(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０２３として寄託されているバチルス属の菌。
【請求項２】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０２３として寄託されているバチルス属の菌、前記菌の菌体破砕物、及び前記菌体破砕物の分画物のいずれか一以上を含有するダイオキシン類分解剤であって、前記菌体破砕物が前記菌の菌体膜の破砕物を含み、前記分画物が前記菌体膜の分画物を含む、ダイオキシン類分解剤。
【請求項３】
ダイオキシン類を含有する水相に、酸素を供給しながら請求項２に記載のダイオキシン類分解剤を混合して前記水相中のダイオキシン類を分解する工程を含む、ダイオキシン類の分解方法。
【請求項４】
前記水相が、
ダイオキシン類を含有する汚染土壌からシルトを分離する工程と、
分離されたシルトを酸で洗浄してシルトのガラス成分をシルトから除去する工程と、
洗浄されたシルト中のダイオキシン類を非水溶性溶剤に抽出する工程と、
非水溶性溶剤中のダイオキシン類を非水溶性溶剤から水溶性溶剤に抽出する工程と、
ダイオキシン類を抽出した水溶性溶剤と水とを混合する工程と、によって得られることを特徴とする請求項３に記載のダイオキシン類の分解方法。
【請求項５】
前記水相が、
ダイオキシン類を含有する汚染土壌からシルトを分離する工程と、
分離されたシルトとフミン質とを含有するアルカリ性の水スラリーを調製して水相にダイオキシン類を抽出する工程と、によって得られることを特徴とする請求項３に記載のダイオキシン類の分解方法。
【請求項６】
水スラリーの調製前に、分離されたシルトを酸で洗浄してシルトのガラス成分をシルトから除去する工程をさらに含む請求項５に記載のダイオキシン類の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ダイオキシン類の分解能に優れる新規な微生物、それを用いたダイオキシン類分解剤、及び該製剤を用いるダイオキシン類の分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
産業廃棄物の分解には、細菌による生分解が利用されている。このような産業廃棄物の生分解に利用される微生物としては、例えば、バチルス・ミドウスジ・ＳＨ２Ｂが知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
また産業廃棄物としては、例えば焼却炉の使用、焼却施設の解体や焼却灰の埋め立てによって発生する、ダイオキシン類を含有する汚染物（ダイオキシン類汚染物）が知られており、このようなダイオキシン類汚染物を生分解によって浄化する方法としては、例えばダイオキシン類汚染土壌又はそれを含有する水スラリーに、バチルス・ミドウスジ又はその菌体破砕物を混合して、ダイオキシン類汚染土壌中のダイオキシン類を分解する方法が知られている（例えば、特許文献２及び３参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００２−５０５０７３号公報
【特許文献２】特開２００２−３０１４６６号公報
【特許文献３】特開２００４−２９８８６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、産業廃棄物中のダイオキシン類をさらに効率よく分解することが可能な技術を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、バチルス・ミドウスジのダイオキシン類の分解能をさらに上回る微生物を発見し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち本発明は、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０２３として寄託されているバチルス属の菌を提供する。
【０００８】
また本発明は、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０２３として寄託されているバチルス属の菌、前記菌の菌体破砕物、及び前記菌体破砕物の分画物のいずれか一以上を含有するダイオキシン類分解剤であって、前記菌体破砕物が前記菌の菌体膜の破砕物を含み、前記分画物が前記菌体膜の分画物を含む、ダイオキシン類分解剤を提供する。
【０００９】
また本発明は、ダイオキシン類を含有する水相に、酸素を供給しながら請求項２に記載のダイオキシン類分解剤を混合して前記水相中のダイオキシン類を分解する工程を含む、ダイオキシン類の分解方法を提供する。
【００１０】
また本発明は、前記水相が、ダイオキシン類を含有する汚染土壌からシルトを分離する工程と、分離されたシルトを酸で洗浄してシルトのガラス成分をシルトから除去する工程と、洗浄されたシルト中のダイオキシン類を非水溶性溶剤に抽出する工程と、非水溶性溶剤中のダイオキシン類を非水溶性溶剤から水溶性溶剤に抽出する工程と、ダイオキシン類を抽出した水溶性溶剤と水とを混合する工程と、によって得られる前記の分解方法を提供する。
【００１１】
又は本発明は、前記水相が、ダイオキシン類を含有する汚染土壌からシルトを分離する工程と、分離されたシルトとフミン質とを含有するアルカリ性の水スラリーを調製して水相にダイオキシン類を抽出する工程と、によって得られる前記の分解方法を提供する。
【００１２】
また本発明は、水スラリーの調製前に、分離されたシルトを酸で洗浄してシルトのガラス成分をシルトから除去する工程をさらに含む前記の分解方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０２３として寄託されているバチルス属の菌の菌株をダイオキシン類分解剤に利用することによって、バチルス・ミドウスジをダイオキシン類分解剤に利用する場合に比べて、産業廃棄物等に含まれるダイオキシン類をさらに効率よく分解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明のダイオキシン類の分解方法で用いられ得る浄化対象シルトの一調製方法を示す図である。
【図２】浄化対象シルトからダイオキシン類を抽出する一方法を示す図である。
【図３】浄化対象シルトからダイオキシン類を抽出する他の方法を示す図である。
【図４】分解対象となるダイオキシン類を含有する水相中のダイオキシン類を分解する一方法を示す図である。
【図５】浄化対象シルトからダイオキシン類の水相への抽出と分解とを行う一方法を示す図である。
【図６】実施例１における混合、分解時間ごとの２，７ＤＣＤＤの濃度を表す図である。
【図７】比較例１における混合、分解中の四塩素化以上のダイオキシン類の濃度の変化を表す図である。
【図８】シルト２の示差熱分析及び熱重量測定の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の新規微生物は、２０１０年１２月２２日に、特許法施行規則に基づく微生物の寄託機関であり、またブダペスト条約に基づく国際寄託当局である特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）へ、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０２３として寄託されているバチルス属の菌である。以下、本発明の新規微生物を「バチルスＵＺＯ３」とも言う。
【００１６】
本発明のダイオキシン類分解剤は、バチルスＵＺＯ３、バチルスＵＺＯ３の菌体破砕物、及び前記菌体破砕物の分画物のいずれか一以上を含有する。前記菌体破砕物は、バチルスＵＺＯ３の菌体膜の破砕物を含み、前記分画物は、菌体膜の分画物を含む。
【００１７】
本発明において、ダイオキシン類とは、ポリ塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン、ポリ塩素化ジベンゾフラン、及びコプラナーＰＣＢ（ポリ塩化ビフェニル）の全ての総称である。本発明では、「ダイオキシン類」は、特に断らない限りこれらの化合物の一部又は全部を表す。
【００１８】
本発明においては、特に断らない限り、バチルスＵＺＯ３の菌体破砕物とは、バチルスＵＺＯ３の菌体全体の破砕物を言う。バチルスＵＺＯ３の菌体膜を含む菌体破砕物は、微生物の菌体破砕物を得るために通常用いられる方法によって得ることができる。このような方法としては、例えば、超音波、圧搾、細胞膜分解酵素の添加等によって菌体を破砕する工程と、必要に応じて破砕物からの菌体膜分画と細胞質分画とを分離する工程とを含む方法が挙げられる。本発明において、菌体膜を含む菌体破砕物は、菌体膜の破砕物が含まれていれば、細胞質等の他の部位の破砕物をさらに含んでいてもよい。
【００１９】
また、前記菌体破砕物の分画物は、ダイオキシン類の分解活性を有するたんぱく質を少なくとも含有する。このような分画物は、前記菌体破砕物全体又は菌体膜の破砕物から、ダイオキシン類の分解活性を有するたんぱく質を抽出することによって、或いは、前記菌体破砕物全体又は菌体膜の破砕物から、ダイオキシン類の分解活性を有さないたんぱく質を分離することによって得られる。このようなたんぱく質の抽出や分離は、例えば、沈殿法による分離、例えば硫安沈殿法、クロマトグラフィーによる分離、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等、電気泳動法による分離法、及びこれらの方法の任意の組み合わせによって実施することができる。
【００２０】
本発明のダイオキシン類分解剤は、ダイオキシン類分解剤の種類に応じて、通常の微生物の生分解による特定化合物の分解方法に従ってダイオキシン類の分解に用いることができる。ダイオキシン類分解剤がバチルスＵＺＯ３を含む場合には、バチルスＵＺＯ３が増殖する条件における、ダイオキシン類を含有する水相に、ダイオキシン類分解剤を混合することによって、水相中のダイオキシン類の分解に用いることができる。ダイオキシン類を含有する水相は、ダイオキシン類分解剤が前記菌体破砕物及び前記分画物の一方又は両方を含む場合には、ダイオキシン類を含有する水相に、酸素を供給しながらダイオキシン類分解剤を混合することによって、水相中のダイオキシン類の分解に用いることができる。
【００２１】
バチルスＵＺＯ３をダイオキシン類分解剤として用いる場合の条件としては、例えば、水相中のダイオキシン類分解剤の含有量が水相に対する重量比で１／１，０００〜１／１０，０００であり、水相中のダイオキシン類の濃度が１００〜６００ｐｇ−ＴＥＱ／総量であり、温度が３０〜６５℃であり、水相への酸素の供給量が０．１〜１．０ｍｇ／Ｌである条件が挙げられる。ダイオキシン類の分解の促進の観点から、温度が６５℃であり、水相への酸素の供給量が１．０ｍｇ／Ｌであることが好ましい。また、前記の観点から、ダイオキシン類以外の基質の濃度が１〜３質量％であり、水相のｐＨが７．０〜８．５であることがより好ましい。ダイオキシン類以外の基質としては、例えば、コンスティープリカー、トリプチソイブロス、及びイーストエキストラクトが挙げられる。
【００２２】
前記菌体破砕物及び前記分画物の一方又は両方をダイオキシン類分解剤として用いる場合の条件としては、例えば、水相中のダイオキシン類分解剤の含有量が水相に対する重量比で１／１，０００〜１／１０，０００であり、水相中のダイオキシン類の濃度が１００〜１，０００ｐｇ−ＴＥＱ／総量であり、温度が２８〜６５℃であり、水相への酸素の供給量が０．１ｍｇ／Ｌ以上である条件が挙げられる。ダイオキシン類の分解の促進の観点から、温度が６５℃であり、水相への酸素の供給量が０．３ｍｇ／Ｌであることが好ましい。また、前記の観点から、水相のｐＨが７．０〜８．０であることがより好ましい。
【００２３】
本発明のダイオキシン類分解剤は、そのまま前記水相と混合して用いることができ、また、たんぱく質やダイオキシン類等の有機化合物に対して吸着能力を有するゼオライトや活性炭、又はハイドロキシアパタイト等の無機担体や、又はアクリルアミドポリマー、アルギン酸やカラギーナン等の有機高分子系担体等の担体に、通常用いられている方法に従って担持させて用いることもできる。
【００２４】
前記菌体破砕物及び前記分画物は、バチルスＵＺＯ３の活動可能な温度で前記水相中のダイオキシン類を分解することが可能であり、またバチルスＵＺＯ３の活動可能な温度よりも低い温度（例えば２５℃以上）でも水相中のダイオキシン類を分解することが可能である。本発明のダイオキシン類分解剤の使用における前記水相の温度は、６０℃以上であることが、前記水相中の雑菌による浸食や分解を防止する観点から好ましく、６５℃であることがより好ましい。
【００２５】
本発明のダイオキシン類の分解方法は、ダイオキシン類を含有する水相に、酸素を供給しながら本発明のダイオキシン類分解剤を混合して前記水相中のダイオキシン類を分解する工程を含む。
【００２６】
水相への酸素の供給は、酸素そのものの供給でもよいし、空気のように酸素を含有するガスの供給であってもよい。酸素の供給は、ダイオキシン類分解剤と酸素とが水相中で接触するように酸素又は酸素含有ガスを水相中に供給することによって行うことができる。水相の撹拌によって大気中の空気が水相に十分に供給される場合には、水相の撹拌装置が水相への酸素供給装置を兼ねてもよい。
【００２７】
前記水相としては、例えば、ダイオキシン類を含有するダイオキシン類汚染物と水との混合物、及び、水溶性成分によって水相中に抽出されたダイオキシン類と水との混合物、が挙げられる。ダイオキシン類汚染物としては、例えば、飛灰（フライ・アッシュ）、ダイオキシン類を含有する土壌、及びダイオキシン類の溶液が挙げられる。
【００２８】
前記水相は、ダイオキシン類汚染物と水とを混合することによって得ることができる。前記水相は、ダイオキシン類汚染物からのダイオキシン類の抽出処理によって得られる水相であることが、ダイオキシン類の分解の効率や汚染物の浄化作業の効率の向上の観点から好ましい。
【００２９】
このようなダイオキシン類汚染物からのダイオキシン類の抽出処理は、ダイオキシン類汚染物の種類に応じて行うことができる。例えばダイオキシン類汚染物がダイオキシン類を含有するダイオキシン類汚染土壌である場合では、土壌は通常、シルトを含有し、このシルトにダイオキシン類が蓄積されやすいことから、ダイオキシン類汚染土壌からシルトを分離し、シルトからダイオキシン類を抽出することによって、ダイオキシン類の抽出処理による前記水相を得ることができる。
【００３０】
例えば、前記水相は、ダイオキシン類を含有する汚染土壌からシルトを分離する第一の工程と、分離されたシルトを酸で洗浄してシルトのガラス成分をシルトから除去する第二の工程と、洗浄されたシルト中のダイオキシン類を非水溶性溶剤に抽出する第三の工程と、非水溶性溶剤中のダイオキシン類を非水溶性溶剤から水溶性溶剤に抽出する第四の工程と、ダイオキシン類を抽出した水溶性溶剤の水溶液を非水溶性溶剤から分液する第五の工程と、によって得ることができる。
【００３１】
また例えば、前記水相は、ダイオキシン類を含有する汚染土壌からシルトを分離する第一の工程と、分離されたシルトとフミン質とを含有するアルカリ性の水スラリーを調製して水相にダイオキシン類を抽出する第六の工程と、によって得ることができる。この水相の調整方法では、シルトからのダイオキシン類の抽出効率をより高める観点から、第一の工程と第六の工程との間に前記第二の工程をさらに含めることができる。
【００３２】
前記第一の工程は、ダイオキシン類を含有する汚染土壌からシルトを分離する。シルトは、珪藻の堆積物から生成された成分と言われており、土壌中の成分のうち、砂と粘土の中間の粒径である、５μｍ以上７５μｍ未満の粒径を有する粒子の成分である。前記第一の工程では、ダイオキシン類汚染土壌からシルトのみが分離されてもよいし、主成分としてシルトがそれ以外の成分を副成分として伴って分離されてもよい。シルトのみの分離は、ダイオキシン類汚染土壌からのダイオキシン類の抽出率を高める観点から好ましく、シルトを主成分とし泥等の副成分を含むシルトの分離は、シルトの分離作業の簡易化の観点から好ましい。
【００３３】
第一の工程は、土壌の分級における常法によって行うことができる。第一の工程に用いられる方法としては、例えば、所定量の水を土壌に加えた試料を振動する篩にかけて、篩の目開きに応じた所望の粒径の成分を分離する、電動ふるい装置を用いる加水ふるい法が挙げられる。
【００３４】
前記第二の工程は、分離されたシルトを酸で洗浄してシルトのガラス成分をシルトから除去する。第二の工程におけるシルトからのガラス成分の除去は、シルトへの酸の添加と、シルト及び酸の十分な混合と、酸によってゲル化したガラス成分のシルトからの分離とによって行うことができる。シルトと酸との混合はスラリーを撹拌可能な通常の撹拌装置を用いて行うことができ、シルトからのゲル化したガラス成分の除去は、例えば、回転式水洗浄機と、スクリュー型湿式分別機又はフィルタプレス型脱水機とを用いた一連の加水洗浄・分別装置を用いて行うことができる。
【００３５】
第二の工程に用いられる酸は一種でも二種以上でもよい。このような酸としては、例えば塩酸、硫酸、及び硝酸等の無機酸や、スルホン酸等の有機酸が挙げられる。第二の工程に用いられる酸の濃度は、シルトのガラス成分を除去する観点から、１規定以上であることが好ましく、２規定以上であることがより好ましい。また、第二の工程における酸の使用量は、シルトと酸との混合性の観点から、シルトに対して体積比で１以上であることが好ましく、２以上であることがより好ましい。
【００３６】
前記第三の工程は、洗浄されたシルト中のダイオキシン類を非水溶性溶剤に抽出する。前記非水溶性溶剤には、静置によって水と分液することができ、かつ、シルト中の有機物を吸収してシルトから分離することができる成分を用いることができる。非水溶性溶剤は一種でも二種以上でもよい。このような非水溶性溶剤としては、例えば、アルカン等の飽和脂肪族炭化水素、アルケン等の不飽和脂肪族炭化水素、ベンゼンやトルエン等の芳香族炭化水素、及びこれらの非水溶性の誘導体が挙げられる。非水溶性溶剤としてより具体的には、炭素数１６以上のアルカンが挙げられ、さらにはｎ−ヘキサデカンが挙げられる。
【００３７】
第三の工程は、２０〜６５℃で行われることが好ましく、２０〜４０℃で行われることがより好ましい。シルトからダイオキシン類を抽出した非水溶性溶剤は、静置及び分液によって回収することができる。
【００３８】
前記第四の工程は、非水溶性溶剤中のダイオキシン類を非水溶性溶剤から水溶性溶剤に抽出する。前記水溶性溶剤は、非水溶性溶剤よりも高いダイオキシン類の溶解性を有し、かつ水溶性を有する溶剤である。水溶性溶剤は一種でも二種以上でもよい。このような水溶性溶剤としては、例えばジメチルスルホキシド及びアセトンが挙げられる。第四の工程は、１０〜３０℃で行われることが好ましく、常温で行われることがより好ましい。第四の工程は、例えば、ダイオキシン類を抽出した非水溶性溶剤と水溶性溶剤とを混合することによって行うことができる。
【００３９】
前記第五の工程は、ダイオキシン類を抽出した水溶性溶剤の水溶液を非水溶性溶剤から分液する。第五の工程は、第四の工程における非水溶性溶剤と水溶性溶剤との混合溶剤にさらに水を加えて混合し、水溶性溶剤と水溶性溶剤に溶解したダイオキシン類とを水相に移し、この水相を非水溶性溶剤と分液することによって行うことができる。前記混合溶剤に添加される水の量は、水溶性溶剤の水溶液が非水溶性溶剤と静置によって分液可能な量であればよい。
【００４０】
前記第六の工程は、分離されたシルトとフミン質とを含有するアルカリ性の水スラリーを調製して水相にダイオキシン類を抽出する。フミン質とは、植物等が微生物によって分解されるときの最終分解生成物で、直鎖炭化水素と多環芳香族化合物（分子量数千から１万程度）の難分解性高分子化合物であり、腐植質ともいう。フミン質はフミン酸やフルボ酸を含む。フミン質には、石炭化度の低い泥炭や褐炭から分離された成分を用いることができ、また、パルプの製造において排出されるパルプ廃液を用いることができる。
【００４１】
フミン酸とは、フミン質のうち、アルカリに溶けて、酸で沈殿する有機高分子化合物をいう。このような溶解特性を有することから、フミン質はフミン酸であることが、ダイオキシン類の抽出効率の向上、及び抽出、分離作業のさらなる効率化の観点から好ましい。
【００４２】
第六の工程における水スラリーは、ダイオキシン類汚染土壌から分離されたシルトにフミン質を添加し、必要に応じて水を添加することによって調製することができる。水スラリーにおける水の含有量は、流動性の担保、本発明のダイオキシン類分解剤とダイオキシン類との反応、及び処理量の減容の観点から、シルト１００質量部に対して８０〜３００質量部であることが好ましく、１００〜２５０質量部であることがより好ましく、１００〜１５０質量部であることがさらに好ましい。
【００４３】
また、水スラリーにおけるフミン質の含有量は、シルトからのダイオキシン類の抽出性能を高める観点から、シルト１００質量部に対して２０〜１００質量部であることが好ましく、５０〜１００質量部であることがより好ましく、８０〜１００質量部であることがさらに好ましい。
【００４４】
水スラリーのアルカリ性への調整は、水スラリーのｐＨをアルカリ側の所望のｐＨに調整可能な薬剤の水スラリーへの添加によって行うことができる。このような薬剤としては、例えば水酸化ナトリウム等のアルカリや、アルカリ性を維持するｐＨ緩衝液が挙げられる。水スラリーのｐＨは、フミン質、例えばフミン酸の水への可溶性を維持する観点から、７より大きく９以下であることが好ましく、８〜９であることがより好ましく、９であることがさらに好ましい。
【００４５】
前記水相の調整方法には、前述した第一から第六の工程以外の他の工程をさらに含めることができる。このような他の工程としては、例えば、摩砕処理工程、及びアルコール処理工程が挙げられる。
【００４６】
前記摩砕処理工程は、前記第一の工程に先立って、ダイオキシン類汚染土壌の一部又は全部を揉み擦り合わせる。摩砕処理工程によって、ダイオキシン類汚染土壌中のダイオキシン類はシルトにより一層偏在することから、摩砕処理工程は、シルトのダイオキシン類の含有量を高める観点から好ましい。摩砕処理工程は、ダイオキシン類汚染土壌を混練可能な装置、例えば新六精機株式会社製、骨材研磨機「ハリケーン」（登録商標）を用いて行うことができる。
【００４７】
前記アルコール処理は、前記第二の工程に続いて、酸処理されたシルトとアルコールとを混合する。アルコールは、タンパク質に対して脱水作用を呈し、タンパク質を変性させて収縮させる。アルコール処理は、シルトの細孔中に収容されている、ダイオキシン類を含みやすい有機物を収縮させて、シルトからのダイオキシン類の抽出効率を高める観点から好ましい。
【００４８】
アルコール処理工程で用いられるアルコールには、前述したタンパク質の変性を生じさせるアルコールを用いることができる。アルコールは一種でも二種以上でもよい。このようなアルコールとしては、例えば、エタノール及びプロパノールが挙げられる。アルコール処理におけるアルコールの濃度は、シルトからの有機物の抽出率をさらに高める観点から、８０体積％以上であることが好ましい。またアルコール処理は、常温で行うことができ、アルコール処理時間は１２〜２４時間であることが好ましい。
【００４９】
前述した水相の調製方法では、シルト中のダイオキシン類の含有量が所望の値を下回るまで、第三の工程でダイオキシン類が抽出されたシルトを第三の工程やアルコール処理工程で処理されるシルトとして繰り返し使用することができ、又は第六の工程でダイオキシン類が抽出されたシルトを第六の工程で処理されるシルトとして繰り返し使用することができる。
【００５０】
本発明のダイオキシン類の分解方法は前述の水相の調製方法と、ダイオキシン類汚染土壌におけるシルト以外の土壌成分やダイオキシン類が除去されたシルトを回収する工程をさらに含むことによって、ダイオキシン類汚染土壌の浄化を行うことができる。このような本発明のダイオキシン類の分解方法では、ダイオキシン類汚染土壌の採取場所で行われること、及び水スラリーとしてダイオキシン類汚染土壌が搬入されること、がダイオキシン類の拡散を防止する観点から好ましい。
【００５１】
本発明のダイオキシン類の分解方法によれば、高いダイオキシン類の分解活性と、高い再現性とが得られる。例えば本発明のダイオキシン類の分解方法によれば、菌体破砕物をダイオキシン類分解剤として用いて、水相中の２，７−ジクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（２，７ＤＣＤＤ）の濃度を約５時間で半減させることができ、また８０％を超える確率でこのような高い分解活性の実施例を得ることができる。
【００５２】
本発明のダイオキシン類の分解方法において、水相中のダイオキシン類の分解の終点は、水相中のダイオキシン類の濃度によって決めることができる。ダイオキシン類汚染土壌の浄化の終点は、水相中のシルトにおけるダイオキシン類の濃度によって決めることができる。水相中のシルトにおけるダイオキシン類の濃度は、例えば、従来のように、シルトを水相から採取し、シルト中のダイオキシン類を水相に抽出し、抽出されたダイオキシン類に対して、ダイオキシン類と選択的に結合する工程を用いるＥＬＩＳＡ法を適用することによって求めることができる。水相中のダイオキシン類の濃度は、水相からの適当な有機溶媒（例えば酢酸エチル等）への抽出やさらなる適当な誘導体化を利用することによって、ＧＣ−ＭＳによってダイオキシン類、その誘導体化物、又はその分解物を検出し、求めることができる。
【００５３】
本発明のダイオキシン類の分解方法において、ダイオキシン類を含有する浄化対象シルトは、例えば図１に示すように、摩砕処理機を用いてダイオキシン汚染土壌を摩砕処理し、次いで電動ふるい装置を用いて砂礫、シルト、及び水に分離することによって、分離されたシルトとして得ることができる。また前記浄化対象シルトは、図１に示すように、分離されたシルトを、摩砕処理機を用いて酸とさらに摩砕処理することによって、酸処理シルトとして得ることができる。摩砕処理機には、例えば新六精機株式会社製、骨材研磨機「ハリケーン」（登録商標）を用いることができ、電動ふるい装置には、例えば筒井理化学器械株式会社製、ふるい振とう機を用いることができる。分離された砂礫は、ダイオキシン類の濃度が規制値未満であれば土壌として埋め立て等に再利用することができる。分離された水は、シルトの分離に再利用することができる。
【００５４】
浄化対象シルトの浄化は、例えば図２に示すように、撹拌装置を用いてアルカン系溶媒等の非水溶性溶剤と浄化対象シルトとを撹拌し、シルトを含む第一の水相、及び第一の油相に分離し、撹拌装置を用いて、分離した第一の油相をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の水溶性溶剤と撹拌し、この撹拌後に水を混合し、第二の水相及び第二の油相に分離することによって行うことができる。浄化対象シルト中のダイオキシン類は、非水溶性溶剤及び水溶性溶剤を経て第二の水相に抽出される。撹拌装置には、水相及び油相を収容する槽と、これらの二相を十分に撹拌、混合可能な撹拌機とを有する装置を用いることができる。
【００５５】
浄化対象シルトと非水溶性溶剤との撹拌前にエタノール等のアルコールとの撹拌や浸漬によって浄化対象シルトをアルコール処理すると、浄化対象シルトからのダイオキシン類のアルカン系溶媒への抽出効率を高める観点から好ましい。また、第一の水相は、浄化対象シルトとして、非水溶性溶剤による抽出操作に繰り返し用いてもよい。また、第二の油相は、非水溶性溶剤として再利用することができる。
【００５６】
また浄化対象シルトの浄化は、例えば図３に示すように、撹拌装置を用いて浄化対象シルト、水、フミン酸、及びアルカリを撹拌し、シルトと上澄み（水相）との分離することによっても行うことができる。浄化対象シルト中のダイオキシン類は、フミン酸によって水相に抽出される。シルトと上澄みとの分離は、例えば沈殿槽や遠心分離機による固液分離のような、スラリーからの土壌の通常の分離方法によって行うことができる。分離したシルトは、そのダイオキシン類の濃度に応じて、浄化対象シルトとして繰り返し使用してもよい。また分離したシルトは、そのダイオキシン類の濃度に応じて、摩砕処理機による酸処理を行って酸処理シルトとした後に浄化対象シルトとして繰り返し使用してもよい。分離したシルトは、ダイオキシン類の濃度が規制値未満であれば土壌として再利用することができる。
【００５７】
図２に示す方法における第二の水相や図３に示す方法における上澄み等の、分解の対象となるダイオキシン類が含まれている分解対象水相中のダイオキシン類の分解は、図４に示すように、ダイオキシン類分解剤の種類に応じて撹拌装置又は撹拌培養装置を用いて分解対象水相とダイオキシン類分解剤と撹拌することによって行うことができる。それにより分解対象水相中のダイオキシン類は分解され、浄化水となる。バチルスＵＺＯ３の生菌をダイオキシン類分解剤として用いる場合では撹拌培養装置を用いる。バチルスＵＺＯ３の菌体破砕物又はその分画物をダイオキシン類分解剤として用いる場合では、撹拌培養装置及び撹拌装置のいずれを用いてもよい。水相中のダイオキシン類濃度が規制値以上である場合には、ダイオキシン類分解剤やフミン酸の追加投入や、水相の温度の調整を必要に応じて行う。
【００５８】
ここでの撹拌装置は、水相を収容する槽を有し、必要に応じて、水相中に酸素含有ガスを供給する装置と、水相を十分に撹拌可能な撹拌機とを有する装置である。撹拌酸素含有ガスの水相への供給によって、ダイオキシン類分解剤によるダイオキシン類の分解を行うのに十分に水相が撹拌される場合には、撹拌装置は撹拌機を有していてなくてもよい。また、水相の撹拌によって、ダイオキシン類分解剤によるダイオキシン類の分解を行うのに十分に水相へ空気が供給される場合には、撹拌装置は酸素含有ガス供給装置を有していなくてもよい。撹拌培養装置は、前述の撹拌装置の構成に加えて、バチルスＵＺＯ３が生育可能な温度に水相の温度を調整する装置をさらに有する装置を用いることができる。
【００５９】
浄化水は、必要に応じて活性汚泥処理等のさらなる処理を施して放流することができる。また浄化水は、例えばバチルスＵＺＯ３の生菌をダイオキシン類分解剤として用いる場合では、浄化水中のダイオキシン類分解剤を回収し、ダイオキシン類分解剤として再利用することができ、また図示の方法における水として再利用することができる。
【００６０】
本発明のダイオキシン類の分解方法では、浄化対象シルトからのダイオキシン類の水相への抽出と、水相におけるダイオキシン類の分解とを一つの操作で行うことも可能である。浄化対象シルトからのダイオキシン類の分解は、例えば図５に示すように、図４に示す分解方法と同様にダイオキシン類分解剤の種類に応じて撹拌装置又は撹拌培養装置を用いて、浄化対象シルト、水、フミン酸、アルカリ、及びダイオキシン類分解剤を撹拌し、シルトと上澄み（水相）との分離することによっても行うことができる。
【００６１】
浄化対象シルト中のダイオキシン類は、フミン酸によって水相に抽出され、水相中でダイオキシン類分解剤によって分解される。分離したシルトは、図３に示す浄化対象シルトの浄化と同様に、シルト中のダイオキシン類の濃度に応じて、浄化対象シルトとして繰り返し使用してもよいし、摩砕処理機による酸処理を行って酸処理シルトとした後に浄化対象シルトとして繰り返し使用してもよい。
【００６２】
分離したシルトは、ダイオキシン類の濃度が規制値未満であれば土壌として再利用することができる。浄化水は、図４に示す方法と同様に放流してもよいし、ダイオキシン類分解剤を含む部分を採取してダイオキシン類分解剤として再利用してもよいし、図示の方法における水として再利用してもよい。
【００６３】
図１に示すシルトの酸処理では、例えば２０％の濃度の塩酸を用いた摩砕処理を１時間以上行うことによってシルトの乾燥重量の６％に相当するガラス成分をシルトから分離することができる。酸処理シルトは、ガラス成分の除去やその後のアルカリの使用量を抑制する観点から、その後の工程に用いる前に水洗されることが好ましい。酸処理シルトの水洗には例えばシルトと同じ重量の水が用いられ、水洗の回数は特に限定されないが二回以上であることが好ましい。
【００６４】
図２に示す方法における非水溶性溶剤であるアルカン系溶媒には、例えばｎ−ヘキサデカンを用いることができる。アルカン系溶媒の使用量は、例えば浄化対象シルトを含有する水相と同体積の量であり、非水溶性溶剤へのダイオキシン類の抽出は、例えば５０〜６５℃で行うことができる。
【００６５】
また図２に示す方法における水溶性溶剤の使用量は、例えば油相に対して８〜１０体積％である。非水溶性溶剤から水溶性溶剤へのダイオキシン類の抽出は、例えば常温で１２時間の攪拌により行われる。またこれらの溶剤の混合物と水との混合によるダイオキシン類の水相への抽出は、例えば常温で１２時間の攪拌により行われる。このときの水の使用量は例えば油相と同体積の量である。
【００６６】
図２に示す方法においてアルコール処理を行う場合では、アルコールの使用量は例えば浄化対象シルトを含有する水相に対して８０体積％以上となる量である。アルコール処理は、例えば９８％エタノールを用いて常温で４時間攪拌することによって行うことができる。
【００６７】
図３や図５に示す方法おける浄化対象シルトに対するフミン酸の使用量は、浄化対象シルトの乾燥重量に対して例えば１５〜３０質量％である。またアルカリには例えば水酸化ナトリウム水溶液を用いることができ、水相のｐＨは例えば９に調整される。またダイオキシン類分解剤としてバチルスＵＺＯ３の生菌を用いる場合の使用量は、例えば水相において０．１〜０．０１質量％である。生菌を用いる場合では、前記水相へ培地をさらに加えることが好ましい。このような培地としては、例えば、水相に対して３％のコンスティープリカー又はトリプチソイブロス等の培地と０．３％濃度のイーストエキストラクトとの溶液が挙げられる。図３に示す浄化対象シルトからのフミン酸による水相へのダイオキシン類の抽出は、例えば２５℃において１６０ｒｐｍで２４時間撹拌することによって行うことができる。
【００６８】
図４や図５に示す方法において、ダイオキシン類分解剤によるダイオキシン類の分解における水相の温度は、生菌を使用する場合では例えば６５℃以上、前記菌体破砕物又はその分画物を使用する場合では例えば２８℃以上である。ダイオキシン類分解剤と水相との撹拌時間は、例えば１〜２４時間である。また、生菌を使用する場合の水相への酸素含有ガスの供給量は、例えば水相中の溶存酸素が１％以上になる量である。
【００６９】
前記の浄化対象シルトの浄化では、採用する方法によって多少は異なるが、一回の抽出でシルト中のダイオキシン類を約５０％まで水相に抽出することができ、水相に抽出したダイオキシン類の約９０％かそれ以上を分解することができる。ダイオキシン類汚染土壌中の実際のダイオキシン類の濃度は、環境基準を若干超える程度であることが多いことから、通常はダイオキシン類の水相への一回の抽出によってダイオキシン類汚染土壌が浄化されることが期待される。
【００７０】
また、抽出を繰り返すことによってダイオキシン類汚染土壌をさらに一層浄化することができる。さらに、水スラリーの調製前にシルトを酸処理することによって、ダイオキシン類の抽出効率をより高めることができ、酸処理されたシルトをさらに水洗することによって、ダイオキシン類の抽出効率をより一層高めることができる。
【実施例】
【００７１】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００７２】
［ダイオキシン類分解バチルス菌のスクリーニング］
総量で５，０００ｐｇ−ＴＥＱ／ｇのダイオキシン類を含む病院跡地における廃棄焼却炉周辺のダイオキシン類汚染土壌から分離したシルト成分と１０8個／ｍＬのＳＨ２Ｂ−Ｊ２菌の共存培養において、６５℃の高温環境に７日間維持することにより、バチルスＳＨ２Ｂのコロニーとは異なるコロニーを得た。この異なるコロニーを採取し、５０ｍＬのコニカルチューブ中で、３質量％のSoybean-Casein Digest Brothと０．３質量％のイーストとを含有する液体培地Ａに投入し、この液体培地Ａを５０ｍＬのコニカルチューブに収容し、円盤式回転培養装置（ＴＡＩＴＥＣ製）により６５℃の雰囲気で２０ｒｐｍの回転数で２時間培養し、ダイオキシン類の分解活性を有するバチルスの菌株を得た。得られた菌株を「バチルスＵＺＯ３」と名付けた。
【００７３】
［バチルスＵＺＯ３株の遺伝子解析］
バチルスＵＺＯ３株のゲノムを抽出し、１６Ｓ  ｒＤＮＡ用プライマーを設計し、ＰＣＲ法によってバチルスＵＺＯ３の１６Ｓ  ｒＤＮＡの増幅と複製を行い、１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を解析した。
【００７４】
ゲノムの抽出は、バチルスＵＺＯ３株をＯＤ600＝０．６〜０．８まで培養し、６，５００ｒｐｍ、４℃で遠心分離し、ＴＥＳＳ  Ｂｕｆｆｅｒで懸濁・洗浄を繰り返し、得られた試料にリゾチウムを添加して細胞壁を加水分解し、次にプロテナーゼＫで細胞を破壊したのち、フェノール処理後にエタノールを加えることによって行った。プライマーによる１６Ｓ  ｒＤＮＡの増幅は、鈴木健一郎らの「微生物の分類・同定実験法」に記載の方法に従って行った。ｒＤＮＡの増幅と複製の試薬には、ｔａｋａｒａ製ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑを用いた。ＤＮＡ配列の決定には、ＢｉｇＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＦＳ  Ｃｏｒｅ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．３．１とＡＢＩ３１００  ａｕｔｏｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。このようにしてバチルスＵＺＯ３株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列、１，４１４の塩基配列を決定した。
【００７５】
［バチルスＵＺＯ３株の生理学的解析］
バチルスＵＺＯ３株の培養液を調製し、マクファーランド比濁法によって菌液を調製し、アピ  マニュアルキット（シスメックス・ビオメリュー株式会社製）を用いた炭素源資化性及び酵素活性の解析を行った。培養液の調製及び菌液の調製は、バチルスＵＺＯ３株をＴｒｉｐｔｉｃａｓｅ  Ｓｏｙ  Ａｇｅｒ培地で１２時間培養したのち、菌体を捕集し、マクファーランド比濁法により所定の濃度に調整することによって行った。炭素源資化性の解析は、アピ５０ＣＨを用い、説明書に記載の方法と手順に従って行った。酵素活性の解析は、アピ２０ＮＥを用い、説明書に記載の方法と手順に従って行った。これらの解析結果を表１に示す。表１において、「＋」は該当する性質を有することを表し、「−」は該当する性質を有さないことを表し、「±」は該当する性質を有するか否かが不明であることを表す。
【００７６】
［バチルス・ミドウスジＳＨ２Ｂ株との対比］
特許文献１にはバチルス・ミドウスジＳＨ２Ｂ株の１６ＳｒＤＮＡ領域の塩基配列のうちの５３８塩基配列が記載されている。バチルス・ミドウスジＳＨ２Ｂ株の１６ＳｒＤＮＡ領域の５３８塩基配列と、前述の得られたバチルスＵＺＯ３株の１６ＳｒＤＮＡ領域の塩基配列のうちのＳＨ２Ｂ株の５３８塩基配列に対応する部分の塩基配列とを比較したところ、１１塩基配列が異なっており、相同性は９８．７％であった。ＳＨ２Ｂ株の５３８塩基配列に対応する部分の塩基配列を含む、バチルスＵＺＯ３株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ領域の６００塩基配列を配列番号１に示す。
【００７７】
また、バチルス・ミドウスジＳＨ２Ｂ株を用いる以外はバチルスＵＺＯ３株と同様にして炭素源資化性及び酵素活性の解析を行った。これらの解析結果も表１に示す。表１から明らかなように、バチルスＵＺＯ３株とバチルス・ミドウスジＳＨ２Ｂ株とでは、炭素源資化性能において、グリセロール及びスクロースの資化性が異なり、酵素活性能において、ウレアーゼの有無が異なっている。
【００７８】
【表１】
0005752951.tif 000002
【００７９】
以上の解析結果より、バチルスＵＺＯ３とバチルス・ミドウスジＳＨ２Ｂは共にGeobacillus属に属すると考えられるが、遺伝的に異なる種のバクテリアであると結論付けた。バチルスＵＺＯ３株は、２０１０年１２月２２日に、特許法施行規則に基づく微生物の寄託機関であり、またブダペスト条約に基づく国際寄託当局である特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）へ、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０２３として寄託した。
【００８０】
［実施例１］
ＵＺＯ３菌をフレンチプレス（１，５００ｋｇ／ｃｍ2）で破砕し、遠心分離（２５，０００ｇ×１０分間）で得た上清を粗酵素とした。粗酵素１ｍｇに２，７−ＤＣＤＤのトルエン溶液（６．２５ｇ／Ｌ）をそれぞれ０．５μＬ加え、これを蓋付き試験管内で、６５℃で、１〜５時間のそれぞれの時間で混合した。そして得られた分解反応液中の２，７−ＤＣＤＤの濃度をＧＣ−ＭＳにて測定した。測定結果を図６に示す。なお、２，７−ＤＣＤＤの濃度は、各測定時間における分解反応液にピリジンを添加した後、溶媒を乾固し、ピリジンを再度添加し、ＴＭＳ化剤であるＢＳＴＦＡ（Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド）をさらに添加して溶解させ、６５℃、３０分間の条件で２，７−ＤＣＤＤをＴＭＳ化し、このＴＭＳ化物をＧＣ−ＭＳで検出した。
【００８１】
図６から明らかなように、バチルスＵＺＯ３の菌体破砕物によるダイオキシン類（２，７−ＤＣＤＤ）の分解では、５時間後には添加されたダイオキシン類がほぼ半減した。
【００８２】
［実施例２及び３］
共存培養における温度を６５℃から３７℃又は２８℃に代えた以外は実施例１と同様に２，７−ＤＣＤＤの分解及び検出を行った。その結果、３７℃又は２８℃においても実施例１と同様にＴＭＳ化物が検出された。
【００８３】
［比較例１］
焼却灰及び飛灰を含有する土壌であるダイオキシン類汚染土壌を、新六精機株式会社製の骨材研磨機「ハリケーン」（登録商標）を用いて摩砕処理した。摩砕処理は、質量比が土壌：水で４：１となるようにダイオキシン類汚染土壌に水を加え、回転数を３００ｒｐとし、常温、常圧の条件で行った。得られた摩砕処理土壌を、筒井理化学機器株式会社製の振とうふるい機、３００−ＭＭを用いて加水ふるい処理法にて分級し、１５０メッシュを通過した、シルトと粘土成分とからなる土壌成分を得た。分級条件は、振動数が１，０００ｒｐｍ、片振幅が１．０ｍｍ、処理試料質量が２００ｇ、加水量が一回当たり１Ｌ、加水回数が３回、とした。得られた土壌成分を原料シルトとした。
【００８４】
得られた原料シルトに１規定の塩酸を等量加え、１６０ｒｐｍで１時間の振とう混合を行うことにより原料シルトを酸処理し、原料シルトからガラス成分を除去して酸処理シルトを得た。
【００８５】
酸処理シルトに、酸処理シルトに対して同量の水を加えて水スラリーを調製し、さらに酸処理シルトと同量のフミン酸を水スラリーに添加し、さらに３％の濃度に調整したＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈの水溶液培地１００ｍＬと、１０8個／ｍＬのバチルスＳＨ２Ｂ菌株とを水スラリーに添加し、さらに水酸化ナトリウムを水スラリーに添加して水スラリーのｐＨを９に調整した。その後、６５℃の環境で１６０ｒｐｍの速度で振とう混合を６日間継続した。振とう混合の間、水スラリーを適時に採取し、水スラリー中の四塩素化以上のダイオキシン類の濃度を実施例１と同様に測定した。測定結果を図７に示す。振とう混合終了後、シャープレス連続遠心器（巴工業株式会社製）を用いて水スラリーを遠心分離することにより、水スラリーからシルトと水相とを分離した。図７から明らかなように、バチルス・ミドウスジＳＨ２Ｂによるダイオキシン類の分解では、水スラリー中のダイオキシン類がほぼ半減するまでに２４時間を要した。
【００８６】
［ダイオキシン類汚染土壌のＤＴＡ解析］
ダイオキシン類汚染土壌を加水ふるい処理法にて分級し、シルト１を得た。また、実施例１に記載の方法によって摩砕処理が施されてなるシルト２を得た。さらに、シルト２を１３．４Ｎの硝酸で常温にて２４時間酸処理し、硝酸処理が施されてなるシルト３を得た。さらには、シルト２を１Ｎの塩酸で常温にて２４時間酸処理し、乾燥後に９５％のエタノールを供給し、常温にてさらに２４時間のアルコール処理が施されてなる、塩酸−アルコール処理シルトであるシルト４を得た。
【００８７】
得られたシルト１〜４のそれぞれを示差熱分析（ＤＴＡ）で分析した。この分析は、島津製作所社製のＤＴＧ−６０を用い、露点が−８０℃の清浄乾燥空気を供給し、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で行った。分析結果を以下の表２に示す。またシルト２のＤＴＡ及び熱重量測定（ＴＧＡ）の結果を図８に示す。
【００８８】
【表２】
0005752951.tif 000003
【００８９】
表２及び図８から明らかなように、酸処理が施されていないシルト１及びシルト２には、５１２℃付近にガラス転移点が見られる。しかしながら表２及び図８から明らかなように、酸処理が施されているシルト３及びシルト４ではこのガラス転移点が見られない。この結果から、シルトの酸による処理によってシルト中のケイ素成分が除去されていることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明は、バチルスＵＺＯ３によってダイオキシン類分解剤を構成することから、生分解によるダイオキシン類の分解において、従来のダイオキシン類分解性微生物を用いる場合に比べてより高い分解能をより高い再現性で得ることができる。また本発明は、自然物由来のフミン質を抽出剤として使用することにより、ダイオキシン類汚染土壌からダイオキシン類を効率よく水相に抽出することができることから、ダイオキシン類汚染土壌の浄化処理を、環境付加がより低い方法によって容易に行うことができ、ダイオキシン類汚染土壌の浄化の作業性のさらなる向上が期待される。
【図１】
0005752951.tif 000004
【図２】
0005752951.tif 000005
【図３】
0005752951.tif 000006
【図４】
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【図５】
0005752951.tif 000008
【図６】
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【図７】
0005752951.tif 000010
【図８】
0005752951.tif 000011
【配列表】
0005752951000001.app