(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１００ｎＭ未満のＩＣ50値を有する少なくとも３つの異なるＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子によりコードされるＭＨＣクラスＩＩ分子を結合できるオリゴペプチド配列を含む単離ポリペプチドであって、オリゴペプチド配列がＡＸ1ＦＶＡＡＸ2ＴＬＸ3ＡＸ4Ａ（配列番号１）を含み、
−  Ｘ1がＹおよびＩからなる群から選択され；
−  Ｘ2がＦ、Ｎ、ＹおよびＷからなる群から選択され；
−  Ｘ3がＨであり；
−  Ｘ4がＡであり；
ここで前記オリゴペプチド配列が配列番号３と比較して、改善されたプロテアーゼ耐性および／または免疫原性を示す、単離ポリペプチド。
【請求項２】
前記オリゴペプチドが配列番号２３、６９および７２からなる群から選択されたオリゴペプチド中の１３個のアミノ酸残基Ｃ末端フラグメントと同一のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドがオリゴペプチドに加えて未変性ポリペプチド配列の大部分を含んでいる、請求項１または２に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
前記未変性ポリペプチド配列がヒトＴＮＦα由来のものである、請求項３に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
前記オリゴペプチドに加えて、少なくとも１つの抗原由来の複数のエピトープを含む、請求項１または２に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６】
前記複数のエピトープが、複数のＣＴＬエピトープ、複数のＢ−細胞エピトープ、複数のＴヘルパーリンパ球エピトープ、複数のＣＴＬおよびＢ細胞エピトープ、複数のＣＴＬおよびＴヘルパーリンパ球エピトープ、複数のＢ細胞およびＴヘルパーリンパ球エピトープおよび複数のＢ細胞、ＣＴＬおよびＴヘルパーリンパ球エピトープから選択されている、請求項５に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７】
前記エピトープが１つの単一抗原タンパク質に由来するものであるか、あるいは同じ種に任意に由来する少なくとも２つの異なる抗原タンパク質に由来するものである、請求項５または６に記載の単離ポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが１００個以下のアミノ酸を有する、請求項１、２および５〜７のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、ＭＨＣ分子を結合できるオリゴペプチド配列と重複しない第２のオリゴペプチド配列を含む、請求項１または３または５〜８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１０】
前記第２のオリゴペプチド配列がＣＴＬ配列またはＢ細胞エピトープを含む、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに対して作動的に連結されたプロモータを含む核酸を含む単離ベクター。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに対して作動的に連結されたプロモータを含む核酸を含む細胞。
【請求項１４】
単離細胞である、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチドと抗原を含む組成物。
【請求項１６】
前記抗原が第２のポリペプチドまたは非タンパク性抗原である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記抗原が炭水化物である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
さらに生理学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物の形態における、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
医薬として用いられる、請求項１２に記載のベクター。
【請求項２０】
有効量の請求項１１に記載のポリヌクレオチドをヒト以外の動物に対して投与することを含む、免疫応答を刺激する方法。
【請求項２１】
医薬として用いられる、請求項１３に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
Ｔヘルパー細胞により認識されるエピトープを含む免疫原性ペプチドが、免疫応答を誘発する上で有用であることが発見されてきた。特定の決定基に対する抗体応答を増強するためのヘルパーペプチドの使用は、例えばＨｅｒｖａｓ−Ｓｔｕｂｂｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ１２：８６７−８７１（１９９４）中に記載されている。
【０００２】
ＭＨＣ対立遺伝子のペプチド結合ポケットをライニングする対立遺伝子多型残基は各々の対立遺伝子に固有のペプチドセットを結合させる能力を付与する傾向にあるが、所与のペプチドが２つ以上のＭＨＣ対立遺伝子に結合することが実証されたケースも存在する。例えば、複数の研究者が、多数のＤＲタイプに関連していくつかのエピトープの変性結合および／または認識を報告し、或る種のエピトープが「万能」エピトープであるかもしれないという概念を導いている（Ｂｕｓｃｈら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４４３−４５１（１９９０）；Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：２２３７−２２４２（１９８９）；Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａら、Ｎａｔｕｒｅ３３６：７７８−７８０（１９８８）；Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６６３−２６６９（１９９１）；Ｒｏａｃｈｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：１８４９−１８５６（１９９１）；Ｈｉｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１８９−１９７（１９９１））。Ｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドは、例えば米国特許第６，４１３，９３５号（ＵＳ６，４１３，９３５）；国際公開第９５／０７７０７号（ＷＯ９５／０７７０７）；国際公開第２００５／１２０５６３号（ＷＯ／２００５／１２０５６３）；およびＡｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：７５１−７６１（１９９４）中で記述されてきた）。これらのペプチドは、抗原に対するさまざまな免疫応答の生成を助けることが示されてきた。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、タンパク質分解酵素に対する安定性が改善された（短ペプチド、オリゴペプチドおよびポリペプチドの両方の形での）免疫原性ペプチドの提供という観点から見たＰＡＤＲＥ配列（配列番号３）内の選択された変異の効果の研究に基づいている。
【０００４】
したがって本発明は、１００ｎＭ未満、例えば少なくとも５０ｎＭのＩＣ50値を有する少なくとも３つの異なるＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子によりコードされるＭＨＣクラスＩＩ分子を結合できるオリゴペプチド配列を含むまたはこれで構成されている単離ポリペプチドであって、オリゴペプチド配列がＡＸ1ＦＶＡＡＸ2ＴＬＸ3ＡＸ4Ａ（配列番号１）を含み、
−  Ｘ1がＷ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、ＩおよびＫからなる群から選択され；
−  Ｘ2がＦ、Ｎ、ＹおよびＷからなる群から選択され；
−  Ｘ3がＨおよびＫからなる群から選択され；
−  Ｘ4がＡ、ＤおよびＥからなる群から選択され；
ただしここでオリゴペプチド配列がＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号３）でないことが条件となっている、
単離ポリペプチドに関する。
【０００５】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびこのようなポリヌクレオチドを含むベクターにも関する。同様に本発明が包含しているのは、本発明のポリヌクレオチドを含む細胞である。本発明はさらに、本発明のポリペプチドまたはオリゴペプチドまたはポリヌクレオチドまたはベクターまたは細胞を含む、医薬組成物を含めた組成物に関する。最後に本発明は、それを必要としている対象に対して、本発明のポリペプチドまたはオリゴペプチドまたはポリヌクレオチドまたはベクターまたは細胞または組成物を投与することによって、免疫応答を刺激する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１−１】さまざまなＨＬＡ−ＤＲ分子に対する本発明のペプチドのＨＬＡ−ＤＲ結合を決定する結合実験からのデータを示す。詳細については実施例１を参照のこと。
【図１−２】図１−１に同じ。
【図１−３】図１−１に同じ。
【図１−４】図１−１に同じ。
【図１−５】図１−１に同じ。
【０００７】
定義
別段の定義がない限り、本明細書中で使用されている全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。本発明は、組換え遺伝学の分野における常用手技に依存するものである。本発明中で使用される一般的な方法を開示する基本的教書としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版２００１）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｕｓｕｂｅｌら、編、１９９４））がある。
【０００８】
本明細書中で使用される「オリゴペプチド」または「ペプチド」という用語は、少なくとも４つのアミノ酸残基またはアミノ酸ミメティックの連鎖を意味する。オリゴペプチドまたはペプチドは、その中性（未荷電）形態または塩形態のいずれであれ、また、グリコシル化、側鎖酸化またはリン酸化を含めた（ただしこれらに限定されない）修飾が無い状態かまたはこれらの修飾を１つ以上含む状態のいずれであれ、さまざまな長さであり得る。任意の修飾は本明細書中で記述されるポリペプチドの生物活性を破壊するものではないが、本発明は、（例えば生体内で修飾が除去されるまで活性を限定するために）修飾が生物活性を削減または削除する選択肢を含むものである。
【０００９】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用されて、アミノ酸残基のポリマーを意味する。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に発生するアミノ酸の人工的化学ミメティックであるアミノ酸ポリマーならびに天然に発生するアミノ酸ポリマーおよび天然に発生しないアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書中で使用されるこれらの用語は、アミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結されている、全長タンパク質（すなわち抗原）を含むあらゆる長さのアミノ酸鎖を包含する。これらの用語はさらに、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／封鎖基による誘導体化、タンパク質分解による分割または非天然発生アミノ酸による修飾などの翻訳後修飾を受けたポリペプチドを含んでいる。
【００１０】
本発明のポリペプチドとして同様に含まれるのは、前述のポリペプチドのフラグメント、誘導体、類似体またはバリアント、およびそれらの任意の組合せである。ポリペプチドおよびそのフラグメント、誘導体、類似体またはバリアントは、抗原性および免疫原性ポリペプチドであり得る。
【００１１】
「アミノ酸残基」、「アミノ酸」および「残基」は、ペプチド、オリゴペプチドまたはタンパク質中のアミノ酸残基に言及している場合、互換的に使用され、本明細書中で使用されている通り、アミド結合またはアミド結合ミメティックを通して少なくとも１つの他のアミノ酸またはアミノ酸ミメティックに共有結合により接合されたアミノ酸またはアミノ酸ミメティックを意味する。
【００１２】
本明細書中で使用される「アミノ酸」という用語は、無条件の場合、「Ｌ−アミノ酸」またはＬ−アミノ酸ミメティックを意味する。
【００１３】
本明細書中で使用される通り、ペプチド化合物を記述するために使用される命名法は、各アミノ酸残基の左側（Ｎ末端）にアミノ基が提示され右側（Ｃ末端）にアルボキシル基が提示されている従来の実践法にしたがっている。エピトープ内でアミノ酸残基の位置が言及されている場合、それらは、アミノからカルボキシル方向に付番されており、１位は、エピトープまたはそれが一部を成していてよいペプチドまたはタンパク質のアミノ末端に基も近い位置である。アミノ酸構造式においては、各残基は一般に、標準的な三文字または一文字の呼称で表わされる。アミノ酸残基のＬ形態は、大文字一文字かまたは三文字記号の最初の大文字によって表わされ、Ｄ−形態を有するこれらのアミノ酸のＤ形態は、小文字一文字かまたは小文字三文字記号により表わされる。グリシンは、非対称炭素原子を全く有しておらず、単に「Ｇｌｙ」または「Ｇ」と称される。
【００１４】
本明細書中で使用されているアミノ酸の記号を以下に示す。
【００１５】
【表１】
0005792630.tif 000002
【００１６】
本明細書中で使用される「ｐａｎＤＲ結合ペプチド」または「ｐａｎ−ＤＲ結合エピトープ」という用語は、２つ以上のＭＨＣクラスＩＩＤＲ分子を結合させる（例えば１００ｎＭ未満例えば少なくとも５０ｎＭのＩＣ50を有する２つ以上のＭＨＣ分子の各々を結合させる）分子ファミリーの一成員を意味する。一部の実施形態においては、本発明のｐａｎ−ＤＲ結合オリゴペプチドは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または全１２個の最も一般的なＤＲ対立遺伝子（ＤＲ１、２ｗ２ｂ、２ｗ２ａ、３、４ｗ４、４ｗ１４、５、７、５２ａ、５２ｂ、５２ｃおよび５３）を結合させることのできるペプチドである。本発明のｐａｎ−ＤＲ結合オリゴペプチドは、第２の決定基に対する免疫応答を促進することに加えて、標的免疫原自体としても役立つことができる。こうして、例えばｐａｎ−ＤＲ結合ペプチド自体が炭水化物エピトープに連結される場合、免疫応答は、ｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドと炭水化物エピトープの両方に対するものであってよい。
【００１７】
本明細書中で使用される「ＰＡＤＲＥ」という用語は、アミノ酸配列ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号３）を有するｐａｎＤＲ結合ペプチドを意味する。
【００１８】
本明細書中で使用される「ＰＡＤＲＥ類似体」という表現は、ＰＡＤＲＥと比べて多くとも１、２、３または４個のアミノ酸変更を含むアミノ酸配列を含み、うち少なくとも１つがＫ２、Ｗ７、Ｋ１０またはＡ１２内で行なわれているアミノ酸配列を含むｐａｎＤＲペプチドを意味する。
【００１９】
本明細書中で使用される「ＩＣ50」という用語は、基準ペプチドの結合の５０％の阻害が観察される結合検定中のペプチドの濃度を意味する。検定が実施される条件（すなわち限定的ＭＨＣタンパク質および標識ペプチド濃度）に応じて、これらの値はＫD値に接近してよい。結合を決定するための検定は、例えばその各々の開示が参照により本明細書に援用されている国際公開第９４／２０１２７号（ＷＯ９４／２０１２７）および国際公開第９４／０３２０５号（ＷＯ９４／０３２０５）の中で詳述されている。検定条件が変動した場合そして使用される特定の試薬（例えばＭＨＣ調製物など）に応じて、ＩＣ50値は、多くの場合劇的に変化し得る。例えば、ＭＨＣ分子の過度の濃度は、所与のリガンドの見かけのＩＣ50測定値を増大させる。
【００２０】
あるいは、結合は、例えばＰＡＤＲＥなどの基準ペプチドとの関係において表現される。特定の検定の感度が増減するにつれて試験対象のペプチドのＩＣ50値は幾分か変化するかもしれないが、基準ペプチドとの関係における結合は有意に変化しない。例えば、基準ペプチドのＩＣ50が１０倍増加するような条件下で実施される検定においては、被検ペプチドのＩＣ50値もおよそ１０倍シフトする。したがって、あいまいさを避けるため、ペプチドが良好な結合性を有するか、あるいは中度の、弱いまたは不良な結合性を有するかについての査定は一般に、標準ペプチドのＩＣ50との関係における対象ペプチドのＩＣ50に基づく。結合は同様に、生細胞（例えば、Ｃｅｐｐｅｌｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ３３９：３９２、１９８９；Ｃｈｒｉｓｔｎｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ３５２：６７、１９９１；Ｂｕｓｃｈら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４４３、１９９９０；Ｈｉｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１８９、１９９１；ｄｅｌ  Ｇｕｅｒｃｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６８５、１９９５））、洗浄剤溶解物を用いた無細胞系（（例えば、Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２０６９、１９９１）、固定化された精製済みＭＨＣ（例えば、Ｈｉｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２、２８９０、１９９４；Ｍａｒｓｈａｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：４９４６、１９９４）；ＥＬＩＳＡ系（例えばＲｅａｙら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：２８２９、１９９２）、表面プラズモン共鳴（例えば、Ｋｈｉｌｋｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５４２５、１９９３）、高流量可溶性相検定（Ｈａｍｍｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３５３、１９９４）およびクラスＩＭＨＣ安定化または会合の測定（例えば、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ３４６：４７６、１９９０；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、Ｃｅｌｌ６２：５６３、１９９０；Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、Ｃｅｌｌ６２：２８５、１９９０；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１８９６、１９９２）を使用するものを含めた他の検定系を用いて判定されてよい。
【００２１】
「発現」という用語は、コーディング配列によってコードされる産物の生物学的産生を意味する。大部分の場合において、コーディング配列を含めたＤＮＡ配列は転写されてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を形成する。メッセンジャーＲＮＡは次に翻訳されて、関連する生物活性を有するポリペプチド産物を形成する。同様に、発現プロセスには、転写のＲＮＡ産物へのさらなるプロセッシングステップ、例えばイントロンを除去するためのスプライシング、および／またはポリペプチド産物の翻訳後プロセッシングが関与してよい。
【００２２】
本明細書中で使用される「構築物」という用語は、一般に、天然に発生しない組成物を一般に表わす。構築物は合成技術、例えば組換え型ＤＮＡの調製および発現または核酸またはアミノ酸用の化学合成技術によって生成可能である。構築物は同様に、結果がその形態では天然に見出されないような形で１つの材料を別の材料と添加または親和させることによっても生成可能である。「マルチ−エピトープ構築物」という用語は、「ミニ遺伝子」または「マルチ−エピトープ核酸ワクチン」という用語と互換的に使用可能であり、例えば一部の実施形態ではＭＨＣクラスＩおよびＴ細胞受容体および／またはＭＨＣクラスＩＩおよびＴ細胞受容体などの、免疫系内で機能する分子に結合し得る任意の長さのペプチドエピトープをコードする多数のエピトープ核酸を含む。マルチエピトープ構築物中のエピトープ核酸は、例えばクラスＩＩＭＨＣエピトープまたはクラスＩＭＨＣエピトープとクラスＩＩＭＨＣエピトープの組合せをコードできる。
【００２３】
特定のアミノ酸配列に関して、「エピトープ」は、特定の免疫グロブリンによる認識に関与する一組のアミノ酸残基、またはＴ細胞に関連しては、Ｔ細胞受容体タンパク質および／または主要組織適合複合体（ＭＨＣ）受容体による認識に必要な残基である。試験管内または生体内における免疫系の設定において、エピトープは、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体またはＭＨＣ分子により認識される部位を合わさって形成している、例えば一次、二次および三次ペプチド構造、および電荷などの分子の集合的特徴である。したがって、「エピトープ」という用語には、適切なＭＨＣ分子に結合しその後細胞傷害性Ｔ細胞応答またはヘルパーＴ細胞応答を誘発できる、あるいは代替的に、抗体を結合させその後、免疫原性ペプチドを誘導する抗原に対する抗体応答を誘発することのできる、本発明の免疫原性ペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】
「フランキング残基」とは、エピトープの隣りに位置づけされている残基である。フランキング残基は、エピトープのＮ末端またはＣ末端に隣接する位置に導入または挿入され得る。
【００２５】
「免疫原」および「抗原」という用語は互換的に使用され、細胞または体液性免疫応答の対象となるべきあらゆる化合物を意味する。さらに、本発明の抗原または免疫原性ペプチドは、線状であるすなわちポリペプチド中の隣接するアミノ酸で構成されていてよく、あるいは抗体−エピトープの場合には三次元または立体配座のもの、すなわち、機能的エピトープがポリペプチドの二次または三次構造に起因して一緒になって１つのエピトープを形成する非隣接アミノ酸で構成されているものであってよい。
【００２６】
本明細書中で使用される「抗原決定基」という用語は、免疫応答を惹起する、促す、または生成するように誘発され得るあらゆる構造、例えば炭水化物エピトープ、脂質、タンパク質、ペプチドまたはそれらの組合せである。
【００２７】
「抗体」という用語は、１つ以上のタンパク質および／または抗原を含む（ただしこれらに限定されない）組成物の中に含まれる特定されたタンパク質または抗原と相互作用しかつこれに結合することのできる１つまたは複数の免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされるポリペプチドを意味する。
【００２８】
「ＣＴＬエピトープ」という用語は、特定のＭＨＣクラスＩ分子により認識され結合され、かつ特定のＭＨＣクラスＩ分子と複合体化された場合にＴリンパ球により認識されるペプチドを意味する。一部の実施形態においては、ＣＴＬエピトープは、長さがアミノ酸約８〜約１３個、約９〜約１１個または約９〜約１０個であり得る。
【００２９】
「ＨＴＬエピトープ」という用語は、特定のＭＨＣクラスＩＩ分子により認識され結合され、かつ特定のＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体化された場合にＴリンパ球により認識されるペプチドを意味する。一部の実施形態においては、ＨＴＬエピトープは、長さがアミノ酸約６〜約３０個、約８〜約３０個、約１０〜約３０個、約１２〜約３０個、約６〜約２５個、約８〜約２５個、約１０〜約２５個、約１２〜約２５個、約６〜約１８個、約８〜約１８個、約１０〜約１８個または約１２〜約１８個であり得る。
【００３０】
Ｔリンパ球がＭＨＣ分子とＣＴＬまたはＨＴＬエピトープ間の複合体を「認識する」という記載は、本明細書、Ｔリンパ球上のＴ細胞受容体が複合体に結合し、その効果でＴリンパ球が活性化されることを意味する。
【００３１】
２つ以上のペプチド配列に関連して「同一の」または「同一性」百分率という用語は、配列比較アルゴリズムを用いてまたは手作業によるアラインメントおよび目視によって測定されるように比較ウインドウ全体にわたる最大限の一致について比較され整列させられた場合に、同じであるかまたは同じであるアミノ酸残基を規定の百分率で有する２つ以上の配列または下位配列を意味する。
【００３２】
配列同一性および配列類似性百分率を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記述されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公開されている。このアルゴリズムには、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合に或る正値の閾値スコアＴと整合するかまたはそれを満たす問い合わせ配列内の長さＷの短かいワードを識別することによって、高スコアの配列対（ＨＳＰ）をまず最初に識別するステップが関与する。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上掲書）。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを発見するための検索を開始するためのシードとして作用する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増大できるかぎり、各々の配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一対の整合する残基のための報酬スコア；つねに０超）およびＮ（不整合残基のためのペナルティスコア；つねに０未満）を用いて計算される。アミノ酸配列については、累積スコアを計算するのにスコアリングマトリクスが使用される。各方向でのワードヒットの拡張は、次の場合に中断される：累積アラインメントスコアが、その最大達成値からＸという数量だけ下落した場合；累積スコアが、１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの累積に起因してゼロ以下となった場合；またはいずれかの配列の終りに達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、１１のワート長（Ｗ）、１０という期待値、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両ストランドの比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルトとして、３というワード長、１０という期待値（Ｅ）を使用し、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５参照）は、５０というアラインメント（Ｂ）、１０という期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４そして両ストランドの比較を使用する。
【００３３】
「単離（された）」または「生物学的に純粋な」という語句は、天然の状態で発見された場合に通常それに随伴する構成要素を実質的にまたは本質的に含んでいない材料を意味する。
【００３４】
本明細書中で使用されている「リンカー」という用語は、２つの機能群（例えばｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドと所望の免疫原）の間の共有結合およびスペーシングを提供するために用いられる任意の化合物のことである。一部の実施形態において、リンカーは、生理学的条件下で実質的に非電荷で線状または分岐側鎖を有していてよい脂肪族炭素鎖、アミノ酸またはアミノ酸ミメティックなどの中性分子を含む。一部の場合において、リンカーはそれ自体免疫原性であり得る。本発明において有用であるさまざまなリンカーについて以下でより詳細に記述する。さらに「連結する（ｌｉｎｋ）」および「コンジュゲートする（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」という動詞は、本明細書において互換的に使用され、２つ以上の種の共有結合付着を意味する。
【００３５】
「連結する」または「接合する」という用語は、組換え融合、共有結合、ジスルフィド結合、イオン結合、水素結合および静電結合を含めた（ただしこれらに限定されない）、ペプチドを機能的に結合するための当該技術分野において公知のあらゆる方法を意味する。
【００３６】
「直接連結された」または「直接接合された」という用語は、何も介在することなく接合されていることを意味する。例えば、直接接合されている２つのペプチドの場合、１つのペプチドは、上述の通り別のペプチドに対して、２つのペプチドの間にいかなる配列、分子、スペーサー、リンカーなども介在することなく接合または結合されると考えられる。直接接合されたペプチドは、共通のアミノ酸を共有していてもいなくてもよい。すなわち２つのペプチドの配列は、重複しなくてもしてもよい。後者は例えば、本発明のＰＡＤＲＥ類似体が挿入を用いて別の（ポリ）ペプチド内に導入される場合に該当し、ＰＡＤＲＥ類似体のアミノ酸配列の存在を保証するためには、挿入点にあるアミノ酸残基と共にＰＡＤＲＥ類似体のための配列全体を提供するアミノ酸残基を挿入することしか必要ではない。
【００３７】
「間接的に連結された」という用語は、何かが介在している状態で接合されていることを意味する。例えば、２つのペプチドが間接的に接合されている場合、１つのペプチドは上述の通り別のペプチドに対し、２つのペプチド間に配列、分子、スペーサー、リンカーなどが介在している状態で接合または結合されると考えられる。
【００３８】
「主要組織適合複合体」または「ＭＨＣ」は、生理学的免疫応答に関与する細胞相互作用の制御において役割を果たす遺伝子クラスタである。ヒトにおいては、ＭＨＣ複合体はＨＬＡ複合体としても公知である。ＭＨＣおよびＨＬＡ複合体の詳細な説明については、例えばＰａｕｌ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３を参照のこと。
【００３９】
「医薬的に許容される」という語句は、一般に無毒性、不活性および／または生理学的に適合性ある組成物を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
発明者らは、ｐａｎ−ＤＲ結合性をもつ新しい部類のペプチド、すなわちペプチドが数多くの異なるＤＲ対立遺伝子によりコードされるＭＨＣクラスＩＩ分子に結合して、ペプチドが広範囲の個体において免疫応答を刺激できるようにすることを発見した。さらに発明者らは、この新しいペプチドの多くが、著しく改善されたプロテアーゼ耐性を有し、こうしてより長い生体内半減期を可能にすることを発見した。意外にも、これらのペプチドの一部は、公知のｐａｎ−ＤＲペプチドに比べて免疫応答を高める大幅に増大した能力を示す。
【００４１】
本発明のポリペプチド（またはそのフラグメント）の生物活性は、適切なＭＨＣ分子を結合し、標的免疫原または免疫原ミメティックに対する免疫応答を誘発するのを任意に補助するＴヘルパー応答を誘発する能力である。抗体応答を刺激するために有用なペプチドの場合、本発明のペプチドはＴヘルパー応答を誘発し、このことが今度は標的免疫原に対する体液性応答の誘発を補助する。
【００４２】
ＩＩ．  ｐａｎ−ＤＲ結合ペプチド
本発明は、ｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドである新しい部類のペプチドを提供し、その使用を提供する。本発明のペプチドは、数多くの異なるＤＲ対立遺伝子の２つ以上を結合でき、こうしてさまざまな抗原／免疫原に対する免疫応答を増大させるのに用いられる。本発明のペプチドはさらに、例えば米国特許第５，７３６，１４２号（ＵＳ５，７３６，１４２）で開示されているような公知のｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドと比べて増強した免疫応答を惹起するのに用いられる。
【００４３】
本明細書中で実証される通り、本発明者らは、多数のＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるＭＨＣ分子に結合する一連のペプチド配列を同定した。一部にはこのデータを考慮して、本発明者らは、以下の配列モチーフが、活性および免疫原性の改善されたｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドを表わすものと判定した。一部の実施形態において、本発明のポリペプチドは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上の異なるＤＲ対立遺伝子によりコードされるＭＨＣ分子を結合できるオリゴペプチド配列を含み、ここでオリゴペプチド配列はＡＸ1ＦＶＡＡＸ2ＴＬＸ3ＡＸ4Ａ（配列番号１）を含み、式中Ｘ1はＷ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、ＩおよびＫからなる群から選択され；Ｘ2はＦ、Ｎ、ＹおよびＷからなる群から選択され；Ｘ3はＨおよびＫからなる群から選択され；Ｘ4はＡ、ＤおよびＥからなる群から選択される。一部の実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上の異なるＤＲ対立遺伝子によりコードされるＭＨＣ分子を結合できるオリゴペプチド配列を含み、ここでオリゴペプチド配列はＡＸ1ＦＶＡＡＸ2ＴＬＨＡＡＡ（配列番号２）を含み、式中Ｘ1はＹ、Ｈ、Ｉ、Ｅ、Ｎ、ＱおよびＫからなる群から選択され；Ｘ2はＦ、Ｎ、ＹおよびＷからなる群から選択される。本発明によると、オリゴペプチド配列はＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号３）を含まない。
【００４４】
一部の実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１または配列番号７２から選択されたオリゴペプチドの１３アミノ酸Ｃ末端フラグメントを構成する１つ以上のアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含む。
【００４５】
本発明のｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドは、多数の異なるＭＨＣ対立遺伝子を結合することができ、「ヘルパーペプチド」とも呼ばれ得る。一部の実施形態において、ｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上の異なるＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子によりコードされるＭＨＣ分子を結合することができる。一部の実施形態において、誘発される応答は、増強された免疫応答である。一部の実施形態において、免疫応答は、本発明のｐａｎ−ＤＲ結合オリゴペプチドに向けられている。代替的に、または付加的に、ＭＨＣ分子に対するｐａｎ−ＤＲ結合オリゴペプチドの結合は、例えば１つ以上のＣＴＬペプチドを含むポリペプチドなどの第２の抗原に対する免疫応答および／またはタンパク質または非タンパク質抗原に対する体液性（すなわち抗体）応答をさらに増強する。
【００４６】
本明細書中で記述されているｐａｎ−ＤＲポリペプチド配列は単独で、またはより大きな融合タンパク質またはコンシュゲートの一部として使用可能である。こうして、本発明のポリペプチドは、本明細書中で記されているｐａｎ−ＤＲペプチド配列に加えていずれかのまたは両方の末端に追加のアミノ酸を含み得る。例えば、タグまたはマーカーとして他のアミノ酸配列を含み入れるかまたは生体内または試験管内の安定性を促進するかまたそうでなければ当該技術分野において一般に理解される通りの追加のメリットを含み入れることが望ましい可能性がある。さらに、本発明のポリペプチドは、ポリペプチド内に１つ以上のｐａｎ−ＤＲオリゴペプチド配列の１、２、３個以上のコピーを含むことができかつ／または本発明のポリペプチド内に多数の異なるｐａｎ−ＤＲオリゴペプチド配列を含むことができる。その上、ポリペプチドは、例えばこのような配列またはこのような配列を含むポリペプチドに対する免疫応答を増強することが必要である場合に、少なくとも１つの追加のＨＴＬオリゴペプチドおよび／またはＣＴＬオリゴペプチドおよび／または抗体誘発性ポリペプチドを含むことができる。このような実施形態において、本明細書中に記述されているｐａｎ−ＤＲ配列は、キーホールリンペットヘモシアニン、破傷風トキソイドおよびジフテリアトキソイドなどの従来の担体タンパク質に対する代替物として、または先行技術の万能Ｔ−ヘルパーエピトープの代替物として機能する。
【００４７】
本発明のポリペプチドは任意の長さのものであり得る。一部の実施形態において、本発明の少なくとも１つのｐａｎ−ＤＲ結合オリゴペプチド配列および任意には他のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、例えばアミノ酸１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、８０、６０、５０、４０、３０、２０または１５個以下の長さを有するが、多くの場合、１つまたは複数のｐａｎ−ＤＲ結合オリゴペプチドを含むポリペプチドは、（ポリペプチドが未変性ポリペプチド配列の大部分を含むように）本発明のｐａｎ−ＤＲ結合オリゴペプチドの１つまたは数個を導入することによって修飾されている未変性ポリペプチドとほぼ同じ長さを有する。一方、本発明のｐａｎ−ＤＲ結合オリゴペプチドを含む本発明の一部のポリペプチドは、「マルチエピトープ構築物」、すなわち１つ以上の抗原から誘導された複数のエピトープを含み、構築物の抗原性または免疫原性を最適化するためにエピトープが非天然発生手順で組織されていないポリペプチドである。したがって、本発明のポリヌクレオチドの開示の下で以下に論述するマルチエピトープ発現産物も同様に、本発明のペプチドの実施形態である。
【００４８】
このようなマルチエピトープ構築物において、複数のエピトープは典型的に、複数のＣＴＬエピトープ、複数のＢ細胞エピトープ、複数のＴヘルパーリンパ球エピトープ、複数のＣＴＬおよびＢ細胞エピトープ、複数のＣＴＬおよびＴヘルパーリンパ球エピトープ、複数のＢ細胞およびＴヘルパーリンパ球エピトープ、ならびに複数のＢ細胞、ＣＴＬおよびＴヘルパーリンパ球エピトープから選択される。これらのエピトープは、単一の抗原タンパク質から誘導されてよいが、少なくとも２つの異なるポリペプチド抗原から誘導されてもよく、同様にこれらは同じまたは異なる種（例えば細菌、ウイルスおよび寄生虫の種）から誘導されてよい。
【００４９】
一部の実施形態では、ｐａｎ−ＤＲ結合オリゴペプチド配列は、末端ＮＨ2アシル化、例えばアルカノイル（Ｃ1−Ｃ20）またはチオグリコリルアセチル化、末端カルボキシアミド化、例えばアンモニア、メチルアミンなどによって修飾されていることにより、原初の配列と異なっている可能性がある。一部の実施形態において、これらの修飾は、支持体またはその他の分子に対する連結のための部位を提供してよい。
【００５０】
以上で同定されたペプチドの生物活性は、さまざまなシステム内で検定されてよい。典型的には、抗原特異的Ｔ細胞活性を阻害する能力が試験される。１つの例示的プロトコルにおいては、余剰のペプチドが、公知のＭＨＣ発現（例えばＤＲ１）を有する抗原提示細胞および公知の抗原特異性（例えば破傷風毒素８３０−８４３）およびＭＨＣ制限（ここでもＤＲ１）を有するＴ細胞クローン、そして免疫原性ペプチド自体（例えば破傷風毒素８３０−８４３）と共にインキュベートされる。検定培養は、Ｔ細胞増殖のために充分な時間、例えば４日間インキュベートされ、その後、最後の１８時間のインキューベーションの間［3Ｈ］−チミジンでパルス処理することなどの標準的な手順を用いて増殖が測定される。ペプチドが与えられなかった対照と比べた阻害百分率が、次に計算される。
【００５１】
試験管内検定における抗原提示を阻害するペプチドの能力は、生体内での免疫応答を阻害するペプチドの能力と相関されてきた。生体内活性は、例えば免疫調節ペプチドそしてペプチドにより認識される特定のＭＨＣ分子に制限されるものとして公知である免疫原を投与することなどによって、動物モデルにおいて判定されてよい。その後、動物からＴリンパ球が取り出され、一用量範囲の免疫原と共に培養される。従来の手段、例えば［3Ｈ］−チミジンでのパルス処理および適切な対照に対する比較により、刺激の阻害が測定される。当然のことながら、或る種の実験上の詳細は、当業者には明白である。同様に、参照により本明細書に援用されているＡｄｏｒｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ３３４：６２３−６２５（１９８８）も参照のこと。
【００５２】
定義されたＭＨＣ分子、特にＭＨＣクラスＩＩ分子を伴う多数の細胞が公知であり、例えばｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（例えば、「Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」、第６版（１９８８）を参照）Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｕ．Ｓ．Ａ．から容易に入手可能である。
【００５３】
本発明のオリゴペプチドの一部の実施形態は、ＮおよびＣ末端残基に対する修飾を含む。当業者であれば充分理解できるように、ＮおよびＣ末端を修飾して、ペプチドの物理的または化学的特性を改変し、例えば結合、安定性、生物学的利用能、連結の容易さなどに影響を与えてもよい。
【００５４】
任意には、例えばＮまたはＣ末端におけるさまざまなアミノ酸ミメティックまたはＤ−アミノ酸でのペプチドの修飾が使用可能であり、例えば生体内でのペプチドの安定性を増大させる上で有用である。このようなペプチドは、「ｉｎｖｅｒｓｏ」型または「ｒｅｔｒｏｉｎｖｅｒｓｏ」型として、すなわち一配列のＬアミノ酸をＤアミノ酸で置換することによってかまたはアミノ酸の配列を逆転させＤアミノ酸でＬ−アミノ酸を置換することによって合成されてよい。Ｄペプチドは実質的にペプチダーゼに対する耐性がより高く、したがってそのＬ−ペプチド対応物と比べて血清および組織中でより安定していることから、生理学的条件下でのＤペプチドの安定性は、対応するＬペプチドと比べた親和性の差異を補償する以上のものであるかもしれない。さらに、置換を伴うまたは伴わないＬアミノ酸含有ペプチドをＤアミノ酸でキャッピングして、免疫原性ペプチドのエクソペプチダーゼ破壊を阻害することができる。
【００５５】
ポリペプチドの生体内安定性は、数多くの方法で検定できる。例えば、ペプチダーゼおよびさまざまな生体媒質例えばヒトの血漿および血清を使用して、安定性が試験されてきた。例えば、全て参照により本明細書に援用されているＶｅｒｈｏｅｆら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ．１１：２９１−３０２（１９８６）；Ｗａｌｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１４８：９８−１０３（１９７５）；Ｗｉｔｔｅｒら、Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ３０：３７７−３８１（１９８０）；Ｖｅｒｈｏｅｆら、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１１０：５５７−５６２（１９８６）；Ｈａｎｄａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７０：５３１−５４０（１９８１）；Ｂｉｚｚｏｚｅｒｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２２：２５１−２５８（１９８２）；Ｃｈａｎｇ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５１：２１７−２２４（１９８５）を参照のこと。
【００５６】
生物活性にとって不可欠である一部のアミノ酸残基、例えば重要な接触部位にあるアミノ酸残基は一般に生物活性に対する不利な効果無く改変され得ないことは容易に認識されることから、本発明のペプチドまたは類似体は、一部の残基の順序または組成を改変させることによって修飾可能である。重要でないアミノ酸は、Ｌ−α−アミノ酸またはそのＤ−異性体などのタンパク質内で自然に発生するアミノ酸に限定される必要はなく、非タンパク質アミノ酸例えばβ−γ−δアミノ酸、ならびにＬ−α−アミノ酸の数多くの誘導体も含んでいてよい。本発明のオリゴペプチドはＬアミノ酸かＤアミノ酸のいずれかを含み得るが、通常、コア結合領域内部にＤアミノ酸を含むことはできない。
【００５７】
本発明のペプチドは、多様な方法で調製可能である。一部の実施形態では、組換えＤＮＡ技術が利用され、この場合本発明の免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現ベクター内に挿入され、適切な宿主細胞へと形質転換またはトランスフェクトされ、発現に適した条件下で培養される。これらの手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）中に一般的に記載されている通り、当該技術分野において一般に公知である。あるいは、そのサイズに応じて、従来の技術にしたがって、溶液中かまたは固体支持体上でポリペプチドを合成することができる。さまざまな自動合成装置が市販されており、公知のプロトコルにしたがって使用可能である。例えばＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（１９８４）、上掲書。
を参照のこと。
【００５８】
ＩＩＩ．  ポリヌクレオチド
本発明は、本明細書中で記述されている通りの本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上の異なるＤＲ対立遺伝子によりコードされるＭＨＣ分子を結合できるオリゴペプチド配列を含み、ここでオリゴペプチド配列はＡＸ1ＦＶＡＡＸ2ＴＬＸ3ＡＸ4Ａ（配列番号１）を含み、式中Ｘ1はＷ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、ＩおよびＫからなる群から選択され；Ｘ2はＦ、Ｎ、ＹおよびＷからなる群から選択され；Ｘ3はＨおよびＫからなる群から選択され；Ｘ4はＡ、ＤおよびＥから選択される。一部の実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上の異なるＤＲ対立遺伝子によりコードされるＭＨＣ分子を結合できるオリゴペプチド配列を含み、ここでオリゴペプチド配列はＡＸ1ＦＶＡＡＸ2ＴＬＨＡＡＡ（配列番号２）を含み、式中Ｘ1はＹ、Ｈ、Ｉ、Ｅ、Ｎ、ＱおよびＫからなる群から選択され；Ｘ2はＦ、Ｎ、ＹおよびＷからなる群から選択される。本発明によると、オリゴペプチド配列はＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号３）を含まない。一部の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１または配列番号７２から選択されたオリゴペプチドの１３アミノ酸Ｃ末端フラグメントを各々構成する１つ以上のアミノ酸配列をコードし、ポリヌクレオチドは、他のアミノ酸配列と融合して配列または切形を含むポリペプチドをコードしてよい。したがって、本発明の少なくとも１つのｐａｎ−ＤＲ結合オリゴペプチド配列を含めた２つ以上のＣＴＬおよび／またはＨＴＬオリゴペプチド配列を含む、本明細書中で開示されている通りのポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドが提供される。
【００５９】
本発明のポリヌクレオチド構築物は、上述のペプチドまたはポリペプチドのいずれでもコードすることができる。例えば多数のクラスＩおよび／またはクラスＩＩＭＨＣエピトープおよび／またはＢ細胞エピトープ、例えば２つ以上のクラスＩＩＭＨＣエピトープ（すなわち本明細書中に記述されている少なくとも１つのｐａｎ−ＤＲ結合オリゴペプチド、例えば配列番号１、２および４〜７２）またはクラスＩＭＨＣエピトープとクラスＩＩＭＨＣエピトープおよびＢ細胞エピトープの組合せなど。クラスＩＭＨＣコーディングエピトープ核酸は、「ＣＴＬエピトープ核酸」とも呼ばれ、クラスＩＩＭＨＣコーディングエピトープ核酸は「ＨＴＬエピトープ核酸」とも呼ばれる。「Ｂ細胞エピトープ」は、抗体またはＢ細胞受容体を結合させる線状または立体構造エピトープである。一部のマルチエピトープ構築物は、クラスＩＭＨＣエピトープおよび／またはＢ細胞エピトープをコードするその配列の一部分と、クラスＩＩＭＨＣエピトープをコードする別の部分とを有することができる。一部の実施形態において、ＣＴＬエピトープ核酸は、長さがアミノ酸約８〜約１５個、例えばアミノ酸約８〜約１１個、例えばアミノ酸約９個のエピトープペプチドをコードする。ＨＴＬエピトープ核酸は、本明細書中に記述されている通り少なくとも１つのｐａｎ−ＤＲオリゴペプチドをコードするが、２つ以上のＨＴＬエピトープが含まれる場合、他のＨＴＬエピトープも同様に使用可能である。一部の実施形態において、ポリヌクレオチド構築物は、例えば５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上または２５個以上のエピトープ核酸を含む。マルチエピトープポリヌクレオチド構築物中のＣＴＬエピトープ核酸は全て、１つの生体に由来するものであり得（例えば全てのエピトープ核酸のヌクレオチド配列はＨＩＶ株内に存在するかもしれない）、またはマルチエピトープ構築物は２つ以上の異なる生体内に存在するエピトープ核酸を含み得る（例えば一部のエピトープがＨＩＶ由来で一部がＨＣＶ由来）。以下で記述する通り、マルチエピトープ構築物内の１つ以上のエピトープ核酸は、スペーサー核酸によりフランキングされていてよい。
【００６０】
この先で理解されるように、本発明のＰＡＤＲＥ類似体に連結されているかまたはその他の形でこの類似体を含むポリペプチドを含むＢ細胞エピトープをコードする核酸構築物が、本発明の一実施形態である。このような核酸構築物は典型的に、発現産物中に存在するＰＡＤＲＥ類似体がポリペプチド由来のＢ細胞エピトープの立体構造とマイナスに干渉しない場合に融合構築物をコードする。Ｂ細胞エピトープが線状である場合、Ｂ細胞エピトープは単純にＰＡＤＲＥ類似体に融合されてよく、したがってコーディング核酸の提供は比較的簡単である。しかしながら、Ｂ細胞エピトープが立体構造エピトープである場合、ＰＡＤＲＥ類似体コーディング核酸の導入点の典型的な例は、ポリペプチドのフレキシブルループ内かまたは、フレキシブル末端内（例えばタンパク質ドメイン全体かさらにはポリペプチド全体を使用することによる立体構造エピトープの３Ｄ構造の保存が求められる場合）であるが、例えば問題のポリペプチドの細胞内に閉じ込められた部分をコードする領域は生体内での免疫応答と関連性をもたないことから、これらの領域内にＰＡＤＲＥ類似体コーディング核酸を導入することも同様に可能である。このような核酸構築物の発現産物は、導入されたＰＡＤＲＥ類似体配列が発現産物に対する免疫応答の惹起において増大したＴリンパ球ヘルプを提供することになるため、抗体誘発用免疫原として有用である。こうして、発現産物は免疫原として直接使用されてよく（例えば動物における抗体産生のために使用される免疫原性組成物またはワクチン内の抗体誘発用）、あるいは、コーディング核酸での核酸免疫付与に付された動物において生体内で発現された後、その効果を及ぼしてもよい。
【００６１】
「スペーサー」とは、接合エピトープの発生を防止するためおよび／またはプロセッシングの効率を増大させるためマルチエピトープ構築物内の２つのエピトープの間に挿入される配列を意味する。マルチエピトープ構築物は、１つ以上のスペーサー核酸を有する場合がある。スペーサー核酸は構築物内で各エピトープ核酸にフランキングしてよく、あるいはスペーサー核酸対エピトープ核酸の比率は約２対１０、約５対１０、約７対１０、約８対１０、または約９対１０であってよく、ここで約８対１０という比率が一部の構築物にとって有利な結果を生み出すものと判定されている。
【００６２】
スペーサー核酸は１つ以上のアミノ酸をコードしてよい。一部の実施形態において、マルチエピトープ構築物内のクラスＩＭＨＣエピトープにフランキングするスペーサー核酸は、長さがアミノ酸１〜約８個、アミノ酸２〜８個、アミノ酸３〜８個、アミノ酸４〜８個、アミノ酸５〜８個、アミノ酸６〜８個、またはアミノ酸７〜８個である。マルチエピトープ構築物内でクラスＩＩＭＨＣエピトープにフランキングするスペーサー核酸は、一部の実施形態において長さがアミノ酸５、６、７個以上、そして一部の実施形態においてアミノ酸５個または６個超である。
【００６３】
１構築物内のスペーサーの数、スペーサポリヌクレオチド内でコードされるアミノ酸の数およびスペーサーのアミノ酸組成を、エピトープのプロセッシングを最適化しかつ／または接合エピトープを最小限に抑えるように選択することができる。一部の実施形態では、スペーサーは、エピトーププロセッシングおよび接合モチーフを同時に最適化することにより選択される。本明細書では、エピトーププロセッシングを最適化するための適切なアミノ酸について記述されている。同様に、構築物内の接合エピトープ数を最小限にするための適切なアミノ酸スペーシングが、本明細書中に、クラスＩおよびクラスＩＩＨＬＡについて記述されている。例えば、クラスＩＩＭＨＣエピトープにフランキングするスペーサーは、一部の実施形態において、一般にＧ、Ｐおよび／またはＮ残基が一次アンカー残基であるものとして公知でないことからこれらを含むことができる（例えばＰＣＴ米国特許第００／１９７７４号（ＰＣＴ／ＵＳ００／１９７７４）を参照のこと）。一部の実施形態において、クラスＩＭＨＣエピトープにフランキングするためのスペーサーは、交互のＧおよびＰ残基例えば（ＧＰ）n、（ＰＧ）n、（ＧＰ）nＧ、（ＰＧ）nＰなどを含み、ここでｎは１〜１０、２〜約２の間の整数であり、一部の実施形態において、このようなスペーサーの具体例はＧＰＧＰＧまたはＰＧＰＧＰである。クラスＩＭＨＣエピトープの一部の実施形態において、スペーサーは、任意にはＫ、ＮまたはＧが先行する１、２、３個以上の連続するアラニン（Ａ）残基を含む。
【００６４】
一部のマルチエピトープ構築物において、各スペーサー核酸が同じアミノ酸配列をコードすることで充分である。同じアミノ酸配列をコードする２つのスペーサー核酸を有するマルチエピトープ構築物において、これらのスペーサーをコードするスペーサー核酸は同じまたは異なるヌクレオチド配列を有していてよく、ここで、細胞内にマルチエピトープ構築物が挿入された場合、異なるヌクレオチド配列が、意図されない組換え事象の発生確率を減少させるかもしれない。
【００６５】
他のマルチエピトープ構築物においては、スペーサー核酸の１つ以上が異なるアミノ酸配列をコードしてよい。スペーサー核酸の多くがマルチエピトープ構築物内の同じアミノ酸配列をコードしてよいが、１、２、３、４、５個以上のスペーサー核酸が異なるアミノ酸配列をコードする場合があり、マルチエピトープ構築物内のスペーサー核酸の全てが異なるアミノ酸配列をコードすることが可能である。スペーサー核酸は、本明細書中で記述されている通り、スペーサー配列がエピトーププロセッシングを最大限にするかおよび／または接合エピトープを最小限にするかを判定することによって、自らフランキングするエピトープ核酸に関して最適化されてよい。
【００６６】
マルチエピトープ構築物は、１つの構築物内のスペーサーが別の構築物に比べてエピトーププロセッシングを最適化するかまたは接合エピトープを最小限に抑えるかによって、互いに区別されてよく、一部の実施形態においては、１つの構築物がもう１つの構築物に比べてエピトーププロセッシングおよび接合エピトープについて同時に最適化されている場合、構築物を区別してよい。１つの構築物がエピトーププロセッシングおよび接合モチーフについて最適化されているか否かを決定するためのコンピュータ援用方法および試験管内および生体内実験室方法が、本明細書において記述されている。
【００６７】
一部の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド構築物は、本発明の少なくとも１つのｐａｎ−ＤＲ結合オリゴペプチド配列そして任意にはポリペプチドに関連して本明細書中で記述された配列のいずれかまたは全てをコードする核酸を含む発現ベクターとして提供されている。このような発現ベクターの構成は、例えばその開示が参照により本明細書に援用されているＰＣＴ米国特許第９９／１０６４６号（ＰＣＴ／ＵＳ９９／１０６４６）の中に記載されている。発現ベクターは、抗原が発現され適切なＭＨＣ分子に標的化されるように生体の適切な細胞内で核酸をコードする転写単位を発現することのできる少なくとも１つのプロモータ要素を含んでいる。例えば、ヒトへの投与のためには、ヒト細胞内で機能するプロモータ要素が発現ベクター内に取込まれる。
【００６８】
本発明において使用される一般的方法を開示する基本的教書には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；および  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、編、１９９４）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｋｕｉｊｐｅｒｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８（１７）：５１９７（１９９４）；Ｄｕｅｈｏｌｍ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：５７６７−５７７３（１９９４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２０巻（Ａｇｒａｗａｌ、編）；およびＴｉｊｓｓｅｎ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ、例えば、第Ｉ部、第２章、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」（１９９３））が含まれる。
【００６９】
関連するオリゴペプチド配列（例えばエピトープ）をコードする核酸は、標準的な技術にしたがって構築物の中に組立てることができる。一部の実施形態において、ｐａｎ−ＤＲ結合オリゴペプチドそして任意にはマルチエピトープポリペプチドをコードする核酸配列は、オリゴヌクレオチドプライマを用いる増幅技術を用いて単離されるかまたは化学的に合成される。該当する場合には、組換えクローニング技術も使用可能である。所望のエピトープを増幅する（構築物を組立てるのにＰＣＲを使用する場合）またはコードする（構築物を組立てるのに合成オリゴヌクレオチドを使用する場合）オリゴヌクレオチド配列が選択される。
【００７０】
典型的にはプライマを使用する増幅技術を用いて、ＤＮＡまたはＲＮＡからの選択されたエピトープをコードする配列を増幅し単離する。（米国特許第４，６８３，１９５号（Ｕ．Ｓ．４，６８３，１９５）および４，６８３，２０２号（４，６８３，２０２）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら、編、１９９０））を参照のこと）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）などの方法を使用して、ｍＲＮＡから、ｃＤＮＡから、ゲノムライブラリからまたはｃＤＮＡライブラリから直接エピトープ核酸配列を増幅することができる。プライマ内に制限エンドヌクレアーゼ部位を取込むことが可能である。ＰＣＲ反応により増幅されたマルチエピトープ構築物をアガロースゲルから精製し、適切なベクター内にクローニングすることが可能である。
【００７１】
本発明のポリヌクレオチドを構成するために、合成オリゴヌクレオチドも使用することができる。一部の実施形態において、この方法は、遺伝子のセンスおよびナンセンスストランドを表わす一連の重複するオリゴヌクレオチドを用いて実施される。これらのＤＮＡフラグメントは次にアニールされ、ライゲートされ、クローニングされる。市販されていないオリゴヌクレオチドは、Ｖａｎ  Ｄｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、７２：６１５９−６１６８（１９８４）中に記載されている通りの自動合成装置を用いてＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９−１８６２（１９８１）が最初に記述した固相ホスホラミジットトリエステル法にしたがって化学的に合成可能である。オリゴヌクレオチドの精製は、ＰｅａｒｓｏｎおよびＲｅａｎｉｅｒ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７−１４９（１９８３）内で記述されているようなアニオン交換ＨＰＬＣまたは未変成アクリルアミドゲル電気泳動法による。
【００７２】
一部の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド構築物のエピトープは、転写を導くための強力なプロモータならびにエンハンサやポリアデニル化部位などの他の調節配列を含む発現ベクターの形にサブクローニングされる。適切なプロモータは当該技術分野において周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、およびＡｕｓｕｂｅｌら、の中に記載されている。哺乳動物細胞のための真核生物発現系は当該技術分野において周知であり、市販されている。このようなプロモータ要素には例えば、サイトメガウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲおよびＳＶ４０が含まれる。
【００７３】
発現ベクターは典型的には、宿主細胞内でのポリヌクレオチド構築物の発現に必要とされる追加の要素を全て含む転写単位または発現カセットを含む。例えば、発現カセットは写しの効率的ポリアデニル化のために必要なシグナルおよびマルチエピトープ構築物に作動的に連結されたプロモータを含み得る。カセットの追加の要素は、機能的スプライスドナーおよびアクセプタ部位を伴うイントロンおよびエンハンサを含んでいてよい。
【００７４】
プロモータ配列に加えて、発現カセットは、効率的終結を提供するために構造遺伝子の下流側に転写終結領域も含むことができる。終結領域は、プロモータ配列と同じ遺伝子から得られてもよいし、あるいは異なる遺伝子から得られてもよい。
【００７５】
本発明のペプチドを発現するために使用される発現ベクター内に選択可能なマーカーを取込むことができる。これらの遺伝子は、選択培地中で成長した形質転換済み宿主細胞の存続または成長に必要な、タンパク質などの遺伝子産物をコードすることができる。選択遺伝子を含む遺伝子で形質転換されていない宿主細胞は培地中で存続しない。典型的な選択遺伝子は、抗生物質またはその他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質をコードする。代替的には、選択可能なマーカーは、栄養要求性欠乏症を補足するかまたは複合培地からは入手できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードしてよい。一部の実施形態において、ベクターは、例えばＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）内、または宿主細胞内への導入に先立ちベクターがその中で複製されるその他の細胞内で機能的である１つの選択可能なマーカーを有するものである。当業者にとっては、数多くの選択可能なマーカーが公知である。
【００７６】
細胞内に遺伝情報を輸送するために、さまざまな発現ベクターを使用することができる。真核細胞内での発現のために使用される従来のベクターのうち任意のものを使用してよい。真核ウイルス由来の調節要素を含む発現ベクターが、典型的に真核細胞発現ベクター、例えばＳＶ４０ベクター、ＣＭＶベクター、乳頭腫ウイルスベクターおよびエプスタイン・バー・ウイルス由来のベクター内で使用される。
【００７７】
本発明のポリヌクレオチド構築物は、プラスミドベクターならびにウイルスまたは細菌ベクターを含めたさまざまなベクターから発現可能である。ウイルス発現ベクターの例としては、弱毒化ウイルス宿主例えば牛痘または鶏痘が含まれる。このアブローチの例として、本発明の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとしてワクチニアウイルスが使用される。腫瘍を担持する宿主内への導入時点で、組換えワクチニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、こうして宿主ＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を惹起する。ワクチニアベクターおよび免疫付与プロトコルにおいて有用な方法は、例えば米国特許第４，７２２，８４８号（ＵＳ４，７２２，８４８）の中で記述されている。
【００７８】
本発明のポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ、その他の細菌宿主、酵母および昆虫細胞を含めたさまざまな宿主細胞中で発現されて、本明細書中で記述されているタンパク質発現産物を提供することができる。宿主細胞は、例えば酵母細胞、細菌細胞または糸状菌細胞などの微生物である。適切な宿主細胞の例としては、他の数多くのもののうち例えばシュードモナス属、エシュリキア属（例えばＥ．ｃｏｌｉ）、バチラス属が含まれる。適切な酵母細胞は、例えばサッカロミセス属（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびカンジタ属を含めた複数の属のうちのいずれかのものであり得る。適切な真核細胞は、ピチア属、アスペルギルス属そして組換え産生に適したその他の真菌から選択される。適切な昆虫細胞は、例えばＳ２、Ｓｆ９およびＨｉ−５細胞を含めた複数の亜種の細胞であり得る。
【００７９】
当業者にとっては、例えばアデノおよびアデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、非ウイルスベクター例えばＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）、チフス菌ベクター、無毒化炭疽菌毒素ベクターなどの、治療的投与または免疫付与に有用な多様な他のベクターが明白である。したがって、本発明は同様に、必要としている個体に対してこのようなベクターを投与することによる、このようなベクターの予防的または治療的使用にも関する。
【００８０】
マルチエピトープ構築物の免疫原性および抗原性は、本明細書中で記述されている通りに評価される。
【００８１】
以上で記したように、本発明は同様に、本明細書中で記述されている通りの本発明のポリヌクレオチドのいずれかによりコードされる単離ポリペプチドにも関し、したがって、これらのポリペプチドも同様に本発明の「ペプチド」またはポリペプチドである。
【００８２】
ＩＶ．  さらなる抗原
以上で説明したように、本発明のｐａｎ−ＤＲオリゴペプチドは、さまざまな抗原に対する細胞または体液性免疫応答を増強するために使用することができる。このような抗原に由来する抗原決定基または抗原自体は、本発明のｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドと混和した形、またはそれに連結させた形で投与可能である。例えば、免疫応答を惹起するまたは増強するために、抗原決定基を本発明のヘルパーペプチドと連結または混合するか、またはそれと共に連続して投与することができる。本質的に、本発明のｐａｎ−ＤＲ結合オリゴペプチド配列と組合せた形でいかなる抗原でも使用することができる（例えば多糖類、タンパク質、糖タンパク質、脂質、糖脂質、リポ多糖類など）。タンパク質抗原は、細菌、真菌、ウイルス、原生動物、蠕虫および他の寄生虫などの感染性因子から誘導されてよいが、或る種の疾病状態において過剰発現されているかまたはその他の形で不適当である抗原あるいは癌抗原などの疾病関連抗原であってもよい。国際公開第００／２００２７号（ＷＯ００／２００２７）に列挙されている癌抗原は全て、関連性あるタンパク質抗原であり、さらなる抗原は炎症に付随する抗原である（ここではＴＮＦがその好例である）。本発明は、全てが本発明の一部を成している数多くのＴＮＦ構築物を開示しており、一般にこれらの構築物は全て、それらをコードする核酸フラグメント、核酸フラグメントを含むベクターおよび核酸フラグメントまたはベクターを含む宿主細胞（またはベクターで形質転換されている宿主細胞）と同様、本発明の一部を成すものである。
【００８３】
一部の実施形態において、本発明のオリゴペプチドは、単独で投与される。一部の実施形態において、本発明のオリゴペプチドは、第２の抗原決定基と併用して投与される。一部の実施形態において、本発明のオリゴペプチドは、抗原決定基と混和される。一部の実施形態において、本発明のペプチドは、抗原決定基に連結される。例えば、タンパク質抗原を、（ペプチド結合を介して）融合タンパク質としてｐａｎ−ＤＲ結合オリゴペプチドに対して間接的に、または直接的に連結させることができる。非タンパク質抗原を含めた抗原を、他の共有結合コンジュゲーション方法を介して、ｐａｎ−ＤＲ結合オリゴペプチドまたはオリゴペプチド配列を含むポリペプチドに対し連結させることができる。
【００８４】
一部の実施形態において、本発明のペプチドと共に投与される抗原決定基はタンパク質である。一部の実施形態において、本発明のペプチドと共に投与される抗原決定基は多糖類である。一部の実施形態において、本発明のペプチドと共に投与される抗原決定基は糖タンパク質である。一部の実施形態において、本発明のペプチドと共に投与される抗原決定基は脂質である。一部の実施形態において、本発明のペプチドと共に投与される抗原決定基は糖脂質である。一部の実施形態において、本発明のペプチドと共に投与される抗原決定基はリポ多糖類である。
【００８５】
炭水化物エピトープは炭水化物構造を含むが、コンジュゲート例えば糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質など、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または多糖類オリゴ糖または単糖として存在することができ、これらに対する免疫応答が所望される。炭水化物エピトープは、広範囲の免疫応答を誘発してよい。当業者であれば、本明細書中で例示されているさまざまな炭水化物構造を、抗原性に不利な影響を及ぼすことなく標準的な方法にしたがってさまざまな形で修飾することができる、ということを認識するものである。例えば、サッカリドの単糖単位は、さまざまな形で置換されるかまたさらには小有機分子と置換されてよく、これは単糖類のためのミメティックとして役立つ。
【００８６】
適切な抗原の例としては、炭水化物ベースのワクチンの中で使用可能である細菌表面多糖類から誘導されたものが含まれる。細菌は典型的には、糖タンパク質、糖脂質、リポ多糖類の０特異的側鎖、莢膜多糖類などの一部としてその細胞表面上で炭水化物を発現する。例示的細菌菌株としては、肺炎連鎖球菌（例えば国際公開第２００５／１２０５６３号（ＷＯ／２００５／１２０５６３）およびその中の炭水化物エピトープを参照のこと）、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ヘモフィラス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、クレブシエラ菌株（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、シュードモナス菌株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、サルモネラ菌株（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、シゲラ菌株（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．）およびグループＢストレプトコッキィ（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）が含まれる。
【００８７】
数多くの適切な細菌炭水化物エピトープが、先行技術（例えばＳａｎｄｅｒｓら、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．３７：８１２−８１９（１９９５）；Ｂａｒｔｏｌｏｎｉら、Ｖａｃｃｉｎｅ１３：４６３−４７０（１９９５）；Ｐｉｒｏｆｓｋｉ、ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：２９０６−２９１１（１９９５）および国際公開第ＷＯ９３／２１９４８号（ＷＯ９３／２１９４８）））中で記述されており、例えば米国特許第６，４１３，９３５号（ＵＳ６，４１３，９３５）に記載の通りである。
【００８８】
一般に、以下の国際特許出願のいずれか１つにおいて開示されているＨＬＡ結合エピトープは、本発明によると有用であるかもしれず、したがってそれらの内容は参照により本明細書に援用される；国際公開第９３／０３７６４号（ＷＯ９３／０３７６４）、国際公開第９５／２２３１７号（ＷＯ９５／２２３１７）、国際公開第９４／０３２０５号（ＷＯ９４／０３２０５）、国際公開第９５／１９７８３号（ＷＯ９５／１９７８３）、国際公開第９７／３４６１７号（ＷＯ９７／３４６１７）、国際公開第０２／２００５３号（ＷＯ０２／２００５３）、国際公開第９４／２０１２７号（ＷＯ９４／２０１２７）、国際公開第９７／３４６２１号（ＷＯ９７／３４６２１）、国際公開第０２／２０６１６号（ＷＯ０２／２０６１６）、国際公開第９５／０７７０７号（ＷＯ９５／０７７０７）、国際公開第９５／０４８１７号（ＷＯ９５／０４８１７）、国際公開第９８／３３８８８号（ＷＯ９８／３３８８８）、国際公開第９４／２６７７４号（ＷＯ９４／２６７７４）、国際公開第９６／０３１４０号（ＷＯ９６／０３１４０）、国際公開第０２／２００３５号（ＷＯ０２／２００３５）、国際公開第９６／４０２１３号（ＷＯ９６／４０２１３）、国際公開第９７／２６７８４号（ＷＯ９７／２６７８４）、国際公開第９７／３３６０２号（ＷＯ９７／３３６０２）、国際公開第９８／３２４５６号（ＷＯ９８／３２４５６）、国際公開第９９／６１９１６号（ＷＯ９９／６１９１６）、国際公開第９９／４５９５４号（ＷＯ９９／４５９５４）、国際公開第９９／６５５２２号（ＷＯ９９／６５５２２）、国際公開第０１／６２７７６号（ＷＯ０１／６２７７６）、国際公開第０１／００２２５号（ＷＯ０１／００２２５）、国際公開第２００４／０３１２１１号（ＷＯ２００４／０３１２１１）、国際公開第９９／５８６５８号（ＷＯ９９／５８６５８）、国際公開第２００５／０１２５０２号（ＷＯ２００５／０１２５０２）、国際公開第００／４４７７５号（ＷＯ００／４４７７５）、国際公開第０２／０１９９８６号（ＷＯ０２／０１９９８６）、国際公開第２００４／０３１２１０号（ＷＯ２００４／０３１２１０）、国際公開第０１／２１１８９号（ＷＯ０１／２１１８９）、国際公開第０１／２４８１０号（ＷＯ０１／２４８１０）、国際公開第２００５／０３３２６５号（ＷＯ２００５／０３３２６５）、国際公開第０１／４２２７０号（ＷＯ０１／４２２７０）、国際公開第０１／４１７８８号（ＷＯ０１／４１７８８）、国際公開第０１／４２２６７号（ＷＯ０１／４２２６７）、国際公開第０１／４５７２８号（ＷＯ０１／４５７２８）、国際公開第０１／４１７８７号（ＷＯ０１／４１７８７）、国際公開第０２／０６１４３５号（ＷＯ０２／０６１４３５）、国際公開第０２／０６１４３５号（ＷＯ０２／０６１４３５）、国際公開第０１／４１７４１号（ＷＯ０１／４１７４１）、国際公開第２００４／０５２９１７号（ＷＯ２００４／０５２９１７）、国際公開第０１／３６４５２号（ＷＯ０１／３６４５２）、国際公開第０３／０８７１２６号（ＷＯ０３／０８７１２６）、国際公開第０１／４７５４１号（ＷＯ０１／４７５４１）、国際公開第０２／０８３７１４号（ＷＯ０２／０８３７１４）、国際公開第０１／４１７９９号（ＷＯ０１／４１７９９）、国際公開第２００５／０８９１６４号（ＷＯ２００５／０８９１６４）、国際公開第２００３／０４０１６５号（ＷＯ）、国際公開第２００５／１２０５６３号（ＷＯ２００５／１２０５６３）、国際公開第２００４／０９４４５４号（ＷＯ２００４／０９４４５４）、国際公開第２００４／０５３０８６号（ＷＯ２００４／０５３０８６）、国際公開第２００４／０８９９７３号（ＷＯ２００４／０８９９７３）、国際公開第２００８／０５４５４０号（ＷＯ２００８／０５４５４０）、国際公開第２００８／０３９２６７号（ＷＯ２００８／０３９２６７）、国際公開第９９／１９４７８号（ＷＯ９９／１９４７８）、国際公開第９２／２１０３３号（ＷＯ９２／２１０３３）、国際公開第９４／１１７３８号（ＷＯ９４／１１７３８）、国際公開第９３／２２３３８号（ＷＯ９３／２２３３８）、国際公開第９５／２５５３０号（ＷＯ９５／２５５３０）、国際公開第９５／２５７３９号（ＷＯ９５／２５７３９）、国際公開第２００５／１１８６２６号（ＷＯ２００５／１１８６２６）、国際公開第９３／０３７５３号（ＷＯ９３／０３７５３）、国際公開第９４／１９０１１号（ＷＯ９４／１９０１１）、国際公開第９５／０３７７７号（ＷＯ９５／０３７７７）、国際公開第９５／１９７８３号（ＷＯ９５／１９７８３）、国際公開第９５／０４５４２号（ＷＯ９５／０４５４２）、国際公開第０１／４２２７０号（ＷＯ０１／４２２７０）、国際公開第０１／４１７８８号（ＷＯ０１／４１７８８）、国際公開第０１／４２２６７号（ＷＯ０１／４２２６７）、国際公開第０１／４５７２８号（ＷＯ０１／４５７２８）、国際公開第０１／４１７８７号（ＷＯ０１／４１７８７）、国際公開第０１／４１７４１号（ＷＯ０１／４１７４１）、国際公開第２００４／０５２９１７号（ＷＯ２００４／０５２９１７）、国際公開第２００４／０９４４５４号（ＷＯ２００４／０９４４５４）および国際公開第２００４／０８９９７３号（ＷＯ２００４／０８９９７３）。
【００８９】
Ｖ．  コンジュゲートの調製
本発明のｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドは、さまざまな形で少なくとも１つのさらなる抗原決定基に連結され得る。末端を介したまたはリジンのε−アミノ基を介したイオン相互作用が可能である。残基の側基と抗原決定基の間の水素結合も同様に可能である。その他の実施形態においては、ｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドと抗原決定基の間の立体構造相互作用が、安定した付着を発生させるかもしれない。
【００９０】
以上で指摘した通り、抗原決定基は、本発明のコンジュゲートを調製するためにｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドに対し共有結合されてよい。一部の実施形態においては、抗原決定基／ｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドが、スペーサー分子またはリンカーにより連結される。一部の実施形態において、抗原決定基はリンカー無しでｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドに付着されてよい。
【００９１】
スペーサーまたはリンカーは典型的には、生理学的条件下で実質的に非荷電性であり線状または分岐側鎖を有していてよい中性分子例えば脂肪族炭素鎖、アミノ酸またはアミノ酸ミメティックで構成されている。当業者にとっては、さまざまな生体分子を連結するための数多くの組成物および方法が公知である。例えば、炭水化物エピトープに対してｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドを共有結合させるための数多くの方法が可能である。ｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドを炭水化物抗原に連結するのに適した方法は、例えば国際公開第９３／２１９４８号（ＷＯ９３／２１９４８）中で開示されている。
【００９２】
数多くのリンカーが周知であり、市販されているかまたは科学的文献中に記載されている。本発明において使用される連結分子は、分子の２つの部分が、それらに曝露された分子と独立してかつ自由に相互作用できるようにするのに充分な長さを有する。炭水化物エピトープの場合、連結分子の長さは典型的に１〜５０原子である。一部の実施形態において、連結分子はアリールアセチレン、２〜１４個のモノマー単位を含むエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二塩基酸、アミノ酸またはそれらの組合せである。他の適切なリンカーとしては、アミノ酸側鎖を通して異なる炭水化物部分が連結されるセラミドおよびアミノ酸残基などの脂質分子が含まれる。
【００９３】
使用される特定の連結分子は、その化学的／物理的特性に基づいて選択されてよい。連結分子は、各端部に適切な官能基を有し、一基は炭水化物部分上の反応性部位に対する付着に適切であり、もう一方の基はアミノ酸／ペプチド部分に対する付着に適切である。例えば、炭水化物部分に対する付着に適切な基は、カルボン酸、エステル、イソシアネート、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アシルおよびイソチオシアネートである。アミノ酸部分に対する付着のためには、類似の基が有用であると考えられる。官能基の適切な選択は、アミノ酸またはペプチドの反応性部分の性質によって左右されるものである。
【００９４】
１群の実施形態においては、アルキルまたはアルキレン基が連結基として有用であり、１〜２０個の炭素原子を有し、一部の実施形態においては３〜６個の炭素原子を含む。例えば、ポリエチレングリコールおよび関係する構造を含むリンカーを使用することができる。「ポリエチレングリコール」という用語は、例えばヘキサエチレングリコール（ＨＯ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）5−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ）などのエチレングリコールの反復単位を有する分子に言及するために用いられる。連結基に言及するために「ポリエチレングリコール」という用語が使用される場合、当業者は、その他のポリエーテルまたはポリオールも同様に使用できる（すなわちポリプロピレングリコールまたはエチレンとプロピレングリコールの混合物）ということを理解すると考えられる。
【００９５】
別の実施形態群において、アルキルまたはアルキレン連結基は過フッ素化され、生物学的分解を受ける可能性が低くなっている。米国特許第５，０５５，５６２号（ＵＳ．５，０５５，５６２）を参照のこと。一部の実施形態において、連結基は、アミノカプロン酸、４−ヒドロキシ酪酸、４−メルカプト酪酸、３−アミノ−１−プロパノール、エタノールアミン、ペルフルオロエタノールアミンおよびペルフルオロヒドロキシ酪酸を含む。一部の実施形態において、２つの部分はポリエチレングリコール部分を介して連結されている。
【００９６】
一部の実施形態において、ｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドとその他のペプチド（例えばｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドとＣＴＬまたはＢ細胞エピトープ（ただしこれらに限定されない））の間のリンカーは、Ａｌａ、Ｇｌｙまたは非極性アミノ酸または中性極性アミノ酸のその他のスペーサーから選択され得る。本明細書中の一部の実施形態において、中性スペーサーはＡｌａである。任意に存在するスペーサーは同じ残基で構成されている必要はなく、したがってヘテロまたはホモオリゴマーであってよい、ということが理解される。一部の実施形態において、例示的スペーサーは、Ａｌａのホモオリゴマーである。存在する場合、スペーサーは通常少なくとも１つまたは２つの残基、さらに通常は３〜６個の残基である。一部の実施形態において、ｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドは、ＣＴＬまたは抗体誘発ペプチドにコンジュゲートされる。一部の実施形態において、ｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドはアミノ末端に位置づけされる。ペプチドは、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａなどの中性リンカーによって接合され得、一部の実施形態においては、典型的にはＳｅｒ−Ｓｅｒ連結などを介してペプチドコンジュゲートのアミノ末端に付着される、Ｌｙｓ残基（（ＰＡＭ）2Ｌｙｓ）のアルファおよびイプシロンアミノ基に付着されているパルミチン酸などの脂質残基を含み得る。
【００９７】
ＣＴＬまたは抗体誘発ペプチドは、直接、あるいはＣＴＬペプチドのアミノまたはカルボキシ末端のいずれかにあるスペーサーを介して、ｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドに連結されてよい。ＣＴＬまたは抗体誘発ペプチドまたはｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドのいずれかのアミノ末端はアシル化可能である。一部の実施形態において、ＣＴＬペプチド／ｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドコンジュゲートは、以下で記述する通り、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒなどの１つ以上の連結残基を介して、一部のアルカノイル（Ｃ1−Ｃ20）脂質に連結され得る。一部の実施形態において、脂質部分はコレステロール、脂肪酸などを含む。
【００９８】
一部の実施形態において、本発明の医薬組成物は、ＣＴＬのプライミングを補助する少なくとも１つの成分を含み得る。脂質が、ウイルス抗原に対する生体内でのＣＴＬプライミングを補助できる作用物質として同定されてきた。例えば、ステロイド例えばコレステロール、脂肪酸例えばパルミチン酸残基（ただしこれらに限定されない）を、システイン残基のスルフヒドリル基、Ｌｙｓ残基のアルファおよびイプシロンアミノ基に付着させ、次に例えば１つ以上の連結残基例えばＧｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒなどを介して、免疫原性ペプチド例えばｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドに対して連結することができる。一部の実施形態において、脂肪酸の代りに、最終的アミノ酸（例えばシステイン残基）に対し、エーテル連結を通して長鎖アルキル基を連結することができる。
【００９９】
脂質化されたペプチドは、リポソーム中に取り込まれたミセル型で直接か、または例えば不完全フロインドアジュバントなどのアジュバント中で乳化された状態のいずれかで、注射され得る。一部の実施形態において、特に有効な免疫原は、免疫原性ペプチドのアミノ末端に対して例えばＳｅｒ−Ｓｅｒなどの連結を介して付着されているＬｙｓのアルファおよびイプシロンアミノ基に付着されたパルミチン酸を含む。
【０１００】
ＣＴＬ応答の脂質プライミングの別の例として、適切なペプチドに対し共有結合により付着されている場合にウイルス特異的ＣＴＬをプライミングするために、Ｅ．ｃｏｌｉリポタンパク質例えばトリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステンリセリル−セリン（Ｐ3ＣＳＳ）を使用することができる。Ｄｅｒｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ３４２：５６１−５６４（１９８９）を参照のこと。本発明のペプチドは例えばＰ3ＣＳＳにカップリングさせることができ、リポペプチドは個体に投与されて標的抗原に対するＣＴＬ応答を特異的にプライミングすることができる。一部の実施形態において、中和抗体の誘発も同様に、適切なエピトープを表示するペプチドにコンジュゲートされたＰ3ＣＳＳを用いてプライミングされ得、２つの組成物を組合せて、感染に対する体液性応答と細胞媒介応答の両方をより効果的に惹起することができる。
【０１０１】
炭水化物エピトープにコンジュゲートされたｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドの場合、脂質部分は、ペプチドの反対側の末端に連結されてよい（例えば炭水化物はＣ末端に連結され、脂質はＮ末端に連結される）。一部の実施形態において、脂質および炭水化物部分は両方共、ペプチドの同じ端部に連結されてよい。一部の実施形態において、２つの部分は、Ｎ末端上の同じリンカーに連結されてよい。
【０１０２】
ＶＩ．  免疫応答を刺激する方法
本発明のポリペプチド免疫原は、当業者にとっては公知のさまざまな方法を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉなどの発現宿主（または以上で論述した他の宿主細胞）から発現され、濃縮され、精製されてよく、代替的には、免疫原は液相または固相ペプチド合成により調製されてよい。精製されたポリペプチドまたはペプチド免疫原は、例えば免疫応答を刺激するかまたは増強し、任意には保護および／または治療的免疫応答を生成する目的で、個体の体内に投与するための医薬的に許容される賦形剤と共に調合可能である。「保護および／または治療的免疫応答」という語句は、何らかの形で疾病の症候、副作用または進行を防止するかまたは少なくとも部分的に阻み感染性因子を一掃する、例えば感染性因子から誘導された疾病関連抗原に対するＣＴＬおよび／またはＨＴＬおよび／または抗体応答を意味する。一部の実施形態において、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、免疫学的に有効な量の本発明のペプチドのうちの１つ以上と適切な薬学的担体とを含むワクチンの形に調合される。したがって、本発明のペプチドは、個別にかまたは単一組成物または多数の組成物のいずれかに組合わされた状態で投与可能である。
【０１０３】
本発明はさらに、免疫応答を刺激するため、本発明の発現ベクターまたはそれから誘導されたポリペプチドを含む医薬組成物を投与する方法に関する。発現ベクターは、例えばＤｏｎｎｅｌｌｙら、（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５：６１７−６４８（１９９７））；Ｆｅｌｇｎｅｒら、（米国特許第５，５８０，８５９号（ＵＳ．５，５８０，８５９）、１９９６年１２月３日発行）；Ｆｅｌｇｎｅｒ（米国特許第５，７０３，０５５号（ＵＳ．５，７０３，０５５）、１９９７年１２月３０日発行）；およびＣａｒｓｏｎら、（米国特許第５，６７９，６４７号（ＵＳ．５，６７９，６４７）、１９９７年１０月２１日発行）中に記載の当該技術分野において周知の方法によって投与される。一実施形態においては、マルチエピトープ構築物は、ネイキッド核酸として投与される。
【０１０４】
本発明の発現ベクターまたはそれから誘導されたポリペプチドを含む医薬組成物は、例えば経口、膣内、直腸または非経口経路例えば静脈内、筋内、皮下、眼窩内、関節包内、腹腔内、嚢内経路を含めたさまざまな経路によって、または例えばそれぞれ皮膚パッチまたは経皮イオントフォレシスを用いた経皮的な受動吸収または吸収促進によって、対象の体内で免疫応答を刺激するために投与することができる。さらにこの組成物を注射、挿管法によってかまたは局所的に投与することもでき、この局所的投与は、軟こうまたは粉末の直接塗布などによる受動的なもの、あるいは鼻腔用スプレーまたは吸入薬などを用いた能動的なものであり得る。発現ベクターは同様に局所的スプレーとして投与することができ、この場合、組成物の一成分は適切な高圧ガスである。医薬組成物は同様に、所望される場合、例えばＦｅｌｇｎｅｒら、米国特許第５，７０３，０５５号（ＵＳ．５，７０３，０５５）；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻（第２版、１９９３）中に記載されているように、リポソーム、ミクロスフェアまたはその他のポリマーマトリクス内に取り込むこともできる。例えば、リン脂質または他の脂質で構成されたリポソームは、比較的簡単に製造し投与できる無毒性で生理学的に許容される代謝性担体である。
【０１０５】
本発明の発現ベクターまたはそれから誘導されたポリペプチドは、例えばＦｅｌｇｎｅｒら、米国特許第５，５８０，８５９号（ＵＳ．５，５８０，８５９）および５，７０３，０５５号（ＵＳ．５，７０３，０５５）中に記載されている通りに、動物の体組織の間質腔に送出され得る。本発明の発現ベクターの筋肉への投与は、皮内および皮下注射および経皮投与を含め、特に有効な投与方法である。イオントフォレシスによるものなどの経皮投与も同様に、筋肉に対して本発明の発現ベクターを送出する有効な方法である。本発明の発現ベクターの表皮投与も同様に利用可能である。表皮投与には、刺激物に対する免疫応答を刺激するために表皮の最も外側の層を機械的または化学的に刺激することが関与する（Ｃａｒｓｏｎら、米国特許第５，６７９，６４７号（ＵＳ．５，６７９，６４７））。
【０１０６】
免疫応答を刺激するために本発明の発現ベクターまたはそれから誘導されたポリペプチドを投与する他の効果的方法には、例えばＣａｒｓｏｎら、米国特許第５，６７９，６４７号（ＵＳ．５，６７９，６４７）中に記載されている通りの粘膜投与が含まれる。粘膜投与について、最も有効な投与方法には、発現ベクターおよび医薬組成物を含む適切なエアロゾルの鼻腔内投与が含まれる。生殖器、膣および眼部位の粘膜組織に対する発現ベクターの送出のためには、座薬および局所的調製物も同様に有効である。追加的には、発現ベクターを粒子に複合体化させ、ワクチンガンにより投与することもできる。
【０１０７】
結論として、本発明のペプチドは、予防目的（すなわち後の疾病の危険性を減少させる目的）および治療目的の両方の目的で免疫応答を誘発するために有用であるが、本発明のペプチドは、実験的にかつ抗体および／またはＢリンパ球を単離できる動物の体内で抗体を誘発する目的で、免疫応答を誘発するためにも有用であり、このことはそれ自体、後にモノクローナル抗体および抗体誘導体の産生を可能にする。
【０１０８】
ＶＩＩ．  医薬組成物
本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチドおよびその医薬組成物およびワクチン組成物は、予防および／または治療目的で哺乳動物、特にヒトに対し投与可能である。本発明のポリペプチドは、病原体または癌関連または癌特異的生体分子（例えばタンパク質、炭水化物など）を含めた（ただしこれらに限定されない）抗原に対する免疫応答を惹起および／または増強するために使用可能である。本発明を用いて治療可能な疾病の例としては、さまざまな細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、寄生虫感染および癌が含まれる。タンパク性抗原に関して以上で論述した通り、国際公開第００／２００２７号（ＷＯ００／２００２７）からの癌抗原に関連する癌も、関節リウマチおよび炎症性腸疾患などのさまざまな炎症性疾患と同様の疾病例である。
【０１０９】
一部の治療的利用分野において、本発明は、すでに癌、炎症性疾患を患っているかまたは問題のウイルスまたは微生物に感染している個体に対して投与される。疾病の潜伏期または急性期にある個体は、適宜本発明を用いて別個に、または他の治療と併用して治療されてよい。
【０１１０】
一部の治療的利用分野において、本発明の組成物は、微生物または腫瘍抗原に対する有効なＣＴＬ応答または体液性応答を惹起し、かつ症候および／または合併症を治ゆするかあるいは少なくとも部分的に阻むのに充分な量で患者に投与される。これを達成するために適切な量が「治療上有効な量」として定義される。この用途にとって有効な量は、一部にはペプチド組成物、投与方法、治療対象の疾病の病期および重症度、患者の体重および全身的健康状態、および処方医師の判断に左右される。
【０１１１】
本発明の組成物の治療上有効な量は一般に、初期免疫付与すなわち治療的または予防的治療のためには、体重７０ｋｇの患者に対しポリペプチド約１．０μｇ〜約１０，０００μｇ、例えば約１００〜約８０００μｇ、例えば約２００〜約６０００μｇである。一部の実施形態において、これらの用量には、特異的免疫応答を測定することにより患者の応答および身体条件に応じて数週間乃至数カ月にわたり、追加免疫処方計画に準じて約１．０μｇ〜約３０００μｇのペプチドの追加免疫投薬量が後続する。
【０１１２】
本発明の組成物は一般に重篤な疾病状態すなわち生命にかかわるかまたは潜在的に生命にかかわる状況において利用可能であるということを念頭に置いておくべきである。このような場合、異物の最少化およびコンジュゲートの相対的無毒性を考慮して、これらの組成物を実質的に余剰に投与することが可能であり、治療医師がそれを望ましいと感じるかもしれない。
【０１１３】
一部の実施形態において、本発明は、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、寄生虫感染および癌を含めた（ただしこれらに限定されない）特定の疾病を予防および／または改善するために、予防的に使用可能である。有効量は、以上で記述した通りである。追加的に、ワクチン技術の当業者であれば、追加免疫することおよび投薬量および投薬計画を調整することなどによって適宜、予防的処置をいかに調整または修正すべきかも認識していると考えられる。
【０１１４】
本発明の調合ワクチンは、医薬的に許容されるアジュバントと組合わせることができる。調合ワクチンは、水溶液、懸濁液またはエマルジョンであり得る。本発明のワクチン中の各免疫原の免疫学的に有効な量は、過度の実験なく当該技術分野において公知の方法により決定可能である。
【０１１５】
アジュバントは、医薬的に許容されるあらゆるアジュバントであり得る。一部の実施形態において、アジュバントはミョウバンベースの化合物である。一部の実施形態において、アジュバントは水酸化アルミニウムである。他の実施形態においては、アジュバントはリン酸アルミニウムである。一部の実施形態において、アジュバントはＥｍｕｎａｄｅ（登録商標）である。Ｅｍｕｎａｄｅ（登録商標）は、油、水および水酸化アルミニウムの組合せで構成されたアジュバントである。一部の実施形態において、アジュバントはＱｕｉｌ  Ａである。一部の実施形態において、アジュバントはＱｕｉｌ  Ａにコレステロールを加えたものである。一部の実施形態において、アジュバントは、ＭＦ５９およびＰｒｏｖａｘなど（ただしこれらに限定されない）のエマルジョンである。
【０１１６】
一部の実施形態において、ＩＳＣＯＭがアジュバントとして用いられる。ＩＳＣＯＭは、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ（免疫刺激複合体）の頭字語であり、その技法は例えばＭｏｒｅｉｎら、（Ｎａｔｕｒｅ３０８：４５７−４６０（１９８４））の中に記載されている。ＩＳＣＯＭは、以下の通りに形成される新油性免疫刺激複合体である。ポリペプチドは、非イオン洗浄剤（例えばＭｅｇａ−９、ＴｒｉｔｏｎＸ−Ｉ００、オクチルグリコシド、Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、Ｃ12Ｅ8、Ｌｕｂｒｏｌ、Ｔｗｅｅｎ−８０）などを用いて、標準的方法により可溶化される。ＩＳＣＯＭ形成を補助するために、脂質混合物が添加される。脂質混合物は、ホスファチジルコリンおよび合成コレステロールを含み得る。一部の実施形態において、混合物はまず最初に、室温で撹拌しながら非イオン洗浄剤で処理され、次に脂質混合物（例えば等量のホスファチジルコリンとコレステロール）が添加され、撹拌が続行される。ポリペプチド組成物にＱｕｉｌ  Ａ（精製サポニン配糖体）が添加され、撹拌が続行される。その後、非イオン洗浄剤が除去される（例えば酢酸アンモニウムでの膜分離法による）。ＩＳＣＯＭのマトリクスがＱｕｉｌ  Ａにより形成される。電子顕微鏡で見たＩＳＣＯＭ粒子の形態は、約３５ｎｍのサイズの典型的なカゴ様構造を示す。ＩＳＣＯＭ形成期は、接線流膜分離法を用いて精製可能である。ＩＳＣＯＭは、臨界濃度でミセルを自然発生的に形成するＱｕｉｌ  Ａの能力に基づいて、かつ精製された抗原を封入する疎水性／親水性連結によって、マルチマー形状で精製抗原を提示する。ＩＳＣＯＭの形成は、典型的なかご様構造が形成されたことを確認するための電子顕微鏡によって確認される。約０．０１〜０．１％の最終的濃度を得るためにＱｕｉｌ  Ａを添加することができる。一部の実施形態において、最終的濃度は約０．０５％である。
【０１１７】
本発明は同様に、医薬的に許容される担体と本発明の発現ベクターまたは本発明のポリペプチドとを含む医薬組成物にも関する。医薬的に許容される担体は、当該技術分野において周知であり、生理的緩衝食塩水、アルコール／水溶液またはその他の溶媒またはビヒクル例えばグリコール、グリセロール、油例えばオリーブ油または注射用有機エステル、脂質またはリポソームを含めた、水溶液または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンを含む。
【０１１８】
医薬的に許容される担体は、例えば発現ベクターを安定化するかまたは発現ベクターの吸収を増大させるために作用する生理学的に許容される化合物を含むことができる。このような生理学的に許容可能な化合物には、例えばグルコース、スクロースまたはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸またはグルタチオンなどの酸化防止剤、キレート剤、低分子量ポリペプチド、抗菌薬、不活性ガスまたはその他の安定化剤または賦形剤が含まれる。発現ベクターは、さらに、ペプチド、ポリペプチドおよび炭水化物などのその他の成分と複合体化され得る。発現ベクターは同様に、例えばワクチンガンを用いて個体に投与できる粒子またはビーズへと複合体化され得る。当業者であれば、生理学的に許容される化合物を含めた医薬的に許容される担体の選択が、例えば発現ベクターの投与経路により左右されるということを認識していると考えられる。
【０１１９】
本発明はさらに、本発明の発現ベクターまたはそれから誘導されたポリペプチドを含む医薬組成物を投与して免疫応答を刺激する方法にも関する。発現ベクターは、例えばＤｏｎｎｅｌｌｙら、｛Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５：６１７−６４８（１９９７））；Ｆｅｌｇｎｅｒら、（米国特許第５，５８０，８５９号（ＵＳ．５，５８０，８５９）、１９９６年１２月３日発行）；Ｆｅｌｇｎｅｒ（米国特許第５，７０３，０５５号（ＵＳ．５，７０３，０５５）、１９９７年１２月３０日発行）；およびＣａｒｓｏｎら、（米国特許第５，６７９，６４７号（ＵＳ．５，６７９，６４７）、１９９７年１０月２１日発行)中で記述されている通りの当該技術分野において周知の方法により投与される。一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ネイキッド核酸として投与される。
【０１２０】
本発明の組成物は、抗体または抗体誘導体を調製することを目的として、例えば実験動物または動物の体内で免疫応答を誘発するためにも有用である。このような組成物においては、組成物が医薬的に許容されるものでなくてはならないという要件は、重要性が低く、例えばヒトにおいて使用するのに適しているとみなされていないアジュバントを使用することが可能である。
【実施例】
【０１２１】
実施例の前文
以下の実施例は、請求対象の発明を限定するためではなく、例証するために提供されるものである。
【０１２２】
ＰＡＤＲＥ（配列番号３）内部のタンパク質分解分割が、ＰＡＤＲＥ含有タンパク質内、特に２つのリジン残基Ｋ２およびＫ１０のまわりで、ただしＷ７のまわりにも観察された。ＰＡＤＲＥ内部の分割は、組換えにより産生されたタンパク質内で不均質、生産収量の低下および安定性の改変を導くことから望ましくない。上流側および下流側のプロセスの間に添加剤を使用することによって分割をうまく回避できるにせよ、それでも、結果として得られるＰＡＤＲＥ含有ワクチンはなお低い免疫原性および薬物動態特性例えば半減期の短縮および１つまたは複数のＴヘルパーエピトープの不適切な提示をなおも示すかもしれない。したがって、ＰＡＤＲＥ配列からプロテアーゼ感受性アミノ酸／配列を除去する必要がある。
【０１２３】
プロテアーゼ活性に対する感受性が低くなったＰＡＤＲＥ類似体を提示することで、特にＥ．ｃｏｌｉおよびショウジョウバエ発現系などの発現系においてプロテアーゼに対する組換え発現産物の感受性が削減されて、タンパク質産生の上流側および／または下流側プロセスの間のｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドアミノ酸配列内部のタンパク質分解分割が回避されることになる。さらに、ＰＡＤＲＥ類似体が、単離形態でまたは免疫原性ポリペプチドの一部としてヒトに投与される場合、感受性の削減によって、薬物動態特性の改善（すなわちより長い血清半減期）そして場合によっては免疫原性の改善というさらなる利点がもたらされる。
【０１２４】
これに基づいて、配列番号３の数多くの類似体を調製し以下の一連の同定ステップに付して、タンパク質分解を比較的受けにくい改良型ｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドを同定した：
１）合成ＰＡＤＲＥ類似体のライブラリの調製ステップ；
２）優れたＨＬＡ結合特性について、１）に由来する類似体を検定し選択するステップ；
３）生体内原位置プロテアーゼ耐性について、２）で選択した類似体を検定し選択するステップ；
４）優れた免疫原特性について、３）で選択した類似体を検定し選択するステップ。
【０１２５】
実施例１
ＰＡＤＲＥ類似体のＨＬＡ−ＤＲ結合についての試験
標準的な固相ペプチド合成により、合計６９個の異なるＰＡＤＲＥ類似体（配列番号：４〜７２）を合成した。これらのＰＡＤＲＥ類似体は全て、Ｎ−からＣ−末端に向かって、２つのアラニン残基とそれに続く残基３〜１５により構成され、これは（２つのアラニン残基が先行するＰＡＤＲＥである配列番号４以外）配列番号３の類似体である。２つの追加のＮ末端アラニンを含み入れる理由は、ＰＡＤＲＥ類似体の免疫原特性が１３Ｃ末端アミノ酸内に存在する一方で、単離ペプチドがプロテアーゼ耐性についての試験管内検定においてエンドプロテアーゼ耐性を示すことができるようになることを保証するためであった。
【０１２６】
ペプチドを、以下の手順にしたがってＨＬＡ−ＤＲに対する結合について試験した：
【０１２７】
ペプチド／ＨＬＡ−ＤＲ結合検定
クラスＩＩＭＨＣ結合検定のための標準的な作業手順は、Ｓｉｄｎｅｙら、（１９９８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１８．３．１−１８．３．１９、１９９８中に記載されている。簡潔に言うと、精製ヒトクラスＩＩ分子［５〜５００ｎＭ］を、さまざまな未標識ペプチド結合阻害物質および１〜１０ｎＭ125Ｉ−放射性標識プローブペプチドと共に４８時間、プロテアーゼ阻害物質カクテルの存在下で５％のＤＭＳを含むＰＢＳ中でインキュベートした。インキューベーション混合物中の最終的洗浄剤濃度は、０．０５％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０であった。ｐＨ４．５で実施したＤＲ３およびｐＨ５．０で実施したＤＲｗ５３を除いて、検定をｐＨ７．０で実施した。ｐＨは、Ｓｅｔｔｅら、（１９９２）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４８：８４４−５１で記述されている通りに調整した。
【０１２８】
Ｓｉｄｎｅｙらの中に記載されている通りにＨＰＬＣ方法を使用してＭＨＣ分子に対するペプチド結合を測定する代りに、抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体がコーティングされた抗体平板ベースの捕獲検定を利用した。この検定は、大量平板内放射分析検定用に特定的に設計された９６ウェルの白色ポリスチレンマイクロタイター平板を使用するように開発されたものである。ＭＨＣに結合した125Ｉ標識ペプチドの測定は、高速大量処理性能を得るためにきわめて感度の高い検定を可能にするＴＯＰＣＯＵＮＴ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）ベンチトップマイクロプレートシンチレーションおよびルミネセンスカウンタを用いて実施される。
【０１２９】
ペプチド結合阻害物質を、３０μｇ／ｍｌ〜３００ｐｇ／ｍｌの範囲内の濃度で試験した。市販の曲線適合アルゴリズムを用いて、データをコンピュータ内でプロットし、５０％の阻害を生成する用量（ＩＣ50）を決定した。適切な化学量論的条件下で、精製ＤＲ分子に対する未標識被験ペプチドのＩＣ50は、相互作用の親和性（ＫD）の適正な近似である。２〜４個の完全に独立した実験においてペプチドを試験した。
【０１３０】
結果
ＩＣ50値を介して表わされる結合親和性を、各ペプチドについて図１に列挙する。これらのＩＣ50値に基づいて、類似体（３８ＰＡＤＲＥ類似体）の画分が充分に優れたＨＬＡ結合能力（図１にボールド体と下線で示す）を示すという結論が下された。これらの優れた結合性を有するもののうち、当初１０個を選択してプロテアーゼ耐性についてさらに試験した：配列番号；４、１０、１９、２３、２９、３８、４６、５２、６７および６９。
【０１３１】
配列番号３および４が示す類似の結合特性により証明されるように、配列番号４〜６９内に２つのＮ末端アラニンを含み入れることでＨＬＡ結合特性に影響が及ぶことはなかったという点を指摘しておくことも重要である。
【０１３２】
実施例２
選択されたＰＡＤＲＥ類似体のプロテアーゼ耐性試験
選択された優れた結合性を有するＰＡＤＲＥ類似体のプロテアーゼ耐性を試験するために、クローニング技術により、ヒトＴＮＦα内のループ（ループＥＥ）内にその配列を挿入した。修飾されたＴＮＦα分子を発現するＥ．ｃｏｌｉ由来の無細胞タンパク質粗製抽出物を調製し、ＰＡＤＲＥ類似体配列内部のタンパク質分解分割を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続く免疫ブロット法によって分析した。
【０１３３】
全長、膜結合ＴＮＦαは、アミノ酸２３３個の長さをもつタンパク質である。アミノ末端フラグメント１〜７６は、ＴＮＦαのアミノ酸１５７個の長さの可溶形態（７７〜２３３）中には存在しない。
【０１３４】
ヒトＴＮＦαワクチン候補の設計のために用いられる鋳型は、Ｅ．ｃｏｌｉ中での発現用のＮ末端Ｍｅｔが先行する、可溶形態のＴＮＦα（フラグメント７７〜２３３、配列番号７３）である。さらに、ＴＮＦαのその２つの受容体に対する結合を取り除くために点変異を行ない（Ｙ８７５）、こうしてタンパク質の細胞傷害性を根絶した。したがってワクチン候補は、長さがアミノ酸１５８個の配列番号７４に基づくものである。
【０１３５】
ＴＮＦ３７．８７（配列番号７５）は、Ａ185とＥ186の間にＰＡＤＲＥが挿入されているＴＮＦバリアント（…ＰＥＧＡ−ＥＡＫ…）である。ＰＡＤＲＥはＡで始まることから、Ａは反復されず、その結果１３個ではなく１２個のアミノ酸が挿入された：
．．．ＰＥＧＡ−ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ−ＥＡＫ．．．  →  ＰＥＧ−Ａ−ＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡＥＡＫ．．．
【０１３６】
したがって、当初プロテアーゼ耐性について試験したＴＮＦバリアントは、以下の通りである：
配列番号７５−ＴＮＦ３７．８７−「従来の」ＰＡＤＲＥを含む基準タンパク質：
ＭＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＲＤＮＱＬＶＶＰＳＥＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＳＴＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡＶＳＳＱＴＫＶＮＬＬＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡＥＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶＹＦＧＩＩＡＬ
−  ならびに、下線位置においてそれぞれ配列番号４、１０、１９、２３、２９、３８、４６、５２、６７および６９の１２のＣ末端アミノ酸残基を各々同じように有するＴＮＦバリアントを含む９個のＰＡＤＲＥ類似体すなわち：
配列番号７６−ＴＮＦ３７．８７−００７配列：
ＭＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＲＤＮＱＬＶＶＰＳＥＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＳＴＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡＶＳＳＱＴＫＶＮＬＬＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＷＦＶＡＡＮＴＬＨＡＡＡＥＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶＹＦＧＩＩＡＬ
配列番号７７−ＴＮＦ３７．８７−０１６配列：
ＭＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＲＤＮＱＬＶＶＰＳＥＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＳＴＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡＶＳＳＱＴＫＶＮＬＬＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＦＦＶＡＡＮＴＬＫＡＤＡＥＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶＹＦＧＩＩＡＬ
配列番号７８−ＴＮＦ３７．８７−０２０配列：
ＭＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＲＤＮＱＬＶＶＰＳＥＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＳＴＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡＶＳＳＱＴＫＶＮＬＬＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＹＦＶＡＡＦＴＬＨＡＡＡＥＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶＹＦＧＩＩＡＬ
配列番号７９−ＴＮＦ３７．８７−０２６配列：
ＭＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＲＤＮＱＬＶＶＰＳＥＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＳＴＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡＶＳＳＱＴＫＶＮＬＬＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＨＦＶＡＡＮＴＬＨＡＡＡＥＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶＹＦＧＩＩＡＬ
配列番号８０−ＴＮＦ３７．８７−０３５配列：
ＭＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＲＤＮＱＬＶＶＰＳＥＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＳＴＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡＶＳＳＱＴＫＶＮＬＬＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＨＦＶＡＡＦＴＬＫＡＥＡＥＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶＹＦＧＩＩＡＬ
配列番号８１−ＴＮＦ３７．８７−０４３配列：
ＭＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＲＤＮＱＬＶＶＰＳＥＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＳＴＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡＶＳＳＱＴＫＶＮＬＬＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＥＦＶＡＡＷＴＬＨＡＡＡＥＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶＹＦＧＩＩＡＬ
配列番号８２−ＴＮＦ３７．８７−０４９配列：
ＭＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＲＤＮＱＬＶＶＰＳＥＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＳＴＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡＶＳＳＱＴＫＶＮＬＬＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＮＦＶＡＡＹＴＬＨＡＡＡＥＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶＹＦＧＩＩＡＬ
配列番号８３−ＴＮＦ３７．８７−０６４配列：
ＭＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＲＤＮＱＬＶＶＰＳＥＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＳＴＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡＶＳＳＱＴＫＶＮＬＬＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＱＦＶＡＡＮＴＬＨＡＡＡＥＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶＹＦＧＩＩＡＬ
配列番号８４−ＴＮＦ３７．８７−０６６配列：
ＭＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＲＤＮＱＬＶＶＰＳＥＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＳＴＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡＶＳＳＱＴＫＶＮＬＬＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＩＦＶＡＡＷＴＬＨＡＡＡＥＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶＹＦＧＩＩＡＬ
【０１３７】
全ての配列中、２重下線は初期メチオニルおよびＹ８７Ｓ変異をそれぞれ示し、１本下線は、挿入されたｐａｎＤＲ結合配列を示し；ボールド体は、ＰＡＤＲＥ（配列番号３）に比べたｐａｎ−ＤＲ結合ペプチド中のアミノ酸変化を表わす。
【０１３８】
組換えＴＮＦαバリアントのクローニング、発現、精製および特徴づけ
鋳型として、ＴＮＦ（Ｙ８７Ｓ）をコードする合成ｃＤＮＡを使用した。ＰＡＤＲＥまたはＰＡＤＲＥ類似体をコードするオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲによりＡ185とＥ186の間で鋳型内に挿入した（上記参照）。結果として得たｃＤＮＡをｐＥＴ２８ｂ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＨＭＳ１７４へと形質転換させた。組換え発現のため、結果として得たＥ．ｃｏｌｉ菌株を発酵槽内において３７℃にて合成培地中で培養した。組換え発現の誘発は、１ｍＭのＩＰＴＧを添加することで開始し、温度を２５℃まで低下させた。ＩＰＴＧ誘発から４、８または２４時間後に培養を収穫した。Ｎｉｅｌｓｅｎら、（２００４）、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：３３５９３−３３６００中で記述されているようにＴＮＦα特異的モノクローナル抗体を用いて親和性クロマトグラフィにより９０％超の均質性までＴＮＦαバリアントを精製した。精製したＴＮＦαバリアントをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって特徴づけしてそれらの同一性と無欠性を確認した。
【０１３９】
生体内原位置プロテアーゼ検定：ウエスタンブロット法を用いたＴＮＦ−αバリアントのプロテアーゼ耐性の分析：
試験すべきさまざまなＴＮＦ−αバリアントを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞培養のアリコート（１ｍｌ）を遠心分離（５０００ｇ／５分／５℃）し、培地を廃棄した。ｐＨ６．０で２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ１ｍｌ中に細胞ペレットを再懸濁させた。超音波処理（各超音波処理ラウンド間で２０秒間休止して、１１μｍの振幅で４×１５秒）により、細胞破壊を達成した。結果として得た懸濁液を遠心分離し（２００００ｇ／３０分／８℃）、上清（粗製抽出物）を新しい管に移した。次に、ブラッドフォードタンパク質分析（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、タンパク質含有量について粗製抽出物を分析した。４〜１２％のＮｕＰＡＧＥゲル（Ｎｏｖｅｘ）上に等量のタンパク質を投入した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、セミドライブロット法によりニトロセルロース膜上にタンパク質を移した。免疫反応については、Ｔｒｉｓ５０ｍＭ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、ＥＤＴＡ５ｍＭ、Ｉｇｅｐａｌ０．１％、ゼラチン０．５％中で、ウサギＴＮＦα抗血清（１時間；希釈度１：１０，０００）およびホースラディッシュペルオキシダーゼでコンシュゲートされた二次抗体（Ｄａｋｏ  Ｐ４４８）と共にインキューベーションを行なった。検出にはＥＣＬTM試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。
【０１４０】
結果
被験ＴＮＦバリアントのうち、３つ（配列番号７８、７９および８４）はプロテアーゼ検定においてプロテアーゼ耐性があることが示され（データ示さず）、これらのＴＮＦバリアントが、ＰＡＤＲＥ類似体配列の内部でのタンパク質分解分割に対する感受性をもたないということを証明した。
【０１４１】
配列番号２３、２９および６９の各々の少なくとも１３Ｃ末端アミノ酸残基により画定されるＰＡＤＲＥ類似体がタンパク質分解に対する耐性の所望の増加を示し、かつ配列番号２３、２９および６９の１３Ｃ末端アミノ酸残基を含み入れることで修飾されたタンパク質は、組換えにより生成された場合により優れた収量を示し（これは、発現産物のフラグメント化が全くまたは限定的にしか発生しないことに起因する）、均質な発現産物を提供し、場合によってはプロテアーゼ耐性免疫原の生物学的半減期の延長を原因として免疫原性の増大を提供するものであるという結論が下された。
【０１４２】
実施例３
選択されたＰＡＤＲＥ類似体の免疫原性試験
実施例２内で同定した３つのプロテアーゼ耐性ＰＡＤＲＥ類似体をその免疫原特性について試験した。１本の実験ライン上で、ヒトのドナー由来のＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）内および２つのマウス株（ＤＲ４およびｂｘｄ）内で遊離ペプチドとしてペプチドを試験した。第２の実験ライン内では、実施例２で同定したプロテアーゼ耐性ＴＮＦバリアントに関連して、ＰＡＤＲＥ類似体を試験した。
【０１４３】
ヒトＰＢＭＣにおけるペプチドの試験
ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を、配列番号２３、２９および６９の１３アミノ酸残基と同一の配列をもつペプチドで刺激した（以下では、これら３つの１３量体をそれぞれＰＡＤＲＥ．Ｙ２．Ｆ７．Ｈ１０、ＰＡＤＲＥ．Ｈ２．Ｎ７．Ｈ１０およびＰＡＤＲＥ．１２．Ｈ１０と呼ぶ）。１日目および４日目に、ＩＬ−２を添加した。７日目に、ｈｅ細胞の一部分を取り出してＩＮＦ−γＥＬＩ−ＰＯＴ検定に付した。残りの細胞を再刺激した。８日目および１１日目に、ＩＬ−２を添加した。１４日目にＣＤ４細胞を精製し、ＩＮＦ−γＥＬＩＳＰＯＴ検定において試験した。
【０１４４】
ＩＮＦ−γＥＬＩＳＰＯＴ検定は、本質的にＴａｎｇｒｉ  Ｓら、（２００５）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７４、３１８７−９６中で記述されている通りに実施した。
【０１４５】
マウスにおけるペプチドの試験
ＨＬＡ−ＤＲ４遺伝子導入マウスとｂｘｄマウス株の各々の３匹の個体からなるグループを、ＣＦＡ中の２０μｇ（６μｌの２０ｍｇ／ｍｌペプチドおよび２９４μｌのＰＢＳ１×＋３００μｌのＣＦＡ）または２μｇ（６μｌの２ｍｇ／ｍｌペプチド＋２９４μｌのＰＢＳ１×＋３００μｌのＣＦＡ）のペプチドを用いて尾の付け根で免疫付与した。１０〜１４日後に、脾臓を収穫し、ＣＤ４細胞を精製し、ＩＮＦ−γＥＬＩＳＰＯＴ検定（ＭｃＫｉｎｎｅｙら、（２００４）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７３、１９４１−５０に記載の通り）で試験した。被験ペプチドは、ヒトＰＢＭＣで試験されたものと同一であった。
【０１４６】
マウスにおけるＴＮＦαバリアントの試験
３匹のＨＬＡ−ＤＲ４遺伝子導入マウスからなるグループを、マウス一匹あたり１００μｌの完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）中１０μｇのＴＮＦ由来の抗原を用いて、尾の付け根で免疫付与した。最初の免疫付与から１４日目に、１００μｌのＩＦＡ（不完全フロインドアジュバント）中の同じ用量の抗原を用いて、動物に追加免疫を付与した。ＴＮＦα特異的抗体力価を決定するため、各々の免疫付与から１４日後に、血清を収集した。その後動物を屠殺して、ＩＮＦ−γＥＬＩＳＰＯＴ検定に付した。
【０１４７】
マウスの抗血清中のＴＮＦα特異的抗体力価の決定
直接ＥＬＩＳＡを用いて、ＴＮＦα特異的抗体力価を決定した。９６ウェル平板（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、Ｎｕｎｃ）を組換えＴＮＦαバリアントＴＮＦＹ８７Ｓ（ｐＨ９．６で炭酸緩衝液中５μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェル、４℃で一晩）を用いてコーティングした。その後平板を３回洗浄し、３７℃で２時間２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（１％のウシ血清アルブミンおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水）を用いてインキュベートした。平板を３回洗浄し、ヒトＴＮＦαバリアントで免疫付与したマウス由来のプールされた血清を、合計１００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液中での１／１０希釈ステップ（出発希釈度１／１０００）を用いて、６ステップで滴定した。全ての試料をデュプリケートで滴定した。血清と対照を２時間３７℃でインキュベートした。平板を３回洗浄し、１００μｌのビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇＧ（ブロッキング緩衝液中で１／１００００希釈）を各ウェルに移し、３７℃で１時間インキュベートした。最後に、平板を３回洗浄し、１００μｌ／ウェルのアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＰＫ−６１００）を用いて室温で４５分間インキュベートした。平板を再び洗浄し、ＴＭＢＳを用いて現像した。１０〜２０分後、１００μｌの４ＮのＨ2ＳＯ4で反応を停止させ、ＥＬＩＳＡ読取り装置を用いてＡ450値を決定した。０．５のＡ450値を生成する抗血清希釈度として抗体力価を定義づけた。
【０１４８】
結果
ヒトＰＢＭＣ中のペプチドの試験から得られた結果は、ＰＡＤＲＥ．Ｙ２．Ｆ７．Ｈ１０およびＰＡＤＲＥ．Ｉ２．Ｈ１０が、配列番号３に比べ７日目と１４日目の両日にＩＮＦ−γＥＬＩＳＰＯＴ検定においてより優れた免疫応答を提供し、一方ＰＡＤＲＥ．Ｈ２．Ｎ７．Ｈ１０は、配列番号３と同じ規模の免疫応答を提供したことを明らかにした。
【０１４９】
マウスにおけるＰＡＤＲＥ類似体ペプチドの試験では、３個の被験類似体の全てが、ＤＲ４マウスにおいて２０μｇ用量でＰＡＤＲＥよりも良い性能を示した一方、ＥＬＩＳＰＯＴ検定により測定された通り２μｇ用量でＤＲ４遺伝子導入マウスにおいて、ＰＡＤＲＥ．Ｉ２．Ｈ１０ペプチドのみが免疫応答の改善を提供した。ｂｘｄマウスモデルでは、３つの被験ＰＡＤＲＥ類似体の全てが、両方の用量でＥＬＩＳＰＯＴ検定内でＰＡＤＲＥに比べて有意な免疫応答を提供したが、ＰＡＤＲＥに比べた免疫応答の改善は得られなかった。
【０１５０】
ＰＡＤＲＥ類似体を含むＴＮＦαバリアントでの免疫付与は、以下のような結果を提供した：すなわち
ＩＮＦ−γＥＬＩＳＰＯＴにより測定されたＨＬＡＤＲ４遺伝子導入マウスにおけるＨＴＬ誘発は、全てのＴＮＦα−バリアントが、ＴＮＦα内に導入されたＰＡＤＲＥ類似体に対するＨＴＬを誘発したこと、そしてこの点においてＰＡＤＲＥ．Ｙ２．Ｆ７．Ｈ１０およびＰＡＤＲＥ．Ｉ２．Ｈ１０がＰＡＤＲＥよりも優れていたこと（ここでＰＡＤＲＥ．Ｈ２．Ｎ７．Ｈ１０はＰＡＤＲＥとほぼ同じＨＴＬ誘発を提供した）を明らかにした。さらに全てのバリアントは、野生型ＴＮＦαにより誘発されたものよりも著しく高い抗体力価を提供し、ＰＡＤＲＥ．Ｙ２．Ｆ７．Ｈ１０およびＰＡＤＲＥ．Ｉ２．Ｈ１０を含むバリアントは、ＰＡＤＲＥに比べ優れており、ここでもまた、ＰＡＤＲＥ．Ｈ２．Ｎ７．Ｈ１０はＰＡＤＲＥに匹敵する免疫応答を提供した。実際、抗体力価とＨＴＬ誘発を相関させた場合、明らかに線形相関が存在していた。
【０１５１】
実施例４
８個のさらなるＰＡＤＲＥ類似体の選択および試験
ｐａｎＤＲ結合性でプロテアーゼ耐性を有する免疫原性ＰＡＤＲＥ類似体ＰＡＤＲＥ．Ｙ２．Ｆ７．Ｈ１０、ＰＡＤＲＥ．Ｈ２．Ｎ７．Ｈ１０およびＰＡＤＲＥ．Ｉ２．Ｈ１０の同定に基づいて、実施例１において優れた結合性を有するものとして同定されたさらなるＰＡＤＲＥ類似体を試験することが決定された。被験ペプチドは、配列番号１５（ＰＡＤＲＥ．Ｆ２．Ｎ７．Ｈ１０）、２１（ＰＡＤＲＥ．Ｙ２．Ｈ１０）、２４（ＰＡＤＲＥ．Ｙ２．Ｎ７．Ｈ１０）、２６（ＰＡＤＲＥ．Ｈ２．Ｈ１０）、４７（ＰＡＤＲＥ．Ｅ２．Ｙ７．Ｈ１０）、５４（ＰＡＤＲＥ．Ｎ２．Ｎ７．Ｈ１０）、６６（ＰＡＤＲＥ．Ｑ２．Ｆ７．Ｈ１０）、および７２（ＰＡＤＲＥ．Ｉ２．Ｎ７．Ｈ１０）からの１３Ｃ末端アミノ酸残基を有するペプチドであった。
【０１５２】
これらの配列のうち３つすなわちＰＡＤＲＥ．Ｅ２．Ｙ７．Ｈ１０、ＰＡＤＲＥ．Ｎ２．Ｎ７．Ｈ１０およびＰＡＤＲＥ．Ｑ２．Ｎ７．Ｈ１０は、実施例２に記された手順に従ってプロテアーゼ耐性を有することが示された。
【０１５３】
結論
上述の実施例は、プロテアーゼ耐性および／または免疫原性の観点から見て改善された特性を有する数多くのＰＡＤＲＥ類似体の存在を実証した。配列番号３内で入念に修飾を行なうことで、組換え発現された場合および生体内免疫原として使用された場合の両方において、ＰＡＤＲＥよりも安定した免疫原が提供される、ということが実証されている。
【０１５４】
本明細書中で記述されている実施例および実施形態は単に例証を目的としており、それに照らしたさまざまな修正または変更が当業者には示唆されるものであり、それらは本出願の精神および視野そして添付のクレームの範囲内含み入れられるべきものである。本明細書中で引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に援用される。
【０１５５】
【表２】
0005792630.tif 000003
【表３】
0005792630.tif 000004
【図１−１】
0005792630.tif 000005
【図１−２】
0005792630.tif 000006
【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【配列表】
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