(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のＳＯＤ１モノマー、第２のＳＯＤ１モノマーおよび架橋剤を含む、安定化されたスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）類似体であって、
前記第１のＳＯＤ１モノマーが、野生型ヒトＳＯＤ１の１１１位に対応する第１のシステインを含み、
前記第２のＳＯＤ１モノマーが、野生型ヒトＳＯＤ１の１１１位に対応する第２のシステインを含み、
前記第１のシステインが前記架橋剤により前記第２のシステインに共有結合により接続されていることを特徴とする、安定化されたスーパーオキシドジスムターゼ類似体。
【請求項２】
前記第１のＳＯＤ１モノマーと前記第２のＳＯＤ１モノマーの配列同一性が８５％以上であることを特徴とする、請求項１記載の類似体。
【請求項３】
前記第１のＳＯＤ１モノマーと前記第２のＳＯＤ１モノマーが、実質的に同じアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１または２記載の類似体。
【請求項４】
前記第１のＳＯＤ１モノマーが、野生型配列であるか、またはＧ９３Ａ、Ｇ８５Ｒ、Ｄ９０Ａ、Ａ４Ｖ、Ｅ１００Ｇ、Ｈ４６Ｒ、Ｃ６ＧおよびＩ１１３Ｔからなる群より選択される変異を含むことを特徴とする、請求項１〜３いずれか１項記載の類似体。
【請求項５】
前記第２のＳＯＤ１モノマーが、野生型配列であるか、またはＧ９３Ａ、Ｇ８５Ｒ、Ｄ９０Ａ、Ａ４Ｖ、Ｅ１００Ｇ、Ｈ４６Ｒ、Ｃ６ＧおよびＩ１１３Ｔからなる群より選択される変異を含むことを特徴とする、請求項１〜４いずれか１項記載の類似体。
【請求項６】
前記架橋剤が、ＤＴＭＥ、ＴＭＥＡ、ＢＭＤＢ、ＢＭ（ＰＥＧ）２、ＢＭＢおよびＢＭＯＥからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１〜５いずれか１項記載の類似体。
【請求項７】
前記架橋剤が、有機水銀化合物、マレイミド、ビニルスルホンおよびアルキル化剤からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１〜５いずれか１項記載の類似体。
【請求項８】
前記類似体の変性温度が、未架橋のモノマーに比例して１０度から６０度まで増大する；
前記類似体の変性温度が、未架橋のモノマーに比例して２０度から４０度まで増大する；
前記類似体の変性温度が、未架橋のモノマーに比例して１５度から２５度まで増大する；
前記類似体の変性温度が、未架橋のモノマーに比例して３０度から５０度まで増大する；
前記類似体の変性温度が、未架橋のモノマーに比例して２０度増大する；または
前記類似体の変性温度が、未架橋のモノマーに比例して４０度増大する、
ことを特徴とする請求項１〜７いずれか１項記載の類似体。
【請求項９】
前記架橋剤が、７オングストローム（０．７ｎｍ）から１１オングストローム（１．１ｎｍ）までの長さを有するスペーサーアームを含む；または
前記架橋剤が、９オングストローム（０．９ｎｍ）の長さを有するスペーサーアームを含む、
ことを特徴とする請求項１〜８いずれか１項記載の類似体。
【請求項１０】
前記類似体が、野生型スーパーオキシドジスムターゼ酵素の活性の少なくとも９０％を７５℃の温度まで保持することを特徴とする請求項１〜８いずれか１項記載の類似体。
【請求項１１】
請求項１〜１０いずれか１項記載の安定化されたＳＯＤ１類似体、および薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１２】
安定化されたスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）類似体の製造方法であって、第１のＳＯＤ１モノマー、第２のＳＯＤ１モノマー、および架橋剤を反応させて前記類似体を形成するステップを含み、
前記第１のＳＯＤ１モノマーが、野生型ヒトＳＯＤ１の１１１位に対応する第１のシステインを含み、
前記第２のＳＯＤ１モノマーが、野生型ヒトＳＯＤ１の１１１位に対応する第２のシステインを含み、
前記第１のＳＯＤ１モノマー、前記第２のＳＯＤ１モノマー、および前記架橋剤を反応させることにより、前記第１のシステインおよび前記第２のシステインを前記架橋剤に共有結合により接続する、
ことを特徴とする、製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜１０いずれか１項記載の安定化されたＳＯＤ１類似体を含む、神経性疾患を治療するための組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１０いずれか１項記載の安定化されたＳＯＤ１類似体を含む、神経変性疾患を予防するための組成物。
【請求項１５】
前記神経変性疾患が、筋委縮性側索硬化症であることを特徴とする、請求項１３または１４記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、全体が参照により本明細書に援用されている２００９年６月２日出願の米国仮特許出願第６１／１８３，２８６号に対する優先権の利益を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、スーパーオキシドジスムターゼモノマーの架橋に関する。
【背景技術】
【０００３】
なかでも最も重大なものとして上位および下位の両方の運動ニューロンの死および３〜５年という診断後平均生存期間を特徴とする疾患である筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む神経変性疾患と闘うために、革新的なアプローチが必要とされている。ＡＬＳの治療用の唯一の米国食品医薬品局（ＦＤＡ）認可薬であるＲｉｌｕｚｏｌｅは、患者の生存率および生活の質に対しせいぜい中程度の効果しかもたない（１−３）。抗炎症性化合物から金属さらには酸化防止剤に至るあらゆるものが関与するＡＬＳについての５０回を超える臨床試験から、１つとして有効な薬剤が特定されていない。注目すべきことに、凝集およびタンパク質安定性喪失が家族性ＡＬＳ症例（ｆＡＬＳ）の病因の一部であることをより多くの証拠が示しているにも関わらず、臨床試験にまで到達した凝集阻害物質または薬理学的シャペロンは１つもない。ＳＯＤ１を特異的に標的とする本出願人らの知る唯一の臨床試験は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが関与する小規模で進行中の第１段階試験である。興味深いことに、ＡＬＳ臨床試験には概してパーキンソン病の試験で使用されたものと同じ戦略および同じ化合物の多くが関与してきたが、それでも、それらが共通の疾患経路を共有していない可能性は高い。
【０００４】
散発性神経変性疾患の原因はなお未解明のままであるが、家族型のこれらの疾患の多く（例えばアルツハイマー、パーキンソンおよびＡＬＳ）をひき起こす変異は公知である。例えば、家族性ＡＬＳ症例（ｆＡＬＳ）の約２０％、そして全ＡＬＳの２％の原因は、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）をコードする遺伝子内の変異にある。このような変異には、野生型様酵素活性を維持するＧ９３Ａ、および本質的に不活性である金属欠乏性Ｇ８５Ｒの２つがある。例えばパーキンソン病におけるアルファ−シヌクレインおよびパーキン修飾、アルツハイマー病におけるアベータおよびタウ修飾そしてＡＬＳにおけるＴＤＰ４３およびＳＯＤ１修飾のような家族性疾患に関与するタンパク質の翻訳後修飾が、対応する散発性疾患の病因として引き合いに出されてきた。したがって、家族性疾患を治療するための戦略を散発性疾患の少なくとも１つのサブセットに転用し得る、ということに希望を見出すことができる。
【０００５】
変異体ＳＯＤ１の優先遺伝およびノックアウトマウスにおける症候の欠如の両方から、機能の喪失に対立するものとして「毒性機能の増加」が示唆されている。ＳＯＤ１の凝集癖および安定性の喪失が、ｆＡＬＳ患者の疾患の重症度にとっての相乗的危険因子であり、試験管内および生体内でのｆＡＬＳバリアントの共通特性が、その凝集癖にあるということが示唆されてきた。ｆＡＬＳ−ＳＯＤ１バリアントの毒性の機序についての最も一般的な仮説には、ダイマーの不安定化およびモノマーへの解離が関与しており、これらのモノマーは次により高次の凝集体の形成の核となる。実際、本研究中で使用されるＧ８５Ｒ  ＳＯＤ１などのバリアントタンパク質は、生体内ではモノマーとして発見される。ＣｕまたはＺｎの喪失、未変性分子内ジスルフィドの分割、酸化およびｆＡＬＳ関連変異を含めた数多くの修飾により、ＳＯＤ１にダイマー解離傾向が付与される。Ａ４Ｖそしてより低いレベルであるがＩ１１３Ｔの両方のＸ線結晶構造；Ｈ４６Ｒ、Ａ４ＶおよびＨ４８Ｑの酵母ツーハイブリッド分析；Ｇ８５Ｒ、Ｇ９３Ｒ、Ｅ１００ＧおよびＩ１１３Ｔのカオトロフによる解離；そして分子動力学シミュレーション法の全てが、この仮説と整合性を示している。ダイマー不安定化が凝集をひきおこすという仮説に加えて、別の凝集仮説は、バリアントをひきおこす新たに翻訳されたｆＡＬＳ  ＳＯＤ１が、サブユニット内ジスルフィド形成の欠如、金属欠乏などに起因して決してダイマー化せず、その結果不安定なモノマーがもたらされる、というものである。この仮説と整合するように、サブユニットを繋留することによるかまたは小分子の使用を通したＳＯＤ１ダイマー界面の安定化が、タンパク質の凝集を妨げ得る。
【０００６】
安定したＳＯＤ１ダイマーの繋留への１つの代表的アプローチとしてチオール−ジスルフィド交換が探求され得る。チオール−ジスルフィド交換は、治療的戦略としての探求に充分適したものであり、事実、生体内でＳＯＤ１  Ｃｙｓ１１１上に発生して、ＳＯＤ１がトリペプチドグルタチオン（ＧＳＨ）を結合させる結果となるものとして公知である。これらは、ＳＯＤ１のダイマー界面にあるＣｙｓ１１１残基が、治療学上の潜在的標的であることを示唆している。その上、ヒトＳＯＤ１Ｃｙｓ１１１は、ｆＡＬＳ変異の毒性を変調させる少なくとも２つの残基の１つである（もう１つはＳＯＤ１Ｗ３２である）。例えば、Ｃ１１１Ｓ変異体はＳＯＤ１の安定性を増大させ、ｆＡＬＳ  ＳＯＤ１変異Ｃ６Ｆ、Ｃ１４６Ｒ、Ｇ９３Ａ、Ａ４ＶおよびＨ４６Ｒの細胞毒性および凝集を逆転させる。アルキル化によるＣｙｓ１１１の化学的修飾も同様にＳＯＤ１の安定性を増大させる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の１つの態様は、２つの異なるＳＯＤ１モノマー上の２つのアミノ酸の側鎖が接続されている、安定化されたスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）類似体である。本発明の別の態様は、安定化されたスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）類似体の製造方法であって、第１のＳＯＤ１モノマー、第２のＳＯＤ１モノマーおよび架橋剤を反応させて前記類似体を形成するステップを含む製造方法にある。この架橋のための有効な代表的部位は、各モノマー上の１１１位である。本発明は同様に、第１のＳＯＤ１モノマーのα−アミノ酸残基と第２のＳＯＤ１モノマーのα−アミノ酸残基が接続されている、ＳＯＤ１類似体の製造方法も含んでいる。本発明の別の態様は、治療上有効な量の安定化されたＳＯＤ１類似体を、それを必要としている哺乳動物に投与するステップを含む、神経変性疾患のための治療的または予防的投与方法である。本発明が有意な効能を有する代表的な神経系疾患は筋萎縮性側索硬化症である。同様に開示されているのは、ＳＯＤ１類似体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＳＯＤ１内のシステイン１１１サブユニット間架橋の部位を示す。相対するＳＯＤ１モノマー上のシステイン１１１残基が各末端に示されている。
【図２】架橋実験において使用されるいくつかの方法を要約するブロック図を示す。
【図３】一部のＳＯＤ１架橋実験のウエスタンブロット分析の結果を示す。（Ａ）異なるマレイミドおよびビニルスルホン架橋剤を用いた架橋。ＳＯＤ１を、１：１または１：３の架橋対タンパク質濃度で架橋した。マレイミド架橋剤の各々がＳＯＤ１を架橋して、ダイマー形成を結果としてもたらした。三官能性架橋剤であるＴＭＥＡが、最も効率の良い架橋剤であるように思われた。ビニルスルホンであるＨＢＶＳは、ＳＯＤ１を架橋するとは思われなかった。（Ｂ）ＳＯＤ１のＤＴＭＥ架橋。リンカー領域内にジスルフィド結合を含むＤＴＭＥを用いてＳＯＤ１を架橋させ、還元剤の存在下または不在下でＳＤＳ  ＰＡＧＥ上を泳動させた。還元剤は、架橋剤を還元して、ダイマーをそのモノマー形態に戻した。
【図４】架橋されたＳＯＤ１のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析の結果を示す。（Ａ）野生型ＳＯＤ１の架橋。（Ｂ）Ｇ９３Ａの架橋。架橋されたＳＯＤ１のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析において観察されたダイマーの増加によってわかるように、マレイミド架橋剤を用いて、ＷＴおよびＧ９３Ａの両方のＳＯＤ１が架橋される。
【図５】架橋されたＳＯＤ１のＬＣ−ＦＴＭＳ分析を示す。架橋されたＧ９３Ａ  ＳＯＤ１のＬＣ−ＦＴＭＳスペクトル。（Ａ）液体クロマトグラフィランについての全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）。ダイマーはおよそ３０分で溶離する。（Ｂ）ＴＩＣ中で３２．１分に関係づけしたダイマーＧ９３Ａの未処理スペクトル。（Ｃ）１つの架橋剤により修飾された１４５５．４におけるＧ９３Ａダイマー。（Ｄ）Ｇ９３Ａ架橋されたダイマーのファンネルスキマー解離。１４４２．４というｍ／ｚはＧ９３Ａモノマーに対応し、１４５６．８というｍ／ｚは分割された架橋剤によって修飾されたＧ９３Ａモノマーに対応し、１４７１．０というｍ／ｚは、１つの架橋剤によって修飾されたＧ９３Ａモノマーに対応し、１４９９．７というｍ／ｚは２つの架橋剤により修飾されたＧ９３Ａに対応する。
【図６】ホモ二官能性およびヘテロ二官能性架橋剤としてＤＴＭＥを用いたＳＯＤ１ダイマーの架橋に由来する反応生成物を表している。ホモ二官能性（上）およびヘテロ二官能性（下）架橋剤としてＤＴＭＥを用いたＳＯＤ１ダイマーの架橋に由来する反応生成物。上の構造には２つのマレイミドで開始された反応が用いられ、一方下の構造ではマレイミドおよびジスルフィド交換が使用されている。
【図７】ダイマー界面に１／２ＤＴＭＥを伴うＳＯＤ１システイン１１１のモデルを示す。システイン１１１硫黄は、黄色の球により表わされ、１／２ＤＴＭＥはシアンブルーで示されている。本出願人らはチオール−ジスルフィド交換を用いて効率良くＳＯＤ１モノマーを架橋することができ、その結果として１／２ＤＴＭＥは結合され、これは、ペプチドベースの治療戦略に適している可能性がある（図１３）。ＬＣ−ＦＴＭＳ分析を介して架橋の部位が確認された（図１４）。
【図８】ダイマー１個あたり１つの架橋剤で架橋されたダイマーを結果としてもたらすＳＯＤ１の架橋を示す。（Ａ）ＳＯＤ１モノマーの１５Ｈ＋の荷電状態についての抽出されたイオンクロマトグラム（ｔ約３６分で３．０超のピークを伴うライン）および（Ｂ）ＤＴＭＥ−架橋されたダイマーの２３Ｈ＋の荷電状態（ｔ約３０分で６．０超のピークを伴うライン）。（Ｃ）未架橋Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１の質量スペクトル、および（Ｄ）ＤＴＭＥで架橋されたＧ９３Ａ  ＳＯＤ１。
【０００９】
図８Ａ中、ｔ＝３７分で３．０超のピークを伴う曲線が、１０５８．２７１ｍ／ｚの強度（モノマー＋１５Ｈ＋）である。図８Ｂ中、ｔ＝３０分で６．０超のピークを伴う曲線が、１３９２．０８５ｍ／ｚの強度（ダイマー＋ＤＴＭＥ＋２３Ｈ＋）である。
【００１０】
ＷＴ  ＳＯＤ１を架橋することに加えて、Ｇ９３Ａを、１：１のモル濃度でＤＴＭＥおよびＢＭＯＥを用いて架橋した。観察したスペクトルは、Ｇ９３Ａと１つの架橋剤すなわちＢＭＯＥまたはＤＴＭＥの分子量と一致している。（Ｅ）還元可能な形で不安定な分子を伴うＷＴ  ＳＯＤ１の化学的架橋。試験されたマレイミド架橋剤の１つであるＤＴＭＥは、そのスペーサーアーム中にＤＴＴなどの還元剤により分割され得るジスルフィド結合を有する。ＷＴ  ＳＯＤ１は、１：１のモル比のＤＴＭＥを用いて架橋され、還元剤ＤＴＴの存在下と不在下の両方でＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルにより分析された。ＳＯＤ１の架橋されたダイマーは還元剤の存在下でモノマーになっており（図８Ｂ、レーン２）、形成されているダイマーが使用中の架橋剤に特異的であることそして架橋剤が触媒として作用したダイマー形成の結果ではなかったことを示唆していた。
【図９】化学的架橋によるｆＡＬＳ関連ＳＯＤ１バリアントの安定化を表している。図１５も同様に参照のこと（熱蛍光検定により測定された変異体ＳＯＤ１の安定性）。２．５〜２０μＭの範囲の濃度のＢＭＯＥと共に、１０μＭのＧ９３Ａ（Ａ）およびＧ８５Ｒ  ＳＯＤ１（Ｃ）をインキュベートした。２０μＭの銅／亜鉛および２．５〜２０μＭの範囲の濃度のＢＭＯＥと共に１０μＭのＧ９３Ａ（Ｂ）およびＧ８５Ｒ（Ｄ）をインキュベートした。ここで使用した架橋剤は、ＤＭＳＯ中に再懸濁され、したがって４％のＤＭＳＯ中のＳＯＤ１の対照が使用された。ＷｔＳＯＤ１も同じく調査されたが、その溶融温度が沸点に近いことから、ここで使用された検定では、安定化が発生したか否かを検出することはできない（データ示さず）。
【００１１】
Ｇ８５ＲおよびＧ９３Ａは、それぞれおよそ４０℃および２０℃の温度まで架橋剤濃度依存的に安定させられた。銅と亜鉛の添加は、野生型様のＧ９３Ａ変異体に対しほとんど効果をもたなかったが、架橋剤と共に金属欠乏性変異体であるＧ８５Ｒに銅と亜鉛を添加すると、タンパク質はほぼ野生型のレベルまで安定化する。図１０はこのきわめて安定した形態のＧ８５Ｒが、野生型様スーパーオキシドジスムターゼ活性を取り戻したことを示している。以上のグラフは、各濃度それぞれの３つの複製の平均を表わす；トリプリケートで反復した。
【図１０】化学的架橋によるｆＡＬＳ−バリアントＧ８５Ｒ  ＳＯＤ１活性の回復を表す。ＷｔＳＯＤ１活性は、銅、亜鉛および／またはＢＭＯＥの添加により変化しないと思われる。ｗｔ様の変異体であるＧ９３Ａも同様に、銅、亜鉛および／またはＢＭＯＥの添加による影響を受けないように思われるが、それは野生型に比べて活性が低くなっているように思われる。Ｇ８５Ｒは、不活性である金属欠乏性変異体である。余剰の銅、亜鉛またはＢＭＯＥが存在する場合、Ｇ８５Ｒの活性は増大する。最も注目すべきことに、銅、亜鉛およびＤＴＭＥの存在下でＧ８５Ｒは、より一層活性を増大させる。したがって、Ｇ８５Ｒの安定性の増加は同様に活性の増加に対応する（図１６）。
【図１１】架橋されたＷＴ  ＳＯＤ１およびＧ９３Ａ  ＳＯＤ１中のダイマー形成の存在を表している。（Ａ）未変性（未架橋）ｗｔＳＯＤ１のスペクトル。（Ｂ）ＤＴＭＥ架橋されたｗｔＳＯＤ１のスペクトル。観察された種の大部分は、ダイマーｗｔＳＯＤ１である。（Ｃ）未変性Ｇ９３Ａのスペクトル。（Ｄ）ＤＴＭＥ架橋されたＧ９３Ａのスペクトル。ＷＴ  ＳＯＤ１を架橋することに加えて、１：１のモル濃度でＤＴＭＥおよびＢＭＯＥを用いてＧ９３Ａを架橋した。より低い分子量の第２のピークは、モノマーＳＯＤ１または［Ｍ＋２Ｈ］２＋ダイマーのいずれかに対応できた。
【図１２】ＳＯＤ１ダイマー形成という結果をシステイン架橋がいかにもたらすかをウエスタンブロット分析により示す。２つのシステイン残基ロトマーの間の結晶学的距離に基づいて、本出願人らは、８．０〜１４．７Å（０．８〜１．４７ｎｍ）の範囲のスペーサーを伴うマレイミド架橋剤および１４．７Å（１．４７ｎｍ）のスペーサーを伴う１つのビニルスルホン架橋剤を使用した。架橋に先立ち、ＳＯＤ１をＤＴＴで処理して、偶発的なスルファン硫黄（ｄｅ  Ｂｅｕｓ、２００４＃１２６８）を除去した。Ｃ１８逆相クロマトグラフィ、５０／５０のＨ２０／ＡＣＮ、０．１％のギ酸中へのＳＯＤ１の溶離および、アミコンＹＭ１０濃縮装置を用いたｐＨ７．４のＰＢＳ中へのこの溶離液の緩衝液交換によって、ＤＴＴ還元を急冷した。１時間室温で１：１または１：３のＳＯＤ１対架橋剤モル比で架橋を実施し、さまざまなマレイミドおよびビニルスルホンを用いたＷＴ  ＳＯＤ１のＳＯＤ１に対するポリクローナル抗体（ＳＯＤ１００、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）（Ａ）の１：１および１：３の化学的架橋を用いたウエスタンブロットによってこれを分析した。
【図１３】ＤＴＭＥのチオール−ジスルフィド交換を示唆する断片化を示す。（Ａ）１つの架橋剤により修飾された１４５５．４でのＧ９３Ａダイマー（前駆体イオン）。（Ｂ）Ｇ９３Ａで架橋されたダイマー（断片イオン）のＦｕｎｎｅｌスキマー解離。１４４２．４のｍ／ｚはＧ９３Ａモノマーに対応し、１４５６．８のｍ／ｚは分割された架橋剤により修飾されたＧ９３Ａモノマーに対応し、１４７１．０のｍ／ｚは１つの架橋剤により修飾されたＧ９３Ａモノマーに対応し、１４９９．７のｍ／ｚは２つの架橋剤により修飾されたＧ９３Ａに対応する。
【図１４】Ｃｙｓ１１１が化学的架橋の代表的部位であることを示す。架橋の代表的部位を同定するために、Ｇ８５ＲをＢＭＯＥで架橋し、Ｇｌｕ−Ｃで消化させた。その後、フーリエ変換質量分析法（ＬＣ−ＦＴＭＳ）を用いてペプチドを分析した。ＬＣ−ＦＴＭＳランから生成されたペプチドデータをＭＡＳＣＯＴ検索を目的として提出し、未架橋のおよび架橋された試料について結果を比較した。架橋された試料中にはあったものの未変性試料にはなかった２つのＭｒは、５２３２．６７４（ｍ／ｚ８７３．１２０）および５３４７．７００（ｍ／ｚ８９２．２９１）であった。０．０１Ｄａの許容誤差を用いて上述のｍ／ｚの各々について抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）を作製した。すなわち、ｔ約２２．５分において１．５超のピークを伴うライン（架橋された試料）およびｔ約２３分で約１．５のピークを伴うライン（未架橋）。両方の試料中でｍ／ｚ４８７．７９０（Ｍｒ９７３．５６３；残基１〜９、アセチル化Ｎ末端）が観察され、陽性対照として提示されている。ＥＩＣの比較の後、５２３２．６７４、５３４７．７４０、そしてその他の架橋候補をＭＳ−Ｂｒｉｄｇｅウェブサイト内に入力し、これがＭｒを、考えられる全ての架橋済みペプチドＭｒと架橋剤の分子量（ＢＭＯＥ２２０．０５Ｄａ）のリストと比較する。ＭＳ−Ｂｒｉｄｇｅは、５２３２．６７４と５３４７．７４０を両方共、それぞれ１つの架橋（残基１０３−１２６に対する残基１０３−１２５）および（残基１０３−１２６に対する残基１０３−１２６）に関与しているものとして同定した。５２３２．６７４についての予測された架橋は、６．１９ｐｐｍの精度を有し、一方５３４７．７００は、５．８８ｐｐｍの精度を有していた。したがって、これらの予測された架橋内には１つのシステインしか入らないことから、ＬＣ−ＦＴＭＳ／ＭＳデータは、架橋の部位をＣｙｓ１１１として明らかにした。注目すべきことに、架橋の複雑性に起因して、予測架橋済みペプチドについてはいかなるＭＳ／ＭＳデータも得られなかった。
【図１５】化学的架橋によるｆＡＬＳ関連ＳＯＤ１バリアントの安定化を示す。（Ａ）２．５〜２０μＭのＤＴＭＥと共にインキュベートされた１０μＭのＧ９３Ａ。（Ｂ）０〜２０μＭのＤＴＭＥと共にインキュベートされた１０μＭのＧ８５Ｒ。ＢＭＯＥ（図９）と類似の結果がＤＴＭＥについて観察された。
【図１６】化学的架橋によるｆＡＬＳバリアントＧ８５Ｒ  ＳＯＤ１活性の回復を示す。ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）１２．５％未変性ポリアクリルアミドゲルベースの検定（６９−７２）を用いて、ＳＯＤ１活性を監視した。以下のものの存在下または不在下で、ＷＴまたはｆＡＬＳ関連ＳＯＤ１バリアントをインキュベートした：２倍余剰の銅および亜鉛；等モルＤＴＭＥ；およびあらゆるＤＴＭＥ媒介型架橋を分割するＴＣＥＰ。Ｇ８５Ｒは、本質的に不活性の金属欠乏性変異体であり、一方、ｗｔＳＯＤ１およびＧ９３Ａ  ＳＯＤ１は完全に活性である。しかしながら、余剰の銅、亜鉛またはＤＴＭＥの存在下では、Ｇ８５Ｒ活性は増大する。注目すべきことに、Ｇ８５Ｒは銅、亜鉛およびＤＴＭＥの存在下で最大の活性増大を示し、ＴＣＥＰによるＤＴＭＥ媒介型架橋の分割は結果として活性の喪失をもたらした。類似の結果がＢＭＯＥについて得られた。
【図１７】野生型ＳＯＤ１および選択された変異体についてのモノマーあたりの金属含有量を示す。
【図１８Ａ】本発明において有用なさまざまなタイプの架橋剤を示す。
【図１８Ｂ】本発明において有用なさまざまなタイプの架橋剤を示す。
【図１８Ｃ】本発明において有用なさまざまなタイプの架橋剤を示す。
【図１８Ｄ】本発明において有用なさまざまなタイプの架橋剤を示す。
【図１８Ｅ】本発明において有用なさまざまなタイプの架橋剤を示す。
【図１８Ｆ】本発明において有用なさまざまなタイプの架橋剤を示す。
【図１８Ｇ】本発明において有用なさまざまなタイプの架橋剤を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本出願人らは一般にシステイン残基がもつ独特の求核性、特に隣接するＳＯＤ１モノマーのＣｙｓ１１１の近接性を活用した、ｆＡＬＳ関連ＳＯＤ１バリアントの熱安定性を増大させるための戦略を開発した。本出願人らは、各ＳＯＤ１モノマーそれぞれの上の２つの隣接するシステイン（Ｃｙｓ１１１）を用いた、ＳＯＤ１のマレイミド交換およびチオール−ジスルフィド交換の両方を媒介とする安定化を紹介している。質量分析法データは、１当量のダイマーを産生する１当量の架橋剤で整合性を有し、還元的に不安定な架橋剤（ＤＴＭＥ）は、架橋剤を触媒とする反応の発生を排除した。ＴＣＥＰを介したＤＴＭＥの還元が同様に、サブユニット間ジスルフィドが関与しないＣｙｓ１１１を媒介とする効果を排除した（図１６）。
【００１３】
化学的架橋は約２０℃でＧ９３Ａを安定化し、余剰の銅、亜鉛および化学的架橋は約４５℃でＧ８５Ｒを安定化し、これはＳＯＤ１について、そして本出願人らの知るかぎりあらゆる疾病関連タンパク質についてこれまで達成された最高のものである。Ｇ８５Ｒは、生体内でモノマーとして発見されるｆＡＬＳバリアントのうちの１つであり、類似のバリアントについて本出願人らのアプローチが有効であるかもしれないということを示唆している。余剰の銅、亜鉛、そして化学的架橋は、Ｇ８５Ｒを安定化させることに加えて、その酵素活性も増大させた。最も一般的な５つのｆＡＬＳ  ＳＯＤ１バリアント（Ｄ９０Ａ、Ａ４Ｖ、Ｅ１００Ｇ、Ｈ４６ＲおよびＩ１１３Ｔ）を含めて、一般的なＳＯＤ１バリアントの全てとは言えないまでもその一部は、増大した安定化および酵素活性をも示すかもしれないということが予想される。
【００１４】
注目すべきことに、活性部位から遠位の残基を標的にすることによりここで達成される活性の増大は、可逆的阻害物質を活性部位に結合させることが関与する薬理学的シャペロンの設計のための最も一般的な戦略と対照的である。このような活性部位阻害物質にとって、毒性の主要源または一部の変異体に対する効能の欠如は、このアプローチにとって基本となるものでありかつ安定化にとっては次善であるかもしれない用量に関する妥協を結果としてもたらす酵素阻害にある。これとは対照的に、ダイマーの界面で相互作用する本出願人らのアプローチは、ＳＯＤ１を安定化すると同時に、少なくとも一部の不活性変異体についてＳＯＤ１活性を増大させる。本明細書で記述されている一部の代表的な架橋剤の使用は、同様に、ＡＬＳ細胞培養およびマウスモデルにおいて有効性を確認できる可能性のある療法として役立つかもしれない高親和性および／または特異性化合物の設計のための足場としての用途にも適している。
【００１５】
潜在的な毒性（他のタンパク質に対する標的外結合）を最小限におさえながらヒトＳＯＤ１ダイマーを安定化するために、本出願人らは、Ｃｙｓロトマーに応じて約９または１３オングストローム（約０．９または１．３ｎｍ）だけ離隔されているダイマー界面の相対する側にある２つの対称に配置されたＣｙｓ１１１残基の存在（図７）、一般にシステイン残基の高い求核性（独特の反応性）、および架橋のエントロピー上のメリットを活用した。共有結合を使用することで、化合物の結合強度は増大し、そのため、結合は本質的に試験管内で不可逆的である。
【００１６】
その他のシステインに向けられた化合物のクラスには、水銀試薬、ペプチド、非ペプチドジスルフィド形成試薬、ビスマレイミドおよびアルキル化剤（例えばヨードアセトアミド）がある。これらの異なる部類の架橋剤を比較するために、本出願人らは、ｌｏｇＰと表現される一般溶解度（オクタノール−水分配係数の対数）および曝露された細胞または動物の５０％致死的用量である、ＩＣ５０またはＩＤ５０として表現される毒性をそれぞれ考慮した。Ｌｉｐｉｎｓｋｉの法則は、５以下（理想的には１〜３の間）のｌｏｇＰ値を有する化合物が「薬剤様」とみなされ、１未満のｌｏｇＰを有する化合物が水溶液中に充分に溶解可能であるということを示した。各クラス中の代表的数（利用可能性に応じて３〜３５０）の化合物を、ＰｕｂＣｈｅｍにより文献中で検索することができる。これらのクラスは、以下の水中溶解度順で最高から最低までランク付けされる：すなわちペプチド（３５０個のペプチドについて−３〜１２の範囲内のｌｏｇＰできわめて可変的かつ配列依存的）＞ビスマレイミド（ＸｌｏｇＰ約１）＞アルキル化剤（ＸｌｏｇＰ、約２．５）＞非ペプチドジスルフィド形成試薬（ＸｌｏｇＰ約４）、水銀剤（毒性が高いため精査せず、以下参照）。最低から最高への毒性ランクは、以下の通りである：ペプチド（可変的、ただし多くの場合１０ｍＭ超の生物学的濃度で耐容可能である、ビスマレイミド（注：最も一般的に研究されるマレイミドであるＮ−エチルマレイミドは、ラット中０．０７５ｍｇ／ｋｇで肝毒性であり、第２のマレイミドは、マウス中４０ｍｇ／ｋｇ未満で細胞培養中で２μｍのＩＣ５０を有していた）＜アルキル化剤［１，３−ジブロモアセトン（マウス中３ｇ／ｋｇ）、ビス−エポキシド（４〜２０ｇ／ｋｇの範囲）、および一部のビニルスルホン（１ｇ／ｋｇ）］、（一方他のアルキル化剤［フェニルヒドラジン（８０ｍｇ／ｋｇ）およびＮ，Ｎ’−エチレンビス−（ヨードアセトアミド）（９ｍｇ／ｋｇ）］はヒトにおいてはそのＬＤ５０値に起因して推奨されない）＜水銀誘導体（可変的、ただし一部の化合物は、ヒトについて１０〜４０ｍｇ／ｋｇの範囲内にある）。これらの化合物のうち、一部のアルキル化剤は、非常に高い用量で耐容可能であった。
【００１７】
データに基づかない（ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ）実施形態
Ｃｙｓ１１１−架橋剤媒介型安定化が最も一般的なｆＡＬＳ  ＳＯＤ１バリアントおよび酸化されたＷＴ  ＳＯＤ１に適用可能であるか否かを判定する
予備的結果の中で、本出願人らは、Ｇ９３ＡおよびＧ８５Ｒ  ＳＯＤ１バリアントの個別のＳＯＤ１モノマーを繋留するために、ホモ二官能性、Ｃｙｓ１１１特異的、マレイミド架橋剤を使用した。本出願人らは、そうでなければ不活性であるＧ８５Ｒバリアントに対するほぼ完全な活性も同時に回復しながら、Ｇ８５Ｒ  ＳＯＤ１の融点を約４５℃だけ上昇させることによって、本出願人らの知るかぎりにおいてあらゆるタンパク質にとっての小分子媒介型安定化の前例のないレベルを達成した。このより広い治療可能性を決定するため、５つの最も一般的なｆＡＬＳ  ＳＯＤ１バリアント（Ｄ９０Ａ、Ａ４Ｖ、Ｅ１００Ｇ、Ｈ４６ＲおよびＩ１１３Ｔ）、Ｃ６Ｇおよび酸化されたＷＴ  ＳＯＤ１が、以下の方法で分析される：
Ａ．  最も一般的なＳＯＤ１  Ｄ９０Ａ、Ａ４Ｖ、Ｅ１００Ｇ、Ｈ４６Ｒ、Ｉ１１３ＴおよびＣ６Ｇバリアントを発現させ精製する。
【００１８】
Ｂ．  Ｃｙｓ１１１ホモ二官能性マレイミドが、１）質量分析法を用いてＣｙｓ１１１でこれらのバリアントのダイマーを繋留しているか判定する；２）「熱蛍光」安定性検定を用いて、ｆＡＬＳ  ＳＯＤ１バリアントを安定化するか判定する；かつ３）酵素活性を改善するか判定する。質量分析法を用いて化合物の部位を決定し、他の遊離システインとの副反応のための代用物としてＳＯＤ１  Ｃｙｓ６に結合した化合物を使用する。
【００１９】
Ｃ．  ホモ二官能性マレイミドがＳＯＤ１の酸化反応生成物、過酸化物によりひき起こされる酸化およびモノマー化速度を低下させるかを判定し、同様にホモ二官能性マレイミドが、先に酸化されたＷＴ  ＳＯＤ１を安定化させるかを判定する。
【００２０】
ペプチドベースのＣｙｓ１１１架橋およびＳＯＤ１安定化分子を開発する
合理的な所定の制約および反復的な実験により決定された制約の両方を用いて、チオール−ジスルフィド交換媒介型ＳＯＤ１ダイマー安定化に適した約２０００個のペプチドの組合せライブラリを、考えられる２０００万超のジ、トリ、テトラおよび環状ペプチドから解析し使用してもよい。これらのペプチドは、ハイスループットサービス施設により合成されてもよい；多重化質量分析法検定が、生理学的還元剤グルタチオンの存在下で、化合物のオンレートおよびそのオフレートを決定する；多重化安定化検定が実施され、ジスムターゼ活性が、最良の２００個の化合物について決定される。
【００２１】
異なるスペーサーアーム長および異なる化学的環境を試験するために、本出願人らはＲ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｒ、Ｒ−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｒ１およびＲ−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｒ架橋剤を作製する。なおここでＲは、ペプチドのシステイニル硫黄に対してジスルフィド結合により付着された可変基であり、Ｘは、２０個の天然に発生するアミノ酸および８個の非天然アミノ酸で構成され得る可変的アミノ酸である。本出願人らは、質量分析法、熱蛍光および活性を用いてＳＯＤ１を安定化させるこれらの化合物の能力を試験する予定である。
【００２２】
本出願人らは、Ａｉｍｓ  ２Ａ−Ｃ由来の最も活性の高いペプチドをそのＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を介してカップリングすることによって、環状ペプチドを創出する予定である。これらの化合物の試験は、上述の通りである。
【００２３】
本出願人らは、実験結果を用いて、定量的構造活性関係モデルを生成し、これらを用いて追加の２００個の最適化されたペプチドを創出する予定であり、これらは上述の通りに試験され、改善された性能を有するものと予想される。
【００２４】
本出願人らは、ペプチドベースのＳＯＤ１  Ｃｙｓ１１１架橋剤の第一世代を開発し特徴づけすることを期待している。ペプチド合成コストは比較的低いことから、試験管内の構造活性関係の規模を同時に増大させることができる。１つの最終目的は、構造−活性関係が発生し、有資格グループ、協力者または企業がペプチド模倣体の設計に着手するよう奨励することになることにある。構造−活性関係は、必須残基のさらなる「類似体化」が関与する、ペプチド模倣体の創出のための前提条件である。別の最終目的は、追加のおよび必須の構造−活性情報を提供する本出願人ら独自の細胞培養に基づく毒物学および生物活性検定を可能にすることにある。他の研究において、本出願人らは、細胞培養および動物由来のＳＯＤ１を日常的に免疫精製しており、将来の細胞培養または動物研究において、架橋されたＳＯＤ１用の生物学的検定として、同じプロトコルを使用できるものと思われる。
【００２５】
本出願人らは、ＳＯＤ１を結合させることのできるペプチドをまず発見し、次にそれらをそのＮおよびＣ末端システイン残基を通して他の活性ペプチドに結合させることによりこれらのペプチドの類似体を創出することを提案している。ペプチドを使用することにより、本出願人らは、合成を下請けさせながら大量の化学的環境を探究し、比較的ハイスループットのスクリーニングに集中できる。ペプチドは化学的環境を探求する１つの比較的安価な方法であり、そして薬理学的特性が劣るという潜在的な弱点は恐らくはペプチド模倣体の専門的知識を用いてのみ克服可能である。換言すると、ペプチドを用いて、非ペプチド小分子の合成についての情報を提供することができる。ペプチド薬剤は、低コストであり、合成が堅調であり、問題のアミノ酸を位置特定する上で特異性が高く、本質的に毒性が低く、本明細書で使用されるペプチドサイズでは事実上免疫原性が全くない。本出願人らのアプローチの主要な差異であり、１つの潜在的な差異は、名目上、ＳＯＤ１を架橋するために必要なアミノ酸がＣｙｓ−Ｃｙｓのわずか２個だけであり、このため本出願人らによるペプチドは他の生物活性ペプチドに比べ潜在的にはるかに小さい。このことは確実に、血液脳関門を通過する上で一助となり、恐らくはペプチターゼによる消化を低減させるものである。
【００２６】
ＳＯＤ１安定化に対する潜在的な代表的ペプチドベースのアプローチは、環状ペプチドの創出にある。システイン−ジスルフィドを用いてペプチドの活性残基を環化する一般的アプローチは、システイン残基でα−ＭＳＨのＨｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ必須活性コアをフランキングし、次に同じシステインを用いて環化し、α−ＭＳＨ類似体の場合において功を奏した。環状ペプチドは、直鎖状ペプチドの生物活性および薬理学的特性を高めるため、ほぼ３０年にわたり使用されてきた。その効能に関する別の証は、バシトラシン、シクロスポリンおよびナイシン（一般的食品保存料）などの周知の抗生物質を含む数多くの天然産物由来の抗生物質が、環状ペプチドである、という点にある。環状ペプチドは、ヒトの消化管でも生き延びるほどに、並外れて安定している可能性がある。得られる環状ペプチドは、６０倍の生物活性を有していた。このペプチドの生物学的半減期は、配列をアミノ酸わずか７個まで短縮し非天然アミノ酸を取込むことによりさらに一層改善された。環状ペプチドにはその直鎖状類似体に比べて、代謝および分泌の両方におけるより優れた薬物動態およびタンパク質分解に対するより高い耐性を含めた数多くの利点がある。環状ペプチドは、より拘束され、より明確な分子構造で満たされ、このことがひいてはペプチド模倣体を構築する場合に適切なファーマコフォアのより良い推定を可能にしている。本出願人らは、定性的な２０ピコ秒のＭＭ２ベースの分子動力学シミュレーションを実施し、８Å（０．８ｎｍ）超であり得た直鎖状ペプチド内のシステイニル硫黄移動度とおよそ２Å（およそ０．２ｎｍ）であった環状ペプチドの間の差異は注目に値するものであった。
【００２７】
本発明の代表的類似体
本発明の一態様は、安定化されたスーパーオキシドジスムターゼ類似体において、前記類似体が三次構造を有し第１のＳＯＤ１モノマーおよび第２のＳＯＤ１モノマーを含み；前記第１のＳＯＤ１モノマーが第１の面および第１のα−アミノ酸残基を含み、前記第２のＳＯＤ１モノマーが第２の面と第２のα−アミノ酸残基を含み；前記第１のα−アミノ酸残基が第１の側鎖を含み、前記第２のα−アミノ酸残基が第２の側鎖を含み；第１のα−アミノ酸残基が１つの接続部により第２のα−アミノ酸残基に接続されている安定化されたスーパーオキシドジスムターゼ類似体である。
【００２８】
類似体の一部の実施形態において、第１のα−アミノ酸残基と第２のα−アミノ酸残基の間の接続は、第１の側鎖と第２の側鎖の間にある。
【００２９】
一部の実施形態において、本発明は、第１の側鎖および第２の側鎖が共有結合、イオン結合または非共有結合により接続されている、上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００３０】
一部の実施形態において、本発明は、三次構造が、野生型スーパーオキシドジスムターゼ酵素と実質的に同じである上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００３１】
一部の実施形態において、本発明は、類似体の酵素活性が低下しないような場所に第１のα−アミノ酸残基および第２のα−アミノ酸残基の場所がある上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００３２】
一部の実施形態において、本発明は、第１のα−アミノ酸残基の位置が、第１の面上に特定され、第２のα−アミノ酸残基の位置が第２の面上に特定される上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００３３】
一部の実施形態において、本発明は、第１のα−アミノ酸残基および第２のα−アミノ酸残基が同じ付番位置を占有している上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００３４】
一部の実施形態において、本発明は、第１のα−アミノ酸残基および第２のα−アミノ酸残基が異なる付番位置を占有している上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００３５】
一部の実施形態において、本発明は、第１のα−アミノ酸残基が１１１位にある上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００３６】
一部の実施形態において、本発明は、第２のα−アミノ酸残基が１１１位にある上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００３７】
一部の実施形態において、本発明は、第１のα−アミノ酸残基がリジン、システイン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリンおよびトレオニンからなる群から選択される上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００３８】
一部の実施形態において、本発明は、第２のα−アミノ酸残基がリジン、システイン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリンおよびトレオニンからなる群から選択される上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００３９】
一部の実施形態において、本発明は、第１のα−アミノ酸残基および第２のα−アミノ酸残基がシステインである上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００４０】
一部の実施形態において、本発明は、第１のα−アミノ酸残基がアスパラギン酸塩であり、第２のα−アミノ酸残基がアルギニンである上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００４１】
一部の実施形態において、本発明は、第１のα−アミノ酸残基がアルギニンであり、第２のα−アミノ酸残基がアスパラギン酸塩である上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００４２】
一部の実施形態において、本発明は、前記第１のＳＯＤ１モノマーと前記第２のＳＯＤ１モノマーの配列相同性が約８５％以上である上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００４３】
一部の実施形態において、本発明は、前記第１のＳＯＤ１モノマーと前記第２のＳＯＤ１モノマーが実質的に同じアミノ酸配列を有する上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００４４】
一部の実施形態において、本発明は、接続部の長さが０オングストローム（０ｎｍ）〜約３０オングストローム（約３ｎｍ）である上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００４５】
一部の実施形態において、本発明は、接続部の長さが約２オングストローム（約０．２ｎｍ）〜約２０オングストローム（約２ｎｍ）である上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００４６】
一部の実施形態において、本発明は、接続部の長さが約５オングストローム（約０．５ｎｍ）〜約１５オングストローム（約１．５ｎｍ）である上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００４７】
一部の実施形態において、本発明は、接続部の長さが約８オングストローム（約０．８ｎｍ）〜１４オングストローム（１．４ｎｍ）である上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００４８】
一部の実施形態において、本発明は、接続部の長さが約９オングストローム（約０．９ｎｍ）〜１１オングストローム（１．１ｎｍ）である上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００４９】
一部の実施形態において、本発明は、接続部の長さが約９オングストローム（約０．９ｎｍ）〜約１３オングストローム（約１．３ｎｍ）である上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００５０】
一部の実施形態において、本発明は、前記類似体の第１のＳＯＤ１モノマーが野生型配列であるか、またはＧ９３Ａ、Ｇ８５Ｒ、Ｄ９０Ａ、Ａ４Ｖ、Ｅ１００Ｇ、Ｈ４６Ｒ、Ｃ６ＧおよびＩ１１３Ｔからなる群から選択された変異を含む上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００５１】
一部の実施形態において、本発明は、前記類似体の第２のＳＯＤ１モノマーが野生型配列であるか、またはＧ９３Ａ、Ｇ８５Ｒ、Ｄ９０Ａ、Ａ４Ｖ、Ｅ１００Ｇ、Ｈ４６Ｒ、Ｃ６ＧおよびＩ１１３Ｔからなる群から選択された変異を含む上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００５２】
一部の実施形態において、本発明は、野生型スーパーオキシドジスムターゼ酵素の活性の少なくとも９０％を約７５℃の温度まで保持する前記類似体のいずれか一つに関する。
【００５３】
一部の実施形態において、本発明は、前記類似体の安定化が、約１０度から約６０度まで増大させられる前記類似体のいずれか一つに関する。
【００５４】
一部の実施形態において、本発明は、前記類似体の安定化が、約２０度から約４０度まで増大させられる前記類似体のいずれか一つに関する。
【００５５】
一部の実施形態において、本発明は、前記類似体の安定化が、約１５度から約２５度まで増大させられる前記類似体のいずれか一つに関する。
【００５６】
一部の実施形態において、本発明は、前記類似体の安定化が、約３０度から約５０度まで増大させられる前記類似体のいずれか一つに関する。
【００５７】
一部の実施形態において、本発明は、前記類似体の安定化が、約２０度増大させられる前記類似体のいずれか一つに関する。
【００５８】
一部の実施形態において、本発明は、前記類似体の安定化が、約４０度増大させられる前記類似体のいずれか一つに関する。
【００５９】
本発明の別の態様は、さらに架橋剤を含み、前記架橋剤が第１のアミノ酸残基と第２のアミノ酸残基を接続する、前記類似体のいずれか一つの安定化されたスーパーオキシドジスムターゼ類似体である。
【００６０】
一部の実施形態において、本発明は、架橋剤が、トリス［２−マレイミドエチル］アミン（ＴＭＥＡ）、ジチオ−ビスマレイミドエタン（ＤＴＭＥ）、１，４−ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、（１，８−ビス−マレイミド−ジエチレングリコール（ＢＭ（ＰＥＧ）２）、１，４−ビス（マレイミド）ブタン（ＢＭＢ）およびビス（マレイミド）エタン（ＢＭＯＥ）からなる群から選択される上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００６１】
一部の実施形態において、本発明は、架橋剤が、有機水銀化合物、マレイミド、ビニルスルホンおよびアルキル化剤からなる群から選択される上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００６２】
一部の実施形態において、本発明は、第１のアミノ酸残基および第２のアミノ酸残基がリジンである上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００６３】
一部の実施形態において、本発明は、架橋剤が０オングストローム（０ｎｍ）〜約２０オングストローム（約２ｎｍ）の長さを有するスペーサーアームを含む上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００６４】
一部の実施形態において、本発明は、架橋剤が約３オングストローム（約０．３ｎｍ）〜約１５オングストローム（約１．５ｎｍ）の長さを有するスペーサーアームを含む上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００６５】
一部の実施形態において、本発明は、架橋剤が約７オングストローム（約０．７ｎｍ）〜約１１オングストローム（約１．１ｎｍ）の長さを有するスペーサーアームを含む上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００６６】
一部の実施形態において、本発明は、架橋剤が約９オングストローム（約０．９ｎｍ）の長さを有するスペーサーアームを含む上述の類似体のいずれか一つに関する。
【００６７】
本発明の別の態様は、安定化されたＳＯＤ１類似体と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。
【００６８】
本発明の代表的方法
本発明の別の態様は、安定化されたスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）類似体の製造方法であって、第１のＳＯＤ１モノマー、第２のＳＯＤ１モノマー、および架橋剤を反応させて前記類似体を形成するステップを含む製造方法である。
【００６９】
本発明の別の態様は、第１のＳＯＤ１モノマーの第１のα−アミノ酸残基を第２のＳＯＤ１モノマーの第２のα−アミノ酸残基と接続するステップを含む、安定化されたスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）類似体の製造方法である。
【００７０】
一部の実施形態において、本発明は、第１のＳＯＤ１モノマーの天然に発生するアミノ酸を第１のα−アミノ酸残基で置換するステップをさらに含む上述の方法のいずれか一つに関する。
【００７１】
一部の実施形態において、本発明は、第２のＳＯＤ１モノマーの天然に発生するアミノ酸を第２のα−アミノ酸残基で置換するステップをさらに含む上述の方法のいずれか一つに関する。
【００７２】
一部の実施形態において、本発明は、第１のα−アミノ酸および第２のα−アミノ酸が架橋剤により接続されている上述の方法のいずれか一つに関する。
【００７３】
一部の実施形態において、本発明は、第１のα−アミノ酸残基がリジン、アスパラギン酸、アルギニン、グルタミン酸、セリン、システインおよびトレオニンからなる群から選択される上述の方法のいずれか一つに関する。
【００７４】
一部の実施形態において、本発明は、第２のα−アミノ酸残基がリジン、アスパラギン酸、アルギニン、グルタミン酸、セリン、システインおよびトレオニンからなる群から選択される上述の方法のいずれか一つに関する。
【００７５】
一部の実施形態において、本発明は、第１のα−アミノ酸残基および第２のα−アミノ酸残基がシステインである上述の方法のいずれか一つに関する。
【００７６】
一部の実施形態において、本発明は、第１のα−アミノ酸残基および第２のα−アミノ酸残基がリジンである上述の方法のいずれか一つに関する。
【００７７】
本発明の別の態様は、治療上有効な量の上述の類似体のいずれか一つの安定化されたＳＯＤ１類似体を、それを必要としている哺乳動物に対して投与するステップを含む神経性疾患の治療方法である。
【００７８】
本発明の別の態様は、治療上有効な量の上述の類似体のいずれか一つを、それを必要としている哺乳動物に対して投与するステップを含む神経変性疾患向けの予防的投与方法である。
【００７９】
一部の実施形態において、本発明は、神経変性疾患が筋委縮性側索硬化症である上述の方法のいずれか一つに関する。
【００８０】
定義
「類似体」という用語は、機能がＳＯＤ１タンパク質に類似している分子またはその断片を意味する。
【００８１】
基準ペリペプチドに関して本明細書で使用されている「アミノ酸配列同一性百分率（％）」または「アミノ酸配列相同性百分率」または「〜パーセント（％）の同一性を有する」という用語は、いずれの保存的置換も配列同一性の一部と考えることなく、最大配列同一性百分率を達成するために、必要な場合、配列を整列させギャップを導入した後の、基準ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一であるポリペプチド配列候補中のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性百分率を決定するための整列は、当該技術分野において公知のさまざまな技術によって、例えばＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）などの公に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用することによって達成可能である。当業者であれば、比較に使用されているペプチド配列の全長にわたり最大の整列を達成するのに必要とされるあらゆるアルゴリズムを含めて、整列を測定するための適切なパラメータを決定することができる。例えば、本発明との関連において、ＳＯＤ１の類似体は、前記類似体のアミノ酸配列が野生型と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％の同一性を有する場合に、ＳＯＤ１と「実質的な相同性」を共有すると言われる。
【００８２】
「薬学的に許容される」という成句は、哺乳動物において、適正な医学的判断の範囲内で、妥当な損益比に見合い、過度の毒性、刺激、アレルギー反応またはその他の問題または合併症が無く、実質的に非発熱性で、人間および動物の組織と接触して使用するのに適しているリガンド、材料、組成物および／または剤形に言及するために用いられている。
【００８３】
本明細書中で使用される「薬学的に許容される担体」という成句は、対象の化学物質を体の一器官または一部分からその別の器官または部分まで搬送または輸送することに関与する液体または固体充填材、希釈剤、賦形剤、溶剤または封入材料などの薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルを意味する。各々の担体は、調合物の他の成分と相容性があり、患者にとって有害でなく実質的に非発熱性であるという意味において「許容される」ものでなくてはならない。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料のいくつかの例としては、次のものが含まれる：（１）糖、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）デンプン、例えばコーンスターチおよびジャガイモデンプン；（３）セルロースとその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；（４）トラガカント粉未；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えばココアバターおよび坐薬用ロウ；（９）油、例えばピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油；（１０）グリコール、例えばプロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリル酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質を含まない水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝液；および（２１）製剤調合において用いられる他の非毒性で相容性ある物質。一部の実施形態において、本発明の医薬組成物は、非発熱性である、すなわち患者に投与された場合に有意な温度上昇を誘発しない。
【００８４】
「予防（する）」という用語は、当該技術分野において認められており、局所再発（例えば疼痛）などの身体条件、癌などの疾患、心不全などの複合症候群または他の何らかの病状に関係して使用される場合、当該技術分野において良く理解されるものであり、その組成物を受けていない対象に比べて或る対象の体内の病状の症候の頻度を削減するかまたはその開始を遅らせる組成物の投与を含む。こうして、癌の予防には、例えば、未処置の対照集団に比べ予防的処置を受けた患者の集団における検出可能な癌成長の数を削減させること、および／または未処置対照集団に比べて処置済み集団において例えば統計学的および／または臨床的に有意な量だけ検出可能な癌成長の出現を遅延させることが含まれる。感染予防には、例えば、未処置の対照集団に比べて処置済み集団において感染診断数を削減させること、および／または、未処置対照集団に比べて処置済み集団において感染の症候の開始を遅延させることが含まれる。疼痛予防には、例えば、未処置対照集団に比べて処置済み集団において対象が感じる疼痛の知覚の規模を削減させることまたはこの知覚を遅延させることが含まれる。
【００８５】
治療における使用に関して、例えば本発明のポリペプチドまたはペプチド類似体などの化合物の「治療上有効な量」とは、所望の用法・用量の一部として（哺乳動物、好ましくはヒトに対し）投与された場合に、例えば任意の医療的処置に適用可能な妥当な損益比で、処置すべき障害または身体条件または化粧品用途のために、臨床的に許容できる標準規格にしたがって症候を軽減するか、身体条件を改善するかまたは疾病条件の開始を遅延させる、調製物中のポリペプチドまたはペプチドの量を意味する。
【００８６】
「予防的」または「治療的」処置という用語は、当該技術分野において認知されたものであり、対象組成物の１つ以上を宿主に対し投与することを含む。望ましくない身体条件（例えば宿主動物の疾病または他の所望されない状態）の臨床的発現に先立ち投与された場合には、その処置は予防的処置であり（すなわち、それは宿主を、所望されない身体条件の発生に対し保護する）、一方それが、所望されない身体条件の発現の後に投与される場合には、処置は治療的処置である（すなわちそれは、既存の所望されない条件またはその副作用を低減、改善または安定化するように意図されている）。
【実施例】
【００８７】
本発明について一般的に記述したが、限定的な意図なくその一部の態様および実施形態の例示のみを目的として含まれている以下の実施例を参照することによって本発明をさらに容易に理解することができるものである。
【００８８】
タンパク質の発現と精製
ＷｔＳＯＤ１をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から購入した。Ｓ・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中のＧ９３ＡおよびＧ８５Ｒの発現のための構成体は、Ｄｒ．Ｐ．Ｊｏｈｎ  Ｈａｒｔ、Ｐｈ．Ｄ．（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ）からの寛大な寄贈品である。Ｇ９３ＡおよびＧ８５Ｒの発現および精製は、先に公表された通り（２６、６７）に実施した。簡単に言うと、酵母発現ベクターＹＥｐ−３５１内の各構成体を、ＥＧｙ１１８ΔＳＯＤ１酵母へと形質転換させ、３０℃で３６〜４８時間成長させた。培養をペレット化し、０．５ｍｍのガラスビーズおよびブレンダーを用いて分解し、６０％の硫酸アンモニウムカットに付した。硫酸アンモニウム沈降の後、試料をペレット化し、上清を、硫酸アンモニウムの最終濃度が２．０Ｍになるまで０．１９体積で希釈した。その後この試料を、高塩分緩衝液（２．０Ｍの硫酸アンモニア、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．１ＭのＥＤＴＡ、０．２５ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．０）から低塩分緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．１ＭのＥＤＴＡ、０．２５ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．０）まで線形的に減少する３００ｍＬの塩勾配を用いて、フェニル−セファロース６高速流（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）疎水性相互作用クロマトグラフィカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製した。ＳＯＤ１を含む試料を１．６〜１．１Ｍの間の硫酸アンモニアで溶離させ、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を用いて同定し、プールし、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０緩衝液に対し交換した。その後タンパク質を、Ｍｏｎｏ  Ｑ１０／１００アニオン交換クロマトグラフィカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に投入し、低塩分緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）から高塩分緩衝液（１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１Ｍの塩化ナトリウム）まで線形的に増加する２００ｍＬの塩勾配を用いて溶離した。勾配を、０〜３０％の１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１Ｍの塩化ナトリウムから実施し、ＳＯＤ１を５〜１２％の間の１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１Ｍの塩化ナトリウムで溶離させた。ＳＯＤ１タンパク質を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＦＴＭＳを介して確認した。
【００８９】
架橋およびウエスタンブロット
Ｗｔ、Ｇ９３ＡまたはＧ８５Ｒ  ＳＯＤ１をおよそ２０分間、５〜２５ｍＭのＤＴＴと共にインキュベートし、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４遠心分離スピンコンセントレーター（ＭＷＣｏ１０Ｋ）を用いるかまたは逆相クロマトグラフィ（ＺＩＰＴＩＰ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｉｎｃ）を用いて、両方の緩衝液を交換した。ＺＩＰＴＩＰにより清浄した試料を、同様に、５ｍＭのＥＤＴＡでのインキュベーションに付した。Ａｍｉｃｏｎコンセントレーターを用いて緩衝液交換したＳＯＤ１試料をＨＰＬＣ水に交換し、一方ＺＩＰＴＩＰ試料は、ＺＩＰＴＩＰの後、ｐＨ７．４のＰＢＳまたはＨＰＬＣ水にさらに交換した。ＤＴＴで還元されたＳＯＤ１を、１：１（２０μＭ：２０μＭまたは１０μＭ：１０μＭ）または１：３（２０μＭ：６０μＭまたは１０μＭ：３０μＭ）のタンパク質対架橋剤比でインキュベートした。
【００９０】
さまざまな架橋剤（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した：ジチオ−ビスマレイミドエタン（ＤＴＭＥ、スペーサーアーム１３．３Å）、１，４−ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ、スペーサーアーム１０．２Å）、１，８−ビス−マレイミドジエチレングリコール（ＢＭ（ＰＥＧ）２、スペーサーアーム１４．７Å）、１，４ビスマレイミドブタン（ＢＭＢ、スペーサーアーム１０．９Å）、トリス［２−マレイミドエチル］−アミオン（ＴＭＥＡ、１０．３Å）および１，６−ヘキサノール−ビス−ビニルスルホン（ＨＢＶＳ、スペーサーアーム１４．７Å）。ｐＨ７．４のＰＢＳまたは水のいずれかの中で、室温で１時間反応をインキュベートすることにより、架橋を達成した。１時間後に、未架橋対照と共に、１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で反応を分析し、ニトロセルロース膜に移し、ＳＯＤ１に対するポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロットに付した。トリプリケートで反復した。
【００９１】
さらに、ＤＴＭＥは、分割可能なスルフヒドリル−スルフヒドリル架橋剤である。したがって、１：１のモル比でｗｔＳＯＤ１とＤＴＭＥを含む架橋反応を、室温で１時間実施した。架橋の後、反応を半分に分割し、試料の半分を、ＤＴＴを含む試料緩衝液（還元性）中で実施し、もう半分を、ＤＴＴを含まない試料緩衝液（非還元性）中で実施した。次に、これらの試料を未架橋対照と共に、１５％のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上で分析し、以上の通りにウエスタンブロットに付した。
【００９２】
マトリクス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）−飛行時間質量分析（ＴＯＦ）
ＷｔＳＯＤ１およびＧ９３Ａ  ＳＯＤ１を上述の通りにＤＴＴ処理し、１：１のモル比で架橋した。ｗｔＳＯＤ１は前述の全ての架橋剤で架橋されたが、一方Ｇ９３Ａは、ＤＴＭＥおよびビス（マレイミド）エタン（ＢＭＯＥ、スペーサーアーム８．０Å（０．８ｎｍ））で架橋された。ＢＭＯＥを使用したのは、そのスペーサーアームの長さが比較的短いからであった。架橋の後、１μｌの試料を、１μｌのマトリクス、２０ｍｇ／ｍＬのシニピン酸を含むＭＡＬＤＩ標的上でスポッティングし、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ上で分析した。ＭＡＬＤＩは、毎回、高分子量タンパク質較正標準Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｉ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いて較正した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを、７２〜９０％の間のレーザー出力を用いて線形モードで作動させた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルは、架橋されたものについてのものであり、未架橋試料は、ＦｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いて分析した。トリプリケートで反復した。
【００９３】
液体クロマトグラフィ（ＬＣ）−フーリエ変換質量分析計（ＦＴＭＳ）およびファンネルスキマー解離（ＦＳＤ）
前述の通り、１：１のモル比（５μＭ：５μＭ）でＤＭＴＥまたはＢＭＯＥを使用してＧ９３Ａを架橋させた。１時間後、３％のアセトニトリルおよび１％のギ酸を試料に加え、１４，０００ＲＰＭで１０分間回転させて、沈殿したタンパク質を全てペレット化した。架橋した試料をオートサンプラ内に入れ、３０分間３〜５０％Ｂ、７分間５０〜９５％Ｂ、５分間９５％Ｂ、１分間９５〜３％Ｂそして１５分間３％Ｂという勾配で、Ｐｒｏｘｅｏｎ  １Ｄ  ＨＰＬＣまたはＥｋｓｉｇｅｎｔ  ２Ｄ  ＵＰＬＣのいずれかの中に１μＬの架橋した試料を吸引させた。緩衝液Ａは、０．１％のギ酸を伴うＨＰＬＣ水であり、緩衝液Ｂは１００％のアセトニトリル、０．１％のギ酸である。液体クロマトグラフィの後、試料を、ナノスプレーイオン化を用いてイオン化し、９４Ｔｅｓｌａ  Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  ＦＴＭＳを用いて分析した。ＦＴＭＳを、Ａｐｅｘ制御ソフトウェアを用いて制御し、Ａｐｏｌｌｏ  ＩＩソフトウェアを用いてソースパラメータを制御した。３５〜４０Ｖのスキマー１電圧を用いてスペクトル（モノマーおよびダイマーＧ９３Ａ）を収集し、一方、スキマー１の電圧を１４０Ｖに上昇させることにより架橋済みＧ９３Ａを断片化するためにファンネルスキマー解離を使用した。架橋されたおよび未架橋のＧ９３ＡのＬＣ−ＦＴＭＳデータを、Ｄａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いて分析した。これらの実験をトリプリケートで反復した。
【００９４】
ＬＣ−ＦＴＭＳを用いたペプチド配列決定（ボトムアップ分析）
前述の通りに、１：１のモル比（５μＭ：５μＭ）でＢＭＯＥを用いてＧ８５Ｒを架橋した。１時間後、架橋されたタンパク質を９９℃で３０分間加熱し、次に１０ｍＭのＴＣＥＰで１０分間インキュベートした。その後、加熱し還元した架橋済みＧ８５Ｒを３０℃で一晩、１．５μＬの０．５ｍｇ／ｍＬのＧｌｕ−Ｃと共にインキュベートした。消化した試料を１４，０００ＲＰＭで１０分間回転させて、次に上記の勾配を用いてＥｋｓｉｇｅｎｔ  ＵＰＬＣ内に注入した。液体クロマトグラフィの後、ナノスプレーイオン化を用いて試料を導入し、ＣＩＤを用いてＭＳ／ＭＳデータを収集した。Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて化合物を同定し、デコンボリューションに付し、包括的マスコットファイルにエキスポートした。１．２Ｄａ（ＭＳ許容誤差）および０．６Ｄａ（ＭＳ／ＭＳ許容誤差）で、ＮＣＢＩｒデータベースを用いて、酵素として無しを選択するＭＡＳＣＯＴ検索エンジン内に包括的マスコットファイルをアップロードすることによって、架橋済みおよび未架橋分析を実施した。未架橋および架橋済み試料についてのＭＡＳＣＯＴ検索を比較し、架橋済み試料内では同定されたものの未架橋試料内では同定されなかったｍ／ｚを、架橋剤（２２０．０５Ｄａ）としてＢＭＯＥを用いてＭＳ  Ｂｒｉｄｇｅ（タンパク質プロスペクター、ＵＣＳＦ）検索に付した。ＭＳ  Ｂｒｉｄｇｅは、架橋済みペプチドの潜在的分子量全てに架橋剤の分子量に加えたものを検索する。架橋済みに関与するものとしてＭＳ  Ｂｒｉｄｇｅ検索から同定されたペプチドを、データ分析ソフトウェア内で抽出イオンクロマトグラムによりさらに特徴づけした。
【００９５】
金属分析
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｌａｂ（Ａｔｈｅｎｓ、ＧＡ）において、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）を用いて金属分析を実施した。簡単に言うと、各バリアント１μＭと共に、ブランクとしての分析のために単独緩衝液を送った。分析はトリプリケートで反復した。さらに、各バリアント５μＭを、直接注入法（ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ）を用いてＥＳＩモードでＦＴＭＳを使用して分析した。
【００９６】
熱蛍光安定性検定
溶融温度の上昇がタンパク質安定性の結合および増加を示唆するＧ９３ＡおよびＧ８５Ｒ  ＳＯＤ１の溶融曲線を、ＤＴＭＥまたはＢＭＯＥおよび余剰の銅および亜鉛の両方の存在下または不在下で監視した。したがって、タンパク質の安定性に対するＤＭＳＯの効果を判定するために、２〜４％のＤＭＳＯの存在下で、架橋剤（これはＤＭＳＯ中に再懸濁している）または銅および亜鉛の不在下で、タンパク質試料を分析した。最初の反応シーケンスにおいては、０〜２０μＭの増大する濃度のＤＴＭＥまたはＢＭＯＥと共に１０μＭの変異体ＳＯＤ１をインキュベートし、２０Ｘ  ＳＹＰＲＯ（商標）Ｏｒａｎｇｅと共にインキュベートし、９６ウェル平板に加えた。あるいは、第２の反応シーケンスでは、１０μＭの変異体ＳＯＤ１を２０μＭの銅、２０μＭの亜鉛そして０〜２０μＭのＢＭＯＥまたはＤＴＭＥと共にインキュベートした。タンパク質の溶融温度を、毎分０．３℃の温度上昇で２５〜１００℃の間、ＲＴ−ＰＣＲマシン（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて監視した。それぞれのウェル各々から染料単独のブランクをサブトラクトすることによってデータを分析し、１に正規化し、折り畳み不良タンパク質の画分に対する温度の関係をグラフにした。ＤＴＭＥまたはＢＭＯＥ、銅、亜鉛、染料ブランクのサブトラクションにより、染料単独のブランクのサブトラクションと類似の結果が得られた。トリプリケートで反復した。
【００９７】
ＳＯＤ１活性検定
ニトロブル−テトラゾリウム（ＮＢＴ）ゲルベースの検定を用いて、ＳＯＤ１活性を監視した（６９−７２）。８０μＭの銅および亜鉛および／または４２μＭのＢＭＯＥの存在下または不在下で、１０μｇ（約４２μＭ）のｗｔまたは変異体ＳＯＤ１をインキュベートし、次に１２．５％のポリアクリルアミドゲル上で分析した。あるいは、８０μＭの銅および亜鉛および／または４２μＭのＤＴＭＥの存在下または不在下で、１０μｇ（約４２μＭ）のｗｔまたは変異体ＳＯＤ１をインキュベートした。ＤＴＭＥで架橋された試料を二分し、ここで半分を１０ｍＭのＴＣＥＰでインキュベートし、残りの半分はインキュベートせずに、その後１２．５％のポリアクリルアミドゲル上で分析した。５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．８、ＮＢＴ１錠（１０ｍｇ／錠）および０．１ｍｇ／ｍＬのリボフラボンを含む溶液を用いて、ゲルを４５分間暗所で染色した。４５分のインキュベーションの後、１μＬ／ｍＬのＴＥＭＥＤを添加し、ゲルを２分間光に曝露した。スーパーオキシドラジカルが、ＮＢＴから不溶性ブルーホルマゾンを形成させる。ＳＯＤ１はスーパーオキシドを除去して青色形成を阻害することから、ＳＯＤ１の活性は、無色のバンドとして見える。トリプリケートで反復した。
【００９８】
結果
ダイマーＳＯＤ１を安定化させるための外因性マレイミド官能基架橋剤を用いた架橋
８〜１４Ａの範囲内の鎖長を有する被験マレイミド架橋剤は全て、ジチオ−ビスマレイミドエタン（ＤＴＭＥ、スペーサーアーム１３．３Å）、１，４−ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ、スペーサーアーム１０．２Å）、１，８−ビス−マレイミドジエチレングリコール（ＢＭ（ＰＥＧ）２、スペーサーアーム１４．７Å）、１，４ビスマレイミドブタン（ＢＭＢ、スペーサーアーム１０．９Å）およびトリス［２−マレイミドエチル］アミオン（ＴＭＥＡ、１０．３Å）を含めたＳＯＤ１ダイマーの安定化を結果としてもたらした（図１２）。あるいは、試験した１つのビニルスルホン、１，６−ヘキサノール−ビス−ビニルスルホン（ＨＢＶＳ、スペーサーアーム１４．７Å）は、結果としてダイマーＳＯＤ１を形成しなかった（図１２）。
【００９９】
架橋剤の化学量論を調査するために本出願人らは、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）−フーリエ変換質量分析法（ＦＴＭＳ）を用いて、架橋済み（ＤＴＭＥまたはＢＭＯＥ）のＧ９３Ａバリアントと未架橋のＧ９３Ａバリアントの分子量を比較した。モノマー未架橋種についての実験上の分子量は、１５８５１．０５５Ｄａであると判定され（理論値１５８５０．８８９Ｄａ）、ダイマー架橋された種についての実験上の分子量は３２０１３．９０４Ｄａであると判定された（２つのＧ９３Ａモノマーの分子量の理論値に１つのＤＴＭＥ（３１２．３７Ｄａ）を加えたものとは０．２４４Ｄａの差異）。ダイマーＤＴＭＥ架橋済みＧ９３Ａの実験上の分子量、３２０１３．９０４Ｄａは、１当量の架橋剤が１当量のダイマーを産生し（図８）、このことは２つのモノマーに対する単一の架橋剤の結合と整合性をもつということを示唆している。Ｇ９３ＡおよびＢＭＯＥ架橋についても類似の結果が得られた（データ示さず）。
【０１００】
架橋剤を触媒とする反応の発生を排除するため、還元的に不安定な架橋剤ＤＴＭＥを使用し、ウエスタンブロット法を用いて架橋を監視した。ＤＴＭＥを使用した架橋の結果ダイマーＳＯＤ１がもたらされたが、還元剤の存在下ではモノマーのみが観察され（図８Ｅ）、ＳＯＤ１ダイマーの形成が特異的に、結合された化学的架橋剤に起因していたことを示唆していた。
【０１０１】
チオール−ジスルフィド交換を媒介にしたＳＯＤ１ダイマーの安定化
ＤＴＭＥで架橋されたＧ９３Ａバリアント（前駆体イオン）のファンネルスキマー解離（ＦＳＤ）を用いた無傷のＳＯＤ１の質量およびＭＳ／ＭＳ断片化データから、ＳＯＤ１を架橋するための独特の反応機序であるチオール−ジスルフィド交換が明らかになった（図１３）。第１に、無傷のＳＯＤ１および１／２のＤＴＭＥを伴うＳＯＤ１は、液体クロマトグラフィのランにおいて異なる保持時間で溶離し、それらが唯一の種でありしたがってＤＴＭＥのジスルフィドにおける断片化の可能性が排除されることを示唆している。第２に、断片化は、架橋の部位で優先的に発生する。半分のＤＴＭＥにより修飾された種は、ＤＴＭＥのスペーサー内部のスルフヒドリル−スルフヒドリル結合とＧ９３Ａ上のシステイン残基のチオール部分との間で交換が起こったことを示唆している。最終的に、チオール−ジスルフィド交換の可能性は、ＳＯＤ１構造のダイマー界面、具体的にはＣｙｓ１１１においてＤＴＭＥの半分をモデル化することによってさらに確認された（（２Ｃ９Ｖ（Ｓｔｒａｎｇｅ、２００６＃９５）））（図７）。こうして、本出願人らは、数多くの分子（図１２）および２つの全く異なる反応機序、すなわちマレイミド（図８、図１１および図１２）およびチオール−ジスルフィド交換（図１３）を用いて（ペプチドベースの治療戦略のためには後者が適している）効率良くＳＯＤ１モノマーを架橋することができた。
【０１０２】
Ｃｙｓ１１１が化学的架橋部位である
架橋部位を同定するために、本出願人らは、未架橋試料と架橋済み試料について、消化されたペプチドの配列データを提供するタンパク質分解およびＬＣ−ＦＴＭＳ／ＭＳデータを比較した（図１４）。ＷＴおよびＧ９３Ａ  ＳＯＤ１のプロテアーゼ耐性がおそらくは金属結合および分子内ジスルフィド結合を介して付与されていることから、プロテアーゼ耐性が比較的低いＧ８５Ｒバリアントが使用された。ｍ／ｚ４８７．７９０（Ｍｒ９７３．５６３；残基１〜９、アセチル化Ｎ末端）は両方の試料中で観察され、未架橋試料と架橋済み試料におけるペプチドの類似の強度を浮彫りにする陽性対照として提示されている。本出願人らは、５２３２．６７４（ｍ／ｚ８７３．１２０）および５３４７．７００（ｍ／ｚ８９２．２９１）という、架橋済み試料内にはあるものの未変性試料内には無い２つのＭｒを観察した。ＭＳ−Ｂｒｉｄｇｅは、それぞれ架橋（ＢＭＯＥを介して第２のモノマーの残基１０３〜１２６に架橋された１つのモノマーの残基１０３〜１２５）および（ＢＭＯＥにより第２のモノマーの残基１０３〜１２６に架橋された１つのモノマーの残基１０３〜１２６）に関与しているものとして５２３２．６７４および５３４７．７４０の両方を同定した。５２３２．６７４についての予測された架橋は、６．１９ｐｐｍの精度を有し、一方５３４７．７００は、５．８８ｐｐｍの精度を有していた。したがって、質量分析法では、架橋が化学量論的であり主としてＣｙｓ１１１を通して発生したこと、そして他のＳＯＤ１システイン残基Ｃｙｓ６、Ｃｙｓ５７およびＣｙｓ１４６との交叉反応が比較的低いものであったことが確認された（図１４）。注目すべきことに、架橋の複雑さに起因して、架橋されたペプチドの前駆体イオン断片化が欠如していた。
【０１０３】
化学的架橋がＧ９３ＡおよびＧ８５Ｒダイマーを安定化させる
Ｓｙｐｒｏ  ｏｒａｎｇｅは、タンパク質が変性されるにつれて露呈状態となる疎水性パッチに優先的に結合する。温度の関数としてのＳｙｐｒｏ  ｏｒａｎｇｅ結合を監視する蛍光ベースの検定を用いて、Ｇ９３ＡとＧ８５Ｒの両方の変性温度の傾向を観察した。この検定は、おそらくはＳＯＤ１の凝集の結果として可逆的でなく、変性温度は以前に観察されたＳＯＤ１の溶融温度に似ているものの、適切な熱力学的安定性を示さない。ＷＴ  ＳＯＤ１は、その溶融温度が検出限界（約１００℃）にあることから、この検定を用いて監視できなかった。本出願人らは、分析した２つの変異体の安定性の空前の増加を観察した（図９および図１５）。例えばＧ９３Ａ  ＳＯＤ１は約２０℃までに安定化し；余剰の銅および亜鉛とのインキュベーションはＧ９３Ａの安定性に対し一切影響を及ぼさず；架橋剤の濃度が低くなると、Ｇ９３Ａの安定性に対しさらに大きい効果が及ぼされた。一方、Ｇ８５Ｒ  ＳＯＤ１は、余剰の銅および亜鉛の存在下において約２０℃で安定化し；銅、亜鉛および架橋剤の存在下において約４５℃（約４０℃〜８５℃）でさらに増大し、架橋剤の濃度が高くなると、Ｇ８５Ｒの安定性にさらに大きい効果がもたらされた。したがって、ここで、本質的に（共有の）薬理学的シャペロンであるものによって達成される安定化度は、本出願人らの知るかぎりいずれの疾病関連タンパク質に関してもＳＯＤ１についてこれまで達成された最高のものである。
【０１０４】
ｆＡＬＳバリアントＳ８５Ｒ  ＳＯＤ１の活性はＳＯＤ１ダイマーを安定化することによって回復される
安定性に加えて、本出願人らは、ゲルベースの検定を用いて、化学的架橋がＳＯＤ１活性に対して及ぼす影響を調査した。ＷＴおよびＧ９３Ａ  ＳＯＤ１活性は、銅、亜鉛または化学的架橋の添加により影響されなかった。しかしながら、Ｇ８５Ｒ  ＳＯＤ１の熱安定性を増大させることに加えて、化学的架橋は、その定性的金属結合親和力を増大させ、その結果として、Ｇ８５Ｒ  ＳＯＤ１を、試験管内および生体内で触媒不活性であるタンパク質から、試験管内でそして潜在的には生体内でも活性であるタンパク質へと変換させた（図１０）。ＤＴＭＥ架橋中に観察されたＧ８５Ｒ活性の増大は、ＴＣＥＰを用いたＤＴＭＥの内部ジスルフィド結合の分割時点で逆転した（図１６）。したがって、Ｇ８５Ｒ  ＳＯＤ１の熱安定性の改善に加えて、これらの化合物は、酸化的ストレスに対する生命体の耐性を増大させる潜在的可能性を有し、本出願人らのアプローチは他の機能喪失疾患について考慮されてもよい。
【０１０５】
ＳＯＤ１の金属含有量が、ＳＯＤ１の安定化において１つの役割を果たす
単離されたままのＷＴ、Ｇ９３ＡおよびＧ８５Ｒ  ＳＯＤ１の金属含有量は誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）を用いて決定され、これらは補足的表１の中に列挙されている。すなわち、単離されたままのＷＴ  ＳＯＤ１はモノマー１個あたりおよそ２個の銅および亜鉛分子を含み、単離されたままのＧ９３Ａは、モノマー１個あたり１個の銅分子と１．５個の亜鉛分子を含み、Ｇ８５Ｒはモノマー１個あたり１個未満の銅と１．５個の亜鉛を含んでいた。これらのデータから、ＷＴおよびＧ９３Ａ  ＳＯＤ１は金属を十分に含み、さらに幾分かの偶発的な（非活性部位）金属結合が発生していたように思われる。したがって本出願人らは、ＦＴＭＳを用いて金属含有量も同様に分析し、脱溶媒和プロセスが大部分の偶発的な金属を除去する傾向をもつことを観察した。すなわち、単離されたままのＷＴ  ＳＯＤ１は、完全に金属化されているように思われ、単離されたままのＧ９３Ａ  ＳＯＤ１は約９５％金属化されているように思われ、単離されたままのＧ８５Ｒ  ＳＯＤ１は部分的に金属化され、金属化されていないまたは一価金属化（ｓｉｎｇｌｙ  ｍｅｔａｌｌａｔｅｄ）された画分のさらに大きい集団で約７０％が金属化されていると思われた。これらのデータによって、Ｇ８５Ｒの集団がより大きい割合の部分金属化形態および未金属化形態で構成されていることを理由として、Ｇ９３Ａ試料の場合に比べてＧ８５Ｒ試料に対し外因性金属が添加された場合に観察された安定性の増大の説明がつくかもしれない。
【０１０６】
参照による援用
本明細書中で引用されている全ての米国特許および米国公開特許出願は、本明細書に参照により援用される。
【０１０７】
均等物
当業者であれば、本明細書中で記述された本発明の具体的実施形態に対する数多くの均等物を認識し、日常的なものにすぎない実験を用いてそれらを確認できるものである。このような均等物は、以下のクレームにより包含されるように意図されている。
【図１】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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