(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的にまたは予防的に有効量の、抗体模倣体（免疫グロブリン様）及び医薬に許容できる担体を含む医薬組成物であって、
前記抗体模倣体は、HIV糖タンパク質上のエピトープに特異的に結合するデンプン結合ドメイン(SBD)を含み、前記SBDがCBMファミリー20またはCBMファミリー21であり、前記SBDがRhizopus oryzae glucoamylase （グルコアミラーゼ）(RoSBD)またはAspergillus niger glucoamylase （グルコアミラーゼ）(AnSBD)に由来する、医薬組成物。
【請求項２】
予防的または治療的なHIV感染の阻害用の、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
SBDがHIV糖タンパク質のエピトープに存在するグリカン構造に特異的に結合する、請求項1または2に記載の組成物。
【請求項４】
前記グリカン構造が、マンノースが豊富なグリカン構造である、請求項3に記載の組成物。
【請求項５】
前記グリカン構造が、N結合型高マンノースグリカンMan9GlcNAc2である、請求項3に記載の組成物。
【請求項６】
HIV糖タンパク質がHIV1-gp120である、請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
錠剤、カプセルまたは懸濁液の形態にある、請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
サンプルに、抗体模倣体（免疫グロブリン様）を添加する工程；及び抗体とサンプルとの間の結合反応を検出する工程を含む、サンプルのHIVを検出するin vitro方法であって、
前記抗体模倣体は、HIV糖タンパク質上のエピトープに特異的に結合するデンプン結合ドメイン(SBD)を含み、前記SBDがCBMファミリー20またはCBMファミリー21であり、前記SBDがRhizopus oryzae glucoamylase （グルコアミラーゼ）(RoSBD)またはAspergillus niger glucoamylase （グルコアミラーゼ）(AnSBD)に由来する、方法。
【請求項９】
SBDが糖タンパク質のエピトープに存在するグリカン構造に特異的に結合する、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記グリカン構造が、マンノースが豊富なグリカン構造である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記グリカン構造が、N結合型高マンノースグリカンMan9GlcNAc2である、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
糖タンパク質がHIV1-gp120である、請求項8から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
サンプルがヒトから単離される、請求項8から12のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HIV糖タンパク質上のエピトープに特異的に結合する炭水化物結合モジュール(CBM)の抗体模倣体に関する。本発明は、また、HIV活性の阻害方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)は、後天性免疫不全症候群(AIDS)を引き起こすことで知られ、HIVは素早い遺伝的浮動を示すため、幅広く分岐した株が出現している。従って、種々の株の検出及び処置は難易度が高く困難であることがわかっている。
【０００３】
また、持続的な衰えることのない流行のために、HIVの伝染を制限するための効果的な予防的ワクチン及び他の治療上の戦略を開発する差し迫った必要性が存在する。最も成功しているワクチンは、弱毒化または不活性化させたウイルス粒子のいずれかから構成される。しかしながら、HIV関連類人猿(simian)免疫不全ウイルスの弱毒化は、ヒトにおける試験を解決困難にさせる安全上の懸念を生じさせ、結果としての病原性を達成することなく防御反応を招く。また、HIVは多くの精緻な機構を有することにより、エンベロープ糖タンパク質を対象とする抗体反応を効率よく回避し、それには、グリカン遮蔽による非常に保存された構造の包囲、及び立体配座や立体構造の制約による脆弱な受容体結合部位のマスキングが含まれる。従って、抗体を得る手段として、研究は、エンベロープ糖タンパク質ベースの免疫源へと向った。糖タンパク質120（gp120）は、HIV-1のエンベロープスパイクの重要な成分である。gp120の内部ドメインはgp41と相互作用し、その外部ドメインはかなり変化しやすく、高度にグリコシル化されている（Kwong, P.D. et al. Structure of an HIV gp120 envelope glycoprotein in complex with the CD4 receptor and a neutralizing human antibody. Nature 393, 648-659 (1998))。配列の比較解析に基づいて、gp120は5つの保存セグメント(C1からC5)及び5つの可変領域(V1からV5)に分けられる（Willey, R.L. et al. Identification of conserved and divergent domains within the envelope gene of the acquired immunodeficiency syndrome retrovirus. Proc Natl Acad Sci U S A 83, 5038-5042 (1986)及びModrow, S. et al. Computer-assisted analysis of envelope protein sequences of seven human immunodeficiency virus isolates: prediction of antigenic epitopes in conserved and variable regions. J Virol 61, 570-578 (1987)）。C1及びC5領域はgp41とのgp120の接触に関する主要な領域を提供し(Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C. & Sodroski, J. Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein. J Virol 65, 2119-2123 (1991))、その他の保存領域(C2からC4)は、gp120分子内に疎水性コアを形成し（Moore, J.P., Sattentau, Q.J., Wyatt, R. & Sodroski, J. Probing the structure of the human immunodeficiency virus surface glycoprotein gp120 with a panel of monoclonal antibodies. J Virol 68, 469-484 (1994)及びMoore, J.P., Willey, R.L., Lewis, G.K., Robinson, J. & Sodroski, J. Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J Virol 68, 6836-6847 (1994)）、可変領域V1〜V3は、単量体gp120の表面に暴露され、CD4に対する抗体の認識かつ結合部位に関する主要なエピトープを有する（Chen, L. et al. Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120. Science 326, 1123-1127 (2009)、 Moore, J.P. & Sodroski, J. Antibody cross-competition analysis of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 exterior envelope glycoprotein. J Virol 70, 1863-1872 (1996)、Pollard, S.R., Rosa, M.D., Rosa, J.J. & Wiley, D.C. Truncated variants of gp120 bind CD4 with high affinity and suggest a minimum CD4 binding region. EMBO J 11, 585-591 (1992)及びOlshevsky, U. et al. Identification of individual human 0immunodeficiency virus type 1 gp120 amino acids important for CD4 receptor binding. J Virol 64, 5701-5707 (1990))。
【０００４】
現在、47事例のHIVを認識する中和モノクローナル抗体(mAb)が米国でフェーズIまたはIIの臨床試験に入っている。それらのうち、ヒトmAbである2F5、4E10及び2G12のHIV-1のエンベロープ糖タンパク質の認識がよく特徴づけされている（Armbruster, C. et al. A phase I trial with two human monoclonal antibodies (hMAb 2F5, 2G12) against HIV-1. AIDS 16, 227-233 (2002)及びStiegler, G. et al. Antiviral activity of the neutralizing antibodies 2F5 and 2G12 in asymptomatic HIV-1-infected humans: a phase I evaluation. AIDS 16, 2019-2025 (2002))。これらの抗体の多くは、gp120の領域を主に標的にし、gp120は、ウイルス表面上の抗体の成熟した三量体型で塞がれる（Zwick, M.B. & Burton, D.R. HIV-1 neutralization: mechanisms and relevance to vaccine design. Curr HIV Res 5, 608-624 (2007)及びKrauss, I.J. et al. Fully synthetic carbohydrate HIV antigens designed on the logic of the 2G12 antibody. J Am Chem Soc 129, 11042-11044 (2007)）。gp120の残りの暴露された面は、N結合型高マンノースグリカンMan9-GlcNAc (M9)で高度にグリコシル化されており、そのような「免疫的に沈黙している(immunologically silent)」領域に結合することが成功している抗体はほとんど単離されていない。しかしながら、ヒトmAb 2G12は、HIV-1のクレードA及びBに対して中和活性を保有することが報告され（Trkola, A. et al. Human monoclonal antibody 2G12 define
s a distinctive neutralization epitope on the gp120 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J Virol 70, 1100-1108 (1996)）、HIV-1 gp120の「サイレント面（silent face）」上のエピトープに結合する。部位特異的突然変異誘発法を採用したアラニンスキャニング研究は、エピトープが、gp120上の残基N295, N332, N386, N392, N397及びN448の高マンノースまたはハイブリッドグリカンの構造の大部分を覆うことを示し(Sanders, R.W. et al. The mannose-dependent epitope for neutralizing antibody 2G12 on human immunodeficiency virus type 1 glycoprotein gp120. J Virol 76, 7293-7305 (2002)及びScanlan, C.N. et al. The broadly neutralizing anti-human immunodeficiency virus type 1 antibody 2G12 recognizes a cluster of alpha1-->2 mannose residues on the outer face of gp120. J Virol 76, 7306-7321 (2002))、アミノ酸側鎖の特定の立体配座を認識する大部分の抗体とは異なる。従って、2G12は、炭水化物のエピトープの認識に基づいて、広範なHIV中和抗体へと変わり得る可能性が存在する。
【０００５】
2G12 (PDB ID: 1ZLS)及びオリゴ糖M9とのその複合体(PDB ID: 1OP5)の結晶構造により、2つのFabが集合してVHドメインスワップダイマー(swapped dimmer)となり、VHドメインは、gp120上の、N結合型M9、特にテトラマンノースManα(1,2)Manα(1,2)Manα(1,3)Manα(Man4)部分を含むD1アームと直接相互作用する2G12の重鎖上に位置することが判明した。さらに、gp120上の2G12認識部位の分子モデリングは、N332, N339及びN392上のN結合型グリカンが2G12結合に関して決定的であることを示している（Calarese, D.A. et al. Antibody domain exchange is an immunological solution to carbohydrate cluster recognition. Science 300, 2065-2071 (2003)）。合成オリゴ糖Man4及びMan9は、gp120と2G12との間の結合を阻害できたので、これらオリゴマンノースデンドレオン(dendrion)が潜在的なHIV1中和剤として同定された。さらに、複数のHIV mAbのIC50中和プロファイルにより、2G12の中和抗体が中程度(moderate)であることが明らかにされている(Binley, J.M. et al. Comprehensive cross-clade neutralization analysis of a panel of anti-human immunodeficiency virus type 1 monoclonal antibodies. J Virol 78, 13232-13252 (2004))。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kwong, P.D. et al. Structure of an HIV gp120 envelope glycoprotein in complex with the CD4 receptor and a neutralizing human antibody. Nature 393, 648-659 (1998)
【非特許文献２】Willey, R.L. et al. Identification of conserved and divergent domains within the envelope gene of the acquired immunodeficiency syndrome retrovirus. Proc Natl Acad Sci U S A 83, 5038-5042 (1986)
【非特許文献３】Modrow, S. et al. Computer-assisted analysis of envelope protein sequences of seven human immunodeficiency virus isolates: prediction of antigenic epitopes in conserved and variable regions. J Virol 61, 570-578 (1987)
【非特許文献４】Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C. & Sodroski, J. Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein. J Virol 65, 2119-2123 (1991)
【非特許文献５】Moore, J.P., Sattentau, Q.J., Wyatt, R. & Sodroski, J. Probing the structure of the human immunodeficiency virus surface glycoprotein gp120 with a panel of monoclonal antibodies. J Virol 68, 469-484 (1994)
【非特許文献６】Moore, J.P., Willey, R.L., Lewis, G.K., Robinson, J. & Sodroski, J. Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J Virol 68, 6836-6847 (1994)
【非特許文献７】Chen, L. et al. Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120. Science 326, 1123-1127 (2009)
【非特許文献８】Moore, J.P. & Sodroski, J. Antibody cross-competition analysis of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 exterior envelope glycoprotein. J Virol 70, 1863-1872 (1996)
【非特許文献９】Pollard, S.R., Rosa, M.D., Rosa, J.J. & Wiley, D.C. Truncated variants of gp120 bind CD4 with high affinity and suggest a minimum CD4 binding region. EMBO J 11, 585-591 (1992)
【非特許文献１０】Olshevsky, U. et al. Identification of individual human 0immunodeficiency virus type 1 gp120 amino acids important for CD4 receptor binding. J Virol 64, 5701-5707 (1990))
【非特許文献１１】Armbruster, C. et al. A phase I trial with two human monoclonal antibodies (hMAb 2F5, 2G12) against HIV-1. AIDS 16, 227-233 (2002)
【非特許文献１２】Stiegler, G. et al. Antiviral activity of the neutralizing antibodies 2F5 and 2G12 in asymptomatic HIV-1-infected humans: a phase I evaluation. AIDS 16, 2019-2025 (2002)
【非特許文献１３】Zwick, M.B. & Burton, D.R. HIV-1 neutralization: mechanisms and relevance to vaccine design. Curr HIV Res 5, 608-624 (2007)
【非特許文献１４】Krauss, I.J. et al. Fully synthetic carbohydrate HIV antigens designed on the logic of the 2G12 antibody. J Am Chem Soc 129, 11042-11044 (2007)
【非特許文献１５】Trkola, A. et al. Human monoclonal antibody 2G12 defines a distinctive neutralization epitope on the gp120 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J Virol 70, 1100-1108 (1996)
【非特許文献１６】Sanders, R.W. et al. The mannose-dependent epitope for neutralizing antibody 2G12 on human immunodeficiency virus type 1 glycoprotein gp120. J Virol 76, 7293-7305 (2002)
【非特許文献１７】Scanlan, C.N. et al. The broadly neutralizing anti-human immunodeficiency virus type 1 antibody 2G12 recognizes a cluster of alpha1-->2 mannose residues on the outer face of gp120. J Virol 76, 7306-7321 (2002)
【非特許文献１８】Calarese, D.A. et al. Antibody domain exchange is an immunological solution to carbohydrate cluster recognition. Science 300, 2065-2071 (2003)
【非特許文献１９】Binley, J.M. et al. Comprehensive cross-clade neutralization analysis of a panel of anti-human immunodeficiency virus type 1 monoclonal antibodies. J Virol 78, 13232-13252 (2004)
【非特許文献２０】Christiansen, C. et al. The carbohydrate-binding module family 20--diversity, structure, and function. FEBS J 276, 5006-5029 (2009)
【非特許文献２１】Cantarel, B.L. et al. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nucleic Acids Res 37, D233-238 (2009)
【非特許文献２２】Cuff, J.A., Clamp, M.E., Siddiqui, A.S., Finlay, M. & Barton, G.J. JPred: a consensus secondary structure prediction server. Bioinformatics 14, 892-893 (1998)
【非特許文献２３】Holm, L., Kaariainen, S., Rosenstrom, P. & Schenkel, A. Searching protein structure databases with DaliLite v.3. Bioinformatics 24, 2780-2781 (2008)
【非特許文献２４】Tung, J.Y. et al. Crystal structures of the starch-binding domain from Rhizopus oryzae glucoamylase reveal a polysaccharide-binding path. Biochem J 416, 27-36 (2008)
【非特許文献２５】Chou, W.I., Pai, T.W., Liu, S.H., Hsiung, B.K. & Chang, M.D. The family 21 carbohydrate-binding module of glucoamylase from Rhizopus oryzae consists of two sites playing distinct roles in ligand binding. Biochem J 396, 469-477 (2006)
【非特許文献２６】Lin, S.C. et al. CBM21 starch-binding domain: a new purification tag for recombinant protein engineering. Protein Expr Purif 65, 261-266 (2009)
【非特許文献２７】Raman, R. et al. Advancing glycomics: implementation strategies at the consortium for functional glycomics. Glycobiology 16, 82R-90R (2006)
【非特許文献２８】Oda, Y. et al. Crocus sativus lectin recognizes Man3GlcNAc in the N-glycan core structure. J Biol Chem 275, 26772-26779 (2000)
【非特許文献２９】Korchagina, E.Y. et al. Design of the blood group AB glycotope. Glycoconj J 22, 127-133 (2005)
【非特許文献３０】Wang, J., Li, H., Zou, G. & Wang, L.X. Novel template-assembled oligosaccharide clusters as epitope mimics for HIV-neutralizing antibody 2G12. Design, synthesis, and antibody binding study. Org Biomol Chem 5, 1529-1540 (2007)
【非特許文献３１】Ji, X., Gewurz, H. & Spear, G.T. Mannose binding lectin (MBL) and HIV. Mol Immunol 42, 145-152 (2005)
【非特許文献３２】Liu, W.T. et al. Identification and characterization of a novel fibril forming peptide in fungal starch binding domain. Biochem Biophys Res Commun 377, 966-970 (2008)
【非特許文献３３】Hong C. Y, W.C.C., Chiu Y. C, Yang S.Y, Horng H.E, and Yang H.C. Magnetic susceptibility reduction method for magnetically labeled immunoassay. Applied Physics Letters 88, 21252 (2006)
【非特許文献３４】Emau, P. et al. Griffithsin, a potent HIV entry inhibitor, is an excellent candidate for anti-HIV microbicide. J Med Primatol 36, 244-253 (2007)
【非特許文献３５】Fromme, R. et al. A monovalent mutant of cyanovirin-N provides insight into the role of multiple interactions with gp120 for antiviral activity. Biochemistry 46, 9199-9207 (2007)
【非特許文献３６】Calarese, D.A. et al. Dissection of the carbohydrate specificity of the broadly neutralizing anti-HIV-1 antibody 2G12. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 13372-13377 (2005）
【非特許文献３７】Tung, J.Y. et al. Crystal structures of the starch-binding domain from Rhizopus oryzae glucoamylase reveal a polysaccharide-binding path. Biochem J 416, 27-36 (2008)
【非特許文献３８】di Marzo Veronese, F. et al. Monoclonal antibodies specific for p24, the major core protein of human T-cell leukemia virus type III. Proc Natl Acad Sci U S A 82, 5199-5202 (1985)
【非特許文献３９】Abd-Elazem, I.S., Chen, H.S., Bates, R.B. & Huang, R.C. Isolation of two highly potent and non-toxic inhibitors of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) integrase from Salvia miltiorrhiza. Antiviral Res 55, 91-106 (2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
タンパク質構造分類データベース(CATH)（Orengo, C.A. et al. CATH--a hierarchic classification of protein domain structures. Structure 5, 1093-1108 (1997)）によると、2G12のVHドメインは、βサンドウィッチ折畳みによる、免疫グロブリン様(Ig-様)構造の特性を有するスーパーファミリー2.60.40.10に分類される。興味深いことに、Aspergillus niger glucoamylaseの粒状デンプン結合ドメイン(SBD)、AnSBD, (PDB ID: 1AC0)が、同じ相同的なスーパーファミリーにおいても同定されている（Christiansen, C. et al. The carbohydrate-binding module family 20--diversity, structure, and function. FEBS J 276, 5006-5029 (2009)）。2G12とかかる炭水化物結合モジュール(CBM)との間の構造類似性は、効果的な検出及び予防的なワクチンとしての共通する機能を暗示し得るものであり、それらは解明可能であるかもしれない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、対象のHIV感染を予防的にまたは治療的に阻害する方法であって、HIV糖タンパク質上のエピトープに特異的に結合する炭水化物結合モジュール(CBM)の抗体模倣体を有効量で対象に投与することを含む方法を提供する。
【０００９】
本発明は、さらに、治療的にまたは予防的に有効量の炭水化物結合モジュールの抗体模倣体及び医薬に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】デンプン結合CBM及び2G12に関する構造、配列及び機能の比較を示す図である。RoSBD（濃い灰色）と、(a)AnSBD(明るい灰色)；(b)2G12 VHドメイン(明るい灰色)及び(c)2G12 VLドメイン（明るい灰色）の構造的な重ね合わせ。(b)のMan4は棒状の表現で示される。(d)Dali重ね合わせの結果に基づいたRoSBD、AnSBD、2G12 VH及び2G12 VLの複数の配列アラインメント。下線を引いた残基はβ鎖領域を示し、ボールド体のアミノ酸はSBDにおけるリガンド結合残基及び2G12 VHドメインにおけるMan4結合部位を示す。(e)100μlのHIV-PC溶液を、100nMヒトIgG12次抗体(2C11), HIV-1 p24 mAb (N29), HIV-1 gp41 mAb (AG10H9), HIV-1 gp120 mAb (ED8.D4), 2G12, RoSBD及びAnSBDで別々に事前にコーティングした96ウェルELIZAプレート中に入れた。HRP共役組換gp120抗原をシグナル検出用に用いた。差は統計的に有意であった(P<0.0001)。
【図２】RoSBD-HIV結合の特異性を示す図である。100μlのHIV-PC、RoSBD mAb及びHCV-PCを一緒に混合し、RoSBDでコーティングしたELISAプレート上にローディングして、37℃で1時間反応させた。検出を、100μlの、(a)HRP共役組換gp120抗原；(b)HRP共役HCV組換抗原；(c)HRP共役HTLV組換抗原または(d)抗マウスIgG HRP共役体の添加により得た。ここで、カットオフ値(COV)を、正常ヒト血清からELISAアッセイにおいて得られる吸光度＋0.1として規定し、最大カットオフ指数(COI)の値を、OD値をCOVで割ることによって計算した。差異は統計的に有意であった(P<0.05)。
【図３】AnSBD-HIV結合の特異性を示す図である。100μlのHIV-PC、RoSBD mAb及びHCV-PCを一緒に混合し、AnSBDでコーティングしたELISAプレート上にローディングして、37℃で1時間反応させた。検出を、100μlの、(a)HRP共役組換gp120抗原；(b)HRP共役HCV組換抗原；(c)HRP共役HTLV抗原または(d)抗マウスIgG HRP共役体の添加により得た。ここで、カットオフ値(COV)を、正常ヒト血清からELISAアッセイにおいて得られる吸光度＋0.1として規定し、最大カットオフ指数(COI)の値を、OD値をCOVで割ることによって計算した。差異は統計的に有意であった(P<0.0001)。
【図４】SBDに対するHIVの競合的結合を示す図である。HIV-PCを、同量の500 nMの、gp140、2G12 mAb、gp120 mAb (ED8.D4)、gp41 mAb (AG10H9)、p24 mAb (N29)、またはヒトIgG1二次抗体(2C11)と1時間、37℃で別々に混合した。混合物を(a) RoSBDまたは(b)AnSBDでコーティングしたプレートに移し、HRP共役組換gp120抗原で検出した。差異は統計的に有意であった(P<0.0001)。
【図５】グリカンの競合的結合を示す図である。HIV-PCを、500μMの、大豆凝集素(SBA)、G7、βCD、またはマンノースのそれぞれ1つと1時間、37℃で混合した。混合物を100 nMの(a)RoSBD及び(b)AnSBDで事前にコーティングしたELISAプレートに移した。HRP共役組換gp120抗原を用いて反応を検出した。差異は統計的に有意であった(P<0.01)。
【図６】mAb及びSBDを用いたHIVの結合プロファイルを示す図である。100μlのHIV-1 発生／有病パフォーマンスパネル(incidence/prevalence performance panel) (PRB601)メンブレンを、100 nMの(a)HIV-1-p24 mAb (N29);(b) HIV-1-gp41 mAb (AG10H9); (c)gp120 mAb (ED8.D4);(d) HIV-1-2G12 mAb; (e) RoSBDまたは(f) AnSBDで事前にコーティングしたELISAプレート上に別々にローディングし、HRP共役組換gp120抗原を用いて反応を検出した。ここで、カットオフ値(COV)を、正常ヒト血清からELISAアッセイにおいて得られる吸光度＋0.1として規定し、最大カットオフ指数(COI)の値を、OD値をCOVで割ることによって計算した。
【図７】HIV-2G12及びHIV-SBD結合プロファイルを示す図である。100μlのHIV-1パフォーマンスパネル(PRB601)メンブレンを、100 nMの(a)2G12、(b)RoSBD及び(c)AnSBDで事前にコーティングした96ウェルELISAプレート中に別々にローディングした。HRP共役組換gp120抗原を用いて反応を検出した。5% BSAを含むPBS (pH7.4)をNCネガティブコントロール(NC)として使用した。カットオフ値(COV)を、正常ヒト血清からELISAアッセイにおいて得られる吸光度＋0.1として規定し、最大カットオフ指数(COI)の値を、OD値をCOVで割ることによって計算した。差異は統計的に有意であった(P<0.0001)。
【図８】RoSBDのグリカン結合活性を示す図である。(a)グリカンのマイクロアッセイ解析を糖鎖科学コンソーシアムのコアH機関(Consortium for Functional Glycomics, Core H facility)で行った。解析に用いた一次抗体は抗RoSBDモノクローナル抗体であり、二次抗体はAlexa Fluor 488共役ヤギ抗マウスIgGであった。(b)PBS (pH7.4)入り60μlの0.7 pM IgG1 (2C11)、HIV-1 gp140、Man4-OR、またはMan9-Asnをガラス管に入れ、そして60μlの磁性剤をガラス管に添加し、磁場減少測定の前に、4℃で15秒間混合した。混合物の磁化率をXacPro-S101リーダーを用いて25℃で測定した。
【図９】合成Man4（6-アミノヘキシルグリコシド Man4-ORとして）及びM9-Asn(SBAより)の構造を示す図である。
【図１０】RoSBDへのMan4結合部位を示す図である。(a) PyMOLを用いて計算されかつ表示される表面電位であって、負電位（赤）及び正電位（青）が示される。左パネル：残基Thr33、Tyr56及びAsp100が標識されたVH-Man4であって、Man4は茶色で示される。右パネル：部位I (Trp47、Tyr83及びTyr94)及び部位II (Tyr32及びPhe58)の主要な結合残基に関して標識してあるRoSBD-G7複合体。G7分子はシアン色で示す。(b) RoSBDへの予測されるMan4結合部位のリボン図である。Man4分子は茶色で示される。左パネル：残基Tyr32、Ser33及びLys34が示される。右パネル：残基Asn29、Tyr32、Lys34、Trp47、Phe58及びAsp68が示される。(c) 野生型及び変異体RoSBDのHIV結合を示す。100μlのHIV-PC溶液を、100 nMの、野生型RoSBDまたは変異体RoSBD N29A, Y32A, S33A, K34A, W47A, F58A, Y83A, Y93A,及びY94Aであらかじめコーティングした96ウェルELISAプレート中にローディングした。HRP共役組換gp120抗原をシグナル検出に用いた。結果をトリプリケート(triplicate)のサンプルの平均±SDで表した。星一つ：p<0.05、星二つ：p<0.01、星三つ：p<0.0001。
【図１１】HIV-1の複製及び細胞の生存に関するRoSBDアミノ酸の効果を示す図である。HIV-1RTMF (AZT耐性ウイルス）を増加させた濃度のRoSBDで処置した。ウイルス複製を8日後にHIV-1 p24抗原ELISAを使用して測定し、阻害に関するIC50値を用量反応曲線から計算した。様々な濃度によるH9細胞生存に関するRoSBDの効果及びMTTアッセイを用いて、H9細胞培養物における細胞毒性を決定した。
【図１２】HIV-1進入(entry)を阻害するための見込まれる戦略を示す図である。(a)標的細胞へのHIV-1の進入は、細胞表面レセプターCD4及びコレセプターCCR-5とのgp120の結合を必要とする。(b)中和mAb 2G12はHIV gp120のCD4結合ドメインを認識することによってHIV-1感染を阻害する。(c)SBD/CBMはHIV-1を認識してHIV-1感染を阻害するために2G12 mAbの模倣体として作用し得る。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、HIV糖タンパク質上のエピトープに特異的に結合する炭水化物結合モジュール(CBM)の抗体模倣体を有効量で対象に投与することを含む、前記対象の、予防的または治療的なHIV感染の阻害方法を提供する。
【００１２】
本明細書で使用される用語「CBM」は、炭水化物結合活性を有するディスクリート(discreet)な折畳み(fold)を有する、炭水化物活性酵素内の、隣接アミノ酸配列を指す。グリコシドヒドロラーゼの一次構造の分類において、炭水化物活性酵素(CAZy)データベース（Cantarel, B.L. et al. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nucleic Acids Res 37, D233-238 (2009)）により、CBMはアミノ酸配列の類似性に基づいて59のファミリーに分類され、かつそれらは多様なリガンド特異性を示し、それには、セルロース、キシラン、キチン、及びデンプン結合などの複数の特異性が含まれる。本発明では、HIV糖タンパク質のエピトープに存在するグリカン構造にCBMは特異的に結合する。好ましい実施態様では、HIV糖タンパク質はgp120であり、グリカンの構造はN結合型高マンノースグリカンMan9-GlcNAc（M9)である。
【００１３】
本明細書で使用される用語「抗体模倣体」は、標的構造に対する結合の観点から抗体と類似の機能を有する物体であるが、その構造が抗体よりも単純であるものを指す。大量の抗体を産生するために、以下の工程が必要となる：(a)培地中で育成する腫瘍細胞に単一の抗体生成細胞を融合させる。生じる細胞はハイブリドーマと呼ばれる。(b)各ハイブリドーマは比較的大量の同一の抗体分子を産生し、(c)ハイブリドーマを培地中で増殖させ、それぞれが同一の抗体分子を産生する細胞集団を産生させることが可能となる。本物の抗体を作成することは骨が折れる作業であり費用もかかる；しかしながら、本発明では、細菌、酵母、昆虫及び哺乳類を含む幅広い宿主の細胞が、動物を用いることなくCBMの抗体模倣体を産生するのに使用可能であり、より単純でかつより経済的である。
【００１４】
本明細書で使用される用語「対象」は、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトに関する。
【００１５】
本発明では、好ましいCBMはデンプン結合ドメイン(SBD)である。本明細書で使用される用語「SBD」は、粒状または可溶性のデンプンに結合可能な機能ドメインを指し、酵素の活性部位で基質の局所濃度を増大させ、デンプン表面の構造をも妨害し得ることによって、デンプン分解活性速度を増大させる。現在のところ、9つのデンプン結合CBMファミリーが存在する：CBM20, CBM21, CBM25, CBM26, CBM34, CBM41, CBM45, CBM48及びCBM53。本発明の好ましい実施態様では、SBDは、それぞれ、Aspergillus niger glucoamylase (AnSBD)及びRhizopus oryzae glucoamylase (RoSBD)に由来する、CBMファミリー20及び21のメンバーである。分子モデリング(Chou, W.I., Pai, T.W., Liu, S.H., Hsiung, B.K. & Chang, M.D. The family 21 carbohydrate-binding module of glucoamylase from Rhizopus oryzae consists of two sites playing distinct roles in ligand binding. Biochem J 396, 469-477 (2006))及び核磁気共鳴(NMR)分光法を用いたRhizopus oryzae glucoamylase (RoSBD)のSBDの構造-機能の関係が同定されている((Liu, Y.N., Lai, Y.T., Chou, W.I., Chang, M.D. & Lyu, P.C. Solution structure of family 21 carbohydrate-binding module from Rhizopus oryzae glucoamylase. Biochem J 403, 21-30 (2007))。さらに、RoSBD上のマルトヘプタオース(G7)及びβ-シクロデキストリン(βCD)の結合部位がX線結晶学により決定されている(Tung, J.Y. et al. Crystal structures of the starch-binding domain fro
m Rhizopus oryzae glucoamylase reveal a polysaccharide-binding path. Biochem J 416, 27-36 (2008))。
【００１６】
本発明は、さらに、治療的にまたは予防的に有効量の炭水化物結合モジュールの抗体模倣体及び医薬に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１７】
用語「医薬に許容できる担体」、「医薬に許容できる賦形剤」、「生理学的に許容できる担体」または「生理学的に許容できる賦形剤」は、医薬に許容できる材料、組成物またはビヒクル、例えば液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料など、を指す。各成分は、医薬剤形の他の材料と適合可能である意味で「医薬に許容できる」。また、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性もしくは他の問題もしくは合併症
なしに、相応の合理的なベネフィット／リスク率を有して、ヒト及び動物の組織または器官に接触して使用するのにも適している。
【００１８】
本明細書に開示される医薬組成物は、単一用量の形態または複数回用量の形態で開示されてよい。本明細書で用いられるように、単一用量の形態は、ヒト及び動物の対象に投与するのに適し、当該技術分野において知られるように個々に包装されている物理的に不連続の単位を指す。各単一用量は、必要となる医薬担体または賦形剤と共同して、望む治療的効果を生じさせるのに十分なあらかじめ決定した量の活性成分を含む。単一用量の形態の例には、アンプル、シリンジ、並びに個々に包装した錠剤及びカプセルが挙げられる。単一用量の形態は、それの分割または複数分で投与されてもよい。複数回用量の形態は、分離された単一用量の形態で投与される単一の容器中に包装される複数の同一の単一用量の形態である。複数回用量の形態の例には、バイアル、錠剤もしくはカプセルのボトル、またはパイントもしくはガロン入りのボトルが挙げられる。
【００１９】
本明細書に開示される組成物は、単独、または、本明細書に開示される一または複数の他の化合物、一または複数の他の活性成分とともに投与してよい。本明細書に開示される化合物を含む医薬組成物は、経口、非経口及び局所投与用の様々な剤形中に製剤化されてよい。医薬組成物は、また、遅延型の、徐放性の、持続性の、継続性の、拍動性の(pulsatile-)、制御された、加速された、及び速効性の(fast-)、標的の、プログラム化した、放出剤形、及び胃貯留の剤形を含む、改変された放出剤形として製剤化されてもよい。これらの剤形は、当該技術分野における当業者に周知の従来の方法及び技術により調製可能である。
【００２０】
本明細書に開示される医薬組成物は、一度に、または時間をおいて複数回投与されてよい。正確な投薬量及び治療期間は、治療される患者の年齢、体重及び疾患により変化し、既知の試験プロトコルを用いて、またはin vivoもしくはin vitroの試験または診断データからの外挿により、経験的に決定してもよいと理解される。さらに、任意の特定の個体のために、特別の投薬計画が、個体（個人）のニーズ、及び投与する人間または製剤の投与を監督する人間の専門的な判断に応じて時間をかけて調整されるべきであると理解される。
【００２１】
本明細書に開示される医薬組成物は、固体、半個体、または液体の剤形で経口投与用に開示されてよい。本明細書で用いられているように、経口投与には、口腔、舌、及び舌下の投与も含まれる。好適な経口剤形には、限定されないが、錠剤、カプセル、ピル、トローチ(troche)、薬用キャンディー(lozenge)、トローチ(pastille)、カシェー(cachet)、ペレット、薬用チューイングガム、顆粒、原末、発泡性もしくは非発泡性の粉末または顆粒、溶液、エマルション、懸濁液、溶液、ウエハース(wafers)、粉砂糖、エリキシル剤、及びシロップが挙げられる。活性成分に加えて、医薬組成物は、制限はされないが、結合剤、充填剤、希釈剤、崩壊剤、湿潤剤、潤滑剤、流動促進剤、着色剤、色流れ防止剤、甘味剤、及び香味剤を含む、一または複数の医薬に許容できる担体または賦形剤を含んでよい。
【００２２】
本発明は、さらに、サンプルに、HIV糖タンパク質上のエピトープに特異的に結合する炭水化物結合モジュール(CBM)の抗体模倣体を添加する工程；及び抗体とサンプルとの間の結合反応を検出する工程を含む、サンプルのHIVを検出する方法を提供する。HIVを検出する方法において、CBMは糖タンパク質のエピトープに存在するグリカン構造に特異的に結合する。以下の実施例は非限定的であり、本発明の多様な態様及び特徴の単に典型となるものである。
【実施例】
【００２３】
［実施例１］
SBDと2G12との間の構造的な相関関係
構造に基づく複数の配列のアラインメント
2次構造予測をJpredサーバー(Cuff, J.A., Clamp, M.E., Siddiqui, A.S., Finlay, M. & Barton, G.J. JPred: a consensus secondary structure prediction server. Bioinformatics 14, 892-893 (1998))及びNetwork Protein Sequence Analysis(NPSA)サーバーを用いて実施した。Jpred及びNPSAサーバーは、それぞれ、6つ(NNSSP, DSC, PREDATOR, MULPRED, ZPRED 及び PHD)及び12（SOPM, SOPMA, HNN, MLRC, DPM, DSC, GORI, GORII, GORIV, PHD, PREDATOR 及び SIMPA96）の異なる方法より得た一致した(consensus)結果を提供する。
【００２４】
結果
RoSBDまたはAnSBDと他のタンパク質ドメインとの間の構造‐機能の相関関係の試験は、DALIデータベースを用いてin silicoスクリーニングで実施した（Holm, L., Kaariainen, S., Rosenstrom, P. & Schenkel, A. Searching protein structure databases with DaliLite v.3. Bioinformatics 24, 2780-2781 (2008))。全部で、RoSBD及びAnSBDに関して、それぞれ、555及び535の構造的に相関したタンパク質を回収し、それらの機能に従って分類した。予期されたように、いずれのケースでも、非常に類似したタンパク質（すなわち、トップ200の）は主にデンプンプロセシング酵素またはCBMであり、続いて抗体ファミリーであった。特に、RoSBD及びAnSBDはそれぞれ158及び57の免疫グロブリン構造と相関した。これらのうち、RoSBDは、病原体である、HIV、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、及びShigella flexneriをそれぞれ認識する、3つの糖結合mAb：2G12、2H1及びF22-4に似ていた。さらに、RoSBDは、2F5及びFAB1583を含む13のHIV中和mAbに似ていた。同様に、AnSBDは、2つの糖結合抗体：2H1及びSE155-4 mAbの一本鎖抗体可変領域(scFv)；及び2つのHIV結合mAbである、2F5及びG3-519に似ていた。2G12、RoSBD及びAnSBDの構造相関関係は、これらのSBDがHIVの糖タンパク質を認識する可能性を有し得るという推論を容易くする。
【００２５】
図１は、RoSBD、AnSBD、並びに2G12ヒトmAbのVHドメイン及びVLドメインの構造比較の結果を示す。RoSBDと、AnSBD、VH、及びVL間の配列同一性は、それぞれ、8.3％、9.5％、及び10.9％と低かったにも関わらず、重ね合わせた像は、構造のペアのうち、全体的な三次元構造が著しく類似していることを示し、平均標準偏差(RMSD)値は、それぞれ、1.4Å（図１a）、2.9Å（図１b）、及び3.0Å（図１c)であった。図１dにおけるRoSBD、AnSBD、VH、及びVLの複数配列アラインメントは低い相同性を示したが、2つのSBD及びVHにおける重要なリガンド結合部位はよく保存されていた（Tung, J.Y. et al. Crystal structures of the starch-binding domain from Rhizopus oryzae glucoamylase reveal a polysaccharide-binding path. Biochem J 416, 27-36 (2008)）。RoSBD、AnSBD、並びに2G12のVHドメイン及びVLドメインの構造類似性は、SBD及び2G12に関して類似の結合特異性を示していよう。
【００２６】
［実施例２］
SBDと2G12との間の機能的相関関係
微生物及びプラスミド
大腸菌Top10F’(Invitrogen社）をプラスミドの増幅に使用する一方で、大腸菌BL21-Gold(DE3)(Invitrogen社）をタンパク質の発現に使用した。T7プロモーターをいずれも含有する、ベクターpET-23a(+)及びpET-15b(Novagen社）を、それぞれ、大腸菌細胞で、組換RoSBD及び組換AnSBDの発現のために使用した。pET23a(+)-RoSBDに関して、それぞれ、NdeI及びXhoI制限酵素認識部位を含む、フォワードプライマー 5’-CATATGGCAAGTATTCCTAGCAGT-3’ (SEQ ID NO. 1) 及びリバースプライマー 5’-CTCGAGTCATGTAGATACTTGGT-3’ (SEQ ID NO. 2)、並びに、pET15b-AnSBDに関して、それぞれ、NdeI及びXhoI制限酵素認識部位を含む、フォワードプライマー 5’-CATATGAGCAAGACCAGCACCAGT-3’ (SEQ ID NO. 3)及びリバースプライマー 5’-CTCGAGCTACCGCCAGGTGT-3’ (SEQ ID NO. 4)を、クローニング及び配列解析に使用した。
【００２７】
形質転換及びSBDの発現
熱ショック方法を用いて大腸菌発現細胞をpET発現ベクターで形質転換した（Chou, W.I., Pai, T.W., Liu, S.H., Hsiung, B.K. & Chang, M.D. The family 21 carbohydrate-binding module of glucoamylase from Rhizopus oryzae consists of two sites playing distinct roles in ligand binding. Biochem J 396, 469-477 (2006)）。100μlのコンピテント細胞及び100 ngのDNAまたは20μlのライゲーション混合物を混合し、次いで、氷上で30分間インキュベーションした。細胞を42℃にあるウォーターバス中で30から60秒間加熱し、次いで、氷上に2分間以上設置した。形質転換体の数を決定するために、形質転換体を、100μｇ/mLのアンピシリンを含んでいるLuria-Bertani(LB）寒天プレート上に播種し、37℃で一晩インキュベーションした。
【００２８】
タンパク質発現を、培地に、0.5 mMのイソプロピルβ-D-チオガラクトシド(IPTG)(Promega社）を添加することによって誘導し、250 x gで振とうしながら16時間20℃でインキュベーションした。細胞を3,700 x gで15分間、4℃で遠心分離することにより回収した。
【００２９】
SBDの精製
組換タンパク質を含む大腸菌の細胞ペレットを100mlの結合バッファー（50 mM NaOAc、pH 5.5）中で再懸濁し、均質化により溶解させ(EmulsiFlex-C5 ホモジナイザー、AVESTIN)、細胞残屑を16,000 x gで30分間、4℃で遠心分離により除去した。得られた細胞溶解物を5 mLのアミロースレジンカラム(New England Biolabs)上にローディングした。次いで、カラムを50 mLの結合バッファー(50 mM NaOAc、pH 5.5)で洗浄し、吸着したタンパク質を溶出バッファー(10 mM グリシン-NaOH、pH 11)で溶出させた。精製SBDを限外ろ過装置(Centricon-10、Millipore)で遠心分離により濃縮し、バッファーを交換して50 mM NaOAc, pH5.5とした（Lin, S.C. et al. CBM21 starch-binding domain: a new purification tag for recombinant protein engineering. Protein Expr Purif 65, 261-266 (2009)）。
【００３０】
質量分光分析
組換タンパク質の分子量決定を液体クロマトグラフィー/質量分析計(LC/MS)(Waters)により実施した。完全なSBD (100 pmol)を50% (v/v)アセトニトリル中0.1 %のギ酸で酸性化し、通常のスキャン解像度の下、800-1800 m/zの範囲に対してデータを得た。複数の荷電イオンシリーズを有する元のエレクトロスプレーの質量スペクトルをデコンボリューションして質量スペクトルを得た。
【００３１】
サンドウィッチELISA
精製したSBD (100 μlの100 nMの溶液)をSBDコーティングバッファー(50 mM Tris-HClバッファー、pH 8)中にまず希釈し、次いで、96ウェルELISAプレート(Greiner-Bio One)中でピペッティングした後、4℃で16時間インキュベーションした。同様に、100μlの100 nMの2G12 mAb (Polymum Scientific)を2G12コーティングバッファー(50 mM グリシン-HClバッファー、pH 3)中にまず希釈し、次いで、第2のELISAプレートでピペッティングして、4℃で16時間とする。以下の4つの試薬（100μl)：(i) HIV-PC (HIV抗原及び抗体陽性血清、ID# 9144532；SeraCare Life Sicences)、(ii)1.0 μg/mLの抗RoSBD mAb (本筆者により製造され、要求があれば入手可能である）、(iii)HCV-PC (抗HCV Mixed Titer Performance Panel;膜10、ID# PHV205；SeraCare Life Sciences)及び(iv)HTLV-PC (抗HTLV I/II Mixed Titer Performance Panel；膜10、ID#PRP206；SeraCare Life Sciences）のそれぞれ一つを別々にSBDでコーティングした、または2G12でコーティングしたELISAプレートに添加し、37℃で1時間反応させた。HIV p24 ELISAキット(Perkin Elmer)及び抗HIV 1+2 ELISAキット(Abbott Diagnostics)を製造業者の指示に従ってそれぞれ用いて、HIV-PCがHIV抗原陽性であり、抗HIV抗体陽性であることを確認した。これに続いて、プレートをPBST (0.01 M リン酸緩衝食塩水＋0.05% tween-20、pH 7.1)で三回洗浄した。
【００３２】
以下の4つの共役試薬：(i)HRP共役組換gp120抗原(General Biologicals)、(ii)HRP共役抗マウスIgG (Jackson ImmunoResearch)、(iii)HRP共役HCV組換抗原(General Biologicals)及び(iv)HRP共役HTLV組換抗原（General Biologicals)のそれぞれ1つを別々に0.05μg/mLに希釈して、30分間、37℃で100μL/ウェルで添加し、次いでPBSTで3回洗浄した。3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン(General Biologicals)基質を100μL/ウェルで添加して、着色現像を37℃で30分間行った。着色反応を2Nの硫酸を100μL/ウェル添加することによって停止させ、吸光度を、Emax精密マイクロプレートリーダーを用いて450 nmで測定した(Molecular Devices)。カットオフ値(COV)をネガティブコントロールである、（正常ヒト血清)のOD+0.1として規定した。1より大きなカットオフ指数(COI)を示すサンプルはポジティブとみなした。ここで、COI=(テストサンプルのOD)/COVである。
【００３３】
統計解析
データの統計解析を双方向ANOVA、次いで不対の両側t検定(unpaired two-tailed t test)(GraphPad Prism Version 4; Graphpad Software)により実施した。P<0.05を有意とみなした。
【００３４】
結果
直接サンドウィッチ酵素結合免疫吸着法(ELISA)を、HIV特異的なmAbまたはSBDでコーティングされたマイクロタイタープレート及び西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)-共役組換gp120を用いて構築した；カットオフ指数(COI)>1を示すサンプルをポジティブとみなした。図１eは、HIV抗原及び抗体ポジティブコントロール(HIV-PC)中に存在するHIV抗原が、予期されたように、抗p24 mAb (N29)、抗gp41 mAb (AG10H9)、抗gp120 mAb (ED8.D4)、及び2G12により明確に検出されたことを示す。RoSBD及びAnSBDが同様なHIV検出能力を有することを強く示唆する、いずれかのSBDでコーティングされたプレートでシグナルが観察された。
【００３５】
図２aは、HIV-PCを試験した場合にのみRoSBDの結合が生じたことを示した。抗C型肝炎ウイルス(HCV)混合タイターパフォーマンスポジティブコントロール(HCV-PC)または抗ヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)混合タイターパフォーマンスポジティブコントロール(HTLV-PC)とのごくわずかな交差反応が観察された。さらに、HRP共役HCV組換抗原、HRP共役HTLV組換抗原、及びHRP共役抗マウスIgGは有意なシグナルをもたらさなかった（図２）ので、これは、恐らくはHIV gp120抗原への結合により、RoSBDがHIV-PCに特異的な認識を示すことを示している。
【００３６】
図３aは、HIV-PCへのAnSBD結合に関する最大COI値がRoSBDのそれと類似していたこと、及びHCV-PCまたはHTLV-PCへのAnSBDの結合に関する交差反応が観察されなかったことを示している。図３b及び３cは、HRP共役組換gp120の存在下で、AnSBDがHIV-PCに結合特異性を示したことを示唆する。さらに、マウス抗RoSBD mAbとAnSBDとの間には結合はなかった(図３d)。
【００３７】
［実施例３］
RoSBD及びAnSBDとHIV-1糖タンパク質との特異性
【００３８】
HIV mAbとグリカンの競合的ELISA
以下のペプチド及びmAb：(i)ヒトIgG12次抗体（[2C11];ヒトIgG1にサブクラス特異的であり、アロタイプ制限がない；Fc領域特異的）、(ii)HIV-1 p24ペプチド（[N29]、HIV-1 p24のN末残基1-104に相当する合成ペプチド）、(iii)HIV-1 gp120ペプチド([ED8.D4]；ヒトHIV-1 BH8分離gp160の残基427-448に相当する合成ペプチド）、(iv)HIV-1 gp41ペプチド（[AG10H9],HIV-1 gp160の残基721-744に相当する合成ペプチド）、(v)2G12 mAb (HIV-1 gp120に対する組換ヒトmAb）、(vi)gp140 (HIVクレードA、株92/UG/037）を、競合的ELISA実験に使用した。Polymun Scientificから購入した2G12及びgp140を除いて、すべてをAbcamから入手した。
【００３９】
ELISA実験のために、50μL HIV-PCを等量の500 nMの前述の(i)から(vi)のそれぞれと混合させた。混合物をRoSBDまたはAnSBDでコーティングしたプレートに移し、37℃で1時間インキュベーションしてから、PBSTで3回洗浄した。反応を100μlの0.05 μg/mLのHIV1組換gp120 HRP共役抗原を添加することによって検出した。グリカンの効果を試験する実験のために、50μlの500μMの4つのサンプルである、ダイズ凝集素(SBA)、マルトヘプタオース(G7)、β-シクロデキストリン(βCD)及びマンノース(Sigma-Aldrich）のそれぞれを、等量のHIV-PCと混合させた。混合物をRoSBDまたはAnSBDでコーティングしたプレートに移し、37℃で1時間インキュベーションしてから、PBSTで3回洗浄した。反応を100μlの0.05μg/mLのHRP共役HIV1組換gp120抗原を添加することによって検出した。
【００４０】
結果
2つのSBDとHIV-1との間の分子間相互作用の特異性を、mAb、糖タンパク質及びグリカンを含む競合物質の存在下で評価した。図４a及び４bでは、ヒトIgG1(2C11)2次抗体の存在は阻害効果を何ら示さなかったので、これは、非特異的な競合が生じなかったことを示している。しかし、RoSBD及びAnSBDへのHIV-PCの結合に関するCOI値は、組換HIV-1 gp140、gp120として同じ高マンノース型グリカンを含むチャイニーズハムスター卵巣由来細胞(CHO)-発現エンベロープ糖タンパク質の存在下で、それぞれ、有意に、72％及び60％に減少した。これは、SBDとHIV糖タンパク質との間の分子間相互作用を示唆する。さらに、mAb 2G12、抗gp120 mAb、抗gp41 mAb及び抗p24 mAb競合物質の阻害率は、RoSBD-HIV PC結合に関してそれぞれ55％、42％、22％及び13％であった一方で、AnSBDのそれは、それぞれ33％、18％、6％及び10％であった。(gp120に対する)mAbと競合させた場合にSBD及びHIV-PC結合が明らかに減少することは、SBDがHIVを認識するという結論をさらにサポートするものである。データは、それぞれのSBDとHIV gp120との間の特別な相互関係を強く示唆しており、恐らくはgp120上のグリカン部分が関与する。
【００４１】
さらに、500μMの四量体糖タンパク質の、M9部分を有するダイズ凝集素(SBA)、マルトヘプタオース(G7)、及びβ-シクロデキストリン(βCD)が、マンノース単糖が阻害効果を示さなかったにも関わらず、それぞれ、RoSBD-HIV及びAnSBD-HIVに関して、38%、20％及び23％、並びに16％、13％及び11％、結合を阻害することが発見された（図５）。これらのデータはSBA及びSBDの多糖リガンドがHIV結合と弱く競合することを暗示する。
【００４２】
［実施例４］
SBD及び2G12のHIV検出の比較
HIV ELISAにおいて使用するためのSBDの任意の実際的な用途を評価するために、HIV-1ポジティブであることが特徴付けされている、7つの一致したケース(incident)及び8つの一致した普及されているサンプルを含む、1セットの、HIV-1 発生／有病パフォーマンスパネル(PRB601; SeraCare Life Sicences)を用いて、抗p24、抗p41、抗gp120、及び2G12 mAb並びにRoSBD及びAnSBDのHIV検出能力を比較した。
【００４３】
結果
図６は、全てのコーティング材料が反応性を示し、2つのSBDが明らかな検出シグナルを示したことを明らかにした。SBDまたはHIV特異的なmAbでコーティングされたアッセイのいずれかを用いて、15のサンプルに関して類似の検出プロファイルが観察されたにも関わらず、2G12及びRoSBDは比較的高い検出感受性を示した；明らかに、サンプル番号5、6、8、10、11及び13は、その他のものより多くのHIV-1抗原を含んだ。これらのデータは、本発明者らのSBDのHIV-1抗原認識能力を強く支持した。
【００４４】
さらに、検出パターンのみならずシグナルの相対的なスケールが2G12（図７a）、RoSBD（図７b）、及びAnSBD（図７c)で非常に類似した。2G12-、RoSBD-、及びAnSBD-でコーティングされたELISAの検出率は、それぞれ93％、93％及び87％の高さであった。サンプル番号1及び番号12は、それらのHIV-1 RNA含量がそれぞれ3 x 104及び2 x 103コピー/mLであることが発見されたにも関わらず、それぞれ、RoSBD及び2G12によって検出されなかったことに留意すべきである。HIV抗原ELISAとHIV-1 RNA試験との不一致は、表面糖タンパク質の異なる検出標的または異なる発現レベルから生じているかもしれない。
【００４５】
［実施例５］
RoSBDの特異的なマンナン結合活性
RoSBDのグリカンアレイスクリーニング
グリカンのマイクロアレイ解析を、糖鎖科学コンソーシアムのコアH機関(Consortium for Functional Glycomics）（CFG), Core H facility)で行った(Raman, R. et al. Advancing glycomics: implementation strategies at the consortium for functional glycomics. Glycobiology 16, 82R-90R (2006))。Mammalian Printed Assayは合計で377の異なる天然及び合成グリカンを含んだ。手短には、70μlのRoSBD (200μg/mL)をアレイのプリント表面(printed surface)に適用し、カバースリップをして、37℃で1時間、暗く湿気のあるチャンバー中でインキュベーションした。インキュベーションの後、カバースリップを取り除き、TSMバッファー(50 mM Tris-HCL, pH 7.5、 10 mM MgCl2、及び0.5 Mのスクロース）で4回すすいだ。70μlの抗RoSBD mAbをマイクロアレイのプリント表面に適用し、37℃で1時間、湿気のあるチャンバーでインキュベーションした。結合を検出するために、マイクロアレイを、PBSバッファー中5μg/mLの濃度にある、2次抗体である、Alexa Fluor 488共役ヤギ抗マウスIgG (Invitrogen)で、湿気のあるチャンバー中で37℃で1時間インキュベーションした後、洗浄工程を行った。結合の程度を、Perkin-Elmer Microarray XL4000スキャナーを用いて決定し、Imagene (V.6)イメージ解析ソフトウェアを用いて解析した。完全なグリカンアレイのデータセットは、cfg_rRequest_1340下にあるCFGデータアーカイブ中に見出してよい。
【００４６】
磁気減少結合アッセイ
磁気減少(MR)測定(MagQu)のために、親水性の界面活性剤（例えばデキストラン）でコーティングされた63.2 nmの均質に分散された磁気ナノ粒子(MagQu)を含む溶液を使用した。複数外部交流磁界の下、磁気ナノ粒子は磁気相互作用を介して振動し、粒子表面と相互作用する分子の存在に感受性のある磁気特性としての、混合周波数磁化率(χac)を示す。χac値は、従って、磁気ナノ粒子とテストサンプル中の結合分子との間の会合に反応して減少し、MRシグナルを発する。
【００４７】
理論混合比で1:2の硫酸第一鉄7水和物(FeSO4・7H20)と塩化鉄6水和物(FeCl3・6H20)を含むフェライト溶液を等量の水性デキストラン(Sigma-Aldrich)と混合し、室温で水中に分散させた。混合物を70〜90℃まで加熱し、10N NaOH (Showa chemical)で滴定してFe3O4粒子を形成させた。凝集体及び過剰な非結合のデキストランを25℃で15分間、3,700 x gで遠心分離し、ゲルろ過クロマトグラフィー(Sigma-Aldrich)により除去した。
【００４８】
Fe3O4磁気ナノ粒子を含む磁気流体を、デキストラン上の酸化アルデヒド基に対して、精製したRoSBD (1.0 mg/mLの200μl)と共役させる前に、リン酸緩衝食塩水(PBS, pH 7.4)で0.3 emu/g (つまり8.3 mg Fe/mL)に希釈して、CH=N結合を生成させた。PBS (pH 7.4)溶液との、60μlの、0.7 pM IgG1 (2C11)、HIV-1-gp140、Man4 (6-アミノヘキシルグリコシド(Man4-OR)として)、M9-Asn (Oda, Y. et al. Crocus sativus lectin recognizes Man3GlcNAc in the N-glycan core structure. J Biol Chem 275, 26772-26779 (2000))またはSBAを別々にガラス管中に添加して、25℃で設置した。次いで、さらに60μLの、RoSBDでコーティングされたナノ粒子を含む磁気試薬をガラス管中に添加して、25℃で15秒間混合させた。最後に、混合物を、25℃でMRシグナルを測定するために、XacPro-S101リーダー(MagQu)を用いて検出した。会合により、磁気ナノ粒子が大きくなるか集団となることを可能にしたので、試薬のχacの減少が記録された。
【００４９】
結果
図８aは、RoSBDにより検出された2つの主要なシグナルをはっきりと示した：グリカン54 Fucα(1,2)Galβ(1,3)GalNAcβ(1,3)Galα、及びグリカン187 Manα(1,2)Manα(1,2)Manα(1,3)Manα(Man4)。前者はヒト血液型O抗原のグリコシル化(Korchagina, E.Y. et al. Design of the blood group AB glycotope. Glycoconj J 22, 127-133 (2005))と関係し、後者はHIV gp120におけるM9の合成多糖成分（Wang, J., Li, H., Zou, G. & Wang, L.X. Novel template-assembled oligosaccharide clusters as epitope mimics for HIV-neutralizing antibody 2G12. Design, synthesis, and antibody binding study. Org Biomol Chem 5, 1529-1540 (2007)）並びにSBAである。宿主上のCD4レセプターを認識するMan4がHIV-1進入の重要な成分として作用するので、これらのデータは、RoSBDとHIV gp120との間の相互作用に関する追加の、そして独立した一連の証拠を提供した。興味深いことに、グリカンアレイ解析及び他の方法を用いて、2G12がHIV-1 gp120のこのMan4構造に結合することも示されている（Ji, X., Gewurz, H. & Spear, G.T. Mannose binding lectin (MBL) and HIV. Mol Immunol 42, 145-152 (2005)及びLiu, W.T. et al. Identification and characterization of a novel fibril forming peptide in fungal starch binding domain. Biochem Biophys Res Commun 377, 966-970 (2008)）。
【００５０】
RoSBDのリアルタイムグリカン結合シグナルは、磁気減少(MR)アッセイを用いて調べられた（Hong C. Y, W.C.C., Chiu Y. C, Yang S.Y, Horng H.E, and Yang H.C. Magnetic susceptibility reduction method for magnetically labeled immunoassay. Applied Physics Letters 88, 21252 (2006)）。RoSBDでコーティングされた磁気ビーズ及びリン酸緩衝食塩水(PBS)またはヒトIgG1を含む混合物の典型的なリアルタイムの磁気反応、χacが図８bに示され（中空でないドット及び中空でない三角形）、図４にも示されるように、RoSBDとヒトIgG12次抗体との間の非特異的な相互作用が存在しないことを示していた。しかしながら、微量のHIV-gp140 (0.7 pM)の存在下では、MRシグナルの明確な減少（中空の四角形）が検出された（3.5%のΔχac)。興味深いことに、同じモル濃度のMan4 (6-アミノヘキシルグリコシド, Man4-ORとして）、M9-Asn (SBAより）及びSBA（図９）の存在により、類似のMRシグナルが生じた（十字型及び中空の三角形；それぞれ、3.6％、3.6％及び4.0％のΔχac）。
【００５１】
MR実験における特徴的なシグナル減少が、HIV gp140、Man4-OR、M9-Asn、及びSBAテスト全体で明確に観察されたが、このことは、RoSBDと高マンノース型グリカンとの間の直接の分子間相互作用に関する強力な証拠を提供する。その四価の特徴から予期されるように、SBAは他のものより遥かに早く反応した。
【００５２】
併せて鑑みるに、これらの結果は、RoSBD及びAnSBDが、新規のタンパク質-グリカン相互作用を介してHIV-PCにおける天然の(native)HIV抗原に結合し、HIV-1 gp120上のMan4部分を特異的に標的とすることを示す。
【００５３】
［実施例６］
SBDとMan4結合タンパク質との間の構造的類似性及びRoSBD上のMan4結合部位のマッピング
推定されるMan4結合部位の分子モデリング
RoSBDの推定されるMan4結合部位のモデリングを、Daliサーバーを用いて、RoSBD複合体（PDB ID: 2V8M)及び2G12-Man4複合体(PDB ID: 1ZLS)の3次元構造を重ね合わせることにより取り組んだ。5Åの半径内でのRoSBD上の推定される結合残基を発見するために単糖Man4を用いた。さらに、2G12-Man4複合体と適合する(coordinate from)Man4を用いて、結合部位I及びIIと最も保存されたヘキソース環が相互作用できるように、RoSBD-G7構造のG7結合部位中にMan4をフィットさせた。予測されるRoSBD-Man4複合体におけるMan4の5Åの半径内の残基を標識した。
【００５４】
RoSBDの部位特異的突然変異
RoSBD及びその変異体を、テンプレートとしてpET23a-ROSBDを用いて、PCRに基づくQuikChange(登録商標）部位特異的突然変異法（Stratagene)を使用して、生成した。SBD誘導体を増幅させるのに使用するプライマーペアーを設計して表１にリスト化した。10 ngのテンプレート、0.625μlの各プライマー(10μM)、2.5μLの反応バッファー(10x)、3.125μL dNTP (2.5 mM)、0.25 μL Pfu Turbo DNAポリメラーゼ（20 U/μL)(Stratagene)を含むPCR混合物をddH2Oを用いて最終体積25μLにした。この研究で使用した熱サイクル条件は、95℃で5分間を1サイクル及び95℃で1分間を20サイクル（変性）、45℃から65℃で30秒間（アニーリング）及び68℃で8分間（伸長）、及び最後に68℃で10分間を1サイクルであった。PCR反応をサーマルサイクラー(9700, Applied Biosystems)で実施した。各変異体のプラスミドの配列をDNA配列決定解析により確認した。
【００５５】
【表１】
0005746149.tif 000002
【００５６】
結果
現在、10のMan4結合タンパク質がCFG Core Hデータベースで入手可能であり、そのうちの2つは、主にβが豊富な構造を有するカルシウム依存性レクチン、Chromobacterium violaceum由来のCvレクチン(CV-IIL)及びBurkholderia cenocepacia由来のBclAレクチンであり、AnSBDとして、同一の相同のCATHスーパーファミリー(2.60.120.400)に属している。これらのレクチンは、メチルα-D-フコシド（Emau, P. et al. Griffithsin, a potent HIV entry inhibitor, is an excellent candidate for anti-HIV microbicide. J Med Primatol 36, 244-253 (2007)）及びメチルα-D-マンノシドに対して最も高い親和性を有する病原菌において発見された毒性因子である。これらの可能性のある役割は、宿主認識、接着及びバイオフィルム形成に関与している可能性がある（Fromme, R. et al. A monovalent mutant of cyanovirin-N provides insight into the role of multiple interactions with gp120 for antiviral activity. Biochemistry 46, 9199-9207 (2007)）。これらの高い構造類似性は、2つの真菌性SBDとマンナン結合タンパク質との間の機能的相関関係に対する強力な証拠を提供する。
【００５７】
図１０aは、複合体2G12VH-Man4及びRoSBD-G7の静電ポテンシャルを示した。Man4の水酸基はThr33及びAsp100に対して水素結合を形成し、Man4のグリカン環IIIは2G12VHドメインのTyr56に結合する（左パネル）一方で、G7はRoSBDのTyr32の周りを回り、近接したTrp47、Tyr83及びTyr94により安定化されるであろう（右パネル）。興味深いことに、4つの異なるコンフォメーションにおけるG7のグリカン環II及びIIIの配向性は非常に保存されていることが示されており、RoSBDにおけるPhe58の疎水性フェニル環がG7のグルコシルユニットのグリカン環IIIと好ましいスタッキング相互作用を提供する。
【００５８】
RoSBD上の推定されるMan4結合部位を予測するために、Man4構造をVHドメインを有するその複合体から単離して、PDB ID: 1ZLS構造におけるMan4座標を用いて、図１bに示されるように、対応するループでRoSBD上で、近接する残基を探索するための中心点がRoSBD上で5Å未満の半径内であるようにして、それを重ね合わせた（Calarese, D.A. et al. Dissection of the carbohydrate specificity of the broadly neutralizing anti-HIV-1 antibody 2G12. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 13372-13377 (2005）)。この手法を用いて、残基Tyr32及びSer33がMan4結合に関与していると予測した（図１０b、左パネル）。RoSBD-G7複合体中に、2つの炭水化物結合部位である、部位I及び部位IIが存在し、部位Iはループβ34の周囲のTrp47にあり、部位IIはループβ23の周囲のTyr32にあることが示されている（Tung, J.Y. et al. Crystal structures of the starch-binding domain from Rhizopus oryzae glucoamylase reveal a polysaccharide-binding path. Biochem J 416, 27-36 (2008)）。Man4でG7を置換することにより、残基Asn29, Tyr32, Lys34, Trp47, Phe58, Glu68, Tyr83及びTyr94がMan4の結合に関与している可能性が明らかにされた（図１０b、右パネル）。
【００５９】
図１０cは、Gln29, Tyr32, Ser33, Lys34, Trp47, Phe58, Tyr83, Tyr93及びTyr94の位置におけるアラニン置換の効果を描写した。興味深いことに、N29A, Y32A, W47A及びF58Aが、それぞれ、有意にHIV結合活性を29％、43％、40％及び53％まで低下させ、K34A, Y83A及びY94AはHIV結合において穏やかな低下を示した。しかしながら、S33A及びY93A変異体は、図１０aにおける結合モデルに反して、野生型のRoSBDと同一のHIV結合活性を保持した。芳香族残基Y32, W47及びF58は、RoSBDの決定的なリガンド結合部位としてよく定義されており、Y83及びY94は、近接するRoSBDからのリガンドを保持し、K34はD6827を安定化することができた；このことは、図１０bに描写されるように、G7リガンド結合部位によりMan4が認識可能であるという予測を強く支持した。これらを併せて鑑みるに、デンプン結合CBMとHIV gp120グリカン結合2G12との間の構造-機能の関係のin silicoの評価は、in vitro解析により確かめられている。
【００６０】
［実施例７］
RoSBDによるHIV-1感染の阻害及びそれらの細胞毒性
細胞、ウイルス株及び抗ウイルスアッセイ
以下の細胞及びウイルス株をAIDS Research and Reference Reagent Program、Division of AIDS、National Institute of Allergy and Infectious Diseaseから入手した：H9細胞及びHIV-1RTMF (AZT耐性ウイルス）のウイルス株。H9細胞を10％のウシ胎児血清、100ユニット/mlのペニシリン及び100 mg/mLのストレプトマイシンが配合されたRPMI 1640培地で育成しかつ維持した。H9細胞を37℃で2時間、HIV-1ウイルスとともにインキュベーションした。H9細胞を1 mLあたり1 x 105細胞で培地中で懸濁し、0.1の感染の多重度でHIVに感染させた。感染後、細胞をPBSで2回洗浄し、次いで培地で洗浄した。細胞懸濁液(100μL)を96ウェルプレートの各ウェルに添加し、次いで、増加させた濃度のSBD (0, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40 & 80 μM)を感染細胞に添加した。4日のインキュベーション後、細胞を適切な濃度のSBDを含む新鮮な培地で継代して、さらに4日インキュベーションした。H9細胞におけるHIV-1RTMFウイルスのウイルス複製に対するSBDの活性を試験した。抗ウイルス活性をHIV-1 p24抗原ELISAを使用して決定した（di Marzo Veronese, F. et al. Monoclonal antibodies specific for p24, the major core protein of human T-cell leukemia virus type III. Proc Natl Acad Sci U S A 82, 5199-5202 (1985)）。
【００６１】
細胞毒性アッセイ
H9細胞に対するSBDの細胞毒性をMTTアッセイを用いて解析した。手短には、指数関数的に増殖しているH9細胞を3x104細胞/ウェルの密度で96ウェルプレート上に播種し、薬剤への暴露に先立ち、37℃で24時間インキュベーションした。処置の日に、一連のSBD濃度（0, 1.25, 2.5, 5, 10及び20 μM)を用いて、H9細胞におけるそれらの細胞毒性を規定通りに試験した（Abd-Elazem, I.S., Chen, H.S., Bates, R.B. & Huang, R.C. Isolation of two highly potent and non-toxic inhibitors of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) integrase from Salvia miltiorrhiza. Antiviral Res 55, 91-106 (2002)）。インキュベーションの8日後に、50μlのMTTを添加し（最終濃度1 mg/mL）、プレートを37℃で4時間インキュベーションして、代謝的に活性な細胞と反応することによりMTTからホルマザンの結晶が形成されるようにした。ホルマザンの結晶をDMSOで溶解させた。各ウェルの吸光度を光学密度540 nmにおいてマイクロタイターリーダーで測定した。反応は特異的であった；死んだ細胞では有意な量のホルマザンは検出することができなかった。
【００６２】
結果
異なるRoSBD濃度の不在及び存在下におけるウイルス複製を、HIV-1 p24抗原ELISAを用いて、8日後に測定した。H9細胞におけるHIV-1感染に対するRoSBDの抗ウイルス活性をmaterials and methodsに記載されるようにして決定した。RoSBDは、用量反応曲線（図１１
から計算されるように、4.5 μMのIC50値でAZT耐性ウイルスを阻害した。1.25から80 μMの範囲にある一連のRoSBD濃度を、H9細胞におけるRoSBDの細胞毒性を試験するために使用した。培地におけるH9細胞の生存を決定するためにMTTアッセイを用い、SBDがより高濃度(40及び80 μM)であってこの場合にはH9細胞が死滅した場合を除けば、全培養期間の間、細胞が生存したことが証明された。20 μMの濃度に関しては、細胞の生存は約79％であったが、10 μmでは88％であった。
【図２（ａ）】
0005746149.tif 000003
【図２（ｂ）】
0005746149.tif 000004
【図２（ｃ）】
0005746149.tif 000005
【図２（ｄ）】
0005746149.tif 000006
【図３（ａ）】
0005746149.tif 000007
【図３（ｂ）】
0005746149.tif 000008
【図３（ｃ）】
0005746149.tif 000009
【図３（ｄ）】
0005746149.tif 000010
【図４】
0005746149.tif 000011
【図５】
0005746149.tif 000012
【図６（ａ）】
0005746149.tif 000013
【図６（ｂ）】
0005746149.tif 000014
【図６（ｃ）】
0005746149.tif 000015
【図６（ｄ）】
0005746149.tif 000016
【図６（ｅ）】
0005746149.tif 000017
【図６（ｆ）】
0005746149.tif 000018
【図７（ａ）】
0005746149.tif 000019
【図７（ｂ）】
0005746149.tif 000020
【図７（ｃ）】
0005746149.tif 000021
【図９】
0005746149.tif 000022
【図１１】
0005746149.tif 000023
【図１】
0005746149.tif 000024
【図８】
0005746149.tif 000025
【図１０】
0005746149.tif 000026
【図１２】
0005746149.tif 000027
【配列表】
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