(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
小児被験者由来の試料が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と関連しているか否かを分類する方法であって、
（ａ）前記試料を転換して２種以上のマーカーの存在又はレベルを測定すること、ここでマーカーは抗フラジェリン抗体及びＡＳＣＡ−ＩｇＡを含むものとし；そして
（ｂ）前記抗フラジェリン抗体及び前記ＡＳＣＡ−ＩｇＡを含む２種以上のマーカーの存在又はレベルに基づき前記試料からパターンを形成すること；そして
（ｃ）統計的アルゴリズムを用いて前記試料をＩＢＤ試料又は非ＩＢＤ試料と分類することを含み、
前記統計的アルゴリズムが前記２種以上のマーカーのパターンをＩＢＤパターン又は非ＩＢＤパターンとして認識し、前記ＩＢＤパターンがクローン病（ＣＤ）パターン及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）パターンを含み、前記非ＩＢＤパターンが健常パターン及び胃腸の対象パターンを含み、
前記ＩＢＤ試料がクローン病試料であり、前記クローン病試料中の前記ＡＳＣＡ−ＩｇＡのレベルが、非ＩＢＤ試料と比較して増加しない、前記分類方法。
【請求項２】
前記抗フラジェリン抗体が抗ＣＢｉｒ−１抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗ＣＢｉｒ−１抗体のレベルが非ＩＢＤ試料と比べＩＢＤ試料で増加する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
２種以上のマーカーがＡＮＣＡ、ｐＡＮＣＡ、ＡＳＣＡ−ＩｇＧ、抗ＯｍｐＣ抗体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１又は複数のマーカーを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
２種以上のマーカーがＡＳＣＡ−ＩｇＧを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
非ＩＢＤ試料と比較して、ＩＢＤ試料中の前記ＡＳＣＡ−ＩｇＧのレベルが同じである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
小児被験者由来の試料が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と関連しているか否かを診断するためのデータ取得方法であって、
（ａ）前記試料を転換して２種以上のマーカーの存在又はレベルを測定すること、ここでマーカーは抗フラジェリン抗体及びＡＳＣＡ−ＩｇＡを含むものとし；そして
（ｂ）前記抗フラジェリン抗体及び前記ＡＳＣＡ−ＩｇＡを含む２種以上のマーカーの存在又はレベルに基づき前記試料からパターンを形成すること；そして
（ｃ）統計的アルゴリズムを用いて前記試料をＩＢＤ試料又は非ＩＢＤ試料と分類することを含み、
前記統計的アルゴリズムが前記２種以上のマーカーのパターンをＩＢＤパターン又は非ＩＢＤパターンとして認識し、前記ＩＢＤパターンがクローン病（ＣＤ）パターン及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）パターンを含み、前記非ＩＢＤパターンが健常パターン及び胃腸の対象パターンを含み、
前記ＩＢＤ試料がクローン病試料であり、前記クローン病試料中の前記ＡＳＣＡ−ＩｇＡのレベルが、非ＩＢＤ試料と比較して増加しない、前記データ取得方法。
【請求項８】
前記抗フラジェリン抗体が抗ＣＢｉｒ−１抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗ＣＢｉｒ−１抗体のレベルが非ＩＢＤ試料と比べＩＢＤ試料で増加する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
２種以上のマーカーがＡＮＣＡ、ｐＡＮＣＡ、ＡＳＣＡ−ＩｇＧ、抗ＯｍｐＣ抗体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１又は複数のマーカーを更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
２種以上のマーカーがＡＳＣＡ−ＩｇＧを更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
非ＩＢＤ試料と比較して、ＩＢＤ試料中の前記ＡＳＣＡ−ＩｇＧのレベルが同じである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記統計的アルゴリズムが単一の学習統計的分類子システム、又は少なくとも２種以上の学習統計的分類子システムの組み合わせである、請求項１又は７に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも２種以上の学習統計的分類子システムがランダムフォレストである、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本願は、あらゆる目的でそれらの内容の全体を参照することにより、本明細書に組み込まれる２００８年１１月１１日出願の米国出願第６１／１１３，５３７号及び２００８年１１月２６日出願の米国出願第６１／１１８，３４６号の優先権を主張するものである。
【０００２】
《発明の背景》
世界的に発生し、そして数百万の人々を苦しめている炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、病因不明の３つの胃腸疾患：クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、及び分類不能大腸炎（indeterminate colitis）（ＩＣ）を表現するのに用いられる総称である。ＩＢＤは、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）と共に、米国人全体の半数が一生の間には罹る疾患であり、その費用はＩＢＤでは２６億ドル以上及びＩＢＳでは８０億ドル以上である。このような高額な医療費の一次決定因子は、消化器疾患を診断することの困難性にある。ＩＢＤ及びＩＢＳの費用は、これらの疾患を患う人達が米国の国内平均より年に少なくとも８日も多くの日数労働を休んでいる関係から、生産性の損失によっていっそう嵩んでいる。
【０００３】
炎症性腸疾患は、腹痛、慢性下痢、体重減少、及び痙攣（cramping）を含む多くの症状が過敏性腸症候群と共通していることから、確定診断が極めて困難である。米国内でＩＢＤの罹患が疑われる５００万人のうちＩＢＤに罹患していると診断されるのはわずか１００万人である。ＩＢＤとＩＢＳとを明確に診断する困難性は、これらの疾患の早期の及び効果的な治療を阻んでいる。従って、ＩＢＳからＩＢＤを明確に識別するための迅速かつ高感度の検査方法が必要である。
【０００４】
ＩＢＤの臨床的サブタイプを正確に診断する上で進展が図られてきたが、小児個体（pediatric individual）がクローン病、潰瘍性大腸炎、又は分類不能大腸炎に罹っていると診断するための現在の方法は比較的高価であり、そして労働集約的な臨床上の、Ｘ線検査、内視鏡検査、及び／又は組織学的技術を必要とする。これらの高価な技術は、先にＩＢＤに罹っていると診断された又は罹っていることが強く示唆された個体に対しては正当化することができるが、小児個体が本当にＩＢＤに罹患しているか否かを最初に決定するには高価ではなく、かつ高感度の代替技術が有利であろう。例えば、かかる高感度のスクリーニングアッセイは、ＩＢＤ罹患個体をＩＢＳ罹患個体から迅速に識別することによってより早期かつより適切な治療的介入を促進し、そして患者及びその家族の疑いを最小にする安価な手段を医師に提供するであろう。高感度のスクリーニングアッセイは、ＩＢＤの臨床的サブタイプ間の識別にも用いることができ、又はそれに続く、ＩＢＤ罹患と診断された小児個体がクローン病、潰瘍性大腸炎、又は分類不能大腸炎に罹っているかを決定するための高度に特異的なアッセイと組み合わせることができるであろう。
【０００５】
小児患者のＩＢＤの診断はとりわけ難しい。過去には、一定の血清学的マーカーを決定して診断を行なう研究がなされてきた。例えば、Gupta et al. Inflamm Bowel Dis. 2004 May;10(3):240-4は、小児における従来の検査によって確立された臨床的診断を用いた炎症性腸疾患の血清学的検査のコンコーダンスを概説している。彼らは、ｐＡＮＣＡ、ＡＳＣＡ ＩｇＡ、及びＡＳＣＡ ＩｇＧが潰瘍性大腸炎に対する感度、特異度（specificity）、陽性及び陰性の的中率（predictive value）でそれぞれ６９．２％、９５．１％、９０．０％及び８７．１％を有し、そしてクローン病でそれぞれ５４．１％、９６．８％、９０．９％、及び８０．８％を有することを見出した。これらのマーカーの特異度はその感度より優れ、そしてその感度はＣＤよりＵＣに対して良好であった（５４．１％に対し６９．２％）。とりわけＣＤに対する低い感度によって、これらのマーカーが炎症性腸疾患を評価する際に、従来の研究と代替することができるという可能性が排除されたことが結論付けられた。
【０００６】
別の小児の研究（Amre DK et al. Am J Gastroenterol. 2006 Mar;101(3):645-52参照）において、早期（初期）及び再発性合併症の発生を予測する血清学的マーカー又は小児ＣＤ患者の外科的処置（surgery）の要件が研究された。１９９６年と１９９８年との間に確認されたＣＤ患者の小児コホートにおいて、血清抗サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cervisiae）（ＡＳＣＡ）（ＩｇＡ及びＩｇＧ）及び核周辺抗好中球細胞質抗体（ｐＡＮＣＡ）が、診断の近くで分析された。ＡＳＣＡと臨床的事象（clinical event）との間の関係が、調整されたＣｏｘ比例ハザードモデリングを用いて研究された。マーカー測定による再発性臨床的事象の相対的比率が比較された。この研究により、診断の近くで測定された血清ＡＳＣＡレベルは、小児ＣＤにおける早期合併症の発生を決定することできることが示された。
【０００７】
前記のことを考慮すれば、とりわけ、ＩＢＤ罹患の疑いがある小児患者に対するＩＢＤ血清学的分析が必要である。小児の疾患進行の極めて初期段階においてＩＢＤを診断し、及びＩＢＤを臨床的サブタイプ、例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、又は分類不能大腸炎と分類するための改良された方法が必要である。本発明は、これらの要求を満たし、関連した利点も提供する。
【発明の簡単な要約】
【０００８】
一般に、血清学的検査は、容易であり実施しやすくそして臨床試験設定におけるルーチンとなっている。概して、これらの検査は個体の年齢に合わせたものとなっていない。しかしながら、個体の年齢に応じた、とりわけ、小児において、個体の症状を評価する必要がある。
【０００９】
１つの態様において、本発明は、小児個体由来の試料が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と関連しているか否かを分類する方法であって、
（ａ）小児個体から前記試料を得ること；
（ｂ）前記試料を転換して（transforming）１種又は２種以上のマーカーの存在又はレベルを測定すること、ここでマーカーは抗フラジェリン抗体を含むものとし；そして
（ｃ）前記抗フラジェリン抗体を含む１種又は２種以上のマーカーの存在又はレベルに基づき統計的アルゴリズムを用いて前記試料をＩＢＤ試料又は非ＩＢＤ試料と分類すること
を含む前記分類方法を提供する。
【００１０】
別の態様において、本発明は、小児個体由来の試料が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と関連しているか否かを診断する方法であって、
（ａ）小児個体から前記試料を得ること；
（ｂ）前記試料を転換して１種又は２種以上のマーカーの存在又はレベルを測定すること、ここでマーカーは抗フラジェリン抗体を含むものとし；そして
（ｃ）前記抗フラジェリン抗体を含む１種又は２種以上のマーカーの存在又はレベルに基づき統計的アルゴリズムを用いて前記試料をＩＢＤ試料又は非ＩＢＤ試料と分類すること
を含む前記診断方法を提供する。
【００１１】
これらの及び他の観点、目的及び態様は、以下の詳細な記載及び図面を読むとき、より明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の１つの態様による疾患分類システム（ＤＣＳ）を示す。
【００１３】
【図２】８個の非終端ノード（Ａ〜Ｈ）及び９個の終端ノード（Ｉ〜Ｑ）を有するＩＢＤ又はその臨床的サブタイプ（例えば、ＣＤ又はＵＣ）を分類するための分類及び回帰木（Ｃ＆ＲＴ）の決定木構造（decision tree structure）を示す。
【００１４】
【図３】血清学的マーカーのパネルを用いたＩＢＤ診断及びＣＤ／ＵＣ識別のために学習統計的分類子（learning statistical classifier）を組み合わせることにより導かれるアルゴリズムを説明するフローチャートを示す。
【００１５】
【図４】ニューラルネットワークモデルについて、入力変数として用いたＣ＆ＲＴモデルからのマーカー入力変数、出力従属変数（診断及び非ＩＢＤ/ＩＢＤ）、及び確率を示す。
【００１６】
【図５】個体の年齢に基づいたＩＢＤ血清学的マーカーの試料の分布を示す。
【００１７】
【図６】臨床的予測に対する開発（development）コホート及びマーカーの分布を示す。
【００１８】
【図７】診断予測（ｙ軸）により階層化されたマーカー（ｘ軸）のチャートを示す。
【００１９】
【図８】年齢（ｙ軸）により階層化されたマーカー（ｘ軸）のチャートを示す。
【発明の詳細な記載】
【００２０】
《Ｉ．定義》
本明細書中で用いる下記の用語は、他に断らない限り、その用語が本来有していると考えられる意味を持つ。
【００２１】
「分類すること（classifying）」という用語は、病状を伴う試料を「関連づけること（to associate）」又は「類別すること（to categorize）」を含む。或る場合には、「分類すること」は、統計的証拠、経験的証拠、又はその両方に基づく。或る態様において、分類の方法及びシステムは、既知の病状を伴う試料のいわゆる訓練用集合を用いる。方法及びシステムが確立されれば、その訓練データ集合は未知の試料の特徴が比較される基礎、モデル、又はテンプレートとして機能し、前記試料の未知の病状を分類する。或る場合には、試料を分類することは前記試料の病状を診断することに似ている。或る場合には、試料を分類することは、別の病状から前記試料の病状を識別することに似ている。
【００２２】
「炎症性腸疾患」又は「ＩＢＤ」という用語は、限定的でなく、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、及び分類不能大腸炎（ＩＣ）を含む胃腸疾患をいう。炎症性腸疾患、例えば、ＣＤ、ＵＣ、及びＩＣは、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）を含む、胃腸病学的消化管（gastroenterological tract）の他のすべての障害、症候群、及び異常と区別される。
【００２３】
「試料」という用語は、小児個体から得られるあらゆる生物学的検体を含む。本発明に用いるのに適当な試料として、限定的でなく、全血、血漿、血清、唾液、尿、便、涙、あらゆる他の体液、組織試料（例えば、生検）、及びそれらの細胞抽出物（例えば、赤血球細胞抽出物）を挙げることができる。好ましい態様において、試料は血清試料である。試料、例えば、血清、唾液、及び尿の使用が当業者に周知である（例えば、Hashida et al., J. Clin. Lab. Anal., 11:267-86 (1997)参照）。マーカーレベルの分析前に試料、例えば、血清試料を希釈することができることは当業者に理解されよう。
【００２４】
「マーカー」という用語は、あらゆる生化学的マーカー、血清学的マーカー、遺伝学的マーカー、又は小児個体由来の試料をＩＢＤ（例えば、ＣＤ又はＵＣ）試料と分類するのに用いることができる他の臨床的若しくは超音波検査上の特徴を含む。本発明に用いるのに適当なマーカーの限定的でない例は以下に記載されるが、抗フラジェリン抗体（例えば、抗ＣＢｉｒ−１）、抗好中球抗体（例えば、ＡＮＣＡ、ｐＡＮＣＡ、ｃＡＮＣＡ、ＮＳＮＡ、ＳＡＰＰＡ等）、抗サッカロミセス・セレビシエ抗体（例えば、ＡＳＣＡ−ＩｇＡ、ＡＳＣＡ−ＩｇＧ、ＡＳＣＡ−ＩｇＭ等）、抗菌抗体（例えば、抗ＯｍｐＣ抗体、抗フラジェリン抗体、抗Ｉ２抗体等）、ラクトフェリン、抗ラクトフェリン抗体、エラスターゼ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、カルプロテクチン、ヘモグロビン、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５、及びそれらの組み合わせを含む。本発明に用いるのに適当な更なるマーカーがあることは当業者に公知であろう。
【００２５】
「個体」、「被験者」又は「患者」という用語は、一般に、ヒトだけでなく、例えば、他の霊長類、げっ歯類、イヌ科動物、ネコ科動物、ウマ科動物、ヒツジ、及びブタ等を含む他の動物も指す。
【００２６】
「実質的に同じアミノ酸配列」という用語は、本明細書中で用いる場合、天然に存在するアミノ酸配列と同一ではないがそれに類似するアミノ酸配列を含む。例えば、ＣＢｉｒ−１タンパク質又はその断片と実質的に同じアミノ酸配列を有するアミノ酸配列、すなわち、ポリペプチドは、改変された（modified）ポリペプチドがＣＢｉｒ−１タンパク質の実質的に少なくとも１つの生物学的活性、例えば、免疫反応性を保持していることを条件に、天然に存在するアミノ酸配列に対する１種又は２種以上の改変、例えば、アミノ酸の付加、欠失、又は置換を有していることができる。アミノ酸配列同士の間の実質的な類似性の比較は、通常、約６〜１００残基、好ましくは約１０〜１００残基、そしてより好ましくは約２５〜３５残基の配列を用いて行なわれる。本発明のポリペプチド又はその断片のとりわけ有効な改変は、例えば、安定性を増大させる改変である。１個又は２個以上のＤ−アミノ酸の取り込みはポリペプチド又はポリペプチド断片の安定性を増大させるのに有効な改変である。同様に、リシン残基の欠失又は置換は、ポリペプチド又はポリペプチド断片を分解から保護することにより安定性を増大させることができる。
【００２７】
「臨床的因子」という用語は、ＩＢＤと関連した小児個体の症状を含む。臨床的因子の例として、限定的でなく、下痢、腹痛、痙攣、発熱、貧血、体重減少、不安、うつ状態（depression）、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。或る態様において、ＩＢＤの診断は、統計的アルゴリズムを用いた小児個体の１種又は２種以上のマーカーの存在又はレベルを分析することと、前記小児個体が１種又は２種以上の臨床的因子を有しているか否かを決定することとの組み合わせに基づく。
【００２８】
「予後」という用語は、ＩＢＤの起こりうる経過及び結果又は当該疾患からの回復の見込みの予測を含む。或る態様において、統計的アルゴリズムを用いることにより小児個体のＩＢＤの予後が提供される。例えば、予後は、外科的処置、ＩＢＤの臨床的サブタイプ（例えば、ＣＤ又はＵＣ）の発現、１種又は２種以上の臨床的因子の発現、腸癌の発現、又は疾患からの回復であることができる。
【００２９】
「ＩＢＤと診断すること」という用語は、小児個体のＩＢＤの有無を決定する本発明の方法、システム、及びコードの使用を含む。この用語は、小児個体の疾患活動性のレベルを評価する方法、システム、及びコードも含む。或る態様において、統計的アルゴリズムを用いて、Ｔｒｕｅｌｏｖｅらによって開発された基準（Truelove et al., Br. Med. J., 12:1041-1048 (1955)）に基づき、ＩＢＤの軽度、中等度、重度、又は劇症（fulminant）の型を診断する。他の態様において、統計的アルゴリズムを用いて、Ｈａｎａｕｅｒらによって開発された基準（Hanauer et al., Am. J. Gastroenterol., 92:559-566 (1997)）に基づき、ＩＢＤの軽度〜中等度、中等度〜重度、又は重度〜劇症の型を診断する。小児個体のＩＢＤの重症度を評価する他の方法があることは当業者に公知であろう。
【００３０】
「ＩＢＤの進行又は退行をモニタリングすること」という用語は、小児個体の病状（例えば、ＩＢＤの存在又は重症度）を決定する本発明の方法、システム、及びコードの使用を含む。或る場合において、統計的アルゴリズム（例えば、学習統計的分類子システム）の結果を、より早い時点の同一個体について得られた結果と比較する。或る観点において、本発明の方法、システム、及びコードを用いて、例えば、試料の少なくとも１種のマーカーの存在又はレベルに基づき小児個体においてＩＢＤが急速に又は徐々に進行する可能性を決定することによって、ＩＢＤの進行を予測することもできる。他の観点において、本発明の方法、システム、及びコードを用いて、例えば、試料の少なくとも１種のマーカーの存在又はレベルに基づき小児個体においてＩＢＤが急速に又は徐々に退行する可能性を決定することによって、ＩＢＤの退行を予測することもできる。
【００３１】
「ＩＢＤを治療するのに有効な薬剤を受ける小児個体において薬効をモニタリングすること」という用語は、本発明の方法、システム、及びコードを用いて、ＩＢＤ治療用の治療薬が投与された後の小児個体の病状（例えば、ＩＢＤの存在又は重症度）を決定することを含む。或る場合において、統計的アルゴリズム（例えば、学習統計的分類子システム）の結果を、治療薬の使用開始前の又は治療のより早い時点の同一個体について得られた結果と比較する。ＩＢＤの治療に有効な薬剤とは、本明細書中で用いる場合、小児個体の健康を改善するのに用いられるあらゆる化合物又は薬剤であり、限定的でなく、ＩＢＤ薬、例えば、アミノサリチレート（例えば、メサラジン、スルファサラジン等）、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン）、チオプリン（例えば、アザチオプリン、６−メルカプトプリン等）、メトトレキサート、モノクローナル抗体（例えば、インフリキシマブ）、それらの遊離塩基、薬学的に許容することのできるそれらの塩、それらの誘導体、それらの類似体、及びそれらの組み合わせを含む。
【００３２】
「ＩＢＤに罹患した小児個体において治療を最適化すること」という用語は、本発明の方法、システム、及びコードを用いて、治療薬（例えば、ＩＢＤ薬）が投与される前に小児個体についての治療過程を決定し又は治療薬が投与された後に小児個体についての治療過程を調整することにより治療薬の薬効を最適化することを含む。或る場合に、統計的アルゴリズム（例えば、学習統計的分類子システム）の結果を、治療過程の間のより早い時点の同一個体について得られた結果と比較する。このようにして、結果の比較は、治療過程の変更の必要性の指標、又は現在の治療過程の用量の増加又は減少の必要性の指標を提供する。
【００３３】
「治療過程」という用語は、ＩＢＤと関連した１つ又は２つ以上の症状（すなわち、臨床的因子）を軽減又は予防するために取られるあらゆる治療的アプローチを含む。この用語は、ＩＢＤに罹患した小児個体の健康を改善するのに有効なあらゆる化合物、薬剤、手順、又はレジメンを施すことを包含し、そして任意の前記治療薬（例えば、ＩＢＤ薬）の他に外科的処置を含む。治療過程又は現在の治療過程の用量は、例えば、本発明の方法、システム、及びコードを用いて得られる統計的アルゴリズム（例えば、学習統計的分類子システム）の結果に基づき、変更することができることは当業者に理解されよう。
【００３４】
「治療有効量又は治療有効用量」という用語は、治療効果の必要がある被験者において治療効果を達成することができる薬剤の用量を含む。例えば、ＩＢＤを治療するのに有効な薬剤の治療有効量は、ＩＢＤと関連した１つ又は２つ以上の症状を予防又は軽減することができる量であることができる。正確な量は、公知の技術を用いて当業者によって確認することができる（例えば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992)；Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)；Pickar, Dosage Calculations (1999)；及びRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins参照）。
【００３５】
「試料を転換すること」という用語は、本明細書中に定義したマーカーを抽出するための試料の物理的又は化学的変化を含む。マーカーを測定するための試料の抽出、操作、化学沈殿、ＥＬＩＳＡ、免疫抽出、物理的又は化学的改変はすべて転換を構成する。試料が転換工程前後で同一でない限り、その変化は転換である。
【００３６】
「小児個体」という用語は、約１月齢〜約１８歳、とりわけ、約０歳〜約５歳（０〜５歳）、又は約１歳〜約１６歳、又は約１歳〜約１０歳、又は約１歳〜約５歳、６歳、７歳、若しくは８歳の個体、又は約０歳〜約１歳、２歳、３歳、４歳、５歳、６歳、７歳、８歳、９歳、１０歳、１１歳、１２歳、１３歳、１４歳、１５歳、１６歳、１７歳、１８歳の個体を含む。
【００３７】
《ＩＩ．態様の記載》
患者、例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に罹っている小児患者を診断することは、ＩＢＤと他の疾患又は障害との間の症状の類似性のゆえに困難であるということができる。本発明は、一定の診断マーカーとりわけ抗フラジェリン抗体（例えば、抗ＣＢｉｒ−１抗体）の存在及びレベルを検出することによって、小児個体由来の生物学的試料をＩＢＤ（例えば、ＣＤ又はＵＣ）試料と分類することの的確性（accuracy）を実質的に改善することができるという意外な発見に一部基づいている。「抗フラジェリン抗体」という用語は本明細書中で用いる場合、例えば、参考までに本明細書に引用するＰＣＴ特許公報第ＷＯ０３／０５３２２０号及び米国特許第７，３６１，７３３号に記載のように細菌鞭毛（bacterial flagella）のタンパク質成分に対する抗体を含む。「フラジェリン」という用語は、抗フラジェリン抗体と免疫反応性である細菌鞭毛タンパク質を含む。微生物のフラジェリンは、中空の円筒内にそれら自体を配列してフィラメントを形成する細胞鞭毛に見出されるタンパク質である。
【００３８】
本発明に有用な他のマーカーとして、抗好中球抗体（例えば、ＡＮＣＡ、ｐＡＮＣＡ等）、抗サッカロミセス・セレビシエ抗体（例えば、ＡＳＣＡ−ＩｇＡ、ＡＳＣＡ−ＩｇＧ等）、及び／又は他の抗菌抗体（例えば、抗ＯｍｐＣ抗体、抗Ｉ２抗体等）を挙げることができる。或る観点において、本発明は、試料をＩＢＤ試料又は非ＩＢＤ試料と分類するのに役立つ統計的アルゴリズムを用いる。他の観点において、本発明は、試料をＣＤ試料、ＵＣ試料、又は非ＩＢＤ試料と分類するのに役立つ統計的アルゴリズムを用いる。或る観点において、本明細書中に記載の統計的アルゴリズムは、先にＩＢＤ罹患と同定された小児個体においてＵＣ試料からＣＤ試料を識別するのに用いることができる。また、本明細書中に記載の統計的アルゴリズムは、先にＩＢＤ罹患とは診断されていない小児個体由来の試料がＣＤ試料、ＵＣ試料、又は非ＩＢＤ試料であるか否かを決定するのに用いることができる。
【００３９】
本発明において、小児試料中の抗フラジェリン抗体レベル（例えば、抗ＣＢｉｒ−１）を測定する。小児個体由来の試料中に存在する抗フラジェリン抗体のレベルは、フラジェリンタンパク質又はその断片、例えば、その免疫反応性の断片を用いて測定することができる。試料中の抗フラジェリン抗体レベルを測定するのに有用である適当なフラジェリン抗原として、限定的でなく、フラジェリンタンパク質、例えば、ＣＢｉｒ−１フラジェリン、フラジェリンＸ、フラジェリンＡ、フラジェリンＢ、それらの断片、及びそれらの組み合わせ、フラジェリンタンパク質と実質的に同じアミノ酸配列を有するフラジェリンポリペプチド、又はその断片、例えば、その免疫反応性の断片を挙げることができる。フラジェリンポリペプチドは本明細書中で用いる場合、一般に、天然に存在するフラジェリンタンパク質と約５０％を超える同一性の、好ましくは、約６０％を超える同一性の、より好ましくは約７０％を超える同一性の、さらにより好ましくは、約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を超える同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドを表し、ここでアミノ酸同一性はシーケンスアラインメントプログラム、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて決定される。かかるフラジェリン抗原は、例えば、細菌、例えば、ヘリコバクター・ビリス（Helicobacter Bilis）、ヘリコバクター・ムステラエ（Helicobacter mustelae）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、ブチリビブリオ・フィブリソルベンス（Butyrivibrio fibrisolvens）、及び盲腸に見出される細菌から精製することによって、フラジェリン抗原をコードする核酸の組換え発現によって、合成手段、例えば、液相若しくは固相ペプチド合成によって、又はファージディスプレイを用いることによって調製することができる。
【００４０】
１つの態様において、本発明は、小児個体由来の試料が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と関連しているか否かを分類する方法であって、
（ａ）小児個体から前記試料を得ること；
（ｂ）前記試料を転換して１種又は２種以上のマーカーの存在又はレベルを測定すること、ここでマーカーは抗フラジェリン抗体を含むものとし；そして
（ｃ）前記抗フラジェリン抗体を含む１種又は２種以上のマーカーの存在又はレベルに基づき統計的アルゴリズムを用いて前記試料をＩＢＤ試料又は非ＩＢＤ試料と分類すること
を含む前記分類方法を提供する。
【００４１】
好ましい観点において、抗フラジェリン抗体は抗ＣＢｉｒ−１抗体である。
【００４２】
別の態様において、本発明は、小児個体由来の試料が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と関連しているか否かを診断する方法であって、
（ａ）小児個体から前記試料を得ること；
（ｂ）前記試料を転換して１種又は２種以上のマーカーの存在又はレベルを測定すること、ここでマーカーは抗フラジェリン抗体を含むものとし；そして
（ｃ）前記抗フラジェリン抗体を含む１種又は２種以上のマーカーの存在又はレベルに基づき統計的アルゴリズムを用いて前記試料をＩＢＤ試料又は非ＩＢＤ試料と分類すること
を含む前記診断方法を提供する。
【００４３】
好ましい観点において、抗フラジェリン抗体は抗ＣＢｉｒ−１抗体である。
【００４４】
個体由来の試料中に存在するいずれかの抗フラジェリン抗体は、本発明の方法に従って検出することができる。好ましい態様において、抗ＣＢｉｒ−１抗体のレベルを測定する。他の態様において、抗フラジェリンＸ抗体、抗フラジェリンＡ抗体、及び／又は抗フラジェリンＢ抗体のレベルを測定する。個体由来の試料中に存在する抗フラジェリン抗体のレベルは、フラジェリンタンパク質又はその断片、例えば、その免疫反応性の断片を用いて測定することができる。試料中の抗フラジェリン抗体レベルを測定するのに有用な適当なフラジェリン抗原として、限定的でなく、フラジェリンタンパク質、例えば、Ｃｂｉｒ−１フラジェリン、フラジェリンＸ、フラジェリンＡ、フラジェリンＢ、それらの断片、及びそれらの組み合わせ、フラジェリンタンパク質と実質的に同じアミノ酸配列を有するフラジェリンポリペプチド、又はその断片、例えば、その免疫反応性の断片を挙げることができる。
【００４５】
或る態様において、フラジェリン抗原は、配列番号１（SEQ ID NO:1）に示した全長Ｃｂｉｒ−１フラジェリン配列の少なくとも約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個、１５０個又はそれを超える個数の隣接アミノ酸（中間の長さをすべて含む）からなるポリペプチド断片を含むＣＢｉｒ−１フラジェリンである。典型的には、ＣＢｉｒ−１フラジェリンポリペプチド断片は、全長ＣＢｉｒ−１フラジェリン配列に結合する抗体及び／又は全長ＣＢｉｒ−１フラジェリン配列と反応するＴ細胞と免疫学的に反応性である。好ましい態様において、ポリペプチド断片は配列番号１に示した配列のアミノ末端の保存領域（アミノ酸残基１〜１４７）である。他の態様において、ポリペプチド断片は配列番号１に示した配列のアミノ末端の保存領域に可変領域を加えた領域（アミノ酸残基１〜４１８）である。或る場合において、ＣＢｉｒ−１フラジェリン抗原は、本明細書中に記載のＣＢｉｒ−１フラジェリンポリペプチド断片及びタグ、例えば、６つのヒスチジン（配列番号２（SEQ ID NO:2））又はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグからなる融合タンパク質である。或る他の態様において、ＣＢｉｒ−１フラジェリン抗原は、配列番号１のアミノ酸配列又はそれと実質的な同一性を有する（例えば、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の同一性を有する）配列を含む。典型的なフラジェリンアミノ酸及び核酸配列（例えば、ＣＢｉｒ−１フラジェリン、フラジェリンＸ、フラジェリンＢ等）は米国特許第７，３６１，７３３号に記載されている。
【００４６】
抗フラジェリン抗体の「増加した」レベルは、対照との比較上検出することができる所定の抗フラジェリン抗体（例えば、抗ＣＢｉｒ−１抗体）レベルの増加を含むことを意図する。検出することができる増加は、対照において検出される所定の抗フラジェリン抗体のレベルより約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、又はそれを超える増加であることができる。所定の抗フラジェリン抗体のレベルの増加は、典型的には、当業者に公知の任意の方法又は技術、例えば、免疫測定法又は免疫組織化学的分析（immunohistochemical assay）を用いて測定する。好ましい態様によれば、免疫測定法は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）である。或る場合には、抗フラジェリン抗体の増加したレベル（例えば、抗ＣＢｉｒ−１抗体の増加したレベル）は、ＥＬＩＳＡを用いた場合に約５．０ＥＵ／ｍＬ、６．０ＥＵ／ｍＬ、７．０ＥＵ／ｍＬ、８．０ＥＵ／ｍＬ、９．０ＥＵ／ｍＬ、１０．０ＥＵ／ｍＬ、１１．０ＥＵ／ｍＬ、１２．０ＥＵ／ｍＬ、１３．０ＥＵ／ｍＬ、１４．０ＥＵ／ｍＬ、１５．０ＥＵ／ｍＬ、１６．０ＥＵ／ｍＬ、１７．０ＥＵ／ｍＬ、１８．０ＥＵ／ｍＬ、１９．０ＥＵ／ｍＬ、２０．０ＥＵ／ｍＬ、２１．０ＥＵ／ｍＬ、２２．０ＥＵ／ｍＬ、２３．０ＥＵ／ｍＬ、２４．０ＥＵ／ｍＬ、２５．０ＥＵ／ｍＬ、２６．０ＥＵ／ｍＬ、２７．０ＥＵ／ｍＬ、２８．０ＥＵ／ｍＬ、２９．０ＥＵ／ｍＬ、３０．０ＥＵ／ｍＬ、３１．０ＥＵ／ｍＬ、３２．０ＥＵ／ｍＬ、３３．０ＥＵ／ｍＬ、３４．０ＥＵ／ｍＬ、３５．０ＥＵ／ｍＬ、３６．０ＥＵ／ｍＬ、３７．０ＥＵ／ｍＬ、３８．０ＥＵ／ｍＬ、３９．０ＥＵ／ｍＬ、又は４０．０ＥＵ／ｍＬ（又はその中のあらゆる範囲若しくは小部分）である基準値を超えたレベルを含む。好ましい態様において、抗フラジェリン抗体の増加したレベル、例えば、抗ＣＢｉｒ−１抗体の増加したレベルは約２１．０ＥＵ／ｍＬである基準値を超えたレベルである。
【００４７】
或る態様において、抗フラジェリン抗体の増加したレベル（例えば、抗ＣＢｉｒ−１抗体の増加したレベル）の存在は、ＣＤ発現の約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、３５倍、３６倍、３７倍、３８倍、３９倍、又は４０倍（又はその中のあらゆる範囲若しくは小部分）の増加したリスクと関係づけられる。
【００４８】
或る態様において、抗フラジェリン抗体は抗ＣＢｉｒ−１抗体である。抗ＣＢｉｒ−１抗体のレベルは非ＩＢＤ試料と比較してＩＢＤ試料において、とりわけクローン病試料において増加が見られる。他の適当なマーカーとして、ＡＮＣＡ、ｐＡＮＣＡ、ＡＳＣＡ−ＩｇＡ、ＡＳＣＡ−ＩｇＧ、抗ＯｍｐＣ抗体、抗Ｉ２抗体、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。
【００４９】
或る場合には、本発明の方法は、１種又は２種以上のマーカー、例えば、ＡＳＣＡ−ＩｇＡを含む。或る場合には、非ＩＢＤ試料と比較したＩＢＤ試料中のＡＳＣＡ−ＩｇＡレベルは正常、すなわち、同様か又は同じである。他の場合に、１種又は２種以上のマーカーはＡＳＣＡ−ＩｇＧであり、非ＩＢＤ試料と比較したＩＢＤ試料中のＡＳＣＡ−ＩｇＧのレベルは正常である。或る場合に、小児試料についての唯一のマーカーは抗フラジェリン抗体（例えば、抗ＣＢｉｒ−１抗体）である。
【００５０】
或る態様において、小児個体の試料において、少なくとも２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、又は１１種以上のＩＢＤマーカーの存在又はレベルを測定する。或る場合において、抗フラジェリン抗体に加えて、他のマーカーとして抗好中球抗体、例えば、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）、核周辺型抗好中球細胞質抗体（ｐＡＮＣＡ）、細胞質型抗好中球細胞質抗体（ｃＡＮＣＡ）、好中球特異的核抗体（neutrophil-specific nuclear antibody）（ＮＳＮＡ）、斑紋型抗ｐａｎ多形核抗体（speckling anti-pan polymorphonuclear antibody）（ＳＡＰＰＡ）、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。或る場合において、小児個体の試料中のＡＮＣＡ及び／又はｐＡＮＣＡの存在又はレベルを測定する。或る他の場合においては、抗サッカロミセス・セレビシエ抗体は、抗サッカロミセス・セレビシエ免疫グロブリンＡ（ＡＳＣＡ−ＩｇＡ）、抗サッカロミセス・セレビシエ免疫グロブリンＧ（ＡＳＣＡ−ＩｇＧ）、抗サッカロミセス・セレビシエ免疫グロブリンＭ（ＡＳＣＡ−ＩｇＭ）、及びそれらの組み合わせを含む。或る場合において、小児個体の試料中のＡＳＣＡ−ＩｇＡ及び／又はＡＳＣＡ−ＩｇＧの存在又はレベルを測定する。更なる場合において、他の抗菌抗体として、例えば、抗外膜タンパク質Ｃ（抗ＯｍｐＣ）抗体、他の抗フラジェリン抗体、抗Ｉ２抗体、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。或る場合において、小児個体の試料中の抗ＯｍｐＣ抗体及び／又は抗フラジェリン抗体の存在又はレベルを測定する。
【００５１】
他の態様において、少なくとも１種のマーカーは、抗フラジェリン抗体の他にさらに１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、又は１１種以上のＩＢＤマーカーを含み、他のマーカーは、限定的でなく、抗好中球抗体、抗サッカロミセス・セレビシエ抗体、及び／又は抗菌抗体を含む。さらなるＩＢＤマーカーとして、限定的でなく、ラクトフェリン、抗ラクトフェリン抗体、エラスターゼ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、カルプロテクチン、ヘモグロビン、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。
【００５２】
少なくとも１種のマーカー、例えば、抗ＣＢｉｒ−１の存在又はレベルを検出又は測定するのに用いられる試料は、典型的には、全血、血漿、血清、唾液、尿、便（すなわち、糞便）、涙、及びあらゆる他の体液、又は組織試料（すなわち、生検）、例えば、小腸若しくは結腸試料である。好ましくは、試料は血清、全血、血漿、便、尿、又は組織生検である。或る場合において、本発明の方法はさらに、試料中の少なくとも１種のマーカー（例えば、抗ＣＢｉｒ−１）の存在又はレベルを検出又は測定する前に小児個体から試料を得ることを含む。
【００５３】
他の態様において、本発明の方法は試料、例えば、血清、血漿、全血、又は便中の抗フラジェリン抗体及び場合により１種又は２種以上の追加のマーカー、例えば、ＡＮＣＡ、ＡＳＣＡ−ＩｇＡ、ＡＳＣＡ−ＩｇＧ、抗ＯｍｐＣ抗体、及びｐＡＮＣＡの存在又はレベルを測定することを含む。前記の１種又は２種以上のＩＢＤマーカーからなるパネルを構成し、そして小児試料をＩＢＤ（例えば、ＣＤ若しくはＵＣ）試料又は非ＩＢＤ試料と分類するために用いることができる。
【００５４】
或る場合において、免疫測定法又は免疫組織化学的分析を用いて少なくとも１種のマーカーの存在又はレベルを測定する。本発明の方法に用いるのに適当な限定的でない免疫測定法の例として、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を挙げることができる。本発明の方法に用いるのに適当な免疫組織化学的分析の例として、限定的でなく、免疫蛍光測定法、例えば、直接蛍光抗体法、間接蛍光抗体（ＩＦＡ）法、抗補体免疫蛍光測定法（anticomplement immunofluorescence assay）、及びアビジン−ビオチン免疫蛍光測定法（avidin-biotin immunofluorescence assay）を挙げることができる。他の型の免疫組織化学的分析として免疫ペルオキシダーゼ法（immunoperoxidase assay）を挙げることができる。
【００５５】
重要なことには、本発明は、診断マーカーのパネルの存在又はレベルに基づく学習統計的分類子システムの組み合わせを用いたＩＢＤ又はその臨床的サブタイプ（例えば、ＣＤ又はＵＣ）の診断予測が非アルゴリズム手法、例えば、カットオフ値解析よりはるかに優れていることを示している。実際に、実質的に高められた感度、陰性的中率、及び／又は総体的的確性（overall accuracy）によってＩＢＤの診断を行なうことができ、そして疾患進行の初期段階でＩＢＤの存在を検出することができる。さらに、本発明は、ＩＢＤの臨床的サブタイプ（例えば、ＣＤ又はＵＣ）間を高い総体的的確性で識別するのに有用である。結果として、特定の個体のＩＢＤの階層化が高く的確な方法で達成される。
【００５６】
本発明は、小児個体由来の試料がＩＢＤ又はその臨床的サブタイプと関連しているか否かを的確に分類する方法、システム、及びコードを提供する。或る態様において、本発明は、統計的アルゴリズム（例えば、学習統計的分類子システム）及び／又は経験的データ（empirical data）（例えば、ＩＢＤマーカーの存在又はレベル）を用いて小児個体由来の試料をＩＢＤ試料と分類するのに有用である。本発明は、統計的アルゴリズム（例えば、学習統計的分類子システム）及び／又は実験的データ（例えば、ＩＢＤマーカーの存在又はレベル）を用いてＣＤ及びＵＣの間を識別するのにも有用である。従って、本発明は、ＩＢＤ又はその臨床的サブタイプの的確な診断予測及び治療法決定を導くのに有用な予後情報を提供する。
【００５７】
或る態様において、試料を分類するのに用いられる統計的アルゴリズムは学習統計的分類子システムである。学習統計的分類子システムは、分類及び回帰木（Ｃ＆ＲＴ）、ランダムフォレスト（ＲＦ）、ブースト型の木（boosted tree）、ニューラルネットワーク（ＮＮ）、サポートベクターマシーン、一般的なカイ二乗による相互作用の自動検出器モデル（chi-squared automatic interaction detector model）、多変量適応回帰スプライン（multiadaptive regression spline）、機械学習分類子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。好ましくは、学習統計的分類子システムは、木をベースとする統計的アルゴリズム（例えば、Ｃ＆ＲＴ、ＲＦ等）及び／又はＮＮ（例えば、人工ＮＮ等）である。
【００５８】
或る場合において、統計的アルゴリズムは単一の学習統計的分類子システムである。好ましくは、前記単一の学習統計的分類子システムは、木をベースとする統計的アルゴリズム、例えば、Ｃ＆ＲＴ又はＲＦを含む。限定的でない例として、単一の学習統計的分類子システムを用いて少なくとも１種のＩＢＤマーカーの存在又はレベル及び的中率又は確率値に基づいて試料をＩＢＤ（例えば、ＣＤ又はＵＣ）試料又は非ＩＢＤ試料と分類することができる。単一の学習統計的分類子システムの使用は、典型的には、少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率、及び／又は総体的的確性で試料をＩＢＤ（例えば、ＣＤ又はＵＣ）試料と分類する。
【００５９】
或る他の場合において、統計的アルゴリズムは少なくとも２つの学習統計的分類子システムの組み合わせである。好ましくは、学習統計的分類子システムの組み合わせは、例えば直列（tandem）又は並列（parallel）に用いられる、Ｃ＆ＲＴ又はＲＦ及びＮＮを含む。限定的でない例として、最初にＣ＆ＲＴを用いて少なくとも１種のＩＢＤマーカーの存在又はレベルに基づき的中率又は確率値を発生させることができ、そして次にＮＮを用いて少なくとも１種のＩＢＤマーカーの存在又はレベル及び的中率又は確率値に基づき試料をＩＢＤ（例えば、ＣＤ又はＵＣ）試料又は非ＩＢＤ試料と分類することができる。有利には、本発明のハイブリッド型Ｃ＆ＲＴ／ＮＮ学習統計的分類子システムは、少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率、及び／又は総体的的確性で試料をＩＢＤ（例えば、ＣＤ又はＵＣ）試料と分類する。
【００６０】
或る場合において、１つ又は複数の学習統計的分類子システムを用いることによって得られるデータは、処理アルゴリズムを用いて処理することができる。かかる処理アルゴリズムは、例えば、多層パーセプトロン、バックプロパゲーションネットワーク、及びレーベンバーグ・マルカートアルゴリズム（Levenberg-Marquardt algorithm）からなる群から選択することができる。他の場合において、前記処理アルゴリズムの組み合わせは、例えば、直列又は並列に用いることができる。
【００６１】
或る態様において、本発明の方法はさらに、ＩＢＤ分類結果を臨床医、例えば、消化器専門医又は一般医に送信することを含む。別の態様において、本発明の方法はさらに、小児個体がＩＢＤ又はその臨床的サブタイプに罹っている確率の形態での診断を提供する。例えば、小児個体は、ＩＢＤ又はその臨床的サブタイプに罹っている確率約０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はそれを超える％を有していることがある。さらに別の態様において、本発明の方法はさらに、小児個体のＩＢＤの予後を提供する。例えば、予後は、外科的処置、ＩＢＤの臨床的サブタイプ（例えば、ＣＤ又はＵＣ）の発現、１種又は２種以上の症状の発現、腸癌の発現、又は疾患からの回復であることができる。或る場合において、試料をＩＢＤ試料と分類する方法はさらに、試料を得る小児個体の症状（すなわち、臨床的因子）に基づく。症状又は症状群は、例えば、下痢、腹痛、痙攣、発熱、貧血、体重減少、不安、うつ状態、及びそれらの組み合わせであることができる。
【００６２】
或る態様において、小児個体がＩＢＤ又はその臨床的サブタイプに罹っているという診断に続いて、ＩＢＤ又はＩＢＤサブタイプ（例えば、ＣＤ又はＵＣ）と関連する１種又は２種以上の症状の治療に有効な薬剤の治療的有効量をその小児個体に投与する。適当なＩＢＤ薬剤として、限定的でなく、アミノサリチレート（例えば、メサラジン、スルファサラジン等）、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン）、チオプリン（例えば、アザチオプリン、６−メルカプトプリン等）、メトトレキサート、モノクローナル抗体（例えば、インフリキシマブ）、それらの遊離塩基、それらの薬学的に許容することのできる塩、それらの誘導体、それらの類似体、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。
【００６３】
或る場合において、本発明の統計的アルゴリズムを用いて、先にＩＢＤに罹っていると同定された小児個体においてＵＣ試料からＣＤ試料を識別することができる。或る他の場合において、本発明の統計的アルゴリズムを用いて、先にＩＢＤに罹っていると診断されなかった小児個体由来の試料をＣＤ試料、ＵＣ試料、又は非ＩＢＤ試料と分類することができる。
【００６４】
別の観点において、本発明は、小児個体のＩＢＤの進行又は退行をモニタリングする方法であって、
（ａ）小児個体由来の試料中の抗フラジェリン抗体（例えば、抗ＣＢｉｒ−１抗体）及び場合により抗好中球抗体、抗サッカロミセス・セレビシエ抗体、抗菌抗体及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１種の追加のマーカーの存在又はレベルを測定すること；及び
（ｂ）前記抗フラジェリン抗体及び場合により少なくとも１種の追加のマーカーの存在又はレベルに基づき統計的アルゴリズムを用いて前記小児個体におけるＩＢＤの存在又は重症度を決定すること
を含む方法を提供する。
【００６５】
関連する観点において、本発明は、ＩＢＤを治療するのに有効な薬剤を受ける小児個体における薬剤効果をモニタリングする方法であって、
（ａ）前記小児個体由来の試料中の抗フラジェリン抗体（例えば、抗ＣＢｉｒ−１抗体）及び場合により抗好中球抗体、抗サッカロミセス・セレビシエ抗体、抗菌抗体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１種の追加のマーカーの存在又はレベルを測定すること；及び
（ｂ）抗フラジェリン抗体及び場合により少なくとも１種の追加のマーカーの存在又はレベルに基づき統計的アルゴリズムを用いて小児個体におけるＩＢＤの存在又は重症度を決定すること
を含む方法を提供する。
【００６６】
前記のように、本発明は、典型的には、小児個体の試料中の抗フラジェリン抗体及び場合により少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、又は１１種以上の追加のＩＢＤマーカーの存在又はレベルを測定することを含む。或る場合において、抗好中球抗体は、ＡＮＣＡ、ｐＡＮＣＡ、ｃＡＮＣＡ、ＮＳＮＡ、ＳＡＰＰＡ、及びそれらの組み合わせを含む。例えば、小児個体の試料中のＡＮＣＡ及び／又はｐＡＮＣＡの存在又はレベルを測定する。或る他の場合において、抗サッカロミセス・セレビシエ抗体は、ＡＳＣＡ−ＩｇＡ、ＡＳＣＡ−ＩｇＧ、ＡＳＣＡ−ＩｇＭ、及びそれらの組み合わせを含む。例えば、小児個体の試料中のＡＳＣＡ−ＩｇＡ及び／又はＡＳＣＡ−ＩｇＧの存在又はレベルを測定する。さらなる場合において、抗菌抗体は、抗ＯｍｐＣ抗体、他の抗フラジェリン抗体、抗Ｉ２抗体、及びそれらの組み合わせを含む。好ましくは、小児個体の試料中の抗ＯｍｐＣ抗体及び／又は抗フラジェリン抗体の存在又はレベルを測定する。
【００６７】
抗好中球抗体、抗サッカロミセス・セレビシエ抗体、及び／又は抗菌抗体のほかに、前記少なくとも１種のマーカーはさらに、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、又は１１種以上のＩＢＤマーカー、例えば、ラクトフェリン、抗ラクトフェリン抗体、エラスターゼ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、カルプロテクチン、ヘモグロビン、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５、及びそれらの組み合わせを含んでいることができる。
【００６８】
少なくとも１種のマーカーの存在又はレベルを検出又は測定するのに用いられる試料は、典型的には、全血、血漿、血清、唾液、尿、便（すなわち、糞便）、涙、及びあらゆる他の体液、又は組織試料（すなわち、生検）、例えば、小腸若しくは結腸試料である。好ましくは、試料は、血清、全血、血漿、便、尿、又は組織生検である。或る場合において、本発明の方法はさらに、試料中の少なくとも１種のマーカーの存在又はレベルを検出又は測定する前に小児個体から試料を得ることを含む。
【００６９】
或る態様において、本発明の方法は、抗フラジェリン抗体、例えば、抗ＣＢｉｒ−１抗体の存在又はレベルを測定することを含む。或る観点において、本方法は場合により、試料、例えば、血清、血漿、全血、又は便中の以下のＡＮＣＡ、ＡＳＣＡ−ＩｇＡ、ＡＳＣＡ−ＩｇＧ、抗ＯｍｐＣ抗体、及びｐＡＮＣＡの１種又は２種以上の存在を測定することを含む。前記１種又は２種以上のＩＢＤマーカーからなるパネルを構成し、そして小児個体におけるＩＢＤ（例えば、ＣＤ又はＵＣ）の存在又は重症度を決定するために用いることができる。
【００７０】
或る場合において、免疫測定法又は免疫組織化学的分析を用いて少なくとも１種のマーカーの存在又はレベルを測定する。本発明の方法に用いるのに適当な免疫測定法の限定的でない例としてＥＬＩＳＡを挙げることができる。本発明の方法に用いるのに適当な免疫組織化学的分析の例として、限定的でなく、免疫蛍光測定法、例えば、直接蛍光抗体法、ＩＦＡ法、抗補体免疫蛍光測定法、及びアビジン−ビオチン免疫蛍光測定法を挙げることができる。他の型の免疫組織化学的分析として免疫ペルオキシダーゼ法を挙げることができる。
【００７１】
或る態様において、ＩＢＤの存在又は重症度を決定するのに用いられる統計的アルゴリズムは学習統計的分類子システムである。学習統計的分類子システムは、分類及び回帰木（Ｃ＆ＲＴ）、ランダムフォレスト（ＲＦ）、ブースト型の木、ニューラルネットワーク（ＮＮ）、サポートベクターマシーン、一般的なカイ二乗による相互作用の自動検出器モデル、多変量適応回帰スプライン、機械学習分類子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。好ましくは、学習統計的分類子システムは、木をベースとする統計的アルゴリズム（例えば、Ｃ＆ＲＴ、ＲＦ等）及び／又はＮＮ（例えば、人工ＮＮ等）である。
【００７２】
或る場合において、統計的アルゴリズムは単一の学習統計的分類子システムである。好ましくは、前記単一の学習統計的分類子システムは、木をベースとする統計的アルゴリズム（例えば、Ｃ＆ＲＴ又はＲＦ等）である。或る他の場合において、統計的アルゴリズムは少なくとも２種の学習統計的分類子システムの組み合わせである。好ましくは、学習統計的分類子システムの組み合わせは、例えば直列又は並列に用いられる、Ｃ＆ＲＴ又はＲＦ及びＮＮを含む。限定的でない例として、最初にＣ＆ＲＴを用いて少なくとも１種のＩＢＤマーカーの存在又はレベルに基づき的中率又は確率値を発生させることができ、そして次にＮＮを用いて少なくとも１種のＩＢＤマーカーの存在又はレベル及び的中率又は確率値に基づき小児個体におけるＩＢＤの存在又は重症度を決定することができる。
【００７３】
或る場合において、１つ又は複数の学習統計的分類子システムを用いることから得られるデータは、処理アルゴリズムを用いて処理することができる。かかる処理アルゴリズムは、例えば、多層パーセプトロン、バックプロパゲーションネットワーク、及びレーベンバーグ・マルカートアルゴリズムからなる群から選択することができる。他の場合において、かかる処理アルゴリズムの組み合わせは、例えば、直列又は並列に用いることができる。
【００７４】
或る態様において、本発明の方法はさらに、工程（ｂ）において決定された小児個体のＩＢＤの存在又は重症度を、より早い時点における当該小児個体のＩＢＤの存在又は重症度と比較することを含む。限定的でない例として、ＩＢＤを治療するのに有効な治療剤を受けた小児個体について決定されたＩＢＤの存在又は重症度は、治療剤の使用開始前に又は治療のより早い時点で同一個体について決定されたＩＢＤの存在又は重症度と比較することができる。或る他の態様において、本方法はさらに、ＩＢＤのモニタリング結果を臨床医、例えば、消化器専門医又は一般医に送信することを含んでいることができる。
【００７５】
さらに別の観点において、本発明は、小児個体由来の試料がＩＢＤと関連しているか否かを分類する１つ又は２つ以上のプロセッサを制御するためのコードを含むコンピュータ可読媒体を提供し、前記コードは、抗好中球抗体、抗サッカロミセス・セレビシエ抗体、抗菌抗体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１種のマーカーの試料中の存在又はレベルを示すデータ集合に統計処理を適用して少なくとも１種のマーカーの存在又はレベルに基づいて試料をＩＢＤ試料又は非ＩＢＤ試料と分類する統計的に導かれた決定を生成する命令を含む。
【００７６】
関連する観点において、本発明は、小児個体由来の試料がＩＢＤの臨床的サブタイプと関連しているか否かを分類する１つ又は２つ以上のプロセッサを制御するためのコードを含むコンピュータ可読媒体を提供し、前記コードは、抗好中球抗体、抗サッカロミセス・セレビシエ抗体、抗菌抗体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１種のマーカーの試料中の存在又はレベルを示すデータ集合に統計処理を適用して少なくとも１種のマーカーの存在又はレベルに基づいて試料をＣＤ試料、ＵＣ試料、又は非ＩＢＤ試料と分類する統計的に導かれた決定を生成する命令を含む。
【００７７】
１つの態様において、統計処理は学習統計的分類子システムである。本発明に用いるのに適当な学習統計的分類子システムの例は前記の通りである。或る場合において、統計処理は単一の学習統計的分類子システム、例えば、Ｃ＆ＲＴ又はＲＦである。或る他の場合において、統計処理は少なくとも２つの学習統計的分類子システムの組み合わせである。限定的でない例として、学習統計的分類子システムの組み合わせは、例えば直列に用いられる、Ｃ＆ＲＴ又はＲＦ及びＮＮを含む。或る場合において、１つ又は複数の学習統計的分類子システムを用いることによって得られるデータは、処理アルゴリズムを用いて処理することができる。
【００７８】
さらなる観点において、本発明は、小児個体由来の試料がＩＢＤと関連しているか否かを分類するためのシステムであって、
（ａ）抗フラジェリン抗体及び場合により抗好中球抗体、抗サッカロミセス・セレビシエ抗体、抗菌抗体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１種の追加のマーカーの試料中の存在又はレベルを示すデータ集合を生成するように構成されたデータ取得モジュール；
（ｂ）前記データ集合に統計処理を適用することによって前記データ集合を処理して、抗フラジェリン抗体及び場合により少なくとも１種の追加のマーカーの存在又はレベルに基づいて試料をＩＢＤ試料又は非ＩＢＤ試料と分類する統計的に導かれた決定を生成するように構成されたデータ処理モジュール；及び
（ｃ）前記統計的に導かれた決定を表示するように構成された表示モジュール
を含む前記システムを提供する。
【００７９】
関連する観点において、本発明は、小児個体由来の試料がＩＢＤの臨床的サブタイプと関連しているか否かを分類するためのシステムであって、
（ａ）抗フラジェリン抗体及び場合により抗好中球抗体、抗サッカロミセス・セレビシエ抗体、抗菌抗体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１種の追加のマーカーの試料中の存在又はレベルを示すデータ集合を生成するように構成されたデータ取得モジュール；
（ｂ）前記データ集合に統計処理を適用することによって前記データ集合を処理して、抗フラジェリン抗体及び場合により少なくとも１種の追加のマーカーの存在又はレベルに基づいて試料をＣＤ試料、ＵＣ試料、又は非ＩＢＤ試料と分類する統計的に導かれた決定を生成するように構成されたデータ処理モジュール；及び
（ｃ）前記統計的に導出された決定を表示するように構成された表示モジュール
を含む前記システムを提供する。
【００８０】
１つの態様において、統計処理は学習統計的分類子システムである。本発明に用いるのに適当な学習統計的分類子システムの例は前記の通りである。或る場合において、統計処理は単一の学習統計的分類子システムである。或る他の場合において、統計処理は少なくとも２つの学習統計的分類子システムの組み合わせである。或る場合において、１つ又は複数の学習統計的分類子システムを用いることによって得られるデータは、処理アルゴリズムを用いて処理することができる。
【００８１】
《ＩＩＩ．ＩＢＤの臨床的サブタイプ》
クローン病（ＣＤ）は、消化管のあらゆる部分を含むことがある慢性炎症の疾患である。一般に、小腸の遠位部、すなわち、回腸、及び盲腸が冒される。他の場合に、疾患は小腸、結腸、又は肛門直腸の部位に限定される。ＣＤは、十二指腸及び胃に影響を及ぼすことがあり、そしてよりまれには食道及び口腔に影響を及ぼすことがある。
【００８２】
ＣＤのさまざまな臨床症状は、部分的に、疾患の種々の解剖学的局在の結果である。ＣＤの最も多い症状は、腹痛、下痢、及び再発性の発熱である。ＣＤは、一般に、腸閉塞又は腸瘻、腸の罹患したループ（diseased loop）間の異常な通路と関連する。ＣＤは、合併症、例えば、眼、関節、及び皮膚の炎症、肝臓疾患、腎結石、及びアミロイドーシスも含む。さらに、ＣＤは腸癌の増加したリスクと関連する。
【００８３】
いくつかの特徴がＣＤの病態に特有である。貫壁性炎症（transmural inflammation）として知られるＣＤと関連した炎症は、腸壁のすべての層に影響を及ぼす。肥厚及び浮腫も、例えば、典型的には、腸壁の全体にわたって現れ、疾患の長期にわたる形態においては線維症が存在する。ＣＤに特有の炎症は、「飛び石病変（skip lesions）」として知られる炎症を起こした組織の部分（segment）同士が外見上正常な腸によって隔てられていることにおいて非連続的である。さらに、介在する組織の炎症、線状潰瘍形成（linear ulceration）、及び浮腫は、ＣＤに特有である腸管粘膜の「敷石（cobblestone）」的外観に至る。
【００８４】
ＣＤの特徴は、粘膜下組織（submucosa）に通常見出される肉芽腫として知られる炎症細胞の孤立性の集合（discrete aggregation）の存在である。或るＣＤの場合は典型的な孤立性の肉芽腫を示すが、他の場合は広範性の肉芽腫性反応（diffuse granulomatous reaction）又は非特異的な貫壁性炎症を示す。結果として、孤立性の肉芽腫の存在はＣＤを示すが、肉芽腫がないこともこの疾患と一致する。従って、肉芽腫の存在よりはむしろ、貫壁性炎症又は非連続性炎症がＣＤの好ましい診断指標である（Rubin and Farber, Pathology (Second Edition), Philadelphia, J.B. Lippincott Company (1994)）。
【００８５】
潰瘍性大腸炎（ＵＣ）は、痙攣、腹痛、直腸出血、血液の穏やかな漏出（loose discharge）、膿、及び粘液を伴う慢性下痢によって特徴付けられる大腸の疾患である。ＵＣの症状は広く変化する。再燃（exacerbation）及び緩解（remission）のパターンは、ＵＣ患者の約７０％についての臨床経過を代表するが、緩解のない持続的な症状がＵＣに罹患した一部の患者に存在する。ＵＣの局部的及び全身的な合併症は、関節炎、眼の炎症、例えば、ブドウ膜炎、皮膚潰瘍、及び肝臓疾患を含む。さらに、ＵＣ、及び当該疾患の長期にわたる広範囲の形態は結腸癌の増加したリスクと関連する。
【００８６】
ＵＣは、通常、直腸の最も遠位の部分から近位にさまざまな距離にわたり広がるびまん性疾患である。「左側結腸炎（left-sided colitis）」という用語は、脾臓の弯曲部まで広がる結腸の遠位部を含む炎症を表す。直腸の回避（sparing）又は結腸の右側（近位部分）単独の関与はＵＣにおいてまれである。ＵＣの炎症過程は結腸に限られ、そして例えば、小腸、胃、又は食道には影響を及ぼさない。さらに、ＵＣは、通常腸壁のより深い層を回避する粘膜の表在性炎症によって区別される。変性した腸陰窩が好中球で満たされる陰窩膿瘍もＵＣに特有である（Rubin and Farber、前記参照）。
【００８７】
直腸の頻繁な回避を伴う斑状疾患であるＣＤと比べて、ＵＣは、通常近位より遠位でより重症である結腸の連続性の炎症によって特徴付けられる。ＵＣの炎症は、通常粘膜層に限られことにおいて表在性であり、そして好中球及び陰窩膿瘍を伴う急性炎症浸潤によって特徴付けられる。対照的に、ＣＤは、常にではないがしばしば存在する肉芽腫を伴い、腸壁の全層を冒す。回盲弁又はそれに遠位の結腸で終わる疾患はＵＣを示し、一方、回腸末端部の関与、敷石様の外観、孤立性の潰瘍、又は瘻孔はＣＤを示唆する。
【００８８】
分類不能大腸炎（ＩＣ）は、ＣＤ及びＵＣの両方の特徴を含むＩＢＤの臨床的サブタイプである。両方の疾患の症状のこのようなオーバーラップは、ＩＣに罹患した患者において一時的に（例えば、疾患の初期段階において）又は持続的に（例えば、疾患の進行の間を通してずっと）生ずることがある。臨床的には、ＩＣは直腸出血を伴う又は伴わない腹痛及び下痢により特徴付けられる。例えば、正常の粘膜によって分離される断続的な（intermittent）多数の潰瘍形成を伴う大腸炎が当該疾患に罹患した患者に見出される。組織学的には、貫壁性炎症を伴う重症の潰瘍形成のパターンがある。直腸は、典型的には疾患を有さず、そしてリンパ球様（lymphoid）炎症細胞は集合を示さない。筋細胞溶解（myocytolysis）の病巣に伴って深いスリット様の亀裂が観察されるが、ＩＣに罹患した患者において、介在性粘膜は、典型的には、杯細胞の維持を伴い最小限のうっ血を生ずる。
【００８９】
《ＩＶ．ＩＢＤマーカー》
種々の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）マーカー、例えば、生化学的マーカー、血清学的マーカー、遺伝学的マーカー、又は他の臨床上若しくは超音波検査上の特徴は、例えば小児個体由来の試料をＩＢＤ試料と分類することによる、ＩＢＤの決定のために本発明の統計的アルゴリズムに用いるのに適している。本明細書中に記載のＩＢＤマーカーは、例えば小児個体由来の試料をＣＤ試料又はＵＣ試料と分類することによって、ＩＢＤの臨床的サブタイプ間を識別するために本発明の統計的アルゴリズムに用いるのにも適している。本発明に用いるのに適当なマーカーの例として、限定的でなく、抗フラジェリン抗体（例えば、抗ＣＢｉｒ−１抗体）、抗好中球抗体（例えば、ＡＮＣＡ、ｐＡＮＣＡ、ｃＡＮＣＡ、ＮＳＮＡ、ＳＡＰＰＡ等）、抗サッカロミセス・セレビシエ抗体（例えば、ＡＳＣＡ−ＩｇＡ、ＡＳＣＡ−ＩｇＧ、ＡＳＣＡ−ＩｇＭ等）、抗菌抗体（例えば、抗ＯｍｐＣ抗体、他の抗フラジェリン抗体、抗Ｉ２抗体等）、ラクトフェリン、抗ラクトフェリン抗体、エラスターゼ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、カルプロテクチン、ヘモグロビン、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。本発明の統計的アルゴリズムに用いるのに適当なさらなるマーカーがあることは当業者に公知であろう。
【００９０】
小児個体由来の試料中の抗ＣＢｉｒ−１抗体のレベルは、例えば、免疫測定法、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定することができる。ある態様において、フラジェリン抗原は、配列番号１に示した全長ＣＢｉｒ−１フラジェリン配列の少なくとも約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個、１５０個又はそれを超える個数の隣接アミノ酸（中間の長さをすべて含む）からなるポリペプチド断片を含むＣＢｉｒ−１フラジェリンである。概して、ＣＢｉｒ−１フラジェリンポリペプチド断片は、全長ＣＢｉｒ−１フラジェリン配列と結合する抗体及び／又は全長ＣＢｉｒ−１フラジェリン配列と反応するＴ細胞と免疫学的に反応性である。好ましい態様において、ポリペプチド断片は配列番号１に示した配列のアミノ末端の保存領域（アミノ酸残基１〜１４７）である。他の態様において、ポリペプチド断片は配列番号１に示した配列のアミノ末端の保存領域に可変領域を加えた領域（アミノ酸残基１〜４１８）である。或る場合において、ＣＢｉｒ−１フラジェリン抗原は、本明細書中に記載のＣＢｉｒ−１フラジェリンポリペプチド断片及びタグ、例えば、６つのヒスチジン（配列番号２）又はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグからなる融合タンパク質である。
【００９１】
抗フラジェリン抗体の「増加した」レベルは、対照との比較上検出することができる所定の抗フラジェリン抗体（例えば、抗ＣＢｉｒ−１抗体）レベルの増加を含むことを意図する。検出することができる増加は、対照において検出される所定の抗フラジェリン抗体のレベルより約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、又はそれを超える増加であることができる。所定の抗フラジェリン抗体のレベルの増加は、典型的には、当該技術分野で公知のあらゆる方法又は技術、例えば、免疫測定法又は免疫組織化学的分析を用いて測定される。
【００９２】
試料中のＡＮＣＡレベル及び／又はｐＡＮＣＡの有無の測定は、本発明において有用である。「抗好中球細胞質抗体」又は「ＡＮＣＡ」という用語は、好中球の細胞質及び／又は核の成分に対する抗体を含む。ＡＮＣＡ活性は、好中球のＡＮＣＡ染色パターン：（１）核周囲にハイライトを有しない細胞質の好中球染色（ｃＡＮＣＡ）；（２）核の外側縁の周囲の核周囲染色（ｐＡＮＣＡ）；（３）核の内側縁の周囲の核周囲染色（ＮＳＮＡ）；及び（4）好中球全体にわたり斑紋を有する広範性（diffuse）染色（ＳＡＰＰＡ）、に基づいていくつかの広いカテゴリーに分けることができる。或る場合には、ｐＡＮＣＡ染色はＤＮａｓｅ処理に対して鋭敏である。ＡＮＣＡという用語は、限定的でなく、ｃＡＮＣＡ、ｐＡＮＣＡ、ＮＳＮＡ、及びＳＡＰＰＡ、を含むすべての種類の抗好中球活性を包含する。同様に、ＡＮＣＡという用語は、限定的でなく、免疫グロブリンＡ及びＧ、を含むすべての免疫グロブリンアイソタイプを包含する。
【００９３】
小児個体由来の試料中のＡＮＣＡレベルは、例えば、アルコール固定された好中球を用いた酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）のような免疫測定法を用いて測定することができる（例えば、実施例１参照）。ＡＮＣＡの特定のカテゴリー、例えば、ｐＡＮＣＡの有無は、例えば、免疫組織化学的分析、例えば、間接蛍光抗体（ＩＦＡ）法を用いて測定することができる。好ましくは、試料中のｐＡＮＣＡの有無は、ＤＮａｓｅ処理され、固定された好中球による免疫蛍光測定法を用いて測定される（例えば、実施例２参照）。固定された好中球のほかに、ＡＮＣＡレベルを測定するのに適当なＡＮＣＡに特異的な抗原として、限定的でなく、精製されていない又は部分的に精製された好中球抽出物；精製されたタンパク質、タンパク質断片、又は合成ペプチド、例えば、ヒストンＨ１又はそのＡＮＣＡ反応性断片（例えば、米国特許第６，０７４，８３５号参照）；ヒストンＨ１様抗原、ポリン抗原、バクテロイデス抗原、又はそのＡＮＣＡ反応性断片（例えば、米国特許第６，０３３，８６４号参照）；分泌小胞抗原又はそのＡＮＣＡ反応性断片（例えば、米国特許出願第０８／８０４，１０６号）；及び抗ＡＮＣＡイディオタイプ抗原を挙げることができる。ＡＮＣＡに特異的なさらなる抗原の使用は本発明の範囲内であることが当業者に理解されよう。
【００９４】
試料中のＡＳＣＡ（例えば、ＡＳＣＡ−ＩｇＡ及び／又はＡＳＣＡ−ＩｇＧ）レベルの測定も本発明に有用である。「抗サッカロミセス・セレビシエ免疫グロブリンＡ」又は「ＡＳＣＡ−ＩｇＡ」という用語は、サッカロミセス・セレビシエと特異的に反応する免疫グロブリンＡアイソタイプの抗体を含む。同様に、「抗サッカロミセス・セレビシエ免疫グロブリンＧ」又は「ＡＳＣＡ−ＩｇＧ」という用語は、サッカロミセス・セレビシエと特異的に反応する免疫グロブリンＧアイソタイプの抗体を含む。
【００９５】
試料がＡＳＣＡ−ＩｇＡ又はＡＳＣＡ−ＩｇＧに対し陽性であるか否かの測定は、ＡＳＣＡに対して特異的な抗原を用いて行なう。かかる抗原は、ＡＳＣＡ−ＩｇＡ及び／又はＡＳＣＡ−ＩｇＧによって特異的に結合するあらゆる抗原又は抗原の混合物であることができる。ＡＳＣＡ抗体は、最初、そのサッカロミセス・セレビシエとの結合能によって特徴付けられたが、ＡＳＣＡによって特異的に結合する抗原は当該抗原がＡＳＣＡ抗体と特異的に結合することができる限りサッカロミセス・セレビシエから又は種々の他の供給源から得ることができることは当業者に理解されよう。従って、試料中のＡＳＣＡ−ＩｇＡ及び／又はＡＳＣＡ−ＩｇＧのレベルを測定するために用いることができる、ＡＳＣＡに対して特異的な抗原の典型的な供給源として、限定的でなく、死滅した（killed）酵母細胞、例えば、サッカロミセス又はカンジダの細胞の全体；酵母細胞壁マンナン、例えば、ホスホペプチドマンナン（ＰＰＭ）；オリゴ糖、例えば、オリゴマンノシド；ネオ糖脂質；抗ＡＳＣＡイディオタイプ抗体；等を挙げることができる。異なる種及び株の酵母、例えば、サッカロミセス・セレビシエ株Ｓｕ１、Ｓｕ２、ＣＢＳ１３１５、若しくはＢＭ１５６、又はカンジダ・アルビカンス株ＶＷ３２は、ＡＳＣＡ−ＩｇＡ及び／又はＡＳＣＡ−ＩｇＧに特異的な抗原として用いるのに適する。ＡＳＣＡに特異的な精製された又は合成の抗原も、試料中のＡＳＣＡ−ＩｇＡ及び／又はＡＳＣＡ−ＩｇＧのレベルの測定に用いるのに適する。精製された抗原の例として、限定的でなく、精製されたオリゴ糖抗原、例えば、オリゴマンノシドを挙げることができる。合成抗原の例として、限定的でなく、合成オリゴマンノシド、例えば、米国特許公報第２００３０１０５０６０号に記載のもの、例えば、式中のＲが水素原子、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、又は場合により標識された連結基である、Ｄ−Ｍａｎβ(１−２)Ｄ−Ｍａｎβ(１−２)Ｄ−Ｍａｎβ(１−２)Ｄ−Ｍａｎ−ＯＲ、Ｄ−Ｍａｎα(１−２)Ｄ−Ｍａｎα(１−２)Ｄ−Ｍａｎα(１−２)Ｄ−Ｍａｎ−ＯＲ、及びＤ−Ｍａｎα(１−３)Ｄ−Ｍａｎα(１−２)Ｄ−Ｍａｎα(１−２)Ｄ−Ｍａｎ−ＯＲを挙げることができる。
【００９６】
酵母細胞壁マンナン、例えば、ＰＰＭの調製物は、試料中のＡＳＣＡ−ＩｇＡ及び／又はＡＳＣＡ−ＩｇＧのレベルを測定するのに用いることができる。かかる水溶性の表面抗原は、当該技術分野で公知の任意の適切な抽出法によって、例えば、オートクレーブ法（autoclaving）によって調製することができ、又は商業的に入手することができる（例えば、Lindberg et al., Gut, 33:909-913 (1992)参照）。ＰＰＭの酸安定性画分も本発明の統計的アルゴリズムにおいて有用である（Sendid et al., Clin. Diag. Lab. Immunol., 3:219-226 (1996)）。試料中のＡＳＣＡレベルを測定するのに有用な代表的ＰＰＭは、Ｓ．ウヴァラム（S. uvarum）株ＡＴＣＣ＃３８９２６から得られる。実施例３は、酵母細胞壁マンナンの調製及びＥＬＩＳＡ分析を用いた試料中のＡＳＣＡレベルの分析を記載する。
【００９７】
精製されたオリゴ糖抗原、例えば、オリゴマンノシドも、試料中のＡＳＣＡ−ＩｇＡ及び／又はＡＳＣＡ−ＩｇＧのレベルを測定するのに有用であることができる。精製オリゴマンノシド抗原は、好ましくは、例えば、Faille et al., Eur. J. Microbiol. Infect. Dis., 11:438-446 (1992)に記載のように、ネオ糖脂質に転換される。かかるオリゴマンノシド抗原のＡＳＣＡとの反応性は、マンノシルの鎖長を変えることによって（Frosh et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 82:1194-1198 (1985)）；アノマー配置を変えることによって（Fukazawa et al., In “Immunology of Fungal Disease,” E. Kurstak (ed.), Marcel Dekker Inc., New York, pp. 37-62 (1989)；Nishikawa et al., Microbiol. Immunol., 34:825-840 (1990)；Poulain et al., Eur. J. Clin. Microbiol., 23:46-52 (1993)；Shibata et al., Arch. Biochem. Biophys., 243:338-348 (1985)；Trinel et al., Infect. Immun., 60:3845-3851 (1992)）；又は結合の位置を変えることによって（Kikuchi et al., Planta, 190:525-535 (1993)）、最適化することができることは当業者に理解されるところである。
【００９８】
本発明の方法に用いるのに適当なオリゴマンノシドとして、これに限定されないが、マンノテトラオースＭａｎ（１−３）Ｍａｎ（１−２）Ｍａｎ（１−２）Ｍａｎを有するオリゴマンノシドを挙げることができる。かかるオリゴマンノシドは、例えば、前出のFaille et al.に記載のようにＰＰＭから精製することができる。ＡＳＣＡに特異的である典型的なネオ糖脂質は、そのそれぞれのＰＰＭからオリゴマンノシドを放出させ、そしてそれに続いて放出されたオリゴマンノシドを４−ヘキサデシルアニリン等に結合することによって構成することができる。
【００９９】
試料中の抗ＯｍｐＣ抗体レベルの測定も本発明において有用である。「抗外膜タンパク質Ｃ抗体」又は「抗ＯｍｐＣ抗体」という用語は、本明細書中で用いる場合、例えば、ＰＣＴ特許公報第ＷＯ０１／８９３６１号に記載の細菌性外膜ポリンに対する抗体を含む。「外膜タンパク質Ｃ」又は「ＯｍｐＣ」という用語は、抗ＯｍｐＣ抗体と免疫反応性である細菌性ポリンを含む。
【０１００】
小児個体由来の試料中に存在する抗ＯｍｐＣ抗体のレベルは、ＯｍｐＣタンパク質又はその断片、例えば、その免疫反応性の断片を用いて測定することができる。試料中の抗ＯｍｐＣ抗体レベルの測定に有用である適当なＯｍｐＣ抗原として、限定的でなく、ＯｍｐＣタンパク質、ＯｍｐＣタンパク質と実質的に同じアミノ酸配列を有するＯｍｐＣポリペプチド、又はそれらの断片、例えば、それらの免疫反応性断片を挙げることができる。ＯｍｐＣポリペプチドは、本明細書中で用いる場合、一般に、ＯｍｐＣタンパク質と約５０％を超える同一性、好ましくは、約６０％を超える同一性、より好ましくは、約７０％を超える同一性、さらにより好ましくは、約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を超えるアミノ酸配列同一性を持ったアミノ酸配列を有するポリペプチドプチドを表し、アミノ酸同一性はシーケンスアラインメントプログラム、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて決定される。かかる抗原は、例えば、腸内細菌、例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉからの精製によって、核酸、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｋ００５４１の組換え発現によって、合成手段、例えば、液相若しくは固相ペプチド合成によって、又はファージディスプレイによって調製することができる。実施例４は、ＯｍｐＣタンパク質の調製及びＥＬＩＳＡ法を用いた試料中の抗ＯｍｐＣ抗体レベルの分析を説明する。
【０１０１】
試料中の抗Ｉ２抗体レベルの測定も本発明に有用である。「抗Ｉ２抗体」という用語は、本明細書中で用いる場合、例えば、米国特許第６，３０９，６４３号に記載のように細菌性の転写制御因子に対する相同性を共有する細菌性抗原に対する抗体を含む。「Ｉ２」という用語は、抗Ｉ２抗体と免疫反応性である細菌性抗原を含む。微生物のＩ２タンパク質は、Ｃ．パスツーリアナム（C. pasteurianum）由来の予測タンパク質（predicted protein）４とある程度類似性の弱い相同性を共有するアミノ酸１００個のポリペプチド、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）由来のＲｖ３５５７ｃ、及びアクイフェックス・エオリカス（Aquifex aeolicus）由来の転写制御因子である。Ｉ２タンパク質の核酸及びタンパク質配列は、例えば、米国特許第６，３０９，６４３号に記載されている。
【０１０２】
小児個体由来の試料中に存在する抗Ｉ２抗体のレベルは、Ｉ２タンパク質又はその断片、例えば、その免疫反応性の断片を用いて測定することができる。試料中の抗Ｉ２抗体レベルを測定するのに有用である適当なＩ２抗原として、限定的でなく、Ｉ２タンパク質、Ｉ２タンパク質と実質的に同じアミノ酸配列を有するＩ２ポリペプチド、又はその断片、例えば、その免疫反応性の断片を挙げることができる。かかるＩ２ポリペプチドは、Ｃ．パスツーリアナムのタンパク質４よりＩ２タンパク質に対してより大きい配列類似性を示し、そしてそのアイソタイプ変異体及び類似体を含む。Ｉ２ポリペプチドは、本明細書中で用いる場合、概して、天然に存在するＩ２タンパク質と約５０％を超える同一性、好ましくは、約６０％を超える同一性、より好ましくは、約７０％を超える同一性、さらにより好ましくは、約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を超えるアミノ酸配列同一性を持ったアミノ酸配列を有するポリペプチドプチドを表し、前記アミノ酸同一性はシーケンスアラインメントプログラム、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて決定される。かかるＩ２抗原は、例えば、微生物からの精製によって、Ｉ２抗原をコードする核酸の組換え発現によって、合成手段、例えば、液相若しくは固相ペプチド合成によって、又はファージディスプレイを用いることによって調製することができる。実施例５は、組換えＩ２タンパク質の調製及びＥＬＩＳＡ分析又は組織学的分析を用いた試料中の抗Ｉ２抗体レベルの分析を記載する。
【０１０３】
試料中のラクトフェリンの存在又はレベルの測定も本発明に有用である。或る場合において、ラクトフェリンの存在又はレベルは、分析、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ又は増幅をベースとする分析を用いてｍＲＮＡ発現のレベルで検出される。或る他の場合において、ラクトフェリンの存在又はレベルは、例えば、免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ）又は免疫組織化学的分析を用いて、タンパク質発現のレベルで検出される。Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手することができるＥＬＩＳＡキットを用いて血漿、尿、気管支肺胞洗浄液（bronchoalveolar lavage）、又は脳脊髄液試料中のヒトラクトフェリンを検出することができる。同様に、Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，ＭＡ）から入手することができるＥＬＩＳＡキットを用いて、血漿試料中のラクトフェリンレベルを測定することができる。同様に、ＴＥＣＨＬＡＢ社（Ｂｌａｃｋｓｂｕｒｇ，ＶＡ）から入手することができるＥＬＩＳＡキットを用いて、便試料中のラクトフェリンレベルを測定することができる。さらに、米国特許公報第２００４０１３７５３６号は、便試料中の増加したラクトフェリンレベルの存在を測定するためのＥＬＩＳＡ分析を記載し、そして米国特許公報第２００４００３３５３７号は、便、粘液、又は胆汁試料中の内在性ラクトフェリンの濃度を測定するためのＥＬＩＳＡ分析を記載している。或る態様において、次に、例えば、ラクトフェリンタンパク質又はその断片を用いて、試料中の抗ラクトフェリン抗体の存在又はレベルを検出することができる。
【０１０４】
試料中のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の存在又はレベルの測定も本発明に有用である。或る場合において、ＣＲＰの存在又はレベルは、分析、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ又は増幅をベースとする分析を用いてｍＲＮＡ発現のレベルで検出される。或る他の場合において、ＣＲＰの存在又はレベルは、例えば、免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ）又は免疫組織化学的分析を用いて、タンパク質発現のレベルで検出される。例えば、Ａｌｐｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓａｌｅｍ，ＮＨ）から入手することができるサンドイッチ比色定量（sandwich colorimetric）ＥＬＩＳＡ分析を用いて、血清、血漿、尿、又は便試料中のＣＲＰのレベルを測定することができる。同様に、Ｂｉｏｍｅｄａ社（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から入手することができるＥＬＩＳＡキットを用いて試料中のＣＲＰレベルを検出することができる。試料中のＣＲＰレベルを測定するための他の方法は、例えば、米国特許第６，８３８，２５０号及び第６，４０６，８６２号；並びに米国特許公報第２００６００２４６８２号及び第２００６００１９４１０号に記載されている。
【０１０５】
さらに、潜血（hemoccult）、便潜血は、しばしば胃腸疾患を示しており、そして胃腸出血をモニタリングするための種々のキットが開発されてきた。例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒの製品であるＨｅｍｏｃｃｕｌｔ ＳＥＮＳＡは、胃腸出血、鉄欠乏、消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎に対する、及び或る場合には、結腸直腸癌のスクリーニングにおける、診断補助となる。この特定の分析は、青色を生ずる過酸化水素によるグアヤクの酸化に基づく。便試料中の血液を検出するための同様の比色定量分析は、Ｈｅｌｅｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｅａｕｍｏｎｔ，ＴＸ）から商業的に入手することができる。ヘモグロビン又はヘム活性の存在又はレベルを測定することにより便試料中の潜血を検出するための他の方法は、例えば、米国特許第４，２７７，２５０号、第４，９２０，０４５号、第５，０８１，０４０号、及び第５，３１０，６８４号に記載されている。
【０１０６】
カルプロテクチンは、体内のすべての細胞、組織、及び液体中に見出されるカルシウム及び亜鉛結合性タンパク質である。カルプロテクチンは、好中球の顆粒球及びマクロファージ中の主要なタンパク質であり、そしてこれらの細胞の細胞質画分中の全タンパク質の６０％もの割合を占める。従って、カルプロテクチンは好中球の代謝回転の代用のマーカーである。便中のカルプロテクチン濃度は、腸管粘膜の好中球浸潤の強度及び炎症の重症度と相関する。カルプロテクチンは少量（５０〜１００ｍｇ）の糞便試料を用いてＥＬＩＳＡにより測定することができる（例えば、Johne et al., Scand J Gastroenterol., 36:291-296 (2001)参照）。
【０１０７】
試料中のＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子中の多型の存在の測定も本発明に有用である。例えば、ＮＯＤ２遺伝子の多型、例えば、Ｒ７０３Ｗタンパク質変異体を生ずるＣ２１０７Ｔヌクレオチド変異体は、個体由来の試料において同定することができる（例えば、米国特許公報第２００３０１９０６３９号参照）。別の態様において、ＮＯＤ２ｍＲＮＡレベルは、ＩＢＤの分類を補助する本発明の診断マーカーとして用いることができる。
【０１０８】
《Ｖ．分析》
当該技術分野で公知の任意の種類の分析、方法、及びキットを用いて、試料中の１種又は２種以上のマーカーの存在又はレベルを測定して当該試料がＩＢＤ又はその臨床的サブタイプと関連しているか否かを分類することができる。
【０１０９】
本発明は、小児個体から得られる試料中の少なくとも１種のマーカーの存在又はレベルを測定することに部分的に依存している。「少なくとも１種のマーカーの存在を測定すること」という用語は、本明細書中で用いる場合、当業者に公知の任意の定量又は定性分析を用いることによって着目した各マーカーの存在を測定することを含む。或る場合において、特定の形質、変数（variable）、又は生化学的若しくは血清学的物質（例えば、タンパク質又は抗体）の有無を測定する定量分析は、着目した各マーカーを検出するのに適している。或る他の場合において、ＲＮＡ、タンパク質、抗体、又は活性の有無を測定する定量分析は、着目した各マーカーを検出するのに適している。「少なくとも１種のマーカーのレベルを測定すること」という用語は、本明細書中で用いる場合、当業者に公知の任意の直接的又は間接的な定量分析を用いることにより着目した各マーカーのレベルを測定することを含む。或る場合において、例えば、ＲＮＡ、タンパク質、抗体、又は活性の相対量又は絶対量を測定する定量分析は、着目した各マーカーのレベルを測定するのに適している。マーカーのレベルを測定するのに有用なあらゆる分析がマーカーの有無を測定するのにも有用であることは当業者に理解されよう。
【０１１０】
「抗体」という用語は、本明細書中で用いる場合、ポリクローナル又はモノクローナル及び任意のアイソタイプであることができる免疫グロブリン分子の集団、又は免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片を含む。かかる免疫学的に活性な断片は、抗原と特異的に結合する抗体分子の一部を構成するＨ鎖及びＬ鎖可変領域を含む。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２として当該技術分野で公知の免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片は、抗体という用語の意味の範疇に含まれる。
【０１１１】
フローサイトメトリーを用いて試料中の１種又は２種以上のマーカーの存在又はレベルを測定することができる。ビーズベースの免疫測定法を含む前記フローサイトメトリー分析を用いて、例えば、カンジダ・アルビカンス及びＨＩＶタンパク質に対する血清抗体の検出について記載されている方法（例えば、Bishop et al., J. Immunol. Methods, 210:79-87 (1997)；McHugh et al., J. Immunol. Methods, 116:213 (1989)；Scillian et al., Blood, 73:2041 (1989)参照）と同じ方法により抗体マーカーレベルを、測定することができる。
【０１１２】
マーカーに特異的な組換え抗原を発現させるファージディスプレイ法も、試料中の１種又は２種以上のマーカーの存在又はレベルを測定するのに用いることができる。例えば抗体マーカーに特異的な抗原を発現するファージ粒子を、所望により、抗体、例えば、抗ファージモノクローナル抗体を用いてマルチウェルプレートに固定することができる（Felici et al., “Phage-Displayed Peptides as Tools for Characterization of Human Sera” in Abelson (Ed.), Methods in Enzymol., 267, San Diego:  Academic Press, Inc. (1996)）。
【０１１３】
競合免疫測定法及び非競合免疫測定法を含む種々の免疫測定法を用いて、試料中の１種又は２種以上のマーカーの存在又はレベルを測定することができる（例えば、Self et al., Curr. Opin. Biotechnol., 7:60-65 (1996)参照）。免疫測定法という用語は、限定的でなく、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、例えば、酵素増幅免疫測定法（ＥＭＩＴ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、抗原捕捉ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ＩｇＭ抗体捕捉ＥＬＩＳＡ（ＭＡＣ ＥＬＩＳＡ）、及び微粒子酵素免疫測定法（ＭＥＩＡ）；キャピラリー電気泳動免疫測定法（ＣＥＩＡ）；放射免疫測定法（ＲＩＡ）；免疫放射定量測定法（ＩＲＭＡ）；蛍光偏光免疫測定法（ＦＰＩＡ）；及び化学発光測定法（ＣＬ）を含む技術を包含する。所望により、前記免疫測定法は自動化することができる。免疫測定法は、レーザ励起蛍光法と併せて用いることもできる（例えば、Schmalzing et al., Electrophoresis, 18:2184-2193 (1997); Bao, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci., 699:463-480 (1997)参照）。リポソームイムノアッセイ、例えば、フローインジェクションリポソームイムノアッセイ及びリポソーム免疫センサーも本発明に用いるのに適している（例えば、Rongen et al., J. Immunol. Methods, 204:105-133 (1997)参照）。さらに、タンパク質／抗体複合体の形成がマーカー濃度の関数としてピークレートシグナルに変換される光散乱の増大を生ずる比濁分析は本発明に用いるのに適している。比濁分析はＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｂｒｅａ，ＣＡ；キット＃４４９４３０）から商業的に入手することができそしてベーリング・ネフェロメーター・アナライザー（Behring Nephelometer Analyzer）を用いて実施することができる（Fink et al., J. Clin. Chem. Clin. Biol. Chem., 27:261-276 (1989)）。
【０１１４】
抗原捕捉ＥＬＩＳＡは、試料中の１種又は２種以上のマーカーの存在又はレベルを測定するのに有用であることができる。例えば、抗原捕捉ＥＬＩＳＡにおいて、着目したマーカーに対する抗体を固相に結合させ、そしてマーカーが前記抗体によって結合されるように試料を添加する。結合しないタンパク質を洗浄によって除去した後、結合したマーカーの量を、例えば、ラジオイムノアッセイを用いて定量化することができる（例えば、Harlow and Lane, Antibodies:  A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1988)参照）。サンドイッチＥＬＩＳＡも本発明に用いるのに適していることができる。例えば、二抗体サンドイッチ分析において、一次抗体を固体支持体に結合させ、そして着目したマーカーを前記一次抗体に結合させる。マーカーの量は、マーカーに結合する二次抗体の量を測定することにより定量化することができる。抗体は、種々の固体支持体、例えば、磁性又はクロマトグラフィーマトリックス粒子、アッセイプレート（例えば、マイクロタイターウェル）の表面、固体基体材料又は膜（例えば、プラスチック、ナイロン、紙）の小片（pieces）等、上に固定化することができる。アッセイストリップは、固体支持体上のアレイ内にその抗体又は複数種の抗体をコーティングすることによって調製することができる。次いで、このストリップを試験試料中に浸漬し、そして洗浄工程及び検出工程を通して迅速に処理して、測定可能なシグナル、例えば、着色スポットを生成することができる。
【０１１５】
例えば、ヨウ素１２５（１２５Ｉ）標識された二次抗体（Harlow and Lane、前記参照）、を用いたラジオイムノアッセイも、試料中の１種又は２種以上のマーカーの存在又はレベルを測定するのに適している。化学発光マーカーで標識された二次抗体も本発明に用いるのに適していることができる。化学発光二次抗体を用いた化学発光測定法は、マーカーレベルの非放射性の鋭敏な検出に適している。かかる二次抗体は種々の供給源、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）から商業的に入手することができる。
【０１１６】
前記免疫測定法は、試料中の１種又は２種以上のマーカーの存在又はレベルを測定するのにとりわけ有効である。限定的でない例として、固定化好中球ＥＬＩＳＡは、試料がＡＮＣＡに陽性であるか否かを測定し又は試料中のＡＮＣＡレベルを測定するのに有効である。同様に、酵母細胞壁ホスホペプチドマンナンを用いたＥＬＩＳＡは、試料がＡＳＣＡ−ＩｇＡ及び／又はＡＳＣＡ−ＩｇＧに陽性であるか否かを測定し、又は試料中のＡＳＣＡ−ＩｇＡ及び／又はＡＳＣＡ−ＩｇＧのレベルを測定するのに有効である。ＯｍｐＣタンパク質又はその断片を用いたＥＬＩＳＡは、試料が抗ＯｍｐＣ抗体に陽性であるか否かを測定し、又は試料中の抗ＯｍｐＣ抗体レベルを測定するのに有効である。Ｉ２タンパク質又はその断片を用いたＥＬＩＳＡは、試料が抗Ｉ２抗体に陽性であるか否かを測定し、又は試料中の抗Ｉ２抗体レベルを測定するのに有効である。フラジェリンタンパク質又はその断片を用いたＥＬＩＳＡは、試料が抗フラジェリン抗体に陽性であるか否かを測定し、又は試料中の抗フラジェリン抗体レベルを測定するのに有用である。さらに、前記免疫測定法は、試料中の他のマーカーの存在又はレベルを測定するのにとりわけ有効である。
【０１１７】
着目したマーカーへの抗体の特異的な免疫学的結合は直接的又は間接的に検出することができる。直接的な標識として、抗体に付けられる蛍光又は発光（luminescent）タグ、金属、色素、放射性核種等を挙げることができる。ヨウ素１２５（１２５Ｉ）で標識された抗体は、試料中の１種又は２種以上のマーカーのレベルを測定するのに用いることができる。マーカーに特異的な化学発光抗体を用いた化学発光測定法は、マーカーレベルの非放射性の鋭敏な検出に適している。蛍光色素で標識された抗体も、試料中の１種又は２種以上のマーカーのレベルを検出するのに適している。蛍光色素の例として、限定的でなく、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、ヘキスト（Hoechst）３３２５８、Ｒ−フィコシアニン、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド（Texas red）、及びリサミン（lissamine）を挙げることができる。蛍光色素に結合される二次抗体は商業的に入手することができ、例えば、ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣは、Ｔａｇｏ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）から入手することができる。
【０１１８】
間接的な標識として、当該技術分野で周知の種々の酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ等を挙げることができる。西洋ワサビペルオキシダーゼ検出系は、例えば、４５０ｎｍにおいて検出可能な可溶性生成物を過酸化水素の存在下に生ずる色素生産性基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と共に用いることができる。アルカリホスファターゼ検出系は、例えば、４０５ｎｍにおいて容易に検出可能な可溶性生成物を生ずる、色素生産性基質ｐ−ニトロフェニルホスフェートと共に用いることができる。同様に、β−ガラクトシダーゼ検出系は、４１０ｎｍにおいて検出可能な可溶性生成物を生ずる、色素生産性基質ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）と共に用いることができる。ウレアーゼ検出系は、基質、例えば、尿素−ブロモクレゾールパープル（Ｓｉｇｍａ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と共に用いることができる。酵素に結合される有用な二次抗体は多くの商業的供給源から入手することができ、例えば、ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ−アルカリホスファターゼは、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ．）から購入することができる。
【０１１９】
直接的又は間接的な標識からのシグナルは、例えば、色素生産性基質由来の色を検出する分光光度計を用いて；放射線を検出するために放射線測定器、例えば、１２５Ｉの検出用ガンマカウンターを用いて；又は一定の波長の光の存在下に蛍光を検出する蛍光光度計を用いて、分析することができる。酵素結合抗体の検出には、製造業者の使用説明書に従い、分光光度計、例えば、ＥＭＡＸ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ；Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用いて、マーカーレベルの量の定量分析を行なうことができる。所望により、本発明の分析は自動化し又はロボット制御により実施することができ、そして多数の試料からのシグナルを同時に検出することができる。
【０１２０】
試料中の１種又は２種以上のマーカーの存在又はレベルを検出又は測定するために定量的ウエスタンブロット法も用いることができる。ウエスタンブロットは、周知の方法、例えば、走査デンシトメトリー又はホスホアイメージング（phosphorimaging）によって定量化することができる。限定的でない例として、タンパク質試料を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥレムリゲル（Laemmli gel）上で電気泳動する。一次マウスモノクローナル抗体をブロットと反応させ、そして予備的スロットブロット（slot blot）試験を用いて抗体結合が直線的であることを確認することができる。二次抗体としてヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体（ＢｉｏＲａｄ）を用い、そして例えば、製造業者の使用説明書に従ってルネッサンス（Renaissance）化学ルミネセンスキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ；Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて、化学ルミネセンスを用いたシグナル検出を行なう。ブロットのオートラジオグラフは、走査型デンシトメーター（scanning densitometer）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて分析し、そしてポジティブコントロールに対して基準化する。数値は、例えば、ポジティブコントロールに対する実測値の間の比（デンシトメトリックインデックス）として報告される。かかる方法は、例えば、Parra et al., J. Vasc. Surg., 28:669-675 (1998)に記載されているように当該技術分野で周知である。
【０１２１】
これとは別に、種々の免疫組織化学的分析法を用いて試料中の１種又は２種以上のマーカーの存在又はレベルを測定することができる。免疫組織化学的分析という用語は、着目したマーカーと反応する抗体に結合される（すなわち、コンジュゲートされる（conjugated））蛍光色素又は酵素の蛍光顕微鏡検査法又は光学顕微鏡検査法を用いた視覚的検出を利用する方法を包含し、そして限定的でなく、直接蛍光抗体分析、間接蛍光抗体（ＩＦＡ）分析、抗補体免疫蛍光法、アビジン−ビオチン免疫蛍光測定法、及び免疫ペルオキシダーゼ分析を含む。ＩＦＡ分析は、例えば、試料がＡＮＣＡに陽性であるか否か、試料中のＡＮＣＡのレベル、試料がｐＡＮＣＡに陽性であるか否か、試料中のｐＡＮＣＡのレベル、及び／又はＡＮＣＡ染色パターン（例えば、ｃＡＮＣＡ、ｐＡＮＣＡ、ＮＳＮＡ、及び／又はＳＡＰＰＡ染色パターン）を測定するのに有効である。試料中のＡＮＣＡの濃度は、例えば、終点滴定（endpoint titration）により又は公知の標準品と比較した蛍光の視覚的強度を測定することにより、定量化することができる。
【０１２２】
これとは別に、着目したマーカーの存在又はレベルは、精製したマーカーの量を検出又は定量化することによって測定することができる。マーカーの精製は、例えば、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）単独により、又は質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ、タンデムＭＳ等）との組み合わせにより、達成することができる。着目したマーカーの定性又は定量検出も、限定的でなく、ブラッドフォード測定法（Bradford assay）、クーマシーブルー染色法、銀染色法、放射標識されたタンパク質の分析、及び質量分析を含む周知の方法によって測定することができる。
【０１２３】
複数のマーカーの分析は、別々に又は１つの試験試料と同時に行なうことができる。マーカーの個別又は連続の分析に適した装置として、臨床検査分析装置、例えば、ＥｌｅｃＳｙｓ（Ｒｏｃｈｅ）、ＡｘＳｙｍ（Ａｂｂｏｔｔ）、Ａｃｃｅｓｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ）、ＡＤＶＩＡ（商標）、ＣＥＮＴＡＵＲ（商標）（Ｂａｙｅｒ）、及びＮＩＣＨＯＬＳ ＡＤＶＡＮＴＡＧＥ（商標）（Ｎｉｃｈｏｌｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）免疫測定装置を挙げることができる。好ましい装置又はタンパク質チップは、単一表面上で複数のマーカーの同時分析を行なう。とりわけ有用な物理フォーマットは、複数の異なるマーカーの検出に対する複数の個々に離れたアドレス可能な（addressable）位置を有する表面を含む。かかるフォーマットは、プロテインマイクロアレイ、又は「プロテインチップ」（例えば、Ng et al., J. Cell Mol. Med., 6:329-340 (2002)参照）及び特定のキャピラリー装置（例えば、米国特許第６，０１９，９４４号参照）を含む。これらの態様において、個々に離れた表面位置のそれぞれがその各位置において検出のための１種又は２種以上のマーカーを固相化する抗体を含んでいることができる。表面は、これとは別に、表面の個々に離れた位置に固相化された１つ又は２つ以上の分離した粒子（例えば、微小粒子又はナノ粒子）を含んでいることができ、前記微小粒子は検出用の１種又は２種以上のマーカーを固相化する抗体を含んでいる。
【０１２４】
着目した種々のマーカーの存在又はレベルを測定するための前記分析に加えて、ルーチン技術を用いたマーカーｍＲＮＡレベルの分析、例えば、ノーザン分析、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、又はマーカーコード配列の一部に対して相補的な核酸配列へのハイブリダイゼーションに基づく任意の他の方法（例えば、スロットブロットハイブリダイゼーション）も本発明の範囲内にある。適用することができるＰＣＲ増幅技術は、例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. New York (1999), Chapter 7 and Supplement 47；Theophilus et al., “PCR Mutation Detection Protocols,” Humana Press, (2002)；及びInnis et al., PCR Protocols, San Diego, Academic Press, Inc. (1990)に記載されている。一般的な核酸ハイブリダイゼーション法は、Anderson, “Nucleic Acid Hybridization,” BIOS Scientific Publishers, 1999に記載されている。複数の転写された核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）の増幅又はハイブリダイゼーションも、マイクロアレイ中に配置されたｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列から実施することができる。マイクロアレイ法は、一般に、“Microarrays Methods and Applications:  Nuts & Bolts,” DNA Press, 2003；及びBaldi et al., “DNA Microarrays and Gene Expression:  From Experiments to Data Analysis and Modeling,” Cambridge University Press, 2002に記載されている。
【０１２５】
マーカー、例えば、遺伝子マーカーの遺伝子型の分析は、限定的でなく、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をベースとする分析、配列分析、及び電気泳動分析を含む当該技術分野で公知の技術を用いて実施することができる。ＰＣＲをベースとする分析の限定的でない例として、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手することができるＴａｑｍａｎ（商標）対立遺伝子識別分析を挙げることができる。配列解析の限定的でない例として、マキサムーギルバート配列決定法（Maxam-Gilbert sequencing）、サンガー配列決定法、キャピラリーアレイＤＮＡ配列決定法、熱サイクル配列決定法（thermal cycle sequencing）（Sears et al., Biotechniques, 13:626-633 (1992)）、固相配列決定法（Zimmerman et al., Methods Mol. Cell Biol., 3:39-42 (1992)）、質量分析を用いた配列決定法、例えば、マトリックス補助レーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ；Fu et al., Nature Biotech., 16:381-384 (1998)）、及びハイブリダイゼーションによる配列決定法（Chee et al., Science, 274:610-614 (1996)；Drmanac et al., Science, 260:1649-1652 (1993)；Drmanac et al., Nature Biotech., 16:54-58 (1998)）を挙げることができる。電気泳動分析の限定的でない例として、スラブゲル電気泳動法、例えば、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、及び変性勾配ゲル電気泳動法を挙げることができる。マーカー中の多型部位（polymorphic site）における小児個体の遺伝子型を同定する他の方法として、例えば、Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社からのＩＮＶＡＤＥＲ（商標）分析、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、ヘテロ二重鎖移動度分析、及び一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析を挙げることができる。
【０１２６】
着目したいくつかのマーカーは、複数の試料の効率的処理のために１つの試験にまとめることができる。さらに、当業者であれば、同一の患者に由来する複数の試料（例えば、連続的な時点等）を試験することの有益性を認めるであろう。かかる一連の試料の試験は、経時的なマーカーレベルの変化の同定を可能とすることができる。マーカーレベルの増減だけでなく、マーカーレベルの変化の有無も、ＩＢＤを分類し、又はＩＢＤの臨床的サブタイプ間を識別するのに有用な情報を提供することができる。
【０１２７】
前記１種又は２種以上のマーカーからなるパネルは、試料をＩＢＤ又はその臨床的サブタイプと関連していると分類する本発明のアプローチに関する関連情報を提供するように構成することができる。かかるパネルは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、又はそれを超える個数の個別のマーカーを用いて構成することができる。単一のマーカー又はマーカーのサブセットの分析も、種々の臨床的環境において当業者によって実施することができる。これらは、限定的でなく、外来診療（ambulatory）、応急手当て、救命救急診療、集中治療、モニター装置、入院患者、外来患者、診療所（physician office）、内科診療所（medical clinic）、及び健康診断の環境を含む。
【０１２８】
マーカーの分析は、さらに種々の物理フォーマットにより実施することができるであろう。例えば、マイクロタイタープレートを用いて又は自動化により多量の試験試料の処理を促進することができるであろう。また、タイムリーに治療及び診断を促進する単一の試料フォーマットを開発することができるであろう。
【０１２９】
《ＶＩ．統計的アルゴリズム》
或る観点において、本発明は、試料をＩＢＤ試料又は非ＩＢＤ試料と分類する統計的アルゴリズム又は統計処理を用いて試料がＩＢＤと関連しているか否かを分類する方法、システム、及びコードを提供する。他の観点において、本発明は、試料をＣＤ試料、ＵＣ試料、又は非ＩＢＤ試料と分類する統計的アルゴリズム又は統計処理を用いて試料がＩＢＤの臨床的サブタイプと関連しているか否かを分類する（すなわち、ＣＤとＵＣとの間を識別する）方法、システム、及びコードを提供する。好ましくは、複数の統計的アルゴリズム又は統計処理は、独立して、１つ又は２つ以上の学習統計的分類子システムを含む。本明細書中に記載のように、学習統計的分類子システムの組み合わせは、有利には、試料がＩＢＤ又はその臨床的サブタイプと関連しているか否かを分類するための改善された感度、特異度、陰性的中率、陽性的中率、及び／又は総体的的確性を提供する。
【０１３０】
「統計的アルゴリズム」又は「統計処理」という用語は、変数間の相関関係を決定するために用いられるあらゆる種々の統計解析を含む。本発明において、変数は着目した少なくとも１種のマーカーの存在又はレベルである。本明細書に記載の統計的アルゴリズムを用いていくつものマーカーを解析することができる。例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、２５種、３０種、３５種、４０種、４５種、５０種、又はそれを超える種類のマーカーの存在又はレベルを統計的アルゴリズムに含めることができる。１つの態様において、ロジスティック回帰を用いる。別の態様において、直線回帰を用いる。或る場合において、本発明の統計的アルゴリズムは、変数として所定の母集団内の特定マーカーの変位値測定値（quantile measurement）を用いることができる。変位値は、データのサンプルを（できるだけ）等しい観察数を含む群に分割する「カットポイント」の集合である。例えば、四分位数は、（できるだけ）等しい観察数を含む４つの群にデータのサンプルを分割する数値である。下位四分位数は、順番に並べたデータの集合を通じて４分の１上がった（quarter way up）データ値であり；上位四分位数は、順番に並べたデータの集合を通じて４分の１下がった（quarter way down）データ値である。五分位数は（できるだけ）等しい観察数を含む５つの群にデータのサンプルを分割する値である。本発明は、アルゴリズムの変数として（連続変数を用いた場合と同様に）マーカーレベルの百分位数範囲（例えば、三分位数、四分位数、五分位数等）、又はそれらの累積的指標（例えば、マーカーレベルの四分位数の合計等）の使用も含んでいることができる。
【０１３１】
好ましくは、本発明の統計的アルゴリズムは１種又は２種以上の学習統計的分類子システムを含む。「学習統計的分類子システム」という用語は、本明細書中で用いる場合、複合データの集合（例えば、着目したマーカーのパネル）に適用し、そしてかかるデータの集合に基づいて判断を行なうことができる機械学習アルゴリズム技術を含む。或る態様において、単一の学習統計的分類子システム、例えば、分類木（例えば、ランダムフォレスト）を用いる。他の態様において、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、又は１１種以上の学習統計的分類子システムの組み合わせを、好ましくは直列に用いる。学習統計的分類子システムの例として、限定的でなく、帰納学習（例えば、決定／分類木、例えば、ランダムフォレスト、分類及び回帰木（Ｃ＆ＲＴ）、ブースト型の木等）、Ｐｒｏｂａｂｌｙ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ Ｃｏｒｒｅｃｔ（ＰＡＣ）学習、コネクショニスト学習（例えば、ニューラルネットワーク（ＮＮ）、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）、ニューロファジーネットワーク（ＮＦＮ）、ネットワーク構造、パーセプトロン、例えば、多層パーセプトロン、多層フィードフォワードネットワーク、ニューラルネットワークのアプリケーション、信念ネットワーク（belief network）におけるベイジアン学習等）、強化学習（例えば、既知環境における受動的学習（passive learning）、例えば、単純学習（naive learning）、適応型動的（adaptive dynamic）学習、及び時間差学習、未知環境における受動的学習、未知環境における能動的学習、行動−価値関数学習、強化学習のアプリケーション等）、及び遺伝的アルゴリズム及び進化的プログラミングを用いた学習統計的分類子システムを挙げることができる。他の学習統計的分類子システムとして、サポート・ベクター・マシーン（例えば、カーネル法）、多変量適応回帰スプライン（ＭＡＲＳ）、レーベンバーグ・マルカートアルゴリズム、ガウス・ニュートンアルゴリズム、ガウス混合（mixtures of Gaussians）、勾配降下アルゴリズム、及び学習ベクトル量子化（ＬＶＱ）を挙げることができる。
【０１３２】
ランダムフォレストは、Ｌｅｏ Ｂｒｅｉｍａｎ及びＡｄｅｌｅ Ｃｕｔｌｅｒによって開発されたアルゴリズムを用いて構築される学習統計的分類子システムである。ランダムフォレストは多数の個別の決定木を用いそして小児個体の木によって決定されるクラスのモード（すなわち、最頻値（most frequently occurring））を選択することによってクラスを決定する。ランダムフォレスト解析は、例えば、Ｓａｌｆｏｒｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手することができるＲａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔｓソフトウェアを用いて実施することができる。例えば、ランダムフォレストの説明については、Breiman, Machine Learning, 45:5-32 (2001)；及びhttp://stat-www.berkeley.edu/users/breiman/RandomForests/cc_home.htmを参照されたい。
【０１３３】
分類及び回帰木は、適当な古典的回帰モデルに対するコンピュータ集約型の代替を表すものであり、そして典型的には、１種又は２種以上の予測変数に基づいて着目したカテゴリー的又は連続的な応答に対する最良の可能なモデルを決定するのに用いられる。分類及び回帰木解析は、例えば、Ｓａｌｆｏｒｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手することができるＣ＆ＲＴソフトウェア又はＳｔａｔＳｏｆｔ社（Ｔｕｌｓａ，ＯＫ）から入手することができるＳｔａｔｉｓｔｉｃａデータ解析ソフトウェアを用いて実施することができる。分類及び回帰木の説明は、例えば、Breiman et al. “Classification and Regression Trees,” Chapman and Hall, New York (1984)；及びSteinberg et al., “CART:  Tree-Structured Non-Parametric Data Analysis,” Salford Systems, San Diego, (1995)に見出される。
【０１３４】
ニューラルネットワークは、計算に対するコネクショニストアプローチに基づく情報処理のための数理又は計算モデルを用いる人工ニューロンの相互接続されたグループである。典型的には、ニューラルネットワークは、ネットワークを通じて流れる外部又は内部情報に基づいてその構造を変える適応システムである。ニューラルネットワークの具体例として、フィードフォワードニューラルネットワーク、例えば、パーセプトロン、単層パーセプトロン、多層パーセプトロン、バックプロパゲーションネットワーク、ＡＤＡＬＩＮＥネットワーク、ＭＡＤＡＬＩＮＥネットワーク、Ｌｅａｒｎｍａｔｒｉｘネットワーク、動径基底関数（ＲＢＦ）ネットワーク、及び自己組織化マップ又はコホーネン自己組織化ネットワーク；リカレントニューラルネットワーク、例えば、シンプルリカレントネットワーク及びホップフィールドネットワーク；確率的ニューラルネットワーク、例えば、ボルツマンマシン；モジュール型ニューラルネットワーク、例えば、機械の委員会（committee of machines）及び連合的（associative）ニューラルネットワーク；及び他の型のネットワーク、例えば、即時訓練型（instantaneously trained）ニューラルネットワーク、スパイキング（spiking）ニューラルネットワーク、動的ニューラルネットワーク、及びカスケーディング（cascading）ニューラルネットワークを挙げることができる。ニューラルネットワーク解析は、例えば、ＳｔａｔＳｏｆｔ社から入手することができるＳｔａｔｉｓｔｉｃａデータ解析ソフトウェアを用いて実施することができる。ニューラルネットワークの説明については、例えば、Freeman et al., In “Neural Networks:Algorithms, Applications and Programming Techniques,” Addison-Wesley Publishing Company (1991)；Zadeh, Information and Control, 8:338-353 (1965)；Zadeh, “IEEE Trans. on Systems, Man and Cybernetics,” 3:28-44 (1973)；Gersho et al., In “Vector Quantization and Signal Compression,” Kluywer Academic Publishers, Boston, Dordrecht, London (1992)；及びHassoun, “Fundamentals of Artificial Neural Networks,” MIT Press, Cambridge, Massachusetts, London (1995)を参照されたい。
【０１３５】
サポートベクターマシーンは、分類及び回帰について用いられる関連した教師あり学習技術の集合でありそして例えば、Cristianini et al., “An Introduction to Support Vector Machines and Other Kernel-Based Learning Methods,” Cambridge University Press (2000)に記載されている。サポートベクターマシーン解析は、例えば、Ｔｈｏｒｓｔｅｎ Ｊｏａｃｈｉｍｓ（コーネル大学）によって開発されたＳＶＭｌｉｇｈｔソフトウェアを用いて又はＣｈｉｈ−Ｃｈｕｎｇ Ｃｈａｎｇ及びＣｈｉｈ−Ｊｅｎ Ｌｉｎ（国立台湾大学）によって開発されたＬＩＢＳＶＭソフトウェアを用いて実施することができる。
【０１３６】
本明細書中に記載した学習統計的分類子システムは、健常者及びＩＢＤ患者由来の試料（たとえば、血清学的試料）のコホートを用いて訓練及び試験することができる。例えば、医師によって、そして好ましくは胃腸科専門医によって生検、大腸内視鏡検査（colonoscopy）、又は例えば、米国特許第６，２１８，１２９号に記載の免疫測定法を用いてＩＢＤに罹患していると診断された患者由来の試料は、本発明の学習統計的分類子システムの訓練及び試験に用いるのに適している。ＩＢＤ罹患と診断された患者由来の試料は、例えば、米国特許第５，７５０，３５５号及び第５，８３０，６７５号に記載のような免疫測定法を用いてクローン病又は潰瘍性大腸炎に分類することもできる。健常者由来の試料は、ＩＢＤ試料と同定されなかった試料を含んでいることができる。本発明の学習統計的分類子システムの訓練及び試験に用いることができる患者試料のコホートを得るためのさらなる技術及び診断基準があることは当業者に公知であろう。
【０１３７】
「感度」という用語は、本明細書中で用いる場合、試料が陽性、例えば、ＩＢＤ又はその臨床的サブタイプに罹患しているものである場合に、本発明の診断方法、システム、又はコードが陽性の結果を与える確率をいう。感度は、真陽性及び偽陰性の合計で真陽性結果を割った数値として計算される。感度は、本質的に、本発明の方法、システム、又はコードがＩＢＤ又はその臨床的サブタイプに罹患した者を、前記疾患に罹患していない者からどれだけよく正確に同定するかの尺度である。統計的アルゴリズムは、ＩＢＤ又はその臨床的サブタイプ（例えば、ＣＤ又はＵＣ）を分類する感度が少なくとも約６０％であり、そして、例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であることができるように選択することができる。
【０１３８】
「特異度」という用語は、試料が陽性でない、例えば、ＩＢＤ又はその臨床的サブタイプに罹患していないものである場合に、本発明の診断方法、システム、又はコードが陰性の結果を与える確率をいう。特異度は、真陰性及び偽陽性の合計で真陰性結果を割った数値として計算される。特異度は、本質的に、本発明の方法、システム、又はコードがＩＢＤ又はその臨床的サブタイプに罹患していない者を、前記疾患に罹患している者からどれだけよく除外するかの尺度である。統計的アルゴリズムは、ＩＢＤ又はその臨床的サブタイプ（例えば、ＣＤ又はＵＣ）を分類する特異度が少なくとも約７０％、例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であるように選択することができる。
【０１３９】
「陰性的中率」又は「ＮＰＶ」という用語は、本明細書中で用いる場合、ＩＢＤ又はその臨床的サブタイプに罹患していないと同定された小児個体が実際に当該疾患に罹患していない確率をいう。陰性的中率は、真陰性及び偽陰性の合計で真陰性を割った数値として計算することができる。陰性的中率は、診断方法、システム、又はコードの特性だけでなく解析される母集団内の疾患の有病率によっても決定される。統計的アルゴリズムは、或る疾患の有病率を有する母集団における陰性的中率が約７０％〜約９０％の範囲内であり、そして、例えば、少なくとも約７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であることができるように選択することができる。
【０１４０】
「陽性的中率」又は「ＰＰＶ」という用語は、ＩＢＤ又はその臨床的サブタイプに罹患していると同定された小児個体が実際に当該疾患に罹患している確率をいう。陽性的中率は、真陽性及び偽陽性の合計で真陽性を割った数値として計算することができる。陽性的中率は、診断方法、システム、又はコードの特性だけでなく解析される母集団内の疾患の有病率によっても決定される。統計的アルゴリズムは、或る疾患の有病率を有する母集団における陽性的中率が約８０％〜約９９％の範囲であり、そして、例えば、少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であることができるように選択することができる。
【０１４１】
陰性的中率及び陽性的中率を含む的中率は、解析される母集団内の疾患の有病率に影響される。本発明の方法、システム、及びコードにおいて、特定のＩＢＤ有病率の臨床的母集団について望ましい臨床的パラメータを生成するように統計的アルゴリズムを選択することができる。例えば、学習統計的分類子システムは、例えば、臨床医の診療室、例えば、胃腸科専門医の診療室又は一般開業医の診療室で見ることができる、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、又は７０％までのＩＢＤ有病率に対して選択することができる。
【０１４２】
「全体的一致」又は「総体的的確性」という用語は、本明細書中で用いる場合、本発明の方法、システム、又はコードが病状を分類する場合の的確性をいう。総体的的確性は、試料結果の総数で真陽性及び真陰性を割った合計として計算され、そして解析される母集団内の疾患の有病率によって影響される。例えば、統計的アルゴリズムは、或る疾患の有病率を有する患者母集団における総体的的確性が少なくとも約６０％であり、そして、例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であることができるように選択することができる。
【０１４３】
《ＶＩＩ．疾患分類システム》
図１は、本発明の１つの態様による疾患分類システム（ＤＣＳ）（１００）を表す。図１に示すように、ＤＣＳは、プロセッサ（１１５）及びメモリモジュール（１１０）を備えた、ＤＣＳインテリジェンスモジュール（１０５）、例えば、コンピュータを含む。インテリジェンスモジュールは、１つ又は２つ以上の直接接続（direct connection）（例えば、ＵＳＢ、Ｆｉｒｅｗｉｒｅ、又は他のインターフェース）及び１つ又は２つ以上のネットワーク接続（例えば、モデム又は他のネットワークインターフェース機器を含む）を通じて情報を送信及び受信するための通信モジュール（図示せず）も含む。メモリモジュールは、内部メモリ装置及び１つ又は２つ以上の外部メモリ装置を含んでいることができる。インテリジェンスモジュールは、ディスプレイモジュール（１２５）、例えば、モニター又はプリンターも含んでいる。１つの観点において、インテリジェンスモジュールは、データ、例えば、直接接続を介して又はネットワーク（１４０）を通じて、データ収集モジュール、例えば、試験システム（１５０）からの患者試験結果、を受け取る。例えば、試験システムは、１つ又は２つ以上の患者試料（１５５）についてマルチアナライト（multianalyte）試験を行いそしてその試験結果をインテリジェンスモジュールに自動的に提供するように構成することができる。データは、ユーザーによる直接入力を介してインテリジェンスモジュールに提供することもでき、又はポータブル媒体、例えば、コンパクトディスク（ＣＤ）又はデジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）からダウンロードすることができる。試験システムは、インテリジェンスモジュールに直結させて、インテリジェンスモジュールと統合させることができ、又はネットワークを通じてインテリジェンスモジュールとリモート結合させることができる。インテリジェンスモジュールは、周知であるようなネットワークを通じて１つ又は２つ以上のクライアントシステム（１３０）へ及びそこからデータ通信することもできる。例えば、要求中の医師又はヘルスケア提供者は、クライアントシステム（１３０）を用いて、研究室又は病院に置かれている（resident）ことができるインテリジェンスモジュールからレポートを取得及び閲覧することができる。
【０１４４】
ネットワークは、ＬＡＮ（ローカルエリアネットワーク）、ＷＡＮ（ワイドエリアネットワーク）、ワイヤレスネットワーク、地点間ネットワーク、スター型ネットワーク、トークンリングネットワーク、ハブネットワーク、又は他の構成であることができる。現在用いられているネットワークの最も一般的な型は、ＴＣＰ／ＩＰ（伝送制御プロトコール及びインターネットプロトコール）ネットワーク、例えば、大文字の「Ｉ」を用いて「Ｉｎｔｅｒｎｅｔ」と頻繁に呼ばれるネットワークのグローバルインターネットワークであり、本明細書中の多くの例に用いられるが、本発明で使用することができるネットワークは、現在のところＴＣＰ／ＩＰが好ましいプロトコールであるがこれに限定されないことを理解されたい。
【０１４５】
図１に示したシステムのいくつかの要素は、本明細書において詳細に説明することを必要としない通常の周知である要素を含んでいることができる。例えば、インテリジェンスモジュールは、デスクトップパーソナルコンピュータ、ワークステーション、メインフレーム、ラップトップ等として実装されていることができる。各クライアントシステムは、デスクトップパーソナルコンピュータ、ワークステーション、ラップトップ、ＰＤＡ、携帯電話、又はあらゆるＷＡＰ対応装置、又はＩｎｔｅｒｎｅｔ若しくは他のネットワークに直接又は間接的にインターフェースで接続することができる他のあらゆる計算装置を含んでいることができる。クライアントシステムは、典型的には、ＨＴＴＰクライアント、例えば、ブラウジングプログラム、例えば、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔのＩｎｔｅｒｎｅｔ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（商標）ブラウザ、ＮｅｔｓｃａｐｅのＮａｖｉｇａｔｏｒ（商標）ブラウザ、Ｏｐｅｒａのブラウザ、又は携帯電話、ＰＤＡ若しくは他のワイヤレス装置の場合にはＷＡＰ対応ブラウザ等を実行して、クライアントシステムのユーザーがネットワークを通じてインテリジェンスモジュールからユーザーに利用可能な情報及びページにアクセス、処理、及び閲覧することができるようにする。それぞれのクライアントシステムは、典型的には、インテリジェンスモジュールによって提供されるページ、フォーム、及び他の情報と共に、ディスプレイ（例えば、モニター画面、ＬＣＤディスプレイ等）（１３５）上のブラウザによって提供されるグラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）と接触するために、１つ又は２つ以上のユーザーインターフェース機器、例えば、キーボード、マウス、タッチスクリーン、ペン等も含んでいる。前記のように、本発明は、ネットワークの特定のグローバルインターネットワークを含むＩｎｔｅｒｎｅｔを用いて使用するのに適している。しかしながら、Ｉｎｔｅｒｎｅｔの代わりに他のネットワーク、例えば、イントラネット、エクストラネット、バーチャル私設ネットワーク（ＶＰＮ）、非ＴＣＰ／ＩＰベースネットワーク、あらゆるＬＡＮ又はＷＡＮ等を用いることができるのは理解されよう。
【０１４６】
１つの態様によれば、各クライアントシステム及びその要素の全ては、中央処理装置、例えば、Ｉｎｔｅｌ Ｐｅｎｔｉｕｍプロセッサ等を用いて実行されるコンピュータコードを含むアプリケーション、例えば、ブラウザを用いてオペレータ設定可能である。同様に、インテリジェンスモジュール及びその要素の全ては、中央処理装置（１１５）、例えば、Ｉｎｔｅｌ Ｐｅｎｔｉｕｍプロセッサ等、又は複数のプロセッサユニットを用いて実行されるコンピュータコードを含むアプリケーションを用いてオペレータ設定可能とすることができる。本明細書に記載のデータ及び試験結果を処理するインテリジェンスモジュールを操作及び設定するためのコンピュータコードは、好ましくは、ダウンロードされそしてハードディスクに記憶されるが、そのプログラムコード全体又はその一部は、任意の他の周知であるような揮発性又は不揮発性のメモリ媒体又は装置、例えば、ＲＯＭ又はＲＡＭに記憶させることもでき、又はプログラムコードを記憶させることができる任意の他のコンピュータ可読媒体（１６０）、例えば、コンパクトディスク（ＣＤ）媒体、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）媒体、フロッピーディスク、ＲＯＭ、ＲＡＭ等に与えることもできる。
【０１４７】
本発明の種々の観点及び態様を実行するためのコンピュータコードは、コンピュータシステム、例えば、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、ＨＴＭＬ、Ｊａｖａ、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔにおいて実行することができる任意のプログラミング言語、又は任意の他のスクリプト言語、例えば、ＶＢＳｃｒｉｐｔで実行することができる。さらに、プログラムコード全体又はその一部は、Ｉｎｔｅｒｎｅｔを通じて、又は任意の周知である通信媒体及びプロトコール（例えば、ＴＣＰ／ＩＰ、ＨＴＴＰ、ＨＴＴＰＳ、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ等）を用いて任意の他の周知である通常のネットワーク接続（例えば、エクストラネット、ＶＰＮ，ＬＡＮ等）を通じて、ソフトウェアソース（例えば、サーバー）から伝送及びダウンロードすることができるキャリアシグナル（carrier signal）として具現化することができる。
【０１４８】
１つの態様によれば、インテリジェンスモジュールは、患者試験結果を解析して患者試料がＩＢＤ又はその臨床的サブタイプと関連しているか否かを決定するための疾患分類処理を実行する。データは、インテリジェンスモジュールと結合されたセパレート型の記憶又はデータベースシステム又はメモリ（１１０）内の１つ又は２つ以上のデータテーブル又は他の論理データ構造に記憶させることができる。患者試料についての試験データを含むデータ集合に、統計処理を適用する。１つの観点において、例えば、試験データは、患者試料の少なくとも１種のマーカーの存在又はレベルを示すデータを含む。統計処理は、当該少なくとも１種のマーカーの存在又はレベルに基づいて患者試料をＩＢＤ（例えば、ＣＤ又はＵＣ）試料又は非ＩＢＤ試料と分類する統計的に導き出された決定を生成する。統計的に導き出された決定は、インテリジェンスモジュールと関連づけられた又は結合されたディスプレイ装置上に表示することができ、又は前記決定は、セパレートシステム、例えば、クライアントシステム（１３０）に提供されそしてそこで表示させることができる。表示された結果は、医師が妥当な診断を行なうことを可能とする。
【０１４９】
《ＶＩＩＩ．治療及び治療モニタリング》
小児個体由来の試料がＩＢＤ（例えば、ＣＤ又はＵＣ）試料と分類された後は、本発明の方法、システム、及びコードはさらにその小児個体にＩＢＤ又はＩＢＤサブタイプと関連した１種又は２種以上の症状を治療するのに有効な薬剤の治療的有効量を投与することを含んでいることができる。治療のために、ＩＢＤ薬は、単独で投与することができ、又は１種若しくは２種以上の追加のＩＢＤ薬及び／又はＩＢＤ薬と関連した副作用を軽減する１種若しくは２種以上の薬剤と組み合わせて同時投与することができる。
【０１５０】
ＩＢＤ薬は必要に応じて適当な薬学的賦形剤と共に投与することができ、そして任意の許容された投与方法によって実施することができる。このように、投与は、例えば、静脈内、局所的、皮下、経皮的（transcutaneous）、経皮的（transdermal）、筋肉内、経口、バッカル（buccal）、舌下、歯肉、口蓋、関節内（intra-joint）、非経口、細動脈内（intra-arteriole）、皮内、心室内（intraventricular）、頭蓋内、腹腔内、病巣内、鼻腔内、直腸内、腟内、又は吸入によるものであることができる。「同時投与する」とは、第二薬剤（例えば、別のＩＢＤ薬、ＩＢＤ薬の副作用を軽減するのに有効な薬剤等）の投与と同時に、その直前に、又はその直後にＩＢＤ薬を投与することを意味する。
【０１５１】
治療的有効量のＩＢＤ薬は、繰り返して、例えば、少なくとも２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、又は９回以上にわたり投与することができ、又はその用量を持続点滴によって投与することができる。投与は、固体、半固体、凍結乾燥粉末、又は液体の剤形、例えば、錠剤、丸剤、ペレット剤、カプセル剤、散剤、水剤、懸濁液、乳濁液、坐剤、停留かん腸、クリーム、軟膏、ローション、ゲル、エアロゾル、フォーム等の形態を、好ましくは、正確な用量の単一の投与に適した単位剤形において、とることができる。
【０１５２】
「単位剤形」という用語は、本明細書中で用いる場合、ヒト対象者及び他の動物に対する単位用量として適当な物理的に分離した単位を含み、各単位は望ましい作用発現、忍容性（tolerability）、及び／又は治療効果を生ずるように計算されたＩＢＤ薬の所定量を、適当な薬学的賦形剤と共に含む（例えば、アンプル）。さらに、より濃縮された剤形を製造することができ、次にその剤形からより希釈された単位剤形を調製することができる。このように、より濃縮された剤形は、ＩＢＤ薬の量より実質的に多い量、例えば、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、又はそれを超える倍数の量を含む。
【０１５３】
前記のような剤形を製造する方法は、当業者に公知である（例えば、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18TH ED., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)参照）。剤形は、典型的には、通常の薬学的担体又は賦形剤を含みそしてさらに他の薬剤、担体、アジュバント、希釈剤、組織透過促進剤（tissue permeation enhancer）、及び可溶化剤等を含んでいることができる。適切な賦形剤は、当該技術分野で周知の方法によって特定の剤形及び投与経路に合わせることができる（例えば、REMINGTON’S PHARMACEUTICALSCIENCES参照、前出）。
【０１５４】
適当な賦形剤の例として、限定的でなく、ラクトース、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、生理食塩水、シロップ、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びポリアクリル酸、例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ、例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９４１、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９８０、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９８１等を挙げることができる。剤形はさらに、潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱油；湿潤剤；乳化剤；懸濁剤；保存剤、例えば、メチル−、エチル−、及びプロピル−ヒドロキシ−ベンゾエート（すなわち、パラベン）；ｐＨ調整剤、例えば、無機及び有機の酸及び塩基；甘味料；及び香味料を含んでいることができる。剤形は、生分解性ポリマビーズ、デキストラン、及びシクロデキストリン包接錯体も含んでいることができる。
【０１５５】
経口投与について、治療的に有効な投与は、錠剤、カプセル剤、乳濁液、懸濁液、水剤、シロップ剤、噴霧剤、ロゼンジ、散剤、及び徐放性製剤の形態であることができる。経口投与に適した賦形剤として、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカン、セルロース、グルコース、ゼラチン、ショ糖、及び炭酸マグネシウム等を挙げることができる。
【０１５６】
或る態様において、治療的に有効な投与は、丸剤、錠剤、又はカプセル剤の形態をとり、そしてこのように、剤形はＩＢＤ薬と共に以下のいずれかを含んでいることができる：希釈剤、例えば、ラクトース、ショ糖、リン酸二カルシウム等；崩壊剤、例えば、デンプン又はその誘導体；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム等；及び結合剤、例えば、デンプン、アカシアガム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、セルロース及びその誘導体。ＩＢＤ薬は、坐剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）担体中に配置された（disposed）坐剤に製剤化することもできる。
【０１５７】
液体剤形は、担体、例えば、水性生理食塩水（例えば、塩化ナトリウム０．９％ｗ／ｖ）、水性デキストロース、グリセロール、エタノール等の中にＩＢＤ薬及び場合により１種又は２種以上の薬学的に許容することのできるアジュバントを溶解又は分散させて、例えば、経口、局所、又は静脈内投与のための、溶液又は懸濁液を形成することにより製造することができる。ＩＢＤ薬は、停留かん腸に製剤化することもできる。
【０１５８】
局所的投与について、治療的に有効な投与は、乳濁液、ローション、ゲル、フォーム、クリーム、ゼリー、水剤、懸濁液、軟膏、及び経皮パッチの形態であることができる。吸入による投与について、ＩＢＤ薬は乾燥粉末として又はネブライザーを介する液体の形態で送ることができる。非経口的投与について、治療的に有効な投与は、滅菌した注射用溶液及び滅菌包装された散剤の形態であることができる。好ましくは、注射用溶液は、ｐＨ約４．５〜約７．５で製剤化される。
【０１５９】
治療的に有効な投与は、凍結乾燥された形態で提供することもできる。かかる剤形は、投与前の再構成のために、緩衝剤、例えば、炭酸水素塩を含んでいることができ、又は例えば、水による再調製用の凍結乾燥の剤形中に緩衝剤を含んでいることができる。凍結乾燥の剤形はさらに、適当な血管収縮剤、例えば、エピネフリンを含んでいることができる。凍結乾燥の剤形は、場合により、再構成される剤形を直ちに小児個体に投与することができるように再構成用の緩衝剤と一緒に包装された、シリンジにより提供することができる。
【０１６０】
ＩＢＤ又はその臨床的サブタイプの処置のための治療用途において、ＩＢＤ薬は、初回投与量一日当たり約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇで投与することができる。一日量範囲で約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、又は約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇを用いることができる。しかしながら、投与量は、小児個体、ＩＢＤ症状の重症度、及び用いられるＩＢＤ薬の要件に基づいて変化させることができる。例えば、本明細書に記載の方法に従ってＩＢＤ罹患と分類された小児個体のＩＢＤ症状の重症度を考慮して投与量を経験的に決定することができる。本発明に照らせば、小児個体に投与される用量は、その小児個体において経時的に有利な治療反応を与えるのに充分な量であるべきである。投与量の大きさは、小児個体における特定のＩＢＤ薬の投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質、及び程度によって決定することもできる。特定の状況に対して適正な用量の決定は、医師の技能の範囲内である。一般に、治療は、ＩＢＤ薬の最適用量より少ない低用量から開始される。その後、状況に応じて最適な効果が達成されるまで用量は少しずつ増やされる。便宜のために、望ましい場合には、一日量全体をその一日間でいくつかの部分に分けて投与することができる。
【０１６１】
「ＩＢＤ薬」という用語は、本明細書中で用いる場合、ＩＢＤに関連した１種又は２種以上の症状を治療するのに有効な薬学的に許容することのできるすべての形態の薬剤を含む。例えば、ＩＢＤ薬は、ラセミ又は異性体混合物、又はイオン交換樹脂に結合された固体錯体（solid complex）等であることができる。さらに、ＩＢＤ薬は溶媒和型であることができる。この用語はまた、記載されたＩＢＤ薬の薬学的に許容することのできるすべての塩、誘導体、及び類似体だけでなく、それらの組み合わせも含むように意図される。例えば、ＩＢＤ薬の薬学的に許容することのできる塩として、限定的でなく、酒石酸塩、コハク酸塩、タルタレート（tartarate）、バイタルタレート（bitartarate）、ジヒドロクロリド、サリチル酸塩、ヘミコハク酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、塩酸塩、カルバミン酸塩、カルバメート、硫酸塩、硝酸塩、及びそれらの安息香酸塩型だけでなく、それらの組み合わせ等も挙げることができる。任意の型のＩＢＤ薬、例えば、ＩＢＤ薬の薬学的に許容することのできる塩、ＩＢＤ薬の遊離塩基、又はそれらの混合物が本発明の方法に用いるのに適している。
【０１６２】
ＩＢＤ又はその臨床的サブタイプと関連した１種又は２種以上の症状を治療するのに有効である適当な薬剤として、限定的でなく、アミノサリチレート（例えば、メサラジン、スルファサラジン等）、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン）、チオプリン（例えば、アザチオプリン、６−メルカプトプリン等）、メトトレキサート、モノクローナル抗体（例えば、インフリキシマブ）、それらの遊離塩基、それらの薬学的に許容することのできる塩、それらの誘導体、それらの類似体、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。本発明に用いるのに適当なさらなるＩＢＤ薬があることは当業者に公知であろう（例えば、Sands, Surg. Clin. North Am., 86:1045-1064 (2006)；Danese et al., Mini Rev. Med. Chem., 6:771-784 (2006)；Domenech, Digestion, 73 (Suppl. 1):67-76 (2006)；Nakamura et al., World J. Gastroenterol., 12:4628-4635 (2006)；及びGionchetti et al., World J. Gastroenterol., 12:3306-3313 (2006)参照）。
【０１６３】
小児個体由来の試料がＩＢＤ（例えば、ＣＤ又はＵＣ）試料と分類された後は、所定の治療方式の効果を評価するために周期的な時間間隔で小児個体をモニターすることもできる。例えば、所定のマーカーのレベルは、処置、例えば、薬剤の治療効果に基づいて変化する。患者をモニターして反応を評価し、そして個別のアプローチによる所定の薬剤又は処置の効果を理解する。さらに、患者は薬剤に反応しないこともあるが、マーカーは変化することがあり、このことは、これらの患者がそのマーカーレベルにより同定することができる（反応を示さない）特別な集団に属することを示唆する。これらの患者には、現在の治療を中止し、そして代わりの治療を処方することができる。
【０１６４】
《ＩＸ．実施例》
以下の実施例は、限定的な意図でなく、特許請求の範囲に記載の発明を説明するために提供するものである。
【０１６５】
《実施例１．ＡＮＣＡレベルの測定》
この実施例は、ＥＬＩＳＡ分析を用いた試料中のＡＮＣＡレベルの分析を説明する。
【０１６６】
固定化好中球酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、Saxon et al., J. Allergy Clin. Immunol., 86:202-210 (1990)に記載のようにＡＮＣＡを検出した。簡潔には、フィコール−ハイパック遠心法により精製されたヒト末梢血由来の好中球ウェル当たり２．５×１０５個でマイクロタイタープレートをコーティングし、そして１００％メタノールで１０分間処理して細胞を固定化した。リン酸緩衝生理食塩水中０．２５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて加湿チャンバー内で室温において６０分間細胞をインキュベートして非特異的抗体結合をブロックした。次いで、ウシ血清／リン酸緩衝生理食塩水のブロッキング緩衝液に対照及びコード化血清を１：１００希釈で添加し、そして加湿チャンバー内で室温において６０分間インキュベートした。アルカリホスファターゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体（γ鎖特異的；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ社；Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，Ｐａ．）を１：１０００希釈で添加して好中球結合抗体を標識し、そして室温で６０分間インキュベートした。ｐ−ニトロフェノールホスフェート基質の溶液を添加し、そしてポジティブコントロールのウェルにおける４０５ｎｍの吸光度がブランクウェルにおける吸光度より大きな、０．８〜１．０光学濃度単位まで発色を進行させた。
【０１６７】
規定のＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）値を有するキャリブレーターと共に２０の検証済みの（verified）ネガティブコントロール試料のパネルを用いた。各ＥＬＩＳＡ実行に対してベースとなるポジティブ／ネガティブカットオフ値は、キャリブレーター（Calibrator）の光学濃度（ＯＤ）から２０のネガティブのパネルの平均値（ＯＤ）（標準偏差２つ分を加算（plus 2 standard deviations））を引いた値にキャリブレーターのＥＵ値を乗じた値と規定した。従って、ＡＮＣＡ反応性に対するベースカットオフ値は約１０〜２０ＥＵであり、ベースカットオフ値より大きい平均ＥＵ値を有する患者試料はいずれも、ＡＮＣＡ反応性に対してＥＬＩＳＡ陽性とした。同様に、平均ＥＵ値を有する患者試料がベースカットオフ値以下である場合は、ＡＮＣＡ反応性について陰性であると決定する。
【０１６８】
《実施例２．ｐＡＮＣＡの存在の測定》
本実施例は、例えば、米国特許第５，７５０，３５５号及び第５，８３０，６７５号に記載のように蛍光免疫測定法を用いて試料中のｐＡＮＣＡの有無を分析することを説明する。とりわけ、ｐＡＮＣＡの存在は、ＤＮａｓｅを用いた好中球の処理後の陽性値の欠如（例えば、検出可能な抗体マーカー及び／又は対照と比較した場合の特異的な細胞の染色パターンの欠如）について測定することによって検出される。
【０１６９】
以下のプロトコールに従って、試料、例えば、血清から単離された好中球をガラススライド上に固相化する：
１．充分な容積の１Ｘハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中に好中球を再懸濁させて細胞約２．５×１０６個／ｍＬを達成する。
２．Ｃｙｔｏｓｐｉｎ3遠心分離機（Ｓｈａｎｄｏｎ社；Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を５００ｒｐｍで５分間用いて、再懸濁させた好中球０．０１ｍＬを各スライドに付与する。
３．試料を覆うのに充分な容積の１００％エタノール中でスライドを１０分間インキュベートすることによりスライドに好中球を固定化する。空気乾燥させる。スライドは−２０℃で保存することができる。
【０１７０】
次いで、以下のようにＤＮａｓｅを用いて、固相化された固定化好中球を処理する：
１．トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）４０ｍＭ、塩化ナトリウム１０ｍＭ、塩化マグネシウム６ｍＭ、及び塩化カルシウム１０ｍＭを含む緩衝液１ｍＬ当たりにＰｒｏｍｅｇａ ＲＱ１（商標）ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）３単位を混合することによりＤＮａｓｅ溶液を調製する。
２．リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０〜７．４）約１００ｍＬを用いて、前記プロトコールを用いて調製したスライドを５分間リンスする。各スライド当たりＤＮａｓｅ溶液０．０５ｍＬ中で３７℃において約３０分間、固相化された好中球をインキュベートする。リン酸緩衝生理食塩水１００〜２５０ｍＬを用いて室温においてスライドを３回洗浄する。本明細書中に記載のように実施したＤＮａｓｅ反応は、核又は細胞の好中球の形態に有意な変化を起こすことなく細胞のＤＮＡの実質的に完全な消化を生じさせる。
【０１７１】
次いで、ＤＮａｓｅ処理した固定化好中球について以下のプロトコールに従って蛍光免疫測定を実施する：
１．ＤＮａｓｅで処理したスライド及び処理していないスライドに、リン酸緩衝生理食塩水中の１：２０希釈のヒト血清０．０５ｍＬを添加する。ブランクとしてクリーンなスライドにリン酸緩衝生理食塩水０．０５ｍＬを添加する。容積損失を最小にするのに充分な湿度において室温で約０．５〜１．０時間インキュベートする。
２．リン酸緩衝生理食塩水１００〜２５０ｍＬを含む容器に浸漬することによって血清を洗い流す。
３．リン酸緩衝生理食塩水中に５分間スライドを浸漬する。軽く吸い取って乾かす。
４．希釈度１：１０００の抗体：リン酸緩衝生理食塩水の、ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ（μ）−ＦＩＴＣ（Ｔａｇｏ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）０．０５ｍＬを各スライドに添加する。容積損失を最小にするのに充分な湿度において室温で３０分間インキュベートする。
５．リン酸緩衝生理食塩水１００〜２５０ｍＬを用いて抗体を洗い流す。リン酸緩衝生理食塩水１００〜２５０ｍＬ中に５分間スライドを浸漬し、次いで空気乾燥させる。
６．蛍光顕微鏡により４０Ｘで蛍光パターンを読む。
７．望ましい場合には、リン酸緩衝生理食塩水を用いて室温で充分にスライドをリンスし、そして室温で１０秒間染色することによりヨウ化プロピジウム染色試薬によってＤＮＡを染色することができる。リン酸緩衝生理食塩水１００〜２５０ｍＬを用いて室温においてスライドを３回洗浄し、そしてカバーガラスを乗せる。
【０１７２】
前記蛍光免疫測定法を用いて、例えば、ＤＮａｓｅ処理後に廃棄される（abolished）対照の好中球（すなわち、ＤＮａｓｅ処理されなかった固定化好中球）におけるｐＡＮＣＡ反応の存在によって、又はＤＮａｓｅ処理後に細胞質になる（become cytoplasmic）対照の好中球におけるｐＡＮＣＡ反応の存在によって、ＤＮａｓｅ処理された固定化好中球中のｐＡＮＣＡの存在を測定することができる。
【０１７３】
《実施例３．ＡＳＣＡレベルの測定》
本実施例は、酵母細胞ウェル（well）マンナンの調製及びＥＬＩＳＡ分析を用いた試料中のＡＳＣＡレベルの分析を説明する。
【０１７４】
Faille et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 11:438-446 (1992)及びKocourek et al., J. Bacteriol., 100:1175-1181 (1969)に記載のように、酵母細胞壁マンナンを調製した。簡潔には、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（＃３８９２６）から酵母サッカロミセス・ウヴァラム（Saccharomyces uvarum）の凍結乾燥ペレットを入手した。Sambrook et al., In “Molecular Cloning,” Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に従って調製した、２ｘＹＴ培地１０ｍＬ中に酵母を再構成した。Ｓ．ウヴァラムを３０℃で２〜３日間増殖させた。最終的なＳ．ウヴァラム培養物を２ｘＹＴ寒天板に接種し、そして続いて３０℃で２〜３日間増殖させた。単一コロニーを用いて２ｘＹＴ培地５００ｍＬに接種し、そして３０℃で２〜３日間増殖させた。蒸留水１リットル当たりグルコース２０ｇ、バクト酵母エキス２ｇ、ＭｇＳＯ４０．２５ｇ、及び２８％Ｈ３ＰＯ４２．０ｍＬを添加することにより発酵培地（ｐＨ４．５）を調製した。培養液５００ｍＬを用いて発酵培地５０リットルに接種し、そして培養物を３７℃で３〜４日間発酵させた。
【０１７５】
各細胞ペースト１００ｇに０．０２Ｍクエン酸緩衝液（クエン酸ナトリウム５．８８ｇ／Ｌ；ｐＨ７．０±０．１）５０ｍＬを添加することにより、Ｓ．ウヴァラムのマンナン抽出物を調製した。細胞／クエン酸塩混合物を１２５℃で９０分間オートクレーブし、そして冷却に付した。５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、その上清を取り出し、そして保持した。次いで、０．０２Ｍクエン酸緩衝液７５ｍＬを用いて細胞を洗浄し、そして細胞／クエン酸塩混合物を再度１２５℃で９０分間オートクレーブした。この細胞／クエン酸塩混合物を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そしてその上清を保持した。
【０１７６】
銅／マンナン複合体を沈殿させるために、一緒にした上清に攪拌しながら等しい容積のフェーリング溶液を添加した。完全フェーリング溶液は、使用直前にフェーリング溶液Ａをフェーリング溶液Ｂと１：１の比率で混合することにより調製した。銅複合体を沈殿させ、そしてその沈殿から液体を静かにデカンタした。次いで、この銅／マンナン沈殿複合体を酵母ペースト１００ｇ当たり３Ｎ ＨＣｌ６〜８ｍＬ中に溶解させた。
【０１７７】
得られた溶液を強攪拌下に８：１のメタノール：酢酸１００ｍＬ中に注ぎ、そして数時間にわたり沈殿を沈降させた。その上清をデカンタして廃棄し、次いで上澄が無色になるまで、約２〜３回、洗浄過程を繰り返した。沈殿物を焼結ガラス漏斗上に集め、メタノールで洗浄し、そして一晩空気乾燥させた。場合によっては、５０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により沈殿物を集めた後、メタノールで洗浄し、そして一晩空気乾燥させた。乾燥させたマンナン粉末を、約２ｇ／ｍＬの濃度まで蒸留水に溶解させた。
【０１７８】
Ｓ．ウヴァラムマンナンＥＬＩＳＡを用いてＡＳＣＡを検出した。以下のようにＳ．ウヴァラムマンナンＥＬＩＳＡプレートを抗原で飽和させた。前記のように調製した精製Ｓ．ウヴァラムマンナンを、リン酸緩衝生理食塩水／０．２％アジ化ナトリウムで１００μｇ／ｍＬの濃度に希釈した。マルチチャンネル・ピペッターを用いて、Ｃｏｓｔａｒ９６穴ハイバインディングプレート（カタログ番号３５９０；Ｃｏｓｔａｒ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）の１ウェル当たり１００μｇ／ｍＬのＳ．ウヴァラムマンナン１００μＬを添加した。最低１２時間にわたり、４℃において抗原でプレートをコーティングした。プレートの各ロットを、使用前に先のロットと比較した。プレートは１ヶ月間まで２〜８℃で保存した。
【０１７９】
ＡＳＣＡ−ＩｇＡ又はＡＳＣＡ−ＩｇＧ反応性について、患者血清を２連で分析した。前記のように抗原で飽和されたマイクロタイタープレートを、リン酸緩衝生理食塩水／０．０５％ツイーン２０と共に室温で４５分間インキュベートして非特異的な抗体結合を阻害した。次いで、ＡＳＣＡ−ＩｇＡの分析の場合は１：８０の希釈率でそしてＡＳＣＡ−ＩｇＧの分析の場合は１：８００の希釈率で患者血清を添加し、そして室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％ツイーン２０でウェルを３回洗浄した。次いで、１：１０００希釈のアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＡ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，Ｐａ．）又は１：１０００希釈のアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）を添加し、そして室温で１時間このマイクロタイタープレートをインキュベートした。ジエタノールアミン中のｐ−ニトロフェノールホスフェート基質緩衝液の溶液を添加し、そして１０分間にわたり発色を進行させた。自動ＥＭＡＸプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて４０５ｎｍにおける吸光度を分析した。
【０１８０】
ＡＳＣＡ−ＩｇＡ及びＡＳＣＡ−ＩｇＧに対するベースカットオフ値を決定するために、固定ＥＵ値を有するシングルポイントキャリブレーターを用いた。患者試料のＯＤ値を当該キャリブレーターのＯＤ値と比較し、そしてキャリブレーターに割り当てられた値（calibrator assigned values）を掛けた。ＡＳＣＡ−ＩｇＡ ＥＬＩＳＡのベースカットオフ値は２０ＥＵであった。ＡＳＣＡ−ＩｇＧのベースカットオフ値は４０ＥＵであった。
【０１８１】
《実施例４．抗ＯｍｐＣ抗体レベルの測定》
本実施例は、ＯｍｐＣタンパク質の調製及びＥＬＩＳＡアッセイ分析を用いた試料中の抗ＯｍｐＣ抗体レベルの分析を説明する。
【０１８２】
以下のプロトコールは、スフェロプラスト溶解を用いたＯｍｐＣタンパク質の精製を表す。１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン補充Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ−Ｓｔｒｅｐ；Ｔｅｋｎｏｖａ；Ｈａｌｆ Ｍｏｏｎ Ｂａｙ，Ｃａｌｉｆ．）１０〜２０ｍＬ中にグリセロールストックからＯｍｐＦ／ＯｍｐＡ変異体Ｅ．Ｃｏｌｉを接種し、そして対数期まで３７℃で約８時間激しく（vigorously）培養し、その後２５℃で１５時間にわたりＬＢ−Ｓｔｒｅｐ中で１リットルまで増やした。遠心分離によって細胞を収穫した。必要により、氷冷２０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）１００ｍＬで２回、細胞を洗浄した。続いて、氷冷のスフェロプラスト形成性緩衝液（２０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．５；２０％ショ糖；０．１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０；１ｍｇ／ｍＬリゾチーム）中に細胞を再懸濁させ、その後、時折混合を反転させながら約１時間、氷上で再懸濁させた細胞をインキュベートした。必要により、スフェロプラストを遠心分離し、そして小容積のスフェロプラスト形成性緩衝液（ＳＦＢ）中に再懸濁させた。場合により、溶解効率を高めるために再懸濁の前にスフェロプラストペレットを凍結させた。溶解の効率を有意に低下させるスフェロプラストの破裂及び染色体ＤＮＡの放出を避けるために、低張緩衝液の使用は避けた。
【０１８３】
１ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩを含む氷冷１０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）中でスフェロプラスト調製物を１４倍に希釈し、そして激しくボルテックスした。試料を泡立て又は過熱することなく、１秒間のパルス「オンタイム（On time）」により、設定値４において５０％出力で４×３０秒間、氷上で調製物を超音波処理した。遠心分離によって細胞片をペレット化し、そしてその上清を取り出し２回遠心処理することにより清澄化した。ペレットのいずれの部分も回収することなく上清を取り出し、そして超遠心チューブに入れた。この超遠心チューブをその頂部から１．５ｍｍまで２０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）で充填した。Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ ６０スウィング型ローターにより４℃において１時間１００，０００×ｇで超遠心分離することにより膜調製物（membrane preparation）をペレット化した。１ｍＬ容ピペットチップを用い、そしてペレット近くで液を噴出させた後に遠心管当たり約１０分間上下にピペット操作して２０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）中にペレットを均質化させることによってペレットを再懸濁させた。１％ＳＤＳ含有２０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）中で１時間、３７℃において回転下に物質を抽出した。その調製物を超遠心チューブに移し、そして膜を１００，０００×ｇでペレット化した。前記のように２０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）中にペレットを均質化させることによりペレットを再懸濁させた。場合により、膜調製物は４℃で一晩放置した。
【０１８４】
３％ＳＤＳ及び０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）中で３７℃において回転下に１時間ＯｍｐＣを抽出した。物質を超遠心チューブに移し、そして１００，０００×ｇの遠心分離によって膜をペレット化した。次いで、抽出されたＯｍｐＣを含む上清を、１０，０００容積を超える容積に対して透析を行ない高い塩分を除去した。０．２％Ｔｒｉｔｏｎに対する洗浄剤交換によりＳＤＳを除去した。５０ｍＭトリス−Ｃｌに対するさらなる透析によりＴｒｉｔｏｎを除去した。三量体の形態でポリンとして機能する精製されたＯｍｐＣを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。室温での電気泳動により、約１００ｋＤａ、約７０ｋＤａ、及び約３０ｋＤａのバンドのラダーを生じた。６５〜７０℃で１０〜１５分間の加熱により複合体は部分的に解離し、そして二量体及び単量体（すなわち、約７０ｋＤａ及び約３０ｋＤａのバンド）のみが生じた。５分間の煮沸により３８ｋＤａの単量体が生じた。
【０１８５】
本質的に以下のようにしてＯｍｐＣ直接ＥＬＩＳＡ分析を行なった。ホウ酸緩衝生理食塩水（ｐＨ８．５）中０．２５μｇ／ｍＬのＯｍｐＣ１００μＬ／ウェルを用いて、４℃で一晩プレート（ＵＳＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｏｃａｌａ，Ｆｌａ．）をコーティングした。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０による３回の洗浄後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ−ＰＢＳ）１５０μＬ／ウェルを用いて室温で３０分間プレートをブロックした。次いで、ブロッキング溶液を、１：１００希釈のクローン病又は正常対照の血清１００μＬ／ウェルと交換した。次いで、室温で２時間プレートをインキュベートし、そして前記のように洗浄した。ＢＳＡ−ＰＢＳ中１：１０００の希釈率のアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＡ（α鎖特異的）、又はＩｇＧ（γ鎖特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，Ｐａ．）をプレートに添加した。室温で２時間このプレートをインキュベートした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄し、続けてトリス緩衝規定生理食塩水（ｐＨ７．５）でさらに３回洗浄した。基質溶液（２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１Ｍトリス（ｐＨ８．６）中１．５ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロフェノールリン酸二ナトリウム（Ａｒｅｓｃｏ；Ｓｏｌｏｎ，Ｏｈｉｏ））を１００μＬ／ウェルで添加し、そして１時間、発色させた。次いで、４０５ｎｍでプレートを分析した。ＩｇＡ ＯｍｐＣ陽性反応性は、試験試料と同時に分析した対照（正常）血清について得られた平均の反応性から標準偏差２つ分（two standard deviations）以上より大きい反応性と定義した。
【０１８６】
《実施例５．抗Ｉ２抗体レベルの測定》
本実施例は、組換えＩ２タンパク質の調製及びＥＬＩＳＡ分析又は組織学的分析を用いた試料中の抗Ｉ２抗体レベルの分析を説明する。
【０１８７】
全長Ｉ２をコードした核酸配列をＧＳＴ発現ベクターｐＧＥＸ中にクローニングした。Ｅ．Ｃｏｌｉ中での発現後、タンパク質をＧＳＴカラム上で精製した。精製したタンパク質は、銀染色により予想された分子量を有していることが示され、そしてウェスタンブロット分析において抗ＧＳＴ反応性を有していた。
【０１８８】
希釈した患者又は健常者の血清を用いてＧＳＴ−Ｉ２融合ポリペプチドによりＥＬＩＳＡ分析を実施した。ＧＳＴ単独に対する反応性を減算した後の反応性を測定した。種々の希釈率のクローン病（ＣＤ）血清及び健常個体由来の血清をＧＳＴ−Ｉ２融合ポリペプチドに対するＩｇＧ反応性について測定した。１：１００〜１：１０００の希釈率で、正常の血清と比較して有意に高い抗Ｉ２ポリペプチド反応性がＣＤ血清について見られた。これらの結果は、Ｉ２タンパク質が正常の血清と比べてＣＤ血清と特異的に反応性であることを示す。
【０１８９】
本質的に以下のようにして直接ＥＬＩＳＡ分析により、ＧＳＴ−Ｉ２融合ポリペプチドに結合するヒトＩｇＡ及びＩｇＧ抗体を検出した。ＧＳＴ−Ｉ２融合ポリペプチド（ホウ酸緩衝生理食塩水（ｐＨ８．５）中５μｇ／ｍＬ）１００μＬ／ウェルを用いて、４℃で一晩、プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ３；；ＤＹＮＥＸ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，Ｖａ．）をコーティングした。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ−ＰＢＳ）１５０μＬ／ウェルを用いて室温で３０分間プレートをブロックした。次いで、ブロッキング溶液を、１：１００希釈のＣＤ血清、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）血清、又は正常の対照血清１００μＬ／ウェルと交換した。次いで、室温で２時間プレートをインキュベートし、そして前記のように洗浄した。アルカリホスファターゼ標識二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＡ（α鎖特異的）；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，Ｐａ．）をＢＳＡ−ＰＢＳ中１：１０００の希釈率でＩｇＡプレートに添加した。ＩｇＧ反応性に対しては、アルカリホスファターゼ標識二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加した。室温で２時間プレートをインキュベートした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄し、続いてトリス緩衝規定生理食塩水（ｐＨ７．５）でさらに３回洗浄した。基質溶液（２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１Ｍトリス（ｐＨ８．６）中１．５ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロフェノールリン酸二ナトリウム（Ａｒｅｓｃｏ；Ｓｏｌｏｎ，Ｏｈｉｏ））を１００μＬ／ウェルで添加し、そして１時間、発色させた。次いで、４０５ｎｍでプレートを分析した。正常な母集団の平均値より標準偏差２つ分大きいカットオフを用いたところ、１０のＣＤ値のうち９つは陽性であり、一方、正常の血清試料はいずれも陽性ではなかった。さらに、１０のＣＤ患者試料のうち７つは０．３より大きいＯＤ４０５値を示し、一方、ＵＣ患者又は健常者の試料はいずれもこの測定による陽性を示さなかった。これらの結果は、Ｉ２ポリペプチドに対する免疫反応性、とりわけ、ＩｇＡ免疫反応性を用いてＣＤを診断することができることを示している。
【０１９０】
組織学的分析に対し、抗原として精製ＧＳＴ−Ｉ２融合タンパク質を用いてウサギ抗Ｉ２抗体を調製した。アガロース支持体（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）に結合したＧＳＴへの付着（adherence）によってＧＳＴ結合性抗体を除去し、そしてウサギ血清を、ＥＬＩＳＡ分析による抗Ｉ２免疫反応性に対して検証した。ＣＤ、ＵＣ、及び正常対照に由来するパラフィン包埋生検材料からスライドを調製した。ヘマトキシリン及びエオシン染色を行なった後、Ｉ２特異的抗血清と一緒にインキュベートした。ペルオキシダーゼ標識された抗ウサギ二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）を用いて抗体の結合を検出した。分析は、バックグランドに対するシグナル及びＣＤと対照母集団との間の差異が最大となるように最適化した。
【０１９１】
《実施例６．ＩＢＤ予測のための組み合わせ的統計的アルゴリズム》
本実施例は、血清学的マーカーのパネルを用いて試料がＩＢＤ又はその臨床的サブタイプと関連しているか否かを分類する学習統計的分類子システムを組み合わせることから導かれる診断的アルゴリズムを説明する。
【０１９２】
この研究では健常者及び罹患患者に由来する血清学的試料の大きなコホートを用いそしてパネルの種々の抗菌抗体マーカーのレベル及び／又は存在を測定してＩＢＤに罹患した患者を同定し、及びＵＣとＣＤとの間を選択的に識別するパネルの診断能力を評価した。或るＩＢＤ有病率を有する約２，０００例の試料を試験した。血清学的マーカーのパネルは、ＡＮＣＡ、ＡＳＣＡ−ＩｇＡ、ＡＳＣＡ−ＩｇＧ、抗ＯｍｐＣ抗体、抗フラジェリン抗体（例えば、抗Ｃｂｉｒ−１抗体）、及びｐＡＮＣＡを含んでいた。ＡＮＣＡ、ＡＳＣＡ−ＩｇＡ、ＡＳＣＡ−ＩｇＧ、抗ＯｍｐＣ抗体、及び抗フラジェリン抗体のレベルはＥＬＩＳＡによって測定した。間接免疫蛍光顕微鏡法を用いて試料がｐＡＮＣＡに対して陽性又は陰性のいずれであるかを測定した。
【０１９３】
この研究において、パネルの血清学的マーカーのレベル及び／又は存在に基づいてＩＢＤ、ＣＤ、又はＵＣを予測する異なる学習統計的分類子システムのハイブリッドを用いた新規なアプローチを開発した。これらの学習統計的分類子システムは、例えば、複合データに適用することができ、そして通常の統計的分類子の制約なしに、提供されたデータに厳密に基づいて決定を行なうことができる、フィードフォワード・バック・プロパゲーションを備えた多層パーセプトロンのような多変量統計的手法を用いる。とりわけ、２つ以上の学習統計的分類子システムを用いてマーカーを解析することにより複数の判別機能を用いる組み合わせ的アプローチを作って、ＩＢＤを診断し、及びＵＣとＣＤとの間を識別する感度及び特異度をさらに改善した。最高の的確性で実行されるモデルは、決定／分類木とニューラルネットワークとの組み合わせから導かれるアルゴリズムを用いた。
【０１９４】
６種のマーカー（すなわち、ＡＮＣＡレベル、ＡＳＣＡ−ＩｇＡレベル、ＡＳＣＡ−ＩｇＧレベル、抗ＯｍｐＣ抗体レベル、抗フラジェリン抗体レベル、及びｐＡＮＣＡ陽性又はｐＡＮＣＡ陰性；「予測変数」）それぞれからの結果及び患者試料のコホートからの診断（０＝正常、１＝ＣＤ、２＝ＵＣ；「従属変数１」）を、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ Ｄａｔａ Ｍｉｎｅバージョン７．１（ＳｔａｔＳｏｆｔ社；Ｔｕｌｓａ，ＯＫ）の分類及び回帰木（Ｃ＆ＲＴ）ソフトウェアモジュールにインプットした。データは訓練用と試験用とに分けた。
【０１９５】
訓練用データ集合からのデータを用いて、６種のマーカー全てに関するデフォルト設定（すなわち、標準Ｃ＆ＲＴ）を用いたＲＴ派生モデルを形成した。Ｃ＆ＲＴ法は、ノード及びノードを接続する同等物からなる最適な決定木構造を構築する。「ノード」又は「非終端ノード」又は「非終端ノード値」という用語は、本明細書中で用いる場合、木の決定点（decision point）をいう。「終端ノード」又は「終端ノード値」という用語は、枝又は最終決定を伴わないノンリーフノードをいう。図２は、８個の非終端ノード（Ａ〜Ｈ）及び９個の終端ノード（Ｉ〜Ｑ）を有するＩＢＤ又はその臨床的サブタイプ（例えば、ＣＤ又はＵＣ）を診断するＣ＆ＲＴ構造の例を提供する。Ｃ＆ＲＴ解析は、各予測に対する確率値も引き出す。これらの確率値は直接にノード値と関連づけられる。ノード値は、各試料の確率値から導かれる。
【０１９６】
次いで、ＮＮソフトウェアからＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｐｒｏｂｌｅｍ Ｓｏｌｖｅｒ（ＩＰＳ）を選択した。終端ノード又は確率値のいずれかを含む、訓練用試料集合からの入力変数を選択した。データに縦列を加えて非ＩＢＤ（０）又はＩＢＤ（１）を同定する別の従属変数を生成した。この縦列は、「診断変数」（０＝正常、１＝ＣＤ、及び２＝ＵＣ）とは別にＮＮを訓練するために用いることができる。出力従属変数として診断及びＩＢＤ／非ＩＢＤを用いた。
【０１９７】
図３は、健常者及び罹患患者に由来する血清学的試料のコホートを用いて形成された前記アルゴリズムモデルの要約を提供する。次いで、これらのモデルは、新規患者由来の試料を解析して１種又は２種以上のマーカーの存在又はレベルに基づいてＩＢＤを診断し又はＣＤとＵＣとを識別するのに用いることができる。
【０１９８】
図３に関して、健常者及び罹患患者から得られた血清学的試料の大きなコホートからのデータベース（３００）を用いて、パネルの抗菌抗体マーカーのレベル及び／又は存在を測定して、ＩＢＤ罹患患者を同定し、そしてＵＣとＣＤとの間を選択的に識別するのに用いることができるモデルを作成した。具体的には、各試料について、患者試料のコホートからの６つの入力予測変数（すなわち、前記の６種のＩＢＤマーカー）及び１つの従属変数（すなわち、診断）を、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ Ｄａｔａ Ｍｉｎｅｒバージョン７．１のＣ＆ＲＴソフトウェアモジュールを用いて処理した。Ｃ＆ＲＴ法から、診断予測、終端ノード値（３０５）、及び確率値を得た。各試料について終端ノード及び確率値を選択及び保存し、そしてＣ＆ＲＴモデルとして用いるために対応する木（３１０）を保存してこのアルゴリズムを用いて新規患者由来のデータを処理した。次いで、ＮＮソフトウェアからＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｐｒｏｂｌｅｍ Ｓｏｌｖｅｒプログラム（３２０）を用いて、７つ又は９つの入力予測変数（すなわち、前記６つのＩＢＤマーカーに終端ノードを加えたもの、又は３つの確率値を加えたもの）及び従属変数（３１５）を処理した。１，０００のネットワークを作りそしてベスト１００のネットワーク（３２５）を選択及び検証した。これら１００のネットワークを、種々の試料を含む試験（３３０）データベースを用いて検証した。最後に、ＩＢＤを診断し及び／又はＣＤとＵＣとの間を識別する最高の感度、特異度、陽性的中率、及び／又は陰性的中率を有するものとして最良のＮＮモデル（３３５）を選択した。
【０１９９】
このアルゴリズムを用いて新規患者由来のデータを処理してＩＢＤ、ＣＤ、又はＵＣを予測し及び／又は患者がＩＢＤ、ＣＤ，又はＵＣに罹患している確率（例えば、ＩＢＤに罹患している確率が約０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はそれを超える数値）を提供するのに用いるためにこのＮＮモデルを保存した。本質的には、患者試料のコホートから形成されたＣ＆ＲＴ及びＮＮモデルを直列に用いて、患者由来の試料中の１種又は２種以上のマーカーの存在又はレベルに基づき新規患者のＩＢＤを診断し又はＣＤとＵＣとの間を識別する。
【０２００】
図４は、マーカー入力変数、出力従属変数（診断及び非ＩＢＤ／ＩＢＤ）、及びＮＮモデルに対する入力変数として用いられるＣ＆ＲＴモデルからの確率を示す。診断データから縦列７（非ＩＢＤ／ＩＢＤ）を形成して、その診断とは別に予測される第二の出力を生成した。
【０２０１】
《実施例７．アルゴリズム的アプローチによるＩＢＤ血清学的マーカーの解析は炎症性腸疾患、クローン病及び潰瘍性大腸炎を検出する的確性を改善する。》
血清学的試験は、医師が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の診断を行い及び疾患をクローン病（ＣＤ）又は潰瘍性大腸炎（ＵＣ）と分類するのを補助することができる。ＩＢＤに対する血清学的試験として、例えば、ＡＳＣＡ（ＩｇＡ及びＩｇＧ）、抗ＯｍｐＣ、抗ＣＢｉｒ１及びｐＡＮＣＡの分析を挙げることができる。本実施例に記載のＩＢＤ血清学的マーカー解析に対する１つのアルゴリズム的アプローチは、統計的分類子からなる高性能なコンピュータを用いた解析とそれに続くニューラルネットワークである。本実施例において、分析結果はカットオフ値との比較をせずに、むしろアルゴリズムによって疾患及び非疾患のパターンを検出する。本実施例では、８６３例の健常及び胃腸の対照、６３３例のＣＤ、及び５５６例のＵＣからなる既知の診断を有する２，０５２例の血清試料のコホートを用いる。
【０２０２】
《実施例８．個体の年齢に基づくＩＢＤ血清学的マーカーの解析》
本実施例において、１４５，６２７例の同定されていない試験結果のデータベースを臨床的洞察のためにマイニングした。１３の正規化されたテーブルを含むリレーショナル臨床データベース（ＰｒＯＳ）のクエリーを行ない、そしてオープンソースソフトウェアパッケージＲを用いて連続的な密度プロットを形成した。年齢分布は二峰性であった。分離したピークが年齢１５〜２０歳について観察され、そして次に、より広いプラトーが年齢２０〜５５歳について見られた。臨床データベースにおける個々のマーカー値の分布は、訓練／検証コホート（Ｎ＝２，０５２）に用いられた分布より正規分布していた。大部分のマーカー分布は臨床データベースでより低かったが、これは多くの試料が健常者又は非ＩＢＤ患者に由来するためと考えることができる。顕著な例外は抗ＣＢｉｒ１であり、訓練／検証の場合より臨床的データベースにおいて高い分布を示した。臨床データベースにおける性別分布は患者の年齢と共に変化した。分布は成人で女性に偏っており（６３％／３７％）、年齢６〜１６歳の年長児童で等しく（５１％／４９％）、そして幼児で男性に偏っていた（４４％／５６％）。小児の場合（年齢０〜５歳）の診断基準には有意な差があった。小児患者の高レベルの抗ＣＢｉｒ１は、小児のクローン病を予測するアルゴリズムによって用いられる重要な要素である。ＡＳＣＡ ＩｇＡ及びＡＳＣＡ ＩｇＧのような他のマーカーの高いレベルは、クローン病罹患と診断された小児においては一般に観察されなかった。これらの年齢に基づく差異がアルゴリズムにより明確に「表現」されなかった２０％の小児ケースについて、本アルゴリズムがその訓練データの多様性に基づいて前記の差異を自動的に発見して利用したことは注目すべきことである。この臨床データの解析は、臨床的生成（clinical production）データとＩＢＤ診断試験を開発するのに最初に用いられた訓練／検証データとの間の類似性及び関係を明らかにするのに有益な手段である。
【０２０３】
本実施例において、以下のマーカーを使用した：ＡＳＣＡ ＩｇＡ（ＥＬＩＳＡ）；ＡＳＣＡ ＩｇＧ（ＥＬＩＳＡ）；抗ＣＢｉｒ１（ＥＬＩＳＡ）；抗ＯｍｐＣ ＩｇＡ（ＥＬＩＳＡ）；ＡＮＣＡ（ＥＬＩＳＡ）；ＤＮＡｓｅ（感度）及びＩＦＡ（核周囲パターン）。
【０２０４】
１３の正規化されたテーブルを含むリレーショナル臨床データベース（ＰｒＯＳ）のクエリーを行ない、そしてオープンソースソフトウェアパッケージＲを用いて連続的な密度プロットを形成した。この研究における診断の分布を表１に示す。
【表１】
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【０２０５】
表示した訓練／検証診断は医師の診断によるものであり（当初の研究）；表示した臨床的診断予測はＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓ Ｓｅｒｏｌｏｇｙ７によるものである。
【０２０６】
《Ａ．方法》
表２〜６は年齢及び性別分布を示す。実際に、年齢分布は二峰性であった（図５）。分離したピークが年齢１５〜２０歳について観察され、そして次に、より広いプラトーが年齢２０〜５５歳について見られた。性別分布は患者の年齢と共に変化した。分布は成人で女性に偏っており、年長児童で等しく、そして幼児で男性に偏っていた。全ての年齢群にわたって有病率はＵＣ予測に対しＣＤ予測の方がより高く、最大の差が年齢０〜５歳群において観察された。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【０２０７】
《Ｂ．結果》
図６は、臨床的予測に対する開発コホート及びマーカーの分布を示す。概して、データは、マーカー分布が訓練／検証の場合より生成臨床データベースの場合の方が低かったことを示す。例外は抗ＣＢｉｒ１であり、臨床データベースの場合の方が高かった。個々のマーカー値の分布は対数正規分布（対数変換後に正規分布）であり、訓練／検証コホートに用いられたデータより臨床データの方が正規分布していた。
【０２０８】
《Ｃ．小児マーカーＩ》
図７は、診断予測により階層化されたマーカーのチャートを示す。４つの横列１）全て；２）非ＩＢＤ；３）ＣＤ及び４）ＵＣが設けられている。５つの縦列は、マーカー１）ＡＮＣＡ；２）ＯｍｐＣ；３）ＡＳＣＡＡ；４）ＡＳＣＡＧ及び５）ＣＢｉｒ１を示す。診断予測を行なうのに用いられるマーカーは年齢により変化する。例えば、ＣＤ診断（第３横列）において、抗ＣＢｉｒ１（第５縦列）は小児において増加する（点線対実線）。
【０２０９】
《Ｄ．小児マーカーＩＩ》
図８は、年齢により階層化されたマーカーのチャートを示す。４つの横列１）全て；２）０〜５歳；３）６〜１６歳及び４）１７歳以上が設けられている。５つの縦列は、マーカー１）ＡＮＣＡ；２）ＯｍｐＣ；３）ＡＳＣＡＡ；４）ＡＳＣＡＧ及び５）ＣＢｉｒ１を示す。成人の場合に、ＣＤ診断予測はＡＳＣＡＡ及び抗ＣＢｉｒ１の両方のレベル増加と関連している（実線矢印）。小児の場合には、ＣＤ診断予測は抗ＣＢｉｒ１のレベル増加と関連しているがＡＳＣＡＡとは関連していない（破線）。
【０２１０】
《Ｅ．単一の増加したマーカー》
唯一の増加したマーカーを有していた患者試料を以下に示す。
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【表７】
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【０２１１】
とりわけ、抗ＣＢｉｒ１だけが増加した試料の割合が高く、一方で全ての他のマーカーでは増加がなかった。このことは強調された年齢０〜５歳の群でなおさらに顕著であった。高い割合の小児試料は、抗ＣＢｉｒ１を単独の増加マーカーとする。
【０２１２】
《Ｆ．結論》
実質的な（ｎ＝１４５，６２７）臨床データベースを用いてＰＲＯＭＥＴＨＥＵＳ ＩＢＤ Ｓｅｒｏｌｏｇｙ ７の遡及的（retrospective）分析を行い、以下の結論に至った。
【０２１３】
年齢分布は二峰性であった。分離したピークが年齢１５〜２０歳について観察され、そして次に、より広いプラトーが年齢２０〜５５歳について見られた。性別分布は患者の年齢と共に変化した。分布は成人で女性に偏っており、年長児童で等しく、そして幼児で男性に偏っていた。大部分のマーカー分布は、訓練／検証の場合より臨床データベースの場合の方が低かった。例外は抗ＣＢｉｒ１であり、臨床データベースの場合の方が高かった。
【０２１４】
個別のマーカー値の分布は対数正規分布であり；臨床データは、対数変換後に、訓練／検証コホートに用いられたデータよりも正規分布していた。診断予測を行なうのに用いられたマーカーは年齢により変化する。成人において、クローン病診断予測はＡＳＣＡＡ及び抗ＣＢｉｒ１の両方の増加したレベルと関連している。小児の場合には、クローン病診断予測は抗ＣＢｉｒ１の増加したレベルと関連しているがＡＳＣＡＡとは関連していない。小児及び青年（adolescent）試料の高い割合は、唯一の増加したマーカーとしての抗ＣＢｉｒ１により特徴付けられる。全ての年齢群にわたって有病率は炎症性大腸炎に対し、クローン病予測の方が高く、最大の差は０〜５歳の年齢群で観察された。
【０２１５】
《実施例９．血清学的試験を用いた炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の予測：多施設（multi-center）臨床研究からの結果》
Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＩＢＤ Ｓｅｒｏｌｏｇｙ ７試験を開発し、そして全体の大きさが２，０５２例の患者試料であるコホートを用いて検証した。この解析において、幅広いさまざまな一般的な臨床胃腸病学サイトからの追加の１，５７４例の試料を加えることにより開発コホートを拡大した。この拡大した開発コホートを用いて、スマートアルゴリズム法（すなわち、拡大したコホートを用いた再訓練及び再検証）を再適用し、以下の知見を得た。
【０２１６】
方法：Ｓ７開発コホート（Ｎ＝２，０５２）に１，５７４例の患者試料（平均年齢及び範囲）（米国内の種々の施設からの試料）の集合を追加して全体を３，６２６例の試料とした開発コホートであって、非ＩＢＤ（１９７１例：５４％）、クローン病（１００７例；２８％）及び潰瘍性大腸炎（６４８例；１８％）を含むコホートを用いた。訓練及び検証用集合の中に、開発コホートの５０の独立したランダム分割を生じさせた。これらの５０の分割のそれぞれについて、訓練用集合にスマートアルゴリズム法を適用し、そして検証用集合を用いて性能値（performance value）を計算した。５０の独立した分割についての平均値及び標準偏差を報告する。
【０２１７】
結果：多施設拡大型開発コホート（Ｎ＝３，６２６）において、観察された平均の性能値は、ＩＢＤ特異度８０％、ＣＤ感度７０％、及びＵＣ感度５１％である。これらの値の標準偏差は特異度１．８％、ＣＤ感度２．６％、及びＵＣ感度３．６％であった。
【０２１８】
これらのデータは、３，６２６例の患者試料を用いて実施した拡大型多施設臨床研究におけるＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＩＢＤ Ｓｅｒｏｌｏｇｙ ７診断試験の臨床的有用性を示す。これらの知見は、より小さいコホートに基づいて前に報告したデータと一致する。
【０２１９】
《実施例１０．血清学的試験を用いた炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の予測：血清学的マーカーの遡及研究及び繰返し試験結果における診断予測の一致性》
ＩＢＤの診断における血清学的マーカーの役割は、科学文献に十分に報告されてきた。一定の血清学的マーカーの経時的な挙動及び診断予測一致性のレベルへのそれらのマーカーの影響をより良く理解するために、マーカー濃度及び診断予測の臨床データベースをクエリーを行なった。
【０２２０】
方法：試験結果の臨床データベースをフィルターにかけ、経時的に２回又は３回以上試験を受けた患者の一致性のパターンを調べた。このデータベースは１６３，６１８例の特有の患者を含んでいた。その中の３，６４７例（２．２％）では、２回又は３回以上の試験が実施された。このサブセットのさらなる分解により、２回の試験結果を有する患者３，４７７例（２．１％）、３回の試験結果を有する患者１５５例（０．１％）、及び４回又は５回以上の試験結果を有する患者１５例（＜０．１％）を同定した。
【０２２１】
これらの繰返し試料を個別のマーカー濃度及び短期間（＜３０日間）、中期間（３０〜９０日間）、及び長期間（９０日間〜２年間）の診断予測の一致性について調査した。
【０２２２】
結果：最初の試験と２回目の試験との間の日数の中央値は１０４日間であった。７４０例の短期間繰返し試験（２０．３％）、９９３例の中期間繰返し試験（２５．６％）、及び１９７４例の長期間繰返し試験（５４．１％）があった。個別のマーカーの経時的な相関を下記表８に示す。診断予測の調査において、短期間（＜３０日間、Ｎ＝７４０）での一致性は８２．０％であり、中期間（３０〜９０日間、Ｎ＝９３３）での一致性は７４．２％であり、そして長期間（９０日間以上、Ｎ＝１９７４）での一致性は７２．０％であった。
【０２２３】
結論：最初の報告と２回目の報告との一致は高いように見える。試験を３０日以内に繰り返した場合が最も高い一致であり；間隔が長くなるほど治療介入及び／又は疾患の進行により一致性が低下することがある。血清学的マーカー濃度への疾患の進行及び治療介入の経時的な影響を評価するさらなる予期的研究が必要である。
【表８】
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【０２２４】
本明細書中に引用された全ての刊行物及び特許出願は、個別の刊行物又は特許出願それぞれが参考までに引用されるものであると明確に及び個々に示されたかのようにして参考までに本明細書中に引用する。前記の発明は、明確に理解されることを目的として説明及び実施例によって多少とも詳細に記載してきたが、特許請求の範囲に記載した発明の精神又は範囲から逸脱することなく一定の変化及び修正をなすことができるということは、本発明の教示に照らし当業者には容易に明らかとなるであろう。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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