(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
モジュレーターのアミノ酸配列がＢ−ドメインに存在するか、またはモジュレーターのアミノ酸配列がＢ−ドメインの一部または全てのアミノ酸配列を置換している、第ＶＩＩＩ因子タンパク質またはポリペプチドを含む第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質または第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーであって、該モジュレーターは、免疫グロブリンのＦｃ領域もしくはその変異体、またはＦｃＲｎ結合ペプチドもしくはその変異体を含み、該Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合ペプチドは、機能的ヒンジドメインを欠いている、第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質または第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー。
【請求項２】
モジュレーターが半減期モジュレーターである、請求項１に記載の第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質または第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー。
【請求項３】
モジュレーターのアミノ酸配列がグリコシル化されている、請求項１に記載の第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質または第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー。
【請求項４】
モジュレーターが、ヒトＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤもしくはＩｇＭもしくはその変異体、またはマウスＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭもしくはその変異体由来の免疫グロブリンのＦｃ領域である、請求項１に記載の第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質または第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー。
【請求項５】
第ＶＩＩＩ因子タンパク質またはポリペプチドが欠失されているＢ−ドメインの一部または全てを含む、請求項１に記載の第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質または第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー。
【請求項６】
配列番号：１のアミノ酸２０−７６４と同一である第１のアミノ酸配列、配列番号：１のアミノ酸１６５６−２３５１と同一である第２のアミノ酸配列およびモジュレーターアミノ酸配列を含む請求項１に記載の第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質または第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーであって、（１）該モジュレーターアミノ酸配列が、そのアミノ末端で第１のアミノ酸配列のカルボキシル末端に共有結合しており、そのカルボキシル末端で第２のアミノ酸のアミノ末端に共有結合しているか、または（２）該モジュレーターアミノ酸配列が、そのアミノ末端で第１のアミノ酸配列のカルボキシル末端に共有結合しており、該モジュレーターアミノ酸配列が、第２のアミノ酸配列に共有結合していない、第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質または第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー。
【請求項７】
モジュレーターが、ヒトＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤもしくはＩｇＭ、またはマウスＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、またはその変異体由来の免疫グロブリンのＦｃ領域である、請求項５に記載の第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質または第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー。
【請求項８】
第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質が、モジュレーターのアミノ酸配列がＢ−ドメインに存在するか、またはモジュレーターのアミノ酸配列がＢ−ドメインの一部または全てのアミノ酸配列を置換している第ＶＩＩＩ因子タンパク質を含む、第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質をコードする核酸であって、該モジュレーターは、免疫グロブリンのＦｃ領域もしくはその変異体、またはＦｃＲｎ結合ペプチドもしくはその変異体を含み、該Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合ペプチドは、機能的ヒンジドメインを欠いている、核酸。
【請求項９】
モジュレーターが、ヒトＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤもしくはＩｇＭ、またはマウスＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、またはその変異体由来の免疫グロブリンのＦｃ領域である、請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
第ＶＩＩＩ因子タンパク質が欠失されているＢ−ドメインの一部または全てを有する、請求項８に記載の核酸。
【請求項１１】
第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質が、配列番号：１のアミノ酸２０−７６４と同一である第１のアミノ酸配列、配列番号：１のアミノ酸１６５６−２３５１と同一である第２のアミノ酸配列およびモジュレーターアミノ酸配列を含む請求項８に記載の核酸であって、該モジュレーターアミノ酸配列が、そのアミノ末端で第１のアミノ酸配列のカルボキシル末端に共有結合しており、そのカルボキシル末端で第２のアミノ酸のアミノ末端に共有結合している、核酸。
【請求項１２】
モジュレーターが、ヒトＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤもしくはＩｇＭ、またはマウスＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、またはその変異体由来である免疫グロブリンのＦｃ領域である、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
請求項８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１４】
請求項８に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１５】
（ａ）第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質または第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーをコードする発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、（ｂ）該細胞を培養し、（ｃ）第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質または第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーを単離することを含む、請求項１に記載の第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質または第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーを生産するための方法。
【請求項１６】
宿主細胞が哺乳動物宿主細胞であり、モジュレーターのアミノ酸配列がグリコシル化されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質または第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーが、配列番号：１のアミノ酸２０−７６４と同一である第１のアミノ酸配列、配列番号：１のアミノ酸１６５６−２３５１と同一である第２のアミノ酸配列およびモジュレーターアミノ酸配列を含む請求項１５に記載の方法であって、（１）該モジュレーターアミノ酸配列が、そのアミノ末端で第１のアミノ酸配列のカルボキシル末端に共有結合しており、そのカルボキシル末端で第２のアミノ酸のアミノ末端に共有結合しているか、または（２）該モジュレーターアミノ酸配列が、そのアミノ末端で第１のアミノ酸配列のカルボキシル末端に共有結合しており、該モジュレーターアミノ酸配列が、第２のアミノ酸配列に共有結合していない、方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質または第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１９】
遺伝的および後天的凝固欠乏症を処置するための、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
遺伝的および後天的凝固欠乏症が血友病Ａである、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
モジュレーターが、非機能的ヒンジを有するヒトもしくはマウスＩｇＧのＦｃ領域の変異体、またはヒトもしくはマウスＩｇＧのＦｃ領域の非ヒンジ部分である、請求項４に記載の第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質または第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー。
【請求項２２】
モジュレーターが、配列番号：１７、１９、２１、２３および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：１７、１９、２１、２３および３０のいずれかと少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する配列を有する、請求項４に記載の第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質または第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー。
【請求項２３】
モジュレーターが、非機能的ヒンジを有するヒトもしくはマウスＩｇＧのＦｃ領域の変異体、またはヒトもしくはマウスＩｇＧのＦｃ領域の非ヒンジ部分である、請求項７に記載の第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質または第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー。
【請求項２４】
モジュレーターが、配列番号：１７、１９、２１、２３および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：１７、１９、２１、２３および３０のいずれかと少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する配列を有する、請求項２３に記載の第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質または第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー。
【請求項２５】
モジュレーターが、非機能的ヒンジを有するヒトもしくはマウスＩｇＧのＦｃ領域の変異体、またはヒトもしくはマウスＩｇＧのＦｃ領域の非ヒンジ部分である、請求項９に記載の核酸。
【請求項２６】
モジュレーターが、配列番号：１７、１９、２１、２３および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：１７、１９、２１、２３および３０のいずれかと少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する配列を有する、請求項２５に記載の核酸。
【請求項２７】
モジュレーターが、非機能的ヒンジを有するヒトもしくはマウスＩｇＧのＦｃ領域の変異体、またはヒトもしくはマウスＩｇＧのＦｃ領域の非ヒンジ部分である、請求項１２に記載の核酸。
【請求項２８】
モジュレーターが、配列番号：１７、１９、２１、２３および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：１７、１９、２１、２３および３０のいずれかと少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する配列を有する、請求項２７に記載の核酸。
【請求項２９】
請求項２６に記載の核酸を含むベクター。
【請求項３０】
請求項２６に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項３１】
請求項２８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項３２】
請求項２８に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項３３】
モジュレーターが、非機能的ヒンジを有するヒトもしくはマウスＩｇＧのＦｃ領域の変異体、またはヒトもしくはマウスＩｇＧのＦｃ領域の非ヒンジ部分である、請求項１５に記載の方法。
【請求項３４】
モジュレーターが、配列番号：１７、１９、２１、２３および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：１７、１９、２１、２３および３０のいずれかと少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する配列を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
モジュレーターが、非機能的ヒンジを有するヒトもしくはマウスＩｇＧのＦｃ領域の変異体、またはヒトもしくはマウスＩｇＧのＦｃ領域の非ヒンジ部分である、請求項１５に記載の方法。
【請求項３６】
モジュレーターが、非機能的ヒンジを有するヒトもしくはマウスＩｇＧのＦｃ領域の変異体、またはヒトもしくはマウスＩｇＧのＦｃ領域の非ヒンジ部分である、請求項１７に記載の方法。
【請求項３７】
モジュレーターが、配列番号：１７、１９、２１、２３、３０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：１７、１９、２１、２３、３０のいずれかと少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する配列を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
モジュレーターが半減期モジュレーターである、請求項３−６のいずれかに記載の第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質または第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー。
【請求項３９】
モジュレーターが半減期モジュレーターである、請求項８に記載の核酸。
【請求項４０】
モジュレーターが半減期モジュレーターである、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年３月２４日に出願された米国仮出願番号６１／１６２，９８６号（この内容は、その全体において出典明示により本明細書に包含させる）の優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、変異体第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質に関する。本発明は、また、変異体ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸およびこのような核酸を同定するための方法に関する。本発明は、変異体ＦＶＩＩＩタンパク質を作製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
血液の凝固は、接触活性化経路（以前は内因性経路として知られていた）または組織因子経路（以前は外因性経路として知られていた）のいずれかにより起こり、それによって、特定の血液タンパク質がタンパク質分解活性化のカスケードに相互作用し、最終的に可溶性フィブリノーゲンを不溶性フィブリンに変換する。これらのフィブリンの繊維状物は架橋して、凝血の足場を形成する。すなわち、フィブリン形成なしに、凝固が起こることができない。
【０００４】
接触活性化経路は、以下のいくつかの工程からなる、（１）第ＸＩＩ因子のタンパク質分解活性化、（２）活性化された第ＸＩＩ因子が第ＸＩ因子を開裂して、それを活性化し、（３）活性化された第ＸＩ因子が第ＩＸ因子を開裂し、それによりそれを活性化し、（４）活性化された第ＩＸ因子が活性化されたＦＶＩＩＩと相互作用して、第Ｘ因子を開裂および活性化し、（５）活性化された第Ｘ因子が膜表面上で活性化された第Ｖ因子に結合し、この複合体がタンパク質分解的にプロトロンビンを開裂して、トロンビンを形成し、（６）トロンビンがタンパク質分解的にフィブリノーゲンを開裂して、フィブリンを形成し、（７）フィブリンモノマーが線維に集合し、次にこれが第ＸＩＩＩ因子により架橋される。
【０００５】
組織因子経路は、以下の工程からなる、（１）血管の破裂時に、第ＶＩＩ因子が血管系の外側の組織に存在する組織因子であるリポタンパク質と結合し、（２）第ＶＩＩ因子が、タンパク質分解的切断により、第ＶＩＩａ因子に活性化され、および（３）第ＶＩＩａ因子−組織因子複合体が、第Ｘ因子を開裂し、活性化させる。その後、組織因子経路は接触活性化経路と同一であり、すなわち、２つの経路は上記最後の３つの工程を共有している。
【０００６】
ＦＶＩＩＩの生合成、細胞内プロセッシングおよび分泌、ならびに次に血漿中で活性化されるメカニズムは、当該分野でよく知られている（例えば、Lentingら., Blood 92:3983-3996, 1998; Thompson, Seminars in 止血 29:11-22, 2003; Grawら., Nature Reviews: Genetics 6:489-501, 2005、参照）。ヒトＦＶＩＩＩは、最初に、２３５１個のアミノ酸の一本鎖ポリペプチド（配列番号：１）として翻訳され、最初の１９個のアミノ酸は、ＥＲ内でシグナルペプチダーゼにより除去されるシグナルペプチドを定義する。したがって、成熟ヒトＦＶＩＩＩは、ドメイン構造Ａ１−ａ１−Ａ２−ａ２−Ｂ−ａ３−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２を有する２３３２個のアミノ酸からなる（図１Ａ）。ＦＶＩＩＩは、Ｂドメインのカルボキシ−末端付近（Ｂ−ａ３接合点のＡｒｇ−１６４８）の切断により、分泌前に細胞内でグリコシル化され、プロセッシングされ、Ｂドメイン内、主にＡｒｇ−１３１３後で可変的に切断され、９０−２１０ｋＤａの重鎖および８０ｋＤａの軽鎖を生産する（図１Ｂ）。ＦＶＩＩＩは、その後、１つの重鎖および１つの軽鎖からなるヘテロダイマー糖タンパク質として分泌される。
【０００７】
血漿糖タンパク質ＦＶＩＩＩは、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷｆ）にしっかりと非共有結合的に結合した、血液中で不活性な前駆体として循環する。ＦＶＩＩＩは、３つのＡｒｇ−Ｓｅｒペプチド結合、すなわちＡｒｇ−３７２、Ａｒｇ−７４０およびＡｒｇ−１６８９後でトロンビンまたは第Ｘａ因子による切断によりタンパク質分解的に活性化され、それはｖＷｆから分離され、カスケードにおけるその凝血促進機能を活性化される。得られるヘテロトリマーはＦＶＩＩＩａとなる（図１Ｃ）。
【０００８】
その活性型（すなわち、ＦＶＩＩＩａ）において、ＦＶＩＩＩは、血液凝固の接触活性化経路において第Ｘ因子活性化の酵素複合体に対する補因子として機能し、それは血友病Ａを有する患者において減少しているか、または非機能的である。ＦＶＩＩＩ活性の減少レベルは、疾患の重症度に正比例する。したがって、ＦＶＩＩＩ欠乏の、またはＦＶＩＩＩに対する抗体を有する人々は、ＦＶＩＩＩで処置されない限り広範で深刻な症状を引き起こし得る非制御の内出血に罹患する。症状は、関節における炎症応答から早期死亡の範囲である。ＦＶＩＩＩの古典的な定義は、実際には、血友病Ａを有する個体由来の血漿における凝固欠損を正す正常血漿中に存在する物質である。ｖＷｆの欠損は、また、ｖＷｆが機能性ＦＶＩＩＩの重要な成分であるため、表現型血友病Ａを引き起こし得る。これらの場合において、血漿中のＦＶＩＩＩの循環半減期は、血液凝固におけるその特定の機能をもはや行うことができない程度に減少している。血友病Ａの現在の処置は、血漿由来または組換えＦＶＩＩＩの投与による欠損タンパク質の補充からなる。
【０００９】
ＦＶＩＩＩの活性を阻害する抗体（「インヒビター」または「阻害抗体」）の発現は、血友病Ａを有する患者の管理において深刻な合併症である。自己抗体は、ＦＶＩＩＩの治療的注入に応答して、血友病Ａを有する患者の約２０％において発現する。インヒビターを発現する以前に処置されていない血友病Ａを有する患者において、インヒビターは、通常、処置から１年以内に発現する。さらに、ＦＶＩＩＩを不活性化する自己抗体は、以前に正常ＦＶＩＩＩレベルを有する個体において時折発現する。インヒビター力価が十分に低いとき、患者はＦＶＩＩＩの用量を増加させることにより管理することができる。しかしながら、しばしば、インヒビター力価は、ＦＶＩＩＩにより圧倒されることができないほど高い。別の戦略は、第ＩＸ因子複合体調製物または組換えヒト第ＶＩＩａ因子を使用して正常な止血中のＦＶＩＩＩの必要性を迂回することである。さらに、ブタＦＶＩＩＩは、通常、ヒトＦＶＩＩＩよりもインヒビターと実質的にあまり反応性を有さないため、部分的に精製されたブタＦＶＩＩＩ調製物が使用され得る。ヒトＦＶＩＩＩに対して阻害抗体を発現した多数の患者は、ブタＦＶＩＩＩで成功裏に処置され、長期間のこのような処置に耐える。しかしながら、ブタＦＶＩＩＩの投与は、１以上の注入後に、ブタＦＶＩＩＩに対するインヒビターが発現し得るため、完全な解決ではない。したがって、組換えヒトＦＶＩＩＩまたは部分的に精製されたブタＦＶＩＩＩの使用は、全ての問題を解決していない。
【００１０】
阻害抗体に加えて、問題は、また、ＦＶＩＩＩが、静脈内に投与されたとき、循環中に比較的に短期の半減期（ヒトにおいて１３時間）を有することで生じ、頻繁な注入が必要であり、患者の投与コンプライアンスにおいて困難性をもたらす。したがって、週１回の投与またはさらに月１回の投与用の長期間作用性ＦＶＩＩＩは、満たされていない医学的要望である（Dargaudら., Expert Opinion on Biological Therapy 7:651-663, 2007）。より長期の保護は、ＦＶＩＩＩ半減期を延長することにより達成される。多くのＦＶＩＩＩの生物工学的アプローチが、より長期の保護を生じる目的のために探索される（Baruら., Thromb. Haemost. 93:1061-1068, 2005; Pipe, J. Thromb. Haemost. 3:1692-1701, 2005; Saenkoら., Haemophilia 12(Suppl 3):42-51, 2006）。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、修飾された活性および／または修飾された薬物動態学的特性（例えば、より長い循環半減期）を示すＦＶＩＩＩ変異体に関する。１つの例として、ＦＶＩＩＩ変異体は、アミノ酸配列（例えば、モジュレーター）がＦＶＩＩＩタンパク質のＢ−ドメイン部分もしくはＢ−ドメインのいずれかにおいて挿入されているか、またはＢ−ドメインの一部が該アミノ酸配列で置換されている融合またはヘテロダイマータンパク質であり得る。該挿入／置換アミノ酸配列はＦＶＩＩＩの翻訳後プロセッシングを中断させず、該ＦＶＩＩＩ変異体は凝固因子としての活性を有する。これらのＦＶＩＩＩ変異体は、血友病Ａを処置するために使用され得、例えば、より長い循環半減期によって、より少ない頻度の投与をもたらし得る。より少ない頻度の投与により、本発明のＦＶＩＩＩ変異体は、患者のコンプライアンスを改善させ、ＦＶＩＩＩが投与されるためにＦＶＩＩＩに対する免疫応答を発現する患者の可能性を減少させ得る。
【００１２】
発明の概要
本発明は、ＦＶＩＩＩ融合タンパク質およびその発現産物に関する（本明細書においてＦＶＩＩＩ融合ヘテロダイマーとしても称される）。本発明は、さらに、ハイブリッドＦＶＩＩＩ融合ヘテロダイマーおよびマルチマーＦＶＩＩＩ融合ヘテロダイマーに関する。１つの態様において、ＦＶＩＩＩ融合ヘテロダイマーは、ＦＶＩＩＩタンパク質またはポリペプチドおよびアミノ酸配列（本明細書においてモジュレーターとして称される）を含む。別の態様において、モジュレーター配列は、ＦＶＩＩＩ  Ｂドメインに挿入される。さらなる態様において、少なくともＢドメインの一部は、モジュレーター配列により欠失および置換されている。
【００１３】
本発明は、また、ＦＶＩＩＩ融合ヘテロダイマーをコードする核酸配列に関する。１つの態様において、核酸配列は、モジュレーター配列がＢドメインに存在するか、またはモジュレーター配列がＢドメインの一部または全てのアミノ酸配列を置換している、ＦＶＩＩＩタンパク質を含むＦＶＩＩＩ融合ヘテロダイマーをコードする。ＦＶＩＩＩ融合ヘテロダイマーをコードする核酸配列は、発現カセットに作動可能に連結し得る。本発明は、また、ＦＶＩＩＩ融合ヘテロダイマーを作製する方法を含む。例えば、ＦＶＩＩＩ融合ヘテロダイマーをコードする発現カセットは、すでに発現ベクターの一部でないとき、発現ベクターに導入され、次にＦＶＩＩＩ融合ヘテロダイマーの組換え生産のために適当な宿主細胞に導入される。生産された融合ヘテロダイマーは、インビトロおよびインビボでＦＶＩＩＩ活性を有し、例えば、インビボでの循環半減期の増加を示し得る。
【００１４】
本発明のさらなる態様において、ＦＶＩＩＩ融合ヘテロダイマーは、配列番号：１、３または５のいずれか１つのアミノ酸２０−７６４に対応する第１のアミノ酸配列、配列番号：１、３または５のいずれか１つのアミノ酸１６５６−２３５１に対応する第２のアミノ酸配列、およびモジュレーター配列を含み、（１）該モジュレーター配列が、そのアミノ末端で第１のアミノ酸配列のカルボキシル末端に共有結合しており、そのカルボキシル末端で第２のアミノ酸のアミノ末端に共有結合しているか、または（２）該モジュレーター配列が、そのアミノ末端で第１のアミノ酸配列のカルボキシル末端に共有結合しており、該モジュレーター配列が、第２のアミノ酸配列に共有結合していない。
【００１５】
本発明の別の態様において、核酸配列は、ＦＶＩＩＩ融合ヘテロダイマーをコードし、該ＦＶＩＩＩ融合ヘテロダイマーは、配列番号：１、３または５のいずれか１つのアミノ酸２０−７６４に対応する第１のアミノ酸配列、配列番号：１、３または５のいずれか１つのアミノ酸１６５６−２３５１に対応する第２のアミノ酸配列、およびモジュレーター配列を含み、該モジュレーター配列が、そのアミノ末端で第１のアミノ酸配列のカルボキシル末端に共有結合しており、そのカルボキシル末端で第２のアミノ酸のアミノ末端に共有結合している。加えて、本発明は、また、ベクター、宿主細胞、融合ヘテロダイマーを生産する方法および凝固欠乏症を処置する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａは、以下のドメイン：Ｓ（シグナルペプチド）、Ａ１、ａ１、Ａ２、ａ２、Ｂ、ａ３、Ａ３、Ｃ１およびＣ２をＮ−末端からＣ−末端に含む全長ヒトＦＶＩＩＩの構造を説明する。図１Ｂは、ヘテロダイマーヒト第ＶＩＩＩ因子の重鎖および軽鎖の構造を説明する。重鎖のサイズは、Ｂ−ドメイン内の可変タンパク質分解的切断の結果として変化する。図１Ｃは、活性ヒトＦＶＩＩＩ（すなわち、ＦＶＩＩＩａ）のサブユニットの構造を説明する。
【００１７】
【図２】図２は、実施例の部において記載されている本発明の第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの３つの典型的な態様を説明する。３つの態様は、「ＢＤＤＦｃ＋ヒンジ」、「ＢＤＤＦｃ−ヒンジ」、および「ＢＤＤＦｃ」（これらは、所望により、単離を容易にするために異種ペプチドタグを含み得る）を示す。３つの典型的な態様は、ダイマー（これらのＦｃ部分を介して）またはタンパク質凝集体を形成するそれらの能力において、およびＦｃＲｎに対するそれらの結合親和性において異なる。
【００１８】
【図３】図３は、実施例１および２にしたがって生産される第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質の構造ドメインを記載している。具体的には、マウスＦｃ領域（ヒンジ有りまたは無し）をＢ−ドメイン欠失（ＢＤＤ）第ＶＩＩＩ因子タンパク質の特定の部位（Ｎ−７４５からＳ−１６３７）に挿入し、Ｂ−ドメインの欠失部分を置換する。マウスＦｃ領域のＮ−末端およびＣ−末端側上の非欠失Ｂ−ドメイン部分のアミノ酸配列を示す。
【００１９】
【図４】図４は、実施例５にしたがって生産されるモノシストロン性ＢＤＤ．ｍＦｃモノマー構築物を説明する。
【００２０】
【図５】図５は、活性アッセイによる高い発現クローンの同定を説明する。ＢＤＤＦｃ＋ヒンジを発現するＨＫＢ１１の安定な細胞系を、ＦＶＩＩＩ  ａＰＰＴ凝固アッセイによりスクリーニングした。クローン（４、８、１２、１８、２７および３３）は、５００−３５００ｍＩＵ／ｍＬの範囲である高い凝固活性を示した。
【００２１】
【図６】図６は、ＥＬＩＳＡアッセイによる高い発現クローンの同定を説明する。ＢＤＤＦｃ＋ヒンジを発現するＨＫＢ１１の安定な細胞系を抗−ＦＶＩＩＩ捕捉ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。３つのクローン（クローン８、１８および２７）は、〜１ｕｇ／ｍＬでＢＤＤＦｃ＋ヒンジ融合を発現する。
【００２２】
【図７】図７は、ＢＤＤＦｃ＋ヒンジ融合タンパク質のタンパク質精製の結果を示す。還元ゲルにおいて、ＢＤＤＦｃ＋ヒンジは、８０−ｋＤａ軽鎖（Ｌ）、１１５−ｋＤａ重鎖（Ｈ）、および１９５−ｋＤａ未処理一本鎖（Ｕ）（レーン８）として分離された。非還元ゲルにおいて、ＢＤＤＦｃ＋ヒンジは、８０−、１１５−、１９５−ｋＤａバンド（レーン８）に加えて３９０−ｋＤａバンド（ダイマー）を生じた。
【００２３】
【図８】図８は、血友病Ａ（ＨｅｍＡ）マウスにおけるＢＤＤＦｃ−ヒンジ（「ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ」）およびＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの回収を示す。９匹のＨｅｍＡマウスに、５％のアルブミンを含む製剤バッファー中の５０μｇ／ｋｇ（４００ＩＵ／ｋｇ）（●）のＢＤＤＦｃ−ヒンジを与えた。さらなるＨｅｍＡマウスに、２００ＩＵ／ｋｇ（□）のＢＤＤＦｃ−ヒンジ由来の第ＶＩＩＩ因子変異体であるＢＤＤ−ＦＶＩＩＩを与えた。ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの減衰曲線と比較して、ＢＤＤＦｃ−ヒンジは、迅速な分配相と二相減衰を示した。ＢＤＤＦｃ−ヒンジのベータ相半減期は、５０μｇ／ｋｇで１１．９ｈｒあり、ベータ相半減期が６．０３ｈｒである修飾されていないＢＤＤ−ＦＶＩＩＩと比較して約２倍に改善された。
【００２４】
【図９】図９Ａは、ＢＤＤＦｃ＋ヒンジのＢＤＤ−Ｆｃキメラ鎖をウエスタンブロット分析において１１５ｋＤａバンドとして検出したことを説明する。一過性トランスフェクタント（ｔｒａｎｓ）および安定なプール（ｓｐ）の両方からのサンプルを５倍濃縮し、次に還元条件下で１０％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル上に流した。レーン：１）分子量マーカー；２）標準として精製されたＢＤＤタンパク質；３−５）ｐＳＫ２０７ベクター、ｐＳＫ２０７ＢＤＤ、およびｐＳＫ２０７ＢＤＤＦｃ＋ヒンジ、それぞれで一過性でトランスフェクトされたＨＫＢ１１細胞からの濃縮馴化培地；７−９）ｐＳＫ２０７ベクター、ｐＳＫ２０７ＢＤＤ、ｐＳＫ２０７ＢＤＤＦｃ＋ヒンジ、それぞれで安定にトランスフェクトされたＨＫＢ１１細胞の安定なプールからの濃縮馴化培地。ブロットは、ＨＲＰ−接合抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で探査した。未処理一本鎖形態のＢＤＤＦｃ＋ヒンジ（「ｓｃ  ＢＤＤ−Ｆｃ」）は、１９５ｋＤａバンドとして検出され、ＢＤＤＦｃ＋ヒンジのヘテロダイマー型は、１１５ｋＤａの第ＶＩＩＩ因子重鎖およびＦｃ（「重鎖Ｆｃ」）のキメラを含んだ。ＨＲＰ−接合抗−マウスＩｇＧにより結合しないため、ヘテロダイマーＢＤＤＦｃ＋ヒンジの軽鎖に関するバンドは現れない。図９Ｂは、ＢＤＤＦｃ軽鎖がウエスタンブロット分析において８０ｋＤａバンドとして検出されたことを示す。タンパク質サンプルを還元条件下で１０％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル上に流した。レーン：１）分子量マーカー；２）標準として精製されたＢＤＤタンパク質；３−５）ｐＳＫ２０７ベクター、ｐＳＫ２０７ＢＤＤ、およびｐＳＫ２０７ＢＤＤＦｃ＋ヒンジ、それぞれで一過性でトランスフェクトされたＨＫＢ１１細胞からの濃縮馴化培地。ブロットは、ＦＶＩＩＩ軽鎖特異的抗体で探査した。
【００２５】
【図１０】図１０は、第ＶＩＩＩ因子活性アッセイの結果を示す。ｐＳＫ２０７ＢＤＤＦｃ＋ヒンジ（「Ｆｃ＋ヒンジ  ｓｕｐ」）およびｐＳＫ２０７ＢＤＤＦｃ−ヒンジ（「Ｆｃ−ヒンジ  ｓｕｐ」）で一過性でトランスフェクトされたＨＫＢ１１細胞からの馴化培地を回収し、Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）アッセイおよびａＰＰＴ凝固アッセイの両方においてＦＶＩＩＩ活性に対して試験した。コントロールとして、修飾されていない第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするベクターｐＳＫ２０７およびｐＳＫ２０７ＢＤＤ（「ＢＤＤ  ｓｕｐ」）を、トランスフェクションならびに活性アッセイにおいて使用した。
【００２６】
【図１１】図１１は、第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーに対する第ＶＩＩＩ因子活性を示す。ＨＫＢ１１細胞［（ＢＤＤＦｃ＋ヒンジ一過性トランスフェクタント（Ｔｒ）および安定なプール（Ｓｐ）］からの馴化培地を、ウサギ−抗−マウスＦｃ抗体であらかじめ被覆された９６−ウェルプレート上に負荷した。室温で２時間インキュベーション後、プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０／ＢＳＡで３回洗浄し、Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）アッセイの前に非特異的結合を除去した。
【００２７】
【図１２】図１２は、ＢＤＤＦｃ＋ヒンジがダイマーを形成し、ＢＤＤＦｃ−ヒンジがモノマーであることを証明する。ウエスタンブロット分析を、ｐＳＫ２０７ＢＤＤＦｃ＋ヒンジまたはｐＳＫ２０７ＢＤＤＦｃ−ヒンジ発現ベクターでトランスフェクトされたＨＫＢ１１細胞からの５倍濃縮馴化培地を使用して行った。サンプルを、還元および非還元条件下で４−１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル上に流した。ブロットは、ウサギモノクローナル抗−ＦＶＩＩＩ軽鎖抗体（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）、次にＨＲＰ−接合抗−ウサギＩｇＧ二次抗体で探査した。未処理一本鎖ＢＤＤおよびＢＤＤＦｃは、それぞれ１７０−ｋＤａおよび１９５−ｋＤａバンドとして検出された。レーン：ＢＤＤ−−精製されたＢＤＤタンパク質；＋Ｈ−−ＢＤＤＦｃ＋ヒンジ；−Ｈ−−ＢＤＤＦｃ−ヒンジ；およびＶ−−ｐＳＫ２０７ベクター単独。
【００２８】
【図１３】図１３は、固定されたマウスＦｃＲｎに結合するマウスＦｃＲｎ結合エピトープを組み込むＢＤＤＦｃ＋ヒンジおよびＢＤＤＦｃ−ヒンジ（「ＢＤＤＦｃ−Ｈ」）の能力を測定するＢｉａｃｏｒｅＴＭ試験の結果を示す。ＢＤＤＦｃ＋ヒンジ（「ＢＤＤＦｃ＋Ｈ」）、ＢＤＤＦｃ−ヒンジ（「ＢＤＤＦｃ−Ｈ」）、ＢＤＤ、および全長組換え第ＶＩＩＩ因子（「ＦＶＩＩＩ」）。検出可能な結合は、ＢＤＤまたは全長第ＶＩＩＩ因子で見られなかった。ＢＤＤＦｃ＋ヒンジおよびＢＤＤＦｃ−ヒンジ融合タンパク質は、ｍＦｃＲｎに対する強い結合をｎＭの親和性で示した。
【００２９】
【図１４】図１４は、固定されたヒトフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）に結合するＢＤＤＦｃ＋ヒンジおよびＢＤＤＦｃ−ヒンジの能力を測定するＢｉａｃｏｒｅＴＭ試験の結果を示す。マウスＦｃＲｎを、アミンカップリングによりＣＭ−５チップ上に固定した。ＢＤＤＦｃ＋ヒンジ（「ＢＤＤＦｃ＋Ｈ」）、ＢＤＤＦｃ−ヒンジ（「ＢＤＤＦｃ−Ｈ」）、ＢＤＤ、および全長組換え第ＶＩＩＩ因子（「ＦＶＩＩＩ」）は、ｖＷＦに対するナノモル以下の親和性を示す。
【００３０】
【図１５】図１５は、ＢＤＤＦｃ−ヒンジがＨｅｍＡマウスの尾静脈切断出血モデルにおいて有効であることを示す。ＢＤＤＦｃ−ヒンジは、インビボで出血を処置する機能性があるか否かを決定するために、１つの側部尾静脈の切断の４８時間前に、ＨｅｍＡマウスにＢＤＤＦｃ−ヒンジ、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩまたは輸送媒体コントロールを尾静脈を介して注射した。損傷２４時間後１０％のみ生存する輸送媒体コントロール群（▲）と比較して、１２ＩＵ／ｋｇ（●）および６０ＩＵ／ｋｇ（■）のＢＤＤＦｃ−ヒンジは、それぞれ２５％および８０％の生存を成し遂げた。ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ−ヒンジの有効性を、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩと比較して４０ＩＵ／ｋｇで６０％生存となる（◆）と評価した。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の説明
本発明は、記載されている特定の方法論、プロトコール、細胞系、動物種または属、構築物、および試薬に限定されず、それ自体変化し得ると理解すべきである。また、本明細書において使用される用語は特定の態様のみを記載するための目的であり、本発明の範囲を限定する意図はなく、特許請求の範囲のみにより限定されると理解すべきである。
【００３２】
文脈が明白に他に指示されていない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「１つ(a、an)」および「その(the)」は、複数形を含むことに注意すべきである。したがって、例えば、「１つのタンパク質」の言及は、１つ以上のタンパク質の言及であり、当業者に知られているものと同等物などを含む。
【００３３】
他に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および学術用語は、本発明が属する当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等のあらゆる方法、デバイスおよび物質が本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法、デバイスおよび物質はここに記載されている。
【００３４】
本明細書に記載されている全ての文献および特許は、本願発明に関連して使用され得る刊行物において記載されている、例えば、構築物および方法論を記載および開示する目的のために、出典明示により本明細書に包含させる。上記および明細書中の刊行物は、単に本特許出願の出願時前の開示のために提供される。本発明者らが以前の発明によってこのような開示に先行する権利がないと認めると、本明細書において解釈されるべきでない。
【００３５】
本明細書において使用される、種々の用語は以下に定義されている。
【００３６】
「核酸」は、一本鎖または二本鎖型のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを示す。具体的に限定されていないかぎり、該用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然ヌクレオチドと同様の様式において代謝される、既知の天然ヌクレオチドの類似体を含む核酸を含む。他に記載のない限り、特定の核酸配列は、また、保存的に修飾されたそれらの変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列ならびに明白に示されている配列を暗に含む。縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を産生することにより達成され得る。核酸なる用語は、文脈に依存して、遺伝子、ｃＤＮＡおよび遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと互換的に使用される。
【００３７】
「遺伝子由来の核酸」は、合成遺伝子またはその部分配列が最終的に鋳型として使用されている核酸を示す。したがって、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡ、ｃＤＮＡから転写されるＲＮＡ、ｃＤＮＡから増幅されるＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されるＲＮＡなどは遺伝子由来であり、このような由来産物の検出は、サンプル中の元の遺伝子および／または遺伝子転写産物の存在および／または存在量を示す。
【００３８】
核酸配列は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれているとき、「作動可能に連結」または「作動可能に挿入」されている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列に作動可能に連結していてよい。作動可能に連結された核酸配列は、２つのタンパク質コード領域で隣接および／または結合していてもよい。いくつかの核酸配列は、作動可能に連結しているが、隣接していないかもしれない。核酸配列の連結は、制限酵素認識部位でのライゲーションにより達成され得る。このような部位が存在しないとき、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーは、慣用の実施にしたがって使用され得る。
【００３９】
生物学的活性を有する第１のポリペプチドは、少なくとも最小限のレベルの生物学的活性が第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの両方により維持されているような、第２のポリペプチドとの機能的な関係に置かれているとき、生物学的活性を有する第２のポリペプチドに「作動可能に連結」されている。ポリペプチドの文脈において、作動可能な連結は、第１および第２のポリペプチドが隣接することを必ずしも意味しない。当業者が理解できるとおり、生物学的活性の維持は、ペプチドリンカーの包含により促進され得る。
【００４０】
ポリペプチド、核酸、または他の成分は、通常、関連している成分（他のペプチド、ポリペプチド、タンパク質（天然配列に伴って起こり得る複合体、例えば、ポリメラーゼおよびリボソームを含む）、核酸、細胞、合成試薬、細胞汚染物、細胞成分など）、例えば、通常、元の由来する細胞と関連している他の成分から部分的に、または完全に分離されているとき、「単離」されている。ポリペプチド、核酸または他の成分は、組成物、混合物または成分の回収物に存在する優勢な種類である（すなわち、モル基準において、組成物中の他のあらゆる個々の種類よりも豊富である）ように、自然環境の他の成分から部分的に、または完全に回収されるか、または分離されているとき、単離されている。場合によっては、調製物は、約６０％、７０％または７５％以上、一般的に約８０％以上、または約９０％以上の単離された種類からなる。
【００４１】
「実質的に純粋な」核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）、ポリペプチド、タンパク質、または組成物は、また、対象の種類（例えば、核酸またはポリペプチド）が、組成物中に存在する全ての分子の種類の少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０または９５重量パーセントを含むことを意味する。対象の種類を、また、十分な同質性に精製することができ（汚染の種類が慣用の検出方法により組成物中で検出することができない）、組成物が本質的に単一の高分子の種類の誘導体からなる。
【００４２】
「精製」なる用語は、一般的に、核酸、ポリペプチドまたはタンパク質が、少なくとも約５０％純粋、６０％純粋、７０％純粋、７５％純粋、８５％純粋、および９９％純粋であることを意味する。
【００４３】
「組換え」なる用語は、例えば、一般的に、細胞、ポリヌクレオチド、ベクター、タンパク質またはポリペプチドに関して使用されるとき、細胞、ポリヌクレオチドまたはベクターが異種（または外来）核酸の導入または天然の核酸の変化により修飾されているか、またはタンパク質またはポリペプチドが異種アミノ酸の導入により修飾されているか、または細胞がそのように修飾されている細胞由来であることを示す。組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）型において見出されないであろう核酸配列を発現するか、または天然の核酸配列を発現するが、異常に発現するか、あまり発現しないか、または全く発現しない。「組換え」なる用語は、細胞を基準にして使用されるとき、細胞が異種核酸を複製するか、または異種核酸によってコードされるポリペプチドを発現することを示す。組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）型内に見られないコード配列を含み得る。組換え細胞は、また、人工的手段により、修飾され、細胞に再導入されている、細胞の天然型において見られるコード配列を含み得る。該用語は、また、細胞から核酸を除去することなく修飾されている細胞に対して内在的な核酸を含む細胞を包含し、このような修飾は、遺伝子置換、部位特異的変異、再結合、および関連技術により得られるものを含む。
【００４４】
「組換え的に生産」なる用語は、核酸セグメントの再帰的な配列再結合もしくはヌクレオチドの他の多様な産生方法（例えば、シャッフリング）のいずれかの化学合成手段、または、例えば、当業者に知られている遺伝子操作技術による、核酸の単離されたセグメントの操作により通常、達成される人工的組合せを示す。「組換え的に発現」は、一般的に、インビトロでの組換え核酸の生産およびインビボ、インビトロまたはエキソビボでの組換え核酸の発現または増殖され得る細胞への移動のための技術を示す。
【００４５】
「組換え発現カセット」または単に「発現カセット」は、このような配列に適合する宿主において構造タンパク質をコードする核酸の発現に影響することができる核酸因子と共に、組換え的に、または合成的に産生される核酸構築物を示す。発現カセットは、必ずしも転写されるべき核酸（例えば、所望のポリペプチドをコードする核酸）、およびプロモーターを含まない。発現の影響において必要な、もしくは補助的なさらなる成分も、また、本明細書に記載されているとおりに使用され得る。例えば、発現カセットは、また、宿主細胞から発現されたタンパク質の分泌を指向する選別シグナル（例えば、シグナルペプチドまたは分泌リーダー配列）をコードするヌクレオチド配列を含み得る。転写終結シグナル、エンハンサー、および遺伝子発現に影響する他の核酸配列も、また、発現カセットに含まれ得る。本発明の目的のために、「第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子を含む発現カセット」は、発現カセットにより発現される所望のタンパク質が、さらに以下で定義されている「第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質」であることを示す。
【００４６】
「ベクター」なる用語は、文脈に依存して、クローニングベクター、発現ベクター、またはその両方を示し得る。ベクターなる用語および「プラスミド」なる用語は互換的に使用される。
【００４７】
「発現ベクター」または「発現プラスミド」なる用語は、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進するように、発現カセットを宿主細胞に導入することができる輸送媒体を示す。
【００４８】
「発現する」および「発現」なる用語は、遺伝子またはＤＮＡ配列における情報を明らかにする、または明らかに誘導する、例えば、対応する遺伝子またはＤＮＡ配列の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによりタンパク質を生産することを意味する。ＤＮＡ配列は、細胞において、または細胞により発現され、「発現産物」、例えば、タンパク質を形成する。発現産物それ自体、例えば、得られたタンパク質も、また、「発現」されたと言う。発現産物は、細胞内、細胞外、または分泌として特徴付けることができる。
【００４９】
「アミノ酸修飾」は、所定のアミノ酸配列のアミノ酸配列における変化を示す。典型的な修飾は、アミノ酸置換、挿入および／または欠失を含む。
【００５０】
「アミノ酸挿入」は、少なくとも１つのアミノ酸の所定のアミノ酸配列への取り込みを示す。挿入は、１つまたは２つのアミノ酸残基の挿入またはより長い挿入からなり得る。挿入される残基は、上記のとおり天然または非天然であり得る。
【００５１】
「アミノ酸欠失」は、所定のアミノ酸配列から少なくとも１つのアミノ酸残基の除去を示す。
【００５２】
「アミノ酸置換」は、所定のアミノ酸配列における少なくとも１つの存在するアミノ酸残基の、別の異なる「置換」アミノ酸残基での置換を示す。置換残基は、「天然アミノ酸残基」（すなわち、遺伝子コードによってコードされる）であり得、アラニン（Ａｌａ）；アルギニン（Ａｒｇ）；アスパラギン（Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）；システイン（Ｃｙｓ）；グルタミン（Ｇｌｎ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グリシン（Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉｌｅ）：ロイシン（Ｌｅｕ）；リジン（Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐｒｏ）：セリン（Ｓｅｒ）；スレオニン（Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｔｒｐ）；チロシン（Ｔｙｒ）；およびバリン（Ｖａｌ）からなる群から選択される。１つまたはそれ以上の非天然アミノ酸残基での置換も、また、本明細書においてアミノ酸置換の定義により包含される。「非天然アミノ酸残基」は、ポリペプチド鎖において隣接アミノ酸残基に共有結合することができる上記天然アミノ酸残基以外の残基を示す。非天然アミノ酸残基の例は、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、および他のアミノ酸残基類似体、例えば、Ellmanら. (Meth. Enzym. 202:301-336, 1991)に記載されているものを含む。このような非天然アミノ酸残基を産生するために、Norenら. (Science 244:182, 1989)およびEllmanら., 1991の方法を使用され得る。簡潔には、これらの方法は、非天然アミノ酸残基でのサプレッサーｔＲＮＡの化学的活性化、次にインビトロでのＲＮＡの転写および翻訳を含む。最後に、当業者は、例えば、タンパク質の領域のアミノ酸置換が１つの工程、または２つの工程（例えば、アミノ酸欠失、次にアミノ酸挿入により、または逆もまた同様）において達成されることができることを認識している。
【００５３】
特定のポリペプチドまたはタンパク質の「変異体」は、本明細書で定義されている少なくとも１つの「アミノ酸修飾」によって特定のポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。「変異体」は、所望の活性を示すポリペプチドまたはタンパク質のフラグメント、例えば、ＦｃＲｎへ結合し、凝固因子と結合しているとき、循環半減期を改善するＩｇＧのＦｃ領域のフラグメントを含む。
【００５４】
「融合ポリペプチド」は、天然に同じポリペプチドにおいて生じることが見られない少なくとも２つの別々のペプチド部分を含むポリペプチドを示す。
【００５５】
「融合タンパク質」は、少なくとも１つの融合ポリペプチドを含むタンパク質を示す。したがって、マルチ−サブユニットタンパク質は、サブユニットの１つのみが融合ポリペプチドであるときでさえ、融合タンパク質として示される。
【００５６】
「ＦＶＩＩＩ」、「第ＶＩＩＩ因子」または「第ＶＩＩＩ因子タンパク質」なる用語は、機能的対立遺伝子変異体を含む野生型第ＶＩＩＩ因子タンパク質、または第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性を有するそのあらゆる誘導体、変異体もしくは類似体を包含することを意図する。この定義の目的のために、「第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性」は、血液凝固の内因性経路に参加することができる能力を示す。一般的に、この生物学的活性は、市販されている第ＶＩＩＩ因子アッセイ（Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）、ｄｉａＰｈａｒｍａ（登録商標）、West Chester, Ohio）または当該分野における他のアッセイを使用して、血漿由来の第ＶＩＩＩ因子標準を基準にして決定され得る。
【００５７】
第ＶＩＩＩ因子ドメインについて記載されているとき、「ドメイン」は、当業者に知られている第ＶＩＩＩ因子の隣接領域を示すために使用される。ヒト第ＶＩＩＩ因子に対して、異なる第ＶＩＩＩ因子ドメインに対するアミノ酸番号付けは、図１において示されている。
【００５８】
「第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子」は、さらに以下で定義されている「第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質」をコードし、Ｂドメインコード部分に対応する第ＶＩＩＩ因子タンパク質コード配列内の位置で、モジュレーターをコードする核酸の第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードする核酸への作動可能な挿入により生産され得る非天然核酸構築物を示す。１つの例として、Ｂドメインコード配列の少なくとも１部分が、モジュレーターをコードする核酸により欠失および置換されている。当業者により理解されるとおり、「作動可能な挿入」は、モジュレーターをコードする１部およびモジュレーターをコードする核酸の上流および下流にある第ＶＩＩＩ因子の１部をコードする核酸が全て適当なリーディングフレーム内にある核酸構築物を生産するモジュレーターをコードする核酸の挿入を包含することを意図するのみである。第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子は、ペプチドリンカーまたは多重合配列をコードするさらなる核酸配列をさらに含み得る。最後に、上記定義の目的のために、「遺伝子」は、他に、転写、翻訳、または適当な翻訳後プロセッシングを可能にするために必要とされる任意の核酸配列（すなわち、プロモーター、エンハンサー、シグナルペプチド、分泌リーダー配列など）の存在を意味することを意図しない。
【００５９】
「第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質」は、翻訳後プロセッシングをまだ受けていない第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子の転写および翻訳により生産される全長ポリペプチドを示す。翻訳後プロセッシング中に、第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質は、以下で定義されている「第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー」に変換される。
【００６０】
「第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー」は、第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性を有し、第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子の転写および翻訳、およびそれにより生産された第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質の翻訳後修飾（タンパク質分解プロセッシングを含む）の結果として生産されるヘテロダイマータンパク質を示す。したがって、第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーは、血漿中の循環が見られる野生型第ＶＩＩＩ因子のヘテロダイマー型（すなわち、重鎖および軽鎖を含む）に類似している。本発明の第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーは、例えば、「修飾された重鎖」（すなわち、モジュレーターを含み、また、Ｂ−ドメインの少なくとも１つの部分の欠失を有し得る第ＶＩＩＩ因子重鎖）から構成されるという点において起源の第ＶＩＩＩ因子タンパク質のヘテロダイマー型と異なっていてよい。本発明の第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーは、融合ヘテロダイマーが起源の第ＶＩＩＩ因子タンパク質と比較して、例えば、循環半減期の増加を示し得る。「第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー」は、また、以下でさらに定義されている「マルチマー」および「ハイブリッド」第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーを包含し得る。
【００６１】
「マルチマー第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー」は、少なくとも２つの第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーを含むタンパク質を示す。マルチマー第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーは、第１の第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーに存在するモジュレーターのアミノ酸、ペプチド、またはポリペプチド部分が、第２の第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーに存在するモジュレーターの同種または異種部分との非共有結合性または共有結合性会合を仲介することができるとき、生じ得る。例えば、ＩｇＧのＦｃ部分のヒンジ領域は、第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーが、同一のアミノ酸配列（マルチマー第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーが「ホモ−マルチマー第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー」として称することができる場合）または異なるアミノ酸配列（マルチマー第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーが「ヘテロ−マルチマー第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー」として称することができる場合）を有するかにかかわらず、２つの第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー間の共有結合性会合を仲介することができる。マルチマー第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーは、また、モジュレーターをコードする核酸に加えて、第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子が、同種アミノ酸、ペプチド、またはポリペプチド（「ホモ−多重合配列」として以下で称される）、または、異種ペプチドまたはポリペプチド（「ヘテロ−多重合配列」として以下で称される）との非共有結合性または共有結合性会合を仲介することができるアミノ酸、ペプチド、またはポリペプチドをコードする作動可能に連結している核酸を含むとき、生じ得る。当業者は、第１の第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子のみがヘテロ−多重合配列を含むとき、第２の異なる第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子がマルチマー第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーを生産するために必要とされ得ることを認識している。例えば、当業者は、米国特許第５，８０７，７０６号に記載されている「空洞への隆起(protuberance-into-cavity)」手法を利用するために、２つの第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子を入手することを認識する。マルチマー第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの組換え生産に関して、当業者は、ホモ−マルチマー型は単一の組換え宿主細胞により生産され得るが、ヘテロ−マルチマー型は単一の宿主細胞内での共発現または複数の宿主細胞（同じか、または異なっている細胞培養系における）における別々の発現により生産され得ることを認識している。現在既知の手法に限定することを意図しないが、以下の非限定的な文献において教示されているマルチマーポリペプチドを生産するための一般的な手法は、マルチマー第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの生産における使用に適している：米国特許公報第２００７／０２８７１７０号；米国特許第７，１８３，０７６号において記載されている「multimerization domain」手法、例えば、免疫グロブリン部分を使用するもの；米国特許第５，９３２，４４８号において使用されているＦｏｓ  ａｎｄ  Ｊｕｎ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒｓの使用；および米国特許第６，８３３，４４１号において使用されている「heterodimerization sequence」手法
【００６２】
「ハイブリッド第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー」は、少なくとも１つの他のポリペプチドと共有結合性または非共有結合性会合する第１の第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーのみを含む本発明のあらゆる組換えタンパク質を示す。当業者は、モジュレーターが、ダイマーまたはマルチマー（例えば、免疫グロブリンのダイマーＦｃ領域）を形成することができるとき、マルチマー第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー（上記定義のとおり）を生産することができることを認識している。しかしながら、当業者は、マルチマー半減期モジュレーターのすべてのポリペプチドが、第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質として発現される必要性がないことを認識している。例えば、Ｆｃ領域がモジュレーターとして使用されるとき、Ｆｃ領域のみ（またはアフィニティータグまたは非第ＶＩＩＩ因子ペプチド、タンパク質またはタンパク質フラグメントに作動可能に連結したＦｃ領域）をコードする発現カセットが、第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子を含む発現カセットを含む同じまたは異なっている宿主細胞に導入され得る。当業者は、また、モジュレーターがダイマーまたはマルチマーを形成することができないときでさえ、ハイブリッド第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーが設計され得ることを認識している。具体的には、ホモ−またはヘテロダイマー配列は、第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子内にモジュレーターをコードする核酸に対して５’（発現するときにＮ−末端）または３’（すなわち、発現するときにＣ−末端）のいずれかで位置し得る。
【００６３】
「モジュレーター」なる用語は、タンパク質（例えば、第ＶＩＩＩ因子）の挿入または置換されたとき、例えば、タンパク質の活性および／または薬物動態学的特性を修飾するあらゆるポリペプチド、タンパク質、タンパク質フラグメント、またはそれらの変異体（１つ以上のポリペプチドサブユニットから構成される）を示す。１つの例として、「半減期モジュレーター」は、起源のタンパク質と比較して、タンパク質（例えば、該挿入または置換の結果として生産される、第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー、ハイブリッド第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー、またはマルチマー第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー）の循環半減期を増加または減少させ得る。半減期モジュレーターは、例えば、タンパク質（例えば、第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー、ハイブリッド第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー、またはマルチマー第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー）の循環半減期を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％増加させ得る。１つの態様において、半減期モジュレーターは、第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー、ハイブリッド第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー、またはマルチマー第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの循環半減期を、起源の第ＶＩＩＩ因子タンパク質と比較して、少なくとも約２倍増加させ得、さらなる態様において、循環半減期を、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍またはそれ以上増加させる。別の態様において、半減期モジュレーターは、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のあらゆる内因性因子、例えば、限定はしないがＢ−ドメインを含まない。
【００６４】
ペプチド薬物を患者へ投与する文脈において本明細書において使用される「循環半減期」、「血漿半減期」、「血清半減期」または「ｔ［１／２］」なる用語は、患者における薬物の血漿濃度が２分の１にまで減少するために必要な時間として定義され得る。多数のクリアランスメカニズム、再分配、および当該分野でよく知られている他のメカニズムに依存して、ペプチド薬物と関連する１つ以上の半減期があり得る。通常、アルファおよびベータ半減期は、アルファ相は再分配と関連し、ベータ相はクリアランスと関連するように定義される。しかしながら、大部分、血流に留まっているタンパク質薬物で、少なくとも２つのクリアランス半減期があり得る。本発明の目的のために、ベータ半減期は、投与後に適当に選択された時点で血漿タンパク質レベル（例えば、抗原ＥＬＩＳＡを使用して）を測定すること、または適当に選択された時点で凝固活性（例えば、Ｃｏａｔｅｓｔアッセイを使用して）を測定することにより計算されうる。「半減期」のさらなる説明は、Pharmaceutical Biotechnology(1997, DFA Crommelin and RD Sindelar, eds., Harwood Publishers, Amsterdam, pp 101-120)において見いだされ得る。
【００６５】
第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子の構築
本発明の１つの局面は、第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子に関する。第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子は、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得る。上記のとおり、第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質をコードする核酸分子である。第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子コード配列、モジュレーターをコードする核酸、および、所望により、モジュレーターをコードする核酸と異なるホモもしくはヘテロ−多重合配列をコードする核酸由来である。第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子のこれらの因子は以下でさらに詳細に記載されているが、第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子の構築が、よく知られている方法を使用してこれらの別々の因子をコードする核酸から合成することができることを当業者は理解している。本発明における使用で見いだされ得る種々の方法は、Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001)、およびCurrent Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons)に記載されている。
【００６６】
第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸の選択
本発明の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質およびヘテロダイマーは、野生型第ＶＩＩＩ因子、存在し、ある個体から別の個体で発生し得る第ＶＩＩＩ因子の天然対立遺伝子変異体、キメラ第ＶＩＩＩ因子（例えば、ヒト／ブタ）、または、他の点で修飾されており、凝血促進機能をなお維持している変異体第ＶＩＩＩ因子、例えば、野生型第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩａ因子タンパク質の特性、例えば、グリコシル化部位およびパターン、抗原性、比活性、循環半減期、タンパク質分泌、第ＩＸａ因子および／または第Ｘ因子に対する親和性、変更された第ＶＩＩＩ因子−不活性化切断部位、活性化された第ＶＩＩＩａ因子形態の安定性、免疫原性、保存期間などに影響するように修飾されている変異体をコードする核酸を修飾することにより製造され得る。本発明にしたがって修飾され得る適当な変異体第ＶＩＩＩ因子配列は、野生型第ＶＩＩＩ因子と関連する凝血促進機能を有する以前に知られているか、または後に同定される任意のあらゆる変異体第ＶＩＩＩ因子配列を含み得る。
【００６７】
本発明にしたがって修飾することができる適当な野生型第ＶＩＩＩ因子は、限定はしないが、哺乳動物、例えば、ヒト（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ５２４８４（アミノ酸）（配列番号：１）およびＫ０１７４０（ヌクレオチド）（配列番号：２）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ５２４８５（アミノ酸）（配列番号：３）およびＭ１４１１３（ヌクレオチド）（配列番号：４）、およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ５２４２０（アミノ酸）（配列番号：５）、参照）；ラット（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＱ２１５８０（アミノ酸）およびＡＹ３６２１９３（ヌクレオチド）、参照）；マウス（ｓｅｅ、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ３７３８５（アミノ酸）およびＬ０５５７３（ヌクレオチド）、参照）；イヌ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ８７４１２（アミノ酸）およびＡＦ０１６２３４（ヌクレオチド）、参照）；コウモリ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣＣ６８９１７（アミノ酸）およびＤＰ０００７２５（ヌクレオチド）、参照）；ニワトリ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＯ３３３６７（アミノ酸）およびＡＦ４６５２７２（ヌクレオチド）、参照）；チンパンジー（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿５２９２１２（アミノ酸）およびＸＭ＿５２９２１２（ヌクレオチド）、参照）；ブタ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号．ＮＰ＿９９９３３２（アミノ酸）およびＮＭ＿２１４１６７（ヌクレオチド）、参照）；ウサギ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣＡ４２５５６（アミノ酸）およびＥＵ４４７２６０（ヌクレオチド）、参照）；ネコ、サル、モルモット、オランウータン、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギまたは他の哺乳動物種を含む種々の動物由来であり得る。ヒト、ブタ、マウスおよびイヌに対する配列は、また、Haemophilia A Mutation, Structure, Test and Resource Site（またはＨＡＭＳＴｅＲＳ）を介して電子的に利用でき、これは、ヒト、ブタ、マウスおよびイヌの第ＶＩＩＩ因子タンパク質のアラインメントをさらに提供する。当業者が理解できるとおり、哺乳動物の第ＶＩＩＩ因子タンパク質中の保存および相同性はよく知られている。
【００６８】
本発明にしたがって修飾され得る適当な変異体第ＶＩＩＩ因子の１つの非限定的な例は、天然ヒトＦＶＩＩＩのＢ−ドメインの１４個のアミノ酸（ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ、配列番号：６）の他全ての欠失を含むアミノ酸配列を有することにより特徴付けられるＢ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子（「ＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子」）である（Lindら., Eur. J. Biochem. 232:19-27, 1995）。このＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子は、配列番号：７のアミノ酸配列を有する。
【００６９】
本発明にしたがって修飾され得る適当な変異体第ＶＩＩＩ因子の別の非限定的な例は、ヒト第ＶＩＩＩ因子の抗原性に関与するヒトアミノ酸残基に対する置換基として１つ以上の動物アミノ酸残基を含むキメラヒト／動物第ＶＩＩＩ因子である（例えば、米国特許第５，３６４，７７１；５，６６３，０６０；および５，８８８，９７４号、参照）。例えば、動物（例えば、ブタ）残基置換は、１つ以上のＲ４８４Ａ、Ｒ４８８Ｇ、Ｐ４８５Ａ、Ｌ４８６Ｓ、Ｙ４８７Ｌ、Ｙ４８７Ａ、Ｓ４８８Ａ、Ｓ４８８Ｌ、Ｒ４８９Ａ、Ｒ４８９Ｓ、Ｒ４９０Ｇ、Ｌ４９１Ｓ、Ｐ４９２Ｌ、Ｐ４９２Ａ、Ｋ４９３Ａ、Ｇ４９４Ｓ、Ｖ４９５Ａ、Ｋ４９６Ｍ、Ｈ４９７Ｌ、Ｌ４９８Ｓ、Ｋ４９９Ｍ、Ｄ５００Ａ、Ｆ５０１Ａ、Ｐ５０２Ｌ、１５０３Ｍ、Ｌ５０４Ｍ、Ｐ５０５Ａ、Ｇ５０６Ａ、Ｅ５０７Ｇ、１５０８Ｍ、１５０８Ａ、Ｍ２１９９Ｉ、Ｆ２２００Ｌ、Ｌ２２５２Ｆ、Ｖ２２２３Ａ、Ｋ２２２７Ｅ、および／またはＬ２２５１を含み得るが、これらに限定されない（例えば、米国特許第５，８５９，２０４および６，７７０，７４４号ならびに米国特許公報第２００３／０１６６５３６号、参照）。
【００７０】
本発明にしたがって修飾され得る適当な変異体第ＶＩＩＩ因子の別の非限定的な例は、融合Ａ２およびＡ３ドメインによって活性化された第ＶＩＩＩ因子のより良い安定性により特徴付けられる第ＶＩＩＩ因子である。例えば、第ＶＩＩＩ因子は、位置６６４および１８２６でシステイン残基に置換することにより修飾され、Ａ２およびＡ３ドメインに共有結合するＣｙｓ６６４−Ｃｙｓ１８２６ジスルフィド結合を含む変異体第ＶＩＩＩ因子をもたらし得る（Galeら., J. Thromb. Haemost. 1:1966-1971, 2003）。
【００７１】
本発明にしたがって修飾され得る適当な変異体第ＶＩＩＩ因子のさらなる非限定的な例は、変更された不活性化切断部位を有する第ＶＩＩＩ因子である（例えば、Amanoら., Thromb. Haemost. 79:557-63, 1998; Thornburgら., Blood 102:299, 2003、参照）。これらの変化は、通常、野生型第ＶＩＩＩ因子を不活性化する切断酵素に対する変異体第ＶＩＩＩ因子の感受性を減少させるために使用され得る。
【００７２】
本発明にしたがって修飾され得る適当な変異体第ＶＩＩＩ因子の別の非限定的な例は、第ＩＸａ因子（例えば、Fayら., J. Biol. Chem. 269:20522-20527, 1994); Bajajら., J. Biol. Chem. 276:16302-16309, 2001;およびLentingら., J. Biol. Chem. 271:1935-1940, 1996、参照）および／または第Ｘ因子（例えば、Lapanら., J. Biol. Chem. 272:2082-2088, 1997、参照）に対する親和性が増強されている第ＶＩＩＩ因子である。
【００７３】
本発明にしたがって修飾され得る適当な変異体第ＶＩＩＩ因子の別の非限定的な例は、第ＶＩＩＩ因子の分泌を増強するように修飾されている第ＶＩＩＩ因子である（例えば、Swaroopら., J. Biol. Chem. 272:24121-24124, 1997、参照）。
【００７４】
本発明にしたがって修飾され得る適当な変異体第ＶＩＩＩ因子のさらなる非限定的な例は、増加した循環半減期を有する第ＶＩＩＩ因子である。これらの変異体第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、限定はしないが、ヘパラン硫酸と減少した相互作用（Sarafanovら., J. Biol. Chem. 276:11970-11979, 2001）および／または低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質（「ＬＲＰ」）と減少した相互作用を有するとして特徴付けることができる（例えば、ＷＯ００／２８０２１；ＷＯ００／７１７１４；Saenkoら., J. Biol. Chem. 274:37685-37692, 1999;およびLentingら., J. Biol. Chem. 274:23734-23739, 1999、参照）。
【００７５】
本発明にしたがって修飾され得る適当な変異体第ＶＩＩＩ因子の別の非限定的な例は、既知の、既存のエピトープ内のアミノ酸をコードし、アスパラギン残基でグリコシル化のための認識配列を生産するように修飾されたヌクレオチド配列によってコードされる修飾された第ＶＩＩＩ因子である（例えば、米国特許第６，７５９，２１６号、参照）。該例の変異体第ＶＩＩＩ因子は、既存の阻害抗体による検出を逃れ（低い抗原性の第ＶＩＩＩ因子）、阻害抗体を発現する可能性を減少させる（低い免疫原性の第ＶＩＩＩ因子）修飾された第ＶＩＩＩ因子の提供において有用であり得る。本発明にしたがって修飾され得る変異体第ＶＩＩＩ因子のこの型の１つの態様は、Ｎ−連結グリコシル化のためのコンセンサスアミノ酸配列を有するように変異されている第ＶＩＩＩ因子である。このようなコンセンサス配列の１つの例は、Ｎ−−Ｘ−−Ｓ／Ｔ（式中、Ｎはアスパラギンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｓ／Ｔはセリンまたはスレオニンを示す）である（例えば、米国特許第６，７５９，２１６号、参照）。
【００７６】
本発明にしたがって修飾され得る適当な変異体第ＶＩＩＩ因子の別の非限定的な例は、種々の変異を有する凝血促進活性な第ＶＩＩＩ因子である（例えば、米国特許第６，８３８，４３７号および米国特許出願第２００４／００９２４４２号、参照）。この態様の１つの例は、（ｉ）フォン・ヴィレブランド因子結合部位を欠失する、（ｉｉ）Ａｒｇ７４０に変異を加える、および（ｉｉｉ）Ａ２およびＡ３−ドメイン間にアミノ酸配列スペーサーを加えるように修飾されている変異体第ＶＩＩＩ因子に関し、ここで、該アミノ酸スペーサーは、活性化時に、凝血促進活性な第ＶＩＩＩ因子タンパク質がヘテロダイマーになるように十分な長さである（例えば、米国特許公報第２００４／００９２４４２号；Pittmanら., PNAS 85:2429-2433, 1988、参照：コファクター活性を産生するために、Ａｒｇ７４０での切断が必須ではないと記載している）。
【００７７】
本発明にしたがって修飾され得る適当な変異体第ＶＩＩＩ因子の別の非限定的な例は、１つ以上の位置に挿入された短縮(truncated)第ＩＸ因子イントロン１を有するヌクレオチド配列によってコードされる変異体第ＶＩＩＩ因子である（例えば、米国特許第６，８００，４６１および６，７８０，６１４号、参照）。この変異体第ＶＩＩＩ因子は、インビトロでの組換え第ＶＩＩＩ因子のより高い生産を得るために、ならびに遺伝子治療のためのトランスファーベクターにおいて使用され得る（例えば、米国特許第６，８００，４６１号、参照）。この態様の１つの例において、変異体第ＶＩＩＩ因子は、２つの位置に挿入された短縮第ＩＸ因子イントロン１、および造血細胞系および血小板における発現を駆動するために適当であるプロモーターを有するヌクレオチド配列によってコードされ得る（例えば、米国特許第６，７８０，６１４号、参照）。
【００７８】
本発明にしたがって修飾され得る適当な変異体第ＶＩＩＩ因子のさらなる非限定的な例は、阻害抗体により阻害の減少を示す変異体第ＶＩＩＩ因子である（例えば、米国特許第５，８５９，２０４；６，１８０，３７１；６，４５８，５６３；および７，１２２，６３４号、参照）。
【００７９】
本発明にしたがって修飾され得る適当な変異体第ＶＩＩＩ因子の別の非限定的な例は、第ＶＩＩＩ因子の半減期および／または比活性の増加の影響を有するＡ２ドメインにおいて１つ以上のアミノ酸置換を有する変異体第ＶＩＩＩ因子である（例えば、米国特許第７，２１１，５５９号、参照）。
【００８０】
本発明にしたがって修飾され得る適当な変異体第ＶＩＩＩ因子のさらなる非限定的な例は、比活性の増加を示す変異体第ＶＩＩＩ因子である（例えば、米国特許公報第２００７／０２６５１９９号、参照）。
【００８１】
本発明にしたがって修飾され得る適当な変異体第ＶＩＩＩ因子の別の非限定的な例は、１つ以上の生体適合性ポリマーにあらかじめ定義された部位で共有結合しているＦＶＩＩＩ変異タンパク質である（例えば、米国特許公報第２００６／０１１５８７６号、参照）。
【００８２】
モジュレーターをコードする核酸の選択
本発明の第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子は、モジュレーターをコードする核酸を含む。例えば、治療的タンパク質と融合されたとき、融合されていない治療的タンパク質と比較して血清半減期を延長する効果を有する多数のタンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、当該分野で知られている。これらの参考文献において教示されている任意のモジュレーターをコードする核酸は、本発明の第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子を構築するために潜在的に使用され得る。例えば、第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの循環半減期を潜在的に増加させ得る（それが由来する第ＶＩＩＩ因子タンパク質と比較して）候補モジュレーターを選択するために、（１）モジュレーターの循環半減期が修飾のために選択される第ＶＩＩＩ因子タンパク質の循環半減期よりも大きくなるべきであること；および（２）融合タンパク質の免疫原性を考慮する。第２の考慮に関して、第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーで処置されることが意図される個体群（例えば、ヒト）において天然に発現されるか、または該群において天然に発現されるタンパク質に由来するモジュレーターを使用することが好ましいかもしれない。例えば、モジュレーターは、処置されることが意図される個体群の血清中に天然に存在する（例えば、ヒトが意図される処置個体群であるとき、ヒトＦｃ領域の使用）。
【００８３】
本発明の１つの態様において、免疫グロブリン定常領域はモジュレーターとして使用され得る。したがって、本発明の第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子の構築において使用されるモジュレーターコード核酸配列は、免疫グロブリン（Ｉｇ）のＦｃ領域をコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントおよび／または変異体、およびＦｃＲｎ結合ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその変異体であり得る。１つの態様において、使用される核酸は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＭ、またはマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、もしくはＩｇＭから得られる免疫グロブリンのＦｃ領域またはそのフラグメントおよび／または変異体であるモジュレーターをコードする。別の態様において、使用される核酸は、ヒトもしくはマウスＩｇＧのＦｃ領域、非機能的ヒンジを有する（ヒンジ領域中のシステイン残基の置換または欠失による）ヒトもしくはマウスＩｇＧのＦｃ領域の変異体、または、ヒトもしくはマウスＩｇＧのＦｃ領域の非ヒンジ部分であるモジュレーターをコードする。さらなる態様において、使用される核酸は、マウスＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、または、ヒトＩｇＧ１またはマウスＩｇＧ１のＦｃ領域の非ヒンジ部分であるモジュレーターをコードする。さらなる態様において、使用される核酸は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、非機能的ヒンジを有する（システイン残基の置換または欠失による）ヒトＩｇＧ１の変異体Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の非ヒンジ部分であるモジュレーターをコードする。
【００８４】
免疫グロブリンのＦｃ領域のフラグメントについて、モジュレーターをコードする核酸は、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）により結合されるエピトープを定義するＦｃ領域の少なくとも１つのアミノ酸セグメントをコードし得、さらにＦｃ領域のヒンジ部分に対応するセグメントをコードし得る。あるいは、モジュレーターをコードする核酸は、少なくとも１つのＦｃＲｎ結合ペプチドをコードし得る。限定はしないが、適当なＦｃＲｎ結合ペプチドの例は配列ＰＫＮＳＳＭＩＳＮＴＰ（配列番号：２４）を含み、さらにＨＱＳＬＧＴＱ（配列番号：２５）、ＨＱＮＬＳＤＧＫ（配列番号：２６）、ＨＱＮＩＳＤＧＫ（配列番号：２７）、またはＶＩＳＳＨＬＧＱ（配列番号：２８）から選択される配列を含み得る（例えば、米国特許第５，７３９，２７７号、参照）。
【００８５】
本発明の１つの態様において、モジュレーターは、配列番号：９（ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域）、配列番号：１１（ヒトＩｇＧ２のＦｃ領域）、配列番号：１３（ヒトＩｇＧ３のＦｃ領域）、配列番号：１５（ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域）、配列番号：２９（マウスＩｇＧ１のＦｃ領域）、配列番号：１７（ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の非ヒンジ部分）、配列番号：１９（ヒトＩｇＧ２のＦｃ領域の非ヒンジ部分）、配列番号：２１（ヒトＩｇＧ３のＦｃ領域の非ヒンジ部分）、配列番号：２３（ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域の非ヒンジ部分）、または配列番号：３０（マウスＩｇＧ１のＦｃ領域の非ヒンジ部分）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％のアミノ酸同一性で同一であるか、または共有するアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされ得る。上記の１つをコードする核酸の特定の例は、配列番号：８（ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域）、配列番号：１０（ヒトＩｇＧ２のＦｃ領域）、配列番号：１２（ヒトＩｇＧ３のＦｃ領域）、配列番号：１４（ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域）、配列番号：４７（マウスＩｇＧ１のＦｃ領域）、配列番号：１６（ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の非ヒンジ部分）、配列番号：１８（ヒトＩｇＧ２のＦｃ領域の非ヒンジ部分）、配列番号：２０（ヒトＩｇＧ３のＦｃ領域の非ヒンジ部分）、配列番号：２２（ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域の非ヒンジ部分）、および配列番号：４８（マウスＩｇＧ１のＦｃ領域の非ヒンジ部分）を含む。
【００８６】
モジュレーターをコードする核酸を同定するための方法
他のポリペプチドまたはタンパク質は、本明細書に記載されている方法論の使用により、適当なモジュレーターとして同定され得る。候補モジュレーター（例えば、第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子および第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質の創造において潜在的に有用であり得るポリペプチド）は、治療的タンパク質への融合により非第ＶＩＩＩ因子治療的タンパク質またはペプチドの血清半減期を延長させることが示されている該モジュレーターのペプチドおよびタンパク質を含む。例えば、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のモジュレーターを同定するための１つの方法は、血友病Ａの動物モデル、例えば、血友病Ａ（ＨｅｍＡ）のマウスにおけるモジュレーターを含む第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの薬物動態学を試験することである。
【００８７】
モジュレーターをコードする核酸の挿入部位
本発明の第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子は、モジュレーターをコードする核酸を含む。モジュレーターをコードする核酸は、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のＢ−ドメイン部分内に挿入され得る。例えば、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のＢ−ドメインをコードする核酸の少なくとも１部分は、モジュレーターをコードする核酸の挿入の前または後に欠失され得る（例えば、Ｎ−７４５からＳ−１６３７のＢドメインの部分をコードする第ＶＩＩＩ因子遺伝子の少なくとも１部分が欠失）。あるいは、部位特異的再結合は、モジュレーターをコードする核酸を同時に挿入し、核酸をコードするＢ−ドメイン領域の部分を欠失するために使用され得る。挿入、欠失および部位特異的再結合を達成するための組換え方法は、当該分野でよく知られている。
【００８８】
１つの態様において、第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、該第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質は、モジュレーターのアミノ酸配列がＢ−ドメインに存在するか、またはモジュレーターのアミノ酸配列がＢ−ドメインの一部または全てのアミノ酸配列と置き換わっている第ＶＩＩＩ因子タンパク質を含む。第２の態様において、第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子は、配列番号：１または５のいずれか１つのアミノ酸２０−７６４に対応する第１のアミノ酸配列、配列番号：１または５のいずれか１つのアミノ酸１６５６−２３５１に対応する第２のアミノ酸配列、および半減期モジュレーターアミノ酸配列がそのアミノ末端で第１のアミノ酸配列のカルボキシル末端に共有結合しており、そのカルボキシル末端で第２のアミノ酸のアミノ末端に共有結合しているモジュレーターアミノ酸配列を含む、第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。
【００８９】
分泌前に、Ｂドメインは、Ａｒｇ１６４８（すなわち、Ｂ−ａ３接合点）で開裂され、主にＡｒｇ１３１３後で、Ｂ−ドメインにおいて可変的に開裂される（例えば、Thompson, Semin. Thromb. Hemost. 29:11-22, 2003、参照）。したがって、当業者は、Ｂ−ドメイン領域における挿入、欠失および／または置換において、Ｂ−ａ３ドメイン接合点で起こる切断部位が第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーへの第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質の適当な翻訳後プロセッシングのために維持されるべきであることを理解できる。同様に、Ｂ−ドメイン領域における挿入のために、モジュレーターをコードする核酸は、Ａｒｇ１３１３をコードする核酸に対して５’であるＢ−ドメインをコードする核酸内の部位で挿入されるべきである。あるいは、Ｂ−ドメイン内の切断部位（Ｂ−ａ３接合点での切断部位を除いて）は、第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質の翻訳後プロセッシング中にＮ−末端（「重鎖」）部分からモジュレーターの切断（したがって分離）を防止するために変異され得る。
【００９０】
ａ２−Ｂドメイン接合点での切断が第ＶＩＩＩ因子のコファクター活性を産生するために必須でないことが知られている（Pittmanら., PNAS 85:2429-2433, 1988）。ヒト第ＶＩＩＩ因子において、ａ２−Ｂドメイン接合点はＡｒｇ７４０で生じる。本発明の第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子は、ａ２−Ｂドメイン接合点で切断を受ける第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質をコードする遺伝子ならびに切断を防止するａ２−Ｂドメイン接合点でアミノ酸修飾を有する第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質をコードする遺伝子を含む。１つの例として、本発明の第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの活性化時の該接合点での切断が、第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー由来の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の活性化時に生産される第ＶＩＩＩａ因子タンパク質と同一である（したがって、同じ生物学的活性を有する）第ＶＩＩＩａ因子タンパク質の形成をもたらすとき、ａ２−Ｂドメイン接合点切断部位は、無傷なままであり得る。
【００９１】
当業者は、第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーにおけるａ２−Ｂドメイン接合点での切断の程度または割合が、それが由来する第ＶＩＩＩ因子タンパク質において見られるものよりも小さいとき、恐らくモジュレーターによる立体障害によると理解する。したがって、ａ２−Ｂドメイン接合点と半減期モジュレーター間のペプチドリンカー（すなわち、スペーサー）、例えば、ペプチドリンカーＤＤＤＤＫ（配列番号：４９）およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：５０）の形態においてさらなるアミノ酸を含むことが望ましいかもしれない。
【００９２】
ホモもしくはヘテロ−多重合配列をコードする核酸の選択および挿入部位
本発明の第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子は、所望により、モジュレーターをコードする核酸と異なるホモもしくはヘテロ−多重合配列をコードする核酸を含む。ホモもしくはヘテロ−多重合配列をコードする核酸の包含は、第１の第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーにおいて使用されるモジュレーターが、第２の第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーに存在するモジュレーターの同種または異種部分と非共有結合性または共有結合性会合を介在することができないとき、マルチマー第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーを生産することが望ましいかもしれない。あるいは、ホモもしくはヘテロ−多重合配列をコードする核酸の包含は、第１の第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーにおいて使用されるモジュレーターが、単一のポリペプチドからなるとき、ハイブリッド第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーを生産することが望ましいかもしれない。
【００９３】
当業者により理解されているとおり、ホモもしくはヘテロ−多重合配列をコードする核酸の選択は、利用されている特定の多重合アプローチにより決定される。以下の非限定的な文献において教示されるマルチマーポリペプチドを生産するために一般的なアプローチにおいて使用されるホモもしくはヘテロ−多重合配列をコードする核酸配列は、本発明の第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子に包含することができる。米国特許公報第２００７／０２８７１７０号、米国特許第７，１８３，０７６号に記載されている「多重合ドメイン」アプローチ、例えば、免疫グロブリン部分を使用するもの、米国特許第５，９３２，４４８号において使用されているとおりのＦｏｓおよびＪｕｎロイシンジッパーの使用、および米国特許第６，８３３，４４１号に記載されている「ヘテロ二量化配列」アプローチ、および米国特許第５，８０７，７０６号に記載されている「空洞への隆起」アプローチ。
【００９４】
当業者は、第１の第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子のみがヘテロ−多重合配列を含むとき、第２の異なる第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子がマルチマー第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーまたはハイブリッド第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーを生産するために必要であり得ることを理解している。例えば、当業者は、米国特許第５，８０７，７０６号に記載されている「空洞への隆起」アプローチを利用するために、それぞれ異なるヘテロ−多重合配列を含む２つの第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子が必要であることを認識している。
【００９５】
当業者は、第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子内のホモもしくはヘテロ−多重合配列をコードする核酸が、モジュレーターに対して５’（すなわち、発現されたときＮ−末端と関連する）または３’（すなわち、発現されたときＣ−末端と関連する）のいずれかで第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子内に位置し得る（ただし、その位置が、他に、第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの形成のために必要である転写、翻訳または翻訳後修飾を妨げない）ことを理解している。モジュレーターをコードする核酸のような多重合配列をコードする核酸は、Ｂドメインをコードする第ＶＩＩＩ因子遺伝子の領域の少なくとも１部分内に挿入されるか、または該部分と置き換えられ得る。
【００９６】
発現カセットおよび発現ベクター
本発明のさらなる局面は、第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子を含む発現カセットまたは発現ベクターに関する。第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子を含む発現カセットの組換え生産のために、第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子を単離し、プロモーターに作動可能に連結させる。該第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子は、所望によりさらに、転写終結シグナル、シグナルペプチドをコードする核酸、または遺伝子発現または翻訳後プロセッシングに影響する他の核酸配列（例えば、便利に位置された制限酵素認識部位、エンハンサー、分泌リーダー配列など）に作動可能に連結していてもよい。発現カセットの所望の因子（第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子以外）がすでに複製可能なクローニングベクターまたは発現ベクター内に含まれているとき、第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子は、当該分野でよく知られている組換え技術により適当な位置に作動可能に挿入されていることのみ必要である。多数のクローニングベクターが市販されており、一般的に１つ以上の以下のもの：シグナル配列、複製起点、エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終結配列、および１つ以上の選択遺伝子またはマーカーを含む。多数の発現ベクターも、また、市販されており、第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子の挿入は、当該分野でよく知られている方法および試薬を使用して達成され得る（例えば、Sambrookら., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, NY (1989); Ausubelら., Current Protocols in Molecular Biology, New York, N.Y.: John Wiley & Sons (1989)、参照）。発現ベクターの選択は、好ましい形質転換技術および形質転換のための標的宿主に依存する。
【００９７】
本発明において有用な発現ベクターは、染色体−、エピソーム−およびウイルス−由来のベクター、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、ウイルス、例えば、バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、家禽ジフテリアウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス由来のベクター、およびそれらの組合せ由来のベクター、例えば、コスミドおよびファージミドを含むが、これらに限定されない。動物細胞において組換え発現のために適当なウイルスベクターは、当該分野でよく知られている（例えば、米国特許第５，８７１，９８６および６，４４８，０４６号、参照）。
【００９８】
本発明を実施するために適当なベクターは、以下のウイルスベクター、例えば、ラムダベクター系  ｇｔ１１、ｇｔＷＥＳ．ｔＢ、Ｃｈａｒｏｎ  ４、およびプラスミドベクター、例えば、ｐＣＭＶ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３３９、ｐＲ２９０、ｐＫＣ３７、ｐＫＣ１０１、ＳＶ  ４０、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ  ＋／−またはＫＳ  ＋／−（Stratagene, LaJolla, CA）、ｐＱＥ、ｐＩＨ８２１、ｐＧＥＸ、ｐＥＴシリーズ（Studierら., Methods Enzymol. 185:60-89, 1990）、およびそれらのあらゆる誘導体を含むが、これらに限定されない。細菌において使用するために適当なベクターは、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９（Qiagen, Valencia, CA）；ｐＢＳ  ベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ  ベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、およびｐＮＨ４６Ａ（Stratagene, LaJolla, CA）；ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen, Carlsbad, CA）；およびｐＧＥＸ、ｐｔｒｘｆｕｓ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＥＴ−５、ｐＥＴ−９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、およびｐＲＩＴ５を含む。適当な真核ベクターは、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＢＫ、およびｐＳＧ（Stratagene, LaJolla, CA）；およびｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬである。他の適当なベクターは、当業者に容易に明白である。
【００９９】
発現ベクターは、選択できる表現型、例えば、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する抵抗性または表面タンパク質の発現を与える選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含むものを使用され得る。使用することができる選択可能なマーカー遺伝子の例は、ｎｅｏ、ｇｐｔ、ｄｈｆｒ、ａｄａ、ｐａｃ（ピューロマイシン）、ｈｙｇ、およびｈｉｓＤを含む。
【０１００】
第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子の成功するライゲーション（またはベクターへの挿入）は、当該分野でよく知られている組換え技術（例えば、慣用の手段を使用する単離およりシーケンシングまたは連結部位に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブの使用）により容易に決定され得る。
【０１０１】
宿主細胞
本発明のさらなる局面は、第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子を含む宿主細胞に関する。該第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子は、クローニングベクター、発現ベクター内に存在するか、または宿主細胞ゲノムに統合されていてもよい。１つの態様において、宿主細胞は、ＤＮＡ分子形態における必要な核酸構築物を安定なプラスミドまたは宿主細胞ゲノムへの安定な挿入もしくは統合のいずれかとして含む。別の態様において、宿主細胞は、発現系においてＤＮＡ分子を含むことができる。
【０１０２】
１つの態様において、本発明の第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子は、オープンリーディングフレームが選択されたプロモーターのコントロール下でコードされたタンパク質の発現に対して適当に指向するように、センス方向において適当なベクターに組み込まれる。これは、適当な調節エレメントの発現ベクターへの包含を含む。これらは、例えば、ベクターの非翻訳領域、有用なプロモーター、および転写および翻訳を実施するために宿主細胞タンパク質と相互作用する５’および３’非翻訳領域を含み得る。このようなエレメントは、それらの強度および特異性において変化し得る。利用されるベクター系および宿主に依存して、構成的および誘導プロモーターを含むあらゆる適当な転写および翻訳エレメントが使用され得る。構成的プロモーターは、生物体の発生および生存中に遺伝子の発現を指向するプロモーターである。誘導プロモーターは、誘導因子に応答して１つ以上のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を直接的または間接的に活性化することができるプロモーターである。誘導因子の非存在下で、該ＤＮＡ配列または遺伝子は転写されない。
【０１０３】
本発明の発現ベクターは、また、選択されたタンパク質をコードするＤＮＡ分子に作動可能に連結した、選択された宿主細胞における発現に対してｍＲＮＡの正しい転写終結およびポリアデニル化を提供することができるものの中から選択される、作動可能な３’調節領域を含み得る。
【０１０４】
宿主細胞において第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーを組換え的に生産するために、第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子は、宿主細胞に組み込まれ得る。クローニングベクター、発現ベクターおよびプラスミドは、当該分野でよく知られている組換え技術を使用して、例えば、形質転換、形質導入、接合、動員、またはエレクトロポレーションを介して細胞に導入され得る。
【０１０５】
宿主細胞は、哺乳動物細胞、細菌細胞（例えば、大腸菌）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）、真菌細胞、酵母細胞（例えば、サッカロミセス(Saccharomyces)またはシゾサッカロミセス(SchizoSaccharomyces)）、植物細胞（例えば、シロイヌナズナまたはタバコ細胞）、または藻細胞を含み得るが、これらに限定されない。本発明を実施するために適当な哺乳動物細胞は、ＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０または１６５１）、赤んぼのハムスター腎臓（「ＢＨＫ」）（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６２８１）、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）、ＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２）、２９３（ＡＴＣＣ番号１５７３）、ＮＳＯ骨髄腫、ＣＨＯＰ、ＮＳ−１およびＨＫＢ１１（例えば、米国特許第６，１３６，５９９号、参照）を含むが、これらに限定されない。
【０１０６】
哺乳動物細胞における発現を指向するために適当な発現ベクターは、一般的に、プロモーター、ならびに当該分野で知られている他の転写および翻訳コントロール配列を含む。一般的なプロモーターは、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、メタロチオネイン−１、アデノウイルスＥｌａ、ＣＭＶ、前初期、免疫グロブリン重鎖プロモーターおよびエンハンサー、およびＲＳＶ−ＬＴＲを含む。当業者は、プロモーターとしての強度に基づいて適当な哺乳動物プロモーターを容易に選択することができる。あるいは、誘導プロモーターは、特定のタンパク質の発現または抑制が望ましいとき、制御の目的のために使用することができる。当業者は、当該分野で知られているものから適当な誘導哺乳動物プロモーターを容易に選択することができる。
【０１０７】
本発明の第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの組換え生産のために選択される宿主細胞にかかわらず、タンパク質発現の増加は、第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子における一般的でないコドンをより一般的であるコドンと置き換えることにより達成され得る（例えば、米国特許第６，９２４，３６５号、参照）。当業者は、特定の第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子コドンが「一般的でない」または「一般的である」であるかを決定することが、組換え生産のために選択される宿主細胞の特定のコドン利用に依存することを理解している。
【０１０８】
第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質およびヘテロダイマーの生産
本明細書に記載されている組換え科学技術を考慮して、本発明の別の局面は、本発明の第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーを生産する方法に関する。この方法は、宿主細胞が第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質を発現する条件下で本発明の宿主細胞を増殖させることを含む。第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質の翻訳後修飾後、次に、組換え第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーは、精製され単離され得る。本発明の１つの局面は、第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質または第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーを生産するための方法であって、（ａ）第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質または第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーをコードする発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供し；（ｂ）該細胞を培養し；（ｃ）第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質または第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーを単離することを含む方法である。さらなる態様において、該宿主細胞は哺乳動物宿主細胞であり得、モジュレーターのアミノ酸配列はグリコシルされていてもよい。
【０１０９】
マルチマー第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの組換え生産に関して、当業者は、ホモ−マルチマー型が、単一の組換え宿主細胞により生産され得るが、ヘテロ−マルチマー型が単一の宿主細胞内の共発現または複数の宿主細胞における別々の発現（同じか、または異なっている細胞培養系において）により生産され得ることを理解している。ヘテロ−マルチマー型と同様に、当業者は、ハイブリッド第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーが、単一の宿主細胞内の共発現または複数の宿主細胞における別々の発現（同じか、または異なっている細胞培養系において）により生産され得ることを理解している。別々の培養系が利用されるとき、それぞれの培養物からの組換えタンパク質産物は単離され、次に当該分野でよく知られている標準技術を使用して再び連合させ得る。マルチマー第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーおよびハイブリッド第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの組換え生産のために、宿主細胞は、所望の様式においてマルチマーまたはハイブリッド第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの鎖を組み立てることができるように選択され得る。
【０１１０】
別々の遺伝子の共発現における代替案として、必要とされるポリペプチド鎖のすべてをコードするモノシストロン性遺伝子が生産され得る。このような遺伝子がどのように設計され得るか特定の実施例、以下の実施例５参照。
【０１１１】
組換え第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーは、実質的に純粋な形態において生産され得る。当該分野でよく知られている方法は、精製された第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの精製および同定のために使用され得る。
【０１１２】
医薬組成物
本発明の別の局面は、第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。「薬学的に許容される担体」は、調製物の製剤化を助けるか、または調製物を安定にさせるために活性成分に加えられ得、患者へ有意な有害な毒性効果を与えない物質である。このような担体の例は、当業者によく知られており、水、糖、例えば、マルトースまたはスクロース、アルブミン、塩、例えば、塩化ナトリウムなどを含む。他の担体は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martinに記載されている。このような組成物は、有効量の少なくとも１つの第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーを含む。
【０１１３】
薬学的に許容される担体は、滅菌水性溶液または分散媒および滅菌注射可能溶液または分散媒の即時調製物のための滅菌粉末を含む。薬学的に有効な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で知られている。該組成物は、非経口注射のために製剤化され得る。該組成物は、高い薬物濃度に適当な溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは他の規則構造として製剤化され得る。該担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、および適当なそれらの混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。該組成物は、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを含み得る。第ＶＩＩＩ因子の医薬組成物の例は、例えば、米国特許第５，０４７，２４９；５，６５６，２８９；５，６６５，７００；５，６９０，９５４；５，７３３，８７３；５，９１９，７６６；５，９２５，７３９；６，８３５，３７２；および７，０８７，７２３号において記載されている。
【０１１４】
滅菌注射可能溶液は、上記されている成分の１つまたは組合せを有する適当な溶媒中に必要な量の活性化合物を包含し、必要なとき、次に滅菌精密濾過することにより製造され得る。一般的に、分散媒は、活性化合物を塩基性分散媒および必要な他の成分を含む滅菌輸送媒体に包含させることにより製造され得る。滅菌注射可能溶液の調製物に関する滅菌粉末の場合において、製造方法は、あらかじめ滅菌濾過された溶液から活性成分プラス任意のさらなる所望の成分の粉末を得る真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）を含む。
【０１１５】
処置の方法
本発明の別の局面は、遺伝的および後天的凝固欠乏症、例えば、血友病（例えば、血友病Ａ）を処置する方法に関する。この方法は、血友病Ａを示す患者に有効量の本発明の第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー（ハイブリッドまたはマルチマー型を含む）を投与し、それにより該患者が血管損傷後の有効な血液凝固を示すことを含む。適当な有効量の第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーは、限定はされないが、約１０から約５０国際ユニット／ｋｇ体重からなる。患者は、何らかの哺乳動物（例えば、ヒト）であり得る。
【０１１６】
本発明の第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーは、静脈内に、皮下に、または筋肉内に投与され得る。特定のモジュレーターは、経口投与が考慮され得る。
【０１１７】
本発明の第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーは、阻害抗体を有する、およびそれを有さない血友病患者ならびに阻害抗体の発現によって後天的第ＶＩＩＩ因子欠乏を有する患者における第ＶＩＩＩ因子欠乏（例えば、関節内、頭蓋内または消化器出血）による非制御出血を処置するために使用され得る。１つの態様において、第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーは、単独または医薬組成物（すなわち、安定剤、送達輸送媒体、および／または担体と組み合わせて）の形態において、ヒトまたは動物第ＶＩＩＩ因子の注入のために使用されるのと同じ方法にしたがって、患者の静脈内に注入される。
【０１１８】
あるいは、またはそれらに加えて、第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーは、第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子発現構築物を含むウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（例えば、Gnatenkoら., Br. J. Haematol. 104:27-36, 1999、参照）を投与することにより、または一般的にこのような細胞を含むデバイスの移植により、第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーを生産するように遺伝的に操作された細胞を移植することにより投与され得る。このような移植は、組換え真皮繊維芽細胞（例えば、Rothら., New Engl. J. Med. 344:1735-1742, 2001、参照）；骨髄間質細胞（例えば、米国特許第６，９９１，７８７号、参照）または造血前駆宿主細胞（例えば、米国特許第７，１９８，９５０号、参照）を使用することを含む。血友病Ａの遺伝子治療（第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸を使用する）における使用のために適当なウイルスベクターおよび遺伝子治療におけるそれらの使用は、当該分野で知られている（例えば、米国特許第６，２００，５６０；６，５４４，７７１；６，６４９，３７５；６，６９７，６６９；６，７７３，７０９；６，７９７，５０５；６，８０８，９０５；６，８１８，４３９；６，８９７，０４５；６，９３９，８６２；７，１９８，９５０；および７，２３８，３４６号、参照）。
【０１１９】
このような処置の必要な患者に投与されるべき第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの処置用量は、第ＶＩＩＩ因子欠乏の重症度に依存して変化する。一般的に、投与レベルは、それぞれの患者の出血症状の重症度および期間としたがって、頻度、期間およびユニットにおいて調節される。したがって、第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーは、標準凝固アッセイにより測定されるとき、患者に治療有効量の出血を止めるためのタンパク質を送達するために十分な量における薬学的に許容される担体、送達輸送媒体、または安定剤中に含まれ得る。
【０１２０】
通常、第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの投与を介して患者中で達成されるべき所望の血漿の第ＶＩＩＩ因子の活性レベルは、通常の３０−１００％の範囲である。１つの態様において、治療的第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの投与は、約５から約５０ユニット／ｋｇ体重の範囲、約１０から約５０ユニット／ｋｇ体重の範囲における用量、および約２０から約４０ユニット／ｋｇ体重の用量で静脈内に与えられ得；間隔頻度は、約８から２４時間の範囲であり得（深刻な血友病患者において）；処置の日数は１から１０日間の範囲もしくは出血症状が解決するまでであり得、または第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの投与は予防であり得る（例えば、Robertsら., pp 1453-1474, 1460, in Hematology, Williams, W. Jら., ed. (1990)、参照）。ヒトまたは血漿由来第ＶＩＩＩ因子での処置におけるとき、注入される治療的組換え第ＶＩＩＩ因子の量は、一段階の第ＶＩＩＩ因子凝固アッセイにより定義され得、選択された例において、インビボでの回収率は、注入後の患者の血漿中の第ＶＩＩＩ因子を測定することにより測定され得る。あらゆる特定の患者に対して、特定の投与レジメンは、必要な個体および組成物を投与する、またはそれの投与を管理する個体の専門的な判断にしたがって時間をかけて調節されるべきであり、本明細書に記載されている濃度範囲は典型的なだけであり、本発明の第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの範囲または実施を限定すると意図すべきでないと理解すべきである。
【０１２１】
処置は、単回投与または長期間の周期的もしくは連続的投与の形態を取り得、または、必要なとき、処置は、予防目的のために投与され得る。
【０１２２】
本発明の第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーは、由来の第ＶＩＩＩ因子タンパク質と比較して循環半減期の増加を示す。より良い循環半減期を有する第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、より少ない頻度の投与で患者の第ＶＩＩＩ因子欠乏を正すことができるため、血友病の処置において有用である。投与の場合におけるこの増加は、処置プロトコールでの患者のコンプライアンスを改善し、それにより凝固障害の症状を減少させ得る。また、投与の頻度の減少は、少ない抗原が投与されるため、第ＶＩＩＩ因子に対する免疫応答の発達の可能性を減少させることが期待される。
【０１２３】
上記記載は、一般的に本発明を記載している。説明のみの目的のために提供され、本発明の範囲を限定することを意図しない以下の実施例を参照することにより、さらなる完全な理解が得ることができる。
【実施例】
【０１２４】
実施例
本発明を良く理解するために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、説明のみの目的のためであり、いかなる形であれ本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。本明細書に記載されている全ての文献は、出典明示によりそれら全体を包含させる。
【０１２５】
実施例１
以下の実施例は、第ＶＩＩＩ因子Ｂ−ドメイン欠失（ＢＤＤ）タンパク質をコードする核酸およびマウスＦｃ領域（「ｍＦｃ＋ヒンジ」と示される）をコードする核酸を使用する、第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子（「ＢＤＤｍＦｃ＋ヒンジ」と示される）を含む哺乳動物発現ベクター（「ｐＭ１１０」または「ｐＳＫ２０７ＢＤＤＦｃ＋ヒンジ」と示される）の構築を記載する。ＢＤＤｍＦｃ＋ヒンジの組換え発現は、図２において示されている第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー（「ＢＤＤＦｃ＋ヒンジ」と示される）の生産をもたらす。機能的免疫グロブリンヒンジ領域の存在によって、ＢＤＤＦｃ＋ヒンジの２つの分子は、マルチマー第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーを形成するためにジスルフィド結合を介して共有結合している。この型の利点は、ダイマーＦｃがＦｃＲｎへの融合タンパク質の高親和性結合をもたらし、その結果、長期循環半減期をもたらすことである。
【０１２６】
ＰｍｅＩおよびＮｈｅＩ部位により結合された第ＶＩＩＩ因子Ｂ−ドメイン欠失（ＢＤＤ）遺伝子を含むプラスミドｐＳＫ２０７（「ｐＳＫ２０７ＢＤＤ」と示される）は、部位特異的変異誘発キットを使用して変異させた。２つの制限酵素認識部位（ｂｐ４４９０でＡｖｒＩＩおよびｂｐ４５２０でＡｆｌＩＩ）は、変異プライマーＣＥＳ１６（５’−ｃａａｔｇｃｃａｔｔｇａａｃｃｔａｇｇａｇｃｔｔｃｔｃｃｃａｇａａｃｃｃａｃｃａｇｔｃｃｔｔａａｇｃｇｃｃａｔｃａａｃｇｇｇ−３’）（配列番号：３４）およびＣＥＳ１７（５’−ｃｃｃｇｔｔｇａｔｇｇｃｇｃｔｔａａｇｇａｃｔｇｇｔｇｇｇｔｔｃｔｇｇｇａｇａａｇｃｔｃｃｔａｇｇｔｔｃａａｔｇｇｃａｔｔｇ−３’）（配列番号：３５）を使用して分子に導入された。ｂｐ２５３７でのＡｆｌＩＩ部位は、変異オリゴＣＥＳ１８（５’−ｃａｇｔｇｇｔｃａｔｔａｃａｃｔｃａａｇａａｃａｔｇｇｃｔｔｃｃｃａｔｃｃ−３’）（配列番号：３６）およびＣＥＳ１９（５’−ｇｇａｔｇｇｇａａｇｃｃａｔｇｔｔｃｔｔｇａｇｔｇｔａａｔｇａｃｃａｃｔｇ−３’）（配列番号：３７）を使用して除去した。得られたプラスミドをｐＭ１０９と称した。これらの変異事象は全てサイレントであり、ＢＤＤに対するアミノ酸変化をもたらさなかった。マウスＦｃ領域の供給源として、ヒト上皮細胞増殖因子受容体に対する全長マウスＩｇＧ１抗体を含むプラスミドｐＧＴ２３４を使用した。マウスＦｃ＋ヒンジ領域を、鋳型としてｐＧＴ２３４でプライマーＣＥＳ３６（５’−ａｇｃｔｔｃｃｔａｇｇａｇｃｔｔｃｔｃｃｃａｇａａｃｇｔｇｃｃｃａｇｇｇａｔｔｇｔｇｇｔｔｇ−３’）（配列番号：３８）およびＣＥＳ３９（５’−ａｇｃｔａｃｔｔａａｇｇａｃｔｇｇｔｇｇｇｔｔｃｔｇｇｇａｔｔｔａｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｇｇａｇａｇ−３’）（配列番号：３９）を使用してＰＣＲ増幅させた。得られたフラグメントをＡｆｌＩＩ／ＡｖｒＩＩで消化し、ＡｆｌＩＩ／ＡｖｒＩＩで消化されたｐＭ１０９にクローニングし、プラスミドｐＭ１１７を製造した。ｂｐ２５３７にて元のＡｆｌＩＩ部位を復帰させるために、ｐＳＫ２０７＋ＢＤＤのＮｈｅＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントをｐＭ１１７に挿入して、その同等領域を置き換え、ｂｐ２５３７にＡｆｌＩＩ部位を含むプラスミドｐＭ１１５を製造した。ｐＭ１１５のＢＤＤ．ｍＦｃ＋ヒンジ遺伝子（５０７７ｂｐのＮｈｅＩ／ＰｍｅＩフラグメントに含まれる）を発現ベクターｐＳＳ２０７のＰｍｅＩ／ＮｈｅＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＭ１１０またはｐＳＫ２０７ＢＤＤＦｃ＋ヒンジを産生した。ｐＳＫ２０７ＢＤＤＦｃ＋ヒンジの第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子因子（すなわち、ＢＤＤｍＦｃ＋ヒンジ）は、配列番号：３１の核酸配列を有する。ＢＤＤｍＦｃ＋ヒンジによりコードされるタンパク質は、図３（「マウスＦｃ」はｍＦｃ＋ヒンジの位置を示す）において説明される構造ドメイン、および配列番号：３２のアミノ酸配列を有する。
【０１２７】
実施例２
以下の実施例は、第ＶＩＩＩ因子Ｂ−ドメイン欠失（ＢＤＤ）タンパク質をコードする核酸およびマウスＦｃ領域のヒンジ部分（「ｍＦｃ−ヒンジ」と示される）以外の全てをコードする核酸を使用する、第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子（「ＢＤＤｍＦｃ−ヒンジ」と示される）を含む哺乳動物発現ベクター（「ｐＭ１１８」または「ｐＳＳ２０７ＢＤＤＦｃ−ヒンジ」と示される）の構築物を記載する。ＢＤＤｍＦｃ−ヒンジの組換え発現は、図２において示されている第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー（「ＢＤＤＦｃ−ヒンジ」と示される）の生産をもたらす。ＢＤＤｍＦｃ−ヒンジによりコードされるタンパク質は、図３（「マウスＦｃ」はｍＦｃ−ヒンジの位置を示す）において説明される構造ドメインおよび配列番号：３３のアミノ酸配列を有する。機能的免疫グロブリンヒンジ領域の非存在によって、ＢＤＤＦｃ−ヒンジはマルチマー第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーを形成しない。この型の不利な点は、非ダイマー化Ｆｃ領域がＦｃＲｎ結合に対する親和性を減少させることである。
【０１２８】
ＢＤＤｍＦｃ−ヒンジの構築物は、上記ＢＤＤｍＦｃ＋ヒンジと非常に類似している。ｍＦｃ−ヒンジ領域を、ＰＣＲプライマーＣＥＳ３７（５’−ａｇｃｔｔｃｃｔａｇｇａｇｃｔｔｃｔｃｃｃａｇａａｃｇｔｃｃｃａｇａａｇｔａｔｃａｔｃｔｇｔｃ−３’）（配列番号：４０）およびＣＥＳ３９（配列番号：３９）を使用してプラスミドｐＧＴ２３４からＰＣＲ増幅させ、ＡｖｒＩＩ／ＡｆｌＩＩで消化し、ＡｖｒＩＩ／ＡｆｌＩＩで消化されたｐＭ１０９プラスミドにおいてクローニングした。得られたプラスミドをｐＭ１１４（「ｐＳＫ２０７．ＢＤＤ．ｍＦｃ−ヒンジ」とも称する）と称した。次に、ＢＤＤ．ｍＦｃ−ヒンジ遺伝子を含むｐＭ１１４のＮｈｅＩ／ＰｍｅＩフラグメントを発現ベクターｐＳＳ２０７にクローニングし、プラスミドｐＭ１１８（すなわち、ｐＳＳ２０７ＢＤＤＦｃ−ヒンジ）を産生した。
【０１２９】
実施例３
以下の実施例は、アミノ末端でＦｌａｇタグを有するマウスＦｃ領域（「ｍＦｃ＋ヒンジ」と示される）の発現のためのプラスミド（「ｐＭ１３０」と示される）の構築物を記載する。同じ宿主細胞においてｐＳＳ２０７ＢＤＤＦｃ＋ヒンジを有するこのプラスミドの共発現は、ＢＤＤＦｃ＋ヒンジダイマー、ｍＦｃ＋ヒンジダイマーならびにＢＤＤＦｃ＋ヒンジおよびｍＦｃ＋ヒンジのヘテロダイマーの混合物を製造する。Ｆｌａｇタグの包含は、連続分離工程において抗−Ｆｌａｇ抗体および抗−第ＶＩＩＩ因子抗体を使用する親和性クロマトグラフィーによる図２において示されているヘテロダイマー（「ＢＤＤＦｃ」と示される）の単離を容易にする。しかしながら、当業者は、ペプチドタグの提供がなくても、当該分野でよく知られている技術、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを使用してヘテロダイマー形態を分離することが可能であることを理解している。
【０１３０】
鋳型としてｐＭ１１０を使用して、５’（アミノ末端）末端にＦｌａｇタグを有するマウスＦｃ領域（ヒンジを有する）を、プライマーＣＥＳ４９（５’−ａｔａｔｇａｔａｔｃｇｃｇｇｃｃｇｃｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇｔｇｔｔｇｃａｇａｃｃｃａｇｇｔｃｔｔｃａｔｔｔｃｔｃｔｇｔｔｇｃｔｃｔｇｇａｔｃｔｃｔｇｇｔｇｃｃｔａｃｇｇｇｇａｃｔａｃａａａｇａｃｇａｔｇａｃｇａｃａａｇｇｔｇｃｃｃａｇｇｇａｔｔｇｔｇｇｔｔｇ−３’）（配列番号：４１）およびＣＥＳ５０（５’−ｔｔｃｇａｔｃｔｃｇａｇｔｃａｔｔｔａｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｇ−３’）（配列番号：４２）を使用してＰＣＲ増幅させた。このフラグメントをＮｏｔＩ／ＸｈｏＩで消化し、ＮｏｔＩ／ＸｈｏＩで消化された発現ベクターｐＡＧＥ１６にライゲートし、プラスミドｐＭ１１９（すなわち、ｐＡＧＥ１６．ｍＦｃ＋ヒンジ．Ｆｌａｇ）を製造した。次に、ｍＦｃ＋ヒンジ．Ｆｌａｇ領域を含むｐＭ１１９のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩで消化された発現プラスミドｐＥＡＫ  ｆｌＣＭＶ  Ｗ／ＧＦＰにサブクローニングし、ｐＭ１３０と称した。
【０１３１】
実施例４
以下の実施例は、第ＶＩＩＩ因子Ｂ−ドメイン欠失（ＢＤＤ）タンパク質をコードする核酸およびＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のヒトＦｃ領域のいずれか１つ、またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のヒトＦｃ領域の非ヒンジ部分のいずれか１つをコードする核酸を使用する第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子（「ＢＤＤ．Ｈｕｍａｎ  Ｆｃ」と示される）の構築物を記載する。１つの例として、第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーを、Ｂドメインを模倣するために、マウスＩｇＧ１  Ｆｃ由来の２２７アミノ酸残基または２１４アミノ酸残基を第ＦＶＩＩＩ因子の特定の部位（例えば、Ｎ−７４５からＳ−１６３７）に挿入することにより産生し得る。
【０１３２】
ＢＤＤ．Ｈｕｍａｎ  Ｆｃ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４抗体由来）発現ベクターの構築物は、上記ＢＤＤ−マウスＦｃ発現構築物と同じ戦略に従う。ｐＭ１０９プラスミドをＡｖｒＩＩ／ＡｆｌＩＩで消化し、ＡｖｒＩＩ／ＡｆｌＩＩ結合Ｆｃ＋ヒンジおよびＦｃ−ヒンジを対応する部位に挿入する。次に、ｐＳＫ骨格を有する得られたプラスミドをＮｈｅＩおよびＰｍｅＩで消化し、ＢＤＤＦｃフラグメントを安定な細胞クローンの創造のためにｐＳＳ２０７にライゲートした。同様に、ｐＣＥＰ４．ｈｕｍａｎ  Ｆｃモノマープラスミドを構築する。
【０１３３】
典型的なヒトＩｇＧのＦｃ領域の核酸コード配列は、配列番号：８（ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域）、配列番号：１０（ヒトＩｇＧ２のＦｃ領域）、配列番号：１２（ヒトＩｇＧ３のＦｃ領域）および配列番号：１４（ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域）を含む。あるいは、配列番号：９（ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域）、配列番号：１１（ヒトＩｇＧ２のＦｃ領域）、配列番号：１３（ヒトＩｇＧ３のＦｃ領域）および配列番号：１５（ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域）と同じアミノ酸配列（または少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列）をコードする核酸配列を使用してもよい。典型的な非ヒンジ部分のヒトＩｇＧのＦｃ領域の核酸コード配列は、配列番号：１６（ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の非ヒンジ部分）、配列番号：１８（ヒトＩｇＧ２のＦｃ領域の非ヒンジ部分）、配列番号：２０（ヒトＩｇＧ３のＦｃ領域の非ヒンジ部分）および配列番号：２２（ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域の非ヒンジ部分）を含む。あるいは、配列番号：１７（ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の非ヒンジ部分）、配列番号：１９（ヒトＩｇＧ２のＦｃ領域の非ヒンジ部分）、配列番号：２１（ヒトＩｇＧ３のＦｃ領域の非ヒンジ部分）および配列番号：２３（ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域の非ヒンジ部分）と同じアミノ酸配列（または少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列）をコードする核酸配列を使用してもよい。
【０１３４】
実施例５
以下の実施例は、ハイブリッド第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーをコードするモノシストロン性第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子の構築物を記載する。翻訳された第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質は、全長ＦＶＩＩＩのＢドメインの代わりに２つのタンデムｍＦｃ＋ヒンジ領域を含む。
【０１３５】
発現プラスミドを以下のとおり構築する：鋳型としてｐＭ１１７（ｐＳＫ２０７＋ＢＤＤ．ｍＦｃ＋ヒンジ）を使用するオリゴの２つのセットでのＰＣＲ−第１は、ＡｖｒＩＩ（ＣＥＳ３６：５’−ａｇｃｔｔｃｃｔａｇｇａｇｃｔｔｃｔｃｃｃａｇａａｃｇｔｇｃｃｃａｇｇｇａｔｔｇｔｇｇｔｔｇ−３’）（配列番号：３０）およびＳａｃＩＩ（ＣＥＳ５１：５’−ｃａｇｔｔｇｃｃｇｃｇｇｇｃｔｔｔａｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｇ−３’）（配列番号：３５）により結合するｍＦｃフラグメントを創造するＣＥＳ３６／ＣＥＳ５１であり、プライマーの第２のセットは、ＳａｃＩＩ（ＣＥＳ５２：５’−ｔｔｃｇｃｃｃｇｃｇｇｃａａｇａｇａｇａｃｔａｃａａａｇａｃｇａｔｇａｃｇａｃａａｇｇｔｇｃｃｃａｇｇｇａｔｔｇｔｇｇｔｔｇ−３’）（配列番号：３５）およびＡｆｌＩＩ（ＣＥＳ３９：５’−ａｇｃｔａｃｔｔａａｇｇａｃｔｇｇｔｇｇｇｔｔｃｔｇｇｇａｔｔｔａｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｇｇａｇａｇ−３’）（配列番号：３１）により結合するｍＦｃフラグメントを創造するＣＥＳ５２／ＣＥＳ３９である。適当に消化およびライゲートされたとき、これらの２つの得られたＰＣＲフラグメントは、順にＡ１、ａ１、Ａ２、ａ２ドメイン、Ｂ−ドメインの最初の５個のＮ−末端アミノ酸、次にｍＦｃ＋ヒンジ領域、ｆｕｒｉｎコンセンサス配列（Ｆｃ領域の末端である最初のリジン（Ｋ）を有するＫＡＲＧＫＲ（配列番号：３６））、Ｆｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号：３７）、ｍＦｃ＋ヒンジ、Ｂ−ドメインの最後の１２個のＣ−末端アミノ酸、ならびに最後にＦＶＩＩＩのａ３、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメイン（図４）を含むモノシストロン性ＢＤＤ遺伝子となる。上記モノマー遺伝子を構築するために、２つのＰＣＲフラグメントをＡｖｒＩＩ／ＳａｃＩＩまたはＳａｃＩＩ／ＡｆｌＩＩで消化し、トリプルライゲーションを介して、ＡｖｒＩＩ／ＡｆｌＩＩで消化したｐＭ１０９（ｐＳＫ２０７．ＢＤＤ）にクローニングする。成功したクローンを配列決定し、次に、１つをｐＳＫ２０７骨格由来のＮｈｅＩ／ＰｍｅＩ（ｐＭ１０９の）を介して発現ベクターにクローニングし、ｐＳＫ２０７をＮｈｅＩ／ＰｍｅＩで消化する。タンパク質の合成および分泌中、該分子を最初にＦｌａｇ−ｍＦｃ領域の上流のｆｕｒｉｎ部位およびａ３のすぐ上流のプロテアーゼ部位で開裂させる。該分子は、図２において示されているとおりにＦｃ−Ｆｃジスルフィド相互作用（ＢＤＤＦｃ）を介してＦＶＩＩＩ分子のｍＦｃ領域に結合しているＦｌａｇ  ｍＦｃ分子を有する成熟ＦＶＩＩＩダイマー（ＢドメインをｍＦｃで置き換えられている）として循環する。ヘテロダイマー産物を、当業者に知られている方法を使用して、上清中に存在するすべてのホモダイマー産物から単離する。
【０１３６】
実施例６
以下の実施例は、哺乳動物宿主細胞の一過性トランスフェクションのために有用な一般的な処理およびその細胞培養を記載する。ＨＫＢ１１細胞をオービタルシェーカー（１００−１２５ｒｐｍ）上で５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃でタンパク質非含有培地中で懸濁培養中で増殖させ、０．２５から１．５×１０６細胞／ｍＬの密度で維持する。トランスフェクションのためのＨＫＢ１１細胞を１，０００ｒｐｍで５分遠心分離により回収し、次に、１．１×１０６細胞／ｍＬでＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３発現培地（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）に再懸濁する。細胞を６つのウェルプレートに播種し（４．６ｍＬ／ウェル）、オービタルローター上で（１２５ｒｐｍ）３７℃  ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートする。それぞれのウェルに対して、５μｇのプラスミドＤＮＡを０．２ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）と混合する。それぞれのウェルに対して、７μＬの２９３ＦｅｃｔｉｎＴＭ試薬（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）を０．２ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地と穏やかに混合し、室温で５分インキュベートする。希釈された２９３ＦｅｃｔｉｎＴＭを希釈されたＤＮＡ溶液に加え、穏やかに混合し、室温で２０−３０分インキュベートし、次に、５×１０６（４．６ｍＬ）のＨＫＢ１１細胞で播種されたそれぞれのウェルに加える。次に、細胞をオービタルローター（１２５ｒｐｍ）上でＣＯ２インキュベーター中で３７℃で３日間インキュベートし、その後、細胞を１０００ｒｐｍで５分、遠心分離によりペレット化し、次に、上清を回収し、−８０℃で保存する。
【０１３７】
実施例７
以下の実施例は、ウエスタンブロッティングによる第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの組換え生産を証明するために有用な一般的な処理を記載する。細胞培養物上清を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）（Millipore Corporation, Billerica, MA）により１０倍に濃縮するか（二次抗体がプロービングのために使用されないとき）、またはそのまま使用する（二次抗体がプロービングのために使用されるとき）。５０μＬの上清をＤＴＴ（還元）有りまたはＤＴＴ（非還元）無しで２０μＬの４×ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング色素と混合し、９５℃で５分加熱し、次に１０％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）（還元条件下）または４−２０％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル（Bis-Tris-MOPs）（非還元条件下）上に負荷する。タンパク質をニトロセルロース膜に移す。５％ミルク／ＰＢＳで６０分ブロッキング後、膜をマウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−標識ウサギポリクローナル抗体またはＨＲＰ−接合抗−第ＶＩＩＩ因子Ｃドメイン抗体とインキュベートする。また、抗−ヒト第ＶＩＩＩ因子ウサギモノクローナル抗体（Epitomics, CA）を第ＶＩＩＩ因子の軽鎖を検出するために使用され得る。次に、膜を抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ二次抗体と室温で６０分インキュベートする。ブロットをＰＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−２０（ポリオキシエチレンモノラウリン酸ソルビタン）で洗浄後、ＨＲＰ由来のシグナルを化学発光基質（ＥＣＬ）（Pierce, Rockford, IL）およびｘ線フィルムへの暴露を使用して検出する
【０１３８】
実施例８
以下の実施例は、ＥＬＩＳＡによる細胞培養物上清中の第ＶＩＩＩ因子抗原の濃度を測定するために有用である一般的な処理を記載する。細胞培養物上清をＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０バッファーで希釈し、標準曲線の範囲内のシグナルを達成する。例えば、ＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０で希釈され、精製された（比活性９，７００ＩＵ／ｍｇ）第ＶＩＩＩ因子ＢＤＤタンパク質を、１００ｎｇ／ｍＬから０．２ｎｇ／ｍＬの標準曲線を創造するために使用され得る。希釈されたサンプルおよび標準物を、ポリクローナル抗−第ＶＩＩＩ因子捕捉抗体Ｃ２であらかじめ被覆されているＥＬＩＳＡプレートに加える。検出抗体としてビオチン化Ｃ２を加えた後、プレートを室温で１時間インキュベートし、広範囲に洗浄し、次にキット製造業者（Pierce, Rockford, IL）により記載されているとおりにＴＭＢ基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）を使用して現像する。シグナルをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）プレートリーダー（SpectraMax(登録商標)340pc, Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を使用して４５０ｎＭで測定され得る。標準曲線を４つのパラメーターモデルに合わせ、未知の値を曲線から推定する。
【０１３９】
無傷な第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーに特異的ではない上記処理の別法として、ＥＬＩＳＡアッセイは、捕捉抗体（または検出抗体）として抗−第ＶＩＩＩ因子抗体および検出抗体（または捕捉抗体）として半減期モジュレーターに特異的な抗体を利用する。
【０１４０】
実施例９
以下の実施例は、９６ウェル型の市販の発色アッセイキット（Coatest(登録商標) SP4 FVIII, Chromogenix, Lexington, MA）を使用する細胞培養物上清および精製された画分中の第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの活性を測定するために有用な一般的な処理を記載する。トリプリケートサンプルをキットアッセイバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．３、１０ｍｇ／Ｌのシプロフロキサシン(ciprofloxin)および１．０％のＢＳＡ）で２５μＬに希釈し、ウェルに加える。次に、５０μＬのリン脂質、第ＩＸａ因子、第Ｘ因子溶液をそれぞれのウェルに加え、水平シェーカー上で３７℃で４分インキュベートする。２５μＬのＣａＣｌ２溶液（２５ｍＭ）を即座にウェルに加え、同じ様式で１０分インキュベートする。発色基質溶液（５０μＬ／ウェル）を加え、プレートを１０分インキュベートし、カラー現像を２５μＬの２０％酢酸の添加により停止させる。個々のウェルを、４０５ｎｍでの吸光度を９６−ウェルプレートリーダー（SpectraMax(登録商標) 340pc, Molecular Devices, Sunnyvale, CA）で測定する。第ＶＩＩＩ因子活性を、未知として、同じバッファーで希釈された５００−０．５ｍＩＵ／ｍＬの範囲である精製された第ＶＩＩＩ因子Ｂ−ドメイン欠失（ＢＤＤ）標準に対して定量し、４つのパラメーターモデルに合わせる。比活性（ＦＶＩＩＩのＩＵ／ｍｇ）をＣｏａｔｅｓｔ（登録商標）および第ＶＩＩＩ因子のＥＬＩＳＡの結果から計算する。
【０１４１】
実施例１０
以下の実施例は、ａＰＴＴアッセイを使用する細胞培養物上清および精製された画分中の第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの凝固活性を測定するために有用な一般的な処理を記載する。第ＶＩＩＩ因子の凝固活性は、ＥｌｅｃｔｒａＴＭ  １８００Ｃ  自動凝固分析器（Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA）により第ＶＩＩＩ因子欠乏ヒト血漿においてａＰＴＴアッセイを使用して測定され得る。簡潔には、凝固希釈剤中の上清サンプルの３つの希釈物を器具により作製し、次に、１００μＬを１００μＬのＦａｃｔｏｒＶＩＩＩ欠乏血漿および１００μＬの自動ａＰＴＴ試薬（ウサギ脳リン脂質および微粉化シリカ、bioMerieux, Inc., Durham, NC）と混合する。１００μＬの２５ｍＭのＣａＣｌ２溶液の添加後、血塊形成の時間を記録する。標準曲線を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて標準として使用されるのと同じ精製された第ＶＩＩＩ因子ＢＤＤの連続希釈を使用してそれぞれ負荷して作成する。標準曲線は、０．９５またはそれ以上の相関係数と直線的であった。標準曲線は、未知のサンプルの第ＶＩＩＩ因子の活性を決定するために使用される。
【０１４２】
実施例１１
以下の実施例は、実施例１および２に記載されているベクターを使用する細胞系の安定なトランスフェクションおよび創造を記載する。ＨＫＢ１１細胞を、実施例６に記載されている２９３ＦｅｃｔｉｎＴＭ試薬を使用してプラスミドＤＮＡ、ｐＳＫ２０７ＢＤＤＦｃ＋ヒンジまたはｐＳＫ２０７ＢＤＤＦｃ−ヒンジでトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を種々の希釈物（１：１００；１：１０００；１：１０，０００）で１００ｍｍ培養皿に分け、５％のＦＢＳおよび２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシン（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）を補ったＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に約２週間維持した。個々の単一のコロニーをつつき取り、滅菌クローニングディスク（Scienceware(登録商標), Bel-Art Products, Pequannock, NJ）を使用して６−ウェルプレートに移した。ｐＳＫ２０７ＢＤＤＦｃ＋ヒンジでトランスフェクトされたＨＫＢ１１細胞の５５を越えるクローンが確立され、寄託された。これらのクローンを、図５において示されている第ＶＩＩＩ因子の活性アッセイ（上記のＣｏａｔｅｓｔ（登録商標）およびａＰＴＴアッセイ）、図６において示されている第ＶＩＩＩ因子のＥＬＩＳＡ（上記）、および増殖アッセイにより第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの高い発現に関してスクリーニングした。非常に高い発現レベルを有する６つの細胞系を図６に示す。ＢＤＤＦｃ＋ヒンジに関してトップのクローンであるクローン８は、粘着して増殖するとき、〜１μｇ／ｍＬの融合タンパク質を発現する。クローン８馴化培地由来のＢＤＤＦｃ＋ヒンジの比活性は、由来のＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子タンパク質に相当する約５，０００−８，０００ＩＵ／ｍｇであった。同様の安定なトランスフェクションおよび選択処理を使用して、ＢＤＤＦｃ−ヒンジに関するクローン（クローンｔ）は、接着して増殖するとき、〜１μｇ／ｍＬの融合タンパク質を発現することを決定した。
【０１４３】
実施例１２
以下の実施例は、１０Ｌ  ＷＡＶＥ  ＢｉｏｒｅａｃｔｏｒＴＭ（GE Healthcare, Piscataway, NJ）を使用する安定な形質転換体によるタンパク質発現のスケールアップを記載する。クローン８およびクローンｔ細胞を５％のＦＢＳおよび２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを補ったＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に維持した。細胞を３日毎にＴ７５からＴ２２５フラスコに１：４で分けた。培養適応のために、１２個のＴ２２５フラスコの約１０億個の細胞を２Ｌもしくは３Ｌ−Ｅｒｌｅｎｍｙｅｒフラスコ中の２．５％のＦＢＳを補った無血清である１Ｌの懸濁培地に移した。２日後、細胞を１．２５％のＦＢＳを補った無血清懸濁培地に拡大した。次に、細胞を５％のヒト血漿タンパク質溶液（ＨＰＰＳ）を補った無血清懸濁培地に移した。約１００−１５０億個の細胞を１０Ｌ  ＷＡＶＥ  ＢｉｏｒｅａｃｔｏｒＴＭバッグにおいて培地中に約１００万／ｍｌの密度で播種した。３日後、細胞密度は５−６００万／ｍＬに到達し、馴化培地を回収した。最初に、粗培地を、蠕動ポンプにより制御されている１５０ｍＬ／分の流速で、Ｃｏｎｔｉｆｕｇｅ（登録商標）  Ｓｔｒａｔｏｓ（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）で６，０００ｒｐｍで連続的な遠心分離により細胞残屑を除去して浄化した。浄化された培地をＸ−１００（ポリエチレングリコール  ｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテル）（０．０５％まで）と混合し、１０ｋＤａ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  接線流膜（Millipore, Billerica, MA）における限外濾過により約１０倍に濃縮した。−８０℃で凍結する前にスクロースを１％の濃度に加えた。精製前の組換え的に生産される第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの比活性は、クローン８により生産されるＢＤＤＦｃ＋ヒンジについて１０，６２９ＩＵ／ｍｇおよびクローンｔにより生産されるＢＤＤＦｃ−ヒンジについて１１，１２２ＩＵ／ｍｇと測定された。
【０１４４】
実施例１３
以下の実施例は、クローン８のスケールアップ培養物からの第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの精製を記載する。抗−第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体親和性カラム（Ｃ７Ｆ７）、次に陰イオン交換Ｑ−セファロースＴＭカラム（GE Healthcare, Piscataway, NJ）を使用して、第ＶＩＩＩ因子ＢＤＤＦｃ＋ヒンジをＨＫＢ１１細胞馴化培地から精製した。全回収率は約３０％であった。１０Ｌ  ＷＡＶＥ  ＢｉｏｒｅａｃｔｏｒＴＭ  バッグからの凍結濃縮物を解凍し、ＡＥＫＴＡＴＭ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ  システム（Amersham Pharmacia, Uppsala, SW）を使用して１ｍＬ／分で免疫親和性カラムに負荷し、次にカラムをバッファー（２０ｍＭのイミダゾール、０．０１ＭのＣａＣｌ２、０．５ＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−８０（ポリエチレングリコール  ソルビタンオレイン酸モノエステル）、ｐＨ７．０）で洗浄した。結合した第ＶＩＩＩ因子ＢＤＤＦｃ＋ヒンジを１．０ＭのＣａＣｌ２を含むバッファーで溶離した。画分をＣｏａｔｅｓｔ（登録商標）アッセイにより第ＶＩＩＩ因子活性についてアッセイし、活性な画分を貯め、バッファーをＨｉＴｒａｐＴＭ  ２６／１０  脱塩カラム  Ｇ２５Ｍ（Amersham Biosciences, Uppsala, SW）でイオン交換ローディングバッファー（２０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのＣａＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−８０、ｐＨ７．０）に交換した。タンパク質を１ｍｌのＨｉＴｒａｐＴＭ  Ｑ  ＨＰ  カラム（Amersham Biosciences, Uppsala, SW）に負荷し、ＮａＣｌ勾配（２００ｍＭ−１０００ｍＭ）で溶離した。画分をＣｏａｔｅｓｔ（登録商標）アッセイにより第ＶＩＩＩ因子活性についてアッセイし、ピーク画分を貯めた。タンパク質濃度および比活性を決定した。ベストな画分（すなわち、図７のレーン８の画分５）の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅＴＭ染色（Invitrogen, Carlsbad, CA）により概算されるとおり約８０％である。ウエスタンブロット分析において抗−Ｆｃ抗体により検出されるため、精製された融合タンパク質はＦｃドメインを含んだ。精製された物質の比活性は、約１０，０００ＩＵ／ｍｇであった。この比活性は、ＢＤＤＦｃ＋ヒンジが完全に活性であることを示唆する第ＶＩＩＩ因子ＢＤＤ（ＢＤＤＦｃ＋ヒンジ由来）にほぼ匹敵する。
【０１４５】
実施例１４
以下の実施例は、組換え的に生産される第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーにおけるエンドトキシン試験を記載する。精製されたタンパク質溶液のエンドトキシンレベルを、０．００５ＥＵ／ｍＬの感度で動態発色  Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  アッセイ（Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）キット）を使用して決定した。ＢＤＤＦｃ＋ヒンジにおけるエンドトキシンレベルは、５ＥＵ／用量をはるかに下回る１．３−２．０ＥＵ／ｍＬと見出された。
【０１４６】
実施例１５
以下の実施例は、これらの第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーが由来する精製されたＢＤＤＦｃ＋ヒンジ、精製されたＢＤＤＦｃ−ヒンジおよび第ＶＩＩＩ因子タンパク質（「ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ」）を使用する正常マウスの薬物動態学試験を記載する。正常Ｃ５７オスマウスを、５０μｇ／ｋｇ体重でＢＤＤおよび融合タンパク質（ＢＤＤＦｃ＋ヒンジまたはＢＤＤＦｃ−ヒンジ）の単回投与で静脈内に注射した。血液サンプルをｔ＝注射後０、０．０８３、０．５、２、４、６、８、２４、２８、３２、４８および７２時間（時点あたり５匹のマウス）で回収した。血液サンプルにおけるタンパク質レベル（抗原ＥＬＩＳＡによる）および凝固活性（Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）アッセイによる）の両方を薬物動態学分析のために決定した。結果は表１に示されている。
【表１】
0005739865.tif 000002
【０１４７】
ＢＤＤＦｃ＋ヒンジおよびＢＤＤＦｃ−ヒンジのベータ半減期は、正常マウスにおけるＢＤＤ−ＦＶＩＩＩと同レベルであった。
【０１４８】
実施例１６
以下の実施例は、精製されたＢＤＤＦｃ−ヒンジ、およびＢＤＤＦｃ−ヒンジが由来する第ＶＩＩＩ因子タンパク質（「ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ」）を使用する血友病Ａ動物モデル（ＨｅｍＡマウス）における薬物動態学試験を記載する。結果は、ＢＤＤＦｃ−ヒンジがＢＤＤ−ＦＶＩＩＩと比較してＨｅｍＡマウスにおいて有意な長期ベータ相半減期を有することを示す。
【０１４９】
ＨｅｍＡマウスを、５％のアルブミンを含む製剤バッファー中の１．２５μｇ／マウス（５０μｇ／ｋｇ）でＢＤＤＦｃ−ヒンジ（「ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ」９匹のマウス）を尾静脈（ｉ．ｖ．）を介して注射した。さらなるＨｅｍＡマウスに、２００ＩＵ／ｋｇのＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ；ＢＤＤＦｃ−ヒンジ由来の第ＶＩＩＩ因子変異体を投与した。血液を、ＢＤＤＦｃ−ヒンジを与えた代わりのマウス（３匹のマウス／時点）から１、２４、４８、６６、７２、９０、１２０および１４８時間目に、およびＢＤＤ−ＦＶＩＩＩを与えた代わりのマウス（５匹のマウス／時点）から１、４、８、１６、２４および３２時間目に眼窩後を介してクエン酸塩中に回収した。血漿ＦＶＩＩＩ活性をＣｏａｔｅｓｔ（登録商標）  ＳＰ  ＦＶＩＩＩキット（Instrumentation Laboratory Company, Lexington, MA）を使用して測定した。ベータ相半減期をＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）（Pharsight, Mountain View, CA）における少量のサンプリング(sparse-sampling)および非区画(non-compartment)モデルにより概算した。Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）アッセイにおいて、標準曲線を作成するためにＢＤＤ−ＦＶＩＩＩを使用した。簡潔には、同じ血漿マトリックス中のサンプル、標準、陽性および陰性コントロール（それぞれ２５μＬ）を９６−ウェルプレートにデュプリケートで加えた。ＦＩＸａ、ＦＸおよびリン脂質溶液の混合物（５０μＬ）を加え、３７℃で５分インキュベートした。次に、２５μＬのＣａＣｌ２溶液を加え、３７℃で５分インキュベートし、次に５０μＬ基質を加え、色が適当な強度に発達するまで３７℃で５分インキュベートした。停止溶液（２５μＬ）を加え、プレートをプレートリーダー（SpectraMax(登録商標) 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA）でＯＤ４０５ｎｍで読んだ。結果は、図８において示されているとおりにＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）  Ｐｒｏ  ４．８（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を使用して計算した。結果は、それぞれの時点で、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩに対して５匹のマウスおよびＦＶＩＩＩ−Ｆｃに対して３匹のマウスからの平均±ＳＤを示した。
【０１５０】
ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの減衰曲線と比較して、ＢＤＤＦｃ−ヒンジは迅速な分布相で二相崩壊を示した（図８）。ＢＤＤＦｃ−ヒンジのベータ相半減期は５０μｇ／ｋｇで１１．９時間であり、これはベータ相半減期が６．０３時間である修飾されていないＢＤＤ−ＦＶＩＩＩと比較して約２倍の改善であった。いくつかの第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーが非血友病Ａ動物モデルにおける薬物動態学試験を使用して分析され得ない可能性があり得る。
【０１５１】
実施例１７
以下の実施例は、上記第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子の発現産物である組換え第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーにおけるインビトロ試験を記載する。哺乳動物発現ベクターｐＳＳ２０７ＢＤＤＦｃ＋ヒンジおよびｐＳＳ２０７ＢＤＤＦｃ−ヒンジをＨＫＢ１１細胞に一過性でトランスフェクトし、馴化培地を上記トランスフェクション７２時間後に回収した。図９Ａにおいて示されているとおり、還元条件下で濃縮された上清のウエスタンブロット分析は、ＢＤＤＦｃ＋ヒンジ第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーが、最初に抗−Ｆｃ抗体により検出されるとおりの（レーン５）〜１９５ｋＤａの第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質として発現し、抗−Ｆｃ抗体により検出されるとおりの（レーン５）１１５−ｋＤａ重鎖に；図９Ｂにおいて示されているとおり、第ＶＩＩＩ因子軽鎖特異的抗体により検出されるとおりの（レーン５）８０−ｋＤａ軽鎖に翻訳後プロセッシングされることを示した。比較のために、精製されたＢＤＤタンパク質およびｐＳＫ２０７またはｐＳＫ２０７ＢＤＤ（ＢＤＤＦｃ＋ヒンジをコードする第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子由来のＢ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子遺伝子を含む発現ベクター）で一過性でトランスフェクトされたＨＫＢ１１細胞からの馴化培地は、抗−Ｆｃ抗体と反応せず（図９Ａ）、第ＶＩＩＩ因子軽鎖抗体を使用すると、精製されたＢＤＤタンパク質またはｐＳＫ２０７ＢＤＤで一過性でトランスフェクトされたＨＫＢ１１細胞からの馴化培地から、予期される８０ｋＤａ軽鎖を同定した（図９Ｂ）。対照的に、ｐＳＫ２０７で一過性でトランスフェクトされたＨＫＢ１１細胞からの馴化培地に軽鎖が存在しなかった（図９Ｂ）。これらの結果は、ＢＤＤＦｃ＋ヒンジをコードする第ＶＩＩＩ因子融合遺伝子がＢ−ａ３ドメイン接合点で機能的切断部位をまだ維持しているため、軽鎖の分子量が変化することが期待されないため、欠失Ｂドメイン領域へのＦｃ領域の挿入が翻訳後修飾に影響しないことを示す。
【０１５２】
第ＶＩＩＩ因子活性を、Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）アッセイおよびａＰＰＴ凝固アッセイによりｐＳＫ２０７ＢＤＤ（コントロール）、ｐＳＫ２０７ＢＤＤＦｃ＋ヒンジおよびｐＳＫ２０７ＢＤＤＦｃ−ヒンジトランスフェクタントからの馴化培地で検出した（図１０）。第ＶＩＩＩ因子活性はｐＳＫ２０７トランスフェクタントからの馴化培地で検出されなかった。ＢＤＤＦｃ融合タンパク質（すなわち、ＢＤＤＦｃ＋ヒンジおよびＢＤＤＦｃ−ヒンジ）の両方の活性範囲は、ＢＤＤに匹敵した。データは、使用される特定の部位へのＦｃ領域の挿入が、由来のＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子タンパク質と比較して、第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの翻訳後プロセッシングまたは生物学的活性に影響しないことを示唆した。
【０１５３】
ｐＳＫ２０７ＢＤＤＦｃ＋ヒンジまたはｐＳＫ２０７ＢＤＤで一過性でトランスフェクトされたＨＫＢ１１細胞から回収された馴化培地を、ウサギ−抗−マウスＦｃ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）であらかじめ被覆された９６−ウェルプレートに加え、第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーを捕捉する固相Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）アッセイ。ＢＤＤＦｃ＋ヒンジ融合タンパク質のみがプレートに結合し、由来の第ＶＩＩＩ因子ＢＤＤタンパク質は流れる。次に、Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）アッセイをウェルに固定されたＢＤＤＦｃ＋ヒンジに対して直接実施し、図１１は、ＢＤＤＦｃ＋ヒンジがこのアッセイにおいて活性であることを示す。
【０１５４】
ｐＳＫ２０７ＢＤＤＦｃ＋ヒンジまたはｐＳＫ２０７ＢＤＤＦｃ−ヒンジ発現ベクターで一過性でトランスフェクトされたＨＫＢ１１細胞からの５倍濃縮馴化培地を使用して、分析を実施した。サンプルを還元および非還元条件下で４−１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲルで分離した。ブロットをウサギモノクローナル抗−ＦＶＩＩＩ軽鎖抗体（Epitomics, Burlingame, CA）、次にＨＲＰ−接合抗−ウサギＩｇＧ二次抗体でプロービングした。結果は、ＢＤＤＦｃ＋ヒンジがダイマーを形成するが（すなわち、マルチマー第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマー）、ＢＤＤＦｃ−ヒンジがモノマーであることを示した（図１２）。同様の結果がｐＳＫ２０７ＢＤＤＦｃ＋ヒンジで安定に形質転換された細胞で見られた。
【０１５５】
実施例１８
以下の実施例は、第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーに包含されているとき、ＦｃＲｎ結合エピトープがＦｎＲｎに結合する能力を維持しているか否かを決定するために、ＢｉａｃｏｒｅＴＭシステムを使用して実施された機能的試験を記載する。ＢｉａｃｏｒｅＴＭ試験における使用のために、組換えマウスＦｃＲｎ（ｍＦｃＲｎ）タンパク質をＣＨＯ−Ｋ１細胞で発現させ、マウスＩｇＧ−親和性クロマトグラフィーにより精製した。マウスＦｃＲｎをアミンカップリングによりＣＭ−５チップ上に固定した。２つの第ＶＩＩＩ因子ヘテロダイマー（ＢＤＤＦｃ＋ヒンジおよびＢＤＤＦｃ−ヒンジ）、ＢＤＤ（ＢＤＤＦｃ＋ヒンジおよびＢＤＤＦｃ−ヒンジ由来の第ＶＩＩＩ因子タンパク質）、および全長組換え第ＶＩＩＩ因子を、種々の濃度（例えば、１．５、３、６、１２、２５、および５０ｎＭ）でチップの表面を通過させた。固定されたｍＦｃＲｎへのＢＤＤＦｃ±ヒンジ第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーの結合を検出した（図１３）。結合親和性（ＫＤ＝２．４８ｎＭ）をＢＤＤＦｃ＋ヒンジ（「ＢＤＤＦｃ＋Ｈ」）に対して計算し、ＢＤＤＦｃ−ヒンジ（「ＢＤＤＦｃ−Ｈ」）はＢＤＤＦｃ＋ヒンジ（ＫＤ＝３．７５ｎＭ）と同様であった。検出可能な結合がＢＤＤ（「ＢＤＤ」）または全長組換え第ＶＩＩＩ因子（「ＦＶＩＩＩ」）で見られなかった。
【０１５６】
結果は、ＢＤＤＦｃ＋ヒンジおよびＢＤＤＦｃ−ヒンジ第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーがｎＭの親和性でｍＦｃＲｎに対して強い結合を示すことを示す。対照的に、ＢＤＤも全長組換えＦＶＩＩＩもｍＦｃＲｎに結合することができなかった。これは、ＦｃＲｎ結合エピトープを含まないため、予期される。ＨｅｍＡマウスを使用して実施される薬物動態学試験を考慮して、結果は、ＢＤＤＦｃ＋ヒンジおよびＢＤＤＦｃ−ヒンジが高親和性でｍＦｃＲｎに結合する機能的ＦｃＲｎ結合エピトープを含み、インビボで長期ベータ相半減期をもたらすことを示唆する。
【０１５７】
実施例１９
循環において、ＦＶＩＩＩは、主に安定な複合体としてフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）に結合している。トロンビン（第ＩＩａ因子）により活性化されると、ＦＶＩＩＩは複合体から分離し、凝固カスケードと相互作用する。活性化ＦＶＩＩＩは、タンパク質分解的にプロセスにおいて不活性化され（活性化タンパク質Ｃおよび第ＩＸａ因子により非常に顕著に）、血流から迅速に除去される。以下の実施例は、第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーに包含されるとき、第ＶＩＩＩ因子タンパク質がフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）に結合する能力を維持しているか否かを決定するために、ＢｉａｃｏｒｅＴＭシステムを使用して実施される機能的試験を記載する。
【０１５８】
ヒトｖＷＦをアミンカップリングによりＣＭ−５チップ上に固定した。２つの第ＶＩＩＩ因子ヘテロダイマー（ＢＤＤＦｃ＋ヒンジおよびＢＤＤＦｃ−ヒンジ）、ＢＤＤ（ＢＤＤＦｃ＋ヒンジおよびＢＤＤＦｃ−ヒンジ由来の第ＶＩＩＩ因子タンパク質）、および全長組換え第ＶＩＩＩ因子を、種々の濃度（例えば、１、２、４、８、１６、および２５ｎＭ）でチップの表面を通過させた。ＢＤＤ（「ＢＤＤ」）および全長組換え第ＶＩＩＩ因子（「ＦＶＩＩＩ」）の両方は、サブナノモル親和性（０．５３−０．６５７ｎＭ）でヒトｖＷＦに結合することができ、ｖＷＦへのＢＤＤＦｃ＋ヒンジ（「ＢＤＤＦｃ＋Ｈ」）またはＢＤＤＦｃ−ヒンジ（「ＢＤＤＦｃ−Ｈ」）の結合も検出した（図１４）。ＢＤＤＦｃ＋ヒンジおよびＢＤＤＦｃ−ヒンジの結合親和性（ＫＤ）は、それぞれ０．４６５ｎＭおよび０．９０８ｎＭと計算された。データは、第ＶＩＩＩ因子融合ヘテロダイマーＢＤＤＦｃ＋ヒンジおよびＢＤＤＦｃ−ヒンジがｖＷＦに対するサブナノモル親和性を有し、モジュレーターとしての免疫グロブリンＦｃ領域の使用がｖＷＦに対するＢＤＤの結合特性をブロックしないことを示す。
【０１５９】
実施例２０
以下の実施例は、ＢＤＤＦｃ−ヒンジがＨｅｍＡマウスの尾静脈切断出血モデルにおいて有効であることを証明する。ＨｅｍＡマウス（８−１０週、〜２５ｇ）に、１つの側部尾静脈の切断の４８時間前に、１２もしくは６０ＩＵ／ｋｇの最終用量で５％のアルブミンを含む製剤バッファー中の１００μＬのＢＤＤＦｃ−ヒンジ、または４０ＩＵ／ｋｇで５％のアルブミンを含む製剤バッファー中の１００μＬのＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ、または製剤バッファー単独（輸送媒体）（２０匹のマウス／処置群）を尾静脈を介して注射した。マウスを麻酔し（ケタミン／キシラジン）、１つの側部尾静脈を尾の直径が約２．７ｍｍである場所で切断した。次に、凝血するまで尾を３７℃にあらかじめ温めた塩水で濯ぎ、出血時間を記録した。次に、マウスを加温パッドの上に紙ベッドを備えた個々のケージに移し、時間単位で最初に損傷９時間後、次に２４時間後に観察した。再出血の事象を記録した。統計分析をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）４で実施し、結果を図１５に示す。
【０１６０】
損傷２４時間後に１０％のみ生存した輸送媒体−コントロール群に対して、ＢＤＤＦｃ−ヒンジの１２ＩＵ／ｋｇおよび６０ＩＵ／ｋｇは、それぞれ２５％および８０％の生存を成し遂げた。ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ−ヒンジの有効性は、４０ＩＵ／ｋｇで６０％の生存をもたらすＢＤＤ−ＦＶＩＩＩと匹敵すると概算される。全ての処置は、有意に改善された（Ｌｏｇ−Ｒａｎｋ試験による両側  ｐ＜０．０５）生存曲線  対  輸送媒体コントロールをもたらした。
【０１６１】
本明細書に記載されている全ての文献および特許は出典明示により本明細書に包含させる。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本発明の記載されている方法の種々の修飾および変化が当業者に明らかである。
【０１６２】
本発明は特定の態様に関連して記載されているが、本発明がこのような特定の態様に過度に限定されるべきでないと理解すべきである。さらに、生化学または関連分野の当業者に明白である本発明を実施するための上記方法の種々の修飾は、特許請求の範囲内であると意図する。当業者は、わずかな日常の実験を使用して、本明細書に記載されている本発明の特定の態様の多数の均等を認識するか、または確かめることができる。このような均等は特許請求の範囲により包含させることを意図する。
【図１】
0005739865.tif 000003
【図２】
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【図３】
0005739865.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0005739865.tif 000011
【図１０】
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【図１１】
0005739865.tif 000013
【図１２】
0005739865.tif 000014
【図１３】
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【図１４】
0005739865.tif 000016
【図１５】
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【配列表】
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