(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的に許容され得る担体、賦形剤または希釈剤の１種類以上とともにシサムペロス  パレイラ（雅紅隆）エキスを含む、デング熱ウイルス感染を処置するための医薬組成物。
【請求項２】
前記エキスは、メタノール抽出物、メタノール：水（５０：５０）抽出物または水性抽出物から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記エキスは、メタノール抽出画分から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記エキスは、ヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタン、ブタノール、水性、酢酸エチルまたはアセトン画分から選択される、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
デング熱ウイルス感染を処置するための医薬の製造におけるシサムペロス  パレイラ（雅紅隆）エキスの使用。
【請求項６】
前記エキスは、
（ａ）シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）の植物塊を、水、アルコール、ケトン、エステル、ハロゲン化炭化水素、石油留分、またはその混合物（１種類もしくは複数種）から選択される１種類以上の溶媒で抽出すること、
（ｂ）該抽出物を濃縮すること、および
（ｃ）該抽出物を乾燥させること
を含む方法によって調製される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記エキスは、
（ａ）シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）の植物塊を、水、アルコール、ケトン、エステル、ハロゲン化炭化水素、石油留分またはその混合物（１種類もしくは複数種）から選択される１種類以上の溶媒で抽出すること、
（ｂ）該抽出物を濃縮すること、
（ｃ）水を添加すること、
（ｄ）該抽出物を、水、石油留分、ハロゲン化炭化水素、エステル、ケトン、アルコール、エーテルまたはその混合物（１種類もしくは複数種）から選択される１種類以上の溶媒により分配すること、および
（ｅ）該抽出物を乾燥させること
を含む方法によって調製される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記エキスは、
（ａ）シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）の植物塊を、水、アルコール、ケトン、エステル、ハロゲン化炭化水素、石油留分またはその混合物（１種類もしくは複数種）から選択される１種類以上の溶媒で抽出すること、
（ｂ）該抽出物を濃縮すること、
（ｃ）該抽出物を、水、アルコール、ケトン、エステル、ハロゲン化炭化水素、石油留分またはその混合物（１種類もしくは複数種）から選択される１種類以上の溶媒で抽出すること、および
（ｄ）該抽出物を乾燥させること
を含む方法によって調製される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
（ａ）シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）の植物塊を、水、アルコール、ケトン、エステル、ハロゲン化炭化水素、石油留分、またはその混合物（１種類もしくは複数種）から選択される１種類以上の溶媒で抽出すること、
（ｂ）該抽出物を濃縮すること、および
（ｃ）該抽出物を乾燥させること、
を含み、該抽出物がデング熱ウイルス感染を処置するために使用される、シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）エキスの調製方法。
【請求項１０】
（ａ）シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）の植物塊を、水、アルコール、ケトン、エステル、ハロゲン化炭化水素、石油留分、またはその混合物（１種類もしくは複数種）から選択される１種類以上の溶媒で抽出すること、
（ｂ）該抽出物を濃縮すること、
（ｃ）水を添加すること、
（ｄ）該抽出物を、水、石油留分、ハロゲン化炭化水素、エステル、ケトン、アルコール、エーテル、またはその混合物（１種類もしくは複数種）から選択される１種類以上の溶媒により分配すること、および
（ｅ）該抽出物を乾燥させること、
を含み、該抽出物がデング熱ウイルス感染を処置するために使用される、シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）エキスの調製方法。
【請求項１１】
（ａ）シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）の植物塊を、水、アルコール、ケトン、エステル、ハロゲン化炭化水素、石油留分、またはその混合物（１種類もしくは複数種）から選択される１種類以上の溶媒で抽出すること、
（ｂ）該抽出物を濃縮すること、
（ｃ）該抽出物を、水、アルコール、ケトン、エステル、ハロゲン化炭化水素、石油留分、またはその混合物（１種類もしくは複数種）から選択される１種類以上の溶媒で抽出すること、および
（ｄ）該抽出物を乾燥させること、
を含み、該抽出物がデング熱ウイルス感染を処置するために使用される、シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）エキスの調製方法。
【請求項１２】
アルコールがメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールまたはブタノールから選択され、ケトンがアセトンまたはメチルイソブチルケトンから選択され、エステルが酢酸メチルまたは酢酸エチルから選択され、ハロゲン化炭化水素がクロロホルム、ジクロロメタンまたは二塩化エチレンから選択され、エーテルがジエチルエーテルであり、石油留分がヘキサン、石油エーテルまたはヘプタンから選択される、請求項６〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
アルコールがメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールまたはブタノールから選択され、ケトンがアセトンまたはメチルイソブチルケトンから選択され、エステルが酢酸メチルまたは酢酸エチルから選択され、ハロゲン化炭化水素がクロロホルム、ジクロロメタンまたは二塩化エチレンから選択され、エーテルがジエチルエーテルであり、石油留分がヘキサン、石油エーテルまたはヘプタンから選択される、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）（ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ  ｐａｒｅｉｒａ）エキスの抗デング熱活性に関する。また、シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）エキスを含む医薬組成物およびシサムペロス  パレイラ（雅紅隆）エキスの調製方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
デング熱ウイルス（ＤＥＮｌ−４）は、フラビウイルス科の蚊媒介性の構成員であり、世界的規模で重要なヒト病原体である。出血性デング熱／デング熱ショック症候群の年間１００万の症例のうち、約２〜５％は致死性である。現在、ＤＥＮ感染を処置するためのワクチンまたは抗ウイルス薬はない（Ａｎｎ，Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５１，ｐ．２６２−２７１（２００１），およびＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｊｕｌｙ，ｐ．４８０−４９６（１９９８））。
【０００３】
さまざまな障害に対する安全で、有効で、比較的安価な新しい治療薬の必要性を満たすためのユニークなアプローチとして、漢方薬が登場している。漢方薬は、あらゆる代替医療の中で、最も急速に成長している分野である。漢方薬は異なる形態で作製され、粗製の煎剤ハーブから精製、濃縮および標準化されたエキスまでの範囲に及ぶ。また、このようなハーブ類を摂取することによる健康上の有益性は、当該製剤の質および当該製剤に関する消費者の知識によって異なる。一部の製剤は、医師による管理下で使用しなければならない（特に、重篤な疾患に対して適応されるもの）が、ほとんどの漢方薬は概ね安全である。
【０００４】
多くの植物は、実験モデルにおいて抗ウイルス剤として科学的に評価されている、すなわち、アラビアゴムモドキ（Ａｃａｃｉａ  ｎｉｌｏｔｉｃａ）では、Ｃ型肝炎ウイルスプロテアーゼに対する阻害効果（Ｈｕｓｓｅｉｎら，Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｓ．，１４（７）ｐ．５１０−１６（２０００））、センシンレン（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）では、ＨＩＶ−１阻害活性（Ｒｅｄｄｙら，Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｓ．，１９（３）：ｐ．２２３−３０，（２００５））、ビンロウ（Ａｒｅｃａ  ｃａｔｅｃｈｕ）では、単純疱疹ウイルス１型のプラーク形成に対する阻害活性（Ｈａｔｔｏｒｉら，Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｒｅｓ．，９，ｐ．２７０−２７６（１９９５））、また、Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡポリメラーゼの阻害（Ｃｈｕｎｇら，Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｒｅｓ，９，ｐ．４２９−４３４（１９９５））、インドセンダン（Ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ  ｉｎｄｉｃａ）では、デング熱ウイルス２型の複製の阻害（Ｐａｒｉｄａら，Ｊ．Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，７９，ｐ．２７３−７８（２００２））、カンゾウ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｇｌａｂｒａ）では、いくつかの非関連ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスの増殖および細胞病理の阻害、また、単純疱疹ウイルスの不可逆的な不活化（Ｐｏｍｐｅｉら，Ｎａｔｕｒｅ，２８１（５７３３）：ｐ．６８９−９０（１９７９））、メボウキ（Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）では、ＤＮＡウイルス、すなわち、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）；アデノウイルス（ＡＤＶ）；Ｂ型肝炎の阻害、また、ＲＮＡウイルス、すなわち、コクサッキーウイルスＢ１（ＣＶＢｌ）、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）の阻害（Ｃｈｉａｎｇら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３２，ｐ．８１１−１６（２００５））、キダチミカンソウ（Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ  ａｍａｒｕｓ）では、ヒトヘパトーム細胞におけるＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）遺伝子発現の抑制（Ｙｅｈら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．，２０，ｐ．１８５−９２（１９９３））、およびＨＢｓＡｇのクリアランス（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎら，Ｌａｎｃｅｔ，ｐ．７６４−６６（１９８８））、ならびにセイタカミロバラン（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ  ｃｈｅｂｕｌａ）では、単純疱疹ウイルス１型感染に対する抵抗性（Ｋｕｒｏｋａｗａら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．，２７，ｐ．１９−３７（１９９５））が科学的に評価されている。さらに、植物起源の抗ウイルス剤は、無毒性で安価であり、許容性され易いものであり得る（Ｐａｒｉｄａら，Ｊ．Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，７９，ｐ．２７３−２７８（２００２））。
【０００５】
いくつかのハーブエキスと抗ウイルス活性との関連性が、文書によって充分裏付けられているが、植物エキスにおける抗ＤＥＮウイルス活性に関する体系的な研究は、これまで着手されていない。以前に、植物の種々の部分に由来する抽出物が抗ウイルス化合物の供給源となり得ることが明らかになった（Ｈｅｒｒｍａｎｎら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１２４，ｐ．８６５−７４（１９６７））。このことが、幾人かの研究者に、植物起源の抗ウイルス化合物の共同研究の着手を促し、これにより、いくつかの植物は、いくつかのウイルスの増殖の抑制に有効性を示すことを示す報告がなされるに至った（Ａｓｗａｌら，Ｉｎｄ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．，３４，ｐ．４４４−６７（１９９６））。
【０００６】
フェルトブッシュ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ  ｐａｒｅｉｒａ  Ｌｉｎｎ）（科：ツヅラフジ科，英語名：Ｖｅｌｖｅｔ  Ｌｅａｆ，ヒンディー語名：Ｐａｔｈａ，サンスクリット語名：Ａｍｂａｓｔｈａｋｉ）は、アジア、東アフリカおよびアメリカの温暖な地域一帯、ならびにインドおよびセイロンに一般に分布している蔓性低木である。これは、インドの熱帯および亜熱帯地域の標高が約１５００ｍまでの温暖で乾燥した地域によく見られる。これは、ヒマーチャル・プラデーシュ州、チョータ・ナーグプル地方、ビハール州、西ベンガル州、パンジャブ州、ラジャスタン州、特に、アラバリの東部、マラスワダ地区の山岳森林地帯、コンカン群、デカン高原、マイソール市のババブダンヒル、タミル・ナドゥ州に見られる（Ａｙｕｒｖｅｄｉｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ，第１版，第１部，第１巻，ｐ．９２−９３；Ｇｏｖｔ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｗｅｌｆａｒｅ，Ｄｅｐｔ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｏｍｏｅｏｐａｔｈｙ，Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ；Ｔｈｅ  Ｗｅａｌｔｈ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ，Ａ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａｎ  Ｒａｗ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒａｗ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ＶｏＩ  ＩＩ，Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｄｅｌｈｉ；Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｐｌａｎｔｓ  Ｕｓｅｄ  Ｉｎ  Ａｙｕｒｖｅｄａ，第２巻，Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ａｙｕｒｖｅｄａ  ａｎｄ  Ｓｉｄｄｈａ，Ｄｅｐｔ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｏｍｏｅｏｐａｔｈｙ，Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ）。
【０００７】
フェルトブッシュは、いくつかの疾患の処置に伝統的に使用されているアーユルヴェーダの薬用植物である。これは、苦い、収斂性、駆虫薬、駆風薬、健胃薬、消化性、抗炎症性、利尿性、解熱薬、去痰薬、催乳薬および苦味強壮薬であると言われている。これは、消化不良、腹痛、下痢、赤痢、発熱、咳、コリーザ、喘息および乳汁分泌障害に有用である（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｐｌａｎｔｓ  Ｕｓｅｄ  Ｉｎ  Ａｙｕｒｖｅｄａ，第２巻，Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ａｙｕｒｖｅｄａ  ａｎｄ  Ｓｉｄｄｈａ，Ｄｅｐｔ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｏｍｏｅｏｐａｔｈｙ，Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ）。
【０００８】
デング熱は、それ自体は、アーユルヴェーダの古典的教科書に記載されていない。しかしながら、多くの型の「ジュヴァラ（Ｊｗａｒａ）」が、その徴候および症状とともに、このような教科書に列挙されている。多くの場合、１つの型の「ジュヴァラ」を、現代科学でいう特定の型の「熱（ｆｅｖｅｒ）」の臨床的対応物として相関させることは困難である。古典的なアーユルヴェーダの教科書では、デング熱の一部の徴候および症状が、すなわち「ヴァータ（Ｖａｔａ）−ピッタ（Ｐｉｔｔａｊａ）ジュヴァラ」と称される熱の型と相関されている。アーユルヴェーダの古典的教科書に「ヴァータ−ピッタジュヴァラ」、「ヴァータ（Ｖａｔａｊ）ジュヴァラ」および「ピッタ（Ｐｉｔｔａｊ）ジュヴァラ」として知られる状態に使用されると言及されている植物が選択され、そのアーユルヴェーダの属性が研究された。これは、基本的に、項目、すなわち、「ラサ（Ｒａｓａ）」；「グナ（Ｇｕｎａ）」；「ビーリャ（Ｖｅｅｒｙａ）」；「ヴィパカ（Ｖｉｐａａｋａ）」；および「ドーシャ・カルマ（Ｄｏｓｈａ−Ｋａｒｍａ）」に分類される。このような属性はすべて、１つ１つの植物について充分研究され、少なくとも、すなわち、チクタ（Ｔｉｋｔａ）および／またはカシャーヤ（Ｋａｓｈａｙａ）・ラサ、ラグ（Ｌａｇｈｕ）および／またはチクシャナ（Ｔｉｋｓｈｎａ）・グナ、ウシャナ（Ｕｓｈｎａ）あるいはシータ（Ｓｈｅｅｔａ）・ビーリャを有し、カツ・ビパーカ（Ｋａｔｕ  Ｖｉｐａａｋａ）ならびにヴァータおよび／またはピッタ・シャーマカ（Ｓｈａａｍａｋａ）を有するハーブはいずれも、デング熱に関連する徴候および症状の緩和に有用であり得ることが前提とされた仮説が立てられた。一部の属性、すなわち、カツ・ラサおよびルクシャ（Ｒｕｋｓｈａ）・グナは、該仮説において提案された属性に加えられたものであった。したがって、提案された仮説および提案されたアーユルヴェーダの属性ならびにそのさらなるアーユルヴェーダの属性の存在に基づき、フェルトブッシュ（アンバスタキ（Ａｍｂａｓｔｈａｋｉ）／パサ（Ｐａｔｈａ））が、デング熱におけるその治療効果の研究を着手するために選択された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ａｎｎ，Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５１，ｐ．２６２−２７１（２００１）
【非特許文献２】Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｊｕｌｙ，ｐ．４８０−４９６（１９９８）
【非特許文献３】Ｈｕｓｓｅｉｎら，Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｓ．，１４（７）ｐ．５１０−１６（２０００）
【非特許文献４】Ｒｅｄｄｙら，Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｓ．，１９（３）：ｐ．２２３−３０，（２００５）
【非特許文献５】Ｈａｔｔｏｒｉら，Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｒｅｓ．，９，ｐ．２７０−２７６（１９９５）
【非特許文献６】Ｃｈｕｎｇら，Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｒｅｓ，９，ｐ．４２９−４３４（１９９５）
【非特許文献７】Ｐａｒｉｄａら，Ｊ．Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，７９，ｐ．２７３−２７８（２００２）
【非特許文献８】Ｐｏｍｐｅｉら，Ｎａｔｕｒｅ，２８１（５７３３）：ｐ．６８９−９０（１９７９）
【非特許文献９】Ｃｈｉａｎｇら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３２，ｐ．８１１−１６（２００５）
【非特許文献１０】Ｙｅｈら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．，２０，ｐ．１８５−９２（１９９３）
【非特許文献１１】Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎら，Ｌａｎｃｅｔ，ｐ．７６４−６６（１９８８）
【非特許文献１２】Ｋｕｒｏｋａｗａら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．，２７，ｐ．１９−３７（１９９５）
【非特許文献１３】Ｈｅｒｒｍａｎｎら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１２４，ｐ．８６５−７４（１９６７）
【非特許文献１４】Ａｓｗａｌら，Ｉｎｄ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．，３４，ｐ．４４４−６７（１９９６）
【非特許文献１５】Ａｙｕｒｖｅｄｉｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ，第１版，第１部，第１巻，ｐ．９２−９３
【非特許文献１６】Ｇｏｖｔ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｗｅｌｆａｒｅ，Ｄｅｐｔ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｏｍｏｅｏｐａｔｈｙ，Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ
【非特許文献１７】Ｔｈｅ  Ｗｅａｌｔｈ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ，Ａ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａｎ  Ｒａｗ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒａｗ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ＶｏＩ  ＩＩ，Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｄｅｌｈｉ
【非特許文献１８】Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｐｌａｎｔｓ  Ｕｓｅｄ  Ｉｎ  Ａｙｕｒｖｅｄａ，第２巻，Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ａｙｕｒｖｅｄａ  ａｎｄ  Ｓｉｄｄｈａ，Ｄｅｐｔ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｏｍｏｅｏｐａｔｈｙ，Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様において、シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）エキスを提供する。
【００１１】
本発明の別の態様では、薬学的に許容され得る担体、賦形剤または希釈剤の１種類以上とともにシサムペロス  パレイラ（雅紅隆）エキスを含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
本発明の別の態様では、シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）エキスの調製方法を提供する。
【００１３】
本発明の別の態様では、デング熱ウイルス感染の処置方法を提供する。
【００１４】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を以下の説明に示す。本発明の他の特徴、目的および利点は、本説明から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、バイオアッセイガイド型分別プロセスのフロー図を示す。
【図２】図２は、ウイルス力価低減（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）アッセイによるデング熱ウイルス血清型３（Ｄｅｎ−３）に対するシサムペロス  パレイラ（雅紅隆）（ｃ．ｐａｒｅｉｒａ）のメタノール抽出物の抗デング熱活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、抗デング熱活性を有するシサムペロス  パレイラ（雅紅隆）エキスを提供する。
【００１７】
活性な抽出物および画分の同定がもたらされる植物材料に対するバイオアッセイガイド型分別アプローチを提供する。該方法は、種々のシサムペロス  パレイラ（雅紅隆）エキスを調製すること、該エキスを生体活性に供すること（一次スクリーニング−慣用的なプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）アッセイ、二次スクリーニング−変形型プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）アッセイおよび三次スクリーニング−ウイルス力価低減アッセイ）を含む。活性な抽出物を、さらに、１種類以上の溶媒による分別に供し、各画分を生体活性について評価した。
【００１８】
抽出用の１種類以上の溶媒は、例えば、水；アルコール、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールもしくはブタノール；ケトン、例えば、アセトンもしくはメチルイソブチルケトン；エステル、例えば、酢酸メチルもしくは酢酸エチル；ハロゲン化炭化水素、例えば、クロロホルム、ジクロロメタンもしくは二塩化エチレン；石油留分、例えば、ヘキサン、石油エーテルもしくはヘプタン；またはその混合物（１種類もしくは複数種）であり得る。
【００１９】
分別用の１種類以上の溶媒は、例えば、水；石油留分、例えば、ヘキサン、石油エーテルもしくはヘプタン；ハロゲン化炭化水素、例えば、クロロホルム、ジクロロメタンもしくは二塩化エチレン；エステル、例えば、酢酸エチルもしくは酢酸メチル；ケトン、例えば、アセトンまたはメチルイソブチルケトン；アルコール、例えば、ブタノール；エーテル、例えば、ジエチルエーテル；またはその混合物（１種類もしくは複数種）であり得る。
【００２０】
本発明の別の態様では、シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）由来のエキスの調製のための方法を提供する。該方法は、シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）の植物塊を、無極性から極性の範囲の１種類以上の溶媒で抽出すること、該抽出物を濃縮すること、および該抽出物を乾燥させること、またはシサムペロス  パレイラ（雅紅隆）の植物塊を、無極性から極性の範囲の１種類以上の溶媒で抽出すること、該抽出物を濃縮すること、水を添加すること、および該抽出物を、無極性から極性の範囲の１種類以上の溶媒により分配すること、ならびに該抽出物を乾燥させること、またはシサムペロス  パレイラ（雅紅隆）の植物塊を、無極性から極性の範囲の１種類以上の溶媒で抽出すること、該抽出物を濃縮すること、該抽出物を、無極性から極性の範囲の１種類以上の溶媒で抽出すること、および該抽出物を乾燥させることを含む。
【００２１】
抽出用の溶媒は、例えば、水；アルコール、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールもしくはブタノール；ケトン、例えば、アセトンもしくはメチルイソブチルケトン；エステル、例えば、酢酸メチルもしくは酢酸エチル；ハロゲン化炭化水素、例えば、クロロホルム、ジクロロメタンもしくは二塩化エチレン；石油留分、例えば、ヘキサン、石油エーテルもしくはヘプタン；またはその混合物（１種類もしくは複数種）であり得る。
【００２２】
分配用の溶媒は、例えば、水；石油留分、例えば、ヘキサン、石油エーテルもしくはヘプタン；ハロゲン化炭化水素、例えば、クロロホルム、ジクロロメタンもしくは二塩化エチレン；エステル、例えば、酢酸エチルもしくは酢酸メチル；ケトン、例えば、アセトンまたはメチルイソブチルケトン；アルコール、例えば、ブタノール；エーテル、例えば、ジエチルエーテル；またはその混合物（１種類もしくは複数種）であり得る。
【００２３】
本発明の別の態様では、デング熱ウイルス感染の処置方法を提供する。
【００２４】
薬学的に許容され得る担体、賦形剤または希釈剤の１種類以上とともにシサムペロス  パレイラ（雅紅隆）エキスを含む医薬組成物を提供し、これは哺乳動物に、デング熱ウイルス感染の処置のために、活性化合物が適切な、または所望の作用部位に有効に輸送される任意の経路（経口、経鼻、経肺、経皮または非経口（経直腸、皮下、静脈内、尿道内、筋肉内もしくは鼻腔内）など）によって投与され得る。医薬用担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図される投与経路および標準的な製薬実務を基にして行なわれ得る。
【００２５】
シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）エキスは、（ａ）シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）の植物塊を１種類以上の溶媒で抽出することによって得られる抽出物、および（ｂ）工程（ａ）の抽出物を１種類以上の溶媒で分配することによって得られる画分を包含する。
【００２６】
「シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）の植物塊」は、着生（ａｅｒｉａｌ）部分、例えば、果実、花、種子、葉、枝、幹樹皮、幹または心材および根を含む植物全体をいう。
【００２７】
以下に示す実施例は本発明の一部の特定の実施形態に対するものであり、これらは、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例１】
【００２８】
メタノール抽出物の調製
粉砕シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）着生部分（１００ｋｇ）を抽出機に仕込んだ。メタノール（５００リットル）を抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。抽出物を濾過し、容器内に保存した。再度、３００リットルのメタノールを抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。抽出物を濾過し、容器内に保存した。再度、３００リットルのメタノールを抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。メタノール抽出物を合わせ、最大限まで低温で減圧濃縮した。抽出物をステンレス鋼トレイ（ｓｓ）内に下降収集（ｄｏｗｎ  ｌｏａｄ）し、高真空炉内で、室温にて約１６時間〜１８時間乾燥させた。
収率＝６％〜１５％
【実施例２】
【００２９】
（メタノール：水：５０：５０）抽出物の調製
粉砕シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）着生部分（１００ｋｇ）を抽出機に仕込んだ。メタノール：水（２５０リットル：２５０リットル）の混合物を抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。抽出物を濾過し、容器内に保存した。再度、メタノール：水（１５０リットル：１５０リットル）の混合物を抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。抽出物を濾過し、容器内に保存した。再度、メタノール：水（１５０リットル：１５０リットル）の混合物を抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。水性アルコール抽出物を合わせ、最大限まで低温で減圧濃縮し、抽出物をｓｓトレイ内に下降収集し、高真空炉内で、室温にて約１６時間〜１８時間乾燥させた。
収率＝１０％〜２５％
【実施例３】
【００３０】
水性抽出物の調製
粉砕シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）着生部分（１００ｋｇ）を抽出機に仕込んだ。水（５００リットル）を抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。抽出物を濾過し、容器内に保存した。再度、水（３００リットル）を抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。抽出物を濾過し、容器内に保存した。再度、水（３００リットル）を抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。水性抽出物を合わせ、最大限まで低温で減圧濃縮し、抽出物をｓｓトレイ内に下降収集し、高真空炉内で、室温にて約１６時間〜１８時間乾燥させた。
収率＝１５％〜３０％
【実施例４】
【００３１】
ヘキサン画分の調製
粉砕シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）着生部分（１００ｋｇ）を抽出機に仕込んだ。メタノール（５００リットル）を抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。抽出物を濾過し、容器内に保存した。再度、３００リットルのメタノールを抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。抽出物を濾過し、容器内に保存した。再度、３００リットルのメタノールを抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。メタノール抽出物を合わせ、最大限まで低温で減圧濃縮した。抽出物を水（５０リットル）に懸濁させ、ヘキサン（４０リットル）により分配した。ヘキサン層を分離し、容器内に収集した。このプロセスをもう３回繰り返し、合わせたヘキサン層を乾燥剤で乾燥させた。これを減圧濃縮し、ｓｓトレイ内に下降収集し、高真空炉内で、室温にて約１６時間〜１８時間乾燥させた。
収率＝１．０％〜３．０％
【実施例５】
【００３２】
クロロホルム画分の調製
粉砕シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）着生部分（１００ｋｇ）を抽出機に仕込んだ。メタノール（５００リットル）を抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。抽出物を濾過し、容器内に保存した。再度、３００リットルのメタノールを抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。抽出物を濾過し、容器内に保存した。再度、３００リットルのメタノールを抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。メタノール抽出物を合わせ、最大限まで低温で減圧濃縮した。抽出物を水（５０リットル）に懸濁させ、ヘキサン（４０リットル）により分配した。ヘキサン層を分離し、容器内に収集した。このプロセスをもう３回繰り返し、合わせたヘキサン層を乾燥剤で乾燥させ、濃縮した。残りの水層をクロロホルム（４０リットル）により分配し、クロロホルム層を分離し、容器内に収集した。このプロセスをもう３回繰り返し、合わせたクロロホルム層を乾燥剤に通した。クロロホルム層を減圧濃縮し、ｓｓトレイ内に下降収集し、高真空炉内で、室温で約１６〜１８時間乾燥させた。
収率＝０．２０％〜１．０％
【実施例６】
【００３３】
ジクロロメタン画分の調製
粉砕シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）着生部分（１００ｋｇ）を抽出機に仕込んだ。メタノール（５００リットル）を抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。抽出物を濾過し、容器内に保存した。再度、３００リットルのメタノールを抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。抽出物を濾過し、容器内に保存した。再度、３００リットルのメタノールを抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。メタノール抽出物を合わせ、最大限まで低温で減圧濃縮した。抽出物を水（５０リットル）に懸濁させ、ヘキサン（４０リットル）により分配し、ヘキサン層を分離し、容器内に収集した。このプロセスをもう３回繰り返し、合わせたヘキサン層を乾燥剤で乾燥させ、濃縮した。水層をジクロロメタン（４０リットル）により分配し、ジクロロメタン層を分離し、容器内に収集した。このプロセスをもう３回繰り返し、合わせたジクロロメタン層を乾燥剤に通した。ジクロロメタン層を減圧濃縮し、ｓｓトレイ内に下降収集し、高真空炉内で、室温にて約１６時間〜１８時間乾燥させた。
収率＝０．２２％〜１．２％
【実施例７】
【００３４】
ジクロロメタン画分の調製
粉砕シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）着生部分（１００ｋｇ）を抽出機に仕込んだ。メタノール（５００リットル）を抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。抽出物を濾過し、容器内に保存した。再度、３００リットルのメタノールを抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。抽出物を濾過し、容器内に保存した。再度、３００リットルのメタノールを抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。メタノール抽出物を合わせ、最大限まで低温で減圧濃縮した。抽出物を水（５０リットル）に懸濁させ、ジクロロメタン（４０リットル）により分配し、ジクロロメタン層を分離し、容器内に収集した。このプロセスをもう３回繰り返し、合わせたジクロロメタン層を乾燥剤に通した。ジクロロメタン層を減圧濃縮し、ｓｓトレイ内に下降収集し、高真空炉内で、室温にて約１６時間〜１８時間乾燥させた。
収率＝１．０％〜１．７５％
【実施例８】
【００３５】
ブタノール画分の調製
粉砕シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）着生部分（１００ｋｇ）を抽出機に仕込んだ。メタノール（５００リットル）を抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。抽出物を濾過し、容器内に保存した。再度、３００リットルのメタノールを抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。抽出物を濾過し、容器内に保存した。再度、３００リットルのメタノールを抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。メタノール抽出物を合わせ、最大限まで低温で減圧濃縮した。抽出物を水（５０リットル）に懸濁させ、ヘキサン（４０リットル）により分配し、ヘキサン層を分離し、容器内に収集した。このプロセスをもう３回繰り返し、合わせたヘキサン層を乾燥剤で乾燥させ、濃縮した。水層をクロロホルム（４０リットル）により分配し、クロロホルム層を分離し、容器内に収集した。このプロセスをもう３回繰り返し、合わせたクロロホルム層を乾燥剤中に通し、濃縮した。水層をブタノール（４０リットル）により分配し、ブタノール層を分離し、容器内に収集した。このプロセスをもう３回繰り返し、合わせたブタノール層を乾燥剤で乾燥させた。ブタノール層を減圧濃縮し、ｓｓトレイ内に下降収集し、高真空炉内で、室温にて約１６時間〜１８時間乾燥させた。
収率＝２．０％〜４．５％
【実施例９】
【００３６】
水性画分の調製
粉砕シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）着生部分（１００ｋｇ）を抽出機に仕込んだ。メタノール（５００リットル）を抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。抽出物を濾過し、容器内に保存した。再度、２００リットルのメタノールを抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。抽出物を濾過し、容器内に保存した。再度、２００リットルのメタノールを抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。メタノール抽出物を合わせ、最大限まで低温で減圧濃縮した。抽出物を水（５０リットル）に懸濁させ、ヘキサン（４０リットル）により分配し、ヘキサン層を分離し、容器内に収集した。このプロセスをもう３回繰り返し、合わせたヘキサン層を乾燥剤で乾燥させ、濃縮した。水層をクロロホルム（４０リットル）により分配し、クロロホルム層を分離し、容器内に収集した。このプロセスをもう３回繰り返し、合わせたクロロホルム層を乾燥剤中に通し、濃縮した。水層をブタノール（４０リットル）により分配し、ブタノール層を分離し、容器内に収集した。このプロセスをもう３回繰り返し、合わせたブタノール層を乾燥剤で乾燥させ、濃縮した。排出（ｅｘｈａｕｓｔｅｄ）した水層を減圧濃縮し、ｓｓトレイ内に下降収集し、高真空炉内で、室温にて約１６時間〜１８時間乾燥させた。
収率＝２．５％〜６．０％
【実施例１０】
【００３７】
酢酸エチル画分の調製
粉砕シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）着生部分（１００ｋｇ）を抽出機に仕込んだ。メタノール（５００リットル）を抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。抽出物を濾過し、容器内に保存した。再度、３００リットルのメタノールを抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。抽出物を濾過し、容器内に保存した。再度、３００リットルのメタノールを抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。メタノール抽出物を合わせ、最大限まで低温で減圧濃縮した。抽出物を水（５０リットル）に懸濁させ、酢酸エチル（４０リットル）により分配し、酢酸エチル層を分離し、容器内に収集した。このプロセスをもう３回繰り返し、合わせた酢酸エチル層を乾燥剤で乾燥させた。酢酸エチル層を減圧濃縮し、ｓｓトレイ内に下降収集し、高真空炉内で、室温にて約１６時間〜１８時間乾燥させた。
収率＝２．０％〜４．０％
【実施例１１】
【００３８】
アセトン画分の調製
粉砕シサムペロス  パレイラ（雅紅隆）着生部分（１００ｋｇ）を抽出機に仕込んだ。メタノール（５００リットル）を抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。抽出物を濾過し、容器内に保存した。再度、３００リットルのメタノールを抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。抽出物を濾過し、容器内に保存した。再度、３００リットルのメタノールを抽出機に添加し、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約１６時間、抽出を行なった。メタノール抽出物を合わせ、最大限まで低温で減圧濃縮した。抽出物をアセトン（５０リットル）で、室温から溶媒の沸点までの範囲の温度で約２時間〜３時間抽出した。抽出物を濾過し、容器内に保存した。このプロセスをもう３回繰り返した。抽出物をｓｓトレイ内に下降収集し、高真空炉内で、室温にて約１６時間〜１８時間乾燥させた。
収率＝２．０％〜３．５％
【実施例１２】
【００３９】
生物学的活性
（ｉ）一次スクリーニング−慣用的なプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）アッセイ
抽出物の抗ウイルス活性は、ＰＲＮＴアッセイ（Ｋｈａｎａｍら，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．，７４（２）ｐ．２６６−２７７（２００６）を用いてアッセイし、２４ウェル形式にて、ＬＬＣＭＫ２細胞（サル腎臓細胞株）を１×１０５／ウェルの濃度で播種した。感染は、ほぼ５０プラーク形成単位（ＰＦＵ）のデング熱ウイルス（ＤＥＮＶ）（４つのすべての血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３、およびＤＥＮＶ−４）を用いて感染多重度（ＭＯＩ）１で行なった。ウイルスは、別途、１００〜０．３３ｍｃｇ／ｍｌの範囲の等容量の抽出物とともにプレインキュベートした。４℃で一晩プレインキュベーション後、ウイルス／抽出物を最終容量２００μＬまで、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋２％熱不活化ウシ胎仔血清（ΔＦＣＳ）で希釈し、２４ウェルプレートの単一のウェルの感染に使用した。各希釈物をウェルにおいて２連でアッセイし、ウイルス／抽出物のプレインキュベーション混合物を、２つのウェルに充分なマスター混合物として調製した。２時間の吸着後、接種源を吸引除去し、細胞に１．２５％メチルセルロース（ＤＭＥＭ中）＋６％ΔＦＣＳ（１ｍＬ／ウェル）を重層した。２００μＬのＤＭＥＭ＋２％ΔＦＣＳを入れた陰性対照（モック−非感染）ウェル、および（個々にＤＥＮ−１、２、３および４ウイルス）を入れた陽性対照ウェルと並行して、適切な対照をセットアップし、抽出物ではなくＤＭＥＭ＋２％ΔＦＣＳとともにプレインキュベートした。プレートは、加湿５％ＣＯ２インキュベータ内で３７℃にてインキュベートした。感染後、６日目、細胞を１ｍＬの４％ホルムアルデヒド溶液で、室温にて２時間固定した。ウェルを水道水で洗浄し、次いで、２０％エタノール中２％のクリスタルバイオレット溶液の１：４０希釈ストックで３０分間染色した。染色後に顕現されたプラークを計数し、プラーク数の５０％減少（抽出物の非存在下のウイルスによって生成されるプラークの数を基準とする）をもたらす抽出物の希釈度をＰＲＮＴ５０力価として示した。
【００４０】
メタノール抽出物は、慣用的なアッセイにおいてデング熱の４つのすべての血清型に対する活性を示し、ＰＲＮＴ５０値は１．２〜１１．１ｍｃｇ／ｍｌの範囲であった。すべての血清型に対する慣用的なアッセイにおいて、水性アルコール抽出物および水性抽出物のＰＲＮＴ５０値は＞１００ｍｃｇ／ｍｌであった。
【００４１】
（ｉｉ）二次スクリーニング−変形型プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）アッセイ
２４ウェル形式にて、ＬＬＣＭＫ２細胞を１×１０５／ウェルの濃度で播種した。播種した細胞を、５０（１Ｘ）プラーク形成単位（ＰＦＵ）の４種類全部の血清型のほぼ５０μｌのウイルスに、１のＭＯＩで感染させた。３７℃および５％ＣＯ２で２時間の吸着後、接種源を吸引した。ウェルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、感染細胞を異なる濃度の抽出物（２００〜０．８２ｍｃｇ／ｍｌ）に２４時間の間、曝露した。３７℃および５％ＣＯ２で２４時間のインキュベーション後、抽出物を吸引除去し、細胞に１％メチルセルロース（ＤＭＥＭ中）＋６％ΔＦＣＳ（１ｍｌ／ウェル）を重層した。各希釈物をウェルにおいて２連でアッセイした。プレートは、加湿５％ＣＯ２インキュベータ内で３７℃にて６日間インキュベートした。感染後、６日目、重層部を静かにデカンテーションし、細胞を１ｍＬの４％ホルムアルデヒド溶液で、室温にて１時間固定した。ウェルを水道水で洗浄し、次いで、２０％エタノール中２％のクリスタルバイオレット溶液の１：４０希釈ストックで３０分間染色した。染色後に顕現されたプラークを計数し、プラーク数の５０％減少（抽出物の非存在下のウイルスによって生成されるプラークの数を基準とする）をもたらす抽出物の希釈度をＰＲＮＴ５０力価として示した。
【００４２】
メタノール抽出物は、変形型アッセイにおいて、４つのすべての血清型に対して７８〜１２５ｍｃｇ／ｍｌの範囲のＰＲＮＴ５０値を示した。しかしながら、水性アルコール抽出物および水性抽出物は、２００ｍｃｇ／ｍｌまで不活性であった。
【００４３】
（ｉｉｉ）三次スクリーニング−ウイルス力価低減アッセイ
ウイルス力価低減アッセイは、Ｐｕｉｇ−Ｂａｓａｇｏｉｔｉら，Ａｎｔｉｍｉｃ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，５０（４）ｐ．１３２０−１３２９（２００６）に従うことにより行なった。２４ウェル形式にて、ベロ細胞を１×１０５／ウェルの濃度で播種した。播種した細胞を、５０（１Ｘ）プラーク形成単位（ＰＦＵ）の４種類全部の血清型のほぼ５０μｌのウイルスに、１のＭＯＩで感染させた。３７℃および５％ＣＯ２で２時間の吸着後、接種源を吸引した。ウェルをＰＢＳで洗浄し、感染細胞を、異なる濃度の抽出物（２００〜０．８２ｍｃｇ／ｍｌ）を含む増殖培地（ＤＭＥＭ＋２％ΔＦＣＳ）に、ＤＭＥＭ＋２％ΔＦＣＳを入れた陰性対照（モック−非感染）ウェル、およびＤＥＮ−３ウイルスを入れた陽性対照ウェルとともに、９日間の間、曝露した。２０μｌの上清み試料を異なる日数、すなわち、０、３、６、９日で抜き出し、さらなる処理まで凍結させた。
【００４４】
アリコートに分けた試料を、ＤＭＥＭ＋２％ΔＦＣＳ培地中で連続希釈した後、コンフルエント細胞を含むウェルに添加した（２連または３連で）。ウイルスを２時間吸着させた後、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。２時間の吸着後、接種源を吸引除去し、細胞に１．２５％メチルセルロース（ＤＭＥＭ中）＋６％ΔＦＣＳ（１ｍＬ／ウェル）を重層した。プレートは、加湿５％ＣＯ２インキュベータ内で３７℃にて６日間インキュベートした。感染後、６日目、重層部を静かにデカンテーションし、細胞を１ｍＬの４％ホルムアルデヒド溶液で、室温にて１時間固定した。ウェルを水道水で洗浄し、次いで、２０％エタノール中２％のクリスタルバイオレット溶液の１：４０希釈ストックで３０分間染色した。染色後に顕現されたプラークを計数し、異なる試験濃度に対する異なる時間点でのプラーク力価の低下の対数を、ウイルス対照と比較して算出した。
【００４５】
メタノール抽出物の致死速度論プロフィールにより、３日目、Ｄｅｎ−３血清型に対する６６．６６ｍｃｇ／ｍｌにおいて、２ｌｏｇの減少が示された。６日目では、２．４６および７．４ｍｃｇ／ｍｌの抽出物濃度において、ウイルス負荷量は１〜１．５ｌｏｇ減少した。
【００４６】
（ｉｖ）細胞毒性アッセイ
メタノール抽出物の細胞毒性を、ＨＥｐＧ−２細胞（ヒト肝臓ヘパトーマ細胞株）を抽出物の６点希釈物（濃度範囲は２００ｍｃｇ／ｍｌ〜０．８２ｍｃｇ／ｍｌ）とともに、培養培地ＲＰＭＩ中（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）２％ΔＦＣＳ中（９６ウェルプレート内）で、３日間（一次および二次スクリーニングにおける抽出物との細胞のインキュベーション期間に相当）インキュベートすることにより評価した。７２時間後、細胞バイアビリティを、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾル−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）の細胞代謝によって測定した（Ｍａｒｋｌａｎｄ  Ｗ．ら，Ａｎｔｉｍｉｃ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，４４（４）ｐ．８５９−８６６（２０００））。増殖指数（ＧＩ）５０は９０ｍｃｇ／ｍｌであることがわかった。
【図１】
0005709762.tif 000002
【図２】
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