(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ粒子と結合したリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物であって、
該ＲＮＡポリヌクレオチドが、該ナノ粒子と官能化されており、標的ポリヌクレオチドと同一の配列を含み；
該ＲＮＡポリヌクレオチドが、追加のポリヌクレオチドとともに二重鎖を形成するのに適した条件下で該二重鎖を形成する配列を有し、該追加のポリヌクレオチドは、該二重鎖を形成するのに適切な条件で該ＲＮＡポリヌクレオチドに対するハイブリッド形成を可能にするために該ＲＮＡポリヌクレオチドにおける配列に十分に相補的な配列を有し、該二重鎖はポリペプチドの相互作用部位を提供し；
該追加のポリヌクレオチドは、該追加のポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとのハイブリッド形成を適切な条件下で可能にする、該標的ポリヌクレオチド内の配列と十分に相補的な少なくとも１つのドメインを有し、該追加のポリヌクレオチドの該ドメインと該標的ポリヌクレオチドとのハイブリッド形成によって、ポリペプチドによって認識される基質部位がもたらされ；
該ＲＮＡポリヌクレオチドが、該ポリペプチドの相互作用部位および該ナノ粒子に対して方向特異的な様式で該ナノ粒子と結合する；
ナノ粒子組成物。
【請求項２】
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、前記ナノ粒子と共有結合している、請求項１に記載のナノ粒子組成物。
【請求項３】
前記ナノ粒子は、少なくとも２つのＲＮＡポリヌクレオチドを含み、該ナノ粒子と結合した各ＲＮＡポリヌクレオチドが、同一の配列を有する、請求項１に記載のナノ粒子組成物。
【請求項４】
前記追加のポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１に記載のナノ粒子組成物。
【請求項５】
前記追加のポリヌクレオチドがデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項１に記載のナノ粒子組成物。
【請求項６】
前記追加のポリヌクレオチドが前記ナノ粒子と共有結合していない、請求項１に記載のナノ粒子組成物。
【請求項７】
前記ポリペプチドの相互作用部位が、前記ＲＮＡポリヌクレオチドの中間点に関して、前記ナノ粒子に対して遠位に位置する、請求項１に記載のナノ粒子組成物。
【請求項８】
前記ＲＮＡの表面密度が、少なくとも２ｐｍｏｌ／ｃｍ２である、請求項１に記載のナノ粒子組成物。
【請求項９】
前記ポリペプチドの相互作用部位が、ＲＮａｓｅＨ、ＲＮａｓｅＤ、ＲＮａｓｅＬ、ＲＮａｓｅＩＩＩ、Ｄｉｃｅｒ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２、およびヒト免疫不全ウイルスのトランス活性化応答ＲＮＡ結合タンパク質（ＴＲＢＰ）からなる群より選択されるタンパク質と結合する、請求項１に記載のナノ粒子組成物。
【請求項１０】
前記二重鎖の前記ドメインの長さが、１０ヌクレオチドである、請求項１に記載のナノ粒子組成物。
【請求項１１】
前記二重鎖が、前記標的ポリヌクレオチド内の第２の配列と十分に相補的な第２のドメインをさらに含み、該二重鎖の該第２のドメインと該標的ポリヌクレオチド内の該第２の配列とのハイブリッド形成によって、第２のポリペプチドによって認識される追加の基質部位がもたらされる、請求項１０に記載のナノ粒子組成物。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドの前記第２のドメインの長さが、１０ヌクレオチドである、請求項１１に記載のナノ粒子組成物。
【請求項１３】
前記基質部位と前記追加の基質部位が同じである、請求項１１に記載のナノ粒子組成物。
【請求項１４】
前記ＲＮＡポリヌクレオチドの長さが、５から１００ヌクレオチドである、請求項１に記載のナノ粒子組成物。
【請求項１５】
前記追加のポリヌクレオチドの長さが、５から１００ヌクレオチドである、請求項１に記載のナノ粒子組成物。
【請求項１６】
金ナノ粒子である請求項１に記載のナノ粒子組成物。
【請求項１７】
標的ポリヌクレオチドの発現を調節するための、請求項１に記載のナノ粒子組成物であって、該ナノ粒子組成物のドメインを該標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成させて、ポリペプチドのための基質部位を形成させることを特徴とする、ナノ粒子組成物。
【請求項１８】
前記ナノ粒子組成物の前記ドメインと前記標的ポリヌクレオチドとのハイブリッド形成によって前記標的ポリヌクレオチドの分解をもたらす、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが、ＲＮａｓｅＨ、ＲＮａｓｅＤ、ＲＮａｓｅＬ、ＲＮａｓｅＩＩＩ、Ｄｉｃｅｒ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２、およびＴＲＢＰからなる群より選択される、請求項１７または１８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の利益についての声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ（ＮＣＩ／ＣＣＮＥ）によって付与された助成金第５Ｕ５４  ＣＡ１１９３４１号、およびにＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）よって付与された助成金第５ＤＰ１  ＯＤ０００２８５号の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、二重鎖ＲＮＡを用いて機能化されたナノ粒子に関する。本発明はまた、ＲＮＡをナノ粒子に結合体化させる方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、細胞内に存在する場合、二本鎖ＲＮＡにおける一本鎖と十分に相補的な配列を有する遺伝子の発現を阻害する現象である。遺伝子発現の阻害は、標的遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解によって起こる［非特許文献１］。ＲＮＡｉの誘発を担う二本鎖ＲＮＡは、干渉ＲＮＡと呼ばれる。ｄｓＲＮＡがＲＮＡｉを仲介する機序および細胞機構は、遺伝的手法と生化学的手法の両方を使用して研究されている。生化学的分析により、細胞の細胞質に導入されたｄｓＲＮＡは、最初に２１〜２５ヌクレオチド長のＲＮＡ断片にプロセシングされることが示唆されている［非特許文献２；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２８６：９５０〜９５２（１９９９）；Ｚａｍｏｒｅら、「Ｃｅｌｌ」１０１：２５〜３３（２０００）；Ｙａｎｇら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」１０：１１９１〜１２００（２０００）；Ｐａｒｒｉｓｈら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ」６：１０７７〜１０８７（２０００）］。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれるこうしたｄｓＲＮＡは、ＲＮａｓｅＩＩＩ様酵素Ｄｉｃｅｒによる少なくとも１つの機序で産生されることが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験で示されている［非特許文献２］。標的ｍＲＮＡが、特定のｓｉＲＮＡとハイブリッド形成した領域の中央の位置で切断されることから、こうしたｓｉＲＮＡは、おそらくｍＲＮＡ切断のガイドとして働くのであろう［非特許文献１］。生化学的証拠が示唆するところによると、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる多成分ヌクレアーゼ複合体の一部である［非特許文献２］。この複合体のタンパク質の１つであるＡｒｇｏｎａｕｔｅ２は、ａｒｇｏｎａｕｔｅ遺伝子ファミリーの産物として同定されている［非特許文献１］。このタンパク質は、マウスの発達に不可欠であり、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２を欠く細胞は、ｓｉＲＮＡに対する実験応答を開始することができない。古細菌のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質の構造との比較によって同定されたＡｒｇｏｎａｕｔｅ２内の未解明リボヌクレアーゼＨドメイン内の変異は、ＲＩＳＣを失活させる。したがって、Ａｒｇｏｎａｕｔｅは、ＲＩＳＣに「スライサー」活性を与え、ＲＮＡｉに触媒的原動力を提供する［Ｌｉｕら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」３０５（５６８９）：１４３７〜１４４１（２００４）］。
【０００４】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ相同体ｒｄｅ−１および関連遺伝子、Ｎ．ｃｒａｓｓａ相同体ｑｄｅ−２、ならびにＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ相同体ａｒｇ−１も包含するこの遺伝子ファミリーが、ＲＮＡｉに必要とされることが、遺伝的研究を通して示されている［非特許文献１；非特許文献２；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２８６：９５０〜９５２（１９９９）］。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓでの遺伝子スクリーニングにより、ｍｕｔ−７遺伝子もＲＮＡｉに不可欠と同定されている。この遺伝子は、ＲＮａｓｅＤに類似しており、この遺伝子の産物が、該反応のｍＲＮＡ分解ステップにおいて作用することが示唆される［非特許文献１］。
【０００５】
研究者らは、過去１０年かけて、多価ＤＮＡで機能化された金ナノ粒子（ＤＮＡ−Ａｕ  ＮＰ）を設計、合成、試験、および利用してきた［Ｍｉｒｋｉｎら、「Ｎａｔｕｒｅ」３８２：６０７（１９９６）］。こうした努力によって、ハイブリッドナノ構造についての新規の基本理解［Ｄｅｍｅｒｓら、「Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．」７２：５５３５（２０００）；Ｊｉｎら、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」１２５：１６４３（２００３）；Ｌｙｔｔｏｎ−Ｊｅａｎら、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ」１２７：１２７５４〜１２７５４（２００５）；Ｓｔｏｒｈｏｆｆら、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」１２２：４６４０（２０００）；Ｙｏｕら、「Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ」２：１９０（２００６）；Ｗａｎｇら、「Ｎａｎｏｍｅｄ．」１：４１３（２００６）］、重要でありかつ場合によっては商業的に実現可能である検出および診断アッセイ［Ｎａｍら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」３０１：１８８４（２００３）；Ｓｔｏｅｖａら、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」１２８：８３７８（２００６）；Ｌｉｕら、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」１２６：１２２９８（２００４）；Ｆａｕｌｄｓら、「Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．」７６：４１２（２００４）］、およびＤＮＡシントンの使用を介する材料組立をプログラムする能力［Ｍｉｒｋｉｎら、「Ｎａｔｕｒｅ」３８２：６０７（１９９６）；Ｐａｒｋら、「Ｎａｔｕｒｅ」４５１：５５３（２００８）；Ｎｙｋｙｐａｎｃｈｕｋら、「Ｎａｔｕｒｅ」４５１：５４９（２００８）］が得られてきた。多価ＤＮＡ−Ａｕ  ＮＰには、融解温度の尖鋭化および上昇［Ｊｉｎら、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」１２５：１６４３（２００３）］、結合特性の向上［Ｌｙｔｔｏｎ−Ｊｅａｎら、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ」１２７：１２７５４−１２７５４（２００５）］（同配列の遊離鎖と比較した場合）、および距離依存性光学特性［Ｅｌｇｈａｎｉａｎら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２７７：１０７８（１９９７）］などのいくつかの独特な特性がある。多価分子系に関する研究［Ｇｅｓｔｗｉｃｋｉら、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」１２４：１４９２２（２００２）］に同意するならば、ナノ粒子の、高い表面ＤＮＡ密度や、多座配位相互作用に関わる能力が、こうした独特な特性の由来を提示するものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｈａｒｐら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２００１）１５：４８５〜４９０
【非特許文献２】Ｈａｍｍｏｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ（２０００）４０４：２９３〜２９６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書に記述するのは、遺伝子調節に有用であるような物性を与えるＲＮＡ単一層が結合したナノ粒子組成物である。この組成物は、ＲＮＡを細胞に導入するための他の材料とは対照的に、単なるＲＮＡの送達手段ではなく、表面リガンドの配置および高密度に由来する協同的特性という利点を生かした単一体因子である。本明細書に記述する組成物は、形質移入剤なしで細胞に入り、また、ノックダウン活性を従来の高分子担体に比べて向上させるような方式での分解に耐性がある。
【０００８】
したがって、ある態様では、ナノ粒子と結合した１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物が提供される。ここでは、ＲＮＡポリヌクレオチドは、ポリペプチドの相互作用部位を有し、かつ、二重鎖を形成するのに適した条件下で二重鎖を形成する配列を有し、該二重鎖は、該二重鎖の一本鎖内に、一本鎖と標的ポリヌクレオチドとのハイブリッド形成を適切な条件下で可能にする、標的ポリヌクレオチド内の配列と十分に相補的な少なくとも１つのドメインを有し、二重鎖の該ドメインと標的ポリヌクレオチド内の該配列とのハイブリッド形成によって、ポリペプチドによって認識される基質部位がもたらされ、ナノ粒子と結合するＲＮＡポリヌクレオチドは、ポリペプチドの相互作用部位およびナノ粒子に対して方向特異的な様式（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍａｎｎｅｒ）である。
【０００９】
ある態様では、ＲＮＡポリヌクレオチドがナノ粒子と共有結合的に結合したナノ粒子組成物が提供される。他の態様では、ＲＮＡポリヌクレオチドがナノ粒子と共有結合的に結びついた状態ではないナノ粒子組成物が提供される。
【００１０】
さらなる態様では、ナノ粒子と結合した各ＲＮＡポリヌクレオチドが同一の配列を有するナノ粒子組成物が提供される。他の態様では、ナノ粒子と結合した少なくとも２つのＲＮＡポリヌクレオチドが異なる配列を有するナノ粒子組成物が提供される。
【００１１】
ある実施形態では、二重鎖が、ＲＮＡポリヌクレオチドによって形成されたヘアピン構造を含む、ナノ粒子組成物が提供される。
【００１２】
本明細書に開示する方法は、二重鎖を形成するのに適した条件下でＲＮＡポリヌクレオチドとのハイブリッド形成を可能にするための、ＲＮＡポリヌクレオチド内の配列と十分に相補的な配列を有する追加のポリヌクレオチドをさらに含む、ナノ粒子組成物を企図する。
【００１３】
ある態様では、追加のポリヌクレオチドがＲＮＡであるナノ粒子組成物が提供される。他の態様では、追加のポリヌクレオチドがデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であるナノ粒子組成物が提供される。
【００１４】
さらなる実施形態では、追加のポリヌクレオチドがナノ粒子と共有結合的に結合したナノ粒子組成物が提供される。ある態様では、追加のポリヌクレオチドがナノ粒子と共有結合していないナノ粒子組成物が提供される。
【００１５】
ある実施形態では、ポリペプチドの相互作用部位が、ＲＮＡポリヌクレオチドの中間点を基準にした場合にナノ粒子に対して近位に位置するナノ粒子組成物が提供される。
【００１６】
さらなる実施形態では、ポリペプチドの相互作用部位がＲＮＡポリヌクレオチドの中間点を基準にした場合にナノ粒子に対して遠位に位置するナノ粒子組成物が提供される。
【００１７】
本方法のある態様では、ＲＮＡの表面密度が少なくとも約２ｐｍｏｌ／ｃｍ２から約１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２であるナノ粒子組成物が提供される。
【００１８】
種々の実施形態では、ポリペプチドの相互作用部位が、ＲＮａｓｅＨ、ＲＮａｓｅＤ、ＲＮａｓｅＬ、ＲＮａｓｅＩＩＩ、Ｄｉｃｅｒ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２、およびヒト免疫不全ウイルスのトランス活性化応答ＲＮＡ結合タンパク質（ＴＲＢＰ）からなる群より選択されるタンパク質と結合する、ナノ粒子組成物が提供される。
【００１９】
本方法のさらなる態様は、ポリヌクレオチドのドメインの長さが約１０ヌクレオチドであるナノ粒子を提供する。
【００２０】
ある実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチド内の第２の配列と十分に相補的な第２のドメインをさらに含み、ＲＮＡポリヌクレオチドの第２の該ドメインと標的ポリヌクレオチド内の第２の該配列とのハイブリッド形成によって、第２のポリペプチドによって認識される追加の基質部位がもたらされるようなナノ粒子組成物が提供される。ある態様では、ポリヌクレオチドの第２のドメインの長さが約１０ヌクレオチドであるナノ粒子組成物が提供される。
【００２１】
ある態様では、基質部位と追加の基質部位が同じであるナノ粒子組成物が提供される。他の態様では、基質部位と追加の基質部位が異なるナノ粒子組成物が提供される。
【００２２】
ある態様では、ＲＮＡポリペプチドと追加のポリヌクレオチドが、ハイブリッド形成できるのに十分な長さにわたって互いに相補的である、ナノ粒子組成物が提供される。他の態様では、ＲＮＡポリヌクレオチドと追加のポリヌクレオチドがその全長にわたって互いに相補的であるナノ粒子組成物が提供される。
【００２３】
ある実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドがチオール連結を介してナノ粒子と結合体化されるナノ粒子組成物が提供される。
【００２４】
ある態様では、ＲＮＡポリヌクレオチドの半減期が、ナノ粒子と結合していない同一のポリヌクレオチドの半減期と少なくとも実質的に同じであるようなナノ粒子組成物が提供される。他の態様では、ＲＮＡポリヌクレオチドの半減期が、ナノ粒子と結合していない同一のＲＮＡの半減期よりも約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、またはそれ以上長いナノ粒子組成物が提供される。
【００２５】
種々の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドの長さが約５から約１００ヌクレオチドであるナノ粒子組成物が提供される。ある態様では、追加のポリヌクレオチドの長さが約５から約１００ヌクレオチドであるナノ粒子組成物が提供される。
【００２６】
ある実施形態では、ナノ粒子が金であるナノ粒子組成物が提供される。ある態様では、ナノ粒子が銀であるナノ粒子組成物が提供される。
【００２７】
ある態様では、ＲＮＡポリヌクレオチドをナノ粒子に結合させる方法であって、チオール化ＲＮＡポリヌクレオチド二重鎖とナノ粒子との混合物を一連の溶液（各溶液は、先の溶液よりも増大した濃度の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含み、約０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む第１の溶液から開始される）中で熟成させて、ＲＮＡポリヌクレオチドをナノ粒子に結合させるステップを含む方法が提供される。関連する態様では、この方法は、最後の熟成ステップの後に、混合物を超音波処理するステップをさらに含む。ある態様では、この方法は、ナノ粒子を単離するステップをさらに含む。
【００２８】
ある実施形態では、ＲＮＡをナノ粒子に結合させる方法であって、以下を含む方法が提供される：
（ａ）約０．１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む溶液中で、チオール化ＲＮＡ二重鎖をナノ粒子と混合すること；
（ｂ）先の溶液よりも増大した濃度のＮａＣｌをそれぞれ含む一連の塩溶液中で、混合物を熟成させること；
（ｃ）混合物を超音波処理すること；および
（ｄ）結合体化されたナノ粒子を調製すること。
【００２９】
本方法の種々の態様では、一連の塩溶液は、約０．１Ｍから約０．３Ｍ  ＮａＣｌの範囲である。
【００３０】
本方法のある態様は、オリゴ（エチレングリコール）チオール（ＯＥＧ）を用いてナノ粒子の表面を不動態化することをさらに含む。
【００３１】
ある実施形態では、標的ポリヌクレオチドの発現を調節する方法であって、本開示のナノ粒子組成物のドメインと標的ポリヌクレオチドをハイブリッド形成させて、ポリペプチドのための基質部位を形成させるステップを含む方法が提供される。ある態様では、ハイブリッド形成によって、標的ポリヌクレオチドの分解が起こる。種々の態様では、ポリペプチドは、ＲＮａｓｅＨ、ＲＮａｓｅＤ、ＲＮａｓｅＬ、ＲＮａｓｅＩＩＩ、Ｄｉｃｅｒ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２、およびＴＲＢＰからなる群より選択される。
【００３２】
本発明のさらなる態様は、下に提供する詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、以下の詳細な説明および実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しながらも、例示目的で与えられるに過ぎないこと、また、この詳細な説明から、本発明の趣旨および範囲内の様々な変更や改変が当業者に明らかになるであろうことを理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、金ナノ粒子（ＮＰ）の特性評価を表す。オートクレーブの前（ａ）および後（ｂ）の、ナノ粒子の吸光度スペクトルおよびＴＥＭ画像。スケールバーは、５０ｎｍである。
【図２】図２は、金ナノ粒子の溶液中のＲＮａｓｅの存在を表す。未処理のＡｕ  ＮＰは、正のシグナルを示すが、ＲＮａｓｅ活性を排除する処理をした粒子は、ＲＮａｓｅを含まないものとなっている。
【図３】図３は、集密的なＨｅＬａ細胞の光学顕微鏡画像を表す。ＲＮＡナノ粒子組成物の合成において、ＲＮＡ二重鎖の添加後、表面不動態化リガンドとして、３０μｍｏｌ／ｍＬのオリゴエチレングリコール−チオール（ＯＥＧ−チオール）を加えた。この添加は、培養における粒子の沈殿を妨げることが分かった。（ａ）ＯＥＧ−チオールを添加しない細胞培養におけるＲＮＡ−ナノ粒子組成物は、粒子の沈殿（黒）を示す。（ｂ）ＯＥＧ−チオールを含む細胞培養におけるＲＮＡ−ナノ粒子組成物。スケールバーは、３０μｍである。
【図４】図４は、細胞によるＲＮＡ−Ａｕ  ＮＰの取り込みを表す。（ａ）ＲＮＡ−Ａｕ  ＮＰ（Ｃｙ５標識したＲＮＡ）と共に６時間インキュベートしたＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡画像。スケールバーは、２０μｍである。（ｂ）ＲＮＡ−Ａｕ  ＮＰ処理した細胞を未処理の対照と比較したフローサイトメトリー分析図。
【図５】図５は、（ａ）４日にわたるルシフェラーゼ発現のノックダウン、（ｂ）ＲＮＡ−Ａｕ  ＮＰの安定性（ｄｓＲＮＡ（四角形）とＲＮＡ−Ａｕ  ＮＰ（三角形）の１０％血清における安定性の比較）を表す。
【図６】図６は、二本鎖または一本鎖ヘアピンＲＮＡを用いて機能化されたＲＮＡ−Ａｕ  ＮＰに対するＲＮａｓｅＩＩＩの活性を表す。どちらの系も、ＲＮａｓｅＩＩＩによって基質として認識される。最大蛍光の相違は、一部は装填の相違によるものである（表１参照）。酵素を加えない反応を、バックグラウンド補正に使用した。
【図７】図７は、二本鎖（センス／ＦＩＴＣ  ＡＳ、ＡＳ／ＦＩＴＣ  センス）または一本鎖ヘアピンＲＮＡ（ＦＩＴＣ  ＨＰ）を用いて機能化されたＲＮＡ−Ａｕ  ＮＰに対するＤｉｃｅｒの活性を表す。どちらの系も、Ｄｉｃｅｒによって基質として認識されるが、センス鎖の固定化の場合に、より高い活性が見られる。最大蛍光の相違は、一部は装填の相違によるものである（表１参照）。酵素を加えない反応を、バックグラウンド補正に使用した。
【図８】図８は、固定化されたセンス、アンチセンス、およびヘアピンＲＮＡ−Ａｕ  ＮＰに対するＲＮａｓｅＩＩＩの活性を表す。この酵素については、センス鎖が固定化された場合に、より高い活性が見られる。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
発明の詳細な説明
多価粒子およびその並外れた特性を利用して、ＲＮＡを装填し、細胞膜を通過させるための方法は、今日まで開発されてこなかった。ＲＮＡに関する最も難しい問題の１つ、すなわち特にその化学的不安定性を克服する合成の経路および材料が開発される必要が、確かに存在する。
【００３５】
ＲＮＡｉによって標的遺伝子の発現を特異的に阻害できることは、明らかに有益である。例えば、多くの疾患は、特定の遺伝子や遺伝子群の異常発現に起因する。ＲＮＡｉを使用すれば、有害な遺伝子の発現を阻害することによって、疾患の症状を軽減したり、さらには治癒させたりすることができる。例えば、癌状態の、またはウイルス複製の一因となる遺伝子を阻害することができる。加えて、筋強直性ジストロフィーなどの優性遺伝性疾患を引き起こす突然変異遺伝子も阻害することができる。シクロオキシゲナーゼまたはサイトカインなどの遺伝子を阻害することによって、関節炎などの炎症性疾患も処置することができる。標的器官の例としては、限定されないが、肝臓、膵臓、脾臓、皮膚、脳、前立腺、心臓などが挙げられるであろう。加えて、ＲＮＡｉを使用すれば、真の遺伝子「ノックアウト」動物を模倣した動物を生み出して、遺伝子機能を研究することができる。企図される使用および標的のさらなる説明を、以下に提供する。
【００３６】
薬物送達も、ＲＮＡ技術によって、容易にすることができる。標的確認のためのＲＮＡ手法によって、潜在的な薬物標的をスクリーニングするための、より迅速で安価な手法が提供される。薬物ターゲティングのための情報は、薬物の潜在的な標的を阻害することによるだけではなく、阻害されるタンパク質ひいてはその経路が、有意な表現型的効果を有するかどうかを決定することによっても得られる。例えば、ＬＤＬ受容体発現の阻害によって血漿ＬＤＬレベルが上昇し、それによって、受容体の上方制御が治療的に有益であろうことが示唆されるはずである。発現アレイを使用して、標的遺伝子または経路ではない遺伝子の発現に対する阻害の応答効果を決定することができる［Ｓｈａｒｐら、「Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」１５：４８５〜４９０（２００１）］。これは、機能性経路およびネットワーク（相互作用経路）内に、遺伝子産物を配置することとなる。
【００３７】
本明細書では、ＲＮＡオリゴヌクレオチドで機能化された金ナノ粒子が、オリゴヌクレオチドの表面機能化に起因する全体特性を利用することによって、結合されたＲＮＡの安定性および有効性を、触媒的ＲＮＡ干渉経路において作用する能力を保持させつつ向上させることを開示する。
【００３８】
多価のＲＮＡ−ナノ粒子組成物（ナノ粒子が金である態様についてはＲＮＡ−Ａｕ  ＮＰ）の合成では、（凝集で明らかな通り）ＲＮＡリガンドを分解し、また、Ａｕ表面を露出させることによってＡｕ  ＮＰ相互作用を不安定にさせるようなＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼを、すべての成分が含まないようにすることが必要である。ＲＮａｓｅを含まない有機成分および溶液を調製する条件は十分に確立されているが、本明細書では、ＲＮａｓｅを含まない無機の金ナノ粒子を作製する方法を提供する。
【００３９】
用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、本明細書では同義的に使用されることに留意すべきである。用語「結合体化された」および「機能化された」も、本明細書では同義的に使用されることに留意すべきである。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「基質部位」は、ポリペプチドが認識および作用する、（一本鎖または二本鎖である）ポリヌクレオチド上の位置である。本明細書で使用する場合、「作用する」は、基質部位を認識してそれに結合するポリペプチドによってなされるいずれの酵素的機能も意味することが理解される。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチドの相互作用部位」は、ポリペプチドによって認識される、（一本鎖または二本鎖である）ポリヌクレオチド上の部位を指す。種々の態様では、ポリペプチドによるこの相互作用部位の認識によって、ポリヌクレオチドの切断が起こる。ある種の実施形態では、ポリペプチドの相互作用部位を認識するポリペプチド自体がポリヌクレオチドに作用し、他の実施形態では、ポリヌクレオチド認識部位を認識するポリペプチドが１つまたは複数のさらなるポリペプチドの活性を導いて、ポリヌクレオチドに作用する。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「標的」または「標的ポリヌクレオチド」は、所与のＲＮＡポリヌクレオチドが指向可能なポリヌクレオチドを指す。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「ＲＮＡ」は、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を指す。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「二重鎖」は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合、あるいは相補的または実質的に相補的であるポリヌクレオチド鎖間の二重鎖を安定化できるような他のいずれの方式によっても互いに塩基対を形成する、２本の相補的または実質的に相補的なポリヌクレオチドの領域を指す。例えば、２１ヌクレオチド単位を有するポリヌクレオチド鎖は、２１ヌクレオチド単位の別のポリヌクレオチドと塩基対合することができるが、各鎖上の１９塩基のみが相補的または実質的に相補的であり、その結果、「二重鎖」は１９個の塩基対を有することとなる。残りの塩基は、例えば、５’および３’突出部として存在してもよい。さらに、二重鎖内では、１００％の相補性は必要ではなく；ある二重鎖内では、実質的相補性が許容可能である。実質的相補性は、７５％以上の相補性を指す。例えば、１９塩基対からなる二重鎖におけるミスマッチによって９４．７％の相補性が生じれば、この二重鎖は、実質的に相補的となる。
【００４５】
ナノ粒子
したがって、ポリヌクレオチドを付着させるために機能化されたナノ粒子が提供される。ナノ粒子のサイズ、形状、および化学組成は、得られるポリヌクレオチドで機能化されたナノ粒子の特性に寄与する。これらの特性には、例えば、光学特性、光電子特性、電気化学特性、電子特性、様々な溶液中での安定性、磁気特性、および細孔やチャネルのサイズの変動が含まれる。サイズ、形状、および／または化学組成が様々であるナノ粒子の混合物、ならびにサイズ、形状、および化学組成が一様であるナノ粒子、ひいてはこれらの特性の混合物の使用が企図される。適切な粒子の例としては、限定されないが、凝集粒子、等方性粒子（球状粒子など）、異方性粒子（非球状の棒状体、四面体、および／または角柱など）、およびコアシェル粒子（その開示全体が参照により組み込まれる米国特許第７，２３８，４７２号および国際公開第ＷＯ２００３／０８５３９号に記載されているものなど）が挙げられる。
【００４６】
一実施形態では、ナノ粒子は金属であり、種々の態様では、ナノ粒子は、コロイド状金属である。したがって、種々の実施形態では、本発明のナノ粒子としては、金属（限定はされないが例えば、銀、金、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケル、またはナノ粒子形成に適用できる任意の他の金属を含めて）、半導体（限定はされないが例えば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、およびＺｎＳでコーティングされたＣｄＳまたはＣｄＳｅを含めて）、および磁性（例えば強磁性鉄鉱（ｆｅｒｒｏｍａｇｎｅｔｉｔｅ））コロイド材料が挙げられる。
【００４７】
また、米国特許公開第２００３／０１４７９６６号に記載されている通り、本発明のナノ粒子としては、市販されているもの、ならびに合成されるもの、例えば、溶液中での（例えばコロイド反応による）漸進的核形成によって、またはスパッタリング蒸着などの様々な物理および化学蒸着プロセスによって生成されるものが挙げられる。例えば、ＨａＶａｓｈｉ、「Ｖａｃ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．」Ａ５（４）：１３７５〜８４（１９８７）；Ｈａｙａｓｈｉ、「ＰｈｙｓｉｃｓＴｏｄａｙ」、４４〜６０（１９８７）；ＭＲＳ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、Ｊａｎｕａｒｙ  １９９０、１６〜４７を参照されたい。米国特許公開第２００３／０１４７９６６にさらに記載されている通り、企図されるナノ粒子は、当分野で既知の方法を使用して、ＨＡｕＣｌ４とクエン酸還元剤を使用して、代替的に生成される。例えば、Ｍａｒｉｎａｋｏｓら、「Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．」１１：３４〜３７（１９９９）；Ｍａｒｉｎａｋｏｓら、「Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．」１０：１２１４〜１９（１９９８）；Ｅｎｕｓｔｕｎ＆Ｔｕｒｋｅｖｉｃｈ、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」８５：３３１７（１９６３）を参照されたい。
【００４８】
ナノ粒子のサイズは、平均径で約１ｎｍから約２５０ｎｍ、平均径で約１ｎｍから約２４０ｎｍ、平均径で約１ｎｍから約２３０ｎｍ、平均径で約１ｎｍから約２２０ｎｍ、平均径で約１ｎｍから約２１０ｎｍ、平均径で約１ｎｍから約２００ｎｍ、平均径で約１ｎｍから約１９０ｎｍ、平均径で、約１ｎｍから約１８０ｎｍ、平均径で約１ｎｍから約１７０ｎｍ、平均径で約１ｎｍから約１６０ｎｍ、平均径で約１ｎｍから約１５０ｎｍ、平均径で約１ｎｍから約１４０ｎｍ、平均径で約１ｎｍから約１３０ｎｍ、平均径で約１ｎｍから約１２０ｎｍ、平均径で約１ｎｍから約１１０ｎｍ、平均径で約１ｎｍから約１００ｎｍ、平均径で約１ｎｍから約９０ｎｍ、平均径で約１ｎｍから約８０ｎｍ、平均径で約１ｎｍから約７０ｎｍ、平均径で約１ｎｍから約６０ｎｍ、平均径で約１ｎｍから約５０ｎｍ、平均径で約１ｎｍから約４０ｎｍ、平均径で約１ｎｍから約３０ｎｍ、または平均径で約１ｎｍから約２０ｎｍ、平均径で約１ｎｍから約１０ｎｍの範囲であり得る。他の態様では、ナノ粒子のサイズは、約５ｎｍから約１５０ｎｍ、約５から約５０ｎｍ、約１０から約３０ｎｍ、約１０から１５０ｎｍ、約１０から約１００ｎｍ、または約１０から約５０ｎｍ（平均径）である。ナノ粒子のサイズは、約５ｎｍから約１５０ｎｍ、約３０から約１００ｎｍ、約４０から約８０ｎｍ（平均径）である。ある方法で使用されるナノ粒子のサイズは、その特定の使用または用途に応じて変動する。ナノ粒子のある種の物理的特徴（例えば、本明細書に記述する通りに得ることができる光学特性または表面積量）を最適化するために、サイズの変動が、有利に使用される。
【００４９】
ナノ粒子へのポリヌクレオチドの付着
したがって、二重鎖ＲＮＡがナノ粒子と結合するような、ポリヌクレオチドが付着されたナノ粒子が提供される。ある態様では、ナノ粒子と結合するＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。二重鎖ＲＮＡとナノ粒子との様々な手段を介した結びつきが企図される。
【００５０】
本明細書に記述する方法によれば、クエン酸で安定化された金ナノ粒子が合成され、この粒子は、０．１％ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で、攪拌しながら１２時間処理された後、１２１℃で６０分間オートクレーブされる。ある態様では、ＤＥＰＣでのナノ粒子の処理は、約１時間行われる。種々の態様では、ＤＥＰＣでのナノ粒子の処理は、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０、約１０．５、約１１、約１１．５、約１２、約１２．５、約１３、約１３．５、約１４、約１４．５、約１５、約２０、約２５、約３０、約３日間、約７日間、またはそれ以上の間行われる。
【００５１】
一実施形態では、一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、本明細書に記述するスペーサーを場合によっては介して、ナノ粒子に直接的に付着される。一本鎖ＲＮＡヌクレオチドがナノ粒子に付着されるようなこうした態様では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、ヘアピン構造を形成するのに適した条件下で互いにハイブリッド形成できるような、十分に相補的である２つの部分を含む。
【００５２】
別の実施形態では、二重鎖ＲＮＡは、二重鎖ＲＮＡのうちの片方の鎖のみがナノ粒子に直接的に付着するように、本明細書に記述するスペーサーを場合によっては介して、ナノ粒子上に直接的に固定化される。
【００５３】
他の実施形態では、ナノ粒子に付着されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。ＤＮＡがナノ粒子に付着される場合には、ＤＮＡは、ナノ粒子に付着するＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡ二重鎖の一本鎖領域とのハイブリッド形成が行われることによってナノ粒子にＲＮＡ二重鎖が結合するように、このＲＮＡ二重鎖の一本鎖領域と十分に相補的である配列から構成される。一態様では、二重鎖ＲＮＡの一本鎖領域は、突出末端である。種々の態様では、ＤＮＡは、その二本鎖分子が、二重鎖ＲＮＡの一本鎖領域とハイブリッド形成する一本鎖領域も含みさえすれば、一本鎖または二本鎖である。
【００５４】
ポリヌクレオチドの方向性
センス  対  アンチセンス
ある態様では、ナノ粒子に付着されるＲＮＡの鎖は、「センス」鎖であり、二重鎖ＲＮＡの相補鎖は、センス鎖とはハイブリッド形成するが、ナノ粒子には付着しない。他の態様では、ナノ粒子に付着されるＲＮＡの鎖は、「アンチセンス」鎖であり、二重鎖ＲＮＡの相補鎖は、アンチセンス鎖とはハイブリッド形成するが、ナノ粒子には付着しない。本明細書で使用する場合、「センス」鎖は、標的ポリヌクレオチドと同一の鎖であり、「アンチセンス」鎖は、標的ポリヌクレオチドと相補的な鎖である。センス鎖またはアンチセンス鎖のナノ粒子への付着によって、二本鎖ＲＮＡのナノ粒子に対する方向性の一態様が決定される。
【００５５】
センス鎖がナノ粒子に付着し、かつアンチセンス鎖がセンス鎖とはハイブリッド形成するがナノ粒子には付着しないＲＮＡ二重鎖は、アンチセンス鎖がナノ粒子に付着し、かつセンス鎖がアンチセンス鎖とはハイブリッド形成するがナノ粒子には付着しないＲＮＡ二重鎖よりも活性が高いことを、本明細書で実証する（実施例５を参照されたい）。理論に拘泥されないが、ＲＮＡ二重鎖のナノ粒子への付着の方向性（限定はされないが例えば、ＲＮＡ二重鎖のセンス鎖とアンチセンス鎖のどちらがナノ粒子に付着するか）は、本開示により企図されるポリペプチドのための基質を提供するために重要であると考えられる。ある態様では、ポリペプチドは、Ｄｉｃｅｒである。ある態様では、ポリペプチドは、Ａｒｇｏｎａｕｔｅである。
【００５６】
ポリペプチド（ｐｏｌｙｅｐｔｉｄｅ）相互作用部位の位置
ある実施形態では、ナノ粒子に付着されるポリヌクレオチドがＲＮＡであることが、本開示によって企図される。また、ＲＮＡ内の配列に位置するタンパク質相互作用部位がナノ粒子に対して近くまたは遠くになるように、ポリヌクレオチドがナノ粒子に付着されることも企図される。これらの態様では、「近く」および「遠く」は、ポリヌクレオチド上の中間点を指す。例えば、ナノ粒子に付着するポリヌクレオチドの長さが２０塩基であれば、その中間点は、ナノ粒子から１０塩基の位置になり、タンパク質相互作用部位は、この第１０塩基に対して近くまたは遠くであり得る。
【００５７】
本明細書に記述する方法を使用して、ナノ粒子上にＲＮＡポリヌクレオチドを固定化させることによって、本開示のポリペプチドによる二重鎖への接近を制御することができる。
【００５８】
ある実施形態では、様々な長さのスペーサー配列を利用して、ナノ粒子上のＲＮＡポリヌクレオチドの本数およびＲＮＡポリヌクレオチド間の距離を変えることによって、標的ポリヌクレオチドの分解速度が制御される。理論に拘泥されないが、タンパク質相互作用部位が上で述べた通りの近位置になるようにナノ粒子上のＲＮＡポリヌクレオチドを固定化させることによって、標的ポリヌクレオチド分解の速度を制御することができる。この態様は、下に記述する通りの表面密度と組み合わせて、本開示のポリペプチドのタンパク質相互作用部位への接近を可能にしたり妨げたりすることができる。
【００５９】
スペーサーについて、以下でさらに詳細に記述する。
【００６０】
スペーサー
ある種の態様では、オリゴヌクレオチドがスペーサーを介してナノ粒子に付着するものを含めた、機能化されたナノ粒子が企図される。本明細書で使用する場合、「スペーサー」は、それ自体は遺伝子発現の調節に関与しないが、ナノ粒子と機能性オリゴヌクレオチドとの間の距離を広げるのに、または多重コピーでナノ粒子に付着する場合には個々のオリゴヌクレオチド間の距離を広げるのに役立つ部分を意味する。したがって、スペーサーは、オリゴヌクレオチドが同一の配列を有するとしても異なる配列を有するとしても、個々のオリゴヌクレオチド間に並べて配置されることが企図される。一態様では、スペーサーは、存在する場合、有機部分である。別の態様では、スペーサーは、これに限定されないが水溶性ポリマーを含めたポリマーや、核酸、ポリペプチド、オリゴ糖、炭水化物、脂質、エチルグリコール、またはこれらの組み合わせである。
【００６１】
ある種の態様では、スペーサーは、スペーサーに共有結合的に結合した、ナノ粒子と結合可能なポリヌクレオチドを有する。こうしたポリヌクレオチドは、上で述べたのと同じポリヌクレオチドである。スペーサーとナノ粒子との結合の結果、ポリヌクレオチドは、ナノ粒子の表面との距離が離れ、ポリヌクレオチドの標的と、よりハイブリッド形成しやすくなる。スペーサーがポリヌクレオチドである例では、種々の実施形態におけるスペーサーの長さは、少なくとも約１０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、さらには３０ヌクレオチド超である。スペーサーは、ポリヌクレオチドがナノ粒子とまたは標的ポリヌクレオチドと結合できるようになる能力を妨げないような任意の配列を有することができる。スペーサー同士が互いに相補的な配列を有するべきではないし、スペーサーはオリゴヌクレオチドの配列と相補的な配列を有するべきではないが、スペーサーは、標的ポリヌクレオチドと、すべてまたは部分的に相補的であり得る。ある種の態様では、ポリヌクレオチドスペーサーの塩基は、すべてアデニン、すべてチミン、すべてシチジン、すべてグアニン、すべてウラシル、またはすべて他の何らかの修飾塩基である。
【００６２】
表面密度
本明細書で提供するナノ粒子は、ナノ粒子間および単一ナノ粒子上のポリヌクレオチド鎖間の協同的挙動をもたらすのに、種々の態様において十分であるような、ポリヌクレオチドのナノ粒子表面上での充填密度を有する。別の態様では、ナノ粒子間の協同的挙動によって、ヌクレアーゼ分解に対するポリヌクレオチドの耐性が増大する。さらに別の態様では、細胞によるナノ粒子の取り込みは、ナノ粒子と結合するポリヌクレオチドの密度によって影響される。参照により本明細書にその全体が組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２００８／６５３６６に記載の通り、ナノ粒子の表面上のポリヌクレオチドの密度がより高いことは、細胞によるナノ粒子の取り込みの増大と関連する。
【００６３】
ナノ粒子を安定させるのに妥当な表面密度、また、所望の組み合わせのナノ粒子とポリヌクレオチドのための表面密度を得るのに必要な条件は、経験的に決定することができる。安定したナノ粒子−オリゴヌクレオチド組成物を提供するためには、一般に、少なくとも２ｐｍｏｌ／ｃｍ２の表面密度が妥当であろう。ある態様では、表面密度は、少なくとも１５ｐｍｏｌ／ｃｍ２である。また、ポリヌクレオチドが、少なくとも２ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも３ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも４ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも６ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも７ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも８ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも９ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１７５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、またはそれ以上の表面密度でナノ粒子に結合されるような方法も提供する。
【００６４】
ナノ粒子表面上のポリヌクレオチドの密度によって、ナノ粒子の表面上のポリヌクレオチドおよび／またはナノ粒子自体と、特定のポリペプチドとの相互作用が調節されることが示されている。ナノ粒子と結合したポリヌクレオチドとの相互作用が、ポリヌクレオチドの密度に起因する立体障害を基にして妨げられる可能性があるポリペプチドも、種々の条件下では存在する。ポリヌクレオチドとポリペプチドとの相互作用が立体障害によって妨げられないことが望ましい態様では、ポリペプチドをポリヌクレオチドと相互作用させるために、ナノ粒子表面上のポリヌクレオチドの密度を低下させる。
【００６５】
ポリヌクレオチド表面密度によって、ナノ粒子と結合したポリヌクレオチドの安定性が調節されることも示されている。一実施形態では、ナノ粒子と結合していない同一のＲＮＡポリヌクレオチドの半減期と少なくとも実質的に同じ半減期であるような、ナノ粒子と結合したＲＮＡポリヌクレオチドが提供される。他の実施形態では、ナノ粒子と結合したＲＮＡポリヌクレオチドの半減期は、ナノ粒子と結合していない同一のＲＮＡポリヌクレオチドの半減期よりも、約５％以上、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約６倍以上、約７倍以上、約８倍以上、約９倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、約６０倍以上、約７０倍以上、約８０倍以上、約９０倍以上、約１００倍以上、約２００倍以上、約３００倍以上、約４００倍以上、約５００倍以上、約６００倍以上、約７００倍以上、約８００倍以上、約９００倍以上、約１０００倍以上、約５０００倍以上、約１０，０００倍以上、約５０，０００倍以上、約１００，０００倍以上、約２００，０００倍以上、約３００，０００倍以上、約４００，０００倍以上、約５００，０００倍以上、約６００，０００倍以上、約７００，０００倍以上、約８００，０００倍以上、約９００，０００倍以上、約１，０００，０００倍以上、またはそれ以上長い。
【００６６】
ポリヌクレオチドを付着させる方法
本方法に使用を企図されるポリヌクレオチドとしては、任意の手段を介してナノ粒子に結合されるポリヌクレオチドが挙げられる。ポリヌクレオチドをナノ粒子に付着させる手段にかかわらず、種々の態様における付着は、５’連結、３’連結、ある種類の内部連結、またはこれらの付着の任意の組み合わせを介して行われる。
【００６７】
一態様では、ナノ粒子またはポリヌクレオチドまたはその両方が、ポリヌクレオチドをナノ粒子に付着させるために官能化される。ナノ粒子およびポリヌクレオチドを官能化させる方法は、当分野で既知である。例えば、３’末端または５’末端にアルカンチオールを用いて官能化されたポリヌクレオチドは、金ナノ粒子に容易に付着する。Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｗｅｌｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ３９ｔｈ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎａｎｏｐｈａｓｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｔｅｘ．」、１０９〜１２１頁（１９９５）を参照されたい。Ｍｕｃｉｃら、［Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５５５〜５５７（１９９６）］（平坦な金表面に３’チオールＤＮＡを付着させる方法を記載している）も参照されたい。このアルカンチオール法はまた、オリゴヌクレオチドを他の金属、半導体、および磁性コロイドに、または本明細書に記述する他の種類のナノ粒子に付着させるために使用することができる。オリゴヌクレオチドを固体表面に付着させるための他の官能基としては、ホスホロチオアート基（例えば、オリゴヌクレオチド−ホスホロチオアートと金表面との結合については、米国特許第５，４７２，８８１号を参照のこと）、置換型アルキルシロキサン［例えば、オリゴヌクレオチドとシリカおよびガラス表面との結合については、Ｂｕｒｗｅｌｌ、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、４、３７０〜３７７（１９７４）、ならびに、ＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」、１０３、３１８５〜３１９１（１９８１）、アミノアルキルシロキサンの結合について、またメルカプトアルキルシロキサンの類似の結合については、Ｇｒａｂａｒら、［Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ、６７、７３５〜７４３］を参照のこと］が挙げられる。５’チオヌクレオシドまたは３’チオヌクレオシドを有するポリヌクレオチドも、オリゴヌクレオチドを固体表面に付着させるために使用することができる。次の参考文献は、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着させるために用いることができる他の方法について記載している：Ｎｕｚｚｏら、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」、１０９、２３５８（１９８７）（金に対してジスルフィド）；ＡｌｌａｒａおよびＮｕｚｚｏ、「Ｌａｎｇｍｕｉｒ」、１、４５（１９８５）（アルミニウムに対してカルボン酸）；ＡｌｌａｒａおよびＴｏｍｐｋｉｎｓ、「Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．」、４９、４１０〜４２１（１９７４）（銅に対してカルボン酸）；Ｉｌｅｒ、「Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｏｆ  Ｓｉｌｉｃａ」、Ｃｈａｐｔｅｒ  ６、（Ｗｉｌｅｙ  １９７９）（シリカに対してカルボン酸）；ＴｉｍｍｏｎｓおよびＺｉｓｍａｎ、「Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．」、６９、９８４〜９９０（１９６５）（白金に対してカルボン酸）；ＳｏｒｉａｇａおよびＨｕｂｂａｒｄ、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」、１０４、３９３７（１９８２）（白金に対して芳香環化合物）；Ｈｕｂｂａｒｄ、「Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．」、１３、１７７（１９８０）（白金に対してスルホラン、スルホキ��ド、および他の機能性溶媒）；Ｈｉｃｋｍａｎら、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」、１１１、７２７１（１９８９）（白金に対してイソニトリル）；ＭａｏｚおよびＳａｇｉｖ、「Ｌａｎｇｍｕｉｒ」、３、１０４５（１９８７）（シリカに対してシラン）；ＭａｏｚおよびＳａｇｉｖ、「Ｌａｎｇｍｕｉｒ」、３、１０３４（１９８７）（シリカに対してシラン）；Ｗａｓｓｅｒｍａｎら、「Ｌａｎｇｍｕｉｒ」、５、１０７４（１９８９）（シリカに対してシラン）；ＥｌｔｅｋｏｖａおよびＥｌｔｅｋｏｖ、「Ｌａｎｇｍｕｉｒ」、３、９５１（１９８７）（二酸化チタンおよびシリカに対して、芳香族カルボン酸、アルデヒド、アルコール、およびメトキシ基）；Ｌｅｃら、「Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．」、９２、２５９７（１９８８）（金属に対して、硬いリン酸塩）。
【００６８】
米国特許出願第０９／７６０，５００号および第０９／８２０，２７９号、ならびに国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／０１１９０号およびＰＣＴ／ＵＳ０１／１００７１号は、環状ジスルフィドを用いて官能化されたオリゴヌクレオチドを記載している。ある種の態様における環状ジスルフィドは、２個の硫黄原子を含めて、環内に５または６個の原子を有する。適切な環状ジスルフィドは、市販品として入手するか、既知の手順によって合成する。還元型の環状ジスルフィドによる官能化も企図される。３員環ジスルフィドアンカー基による官能化は、参照により本明細書にその全体が組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２００８／６３４４１に記載されている。
【００６９】
環状ジスルフィドによる官能化が利用されるある種の態様では、オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のリンカーを介して、ナノ粒子に付着される。一実施形態では、リンカーは、環状ジスルフィドに付着した炭化水素部分を含む。適切な炭化水素は市販品として入手でき、これを環状ジスルフィドに付着させる。一態様では、炭化水素部分は、ステロイド残基である。環状ジスルフィドに付着させたステロイド残基を含むリンカーを使用して調製されるオリゴヌクレオチド−ナノ粒子組成物は、リンカーとしてアルカンチオールまたは非環状ジスルフィドを使用して調製される組成物よりも安定しており、ある種の例では、オリゴヌクレオチド−ナノ粒子組成物は、３００倍も安定していることが判明している。ある種の実施形態では、環状ジスルフィドの２個の硫黄原子は、両方の硫黄原子が同時にナノ粒子に付着できるように互いに十分に近接している。他の態様では、２個の硫黄原子は、互いに隣接する。利用される態様では、炭化水素部分は、ナノ粒子の表面を覆う疎水性表面を与えるのに十分に大きい。
【００７０】
他の態様では、表面上にオリゴヌクレオチドを付着させるための方法は、参照により本明細書にその開示全体が組み込まれる米国特許出願第０９／３４４，６６７号（１９９９年６月２５日出願）；第０９／６０３，８３０号（２０００年６月２６日出願）；第０９／７６０，５００号（２００１年１月１２日出願）；第０９／８２０，２７９号（２００１年３月２８日出願）；第０９／９２７，７７７号（２００１年８月１０日出願）；および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１２７８３号（１９９７年７月２１日出願）；ＰＣＴ／ＵＳ００／１７５０７号（２０００年６月２６日出願）；ＰＣＴ／ＵＳ０１／０１１９０号（２００１年１月１２日出願）；ＰＣＴ／ＵＳ０１／１００７１号（２００１年３月２８日出願）に記載された熟成プロセスに基づいている。熟成プロセスによって、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド組成物に安定性および選択性の向上が提供される。このプロセスは、ナノ粒子に結合できる官能基を含む部分と、一態様では共有結合的に結合しているオリゴヌクレオチドを提供することを含む。この部分および官能基は、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に（化学吸着または共有結合によって）結合させることができるものである。例えば、アルカンチオール、アルカンジスルフィド、または環状ジスルフィドが５’または３’末端に共有結合的に結合したオリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドと、金ナノ粒子を含めた様々なナノ粒子とを結合する。
【００７１】
「熟成」ステップの使用によって生成した組成物は、「熟成」ステップなしで生成したものよりかなり安定していることが発見されている。この「熟成」プロセスによって、ナノ粒子表面上でのオリゴヌクレオチドの密度の増大が実現される。「熟成」ステップによって実現される表面密度は、ナノ粒子のサイズや種類に、また、オリゴヌクレオチドの長さ、配列、および濃度に依存することとなる。ナノ粒子を安定させるのに妥当な表面密度、また、所望の組み合わせのナノ粒子とポリヌクレオチドのための表面密度を得るのに必要な条件は、経験的に決定することができる。一般に、少なくとも２ｐｍｏｌ／ｃｍ２の表面密度が、安定したナノ粒子−オリゴヌクレオチド組成物を提供するのに妥当であるだろう。それにもかかわらず、本明細書に開示する通り、様々なオリゴヌクレオチド密度が企図される。
【００７２】
「熟成」ステップは、ナノ粒子へのオリゴヌクレオチドの最初の結合の後の、機能化されたナノ粒子の生成に組み込まれる。簡単に言うと、少なくともある程度のオリゴヌクレオチドを官能基を介してナノ粒子に結合させるのに十分な時間、オリゴヌクレオチドをナノ粒子と水中で接触させる。こうした時間は、経験的に決定することができる。一態様では、約１２〜２４時間という時間が企図される。オリゴヌクレオチドの結合に適した他の条件も、経験的に決定することができる。例えば、約１０〜２０ｎＭの濃度のナノ粒子、および室温でのインキュベーションが企図される。
【００７３】
次に、水に少なくとも１種の塩を加えて、塩溶液を生成する。塩は、例えば、限定されないが、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、これらのうちの２種以上の組み合わせ、またはリン酸緩衝液中のこれらの塩のうちの１種、を含めた任意の水溶性の塩である。塩は、濃縮された溶液として、または代替形態では固体として添加される。種々の実施形態では、塩は、１度にすべて添加されるか、時間をかけて徐々に添加される。「時間をかけて徐々に」は、塩が、ある期間をあけて、少なくとも２回に分けて添加されることを意味する。適切な時間間隔は、経験的に決定することができる。
【００７４】
塩溶液のイオン強度は、オリゴヌクレオチド同士の静電反発力、および、正に帯電したナノ粒子に対する負に帯電したオリゴヌクレオチドの静電引力、または負に帯電したナノ粒子から受ける負に帯電したオリゴヌクレオチドの静電反発力を、少なくとも部分的に抑えるのに十分でなければならない。時間をかけて徐々に塩を添加することによって静電引力および静電反発力を徐々に弱めていくことで、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの表面密度が最大になる。適切なイオン強度は、各塩または塩の組み合わせについて、経験的に決定することができる。一態様では、最終濃度が約０．０１Ｍから約１．０Ｍの塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液が利用され、塩化ナトリウムの濃度は、時間をかけて徐々に上げられる。別の態様では、最終濃度が約０．０１Ｍから約０．５Ｍ、または約０．１Ｍから約０．３Ｍの塩化ナトリウムが利用され、塩化ナトリウムの濃度は、時間をかけて徐々に上げられる。
【００７５】
塩を添加した後、追加のオリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させて、安定したナノ粒子−オリゴヌクレオチド組成物を生成するために、オリゴヌクレオチドとナノ粒子を、塩溶液中で、ある期間インキュベートする。本明細書に記述している通り、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの表面密度の増大により、該組成物は安定化する。このインキュベーションの時間は、経験的に決定することができる。例として、一態様では、約２４〜４８という総インキュベーション時間（ここでは、塩濃度は、この総時間を通して徐々に上げられる）が企図される。塩溶液中でのこの第２のインキュベーション期間は、本明細書では「熟成」ステップと呼ばれる。この「熟成」ステップに適した他の条件も、経験的に決定することができる。例として、熟成ステップは、室温でのインキュベーションおよびｐＨ７．０を用いて実施される。
【００７６】
「熟成」の使用によって生成される組成物は一般に、「熟成」ステップなしで生成されるものよりも安定している。上で述べた通り、この安定性の向上は、「熟成」ステップにより実現されるような、ナノ粒子表面上のオリゴヌクレオチドの密度の増大によるものである。「熟成」ステップによって実現される表面密度は、ナノ粒子のサイズや種類に、また、オリゴヌクレオチドの長さ、配列、および濃度に依存することとなる。
【００７７】
本明細書で使用する場合、「安定した」は、組成物が作製されてから少なくとも６か月の期間の間、多数のオリゴヌクレオチドがナノ粒子に付着したままであり、かつ、オリゴヌクレオチドが、核酸を検出する方法で、またナノ製造（ｎａｎｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）の方法で直面する標準の条件下で、核酸およびオリゴヌクレオチド標的とハイブリッド形成することができることを意味する。
【００７８】
ポリヌクレオチド
本明細書で使用する場合、用語「ヌクレオチド」またはその複数形は、本明細書で論じる通りの改変された形や、その他当分野で既知のものと同義的である。ある種の例では、当分野では、天然に存在するヌクレオチド、ならびに重合可能なヌクレオチドの改変形態を包含する、用語「核酸塩基」が使用される。したがって、ヌクレオチドまたは核酸塩基は、天然に存在する核酸塩基、すなわちアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、ならびに天然に存在しない核酸塩基、すなわちキサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ’，Ｎ’−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−（Ｃ３〜Ｃ６）−アルキニル−シトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、プソイドイソシトシン、２−ヒロドキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、ならびに、Ｂｅｎｎｅｒら、米国特許第５，４３２，２７２号およびＳｕｓａｎ  Ｍ．ＦｒｅｉｅｒおよびＫａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ  Ａｌｔｍａｎｎ、１９９７、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、第２５巻：４４２９〜４４４３頁に記載されている「天然に存在しない」核酸塩基、を意味する。用語「核酸塩基」には、既知のプリン複素環およびピリジン複素環だけでなく、それらの複素環式類似体および互変異性体も含まれる。さらに、天然に存在するおよび天然に存在しない核酸塩基としては、参照により本明細書にそれぞれその全体が組み込まれる、米国特許第３，６８７，８０８号（Ｍｅｒｉｇａｎら）に；「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｓ．Ｔ．ＣｒｏｏｋｅおよびＢ．Ｌｅｂｌｅｕ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３中の、ＳａｎｇｈｖｉによるＣｈａｐｔｅｒ  １５に；Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、１９９１、「Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」、３０：６１３〜７２２（特に６２２頁および６２３頁参照）に；また、「ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９０、８５８〜８５９頁、Ｃｏｏｋ、「Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １９９１」、６、５８５〜６０７に開示されているものも挙げられる。種々の態様では、ポリヌクレオチドは、最も典型的な意味ではヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基として機能する、ある種の「万能塩基」を含めて、核酸塩基のように機能することができる複素環式化合物などの化合物を含めた１種または複数の「ヌクレオシド塩基」または「塩基単位」も含む。万能塩基としては、３−ニトロピロール、任意選択で置換されたインドール（例えば、５−ニトロインドール）、および任意選択で置換されたヒポキサンチンが挙げられる。他の望ましい万能塩基としては、当分野で既知の万能塩基を含めた、ピロール誘導体、ジアゾール誘導体、またはトリアゾール誘導体が挙げられる。
【００７９】
ポリヌクレオチドはまた、修飾核酸塩基も含むことができる。「修飾塩基」は、当分野では、天然の塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、および／またはチミン）と対合可能であるかつ／または天然に存在しない塩基と対合可能であるものであると理解される。例示的な修飾塩基は、参照により本明細書にその開示が組み込まれるＥＰ１０７２６７９およびＷＯ９７／１２８９６に記載されている。修飾核酸塩基としては、限定されないが、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、および２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシンならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシルおよびシトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオールアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換型アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、および他の５−置換型ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられる。さらなる修飾塩基としては、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換型フェノオキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）などのＧ−クランプ、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）、などの三環式ピリミジンが挙げられる。修飾塩基には、プリン塩基またはピリミジン塩基が、例えば７−デアザアデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、および２−ピリドンなどの他の複素環で置き換えられたものも含めることができる。追加の核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、「Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８〜８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９０、に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、１９９１、「Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」、３０：６１３、によって開示されているもの、およびＣｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａ���ｉｏｎｓ」、Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．、Ｃｈａｐｔｅｒ  １５、２８９〜３０２頁、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３、によって開示されているものが挙げられる。これらの塩基の中には、結合親和性を増大させるのに有用なものもあり、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含めた、５−置換型ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換型プリンが挙げられる。５−メチルシトシン置換塩基は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃向上させることが示されており、ある種の態様では、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾塩基と組み合わされる。参照により本明細書にその開示が組み込まれる、米国特許第３，６８７，８０８号、米国特許第４，８４５，２０５号；第５，１３０，３０２号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７；第５，６４５，９８５号；第５，８３０，６５３号；第５，７６３，５８８号；第６，００５，０９６号；第５，７５０，６９２号、および第５，６８１，９４１号を参照されたい。
【００８０】
所定の配列のポリクレオチドを作製する方法は、周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」：「Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（第２版  １９８９）、およびＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（編）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ」、初版（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１）を参照されたい。固相合成法は、ポリリボヌクレオチドとポリデオキシリボヌクレオチドの両方について好ましい（ＤＮＡを合成する周知の方法は、ＲＮＡを合成するのにも有用である）。ポリリボヌクレオチドはまた、酵素的に調製することもできる。天然に存在しない核酸塩基も、ポリヌクレオチドに組み込むことができる。例えば、米国特許第７，２２３，８３３号；Ｋａｔｚ、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」、７４：２２３８（１９５１）；Ｙａｍａｎｅら、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」、８３：２５９９（１９６１）；Ｋｏｓｔｕｒｋｏら「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、１３：３９４９（１９７４）；Ｔｈｏｍａｓ、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」、７６：６０３２（１９５４）；Ｚｈａｎｇら、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」、１２７：７４〜７５（２００５）；およびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎら、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」、１２４：１３６８４〜１３６８５（２００２）を参照されたい。
【００８１】
ポリヌクレオチドまたはその改変形を用いて機能化されたナノ粒子は、一般に、長さが約５ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドを含む。より詳細には、ナノ粒子は、長さが約５から約９０ヌクレオチド、長さが約５から約８０ヌクレオチド、長さが約５から約７０ヌクレオチド、長さが約５から約６０ヌクレオチド、長さが約５から約５０ヌクレオチド、長さが約５から約４５ヌクレオチド、長さが約５から約４０ヌクレオチド、長さが約５から約３５ヌクレオチド、長さが約５から約３０ヌクレオチド、長さが約５から約２５ヌクレオチド、長さが約５から約２０ヌクレオチド、長さが約５から約１５ヌクレオチド、長さが約５から約１０ヌクレオチドであるポリヌクレオチド、および所望の結果を実現できる範囲の具体的に開示されたサイズの長さであるすべてのポリヌクレオチド中間体、を用いて機能化される。したがって、長さが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００ヌクレオチドまたはそれ以上であるポリヌクレオチドが企図される。
【００８２】
ナノ粒子への付着のために企図されるポリヌクレオチドには、標的ポリヌクレオチドから発現される遺伝子産物の発現を調節するものが含まれる。したがって、標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成してＲＮａｓｅ（例えば、ＲＮａｓｅＨ）活性を誘発するＲＮＡポリヌクレオチドや、二本鎖ポリヌクレオチドとハイブリッド形成して転写を阻害する三重らせん形成ポリヌクレオチドや、標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成して翻訳を阻害するリボザイムが企図される。
【００８３】
種々の態様では、特定のｍＲＮＡが標的にされる場合、単一のナノ粒子結合因子組成物が、同じ転写物の多重コピーに結合する能力を有する。一態様では、同一の（すなわち、各ヌクレオチドが同じ長さと同じ配列を有する）ポリヌクレオチドで機能化されたナノ粒子が提供される。他の態様では、ナノ粒子は、２種以上の同一ではない（すなわち、少なくとも１つの付着されるポリヌクレオチドが、異なる長さおよび／または異なる配列を有するという点で、他の少なくとも１つの付着されるポリヌクレオチドと異なる）ポリヌクレオチドで機能化される。異なるポリヌクレオチドがナノ粒子に付着される態様では、これらの異なるポリヌクレオチドが、異なる位置または基質部位の同じ単一の標的ポリヌクレオチドと結合する、あるいは、異なる遺伝子産物をコードする異なる標的ヌクレオチドと結合する。したがって、種々の態様では、単一のナノ粒子結合因子組成物が、２種以上の遺伝子産物を標的にする。したがって、ポリヌクレオチドは、所望のレベルの遺伝子発現阻害が行われるために必要とされるような、標的ポリヌクレオチド内の１つまたは複数の特定領域で、または標的ポリヌクレオチドの全長にわたって、標的特異的なポリヌクレオチドである。
【００８４】
ポリヌクレオチドの特色
本開示は、種々の実施形態において、遺伝子調節に有用である多価ＲＮＡ−ナノ粒子組成物を提供する。低分子干渉ＲＮＡは、標的ＲＮＡ（一般にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））の一部との相補性を有する（すなわちハイブリッド形成できる）二本鎖ＲＮＡ因子である。こうした相補性は、一般には、１００％であるが、所望により、例えば、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のように低くすることができる。例えば、２１塩基のうちの１９塩基を塩基対合させることができる。したがって、本方法において使用されるオリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリッド形成可能であるために、所望の標的核酸と１００％相補的である必要はないことが理解されるであろう。さらに、オリゴヌクレオチドは、介在または隣接セグメントがハイブリッド形成事象（例えば、ループ構造またはヘアピン構造）に関与しないように、１つまたは複数のセグメントを飛び越えて互いにハイブリッド形成することができる。任意の所与のオリゴヌクレオチド間の相補性（％）は、当分野で既知のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌｓ）プログラムおよびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラムを使用して、機械的に決定することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」、２１５：４０３〜４１０；ＺｈａｎｇおよびＭａｄｄｅｎ、１９９７、「Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．」、７：６４９〜６５６）。
【００８５】
ある態様では、様々な対立遺伝子変異体の中から選択することが望まれる場合、標的配列と他の対立遺伝子配列を有効に識別するために、標的遺伝子に対する１００％相補性が必要となる。対立遺伝子標的から選択する際に、長さの選択も重要な要素である。なぜなら、長さの選択は、相補性（％）および対立遺伝子間の違いを区別する能力に関与するもう１つの要素であるからである。
【００８６】
「ハイブリッド形成」は、Ｗａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋのＤＮＡ相補性の規則、Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ結合の規則、または当分野で既知の他の配列特異的結合の規則に従う水素結合による、核酸の二本または三本の鎖の間の相互作用を意味する。ハイブリッド形成は、当分野で既知の、様々な厳密性の条件下で実施することができる。
【００８７】
用語「ＲＮＡ」は、二本の別の鎖の二重鎖、ならびに、一本鎖、三重鎖、または四重鎖構造を含む。一本鎖ＲＮＡの例は、ヘアピンループを有するＲＮＡである。このＲＮＡ配列は、相補的塩基対合作用を介して低分子干渉ＲＮＡと標的ＲＮＡとを結合させるのに十分な長さである必要がある。本明細書に開示する方法に有用なＲＮＡは、様々な長さのものであり得る。該ＲＮＡは、本明細書に開示する通り、二重鎖の一本鎖と標的ポリヌクレオチドとのハイブリッド形成を適切な条件下で可能にする、標的ポリヌクレオチド内の配列と十分に相補的な、二重鎖の一本鎖内のドメインを含み、二重鎖の該ドメインと標的ポリヌクレオチド内の該配列とのハイブリッド形成によって、ポリペプチドによって認識される基質部位がもたらされる。このドメインの長さは、一般に１０ヌクレオチド以上であり、標的ＲＮＡとハイブリッド形成するのに十分な長さ；詳細には１０〜１００ヌクレオチド；より詳細には１０と８０ヌクレオチドとの間の任意の整数値（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、および１００など）である。「十分な長さ」は、意図される機能を所期の条件下で提供するのに必要なサイズの長さである１０ヌクレオチド以上のオリゴヌクレオチドを意味する。
【００８８】
ＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで重合させることもできるし、組み換えＲＮＡであってもよいし、キメラ配列を含有することもできるし、これらの群の誘導体であってもよい。種々の実施形態では、ＲＮＡは、標的遺伝子の発現が阻害されるような、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、または任意の適切な組み合わせを含有する。
【００８９】
送達されるＲＮＡは、細胞質内または核内にとどまることができる。ＲＮＡは、細胞に送達されて、内因性または外因性ヌクレオチド配列の発現を阻害したり、細胞に天然には伴われない特定の生理的特徴を与えたりすることもできる。
【００９０】
ＲＮＡを、治療的である細胞変化をもたらすために細胞に送達することができる。ＲＮＡまたは他の遺伝子材料を治療目的で送達すること（疾患の処置または予防を含めた、動物の健康を向上させる技術）は、遺伝子治療と呼ばれる。ＲＮＡは、ｉｎ  ｓｉｔｕで生体に直接的に、またはｅｘ  ｖｉｖｏで細胞に移入され、次いでこれが生体内に移植されることによって間接的に、送達することができる。タンパク質の産生をブロックするためには、または、あるＲＮＡの量を低下させるためには、ＲＮＡが細胞内に入ることが必要である。本開示によって企図されるポリヌクレオチド配列を、さらに以下で述べる。
【００９１】
ポリヌクレオチド配列およびハイブリッド形成
ある態様では、本開示は、特定の核酸を標的にする方法を提供する。いかなる種類の核酸も標的にすることができ、本方法は、例えば、遺伝子発現の治療的調節のために使用することができる（例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２３２５を参照されたい）。本発明の方法により標的にされる核酸の例としては、遺伝子（例えば、特定の疾患に関連する遺伝子）、ウイルスＲＮＡ、またはｍＲＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖の核酸が挙げられるが、これに限定されない。
【００９２】
標的核酸は、当分野で既知でもある通り、細胞、組織サンプル、または生体液中に存在し得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」：「Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（第２版、１９８９）、およびＢ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、「Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １」（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９５）を参照されたい。
【００９３】
用語「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」は、翻訳開始コドンからのいずれかの方向（すなわち５’または３’）の隣接するヌクレオチドを包含する、ｍＲＮＡまたは遺伝子の部分を指す。同様に、用語「終止コドン領域」および「翻訳終結コドン領域」は、翻訳終結コドンからのいずれかの方向（すなわち５’または３’）の隣接するヌクレオチドを包含するようなｍＲＮＡまたは遺伝子の部分を指す。したがって、「開始コドン領域」（または「翻訳開始コドン領域」）および「終止コドン領域」（または翻訳終結コドン領域」）は、機能化されたナノ粒子上のオリゴヌクレオチドで有効に標的にされ得るすべての領域である。
【００９４】
他の標的領域としては、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、すなわち、ｍＲＮＡの５’キャップ部位と翻訳開始コドンとの間のヌクレオチド（または遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含む、翻訳開始コドンから５’方向のｍＲＮＡの部分と、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、すなわち、ｍＲＮＡの翻訳終結コドンと３’末端との間のヌクレオチド（または遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含む、翻訳終結コドンから３’方向のｍＲＮＡの部分が挙げられる。ｍＲＮＡの５’キャップ部位は、５’−５’三リン酸連結を介してｍＲＮＡの最も５’側の残基（５’−ｍｏｓｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ）と連結されるＮ７−メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ部位は、５’キャップ構造自体、ならびに該キャップ部位に隣接する最初の５０ヌクレオチドを含むと考えられる。
【００９５】
原核生物の標的核酸に関しては、種々の態様において、核酸は、ゲノムＤＮＡから転写されたＲＮＡである。真核生物の標的核酸に関しては、核酸は、動物の核酸、植物の核酸、菌類の核酸（酵母菌の核酸を含む）である。上と同様に、標的核酸は、ゲノムＤＮＡ配列から転写されたＲＮＡである。ある種の態様では、標的核酸は、ミトコンドリアの核酸である。ウイルスの標的核酸に関しては、核酸は、ウイルスのゲノムＲＮＡ、またはウイルスのゲノムＤＮＡから転写されたＲＮＡである。
【００９６】
遺伝子産物発現を阻害するための提供される方法には、標的遺伝子産物の発現が、オリゴヌクレオチドで機能化されたナノ粒子の非存在下での遺伝子産物発現と比較すると、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％阻害される方法が含まれる。言い換えれば、提供される方法は、標的遺伝子産物の発現の本質的に任意の程度の阻害をもたらす方法を包含する。
【００９７】
阻害の程度は、体液サンプルから、または生検サンプルから、または当技術分野で周知の画像技術によって、ｉｎ  ｖｉｖｏで決定される。あるいは、阻害の程度は、一般的には、特定の種類のナノ粒子と特定のオリゴヌクレオチドとの使用によるｉｎ  ｖｉｖｏで期待できる阻害の程度の予測可能な測定値として、細胞培養アッセイにおいて決定される。
【００９８】
改変されたポリヌクレオチド
ナノ粒子を機能化させるために、ポリヌクレオチド中のヌクレオチド単位の１つまたは複数の糖かつ／または１つまたは複数のヌクレオチド間連結が、「天然に存在しない」基で置き換えられるような、改変されたポリヌクレオチドが企図される。一態様では、この実施形態は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を企図する。ＰＮＡ化合物において、ポリヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格で置き換えられる。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；および第５，７１９，２６２号、およびＮｉｅｌｓｅｎら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、１９９１、２５４、１４９７〜１５００を参照されたい。
【００９９】
開示されるポリヌクレオチドのために企図される、ヌクレオチドと天然でないヌクレオチドとの間の他の連結としては、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；第５，７９２，７４７号；および第５，７００，９２０号；米国特許公開第２００４０２１９５６５号；国際特許公開ＷＯ９８／３９３５２号およびＷＯ９９／１４２２６号；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」５：３４３〜３５５（１９９５）、ならびにＳｕｓａｎ  Ｍ．ＦｒｅｉｅｒおよびＫａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ  Ａｌｔｍａｎｎ、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、２５：４４２９〜４４４３（１９９７）に記載されているものが挙げられる。
【０１００】
ポリヌクレオチドの具体例としては、改変された骨格または非天然のヌクレオシド間連結を含有するものが挙げられる。改変された骨格を有するポリペプチドとしては、骨格中にリン原子を保持するもの、および骨格中にリン原子がないものが挙げられる。ヌクレオシド間骨格にリン原子がない改変されたポリヌクレオチドも、「ポリヌクレオチド」の意味の範囲内であるとみなされる。
【０１０１】
リン原子を含有する改変されたポリヌクレオチド骨格としては、例えば、通常の３’−５’連結を有する、ホスホロチオアート、キラルなホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホナートおよび（３’−アルキレンホスホナート、５’−アルキレンホスホナート、およびキラルなホスホナートを含めて）他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、（３’−アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダートを含めて）ホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスファートおよびボラノホスファート；これらの２’−５’連結類似体；ならびに、１つまたは複数のヌクレオチド間連結が、３’から３’、５’から５’または２’から２’連結である、極性が反転したもの；が挙げられる。最も３’側の（３’−ｍｏｓｔ）ヌクレオチド間連結に単一の３’から３’連結、すなわち、脱塩基であり得る（ヌクレオチドが欠損している、またはその代わりにヒドロキシル基を有する）単一の反転したヌクレオシド残基を含む、極性が反転したポリヌクレオチドも企図される。塩、混合塩、および遊離酸形も企図される。
【０１０２】
上のリン含有型連結の調製を教示する代表的な米国特許としては、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；第５，１９４，５９９号；第５，５６５，５５５号；第５，５２７，８９９号；第５，７２１，２１８号；第５，６７２，６９７号；および第５，６２５，０５０号が挙げられる。
【０１０３】
リン原子を含まない改変されたポリヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキル・ヌクレオシド間連結、ヘテロ原子とアルキルまたはシクロアルキルとの混合型のヌクレオシド間連結、あるいは１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子または複素環・ヌクレオシド間連結によって形成される骨格を有する。これらとしては、モルホリノ連結；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホナートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；を有するもの；ならびに、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２混合型の構成部分を有する他のもの；が挙げられる。さらなる他の実施形態では、ホスホロチオアート骨格を有する、および米国特許第５，４８９，６７７号および第５，６０２，２４０号に記載されている−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−を含めたヘテロ原子骨格をもつオリゴヌクレオシドを有するポリヌクレオチドが提供される。例えば、参照により本明細書にその開示全体が組み込まれる、米国特許第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；第５，７９２，６０８号；第５，６４６，２６９号；および第５，６７７，４３９号を参照されたい。
【０１０４】
種々の形態では、オリゴにおける２つの連続するモノマーの間の連結は、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲＨ−、＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ＝ＮＲＨ、＞Ｃ＝Ｓ、−Ｓｉ（Ｒ’’）２−、−ＳＯ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｐ（Ｏ）２−、−ＰＯ（ＢＨ３）−、−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−、−Ｐ（Ｓ）２−、−ＰＯ（Ｒ’’）−、−ＰＯ（ＯＣＨ３）−、および−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−から選択される、２から４個、望ましくは３個の基／原子からなる。ここでは、ＲＨは、水素およびＣ１〜４アルキルから選択され、Ｒ’’は、Ｃ１〜６アルキルおよびフェニルから選択される。こうした連結の実例は、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝（これに続くモノマーへの連結として使用される場合はＲ５を含む）、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＳ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｃ（＝ＮＲＨ）−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ＝（これに続くモノマーへの連結として使用する場合はＲ５を含む）、−ＣＨ２−Ｏ−ＮＲＨ−、−ＣＯ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＯ−、−Ｏ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＮＲＨ、−Ｏ−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ＝（これに続くモノマーへの連結に使用される場合はＲ５を含む）、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＳＯ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＳＯ−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−；−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ’’）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｏ  ＣＨ２ＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｏ  ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＮ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＮＲＨ  Ｈ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ’’）２−Ｏ−であり；これらのうち、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−Ｏ−Ｐ（−Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−ＮＲＨ  Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ’’）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＣＨ３）−Ｏ−、および−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＮ）−Ｏ−（ここでは、ＲＨは、水素およびＣ１〜４アルキルから選択され、Ｒ’’は、Ｃ１〜６アルキルおよびフェニルから選択される）が企図される。さらなる実例は、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、１９９５、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、５：３４３〜３５５、ならびにＳｕｓａｎ  Ｍ．ＦｒｅｉｅｒおよびＫａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ  Ａｌｔｍａｎｎ、１９９７、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」第２５巻：４４２９頁〜４４４３頁に示されている。
【０１０５】
ポリヌクレオチドのさらなる他の改変形態は、参照により本明細書にその開示全体が組み込まれる米国特許出願第２００４０２１９５６５号に詳細に記載されている。
【０１０６】
改変されたポリヌクレオチドはまた、１つまたは複数の置換された糖部分を含有することができる。ある種の態様では、ポリヌクレオチドは、次のもののうちの１つを２’位置に含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル（式中、アルキル、アルケニル、アルキニルは、置換または非置換のＣ１からＣ１０アルキルまたはＣ２からＣ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る）。他の実施形態は、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２（ここでは、ｎおよびｍは、１から約１０である）を含む。他のポリヌクレオチドは、次のもののうちの１つを２’位置に含む：Ｃ１からＣ１０低級アルキル、置換型低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換型シリル、ＲＮＡ切断基（ＲＮＡ  ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）、レポーター基、インターカレーター、ポリヌクレオチドの薬物動態特性を向上させるための基、またはポリヌクレオチドの薬力学的特性を向上させるための基、および同様の特性を有する他の置換基。一態様では、改変形態としては、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３；２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られている）（Ｍａｒｔｉｎら、１９９５、「Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ」、７８：４８６〜５０４）、すなわちアルコキシアルコキシ基が挙げられる。他の改変形態としては、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ（２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている）、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当分野では２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、すなわち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２が挙げられる。
【０１０７】
さらなる他の改変形態としては、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。この２’−改変形態は、アラビノ（上向き（ｕｐ））配置またはリボ（下向き（ｄｏｗｎ））配置で存在可能である。一態様では、２’−アラビノ改変形態は、２’−Ｆである。同様の改変形態はまた、ポリヌクレオチド上の他の位置、例えば、３’末端ヌクレオチド上または２’−５’連結ポリヌクレオチド中の糖の３’位置で、または５’末端ヌクレオチドのおよび５’位置で行われることが可能である。ポリヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有することもできる。例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；第５，７９２，７４７号；および第５，７００，９２０号を参照されたい。
【０１０８】
一態様では、糖の改変形態として、２’−ヒドロキシル基が糖環の３’または４’炭素原子に連結されることによって二環性糖部分が形成されたロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）が挙げられる。この連結は、ある種の態様では、メチレン（−ＣＨ２−）ｎ基（ここではｎは１または２である）が２’酸素原子と４’炭素原子とを橋かけさせるものである。ＬＮＡおよびその調製は、参照により本明細書にその開示が組み込まれるＷＯ９８／３９３５２およびＷＯ９９／１４２２６に記載されている。
【０１０９】
キメラ体
所与の化合物中のすべての位置が一様に改変される必要はなく、実際には、２つ以上の上述の改変が、単一の化合物中に組み込まれても、あるオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドに組み込まれてもよい。こうした「キメラ」アンチセンス化合物は、典型的には、本明細書に記述する通りの改変形態を含む少なくとも１つの領域を含有するが、残りのオリゴヌクレオチドは「未改変」のままである。
【０１１０】
ある種の態様では、改変形態によって、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の向上、細胞取り込みの向上、安定性の向上、および／または標的核酸に対する結合親和性の増大が与えられる。他の態様では、改変形態は、ＲＮＡ：ＤＮＡ、またはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することが可能な酵素に対する基質としての役割を果たす。例えば、ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞内エンドヌクレアーゼである。そのため、ＲＮａｓｅＨを活性化すると、ＲＮＡ標的の切断がもたらされ、それによって、オリゴヌクレオチド介在性の遺伝子発現阻害の効率が大幅に向上する。ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの切断は、同様に、細胞性ＲＮＡとウイルス性ＲＮＡの両方を切断するＲＮａｓｅＬなどのエンドリボヌクレアーゼの作用を通して実現することができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、また必要であれば、当分野で周知の関連する核酸ハイブリッド形成技術によって、ごく普通に検出することができる。
【０１１１】
キメラ化合物は、２種以上の、オリゴヌクレオチド、改変型オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、および／または上述の通りのオリゴヌクレオチド模倣体の、複合構造として形成することができる。こうした化合物は、当分野では、ハイブリッドまたはギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）とも呼ばれる。例えば、参照により本明細書にその開示全体が組み込まれる米国特許第５，０１３，８３０号；第５，１４９，７９７号；第５，２２０，００７号；第５，２５６，７７５号；第５，３６６，８７８号；第５，４０３，７１１号；第５，４９１，１３３号；第５，５６５，３５０号；第５，６２３，０６５号；第５，６５２，３５５号；第５，６５２，３５６号；および第５，７００，９２２号を参照されたい。
【実施例】
【０１１２】
実施例１
ＲＮａｓｅを含まないナノ粒子の調製
クエン酸で安定化された金ナノ粒子（１３ｎｍ）を、発表されている手順［Ｆｒｅｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：２０〜２２（１９７３）］を使用して調製した。合成後、粒子を０．１％ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で、攪拌しながら１２時間処理し、次いで、１２１℃で６０分間オートクレーブした。重要なことに、また、かなり驚いたことに、紫外分光および透過型電子顕微鏡ＴＥＭ分析（図１）によって測定された通り、このナノ粒子の光学的および物理的特性は、この比較的過酷な処理によって影響を受けない。それに続くリガンド官能化も、この処理によって影響を受けなかった。ＲＮａｓｅ  Ａｌｅｒｔキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、これらの溶液のＲＮａｓｅ活性を試験しても、対照または未処理粒子（図２）と比較して、検出可能なＲＮａｓｅ活性は示されなかった。
【０１１３】
実施例２
ＲＮａｓｅを含まないナノ粒子の改変
ＲＮａｓｅを含まない得られたナノ粒子は、発表されている方法［Ｄｅｍｅｒｓら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２：５５３５（２０００）］を使用する、チオール化オリゴヌクレオチドによるさらなる改変に適用可能であった。この前処理を行わないと、おそらく、ＲＮＡベースの表面を覆うリガンドの急速な分解によって、ＲＮＡを用いるそれに続く機能化は達成できなかった。２７塩基のＲＮＡ鎖と、エチレングリコールスペーサーおよびアルキルチオールを末端とする２５塩基の相補鎖とからなる二重鎖をハイブリッド形成させ、チオール−金結合を介して化学吸着が可能となるような、ＲＮａｓｅを含まないＡｕ  ＮＰに付加した。この研究のために、これらの配列は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を標的とするように設計された。
【０１１４】
ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ＴＯＭ−ＲＮＡ試薬（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）およびＭｅｒＭａｄｅ６（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）を使用して合成した、または商業的に作成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。非商業的原料によって合成したオリゴヌクレオチドは、ＴＯＰ−ＲＮＡカートリッジ（Ｖａｒｉａｎ）を使用して精製した。本研究に使用した配列は：ルシフェラーゼセンス、５’−リン酸ｒＣｒＧｒＡ  ｒＣｒＵｒＵ  ｒＣｒＧｒＵ  ｒＧｒＣｒＣ  ｒＡｒＧｒＡ  ｒＧｒＵｒＣ  ｒＵｒＵｒＵ  ｒＣｒＧＡＣ  スペーサー１８  スペーサー１８−チオール−３’（配列番号：１）、ルシフェラーゼアンチセンス、５’−ｒＧｒＵｒＣ  ｒＧｒＡｒＡ  ｒＡｒＧｒＡ  ｒＣｒＵｒＣ  ｒＵｒＧｒＧ  ｒＣｒＡｒＣ  ｒＧｒＡｒＡ  ｒＧｒＵｒＣ  ｒＧｒＵｒＡ−３’（配列番号：２）、Ｃｙ３ルシフェラーゼ、５’−Ｃｙ３  ｒＧｒＵｒＣ  ｒＧｒＡｒＡ  ｒＡｒＧｒＡ  ｒＣｒＵｒＣ  ｒＵｒＧｒＧ  ｒＣｒＡｒＣ  ｒＧｒＡｒＡ  ｒＧｒＵｒＣ  ｒＧｒＵｒＡ−３’（配列番号：３）、Ｃｙ５ルシフェラーゼ、５’−Ｃｙ５  ｒＧｒＵｒＣ  ｒＧｒＡｒＡ  ｒＡｒＧｒＡ  ｒＣｒＵｒＣ  ｒＵｒＧｒＧ  ｒＣｒＡｒＣ  ｒＧｒＡｒＡ  ｒＧｒＵｒＣ  ｒＧｒＵｒＡ−３’（配列番号：４）、ルシフェラーゼダブシル、５’−ｒＣｒＧｒＡ  ｒＣｒＵｒＵ  ｒＣｒＧｒＵ  ｒＧｒＣｒＣ  ｒＡｒＧｒＡ  ｒＧｒＵｒＣ  ｒＵｒＵｒＵ  ｒＣｒＧＡ  Ｃ−ダブシル−３’（配列番号：５）、ウミシイタケルシフェラーゼセンス、５’−リン酸ｒＧｒＧｒＡ  ｒＧｒＧｒＡ  ｒＣｒＧｒＣ  ｒＵｒＣｒＣ  ｒＡｒＧｒＡｒ  ＵｒＧｒＡ  ｒＡｒＡｒＵ  ｒＧｒＧＧＴ  スペーサー１８  スペーサー１８−チオール−３’（配列番号：６）、ウミシイタケルシフェラーゼアンチセンス、５’ｒＡｒＣｒＣ  ｒＣｒＡｒＵ  ｒＵｒＵｒＣ  ｒＡｒＵｒＣ  ｒＵｒＧｒＧ  ｒＡｒＧｒＣ  ｒＧｒＵｒＣ  ｒＣｒＵｒＧ−３’（配列番号：７）である。
【０１１５】
あらかじめ形成したチオール化ＲＮＡ二重鎖（１０００ｎＭ）を、０．１Ｍ  ＮａＣｌで調節した、Ａｕ  ＮＰ（１０ｎＭ）のＲＮａｓｅを含まない溶液でインキュベートした。この混合物を、塩濃度を上昇させた溶液（０．１から０．３ＭのＮａＣｌ）中で熟成させ、超音波処理して表面上のオリゴリボヌクレオチドの被覆度を増大させた。二重鎖添加の２４時間後に、オリゴエチレングリコール（ＯＥＧ）を加えて（最終濃度３０μｍｏｌ／ｍＬ）、細胞培養中の粒子沈殿を防止した（図３）。この濃度での添加は、二重鎖装填を変化させなかった。機能化後、４℃で遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、２０分）することによって粒子を精製し、滅菌したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  リン酸塩、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）中に再懸濁した。このプロセスを３回繰り返した。遠心分離プロセスによって生じる加熱による二重鎖の脱ハイブリッド形成を防止するために、冷却遠心分離が必要であった。ｄｓＲＮＡ装填を測定するために、アンチセンス鎖をシアニン３（Ｃｙ３）蛍光色素で標識した。５５０ｎｍでの励起と、５６０から６２０ｎｍの増分１ｎｍでの発光測定を用いて、Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ  Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ  ＦＬ３−２２を使用して蛍光を測定し、検量線と比較した。２５μＭのシアン化カリウムを使用して金を酸化し、蛍光アンチセンス鎖（形成された二本鎖の指標となる）の数を測定し、ナノ粒子の濃度で割ることによって、粒子あたりの二重鎖の数を計算した。各ＲＮＡ−金ナノ粒子組成物は、１３ｎｍ  Ａｕ  ＮＰあたり３３±４個のＲＮＡ二重鎖を含有していた。
【０１１６】
ＲＮＡ二重鎖の脱ハイブリッド形成を防止するために、Ａｕ  ＮＰ溶液の塩濃度を、二重鎖添加の前に、ＮａＣｌで０．１Ｍに調節した。それに続いて、ナノ粒子表面上のオリゴヌクレオチドの被覆度を増大させるために、各添加後に、短時間の超音波処理をしながら、１２時間かけて、塩濃度を０．１から０．３Ｍ  ＮａＣｌに上昇させた［Ｈｕｒｓｔら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７８：８３１３（２００６）］。より安定な組成物を得るために、ＲＮＡで機能化された粒子を、追加的な表面不動態化リガンドとしての３０μｍｏｌ／ｍＬのオリゴエチレングリコール−チオール（ＯＥＧ−チオール）で処理した（スキーム１）。ＯＥＧ−チオール不動態化は、細胞培養条件下で、これらのナノ材料を長期間安定化させることが判明した。
【０１１７】
【化１】
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スキーム１．多価ＲＮＡ金ナノ粒子組成物の調製。ＲＮＡ二重鎖（二本鎖ＲＮＡ配列、エチレングリコールスペーサー、およびアルキルチオール基を含有する）をハイブリッド形成を介して形成し、それに続いて、ＲＮａｓｅを含まないナノ粒子と共にインキュベートした。オリゴエチレングリコール−チオール（ＯＥＧ−チオール）を用いたさらなる不動態化によって、細胞培養の際の追加的な安定性を加えた。
【０１１８】
実施例３
ＲＮＡ−ナノ粒子組成物の細胞内取り込み
組成物が細胞に入る能力を、上述の通りに調製した蛍光（シアニン５、Ｃｙ５）組成物を使用して、共焦点顕微鏡によって調べた。ＲＮＡ−Ａｕ  ＮＰをＨｅＬａ細胞の培養物に添加した。細胞をガラスカバーガラス上で生育させ、蛍光標識したＲＮＡ二重鎖で機能化されたナノ粒子で処理した。処理の６時間後、このカバーガラスを取り除き、ＰＢＳで洗浄し、スライドガラス上に装備した、ＰＢＳを満たしたチャンバーに固定した。画像はすべて、６３×の拡大率と６３３ｎｍ  ＨｅＮｅレーザー励起源で、走査型共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ５１０  ＬＳＭ）よって取得した。画像研究によれば、６時間後のＨｅＬａ細胞の細胞質中のいたるところに、蛍光が現れる（図４ａ）。興味深いことに、ＤＮＡ  Ａｕ−ＮＰのように、ＲＮＡ  Ａｕ−ＮＰは、細胞に入るために形質移入剤を必要としない［Ｇｉｌｊｏｈａｎｎら，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．７：３８１８（２００７）］。実際、分析的フローサイトメトリーによって、細胞集団の９９％より多くでＲＮＡ−Ａｕ  ＮＰの取り込みが確認された（図４ｂ）。このフローサイトメトリー実験のために、細胞を、蛍光標識された（Ｃｙ５）ＲＮＡ−ナノ粒子組成物で処理した。形質移入の６時間後に細胞をトリプシン処理して、細胞培養ウェルから細胞を取り出した。フローサイトメトリーは、励起６３５ｎｍでＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ  ＣｙＡｎを使用して行った。
【０１１９】
実施例４
ＲＮＡ−ナノ粒子組成物の活性
ＲＮＡ−Ａｕ  ＮＰが細胞によって内部に取り込まれたことが確定したので、次に、ＲＮＡ−金ナノ粒子組成物の細胞内活性を試験した。このモデル系の標的として、形質移入されたルシフェラーゼプラスミドを使用して、タンパク質ノックダウン研究をＨｅＬａ細胞で行った。ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％の熱失活したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＥａｇｌｅの最少基本培地（ＥＭＥＭ）中で生育させ、５％ＣＯ２中で３７℃で維持した。細胞を９６ウェルプレートに播種し、１日生育させて、ホタルルシフェラーゼとウミシイタケ遺伝子の両方を含有するプラスミド（ｐｓｉＣＨＥＣＫ２、Ｐｒｏｍｅｇａ）を形質移入した。プラスミド（ウェルあたり０．２μｇ）を、製造者の勧告に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して加えた。プラスミド導入後（２４時間）、培地を、ホタルルシフェラーゼに指向する機能化されたＲＮＡ−Ａｕ  ＮＰ（３ｎＭナノ粒子濃度、約１００ｎＭ  ＲＮＡ二重鎖濃度）を含有する低血清培地に交換した。処理の１日目には、細胞は約７０％集密であった。実験の終わりに、処理された細胞の反復実験ウェルを、Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅ  Ｍｉｎｉ（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、生存率について計数および測定した。インキュベーション後の生存率は、ＲＮＡ  Ａｕ  ＮＰで処理した細胞については９８％を超えていた。
【０１２０】
比較のために、同じ数のルシフェラーゼＲＮＡ二重鎖（１００ｎＭ）を、製造者の推奨プロトコルに従って、市販剤Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して形質移入した。処理の２４時間後、培地を新鮮なＥＭＥＭに交換した。指定の日数後、製造者のプロトコルに従って、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイを使用して、細胞をルシフェラーゼ発現についてアッセイした。
【０１２１】
ルシフェラーゼ発現の定量化を、形質移入していない対照に対して正規化すると、ナノ粒子剤が、ホタルルシフェラーゼを用量および時間依存的に下方制御することが明らかになった。対照（ウミシイタケ）の発現は、ホタルルシフェラーゼに対して設計したＲＮＡ−Ａｕ  ＮＰによって影響を受けず、このことは、このノックダウンはまた、配列特異的であることを示す。興味深いことに、ＲＮＡ−Ａｕ  ＮＰを用いる３つの独立した実験の結果は、処理４日後に、単独のＲＮＡを超えるノックダウンを示した（単独のもの３３±２％に対して、ＲＮＡ−Ａｕ  ＮＰ  ７３±７％、図５ａ）。
【０１２２】
ルシフェラーゼの持続的ノックダウンは、ナノ粒子上のＲＮＡの安定化の結果である。この測定を行うために、Ｃｙ３標識したＲＮＡ粒子を、９６ウェルプレート内の９０μＬのＰＢＳ中に５ｎＭの濃度に希釈した。ダブシル標識分子したＲＮＡについては、濃度は１５０ｎＭとした。マイクロプレートを、３７oＣに維持したＰｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＦｌｕｏＤｉａ  Ｔ７０蛍光プレートリーダー中に配置した。このサンプルを平衡化（１０分）させた後、１０μＬのウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）を加えて、サンプルを１０％の血清濃度にした。蒸発を防止するために、この反応物を４０μＬの鉱油で覆った。サンプルの蛍光（励起＝５３０ｎｍ、発光＝５７０ｎｍ）を５分毎に４８時間測定した。ベースラインの蛍光は、ＦＢＳの代わりに１０μＬ分量のＰＢＳで処理したサンプルから決定した。反応の終点は、時間の関数として観察される蛍光がさらに増加しなくなった時点に決定した。すべてのサンプルを３回測定した。
【０１２３】
こうした安定性実験では、血清中でインキュベートした組成物は、その分子状ＲＮＡ対応物と比較して、大いに増強された安定性を示した。例えば、１０％血清の存在下では、ＲＮＡ−Ａｕ  ＮＰ組成物は、分子状ＲＮＡ二重鎖よりも６倍以上の半減期を有していた（１３３±３０分に対して８１６±５９分、図５ｂ）。こうしたデータは、ナノ粒子コンジュゲーションが、細胞外状況において、分解からの有意な保護を提供することを示す。ＲＮＡの細胞外寿命は、その保存、取扱い、および潜在的な治療的用途に非常に重要であるので、ナノ粒子コンジュゲーションは、機能性ＲＮＡリガンドの保護および送達に対するかなりの利点を提供することができる。重要なことに、この安定性の向上は、ＲＮＡの完全性を保護するための化学的改変を必要としない。
【０１２４】
実施例５
ナノ粒子表面上のポリヌクレオチドの方向性
ナノ粒子上に固定化されるＲＮＡの方向性は、制御可能である。Ｄｉｃｅｒ酵素に対するＲＮＡ基質を固定化する戦略によって、二本鎖への接近の制御が可能になる。様々な固定化化学、モノチオールまたはジチオール、および様々な長さのスペーサー配列を利用して、ＲＮＡ二本鎖の数およびＲＮＡ二本鎖間の距離を変動させることによって、ＲＮＡ分解の速度を制御することができる。
【０１２５】
Ｄｉｃｅｒ、すなわちこの系においてＲＮＡｉの開始を担うＲＮａｓｅが、これらの二重鎖を認識および切断できるかどうかを決定するために実験を行った。典型的な酵素動態実験において、３７℃の反応バッファー中で、ＲＮＡ−Ａｕ  ＮＰ（約５ｎＭ）をＤｉｃｅｒ（最終０．１Ｕ／ｍＬ）と混合した。ＲＮＡ二重鎖の分解の速度は、蛍光増大を７２秒毎に少なくとも１２時間モニタリングすることによって測定した。最小および最大蛍光を決定するために、酵素を含有しないサンプル（最小）または金を溶解するための３ｍＭシアン化カリウム（ＫＣＮ）を含むサンプル（最大）を使用した。ＫＣＮは、金ナノ粒子を酸化し、フルオロフォア標識された鎖の消光をなくす。
【０１２６】
片方または両方の鎖を蛍光標識し、ＲＮＡで機能化された所与の濃度のナノ粒子に伴われる蛍光を、同じ鎖を使用して作成した検量線と比較することによって、ナノ粒子あたりの二重鎖の数を決定した。代表的な装填試験の結果を表１に示す。
【０１２７】
【表１】
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表１．２つの異なるＲＮＡ装填戦略を使用する、ＲＮＡ二重鎖装填の測定。結合体は、アンチセンス鎖（ナノ粒子に共有結合的に連結されたセンス鎖とハイブリッド形成している）にフルオレセインを含む、または、ヘアピン系の場合には、ＲＮＡは、その５’末端上をフルオレセインで標識される。
【０１２８】
ＲＮａｓｅＩＩＩ、すなわちｄｓＲＮＡを分解することが知られているリボヌクレアーゼを、Ｄｉｃｅｒの活性と比較した。ＲＮａｓｅＩＩＩとＤｉｃｅｒは両方とも、時間に対する、バックグラウンド（反応に酵素を加えていないもの）よりも上への蛍光の増大によって測定される通りの、試験した２つの系に対して活性である。図６は、ＲＮａｓｅＩＩＩの存在下での活性を示す。
【０１２９】
各系を、ＲＮａｓｅＩＩＩに対して、同様の方式でＤｉｃｅｒを用いて処理した場合、時間と共に、相応する蛍光の増大が観察された（図７）。さらに、バックグラウンドに対する蛍光の絶対差は、Ｄｉｃｅｒの方が、ＲＮａｓｅＩＩＩと比べて高かった。これらのデータから、これらのＲＮＡは、ナノ粒子表面上に高密度に固定化された場合、ＲＮａｓｅＩＩＩのような非特異的酵素よりもＤｉｃｅｒによってより特異的に認識されることが示唆される。さらに、センス鎖対アンチセンス鎖の固定化に関して、方向性の優先性が観察できる（図８）。センス鎖が化学的に粒子に付着された場合には、より高い活性が観察される。理論に拘泥されないが、これは、ＲＮＡｉ機構においてガイド鎖として働くアンチセンス鎖の能力を反映する可能性がある。この違いを、細胞中のＲＮＡｉ応答の調節および調整に役立てることが企図される。本発明は以下をも提供する。
（１）ナノ粒子と結合した１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物であって、
該ＲＮＡポリヌクレオチドが、ポリペプチドの相互作用部位を有し；
該ＲＮＡポリヌクレオチドが、二重鎖を形成するのに適した条件下で該二重鎖を形成する配列を有し；
該二重鎖は、該二重鎖の一本鎖内に、該一本鎖と標的ポリヌクレオチドとのハイブリッド形成を適切な条件下で可能にする、該標的ポリヌクレオチド内の配列と十分に相補的な少なくとも１つのドメインを有し、該二重鎖の該ドメインと該標的ポリヌクレオチド内の該配列とのハイブリッド形成によって、ポリペプチドによって認識される基質部位がもたらされ；
該ＲＮＡポリヌクレオチドが、該ポリペプチドの相互作用部位および該ナノ粒子に対して方向特異的な様式で該ナノ粒子と結合する；
ナノ粒子組成物。
（２）前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、前記ナノ粒子と共有結合している、項目１に記載のナノ粒子組成物。
（３）前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、前記ナノ粒子と共有結合していない、項目１に記載のナノ粒子組成物。
（４）前記ナノ粒子と結合した各ＲＮＡポリヌクレオチドが、同一の配列を有する、項目１に記載のナノ粒子組成物。
（５）前記ナノ粒子と結合した少なくとも２つのＲＮＡポリヌクレオチドが、異なる配列を有する、項目１に記載のナノ粒子組成物。
（６）前記二重鎖が、前記ＲＮＡポリヌクレオチドによって形成されたヘアピン構造を含む、項目１に記載のナノ粒子組成物。
（７）前記二重鎖を形成するのに適した条件下で前記ＲＮＡポリヌクレオチドとのハイブリッド形成を可能にするための、該ＲＮＡポリヌクレオチド内の配列と十分に相補的な配列を有する追加のポリヌクレオチドをさらに含む、項目１に記載のナノ粒子組成物。
（８）前記追加のポリヌクレオチドがＲＮＡである、項目７に記載のナノ粒子組成物。
（９）前記追加のポリヌクレオチドがデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、項目７に記載のナノ粒子組成物。
（１０）前記追加のポリヌクレオチドが前記ナノ粒子と共有結合している、項目７に記載のナノ粒子組成物。
（１１）前記追加のポリヌクレオチドが前記ナノ粒子と共有結合していない、項目７に記載のナノ粒子組成物。
（１２）前記ポリペプチドの相互作用部位が、前記ＲＮＡポリヌクレオチドの中間点に関して、前記ナノ粒子に対して近位に位置する、項目１に記載のナノ粒子組成物。
（１３）前記ポリペプチドの相互作用部位が、前記ＲＮＡポリヌクレオチドの中間点に関して、前記ナノ粒子に対して遠位に位置する、項目１に記載のナノ粒子組成物。
（１４）前記ＲＮＡの表面密度が、少なくとも約２ｐｍｏｌ／ｃｍ２から約１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２である、項目１に記載のナノ粒子組成物。
（１５）前記ポリペプチドの相互作用部位が、ＲＮａｓｅＨ、ＲＮａｓｅＤ、ＲＮａｓｅＬ、ＲＮａｓｅＩＩＩ、Ｄｉｃｅｒ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２、およびヒト免疫不全ウイルスのトランス活性化応答ＲＮＡ結合タンパク質（ＴＲＢＰ）からなる群より選択されるタンパク質と結合する、項目１に記載のナノ粒子組成物。
（１６）前記ポリヌクレオチドの前記ドメインの長さが、約１０ヌクレオチドである、項目１に記載のナノ粒子組成物。
（１７）前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチド内の第２の配列と十分に相補的な第２のドメインをさらに含み、該ＲＮＡポリヌクレオチドの該第２のドメインと該標的ポリヌクレオチド内の該第２の配列とのハイブリッド形成によって、第２のポリペプチドによって認識される追加の基質部位がもたらされる、項目１６に記載のナノ粒子組成物。
（１８）前記ポリヌクレオチドの前記第２のドメインの長さが、約１０ヌクレオチドである、項目１７に記載のナノ粒子組成物。
（１９）前記基質部位と前記追加の基質部位が同じである、項目１７に記載のナノ粒子組成物。
（２０）前記基質部位と前記追加の基質部位が異なる、項目１７に記載のナノ粒子組成物。
（２１）前記ＲＮＡポリヌクレオチドと前記追加のポリヌクレオチドが、ハイブリッド形成できるのに十分な長さにわたって互いに相補的である、項目７に記載のナノ粒子組成物。
（２２）前記ＲＮＡポリヌクレオチドと前記追加のポリヌクレオチドが、それらの全長にわたって互いに相補的である、項目２１に記載のナノ粒子組成物。
（２３）前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、チオール連結を介して前記ナノ粒子と結合体化される、項目１に記載のナノ粒子組成物。
（２４）前記ＲＮＡポリヌクレオチドの半減期が、ナノ粒子と結合していない同一のＲＮＡポリヌクレオチドの半減期と少なくとも実質的に同じである、項目１に記載のナノ粒子組成物。
（２５）前記ＲＮＡポリヌクレオチドの半減期が、ナノ粒子と結合していない同一のＲＮＡポリヌクレオチドの半減期よりも約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上長い、項目１に記載のナノ粒子組成物。
（２６）前記ＲＮＡポリヌクレオチドの長さが、約５から約１００ヌクレオチドである、項目１に記載のナノ粒子組成物。
（２７）前記追加のポリヌクレオチドの長さが、約５から約１００ヌクレオチドである、項目７に記載のナノ粒子組成物。
（２８）金ナノ粒子である項目１に記載のナノ粒子組成物。
（２９）銀ナノ粒子である項目１に記載のナノ粒子組成物。
（３０）ＲＮＡポリヌクレオチドをナノ粒子に結合させる方法であって、チオール化ＲＮＡポリヌクレオチド二重鎖と該ナノ粒子との混合物を一連の溶液中で熟成させて、該ＲＮＡポリヌクレオチドを該ナノ粒子に結合させるステップを含み、各溶液は、約０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む第１の溶液から開始して、先の溶液よりも増大した濃度の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む、方法。
（３１）最後の前記熟成ステップの後に、前記混合物を超音波処理するステップをさらに含む、項目３０に記載の方法。
（３２）前記ナノ粒子を単離するステップをさらに含む、項目３０または３１に記載の方法。
（３３）ＲＮＡをナノ粒子に結合させる方法であって、
（ａ）約０．１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む溶液中で、チオール化ＲＮＡ二重鎖を該ナノ粒子と混合すること；
（ｂ）先の溶液よりも増大した濃度のＮａＣｌをそれぞれ含む一連の塩溶液中で、該混合物を熟成させること；
（ｃ）該混合物を超音波処理すること；および
（ｄ）結合体化された該ナノ粒子を精製すること
を含む方法。
（３４）前記一連の塩溶液が、約０．１Ｍから約０．３Ｍ  ＮａＣｌの範囲である、項目３３に記載の方法。
（３５）オリゴ（エチレングリコール）チオール（ＯＥＧ）を用いて前記ナノ粒子の表面を不動態化することをさらに含む、項目３３に記載の方法。
（３６）標的ポリヌクレオチドの発現を調節する方法であって、項目１に記載のナノ粒子組成物のドメインと該標的ポリヌクレオチドをハイブリッド形成させて、ポリペプチドのための基質部位を形成させるステップを含む、方法。
（３７）ハイブリッド形成によって前記標的ポリヌクレオチドの分解をもたらす、項目３６に記載の方法。
（３８）前記ポリペプチドが、ＲＮａｓｅＨ、ＲＮａｓｅＤ、ＲＮａｓｅＬ、ＲＮａｓｅＩＩＩ、Ｄｉｃｅｒ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２、およびＴＲＢＰからなる群より選択される、項目３７に記載の方法。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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