(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３の、一式のＣＤＲを含む、ＩＬ−１Ｒ１に対して特異的な単離抗体であって、
ＨＣＤＲ１が、配列番号６３のアミノ酸配列を有し、
ＨＣＤＲ２が、配列番号６４のアミノ酸配列を有し、
ＨＣＤＲ３が、配列番号６５のアミノ酸配列を有し、
ＬＣＤＲ１が、配列番号６８のアミノ酸配列を有し、
ＬＣＤＲ２が、配列番号６９のアミノ酸配列を有し、
ＬＣＤＲ３が、配列番号７０のアミノ酸配列を有する、
単離抗体。
【請求項２】
配列番号６２に対して少なくとも９０、９５、９８または９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインと、配列番号６７に対して少なくとも９０、９５、９８または９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインとを含む、ＩＬ−１Ｒ１に対して特異的な単離抗体。
【請求項３】
ＶＨドメインが配列番号６２のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインが配列番号６７のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の単離抗体。
【請求項４】
配列番号１３７の
（ｉ）Ｎ１２３−Ｖ１３４、
（ｉｉ）Ｌ１４０−Ｋ１５７、および／または
（ｉｉｉ）Ｋ１７８−Ｒ１８０、
の、ＩＬ−１Ｒ１の配列のうちの１から３個の中に含まれるエピトープに結合する、請求項１から３のうちのいずれか１項に記載のＩＬ−１Ｒ１に対して特異的な単離抗体。
【請求項５】
（ｉ）Ｎ１２３−Ｖ１３４と、
（ｉｉ）Ｌ１４０−Ｋ１５７と、
（ｉｉｉ）Ｋ１７８−Ｒ１８０と、
の、ＩＬ−１Ｒ１の配列内に含まれる不連続エピトープに結合する、請求項４に記載のＩＬ−１Ｒ１に対して特異的な単離抗体。
【請求項６】
前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項１から５のうちのいずれか１項に記載の単離抗体。
【請求項７】
抗体が更に
（ａ）ヒトＩｇＭ定常ドメイン
（ｂ）ヒトＩｇＧ１定常ドメイン
（ｃ）ヒトＩｇＧ２定常ドメイン
（ｄ）ヒトＩｇＧ３定常ドメイン
（ｅ）ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、および
（ｆ）ヒトＩｇＡ定常ドメイン
からなる群より選択される免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む、請求項１から６のうちのいずれか１項に記載の単離抗体。
【請求項８】
抗体が更に
（ａ）ヒトＩｇκ定常ドメイン
（ｂ）ヒトＩｇλ定常ドメイン
からなる群より選択される免疫グロブリン軽鎖定常ドメインを含む、請求項１から７のうちのいずれか１項に記載の単離抗体。
【請求項９】
請求項１から８のうちのいずれか１項に記載の単離抗体をコードする、単離核酸分子。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸分子で形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１から８のうちのいずれか１項に記載の抗体を産生する方法であって、前記抗体の産生のための条件下で請求項１０に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、方法。
【請求項１２】
請求項１から８のうちのいずれか１項に記載の抗体と、薬学的に容認可能な賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１３】
薬物として使用するための請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
ＩＬ−１Ｒ１と関連する障害を治療するための請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記障害は、関節リウマチ、変形性関節症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、ＨＩＶ、固形腫瘍、白血病、アルツハイマー病、２型糖尿病、虚血性疾患、およびアテローム性動脈硬化症のうちの１つ以上である、請求項１４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン１受容体１（ＩＬ−１Ｒ１）に対する結合構成要素、特に抗体分子に関する。結合構成要素は、関節リウマチ、喘息、および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む、ＩＬ−１Ｒ１によって仲介される障害の治療に有用である。本発明はまた、そのような結合構成要素の調製方法、本発明の結合構成要素を使用する、ＩＬ−１Ｒ１によって仲介される障害の治療の方法、およびＩＬ−１Ｒ１によって仲介される障害の治療のための薬物の調製における本発明の結合構成要素の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン１（ＩＬ−１）は、免疫介在性疾患および感染症中の炎症反応で主要な役割を果たす、多機能性サイトカインである。ＩＬ−１は、細菌産物、サイトカイン、または免疫複合体による刺激後に、種々の細胞型から産生される。ＩＬ−１は、種々の細胞型に対してオートクリンおよびパラクリン活性を示し、プロスタグランジン、一酸化窒素、サイトカイン、ケモカイン、メタロプロテイナーゼ、および接着分子等の炎症性メディエータの産生を推進する。ＩＬ−１の生物活性を遮断することは、過剰産生または調節不全ＩＬ−１活性によって引き起こされる組織損傷を防止するため、または、例えば、ＣＯＰＤの増悪中に、病原体に対する異常反応を正常化するために、有益となるはずである。
【０００３】
サイトカインのＩＬ−１族は、現在、ＩＬ−１アルファ（ＩＬ−１α）、ＩＬ−１ベータ（ＩＬ−１β）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン１拮抗薬（ＩＬ−１Ｒａ）、ＩＬ１Ｆ５〜１０、およびインターロイキン−３３（ＩＬ−３３）の、１１個の個別構成員から成る。これらのうちの４つ、すなわち、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１８、およびＩＬ−１Ｒａ（ＩＬ−１受容体拮抗薬）が、最も完全に特徴付けられ、種々の疾患における病理学的過程に結び付けられており、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−１Ｒａのみが、膜ＩＬ−１Ｒ１（１、２、３）と相互作用することが明確に示されている。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは、別個の遺伝子の産物である。これらのタンパク質は、アミノ酸レベルで関連し、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは２２％相同性を共有し、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１Ｒａは１８％相同性を共有する。ＩＬ−１βは、ＩＬ−１Ｒａと２６％相同性を共有する。ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−１Ｒａ構成要素に対する遺伝子は、ヒト染色体２ｑ１４（４、５）の中の同様の領域上に位置する。
【０００４】
ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの両方は、１７−ｋＤａ成熟ＩＬ−１αおよびＩｌ−１βを生成するように開裂される、３１−ｋＤａ前駆体ペプチドとして合成される。ＩＬ−１βは、上皮細胞およびマクロファージを含む、種々の細胞型によって産生される。それは、システインプロテアーゼカスパーゼ−１（ＩＬ−１β変換酵素（ＩＣＥ）（６））による開裂後に細胞から放出される。ＩＬ−１αは、カルパインプロテアーゼによって開裂され、原形質膜上にとどまることができ、そこから、直接細胞間接触を介して細胞を活性化させるようである（７）。Ｐｒｏ−ＩＬ−１αは、そのアミノ末端において核局在配列を含有し、それは種々の細胞経路の活性をもたらすことができる（８）。
【０００５】
ＩＬ−１Ｒａは、ＩＬ−１系の自然発生阻害剤である。それは、選択的ｍＲＮＡスプライシングおよび選択的翻訳開始に由来する、４つの異なるイソ型として産生される。ＩＬ−１Ｒａの１７ｋＤａ分泌イソ型は、現在ｓＩＬ−１Ｒａと称される、２２〜２５Ｋｄａ（９、１０）の可変的にグリコシル化された種として発現される。１８ｋＤａ細胞内イソ型は、ｉｃＩＬ−１Ｒａ１（１１）と称される。イソ型ｉｃＩＬ−１Ｒａ２は、ｉｃＩＬ−１Ｒａ１およびｓＩＬ−１Ｒａ第１エクソンの間に位置するエクソンからの選択的転写スプライスによって産生される（１２）。第３の１６ｋＤａ細胞内イソ型ｉｃＩＬ−１Ｒａ３も同定されている（１３）。Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）（アナキンラ）は、可溶性ヒトインターロイキン−１受容体拮抗薬（ＩＬ−１Ｒａ）の組み換え非グリコシル化型である。Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）は、そのアミノ末端において単一のメチオニン残基の添加を有するという点で、天然ヒトＩＬ−１Ｒａとは異なる。Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）は、１５３個のアミノ酸から成り、１７．３キロダルトンの分子量を有する。Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）は、中度から重度の活動性関節リウマチの治療のために承認されている。
【０００６】
ＩＬ−１αおよびＩｌ−１βは、ＩＬ−１受容体族に属する、膜貫通受容体ＩＬ−１Ｒ１（ＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿００８７７）に結合することによって、それらの生物学的効果を及ぼす。現在、ＩＬ−１受容体族の１０個の構成要素があり（１４）、ＩＬ−１受容体１（ＩＬ−１Ｒ１（８０ｋＤａ）、ＩＬ−１ＲＩＩ（６８ｋＤａ）、およびＩＬ−１受容体付属タンパク質（ＩＬ−１ＲａｃＰ）がＩＬ−１αおよびβの信号伝達に関連する。ＩＬ−１Ｒ１およびＩＬ１ＲａｃＰは、細胞膜中で複合体を成し、ＩＬ−１αまたはＩｌ−１βの結合に信号伝達することができる高親和性受容体を形成する。ＩＬ−１Ｒａは、ＩＬ−１Ｒ１に結合するが、ＩＬ−１ＲＡｃＰとは相互作用しない。ＩＬ−１α、Ｉｌ−１β、およびＩＬ−１Ｒａも、細胞内信号伝達ドメインを持たないＩＬ−ＲＩＩに結合する。
【０００７】
これらの受容体のうちの３つ全ては、膜結合または可溶性タンパク質として発現させることができる。１型ＩＬ−１Ｒ（ＩＬ−１Ｒ１）、ＩＬ−１ＲＩＩ、およびＩＬ−１Ｒ付属タンパク質（ＩＬ−１ＲＡｃＰ）は、３つのＩｇ様ドメインを含有する細胞外領域を有して、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子スーパーファミリーに属する。ＩＬ−１Ｒ１およびＩＬ−１ＲａｃＰは、トール様受容体（ＴＬＲ）スーパーファミリーに関連する、細胞質ドメイン（トール様ＩＬ−１Ｒ（ＴＩＲ））ドメインを有する。ＩＬ−１Ｒ１は、ＩＬ−１ＲＡｃＰとのリガンド結合および複合体形成時に、信号伝達が２１３個のアミノ酸残基の細胞質尾部を介して開始されるため、信号伝達受容体と称される（１５）。現在の文献は、ＩＬ−１ＲＩＩが、可溶型として細胞表面または細胞外で「おとり受容体」としての役割のみを果たすと示唆している（１６）。
【０００８】
ＩＬ−１βに結合されたＩＬ−１Ｒ１の細胞外領域の結晶構造は、２．５Ａ分解度に分解されている（１７）。２つのＮ末端Ｉｇドメインは、ジスルフィドリンカーにより剛性に見え、第３のドメインがより可撓性を示す。ＩＬ−１Ｒ１は、２つの重要な接触域を伴って、ＩＬ−１βに巻き付けられて見える。これらのうちの１つが、ドメイン１および２の間の溝にある一方で、第２の接触域は、第３のドメイン上に位置する、より小さい領域である。興味深いことに、ＩＬ−１Ｒａも、ＩＬ−１Ｒ１のドメイン１および２の間の溝領域に結合するように見えるが、ＩＬ−１ＲａとＩＬ−１Ｒ１の第３のＩｇドメインとの間にいずれの接触もないように見える（１８）。
【０００９】
いったんＩＬ−１がＩＬ−１Ｒ１鎖に結合すると、ＩＬ−１ＲＡｃＰは、リガンド・受容体ペアに動員され、高親和性受容体複合体を形成し、それが信号伝達の開始をもたらす。
【００１０】
ＩＬ−１−ＩＬ−１Ｒ１とのＩＬ−１ＲＡｃＰの相互作用のモデルが、突然変異および抗体の研究に基づいて提案されている（１９、２０、および２１）。それは、ＩＬ−１ＲＡｃＰがＩＬ−１とＩＬ−１Ｒ１との間の界面と相互作用することを示す。これらの研究はまた、ＡｃＰが、より緩和した構造を形成するＩＬ−１Ｒａ−ＩＬ−１Ｒ１ペアと相互作用できないことを実証した。Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒら（２２）は、ＩＬ−１Ｒａと結合されたＩＬ−１Ｒ１が、ＩＬ−１ＲＡｃＰを動員できず、したがって、信号伝達できないことを示している。ＩＬＲａは、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１αに対するＩＬ−１Ｒ１上の結合部位を占有することによって作用し、それに加えて、ＩＬ−１ＲＡｃＰとの信号伝達複合体を形成できない。
【００１１】
ＩＬ−１Ｒ族のさらなる構成要素は、２型ＩＬ−１Ｒ（ＩＬ−１ＲＩＩ）である。この受容体は、細胞外領域中でＩＬ−１Ｒ１と極めて相同であり、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βに結合することができる。しかしながら、現在の証拠は、ＩＬ−１ＲＩＩは、細胞質内ドメインの欠如により、信号伝達を開始しないことを示唆している。この受容体は、細胞表面から開裂され、膜型とともに、おとり受容体の役割を果たすことによって、ＩＬ−１活性の阻害剤としての役割を果たすことができる（１６）。ＩＬ−１ＲＩＩは、ＩＬ−１βに対してより高い親和性を、およびＩＬ−１Ｒａに対してより低い親和性を有し、それは、ＩＬ−１ＲＩＩがＩＬ−１Ｒａの阻害活性を遮断しないことを意味する（２３）。ＩＬ−１ＲＩＩへのリガンド結合は、ＩＬ−１ＲＡｃＰの動員を引き起こすが、この複合体は、非信号伝達性のままである（２４）。ＩＬ−１ＲＡｃＰは、このようにＩＬ−１ＲＩＩによって除去され、ＩＬ−１ＲＡｃＰがＩＬ−１Ｒ１に結合するのを妨げるため、この機構によってＩＬ−１作用も遮断することができ、これは、「コレセプター競合」と称される（２４）。しかしながら、高レベルのＩＬ−１ＲＩＩを発現する細胞は、ＩＬ−１βに反応しなくなることが示されているが、現時点では、ＩＬ−１ＲＩＩが別の信号伝達鎖を動員できることについては、確実には反証されていない（２５）。
【００１２】
ＩＬ−１がＩＬ−１Ｒ１に結合する際に形成される高親和性複合体は、ＩＬ−１ＲＡｃＰの動員につながり、受容体信号伝達を開始する。ＩＬ−１Ｒ１およびＩＬ−１ＲａｃＰは、トール様受容体（ＴＬＲ）スーパーファミリーに関連する、細胞質ドメイン（トール様ＩＬ−１Ｒ（ＴＩＲ））を有する。
【００１３】
信号伝達中に、アダプタ分子ＭｙＤ８８のＴＩＲドメインは、ＩＬ−１ＲＡｃＰのＴＩＲドメインと相互作用し、ＩＲＡＫ−４およびＩＲＡＫ−１を含有する受容体複合体の動員を引き起こす。リン酸化ＩＲＡＫが、次いで受容体複合体にＴＲＡＦ６を動員することが提案されている。次いで、ＩＲＡＫは、膜関連複合体ＩＩを形成する刺激の前に、膜上にあらかじめ結合している、ＴＡＫ１、ＴＡＢ１、およびＴＡＢ２に、ＴＲＡＦ６をもたらす。複合体ＩＩの形成は、未知のキナーゼによる膜上のＴＡＫ１およびＴＡＢ２のリン酸化をもたらし、その後に、ＩＲＡＫからのＴＲＡＦ６−ＴＡＫ１−ＴＡＢ１−ＴＡＢ２（複合体ＩＩＩ）の解離、およびサイトゾルへの複合体ＩＩＩの結果的な移行が続く。複合体ＩＩＩの形成、およびさらなるサイトゾル因子との相互作用は、ＴＡＫ１の活性化につながる。リン酸化ＩＲＡＫは、膜上にとどまり、最終的にユビキチン化され、分解される。ＴＡＫ−１の活性化は、ＩＫＫの活性化、ＩｋＢタンパク質の分解につながり、核中の転写を活性化するＮＦ−ｋＢの活性化をもたらす。ＴＡＫ−１はまた、ｐ３８、ＪＮＫ、およびＥＲＫ１／２の活性化を介して、ＡＰ１を含む転写因子の活性を調節する、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ経路（ＭＡＰＫ）の活性化で役割を果たすことも示されている（２６）。信号伝達がこれらの複数の経路で増幅されるため、リガンドによる細胞毎の受容体占有率は、ＩＬ−１Ｒ発現細胞において生理学的反応を開始するために低くなる必要がある（おそらく細胞毎に１０個の受容体が占有されるほど低い）。
【００１４】
ＩＬ−１は、多くの慢性炎症性疾患で重要な役割を持つ、主要な炎症性サイトカインである。遺伝子およびタンパク質レベルでのＩＬ−１の発現は、種々の疾患で検査されている。増加したレベルのＩＬ−１が、２型糖尿病（２７、２８、２９）、ＨＩＶ−１固形腫瘍、白血病、アルツハイマー病、虚血性疾患（３０）およびアテローム性動脈硬化症（３１）、喘息、ＣＯＰＤ、およびＯＡ（３２）で報告されている。ＩＬ−１は、種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ研究によって、複数の生物学的効果を及ぼすことが示されている。その多様な作用は、プロスタノイド、一酸化窒素、サイトカイン、ケモカイン、プロテアーゼおよび接着分子、およびサイトカイン受容体発現（３２）を含む、種々の炎症性メディエータの遺伝子発現における、その主要な役割に関連する。これらの炎症性メディエータの過剰産生または発現は、疾患の病理ならびに組織の再形成および破壊と関連している。したがって、ＩＬ−１は、関節リウマチ、変形性関節症（ＯＡ）、喘息および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、２型糖尿病、虚血性疾患、およびアテローム性動脈硬化症等の、多くの一般的な炎症性疾患に対する中枢の治療標的を表す。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  ＣＡ（２００２）Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｈｅｍａｔｏｌ  ２０（５）Ｓ２７，Ｓ１  −Ｓ１３
【非特許文献２】Ｄｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２（１０）５３３−６
【非特許文献３】Ｓｃｈｍｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２３，２７９−９０
【非特許文献４】Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １５（１），１７３−６
【非特許文献５】Ｓｔｅｉｎｋａｓｓｅｒｅｒ  Ａ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３（３），６５４−７
【非特許文献６】Ｂｌａｃｋ  ＲＡ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３（１９），９４３７−４２
【非特許文献７】Ｎｉｋｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２（１）５７７−８４
【非特許文献８】Ｗｅｓｓｅｎｄｏｒｆ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８（２９）２２１００−４
【非特許文献９】Ｃａｒｔｅｒ  ＤＢ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４４（６２６７）６３３−８
【非特許文献１０】Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＰ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４３（６２５６）３４１−６
【非特許文献１１】Ｄｅｗｂｅｒｒｙ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｅ  Ｂｉｏｌ  ２０（１１）２３９４−４００
【非特許文献１２】Ｍｕｚｉｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８２（２）６２３−８
【非特許文献１３】Ｇａｂａｙ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９（１２）５９０５−１３
【非特許文献１４】Ｓｉｍｓ  ＪＥ（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４，１１７−１２２
【非特許文献１５】Ｓｉｍｓ  ＪＥ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  ７２（１）９−１４
【非特許文献１６】Ｃｏｌｏｔｔａ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １５（１２）５６２−６
【非特許文献１７】Ｖｉｇｅｒｓ  ＧＰ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８６（６６２１）１９０−４
【非特許文献１８】Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８６（６６２１）１９４−２００
【非特許文献１９】Ｂｏｒａｓｃｈｉ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５５（１０  ）４７１９−２５
【非特許文献２０】Ｃａｓａｄｉｏ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ（２００１）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４９９（１−２）６５−８
【非特許文献２１】Ｄ’Ｅｔｔｏｒｒｅ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｅｕｒ  Ｃｙｔ  Ｎｅｔｗ  ８（２）１６１−７１
【非特許文献２２】Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒ  ＳＡ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０（２３）１３７５７−６５
【非特許文献２３】Ｈａｎｍｕｍ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４３，３３６−３４０
【非特許文献２４】Ｌａｎｇ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６１  ６８７１−７７
【非特許文献２５】Ｒｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８３，１８４１−１８５０
【非特許文献２６】Ｊｉａｎｇ  Ｚ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２２（２０）７１５８−７１６７
【非特許文献２７】Ｏｓｂｏｒｎ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ４４（１）：１４１−８，２００８
【非特許文献２８】Ｓａｕｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４９：２２０８−２２１８
【非特許文献２９】Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５６：１５１７−１５２６
【非特許文献３０】Ｗａｎｄｅｒｅｒ（２００８）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２８：１２７−１３２
【非特許文献３１】Ｉｋｏｎｏｍｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１７：２６６２−２６６９
【非特許文献３２】Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  ＣＡ（１９９６）Ｂｌｏｏｄ  ８７（６）２０９５−１４７
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、完全ヒト抗体またはその抗原結合部分を含む、ＩＬ−１Ｒ１に結合し、ＩＬ−１αおよび／またはＩＬ−１βの生物活性を阻害する、結合構成要素を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、カニクイザルＩＬ−１Ｒ１細胞外ドメインｃＤＮＡの配列を示す［配列番号１３１］。
【図２】図２は、カニクイザルＩＬ−１Ｒ１細胞外ドメインアミノ酸配列の配列を示す［配列番号１３２］
【図３】図３は、ヒトＩＬ１Ｒ１Ｆｃ  ｃＤＮＡヌクレオチド配列を示す［配列番号１３３］。
【図４】図４は、ヒトＩＬ１Ｒ１Ｆｃタンパク質配列を示す［配列番号１３４］。
【図５】図５は、カニクイザルＩＬ１Ｒ１Ｆｃ  ｃＤＮＡヌクレオチド配列を示す［配列番号１３５］。
【図６】図６は、カニクイザルＩＬ１Ｒ１Ｆｃタンパク質配列を示す［配列番号１３６］。
【図７】図７は、ヒトＩＬ−１Ｒ１細胞外配列を示す［配列番号１３７］。
【図８】図８は、ヒトＩＬ−１Ｒ１ｃＤＮＡ配列を示す［配列番号１３８］。
【図９】図９は、Ｃｙｎｏ  ＩＬ−１Ｒ１細胞外配列（残基１から３３７）を示す［配列番号１３９］。
【図１０】図１０は、Ｃｙｎｏ  ｃＤＮＡ細胞外ＩＬ−１Ｒ１配列を示す［配列番号１４０］。
【図１１】図１１は、成熟ヒトＨＩＳ−ＦＬＡＧ  ＩＬ−１ｒａの配列を示す［配列番号１４１］。
【図１２】図１２は、成熟ヒトＨＩＳ−ＦＬＡＧ  ＩＬ−１βの配列を示す［配列番号１４２］。
【図１３】図１３は、抗体６ＩｇＧ２についてのヒト全血におけるＩＬ−１β誘発ＩＬ−６産生の阻害を示す（実施例２．７）。Ｘ軸は、抗体６の濃度（ログモル濃度）を示し、Ｙ軸は、ＩＬ６産生の阻害率（％）である。
【図１４】図１４は、Ｖｈ３＿ＤＰ−４７＿（３−２３）族のリボソーム提示構造および回収において、ＧｌｕからＧｌｎに変換する、ＳＤＣＡＴ−ＣＧプライマーを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ＩＬ−１Ｒ１を対象とする結合構成要素は、国際公開第ＷＯ２００４／０２２７１８号、国際公開第ＷＯ２００５／０２３８７２号、国際公開第ＷＯ２００７／０６３３１１号、国際公開第ＷＯ２００７／０６３３０８号、および国際公開第ＷＯ２００６／０５９１０８号の、国際特許出願で開示されている。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、単離結合構成要素、例えば、ＩＬ−１Ｒ１への結合に対してＩＬ−１Ｒａと競合する、ＩＬ−１Ｒ１に対して特異的な抗体を提供する。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、ＩＬ−１Ｒ１への結合に対してＩＬ−１およびＩＬ−１Ｒａと競合し、ＫｉｎｅｘａＴＭによって測定された時に１０ｐＭ以下のＫＤでＩＬ−１Ｒ１に結合する、ＩＬ−１Ｒ１に対して特異的な単離結合構成要素を提供する。一実施形態では、ＩＬ−１は、ＩＬ−１αに関し、別の実施形態では、Ｉｌ−１は、ＩＬ−１βに関する。別の実施形態では、Ｉｌ−１は、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの両方に関する。
【００２１】
ＩＬ−１およびＩＬ１Ｒａの両方の結合を遮断する抗体が、特に有効であると考えられる。ＩＬ−１の非存在下では、ＩＬ−１Ｒ１は、約１１時間のｔ１／２で内在化するが、ＩＬ−１の存在下では、受容体は、ｔ１／２が約１．５時間であるように、より急速な内在化を受ける［３３、３４］。対照的に、ＩＬ−１Ｒａは、ＩＬ−１Ｒ１に結合するが、受容体の増加した内在化を誘発しない［３５］。ＩＬ−１Ｒ１は、内在化されると、直ちに膜表面に再循環されることはなく［３３］、それにより、ＩＬ−１と同様なエピトープに結合する抗体のみが直ちに内在化され得、結果としてエンドソーム経路の中へ運ばれ得、この受容体介在クリアランス機構を介して、より高いクリアランス率を受け得ることが可能である。ＩＬ−１ｒａとより類似するエピトープに対する抗体は、受容体内在化率を増加させることの影響を受けにくい可能性があり、受容体介在機構を介した、増加したクリアランスを受け得ず、したがって、おそらく、ヒトＩｇＧに特有の循環クリアランスおよび半減期を有する可能性が高い。国際公開第ＷＯ２００４／０２２７１８は、ＩＬ−１およびＩＬ−１Ｒａの両方のＩＬ−１Ｒ１に対する結合を遮断した抗体のクラスを開示したが、このクラスは、Ｉｌ−１Ｒの第３のドメインに結合し、Ｉｌ−１β結合を防止した、開示されている好ましい種類の抗体よりはるかに効能が低かった。それとは異なり、本発明の抗体は、ＩＬ−１およびＩｌ−１ＲａのＩＬ−１Ｒ１に対する結合を遮断し、高親和性でＩＬ−１Ｒ１に結合することができる。
【００２２】
本発明の別の実施形態では、３０ｐＭのＩＬ−１βの存在下でヒト全血中のＩＬ−１β誘発ＩＬ−６産生の阻害に対して、少なくとも６人の異なるドナーから平均化された、１ｎＭ未満の平均ＩＣ５０を有する、ＩＬ−１Ｒ１に対して特異的な単離結合構成要素が提供される。さらなる実施形態では、平均ＩＣ５０は、少なくとも１０、１５、または２０人の異なるドナーから平均化される。さらなる実施形態では、平均ＩＣ５０は、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、または５０ｐＭ未満である。
【００２３】
本発明の結合構成要素は、ＩＬ−１Ｒ１に結合し、高い有効性でＩＬ−１Ｒ１を中和する。中和は、ＩＬ−１Ｒ１の生物活性の阻害を意味する。本発明の結合構成要素は、ＩＬ−１Ｒ１の１つ以上の生物活性を中和することができ、典型的には、本発明の結合構成要素は、ＩＬ１αおよびＩＬ１βのＩＬ−１Ｒ１に対する結合を阻害する。
【００２４】
本発明の結合構成要素はまた、ヒト以外の種で自然発生するＩＬ−１Ｒ１相同分子種を意味する、非ヒトＩＬ−１Ｒ１に結合し、中和することができる。
【００２５】
本発明の結合構成要素は、通常、他のタンパク質と比べてＩＬ−１Ｒ１に対して特異的であり、したがって、選択的にＩＬ−１Ｒ１に結合する。そのような選択性は、例えば、標準競合アッセイで判定または実証することができる。
【００２６】
本発明の結合構成要素によるＩＬ−１Ｒ１の中和を測定するための好適なアッセイは、例えば、リガンド受容体生化学アッセイ、および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ）を含む。
【００２７】
ヒトＩＬ−１Ｒ１に対するＩＬ−１Ｒ１結合構成要素の結合動態および親和性（平衡解離定数ＫＤとして表される）は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ）を使用して判定される。本発明の結合構成要素は、通常、約１ｎＭ未満のヒトＩＬ−１Ｒ１に対する親和性（ＫＤ）を有し、いくつかの実施形態では、約１００ｐＭ未満のＫＤを有し、他の実施形態では、５０ｐＭ未満のＫＤを有し、他の実施形態では、２５ｐＭ未満のＫＤを有し、他の実施形態では、１０ｐＭ未満のＫＤを有し、他の実施形態では、５ｐＭ未満のＫＤを有し、他の実施形態では、３ｐＭ未満のＫＤを有し、他の実施形態では、１ｐＭ未満のＫＤを有する。
【００２８】
いくつかの方法が、抗体の、その抗原に対する結合親和性の測定に利用可能であり、そのような方法の１つは、ＫｉｎＥｘＡＴＭである。Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＫｉｎＥｘＡＴＭ）は、抗原／抗体相互作用に対する平衡解離定数、ならびに会合および解離速度定数を測定することができる、汎用免疫測定プラットフォーム（基本的にはフロー蛍光分光計）である。ＫｉｎＥｘＡＴＭは、平衡が得られた後に実施されるため、相互作用のオフ速度が非常に遅い場合がある、高親和性相互作用のＫＤを測定するために使用する有利な技法である。ＫｉｎＥｘＡＴＭの使用は、抗体および抗原の親和性が、表面プラズモン共鳴分析によって正確に予測できるよりも高い場合に、特に適切である。ＫｉｎＥｘＡＴＭ方法論は、Ｄｒａｋｅ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２８，３５−４３で説明されているように行うことができる。
【００２９】
本発明の一実施形態では、本発明の結合構成要素は、ＫｉｎＥｘＡＴＭ法を使用して測定した時に３００ｐＭ以下のＫＤでＩＬ−１Ｒに対して特異的である。あるいは、２００ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下、１０ｐＭ以下、５ｐＭ以下、３ｐＭ以下、１ｐＭ以下のＫＤである。
【００３０】
生物活性の阻害は、部分的または完全であり得る。結合構成要素は、ＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞中のＩＬ−１β誘発によるＩＬ−８放出、またはＨｅＬａ細胞中のＩＬ−１αおよびＩＬ−１β誘発によるＩＬ−８放出等の、ＩＬ−１Ｒ１生物活性を、１００％、あるいは、結合構成要素の非存在下で最大可能活性の５０％または８０％を誘発するＩＬ−１αまたはβの濃度の活性の少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％だけ、阻害し得る。
【００３１】
結合構成要素の中和能力は、通常、他に記述がない限り、ｎＭ単位のＩＣ５０値として表される。機能アッセイでは、ＩＣ５０は、その最大値の５０％だけ生物学的反応を低減する、結合構成要素の濃度である。リガンド結合試験では、ＩＣ５０は、最大特異的結合レベルの５０％だけ受容体結合を低減する濃度である。ＩＣ５０は、結合構成要素濃度の対数の関数として、最大生物学的応答に対する％をプロットし、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）等のソフトウェアプログラムを使用して、シグモイド関数をデータに当てはめてＩＣ５０値を生成することによって、計算することができる。効能は、当業者に公知である、および／または本明細書で説明あるいは参照される、１つ以上のアッセイを使用して、判定または測定することができる。結合構成要素の中和効能は、Ｇｅｏｍｅａｎ（幾何平均）として表すことができる。
【００３２】
本明細書で説明されるアッセイにおける結合構成要素によるＩＬ−１Ｒ１活性の中和は、結合構成要素がＩＬ−１Ｒ１に結合して中和することを示す。ＩＬ−１Ｒ１への結合構成要素の結合を決定するために使用できる他の方法は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法、免疫沈降、親和性クロマトグラフィ、および生化学アッセイを含む。
【００３３】
本発明の結合構成要素は、他の種のＩＬ−１Ｒ１よりもヒトＩＬ−１Ｒ１に対して同様または強い親和性を有し得る。ヒトＩＬ−１Ｒ１に対する結合構成要素の親和性は、カニクイザルＩＬ−１Ｒ１に対するものと同様であるか、または、例えば、５または１０倍以内であり得る。あるいは、結合構成要素は、ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１Ｒ１に対して同様の親和性を有し得る。
【００３４】
本発明の結合構成要素は、１つ以上のＣＤＲ、例えば、骨格内の「一式のＣＤＲ」を含む、ＩＬ−１Ｒ１結合モチーフを含む。一式のＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３から選択される、１つ以上のＣＤＲを含む。一実施形態では、一式のＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３から選択される、１つ以上のＣＤＲ、例えば、表２の中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３から選択される、１つ以上のＣＤＲと随意的に組み合わせられた、表２の中のＨＣＤＲ３を含む。本発明の別の実施形態では、一式のＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、およびＬＣＤＲ２から選択される、１つ以上のＣＤＲ、例えば、表２の中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、およびＬＣＤＲ２から選択される、１つ以上のＣＤＲと随意的に組み合わせられた、表２の中のＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３を含む。本発明の別の実施形態では、一式のＣＤＲは、表２の中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む。表２の中の同じ抗体から１つ以上のＣＤＲを選択することが好ましいが、ＣＤＲは、表２に記載された１つ以上の抗体から選択されてもよい。
【００３５】
別の実施形態では、本発明の結合構成要素、例えば、抗体は、例えば、表１ａおよび１ｂで開示されるような、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３から選択される１つ以上のＣＤＲを含む、ＩＬ−１Ｒ１結合モチーフを含み、該結合構成要素は、ＩＬ−１Ｒ１に特異的に結合する。
【００３６】
別の実施形態では、本発明の結合構成要素、例えば、抗体は、例えば、表１ａおよび１ｂで開示されるような、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３から選択される１つ以上のＣＤＲを含む、ＩＬ−１Ｒ１結合モチーフを含み、該結合構成要素は、ＩＬ−１Ｒ１に特異的に結合し、ＩＬ−１Ｒ１への結合に対してＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒａと競合し、Ｋｉｎｅｘａ（登録商標）によって測定された時に１０ｐＭ以下のＫＤでＩＬ−１Ｒ１に結合する。
【００３７】
本明細書で説明されるように、表１ａに示される一式のＣＤＲ配列を有する親抗体分子を単離した（抗体１を参照）。最適化の過程を通して、親ＣＤＲ配列に由来するＣＤＲ配列を伴い、表１で示された位置に修飾を有する、２〜３と番号付けられた抗体クローンの一団を生成した。したがって、例えば、抗体２は、親ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、およびＬＣＤＲ２を有し、Ｋａｂａｔ残基１００ＥがＴと置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００ＦがＶと置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００ＧがＤと置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００ＨがＡと置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００ＩがＡと置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１０１がＶと置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１０２がＤと置き換えられる、親ＨＣＤＲ３配列を有することが、表１ａから分かる。
【００３８】
本明細書で説明されるように、表１ｂに示される一式のＣＤＲ配列を有する第２の親抗体分子を単離した（抗体４を参照）。最適化の過程を通して、親ＣＤＲ配列に由来するＣＤＲ配列を伴い、表１ｂで示された位置に修飾を有する、５〜１０と番号付けられた抗体クローンの一団を生成した。したがって、例えば、抗体５は、親ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、およびＬＣＤＲ２を有し、Ｋａｂａｔ残基１００ＡがＡと置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００ＢがＰと置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００ＣがＰと置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００ＤがＰと置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００ＥがＬと置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００ＦがＧと置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００ＩがＧと置き換えられる、親ＨＣＤＲ３配列を有することが、表１ｂから分かる。また、抗体６は、親ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、およびＬＣＤＲ２を有し、Ｋａｂａｔ残基１００ＡがＥと置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００ＢがＱと置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００ＣがＹと置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００ＤがＧと置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００ＥがＶと置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００ＦがＶと置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００Ｊが欠失されており、Ｋａｂａｔ残基１０１がＦと置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１０２がＶと置き換えられる、親ＨＣＤＲ３配列を有することも、表１ｂから分かる。
【００３９】
本明細書では、表１ａ（抗体１）に示されるような親の一式のＣＤＲを含む、結合構成要素が説明され、ＨＣＤＲ１は、配列番号９３（Ｋａｂａｔ残基３１〜３５）であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号９４（Ｋａｂａｔ残基５０〜６５）であり、ＨＣＤＲ３は、配列番号９５（Ｋａｂａｔ残基９５〜１０２）であり、ＬＣＤＲ１は、配列番号９８（Ｋａｂａｔ残基２４〜３４）であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号９９（Ｋａｂａｔ残基５０〜５６）であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１００（Ｋａｂａｔ残基８９〜９７）である。本発明による結合構成要素はまた、表１ａに示されるような親結合構成要素（抗体１）であり得、ＣＤＲのうちの１つ以上は、１つ以上のアミノ酸付加、置換、欠失、および／または挿入を有する。いくつかの実施形態では、結合構成要素は、抗体１の親配列に対して、１から１２個の付加、置換、欠失、および／または挿入を有する、一式のＣＤＲを含む。別の実施形態では、抗体１に対して、１から１０個の付加、置換、欠失、および／または挿入である。別の実施形態では、抗体１の親配列に対して、１から５個の付加、置換、欠失、および／または挿入である。別の実施形態では、抗体１に対して、１から３個の付加、置換、欠失、および／または挿入である。
【００４０】
ある実施形態では、本発明の結合構成要素は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ３は、１から７個のアミノ酸付加、置換、欠失、および／または挿入を随意的に有する、配列番号９５のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、１から５個のアミノ酸付加、置換、欠失、および／または挿入を随意的に有する、配列番号１００のアミノ酸配列を有する。そのような実施形態では、ＨＣＤＲ１は、アミノ酸配列配列番号９３を有してもよく、ＨＣＤＲ２は、アミノ酸配列配列番号９４を有してもよく、ＬＣＤＲ１は、アミノ酸配列配列番号９８を有してもよく、ＬＣＤＲ２は、アミノ酸配列配列番号９９を有してもよい。代替として、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、およびＬＣＤＲ２はまた、親配列（抗体１）に対して、１から１０個の置換等の、１つ以上のアミノ酸付加、置換、欠失、および／または挿入をまとめて有してもよい。
【００４１】
本明細書では、表１ｂ（抗体４）に示される親の一式のＣＤＲを含む、結合構成要素が説明され、ＨＣＤＲ１は、配列番号１０３（Ｋａｂａｔ残基３１〜３５）であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号１０４（Ｋａｂａｔ残基５０〜６５）であり、ＨＣＤＲ３は、配列番号１０５（Ｋａｂａｔ残基９５〜１０２）であり、ＬＣＤＲ１は、配列番号１０８（Ｋａｂａｔ残基２４〜３４）であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１０９（Ｋａｂａｔ残基５０〜５６）であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１１０（Ｋａｂａｔ残基８９〜９７）である。本発明による結合構成要素はまた、表１ｂに示される親結合構成要素であってもよく、ＣＤＲのうちの１つ以上は、１つ以上のアミノ酸付加、置換、欠失、および／または挿入を有する。いくつかの実施形態では、結合構成要素は、抗体４の親配列に対して、１から１５個の付加、置換、欠失、および／または挿入を有する、一式のＣＤＲを含む。別の実施形態では、抗体４に対して、１から１０個の付加、置換、欠失、および／または挿入である。別の実施形態では、抗体４の親配列に対して、１から５個の付加、置換、欠失、および／または挿入である。別の実施形態では、抗体４に対して、１から３個の付加、置換、欠失、および／または挿入である。
【００４２】
ある実施形態では、本発明の結合構成要素は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ３は、１から９個のアミノ酸付加、置換、欠失、および／または挿入を随意的に有する、配列番号１０５のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、１から６個のアミノ酸付加、置換、欠失、および／または挿入を随意的に有する、配列番号１１０のアミノ酸配列を有する。そのような実施形態では、ＨＣＤＲ１は、アミノ酸配列配列番号１０３を有してもよく、ＨＣＤＲ２は、アミノ酸配列配列番号１０４を有してもよく、ＬＣＤＲ１は、アミノ酸配列配列番号１０８を有してもよく、ＬＣＤＲ２は、アミノ酸配列配列番号１０９を有してもよい。代替として、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、およびＬＣＤＲ２はまた、親配列（抗体４）に対して、１から１０個の置換等の、１つ以上のアミノ酸付加、置換、欠失、および／または挿入をまとめて有してもよい。
【００４３】
本明細書では、表１ｂに示される抗体６の一式のＣＤＲを含む、結合構成要素が説明され、ＨＣＤＲ１は、配列番号６３（Ｋａｂａｔ残基３１〜３５）であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号６４（Ｋａｂａｔ残基５０〜６５）であり、ＨＣＤＲ３は、配列番号６５（Ｋａｂａｔ残基９５〜１０２）であり、ＬＣＤＲ１は、配列番号６８（Ｋａｂａｔ残基２４〜３４）であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号６９（Ｋａｂａｔ残基５０〜５６）であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号７０（Ｋａｂａｔ残基８９〜９７）である。本発明による結合構成要素はまた、表１ｂに示される抗体６結合構成要素であってもよく、ＣＤＲのうちの１つ以上は、１つ以上のアミノ酸付加、置換、欠失、および／または挿入を有する。いくつかの実施形態では、結合構成要素は、抗体６の配列に対して、１から１７個の付加、置換、欠失、および／または挿入を有する、一式のＣＤＲを含む。別の実施形態では、抗体６に対して、１から１０個の付加、置換、欠失、および／または挿入である。別の実施形態では、抗体６の配列に対して、１から５個の付加、置換、欠失、および／または挿入である。別の実施形態では、抗体６に対して、１から３個の付加、置換、欠失、および／または挿入である。別の実施形態では、抗体６に対して、１から２個の付加、置換、欠失、および／または挿入である。別の実施形態では、抗体６に対して、１個の付加、置換、欠失、および／または挿入である。
【００４４】
ある実施形態では、本発明の結合構成要素は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ３は、１から１１個のアミノ酸付加、置換、欠失、および／または挿入を随意的に有する、配列番号６５のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、１から６個のアミノ酸付加、置換、欠失、および／または挿入を随意的に有する、配列番号７０のアミノ酸配列を有する。そのような実施形態では、ＨＣＤＲ１は、アミノ酸配列配列番号６３を有してもよく、ＨＣＤＲ２は、アミノ酸配列配列番号６４を有してもよく、ＬＣＤＲ１は、アミノ酸配列配列番号６８を有してもよく、ＬＣＤＲ２は、アミノ酸配列配列番号６９を有してもよい。代替として、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、およびＬＣＤＲ２はまた、抗体６の配列に対して、１から１０個の置換等の、１つ以上のアミノ酸付加、置換、欠失、および／または挿入をまとめて有してもよい。
【００４５】
本発明の結合構成要素は、本明細書で説明されるような１つのＣＤＲまたはＣＤＲの組み合わせを含んでもよい。例えば、本発明の結合構成要素は、配列番号９３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１と、配列番号９４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２と、配列番号９５、５、または１２５から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３と、配列番号９８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１と、アミノ酸配列番号９９を有するＬＣＤＲ２と、配列番号１００、１０、または１３０から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３とを含んでもよい。
【００４６】
本発明の結合構成要素は、本明細書で説明されるような１つのＣＤＲまたはＣＤＲの組み合わせを含んでもよい。例えば、本発明の結合構成要素は、配列番号１０３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１と、配列番号１０４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２と、配列番号１０５、１５、６５、２５、３５、７５、４５、１１５、５５、または８５から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３と、配列番号１０８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１と、配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２と、配列番号１１０、２０、７０、３０、４０、８０、５０、１２０、６０、または９０から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３とを含んでもよい。
【００４７】
本発明の結合構成要素は、本明細書で説明されるような１つのＣＤＲまたはＣＤＲの組み合わせを含んでもよい。例えば、本発明の結合構成要素は、配列番号９３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１と、配列番号９４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２と、配列番号９５、５、１２５、１０５、１５、６５、２５、３５、７５、４５、１１５、５５、または８５から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３と、配列番号９８または１０８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１と、配列番号９９または１０９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２と、配列番号：１００、１０、１３０、１１０、２０、７０、３０、４０、８０、５０、１２０、６０、または９０から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３とを含んでもよい。
【００４８】
ある実施形態では、本発明の結合構成要素またはＶＨドメインは、以下の置換または欠失のうちの１つ以上を伴う、抗体１ＨＣＤＲ３（配列番号９５）を含んでもよい：
Ｔに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１００Ｅ、
ＶまたはＬに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１００Ｆ、
Ｄに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１００Ｇ、
ＡまたはＰに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１００Ｈ、
ＡまたはＰに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１００Ｉ、
ＶまたはＧに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１０１、
ＤまたはＶに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１０２。
【００４９】
ある実施形態では、本発明の結合構成要素またはＶＨドメインは、以下の置換または欠失のうちの１つ以上を伴う、抗体４ＨＣＤＲ３（配列番号１０５）を含む：
ＡまたはＥに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１００Ａ、
Ｐ、Ｑ、またはＡに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１００Ｂ、
Ｐ、Ｙ、Ｓ、またはＬに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１００Ｃ、
Ｐ、Ｇ、またはＡに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１００Ｄ、
ＬまたはＶに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１００Ｅ、
Ｇ、Ｖ、またはＰに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１００Ｆ、
Ｖに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１００Ｇ、
Ｙに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１００Ｈ、
ＧまたはＤに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１００Ｉ、
Ａに置き換えられるか、または欠失される、Ｋａｂａｔ残基１００Ｊ、
Ｆに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１０１、
Ｖに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１０２。
【００５０】
いくつかの実施形態では、結合構成要素、またはそのＶＬドメインは、以下の置換のうちの１つ以上を伴う、抗体１ＬＣＤＲ３（配列番号１００）を含んでもよい：
ＨまたはＡに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基９４、
Ａに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基９５、
ＥまたはＲに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基９５Ａ、
ＱまたはＶに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基９５Ｂ、
ＨまたはＬに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基９７。
【００５１】
いくつかの実施形態では、結合構成要素、またはそのＶＬドメインは、以下の置換のうちの１つ以上を伴う、抗体４ＬＣＤＲ３（配列番号１１０）を含んでもよい：
Ａ、Ｖ、Ｄ、Ｈ、Ｌ、またはＲに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基９４、
Ｇ、Ｒ、またはＡに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基９５、
Ｇ、Ｌ、Ａ、Ｖ、またはＤに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基９５Ａ、
Ｈ、Ｒ、Ａ、またはＤに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基９５Ｂ、
Ｈ、Ｐ、またはＡに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基９６、
Ｈ、Ｖ、またはＱに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基９７。
【００５２】
ある実施形態では、本発明の結合構成要素またはＶＬドメインは、以下の置換または付加のうちの１つ以上を伴う、抗体６ＨＣＤＲ３（配列番号６５）を含む：
ＧまたはＡに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１００Ａ、
Ｓ、Ｐ、またはＡに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１００Ｂ、
Ｄ、Ｐ、Ｓ、またはＬに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１００Ｃ、
Ｙ、Ｐ、またはＡに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１００Ｄ、
ＴまたはＬに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１００Ｅ、
Ｔ、Ｇ、またはＰに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１００Ｆ、
Ｖに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１００Ｇ、
Ｙに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１００Ｈ、
ＧまたはＤに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１００Ｉ、
ＡまたはＦとして回復される、抗体６において欠失されるＫａｂａｔ残基１００Ｊ、
Ｄに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１０１、
Ｉに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基１０２。
【００５３】
いくつかの実施形態では、結合構成要素、またはそのＶＬドメインは、以下の置換のうちの１つ以上を伴う、抗体６ＬＣＤＲ３（配列番号７０）を含んでもよい：
Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｌ、またはＲに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基９４、
Ｌ、Ｇ、またはＡに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基９５
Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｖ、またはＤに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基９５Ａ、
Ｇ、Ｒ、Ａ、またはＤに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基９５Ｂ、
Ｓ、Ｐ、またはＡに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基９６、
Ｌ、Ｈ、またはＱに置き換えられる、Ｋａｂａｔ残基９７。
【００５４】
一実施形態では、本発明は、一式のＣＤＲを含む、結合構成要素であり、ＨＣＤＲ１は、アミノ酸配列番号３を有し、ＨＣＤＲ２は、アミノ酸配列番号４を有し、ＨＣＤＲ３は、アミノ酸配列番号５を有し、ＬＣＤＲ１は、アミノ酸配列番号８を有し、ＬＣＤＲ２は、アミノ酸配列番号９を有し、ＬＣＤＲ３は、アミノ酸配列番号１０を有する。
【００５５】
一実施形態では、本発明は、一式のＣＤＲを含む、結合構成要素であり、ＨＣＤＲ１は、アミノ酸配列番号６３を有し、ＨＣＤＲ２は、アミノ酸配列番号６４を有し、ＨＣＤＲ３は、アミノ酸配列番号６５を有し、ＬＣＤＲ１は、アミノ酸配列番号６８を有し、ＬＣＤＲ２は、アミノ酸配列番号６９を有し、ＬＣＤＲ３は、アミノ酸配列番号７０を有する。
【００５６】
一実施形態では、本発明は、一式のＣＤＲを含む、結合構成要素であり、ＨＣＤＲ１は、アミノ酸配列番号２３を有し、ＨＣＤＲ２は、アミノ酸配列番号２４を有し、ＨＣＤＲ３は、アミノ酸配列番号２５を有し、ＬＣＤＲ１は、アミノ酸配列番号２８を有し、ＬＣＤＲ２は、アミノ酸配列番号２９を有し、ＬＣＤＲ３は、アミノ酸配列番号２０を有する。
【００５７】
一実施形態では、本発明は、一式のＣＤＲを含む、結合構成要素であり、ＨＣＤＲ１は、アミノ酸配列番号１１３を有し、ＨＣＤＲ２は、アミノ酸配列番号１１４を有し、ＨＣＤＲ３は、アミノ酸配列番号１１５を有し、ＬＣＤＲ１は、アミノ酸配列番号１１８を有し、ＬＣＤＲ２は、アミノ酸配列番号１１９を有し、ＬＣＤＲ３は、アミノ酸配列番号１２０を有する。
【００５８】
一実施形態では、本発明は、一式のＣＤＲを含む、結合構成要素であり、ＨＣＤＲ１は、アミノ酸配列番号５３を有し、ＨＣＤＲ２は、アミノ酸配列番号５４を有し、ＨＣＤＲ３は、アミノ酸配列番号５５を有し、ＬＣＤＲ１は、アミノ酸配列番号５８を有し、ＬＣＤＲ２は、アミノ酸配列番号５９を有し、ＬＣＤＲ３は、アミノ酸配列番号６０を有する。
【００５９】
本発明の結合構成要素は、ＩＬ−１Ｒ１に結合するとともに、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、ＣＤＲ、例えば、ＨＣＤＲ３、および／または本明細書で開示される一式のＣＤＲ、例えば、表２で開示される抗体等の、結合構成要素を備える、本明細書で開示される任意の結合構成要素と、ＩＬ−１Ｒ１への結合に対して、競合または交差競合するものであってもよい。結合構成要素の間の競合は、ＥＬＩＳＡを使用して、および／または、同じエピトープまたは重複エピトープに結合する結合構成要素の特定を可能にするように、例えば、１つ以上の他の未標識結合構成要素の存在下で検出することができる１つの結合構成要素に、特異的レポータ分子を標識することによって、容易にｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイをおこなうことができる。そのような方法は、当業者に容易に知られており、本明細書でさら詳細に説明される。したがって、本発明のさらなる態様は、抗体１から１０のうちのいずれかのＶＨおよび／またはＶＬドメインまたはＣＤＲ、例えば、ＨＣＤＲ３、または一式のＣＤＲを含む、抗体分子と、ヒトＩＬ−１Ｒ１への結合に対して競合または交差競合する、ＩＬ−１Ｒ１に対して特異的な結合構成要素を提供する。一実施形態では、本発明の結合構成要素は、表２の抗体１および／または抗体３と競合または交差競合する。
【００６０】
本発明の別の実施形態は、ＩＬ−１Ｒ１の特異的領域、例えば、エピトープに結合する、結合構成要素を提供する。具体的には、表２に記載される抗体のうちのいずれか１つによって結合されるのと同じエピトープまたはその一部である。
【００６１】
本発明の別の実施形態は、以下のＩＬ−１Ｒ１の配列のうちの１つ以上の中に含まれるエピトープに結合する、単離結合構成要素を提供する：
（ｉ）Ｎ１２３−Ｖ１３４、
（ｉｉ）Ｌ１４０−Ｋ１５７、および／または、
（ｉｉｉ）Ｋ１７８−Ｒ１８０。
【００６２】
本発明の別の実施形態は、以下のＩＬ−１Ｒ１の配列内に含まれる不連続エピトープに結合する、請求項１６に記載のＩＬ−１Ｒ１に対して特異的な単離結合構成要素を提供する：
（ｉ）Ｎ１２３−Ｖ１３４、
（ｉｉ）Ｌ１４０−Ｋ１５７、および
（ｉｉｉ）Ｋ１７８−Ｒ１８０。
【００６３】
さらなる態様では、本発明は、ヒトＩＬ−１Ｒ１への結合に対して抗体抗原結合部位と競合または交差競合する、ヒト抗体抗原結合部位を備える、結合構成要素を提供し、抗体抗原結合部位は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインから成り、ＶＨおよびＶＬドメインは、親の一式のＣＤＲ（抗体１または抗体４）、または表に２に記載される抗体２から３あるいは５から１０のうちのいずれかを含む。
【００６４】
任意の好適な方法を、結合構成要素によって結合される残基の配列を決定するために使用することができる。例えば、ＰＥＰＳＣＡＮベースの酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等の、ペプチド結合スキャンを使用することができる。ＰＥＰＳＣＡＮ  Ｓｙｓｔｅｍｓによって提供される種類等のペプチド結合スキャンでは、抗原に由来する短い重複ペプチドが、結合構成要素への結合について系統的にスクリーニングされる。ペプチドは、ペプチドのアレイを形成するように支持表面に共有結合されてもよい。ペプチドは、線形または制約配座（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）であり得る。制約配座は、ペプチド配列の各端において末端Ｃｙｓ残基を有するペプチドを使用して産生することができる。Ｃｙｓ残基は、ペプチドがループ状配座で保持されるように、支持表面に直接または間接的に共有結合することができる。したがって、該方法で使用されるペプチドは、抗原の断片に対応するペプチド配列の各端に付加される、Ｃｙｓ残基を有してもよい。Ｃｙｓ残基がペプチド配列の中間に、またはその付近に付加的に位置する、二重ループ状ペプチドも使用されてもよい。Ｃｙｓ残基は、中心Ｃｙｓ残基のそれぞれの側に１つのループを伴って、ペプチドが二重ループ状配座を形成するように、支持表面に直接または間接的に共有結合することができる。ペプチドは、合成的に生成することができ、したがって、Ｃｙｓ残基は、ＩＬ−１Ｒ１配列で自然発生しないにもかかわらず、所望の場所で改変することができる。随意で、線形および制約ペプチドは、両方とも、ペプチド結合アッセイでスクリーニングすることができる。ペプチド結合スキャンは、結合構成要素が結合する一式のペプチドを同定することを含んでよく（例えば、ＥＬＩＳＡを使用して）、そこでペプチドは、ＩＬ−１Ｒ１の断片に対応するアミノ酸配列を有し（例えば、ＩＬ−１Ｒ１の約５、１０、または１５個の隣接残基のペプチド）、結合構成要素によって結合される残基のフットプリントを決定するためにペプチドを整列し、そこでフットプリントは、重複ペプチドに共通する残基を含む。
【００６５】
代替として、または加えて、ペプチド結合スキャンの方法は、少なくとも所与の信号対雑音比で結合構成要素が結合する、ペプチドを特定するステップを伴ってもよい。結合を決定するための好適なペプチド結合スキャンの方法の詳細は、当技術分野で公知である。当技術分野で周知であり、抗体によって結合される残基を決定するため、および／またはペプチド結合スキャンの結果を確認するために使用することができる、他の方法は、部位特異的突然変異誘発法、水素重水素交換、質量分析法、ＮＭＲ、およびＸ線結晶学を含む。
【００６６】
本発明の結合構成要素は、抗体分子またはその結合断片、好ましくは、ヒト抗体分子またはヒト化抗体分子あるいはその結合断片であり得る。抗体は、特に、ヒト、マウス、キメラ、またはヒト化由来のモノクローナル抗体であってもよく、それらは当業者に周知である標準的方法にしたがって得ることができる。
【００６７】
以下で記述されるように、ＣＤＲは、非抗体骨格によって保持することができるが、本発明のＣＤＲまたは一式のＣＤＲを保持するための構造は、概して、ＣＤＲまたは一式のＣＤＲが、再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされる自然発生ＶＨおよびＶＬ抗体可変ドメインのＣＤＲまたは一式のＣＤＲに対応する場所に位置する、抗体重鎖または軽鎖配列あるいはその大部分である。免疫グロブリン可変ドメインの構造および場所は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７［３６］、および任意のインターネット検索エンジンを使用して「Ｋａｂａｔ」の下で見つけることができる、その最新版を参照することによって決定することができる。
【００６８】
本発明の抗体は、通常、抗体ＶＨおよび／またはＶＬドメインを含む。本発明のＶＨドメインは、一式のＨＣＤＲを含み、ＶＬドメインは、一式のＬＣＤＲを含む。抗体分子は、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、抗体ＶＨドメインと、フレームワークとを含んでもよい。抗体は、代替として、またはさらに、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、抗体ＶＬドメインと、フレームワークとを含んでもよい。本発明の抗体ＶＨドメインの実施例は、配列番号２２であり、本発明の抗体ＶＬドメインの実施例は、配列番号２７である。
【００６９】
本発明は、表２の中の抗体のうちのいずれかのＨＣＤＲ１および／またはＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３、および／または、表２の中の抗体のうちのいずれかのＬＣＤＲ１および／またはＬＣＤＲ２および／またはＬＣＤＲ３を含む、結合構成要素を提供する。結合構成要素は、一式のＶＨ  ＣＤＲを含んでもよく、随意で、一式のＶＬ  ＣＤＲも含んでもよく、ＶＬ  ＣＤＲは、ＶＨ  ＣＤＲと同じ抗体または異なる抗体からであってもよい。
【００７０】
典型的には、ＶＨドメインは、抗体抗原結合部位を提供するようにＶＬドメインと対合されるが、以下でさらに論議されるように、ＶＨまたはＶＬドメインのみが、抗原に結合するために使用されてもよい。例えば、抗体１ＶＨドメイン（表２参照）は、抗体１ＶＬドメインと対合されて、抗体抗原結合部位が、抗体１ＶＨおよびＶＬドメインの両方を含んで形成されるようにしてもよい。本明細書で開示される他のＶＨおよびＶＬドメインについて、類似の実施形態が提供される。他の実施形態では、抗体１ＶＨは、抗体１以外のＶＬドメインと対合される。軽鎖の無差別性が、当業者分野で十分に確立されている。ここでも、本明細書で開示される他のＶＨおよびＶＬドメインについて、類似の実施形態が本発明によって提供される。したがって、表２の中の抗体のうちのいずれのＶＨも、表２の中の同じ抗体または任意の他の抗体のＶＬと対合されてもよい。
【００７１】
本発明のさらなる態様は、表２に示される抗体のうちのいずれかのＶＨドメインとの少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８、または９９％アミノ酸配列同一性を有する、ＶＨドメインを含む、または、表１ａまたは１ｂに示される一式のＨＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、および／またはＨＣＤＲ３）を含む、抗体分子である。抗体分子は、随意で、抗体１から２８のうちのいずれかのＶＨドメインと、または、表１ａまたは１ｂに示される一式のＬＣＤＲ（例えば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、および／またはＬＣＤＲ３）と、少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８、または９９％アミノ酸配列同一性を有する、ＶＬドメインも備えてもよい。２つのアミノ酸配列の相同性％を計算するために使用することができるアルゴリズムは、例えば、既定のパラメータを採用する、例えば、ＢＬＡＳＴ［３７］、ＦＡＳＴＡ［３８］、またはスミス・ウォーターマンアルゴリズム［３９］を含む。
【００７２】
本発明の結合構成要素はさらに、抗体定常領域またはその複数部分、例えば、ヒト抗体定常領域またはその複数部分を含んでもよい。例えば、ＶＬドメインは、そのＣ末端において、ヒトＣκまたはＣλ鎖を含む、抗体軽鎖定常ドメインに付着されてもよい。同様に、ＶＨドメインに基づく結合構成要素は、そのＣ末端において、任意の抗体イソタイプに由来する免疫グロブリン重鎖の全体または一部（例えば、ＣＨ１ドメイン）、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＭ、ならびにイソタイプ下位分類のうちのいずれか、特に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４に付着されてもよい。ＩｇＧ１は、その製造の容易性および安定性、例えば、半減期により、有利である。結合構成要素機能および／または特性を調節する、例えば、可変領域を安定化する、任意の合成または他の定常領域変異形も、本発明で有用であり得る。
【００７３】
さらに、本発明によれば、本明細書で説明されるアミノ酸配列を修飾すること、特に、ヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列を修飾して、所望のアロタイプ、例えば、白人人口で見られるアロタイプに配列を適応させることが所望され得る。
【００７４】
結合構成要素は、抗体骨格内に、１つ以上のＣＤＲ、例えば、一式のＣＤＲを有する、抗体分子またはその結合断片を含んでもよい。例えば、抗体の１つ以上のＣＤＲまたは一式のＣＤＲは、抗体分子を提供するようにフレームワーク（例えば、ヒトフレームワーク）に移植されてもよい。フレームワーク領域は、ヒト生殖系列遺伝子配列、または非生殖系列であってもよい。したがって、フレームワークは、最も類似するヒト生殖系列フレームワークにおける等価位置の残基に合致するように、フレームワーク内の１つ以上の残基が変化させられる、生殖系列であってもよい。したがって、本発明の結合構成要素は、ヒト生殖細胞系フレームワーク、例えば、ヒト生殖細胞系ＩｇＧ  ＶＨフレームワークの中に一式のＨＣＤＲを含む、ＶＨドメインを有する、単離ヒト抗体分子であってもよい。結合構成要素はまた、例えば、ヒト生殖細胞系ＩｇＧ  ＶＬフレームワークの中に、一式のＬＣＤＲを含む、ＶＬドメインも有する。
【００７５】
ＶＨおよび／またはＶＬフレームワーク残基は、例えば部位特異的突然変異誘発法を使用して、本明細書で論じられ、例示されているされるように修飾することができる。本発明によるＶＨまたはＶＬドメイン、またはそのようなＶＬドメインを含む結合構成要素は、好ましくは、表２の抗体のＶＨおよび／またはＶＬドメイン配列を有し、本発明のＨＣＤＲ３を含む。
【００７６】
非生殖細胞系抗体分子は、同じＣＤＲを有するが、生殖細胞系抗体分子と比較して、異なるフレームワークを有する。生殖細胞系抗体は、これらの抗体について本明細書で示されるＶＨおよびＶＬドメイン配列の生殖細胞系フレームワーク領域によって産生され得る。
【００７７】
１つ以上のフレームワーク領域および／または１つ以上のＣＤＲで変更がなされ得る。変更は、通常、機能の損失をもたらさないため、そのように変更されたアミノ酸配列を含む結合構成要素は、ＩＬ−１Ｒ１に結合し、および／または中和する能力を保持するはずである。それは、例えば、本明細書で説明されるアッセイで測定された時に、変更が行われない結合構成要素と同じ定量的結合および／または中和能力を保持することができる。そのように変更されたアミノ酸配列を含む結合構成要素は、向上したＩＬ−１Ｒ１に結合し、および／または中和する能力を有し得る。
【００７８】
変更は、１つ以上のアミノ酸残基を、非自然発生または非標準アミノ酸に置き換えること、１つ以上のアミノ酸残基を非自然発生または非標準形態に修飾すること、または１つ以上の非自然発生または非標準アミノ酸を配列に挿入することを含み得る。本発明の配列における変更の数および場所の例を、本明細書の他の場所で説明する。自然発生アミノ酸は、それらの標準１文字コードによって、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｃ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅとして識別される、２０個の「標準」Ｌ−アミノ酸を含む。非標準アミノ酸は、ポリペプチド骨格に組み込まれてもよい、または既存のアミノ酸残基の修飾に起因し得る、任意の他の残基を含む。非標準アミノ酸は、自然発生または非自然発生であってもよい。４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン、３−メチルヒスチジン、Ｎ−アセチルセリン等［４０］の、いくつかの自然発生非標準アミノ酸が、当技術分野で公知である。Ｎ−α位置で誘導体化されたアミノ酸残基は、アミノ酸配列のＮ−末端のみに位置する。通常、本発明では、アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸であるが、Ｄ−アミノ酸であってもよい。したがって、変更は、Ｌ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に修飾するステップ、またはＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸で代替することを含み得る。アミノ酸のメチル化、アセチル化、および／またはリン酸化した形態も公知であり、本発明のアミノ酸は、そのような修飾を受けてもよい。
【００７９】
本発明の抗体ドメインおよび結合構成要素の中のアミノ酸配列は、上記で説明される、非天然または非標準アミノ酸を含んでもよい。非標準アミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸）は、合成中に、または、アミノ酸配列の合成後に「元の」標準アミノ酸の修飾または代替によって、アミノ酸配列に組み込まれてもよい。
【００８０】
非標準および／または非自然発生アミノ酸の使用は、構造的および機能的多様性を増大させ、したがって、本発明の結合構成要素において所望のＩＬ−１Ｒ１結合および中和特性を達成する可能性を増大させることができる。加えて、Ｄ−アミノ酸および類似体は、動物、例えば、ヒトへの投与後に、Ｌ−アミノ酸を有するポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ分解により、標準Ｌ−アミノ酸と比較して、より良好な薬物動態プロファイルを有することが示されている。
【００８１】
本発明のＣＤＲ由来の配列を持つ新規のＶＨまたはＶＬ領域は、可変ドメイン全体内で突然変異を生成するように、１つ以上の選択されたＶＨおよび／またはＶＬ遺伝子のランダム突然変異誘発を使用して、生成されてもよい。そのような技法は、変異性ＰＣＲを使用した、Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．［４１］によって説明されている。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのアミノ酸置換が、可変ドメイン全体または一式のＣＤＲ内で行われる。
【００８２】
使用されてもよい別の方法は、ＶＨまたはＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に突然変異誘発を向けることである。そのような技法は、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．［４２］およびＳｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．［４３］によって開示されている。
【００８３】
上記の技法の全ては、そのように当技術分野で公知であり、当業者であれば、当技術分野での日常的な方法を使用して、本発明の結合構成要素を提供するために、そのような技法を使用できるであろう。
【００８４】
本発明のさらなる態様は、ＩＬ−１Ｒ１に対する抗体抗原結合部位を得るための方法を提供し、該方法は、本明細書に記載されるＶＨドメインのアミノ酸配列の中の１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入によって提供すること、随意で、そのようにして提供されたＶＨドメインを１つ以上のＶＬドメインと組み合わせることと、ＩＬ−１Ｒ１に対し、また随意で、１つ以上の所望の特性、例えば、ＩＬ−１Ｒ１活性を中和する能力を伴う、結合構成要素または抗体抗原結合部位を同定するように、ＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬの１つまたは複数の組み合わせを試験することを含む。該ＶＬドメインは、実質的に本明細書で説明されるアミノ酸配列を有し得る。本明細書で開示されるＶＬドメインの１つ以上の配列変異形が１つ以上のＶＨドメインと組み合わせられる、類似の方法が採用され得る。
【００８５】
配列が本明細書で具体的に開示される、ＶＨおよびＶＬドメインのうちのいずれかの可変ドメインアミノ酸配列変異形を、論じられたように、本発明に従って採用することができる。特定の変異形は、１つ以上のアミノ酸配列の変更（アミノ酸残基の付加、欠失、置換、および／または挿入）を含み得る。ある実施形態では、変異形は、約２０未満、１５未満、１０未満、または５未満のそのような変更を有する。
【００８６】
上述のように、実質的に本明細書で説明されるＣＤＲアミノ酸配列は、ヒト抗体可変ドメインまたはその大部分の中のＣＤＲとして保持されうる。実質的に本明細書で説明されるＨＣＤＲ３配列は、本発明の実施形態を表し、これらのそれぞれは、随意で、本発明のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、および／またはＬＣＤＲ３と組み合わせて、ヒト重鎖可変ドメインまたはその大部分の中のＨＣＤＲ３として保持され得る。
【００８７】
本発明の結合構成要素はまた、抗体抗原結合部位を含む、抗体の断片を含む。抗体の断片は、組み換えＤＮＡ技法によって、または無傷抗体の酵素あるいは化学開裂によって、産生される。抗体抗原結合部位を含む、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、およびジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）等の分子を含むが、それらに限定されない。例えば、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、三特異性抗体、四特異性抗体、およびミニ抗体を含む、１つ以上の抗体抗原結合部位を含む、種々の他の抗体分子が作り出されている。抗体分子ならびにそれらの構築および使用方法は、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ＆  Ｈｕｄｓｏｎ（４４）で説明されている。
【００８８】
全抗体の断片は、抗原に結合する機能を果たせることが示されている。結合断片の実施例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）、および定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）ドメインから成るＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖ断片、（ｉｖ）ＶＨまたはＶＬドメインから成るｄＡｂ断片［４５、４６、４７］、（ｖ）単離ＣＤＲ領域、（ｖｉ）２つの連結されたＦａｂ断片を含む、二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｖｉｉ）２つのドメインが抗原結合部位を形成するように関連することを可能にするペプチドリンカーによって、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが連結される、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）［４８、４９］、（ｖｉｉｉ）（例えば、国際公開第ＷＯ１９９３／０１１１６１号で開示されている）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体、および（ｉｘ）（例えば、国際公開第ＷＯ９４／１３８０４号および［５０］で開示されている）遺伝子融合によって構築される、多価または多特異的断片である「二特異性抗体」である。Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または二特異性抗体分子は、ＶＨおよびＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋を組み込むことによって安定化され得る［５１］。ＣＨ３ドメインに接合されるｓｃＦｖを含むミニ抗体も、作製することができる［５２］。結合断片の他の実施例は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における、いくつかの残基の添加によってＦａｂ断片とは異なる、Ｆａｂ’と、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担うＦａｂ’断片である、Ｆａｂ’−ＳＨである。
【００８９】
本発明の抗体断片は、酵素、例えば、ペプシンまたはパパインによる、および／または化学的還元によるジスルフィド架橋の開裂による、分解等の方法によって、親抗体分子（抗体１または４）、または抗体分子２、３、５から１０のうちのいずれかから始まって得ることができる。別の方式では、本発明に含まれる抗体断片は、当業者に同様に周知である遺伝子組み換えの技法によって、あるいは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）という企業によって供給されているもの等の、例えば、自動ペプチドシンセサイザを用いたペプチド合成によって、または、核酸合成および発現によって、得ることができる。
【００９０】
本発明による機能的抗体断片は、化学修飾によって、例えば、ＰＥＧ化によって、またはリポソームへの取り込みによって、半減期が増加させられる、任意の機能的断片を含む。
【００９１】
ｄＡｂ（ドメイン抗体）は、抗体の小単量体抗原結合断片、すなわち、抗体重鎖または軽鎖の可変領域である［４７］。ＶＨ  ｄＡｂは、ラクダ科の動物（例えば、ラクダ、ラマ）で自然発生し、標的抗原でラクダ科の動物に免疫を与え、抗原特異的Ｂ細胞を単離し、個々のＢ細胞からｄＡｂ遺伝子を直接クローン化することによって産生することができる。ｄＡｂはまた、細胞培養でも産生可能である。それらの小さいサイズ、良好な可溶性、および温度安定性により、選択および親和性成熟にとって、特に生理学的に有用かつ好適となる。ラクダ科の動物のＶＨ  ｄＡｂは、「ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓＴＭ」という名の下で治療的使用のために開発されている。本発明の結合構成要素は、実質的に本明細書で説明されるＶＨまたはＶＬドメインを含むｄＡｂ、または実質的に本明細書で説明される一式のＣＤＲを含むＶＨまたはＶＬドメインであってもよい。
【００９２】
本発明の抗体は、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を含む。二重特異性または二元機能性抗体は、２つの異なる可変領域が同じ分子の中で組み合わせられる、モノクローナル抗体の第２世代を形成する［５３］。これらの使用は、新しいエフェクタ機能を動員する、または腫瘍細胞の表面上のいくつかの分子を標的にする能力から、診断分野および治療分野の両方で実証されている。二重特異性抗体が使用される場合、これらは、種々の方法で製造することができる［５４］、例えば、化学的に、またはハイブリッドハイブリドーマから調製される、従来の二重特異性抗体であってもよく、または、上述の二重特異性抗体断片のうちのいずれかであってもよい。これらの抗体は、化学的方法［５５、５６］または身体的（ｓｏｍａｔｉｃ）方法［５７、５８］によって得ることができるが、同様に、かつ好ましくは、ヘテロ二量化が強制されることを可能にし、したがって、求められている抗体の精製の過程を促進する、遺伝子工学技法によって得ることができる［５９］。二重特異性抗体の実施例は、異なる特異性を伴う２つの抗体の結合ドメインを使用し、短い可撓性ペプチドを介して直接連結することができる、ＢｉＴＥＴＭ技術のものを含む。これは、短い単一ポリペプチド鎖上に２つの抗体を組み合わせる。可変ドメインのみを使用して、Ｆｃ領域無しに二特異性抗体およびｓｃＦｖを構築することができ、抗イディオタイプ反応の効果を潜在的に低減する。
【００９３】
二重特異性抗体は、ＩｇＧ全体として、二重特異性Ｆａｂ’２として、Ｆａｂ’ＰＥＧとして、二特異性抗体として、あるいは二重特異性ｓｃＦｖとして構築することができる。さらに、当技術分野で公知の日常的方法を使用して、２つの二重特異性抗体を連結して、四価抗体を形成することができる。
【００９４】
二重特異性の二特異性抗体もまた、二重特異性全抗体とは異なり、容易に構築し、大腸菌で発現させることができるため、特に有用であり得る。適切な結合特異性の二特異性抗体（および抗体断片等の多くの他のポリペプチド）は、ファージ提示法（国際公開第ＷＯ１９９４／１３８０４号）を使用して、ライブラリから容易に選択することができる。例えば、二特異性抗体の一方のアームが、ＩＬ−１Ｒ１に対する特異性を有して一定に保たれた場合には、他方のアームが変化され、適切な特異性の抗体が選択される、ライブラリを作製することができる。二重特異性全抗体は、Ｒｉｄｇｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．［６０］で説明されているか、または国際公開第ＷＯ１９９６／２７０１１号、国際公開第ＷＯ１９９８／５０４３１号、および国際公開第ＷＯ２００６／０２８９３６号で説明されているような代替の改変法によって作製されてもよい。
【００９５】
代替として、本発明の結合構成要素は、以下でさらに論じられるように、１つ以上のＣＤＲ、例えば、非抗体タンパク質骨格の中の一式のＣＤＲによって通常は提供される、非抗体分子内の抗原結合部位を含んでもよい。
【００９６】
抗原結合部位は、フィブロネクチンまたはシトクロムＢ等［６１、６２、６３］の非抗体タンパク質骨格上のＣＤＲの配設を用いて、または、所望の標的に対する結合特異性を与えるように、タンパク質骨格内のループのアミノ酸残基を無作為化または突然変異させることによって、提供されてもよい。タンパク質の中の新規の結合部位を作り出すするための骨格は、Ｎｙｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．［６３］によって詳細に論評されている。抗体模倣体に対するタンパク質骨格は、少なくとも１つの無作為化ループを有する３型フィブロネクチンドメインを含む、タンパク質（抗体模倣体）を発明者らが説明している、その全体で参照することにより本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０００３４７８４号で開示されている。１つ以上のＣＤＲ、例えば、一式のＨＣＤＲを移植する好適な骨格は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの任意のドメイン構成要素によって提供され得る。骨格は、ヒトまたは非ヒトタンパク質であってもよい。非抗体タンパク質骨格の利点は、少なくともいくつかの抗体分子よりも小さく、および／または製造しやすい、骨格分子の中の抗原結合部位を提供し得ることである。結合構成要素の小さいサイズは、細胞に進入する、組織に深く浸透する、または他の構造内の標的に到達する能力、または標的抗原のタンパク質空洞内で結合する能力等の、有用な生理学的特性を与え得る。非抗体タンパク質骨格での抗原結合部位の使用は、Ｗｅｓｓ，２００４［６４］で論評されている。典型的な形態は、標的抗原に結合する抗原結合部位を作成するように、１つまたは複数のループのアミノ酸配列が特異的または無作為に突然変異させられる、安定した骨格および１つ以上の可変ループを有する、タンパク質である。そのようなタンパク質は、黄色ブドウ球菌からのプロテインＡ、トランスフェリン、テトラネクチン、フィブロネクチン（例えば、１０番目の３型フィブロネクチンドメイン）、リポカリン、ならびにガンマクリスタリンおよび他のＡｆｆｉｌｉｎＴＭ骨格（Ｓｃｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）のＩｇＧ結合ドメインを含む。他のアプローチの実施例は、分子内ジスルフィド結合を有する低分子タンパク質である、サイクロチドに基づく合成「ミクロボディ」、マイクロタンパク質（ＶｅｒｓａｂｏｄｉｅｓＴＭ、Ａｍｕｎｉｘ  Ｉｎｃ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）、およびアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ−Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含む。そのようなタンパク質はまた、例えば、免疫ドメイン等の低分子改変タンパク質ドメインも含む（例えば、米国特許公開第２００３／０８２６３０号および第２００３／１５７５６１号を参照）。免疫ドメインは、抗体の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。
【００９７】
本発明による結合構成要素は、例えば、折り畳みドメイン等のペプチドまたはポリペプチドを形成する、または、抗原に結合する能力に加えて、別の機能的特徴を分子に付与する、他のアミノ酸を含んでもよい。本発明の結合構成要素は、検出可能な標識を持ってもよく、または、毒素または標的化部分あるいは酵素に抱合されてもよい（例えば、ペプチジル結合またはリンカーを介して）。例えば、結合構成要素は、（例えば、酵素ドメインの中の）触媒部位、ならびに抗原結合部位を含んでもよく、抗原結合部位は、抗原に結合し、したがって、触媒部位を抗原へ向けさせる。触媒部位は、例えば、開裂によって、抗原の生物学的機能を阻害することができる。
【００９８】
本発明はまた、結合構成要素の生物学的効果を変化させる、すなわち、増加させる、減少させる、または排除するように修飾されている結合構成要素、例えば、修飾Ｆｃ領域を伴う抗体も含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される結合構成要素または抗体は、補体に結合し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に関与する能力を強化するように修飾することができる。他の実施形態では、結合構成要素または抗体は、エフェクタ細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する能力を強化するように修飾することができる。さらに他の実施形態では、本明細書で開示される結合構成要素または抗体は、エフェクタ細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する能力を強化するとともに、補体に結合し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に関与する能力を強化するように修飾することができる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される結合構成要素または抗体は、補体に結合し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に関与する能力を低減するように修飾することができる。他の実施形態では、結合構成要素または抗体は、エフェクタ細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する能力を低減するように修飾することができる。さらに他の実施形態では、本明細書で開示される結合構成要素または抗体は、エフェクタ細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する能力を低減するとともに、補体に結合し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に関与する能力を低減するように修飾することができる。
【０１００】
ある実施形態では、本明細書で開示される結合構成要素または抗体、および本発明の組成物の半減期は、少なくとも約４から７日である。ある実施形態では、本明細書で開示される結合構成要素または抗体、および本発明の組成物の平均半減期は、少なくとも約２から５日、３から６日、４から７日、５から８日、６から９日、７から１０日、８から１１日、８から１２日、９から１３日、１０から１４日、１１から１５日、１２から１６日、１３から１７日、１４から１８日、１５から１９日、または１６から２０日である。他の実施形態では、本明細書で開示される結合構成要素または抗体、および本発明の組成物の平均半減期は、少なくとも約１７から２１日、１８から２２日、１９から２３日、２０から２４日、２１から２５日、２２から２６日、２３から２７日、２４から２８日、２５から２９日、または２６から３０日である。なおもさらなる実施例では、本明細書で開示される結合構成要素または抗体、および本発明の組成物の半減期は、最大で約５０日となり得る。ある実施形態では、抗体および本発明の組成物の半減期は、当技術分野で公知の方法によって長引かせることができる。そのような延長は次いで、抗体組成物の投薬の量および／または頻度を低減することができる。向上したｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を伴う抗体およびそれらを調製するための方法は、米国特許第６，２７７，３７５号、および国際公開第ＷＯ１９９８／２３２８９号および国際公開第ＷＯ１９９７／３４６１号で開示されている。
【０１０１】
別の実施形態では、本発明は、容器を含む、製品を提供する。容器は、本明細書で開示される結合構成要素または抗体を含有する組成物と、ＩＬ−１Ｒ１と関連する障害を治療するために組成物を使用できることを示す添付文書またはラベルとを含む。
【０１０２】
他の実施形態では、本発明は、本明細書で開示される結合構成要素または抗体を含有する組成物と、治療を必要としている被験体に組成物を投与する使用説明書とを備える、キットを提供する。
【０１０３】
本発明は、変異Ｆｃ領域を含むタンパク質の製剤を提供する。つまり、非自然発生Ｆｃ領域、例えば、１つ以上の非自然発生アミノ酸残基を含むＦｃ領域である。また、本発明の変異Ｆｃ領域によって包含されるのは、アミノ酸欠失、付加、および／または修飾を含むＦｃ領域である。
【０１０４】
Ｆｃ領域を含むタンパク質の血中半減期は、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合親和性を増加させることによって増加させられる。一実施形態では、Ｆｃ変異タンパク質は、同等の分子に対して強化した血中半減期を有する。
【０１０５】
別の実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異体を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔで規定されるＥＵインデックスによって番号付けられる、２３９、３３０、および３３２から成る群より選択される１つ以上の位置で、少なくとも１つの非自然発生アミノ酸を含む。具体的な実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異体を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔで規定されるＥＵインデックスによって番号付けられる、２３９Ｄ、３３０Ｌ、および３３２Ｅから成る群より選択される、少なくとも１つの非自然発生アミノ酸を含む。随意で、Ｆｃ領域はさらに、Ｋａｂａｔで規定されるＥＵインデックスによって番号付けられる、２５２、２５４、および２５６から成る群より選択される１つ以上の位置で、付加的な非自然発生アミノ酸を含んでもよい。具体的な実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異体を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔで規定されるＥＵインデックスによって番号付けられる、２３９Ｄ、３３０Ｌ、および３３２Ｅから成る群より選択される、少なくとも１つの非自然発生アミノ酸と、Ｋａｂａｔで規定されるＥＵインデックスによって番号付けられる、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅから成る群より選択される１つ以上の位置における、少なくとも１つの非自然発生アミノ酸とを含む。
【０１０６】
別の実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異体を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔで規定されるＥＵインデックスによって番号付けられる、２３４、２３５、および３３１から成る群より選択される１つ以上の位置で、少なくとも１つの非自然発生アミノ酸を含む。具体的な実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異体を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔで規定されるＥＵインデックスによって番号付けられる、２３４Ｆ、２３５Ｆ、２３５Ｙ、および３３１Ｓから成る群より選択される、少なくとも１つの非自然発生アミノ酸を含む。さらなる具体的な実施形態では、本発明のＦｃ変異体は、Ｋａｂａｔで規定されるＥＵインデックスによって番号付けられる、２３４Ｆ、２３５Ｆ、および３３１Ｓ非自然発生アミノ酸残基を含む。別の具体的な実施形態では、本発明のＦｃ変異体は、Ｋａｂａｔで規定されるＥＵインデックスによって番号付けられる、２３４Ｆ、２３５Ｙ、および３３１Ｓ非自然発生アミノ酸残基を含む。別の具体的な実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異体を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔで規定されるＥＵインデックスによって番号付けられる、２３４Ｆ、２３５Ｅ、および３３１Ｓから成る群より選択される、少なくとも１つの非自然発生アミノ酸を含む。別の具体的な実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異体を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔで規定されるＥＵインデックスによって番号付けられる、２３４Ｆ、２３５Ｅ、および３３１Ｓから成る非自然発生アミノ酸を含む。随意で、Ｆｃ領域はさらに、Ｋａｂａｔで規定されるＥＵインデックスによって番号付けられる、２５２、２５４、および２５６から成る群より選択される１つ以上の位置で、付加的な非自然発生アミノ酸を含んでもよい。具体的な実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異体を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔで規定されるＥＵインデックスによって番号付けられる、２３４Ｆ、２３５Ｆ、２３５Ｙ、および３３１Ｓから成る群より選択される、少なくとも１つの非自然発生アミノ酸を含み、１つ以上の位置における少なくとも１つの非自然発生アミノ酸は、Ｋａｂａｔで規定されるＥＵインデックスによって番号付けられる、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅから成る群より選択される。
【０１０７】
別の実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異タンパク質製剤を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔで規定されるＥＵインデックスによって番号付けられる、２３９、３３０、および３３２から成る群より選択される１つ以上の位置で、少なくとも１つの非自然発生アミノ酸を含む。具体的な実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異タンパク質製剤を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔで規定されるＥＵインデックスによって番号付けられる、２３９Ｄ、３３０Ｌ、および３３２Ｅから成る群より選択される、少なくとも１つの非自然発生アミノ酸を含む。随意で、Ｆｃ領域はさらに、Ｋａｂａｔで規定されるＥＵインデックスによって番号付けられる、２５２、２５４、および２５６から成る群より選択される１つ以上の位置で、付加的な非自然発生アミノ酸を含んでもよい。具体的な実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異タンパク質製剤を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔで規定されるＥＵインデックスによって番号付けられる、２３９Ｄ、３３０Ｌ、および３３２Ｅから成る群より選択される、少なくとも１つの非自然発生アミノ酸を含み、１つ以上の位置における、少なくとも１つの非自然発生アミノ酸は、Ｋａｂａｔで規定されるＥＵインデックスによって番号付けられる、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅから成る群より選択される。
【０１０８】
別の実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異タンパク質製剤を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔで規定されるＥＵインデックスによって番号付けられる、２３４、２３５、および３３１から成る群より選択される１つ以上の位置で、少なくとも１つの非自然発生アミノ酸を含む。具体的な実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異タンパク質製剤を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔで規定されるＥＵインデックスによって番号付けられる、２３４Ｆ、２３５Ｆ、２３５Ｙ、および３３１Ｓから成る群より選択される、少なくとも１つの非自然発生アミノ酸を含む。随意で、Ｆｃ領域はさらに、Ｋａｂａｔで規定されるＥＵインデックスによって番号付けられる、２５２、２５４、および２５６から成る群より選択される１つ以上の位置で、付加的な非自然発生アミノ酸を含んでもよい。具体的な実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異タンパク質製剤を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔで規定されるＥＵインデックスによって番号付けられる、２３４Ｆ、２３５Ｆ、２３５Ｙ、および３３１Ｓから成る群より選択される、少なくとも１つの非自然発生アミノ酸を含み、１つ以上の位置における少なくとも１つの非自然発生アミノ酸は、Ｋａｂａｔで規定されるＥＵインデックスによって番号付けられる、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅから成る群より選択される。
【０１０９】
非自然発生Ｆｃ領域を生成するための方法が、当技術分野で公知である。例えば、アミノ酸置換および／または欠失は、部位特異的突然変異誘発法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２（１９８５））、ＰＣＲ突然変異誘発法（Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｉｎ  “ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．１７７−１８３（１９９０））、およびカセット式突然変異誘発法（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３（１９８５））を含むが、それらに限定されない、突然変異誘発方法によって生成することができる。好ましくは、部位特異的突然変異誘発法は、重複延長ＰＣＲ方法によって行われる（Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｉｎ  “ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．６１−７０（１９８９））。重複延長ＰＣＲの技法（Ｈｉｇｕｃｈｉ、同書）はまた、標的配列（開始ＤＮＡ）に任意の所望の突然変異を導入するために使用することもできる。例えば、重複延長方法における第１回のＰＣＲは、外部プライマー（プライマー１）および内部突然変異誘発プライマー（プライマー３）により、かつ別個に、第２の外部プライマー（プライマー４）および内部プライマー（プライマー２）により、標的配列を増幅し、２つのＰＣＲセグメント（セグメントＡおよびＢ）を生じることを伴う。内部突然変異誘発プライマー（プライマー３）は、所望の突然変異を特定する標的配列との不一致を含有するように設計されている。第２回のＰＣＲでは、第１回のＰＣＲの産物（セグメントＡおよびＢ）は、２つの外部プライマー（プライマー１および４）を使用して、ＰＣＲによって増幅される。結果として生じる全長ＰＣＲセグメント（セグメントＣ）は、制限酵素で消化され、結果として生じる制限断片は、適切なベクターにクローン化される。突然変異誘発の第１のステップとして、開始ＤＮＡ（例えば、Ｆｃ融合タンパク質、抗体、または単純にＦｃ領域をコードする）は、突然変異誘発ベクターに動作可能にクローン化される。プライマーは、所望のアミノ酸置換を反映するように設計される。変異Ｆｃ領域の生成に有用な他の方法が、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号、同第５，８８５，５７３号、同第５，６７７，４２５号、同第６，１６５，７４５号、同第６，２７７，３７５号、同第５，８６９，０４６号、同第６，１２１，０２２号、同第５，６２４，８２１号、同第５，６４８，２６０号、同第６，５２８，６２４号、同第６，１９４，５５１号、同第６，７３７，０５６号、同第６，８２１，５０５号、同第６，２７７，３７５号、米国特許公開第２００４／０００２５８７号、およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ９４／２９３５１号、国際公開第ＷＯ９９／５８５７２号、国際公開第ＷＯ００／４２０７２号、国際公開第ＷＯ０２／０６０９１９号、国際公開第ＷＯ０４／０２９２０７号、国際公開第ＷＯ０４／０９９２４９号、国際公���第ＷＯ０４／０６３３５１号、国際公開第ＷＯ０６／２３４０３号を参照）。
【０１１０】
本発明のいくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体のグリコシル化パターンは、ＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクタ機能を強化するように修飾される。Ｓｈｉｅｌｄｓ  ＲＬ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）ＪＢＣ．２７７：２６７３３、Ｓｈｉｎｋａｗａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）ＪＢＣ．２７８：３４６６、およびＯｋａｚａｋｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３６：１２３９を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｆｃ変異タンパク質は、１つ以上の改変糖型、すなわち、Ｆｃ領域を含む分子に共有結合される炭水化物組成物を含む。改変糖型は、エフェクタ機能を強化または低減することを含むがそれに限定されない、種々の目的に有用であり得る。改変糖型は、当技術分野で公知である任意の方法によって、例えば、改変または変異発現株を使用することによって、１つ以上の酵素、例えば、ＤＩ  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩ１１）による同時発現によって、種々の生物または種々の生物からの細胞系の中のＦｃ領域を含む分子を発現させることによって、またはＦｃ領域を含む分子が発現された後に炭水化物を修飾することによって、生成され得る。改変糖型を生成するための方法は、当技術分野で公知であり、Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：１７６−１８０、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１７  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７４：２８８−２９４、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３−２６７４０、Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６−３４７３、米国特許第６，６０２，６８４号、Ｕ．Ｓ．Ｓｅｒ．第１０／２７７，３７０号、Ｕ．Ｓ．Ｓｅｒ．第１０／１１３，９２９号、ＰＣＴ  国際公開第ＷＯ００／６１７３９Ａ１号、ＰＣＴ  国際公開第ＷＯ０１／２９２２４６Ａ１号、ＰＣＴ  国際公開第ＷＯ０２／３１１１４０Ａ１号、ＰＣＴ  国際公開第ＷＯ０２／３０９５４Ａ１号、ＰｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔＴＭ技術（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＧｌｙｃｏＭＡｂＴＭグリコシル化改変技術（Ｇｌｙｃａｒｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で説明されているものを含むが、それらに限定されない。例えば、国際公開第ＷＯ００／０６１７３９号、ＥＡ  ０１２２９１２５、ＵＳ２００３０１１５６１４、Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ＪＭＢ，３３６：１２３９−４９を参照されたい。
【０１１１】
また、当技術分野では、エフェクタ機能を増加または減少させるように、Ｆｃ領域のグリコシル化を修飾できることも公知である（例えば、Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：１７６−１８０、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７４：２８８−２９４、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３−２６７４０、Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６−３４７３、米国特許第６，６０２，６８４号、Ｕ．Ｓ．Ｓｅｒ．第１０／２７７，３７０号、Ｕ．Ｓ．Ｓｅｒ．第１０／１１３，９２９号、ＰＣＴ  国際公開第ＷＯ００／６１７３９Ａ１号、ＰＣＴ  国際公開第ＷＯ０１／２９２２４６Ａ１号、ＰＣＴ  国際公開第ＷＯ０２／３１１１４０Ａｌ号、ＰＣＴ  国際公開第ＷＯ０２／３０９５４Ａ１号、ＰｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔＴＭ技術（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．、ＧｌｙｃｏＭＡｂＴＭグリコシル化改変技術（Ｇｌｙｃａｒｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を参照されたい）。したがって、一実施形態では、本発明の抗体のＦｃ領域は、アミノ酸残基の変更されたグリコシル化を含む。別の実施形態では、アミノ酸残基の変更されたグリコシル化は、低下したエフェクタ機能をもたらす。別の実施形態では、アミノ酸残基の変質グリコシル化は、増加したエフェクタ機能をもたらす。具体的な実施形態では、Ｆｃ領域は、低減したフコシル化を有する。別の実施形態では、Ｆｃ領域は、アフコシル化される（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２２６８６７号を参照されたい）。別の実施形態では、少なくとも１つのガラクトース部分が、α２，６連結によって各末端シアル酸部分に接続される等、Ｆｃ領域がシアル酸付加される（例えば、国際公開第ＷＯ２００９０７９３８２号を参照）。
【０１１２】
結合構成要素は、ＩＬ−１Ｒ１によって仲介される障害、特に、関節リウマチ、変形性関節症（ＯＡ）、喘息、および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）等の炎症性障害を治療および／または予防するために有用である。結合構成要素はまた、ＨＩＶ−１、固形腫瘍、白血病、アルツハイマー病、および虚血性疾患等の、ＩＬ−１Ｒ１によって仲介される障害を治療および／または予防するためにも有用である。
【０１１３】
本発明のさらなる態様は、本発明の結合構成要素を含有する組成物と、治療法によるヒトまたは動物体の治療の方法を含む、ＩＬ−１Ｒ１を阻害および／または中和する方法でのそれらの使用とを提供する。
【０１１４】
例えば、本発明による結合構成要素は、治療および／または予防の方法で使用することができ、または、ヒトあるいは動物体における（例えば、ヒト患者における）、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生物学的反応、疾患、障害、または病態の診断の方法で使用することができる。
【０１１５】
治療および／または予防の方法は、ＩＬ−１Ｒ１を測定可能に中和するのに十分な量で、本発明の結合構成要素を該患者に投与することを含み得る。本発明に従って治療可能な病態は、ＣＯＰＤおよび喘息等の、ＩＬ−１Ｒ１が役割を果たすあらゆるものを含む。
【０１１６】
本発明の結合構成要素は、ヒトまたは動物被験体、特にヒトにおける、診断または治療の方法で使用することができる。本発明の結合構成要素は、ヒトまたは動物被験体、特にヒトにおける、診断または治療の方法で使用するための薬物の調製で使用することができる。本発明はさらに、ヒトまたは動物被験体、特にヒトにおける、診断または治療のための本発明の結合構成要素の使用を提供する。治療は、ＩＬ−１Ｒ１によって仲介される生物学的効果によって特徴付けられる障害、特に、関節リウマチ、変形性関節症（ＯＡ）、喘息、およびＣＯＰＤ等の炎症性障害を含む。
【０１１７】
したがって、本発明は、本発明の結合構成要素を哺乳動物に投入することを含む、該哺乳動物における関節リウマチ、変形性関節症、喘息、およびＣＯＰＤ等の炎症性障害を治療するための方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、哺乳動物における関節リウマチ、変形性関節症、喘息、およびＣＯＰＤ等の炎症性障害の治療のための薬物の製造での本発明の結合構成要素の使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、哺乳動物における関節リウマチ、変形性関節症、喘息、およびＣＯＰＤ等の炎症性障害の治療のための本発明の結合構成要素の使用を提供する。一実施形態では、哺乳動物はヒトであり、別の実施形態では、哺乳動物はヒト以外の動物である。一実施形態では、結合構成要素は、ＩＬ−１Ｒ１を中和するのに十分な量での本発明の抗体、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインである。
【０１１８】
したがって、本発明は、本発明の結合構成要素を哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物の肺の中への好中球動員および走化性の阻害のための方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、哺乳動物の肺の中への好中球動員および走化性の阻害のための薬物の製造での本発明の結合構成要素の使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、哺乳動物の肺の中への好中球動員および走化性の阻害のための本発明の結合構成要素の使用を提供する。一実施形態では、哺乳動物はヒトであり、別の実施形態では、哺乳動物はヒト以外の動物である。一実施形態では、結合構成要素は、ＩＬ−１Ｒ１を中和するのに十分な量での本発明の抗体、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインである。
【０１１９】
したがって、本発明は、本発明の結合構成要素を哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物におけるＨＩＶ、固形腫瘍、白血病、アルツハイマー病、２型糖尿病、虚血性疾患、およびアテローム性動脈硬化症から選択される障害を治療するための方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、哺乳動物におけるＨＩＶ、固形腫瘍、白血病、アルツハイマー病、２型糖尿病、虚血性疾患、およびアテローム性動脈硬化症から選択される障害の治療のための薬物の製造での本発明の結合構成要素の使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、哺乳動物におけるＨＩＶ、固形腫瘍、白血病、アルツハイマー病、２型糖尿病、虚血性疾患、およびアテローム性動脈硬化症から選択される障害の治療のための本発明の結合構成要素の使用を提供する。一実施形態では、哺乳動物はヒトであり、別の実施形態では、哺乳動物はヒト以外の動物である。一実施形態では、結合構成要素は、ＩＬ−１Ｒ１を中和するのに十分な量での本発明の抗体、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインである。
【０１２０】
被検細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで本発明の結合構成要素と接触させられる場合、対照細胞はまた、陽性対照（例えば、結合構成要素を含有しない反応）および／または陰性対照（例えば、ＩＬ−１Ｒ１および／または抗原を含有しない反応）のために使用されてもよい。
【０１２１】
例えば、ＩＬ−１αおよび／またはＩＬ−１β介在の生物学的反応を示す哺乳動物に、本発明の結合構成要素を投与することによって、細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで結合構成要素と接触させられる場合、本発明の結合構成要素は、ＩＬ−１Ｒ１を中和するのに十分な量で投与される。
【０１２２】
なおもさらに、本発明は、本発明の抗体、ＶＨドメイン、またはＶＬドメイン等の結合構成要素を投与することを含む、ヒト等の哺乳動物におけるＩＬ−１Ｒ１介在の活性を低減するための方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、哺乳動物におけるＩＬ−１Ｒ１介在の活性を低減するための薬物の製造での本発明の結合構成要素の使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、哺乳動物におけるＩＬ−１Ｒ１介在の活性を低減するための本発明の結合構成要素の使用を提供する。一実施形態では、哺乳動物はヒトであり、別の実施形態では、哺乳動物はヒト以外の動物である。一実施形態では、結合構成要素は、ＩＬ−１Ｒ１を中和し、ＩＬ−１Ｒ１介在活性を低減するのに十分な量での本発明の抗体、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインである。
【０１２３】
本発明の結合構成要素を使用することができる疾患または障害は、以下を含むが、それらに限定されない。
【０１２４】
１．  気道：間欠性および持続性の両方であり、全ての重症度の気管支、アレルギー、内因性、外因性、運動誘発性、薬剤誘発性（アスピリンおよびＮＳＡＩＤ誘発性を含む）、および塵埃誘発性喘息を含む、喘息、および気道過敏反応性の他の原因と、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）と、感染性および好酸球性気管支炎を含む気管支炎と、肺気腫と、気管支拡張症と、嚢胞性線維症と、サルコイドーシスと、農夫肺および関連疾患と、過敏性肺炎と、潜源性線維化性肺胞炎、特発性間質性肺炎、結核およびアスペルギルス症を含む、抗腫瘍療法および慢性感染症ならびに他の真箘感染症に合併する線維症を含む、肺線維症と、肺移植の合併症と、肺血管系の脈管および血栓疾患、ならびに肺高血圧症と、気道の炎症性および分泌性症状と関連する慢性咳、および医原性咳の治療を含む、鎮咳活性と、薬物性鼻炎および血管運動神経性鼻炎を含む、急性および慢性鼻炎と、神経性鼻炎（枯草熱）を含む通年性または季節性アレルギー性鼻炎と、鼻茸と、風邪、および呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザ、コロナウイルス（ＳＡＲＳを含む）、アデノウイルスによる感染症を含む、急性ウイルス感染と、ＡＲＤＳおよびＡＬＩとを含む、気道の閉塞性疾患。
【０１２５】
２．  骨および関節：原発性関節症、および、例えば先天性股関節形成不全に続発する関節症の両方である、変形性関節症／骨関節症と関連する、または変形性関節症／骨関節症を含む、関節炎と、頸部および腰部脊椎炎、ならびに腰痛および頸痛と、関節リウマチおよびスティル病と、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、および未分化脊椎関節炎を含む、血清反応陰性脊椎関節炎と、敗血症性関節炎、ならびに、ポット病およびポンセット症候群を含む、結核等の他の感染症関連関節炎および骨疾患と、尿酸塩痛風、ピロリン酸カルシウム沈着症、ならびにカルシウムアパタイト関連の腱、滑液、および滑膜炎症を含む、急性および慢性結晶誘発性滑膜炎と、ベーチェット症候群と、原発性および続発性シェーグレン症候群と、全身性硬化症および限局性強皮症と、全身性紅斑性狼瘡、混合結合組織病、および未分化結合組織病と、皮膚筋炎および多発性筋炎を含む炎症性筋疾患と、リウマチ性多発筋痛と、あらゆる関節分布の特発性炎症性関節炎および関連症候群を含む、若年性関節炎、ならびにリウマチ熱およびその全身性合併症と、巨細胞性動脈炎、高安動脈炎、チャーグ・ストラウス症候群、結節性多発動脈炎、顕微鏡的多発性動脈炎、ならびにウイルス感染、超過敏反応、クリオグロブリン、およびパラプロテインと関連する血管炎を含む、血管炎と、腰痛と、家族性地中海熱、マックル・ウェルズ症候群、および家族性アイルランド熱、川崎病、菊池病と、薬剤誘発性関節痛、腱炎、および筋疾患。
【０１２６】
３．  傷害、例えば、スポーツ傷害、または疾患による、疼痛、および筋骨格疾患の結合組織再形成：関節炎（例えば、関節リウマチ、変形性関節症、痛風、または結晶性関節症）、他の関節疾患（椎間板変性または顎関節変性等）、骨再形成疾患（骨粗鬆症、パジェット病、または骨壊死等）、多発性軟骨炎、強皮症、混合結合組織疾患、脊椎関節症、または歯周病（歯周炎等）。
【０１２７】
４．  皮膚：乾癬、類乾癬、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、または他の湿疹性皮膚疾患、および遅延型超過敏反応と、植物性および光線皮膚炎と、脂漏性皮膚炎、疱疹状皮膚炎、扁平苔癬、萎縮性苔癬硬化症、壊疽性膿皮症、皮膚類肉腫、円板状紅斑性狼瘡、天疱瘡、類天疱瘡、表皮水疱症、菌状息肉腫、蕁麻疹、血管浮腫、血管炎、中毒疹、皮膚好酸球増加症、円形脱毛症、男性型はげ頭症、スイート症候群、ウェーバー・クリスチャン症候群、多形紅斑と、感染性および非感染性の両方である蜂巣炎と、脂肪織炎と、皮膚リンパ腫、非黒色腫皮膚癌、および他の異形成病変と、固定薬疹を含む薬剤誘発性疾患。
【０１２８】
５．  目：眼瞼炎と、通年性および春季アレルギー性結膜炎を含む結膜炎と、虹彩炎と、前部および後部ブドウ膜炎と、脈絡膜炎と、自己免疫と、網膜に影響を及ぼす変性または炎症性疾患と、交換性眼炎を含む眼炎と、サルコイドーシスと、ウイルス、真箘、および細菌感染を含む感染症。
【０１２９】
６．  消化管：舌炎、歯肉炎、歯周炎と、逆流を含む食道炎と、好酸球性胃腸炎、肥満細胞症、クローン病、大腸炎、例えば、潰瘍性大腸炎、不確定大腸炎、直腸炎、顕微鏡的大腸炎、肛門掻痒症と、セリアック病、過敏性腸症候群、過敏性腸疾患、非炎症性下痢、および腸から遠隔に影響を及ぼす場合がある（例えば、片頭痛、鼻炎、または湿疹）食物関連アレルギー。
【０１３０】
７．  腹部：自己免疫性、アルコール性、およびウイルス性肝炎を含む肝炎と、肝臓の線維症および肝硬変と、胆嚢炎と、急性および慢性両方である膵臓炎。
【０１３１】
８．  泌尿生殖器：間質性腎炎および糸球体腎炎を含む腎炎と、ネフローゼ症候群と、急性および慢性（間質性）膀胱炎およびハンナー潰瘍を含む、膀胱炎と、急性および慢性尿道炎、前立腺炎、精巣上体炎、卵巣炎、および卵管炎と、外陰腟炎と、ペーロニー病と、勃起機能不全（男性および女性の両方）。
【０１３２】
９．  同種移植の拒絶反応：例えば、腎臓、心臓、肝臓、肺、骨髄、皮膚、または角膜の移植後、または、輸血後の急性および慢性拒絶反応、あるいは、急性および慢性移植片対宿主病。
【０１３３】
１０．  中枢神経系：アルツハイマー病、ならびにＣＪＤおよびｎｖＣＪＤを含む他の認知疾患と、アミロイドーシスと、多発性硬化症および他の脱髄性症候群と、脳アテローム性動脈硬化症および血管炎と、側頭動脈炎と、重症筋無力症と、内臓痛、頭痛、片頭痛、三叉神経痛、非定型顔面痛、関節および骨痛、癌および腫瘍浸潤に起因する疼痛、糖尿病性、ヘルペス後、およびＨＩＶ関連神経障害を含む、神経障害性疼痛症候群を含む、急性および慢性疼痛（中枢起源であるか、末梢起源であるかにかかわらず、急性、間欠性、または持続性）と、熱帯性痙性不全対麻痺、神経サルコイドーシスと、悪性、感染性、または自己免疫過程の中枢および末梢神経系合併症。
【０１３４】
１１．  橋本甲状腺炎、グレーブス病、アディソン病、糖尿病、特発性血小板減少性紫斑病、好酸球性筋膜炎、高ＩｇＥ症候群、抗リン脂質症候群を含む、他の自己免疫およびアレルギー性障害（他のアレルギー療法との組み合わせを含む）と、早期分娩。
【０１３５】
１２．  後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、癩病、セザリー症候群、および傍腫瘍症候群を含む、炎症性または免疫成分を伴う他の障害。
【０１３６】
１３．  心臓血管：冠状動脈および末梢循環に影響を及ぼす、アテローム性動脈硬化症と、心膜炎と、心筋炎、心筋類肉腫を含む炎症性および自己免疫心筋症と、虚血再灌流障害と、心内膜炎、弁膜炎、および感染性（例えば、梅毒性）大動脈炎を含む大動脈炎と、血管炎と、深部静脈血栓症および静脈瘤の合併症を含む、静脈炎および血栓症を含む近位および末梢静脈の疾患。
【０１３７】
１４．  腫瘍学：転移性疾患および腫瘍再発、ならびに傍腫瘍症候群の予防および治療を含む、前立腺、乳房、肺、卵巣、膵臓、腸管および結腸、胃、皮膚および脳の腫瘍を含む、一般的な癌、および、骨髄に影響を及ぼす悪性腫瘍（白血病を含む）、ならびにホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫等のリンパ球増殖系に影響を及ぼす悪性腫瘍の治療。
【０１３８】
したがって、ＩＬ−１Ｒ１の結合および中和に関して本明細書で提示されるデータは、障害の重症度の低減を含む、そのような障害を治療または予防するために、本発明の結合構成要素を使用できることを示す。したがって、本発明は、上記の障害のうちのいずれかの少なくとも１つの症状が低減されるように、本発明の１つ以上の結合構成要素の有効量を、単独で、または、当技術分野で公知であるか、あるいは本明細書で説明される別の薬物との併用治療計画で、それを必要としている患者に投与することを含む、本明細書で記述される障害のうちのいずれかの少なくとも１つの症状の重症度を治療または低減する方法を提供する。
【０１３９】
本発明の結合構成要素は、適切な動物で、および疾患の動物モデル、特にサルで、使用されてもよい。
【０１４０】
したがって、本発明の結合構成要素は、ＩＬ−１Ｒ１、例えば、ＩＬ−１Ｒ１産生、発現、および／または活性、特に、異常産生、発現、または活性を伴う、疾患または障害の治療において、治療薬として有用である。治療の方法は、それを必要としている患者に本発明の結合構成要素の有効量を投与するステップを含み得、それにより、ＩＬ−１Ｒ１の産生、発現、および／または活性が、減少させられる。治療の方法は、（ｉ）例えば、上で説明される診断方法を使用して、その増加したＩＬ−１Ｒ１またはＩＬ−１レベルまたは活性を示す患者を特定することと、（ｉｉ）患者に発明の結合構成要素の有効量を投与することをとを含み得、ＩＬ−１Ｒ１の増加した産生、発現、および／または活性が、減少させられる。治療の代替的方法は、（ｉ）ＩＬ−１Ｒ１介在活性の明白な増加はないが、本発明の結合構成要素の投与が有益であると考えられる患者を特定することと、（ｉｉ）患者に発明の結合構成要素の有効量を投与することをとを含み得る。本発明による有効量は、必ずしも疾病または疾患を治癒しないが、治療されている特定の疾患または障害の少なくとも１つの症状の重症度を減少または低下させるよう、ＩＬ−１Ｒ１の増加した産生、発現、および／または活性を減少させる量である。
【０１４１】
本発明はまた、ＩＬ−１Ｒ１の少なくとも１つの効果が拮抗されるように、本発明の１つ以上の結合構成要素の有効量と接触させる、または投与するステップを含む、ＩＬ−１Ｒ１の該少なくとも１つの効果を拮抗する方法も提供する。本発明の方法によって拮抗され得るＩＬ−１Ｒ１の効果は、ＩＬ−１αおよび／またはＩＬ−１βによって仲介される生物学的反応、およびこれらの結合反応の結果として発生する、あらゆる下流効果を含む。
【０１４２】
したがって、本発明のさらなる態様は、本明細書で論じる、ＩＬ−１Ｒ１と関連する、またはＩＬ−１Ｒ１によって仲介される障害を治療するための薬物の製造のための、本発明の抗体、ＶＨドメイン、またはＶＬドメイン等の単離結合構成要素の使用を提供する。薬物または医薬組成物のそのような使用、または作製方法は、薬学的に容認可能な賦形剤で結合構成要素を製剤化することを含む。
【０１４３】
薬学的に容認可能な賦形剤は、医薬組成物に入り、２次反応を引き起こさず、例えば、活性化合物の投与の促進、その寿命および／または体内での有効性の増加、溶液中でのその可溶性の増加、あるいはその保存の向上を可能にする、化合物または化合物の組み合わせであり得る。これらの薬学的に容認可能な賦形剤は、周知であり、選択された活性化合物の投与の性質およびモードに応じて、当業者によって適応される。
【０１４４】
本発明の結合構成要素は通常、結合構成要素に加えて少なくとも１つの成分を含み得る、医薬組成物の形態で投与される。したがって、本発明による医薬組成物であって、本発明に従って使用するための医薬組成物は、活性成分に加えて、薬学的に容認可能な賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、または当業者に周知である他の材料を含んでもよい。そのような材料は、非毒性であるべきであり、活性成分の有効性を妨げるべきではない。担体または他の材料の正確な性質は、以下で論じられるように、経口、吸入、気管内、局所、膀胱内、または注射によるものであり得る、投与の経路に依存する。
【０１４５】
例えば、単一ドメイン抗体分子（例えば、「ｎａｎｏｂｏｄｙＴＭ」）等の、経口投与用の医薬組成物も、本発明で構想される。そのような経口製剤は、錠剤、カプセル、粉末、液体、または半固体形態であり得る。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバント等の固体担体を含み得る。液体医薬組成物は、概して、水、石油、動物または植物油、鉱油、または合成油等の、液体担体を含む。生理食塩水、デキストロースまたは他のサッカリド溶液、または、エチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコール等のグリコール類が含まれてもよい。
【０１４６】
静脈注射、または苦痛部位における注射のために、活性成分は、発熱物質を含まず、好適なｐＨ、等張性、および安定性を有する、非経口的に容認可能な水溶液の形態となる。当業者であれば、例えば、塩化ナトリウム注射、リンガー液注射、乳酸加リンガー液注射等の等張媒介物を使用して、好適な溶液を調製することが十分可能である。リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸等の緩衝剤と、アスコルビン酸およびメチオニン等の酸化防止剤と、防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール、メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール、３’−ペンタノール、およびｍ−クレゾール等）と、低分子量ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質と、ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマーと、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン等のアミノ酸と、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物と、ＥＤＴＡ等のキレート化剤と、蔗糖、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール等の糖類と、ナトリウム等の塩形成対イオンと、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）と、および／または、ＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤とを含む、防腐剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤、および／または他の添加剤が、必要に応じて採用されてもよい。
【０１４７】
本発明の結合構成要素は、分子の物理化学的特性および送達経路に応じて、液体、半固体、固体形態で製剤化されてもよい。製剤は、賦形剤または賦形剤の組み合わせ、例えば、糖類、アミノ酸、および界面活性剤を含んでもよい。液体製剤は、広範囲の抗体濃度およびｐＨを含み得る。固体製剤は、例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥、または超臨界流体技術による乾燥によって産生することができる。抗ＩＬ−１Ｒ１の製剤は、意図された送達経路に依存し、例えば、肺送達用の製剤は、吸入時に肺深部への浸透を確実にする物理的特性を伴う粒子から成り得、局所製剤（例えば、瘢痕、例えば皮膚瘢痕の治療用）は、薬剤が作用部位に常在する時間を長引かせる、粘度修飾剤を含んでもよい。結合構成要素は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムを含む、制御放出製剤等の、急速放出に対して結合構成要素を保護する担体を伴って調製されてもよい。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の、生分解性の生体適合性ポリマーも使用することができる。そのような製剤の調製のための多くの方法が、当業者に公知である［６５］。
【０１４８】
抗ＩＬ−１Ｒ１処置は、経口で（例えば、単一ドメイン抗体分子（例えば、「ｎａｎｏｂｏｄｙＴＭ」）等）、注射によって（例えば、皮下、関節内、静脈内、腹腔内、動脈内、または筋肉内）、気管内吸入によって、膀胱内経路（膀胱への注入）によって、また局所的に（例えば、眼内、鼻腔内、直腸、創傷の中へ、皮膚上に）、与えられてもよい。処置は、特に、結合構成要素の漸減投与量によるパルス注入によって、投与されてもよい。投与経路は、処置の物理化学的特性によって、疾患に対する特別な考慮事項によって、または有効性を最適化するまたは副作用を最小限化するための要件によって決定されてもよい。１つの特定の投与経路は、静脈内である。本発明の医薬組成物を投与する別の経路は、皮下である。抗ＩＬ−１Ｒ１処置は、診療所での使用に制限されないことが構想される。したがって、針を含まないデバイスを使用する皮下注射も有利である。
【０１４９】
静脈内製剤の実施例は、
２５ｍＭヒスチジン、
１２０ｍＭ塩化ナトリウム
ｐＨ６．０、
を含む。
【０１５０】
ＩＬ−１Ｒ１に対する結合構成要素、またはＩＬ−１Ｒ１に対する結合構成要素を含む組成物は、付加的な薬用成分と併せた併用療法の一部として使用されてもよい。併用治療、特に、１つ以上の他の薬剤との抗ＩＬ−１Ｒ１結合構成要素の組み合わせを、有意な相乗効果を提供するために使用することができる。ＩＬ−１Ｒ１に対する結合構成要素は、本明細書で記載される病態のうちの１つ以上の治療のために、同時に、または連続的に、あるいは別の治療薬との複合調合薬として投与されてもよい。
【０１５１】
本発明の結合構成要素は、気道の閉塞性疾患、喘息、アレルギー性疾患、またはＩＬ−１Ｒ１介在効果を伴う他の疾患等の、ＩＬ−１Ｒ１介在疾患に対する他の利用可能な治療と組み合わせて製剤化および／または使用されてもよい。
【０１５２】
本発明による結合構成要素は、単独療法として、または以下の薬剤のうちの１つ以上と組み合わせて、あるいはそれらに加えて、提供されてもよい。
【０１５３】
−  α、β、および／またはγインターフェロン等の、サイトカイン、またはサイトカイン機能の作動薬あるいは拮抗薬（例えば、ＳＯＣＳ系の調節剤等のサイトカイン信号伝達経路に作用する薬剤）と、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、その受容体および関連結合タンパク質と、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−２から−３３のうちの１つ以上、および／またはアナキンラ等のインターロイキン拮抗薬あるいは阻害剤と、インターロイキン族構成要素の受容体の阻害剤、またはそのような受容体の特定のサブユニットの阻害剤、抗ＴＮＦモノクローナル抗体（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、および／またはＣＤＰ−８７０）等の腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）阻害剤、および／またはＴＮＦ受容体拮抗薬、例えば、免疫グロブリン分子（エタネルセプト等）と、および／またはペントキシフィリン等の低分子量薬剤。
【０１５４】
−Ｂ細胞の調節剤、例えば、Ｂリンパ球を標的とするモノクローナル抗体（ＣＤ２０（リツキシマブ）またはＭＲＡ−ａＩＬ１６Ｒ等）またはＴリンパ球を標的とすするモノクローナル抗体（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＨｕＭａｘ  Ｉｌ−１５、またはアバタセプト）。
【０１５５】
−破骨細胞活性を阻害する調節剤、例えば、ＲＡＮＫＬに対する抗体。
【０１５６】
−（Ｃ−Ｃ族については）ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ２Ａ、ＣＣＲ２Ｂ、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、およびＣＣＲ１１、（Ｃ−Ｘ−Ｃ族については）ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、およびＣＸＣＲ６、Ｃ−Ｘ３−Ｃ族についてはＣＸ３ＣＲ１の拮抗薬等の、ケモカインまたはケモカイン受容体機能の調節剤。
【０１５７】
−  マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の阻害剤、すなわち、ストロメライシン、コラゲナーゼ、およびゲラチナーゼのうちの１つ以上、ならびにアグリカナーゼ、特に、コラゲナーゼ−１（ＭＭＰ−１）、コラゲナーゼ−２（ＭＭＰ−８）、コラゲナーゼ−３（ＭＭＰ−１３）、ストロメライシン−１（ＭＭＰ−３）、ストロメライシン−２（ＭＭＰ−１０）、および／またはストロメライシン−３（ＭＭＰ−１１）、および／またはＭＭＰ−９、および／またはＭＭＰ−１２、例えば、ドキシサイクリン等の薬剤。
【０１５８】
−  ロイコトリエン生合成阻害剤、５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）阻害剤、またはジロートン等の５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質（ＦＬＡＰ）拮抗薬と、ＡＢＴ−７６１と、フェンロイトンと、テポキサリンと、Ａｂｂｏｔｔ−７９１７５と、Ａｂｂｏｔｔ−８５７６１と、Ｎ−（５−置換）−チオフェン−２−アルキルスルホンアミドと、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノールヒドラゾンと、Ｚｅｎｅｃａ  ＺＤ−２１３８等のメトキシテトラヒドロピランと、化合物ＳＢ−２１０６６１と、Ｌ−７３９，０１０等のピリジニル置換２−シアノナフタレン化合物と、Ｌ−７４６，５３０等の２−シアノキノリン化合物と、ＭＫ−５９１、ＭＫ−８８６、および／またはＢＡＹ  ｘ  １００５等の、インドールおよび／またはキノリン化合物。
【０１５９】
−  Ｌ−６５１，３９２等のフェノチアジン−３−１から成る群より選択される、ロイコトリエン（ＬＴ）Ｂ４、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、およびＬＴＥ４に対する受容体拮抗薬と、ＣＧＳ−２５０１９ｃ等のアミジノ化合物と、オンタゾラスト等のベンゾキサラミンと、ＢＩＩＬ  ２８４／２６０等のベンゼンカルボキシミドアミドと、ザフィルルカスト、アブルカスト、モンテルカスト、プランルカスト、ベルルカスト（ＭＫ−６７９）、ＲＧ−１２５２５、Ｒｏ−２４５９１３、イラルカスト（ＣＧＰ  ４５７１５Ａ）、およびＢＡＹ  ｘ  ７１９５等の化合物。
【０１６０】
−  メチルキサンタニン等のホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤、例えば、テオフィリンおよび／またはアミノフィリンと、および／または、選択的ＰＤＥアイソザイム阻害剤、例えば、ＰＤＥ４阻害剤および／またはイソ型ＰＤＥ４Ｄの阻害剤、および／またはＰＤＥ５の阻害剤。
【０１６１】
−  セチリジン、ロラタジン、デスロラタジン、フェキソフェナジン、アクリバスチン、テルフェナジン、アステミゾール、アゼラスチン、レボカバスチン、クロルフェニラミン、プロメタジン、シクリジン、および／またはミゾラスチン等の、ヒスタミン１型受容体拮抗薬（概して、経口的、局所的、または非経口的に適用される）。
【０１６２】
−  プロトンポンプ阻害剤（オメプラゾール等）または胃保護ヒスタミン２型受容体拮抗薬。
【０１６３】
−  ヒスタミン４型受容体の拮抗薬。
【０１６４】
−  プロピルヘキセドリン、フェニレフリン、フェニルプロパノールアミン、エフェドリン、プソイドエフェドリン、塩酸ナファゾリン、塩酸オキシメタゾリン、塩酸テトラヒドロゾリン、塩酸キシロメタゾリン、塩酸トラマゾリン、および塩酸エチルノルエピネフリン等の、α−１／α−２アドレナリン受容体作動薬血管収縮交感神経様作用薬。
【０１６５】
−  抗コリン剤、例えば、アトロピン、ヒヨスチン、グリコピロレート、臭化イプラトロピウム、臭化チオトロピウム、臭化オキシトロピウム、ピレンゼピン、およびテレンゼピン等の、ムスカリン受容体（Ｍ１、Ｍ２、およびＭ３）拮抗薬。
【０１６６】
−  イソプレナリン、サルブタモール、フォルモテロール、サルメテロール、テルブタリン、オルシプレナリン、ビトルテロールメシレート、および／またはピルブテロール等のβ−アドレナリン受容体作動薬（β受容体サブタイプ１−４を含む）、例えば、そのキラルエナンチオマー。
【０１６７】
−  クロモン、例えば、クロモグリク酸ナトリウムおよび／またはネドクロミルナトリウム。
【０１６８】
−  フルニソリド、トリアムシノロンアセトニド、ベクロメタゾンジプロピオネート、ブデソニド、プロピオン酸フルチカゾン、シクレソニド、および／またはフロ酸モメタゾン等の、グルココルチコイド。
【０１６９】
−  ＰＰＡＲ等の核ホルモン受容体を調節する薬剤。
【０１７０】
−  本発明の結合構成要素と同じエピトープまたは異なるエピトープに結合する抗ＩＬ−１Ｒ１等の、免疫グロブリン（Ｉｇ）またはＩｇ調合薬、あるいはＩｇ機能を調節する拮抗薬または抗体。
【０１７１】
−  他の全身もしくは局所適用抗炎症剤、例えば、サリドマイドまたはその誘導体、レチノイド、ジトラノール、および／またはカルシポトリオール。
【０１７２】
−  スルファサラジン、メサラジン、バルサラジド、およびオルサラジン等の、アミノサリチル酸およびスルファピリジンの組み合わせと、チオプリン等の免疫調節剤と、ブデソニド等のコルチコステロイド。
【０１７３】
−  抗菌剤、例えば、ペニシリン誘導体、テトラサイクリン、マクロライド、ベータラクタム、フルオロキノロン、メトロニダゾール、および／または吸入アミノグリコシドと、および／または抗ウイルス剤、例えば、アシクロビル、ファムシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、シドフォビルと、アマンタジンと、リマンタジンと、リバビリンと、ザナミビルおよび／またはオセルタミビルと、インジナビル、ネルフィナビル、リトナビル、および／またはサキナビル等のプロテアーゼ阻害剤と、ジダノシン、ラミブジン、スタブジン、ザルシタビン、ジドブジン等のヌクレオシド逆転写阻害剤と、ネビラピン、エファビレンツ等の非ヌクレオシド逆転写阻害剤。
【０１７４】
−  以下のような心血管薬：
１）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（例えば、スタチン）等の抗脂質異常症剤と、ＰＰＡＲａ作動薬（フィブレート、例えば、ゲムフィブロジル）と、胆汁酸抑制薬（コレスチラミン）と、コレステロール吸収阻害剤（植物スタノール、合成阻害剤）と、胆汁酸吸収阻害剤（ＩＢＡＴｉ）ならびにニコチン酸および類似体（ナイアシンおよび徐放製剤）；
２）β遮断薬（例えば、アテノロール、インデラル）等の抗高血圧薬と、ＡＣＥ阻害剤（例えば、リシノプリル）と、カルシウム拮抗薬（例えば、ニフェジピン）と、アンギオテンシン受容体拮抗薬（例えば、カンデサルタン）、拮抗薬、および利尿薬（例えば、フロセミド、ベンズチアジド）；
３）抗血栓剤、線維素溶解の活性剤、抗血小板剤等の止血調節剤と、トロンビン拮抗薬と、Ｘａ因子阻害剤と、ＶＩＩａ因子阻害剤と、抗血小板剤（例えば、アスピリン、クロピドグレル）と、抗凝血剤（ヘパリンおよび低分子量類似体、ヒルジン）およびワルファリン；
４）グルカゴンの作用に拮抗する薬剤；
５）非ステロイド性抗炎症剤（例えば、アスピリン）およびステロイド性抗炎症剤（例えば、コルチゾン）等の抗炎症剤；
６）ペントキシフィリン等の血液細胞形態の調節剤。
【０１７５】
−  以下のような抗糖尿病薬：
１）インスリンおよびインスリン類似体；
２）スルホニルウレア（例えば、グリベンクラミド、グリピジド）、食事グルコース調節剤（例えば、レパグリニド、ナテグリニド）を含む、インスリン分泌促進剤；
３）インクレチン作用を向上させる薬剤（例えば、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤、例えば、サクサグリプチン、シタグリプチン、ビルダグリプチン、またはアログリプチン、およびＧＬＰ−１作動薬）；
４）ＰＰＡＲγ作動薬（例えば、ピオグリタゾンおよびロシグリタゾン）、ならびに複合ＰＰＡＲαおよびγ活性を伴う薬剤を含む、インスリン感作剤；
５）肝臓のグルコースバランスを調節する薬剤（例えば、メトホルミン、フルクトース１，６ビスホスファターゼ阻害剤、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ阻害剤）；
６）腸からのグルコースの吸収を低減するように設計されている薬剤（例えば、アカルボース）；
７）腎臓によるグルコースの再吸収を妨げる薬剤（ＳＧＬＴ阻害剤）；
８）長期高血糖症の合併症を治療するように設計されている薬剤（例えば、アルドース還元酵素阻害剤）。
【０１７６】
−  ノルアドレナリン／セロトニン非選択的再取り込み阻害剤等の抗肥満剤。
【０１７７】
−  抗うつ剤（セルトラリン等）、抗パーキンソン病薬（デプレニル、Ｌ−ドーパ、ロピニロール、プラミペキソール、セレジンおよびラサジリン等のＭＡＯＢ阻害剤、タスマー等のｃｏｍＰ阻害剤、Ａ−２阻害剤、ドーパミン再取り込み阻害剤、ＮＭＤＡ拮抗薬、ニコチン作動薬、ドーパミン作動薬、および／または神経型一酸化窒素シンターゼの阻害剤等）、ドネペジル、リバスチグミン、タクリンＣＯＸ−２阻害剤、プロペントフィリン、またはメトリホネート等の、抗アルツハイマー病薬等の、中枢神経系剤。
【０１７８】
−  急性および慢性疼痛の治療のための薬剤、例えば、オピオイド類似体または誘導体、カルバマゼピン、フェニトイン、バルプロ酸ナトリウム、アミトリプチリンまたは他の抗うつ剤、パラセタモール、または非ステロイド性抗炎症剤等の、中枢または末梢作用鎮痛剤。
【０１７９】
−  リグノカインまたはその類似体等の、非経口または局所適用（吸入を含む）局所麻酔薬。
【０１８０】
−  抗骨粗鬆症剤、例えば、ラロキシフェン等のホルモン剤、またはアレンドロネート等のビスホスホネート。
【０１８１】
−  （ｉ）トリプターゼ阻害剤、（ｉｉ）血小板活性化因子（ＰＡＦ）拮抗薬、（ｉｉｉ）インターロイキン変換酵素（ＩＣＥ）阻害剤、（ｉｖ）ＩＭＰＤＨ阻害剤、（ｖ）ＶＬＡ−４拮抗薬を含む接着分子阻害剤、（ｖｉ）カテプシン、（ｖｉｉ）キナーゼ阻害剤、例えば、チロシンキナーゼの阻害剤（Ｂｔｋ、Ｉｔｋ、Ｊａｋ３  ＭＡＰ等、阻害剤の実施例は、ゲフィチニブ、メシル酸イマチニブを含む場合がある）、セリン／トレオニンキナーゼ（例えば、ｐ３８、ＪＮＫ、タンパク質キナーゼＡ、Ｂ、およびＣ、ならびにＩＫＫ等の、ＭＡＰキナーゼの阻害剤）、または細胞周期調節に関与するキナーゼ（例えば、サイクリン依存性キナーゼ）、（ｖｉｉｉ）グルコース−６リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、（ｉｘ）キニン−Ｂ．ｓｕｂ１．−および／またはＢ．ｓｕｂ２．−受容体拮抗薬、（ｘ）抗痛風剤、例えば、コルヒチン、（ｘｉ）キサンチンオキシダーゼ阻害剤、例えば、アロプリノール、（ｘｉｉ）尿酸排泄剤、例えば、プロベネシド、スルフィンピラゾン、および／またはベンズブロマロン、（ｘｉｉｉ）成長ホルモン分泌促進物質、（ｘｉｖ）形質転換成長因子（ＴＧＦβ）、（ｘｖ）血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、（ｘｖｉ）線維芽細胞成長因子、例えば、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、（ｘｖｉｉ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、（ｘｖｉｉｉ）カプサイシンクリーム、（ｘｉｘ）ＮＫＰ−６０８Ｃ、ＳＢ−２３３４１２（タルネタント）、および／またはＤ−４４１８等の、タキキニンＮＫ．ｓｕｂ１．および／またはＮＫ．ｓｕｂ３．受容体拮抗薬、（ｘｘ）エラスターゼ阻害剤、例えば、ＵＴ−７７および／またはＺＤ−０８９２、（ｘｘｉ）ＴＮＦ−α変換酵素阻害剤（ＴＡＣＥ）、（ｘｘｉｉ）誘導型一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）阻害剤、または（ｘｘｉｉｉ）ＴＨ２細胞で発現される化学誘引物質受容体相同分子（ＣＲＴＨ２拮抗薬等）、（ｘｘｉｖ）Ｐ３８の阻害剤、（ｘｘｖ）トール様受容体（ＴＬＲ）の機能を調節する薬剤、および（ｘｘｖｉ）Ｐ２Ｘ７等のプリン受容体の活性を調節する薬剤、（ｘｘｖｉｉ）ＮＦｋＢ、ＡＰＩ、および／またはＳＴＡＴＳ等の、転写因子活性化の阻害剤。
【０１８２】
本発明による結合構成要素はまた、単独療法として、あるいは、従来の手術または放射線療法または癌化学療法と組み合わせて、あるいはそれらに加えて、提供されてもよい。そのような癌化学療法は、以下の抗腫瘍剤の分類のうちの１つ以上を含んでもよい。
【０１８３】
（ｉ）アルキル化剤（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロランブシル、ブスルファン、テモゾラミド、およびニトロソ尿素）、代謝拮抗剤（例えば、ゲムシタビン、ならびに、５−フルオロウラシルおよびテガフールのようなフルオロピリミジン、ラルチトレキセド、メトトレキセート、シトシンアラビノシド、およびヒドロキシ尿素等の、抗葉酸剤）、抗腫瘍抗生物質（例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシン、およびミトラマイシンのようなアントラサイクリン類）、抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビンのようなビンカアルカロイド類、ならびにタキソールおよびタキソテールのようなタキソイド類、およびポロキナーゼ阻害剤）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシドおよびテニポシド等のエピポドフィロトキシン類、アムサクリン、トポテカン、およびカンプトテシン）等の、医学的腫瘍学で使用される抗増殖／抗腫瘍薬およびそれらの組み合わせ。
【０１８４】
（ｉｉ）抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン、フルベストラント、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、およびヨードキシフェン）、抗アンドロゲン剤（例えば、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、および酢酸シプロテロン）、ＬＨＲＨ拮抗薬またはＬＨＲＨ作動薬（例えば、ゴセレリン、リュープロレリン、およびブセレリン）、プロゲストゲン（例えば、酢酸メゲストロール）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ボラゾール、およびエキセメスタン）、およびフィナステリド等の５α−還元酵素の阻害剤等の、細胞増殖抑制剤。
【０１８５】
（ｉｉｉ）抗浸潤剤［例えば、４−（６−クロロ−２，３−メチレンジオキシアニリノ）−７−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エトキシ］−５−テトラヒドロピラン−４−イルオキシキナゾリン（ＡＺＤ０５３０、国際公開第ＷＯ０１／９４３４１）、Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−｛６−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］−２−メチルピリミジン−４−イルアミノ｝チアゾール−５−カルボキサミド（ダサチニブ、ＢＭＳ−３５４８２５；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００４，４７，６６５８−６６６１）、およびボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）のような、ｃ−Ｓｒｃキナーゼ族阻害剤、ならびに、マリマスタット、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化受容体機能の阻害剤、またはヘパラナーゼに対する抗体の阻害剤のようなメタロプロテイナーゼ阻害剤］。
【０１８６】
（ｉｖ）成長因子機能の阻害剤、例えば、そのような阻害剤は、成長因子抗体および成長因子受容体抗体（例えば、抗ｅｒｂＢ２抗体トラスツズマブ［ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ］、および抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブ、抗ｅｒｂＢ１抗体セツキシマブ［Ｅｒｂｉｔｕｘ、Ｃ２２５］、およびＳｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ／ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００５，Ｖｏｌ．５４，ｐｐ  １１−２９によって開示されている任意の成長因子または成長因子受容体抗体）を含み、そのような阻害剤はまた、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、上皮成長因子族の阻害剤（例えば、Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ゲフィチニブ、ＺＤ  １８３９）、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン（エルロチニブ、ＯＳＩ−７７４）、および６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）−キナゾリン−４−アミン（ＣＩ  １０３３）等のＥＧＦＲ族チロシンキナーゼ阻害剤、ラパチニブ等のｅｒｂＢ２チロシンキナーゼ阻害剤、肝細胞成長因子族の阻害剤、インスリン成長因子族の阻害剤、イマチニブおよび／またはニロチニブ（ＡＭＮ  １０７）等の、血小板由来成長因子族の阻害剤、セリン／トレオニンキナーゼの阻害剤（例えば、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤等のＲａｓ／Ｒａｆ信号伝達阻害剤、例えば、ソラフェニブ（ＢＡＹ  ４３−９００６）、ティピファニブ（Ｒ１１５７７７）、およびロナファーニブ（ＳＣＨ６６３３６））、ＭＥＫおよび／またはＡＫＴキナーゼを通した細胞信号伝達の阻害剤、ｃ−ｋｉｔ阻害剤、ａｂｌキナーゼ阻害剤、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、Ｐｌｔ３キナーゼ阻害剤、ＣＳＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、ＩＧＦ受容体（インスリン様成長因子）キナーゼ阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤（例えば、ＡＺＤ１１５２、ＰＨ７３９３５８、ＶＸ−６８０、ＭＬＮ８０５４、Ｒ７６３、ＭＰ２３５、ＭＰ５２９、ＶＸ−５２８、およびＡＸ３９４５９）、ならびにＣＤＫ２および／またはＣＤＫ４阻害剤等のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤も含む。
【０１８７】
（ｖ）血管内皮成長因子の効果を阻害するもの等の抗血管新生剤［例えば、抗血管内皮細胞成長因子抗体ベバシズマブ（ＡｖａｓｔｉｎＴＭ）、例えば、バンデタニブ（ＺＤ６４７４）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、スニチニブ（ＳＵ１１２４８）、アクシチニブ（ＡＧ−０１３７３６）、パゾパニブ（ＧＷ  ７８６０３４）、および４−（４−フルオロ−２−メチルインドール−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１、国際公開第ＷＯ００／４７２１２号内の実施例２４０）等のＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤、国際特許出願国際公開第ＷＯ９７／２２５９６号、国際公開第ＷＯ９７／３００３５号、国際公開第ＷＯ９７／３２８５６号、および国際公開第ＷＯ９８／１３３５４号で開示されているもの等の化合物、他の機構によって機能する化合物（例えば、リノマイド、インテグリンαｖβ３機能の阻害剤、およびアンジオスタチン）］。
【０１８８】
（ｖｉ）コンブレタスタチンＡ４、ならびに、国際特許出願国際公開第ＷＯ９９／０２１６６号、国際公開第ＷＯ００／４０５２９号、国際公開第ＷＯ００／４１６６９号、国際公開第ＷＯ０１／９２２２４号、国際公開第ＷＯ０２／０４４３４号、および国際公開第ＷＯ０２／０８２１３号で開示されている化合物等の、血管損傷剤。
【０１８９】
（ｖｉｉ）エンドセリン受容体拮抗薬、例えば、ジボテンタン（ＺＤ４０５４）またはアトラセンタン。
【０１９０】
（ｖｉｉｉ）アンチセンス療法、例えば、ＩＳＩＳ  ２５０３、抗ｒａｓアンチセンス等の、上記に記載される標的を対象とするもの。
【０１９１】
（ｉｘ）例えば、異常ｐ５３または異常ＢＲＣＡ１あるいはＢＲＣＡ２等の異常遺伝子を代替するアプローチ、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ、または微生物性ニトロ還元酵素を使用するもの等の、ＧＤＥＰＴ（遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法）アプローチ、および多剤耐性遺伝子療法等の化学療法または放射線療法に対する患者耐容性を増大させるアプローチを含む、遺伝子療法アプローチ。
【０１９２】
（ｘ）例えば、インターロイキン２、インターロイキン４、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子等のサイトカインによるトランスフェクション等の、患者の腫瘍細胞の免疫原性を増大させるｅｘ  ｖｉｖｏアプローチおよびｉｎ  ｖｉｖｏアプローチ、Ｔ細胞アネルギーを減少させるアプローチ、サイトカインがトランスフェクトされた樹状細胞等の、トランスフェクトされた免疫細胞を使用するアプローチ、サイトカインをトランスフェクトさせた腫瘍細胞株を用いたアプローチ、サイトカインがトランスフェクトされた腫瘍細胞系を使用するアプローチ、および抗イディオタイプ抗体を使用するアプローチを含む、免疫療法アプローチ。
【０１９３】
阻害剤は、特異的であってもよく、または、混合阻害剤、例えば、上で記述される分子（例えば、受容体）または分子分類のうちの２つ以上を標的とする阻害剤であってもよい。
【０１９４】
結合構成要素はまた、同時投与において、または免疫抱合体の形態で、チロシンキナーゼ阻害剤等の化学療法剤と関連して使用することもできる。該抗体の断片もまた、組み換え機構または生化学カップリングによって得られる二重特異性抗体で使用することもでき、次いで、上記の抗体の特異性を、ＩＬ−１Ｒ１が関連する活性に関与する他の分子を認識することが可能な他の抗体の特性と関連付ける。
【０１９５】
炎症性疾患、例えば、関節リウマチ、変形性関節症、喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、または乾癬の治療のために、本発明の結合構成要素は、局所または全身に適用される、ピロキシカム、ジクロフェナク、ナプロキセン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、およびイブプロフェン等のプロピオン酸類、メフェナム酸等のフェナメート類、インドメタシン、スリンダク、アザプロパゾン、フェニルブタゾン等のピラゾロン類、アスピリン等のサリチレート類等の、非選択性シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−１／ＣＯＸ−２阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤（メロキシカム、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、ルマロコキシブ、パレコキシブ、およびエトリコキシブ等）、シクロオキシゲナーゼ阻害一酸化窒素ドナー（ＣＩＮＯＤ）、グルココルチコステロイド（局所、経口、筋肉内、静脈内、または関節内経路によって投与される）、メトトレキセート、レフルノミド、ヒドロキシクロロキン、ｄ−ペニシラミン、オーラノフィン、または他の非経口または経口金調合薬、鎮痛剤、ジアセレイン、ヒアルロン酸誘導体等の関節内療法、およびグルコサミン等の栄養補給剤等の、１つ以上の薬剤と組み合わせられてもよい。
【０１９６】
本発明の結合構成要素、および上記の追加の薬用成分のうちの１つ以上は、薬物の製造で使用されてもよい。薬物は、個人への別個または併用投与用であってもよく、したがって、併用調合薬として、または別個の調合薬として、結合構成要素および追加の成分を含んでもよい。別個の調合薬は、別個および連続または同時投与を促進し、異なる経路、例えば、経口および非経口投与による、成分の投与を可能にするために使用されてもよい。
【０１９７】
本発明によれば、提供される組成物は、哺乳動物に投与することができる。投与は通常、「治療的有効量」であり、これは、患者への有益性を示すのに十分である。そのような有益性は、少なくとも１つの症状の少なくとも改善であり得る。実際に投与される量、ならびに投与の速度および時間的経過は、治療されているものの性質および重症度、治療されている特定の哺乳動物、個別患者の臨床症状、障害の原因、組成物の送達の部位、結合構成要素の種類、投与の方法、投与のスケジューリング、および医療従事者に公知である他の因子に依存する。治療の処方、例えば、投与量等についての決定は、一般開業医および他の医師の責任の範囲内であり、症状の重症度および／または治療されている疾病の進行に依存し得る。抗体の適切な投与量は、当技術分野で周知である［６６、６７］。投与されている薬物の種類に対して適宜に、本明細書またはＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（２００３）で示されている具体的な投与量が使用され得る。本発明の結合構成要素の治療的有効量または好適な投与量は、動物モデルにおいて、そのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性およびｉｎ  ｖｉｖｏ活性を比較することによって、決定することができる。マウスおよび他の実験動物からヒトにおける有効投与量を推定するための方法が公知である。正確な投与量は、抗体が診断用であるか、予防用であるか、または治療用であるか、治療される領域のサイズおよび場所、抗体の正確な性質（例えば、全抗体、断片、または二特異性抗体）、および抗体に付着した任意の検出可能な標識または他の分子の性質に依存する。典型的な抗体投与量は、全身性適用については１００μｇから１ｇ、および局所適用については１μｇから１ｍｇの範囲である。初期のより高い負荷投与量が、１回以上のより低い投与量が後に続くように投与されてもよい。典型的には、抗体は、全抗体、例えば、ＩｇＧ１イソタイプ、ＩｇＧ２イソタイプ、ＩｇＧ３イソタイプ、またはＩｇＧ４イソタイプとなる。これは、成人患者の単回治療用の投与量であり、小児および幼児に対して比例的に調整され、また、分子量に比例して他の抗体形式に対しても調整されてもよい。治療は、医師の判断により、毎日、週２回、毎週、または毎月の間隔で繰り返されてもよい。治療は、皮下投与については２週間から４週間ごと、静脈内投与については４週間から８週間ごとであってもよい。治療は周期的であってもよく、投与間の期間は、約２週間以上、例えば、約３週間以上、約４週間以上、または月に約１回である。治療は、手術の前および／または後に与えられてもよく、および／または、外科的治療の解剖学的部位において投与または直接適用されてもよい。
【０１９８】
本発明の結合構成要素はまた、ＩＬ−１Ｒが関与する気道の閉塞性疾患または他の炎症性疾患があるサンプル患者等において、ＩＬ−１Ｒ１の存在または量を検出するため等の診断的有用性も有する。そのような診断的有用性は、本発明の結合構成要素を標識化することを含み得る。
【０１９９】
本発明の結合構成要素は、検出可能または機能的な標識で標識化されてもよい。したがって、結合構成要素または抗体分子は、検出可能および／または定量化可能な信号を得るよう、免疫抱合体の形態で存在することができる。免疫抱合体は、検出可能または機能的な標識に抱合された、本発明の抗体分子を含み得る。標識は、蛍光発光体、放射性標識、酵素、化学発光体、または光線感作物質を含むがそれらに限定されない、信号を産生する、または産生するように誘発することができる、任意の分子となり得る。したがって、結合は、蛍光、発光、放射能、酵素活性、または光吸収を検出することによって検出および／または測定することができる。
【０２００】
好適な標識は、限定ではなく例証として、以下を含む。
【０２０１】
−  アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（「Ｇ６ＰＤＨ」）、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸脱水素酵素、およびペルオキシダーゼ、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の、酵素；
−  色素；
−  フルオレセインおよびその誘導体、蛍光色素、ローダミン化合物および誘導体、ＧＦＰ（「緑色蛍光タンパク質」のＧＦＰ）、ダンシル、ウンベリフェロン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、およびフルオレスカミン等の、蛍光標識または蛍光発光体、ランタニドクリプタートおよびキレート等のフルオロフォア、例えば、ユーロピウム等（Ｐｅｒｋｉｎ  ＥｌｍｅｒおよびＣｉｓ  Ｂｉｏｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；
−  イソルミノール、ルミノール、およびジオキセタン等の化学発光標識または化学発光体；
−  ルシフェラーゼおよびルシフェリン等の生物発光標識；
−  感作物質；
−  補酵素；
−  酵素基質；
−  臭素７７、炭素１４、コバルト５７、フッ素８、ガリウム６７、ガリウム６８、水素３（トリチウム）、インジウム１１１、インジウム１１３ｍ、ヨウ素１２３ｍ、ヨウ素１２５、ヨウ素１２６、ヨウ素１３１、ヨウ素１３３、水銀１０７、水銀２０３、リン３２、レニウム９９ｍ、レニウム１０１、レニウム１０５、ルテニウム９５、ルテニウム９７、ルテニウム１０３、ルテニウム１０５、スカンジウム４７、セレン７５、硫黄３５、テクネチウム９９、テクネチウム９９ｍ、テルル１２１ｍ、テルル１２２ｍ、テルル１２５ｍ、ツリウム１６５、ツリウム１６７、ツリウム１６８、イットリウム１９９、および本明細書で記述される他の放射性標識を含むが、それらに限定されない放射性標識；
−  色素、触媒、または他の検出可能な基でさらに標識化することができる、ラテックスおよび炭素粒子等の粒子、金属ゾル、晶子、リポソーム、細胞等；
−  ビオチン、ジゴキシゲニン、または５−ブロモデオキシウリジン等の分子；
−  緑膿菌外毒素（ＰＥまたはその細胞傷害性断片あるいは突然変異体）、ジフテリア毒素または細胞傷害性断片あるいは突然変異体、ボツリヌス毒素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、またはＦ、リシンまたはその細胞傷害性断片、例えば、リシンＡ、アブリンまたはその細胞傷害性断片、サポリンまたはその細胞傷害性断片、ヤマゴボウ抗ウイルス毒素またはその細胞傷害性断片、およびブリョジン（ｂｒｙｏｄｉｎ）１またはその細胞傷害性断片の群から選択される毒素部分等の、毒素部分。
【０２０２】
好適な酵素および補酵素は、それぞれがそれらの全体で参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｌｉｔｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ４，２７５，１４９、およびＢｏｇｕｓｌａｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ４３１８９８０で開示されている。好適な蛍光発光体および化学発光体は、その全体で参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｌｉｔｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ４２７５１４９で開示されている。標識はさらに、特定の同種検出可能部分、例えば、標識化されたアビジンまたはストレプトアビジンへの結合を介して検出されてもよい、ビオチン等の化学部分を含む。検出可能な標識は、当技術分野で公知である従来の化学反応を使用して、本発明の抗体に付着することができる。
【０２０３】
免疫抱合体またはそれらの機能的断片は、当業者に公知の方法によって調製することができる。それらは、直接、あるいは、グルタルアルデヒドのようなポリアルデヒド、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）等のスペーサ基または連結基を介して、あるいは、治療用抱合体について上で記述されるもの等の結合剤の存在下で、酵素または蛍光標識に連結することができる。フルオレセイン型の標識を含有する抱合体は、イソチオシアネートとの反応によって調製することができる。
【０２０４】
直接、または上で記述されるＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ等のキレート化剤を介して、治療用放射性同位体を抗体に結合するために存在する、当業者に公知である方法は、診断で使用することができる放射性元素に使用することができる。同様に、クロラミンＴ方法［６８］によるナトリウム１２５を用いて、あるいはＣｒｏｃｋｆｏｒｄらの技法（その全体で参照することにより本明細書に組み込まれる、ＵＳ４４２４２００）による、またはＨｎａｔｏｗｉｃｈ（その全体で参照することにより本明細書に組み込まれる、ＵＳ４，４７９，９３０）によって説明されるようにＤＴＰＡを介して付着されたテクネチウム９９ｍを用いて、標識化を行うことが可能である。
【０２０５】
外部手段によって、例えば、目視検査、電磁放射線、熱、および化学試薬によって検出可能である信号を、標識が産生することができる、多数の方法がある。標識はまた、本発明の抗体に結合する別の結合構成要素に、または支持体に結合させることもできる。
【０２０６】
標識は、信号を直接産生することができ、したがって、信号を産生するために付加的な成分は必要とされない。多数の有機分子、例えば、蛍光発光体は、紫外線および可視光を吸収することができ、その場合、光の吸収は、エネルギーをこれらの分子に伝達し、それらの励起エネルギー状態まで高める。次いで、この吸収されたエネルギーは、第２の波長における発光によって消散される。この第２の波長の発光はまた、エネルギーを標識化されたアクセプタ分子に伝達し得、結果として生じたエネルギーは、発光、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって、アクセプタ分子から消散される。信号を直接産生する他の標識は、放射性同位体および色素を含む。
【０２０７】
代替として、標識は、信号を産生するために他の成分を必要とし得、その場合、信号産生システムは、測定可能な信号を産生するために必要とされる全ての成分を含むこととなり、それらは、酵素産物、触媒、活性剤、共同因子、阻害剤、スカベンジャー、金属イオン、および信号生成物質の結合のために必要とされる特異的結合物質と反応する、基質、補酵素、エンハンサー、付加的な酵素、物質を含み得る。好適な信号産生システムの詳細な考察は、その全体で参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｕｌｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．ＵＳ５，１８５，２４３で見出すことができる。
【０２０８】
本発明は、ＩＬ−１Ｒ１への本明細書で提供される結合構成要素の結合を引き起こす、または可能にすることを含む、方法を提供する。述べたように、そのような結合は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、ヒトまたは動物（例えば、哺乳動物）への結合構成要素または符号化核酸の投与後に、発生し得、または、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法、免疫細胞化学、免疫沈降、親和性クロマトグラフィ、および生化学アッセイまたは細胞に基づいたアッセイで発生し得る。
【０２０９】
概して、本発明の結合構成要素とＩＬ−１Ｒ１との間の複合体は、とりわけ、酵素結合免疫測定、放射能測定、免疫沈降、蛍光免疫測定、化学発光アッセイ、免疫ブロットアッセイ、側方流動アッセイ、凝集アッセイ、および微粒子に基づいたアッセイによって検出することができる。
【０２１０】
本発明はまた、例えば、バイオセンサシステムにおいて、本発明による結合構成要素を採用することによって、抗原のレベルを直接測定することも提供する。例えば、本発明は、（ｉ）該結合構成要素をＩＬ−１Ｒ１に曝露させることと、（ｉｉ）ＩＬ−１Ｒ１への該結合構成要素の結合を検出し、結合は、本明細書で説明される任意の方法または検出可能な標識を使用して検出すること、を含む、ＩＬ−１Ｒ１への結合を検出および／または測定する方法を含む。この方法、および本明細書で説明される任意の他の結合検出方法は、例えば、検出可能な標識を視覚的に観察することによって、方法を実施する個人によって直接解釈され得る。代替として、この方法、または本明細書で説明される任意の他の結合検出方法は、オートラジオグラフ、写真、コンピュータプリントアウト、フローサイトメトリレポート、グラフ、チャート、結果を含有する試験管または容器またはウェル、または方法の結果の任意の他の視覚的または物理的表示の形態で、レポートを生成することもできる。
【０２１１】
ＩＬ−１Ｒ１への結合構成要素の結合の量を決定することができる。定量法は、診断の対象であり得る、試験サンプルの中の抗原の量に関係し得る。ＩＬ−１Ｒ１結合に対するスクリーニングおよび／またはその定量法は、例えば、本明細書で言及される疾患または障害、および／または、異常ＩＬ−１Ｒ１産生、発現、および／または活性を伴う任意の他の疾病または疾患について、患者をスクリーニングするために有用であり得る。
【０２１２】
本発明の診断方法は、（ｉ）被験体から組織または流体サンプルを取得することと、（ｉｉ）該組織または流体サンプルを本発明の１つ以上の結合構成要素に曝露させることと、（ｉｉｉ）対照サンプルと比較して、結合されたＩＬ−１Ｒ１を検出し、対照と比較したＩＬ−１Ｒ１結合の量の増加が、ＩＬ−１Ｒ１産生、発現、または活性の異常レベルを示しうること、とを含み得る。検査される組織または流体サンプルは、血液、血清、尿、生検材料、腫瘍、または異常ＩＬ−１Ｒ１レベルを含有する疑いがある任意の組織を含む。異常ＩＬ−１Ｒ１レベルまたは活性について陽性である検査の被験体はまた、本明細書で以降に開示される治療方法から便益を得ることができる。
【０２１３】
本発明の診断方法はさらに、固定化された抗原を介して、結合構成要素およびＩＬ−１Ｒ１の複合体を捕捉するステップを含んでもよい。例えば、抗原は、関心のサンプルの中の抗原特異的ＩＬ−１Ｒ１を捕捉するための側方ストリップアッセイ上で固定されてもよい。
【０２１４】
当業者であれば、本明細書で開示される方法に照らして、選好および一般知識に従って、抗原への結合構成要素の結合を判定する好適な様態を選択することが可能である。
【０２１５】
サンプル中の結合構成要素の反応性は、任意の適切な手段によって決定され得る。放射免疫測定（ＲＩＡ）が、１つの可能性である。放射性標識化抗原は、標識化されていない抗原（試験サンプル）と混合され、結合構成要素に結合できるようさせる。結合された抗原が非結合抗原から物理的に分離され、結合構成要素に結合された放射性抗原の量が測定される。より多くの抗原が試験サンプルの中にあるほど、より少ない放射性抗原が結合構成要素に結合する。競合的結合アッセイも、抗原またはレポータ分子に連結された類似体を使用して、非放射性抗原とともに使用することができる。レポータ分子は、スペクトルで単離された吸収または発光特性を伴う、蛍光色素、蛍光体、またはレーザ色素であってもよい。好適な蛍光色素は、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、およびテキサスレッド、およびランタニドキレートまたはクリプタートを含む。好適な発色色素は、ジアミノベンジジンを含む。
【０２１６】
他のレポータは、着色された、磁性である、または常磁性であるラテックスビーズ、および、直接または間接的に、検出可能な信号を視覚的に観察させ、電子的に検出させ、または別様に記録させることができる、生物学的または化学的活性薬剤等の、高分子コロイド粒子または粒子材料を含む。これらの分子は、例えば、発色または変色させる、あるいは電気的特性の変化を引き起こす、反応を触媒する酵素であり得る。それらは、エネルギー状態間の電子遷移が、特徴的なスペクトル吸収または放出をもたらすように、分子的に励起可能であってもよい。それらは、バイオセンサと併せて使用される化学物質を含んでもよい。ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンおよびアルカリホスファターゼ検出システムが採用されてもよい。
【０２１７】
個々の結合構成要素・レポータ抱合体によって生成される信号は、サンプル（正常および試験）中の関連結合構成要素の結合の定量化可能な絶対または相対データを導出するために使用されてもよい。
【０２１８】
本発明の任意の態様および実施形態による結合構成要素を含む、キットも、本発明の態様として提供される。キットにおいて、結合構成要素は、例えば、以下でさらに説明されるように、サンプル中のその反応性が判定されることを可能にするように標識化されてもよい。さらに、結合構成要素は、固体支持材に付着されてもされなくてもよい。キットの成分は、概して、無菌性であり、密閉バイアルまたは他の容器の中にある。キットは、結合構成要素が有用である診断分析または他の方法で採用されてもよい。キットは、方法における、例えば、本発明による方法における、成分の使用説明書を含有してもよい。そのような方法の実施を支援する、または可能にする付属材料が、本発明のキット内に含まれてもよい。付属材料は、第１の結合構成要素に結合し、検出可能な標識（例えば、蛍光標識、放射性同位体、または酵素）に抱合される、第２の異なる結合構成要素を含む。抗体に基づいたキットはまた、免疫沈降を行うためのビーズを含んでもよい。キットの各成分は、概して、独自の好適な容器の中にある。したがって、これらのキットは、概して、各結合構成要素にとって好適である別個の容器を備える。さらに、キットは、アッセイ、ならびにアッセイの実施によって得られるデータを解釈および分析するための方法を実施するための使用説明書を備えてもよい。
【０２１９】
本発明はまた、競合アッセイにおいて抗原レベルを測定するための、上記の結合構成要素の使用、つまり、競合アッセイにおいて、本発明によって提供される結合構成要素を採用することによって、サンプル中の抗原のレベルを測定する方法を提供する。これは、非結合抗原からの結合抗原の物理的分離が必要とされない場合であり得る。物理的または光学的変化が結合に発生するように、レポータ分子を結合構成要素に連結することが、１つの可能性である。レポータ分子は、定量化可能であり得る、検出可能な信号を直接または間接的に生成することができる。レポータ分子の連結は、直接または間接的に、共有結合的に、例えば、ペプチド結合を介して、または非共有結合的に行われてもよい。ペプチド結合を介した連結は、抗体およびレポータ分子をコードする遺伝子融合の組み換え発現の結果であり得る。
【０２２０】
一実施形態では、本発明は、（ｉ）ＩＬ−１Ｒ１を支持体に固定化することと、
（ｉｉ）同時に、または段階的に、本発明による少なくとも１つのタグ付きまたは標識化結合構成要素、および１つ以上の未タグまたは未標識化試験結合化合物と、該固定化されたＩＬ−１Ｒ１を接触させることと、（ｉｉｉ）タグ付き結合構成要素からの結合されたタグの量の減少を観察することによって、新しいＩＬ−１Ｒ１結合化合物を同定することとを含む、ＩＬ−１Ｒ１結合化合物を同定する方法を含む。そのような方法は、マルチウェルまたはアレイ形式を使用して、高スループット方式で実施することができる。そのようなアッセイはまた、溶液中で実施されてもよい。例えば、その全体で参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．５，８１４，４６８を参照されたい。上で説明されるように、結合の検出は、例えば、検出可能な標識、またはその存在の減少を視覚的に観察することによって、方法を実施する個人によって直接解釈され得る。代替として、本発明の結合方法は、オートラジオグラフ、写真、コンピュータプリントアウト、フローサイトメトリレポート、グラフ、チャート、結果を含有する試験管または容器またはウェル、または方法の結果の任意の他の視覚的または物理的表示の形態で、レポートを生成することができる。
【０２２１】
本発明はさらに、本発明の結合構成要素をコードする単離核酸を提供する。核酸は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含んでもよい。一実施形態では、本発明は、ＣＤＲまたは一式のＣＤＲ、あるいはＶＨドメインまたはＶＬドメイン、あるいは抗体抗原結合部位または抗体分子、例えば、本発明のｓｃＦｖまたはＩｇＧｌをコードする、核酸を提供する。
【０２２２】
さらなる側面では、本発明は、本発明の結合構成要素、本発明によるＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインをコードする配列を含む、単離核酸を提供する。例えば、配列番号９２、２、１２２、１０２、１２、６２、２２、３２、７２、４２、１１２、５２、および８２は、本発明の例示的なＶＨドメインをコードし、配列番号９７、７、１２７、１０７、１７、６７、２７、３７、７７、４７、１１７、５７、および８７は、本発明の例示的なＶＬドメインをコードする。
【０２２３】
本発明はまた、上記のような少なくとも１つの核酸を含む、プラスミド、ベクター、転写、または発現カセットの形態の構築物も提供する。
【０２２４】
本発明はまた、上記のような１つ以上の構築物を含む、組み換え宿主細胞も提供し、またコードされた産物の産生の方法を提供し、その方法は、該コードする構築物からの発現を含む。発現は、適切な条件下で、構築物を含有する組み換え宿主細胞を培養することによって、便宜的に達成することができる。発現による産生後、ＶＨまたはＶＬドメイン、あるいは結合構成要素は、任意の好適な技法を使用して単離および／または精製され、次いで、適宜に使用することができる。
【０２２５】
本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよく、また完全または部分的に合成であってもよい。本明細書で記述されるヌクレオチド配列への言及は、特定配列を伴うＤＮＡ分子を包含し、かつ文脈上他の意味を必要としない限り、ＵがＴと置換される、特定配列を伴うＲＮＡ分子を包含する。
【０２２６】
さらなるは、抗体またはＶＨ可変ドメインの産生の方法であって、コードする核酸からの発現を引き起こすことを含む、方法を提供する。そのような方法は、該抗体ＶＨ可変ドメインの産生のための条件下で宿主細胞を培養するステップを含んでもよい。
【０２２７】
ＶＨおよび／またはＶＬドメインを含む抗体等の、ＶＬ可変ドメインおよび結合構成要素の産生のための類似方法が、本発明のさらなる態様として提供される。
【０２２８】
産生の方法は、産物の単離および／または精製のステップを含んでもよい。産生の方法は、薬学的に容認可能な賦形剤等の、少なくとも１つの付加的な成分を含む組成物に、産物を処方することを含んでもよい。
【０２２９】
種々の異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローン化および発現のためのシステムが周知である。好適な宿主細胞は、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、糸状菌、酵母およびバキュロウイルス系、ならびにトランスジェニック植物および動物を含む。原核細胞における抗体および抗体断片の発現が、当技術分野で十分確立されている。論評については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ［６９］を参照されたい。一般的な細菌宿主は大腸菌である。
【０２３０】
培養液中の真核細胞における発現も、結合構成要素の産生のための選択肢として、当業者に利用可能である［７０、７１、７２］。異種ポリペプチドの発現のために当技術分野で利用可能な哺乳動物細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、幼生ハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウスメラノーマ細胞、ＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞、ヒト胚腎臓細胞、ヒト胚網膜細胞、およびその他多くを含む。
【０２３１】
プロモーター配列、終了配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および他の配列を適宜に含む、適切な調節配列を含有する好適なベクターを選択または構築することができる。ベクターは、適宜に、プラスミド、例えば、ファージミド、またはウイルス性、例えば、‘ファージであってもよい［７３］。核酸の操作、例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入、および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析のための多くの公知の技法およびプロトコルが、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．［７４］で詳細に説明されている。
【０２３２】
本発明のさらなる態様は、本明細書で開示される核酸を含有する宿主細胞を提供する。そのような宿主細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにあってもよく、かつ培養液中にあってもよい。そのような宿主細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにあってもよい。宿主細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ存在は、「細胞内抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）」または細胞内の抗体として、本発明の結合構成要素の細胞内発現を可能にすることができる。細胞内抗体は、遺伝子療法に使用することができる。
【０２３３】
本発明はまた、結合構成要素、ＶＨドメイン、および／またはＶＬドメインの産生を引き起こす条件下で該核酸を発現させることと、結合構成要素を単離または精製することによってそれを回収することとを含む、本発明の該結合構成要素、ＶＨドメイン、および／またはＶＬドメインを調製する方法も含む。
【０２３４】
なおもさらなる態様は、宿主細胞に本発明の核酸を導入することを含む方法を提供する。導入は、任意の利用可能な技法を採用してもよい。真核細胞については、好適な技法は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム介在トランスフェクション、および、レトロウイルスまたは他のウイルス、例えば、ワクシニア、または昆虫細胞についてはバキュロウイルスを使用する、形質導入を含んでもよい。宿主細胞、特に、真核細胞に核酸を導入するには、ウイルス性またはプラスミドに基づいたシステムを使用してもよい。プラスミドシステムは、エピソームに維持されてもよく、または、宿主細胞に、あるいは、人工染色体に組み込まれてもよい。組み込みは、単一または複数の遺伝子座における１つ以上のコピーのランダムまたは標的化組み込みによるものであってもよい。細菌細胞については、好適な技法は、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、およびバクテリオファージを使用するトランスフェクションを含み得る。
【０２３５】
導入の後には、例えば、遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養することによって、核酸からの発現を引き起こす、または可能にすることが続いてもよい。発現された産物の精製は、当業者に公知である方法によって達成することができる。
【０２３６】
本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）に組み込まれてもよい。組み込みは、標準的技法に従って、ゲノムとの組み換えを推進する配列を含むことによって推進されてもよい。
【０２３７】
本発明はまた、上記のような結合構成要素またはポリペプチドを発現させるために、発現系において上で記述されるような構築物を使用することを含む、方法も提供する。
【０２３８】
一般に、特に、マウス由来のモノクローナル抗体またはそれらの機能的断片の調製のために、特に、手引書「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」［７５］で説明されている技法、またはＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ［７６］によって説明されているハイブリドーマからの調製の技法を参照することが可能である。
【０２３９】
モノクローナル抗体は、例えば、ＩＬ−１Ｒ１または該モノクローナル抗体によって認識されるエピトープを含有するその断片のうちの１つに対して免疫がある動物から取得された細胞から取得することができる。それらを含む、好適な断片およびペプチドまたはポリペプチドを、ＩＬ−１Ｒ１に対する抗体を生成するように動物に免疫を与えるために使用することができる。該ＩＬ−１Ｒ１、またはその断片のうちの１つは、特に、通常の作業方法に従って、ＩＬ−１Ｒ１またはその断片をコードするｃＤＮＡ配列に含有された核酸配列から開始する遺伝子組み換えによって、ＩＬ−１Ｒ１および／またはその断片のペプチド配列に含まれるアミノ酸の配列から開始するペプチド合成によって、産生することができる。
【０２４０】
モノクローナル抗体は、例えば、ＩＬ−１Ｒ１、または該モノクローナル抗体によって認識されるエピトープを含有するその断片のうちの１つが、前もってに固定されている、親和性カラム上で精製することができる。より具体的には、モノクローナル抗体は、プロテインＡおよび／またはＧ上のクロマトグラフィによって精製することができ、その後に、それ自体の中の残留タンパク質汚染物質ならびにＤＮＡおよびリポ多糖（ＬＰＳ）を排除することを目的とした、イオン交換クロマトグラフィが続くか、または続かず、その後に、二量体または他の多量体の存在による潜在的凝集体を排除するために、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭゲル上での排除クロマトグラフィが続くか、または続かない。一実施形態では、これらの技法の全体を同時または順番にに使用することができる。
【０２４１】
モノクローナルおよび他の抗体を取り、標的抗原に結合する他の抗体またはキメラ分子を産生するために組み換えＤＮＡ技術の技法を使用することが可能である。そのような技法は、抗体の免疫グロブリン可変領域またはＣＤＲをコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域、またはフレームワーク領域および定常領域に導入するステップを含んでもよい。例えば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ  ２１８８６３８Ａ、またはＥＰ−Ａ−２３９４００、および大半の後続の文献を参照されたい。抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞は、遺伝子突然変異または他の変化を受けてもよく、それは、産生される抗体の結合特異性を変更してもしなくてもよい。
【０２４２】
抗体改変の技術分野で利用可能なさらなる技法は、ヒトおよびヒト化抗体を単離することを可能にしている。例えば、ヒトハイブリドーマを、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ［７７］によって説明されているように作製することができる。結合構成要素を生成するための別の確立された技法である、ファージ提示法が、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ［７７］、ならびに国際公開第ＷＯ９２／０１０４７号（以下でさらに詳細に論議される）、ならびに米国特許ＵＳ第５，９６９，１０８、ＵＳ５，５６５，３３２、ＵＳ５，７３３，７４３、ＵＳ５，８５８，６５７、ＵＳ５，８７１，９０７、ＵＳ５，８７２，２１５、ＵＳ５，８８５，７９３、ＵＳ５，９６２，２５５、ＵＳ６，１４０，４７１、ＵＳ６，１７２，１９７、ＵＳ６，２２５，４４７、ＵＳ６，２９１，６５０、ＵＳ６，４９２，１６０、およびＵＳ６，５２１，４０４等の、多くの出版物で詳細に説明されている。
【０２４３】
マウス抗体遺伝子が非活性化され、ヒト抗体遺伝子と機能的に置換される一方で、マウス免疫系の他の成分が原型を保っている、トランスジェニックマウスを、ヒト抗体を単離するために使用することができる［７８］。ヒト化抗体は、例えば、国際公開第ＷＯ９１／０９９６７号、ＵＳ５，５８５，０８９、ＥＰ５９２１０６、ＵＳ５，５６５，３３２、および国際公開第ＷＯ９３／１７１０５号で開示されている技法等の、当技術分野で公知の方法を使用して産生することができる。さらに、国際公開第ＷＯ２００４／００６９５５号は、非ヒト抗体の可変領域のＣＤＲ配列に対する正準ＣＤＲ構造型を、ヒト抗体配列のライブラリ、例えば、生殖細胞系抗体遺伝子セグメントからの対応するＣＤＲに対する正準ＣＤＲ構造型と比較することによって、ヒト抗体遺伝子から可変領域骨格配列を選択することに基づいて、抗体をヒト化するための方法を説明している。非ヒトＣＤＲに類似する正準ＣＤＲ構造型を有する、ヒト抗体可変領域は、そこからヒト骨格配列を選択する、構成要素ヒト抗体配列の一部を形成する。一部の構成要素はさらに、ヒトおよび非ヒトＣＤＲ配列の間のアミノ酸類似性によってランク付けされてもよい。国際公開第ＷＯ２００４／００６９５５号の方法では、選択された一部の構成要素のヒトフレームワークを使用して、ヒトＣＤＲ配列を非ヒトＣＤＲ対応物と機能的に置換する、キメラ抗体を構築するための骨格配列を提供するように、最高位のヒト配列が選択され、それにより、非ヒトおよびヒト抗体の間でフレームワーク配列を比較する必要なく、高親和性および低免疫原性のヒト化抗体を提供する。
【０２４４】
合成抗体分子は、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．［７９］またはＫｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．［８０］によって説明されるように、好適な発現ベクター内で合成され、組み立てられたオリゴヌクレオチドを用いて生成される、遺伝子からの発現によって作成されてもよい。
【０２４５】
上で記述されるように、本発明による結合構成要素は、ＩＬ−１Ｒ１の生物活性を調節し、かつ中和し得る。本明細書で説明されるように、本発明のＩＬ−１Ｒ１結合構成要素は、中和能力について最適化されてもよい。概して、能力の最適化は、結合構成要素のライブラリを生成するように、選択された結合構成要素の配列（通常、抗体の可変ドメイン配列）を突然変異させることを伴い、次いで、それらは能力について分析され、より有能な結合構成要素が選択される。したがって、選択された「能力最適化」結合構成要素は、そこからライブラリが生成された結合構成要素よりも高い能力を有する傾向がある。それにも関わらず、高能力結合構成要素はまた、最適化を伴わずに取得され得、例えば、高能力結合構成要素は、初期スクリーニング、例えば、生化学中和アッセイから、直接取得されてもよい。「能力最適化」結合構成要素とは、特定の活性または下流機能の中和の最適化された能力を伴う結合構成要素を指す。アッセイおよび能力は、本明細書の他の場所で、さらに詳細に説明される。本発明は、能力最適化結合構成要素および非最適化結合構成要素の両方、ならびに選択された結合構成要素からの能力最適化のための方法を提供する。したがって、本発明は、当業者が、高能力を有する結合構成要素を生成することを可能にする。
【０２４６】
能力最適化は、所与の結合構成要素からより高い能力の結合構成要素を生成するために使用されてもよいが、能力最適化を伴わなくても高能力結合構成要素が取得し得ることも留意される。
【０２４７】
さらなる態様では、本発明は、抗原に結合することが可能な１つ以上の結合構成要素を取得するための方法であって、本発明による結合構成要素のライブラリおよび該抗原を接触させることと、該抗原に結合することができるライブラリの１つ以上の結合構成要素を選択することとを含む、方法を提供する。
【０２４８】
ライブラリは、粒子または分子複合体、例えば、酵母、細菌またはバクテリオファージ（例えば、Ｔ７）粒子、ウイルス、細胞、または共有結合、リボソーム、あるいは他のｉｎ  ｖｉｔｒｏ提示系等の、複製可能な遺伝子パッケージ上で提示されてもよく、各粒子または分子複合体は、その上で提示される抗体ＶＨ可変ドメイン、また、随意で、存在するならば提示されるＶＬドメイン上をコードする核酸を含有する。ファージ提示法は、それぞれが、それらの全体で参照することにより本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ９２／０１０４７、ならびに、例えば、米国特許ＵＳ第５，９６９，１０８、ＵＳ５，５６５，３３２、ＵＳ５，７３３，７４３、ＵＳ５，８５８，６５７、ＵＳ５，８７１，９０７、ＵＳ５，８７２，２１５、ＵＳ５，８８５，７９３、ＵＳ５，９６２，２５５、ＵＳ６，１４０，４７１、ＵＳ６，１７２，１９７、ＵＳ６，２２５，４４７、ＵＳ６，２９１，６５０、ＵＳ６，４９２，１６０、およびＵＳ６，５２１，４０４で説明されている。
【０２４９】
抗原に結合することが可能であり、バクテリオファージまたは他のライブラリ粒子あるいは分子複合体上で提示される、結合構成要素の選択後に、核酸は、選択された結合構成要素を提示する、バクテリオファージまたは他の粒子あるいは分子複合体から採取されてもよい。そのような核酸は、該選択された結合構成要素を提示する、バクテリオファージまたは他の粒子あるいは分子複合体から取得された核酸の配列を伴う、核酸からの発現によって、結合構成要素または抗体ＶＨあるいはＶＬ可変ドメインの後続産生で使用されてもよい。
【０２５０】
該選択された結合構成要素の抗体ＶＨ可変ドメインのアミノ酸配列を伴う、抗体ＶＨ可変ドメインは、そのようなＶＨドメインを含む結合構成要素のように、単離形態で提供されてもよい。
【０２５１】
ＩＬ−１Ｒ１に結合する能力、また、ＩＬ−１Ｒ１に結合するために、例えば、親抗体分子（抗体１または４）または抗体分子２、３、５から１０（例えば、ｓｃＦｖ形式および／またはＩｇＧ形式における、例えば、ＩｇＧ１）と競合する能力も、さらに検査することができる。本明細書の他の場所でさらに論じられるように、ＩＬ−１Ｒ１を中和する能力を検査することができる。
【０２５２】
本発明による結合構成要素は、親（抗体１または４）または他の抗体分子、例えば、ｓｃＦｖ、あるいは抗体２、３、５から１０のうちの１つ、例えば、ＩｇＧ１の親和性で、またはより良好である親和性で、結合することができる。
【０２５３】
本発明による結合構成要素は、親（抗体１または４）または他の抗体分子、抗体２、３、５から１０のうちの１つ、例えば、ｓｃＦｖまたはＩｇＧ１の能力で、またはより良好である能力で、ＩＬ−１Ｒ１の生物活性を中和することができる。
【０２５４】
異なる結合構成要素の結親和性および中和能力は、適切な条件下で比較することができる。
【０２５５】
アミノ酸配列が本明細書で記述されるものを含み、ＩＬ−１Ｒ１に対する結合構成要素で採用することができる、本発明のＶＨおよびＶＬドメインならびにＣＤＲの変異体は、配列の変更または突然変異の方法、および所望の特性を伴う抗原結合構成要素のスクリーニングを用いて取得することができる。所望の特性は、以下を含むが、それらに限定されない。
【０２５６】
・  抗原に対して特異的である公知の抗体と比較した、抗原への増加した結合親和性
・  活性が分かっている場合、抗原に対して特異的である公知の抗体と比較した、抗原活性の増加した中和
・  特定のモル比における、公知の抗体またはリガンドとの抗原への特定競合能力
・  複合体を免疫沈降させる能力
・  特定エピトープに結合する能力
−  線形エピトープ、例えば、本明細書で説明されるようなペプチド結合スキャンを使用して、例えば、線形および／または制約立体配座でスクリーニングされたペプチドを使用して同定される、ペプチド配列
−  不連続残基によって形成される、立体構造エピトープ
・  ＩＬ−１Ｒ１の新しい生物活性または下流分子を調節する能力。そのような方法も本明細書で提供される。
【０２５７】
本明細書で開示される抗体分子の変異体が、本発明で産生され、使用されてもよい。構造／特性・活性関係［８１］に多変量データ分析技法を適用する計算化学の先導後に、統計的回帰、パターン認識、および分類等の、周知の数学的技法を使用して、抗体の定量的活性・特性関係を導出することができる［８２、８３、８４、８５、８６、８７］。抗体の特性は、抗体配列、機能的および３次元構造の経験的および理論的モデル（例えば、考えられる接触残基または計算された物理化学的特性の分析）から導出することができ、これらの特性は、単独で、かつ組み合わせて考慮することができる。
【０２５８】
ＶＨドメインおよびＶＬドメインから成る抗体抗原結合部位は、典型的には、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）からの３つ、および重鎖可変ドメイン（ＶＨ）からの３つである、ポリペプチドの６つのループによって形成される。公知の原子構造の抗体の分析が、抗体結合部位の配列と３次元構造との間の関係を解明している［８８、８９］。これらの関係は、ＶＨドメインの第３の領域（ループ）を除いて、結合部位ループが、正準構造である少数の主鎖立体配座のうちの１つを有することを示唆する。特定のループにおいて形成される正準構造は、そのサイズと、ループおよびフレームワーク領域の両方における主要部位での特定の残基の存在とによって、決定されることが示されている［８８、８９］。
【０２５９】
この配列・構造関係の研究は、配列は知られているが、そのＣＤＲループの３次元構造を維持する際に重要であり、したがって、結合特異性を維持する、３次元構造が未知である抗体におけるこれらの残基の予測に使用することができる。これらの予測は、先導最適化実験からの出力との予測の比較によって裏付けることができる。構造的アプローチでは、ＷＡＭ［９１］等の任意の無料入手可能または市販パッケージを使用して、抗体分子のモデルを作成することができる［９０］。次いで、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ．）またはＤｅｅｐ  Ｖｉｅｗ［９２］等のタンパク質可視化および分析ソフトウェアパッケージを、ＣＤＲにおける各位置での可能な置換を評価するために使用することができる。次いで、この情報は、活性に最小限の影響、または有益な効果を及ぼす可能性のある置換を行うために使用することができる。
【０２６０】
ＣＤＲ、抗体ＶＨまたはＶＬドメイン、および結合構成要素のアミノ酸配列内で置換を行うために必要とされる技法は、概して、当技術分野で利用可能である。活性に最小限の影響、または有益な効果を及ぼすことが予測され得、またはされ得ない置換を伴って、変異配列が作製され、ＩＬ−１Ｒ１を結合および／または中和する能力について、および／または任意の他の所望の特性について検査することができる。
【０２６１】
本発明で採用される可変ドメインは、任意の生殖細胞系または再編成ヒト可変ドメインから取得または導出されてもよく、または、公知のヒト可変ドメインのコンセンサスまたは実際の配列に基づく、合成可変ドメインであってもよい。可変ドメインは、非ヒト抗体から導出することができる。本発明のＣＤＲ配列（例えば、ＨＣＤＲ３）は、組み換えＤＮＡ技術を使用して、ＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ３）が欠けている可変ドメインのレパートリーに導入されてもよい。例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．［９３］は、可変ドメイン領域の５’末端に方向付けられる、またはそれに隣接するコンセンサスプライマーが、ＣＤＲ２が欠けているＶＨ可変ドメインのレパートリーを提供するために、ヒトＶＨ遺伝子の第３のフレームワーク領域へのコンセンサスプライマーと併せて使用される、抗体可変ドメインのレパートリーを産生する方法を説明している。Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．はさらに、どのようにこのレパートリーが特定の抗体のＣＤＲ２と組み合わせられ得るかを説明している。類似の技法を使用して、本発明のＣＤＲ２由来配列は、ＣＤＲ２が欠けているＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーとシャッフルされてもよく、シャッフルされた完全なＶＨまたはＶＬドメインは、本発明の結合構成要素を提供するように、同種ＶＬまたはＶＨドメインと組み合わせられてもよい。次いで、好適な結合構成要素が選択され得るように、レパートリーは、その全体で参照することにより本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ９２／０１０４７号、またはＫａｙ、Ｗｉｎｔｅｒ、およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ［９４］を含む、大部分の文献のいずれかのファージ提示系等の、好適な宿主系で提示することができる。レパートリーは、１０４個以上の個別構成要素、例えば、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、または少なくとも１０１０個以上の構成要素から成ってもよい。他の好適な寄主系には、限定されないが、酵母ディスプレイ、バクテリアディスプレイ、Ｔ７ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、細胞ディスプレイ、リボゾームディスプレイ、および共有結合ディスプレイが挙げられる。
【０２６２】
ＩＬ−１Ｒ１抗原に対する結合構成要素を調製する方法が提供され、その方法は、
（ａ）置き換えられるＣＤＲ２を含むか、またＣＤＲ２コード領域が欠けている、ＶＨドメインをコードする核酸の開始レパートリーを提供することと、
（ｂ）ＶＨドメインをコードする核酸の産物レパートリーを提供するよう、ドナー核酸がレパートリーの中のＣＤＲ２領域に挿入されるように、ＶＨ  ＣＤＲ２について実質的に本明細書で記述されるアミノ酸配列をコードする該ドナー核酸と、該レパートリーを組み合わせることと、
（ｃ）該産物レパートリーの核酸を発現させることと、
（ｄ）ＩＬ−１Ｒ１に対する結合構成要素を選択することと、
（ｅ）該結合構成要素またはそれをコードする核酸を回収することと、
を含む。
【０２６３】
ここでも、本発明のＶＨまたはＶＬ  ＣＤＲ３が、置き換えられるＣＤＲ３を含むか、またＣＤＲ３コード領域が欠けている、ＶＨまたはＶＬドメインをコードする核酸のレパートリーと組み合わせられる、類似の方法を採用することができる。
【０２６４】
同様に、１つ以上または３つ全てのＣＤＲを、ＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーに移植し、ＩＬ−１Ｒ１に対する１つまたは複数の結合構成要素についてスクリーニングすることができる。
【０２６５】
同様に、本明細書で開示される、他のＶＨおよびＶＬドメイン、複数組のＣＤＲおよび複数組のＨＣＤＲ、および／または複数組のＬＣＤＲを採用することができる。
【０２６６】
免疫グロブリン可変ドメインの大きな部分が、それらの介在フレームワーク領域とともに、少なくとも３つのＣＤＲ領域を含んでもよい。該部分はまた、第１および第４のフレームワーク領域のいずれか一方または両方の少なくとも約５０％を含んでもよく、Ｃ末端が第１のフレームワーク領域の５０％であり、Ｎ末端が第４のフレームワーク領域の５０％である。可変ドメインの大きな部分のＮ末端またはＣ末端における追加の残基は、自然発生可変ドメイン領域には通常伴わないものであってもよい。例えば、組み換えＤＮＡ技法によって作製される本発明の結合構成要素の構造は、クローン化または他の操作ステップを促進するように導入されるリンカーによってコードされる、ＮまたはＣ末端残基の導入をもたらし得る。他の操作ステップは、本明細書の他の場所でさらに詳細に論じられるように、抗体定常領域、他の可変ドメイン（例えば、二特異性抗体の産生において）、または検出可能／機能的標識を含む、さらなるタンパク質配列への本発明の可変ドメインに接合するように、リンカーの導入を含む。
【０２６７】
本発明のいくつかの態様では、結合構成要素は、一対のＶＨおよびＶＬドメインを含むが、ＶＨまたはＶＬドメイン配列に基づく単一結合ドメインが、本発明のさらなる態様を形成する。単一の免疫グロブリンドメイン、特に、ＶＨドメインは、特定の方式で標的抗原に結合することができることが公知である。例えば、ｄＡｂｓの考察を参照されたい。
【０２６８】
単一結合ドメインのうちのいずれか一方の場合では、これらのドメインは、ＩＬ−１Ｒ１に結合することが可能な２ドメイン結合構成要素を形成することが可能な相補ドメインについてスクリーニングするために使用されてもよい。これは、その全体で参照することにより本明細書に組込まれる、国際公開第ＷＯ９２／０１０４７号で開示されているような、いわゆる階層的二重組み合わせアプローチを使用する、ファージ提示スクリーニング方法によって達成することができ、その場合、ＨまたはＬ鎖クローンを含有する個別コロニーが、他方の鎖（ＬまたはＨ）をコードするクローンの完全ライブラリを感染させるために使用され、結果として生じる二重鎖結合構成要素は、その参考文献で説明される技法等のファージ提示技法に従って選択される。この技法はまた、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ（同書）でも開示されている。
【０２６９】
本明細書で使用される、２０個の標準「アミノ酸」およびそれらの略語は、従来の用法に従う。参照することにより本明細書に組込まれる、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  −  Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照されたい。２０個の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、α−、α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非従来型アミノ酸等の非天然アミノ酸も、本発明のポリペプチドにとって好適な成分であり得る。非従来型アミノ酸の例は、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の同様のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）を含む。本明細書で使用されるポリペプチド表記では、標準的用法および慣例に従って、左手方向がアミノ末端方向であり、右手方向がカルボキシ末端方向である。
【０２７０】
本明細書で使用される「アロタイプ」という用語は、抗体遺伝子の対立形質によって特定される抗原決定基に関して使用される。アロタイプは、異なる個人の重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のわずかな違いを表し、サブクラスの対立遺伝子間の配列の違いであり、それにより、抗血清が対立遺伝子の違いのみを認識する。最も重要な種類は、Ｇｍ（重鎖）およびＫｍ（軽鎖）である。Ｇｍ多型は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３分子のマーカーについて、Ｇ１ｍ、Ｇ２ｍ、およびＧ３ｍアロタイプと呼ばれる、アロタイプ抗原決定基をコードする対立遺伝子を有する、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２、およびＩＧＨＧ３遺伝子によって決定される。現在、Ｇ１ｍ（１、２、３、１７）またはＧ１ｍ（ａ、ｘ、ｆ、ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）またはＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５、６、１０、１１、１３、１４、１５、１６、２１、２４、２６、２７、２８）またはＧ３ｍ（ｂ１、ｃ３、ｂ５、ｂ０、ｂ３、ｂ４、ｓ、ｔ、ｇ１、ｃ５、ｕ、ｖ、ｇ５）の、１８個のＧｍアロタイプが公知である（Ｌｅｆｒａｎｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．４３−７８（１９９０）；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．：５０，１９９−２１  １、両方とも参照することにより完全に組み込まれる）。
【０２７１】
ヒト免疫グロブリンの対立形質が、十分に特徴付けられている（ＷＨＯ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｌｌｏｔｙｐｉｃ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．Ｊ  ｌｍｍｕｎｏｇｅｎ  １９７６，３：３５７−３６２；ＷＨＯ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｌｌｏｔｙｐｉｃ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．１９７６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，５９９−６０１；Ｅ．ｖａｎ  Ｌｏｇｈｅｍ，１９８６，Ａｌｌｏｔｙｐｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ，Ｍｏｎｏｇｒ  Ａｌｌｅｒｇｙ  １９：４０−５１、全て参照することにより完全に組み込まれる）。加えて、他の多型が特徴付けられている（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．ＭｏＩ．Ｅｖｏｌ．５４：１−９、参照することにより完全に組み込まれる）。
【０２７２】
本明細書で使用される、「抗体」という用語は、単独で、または公知の方法によって提供される他のアミノ酸配列と組み合わせて、オリゴクローナル、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、多特異的抗体、二重特異性抗体、触媒抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、または抗イディオタイプ抗体、および可溶性または結合形態で標識化することができる抗体、ならびにその断片、変異体、または誘導体を指す。抗体は、任意の種に由来してもよい。抗体という用語はまた、本発明の抗体の結合断片も含み、例示的な断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、一本鎖抗体（ｓｖＦＣ）、二量体可変領域（二特異性抗体）、三特異性抗体、四特異性抗体、ミニ抗体、およびジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）を含む。
【０２７３】
抗体は、典型的には、同一の２対のポリペプチド鎖を含む四量体形態を有し、各対は、１つの「軽」鎖および１つの「重」鎖を有する。各軽／重鎖対の可変領域が、抗体結合部位を形成する。抗体とは、天然であるか、部分的または完全に合成産生される抗体を指す。本発明は、天然形態の抗体に関しない、つまり、それらは自然環境になく、天然源からの精製によって単離または取得されているか、あるいは、遺伝子組み換えによって、または、非天然アミノ酸による修飾を含む化学合成によって、取得されていることをここで理解しなければならない。
【０２７４】
「二重特異性」または「二元機能性」抗体以外の抗体は、その結合部位のそれぞれが同一であると理解される。過剰な抗体が、受容体に結合されたリガンドの量を、（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ競合的結合アッセイで測定して）少なくとも約２０％、４０％、６０％、または８０％、より通常は、約８５％以上低減すると、抗体は受容体へのリガンドの結合を実質的に阻害する。
【０２７５】
本明細書で使用される、「抗原結合部位」という用語は、標的抗原の全体または一部に結合し、かつそれと相補性を有する分子の一部である。抗体分子では、それは抗体抗原結合部位と呼ばれ、標的抗原の全体または一部に結合し、かつそれと相補性を有する抗体の一部を含む。抗原が大きい場合、結合構成要素は、抗原の特定の部分のみに結合することができ、その部分は、エピトープと称される。抗体抗原結合部位は、１つ以上の抗体可変ドメインによって提供され得る。抗体の抗原結合部位は、概して、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される、６つの表面ポリペプチドループによって形成される抗原結合界面を伴って、可変重（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）免疫グロブリンドメインによって形成される。フレームワーク領域（ＦＲ）とともに、３つのＣＤＲが、各ＶＨの中（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）および各ＶＬの中（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）にある。
【０２７６】
本明細書で使用される、「結合構成要素」という用語は、抗原の抗原決定基の特徴を補完する内面形状および電荷分布を伴う３次元結合空間を有する、ポリペプチド鎖の折り畳みから形成される、少なくとも１つの抗原結合部位から成る、ポリペプチドまたはポリペプチド群を指す。一実施形態では、結合構成要素は、１つだけの標的部位に対して特異的である。他の実施形態では、結合構成要素は、２つ以上の標的部位に対して特異的である。一実施形態では、結合構成要素は、抗体、例えば、モノクローナル抗体である。
【０２７７】
本明細書で使用されるように、「キメラ抗体」という用語は、別のポリペプチド（例えば、別の種に由来する、または別の抗体クラスあるいはサブクラスに属する）に融合され、したがって含まれる、抗体抗原結合部位または同等物を含む、分子を指す。キメラ抗体のクローン化および発現は、ＥＰ−Ａ−０１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３、ならびに大半の後続の文献で説明されている。
【０２７８】
本明細書で使用されるように、「競合する」という用語は、結合構成要素が、抗体１から１０のうちのいずれか１つと、ＩＬ−１Ｒ１への結合に対して競合する、すなわち、競合が一方向性であることを示す。
【０２７９】
本明細書で使用される、「交差競合する」という用語は、結合構成要素が、抗体１から１０のうちのいずれか１つと、ＩＬ−１Ｒ１への結合に対して競合し、逆も同様である、すなわち、競合が双方向性であることを示す。
【０２８０】
本明細書で使用されるように、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９１［９５］および後続版によって定義される、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を示すことを目的とする。抗体は、典型的には、３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲを含有する。ＣＤＲという用語は、場合に応じて、抗原に対する抗体またはそれが認識するエピトープの親和性による結合に関与する、アミノ酸残基の大部分を含有する、これらの領域のうちの１つ、またはこれらの領域のうちのいくつかあるいは全体を示すために、ここでは使用される。
【０２８１】
６つの短いＣＤＲ配列の中で、重鎖の第３のＣＤＲ（ＨＣＤＲ３）は、さらに大きなサイズ可変性（本質的に、それを生じさせる遺伝子の配列の機構による、さらに大きな多様性）を有する。それは、２つのアミノ酸ほど短くあり得るが、公知の最長サイズは２６である。ＣＤＲの長さはまた、特定の基礎骨格によって収容することができる長さに従って変化し得る。機能的に、ＨＣＤＲ３は、抗体の特異性の決定において役割を果たす［参考文献９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３を参照］。
【０２８２】
本明細書で使用される、「エピトープ」という用語は、結合構成要素への特異的結合が可能な任意のタンパク質決定基、例えば、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体を含む。エピトープ決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖等の、分子の化学的活性表面集団から成り、必ずしもではないが、特異的な３次元構造特性、ならびに特異的な電荷特性を有し得る。抗体は、解離定数が１μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、最も好ましくは１０ｎＭ以下である時に、抗原に特異的に結合すると言われる。
【０２８３】
本明細書で使用される、「フレームワーク」という用語は、原子の任意の組み合わせ、例えば、ＩＬ−１Ｒ１に結合する構成で１つ以上のＣＤＲを保持する、アミノ酸を指す。
【０２８４】
本明細書で使用される、「Ｆｖ」という用語は、抗原認識および抗原結合部位の両方を保持する、抗体の最小断片を指す。
【０２８５】
本明細書で使用される、「Ｆａｂ」という用語は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖のＣＨ１ドメインを含む、抗体の断片を指す。
【０２８６】
本明細書で使用される、「ｈｕＩＬ」という用語は、ヒトインターロイキンを指す。
【０２８７】
本明細書で使用される、「ＩＬ−１Ｒ１」という用語は、インターロイキン１受容体１を意味する。ＩＬ−１Ｒ１のアミノ酸配列は、公的に入手可能である（ＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿００８７７）。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１Ｒ１は、ヒトまたはカニクイザルＩＬ−１Ｒ１であり得る。本明細書の他の場所で説明されるように、ＩＬ−１Ｒ１は、組み換え型であってもよく、および／またはグリコシル化または非グリコシル化されてもよい。
【０２８８】
本明細書で使用されるように、「Ｇｅｏｍｅａｎ」という用語（幾何平均としても知られている）は、１０進数に逆変換された、データセットの対数値の平均を指す。これは、少なくとも２つの測定値、例えば、少なくとも２、好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０の繰り返しがあることを必要とする。当業者であれば、繰り返しの数が多いほど、ｇｅｏｍｅａｎ値がより強固になることを理解するであろう。繰り返しの数の選択は、当業者の判断に任されている。
【０２８９】
本明細書で使用されるように、「単離された」という用語は、本発明の結合構成要素、またはそのような結合構成要素をコードする核酸が、概して、本発明によるものとなる、状態を指す。したがって、結合構成要素、本発明による、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、ならびにコード核酸分子およびベクターは、例えば、実質的に純粋または均質な形態で、自然環境から単離および／または精製されて提供され得、または、核酸の場合は、必要機能を有するポリペプチドをコードする配列以外に由来する核酸または遺伝子を含まないか、または実質的に含まない。単離構成要素および単離核酸は、天然環境、または、そのような調製が組み換えＤＮＡ技術によってｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実践される時に調製される環境（例えば、細胞培養）で見出される、他のポリペプチドまたは核酸等の、それらが自然に関連付けられる物質を含まないか、または実質的に含まない。構成要素および核酸は、希釈剤またはアジュバントで処方されても、依然として実用目的では、単離されているとし得、例えば、構成要素は通常、免疫学的検定で使用するためのマイクロタイタープレートを被覆するために使用される場合には、ゼラチンまたは他の担体と混合され、または、診断または治療法で使用される時には、薬学的に容認可能な担体または希釈剤と混合される。結合構成要素は、自然に、または異種真核細胞系（例えば、ＣＨＯまたはＮＳ０（ＥＣＡＣＣ  ８５１１０５０３）細胞）によって、グリコシル化されてもよく、または、（例えば、原核細胞における発現によって産生される場合は）非グリコシル化されてもよい。
【０２９０】
抗ＩＬ−１Ｒ１抗体分子を含む異種調合薬も、本発明の一部を形成する。例えば、そのような調合薬は、Ｃ末端リジンが欠けている、種々の程度のグリコシル化を伴う、および／または、ピログルタミン酸残基を形成するＮ末端グルタミン酸の環化等の誘導体化アミノ酸を伴う、全長重鎖および重鎖との抗体の混合物であり得る。
【０２９１】
本明細書で使用されるように、「モノクローナル抗体」という用語は、同じエピトープに特異的に結合する抗体の実質的に均質な集団からの抗体を指す。「ｍＡｂ」という用語は、モノクローナル抗体を指す。
【０２９２】
本明細書で使用されるように、「実施的に記述された」という語句は、本明細書で説明される結合構成要素のＶＨまたはＶＬドメインの関連ＣＤＲの特性が、その配列が本明細書で記述される特定領域と同一となるか、または極めて同様となることを指す。本明細書で使用される、１つ以上の可変ドメインの特定領域に関して「極めて同様」という語句では、１から約６、例えば、１から３、あるいは１、または２、または３、または４を含む、１から５個のアミノ酸置換が、ＣＤＲおよび／またはＶＨあるいはＶＬドメインで行われてもよいことが意図される。
【０２９３】
ここでは、本明細書で使用される場合の「および／または」が、他方を伴って、または伴わずに、２つの特定特徴または成分のそれぞれの具体的開示として解釈されるものであることを指摘することが便宜的である。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、それぞれが本明細書で個別に記述されるかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれの具体的開示として解釈されるものである。
【０２９４】
表の簡単な説明
表１ａは、抗体１〜３のそれぞれの重鎖および軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を記載する。
【０２９５】
表１ｂは、抗体４〜１０のそれぞれの重鎖および軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を記載する。
【０２９６】
表２は、配列番号が表３に示されるように対応する、添付の配列表に示される、本発明の例示的な結合構成要素の配列を示す。
【０２９７】
表３は、ＨＴＲＦ（登録商標）ヒト受容体リガンドＩＬ１β結合アッセイにおける先導ｓｃＦｖ能力の実施例を示す。
【０２９８】
表４は、ヒトＩＬ−１β誘発ＩＬ−８放出アッセイにおける先導ＩｇＧ１能力の実施例を示す。
【０２９９】
表５は、ＨｅＬａ細胞中のＩＬ−αまたはＩＬ−１β誘発ＩＬ−８放出の阻害のための最適化ＩｇＧ１およびＧＬ  ＩｇＧ２の能力を示す。
【０３００】
表６は、ヒトＩＬ−１Ｒ結合最適化ＩｇＧアッセイ（ＤＥＬＦＩＡ（登録商標））におけるＩＬ−１Ｒ族構成要素および異なるＩＬ−１Ｒ種の能力を示す。
【０３０１】
表７は、受容体リガンド（ＩＬ１Ｒａ）ＨＴＲＦ（登録商標）結合アッセイにおける最適化ＩｇＧによる阻害を示す。
【０３０２】
表８は、内因性カニクイザルＩＬ−１Ｒを発現するＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞からのＩＬ−１β誘発ＩＬ−８放出の最適化ＩｇＧによる阻害を示す。
【０３０３】
表９は、ヒト全血におけるＩＬ−１β誘発ＩＬ−６産生の阻害についてのＩＣ５０値を示す。
【０３０４】
表１０は、可溶性ヒトＩＬ−１Ｒ１および可溶性カニクイザルＩＬ−１Ｒ１への抗ＩＬ−１Ｒ１  ＦＡｂについての親和性測定の結果を示す。
【０３０５】
表１１は、可溶性ヒトＩＬ−１Ｒ１への抗体６およびＡＭＧ１０８結合についての親和性測定の結果を示す。
【０３０６】
表１２は、ヒトＩＬ−１Ｒ１の抗体への結合に対して競合するキメラＩＬ−１Ｒ１分子のＩＣ５０（ｎＭ単位）を示す。
【実施例】
【０３０７】
糸状ファージＭ１３に基づいてファージミドベクターにクローン化された無感作ヒト一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ファージ提示ライブラリを、選択に使用した［１０４、１０５］。
【０３０８】
抗ＩＬ−１Ｒ１特異的ｓｃＦｖ抗体が、組み換えヒトＩＬ−１Ｒ１上の一連の選択サイクルを使用して、ファージ提示ライブラリから単離される。
【０３０９】
選択されたｓｃＦｖ抗体は、ヒトＩＬ−１Ｒ１への結合について、および／または能力のために最適化され、ＩｇＧ抗体として再フォーマットされる。
【０３１０】
配列
本発明の例示的な結合構成要素の配列を添付の配列表に示し、配列番号は、以下の表２に示されるように対応する。
【０３１１】
ｉ）抗体番号の後にＧＬが続く場合、例えば、１１ＧＬは、残基のうちの１つ以上が生殖細胞系構成に逆変異されている抗体を指し、一般に、ＧＬが使用される場合、活性の感知可能な損失を伴わずに生殖細胞系に逆変異させることができる全ての非生殖細胞系残基は、生殖細胞系化されている。抗体１から１０のうちのいずれか１つまたは全てが参照される場合、これは、表２に記載された生殖細胞系変異体も含むことに留意されたい。
【０３１２】
ＣＤＲを表１ａおよび１ｂに示す。
【表１ａ】
0005814123.tif 000002
【表１ｂ】
0005814123.tif 000003
【表２】
0005814123.tif 000004
0005814123.tif 000005
0005814123.tif 000006
0005814123.tif 000007
0005814123.tif 000008
【０３１３】
ここで、以下の非限定的実施例によって本発明を例示する。
【実施例１】
【０３１４】
抗体先導単離
１．１  選択
糸状ファージＭ１３に基づいてファージミドベクターにクローン化された大型一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ヒト抗体ライブラリを、選択に使用した（１０６、１０７）。本質的に以前に記載されたように（１０８）、ビオチン化組み換えヒトＩＬ−１Ｒ−Ｆｃ上の一連の選択サイクルを使用して、抗ＩＬ−１Ｒ特異的ｓｃＦｖ抗体を、ファージ提示ライブラリから単離した。簡潔に言えば、ｓｃＦｖ−ファージ粒子を、溶液中の１００ｎＭの組み換えビオチン化ヒトＩＬ−１Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質（材料および方法で説明され、自家ビオチン化されるｈｕＩＬ−１Ｒ１−Ｆｃ融合タンパク質）と共にインキュベートした。次いで、抗原に結合されたＳｃＦｖ−ファージを、製造業者の推奨に従って、ストレプトアビジンで被覆した常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０）上で捕捉した。次いで、選択されたｓｃＦｖ−ファージ粒子を以前に記載されたように（１０９）救済し、選択過程を２回目で繰り返した。
【０３１５】
２回の選択からの代表的な数の個々のクローンを、９６ウェルプレートの中で増殖させた。ＳｃＦｖが細菌ペリプラズムにおいて発現され、材料および方法で説明されるヒト受容体リガンド（ＩＬ−１β）結合ＨＴＲＦアッセイで、それらの阻害活性についてスクリーニングした。粗ペリプラズム抽出物として、このアッセイで有意な阻害作用を示したＳｃＦｖを、ＤＮＡ配列決定に供した（１０６、１０９）。固有のｓｃＦｖを細菌において再び発現させ、親和性クロマトグラフィによって精製し（１１０）、同じリガンド受容体結合アッセイにおいて精製されたｓｃＦｖの希釈系列を試験することによって、ＩＣ５０値を判定した。
【０３１６】
１．２  受容体リガンド（ＩＬ−１β）結合アッセイにおけるｓｃＦｖによる阻害
ヒトヒスチジンタグ付き（ＨＩＳ）ＩＬ１ＲＦｃ融合タンパク質（自家）に結合するＨＩＳ  ＦＬＡＧタグ付きヒトＩＬ１β（自家、大腸菌発現、ＨＩＳ  ＦＬＡＧ  ＩＬ−１β）の阻害について、選択出力を、受容体リガンド結合ＨＴＲＦ（登録商標）（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）アッセイ形式でスクリーニングした。詳細なアッセイ方法、および材料発現方法は、材料および方法の項で提供される。
【０３１７】
結合アッセイから得た先導ｓｃＦｖ能力の実施例を表３に示す。
【表３】
0005814123.tif 000009
【０３１８】
１．３  ｓｃＦｖのＩｇＧ１への再フォーマット化
受容体リガンドＨＴＲＦ結合アッセイにおいて阻害性として同定されたクローンを、ＶＨおよびＶＬドメインを、それぞれ全抗体重鎖および軽鎖を発現するベクターにサブクローン化することによって、ｓｃＦｖからＩｇＧ１形式に変換した。ＶＨドメインを、哺乳動物細胞において全ＩｇＧ重鎖を発現するように、ヒト重鎖定常ドメインおよび調節要素を含有するベクター（ｐＥＵ１５．１）にクローン化した。同様に、ＶＬドメインを、哺乳動物細胞において全ＩｇＧ軽鎖を発現するように、ヒト軽鎖（λ）定常ドメインおよび調節要素の発現のためのベクター（ｐＥＵ４．４）にクローン化した。重鎖および軽鎖の発現のためのベクターは、参考文献で当初説明されていたものに基づいた（１１１）。本出願人のベクターは、単純にＯｒｉＰ要素を導入することによって改変されている。ＩｇＧを取得するために、重鎖および軽鎖ＩｇＧを発現するベクターを、ＥＢＮＡ−ＨＥＫ２９３哺乳動物細胞にトランスフェクトした。ＩｇＧが発現され、培地中へ分泌された。収穫物をプールし、精製前に濾過し、次いで、プロテインＡクロマトグラフィを使用してＩｇＧを精製した。培養上清を、Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ＢｉｏＳｅｐｒａ）の適切なサイズのカラム上に位置付け、ｐＨ８．０の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄した。０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）を使用して、結合されたＩｇＧをカラムから溶出し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）の添加によって中和した。Ｎａｐ１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，＃１７−０８５４−０２）を使用して、溶出材料をＰＢＳに緩衝液交換し、ＩｇＧのアミノ酸配列に基づく消散係数を使用して、ＩｇＧの濃度を分光光度法で決定した（１１２）。ＳＥＣ−ＨＰＬＣを使用して、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、精製されたＩｇＧを凝集および分解について分析した。
【０３１９】
１．４  親ＫＥＮＢ０２６およびＫＥＮＢ０６１の生殖細胞系化
生物学的アッセイにおいて阻害性であった、親抗体である抗体１および抗体４のＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列を、ＶＢＡＳＥデータベースの中の公知のヒト生殖細胞系配列（１１３）と整合させ、配列類似性によって、最も近い生殖細胞系を特定した。不変のままであったベルニエ残基（１１４）を考慮せずに、適切な変異プライマーを用いた標準的な部位特異的突然変異誘発技法を使用して、ヒト抗体と同様に合致するように、ＶＨおよびＶＬドメインのフレームワークの変化を、最も近い生殖細胞系配列に戻した。これらの突然変異誘発手順は、親に対するＩｇＧ１ベクターにおいて実施した。
【０３２０】
１．５  先導抗体のＩｇＧ２としての生殖細胞系化
親抗体４（ＩｇＧ１形式における）を、先導抗体を生殖細胞系化するための突然変異誘発用のテンプレートとして使用した。適切な変異プライマーを用いた標準的な部位特異的突然変異誘発技法を使用して、生殖細胞系化した先導物を産生するように、先導物の個々のＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲ３配列を、ＩｇＧ１ベクターの中の生殖細胞系化した親に導入した。標準的なクローン化手順を使用して、ＩｇＧ１からＩｇＧ２への変換を行った。ＩｇＧ１  ＶＨ先導プラスミドを単離し、ＩｇＧ２  ＶＨベクターにクローン化するために生殖細胞系化ＶＨを除去した。
【０３２１】
0005814123.tif 000010
【０３２２】
１．６  ＨｅＬａ細胞からのＩＬ−１誘発ＩＬ−８放出の阻害
ＩＬ−１Ｒ阻害剤の生物活性を決定するために、受容体リガンド結合アッセイにおけるｓｃＦｖ阻害剤の一団をＩｇＧに変換し、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１α誘発ＩＬ−８放出の用量依存性阻害を測定することによって、ＨｅＬａヒト細胞アッセイでそれらの活性を評価した。アッセイ方法の詳細については、材料および方法の項を参照されたい。
【０３２３】
このアッセイでは、ヒトＩＬ−１βまたはＩＬ−１αのＥＣ５０濃度（アッセイにおいて半最大反応を生じるＩＬ−１の濃度として定義され、この場合は約２ｐＭ）に応じて、抗ＩＬ−１Ｒ  ＩｇＧの一団の阻害活性を判定した。ＩＬ−１誘発反応の有意な阻害を示す抗体を、先導単離へ進め、実施例を表４に示す。抗体１および抗体４の生殖細胞系化ＩｇＧ１変異体も、このアッセイで活性であることが示された。
【表４】
0005814123.tif 000011
【実施例２】
【０３２４】
抗体最適化
２．１  親和性成熟
親和性に基づいたファージおよびリボソーム提示選択を使用して、抗体４および抗体１を最適化した。
【０３２５】
説明されている標準的分子生物学的技法（１１５）を使用して、可変重（ＶＨ）および軽（ＶＬ）鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）のオリゴヌクレオチド指令性突然変異誘発によって、先導クローンに由来する大型ｓｃＦｖファージライブラリを作成した。ライブラリは、ヒトＩＬ−１Ｒ−Ｆｃに対するより高い親和性を伴う変異体を選択するために、親和性に基づいたファージ提示選択を受けた。その結果、これらは、ヒトＩＬ−１β結合ＩＬ−１Ｒ１に対して向上した阻害活性を示すことが予期された。選択は、本質的に以前に記載されたように実施された（１０８）。簡潔に言えば、ｓｃＦｖ−ファージ粒子を、溶液中の組み換えビオチン化ヒトＩＬ−１Ｒ−Ｆｃと共にインキュベートした。次いで、抗原に結合されたｓｃＦｖ−ファージを、製造業者の推奨に従って、ストレプトアビジンで被覆した常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  Ｍ−２８０）上で捕捉した。次いで、選択されたｓｃＦｖ−ファージ粒子を以前に記載されたように救済し（１０９）、減少する濃度のビオチン化ヒトＩＬ−１Ｒ−１の存在下で選択過程を繰り返した（３回にわたって５０ｎＭから０．０５ｎＭ）。
【０３２６】
可変重（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）選択出力からの代表的な数の個々のクローンの粗ｓｃＦｖ含有ペリプラズム抽出物を調製し、ヒトヒスチジンタグ付き（ＨＩＳ）ＩＬ１ＲＦｃ融合タンパク質（自家）に結合するＨＩＳ  ＦＬＡＧタグ付きヒトＩＬ１β（自家、大腸菌発現、ＨＩＳ  ＦＬＡＧ  ＩＬ−１β）の阻害について、受容体リガンド結合ＨＴＲＦ（登録商標）（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）アッセイ形式でスクリーニングした。それぞれの親抗体と比較すると、有意に向上した阻害作用を示した、スクリーニングヒット、すなわち、ｓｃＦｖ変異体が、ＤＮＡ配列決定を受け、可変重および可変軽ライブラリ出力からの固有の変異体が、さらなる特性化のために精製されたｓｃＦｖとして産生された。次いで、いくつかのｓｃＦｖを選択し、ＩｇＧ１に変換し、付加的な能力獲得を実現しようとして再び検査した。
【０３２７】
クローンがランダムに対合された個別ランダム化ＶＨおよびＶＬ配列を含有した、ファージ提示形式で単一のライブラリを形成するように、ヒトＩＬ−１Ｒ１へのヒトＩＬ−１βの結合を阻害する能力を伴う多数のｓｃＦｖ変異体から成る、可変重（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）選択出力を、組み換えた。次いで、減少する濃度のビオチン化ヒトＩＬ−１Ｒ−Ｆｃの存在下で、前述のようにファージ選択を続けた（さらに３回にわたって０．１ｎＭから５ｐＭ）。
【０３２８】
代替として、選択出力を組み換えるために、リボソーム提示方法を使用した。リボソーム提示のために、ヒトＩＬ−１Ｒ１へのヒトＩＬ−１βの結合を阻害する能力を伴う多数のｓｃＦｖ変異体から成る、可変重（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）選択出力を、単一のライブラリを形成するように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって組み換え、本質的に参考文献１１６で説明されるようなリボソーム提示形式に適応させた。リボソーム提示親和性に基づいた選択を組み換えライブラリ上で実行し、減少する濃度のビオチン化ヒトＩＬ−１Ｒ１の存在下で、選択過程を繰り返した（３回にわたって１ｎＭから５ｐＭ）。次いで、本質的に参考文献１１７で説明されるように、さらなる特性化のために、リボソーム提示出力をファージ提示ベクターにクローン化した。
【０３２９】
ファージ提示およびリボソーム提示出力からの代表的な数の個々のクローンの粗ｓｃＦｖ含有ペリプラズム抽出物を調製し、ヒトＩｌ−１ＲＩ受容体へのヒトバイオ・ヒトＩｌ−１βの結合を阻害する能力について、スクリーニングした。それぞれの親抗体および組み換え前に精製された先導物と比較して、有意に向上した阻害作用を示した、スクリーニングヒット、すなわち、ｓｃＦｖ変異体が、ＤＮＡ配列決定を受け、固有の組み換え変異体が、さらなる特性化のために精製されたｓｃＦｖとして産生された。
【０３３０】
このアッセイにおける最も活性なｓｃＦｖを、実施例１．３および１．５で説明されるように、非生殖細胞系ＩｇＧ１および／または生殖細胞系ＩｇＧ２に変換し、受容体リガンドＩＬ−１Ｒａ  ＨＴＲＦならびにＨｅＬａ  ＩＬ−１−βおよびα誘発ＩＬ−８放出アッセイにおいて、競合ＥＬＩＳＡ形式で特異性について試験した。抗体はまた、カニクイザルＩＬ−１Ｒ１に対する交差反応性についても試験した。
【０３３１】
２．３  ＨｅＬａ細胞からのＩＬ−１βおよびＩＬ−１α誘発ＩＬ−８放出の最適化ＩｇＧによる阻害
材料および方法の項で説明されるように、ＥＣ８０濃度（両方について５ｐＭ）におけるｈｕＩＬ−１βおよびｈｕＩＬ−１α（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＨｅＬａ  ＩＬ−８放出アッセイで、先導最適化およびＩｇＧへの再フォーマット化後のクローンの生物活性の向上を評価した。結果を表５に示す。
【表５】
0005814123.tif 000012
【０３３２】
以降で、親と比較して増大した能力を有するクローンの一部を、ＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞を使用したカニクイザルＩＬ−１Ｒアッセイを含む付加的なアッセイ（以下の項、ならびに材料および方法のアッセイ説明で説明される）において分析した。最適化された抗体を、ＩＬ−１Ｒａ（Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）；Ａｍｇｅｎ、薬局で市販提供されている）および２００４年４月１５日公開のＵＳ２００４／０７１７０２からのＡＭＧ１０８配列と比較した。
【０３３３】
２．４  ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）エピトープ競合アッセイにおける最適化抗体の選択性および種交差反応性
ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）エピトープ競合アッセイを使用して、ＩＬ−１Ｒ族構成要素に対する先導抗体の選択性および種交差反応性を確立した。アッセイは、各最適化抗ＩＬ１Ｒ抗体に結合するビオチン化ヒトＨＩＳ−ＩＬ１ＲＦｃ（自家発現され、自家ビオチン化された）の阻害を測定した。
【０３３４】
アッセイにおいてＩＣ５０値によって測定して、それぞれの構造上関係する族の構成要素の能力を確立するように、非ビオチン化精製ヒト組み換えＩＬ１ｓＲＩＩ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒト組み換えＩＬ−１Ｒ６／ＩＬ１  Ｒ  ｒｐ２／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒト組み換えＩＬ１８Ｒα／ＩＬ−１Ｒ５／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、および組み換えヒトＩＬ−１  Ｒ４（ＳＴ２）／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）のタイトレーションを、各アッセイで試験した。
【０３３５】
最適化抗体の種交差反応性を確立するように、ヒトＨＩＳ−ＩＬ１ＲＦｃ（自家）、カニクイザルＨＩＳ−ＩＬ１ＲＦｃ（自家）、およびラットＩＬ−１ＲＦｃ（自家）を含む、ＩＬ−１Ｒ種のタイトレーションを、各アッセイで試験した。
【０３３６】
結果例を表６に要約する。結果は、先導最適化抗体がヒトＩＬ−１Ｒに対して選択性であり、同様にカニクイザルＩＬ−１Ｒにも結合したが、構造上関係するタンパク質を認識しなかったことを示す。ラットＩＬ−１Ｒ−Ｆｃは、最適化抗体のうちのいずれによっても認識されなかった。
【表６】
0005814123.tif 000013
【０３３７】
２．５  受容体リガンド（ＩＬ−１Ｒａ）結合アッセイにおける最適化ＩｇＧによる阻害
材料および方法の項で説明されるように、ヒトヒスチジンタグ付き（ＨＩＳ）ＩＬ１ＲＦｃ融合タンパク質（自家）に結合するＨＩＳ  ＦＬＡＧタグ付きヒトＩＬ１Ｒａ（自家、大腸菌発現、ＨＩＳ  ＦＬＡＧ  ＩＬ−１ＲＡ）の阻害について、ＩＬ−１Ｒ１に対するＩＬ−１Ｒａを阻害する先導抗体の能力を、受容体リガンド結合ＨＴＲＦ（登録商標）（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）アッセイ形式で評価した。
【０３３８】
これは、抗体が、ＩＬ−１−βおよびＩＬ−１−αに加えて、ＩＬ−１Ｒ１へのＩＬ−１Ｒａの結合に対して競合した、有利なエピトープが取得されたかどうかを決定するものであった。ｉｎ  ｖｉｖｏで、これは受容体結合ＩＬ−１Ｒａを解放し、それにより、別の受容体に結合することを可能にし、これは有利であると考えられる。ＩＬ−１Ｒａは、そうでなければＩｇＧに不完全にアクセス可能な組織にアクセスすることが可能であり得、それはまた、ＩｇＧよりも速く循環から遠位にある組織に浸透し得る。ＡＭＧ１０８  Ａｍｇｅｎ（ＵＳ２００４／００９７７１２Ａ１）およびＨｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  ＡＧ（国際公開第ＷＯ２００５／０２３８７２号）に対する特許において、これらの従来技術の抗体は、ＩＬ−１Ｒ１に結合するＩＬ−１Ｒａと直接競合しないことが言明されている。Ａｍｇｅｎの特許（ＵＳ２００４／００９７７１２Ａ１）では、ＩＬ−１およびＩＬ−１ｒａと競合したものにＩＬ−１介在作用の阻害を示すように設計されたアッセイにおいて、ＩＬ−１と競合したがＩＬ−１Ｒａとは競合しなかった抗体が、優れた能力を示し、したがって、すぐれたエピトープを表したことが論じられた。本出願人は、驚くべきことに、ＩＬ−１ｒａならびにＩＬ−１を阻害する抗体が、ＵＳ２００４／００９７７１２Ａ１で説明された、阻害しなかった抗体に対するＩＬ−１活性の阻害アッセイにおいて同様に効能を表し得ることを報告する。
【０３３９】
結果例を以下の表７に示し、従来の抗体は、ＩＬ−１ＲａのＩＬ−１Ｒ１への結合に対して完全に競合することはできなかったが、我々の先導抗体は、示されるＩＣ５０で、この相互作用を完全に阻害したことを確認する。
【表７】
0005814123.tif 000014
【０３４０】
２．６  ＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞からのｈｕＩＬ−１β誘発ＩＬ−８放出の最適化ＩｇＧによる阻害
先導抗体が、内因性発現したカニクイザルＩＬ−１Ｒ１を通したＩＬ−１β信号伝達の活性を阻害することに有効であったかどうかを確立するために、ＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞からのｈｕＩＬ−１β誘発ＩＬ−８放出を阻害する先導ＩｇＧの能力を測定した。先導抗体は、ＩＬ−１Ｒａに対してと等しい活性で、カニクイザルＩＬ−１Ｒ１を通して作用するＩＬ−１βを、明確かつ完全に阻害し、一方で、ＡＭＧ１０８ＩｇＧはこの相互作用を阻害しなかった。ヒトＩＬ−８に対する市販のＥＬＩＳＡが、細胞上清中のカニクイザルＩＬ−８を検出することも示され、ＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞に対するＩＬ−１誘発作用を判定するために使用された。
【表８】
0005814123.tif 000015
【０３４１】
２．７  ヒト全血におけるＩＬ−１β誘発ＩＬ−６産生の阻害
正常ボランティア（６人のドナー）からヘパリンナトリウムＭｏｎｏｖｅｔｔｅ容器の中へ、全血を収集した。アッセイ緩衝液（ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ）中に１０μｌの抗ＩＬ−１ＲＩモノクローナルＡｂ抗体６ＧＬ  ＩｇＧ２を含有する９６ウェルプレートのウェルの中へ、全血（８０μｌ）を等分した。３０ｐＭ（ＥＣ５０）の最終濃度を生じるように、ＩＬ−１βを３０分後に添加した。上清を１８時間後に採集し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ）を使用して、上清中のＩＬ−６レベルを測定した。抗ＩＬ−１ＲＩ抗体は、図１３に示されるようにＩＬ−１活性を遮断した。ヒト全血におけるＩＬ−１誘発ＩＬ−６産生の阻害のためのＩＣ５０値の範囲を表９に示す。６人のドナーの平均ＩＣ５０は、２２９ｐＭであった。
【表９】
0005814123.tif 000016
【０３４２】
アッセイ材料および方法
受容体リガンド（ＩＬ１β）結合ＨＴＲＦ（登録商標）アッセイ
ヒトヒスチジンタグ付き（ＨＩＳ）ＩＬ１ＲＦｃ融合タンパク質（以下で説明されるような、自家ＨＥＫ  ＥＢＮＡ発現）に結合するＨＩＳ  ＦＬＡＧタグ付きヒトＩＬ１β（自家、大腸菌発現、ＨＩＳ  ＦＬＡＧ  ＩＬ−１β）の阻害について、選択出力を、受容体リガンド結合ＨＴＲＦ（登録商標）（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）アッセイ形式でスクリーニングした。ＨＴＲＦ（登録商標）アッセイのさらなる詳細は、Ｍａｔｈｉｓ（１９９５）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１（９），１３９１−１３９７で見出すことができる。
【０３４３】
先導単離中の出力を、未希釈としてスクリーニングし、ｐＨ７．４の２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．５Ｍ蔗糖中で、粗ｓｃＦｖ含有ペリプラズム抽出物を調製した。５μｌの粗ｓｃＦｖサンプルを、３８４ウェル少量アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６７６）に添加した。次いで、この後に、２０μｌの容量への２ｎＭヒトＨＩＳ  ＩＬｌＲＦｃの添加が続いた。次いで、アッセイプレートを密閉し、暗室で室温にて１時間インキュベートした。
【０３４４】
これらのアッセイプレートの前インキュベーション後に、５μｌの４ｎＭ  ＨＩＳ  ＦＬＡＧ  ＩＬ１βを添加した。この後に続いて、ＸＬ６６５（ＣＩＳ  Ｂｉｏ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ６１ＦＧ２ＸＬＢ）で標識化された５μｌの２０ｎＭ抗ＦＬＡＧ  ＩｇＧ、およびクリプタート（ＣＩＳ  Ｂｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ６１ＨＦＣＫＬＢ）で標識化された５μｌの３．２ｎＭ抗ヒトＦｃ  ＩｇＧが添加された。全ての希釈を、０．４Ｍフッ化カリウムおよび０．１％ＢＳＡ（アッセイ緩衝液）を含有する、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で行った。
【０３４５】
アッセイプレートを暗室で室温にて３時間インキュベートした後、Ｅｎ  Ｖｉｓｉｏｎプレートリーダ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、６２０ｎｍおよび６６５ｎｍ発光波長における時間分解蛍光を読み取った。
【０３４６】
それぞれ、式１および式２に従って、各サンプルについてデルタＦ値率（％）および特異的結合率（％）を計算することによって、データを分析した。
【０３４７】
また、以下のように、ＦＬＡＧ  ＩＬ１βの代替ソース（Ａｌｅｘｉｓ，ＡＬＸ−５２２−０５６）を使用して、受容体リガンドアッセイを行った。ｐＨ７．４の２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．５Ｍ蔗糖中で調製された、５μｌの粗ｓｃＦｖ含有ペリプラズム抽出物を、３８４ウェル少量アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６７６）に添加した。次いで、この後に、２０μｌの体積まで８ｎＭヒトＨＩＳ  ＩＬｌＲＦｃの添加が続いた。次いで、アッセイプレートを密閉し、暗室で室温にて１時間インキュベートした。
【０３４８】
アッセイプレートの前インキュベーション後に、５μｌの８０ｎＭ  ＦＬＡＧ  ＩＬ１β（Ａｌｅｘｉｓ  ＡＬＸ−５２２−０５６）を添加した。この後に続いて、ＸＬ６６５（ＣＩＳ  Ｂｉｏ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ６１ＦＧ２ＸＬＢ）で標識化された５μｌの４０ｎＭ抗ＦＬＡＧ  ＩｇＧ、およびクリプタート（ＣＩＳ  Ｂｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ６１ＨＦＣＫＬＢ）で標識化された５μｌの３．２ｎＭ抗ヒトＦｃ  ＩｇＧを添加した。全ての希釈を、０．４Ｍフッ化カリウムおよび０．１％ＢＳＡ（アッセイ緩衝液）を含有する、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で行った。
【０３４９】
アッセイプレートを暗室で室温にて３時間インキュベートした後、Ｅｎ  Ｖｉｓｉｏｎプレートリーダ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、６２０ｎｍおよび６６５ｎｍ発光波長における時間分解蛍光を読み取った。
【０３５０】
それぞれ、式１および式２に従って、各サンプルについてデルタＦ値率（％）および特異的結合率（％）を計算することによって、データを分析した。
【数１】
0005814123.tif 000017
【０３５１】
次に、式２で表されるように、デルタＦ値率を使用して、特異的結合率（％）を計算した。
【数２】
0005814123.tif 000018
【０３５２】
ヒトＨＩＳ  ＩＬ１ＲＦｃへのヒトＨＩＳ  ＦＬＡＧタグ付きヒトＩＬ１βの結合の阻害について、スクリーニングから識別された陽性クローンからの精製ｓｃＦｖを、上記の受容体リガンドＨＴＲＦ（登録商標）アッセイのいずれかで検査した。当業者であれば、ＩｇＧまたは他の阻害剤形式を検査するように、これらのアッセイを修正することが可能であろう。アッセイにおいてＩＣ５０値によって測定される、クローン能力を確立するために、ｓｃＦｖ濃度のタイトレーションを使用した。全ての希釈を、アッセイ緩衝液中で実行した。精製ｓｃＦｖサンプルの５μｌのタイトレーションを、３８４ウェル少量アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６７６）に添加した。次いで、この後に、２０μｌの容量への２ｎＭヒトＨＩＳ  ＩＬｌＲＦｃ（自家ＨＩＳ  ＩＬ１βを使用した時）または８ｎＭ  ＨＩＳ  ＩＬｌＲＦｃ（ＡｌｅｘｉｓソースＩＬ１βを使用した時）の添加が続いた。次いで、アッセイプレートを密閉し、暗室で室温にて１時間インキュベートした。後続の添加ステップは、粗ｓｃＦｖ含有ペリプラズム抽出物について説明された通りに実行した。
【０３５３】
アッセイプレートを暗室で室温にて３時間インキュベートした後、Ｅｎ  Ｖｉｓｉｏｎプレートリーダ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、６２０ｎｍおよび６６５ｎｍ発光波長における時間分解蛍光を読み取った。
【０３５４】
各サンプルについてデルタＦ値率（％）を計算することによって、データを分析した。それぞれ、式１および式２に従って、デルタＦおよび特異的結合を決定した。４パラメータロジスティック式を使用した曲線適合によって、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、ＩＣ５０値を判定した（式３）。
【数３】
0005814123.tif 000019
【０３５５】
参照マウス抗ヒトＩＬ１Ｒ１ｍＡｂ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  １０−Ｉ７３）およびＩＬ−１受容体拮抗薬アナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）；ＡＭＧＥＮ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｐｈａｒｍａｃｙ）を、陽性対照として、全ての精製ｓｃＦｖタイトレーションアッセイに含めた。
【０３５６】
先導最適化のために、粗ｓｃＦｖをアッセイ緩衝液中で希釈した。５μｌの希釈粗ｓｃＦｖサンプルを、３８４ウェル少量アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６７６）に添加した。次いで、この後に、２０μｌの体積までの２ｎＭヒトＨＩＳ  ＩＬｌＲＦｃの添加が続いた。次いで、アッセイプレートを密閉し、暗室で室温にて１時間インキュベートした。
【０３５７】
アッセイプレートの前インキュベーション後に、５μｌの４０ｎＭ  ＨＩＳ  ＦＬＡＧ  ＩＬ１β（自家大腸菌発現）を添加した。この後に続いて、ＸＬ６６５（ＣＩＳ  Ｂｉｏ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ６１ＦＧ２ＸＬＢ）で標識化された５μｌの４０ｎＭ抗ＦＬＡＧ  ＩｇＧ、およびクリプタート（ＣＩＳ  Ｂｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ６１ＨＦＣＫＬＢ）で標識化された５μｌの３．２ｎＭ抗ヒトＦｃ  ＩｇＧを添加した。全ての希釈を、０．４Ｍフッ化カリウムおよび０．１％ＢＳＡ（アッセイ緩衝液）を含有する、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で行った。
【０３５８】
アッセイプレートを暗室で室温にて３時間インキュベートした後、Ｅｎ  Ｖｉｓｉｏｎプレートリーダ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、６２０ｎｍおよび６６５ｎｍ発光波長における時間分解蛍光を読み取った。
【０３５９】
先導単離に関して、それぞれ、式１および式２に従って、デルタＦおよび特異的結合を計算した。
【０３６０】
受容体リガンド（ＩＬ１受容体拮抗薬）結合ＨＴＲＦ（登録商標）アッセイ
スクリーニングから識別された陽性クローンからの精製ｓｃＦｖを、受容体リガンドＩＬ１受容体拮抗薬（ＩＬ１ｒａ）結合ＨＴＲＦ（登録商標）で試験した。ＩｇＧも、このアッセイ形式で検査した。
【０３６１】
アッセイにおいてＩＣ５０値によって測定される、クローン能力を確立するために、阻害剤のタイトレーションを使用した。全ての希釈を、上記のリガンド結合アッセイに関してアッセイ緩衝液中で実行した。阻害剤の５μｌのタイトレーションを、３８４ウェル少量アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６７６）に添加した。次いで、この後に、０．４ｎＭクリプタート標識化ＨＩＳ  ＩＬｌＲＦｃの添加が続いた。次いで、アッセイプレートを密閉し、暗室で室温にて１時間インキュベートした。
【０３６２】
前インキュベーション後に、５μｌの０．６ｎＭ  ＦＬＡＧ  ＨＩＳ  ＩＬ１ｒａ（自家大腸菌発現）を添加した。この直後、続いて、ＸＬ６６５（ＣＩＳ  Ｂｉｏ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ６１ＦＧ２ＸＬＢ）で標識化された５μｌの４０ｎＭ抗ＦＬＡＧ  ＩｇＧを添加した。
【０３６３】
アッセイプレートを暗室で室温にて３時間インキュベートした後、Ｅｎ  Ｖｉｓｉｏｎプレートリーダ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、６２０ｎｍおよび６６５ｎｍ発光波長における時間分解蛍光を読み取った。
【０３６４】
それぞれ、式１および式２に従って、デルタＦ値率（％）および特異的結合率（％）を計算することによって、データを分析した。４パラメータロジスティック式を使用した曲線適合によって、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、ＩＣ５０値を判定した（式３）。
【０３６５】
競合結合アッセイにおける抗体の選択性および種交差反応性
ビオチン化ヒトＨＩＳ  ＩＬ１ＲＦｃが、ほぼその特定のＩｇＧに対する推定ＫＤにおいて添加された時に、有意な信号を生じた濃度においてＰＢＳ中で、精製ＩｇＧを９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）上に吸収した。過剰なＩｇＧをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％ｖ／ｖ）で洗い流し、ウェルをＰＢＳ中の脱脂粉乳（３％ｗ／ｖ）中で１時間ブロッキングした。カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＨＩＳ  ＩＬ１ＲＦｃ（以下で説明される、自家ＨＥＫ  ＥＢＮＡ発現）、ラットＨＩＳ  ＩＬ１ＲＦｃ（自家ＨＥＫ  ＥＢＮＡ発現）、組み換えヒトＩＬ１  ｓＲＩ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ２６９−１Ｒ／ＣＦ）、ヒトＩＬ−１  Ｒ６／ＩＬ−１  Ｒ  ｒｐ２／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ８７２−ＲＰ）、組み換えヒトＩＬ−１８Ｒα（ＩＬ−１  Ｒ５）／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ８１６−ＬＲ）、組み換えヒトＩＬ−１  Ｒ４（ＳＴ２）／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ５２３−ＳＴ）の、競合物質のそれぞれの希釈系列を３％脱脂粉乳中で調製し、ビオチン化ヒトＩＬ１ＲＦｃと各ＩｇＧとの間の相互作用のＫＤ値の約４００倍の濃度から開始した。非ビオチン化ヒトＨＩＳ  ＩＬｌＲＦｃを陽性対照として含めた。この希釈系列の２５μｌを、ブロッキングされたＩｇＧアッセイプレートに添加した。
【０３６６】
２５μｌの１．４ｎＭビオチン化ヒトＨＩＳ  ＩＬｌＲＦｃをアッセイプレートに添加した。次いで、プレートを密閉し、室温で２時間インキュベートした。非結合抗原をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％ｖ／ｖ）で洗浄することによって除去する一方で、残りのビオチン化ヒトＩＬ１ＲＦｃを、ストレプトアビジン−ユーロピウム３＋抱合体（ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）検出、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって検出した。Ｅｎ  Ｖｉｓｉｏｎプレートリーダ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上で、時間分解蛍光を６２０ｎｍにおいて測定した。蛍光データをユーロピウム計数としてプロットした。４パラメータロジスティック式を使用した曲線適合によって、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、ＩＣ５０値を判定した（式３）。
【０３６７】
組み換えヒトおよびカニクイザルＩＬ−１Ｒ１Ｆｃ融合タンパク質の生成
ヒトＩＬ−１Ｒ１ｃＤＮＡ配列に基づくプライマー（ＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿００８７７）を使用して、ヒトＩＬ−１Ｒ１細胞外ドメインの配列（アミノ酸残基１−３３６  ＮＰ＿０００８６８）をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲを介してヒト肝臓ｃＤＮＡから増幅した。ヒトＰＣＲ増幅に使用されるのと同じプライマーを使用して、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＩＬ−１Ｒ１細胞外ドメイン配列（アミノ酸残基１−３３６）をコードするｃＤＮＡを、カニクイザル肝臓ｃＤＮＡから増幅した。カニクイザル配列は、標準ジデオキシ蛍光終了配列決定を使用したＰＣＲ産物の分析によって決定した。結果として生じたＤＮＡ配列を図１に示し、予測アミノ酸配列を図２に示す。結果として生じたｃＤＮＡを、製造業者の指示に従って、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローン化した。
【０３６８】
次いで、ＬＲ  Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＩＬ−１Ｒ１細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ断片を、哺乳動物発現ベクターｐＤＥＳＴ１２．２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移入した。ｐＤＥＳＴ１２．２ベクターは、関心の挿入遺伝子を伴うヒトＩｇＧ１Ｆｃコード領域をインフレームで含有するように修飾されており、また、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｏｒｉＰ複製起点の挿入によって、ＥＢＮＡ−１遺伝子産物（ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞等）を発現する細胞系へのトランスフェクション時に、エピソームプラスミド複製も可能にする。ヒトＩＬ−１Ｒ１Ｆｃについて、結果として生じたヌクレオチドおよび予測アミノ酸配列を図３および図４に示し、カニクイザルＩＬ−１Ｒ１Ｆｃについては、それぞれ図５および６に示す。
【０３６９】
プロテインＧクロマトグラフィを使用して、その後にサイズ排除クロマトグラフィを行って、タンパク質を馴化培地から精製した。
【０３７０】
組み換えヒトおよびカニクイザルラットＩＬ−１Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質の生成
ラットＩＬ−１Ｒ−Ｆｃを、上で説明される、組み換えヒトおよびカニクイザルＩＬ−１Ｒ１Ｆｃ融合タンパク質の生成と類似した方法によって作製した。
【０３７１】
ＨｅＬａ  ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β誘発ＩＬ−８放出アッセイ
ＨｅＬａ細胞（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＥＣＡＣＣカタログ番号９３０２１０１３、ＭＥＭおよび１０％ウシ胎仔血清および１％非必須アミノ酸中で維持された、ヒトネグロイド頸部類上皮癌細胞系（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９５２；１２：２６４；Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  １９５４；８７：４８０）、細胞はルーチン培養のための１００％密集度から１：４〜１：１２で分割した）を、１００μｌ培地容量／ウェル（１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を伴うＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中で１．５×１０４細胞／ウェルで、９６ウェル平底組織培養アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ）の中に播種し、次いで、細胞を３７℃および５％ＣＯ２における加湿大気中で一晩（１６〜１８時間）培養した。
【０３７２】
精製ｓｃＦｖ／ＩｇＧのタイトレーションを培地で調製し、この希釈系列の５０μｌ／ウェルを、一晩の培養培地を除去することなくＨｅＬａ細胞に添加し、ＨｅＬａ細胞とともに３７℃で３０〜６０分にわたって前インキュベートした。この後に、５０μｌ／ウェルのＩＬα／ＩＬ−１βの添加、および３７℃および５％ＣＯ２における加湿大気中での４〜５時間のインキュベーションが続いた。使用されたリガンドの濃度は、試験されているｓｃＦｖ／ＩｇＧの能力に応じて、ＥＣ５０またはそれ以上であり、ＥＣ５０は、このアッセイでリガンドに対する最大反応の半分を生じたリガンドの濃度である（式３と同様に計算される）。
【０３７３】
参照マウス抗ヒトＩＬ１Ｒ１ｍＡｂ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  １０−Ｉ７３）およびＩＬ−１受容体拮抗薬アナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）、薬局から市販提供されている）を、陽性対照として、タイトレーションアッセイに含めた。
【０３７４】
上清（馴化培地）を採集し、ＩＬ−８分析まで−２０℃で保管した（通常１週間未満）。
【０３７５】
ヒトＩＬ−８  Ｄｕｏｓｅｔ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、上清中のＩＬ−８レベルを決定した。ＩＬ−８捕捉抗体（ＰＢＳ中で希釈された４μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェル）を、４℃で一晩、９６ウェル低自己蛍光高タンパク質結合プレート（ＦｌｕｏｒｏＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート）に吸収した。過剰なＩｇＧをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄することによって除去し、ウェルをＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で室温にて１時間ブロッキングし、その後、プレートを前述のように洗浄した。８０μｌのＰＢＳ中の０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をウェルごとに添加した。次いで、馴化培地の１：５希釈を生じるように、２０μｌ／ウェルの馴化培地を添加した。ＩＬ−８規準（１０００ｐｇ／ｍｌから、１：２希釈）もＥＬＩＳＡ対照としてＥＬＩＳＡプレートに添加し、プレートを室温で２時間インキュベートした。
【０３７６】
インキュベーション後、非結合タンパク質を除去するように、以前のようにプレートを洗浄した。次いで、ビオチン化ＩＬ−８検出Ａｂ（試薬希釈剤（０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）中で２０ｎｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェル）をプレートに添加し、室温で１時間イキュベートした。非結合検出抗体をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％ｖ／ｖ）で洗浄することによって除去する一方で、残りのビオチン化抗体を、ストレプトアビジン−ユーロピウム３＋抱合体（ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）検出、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって検出した。Ｖｉｃｔｏｒプレートリーダ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上で、時間分解蛍光を６１５ｎｍにおいて測定した。蛍光データを、ユーロピウム計数値としてプロットした。式４のように、阻害剤対照の非存在下でのＩＬ−１刺激からのユーロピウム計数を使用し（最大対照）、かつＩＬ−１対照を使用せずに（培地対照）、最大ＩＬ−８放出の割合（％）に対して阻害剤データを正規化した。
【数４】
0005814123.tif 000020
【０３７７】
ＩＣ５０値は、４パラメータロジスティック式を使用した曲線適合によって、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して判定した（式３）。
【０３７８】
ＣＹＮＯＭＫ１  ＩＬ−１β誘発ＩＬ−８放出アッセイ
０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを使用して、ＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞（カニクイザル由来線維芽細胞系、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＥＣＡＣＣ参照番号９００７１８０９、供給業者の指示に従って維持された）を採集し、１００μｌ培地容量／ウェル（２０％（ｖ／ｖ）非熱不活性化ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を伴うＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中で８×１０３細胞／ウェルにおいて、９６ウェル平底組織培養アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ）の中に播種し、次いで、細胞を３７℃および５％ＣＯ２における加湿大気中で一晩（１６〜１８時間）培養した。
【０３７９】
精製ｓｃＦｖ／ＩｇＧのタイトレーションを培地で調製し、この希釈系列の５０μｌ／ウェルを、一晩の培養培地を除去することなくＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞に添加し、ＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞とともに３７℃で３０〜６０分にわたって前インキュベートした。この後に、５０μｌ／ウェルのＩＬα／ＩＬ−１βの添加、および３７℃および５％ＣＯ２における加湿大気中での４〜５時間のインキュベーションが続いた。使用されたリガンドの濃度は、ＥＣ８０であり、ＥＣ８０は、このアッセイでリガンドに対する最大反応の８０％を生じたリガンドの濃度である（式３と同様に計算される）。
【０３８０】
ＩＬ−１受容体拮抗薬であるアナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）、薬局から市販提供されている）を、陽性対照として、タイトレーションアッセイに含めた。
【０３８１】
上清（馴化培地）を採集し、ＩＬ−８分析まで−２０℃で保管した（通常１週間未満）。
【０３８２】
ヒトＩＬ−８  Ｄｕｏｓｅｔ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、上清中のＩＬ−８レベルを決定した。ＩＬ−８捕捉抗体（ＰＢＳ中で希釈された４μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェル）を、４℃で一晩、９６ウェル低自己蛍光高タンパク質結合プレート（ＦｌｕｏｒｏＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート）に吸収した。過剰なＩｇＧをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄することによって除去し、ウェルをＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で室温にて１時間ブロッキングし、その後、プレートを前述のように洗浄した。８０μｌのＰＢＳ中の０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をウェルごとに添加した。次いで、馴化培地の１：５希釈を生じるように、２０μｌ／ウェルの馴化培地を添加した。ＩＬ−８規準（１０００ｐｇ／ｍｌから、１：２希釈）もＥＬＩＳＡ対照としてＥＬＩＳＡプレートに添加し、プレートを室温で２時間インキュベートした。
【０３８３】
インキュベーション後、非結合タンパク質を除去するように、以前のようにプレートを洗浄した。次いで、ビオチン化ＩＬ−８検出Ａｂ（試薬希釈剤（０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）中で２０ｎｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェル）をプレートに添加し、室温で１時間イキュベートした。非結合検出抗体をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％ｖ／ｖ）で洗浄することによって除去する一方で、残りのビオチン化抗体を、ストレプトアビジン−ユーロピウム３＋抱合体（ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）検出、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって検出した。Ｖｉｃｔｏｒプレートリーダ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上で、時間分解蛍光を６１５ｎｍにおいて測定した。蛍光データをユーロピウム計数としてプロットした。式４のように、阻害剤対照の非存在下でのＩＬ−１刺激からのユーロピウム計数を使用し（最大対照）、かつＩＬ−１対照を使用せずに（培地対照）、最大ＩＬ−８放出の割合（％）に対して阻害剤データを正規化した。
【数５】
0005814123.tif 000021
【０３８４】
ＩＣ５０値は、４パラメータロジスティック式を使用した曲線適合によって、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して判定した（式３）。
【０３８５】
ヒトＩＬ−１Ｒ１細胞外ドメインのクローン化
配列ＲｅｆＳｅｑＮＭ  ００８７７を、ヒトＩＬ−１Ｒ１の参照配列として使用した。テンプレートとしてヒト肝臓ｃＤＮＡを使用したＰＣＲによって、細胞外ドメイン（残基１−３３６）を増幅した。使用されたプライマーは、ＮＣ２６８（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＧＴＧＴＴＡＣＴＣＡＧＡＣ）およびＮＣ２６９（５’−ＣＴＴＣＴＧＧＡＡＡＴＴＡＧＴＧＡＣＴＧＧ）であった。製造業者の指示を使用して、増幅したＰＣＲ産物を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＴＯＰＯにクローン化した。いくつかのクローンを取得し、配列決定した。クローン４は、参照配列と同一であり、後続の使用のために保存した。
【０３８６】
ヒトｐＥＮＴＲ−Ｄ−ｔｏｐｏ  ＩＬ−１Ｒ１クローン４中のＧＧＡに対する関連ＧＣＡコドンの標準的な部位特異的突然変異誘発法を使用して、ヒト多型Ａ１２４Ｇを生成した。
【０３８７】
ｃｙｎｏ  ＩＬ−１Ｒ１細胞外ドメインのクローン化
ＩＬ−１Ｒ１をコードするカニクイザルｃＤＮＡの配列は、ＥＭＢＬデータベース（ＥＭＢＬ  ＡＹ４９７００８）で入手可能であった。この配列は、ヒト配列と極めて相同であったが、ヒトＩＬ−１Ｒ１と比較すると、コード配列の最初の５’２７ｂｐが欠けていた。テンプレートとしてカニクイザル肝臓ｃＤＮＡを使用したＰＣＲによって、カニクイザルＩＬ−１Ｒ１の可溶性細胞外ドメイン（残基１−３３６）をコードするｃＤＮＡを増幅した。使用されたプライマーは、ヒトＩＬ−１Ｒ１  ５’−プライマーであった上記のＮＣ２６８、および逆プライマーとしてのＮＣ２７０（５’−ＣＴＴＣＴＧＧＡＡＴＴＴＡＧＴＧＡＣＴＧＧ）であった。増幅したＰＣＲ産物を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＴＯＰＯにクローン化した。
【０３８８】
いくつかのクローンを配列決定し、使用された翻訳参照配列からの変化があった（ＥＭＢＬ  ＡＹ４９７００８）。
【０３８９】
変化は、以下の通りであった：
１．Ｓ１７Ｆ：全クローンにおいて、公開配列ＴＴＴの中のＴＣＴ（信号配列）
２．Ｖ６６Ｉ：全クローンにおいて、公開配列ＡＴＡの中のＧＴＡ
３．Ｈ１７３Ｎ：公開配列およびクローン５において、ＣＡＣ、全ての他のクローンにおいて、ＡＡＣ。
【０３９０】
公開配列と比較した、これらの配列変化の妥当性をチェックするために、標準ジデオキシ蛍光終了配列決定を使用して、細胞外ドメインをコードする増幅ｃＤＮＡを直接配列決定した。Ｓ１７Ｆ変化は、増幅ＰＣＲ産物に存在し、公開配列からの真の変化と思われる。Ｖ６６Ｉ変化も、増幅ＰＣＲ産物に存在し、公開配列からの真の変化と思われる。Ｈ１７３Ｎ変化は、ＣＡＣおよびＡＡＣコドンの両方が同じ強度で同じ位置に存在したため、真の多型と思われる。ＰＣＲ産物の直接配列決定は、さらなる多型Ｅ３００Ｋを同定した。この場合、配列決定反応は、等量のＧＡＡおよびＡＡＡコドンを明確に示した。
【０３９１】
ラットＩＬ−１Ｒ１細胞外ドメインのクローン化
ＩＬ−１Ｒ１をコードするラットｃＤＮＡの配列を、ＥＭＢＬデータベース（ＥＭＢＬ  ＩＤ  ＲＮＩＬ１Ｒ）から取得し、参照配列として使用した。テンプレートとしてラット肝臓ｃＤＮＡを使用したＰＣＲによって、細胞外ドメイン（残基１−３３６）を増幅した。使用されたプライマーは、ＮＣ２８８（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＡＧＧＣＴＴＧ）およびＮＣ２８９（５’−ＡＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＧＴ）であった。製造業者の指示を使用して、増幅したＰＣＲ産物を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＴＯＰＯにクローン化した。いくつかのクローンを取得し、配列決定した。クローン１は、参照配列と同一であり、後続の使用のために保存した。
【０３９２】
ヒトＨＩＳ  ＦＬＡＧ  ＩＬ−１Ｒａのクローン発現および精製
ヒトＩＬ−１Ｒａの配列を、ＲｅｆＳｅｑデータベース（ＮＭ＿１７３８４２）から取得し、参照配列として使用した。ヒト肺ｃＤＮＡからのＰＣＲによって、ヒトＩＬ−１Ｒａの成熟配列（残基２６〜１７７）をコードするｃＤＮＡを増幅した。使用されたプライマーは、ＩＬ１ＲａＦ（５’−ＣＣＴＣＡＴＡＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＧＴＣＴＣＧＡＣＣＣＴＣＴＧＧＧＡＧＡＡＡ）およびＩＬ１ＲａＲ（５’−ＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＣＴＡＣＴＣＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧ）であった。プライマーＩＬ１ＲａＦの設計は、タバコエッチモザイクウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）開裂部位が、成熟ＩＬ−１ＲａのＮ末端アルギニン残基に直接隣接したようなものであった。製造業者の指示を使用して、増幅したＰＣＲ産物を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐＣＲ４ｂｌｕｎｔ−ｔｏｐｏにクローン化した。いくつかのクローンを取得し、それらの配列を生成した。参照配列と比較して正しいコード配列を伴うクローンを、さらなる操作のために選択した。後に、Ｎ末端（ＨＩＳ）６−ＦＬＡＧタグとともにインフレームでＮｄｅＩ部位を使用して、挿入ＤＮＡをｐＴ７大腸菌発現ベクターにサブクローン化した。
【０３９３】
可溶性ＨＩＳ−ＦＬＡＧタグ付きタンパク質を発現させるために、発現プラスミドを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの化学的コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）星形細胞に形質転換させた。発現プラスミドを含有する細胞を、３７℃にて溶原性培養液（ＬＢ、１０ｇ／リットルのトリプトン、５ｇ／リットルの酵母抽出物、５ｇ／リットルのＮａＣｌを含有する）中で、０．５のＯＤ６００まで培養した。次いで、１Ｍの原液から５０μＭの最終濃度になるようにＩＰＴＧを添加した。細胞を３７℃で３時間インキュベートした。６，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって細胞を採集し、ペレットを−８０℃で保管した。細胞を解凍し、ｐＨ８．０の５０ｍＭトリス、１０％グリセロール、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール（緩衝液Ａ）およびＣｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）中で再懸濁した。Ｈｅａｔｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．の超音波処理器を使用した、３×３０秒間の超音波処理によって、細胞を溶解させた。溶解物を１００，０００ｇおよび４℃で３０分にわたって遠心分離した。Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、上清を親和性クロマトグラフィに供した。結合物質を、０．３Ｍイミダゾールを含有する緩衝液Ａで溶出させた。ＩＬ−１Ｒａを含有する分画をプールし、Ｈｉｐｒｅｐ  ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＰＢＳに緩衝液交換した。ＳＤＳゲル電気泳動を使用して、サンプルの純度を試験した。タンパク質を、ゲル濾過クロマトグラフィによって分析し、単量体であることが分かった。
【０３９４】
ポリミキシンＢアガロース（Ｓｉｇｍａ製品番号Ｐ１４１１）を使用して、ＬＰＳを、５ｍｌ（１４ｍｇ）の精製ＩＬ−１Ｒａから除去した。Ｓｉｇｍａポリミキシンアガロースを、ＬＰＳを含まないＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｄ８５３７）で３回洗浄し、空のＢｉｏＲａｄ  Ｐｏｌｙｐｒｅｐカラムに適用し、ビーズを重力下で定着させた。１ｍｌの充填ビーズを、１０ｍｌのＬＰＳを含まないＰＢＳで洗浄した。ＩＬ−１ｒａサンプルをカラムに適用し、重力下で樹脂に通過させた。サンプルを、さらに１ｍｌのポリミキシンカラムに通過させた。Ｐｙｒｏｃｈｒｏｍｅ  ＬＡＬアッセイ（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ  Ｉｎｃ．Ｃ０１８０）を使用して、ポリミキシン処理の前および後のＩＬ−１ＲａサンプルのＬＰＳレベルを決定した。Ｑ−ＴｏＦ質量分析を使用した無傷質量分析を使用して、ＬＰＳを含まないタンパク質の分子量を測定した。測定された質量は、Ｎ末端Ｍｅｔを伴わないＨｉｓ−Ｆｌａｇ−Ｔｅｖ−ＩＬ−１ｒａの計算された質量（２０３２５．６７Ｄａ）の１Ｄａ以内であった。
【０３９５】
ヒトＨＩＳ  ＦＬＡＧ−ＩＬ−１βのクローン化、発現、および精製
ヒトＩＬ−１βの配列を、ＲｅｆＳｅｑデータベース（ＮＭ＿０００５７６）から取得し、参照配列として使用した。ヒト肺ｃＤＮＡからのＰＣＲによって、ヒトＩＬ−１βの成熟配列（残基１１７−２６９）をコードするｃＤＮＡを増幅した。使用されたプライマーは、ＩＬ１ｂＦ（５’−ＣＣＴＣＡＴＡＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＧＴＣＴＧＣＡＣＣＴＧＴＡＣＧＡＴＣＡＣＴＧ）およびＩＬ１ｂＲ（５’−ＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＧＡＡＧＡＣＡＣＡＡＡＴＴＧＣＡＴＧＧ）であった。プライマーＩＬ１ｂＦの設計は、タバコエッチモザイクウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）開裂部位が、成熟ＩＬ−１βのＮ末端アラニン残基に直接隣接したようなものであった。製造業者の指示を使用して、増幅したＰＣＲ産物を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐＣＲ４ｂｌｕｎｔ−ｔｏｐｏにクローン化した。いくつかのクローンを取得し、それらの配列を生成した。参照配列と比較して正しいコード配列を伴うクローンを、さらなる操作のために選択した。後に、Ｎ末端（ＨＩＳ）６−ＦＬＡＧタグとともにインフレームでＮｄｅＩ部位を使用して、挿入ＤＮＡをｐＴ７大腸菌発現ベクターにサブクローン化した。
【０３９６】
可溶性ＨＩＳ−ＦＬＡＧタグ付きＩＬ−１βタンパク質を発現させるために、発現プラスミドを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの化学的コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）星形細胞に形質転換させた。発現プラスミドを含有する細胞を、３７℃にてＬＢ中で、０．５のＯＤ６００まで培養した。次いで、１Ｍの原液から５０μＭの最終濃度になるようにＩＰＴＧを添加した。細胞を３７℃でさらに３時間インキュベートした。６，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって細胞を採集し、ペレットを−８０℃で保管した。細胞を解凍し、ｐＨ８．０の５０ｍＭトリス、１０％グリセロール、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール（緩衝液Ａ）およびＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）中で再懸濁した。Ｈｅａｔｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．の超音波処理器を使用した、３×３０秒間の超音波処理によって、細胞を溶解させた。溶解物を１００，０００ｇおよび４℃で３０分にわたって遠心分離した。Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、上清を親和性クロマトグラフィに供した。結合物質を、０．３Ｍイミダゾールを含有する緩衝液Ａで溶出させた。ＩＬ−１βを含有する分画をプールし、Ｈｉｐｒｅｐ  ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＰＢＳに緩衝液交換した。ＳＤＳゲル電気泳動を使用して、サンプルの純度を試験した。タンパク質は、ゲル濾過クロマトグラフィによって分析され、単量体であることが分かった。
【０３９７】
ポリミキシンＢアガロース（Ｓｉｇｍａ製品番号Ｐ１４１１）を使用して、上記で説明されるのと本質的に同じ方式で、ＬＰＳを精製ＩＬ−１βから除去した。
【０３９８】
Ｑ−ＴｏＦ質量分析を使用した無傷質量分析を使用して、ＬＰＳを含まないＩＬ−１βタンパク質の分子量を測定した。測定された質量は、Ｎ末端Ｍｅｔを伴わないＨｉｓ−Ｆｌａｇ−Ｔｅｖ−ＩＬ−１βの計算された質量（２０５７６．１０Ｄａ）の１Ｄａ以内であった。
【実施例３】
【０３９９】
抗体６およびＡＭＧ１０８の親和性測定
本発明のＩＬ−１Ｒ１に対する抗体の親和性を、両方ともＫｉｎＥｘＡＴＭ．技術（１１８）を使用した２つの方法で測定した。ＫｉｎＥｘＡＴＭ．（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ／動的排除アッセイ）は、ピコモル以下の範囲のものを含む、高親和性相互作用を正確に定量化するために使用することができる、フロー分光蛍光に基づいた技術である（１１９）。最初に、単量体化ＦＡｂをｓＩＬ−１Ｒ１−Ｆｃ（可溶性ｓＩＬ−１Ｒ１−Ｆｃ）と平衡状態にさせるか、または、ＩｇＧをｓＩＬ−１Ｒ１（非タグ付き）と平衡状態にさせる。次いで、ＫｉｎＥｘＡＴＭ．３２００技術を使用して、これらの相互作用分子の平衡溶液を分析した。簡潔に言えば、各平衡サンプルについて、ＫｉｎＥｘＡＴＭ．３２００機器が、ｓＩＬ−１Ｒ１抱合型マイクロビーズの未使用カラムを自動的に充填した。抗原ビーズとのサンプルの接触時間を極めて短く保つように、抗体（またはＦＡｂ断片）、抗原、およびＡｂ／抗原（またはＦＡｂ／抗原）複合体を（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ、１ｍｇ  ｍＬ−１ウシ血清アルブミン、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム中に）含有するサンプルを、カラムを通して急速に流した（０．２５ｍＬ／分）。この急速な接触時間は、高親和性（徐解離）相互作用について、この短い接触時間中に、複合体の解離がごくわずかであることを確実にした。遊離抗体がＩＬ−１Ｒ１ビーズに結合した。次いで、Ｃｙ５ＴＭ（シアニン）蛍光標識化二次抗体である、マウス抗ヒトＩｇＧ（重鎖および軽鎖特異的）を、カラムに通過させた。標識化二次抗体は、カラムに結合された抗体に結合した。緩衝液洗浄が、過剰な標識を除去し、元のサンプル中の遊離受容体の量に正比例した、ビーズカラム上の蛍光信号を残した。一連の異なる濃度の抗体およびｓＩＬ−１Ｒ１のタイトレーションを行い、これらの条件のそれぞれの後に遊離抗体を測定することによって、受容体に対する抗体についてＫＤを推定した（供給されたＫｉｎＥｘＡＴＭ．Ｐｒｏソフトウェア内の１：１可逆性二分子相互作用モデルを使用した、最小二乗当てはめ）。ＢＩＡｃｏｒｅ技術（表面プラズモン共鳴）を使用した親和性推定値は、同程度であったが、極めて遅い解離速度は、ＫｉｎＥｘＡＴＭ．評価が、１０ｐＭ未満のＫＤ値における親和性のより信頼性のある尺度を与えることを意味する。可溶性ヒトＩＬ−１Ｒ１および可溶性カニクイザルＩＬ−１Ｒ１に対する抗ＩＬ−１Ｒ１  ＦＡｂの親和性測定の結果を、以下の表１０に挙げる。結果は、この抗体が、等しく高い親和性でヒトおよびカニクイザルＩＬ−１Ｒ１に結合し、ＩＬ−１−α、−β、およびＩＬ−１受容体拮抗薬（ＩＬ−１ｒａ）との競合が全て可能であったエピトープ上にあるにもかかわらず、受容体に対する親和性が非常に高いことを示す。ヒトｓＩＬ−１Ｒ１に対する親和性を、ＡＭＧ１０８  ＩｇＧ２に対するＩｇＧ１ＴＭ形式としての抗体例について比較した。ＡＭＧ１０８  ＩｇＧ２は、カニクイザルＩＬ−１Ｒ１−Ｆｃに結合せず、ＩｇＧ２であるＡＭＧ  １０８は、単量体安定均質ＦＡｂ断片を容易に形成しない。したがって、全ＩｇＧ間の比較のみが可能であった。表１１の結果は、ヒトｓＩＬ−１Ｒ１に対する親和性が���抗体例とＡＭＧ  １０８との間で同程度であったことを実証する。以前の公報（国際公開第ＷＯ２００４／０２２７１８号）では、ＩＬ−１ｒａと競合した、開示された抗体があったが、これら（識別された第２の分類の抗体と名付ける）は、より低い親和性および能力であった。対照的に、ここで本出願人は、ＩＬ−１ｒａ対して競合し、なおもＩＬ−１Ｒ１に対する非常に高い親和性を有する抗体を示す。抗体６に対するＦＡｂおよびＩｇＧ１ＴＭの結果は同様であった。
【表１０】
0005814123.tif 000022
【表１１】
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【０４００】
方法：
ＦＡｂ単量体化
活性化パパインを使用して、抗体６ＩｇＧ１ＴＭ（三重変異体、２３４Ｆ、２３５Ｅ、および３３１Ｓ）を溶液中で消化した。６２０μｌのＤｕｌｂｅｃｃｏｓ  ＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）中で溶解させ、Ｄ−ＰＢＳ中の６２μｌの１００ｍＭ  Ｌ−Ｃｙｓ、続いてＤ−ＰＢＳ中の１０μｌの１Ｍ  ＮａＨＣＯ３でインキュベートし、パパイン（ＳＩＧＭＡ）（６．２ｍｇ）を活性化した。次いで、溶液をＤ−ＰＢＳ平衡Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５（ＰＤ−１０）カラム上で脱塩し、２．７５〜３．８５ｍｌ分画を収集した。これにより、不要な残留Ｌ−Ｃｙｓおよび阻害性低分子量パパイン自己消化産物を取り除いた。２５０μｌの抗体６ＩｇＧ１ＴＭ（９．３２ｍｇｍｌ−１）を（ｐＨを８〜８．５に増加させるための）Ｄ−ＰＢＳ中の２５μｌＮａＨＣＯ３および（上記で説明されるような）５０μｌのＬ−Ｃｙｓ活性化パパインＰＤ−１０溶出物と混合し、室温で反応をインキュベートした。反応進行後に、０．５ｍＬ  ｍｉｎ−１でＤ−ＰＢＳとの平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５サイズ排除クロマトグラフィカラム上に５０μｌサンプルを注入した。残りの消化物の全てを、０．４３ｇ（湿重量）のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗに添加した。単量体ＦＡｂ断片に対応するピークを収集し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ４  １０，０００  ＭＷＣＯ遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、１０５μｌまで濃縮した。次いで、これをＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラム上に再注入し、ＦＡｂ分画に対応するピークを収集した。最終Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５精製ステップからの２１．０〜２１．８分の分画を、純抗体６ＦＡｂのソースとして使用した。４℃での３日間の保管後に、ＦＡｂをＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラム上で再分析し、０．４％未満の多量体を測定し、単量体ＦＡｂ調製が親和性分析のために十分安定していたことを実証した。還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ならびに還元および非還元ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光分析を使用して、単量体ＦＡｂの純度も確認した。
【０４０１】
ＫｉｎＥｘＡＴＭ．分析
ヒト（配列番号１３４、完全還元単量体として６５，０３６．９２Ｄａの予期ペプチド配列に基づいた質量、−Ｆｃ二量体として１３３，０３９．８Ｄａ、単量体濃度として１１，０７１ｎＭ）またはカニクイザル（配列番号１３６、完全還元されて６５２１３．１４Ｄａの予期ペプチド配列に基づいた質量、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ、−Ｆｃ二量体として１３０，３９２．３Ｄａ、単量体濃度として７，９７４ｎＭ）のいずれか一方である、ＩＬ−１Ｒ−Ｆｃｓを、抗体６ＦＡｂを用いた親和性測定のための抗原として使用した（ヒトおよびｃｙｎｏ  ＩＬ−１Ｒとの親和性の直接比較）。ヒトｓＩＬ−１Ｒ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、４９，５０３Ｄａの予期ペプチド配列に基づいた質量）を、ＩｇＧとしてのＡＭＧ１０８および抗体６の親和性を測定する実験において、抗原として使用した（ＡＭＧ１０８および抗体６ＩｇＧの親和性の直接比較のために）。長い平衡時間の故に、ＫｉｎＥｘＡＴＭ．実験で使用された全ての緩衝液は、０．２μｍフィルタで滅菌した。カラム（ＦＡｂおよびＩｇＧに基づいた測定の両方に共通である）には、ヒトＩＬ−１Ｒ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、５０分間の一定撹拌により、室温において、ｐＨ＝８．４で３ｍｌの５０ｍＭ炭酸ナトリウム中の１００ｍｇ（１ｍｇのビーズにつき１μｇのＩＬ−１Ｒ１）のアズラクトンＵｌｔｒａＬｉｎｋ  Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）に共有結合した。洗浄およびブロッキングを、ｐＨ８．７の１Ｍトリス中の１０ｍｇｍｌ−１  ＢＳＡで達成した（ビーズの遠心分離後の１ｍｌの単回洗浄、第２の遠心分離後の室温での１．５時間の２５ｒ．ｐ．ｍ．撹拌を伴う２ｍｌの洗浄）。最後に、沈降ビーズを、２ｍｌの新鮮ＢＳＡ緩衝液の中にもう１回移し、使用するまで４℃で保管した。最後に、このビーズ懸濁液を６０ｍｌのＤ−ＰＢＳ＋０．０２％アジ化ナトリウムに添加し、器具ビーズ処理システム上に接続した。マウス抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｃｙ５抱合体を、０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム、１５ｍｇｍｌ−１のＢＳＡを伴う０．２５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．６）、および０．０５％アジ化ナトリウム中で１．４ｍｇｍｌ−１において組成した。これを、必要とするまで４℃で保持した。ＦＡｂおよびＩｇＧを、５０ｎＭまたは２５０ｐＭ、あるいは１００ｐＭまたは１０ｐＭまで希釈した。抗体６ＦＡｂまたは抗体６Ａｂ／ＡＭＧ１０８Ａｂを、２５または５ｎＭから０．１５２５ｐＭの希釈系列（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ、１ｍｇｍＬ−１ウシ血清アルブミン、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム中）と合併する、２倍希釈系列中で、ＦｃＲを希釈した。複合体を１２〜１６日にわたって１８℃（室温）で平衡状態にさせ、次いで、信号検査後にカラムを通して流した。５０μｌのＣｙ５標識化二次抗体を使用して、結合遊離抗体を検出した。ＫｉｎＥｘＡＴＭ．Ｐｒｏ（ｖ  ２．０．０．１７）ソフトウェアを使用して、データ処理および分析を行った。
【実施例４】
【０４０２】
全血アッセイ
ＩＬ−１β（ＧＩＢＣＯ、凍結乾燥、担体を含まない）インキュベーションがＩＬ−６放出をもたらす、全血アッセイにおいて、抗体を能力について分析した。簡潔に言えば、抗体を、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で１５μｇ／ｍｌまで希釈し、次いで、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中の１：３希釈において連続的に量を設定した。１０μｌの各濃度の抗体、またはＰＢＳ／１％ＢＳＡ対照を、８０μｌのヒト全血とともに室温で３０分間インキュベートした。３０ｐＭの最終アッセイ濃度を生じるように、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中の１０μｌのＩＬ−１βまたはＰＢＳ／ＢＳＡ単独を添加し、加湿５％ＣＯ２インキュベータの中で３７℃において２２±２時間インキュベートした。１００μｌのＰＢＳをウェルに添加し、３００ｇで１０分間回転した後、上清を除去し、市販のｈｕＩＬ−６  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｕｏｓｅｔ、取扱説明書の通り）を使用してＩＬ−６含有量について分析した。このアッセイでの抗体６ＩｇＧ１ＴＭの能力は３１１ｐＭ（８３ｐＭ〜１．２ｎＭ）（平均ＩＣ５０；９５％信頼区間）であった。
【実施例５】
【０４０３】
キメラヒト／マウスＩＬ−１Ｒ１細胞外ドメインを使用した、抗体６相互作用のエピトープマッピング
５．１  全ドメイン交換キメラＩＬ−１Ｒ１分子の生成
抗体６は、ヒトＩＬ−１Ｒ１に結合するが、マウスＩＬ−１Ｒ１には結合しない。この性質を使用して、キメラＩＬ−１Ｒ１分子をエピトープマッピングのために生成した。ヒトＩＬ−１Ｒ１細胞外ドメインのドメイン１（Ｄ１）（Ｍ１−Ｙ１２２）、ドメイン２（Ｄ２）（Ｎ１２３−Ｖ２２７）、またはドメイン３（Ｄ３）（Ｉ２２８−Ｋ３３６）を、対応するマウスＩＬ−１Ｒ１配列と置き換えることによって、全ドメイン交換キメラを作成した。ヒトＩＬ−１Ｒ１からのＩＬ１β［１２０］およびＩＬ１ｒａ［１２１］と相互作用することが知られている領域を、マウスＩＬ−１Ｒ１からの対応する領域と置き換えることによって、サブドメイン交換キメラを生成した。キメラの抗体への結合を決定するために、ＨＴＲＦ（均質時間分解蛍光）競合アッセイを使用した。アッセイでは、Ｅｕ３＋クリプタートで標識化された抗体が、ビオチンで標識化されたヒトＩＬ−１Ｒ１と相互作用した。相互作用は、Ｅｕ３＋クリプタートとＸＬｅｎｔ！標識化ストレプトアビジンとの間のＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）信号によって検出された［１２２］。
【０４０４】
５．１．１  材料および方法−キメラのクローン化、発現、および精製
プライマー伸長ＰＣＲクローン化によって、ヒトＩＬ−１Ｒ１細胞外ドメイン（アミノ酸残基１−３３６  ＮＰ＿０００８６８）およびマウスＩＬ−１Ｒ１細胞外ドメイン（アミノ酸残基１−３３８  ＮＰ＿０３２３８８）のキメラをコードするｃＤＮＡ分子を合成し、ｐＤＯＮＲ２２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１２５３６−０１７）にクローン化した。次いで、製造業者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１２５３８−１２０）に従ってＬＲ  Ｇａｔｅｗａｙ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ酵素を使用して、ＩＬ−１Ｒ１細胞外ドメインキメラをコードするｃＤＮＡ断片を、哺乳動物発現ベクターｐＤＥＳＴ１２．２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移した。ｐＤＥＳＴ１２．２ベクターは、関心の挿入遺伝子とともにインフレームでヒトＩｇＧ１Ｆｃ断片および６ｘｈｉｓタグ（配列番号１３４）を含有するように修飾されており、また、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｖ０４４−５０）からのｏｒｉＰ複製起点の挿入によって、ＥＢＮＡ−１遺伝子産物を発現する細胞系（ＥＢＮＡ−１遺伝子をトランスフェクトされたＣＨＯ細胞［ＣＨＯ−ＥＢＮＡ］等）へのトランスフェクション時に、エピソームプラスミド複製も可能にする。プロテインＧ親和性クロマトグラフィ（ＨｉＴｒａｐプロテインＧ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号１７−０４０４−０３））を使用し、その後にサイズ排除クロマトグラフィ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号１７−１０６９−０１））を使用して、ＣＨＯ−ＥＢＮＡ遺伝子からの上清の中の発現タンパク質を精製した。ベクターコード配列である、ヒトＩＬ−１Ｒ１細胞外ドメインの配列（アミノ酸残基１〜３３６  ＮＰ＿０００８６８）、ヒトＩｇＧ１Ｆｃタグおよび６ｘｈｉｓタグが、配列番号１３４で開示される。マウスＩＬ−１Ｒ１細胞外ドメインの配列（アミノ酸残基１−３３８  ＮＰ＿０３２３８８）はベクターコード配列である。
【０４０５】
５．１．２  ＩＬ−１Ｒ１キメラへの抗体の結合
製造業者の指示（ＣｉｓＢｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌカタログ番号６２ＥＵＳＰＥＡ）に従って、抗体をＥｕ３＋クリプタート標識キットでクリプタート標識化し、製造業者の指示に従って、ＩＬ−１Ｒ１／Ｆｃ（配列番号１３４、材料および方法を参照）をＥＺ  Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｅｒｂｉｏカタログ番号２１３３５）でビオチン標識化した。アッセイ条件は、３８４ウェル浅ウェルｃｏｓｔａｒプレート（３６７６）の中で２０μｌの全容量における、１ｘＤ−ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．４Ｍフッ化カリウム中の０．２５ｎＭクリプタート標識化抗体、０．３ｎＭビオチン標識化ＩＬ−１Ｒ１／Ｆｃ、２．５ｎＭストレプトアビジンＸＬｅｎｔ！（ＣｉｓＢｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌカタログ番号６１１ＳＡＸＬＢ）であった。アッセイに、試験タンパク質の希釈系列（最大１００ｎＭから０．００１７ｎＭ）を添加し、アッセイを室温で３時間インキュベートした。３２０ｎｍ励起フィルタならびに６２０ｎｍおよび６６５ｎｍ発光フィルタを使用した、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダを使用して、ＦＲＥＴ信号を検出した。結果を、特異的結合（競合抗原のない信号）の割合（％）として６６５／６２０比から計算した。結果を、Ｓ字状用量反応モデルを使用して、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）で分析した。
【０４０６】
５．２  結果
キメラ分子の抗体結合を、ＨＴＲＦ（均質時間分解蛍光）競合アッセイで検査した。ヒトＩＬ−１Ｒ１と同じパラトープにおいて抗体に結合した分子は、結合相互作用を阻害し、信号の低減につながった。阻害曲線から、ヒトＩＬ−１Ｒ１、マウスＩＬ−１Ｒ１、およびキメラ分子のＩＣ５０値を計算した（表１２）。分子が結合を完全には阻害しなかった場合、最高濃度において見られた阻害率を計算した。天然ヒトＩＬ−１Ｒ１に同様のＩＣ５０値を与えたキメラは、依然としてエピトープを含有していた。抗体に結合するＩＬ−１Ｒ１を完全には阻害しなかった、または増加したＩＣ５０値を示したキメラは、完全エピトープを含有していなかった。これらのデータは、抗体エピトープの局在化を可能にした。
【表１２】
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【０４０７】
キメラヒト／マウスＩＬ−１Ｒ１キメラの結合は、抗体によって結合されたヒトＩＬ−１Ｒ１エピトープの局在化を可能にした。ヒトＤ２  ＩＬ１Ｒ１（ＭｏＩＬ−１Ｒ１、ＭｏＤ１−Ｄ２  ＨｕＤ３  ＩＬ１Ｒ１、ＭｏＤ２  ＨｕＤ１  ＨｕＤ３  ＩＬ１Ｒ１、ＭｏＤ２−Ｄ３  ＨｕＤ１）を置き換えるＩＬ１Ｒ１のマウスＤ２ドメインを含有する全てのキメラが、ヒトＩＬ１Ｒ１を完全には阻害できなかったため、全ドメイン交換キメラは、エピトープをヒトＩＬ−１Ｒ１のＤ２に局在化した（残基Ｎ１２３〜Ｖ２２７）が、一方で、Ｄ２ヒトＩＬ１Ｒ１（ＨｕＩＬ−１Ｒ１、ＭｏＤ３  ＨｕＤ１−Ｄ２）を含有するものは、ヒトＩＬ−１Ｒ１と競合することができた（表１２）。
【０４０８】
ヒトＩＬ−１Ｒ１は、結晶構造でＩＬ１βにごく接近している３つのドメインに散在する、７つのβ鎖および４つのループ領域を含有する［１２３］。また、ヒトＩＬ１Ｒ１は、結晶構造でＩＬ１ｒａにごく接近している、３つのβ鎖および７つのループ領域を含有する（Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：１９４−２００，１９９７）。β鎖またはループ交換キメラは、β鎖ａ２（残基Ｎ１２３−Ｖ１３４）を含むドメイン２中の主成分、ならびにループｂ２−ｃ２（残基Ｌ１４０−Ｋ１５７）（Ｖｉｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：１９０−１９４，１９９７）およびループｄ２−ｅ２（残基Ｋ１７８−Ｒ１８０）（Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：１９４−２００，１９９７）中の副成分への、ヒトＩＬ−１Ｒ１エピトープの局在化を可能にした。ヒトβ鎖ａ２を伴わないキメラは、ヒトＩＬ１Ｒ１の抗体への結合よりも２６倍高いＩＣ５０を生じ、ループｂ２−ｃ２またはｄ２−ｅ２を伴わないキメラは、ヒトＩＬ−１Ｒ１よりも３倍超高いＩＣ５０を生じた（表ｘ）。ドメイン交換データと一致して、β鎖ａ２、ループｂ２−ｃ２およびｄ２−ｅ２は、ドメイン２の中に位置する（Ｖｉｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：１９０−１９４，１９９７）。
【０４０９】
これらのデータから、抗体は、Ｎ１２３−Ｖ１３４、Ｌ１４０−Ｋ１５７、およびＫ１７８−Ｒ１８０の、ヒトＩＬ−１Ｒ１の３つの領域中の３３個のアミノ酸の不連続エピトープの中でアミノ酸に結合する。
【０４１０】
生物学的寄託物
大腸菌ＴＯＰ１０における生物学的寄託物は、ブダペスト条約の下で、以下にて作製されている。
【０４１１】
ＮＣＩＭＢ  Ｌｉｍｉｔｅｄ
Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，
Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，
Ａｂｅｒｄｅｅｎ，
ＡＢ２１  ９ＹＡ．
Ｓｃｏｔｌａｎｄ
ＵＫ
0005814123.tif 000025
【０４１２】
該寄託物は、本発明の別の実施形態を表す。
【０４１３】
参考文献
上記のどこかで引用されるものを含む、本明細書のどこかで引用される全ての参考文献は、全ての目的で、それらの全体で参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０４１４】
１  Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  ＣＡ（２００２）Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｈｅｍａｔｏｌ  ２０（５）Ｓ２７，Ｓ１  −Ｓ１３
２  Ｄｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２（１０）５３３−６
３  Ｓｃｈｍｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２３，２７９−９０
４  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １５（１），１７３−６
５  Ｓｔｅｉｎｋａｓｓｅｒｅｒ  Ａ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３（３），６５４−７
６  Ｂｌａｃｋ  ＲＡ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３（１９），９４３７−４２
７  Ｎｉｋｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２（１）５７７−８４
８  Ｗｅｓｓｅｎｄｏｒｆ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８（２９）２２１００−４
９  Ｃａｒｔｅｒ  ＤＢ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４４（６２６７）６３３−８
１０  Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＰ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４３（６２５６）３４１−６
１１  Ｄｅｗｂｅｒｒｙ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｅ  Ｂｉｏｌ  ２０（１１）２３９４−４００
１２  Ｍｕｚｉｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８２（２）６２３−８
１３  Ｇａｂａｙ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９（１２）５９０５−１３
１４  Ｓｉｍｓ  ＪＥ（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４，１１７−１２２
１５  Ｓｉｍｓ  ＪＥ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  ７２（１）９−１４
１６  Ｃｏｌｏｔｔａ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １５（１２）５６２−６
１７  Ｖｉｇｅｒｓ  ＧＰ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８６（６６２１）１９０−４
１８  Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８６（６６２１）１９４−２００
１９  Ｂｏｒａｓｃｈｉ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５５（１０  ）４７１９−２５
２０  Ｃａｓａｄｉｏ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ（２００１）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４９９（１−２）６５−８
２１  Ｄ’Ｅｔｔｏｒｒｅ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｅｕｒ  Ｃｙｔ  Ｎｅｔｗ  ８（２）１６１−７１
２２  Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒ  ＳＡ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０（２３）１３７５７−６５
２３  Ｈａｎｍｕｍ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４３，３３６−３４０
２４  Ｌａｎｇ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６１  ６８７１−７７
２５  Ｒｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８３，１８４１−１８５０
２６  Ｊｉａｎｇ  Ｚ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２２（２０）７１５８−７１６７
２７  Ｏｓｂｏｒｎ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ４４（１）：１４１−８，２００８
２８  Ｓａｕｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４９：２２０８−２２１８
２９  Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５６：１５１７−１５２６
３０  Ｗａｎｄｅｒｅｒ（２００８）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２８：１２７−１３２
３１  Ｉｋｏｎｏｍｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１７：２６６２−２６６９
３２  Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  ＣＡ（１９９６）Ｂｌｏｏｄ  ８７（６）２０９５−１４７
３３  Ｍｉｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ  １９８７  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３８，２９０６−２９１２
３４  Ｑｗａｒｎｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ  １９８８  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３，８２６１−８２６９
３５  Ｄｒｉｐｐｓ  ｅｔ  ａｌ  １９９１  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６，１０３３１−１０３３６
３６  Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．１９８７
３７  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０５−４１０
３８  Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８
３９  Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７
４０  Ｖｏｅｔ  ＆  Ｖｏｅｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｗｉｌｅｙ）１９９５．
４１  Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．ＳｃＬ，ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０
４２  Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．ＳｃＬ，ＵＳＡ，９１  ：３８０９−３８１３
４３  Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｊ．ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  ２６３：５５１−５６７
４４  Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ＆  Ｈｕｄｓｏｎ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（９）：１１２６−１１３６
４５  Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９）
４６  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８，５５２−５５４
４７  Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１，４８４−４９０
４８  Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６，１９８８
４９  Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３，１９８８
５０  Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  ６４４４−６４４８，１９９３
５１  Ｒｅｉｔｅｒ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４，１２３９−１２４５，１９９６
５２  Ｈｕ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，３０５５−３０６１，１９９６
５３  Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｈｌｅｎ  １９９９  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｒｅｖ．１８：４１１−４１９
５４  Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ４，４４６−４４９  １９９３
５５  Ｇｌｅｎｎｉｅ  Ｍ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９，２３６７−２３７５
５６  Ｒｅｐｐ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｊ．Ｈｅｍａｔ．３７７−３８２
５７  Ｓｔａｅｒｚ  Ｕ．Ｄ．ａｎｄ  Ｂｅｖａｎ  Ｍ．Ｊ．１９８６  ＰＮＡＳ  ８３
５８  Ｓｕｒｅｓｈ  Ｍ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９８６  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１  ：２１０−２２８
５９  Ｍｅｒｃｈａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７−６８１
６０  Ｒｉｄｇｅｗａｙ，Ｊ．Ｂ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，９，６１６−６２１，１９９６
６１  Ｈａａｎ  ＆  Ｍａｇｇｏｓ（２００４）ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，１２（５）：Ａ１−Ａ６
６２  Ｋｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２８４：１１４１−１１５１．
６３  Ｎｙｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７：４６３−４６９
６４  Ｗｅｓｓ，Ｌ．Ｉｎ：ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，Ｔｈｅ  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ＢｉｏＢｕｓｉｎｅｓｓ，１２（４２），Ａ１−Ａ７，２００４
６５  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．ｅｄ．，Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８
６６  Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ  Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４７：６５９−６６４
６７  Ｂａｇｓｈａｗｅ  Ｋ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｍｍｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ４：９１５−９２２
６８  Ｈｕｎｔｅｒ  Ｗ．Ｍ．ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ  Ｆ．Ｃ．（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ  １９４：４９５
６９  Ｐｌuｃｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５４５−５５１（１９９１）
７０  Ｃｈａｄｄ  ＨＥ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｏｗ  ＳＭ（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：１８８−１９４
７１  Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ＤＣ  ａｎｄ  Ｋｒｕｍｍｅｎ  Ｌ（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：１１７
７２  Ｌａｒｒｉｃｋ  ＪＷ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ  ＤＷ（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：４１１−４１８
７３  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ
７４  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  １９９９
７５  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．７２６，１９８８
７６  Ｋoｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，１９７５
７７  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ  ＆  Ｄｕｂｅｌ，Ｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＬＬＣ；２００１，ＩＳＢＮ：３５４０４１３５４５
７８  Ｍｅｎｄｅｚ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ，１５（２）：１４６−１５６
７９  Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．（２０００）２９６，５７−８６
８０  Ｋｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５４  ２００１  ６７−８４
８１  Ｗｏｌｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ  −Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｅｄ．：Ｂ．Ｋｏｗａｌｓｋｉ），Ｄ．Ｒｅｉｄｅｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｈｏｌｌａｎｄ，１９８４（ＩＳＢＮ  ９０−２７７−１８４６−６）
８２  Ｎｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｐｒｉｌ  １９９８）ＩＳＢＮ：０４７１１７０８２８
８３  Ｋａｎｄｅｌ，Ａｂｒａｈａｍ  ＆  Ｂａｃｋｅｒ，Ｅｒｉｃ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｒｅａｓｏｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ  ＰＴＲ，（Ｍａｙ  １１，１９９５），ＩＳＢＮ：０１３３４１８８４７
８４  Ｋｒｚａｎｏｗｓｋｉ，Ｗｏｊｔｅｋ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｏ  ２２（Ｐａｐｅｒ））．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０００），ＩＳＢＮ：０１９８５０７０８９
８５  Ｗｉｔｔｅｎ，Ｉａｎ  Ｈ．＆  Ｆｒａｎｋ，Ｅｉｂｅ．Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｊａｖａ  Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ．Ｍｏｒｇａｎ  Ｋａｕｆｍａｎｎ；（Ｏｃｔｏｂｅｒ  １１，１９９９），ＩＳＢＮ：１５５８６０５５２５
８６  Ｄｅｎｉｓｏｎ  Ｄａｖｉｄ  Ｇ．Ｔ．（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｃ．Ｈｏｌｍｅｓ，Ｂａｎｉ  Ｋ．Ｍａｌｌｉｃｋ，Ａｄｒｉａｎ  Ｆ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ．Ｂａｙｅｓｉａｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；（Ｊｕｌｙ  ２００２），ＩＳＢＮ：０４７１４９０３６９
８７  Ｇｈｏｓｅ，Ａｒｕｐ  Ｋ．＆  Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｎ，Ｖｅｌｌａｒｋａｄ  Ｎ．．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｔｏｏｌｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．ＩＳＢＮ：０−８２４７−  ０４８７−８
８８  Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９２）２２７，７９９−８１７
８９  Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７）２７３（４），９２７−９４８
９０  Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２３，７５５−７５８（１９８６）
９１  Ｗｈｉｔｅｌｅｇｇ，Ｎ．Ｒ．ｕ．ａｎｄ  Ｒｅｅｓ，Ａ．Ｒ（２０００）．Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．，１２，８１５−８２４
９２  Ｇｕｅｘ，Ｎ．ａｎｄ  Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｍ．Ｃ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（１９９７）１８，２７１４−２７２３
９３  Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏ  ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０：７７９−７８３
９４  Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．（１９９６）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ
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１０１  Ｓｈａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，８７：４８１４−４８１７，１９９０
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１０３  Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４７：１７０９−１７１９，１９９１
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１０８  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．２５６（１）：７７−８８，１９９６
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１１２  Ｍａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００（１）：２０−２６，１９９２
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１１４  Ｆｏｏｔｅ  Ｊ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ（１９９２）Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  ２２４（２）４８７−９９
１１５  Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  −  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，２００４．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ
１１６  Ｇｒｏｖｅｓ，Ｍ．Ａ．Ｔ  ａｎｄ  Ｏｓｂｏｕｒｎ，Ｊ．Ｋ．（２００５  ）Ｅｘｐｅｒｔ  ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５（１）：１２５−１３５
１１７  Ｇｒｏｖｅｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３１３（１２９−１３９）
１１８  Ｄａｒｌｉｎｇ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｂｒａｕｌｔ  Ｐ−Ａ，２００４，Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｌｏｐｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，ｎｏ．６，６４７−６５７
１１９  Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ，Ｐ．，Ｒｏａｌｓｔａｄ，Ｓ．，Ｒｏｓｋｏｓ，Ｌ，Ｑｉａｏｊｕａｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｌａｃｋｉｅ，Ｓ  ａｎｄ  Ｂａｂｃｏｏｋ，Ｊ．，２００５，Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｓｕｂ−ｐｉｃｏｍｏｌａｒ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，３３４，１００４−１０１３
１２０  Ｖｉｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：１９０−１９４，１９９７
１２１  Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：１９４−２００，１９９７
１２２  Ｍａｔｈｉｓ  ｅｔ  ａｌ，ＣＨｎ  Ｃｈｅｍ  ４１  ：１３９１−１３９７，１９９５
１２３  Ｖｉｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：１９０−１９４，１９９７
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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