(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性架橋重合体粒子からなる液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法であって、
水性分散媒中に架橋性単量体を分散させて分散液を得る工程１と、
前記架橋性単量体の融点以上、かつ、実質的に前記架橋性単量体の重合反応が進行しない温度で、前記分散液を攪拌回転数２００〜３５０ｒｐｍで５〜４８時間撹拌する工程２と、
反応系を一定の温度に保持して重合開始剤の存在下で第１の重合反応を行い、架橋重合体粒子を得る工程３と、
反応系の温度を５〜４０℃に冷却する工程４と、
反応系に親水性単量体を添加し、反応系を５〜４０℃で０．２〜２４時間撹拌する工程５と、
反応系を一定の温度に保持して第２の重合反応を行い、前記架橋重合体粒子の表面に親水性単量体を重合する工程６を有する
液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法。
【請求項２】
工程２における、架橋性単量体の融点以上、かつ、実質的に架橋性単量体の重合反応が進行しない温度が５〜４０℃である請求項１記載の液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法により得られるカラム充填剤を用いる液体クロマトグラフィーによる試料の測定方法。
【請求項４】
請求項３記載の液体クロマトグラフィーによる試料の測定方法を用いる、ヘモグロビン類の測定方法。
【請求項５】
測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する請求項４記載のヘモグロビン類の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親水性架橋重合体粒子からなる液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法に関する。また、本発明は、該液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法を用いて得られるカラム充填剤を用いた液体クロマトグラフィーによる試料の測定方法、及び、ヘモグロビン類の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
親水性のカラム充填剤を用いた液体クロマトグラフィーは、親水性物質の測定に極めて有益な測定方法であり、現在汎用されている分析手法の一つである。親水性のカラム充填剤を用いた測定モードとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、親水性ゲル浸透クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー等が挙げられる。
【０００３】
親水性の液体クロマトグラフィー用カラム充填剤（以下、単にカラム充填剤ともいう）は、無機系高分子粒子、又は、有機系高分子粒子に、親水性基を導入することにより得ることができる。無機系高分子粒子の素材としては、シリカ、セラミックス、ガラス等が挙げられ、有機系高分子粒子の素材としては、ポリスチレン系高分子やアクリル系高分子等の有機合成高分子系素材、ポリアミノ酸や多糖類等の天然高分子系素材等が挙げられる。
【０００４】
無機系カラム充填剤として汎用されているシリカ系充填剤は、中性以上のｐＨ条件下におけるシリカ自体の溶出や、残存するシラノール基による非特異吸着等の欠点が報告されている。また、有機高分子系の中でも天然高分子系充填剤は、親水性が大きく非特異吸着が少ない反面、機械的強度に乏しいため高流速での測定が行えず、測定時間が大幅に延長されるという問題がある。一方、有機合成高分子系カラム充填剤は、上記無機系カラム充填剤や上記天然高分子系カラム充填剤が有する欠点が少なく、簡便な方法により製造できる利点がある。
【０００５】
有機合成高分子系カラム充填剤として、例えば、特許文献１には、親水性基であるカルボキシル基を含有する単量体５〜９０重量％、架橋性単量体１０〜９５重量％、非架橋性単量体０〜８５重量％を混合し、共重合して得られるイオン交換クロマトグラフィー用カラム充填剤が開示されている。また、特許文献２には、疎水性架橋重合体粒子の表面に、親水性基を有する親水性単量体を重合させたカラム充填剤が開示されている。更に、特許文献３には、２段階重合法による、分離性能に優れたカラム充填剤の製造方法が開示されている。
【０００６】
しかし、これらの有機合成高分子系カラム充填剤は、液体クロマトグラフィーに適用した場合の性能にロット間等のバラツキが認められる。再現性の良いカラム充填剤を得るためには、有機合成高分子を得るための重合反応の諸条件を、厳密に制御する必要があった。しかしながら、その制御は困難であり、収率の低下を招く場合が多い。一般に、カラム充填剤、及び、充填カラムは高価であるため、収率の低下はコスト抑制の大きな弊害となっていた。
【０００７】
液体クロマトグラフィーの臨床検査分野への代表的な実用例として、例えば、糖尿病診断を目的としたヘモグロビンＡ１ｃの測定が挙げられる。液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定方法は、他の測定方法に比較して精度が良く、短時間で測定できるため、特に糖尿病患者のヘモグロビンＡ１ｃ値の管理に用いられている。この用途では、測定値のＣＶ値が１％以下程度となる高い精度が要求される。
【０００８】
高精度に測定するためには、ヘモグロビンＡ１ｃと他のヘモグロビン類との良好な分離が必要である。高い分離性能を得るための一般的な手段は、カラム充填剤粒子の粒径を小さくし、より均一にすることである。例えば、特許文献４には、平均粒径値が３〜４μｍの微小な充填剤を用いてヘモグロビン類を測定する方法が開示されている。しかし、その結果、測定系にかかる圧力は５ＭＰａ以上と大きくなる。
【０００９】
そのため、使用する液体クロマトグラフは高い耐圧性能が必要になり、高価で複雑な機構となる。また、測定系に常時高圧がかかる場合、長期間使用した場合の配管系の詰まりや劣化、カラム寿命の短縮等の弊害をもたらす。ヘモグロビンＡ１ｃの測定のような多数の検体を測定する項目においては、カラム寿命はコストに直接影響を及ぼすため、短期間で測定精度が低下するカラムは実用上使用できない。
【００１０】
従って、測定系に生じる圧力値は低いほど有利であると考えられるが、従来のカラム充填剤を用いて高精度な測定を行う場合は、特許文献４に示された程度か、又は、それ以上の圧力値が生じる。一方、圧力値を低くするためにカラム充填剤の粒径を大幅に増大させると、測定精度の低下、及び、カラム寿命の短縮という問題が生じる。更に、圧力値が低すぎる場合、送液が不安定になり、測定時間が延長する等の問題が生じる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開昭５７−１７８１５７号公報
【特許文献２】特開平０３−０７３８４８号公報
【特許文献３】特開２０００−８８８２６号公報
【特許文献４】特開平０５−００５７３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、性能の再現性が良好なカラム充填剤の製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、該カラム充填剤の製造方法を用いて得られるカラム充填剤を用いた液体クロマトグラフィーによる試料の測定方法、及び、ヘモグロビン類の測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、親水性架橋重合体粒子からなる液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法であって、水性分散媒中に架橋性単量体を分散させて分散液を得る工程１と、上記架橋性単量体の融点以上、かつ、実質的に上記架橋性単量体の重合反応が進行しない温度で、上記分散液を１時間以上撹拌する工程２と、反応系を一定の温度に保持して重合開始剤の存在下で第１の重合反応を行い、架橋重合体粒子を得る工程３と、反応系の温度を５〜４０℃に冷却する工程４と、反応系に親水性単量体を添加し、反応系を５〜４０℃で０．２〜２４時間撹拌する工程５と、反応系を一定の温度に保持して第２の重合反応を行い、上記架橋重合体粒子の表面に親水性単量体を重合する工程６を有する液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法である。
以下に本発明を詳述する。
【００１４】
本発明者らは、従来のカラム充填剤の性能の再現性が不良となる要因は、粒度分布の再現性が低いこと、及び、分離性能に大きな影響を及ぼす親水基の導入量の再現性が低いことであると考えた。そこで本発明者らは、重合反応の精密制御ではなく、従来省みられなかった、重合反応を行う前の工程において攪拌条件を規定することにより、カラム充填剤の性能の再現性が向上することを見出した。また、攪拌条件の規定により、低い圧力においても高い分離性能を維持できること見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
本発明のカラム充填剤の製造方法は、水性分散媒中に架橋性単量体を分散させて分散液を得る工程１を有する。
架橋性単量体は、１分子中にビニル基を２個以上有する単量体であることが好ましい。また、架橋性単量体は、イオン交換基を有さない、又は、イオン交換基を有していても微量である架橋性単量体が好ましい。更に架橋性単量体は、アクリル系の架橋性単量体であることがより好ましい。
なお、本明細書において上記「アクリル系」とは、アクリル基又はメタクリル基を有することを意味する。また、「（メタ）アクリレート」とは、「アクリルレート又はメタクリレート」を意味し、「（メタ）アクリル酸」とは、「アクリル酸又はメタクリル酸」を意味する。
【００１６】
架橋性単量体としては、例えば、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類等が挙げられる。
ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、ポリテトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール−テトラメチレングリコール）−ジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコールポリエチレングリコール−ジ（メタ）アクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサグリコールジ（メタ）アクリレート、１，９−ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、２−ヒドロキシ−１，３−ジ（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−１−（メタ）アクリロキシ−３−（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル（メタ）アクリレート、グリセロールジ（メタ）アクリレート、グリセロールアクリレートメタクリレート、ウレタン（メタ）ジアクリレート、イソシアヌル酸ジ（メタ）アクリレート、イソシアヌル酸トリ（メタ）アクリレート、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−５−メチル−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１１−ジ（メタ）アクリロキシ−４，８−ジオキサウンデガン−２，６，１０−トリオール等が挙げられる。
分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類としては、例えば、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタントリ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらの架橋性単量体は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１７】
水性分散媒には、架橋性単量体以外に、必要に応じて非架橋性単量体を添加してもよい。
【００１８】
非架橋性単量体は、アクリル系単量体が好ましく、具体的には例えば、（メタ）アクリル酸アルキル類、水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体等が挙げられる。
（メタ）アクリル酸アルキル類としては、例えば、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸イソプロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル等が挙げられる。
水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体としては、例えば、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、その他の水酸基を有する（メタ）アクリレート類等が挙げられる。
ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシトリ（ポリ）エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、ポリ（エチレングリコール・プロピレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、オクトキシポリエチレングリコールポリプロピレングリコール−モノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
その他の水酸基を有する（メタ）アクリレート類としては、例えば、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルプロピル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらの非架橋性単量体は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１９】
非架橋性単量体を用いる場合、非架橋性単量体の添加量は、架橋性単量体１００重量部に対して１００重量部以下であることが好ましい。非架橋性単量体の添加量が１００重量部を超えると、得られる架橋重合体粒子の架橋度が低下してカラム充填剤が耐圧性に劣るものとなり、膨潤や収縮が起きて分離精度が低下しやすくなる。
【００２０】
工程１では、架橋性単量体、又は、架橋性単量体と非架橋性単量体との混合物（以下、両者を合わせて「単量体混合物」ともいう）を水性分散媒に添加する。なお、単量体混合物には、水性分散媒に添加する前に、後述する工程３で用いる重合開始剤を溶解しておくことが好ましい。
【００２１】
水性分散媒としては、水、水溶性有機溶媒、水と水溶性有機溶媒との混合物等が挙げられる。
水溶性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール類、アセトン、アセトニトリル等が挙げられる。
水溶性有機溶媒を水との混合物として用いる場合、水溶性有機溶媒の濃度の好ましい上限は２０重量％である。
【００２２】
水性分散媒の使用量は、単量体混合物１００重量部に対して、好ましい下限は２００重量部、好ましい上限は１万重量部である。
【００２３】
分散液は、必要に応じて、界面活性効果を有する物質（以下、分散剤ともいう）を含有してもよい。
分散剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、デンプン、ヒドロキシセルロース、ポリビニルエーテル等の水溶性高分子化合物や、リン酸カルシウム等の無機塩類や、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム、ジアルキルスルホコハク酸ナトリウム等のイオン性界面活性剤や、ポリオキシエチレンノニルフェニールエーテル、ポリエチレングリコールモノステアリレート、ソルビタンモノステアリレート等の非イオン性界面活性剤等が挙げられる。
【００２４】
分散液中の分散剤の含有量の好ましい下限は０．０１重量％、好ましい上限は２０重量％である。分散剤の含有量が０．０１重量％未満であると、添加した単量体が分散しにくくなり、凝集物が発生しやすくなる。分散剤の含有量が２０重量％を超えると、得られる親水性架橋重合体粒子の粒径が小さくなり、重合中に凝集物が発生しやすくなる。分散剤の含有量のより好ましい下限は０．１重量％、より好ましい上限は１０重量％である。
【００２５】
分散液は、その他に公知の各種添加剤を含有してもよい。
添加剤としては、例えば、ｐＨ調節剤、消泡剤、得られる親水性架橋重合体粒子にマクロポアを形成させるための多孔質化剤、重合反応を制御するための各種連鎖移動剤、単量体混合物の溶解度を調節するための有機化合物又は無機化合物等が挙げられる。
【００２６】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法は、架橋性単量体の融点以上、かつ、実質的に上記架橋性単量体の重合反応が進行しない温度で、上記分散液（以下、「反応系」ともいう）を１時間以上撹拌する工程２を有する。
【００２７】
工程２における反応系の温度は、架橋性単量体の融点以上、かつ、実質的に架橋性単量体の重合反応が進行しない温度である。
「架橋性単量体の融点以上」とは、複数の架橋性単量体を使用する場合は、全ての架橋性単量体の融点以上であることを意味し、上記非架橋性単量体を併用する場合は、全ての架橋性単量体と全ての非架橋性単量体の融点以上であることを意味する。
上記「実質的に上記架橋性単量体の重合反応が進行しない温度」とは、その温度で少なくとも１時間撹拌を行った場合に生じる重合物が、単量体混合物全量の１０重量％以下となる温度を意味する。具体的には、単量体混合物として上記例示したものを用い、重合開始剤として下記例示するものを用いる場合、工程２における反応系の温度は、５〜４０℃であることが好ましい。工程２における反応系の温度が５℃未満であると、単量体混合物の一部が凍結して均一に撹拌することが困難となることがある。工程２における反応系の温度が４０℃を超えると、撹拌中に単量体混合物の一部が重合し、得られるカラム充填剤の性能の再現性が低下することがある。工程２における反応系の温度のより好ましい下限は１０℃、より好ましい上限は３０℃である。
【００２８】
工程２における撹拌時間の下限は１時間である。工程２における撹拌時間が１時間未満であると、分散液の単量体混合物が安定せず、得られる親水性架橋重合体粒子の粒径の再現性が悪くなる。工程２における撹拌時間の好ましい下限は３時間、より好ましい下限は５時間である。
工程２における撹拌時間は、長時間行っても操作時間が延長するのみで再現性や分離性能を向上する効果は得られない。また、反応系が上述した「実質的に重合反応が進行しない温度」であっても、重合が進行してしまう可能性があるため、実質的には、工程２における撹拌時間の好ましい上限は４８時間である。
【００２９】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法は、反応系を一定の温度に保持して重合開始剤の存在下で第１の重合反応を行い、架橋重合体粒子を得る工程３を有する。
【００３０】
第１の重合反応としては、公知の重合方法を用いることができる。なかでも、重合開始剤を添加した後に、反応系を一定の温度に保持する方法が好ましく、重合開始剤を溶解した単量体混合物を水性分散媒中に添加した後に反応系を一定の温度に保持する方法がより好ましい。
【００３１】
工程３で用いる重合開始剤は、水溶性又は油溶性の公知のラジカル重合開始剤を用いることが好ましく、例えば、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム等の過硫酸塩や、クメンハイドロパーオキサイド、ベンゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、オクタノイルパーオキサイド、ｏ−クロロベンゾイルパーオキサイド、アセチルパーオキサイド、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシアセテート、ｔ−ブチルパーオキシイソブチレート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物や、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、４，４’−アゾビス（４−シアノペンタン酸）、２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル等のアゾ化合物や、これらの誘導体類等が挙げられる。
【００３２】
工程３で用いる重合開始剤の使用量は、単量体混合物１００重量部に対して、好ましい下限は０．０５重量部、好ましい上限は５重量部である。重合開始剤の使用量が０．０５重量部未満であると、第１の重合反応が充分に進行せず、未反応の単量体が反応系に残存する可能性がある。また、重合反応を完了させるために長時間を要し、作業効率が低下する。上記重合開始剤の使用量が５重量部を超えると、急激な反応の進行により、凝集物が発生しやすくなる。
【００３３】
第１の重合反応において保持する温度の好ましい下限は４０℃、好ましい上限は１００℃である。第１の重合反応において保持する温度が４０℃未満であると、温度を制御することが困難であり、反応に長時間を要する場合がある。第１の重合反応において保持する温度が１００℃を超えると、凝集物が発生しやすくなる。
また、第１の重合反応における反応時間の好ましい下限は０．３時間、好ましい上限は１２時間である。第１の重合反応における反応時間が０．３時間未満であると、単量体混合物の重合が不充分となり、得られるカラム充填剤の性能の再現性が低下することがある。第１の重合反応における反応時間が１２時間を超えると、凝集物が発生しやすくなる。上記第１の重合反応における反応時間のより好ましい下限は１時間、より好ましい上限は６時間である。
【００３４】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法は、反応系の温度を５〜４０℃に冷却する工程４を有する。上記工程４により、上記第１の重合反応は、実質上進行しない状態に保持される。
工程４における冷却温度が５℃未満であると、５℃未満に冷却する作業、及び、設備が煩雑となり作業時間が延長する。また、反応系に残存する単量体が析出することがある。工程４における冷却温度が４０℃を超えると、重合が進行する場合があるため、得られるカラム充填剤の性能の再現性が悪くなることがある。
第１の重合反応時において保持した温度から、工程４で冷却する温度までの反応系の降温に要する時間の好ましい上限は６０分、より好ましい上限は３０分である。
【００３５】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法は、反応系に親水性単量体を添加し、反応系を５〜４０℃で０．２〜２４時間撹拌する工程５を有する。
【００３６】
親水性単量体は、重合性基、及び、親水性官能基を有する単量体であることが好ましい。上記親水性官能基は、重合後に得られる架橋重合体粒子に親水性を付与し、かつ、液体クロマトグラフィーによる測定の際に、試料中の各成分との相互作用により分離を行う役割を担う。従って、親水性単量体は、カラム充填剤として適用する測定モードによって、適宜選択できる。
【００３７】
例えば、本発明のカラム充填剤の製造方法を用いて得られるカラム充填剤（以下、本発明によるカラム充填剤ともいう）を、イオン交換クロマトグラフィーに用いる場合に使用する親水性単量体は、１分子中に１個以上のイオン交換基を有する親水性単量体（以下、イオン交換性単量体ともいう）であることが好ましい。
イオン交換基としては、例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基等のカチオン交換基、３級アミノ基、４級アンモニウム基等のアニオン交換基等が挙げられる。
なお、本明細書において、イオン交換基には、イオン交換基に付随する構造は問わないため、イオン交換基を末端に有する全ての官能基を含む。例えば、「カルボキシル基」とは、カルボキシルエチル基、カルボキシルプロピル基等、カルボキシル基が結合する官能基類全てを含む（以下、官能基を記載する場合は同様の構造を意味する）。
【００３８】
カルボキシル基を有する単量体としては、例えば、（メタ）アクリル酸、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルサクシネート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルフタル酸等の（メタ）アクリル酸誘導体類や、クロトン酸、イタコン酸、シトラコン酸、メサコン酸、マレイン酸、フマル酸及びこれらの誘導体等が挙げられる。
【００３９】
スルホン酸基を有する有単量体としては、例えば、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、２−スルホエチル（メタ）アクリレート、３−スルホプロピル（メタ）アクリル酸等の（メタ）アクリル酸誘導体類や、スチレンスルホン酸、アリルスルホン酸、（３−スルホプロピル）−イタコン酸及びこれらの誘導体等が挙げられる。
【００４０】
リン酸基を有する単量体としては、例えば、（（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（２−（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル）アシッドホスフェート及びこれらの誘導体等が挙げられる。
【００４１】
３級アミノ基を有する単量体としては、例えば、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシ−３−ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、及びこれらの誘導体等が挙げられる。
【００４２】
４級アンモニウム基を有する単量体としては、例えば、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロライド、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルトリエチルアンモニウムクロライド、２−ヒドロキシ−３−（メタ）アクリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライド及びこれらの誘導体等が挙げられる。
【００４３】
本発明によるカラム充填剤を、イオン交換クロマトグラフィーに用いるための他の方法としては、イオン交換性単量体を用いる代わりに、イオン交換基を有する化合物（以下、イオン交換性化合物ともいう）と反応可能な官能基（以下、反応性基ともいう）を有する親水性単量体（以下、反応性単量体ともいう）を上記架橋重合体粒子の表面に重合し、その後に、該反応性基にイオン交換性化合物を反応させる方法が挙げられる。
【００４４】
反応性基は、非イオン性の親水性基であることが好ましい。
非イオン性の親水性基としては、例えば、水酸基、グリコール基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、アルデヒド基等が挙げられ、なかでも、水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基が好ましく、水酸基、エポキシ基、グリシジル基がより好ましい。
【００４５】
反応性単量体は、（メタ）アクリル酸エステル類が好ましく、例えば、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、エポキシ化又はヒドロキシル化（メタ）アクリレート類、アミノ化（メタ）アクリレート類、アルデヒド化又はシアノ化（メタ）アクリレート類等が挙げられる。
ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類は、例えば、エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシトリ（ポリ）エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート類としては、例えば、プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、ポリ（エチレングリコール・プロピレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、オクトキシポリエチレングリコールポリプロピレングリコール−モノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
エポキシ化又はヒドロキシル化（メタ）アクリレート類としては、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルプロピル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
アミノ化（メタ）アクリレート類としては、例えば、２−アミノエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジアミノエチル（メタ）アクリレート、２−アミノプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジアミノプロピル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。
アルデヒド化又はシアノ化（メタ）アクリレート類としては、例えば、（メタ）アクロレイン、シアノ（メタ）アクリレート、メチルシアノアクリレート、エチルシアノアクリレート、ブチルシアノアクリレート、（メタ）アクリロニトリル、等が挙げられる。
これらの反応性単量体は、単独で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４６】
反応性基にイオン交換性化合物を反応させる方法は、公知の化学反応を用いることができる。架橋重合体粒子の分解等の反応を伴わない条件であれば、これらの公知の化学反応を限定なく用いることができる。
【００４７】
反応性基が水酸基の場合、例えば、ブロムエタンスルホン酸ナトリウム等のハロゲン化エタンスルホン酸類やクロロ酢酸ナトリウム等のハロゲン化酢酸類をイオン交換性化合物として用いる。これらのイオン交換性化合物と、表面に水酸基を有する架橋重合体粒子とを水酸化アルカリ水溶液中で反応させることにより、イオン交換基を導入できる。
また、イオン交換基を有するアルデヒド化合物を、酸触媒下にてアセタール化反応により、表面に水酸基を有する架橋重合体粒子と反応させることにより、イオン交換基を導入できる。
更に、例えば、トリカルバニル酸、ブタンテトラカルボン酸等の多官能カルボン化合物と水酸基との脱水反応によるエステル化により、上記架橋重合体粒子の表面にカルボキシル基を導入できる。
加えて、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン等を、水酸化アルカリの水溶液中又は有機溶媒溶液中で、表面に水酸基を有する架橋重合体粒子と反応させることによっても架橋重合体粒子の表面にスルホン酸基を導入できる。
【００４８】
反応性基がエポキシ基又はグリシジル基の場合、表面にエポキシ基又はグリシジル基を有する架橋重合体粒子と硫酸ナトリウムやタウリン、グリコール酸等のイオン交換性化合物とを反応させる方法、表面にエポキシ基又はグリシジル基を有する架橋重合体粒子と三フッ化ホウ素エーテラートとを結合した後、亜硫酸ナトリウム水溶液中で加熱処理する方法等によりイオン交換基を導入できる。
【００４９】
反応性基がアミノ基の場合、エピクロルヒドリンやトリグリシジルエーテルのようなエポキシ化合物を水酸化アルカリの水溶液中又は有機溶媒溶液中で反応させてエポキシ化した後、上記のエポキシ基又はグリシジル基の場合と同様の処理を行うことによりイオン交換基を導入できる。
【００５０】
本発明によるカラム充填剤を、ゲル浸透クロマトグラフィーに用いる場合に使用する親水性単量体は、水酸基、又はエポキシ基のような非イオン性親水基を１分子中に１個以上有する親水性単量体であることが好ましく、例えば、上記のポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、エポキシ化又はヒドロキシル化（メタ）アクリレート類等の単量体類が挙げられる。
【００５１】
本発明によるカラム充填剤を、順相クロマトグラフィーに用いる場合に使用する親水性単量体は、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、水酸基のような非イオン性親水基を１分子中に１個以上有する親水性単量体であることが好ましく、例えば、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、アミノ化（メタ）アクリレート類、アルデヒド化又はシアノ化（メタ）アクリレート類を有する単量体の他に、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド等のアクリルアミド類及びこれらの誘導体等の単量体類が挙げられる。
【００５２】
親水性単量体は、アクリル系単量体であることが好ましい。また、親水性単量体は、ナトリウム塩、カリウム塩等の塩類、塩化物等でもよい。
親水性単量体は、２種類以上を混合して用いてもよく、上述した各測定モードに限定されず、他の測定モードに使用したり、他の測定モードに挙げた親水性単量体と混合して用いたりしてもよい。親水性単量体として、１分子中に同一の複数の官能基を有する単量体を用いてもよく、１分子中に異なる種類の官能基を有する単量体を用いてもよい。
【００５３】
親水性単量体の添加量は、単量体混合物１００重量部に対して、好ましい下限は１０重量部、好ましい上限は２００重量部である。親水性単量体の添加量が１０重量部未満であると、得られるカラム充填剤を用いた場合の分離性能が低下することがある。親水性単量体の添加量が２００重量部を超えると、親水性が大きくなり過ぎ、耐圧性や耐膨潤性が低下することがある。また、複数の溶離液を用いて測定を行う場合に、溶離液の切り替え時における平衡化に長時間を要し、測定時間が延長することがある。
【００５４】
反応系に親水性単量体を添加する方法は、使用する親水性単量体の種類、及び、添加量に応じて最適な手法を選択することができる。例えば、親水性単量体の全量を一括して添加する方法、その一部を分割して添加する方法、数分〜数時間かけて添加する方法等が挙げられる。
【００５５】
工程５における反応系の温度は、５〜４０℃である。工程５における撹拌時の温度が５℃未満であると、温度を変更する作業が繁雑となり、作業時間が延長するとともに、内容物によっては、溶解度の大きな低下により析出する。工程５における撹拌時の温度が４０℃を超えると、重合が徐々に進行するため、重合率の制御が困難となり、得られたカラム充填剤の性能の再現性が低下する。工程５における撹拌時の温度の好ましい下限は１５℃、好ましい上限は３５℃である。
なお、工程４における冷却後の反応系の温度と工程５における攪拌温度とを同じ温度にできる場合は、工程５を行う際に温度を変更する必要がなくなるため、同じ温度にしておくことが好ましい。工程４における冷却後の反応系の温度と工程５における攪拌温度とを異なる温度とする必要がある場合は、工程５を行う前に適宜温度を調整する工程を追加する。
【００５６】
工程５における撹拌時間は、０．２〜２４時間である。工程５における撹拌時間が０．２時間未満の場合、親水性単量体が反応系に均一に分散しないため、得られるカラム充填剤の性能の再現性が悪くなる。工程５において２４時間を超えて撹拌を行っても、それ以上分散の均一化効果は向上せず、作業時間の延長を招くのみである。工程５における撹拌時間の好ましい下限は０．５時間、好ましい上限は２４時間である。
【００５７】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法は、反応系を一定の温度に保持して第２の重合反応を行い、架橋重合体粒子の表面に親水性単量体を重合する工程６を有する。
【００５８】
第２の重合反応において保持する温度の好ましい下限は４０℃、好ましい上限は１００℃である。第２の重合反応において保持する温度が４０℃未満であると、温度を制御することが困難であり、反応に長時間を要する場合がある。第２の重合反応において保持する温度が１００℃を超えると、凝集物が発生しやすくなる。
また、第２の重合反応における反応時間の好ましい下限は０．３時間、好ましい上限は１２時間である。第２の重合反応における反応時間が０．３時間未満であると、親水性単量体の重合が不充分となり、得られるカラム充填剤の性能の再現性が低下することがある。第２の重合反応における反応時間が１２時間を超えると、凝集物が発生しやすくなる。
【００５９】
第２の重合反応時においては、第１の重合反応において挙げたものと同様の重合開始剤を添加してもよいが、重合開始剤を添加せずに第２の重合反応を行う方法が好ましい。この場合は、第１の重合反応によって消費されなかった反応系に残存する重合開始剤用いて重合反応を行う。
【００６０】
第２の重合反応を行った後、得られた重合物を反応系より取り出し、必要に応じて、水、有機溶媒、水と有機溶媒との混合物等で洗浄することにより、架橋重合体粒子の表面に親水性重合体を有する親水性架橋重合体粒子を得ることができる。また、得られた親水性架橋重合体粒子に、必要に応じて、公知の技術による親水化処理を行ってもよい。
親水化処理は、例えば、特開２００１−９１５０５号公報に開示されている、ヘモグロビン、アルブミン、グロブリン等の蛋白質、糖類、ノニオン系界面活性剤等の親水基を有する化合物を吸着させる方法や、特開２００４−２９５３６８号公報に記載の方法によるオゾン処理を行う方法等が好ましい。
【００６１】
本発明によるカラム充填剤をカラムに充填することにより、液体クロマトグラフィーに適用することができる。本発明のカラム充填剤の製造方法により得られるカラム充填剤を用いる液体クロマトグラフィーによる試料の測定方法もまた、本発明の１つである。
本発明の液体クロマトグラフィーによる試料の測定方法は、公知の構成による液体クロマトグラフ、及び、公知の組成による溶離液を用いることができる。
【００６２】
本発明の液体クロマトグラフィーによる試料の測定方法は、ヘモグロビン類やその他のタンパク質類、糖類等の親水性物質を測定することができる。
【００６３】
本発明の液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法もまた、本発明の１つである。
本発明者らは、液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定において、測定精度が最も向上する圧力範囲を見出した。また、該圧力範囲における測定を安定して維持することにより、カラム寿命を延長させることができることを見出した。更に、本発明者らは、本発明によるカラム充填剤を用いることにより、高い分離性能を維持したまま、測定系の圧力値を上記圧力範囲内に安定させることができることを見出した。
【００６４】
本発明のヘモグロビン類の測定方法は、健常人血に含まれるヘモグロビン類、例えば、ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＡ１ｃ、ヘモグロビンＦ（胎児性ヘモグロビン）やヘモグロビンＡ２を短時間で高精度に測定することができる。更に、異常ヘモグロビン類、例えば、ヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣ、ヘモグロビンＤ、ヘモグロビンＥ等を測定することができる。
【００６５】
本発明のヘモグロビン類の測定方法においては、測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定することが好ましい。
なお、本明細書において、上記「測定系に生じる圧力値（以下、単に圧力値ともいう）」とは、クロマトグラフィーの流路系において、カラムを含む、送液ポンプ以降の配管系流路全体により発生する圧力の値を意味する。この圧力値は、具体的には例えば、送液ポンプとカラムとの間に接続した圧力計により測定できる値である。
【００６６】
本発明のヘモグロビン類の測定方法において、圧力値を９．８×１０３Ｐａ未満に設定した場合、ヘモグロビン類の測定値の精度が低下したり、測定時間が長くなったりすることがある。また、圧力値が非常に小さいため、圧力値の制御が困難となる。圧力値が１９．６×１０５Ｐａを超える値に設定した場合、測定精度が低下し、カラム寿命が短くなる。本発明のヘモグロビン類の測定方法では、本発明によるカラム充填剤を用いることにより、高い分離性能及び短い測定時間を維持したまま、上記圧力値を、再現性良く、１９．６×１０５Ｐａ以下にすることできる。
【００６７】
本発明のヘモグロビン類の測定方法に用いられる液体クロマトグラフィーは、溶離液送液用のポンプ、検出器、試料導入装置等を備えた公知の液体クロマトグラフに、本発明によるカラム充填剤を充填したカラムを接続することにより行うことができる。
【００６８】
本発明のヘモグロビン類の測定方法に用いる溶離液は、公知の塩化合物を含む緩衝液類や有機溶媒類を用いることが好ましく、具体的には例えば、有機酸、無機酸、及び、これらの塩類、アミノ酸類、グッドの緩衝液等が挙げられる。
有機酸は、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。上記無機酸は特に限定されず、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等が挙げられる。
アミノ酸類は、例えば、グリシン、タウリン、アルギニン等が挙げられる。
また、上記緩衝液には、他に一般的に添加される物質、例えば、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物、カオトロピックイオン類等を適宜添加してもよい。
【００６９】
本発明のヘモグロビン類の測定方法において、ヘモグロビン類の測定を行う際の上記緩衝液の塩濃度の好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は１０００ｍｍｏｌ／Ｌである。緩衝液の塩濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌ未満の場合、イオン交換反応が行なわれず、ヘモグロビン類を分離することができなくなることがある。緩衝液の塩濃度が１０００ｍｍｏｌ／Ｌを超える場合、塩が析出しシステムに悪影響を及ぼすことがある。
【発明の効果】
【００７０】
本発明のカラム充填剤の製造方法は、所定の温度、及び、所定の時間で単量体混合物の分散液を撹拌した後に第１の重合反応を行い、その後、反応系を一定の温度に保持して親水性単量体を添加し、第２の重合反応を行うカラム充填剤の製造方法である。単量体混合物の分散液を、重合反応の前に一定の条件下で撹拌することにより、得られるカラム充填剤が保持時間や分離性能等の再現性に優れたものとなる。また、第２の重合反応において、架橋重合体粒子の表面に親水性単量体を重合することで、高い分離性能を有するカラム充填剤を再現性良く製造することができる。
また、本発明のカラム充填剤を用いた液体クロマトグラフィーによる試料の測定方法は、ヘモグロビン類やその他のタンパク質類、糖類等の親水性物質を、短時間に精度よく測定することができる。
更に、本発明によるカラム充填剤を用いたヘモグロビン類の測定方法は、従来よりも低い圧力値で、ヘモグロビン類を短時間で高精度に測定することができ、かつ、カラム寿命を延長することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】実施例１で得られたカラム充填剤を用いて、タンパク質類の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図２】実施例１で得られたカラム充填剤を用いて、健常人血のヘモグロビン類の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図３】実施例２で得られたカラム充填剤を用いて、タンパク質類の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図４】実施例３で得られたカラム充填剤を用いて、タンパク質類の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図５】実施例４で得られたカラム充填剤を用いて、糖類の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図６】実施例１で得られたカラム充填剤を用いて、異常ヘモグロビン類の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図７】比較例１で得られたカラム充填剤を用いて、異常ヘモグロビン類の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図８】実施例１で得られたカラム充填剤を用いて、ヘモグロビンＡ２を含むヘモグロビン類の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図９】比較例１で得られたカラム充填剤を用いて、ヘモグロビンＡ２を含むヘモグロビン類の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図１０】測定例３、７、及び、１０によるカラム耐久性試験の結果である。
【図１１】測定例１、２、１１、及び、１２によるカラム耐久性試験の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されない。
【００７３】
（実施例１）
実施例１では、本発明のカラム充填剤の製造方法を用いて、カチオン交換クロマトグラフィー用カラム充填剤を調製し、性能を確認した。
【００７４】
（１）カラム充填剤の調製
架橋性単量体として、テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）１５０ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）１４０ｇ、及び、２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン（新中村化学工業社製）６０ｇを混合して得られた単量体混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル（キシダ化学社製）１．０ｇを混合して溶解し、分散剤として５重量％のポリビニルアルコール（日本合成化学社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液２０００ｍＬに分散させた。得られた分散液を、２５℃で１５時間撹拌した（撹拌工程１）。攪拌工程後の重合率は１．２％であった。
次に反応系を窒素雰囲気下で８０℃に加温して１．２時間重合反応を行った（第１の重合反応）。第１の重合反応後の重合率は９０％であった。
反応系を約１５分かけて３０℃に冷却した（冷却工程）後、親水性単量体として２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東亞合成社製）１８０ｇ、及び、ポリエチレングリコールモノメタクリレート（日油社製）６０ｇ、並びに、メタノール１００ｇを溶解したイオン交換水２００ｍＬを反応系に添加して、３０℃で０．５時間撹拌した（撹拌工程２）。その後、昇温して８０℃で２時間重合反応を行った（第２の重合反応）。得られた重合物を洗浄して、カラム充填剤を得た。
粒度分布測定装置（ナイコンプ社製、「アキュサイザー７８０」）により、得られたカラム充填剤の粒度分布を測定した結果、平均粒子径は６．４μｍ、粒度分布のＣＶ値は２７．６％であった。
【００７５】
（２）カラムへの充填
「（１）カラム充填剤の調製」で得られたカラム充填剤０．８ｇを、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍＬに分散して撹拌し、スラリー化した。５分間超音波処理した後、スラリー全量を、ステンレス製空カラム（４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（アズワン社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（ＧＬサイエンス社製、「ＰＵ−６１４」）を接続し、圧力２０ＭＰａで送液して、定圧充填した。
【００７６】
（３）液体クロマトグラフィーによる性能評価１
「（２）カラムへの充填」で得られたカラムを用いて、タンパク質類の標準物質混合物を測定した。測定条件を以下に示す。
システム：ＬＣ−１０Ａシステム（島津製作所社製）
検出波長：２８０ｎｍ
溶離液Ａ：１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）
溶離液Ｂ：溶離液Ａ＋５３０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．９）
溶出条件：溶離液Ａ１００％から溶離液Ｂ１００％へのリニアグラジエント
流速    ：１．５ｍＬ／分
測定試料：トリプシノーゲン、α−キモトリプシノーゲン、リボヌクレアーゼＡ、リゾチーム（以上、いずれもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）の混合物
【００７７】
得られたクロマトグラムを図１に示す。図１において、ピーク１はトリプシノーゲン、ピーク２はα−キモトリプシノーゲン、ピーク３はリボヌクレアーゼＡ、ピーク４はリゾチームを示す。図１より、各ピークが短時間で良好に分離できることを確認した。また、同様の測定を１０回連続して繰り返した際の、リゾチームの保持時間の再現性を表１に示す。１０回連続して測定した際のリゾチームの保持時間のＣＶ値は１．２％となり、再現性は良好であった。
【００７８】
【表１】
0005749031.tif 000002
【００７９】
（４）液体クロマトグラフィーによる性能評価２
「（２）カラムへの充填」で得られたカラムを用いて、健常人血中のヘモグロビンＡ１ｃを含むヘモグロビン類の測定を行った。測定条件を以下に示す。
システム：ＬＣ−１０Ａシステム（島津製作所社製）
検出波長：４１５ｎｍ
溶離液Ｃ：４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ｄ：２５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）
溶出条件：溶離液Ｃ１００％から溶離液Ｄ１００％へのステップグラジエント
流速    ：１．５ｍＬ／分
測定試料：フッ化ナトリウム採血した健常人血を、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）により１５０倍に溶血希釈したもの
【００８０】
得られたクロマトグラムを図２に示す。図２において、ピーク１１はヘモグロビンＦ、ピーク１２はヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク１３はヘモグロビンＡ０を示す。図２より、各ピークが短時間で良好に分離できることを確認した。また、同様の測定を１０回連続して繰り返した際の、ヘモグロビンＡ１ｃの保持時間の再現性を表１に示す。１０回連続して測定した際のヘモグロビンＡ１ｃの保持時間のＣＶ値は０．８％となり、再現性は良好であった。
【００８１】
（５）重合再現性の評価
「（１）カラム充填剤の調製」と同様の条件により、カラム充填剤を２０回（２０ロット）調製した。各ロットについて、「（４）液体クロマトグラフィーによる性能評価２」を行い、ヘモグロビンＡ１ｃの保持時間の再現性を確認した。なお、各ロットの測定を３回実施した際の平均値を該当ロットの測定値とした。得られた結果を表１に示す。２０ロット測定した際のヘモグロビンＡ１ｃの保持時間のＣＶ値は２．１％となり、再現性は良好であった。
【００８２】
（実施例２）
実施例２では、本発明のカラム充填剤の製造方法を用いて、アニオン交換クロマトグラフィー用カラム充填剤を調製し、性能を確認した。
【００８３】
（１）カラム充填剤の調製
架橋性単量体として、ジエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）１５０ｇ、テトラメチロールメタントリアクリレート（新中村化学工業社製）３０ｇ、及び、トリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）１４０ｇを混合して得られた単量体混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル１．０ｇを混合して溶解し、５重量％のポリビニルアルコール水溶液２０００ｍＬに分散させた。得られた分散液を、２０℃で１０時間撹拌した（撹拌工程１）。撹拌工程後の重合率は０．６％であった。
次に反応系を窒素雰囲気下で８０℃に加温して１時間重合反応を行った（第１の重合反応）。第１の重合反応後の重合率は８７％であった。
反応系を約１５分かけて３０℃に冷却した後、親水性単量体としてジエチルアミノエチルメタクリレート（和光純薬工業社製）２２０ｇ、及び、メタノール１００ｇを溶解したイオン交換水２００ｍＬを反応系に添加して、２０℃で５時間撹拌した（撹拌工程２）。その後、昇温して８０℃で１．６時間重合反応を行った（第２の重合反応）。得られた重合物を洗浄して、カラム充填剤を得た。
実施例１と同様にして、得られたカラム充填剤の粒度分布を測定した結果、平均粒子径は８．２μｍ、粒度分布のＣＶ値は２６．３％であった。
【００８４】
（２）カラムへの充填
実施例１と同様に操作して、得られたカラム充填剤１．４ｇをステンレス製空カラム（４．６φ×５０ｍｍ）に充填した。
【００８５】
（３）液体クロマトグラフィーによる性能評価
「（２）カラムへの充填」で得られたカラムを用いてタンパク質類の標準物質混合物を測定した。測定条件を以下に示す。
システム：ＬＣ−１０Ａシステム（島津製作所社製）
検出波長：２８０ｎｍ
溶離液Ｅ：４０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．１）
溶離液Ｆ：溶離液Ｅ＋４００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．１）
溶出条件：溶離液Ｅ１００％から溶離液Ｆ１００％へのリニアグラジエント
流速    ：１．３ｍＬ／分
測定試料：コンアルブミン、オブアルブミン、トリプシンインヒビターの混合物
【００８６】
得られたクロマトグラムを図３に示す。図３において、ピーク２１はコンアルブミン、ピーク２２はオブアルブミン、ピーク２３はトリプシンインヒビターを示す。図３より、各ピークが短時間で良好に分離できることを確認した。また、同様の測定を１０回連続して繰り返した際の、トリプシンインヒビターの保持時間の再現性を表１に示す。１０回連続して測定した際のトリプシンインヒビターの保持時間のＣＶ値は１．７％となり、再現性は良好であった。
【００８７】
（４）重合再現性の評価
「（１）カラム充填剤の調製」と同様の条件により、カラム充填剤を２０回（２０ロット）調製した。各ロットについて、「（３）液体クロマトグラフィーによる性能評価」を行い、トリプシンインヒビターの保持時間の再現性を確認した。得られた結果を表１に示す。２０ロット測定した際のトリプシンインヒビターの保持時間のＣＶ値は２．４％となり、再現性は良好であった。
【００８８】
（実施例３）
実施例３では、本発明のカラム充填剤の製造方法を用いて、水系ゲル浸透クロマトグラフィー用カラム充填剤を調製し、性能を確認した。
【００８９】
（１）カラム充填剤の調製
架橋性単量体としてテトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）２００ｇ、非架橋性単量体として、ポリエチレングリコールモノメタクリレート（新中村化学工業社製）１５０ｇ、及び、トルエン３５０ｇを混合して得られた単量体混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル１．０ｇを混合して溶解し、４重量％のポリビニルアルコール水溶液２０００ｍＬに分散させた。得られた分散液を、１０℃で２０時間撹拌した（撹拌工程）。撹拌工程後の重合率は０．３％であった。
窒素雰囲気下で８０℃に加温して２．３時間重合反応を行った（第１の重合反応）。第１重合反応後の重合率は９４％であった。
反応系を約１５分かけて３０℃に冷却した後、親水性単量体として２，３−ジヒドロキシルエチルメタクリレート（日油社製）２００ｇを溶解したイオン交換水２００ｍＬを反応系に添加して、２５℃で１時間撹拌した（撹拌工程２）。その後、昇温して８０℃で２．５時間重合反応を行った（第２の重合反応）。得られた重合物を洗浄して、カラム充填剤を得た。
実施例１と同様にして、得られたカラム充填剤の粒度分布を測定した結果、平均粒子径は８．６μｍ、粒度分布のＣＶ値は２８．１％であった。
【００９０】
（２）カラムへの充填
実施例１と同様に操作して、得られたカラム充填剤３．２ｇをステンレス製空カラム（６．０φ×１００ｍｍ）に充填した。
【００９１】
（３）液体クロマトグラフィーによる性能評価
「（２）カラムへの充填」で得られたカラムを用いて分子量標準物質の混合物を測定した。測定条件を以下に示す。
システム：ＬＣ−１０Ａシステム（島津製作所社製）
検出器  ：示差屈折計ＳＥ−５１（昭和電工社製）
溶離液Ｇ：８０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウムを含む１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）
流速    ：１．５ｍＬ／分
測定試料：チログロブリン（分子量６４万）、γ−グロブリン（分子量１５５０００）、オブアルブミン（分子量４７０００）、リボヌクレアーゼ（分子量１３７００）（以上、いずれも和光純薬工業社製）の混合物
【００９２】
得られたクロマトグラムを図４に示す。図４において、ピーク３１はチログロブリン、ピーク３２はγ−グロブリン、ピーク３３はオブアルブミン、ピーク３４はリボヌクレアーゼを示す。図４より、各ピークが短時間で良好に分離できることを確認した。また同様の測定を１０回連続して繰り返した際の、リボヌクレアーゼの保持時間の再現性を表１に示す。１０回連続して測定した際のリボヌクレアーゼの保持時間のＣＶ値は１．３％となり、再現性は良好であった。
【００９３】
（４）重合再現性の評価
「（１）カラム充填剤の調製」と同様の条件により、カラム充填剤を２０回（２０ロット）調製した。各ロットについて、「（３）液体クロマトグラフィーによる性能評価」を行い、リボヌクレアーゼの保持時間の再現性を確認した。得られた結果を表１に示す。２０ロット測定した際のリボヌクレアーゼの保持時間のＣＶ値は３．１％となり、再現性は良好であった。
【００９４】
（実施例４）
実施例４では、本発明のカラム充填剤の製造方法を用いて、順相クロマトグラフィー用カラム充填剤を調製し、性能を確認した。
【００９５】
（１）カラム充填剤の調製
架橋性単量体として、トリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）２００ｇ、及び、テトラメチロールプロパントリアクリレート（新中村化学工業社製）５０ｇ、非架橋性単量体としてポリエチレングリコールモノメタクリレート（新中村化学工業社製）１５０ｇを混合して得られた単量体混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル１．０ｇを混合して溶解し、５重量％のポリビニルアルコール水溶液２０００ｍＬに分散させた。得られた分散液を、３０℃で５時間撹拌した（撹拌工程１）。撹拌工程後の重合率は２．８％であった。
次に反応系を窒素雰囲気下で８０℃に加温して１．８時間重合反応を行った（第１の重合反応）。第１の重合反応後の重合率は９２％であった。
反応系を約１５分かけて３０℃に冷却した後、親水性単量体として２−アミノエチルメタクリレート（和光純薬工業社製）２００ｇ、及び、メタノール５０ｇを溶解したイオン交換水２００ｍＬを反応系に添加して、２５℃で２時間撹拌した（撹拌工程２）。その後、昇温して８０℃で２．８時間重合反応を行った（第２の重合反応）。得られた重合物を洗浄して、カラム充填剤を得た。
実施例１と同様にして、得られたカラム充填剤の粒度分布を測定した結果、平均粒子径は４．１μｍ、粒度分布のＣＶ値は２９．４％であった。
【００９６】
（２）カラムへの充填
実施例１と同様に操作して、得られたカラム充填剤１．４ｇをステンレス製空カラム（４．６φ×５０ｍｍ）に充填した。
【００９７】
（３）液体クロマトグラフィーによる性能評価
「（２）カラムへの充填」で得られたカラムを用いて糖類の標準物質混合物を測定した。測定条件を以下に示す。
システム：ＬＣ−１０Ａシステム（島津製作所社製）
検出波長：２８０ｎｍ
溶離液Ｈ：アセトニトリル：水＝７５：２５の混合水溶液
流速    ：１．３ｍＬ／分
測定試料：フルクトース、グルコース、シュクロース、マルトース（以上、いずれも和光純薬工業社製）の混合物
【００９８】
得られたクロマトグラムを図５に示す。図５において、ピーク４１はフルクトース、ピーク４２はグルコース、ピーク４３はシュクロース、ピーク４４はマルトースを示す。図５より、各ピークが短時間で良好に分離できることを確認した。また同様の測定を１０回連続して繰り返した際の、マルトースの保持時間の再現性を表１に示す。１０回連続して測定した際のマルトースの保持時間のＣＶ値は１．２％となり、再現性は良好であった。
【００９９】
（４）重合再現性の評価
「（１）カラム充填剤の調製」と同様の条件により、カラム充填剤を２０回（２０ロット）調製した。各ロットについて、「（３）液体クロマトグラフィーによる性能評価」を行い、マルトースの保持時間の再現性を確認した。得られた結果を表１に示す。２０ロット測定した際のマルトースの保持時間のＣＶ値は２．６％となり、再現性は良好であった。
【０１００】
（比較例７）
比較例７では、実施例１の撹拌工程１の条件を変更してカチオン交換クロマトグラフィー用カラム充填剤を調製し、性能を確認した。
【０１０１】
（１）カラム充填剤の調製
実施例１における撹拌工程１の条件を、５℃及び３時間に変更した以外は、実施例１と同様に操作してカラム充填剤を得た。
実施例１と同様にして、得られたカラム充填剤の粒度分布を測定した結果、平均粒子径は６．１μｍ、粒度分布のＣＶ値は２９．３％であった。
【０１０２】
（２）カラムへの充填、及び液体クロマトグラフィーによる性能評価
実施例１と同様の方法により、カラムへの充填、及びヘモグロビン類の測定を行った。１０回連続して測定した際のヘモグロビンＡ１ｃの保持時間のＣＶ値は１．５％で、再現性は良好であった。
【０１０３】
（３）重合再現性の評価
実施例１と同様の方法により、重合再現性を評価した。２０ロット測定した際のヘモグロビンＡ１ｃの保持時間のＣＶ値は３．０％で、再現性は良好であった。
【０１０４】
（比較例８）
比較例８では、実施例１の撹拌工程１の条件を変更してカチオン交換クロマトグラフィー用カラム充填剤を調製し、性能を確認した。
【０１０５】
（１）カラム充填剤の調製
実施例１における撹拌工程１の条件を、４０℃及び１時間に変更した以外は、実施例１と同様に操作してカラム充填剤を得た。
実施例１と同様にして、得られたカラム充填剤の粒度分布を測定した結果、平均粒子径は５．８μｍ、粒度分布のＣＶ値は３２．８％であった。
【０１０６】
（２）カラムへの充填、及び液体クロマトグラフィーによる性能評価
実施例１と同様の方法により、カラムへの充填、及びヘモグロビン類の測定を行った。１０回連続して測定した際のヘモグロビンＡ１ｃの保持時間のＣＶ値は２．３％で、再現性は良好であった。
【０１０７】
（３）重合再現性の評価
実施例１と同様の方法により、重合再現性を評価した。２０ロット測定した際のヘモグロビンＡ１ｃの保持時間のＣＶ値は４．１％で、再現性は良好であった。
【０１０８】
（比較例１〜６）
比較例では、本発明の液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法における工程２（撹拌工程１）の条件を満たさないカラム充填剤を調製した。比較例１〜６における撹拌工程の条件、及び、攪拌工程終了後の重合率を表１に示す。
撹拌工程１以外の条件は、比較例１は実施例１、比較例２は実施例２、比較例３は実施例３、比較例４は実施例４、比較例５は比較例７、比較例６は比較例８と同様に操作してカラム充填剤を調製した。なお、比較例５は撹拌工程１を行わなかった例、すなわち、単量体混合物を水性分散媒に添加した後、すぐに第１の重合反応を行った例を示す。
得られた各カラム充填剤の粒度分布の測定結果を表１に示す。比較例４では、攪拌工程において、分散液中の単量体混合物の一部が凍結して均一に撹拌することができず、第１の重合反応中に凝集物が発生してカラム充填剤粒子が得られなかった。
比較例における、保持時間による重合再現性（ｎ＝２０）の評価結果を表１に示す。実施例に比較してＣＶ値が大きな値となった。
以上から、撹拌工程の条件を規定することにより、得られるカラム充填剤の重合再現性が向上した。
【０１０９】
（ヘモグロビン類の測定性能評価）
撹拌工程の条件を規定したことによる、カラム充填剤の分離性能への影響を確認するため、実施例１、比較例１及び比較例６のカチオン交換クロマトグラフィー用カラム充填剤を用いて、種々のヘモグロビン類を測定し、分離性能を評価した。
【０１１０】
（１）修飾ヘモグロビン類の測定
実施例１、比較例１及び比較例６のカチオン交換クロマトグラフィー用カラム充填剤を用いて、人為的に調製した修飾ヘモグロビン類の測定を行った。修飾ヘモグロビン類を含む試料として、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ含有試料（試料Ｌ）、アセチル化ヘモグロビン含有試料（試料Ａ）、カルバミル化ヘモグロビン含有試料（試料Ｃ）の３種類を、公知の方法により調製した。
試料Ｌは、健常人血に、グルコースを２５００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で３時間加温して調製した。試料Ａは、健常人血に、アセトアルデヒドを６０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温して調製した。試料Ｃは、健常人血に、シアン酸ナトリウムを６０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温して調製した。
分離性能は、修飾ヘモグロビン類を含む試料のヘモグロビンＡ１ｃ値から、修飾ヘモグロビン類を含む試料の調製に用いた健常人血（非修飾品）のヘモグロビンＡ１ｃ値を差し引いた値（Δ値）を算出し、両者を比較して評価した。結果を表２に示す。
表２より、実施例１のカラム充填剤を用いた場合、Δ値は０．１５％以下と小さく、修飾ヘモグロビン類が含まれる試料においても、正確にヘモグロビンＡ１ｃが測定できた。比較例１及び比較例６のカラム充填剤を用いた場合ではΔ値が大きく、ヘモグロビンＡ１ｃの測定時において、修飾ヘモグロビン類の影響を受けた。
【０１１１】
【表２】
0005749031.tif 000003
【０１１２】
（２）異常ヘモグロビン類の測定
実施例１、比較例１及び比較例６のカチオン交換クロマトグラフィー用カラム充填剤を用いて、異常ヘモグロビンであるヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含む試料（ヘレナ研究所社製、「ＡＦＳＣヘモコントロール」）を測定した。
実施例１のカラム充填剤を用いて測定した結果、得られたクロマトグラムを図６に示す。図６において、ピーク１４はヘモグロビンＳ、ピーク１５はヘモグロビンＣを示す。図６より、実施例１で得られたカラム充填剤を用いた場合は、異常ヘモグロビン類を良好に分離できた。比較例１で得られたカラム充填剤を用いた場合は、図７に示すように、異常ヘモグロビン類の分離性能は悪かった。比較例６で得られたカラム充填剤を用いた場合も比較例１の場合と同様に、異常ヘモグロビン類の分離性能は悪かった。
【０１１３】
（３）ヘモグロビンＡ２の測定
実施例１、比較例１及び比較例６のカチオン交換クロマトグラフィー用カラム充填剤を用いて、ヘモグロビンＡ２を含む試料（バイオラッド社製「Ａ２コントロール（レベル２）」）を測定した。
実施例１の充填剤を用いて測定して得られたクロマトグラムを図８に示す。図８において、ピーク１６はヘモグロビンＡ２を示す。図８より、実施例１で得られたカラム充填剤を用いた場合は、ヘモグロビンＡ２を良好に分離することができた。比較例１で得られたカラム充填剤を用いた場合は、図９に示すようにヘモグロビンＡ２を分離することはできなかった。比較例６で得られたカラム充填剤を用いた場合も比較例１の場合と同様に、ヘモグロビンＡ２を分離することはできなかった。
【０１１４】
上記のヘモグロビン類の測定性能評価から、撹拌工程の条件を規定したことにより、カラム充填剤の重合再現性だけでなく、分離性能も向上することが確認できた。
【０１１５】
（ヘモグロビン類の測定における、液体クロマトグラフィーの測定条件）
（測定例１〜１２）
実施例１の「（１）カラム充填剤の調製」において、ポリビニルアルコール濃度、及び、撹拌時の回転数を表３に示すように制御して、平均粒径値の異なるカラム充填剤を調製し、各カラム充填剤を表３に示す内径、及び、長さの空カラムに充填した。なお、測定例７のカラム充填剤は実施例１で得られたカラム充填剤と同様のものである。
得られたカラムを用いて、実施例１の「（４）液体クロマトグラフィーによる性能評価２」の条件で健常人血のヘモグロビン類の測定を行った。なお、測定時における流速を表３に示すように変更して圧力値が異なる状態にして比較した。
【０１１６】
【表３】
0005749031.tif 000004
【０１１７】
（性能評価）
（１）圧力値の測定
圧力値は、以下の方法により測定した。まず、各カラムを、液体クロマトグラフ（島津製作所社製、「ＬＣ−１０Ａシステム」）に接続した。次に、送液ポンプとカラムの間に、デジタル圧力計（長野計器社製、「ＧＣ６１」）を接続し、溶離液Ｃを送液した時の圧力計の表示値を読み取った。測定結果を表３に示す。
【０１１８】
（２）同時再現性評価
健常人血を用いて、実施例１の「（４）液体クロマトグラフィーによる性能評価２」の条件でヘモグロビンＡ１ｃの測定を１０回連続で行い、同時再現性の比較を行った。１０回連続して測定した際のヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値を表３に示す。
測定例３〜１０において、ＣＶ値は１．５％以下であり、糖尿病患者のヘモグロビンＡ１ｃ値の管理を行うための充分な測定精度を示した。一方、測定例１及び測定例２では、ＣＶ値が５％以上と悪く、実用上問題のあるレベルであった。
【０１１９】
（３）カラム耐久性の評価
各測定例において、健常人血を繰り返し測定し、ヘモグロビンＡ１ｃ値の推移を確認した。測定結果を図１０及び図１１に示す。ヘモグロビンＡ１ｃ値（ＨｂＡ１ｃ（％））は、測定例３、７、及び、１０では、２０００回測定まで安定していた。一方、測定例１、２、１１、及び、１２では、ヘモグロビンＡ１ｃ値が大きく低下した。
カラム耐久性の評価結果から、撹拌工程の条件、及び、圧力値を規定したことにより、カラム充填剤の分離性能は、多数の試料を測定しても維持された。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本発明によれば、性能の再現性が良好なカラム充填剤の製造方法を提供することができる。また、本発明によれば、該カラム充填剤の製造方法を用いて得られるカラム充填剤を用いた液体クロマトグラフィーによる試料の測定方法、及び、ヘモグロビン類の測定方法を提供できる。
【符号の説明】
【０１２１】
１  トリプシノーゲン
２  α−キモトリプシノーゲン
３  リボヌクレアーゼＡ
４  リゾチーム
１１  ヘモグロビンＦ
１２  ヘモグロビンＡ１ｃ
１３  ヘモグロビンＡ０
１４  ヘモグロビンＳ
１５  ヘモグロビンＣ
１６  ヘモグロビンＡ２
２１  コンアルブミン
２２  オブアルブミン
２３  トリプシンインヒビター
３１  チログロブリン
３２  γ−グロブリン
３３  オブアルブミン
３４  リボヌクレアーゼ
４１  フルクトース
４２  グルコース
４３  シュクロース
４４  マルトース
【図１】
0005749031.tif 000005
【図２】
0005749031.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0005749031.tif 000010
【図７】
0005749031.tif 000011
【図８】
0005749031.tif 000012
【図９】
0005749031.tif 000013
【図１０】
0005749031.tif 000014
【図１１】
0005749031.tif 000015