(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列KEFLHPSKVD LPRを含む単離ペプチドであって、麻痺活性なくカルシウムチャネル活性を阻害するペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列:EGKLSSNDTE GGLCKEFLHP SKVDLPR(配列番号1)を含む、請求項1に記載のペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列KEFLHPSKVD LPRからなる、請求項1に記載のペプチド。
【請求項４】
アミノ酸配列:EGKLSSNDTE GGLCKEFLHP SKVDLPR(配列番号1)からなる、請求項1に記載のペプチド。
【請求項５】
前記カルシウムチャネルが、TRPV6カルシウムチャネルを含む、請求項1に記載のペプチド。
【請求項６】
35個未満のアミノ酸からなる、請求項1に記載のペプチド。
【請求項７】
30個未満のアミノ酸からなる、請求項1に記載のペプチド。
【請求項８】
癌細胞によるカルシウムの取込みを阻害するための医薬の製造における、請求項1から7のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項９】
癌細胞のアポトーシスを誘導するための医薬の製造における、請求項1から7のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項１０】
前記癌細胞が、乳癌細胞または卵巣癌細胞である、請求項8または9に記載の使用。
【請求項１１】
前記癌細胞が乳癌細胞である、請求項8または9に記載の使用。
【請求項１２】
前記癌細胞が、卵巣癌細胞、血液癌細胞、脳癌細胞、網膜癌細胞、肝臓癌細胞、甲状腺癌細胞、結腸癌細胞、前立腺癌細胞または子宮内膜癌細胞である、請求項8または9に記載の使用。
【請求項１３】
前記細胞がin vivoである、請求項8から12のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記細胞がin vitroである、請求項8から12のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
癌治療を必要とする動物において癌を治療するための医薬の製造における、請求項1から7のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項１６】
前記癌が、卵巣癌、血液癌、脳癌、網膜癌、肝臓癌、甲状腺癌、結腸癌、前立腺癌または子宮内膜癌である、請求項15に記載の使用。
【請求項１７】
前記癌が、乳癌または卵巣癌である、請求項15に記載の使用。
【請求項１８】
前記動物が哺乳動物を含む、請求項15から17のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
前記動物がヒトを含む、請求項18に記載の使用。
【請求項２０】
前記癌が転移性癌を含む、請求項15から19のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
前記転移性癌が、リンパ節、肺組織、腎臓組織または肝臓組織中に位置する、請求項20に記載の使用。
【請求項２２】
請求項1から7のいずれか一項に記載のペプチド、および担体を含む医薬組成物。
【請求項２３】
更に第二の抗癌剤を含む、請求項22に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記第二の抗癌剤がタキソールである、請求項23に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記第二の抗癌剤がタモキシフェンである、請求項23に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
細胞中のカルシウムチャネルを阻害し、癌細胞のアポトーシスを誘導し、かつ/または癌を治療する際に使用するための、請求項1から7のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２７】
細胞中のカルシウムチャネルを阻害し、癌細胞のアポトーシスを誘導し、かつ/または癌を治療するための医薬品の調製において使用するための、請求項1から7のいずれか一項に記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞増殖を低下させ、転移性癌を含めた癌を治療する際に使用するためのペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ソリシジン(soricidin)と名付けられた54個のアミノ酸の麻痺性ペプチド(NCBI受託番号:P0C2C6)が、ブラリナトガリネズミ(Northern Short-tailed Shrew)(Blarina brevicauda)の顎下唾液腺から発見され、単離された。疼痛の治療におけるソリシジンの使用に関する以前の特許(その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第7,119,168号)によって、この54-merのペプチドが、麻痺を引き起こし、2種の卵巣癌細胞系によるカルシウムの取込みを阻害したことを示したデータが提供された(その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第7,273,850)。麻痺活性を示さない抗癌剤が依然として求められている。
【０００３】
癌に関係する一群のカルシウムイオンチャネルが、無脊椎動物および脊椎動物にわたって見出される一過性受容体電位(Transient Receptor Potential)(TRP)チャネルである。あるTRPスーパーファミリーのメンバーは、それがバニロイド(例えば、唐辛子由来のカプサイシン)の存在下で活性化することの発見にちなんで名付けられ、一過性受容体電位バニロイドと呼ばれている。試験されたこれらの受容体の最初の4つ(TRPV1、TRPV2、TRPV3およびTRPV4)は全て、カプサイシンに応答し、また、温度変化の検出にも関与した。TRPVサブファミリーの残りの2つ、すなわち、TRPV5およびTRPV6は、上皮型組織中に優勢に見出され、カルシウムイオンの流入に関与した。TRPV5/6は、カルシウムの腸上皮組織中への移入、したがって、食餌からのカルシウムの取込みに関与するものとして同定された。また、これらのチャネルは、いくつかのその他の組織中にも様々な量で存在するが、最も顕著には、腸上皮細胞、腎臓、胎盤および膵臓中に存在することが示された。ヒトの卵巣、前立腺および乳房の癌、甲状腺および結腸の腫瘍、ならびにいくつかの公知の前立腺癌細胞系で極めて高いTRPV6の発現が測定された。前立腺癌においては、TRPV6は、組織の壁まで突破し、転移し始めている癌腫で大幅に上方制御されていた(Zhuangら、2002年)。したがって、TRPV6は、癌療法の潜在的な標的である。したがって、癌細胞中の過剰に豊富なTRPV6チャネルの活性を遮断する化合物が強く求められている。
【０００４】
より最近になって、TRPV6を過剰発現している2種の癌細胞系において、生存促進性/抗アポトーシス性の経路を活性化することにより、癌におけるTRPV6の関与が示唆されている。前立腺癌細胞系(LnCaP)においては、TRPV6のより高いレベルによって増加した細胞内カルシウム濃度が、活性化T細胞核内因子(NFAT)を活性化する(Lehen'kyiら、2007年)。また、Bolanzら(2008年)は、ヒト乳癌細胞系(T 47-D)における抗アポトーシス遺伝子へのスイッチングにカルシウム活性化NFATが関与することを示している。Bolanzらは、TRPV6の産生をRNA干渉によって低下させると、アポトーシスの遮断が軽減されるらしいことを示した。これらの報告は、癌治療におけるTRPV6阻害剤の必要性をさらに強調する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第7,119,168号
【特許文献２】米国特許第7,273,850号
【特許文献３】米国特許第5,843,456号
【特許文献４】米国特許第5,688,681号
【特許文献５】米国特許第5,688,657号
【特許文献６】米国特許第5,683,693号
【特許文献７】米国特許第5,667,781号
【特許文献８】米国特許第5,665,356号
【特許文献９】米国特許第5,591,628号
【特許文献１０】米国特許第5,510,241号
【特許文献１１】米国特許第5,503,987号
【特許文献１２】米国特許第5,501,988号
【特許文献１３】米国特許第5,500,345号
【特許文献１４】米国特許第5,496,705号
【特許文献１５】米国特許第5,512,282号
【特許文献１６】米国特許第4,828,985号
【特許文献１７】米国特許第5,225,331号
【特許文献１８】米国特許第5,124,147号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Merrifield、1964、J. Am. Chem. Assoc.、85:2149〜2154頁
【非特許文献２】Houbenweyl、1987、Methods of Organic Chemistry、E. Wansch編、Vol. 15 IおよびII、Thieme、Stuttgart
【非特許文献３】Sambrook Jら、2000、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition)、Cold Spring Harbor Laboratory Press
【非特許文献４】Altschul, S.F.、Gish, W.、Miller, W.、Myers, E.W.およびLipman, D.J. (1990)「Basic local alignment search tool.」、J. Mol. Biol. 215:403〜410頁
【非特許文献５】Gish, W.およびStates, D.J. (1993)「Identification of protein coding regions by database similarity search.」、Nature Genet. 3:266〜272頁
【非特許文献６】Madden, T.L.、Tatusov, R.L.およびZhang, J. (1996)「Applications of network BLAST server」、Meth. Enzymol. 266:131〜141頁
【非特許文献７】Altschul, S.F.、Madden, T.L.、Schaffer, A.A.、Zhang, J., Zhang, Z.、Miller, W.およびLipman, D.J. (1997)「Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.」、Nucleic Acids Res. 25:3389〜3402頁
【非特許文献８】Zhang, J.およびMadden, T.L. (1997)「PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation.」、Genome Res. 7:649〜656頁
【非特許文献９】Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton、Pa.、米国
【非特許文献１０】MichaelおよびIrene Ash編、Gower Publishing Limited、Aldershot、英国(1995)
【非特許文献１１】Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185、Academic Press, San Diego, Calif. (1990)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、カルシウムチャネル阻害活性、特に、TRPV6カルシウムチャネル阻害活性をもたらす単離ペプチドを合成するに至った。これらのペプチドは、転移性癌を含めた癌を治療するのに有用である。驚くべきことに、これらの化合物は、ソリシジン中の連続してつながるアミノ酸に対して配列同一性を示すが、麻痺活性のないカルシウムチャネル阻害活性を示す。カルシウムチャネル阻害活性をもたらすソリシジンの構造と、麻痺活性を引き起こす構造とが分離していることは、以前は知られていなかった。本発明のペプチドは、場合により、ソリシジンの半分以下の長さである。また、予想外なことに、本発明のペプチドは、いくつかの細胞においては、ソリシジンよりも高いカルシウムチャネル阻害活性も示す。また、いくつかの細胞においては、ペプチドの長さが減少するにつれて、阻害活性が増加することも決定された。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のペプチドは、完全長のソリシジンと比較して、増加した溶解性、増加した貯蔵安定性、および低下した抗原性等のその他の予想外の特性を示す。一実施形態では、本発明は、アミノ酸配列:EGKLSSNDTE GGLCKEFLHP SKVDLPR(配列番号1)の全部または一部を含む単離ペプチドに関し、このペプチドは、カルシウムチャネル活性を阻害する。このペプチドは、場合により、KEFLHPSKVD LPRまたはHP SKVDLPRである。本発明の別の態様は、癌細胞によるカルシウムの取込みを阻害し、細胞のアポトーシスを誘導し、かつ/または癌を予防もしくは治療する方法に関し、この方法は、本発明のペプチドの全部または一部を細胞に投与するステップを含み、このペプチドは、癌細胞によるカルシウムの取込みを阻害する。癌は、場合により、乳癌、卵巣癌、血液癌、脳癌、網膜癌、肝臓癌、甲状腺癌、結腸癌、前立腺癌または子宮内膜癌を含む。本発明のペプチドは、TRPV6カルシウムチャネル活性等のカルシウムチャネル活性を阻害する。癌は、場合により、リンパ節、肺組織、腎臓組織または肝臓組織中に位置する転移性癌等の転移性癌を含む。
【０００９】
本発明の別の実施形態は、本発明のペプチド、および担体を含む医薬組成物に関する。本発明は、細胞中のカルシウムチャネルを阻害し、癌細胞のアポトーシスを誘導し、かつ/または癌を治療するための医薬品の調製において使用するための本発明のペプチドを含む。また、本発明は、細胞中のカルシウムチャネルを阻害し、癌細胞のアポトーシスを誘導し、かつ/または癌を治療する際に使用する本発明のペプチドも含む。
【００１０】
本発明のその他の特色および利点が、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者には、詳細な説明から本発明の精神および範囲に属する種々の変更形態および改変形態が明らかとなることから、これらは、例示のために提示されているに過ぎないことを理解されたい。
【００１１】
本発明の実施形態を、図面との関連で説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ペプチド濃度の関数としての、TRPV6チャネルを通るカルシウム電流(Isoc)の正味の変化の平均を示すグラフである(パネルA)。SorC13を、中空の丸および破線で示す。SorC27を、中空の四角および実線で示す。正の数は、細胞内に流入するカルシウム電流の阻害(正味の電流)を示すことに留意されたい。パネルBは、ペプチド濃度の関数としての、TRPV6チャネルを通るカルシウム電流(Isoc)の最大阻害パーセントを示す。SorC13を、中空の丸および破線で示す。SorC27を、中空の四角および実線で示す。
【図２】SorC27の、卵巣癌細胞系(SKOV-3、パネルA)および乳癌細胞系(MCF 7、パネルB)に対する作用を示すグラフである。
【図３】SorC13の、卵巣癌細胞系(SKOV-3、パネルA)および乳癌細胞系(T 47D、パネルB)に対する作用を示すグラフである。
【図４】T 47Dにおける、パクリタキセル(10μM)とSorC13(10μM)によるアポトーシス誘導の比較を示すグラフである(パネルA)。パネルBは、MCF 7における、パクリタキセル(10μM)とSorC27 (10μM)の比較を示すグラフである。
【図５】SKOV3に対する、CAT処置:CAT対照(CATなし)の比と、SorC13処置:SorC13対照(SorC13なし)の比およびSorC27処置:SorC27対照(SorC27なし)の比との比較を示すグラフである(パネルA)。パネルBは、CaOV3に対する、CAT処置とSorC13処置の比較を示すグラフである。SorC13の濃度は100μMであり、SorC27の濃度は10μMであった。CAT=パクリタキセル(10μM)プラスカルボプラチン(20mM)。データ点は、アポトーシス誘導の4回の測定値の平均である。点線は、作用が得られない1:1の比である。
【図６】OVCAR3に対する、CAT処置:CAT対照(CATなし)の比と、SorC27処置:SorC27対照(SorC27なし)の比との比較を示すグラフである。SorC27の濃度は、10μM(中黒の四角)および100μM(中空の四角)であった。CAT=パクリタキセル(10μM)プラスカルボプラチン(20mM)。データ点は、アポトーシス誘導の4回の測定値の平均である。点線は、作用が得られない1:1の比である。
【図７】マウス内のリンパ節の場所を示す線画である。標識ペプチドそれぞれ100μgをCD1マウスにi.v.注射した後4時間目に、SorC13-Cy5.5およびSorC27-Cy5.5の顕著な蓄積を、図7中に表示した以下のリンパ節において観察した:1.浅頚節、4.腋窩節、5.上腕節、8.腸間膜節、および9.鼠径節。
【図８】CD1マウスにおける、i.v.注射後4時間目のCy5.5標識SorC13の分布を示すグラフである。Y軸は、全ての組織中で測定した全蛍光のパーセントである。
【図９】CD1マウスにおける、i.v.注射後4時間目のCy5.5標識SorC27の分布を示すグラフである。Y軸は、各組織中で測定した全蛍光のパーセントである。
【図１０】CD1マウスにおける、液体を洗い流すための灌流後の経時的なi.v.注射後のCy5.5標識SorC27の分布を示すグラフである。Y軸は、全ての組織中で測定した全蛍光のパーセントである。SorC27の(全蛍光のうちの)最も高いパーセント取込みが、肝臓、肺および腎臓において観察された。灌流によってリンパ液が洗い流されているので、リンパ節は提示されていない。パネルAは、i.v.注射後4時間目の分布を示し、パネルBは、i.v.注射後24時間目の分布を示す。
【図１１】100μlの血漿を、100μlの2M KCl中で希釈し、94μlを注入したHPLC解析からの、ヒト血漿中のSorC27の分解を示すグラフである。Y軸は、KClを用いて希釈する前の血漿中のSorC27の量(μg)を示す。半減期=20.0分、r=0.87、p<0.05。データは、平均±SEM、n=6である。
【図１２】ヒトSKOV3卵巣癌腫瘍を異種移植したNOD/SCIDマウスを用いたin vivo実験の結果を示すグラフである。対照食塩水、SorC27、またはパクリタキセルとカルボプラチンとの混合物(CAT)のいずれかを、マウスに注射した。SorC27は、腫瘍サイズを体重に対して正規化した場合、12日にわたり、対照の食塩水注射と比較して腫瘍体積を有意に(p<0.05)低下させたが、CATを用いて処置したマウスとは違いがなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明者らは、カルシウムチャネル阻害活性をもたらす単離ペプチドを作製した。特に、これらのペプチドは、TRPV6カルシウムチャネル阻害活性を示し、TRPV6を過剰発現している癌細胞においてTRPV6の機能を遮断する。これらのペプチドは、乳癌、卵巣癌、血液癌(白血病)、脳癌、網膜癌、肝臓癌、甲状腺癌、結腸癌、前立腺癌および子宮内膜癌等の癌を治療する方法において有用である。
【００１４】
また、これらのペプチドは、最初の組織において発生し、リンパ節、肝臓、肺または腎臓の組織等の二次的な部位に広がる転移性癌を医学的に治療する方法においても有用である。
【００１５】
一実施形態では、本発明のペプチドは、アミノ酸配列:HPSKVDLPR(「SorC9」と呼ばれる;配列番号1のアミノ酸番号19〜27)を有する。別の実施形態では、この化合物は、アミノ酸配列KEFLHPSKVDLPR(「SorC13」と呼ばれる;配列番号1のアミノ酸番号15〜27)を有する。別の実施形態では、この化合物は、アミノ酸配列EGKLSSNDTEGGLCKEFLHPSKVDLPR(「SorC27」と呼ばれる;配列番号1)の全部または一部を含む。
【００１６】
また、本発明は、本明細書に記載する配列番号1またはその断片のうちの1つをコードする核酸等、本発明のペプチドをコードする単離核酸も含む。また、本発明は、本発明のペプチドに対する単離抗体にも関する。この抗体は、場合により、本発明のペプチドに選択的に結合するが、ソリシジンには結合しない。
【００１７】
驚くべきことに、本発明の化合物は、ソリシジンの一部に対して配列同一性を示すが、麻痺活性のないカルシウムチャネル阻害活性を示す。ソリシジンが、その構造中に2つの機能性ドメインを有することは、以前は知られていなかった。また、カルシウムチャネル阻害活性と麻痺活性とを分けてペプチドを調製することができることも知られていなかった。本発明のペプチドは、場合により、ソリシジンの半分以下の長さである。本発明のペプチドは、単離すると、カルシウムチャネル阻害活性を保持するのみならず、また、予想外なことに、OV 2008等の特定の細胞系においては、ソリシジンよりも高いカルシウムチャネル阻害活性も示す。また、特定の細胞系においては、ペプチドの長さが減少するにつれて、阻害活性も増加する。
【００１８】
生物学的な系においては、二機能性の大型のタンパク質および酵素はありふれたものであるが、小型のペプチドにおいて、2つの機能が内在することは、非常に稀な現象であることを考慮することによって、本発明の驚くべき性質が強調される。文献中の二機能性の報告は、典型的には、人工的に産生されて生じるものであり、例えば、2種の異なるペプチドが化学的に融合されている(Anesら、2006年;Yamamotoら、2008年)。本発明者は、ソリシジンのN末端が麻痺性機能を示し、そのC末端がカルシウムチャネル阻害機能を示すことを決定した。ソリシジンをN末端で切断すると、麻痺活性のないカルシウムチャネル阻害活性を保持するペプチドの産生に成功した。
【００１９】
本発明のペプチドは、完全長のソリシジンと比較して、その他の予想外の特性を示す。例えば、本発明のペプチドは、溶解性の増加を示し、これによって、より低い用量を提供して、血漿中の標的ペプチド濃度を達成することが可能になる。相対的な溶解性に基づくと、標的血中濃度を達成するための本発明のペプチドの用量体積は、ソリシジンよりも少なくとも10倍低くてよかろう。
【００２０】
さらに、これらのペプチドは、存在する感受性のジスルフィド結合(ソリシジンは、3つのジスルフィド結合を有する)が少なくなっていることに起因して、有効期間中の安定性および溶液安定性も向上している。本発明のペプチドは、場合により、ジスルフィド結合を有さない。ジスルフィド結合が存在しないことによって、固体として最低限の冷蔵下でまたは室温において貯蔵する間、非常に長い有効期間が得られる。さらに、ジスルフィド結合を有さない本発明のペプチドを水中に溶解させる場合、ジスルフィド結合の切断は生じ得ない。完全長のソリシジンにおいては、そのような切断によって、ペプチドの活性が低下し、分子間S-S結合がより形成しやすくなる場合がある。また、ペプチド間S-S結合が形成されると、ソリシジンの沈殿も生じる。SorC13およびSorC27等の本発明のペプチドは、典型的には、HPLCによって測定する場合、水溶液中、8℃で少なくとも3週間は安定であり、純度は変化しない。
【００２１】
また、本発明のペプチドは、医薬の主要な有害作用のうちの1つも回避する。これは、中枢神経系の防護壁、すなわち、血管脳関門を横断する能力に関する有害作用である。本発明のペプチドが、この防護壁を横断できないことによって、中枢神経系に対する潜在的な毒性が未然に防がれる。
【００２２】
好都合なことに、本発明のペプチドの毒性は低い。実施例23に示すように、in vivoにおいて、SorC27をCD1マウスにi.v.注射した後、1  時間の測定期間にわたり、血圧も心拍数も変化しなかった。また、72時間にわたり、神経学的/行動上の変化もなかった。in vivoにおいて、SorC13をCD1マウスにi.v.注射すると、最初の15分以内に血圧が若干急上昇し(およそ25%)、これは、1時間目までには消失した。72時間にわたり、マウスの神経学的/行動上の変化はなかった。SorC13またはSorC27を、CD1マウスに、10mg/kg、100mg/kgおよび500mg/kgの用量で単回静脈内注射した場合、注射後の5日間の観察期間にわたり、有害事象は発生しなかった。また、剖検からも、全ての主要な臓器系において顕著な変化は示されなかった。さらに、SorC27を、マウスに、1日当たり400 mg/kg (i.p.)で12日間、複数回投与した場合にも、毒性の徴候は示されなかった。
【００２３】
本発明のペプチド、特に、SorC13等のより短いペプチドは、典型的には、ソリシジンよりも抗原性が低い。抗原性についての経験的カットオフ(これは、典型的には、ペプチド一般については13個のアミノ酸であるとみなされている)以下のいくつかのアミノ酸を有するペプチドは、抗原性を示さない。
【００２４】
上記したように、本発明のペプチドは、麻痺活性のないカルシウムチャネル阻害活性(すなわち、チャネル活性を部分的または全体的に阻害する能力)を示す。そのような活性を示すペプチドは、i)カルシウムチャネルの遮断、およびii)麻痺活性の欠如を測定するのに適した任意の公知のアッセイを用いて容易に同定される。例えば、一実施形態では、ペプチドが、カルシウムチャネルを通るカルシウムの流れを低下させること(すなわち、部分的または完全な阻害)によりカルシウムチャネル活性を低下させることを決定することによって、場合により、カルシウムチャネル阻害活性を示すペプチドを同定する。
【００２５】
TRPV6のための発現ベクターを用いてトランスフェクトした、容易に入手できる細胞系(例えば、ヒト胚性腎臓細胞系であるHEK、リンパ節前立腺癌細胞であるLnCaP)によって、場合により、カルシウムチャネル阻害活性を同定する。そのようなトランスフェクト細胞は、必要になるまで、容易に一定分量に分け、貯蔵される(典型的には、-80°C)。これによって、細胞によるカルシウムイオン取込み阻害について試験するための、標準的なトランスフェクト細胞が提供される。カルシウムチャネル活性の低下をもたらす本発明のペプチドを同定するための、カルシウムの細胞系内への移動の解析は、場合により、蛍光定量的測定(内部に取り入れられたFURAカルシウムイオンプローブ)によって、または細胞をパッチクランプし、ペプチドの存在下もしくは非存在下においてカルシウム電流を測定することを含む電気生理学的プロトコールによって行われる。場合により、これらのペプチドは、LnCaP細胞モデルにおいては、1000nM未満、150nM未満または100nM未満の平衡阻害定数を有し、かつラット坐骨神経モデルにおいては、活動電位の坐骨神経伝達には影響を及ぼさない(すなわち、麻痺活性がない)。例えば、LnCaPモデルにおいては、平衡解離定数(Kd)は、SorC27については140nMであり、SorC13については100nMである(図6)。アミノ酸の数との直線関係に基づくと、SorC9のKd  は、およそ90nMであることが予想される。
【００２６】
これらの単離ペプチドは、いくつかの目的で有用である。一実施形態では、本発明は、本発明のペプチドを癌細胞等の細胞に投与することによって、細胞増殖を低下させる方法を含む。in vitroまたはin vivoにおいて、ペプチドを癌細胞等の増殖細胞と接触させ、このペプチドが細胞増殖を低下させる(すなわち、完全または部分的に阻害する)かどうかを決定することによって、細胞増殖の低下は容易に決定される。別の実施形態では、本発明は、本発明のペプチドを癌細胞等の細胞に投与することによって、そうした細胞のアポトーシスを誘導する方法を含む。in vitroまたはin vivoにおいて、ペプチドを癌細胞等の細胞と接触させ、このペプチドがアポトーシスを誘導するかどうかを決定することによって、細胞増殖の低下は容易に決定される。
【００２７】
上記したように、これらの単離ペプチドは、癌を治療するのに有用である。本発明は、本発明の単離ペプチドをヒト等の哺乳動物に投与することによって、そうした哺乳動物において癌を治療する方法を含む。目覚しいことに、周知の抗癌薬であるパクリタキセル、ならびに抗癌薬のカクテルであるパクリタキセルおよびカルボプラチン(「CATカクテル」)に対する別個の一対一の試験において、2種の本発明のペプチドSorC13およびSorC27は、特定の細胞系において、より迅速かつより活性なアポトーシス誘導をもたらした。この優れた作用は、乳癌および卵巣癌の両方に対して示されている。乳癌の典型的な治療は、パクリタキセルであり、卵巣癌の典型的な治療は、CATカクテルである。その他の細胞系においては、SorC13およびSorC27の性能は、CATに匹敵した。
【００２８】
また、単離ペプチドSorC27は、in vivo異種移植マウス癌モデルにおいても、癌を処置するのに有用であることが示されている。実施例14および図12に示すように、ヒト卵巣癌腫瘍を異種移植したNOD/SCIDマウスにおいて、SorC27は、腫瘍サイズを体重に対して正規化した場合、12日にわたり、対照条件(食塩水注射)と比較して腫瘍体積を有意に(p<0.05)低下させたが、CATを用いて処置したマウスとは違いがなかった。
【００２９】
抗癌作用の原因に関して理論に縛られる意図はないが、本発明者は、SorC27およびSorC13を用いた実験を通して、本発明のペプチドが、10種の異なる癌細胞系においては、アポトーシスカスケードをカスパーゼ3および/または7を通して活性化するが、2種の非癌性細胞系においては、活性化しないことを決定するに至った。
【００３０】
したがって、本発明のペプチドは、場合により、酵素カスパーゼ3およびカスパーゼ7の対照細胞レベルを上回って、カスパーゼ3およびカスパーゼ7の誘導を引き起こす場合、抗癌活性を示すと同定される。これらの酵素が活性化されると、細胞の死滅が生じる。処置した細胞中のカスパーゼ酵素の活性は、容易に測定され、対照の未処置細胞と比較される。
【００３１】
さらに、Table 9(表9)および実施例25に示すように、細胞系中のTRPV6のmRNAの存在は、本発明のペプチドに応答してアポトーシス作用を示す細胞系に対応する。
【００３２】
転移性癌
本発明のペプチドは、原発腫瘍部位における癌細胞または二次的な癌部位における転移癌細胞に対する抗癌活性を示す。これらのペプチドは、リンパ節に優勢に局在するが、また、肺、肝臓および腎臓にも局在し、これらは、転移性癌が位置する一般的な部位である(図7)。
【００３３】
本出願のペプチドは、肺、脳、肝臓、腎臓、脾臓および骨髄に広がっている癌を含めた転移性癌を治療する際に有用である。これらのペプチドは、単独で使用してもよく、または第2の抗癌剤を含む医薬組成物中で使用してもよい。
【００３４】
本出願のペプチドは、リンパ節転移を治療する際に特に有用である。「リンパ節転移」は場合により、肺癌(Mujoomdarら、2007年)、胃癌、子宮頚癌(Lyshchikら、2007年)、外陰癌(Vernooijら、2007年)、子宮内膜癌(Aaldersら、2007年)、頭頚部扁平上皮癌(Venessら、2007年)、食道および咽頭の癌、上咽頭癌(Maら、2007年)、消化管癌(Windら、2006年)、胆嚢癌、脳癌(Mujoomdarら、2007年)、甲状腺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、ならびに結腸直腸癌を含む。したがって、本発明のペプチドは、哺乳動物において、癌段階I、II、IIIまたはIVのうちの任意の段階における癌を治療する際に有用である。
【００３５】
本発明のペプチド
配列番号1のうちのいずれかの全部または一部を含み、麻痺活性のないカルシウムチャネル阻害活性(TRPV6阻害活性)を示す単離ペプチドは、癌を治療するのに有用なペプチドである。アミノ酸を、本発明のペプチドに付加することができるが、アミノ酸を加えた単離ペプチドは、典型的には、35または30以下のアミノ酸長であり、場合により27、25、20、15または13未満のアミノ酸長であり、場合により少なくとも9アミノ酸長である。最大で、例えば、30、35、40または45アミノ酸長であり得るペプチドを作製するために、多様な追加のアミノ酸をSorC27配列に付加することによって、より長いペプチドを容易に作製することができる(例えば、C末端アミノ酸(SILARPAELNTETCILEC、配列番号2)のうちの1つもしくは複数等のソリシジンのアミノ酸配列に対応する追加のアミノ酸、標的配列、またはその他のアミノ酸)。
【００３６】
ペプチドは、場合により、アミノ酸配列:HPSKVDLPR(配列番号1のアミノ酸番号19〜27)、KEFLHPSKVDLPR(配列番号1のアミノ酸番号15〜27)、またはEGKLSSNDTEGGLCKEFLHPSKVDLPR(配列番号1)を含み、それから本質的になり、またはそれからなる。場合により、ペプチドは、配列番号1のうちの、少なくとも9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸を含む。場合により、単離ペプチドは、配列番号1のうちの、少なくとも9、10、11、15または18個のアミノ酸を含む。場合により、ペプチドは、配列番号1のうちの9〜13、10〜15、15〜20、20〜25または20〜27個のアミノ酸断片を含み、このペプチドは、カルシウムチャネルを阻害し、細胞増殖を低下させ、麻痺活性を示さない。
【００３７】
また、本発明のペプチドは、場合により、上記のペプチドの類似体も含む。本発明のタンパク質の類似体として、場合により、これらに限定されないが、1つまたは複数のアミノ酸の置換、挿入、欠失および/または突然変異を含有するアミノ酸配列が挙げられる。アミノ酸置換の性質は、保存的であっても、または非保存的であってもよい。保存的アミノ酸置換には、本発明のペプチドの1つまたは複数のアミノ酸を、類似の電荷、サイズおよび/または疎水性の特徴のアミノ酸で置換することが関与する。保存的置換のみが作製される場合、得られる類似体は、機能的に同等であるはずである。非保存的置換には、アミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸を、類似しない電荷、サイズおよび/または疎水性の特徴を有する1つまたは複数のアミノ酸で置換することが関与する。この類似体は、場合により、ペプトイドであり、これは、N-置換ポリグリシンであり、アミノ酸R基がN原子につながっている。
【００３８】
1つまたは複数のアミノ酸の挿入が、場合により、本発明のアミノ酸配列中に導入される。アミノ酸の挿入は、単一のアミノ酸残基、または例えば、2〜15アミノ酸長に及ぶ連続的なアミノ酸からなる。
【００３９】
欠失は、ペプチドのアミノ酸配列から、1つまたは複数のアミノ酸、または個別の部分を除去することからなる。除去されるアミノ酸は、近接していても、または近接していなくてもよい。
【００４０】
本発明のペプチドは、化学合成によって、固相合成(Merrifield、1964、J. Am. Chem. Assoc.、85:2149〜2154頁)または均質溶液中での合成(Houbenweyl、1987、Methods of Organic Chemistry、E. Wansch編、Vol. 15 IおよびII、Thieme、Stuttgart)等のタンパク質化学における周知の技法を使用して容易に調製される。
【００４１】
場合により、ペプチドをコードするヌクレオチド配列中に突然変異を導入することによって、本発明のタンパク質の類似体を調製する。本発明のタンパク質の類似体を発現させるために構築されたヌクレオチド配列中の突然変異は、コード配列の読み枠を保存する。さらに、これらの突然変異は、好ましくは、ハイブリダイズして、ループまたはヘアピン等の二次的なmRNA構造を生じ得る相補領域を生み出さない。こうした構造は、mRNAの翻訳に有害な影響を及ぼす場合がある。
【００４２】
突然変異を、場合により、特定の座位に、天然の配列の断片へのライゲーションを可能にする制限部位に隣接する突然変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって導入する。ライゲーション後には、得られた再構築配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換または欠失を有する類似体をコードする。
【００４３】
あるいは、オリゴヌクレオチド指定部位特異的変異誘発の手順を利用して、必要な置換、欠失または挿入に従って変化させた特定のコドンを有する変化した遺伝子をもたらす。また、本発明のペプチドの欠失または切断は、所望の欠失に隣接する好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位を活用することによっても容易に達成される。制限に続いて、オーバーハングを埋め、DNAを再度ライゲーションすることができる。上記の変化を作製する例示的な方法が、Sambrookらによって開示されている(Sambrook Jら、2000、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition)、Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
【００４４】
さらに、本発明のタンパク質の類似体は、化学合成によって、固相合成(Merrifield、1964、J. Am. Chem. Assoc.、85:2149〜2154頁)または均質溶液中での合成(Houbenweyl、1987、Methods of Organic Chemistry、E. Wansch編、Vol. 15 IおよびII、Thieme、Stuttgart)等のタンパク質化学における周知の技法を使用しても容易に調製される。また、本発明のペプチドは、本明細書に記載する本発明のペプチド、その突然変異ペプチドおよび/または切断体に対して配列同一性を示すペプチドも含む。そのようなペプチドは、本発明のペプチドを得るために使用されるプローブを用いて、厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列に対応するアミノ酸配列を有する(本明細書の厳密なハイブリダイゼーション条件についての論述を参照されたい)。配列同一性を示すペプチドは、しばしば、タンパク質に特徴的である領域を有する。
【００４５】
その他の有用な本発明のペプチドは、場合により、本明細書に記載する配列番号1の全部または一部に対して、少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または95%の配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、それから本質的になり、またはそれからなり、このペプチドは、カルシウムチャネル阻害活性を示すが、麻痺活性は示さず、癌を治療するのに有用である。配列同一性は、典型的には、BLAST 2.1版プログラムの高度検索によって判定する(上記のパラメータ; Altschul, S.F.、Gish, W.、Miller, W.、Myers, E.W.およびLipman, D.J. (1990)「Basic local alignment search tool.」、J. Mol. Biol. 215:403〜410頁)。BLASTは、米国National Center for Biotechnology Information (National Library of Medicine Building、38A Bethesda、MD 20894)からオンラインで利用することができる一連のプログラムである。高度なBlast検索は、デフォルトパラメータに設定されている。Blastプログラムについての参考文献として、Altschul, S.F.、Gish, W.、Miller, W.、Myers, E.W.およびLipman, D.J. (1990)「Basic local alignment search tool.」、J. Mol. Biol. 215:403〜410頁;Gish, W.およびStates, D.J. (1993)「Identification of protein coding regions by database similarity search.」、Nature Genet. 3:266〜272頁;Madden, T.L.、Tatusov, R.L.およびZhang, J. (1996)「Applications of network BLAST server」、Meth. Enzymol. 266:131〜141頁;Altschul, S.F.、Madden, T.L.、Schaffer, A.A.、Zhang, J., Zhang, Z.、
Miller, W.およびLipman, D.J. (1997)「Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.」、Nucleic Acids Res. 25:3389〜3402頁;Zhang, J.およびMadden, T.L. (1997)「PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation.」、Genome Res. 7:649〜656頁が挙げられる。
【００４６】
また、本発明は、選択されたタンパク質とコンジュゲートした本発明のタンパク質、または融合タンパク質を産生するための選択マーカータンパク質も含む。
【００４７】
治療方法
本明細書に記載する配列番号1の全部または一部等の本発明のペプチドは、このペプチドをヒトに投与することによって、細胞増殖を低下させ、細胞アポトーシスを誘導し、癌を予防または治療するのに有用である。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「細胞増殖を低下させる」という句は、細胞増殖速度を、物質の非存在下における細胞増殖速度と比較して減速させることを指す。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「細胞アポトーシスを誘導する」という句は、細胞アポトーシス速度を、物質の非存在下における細胞アポトーシス速度と比較して加速させることを指す。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、所望の結果(例えば、場合により、カルシウムチャネル活性の遮断、細胞増殖の低下、アポトーシスの誘導、および/または癌の予防もしくは治療)を達成するために必要な投与量および期間において効果を示す量を意味する。
【００５１】
ペプチドまたは物質の哺乳動物への投与は、in vivoおよびex vivoにおける投与を含む。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「細胞」という用語は、単一細胞、および複数細胞または細胞集団を含む。ペプチドまたは物質の細胞への投与は、in vitroおよびin vivoにおける投与を含む。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「カルシウムチャネル活性を低下させる」という句は、物質が、この物質の非存在下におけるカルシウムチャネル活性と比較して、カルシウムチャネル活性を減少させることができることを意味する。
【００５４】
本発明のペプチドは、癌細胞、特に、カルシウム取込みチャネルTRPV6が発現を増加させている癌細胞、例として、乳癌、卵巣癌、血液癌、脳癌、網膜癌、肝臓癌、甲状腺癌、結腸癌、前立腺癌および子宮内膜癌において、カルシウムの取込みを強力に阻害する。本発明のペプチドは、カルシウムの取込みを低下させることによって、正常細胞および癌細胞の増殖に不可欠な細胞内カルシウムを混乱させる。したがって、本発明は、哺乳動物(例えば、ヒト)において、このペプチドを哺乳動物に投与することによって、細胞増殖を低下させ、アポトーシスを誘導し、かつ/または腫瘍および癌を予防もしくは治療するために、本発明のペプチドを使用することを含む。
【００５５】
本明細書で使用する場合、また当技術分野でも理解されているように、「治療する」または「治療」は、臨床結果を含めた、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。有益なまたは所望の臨床結果として、これらに限定されないが、検出可能であっても検出不可能であっても、1つまたは複数の症状または状態の軽減または回復、疾患の程度の縮小、疾患または障害の状況の安定化(すなわち、悪化しないこと)、疾患または障害の蔓延の予防、疾患または障害の進行の遅延または減速、疾患または障害の状況の回復または緩和、および(部分的であっても、全体的であっても)寛解を挙げることができる。また、「治療」は、治療を受けない場合に予想される生存と比較して生存を延長させることも意味し得る。
【００５６】
医薬組成物
また、本発明は、癌を治療するための医薬品を調製するための本発明のペプチドの使用も含む。本発明の単離ペプチドを、場合により、in vivoにおいて投与するのに適している生物学的適合性のある形態で対象に投与するための医薬組成物に製剤化する。「in vivoにおいて投与するのに適している生物学的適合性のある形態」とは、治療効果が、任意の毒性作用を上回る、投与しようとする物質の形態を意味する。この物質は、ヒトおよび動物を含めた生存生物体に投与することができる。
【００５７】
治療的に活性な量の本発明の医薬組成物の投与は、所望の結果を達成するために必要な投与量および期間において効果を示す量と定義される。例えば、疾患の状況、個体の年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の応答を惹起する物質の能力等の要因に従って、物質の治療的に活性な量は変化してよい。投与計画を調整して、最適な治療応答をもたらすことができる。例えば、いくつかの分割用量を毎日投与してもよく、または治療状況の要件が示すところに従って、用量を比例的に低下させてもよい。
【００５８】
本発明のペプチドを、好ましくは、医薬組成物等の組成物中で、担体等のその他の成分と組み合わせる。これらの組成物は、癌を医学的に処置する方法または予防する方法において投与する場合に有用である。
【００５９】
医薬組成物を、これらに限定されないが、外用投与、経口投与、エアロゾル投与、気管内注入、腹腔内注射、脳脊髄液への注射、静脈内注射および皮下注射を含めた、多様な方法によって、ヒトまたは動物に投与することができる。投与すべき投与量は、患者の必要性、所望の効果、および選ばれた投与経路に依存する。核酸分子およびペプチドを、リポソーム等のin vivo送達ビヒクルを使用して細胞内に導入することができる。また、これらを、マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーション等の物理的技法、もしくは共沈殿、ペグ化等の化学方法を使用して、またはリポソームを使用して、これらの細胞内に導入することもできる。
【００６０】
患者に投与することができ、したがって、有効分量の核酸分子またはペプチドが、混合物中で、薬学的に許容できるビヒクルと組み合わさっている医薬組成物を、薬学的に許容できる組成物を調製するための公知の方法によって調製する。適切なビヒクルは、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton、Pa.、米国)、またはHandbook of Pharmaceutical additives (MichaelおよびIrene Ash編、Gower Publishing Limited、Aldershot、英国(1995))に記載されている。これに基づいて、組成物は、これらに限定されないが、1つまたは複数の薬学的に許容できるビヒクルまたは希釈剤と合わせた物質の溶液を含み、適切なpHを有する緩衝溶液中に含有させてもよく、かつ/または生理的液体と等張であってもよい。これに関しては、米国特許第5,843,456号を参照することができる。
【００６１】
これに基づいて、医薬組成物は、場合により、ペプチドまたは核酸分子等の活性な化合物または物質を、1つまたは複数の薬学的に許容できるビヒクルまたは希釈剤と合わせて含み、適切なpHを有し、生理的液体と等張である緩衝溶液中に含有させる。活性分子をビヒクルと組み合わせる、または活性分子を希釈剤と組み合わせる方法は、当業者には周知である。組成物は、場合により、活性化合物を組織内の特定の部位に輸送するための標的化剤を含む。
【００６２】
抗体の調製
このペプチドに対する抗体は、試験試料中のこのペプチドの存在を同定するのに有用である。ペプチドの密度/場所を伝える抗体を標識する方法はいずれも有用であろう(例えば、放射標識ペプチドまたは蛍光タグ付きペプチド)。抗体は、典型的には、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。また、これらの抗体は、ペプチドの免疫精製のためにも役立つ。例えば、抗体と抗体が認識するペプチドとの間の免疫学的複合体の形成を可能にし、免疫学的複合体の有無を検出する条件下で、生物学的試料を抗体と接触させることができ、それによって、試料中の本発明のペプチドが検出される。また、本発明は、好ましくは、抗体、抗体と抗体が認識するペプチドとの間で免疫学的複合体を形成させるのに適している媒体、および本発明のペプチドまたは類似のペプチドの存在を究明するために、免疫学的複合体を検出することができる試薬を含む組成物も含む。
【００６３】
本発明のペプチドを認識するために、ペプチド全体にわたる様々な独特のエピトープに対する抗体を産生することができる。
【００６４】
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は、本出願の記載および当技術分野で公知の技法に従って調製される。モノクローナル抗体の調製方法および使用の例については、その全体が参照により組み込まれている、米国特許第5,688,681号、第5,688,657号、第5,683,693号、第5,667,781号、第5,665,356号、第5,591,628号、第5,510,241号、第5,503,987号、第5,501,988号、第5,500,345号および第5,496,705号を参照されたい。ポリクローナル抗体の調製および使用の例は、米国特許第5,512,282号、第4,828,985号、第5,225,331号および第5,124,147号に開示されており、これらはその全体が、参照により組み込まれている。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、また、本発明のペプチドと特異的に反応するその断片も含む。抗体は、従来の技法を使用して断片化し、それらの断片を、有用性について上記と同じ様式でスクリーニングすることができる。例えば、F(ab')2断片を、ペプシンを用いて抗体を処理することによって産生することできる。得られたF(ab')2断片を処理して、ジスルフィド架橋を還元して、Fab'断片を産生することができる。
【００６６】
また、本発明は、本発明のペプチドに結合する受容体の検出等で抗体を使用する方法も含む。例えば、本発明は、a)抗体が特異的な反応性を示すペプチドに、抗体が結合するのに適している条件下で、1種または複数のペプチドを含有する試料を、本発明の抗体と接触させ、b)抗体から未結合ペプチドを分離し、c)試料中の、ペプチドのうちの1種または複数に対する結合を維持している抗体を検出することによって、本発明のペプチドの存在を検出するための方法を含む。
【００６７】
研究ツール
本発明のペプチドは、神経筋接合部およびイオンチャネルを探索するための研究プロトコールにおいて有用である。特定のイオンチャネルまたはイオンチャネルのクラスを変化させる能力は、神経筋接合部を予測可能に撹乱させる別のツールを選択的に提供する。これによって、神経筋の機能およびプロセスにおける感受性ペプチド標的の役割が同定される。本発明は、イオンチャネルの麻痺性ペプチドに対する応答を決定する方法を含み、この方法は、チャネルまたはチャネルを含む細胞を、本発明のペプチドまたはその誘導体と接触させるステップと、これらのチャネルがイオンを輸送するかどうか、またはイオンの輸送(例えば、Ca2+)が低下しているかどうかを決定するステップとを含む。
【００６８】
本発明のペプチドは、TRPV6  チャネルを阻害し、標識(蛍光標識、放射性標識、ビオチン標識等)を用いて容易にタグ付けされて、細胞もしくは組織中のTRPV6チャネルを同定するか、またはカルシウムチャネルを大量に発現する細胞もしくは組織を標識する。したがって、本発明は、細胞または組織中のTRPV6チャネルを同定する方法に関し、この方法は、細胞または組織を、検出標識を用いてタグ付けされている本発明のペプチドと接触させるステップと、細胞または組織中のTRPV6チャネルに結合しているペプチドを検出するステップとを含む。
【００６９】
核酸
本発明のペプチド(切断体、類似体等を含む)を、化学合成または組換えDNA法を使用することによって調製することができる。したがって、本発明は、本発明のペプチドをコードする配列を有する核酸分子を含む。これらの配列は、当技術分野で公知の手順に従って、ペプチドの良好な発現を確実にする適切な発現ベクター内に容易に組み込まれる。発現ベクターとして、これらに限定されないが、コスミド、プラスミド、または改変ウイルス(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)が挙げられるが、ただし、ベクターは、使用する宿主細胞と適合性がある。「宿主細胞の形質転換に適しているベクター」という表現は、発現ベクターが、本発明の核酸分子、および発現のために使用しようとする宿主細胞に基づいて選択された調節配列を含有することを意味し、これらの調節配列は、核酸分子に作動可能に連結されている。
【００７０】
「作動可能に連結されている」は、核酸が、調節配列に核酸の発現を可能にする様式で連結されていることを意味する。
【００７１】
したがって、本発明は、本発明の核酸分子またはその断片、ならびに挿入されたペプチド配列の転写および翻訳のために必要な調節配列を含有する本発明の組換え発現ベクターを含む。適切な調節配列は、場合により、多様な供給源に由来し、それらとして、細菌、真菌またはウイルスの遺伝子が挙げられる(例えば、Goeddel、Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185、Academic Press、San Diego、Calif. (1990).に記載されている調節配列を参照されたい)。適切な調節配列の選択は、選ばれた宿主細胞に依存し、当業者であれば容易に達成することができる。そのような調節配列の例として、転写のプロモーターおよびエンハンサー、またはRNAポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含めた、リボゾーム結合配列が挙げられる。さらに、選ばれた宿主細胞および利用するベクターに応じて、その他の配列、例として、複製開始点、追加のDNA制限部位、エンハンサー、および転写誘導能を付与する配列を、発現ベクター内に組み込むこともできる。また、必要な調節配列を、天然の化合物および/またはその隣接領域によって供給することができることも理解されるであろう。
【００７２】
本発明は、発現ベクター内にアンチセンス方向でクローニングされた本発明のDNA核酸分子を含む組換え発現ベクターをさらに提供する。これらのベクターは、本発明のペプチドもしくはその変異体を研究するため、または解毒剤を試験するための有用な実験系である。これらのペプチドは、宿主細胞に対して毒性である場合もあれば、またはそうでない場合もある。また、これらのベクターは、ペプチドを大量に産生するためにも有用である。
【００７３】
また、本発明の組換え発現ベクターは、本発明の組換え分子を用いて形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を促進する選択マーカー遺伝子を含有することもできる。選択マーカー遺伝子の例は、G418およびハイグロマイシン等の特定の薬物に対する耐性を付与するタンパク質、ベータ-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子である。ベータ-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼ等の選択マーカータンパク質の濃度変化によって、選択マーカー遺伝子の転写がモニターされる。選択マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性等の抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードする場合には、形質転換細胞を、G418を用いて選択することができる。選択マーカー遺伝子を組み込んでいる細胞は生存し、一方、その他の細胞は死滅する。これによって、本発明の組換え発現ベクターの発現について可視化し、アッセイすることが可能になり、特に、発現および表現型に対する突然変異の作用を決定することが可能になる。選択マーカーを、対象とする核酸とは別のベクター上に導入することができることが理解されるであろう。
【００７４】
また、これらの組換え発現ベクターは、組換えタンパク質の発現を増加させる融合部分、組換えタンパク質の溶解性を増加させる融合部分、および親和性精製におけるリガンドとして作用することにより、標的組換えタンパク質の精製を援助する融合部分をコードする遺伝子を含有することもできる。例えば、タンパク質分解性の切断部位を標的組換えタンパク質に付加して、融合タンパク質の精製後の、組換えタンパク質と融合部分との分離を可能にすることができる。
【００７５】
組換え発現ベクターを、宿主細胞内に導入して、形質転換宿主細胞を産生することができる。これらの細胞は、有用な実験系である。したがって、本発明は、本発明の組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含む。「形質転換宿主細胞」という用語は、本発明の組換え発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトされている原核生物細胞および真核生物細胞を含むことを意図する。原核生物細胞を、核酸を用いて、例えば、エレクトロポレーションまたは塩化カルシウム媒介形質転換によって形質転換することができる。従来の技法、例として、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムによる共沈殿、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクチン、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションによって、哺乳動物細胞内に核酸を導入することができる。宿主細胞を形質転換およびトランスフェクトするのに適した方法を、Sambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition)、Cold Spring Harbor Laboratory Press)、およびその他のそのような実験用教科書に見出すことができる。
【００７６】
適切な宿主細胞には、多種多様な原核生物および真核生物の宿主細胞がある。例えば、本発明のペプチドを、大腸菌(E. coli)、シュードモナス(Pseudomonas)、枯草菌(Bacillus subtillus)等の細菌細胞、昆虫細胞(バキュロウイルスを使用する)、酵母細胞または哺乳動物細胞中で発現させることができる。その他の適切な宿主細胞を、Goeddel、Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185、Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に見出すことができる。
【００７７】
例えば、ペプチドを組換えにより産生するためには、例えば、T7 RNAポリメラーゼ/プロモーター系を使用し、2種のプラスミドを使用して、またはプラスミドコードタンパク質を標識することによって、またはM13ファージmGPI-2を用いる感染により発現させることによって、大腸菌を使用することができる。また、ファージラムダ調節配列を用いて、融合タンパク質ベクター(例えば、lacZおよびtrpE)によって、マルトース結合タンパク質融合体によって、ならびにグルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質によって、大腸菌ベクターを使用することもできる。
【００７８】
あるいは、ペプチドを、昆虫細胞中で、バキュロウイルスベクターを使用して発現させてもよく、または哺乳動物細胞中で、ワクシニアウイルスを使用して発現させてもよい。哺乳動物細胞中で発現させるためには、cDNA配列を、異種のプロモーターにライゲーションし、COS細胞等の細胞内に導入して、一過性または長期の発現を達成することができる。キメラ遺伝子構築物の安定な組込みを、哺乳動物細胞中で、ネオマイシンおよびミコフェノール酸等の生化学的選択によって維持することができる。
【００７９】
制限酵素消化、DNAポリメラーゼを用いる穴埋め、エキソヌクレアーゼによる欠失、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼによる伸長、合成またはクローニングしたDNA配列のライゲーション、特異的なオリゴヌクレオチドをPCRと一緒に使用する部位指定配列変化等の手順を使用して、DNA配列を変化させることができる。例えば、1〜5または5〜10個以上のアミノ酸を除去し、または突然変異させることができる。
【００８０】
DNA配列もしくはその一部、またはイントロンおよびそれ自体のプロモーターを有するDNAからなるミニ遺伝子が、真核生物発現ベクター内に、従来の技法によって導入される。これらのベクターは、DNAの転写を開始および増強し、その適切なスプライシングおよびポリアデニル化を確実にする調節配列を提供することによって、真核生物細胞中でのDNAの転写を可能にする。また、内在性遺伝子プロモーターを使用してもよい。ベクター内部の異なるプロモーターは、cDNAの発現レベルを変化させる異なる活性を示す。さらにまた、マウス乳房腫瘍ウイルス由来のグルココルチコイド応答性プロモーター等の特定のプロモーターも、機能を調節することができる。
【００８１】
列挙したベクターのうちのいくつかは、化学的選択による細胞の単離を可能にする選択マーカーまたはneo細菌遺伝子を含有する。ウイルスの調節エレメントを使用することによって、ベクターを、細胞中に、エピソーム性の自由に複製する実体として安定して長期に維持することができる。また、ベクターをゲノムDNA内に組み込んでいる細胞系を産生することもできる。この様式では、遺伝子産物が、連続して産生する。
【００８２】
レシピエント細胞内に、ベクターが、リン酸カルシウム、リン酸ストロンチウム、エレクトロポレーション、リポフェクション、DEAEデキストラン、マイクロインジェクションを含めた、種々の方法、または原形質融合によって導入される。あるいは、cDNA  を、ウイルスベクターを使用する感染により導入してもよい。
【００８３】
本発明のペプチドは、ペプチドが発現している、哺乳動物の細胞または組織を含めた、細胞または組織から容易に単離される。
【００８４】
このペプチドは、クロマトグラフィーによる方法、高速液体クロマトグラフィーによる方法または沈殿等の当業者に公知の従来の精製方法によって容易に精製される。
【００８５】
例えば、(本明細書に記載するように)抗ペプチド抗体を容易に使用して、ペプチドを単離し、次いで、これを、標準的な方法によって精製する。
【００８６】
また、本発明の単離ペプチドは、化学合成によって、固相合成(Merrifield、1964、J. Am. Chem. Assoc.、85:2149〜2154頁)または均質溶液中での合成(Houbenweyl、1987、Methods of Organic Chemistry、E. Wansch編、Vol. 15 IおよびII、Thieme、Stuttgart)等のタンパク質化学における周知の技法を使用しても容易に調製される。
【００８７】
(実施例)
以下の実施例によって、本発明の実施形態を例証するが、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
【００８８】
(実施例1)
ソリシジン由来カルシウムチャネル阻害剤のアミノ酸配列の分離
ソリシジンのカルボキシル末端領域由来のアミノ酸配列を合成した。これらのセグメントを、(ソリシジンのC末端の13個のアミノ酸に対して配列同一性を示す)SorC13および(ソリシジンのC末端の27個のアミノ酸に対して配列同一性を示す)SorC27と名付けるに至った。SorC13およびSorC27のアミノ酸配列、ならびにそれらの物理的および生理学的な特性のうちのいくつかの概要をTable 1(表1)に示す。(実施例22に示すように)SorC13およびSorC27の半減期は、Sor54の半減期よりも短かった。
【００８９】
【表１Ａ】
0005749154.tif 000002
【００９０】
【表１Ｂ】
0005749154.tif 000003
【００９１】
上記の表の「非常に安定」は、固体ペプチドの分解が6カ月にわたり観察されなかったことを意味する。これらのペプチドは滅菌水の溶液として、典型的には、8℃では少なくとも3週間安定であり、-20℃では1年超安定であることが予想される。
【００９２】
SorC27およびSorC13は、麻痺活性を示さない。このことを示すために、以前に報告されたゴミムシダマシ幼虫麻痺性バイオアッセイ(米国特許第7,119,168号)を使用した。ゴミムシダマシコロニーから動物を適宜選択し、群(処置および対照)に分けた。これらの動物の体重を測定することによって、当量用量の計算が可能になった。緩衝化昆虫用リンゲル液中に溶解させたSorC13またはSorC27のいずれかを用いて処置した。対照には、等価体積の昆虫用リンゲル液(1LのMillipore製滅菌水に溶解させたNaCl、10.40g;KCl、0.32g;CaCl2、0.48g;NaHCO3、0.32g、pH 7.4)を注射した。ペプチド製剤は、SorC27溶液を、1.0mg/100μL昆虫用リンゲル液(10μg/μL、3.4μM、MW=2957)で調製し、SorC13を、0.5mg/100μL(5μg/μL、3.4μM、MW=1566)で調製した。用量は、100mgの動物質量当たり50μgのSorC27、および100 mgの動物質量当たり25μgのSorC13であった。ペプチド溶液および対照食塩水を、頭部から4番目の体節、外皮の直下に背側から注射した。ピンセットを用いて、穏やかに動物の「尾をつまんで」、逃避反射反応を引き起こし、作用までの時間(time-to-effect)、作用の持続時間、および作用強度に関してスコア化した。SorC13またはSorC27を用いて処置した動物のうちで、何らかの注目に値する効果を示したものはなく、一方、ソリシジンを用いて処置した動物は、重度の麻痺を示した。
【００９３】
Table 2(表2)は、ソリシジンおよび対照の食塩水注射と比較したC-ペプチド注射により麻痺した幼虫の数の比較を示す。トガリネズミペプチド(ソリシジン)は、ゴミムシダマシ幼虫モデルにおいて重度の麻痺性を示す。SorC27ペプチドおよびSorC13ペプチドを、幼虫にモル当量用量(20ナノモル/100mg幼虫)で注射した場合には、麻痺は証明されなかった。
【００９４】
【表２】
0005749154.tif 000004
【００９５】
(実施例2)
SorC13およびSorC27の、カルシウムイオン取込みの一過性受容体電位(バニロイド)6(TRPV6)を通した強力な阻害
ヒトTRPV6bをコードするヌクレオチドを含有する発現ベクター(pCAGS-IRES-hTRPV6b)(Boddingら、2003年)を、ヒトリンパ節前立腺癌(LnCaP、ATCC CRL-1740)内にトランスフェクトし、このベクターをそれによって発現させた。全細胞電流を得るパッチクランプを使用して、このチャネルを通るカルシウム電流を測定した。細胞を処置し、貯蔵カルシウム作動性電流(calcium store operated current)(Isoc)を、SorC13(n=90)またはSorC27(n=30)のいずれかを用いて、閉回路灌流中、0(ベースライン)、100 nM、500nM、1μM、30μMおよび100μMの累積濃度のうちのいずれかで3分間測定した。洗い流しの灌流を、2mL/分で3分間行った。使用した正の対照は、公知の貯蔵作動性チャネル(store operated channel)(SOC)阻害剤MRS-1845(N-プロパルギルニトレンジペン、Sigma Aldrichから入手)、5μMであり、この系においては、カルシウム電流の阻害を示した。SorC13およびSorC27の作用の概要を、図1に示す。これらのC-ペプチドの両方が、カルシウムのTRPV6チャネルを通る流れを強力に阻害したことが明らかである。データを双曲線関数に適合させることによって、SorC13(Isoc-50=0.10μM)およびSorC27(Isoc-50=0.14μM)について、SOCの50%阻害をもたらす濃度の計算が可能となった。さらに、両方のC-ペプチドは、TRPV6チャネルを通るカルシウム電流の非常に強力な阻害剤でもあり、阻害定数は100nMの範囲にある。
【００９６】
(実施例3)
SorC13およびSorC27の、ヒトの乳癌細胞系および卵巣癌細胞系、特にTRPV6癌細胞系におけるアポトーシス誘導
本発明のペプチドは、in vitroおよびin vivoにおいて、細胞、特に、Table 3(表3)に列挙する細胞系等の癌細胞においてアポトーシスを誘導するのに有用である。ヒト乳癌およびヒト卵巣癌をモデル化するために使用する細胞系を、American Type Culture Collection(ATCC)から入手し、ATCC推奨条件下およびATCCが推奨する培地中で増殖させた。
【００９７】
癌細胞系の培養
これらの細胞系を、無菌条件下、加湿5%CO2雰囲気中37℃で培養した。使用した培地を、各細胞系について、以下に列挙する。
【００９８】
T 47Dを、15%ウシ胎仔血清、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mg/mLウシインスリン、およびペニシリンプラスストレプトマイシンの混合物(各50μg/mL)を用いて改変したRPMI培地(Sigma-Aldrich)中で培養した。
【００９９】
MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-415、MDA-MB-468を、10%(v/v)ウシ胎仔血清、2mM L-グルタミン、ならびに各50μg/mLのペニシリンおよびストレプトマイシンを用いて改変したDMEM中で増殖させた。
【０１００】
MCF-10A、MCF-12Aを、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、0.01mg/mLウシインスリン、500ng/mLヒドロコルチゾン、50μg/mLのペニシリンおよびストレプトマイシンを用いて改変した50%DMEMプラス50%ハムF12を加えた中で培養した。組み合わせた培地に、5%(v/v)ウシ胎仔血清を補った。
【０１０１】
OVCAR-3を、1.0mMピルビン酸ナトリウム、0.01 mg/mLインスリンおよび10%(v/v)ウシ胎仔血清を補ったRPMI 1640培地中で培養した。
【０１０２】
SKOV-3を、1.5mM L-グルタミン、2.2g/L炭酸水素ナトリウムおよび10%(v/v)ウシ胎仔血清を補ったマッコイ5A培地中で培養した。
【０１０３】
CAOV-3を、4mM L-グルタミン、1.5g/L炭酸水素ナトリウムおよび10%(v/v)ウシ胎仔血清を有するダルベッコ改変イーグル培地(4.5g/Lグルコース)中で培養した。
【０１０４】
OV-90を、15%(v/v)ウシ胎仔血清を補った、MCDB 105倍地とMedium 199との1:1  混合物中で培養した。
【０１０５】
HeyC2を、1.0mMピルビン酸ナトリウム、0.01mg/mLインスリンおよび10%(v/v)ウシ胎仔血清を補ったRPMI 1640培地中で培養した。
【０１０６】
【表３】
0005749154.tif 000005
【０１０７】
MCF-7、MDA-MB-468、MCF-10A、MCF-12AおよびOVCAR-3は、SorC13およびSorC27の両方によるアポトーシス誘導について試験した。T 47DおよびCaOV-3は、SorC13によるアポトーシス誘導について試験した。MDA-MB-231およびMDA-MB-415は、SorC27によるアポトーシス誘導について試験した。その他の細胞系は、SorC13およびSorC27を用いて、類似の方法を使用して試験して、これらのC-ペプチドがアポトーシスを誘導することを示した。
【０１０８】
アポトーシス誘導および細胞生存率のモニタリング
アポトーシス誘導のレベルおよび細胞生存率を、単一試料の測定を多重化することによって決定した。Promega製のCellTiter BlueおよびAPO-ONEアッセイによって、細胞数に相関させた細胞生存率、およびアポトーシス誘導の決定が可能となる。このプロトコールは、カスパーゼ3およびカスパーゼ7についてのペプチド認識配列を含有する蛍光発生ペプチドを使用し、アポトーシスカスケードのタンパク質分解酵素を開始させる。ペプチド溶液またはビヒクルの添加直後に、CellTiter Blue試薬を、試験下の細胞を含有する、96ウエルプレート中のウエルに添加した。前日に、約5000個の細胞をウエル内に蒔いた。選ばれた時間(1日目、2日目等)に、560nmで励起した後、蛍光を590nm(発光)で測定した。同じウエル中で、120μLのApo-ONE試薬の添加後にカスパーゼ3/7活性を測定し(励起、485 nm/発光、527 nm)、-80℃で1時間凍結破壊し、室温で1時間インキュベートした。
【０１０９】
この研究のために使用したSorC13およびSorC27の濃度は、0μM、1μM、10μMおよび100μMであった。実験は、5〜7日の期間に及んだ。全ての測定を、四連で、試験測定値を補正するために使用するブランク(細胞なし)および対照(ビヒクル、ペプチドなし)の両方と共に行った。時間-応答のデータおよび用量-応答のデータを、平均±平均の標準誤差としてプロットした。統計学的比較はいずれも、用量コースにわたり、スチューデントt検定を用いて、またはANOVA解析によって行った。統計学的有意性レベルは、95%信頼区間(すなわち、p<0.05)であるとみなした。
【０１１０】
アポトーシス誘導および付随する細胞生存率の減少が、乳癌細胞系および卵巣癌細胞系の両方において観察された。SorC27の卵巣癌細胞系(SKOV-3)および乳癌細胞系(MCF 7)に対する作用を、図2に示す。同様に、SorC13の卵巣癌細胞系および乳癌細胞系に対する作用を、図3に示す。カスパーゼ3/7活性の大きな増加から、アポトーシス誘導に対する時間依存性の作用および用量依存性の作用があることが明らかである。
【０１１１】
SorC13の乳癌細胞系に対する作用の観察結果を、Table 4(表4)に要約し、これは以下のことを示す:
--SorC13は、4種のうちの3種の癌細胞系において、統計学的に有意なレベルで、アポトーシスを誘導し、細胞生存率を減少させる。
--SorC13は、T 47D(Table 4(表4)、図3B)においては、統計学的に有意なレベルで、アポトーシスを誘導する。
--SorC13は、2種の対照、非癌性細胞系(MCA 10AおよびMCA 12A)においては、アポトーシスを誘導しなかった。
【０１１２】
SorC13の卵巣癌細胞系に対する作用の観察結果を、Table 5(表5)に要約し、これは以下のことを示す:
--処置した3種の卵巣癌細胞系が、「未処置」の対照を有意に上回るアポトーシスカスケードの誘導を示した(正: CaOV3、OVCAR3、SKOV3)。
【０１１３】
【表４】
0005749154.tif 000006
【０１１４】
【表５】
0005749154.tif 000007
【０１１５】
SorC27の乳癌細胞系に対する作用の観察結果を、Table 6(表6)に要約し、これは以下のことを示す:
--SorC27を用いて処置した4種の癌性の乳癌細胞系は、SorC27に対する曝露に応答して有意なアポトーシス応答を示す(正:MB 416、MB 468、MB 231、MCF 7)。
--非癌性の乳房細胞系(MCA 10AおよびMCA 12A)は、SorC27によって影響を受けなかった。
【０１１６】
SorC27の卵巣癌細胞系に対する作用の観察結果を、Table 7(表7)に要約し、これは以下のことを示す:
--4種の卵巣癌細胞系(OV90、OVCAR3、SKOV3、HEYC2)が、SorC27を用いて処置した後にアポトーシス誘導を示した。それらの作用は、未処置の対照条件よりも1.9倍〜6.3倍大きかった。
【０１１７】
【表６】
0005749154.tif 000008
【０１１８】
【表７】
0005749154.tif 000009
【０１１９】
(実施例4)
転移性ヒト乳癌細胞系のアポトーシス誘導における、SorC13およびSorC27の、パクリタキセルと比べた解析
両方のC型ペプチドの作用を、乳癌に対して現在使用されている最も信頼できる基準の治療(パクリタキセル)に対して評価するために、SorC13、SorC27およびパクリタキセル(10μM)を比較した。APO-ONEアッセイ(Promega)およびCellTiter Blueの両方を、乳癌細胞系のパネル上で使用した。データを平均応答に関して直接比較し、有意差について検定した。
【０１２０】
使用した細胞系はT47DおよびMCF7であり、American Type Culture Collection(ATCC)から入手し、ATCC推奨条件下およびATCCが推奨する培地中で増殖させた。これらの細胞系を、上記の培地を使用し、無菌条件下、加湿5%CO2雰囲気中37℃で培養した。
【０１２１】
SorC-ペプチドは、パクリタキセルと比較して著しい作用を示した。図4に示すように、SorC13は、全ての場合において、より迅速でかつより強いアポトーシス応答を誘導する点で、パクリタキセルよりも有効であり、この基準では有効性が優った。また、SorC27も、全ての場合において、より迅速でかつより強いアポトーシスカスケードを誘導する点で、パクリタキセルよりも有効であった。NFAT転写因子回路を通して伝えられるカルシウムのTRPV6を通る流れが、癌細胞においては抗アポトーシス応答を開始することができ(Lehen'kyiら、2007年)、乳癌細胞系T 47D中のTRPV6の量の低下が、タモキシフェン、タキソールの作用を増強する(Bolanzら、2008年)という最近の知見から、C-ペプチドのいずれか(またはそれらの組合せ)とタキソールのうちのいずれかとの同時処置によって、抗癌処置の増強が得られるであろう。
【０１２２】
ヒト乳癌細胞系T 47DにおけるSorC13とパクリタキセルとの比較、およびヒト乳癌細胞系MCF 7におけるSorC27とパクリタキセルとの比較を、図4に示す。これら2種の細胞系においては、SorC-ペプチドにより、より迅速なアポトーシス誘導が生じ、アポトーシスカスケードの強度はより大きかった。これら2種のSorC -ペプチドによる、アポトーシスカスケードのより早期のかつより強い開始の類似の作用が、MB 468およびMB231において観察された。
【０１２３】
(実施例5)
転移性ヒト乳癌細胞系におけるアポトーシス誘導の増強に関する、SorC13およびSorC27の、パクリタキセルを用いた解析
両方のC型ペプチドの作用を、乳癌に対して現在使用されている最も信頼できる基準の治療(パクリタキセル)に対して評価するために、ヒト乳癌細胞系MCF7(ATCC HTB-22由来)およびT47D(ATCC HTB-133由来)において、SorC13(10および100μM)、SorC27(10および100μM)、ならびにパクリタキセル(10μM)の組合せを比較する。これらの細胞系は、ATCCの方法に従って調製する。APO-ONEアッセイ(Promega)およびCellTiter Blueの両方を、乳癌細胞系のパネル上で使用する。処置群を以下に示す:
(処置当たりn=8)
1)処置なし(対照)
2)パクリタキセル(10μM)を用いた処置
3)2種の用量のSorC13(10、100μM)を用いた処置
3)2種の用量のSorC27(10、100μM)を用いた処置
5)単一の用量のパクリタキセル(10μM)および2種の用量のSorC13(10、100μM)を用いた処置
6)単一の用量のパクリタキセル(10μM)および2種の用量のSorC27(10、100μM)を用いた処置
【０１２４】
データを平均応答に関して直接比較し、有意差について検定する。
【０１２５】
ヒト乳癌細胞系において、SorC27またはSorC13のいずれかとパクリタキセルとの組合せは、単独処置のうちのいずれよりも、アポトーシス誘導の大きな作用を示す。これらの結果を、アポトーシス指数(処置の応答/対照の応答、作用がない場合、AI=1)として、かつ細胞生存率が減少した(+)か、否(-)かを決定することによって測定した。
【０１２６】
(実施例6)
転移性ヒト卵巣癌細胞系のアポトーシス誘導における、SorC13およびSorC27の、パクリタキセル/カルボプラチンのカクテルと比べた解析
これら2種のSorC-ペプチドの作用を、卵巣癌のための最も信頼できる基準の治療と比較するために、SorC13またはSorC27を、カルボプラチンおよびタキソール(CAT)のカクテル(10μMパクリタキセル、20mMカルボプラチン)を用いた処置と、カスパーゼ3およびカスパーゼ7を組み合わせた活性を測定するAPO-ONEアッセイを使用して比較した。混合処置(CAT)であることから、作用を、処置:対照の比に関して比較した。作用が認められない場合には、比=1であった。処置:対照の比の比較を、スチューデントt検定を用いて、95%の信頼水準で調べた。1の値より大きい比は、正の作用を示した。これらの作用を、図5に示す。SorC27の卵巣細胞系のうちの1種に対する濃度効果を、図6に示す。これらの図は、以下のことを示す:
--SorC27(10μMおよび100μM)は、SKOV3、OVCAR3においては、アポトーシスをCATカクテルよりも早くかつ強く起こし、CaOV3およびOV90においては、CATに類似していた。
--SorC13は、SKOV3、CaOV3、OVCa3およびOV90については、アポトーシスカスケードを、CATカクテルよりも早くかつ強く起こした。
【０１２７】
(実施例7)
転移性ヒト卵巣癌細胞系のアポトーシス誘導における、SorC13およびSorC27の、パクリタキセル/カルボプラチンのカクテルを用いた解析
これら2種のC-ペプチドの作用を、卵巣癌のための最も信頼できる基準の治療と比較するために、SorC13およびSorC27を、カルボプラチンおよびタキソール(CAT)のカクテル(10μMパクリタキセル、20mMカルボプラチン)を用いた処置と、APO-ONEアッセイを使用して比較した。2種のヒト卵巣腺癌腫瘍細胞系SKOV3(ATCC HTB-77由来)およびNIH:OVCAR-3(ATCC HTB-161由来)を使用し、ATCCの方法に従って調製する。混合処置(CAT)であることから、作用を、処置:対照の比に関して比較する。作用が認められない場合には、比=1である。処置:対照の比の比較を調べる。1の値より大きい比は、正の作用を示す。処置群を以下に示す:
(処置当たりn=8)
1)処置なし(対照)
2)パクリタキセル(10μM)を用いた処置
3)2種の用量のSorC13(10、100μM)を用いた処置
3)2種の用量のSorC27(10、100μM)を用いた処置
5)単一の用量のパクリタキセル(10μM)および2種の用量のSorC13(10、100μM)を用いた処置
6)単一の用量のパクリタキセル(10μM)および2種の用量のSorC27(10、100μM)を用いた処置
【０１２８】
データを平均応答に関して直接比較する。SorC27+パクリタキセルおよびSorC13+パクリタキセルの、卵巣細胞系のうちの1つに対する組合せ効果は、以下のことを示す:
--CATカクテルと組み合わせたSorC27(10μMおよび100μM)は、SKOV3およびNIH:OVCAR-3の卵巣癌細胞系においては、アポトーシスを、いずれの単独処置よりも早くかつ強く増強する。
-- CATカクテルと組み合わせたSorC13 (10μMおよび100μM)は、SKOV3およびNIH:OVCAR-3の卵巣癌細胞系においては、アポトーシスを、いずれの単独処置よりも早くかつ強く増強する。
【０１２９】
これらの結果を、アポトーシス指数(処置の応答/対照の応答、作用がない場合、AI=1)として、かつ細胞生存率が減少した(+)か、否(-)かを決定することによって測定する。
【０１３０】
(実施例8)
SorC13およびSorC27の組織分布
SorC13およびSorC27を、近赤外プローブCy5.5を用いて標識した。SorC13を、リジン-1およびリジン-8において、赤外蛍光プローブcy5.5を用いて、Cy5.5 NHSエステル活性化プロセスを用いる反応によって標識した。SorC27を、単一のシステインのチオールにおいて、Cy5.5マレイミド活性化反応を用いて標識した。標識ペプチドを、サイズ排除クロマトグラフィーおよびHPLCの組合せを用いて精製した。標識Cy5.5は、走査型レーザーを用いて励起すると、赤外領域において蛍光を発する。低いエネルギーのレーザーは、動物に約1cmまで貫通することが可能であり、したがって、腹臥位および仰臥位を走査することによって、タグ付きペプチドの存在を三次元で定量化することができる。
【０１３１】
Cy5.5標識ペプチドを、CD1マウス(各化合物当たり4匹)に、動物1匹当たり100μL中100μgで静脈内注射し、動物を生存状態で、光学画像システムOptix eXplorer(GE Healthcare Systems)を使用して、異なる時点(30分、90分、4時間)で撮像した。いくつかの動物を、血液(およびリンパ液)を取り出すための灌流後24時間目において観察した。異なる臓器および組織中の標識ペプチドの体内分布を可視化し、光学画像解析により相対的に定量化した。このプロトコールによって、標識ペプチドの場所および経時的な場所の変化の様子の可視化が可能になる。図7に、マウス内のリンパ節の場所を示す。標識ペプチドが蓄積した節を、線1(浅頚節)、線4(腋窩節)、線5(上腕節)、線8(腸間膜節)、および線9(鼠径節)によって示す。図8、9および10は、ex vivoにおける種々の臓器中の標識ペプチドの量を示す。総合して、これらの実験は、以下のことを示す:
-- C-ペプチドはいずれも、血管脳関門を越えて移動しなかった。
--タグ付きのSorC13およびSorC27は、リンパ節、肺、肝臓および腎臓中に優性に局在する。
--タグ付きのSorC13およびSorC27は、灌流後24時間目においても依然として、これらの組織中で検出可能であった。
-- Cy5.5はペプチド/Cy5.5付加体よりも短い生存期間を有することから、種々の臓器中の蛍光の生存期間の測定によって、標識ペプチドの代謝は、肝臓および腎臓中でなされるようであることが示された。
【０１３２】
(実施例9)
ヒト非小細胞肺癌(NSCLC)腫瘍細胞における、SorC13およびSorC27によるアポトーシス誘導
C-ペプチドの転移性ヒト肺癌細胞に対する作用を研究する。上記の組織分布データから、C-ペプチドが肺中に蓄積し、リンパ節中に局在することが示された。SorC13およびSorC27を利用して、in vitroにおける研究を、転移性リンパ節由来細胞系中で実施して、ヒト非小細胞肺癌(NSCLC)系のH1437(ATCC CRL-5872由来)およびH2087(ATCC CRL-5922由来)に対するそれらの作用を決定する。これらの細胞系の両方が、転移部位(リンパ節)に由来する腺癌であり、段階1のNSCLC肺癌に由来する。本発明のペプチドを用いて有用に治療される、対象とする主要なリンパ管は、浅頚節、腋窩節、上腕節、腸間膜節および鼠径節を含む。
【０１３３】
この研究のために、これらの細胞系を、ATCC推奨条件下およびATCCが推奨する培地中で増殖させる。細胞系を、無菌条件下、加湿5%CO2雰囲気中37℃で培養する。
【０１３４】
APO-ONEアッセイおよびCellTiter Blue (Promega)の両方を、これらの細胞系上で使用して、アポトーシスおよび細胞生存率のそれぞれを評価する。処置群を以下に示す:
1)処置なし
2)2種の用量のSorC13(10、100μM)を用いた処置
3)2種の用量のSorC27(10、100μM)を用いた処置
【０１３５】
データを平均応答に関して直接比較する。SorC27およびSorC13は、ヒト転移性NSCLC系においてアポトーシスを誘導する。
【０１３６】
(実施例10〜13)
多様なヒト癌細胞系における、C-ペプチドの作用の評価
SorC13およびSorC27の処置の、いくつかの癌細胞系に対する作用を、in vitroにおいて試験する。上記したように、C-ペプチドは、乳癌細胞系および卵巣癌細胞系の両方において、アポトーシスを誘導した。また、C-ペプチドは、in vitroにおいて、その他の癌細胞においても、アポトーシスを誘導し、細胞生存率を減少させる能力を示す。以下の実施例10〜13では、SorC13およびSorC27を、選択された多様なヒト癌系においてアポトーシスを誘導するそれらの能力を判定する。それらは、PC3、ヒト慢性骨髄性白血病(CML)K-562、ヒト急性骨髄性白血病(AML) MV-4-11、バーキットリンパ腫細胞系Daudiを含む。
【０１３７】
この研究のために使用したSorC13およびSorC27の濃度は、0μM、10μMおよび100μMであった。実験は、5〜7日の期間に及んだ。全ての測定を、四連で、試験測定値を補正するために使用するブランク(細胞なし)および対照(ビヒクル、ペプチドなし)の両方と共に行う。時間-応答のデータおよび用量-応答のデータを、平均±平均の標準誤差としてプロットする。
【０１３８】
(実施例10)
ヒト前立腺癌細胞系における、C-ペプチドのアポトーシス誘導
細胞系PC3(ATCC CRL-1435由来)およびLnCaPクローンFGC(ATCC CRL-1740由来)をAmerican Type Culture Collection (ATCC)から入手し、ATCC推奨条件下およびATCCが推奨する培地中で増殖させた。これらの細胞系を、無菌条件下、加湿5%CO2雰囲気中37℃で培養した。
【０１３９】
アポトーシス誘導および付随する細胞生存率の減少が、これらの癌細胞系において観察される。カスパーゼ3/7活性の大きな増加から、アポトーシス誘導に対する時間依存性の作用および用量依存性の作用があることが明らかである。
【０１４０】
SorC13およびSorC27のこれらの細胞系に対する作用の観察結果は、
--SorC27は、アポトーシスを誘導し、細胞生存率を減少させ、
--SorC13は、アポトーシスを誘導し、細胞生存率を減少させる
ことである。
【０１４１】
(実施例11)
バーキットリンパ腫細胞系における、C-ペプチドのアポトーシス誘導
細胞系Daudi(ATCC CCL-213由来)を、ATCC推奨条件下およびATCCが推奨する培地中で増殖させる。この細胞系を、無菌条件下、加湿5%CO2雰囲気中37℃で増殖させた。
【０１４２】
アポトーシス誘導および付随する細胞生存率の減少が、この癌細胞系において観察される。カスパーゼ3/7活性の大きな増加から、アポトーシス誘導に対する時間依存性の作用および用量依存性の作用があることが明らかである。
【０１４３】
SorC13およびSorC27のこの細胞系に対する作用の観察結果は、
--SorC27は、アポトーシスを誘導し、細胞生存率を減少させ、
--SorC13は、アポトーシスを誘導し、細胞生存率を減少させる
ことである。
【０１４４】
(実施例12)
ヒト慢性骨髄性白血病(CML)細胞系K-562における、C-ペプチドのアポトーシス誘導
細胞系K-562(ATCC CCL-243由来)を、ATCC推奨条件下およびATCCが推奨する培地中で増殖させる。この細胞系を、無菌条件下、加湿5%CO2雰囲気中37℃で増殖させた。
【０１４５】
アポトーシス誘導および付随する細胞生存率の減少が、この癌細胞系において観察される。カスパーゼ3/7活性の大きな増加から、アポトーシス誘導に対する時間依存性の作用および用量依存性の作用があることが明らかである。
【０１４６】
SorC13およびSorC27のこの細胞系に対する作用は、
--SorC27は、アポトーシスを誘導し、細胞生存率を減少させ、
--SorC13は、アポトーシスを誘導し、細胞生存率を減少させる
ことである。
【０１４７】
(実施例13)
ヒト急性骨髄性白血病(AML)細胞系MV-4-11における、C-ペプチドのアポトーシス誘導
細胞系MV-4-11(ATCC DRL-9591由来)を、ATCC推奨条件下およびATCCが推奨する培地中で増殖させる。この細胞系を、無菌条件下、加湿5%CO2雰囲気中37℃で増殖させた。
【０１４８】
アポトーシス誘導および付随する細胞生存率の減少が、この癌細胞系において観察される。カスパーゼ3/7活性の大きな増加から、アポトーシス誘導に対する時間依存性の作用および用量依存性の作用があることが明らかである。
【０１４９】
SorC13およびSorC27のこの細胞系に対する作用の観察結果は、
--SorC27は、アポトーシスを誘導し、細胞生存率を減少させ、
--SorC13は、アポトーシスを誘導し、細胞生存率を減少させる
ことである。
【０１５０】
(実施例14〜20)
in vivoにおけるSorC-ペプチドの示す抗腫瘍活性
異種移植モデルでC-ペプチドを利用するin vivoにおける研究を実施して(実施例14〜20)、げっ歯類(マウス)モデルにおける、ヒト癌細胞系の異種移植片の、処置に対する応答を評価した。SorCペプチドは、in vivoにおいて抗腫瘍活性を示す。
【０１５１】
ヒト乳癌およびヒト卵巣癌をモデル化するために使用する細胞系を、American Type Culture Collection(ATCC)から入手し、ATCC推奨条件下およびATCCが推奨する培地中で増殖させた。これらの細胞型、ATCCカタログ番号、および細胞系の説明をTable 8(表8)に列挙する。
【０１５２】
【表８Ａ】
0005749154.tif 000010
【０１５３】
【表８Ｂ】
0005749154.tif 000011
【０１５４】
(実施例14)
マウス異種移植モデルにおける、ヒト卵巣腺癌腫瘍細胞に対する、単独およびCAT(カルボプラチンとパクリタキセルとのカクテル)と組み合わせた場合のSorC13およびSorC27の抗腫瘍活性
ヒト卵巣腺癌細胞系のSKOV3(ATCC番号:HTB-77)およびNIH:OVCAR-3(ATCC番号:HTB-161)を、ATCC完全増殖培地を用いて調製した増殖培地中で培養する。
【０１５５】
細胞培養
SKOV3細胞系
SKOV3系のための基本培地は、ATCC処方のマッコイ5a培地(改変)(ATCCカタログ番号:30-2007)である。完全増殖培地を作製するために、以下の成分を、基本培地に37℃で添加する:ウシ胎仔血清、10%の最終濃度(空気95%、二酸化炭素(CO2)5%)。SKOV3を細胞培養するための、ATCCの継代培養プロトコールに従う。
【０１５６】
NIH-OVCAR-3細胞系
NIH-OVCAR-3細胞系のための基本培地は、ATCC処方のRPMI-1640培地(ATCCカタログ番号: 30-2001)である。完全増殖培地を作製するために、NIH-OVCAR-3を細胞培養するための、ATCCの増殖プロトコールに従う。
【０１５７】
細胞の調製
液体窒素中に凍結保存されていた細胞を、37℃で迅速に解凍し、増殖培地を含有する組織培養フラスコに移し、次いで、5% CO2のインキュベーター中、37℃でインキュベートする。細胞系を拡大増殖するために、培養物を、等しい体積の新鮮な増殖培地を添加することによって、1:2で3日に1回継代して、5×106細胞/mlの密度とする。フラスコが、およそ10×106細胞/mlの密度に達したら、上記の継代プロセスを、マウス内への移植に十分な細胞が得られるまで繰り返す。
【０１５８】
7〜8週齢の雌のNOD/SCIDマウスを、マイクロアイソレーター中で、4〜5匹/ケージで、12時間/12時間の明/暗サイクルで飼育し、使用前に少なくとも1週間順応させ、通常の実験動物用固形飼料を自由に与えた。研究を、腫瘍細胞の移植時に8〜12週齢の動物上で実施した。
【０１５９】
製剤化手順
SorC13/SorC27
SorC13およびSorC27を製剤化するために、10 mg/Kgマウスおよび100mg/Kgマウスを送達するための最終溶液を構成するのに適した量の化合物を、生理的に緩衝化されている食塩水(pH7.0〜7.4、25℃)中に溶解させることによって、試験物品の保存液を調製する。保存液は、毎週調製し、-20℃で貯蔵し、投与のために毎日新たに希釈する。全ての溶液を、その後の操作の前に、0.22μmのフィルターを用いてろ過滅菌する。ろ過滅菌ユニットを、少量の滅菌蒸留水を用いて、あらかじめ洗浄した。
【０１６０】
カルボプラチン/パクリタキセル(CAT)参照溶液
カルボプラチンおよびパクリタキセルをそれぞれ20mMおよび10μM含有する保存液を調製する。カルボプラチンおよびパクリタキセルは、Sigma-Aldrichから入手する。全ての溶液を、その後の操作の前に、0.22μmのフィルターを用いてろ過滅菌する。
【０１６１】
移植手順
場合により、NIH-OVCAR-3腫瘍細胞またはSKOV3腫瘍細胞を、NOD/SCIDマウス内に移植するために、細胞培養物を遠心分離して、細胞をペレット化し、上清を吸引し、この細胞ペレットを10mlの増殖培地中に再懸濁させ、血球計数器を使用して細胞数を決定する。次いで、これらの細胞を、適切な培地中で洗浄し、培地中に5×107細胞/mlの濃度で再懸濁させる。27ゲージの針および1ccのシリンジを使用して、0.1 mlの細胞懸濁液を、マウスの側腹部内に皮下注射する。次いで、腫瘍を、in vivoにおいて大部分の腫瘍体積が100〜200 mm3に達するまで発達させ、これは、典型的には、移植後1〜2週間を要する。これらの腫瘍を使用して、NOD/SCIDマウス内の皮下組織に移植し、その2日後に、試験ペプチドまたはCATのいずれかを用いて処置する。
【０１６２】
典型的には、以下の群を含む:
1)ビヒクル投与腫瘍移植マウス、
2)参照化合物CAT投与腫瘍移植マウス、
3)1回用量のSorC13投与腫瘍移植マウス、
4)1回用量のSorC27投与腫瘍移植マウス、
5)1回用量のSorC13およびCAT投与腫瘍移植マウス、
6)1回用量のSorC27およびCAT投与腫瘍移植マウス。
【０１６３】
測定
長方形の非常に小型または大型の腫瘍を有する動物を破棄し、研究のために、一貫した増殖速度を示す腫瘍を担持する動物のみを選択する。腫瘍体積(V)を、ノギスで測定することによって、腫瘍の幅(VV)、長さ(L)および厚み(T)の標準的な測定値を使用して計算する。動物を処置群に無作為化し、その結果、各群の腫瘍体積の中央値は、投与開始時において類似する。有効性の尺度として、%T/C値を決定する。式中、Cは、対照または未処置の腫瘍の体積を指し、Tは、処置した腫瘍の体積を指す。
【０１６４】
処置手順
動物に、この製剤を、体重1kg当たり10mlでスケジュールに従って腹腔内(i.p.)注射する。
【０１６５】
結果
NOD/SCIDマウスにおいて、SorC13およびSorC27の400 mg/kg体重の用量を用いた処置は、NIH-OVCAR-3細胞およびSKOV3細胞の増殖速度を実質的に減少させる。この作用は、体重が安定しており、ストレス症状(下痢、あえぎ呼吸、逆立った毛皮)を欠くことによって示されるように、毒性を伴わない。
【０１６６】
SKOV3細胞およびSorC27を用いた実験の結果
SKOV3細胞を、ATCCから入手し、培養し、適切な数になるまで拡大増殖して、マウス内で異種移植片を確立し、次いで、ゲルペレットに配合し、腫瘍を確立するために、代理NOD/SCIDマウスの腎臓莢膜下に移植した。次いで、腫瘍をin vivoにおいて大部分の腫瘍体積が100〜200 mm3に達するまで発達させ、これは、典型的には、移植後1〜2週間を要する。異種移植片が確立したら、これらを収集し、複数の均一な小片に切断する。実験のために、16〜18片を各NOD/SCIDマウスの皮下に移植した。2日後、動物を、試験ペプチドまたはCATまたは組合せのいずれかを用いて処置する。
【０１６７】
上記に詳述した、SKOV3  細胞を移植したマウスに、食塩水(対照)、SorC27(400mg/kg)をi.p.注射により毎日12日間投与するか、またはCAT注射を週1回投与した。腫瘍体積および体重を、毎日測定した。また、動物の一般的な健康も、毎日モニターした。体重に対して正規化した腫瘍量に関して示された結果を、図12に示す。SorC27処置およびCAT処置の両方が、腫瘍体積の大きな低下を示し、対照とは有意に異なった。%T/C比(処置の平均腫瘍体積/対照の平均腫瘍体積)は39.9%であり、これは、腫瘍増殖の60.1%の減少を反映する。12日目までに、この用量においてはCATとSorC27との間には、統計学的に有意な差はなかった。
【０１６８】
(実施例15)
マウス異種移植モデルにおける、ヒト乳癌細胞に対する、単独およびパクリタキセルと組み合わせた場合のSorC13およびSorC27の抗腫瘍活性
ヒト乳癌細胞系のMCF7(ATCC番号:HTB-22)およびT47D(ATCC番号:HTB-133)を、ATCC完全増殖培地を用いて調製した増殖培地中で培養する。
【０１６９】
細胞培養、細胞の調製、動物の手順、SorC13/SorC27の製剤化手順、移植手順、測定および処置手順は、実施例14の記載に従う。
【０１７０】
典型的には、以下の群を含む:
1)ビヒクル投与腫瘍移植マウス、
2)参照化合物パクリタキセル投与腫瘍移植マウス、
3)1回用量のSorC13投与腫瘍移植マウス、
4)1回用量のSorC27投与腫瘍移植マウス、
5)1回用量のSorC13およびパクリタキセル投与腫瘍移植マウス、
6)1回用量のSorC27およびパクリタキセル投与腫瘍移植マウス。
【０１７１】
製剤化手順
パクリタキセル参照溶液
10μMのパクリタキセルを含有する保存液を調製する。パクリタキセルは、Sigma-Aldrichから入手する。
【０１７２】
結果
NOD/SCIDマウスにおいて、SorC13またはSorC27の場合により200〜400 mg/kg体重の用量を用いた処置は、MCF7細胞およびT47D細胞の増殖速度を実質的に減少させ、%T/C値は、<100%である。この作用は、研究のコースにわたる%T/Cの低下によって示されるように、毒性を伴わない。
【０１７３】
(実施例16)
マウス異種移植モデルにおける、ヒト慢性骨髄性白血病(CML)腫瘍細胞[K-562(ATCC番号:CCL-243)]に対するSorC13およびSorC27の抗腫瘍活性
ヒト慢性骨髄性白血病(CML)細胞系K-562 (ATCC番号:CCL-243)を、American Type Culture Collectionから入手する。これらの細胞を、ATCC完全増殖培地を用いて調製した増殖培地中で培養する。
【０１７４】
細胞培養
K-562系のための基本培地は、ATCC処方のイスコフ改変ダルベッコ培地、カタログ番号:30-2005である。完全増殖培地を作製するために、以下の成分を、基本培地に添加する:ウシ胎仔血清、10%の最終濃度。完全増殖培地を作製するために、K-562を細胞培養するための、ATCCの増殖プロトコールに従う。
【０１７５】
典型的には、以下の群を含む:
1)ビヒクル投与腫瘍移植マウス、
2)1回用量のSorC13投与腫瘍移植マウス、
3)1回用量のSorC27投与腫瘍移植マウス。
【０１７６】
細胞の調製、動物の手順、SorC13/SorC27の製剤化手順、移植手順、測定および処置手順は、実施例14の記載に従う。
【０１７７】
結果
NOD/SCIDマウスにおいて、SorC13またはSorC27の場合により200〜400 mg/kg体重の用量を用いた処置は、K-562細胞の増殖速度を実質的に減少させ、%T/C値は、<100%である。この作用は、毒性を伴わない。
【０１７８】
(実施例17)
マウス異種移植モデルにおける、ヒト前立腺癌腫瘍細胞LnCaPクローンFGCに対するSorC13およびSorC27の抗腫瘍活性
ヒト前立腺癌細胞系LnCaPクローンFGC(ATCC CRL-1740由来)を、American Type Culture Collectionから入手する。これらの細胞を、ATCC完全増殖培地を用いて調製した増殖培地中で培養する。
【０１７９】
細胞培養
LnCaPクローンFGC系のための基本培地は、ATCC処方である。
【０１８０】
動物の手順
実施例14の記載に従う。
典型的には、以下の群を含む:
1)ビヒクル投与腫瘍移植マウス、
2)1回用量のSorC13投与腫瘍移植マウス、
3)1回用量のSorC27投与腫瘍移植マウス。
【０１８１】
細胞の調製、SorC13/SorC27の製剤化手順、移植手順、測定および処置手順は、実施例14の記載に従う。
【０１８２】
結果
SCIDマウスにおいて、SorC13またはSorC27の場合により200〜400 mg/kg体重の用量を用いた処置は、LnCaP細胞の増殖速度を実質的に減少させ、%T/C値は、<100%である。この作用は、研究のコースにわたる%T/Cの低下によって示されるように、毒性を伴わない。
【０１８３】
(実施例18)
マウス異種移植モデルにおける、ヒト乳癌腫瘍細胞MCF7に対するSorC13およびSorC27の抗腫瘍活性
ヒト乳癌細胞系MCF-7(ATCC HTB-22由来)を、American Type Culture Collectionから入手する。これらの細胞を、ATCC完全増殖培地を用いて調製した増殖培地中で培養する。
【０１８４】
動物の手順
実施例14の記載に従う。
典型的には、以下の群を含む:
1)ビヒクル投与腫瘍移植マウス、
2)1回用量のSorC13投与腫瘍移植マウス、
3)1回用量のSorC27投与腫瘍移植マウス。
【０１８５】
細胞培養、細胞の調製、SorC13/SorC27の製剤化手順、移植手順、測定および処置手順は、実施例14の記載に従う。
【０１８６】
結果
NOD/SCIDマウスにおいて、SorC13またはSorC27の場合により200〜400 mg/kg体重の用量を用いた処置は、MCF7細胞の増殖速度を実質的に減少させ、%T/C値は、<100%である。この作用は、研究のコースにわたる%T/Cの低下によって示されるように、毒性を伴わない。
【０１８７】
(実施例19)
マウス異種移植モデルにおける、ヒト乳癌腫瘍細胞MDA-MB-231に対するSorC13およびSorC27の抗腫瘍活性
ヒト乳癌細胞系MDA-MB-231(ATCC HTB-26由来)を、American Type Culture Collectionから入手する。これらの細胞を、ATCC完全増殖培地を用いて調製した増殖培地中で培養する。
【０１８８】
細胞培養
MDA-MB-231細胞系のための基本培地は、ATCC処方のレイボビッツL-15培地、カタログ番号:30-2008である。完全増殖培地を作製するために、以下の成分を、基本培地に添加する:ウシ胎仔血清、10%の最終濃度。完全増殖培地を作製するために、MDA-MB-231を細胞培養するための、ATCCの増殖プロトコールに従う。
【０１８９】
動物の手順
実施例14の記載に従う。
典型的には、以下の群を含む:
1)ビヒクル投与腫瘍移植マウス、
2)1回用量のSorC13投与腫瘍移植マウス、
3)1回用量のSorC27投与腫瘍移植マウス。
細胞の調製、SorC13/SorC27の製剤化手順、移植手順、測定および処置手順は、実施例14の記載に従う。
【０１９０】
結果
SCIDマウスにおいて、SorC13またはSorC27の場合により200〜400 mg/kg体重の用量を用いた処置は、MDA-MB-231細胞の増殖速度を実質的に減少させ、%T/C値は、<100%である。この作用は、研究のコースにわたる%T/Cの低下によって示されるように、毒性を伴わない。
【０１９１】
(実施例20)
マウス異種移植モデルにおける、ヒト急性骨髄性白血病(AML)腫瘍細胞MV-4-11に対するSorC13およびSorC27の抗腫瘍活性
ヒト乳癌細胞系MV-4-11(ATCC CRL-9591由来)を、American Type Culture Collectionから入手する。これらの細胞を、ATCC完全増殖培地を用いて調製した増殖培地中で培養する。
【０１９２】
細胞培養
MV-4-11細胞系のための基本培地は、ATCC処方のイスコフ改変ダルベッコ培地、カタログ番号:30-2005である。完全増殖培地を作製するために、以下の成分を、基本培地に添加する:ウシ胎仔血清、10%の最終濃度。完全増殖培地を作製するために、MV-4-11を細胞培養するための、ATCCの増殖プロトコールに従う。
【０１９３】
動物の手順
実施例14の記載に従う。
典型的には、以下の群を含む:
1)ビヒクル投与腫瘍移植マウス、
2)1回用量のSorC13投与腫瘍移植マウス、
3)1回用量のSorC27投与腫瘍移植マウス。
【０１９４】
細胞の調製、SorC13/SorC27の製剤化手順、移植手順、測定および処置手順は、実施例14の記載に従う。
【０１９５】
結果
SCIDマウスにおいて、SorC13またはSorC27の場合により200〜400 mg/kg体重の用量を用いた処置は、MV-4-11細胞の増殖速度を実質的に減少させ、%T/C値は、<100%である。この作用は、研究のコースにわたる%T/Cの低下によって示されるように、毒性を伴わない。
【０１９６】
(実施例21)
C-ペプチドの検出および検出限界
逆相HPLCを使用して、SorC13およびSorC27を検出および定量化した。Phenomenex Gemini、5μ、C-18逆相カラム(250×4.60 mm)を、解析手順のために使用した。溶媒系は、アセトニトリルと水との勾配であり、それぞれが、0.1%v/vトリフルオロ酢酸を含有した。HPLCを、30.0℃のカラム温度で実施した。溶媒系は、40分にわたる、1.0mL/分の流速における、90%〜40%の水(0.1%TFA)を有する10%〜60%のアセトニトリル(0.1%TFA)勾配であった。検出は、224nmにおいて行った。ペプチドの保持時間は、SorC13およびSorC27について、それぞれ11.5分および14.7分であった。
【０１９７】
純粋なペプチドの既知の質量を含有する溶液を段階希釈し、HPLC解析にかけることによって、水中におけるSorC13およびSorC27の定量化および検出限界の決定を行った。ラットまたはヒトの血漿中のこれら2種のC-ペプチドを定量化する場合には、このプロセスには、血漿試料からタンパク質分解活性を排除するための前処理が必要であった。2mMのPefabloc (Sigma-Aldrich、プロテアーゼ阻害剤)を溶液100μL当たり2μL添加することと、Amicon YM-10 Centriconサイズ排除フィルター (MWCO 10 kDa)中で遠心分離することとを組み合わせて、タンパク質分解酵素を除去して、ペプチドの安定な媒体を得た。全ての定量化実験を三つ組みで行い、95%の信頼水準で最良の直線方程式を計算することによって解析した。
【０１９８】
3種の媒体全てにおいて、標準曲線が、直線モデルに95%(以上)の信頼水準の範囲内で適合した。これらの条件下では、全ての媒体中のSorC13およびSorC27の検出の下限は、94μLの試料注入体積の場合、少なくとも1μgであった。これらのペプチドの検出限界を下げることは、比色分析法および蛍光定量法の場合、解析前に誘導体化すれば容易に達成される。さらにまた、検出波長を下げること(例えば、204 nm)によっても、ペプチドの検出限界が下がる。
【０１９９】
(実施例22)
ラットおよびヒトの血漿中におけるC-ペプチドの分解速度
ラット血漿を、屠殺したラット(Sprague-Dawley)から採血した血液から得、ヘパリン処置ガラス製バイアルに入れて、凝固を防止した。全血を8000×gで5分間遠心分離して、細胞を沈降させ、血漿を上清として残した。健康なヒトからのヒト全血試料を、リチウム-ヘパリン処置真空チューブ中に採血した。試料を2.0mLの微遠心分離用チューブ中に入れ、8000×gで5分間遠心分離した。血漿を赤血球細胞から注意深く分離し、直ちに使用した。
【０２００】
HPLCプロトコールを用いて、投与を受けた血漿試料中のSorC13またはSorC27のいずれかの量を時間経過後に測定することによって、C-ペプチドの分解速度を決定した。2μLの2mM Pefablocを含有する試料チューブ(500μL)を、試料の送達のためにあらかじめ調製した。SorC13(1.0mg)またはSorC27(2.0mg)を、1.0 mLの新鮮な血漿中に溶解させ(37°C)、37℃のインキュベート用の水浴中に置いた。試料(100μL)を直ちに採取し、2μLの2mM Pefablocを含有する試料チューブ中でクエンチし、激しく混合し、-80℃で直ちに凍結した。この最初の試料が、試験のゼロ時に相当する。5分の時間間隔で連続して、100μLの試料を取り出し、Pefabloc中でクエンチし、混合し、解析まで-80℃で凍結した。
【０２０１】
ラット血漿の分解速度を、3匹の異なるラットからの血漿について決定し、ヒト血漿中の分解速度には、6つの別個の血漿試料を使用した。使用したデータは、平均(±SEM)であり、これを、単純な一相性の指数関数的崩壊モデルに適合させて、これら2種のペプチドの半減期を決定した。また、これによって、静的な分解速度の計算も可能になった。図11に、ヒト血漿中におけるSorC27の分解速度を示す。両方の血漿型中におけるこれら2種のペプチドについての類似の解析から、
--SorC27は、ラット血漿中では21分の半減期で分解し、ヒト血漿中では20分の半減期で分解し、
--SorC13は、ラット血漿中では58分の半減期で分解し、ヒト血漿中では56.6分の半減期で分解する
ことが示された。
【０２０２】
(実施例23)
SorC13およびSorC27の毒性の研究
SorC13およびSorC27の急性毒性
以下に記載するように、CD-1マウスにおいて、急性静脈内ボーラス注射を単回投与した後、5日の観察期間にわたり毒性研究を行った。SorC13およびSorC27のそれぞれの3つの用量を使用した(10、100および500mg/Kg)。注射後の最初の4時間は1時間毎に調べ、5日にわたり毎日ケージの外から調べた。解析の一部として、以下の判定を行った:投与前および終了時の体重、全動物の剖検(骨髄の塗抹標本を含む)、全動物から得た臓器重量。
【０２０３】
in vivoにおけるCD1マウスへのi.v.注射後、SorC27によっては、1時間の測定期間にわたり、血圧にも心拍数にも変化は生じなかった。また、72時間にわたり、神経学的/行動上の変化もなかった。in vivoにおけるCD1マウスへのi.v.注射後、SorC13によって、最初の15分以内に血圧の若干の急上昇(およそ25%)が生じ、これは、1時間目までには消失した。72時間にわたり、マウスの神経学的/行動上の変化はなかった。SorC13またはSorC27を、CD1マウスに、10mg/kg、100mg/kgおよび500mg/kgの用量で単回静脈内注射した場合、注射後の5日間の観察期間にわたり、有害事象は発生しなかった。この後者の実験において、剖検からは、全ての主要な臓器系において顕著な変化は示されなかった。また、SorC27を、マウスに、1日当たり400mg/kg(i.p.)で12日間、複数回投与した場合にも、毒性の徴候は示されなかった。
【０２０４】
反復投与による毒性の研究
反復投与による毒性を調査するために、食塩水中に配合した400mg/kgのSorC27を、NOD/SCIDマウスに、毎日12日間(i.p.)注射した。動物を、毎日ケージの外から観察し、実験期間の終わりに検査した。食塩水を単独で注射した対照マウスと比較して、毒性作用、体重減少、または剖検上の臓器の変化は示されなかった。
【０２０５】
(実施例24)
SorC13およびSorC27の薬物動態(PK)プロファイル
急性静脈内ボーラス注射の単回投与によるPK研究を、SorC13およびSorC27のそれぞれの3つの用量(3mg/Kg、30mg/Kgおよび150mg/Kg)を使用し、投与群当たり少なくとも3匹のマウスを使用して実施する。血液試料を、6つの時点、すなわち、投与後の5分、15分、1時間、2時間および4時間において採血する。次いで、試料を、SorC13またはSorC27の存在についてアッセイする。
【０２０６】
結果
血液区画からのクリアランス速度と、血漿中の酵素による酵素分解とを組み合わせると、30分未満の半減期を有する、血液区画からの移動が得られる。
【０２０７】
(実施例25)
異なる細胞系における、TRPV6 mRNAの存在とC-ペプチドのアポトーシス活性との比較
表9に列挙する細胞系のうちのそれぞれにおける、TRPV6のmRNAの存在を、RT-PCRを使用して試験した。使用したTRPV6プライマー(アンプリコンのサイズ:寒天ゲル上で約400bp)は、5'-CTGCCTATGGAGCAAGTTCTG(順方向プライマー)、および
5'-TCAGATGTCATGGGCTCAAAG(逆方向プライマー)であった。増幅反応のために使用したサーモサイクラーのプログラムは、94℃で3分間、次いで、94℃で30秒間、53℃で30秒間、72℃で1分30秒間の30サイクル、および72℃で7分間であった。増幅反応を、標準的な寒天ゲル電気泳動によってモニターした。
【０２０８】
結果
Table 9(表9)に、種々の乳癌細胞系および卵巣癌細胞系におけるC-ペプチドのアポトーシス誘導能力と、TRPV6のmRNAの存在との間のいくつかの対応を示す。これらのtrpv6遺伝子を発現する細胞系は、C-ペプチド誘導性アポトーシスに対して感受性であることが明らかである。
【０２０９】
【表９】
0005749154.tif 000012
【０２１０】
SorC9(HPSKVDLPR)等の本発明のその他のSorCペプチドは、上記の実施例で記載したプロトコールにおいて容易に試験され、in vitroおよびin vivoにおいて、カルシウム活性を阻害する活性を示し、麻痺活性はないことが示されている。また、これらのペプチドは、細胞増殖を阻止し、アポトーシスを誘導し、癌を予防または治療するためにも有用である。
【０２１１】
本発明を、好ましい実施例であると現時点でみなされているものを参照して説明してきたが、本発明は、開示した実施例に限定されるものではないことを理解されたい。それどころか、本発明は、添付の特許請求項の精神および範囲内に含まれる種々の改変形態および均等な設定を網羅することを意図する。
【０２１２】
全ての刊行物、特許および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許および特許出願の全体が参照により組み込まれていることが具体的かつ個々に示されている場合と同じ程度で、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０２１３】
(参考文献)
0005749154.tif 000013
0005749154.tif 000014
【図１】
0005749154.tif 000015
【図２】
0005749154.tif 000016
【図３】
0005749154.tif 000017
【図４】
0005749154.tif 000018
【図５】
0005749154.tif 000019
【図６】
0005749154.tif 000020
【図７】
0005749154.tif 000021
【図８】
0005749154.tif 000022
【図９】
0005749154.tif 000023
【図１０】
0005749154.tif 000024
【図１１】
0005749154.tif 000025
【図１２】
0005749154.tif 000026
【配列表】
0005749154000001.app