(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダプトマイシンを精製する方法であって、
ａ）部分的に精製されたダプトマイシンを含む溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに注入する工程、
ｂ）工程ａ）の溶液を第１の逆相クロマトグラフィーカラムに注入する工程、
ｃ）工程ｂ）の溶液を第２の逆相クロマトグラフィーカラムに少なくとも１回注入する工程
からなり、
ａ）における溶出バッファーは一価の塩の溶液であり、かつｂ）およびｃ）における溶出バッファーは水溶性アルコールであり、
第１の逆相クロマトグラフィーカラムはｐＨ６．５〜８．５で溶出され、第２の逆相クロマトグラフィーカラムはｐＨ２．５〜３．５で溶出される方法。
【請求項２】
陰イオン交換クロマトグラフィー工程ａ）の前に、１つまたは複数の浄化工程が実施される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
逆相クロマトグラフィー工程ｃ）の生成物は、１つまたは複数のろ過工程によりさらに精製される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
逆相の生成物はさらに凍結乾燥工程に供される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ａ）における溶出溶液はＮａＣｌである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
溶出バッファーは０．１〜１．５Ｍ  ＮａＣｌである請求項２に記載の方法。
【請求項７】
ｂ）およびｃ）における溶出バッファーは含水エタノールである請求項１に記載の方法。
【請求項８】
溶出バッファーは５〜８０％エタノールである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
陰イオン交換クロマトグラフィー工程は、デキストラン表面拡張剤を有する高度に架橋されたアガロース樹脂を用いて実施される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
逆相クロマトグラフィー工程は、スチレン系樹脂カラムを用いて実施される請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ダプトマイシンを精製する方法であって、
ａ）ダプトマイシンを含む発酵ブロスを１つまたは複数の浄化工程に供する工程、
ｂ）工程ａ）の溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに注入する工程、
ｃ）工程ｂ）の溶液を第１の逆相クロマトグラフィーカラムに注入する工程、
ｄ）工程ｃ）の溶液を第２の逆相クロマトグラフィーカラムに少なくとも１回注入する工程、
ｅ）工程ｄ）で得られた溶液を１つまたは複数のろ過工程に供する工程、および
ｆ）ｅ）のろ液を凍結乾燥させ、精製されたダプトマイシンの粉末を得る工程を含み、
工程ｃ）および工程ｄ）における溶出バッファーは水溶性アルコールであり、
第１の逆相クロマトグラフィーカラムはｐＨ６．５〜８．５で溶出され、第２の逆相クロマトグラフィーカラムはｐＨ２．５〜３．５で溶出される方法。
【請求項１２】
ａ）における浄化工程は、逆浸透、遠心分離、ろ過、限外ろ過、ナノろ過、および陰イオン交換クロマトグラフィーのうちの１つまたはそれらの組合せである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ｂ）における溶出溶液はＮａＣｌである請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
溶出バッファーは０．１〜１．５Ｍ  ＮａＣｌである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ｃ）およびｄ）における溶出バッファーは含水エタノールである請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
溶出バッファーは５〜８０％エタノールである請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−デカノイル−Ｌ−トリプトフィル−Ｄ−アスパラギニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トレオニルグリシル−Ｌ−オルニチル−Ｌ−アスパルチル−Ｄ−アラニル−Ｌ−アスパルチルグリシル−Ｄ−セリル−トレオ−３−メチル−Ｌ−グルタミル−３−アントラニロイル−Ｌ−アラニンε１−ラクトンという化学名で表されるダプトマイシンの精製のための改善された精製方法に関する。ダプトマイシンは下記の式Ｉによって表される。
【０００２】
【化１】
0005752609.tif 000002
【背景技術】
【０００３】
ダプトマイシンはグラム陽性菌に対する活性を有するリポペプチド抗生物質である。ダプトマイシンはストレプトマイセス・ロゼオスポラス（Strepromyces roseosporus）の発酵、続いて発酵ブロスの精製により製造される。ダプトマイシンの作用のメカニズムは、細菌の膜に結合することにより、膜電位の急速な脱分極を引き起こすことである。この膜電位の消失は、タンパク質、ＤＮＡおよびＲＮＡの合成の抑制を引き起こし、細菌の細胞死をもたらす。ダプトマイシンは複雑性皮膚・皮膚組織感染症（ｃＳＳＳＩ）およびスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）血流感染症（菌血症）に対して認可されている。ダプトマイシンはキュービスト  ファーマシューティカルズ社（Cubist Pharmaceuticals）から、キュービシン（Cubicin：登録商標）の商標で販売されている。
【０００４】
ダプトマイシンは１９８０年代半ばに、複数の特許文献および雑誌に初めて記載された（特許文献１および非特許文献１）。それ以来、改善された発酵方法および精製方法に関する複数の文献が出版されている。
【０００５】
特許文献２には、ダプトマイシンを製造するための改善された発酵方法が記載されている。この方法は、デカン脂肪酸あるいはそのエステルまたは塩を、ストレプトマイセス・ロゼオスポラス（Strepromyces roseosporus）の発酵ブロスに供給する工程を記載している。発酵中、デカン脂肪酸は恐らく分子中に挿入されてダプトマイシンのデカン側鎖を形成する。
【０００６】
従来技術において、ダプトマイシンを精製するためのいくつかの精製方法が説明されてきた。特許文献３は、ダプトマイシンの精製方法において、発酵ブロスがろ過され、ＨＰ−２０樹脂を含有するクロマトグラフィーカラムに添加される精製方法を記載している。溶出の後、半精製されたダプトマイシンをＨＰ−２０ｓｓ樹脂含有カラムに通し、続いて別のＨＰ２０樹脂含有カラムに添加する。これらの工程に加え、複数のクロマトグラフィー工程を追加することにより純度を上げる試みがなされたものの、成功については記載されていない。特許文献３はさらに、非機能性樹脂および水溶液の使用、ならびに、水を物理的に除去してから樹脂を極性有機溶媒で再度湿らせる工程を含めることにより、生成物の純度は８０％から９３％に上昇することを教示している。この方法は時間を要し、工業生産法としてあまり適切ではない。
【０００７】
特許文献４は、ダプトマイシンの製造において見られる２つの主要な不純物である無水ダプトマシンおよびダプトマイシンのβ異性体について記載している。特許文献４はさらに、実施例１〜３に記載の方法を使用することにより、上述の２つの不純物を６％未満含むダプトマイシン生成物が得られると述べている。実施例３は、４つのクロマトグラフィー工程および追加の脱塩、濃縮および凍結乾燥工程を含む方法において、ダプトマイシンの中間品質がさらに精製される方法を記載している。クロマトグラフィー工程では洗浄および溶出にアセトニトリルが使用され、その上、その方法は冷却した溶液を用いて低温室内で実施されなければならない。
【０００８】
特許文献５は、溶出に変性バッファーを使用する陰イオン交換クロマトグラフィー工程を利用し、かつダプトマイシンがミセルを形成する精密ろ過を利用することによりダプトマイシンを精製する方法を開示している。この特許文献には、上述の２つの工程の組合せを当業者に知られている他の精製工程と組み合わせたいくつかの方法が記載されている。この特許文献では、高度に精製されたダプトマイシン生成物は、ダプトマイシンが９５〜９７％の純度レベルになると規定されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第４，５３７，７１７号明細書
【特許文献２】米国特許第４，８８５，２４３号明細書
【特許文献３】米国特許第４，８７４，８４３号明細書
【特許文献４】米国再発行特許第３９０７１号明細書
【特許文献５】米国特許第６，６９６，４１２号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Debono M．et al，Journal of Antibiotics，1986，Vol．XL，No 6，761−777
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ダプトマイシンを精製するための改善された精製方法であって、少なくとも９５％の純度の生成物をもたらす方法を提供する。説明する方法は、従来技術において記載された方法よりも簡素であり、また後述するように、変性バッファーの使用を不要とし、さらにアセトニトリルの使用を回避するため環境に有益である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明による方法は陰イオン交換クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーの工程を利用する。加えて、通常のろ過工程および最終生成物の凍結乾燥工程を実施してもよい。
【００１３】
一実施形態によれば、陰イオン交換クロマトグラフィー工程で溶出バッファーとして使用される一価の塩溶液は塩化ナトリウムの水溶液である。
本発明の逆相クロマトグラフィー工程ｂ）の溶出バッファーは水溶性アルコールである。好ましくは、水溶性アルコールは含水エタノールである。本発明の一実施形態によれば、ダプトマイシンは、４０〜７０％エタノール水溶液からなる溶出バッファーを使用する逆相クロマトグラフィー工程から溶出される。
【００１４】
本発明は反応スキーム１に示される工程によって例示される。
【００１５】
【表１】
0005752609.tif 000003
本発明は総純度９５％以上のダプトマイシン生成物をもたらす。無水ダプトマイシンの量は０．５〜１．５％間で変動し、β異性体の量は０．５％未満である。
【００１６】
本発明による方法は、当該技術分野において周知の方法よりも、使用するバッファーおよび工程の点で簡素な精製方法を提供し、環境に対して有毒な溶媒の使用を回避する。さらに、それは前記２つの最重要不純物、すなわち無水ダプトマイシンおよびダプトマイシンのβ異性体の非常に良好な分離および量の低下をもたらす。本発明による方法は簡素な精製方法を与えると同時に、従来技術において記載される生成物と少なくとも同程度の純度を有する生成物を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明による方法の出発物質は特許文献２に記載の方法によって製造することができ、その方法では、供給される脂肪酸はデカン酸である。
本発明によれば、ダプトマイシンは、第１の陰イオンクロマトグラフィー工程、さらにそれに続く第２の逆相クロマトグラフィー工程の使用により精製される。
【００１８】
本発明の出発物質として使用される発酵ブロスは、前記２つのクロマトグラフィー工程の前に、大きい粒子や生物塊を除去するために前処理されてもよい。前処理の方法として、本発明の出発物質として使用される発酵ブロスを１つ以上の浄化工程に供してもよい。種々の有効な浄化工程が当業者に知られている。本発明による発酵ブロスを前処理するのに有効な浄化工程の非限定的な例は、逆浸透、遠心分離、限外ろ過、精密ろ過、ナノろ過、および透析ろ過である。高多孔性樹脂を用いた陰イオン交換工程も浄化に利用することが可能である。
【００１９】
陰イオン交換クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーによるダプトマイシンのさらなる精製の前に、当業者によく知られている浄化方法の様々な組合せが、本発明にしたがって、発酵ブロスを前処理するために使用され得ることが理解されるべきである。
【００２０】
浄化された発酵ブロスは陰イオン交換カラムに添加される。Capto Q、Q Sepharose XL、Q Sepharose FF、Source 30 QまたはMacroprep High Q、またはそれらの同等物などの強陰イオン交換樹脂、ならびに市販の樹脂であるDEAE Sepharose FF、ANX Sepharose FF、Source 15 Qなどの弱陰イオン交換樹脂の両方を本発明にしたがって使用することができる。好ましい樹脂は、市販の樹脂であるCapto Qのようなデキストラン表面拡張剤（dextran surface extender）を有する高度に架橋されたアガロース樹脂である。浄化溶液の注入後、カラムは水で洗浄される。
【００２１】
本発明の陰イオン交換クロマトグラフィー工程ａ）の溶出バッファーは一価の塩溶液である。前記一価の塩は、例えばＮａＣｌまたはＫＣｌなどの塩化物塩である。他の一価の塩、たとえば酢酸ナトリウムなどのアセタートの一価の塩も使用することができる。
【００２２】
一実施形態によれば、ダプトマイシンは、０．１Ｍ  ＮａＣｌ〜１．５Ｍ  ＮａＣｌ、好ましくは０．２Ｍ  ＮａＣｌ〜１．０Ｍ  ＮａＣｌの水中ＮａＣｌ勾配でカラムから溶出され得る。
【００２３】
半精製されたダプトマイシンは、続いて逆相カラムに添加される。好ましい逆相樹脂はポリスチレンおよびジビニルベンゼンからなる単一サイズの多孔性樹脂であり、例えば市販の樹脂であるSource PRC 30、SP20ss、HP20ssまたは同種のポリスチレン系樹脂である。ダプトマイシン溶液がカラムに適用された後、カラムは１５％エタノールのような１５％のアルコールを含有する水で洗浄される。
【００２４】
ダプトマイシンは、例えばメタノール、エタノールまたはイソプロパノールのようなＣ１〜Ｃ３アルキルアルコールなどの水溶性アルコールで溶出することができる。本発明の一実施形態によれば、ダプトマイシンは溶出溶媒としてエタノールを用いて逆相カラムから溶出される。
【００２５】
ダプトマイシンは、一実施形態によれば、水中のエタノール勾配によって逆相カラムから溶出される。その勾配は５〜８０％エタノールであり、好ましくは４０％〜７０％のエタノールである。
【００２６】
本発明の１つの好ましい実施形態では、逆相クロマトグラフィーの追加工程がある。本発明の好ましい実施形態は、生成物の純度を高めるため、２つの逆相カラムを異なるｐＨで操作することである。１つの好ましい実施形態では、第１のカラムを中性ｐＨで操作し、第２のカラムを酸性ｐＨで操作する。ｐＨに関してどの順序で上記２つの逆相クロマトグラフィー工程を実施するかは重要ではない。第１のカラムを酸性ｐＨで、かつ第２のカラムを中性ｐＨで操作してもよいし、その逆でもよい。
【００２７】
本発明の一実施形態によれば、第１の逆相クロマトグラフィーカラムはｐＨ６．５〜８．５、好ましくはｐＨ７．５〜８．０で溶出される。本発明の別の実施形態によれば、第２の逆相クロマトグラフィーカラムはｐＨ２．５〜３．５、好ましくはｐＨ３．０〜３．１で溶出される。
【００２８】
本発明による方法における逆相クロマトグラフィー工程で使用されるカラムは、市販の樹脂であるSource 30PRCのようなスチレン系樹脂であってよい。他の同等な逆相クロマトグラフィー樹脂、例えばSP20ss、HP20ssまたは当業者に周知の同種のポリスチレン系樹脂を使用してもよい。
【００２９】
精製されたダプトマイシンは、続いて標準条件下でろ過および凍結乾燥される。最終的な精製ダプトマイシンは少なくとも９５％の純度を有する。
（実験の部）
（実施例１）
浄化して部分的に精製されたダプトマイシン溶液を陰イオン交換カラムに注入した。出発物質は透析ろ過により浄化した。
【００３０】
イオン交換クロマトグラフィーでの精製
透析ろ過されたダプトマイシンを陰イオン交換カラム、Capto Q樹脂に注入した。別個のタンク内で、下記の組成の各種バッファーを調製した。
【００３１】
バッファー１：脱イオン水
バッファー２：０．２Ｍ  ＮａＣｌ
バッファー３：０．４Ｍ  ＮａＣｌ
バッファー４：１．０Ｍ  ＮａＣｌ
出発溶液は、注入前に希釈ＮａＯＨでｐＨ６〜８に調整した。ダプトマイシンを、２０ｇ／Ｌ樹脂の最大容量で樹脂に結合させた。樹脂に結合させた後、最初にバッファー１で、次にバッファー２で発酵関連不純物を洗い流した。
【００３２】
ダプトマイシンの溶出および回収はバッファー３でアイソクラティックに行った。溶出の後、カラムをバッファー４で処理（stripped）して残留ダプトマイシンまたは高濃度の結合不純物を除去した。
【００３３】
ダプトマイシンは５〜１０ＢＶの容量適用に基づいて回収された。
逆相クロマトグラフィーＩ（ＲＰＣ  Ｉ）
ダプトマイシンをスチレン系Source 30RPC樹脂を用いたＨＰＬＣにより精製した。
【００３４】
この工程のためのバッファーは別個のタンク内で調製した。
バッファー１：脱イオン水
バッファー２：１２〜１６％エタノール
バッファー３：５５〜６５％エタノール
ダプトマイシンを中性ｐＨ（ｐＨ７．５〜８．０）で精製した。最初にカラムをバッファー１で平衡化した。ダプトマイシンをカラムに注入した後（最大注入量＜３０ｇ／Ｌ樹脂）、バッファー２を用いて疎水性の低い不純物（主に分解生成物）を洗い流した。
【００３５】
次に、勾配溶出１５〜６０％エタノール（バッファー１から２への勾配混合物）により、１２〜１６ＢＶにわたってダプトマイシンを回収した。ＵＶシグナルに基づきダプトマイシンを回収した。
【００３６】
逆相クロマトグラフィーＩＩ
純度に基づき、第１の逆相クロマトグラフィー工程（ＲＰＣ  Ｉ）から各画分を回収してプールし、タンク内でダプトマイシンが沈降するのを防止するため高速撹拌しながら、ｐＨを酢酸でｐＨ３．０〜３．１に調整した。
【００３７】
この工程のためのバッファーを別個のタンク内で調製した。
バッファー１：脱イオン水、ｐＨ３．０〜３．１を酢酸で調整した
バッファー２：３０〜３５％エタノール、ｐＨ３．０〜３．１を酢酸で調整した
バッファー３：６５〜７５％エタノール、ｐＨ３．０〜３．１を酢酸で調整した
ｐＨ調整されたダプトマイシン溶液をカラムに注入し（最大注入量＜３０ｇ／Ｌ樹脂）、疎水性の低い不純物をバッファー１で洗い流した。バッファー２および３を混合して３５％〜７０％のエタノール勾配を操作することにより、８〜１２ＢＶにわたってダプトマイシンの溶出および回収を行った。
【００３８】
ＵＶシグナルに基づきダプトマイシンを回収した。
（実施例２）
発酵ブロスを浄化するために、いくつかの浄化方法を使用した。最初に、大きい粒子および生物塊を除去するために発酵ブロスを遠心分離した。発酵ブロスのｐＨは６．４であり、乾燥物質（ＤＭ）は約６〜７％であった。遠心分離後の上清は３％のＤＭしか含有していなかった。続いて、２５〜１００μｍよりも大きい粒子を除去するために、上清をさらに２５〜１００μｍフィルタを通して前ろ過した。
【００３９】
遠心分離および前ろ過された溶液を、続いてPellicon 2500kD（ミリポア社（Millipore））フィルタを通して限外ろ過し、大きい分子を除去した。限外ろ過の後、溶液をナノろ過により濃縮した。フィルタはＤＬシリーズの３５０Ｄ（ＧＥオスモニクス社（GE Osmonics））を使用した。濃縮液は５ｇ／ｌのダプトマイシンを含有し、ｐＨ６を有していた。
【００４０】
本発明にしたがい、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムによって濃縮液をさらに精製した。樹脂はＧＥヘルスケア社（GE Healthcare）のCapto Q（９０μｍ）を使用した。必要な場合、濃縮液のｐＨをＮａＯＨでｐＨ６に調整してからカラムに注入した。濃縮液をカラムに注入した後、カラムを水で洗浄し、ＮａＣｌ段階勾配でダプトマイシンを溶出した。溶出溶液は、水中に０．２Ｍ、０．４Ｍおよび１．０ＭのＮａＣｌを含有していた。陰イオン交換カラムからプールされた画分は、約２．５ｇ／ｌのダプトマイシンを含有していた。
【００４１】
陰イオン交換カラムからプールされた画分を、次に第１の逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ  Ｉ）に注入した。樹脂は、ＧＥヘルスケア社のSource 30RPC（３０μｍ）を使用した。注入後、カラムを水で洗浄し、２０〜５０％勾配のｐＨ７〜８のエタノールで溶出した。この工程からの画分プールは約６ｇ／ｌのダプトマイシンを含有していた。この画分プールをさらに、同じ樹脂の第２の逆相カラムに注入した。前回の逆相カラムからのダプトマイシン溶液を注入した後、カラムを水で洗浄し、ダプトマイシンを２０〜５０％勾配のｐＨ３．０のエタノールで溶出させた。この工程からの画分プールは約８ｇ／ｌのダプトマイシンを含有していた。
【００４２】
その後、ＧＥオスモニクス社のＤＬシリーズ３５０Ｄメンブレンを用いたナノろ過工程によりダプトマイシン溶液を処理した。ナノろ過後のダプトマイシン溶液を、標準条件を用いて凍結乾燥させた。
【００４３】
最終生成物の純度は９５〜９７％である。