(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
毒性ペプチドの局所的殺虫活性を増加させるための方法であって、
ａ）ペプチドに極性有機溶媒を混合して、極性有機溶媒ペプチド懸濁液を作製する工程、および
ｂ）前記極性有機溶媒ペプチド懸濁液に極性非プロトン溶媒を添加して、最終ペプチド懸濁液を作製する工程
を包含し、
前記最終ペプチド懸濁液は、９０％以上の極性有機溶媒と１０％以下の極性非プロトン溶媒とを含み、
極性有機溶媒は、１５以上の比誘電率を与えるために十分な双極子モーメントを有する有機溶媒であり、
極性非プロトン性溶媒は、イオン溶解力を有するが酸性の水素を有さない有機溶媒である、方法。
【請求項２】
前記極性非プロトン溶媒は、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキサンおよびヘキサメチルホスホロトリアミドから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記極性有機溶媒は、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノールおよびプロパノールのすべての異性体、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、アセトニトリル、ならびにエチルアセトアセテートから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記極性非プロトン溶媒は、ジメチルスルホキシドまたはジメチルホルムアミドから選択され、前記極性有機溶媒は、アセトン、メタノール、エタノールおよびプロパノールから選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記極性有機溶媒が前記ペプチドと混合される前に、前記ペプチドは凍結乾燥される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチドは、クモ、サソリ、ヘビ、ダニ、巻貝、ナメクジまたは植物のあらゆる種からの毒性ペプチドから選択されるか、またはそれに由来するあらゆる局所的毒性ペプチド、およびこうしたペプチドのいずれかに対する５０％またはそれを超える相同性を有するあらゆるペプチドである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドの長さは、１０から２００アミノ酸の長さである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドは１〜５個の内部ジスルフィド結合を有する、請求項１に記載の方法
【請求項９】
前記ペプチドはクモまたはサソリから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドは、Ａｔｒａｘ属またはＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ属のオーストラリアジョウゴグモから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号１１７を含む、昆虫に毒性のペプチド。
【請求項１２】
配列番号１１８を含む、昆虫に毒性のペプチド。
【請求項１３】
配列番号１１９を含む、昆虫に毒性のペプチド。
【請求項１４】
ペプチド調合物であって、
ａ）毒性ペプチドと、
ｂ）前記調合物の最終溶媒体積の９０％から９９％を構成する極性有機溶媒と、
ｃ）極性非プロトン溶媒と、任意選択で水と
を含み、
前記極性非プロトン溶媒は前記調合物の最終溶媒体積の１０パーセントから１パーセント（％）を構成し、
前記任意選択の水相は前記調合物の最終溶媒体積の０（ゼロ）パーセントから９パーセント（％）を構成し、
極性有機溶媒は、１５以上の比誘電率を与えるために十分な双極子モーメントを有する有機溶媒であり、
極性非プロトン性溶媒は、イオン溶解力を有するが酸性の水素を有さない有機溶媒である、ペプチド調合物
【請求項１５】
請求項１に記載の方法によって作製される、毒性ペプチド懸濁液。
【請求項１６】
請求項１４に記載の毒性ペプチド調合物による昆虫の制御であって、前記特殊な毒性ペプチドおよび調合物は前記昆虫の環境に適用される、制御。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、先に２００８年１０月１日に出願された米国仮特許出願第６１／１０１，８２５号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、殺虫性ペプチドに対する調合物の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
殺虫性ペプチドは、内部に送達されるときはその標的に対して毒性であるが、局所的な活性はほとんどまたは全く有さないことがしばしばある。局所的殺虫活性とは、毒素を注射によって昆虫の腸または内部器官に直接送達するか、またはたとえば昆虫にトランスジェニック植物を摂食させるなど、昆虫を誘導してその食物から毒素を摂取させるのではなく、噴霧またはその他の手段によって毒素が昆虫または昆虫の環境に送達されたときに、昆虫の生育を阻害するか、動きを損なうか、または昆虫を殺してしまう毒素の能力を示す。
【０００４】
溶媒によってペプチドの特性をうまく高めるか、または変化させられる能力は、現在までよく分かっていない。多様で、一意の特性および特別な性質を有するペプチドを、選択可能な莫大な種類の溶媒と組み合わせても、過去５０年ほどの間にいくつかの選択されたペプチドの増強に対する方法がほんのいくつか報告されただけである。この主題に対するさまざまな文献が存在する。たとえば、非特許文献１などを参照されたい。
【０００５】
いくつかのペプチドの活性を精製および抽出によって高める試みが行なわれてきた。たとえば、特許文献１、Ｈｅｎｓｌｅｙは、３９〜４３残基のペプチドであるアミロイドβペプチドの活性を高めるための手順を記載しており、この手順は、ペプチドを有機溶媒に溶解し、それを室温より高い温度で４５分から３時間インキュベートし、室温に平衡化させてから溶媒を除去する工程を含む方法を有する。
【０００６】
特許文献２、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇは、特別に調製した培地を揮発性の非変性沈殿剤と混合することによって、哺乳動物における悪性細胞に対する生育の接触阻害を回復する生物活性を有する因子を抽出する方法に関する。この反応によって形成される沈殿を調合物から分離して、生物学的に許容できるイオン性緩衝剤によって抽出する。
【０００７】
特許文献３、Ｄｉａｚは、ＤＭＦの溶液中での段階的なペプチドカップリング反応を用いて、ソマトスタチンを調製する方法である。この反応の生成物は、蒸発によって単離されるか、またはソマトスタチンを不溶性にする第２の溶媒による沈殿によって単離され、得られた粗ペプチドは次いで精製される。
【０００８】
しかしながら、局所的殺虫活性の低いペプチドを局所的殺虫活性が有意に高いペプチドに変換するための方法についての記載は、あったとしてもごくわずかである。
【０００９】
本明細書に記載される手順は、殺虫性ペプチドの局所的殺虫毒性を増加させるものである。本明細書において、このように処理されたペプチドは「増強局所ペプチド（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｏｐｉｃａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」と呼ばれる。増強局所ペプチドを作製する本明細書に記載される方法は、ペプチドを「特別用（ｓｐｅｃｉａｌ）」に作製すると呼ばれることがある。ペプチドを特別用に作製する方法は、ペプチドが本明細書に記載される方法または処理によって処理される前よりも、ペプチドの活性を高くする。ペプチドが特別用に作製されると、昆虫を制御するために、ペプチドを操作して好適な植物またはその他の食物のゲノムに入れる必要なく、そのペプチドを昆虫に局所的に、昆虫の環境、昆虫が生息する場所、昆虫の生育地、および昆虫が接触するか、食べるか、または摂取する食物に適用できる。新しい方法、調合物、およびその方法によって生成された新しい増強局所ペプチドは、いずれも本明細書に記載されて請求される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，８４０，８３８号
【特許文献２】米国特許第４，５３０，７８４号
【特許文献３】米国特許第４，３３７，１９４号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｊｅｎｎｅｓｓ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｏｎ（１９５９）ｐｐ．１１５−１１７，１２７，３１７，３２６−３２８，３３３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
溶媒を用いて昆虫毒性ペプチドの毒性を増加させる手順が記載される。これらの手順は、必要であればペプチドを乾燥することによってペプチドを調製した後に、１）乾燥ペプチドに水を有するかもしくは有さない極性有機溶媒を加えるか、または２）乾燥ペプチドに極性非プロトン溶媒もしくはその他のアジュバントを加え、その後ペプチド調合物に、１）（極性非プロトン溶媒が最初に加えられたときは）水を有するかもしくは有さない極性有機溶媒を加えるか、または２）（極性有機溶媒が最初に加えられたときは）ペプチド極性有機溶媒に極性非プロトン溶媒もしくはその他のアジュバントを加えることを含む。
【００１３】
この手順を以下のように記載することもできる：昆虫毒性ペプチドの局所的殺虫活性を増加させる方法であって、この方法は本明細書においてペプチドを特別用に作製する方法と呼ばれ、この方法は、ペプチドにｉ）極性有機溶媒またはｉｉ）極性非プロトン溶媒もしくはアジュバントのいずれかを加える工程と、上記の最初のペプチド調合物に最初に加えられなかったｉ）極性有機溶媒またはｉｉ）極性非プロトン溶媒もしくはアジュバントのいずれかを加える工程とを含む。
【００１４】
本明細書に記載される方法において、極性有機溶媒は調合物の最終体積の約５０パーセントから約９９．９パーセント（％）を構成する。特定的に記載される方法において、極性有機溶媒は調合物の最終体積の約６０、７０、８５、９０パーセントから約９９．０パーセント（％）を構成する。記載される方法において、極性有機溶媒は調合物の最終体積の約７０パーセントから約９９．０パーセント（％）を構成する。特定的に記載される方法において、極性有機溶媒は調合物の最終体積の約６０、７０、８０、８５、９０パーセントから約９９．０パーセント（％）を構成する。極性有機溶媒は、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノールおよびそのすべての異性体、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、アセトニトリル、エチルアセトアセテートから選択されてもよい。アセトン、メタノール、エタノール、プロパノールおよびそのすべての異性体から選択された極性有機溶媒は、特に有用である。
【００１５】
極性非プロトン溶媒またはアジュバントは、調合物の最終体積の約２０％から約０．００１％を構成する。特定的に、極性非プロトン溶媒またはアジュバントは、調合物の最終体積の約１５％から約０．００５％、約１０％から約０．０１％、約８％から約０．１％、約５％から約０．１％を構成する。極性非プロトン溶媒またはアジュバントは、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキサンおよびヘキサメチルホスホロトリアミドから選択される。ＤＭＳＯとしても公知であるジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）が例示される。
【００１６】
昆虫毒性ペプチドは、好ましくはａ）１０アミノ酸残基よりも大きく、かつ３０００アミノ酸残基よりも小さく、ｂ）分子量が約５５０Ｄａから約３５０，０００Ｄａであり、かつｃ）殺虫活性を有するペプチドである。このペプチドは任意に１個から５個のジスルフィド結合を有してもよい。ペプチドの殺虫活性は、任意には少なくとも１つの再現可能な局所的殺虫性アッセイにおいて局所的活性を有するペプチドである。昆虫毒性ペプチドは、クモ、ダニ、サソリ、ヘビ、巻貝、特定の植物またはそのあらゆる組み合わせの毒液から選択されてもよい。クモはオーストラリアジョウゴグモ（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ｆｕｎｎｅｌ  ｗｅｂ  ｓｐｉｄｅｒ）であってもよく、Ａｔｒａｘ属またはＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ属からのペプチドは、本明細書に記載される手順を用いて容易に特別用に作製される。クモ、サソリおよび植物からの特定のペプチドが配列リストに提供される。
【００１７】
特殊な毒性ペプチドの調合物が開示され、この調合物はａ）ペプチドと、ｂ）極性有機溶媒と、ｃ）極性非プロトン溶媒またはアジュバントとを含み、ｄ）前記極性有機溶媒は、調合物の最終体積の約８０パーセントから約９９パーセント（％）を構成し、ｅ）前記極性非プロトン溶媒またはアジュバントは、懸濁液の最終体積の約１パーセントから約１０パーセント（％）を構成し、この調合物はさらにｆ）任意選択の水相を含み、前記水相は懸濁液の最終体積の０（ゼロ）パーセントから約１０パーセント（％）を構成する。
【００１８】
本発明の方法によって特別用に作製されるペプチドは新規であり、別々に請求されてもよい。これらのペプチドは単にその配列だけでなく、そのすべての特性によって説明される。本明細書に記載されるとおり、特別用に作製できるペプチドのペプチド配列情報の大部分は公知である。しかし、一旦処理されると、同じペプチドがより高い局所的活性を有するようになる。特別用に作製されたこれらのペプチドは一意の特性を有する新規のものであり、ペプチドおよびこれらを作製する方法の両方が本明細書において開示され、請求される。
【００１９】
昆虫を制御するための方法、特に昆虫の環境に適用される特殊な毒性ペプチドまたは特殊な毒性ペプチド調合物の適用も開示される。この特殊な毒性ペプチドは、乾燥または液体調合物として適用されてもよい。この調合物は、湿潤剤および分散剤、界面活性剤、ならびに殺虫性ペプチド調合物のその他の一般的な構成要素を含んでもよい。加えて、本明細書に記載される方法のいずれかの生成物として生成される特殊な毒性ペプチドも記載される。本明細書に記載される方法は、あらゆるペプチドとともに用いられてもよい。以下のペプチドは特定の例として示されるものであって、この方法を用いて特別用に作製できるペプチドの範囲、タイプまたは数を制限することは意図されない。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
毒性ペプチドの局所的殺虫活性を増加させるための方法であって、
ａ）局所的毒性ペプチドを調製する工程と、
ｂ）上記ペプチドに第１の溶媒を混合する工程であって、ここで、上記第１のタイプの溶媒は極性非プロトン溶媒または極性有機溶媒のいずれかである工程と、
ｃ）上記第１の溶媒ペプチド混合物に第２のタイプの溶媒を混合する工程であって、ここで、上記第２のタイプの溶媒は上記第１のタイプの溶媒と同じタイプの溶媒ではなく、かつ極性非プロトン溶媒または極性有機溶媒のいずれかである工程とを含む、方法。
（項目２）
上記極性非プロトン溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド、ジオキサンおよびヘキサメチルホスホロトリアミドから選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記極性有機溶媒は、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノールおよびプロパノールのすべての異性体、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、アセトニトリル、ならびにエチルアセトアセテートから選択される、項目２に記載の方法。
（項目４）
上記極性非プロトン溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはＭＳＯ（登録商標）から選択され、上記極性有機溶媒は、アセトン、メタノール、エタノールおよびプロパノールから選択される、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
上記第１の溶媒が上記ペプチドと混合される前に、上記ペプチドは凍結乾燥される、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目６）
上記第１の溶媒は極性非プロトン溶媒である、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目７）
上記極性非プロトン溶媒は全溶媒体積の約６０％から約９９％パーセントであり、上記極性有機溶媒は全溶媒体積の約４０％から約１％である、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目８）
上記極性非プロトン溶媒は全溶媒体積の約７５％から約９５％であり、上記極性有機溶媒は全溶媒体積の約２５％から約５％である、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目９）
上記極性非プロトン溶媒は全溶媒体積の約８０％から約９０％であり、上記極性有機溶媒は全溶媒体積の約２０％から約１０％である、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
上記ペプチドは、クモ、サソリ、ヘビ、ダニ、巻貝、ナメクジまたは植物のあらゆる種からの毒性ペプチドから選択されるか、またはそれに由来するあらゆる局所的毒性ペプチド、およびこうしたペプチドのいずれかに対する５０％またはそれを超える相同性を有するあらゆるペプチドである、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
上記ペプチドの長さは、１０から２００アミノ酸の長さである、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
上記ペプチドは１〜５個の内部ジスルフィド結合を有する、項目１に記載の方法
（項目１３）
上記ペプチドはクモまたはサソリから選択される、項目１に記載の方法。
（項目１４）
上記ペプチドは、Ａｔｒａｘ属またはＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ属のオーストラリアジョウ
ゴグモから選択される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
上記ペプチドは、上記配列リスト中のあらゆる配列、または上記列挙される配列のいずれかに対する５０％もしくはそれを超える相同性を有するあらゆる配列から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１６）
上記ペプチドは、上記配列リスト中の上記配列のいずれかから選択される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
上記ペプチドは、以下の配列：配列番号６０、配列番号１１７、配列番号１１８、または配列番号１１９のうちのいずれかから選択される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
ペプチド調合物であって、
ａ）ペプチドと、
ｂ）極性有機溶媒と、
ｃ）極性非プロトン溶媒またはアジュバントと
を含み、
ｄ）上記極性有機溶媒は上記調合物の最終体積の約７０パーセントから約９９パーセント（％）を構成し、
ｅ）上記極性非プロトン溶媒またはアジュバントは上記懸濁液の最終体積の約３０パーセントから約１パーセント（％）を構成し、上記ペプチド調合物は
ｆ）任意選択の水相を含み、上記水相は上記懸濁液の最終体積の０（ゼロ）パーセントから約１０パーセント（％）を構成する、ペプチド調合物
（項目１９）
項目１０に記載のペプチドであって、項目１に記載の方法によって特別用に作製される、ペプチド。
（項目２０）
項目１８に記載の特殊な毒性ペプチド調合物による昆虫の制御であって、上記特殊な毒性ペプチドおよび調合物は上記昆虫の環境に適用される、制御。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
「活性成分」とはペプチドまたはポリペプチドを意味し、本明細書においてはしばしば毒素と呼ばれる。
【００２１】
「殺虫活性」、「昆虫制御」または「昆虫を制御する」とは、昆虫を活性成分に露出させたときまたはその後に、その昆虫が死ぬか、その運動もしくは摂食を停止もしくは遅らせるか、その生育を停止もしくは遅らせるか、蛹化できないか、繁殖できないか、または繁殖性の子孫を生成できないかのいずれかとなることを意味する。
【００２２】
「昆虫（の）環境」とは、昆虫に現在または将来露出されるあらゆる場所または表面を意味する。昆虫の環境は、昆虫が生息する場所、昆虫の生育地、および昆虫が接触するか、食べるか、または摂取する食物を含む。
【００２３】
「昆虫毒性ペプチド（Ｔｏｘｉｃ  ｉｎｓｅｃｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」とは、昆虫が摂取するかまたは昆虫に注射したときには殺虫活性を有するが、局所的殺虫活性はほとんどないか、低いかまたは全くないペプチドを意味する。
【００２４】
「特別用に作製されたペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍａｄｅ  ｓｐｅｃｉａｌ）」とは、下記の「特殊な局所ペプチド（Ｓｐｅｃｉａｌ  ｔｏｐｉｃａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」と同じ意味である。
【００２５】
「極性非プロトン溶媒」とは、イオン溶解力を有するが酸性の水素を有さない有機溶媒である。極性非プロトン溶媒は水素（Ｈ＋またはプロトン）を供与できない。これらの溶媒は一般的に、高い比誘電率および高い極性を有する。代表的なものであって限定するものではないと考えられるべきさらなる例は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、ヘキサメチルホスホロトリアミドおよびメチルスルホキシド（ｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ：ＭＳＯ（登録商標））である。極性非プロトン溶媒としてのアジュバント。特定のアジュバントは極性非プロトン溶媒となることもできる。一般的にアジュバントと呼ばれる、油と界面活性剤との混合物は、極性非プロトン溶媒の他の例である。界面活性剤と組み合わせた穀物油も極性非プロトン溶媒として作用できる。商業用アジュバントを示すために提供される、たとえばすべてＬｏｖｅｌａｎｄ社より入手可能なＡｇｉｃｉｄｅ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（登録商標）、Ｈｅｒｂｉｍａｘ（登録商標）、Ｍａｘｉｍｉｚｅｒ（登録商標）、およびＭＳＯ（登録商標）などの例は、本発明によって定義された用語としての極性非プロトン溶媒として作用できる。ＭＳＯ（登録商標）は、大豆油のメチルエステルを用いた、メチル化された種子油および界面活性剤の混合物であり、約８０パーセントから８５パーセントの量の石油および１５パーセントから２０パーセントの量の界面活性剤を用いている。極性非プロトン溶媒として使用されるＭＳＯ（登録商標）の使用および説明は、実施例７に見出すことができる。
【００２６】
「極性有機溶媒」は、１５以上の比誘電率を与えるために十分な双極子モーメントを有する有機溶媒であり、アセトンはその一例である。極性有機溶媒の他の例は、解離できるＨ＋を有する化合物、たとえば低級アルキルアルコールなどを含む。代表的なものであって限定するものではないと考えられるべきさらなる例は以下のとおりである：アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、１−および２−プロパノール（それぞれｎ−およびイソ−プロパノール）を含むプロパノールのすべての異性体。この調合物の部分としてうまく使用され得る他の極性有機溶媒は、当業者によって定められ得る；それらは、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、アセトニトリル、エチルアセトアセテートなどを含んでもよい。
【００２７】
「特殊な局所ペプチド」とは、ペプチドの局所的活性を増加させるために用いられる本明細書に記載される手順によって、比較的高い局所的殺虫活性を有するようになる、以前は低い局所的殺虫活性を有したペプチドを意味する。
【００２８】
「局所的活性」または「局所的殺虫活性」とは、殺虫性ペプチドに昆虫の外層を露出または接触させた結果もたらされる殺虫活性を意味する。局所的活性は、処理された材料または表面と、昆虫の外側部分、たとえば昆虫の足、腹部、触角、口などとの露出または接触の結果もたらされてもよい。局所的活性は、昆虫の外側部分を昆虫が身繕いした後に毒素を摂取した結果もたらされてもよい。あらゆる材料または表面を殺虫剤または毒素で処理して昆虫と接触させることによって殺虫活性が得られるものは、局所的活性を有するとみなされる。
【００２９】
「局所的適用」とは、昆虫の環境または昆虫自体に活性成分を適用することを意味する。昆虫の環境は、噴霧、塗布、給餌、材料の含浸、たとえば紙またはその他の物体を処理した後に、昆虫が訪れるかまたは頻繁に訪れることが既知であるかまたは予期されるときに、同じ範囲にそれを置くことなどを含むあらゆる態様で、「局所的適用」によって処理されてもよい。局所的適用は、昆虫と殺虫剤との直接的接触も意味し得る。
【００３０】
特別用に作製するための方法
ペプチドを特別用に作製するための方法の説明。
【００３１】
水を有するかもしくは有さない極性有機溶媒を乾燥ペプチドに加え、次いで極性非プロトン溶媒もしくはその他のアジュバントをペプチド極性有機溶媒（任意には水）調合物に加えるか、または代替的に、最初に極性非プロトン溶媒もしくはその他のアジュバントを乾燥ペプチドに加え、次いで（水を有するかもしくは有さない）極性有機溶媒を極性非プロトン溶媒ペプチド調合物に加える。ペプチドおよびペプチド溶媒調合物に対する付加的な処理および前処理は任意のものであり、以下に考察される。
【００３２】
特別用に作製されたペプチドは、次いで効果に対して望まれるとおりに使用される。特別用に作製されたペプチドの適用および使用は、標準的であっても、当業者である実施者が有効であると定めるとおりであってもよいあらゆる手段を伴ってもよく、その手段は以下を含むがそれらに限定されない：アトマイザまたはその他の種類の噴霧ノズルによる噴霧、調合物の小滴の直接的／間接的適用、標的昆虫のあらゆる体表面に対する調合物の乾燥残留物の適用、浴槽における標的昆虫の浸漬など。
【００３３】
極性有機溶媒および極性非プロトン溶媒またはその他のアジュバントの添加が完了するとペプチドは特別用に作製され、溶媒はいずれの順序で加えられてもよい。非水性環境にあるペプチドから出発する方がよい。溶媒添加の好ましい順序は、使用される特定のペプチドに注意し考慮して、殺虫性調合物の技術分野における当業者である実施者によって定められるだろう。溶媒を加える態様には多数の変更を加えることができ、それらは当業者に明らかとなるはずである。手順のいくつかの変更形およびより多くの詳細を以下に提供する。
【００３４】
出発ペプチドが水に溶解されているときは、水を除去することによるペプチドの調製が必要なことがある。ペプチドを特別用に作製する手順は、水への溶解度が高いかまたは低いペプチドのいずれによって実施されてもよい。ペプチドは水に基づく溶媒中で調製されたり、水性環境中で発現されたりすることがしばしばある。特別用に作製すべきペプチドが水性環境中にあるときには、最初にほとんどの水を除去すべきであり、つまりペプチドを乾燥すべきである。もしペプチドがすでに乾燥状態にあれば、乾燥は必要ない。ペプチドの調製は、ペプチドおよびまたはサンプル中のペプチドの量もしくは濃度を、濃縮、精製、単離または同定することを含み得る。ペプチドが好ましい状態、条件または濃度になったら、それを「乾燥」すべきである。ペプチドを乾燥するか、ペプチドを水性環境から取り出す方法の１つは、伝統的なペプチド凍結乾燥手順を用いてペプチドを凍結乾燥することである。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、第２版、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、２００５、ｐｐ１４０を参照されたい。その他の方法は、噴霧乾燥、回転蒸発および真空遠心分離を含むがこれらに限定されない。ペプチド乾燥は、ペプチドが過度に損傷または破壊されないような態様で行なわれるべきである。過剰な熱は避けるべきである。当業者は、ペプチドを乾燥するための適切な手順が分かって実施できるだろう。
【００３５】
乾燥ペプチドに極性有機溶媒を加える。ほとんどの水を除去することによってペプチドが調製されると、それを極性有機溶媒または極性非プロトン溶媒もしくはアジュバントと混合できる。極性非プロトン溶媒を加える前に極性有機溶媒を乾燥ペプチドに加えたときの方が良い結果が得られることがあり、順序を以下に説明するが、いくつかの状況におけるいくつかのペプチドについては、乾燥ペプチドに極性非プロトン溶媒を加えた後に極性有機溶媒を加える。
【００３６】
極性有機溶媒
多くの極性有機溶媒が使用可能であり、そのいくつかは他のものよりも高い局所的活性を有するペプチドを生成するようにみえる。我々は、ペプチドを特別用に作製するためのこの手順において以下の極性有機溶媒がうまく働くことを見出した：アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、１−および２−プロパノール（それぞれｎ−およびイソ−プロパノール）を含むプロパノールのすべての異性体。この調合物の部分としてうまく使用され得る他の極性有機溶媒は、当業者によって定められ得る；それらは、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、アセトニトリル、エチルアセトアセテートなどを含んでもよい。ペプチドと溶媒との混合は、たとえばボルテックス混合、撹拌、振とうなど、あらゆる混合の実験方法によって行なわれてもよい。
【００３７】
非プロトン溶媒／アジュバントの前に極性有機溶媒が乾燥ペプチドに加えられるとき、それ（極性有機溶媒）は調合物中の液体の約９８％から１００％であってもよく、ペプチドは溶媒中で沈殿を形成するであろう。調合物は曇った、または濁った懸濁液のように見えるかもしれない。それは勢いよく混合されるべきである。極性有機溶媒は中にいくらかの水を有していてもよく、下記の「水」を参照されたいが、純粋な溶媒またはドライ溶媒もうまく働く。水および極性有機溶媒の最適な最終濃度は、当業者によって特定の特殊な局所ペプチドの調合物に対して決定され得る。我々は、８０％から９９％の最終濃度の極性有機溶媒によって特殊な局所ペプチドを調合した。いくつかのペプチドについては、８０％より低い濃度でも働くであろう。我々は、６０、７０、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８および９９％の最終濃度であって、かつ０％から１０％の最終濃度の水を伴う極性有機溶媒を特定的に記載し、特に１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０％の最終水濃度を記載する。当業者は、特定の特殊な局所ペプチドの特定の調合物に対して、これらのサンプル範囲の外側の値をうまく用いることができるだろう。
【００３８】
超音波処理。ペプチドが溶媒に適切に取込まれた後、その局所的活性をさらに増加させるために、それを超音波処理または別様で処理してもよい。超音波処理は溶液中のペプチド粒子をばらばらにして懸濁粒子のサイズを低減させてもよい。粒子サイズを低減させるための超音波処理またはその他の手順によって、ペプチドの局所的毒性が増加するようである。局所的活性を増すために、超音波処理に加えて、粒子サイズを低減させるその他の手順が用いられてもよい。ペプチド操作に精通した者は、粒子サイズを低減させるためのさまざまな手順を知っているはずである。いかなる特定の手順または機構にも限定されることなく、高速ブレンダの使用、ガラスビーズを伴う振とうまたは撹拌も、特殊な毒性ペプチドの毒性を増すために有用であり得る。
【００３９】
水。上述のとおり、極性有機溶媒は使用されるときに純粋または無水である必要はない：極性有機溶媒は水を含有し得る。さらに、この水は塩、有機分子、ペプチドなどを含有していてもよい。水はおそらく、極性有機溶媒がペプチド調合物に加えられる前、または極性有機溶媒の添加と同時もしくはその後に、ペプチドに加えられてもよい。過度に高濃度の水を使用しないように注意すべきである。なぜなら我々は、それによって特定の特殊な局所ペプチドの特定の調合物の活性が低減または消失し得ることを観察したためである。水は純粋である必要はなく、より有用で安定した最終溶液を生成するために、たとえばキチナーゼ、ホスホリパーゼ、レクチンなどのさまざまなタンパク質、または塩、糖、炭水化物などを含んでもよい。代替的には、水相は最初は純粋な水であってもよく、次いで水相が極性有機溶媒およびペプチドと混合された後に、たとえばキチナーゼ、ホスホリパーゼ、レクチンなどのさまざまなタンパク質が水相に加えられてもよい。
【００４０】
極性非プロトン溶媒。極性非プロトン溶媒またはアジュバントは、乾燥ペプチドに加えられる第１の成分として使用されてもよいし、上記のペプチド極性有機溶媒（任意には水）調合物に加えられてもよい。当業者は、ペプチドを特別用に作製するためのより良い態様を定めるために、極性非プロトン溶媒または極性有機溶媒のいずれを乾燥ペプチドに加える第１の液体とすべきかを決定できる。この決定は、各々の場合の状況、ならびに特に、正確にどの昆虫毒性ペプチドを用いるか、および所望の最終調合物に依存するだろう。しかし、こうした変更は注意して実施するべきである。なぜなら我々はいくつかの場合において、極性有機溶媒を加える前にペプチドに極性非プロトン溶媒を加えた結果、より低い殺虫活性がもたらされることを観察したためである。
【００４１】
極性非プロトン溶媒は酸性の水素を有さない。これらの溶媒は一般的に、高い比誘電率および高い極性を有する。その例には、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキサンおよびヘキサメチルホスホロトリアミドが含まれる。
【００４２】
アジュバントは、農薬および特にペプチドの農業的適用のために調合されたあらゆる油および／または乳化界面活性剤であってもよい。これらの商業的調合物は典型的に、活性成分を「保有および拡散」するように調合された油および乳化界面活性剤を有する。その例には、Ｈｅｌｅｎａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．による「Ａｅｒｏ  Ｄｙｎｅａｍｉｃ」が含まれ、これはメチル化またはエチル化された植物油、非イオン性界面活性剤、および緩衝剤または酸化剤を有する。これはさらに、「エトキシ化アルキルリン酸エステル、ポリアルキレン修飾されたポリジメチルシロキサン、非イオン性乳化剤、およびメチル化された植物油の独自の混合物。空気中での使用は２−８ｑｔ／１００ｇａｌ．、３０〜７０パーセントに限る。ｐＨ低減および緩衝、ＮＩＳおよび油の混合を提供する」とも説明される。比率についてはラベルを参照されたい。アジュバントのさらなる例および製造品を表１に見出すことができる。
【００４３】
【表１】
0005746628.tif 000002
極性非プロトン溶媒および／またはアジュバントの最適な最終濃度は、当業者によって特別用に作製される特定の局所ペプチドの調合物に対して決定できる。我々は、１０％および０．０１％まで低くした最終濃度の極性非プロトン溶媒によって特殊な局所ペプチドを調合することに成功し、０．５％のものがうまく働いた。たとえばアジュバントＳｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７は０．０１％まで低くした最終濃度でもうまく働き、当業者は、特別用に作製される特定の局所ペプチドの特定の調合物に対して、本明細書に記載される範囲よりもなお高いかまたは低い値を用いる他のアジュバントをうまく見出せるはずである。
【００４４】
上述した水および超音波処理工程はあらゆる順序で適用されてもよい。特殊な局所ペプチドの特定の調合物に対する殺虫性適用の特定のモードは、当業者によって決定されるだろう。
【００４５】
局所的毒性ペプチドおよびその調製。
【００４６】
昆虫毒性ペプチドの例は周知であり、多数の参考文献に見出すことができる。それらのペプチドは、そのペプチド性の性質および活性、通常は経口または注射殺虫活性によって同定できる。我々は、本発明をより良く示して説明するために本明細書にいくつかの例を提供するが、本発明はこれらの例に限定されない。これらの例およびここに示されない他の例はすべて、本明細書において最初に記載され請求される新しい材料を記述するものである。
【００４７】
昆虫毒性ペプチドは、５アミノ酸残基よりも大きく、３０００アミノ酸残基よりも小さいペプチドである。それらの分子量は約５５０Ｄａから約３５０，０００Ｄａの範囲である。昆虫毒性ペプチドは何らかの種類の殺虫活性を有する。典型的に、それらのペプチドは昆虫に注射されたときには活性を示すが、昆虫に局所的に適用されたときには顕著な活性を有さないものがほとんどである。昆虫毒性ペプチドの殺虫活性は、さまざまなやり方で測定される。一般的な測定方法は当業者に広く公知である。こうした方法は、たとえば麻痺、死亡率、体重が増加しないことなど、さまざまなパラメータのスコアリングに基づく用量反応プロットの適合による中央反応用量（例、ＬＤ５０、ＰＤ５０、ＬＣ５０、ＥＤ５０）の決定を含むがこれに限定されない。問題の殺虫性調合物のさまざまな用量に露出させた昆虫のコホートに対して測定が行なわれてもよい。プロビット分析および／またはＨｉｌｌ方程式などによって定義される曲線を作成することによって、データの分析が行なわれてもよい。こうした場合には、皮下注射、高圧注入、食物または餌のサンプルの部分として殺虫性調合物を提供することなどによって、用量が投与される。
【００４８】
本明細書において昆虫毒性ペプチドは、昆虫への皮下注射、高圧注入、または経口送達（すなわち昆虫に提供される食物のサンプルの部分としての摂取）のいずれかによって昆虫に送達されたときに殺虫性であることが示されるすべてのペプチドとして定義される。よってこのクラスのペプチドは、クモ、ダニ、サソリ、ヘビ、巻貝などの毒液の構成要素として天然に生成される多くのペプチドを含むがそれらに限定されない。加えてこのクラスは、植物によって生成されるさまざまなペプチド（例、さまざまなレクチン、リボソーム不活性化タンパク質およびシステインプロテアーゼ）、および昆虫病原性微生物によって生成されるさまざまなペプチド（例、さまざまなＢａｃｉｌｌｕｓ種によって生成されるＣｒｙ１／デルタエンドトキシンファミリーのタンパク質）も含むがそれらに限定されない。
【００４９】
以下の文書は、米国および許可される他の管区においてその全体にわたって引用により援用され、これらはその出版によって周知の知識である。加えてこれらの文書は引用により援用され、特定的にそれらがペプチド配列を記載している範囲でそれらの配列リストについて公知である。以下を参照されたい：米国特許：米国特許第５，７６３，５６８号、１９９８年６月９日発行、特定的に配列リスト中の配列、および１〜２６の番号が付けられたもの、および「カッパ」または「オメガ」毒素として公知のもの、その中には２〜４個の鎖内ジスルフィド架橋を形成できるものが含まれる、さらに列２および４、および表５、および図５、図１５、図１６、図１７、図１８に示されるペプチド。米国特許第５，９５９，１８２号、１９９９年９月２８日発行、特定的に配列リスト中の配列、および１〜２６の番号が付けられたもの、および「カッパ」または「オメガ」毒素として公知のもの、その中には２〜４個の鎖内ジスルフィド架橋を形成できる毒素が含まれる、さらに列２および４、および表５、および図５、図１５、図１６、図１７、図１８に示されるペプチド。米国特許第６，５８３，２６４  Ｂ２号、２００３年６月２４日発行、および米国特許第７，１７３，１０６  Ｂ２号、２００７年２月６日発行、特定的に配列番号１、「オメガ−アトラコトキシン−Ｈｖ２ａまたはω−アトラコトキシン−Ｈｖ２ａと命名される、その中には２〜４個の鎖内ジスルフィド架橋を形成できる毒素が含まれる。米国特許第７，２７９，５４７  Ｂ２号、２００７年１０月９日発行、特定的に配列リスト中の配列、および１〜３５の番号が付けられたもの、およびω−アトラコトキシン−Ｈｖ２ａの変異体、２〜４個の鎖内ジスルフィド架橋を形成できる毒素、ならびに明細書の列４〜８、および図３および図４に示されるペプチド。米国特許第７，３５４，９９３  Ｂ２号、２００８年４月８日発行、特定的に配列リスト中に列挙されるペプチド配列、および１〜３９の番号が付けられたもの、およびＵ−ＡＣＴＸポリペプチドと命名されたもの、２〜４個の鎖内ジスルフィド架橋を形成できる毒素、およびその変異体、ならびに明細書の列４〜９および図１に示されるペプチド。欧州特許第１  ８１２  ４６４  Ｂ１号、公開および特許付与０８．１０．２００８公報２００８／４１、特定的に配列リスト中に列挙されるペプチド配列、２〜４個の鎖内ジスルフィド架橋を形成できる毒素、および１〜３９の番号が付けられたもの、およびＵ−ＡＣＴＸポリペプチドと命名されたもの、およびその変異体、および段落００２３から００５５に示されるペプチド、および図１に示されるペプチド。
【００５０】
本明細書において同定されるペプチドに対して記載され引用により援用されるものは、言及される配列の相同変異体であり、こうした配列に対する相同性を有するか、または本明細書に記載される方法に従って特別用に作製するために好適であるとして本明細書において同定され請求されるものであると記載されており、それは本明細書に開示される配列のいずれか、または引用により援用されるいずれかの配列に対して以下のパーセント同一性の少なくともいずれかを有する相同配列を含むすべての相同配列を含むがそれらに限定されない：上に示す特許において同定されるあらゆるすべての配列、ならびに本出願の配列リストの各配列およびすべての配列を含む、本明細書において同定されるあらゆるその他の配列に対する同一性が、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上のもの。本明細書において、たとえば３０％以上などの数字とともに相同または相同性という用語が用いられるとき、それは２つのペプチド間のパーセント同一性またはパーセント類似性を意味する。パーセント数を伴わずに相同または相同性が用いられるとき、それは進化または発達の面において密接に関係する２つのペプチド配列を示しており、それらのペプチド配列は、たとえば局所的毒性および１００％大きい長さもしくは５０％短い長さのうちの類似サイズまたはペプチドなどの共通の物理的および機能的局面を共有する。
【００５１】
本明細書において同定されるペプチドに対して記載され引用により援用されるものは、上に示した米国および欧州特許文書において述べられているあらゆる供給源に由来するものであり、それは以下を含むがそれらに限定されない：植物および昆虫から単離された毒素、特に、たとえばジョウゴグモおよび特にオーストラリアジョウゴグモなど、昆虫を捕食するかまたは昆虫から身を守るクモ、サソリおよび植物からの毒素、その中にはＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｖｅｒｓｕｔａまたはブルーマウンテンジョウゴグモ、Ａｔｒａｘ  ｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ａｔｒａｘ  ｆｏｒｍｉｄａｂｉｌｉｓ、Ａｔｒａｘ  ｉｎｆｅｎｓｕｓ属種を含むＡｔｒａｘ属またはＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ属に見出されるか、それから単離されるか、それに由来する毒素が含まれ、その中には「アトラコトキシン」、「コアトラコトキシン（ｃｏ−ａｔｒａｃｏｔｏｘｉｎｓ）」、「カッパ」アトラコトキシン、ω−アトラコトキシンとしても公知の「オメガ」アトラコトキシン、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂ、または突然変異体もしくは変異体として公知の毒素が含まれ、特にこれらのタイプのいずれかのペプチド、および特に約２００アミノ酸よりも小さいが約１０アミノ酸よりも大きいペプチド、および特に約１５０アミノ酸よりも小さいが約２０アミノ酸よりも大きいペプチド、特に約１００アミノ酸よりも小さいが約２５アミノ酸よりも大きいペプチド、特に約６５アミノ酸よりも小さいが約２５アミノ酸よりも大きいペプチド、特に約５５アミノ酸よりも小さいが約２５アミノ酸よりも大きいペプチド、特に約３７または３９または約３６から４２アミノ酸のペプチド、特に約５５アミノ酸よりも小さいが約２５アミノ酸よりも大きいペプチド、特に約４５アミノ酸よりも小さいが約３５アミノ酸よりも大きいペプチド、特に約１１５アミノ酸よりも小さいが約７５アミノ酸よりも大きいペプチド、特に約１０５アミノ酸よりも小さいが約８５アミノ酸よりも大きいペプチド、特に約１００アミノ酸よりも小さいが約９０アミノ酸よりも大きいペプチド、その中には２個、３個およびまたは４個またはそれより多い鎖内ジスルフィド架橋を形成できる、本明細書に述べられるあらゆる長さのペプチド毒素が含まれ、カルシウムチャンネル電流を乱す毒素が含まれ、カリウムチャンネル電流を乱す毒素が含まれ、それは特に昆虫カルシウムチャンネルまたはその混成体であり、さらに特にこれらのタイプのいずれかの毒素またはその変異体、および局所的殺虫活性を有する本明細書に記載されるいずれかのタイプの毒素のあらゆる組み合わせ。これらのペプチドは本明細書に記載される方法によって特別用に作製できる。
【００５２】
オーストラリアジョウゴグモ、Ａｔｒａｘ属およびＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ属からの有毒ペプチドは、本発明によって記載される方法、手順または方法によって処理されるときに、特に好適であってうまく働く。これらのクモペプチドは、特に毒性サソリペプチドおよび毒性植物ペプチドを含む他の多くの毒性ペプチドと同様に、本発明によって記載される方法によって処理されるときに局所的に活性または毒性となる。テストされてデータを有する好適なペプチドの例を本明細書に提供する。上述の生物に加えて、以下の種も本発明の方法によって特別用に作製するのに好適な毒素を有することが特定的に知られている。以下の種は特定的に、Ａｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓ  ａｐｅｒｔａ、Ａｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ  Ｈｅｃｔｏｒ、Ａｎｔｒａｘ  ｆｏｒｍｉｄａｂｉｌｌｉｓ、Ａｎｔｒａｘ  ｉｎｆｅｎｓｕｓ、Ａｔｒａｘ  ｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂｏｔｈｕｓ  ｍａｒｔｅｎｓｉｉ  Ｋａｒｓｃｈ、Ｂｏｔｈｕｓ  ｏｃｃｉｔａｎｕｓ  ｔｕｎｅｔａｎｕｓ、Ｂｕｔｈａｃｕｓ  ａｒｅｎｉｃｏｌａ、Ｂｕｔｈｏｔｕｓ  ｊｕｄａｉｃｕｓ、Ｂｕｔｈｕｓ  ｏｃｃｉｔａｎｕｓ  ｍａｒｄｏｃｈｅｉ、Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ  ｎｏｘｉｕｓ、Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ  ｓｕｆｆｕｓｕｓ  ｓｕｆｆｕｓｕｓ、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｉｎｆｅｎｓａ、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｖｅｒｓｕｔａ、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｖｅｒｓｕｔｕｓ、Ｈｏｌｏｌｅｎａ  ｃｕｒｔａ、Ｈｏｔｔｅｎｔｏｔｔａ  ｊｕｄａｉｃａ、Ｌｅｉｕｒｕｓ  ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ、Ｌｅｉｕｒｕｓ  ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ  ｈｅｂｒａｅｕｓ、Ｌｅｉｕｒｕｓ  ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ  ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ、Ｏｌｄｅｎｌａｎｄｉａ  ａｆｆｉｎｉｓ、Ｓｃｏｒｐｉｏ  ｍａｕｒｕｓ  ｐａｌｍａｔｕｓ、Ｔｉｔｙｕｓ  ｓｅｒｒｕｌａｔｕｓ、Ｔｉｔｙｕｓ  ｚｕｌｉａｎｕと命名されている。上に列挙された属およびまたは属種のいずれかからのあらゆるペプチド毒素が、本発明における方法に従って特別用に作製するために好適である。
【００５３】
本明細書における実施例は本発明を限定することは意図されておらず、本発明を限定するために用いられてはならず、実施例は本発明を例示するためにのみ提供される。
【００５４】
上記のとおり、特別用に作製するための方法の対象として、多くのペプチドが好適な候補である。上記、下記および配列リスト中の配列は、特別用に作製できる特に好適なペプチドであり、これらのペプチドの多くが本発明に従って特別用に作製されており、その結果は以下の実施例に示されている。
【００５５】
【化１】
0005746628.tif 000003
【００５６】
【化２】
0005746628.tif 000004
局所的毒性ペプチドの調製
上述の毒性ペプチドはさまざまなやり方で調製でき、いくつかの実施形態においては、それらを何らかの形式的方法によって調製する必要はない。ペプチドは組成物中の他の不純物を伴うかまたは伴わずに単純に回収されて、利用されてもよい。以下にいくつかの実施例を提供する１つの実施形態において、ペプチドは特別用に作製される前に凍結乾燥されるか、またはその液体の一部、ほとんどもしくはほぼすべてを除去される。いくつかの実施形態において、ペプチドは湿潤なままであり、過剰な液体のみが除去される。いくつかの実施形態において、ペプチドは水溶液または水溶液に類似したものの中にある。特別用に作製する前にペプチドを単離または精製する必要はない。
【００５７】
局所的殺虫活性を測定するための再現可能なアッセイ。
【００５８】
ペプチドの局所的殺虫活性を測定して定量することができる。多数のアッセイが利用可能である。ペプチドの局所的活性を定めるために有用な再現可能なアッセイのいくつかの例を、以下の実施例において提供する。これらの実施例はペプチドおよびアッセイの両方を詳細に説明するものであるが、請求項または本発明の範囲を限定するためにこれらの実施例を使用するべきではない。
【実施例】
【００５９】
材料および方法−実施例
（実施例１）
イエバエを用いたアセトンおよびＤＭＳＯによる局所的アッセイ
毒素はω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａである：
【００６０】
【化３】
0005746628.tif 000005
合成。分子量：４０５０Ｄａ。イエバエにおけるＬＤ５０：９０．２ｐｍｏｌ／ｇ
調合物の投与および適用。
【００６１】
昆虫はＢｅｎｚｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈからのイエバエ（Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）であり、体重１２〜２０ｍｇ（平均質量１６ｍｇ）のものが各々、体の背側の胸部表面に調合物の２μＬマイクロピペット適用を受ける。
【００６２】
毒素用量：
約９０，０００ｐｍｏｌ／ｇのω−ＡＣＴＸ（１０００×注射ＬＤ５０）を、９０％アセトン／１０％ＤＭＳＯまたはＤＭＳＯ（１０％〜２０％）および０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０に溶解したもの、
約９，０００ｐｍｏｌ／ｇ（１００×注射ＬＤ５０）、および
約９００ｐｍｏｌ／ｇ（１０×ＬＤ５０）をＤＭＳＯ（１０％〜２０％）および０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０に溶解したもの。
【００６３】
水に基づく適用溶液の調製
ω−ＡＣＴＸ／ＤＭＳＯストック−３．５ｍｇの凍結乾燥ω−ＡＣＴＸ（Ａｕｓｐｅｐ）を一塊にして７０μＬのＤＭＳＯに溶解した（５０μｇ／μＬストック）。水＋Ｔｗｅｅｎストック−１％Ｔｗｅｅｎ  ２０ストックから、Ｔｗｅｅｎ  ２０ストックの１０００μＬアリコートを、パーセント体積対体積値（以下に挙げられる）に対して水中で調製した（例、０．１１１％Ｔｗｅｅｎ  ２０ストックに対しては、１１１μＬの１％Ｔｗｅｅｎ  ２０＋８８９μＬの水など）。すべての場合において、最初にＴｗｅｅｎ  ２０ストックを管に加え、次いでＤＭＳＯ、最後にω−ＡＣＴＸ／ＤＭＳＯストックを加えた。
【００６４】
【表２】
0005746628.tif 000006
注記。表２および以下の表の多くにおいては、次の略語のいくつかまたはすべてが用いられる：「ｔｗｉｔｃｈ」または「ｔｗｃｈ」は単収縮（ｔｗｉｔｃｈｉｎｇ）を意味する；「ｍｏｒｂ」は瀕死（ｍｏｒｉｂｕｎｄ）を意味し、「−ｖｅ」は実験条件と同じであるがいかなる活性成分（単数または複数）も伴わない「負の対照条件（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」を意味する。
【００６５】
アセトンに基づく適用溶液の調製：
アセトン−  ＤＭＳＯ中の同じ５０μｇ／μＬのω−ＡＣＴＸストックを用いて、平均質量１６ｍｇのイエバエに２μＬの小滴として適用したときに９０，０００ｐｍｏｌ／ｇの用量当量を送達する、９０％アセトンおよび１０％ＤＭＳＯ中の調合物を作製した。この場合、最初に毒素ストックをアセトンに加え、次いで最終体積のＤＭＳＯを加えて１０％ｍ／ｖのＤＭＳＯに到達させた。これは、溶解した毒素がアセトンに加えられたときの沈殿の量を調べるために行なわれた。
【００６６】
１．２ｍｇの凍結乾燥ω−ＡＣＴＸ（Ａｕｓｐｅｐ）を２４０μＬのアセトンに溶解することによって、第２のω−ＡＣＴＸ溶液も調製した（５μｇ／μＬストック）。このストック５０μＬを１２１．５μＬのアセトンで希釈した後に、１７．１５μＬのＤＭＳＯを加えた（１０％濃度）。この調合物に対するω−ＡＣＴＸ用量を推定するための計算は以下のとおりである：
５０μＬ×５μｇ／μＬ  ω−ＡＣＴＸストック＝２５０μｇ  ω−ＡＣＴＸ÷１７１．５μＬ合計体積＝１．４５８μｇ／μＬ×２μＬ／昆虫＝２．９１５μｇ／昆虫
２．９１５μｇ／昆虫×１μｍｏｌ／４０５０μｇ×１０６ｐｍｏｌ／１μｍｏｌ＝７１９．７ｐｍｏｌ／昆虫×１昆虫／０．０１６ｇ＝４５，０００ｐｍｏｌ／ｇ
ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ）の対照調合物もアセトンおよびＤＭＳＯ中で調製した。ストックＢＳＡの濃度のために、アセトンの濃度は１０％ＤＭＳＯ中に約６０％だけであった。
【００６７】
【表３】
0005746628.tif 000007
調合物の投与および適用
イエバエを約４時間冷蔵し、次いでＣＯ２で麻酔した。上述の各処置調合物を１０匹の麻酔したハエのグループに適用した。処置は、それぞれの調合物の２μＬ小滴を、ハエの背側胸部体表面上にピペッティングすることからなった。１０匹の麻酔したハエのグループを用いて、各処置体制（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｍｅ）をテストした。アセトン／ＤＭＳＯ溶液は角皮から迅速に蒸発した。ＤＭＳＯ調合物は角皮を通って吸収された。背側表面を下にして復活した処置後のハエは、ビンの底にくっついて、食物および水とともに配置した後にもがく傾向があった；これを防ぐために、ビンを静かにたたくか、またはくっついたハエをピンセットで操作してまっすぐな向きに戻すことによる介入を行なった。未処置のハエの対照グループも準備することによって、死亡率がＣＯ２露出に影響されていないことを確認した。すべての処置に食物および水を与え、２４時間観察した。
【００６８】
結果（すべての処置グループに対してｎ＝１０、グループ当りの死亡したハエの数を第２列に報告している）：
【００６９】
【表４−１】
0005746628.tif 000008
【００７０】
【表４−２】
0005746628.tif 000009
【００７１】
【表４−３】
0005746628.tif 000010
１０％ＤＭＳＯを有するアセトン中に溶解したω−ＡＣＴＸの局所的適用はハエに対する殺虫性があった（２４時間で７０％の死亡率）のに対し、ＤＭＳＯに溶解してからアセトン中で１０％ＤＭＳＯに希釈したω−ＡＣＴＸの類似の調製物は、もっと殺虫性が低かった（約３０％）。これらの結果は、ＤＭＳＯを１０％の濃度になるよう加えたアセトンに溶解したω−ＡＣＴＸが９０％のイエバエを殺した（６／１９／０８）のに対し、ＤＭＳＯに溶解してからアセトン中で９０，０００ｐｍｏｌ／ｇの濃度に希釈したω−ＡＣＴＸが処置した昆虫の４０％を殺したという局所的アッセイと類似している。水中の１０〜２０％ＤＭＳＯ中のω−ＡＣＴＸの局所的適用も殺虫性があったが、アセトン／ＤＭＳＯ溶液よりも殺虫性はかなり低かった（３０％対７０％）。
【００７２】
（実施例２）
イエバエを用いたアセトン／メタノール／ＤＭＳＯによる局所的アッセイ
毒素はω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ：
【００７３】
【化４】
0005746628.tif 000011
合成。分子量：４０５０Ｄａ。イエバエにおけるＬＤ５０：９０．２ｐｍｏｌ／ｇ。
【００７４】
調合物の投与および適用。
【００７５】
昆虫：Ｂｅｎｚｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈからのイエバエ（Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、体重１２〜１８ｍｇ（平均質量１５ｍｇ）；背側胸部への２μＬマイクロピペット適用。
【００７６】
Ｂｅｎｚｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈからのタマナキンウワバガ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、体重約３０ｍｇ；背側前部への２μＬマイクロピペット適用。
【００７７】
毒素用量の算出：約９０，０００ｐｍｏｌ／ｇのω−ＡＣＴＸ（１０００×注射ＬＤ５０）、
０．０１５ｇ／ハエ×９０，０００ｐｍｏｌ／ｇ＝１３５０ｐｍｏｌ／ハエ×４０５０ｐｇ／ｐｍｏｌ×１μｇ／１０６ｐｇ＝５．４６７μｇ／昆虫。
【００７８】
５．４６７μｇ／２μＬ適用＝２．７３３μｇ／μＬ×１５０μＬ＝４１０．０６μｇ×１μＬ／５μｇ＝８２μＬの５μｇ／μＬ  ω−ＡＣＴＸストック
適用溶液の調製。
【００７９】
１．５ｍｇの凍結乾燥ω−ＡＣＴＸを３００μＬのアセトンに溶解して５ｍｇ／ｍＬ溶液を生成したストック調製物から、表５に従ってアセトン（９０％）およびＤＭＳＯ（１０％）中のω−ＡＣＴＸの混合物を調製した。アセトンを加えたときにω−ＡＣＴＸは濁った沈殿を形成し、それはベンチに置いておくと沈降した。希釈前に調製物を約５秒間ボルテックスして沈殿物を均一化した。
【００８０】
メタノール／ＤＭＳＯ−  ２．３ｍｇの凍結乾燥ω−ＡＣＴＸを４６０μＬのメタノールに溶解して５ｍｇ／ｍＬの最終ペプチド濃度を有する混合物を生成したストック調製物から、表５に従ってメタノール（９０％）およびＤＭＳＯ（１０％）中のω−ＡＣＴＸの混合物を調製した。アトラコトキシン／アセトン懸濁液と類似の態様で、メタノールを加えたときにω−ＡＣＴＸは濁った沈殿を形成し、それはベンチに置いておくと沈降した。希釈前に調製物を約５秒間ボルテックスして沈殿物を均一化した。
【００８１】
【表５】
0005746628.tif 000012
表５の処置調製物は、アセトン／メタノール／ＤＭＳＯの調合物である；各調合物を調製するときの添加の順序は、溶媒、ω−ＡＣＴＸストック（必要なとき）、および最後にＤＭＳＯであった。
【００８２】
調合物の投与および適用。
【００８３】
上記の各処置調合物を、１０匹のＣＯ２麻酔したイエバエのグループに適用した。処置適用は、それぞれの調合物の２μＬ小滴を、ハエの背側胸部体表面上にピペッティングすることからなった。各適用の直前に各混合物をボルテックスすることによって、沈殿粒子の懸濁を確実にした。処置後の昆虫を新鮮な食物および水とともにビンに入れて回復させ、２４時間にわたって観察した。
【００８４】
上記の各処置調合物を、１０匹の第２齢のＴ．ｎｉのグループにも適用した。処置適用は、それぞれの調合物の２μＬ小滴を、前部背側体表面上にピペッティングすることからなった。各適用の直前に各混合物をボルテックスすることによって、沈殿粒子の懸濁を確実にした。適用の直前にすべての処置混合物をボルテックスすることによって、沈殿粒子の懸濁を確実にした。処置後の昆虫を新鮮な培地の上に置いて、２４時間観察した。
【００８５】
【表６】
0005746628.tif 000013
アセトン中のω−ＡＣＴＸで処理したイエバエの死亡率は４０％しかなかったのに比べて、メタノールおよびＤＭＳＯ中の高用量のω−ＡＣＴＸによるイエバエの局所的処置は、処置後１８時間で１００％の死亡率という殺虫性であった。どちらの処置においても対照の死亡率はなかった。タマナキンウワバガのω−ＡＣＴＸ処置および対照処置は、昆虫の死亡、摂食または挙動に関して差がなかった。この実験においては、メタノールはアセトンよりもω−ＡＣＴＸの局所的活性を多く増強した。
【００８６】
（実施例３）
イエバエを用いたメタノールおよびエタノールによる局所的アッセイ
毒素はω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ
【００８７】
【化５】
0005746628.tif 000014
合成。分子量：４０５０Ｄａ
イエバエにおけるＬＤ５０：９０．２ｐｍｏｌ／ｇ
調合物の投与および適用。
【００８８】
昆虫：Ｂｅｎｚｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈからのイエバエ（Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、体重１２〜２０ｍｇ（平均質量１６ｍｇ）。背側胸部への２μＬマイクロピペット適用。
【００８９】
毒素用量の算出：
約９０，０００ｐｍｏｌ／ｇのω−ＡＣＴＸ（１０００×注射ＬＤ５０）、
０．０１５ｇ／ハエ×９０，０００ｐｍｏｌ／ｇ＝１３５０ｐｍｏｌ／ハエ×４０５０ｐｇ／ｐｍｏｌ×１μｇ／１０６ｐｇ＝５．４６７μｇ／昆虫
５．４６７μｇ／２μＬ適用＝２．７３３μｇ／μＬ×２５０μＬ＝６８３．４３μｇ×１μＬ／５μｇ＝１３６．７μＬの５μｇ／μＬ  ω−ＡＣＴＸストック
注記：平均質量１５ｍｇ（１２〜１８ｍｇの範囲）のハエについて算出された処置溶液；使用された昆虫の実際の平均質量は１６ｍｇ（１２〜２０ｍｇの範囲）であった。以下の表中のω−ＡＣＴＸ用量は、この矛盾に対して調整されたものである。
【００９０】
適用溶液の調製
メタノール−  １．０ｍｇの凍結乾燥ω−ＡＣＴＸを２００μＬのメタノールに溶解したストック調製物（５ｍｇ／ｍＬ溶液）を用いて、表７に従ってメタノール中のω−ＡＣＴＸの溶液を調製した。
【００９１】
【表７】
0005746628.tif 000015
メタノール＋ＤＭＳＯ−  ５ｍｇ／ｍＬストックを用いて、表８に従ってメタノール中のω−ＡＣＴＸの溶液を調製した。ストック混合物をメタノール（８８．３μＬ）で希釈して８４，３７５ｐｍｏｌ／ｇ溶液を調製した後に、ＤＭＳＯ（２５μＬ）を加えて１０％ＤＭＳＯの最終濃度にした。次いでメタノール中の１０％ＤＭＳＯ溶液を調製し、段階希釈シリーズに対して後述されるとおりにアリコートした。
【００９２】
【表８】
0005746628.tif 000016
エタノール＋ＤＭＳＯ−  ０．８ｍｇの凍結乾燥ω−ＡＣＴＸを１６０μＬのエタノールに溶解して５ｍｇ／ｍＬ溶液を生成したストック調製物から、表９に従ってエタノール中のω−ＡＣＴＸの溶液を調製した。ストック溶液をエタノール（８８．３μＬ）で希釈して８４，３７５ｐｍｏｌ／ｇ溶液を調製した後に、ＤＭＳＯ（２５μＬ）を加えて１０％ＤＭＳＯの最終濃度にした。次いで１０％ＤＭＳＯ／エタノール溶液を調製し、段階希釈シリーズに対して後述されるとおりにアリコートした。
【００９３】
【表９】
0005746628.tif 000017
；８４，３７５ｐｍｏｌ／ｇ調合物を調製するときの添加の順序は、エタノール、ω−ＡＣＴＸストック、および最後にＤＭＳＯであった。１０％ＤＭＳＯ／エタノール溶液を調製してラベル付けした管にアリコートし、８４，３７５ｐｍｏｌ／ｇ処置からの５×段階希釈を行なった。
【００９４】
調合物の投与および適用
上記の各処置調合物を、１０匹のＣＯ２麻酔したイエバエのグループに適用した。処置適用は、それぞれの調合物の２μＬ小滴を、ハエの背側胸部体表面上にピペッティングすることからなった。各適用の直前に各混合物をボルテックスすることによって、沈殿粒子の懸濁を確実にした。処置後の昆虫を新鮮な食物および水とともにビンに入れて回復させ、６０時間にわたって観察した。
【００９５】
メタノールまたはエタノールおよびＤＭＳＯ処置の結果
【００９６】
【表１０】
0005746628.tif 000018
エタノールおよびＤＭＳＯ中の高用量（８４，３７５ｐｍｏｌ／ｇ）のω−ＡＣＴＸによるイエバエの局所的処置は、処置後２４時間および５０時間でそれぞれ３０％および７０％の死亡率をもたらす殺虫性を有した。エタノールによって調製した処置は、メタノールによって調製したものよりも強力だった（最高用量に対して２４時間で７０％対３０％の死亡率、１６，８７５ｐｍｏｌ／ｇ処置において２４時間で３０％対０％の死亡率）。メタノールおよびＤＭＳＯ中の最高用量のω−ＡＣＴＸの効果は、前のアッセイほど強力ではなかった（最高用量にて２４時間後に「３匹死亡、３匹単収縮」対「１０匹死亡」）。
【００９７】
ＤＭＳＯを伴わないメタノール／ω−ＡＣＴＸ処置は殺虫性がなく、ω−ＡＣＴＸの局所的調製物の活性には非プロトン性浸透剤または何らかの他のタイプの分子アジュバントの包含が重要であることが示唆された。
【００９８】
この実験は、メタノールで希釈された局所的適用ω−ＡＣＴＸの有効用量範囲の例、ならびに使用される局所的バイオアッセイパラダイムにおける調合物の殺虫活性に対して、ＤＭＳＯの包含およびエタノールがどのような効果を有するかを示すものである。
【００９９】
（実施例４）
毒素：ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａによる局所的アッセイ：
【０１００】
【化６】
0005746628.tif 000019
分子量：４０５０。イエバエにおけるＬＤ５０：９０．２ｐｍｏｌ／ｇ
凍結ストックより１．５ｍｇの毒素の凍結乾燥アリコートを調製
局所的適用：Ｂｅｎｚｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈからの１０匹のイエバエ（Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）のグループ、体重１２〜２０ｍｇ（平均質量１６ｍｇ）が、各々の体の背側胸部表面に、エタノール−ＤＭＳＯに懸濁した毒素沈殿の２μＬマイクロピペット適用を受けた。
【０１０１】
局所的および経口的処置のためのストック溶液の調製：
ストック１（ボルテックス調製物）：１ｍＬのエタノールを約１５００μｇの凍結乾燥ω−ＡＣＴＸに加え、得られた混合物を勢いよくボルテックスした。次いでペプチド懸濁液の５０μＬアリコートを局所的適用アッセイのために取出して、氷上に約２時間置いた；残りを２つの約４７５μＬアリコートに分けて、氷上に約２時間置いた。
【０１０２】
ストック２（ボルテックスおよび超音波処理調製物）：１ｍＬのエタノールを約１５００μｇの凍結乾燥ω−ＡＣＴＸに加え、得られた混合物を勢いよくボルテックスし、次いで約１０〜１５秒間超音波処理し、この期間内に強度設定「０」から設定「５」までゆっくりと増加させた。次いでペプチド懸濁液の５０μＬアリコートを局所的適用アッセイのために取出して、氷上に約２時間置いた；残りを２つの約４７５μＬアリコートに分けて、氷上に約２時間置いた。
【０１０３】
毒素用量の算出：
１．５μｇ／μＬ×２μＬ／適用×１０６ｐｇ／１μｇ×１ｐｍｏｌ／４０５０ｐｇ×１ハエ／０．０１６ｇ＝４６，８７５ｐｍｏｌ／ｇ
毒素溶液の局所的適用およびその結果
上記のとおり、エタノール中のω−ＡＣＴＸのストック溶液を調製した。下の表１１は、イエバエへの局所的適用のためにストック溶液を希釈するために用いた処方を示す：
【０１０４】
【表１１】
0005746628.tif 000020
処置後のハエを、食物および水に自由に近付けるようにした容器に入れ、その後以下の表１２に示されるとおりに死亡率（および、おそらくは毒素の作用による生理的標準の破壊の結果起こる「単収縮」の挙動）をスコア付けした：
【０１０５】
【表１２】
0005746628.tif 000021
この実験は、エタノール中に懸濁したω−ＡＣＴＸを超音波処理することによって、結果的に得られる毒素調合物の局所的殺虫活性が増加することを示している。
【０１０６】
オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのエタノール−ＤＭＳＯ沈殿物の超音波処理は、適用の最高２４時間後まで、接触処置されたイエバエの死亡率を増加させることによって、オメガ毒素の殺虫活性を高める。
【０１０７】
（実施例５）
毒素は以下のとおりである：
１）ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２：
【０１０８】
【化７】
0005746628.tif 000022
は３個のジスルフィド架橋を有する：６−２０、１３−２４および１９−３８。
【０１０９】
分子量：４１９９。イエバエにおける注射ＬＤ５０：７７ｐｍｏｌ／ｇ
２）ｒカッパ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｃ：
【０１１０】
【化８】
0005746628.tif 000023
は４個のジスルフィド架橋を有する：５−１９、１２−２４、１５−１６、１８−３４
ｐＤＲ２（ｐＥＴ−３２ａ）からの組換え体。分子量：３９１２．１５
イエバエにおける注射ＬＤ５０：３８９ｐｍｏｌ／ｇ
３）ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２：
【０１１１】
【化９】
0005746628.tif 000024
は３個のジスルフィド架橋を有する：５−２０、１２−２５および１９−３９。
【０１１２】
分子量：４５７０．５１
イエバエにおける注射ＬＤ５０：８１．５ｐｍｏｌ／ｇ
局所的処置のための混合物の調製：
処置混合物を調合するために用いられる毒素ストックのための処方は以下のとおりであった：
ストック１：ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２：１．５ｍｇの凍結乾燥毒素のアリコートを８５０μＬのエタノールに懸濁し、超音波処理器において設定「０」から設定「５」までゆっくり増加させながら１０〜１５秒間超音波処理して、微細粒子を作製した。
【０１１３】
ストック２：ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２：１．５ｍｇの凍結乾燥毒素のアリコートを９００μＬのアセトンに懸濁し、超音波処理器において設定「０」から設定「５」までゆっくり増加させながら１０〜１５秒間超音波処理して、微細粒子を作製した。
【０１１４】
ストック３：ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２：１．５ｍｇの凍結乾燥毒素のアリコートを９００μＬのメタノールに懸濁し、超音波処理器において設定「０」から設定「５」までゆっくり増加させながら１０〜１５秒間超音波処理して、微細粒子を作製した。
【０１１５】
ストック４：ｒカッパ−Ｈｖ１ｃ＋２：１．５ｍｇの凍結乾燥毒素のアリコートを９００μＬのアセトンに懸濁し、超音波処理器において設定「０」から設定「５」までゆっくり増加させながら１０〜１５秒間超音波処理して、微細粒子を作製した。
【０１１６】
ストック５：ｒカッパ−Ｈｖ１ｃ＋２：１．５ｍｇの凍結乾燥毒素のアリコートを９００μＬのメタノールに懸濁し、超音波処理器において設定「０」から設定「５」までゆっくり増加させながら１０〜１５秒間超音波処理して、微細粒子を作製した。
【０１１７】
局所的適用のための混合物の最終調製は、ストックを以下に挙げられる他の試薬と混合することによって行なった：
対照１−エタノール＋０．０５％ＬＩ−７００  −４７５μＬのエタノール。２５μＬの１％ＬＩ−７００、エタノール中
対照２−エタノール＋０．０１％ＬＩ−７００  −４９５μＬのエタノール。５μＬの１％ＬＩ−７００、エタノール中
対照３−エタノール＋０．１％ＭＳＯ（登録商標）−４５０μＬのエタノール。５０μＬの１％ＭＳＯ（登録商標）、エタノール中
対照４−エタノール＋０．０２％ＭＳＯ（登録商標）−４９０μＬのエタノール。１０μＬの１％ＭＳＯ（登録商標）、エタノール中
処置１−ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２エタノール沈殿＋１０％ＤＭＳＯ＋０．０５％Ｓｉｌｗｅｔ−４２５μＬのストック１
２５μＬの１％Ｓｉｌｗｅｔ、エタノール中。５０μＬのＤＭＳＯ
対照５−エタノール＋１０％ＤＭＳＯ＋０．０５％Ｓｉｌｗｅｔ−４２５μＬのエタノール
２５μＬの１％Ｓｉｌｗｅｔ、エタノール中。５０μＬのＤＭＳＯ
処置２−ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２アセトン沈殿＋１０％ＤＭＳＯ−４５０μＬのストック２。５０μＬのＤＭＳＯ
処置３−ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２メタノール沈殿＋１０％ＤＭＳＯ−４５０μＬのストック３。５０μＬのＤＭＳＯ
処置４−ｒカッパ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｃアセトン沈殿＋１０％ＤＭＳＯ−４５０μＬのストック４。５０μＬのＤＭＳＯ
処置５−ｒカッパ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｃメタノール沈殿＋１０％ＤＭＳＯ−４５０μＬのストック５。５０μＬのＤＭＳＯ
対照６−アセトン＋１０％ＤＭＳＯ−４５０μＬのアセトン。５０μＬのＤＭＳＯ
対照７−メタノール＋１０％ＤＭＳＯ−４５０μＬのメタノール。５０μＬのＤＭＳＯ
対照８−エタノール＋１０％ＤＭＳＯ−４５０μＬのエタノール。５０μＬのＤＭＳＯ
調合物の投与および適用。
【０１１８】
前の実施例に記載したとおり、Ｐ１０マイクロピペットによって１２〜１８ｍｇのイエバエの腹側の腹部に２μＬ小滴を局所的に適用した。適用後のハエには食物および水を自由に与えて、死亡率を観察した。
【０１１９】
【表１３】
0005746628.tif 000025
最低０．０１％までの濃度のＬＩ−７００は、処置されたハエの挙動をかなり妨げ、おそらくはいくらかの死亡率ももたらした。最低０．０２％までの濃度のＭＳＯ（登録商標）は、処置されたハエの挙動をかなり妨げ、かなり（すなわち３０〜４０％）の死亡率ももたらした。０．０５％のＳｉｌｗｅｔは、この実験パラダイムにおいてオメガ−毒素／エタノール／ｄｍｓｏ懸濁液の局所的殺虫活性をわずかに増強するかもしれない。本明細書に提供される結果およびその他の開示されない研究に基づくと、増強は１５〜２０％の範囲になるだろう。
【０１２０】
９０％エタノールが９０％アセトンまたは９０％メタノールに置換えられるとき、混成およびカッパアトラコトキシン−１の局所適用調合物は殺虫性である。この混成毒素のアセトンおよびメタノール調合物は、前にテストされたエタノール調合物よりもわずかに殺虫性が低いかもしれない。アセトンおよびメタノール調合物は、カッパ毒素のエタノール調合物と比べると同等またはわずかに高いレベルの殺虫活性をもたらすと我々は考えている。
【０１２１】
（実施例６）
局所的に適用される毒素はω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ：
【０１２２】
【化１０】
0005746628.tif 000026
分子量：４０５０。イエバエにおけるＬＤ５０：９０．２ｐｍｏｌ／ｇ。
【０１２３】
凍結ストックから１．５ｍｇの毒素の凍結乾燥アリコートを調製。
【０１２４】
調合物の投与および適用
局所的適用：Ｂｅｎｚｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈからの１０匹のイエバエ（Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）のグループ、体重１２〜２０ｍｇ（平均質量１６ｍｇ）が、各々の体の背側胸部表面に、エタノール−ＤＭＳＯに懸濁した毒素沈殿の２μＬマイクロピペット適用を受けた。
【０１２５】
局所的処置のためのストック溶液の調製：
ストック１（ボルテックスおよび超音波処理したエタノール調製物）：０．９ｍＬのエタノールを約１５００μｇの凍結乾燥ω−ＡＣＴＸに加え、得られた混合物を勢いよくボルテックスし、次いで約１０〜１５秒間超音波処理し、この期間内に強度設定「０」から設定「５」までゆっくりと増加させた。次いで毒素懸濁液に０．１ｍＬのＤＭＳＯを加え、得られた混合物をボルテックスし、次いでこのアルコール−ＤＭＳＯ−ペプチド懸濁液の１００μＬアリコートを局所的適用アッセイのために取出して、氷上に約２時間置いた。
【０１２６】
ストック２（ボルテックスおよび超音波処理した１−プロパノール調製物）：０．９ｍＬの１−プロパノールを約１５００μｇの凍結乾燥ω−ＡＣＴＸに加え、得られた混合物を勢いよくボルテックスし、次いで約１０〜１５秒間超音波処理し、この期間内に強度設定「０」から設定「５」までゆっくりと増加させた。次いで毒素懸濁液に０．１ｍＬのＤＭＳＯを加え、得られた混合物をボルテックスし、次いでこのアルコール−ＤＭＳＯ−ペプチド懸濁液の１００μＬアリコートを局所的適用アッセイのために取出して、氷上に約２時間置いた。
【０１２７】
ストック３（ボルテックスおよび超音波処理した２−プロパノール調製物）：０．９ｍＬの２−プロパノールを約１５００μｇの凍結乾燥ω−ＡＣＴＸに加え、得られた混合物を勢いよくボルテックスし、次いで約１０〜１５秒間超音波処理し、この期間内に強度設定「０」から設定「５」までゆっくりと増加させた。次いで毒素懸濁液に０．１ｍＬのＤＭＳＯを加え、得られた混合物をボルテックスし、次いでこのアルコール−ＤＭＳＯ−ペプチド懸濁液の１００μＬアリコートを局所的適用アッセイのために取出して、氷上に約２時間置いた。
【０１２８】
ストック４（ボルテックスおよび超音波処理した２−ブタノール調製物）：０．９ｍＬの２−ブタノールを約１５００μｇの凍結乾燥ω−ＡＣＴＸに加え、得られた混合物を勢いよくボルテックスし、次いで約１０〜１５秒間超音波処理し、この期間内に強度設定「０」から設定「５」までゆっくりと増加させた。次いで毒素懸濁液に０．１ｍＬのＤＭＳＯを加え、得られた混合物をボルテックスし、次いでこのアルコール−ＤＭＳＯ−ペプチド懸濁液の１００μＬアリコートを局所的適用アッセイのために取出して、氷上に約２時間置いた。
【０１２９】
なお各ストックは、約１６ｍｇのイエバエの体表面にストックの２μＬの適用を行なったときに、約４５，０００ｐｍｏｌ／ｇの毒素用量をもたらすような濃度に作製した。よって以下に記載されるいくつかの場合には、上記の４つのストックのうち１つが完全な強度でイエバエに局所的に適用されたが、他の場合には、２μＬの体積中により低い毒素用量を送達するために用いられ得る溶液を得るために、（ストックおよび対応する９０％アルコール−１０％ＤＭＳＯ溶液を用いて）５倍の段階希釈が行なわれた。負の対照手順（以下の表において「−ｖｅ」と示される）は、（ＤＭＳＯによって９０％ｖ／ｖに希釈された）問題のアルコールの溶液の２μＬ背側胸部適用によって処置されたイエバエを含んだ。
【０１３０】
毒素溶液の局所的適用およびその結果：
さまざまなアルコール中のω−ＡＣＴＸのストック溶液は、上述のとおりに調製された。以下の表１４は、イエバエへの局所的適用に用いられたストック調合物および用量、ならびに対応するグループのハエに対して観察された死亡率を示すものである：
【０１３１】
【表１４】
0005746628.tif 000027
（対応アルコール−ＤＭＳＯ溶液を投与された）負の対照グループにおいて観察された死亡率に対して正規化されたとき、オメガ毒素のエタノール沈殿物は、この一連の実験においてテストされたあらゆる他の毒素−アルコール沈殿物と同等またはそれより高い殺虫活性を有するようである。
【０１３２】
９０％オクタノール−１０％ＤＭＳＯ、９０％２−ブタノール−１０％ＤＭＳＯ、および９０％２−プロパノール−１０％ＤＭＳＯは、受容できないレベルのバックグラウンド死亡率をもたらすようである；後者はおそらく、処置されたイエバエにおけるオメガ毒素の標的部位作用による死亡率をマスクするだろう。９０％１−プロパノール−１０％ＤＭＳＯは、受容できないレベルのバックグラウンド死亡率をもたらすように見えないが、９０％エタノール−１０％ＤＭＳＯと同様に、適用された毒素の標的部位活性を増強するようにも見えない。
【０１３３】
（実施例７）
局所的に適用される毒素
ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２：
【０１３４】
【化１１】
0005746628.tif 000028
分子量：４１９６
凍結ストックより１．５ｍｇの毒素の凍結乾燥アリコートを調製
処置混合物の調製
すべての処置は、最終濃度１．５μｇ／μＬのω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２に対して作製された。前と同様に、エタノールを凍結乾燥ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２の約１５００μｇのサンプルに加え、得られた混合物を勢いよくボルテックスし、次いで約１０〜１５秒間超音波処理し、この期間内に強度設定「０」から設定「５」までゆっくりと増加させた。超音波処理の後に、たとえばＤＭＳＯ、ＭＳＯ（登録商標）、水、およびＴｗｅｅｎ  ２０界面活性剤などの付加的な成分を加え、成分の均一な混合を確実にするために、局所的適用の前に、得られた混合物を勢いよくボルテックスした。平均のハエ質量を１６ｍｇ（１２〜２０ｍｇコホート）と仮定して、用量を以下のように算出する：
３μｇ／昆虫×１μｍｏｌ／４１９６μｇ×１０６ｐｍｏｌ／１μｍｏｌ×１昆虫／０．０１６ｇ＝４４，６８５ｐｍｏｌ／ｇ用量
処置混合物を調合するために用いられる毒素ストックのための処方は以下のとおりであった：
ストック１−１．５ｍｇの凍結乾燥ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２を５００μＬのエタノールに溶解し、ボルテックスおよび超音波処理したもの。
【０１３５】
ストック２−１．５ｍｇの凍結乾燥ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２を１５０μＬの滅菌水に溶解したもの（１０ｍｇ／ｍＬ）。
【０１３６】
ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２をＤＭＳＯとともに用いた局所的アッセイ：
処置混合物に対する処方は以下のとおりであった：
４５，０００ｐｍｏｌ／ｇのω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２  ９０％エタノール／１０％ＤＭＳＯ溶液（＋−ｖｅ対照）−５０μＬのストック１、４０μＬのエタノール、１０μＬのＤＭＳＯ。
【０１３７】
９０％水／１０％ＤＭＳＯ／０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０（−ｖｅ対照）−７．５μＬのストック２、８２．５μＬの滅菌水、１０μＬのＤＭＳＯ。１μＬの１０％Ｔｗｅｅｎ  ２０。
【０１３８】
４５，０００ｐｍｏｌ／ｇのω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２  ８０％エタノール／１０％水／１０％ＤＭＳＯ−５０μＬのストック１、３０μＬのエタノール、１０μＬの滅菌水、１０μＬのＤＭＳＯ。
【０１３９】
４５，０００ｐｍｏｌ／ｇのω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２  ７０％エタノール／２０％水／１０％ＤＭＳＯ−５０μＬのストック１、２０μＬのエタノール、２０μＬの滅菌水、１０μＬのＤＭＳＯ。
【０１４０】
４５，０００ｐｍｏｌ／ｇのω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２  ６０％エタノール／３０％水／１０％ＤＭＳＯ−５０μＬのストック１、１０μＬのエタノール、３０μＬの滅菌水、１０μＬのＤＭＳＯ。
【０１４１】
４５，０００ｐｍｏｌ／ｇのω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２  ５０％エタノール／３０％水／１０％ＤＭＳＯ−５０μＬのストック１、４０μＬの滅菌水、１０μＬのＤＭＳＯ。
【０１４２】
ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２をＭＳＯ（登録商標）界面活性剤とともに用いる局所的アッセイに対して：
５％ＭＳＯ（登録商標）（−ｖｅ対照）−９５μＬのエタノール、５μＬのＭＳＯ（登録商標）濃縮物。
【０１４３】
１．２５％ＭＳＯ（登録商標）（−ｖｅ対照）−９８．７５μＬのエタノール、１．２５μＬのＭＳＯ（登録商標）濃縮物。
【０１４４】
４５，０００ｐｍｏｌ／ｇのω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２  ５％ＭＳＯ（登録商標）−５０μＬのストック１、４５μＬのエタノール、５μＬのＭＳＯ（登録商標）濃縮物。
【０１４５】
４５，０００ｐｍｏｌ／ｇのω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２  ２．５％ＭＳＯ（登録商標）−２５μＬのストック１、２３．７５μＬのエタノール、１．２５μＬのＭＳＯ（登録商標）濃縮物。
【０１４６】
４５，０００ｐｍｏｌ／ｇのω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２  １．２５％ＭＳＯ（登録商標）−２５μＬのストック１、２４．３７μＬのエタノール、０．６２５μＬのＭＳＯ（登録商標）濃縮物。
【０１４７】
すべての処置混合物は、投与および適用の前に約１時間氷上に置いた。
【０１４８】
調合物の投与および適用。
【０１４９】
各処置混合物の２μＬサンプルを、個々のイエバエの背側胸部にスポットした（混合物当り１０匹のイエバエを処置）。１０匹のハエの第２グループは各々、９０％エタノール／１０％ＤＭＳＯ中の４５，０００ｐｍｏｌ／ｇのω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２の２μＬサンプルで処置されたが、背側胸部表面ではなく、ハエの腹側腹部表面に処置が適用された。適用後、食物（乾燥粉乳および砂糖の１：１混合物）および水（浸漬した綿ボール中に提供）に自由に近付けるようにしたプラスチック容器のウェルにハエを入れて、８〜２４時間おきに２日間観察した。
【０１５０】
ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２の局所的適用の結果
適用後の死亡率（ならびに、どちらもおそらくは毒素の作用による生理的標準の破壊の結果起こる「単収縮」および「瀕死」の挙動）を以下の表１５にまとめている。
【０１５１】
【表１５−１】
0005746628.tif 000029
【０１５２】
【表１５−２】
0005746628.tif 000030
番号１−エタノール／ＤＭＳＯ溶液中のオメガ毒素の沈殿物に１０％の水を加えると、上でテストした条件下で沈殿物の局所的殺虫活性を低減させるようである。
【０１５３】
番号２−エタノール／ＤＭＳＯ溶液中のオメガ毒素の沈殿物に２０％、３０％および４０％の水を加えると、上でテストした条件下で沈殿物の局所的殺虫活性を完全に除去するようである。
【０１５４】
番号３−９０％水／１０％ＤＭＳＯにおける毒素の溶媒和／希釈は、上でテストした条件下で殺虫活性を有さない溶液をもたらす。
【０１５５】
番号４−１０％ＤＭＳＯを、１．２５％のＭＳＯ（登録商標）、２．５％のＭＳＯ（登録商標）または５％のＭＳＯ（登録商標）で置換すると、上でテストした条件下で顕著な殺虫活性を有する混合物を明らかにもたらす。
【０１５６】
番号５−上で用いられた実験条件下で、（９０％エタノール／１０％ＤＭＳＯ中のオメガ毒素の）沈殿物を腹側腹部に適用することは、同じ沈殿混合物の背側胸部適用による死亡率の誘導よりも大きくないとしてもそれに類似する速度および有効性を伴って、昆虫死亡率を誘導するようである。腹側腹部適用は背側胸部適用の約２倍の速さで実行できるため、これは将来の局所的適用バイオアッセイに対するかなりの技術的改善を示すものである。
【０１５７】
毒性ペプチドおよび配列リストのさらなる例。
【０１５８】
昆虫毒性ペプチドとは、毒性昆虫からのペプチドではないが、昆虫に対する毒性のあるペプチドを示す。その供給源は昆虫である必要はない。本出願の配列リストには広範囲の好適な昆虫毒性ペプチドが提供されている。この約１７４ペプチドの小さな選択物は、クモ、サソリおよび植物からの代表的なペプチドを含む。配列１〜１４０はジョウゴグモからのもの、配列１４１から１７１はサソリからのものであり、配列１７２から１７４は植物からのものである。配列リストは、「Ｋａｌａｔａ」型ペプチドと呼ばれる環状ペプチドを生成することが公知であるＯｌｄｅｎｌａｎｄｉａ  ａｆｆｉｎｉｓを供給源とするペプチドの例を含む。Ｏｌｄｅｎｌａｎｄｉａ植物ファミリーは、殺虫活性を有するペプチドを生成することが公知である。植物からの他の殺虫性ペプチドも公知である。本出願を通じて考察される多数の毒グモペプチドも提供される。
【配列表】
0005746628000001.app