(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号４及び配列番号１２；
（ｂ）配列番号７及び配列番号１２；
（ｃ）配列番号３及び配列番号１７；
（ｄ）配列番号６及び配列番号１２；
（ｅ）配列番号５及び配列番号１２；
（ｆ）配列番号３及び配列番号１２；
（ｇ）配列番号７及び配列番号１１；
（ｈ）配列番号１及び配列番号１２；
（ｉ）配列番号７及び配列番号１３；
（ｊ）配列番号４及び配列番号１３；
（ｋ）配列番号２及び配列番号１２；
（ｌ）配列番号７及び配列番号１０；
（ｍ）配列番号３及び配列番号１６；
（ｎ）配列番号４及び配列番号１１；
（ｏ）配列番号３及び配列番号９；
（ｐ）配列番号３及び配列番号１１；
（ｑ）配列番号３及び配列番号１０；
（ｒ）配列番号７及び配列番号１５；
（ｓ）配列番号７及び配列番号８；
（ｔ）配列番号３及び配列番号１５；
（ｕ）配列番号７及び配列番号１６；及び
（ｖ）配列番号７及び配列番号１４
からなる群から選択される重鎖可変部及び軽鎖可変部を含む単離抗体又はその抗原結合断片であって、Ｔｉｅ２受容体のＡｎｇ１リガンドおよびＡｎｇ２リガンドの両方に特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
請求項１の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離核酸分子。
【請求項３】
請求項２の核酸分子を含むベクター。
【請求項４】
請求項３のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
請求項１の抗体又はその抗原結合断片を作製する方法であって、前記抗体を宿主細胞内で発現させることを含む方法。
【請求項６】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項５の方法。
【請求項７】
請求項１の抗体又はその抗原結合断片を、薬理学的に許容可能な担体と共に含む医薬組成物。
【請求項８】
レポーター分子、水溶性ポリマー、抗体のＦｃ領域、および細胞毒性剤からなる群から選択される分子をさらに含む、請求項７の医薬組成物。
【請求項９】
前記薬理学的に許容可能な担体が医薬製剤化剤である、請求項８の医薬組成物。
【請求項１０】
ヒトＩｇＧ定常領域をさらに含む請求項１の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１１】
ＩｇＧ定常領域のアイソタイプが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４である請求項１０の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１２】
軽鎖定常ドメインをさらに含む請求項１１の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１３】
軽鎖定常ドメインがκ定常ドメインである請求項１２の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１４】
ヒト免疫グロブリン定常領域をさらに含む請求項１の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１５】
定常領域の重鎖アミノ酸配列が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４配列から選択され、定常領域軽鎖アミノ酸配列が、配列番号４４及び４６から選択される請求項１４の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１６】
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、単鎖抗体又はｓｃＦｖ断片である、請求項１の抗原結合断片。
【請求項１７】
検出可能な標識をさらに含む請求項１及び１０〜１６のいずれか１項の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１８】
請求項１及び１０〜１６のいずれか１項の抗体又はその抗原結合断片を含む、望ましくない血管新生を阻害するための医薬組成物。
【請求項１９】
前記望ましくない血管新生が癌である、請求項１８の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本出願は、２００８年１２月１９日に出願された米国特許仮出願第６１／１３９，３６１号、２００８年６月１６日に出願された米国特許仮出願第６１／０６１，９４３号、および２００８年２月２０日に出願された米国特許仮出願第６１／０６６，６３２号の利益を主張するものであり、これらの特許は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、アンジオポエチン−１（Ａｎｇ−１）および／またはアンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）を認識してこれに結合する特異的結合剤に関する。さらに具体的には、本発明は、Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２に特異的に結合するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびに、これらの抗原結合断片の製造、診断上の利用、および治療上の利用に関する。また、本発明の態様は、このような抗体を発現させるハイブリドーマまたはその他の細胞株にも関する。記載されている抗体は、Ａｎｇ−１またはＡｎｇ−２の活性および産生過剰に関係する疾患の診断および治療に有用である。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
血管新生（既存の血管から新たな血管が形成されること）は、多くの生理的過程および病的過程に不可欠である。通常、血管新生は血管新生促進因子と血管新生抑制因子によって厳密に調節されているが、癌、眼血管新生疾患、関節炎、および乾癬などの疾患の場合には、その過程が消失してしまうことがある。Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１：２７−３１（１９９５）。
【０００４】
血管新生の調節不全または望ましくない血管新生が関連することが知られている多くの疾患が存在する。このような疾患としては、網膜症（糖尿病網膜症、加齢性黄斑変性など）のような眼血管新生、乾癬、血管芽腫、血管腫、動脈硬化、リウマチ様もしくはリウマチ性炎症性疾患、特に関節炎（関節リウマチなど）のような炎症性疾患、または、慢性喘息、アテローム性動脈硬化、もしくは移植後のアテローム性硬化、子宮内膜症のようなその他の慢性炎症性疾患、新生物性疾患、例えば、いわゆる固形腫瘍および液状（または造血器）腫瘍（白血病およびリンパ腫など）が挙げられるが、これらに限定されない。望ましくない血管新生に関係する他の疾患は、当業者には明らかである。
【０００５】
多くのシグナル伝達系が血管新生の調節に関連付けられてきたが、最も特徴付けられており、かつ最も内皮細胞選択的である系の１つは、Ｔｉｅ−２という受容体型チロシンキナーゼ（「Ｔｉｅ２」または「Ｔｉｅ−２Ｒ」と呼ばれる（「ＯＲＫ」とも呼ばれる）。また、マウスＴｉｅ−２は「ｔｅｋ」とも呼ばれる）と、そのリガンドであるアンジオポエチンを含む（Ｇａｌｅ，Ｎ．Ｗ．ａｎｄ  Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．Ｄ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：１０５５−１０６６［１９９９］）。アンジオポエチン−１（「Ａｎｇ−１」）からアンジオポエチン−４（「Ａｎｇ−４」）まで、４つの既知のアンジオポエチンが存在する。これらのアンジオポエチンは「Ｔｉｅ−２リガンド」とも呼ばれる。（Ｄａｖｉｓ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ,８７：１１６１−１１６９［１９９６］、Ｇｒｏｓｉｏｓ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ，８４：１１８−１２０［１９９９］、Ｈｏｌａｓｈ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４２：１６１７−１６２５［１９９９］、Ｋｏｂｌｉｚｅｋ，Ｔ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８：５２９−５３２［１９９８］、Ｌｉｎ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９５：８８２９−８８３４［１９９８］、Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：５５−６０［１９９７］、Ｐａｐａｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ，７９：２１３−２２３［１９９９］、Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，３７５：７０−７４［１９９８］、Ｓｈｙｕ，Ｋ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９８：２０８１−２０８７［１９９８］、Ｓｕｒｉ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８７：１１７１―１１８０［１９９６］、Ｓｕｒｉ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：４６８―４７１［１９９８］、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ，９６：１９０４−１９０９［１９９９］、Ｗｉｔｚｅｎｂｉｃｈｌｅｒ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７３：１８５１４−１８５２１［１９９８］）。Ａｎｇ−１のＴｉｅ−２への結合は、培養内皮細胞において受容体のリン酸化を刺激するが、Ａｎｇ−２は、Ｔｉｅ−２受容体のリン酸化の作動と拮抗の両方を行うことが観察されている（前出のＤａｖｉｓ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，［１９９６］、前出のＭａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，  Ｐ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，［１９９７］、Ｋｉｍ，Ｉ．，Ｊ．Ｈ．Ｋｉｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９（３９）：４５４９−４５５２（２０００）、Ｔｅｉｃｈｅｒｔ−Ｋｕｌｉｓｚｅｗｓｋａ，Ｋ．，Ｐ．Ｃ．Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４９（３）：６５９−７０（２００１））。
【０００６】
Ｔｉｅ−２ノックアウトマウスとＡｎｇ−１ノックアウトマウスの表現型は似ており、Ａｎｇ−１によって刺激されるＴｉｅ−２のリン酸化は、内皮細胞と支持細胞との接着の維持を通じて、胎内における発生中の脈管の再構築と安定化を仲介することが示唆されている（Ｄｕｍｏｎｔ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，８：１８９７−１９０９［１９９４］、Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７６：７０−７４［１９９５］、前出のＳｕｒｉ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，［１９９６］）。Ａｎｇ−１の脈管安定化での役割は、成体内で維持されていると考えられており、成体内で、Ａｎｇ−１は広範かつ構成的に発現する（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：４８−５０［１９９７］、Ｚａｇｚａｇ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１５９：３９１−４００［１９９９］）。これに対し、Ａｎｇ−２の発現は主に血管再構築部位に限られ、この部位において、Ａｎｇ−２はＡｎｇ−１の機能を遮断し、それによって、血管新生を促す血管形成性の状態を誘導すると考えられている（前出のＨａｎａｈａｎ，Ｄ．，［１９９７］、Ｈｏｌａｓｈ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：１９９４−１９９８［１９９９］、前出のＭａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，［１９９７］）。
【０００７】
公表されている多くの研究では、血管新生に関係する病状において血管選択的Ａｎｇ−２が発現することが意図的に立証されている。これらの病的状態としては例えば、乾癬、黄斑変性、および癌が挙げられる（Ｂｕｎｏｎｅ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１５５：１９６７−１９７６［１９９９］、Ｅｔｏｈ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１：２１４５―２１５３［２００１］、Ｈａｎｇａｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４２：１６１７−１６２５［２００１］、前出のＨｏｌａｓｈ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，［１９９９］、Ｋｕｒｏｄａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１１６：７１３−７２０［２００１］、Ｏｔａｎｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４０：１９１２−１９２０［１９９９］、Ｓｔｒａｔｍａｎｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１５３：１４５９−１４６６［１９９８］、Ｔａｎａｋａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１０３：３４−３４５［１９９９］、Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１５：１２２１−１２２５［１９９９］、Ｙｕａｎ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：１６５−１７１［２００１］、前出のＺａｇｚａｇ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，［１９９９］）。これらの研究の大半は癌に焦点を当てており、多くの腫瘍型は、血管でのＡｎｇ−２の発現を示すと見られる。病的血管新生におけるＡｎｇ−２の発現とは対照的に、正常組織でのＡｎｇ−２の発現は極めて限られている（前出のＭａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，［１９９９］、Ｍｅｚｑｕｉｔａ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２６０：４９２−４９８［１９９９］）。健常な成人では、血管新生の３つの主要部位は卵巣、胎盤、および子宮であり、これらは、Ａｎｇ−２  ｍＲＮＡが検出された正常（すなわち非癌性）組織中の主要な組織である。
【０００８】
ある特定の機能的研究では、Ａｎｇ−２が腫瘍の血管新生に関与する場合があることが示唆されている。Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１：１２５５−１２５９［２００１］）には、Ａｎｇ２の過剰発現について説明されており、マウス異種移植モデルにおいて、この過剰発現が腫瘍成長の拡大に関係することが意図的に示されている。前出のＥｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，および前出のＴａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，も参照されたい。これらの文献では、その称するところによれば、Ａｎｇ−２の過剰発現を腫瘍の血管分布過多と関連付けるデータが示されている。しかし、対照的に、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，１５８：５６３−５７０［２００１］）には、その称するところによれば、ルイス肺癌細胞およびＴＡ３乳癌細胞におけるＡｎｇ−２の過剰発現が、対応するトランスフェクタントを注射されたマウスの寿命を延長させたことを示すデータが報告されている。
【０００９】
ここ数年、さまざまな文献において、抗癌治療の考え得る標的として、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、およびＴｉｅ−２が提示されている。例えば、米国特許第６,１６６,１８５号、同第５，６５０，４９０号、および同第５,８１４,４６４号にはそれぞれ、抗Ｔｉｅ−２リガンド抗体および受容体の概念が開示されている。米国特許出願公開第２００３／０１２４１２９Ａ１号には、特定の抗Ａｎｇ２抗体、および癌治療におけるそれらの使用について記載されている。Ｌｉｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９５：８８２９−８８３４［１９９８］）は、可溶性Ｔｉｅ−２を発現するアデノウイルスをマウスに注入した。その称するところによれば、この可溶性Ｔｉｅ−２によって、マウスの発症する腫瘍の数と大きさが低下した。関連する研究において、Ｌｉｎら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２０７２−２０７８［１９９７］）は、可溶性形態のＴｉｅ−２をラットに注入した。その称するところによれば、この化合物によって、ラットの腫瘍の大きさが縮小した。Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９：３１８５−３１８９［１９９９］）は、Ｔｉｅ−２の細胞外ドメインを発現するヒトメラノーマ細胞株を生成し、これらの細胞株をヌードマウスに注入して、その称するところによれば、可溶性Ｔｉｅ−２によって、腫瘍の成長および腫瘍の血管新生が「有意に阻害」されると結論付けた。
【００１０】
以上のことから、大半の固形腫瘍は、直径１〜２ミリメートル超に成長するためには新血管新生を必要とするので、有効な抗Ａｎｇ−２療法があれば、膨大な癌患者群のためになる。このような療法は、網膜症、関節炎、および乾癬のように血管新生に関係する他の疾患でも、より広範な用途を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第６,１６６,１８５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６５０，４９０号明細書
【特許文献３】米国特許第５,８１４,４６４号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００３／０１２４１２９Ａ１号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１：２７−３１（１９９５）
【非特許文献２】Ｇａｌｅ，Ｎ．Ｗ．ａｎｄ  Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．Ｄ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：１０５５−１０６６［１９９９］
【非特許文献３】Ｄａｖｉｓ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ,８７：１１６１−１１６９［１９９６］
【非特許文献４】Ｇｒｏｓｉｏｓ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ，８４：１１８−１２０［１９９９］
【非特許文献５】Ｈｏｌａｓｈ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４２：１６１７−１６２５［１９９９］
【非特許文献６】Ｋｏｂｌｉｚｅｋ，Ｔ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８：５２９−５３２［１９９８］
【非特許文献７】Ｌｉｎ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９５：８８２９−８８３４［１９９８］
【非特許文献８】Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：５５−６０［１９９７］
【非特許文献９】Ｐａｐａｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ，７９：２１３−２２３［１９９９］
【非特許文献１０】Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，３７５：７０−７４［１９９８］
【非特許文献１１】Ｓｈｙｕ，Ｋ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９８：２０８１−２０８７［１９９８］
【非特許文献１２】Ｓｕｒｉ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８７：１１７１―１１８０［１９９６］
【非特許文献１３】Ｓｕｒｉ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：４６８―４７１［１９９８］
【非特許文献１４】Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ，９６：１９０４−１９０９［１９９９］
【非特許文献１５】Ｗｉｔｚｅｎｂｉｃｈｌｅｒ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７３：１８５１４−１８５２１［１９９８］
【非特許文献１６】Ｋｉｍ，Ｉ．，Ｊ．Ｈ．Ｋｉｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９（３９）：４５４９−４５５２（２０００）
【非特許文献１７】Ｔｅｉｃｈｅｒｔ−Ｋｕｌｉｓｚｅｗｓｋａ，Ｋ．，Ｐ．Ｃ．Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４９（３）：６５９−７０（２００１）
【非特許文献１８】Ｄｕｍｏｎｔ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，８：１８９７−１９０９［１９９４］
【非特許文献１９】Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７６：７０−７４［１９９５］
【非特許文献２０】Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：４８−５０［１９９７］
【非特許文献２１】Ｚａｇｚａｇ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１５９：３９１−４００［１９９９］
【非特許文献２２】Ｈｏｌａｓｈ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：１９９４−１９９８［１９９９］
【非特許文献２３】Ｂｕｎｏｎｅ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１５５：１９６７−１９７６［１９９９］
【非特許文献２４】Ｅｔｏｈ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１：２１４５―２１５３［２００１］
【非特許文献２５】Ｈａｎｇａｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４２：１６１７−１６２５［２００１］
【非特許文献２６】Ｋｕｒｏｄａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１１６：７１３−７２０［２００１］
【非特許文献２７】Ｏｔａｎｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４０：１９１２−１９２０［１９９９］
【非特許文献２８】Ｓｔｒａｔｍａｎｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１５３：１４５９−１４６６［１９９８］
【非特許文献２９】Ｔａｎａｋａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１０３：３４−３４５［１９９９］
【非特許文献３０】Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１５：１２２１−１２２５［１９９９］
【非特許文献３１】Ｙｕａｎ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：１６５−１７１［２００１］
【非特許文献３２】Ｍｅｚｑｕｉｔａ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２６０：４９２−４９８［１９９９］
【非特許文献３３】Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１：１２５５−１２５９［２００１］Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，１５８：５６３−５７０［２００１］
【非特許文献３４】Ｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９５：８８２９−８８３４［１９９８］
【非特許文献３５】Ｌｉｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２０７２−２０７８［１９９７］
【非特許文献３６】Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９：３１８５−３１８９［１９９９］
【発明の概要】
【００１３】
（発明の要旨）
多くの証拠によって、望ましくない血管新生（または、動脈発生のような望ましくない血管の発生に伴う状態の一部）の治療において、Ａｎｇ２のレベルを抑制することの有用性が指摘されているが、当該技術分野の現状では、上記の治療においてＡｎｇ１の同時阻害が有益であるか否かは不明であり、有益な場合、Ａｎｇ２の阻害に加えて、どの程度Ａｎｇ１を阻害させるかが明らかになれば、少なくとも付加的な治療効果をもたらすことが判明する。したがって、本発明は、Ａｎｇ−１リガンドおよびＡｎｇ−２リガンドの両方を特異的に認識して、これらに結合する新たな薬剤を同定する未認識の必要性を取り扱う。本発明の抗体のような結合剤は、Ａｎｇ１に加えてＡｎｇ２を阻害する際に、所望される活性レベルを有し、これにより、癌、炎症、および望ましくない血管新生に関連するその他の疾患のように、Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２の活性と関係する疾患において、診断スクリーニング、バイオアッセイ、および治療的介入といったさまざまな状況でとりわけ有用なものとなる。
【００１４】
本発明のさまざまな実施形態は、Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ２に特異的に結合して、生理的または病的血管新生を阻害する標的結合剤に関する。これを実現できるメカニズムとしては、Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ２のＴｉｅ１および／またはＴｉｅ２受容体への結合の阻害、Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ２によって誘導されるＴｉｅ１および／またはＴｉｅ２のシグナル伝達の阻害、または、Ａｎｇ１および／またはＡｎｇ−２の患者の身体からのクリアランスの上昇のいずれかによって、Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２の有効濃度を下げることを挙げることができるが、これらに限らない。
【００１５】
本発明の１つの実施形態では、特異的結合剤は、Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２に特異的に結合して、Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２のＴｉｅ１および／またはＴｉｅ２受容体への結合を阻止する完全ヒト抗体である。本発明のさらに別の実施形態は、Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２に特異的に結合すると共に、Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２によって誘導されるＴｉｅ１および／またはＴｉｅ２のリン酸化も阻害する完全ヒトモノクローナル抗体である。この抗体は、約１００ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、または１ｐＭ未満のＫｄでＡｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２結合することができる。本発明の特定の実施形態は、ＩｇＧ型の抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４である。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、重鎖と軽鎖を含む抗体のような結合剤を提供し、該重鎖は、Ｈ２（配列番号１）、Ｈ３（配列番号２）、Ｈ４（配列番号３）、Ｈ６（配列番号４）、Ｈ１０（配列番号５）、Ｈ１１（配列番号６）、Ｈ５Ｐ（配列番号７）、およびこれらの抗原結合断片からなる群から選択される重鎖可変領域を含み、該軽鎖は、Ｌ１（配列番号８）、Ｌ２（配列番号９）、Ｌ４（配列番号１０）、Ｌ６（配列番号１１）、Ｌ７（配列番号１２）、Ｌ８（配列番号１３）、Ｌ９（配列番号１４）、Ｌ１１（配列番号１５）、Ｌ１２（配列番号１６）、Ｌ１３（配列番号１７）、およびこれらの抗原結合断片からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む。
【００１７】
本発明は、Ｈ２（配列番号１）、Ｈ３（配列番号２）、Ｈ４（配列番号３）、Ｈ６（配列番号４）、Ｈ１０（配列番号５）、Ｈ１１（配列番号６）、Ｈ５Ｐ（配列番号７）、Ｌ１（配列番号８）、Ｌ２（配列番号９）、Ｌ４（配列番号１０）、Ｌ６（配列番号１１）、Ｌ７（配列番号１２）、Ｌ８（配列番号１３）、Ｌ９（配列番号１４）、Ｌ１１（配列番号１５）、Ｌ１２（配列番号１６）、Ｌ１３（配列番号１７）、およびこれらの抗原結合断片からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを含む特異的結合剤も提供する。
【００１８】
特異的結合剤は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体のような抗体であることができることは明らかである。抗体は一本鎖抗体であってもよい。特異的結合剤の他の例としては、タンパク標的（本文脈ではＡｎｇ２リガンドおよびまたはＡｎｇ１リガンド）を認識してこれに結合するペプチド配列を含む、ペプチボディｍＬ４−３のようなペプチボディ、アビマー、その他の形態のペプチド分子（Ｆｃ融合分子およびＡｂ融合分子など（ＣｏｖＸ−ファイザーの技術を参照されたい））などが挙げられる。
【００１９】
本発明の具体的な実施形態は、Ａｎｇ１に結合する、ｍＬ４−３のようなペプチボディに関する。本発明の他の実施形態としては、ｍＬ４−３のペプチド部分、ならびに、このペプチドへのアミノ酸の付加、欠失、および／または挿入によって作製することができる類似のＡｎｇ１結合ペプチドが挙げられる。同様の付加、欠失、または挿入は、ｍＬ４−３ペプチボディのＦｃ部分にも行うことができる。ｍＬ４−３および一般的なペプチボディに対するさらなる改変は、当該技術分野において周知であり、例えば、ＷＯ００／２４７８２、およびＷＯ０３／０５７１３４に教示されており、これらの特許は参照により、ランダムに生成されたペプチドで、所望の標的に結合するペプチドを含有する結合剤の作製について説明および教示する本明細書の部分に組み込まれる。
【００２０】
本発明はさらに、本発明によるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、および、（トランスフェクション、形質転換、エレクトロポレーションによるなど、いずれかの手段を通じて、）本明細書に記載の抗体のような本発明の特異的結合剤を発現させるのに必要な核酸配列を含む細胞株に関する。
【００２１】
本発明が、本明細書に記載されているようなコンジュゲートに関するものであることも明らかである。このコンジュゲートは例えば、他のタンパク性物質、炭水化物、脂質、または、１つ以上の混合分子部分にコンジュゲートした本発明の特異的結合剤（抗体など）であることができる。
【００２２】
本発明はさらに、本発明の特異的結合剤（抗体など）をコードする核酸分子、該核酸分子を含むベクター、および、該ベクターを含有する宿主細胞に関する。
【００２３】
加えて、本発明は、特異的結合剤を作製する方法であって、（ａ）特異的結合剤をコードする少なくとも１つの核酸分子で宿主細胞を形質転換することと、（ｂ）該宿主細胞内で該核酸分子を発現させることと、（ｃ）該特異的結合剤を単離することとを含む方法を提供する。本発明はさらに、抗体を作製する方法であって、（ａ）本発明による抗体をコードする少なくとも１つの核酸分子で宿主細胞を形質転換することと、（ｂ）該宿主細胞内で該核酸分子を発現させることと、（ｃ）該特異的結合剤を単離することとを含む方法を提供する。
【００２４】
さらに、本発明は、本発明による特異的結合剤を治療有効量投与することによって、哺乳類における望ましくない血管新生を阻害する方法に関する。また、本発明は、本発明による特異的結合剤を治療有効量投与することによって、哺乳類の癌を治療する方法も提供する。
【００２５】
また、本発明は、哺乳類における望ましくない血管新生を阻害する方法であって、本発明による抗体を治療有効量投与することを含む方法に関する。加えて、本発明は、哺乳類の癌を治療する方法であって、本発明による抗体を治療有効量投与することを含む方法を提供する。
【００２６】
本発明がさらに、本発明による特異的結合剤と、薬理学的に許容可能な製剤化剤とを含む医薬組成物に関するものであることは明らかである。この医薬組成物は、本発明による抗体と、薬理学的に許容可能な製剤化剤とを含んでもよい。
【００２７】
本発明は、本発明の１つ以上の特異的結合剤を投与することによって、アンジオポエチン−２の活性を調節または阻害する方法を提供する。また、本発明は、本発明の抗体を投与することによって、アンジオポエチン−２の活性を調節または阻害する方法も提供する。
【００２８】
本発明はさらに、哺乳類の血管透過または血漿漏出のうちの少なくとも１つを調節する方法であって、本発明による特異的結合剤を治療有効量投与することを含む方法に関する。また、本発明は、哺乳類の眼血管新生疾患、肥満症、血管芽腫、血管腫、動脈硬化、炎症性疾患、炎症性障害、アテローム性硬化、子宮内膜症、新生物性疾患、骨関連疾患、または乾癬のうちの少なくとも１つを治療する方法であって、本発明による特異的結合剤を治療有効量投与することを含む方法にも関する。
【００２９】
本発明はさらに、哺乳類の血管透過または血漿漏出のうちの少なくとも１つを調節する方法であって、本発明による抗体を治療有効量投与することを含む方法を提供する。また、本発明は、哺乳類の眼血管新生疾患、肥満症、血管芽腫、血管腫、動脈硬化、炎症性疾患、炎症性障害、アテローム性硬化、子宮内膜症、新生物性疾患、骨関連疾患、または乾癬のうちの少なくとも１つを治療する方法であって、本発明による抗体を治療有効量投与することを含む方法にも関する。
【００３０】
さらに、本発明は、哺乳類の癌を治療する方法であって、本発明による特異的結合剤と化学療法剤とを治療有効量投与することを含む方法に関する。特異的結合剤と化学療法剤は同時に投与する必要がないことは当業者には明らかである。
【００３１】
また、本発明は、配列番号１８のいずれかの重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）を含む特異的結合剤も提供する。本発明はさらに、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９のいずれかの重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を含む特異的結合剤と、その抗原結合断片に関する。
【００３２】
また、本発明は、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９）のいずれかの重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む特異的結合剤と、その抗原結合断片に関する。
【００３３】
また、本発明は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５のいずれかの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１）を含む特異的結合剤と、その抗原結合断片を提供する。
【００３４】
本発明はさらに、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３１のいずれかの軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を含む特異的結合剤と、その抗原結合断片に関する。
【００３５】
また、本発明は、配列番号３３、配列番号３６、配列番号４０のいずれかの軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む特異的結合剤と、その抗原結合断片に関する。
【００３６】
本発明の別の実施形態としては、本明細書に記載されている抗体のいずれかをコードする単離核酸分子、抗Ａｎｇ−１抗体および／もしくは抗Ａｎｇ−２抗体をコードする単離核酸分子を有するベクター、または、該核酸分子のいずれかで形質転換された宿主細胞が挙げられる。加えて、本発明の１つの実施形態は、核酸分子を発現させて抗体を産生させる条件下で宿主細胞を培養した後、その抗体を回収することによって、抗Ａｎｇ−１抗体および／または抗Ａｎｇ−２抗体を製造する方法である。本発明の実施形態として、抗体産生用の宿主細胞にトランスフェクションされた時に、抗体またはその断片の収率を高めるように最適化された核酸配列も含む、本発明の抗体または抗体の断片をコードするあらゆる核酸分子も挙げられると認識すべきである。
【００３７】
本発明のさらなる実施形態としては、ヒトＡｎｇ−１もしくは２、またはその断片と、１つ以上のオルソログ配列またはその断片で哺乳類を免疫することによって、Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２に対する親和性の高い抗体を製造する方法が挙げられる。
【００３８】
さらに、本発明は、（ａ）本発明の特異的結合剤を生体サンプルと接触させ、（ｂ）特異的結合剤のサンプルへの結合の程度を割り出すことによって、生体サンプル中のＡｎｇ−１またはＡｎｇ−２のレベルを検出する方法に関する。また、本発明は、（ａ）本発明の抗体を生体サンプルと接触させ、（ｂ）抗体のサンプルへの結合の程度を割り出すことによって、生体サンプル中のＡｎｇ−２のレベルを検出する方法に関する。
【００３９】
また、本発明は、哺乳類における望ましくない血管新生を阻害する方法であって、本明細書に記載されているようなポリペプチドまたは組成物を治療有効量投与することを含む方法に関する。また、本発明は、哺乳類における血管新生を調節する方法であって、本明細書に記載されているようなポリペプチドまたは組成物を治療有効量投与することを含む方法に関する。本発明はさらに、哺乳類における望ましくない血管新生を特徴とする腫瘍増殖を阻害する方法であって、本明細書に記載されているようなポリペプチドまたは組成物を治療有効量投与することを含む方法に関する。加えて、本発明は、哺乳類の癌を治療する方法であって、本明細書に記載されているようなポリペプチドまたは組成物と、化学療法剤とを治療有効量投与することを含む方法に関する。本明細書に記載されているような特異的ポリペプチドまたは組成物と化学療法剤は、同時に投与する必要はない。好ましい実施形態では、化学療法剤は、５−ＦＵ、ＣＰＴ−１１、およびタキソテールのうちの少なくとも１つである。しかしながら、他の好適な化学療法剤と他の癌療法を用いることができるのは明らかである。
【００４０】
加えて、本発明は、哺乳類の癌を治療する方法であって、本明細書に記載されているようなポリペプチドまたは組成物と、抗ＶＥＧＦ剤またはマルチキナーゼ阻害剤（ＭＫＩ）とを治療有効量投与することを含む方法に関する。好ましい実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤またはマルチキナーゼ阻害剤（ＭＫＩ）は、アバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）、ルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ）、マクゲン（登録商標）（ペガプタニブ）、スーテント（登録商標）（スニチニブ）、ネクサバール（登録商標）（ソラフェニブ）、モテサニブ二リン酸、ザクティマ（登録商標）（バンデタニブ）、レセンチン（ＡＺＤ２１７１）、ＡＧ−０１３７３６（アクシチニブ）から選択することになる。しかしながら、他の好適な抗血管新生剤と他の癌療法を用いることができるのは明らかである。
【００４１】
本発明の特異的結合剤を用いて、調節不全の血管新生または望ましくない血管新生と関係する多くの疾患を治療することは明らかである。このような疾患としては、網膜症（糖尿病網膜症および加齢性黄斑変性など）のような眼血管新生と、乾癬と、血管芽腫と、血管腫と、動脈硬化と、リウマチ様もしくはリウマチ性炎症性疾患、特に関節炎（関節リウマチなど）のような炎症性疾患、または、慢性喘息、アテローム性動脈硬化、もしくは移植後のアテローム性硬化、子宮内膜症のようなその他の慢性炎症性疾患と、新生物性疾患、例えば、いわゆる固形腫瘍および液状腫瘍（白血病など）とが挙げられるが、これらに限らない。特異的結合剤の投与によって治療することができるさらなる疾患は、当業者には明らかである。このようなさらなる疾患としては、肥満症、血管透過、血漿漏出、および、骨粗しょう症を含む骨関連疾患が挙げられるが、これらに限らない。したがって、本発明はさらに、調節不全の血管新生または望ましくない血管新生と関係するこれらの疾患を治療する方法に関する。
【００４２】
本発明のさらなる実施形態としては、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを含む特異的結合剤と、その抗原結合断片が挙げられる。また、上記のポリペプチド配列を含有する抗体も考えられる。これらの抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である。これらは、一本鎖抗体および複数鎖抗体である。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、ポリペプチドおよび抗体をコードする核酸分子、これらの核酸分子を含有するベクター、ならびに、これらの核酸分子を含有および発現するＣＨＯ細胞のような宿主細胞も考えられる。本発明の結合剤または抗体を作製する方法は、その結合剤または抗体をコードする少なくとも１つの核酸分子で宿主細胞を形質転換することと、該核酸分子を該宿主細胞内で発現させるｆと、該特異的結合剤または抗体を単離することとを含む。
【００４３】
本発明の診断での利用としては、生体サンプル中のアンジオポエチン−１および／またはアンジオポエチン−のレベルを検出する方法であって、本明細書に記載されている抗体または結合剤を該生体サンプルと接触させることと、該抗体または結合剤の該サンプルへの結合の程度を割り出すこととを含む方法が挙げられる。
【００４４】
本発明の具体的な診断での利用には、哺乳類における望ましくない血管新生（または、動脈発生のように望ましくない血管の発生に伴う状態の一部）を阻害する方法であって、単離ポリペプチドまたは、そのポリペプチドから作製した抗体などの結合剤を治療有効量投与することを含む方法がある。このような望ましくない血管新生（または、動脈発生のように望ましくない血管の発生に伴う状態の一部）には、哺乳類の癌および炎症性疾患がある。したがって、医薬組成物用の製剤用担体と共に、本発明の単離ペプチド、結合剤、または抗体を含む医薬組成物が考えられる。当然ながら、上記の医薬組成物を必要とする患者に投与するために上記の医薬組成物を調製する目的で、薬理学的に許容可能な製剤化剤もよく用いられる。
【００４５】
本発明の組成物を用いる他の方法としては、アンジオポエチン−１および／またはアンジオポエチン−２の活性を調節または阻害する方法であって、本明細書に記載されている単離ポリペプチド、結合剤、または抗体を患者に投与することを含む方法が挙げられる。アンジオポエチン−１および／またはアンジオポエチン−２の活性を調節または阻害するこのような方法は、本明細書に記載されているポリペプチド、結合剤、または抗体を患者に投与することを含む。このような方法としては、哺乳類における血管透過または血漿漏出のうちの少なくとも１つを調節することが挙げられ、この方法は、哺乳類に、本明細書に記載されている単離ポリペプチド、結合剤、または抗体を治療有効量投与することを含む。また、眼血管新生疾患、肥満症、血管芽腫、血管腫、動脈硬化、炎症性疾患、炎症性障害、アテローム性硬化、子宮内膜症、新生物性疾患、骨関連疾患、または乾癬のうちの少なくとも１つを治療する方法も挙げられる。
【００４６】
併用療法、例えば哺乳類の癌を治療する方法であって、本明細書に記載されている単離ポリペプチド、結合剤、または抗体と、化学療法剤とを治療有効量投与することを含む方法も考えられる。このような方法では、特有の状態、規制当局の認可、および医療専門家の判断に応じて、単離ポリペプチド、結合剤、または抗体と、化学療法剤とを同時に投与することもあれば、同時に投与しないこともある。
【００４７】
他のタイプの併用療法としては、哺乳類の癌を治療する方法であって、必要とする被検者に、本明細書に記載されている単離ポリペプチド、結合剤、または抗体と、ＶＥＧＦ受容体１〜３のいずれか１つにリガンドを結合させる第２の分子とを治療有効量投与することを含む方法が挙げられる。ＶＥＧＦ受容体１〜３のいずれか１つにリガンドを結合させるこのような第２の分子の例は、アバスチン（登録商標）、ルセンティス（登録商標）、およびマクゲン（登録商標）である。
【００４８】
また、本明細書に記載されているポリペプチド、結合剤、または抗体を小分子剤と組み合わせて、必要とする患者に治療目的で投与する目的で利用することも考えられる。このような小分子剤としては、ＶＥＧＦ受容体１〜３のいずれか１つのシグナル伝達を調節するもの、および、マルチキナーゼ阻害剤であるものが挙げられる。例えば、本明細書に記載されているポリペプチド、結合剤、または抗体との併用治療用には、スーテント（登録商標）、ネクサバール（登録商標）、モテサニブ二リン酸、アクシチニブ、ザクティマ、ＡＺＤ２１７１、レセンチン、およびＡＧ−０１３７３６が考えられる。
【００４９】
本発明の特定の他の実施形態は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５のいずれかのＣＤＲ１を含む特異的結合剤と、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１のいずれかのＣＤＲ２を含む特異的結合剤と、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０のいずれかのＣＤＲ３を含む特異的結合剤に関する。特異的結合剤は、１、２、３、４、５、または６個のＣＤＲを含んでもよい。
【００５０】
同様に、上記の特異的結合剤をコードする核酸分子も考えられる。また、生体サンプル中のアンジオポエチン−１および／またはアンジオポエチン２のレベルを検出する方法であって、本明細書に記載されているような特異的結合剤を該生体サンプルと接触させることと、該特異的結合剤の該サンプルへの結合の程度を割り出すこととを含む方法も考えられる。加えて、生体サンプル中のアンジオポエチン−１および／またはアンジオポエチン２のレベルを検出するための方法であって、本明細書に記載されている抗体のいずれか１つを該生体サンプルと接触させることと、該抗体の該サンプルへの結合の程度を割り出すこととを含む方法が考えられる。
【００５１】
本発明のさらなる実施形態は、重鎖と軽鎖を含む抗体であって、重鎖が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７からなる群から選択される重鎖可変領域を含み、軽鎖が、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む抗体と、その抗原結合断片である。当然ながら、上記の抗体と抗原結合断片をコードする核酸分子も考えられる。
【００５２】
別の実施形態では、本発明は、重鎖と軽鎖を含む単離抗体であって、軽鎖が軽鎖可変ドメインを含み、重鎖が重鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７からなる群から選択される配列を有する抗体に関し、この抗体は、Ｔｉｅ２受容体のＡｎｇ１リガンドおよびＡｎｇ２リガンドのうちの少なくとも１つに特異的に結合する。
【００５３】
さらなる実施形態では、本発明は、重鎖と軽鎖を含む単離抗体であって、重鎖が重鎖可変ドメインを含み、軽鎖が軽鎖可変ドメインを含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７からなる群から選択される配列を有する抗体であり、この抗体は、Ｔｉｅ２受容体のＡｎｇ１リガンドおよびＡｎｇ２リガンドのうちの少なくとも１つに特異的に結合する。
【００５４】
追加の実施形態では、本発明は、重鎖と軽鎖を含む単離抗体であって、重鎖が重鎖可変ドメインを含み、軽鎖が軽鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメインが、配列番号１８、２６、２８、３２、３４、３５、３７、３８、および３９からなるＨＣ  ＣＤＲの群から選択された１、２、または３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体に関し、この抗体は、Ｔｉｅ２受容体のＡｎｇ１リガンドおよびＡｎｇ２リガンドのうちの少なくとも１つに特異的に結合する。
【００５５】
別の実施形態では、本発明は、軽鎖と重鎖を含む単離抗体であって、軽鎖が軽鎖可変ドメインを含み、重鎖が重鎖可変ドメインを含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２７、３３、３６、４０からなるＬＣ  ＣＤＲの群から選択された１、２、または３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体に関し、この抗体は、Ｔｉｅ２受容体のＡｎｇ１リガンドおよびＡｎｇ２リガンドのうちの少なくとも１つに特異的に結合する。
【００５６】
さらなる実施形態では、本発明は、重鎖と軽鎖を含む単離抗体であって、重鎖が重鎖可変ドメインを含み、軽鎖が軽鎖可変ドメインを含み、重鎖が３つの重鎖（ＨＣ）ＣＤＲを含み、該軽鎖可変ドメインが３つの軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲを含み、抗体の該ＨＣ  ＣＤＲと該ＬＣ  ＣＤＲの配列が、
（ａ）ＨＣは配列番号１８、２６、３２で、ＬＣは配列番号１９、２７、３３、
（ｂ）ＨＣは配列番号１８、２６、３４で、ＬＣは配列番号１９、２７、３３、
（ｃ）ＨＣは配列番号１８、２６、３５で、ＬＣは配列番号２０、２７、３６、
（ｄ）ＨＣは配列番号１８、２６、３７で、ＬＣは配列番号１９、２７、３３、
（ｅ）ＨＣは配列番号１８、２６、３８で、ＬＣは配列番号１９、２７、３３、
（ｆ）ＨＣは配列番号１８、２６、３５で、ＬＣは配列番号１９、２７、３３、
（ｇ）ＨＣは配列番号１８、２６、３４で、ＬＣは配列番号２１、２７、３３、
（ｈ）ＨＣは配列番号１８、２８、３９で、ＬＣは配列番号１９、２７、３３、
（ｉ）ＨＣは配列番号１８、２６、３４で、ＬＣは配列番号２２、２７、３３、
（ｊ）ＨＣは配列番号１８、２６、３２で、ＬＣは配列番号２２、２７、３３、
（ｋ）ＨＣは配列番号１８、２９、３９で、ＬＣは配列番号１９、２７、３３、
（ｌ）ＨＣは配列番号１８、２６、３４で、ＬＣは配列番号２３、２７、３３、
（ｍ）ＨＣは配列番号１８、２６、３５で、ＬＣは配列番号２０、２７、４０、
（ｎ）ＨＣは配列番号１８、２６、３２で、ＬＣは配列番号２１、２７、３３、
（ｏ）ＨＣは配列番号１８、２６、３５で、ＬＣは配列番号２４、２７、３３、
（ｐ）ＨＣは配列番号１８、２６、３５で、ＬＣは配列番号２１、２７、３３、
（ｑ）ＨＣは配列番号１８、２６、３５で、ＬＣは配列番号２３、２７、３３、
（ｒ）ＨＣは配列番号１８、２６、３４で、ＬＣは配列番号２０、３０、３３、
（ｓ）ＨＣは配列番号１８、２６、３４で、ＬＣは配列番号２５、２７、３３、
（ｔ）ＨＣは配列番号１８、２６、３５で、ＬＣは配列番号２０、３０、３３、
（ｕ）ＨＣは配列番号１８、２６、３４で、ＬＣは配列番号２０、２７、４０、および
（ｖ）ＨＣは配列番号１８、２６、３４で、ＬＣは配列番号２０、３１、３３
からなる群から選択される抗体であり、
この抗体は、Ｔｉｅ２受容体のＡｎｇ１リガンドおよびＡｎｇ２リガンドのうちの少なくとも１つに特異的に結合する。
【００５７】
また、本発明は、重鎖と軽鎖とを有する抗体であって、上記の（ａ）〜（ｖ）のいずれか１つのＬＣ  ＣＤＲを３つ有する軽鎖可変ドメインを軽鎖が有する抗体に関し、この抗体は、Ｔｉｅ２受容体のＡｎｇ１リガンドおよびＡｎｇ２リガンドのうちの少なくとも１つに特異的に結合する。
【００５８】
加えて、本発明は、重鎖と軽鎖を有する抗体であって、上記の（ａ）〜（ｖ）のいずれか１つのＨＣ  ＣＤＲを３つ有する重鎖可変ドメインを重鎖が有する抗体にも関し、この抗体は、Ｔｉｅ２受容体のＡｎｇ１リガンドおよびＡｎｇ２リガンドのうちの少なくとも１つに特異的に結合する。
【００５９】
上記の抗体のいずれかとその抗原結合断片とをコードする核酸分子も考えられる。本発明の他の実施形態は、本明細書によって提供される開示内容から容易に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明の抗Ａｎｇ１／２抗体（Ｈ４ＬＡ、Ｈ４Ｌ１１、もしくはＨ６Ｌ７）、または、非常に強力なコントロールペプチボディ（ＡＭＧ３８６）もしくは抗体５３６のいずれかで処置した担腫瘍マウスの腫瘍の大きさ（ｙ軸）と時間（ｘ軸）との関係を、アイソタイプコントロール抗体で処置したマウスとの比較において示しているグラフである。詳細は実施例の項に説明されている。
【図２】本発明の抗Ａｎｇ１／２抗体（Ｈ４ＬＡ、Ｈ４Ｌ１１、もしくはＨ６Ｌ７）、または、非常に強力なコントロールペプチボディ（ＡＭＧ３８６）もしくは抗体５３６で処置した担腫瘍マウスの腫瘍組織量（生着腫瘍［二等分切片］の割合（％）×腫瘍重量）を、アイソタイプコントロール抗体で処置したマウスとの比較において示している。詳細は実施例の項に説明されている。
【図３】本発明のＨ４Ｌ４、Ｈ４Ｌ１１、およびＨ６Ｌ７と、非常に強力なコントロールペプチボディ（ＡＭＧ３８６）および抗体５３６が、Ｃｏｌｏ２０５腫瘍担持マウスにおいて内皮細胞の増殖に及ぼす作用を示している。詳細は実施例の項に説明されている。
【図４】Ｃｏｌｏ２０５腫瘍担持マウスにおけるＨ４Ｌ４抗体の用量反応関係を示している。詳細は実施例の項に説明されている。
【図５】Ｈ４Ｌ４抗体がインビボでＣｏｌｏ２０５の腫瘍組織量に及ぼす作用を示している。詳細は実施例の項に説明されている。
【図６】Ｈ４Ｌ４抗体が、Ｃｏｌｏ２０５腫瘍担持マウスにおいて内皮細胞の増殖に及ぼす作用を示している。詳細は実施例の項に説明されている。
【図７】全身投与されたｍＬ４−３が、マウス肺において、Ａｎｇ１誘導性のＴｉｅ２のリン酸化を中和することを示している。Ａｎｇ１またはＢＳＡの静脈内投与の前に、マウス（１グループ当たりｎ＝３）をＬ１−７（Ｎ）（２ｍｇ／ｋｇ）、ｍＬ４−３（２０ｍｇ／ｋｇ）、またはＦｃコントロール（２０ｍｇ／ｋｇ）で２３日間、連日処置した。その後、マウス肺を回収し、免疫沈降−ウエスタンブロット解析によって、リン酸化Ｔｉｅ２のレベルを割り出した。データは平均値±標準誤差である。＊Ａｎｇ１とＦｃを比較した場合のＰ値は０．０００５であった（ＡＮＯＶＡと共にフィッシャーのポストホックテストを行った）。
【図８】初期器官形成期にＡｎｇ１を薬理学的に阻害させると、心臓発生を変化させることを示している。Ａ）３００ｍｇ／ｋｇのｍＬ４―３に暴露させたマウス胚（右側パネル）では、心臓が小さく、小柱も少なく、幅が狭く、間隔も広かったのに対して、これに匹敵する段階の胚を３００ｍｇ／ｋｇのＦｃコントロールに暴露させたもの（左側パネル）では、心臓が大きく、小柱も大きく、幅も広かった。代表的な画像が示されている。Ｂ）Ｆｃで処置した胚とｍＬ４−３で処置した胚の心臓異常の発生数である。＊Ｆｃと比較した場合のＰ値は０．０００１未満であった（カイ二乗検定）。
【図９】Ａｎｇ１とＡｎｇ２との同時阻害が、Ｃｏｌｏ２０５腫瘍異種移植片の増殖に及ぼす作用を示している。マウス（１グループ当たりｎ＝１０）にＣｏｌｏ２０５細胞を移植し、腫瘍が約５００ｍｍ３に達したときに、Ｆｃコントロール（５．２ｍｇ／ｋｇ、１日１回）、ｍＬ４−３（３．２ｍｇ／ｋｇ、１日１回）、Ｌ１−７（Ｎ）（２．０ｍｇ／ｋｇ、１日１回）、Ｌ１−７（Ｎ）とｍＬ４−３との組み合わせ（単剤グループで用いたものと同じ投与レジメン）、またはＡＭＧ３８６（５．６ｍｇ／ｋｇ、１週間に２回）による処置を開始した。４回の代表的な実験のうちの１つが示されている。データは平均値±標準誤差である。＊Ｌ１−７（Ｎ）と比較した場合のＰ値は０．０００１未満であった（ＲＭＡＮＯＶＡと共にシェフェのポストホックテストを行った）。
【図１０】Ａｎｇ１とＡｎｇ２の拮抗作用が、腫瘍内皮細胞の増殖、角膜血管新生、および網膜血管新生に及ぼす作用を示している。Ａ）Ａｎｇ１とＡｎｇ２の阻害が、Ｃｏｌｏ２０５腫瘍異種移植片由来のマウス内皮細胞におけるＢｒｄＵの取り込みに及ぼす作用である。担腫瘍マウスをＦｃ（５．７ｍｇ／ｋｇ、１日１回）、ＡＭＧ３８６（６ｍｇ/ｋｇ、単回投与）、Ｌ１−７（Ｎ）（２．２ｍｇ／ｋｇ、１日１回）、ｍＬ４−３（３．５ｍｇ／ｋｇ、１日１回）、またはＬ１−７（Ｎ）とｍＬ４−３との組み合わせ（単剤グループで用いたものと同じ用量およびスケジュール）で３日間処置した。各バーは、内皮細胞：全マウス細胞のＢｒｄＵの比率の平均を表している（ｎ＝３）。データは平均値±標準誤差である。＊Ｆｃと比較した場合のＰ値は０．０５未満であった（独立スチューデントｔ検定）。ＢおよびＣ）Ａｎｇ１とＡｎｇ２の阻害が（Ｂ）ＶＥＧＦ誘導性の角膜血管新生、および（Ｃ）ｂＦＧＦ誘導性の角膜血管新生に及ぼす作用である。ＶＥＧＦまたはｂＦＧＦに浸したナイロンディスクをラットの角膜支質に埋め込むことによって、血管新生を誘導した（１グループ当たりｎ＝８）。角膜への埋め込みの１日前に処置を開始し、３日おきに、Ｆｃ（６０ｍｇ／ｋｇ）、Ｌ１−７（Ｎ）（５ｍｇ／ｋｇ）、ｍＬ４−３（６０ｍｇ／ｋｇ）、および、Ｌ１−７（Ｎ）とｍＬ４−３との組み合わせ（単剤グループで用いたものと同じ投与レジメン）によって処置を継続した。データは平均値±標準誤差である。†Ｆｃ＋ＶＥＧＦと比較した場合のＰ値は０．０００１未満であった（Ｂ）。＃Ｆｃ＋ｂＦＧＦと比較した場合のＰ値は０．００２未満であった（Ｃ）。（ＡＮＯＶＡと共にフィッシャーのポストホックテストを行った。）Ｄ）Ａｎｇ２の阻害によって、マウス網膜において酸素誘導性の新血管形成が抑制される。出生後７日目から、仔（１グループ当たりｎ＝５）に、９日間、Ｆｃ（２００ｍｇ／ｋｇ）、Ｌ１−７（Ｎ）（１００ｍｇ／ｋｇ）、ｍＬ４−３（１００ｍｇ／ｋｇ）、またはＬ１−３とｍＬ４−３との組み合わせ（単剤グループで用いたものと同じ用量およびスケジュール）を連日、皮下投与した。データは平均値±標準誤差である。§Ｆｃと比較した場合のＰ値は０．０００１未満であった（ＡＮＯＶＡと共にフィッシャーのポストホックテストを行った）。
【図１１】Ａｎｇ１阻害剤とＡｎｇ２阻害剤が協働して卵胞血管新生を抑制することを示している。ＨＣＧを用いて、マウスにおいて過剰排卵を誘導した。皮下投与したＦｃ（３００ｍｇ／ｋｇ）、ｍＬ４−３（１５０ｍｇ／ｋｇ）、Ｌ１−７（Ｎ）（１５０ｍｇ／ｋｇ）、またはｍＬ４−３とＬ１−７（Ｎ）との組み合わせ（それぞれ１５０ｍｇ／ｋｇ）（１グループ当たりｎ＝７〜１０匹のマウス）において、排卵卵胞における新血管新生を抑制する能力を評価した。個々の卵胞の抗ＣＤ３１免疫染色切片から血管面積を算出した。データは平均値±標準誤差である。２つの独立した実験が示されている。＊ｍＬ４−３とＬ１−７（Ｎ）との組み合わせをいずれかの単剤のみの場合と比較した場合のＰ値は０．００５であった。＃Ｆｃと比較した場合のＰ値は０．０５未満であった。ＡＮＯＶＡと共にダネットのポストホックテストを行った。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
（発明の詳細な記述）
本明細書では、項目見出しは、系統立てる目的のみで用いられており、いかなる場合も、記載されている主題を限定するものと解釈すべきではない。
【００６２】
組み換えＤＮＡ分子、タンパク、および抗体の産生、ならびに、組織培養および細胞形質転換には、標準的な手法を用いてよい。酵素反応および精製技法は典型的には、製造者の仕様書に従って、または、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ,ＮＹ［１９８９］）に記述されているような従来の手順を用いて当該技術分野において広く実施されているように、もしくは、本明細書に記載されているように実施する。具体的な定義が与えられていない限り、本明細書に記載されている、分析化学、合成有機化学、医薬品化学、および製薬化学に関連して用いられる学名、ならびに、分析化学、合成有機化学、医薬品化学、および製薬化学の実験手順および技法は、当該技術分野において周知かつ広く用いられているものである。化学合成、化学分析、製剤の調製、調合、および送達、ならびに患者の処置には、標準的な技法を用いてよい。
【００６３】
本発明を説明する目的で用いられる用語は、本明細書で具体的に定義されている場合を除き、当該技術分野において理解および使用されている意味を有するものとする。
【００６４】
Ｈ５およびＨ５Ｐという用語は同義的に用いられると共に、本発明のさまざまな実施形態で使用される重鎖、例えば、Ｈ５Ｌ７、Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ８、Ｈ５Ｌ４、Ｈ５Ｌ１１、Ｈ５Ｌ１、Ｈ５Ｌ１２、およびＨ５Ｌ９と命名されたｍＡｂｓを指すことに留意されたい。
【００６５】
「Ａｎｇ−２」という用語は、米国特許第６，１６６，１８５号（参照として本明細書に組み込まれる）の図６に記載されているポリペプチド（「Ｔｉｅ−２リガンド−２」、またはその断片と、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、誘導体、置換、欠失、および／または挿入変異体、融合ペプチドおよびポリペプチド、ならびに、種間ホモログを含む関連ポリペプチドとを指す。Ａｎｇ−２ポリペプチドは、調製される方法に応じて、付加的な末端残基、例えばリーダー配列、標的配列、アミノ末端メチオニン、アミノ末端メチオニンおよびリシン残基、ならびに／または、タグもしくは融合タンパク配列を含んでも、含まなくてもよい。
【００６６】
「特異的結合剤」という用語は、他のアンジオポエチンよりも高い親和性でＡｎｇ−２およびＡｎｇ−１（ならびに本明細書に記載されているようなこれらの変異体および誘導体）に結合する分子、好ましくはタンパク性分子を指す。特異的結合剤は、Ａｎｇ−２およびＡｎｇ−１に選択的に結合するタンパク、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、または低分子量化合物であってよい。好ましい実施形態では、本発明による特異的結合剤は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、多特異性抗体、双特異性抗体、触媒抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体のような抗体と、可溶性形態もしくは結合形態で標識することができる抗体と、これらの抗原結合断片、変異体、または誘導体であって、単独か、または他のアミノ酸配列と組み合わせたものであり、これは、既知の技法によって得られる。このような技法としては、酵素的切断、化学的切断、ペプチド合成、または組み換え技法が挙げられるが、これらに限らない。本発明の抗Ａｎｇ−２およびＡｎｇ−１特異的結合剤は、Ａｎｇ−２およびＡｎｇ−１の生物活性、ならびに／またはＡｎｇ−２およびＡｎｇ−１に関連する他の活性を調節、例えば阻害または促進するＡｎｇ−２部分およびＡｎｇ−１部分に結合することができる。
【００６７】
「ポリクローナル抗体」という用語は、同一抗原上の異なるエピトープを認識して、これに結合する抗体の不均一混合物を指す。ポリクローナル抗体は、粗血清調製物から得てよく、または、例えば、抗原アフィニティークロマトグラフィー、もしくはプロテインＡ／プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製してよい。
【００６８】
「モノクローナル抗体」という用語は、各モノクローナル抗体が通常、抗原上の同じエピトープを認識するように、単一のハイブリドーマ（もしくはそのクローン）、または他の細胞株によって、あるいは、トランスジェニック哺乳類によって任意に産生される同一核酸分子によってコードされる抗体の一群を指す。「モノクローナル」という用語は、抗体を作製するためのいずれかの特定の方法に限定されず、また、特定の種、例えば、マウス、ラットなどで産生される抗体に限定される用語でもない。
【００６９】
「キメラ抗体」という用語は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか、または相同性がある一方で、鎖の残部が、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか、または相同性がある抗体を指す。また、所望の生物活性（すなわち、Ａｎｇ−２に特異的に結合する能力）を呈する上記抗体の抗原結合断片も含む。米国特許第４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ），８１：６８５１−６８５５［１９８５］を参照されたい。
【００７０】
「ＣＤＲ移植抗体」という用語は、特定の種またはアイソタイプの１つの抗体から採ったＣＤＲを、同じかまたは異なる種またはアイソタイプの別の抗体の骨格に組み換え技術によって挿入した抗体を指す。
【００７１】
「多特異性抗体」という用語は、１つ以上の抗原上の２つ以上のエピトープを認識する可変領域を有する抗体を指す。このタイプの抗体のサブクラスが、同じかまたは異なる抗原上の２つの別個のエピトープを認識する「双特異性抗体」である。
【００７２】
「触媒」抗体は、１つ以上の細胞毒性部分、または、より一般的には１つ以上の生物活性部分が標的結合剤に結合している抗体を指す。
【００７３】
「ヒト化抗体」という用語は、抗体骨格枠領域はヒト由来であるが、各ＣＤＲが、別種由来のもの、例えばマウスＣＤＲで置換されている特定のタイプのＣＤＲ移植抗体を指す。「ＣＤＲ」という用語は下に定義されている。
【００７４】
「完全ヒト」抗体という用語は、ＣＤＲと骨格の双方が、１つ以上のヒトＤＮＡ分子に由来している抗体を指す。
【００７５】
「抗イディオタイプ」抗体という用語は、抗原を認識する別の抗体に特異的に結合するあらゆる抗体を指す。抗イディオタイプ抗体の製造は、例えば、Ａｎｇ−２ポリペプチドそのものまたはその断片ではなく、Ａｎｇ−２特異的抗体またはそのＡｎｇ−２結合断片で動物を免疫して生ずるような抗体以外のＡｎｇ−２特異的抗体を製造するための、本明細書に記載のいずれかの方法によって行うことができる。
【００７６】
「変異体」という用語は、本明細書で使用する場合、結合剤の天然の（または少なくとも既知の）アミノ酸配列に、アミノ酸残基が挿入、欠失、および／または置換されているポリペプチドを含む。本発明の変異体としては、後述のような融合タンパクが挙げられる。
【００７７】
「誘導体」としては、挿入、欠失、または置換変異体とは異なる何らかの形で化学修飾された結合剤が挙げられる。
【００７８】
「特異的に結合する」とは、本発明の特異的結合剤（抗体またはその断片など）が、成熟、完全長、もしくは部分長標的ポリペプチド（本発明ではＡｎｇ−２およびＡｎｇ−１）、またはそのオルソログを認識して結合でき、その際に、その親和性（例えば、本明細書に記載されているアフィニティーＥＬＩＳＡまたはＢＩＡｃｏｒｅアッセイによって測定）または中和能（例えば、本明細書に記載の中和ＥＬＩＳＡアッセイ、または類似のアッセイによって測定）が、他のいずれかのアンジオポエチン、または、他のペプチドもしくはポリペプチドに対する親和性または中和能の少なくとも１０倍、任意で５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、またさらには少なくとも１０００倍であることを指す。
【００７９】
「抗原結合ドメイン」または「抗原結合領域」という用語は、特異的結合剤（抗体分子など）の部分のうち、抗原と相互作用すると共に、抗原に対する特異性および親和性を結合剤に付与する、特異的結合剤のアミノ酸残基（または他の部分）を含有する部分を指す。抗体においては、抗原結合ドメインは一般に、「相補性決定領域またはＣＤＲ」と呼ばれる。
【００８０】
「エピトープ」という用語は、特異的結合剤（例えば、抗体）が、その結合剤の抗原結合領域の１つ以上で認識および結合できるいずれかの分子の部分を指す。エピトープは通常、分子の化学的に活性な表面グループ、例えばアミノ酸または炭化水素側鎖から構成され、特定の３次元構造的特性と特定の帯電特性を有する。エピトープは、本明細書で用いる場合、隣接的でも非隣接的であってもよい。さらに、エピトープは、抗体を生成するために使用されるエピトープと同一の３次元構造を含む一方で、抗体免疫応答を刺激するために使用されるＡｎｇ−２中に存在するアミノ酸残基を全く含まないか、またはほんの一部しか含まない点で、模倣的である場合がある。
【００８１】
「阻害および／または中和エピトープ」という用語は、抗体のような特異的結合剤が結合したときに、インビボ、インビトロ、またはインサイチューで当該エピトープを含有する分子、細胞、または生物の生物活性が喪失（または少なくとも低下）するエピトープである。本発明との関連においては、中和エピトープは、Ａｎｇ−２の生物活性領域に位置するか、または関連している。この代わりに、「活性化エピトープ」という用語は、本発明の特異的結合剤（抗体など）が結合したときに、Ａｎｇ−２が活性化されるか、または、Ａｎｇ−２の生物活性コンホメーションが少なくとも維持されるエピトープである。
【００８２】
「抗体断片」という用語は、完全で無傷とはいえない抗体を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。完全抗体は、２つの機能的に独立した部分または断片、すなわち「Ｆａｂ」として知られる抗原結合断片と、「Ｆｃ」断片として知られるカルボキシ末端結晶化可能断片を含む。Ｆａｂ断片は、重鎖（ＣＨ１）および軽鎖（ＣＬ１）の双方由来の第１の定常ドメインと共に、特異抗原に結合する重鎖および軽鎖の双方由来の可変領域を含む。重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）と、個々のＣＤＲを分離する骨格アミノ酸残基を含む。Ｆｃ領域は、第２および第３の重鎖定常領域（ＣＨ２およびＣＨ３）を含み、補体の活性化および食細胞による攻撃のようなエフェクター機能に関与している。いくつかの抗体では、Ｆｃ領域およびＦａｂ領域は、抗体の「ヒンジ領域」によって隔てられており、完全長抗体がタンパク分解によって切断される方法に応じて、ヒンジ領域はＦａｂ断片またはＦｃ断片のいずれかと結合することができる。例えば、抗体をプロテアーゼパパインで切断すると、ヒンジ領域はＦｃ断片と結合する。一方で、プロテアーゼペプシンで切断すると、ヒンジが両方のＦａｂ断片と同時に結合している断片が生じる。実際、２つのＦａｂ断片は、ペプシン切断後、共有結合しているので、生じた断片はＦ（ａｂ’）２断片と呼ばれている。
【００８３】
Ｆｃドメインは、比較的長い血清半減期を有することがある一方で、Ｆａｂは短命である［Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−５３１（１９８９）］。Ｆｃドメインは、融合タンパクの一部として発現させると、もっと長い半減期を付与するか、または、Ｆｃ受容体結合、プロテインＡ結合、補体結合、および、おそらくはさらに、融合されるタンパクへの胎盤通過のような機能を導入することができる。Ｆｃ領域は、天然のＦｃ領域であってもよく、または、治療品質もしく循環時間のような特定の品質を向上させるように改変してもよい。
【００８４】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の軽鎖および／または重鎖の一部を指し、典型的には、重鎖では約１２０〜１３０アミノ末端アミノ酸を、軽鎖では約１００〜１１０アミノ末端アミノ酸を含む。可変領域のアミノ酸配列は典型的に、同一種の抗体においても大きく異なる。抗体の可変領域は通常、特定の各抗体の特定の抗原に対する結合性と特異性を決定する。配列の可変性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる領域に集中している一方で、可変ドメインにおける、高度に保存される方の領域は、骨格領域（ＦＲ）と呼ばれる。軽鎖および重鎖のＣＤＲはその中に、抗体と抗原との直接的な相互作用に大きく関与するアミノ酸を含有するが、ＦＲ中のアミノ酸は、後述のように、抗原の結合／認識に有意な作用を及ぼすことができる。
【００８５】
「軽鎖」という用語は、抗体に関して使用する場合、定常ドメインのアミノ酸配列に基づきカッパ（κ）またはラムダ（λ）と呼ばれる２つの別個のタイプの総称である。
【００８６】
「重鎖」という用語は、抗体に関して使用する場合、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に基づきα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる５つの別個のタイプの総称である。重鎖と軽鎖を組み合わせることによって、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭという５つの既知のクラスの抗体が生ずる。この中には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４と呼ばれるＩｇＧの４つの既知のサブクラスが含まれる。
【００８７】
「天然の」という用語は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などのような生物材料に関して使用する場合、天然に存在すると共に、人間によって修飾されていないものを指す。
【００８８】
「単離」という用語は、Ａｎｇ−２またはＡｎｇ−２の特異的結合剤に関して使用する場合、自然環境に存在する少なくとも１つの混入ポリペプチドまたは化合物を含まない化合物、好ましくは、治療または診断での利用の妨げとなる他のあらゆる混入哺乳類ポリペプチドを実質的に含まない化合物を指す。
【００８９】
「成熟」という用語は、Ａｎｇ−２、抗−Ａｎｇ−２抗体、またはＡｎｇ−２の他のいずれかのタンパク性特異的結合剤に関して使用する場合、リーダーまたはシグナル配列が欠損しているペプチドまたはポリペプチドを指す。本発明の結合剤を、例えば原核宿主細胞内で発現させるとき、「成熟」ペプチドまたはポリペプチドは、アミノ末端メチオニン、または１つ以上のメチオニンおよびリシン残基のような追加のアミノ酸残基も含んでよい（ただし、リーダー配列は欠損している）。このようにして製造したペプチドまたはポリペプチドは、これらの追加アミノ酸残基を除去した状態でも、除去していない状態でも使用してよい。
【００９０】
特異的結合剤および抗体
本明細書で使用する場合、「特異的結合剤」という用語は、本明細書に記載されているように、Ａｎｇ−２およびＡｎｇ−１を認識および結合するための特異性を有する分子を指す。好適な特異的結合剤としては、抗体およびその誘導体、ポリペプチド、ならびに小分子が挙げられるが、これらに限らない。好適な特異的結合剤は、当該技術分野において既知の方法を用いて調製してよい。本発明のＡｎｇ−２ポリペプチドおよびＡｎｇ−１ポリペプチドに対する代表的な特異的結合剤は、Ａｎｇ−２ポリペプチドおよびＡｎｇ−１ポリペプチドの特定部分に結合することができ、好ましくは、Ａｎｇ−２ポリペプチドおよびＡｎｇ−１ポリペプチドの活性または機能を調節することができる。
【００９１】
Ａｎｇ−２ポリペプチドおよびＡｎｇ−１ポリペプチドに特異的に結合する抗体および抗体断片のような特異的結合剤は、本発明の範囲内である。これらの抗体は、単一特異性ポリクローナル抗体を含むポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、組み換え抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体のようなヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、触媒抗体、多特異性および／または双特異性抗体、ならびに、これらの抗原結合断片、変異体、および／または誘導体であってよい。
【００９２】
Ａｎｇ２ポリペプチドおよびＡｎｇ１ポリペプチドに対するポリクローナル抗体は一般に、動物（例えば、ラビット、ハムスター、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ラット、アレチネズミ、モルモット、マウス、または他の好適な哺乳類、ならびに、哺乳類以外の他の種）において、Ａｎｇ−２ポリペプチドおよび／もしくはＡｎｇ−１ポリペプチド、またはその断片を、アジュバントと共に、またはアジュバントなしで、複数回、皮下または腹腔内注射することにより産生される。このようなアジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、鉱物ゲル（水酸化アルミニウムなど）、および表面活性物質（リゾレシチン、プルロニックポリオル、多価陰イオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールなど）が挙げられるが、これらに限らない。ＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウムパルブムも、潜在的に有用なヒトアジュバントである。免疫する種において免疫原性である運搬体タンパク、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシチログロブリン、またはダイズトリプシン阻害因子に抗原ポリペプチドをコンジュゲートするのが有用である場合がある。また、免疫応答を高める目的で、ミョウバンのような凝集剤を用いる。免疫後、動物を放血させ、抗Ａｎｇ−２ポリペプチド抗体力価について血清をアッセイする。この力価は、「実施例」の項に記載されているアッセイを用いて割り出すことができる。ポリクローナル抗体は、その抗体が検出される血清中で使用してよく、または、例えば抗原アフィニティークロマトグラフィー、または、プロテインＡもしくはＧアフィニティークロマトグラフィーを用いて、血清から精製してよい。
【００９３】
Ａｎｇ−２ポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、例えば、従来の「ハイブリドーマ」法、またはより新しい「ファージディスプレイ」法（これらに限らない）を用いて産生させることができる。例えば、本発明のモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５［１９７５］に記載されているようなハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法［Ｋｏｓｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）、Ｃｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ）８０：２０２６−２０３０（１９８３）、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８７）］、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法［Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｎ．Ｙ．，ｐｐ  ７７−９６，（１９８５）］を用いて産生させることができる。本発明は、Ａｎｇ−２ポリペプチドとの反応性があるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株も提供する。
【００９４】
ハイブリドーマ法を採用する場合、ミエローマ細胞株を使用することができる。ハイブリドーマ産生融合工程での使用に適したこのような細胞株は、好ましくは非抗体産生性であり、高い融合効率を有し、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支える特定の選択培地中で該細胞株が増殖できないようにする酵素欠損を有する。例えば、マウス融合で用いられる細胞株は、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４１、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７、およびＳ１９４／５ＸＸ０  Ｂｕｌである。ラット融合で用いられる細胞株は、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ、および４Ｂ２１０である。細胞融合で用いられる他の細胞株は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２、およびＵＣ７２９−６である。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマおよび他の細胞株は、本発明の新規組成物であると考えられる。
【００９５】
また、ファージディスプレイ法を用いて、任意の種からモノクローナル抗体を生成してもよい。好ましくは、この方法を用いて、単一のＦａｂまたはＦｖ抗体断片をコードするポリヌクレオチドがファージ粒子の表面上で発現する完全ヒトモノクローナル抗体を産生させる。［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２：５８１（１９９１）、米国特許第５，８８５，７９３号も参照されたい。）］本明細書に記載されている結合アッセイを用いて、各ファージをスクリーニングして、Ａｎｇ−２に対する親和性を有する抗体断片を同定することができる。つまり、これらのプロセスは、糸状バクテリオファージの表面上に抗体断片レパートリーを提示することによる免疫選択と、その後のＡｎｇ−２に対する結合によるファージの選択を模倣している。このような方法の１つは、Ａｄａｍｓらの名で出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７３６４に記載されており、この特許には、上記のようなアプローチを用いて、ＭＰＬ−およびｍｓｋ−受容体に対する高親和性および機能性アゴニスト抗体断片を単離することが記載されている。このアプローチでは、上述［Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ）８７：８０９５−８０９９（１９９０）］のように、末梢血リンパ球由来の自然に再構成されたヒトＶ遺伝子をクローニングすることによって、ヒト抗体遺伝子の完全レパートリーを作製することができる。
【００９６】
本発明の完全長モノクローナル抗体、または、ＦａｂもしくはＦｖ断片の各鎖をコードするポリヌクレオチド配列が同定されたら、真核または原核宿主細胞を用いて、当該技術分野において周知かつ日常的に実施されている組み換え技法によって、モノクローナル抗体ポリヌクレオチドを発現させてよい。あるいは、モノクローナル抗体または他の特異的結合剤をコードするポリヌクレオチド分子の発現を可能にする形で、所望の特異的結合剤をコードするポリヌクレオチドが、受容動物（例えば、マウス、ラビット、ヤギ、またはウシ）のゲノムに導入されているトランスジェニック動物を作製する。１つの態様では、モノクローナル抗体または他の特異的結合剤をコードするポリヌクレオチドを、哺乳類に特異的な調節配列にライゲーションすることができると共に、キメラポリヌクレオチドを標的動物の生殖細胞系に導入することができる。続いて、得られたトランスジェニック動物は、その乳内に所望の抗体を産生する［Ｐｏｌｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２３１：１４７−１５７（１９９９）、Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ８：３６４−３７０（２０００）］。加えて、植物を用いて、モノクローナル抗体または他の特異的結合剤をコードするポリヌクレオチドで好適な植物をトランスフェクションすることによって、モノクローナル抗体のようなＡｎｇ−２特異的結合剤を発現および産生させてよい。
【００９７】
本発明の別の実施態様では、ヒト種以外の他の種に由来するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、またはその断片を「ヒト化」または「キメラ化」してもよい。非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野において周知である。（米国特許第５，８５９，２０５号、同第５，５８５，０８９号、および同第５，６９３，７６２号を参照されたい）。ヒト化は、例えば、当該技術分野において説明されている方法［Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］を用いて、例えば齧歯類の相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部をヒト抗体の対応する領域に置換することによって実施する。本発明は、本明細書に論じられており、かつ当業界で周知であるように、これらのヒト抗体の変異体および誘導体も提供する。
【００９８】
また、本発明は、Ａｎｇ−２ポリペプチドに結合する完全ヒト抗体、ならびに、その抗体結合断片、変異体、および／または誘導体も包含する。このような抗体は、上記のファージディスプレイ法を用いて製造することができる。あるいは、内在性免疫グロブリン産生の不存在下でヒト抗体のレパートリーを産生できるトランスジェニック動物（例えばマウス）を用いて、上記の抗体を生成することができる。これは、Ａｎｇ−２断片がＡｎｇ−２特有のアミノ酸配列を有するＡｎｇ−２抗原またはその断片で動物を免疫することによって実施することができる。このような免疫原は、任意により担体にコンジュゲートすることができる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  （ＵＳＡ），９０：２５５１−２５５５（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ，７：３３（１９９６）を参照されたい。１つの方法では、このようなトランスジェニック動物は、その免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードする内在性座を無能にし、ヒト重鎖および軽鎖タンパクをコードする座をそのゲノムに挿入することによって作製する。次いで、完全補体よりも少ない修飾を有する部分修飾動物を交雑して、所望の免疫系修飾をすべて有する動物を得る。免疫原を投与すると、これらのトランスジェニック動物は、所望抗原に対して免疫特異性である（例えばマウスではなく）ヒトアミノ酸配列を含むヒト可変領域を有する抗体を産生することができる。ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８および同ＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９２６を参照されたい。さらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／２４５、同ＰＣＴ／ＧＢ８９／０１２０７、ならびにＥＰ５４６０７３Ｂ１、およびＥＰ５４６０７３Ａ１に記載されている。ヒト抗体は、宿主細胞内で組み換えＤＮＡを発現させることによって、または、本明細書に記載されているように、ハイブリドーマ細胞内で発現させることによって製造してもよい。
【００９９】
遺伝子導入は多種多様な方法で実施される。例えば、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １７：３９１−７（１９９６）を参照されたい。１つのアプローチでは、生殖細胞系コンフィギュレーションの遺伝子セグメントが相互に人工的に近づき合うように、ミニ座を構築する。大きさの制限（すなわち、通常３０ｋｂ未満を有する）が原因で、得られるミニ座は、異なる遺伝子セグメントを限られた数しか含まないが、それでも、大規模な抗体レパートリーを産生することができる。プロモーターおよびエンハンサーを含むヒトＤＮＡ配列のみを含むミニ座は、トランスジェニックマウスにおいて完全に機能する。
【０１００】
トランスジェニック動物において、さらに多数の遺伝子セグメントが所望されるときには、酵母人工染色体（ＹＡＣ）を用いる。ＹＡＣは、数百キロベースから１Ｍｂの範囲であることができ、卵に直接マイクロインジェクションすることによって、またはＹＡＣを胚性幹（ＥＳ）細胞株に導入することによって、マウス（または他の適当な動物）のゲノムに導入する。一般に、ＹＡＣは、精製ＤＮＡ、または精製ＤＮＡをミセル中に含む酵母スフェロプラスト融合物のリポフェクションによって、ＥＳ細胞に導入し、融合は、ハイブリドーマ融合プロトコルに類似の方法で実施する。ＤＮＡ導入後の所望のＥＳ細胞の選択は、当該技術分野において既知の選択可能マーカーのいずれかをＹＡＣ上に含めることによって実施する。
【０１０１】
別の方法として、細菌の大腸菌宿主中で増幅されるバクテリオファージＰ１ベクターを用いる。これらのベクターは一般に、ＹＡＣよりも少ない挿入ＤＮＡを有するが、そのクローンは、マウス卵への直接的なマイクロインジェクションを可能にするのに十分な高さの収率で容易に増殖する。各種Ｐ１ベクターのカクテルの使用によって、高レベルの相同組み換えが生ずることが示されている。
【０１０２】
循環抗体の血清レベルを検出するための当該技術分野において既知の技法（例えばＥＬＩＳＡ）のいずれかを用いて、適当なトランスジェニックマウス（または、他の適当な動物）を同定したら、このトランスジェニック動物を、内在性Ｉｇ座が破壊されているマウスと交配させる。その結果、本質的にすべてのＢ細胞がヒト抗体を発現させる子孫がもたらされる。
【０１０３】
更に別の方法として、すべての動物Ｉｇ座をヒトＩｇ座で置換する。その際、得られた動物はヒト抗体のみを発現する。別のアプローチでは、動物座の一部をヒト座中の特異的かつ対応する領域で置換する。ある特定のケースでは、この手順から得られた動物は、マウスＩｇ座における置換の種類に応じて、完全ヒト抗体とは対照的に、キメラ抗体を発現することができる。
【０１０４】
ヒト抗体は、インビトロでヒト脾細胞（ＢまたはＴ細胞）を抗原に暴露した後、暴露細胞を免疫無防備状態の細胞、例えばＳＣＩＤまたはｎｏｄ／ＳＣＩＤにおいて再構成することによっても製造することができる。Ｂｒａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６０：２０５１−２０５８［１９９８］、Ｃａｒｂａｌｌｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ，６：１０３−１０６［２０００］を参照されたい。１つのアプローチでは、ヒト胎児組織をＳＣＩＤマウス（ＳＣＩＤ−ｈｕ）に移植すると、長期間にわたり造血およびヒトＴ細胞が発する［ＭｃＣｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１５３２−１６３９（１９８８）、Ｉｆｖｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８：２４３−２４８（１９９６）］。上記のキメラマウスにおけるいずれの液性免疫応答も、動物におけるＴ細胞の同時発生に完全に依存している［Ｍａｒｔｅｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８３：１２７１−１７９（１９９４）］。別のアプローチでは、ヒト末梢血リンパ球をＳＣＩＤマウスに腹腔内（または他の方法で）移植する［Ｍｏｓｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３５：２５６−２５９（１９８８）］。移植した細胞をブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）［Ｍａｒｔｅｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８４：２２４−２３０（１９９５）］のようなプライミング剤、または抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体［Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ８６：１９４６−１９５３（１９９５）］のいずれかで処理すると、高レベルのＢ細胞の産生が検出される。
【０１０５】
あるいは、完全合成ヒト重鎖レパートリーは、非再編成Ｖ遺伝子セグメントから、各ヒトＶＨセグメントをランダムヌクレオチドのＤセグメントおよびヒトＪセグメントと組み立てることによって構築する［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２７：３８１−３８８（１９９２）］。同様に、軽鎖レパートリーは、各ヒトＶセグメントをＪセグメントと組み合わせることによって構築する［Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：３２４５−３２６０（１９９４）］。完全抗体（すなわち、重鎖および軽鎖）をコードするヌクレオチドを一本鎖Ｆｖ断片として連結し、糸状ファージマイナーコートタンパクをコードするヌクレオチドに、このポリヌクレオチドをライゲーションする。この融合タンパクがファージの表面上で発現したら、固定化抗原を用いる選択によって、特異的抗体をコードするポリヌクレオチドを同定する。
【０１０６】
さらに別のアプローチでは、一方の鎖をファージタンパクに融合し、もう一方の鎖を細菌のペリプラズムに分泌することによって、抗体断片を２つのＦａｂ断片として組み立てる［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３［１９９１］、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ）８８：７９７８−７９８２（１９９１）］。
【０１０７】
キメラ抗体、ヒト化抗体、ＤＣＲ移植抗体、および完全ヒト抗体、またはその抗原結合断片の大規模製造は典型的には、組み換え法によってもたらす。各抗体またはその抗原結合断片の重鎖および軽鎖をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子は、本明細書に記載されている材料および手順を用いて、宿主細胞に導入させて、発現させることができる。好ましい実施態様では、抗体は、ＣＨＯ細胞のような哺乳類宿主細胞内で産生させる。このような産生の詳細は、本明細書に記載されている。
【０１０８】
本発明の特異的結合剤（本発明の抗体、抗体断片、および抗体誘導体など）はさらに、当該技術分野において既知のいずれかの定常領域を含むことができる。軽鎖定常領域は、例えば、κまたはλ型軽鎖定常領域、例えば、ヒトκまたはλ型軽鎖定常領域であることができる。重鎖定常領域は、例えば、α、δ、ε、γ、またはμ型重鎖定常領域、例えば、ヒトα、δ、ε、γ、またはμ型重鎖定常領域であることができる。１つの実施形態では、軽鎖または重鎖定常領域は、天然の定常領域の断片、誘導体、変異体、またはムテインである。
【０１０９】
１つの実施形態では、本発明の特異的結合剤（本発明の抗体、抗体断片、および抗体誘導体など）は、ＩｇＧを含む。
【０１１０】
目的の抗体から、異なるサブクラスまたはアイソタイプの抗体を取り出すための技法、すなわちサブクラススイッチは既知である。すなわち、例えば、ＩｇＧ抗体をＩｇＭ抗体から、および、ＩｇＭ抗体をＩｇＧ抗体から取り出すことがでる。このような技法によって、所定の抗体（親抗体）の抗原結合特性を有するが、親抗体とは異なる抗体アイソタイプまたはサブクラスに付随する生物学的特性も呈する新たな抗体の調製が可能になる。組み換えＤＮＡ技術を用いてもよい。このような手順においては、特定の抗体ポリペプチドをコードするクローン化ＤＮＡ、例えば、所望のアイソタイプの抗体の定常ドメインをコードするＤＮＡを用いてもよい。Ｌａｎｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：３０３−１６も参照されたい。
【０１１１】
本発明の特異的結合剤（本発明の抗体、抗体断片、および抗体誘導体など）は、ＩｇＧ１重鎖定常ドメイン、またはＩｇＧ１重鎖ドメインの断片を含んでもよい。本発明の抗体、抗体断片、および抗体誘導体はさらに、軽鎖の定常κもしくはλドメイン、またはこれらの断片を含んでもよい。軽鎖定常領域と、それらをコードするポリヌクレオチドは、本明細書において後述されている。別の実施形態では、本発明の抗体、抗体断片、および抗体誘導体はさらに、重鎖定常ドメイン、またはその断片、例えばＩｇＧ2重鎖定常領域を含み、これらも後述されている。
【０１１２】
重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメイン、ならびに、重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸（ＤＮＡ）を以下に示す。λ可変ドメインは、λ定常ドメインに融合することができ、κ可変ドメインは、κ定常ドメインに融合することができる。
【０１１３】
ＩｇＧ２重鎖定常ドメインのＤＮＡ（配列番号４１）
ｇｃｔａｇｃａｃｃａａｇｇｇｃｃｃａｔｃｇｇｔｃｔｔｃｃｃｃｃｔｇｇｃｇｃｃｃｔｇｃｔｃｃａｇｇａｇｃａｃｃｔｃｃｇａｇａｇｃａｃａｇｃｇｇｃｃｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｃｃｃｇａａｃｃｇｇｔｇａｃｇｇｔｇｔｃｇｔｇｇａａｃｔｃａｇｇｃｇｃｔｃｔｇａｃｃａｇｃｇｇｃｇｔｇｃａｃａｃｃｔｔｃｃｃａｇｃｔｇｔｃｃｔａｃａｇｔｃｃｔｃａｇｇａｃｔｃｔａｃｔｃｃｃｔｃａｇｃａｇｃｇｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇｃｃｃｔｃｃａｇｃａａｃｔｔｃｇｇｃａｃｃｃａｇａｃｃｔａｃａｃｃｔｇｃａａｃｇｔａｇａｔｃａｃａａｇｃｃｃａｇｃａａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｃａａｇａｃａｇｔｔｇａｇｃｇｃａａａｔｇｔｔｇｔｇｔｃｇａｇｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃａｃｃｔｇｔｇｇｃａｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｃｃａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃａｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｇｔｔｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｔｇｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｇｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａａｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｇｇａｇａｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃａｃｃｔｃｃｃａｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｇｇｔａａａｔｇａ
【０１１４】
ＩｇＧ２重鎖定常ドメインタンパク（配列番号４２）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０１１５】
κ軽鎖定常ドメインＤＮＡ（配列番号４３）
ｃｇｔａｃｇｇｔｇｇｃｔｇｃａｃｃａｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｔｃｔｇａｔｇａｇｃａｇｔｔｇａａａｔｃｔｇｇａａｃｔｇｃｃｔｃｔｇｔｔｇｔｇｔｇｃｃｔｇｃｔｇａａｔａａｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇａｇａｇｇｃｃａａａｇｔａｃａｇｔｇｇａａｇｇｔｇｇａｔａａｃｇｃｃｃｔｃｃａａｔｃｇｇｇｔａａｃｔｃｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｔｃａｃａｇａｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇａｃａｇｃａｃｃｔａｃａｇｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｃｃｔｇａｃｇｃｔｇａｇｃａａａｇｃａｇａｃｔａｃｇａｇａａａｃａｃａａａｇｔｃｔａｃｇｃｃｔｇｃｇａａｇｔｃａｃｃｃａｔｃａｇｇｇｃｃｔｇａｇｃｔｃｇｃｃｃｇｔｃａｃａａａｇａｇｃｔｔｃａａｃａｇｇｇｇａｇａｇｔｇｔｔａｇ
【０１１６】
κ軽鎖定常ドメインタンパク（配列番号４４）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０１１７】
λ軽鎖定常ドメインＤＮＡ（配列番号４５）
ｇｇｃｃａａｃｃｇａａａｇｃｇｇｃｇｃｃｃｔｃｇｇｔｃａｃｔｃｔｇｔｔｃｃｃｇｃｃｃｔｃｃｔｃｔｇａｇｇａｇｃｔｔｃａａｇｃｃａａｃａａｇｇｃｃａｃａｃｔｇｇｔｇｔｇｔｃｔｃａｔａａｇｔｇａｃｔｔｃｔａｃｃｃｇｇｇａｇｃｃｇｔｇａｃａｇｔｇｇｃｃｔｇｇａａｇｇｃａｇａｔａｇｃａｇｃｃｃｃｇｔｃａａｇｇｃｇｇｇａｇｔｇｇａｇａｃｃａｃｃａｃａｃｃｃｔｃｃａａａｃａａａｇｃａａｃａａｃａａｇｔａｃｇｃｇｇｃｃａｇｃａｇｃｔａｔｃｔｇａｇｃｃｔｇａｃｇｃｃｔｇａｇｃａｇｔｇｇａａｇｔｃｃｃａｃａｇａａｇｃｔａｃａｇｃｔｇｃｃａｇｇｔｃａｃｇｃａｔｇａａｇｇｇａｇｃａｃｃｇｔｇｇａｇａａｇａｃａｇｔｇｇｃｃｃｃｔａｃａｇａａｔｇｔｔｃａｔａｇ
【０１１８】
λ軽鎖定常ドメインタンパク（配列番号４６）
ＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
【０１１９】
本発明の特異的結合剤（本発明の抗体、抗体断片、および抗体誘導体など）としては、例えば、所望のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤ）を有するＨ６Ｌ７、Ｈ５Ｌ７、Ｈ４Ｌ１３、Ｈ１１Ｌ７、Ｈ４Ｌ７、Ｈ１０Ｌ７、Ｈ５Ｌ６、Ｈ２Ｌ７、Ｈ５Ｌ８、Ｈ６Ｌ８、Ｈ３Ｌ７、Ｈ５Ｌ４、Ｈ４Ｌ１２、Ｈ６Ｌ６、Ｈ４Ｌ２、Ｈ４Ｌ６、Ｈ４Ｌ４、Ｈ５Ｌ１１、Ｈ５Ｌ１、Ｈ４Ｌ１１、Ｈ５Ｌ１２、Ｈ５Ｌ９という可変ドメインの組み合わせを含む抗体、および、これらのＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片が挙げられる。さらに、ＩｇＧ４が望ましい場合には、ＩｇＧ４抗体における異種性をもたらすことができるＨ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を低下させる目的で、Ｂｌｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６：４０７（参照として本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ヒンジ領域における点突然変異を導入することが望ましい場合もある。
【０１２０】
さらなる有用な配列情報
本発明の抗体の可変重鎖配列と組み合わせて、以下の配列のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４アイソトープを用いて、該抗体の具体的な所望のアイソトープを作製してもよい。
【０１２１】
ヒトＩｇＧ１
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０１２２】
ヒトＩｇＧ２
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０１２３】
ヒトＩｇＧ３
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＴＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＫＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０１２４】
ヒトＩｇＧ４
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＥＥＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
【０１２５】
ＩｇＧ２としての本発明の抗体のＨＣ配列
以下の配列は、ＩｇＧ２アイソトープとしての本発明の抗体の重鎖配列を表している。軽鎖配列は同じままであり、その配列は実施例の項に示されている。下線が引かれた配列部分は、ＩｇＧ２配列を表している。
【０１２６】
Ｈ２
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＧＳＴＩＥＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＬＤＹＤＩＬＴＧＹＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０１２７】
Ｈ３
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＧＳＴＩＱＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＬＤＹＤＩＬＴＧＹＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０１２８】
Ｈ６
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＬＤＹＤＩＹＴＧＹＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０１２９】
Ｈ１０
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＬＤＹＤＩＬＴＧＹＧＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０１３０】
Ｈ１１
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＬＤＹＤＩＬＴＧＹＧＭＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０１３１】
Ｈ４
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＬＤＹＤＬＬＴＧＹＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０１３２】
Ｈ５
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＬＤＹＤＩＷＴＧＹＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０１３３】
特異的結合剤の融合パートナー
本発明のさらなる実施形態では、Ａｎｇ−２抗体のアミノ酸配列可変領域、例えば、本明細書に記載されているようなアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、または本明細書に記載されているようなアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むポリペプチドを、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかで、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の１つ以上のドメインに融合してもよい。Ａｎｇ−２特異的抗体のＦａｂのような治療用タンパクと共に構築した場合、Ｆｃドメインは、半減期の延長をもたらすか、または、Ｆｃ受容体結合、プロテインＡ結合、補体結合、および、おそらくはさらに胎盤通過のような機能を導入することができる［Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−５３１（１９８９）］。
【０１３４】
１つの例では、抗体ヒンジのＣＨ２およびＣＨ３領域は、当業者に既知の方法を用いて、特異的結合剤ポリペプチド、例えば抗Ａｎｇ−２  ＦａｂまたはＦｖ断片（例えばファージディスプレイライブラリーから得られる）のＮ末端またはＣ末端のいずれかで融合してよい。得られた融合タンパクは、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティーカラムを用いて精製してよい。Ｆｃ領域に融合したペプチドおよびタンパクは、非融合対応物よりも実質的に長いインビボ半減期を呈することが明らかになっている。また、Ｆｃ領域への融合によって、融合ポリペプチドの二量体化／多量体化が可能になる。Ｆｃ領域は、天然のＦｃ領域であってもよく、または、治療品質または循環時間のような特定の品質を改善したり、凝集の問題を軽減したりするなどの目的で改変してもよい。当該技術分野において既知の他の例としては、ホジキン病、未分化リンパ腫、およびＴ細胞白血病を治療する目的で、Ｆｃ領域（ヒトもしくは別の種であっても、合成物であってもよい）がＣＤ３０ＬのＮ末端に融合しているもの（米国特許第５，４８０，９８１号）、敗血症性ショックを治療する目的で、Ｆｃ領域がＴＮＦ受容体に融合しているもの［Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３３４：１６９７−１７０２（１９９６）］、ならびに、ＡＩＤＳを治療する目的で、Ｆｃ領域がＣｄ４受容体に融合しているもの［Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−３１（１９８９）］が挙げられる。
【０１３５】
触媒抗体は別のタイプの融合分子であり、この抗体としては、１つ以上の細胞毒性部分、またはさらに一般的には１つ以上の生物活性部分が特異的結合剤に結合している抗体が挙げられる。例えば、Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｅｕｒ  Ｊ  １２：２０９１−２０９５（２０００）を参照されたい。このタイプの細胞毒性剤は、抗体媒介性の細胞毒性を改善するものであり、この薬剤としては、直接または間接的に細胞死を刺激するサイトカイン、放射性同位元素、化学療法剤（プロドラッグを含む）、細菌毒素（例えば、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素など）、植物毒素（例えば、リシン、ゲロニンなど）、化学コンジュゲート（例えば、メイタンシノイド毒素、カリチアマイシンなど）、放射性コンジュゲート、酵素コンジュゲート（ＲＮａｓｅコンジュゲート、抗体介在性酵素／プロドラッグ治療［ＡＤＥＰＴ）］）などのような部分が挙げられる。１つの態様では、細胞毒性剤は、双特異性抗体または多重特異性抗体上の代わりの抗原認識部位の１つに結合させることによって、双特異性抗体または多重特異性抗体の１つの成分に「接続」させることができる。この代わりとして、タンパク細胞毒をコードするポリヌクレオチドを、結合剤をコードするポリヌクレオチドにライゲーションした後、特異的結合剤との融合タンパクとして、タンパク細胞毒を発現させることができる。さらに別の代替形態では、所望の細胞毒を含むように、特異的結合剤を共有結合によって修飾することができる。
【０１３６】
このような融合タンパクの例は、長い循環半減期を有する免疫原性ポリペプチド、タンパク、例えば、免疫グロブリン定常領域、マーカータンパク、所望の特異的結合剤ポリペプチドの精製を促すタンパクまたはポリペプチド、および、多量体タンパクの形成を促すポリペプチド配列（多量体の形成／安定性に有用なロイシンジッパーモチーフなど）である。
【０１３７】
このタイプの挿入変異体は一般に、ＮまたはＣ末端で、第２のポリペプチドの全部または一部に結合した天然分子の全部またはかなりの部分を有する。例えば、融合タンパクは典型的には、別の種に由来するリーダー配列を使用して、異種宿主でのタンパクの組み換え発現を可能にする。別の有用な融合タンパクは、融合タンパクの精製を促す目的で、抗体エピトープのような免疫学的に活性なドメインの付加体を含む。融合連結部またはその近くに切断部位を含めることによって、精製後に異質ポリペプチドの除去を促す。他の有用な融合法としては、酵素由来の活性部位のような機能ドメイン、グリコシル化ドメイン、細胞標的シグナル、または膜貫通領域の連結が挙げられる。
【０１３８】
本発明で用いてよい市販の融合タンパク発現系には、さまざまなものがある。特に有用な系としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）系（ファルマシア）、マルトース結合タンパク系（マサチューセッツ州ベバリーのＮＥＢ）、ＦＬＡＧ系（コネティカット州ニューヘーブンのＩＢＩ）、および６ｘＨｉｓ系（カリフォルニア州チャッツワースのキアゲン）が挙げられるが、これらに限らない。これらの系は、組み換えポリペプチドの抗原能に影響を及ぼす可能性の低い追加的なアミノ酸をごく少数有する組み換えポリペプチドを産生することができる。例えば、ＦＬＡＧ系および６ｘＨｉｓ系はいずれも、短い配列しか付加せず、これらはいずれも、抗原性に乏しいことが知られており、かつ、ポリペプチドの天然コンホメーションへのフォールディングに悪影響を及ぼさない。有用であると考えられる別のＮ末端融合法は、タンパクまたはペプチドのＮ末端領域でのＭｅｔ−Ｌｙｓジペプチドの融合である。このような融合は、タンパクの発現または活性を有益に上昇させる場合がある。
【０１３９】
特に有用な融合構築体は、例えば本発明の抗イディオタイプ抗体の産生において有用な特異的結合剤融合構築体の免疫原性を高める目的で、特異的結合剤ペプチドがハプテンに融合しているものである場合がある。免疫原性を高めるためのこのような融合構築体は当業者に周知であり、例えば、特異的結合剤と、ヘルパー抗原（ｈｓｐ７０、もしくはジフテリア毒素鎖由来のようなペプチド配列など）、またはサイトカイン（ＩＬ−２など）との融合物が、免疫応答を引き出すのに有用である。別の実施態様では、抗原結合剤組成物の特定の部位または細胞へのターゲッティングを高める融合構築体を作製することができる。
【０１４０】
所望の特性を有する異種ポリペプチド、例えば、ターゲッティングのための、血清半減期を延長させるＩｇ定常領域、または、抗体もしくはその断片を含む他の融合構築体も考えられる。他の融合系は、所望のポリペプチドから融合パートナーを切り出すことが望ましいポリペプチドハイブリッドを産生する。１つの実施態様では、融合パートナーは、プロテアーゼに対する特異的認識配列を含むペプチド配列によって、組み換え特異的結合剤ポリペプチドに連結させる。好適な配列の例は、Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓプロテアーゼ（メリーランド州ゲーザーズバーグのライフ・テクノロジーズ）またはＦａｃｔｏｒ  Ｘａ（マサチューセッツ州ベバリーのニュー・イングランド・バイオラボ）によって認識されるものである。
【０１４１】
また、本発明は、腫瘍血管凝固剤として作用するヒト凝固誘導タンパクの切断形態からなる血管ターゲッティング剤の切断組織因子（ｔＴＦ）と共に、Ａｎｇ−２抗体の可変領域、例えば、本明細書に記載されているようなアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、または本明細書に記載されているようなアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の全部または一部を含む融合ポリペプチドを提供する。ｔＴＦの抗Ａｎｇ−２−抗体またはその断片への融合によって、抗Ａｎｇ−２の標的細胞への送達を促すことができる。
【０１４２】
特異的結合剤の変異体
本発明の特異的結合剤の変異体としては、挿入変異体、欠失変異体、および／または置換変異体が挙げられる。本発明の１つの態様では、１つ以上のアミノ酸残基が、特異的結合剤アミノ酸配列に付加されている挿入変異体を提供する。挿入体は、タンパクの片方もしくは両方の末端に位置してもよく、または、特異的結合剤のアミノ酸配列の内部領域内に位置していてもよい。片方または両方の末端に追加残基を有する挿入変異体としては、例えば、融合タンパク、および、アミノ酸タグまたは標識を含むタンパクを挙げることができる。挿入変異体には、１つ以上のアミノ酸残基が特異的結合剤のアミノ酸配列に付加されている特異的結合剤ポリペプチド、またはその断片が含まれる。
【０１４３】
本発明の変異体産物としては、成熟特異的結合剤生成物も挙げられる。このような特異的結合剤生成物では、リーダー配列またはシグナル配列が除去されているが、得られるタンパクは、野生型Ａｎｇ−２ポリペプチドとの比較において、追加のアミノ末端残基を有する。追加のアミノ末端残基は、別のタンパクに由来してもよく、または、特定のタンパクに由来するものとして同定不可能である１つ以上の残基を含んでもよい。１位に追加のメチオニン残基を有する特異的結合剤生成物（Ｍｅｔ−１−特異的結合剤）が考えられると共に、２位に追加のメチオニン残基、１位に追加のリシン残基を有する特異的結合剤生成物（Ｍｅｔ−２−Ｌｙｓ−１−特異的結合剤）も考えられる。追加のＭｅｔ、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ残基（または、１つ以上の一般的な塩基性残基）を有する特異的結合剤の変異体は、細菌宿主細胞での組み換えタンパクの産生を高めるのに特に有用である。
【０１４４】
また、本発明は、特異的発現系の使用によって生じる追加のアミノ酸残基を有する特異的結合剤変異体も包含する。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合産物の一部として、所望のポリペプチドを発現する市販のベクターを使用すると、所望のポリペプチドからＧＳＴ成分を切断後、アミノ酸１位に追加のグリシン残基を有する所望のポリペプチドが得られる。ポリヒスチジンタグをアミノ酸配列に、一般には配列のカルボキシおよび／またはアミノ末端に組み込んだものを含め、他のベクター系での発現によって生じる変異体も考えられる。
【０１４５】
挿入変異体としては、特異的結合剤ポリペプチドのアミノおよび／またはカルボキシ末端が、別のポリペプチド、その断片、またはいずれかの特定のタンパク配列の一部であると通常認識されないアミノ酸配列に融合している上記のような融合タンパクも挙げられる。
【０１４６】
別の態様では、本発明は、特異的結合剤ポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸残基が除去されている欠失変異体を提供する。欠失部分は、特異的結合剤ポリペプチドの片方もしくは両方の末端にもたらすか、または、特異的結合剤のアミノ酸配列内の１つ以上の残基の除去によってもたらすことができる。欠失変異体は必ず、特異的結合剤ポリペプチドのすべての断片を含む。
【０１４７】
抗体断片は、抗原ポリペプチド上のエピトープに結合する抗体の部分を含む。このような断片の例としては、例えば完全長抗体の酵素的または化学的切断によって生成されるＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が挙げられる。他の結合断片としては、抗体可変領域をコードする核酸配列を含む組み換えプラスミドの発現のような組み換えＤＮＡ技法によって生成されるものが挙げられる。また、本発明は、Ａｎｇ−２結合剤のポリペプチド断片で、Ａｎｇ−２ポリペプチドに特異的に結合する能力を保持する断片を包含する。本発明では、本発明のペプチドまたはポリペプチドの連続アミノ酸を少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、もしくは５０個、またはそれ以上含む断片が考えられる。好ましいポリペプチド断片は、本発明の抗原結合剤に特有または特異的な免疫学的特性を呈する。所望の免疫学的特性を有する本発明の断片は、当該技術分野において周知かつ日常的に実施されている方法のいずれかによって調製することができる。
【０１４８】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の特異的結合剤の置換変異体を提供する。置換変異体は一般に、元のポリペプチドに「類似」しているか、または元のポリペプチドに対して、ある特定の「同一性（％）」を有しているとみなされるものであり、この変異体としては、ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸残基が除去され、かつ、代わりの残基で置換されているポリペプチドが挙げられる。１つの態様では、置換部分は本質的には保存的であるが、本発明は、非保存的な置換部分も包含する。
【０１４９】
関連ポリペプチドの同一性および類似性は、既知の方法によって容易に算出することができる。このような方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８年）、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ１，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）、およびＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されているものが挙げられるが、これらに限らない。
【０１５０】
２つのポリペプチドの関連性または同一性（％）を割り出すための好ましい方法は、試験する配列間において最も大きくマッチするように設計される。同一性を割り出す方法は、公に入手可能なコンピュータープログラムに記述されている。２つの配列間の同一性を割り出すための好ましいコンピュータープログラム法としては、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１２：３８７（１９８４）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））を含むＧＣＧプログラムパッケージが挙げられるが、これらに限らない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）および他の供給元（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ２０８９４、前出のＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０））から公に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも、同一性を割り出すのに使用してよい。
【０１５１】
２つのアミノ酸配列をアラインメントするためのある特定のアラインメントスキームによって、２つの配列の短い領域のみをマッチすることができ、この小さなアラインメント領域は、２つの完全長配列間に有意な関係がなくても、非常に高い配列同一性を有する場合がある。したがって、ある特定の実施態様では、選択したアラインメント方法（ＧＡＰプログラム）によって、比較する標的ポリペプチドの完全長の少なくとも１０％、すなわち少なくとも４００アミノ酸の配列を比較するときには少なくとも４０個の連続アミノ酸、少なくとも３００〜約４００アミノ酸の配列を比較するときには３０個の連続アミノ酸、２００〜約３００アミノ酸の配列を比較するときには少なくとも２０個の連続アミノ酸、および、約１００〜２００アミノ酸の配列を比較するときには少なくとも１０個の連続アミノ酸の範囲のアラインメントが行われる。
【０１５２】
例えば、コンピューターアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン州マディソンのウィスコンシン大学）を用いて、配列の同一性（％）を割り出す対象である２つのポリペプチドをアラインメントして、各アミノ酸の最適なマッチを得る（アルゴリズムによって測定した「マッチドスパン」）。ある特定の実施態様では、このアルゴリズムと組み合わせて、ギャップオープニングペナルティー（典型的には、３×平均ダイアゴナルとして算出される。「平均ダイアゴナル」は、使用した比較マトリクスのダイアゴナルの平均である。「ダイアゴナル」は、特定の比較マトリクスによる完全アミノ酸マッチの各々に割り当てられるスコアまたは数である）、およびギャップエクステンションペナルティー（一般に、ギャップオープニングペナルティーの１／１０倍）、ならびに、比較マトリクス（ＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２など）を用いる。特定の実施態様では、標準的な比較マトリクス（ＰＡＭ２５０比較マトリクスに関しては、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５（３）（１９７８）を、ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリクスに関しては、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）を参照されたい）も上記のアルゴリズムによって用いられる。
【０１５３】
特定の実施形態では、ポリペプチド配列の比較のためのパラメーターとしては、以下のものが挙げられる。
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０）
比較マトリクス：前出のＨｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）のＢＬＯＳＵＭ６２
ギャップペナルティー：１２
ギャップレングスペナルティー：４
類似性の閾値：０
【０１５４】
ＧＡＰプログラムは、上記パラメーターで有用である場合がある。特定の実施態様では、上記のパラメーターは、ＧＡＰアルゴリズムを用いるポリペプチド比較（エンドギャップに対してはペナルティーなしで行う）のためのデフォルトパラメーターである。
【０１５５】
特定の実施態様では、ポリヌクレオチド分子配列の比較のためのパラメーターとしては、以下のものが挙げられる。
アルゴリズム：前出のＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７０）
比較マトリクス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０
ギャップペナルティー：５０
ギャップレングスペナルティー：３
【０１５６】
ＧＡＰプログラムは上記のパラメーターでも有用である場合がある。上記のパラメーターは、ポリヌクレオチド分子の比較のためのデフォルトパラメーターである。
【０１５７】
Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１９９７に記載されているものを含め、他の代表的なアルゴリズム、ギャップオープニングペナルティー、ギャップエクステンションペナルティー、比較マトリクス、類似性の閾値などを使用してよい。行われる特定の選択は、当業者には明らかであると共に、行われる具体的な比較、例えば、ＤＮＡ対ＤＮＡ、タンパク対タンパク、タンパク対ＤＮＡ、さらには、比較が、所定の対の配列間の比較（この場合には通常、ＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが好ましい）、または１つの配列と、大規模な配列データベースとの間の比較（この場合には、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡが好ましい）であるか否かによって決まる。
【０１５８】
本明細書で使用する場合、２０個の慣用アミノ酸およびその略号は、慣例的な用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．  Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照されたい。この文献は、いずれかの目的で参照として本明細書に組み込まれる。
【０１５９】
アミノ酸は、Ｌ形またはＤ形のいずれかの立体化学性を有することがあり（ＬでもＤでもないＧｌｙは除く）、本発明のポリペプチドおよび組成物は、立体化学性の組合せを含んでよい。しかしながら、Ｌ形の立体化学性が好ましい。また、本発明は、アミノ酸のアミノ末端からカルボキシ末端までの配列が逆転している逆分子も提供する。例えば、正常な配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３を有する分子の逆は、Ｘ３−Ｘ２−Ｘ１である。また、本発明は、上記のように、アミノ酸のアミノ末端からカルボキシ末端までの配列が逆で、通常「Ｌ形の」鏡像異性体である残基が「Ｄ形の」立体異性体形態に変化しているレトロ逆分子も提供する。
【０１６０】
２０個の慣用アミノ酸、非天然アミノ酸（α−，α−ジ置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非慣用アミノ酸など）の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）も、本発明のポリペプチドに適した成分である場合がある。非慣用アミノ酸の例としては、アミノアジピン酸、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、アミノ酪酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノヘプタン酸、アミノイソ酪酸、アミノピメリン酸、ジアミノ酪酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリシン、アロ−ヒドロキシリシン、ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、サルコシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、δ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに、他の類似のアミノ酸およびアミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられるが、これらに限らない。
【０１６１】
同様に、別段の指定がない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’への付加方向は転写方向と称され、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域であって、ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’にある配列領域は、「上流配列」と称され、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域であって、ＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’にある配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。
【０１６２】
保存的アミノ酸置換体は、典型的には、生物系での合成ではなく、化学的ペプチド合成によって組み込まれる非天然アミノ酸残基を含む場合がある。これらとしては、ペプチド模倣体、およびアミノ酸部分の他の逆形態または反転形態が挙げられる。
【０１６３】
天然残基は、共通の側鎖特性に基づいて、下記のクラスに分類することができる。
１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
【０１６４】
例えば、非保存的置換体は、上記のクラスのうちの１つのメンバーが別のクラスのメンバーに置換されたものを含んでよい。このような置換残基は、非ヒト抗体と相同なヒト抗体の領域、または当該分子の非相同領域に導入してよい。
【０１６５】
このような変化を加える際には、特定の実施態様によれば、アミノ酸のハイドロパシックインデックスを考慮してよい。各アミノ酸に対して、その疎水性と電荷特性に基づいて、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、スレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸塩（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸塩（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リシン（−３．９）、およびアルギニン（−４．５）のように、ハイドロパシックインデックスが割り当てられている。
【０１６６】
タンパクに対して相互作用的な生物学的機能を付与する際のアミノ酸のハイドロパシックインデックスの重要性は、当該技術分野において理解されている（Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１（１９８２））。特定のアミノ酸を、同様のハイドロパシックインデックスまたはスコアを有するうえに、同様の生物活性を保持している他のアミノ酸で置換してよいことは既知である。ハイドロパシックインデックスに基づいて変化を加える際、特定の実施態様では、ハイドロパシックインデックスが±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。特定の実施態様では、±１以内のアミノ酸の置換が含まれ、特定の実施態様では、±０．５以内のアミノ酸の置換が含まれる。
【０１６７】
類似のアミノ酸の置換は、特に、置換によって作られる生物学的に機能的なタンパクまたはペプチドが、本発明のケースのように、免疫学的実施態様での使用が意図されている場合には、親水性に基づいて効果的に行うことができるのは、当該技術分野において理解されている。特定の実施態様では、隣接するアミノ酸の親水性により決定される、タンパクの最大局所平均親水性は、その免疫原性と抗原性、すなわちタンパクの生物学的特性と相関している。
【０１６８】
これらのアミノ酸残基に対して、アルギニン（＋３．０）、リシン（＋３．０）、アスパラギン酸塩（＋３．０±１）、グルタミン酸塩（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、およびトリプトファン（−３．４）のように親水性値が割り当てられている。同様の親水性値に基づいて変化を加える場合、特定の実施態様では、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、特定の実施態様では、±１以内のアミノ酸の置換が含まれ、特定の実施態様では、±０．５以内のアミノ酸の置換が含まれる。親水性に基づいて、一次アミノ酸配列からエピトープを同定してもよい。これらの領域は「エピトープコア領域」とも呼ばれる。
【０１６９】
代表的なアミノ酸置換を表１に示す。
【０１７０】
【表１】
0005739163.tif 000002
【０１７１】
当業者は、周知の技法を用いて、本明細書に記載されているようなポリペプチドの好適な変異体を決定することができる。特定の実施態様では、当業者は、活性にとって重要でないと考えられている領域を標的にすることによって、活性を破壊することなく変化を加えることができる、分子の好適な区域を同定してよい。特定の実施態様では、類似のポリペプチドの中で保存される分子の残基および部分を同定することができる。特定の実施態様では、生物活性または構造にとって重要であり得る区域に対しても、生物活性を破壊することなく、または、ポリペプチド構造に悪影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換を行うことができる。
【０１７２】
加えて、当業者は、活性または構造にとって重要である残基を類似のポリペプチド中で同定する構造−機能研究を検討することができる。このような比較を考慮して、類似のタンパクにおける活性または構造にとって重要であるアミノ酸残基に相当するタンパク中のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、このように予測した重要なアミノ酸残基に対して、化学的に類似のアミノ酸置換を選択してよい。
【０１７３】
当業者は、類似ポリペプチドの中の前記構造に関連する３次元構造およびアミノ酸配列を分析することもできる。当業者は、このような情報を考慮して、３次元構造に対する抗体のアミノ酸残基のアラインメントを予測してよい。特定の実施態様では、当業者は、タンパクの表面上にあると予測されるアミノ酸残基は、他の分子との重要な相互作用に関与する場合があるので、そのような残基に対して極端な変化を加えないように選択してよい。さらに、当業者は、所望の各アミノ酸残基に単一のアミノ酸置換を含む試験変異体を生成してよい。その後、この変異体を、当業者に既知の活性アッセイを用いてスクリーニングすることができる。このような変異体を用いて、好適な変異体に関する情報を集めることができる。例えば、特定のアミノ酸残基に変化を加えると、破壊されたか、望ましくない形で低下したか、または不適当である活性が生ずることが明らかになった場合、そのような変化を有する変異体を回避してよい。換言すると、このようなルーチンの実験から集めた情報に基づいて、当業者は、単独で、または他の突然変異体と組み合わせて、さらなる置換を避けなければならないアミノ酸を容易に判断することができる。
【０１７４】
多数の科学文献で、二次構造の予測が取り上げられている。Ｍｏｕｌｔ  Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７（４）：４２２−４２７（１９９６）、Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３（２）：２２２−２４５（１９７４）、Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１３（２）：２１１−２２２（１９７４）、Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７：４５−１４８（１９７８）、Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１−２７６、およびＣｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７−３８４（１９７９）を参照されたい。さらに、現在、二次構造の予測を支援するためのコンピュータープログラムが利用可能である。二次構造を予測する１つの方法は、ホモロジーモデリングに基づいている。例えば、３０％超の配列同一性、または４０％超の類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパクは、類似の構造トポロジーを有することが多い。タンパク構造データーベース（ＰＤＢ）の最近の発達によって、ポリペプチドまたはタンパクの構造内のフォールドの潜在数を含む二次構造の予測性が向上した。Ｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２７（１）：２４４−２４７（１９９９）を参照されたい。所定のポリペプチドまたはタンパクではフォールドの数は限られており、臨界数の構造が解明されたら、構造予測の正確性は劇的に高くなることが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３６９−３７６（１９９７））。
【０１７５】
二次構造を予測する追加的な方法としては、「スレッディング」（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３７７−８７（１９９７）、Ｓｉｐｐｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４（１）：１５−１９（１９９６））、「プロファイル解析」（Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−１７０（１９９１）、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１８３：１４６−１５９（１９９０）、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４（１３）：４３５５−４３５８（１９８７））、および「進化的関連性」（前出のＨｏｌｍ，（１９９９）、および前出のＢｒｅｎｎｅｒ，（１９９７）を参照）が挙げられる。
【０１７６】
特定の実施態様では、抗体変異体として、グリコシル化部位の数および／または種類が、親ポリペプチドのアミノ酸配列との比較において改変されているグリコシル化変異体が挙げられる。特定の実施態様では、タンパク変異体は、天然タンパクよりも多いかまたは少ない数のＮ結合型グリコシル化部位を含む。Ｎ結合型グリコシル化部位は、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（Ｘで表されるアミノ酸残基は、プロリン以外のいずれのアミノ酸残基であってもよい）という配列によって特徴付けられる。アミノ酸残基を置換してこの配列を作製すると、Ｎ結合型炭水化物鎖を付加するための潜在的に新しい部位が得られる。あるいは、この配列を排除する置換では、既存のＮ結合型炭水化物鎖が除去されることになる。また、１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位（典型的には天然のもの）が排除され、１つ以上の新しいＮ結合型部位が作製されているＮ結合型炭水化物鎖の再構成も提供する。追加的な好ましい抗体変異体としては、親アミノ酸配列との比較において、１つ以上のシステイン残基が欠失しているか、または別のアミノ酸（例えばセリン）で置換されているシステイン変異体が挙げられる。システイン変異体は、不溶性封入体の単離後などに、抗体を生物活性のあるコンホメーションにリフォールディグしなければならないときに有用である場合がある。システイン変異体は一般に、天然タンパクよりも少ないシステイン残基を有しており、典型的には、不対システインに起因する相互作用を最小限にする目的で、偶数のシステイン残基を有する。
【０１７７】
特定の実施態様によれば、アミノ酸置換は、（１）タンパク分解に対する感受性を低下させるもの、（２）酸化に対する感受性を低下させるもの、（３）タンパク複合体を形成するための結合親和性を変化させるもの、（４）結合親和性を変化させるもの、および／または、（５）当該ポリペプチドに他の機能特性を付与または修飾するものである。特定の実施態様によれば、天然配列において（特定の実施態様では、分子間接触を形成する１つ以上のドメイン外のポリペプチドの部分において）、単一または複数のアミノ酸置換（特定の実施態様では、保存的アミノ酸置換）を行ってよい。特定の実施態様では、保存的アミノ酸置換は典型的には、親配列の構造特性を実質的に変化させない場合がある（例えば、置換アミノ酸は、親配列で見られるヘリックスを破壊したり、または、親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を壊したりする傾向を有してはならない）。当該技術分野において認識されているポリペプチドの二次および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）、およびＴｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｔ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５（１９９１）に記載されている。
【０１７８】
ポリペプチドまたはペプチド置換変異体である本発明の特異的結合剤分子は、元のアミノ酸配列の約１０〜１２％まで置換されていてもよい。抗体変異体の場合、重鎖は、置換アミノ酸を５０個、４９個、４８個、４７個、４６個、４５個、４４個、４３個、４２個、４１個、４０個、３９個、３８個、３７個、３６個、３５個、３４個、３３個、３２個、３１個、３０個、２９個、２８個、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、または１個有してよく、軽鎖は、置換アミノ酸を２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、または１個有してよい。
【０１７９】
特異的結合剤の誘導体
本発明は、特異的結合剤ポリペプチドの誘導体も提供する。この誘導体としては、アミノ酸残基の挿入、欠失、または置換以外の修飾部を有する特異的結合剤ポリポプチドが挙げられる。好ましくは、この修飾部は本質的に共有結合性であり、例えば、ポリマー、脂質、他の有機および無機部分との化学的結合が挙げられる。本発明の誘導体は、特異的結合剤ポリペプチドの循環半減期を延長させるように調製してよく、または、ポリペプチドが所望の細胞、組織、または器官をターゲッティングする能力を改善するように設計してもよい。
【０１８０】
本発明はさらに、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、および同第４，１７９，３３７号に記載されているような、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコールのような１つ以上の水溶性ポリマー結合体を含むように、共有結合によって修飾された誘導体結合剤を包含する。当該技術分野において既知のさらに他の有用なポリマーとしては、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物系ポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、およびポリビニルアルコール、ならびに、これらのポリマーの混合物が挙げられる。特に好ましいのは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）サブユニットで共有結合によって修飾された特異的結合剤生成物である。水溶性ポリマーは、特定の位置、例えば特異的結合剤生成物のアミノ末端で結合されていても、ポリペプチドの１つ以上の側鎖にランダムに結合されていてもよい。特異的結合剤、および特にヒト化抗体の治療能を改善するためにＰＥＧを使用することは、２０００年１０月１７日にＧｏｎｚａｌｅｓらに付与された米国特許第６，１３３，４２６号に記載されている。
【０１８１】
抗体突然変異誘発のための標的部位
特定の方策を用いて、Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２特異的抗体の固有の特性、例えばこの抗体の標的に対する親和性を操作することができる。この方策としては、当該抗体をコードするポリヌクレオチド分子の部位特異的またはランダム突然変異誘発を利用して、抗体変異体を生成した後、所望の変化、例えば、親和性の向上または低下を呈する抗体変異体を回収するように設計されたスクリーニング工程を行うことが挙げられる。
【０１８２】
突然変異誘発策において最も一般的に標的とされるアミノ酸残基は、ＣＤＲ中のものである。上記のように、これらの領域は、Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２、ならびに、当該残基の空間的配置に影響を及ぼす他のアミノ酸と実際に相互作用する残基を含む。しかしながら、ＣＤＲ領域外の可変ドメインの骨格領域中のアミノ酸が、抗体の抗原結合性にかなり寄与することも示されており、このアミノ酸を標的にして、上記の特性を操作することができる。Ｈｕｄｓｏｎ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，９：３９５−４０２（１９９９）、およびその引用文献を参照されたい。
【０１８３】
抗体変異体のさらに小規模、かつさらに効率的にスクリーニングされたライブラリーは、体細胞の親和性成熟プロセス中に「超突然変異」する傾向のある区域に対応するＣＤＲ中の部位に、ランダムまたは部位特異的な突然変異誘発を限定することによって製造することができる。Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１７：５６８−５７２［１９９９］、およびその引用文献を参照されたい。このようにして超突然変異部位を定めることが知られているＤＮＡ因子のタイプとしては、直列反復配列、逆方向反復配列、特定のコンセンサス配列、二次構造、およびパリンドロームが挙げられる。コンセンサスＤＮＡ配列としては、４塩基配列のプリン−Ｇ−ピリミジン−Ａ／Ｔ（すなわち、ＡまたはＧ−Ｇ−ＣまたはＴ−ＡまたはＴ）、およびセリンコドンＡＧＹ（Ｙは、ＣまたはＴであることができる）が挙げられる。
【０１８４】
したがって、本発明の実施態様として、抗体の標的に対する親和性を向上させることを目的とする突然変異誘発策が挙げられる。これらの方策としては、すべての可変重鎖および軽鎖の突然変異誘発、ＣＤＲ領域のみの突然変異誘発、ＣＤＲ内のコンセンサス超突然変異部位の突然変異誘発、骨格領域の突然変異誘発、またはこれらのアプローチのいずれかの組み合わせが挙げられる（この文脈における「突然変異誘発」は、ランダムまたは部位特異的であることができる）。ＣＤＲ領域の明確な線引き、および抗体の結合部位を含む残基の同定は、当業者に既知の技法、例えばＸ線結晶構造解析によって、問題の抗体および抗体−リガンド複合体の構造を解明することによって行うことができる。このような抗体結晶構造の解析および特徴付けに基づくさまざまな方法は当業者に既知であり、このような方法を用いて、確定的なものではないものの、ＣＤＲ領域を大まかに解析することができる。このような広く用いられている方法の例としては、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、ＡｂＭの定義、および接触定義が挙げられる。
【０１８５】
Ｋａｂａｔの定義は、配列変化に基づくものであり、ＣＤＲ領域を予測するのに最も広く使用されている定義である［Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２８：２１４−８（２０００）］。Ｃｈｏｔｈｉａの定義は、構造ループ領域の位置に基づくものである［Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１９６：９０１−１７（１９８６）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８３（１９８９）］。ＡｂＭの定義は、Ｋａｂａｔの定義とＣｈｏｔｈｉａの定義を折衷したものである。ＡｂＭは、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐが作成した抗体構造モデリングのための総合プログラムスイートである［Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ）８６：９２６８−９２７２（１９８９）、Ｒｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＢＭ（商標），ａ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｌｔｄ．］。ＡｂＭスイートは、ナレッジデーターベースと非経験的な方法との組み合わせを用いて、一次配列のシークエンシングから抗体の３次構造をモデリングする。接触定義として知られているさらなる定義は、最近導入されたものである[ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，５：７３２−４５（１９９６）］。この定義は、利用可能な複合結晶構造の解析に基づいている。
【０１８６】
慣例により、重鎖中のＣＤＲ領域は典型的に、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３と称され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって数を数える目的で、連番が付けられている。軽鎖中のＣＤＲ領域は典型的に、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３と称され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって数を数える目的で、連番が付けられている。
【０１８７】
ＣＤＲ−Ｈ１は、約１０〜１２残基の長さを有し、ＣｈｏｔｈｉａおよびＡｂＭの定義によれば、典型的にはＣｙｓの４残基後、または、Ｋａｂａｔの定義によれば、典型的には５残基後から始まる。Ｈ１の後には典型的に、Ｔｒｐ、典型的にはＴｒｐ−Ｖａｌが続くが、Ｔｒｐ−ＩｌｅまたはＴｒｐ−Ａｌａも続く。Ｈ１の長さは、ＡｂＭの定義によれば、約１０〜１２個の残基である一方で、Ｃｈｏｔｈｉａの定義では、最後の４個の残基が除外される。
【０１８８】
ＣＤＲ−Ｈ２は典型的には、ＫａｂａｔおよびＡｂＭ定義によれば、Ｈ１の末端から１５残基目から始まる。Ｈ２の前の残基は典型的には、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙであるが、多数の変形形態が存在する。Ｈ２の後には典型的に、Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ｉｌｅ／Ａｌａというアミノ酸配列が続く。Ｋａｂａｔの定義によれば、Ｈ２の長さは約１６〜１９残基であり、ＡｂＭの定義では、長さは典型的には９〜１２残基であると予測されている。
【０１８９】
ＣＤＲ−Ｈ３は典型的には、Ｈ２の末端から３３残基目から始まり、その前には典型的に、アミノ酸配列（典型的にはＣｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ）が付いている。Ｈ３の後には典型的に、−Ｇｌｙというアミノ酸配列がある。Ｈ３の長さは、３〜２５残基のいずれかであることができる。
【０１９０】
ＣＤＲ−Ｌ１は典型的には、約２４残基目から始まり、典型的にはＣｙｓに続く。ＣＤＲ−Ｌ１の後の残基は必ずＴｒｐであり、典型的には、Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ、またはＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕという配列が始まる。ＣＤＲ−Ｌ１の長さは約１０〜１７残基である。本発明の抗体の推定ＣＤＲ−Ｌ１は、このパターンに正確に従い、Ｃｙｓ残基の後に１５アミノ酸、その後にＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎが続く。
【０１９１】
ＣＤＲ−Ｌ２は、Ｌ１の末端から約１６残基目から始まる。ＣＤＲ−Ｌ２は一般に、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ、またはＩｌｅ−Ｐｈｅという残基の後に続く。ＣＤＲ−Ｌ２の長さは約７残基である。
【０１９２】
ＣＤＲ−Ｌ３は典型的には、Ｌ２の末端から３３残基目から始まり、典型的にはＣｙｓの後に続く。Ｌ３の後には典型的に、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＸＸＸ−Ｇｌｙというアミノ酸配列が続く。Ｌ３の長さは約７〜１１残基である。
【０１９３】
当該技術分野において、さまざまな抗体修飾法が説明されている。例えば、米国特許第５，５３０，１０１号（Ｑｕｅｅｎら、１９９６年６月２５日）には、ヒト化免疫グロブリンの重鎖可変領域の骨格の配列が、ドナー免疫グロブリンの重鎖可変領域の骨格の配列と６５％〜９５％同一であるヒト化抗体を製造する方法が記載されている。各ヒト化免疫グロブリン鎖は一般に、ＣＤＲに加えて、例えばＣＤＲと相互作用して結合親和性に影響を及ぼすことができるドナー免疫グロブリンの骨格由来のアミノ酸、例えばドナー免疫グロブリン中のＣＤＲに直接隣接している１つ以上のアミノ酸、または分子モデリングで予測した場合に約３オングストローム以内のアミノ酸を含む。重鎖および軽鎖はそれぞれ、各種の位置基準のいずれか１つまたはすべてを用いて設計してよい。本発明のヒト化免疫グロブリンは、無傷の抗体と合わせたときには、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、抗原（エピトープを含むタンパクまたは他の化合物など）に対してドナー免疫グロブリンと実質的に同じ親和性を保持する。１９９７年１２月２日にＱｕｅｅｎらに付与された米国特許第５，６９３，７６１号（「Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」）、１９９７年１２月２日にＱｕｅｅｎらに付与された米国特許第５，６９３，７６２号（「Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」）、１９９６年１２月１７日にＱｕｅｅｎらに付与された米国特許第５，５８５，０８９号（「Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」）に記載されている関連する方法も参照されたい。
【０１９４】
１つの例では、１９９６年１０月１５日にＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍらに付与された米国特許第５，５６５，３３２号（「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ」）には、親抗体と同様の結合特異性を有するが、向上したヒト特性を有する抗体および抗体断片を製造する方法が記載されている。例えばファージディスプレイ法を用いる鎖シャフリングによって、ヒト化抗体を得て、目的の抗原に対して特異的な非ヒト抗体の重鎖または軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドを、ヒト相補性（軽または重）鎖可変ドメインのレパートリーと組み合わせる。目的の抗原に特異的なハイブリッド対合を同定し、選択した対合から採ったヒト鎖を、ヒト相補性可変ドメイン（重鎖または軽鎖）のレパートリーと組み合わせる。別の実施態様では、非ヒト抗体由来のＣＤＲの成分を、ヒト抗体由来のＣＤＲの成分部分のレパートリーと組み合わせる。得られた抗体ポリペプチド二量体のライブラリーから、ハイブリッドを選択し、そのハイブリッドを第２のヒト化シャフリング工程で使用する。あるいは、ハイブリッドが既に、治療価値のあるものとなるのに十分なヒト特性を有する場合には、この第２の工程は省略する。ヒト特性を向上させるための修飾法も説明されている。Ｗｉｎｔｅｒ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ  ４３０：９２−９２（１９９８）も参照されたい。
【０１９５】
別の例として、２０００年４月２５日にＣａｒｔｅｒらに付与された米国特許第６，０５４，２９７号には、ＣＤＲアミノ酸配列を、対応するヒトＣＤＲアミノ酸配列で置換すること、および／または、ＦＲアミノ酸配列を、対応するヒトＦＲアミノ酸配列で置換することによって、ヒト化抗体を作製する方法が記載されている。
【０１９６】
別の例として、１９９８年６月１６日にＳｔｕｄｎｉｃｋａらに付与された米国特許第５，７６６，８８６号（「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ」）には、異種に対する免疫原性を低下させながら、抗原結合ドメインの本来の親和性を損なうことなく修飾することができる抗体可変ドメインのアミノ酸残基を同定する方法と、異種に投与するのに有用であるこれらの修飾抗体可変ドメインを調製する方法が記載されている。１９９９年２月９日にＳｔｕｄｎｉｃｋａに付与された米国特許第５，８６９，６１９号も参照されたい。
【０１９７】
上記のように、当該技術分野において既知の方法を用いる抗体の修飾は典型的に、抗原に対する結合親和性を向上させ、および／または、レシピエントにおける抗体の免疫原性を低下させるように設計される。１つのアプローチでは、ヒト化抗体を修飾して、抗体の、その同族抗原に対する親和性を向上させる目的で、グリコシル化部位を排除することができる［Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０：１３６１−１３６７（１９９３）］。「再成形」、「ハイパーキメラ化」、および「ベニアリング(veneering)/リサーフェシング(resurfacing)」などの技法によって、さらに大きな治療潜在性を有するヒト化抗体が生成されている［Ｖａｓｗａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ，＆Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８１：１０５（１９９８）、Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒ  ９：８９５−９０４（１９９６）］。抗体を再成形する方法について記載している２０００年６月６日にＨａｒｄｍａｎらに付与された米国特許第６，０７２，０３５号も参照されたい。これらの技法は、外来残基の数を減らすことによって抗体の免疫原性を低下させるが、これらは、抗体の繰り返し投与後の抗イディオタイプおよび抗アロタイプ応答を抑えない。免疫原性を低下させるためのこれらの方法の代替方法は、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６２（６）：３６６３−７１（１９９９）に記載されている。
【０１９８】
多くの場合、抗体のヒト化によって、抗原結合能が喪失する。したがって、抗体の結合親和性を回復させる試みとして、ヒト化抗体を「復帰突然変異」させて、元の(大半の場合は齧歯類の)抗体中にあるアミノ酸残基の１つ以上を含めるのが好ましい。例えば、Ｓａｌｄａｎｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３６：７０９−７１９（１９９９）を参照されたい。
【０１９９】
非ペプチド特異的結合剤類似体／タンパク模倣体
さらに、構造の安定化または生分解性の低下をもたらす、ペプチドの非ペプチド特異的結合剤類似体も考えられる。特異的結合剤ペプチドの模倣類似体は、特定の抑制性ペプチドをベースとして、１つ以上の残基を非ペプチド部分で置換することによって調製することができる。好ましくは、この非ペプチド部分によって、ペプチドは、その本来のコンホメーションを保持できるようになるか、または、Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２を認識かつ結合する能力を保持する好ましい（例えば生物活性のある）コンホメーションを安定化できるようになる。１つの態様では、得られる類似体／模倣体は、Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２に対する結合親和性の向上を呈する。特異的結合剤ペプチドから非ペプチド模倣類似体を調製する方法の１つの例は、Ｎａｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｇｕｌ  Ｐｅｐｔ  ５７：３５９−３７０（１９９５）に記載されている。所望される場合には、本発明の特異的結合剤ペプチドは、例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、もしくはリン酸化によって、または、本発明のペプチドの酸付加塩、アミド、エステル（特にＣ末端エステル）、およびＮ−アシル誘導体を生成することによって修飾することができる。また、他の部分との共有結合または非共有結合複合体を形成することによって、特異的結合剤ペプチドを修飾して、ペプチド誘導体を生成することもできる。共有結合複合体は、特異的結合剤ペプチドを含むアミノ酸の側鎖上、または、Ｎ−もしくはＣ末端の官能基に化学的部分を連結させることによって調製することができる。
【０２００】
特に、特異的結合剤ペプチドをレポーター基にコンジュゲートできることが予想される。このレポーター基としては、放射性標識、蛍光標識、酵素（例えば、比色反応もしくは蛍光反応を触媒するもの）、基質、固体マトリクス、または担体（例えば、ビオチンもしくはアビジン）が挙げられるが、これらに限らない。したがって、本発明は、抗体分子を含む分子であって、放射性標識、蛍光標識、酵素、基質、固体マトリクス、および担体からなる群から選択したレポーター基をさらに含むのが好ましい分子を提供する。このような標識は当業者に周知であり、例えば、ビオチン標識が特に考えられる。このような標識の使用法は当業者に周知であり、例えば、米国特許第３，８１７，８３７号、米国特許第３，８５０，７５２号、米国特許第３，９９６，３４５号、および米国特許第４，２７７，４３７号に記載されている。有用である他の標識としては、放射性標識、蛍光標識、および化学発光標識が挙げられるが、これらに限らない。このような標識の使用に関する米国特許としては、例えば、米国特許第３，８１７，８３７号、米国特許第３，８５０，７５２号、米国特許第３，９３９，３５０号、および米国特許第３，９９６，３４５号が挙げられる。本発明のペプチドのいずれも、これらの標識のいずれかを１つ、２つ、またはそれ以上含んでよい。
【０２０１】
特異的結合剤を作製する方法
タンパクである本発明の特異的結合剤は、従来の技法に従って、溶液中または固体支持体上での化学合成によって調製することができる。固相合成の現在における上限は、長さ約８５〜１００アミノ酸である。しかしながら、化学合成法技法を用いて、一連の少量のペプチドを化学的にライゲーションして、完全長ポリペプチドを生成できることが多い。さまざまな自動合成装置が市販されており、これらの装置は、既知のプロトコルに従って用いることができる。例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，（１９８４）、Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，１０５：６４４２（１９８３）、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２：３４１−３４７（１９８６）、Ｂａｒａｎｙ  ａｎｄ  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１−２８４、Ｂａｒａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，３０：７０５−７３９（１９８７）、および米国特許第５，４２４，３９８号）を参照されたい。これらの各文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【０２０２】
固相ペプチド合成法では、ポリマー１ｇ当たり０．１〜１．０ｍＭのアミンを含有するコポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）を使用する。ペプチド合成のためのこれらの方法では、α−アミノ基の保護のために、ブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）または９−フルオレニルメチルオキシ−カルボニル（ＦＭＯＣ）を用いる。いずれの方法も、ペプチドのＣ末端を起点として各ステップで１つのアミノ酸を付加する段階的合成を含む（Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｕｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，Ｕｎｉｔ  ９を参照されたい）。化学合成が完了したら、合成ペプチドを脱保護して、ｔ−ＢＯＣまたはＦＭＯＣアミノ保護基を除去し、低温にて酸で処理することによって（例えば、液体ＨＦ−１０％アニソールで０℃にて約０．２５〜約１時間）、合成ペプチドを当該ポリマーから切断することができる。試薬の蒸発後、１％酢酸溶液によって、特異的結合剤ペプチドを当該ポリマーから抽出し、その後凍結乾燥して、粗生成物を得る。この粗生成物は通常、溶媒として５％酢酸を用いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１５でゲル濾過するような技法を用いて精製することができる。カラムの適当な画分を凍結乾燥すると、均質な特異的結合剤ペプチドまたはペプチド誘導体が得られ、続いて、これをアミノ酸解析、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、紫外吸収分光法、モル旋光度、溶解度のような標準的な技法を用いて特徴付けると共に、固相エドマン分解によって定量化することができる。
【０２０３】
抗Ａｎｇ−１および／または抗Ａｎｇ−２抗体、その誘導体、変異体、および断片、ならびに、他のタンパクをベースとするＡｎｇ−２結合剤を化学合成すると、非天然アミノ酸を当該薬剤に導入することが可能になる。
【０２０４】
組み換えＤＮＡ技術は、本発明の完全長抗体および他の大きなタンパク性特異的結合剤、またはこれらの断片を調製するための便利な方法である。抗体または断片をコードするｃＤＮＡ分子を発現ベクターに挿入してよく、続いて、抗体またはその断片の産生のために、発現ベクターを宿主細胞に挿入することができる。このような抗体をコードするｃＤＮＡを修飾して、「元の」ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡから翻訳されたもの）から変化させて、コドンの縮退をもたらすか、または各種宿主細胞におけるコドンの選択的使用を可能にすることが理解されている。
【０２０５】
一般に、抗体をコードするＤＮＡ分子は、本明細書において実施例の項に記載されている手順を用いて得ることができる。元の抗体分子に関連するＦａｂ分子またはＣＤＲを得るのが望ましい場合には、標準的な技法を用いて好適なライブラリー（ファージディスプレイライブラリー、リンパ球ライブラリーなど）をスクリーニングして、関連するＦａｂ／ＣＤＲを同定およびクローニングすることができる。このようなスクリーニングに用いられるプローブは、元の抗体のＦａｂ部分をコードする完全長もしくは切断Ｆａｂプローブ、元の抗体のＦａｂ部分由来の１つ以上のＣＤＲに対するプローブ、または、他の好適なプローブであってよい。ＤＮＡ断片をプローブとして使用する場合、典型的なハイブリダイゼーション条件は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｐｒｅｓｓ［１９９４］）に記載されているような条件である。ハイブリダイゼーション後、プローブサイズ、プローブのクローンに対する予想される相同性、スクリーニングするライブラリーの種類、およびスクリーニングするクローンの数のような要因に応じて、プローブしたブロットを好適なストリンジェンシーで洗浄することができる。高ストリンジェントなスクリーニングの例は、５０〜６５℃の温度の０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳである。
【０２０６】
さまざまな発現ベクター／宿主系を用いて、本発明の特異的結合剤ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を含有および発現させてよい。これらの系としては、組み換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌のような微生物、酵母発現ベクターで形質転換した酵母、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））をトランスフェクションした植物細胞系、細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系、または、動物細胞系が挙げられるが、これらに限らない。
【０２０７】
組み換え特異的結合剤タンパクの製造において有用な哺乳類細胞としては、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−７など）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、および２９３細胞、ならびに、本明細書に記載されているようなハイブリドーマ細胞株が挙げられるが、これらに限らない。通常はグリコシル化されていると共に、活性のために適切なリフォールディングを必要とする抗体および抗体断片のような特異的結合剤の調製には、哺乳類細胞が好ましい。好ましい哺乳類細胞としては、ＣＨＯ細胞、ハイブリドーマ細胞、および骨髄性細胞が挙げられる。
【０２０８】
特異的結合剤タンパクの組み換え発現のためのいくつかの代表的なプロトコルは、後述されている。
【０２０９】
「発現ベクター」という用語は、ＤＮＡ（ＲＮＡ）配列からポリペプチドを発現させるためのプラスミド、ファージ、ウイルス、またはベクターを指す。発現ベクターは、（１）遺伝子発現において調節機能を有する１つ以上の遺伝要素、例えばプロモーターまたはエンハンサーと、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパクに翻訳される結合剤をコードする構造または配列と、（３）適切な転写開始配列および転写終結配列との集合体を含む転写単位を含むことができる。酵母または真核発現系での使用が意図されている構造単位は、宿主細胞によって、翻訳されたタンパクを細胞外分泌できるようにするリーダー配列を含むことが好ましい。あるいは、リーダー配列または輸送配列なしで、組み換え特異的結合剤タンパクが発現される場合には、そのタンパクは、アミノ末端メチオニン残基を含んでよい。この後、この残基は、最終的な特異的結合剤生成物を得る目的で、発現した組み換えタンパクから切断してもしなくてもよい。
【０２１０】
例えば、特異的結合剤は、市販の発現系、例えばＰｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（カリフォルニア州サンディエゴのインビトロジェン）を用いて、製造者の説明書に従って、酵母内で組み換え発現させてよい。この系は、分泌を誘導するためにプレ−プロ−α配列にも依存しているが、挿入体の転写は、メタノールによる誘導時に、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターによって促される。
【０２１１】
分泌された特異的結合剤ペプチドは、例えば、細菌および哺乳類細胞の上清からペプチドを精製するのに用いる方法によって、酵母増殖培地から精製する。
【０２１２】
あるいは、特異的結合剤ペプチドをコードするｃＤＮＡを、バキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（カリフォルニア州サンディエゴのファーミンジェン）にクローニングしてよい。このベクターを製造業者の指示（ファーミンジェン）に従って用いて、ｓＦ９無タンパク培地中でスポドプテラフルギペルダ細胞を感染させ、組み換えタンパクを産生させることができる。特異的結合剤タンパクは、ヘパリン−セファロースカラム（ファルマシア）を用いて、当該培地から精製および濃縮することができる。
【０２１３】
あるいは、ペプチドは、昆虫系で発現させてよい。タンパク発現用の昆虫系は、当業者に周知である。このような系の１つでは、オウトグラファカリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用いて、スポドプテラフルギペルダ細胞またはイラクサキンウワバの幼虫で外来遺伝子を発現させることができる。特異的結合剤ペプチドのコード配列は、ウイルスの非必須領域、例えばポリヘドリン遺伝子にクローニングすると共に、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。特異的結合剤ペプチドをうまく挿入すると、ポリヘドリン遺伝子は不活性となり、コートタンパクのコートが欠損している組み換えウイルスが産生される。組み換えウイルスを用いて、ペプチドが発現されているＳ．フルギペルダ細胞またはイラクサキンウワバの幼虫を感染させることができる［Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ４６：５８４（１９８３）、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ）９１：３２２４−７（１９９４）］。
【０２１４】
別の例では、特異的結合剤ペプチドをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲによって増幅して、適当なベクター、例えばｐＧＥＸ−３Ｘ（ファルマシア）にクローニングすることができる。ｐＧＥＸベクターは、このベクターによってコードされるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と、ベクターのクローニング部位に挿入されたＤＮＡ断片によってコードされる特異的結合剤タンパクとを含む融合タンパクを産生するように設計されている。ＰＣＲ用のプライマーは、例えば、適当な切断部位を含むように生成させることができる。特異的結合剤融合部分だけを用いて発現を促す場合、または、特異的結合剤融合部分が、目的のペプチドへの結合体として望ましくない場合には、組み換え特異的結合剤融合タンパクは、その後、融合タンパクのＧＳＴ部分から切断してもよい。ｐＧＥＸ−３Ｘ／特異的結合剤ペプチド構築体を大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞（カリフォルニア州ラホーヤのストラタジーン）に形質転換し、個々の形質転換体を単離および増殖させる。個々の形質転換体から採られるプラスミドＤＮＡを精製し、自動シークエンサーを用いて部分的にシークエンシングして、適切な配向で核酸挿入体をコードする所望の特異的結合剤の存在を確認することができる。
【０２１５】
上記の組み換え系を用いて、抗Ａｎｇ−１および／または抗Ａｎｇ−２抗体、ならびにその断片をコードするポリヌクレオチドを発現させると、生物活性を得る目的で、「リフォールディング」（複数のジスルフィド架橋を適切に生成するためのもの）されなければならない抗体またはその断片が産生される。このような抗体のための典型的なリフォールディング手順は、本明細書の実施例の項、および下記の項に記載されている。
【０２１６】
細菌細胞内で作られる特異的結合剤は、細菌中の不溶性封入体として作製してよく、以下のように精製することができる。宿主細胞を遠心によって殺して、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス（ｐＨ８）、１ｍＭのＥＤＴＡ中で洗浄し、０．１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（ミズーリ州セントルイスのシグマ）で１５分間、室温で処理することができる。このライセートを音波処理によって清澄化することができ、細胞破壊片を１２，０００×ｇで１０分間遠心することによってペレット化することができる。特異的結合剤を含有するペレットを５０ｍＭのトリス（ｐＨ８）および１０ｍＭのＥＤＴＡ中に再懸濁させ、５０％グリセロール上に重層し、３０分間、６０００×ｇで遠心することができる。このペレットを、Ｍｇ＋＋およびＣａ＋＋を含まない標準的なリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させることができる。再懸濁したペレットを変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で分画することによって、特異的結合剤をさらに精製することもできる（前出のＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｔｔ  ａｌ．）。このゲルを０．４ＭのＫＣｌ中に浸して、タンパクを可視化することができ、このタンパクを切り出して、ＳＤＳを含まないゲルランニング緩衝液中で電気溶出することができる。ＧＳＴ融合タンパクを細菌中で可溶性タンパクとして産生させる場合には、このタンパクは、ＧＳＴ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ（ファルマシア）を用いて精製することができる。
【０２１７】
組み換えタンパクの発現用の哺乳類宿主系は当業者に周知である。宿主細胞株は、発現タンパクをプロセシングする能力、または、タンパク活性をもたらすのに有用な特定の翻訳後修飾をもたらす能力で、選択することができる。ポリペプチドのこのような修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が挙げられるが、これらに限らない。ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８のようなさまざまな宿主細胞、およびハイブリドーマ細胞株などは、上記のような翻訳後活性のための特定の細胞機構と特徴的なメカニズムを有しており、導入された外来タンパクの正確な修飾およびプロセシングが確実に行われるように選択することができる。
【０２１８】
数くの選択系を用いて、組み換えタンパクの産生のために形質転換された細胞を回収することができる。このような選択系としては、ｔｋ−細胞中のＨＳＶチミジンキナーゼ、ｈｇｐｒｔ−細胞中のヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびａｐｒｔ−細胞中のアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられるが、これらに限らない。また、メトトレキサートに対する耐性を付与するＤＨＦＲ、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ、アミノグリコシドＧ４１８に対する耐性を付与すると共に、クロロスルフロンに対する耐性を付与するｎｅｏ、およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏの選択の基準として、代謝拮抗物質耐性を用いることもできる。有用である場合のあるさらなる選択可能な遺伝子としては、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを使用できるようにするｔｒｐＢ、または、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを使用できるようにするｈｉｓＤが挙げられる。形質転換体を同定するための視覚的指標をもたらすマーカーとしては、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質、ＧＵＳ、ルシフェラーゼおよびその基質、ルシフェリンが挙げられる。
【０２１９】
特異的結合剤の精製およびリフォールディング
いくつかのケースでは、上記の手順を用いて製造した特異的結合剤は、生物活性を持たせる目的で、適切な三次構造に「リフォールディング」および酸化させて、ジスルフィド結合を形成させる必要がある場合がある。リフォールディングは、当該技術分野において既知の多くの手順を用いて実現することができる。このような方法としては、例えば、カオトロピック剤の存在下で可溶化ポリペプチド剤を、通常７超のｐＨに暴露することが挙げられる。カオトロピック剤の選択は、封入体の可溶化に用いる選択と同様であるが、カオトロピック剤は典型的には低濃度で使用する。代表的なカオトロピック剤はグアニジンである。大半のケースでは、リフォールディング／酸化溶液は、システイン架橋を形成させるためのジスルフィドシャフリングを可能にする特定の酸化還元電位をもたらすように、特定の比率で還元剤およびその酸化型も含有する。広く使用されているいくつかの酸化還元対としては、システイン／シスタミン、グルタチオン／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオトレイトールＤＴＴ／ジチアンＤＴＴ、および２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂＭＥが挙げられる。多くの場合、共溶媒を用いて、リフォールディングの効率を高めてもよい。広く使用されている共溶媒としては、グリセロール、さまざまな分子量のポリエチレングリコール、およびアルギニンが挙げられる。
【０２２０】
本発明の特異的結合剤タンパクまたはその変異体を精製するのが望ましい。タンパクの精製技法は当業者に周知である。これらの技法は、１つのレベルでは、ポリペプチド画分および非ポリペプチド画分の粗分画を含む。特異的結合剤ポリペプチドを他のタンパクから分離したら、クロマトグラフィーおよび電気泳動の技法を用いて、目的のポリペプチドをさらに精製して、部分的もしくは完全な精製（または均一になるまでの精製）を行うことができる。純粋な特異的結合剤ペプチドの調製に特に適した解析法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動である。ペプチドを精製するための特に効率的な方法は、高速タンパク液体クロマトグラフィー、またはさらにはＨＰＬＣである。
【０２２１】
本発明の特定の態様は、コードされた特異的結合剤タンパクまたはペプチドの精製に関し、特定的な実施形態では、コードされた特異的結合剤タンパクまたはペプチドの実質的な精製に関する。「精製特異的結合剤タンパクまたはペプチド」という用語は、本明細書で使用する場合、他の成分から単離可能な組成物であって、特異的結合剤タンパクまたはペプチドが、天然で得られる状態と比べて任意の程度まで精製されているものを指すよう意図されている。したがって、精製特異的結合剤タンパクまたはペプチドとは、それが天然に存在できる際の環境から解放された特異的結合剤タンパクまたはペプチドも指す。
【０２２２】
一般に「精製」とは、さまざまな他の成分を除去する目的で分画化されている特異的結合剤組成物であって、その発現された生物活性を実質的に保持している特異的結合剤組成物を指す。「実質的な精製」という用語を用いる場合、この用語は、特異的結合剤タンパクまたはペプチドが、組成物中のタンパクの約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、またはそれ以上を構成するなど、組成物の主成分を形成する特異的結合剤組成物を指す。
【０２２３】
特異的結合剤の精製度を定量化するためのさまざまな方法については、当業者は、本開示を鑑みれば分かる。この方法としては、例えば、例えば活性画分の特異的結合活性を割り出すもの、または、分画内の特異的結合剤ポリペプチドの量をＳＤＳ／ＰＡＧＥ解析によって評価するものが挙げられる。特異的結合剤分画の純度を評価するための好ましい方法は、当該分画の結合活性を算出し、その値を最初の抽出物の結合活性と比較し、精製度を算出することであり、本明細書では、「〜倍の精製数」によって評価する。結合活性の量を表すのに用いられる実際の単位は、当然ながら、精製を追跡するために選択した特定のアッセイ技法と、発現した特異的結合剤タンパクまたはペプチドが、検出可能な結合活性を呈するか否かによって決まる。
【０２２４】
特異的結合剤タンパクの精製に用いるのに適したさまざまな技法は、当業者に周知である。これらの技法としては、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体（免疫沈降）などによる沈降または熱変性による沈降後に遠心するもの、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ−セファロース）、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー工程、等電点電気泳動、ゲル電気泳動、ならびに、これらの技法および他の技法の組み合わせが挙げられる。当該技術分野において一般的に知られているように、さまざまな精製工程を実施する順序は変更してもよく、または、特定の工程を省略してもよく、このようにしても、実質的に精製された特異的結合剤を調製するための適切な方法が得られると考えられている。
【０２２５】
特異的結合剤を常に最も精製された状態で提供することは一般的な要件ではない。実際、特定の実施態様では、あまり実質的に特異的でない結合剤生成物が有用性を有すると考えられている。より少ない数の精製工程を組み合せて用いることによって、または、同じ一般的精製スキームの異なる形態を用いることによって、部分的精製を行ってよい。例えば、ＨＰＬＣ装置を用いて実施する陽イオン交換カラムクロマトグラフィーによって、一般的に、低圧クロマトグラフィー系を用いた同じ技法よりも「数倍」高く精製されることは明らかである。より低い程度の相対的精製度を示す方法は、特異的結合剤タンパク生成物の全面的回収、または発現した特異的結合剤タンパクの生物活性の保持の点で有利である場合がある。
【０２２６】
ＳＤＳ／ＰＡＧＥの条件の違いに応じてポリペプチドの泳動が異なることがあり、場合によっては、大きく異なる場合があることが知られている［Ｃａｐａｌｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ＼Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ，７６：４２５（１９７７）］。したがって、異なる電気泳動条件下では、精製または部分的に精製された特異的結合剤発現産物の見かけ分子量が異なる場合のあることは明らかである。
【０２２７】
結合アッセイ
免疫学的結合アッセイでは典型的に、アナライトの標的抗原に特異的に結合すると共に、多くの場合にはこの抗原を固定化する目的で、捕捉剤を使用する。この捕捉剤は、アナライトに特異的に結合する部分である。本発明の１つの実施態様では、捕捉剤は、Ａｎｇ−２および／またはＡｎｇ−１に特異的に結合する抗体またはその断片である。これらの免疫学的結合アッセイは、当該技術分野において周知である［Ａｓａｉ，ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３７，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）を参照されたい］。
【０２２８】
免疫学的結合アッセイでは、捕捉剤と抗原によって形成された結合複合体の存在を示す標識剤を使用する場合が多い。この標識剤は、当該結合複合体を含む分子の１つであることができ、すなわち、標識特異的結合剤または標識抗特異的結合剤抗体であることができる。あるいは、標識剤は、当該結合複合体に結合する第３の分子、一般には別の抗体であることができる。標識剤は例えば、標識を有する抗特異的結合剤抗体であることができる。当該結合複合体に対して特異的な第２の抗体は、標識を有していなくてもよいが、第２の抗体には、第２の抗体がメンバーである抗体種に特異的な第４の分子が結合することができる。例えば、第２の抗体は、ビオチンのような検出可能な部分で修飾することができ、その後、この検出可能な部分には、酵素標識ストレプトアビジンのような第４の分子が結合することができる。免疫グロブリン定常領域に特異的に結合できる他のタンパク、例えばプロテインＡまたはプロテインＧも、標識剤として使用してよい。これらの結合タンパクは、連鎖球菌の細胞壁の正常成分であり、さまざまな種由来の免疫グロブリン定常領域との強い非免疫原性反応性を呈する［一般に、Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３５：２５８９−２５４２（１９８５）、およびＣｈａｕｂｅｒｔ，Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ，１０：５８５−５９１（１９９７）を参照されたい］。
【０２２９】
このアッセイを通じて、試薬をそれぞれ組み合わせた後に、温置および／または洗浄工程が必要な場合がある。温置工程は、約５秒〜数時間、好ましくは約５分〜約２４時間の範囲で変更することができる。しかしながら、温置時間はアッセイ形態、アナライト、溶液の体積、濃度などによって決まる。一般に、アッセイは大気温度で実施するが、広範な温度で実施することができる。
【０２３０】
Ａ．非競合結合アッセイ
免疫学的結合アッセイは、非競合タイプのものであることができる。これらのアッセイでは、捕捉されたアナライトの量を直接測定する。例えば、１つの好ましい「サンドイッチ」アッセイでは、捕捉剤（抗体）を固体基質に直接結合させることができ、その固体基質で捕捉剤が固定される。続いて、これらの固定化抗体は、試験サンプル中に存在する抗原を捕捉（結合）する。次いで、このようにして固定化されたタンパクを標識剤、例えば標識を有する第２の抗体に結合させる。別の好ましい「サンドイッチ」アッセイでは、第２の抗体は標識を有さないが、第２の抗体が由来する種の抗体に特異的な標識抗体が、第２の抗体に結合することができる。また、第２の抗体は、ビオチンのような検出可能部分で修飾することができ、この検出可能部分には、ストレプトアビジンのような第３の標識分子が特異的に結合することができる［Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｈ１４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ（１９８８）を参照されたい。この文献は参照として本明細書に組み込まれる］。
【０２３１】
Ｂ．競合結合アッセイ
免疫学的結合アッセイは、競合タイプのものであることができる。サンプル中に存在するアナライトの量は、サンプル中に存在するアナライトによって置換されたか、または捕捉剤から競合除去された添加アナライトの量を測定することによって、間接的に測定する。１つの好ましい競合結合アッセイでは、既知量のアナライト（通常、標識されている）をサンプルに添加してから、そのサンプルを抗体（捕捉剤）と接触させる。この抗体に結合した標識アナライトの量は、サンプル中に存在するアナライトの濃度に反比例する（前出のＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｈ１４，ｐｐ．５７９−５８３を参照されたい）。
【０２３２】
別の好ましい競合結合アッセイでは、抗体を固体基質に固定する。この抗体に結合したタンパクの量は、タンパク／抗体複合体中に存在するタンパクの量を測定するか、または、この代わりに、残存している非複合体化タンパクの量を測定するかのいずれかによって割り出してよい。タンパクの量は、標識タンパクを提供することによって検出してよい。前出のＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｈ１４を参照されたい）。
【０２３３】
さらに別の好ましい競合結合アッセイでは、ハプテン阻害を利用する。この場合には、既知のアナライトを固体基質に固定化する。既知量の抗体をサンプルに添加し、そのサンプルを固定化アナライトと接触させる。固定化アナライトに結合した抗体の量は、サンプル中に存在するアナライトの量に反比例する。固定化抗体の量は、抗体の固定化画分、または溶液中に残存している画分のいずれかを検出することによって検出してよい。検出は、抗体を標識した場合には直接行ってよく、または、上記のように、抗体に特異的に結合する標識部分を後で添加することによって間接的に行ってよい。
【０２３４】
Ｃ．競合結合アッセイの利用
競合結合アッセイを交差反応性測定で用いて、当業者が、本発明の特異的結合剤によって認識されるタンパクまたは酵素複合体が、所望タンパクであり、交差反応分子ではないか否かを割り出したり、または、当該抗体が、当該抗原に対して特異的であり、非関連抗原に結合しないか否かを割り出したりできるようにすることができる。このタイプのアッセイでは、抗原を固体支持体に固定することができ、この固定化タンパクに対する特異的結合剤の結合と競合する未知のタンパク混合物をアッセイ試料に添加する。競合分子も、当該抗原に関連しない１つ以上の抗原に結合する。タンパクが、特異的結合剤抗体の固定化抗原に対する結合と競合する能力を、固体支持体に固定化した同じタンパクによる結合と比較して、タンパク混合物の交差反応性を割り出す。
【０２３５】
Ｄ．他の結合アッセイ
また、本発明は、サンプル中のＡｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２の存在を検出または定量するためのウエスタンブロット法を提供する。この技法は一般に、サンプルタンパクを分子量に基づきゲル電気泳動によって分離し、そのタンパクを、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体化ナイロンフィルターのような好適な固体支持体に移すことを含む。当該サンプルを、Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２に特異的に結合する抗体またはその断片と温置し、得られた複合体を検出する。これらの抗体は、直接標識してもよく、または、この代わりに、後で、当該抗体に特異的に結合する標識抗体を用いて検出してもよい。
【０２３６】
Ａｎｇ−２のその受容体への結合を阻害するＡｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２特異的結合剤を検出するための結合アッセイは、本明細書の実施例の項に記載されている。
【０２３７】
診断アッセイ
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、Ａｎｇ−１および／もしくはＡｎｇ−２、またはサブユニットの発現によって特徴付けられる症状もしくは疾患の診断、または、Ａｎｇ−１および／もしくはＡｎｇ−２の誘導物質もしくはその断片、Ａｎｇ−１および／もしくはＡｎｇ−２活性のアゴニストもしくは阻害剤で治療している患者をモニタリングするためのアッセイで有用である。Ａｎｇ−１および／もしくはＡｎｇ−２に関する診断アッセイとしては、特異的結合剤と標識を用いて、ヒト体液、または、細胞もしくは組織の抽出物中のＡｎｇ−１および／もしくはＡｎｇ−２を検出する方法が挙げられる。本発明の特異的結合剤は、修飾した状態でもしていない状態でも使用することができる。好ましい診断アッセイでは、例えば標識またはレポーター分子を結合させることによって、特異的結合剤を標識する。広範な標識およびレポーター分子が既知であり、このうちのいくつかは、本明細書にすでに記載されている。特に、本発明は、ヒトの疾患の診断に有用である。
【０２３８】
それぞれのタンパクに対して特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを用いて、Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２タンパクを測定するためのさまざまなプロトコルが、当該技術分野において知られている。例としては、酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる２部位型のモノクローナルベースの免疫測定法が好ましいが、競合結合アッセイも用いることができる。これらのアッセイは、例えば、Ｍａｄｄｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１５８：１２１１［１９８３］に記載されている。
【０２３９】
診断基準を与える目的で、ヒトＡｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２発現の正常値または標準値が一般的に確立されている。この値は、当該技術分野において周知の複合体形成に適した条件下で、正常被検者（好ましくはヒト）から採った体液または細胞抽出物をＡｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２に対する特異的結合剤（例えば抗体）と混合することによって、割り出すことができる。標準的な複合体形成の量は、既知量のＡｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２タンパクに対する特異的結合剤の結合を、コントロールおよび疾患サンプルの両方と比較することによって定量化することができる。続いて、正常サンプルから得た標準値を、疾患に罹患している可能性のある被検者から採ったサンプルから得た値と比較することができる。標準値と被検者の値の偏差によって、罹患状態におけるＡｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２の役割が示唆される。
【０２４０】
診断用途では、特定の実施態様では、特異的結合剤は典型的に、検出可能な部分で標識する。この検出可能な部分は、検出可能なシグナルを直接または間接的に生成できるいずれか１つであることができる。例えば、検出可能部分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉのような放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリンのような蛍光化合物もしくは化学発光化合物、または、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、もしくはホースラディッシュペルオキシダーゼのような酵素であってよい［Ｂａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚ，１８４；１３８−１６３（１９９０）］。
【０２４１】
疾患
本発明は、ヒトの疾患および病的状態を治療するのに有用である、Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２に結合する特異的結合剤を提供する。Ａｎｇ−１および／もしくはＡｎｇ−２の結合活性、または他の細胞活性を調節する薬剤を他の治療薬と併用して、治療効果を高めるか、または潜在的副作用を軽減してよい。
【０２４２】
１つの態様では、本発明は、細胞における、望ましくないかまたは異常なレベルのＡｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２活性によって特徴付けられる疾患および状態の治療に有用である試薬と方法を提供する。これらの疾患としては、癌、ならびに、過形成、乾癬、接触皮膚炎、免疫障害、および不妊症のような他の過剰増殖状態が挙げられる。
【０２４３】
また、本発明は、ヒトを含む動物の癌を治療するであって、Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２活性を阻害または低下させる特異的結合剤を有効量、その動物に投与することを含む方法も提供する。本発明はさらに、生物系における細胞増殖、侵襲、および転移のプロセスを含め、癌細胞の増殖を阻害する方法に関する。この方法は、癌細胞増殖阻害剤として本発明の化合物を使用することを含む。好ましくは、この方法を用いて、哺乳類のような生存している動物における癌細胞の増殖、侵襲、転移、または腫瘍の発生を阻害または低下させる。また、本発明の方法は、アッセイ系での使用、例えば、癌細胞の増殖およびその特性をアッセイする場合、ならびに、癌細胞の増殖に影響を及ぼす化合物を同定する場合などに容易に適合可能である。
【０２４４】
本発明の方法によって治療可能な癌は好ましくは、哺乳類で発生するものである。哺乳類としては例えば、ヒトおよび他の霊長類に加えて、イヌおよびネコのようなペットまたはコンパニオンアニマル、ラット、マウス、およびラビットのような実験動物、ならびに、ウマ、ブタ、ヒツジ、および畜牛のような家畜が挙げられる。
【０２４５】
腫瘍または新生物は、細胞増殖が制御されておらず、かつ進行している組織細胞の増殖を含む。このような増殖は、良性のものもあれば、悪性と称され、器官の壊死を導く場合があるものもある。悪性新生物または癌は、攻撃的な細胞増殖を呈するのに加えて、周囲組織に侵襲し、転移する場合がある点で、良性増殖と区別される。さらに、悪性新生物は、相互および周囲組織との比較において、分化状態の喪失の増大（脱分化の増大）を示すと共に、構造の喪失の増大を示すことを特徴とする。この特性は「退生」ともいう。
【０２４６】
本発明によって治療可能な新生物としては、固形腫瘍、すなわち、癌腫および肉腫も挙げられる。癌腫としては、周囲組織に浸潤（侵襲）して転移を起こす、内皮細胞由来の悪性新生物が挙げられる。腺癌は、腺組織由来の癌腫、または、認識可能な腺構造を形成する癌腫である。別の広範なカテゴリーの癌としては、胚性結合組織のような原線維または均質物質中に細胞が組み込まれる腫瘍である肉腫が挙げられる。また、本発明は、白血病、リンパ腫、および、典型的には腫瘤としては存在しないが、血管系またはリンパ細網系中に分布している他の癌を含む骨髄系またはリンパ系の癌も治療可能にする。
【０２４７】
本発明による治療に適合可能である癌または腫瘍細胞の種類としては、例えば、ＡＣＴＨ産生腫瘍、急性リンパ性白血病、急性非リンパ性白血病、副腎皮質癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング肉腫、胆嚢癌、毛様細胞性白血病、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、カポージ肉腫、腎臓癌、肝癌、肺癌（小細胞肺癌および非小細胞肺癌）、悪性腹水、悪性胸水、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、神経膠腫、非ホジキンリンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、卵巣（胚細胞）癌、膵臓癌、陰茎癌、前立腺癌、網膜芽腫、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、栄養膜新生物、子宮癌、膣癌、外陰癌、およびウィルムス腫が挙げられる。
【０２４８】
本発明については、本明細書において、実験で定義済みの特定タイプの癌の治療を参照しながら詳細に例証されている。それらの例証的な治療では、当該技術分野の標準的な状態のインビトロおよびインビボモデルが使用されている。これらの方法を用いて、インビボ治療レジメンにおいて有効であると予想できる薬剤を同定することができる。しかしながら、本発明の方法は、上記の種類の腫瘍の治療方法に限定されず、あらゆる臓器系に由来するあらゆる固形腫瘍にも及ぶものと理解されたい。侵襲または転移がＡｎｇ−２の発現または活性と関係のある癌は特に、本発明の手段によって阻害されやすいか、またはさらには、後退するように誘導されやすい。
【０２４９】
また、本発明は、別の抗癌化学療法剤（いずれかの従来の化学療法剤など）と併せて、本発明の特異的結合剤（抗体など）を含めることによって実施することができる。特異的結合剤とこのような他の薬剤との併用によって、化学療法プロトコルの効果を高めることができる。熟練した医師であれば、本発明の方法に組み込むことできる多数の化学療法プロトコルを思いつく。アルキル化剤、抗代謝薬、ホルモンおよびアンタゴニスト、放射性同位体、ならびに天然産物を含むいずれの化学療法剤も使用することができる。例えば、本発明の化合物は、ドキソルビシンおよび他のアントラサイクリン類似体のような抗生物質、シクロホスファミドのようなナイトロジェンマスタード、５−フルオロウラシルのようなピリミジン類似体、シスプラチン、ヒドロキシウレア、タキソール、ならびに、その天然誘導体および合成誘導体などと共に投与することができる。別の例として、腫瘍がゴナドトロピン依存性細胞およびゴナドトロピン非依存性細胞を含む乳腺癌のような混合腫瘍の場合には、本化合物をロイプロリドまたはゴセレリン（ＬＨ−ＲＨの合成ペプチド類似体）と共に投与することができる。他の抗新生物プロトコルとしては、テトラサイクリン化合物と別の治療様式、例えば、手術、放射線療法などとの併用が挙げられる。これらは、本明細書においては、「補助的抗新生物療法」ともいう。したがって、本発明の方法をこのような従来のレジメンと共に用いて、副作用を軽減し、効能を高める効果を得ることができる。
【０２５０】
したがって、本発明は、固形腫瘍および白血病を含む広範な癌の治療に有用な組成物と方法を提供する。治療してよい癌の種類としては、乳腺癌、前立腺癌、結腸腺癌、あらゆる形態の気管支原性肺癌、骨髄腫、黒色腫、肝癌、神経芽腫、乳頭腫、アプドーマ、分離腫、鰓腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心疾患、癌腫（例えば、ウォーカー癌腫、基底細胞癌、基底有棘細胞癌、ブラウン−ピアース癌、腺管癌、エールリヒ腫瘍、クレブス２癌、メルケル細胞腫、粘液性癌腫、非小細胞性肺癌、燕麦細胞癌、乳頭癌、硬癌、細気管支癌、気管支癌、扁平上皮癌、および移行上皮癌）、組織球障害、白血病、悪性組織球増殖、ホジキン病、免疫増殖性肺小細胞癌、非ホジキンリンパ腫、形質細胞腫、細網内皮症、黒色腫、軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、線維腫、線維肉腫、巨細胞腫、組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、未分化胚細胞腫、過誤腫、間葉腫、中腎腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント質腫、歯牙腫、奇形腫、胸腺腫、栄養膜腫瘍が挙げられるが、これらに限らない。さらに、腺腫、胆管腫、コレステリン腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢腺腺腫、顆粒膜細胞腫、半陰陽性卵巣腫瘍、肝癌、汗腺腫、ランゲルハンス島細胞腫、ライディヒ細胞腫、乳頭腫、セルトーリ細胞腫、卵胞膜細胞腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、筋原細胞腫、筋腫、筋肉腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、上衣腫、神経節細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、神経鞘腫、神経芽腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経腫、傍神経節腫、非クロム親和性傍神経節腫、被角血管腫、好酸球増加随伴性血管類リンパ組織増殖症、硬化性血管腫、血管腫症、グロムス血管腫、血管内皮腫、血管腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、葉状嚢肉腫、線維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、白血肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、肉腫、新生物、神経線維腫、および子宮頸部形成異常という種類の癌も治療してよい。
【０２５１】
本発明の別の態様は、本発明の材料および方法を用いて、乾癬および接触皮膚炎を含む皮膚のいずれかの過剰増殖状態、または他の過剰増殖性疾患を予防および／または治療することである。乾癬および接触皮膚炎の患者は、その病変部中のＡｎｇ−２活性が高いことが示されている［Ｏｇｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，，Ｊ．Ｉｎｖ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１０：８１８−２３（１９９８）］。これらの臨床症状を発現する人を治療するためには、Ａｎｇ−２に対して特異的な特異的結合剤を他の薬剤と併用するのが好ましい。特異的結合剤は、さまざまな担体のいずれかを用いて、本明細書に記載されいる投与経路、および当業者に周知の他の投与経路を通じて、送達することができる。
【０２５２】
本発明の他の態様としては、血管新生が関与しているさまざまな網膜症（糖尿病網膜症および加齢性黄斑変性を含む）、ならびに、女性生殖器官の障害／疾患、例えば、子宮内膜症、子宮筋腫、および女性の生殖周期中の機能不全性血管増殖（子宮内膜微小血管増殖を含む）に関係する他の状態を治療することが挙げられる。
【０２５３】
本発明のさらに別の態様は、脳動静脈奇形（ＡＶＭ）を含む血管増殖異常、胃腸粘膜の障害および修復、消化性潰瘍疾患の病歴を有する患者の胃十二指腸粘膜の潰瘍化（卒中により生ずる虚血も含む）、肝疾患における広範な肺血管疾患、ならびに、肝外門脈圧亢進患者の門脈圧亢進を治療することに関する。
【０２５４】
本発明の別の態様は、本発明が提供する組成物および方法を用いて癌を予防することである。このような試薬としては、Ａｎｇ−２に対する特異的結合剤が挙げられる。
【０２５５】
医薬組成物
Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２特異的結合剤の医薬組成物は、本発明の範囲内である。抗体を含む医薬組成物は、例えば２００１年１月９日にＬａｍらに付与された米国特許第６，１７１，５８６号明細書に詳述されている。このような組成物は、薬理学的に許容可能な薬剤と共に、本明細書に記載されているような特異的結合剤（抗体など）、または、その断片、変異体、誘導体、もしくは融合体を治療または予防有効量含む。好ましい実施態様では、医薬組成物は、薬理学的に許容可能な薬剤と共に、Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２の少なくとも１つの生物活性を部分的または完全に調節するアンタゴニスト特異的結合剤を含む。典型的には、特異的結合剤は、動物に投与するために十分に精製する。
【０２５６】
医薬組成物は、例えば、その組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明性、色、等張性、臭い、無菌性、安定性、溶解速度もしくは放出速度、吸収度、または浸透度を修正、維持、または保存するための製剤材料を含んでよい。好適な製剤材料としては、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリシンなど）、抗菌剤、酸化防止剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウムなど）、緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、他の有機酸など）、増量剤（マンニトールまたはグリシンなど）、キレート化剤［エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）など］、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）、充填剤、単糖類、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンなど）、タンパク（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）、着色剤、矯味矯臭剤、賦形剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素など）、溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールなど）、糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）、懸濁化剤、界面活性剤もしくは湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０のようなポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、またはチロキサポールなど）、安定性向上剤（スクロースまたはソルビトールなど）、張度向上剤（アルカリ金属ハロゲン化物、（好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール、ソルビトールなど）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤、ならびに／または佐剤が挙げられるが、これらに限らない（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）。
【０２５７】
最適な医薬組成物は、当業者が、例えば、意図する投与ルート、送達形式、および所望用量に応じて決定することになる。例えば、前出のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照されたい。当該組成物は、特異的結合剤の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響を及ぼす場合がある。
【０２５８】
医薬組成物中の主ビヒクルまたは担体は、本質的に水性または非水性のいずれかであってよい。例えば、好適なビヒクルまたは担体は、注射用蒸留水、生理食塩水、または人工脳脊髄液であってよく、場合により、非経口投与用の組成物中の一般的な他の材料が添加されている。中性緩衝食塩水、または血清アルブミンと混合した食塩水が、さらなる代表的なビヒクルである。他の代表的な医薬組成物は、ｐＨが約７．０〜８．５のトリス緩衝液、またはｐＨが約４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含み、したがって、ソルビトールまたはその好適な置換体をさらに含んでもよい。本発明の１つの実施形態では、結合剤組成物は、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態で、所望の純度を有する所定の組成物を任意の製剤化剤（前出のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合することによって、保管用に調製してよい。さらに、結合剤生成物は、スクロースのような適切な賦形剤を用いて、凍結乾燥体として調合してよい。
【０２５９】
医薬組成物は、非経口送達用に選択することができる。あるいは、この組成物は、吸入用に、または、経口送達、点耳、点眼、直腸内送達、または膣内送達のような腸内送達用に選択してよい。このような薬理学的に許容可能な組成物の調製は、当該技術分野の範囲内である。
【０２６０】
製剤成分は、投与部位にとって許容可能な濃度で存在する。例えば、緩衝剤は、組成物を生理的ｐＨ、または生理的ｐＨよりもやや低いｐＨ、典型的には約５〜約８の範囲のｐＨ内に維持する目的で用いられる。
【０２６１】
非経口投与を意図する場合、本発明で用いられる治療用組成物は、発熱物質を含まず、非経口投与用として許容可能な水溶液で、薬理学的に許容可能なビヒクル中に所望の特異的結合剤を含む水溶液の形態であってよい。非経口注射に特に適したビヒクルは、結合剤が、適切に保存された滅菌等張液として調合されている滅菌蒸留水である。さらに別の調製法は、当該生成物（後に、蓄積注射によって送達してよい）の放出の制御または持続をもたらす薬剤、例えば、注射可能なミクロスフェア、生体分解性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸、ポリグリコール酸）、ビード、またはリポソームと共に、所望の分子を調合することを含むことができる。ヒアルロン酸も用いてよく、ヒアルロン酸は、循環血液中での持続期間の延長を促す効果を有する場合がある。所望の分子を導入するための他の好適な手段としては、埋め込み型薬物送達装置が挙げられる。
【０２６２】
別の態様では、非経口投与に適した医薬製剤は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンガー液、または生理的緩衝食塩水のような生理学的に適合性の緩衝液中に調合してよい。水性注射用懸濁液は、その懸濁液の粘度を上昇させる物質、例えばカルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含んでよい。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油状注射用懸濁液として調製してよい。好適な脂肪親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（オレイン酸エチル、トリグリセリド、またはリポソーム）が挙げられる。非脂質のポリカチオン性アミノポリマーも、送達のために使用してよい。任意により、上記懸濁液は、好適な安定剤、または、当該化合物の溶解度を高めると共に、高濃度溶液の調製を可能にする薬剤を含んでよい。
【０２６３】
別の実施形態では、医薬組成物は、吸入用に調合してよい。例えば、結合剤は、吸入用のドライパウダーとして調合してよい。また、ポリペプチドまたは核酸分子吸入溶液は、エアゾール送達用の噴射剤と共に調合してよい。さらに別の実施形態では、溶液を噴霧してよい。肺投与については、化学修飾タンパクの肺送達について記載しているＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５にさらに記載されている。
【０２６４】
また、特定の製剤を経口投与してよいことも考えられる。本発明の１つの実施形態では、このように経口投与される結合剤分子は、錠剤およびカプセル剤のような固形剤型の化合において慣用されている担体と共に、またはこのような担体なしに調合することができる。例えば、カプセル剤は、バイオアベイラビリティーが最大で、かつ前全身性分解が最小のときに、胃腸管のとある点で、その製剤の活性部分が放出されるように設計してよい。結合剤分子の吸収を促進するために、追加の薬剤を含めることができる。希釈剤、矯味矯臭剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤も用いてよい。
【０２６５】
また、経口投与用の医薬組成物は、経口投与に適した剤型の、当該技術分野において周知である薬理学的に許容可能な担体を用いて調合することもできる。このような担体によって、医薬組成物は、患者が服用する用に、錠剤、丸剤、糖剤、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして調合可能になる。
【０２６６】
経口用途用の医薬調製物は、活性化合物を固体賦形剤と混合し、（任意により粉砕した後、）得られた顆粒混合物を加工して、錠剤または糖剤コアを得ることによって得ることができる。所望される場合、好適な助剤を添加することができる。好適な賦形剤としては、ラクトース、スクロース、マンニトール、およびソルビトールを含む糖のような炭水化物またはタンパク充填剤、トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ、または他の植物に由来するデンプン、メチルセルローク、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのようなセルロース、アラビアゴムおよびトラガカントを含むゴム、ならびに、ゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパクが挙げられる。所望される場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、およびアルギン酸またはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）のような崩壊剤または溶解剤を添加してよい。
【０２６７】
糖剤コアは、濃縮糖溶液（アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタンも含んでよい）、ラッカー溶液、ならびに、好適な有機溶媒または溶媒混合物のような好適なコーティングと共に用いてよい。生成物の同定のため、または、活性化合物の量、すなわち用量の特徴付けのために、染料または色素を錠剤または糖剤のコーティングに添加してもよい。
【０２６８】
経口使用することができる医薬調製物としては、ゼラチンで作られたプッシュフィットカプセル剤、ならびに、ゼラチンと、グリセロールまたはソルビトールのようなコーティングとで作られた軟密閉カプセル剤も挙げられる。プッシュフィットカプセル剤は、充填剤または結合剤（ラクトースまたはデンプンなど）、滑沢剤（タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）、および、任意により、安定剤と混合された活性成分を含むことができる。軟カプセル剤では、この活性化合物を好適な液体（脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコール）中に、安定剤と共に、または安定剤なしで、溶解または懸濁させてよい。
【０２６９】
別の医薬組成物は、錠剤の製造に適した非毒性賦形剤との混合物中に、有効量の結合剤を含んでよい。滅菌水、または他の適切なビヒクル中に錠剤を溶解させることによって、１回量剤型で溶液を調製することができる。好適な賦形剤としては、不活性希釈剤（炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、もしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、またはリン酸カルシウムなど）、結合剤（デンプン、ゼラチン、またはアカシアなど）、あるいは、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクなど）が挙げられるが、これらに限らない。
【０２７０】
さらなる医薬組成物は、持続または制御送達製剤中に結合剤分子を含む製剤を含め、当業者には明らかである。さまざまな他の持続または制御送達手段、例えばリポソーム担体、生体分解性微粒子、または多孔性ビード、および蓄積注射剤を調合するための技法も当業者に既知である。例えば、医薬組成物を送達するための多孔性ポリマー微粒子の制御放出について記載しているＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照されたい。持続放出性調整物のさらなる例としては、成形物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態の半透性ポリマーマトリクスが挙げられる。持続放出性マトリクスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリアクチド（ＵＳ３，７７３，９１９およびＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー［Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３）］、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）［Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ，１５：１６７−２７７（１９８１）］および［Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ，１２：９８−１０５（１９８２）］、エチレンビニルアセテート（前出のＬａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，）、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）を挙げてよい。持続放出性組成物としては、当該技術分野において既知であるいくつかの方法のいずれかによって調製することができるリポソームも挙げられる。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ），８２：３６８８−３６９２（１９８５）、ＥＰ３６，６７６、ＥＰ８８，０４６、ＥＰ１４３，９４９を参照されたい。
【０２７１】
インビボ投与に用いられる医薬組成物は典型的には、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜で濾過することによって実現してよい。組成物を凍結乾燥する場合には、この方法を用いる滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれかに行ってよい。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態または溶液中で保管してよい。加えて、非経口組成物は一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈内投与溶液バッグまたはバイアル中に収容する。
【０２７２】
医薬組成物を調合したら、溶液、懸濁液、ゲル、エマルション、固体、または、脱水もしくは凍結乾燥粉末として、滅菌バイアル中に保管してよい。このような製剤は、レディトゥユース形態、または投与前に再構成を必要とする形態（例えば凍結乾燥形態）で保管してよい。
【０２７３】
１つの具体的実施形態では、本発明は、１回量投与単位を作製するためのキットに関する。このキットはそれぞれ、乾燥タンパクを有する第１の容器と、水性製剤を有する第２の容器の両方を含んでよい。また、本発明の範囲内には、単一および複数の区画を有する事前充填型注射器（例えば、液体注射器およびリオ注射器）を含むキットも含まれる。
【０２７４】
治療で用いられる医薬組成物の有効量は、例えば治療の内容と目的によって決まる。したがって、治療に適切な用量レベルは、部分的には、送達される分子、結合剤分子が用いられている適応症、投与ルート、ならびに、患者のサイズ（体重、体表面積、または器官のサイズ）、および状態（年齢および全身健康状態）に応じて変化することは当業者には明らかである。これに従い、臨床家は、最適の治療効果を得る目的で、用量を滴定し、投与ルートを修正してよい。典型的な用量は、上記の要因に応じて約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であってよい。別の実施形態では、用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であってよい。
【０２７５】
いずれの化合物の場合も、治療効果のある用量は、まず、細胞培養アッセイ、または、マウス、ラット、ラビット、イヌ、もしくはブタのような動物モデルのいずれかにおいて推定することができる。また、動物モデルを用いて、適切な濃度範囲と投与ルートを決定してもよい。続いて、これらの情報を用いて、ヒトに投与するのに有用な用量とルートを決定することができる。
【０２７６】
正確な用量は、治療を要する患者に関連する要因を鑑みて決定する。十分なレベルの活性化合物を供給するか、または、所望の効果を維持するように、用量および投与を調節する。考慮してよい要因としては、病状の重篤度、患者の全身健康状態、年齢、体重、および性別、投与の時間および頻度、薬物組成、反応感受性、ならびに、治療に対する応答が挙げられる。長時間作用する医薬組成物は、特定の製剤の半減期とクリアランス率に応じて、３〜４日に１回、１週間に１回、または２週間に１回投与してよい。
【０２７７】
投与頻度は、使用する製剤中の結合剤分子の薬物動態パラメーターによって決まる。典型的には、所望の効果が得られる用量に達するまで、組成物を投与する。したがって、組成物は、ある期間中に１回または複数回（同じかもしくは異なる濃度／用量で）投与するか、あるいは、持続注入してよい。適切な用量のさらなる精緻化を定期的に行う。適切な用量は、適切な用量−応答データを用いて決定してよい。
【０２７８】
医薬組成物の投与ルートは、既知の方法、例えば、経口投与、静脈内ルート、腹腔内ルート、大脳内（実質内）ルート、脳質内ルート、筋肉内ルート、眼内ルート、動脈内ルート、門脈内ルート、もしくは病巣内ルートによる注射、髄内投与手段、髄腔内投与手段、脳質内投与手段、経皮投与手段、皮下投与手段、腹腔内投与手段、鼻腔内投与手段、腸内投与手段、局所投与手段、舌下投与手段、尿道投与手段、膣投与手段、もしくは直腸投与手段、持続放出システムによる方法、または、移植デバイスによる方法と合致している。所望される場合、組成物は、ボーラス注射、持続注入、または移植デバイスによって投与してよい。
【０２７９】
上記の代わりに、または上記に加えて、組成物は、所望分子を上に吸収または封入させた膜、スポンジ、または他の適切な材料の移植を介して、局所投与してよい。移植デバイスを用いる場合には、そのデバイスは、いずれかの好適な組織または器官に移植してよく、所望分子の送達は、拡散、持続放出性ボーラス、または連続投与によるものであってよい。
【０２８０】
いくつかのケースでは、医薬組成物をエキソビボの形で用いることが望ましい場合もある。このような場合には、患者から摘出した細胞、組織、または器官を医薬組成物に暴露し、その後、その細胞、組織、および／または器官を患者に移植して戻す。
【０２８１】
他のケースでは、ポリペプチドである結合剤は、本明細書に記載されているような方法を用いて、遺伝子操作した特定の細胞を移植して、そのポリペプチドを発現および分泌させることによって送達することができる。上記の細胞は、動物細胞またはヒト細胞であってよく、自己細胞、異種動物細胞、または移植組織などが異種の細胞であってよい。任意により、上記の細胞は不死化してもよい。免疫応答の可能性を低下させる目的で、上記の細胞をカプセル化して、周囲組織の浸潤を回避してもよい。カプセル化材料は典型的には、タンパク産物の放出を可能にするが、患者の免疫系または、周囲組織由来の他の有害因子による細胞の破壊を防ぐ生体適合性の半透ポリマー封入体または膜である。
【０２８２】
併用療法
本発明の特異的結合剤は、Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２による病状の治療において、他の治療法と組み合わせて用いることができる。このような他の治療法としては例えば、放射線治療、化学治療剤、および、他の増殖因子または阻害因子が挙げられる。
【０２８３】
化学療法では、抗腫瘍剤を用いることができ、抗腫瘍剤としては例えば、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、およクロラムブシルなど）、ニトロソウレア（カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、およびセムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）など）、エチレンイミン／メチルメラミン（トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホラミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン）など）、スルホン酸アルキル（ブスルファンなど）、トリアジン（ダカルバジン（ＤＴＩＣ）など）を含むアルキル化剤と、葉酸類似体（メトトレキサートおよびトリメトレキサートなど）、ピリミジン類似体（５−フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、２，２’−ジフルオロデオキシシチジンなど）、プリン類似体（６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、２’−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、および２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ）など）を含む代謝拮抗薬と、抗有糸分裂薬（パクリタキセルなど）、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、およびビノレルビンを含む）、タキソテール、エストラムスチン、およびリン酸エストラムスチンを含む天然産物と、エピポドフィロトキシン（エトポシドおよびテニポシドなど）と、抗生物質（アクチノマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ、およびアクチノマイシンなど）と、酵素（Ｌ−アスパラギナーゼなど）と、生物反応修飾物質（インターフェロンα、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ、およびＧＭ−ＣＳＦなど）と、白金配位錯体（シスプランチンおよびカルボプラチンなど）、アントラセンジオン（ミトキサントロンなど）、置換尿素（ヒドロキシウレアなど）、メチルヒドラジン誘導体（Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）およびプロカルバジンを含む）、副腎皮質サプレッサー（ミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）およびアミノグルテチミドなど）を含むその他の薬剤と、アドレノコルチコステロイドアンタゴニスト（プレドニゾンおよび等価体、デキサメタゾン、ならびにアミノグルテチミドなど）、プロゲスチン（カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロールなど）、エストロゲン（ジエチルスチルベストロール、およびエチニルエストラジオール等価体など）、アンチエストロゲン（タモキシフェンなど）、アンドロゲン（プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン／等価体を含む）、アンチアンドロゲン（フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体、およびロイプロリドなど）、および、非ステロイドアンチアンドロゲン（フルタミドなど）を含むホルモンおよびアンタゴニストとが挙げられる。
【０２８４】
併用療法は、下に列挙されている増殖因子、または、下に列挙されている増殖因子を阻害するように設計された薬剤との組み合わせで行うことができる。増殖因子としては、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子または他の造血因子、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、およびエリスロポエチンが含まれ得る。他には公知のアンジオポエチン、例えばＡｎｇ−１，−２，−４，−Ｙおよび／またはヒトＡｎｇ様ポリペプチド、および／または脈管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が挙げられる。他の組成物としては、既知のアンジオポエチン、例えばＡｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ、および／もしくはヒトＡｎｇ様ポリペプチド、ならびに／または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を挙げることができる。増殖因子としては、アンジオゲニン、骨形態形成タンパク−１、骨形態形成タンパク−２、骨形態形成タンパク−３、骨形態形成タンパク−４、骨形態形成タンパク−５、骨形態形成タンパク−６、骨形態形成タンパク−７、骨形態形成タンパク−８、骨形態形成タンパク−９、骨形態形成タンパク−１０、骨形態形成タンパク−１１、骨形態形成タンパク−１２、骨形態形成タンパク−１３、骨形態形成タンパク−１４、骨形態形成タンパク−１５、骨形態形成タンパク受容体−ＩＡ、骨形態形成タンパク受容体−ＩＢ、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、毛様体神経栄養因子受容体、サイトカイン誘導性好中球走化因子−１、サイトカイン誘導性好中球走化因子−２、サイトカイン誘導性好中球走化因子−２、内皮細胞増殖因子、エンドセリン−１、上皮細胞増殖因子、上皮由来好中球誘因物質、線維芽細胞増殖因子−４、線維芽細胞増殖因子−５、線維芽細胞増殖因子−６、線維芽細胞増殖因子−７、線維芽細胞増殖因子−８、線維芽細胞増殖因子−８ｂ、線維芽細胞増殖因子−８ｃ、線維芽細胞増殖因子−９、線維芽細胞増殖因子−１０、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体−１、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体−２、増殖関連タンパク、増殖関連タンパク−２、増殖関連タンパク−２、増殖関連タンパク−３、ヘパリン結合性上皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合タンパク、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体−１、神経増殖因子、神経増殖因子受容体、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、胎盤成長因子、胎盤成長因子−２、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子Ａ鎖、血小板由来増殖因子ＡＡ、血小板由来増殖因子ＡＢ、血小板由来増殖因子Ｂ鎖、血小板由来増殖因子ＢＢ、血小板由来増殖因子受容体−１、血小板由来増殖因子受容体−２、プレＢ細胞増殖刺激因子、幹細胞因子、幹細胞因子受容体、トランスホーミング増殖因子−１、トランスホーミング増殖因子−２、トランスホーミング増殖因子−３、トランスホーミング増殖因子−１．２、トランスホーミング増殖因子−４、トランスホーミング増殖因子−５、潜在型トランスホーミング増殖因子−１、トランスホーミング増殖因子結合タンパクＩ、トランスホーミング増殖因子結合タンパクＩＩ、トランスホーミング増殖因子結合タンパクＩＩＩ、腫瘍壊死因子受容体タイプＩ、腫瘍壊死因子受容体タイプＩＩ、ウロキナーゼタイププラスミノゲン活性化因子受容体、血管内皮細胞増殖因子、およびキメラタンパク、ならびに、これらの生物学的または免疫学的活性断片が挙げられる。
【０２８５】
また、併用療法は、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬ  Ｒ−１）および／またはＤＲ５（ＴＲＡＩＬ  Ｒ−２）受容体を介してアポトーシスを誘導する特異的結合剤（例えばアゴニスト抗体またはＴＲＡＩＬリガンド）のようなアポトーシス誘導物質と組み合わせた本発明の特異的結合剤（抗体など）によっても行うことができる。このような特異的結合剤の例は、ＤＲ５受容体を介してアポトーシスを誘導するアゴニスト抗体を開示している国際公開第２００７／０２７７１３号（参照として本明細書に組み込まれる）に示されている。
【０２８６】
免疫療法
免疫療法は一般に、免疫エフェクター細胞および分子を用いて、癌細胞を標的にして破壊することに依存している。免疫エフェクターは、例えば、標的細胞の表面上の何らかのマーカーを認識する本発明の抗体であってよい。この抗体は、単独で治療のエフェクターとして用いてよく、または、実際に細胞を殺すように、他の細胞を増強してもよい。この抗体は、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）にコンジュゲートしてよく、つまりは、単に標的剤として使用してよい。
【０２８７】
本発明によれば、Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２の突然変異形態を、免疫療法によって、本発明の抗体または抗体コンジュゲートの標的にすることができる。特に、本発明の抗体組成物は、併用療のアプローチにおいて、Ａｎｇ−２標的治療と共に用いることができると考えられる。
【０２８８】
受動免疫療法は、多くの癌に対して特に有効であることが判明している。例えば、ＷＯ９８／３９０２７を参照されたい。
【０２８９】
下記の実施例は、単に例示のためのものとして意図されており、いかなる場合も、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【実施例】
【０２９０】
実施例１
ファージディスプレイによるＡｎｇ２に対する親和性成熟抗体の生成
全体的方策
従来のアプローチ（Ｃｈｅｎ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２９３）８６５−８８１、Ｙｅｌｔｏｎ  ＤＥ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１５５）１９９４−２００４、Ｙａｎｇ  Ｗ−Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２５４）３９２−４０３）と同様に、ＣＤＲのランダム化を用いて、Ａｎｇ２抗体の活性を高めた。簡潔に言うと、Ａｎｇ２抗体５３６の可変領域をＴａｒｇｅｔＱｕｅｓｔという改変ｐＣＥＳ−１ベクターにクローニングした（Ｄｙａｘ  Ｃｏｒｐ，  ｄｅ  Ｈａａｒｄ  ＨＪ  ｅｔ  ａｌ  １９９９  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２７４）１８２１８−３０）。ＮＮＫ含有オリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発によって、すべてのＣＤＲ領域を各ＣＤＲ残基のランダム化の対象にした。突然変異誘発反応の後、ファージＥＬＩＳＡを用いて、ファージクローンの各位置を調べ、良性突然変異を同定した（方法については、ＷＯ２００４／０４６３０６、ＷＯ２００３／０３０５７１３４、およびＵＳ２００３／００９９６４７Ａ１を、ファージ抗体全般については、Ｍａｒｋｓ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２２２）５８１−８９７、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ＨＲ  ｅｔ  ａｌ  １９９２  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２２７）３８１−３８８、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ＡＤ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３ＥＭＢＯ  Ｊ（１２）７２５−７３４、Ｖａｕｇｈａｎ  ＴＰ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１４）３０９−３１４を参照されたい）。良性突然変異を有するクローンを完全抗体に変換した。重鎖クローンを軽鎖クローンと対合し、得られたＩｇＧの中和活性を試験した。上位２２個のクローンの特徴をさらに調べた。
【０２９１】
Ａ．Ａｂ５３６  Ｆａｂ鋳型の構築
標準的な分子生物学的技法を用いて、５３６抗体の可変領域をｐＣＥＳ−１ベクターにクローニングした（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）。下記のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって、重鎖可変断片および完全長軽鎖断片を作製した。
重鎖（リバース側）：ＣＣＧＣＴＧＴＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＣ
重鎖（フォワード側）：ｔｔｔｔｔｔｃｃａｔｇｇｃｃｇａｇｇｔｃｃａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇｔｃ
軽鎖（リバース側）：ＴＴＴＴＴＴＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＡＴＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴ
軽鎖（フォワード側）：ｔｔｔｔｔｔｇｔｇｃａｃｔｔｇａｃａｔｔｇｔｇａｔｇａｃｔｃａｇｔｃｔ
【０２９２】
ＮｃｏＩとＢｓｔＥＩＩという制限酵素認識部位の間に重鎖可変領域を挿入した。ＡｐａＬＩとＡｓｃＩという制限酵素認識部位の間に完全長軽鎖を挿入した。得られた構築体をＣＤＲランダム化の鋳型として用いた。
【０２９３】
Ｂ．ＣＤＲ突然変異体
各ＣＤＲ位置に対するＮＮＫ（Ｎ＝ＡＴＣＧ、Ｋ＝ＧＴ）コドン含有オリゴヌクレオチドを用いた段階的な位置指定突然変異誘発によって、ベクターｐＣＥＳ−１中のＦａｂとしての抗体５３６の親和性を成熟させた。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン番号２００５１８−５）を製造者推奨のプロトコルに従って使用した。Ａｎｇ２に対する結合の高いファージを同定するために、２μｇ／ｍｌにてＰＢＳ中で９６ウェルのＭａｘｉｓｏｒｐプレート（ＮＵＮＣ）上にコーティングしたビオチン化ヒトＡｎｇ２タンパクによって、ファージＥＬＩＳＡを行った。簡潔に言うと、ＰＢＳ中の２％ミルクでブロックした後、ヘルパーファージによって増殖させたファージのオーバーナイト培養液を温置し、ＨＲＰとコンジュゲートした抗Ｍ１３抗体（ファルマシア）を用いて、結合ファージを検出した。発光シグナルを親の５３６Ｆａｂと比較し、さらなる解析のために、高いシグナルを有するクローンを選択した。
【０２９４】
Ｃ．ファージのＦａｂのＩｇＧの変換
ファージＥＬＩＳＡおよび配列解析の後、Ａｎｇ２に対する結合の高い軽鎖および重鎖の突然変異誘発体から採ったクローンを９５個ずつ選択し、ＩｇＧに変換した。簡潔に言うと、１対のプライマーを用いて、各クローンの可変領域をＰＣＲ増殖した。ＬＣ用のプライマー配列は、ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＡＧＡ  ＧＧＴ  ＧＣＧ  ＣＧＣ  ＴＧＴ  ＧＡＴ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＣＣＡ  ＣＴＣ  ＴＣＣ、およびＡＡＡ  ＡＡＡ  ＣＧＴ  ＡＣＧ  ＴＴＴ  ＧＡＴ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＣＣであった。ＨＣ用のプライマーは、ＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＣＧＣＴＧＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣ、およびＡＡＡＡＡＡＧＧＣＡＣＴＡＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣであった。ＬＣはＢｓｓＨＩＩおよびＢｓｉＷＩによって、ＨＣはＢｓｓＨＩおよびＢｓｍＢＩによって消化後、標準的な分子生物学的技法を用いて、ＶＫ１というリーダー配列、ならびに、ヒトκおよびヒトＩｇＧ１の定常配列を含むｐｃＤＮＡ３ベクターに当該可変領域を挿入した。ＸＬ１０  ｇｏｌｄ（ストラタジーン）というコンピテント細胞の入った２つの９６ウェルプレートに、各ライゲーション混合物を入れて形質転換させ、翌日にプラスミドを調製するために、形質転換混合物をオーバーナイトで増殖させた。得られたＤＮＡを、関連する親の５３６ＬＣまたはＨＣ  ＤＮＡと対合し、Ｆｕｇｅｎｅ６を用いて、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ中の２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクションした。７日後、トランスフェクション細胞由来の培地を回収し、ユウロピウムで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｆｃ特異的）、および、ＡＰＣで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体を用いたＬａｎｃｅアッセイ（パーキンエルマー）によって、ＩｇＧ濃度を定量化した。
【０２９５】
Ｄ．ＩｇＧクローンの選択
ＩｇＧを含有する馴化培地が、Ｔｉｅ２のＡｎｇ１またはＡｎｇ２のいずれかとの相互作用を阻害する作用をＨＴＲＦ中和アッセイで試験した。最初のスクリーニングから、活性の向上を示した１５ＬＣクローンおよび１１ＨＣクローンを選んだ。選択したクローンのＤＮＡを調製し、シークエンシングによって確認した。続いて、それぞれのＬＣ突然変異体およびＨＣ突然変異体の組み合わせを５３６親クローンと共に、２９３Ｔ細胞を播種した２つの９６プレートに入れてトランスフェクションした。馴化培地を回収し、Ｔｉｅ２中和アッセイでＩｇＧ濃度と阻害作用について解析した。この組み合わせから、さらなる解析のために、ＬＣおよびＨＣそれぞれに単一突然変異を含有する２２個のクローンを選択した。
【０２９６】
Ｅ．ＣＨＯ細胞におけるヒト親和性成熟Ａｎｇ２抗体の発現と精製
抗Ａｎｇ２  ＩｇＧ発現プラスミドのトランスフェクションに用いるＣＳ−９細胞は、無血清懸濁ＣＨＯ細胞株である。この細胞は、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９８（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｂ．，Ｄａｖｉｓ，Ｒ．，  Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．，Ｒｅｄｄｙ，Ｐ．１９９８．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ：Ａ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ＣＨＯ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２８：３１−４２）に記載されているように、ＤＸＢ１１  ＣＨＯ細胞を徐々に適合させて無血清培地中で増殖させることによって得た。ＤＸＢ１１株は、ＣＨＯ  Ｋ１細胞由来のＤＨＦＲ欠損突然変異誘導体である（Ｃｈａｓｉｎ  ａｎｄ  Ｕｒｌａｕｂ，１９８３；Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ．１９８０．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７，４２１６−４２２０、Ｃｈａｓｉｎ  Ｌ．Ａ．，Ｇｒａｆ，Ｌ．，Ｅｌｌｉｓ，Ｎ．，Ｌａｎｚｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．１９８２．Ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉｈｙｄｒｏ  ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｕｔａｎｔｓ．Ｓｃｈｉｍｋｅ，Ｒ．Ｔ．（Ｅｄ．）Ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，ｐ１６１−１６６．）。ＣＨＯ  Ｋ１は、元々チャイニーズハムスター卵巣から単離した類上皮細胞株である（Ｋａｏ  ａｎｄ  Ｐｕｃｋ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．ＶＩＩ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６０：１２７５−１２８１，１９６８）。
【０２９７】
ＣＳ９宿主細胞株を得るために、１００回の継代培養にわたって徐々に血清を減らした培地中でＤＸＢ１１細胞を増殖させて、ＳＦ  ＣＨＯと呼ばれる無血清適応細胞を得た（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９８）。続いて、限界希釈クローニングによってＳＦ  ＣＨＯ細胞をサブクローニングし、個々のクローンを評価した。組み換えタンパクの発現用の宿主細胞株としてＣＳ−９クローンを選択し、無血清培地中に貯蔵した。この貯蔵物の外来性物質と無菌性について試験し、ウイルス性因子、マイコプラズマ因子、および微生物因子が含まれないことが明らかになった。細胞株ＣＳ−９は、グリシン、ヒポキサンチン、およびチミジン（ＧＨＴ）に対して栄養要求性のＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株である。プラスミドｐＤＣ３２３およびｐＤＣ３２４はそれぞれ、ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡの部分をコードし、この２つのプラスミドは、インビボにおける２つのＤＨＦＲ断片の会合によって機能性ＤＨＦＲ分子を発現させるように、相互に補完し合わなければならない。
【０２９８】
下記の２２個の抗体は、下記の表２に示されているように、それぞれ２本の重鎖と２本の軽鎖（κまたはλ）からなる。
【０２９９】
【表２】
0005739163.tif 000003
【０３００】
表３および４は、ファージから完全長ＩｇＧ１抗体に変換した上記の２２個の抗Ａｎｇ−１および／または抗Ａｎｇ―１抗体の重鎖および軽鎖（κおよびλ）の配列と配列番号を示している。ＫａｂａｔらがＳｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，５ｔｈ  ｅｄ．）で説明している技法を用いたＶＢＡＳＥデータベースを用いて、これらのモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を予測した。Ｆａｂ領域を、最も近い生殖細胞系配列を含むデータベース内の配列にアラインメントしてから、この配列と視覚的に比較した。各可変領域（重鎖または軽鎖）のＣＤＲ（残基と配列の両方）を表５に示す。
【０３０１】
【表３】
0005739163.tif 000004
【０３０２】
【表４】
0005739163.tif 000005
【０３０３】
【表５】
0005739163.tif 000006
0005739163.tif 000007
0005739163.tif 000008
【０３０４】
実施例２
Ａｎｇ−２抗体を評価するための分子アッセイ
Ａｎｇ−２および関連ファミリーメンバー（例えばＡｎｇ−１）への直接的な抗体結合、ならびに、抗体がＡｎｇ−２とＴｉｅ２との相互作用に及ぼす作用を評価する目的で、分子アッセイ（アフィニティーＥＬＩＳＡ、中和ＥＬＩＳＡ、およびＢＩＡｃｏｒｅ）を開発した。以下で、インビボおよび細胞ベースでのこれらのアッセイについて説明する。
【０３０５】
Ａ．アフィニティーＥＬＩＳＡ
抗Ａｎｇ−２抗体候補の初期スクリーニング用に、精製ヒトＡｎｇ２（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号６２３−ＡＮ。Ａｎｇ−２は２つの切断型の混合物として提供されている）、またはマウスＡｎｇ−２ポリペプチド（上記のように調製したもの）を使用した。確認的結合アッセイ用に、完全長ヒトＡｎｇ−２ＤＮＡでトランスフェクションして、１ミリリットル当たり約５０マイクログラムのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する無血清ＤＭＥＭ中で培養したヒト２９３Ｔ細胞の馴化培地からヒトＡｎｇ−２を得た。
【０３０６】
マイクロタイタープレートを用いて、各ウェルに１ウェル当たり約１００マイクロリットルのＡｎｇ−２を加え、このプレートを約２時間温置した後、約０．１パーセントのＴｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、プレートを４回洗浄した。続いて、ＰＢＳ中において約５％のＢＳＡを１ウェル当たり約２５０マイクロリッター用いて、ウェルをブロックし、そのプレートを室温で約２時間温置した。温置後、過剰なブロッキング溶液を捨て、約４０ナノモルの濃度から出発して、約１パーセントのＢＳＡを含有するＰＢＳ中で４倍に段階希釈する希釈系列の入った各ウェルに、抗Ａｎｇ−２ペプチボディ候補約１００マイクロリットルを加えた。その後、プレートを室温にてオーバーナイトで温置した。温置後、約０．１パーセントのＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳでプレートを洗浄した。洗浄をさらに４回繰り返した後、１パーセントのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含有するＰＢＳ中で１：５０００に予め希釈しておいたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）−ＨＲＰ（ピアースケミカル社、カタログ番号３１４１６）を１ウェル当たり約１００マイクロリットル加えた。プレートを室温で約１時間温置した。続いて、約０．１パーセントのＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中でプレートを５回洗浄した後、１ウェル当たり約１００マイクロメートルのＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンのＬｉｑｕｉｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社、カタログ番号Ｔ８６６５）基質を加え、青色を呈するまでプレートを約５〜１５分間温置した。次いで、分光光度計で約３７０ｎｍにて吸光度を読み取った。
【０３０７】
Ｂ．中和ＥＬＩＳＡ
アフィニティーＥＬＩＳＡの項で説明されているように、ヒトＡｎｇ−２ポリペプチドが結合したマイクロタイタープレートを調製した。抗Ａｎｇ−２抗体候補を、約１パーセントのＢＳＡ、および約１ｎＭのＴｉｅ２（Ｔｉｅ２部分が当該分子の可溶性細胞外部分のみを含有するＴｉｅ２−Ｆｃ分子として提供されている。Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号３１３−ＴＩ）を含有するＰＢＳの溶液中で、アフィニティーＥＬＩＳＡの項で上述したような段階希釈法で調製した。約１００マイクロリットルの抗体／Ｔｉｅ２溶液を各ウェルに加えた後、プレートを室温にてオーバーナイトで温置し、次いで、約０．１パーセントのＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中で５回洗浄した。洗浄後、１ウェル当たり約１００マイクロリットルの抗Ｔｉｅ２抗体（ファーミンジェン社、カタログ番号５５７０３９）を１ミリリットル当たり約１マイクログラムの最終濃度で添加し、そのプレートを室温にて約１時間温置してから、約０．１パーセントのＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中で５回洗浄した。次に、１ウェル当たり約１００マイクロリットルのヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ピアースケミカル社、カタログ番号３１４３２）を、約１パーセントのＢＳＡを含有するＰＢＳ中において１：１０，０００の希釈度で加えた。このプレートを室温で約１時間温置した後、約０．１パーセントのＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳでプレートを５回洗浄した。続いて、１ウェル当たり約１００マイクロリットルのＴＭＢ基質（上記のもの）を加えて、呈色させた。次いで、分光光度計で３７０ｎｍにて吸光度を読み取った。
【０３０８】
Ｃ．アフィニティーＢＩＡｃｏｒｅ
各Ａｎｇ−２ペプチボディ候補のアフィニティー解析をＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００（ニュージャージー州ピスカタウェイのバイアコア社）で、ＰＢＳおよび０．００５パーセントのＰ２０界面活性剤（バイアコア社）をランニング緩衝液として行った。Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（バイアコア社）を製造者推奨のプロトコルに従って使用して、組み換えプロテインＧ（マサチューセッツ州ニーダムのレプリゲン）を研究グレードのＣＭ５センサーチップ（バイアコア社）に、第一アミン基を介して固定した。
【０３０９】
まず、各抗Ａｎｇ−２ペプチボディ候補約１００Ｒｕを固定化プロテインＧに結合させた後、さまざまな濃度（０〜１００ｎＭ）のｈｕＡｎｇ−２またはｍＡｎｇ−２を約５０μｌ／分の流速で３分間、結合抗体表面を覆うように注入することによって、結合アッセイを実施した。ＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．１というコンピュータープログラム（バイアコア社）を用いて、ｋａ（会合速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）、およびＫＤ（解離平衡定数）を含む抗体結合反応速度を割り出した。解離平衡定数が低いほど、抗体のＡｎｇ−２に対する親和性が高いことを示していた。
【０３１０】
アフィニティーＥＬＩＳＡおよび中和ＥＬＩＳＡ（実施例３において上述したもの）、ならびに、ＢＩＡｃｏｒｅ中和アッセイを用いて、２２個のすべての抗体とネガティブコントロールのＩｇＧ１（ＲＤＢ１と称する）を試験し、これらの親和性、中和能、および特異性を割り出した。これらの結果は後述されており（表２）、標準的な手順を用いて算出した。Ｈ６Ｌ７、Ｈ４Ｌ４、およびＨ４Ｌ１１という３つの抗体において、上記のＥＬＩＳＡ解析を用いて、ヒトおよびマウスＡｎｇ−１およびＡｎｇ−２に対するＩＣ５０中和濃度を評価した。これらの３つの抗体はいずれも、マウス、ラビット、およびカニクイザルのＡｎｇ１およびＡｎｇ２と交差反応して、アンジポエチンオルソログにわたって同様の力価を呈することが分かった。これらの結果は下記の表３に示されている。
【０３１１】
Ｄ．ＨＴＲＦ  ｈＡＮＧ−１およびｈＡｎｇ−２抗体のＩＣ５０およびＩＣ９０
等体積の１．６ｎＭストレプトアビジン−ユウロピウム（ＳＡ−ＥＵ）と、８ｎＭビオチン化アンジポエチン２（自社製）またはビオチン化アンジポエチン１（Ｒ＆Ｄカタログ番号ＢＡＦ９２３）を混合して、室温で３０分間、暗黒下で、１５ｍｌのコニカルチューブ（フィッシャー３５２０９６）中で回転させながら温置した。続いて、ミキシングプレート（Ｃｏｓｔａｒ３３５６）の各ウェルに、上記のＳＡ−ＥＵ／ビオチン化Ａｎｇ２（１）混合物５０μｌを加えた。このミキシングプレートには、各ウェルに、４倍の最終濃度で段階希釈したＡｎｇ１およびＡｎｇ２を５０μｌ加えた。続いて、ミキシングプレートを室温で１時間、暗黒下、振盪機上で温置した。アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ３３５６）上の各ウェルに、１０ｎＭのｈｕＴｉｅ−２−Ｆｃ−ＡＰＣ（プロザイムカスタムロット番号ＤＦ９９−０４８）２０μｌを加えた。続いて、ミキシングプレートの各ウェルから採った混合物２０μｌを上記のアッセイプレートの各ウェルに移した。このアッセイプレートを室温で２時間、暗黒下で回転させながら温置した。続いて、ＲＵＢＹｓｔａｒというプレートリーダー（ＢＭＧラブテクノロジーズ社）でアッセイプレートを読み取った。このアッセイのすべての試薬をＨＴＲＦ緩衝液（５０ｍＭ  トリスＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で希釈した。ＧＲＡＦＩＴ５．０でＩＣ５０およびＩＣ９０を算出した。
【０３１２】
【表６】
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【０３１３】
実施例３
アンジポエチン抗体の分子特性解析
さらなる調査のために、強力なｈＡｎｇ２阻害活性と、ある範囲のｈＡｎｇ１阻害活性を有する４つの完全ヒトＩｇＧ抗体（Ａｂ５３６、Ｈ４Ｌ４、Ｈ６Ｌ７、およびＨ４Ｌ１１）を選択した。４つの抗体はすべて、マウス、ラビット、およびカニクイザルのＡｎｇ１およびＡｎｇ２と交差反応して、アンジポエチンオルソログにわたって同様の力価を呈することが分かった（表７および８）。
【０３１４】
【表７】
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【０３１５】
【表８】
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【０３１６】
実施例４
Ｃｏｌｏ２０５腫瘍異種移植片におけるアンジポエチン抗体の活性
Ｃｏｌｏ２０５というヒト結腸直腸癌異種移植モデル中で、３つの抗体（Ｈ６Ｌ７、Ｈ４Ｌ４、およびＨ４Ｌ１１）を評価した。各実験グループにおいて、マウスの右脇腹に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中の２×１０６細胞を皮下注射した。平均腫瘍体積が３００ｍｍ３の１０匹を各実験グループにランダムに割り当てた。移植後１７日目から、これらの動物に１週間に２回、アンジオポエチン標的抗体またはアイソタイプコントロール抗体を３００μｇ腹腔内注射した。ポジティブコントロールとして、このモデルにおける最適な生物学的用量（ＯＢＤ）である１４μｇのＡＭＧ３８６（１週間に２回）（ＳＣ）も含めると共に、抗体５３６ＬＣ１も３００μｇで１週間に２回含めた。体重と腫瘍の大きさを１週間に２回測定した。
【０３１７】
図１に示されているように、アイソトープコントロール抗体による処置と比べて、３つのすべての抗体は腫瘍増殖を有意に阻害した（ｐ＜０．０００１）。Ｈ６Ｌ７およびＨ４Ｌ４で処置したケースでは、５３６ＬＣ１の場合よりも、腫瘍増殖の阻害が有意に大きかった。データは平均値±標準誤差を表している。実験の最後に腫瘍を回収し、亜鉛−ホルマリンに固定し、パラフィン包埋した。腫瘍の組織切片をヘマトキシリンで染色した。続いて、ＲＧＢの閾値化および自動ピクセル計数を用いて、腫瘍横断面全体の１倍のデジタル画像から、生着腫瘍の割合を推計した。生着率に末期腫瘍の重量を乗ずることによって、生着腫瘍組織量を算出した。データは平均値±標準誤差を表している（ｎ＝１０）。図２には、抗体Ｈ６Ｌ７、Ｈ４Ｌ４、およびＨ４Ｌ１１も、コントロールに比べて、腫瘍組織量を有意に減少させたことが示されており（ｐ＜０．０００１）、体積ベースの腫瘍測定では、これらの抗体の抗腫瘍作用が過小評価されたことが示唆されている。
【０３１８】
図１および２に示されている実験のマウスから採取した腫瘍および正常組織に対して組織病理検査を行った。異種移植片を有するヌードマウスをアンギポエチン阻害剤（ＡＭＧ３８６、５３６ＬＣ１、Ｈ４Ｌ４、Ｈ４Ｌ１１、またはＨ６Ｌ７）で処置したところ、非標的組織においては有害な解剖学的作用は誘発されなかった。
【０３１９】
実施例５
抗Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２抗体が内皮細胞の増殖に及ぼす作用
平行実験において、約４００ｍｍ３の腫瘍を有する動物を５３６ＬＣ１（ＬＣ１とも呼ばれる）、Ｈ４Ｌ１１、Ｈ４Ｌ４、Ｈ６Ｌ７、ＡＭＧ３８６、またはコントロールのＩｇＧ２で７２時間処置した。殺処分の７時間前に、３ｍｇ／ｍＬのＢｒｄＵを含有する浸透圧ミニポンプを動物に埋め込んだ。殺処分したら、Ｃｏｌｏ２０５腫瘍担持マウスから内皮細胞を単離し、フローサイトメトリーによって解析して、増殖を評価した。分離した細胞を抗マウスＣＤ４５−ＦＩＴＣおよびＣＤ３１−ＰＥ抗体で染色してから、抗ＢｒｄＵ−ａｌｅｘａ６４７抗体で固定および染色した。データは平均値±標準誤差を表している（ｎ＝５）。図３に示されているように、いずれの抗体で処置した場合にも、ＢｒｄＵ陽性細胞の割合が有意に低下した（ＩｇＧコントロールと比較した場合のＰ値は０．００２未満であった）。これらのデータは、インビボでアンジオポエチン標的抗体が腫瘍内皮細胞の増殖を阻害する抗血管新生療法のメカニズムと整合している。
【０３２０】
実施例６
Ｃｏｌｏ２０５腫瘍異種移植片におけるＨ４Ｌ４の用量滴定
Ｈ４Ｌ４媒介性の腫瘍増殖抑制作用の用量依存性を探るさらに詳しい解析を行うために、抗体Ｈ４Ｌ４を選択した。１４日目から、動物にＨ４Ｌ４を１週間に２回、３μｇ〜３００μｇの範囲の用量で腹腔内注射した。ポジティブコントロールとして、最適な生物学的用量である１４μｇのＡＭＧ３８６（ＳＣ）（１週間に２回）も含めた。図４に示されているように、いずれの用量のＨ４Ｌ４も、腫瘍増殖および腫瘍組織量を有意に抑制し（ｐ＜０．０００１）、生着腫瘍組織量解析ではＯＢＤが約３０μｇであった（図５）。
【０３２１】
実施例７
インビボでＨ４Ｌ４がＣｏｌｏ２０５腫瘍内皮細胞の増殖に及ぼす作用
平行実験において、約４５０ｍｍ３の腫瘍を有するＣｏｌｏ２０５腫瘍担持マウスを、Ｈ４Ｌ４、ＡＭＧ３８６、またはコントロールのＩｇＧ２で７２時間、単回投与することによって処置してから、図３の場合のように解析した。図６に示されているように、Ｈ４Ｌ４による処置によって、用量に依存する形で、内皮細胞の増殖が有意に抑制され、ＯＢＤは３０μｇであった。
【０３２２】
実施例８
マウス、ラット、およびカニクイザルにおけるＨ４Ｌ４、Ｈ６Ｌ７、Ｈ４Ｌ１１、および５３６Ｌ１１の薬物動態解析
Ｈ４Ｌ４、Ｈ６Ｌ７、Ｈ４Ｌ１１、および５３６ＬＣ１の薬物動態（ＰＫ）は、単回静脈内（ＩＶ）または腹腔内投与後のＣＤ−１マウスで特徴付けてきた。また、Ｈ４Ｌ４およびＨ６Ｌ７のＰＫは、単回ＩＶ投与後のスプラーグドーリーラットおよびカニクイザルで特徴付けてきた。
【０３２３】
マウスに単回ＩＶまたはＩＰ投与後、Ｈ４Ｌ４の暴露量は、おおむね用量に比例して、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で増大したようであった（表４）。消失半減期（ｔ１／２，ｚ）の全体平均は２０７時間、クリアランス（ＣＬ）は０．４３ｍＬ／ｈｒ／ｋｇ、定常状態分布容積（Ｖｓｓ）は１２８ｍＬ／ｋｇであった。ＩＰ投与後のバイオアベイラビリティ（％Ｆ）は、すべての用量グループにおいて９０％超であった。これに対し、Ｈ６Ｌ７、Ｈ４Ｌ１１、および５３６ＬＣ１は、マウスにおいて非線形のＰＫを示し、暴露量は、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇにおいて、用量に比例した形よりも大きく増大した。ラットおよびサルにおけるＨ６Ｌ７の暴露量も、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇを単回ＩＶ投与後、用量に比例した形よりも大きく増大した。
【０３２４】
Ｈ４Ｌ４は、マウスにおける線形のＰＫプロファイルとは対照的に、ラットおよびサルでは非線形のＰＫを示した。ラットにおける平均滞留時間（ＭＲＴ）は５７〜２１７時間、ＣＬは０．３〜１．４ｍＬ／ｈｒ／ｋｇ、Ｖｓｓは５７〜６８ｍＬ／ｋｇの範囲であった。サルにおいては、ＭＲＴは４０〜１６３時間の範囲、ＣＬは０．４〜１．９ｍＬ／ｈｒ／ｋｇの範囲、Ｖｓｓは４９〜７５ｍＬ／ｋｇの範囲であった。
【０３２５】
Ｈ４Ｌ４のＰＫも、Ｃｏｌｏ２０５腫瘍異種移植片を有するヌードマウスで、薬理学的な実験にて、マウス１匹当たり３、１０、３０、１００、または３００μｇの用量で、４週間に２回ＩＰ投与して評価した。血清トラフ濃度によって評価したところ、血清Ｈ４Ｌ４の暴露量は、おおむね用量に比例して増加した。ヌードマウスにおけるＨ４Ｌ４のＰＫは、ＣＤ−１マウスで観察されたものと同様であったと共に、ＰＫは、時間の経過と共に変化はしないようであった。
【０３２６】
【表９】
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【０３２７】
実施例９
アンジオポエチン−１の中和は、血管新生と腫瘍増殖の状況依存的抑制を媒介する
アンジオポエチン−２（Ａｎｇ２）が、生後の血管新生の重要なメディエーターである一方で、この環境におけるアンジオポエチン−１（Ａｎｇ１）の役割は、Ａｎｇ２よりも不明瞭である。Ａｎｇ１の生後における機能を調べるために、我々は、Ａｎｇ１とその受容体Ｔｉｅ２との相互作用を阻害する強力かつ選択的なペプチボディ（ペプチド−Ｆｃ融合タンパク）を開発した。選択的Ａｎｇ１拮抗作用は、血管新生に関係する疾患モデル（癌および糖尿病網膜症）において、独立した作用を有さないが、正常幼若ラットにおいて卵巣萎縮を誘導できると共に、ホルモン誘導性排卵モデルにおいて卵胞血管新生を阻害できることを我々は示す。驚くべきことに、Ａｎｇ１阻害剤の活性は、いくつかの疾患モデルにおいては、Ａｎｇ２阻害剤と組み合わせると現れるようである。Ａｎｇ１とＡｎｇ２の二重阻害によって、協働的に、卵胞の血管新生と腫瘍異種移植片の増殖が抑制されるが、Ａｎｇ１の阻害によっては、腫瘍内皮細胞の増殖、角膜血管新生、および酵素誘導性網膜血管新生を抑制する際に、Ａｎｇ２阻害活性を向上させることはできない。いかなる場合も、Ａｎｇ１の阻害によって、１）Ａｎｇ２阻害またはＡｎｇ１／Ａｎｇ２二重阻害の活性に、より優れた活性が付与されたり、または、２）Ａｎｇ２阻害作用が拮抗されたりすることは明らかにならなかった。これらの結果は、Ａｎｇ１が、生後の血管新生、および血管新生に関係する病状を促す際、状況依存的役割を果たすことを示唆している。
【０３２８】
Ａｎｇ１は、発生時の血管新生において重要な役割を果たすが、生後の新血管新生における機能はあまり明らかではない。Ａｎｇ１は、さまざまな生後環境において、血管新生促進作用および血管新生抑制作用の両方を媒介することが示されている。内因性Ａｎｇ１を阻害することによってＡｎｇ１の機能を調べるために、我々はＡｎｇ１中和ペプチボディを開発し、生後血管新生の症状発現前モデルで、このぺプチボディを単独で、または、Ａｎｇ２阻害剤と組み合わせて試験した。
【０３２９】
我々は、血管新生におけるＡｎｇ１の機能的役割を調べる目的で、Ａｎｇ１中和ペプチボディを生成した。ファージディスプレイペプチドライブラリーをパニングして、Ａｎｇ１を結合させるが、Ａｎｇ２は結合させないペプチドを同定した。ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分への融合体として、大腸菌で当該ペプチドを発現させることによって、得られたクローンをペプチドボディに変換した。続いて、酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）、および均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイによって、Ｔｉｅ２とアンジオポエチンとの相互作用を中和する能力に関してペプチボディをスクリーニングした。これらのペプチボディの１つの親和性を成熟させて、Ａｎｇ１を拮抗する能力を向上させ、得られたペプチボディｍＬ４３を本項の実験用に選択した。ｍＬ４−３は、いくつかのＡｎｇ１オルソログに対して同様の力価を示したと共に、Ａｎｇ２の４０，０００倍超の選択性を示した（表１０および１１）。また、表１０には、ＡＭＧ３８６［２×Ｃｏｎ４（Ｃ）としても知られる］、およびＬ１−７（Ｎ）という２つの上記のペプチボディも示されている。Ｌ１−７（Ｎ）は、非常に強力かつ選択的なＡｎｇ２阻害剤であり、ＡＭＧ３８６は、Ａｎｇ１およびＡｎｇ２の二重阻害剤である。齧歯類におけるｍＬ４−３の薬物動態プロファイルは、１日〜１週間に１回の皮下投与用として許容可能なものであった（表３）。
【０３３０】
ｍＬ４−３は、インビボでのＡｎｇ１の機能を調べるための試薬として用いることができる。ｍＬ４−３がインビボでＡｎｇ１を選択的に隔離できるか否かを評価するために、ｍＬ４−３、Ｌ１−７（Ｎ）、およびＦｃをマウスに皮下投与してから、組み換えＡｎｇ１を静脈内投与した。Ａｎｇ１が、マウス肺内皮細胞においてＴｉｅ２のリン酸化を誘導する作用は、ｍＬ４−３によって抑制できたが、Ｌ１−７（Ｎ）またはＦｃでは抑制できなかった（約５倍）（図７）。
【０３３１】
次に、我々は、Ａｎｇ１が生理学的に適切な役割を果たすことが知られている環境において、ｍＬ４−３が内因性Ａｎｇ１を中和できるか割り出したいと考えた。発生遺伝子ノックアウトの研究によって、Ａｎｇ１の欠失によって、胚において、心臓の大きさと心内膜ひだが減ることが示されている。薬理学的にこの表現型を模倣する目的で、ｍＬ４−３を妊娠初期および中期の妊娠マウスに投与した。Ａｎｇ１ヌルマウス胚において死亡が観察された胚齢１２．５日目に胚を回収した。マウス胚溶解産物の薬物動態評価によって、組織のｍＬ４−３の平均トラフレベルが３．０μｇ／ｇであることが示され、ｍＬ４−３が胎盤を横断できることが確認された。組織学的解析によって、Ａｎｇ１ヌルマウス胚で観察されたのと同様に、心臓の大きさおよび小柱形成が低下したが、Ａｎｇ１ヌルマウス胚の場合ほどの劇的な低下ではなかったことが明らかになった（図８）。ｍＬ４−３で処置した胚の表現型があまり顕著でないのは、胚へのｍＬ４−３への暴露が次善的であったこと、および、Ａｎｇ１の隔離が不完全であったのが原因である場合がある。とはいえ、ｍＬ４−３は明らかに、Ａｎｇ１遺伝子ノックアウトマウスの表現型を表現模写する胚心臓障害を誘導し、インビボでのＡｎｇ１の機能を調べる試薬としてのｍＬ４−３の有用性を裏づけている。
【０３３２】
Ａｎｇ１の拮抗作用は、腫瘍増殖を抑制する際のＡｎｇの拮抗作用を増大させる。既出の報告において、我々は、全身投与したＬ１−７（Ｎ）およびＡＧＭ３８６が、ヌードマウスに移植したＣｏｌｏ２０５腫瘍異種移植片の増殖を阻害できることを示した。この実験では、ＡＭＧ３８６の抗腫瘍作用は、Ｌ１−７（Ｎ）よりもやや優れていた（Ｐ＝０．００６）。Ａｎｇ１／Ａｎｇ２の二重阻害では、Ａｎｇ２阻害単独の場合よりも、腫瘍増殖の抑制が優れていることを確認するために、同様の実験を行った。ただし、今回は、ｍＬ４−３、またはｍＬ４−３とＬ１−７（Ｎ）との組み合わせで処置したグループも試験した（図９）。ＡＭＧ３８６で処置したグループと、ｍＬ４−３／Ｌ１−７（Ｎ）の組み合わせで処置したグループは、同程度の抗腫瘍効果を示し、さらに、どちらのグループも、Ｌ１−７（Ｎ）またはｍＬ４−３単独によって媒介された場合よりも優れた効果を示した。実際、ｍＬ４−３には、単剤としては腫瘍増殖に対する認識できる作用はなく、Ａｎｇ２拮抗作用をＡｎｇ１拮抗作用と組み合わせると、Ａｎｇ１阻害の抗腫瘍作用が現れる場合のあることが示唆された。これらの実験の追加的な追試実験によって、ＡＭＧ３８６、およびｍＬ４−３／Ｌ１−７（Ｎ）の組み合わせが、Ｌ１−７（Ｎ）単独よりも、優れた腫瘍増殖抑制作用を媒介したことが確認された（データは不示）。ただし、ごくわずかなケースで、これらの差異が統計的有意性に達しなかったが、これはおそらく、選択的Ａｎｇ２阻害を上回るＡｎｇ１／Ａｎｇ２二重阻害によって付与された付加的利点の微妙な性質が反映されたのだと考えられる。選択的Ａｎｇ１阻害には、試験した実験のいずれにおいても、単独による抗腫瘍作用はなかった（図９、データは不示）。
【０３３３】
Ａｎｇ２拮抗作用は、腫瘍内皮細胞の増殖、角膜血管新生、および網膜血管新生を阻害するが、Ａｎｇ１拮抗作用は阻害しない。我々は、Ａｎｇ１／Ａｎｇ２二重阻害は、インビボでＣｏｌｏ２０５腫瘍内皮細胞の増殖を抑制できることを既に示した。この作用がＡｎｇ１の阻害、Ａｎｇ２の阻害、またはＡｎｇ１の阻害とＡｎｇ２の阻害との組み合わせによって付与されたのか調べるために、Ｃｏｌｏ２０５腫瘍担持マウスをｍＬ４−３、Ｌ１−７（Ｎ）、ｍＬ４−３／Ｌ１−７（Ｎ）、またはＡＭＧ３８６で処置した。上の項に記載した腫瘍体積を読み取った場合のように、ｍＬ４−３には、単剤としては腫瘍内皮細胞の増殖に対する作用がなかったが、Ｌ１−７（Ｎ）には阻害性があった（図１０Ａ）。しかし不思議なことに、Ａｎｇ１／Ａｎｇ２二重阻害のケースでは、Ａｎｇ２阻害単独の場合よりも、内皮細胞の増殖に対する作用が大きいわけではなく（図１０Ａ）、繰り返し再現された観察結果（データは不示）は、Ａｎｇ１／Ａｎｇ２複合阻害のＣｏｌｏ２０５腫瘍の増殖に対する明らかに協働的な作用とは対照をなしている。この相違性によって、内皮細胞の増殖の抑制は、アンジオポエチン拮抗作用によって媒介される腫瘍増殖阻害の基礎をなす１つの要素に過ぎないことが示唆されている。
【０３３４】
次に、これらの薬剤を眼球血管新生の２つのモデルで試験した。１つのモデルは角膜に関するもので、もう一方は網膜に関するものであった。角膜は通常は無血管であるが、病的血管新生が、角膜炎および角膜移植片拒絶反応のような状態に伴い角膜内で発生することがある。角膜血管新生のＶＥＧＦおよび塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）誘導性モデルを用いて、新血管形成におけるＡｎｇ１およびＡｎｇ２拮抗作用の役割を試験した。内皮細胞の増殖によって観察されたように、角膜血管新生は、Ａｎｇ２依存性と見られるが、Ａｎｇ１依存性ではないようであった（図１０Ｂおよび１０Ｃ）。周囲酵素圧の変化によって新血管新生が誘導される血管新生のＴｉｅ２依存性網膜モデルにおけるこれらのアンジオポエチン拮抗ペプチボディの評価結果から、同じ結論を導くことができた（図１０Ｄ）。したがって、３つの病状発現前環境（内皮細胞の増殖、角膜血管新生、および網膜血管新生）では、Ａｎｇ２の阻害によって、新血管新生が著しく抑制されたが、Ａｎｇ１の阻害では、単独でも、またはＡｎｇ２との組み合わせにおいても、作用は存在しなかった。
【０３３５】
Ａｎｇ１またはＡｎｇ２の選択的阻害によって、卵巣萎縮が誘導されるが、骨端板の肥厚は誘導されない。正常動物におけるアンジオポエチン阻害の作用を評価するために、ラットをｍＬ４−３、Ｌ１−７（Ｎ）、またはＡＭＧ３８６で１カ月間、全身処置した。ＡＭＧ３８６は、ＶＥＧＦアンタゴニストのように、骨端板の肥厚と卵巣萎縮を誘導することが観察されており、作用は、抗血管新生療法のメカニズムベースの結果とみなされている。本発明の実験では、ＡＭＧ３８６は、すべての処置動物で骨端板の肥厚を誘発させたが、注目すべきことに、Ｌ１−７（Ｎ）とｍＬ４−３は、いずれのラットにおいても骨端の形態を変化させなかった（表１３）。したがって、骨端板の肥厚の誘導には、Ａｎｇ１およびＡｎｇ２双方の阻害が必要であると思われる。非常に対照的に、上記の３つのペプチボディはすべて、同様の発症率で卵巣萎縮を引き起こした。これは、Ａｎｇ１またはＡｎｇ２の選択的阻害は、卵巣萎縮を誘導するのに十分であることを示している。
【０３３６】
Ａｎｇ１およびＡｎｇ２阻害剤は協働して、卵胞血管新生を抑制する。アンジオポエチンの阻害が卵巣に及ぼす作用に関する理解を深めるために、我々は、卵胞血管新生のホルモン誘導性モデルのうち、過去に排卵したことがないマウスにおける新血管新生の制御評価を可能にするモデルを用いた。このモデルでは、妊馬血清（ＰＭＳ）とヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＦ）を用いて、複数の卵胞において急激な排卵同期化を誘導した（図１１）。マウスをＦｃコントロール、ｍＬ４−３、Ｌ１−７（Ｎ）、またはｍＬ４−３／Ｌ１−７（Ｎ）の組み合わせで全身処置し、これらの薬剤が、グラーフ卵胞を形質転換させる際の新血管形成に及ぼす作用を割り出した。この実験とまったく同じように設計された２つの追試実験を異なる日に行ったところ、注目すべきことに、双方において、血管面積の阻害率に関して、ほとんど同じ活性プロファイルが生じた（（追試１、追試２）：Ｌ１−７（Ｎ）（８％、１１％）、ｍＬ４−３（１５％、１４％）、ｍＬ４−３／Ｌ１−７（Ｎ）（２４％、２６％））。すべての単剤および組み合わせのペプチボディグループは、実験１のＬ１−７（Ｎ）グループを除いて、Ｆｃコントロールと比べて、血管新生の統計的に有意な阻害を媒介した（Ｐ＜０．０５）（図１１）。したがって、卵巣血管新生の阻害、および卵巣萎縮の誘導は双方とも、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、またはこの両方を阻害することによって誘発させることができた。この結果は、観察された卵巣萎縮は、新血管が発生しなかったことが原因であるという考えと整合している。
【０３３７】
我々は、Ａｎｇ１の阻害が、症状発現前疾患モデルおよび正常動物において、血管新生の抑制で状況依存的役割を果たすことを立証する。子宮内において、薬理学的なＡｎｇ１阻害によって、部分的に、Ａｎｇ１の遺伝子除去の表現型が模写された。これは、発生的血管新生におけるＡｎｇ１の重要な役割と整合している。生後においては、選択的Ａｎｇ１拮抗作用が、卵巣血管新生を阻害し、卵巣萎縮を誘導し、これらの作用も、Ａｎｇ２のみ、またはＡｎｇ２とＡｎｇ２を併せて阻害することによって実現することができた。しかし、生後の疾患モデルでは、Ａｎｇ１の阻害には、単独での作用はほとんどなかったが、その生物活性は、Ａｎｇ２の抑制と組み合わせたとき、いくつかの環境において現れるようであった。これらの環境においてＡｎｇ１に対する異なる依存性の基礎をなすメカニズムは、以前として不明である。
【０３３８】
卵巣は、生殖周期におけるその役割のおかげで、成体において正常な血管新生を経る数少ない器官の１つである。ホルモンの誘導によって排卵しているラットのＡｎｇ１およびＡｎｇ２の卵巣での発現パターンに基づき、Ａｎｇ２が、血管浸潤において初期的役割を果たし、Ａｎｇ１が、新たに形成された血管を成熟させる後期的役割を果たすことが提案されている。この仮説下では、Ａｎｇ２およびＡｎｇ１は、反対の機能を果たす。Ａｎｇ２が最初に、Ａｎｇ１をＴｉｅ２から引き離し、血管の不安定化と血管新生を引き起こす。この形成性状態は、後に、Ａｎｇ１がＡｎｇ２を受容体から追いやって、血管の静止と安定性を再確立すると、無効になる。このモデルと矛盾して、最新の研究によるデータでは、Ａｎｇ１およびＡｎｇ２の双方が、卵巣において血管新生を促進する役割を果たすことが示唆されている。
【０３３９】
Ｃｏｌｏ２０５腫瘍異種移植片モデルでは、Ａｎｇ１およびＡｎｇ２の拮抗作用の方が、Ａｎｇ１またはＡｎｇ２を個別に阻害することによって得られた場合よりも、高い腫瘍抑制作用を媒介した。これは、このモデルが、双方のアンジオポエチンに依存していることを示している。しかし、同じモデルでは、Ａｎｇ２の阻害のみによって、腫瘍内皮細胞の増殖の抑制的調節を行うことができた。これは、Ａｎｇ１がこの機能に関与していないことを示唆している。Ａｎｇ１に関するこれらの２つのエンドポイントの依存性が異なる理由は何だろうか。１つの可能性は、Ａｎｇ１の阻害が、腫瘍細胞に直接作用するということである。しかし、Ａｎｇ１およびＡｎｇ２の二重阻害剤であるＡＭＧ３８６が、培養Ｃｏｌｏ２０５腫瘍細胞のインビボでの増殖に作用を及ぼさないことを考えると、この可能性は低そうである。第２の可能性は、Ａｎｇ１拮抗作用が、内皮細胞の増殖の阻害によってではなく、内皮細胞の遊走または侵入のような機能に影響を及ぼすことができるメカニズムによって付与される血管新生抑制的な役割を果たすということである。Ａｎｇ１およびＡｎｇ２が、Ｔｉｅ２を通じて質的もしくは量的に異なるシグナルを媒介する場合、または、Ａｎｇ２に応答しない追加的な受容体を通じて、Ａｎｇ１がシグナル伝達する場合には、この説明が適用可能である場合がある。第３の可能性は、Ａｎｇ１が、Ｔｉｅ２−発現単球（ＴＥＭ）などの非内皮細胞上のＴｉｅ２を通じて、シグナル伝達することである。ＴＥＭは腫瘍に補充され、その腫瘍においてＴＥＭは新血管の周りに群がる。担腫瘍マウスでのＴＥＭの選択的除去によって、腫瘍血管新生が抑制されると共に、腫瘍増殖が阻害され、ＴＥＭは、新血管を刺激するパラクリンシグナルを供給することによって、腫瘍血管新生を促すと想定されている。おそらく、Ａｎｇ１はＴＥＭを刺激して、アンジオポエチン以外の血管新生促進サイトカインを放出させる。このような状況では、Ａｎｇ１の阻害は、Ａｎｇ２抑制の直接的な血管新生抑制作用を補完できる間接的な新血管形成抑制作用を有することができる。
【０３４０】
Ａｎｇ１阻害の繊細かつ状況依存的な作用とは対照的に、Ａｎｇ２の阻害は、Ａｎｇ１とＡｎｇ２の複合拮抗作用によって付与される作用と同等か、またはほぼ同等の作用を媒介することが多かった。これは、Ａｎｇ２が、生後の血管新生に関与する優性アンジオポエチンであることを示唆している。Ａｎｇ１は、出生前の血管新生に関与する優性アンジオポエチンと見られ、これは、出生前後にこれらの２つの因子に対する依存性がシフトすることを示唆している。我々の阻害剤は、Ａｎｇ４を拮抗しないが、その肺に限られた発現パターンを考えると、この因子の機能的関連性は不明である。
【０３４１】
Ａｎｇ１およびＡｎｇ２は、さまざまなインビトロおよびインビボ系において、同様の機能的役割と反対の機能的役割の両方を果たすことが分かっている。この点について、多くの文献で一貫した結論が出せていない１つの理由は、この問題を検討する際の条件が異なることである場合がある。このような相違としては、１）インビトロ系に対するインビボ系と、２）出生前の血管新生に対する生後の血管新生と、３）さまざまな血管床と、４）病的な血管新生に対する正常な血管新生と、５）機能獲得型の実験設計に対する機能喪失型の実験設計との評価が挙げられる。モデル系に外生要因を加えるのは、機能を解明するための手段としては、外生因子を除去するものよりも生理学的な適切性が低い手段である場合があるので、この最終的な相違は特に重要である場合がある。おそらく、この点に関して最も情報が参考になる公の実験は、齧歯類の生殖細胞系においてＡｎｇ１とＡｎｇ２を遺伝的に欠失させた実験である。これらの研究は、Ａｎｇ１およびＡｎｇ２の発生段階での役割への有意義な見識を提供している。しかしながら、条件付きノックアウト系の可用性なしには、Ａｎｇ１およびＡｎｇ２の生後におけるインビボ機能を遺伝的に調べるのは、これよりも難しい。（いくつかの株のバックグラウンドで構成性Ａｎｇ２ノックアウトが死亡したように）子宮内で死亡した構成性Ａｎｇ１ノックアウトマウス、ならびに、生き残ったＡｎｇ２ノックアウトマウスの生後表現型は、発生段階での遺伝子除去の残留作用による影響を受ける場合がある。インビボでのＡｎｇ１およびＡｎｇ２の生後の役割を調べるための薬理学的なＡｎｇ１およびＡｎｇ２阻害剤を用いることによって、我々はこれらの問題を回避した。最新の研究の結果によって、Ａｎｇ１およびＡｎｇ２が、生後の系においては機能的に対抗し合うことがなく、いくつかのケースでは、協働的に作用するようであることが示唆されている。
【０３４２】
病的な血管新生は、癌、糖尿病網膜症、黄斑変性、関節リウマチ、変形性関節症、および乾癬を含む多くの疾患において、アンジオポエチンレベルの変化と関係している。これらの治療指標における、アンジオポエチンを標的とする介入は、臨床的な有益性を提供することがある。本明細書に示されているデータは、状況によっては、Ａｎｇ１およびＡｎｇ２の複合阻害によって、Ａｎｇ２のみを標的にすることで媒介される治療効力よりも優れた治療効力が得られる場合があることを示唆している。
【０３４３】
方法
Ａｎｇ１結合ペプチドのファージディスプレイ選択  ＴＮ８−ＩＸ（５×１０９個の独立した形質転換体）、ＴＮ１２−Ｉ（１．４×１０９個の独立した形質転換体）、およびＬｉｎｅａｒ（２．３×１０９個の独立した形質転換体）（マサチューセッツ州ケンブリッジのダイアックス社）という３つの線状ファージライブラリーを用いて、Ａｎｇ−１結合ファージの選択を行った。２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした空のストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓ（カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン社）、または、ビオチン化Ａｎｇ２を充填したビーズ（ミネソタ州ミネアポリスのＲ＆Ｄシステムズ社）上で陰性選択後、ビオチン化Ａｎｇ１を充填したビーズ（Ｒ＆Ｄシステムズ社）で残存ファージを温置した。丁寧に洗浄後、１００ｍＭのトリエチルアミン溶液（ミズーリ州セントルイスのシグマアルドリッチ社）を用いて、各選択ラウンドから採ったファージを非特異的な形で溶出した。溶出したファージを大腸菌株ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’中で増幅させ、沈殿によって精製してから、次の選択ラウンドに用いた。
【０３４４】
３回の選択を繰り返した後、個々のファージクローンを単離し、ファージＥＬＩＳＡとＤＮＡ塩基配列決定法によって解析した。簡潔に言うと、９６ウェルのＭａｘｉｓｏｒｐプレート（ヌンクブランド、ニューヨーク州ロチェスターのサーモフィッシャーサイエンティフィック）の上にＡｎｇ１タンパクをコーティングし、４％の粉乳を含有するＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）でブロックした。これらのウェル内でファージの上清を温置し、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｍ１３抗体（ニュージャージー州ピスキャタウェイのアマシャムファルマシアバイオテク）で結合ファージを検出した。Ａｎｇ２またはストレプトアビジンに対する交差反応性をチェックするために、同様の方法でコントロールプレートを用意した。ペプチボディ形態で発現させるぺプチド配列を選択する基準として、ＥＬＩＳＡの結果とＤＮＡ塩基配列決定データを用いた。ペプチボディをＨＴＲＦアッセイで評価し、親和性成熟用に、数個を選んだ。
【０３４５】
ヌクレオチドを添加したファージディスプレイライブラリーを作製およびパニングすることによって、ペプチドの親和性成熟を行った。１×１０９個超の独立した形質転換体を含むライブラリーを得た。一次ライブラリーのパニングで用いたものと同様の手順によって、これらの絞り込まれたライブラリーをパニングした。
【０３４６】
ペプチボディの発現と精製  Ｏｌｉｎｅｒ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．２００４．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ６：５０７−５１６に記載されているように、ペプチボディｍＬ４−３を発現および精製した。ｍＬ４−３のアミノ酸配列は以下のとおりであり、太字イタリック体のＦｃは、Ｏｌｉｎｅｒ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．２００４．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ６：５０７−５１６ですでに説明されているようなヒトＩｇＧ１のＦｃ配列を表している。
【０３４７】
【化１】
0005739163.tif 000013
【０３４８】
ペプチボディｍＬ４−３のＦｃ部分のアミノ酸配列は以下のとおりである（アミノ末端からカルボキシル末端方向）。
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４８）
【０３４９】
アンジオポエチン：Ｔｉｅ２中和ＨＴＲＦアッセイ  ユウロピウム標識ストレプトアビジン（ＬＡＮＣＥ試薬、マサチューセッツ州ボストンのパーキンエルマー社）と、ビオチン化ヒトＡｎｇ１（Ｒ＆Ｄシステムズ社）またはＡｎｇ２をＨＴＲＦ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、０．１％のＢＳＡ）中で混合し、室温にて暗黒下で３０分間、振盪機上で温置した。等体積の上記混合物と段階希釈ペプチドまたはＦｃを混合し、１時間、室温で温置した。等体積のアロフィコシアニンコンジュゲートＴｉｅ２−Ｆｃ（Ｔｉｅ２−ＡＰＣ）（カリフォルニア州サンリアンドロのプロザイム）と上記の混合物を混合して、２時間、室温で温置した。このアッセイにおける試薬の最終濃度は、ユウロピウム−ストレプトアビジン４ｎＭ、ビオチン化Ａｎｇ１またはＡｎｇ２、２ｎＭ、および、Ｔｉｅ２−ＡＰＣ、５ｎＭであった。ペプチボディを１０，０００ｎＭから０．５ｎＭ、または１００ｎＭから０．００５ｎＭに段階希釈し、完全な滴定曲線を得た。ＡＰＣとユウロピウムとの間のエネルギー移動の減少によって、アンジオポエチンとＴｉｅ２の相互作用の中和度を測定し、Ｒｕｂｙｓｔａｒというプレートリーダー（ドイツ、オッフェンベルクのＢＭＧラブテクノロジーズ社）を用いて定量化した。最高値の阻害コントロール（アッセイ混合物中にアンジオポエチンを含まないもの）と、最小値の阻害コントロール（アッセイ混合物中にペプチボディを含まないもの）に関連させて、各ペプチボディの阻害率を算出することによって、アンジポエチン／Ｔｉｅ２の中和の力価を割り出した。ＸＬｆｉｔ４（ｆｉｔ＝Ａ＋（（Ｂ−Ａ）／（１＋（（Ｃ／Ｘ）＾Ｄ）））（英国ギルフォードのＩＤＢＳ）を用いて阻害率をプロットすることによって、ＩＣ５０値を算出した。
【０３５０】
アンジオポエチン：Ｔｉｅ２中和ＥＬＩＳＡ  ３７℃にて１時間、２９３Ｔ細胞馴化培地（ＤＭＥＭ／５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中の組み換えアンジオポエチンのパネルで、９６ウェルマイクロタイタープレートをコーティングした。この馴化培地は、１ｎＭのｈＴｉｅ２−Ｆｃ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈＴｉｅ２−Ｆｃ、カタログ番号３１３−ＴＩ、Ｒ＆Ｄシステムズ社）に対する実現可能な最大限の結合の７０％をもたらすアンジオポエチン濃度で用いた。プレートをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄してから、ＰＢＳ／５％ＢＳＡで２時間、室温にてブロックした。プレートを洗浄せずに、ブロッキング溶液を除去した。１ｎＭ  Ｔｉｅ２−Ｆｃ／１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で段階希釈したｍＬ４−３またはＦｃを、アンジオポエチンでコーティングしたプレートに加え、室温にてオーバーナイトで温置してから、ＰＢＳ／１％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄した。各ウェルにマウス由来抗Ｔｉｅ２抗体（カタログ番号５５７０３９、カリフォルニア州サンノゼのＢＤファーミンジェン社）を最終濃度１μｇ／ｍｌで加えて、１時間、室温で温置した。続いて、プレートをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウス抗体、カタログ番号３１４３２、イリノイ州ロックフォードのピアース）を、１：１０，０００の希釈度（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中）で各ウェルに加え、そのプレートを１時間、室温で温置した。プレートをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄してから、ＴＭＢ基質（ＳｕｐｅｒＢｌｕｅ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ＴＭＢ、カタログ番号５３−００００２、メリーランド州ゲイザースバーグのＫＰＬ）を加え、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ、カリフォルニア州サニーベールのモレキュラーデバイス）で、６５０ｎＭにおける吸光度を測定した。ＸＬｆｉｔを用いて、Ｔｉｅ２の標準曲線（競合物質の不存在下における、段階希釈Ｔｉｅ２の結合活性）と比較することによって、アンジオポエチンとＴｉｅ２の中和の程度（ＩＣ５０）を割り出した。
【０３５１】
動物実験  すべての手順は、アムジェン・アニマルケア・アンド・ユース・コミッティ（Amgen  Animal  Care  and  Use  Committee）による承認を受けたものであり、国際実験動物管理公認協会の基準を満たしている。
【０３５２】
薬物動態評価  ３匹のＣＤ−１マウスに３．２ｍｇ／ｋｇのｍＬ４−３を１回皮下注射し、２匹のスプラーグドーリーラットに、１０ｍｇ／ｋｇのｍＬ４−３を１回皮下注射した。血清の薬物動態評価のために、血液サンプルをマウスからは最長で２７４時間、ラットからは３３６時間採取した。各動物種から採った血清サンプル中のｍＬ４−３濃度を酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。ポリスチレン製の９６ウェルプレートをヒトＡｎｇ１でコーティングしてから、ｍＬ４−３を含有する血清サンプルで温置した。未結合物質をすべて洗い落とした後、ウェルにホースラディッシュペルオキシダーゼ標識モノクローナルマウス抗ＩｇＧ１抗体を加えた。未結合モノクローナル抗体をすべて除去するための洗浄工程後、ＴＭＢ−ペルオキシダーゼ基質をウェルに加えた。同時解析した標準曲線と比較することによって、４５０〜６５０ｎＭで測定した吸光度単位を濃度に変換した。
【０３５３】
個々の血清濃度−時間データの非コンパートメント解析（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，ｖｅｒｓｉｏｎ３．３、カリフォルニア州マウンテンビューのファーサイト社）によって、薬物動態パラメーターを算出した。消失半減期（ｔ１／２）をｔ１／２＝Ｉｎ（２）／λｚとして算出した。式中のλｚは、消失対数線形減衰期の直線回帰によって推定した一次消失相の消失速度定数である。血清濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ０−ｌａｓｔ）を、０時点から最後の定量可能濃度（Ｃｌａｓｔ）の時点まで、線形／対数台形法によって推定した。ＡＵＣ０−ｉｎｆを、０時点から無限大まで、ＡＵＣ０−ｉｎｆ＝ＡＵＣ０−ｌａｓｔ＋Ｃｌａｓｔ／λｚとして推定した。ＡＵＣ０−ｉｎｆの値を１ｍｇ／ｋｇの用量に正規化した。
【０３５４】
ｍＬ４−３、Ｌ１−７、およびＡＭＧ３８６の薬物動態特性は異なっていたので、可能な場合、薬物動態解析における等モルの血清定常状態Ｃｍｉｎ濃度を得られるように、各薬剤の用量レベルおよびスケジュールを選択した。
【０３５５】
ｍＬ４−３の妊娠マウスへの投与  ６匹の１２９／ＳＶメスマウスからなる２つのグループをＣ５７ＢＬ／６オスマウスによって妊娠させた。妊娠Ｅ４．５日目、Ｅ７．５日目、およびＥ１１．５日目に、妊娠メスマウスに３００ｍｇ／ｋｇのＦｃコントロールまたはｍＬ４−３を皮下投与した。Ｅ１２．５日目に受胎産物（胚および胎盤）を除去し、肉眼的異常について評価し、ＩＨＣ−亜鉛溶液（ｍＬ４−３処置マウスはｎ＝１０、Ｆｃコントロール処置マウスはｎ＝１０）、またはブワン溶液（ｍＬ４−３処置マウスはｎ＝５、Ｆｃコントロール処置マウスはｎ＝６）中への浸漬によって固定した。パラフィン包理組織を５０μｍ間隔で、心臓を通るように（縦配向と横配向の両方の胚）、および胎盤の中央を通るように段階的に切断した。各区間から採った連続切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色するか、または、ポリクローナル抗ＣＤ３１（ラット抗マウスモノクローナルＭＥＣ１３．３、カリフォルニア州サンディエゴのＢＤバイオサイエンス・ファーミンジェン）を用いて、従来の間接的な免疫組織学的手順で染色するかして、特異的に血管を標識した。処置の内容を事前に知らされている状態で切片を評価することによって、変化をスコアリングする基準を構築した。続いて、段階的尺度（最低、軽度、中度、または重度）と盲検解析パラダイムを用いて、病変重篤度を速やかに等級付けした。ＪＭＰという統計ソフトウェアパッケージ（ｖ.５．１、ノースカロライナ州カリーのＳＡＳインスティチュート社）に含まれているカイ二乗検定を用いて、これらの順序病理データを解析した。ヒトＡｎｇ１を捕捉試薬として、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識モノクローナルマウス抗ＩｇＧ１抗体を検出試薬として用いたＥＬＩＳＡによって、Ｅ１２．５日目に各妊娠マウスから採った胚を解析した。
【０３５６】
Ｔｉｅ２リン酸化アッセイ  Ｈｏｄｏｕｓ，Ｂ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．２００７．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  ５０：６１１−６２６）に記載されているように、マウス肺におけるＡｎｇ１誘導性のＴｉｅ２のリン酸化に選択的アンジオポエチン阻害剤が及ぼす作用を実行させた。簡潔に言うと、ＣＤ−１ヌードマウス（マサチューセッツ州ウィルミントンのチャールス・リバー・ラボラトリーズ、）に１日に１回、２３日間、Ｆｃコントロール（２０ｍｇ／ｋｇ）、ｍＬ４−３（２０ｍｇ／ｋｇ）、またはＬ１−７（Ｎ）（２ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与した。続いて、マウス（１グループ当たりｎ＝３）に組み換えＡｎｇ１（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を１２μｇ、静脈内注射によって投与した。１５分後、マウス肺を回収し、免疫沈降−ウエスタンブロット解析によって、リン酸化Ｔｉｅ２のレベルを割り出した。ＳｔａｔＶｉｅｗ５．０．１というソフトウェア（ＳＡＳインスティチュート社）を用いて分散分析（ＡＮＯＶＡ）の後にフィッシャーのポストホックテストを行って、統計的解析を行った。結果は平均値±標準誤差（ＳＥ）として表されている。
【０３５７】
腫瘍異種移植片モデル  すべての実験で、生後８〜１０週のメスＣＤ１ヌードマウス（チャールス・リバー・ラボラトリーズ）を用いた。マウスに、２×１０６個のＣｏｌｏ２０５細胞（３分の１の体積のＭａｔｒｉｇｅｌ（カリフォルニア州サンノゼのＢＤバイオサイエンス）中）を皮下注射した。腫瘍が構築されたら、ペプチボディまたはＦｃコントロールを皮下注射した。ＡＭＧ３８６を１週間に２回投与し、他のペプチボディとＦｃコントロールを１日に１回と投与した。必要に応じて、Ｆｃコントロールタンパクを処置グループに加えて、この組み合わせグループに送達されるタンパクの総量を適合させた（５．２ｍｇ／ｋｇ）。腫瘍の測定値と体重を１週間に２回記録した。すべての腫瘍実験は盲検で行った。腫瘍体積を長さ×幅×高さ（ｍｍ３）で算出した。結果は平均値±ＳＥとして表されている。ＳｔａｔＶｉｅｗ５．０．１というソフトウェア（ＳＡＳインスティチュート社）を用いて反復測定分散分析の後にシェフェのポストホックテストを行って、統計的解析を行った。
【０３５８】
腫瘍内皮細胞増殖アッセイ  上記のように腫瘍内皮細胞の増殖をアッセイした（Ｏｌｉｎｅｒ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．２００４．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ６：５０７−５１６）。簡潔に言うと、Ｃｏｌｏ２０５腫瘍担持マウスをペプチボディで７２時間、全身処置し、安楽死の１６時間前に、３ｍｇ／ｍＬのＢｒｄＵを含有する浸透圧ポンプを埋め込んだ。腫瘍を回収し、解離し、固定し、染色して、腫瘍内皮細胞中へのＢｒｄＵの取り込みを割り出すことができるようにした。独立ｔ検定を用いて統計的解析を行った。
【０３５９】
角膜血管新生モデル  Ｃｏｘｏｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ４６：２６０４−２６１２，２００２に記載されているように、メスＣＤラット（１グループ当たりｎ＝８）で、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦ誘導性血管新生の実験を行った。角膜血管新生およびアジュバント関節炎のラットモデルでは、腫瘍壊死因子ではなく、インターロイキン−１の阻害によって、新血管新生を抑制する。施術の前日に、Ｆｃ（６０ｍｇ／ｋｇ）、Ｌ１−７（Ｎ）（５ｍｇ／ｋｇ）、ｍＬ４−３（６０ｍｇ／ｋｇ）、またはＬ１−７（Ｎ）とｍＬ４−３との組み合わせ（単剤のグループと同じ用量）での処置を開始し、３日目および６日目に続けて行った。８日目に実験を終わらせ、記載されているように（Ｏｌｉｎｅｒ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．２００４．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ６：５０７−５１６）、角膜の写真を撮影した。各角膜画像において、埋め込んだディスクと角膜縁との中点を横断する血管の数を計数した。すべての評価は盲検で行った。ＡＮＯＶＡの後にフィッシャーのポストホックテストを行って、統計的特異性を評価した。
【０３６０】
網膜新血管新生  Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３５：１０１−１１１，１９９４に記載されている方法を用いて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに虚血性網膜症を発症させた。生後７日（Ｐ７）の仔マウスとそれらの母マウスを高酸素チャンバー（７５±０．５％の酸素）に５日間入れてから、室内大気に戻し、さらに５日間置いた（１グループ当たりｎ＝７匹の仔マウス）。チャンバー温度は、２０℃〜２２℃に保ち、酸素は、酸素制御ユニット（酸素センサーＭｏｄｅｌ  Ｅ７０２に連結されたＰｒｏＯｘ  Ｍｏｄｅｌ  Ｐ１１０、ニューヨーク州レッドフィールドのバイオスフェリックス社）によって常に制御した。Ｐ７の仔が入った１つのケージを室内大気（酸素正常状態）に残した。Ｐ８から、Ｆｃコントロール（２００ｍｇ／ｋｇ）、ｍＬ４−３（１００ｍｇ／ｋｇ）、Ｌ１−７（Ｎ）（１００ｍｇ／ｋｇ）、またはｍＬ４−３／Ｌ１−７（Ｎ）の組み合わせ（それぞれ１００ｍｇ／ｋｇ）を１日に１回、９日間、皮下投与した。Ｐ８からＰ１１まで、チャンバー内に手を入れる手段である穴を用いて、注射を行った。Ｐ１７に、仔マウスを殺し、眼を除去して、ダビッドソン固定液を用いて固定した。続いて、標準的な方法を用いて、これらの眼をパラフィンに加工した。光軸と平行に１００μｍ間隔で段階的切片を切断した。これらの塊は、完通して切断し、その結果、１つの眼につき１５〜１６個の切片が得られた。すべての切片をＨ＆Ｅで染色した。一連の段階的切片における１５または１６個のスライドのうち、中央の１０個の連続したスライドを解析で使用し、光軸のいずれかの側をブラケットで支えた。各切片において、内境界膜の硝子体側にある血管核（内皮細胞核と周皮細胞核の両方）の数を計数した。個々のスライドの計数値を記録し、各動物において、１０個の切片の計数値のすべてを合計した。各実験グループの５匹のマウスを計数した。すべての計数は、処置の内容を知らない状態で、盲検で行った。ＡＮＯＶＡの後にフィッシャーのポストホックテストを行って、統計的解析を行った。
【０３６１】
卵胞血管新生  標準的な方法を用いて、被験マウスにおいて過排卵を誘導した。簡潔に言うと、生後４週間のメスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、５〜７ＩＵのＰＭＳを注射し、発情周期を効果的にリセットした。４８時間後、これらのマウスに、５ＩＵのＨＣＧを注射して、過排卵を誘導した。続いて、これらのメスに偽受精させ、２４時間、実験を維持した。被験マウスを１日に２回、ペプチボディで処置した。投与は、最初にＰＭＳを注射した時点に開始し、２日間連続で行い、４回目の投与は、ＨＣＧの注射と同時に行った。ＨＣＧの注射から４８時間後に、マウスを安楽死させた。左右の卵巣を除去し、低温の亜鉛トリス溶液に浸漬・固定した。４８時間後、卵巣を７０％エタノール中に移し、標準的な方法を用いて、パラフィンに加工した。２つの連続切片を各卵巣対から切断し、血管内皮に対して、個別にＨ＆Ｅで染色、または、ＤＡＢを色素原として用いる免疫染色（ＣＤ３１、ラット抗マウスモノクローナルＭＥＣ１３．３、ＢＤバイオサイエンス・ファーミンジェン）のいずれかを行った。加えて、抗ＣＤ３１  ＩＨＣ切片をヘマトキシリンで薄く対比染色した。解析用に選択した個々の卵巣を、形質転換状態に基づいて同定した。これは、Ｈ＆Ｅ切片の処置内容が分からない状態での低倍率下における検査によって決定した。続いて、実行可能な場合、１匹の動物当たり１０個の形質転換卵巣の対応画像を１０倍の対物倍率で、抗ＣＤ３１免疫染色切片からキャプチャーした。卵胞切片区域をＲＯＩとして描き、ＭｅｔａＭｏｒｐｈという画像解析ソフトウェア（ＭｅｔａＭｏｒｐｈ  ｖ６．１、ペンシルベニア州ダウニングタウンのＵＩＣ）を用いたＲＧＢの閾値化によって、ＣＤ３１陽性区域の割合を割り出した。ＡＮＯＶＡの後にダネットのポストホックテストを行って、統計的解析を行った。
【０３６２】
処置ラットの正常組織の評価  スプラーグドーリーラット（チャールス・リバー・ラボラトリーズ）トで、ペプチドボディの正常組織に対する作用を評価した。動物に、３００ｍｇ／ｋｇのＡＭＧ３８６、Ｌ１−７（Ｎ）、またはｍＬ４−３を１週間に２回、２８日間、静脈内投与した（１グループ当たりｎ＝１０匹の動物）。スケジュールしていた死体解剖時に、完全組織一式を切片化し、染色して、顕微鏡的変化について観察した。
【０３６３】
【表１０】
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【０３６４】
【表１１】
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【０３６５】
【表１２】
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【０３６６】
【表１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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