(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインスリンのアシル化アナログであって、該インスリンアナログは
Ａ２１アミノ酸残基のＣ末端に結合したリジン残基（Ａ２２Ｋ）を含むか、又はＡ２１アミノ酸残基のＣ末端に結合した、１つのリジン残基を含む最大４アミノ酸残基を含み、
アシル部分がＡ２２位置のリジン残基に取り付けられたアルキレングリコール部分か又はＡ２１アミノ酸残基のＣ末端終端に取り付けられたペプチド残基に存在するリジン残基に取り付けられたアルキレングリコール部分を含み、
該インスリンアナログには１つのみのリジン（Ｋ、Ｌｙｓ）が存在し、
該インスリンアナログのＡ１８位置のアミノ酸残基は当該位置に天然に存在するアミノ酸であるか、又はロイシン残基（Ｌ、Ｌｅｕ）であり、
該インスリンアナログのＢ３０位置のアミノ酸残基が欠失しており（ｄｅｓＢ３０）、
該インスリンアナログのＢ２９位置のアミノ酸残基がＲであり、
位置Ａ１及びＢ１に存在するアミノ酸残基のＮ末端終端に結合されるアミノ酸残基がなく、及び
位置Ｂ２９に存在するアミノ酸残基のＣ末端終端に結合されるアミノ酸残基がない
ことを特徴とするヒトインスリンのアシル化アナログ。
【請求項２】
アシル部分は一般式Ｉ：
Ａｃｙ−ＡＡ１ｎ−ＡＡ２ｍ−ＡＡ３ｐ−    （Ｉ）、
［式中、ｎは０または範囲１−３の整数であり、ｍは０又は範囲１−６の整数であり、ｐは１、２または３であり、
Ａｃｙは形式的に脂肪酸のカルボキシ基から又は脂肪族二酸のカルボキシ基の一つから水酸基を除去された、８−２４の炭素原子を含む脂肪酸又は脂肪族二酸であり、
ＡＡ１は形式的にアミノ基から水素原子を除去され、カルボキシ基から水酸基を除去された中性環状アミノ酸であり、
ＡＡ２は形式的にアミノ基から水素原子を除去され、カルボキシ基から水酸基を除去された酸性アミノ酸であり、
ＡＡ３は形式的にアミノ基から水素原子が除去され、カルボキシ基から水酸基が除去された中性アルキレングリコール含有アミノ酸であり、
ＡＡ１、ＡＡ２及びＡＡ３が式に現れる順番は、独立に交換することができ、
Ａｃｙ、ＡＡ１、ＡＡ２および／またはＡＡ３の間の結合は、アミド（ペプチド）結合である］であって、親インスリンへの取り付けは式（Ｉ）のアシル部分のＡＡ１、ＡＡ２、又はＡＡ３残基のＣ末端終端または式（Ｉ）の部分に存在するＡＡ２残基の側鎖の１つから行われうる請求項１に記載のヒトインスリンのアシル化アナログ。
【請求項３】
ＡＡ１が、形式的にアミノ基から水素原子が除去され、カルボキシ基から水酸基が除去された
0005730569.tif 000040
［式中、ｑは０，１、２、３又は４である］
から選択される、請求項２に記載のヒトインスリンのアシル化アナログ。
【請求項４】
ＡＡ１が、形式的にアミノ基から水素原子が除去され、カルボキシ基から水酸基が除去された
0005730569.tif 000041
である、請求項３に記載のヒトインスリンのアシル化アナログ。
【請求項５】
ＡＡ２が、形式的にアミノ基から水素原子が除去され、カルボキシ基から水酸基が除去されたγＧｌｕ、βＡｓｐ又は以下の化合物の何れか：
0005730569.tif 000042
［式中、矢印はＡＡ１、ＡＡ２又はＡＡ３のアミノ基への付着点を示す］
から選択される、請求項２から４の何れか一項に記載のヒトインスリンのアシル化アナログ。
【請求項６】
A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル-γGlu), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-(2-アミノエチル-PEG2000-イルアセチル)), B29R,   desB30 ヒトインスリン; 
A22K(Nε-3-(3-{4-[3-(5-カルボキシペンタノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γGlu), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A22K(Nε-[2-(2-[2-(2-[2-(オクタデカンジオイル-γGlu)アミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A22K(Nε-3-(3-{4-[3-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)-プロピオニル-γGlu), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A22K(Nε-[2-(2-[2-(2-[2-(エイコサンジオイル-γGlu)アミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)-アセチル]), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A14E, A22K(Nε-[2-(2-[2-(2-[2-(オクタデカンジオイル-γGlu)アミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]-エトキシ)アセチル]), B25H, B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]-アセチル), desB29, desB30 ヒトインスリン; 
A14E, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)-プロピオニル)), B25H, B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A18L, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)-エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A8H, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)-エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン;
A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]-アセチル-γGlu), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]-エトキシ}プロピオニル)), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル)), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A14E, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-(3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}-エトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル)), B25H, B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A14E, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-γGlu-(3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}-エトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル)), B25H, B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A14E, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)-プロピオニル)-γGlu), B25H, B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)-エトキシ]アセチル), B28E, B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)-エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A14E, A22K(Nε-[2-(2-[2-(2-[2-(エイコサンジオイル-γGlu)アミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]-エトキシ)アセチル]), B25H, B29R, desB30 ヒトインスリン;
A22K(Nε-オクタデカンジオイル-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル-γGlu), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A22K(Nε-エイコサンジオイル-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル-γGlu), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A22K(Nε-オクタデカンジオイル-(2-アミノエチル-PEG2000-イルアセチル)), B29R,  desB30 ヒトインスリン; 
A22K(Nε-エイコサンジオイル-(2-アミノエチル-PEG2000-イルアセチル)), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A22K(Nε-3-(3-{4-[3-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)-プロピオニル-γGlu), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A22K(Nε-3-(3-{4-[3-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)-プロピオニル-γGlu), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A22K(Nε-テトラデカンジオイル-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル-γGlu), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A8H, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}-エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A18L, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}-エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}-エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A8H, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}-エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}-エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A18L, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]-アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}-エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A8H, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}-エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A8H, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}-エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A18L, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}-エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}-エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A8H, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]-アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}-エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A18L, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]-アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A8H, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}-エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A8H, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}-エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A18L, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}-エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]-アセチルアミノ}-エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A8H, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A18L, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]-アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; 
A8H, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン及び
A18L, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン
の化合物から選択される、請求項１に記載のヒトインスリンのアシル化アナログ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規アシル化インスリンアナログ及びその関連する態様に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリンは、すい臓β細胞によって分泌されるポリペプチドホルモンである。インスリンは２つの鎖間ジスルフィド架橋によって連結されるＡ鎖及びＢ鎖と呼ばれる２つのポリペプチド鎖を含む。ヒト、ブタ及びウシ・インスリンでは、Ａ鎖とＢ鎖はそれぞれ２１及び３０アミノ酸残基を含む。しかしながら、種によって、２つの鎖の異なる位置に存在するアミノ酸残基に変異がある。遺伝子工学の広範囲にわたる使用により、１又は複数のアミノ酸残基を交換することによって天然に存在するインスリンのアナログを調製することが可能になった。
【０００３】
インスリンは、糖尿病、それに関連する疾患又はそれから生じる疾患の治療のために用いられる。インスリンは、正常な代謝制御を維持するために不可欠である。通常、インスリンは注射によって投与される。残念なことに、多くの糖尿病患者は、グルコース濃度の厳密な制御を維持するために必要とされる多数の注射に伴う苦痛のため強化療法を嫌がる。経口投与では、インスリンは、胃腸管において迅速に分解され、血流に吸収されない。従って、インスリンを投与するための代替的ルート、例えば、口、直腸、経皮及び鼻ルートは調査された。しかしながら、これまでのところ、これらの投与ルートは、十分に効果的なインスリン吸収に結果としてなっていない。
【０００４】
何十年にもわたって、持続性インスリン製剤及び速効性インスリン製剤の両方を入手することができ、多数の患者は１日に２〜４回の注射をする。ここ数十年において、糖尿病患者にとって血中グルコース濃度の厳密制御を維持することが極めて重要なことがわかった。
【０００５】
２００７年８月３０日に公開された公開番号ＷＯ２００７／０９６４３１の国際特許出願（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）は、アルキレングリコール部分なしの複雑な側鎖を有するインスリンを記載する。公開番号ＷＯ２００６／０８２２０５（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）を有する国際特許出願は、Ｂ鎖のアミノ酸に接続している複雑な側鎖を有するインスリンを記載する。ＵＳ６４４４６４１Ｂ１は、請求項１によれば、脂肪族アシル鎖がアミド結合によって接続されたインスリンアナログを含む脂肪酸アシル化インスリンアナログに関連し、前記脂肪族のインスリンアナログはインスリンの等電点より高い等電点を有する。ＷＯ２００６／０８２２０５（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）は、請求項１によれば、親インスリン分子のＢ鎖のＮ末端アミノ酸残基のα−アミノ基又はＢ鎖に存在するＬｙｓ残基のε−アミノ基のどちらかに取り付けられる側鎖を有するインスリン誘導体に関する。Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１（２００４），１４９８−１５０４は、インスリンデテミルの延長の機構を扱う。    
【０００６】
（定義）
本願明細書において、インスリンなる用語は、天然に存在するインスリン、例えばヒトインスリンに加えて、インスリンアナログをカバーする。
本願明細書において、アミノ酸残基なる用語は、水素原子がアミノ基から取り除かれたアミノ酸、および／または、水酸基がカルボキシ基から取り除かれたアミノ酸、および／または、水素原子がメルカプト基から取り除かれたアミノ酸をカバーする。正確ではないが、アミノ酸残基はアミノ酸と呼ぶことができる。
【０００７】
本願明細書において、ペプチド残基なる用語は水素原子がアミノ基から取り除かれたペプチド、および／または、水酸基はカルボキシ基から取り除かれたペプチド、および／または、水素原子はメルカプト基から取り除かれたペプチドをカバーする。正確ではないが、ペプチド残基はペプチドと呼ぶことができる。
【０００８】
本願明細書において、インスリンアナログなる用語は、天然に存在するインスリンの構造から、天然のインスリンに存在する一つ以上のアミノ酸残基を欠失および／または置換（交換）することによって及び一つ以上のアミノ酸残基をＡ２１アミノ酸残基に加えることによって、形式的に誘導されうる分子構造を有するポリペプチドをカバーする。好ましくは、付加および／または置換されたアミノ酸残基は、コード可能アミノ酸残基である。例えば、Ａ鎖は、例えば（ヒトインスリンと比較して）１、２、３又は４アミノ酸残基により、Ｃ末端終端を伸長してもよく、その位置はそれぞれＡ２２、Ａ２３、Ａ２４及びＡ２５と示される。インスリンアナログがＡ２１／Ａ２２位置に伸長を有する場合であっても、前記インスリンアナログの別の位置に欠失があってもよい。ヒトインスリンと同様に、本発明のインスリンアナログでは、Ａ２１アミノ酸残基は２０位のＣｙｓ残基に連結し、Ｃｙｓ残基が鎖間ジスルフィド架橋の形成に加わる。また、本願明細書において、親インスリンまたは親インスリンアナログなる用語が、インスリンアナログについて使用される。主に、親なる用語は、側鎖（例えばアシル化によって化学的に導入されうる）を担持しているインスリンアナログから分化している場合に使用される。 
【０００９】
本願明細書において、Ａ１、Ａ２、Ａ３等の用語は、それぞれインスリンのＡ鎖の（Ｎ末端終端からカウントした）位置１、２及び３を示す。同様に、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３等の用語は、それぞれインスリンのＢ鎖の（Ｎ末端終端からカウントした）位置１、２及び３を示す。アミノ酸をコードする１文字を使用するＡ２１Ａ，Ａ２１Ｇ及びＡ２１Ｑは、Ａ２１位置のアミノ酸がそれぞれＡ、Ｇ及びＱであることを示す。アミノ酸をコードする３文字を使用した場合、対応する表記は、それぞれＡｌａＡ２１、ＧｌｙＡ２１及びＧｌｎＡ２１である。
【００１０】
本願明細書において、ｄｅｓＢ２９及びｄｅｓＢ３０のような用語は、それぞれＢ２９またはＢ３０アミノ酸残基を欠いたインスリンアナログを示す。
インスリンアナログ及びＡ鎖及びＢ鎖の位置の番号付けがされることにより、親化合物は使用する番号付けを有するヒトインスリンである。
【００１１】
本願明細書において、アミノ酸、アミノ酸残基、ペプチドまたはペプチド残基に関する「コード可能」なる表現は、遺伝子工学の参照によりトリプレット（「コドン」）のヌクレオチドによってコードされることが可能なアミノ酸、アミノ酸残基、ペプチドまたはペプチド残基を示すために使用される。
【００１２】
本願明細書において、変異なる用語は、アミノ酸配列の任意の変化をカバーする（コード可能アミノ酸の置換及び挿入、更に欠失）。
【００１３】
速効性インスリン又はボーラスインスリンは、通常のヒトインスリンと類似又はより速いした速い作用開始を有するインスリンを、及び／又は通常のヒトインスリンと類似又はわずかに長いした作用期間を有するインスリンを意味する。
【００１４】
延長作用インスリン又は基礎インスリンにより、正常又は通常のヒトインスリンよりも長い作用期間を有するインスリンを意味する。
【００１５】
高い物理安定性とは、ヒトインスリンのフィブリル化傾向が５０%未満のものを意味する。フィブリル化は所与の条件でフィブリル形成が開始する前の遅延時間により記載される。
【００１６】
インスリン受容体及びＩＧＦ-１受容体親和性を有するポリペプチドは、適切な結合実験においてインスリン受容体及びヒトＩＧＦ-１受容体と相互作用することができるポリペプチドである。このような受容体アッセイは、当該分野でよく知られており、実施例に更に記載されている。本発明のアシル化インスリンアナログは、ＩＧＦ-１受容体と結合しないか、又は前記受容体にかなり低い親和性を有する。より正確には、本発明のアシル化インスリンアナログは、ヒトインスリンと実質的に同じ大きさか、又はそれ以下のＩＧＦー１受容体に対する親和性を有する。
【００１７】
便宜上、次に、アミノ酸の名前とカッコ内に通常の３文字コード及び１文字コードを示す：グリシン（Ｇｌｙ及びＧ）、プロリン（Ｐｒｏ及びＰ）、アラニン（Ａｌａ及びＡ）、バリン（Ｖａｌ及びＶ）、ロイシン（Ｌｅｕ及びＬ）、イソロイシン（Ｉｌｅ及びＩ）、メチオニン（Ｍｅｔ及びＭ）、システイン（Ｃｙｓ及びＣ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ及びＦ）、トリプシン（Ｔｙｒ及びＹ）、トリプトファン（Ｔｒｐ及びＷ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ及びＨ）、リジン（Ｌｙｓ及びＫ）、アルギニン（Ａｒｇ及びＲ）、グルタミン（Ｇｌｎ及びＱ）、アスパラギン（Ａｓｎ及びＮ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ及びＥ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ及びＤ）、セリン（Ｓｅｒ及びＳ）及びスレオニン（Ｔｈｒ及びＴ）。タイピング・エラーにより、一般的に用いられるコードからのずれがある場合は、一般的に用いられるコードを適用する。本発明のインスリンに存在するアミノ酸は、好ましくは、核酸によってコードされることができるアミノ酸である。Ｇｌｕ及びＡｓｐのようなアミノ酸は、α、γ、Ｌ又はＤ型である。
【００１８】
以下の略語が、明細書及び実施例において使われた：Ｄａはダルトン（分子量）であり、ｋＤａはキロダルトン（＝１０００Ｄａ）であり、Ｍｗは分子量であり、Ｏｓｕは１-スクシンイミジルオキシ= 2,5-ジオキソピロリジン-1-イルオキシであり、ＲＴは室温であり、ＳＡはシナピン酸であり、Ｓｕは１-スクシンイミジル＝2,5-ジオキソピロリジン-1-イルであり、ＤＣＭはジクロロメタンであり、ＤＩＥＡ（とＤＩＰＥＡ）はN,N-ジイソプロピルエチルアミンであり、ＴＳＴＵはN,N,N',N'-テトラメチル-O-（N-スクシンイミジル）ウロニウム・テトラフルオロホウ酸であり、Ｔｒｉｓはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンであり、ＣＶはカラム体積であり、ＮＭＰはN-メチルピロリジン-2-ワンであり、ＯＴＢＵがtert-ブトキシであり、ＯＥＧはアミノ酸8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸であり、ＨＳＡはヒト血清アルブミンであり、ＴＮＢＳは2,4,6-トリニトロ・ベンゼンスルホン酸酸であり、ＨＯＢＴ（またはＨＯＢｔ）は１-ヒドロキシベンゾトリアゾールであり、ＨＯＡｔは１-ヒドロキシ-７-アザベンゾトリアゾールであり、ＮａＯＨは水酸化ナトリウムであり、ＤＭＦはN,N-ジメチルホルムアミドであり、ＴＨＦはテトラヒドロフランであり、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸であり、ｍｍｏｌはミリモルであり、Ｆｍｏｃはフルオレン-9-イルメトキシカルボニルであり、ＯＥＧは8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸（またはその残基）であり、ｇＧｌｕ（本願明細書において、γＧｌｕとも呼ばれる）はγ-グルタミン酸であり、実施例４８において、便宜上、以下の注釈は、本発明及び従来技術のインスリンのアシル部分の配列を特定するために用いる：Ｃ１８はオクタデカンジオイルであり、Ｃ２０はエイコサンジオイルであり、ｇＧｌｕはγ-グルタミン酸であり、ＰＥＧ３は3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオン酸であり、 ＰＥＧ５は3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}プロピオン酸、及びＰＥＧ７は3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオン酸である（完全な構造/配列は実施例で明らかにされる）。
【００１９】
（発明の目的）
本発明の目的は、従来技術の欠点のうちの少なくとも1つを克服するか又は改善するか、または有用な代替物を提供することである。
本発明の１つの目的は、良好なバイオアベイラビリティーを有するインスリン誘導体を供給することにである。
本発明の別の目的は、速効性インスリンとして使用できるインスリン誘導体を供給することである。
本発明の他の目的は、肺に投与できるインスリン誘導体を供給することである。
本発明の他の目的は、延長された作用プロフィールを有するインスリン誘導体を供給することである。
本発明の他の目的は、基礎インスリンとして使用できるインスリン誘導体を供給することである。
本発明の他の目的は、高いインスリン受容体結合能を有するインスリン誘導体を供給することである。
本発明の別の態様は、インスリンのインビボ半減期を改良することである。
本発明の他の目的は、ヒトインスリンが有するよりも、低血糖状態を引き起こす傾向が低いインスリン誘導体を供給することである。
本発明の別の態様は、特に２年間の貯蔵後に、申し分ない物理安定性を有するインスリンを見いだすことである。 
本発明の別の態様は、特に２年間の貯蔵後に、申し分ない化学安定性を有するインスリンを見いだすことである。 
本発明の別の態様は、特に２年間の貯蔵後に、申し分ないタンパク質分解安定性を有するインスリンを見いだすことである。
本発明の別の態様は、申し分ない溶解性を有するインスリンを見いだすことである。
【００２０】
（発明の概要）
簡潔には、本発明は、Ａ２１アミノ酸残基のＣ末端終端に連結されたアミノ酸残基またはＡ２１アミノ酸残基のＣ末端終端に連結された多くとも４アミノ酸残基のペプチド残基を含むアシル化インスリンアナログであって、アシル部分がＡ２２位置のリジン残基に取り付けられているか又はＡ２１アミノ酸残基のＣ末端終端に付属するペプチド残基に存在するリジン残基に取り付けられているアルキレングリコール部分を含むことを特徴とするアシル化インスリンアナログに関する。それ故、インスリンアナログは、Ａ２２位置のアミノ酸を含む。
【００２１】
本発明のインスリン（一つ以上のアルキレングリコール部分を含むアシル化インスリンアナログ）は、高いＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）濃度（例えば４．５％ＨＳＡ）の存在下で実施したインスリン受容体結合アッセイにおいて測定した場合、驚くべきことに、アルキレングリコール部分を有さない類似のアシル化インスリンアナログよりも、より高いインスリン受容体結合親和性を有することを見いだされた。
【００２２】
（好適な実施例の説明）
驚くべきことに、本発明のアシル化インスリンアナログは、高いＨＳＡ濃度の存在下において良好なバイオアベイラビリティーと高いインスリン受容体結合性を示す。
本発明のアシル化インスリンアナログに存在するインスリンアナログは、場合により位置Ａ１-Ａ２１及びＢ１−Ｂ３０に１つ以上のアミノ酸が欠失しているか又は別のアミノ酸残基により置換されており、位置Ａ２１のアミノ酸残基にＣ末端に連結した１つのアミノ酸残基を有するヒトインスリンとして、または位置Ａ２１のアミノ酸残基にＣ末端に連結した多くとも４アミノ酸残基のペプチド残基を有するヒトインスリンとして、形式的に例示される。命名については、位置Ａ２１のアミノ酸残基に連結されるアミノ酸残基は、Ａ２２位置である。同様に、位置Ａ２１のアミノ酸残基に連結されたペプチド残基に存在するアミノ酸残基は、位置Ａ２２、Ａ２３、Ａ２４またはＡ２５である。
【００２３】
本発明のるアシル化インスリンアナログは、形式的に、インスリンアナログ及び集合式（Ｉ）：Ａｃｙ−ＡＡ１ｎ−ＡＡ２ｍ−ＡＡ３ｐ−［式中、Ａｃｙ、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ｎ、ｍ、及びｐは本願明細書に定義の通りである］を有するアシル部分を含むアルキレングリコールから、例えば、インスリンアナログのアミノ基から水素原子を形式的に取り除き、そこに式（Ｉ）の側鎖を取り付けることによって、形式的に構築することができる。
【００２４】
本発明のアシル化インスリンアナログにおいて、式（Ｉ）のアシル部分を含んでいるアルキレングリコールは、Ａ２１アミノ酸残基のＣ末端側または終端にある位置のリジン残基に連結される。例えば、式（Ｉ）のアシル部分を含んでいるアルキレングリコールは、位置Ａ２２のリジン残基に連結されてもよい。式（Ｉ）のアシル部分を含むアルキレングリコールが位置Ａ２１のアミノ酸残基に連結したペプチド残基に連結される場合、式（Ｉ）のアシル部分を含むアルキレングリコールは位置Ａ２２、Ａ２３、Ａ２４、又はＡ２５の何れかのリジン残基に連結する。
【００２５】
本願明細書の記載のように、式Ａｃｙ−ＡＡ１ｎ−ＡＡ２ｍ−ＡＡ３ｐ−に存在するアシル基は、脂肪酸または脂肪族二酸から生じる。
本願明細書において、「脂肪酸」なる用語は、少なくとも２つの炭素原子を有する飽和又は不飽和の、直鎖状又は分枝状の、脂肪族カルボン酸を含む。脂肪酸の非限定的例は、ミリスチン酸、パルミチン酸およびステアリン酸である。
本願明細書において、「脂肪族二酸」なる用語は、少なくとも２つの炭素原子を有する飽和又は不飽和の、直鎖状又は分枝状の、脂肪族カルボン酸を含む。脂肪族二酸の非限定的例は、コハク酸、ヘキサン二酸、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカンニ酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、ヘプタデカンニ酸、オクタデカン二酸及びエイコサンニ酸である。
ＡＡ１で示される中性の環状アミノ酸残基は、飽和６員炭素環を有するアミノ酸であり、任意に窒素ヘテロ原子を含んでおり、好ましくは環はシクロヘキサン環またはピペリジン環であるアミノ酸である。好ましくは、この中性の環状アミノ酸の分子量は、約１００から２００Ｄａの範囲にある。
ＡＡ２で示される酸性アミノ酸残基は、最大約２００Ｄａの分子量を有するアミノ酸であり、２つのカルボン酸基と第１又は第２のアミノ基を含む。
ＡＡ３で示される中性のアルキレングリコール含有アミノ酸残基はアルキレングリコール部分であり、場合により１方の末端にカルボン酸官能基と他方の末端にアミノ基官能基を含むオリゴ-又はポリアルキレングリコール部分である。
【００２６】
本願明細書において、アルキレングリコール部分なる用語は、オリゴ-及びポリアルキレングリコール部分に加えてモノアルキレングリコール部分を含む。
ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールに基づく鎖、ポリプロピレングリコールに基づく鎖及びポリブチレングリコールに基づく鎖、すなわち反復単位−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−または−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−に基づく鎖である。アルキレングリコール部分は、（明確な長さ／分子量を有する）単分散でも、（あまり明確でない長さ／平均分子量を有する）多分散でもよい。モノアルキレングリコール部分は、各末端に異なる基を含む−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−またはＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−を含む。
【００２７】
本願明細書の記載では、式（Ｉ）（Ａｃｙ−ＡＡ１ｎ−ＡＡ２ｍ−ＡＡ３ｐ−）のアシル部分においてＡＡ１、ＡＡ２及びＡＡ３の現れる順序は、独立に交換されうる。従って、式Ａｃｙ−ＡＡ１ｎ−ＡＡ２ｍ−ＡＡ３ｐ−は、例えば、式Ａｃｙ−ＡＡ２ｍ−ＡＡ１ｎ−ＡＡ３ｐ−及び式Ａｃｙ−ＡＡ３ｐ−ＡＡ２ｍ−ＡＡ１ｎ−［式中、Ａｃｙ、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ｎ、ｍ及びｐは本願明細書で定義された通りである］のような部分を含む。    
【００２８】
本願明細書の記載では、部分Ａｃｙ、ＡＡ１、ＡＡ２および／またはＡＡ３の間の結合は、アミド結合（−ＣＯＮＨ−、ここで−ＣＯ−は部分ＡＡ１、ＡＡ２及びＡＡ３の１つから生じ、−ＮＨ−は部分ＡＡ１、ＡＡ２及びＡＡ３のうちの１つから生じる）である。
【００２９】
（本発明の好ましい実施形態）
ある実施形態において、本発明の親インスリンは、位置Ａ２２のリジンとは別に、Ａ２１アミノ酸残基のＣ末端に連結した多くとも４つのアミノ酸の任意のペプチド残基とは別に、Ｂ２９Ｒ及び／又はｄｅｓＢ３０変異とは別に、以下の変異の１つ以上を含む。本願明細書において、初めにＡ又はＢ鎖の位置を与えられ、その後に可能なアミノ酸残基が１文字コードとして与えられる。ある実施形態では、位置Ａ２２のリジンとは別に、Ａ２１アミノ酸残基のＣ末端に連結した多くとも４つのアミノ酸の任意のペプチド残基とは別に、Ｂ２９Ｒ及び／又はｄｅｓＢ３０変異とは別に、５つの変異があり、別の実施形態では４つの変異があり、別の実施形態では３つの変異があり、別の実施形態では２つの変異があり、別の実施例では１つの変異があり、別の実施形態では変異がない：
Ａ４：  ＡまたはＱ。
Ａ５：  Ｌ。
Ａ８：  Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、ＬまたはＷ。
Ａ９：  ＲまたはＬ。
Ａ１４：  ＥまたはＤ。
Ａ１５：  ＡまたはＴ。
Ａ１６：  Ｍ。
Ａ１７：  ＤまたはＦ。
Ａ１８：  Ｒ、Ｌ、Ｉ、ＤまたはＶ。
Ａ２１：  ＧまたはＡ。
Ｂ３：  Ａ、Ｒ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＳまたはＴ。
Ｂ１０：  ＤまたはＥ。
Ｂ２５：  Ｙ、ＨまたはｄｅｓＢ２５。
Ｂ２６：  Ｑ、Ｅ、ＳまたはｄｅｓＢ２６。
Ｂ２７：  Ｈ、Ｌ、Ｍ、ＷまたはＹ。
Ｂ２８：  ＤまたはＥ。
【００３０】
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、Ａ４ＡまたはＡ４Ｑ変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、Ａ５Ｌ変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、Ａ８Ｌ、Ａ８Ｎ、Ａ８Ｑ、Ａ８Ｅ、Ａ８Ｈ、Ａ８ＬまたはＡ８Ｗ変異を含む。他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、Ａ８Ｈ変異を含む。  
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、Ａ９ＲまたはＡ９Ｌ変異を含む。  他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、Ａ９Ｌ変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、Ａ１４ＥまたはＡ１４Ｄ変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、Ａ１５ＡまたはＡ１５Ｔ変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、Ａ１６Ｍ変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、Ａ１７ＤまたはＡ１７Ｆ変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、Ａ１８Ｒ、Ａ１８Ｌ、Ａ１８Ｉ、Ａ１８ＤまたはＡ１８Ｖ変異を含む。他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、Ａ１８ＬまたはＡ１８Ｖ変異を含む。他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、Ａ１８Ｉ変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、Ａ２１ＧまたはＡ２１Ａ変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、Ｂ３Ａ、Ｂ３Ｒ、Ｂ３Ｈ、Ｂ３Ｉ、Ｂ３Ｌ、Ｂ３Ｍ、Ｂ３Ｆ、Ｂ３Ｗ、Ｂ３Ｙ、Ｂ３ＳまたはＢ３Ｔ変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、Ｂ１０ＤまたはＢ１０Ｅ変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、Ｂ２５Ｙ、Ｂ２５ＨまたはｄｅｓＢ２５変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、Ｂ２６Ｑ、Ｂ２６Ｅ、Ｂ２６ＳまたはｄｅｓＢ２６変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、Ｂ２７Ｈ、Ｂ２７Ｌ、Ｂ２７Ｍ、Ｂ２７ＷまたはＢ２７Ｙ変異を含む。他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、Ｂ２７ＷまたはＢ２７Ｙ変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、Ｂ２８ＤまたはＢ２８Ｅ変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、Ａ２１Ｑ、Ｂ１Ｑ、ｄｅｓＢ１、Ｂ３Ｑ、Ｂ３Ｓ、Ｂ３Ｔ、Ｂ１３ＱまたはｄｅｓＢ２７変異を含む。
【００３１】
本発明のアシル化インスリンアナログに存在してもよい親インスリンアナログの非限定的例は、ヒトインスリンから以下のずれを含む：
0005730569.tif 000002
0005730569.tif 000003
0005730569.tif 000004
0005730569.tif 000005
【００３２】
本発明のアシル化インスリンアナログに存在してもよい式Ａｃｙ−ＡＡ１ｎ−ＡＡ２ｍ−ＡＡ３ｐ-のアシル部分の非限定的な具体例は、以下のとおりである：
0005730569.tif 000006
0005730569.tif 000007
0005730569.tif 000008
【００３３】
ある実施形態では、ＡＡ３で示された部分は、水素原子がアミノ基から取り除かれ、水酸基がカルボキシ基から取り除かれた以下の化合物の中から選ばれる：
0005730569.tif 000009
【００３４】
式Ａｃｙ−ＡＡ１ｎ−ＡＡ２ｍ−ＡＡ３ｐ−のアシル部分の上記の非限定的な具体例の何れかは、上記の非限定的な具体的の何れかに存在するリジン残基のイプシロン・アミノ基に取り付けることができ、それにより本発明のアシル化インスリンアナログの更なる具体例が与えられる。
【００３５】
親インスリンは、それ自体は公知の方法で調製されうる。例えば、それらは、例えばＥＰ１２４６８４５に開示されているように、周知技術によって適切な宿主細胞中の問題の単鎖インスリンをコードするＤＮＡ配列の発現により産生されうる。例えばＥＰ１６３５２９及びＥＰ２１４８２６に開示のように、インスリンは、形質転換された宿主細胞において、インビトロプロセスで、酵素的に及び化学的に、所望のインスリン分子に変換される前駆体分子として発現される。前駆体分子は、例えばＥＰ１２４６８４５に開示されているように、後に切断されるＮ末端伸長と共に発現されてもよい。本発明に適切なタイプのＮ末端伸長の例は、例えば、米国特許第５３９５９２２号及びＥＰ特許第７６５３９５号において開示されている。より詳細には、ＷＯ２００６／０８２２０５の３７頁３１行目から３９頁２９行目を参照することができる。
【００３６】
親インスリンアナログは、インスリンアナログのリジン残基に式Ａｃｙ−ＡＡ１ｎ−ＡＡ２ｍ−ＡＡ３ｐ−の所望の基を導入することにより、本発明のアシル化インスリンアナログに変換されることができる。式Ａｃｙ−ＡＡ１ｎ−ＡＡ２ｍ−ＡＡ３ｐ−の所望の基は、任意の都合のよい方法によって導入することができ、多数の方法は当該反応のための従来技術で開示されている。更なる詳細は、以下の実施例に示される。
【００３７】
本発明のアシル化インスリンアナログは、基本的に亜鉛フリー化合物の形態で、または亜鉛錯体の形態で提供されてもよい。本発明のアシル化インスリンアナログの亜鉛錯体が提供される場合、２つのＺｎ２＋イオン、３つのＺｎ２＋イオンまたは４つのＺｎ２＋イオンは各インスリン六量体に結合することができる。このアシル化インスリンアナログの亜鉛錯体の溶液は、この種の混合物を含む。
【００３８】
更なる態様において、本発明は薬学的に許容可能な担体と共に本発明のアシル化インスリンアナログの治療上有効量を含む医薬組成物であって、治療を必要とする患者の１型糖尿病、２型糖尿病及びの高血糖症を引き起こす症状の治療のために使用することができる医薬組成物に関する。本発明のアシル化インスリンアナログは、１型糖尿病、２型糖尿病及びの高血糖症を引き起こす症状の治療における使用のための医薬組成物の製造に使用できる。当該組成物は、それ自体は公知の方法で調製される。
【００３９】
本発明の更なる態様において、治療を必要とする患者の１型糖尿病、２型糖尿病及びの高血糖症を引き起こす症状の治療用医薬組成物であって、迅速な作用開始を有するインスリン又はインスリンアナログと混合された本発明のアシル化インスリンアナログの治療上有効量と共に、薬学的に許容可能な担体及び添加剤を含む医薬組成物が提供される。
【００４０】
本発明の更なる態様において、本発明は、治療を必要とする患者の１型糖尿病、２型糖尿病及びの高血糖症を引き起こす症状の治療のための肺投与であって、迅速な作用開始を有するインスリン又はインスリンアナログと混合された本発明のアシル化インスリンアナログの治療上有効量と共に、薬学的に許容可能な担体及び添加剤を含む肺投与に関する。
ある態様では、本発明は、本発明のアシル化インスリンアナログと、ＡｓｐＢ２８ヒトインスリン、ＬｙｓＢ２８  ＰｒｏＢ２９ヒトインスリン及びＬｙｓＢ３  ＧｌｕＢ２９ヒトインスリンからなる群から選択された速効性インスリンアナログの混合物である医薬組成物を提供する。 
【００４１】
本発明のアシル化インスリンアナログと速効性インスリンアナログは、約９０／１０％；約７０／３０％又は約５０／５０％の比率で混合されうる。
【００４２】
本発明の更なる態様において、治療を必要とする患者の１型糖尿病、２型糖尿病及びの高血糖症を引き起こす症状の治療方法であって、薬学的に許容可能な担体と薬学的に許容可能な添加剤と共に本発明のアシル化インスリンアナログの治療上有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。
【００４３】
本発明の更なる態様において、治療を必要とする患者の１型糖尿病、２型糖尿病及びの高血糖症を引き起こす症状の治療方法であって、薬学的に許容可能な担体と薬学的に許容可能な添加剤と共に、迅速な作用開始を有するインスリン又はインスリンアナログと混合された本発明のアシル化インスリンアナログの治療上有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。
【００４４】
本発明の更なる態様において、治療を必要とする患者の糖尿病の治療用医薬組成物であって、薬学的に許容可能な担体と共に、迅速な作用開始を有するインスリン又はインスリンアナログと混合された本発明のアシル化インスリンアナログの治療上有効量を含む医薬組成物を提供する。
【００４５】
本発明の更なる態様において、肺投与を目的とする本発明に係る医薬組成物が提供される。
【００４６】
本発明の更なる態様において、治療を必要とする患者の糖尿病の治療方法であって、薬学的に許容可能な担体と共に請求項１に記載のアシル化インスリンアナログの治療上有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。
【００４７】
本発明の更なる態様において、治療を必要とする患者の糖尿病の治療方法であって、薬学的に許容可能な担体と共に迅速な作用開始を有するインスリン又はインスリンアナログと混合された請求項１に記載のアシル化インスリンアナログの治療上有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。
【００４８】
更なる態様において、本発明は、本願明細書に記載のとおり、ＨＳＡの存在下（例えば０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％または４．５％ＨＳＡの存在下）での測定において、ヒトインスリンと比較して＞３％、より好ましくは＞５％、より好ましくは＞１０％、より好ましくは＞１５％、より好ましくは＞２０％、より好ましくは＞３０％、より好ましくは＞４０％、より好ましくは＞４０％、より好ましくは＞６０％と測定されたインスリン受容体結合性を有する本発明のアシル化インスリンに関する。
【００４９】
更なる態様において、本発明は、ヒトインスリンと基本的に類似した全体的疎水性を有する本発明のアシル化インスリンアナログに関する。
更なる態様において、本発明のアシル化インスリンアナログは約０．０２から約１０、約０．１から約５；約０．５から約５；約０．２から約２；約０．２から約１；約０．１から約２；または約０．５から約２までの範囲にある疎水性インデックス（ｋ’ｒｅｌ）を有する。ヒトインスリンに関連する本発明のアシル化インスリンアナログの疎水性（疎水性インデックス）Ｋ’ｒｅｌは、ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ  ＲＰ１８（５μｍ，２５０×４ｍｍ）  ＨＰＬＣカラムで、Ａ）１０％アセトニトリルを含有する０．１Ｍのリン酸ナトリウム・バッファー（ｐＨ７．３）とＢ）５０％アセトニトリル水溶液との混合物を溶出剤として使用して、４０℃の定組成溶離により、測定した。溶出は、２１４ｎｍで溶出液のＵＶ吸収に従って監視した。ボイド時間（ｔ０）は、０．１ｍＭの硝酸ナトリウムを注入することによって見いだされた。ヒトインスリン（ｔヒト）の保持時間は、Ａ溶液とＢ溶液との間の比率を変化させることによって、少なくとも２ｔ０に合わせた。ｋ’ｒｅｌ＝（ｔ誘導体−ｔ０）／（ｔヒト−ｔ０）。
【００５０】
別の態様において、本発明は、生理的ｐＨ値で可溶性である本発明のアシル化インスリンアナログを含む医薬組成物に関する。
別の態様において、本発明は、約６．５から約８．５まで間隔のｐＨ値において可溶性である本発明のアシル化インスリンアナログを含む医薬組成物に関する。
別の態様において、本発明は、本発明のアシル化インスリンアナログを含む延長された作用プロフィールを有する医薬組成物に関する。
別の態様において、本発明は、肝選択的又は肝優先的作用を有するインスリンに関する。
別の態様において、本発明は、約１２０ｎｍｏｌ／ｍｌから約２４００ｎｍｏｌ／ｍｌまで、約４００ｎｍｏｌ／ｍｌから２４００ｎｍｏｌ／ｍｌまで、約４００ｎｍｏｌ／ｍｌから約１２００ｎｍｏｌ／ｍｌまで、約６００ｎｍｏｌ／ｍｌから約２４００ｎｍｏｌ／ｍｌまで、または約６００ｎｍｏｌ／ｍｌから約１２００ｎｍｏｌ／ｍｌまでの本発明のアシル化インスリンアナログまたは本発明のアシル化インスリンアナログと迅速に作用開始するインスリンアナログとの混合物を含む溶液である医薬組成物に関する。
【００５１】
（本発明の化合物の使用）
投与経路は、例えば、皮下、筋肉内または静脈内のように非経口的に、本発明の化合物を、効果的に身体の所望又は適切な場所へ運ぶ任意の経路であってもよい。あるいは、本発明の化合物は経口、肺、鼻に投与されることができる。
非経口投与のために、本発明の化合物は、既知のインスリン製剤と同じように製剤化される。さらに、非経口投与の場合、本発明の化合物は既知のインスリンと同じように投与され、医師はこの手順に精通している。
非経口投与は、注射器（場合によりペン型注射器）によって行われることができる。あるいは、非経口投与は、インフュージョンポンプによって行われることができる。
本発明の化合物の注射可能な組成物は、所望の最終産物を得るために、溶解されること及び適切な成分と混合されることを含む医薬品工業の従来技術を使用して調製されうる。したがって、ある手順によれば、本発明の化合物は調製される組成物の最終体積よりいくらか少ない水量に溶解される。等張剤、防腐剤及びバッファーは必要に応じて加えられ、溶液のｐＨ値は、必要に応じて、酸（例えば塩酸）または塩基（例えば水酸化ナトリウム水溶液）を使用して調整される。最後に、溶液の体積は、成分の所望の濃度を得るために、水によって調整される。
【００５２】
より正確には、本発明のインスリン製剤（例えば、溶液または懸濁液）は、本発明の化合物を、例えば約２４０から約１２００ｎｍｏｌｅ／ｍｌまでの範囲の濃度で、弱酸性状態の水性媒体に溶解することによって調製されてもよい。水性媒体は、例えば塩化ナトリウムまたはグリセリンによって、均張性にされる。さらに、水性媒体は、インスリン活性単位につき最大約２０μｇのＺｎ＋＋濃度の亜鉛イオン、酢酸及びクエン酸のようなバッファー、及びｍ−クレゾール又はフェノールのような防腐剤をふくんでもよい。溶液のｐＨ値は、沈殿を回避するために本発明の化合物の等電点にあまりに近くなることのない中性に向けて調整される。最終インスリン製剤のｐＨ値は、本発明の化合物において場合により変化された電荷の数、亜鉛イオンの濃度、本発明の化合物の濃度及び選択された本発明の化合物によって決まる。インスリン製剤は、例えば濾過滅菌法によって滅菌される。
本発明のインスリン製剤が、既知のインスリン製剤の使用と同様に使用される。
投与される本発明の化合物の量、本発明の化合物を投与する頻度の決定、投与される化合物又は本発明の化合物の選択は、場合により他の抗糖尿病用化合物と共に、糖尿病の治療に精通している医者と相談して決定される。
それ故、本発明は、当該治療を必要とする患者に、本発明の化合物の有効量を投与すること含んで成る、糖尿病の治療方法にも関する。
【００５３】
（医薬組成物）
本発明のアシル化インスリンアナログは皮下に、経口的に、又は肺に投与されることができる。
皮下投与の場合、本発明のアシル化インスリンアナログは、既知のインスリンの製剤と同じように製剤化される。さらに、皮下投与の場合、本発明のアシル化インスリンアナログは既知のインスリンの投与と同じように投与され、通常は医師はこの手順に精通している。
本発明のアシル化インスリンアナログは、循環するインスリンレベルを増加させるためにおよび／または循環するグルコース濃度を低下させるために効果的な量を吸入によって投与されてもよい。このような投与は、疾患（例えば糖尿病または高血糖）を治療するために効果的である。インスリンの有効量の達成は、本発明のアシル化インスリンアナログの約０．５μｇ／ｋｇから約５０μｇ／kgまでの範囲の吸入量の投与を必要とする。治療上の有効量は知識のある医者によって、インスリン濃度、血中グルコース濃度、患者の体調、患者の肺の状況等を含む要因を考慮して決定されることができる。
本発明のアシル化インスリンアナログは、その遅い吸収および／または減じた全身的なクリアランスを達成するために、吸入によって送達されてもよい。類似の粒径及び類似の肺の蓄積レベルを比較する場合、異なる吸入装置は通常は類似した薬物動態を提供する。
【００５４】
本発明のアシル化インスリンアナログは、吸入による治療薬の投与のために当該分野で知られている吸入装置の任意の種類によって送達されてもよい。これらの装置は、定量吸入器、噴霧器、乾燥粉末発生器、噴霧器などを含む。好ましくは、本発明のアシル化インスリンアナログは、乾燥粉末吸入器または噴霧器によって送達される。本発明のアシル化インスリンアナログを投与するために吸入装置のいくつかの望ましい特徴がある。例えば、吸入装置による送達は、有利には信頼性が高く、再現可能であり、正確である。良好な呼吸可能性のために、吸入装置は、例えば約１０μｍ未満、例えば約１−５μｍの小さい粒子またはエアゾールを送達すべきである。本発明の実行に適している市販の吸入装置のいくつかの具体例は、Ｃｙｃｌｏｈａｌｅｒ、ＴｕｒｂｏｈａｌｅｒTM（アストラ）、Ｒｏｔａｈａｌｅｒ（登録商標）（グラクソ）、Ｄｉｓｋｕｓ（登録商標）（グラクソ）、ＳｐｉｒｏｓTM吸入器（Ｄｕｒａ）、Ｉｎｈａｌｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社によって市販されている装置、ＡＥＲｘTM（Ａｒａｄｉｇｍ）、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ（登録商標）噴霧器（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）、ＡｃｏｒｎＩＩ（登録商標）定量吸入器、Ｓｐｉｎｈａｌｅｒ（登録商標）粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ）等である。
【００５５】
当業者が認めるように、本発明のアシル化インスリンアナログの処方、加えられる処方の量及び一回の投与の投与期間は、使用する吸入装置の種類によって決まる。いくつかのエアゾール送達システム（例えば噴霧器）の場合、システムが作動する投与の頻度及び時間は、主にエアゾールのアシル化インスリンアナログの濃度によって決まる。例えば、より短い投与時間に、より高い濃度のアシル化インスリンアナログの噴霧溶液が使用できる。定量吸入器のような装置は、より高いエアゾール濃度を生じることができ、本発明のアシル化インスリンアナログの所望の量の送達をより短い時間で操作することができる。薬剤の所与の充填が装置から排出されるまで、粉末吸入器のような装置は活性薬剤を送達する。この種の吸入器では、本発明のアシル化インスリンアナログの量は、単回投与で送達される用量を決定する。 
【００５６】
吸入装置に送達される本発明のアシル化インスリンアナログの粒径は、肺に、好ましくは気道下部または肺胞の中にいれるインスリンの能力に関して重要である。好ましくは、本発明のアシル化インスリンアナログは製剤化され、それにより好ましくは約１０％から約２０％、あるいはそれ以上のアシル化インスリンアナログが肺に堆積する。吸入により送達されるアシル化インスリンアナログの粒子は、好ましくは１０μｍ未満、より好ましくは約１μｍから約５μｍの範囲の粒径を有する。アシル化インスリンアナログの
【００５７】
剤形は、選択された吸入装置の所望の粒径を生ずるために選択される。 
有利には乾燥粉末として投与する場合、発明のアシル化インスリンアナログは、約１０μｍ未満、好ましくは約１から約５μｍの粒径を有する粒状形態に調製される。好適な粒径は、患者の肺の肺胞への送達のために効果的である。好ましくは、乾燥粉末は粒子の大多数が所望の範囲のサイズを有するように産生される粒子から主に成る。有利には、乾燥粉末の少なくとも約５０％は、約１０μｍ未満の直径を有する粒子からなる。当該剤形は、噴霧乾燥、ミリング（milling)、マイクロ化（micronisation)、又は本発明のアシル化インスリンアナログの粒子及び他の所望の成分を含む溶液の臨界点凝結によって得ることができる。本発明で使用できる粒子を生成することに適している他の方法も公知技術である。
【００５８】
粒子は、通常、容器中の乾燥粉末剤形から分離されて、次に担体気流によって患者の肺に運ばれる。通常は、現在の乾燥粉末吸入器では、固体を壊すための力は患者の吸入によってのみ提供される。吸入器の別の種類では、患者の吸入によって作られる気流量は、粒子を脱凝集させるインペラー・モーターを作動させる。 
乾燥粉末吸入器からの投与のための本発明のアシル化インスリンアナログの剤形は通常は、誘導体を含む微細に分けられた乾燥粉末を含むが、更に粉末は充填剤、担体、賦形剤、他の添加物等を含むことができる。添加物は、例えば、特別な粉末吸入器から必要に応じて送達のための粉末を希釈するために、剤形の処理を促進するために、剤形に有利な粉体物性を提供するために、吸入装置から粉末の分散を促進するために、剤形（例えば抗酸化剤またはバッファー）を安定させるために、剤形に味を付けるため又はその類のために、アシル化インスリンアナログの乾燥粉末剤形に含めることができる。有利には、添加物は、患者の気道に悪影響を与えない。アシル化インスリンアナログは分子レベルで添加物を混合することができるか、または固体剤形は添加物の粒子と混合により又は添加物の粒子を被膜することによりアシル化インスリンアナログを含むことができる。典型的添加物は、単糖類、二糖類及び多糖類、糖アルコール及び他のポリオール（例えばラクトース、グルコース、ラフィノース、メレチトース、ラクチトール、マルチトール、トレハロース、スクロース、マンニトール、デンプン又はそれらの組合せ）；界面活性剤（例えばソルビトール、ジ・ホスファチジルコリンまたはレシチン）；またはその類である。通常は、充填剤のような添加物は、上で記載されている目的のための有効量、しばしば製剤の約５０％から約９０重量％で存在する。インスリンアナログタンパク質のようなタンパク質の製剤のために当該分野で知られている添加剤は、更に製剤に含まれることができる。 
【００５９】
本発明のアシル化インスリンアナログを含む噴霧剤は、圧力下でノズルを介してアシル化インスリンアナログの懸濁液または溶液をおすことによって産生できる。ノズルサイズ及び構造、加圧力、及び液体供給速度は、所望の出力と粒径を得るために選択されうる。エレクトロスプレーは、例えば、毛細管またはノズル供給と関連して電界によって生じうる。有利には、噴霧器によって送達されるインスリンコンジュゲートの粒子は、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍから約５μｍの範囲の粒径を有する。 
噴霧器の用途に適している本発明のアシル化インスリンアナログの剤形は、通常は溶液１ｍｌにつき約１ｍｇから約５００ｍｇのアシル化インスリンアナログの濃度で、アシル化されたインスリンアナログを水溶液に含む。選択されるアシル化インスリンアナログ及び医学アドバイザーに知られている他の要因に応じて、上限値を低くしてもよく、例えば溶液１ｍｌにつき４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１２０、１００または５０ｍｇのアシル化インスリンアナログである。製剤は、賦形剤、バッファー、等張剤、防腐剤、界面活性剤、好ましくは亜鉛のような剤を含むことができる。製剤は、バッファー、還元剤、バルクタンパク質または炭水化物のようなアシル化インスリンアナログの安定化のための賦形剤または薬剤を含むこともできる。バルクタンパク質は、アルブミン、プロタミン又はその類を含むインスリンコンジュゲートの調製に役立つ。典型的な炭水化物は、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコースなどを含むアシル化インスリンアナログの調製に役立つ。アシル化インスリンアナログ製剤はまた、エアゾールを形成する際の溶液の噴霧化によって生じるインスリンコンジュゲートの表面誘発性凝集を減少または防止することができる界面活性剤を含むことができる。さまざまな従来の界面活性剤、例えばポリオキシエチレン脂肪酸エステルとアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルなどを使用することができる。一般的に、量は製剤の約０．００１と約４重量％との間の範囲にわたる。  
【００６０】
本発明のアシル化インスリンアナログを含む医薬組成物は、治療を必要とする患者に、非経口的に投与されることもできる。非経口投与は、注射器、場合によりペン型注射器によって、皮下、筋肉内、静脈内注射によって実施することができるあるいは、非経口投与は、インフュージョンポンプによって実施できる。 
本発明のアシル化インスリンアナログの注射可能な組成物は、溶解すること及び所望の最終産物を得るために適切な成分と混合されることを含む医薬品工業の従来の技術を使用して調製することができる。したがって、ある手順によれば、アシル化インスリンアナログは、調製される組成物の最終体積よりもいくらか少ない水量に溶解される。Ｚｉｎｋ、等張剤、防腐剤および／またはバッファーは必要に応じて添加され、溶液のｐＨ値は必要に応じて、酸（例えば塩酸）又は塩基（例えば水酸化ナトリウム）を使用して調整される。最終的に、溶液の体積は、成分の所望の濃度を得るために、水によって調整される。
本発明の更なる実施態様において、バッファーは、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム及びトリス（ヒドロキシメチル）-アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、スクシナート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸またはそれらの混合物から選択される。これらの特異的なバッファーのそれぞれは、本発明の別の実施形態を構成する。
【００６１】
本発明の更なる実施態様において、製剤は、フェノール、o-クレゾール、m-クレゾール、p-クレゾール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、プロピルp-ヒドロキシベンゾアート、2-フェノキシエタノール、ブチルp-ヒドロキシベンゾアート、２‐フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール及びチオメルサール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロフェネシン（3-（4-クロロフェノキシ）-1,2-プロパンジオール）またはそれらの混合物から更に成る。本発明の更なる実施態様において、防腐剤は約０．１ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌまでの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様において、防腐剤は約０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌまでの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様において、防腐剤は約５ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌまでの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様において、防腐剤は約１０ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌまでの濃度で存在する。これらの特異的な防腐剤の各々は、本発明の別の実施形態を構成する。医薬組成物の防腐剤の使用は、当業者にはよく知られている。便宜のために、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、１９９５）を参照することができる。
【００６２】
この発明の更なる実施態様において、製剤は、塩（例えば塩化ナトリウム）、糖または糖アルコール、アミノ酸（例えばL-グリシン、L-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファンまたはスレオニン）、アルジトール（例えばグリセロール（グリセリン）、1,2-プロパンジオール（プロピレングリコール）、1,3-プロパンジオールまたは1,3-ブタンジオール）、ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ４００）またはそれら混合物からなる群から選択されることができる等張剤から更に成る。単糖類、二糖類、又は多糖類、又は水溶性グルカンなどの任意の糖、例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性スターチ、ヒドロキシエチルスターチ及びカルボキシメチルセルロース-Naが使用されてもよい。ある実施態様において、糖添加物はスクロースである。糖アルコールは、少なくとも１つの−ＯＨ基を有するＣ４−Ｃ８炭化水素として定義され、例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール及びアラビトールを含む。ある実施形態において、糖アルコール添加物はマンニトールである。上記の糖または糖アルコールは、個々にまたは組合せにより使用されてもよい。糖または糖アルコールが液体製剤に可溶であり、本発明の方法を使用して得られる安定的な効果に不利に影響しない限り、使用される量について決められた制限はない。ある実施形態において、糖または糖アルコール濃度は、約１ｍｇ／ｍｌと約１５０ｍｇ／ｍｌとの間である。本発明の更なる実施態様において、等張剤は約１ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌまでの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様において、等張剤は約１ｍｇ／ｍｌから７ｍｇ／ｍｌまでの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様において、等張剤は約８ｍｇ／ｍｌから２４ｍｇ／ｍｌまでの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様において、等張剤は約２５ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌまでの濃度で存在する。これらの特異的な等張剤のそれぞれは、本発明の別の実施形態を構成する。医薬組成物における等張剤の使用は、当業者にはよく知られている。便宜のために、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、１９９５）を参照することができる。
【００６３】
典型的等張剤は塩化ナトリウム、マンニトール、ジメチル・スルホン及びグリセリンであり、典型的防腐剤はフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル及びベンジルアルコールである。
適切なバッファーの例は、酢酸ナトリウム、グリシルグリシン、ＨＥＰＥＳ（4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸）及びリン酸ナトリウムである。
本発明のアシル化インスリンアナログの鼻噴投与のための組成物は、例えば、欧州特許第２７２０９７号に記載のとおり調製することができる。
本発明のアシル化インスリンアナログを含む組成物が、インスリンに感受性がある病状の治療に使用されることができる。したがって、それらは、１型糖尿病、２型糖尿病、及び例えば大手術を受けた人及び重傷患者に見られる高血糖症を治療するために使用できる。任意の患者にとっての最適な服用レベルは、使用される特異的インスリン誘導体の有効量、患者の年齢、体重、身体活動により、他の薬剤との可能な組合せにより、及び治療される病状の重症度により決まる。それは、本発明のアシル化インスリンアナログの１日の投与量は、公知のインスリン組成物と類似した方法で、当業者によって、患者ごとに決定される。
【００６４】
（本発明の重要な特徴）
まとめると本発明の特徴のいくつかは以下の通りである：
１．Ａ２１アミノ酸残基のＣ末端に結合するリジン残基を含むインスリンアナログか又はリジン残基を含む最大４アミノ酸残基のペプチド残基であってペプチド残基がＡ２１アミノ酸残基のＣ末端に結合するインスリンアナログであるアシル化インスリンアナログであって、アシル部分がＡ２２位置のリジン残基に取り付けられたアルキレングリコール部分か又はＡ２１アミノ酸残基のＣ末端終端に取り付けられたペプチド残基に存在するリジン残基に取り付けられたアルキレングリコール部分を含み、インスリンアナログには単一のリジン（Ｋ、Ｌｙｓ）が存在することを特徴とするアシル化インスリンアナログ。
２．アシル部分は式Ｉ：
Ａｃｙ−ＡＡ１ｎ−ＡＡ２ｍ−ＡＡ３ｐ−（Ｉ）、
［式中、ｎは０または範囲１−３の整数であり、
ｍは０又は範囲１−６の整数であり、
ｐは１、２または３であり、
Ａｃｙは形式的に脂肪酸のカルボキシ基から又は脂肪族二酸のカルボキシ基の一つから水酸基を除去された、約８−２４の炭素原子を含む脂肪酸又は脂肪族二酸であり、
ＡＡ１は形式的にアミノ基から水素原子を除去され、カルボキシ基から水酸基を除去された中性環状アミノ酸であり、
ＡＡ２は形式的にアミノ基から水素原子を除去され、カルボキシ基から水酸基を除去された酸性アミノ酸であり、
ＡＡ３は形式的にアミノ基から水素原子が除去され、カルボキシ基から水酸基が除去された中性アルキレングリコール含有アミノ酸であり、
ＡＡ１、ＡＡ２及びＡＡ３が式に現れる順番は独立に交換することができ、  
Ａｃｙ、ＡＡ１、ＡＡ２および／またはＡＡ３の間の結合は、アミド（ペプチド）結合である］
であって、親インスリンへの取り付けは式（Ｉ）のアシル部分のＡＡ１、ＡＡ２、又はＡＡ３残基のＣ末端終端または式（Ｉ）の部分に存在するＡＡ２残基の側鎖の１つから行われる、１項に記載のアシル化インスリンアナログ。
３．Ａ２１アミノ酸残基のＣ末端に結合するリジン残基を含むインスリンアナログか又はリジン残基を含む最大４つのアミノ酸残基のペプチド残基がＡ２１アミノ酸残基のＣ末端に結合するインスリンアナログであるアシル化インスリンアナログであって、
アシル部分がＡ２２位置のリジン残基に取り付けられたアルキレングリコール部分又はＡ２１アミノ酸残基のＣ末端終端に取り付けられたペプチド残基に存在するリジン残基に取り付けられたアルキレングリコール部分を含み、インスリンアナログには単一のリジン（Ｋ、Ｌｙｓ）が存在し、アシル部分が一般式Ｉ：Ａｃｙ−ＡＡ１ｎ−ＡＡ２ｍ−ＡＡ３ｐ−（Ｉ）
［式中、ｎは０または範囲１−３の整数であり、
ｍは０又は範囲１−６の整数であり、
ｐは１、２または３であり、
Ａｃｙは形式的に脂肪酸のカルボキシ基から又は脂肪族二酸のカルボキシ基から水酸基を除去された、約８−２４の炭素原子を含む脂肪酸又は脂肪族二酸であり、
ＡＡ１は形式的にアミノ基から水素原子が除去され、カルボキシ基から水酸基が除去された中性環状アミノ酸であり、
ＡＡ２は形式的にアミノ基から水素原子が除去され、カルボキシ基から水酸基が除去された酸性アミノ酸であり、
ＡＡ３は形式的にアミノ基から水素原子が除去され、アルボキシ基から水酸基が除去された中性アルキレングリコール含有アミノ酸であり、
ＡＡ１、ＡＡ２及びＡＡ３が式に現れる順番は、独立に交換することができ、Ａｃｙ、ＡＡ１、ＡＡ２および／またはＡＡ３の間の結合は、アミド（ペプチド）結合である］を有するアルキレングリコール部分を含み、親インスリンへの取り付けは式（Ｉ）のアシル部分のＡＡ１、ＡＡ２、又はＡＡ３残基のＣ末端終端または式（Ｉ）の部分に存在するＡＡ２残基の側鎖の１つから行われることを特徴とするアシル化インスリンアナログ。
４．Ａｃｙが１４から２０炭素原子、好ましくは１６から２０炭素原子、より好ましくは１６から１８炭素原子、あるいは１８から２０炭素原子、とりわけ８、１０、１２、１４、１６、１７、１８、２０、２２又は２４炭素原子を有する脂肪酸又は脂肪族二酸から誘導される、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
５．Ａｃｙがジカルボン酸から誘導される、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
６．Ａｃｙが、水酸基が取り除かれたテトラデカン二酸、ペンタデカン二酸、ヘクサデカン二酸、ヘプタデカン二酸、オクタデカン二酸又はエイコサン二酸である、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。 
７．Ａｃｙが水酸基が取り除かれたヘクサデカン二酸、オクタデカン二酸、又はエイコサン二酸である、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。 
８．ＡＡ１が、
形式的にアミノ基から水素原子が除去され、カルボキシ基から水酸基が除去された
0005730569.tif 000010
［式中、ｑは０，１、２、３又は４である］
から選択される、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
９．ＡＡ１が、形式的にアミノ基から水素原子が除去され、カルボキシ基から水酸基が除去された
0005730569.tif 000011
から選択される、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
１０．ＡＡ２が、形式的にアミノ基から水素原子が除去され、カルボキシ基から水酸基が除去されたＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｄ-Ｇｌｕ、Ｄ-Ａｓｐ、γＧｌｕ、γＡｓｐ、γ-Ｄ-Ｇｌｕ、γ-Ｄ-Ａｓｐ、又は以下の化合物の何れか：
0005730569.tif 000012
［式中、矢印はＡＡ１、ＡＡ２又はＡＡ３のアミノ基への付着点を示す］から選択される、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
１１．ＡＡ２がγＧｌｕである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
１２．ＡＡ３が形式的にアミノ基から水素原子が除去され、カルボキシ基から水酸基が除去された以下の化合物：
0005730569.tif 000013
［ｒが範囲１−１００、好ましくは１−１０の整数であり、ｓが範囲１−３０、好ましくは１−１０の整数であり、ｔが範囲１−１５０、好ましくは２０−７０の整数である］
の何れかから選択される、
上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
１３．ｒが１、２、３、４、５、７、１１、２３又は２７である、前項のアシル化インスリンアナログ。
１４．ｓが１、２、３、４、１０、２０又は３０である、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
１５．整数ｔが現われている上式の平均分子量が２０００Ｄａ、３４００Ｄａ又は５０００Ｄａとなるように、整数ｔが選択される、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
１６．式Ａｃｙ−ＡＡ１ｎ−ＡＡ２ｍ−ＡＡ３ｐ−
［式中、Ａｃｙ、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ｎ、ｍ及びｐは上に定義の通りである］
のアシル部分が位置Ａ２２のリジン残基に結合する、
、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
１７．式Ａｃｙ−ＡＡ１ｎ−ＡＡ２ｍ−ＡＡ３ｐ−
［式中、Ａｃｙ、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ｎ、ｍ及びｐは上に定義の通りである］
のアシル部分が位置Ａ２３のリジン残基に結合する、
上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
１８．式Ａｃｙ−ＡＡ１ｎ−ＡＡ２ｍ−ＡＡ３ｐ−
［式中、Ａｃｙ、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ｎ、ｍ及びｐは上に定義の通りである］
のアシル部分が位置Ａ２４のリジン残基に結合する、
上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
１９．式Ａｃｙ−ＡＡ１ｎ−ＡＡ２ｍ−ＡＡ３ｐ−
［式中、Ａｃｙ、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ｎ、ｍ及びｐは上に定義の通りである］
のアシル部分が位置Ａ２５のリジン残基に結合する、
上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
２０．インスリンアナログが５２アミノ酸残基を含む、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
２１．インスリンアナログが５１アミノ酸残基を含む、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
２２．インスリンアナログが５３アミノ酸残基を含む、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
２３．インスリンアナログが５４アミノ酸残基を含む、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
２４．インスリンアナログが５０アミノ酸残基を含む、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
２５．インスリンアナログが４９アミノ酸残基を含む、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
２６．インスリンアナログの位置Ａ１−Ａ２１及びＢ１−Ｂ３０の唯一のアミノ酸残基がヒトインスリンに存在するそれらのアミノ酸残基から逸脱する、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
２７．インスリンアナログの位置Ａ１−Ａ２１及びＢ１−Ｂ３０の２つのみのアミノ酸残基がヒトインスリンに存在するそれらのアミノ酸残基から逸脱する、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
２８．インスリンアナログの位置Ａ１−Ａ２１及びＢ１−Ｂ３０の３つのみのアミノ酸残基がヒトインスリンに存在するそれらのアミノ酸残基から逸脱する、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
２９．インスリンアナログの位置Ａ１−Ａ２１及びＢ１−Ｂ３０の４つのみのアミノ酸残基がヒトインスリンに存在するそれらのアミノ酸残基から逸脱する、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
３０．位置Ａ１またはＢ１に存在するアミノ酸残基のＮ末端終端に結合されるアミノ酸残基がないか、または位置Ｂ３０に存在するアミノ酸残基のＣ末端終端に連結されるアミノ酸残基がない、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。   
３１．インスリンアナログのＡ１４位置のアミノ酸残基がＥである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
３２．インスリンアナログのＡ１８位置のアミノ酸残基がＱである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
３３．インスリンアナログのＡ２１位置のアミノ酸残基がＡ、ＧまたはＱである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
３４．インスリンアナログのＡ２２位置のアミノ酸残基がＫまたはＧである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
３５．インスリンアナログのＡ２２位置のアミノ酸残基がＫである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
３６．インスリンアナログのＡ２２位置のアミノ酸残基がＫであり、当該Ａ２２Ｋアミノ酸残基のＣ末端終端に結合するアミノ酸残基がない、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
３７．インスリンアナログのＡ２３位置のアミノ酸残基がＫまたはＧである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
３８．インスリンアナログのＡ２４位置のアミノ酸残基がＫまたはＧである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
３９．インスリンアナログのＡ２５位置のアミノ酸残基がＫである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
４０．インスリンアナログのＢ１位置のアミノ酸残基がＱまたは欠失である、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
４１．インスリンアナログのＢ３位置のアミノ酸残基がＱまたはＴである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
４２．インスリンアナログのＢ１３位置のアミノ酸残基がＱである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
４３．インスリンアナログのＢ２５位置のアミノ酸残基がＨである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
４４．インスリンアナログのＢ２７位置のアミノ酸残基が欠失している、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
４５．インスリンアナログのＢ２８位置のアミノ酸残基がＤ、ＥまたはＲである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
４６．インスリンアナログのＢ２８位置のアミノ酸残基がＲであり、Ｂ２９位置のアミノ酸残基がＰである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
４７．インスリンアナログのＢ２９位置のアミノ酸残基がＲである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
４８．インスリンアナログのＢ３０位置のアミノ酸残基が欠失している、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
４９．インスリンアナログのＡ１４位置のアミノ酸残基がＹまたはＥであり、
インスリンアナログのＡ１８位置のアミノ酸残基がＮまたはＱであり、
インスリンアナログのＡ２１位置のアミノ酸残基がＮ、Ａ、ＧまたはＱであり、
インスリンアナログのＡ２２位置のアミノ酸残基がＫまたはＧであり、
インスリンアナログのＡ２３位置のアミノ酸残基が欠失、ＫまたはＧであり、
インスリンアナログのＡ２４位置のアミノ酸残基が欠失、ＫまたはＧであり、
インスリンアナログのＡ２５位置のアミノ酸残基が欠失またはＫであり、
インスリンアナログのＢ１位置のアミノ酸残基がＦ、Ｑ又は欠失であり、
インスリンアナログのＢ３位置のアミノ酸残基がＮ、Ｑ又はＴであり、
インスリンアナログのＢ１３位置のアミノ酸残基がＥまたはＱであり、
インスリンアナログのＢ２５位置のアミノ酸残基がＦまたはＨであり、
インスリンアナログのＢ２７位置のアミノ酸残基がＴまたは欠失しており、
インスリンアナログのＢ２８位置のアミノ酸残基がＰ、Ｄ、Ｅ又はＲであり、
インスリンアナログのＢ２９位置のアミノ酸残基がＫ又はＲであり、
インスリンアナログのＢ３０位置のアミノ酸残基がＴ又は欠失である、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。 
５０．インスリンアナログの全てのアミノ酸残基がコード可能アミノ酸の残基である、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
５１．ＡＡ２がｇＧｌｕである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
５２．一般式Ａｃｙ−ＡＡ１ｎ−ＡＡ２ｍ−ＡＡ３ｐ−のアシル部分が、Ａｃｙ-ＡＡ３-、Ａｃｙ-ＡＡ２-ＡＡ３-、Ａｃｙ-ＡＡ２-ＡＡ３-ＡＡ２-、Ａｃｙ-ＡＡ２-（ＡＡ３）２-、Ａｃｙ-ＡＡ２-（ＡＡ３）２-ＡＡ２又はＡｃｙ-ＡＡ３-ＡＡ２-［式中、Ａｃｙ、ＡＡ２及びＡＡ３の各々は本願明細書に定義の通りである］を有する、
上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。 
５３．特に本願明細書において言及される化合物、例えば本願明細書の具体的な例に記載されている化合物の何れか一つある、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
５４．医薬として使用されるための、あるいは医薬に使用されるための上記の可能な生産物の項の何れか一つに記載の化合物。
５５．糖尿病の治療用の上記の可能な生産物の項の何れか一つに記載の化合物、あるいは糖尿病の治療用医薬の調製のための上記の可能な生産物の項の何れか一つに記載の化合物。
５６．上記の可能な生産物の項の何れか一つに記載の化合物の治療的な有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、糖尿病の治療方法。
５７．本願明細書に記載されている新規な特徴あるいは特徴の組合せ。
【００６５】
本願明細書に記載されている実施態様の一つ以上と、場合により、下記の請求項の一つ以上及び本願明細書に記載の一つ以上の項の組合せについては、更なる実施態様に結果としてなり、本願発明は前記実施形態、項及び請求項の全ての可能な組合せに関する。
本明細書に引用する刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各文献が個々に且つ特定の形で参照により本明細書に包含されるとして示され、且つその内容全体が本明細書に開示されたように、参照によりその内容全体及び同じ範囲が（準拠法によって許される最大の範囲を限度として）本発明の開示に含まれる。
全ての表題及び副題は本明細書において、説明のためにのみ便宜上使用されるのであり、決して本発明を制限するものとして捉えられるべきではない。
本明細書で使用されたあらゆる実施例、又は例示表現（例えば「〜などの」）は、単に、本発明を理解し易く説明するために用いたのであり、特に断らない限り、本発明の技術範囲を制限するものではない。本明細書におけるいかなる表現も、特許請求されない要素を本発明の実施に必須のものとして示すものではない。
本明細書における特許文献の引用及び援用は単に、本発明を理解し易くするために行なわれるのであり、決して、このような特許文献が持つ有効性、特許性、及び／又は強制力の側面を提示するためのものではない。本願明細書の参考文献の記載が、従来技術を構成することは許されない。
本願明細書において、「含む」なる言葉は、「備える」、「含有する」又は「包含する」を意味するものとして広義に解釈される（ＥＰＯガイドラインＣ４．１３）。
本発明は、本明細書に添付する請求項において列挙される特許発明の主題の全ての変形物及び均等物を、準拠法によって許される範囲を限度として含む。
以下の実施例は、非限定的な具体例として提供される。
【実施例】
【００６６】
一般的手順：
発現ベクター、イースト細胞の形質転換、及び本発明のインスリン前駆体の発現
Ｃ−ＰＯＴ型の全ての発現プラスミドは、EP171142に記載のものと類似しており、S. cerevisiaeのプラスミド選択及び安定化の目的において、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子（ＰＯＴ）を含むことによって特徴づけられる。また、プラスミドは、S. cerevisiaeトリオースリン酸イソメラーゼ・プロモーター及びターミネーターを含む。これらの配列は、リーダーとインスリン生成物の融合タンパク質をコードするＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片の配列以外の全ての配列について、プラスミドｐＫＦＮ１００３（ＷＯ９０／１００７５に記載される）の対応配列と類似している。異なる融合タンパク質を発現するために、ｐＫＦＮ１００３のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片は、単純に関心のリーダーインスリン融合をコードするＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片と置き換えられる。当該ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片は、基準技術に従って合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲを使用して合成されてよい。
イースト形質転換体は、宿主株S. cerevisiae菌株ＭＴ６６３の形質転換によって調製された（ＭＡＴａ／ＭＡＴα  ｐｅｐ４−３／ｐｅｐ４−３  ＨＩＳ４／ｈｉｓ４  ｔｐｉ：：ＬＥＵ２／ｔｐｉ：：ＬＥＵ２  Ｃｉｒ＋）。イースト菌株ＭＴ６６３は、ＷＯ９２／１１３７８の出願に関連してＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎに寄託され、寄託番号ＤＳＭ６２７８を与えられた。 
【００６７】
ＭＴ６６３は、６００ｎｍのＯ．Ｄ．が０．６まで、ＹＰＧａＬ（１％のＢａｃｔｏイースト抽出物、２％のＢａｃｔｏペプトン、２％のガラクトース、１％のラクタート）で増殖させた。１００ｍｌの培養は、遠心により回収され、１０ｍｌの水によって洗浄され、再遠心され、１．２Ｍのソルビトール、２５ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ（ｐＨ＝８．０）及び６．７ｍｇ／ｍｌのジチオトレイトールを含む溶液１０ｍｌに再懸濁した。懸濁液は３０℃で１５分間インキュベートし、遠心分離し、細胞は１．２Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、０．１Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．８）、及び２ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）２３４を含む溶液に再懸濁した。懸濁液は３０℃で３０分間インキュベートし、細胞は遠心により採取し、１０ｍｌの１．２Ｍソルビトール及び１０ｍｌのＣＡＳ（１．２Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５））で洗浄し、２ｍｌのＣＡＳに再懸濁した。
形質転換のために、１ｍｌのＣＡＳ−懸濁細胞は、約０．１ｍｇのプラスミドＤＮＡを混合され、１５分間室温に置かれた。
１ｍｌの（２０％のポリエチレングリコール４０００、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ＝７．５）を加えて、混合物は室温で更なる３０分間放置した。混合物は遠心分離し、ペレットを０．１のＳＯＳ（１．２Ｍのソルビトール、３３％（ｖ／ｖ）ＹＰＤ、６．７ｍＭのＣａＣｌ２）に再懸濁し、３０℃で２時間インキュベートした。次に、懸濁液は遠心分離し、ペレットは１．２Ｍのソルビトールの０．５ｍｌに再懸濁された。次に、６ｍｌの上層寒天（Ｓｈｅｒｍａｎ等（１９８２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＳＣ培地、１．２Ｍのソルビトール及び２．５％寒天含有）を５２℃で加え、懸濁液を同じ寒天凝固したソルビトール含有培地を含むプレートの上に流した。発現プラスミドによって形質転換したS. cerevisiae菌株ＭＴ６６３は、ＹＰＤにおいて３０℃７２時間増殖させた。
【００６８】
（本発明のアシル化インスリンアナログの産生、精製及び特徴づけ）
以下の実施例は、明細書及び実施例において同定される中間化合物及び最終生産物に関連する。本発明のアシル化インスリンアナログの調製は以下の実施例を使用して詳細に記載されているが、記載の化学反応及び精製スキームは本発明のインスリン誘導体の調製に対するそれらの一般的適用に関して開示される。場合により、本発明の開示された範囲の中に含まれる各々の化合物に記載されているとおり、反応が適用できないかもしれない。これが起こる化合物は当業者によって容易に認められるだろう。これらの場合、反応は、当業者に知られている従来修飾によって、すなわち干渉基の適切な保護によって、他の従来の試薬との交換によって、又は反応条件のルーチンの修飾によって、成功裏に実施できる。あるいは、本願明細書において開示される他の反応またはその他の従来のものは、本発明の対応する化合物の調製に適用できる。全ての準備方法において、全ての開始材料は公知であるか、又は当然知られている方法を使用している開始材料から容易に調製されることができる。全ての温度は摂氏度で記載され、特に明記しない限り、収率を記載する全ての割合及びパーセンテージは重量により記載され、溶媒と溶出剤を記載する割合は体積により記載される。 
本発明のアシル化インスリンアナログは、当該分野で典型的である以下の手順の一つ以上を使用することによって精製することができる。これらの手順は ― 必要に応じて ― 勾配、ｐＨ、塩類、濃度、流速、カラムその他に関して変更することができる。不純物プロフィール、問題のインスリンの溶解性のような要因に応じて、これらの修飾は容易に認識され、当業者により作ることができる。
【００６９】
一般式（ＩＩ）：
（ＩＩ）：Ａｃｙ−ＡＡ１ｎ−ＡＡ２ｍ−ＡＡ３ｐ−Ａｃｔ
［式中、Ａｃｙ、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ｎ、ｍ、及びｐは上に定義の通りであり、ＡｃｔはN-ヒドロキシスクシンイミド（ＯＳｕ）または1-ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルのような活性エステルの脱離基であって、アシル部分内のカルボキシル酸はtert-ブチルエステルとして保護されている］
のアシル化試薬の固相合成のための一般的手順
本発明の一般式（ＩＩ）の化合物は、固相ペプチド合成の分野の当業者によく知られている手順を使用して固体支持体上で合成することができる。この手順は、ポリスチレン2-クロロトリチルクロリド樹脂にＦｍｏｃ保護されたアミノ酸を付加することを含む。付加は、例えば、トリエチルアミン又はN,N-ジイソプロピルエチルアミン（下記の文献を参照）のような第３アミンの存在下で、遊離N-保護アミノ酸を使用して達成することができる。このアミノ酸のＣ末端終端（樹脂に取り付けられる）は、本発明の親インスリンに結合された合成配列の終端にある。樹脂へのＦｍｏｃアミノ酸の付加後、Ｆｍｏｃ基は、例えばピペリジンまたはジエチル・アミンのような第ニアミンを使用して脱保護され、続いて他の（または同じ）Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸の結合及び脱保護される。合成配列は、モノ-tert-ブチル保護された脂肪族（α,ω）二酸、例えばヘキサデカン二酸、ヘプタデカン二酸、オクタデカン二酸又はエイコサン二酸モノ-tert-ブチルエステルの結合によって終了する。樹脂から化合物の切断は０．５−５％のＴＦＡ／ＤＣＭ（トリフルオロ酢酸のジクロロメタン溶液）、酢酸（例えばＣＤＭ中の１０％、ＨＯＡｃ／トリフルオロエタノール／ＤＣＭ  １：１：８）、又はヘキサフルオロイソプロパノールのＤＣＭ溶液のような希釈された酸を使用して達成することができる(参照 "Organic Synthesis on Solid Phase", F.Z. Dorwald, Wiley-VCH, 2000. ISBN 3-527-29950-5, "Peptides: Chemistry and Biology", N. Sewald & H.-D. Jakubke, Wiley-VCH, 2002, ISBN 3-527-30405-3 又は "The Combinatorial Cheemistry Catalog" 1999, Novabiochem AG, 及びそれらの引用文献）。これは化合物に存在するtert-ブチル・エステルについて、カルボキシル酸保護基が脱保護されないことを確実にする。最後に、例えば、（樹脂から遊離された）Ｃ末端カルボキシ基は、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＯＳｕ）として活性化され、直接的に又は精製後に、本発明の親インスリンへの付加におけるカップリング試薬として使われる。この手順は、実施例４に例示される。
【００７０】
あるいは、上の一般式（ＩＩ）のアシル化試薬は、後述するように液相合成によって調製することができる。
ヘキサデカン二酸、ヘプタデカン二酸、オクタデカン二酸又はエイコサン二酸モノ-tert-ブチルエステルのようなモノ-tert-ブチル保護された脂肪族二酸は、例えば後述のようなＯＳｕエステル又は当業者に公知の任意の他の活性化エステル（ＨＯＢｔ−又はＨＯＡｔ-エステル）として活性化される。この活性化エステルは、ＴＨＦ、ＤＭＦ、ＮＭＰ（又は溶媒混合物）のような適切な溶媒中、適切な塩基（例えばＤＩＰＥＡ又はトリエチルアミン）の存在下で、アミノ酸ＡＡ１、モノ-tert-ブチル保護されたＡＡ２、又はＡＡ３の一つと結合することができる。例えば抽出手順によって又はクロマトグラフィー手順によって、中間体は単離される。結果として生じる中間体は、再度（上記の通り）活性化され、上記の通りアミノ酸ＡＡ１、モノ-tert-ブチル保護されたＡＡ２、又はＡＡ３の一つと結合される。所望の脱保護中間体Ａｃｙ−ＡＡ１ｎ−ＡＡ２ｍ−ＡＡ３ｐ−ＯＨが得られるまで、この手順は繰り返される。これは、一般式（ＩＩ）  Ａｃｙ−ＡＡ１ｎ−ＡＡ２ｍ−ＡＡ３ｐ−Ａｃｔのアシル化試薬を供給するために、次々に活性化される。この手順は、実施例９に例示される。
【００７１】
本発明のアシル化インスリンアナログの調製のための一般的手順（Ａ）
一般的手順（Ａ）は次に概説され、最初の実施例に例示される：
実施例１、一般的手順（Ａ）：
A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル-γGlu), B29R, desB30ヒトインスリン
0005730569.tif 000014
このインスリンは、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンの代わりに、Ａ２２Ｋ、Ｂ２９Ｒ  ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン使用しているＷＯ２００６／０８２２０５（実施例３）に記載されているインスリンと同様に調製された。
LC-MS (エレクトロスプレー); m/z: 1627 (M+4)+/4; 1302 (M+5)+/5
【００７２】
実施例２、一般的手順（Ａ）：
A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-(2-アミノエチル-PEG2000-イルアセチル)), B29R desB30ヒトインスリン：
0005730569.tif 000015
工程１：
ヘキサデカンニ酸tert-ブチルエステル2,5-ジ・オキソピロリジン-1-イルエステル（２１８ｍｇ、０．４９７ｍｍｏｌ）はＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解され、プロピルアミン−ＰＥＧ−カルボキシル酸ＭＷ２０００（ＮＯＦ法人のＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＰＡ−２０ＨＣ、１０００ｍｇ、約０．４９７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物は一夜窒素下で撹拌された。反応混合物は、シリカゲルカラムへ移されてエタノール勾配（０−１０％）を有するＤＣＭによって溶出して、ｔｅｒｔ−ブチルヘキサデカンジオイルプロピルアミン−ＰＥＧ−カルボキシル酸（ＭＷ２０００）中間体を得る。  
【００７３】
工程２：A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-(2-アミノエチル-PEG2000-イルアセチル)), B29R, desB30ヒトインスリンの合成。
tert-ブチルヘキサデカンジオイルプロピルアミン-PEG-カルボン酸（ＭＷ２０００）（７２ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）はＴＨＦ（４ｍＬ）に溶解され、ＤＩＰＥＡ（６．３Ｌ、０．０３７ｍｍｏｌ）及びＴＳＴＵ（１１．１ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物は窒素下で一晩撹拌し、ＤＭＳＯ（１ｍＬ）を添加し、混合物にＡ２２Ｋ、Ｂ２９Ｒ  ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（１８０ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）をトリエチルアミン（４３Ｌ、０．３１ｍｍｏｌ）と共にＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解した溶液を加えた。混合物は氷上で冷却し、水（１５ｍＬ）を加え、ｐＨは１ＮのＨＣｌにより５．２に合わせ、次に１％のアンモニア水によりｐＨ  ７−８に調整した。混合物は、０．１％のＴＦＡを含むアセトニトリル水溶液の３５−７５％勾配を使用して分取ＨＰＬＣで精製された。分画はＬＣ−ＭＳで分析され、所望の生成物を含む分画はプールされ、真空中で溶媒を除去後、凍結乾燥した。凍結乾燥された物質は３０分間のＴＦＡ／水  ９５：５によって処理され、溶媒は真空で除去された。粗生成物は陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｒｅｓｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラム，１  ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を使用して精製し、４２．５％ＥｔＯＨ，０．２５％ＴＲＩＳ（ｐＨ７．５）中の酢酸アンモニウム（２５ＣＶにつき０．２５％〜１．２５％）の勾配により溶出し、続いてＪｕｐｉｔｅｒＣ４，５カラムを使用する分取ＨＰＬＣで、０．１％ＴＦＡ含有する３０−７０％アセトニトリル／水勾配により９０分以上表記化合物を得るために溶出した。  
HPLC-MS: m/z around 1360 (M+/6). 
【００７４】
実施例３、一般的手順（Ａ）：
A22K(Nε-3-(3-{4-[3-(5-カルボキシペンタノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γGlu), B29R, desB30ヒトインスリン
0005730569.tif 000016
このインスリンは、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンの代わりに、Ａ２２Ｋ、Ｂ２９Ｒ  ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン使用し、オクタン二酸モノ-tert-ブチルエステルの代わりにヘキサン二酸モノ-tert-ブチルエステルを使用して、ＷＯ２００６／０８２２０５（実施例８）に記載されているインスリンと同様に調製された。
MALDI-TOF MS (マトリックス：シナピン酸); m/z: 6411.
【００７５】
実施例４、一般的手順（Ａ）：A22K(Nε-[2-(2-[2-(2-[2-(オクタデカンジオイル-γGlu)アミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]), B29R, desB30ヒトインスリン
0005730569.tif 000017
MALDI-TOF MS (マトリックス：シナピン酸); m/z: 6581.
本インスリンの調製のためのアシル化試薬は以下のように調製した：
0005730569.tif 000018
開始樹脂：2-クロロトリチル樹脂、１．６０ｍｍｏｌ／ｇ
１．０ｇの樹脂は、ＤＣＭ（１０ｍｌ）で３０分間膨張させた。  
【００７６】
１．  Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸によるアシル化：
０．３９ｇ（０．６３ｅｑ、１．０ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（Ｆｍｏｃ−ＯＥＧ−ＯＨ）をＤＣＭ（１５ｍｌ）に溶解し、樹脂に加えた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（０．４４ｍｌ、２．５ｍｍｏｌ）は滴下で加えた。反応混合物は、３０分間ボルテックスにかけ、次にメタノール（２ｍｌ）を添加し、混合物は更なる１５分間ボルテックスにかけた。樹脂はろ過し、ＮＭＰ（２×８ｍｌ）及びＤＣＭ（８×８ｍｌ）によって洗浄した。
２０％のピペリジン／ＮＭＰ（８ｍｌ）を添加して、１０分間静置した。再度繰り返した。
ろ過し、ＮＭＰ（２×８ｍｌ）、ＤＣＭ（３×８ｍｌ）及びＮＭＰ（５×８ｍｌ）によって洗浄した。
陽性ＴＮＢＳテストは、赤色樹脂を生じる。
【００７７】
２．  Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸によるアシル化：
０．７８ｇ（２ｅｑ、２．０ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸は、ＮＭＰ／ＤＣＭ  １：１（１０ｍｌ）に溶解した。０．２８ｇ（２．２ｅｑ、２．４ｍｍｏｌ）のＨＯＳｕを加え、続いて０．３７ｍｌ（２．２ｅｑ、２．４ｍｍｏｌ）のＤＩＣを追加した。反応混合物は１時間静置し、次に樹脂に加え、最後に０．４０７ｍｌ（２．２ｅｑ）のＤＩＥＡを加えた。混合物を１６時間ボルテックスし、ろ過し、ＮＭＰ（２×８ｍｌ）、ＤＣＭ（３×８ｍｌ）及びＮＭＰ（５×８ｍｌ）によって洗浄した。
陽性ＴＮＢＳテストは、無色の樹脂を生じた。
２０％のピペリジン／ＮＭＰ（１０ｍｌ）を加え、１０分間静置した。再度繰り返した。
ろ過し、ＮＭＰ（２×８ｍｌ）、ＤＣＭ（３×８ｍｌ）及びＮＭＰ（５×８ｍｌ）によって洗浄した。
陽性ＴＮＢＳテストは、赤色の樹脂を生じた。
【００７８】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕによるアシル化：
０．８６ｇ（２ｅｑ、２．０ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕは、ＮＭＰ／ＤＣＭ  １：１（１０ｍｌ）に溶解した。０．３２ｇ（２．２ｅｑ、２．４ｍｍｏｌ）のＨＯＢＴを加え、続いて０．３７ｍｌ（２．２ｅｑ、２．４ｍｍｏｌ）のＤＩＣの追加した。反応混合物を２０分間静置し、次に樹脂に移され、最後に０．４０７ｍｌ（２．２ｅｑ）のＤＩＥＡを添加した。混合物を１６時間ボルテックスし、ろ過し、ＮＭＰ（２×８ｍｌ）、ＤＣＭ（３×８ｍｌ）及びＮＭＰ（５×８ｍｌ）によって洗浄した。
陽性ＴＮＢＳテストは、無色の樹脂を生じた。
２０％のピペリジン／ＮＭＰ（１０ｍｌ）を加え、１０分間静置した。再度繰り返した。
ろ過し、ＮＭＰ（２×８ｍｌ）、ＤＣＭ（３×８ｍｌ）及びＮＭＰ（５×８ｍｌ）によって洗浄した。
陽性ＴＮＢＳテストは、赤色の樹脂を生じた。
【００７９】
オクタデカン二酸モノtert-ブチル・エステルによるアシル化：
０．７５ｇ（２ｅｑ、２．０ｍｍｏｌ）のオクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステルは、ＮＭＰ／ＤＣＭ  １：１（１０ｍｌ）に溶解された。０．３２ｇ（２．２ｅｑ、２．４ｍｍｏｌ）のＨＯＢＴを加え、続いて０．３７ｍｌ（２．２ｅｑ、２．４ｍｍｏｌ）のＤＩＣを加えた。反応混合物を２０分間静置し、次に樹脂に加え、最後に０．４１ｍｌ（２．２ｅｑ）のＤＩＥＡを加えた。混合物を１６時間ボルテックスし、ろ過し、ＮＭＰ（２×８ｍｌ）、ＤＣＭ（３×８ｍｌ）及びＮＭＰ（５×８ｍｌ）によって洗浄した。
【００８０】
ＴＦＡによる切断：
８ｍｌの５％ＴＦＡ／ＤＣＭを樹脂に加え、混合物を２時間ボルテックスし、ろ過し、ろ液を収集した。さらに５％ＴＦＡ／ＤＣＭ（８ｍｌ）を樹脂に加え、混合物を１０分間ボルテックスし、ろ過し、樹脂はＤＣＭ（２×１０ｍｌ）で洗浄した。ろ液と洗浄液を混合したものを、約８００ｕｌのＤＩＥＡを使用してＰＨを塩基性に調製した。混合物は油（３．５ｇ）を与えて真空で蒸発させた。ジエチル・エーテル（３０ｍｌ）を加え、溶解しない油は、デカンテーションによって分離され、真空で蒸発させた。これは、１．１ｇの17-{(S)-1-tert-ブトキシカルボニル-3-[2-(2-{[2-(2-カルボキシメトキシエトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ヘプタデカン酸 tert-ブチルエステル (別名:Tert-ブチルオクタデカンジオイル−Ｇｌｕ（ＯＥＧ−ＯＥＧ−ＯＨ）−ＯＴＢＵ) を油として産出した。
LCM（Sciex100 API）：m/z = 846.6（M+1）+。
【００８１】
ＯＳｕ−活性化：
上記のtert-ブチルオクタデカンジオイル−Ｇｌｕ（ＯＥＧ−ＯＥＧ−ＯＨ）−ＯＴＢＵ（０．６３ｇ）を、ＴＨＦ（３５ｍｌ）に溶解した。ＤＩＥＡ（０．２５５ｍｌ，２ｅｑ．）  、続いてＴＳＴＵ（０．４５ｇ，２ｅｑ．）が加えられ、混合物は１６時間室温で撹拌された。
混合物は、酢酸エチル（２５０ｍｌ）と水性のＮａＨＳＯ４（３×１００ｍｌ）との間で分割された。有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、真空で濃縮し０．６５ｇの17-((S)-1-tert-ブトキシカルボニル-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イルオキシカルボニルメトキシ)エトキシ]エチルカルバモイル}メトキシ)エトキシ]エチルカルバモイル}プロピルカルバモイル)ヘプタデカン二酸 tert-ブチルエステル(別名:tert-ブチルオクタデカンジオイル-Glu(OEG-OEG-OSu)-OTBU) を油として得た。
LC-MS: m/z = 943.4 (M+1)+.
【００８２】
実施例５、一般的手順（Ａ）：
A22K(Nε-3-(3-{4-[3-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γGlu), B29R, desB30ヒトインスリン
0005730569.tif 000019
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z = 1630, (M+4)+/4
【００８３】
実施例６、一般的手順（Ａ）：
A22K(Nε-[2-(2-[2-(2-[2-(エイコサンジオイル-γGlu)アミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]), B29R, desB30ヒトインスリン
0005730569.tif 000020
MALDI-MS (マトリックス：シナピン酸); m/z: 6606
【００８４】
実施例７、一般的手順（Ａ）：
A14E, A22K(Nε-[2-(2-[2-(2-[2-(オクタデカンジオイル-γGlu)アミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]), B25H, B29R, desB30 ヒトインスリン
0005730569.tif 000021
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z = 1634, (M+4)+/4
【００８５】
実施例８、一般的手順（Ａ）：
A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), desB29, desB30ヒトインスリン
0005730569.tif 000022
６３ｍｇのA22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン（実施例４）はＴｒｉｓバッファー、ｐＨ８（５０ｍＭ、１０ｍｌ）に溶解し、２０％エタノール含有Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ８（５０ｍＭ、０．２ｍＬ）中セファロース・ゲルに固定化したカルボキシペプチダーゼＢに加え、混合物は室温で１６時間穏やかに振盪した。更に２０％エタノール含有Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ８（５０ｍＭ、０．８ｍＬ）中のセファロースゲルに固定化したカルボキシペプチダーゼＢを加え、２４時間優しく振盪した。混合物はろ過され、フィルターは２０％エタノール含有ＴｒｉｓバッファーｐＨ８（５０ｍＭ、０．８ｍＬ）で洗浄した。混合したろ液と洗浄液は凍結乾燥された。残留物は、表題のインスリンを得るために、ＨＰＬＣによって精製された
MALDI-TOF MS: m/z = 6424 
【００８６】
実施例９、一般的手順（Ａ）：
A14E, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル)), B25H, B29R, desB30ヒトインスリン
0005730569.tif 000023
アシル化試薬19-{1-tert-ブトキシカルボニル-3-[2-(2-{2-[2-(2-カルボキシエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ノナデカン酸 tert-ブチル エステルN-ヒドロキシスクシンイミドエステルの調製及び親インスリンへの結合：
エイコサン二酸 tert-ブチルエステルN-ヒドロキシスクシンイミドエステル：
0005730569.tif 000024
エイコサン二酸モノ−ｔｅｒｔ−ブチル・エステル（５ｇ、１２．５４ｍｍｏｌ）とＴＳＴＵ（４．５３ｇ、１５．０５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５０ｍＬ）中で混合し、ＤＩＰＥＡ（２．６２ｍＬ）を加えて、結果物の濁った混合物は２時間ＲＴで撹拌され、次にＤＭＦ（３０ｍＬ）を加え透明溶液を生じさせ、更に一晩撹拌した。結果として生じる混合物はほとんど乾燥するまで蒸発させ、残留物は冷却したアセトニトリルと混合させ、沈殿物の沈殿に結果としてなった。これはろ過され、一晩真空において乾燥し、６．０１ｇ（９７％）のエイコサン二酸tert-ブチルエステルN-ヒドロキシスクシンイミドエステルを得た。
MS (エレクトロスプレー): m/z: 440 (M-56 (tBu)).
【００８７】
2-(19-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル
0005730569.tif 000025
エイコサン二酸tert-ブチルエステル２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（６．０１ｇ、１２．１２４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１５０ｍＬ）に溶解し、ＤＭＦ／水（１／１、４０ｍｌ）中でＨ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ（２．７１ｇ、１３．３３ｍｍｏｌ）のスラリーを混合させる。これはゲル状溶液に結果としてなり、加熱して透明溶液を得て、３時間ＲＴで撹拌する。次に溶液を蒸発させ、１００ｍＬの水を加えて、混合物は６０℃まで加熱され、溶液を生じさせ、冷却することで結晶化される。沈殿物はアセトニトリルから再結晶され、結晶は真空において乾燥した。収率６．８２ｇ（９６％）。
MS (エレクトロスプレー): m/z 584 (M+1).
【００８８】
2-(19-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)ペンタン二酸1-tert-ブチル エステル 5-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル) エステル
0005730569.tif 000026
2-(19-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル 5-(2,5-ジオキソピロリジン-1-yl)エステル（6.52g、11.17mmol）はＴＨＦ（１００ｍｌ）に溶解され、ＤＩＰＥＡ（２．１４ｍｌ）を加え、続いてＴＳＴＵ（３．７０ｇ、１２．２９ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（２５ｍＬ）を加えた。混合物はＲＴで一晩撹拌し、次に蒸発させ、アセトニトリルから再結晶した褐色の残留物に結果としてなった。５℃で一晩冷却した後に、粉末が形成された。これはＴＨＦに溶解され、ＭｇＳＯ４によって乾燥され、乾燥するまで蒸発させ、６．１７ｇ（８１％）の表記化合物を得た。
MS（エレクトロスプレー）：m/z：681（M+1）。
【００８９】
19-{1-tert-ブトキシカルボニル-3-[2-(2-{2-[2-(2-カルボキシエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ノナデカン酸 tert-ブチル エステル
0005730569.tif 000027
2-(19-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)ペンタン二酸1-tert-ブチル エステル 5-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル) エステル (0.56g, 0.822 mmol) をＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解し、3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオン酸（０．２２ｇ，０．８２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（２０ｍＬ）を加えられ、混合物は３時間ＲＴで撹拌した。ＬＣＭＳは反応が終了したことを示し（ＭＳ：ｍ／ｚ  ８３１（Ｍ＋１））、反応混合物がＴＳＴＵとの以下の反応のために直接用いられた。
【００９０】
19-(1-tert-ブトキシカルボニル-3-{2-[2-(2-{2-[2-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルオキシカルボニル)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エチルカルバモイル}プロピルカルバモイル)ノナデカン酸 tert-ブチル エステル
0005730569.tif 000028
19-{1-tert-ブトキシカルボニル-3-[2-(2-{2-[2-(2-カルボキシエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ノナデカン酸 tert-ブチル エステル (ＴＨＦ４０ｍＬ中の０．６８ｇ粗溶液、０．８２ｍｍｏｌ）とＴＳＴＵ（０．２９６ｇ、０．９８２ｍｍｏｌ）を混合し、ｐＨはＤＩＰＥＡ（０．１７１ｍＬ）の添加により調製し、結果の混合物は一晩ＲＴで撹拌した。これは透明溶液を生じ、乾燥まで蒸発させ、ジエチルエーテルにより処理し、１．２ｇの表記化合物をワックス状の塊として得て、それは更なる精製なしに使用した。
MS（エレクトロスプレー）：m/z 816（M-2 tBu）（calcd. 816）。
【００９１】
19-(1-tert-ブトキシカルボニル-3-{2-[2-(2-{2-[2-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルオキシカルボニル)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エチルカルバモイル}プロピルカルバモイル)ノナデカン酸 tert-ブチル エステルのA14E, A22K, B25H, B29R, desB30 ヒトインスリンへの結合:
Ａ１４Ｅ、Ａ２２Ｋ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（０．３ｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４ｍｌ）とＮａ２ＣＯ３（０．１Ｍ、１０ｍｌ）の混合物に溶解し、ｐＨはＮａＯＨ（１Ｍ）で１０．６に調製した。 19-(1-tert-ブトキシカルボニル-3-{2-[2-(2-{2-[2-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルオキシカルボニル)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エチルカルバモイル}プロピルカルバモイル)ノナデカン酸 tert-ブチル エステル （０．０４８ｇ，０．０５２  ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（４ｍＬ）をこの溶液に加え、混合物を穏やかにＲＴで撹拌した。５滴のメチルアミン溶液（ＭｅＯＨ中４０％）を加え、混合物は更に５分間撹拌された。次に酢酸（氷酢酸、５ｍｌ）を１部分加え、結果として生じる混合物は分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、３ｃｍのカラム、勾配０−７分の２０％アセトニトリル、７−３２分の２０−１００％アセトニトリル、３２−３７分の１００％のアセトニトリル）によって精製された。
純粋な分画はプールされ、凍結は乾燥した。
結果として生じる化合物はＴＦＡ（３０ｍｌ）に溶解され、ＲＴで２時間撹拌された、次にアセトニトリル（２０ｍｌ）と水（２０ｍｌ）を加え、混合物は分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、３ｃｍカラム、勾配０−７分の２０％アセトニトリル、７−３２分の２０−６０  ％  アセトニトリル、３２−３７分の６０％アセトニトリル）によって精製された。
純粋な分画はプールされ、凍結乾燥された。
ＨＰＬＣ（Ｃ１８、３ｃｍカラム、勾配０−７分の２５％アセトニトリル、７−４７分の２５−６０％アセトニトリル、４７−５２分の６０％アセトニトリル）によって再精製され、純粋な分画はプールされ、凍結乾燥した。
これにより１３ｍｇの最終生産物を得た。
MS（エレクトロスプレー）：m/z 6520（calcd.6520）。
【００９２】
実施例１０、一般的手順（Ａ）：
A18L, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
0005730569.tif 000029
MS (エレクトロスプレー): m/z: 6578 (Calcd:6578).
【００９３】
実施例１１、一般的手順（Ａ）：
A8H, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
0005730569.tif 000030
MALDI-TOF MS: m/z = 6615 (Calcd.: 6615).
【００９４】
実施例１２、一般的手順（Ａ）：
A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル-γGlu), B29R, desB30ヒトインスリン
0005730569.tif 000031
MS（エレクトロスプレー）：m/z = 1677（m+4）/4。
【００９５】
実施例１３、一般的手順（Ａ）：
A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}プロピオニル)), B29R, desB30ヒトインスリン
0005730569.tif 000032
MS (エレクトロスプレー): m/z = 6653 (Calcd.: 6653).
【００９６】
実施例１４、一般的手順（Ａ）：
A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル)), B29R, desB30 ヒトインスリン
0005730569.tif 000033
MALDI-TOF MS: m/z = 6535 (Calcd.: 6535)
【００９７】
実施例１５、一般的手順（Ａ）：
A14E, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-(3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル)), B25H, B29R, desB30ヒトインスリン
0005730569.tif 000034
MS（エレクトロスプレー）：m/z = 1667.9（m+4）/4。
【００９８】
実施例１６、一般的手順（Ａ）：
A14E, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-γGlu-(3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル)), B25H, B29R, desB30ヒトインスリン
0005730569.tif 000035
MALDI-TOF MS: m/z = 6824 (Calcd.: 6825)
【００９９】
実施例１７、一般的手順（Ａ）：
A14E, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル)-γGlu), B25H, B29R, desB30ヒトインスリン
0005730569.tif 000036
MALDI-TOF MS: m/z = 6620 (Calcd.: 6621)
【０１００】
実施例１８、一般的手順（Ａ）：
A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B28E, B29R, desB30ヒトインスリン
0005730569.tif 000037
MALDI-TOF MS: m/z = 6610 (Calcd.: 6610)
【０１０１】
実施例１９、一般的手順（Ａ）：
A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
0005730569.tif 000038
MALDI-TOF MS: m/z = 6724 (Calcd.: 6724)
以下の実施例のインスリンは、類似した手順を使用して調製することができる：
【０１０２】
実施例２０：
A14E, A22K(Nε-[2-(2-[2-(2-[2-(エイコサンジオイル-γGlu)アミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]), B25H, B29R, desB30ヒトインスリン
【０１０３】
実施例２１：
A22K(Nε-オクタデカンジオイル-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル-γGlu), B29R, desB30ヒトインスリン
【０１０４】
実施例２２：
A22K(Nε-エイコサンジオイル-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル-γGlu), B29R, desB30ヒトインスリン
【０１０５】
実施例２３：
A22K(Nε-オクタデカンジオイル-(2-アミノエチル-PEG2000-イルアセチル)), B29R desB30ヒトインスリン
【０１０６】
実施例２４：
A22K(Nε-エイコサンジオイル-(2-アミノエチル-PEG2000-イルアセチル)), B29R desB30 ヒトインスリン
【０１０７】
実施例２５：
A22K(Nε-3-(3-{4-[3-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γGlu), B29R desB30ヒトインスリン
【０１０８】
実施例２６：
A22K(Nε-3-(3-{4-[3-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γGlu), B29R desB30ヒトインスリン
【０１０９】
実施例２７：
A22K(Nε-テトラデカンジオイル-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル-γGlu), B29R, desB30ヒトインスリン
【０１１０】
実施例２８：
A8H, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン
【０１１１】
実施例２９：
A18L, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン
【０１１２】
実施例３０：
A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
【０１１３】
実施例３１：
A8H, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
【０１１４】
実施例３２：
A18L, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
【０１１５】
実施例３３：
A8H, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
【０１１６】
実施例３４：
A8H, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
【０１１７】
実施例３５：
A18L, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン
【０１１８】
実施例３６：
A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
【０１１９】
実施例３７：
A8H, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
【０１２０】
実施例３８：
A18L, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
【０１２１】
実施例３９：
A8H, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン
【０１２２】
実施例４０：
A8H, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン
【０１２３】
実施例４１：
A18L, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン
【０１２４】
実施例４２：
A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
【０１２５】
実施例４３：
A8H, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
【０１２６】
実施例４４：
A18L, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
【０１２７】
実施例４５：
A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
【０１２８】
実施例４６：
A8H, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
【０１２９】
実施例４７：
A18L, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
【０１３０】
実施例４８：
本発明のインスリン誘導体のインスリン受容体結合性
ヒトインスリン受容体に対する本発明のアシル化インスリンアナログの親和性は、ＳＰＡアッセイ（シンチレーション近接性アッセイ）マイクロタイタープレート抗体捕獲アッセイによって測定される。ＳＰＡ−ＰＶＴ抗体−結合ビーズ、抗マウス試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣａｔＮｏ．ＰＲＮＱ００１７）は２５ｍｌの結合バッファーと混合される（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．８；１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、０．０２５％のＴｗｅｅｎ−２０）。単一のパッカードオプティプレート（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｎｏ．６００５１９０）用の試薬ミックスは、２．４μｌの１：５０００希釈の精製組換えヒトインスリン受容体（エクソン１１を有するものまたは有しないもののどちらか）、１００μｌの試薬混合物につき５０００ｃｐｍに対応するＡ１４Ｔｙｒ［１２５Ｉ］−ヒトインスリンのストック溶液の量、１２μｌの１：１０００希釈のＦ１２抗体、３ｍｌのＳＰＡ−ビーズ及び総量１２ｍｌまでの結合バッファーから成る。トータル１００μｌの試薬混合物は次にパッカードオプティプレートの各ウェルに加えられ、インスリン誘導体の希釈シリーズはオプティプレートにおいて適切な試料から作られる。試料は次に穏やかに振とうしながら、１６時間インキュベートされる。次に、相は１分間の遠心によって分離され、プレートはＴｏｐｃｏｕｎｔｅｒで計測される。結合性データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ２．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の非線形回帰アルゴリズムを使用してフィットさせた。  
0005730569.tif 000039
【０１３１】
実施例４９：
本発明のインスリン誘導体のラットにおけるｉ．ｖ．ボーラス注射後の血中グルコース低下効果
１８時間絶食させた雄ウィスターラット（２００−３００ｇ）は、Ｈｙｐｎｏｒｍ−Ｄｏｒｍｉｃｕｍ  ｓ．ｃ．（１．２５ｍｇ／ｍｌのドルミカム、２．５ｍｇ／ｍｌのフルアニソン、０．０７９ｍｇ／ｍｌのクエン酸フェンタニル）をプライミング投与量として２ｍｌ／ｋｇを使用して（試験物質の投与の３０分前の時点）、さらに２０分ごとに１ｍｌ／ｋｇの追加を使用して、麻酔をかける。
動物は、１ｍｌ／ｋｇの対照と試験化合物（通常用量範囲０．１２５−２０ｎｍｏｌ／ｋｇ）を静注（尾静脈）で投与される。全血グルコース濃度の決定のための血液サンプルは（投与前）−２０分及び０分に、並びに投与後の時間１０、２０、３０、４０、６０、８０、１２０、及び１８０分に、尾部の毛細血管穿刺によって、ヘパリン添加１０μｌガラス管に収集される。
血中グルコース濃度は、EBIO Plus autoanalyzer（エッペンドルフ、ドイツ）を使用して、固定化グルコースオキシダーゼ法によって、解析バッファーへの希釈後に測定される。平均血漿グルコース濃度コース（平均±ＳＥＭ）は、各量及び各化合物について作られる。
【０１３２】
実施例５０：
ヒトインスリンに比較した本発明のアシル化されたインスリンアナログの効力
実験日に体重２３８−３８３ｇになっているスピローグ・ドーリー雄ラットがクランプ実験のために使われる。ラットは制御された周囲条件下で餌に自由にアクセスでき、クランプ実験より前に（午後３時から）絶食させる。
実験プロトコル：
ラットは、外科的処置の少なくとも１週間前に動物設備に順応させる。クランプ実験の約１週前に、Ｔｙｇｏｎカテーテルを（注入のための）頸静脈と（採血のための）頸動脈にハロタン麻酔下で挿入し、外面化し、首の裏に固定する。ラットは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｉｌｉｎ  ｖｅｔ．（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ；  ０．１５ｍｌ／ラット，  ｉ．ｍ．）を術後に与えられ、回復期間中、動物ケアユニット（２５℃）に置かれる。無痛にするために、Ａｎｏｒｐｈｉｎ（０．０６ｍｇ／ラット、ｓ．ｃ．）が麻酔中投与され、Ｒｉｍａｄｙｌ（１．５ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）は麻酔（２−３ｈ）から完全に回復した後に、及びさらに１日１回２日間投与される。  
実験日の午前７時に、（前日午後３時から）一晩の絶食させたラットは体重を計測され、サンプリングシリンジ及び注入システム（ハーバード２２ベーシックポンプ、ハーバード、及びＰｅｒｆｅｃｔｕｍ皮下注射ガラスシリンジ、アルドリッチ）をつなぎ、次に
実験のスタート前に約４５分間休んだ個々のクランプケージに入れられる。ラットは、全実験の間それらの通常の寝床で自由に動くこと、飲料水を自由に摂取することが可能である。血漿グルコース濃度が１０分間隔で測定された３０分の基礎期間後、試験されるインスリン誘導体及びヒトインスリン（ラットにつき１用量レベル、用量レベルにつきｎ＝６−７）は、３００分間の一定速度で注入される（ｉ．ｖ．）。
血漿グルコース濃度は終始１０分間隔で測定され、２０％のグルコース水溶液の注入は正常血糖を維持するために調整される。再懸濁された赤血球の試料は、各々のラットからプールされて、頸動脈のカテーテルを介して１／２ｍｌ体積について戻された。  
各実験日に、試験される個々のインスリン誘導体の溶液とヒトインスリン溶液の試料はクランプ実験の前と終わりに取り出され、ペプチド濃度はＨＰＬＣによって確認される。ラットインスリン及びＣ−ペプチド、同様に試験されるインスリン誘導体及びヒトインスリンの血漿中濃度は、研究の前及び終わりの適切な時点で試験される。ラットは、ペントバルビタールオーバードースにより実験終了後死亡させた。
【０１３３】
実施例５１：
ラットに対するインスリン誘導体の肺送達
試験物質は滴下注入法によって肺投与される。簡単に言うと、雄ウィスターラット（約２５０  ｇ）は、約６０ｍｌのフェンタニル／デヒドロベンズペリドール／ドルミカムを６．６ｍｌ／ｋｇのｓｃプライミング投与量として麻酔され、続いて３０分間隔で３．３ｍｌ／ｋｇ  ｓｃの３回維持量を投与される。
麻酔誘導の１０分後に、基礎試料は尾静脈（ｔ＝−２０分）から採られ、続いて試験物質投与（ｔ＝０）の直前に基礎試料が採られる。ｔ＝０で、試験物質は、一方の肺内に気管内に投与される。丸い終末を有する特別なカニューレは、２００μｌの空気及び試験物質（１ｍｌ／ｋｇ）を含むシリンジに載置する。開口部を経て、カニューレは気管に導入され、主な気管支のうちの１つに進められ、ちょうどｂｉｆｕｒｃａｔｕｒｅを通過する。挿入の間、気管内の位置を確実にするために、首は外部から触診される。シリンジの内容は２秒の休止に続いて射出される。その後、カニューレはゆっくり引き戻される。ラットは、テスト（血液サンプルのため、４又は８時間まで）の間麻酔されたままであり、実験後に安楽死する。
【０１３４】
配列リスト 
配列番号１は、実施例１−６、８、１２−１４、１８及び１９のＡ１−Ａ２１鎖である。
配列番号２は、実施例１−６、１０−１４及び１９のＢ１−Ｂ２９鎖である。配列番号３は、実施例７、９及び１５−１７のＡ１−Ａ２１鎖である。配列番号４は、実施例７、９及び１５−１７のＢ１−Ｂ２９鎖である。配列番号５は、実施例１０のＡ１−Ａ２１鎖である。配列番号６は、実施例１１のＡ１−Ａ２１鎖である。配列番号７は、実施例１８のＢ１−Ｂ２９鎖である。配列番号８は、実施例８のＢ１−Ｂ２８鎖である。
【配列表】
0005730569000001.app