(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の配列を有するペプチド：
（１）ＧｎＲＨｍ１−ＴＴ                ＱＨＷＳＹＰＬＲＰＧ  ＧＧＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号４）
（２）ＴＴ−ＧｎＲＨｍ１                ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬＧＧ  ＱＨＷＳＹＰＬＲＰＧ（配列番号６）
（３）ＧｎＲＨｍ１−Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ    ＱＨＷＳＹＰＬＲＰＧＧＧ  ＩＰＧＶＡＹＴＳＰＥＶＡＷＶＧ（配列番号５）
（４）Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ−ＧｎＲＨｍ１    ＩＰＧＶＡＹＴＳＰＥＶＡＷＶＧＧＧ  ＱＨＷＳＹＰＬＲＰＧ
から独立して選択される２つの改変ＧｎＲＨ変異体の混合物を含む、性ホルモンを除去するための医薬組成物であって、
変異体の一方はカルボキシル末端に結合した担体分子を有し、他方はアミノ末端に結合した同一の担体分子を有し、
前記２つの改変ＧｎＲＨ変異体は、ＧｎＲＨｍ１−ＴＴ及びＴＴ−ＧｎＲＨｍ１の組合せ、又はＧｎＲＨｍ１−Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ及びＰ４８−Ｐ６４Ｋ−ＧｎＲＨｍ１の組合せである、
上記医薬組成物。
【請求項２】
下記の配列を有するペプチド：
（１）ＧｎＲＨｍ１−ＴＴ                ＱＨＷＳＹＰＬＲＰＧ  ＧＧＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号４）
（２）ＴＴ−ＧｎＲＨｍ１                ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬＧＧ  ＱＨＷＳＹＰＬＲＰＧ（配列番号６）
（１’）ＧｎＲＨｍ１−ＴＴ（ＱＨＷＳＹＰＬＲＰＧ  ＧＧＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ、配列番号４）から改変した配列であって、改変ＧｎＲＨ領域の配列（ＱＨＷＳＹＰＬＲＰＧ（配列番号１））が、天然型（ＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧ）で置換される、上記配列
ＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧ  ＧＧＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ
（２’）ＴＴ−ＧｎＲＨｍ１（ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬＧＧ  ＱＨＷＳＹＰＬＲＰＧ、配列番号６）から改変した配列であって、改変ＧｎＲＨ領域の配列（ＱＨＷＳＹＰＬＲＰＧ（配列番号１））が、天然型（ＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧ）で置換される、上記配列
ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬＧＧ  ＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧ
から独立して選択される、改変及び／又は天然型ＧｎＲＨの２つの変異体の混合物を含む、性ホルモンを除去するための医薬組成物であって、
変異体の一方はカルボキシル末端に結合した担体分子を有し、他方はアミノ末端に結合した同一の担体分子を有し、
前記２つの変異体は、
（１）及び（２）の組合せ、
（１’）及び（２）の組合せ、
（１）及び（２’）の組合せ、並びに
（１’）及び（２’）の組合せ、
からなる群から選択される、
上記医薬組成物。
【請求項３】
下記の配列を有するペプチド：
（３）ＧｎＲＨｍ１−Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ    ＱＨＷＳＹＰＬＲＰＧＧＧ  ＩＰＧＶＡＹＴＳＰＥＶＡＷＶＧ（配列番号５）
（４）Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ−ＧｎＲＨｍ１    ＩＰＧＶＡＹＴＳＰＥＶＡＷＶＧＧＧ  ＱＨＷＳＹＰＬＲＰＧ
（３’）ＧｎＲＨｍ１−Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ（ＱＨＷＳＹＰＬＲＰＧＧＧ  ＩＰＧＶＡＹＴＳＰＥＶＡＷＶＧ、配列番号５）から改変した配列であって、改変ＧｎＲＨ領域の配列（ＱＨＷＳＹＰＬＲＰＧ（配列番号１））が、天然型（ＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧ）で置換される、上記配列
ＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧＧＧ  ＩＰＧＶＡＹＴＳＰＥＶＡＷＶＧ
（４’）Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ−ＧｎＲＨｍ１（ＩＰＧＶＡＹＴＳＰＥＶＡＷＶＧＧＧ  ＱＨＷＳＹＰＬＲＰＧ）から改変した配列であって、改変ＧｎＲＨ領域の配列（ＱＨＷＳＹＰＬＲＰＧ（配列番号１））が、天然型（ＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧ）で置換される、上記配列
ＩＰＧＶＡＹＴＳＰＥＶＡＷＶＧＧＧ  ＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧ
から独立して選択される、改変及び／又は天然型ＧｎＲＨの２つの変異体の混合物を含む、性ホルモンを除去するための医薬組成物であって、
変異体の一方はカルボキシル末端に結合した担体分子を有し、他方はアミノ末端に結合した同一の担体分子を有し、
前記２つの変異体は、
（３）及び（４）の組合せ、
（３’）及び（４）の組合せ、
（３）及び（４’）の組合せ、並びに
（３’）及び（４’）の組合せ、
からなる群から選択される、
上記医薬組成物。
【請求項４】
改変及び／又は天然型ＧｎＲＨのアミノ及びカルボキシル末端変異体の混合物が、化学結合を介して、合成、コンジュゲーション又はクローニングにより得られる、請求項１から３までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
改変及び／又は天然型ＧｎＲＨがＤ−アミノ酸を用いて化学的に合成され、担体分子への結合が担体分子との化学的コンジュゲーション又は同一プロセスでの直接合成のいずれかにより実施され得る、請求項１から４までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
カルボキシル末端変異体及びアミノ末端変異体を、５０／５０（ｗ／ｗ）又は７０／３０（ｗ／ｗ）の組合せを最良の組合せとして含む、請求項１から５までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
経済的に重要な動物の行動を管理及び制御するために使用される、請求項１から６までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記経済的に重要な動物が、ウシ、水牛又はウマである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
良性疾患及び悪性疾患のいずれもを制御及び治療するための治療ツールとしてヒト生殖能力を制御するために使用される、請求項１から６までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記良性疾患及び悪性疾患が、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、精巣癌及び顎下腺癌から選択されるホルモン依存性癌又は肝癌である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
家畜動物の不妊化のための哺乳動物における免疫原としての、請求項１から６までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記家畜動物が、イヌ及びネコから選択される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
齧歯類の種における生殖能力の制御のための哺乳動物における免疫原としての、請求項１から６までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
動物の去勢のための哺乳動物における免疫原としての、請求項１から６までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記動物が、ウシ、ブタ及びヤギから選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
去勢していない動物の不快な肉及び脂の臭い、並びに上記動物における生理的濃度のアンドロステノン及びスカトールを防ぐための免疫去勢の使用のための、哺乳動物における免疫原としての、請求項１から６までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、精巣癌及び顎下腺癌から選択されるホルモン依存性癌から選択される良性疾患及び悪性疾患を制御するための治療ツールとしての、請求項１から６までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫学、内分泌学、腫瘍学、生殖の分野に関し、詳細には全てのＧｎＲＨ分子、主にはこのホルモンのカルボキシル末端及びアミノ末端に対する強力な免疫反応を同時発生させることに基づき、したがって、その天然型又はＤ−アミノ酸に基づく変異体を含む模倣型のいずれでもよいＧｎＲＨ分子を、異なる２つの免疫分子を形成するように一方はカルボキシル末端で他方はアミノ末端で担体分子と結合させると、このＧｎＲＨ分子が免疫系に対して最良に暴露されることを利用するものである。このＧｎＲＨ分子を以降、それぞれカルボキシル末端変異体及びアミノ末端変異体と呼ぶことにする。
【背景技術】
【０００２】
ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）は、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）としても知られており、脳下垂体前葉に作用して卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）や黄体形成ホルモン（ＬＨ）を血液に放出させる、視床下部性のデカペプチドである。ＧｎＲＨは同時に若年男性及び青年期男性の男性生殖腺の発達に伴う精巣のステロイド合成を刺激する。女性については、このホルモンは卵巣や卵胞の発達、卵巣ステロイドの合成及び排卵を刺激する。
【０００３】
生殖能力調節におけるＬＨＲＨの役割は良く知られている。それ故に、多くの疾病がゴナドトロピンや生殖腺ステロイドホルモン、具体的にはエストロゲンやテストステロンに関係している。そのような疾病としては乳癌、子宮癌及びその他の種類の婦人科癌、又は例えば子宮内膜症、子宮線維症、前立腺癌や良性前立腺過形成などの疾病がある。
【０００４】
去勢は、性腺摘出としても知られるが、外科的、化学的なもののいずれも、ホルモン依存性新生物の治療的介入において最も有効な方法の１つとなる（Ｈｕｇｇｉｎｓ  Ｃ，Ｈｏｄｇｅｓ  ＣＶ．Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｉ．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ，ｏｆ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ａｎｄ  ｏｆ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｓｅｒｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９４１；１：２９３−７）。家畜生産の部門において、去勢は経済的に重要である成体雄性動物由来の肉が持つ不快な臭いと味を防ぐために実施される。（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ  １７５：２５９−２８１，１９８４．Ｍｅｌｏｅｎ  ＲＨ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｃａｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｌｅ  ｐｉｇｌｅｔｓ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｏｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧｎＲＨ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｅｗ  ＧｎＲＨ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９４；１２：７４１−７４７．Ｃｒｏｗｌｅｙ  ＷＦ，Ｖａｌｅ  ＷＷ，Ｒｉｖｉｅｒ  Ｊ，ＭａｃＡｒｔｈｕｒ  ＪＷ：ＬＨＲＨ  ｉｎ  ｈｙｐｏｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｃ  ｈｙｐｏｇｏｎａｄｉｓｍ．Ｉｎ  ＺａｔｕｃｈｎｉＧＬ，Ｓｈｅｌｔｏｎ  ＪＤ，Ｓｃｉａｒｒａ  ＪＪ（ｅｄｓ）：“ＬＨＲＨ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ｆｅｍａｌｅ  ａｎｄ  Ｍａｌｅ  Ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｖｅｓ”．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｈａｒｐｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｗ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８１，ｐｐ３２１−３３３）。
【０００５】
ＧｎＲＨアナログは前立腺癌、卵巣癌及び乳癌の治療に最もよく用いられる薬剤である。このＧｎＲＨアナログはエストロゲン若しくはアンドロゲンの枯渇及び／又は癌細胞に対する直接的な効果を介して作用を発揮する（Ｓｃｈａｌｌｙ，Ｃｏｍａｒｕ−Ｓｃｈａｌｌｙ  ＡＭ，Ｒｅｄｄｉｎｇ  ＴＷ：Ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｏｆ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ｉｎ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃａｎｃｅｒｓ）。これらＧｎＲＨアナログ及びアンタゴニストが作用を発揮する際に介する直接的なメカニズムは、これらが慢性的に投与された場合にＧｎＲＨ受容体が脱感作及び脱制御されることと関連している。これら強力なアナログ及びアンタゴニストのいくつかについては異なる著者から報告がされている（Ｗａｘｍａｎ  ＪＨ，Ｗａｓｓ  ＪＡＨ，Ｈｅｎｄｒｙ  ＷＦ，Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ  ＨＮ，Ｂｅｓｓｅｒ  ＧＭ，Ｍａｌｐａｓ  ＪＳ，Ｏｌｉｖｅｒ  ＲＴＤ：Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．２８６：１３０９−１３１２，１９８３．Ａｌｌｅｎ  ＪＭ，Ｏ’Ｓｈｅａ  ＪＰ，Ｍａｓｈｉｔｅｒ  Ｋ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｇ，Ｂｌｏｏｍ  ＳＲ：Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ：Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｇｏｎｉｓｔ．Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．２８６：１６０７−１６０９，１９８３）．（Ｃｏｕｉｌｌａｒｄ  Ｓ．Ｌａｂｒｉｅ  Ｃ．Ｂｅｌａｎｇｅｒ  Ａ．Ｃａｎｄａｓ  Ｂ．Ｐｏｕｌｉｏｔ  Ｆ．Ｌａｂｒｉｅ  Ｆ．‘‘Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｄｅｈｙｄｒｏｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｎｔｉａｎｄｒｏｇｅｎ  ＥＭ−８００  ｏｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＺＲ−７５−１  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ’’．Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，Ｍａｙ  ２０，７７２−７７８，１９９８；Ｋｏｌｌｅ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．：‘‘Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ’’．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．５，ｐ９１１−９１６，１９９９）。
【０００６】
ＧｎＲＨ／ＬＨＲＨアナログの使用に代わる変異体は、天然のホルモン又はその模倣ペプチドを用いた能動免疫であり、これらは特に破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド若しくはそのエピトープ、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）又はＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）などのより免疫原性の高い分子に結合した場合にワクチンとして働くことが可能である（Ｇｕａｌ  Ｃ，Ｇａｒｚａ−Ｆｌｏｒｅｓ  Ｊ，Ｍｅｎｊｉｖａｒ  Ｍ，Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ｎａｊａｒ  Ａ，Ｐａｌ  Ｒ，Ｔａｌｗａｒ  ＧＰ．Ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎｓ  ｉｎ  ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｗｏｍｅｎ．Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  １９９７；６７：４０４−７）。
【０００７】
ＧｎＲＨ／ＬＨＲＨを適切な抗原として用いたワクチン接種に関して、ＵＳ５，８９７，８６３、ＵＳ６，１３２，７２０などの異なる報告が発表されている。しかし、実施当初から存在する問題点の１つに、有効濃度の抗ＧｎＲＨ抗体を産生するために強力な免疫反応を誘導する能力が不十分な点がある。これは主として、全ての哺乳類においてこのデカペプチドのサイズが小さいということと、自家であるという性質によるものである。そのため、最初の試みから、類似の分子で蓄積された経験やこのペプチドの免疫系に対する認知度を増強する担体の使用が非常に役立っている。
【０００８】
担体分子の破傷風トキソイドに結合したＧｎＲＨ又はその模倣ペプチドに基づくワクチン候補について、雄性のブタ、齧歯類及び霊長類で実験が試行されている。これらの実験では精巣、前立腺のほか雌の卵巣でも萎縮が認められた（Ｔａｌｗａｒ  ＧＰ，Ｒａｉｎａ  Ｋ，Ｇｕｐｔａ  Ｊ．Ｃ，Ｒａｙ  Ｒ，Ｗａｄｈｗａ  Ｓ，Ａｌｉ  ＭＭ．Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ−ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  ｂｉｏｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｃａｕｓｉｎｇ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００４；２２：３７１３−３７２．Ｍｉｌｌａｒ  ＲＰ，Ｋｉｎｇ  ＪＡ，Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ＪＳ，Ｍｉｌｔｏｎ  ＲＣ．Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓ  Ａｆｒ  Ｍｅｄ  Ｊ  １９８７；７２：７４８−７５５）。高用量が用いられた場合でさえ免疫群の個体間で観察された結果が大きくばらつくことは、ペットや経済的に重要な動物において生殖能力に対するワクチンとしてＧｎＲＨ／ＬＨＲＨベースの免疫原を用いる際にしばしば言及される別の欠点である。この欠点はフロイント完全アジュバントなどの高度な反応誘導性を持つアジュバントの問題ある使用により悪化する（Ｈｏｓｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｕｓｔｒ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ；４，１６６−１７０（１９９０）；Ｂｏｎｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．７２，１４−２０（１９９４）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６０８，２５１；Ｉｎｔ．ｐａｔｅｎｔ  ａｐｐｌ．ＷＯ８８２０５１０９；Ｃａｒａｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃ．Ｐａｒｉｓ，ｔ．３０３，Ｓｅｒｉｅ  ＩＩＩ，Ｎｏ．１６，６７３−６７６（１９８６）；Ｆａｌｖｏ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．６３，９８６−９９４（１９８６）。
【０００９】
同様にＲ．ＢｒｉｎｇａｓらのＷＯ９８／２７１１１特許‘‘Ｐｒｅｐａｒａｄｏ  ｖａｃｕｎａｌ  ｐａｒａ  ｌａ  ｉｎｍｕｎｏｃａｓｔｒａｃｉｏｎ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｄｅ  ｍａｍｉｆｅｒｏｓ’’には、合成プロセスで破傷風トキソイド（ＴＴ）と結合し、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）においてアジュバントになる変異ＧｎＲＨを用いた春機発動前のブタの免疫去勢に関する肯定的な結果が記載されている。しかし、春機発動の動物においてこのワクチン製剤を広範囲に使用しても、上で観察された均質性は認められなかった。
【００１０】
進行性前立腺癌患者及び閉経後女性での最初の臨床試験は、ゴナドトロピンの阻害に関する研究の目的で前世紀９０年代の１０年間で初めて行われ、Ｔａｌｗａｒ  ＧＰらによって発表された（（Ｔａｌｗａｒ  ＧＰ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９７；７５：１８４−１８９．Ｇｕａｌ  Ｃ，Ｇａｒｚａ−Ｆｌｏｒｅｓ  Ｊ，Ｍｅｎｊｉｖａｒ  Ｍ，Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ｎａｊａｒ  Ａ，Ｐａｌ  Ｒ，Ｔａｌｗａｒ  ＧＰ．Ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎｓ  ｉｎ  ｐｏｓｔ−ｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｗｏｍｅｎ．Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  １９９７；６７：４０４−７）。上述の使用されてきたワクチン候補のほか、担体としての破傷風トキソイド（ＴＴ）やジフテリアトキソイド（ＤＴ）に化学的にコンジュゲートしたＬＨＲＨはしばしば抗ハプテン性の免疫抑制を生じさせるが（Ｓｃｈｕｔｚｅ  Ｍ−Ｐ，Ｌｅｃｌｅｒｃ  Ｃ，Ｊｏｌｉｖｅｔ  Ｍ，Ａｕｄｉｂｅｒｔ  Ｆ，Ｃｈｅｄｉｄ  Ｌ．Ｃａｒｒｉｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｉｃ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａ  ｍａｊｏｒ  ｉｓｓｕｅ  ｆｏｒ  ｆｕｔｕｒｅ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｊ  ｉｍｍｕｎｏｌ  １９８５；１３５：２３１９−２２．Ｇａｕｒ  Ａ，Ａｒｕｎａｎ  Ｋ，Ｓｉｎｇｈ  ＯＭ，Ｔａｌｗａｒ  ＧＰ．Ｂｙ  ｐａｓｓ  ｂｙ  ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｏｆ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｔｏ  ＨＣＧ  ｕｐｏｎ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｅｔａｎｕｓ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９０；２（２）：１５１−５．Ｓａｄ  Ｓ，Ｇｕｐｔａ  ＨＭ，Ｔａｌｗａｒ  ＧＰ，Ｒａｇｈｕｐａｔｈｙ  Ｒ．Ｃａｒｒｉｅｒ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｓｅｌｆ  ｈａｐｔｅｎ．Ｉｍｍｕｎｌｏｇｙ  １９９１；７４：２２３−７）、これは報告されているコンジュゲーションプロセスでの損失に加わるものである（Ｇｕａｌ  Ｃ，Ｇａｒｚａ−Ｆｌｏｒｅｓ  Ｊ，Ｍｅｎｊｉｖａｒ  Ｍ，Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ｎａｊａｒ  Ａ，Ｐａｌ  Ｒ，Ｔａｌｗａｒ  ＧＰ．Ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎｓ  ｉｎ  ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｗｏｍｅｎ．Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  １９９７；６７：４０４−７）。
【００１１】
近年、北アメリカの研究者グループが、頻発性の感染性小児疾患に関与する微生物抗原に由来するＴ細胞エピトープ協力物質を使用したという報告がされている。これらの物質は、より一層強力で普遍的な反応を獲得するため、まさしく化学合成プロセスにおいてＧｎＲＨアミノ末端に結合している（Ｆｉｎｓｔａｄ  Ｃ．Ｌ，Ｗａｎｇ  Ｃ．Ｙ，Ｋｏｗａｌｓｋｙ  Ｊ，Ｚｈａｎｇ  Ｍ，Ｌｉ  Ｍ，Ｌｉ  Ｘ，Ｘｉａ  Ｗ，Ｂｏｓｌａｎｄ  Ｍ，Ｍｕｒｔｈｙ  ｋ．ｋ，Ｗａｌｆｉｅｌｄ  Ａ，Ｋｏｆｆ  Ｗ．Ｃ，Ｚａｍｂ  Ｔ．Ｊ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ（ＬＨＲＨ）ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００４；２２：１３００−１３１３）。それでもなお、同一免疫原中の４つのヘルパーＴ細胞エピトープを使用することで良好な免疫応答を得られたにもかかわらず、油性アジュバントを伴う反復免疫を用いることが必要であった。前記処方は再現するに難しいプロセスで、費用が高額で、主要な工業プロセスにおいて実施するのは容易でない。この場合、免疫応答の潜在能力はとりわけ担体分子の多様性に基づいて活用され、アミノ及びカルボキシルが存在する混合物（ＧｎＲＨ又はその模倣体を含まない）を提供する潜在能力は無視される。
【００１２】
最後に、ＧｎＲＨ又はその模倣体の異なる免疫コンジュゲートが持つ免疫原性能力のほか、コンジュゲーションを促進する追加アミノ酸の使用を含め、カルボキシル末端及びアミノ末端でコンジュゲートしたＧｎＲＨ免疫分子を用いて得られた異なる著者によるばらつきのある結果についても、いくつかの文献が報告していることに注目すべきである。同様に、従来のペプチド合成若しくはＤＮＡ組換え、又は「タンデム」やＭＡＢＳ型の複合分子により得られる、末端の１つに結合する異なる担体分子の使用に関する報告も認められる。しかし、担体分子に結合した２つのＧｎＲＨ変異体処方（アミノ末端を介して結合した一方の変異体と、カルボキシル末端を介して結合した他方の変異体を同一の医薬製剤中で用いている）の使用に関しては、免疫反応に対する相乗効果、性ホルモン濃度や標的器官（前立腺、精巣、乳房、卵巣）に対する効果を取り扱った報告は未だ認められない。
【００１３】
本提案分子の構築プロセスとしては、合成による化学的結合、ＧｎＲＨ又はその模倣体と担体分子とのコンジュゲーション又は融合タンパク質のクローニングが挙げられる。担体分子は完全なタンパク質又はその断片若しくはエピトープであることができ、例えば破傷風トキソイド、髄膜炎菌（Ｎｉｓｓｅｒｉａ  Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｐ６４Ｋタンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原、肝炎ウイルスコア抗原などがある。
【００１４】
本明細書の医薬製剤を同一処方で投与すると、ＧｎＲＨのないアミノ及びカルボキシル末端を標的とした相乗的な免疫応答が引き起こされる。その結果、男性及び女性の性ホルモン（それぞれアンドロゲン及びエストロゲン）は速やかに著しく除去され、積極的な免疫去勢を明確に生じさせる。この処方は、ペットや経済的に重要な動物の免疫去勢、並びにヒトの生殖能力の制御、及び例えば前立腺、乳房、卵巣、精巣及び子宮内膜の癌、さらには下垂体や唾液腺その他の腫瘍などのホルモン感受性腫瘍の治療に直接適用される。この処方の顕著な効果には、標的器官の体積減少、腫瘍塊の縮小及び個人の生存期間延長がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本提案発明の新規性及び利点
本発明は、天然、又はＤ−アミノ酸で合成される逆反転変異体を含む模倣体のいずれでもよい、２つのＧｎＲＨ／ＬＨＲＨホルモン変異体の、同一の免疫方式での組合せに基づくものである。ここでＧｎＲＨ変異体は、化学合成、コンジュゲーション又はアミノ末端及びカルボキシル末端でＴＴ型の担体分子若しくはそのエピトープと区別できないように結合したＧｎＲＨ  ＤＮＡキメラの使用により作製される。本発明の明確な目的は、内因性のＧｎＲＨに対するより速やかでより強力な免疫応答を見出すことである。この場合、カルボキシル末端及びアミノ末端変異体（ＧｎＲＨの担体分子への結合部位に関する）を同一の製剤中で又は別個で、同一の免疫方式により順次的又は交互の形式で、同時投与することができる。
【００１６】
本発明の新規性は、免疫系に対して生じる相乗的な効果、カルボキシル末端（担体がＧｎＲＨ又はその模倣体のカルボキシル末端に結合している変異体）及びアミノ末端（担体がＧｎＲＨ又はその模倣体のアミノ末端に結合している変異体）と呼ばれる前述の２つのＧｎＲＨ変異体を用いた能動免疫にある。これら変異体が同一処方の一部として投与されると、男性及び女性の性ホルモン（それぞれアンドロゲン及びエストロゲン）を速やかに強力に除去して、積極的な免疫去勢作用を生じる。それ故ペットや経済的に重要な動物の免疫去勢において有効である。他方、本発明はヒトの生殖能力制御やヒトホルモン感受性腫瘍、すなわち前立腺、乳房、卵巣、子宮内膜、精巣、下垂体や唾液腺やその他の腫瘍の治療にも用いることができる。治療の効果は標的器官の体積減少、腫瘍塊の縮小及び個人の生存期間延長で表される。
【００１７】
上記の組合せは２つの変異体（カルボキシル末端及びアミノ末端）の作用の和を表すだけでなく、先に記載された組合せで変異体が投与されると免疫系に対する相乗的な効果も標的器官に同じように表れる。
【００１８】
先に記載された治療に優る利点として、本発明は、カルボキシル末端及びアミノ末端変異体の混合物を用いて得られる相乗効果により、標的器官（精巣、前立腺、卵巣など）において及び／又は性ホルモン依存性腫瘍（前立腺、乳房、卵巣、子宮内膜、唾液腺、精巣など）に対して、より速やかでより強力な作用を示す。
【００１９】
本提案の変異体の組合せは、得られる抗ＧｎＲＨ抗体の力価と性ホルモン（アンドロゲン及びエストロゲン）の去勢レベルへの減少との間の密接な関係を明らかにする。次にこれは標的器官で生じる効果と関連している。これらの結果から、油性アジュバント（モンタナイド）の使用で得られる効果に加えて、アルミニウム塩などのより反応誘導性の低い（無害の）他のアジュバントを使用することができる。上述の態様により、ＧｎＲＨアミノ及びカルボキシル末端変異体の混合物が有する、これまでに報告されたＧｎＲＨホルモンベースの他の免疫原に優る相当の利点がもたらされる。
【００２０】
同一処方におけるＧｎＲＨカルボキシル末端及びアミノ末端ペプチド変異体又はワクチン候補を用いた健常な成体ラットの免疫により生じる免疫反応で、単独の変異体（カルボキシル末端又はアミノ末端）のみが用いられる他の免疫方式と比べてより良好な結果を得ることができた。上記の結果は、免疫去勢の誘導と良性増殖性疾患（子宮内膜症など）又は悪性増殖性疾患（前立腺、乳房、子宮内膜、卵巣、精巣、顎下腺の癌）及び他のホルモン欠乏感受性疾患の治療との両方において相乗効果を示す。
【００２１】
従前に用いられた技術とは違い、天然のＧｎＲＨ分子又はその模倣体、特にＧｎＲＨｍ１は、ペプチド合成プロセスにおいて担体タンパク質に直接結合することができ、又は高い免疫原性を持つ分子と化学的にコンジュゲートし、若しくは融合タンパク質の形でクローニングすることができ、これにより異なる２つの変異体、カルボキシル末端及びアミノ末端を形成する。これら変異体は最もよく報告される担体タンパク質のいくつか、又はそのエピトープと結合することができるが、これらはすなわち破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、髄膜炎菌Ｐ６４Ｋタンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎コア抗原などであり、これによりＧｎＲＨの除去及びＧｎＲＨ／ＬＨ−ＦＳＨ／テストステロン／エストロゲンのカスケードに関係するホルモンの除去につながる相乗的効果を伴う迅速で強力な免疫応答を獲得する。
【００２２】
カルボキシル末端及びアミノ末端変異体は同じ処方中で異なる比率で用いることができ、カルボキシル末端変異体とアミノ末端との関係は１０：９０から８０：２０（重量／重量）まで変わることができる。このようにカルボキシル末端で結合しているＧｎＲＨ分子は全ての場合において混合物全体の質の１０％より少ない割合を占め、同時にアミノ末端変異体は少なくとも混合物全体の２０％を占める。
【００２３】
カルボキシル末端及びアミノ末端の組合せでの最良の結果は、各変異体を５０％（重量／重量）の比率で混合したときに得られる。
【００２４】
同様にＧｎＲＨ分子、カルボキシル末端及びアミノ末端は、同じ担体において、一方はアミノ末端で他方はカルボキシル末端で区別できないように結合することができる。別の方法では、一方の変異体（カルボキシル末端）は担体タンパク質に結合することができ、他方の変異体（アミノ末端）は別の担体タンパク質に結合する。したがって免疫原性を有する混合物は、例えば、一方はＴＴ又はそのエピトープの１つの担体に、他方は髄膜炎菌Ｐ６４Ｋタンパク質、Ｂ型肝炎コア抗原若しくはそのエピトープ、又は高い免疫原性を持つ別の担体分子に結合したＧｎＲＨ又はその模倣体で構成することができる。
【００２５】
この種の組合せは、モンタナイド型の油性エマルジョン又はアルブミン型の水溶性アジュバント及びＱＳ２１でアジュバント形成された混合ＧｎＲＨカルボキシル末端及びアミノ末端変異体を用いることで、他の免疫原と比べてより速やかでより強力な抗ＧｎＲＨ免疫応答を実現する。
【００２６】
上記処方の潜在能力は、微小サイズプロテオリポソーム（ＶＳＳＰ）などの免疫刺激物質の添加により表面上増強することができるが、この物質は髄膜炎菌細胞壁リポタンパク質とＮ−アセチル若しくはＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシド又は同様のものとの混合物をｃｏｃｌｅａｔｅｓやアルギネートのような水溶性アジュバントと混合したときに得られるものである。
【００２７】
先に述べたように、本発明は広い範囲の脊椎動物の免疫に用いられることができ、ペット（イヌ、ネコなど）、野生種（齧歯類、リスその他）での哺乳類生殖能力制御に用いることが特に重要である。本提案の組合せはブタ、ヤギなどの免疫去勢において高い免疫原性率を確実なものとし、これら動物の肉や脂から生じる不快な臭いを回避する。本組合せの別の用途は、雄牛、水牛、ウマその他などの経済的に重要な動物の生殖能力及び攻撃性を制御することである。ヒトの医薬に関して、本発明の用途は、前立腺癌及び乳癌、並びに子宮、卵巣、精巣、顎下腺の癌、下垂体病変や他のホルモン感受性新生物の治療への直接適用である。
【００２８】
組合せ成分の１つとしてのカルボキシル末端型の免疫原性製剤
ワクチン成分の１つであるカルボキシル末端変異体は、事例の１つにおいては、天然のＧｎＲＨ分子又はその模倣体の１つ、例えばＱＨＷＳＹＰＬＲＰＧという配列を持つＧｎＲＨｍ１が破傷風トキソイドのヘルパーＴ細胞エピトープ（８３０−８４４）（ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ）又はジフテリアトキソイド、髄膜炎菌Ｐ６４Ｋタンパク質、Ｂ型肝炎コア抗原などの他の担体に結合することで構築することができ、遺伝的構築の発現系を用いた融合タンパク質として得られる。
【００２９】
完全ペプチドＱＨＷＳＹＰＬＲＰＧ  ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬを化学合成して（モンタナイド型の）油性アジュバントでアジュバント形成させると、春機発動前の動物にはたった２回の免疫で、成体動物においては３又は４回の免疫で、強力なテストステロン除去効果を持つようになることが示された。この変異体を用いて得られた抗体力価は９０％の血清変換に達した４回目の免疫後、ほとんどの個体で１／１０００〜１／２０００であった。
【００３０】
アミノ末端、第二の組合せ成分
同様に、天然のＧｎＲＨ分子又はその模倣体の１つの構築物、上記の事例のようにＧｎＲＨｍ１がそのアミノ末端で破傷風トキソイドの８３０−８４４エピトープに結合して作られた分子（ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬＧＧＱＨＷＳＹＰＬＲＰＧ）、又はそのアミノ末端で髄膜炎菌Ｐ６４Ｋタンパク質のＰ４８ぺプチドに結合したもの（ＩＰＧＶＡＹＴＳＰＥＶＡＷＶＧＧＧＧＱＨＷＳＹＰＬＲＰ）、又は上述のタイプの他の担体分子に結合した構築物は、既に述べたカルボキシル末端変異体により生じるものと比べ、内因性のＧｎＲＨに対してより高い免疫原性能力を持つ活性成分を構成する。意義深いことに、ＴＴ−ＧｎＲＨｍ１で免疫した個体は初回免疫の直後に天然ＧｎＲＨの血清変換を示し、３回目又は４回目の免疫後に１：６０００〜１：１２０００という抗体力価に達することが見出された。同じくアミノ末端変異体（Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ−ＧｎＲＨｍ１）はたった１回の免疫後に９０％の抗体応答を、４回目の免疫後に１：５０００及び１：１２０００という力価を誘導する。ＧｎＲＨが全ての哺乳類で保存されている非常に小さな自家分子であることを考慮すると、前記力価は非常に意味のあるものと考えることができる。このアミノ末端変異体はしかし、カルボキシル末端変異体と比べ、標的器官（男性の前立腺、精巣又は女性の卵巣）に対して著しく優れた効果を生じなかった。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】天然のＧｎＲＨ、ＧｎＲＨｍ１−ＴＴ、ＴＴ−ＧｎＲＨｍ１、ＧｎＲＨｍ１−Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ及びＰ４８−Ｐ６４Ｋ−ＧｎＲＨｍ１変異体のアミノ酸配列表示の図である。
【図２】ＴＴ担体分子に結合した異なるＧｎＲＨ変異体で免疫された動物の平均抗ＧｎＲＨ（天然）血清変換を表す図である。
【図３】ＴＴ担体分子に結合した異なるＧｎＲＨ変異体で免疫された健常コペンハーゲンラットにおける抗ＧｎＲＨ抗体力価を表す図である。
【図４】屠殺時（１００日目）の精巣重量評価を表す図である。ＬＳＤ  Ｓｔａｔ−Ｇｒａｐｈｉｃ統計的評価。１−プラセボ、２−ＧｎＲＨｍ１−ＴＴ、３−ＴＴ−ＧｎＲＨｍ１、４−２＋３の組合せ（５０／５０）、５−２＋３の組合せ（７０／３０）、６−交互方式。
【図５】屠殺時（１００日目）の前立腺重量評価を表す図である。ＬＳＤ統計的評価Ｓｔａｔ−Ｇｒａｐｈｉｃ．１−プラセボ、２−ＧｎＲＨｍ１−ＴＴ、３−ＴＴ−ＧｎＲＨｍ１、４−２＋３の組合せ（５０／５０）、５−２＋３の組合せ（７０／３０）、６−交互方式。
【図６】全ての評価動物の精巣及び前立腺の肉眼的外観を表す図である（各群ｎ＝１０）。群は左から右に向かって１番目がプラセボ、２番目がＧｎＲＨｍ１−ＴＴ（Ｃ−Ｔ）、３番目がＴＴ−ＧｎＲＨｍ１（Ａ−Ｔ）、４番目が［Ｃ−Ｔ］＋［Ａ−Ｔ］の組合せ（５０／５０）、５番目が［Ｃ−Ｔ］＋［Ａ−Ｔ］の組合せ（７０／３０）、６番目が交互方式（Ａｌｔ）である。
【図７】破傷風トキソイド担体分子に結合した異なるＧｎＲＨ変異体の腫瘍体積平均値を表す図である。
【図８】ＴＰ４８−Ｐ６４Ｋ担体分子に結合した異なるＧｎＲＨ変異体で免疫されたコペンハーゲンラットの抗ＧｎＲＨ抗体力価を表す図である。
【図９】屠殺時（１００日目）の精巣重量評価を表す図である。ＬＳＤ統計的評価Ｓｔａｔ−Ｇｒａｐｈｉｃ．１−プラセボ、２−ＧｎＲＨｍ１−Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ、３−Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ−ＧｎＴＨｍ１、４−２＋３の組合せ（５０／５０）、５−２＋３の組合せ（７０／３０）、６−交互方式。
【図１０】屠殺時（１００日目）の前立腺重量評価を表す図である。ＬＳＤ統計的評価Ｓｔａｔ−Ｇｒａｐｈｉｃ．１−プラセボ、２−ＧｎＲＨｍ１−Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ、３−Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ−ＧｎＴＨｍ１、４−２＋３の組合せ（５０／５０）、５−２＋３の組合せ（７０／３０）、６−交互方式。
【図１１】動物免疫前にコペンハーゲンラットに移植されたＤｕｎｎｉｎｇＲ３３２７−Ｈ腫瘍細胞系の腫瘍増殖速度評価を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００３２】
異なる担体分子に結合したＧｎＲＨカルボキシル末端及びアミノ末端変異体を用いた免疫原性実験及び標的器官に対する効果
（例１）担体分子としてＴＴを用いたカルボキシル末端及びアミノ末端変異体であるＧｎＲＨｍ１−ＴＴの免疫原性
生物学的測定に用いたＧｎＲＨアミノ及びカルボキシル末端変異体及び合成ＴＴペプチドの配列は図１ａ及び１ｂに記載されている。
【００３３】
１．１．実験群
１−プラセボ
２−カルボキシル末端（ＧｎＲＨｍ１−ＴＴ）総ペプチドで７５０μｇ
３−アミノ末端（ＴＴ−ＧｎＲＨｍ１）総ペプチドで７５０μｇ
４−カルボキシル末端（ＧｎＲＨｍ１−ＴＴ）変異体＋アミノ末端（ＴＴ−ＧｎＲＨｍ１）変異体の同じエマルジョン中での５０／５０組合せ（ｗ／ｗ）；総ペプチドで７５０μｇ（それぞれ３７５μｇ）
５−カルボキシル末端（ＧｎＲＨｍ１−ＴＴ）変異体＋アミノ末端（ＴＴ−ＧｎＲＨｍ１）変異体の同じエマルジョン中での７０／３０（ｗ／ｗ）；総ペプチドで７５０μｇ（５２５μｇのＧｎＲＨｍ１−ＴＴと２２５μｇのＴＴ−ＧｎＲＨｍ１）
６−０、３０、６０日目にカルボキシル末端（ＧｎＲＨｍ１−ＴＴ）を総ペプチドで７５０μｇ、１５、４５日目にアミノ末端（ＴＴ−ＧｎＲＨｍ１）を総ペプチドで７５０μｇ、交互に免疫
全ての場合において、モンタナイドアジュバントを用いて、各変異体の皮下免疫を５回行った。
【００３４】
１．２．実験の進行
１．２．１．免疫原性製剤、動物の免疫及び結果の分析
１．２．２．アジュバント形成
対応する用量のカルボキシル末端ペプチド変異体ＧｎＲＨｍ１−ＴＴ及び／又はアミノ末端ペプチド変異体ＴＴ−ＧｎＲＨｍ１を注射のため個別に水に再懸濁した。その後、再懸濁ペプチドと油性アジュバントとの５０％（ｖ／ｖ）の混合物を得た。最後に、混合物を機械装置で２０分間振盪して、すぐに使用できる乳白色の乳剤とした。
【００３５】
１．２．３．免疫
乳剤１ｍＬを使い捨てシリンジに充填し、９〜１２週齢のコペンハーゲンラットの背部に２週間ごとの方式で皮下注射した。
【００３６】
１．２．４．抗ＧｎＲＨ抗体力価の測定
ワクチン接種後に誘導された循環している抗ＧｎＲＨ抗体をＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定）法を用いて測定した。９６穴ポリスチレンプレートを１００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ９．６）に溶解した天然ＧｎＲＨペプチド（５μｇ／ｍｌ）１００μＬでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ  １ｘ（ｐＨ７．４）で数回洗浄した後、プレートをＰＢＳに溶解した２％ＢＳＡを用いてブロッキングして３７℃で１時間インキュベートした。動物血清試料は１％ＢＳＡ、Ｔｗｅｅｎ２０（０．０１％、ｗ／ｖ）を含むＰＢＳで希釈して（倍率１／６０〜１／２０００）、３７℃で３時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで数回洗浄して、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたラット抗ＩｇＧ抗体（ＳＩＧＭＡ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＵＳＡ）との反応に供した。プレートをさらに洗浄した後、クエン酸バッファー中にオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）及びＨ２Ｏ２基質を含む混合液と共にインキュベートした。力価は、値が測定カットオフ値と比べて２倍を超えた試料最大希釈倍率で表した。
【００３７】
１．２．５．テストステロン濃度の決定
テストステロン濃度はＴＥＳＴＯ  ＣＴ２キット（ＣｉｓＢｉｏ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて決定した。各血清試料２５μＬをコーティング済チューブに直接加えた。試料は２連でインキュベートした。最後にチューブを蒸留水で洗浄し、ガンマを用いて読み取った。結果はｎｍｏｌ／Ｌで表した。
【００３８】
１．２．６．動物の屠殺及び統計分析
動物は５回目の免疫から１カ月後（１００日目）に、医薬品安全性試験実施基準に従って麻酔し屠殺した。精巣及び前立腺の大きさについての統計的有意差はＤｕｎｃａｎ検定を用いて評価した（Ｓｔａｔ−Ｇｒａｐｈｉｃ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）。同様に、テストステロン濃度を同じ統計手法を用いて分析した（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，ＳＡＳ／ＳＴＡＴＴＭ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，Ｒｅｌｅａｓｅ  ６．０３  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃａｒｙ，ＮＣ：ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，１９８８．１０２８ｐｐ）。
【００３９】
１．３  実験結果
１．３．１  血清変換分析
ＧｎＲＨ分子は、前述のように、全ての哺乳類及び多数の高等脊椎動物において１００％の相同性を有する。この分子はまたサイズが非常に小さく（たった１０アミノ酸）、これが内因的である性質に起因する高い寛容原性能力と対照的に、非常に低い免疫原性力を与えている。
【００４０】
記載している例において、アミノ末端変異体（ＴＴ−ＧｎＲＨｍ１）で免疫された群は初回免疫後に１００％の血清変換を獲得したのに対し、カルボキシル末端変異体（ＧｎＲＨｍ１−ＴＴ）で免疫された群は３回目の免疫をして初めて９０％の血清変換を示した。混合したアミノ及びカルボキシル末端変異体の組合せ（５０／５０）は２回目の免疫後に１００％の血清変換を示し、最後に、アミノ及びカルボキシル末端変異体混合物の組合せ（７０／３０）は３回目の免疫後に１００％の血清変換に達した（図２）。
【００４１】
１．３．２．抗ＧｎＲＨ抗体力価の評価
各実験群の血清試料における抗ＧｎＲＨ抗体力価を図３に示す。グラフに見られるように、ＴＴ−ＧｎＲＨｍ１群は抗ＧｎＲＨ力価の出現と相関したより高速の免疫反応を示し、実験開始後７５日目と１００日目にそれぞれ１／６０００〜１／１２０００の範囲にあった。５０／５０及び７０／３０の組合せ変異体は同じような抗ＧｎＲＨ抗体力価を示したが、第一のものはより高速の力価応答を示した。ＧｎＲＨｍ１−ＴＴ変異体とＴＴ−ＧｎＲＨｍ１変異体との交互免疫方式は５０／５０組合せのような高力価を維持できなかったが、同様の力価誘導速度に達している。ＧｎＲＨｍ１−ＴＴ変異体で免疫された群ではその他の実験群よりも遅く力価が出現し（３回目の免疫後）、１／１０００より高い力価レベルに達することができなかった。
【００４２】
１．３．３．異なるＧｎＲＨ部位に対して誘導された抗ＧｎＲＨ抗体力価と標的器官に対する効果との相関
抗ＧｎＲＨ抗体力価と標的器官（前立腺、精巣）に対する効果との相関分析が行われた。図３に示すように、アミノ末端部ＴＴ−ＧｎＲＨｍ１での免疫は高い免疫原性プロファイルを示す一方、カルボキシル末端変異体（ＧｎＲＨｍ１−ＴＴ）はより遅い血清変換と顕著に低いＧｎＲＨに対する抗体力価を示した。標的器官に対する効果において、屠殺時に同様の結果が認められた。アミノ末端変異体（ＴＴ−ＧｎＲＨｍ１）で免疫された群は１：１２０００という高い力価を達成した一方で、標的器官（前立腺及び精巣）に対する効果はカルボキシル末端変異体（ＧｎＲＨｍ１−ＴＴ）で免疫された群と比較して同様であった（図４及び５）。
【００４３】
免疫方式が同じで比率の異なるアミノ及びカルボキシル末端変異体混合物は、単一のカルボキシル末端ペプチドで得られるよりも顕著に高い免疫応答を誘導し、これにより２つの変異体を個別に投与する場合よりも顕著に高い生物学的効果を生じる。とはいえ、アミノ末端変異体の使用で得られるもののように完全な力価の値には達しない。同じ免疫方式で両ペプチドを交互形式で接種した場合にも同様の結果が得られた（図４、５、６）。
【００４４】
（例２）担体分子としてＰ４８−Ｐ６４Ｋを用いたカルボキシル末端及びアミノ末端変異体であるＧｎＲＨｍ１−ＴＴの免疫原性
２．１．実験群
１−プラセボ
２−カルボキシル末端（ＧｎＲＨｍ１−Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ）総ペプチドで７５０μｇ
３−アミノ末端（Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ−ＧｎＲＨｍ１）総ペプチドで７５０μｇ
４−カルボキシル末端（ＧｎＲＨｍ１−Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ）変異体＋アミノ末端（Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ−ＧｎＲＨｍ１）変異体の同じエマルジョン中での５０／５０組合せ（ｗ／ｗ）；総ペプチドで７５０μｇ（それぞれ３７５μｇ）
５−カルボキシル末端（ＧｎＲＨｍ１−Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ）変異体＋アミノ末端（Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ−ＧｎＲＨｍ１）変異体の同じエマルジョン中での７０／３０（ｗ／ｗ）；総ペプチドで７５０μｇ（５２５μｇのＧｎＲＨｍ１−Ｐ４８−Ｐ６４Ｋと２２５μｇのＰ４８−Ｐ６４Ｋ−ＧｎＲＨｍ１）
６−０、３０、６０日目にカルボキシル末端（ＧｎＲＨｍ１−Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ）を総ペプチドで７５０μｇ、１５、４５日目にアミノ末端（Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ−ＧｎＲＨｍ１）を総ペプチドで７５０μｇ、（２と３の）交互免疫
全ての場合において、モンタナイドアジュバントを用いて、各変異体の皮下免疫を５回行った。
【００４５】
２．２．実験の進行
免疫原性製剤、動物の免疫並びに結果及び統計的データの分析は１．２．１から１．３．３．に記載されているように処理を行った。
【００４６】
２．３．実験結果
２．３．１．血清変換分析：
本実験では、アミノ末端ペプチド変異体（Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ−ＧｎＲＨｍ１）で免疫された群は初回免疫後に１００％の血清変換を獲得した一方、カルボキシル末端ペプチド変異体（ＧｎＲＨｍ１−Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ）で免疫された群は３回目の免疫をして初めて７０〜８０％の血清変換を示した。しかし、カルボキシル末端及びアミノ末端混合変異体の組合せ（５０／５０）は２回目の免疫後に１００％の血清変換を示した。他方、カルボキシル末端及びアミノ末端変異体の組合せ（７０／３０）及び交互免疫方式は３回目の免疫後に１００％の血清変換を示した（図７）。
【００４７】
２．３．２．抗ＧｎＲＨ抗体力価の評価
図８に各実験群の血清抗ＧｎＲＨ抗体力価を示す。本グラフにおいて、Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ−ＧｎＲＨｍ１群はより速く抗ＧｎＲＨ力価が出現し、実験終了時に１／５０００から１／８０００の範囲にあることが観察された。組合せ変異体である５０／５０及び７０／３０変異体の間では、同じような抗ＧｎＲＨ抗体力価が誘導された。しかし５０／５０変異体を用いると、力価はより速く応答した。他方、ＧｎＲＨｍ１−Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ変異体とＰ４８−Ｐ６４Ｋ−ＧｎＲＨｍ１変異体との交互免疫方式は、７０／３０変異体で誘導されたのと同様の免疫原性レベルを発現した。しかし、交互免疫方式の力価は第一のものほど高く維持されなかった。ＧｎＲＨｍ１−Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ変異体で免疫された群についてはその他の実験群よりも遅く力価が出現し、一番良好な事例の１／１０００より高い濃度に達しなかった。
【００４８】
２．３．３．異なるＧｎＲＨ部位に対して誘導された抗ＧｎＲＨ抗体力価と標的器官に対する効果との相関
図７及び８に示すように、Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ−ＧｎＲＨｍ１アミノ末端変異体での免疫は高い免疫原性を誘導した一方、カルボキシル末端変異体（ＧｎＲＨｍ１−Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ）は血清変換がより遅く、また抗ＧｎＲＨ抗体力価も顕著に低かった。血清変換において観察された相違点は、屠殺時の標的器官効果に関しては明白でなかった。このようにしてアミノ末端変異体（Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ−ＧｎＲＨｍ１）で免疫された群における１：８０００という高い力価は、カルボキシル末端変異体ＧｎＲＨｍ１−Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ）で免疫された群と比べて標的器官（精巣、前立腺）に対する同じような効果を引き起こした（図９及び１０）。
【００４９】
免疫方式が同じで異なる比率で混合したカルボキシル末端及びアミノ末端変異体は、個々のカルボキシル末端ペプチドで得られるものよりも顕著に優れた免疫応答を獲得し、アミノ末端変異体を用いて得られる力価より低いにもかかわらず、その生物学的効果は個別投与の２つの変異体より顕著に優れている。同じ免疫方式で両ペプチドを交互形式で接種した場合にも同様の結果が得られた（図８、９及び１０）。
【００５０】
（例３）異なるＧｎＲＨ部位に対して誘導された体液性応答と標的器官に対する効果との相関、組合せ効果
抗体力価の分析後すぐに、これら力価と標的器官（前立腺及び精巣）に対する効果との間の相関分析を行った。図３及び８に示すように、カルボキシル末端及びアミノ末端変異体に対応する実験群２及び３において、免疫原性能力に関して完全に異なる挙動が観察された。それに伴って、ＴＴ−ＧｎＲＨｍ１及びＰ４８−Ｐ６４Ｋ−ＧｎＲＨｍ１ＴＴペプチドで表されるアミノ末端は、使用されたモデルにおいてより速い抗ＧｎＲＨ抗体産生のほかこのホルモンに対する高い力価を示した一方、カルボキシル末端変異体（ＧｎＲＨｍ１−ＴＴ及びＧｎＲＨｍ１−Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ）ではさらに遅い血清変換と顕著に低いＧｎＲＨに対する抗体力価が得られた。これらの血清変換及び血清力価決定は、異なるものであるにもかかわらず、動物屠殺時の評価では標的器官に及ぼす作用において同じような結果を生じた。それに伴って、アミノ末端変異体で免疫された群における１：１２０００という高い抗体力価は、カルボキシル末端変異体で免疫された群と比べて標的器官（前立腺及び精巣）に対する同じような効果を発揮したことが観察できた（図４と５、及び９と１０）。しかし、同じ免疫方式のカルボキシル末端及びアミノ末端変異体が異なる比率で混合された場合、個別のカルボキシル末端ペプチドのものよりも顕著に高い免疫応答が得られる。この応答はアミノ末端変異体で得られるような高い力価の値には達しないが、個別投与の２つの変異体より顕著に高い生物学的効果を生じる。同じ免疫方式で両ペプチドを交互形式で接種した場合に同様の結果が得られた（図４、５、９及び１０）。
【００５１】
これらの結果から、ＧｎＲＨがアミノ末端で又はカルボキシルから離れた他のアミノ酸で担体分子に結合する場合、ＧｎＲＨ中の遊離のカルボキシル基がこのホルモンに対する免疫応答を強く刺激するという結論が導かれる。逆に、カルボキシル末端で担体分子に結合しているＧｎＲＨｍ１−ＴＴは、このカルボキシル末端部の免疫系への暴露を損なってアミノ末端のみを暴露しているように見える。このアミノ末端部は第一のものと同じような高い免疫刺激能力を持たないが、１０倍弱いにもかかわらず、ＴＴ−ＧｎＲＨｍ１変異体と同じ用量で投与されると、同様にホルモンを中和する反応を起こすことができる。
【００５２】
これらの知見に基づいて、ＧｎＲＨの場合、最も免疫原性の高い部位は必ずしも免疫中和領域ではないことが確認できる。同じことが他のタンパク質やペプチドで生じている。
【００５３】
上述の結果から、一方はアミノ末端で他方はカルボキシル末端で担体分子と結合している同じ免疫方式の２つのＧｎＲＨ変異体又はその模倣体を混合物中で同時に使用することにより抗ＧｎＲＨ免疫応答の相乗効果が生み出されるという結論を出すことができる。この場合、免疫応答に対する効果は組み合わせていない変異体で期待される効果の単なる総和より高い。
【００５４】
５０／５０及び７０／３０の変異体組合せでは、ペプチド混合物が免疫プロセスに用いられた場合、前立腺及び精巣のサイズ減少に対する顕著な相乗的効果が認められた。交互且つ順次的な方式もまた組合せ効果を生じるが、同時方式より弱い。この効果は主として精巣及び前立腺の委縮に現れた。
【００５５】
治療効果（Ｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は、１からプラセボ動物における標的器官の平均重量（Ｐｐｌａｃｅｂｏ）に対する処置動物における標的器官（前立腺及び精巣）の平均重量（Ｐｔｒｅａｔｍｅｎｔ）の比を引いたものとして考えた。
Ｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ＝１−（Ｐｔｒｅａｔｍｅｎｔ／Ｐｐｌａｃｅｂｏ）      （１）
【００５６】
表１ａ及び１ｂに示すように、カルボキシル末端及びアミノ末端の５０／５０組合せによって得られた前立腺及び精巣に対する実験の効果は期待された理論的な効果より高く、したがって、図１に記載された分子のいずれを用いても上の組合せが標的器官サイズの減少における相乗的な効果を示すことを証明した。２つのペプチドの７０／３０組合せの場合、カルボキシル＋アミノ末端（５０／５０）組合せの場合と結果は非常に類似していた。交互免疫方式を用いた場合は、標的器官（前立腺及び精巣）に対する生物学的効果に関して、得られた力価は個々の免疫変異体より優れていたにもかかわらず、単なる効果の総和のみが認められた。
【００５７】
健常な成体動物への免疫で用いられた際の、個別の各ペプチド変異体を別々に用いた場合と比べ組合せ免疫で得られる総合的な相乗効果を表１ａ及び１ｂに示した。
【表１】
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【００５８】
（例４）Ｄｕｎｎｉｎｇ  Ｒ３３２７−Ｈ細胞系を移植した成体コペンハーゲンラットでの個別のＧｎＲＨｍ１−ＴＴ変異体及びＴＴ−ＧｎＲＨｍ１変異体並びにその組合せ（ＧｎＲＨｍ１−ＴＴ＋ＴＴ−ＧｎＲＨｍ１）を用いた治療実験
４．１．動物、腫瘍モデル
（２ｘ２ｘ２ｍｍ）のマウス腫瘍モデルＤｕｎｎｉｎｇ  Ｒ３３２７−Ｈの腫瘍断片を、体重１５０〜２００ｇの成体コペンハーゲンラット（ＣＥＮＰＡＬＡＢ，Ｃｕｂａ）の右後肢遠位域に皮下（ｓ．ｃ）移植した。これは、体積倍加時間が１７日間のホルモン依存性高度分化腫瘍細胞系である。腫瘍増殖速度を決定するため、週に１回腫瘍を定期的に測定した。腫瘍体積はｒを平均半径とした４／３πｒ３の式を用いて計算した。動物は市販飼料と新鮮な水を自由摂取させて維持した。
【００５９】
４．２．実験計画
実験群
１．プラセボ動物（モンタナイドＩＳＡ５１中のＰＢＳで免疫）
２．外科的去勢動物
３．ＧｎＲＨｍ１−ＴＴペプチド免疫動物
４．ペプチドＧｎＲＨｍ１−ＴＴ＋ＴＴ−ＧｎＲＨｍ１混合物（５０／５０）で免疫された動物
５．ＧｎＲＨｍ１−Ｐ４８−Ｐ６４Ｋペプチド免疫群
６．ペプチドＧｎＲＨｍ１−Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ＋Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ−ＧｎＲＨｍ１混合物（５０／５０）で免疫された動物
【００６０】
４．３．動物の処置
動物の処置は、パラグラフ３．１．１に記載されているようにＤｕｎｎｉｎｇ  Ｒ３３２７−Ｈ腫瘍細胞系断片を接種した治療モデルを用いて行われた。腫瘍が直径およそ１０ｍｍに達した時に治療的介入（免疫）を開始した。免疫は２週間ごとに行われた。
群３〜７の実験で使用した用量はパラグラフ１．１に記載されたものと同じであった。
【００６１】
４．４．実験結果
Ｄｕｎｎｉｎｇ  Ｒ３３２７−Ｈ腫瘍細胞系を移植したコペンハーゲンラットにおける腫瘍増殖速度の評価
図１１に示すように、プラセボ群では急激な腫瘍増殖が観察された一方、去勢群及び免疫群では腫瘍増殖が著しく阻害された。全ての変異体のうち、去勢動物とＧｎＲＨｍ１−ＴＴ＋ＴＴ−ＧｎＲＨｍ１（５０／５０）とＧｎＲＨｍ１−Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ＋Ｐ４８−Ｐ６４Ｋ−ＧｎＲＨｍ１（５０／５０）組合せ変異体とが最も優れた阻害能力を示した。これら３つの実験的変異体の阻害は非常に類似していて、プラセボ及び他の群と比べて顕著に異なることがわかった。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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