても）又は後でのこれらＤＣのＬＰＳ／ＩＦＮ−γのような成熟刺激への曝露との組み合わせでのみ、ＤＣの遺伝子操作が好まれる。Ｔリンパ球抑制性ＤＣ免疫医薬を遺伝子操作することなく、そのような抑制性ＤＣ免疫医薬は、ＤＣ分化の抑制性ウィンドウのあいだに適用する必要があり、一方、Ｔリンパ球活性の抑制を介在する分子を過剰発現させるために遺伝子操作されたＴリンパ球抑制性ＤＣ免疫医薬は、非常に柔軟な患者への投与を可能にする。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
遺伝子操作の前又は後にＬＰＳ／ＩＦＮ−γ又は類似の成熟刺激も受けているＤＣを遺伝子操作してＴリンパ球刺激性分子及び免疫刺激性ウィンドウの終了を妨げる分子を過剰発現させることにより、ＤＣ分化は、ＤＣ分化の免疫刺激性時間ウィンドウを広げることが可能になる。ＤＣから発現されたＣＤ４０と活性化Ｔリンパ球から発現されたＣＤ４０Ｌとの相互作用は、強力な活性化及び成熟シグナルをＤＣへ送達するため、ＣＤ４０Ｌ遺伝子導入を用いることで本発明の実施可能性を立証することが選択された。そのような実験は、ＤＣの成熟において重要な共因子であるＩＦＮ−γの存在下で実施されることが好ましく、実施例で報告したＣＤ４０Ｌトランスジェニック細胞を用いる全ての実験は、ＩＦＮ−γ存在下で行った。ＣＤ４０Ｌ遺伝子導入と同一の原理は、ＤＣに刺激能改善を付与する他の分子に適用することができる。あるいは、Ｔリンパ球抑制性ＤＣ免疫医薬は、ＣＤ４０又はＩＬ−１２又は類似分子のような分子の発現をノックアウトすることにより、又はＴリンパ球抑制を付与する分子をＤＣ免疫医薬から過剰発現させることにより設計することができる。
【００２３】
Ｔリンパ球抑制性分子の発現及び／又は機能を妨げることによって、ＤＣ分化の免疫抑制性ウィンドウを閉じるか狭くするかより遅い時点に動かすことことができる。このアプローチの実行可能性は、ＤＣによるＴリンパ球活性化を妨げる分子の発現をノックダウンさせることにより立証される。ＤＣ由来Ｔリンパ球抑制性シグナル、例えば活性化Ｔリンパ球が大きく依存しているトリプトファンを活性化Ｔリンパ球に対しアポトーシス促進効果を有するキヌレニンへ代謝する酵素ＩＤＯをノックダウンさせることによるＴリンパ球機能の改善を実施例の欄に示す。第２の例として、原型免疫抑制性分子であると考えられ、免疫抑制性の分化時間ウィンドウのあいだにＤＣによって発現されるＩＬ−１０の発現を標的にした。標的分子発現をノックダウンさせるには、ＲＮＡ干渉を用いることが好ましいが、１本鎖モノクローナル抗体又はアンチセンスＲＮＡの細胞内発現のような他の技術も同一目的を果たすことができる。あるいは、当該分子（例えばＩＤＯ又はＩＬ−１０）又は類似分子の過剰発現は、未成熟のｓｍＤＣに基づいたＴリンパ球抑制性ＤＣ免疫医薬の設計に役立つことができる。実施例の欄の結果（図９）は、ＩＬ−１０及び／又はＩＤＯに匹敵する発現動態を有する分子の発現をノックダウンさせることも遺伝子操作されたＤＣのＴ細胞刺激能改善をもたらすことを示している。
【００２４】
ＤＣの発達期を考慮したダイナミックな様式でＤＣの構造及び特性を記載する必要がある。これらの期のそれぞれはある種のマーカー分子の不在又は存在によって特徴付けることができる。これは、ＤＣの分子の特徴は、このＤＣの分化の特定の期及びＤＣにある種の分化経路をとらせる条件に依存していることも示す。ＤＣの発達可塑性も、半成熟１型ＤＣ（ｓｍＤＣ１）（「インターロイキン１２の放出を特徴とするＴ細胞活性化樹状細胞」）と称するものを用いることが何故有益であるかを説明する。寛容維持機能から免疫刺激期へのスイッチを開始するには、ＤＣを成熟刺激（樹状細胞成熟因子）へ曝露させる必要がある。これは、ＬＰＳとＩＦＮ−γとの組み合わせ又はＤＣ産生培地へ添加される類似の試薬への応答としてＤＣが最も多くＩＬ−１２を放出する免疫刺激性時間ウィンドウを開く。ＩＬ−１２はヘルパーＴリンパ球上の特異的受容体を介して作用してＴｈ１表現型にし、細胞溶解性免疫を支持する。このＤＣ／Ｔリンパ球相互作用及び細胞溶解性免疫を発達させるには、ＤＣは免疫刺激性ウィンドウの初期の時点で生物（例えばヒト）に接種されることが好ましい。ＤＣは成熟刺激後６時間に注射されることが特に好ましい。明らかに、接種は、樹状細胞成熟因子（例えば刺激性分子ＬＰＳ及びＩＦＮ−γ）を含有するＤＣ培地の除去を伴う。２時間、好ましくは４時間、より好ましくは６時間の成熟因子（例えばＬＰＳ及びＩＦＮ−γ）への曝露によって、十分に維持可能なシグナルがＤＣへ伝達され、その結果、曝露後、ＤＣは成熟過程を終了し、リガンド、即ちＤＣ成熟因子の存在にもはや依存しないように不可逆的にコミットされる。しかしながら、形式的には、適用時、ＤＣは１〜２日を要する成熟過程をまだ終了していない。ｓｍＤＣ１の設計は、成熟開始後最初の２４時間のあいだ及び免疫抑制性時間ウィンドウが開き、免疫応答の下方調節を開始する前の、免疫刺激性時間ウィンドウの最適な利点をとる。
【００２５】
ＬＰＳ／ＩＦＮ−γのような成熟刺激への曝露後初期に、ＤＣは強力な免疫活性化特性を有し（活性化ウィンドウ、図１）、一方、発達後期には、免疫抑制期に入る（抑制性ウィンドウ、図１）。Ｔ細胞活性化の分子メカニズムは十分に研究され理解されている。負の調節フィードバックループの分子の性質及び負の調節フィードバックループを開始するイベントは、あまり多くは研究されていない。したがって、本発明によるＤＣ免疫医薬の設計は、免疫活性化を促進するために免疫刺激性ウィンドウを広げること、及び免疫抑制性ウィンドウの縮小又は閉鎖を目的とし、したがって、ＤＣにおいて負の調節フィードバックループをブロックする。これは、遺伝子操作の前又は後にそれらをＬＰＳ／ＩＦＮ−γのようなＤＣ成熟因子へ曝露することに加えて免疫刺激性遺伝子を過剰発現させることにより、又は免疫抑制性遺伝子をＲＮＡ干渉を用いてノックダウンさせることにより、ＤＣを遺伝子操作することによって達成される。多数の免疫刺激性又は免疫抑制性遺伝子の発現は、同一の基本原理に従って調節することができる。免疫刺激性ＣＤ４０Ｌ分子を過剰発現させること又は免疫抑制性分子ＩＬ−１０及びＩＤＯをノックダウンさせることによるこのアプローチの実施可能性を実施例の欄に示す。過剰発現とノックダウンとの組み合わせは、ＤＣ免疫医薬の効力を高めることができるが、同一の基本論理に従う。免疫系の病的な過活性を治療するためのＴリンパ球抑制性ＤＣ免疫医薬は、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γのような成熟刺激に最初に曝露したＤＣを遺伝子操作することによって、得られたｓｍＤＣを遺伝子操作してＤＣにおいて免疫抑制分子を過剰発現及び／又は免疫刺激性分子をノックダウンさせることによって、Ｔリンパ球刺激性ＤＣ免疫医薬と同様に設計することができる。
【００２６】
本発明に記載の遺伝子操作に基づいた新規のＴリンパ球刺激性又は抑制性ＤＣ免疫医薬によれば、部分的に成熟したｓｍＤＣは、少なくとも１つの免疫刺激性又は免疫抑制性分子をコードする核酸分子及び／又は核酸分子、好ましくはリボ核酸分子（例えばｓｉＲＮＡ）をＤＣへ導入することにより操作され、少なくとも１つの免疫抑制性又は免疫刺激性分子の発現を阻害又は阻止する。
【００２７】
ＤＣにおける免疫刺激性及び免疫抑制性分子の発現は、各種方法によって影響又は誘導され得、先に概説したように核酸分子を導入することにより発現を調節することが好ましい。例えば、核酸分子導入は、レンチウイルス遺伝子導入ビヒクル及びリポソーム介在トランスフェクションで達成することができる。しかしながら、同一原理は、レトロウイルス若しくはアデノウイルスのような他のウイルスベクター、又は遺伝子銃若しくはポリカチオン技術のような非ウイルスベクター、あるいは他の遺伝子導入を用いる場合に当てはまるであろう。
【００２８】
外来遺伝子を細胞へ導入するための、プラスミド又はＤＮＡリポソーム複合体の直接注射及び改変ウイルスによる感染を含めたいくつかの戦略が開発されている。しかしながら、安全性及び効率は、そのような遺伝子導入法を用いる療法プロトコールを開発する際に考慮すべき重要な点である。例えば、１つの組織との関連で治療的なタンパク質は、他に対して有害であり得る。したがって、治療的配列の発現を適切な細胞に限定することができる転写的に標的にされるベクターは特に望ましい。更に、特定タンパク質の治療的ウィンドウが存在する場合があり、特定閾値以下又は以上の発現レベルは、それぞれ有効でないか又は毒性であり得る。したがって、構築体を作製し、発現の外来対照を可能にする方法を考案することも望ましく、その結果、治療的タンパク質のレベルは、治療的必要性に従って増加させるか又は低下させることができる。
【００２９】
慣用のウイルス及び非ウイルスに基づいた遺伝子導入法を用いて、それぞれの分子をコードする核酸、あるいは、当該分子の転写又は翻訳を阻害するｓｉＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡのような核酸を本発明のＤＣへ導入することができる。非ウイルスベクター送達系には、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、及び核酸とリポソームのような送達ビヒクルとの複合体が含まれる。ウイルスベクター送達系には、ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが含まれ、細胞への送達後エピソーム性ゲノム又は組み込まれたゲノムを有する。遺伝子送達手順の概説として、非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；並びに非特許文献１２を参照されたい。
【００３０】
小さな干渉ＲＮＡ分子を用いることもできる。哺乳類細胞では、長いｄｓＲＮＡ（＞３０ヌクレオチド）の導入は、タンパク質合成及びＲＮＡ分解の非特異的阻害によって例示される、強力な抗ウイルス性応答を開始することが多い。ＲＮＡ干渉の現象は、例えば非特許文献１３；非特許文献１４；及び非特許文献１５に記載され、考察されており、干渉ＲＮＡの作製方法も考察されている。本発明に用いるｓｉＲＮＡ配列は、好ましくは１００塩基対未満、典型的には３０塩基対以下であり、当該技術分野において公知の方法によっ作製される。本発明による典型的ｓｉＲＮＡは、２９塩基対以下、２５塩基対、２２塩基対、２１塩基対、２０塩基対、１９塩基対、１５塩基対、１０塩基対、５塩基対、又はそれ以上若しくはそのあいだの整数を有する。
【００３１】
本発明の好ましい態様によれば、未成熟ＤＣを製造するための前駆体は、皮膚、脾臓、骨髄、胸腺、リンパ節、臍帯血、又は最も好ましくは末梢血から得られる。本発明の方法に用いるＤＣは、それぞれの供給源から直接単離することができ、又は前駆細胞に由来することができる。当業者にはそれぞれの方法は公知である。例えば、ＤＣ前駆体及び未成熟ＤＣは、白血球アフェレーシスで抗凝固末梢血、造血幹細胞を回収することにより、又はバフィーコートの調製、ロゼット、遠心分離、密度勾配遠心分離（例えばＦｉｃｏｌｌ（Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅなど）、Ｐｅｒｃｏｌｌ（透析不可能なポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）で被服されたコロイド状シリカ粒子（直径１５〜３０ｎｍ））、スクロースなどを用いる）、細胞の分別溶解、ろ過などにより単離することができる。特定の態様では、例えば被験者から血液を採取し、それをdefribrinateし、血小板を除去し、赤血球細胞を溶解させることによって、白血球集団を調製することができる。ＤＣ前駆体、単球、又は骨髄前駆細胞若しくは幹細胞を用いてｉＤＣを分化させることができる。場合により、例えば、プラスチック表面への接着能を利用して、密度勾配遠心分離、モノクローナル抗体パニング、向流遠心分離などにより単球を末梢血から濃縮することができる。本発明による方法によって得ることが可能なＤＣを個体の治療に用いる場合、ｉＤＣは、治療すべき個体から、又は治療すべき個体とＨＬＡが適合した健常な個体から採取することができる。
【００３２】
ＤＣ前駆細胞は、好適な培地中で培養し、分化させることができる。好適な組織培地には、例えばＲＰＭＩ  １６４０及びＤＭＥＭが含まれる。組織培地には、ヒト自家血清若しくはウシ由来血清ではないプールドナー血清、アミノ酸、ビタミン、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４若しくはＩＬ−１３又はＩＦＮ−γなどのサイトカイン、及び細胞分化を促進させる２価のカチオンを添加することができる。前駆細胞は、好ましくは無血清臨床品質培地においても培養することができる。樹状細胞培地と共に用いられる典型的なサイトカインの組み合わせは、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４若しくはＩＬ−１３、又はＩＦＮ−γで構成される。
【００３３】
本発明のＤＣ免疫医薬にとって好ましい状態であるｓｍＤＣ分化状態（遺伝子操作の前若しくは後、又は単球又は造血幹細胞又は前駆細胞のようなＤＣ前駆細胞の段階）へ駆動する成熟刺激をＤＣへ適用するために、遺伝子操作、有効量の少なくとも１つのＤＣ成熟因子をｉＤＣと接触させる。少なくとも１つのＤＣ成熟因子は、加熱不活性化若しくはホルマリン処理したカルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）、好ましくはＢＣＧの細胞壁構成物質、ＢＣＧ由来リポアラビノマンナン、又はＢＣＧ構成成分、大腸菌由来リポ多糖（ＬＰＳ）、又は不活性化グラム陽性若しくはグラム陰性微生物、イミダゾキノリン化合物、好ましくはイミダゾキノリン−４−アミン化合物、特に４−アミノ−２−エトキシメチル−ｘ−ジメチル−１Ｈ−イミダゾール［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール若しくは１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン、又はそれらの誘導体（例えば特許文献２を参照されたい）、合成２本鎖ポリリボヌクレオチド、好ましくはポリＩ：Ｃ、天然２本鎖ＲＮＡ又はＲＮＡウイルス又はＲＮＡの断片、又は非メチル化ＣｐＧモチーフを含む合成類似体、又は合成若しくは天然核酸分子から成る群より選択されることが好ましい。これら化合物の大部分はＴＬＲアゴニストである（比較のため表１を参照されたい）。本発明では、ＬＰＳを樹状細胞成熟因子として用いることが特に好ましい。しかしながら、原則として、ＴＬＲアゴニスト単独で又はＩＦＮ−γと組み合わせて使用することも実行可能である。原則として、成熟させるためにｉＤＣを、限定されるものではないが腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、ＩＬ−１、ＩＬ−６、及びプロスタグランジンＥ６、又はそららの組み合わせの一部を典型的には含むサイトカインカクテルに曝露させることも可能である。更に、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌシグナル伝達経路を誘発することも可能である。これは、ｉＤＣを、組換えＣＤ４０Ｌ分子、又はＣＤ４０ＬドメインとＩｇＧ−Ｆｃのような他のタンパク質とで構成される融合タンパク質に可溶性型で又は表面例えば培養皿又はナノ粒子に固定されて接触させることによって、又はＣＤ４０Ｌを発現するように遺伝子操作された初代細胞若しくは細胞株と、又はＣＤ４０Ｌの発現を生理的に上方制御された活性化Ｔリンパ球と接触させることによって行うことができる。ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌシグナルは、ＴＬＲアゴニスト、炎症性サイトカインとの組み合わせで適用することができる。当然、少なくとも２つの成熟因子からなる組み合わせを本発明に従って用いることができる。少なくとも１つの（好ましくは少なくとも２、３、５、１０）樹状細胞成熟因子をＩＦＮ−γ存在下で樹状細胞と接触させることが好ましい。
【００３４】
本発明の他の好ましい態様によれば、ｉＤＣを遺伝子操作工程ｃ）の前に有効量の少なくとも１つの樹状細胞成熟因子と少なくとも２時間、好ましくは少なくとも６時間、特に少なくとも１２時間、最大２４時間まで接触させる。成熟時間は各種パラメータ（例えばＤＣ成熟因子）に依存する。接触時間及び他のパラメータは、当該技術分野に公知の方法を用いてｉＤＣが部分的にのみｓｍＤＣへ成熟するように選択される必要がある。細胞表面マーカーは、フローサイトメトリー及び免疫組織化学のような当該技術分野によく知られているアッセイで検出することができる。細胞をサイトカイン産生についてモニターすることもできる（例えばＥＬＩＳＡ、他の免疫アッセイによって、又はオリゴヌクレオチドアレイ若しくはタンパク質アレイを使用することによって）。
【００３５】
ｉＤＣのＩＬ−１２放出ｓｍＤＣへの成熟を介在可能な少なくとも１つの分子は、改善された特徴を有する新規のＴリンパ球刺激性又は抑制性ＤＣ免疫医薬を製造するための遺伝子操作工程のためのＤＣを用意するため、ＩＦＮ−γ存在下、ＬＰＳから成る群より選択されることが好ましい。ＤＣを例えばＩＬ−１２分泌を特徴とする免疫刺激性表現型におよそ２４時間の生理学的免疫刺激性ウィンドウを超えて維持可能な、従ってｓｍＤＣと比較して優れた特徴を付与する少なくとも１つの分子は、典型的には、しかし必須ではないがＩＦＮ−γ存在下のＣＤ４０Ｌである。ここで、先に概説した遺伝子操作法を用いて、ｓｍＤＣに通常は発現しないＣＤ４０Ｌを人工的に発現させることに基づくアプローチを用いるために選択した。しかしながら、ＤＣ自体ではなく、むしろ補助的な初代細胞又は細胞株、活性化Ｔリンパ球からＣＤ４０Ｌを発現すること、又は可溶性の若しくは固定された組換えＣＤ４０Ｌ分子又は融合タンパク質を用いることは考えられる。本発明の他の好ましい態様によれば、Ｔリンパ球抑制活性を介在するＤＣ分子の発現を干渉する少なくとも１つの分子は、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）及びインドールアミン  ２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）から成る群より選択される。Ｔリンパ球抑制活性を介在する分子は、実施例の欄の表２及び表３に列挙されている分子からも選択することができ、ＤＮＡマイクロアレイ発現プロファイリングデータにおいて２倍の過剰発現を示す分子が好ましいが、６倍以上の過剰発現を示す分子が特に好ましい。
【００３６】
本発明の好ましい態様によれば、少なくとも１つの抗原は、以下の群から選択される：
ａ）  腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、又は他のヒト微生物若しくは寄生性病原体から成る群；あるいは
ｂ）  アレルギーを引き起こす環境抗原、疾患を引き起こす免疫応答を開始させる自己抗原、移植抗原から成る群。
【００３７】
個体において抗原に対する特異的な免疫応答又は免疫抑制の促進を誘導することができるｓｍＤＣに基づく特徴が改善された新規のＴリンパ球刺激性又は抑制性ＤＣ免疫医薬を産生するには、ｓｍＤＣを製造するための好ましいＬＰＳ／ＩＦＮ−γ刺激と接触させる前にｉＤＣに少なくとも１つの抗原を負荷し、その後遺伝子操作することが好ましい。抗原負荷は、どの抗原に対して活性化する必要があるのか又はどの抗原に対して寛容化する必要があるのかをＴリンパ球に指示するために必要である。ＤＣに負荷するための抗原は、腫瘍抗原又はウイルス感染細胞由来のウイルス抗原のように疾患組織に由来することができる。それらは、完全な死滅若しくは生存微生物、又はそれらの断片、又は死滅若しくは生存ヒト若しくは動物細胞、例えばヒト又は動物の腫瘍細胞であり得る。抗原は、組換えタンパク質、又は合成ペプチド、ＤＮＡベースのウイルス性若しくは非ウイルス性組換え発現ベクター、又は抗原をコードする天然若しくは合成ＲＮＡであり得る。あるいは、抗原は、免疫機能不全を誘発している、アレルギー、病的な自己免疫応答が疾患を引き起こしている自己抗原のような環境抗原、又は臓器又は幹細胞移植拒絶反応を決定するＭＨＣ分子のような抗原であり得る。同種異系移植に対する寛容誘導のためのＴリンパ球抑制性ＤＣ免疫医薬の場合、臓器又は幹細胞ドナーＤＣは移植片と同一のＭＨＣ分子を有するため、負荷が必要でないことは注目に値する。明らかに、これら後者の状況では、ＤＣ免疫医薬は、アレルゲン、移植抗原、又は自己抗原に対する免疫を抑制するように設計されるであろう。抗原をＤＣへ送達するには、タンパク質若しくはペプチド抗原、抗原性タンパク質複合体、抗原若しくは抗原性ペプチドを発現する細胞若しくは細胞膜、ｔｅｘｏｓｏｍｅ、抗原若しくは抗原性ペプチドを含有するリポソーム、抗原若しくは抗原性ペプチドをコードする核酸（おそらくプラスミド又はウイルスベクターに組み込まれている）、又は腫瘍細胞由来の全ＲＮＡをＤＣに貪食させる受動的曝露のような各種方法を用いることができる。これらの方法は、例えば特許文献３に開示されている。そのようなビヒクルは、ウイルス又は非ウイルス由来でも、ナノ粒子でもよい。抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原などであり得、より一般的には、免疫応答又は反応が求められるペプチド又はポリペプチドであり得る。この点で、当該技術分野において公知の各種技術にしたがい、ＤＣは１種又は数種の抗原に感作されることができる。「感作される」という用語は、抗原又はその一部がＤＣの表面で、好ましくは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子との複合体で曝露されることを示す。原則として、ＤＣは、抗原を前負荷することなく患者へ接種することができ、例えば腫瘍若しくはその周辺へ、転移層へ、又はリンパ節並びに１次及び／又は２次リンパ系組織を含めた流入領域リンパ系へ直接注射することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗原をとることを可能にした。特に、抗原の存在及びＴリンパ球へのその提示のみがＤＣ免疫医薬を決定するが、抗原がＤＣに達する方法ではない。ＤＣ負荷技術の概説は、非特許文献６及びその中の参考文献にある。
【００３８】
本発明の抗原負荷され、遺伝子操作されたＤＣを用いて、当該細胞へ負荷された抗原、及びＤＣの生理学的な機能状態に依存する各種免疫学的機能不全において免疫応答を、ＤＣ成熟因子のような各種シグナル伝達分子の使用により、又はＤＣの遺伝子操作により、治療的に調節することができる。そのような機能不全には、限定されるものではないが、がん、これは形質転換細胞及び変異細胞を拒絶するための免疫系の不全として描写することができる；例えば重篤なさもなければ治療不可能な微生物感染との関連における、又は特に臓器移植又は幹細胞移植のあいだの免疫が低下した個体における感染性疾患を含めることができる。そのようなＤＣ免疫医薬によって治療することができる他の免疫機能不全は、免疫学的多動性から、例えば環境抗原に対して生じ得、アレルギー、又は免疫系が宿主を攻撃して自己免疫疾患を引き起こす状況をもたらす。最後に、ＤＣ免疫医薬は、他の細胞の遺伝子操作によって作製された誘導された前駆細胞（ｉＰＳ）を含めて、臓器又は幹細胞／前駆細胞移植の拒絶を干渉する本発明の方法に基づいて設計することができ、したがって宿主による移植片の受容を容易にする。本発明の好ましい態様によれば、少なくとも１つの抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、及び細菌抗原から成る群より選択される。本発明により遺伝子操作されたＤＣは、個体において免疫応答を誘導、抑制、又は防止すべきである抗原を負荷することができる。特に好ましいのは腫瘍抗原である。
【００３９】
本発明によるＴリンパ球刺激能又は抑制能が改善された新規の遺伝子操作されたＤＣ免疫医薬は、患者への投与前、ｉＤＣとして成熟する前、ｓｍＤＣとして部分的に成熟した後、改善されたＤＣとして遺伝子操作する前又は後に、例えば低温保存によって、保存することができる。使用できる低温保存剤には、限定されるものではないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、アルブミン、デキストラン、スクロース、エチレングリコール、ｉ−エリスリトール、Ｄ−リビトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、ｉ−イノシトール、Ｄ−ラクトース、塩化コリン、アミノ酸、メタノール、アセトアミド、モノ酢酸グリセロール、及び無機塩が含まれる。
【００４０】
本発明の更なる側面は、Ｔリンパ球刺激能又は抑制能が改善された本発明の新規の遺伝子操作されたＤＣ免疫医薬を含む医薬組成物に関するものである。本発明のＤＣは、当業者に周知の方法及び組成物を用いて、生理的に許容可能な担体、賦形剤、緩衝剤、及び／又は希釈剤と共に製剤化することができる。
【００４１】
Ｔリンパ球刺激能又は抑制能が改善された新規の遺伝子操作されたＤＣ免疫医薬は、免疫調節を必要とする被験者へ直接投与することができる。典型的には、約１０２〜約１０１０細胞を医薬的に許容可能な担体中に懸濁する。がんを患う個体を治療する場合、疾患のないリンパ節へ、好ましくは鼠径部へ、腫瘍のない又は腫瘍を有する(転移性)リンパ節は目的を果たすであろうが、腫瘍へ直接、又は領域へ、近傍へ、隣接部へ、又は腫瘍又は腫瘍床との循環接触又はリンパ管接触に、又は転移性疾患へ、細胞を注射することが好ましい。ＤＣ免疫医薬は、皮膚へ皮下投与又は経皮投与することができ、リンパ節への遊走を可能にする。原則として、ＤＣ免疫医薬を、単回接種として又はより長期にわたる注入として血流へ、末梢血へ、又はカテーテルを介して体内の疾患臓器又は疾患領域、あるいは門脈又は肺静脈若しくは肺動脈などを提供する血管（動脈又は静脈）へ注射することも可能である。埋め込まれた放出装置は、ＤＣ医薬の持続的な流れを腫瘍若しくは転移層、リンパ節、血流、又は皮膚へ送達するために用いることができる。
【００４２】
Ｔリンパ球刺激能又は抑制能が改善された本発明の新規の遺伝子操作されたＤＣ免疫医薬は、製剤及び投与様式に好適ないかなる手段によっても投与することができる。例えば、細胞は医薬的に許容可能な担体と組み合わせることができ、注射器、カテーテル、カニューレなどで投与することができる。上記のように、細胞は徐放性マトリックス中に製剤化することができる。この様式で投与する場合、製剤は、用いるマトリックスに好適な手段で投与することができる。本発明に適用可能な他の投与方法及び投与様式は、当業者に周知である。
【００４３】
本発明の組成物は、個体の治療に単独で用いることができ、又は腫瘍を治療するための他の方法と組み合わせて用いることができる。例えば、本発明の方法は、放射線療法及び／又は化学療法（細胞障害性薬、アポトーシス剤、抗体など）；低温療法；小線源療法；他の型の免疫療法（生体外で増殖させた腫瘍抗原特異的Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、サイトカイン及び成長因子、腫瘍抗原特異的抗体、又は腫瘍細胞の生存に重要な血管などの腫瘍組織の標的構造）；ウイルス又は非ウイルスベクターなどを用いた遺伝子療法の前に、同時に、又は後で、腫瘍の外科的切除と組み合わせて用いることができる。更に、本発明のＤＣ免疫医薬は、樹状細胞成熟及び／又は腫瘍内又は腫瘍の近傍若しくは隣接領域内の抗原のプロセシングのためのアジュバントとして作用する他の薬剤と共に投与することができる。これらの方法のいずれか又は全ては、いずれかの組み合わせて用いることもできる。組み合わせ治療は、並行して又は順次行うことができ、処置する医師が決定するいずれの順序でも投与することができる。
【００４４】
本発明の他の側面は、がん及び／又は微生物若しくは寄生性感染を治療及び／又は予防するため；あるいはアレルギー、自己免疫疾患、又は幹細胞若しくは臓器移植拒絶を治療及び／又は予防するための医薬の製造のための、本発明の樹状細胞の使用に関するものである。本発明の部分的に成熟した樹状細胞は、好ましくは、がん予防及び／又はがん治療に用いることができる。そのような場合、樹状細胞は少なくとも１種の腫瘍抗原を負荷している。例えば、限定するものではないが、細胞は、腫瘍、腫瘍の外科的除去即ち切除した後の腫瘍床へ、腫瘍周辺に、腫瘍と直接接触している流入領域リンパ節、腫瘍又は腫瘍を患っている臓器、例えば門脈又は肺静脈若しくは肺動脈などに通じ、栄養供給している血管又はリンパ管へ直接投与することができる。
【００４５】
本発明の部分的に成熟した樹状細胞の投与は、腫瘍のための化学療法又は放射線療法のような他の治療と同時にあるいはその後に行うことができる。更に、本発明の部分的に成熟した樹状細胞は、樹状細胞の成熟及び／又は腫瘍内又は腫瘍の近傍若しくは隣接した領域内の抗原のプロセシングのためのアジュバントとして作用する他の薬剤と共に投与することができる。更に、樹状細胞は、腫瘍若しくは腫瘍床領域又は周辺領域へ埋め込むために徐放性マトリックス中へ製剤化又は組み合わせることもでき、その結果、細胞は腫瘍又は腫瘍床へゆっくり放出され、腫瘍抗原と接触する。
【００４６】
本発明の好ましい態様によれば、医薬は、放射線療法及び／又は抗腫瘍若しくは抗微生物化学療法、あるいはアレルギー、自己免疫疾患、又は幹細胞若しくは臓器の移植拒絶の治療を目的とした療法の前に、同時に、又は後で個体へ投与される。本発明の樹状細胞は、他のがん療法と組み合わせて用いて、より有益な効果を達成することができる。
【００４７】
本発明の他の側面は、アレルゲンのような環境抗原又は自己免疫疾患の過程における自己抗原に対する免疫系の病的過剰反応によって引き起こされる免疫疾患を治療及び/又は予防するための医薬の製造のための、本発明の樹状細胞の使用に関するものである。
【００４８】
当該医薬は、アレルギー若しくは自己免疫疾患の治療又は予防を目的とした他のモダリティの前に、同時に、あるいは後で個体へ投与することが好ましい。
本発明の更なる側面は、好ましくは悪性血液疾患の治療に用いられる同種異系幹細胞移植の免疫学的拒絶を治療及び／又は予防するため、あるいは同種異系臓器移植拒絶を治療及び／又は予防するための医薬の製造のための、本発明の樹状細胞の使用に関するものである。
【００４９】
当該医薬は、同種異系幹細胞若しくは臓器移植の拒絶を治療又は予防することを目的とした他のモダリティの前に、同時に、又は後で個体へ投与することが好ましい。
本発明を、以下の図面及び実施例によって更に説明するが、それらに限定されるものではない。
【実施例】
【００５０】
実施例：  遺伝子操作によるＴリンパ球刺激性又は抑制性ＤＣ免疫医薬の製造方法
白血球アフェレーシス
Ａｍｉｃｕｓ白血球アフェレーシス装置（Ｂａｘｔｅｒ、イリノイ州ディアフィールド）を用いて、健常ボランティア及び責任ある施設内倫理委員会によって承認された臨床試験を背景に治療された各種新生物を患う患者から白血球を採取した。全ての個人は、これらの研究に対し世界医師会ヘルシンキ宣言に従ったインフォームドコンセントを与えた。Ｓｙｓｍｅｘ細胞カウンター（Ｓｙｓｍｅｘ、Ｂｏｒｎｂａｒｃｈ、ドイツ）で及び／又はフローサイトメトリーによって細胞数及びサブセットを測定した。
【００５１】
単球濃縮
１％ヒトプールＡＢ血漿（Ｏｃｔａｐｌａｓ、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ、ウィーン、オーストリア）を添加したＡＩＭ−Ｖ（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）又はＣｅｌｌＧｒｏ培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）を用いて、先に記載されたようなプラスチック接着により単球を濃縮した。インライン手順に関して、製造者の指示に従った。Ｅｌｕｔｒａ細胞分離器（Ｇａｍｂｒｏ  ＢＣＴ、コロラド州レイクウッド）を用いて、遠心分離速度を２４００ｒｐｍに維持しながらエルトリエーションチャンバーへ取り込むことによって、白血球アフェレーシス産物から単球を濃縮した。その後、細胞分画のために遠心分離速度及びエリトリエーション培地（ＰＢＳ／ＨＳＡ  Ｂａｘｔｅｒ、ニュージャージー州ニュージャージー）の流れを一定に保った。あるいは、ＣＤ１４コーティング磁気ビーズを用いて単球を磁気カラムに保持するＣｌｉｎｉＭＡＣＳ細胞選択システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）で単球の選択を行った。単球を濃縮するための他の選択肢は、Ｔ及びＢリンパ球の枯渇であり、Ｉｓｏｌｅｘ３００ｉ磁気細胞選択器（Ｎｅｘｅｌｌ、カリフォルニア州アーバイン）を用いて行った。リンパ球は、それらをＣＤ２及びＣＤ１９コーティング磁気ビーズに接続し、流入を採取することによって磁気カラムに保持された。全ての濃縮手順の最終産物はフローサイトメトリーで特徴付けた。
【００５２】
フローサイトメトリー
白血球アフェレーシス産物及び単球濃縮産物を、全白血球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、及び顆粒球について、それぞれ抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ、抗ＣＤ１９−ＡＰＣ、抗ＣＤ１４−ＡＰＣ、及び抗ＣＤ１５−ＦＩＴＣ（ＢＤファーミンジェン、カリフォルニア州サンディエゴ）で標識した抗体によってＴｒｕｃｏｕｎｔシステム（ベクトン・ディッキンソン、ニュージャージー州ニュージャージー）を用いて分析した。標識細胞をＦＡＣＳキャリバーフローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン、カリフォルニア州マウンテンビュー）で分析した。分析には好適なアイソタイプ対照抗体が含まれた。
【００５３】
ＤＣ製造
上記それそれの濃縮手順によって単離した単球を、１×１０６単球／ｃｍ２の濃度で、２％プールヒトＡＢ血漿を添加したＡＩＭ−Ｖ培地又はＣｅｌｌＧｒｏ培地中で３７℃にて、加湿インキュベーター内で６日間培養した。培地に１０００Ｕ／ｍｌヒトＧＭ−ＣＳＦ及び３００Ｕ／ｍｌヒトＩＬ−４（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、フライブルグ、ドイツ）を添加し、第３日目に同一容量のＡＩＭ−Ｖ／２％ＯＰ又はＣｅｌｌＧｒｏ＋ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４に交換した。第６日目に５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＦＮ−γ（ベーリンガー・インゲルハイム、ウィーン、オーストリア）及び１〜１０００ｎｇ／ｍｌの範囲のリポ多糖（ＬＰＳ、大腸菌株Ｏ１１１：Ｂ４、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州サンディエゴ、米国）を培養物へ６時間加えることによって成熟させ、半成熟（ｓｍ）ＤＣを作製し、その後凍結した；臨床品質のＬＰＳ（ＵＳ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ、メリーランド州ベセスダ）を用いて患者のＤＣワクチンを製造した。
【００５４】
ＤＣ免疫表現型検査
以下の抗体：抗ＣＤ８６−ＡＰＣ（ＢＤファーミンジェン、カリフォルニア州サンディエゴ）、抗ＣＤ８０−ＰＥ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、ベックマン・コールター、カリフォルニア州フラートン）、抗ＣＤ８３−ＡＰＣ（３種全てＢＤファーミンジェン、カリフォルニア州サンディエゴ）、抗ＭＨＣ  Ｉ−ＰＥ、抗ＭＨＣ  ＩＩ−ＦＩＴＣ（共にダコ・サイトメーション、カリフォルニア州カーピンテリア）、及び抗ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ（ＢＤファーミンジェン、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いてＤＣの成熟状態を決定した。ヨウ化プロピジウム染色（シグマ、ミズーリ州セントルイス）によってＤＣの生存率を測定した。ＦＡＣＳキャリバーフローサイトメーターで細胞を分析した。分析には好適なアイソタイプ対照抗体が含まれた。
【００５５】
ＥＬＩＳＡによるＩＬ−１２検出
ＤＣ培養物上清中のＩＬ−１２濃度を先に記載されたようにして測定した。
同種異系混合白血球反応
同種異系応答ＰＢＭＣを勾配遠心分離によって末梢血から単離した。刺激ＤＣ（１００００、２０００、又は４００）を、２％プールヒト血漿を添加した２００μｌ  ＡＩＭ−Ｖ培地中の１０５応答細胞と共に９６穴丸底プレートに３重にして入れた。陽性基準として、１０５応答細胞を１００ｎｇ／ｍｌブドウ球菌エンテロトキシンＡ／Ｂ（ＳＥＡ／ＳＥＢ、トキシンテクノロジー社、フロリダ州サラソータ）で刺激した。第４日目に、共培養物を１μＣｉ  ３Ｈ−チミジン溶液（ＮＥＮライフサイエンスプロダクツ、メリーランド州ボストン）と共に更に１８時間インキュベートした。最後に、Ｓｋａｔｒｏｎ（Ｌｉｅｒ、ノルウェイ）ハーベスターで細胞を回収した。Ｔｒｉｌｕｘプレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ、トゥルク、フィンランド）で取り込まれた３Ｈ−チミジンを計測した。あるいは、同種異系ＰＢＭＣをＣＦＳＥ（モレキュラープローブス、オレゴン州ユージーン）で標識し、１／５、１／１０、１／２０、１／４０、及び１／８０の比でＤＣと混合した。対照として、ＤＣなし又はＳＥＡ／ＳＥＢを加えた。最後に、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰで標識し、ＦＡＣＳキャリバーフローサイトメーターを用いて分析した。ＣＤ３陽性ＣＦＳＥ陰性Ｔリンパ球の割合を決定した。
【００５６】
ｓｍＤＣへのレンチウイルス遺伝子導入
ＶｉｒａＰｏｗｅｒＴＭレンチウイルス発現系（インビトロジェン製）を用いて、２９３ＦＴ生産用細胞株に、ウイルス構造タンパク質、ポリメラーゼ、及び逆転写酵素をコードするｐＬＰ−プラスミド（ｐＬＰ／ＶＳＶＧ、ｐＬＰ−１、ｐＬＰ−２）と、ＧＦＰ又はＣＤ４０Ｌを含有するプラスミドとを共トランスフェクションすることによってレンチウイルス粒子を作製した。共トランスフェクション後７２時間に、全上清を回収し、超遠心分離で１００倍に濃縮した。ＤＣを上で概説したような条件下で培養し、成熟させた。ＤＣはそれぞれ成熟開始後４８時間又は６時間に回収した。次に未成熟ｓｍＤＣに、レンチウイルス粒子（２５０μｌの１００倍濃縮レンチウイルス上清／１×１０６ＤＣ）を６μｇ／ｍｌポリブレン（シグマ−アルドリッチ製）＋標準濃度のＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＩＦＮ−γと組み合わせて形質導入した。ＩＬ−１２品質管理のため、２４時間後に上清を採取し、４８時間後に標準の手順に従ってＧＦＰ／ＣＤ４０Ｌの発現を測定した。
【００５７】
ＤＣにおけるＲＮＡ干渉
ＤＣを上で概説した標準の手順に従って製造した。第６日目に、トランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を用いて製造者の指示に従い、１０６のＤＣに１００ｐｍｏｌの遺伝子特異的ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクション後１２時間に、ＤＣをＬＰＳ／ＩＦＮ−γで６時間刺激する。使用する全てのものは先に概説した方法と同様である。
【００５８】
結果
現在使用されているＤＣ免疫医薬は、序論で概説したような、いずれかの性質の抗原を負荷している単球由来ＤＣを使用し、ＤＣからのＩＬ−１２放出誘発能を有する成熟刺激へ曝露する。ＩＬ−１２分泌を特徴とするＤＣ表現型は、細胞溶解性免疫を支持する１型免疫系への分極誘導能を有する。これは、刺激性ＤＣ免疫医薬は、ＩＬ−１２分泌の時間ウィンドウのあいだに患者へ適用し、ＩＬ−１２存在下でＤＣからＴリンパ球への抗原提示を可能にする必要があることを暗示している（図１）。Ｔリンパ球刺激能又は抑制能が改善された新規の遺伝子操作されたＤＣ免疫医薬は、ＤＣの遺伝子操作は免疫刺激性ウィンドウをより長期間開いたままにするため、この制約を克服するものである。
【００５９】
以下の実施例では、遺伝子操作されたＤＣ免疫医薬が製造され、研究されている。ＤＮＡ又はＲＮＡをＤＣへ送達するためにレンチウイルス遺伝子導入又はリポソームに基づいたトランスフェクションを用いたが、いずれの核酸送達技術もその能力を果たし得ると想定することができる。ＤＣ免疫医薬における免疫刺激性遺伝子の過剰発現例として、レンチウイルス遺伝子導入を用いてＤＣを操作し、ＣＤ４０Ｌ分子を発現させた。機能的研究により、そのように操作されたＤＣ免疫医薬は、免疫応答を刺激するポテンシャルが高められていることを確認した。更に、免疫抑制性分子ＩＬ−１０及びＩＤＯのノックダウンも、ＩＬ−１０及びＩＤＯに対するＲＮＡ干渉のために設計されたｓｉＲＮＡ分子でＤＣを操作することにより刺激能を高めることが立証されている。免疫抑制フィードバックループに関与する更なるＤＣ分子を同定するために、ＤＮＡマイクロアレイを用いて全ゲノムＤＮＡ発現プロファイリングを行った。ＩＬ−１０又はＩＤＯと類似の発現プロファイルを有する遺伝子をグループ分けしたクラスター分析に基づいて、遺伝子リストは、免疫応答を負に調節するポテンシャルを有するものを発見した。したがって、ＤＣ免疫医薬においてこれらの遺伝子をノックダウンさせることは、その免疫刺激能を改善させるであろう。したがって、規定の免疫系成分を特異的に調節するために遺伝子操作されたＤＣ免疫医薬は、関連する免疫系機能不全の治療を可能にする。最後に、ＲＮＡ干渉を用いたＤＣ発現プロファイリング実験においてＩＬ−１０又はＩＤＯに類似の動態を示す標的遺伝子のノックダウンの機能的結果の例を示す。同種異系Ｔリンパ球との共培養において、Ｔリンパ球刺激の促進を示す、そのように遺伝子操作されたＤＣの増殖誘発能の改善が観察された。
【００６０】
図２は、遺伝子操作に用いるｓｍＤＣ１基本デザインの品質管理を示す。ＤＣ免疫医薬は規定の品質管理基準を満たす必要がある。パネルＡは、末梢血単球から製造されたＤＣの純度、生存率、及び収率を示す。そのような単球を白血球アフェレーシスによって回収し、単球を向流遠心分離（エルトリエーション）によって濃縮する。ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦの存在下にて、単球はｉｎ  ｖｉｔｒｏで６日以内にｉＤＣへ分化する。ｉＤＣは抗原を負荷し、その後ＬＰＳ及びＩＦＮ−γで構成される成熟刺激に６時間曝露し、凍結する。半成熟と称するこの段階で、それらは成熟を継続するように不可逆的にコミットされるが、ｍＤＣの典型的な表現型の機能的な特徴をまだ示さない。最も重要なことは、その段階（免疫刺激性ウィンドウ、成熟開始後およそ０〜２４時間、図１）で、ＤＣは免疫を誘発し、一方でより後期の段階（免疫抑制性ウィンドウ、成熟開始後およそ２４〜４８時間、図１）。しかしながら、臨床応用では、成熟を完了し、免疫応答を誘発する（２４時間以前）が、その後（およそ２４時間）−成熟刺激によって誘発されるそれらの生理学的発達プログラムに従って−ＤＣ免疫医薬の遺伝子操作によって妨げることを目的としている免疫抑制段階に入るこの分化期で、それらは患者に注射される。
【００６１】
品質管理のために、ＤＣ免疫医薬の１つのアリコートを融解し、２日間再培養してＤＣの成熟プロセスを完了させる。これらの２日間に、それらはサイトカイン、最も重要なことにはＩＬ−１２（成熟後早期）及びＩＬ−１０（成熟後後期）を分泌する（パネルＢ；３つの個別のものからの平均±ＳＥＭを示す）。また、それらは重要なＤＣ膜分子の発現パターンに変化を示す（パネルＣ）。最後に、ＣＦＳＥ標識同種異系ＰＢＭＣと表示の比で共培養することによってＤＣをアロＭＬＲ効力試験に付す（パネルＤ）。これは、ＣＦＳＥの希釈及び蛍光減少を伴う細胞分裂を誘発する。棒グラフは、３つの個別のものからの増殖細胞の平均±ＳＥＭ％を示す。
【００６２】
免疫抑制性フィードバックループを開始するには初期刺激も必要である。一般に、免疫活性化を基準レベルまで下方制御するには、特定刺激に対する応答の活性化が強力であるほど、フィードバックシグナル伝達は強力であろう。それにより、免疫応答が制御から逃れることを妨げ、自己免疫疾患を引き起こす。このように、成熟刺激ＬＰＳ／ＩＦＮ−γは、最高量のＩＬ−１２放出だけでなく、最高量のＩＬ−１０放出ももたらすことがわかった。
【００６３】
【表２】
0005730577.tif 000003
【００６４】
ＣＤ４０Ｌ分子の過剰発現を介して高められた刺激性ＤＣ免疫医薬についての説明
ＩＬ−１２分泌を特徴とするＤＣの免疫刺激性ウィンドウ（図１）を広げるために、ＤＣを遺伝子操作してＣＤ４０Ｌを過剰発現させた。この分子は正常には活性化Ｔリンパ球から発現され、ＤＣ上のＣＤ４０と相互作用し、重要な活性化シグナルをＤＣへ伝達する。この実験は、ＤＣ免疫医薬への活性化分子導入例として設計した。しかしながら、原則として、他の刺激性分子に対して同一手順を用いることができ、又は、抑制性ＤＣ免疫医薬を設計するために、免疫抑制性分子をＤＣから過剰発現させることができる。具体的には、ＤＣへのＣＤ４０Ｌ遺伝子導入の論拠は：
（ｉ）  ＤＣを活性化Ｔリンパ球に対して非依存性にして、ＣＤ４０ＬシグナルをＤＣへ送達する；
（ｉｉ）  構成的に活性なプロモーターからの発現によりＤＣ自体にＣＤ４０Ｌが継続的に存在するために、ＤＣをＬＰＳ／ＩＦＮ−γのような慣用の成熟刺激に付した場合よりも非常に長い期間、ＤＣがＩＬ−１２を分泌することを可能にすることを本実験において仮定し、発見した；
（ｉｉｉ）  ＤＣから分泌されるＩＬ−１２の全量は、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ又はＣＤ４０Ｌ／ＩＦＮ−γ刺激単独と比較して非常に高く、ＩＬ−１２分泌動態は刺激適用後より早く開始し質的に異なっており、したがってＤＣ分化の免疫刺激性ウィンドウを広げた；
（ｉｖ）  ＬＰＳ／ＩＦＮ−γへの曝露後４８時間でさえ、ＤＣがＩＬ−１２分泌能を使い果たしていた場合、ＣＤ４０Ｌ遺伝子導入は、ＤＣにＩＬ−１２分泌の第２期を開始させた（図３）。
【００６５】
図３はＣＤ４０Ｌ遺伝子導入を示す。パネルＡには、レンチウイルス遺伝子導入後６時間のｓｍＤＣ及び４８時間のｍＤＣのＧＦＰ又はＣＤ４０Ｌの発現を示す。ここに示す測定は全て未成熟ＤＣのレンチウイルスベクターへの曝露後４８時間に行った。ＤＣからのＣＤ４０Ｌの発現は、ｉＤＣ、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ単独へ曝露したＤＣ、又はＧＦＰで操作した６時間ｓｍＤＣ及び４８時間ｍＤＣと比較してＩＬ−１２分泌を高めた（パネルＢ）。ＧＦＰ遺伝子導入によるＩＬ−１２放出促進は、おそらくウイルス、６時間ｍＤＣでは発現されるが４８時間ＬＰＳ／ＩＦＮ−γｍＤＣではもはや発現されないＴＬＲを介してシグナル伝達する２本鎖ＲＮＡによって引き起こされる（表１を参照されたい）。機能的に重要なＤＣ膜分子の発現プロファイル（パネルＣ）は、ＤＣへのレンチウイルス遺伝子導入によって変化しなかった（黒いヒストグラム、未成熟ＤＣ；白いヒストグラム、ｍＤＣ）。
【００６６】
サイトカインＩＬ−１２及びＩＬ−１０の分泌は、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ、ＣＤ４０Ｌ／ＩＦＮ−γ、又は両者の組み合わせへ曝露したＤＣにおいて質的にも量的にも異なっていた（図４）。ＩＬ−１２分泌は、ＣＤ４０Ｌ／ＩＦＮ−γ刺激単独と比較して、組み合わせ刺激を適用したときほぼ２倍高く、また、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ刺激単独と比較して非常に高かった。更に、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ／ＣＤ４０Ｌ組み合わせ刺激へ曝露したＤＣからのＩＬ−１２分泌は、１２時間後、すでに明らかに多量で検出可能であった。一方、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ及びＣＤ４０Ｌ／ＩＦＮ−γは初期成熟シグナルへの曝露後１２〜２４時間に生物学的に関連レベルのＩＬ−１２分泌を誘発した。この観察は、ＤＣ免疫医薬の刺激能を改善するためにＤＣ分化の免疫刺激性ウィンドウを広げるという本発明の目的に沿っている。ＩＬ−１０の最大発現は、ＤＣをＬＰＳ／ＩＦＮ−γ／ＣＤ４０Ｌ又はＣＤ４０Ｌ／ＩＦＮ−γ単独に曝露した場合に類似していたが、ＤＣ成熟にＬＰＳ／ＩＦＮ−γのみを用いた場合には低かった。しかしながら、免疫抑制性サイトカインＩＬ−１０はＣＤ４０Ｌ／ＩＦＮ−γシグナル伝達後に生物学的関連レベルで１２時間後に既に検出可能であったが、一方、組み合わせ刺激ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ／ＣＤ４０Ｌは、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ成熟ＤＣのみのものと類似の動態を示した。ＩＬ−１０の初期放出は、ＣＤ４０Ｌ／ＩＦＮ−γ刺激後、ＤＣ分化の免疫刺激性ウィンドウを負に干渉し、免疫刺激性ＤＣ医薬を設計する場合、回避される必要がある。組み合わせ刺激ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ／ＣＤ４０Ｌの免疫刺激能と免疫抑制能とのバランスの正味の効果は、ＩＬ−１及びＩＬ−１０の分泌パターンを考慮すると、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ又はＣＤ４０Ｌ／ＩＦＮ−γ単独と比較すると、明らかに免疫刺激能の改善に向いていると結論付けられる。初期の出版物とは対照的に、本発明で用いるＤＣは、成熟刺激の組み合わせを受けるであろう。生理的に、ＤＣがＴリンパ球を活性化できる１つの段階（ＩＬ−１２分泌を特徴とする）、及びＤＣがＴリンパ球の活性を抑制する第２の段階（ＩＬ−１０分泌及び酵素ＩＤＯの活性によるトリプトファン枯渇を特徴とする）は、ｉＤＣとＬＰＳ／ＩＦＮ−γのような適正な成熟刺激とを接触させることによって誘発されるであろう（図１）。本明細書において、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ（又はＩＦＮ−γ存在下で他のＴＬＲアゴニスト）への初期曝露、その後のＣＤ４０Ｌのような分子を過剰発現させるためのＤＣの遺伝子操作は、Ｔリンパ球の活性化が可能なＤＣ表現型を維持し、ＤＣを抑制性表現型にすることを妨げることが立証されている（図４）。ＩＬ−１２分泌は、ＩＦＮ−γ存在下でのＴＬＲシグナル伝達経路を介した初期成熟後６時間又は４８時間に遺伝子操作を行うと２０〜２４時間の生理学的時間ウィンドウよりも長く維持される。
【００６７】
図４は、ＩＬ−１２及びＩＬ−１０の分泌の量及び質を示す。ＤＣは、ＩＦＮ−γ存在下で表示の成熟刺激へ曝露した。培養上清中のＩＬ−１２及びＩＬ−１０の濃度を表示の時点で測定した。
【００６８】
遺伝子操作されたＴリンパ球刺激性ＤＣ免疫医薬の本発明のデザインのうち特に重要なのは、ＩＬ−１２分泌ＤＣが、免疫応答の１型分極を介して細胞溶解免疫誘発能を有することである。したがって、ＣＤ４０ＬトランスジェニックＤＣへ曝露したＴリンパ球の、細胞溶解免疫応答を誘発するポテンシャルを、ＣＤ８陽性ＣＴＬ中のグランザイムＢ含量を解析することによって更に調査した（図５）。実際、ＣＴＬとＣＤ４０ＬトランスジェニックＤＣとの共培養は、対照ＧＦＰトランスジェニックＤＣ又は非トランスフェクトｍＤＣと比較して、グランザイムＢの発現を明らかに高めることを見い出した。これは、そのようなＣＴＬの改善された細胞溶解ポテンシャルの強力な指標であり、したがって、ＤＣ免疫医薬からのＣＤ４０Ｌ発現が免疫刺激能を改善させた証拠を提供する。
【００６９】
図５は、細胞溶解活性のポテンシャルを示す。ＣＴの全％は、ＰＢＭＣをＣＤ４０ＬトランスジェニックＤＣを共培養したときに、ＧＦＰトランスジェニックＤＣ（菱形）及び非トランスフェクトｍＤＣ（三角）と比較してわずかに上昇しただけであった（左パネル、四角）。ＣＤ４０ＬトランスジェニックＤＣと共培養したＣＴＬ中のグランザイムＢ発現を解析したとき、ＧＦＰトランスジェニックＤＣ（菱形）及び非トランスフェクトｍＤＣ（三角）と比較して明確な上昇が見られた（右パネル、四角）。
【００７０】
遺伝子操作して免疫抑制性サイトカインＩＬ−１０の発現をノックダウンさせることによって改善されたＴリンパ球刺激能を有するＤＣ免疫医薬の説明
ＤＣ免疫医薬は、免疫抑制を介在する分子の発現がノックダウンされているという仮定に基づいて、４つの標的特異的ｓｉＲＮＡのプールを用いるＲＮＡ干渉によってＤＣにおけるＩＬ−１０遺伝子発現をブロックするように実験を考案した（図６）。これは、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ活性化ＤＣにおけるＩＬ−１０発現の非常に一貫性及び再現性のあるノックダウンをもたらし、対照沈黙ｍＤＣと比較してＩＬ−１２分泌が高かった。この観察は、ＤＣから分泌された、同一ＤＣ上のＩＬ−１０受容体へ結合するＩＬ−１０に基づいた自己分泌経路を示唆しており、下方調節されたＩＬ−１２産生をもたらす。それ以外は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ、及びクラスＩＩの発現によって評価されるように、遺伝子操作されたＤＣと正常ＤＣとのあいだで免疫表現型の相違はなかった。最も重要なことは、アロＭＬＲでは、ＩＬ−１０分泌を抑制してＴリンパ球を活性化するために操作されたＤＣ免疫医薬の、対照実験と比較して非常に大きな効力が観察された。
【００７１】
更に、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団、推定では免疫応答を抑制する調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の集団中のＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞の割合は、おそらくＬＰＳ／ＩＦＮ−γ活性化ＤＣにおけるＩＬ−１０沈黙により低下していた。
【００７２】
図６は、ＩＬ−１０発現が遺伝子操作によってブロックされた、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ−活性化ＤＣの免疫刺激能を示す。ＬＰＳ／ＩＦＮ−γによる活性化前１２時間に、ＤＣを４つのＩＬ−１０特異的ｓｉＲＮＡ又は非特異的対照ｓｉＲＮＡのプールによりトランスフェクトした。次に単離された同種異系ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＩＬ−１０沈黙（黒棒）か対照沈黙（白棒）であるＬＰＳで６時間成熟させたＤＣ（ｍＤＣ）でＤＣ：Ｔ細胞比１：３にて刺激した。ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、（パネルＡ）及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞（パネルＢ）を、Ｔｒｕｃｏｕｎｔシステム及びＦＡＣＳ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで共培養第６日目に分析した。免疫表現型並びにＩＬ−１０及びＩＬ−１２の分泌を、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ活性化後４８時間にそれぞれフローサイトメトリー及びＥＬＩＳＡで測定した（パネルＣ）。免疫表現型分析は、ＩＬ−１０沈黙ＤＣ（パネルＤ）又は対照沈黙ＤＣ（パネルＥ）において、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ−活性化ＤＣ（白ヒストグラム）をｉＤＣ（黒ヒストグラム）と比較する。
【００７３】
免疫抑制性酵素ＩＤＯの発現をノックダウンさせるために操作されたＴリンパ球刺激性ＤＣ免疫医薬の説明
ｓｉＲＮＡを用いて公知免疫抑制性エフェクター分子ＩＤＯの発現をノックダウンさせた（図７）。ｓｉＲＮＡのトランスフェクション及びＩＤＯノックダウンの効率を最適化するために、最初にＩＦＮ−γで活性化したＨｅＬａ細胞を用いた。その後、ＤＣを最適条件下でトランスフェクトした。ＨｅＬａ細胞及びＤＣの両者において、ウエスタンブロット実験で立証されるようなＩＤＯの発現を沈黙させることができた。ＩＤＯ沈黙ＤＣ、寄せ集めた対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＤＣ、及びｉＤＣをアロＭＬＲ効力アッセイにて刺激因子として用いた。ＩＤＯ沈黙ＤＣの刺激性効力は、寄せ集めのｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＤＣ又はｉＤＣと比較して非常に高いことが観察された。これは、ＣＤ８＋ＣＴＬ及びＣＤ４＋Ｔｈ細胞に対しても当てはまった。
【００７４】
図７は、ＩＤＯ発現を沈黙させた、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ活性化ＤＣの免疫刺激能を示す。最初に、ＨｅＬａ細胞（パネルＡ）及びＤＣ（パネルＢ）における効率的なＩＤＯノックダウンをウエスタンブロッティング実験で立証した。ＩＤＯ沈黙ＤＣのＣＤ８＋ＣＴＬ（パネルＣ）及びＣＤ４＋Ｔｈリンパ球（パネルＤ）に対する刺激性効力を調査するために、ＰＢＭＣをＩＤＯ沈黙ＤＣ（四角）、対照沈黙ＤＣ（菱形、ｓｃｒａ＝配列寄せ集め）、又はｉＤＣ（三角）と共培養した。全ての場合において、ＩＤＯ沈黙ＤＣの刺激能は対照よりも優れていた。
【００７５】
免疫抑制性分子
全ゲノムＤＮＡマイクロアレイを用いて、成熟刺激ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ、ＣＤ４０Ｌ／ＩＦＮ−γシグナル伝達、又はＬＰＳ／ＩＦＮ−γ／ＣＤ４０Ｌシグナル伝達の組み合わせ、及び適切な対照に曝露させたＤＣの発現プロファイルを作製した（図８）。
【００７６】
図８はＤＣ発現プロファイリングを示す。ＤＣを表示の成熟刺激へ曝露させるか、又は未成熟のままにした。ＲＮＡを表示の時点で抽出し、全ゲノムＤＮＡマイクロアレイを用いた発現プロファイリングに付した。発現プロファイリングの結果をＣａｒｍａＷｅｂ（包括的なＲベースマイクロアレイ解析、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｇｒａｚ及びチロリアンがん研究所、オーストリア）を用いて解析した。全てのデータをＣａｒｍａＷｅｂソフトウェアプラットフォームのベーシックアルゴリズムを用いて２０のクラスターにグループ分けし、ＩＤＯ及びＩＬ−１０を含有するクラスターを同定した。これらのクラスター中の遺伝子は、２つの公知免疫抑制性ＤＣ分子と類似の発現プロファイルを有し、それらは、やはり免疫抑制性であるＤＣの免疫調節において機能を有すると結論付けた（表３及び表４）。
【００７７】
【表３−１】
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【００７８】
【表３−２】
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【００７９】
【表３−３】
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【００８０】
【表３−４】
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【００８１】
【表３−５】
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【００８２】
【表３−６】
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【００８３】
【表４−１】
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【００８４】
【表４−２】
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【００８５】
【表４−３】
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【００８６】
【表４−４】
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【００８７】
【表４−５】
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【００８８】
現在のＤＮＡマイクロアレイでは、ＤＣにおいて、免疫抑制効果を有することが知られている遺伝子ＩＬ−１０、ＴＳＬＰ、ＩＮＤＯ、ＩＬ２ＲＡ、ＣＳＦ−２、及びＣＳＦ−３の調節に関与するＬＰＳ／ＩＦＮ−γ又はＣＤ４０Ｌ／ＩＦＮ−γシグナル伝達に対して誘導された遺伝子も同定された。免疫調節の潜在的マスタースイッチを同定するために、それらの遺伝子の調節因子のネットワークを、ＰｕｂＭｅｄ及び４４の開架定期刊行物に由来する哺乳動物経路及び分子相互作用のデータベースであるＲｅｓｎｅｔ  ５（バージョン１．２、２００７年１月）を用いてＰａｔｈｗａｙ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアで作製した。さまざまに活性化されたＤＣ由来のマイクロアレイデータを調節ネットワークへアップロードすることによって、成熟ＤＣにおいて誘導された潜在的マスター調節因子（表５）を選択することができた。
【００８９】
【表５−１】
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【００９０】
【表５−２】
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【００９１】
図９は、ＲＮＡ干渉を用いた発現プロファイリングにおいて同定されたＤＣの標的分子の発現をノックダウンさせた後の改善された増殖性応答の例を示す。ＩＬ−１０、ＩＤＯと類似のＤＣ発現動態を示すか又は免疫調節のマスタースイッチのクラスターに属する遺伝子は、負に調節する免疫抑制性フィードバックループに関与することが示されている。ＩＬ−１０又はＩＤＯの発現がＲＮＡ干渉を用いてノックダウンされているものと類似の実験を設計した。ＤＣを、表３、表４、又は表５からのｓｉＲＮＡ特異的遺伝子でトランスフェクトした。図９に示すのは、遺伝子ＭＡＰＫＡＰＫ２、ＩＲＦ２、ＰＨＦ１１、ＩＲＦ４、ＪＡＫ１、ＣＥＢＰＢ、及びＥＴＶ６である。ＬＰＳ／ＩＦＮ−γで６時間曝露することによる成熟開始後、遺伝子操作したＤＣを同種異系Ｔリンパ球と６日間共培養した。同種異系Ｔリンパ球を、細胞内に入りタンパク質と結合する蛍光色素ＣＦＳＥで標識して細胞内に保持し；過剰のＣＦＳＥは洗浄除去した。それぞれの細胞分裂により、Ｔリンパ球の蛍光強度は半減するため、共培養第６日目にＴリンパ球増殖の評価を可能にした。対照として非トランスフェクトＤＣ又は対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＤＣを用いた。遺伝子操作したＤＣが同種異系Ｔリンパ球を刺激する能力の改善により、ｓｉＲＮＡの標的遺伝子が負の調節フィードバックループに関与することの証拠を提供する。これは、そのような遺伝子をノックダウンさせるために遺伝子操作されているＤＣ免疫医薬は、慣用の免疫治療法と比較して、治療効果が改善することを更に示している。
【００９２】
結論
ＤＣ免疫医薬の特徴は遺伝子操作によって調節できる証拠が本発明によって提供される。ＤＣにおける免疫刺激性分子の過剰発現及び免疫抑制性分子のノックダウンは、免疫刺激能を高めることを立証した。これは、ＤＣがんワクチン又は抗感染ＤＣ免疫医薬としての適用を見い出すことができる。ここで、ＤＣは、腫瘍由来抗原又は微生物由来抗原を負荷しており、成熟刺激へ曝露され、記載のように操作されている。更に、本明細書において提示したデータは、免疫刺激性分子をノックダウンさせることによって、及び免疫抑制性分子を過剰発現させることによって、免疫抑制性ＤＣ医薬を設計することができることを暗示する。そのような抑制性ＤＣ免疫医薬は、アレルギー又は自己免疫だけでなく、移植レシピエントの免疫系を移植組織に対して寛容化するめの移植医薬にも適用し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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