(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の放射粒子（１０１）を３次元位置特定するための超解像顕微鏡法であって、
顕微鏡検査撮像システム（１２１、１２３、１２４、１２５）によって検出器（１１０）の検出面（１１１）に前記放射粒子の少なくとも１つの画像を形成すること、
前記放射粒子と前記検出面との間に存在する光学的欠点の少なくとも一部を波面変調デバイス（１５０）によって補正すること、
前記放射粒子によって放出された波面の変形を前記波面変調デバイスによって導入し、前記検出面における前記放射粒子の像の形状と、前記顕微鏡検査撮像システムによって前記検出面と光学的に共役させられる対物面に対する前記放射粒子の軸方向位置との間に、前記粒子の前記軸方向位置の値の所定の範囲において全単射関係を形成するのを可能にすることを含み、前記波面の前記変形が、前記波面変調デバイスを制御するための手段によって制御されることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記放射粒子と前記検出面との間に存在する波面光学的欠点を波面分析デバイス（１６０）によって分析する事前のステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記放射粒子の画質の程度に基づいてすべてまたは一部の前記光学的欠点の補正が繰り返し実施されることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の方法であって、少なくとも１つの放射粒子を励起させるための１条または複数条の光線を放出し、前記粒子が所定の範囲内の波長で光信号を放出するのを可能にすることをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の方法であって、前記制御された変形は非点収差であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の方法であって、放射粒子に動的に合焦させるステップをさらに含み、前記動的な合焦は、前記波面変調デバイスにより、前記粒子によって放出される前記波面の焦点を制御可能にぼかすことによって得られることを特徴とする方法。
【請求項７】
光学撮像システムおよび検出器を搭載した顕微鏡を備える、放射粒子を位置特定するための超解像顕微鏡検査システムに接続されるようになっている波面制御デバイス（２００）であって、
それぞれ、前記顕微鏡の前記光学撮像システムの像面（１１２）および前記検出器の検出面（１１１）と一致するようになっている入射面および出射面を光学的に共役させるためのリレー光学系（１２４、１２５）と、
補正面（１５１）を備え、前記制御デバイスが前記超解像顕微鏡検査システムに接続されたときに前記放射粒子によって放出される波面を変調するのを可能にする、波面を空間的に変調するためのデバイス（１５０）と、
前記顕微鏡の前記光学撮像システムの出射瞳と一致するようになっている前記制御デバイスの入射瞳面を前記補正面と光学的に共役させる光学系（１２４）と、
波面を空間的に変調するための前記デバイスを制御し、前記波面制御デバイスが前記超解像顕微鏡検査システムに接続されたときに、前記粒子と前記検出面との間に存在する光学的欠点の少なくとも一部を補正するのを可能にし、かつ前記波面の制御された変形を導入するのを可能にし、前記検出面における前記放射粒子の像の形状と、前記検出面と光学的に共役させられる対物面に対する前記放射粒子の軸方向位置との間の全単射関係を、前記粒子の前記軸方向位置の値の所定の範囲において形成するのを可能にするための手段（１８０）とを備えることを特徴とする波面制御デバイス（２００）。
【請求項８】
請求項７に記載の波面制御デバイスであって、光を空間的に変調するための前記デバイスは変形可能なミラーであることを特徴とする波面制御デバイス。
【請求項９】
請求項７または８に記載の波面制御デバイスであって、前記制御手段に接続された、光学的欠点を分析するためのデバイス（１６０）をさらに備えることを特徴とする波面制御デバイス。
【請求項１０】
請求項９に記載の波面制御デバイスであって、光学的欠点を分析するための前記デバイスはシャック−ハルトマン分析器であることを特徴とする波面制御デバイス。
【請求項１１】
請求項７から１０のいずれか一項に記載の波面制御デバイスであって、前記波面制御デバイスを前記超解像顕微鏡検査システムに接続するための機械的インターフェースをさらに備えることを特徴とする波面制御デバイス。
【請求項１２】
１つまたは複数の放射粒子（１０１）の３次元位置特定を行うための超解像顕微鏡検査デバイス（１００）であって、
検出器（１１０）の検出面（１１１）において前記放射粒子を撮像するためのシステム（１２１、１２３、１２４、１２５）と、
波面を空間的に変調し、前記放射粒子によって放出される前記波面を変調するのを可能にするためのデバイス（１５０）と、
前記波面を空間的に変調するための前記デバイスを制御し、前記粒子と前記検出面との間に存在する光学的欠点の少なくとも一部を補正するのを可能にし、かつ前記波面の制御された変形を導入するのを可能にし、前記検出面における前記放射粒子の像の形状と、前記撮像システムによって前記検出面と光学的に共役させられる対物面に対する前記放射粒子の軸方向位置との間の全単射関係を、前記粒子の前記軸方向位置の値の所定の範囲において形成するのを可能にするための手段（１８０）とを備えることを特徴とするデバイス（１００）。
【請求項１３】
請求項１２に記載の３次元位置特定を行うためのデバイスであって、波面を空間的に変調するための前記デバイスは、前記撮像システムの瞳と光学的に共役させられる補正面（１５１）を含むことを特徴とする３次元位置特定を行うためのデバイス。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の３次元位置特定を行うためのデバイスであって、光を空間的に変調するための前記デバイスは変形可能なミラーであることを特徴とする３次元位置特定を行うためのデバイス。
【請求項１５】
請求項１２から１４のいずれか一項に記載の３次元位置特定を行うためのデバイスであって、前記制御手段に接続された、光学的欠点を分析するためのデバイス（１６０）をさらに備えることを特徴とする３次元位置特定を行うためのデバイス。
【請求項１６】
請求項１５に記載の３次元位置特定を行うためのデバイスであって、光学的欠点を分析するための前記デバイスはシャック−ハルトマン分析器であることを特徴とする３次元位置特定を行うためのデバイス。
【請求項１７】
請求項１２から１６のいずれか一項に記載の３次元位置特定を行うためのデバイスであって、前記制御手段は、前記放射粒子で形成された像の画質の程度に基づいてすべてまたは一部の前記光学的欠点を確実に繰り返し補正することを特徴とする３次元位置特定を行うためのデバイス。
【請求項１８】
請求項１２から１７のいずれか一項に記載の３次元位置特定を行うためのデバイスであって、少なくとも１つの放射粒子を励起させるための１条または複数条の光線を放出し、前記粒子が所定の範囲内の波長で光信号を放出するのを可能にするためのデバイス（１４１）をさらに備えることを特徴とする３次元位置特定を行うためのデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超解像顕微鏡法および光学デバイス、すなわち、１つまたは複数の粒子を３次元位置特定するための回折限界よりも低い解像度による超解像顕微鏡法および光学デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の動的構成に関する人類の理解は、生体において個々の分子を光学的に検出するのを可能にする技術的な開発によって完全に変わりつつある。超高感度の測定方法によって、現在、生物学的分子の分子環境における動きを計数し、位置特定し、追跡することが可能になっている（たとえば、Ｂ．ファンら「Ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７８、９９３（２００９）参照）。このように、数ナノメートルの空間解像度およびミリ秒に達する時間解像度によって分子複合体の組成、構造、および空間的動態を分析することが可能である。これによって、従来生物学および生化学で使用されている顕微鏡検査技術では過去には調査できなかった複雑な分子組織を解明する機会が与えられている。特に、単一の分子を撮像するための技術はすでに、基礎研究を超えた分野、特に、ＤＮＡ塩基配列決定という重要な分野に応用されている（Ｔ．Ｄ．ハリスら「Ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｏｍｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２０、１０６（２００８））。長い目で見ると、このような技術の使用は、診察または分子標的治療の分野、すなわち、超高感度検出能力が重要な利点となる分野に普及すると思われる。したがって、科学および工業面において、個々の分子のスケールでの有効な撮像手法を開発することが強く求められている。
【０００３】
一般に、人間の細胞は、かなりの数の反応物質（たいていの場合、タンパク質である）間で多数の生化学反応が起こる反応器とみなされることがある。細胞内で、タンパク質は、高分子複合体と呼ばれる反応単位として集合する。細胞機能を有するタンパク質集合の平均サイズは通常、小さい複合体の場合の数ナノメートルから核孔のような最大の構造の場合の約１００ナノメートルまでの範囲である。最も大きい分子複合体（ヌクレオソーム、ＲＮＡポリメラーゼ、リボソーム）のサイズは１０ｎｍから３０ｎｍの間である。これらの複合体間の様々な相互作用と、その結果生じる分子修飾によって、すべての細胞制御の物理的および化学的媒介である相互作用および反応のネットワークが形成される。このようなネットワークの分析は、細胞のプロセスを理解するうえで最も重要である。実際、病変を生じさせる大部分の細胞機能障害は、細胞高分子複合体のパートナーの一方の相互作用の欠陥または存在によって生じる。このような病変を有効に治療することを目的としてこのような病変を理解するには、タンパク質複合体の互いの相対的な化学量（分子計数）および位置に関する量的情報を提供することのできる測定器具を開発することが不可欠である。
【０００４】
現在、直接蛍光を発するかまたは可溶性蛍光化合物に反応することのできる遺伝子暗号化タグを付加することによって、有機体におけるほぼあらゆるタンパク質を機能化することが可能である（たとえば、Ｂ．Ｎ．Ｇｉｅｐｍａｎｓら「Ｔｈｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｔｏｏｌｂｏｘ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１２、２１７（２００６）を参照）。このようなプローブは、光退色の前に数十万個から数百万個の間の多数の光子を放出することができる。言い換えれば、プローブによってタグ付けすることは、特定のタンパク質に「光子量」を割り振ることと同等であり、次いで、この量を使用して分子情報を（たとえば増幅ＣＣＤカメラによって）人間の肉眼環境に移すことができる。したがって、蛍光タンパク質によって放出される光子は特に、蛍光タンパク質の細胞環境における位置を数十ナノメートルの解像度で特定するか、または経時的に追跡するのを可能にし、それによって、蛍光タンパク質の移動度および細胞系との相互作用を測定するのを可能にする。
【０００５】
分子を位置特定する能力は、点描画超解像顕微鏡法（ｐｏｉｎｔｉｌｌｉｓｔ  ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（「光活性化位置特定顕微鏡法」を表す頭字語ＰＡＬＭまたは「確率論的光学再構成顕微鏡法（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）」を表す頭字語ＳＴＯＲＭによって知られている）において最も重要である。これらの顕微鏡法は、光活性化による、同時に活性化する放射体の数についてのナノスケールの位置特定と制御を組み合わせ、細胞サンプルの２次元画像を従来の回折限界（現代の落射蛍光顕微鏡では約２５０ｎｍ）よりもずっと低い１０ｎｍ〜５０ｎｍの解像度で得るのを可能にする（Ｂ．ファンら「Ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７８、９９３（２００９）参照）。得られる解像度は、関与する高分子集合のサイズと同程度であるので、高分子の空間組織と機能および構造との関係を調査することが可能になる。
【０００６】
２００８年にハーバードにあるＸ．チョアンの研究所において、信号の光学経路上に円筒形レンズを配置し、かつ個々の分子について顕微鏡の点広がり関数（ＰＳＦ）において生じる楕円率を較正することによって、垂直平面における解像度の約２．５倍である約１００ｎｍの軸方向解像度を有する３Ｄ  ＳＴＯＲＭ顕微鏡法が実証された（たとえば、Ｂ．ファンら「Ｔｈｒｅｅ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｂｙ  ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１９、８１０（２００８）または同じ発明者の名義の米国特許出願第２０１１／０００２５３０号を参照）。この技術では、軸方向解像度が、焦点面からフルオロフォアまでの距離の関数としての、ｘ軸およびｙ軸に沿った光学信号の対称性の破れに関係付けられる。
【０００７】
第２の方法は、軸方向に分離された２つの平面における個々の分子からの信号を同時に撮像することから成る。この同時「２平面」検出では、２つの平面間の分子のｚ位置を非点収差手法によって実現される精度と同様な精度で求めることができる（たとえば、Ｍ．Ｆ．ジュエットら「Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｕｂ−１００  ｎｍ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  ｔｈｉｃｋ  ｓａｍｐｌｅｓ」Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５、５２７（２００８）を参照）。この技術の利点は、横方向解像度と軸方向解像度が結合されないことである。
【０００８】
しかし、円筒形レンズと２平面技術の両方に共通する制限は、ＰＳＦを変形し、放射粒子を横方向および軸方向において位置特定するためのアルゴリズムを劣化させる残留光学収差と関係がある。さらに、分子の軸方向位置を求めることが可能な深度（範囲）が、（約１〜２μｍに）制限され、装置の光学機械要素によって全体的に固定され、すなわち、迅速に調整することは不可能である。このことは明らかに、使用されるフルオロフォアの様々な種類および対象となる生物学的用途に応じた「光子量」の最適な使用に対する障害である。
【０００９】
最後に、「２重螺旋ＰＳＦ」法（Ｓ．Ｒ．パバーニら「Ｔｈｒｅｅ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ，ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｂｅｙｏｎｄ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｌｉｍｉｔ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｈｅｌｉｘ  ｐｏｉｎｔ  ｓｐｒｅａｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０６、２９９５（２００９））または「ｉＰＡＬＭ」法（Ｇ．シュテンゲルら「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｒｅｓｏｌｖｅｓ  ３Ｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０６、３１２５（２００９））のような、それほど一般的ではない他の方法が実証されていることに留意されたい。さらに、現在、ｉＰＡＬＭ技法ではｚ方向における最適な位置特定が可能であるが、実験がかなり複雑になり（４ｐｉ測定システムおよび放出される光子の３重干渉検出）、生物学研究所での最低限の使用に制限されている。さらに、ｉＰＡＬＭ技法は固定されたサンプルに制限されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｂ．ファンら「Ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７８、９９３（２００９）
【非特許文献２】Ｔ．Ｄ．ハリスら「Ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｏｍｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２０、１０６（２００８）
【非特許文献３】Ｂ．Ｎ．Ｇｉｅｐｍａｎｓら「Ｔｈｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｔｏｏｌｂｏｘ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１２、２１７（２００６）
【非特許文献４】Ｂ．ファンら「Ｔｈｒｅｅ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｂｙ  ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１９、８１０（２００８）
【非特許文献５】Ｍ．Ｆ．ジュエットら「Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｕｂ−１００  ｎｍ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  ｔｈｉｃｋ  ｓａｍｐｌｅｓ」Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５、５２７（２００８）
【非特許文献６】Ｓ．Ｒ．パバーニら「Ｔｈｒｅｅ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ，ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｂｅｙｏｎｄ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｌｉｍｉｔ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｈｅｌｉｘ  ｐｏｉｎｔ  ｓｐｒｅａｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０６、２９９５（２００９）
【非特許文献７】Ｇ．シュテンゲルら「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｒｅｓｏｌｖｅｓ  ３Ｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０６、３１２５（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、放射粒子または「放射体」を回折限界よりも低い解像度で３次元位置特定するための方法およびデバイスであって、顕微鏡の点広がり関数を適切に調節することができ、特に測定の信頼性を向上させることを可能にし、かつ所定の放射体に対する利用可能な「光子量」の使用を最適化するのを可能にする方法およびデバイスを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
第１の態様では、本発明は、１つまたは複数の放射粒子を３次元位置特定するための超解像顕微鏡法であって、
顕微鏡検査撮像システムによって検出器の検出面に前記放射粒子の少なくとも１つの画像を形成すること、
前記放射粒子と前記検出面との間に存在する光学的欠点の少なくとも一部を波面変調デバイスによって補正すること、
前記放射粒子によって放出された波面の変形を前記波面変調デバイスによって導入し、検出面における前記放射粒子の像の形状と、顕微鏡検査撮像システムによって検出面と光学的に共役させられる対物面に対する前記放射粒子の軸方向位置との間に、粒子の前記軸方向位置の値の所定の範囲において全単射関係を形成するのを可能にすることを含み、波面の前記変形が、波面変調デバイスを制御するための手段によって制御される方法に関する。
【００１３】
本発明による３次元位置特定方法において、波面変調デバイスを使用して放射粒子と検出面との間に存在する光学的欠点を補正するとともに、粒子によって放出される波面に導入される変形を制御して粒子の軸方向位置を求めると、特にＰＳＦが完全に制御されることによって感度および精度が向上し、それによって利用可能な「光子量」を所定の放射粒子に適合することが可能になる。具体的には、「光子量」、すなわち、放射粒子によって放出される光子の数が多い場合、十分な検出感度を維持しつつ、粒子によって放出される波面のより大きい振幅での変形を導入し、放射粒子を観察することのできる深度範囲を広げることが可能になる。これに対して、「光子量」がより少ない場合、ＰＳＦの質が向上して深度範囲が狭くなり、粒子によって放出される波面に導入される変形の振幅が制限されることによって十分な検出信号が得られる。
【００１４】
一実施形態では、この方法は、前記放射粒子と前記検出面との間に存在する波面光学的欠点を波面分析デバイス、たとえばシャック−ハルトマンデバイスによって分析する事前のステップを含んでよい。このステップは、たとえば、放射信号が、光学的欠点を分析器によって良好な精度で分析するのを可能にするのに十分な強度を有する蛍光ビードを、サンプルに導入することが可能なときに実施されてもよい。
【００１５】
代替として、たとえば、蛍光ビードをサンプルに導入するのが困難であるとき、放射粒子の画質の程度に基づいてすべてまたは一部の光学的欠点の補正が繰り返し実施される場合がある。
【００１６】
一実施形態では、この方法は、少なくとも１つの放射粒子を励起させるための１条または複数条の光線を放出することをさらに含み、前記粒子が所定の範囲内の波長で光信号を放出するのを可能にする。放射粒子の励起は、たとえば蛍光プローブによってマーク付けされた粒子の場合に必要である。
【００１７】
制御された変形が、偶数次方位角のゼルニケ多項式の組合せ、たとえば非点収差、より詳細には３次非点収差を使用して得られると有利である。非点収差を導入すると、波面の分解がゼルニケ多項式に基づくときにゼルニケ多項式の係数のうちの１つのみを調整することによって、粒子の像の形状と粒子の軸方向位置との間に全単射関係を形成するのが可能になる。その場合、導入される非点収差の振幅を調整して粒子の対象となる軸方向位置範囲を変化させることが可能になる。
【００１８】
一実施形態では、この方法は場合によっては、放射粒子に動的に合焦させるステップも含み、この動的な合焦は、前記波面変調デバイスにより、前記粒子によって放出される波面の焦点を制御可能にぼかすことによって得られる。したがって、本発明による３次元位置特定方法において波面変調デバイス変調器を使用すると、他の機能を利用することが可能になり、たとえば、サンプルを顕微鏡検査デバイスに対して機械的に移動させずに粒子を追跡するのに使用されることになる。
【００１９】
第２の態様では、本発明は、光学撮像システムおよび検出器を搭載した顕微鏡を備える、放射粒子を位置特定するための超解像顕微鏡検査システムに接続されるようになっている波面制御デバイスに関する。そのような波面制御デバイスは、従来技術の超解像顕微鏡検査システムに接続され、第１の態様による方法を実施するようになっている。第２の態様による波面制御デバイスは、
それぞれ、顕微鏡の前記光学撮像システムの像面および検出器の検出面と一致するようになっている入射面および出射面を光学的に共役させるためのリレー光学系と、
補正面を備え、前記制御デバイスが超解像顕微鏡検査システムに接続されたときに前記放射粒子によって放出される波面を変調するのを可能にする、波面を空間的に変調するためのデバイスと、
顕微鏡の光学撮像システムの出射瞳と一致するようになっている制御デバイスの入射瞳面を前記補正面と光学的に共役させる光学系と、
波面を空間的に変調するための前記デバイスを制御し、波面制御デバイスが超解像顕微鏡検査システムに接続されたときに、前記粒子と前記検出面との間に存在する光学的欠点の少なくとも一部を補正するのを可能にし、かつ波面の制御された変形を導入するのを可能にし、検出面における前記放射粒子の像の形状と、検出面と光学的に共役させられる対物面に対する前記放射粒子の軸方向位置との間の全単射関係を、粒子の前記軸方向位置の値の所定の範囲において形成するのを可能にするための手段とを備える。
【００２０】
したがって、任意の超解像顕微鏡検査システムに接続されて感度を向上させるとともに機能を増大させることのできる「モジュール」を形成することが可能である。そのような波面制御デバイスは場合によっては、超解像顕微鏡検査システムに接続するための機械的インターフェースを前記顕微鏡検査システムの顕微鏡と検出器との間に備えると有利であろう。
【００２１】
たとえば、光を空間的に変調するためのデバイスは変形可能なミラーである。
【００２２】
一実施形態では、波面変調デバイスは、前記制御手段に接続された、光学的欠点を分析するためのデバイス、たとえばシャック−ハルトマン分析器をさらに備えてもよい。波面分析器は場合によっては、光学的欠点を分析する事前のステップを実施するのを可能にする。
【００２３】
第３の態様では、１つまたは複数の放射粒子の３次元位置特定を行うための超解像顕微鏡検査デバイスであって、
検出器の検出面において前記放射粒子を撮像するためのシステムと、
波面を空間的に変調し、前記放射粒子によって放出される波面を変調するのを可能にするためのデバイスと、
波面を空間的に変調するための前記デバイスを制御し、前記粒子と前記検出面との間に存在する光学的欠点の少なくとも一部を補正するのを可能にし、かつ波面の制御された変形を導入するのを可能にし、検出面における前記放射粒子の像の形状と、顕微鏡検査撮像システムによって検出面と光学的に共役させられる対物面に対する前記放射粒子の軸方向位置との間の全単射関係を、粒子の前記軸方向位置の値の所定の範囲において形成するのを可能にするための手段とを備える超解像顕微鏡検査デバイスに関する。
【００２４】
一実施形態では、第３の態様による３次元位置特定のためのデバイスは場合によっては、一方では、光学撮像システムを搭載した顕微鏡および検出器を備える種類の、放射粒子を位置特定するための超解像顕微鏡検査システムと、他方では、前記顕微鏡検査システムに接続された第２の態様による波面制御デバイスとを含むモジュール式デバイスである。この場合、第３の態様によるデバイスの前記撮像システムは場合によっては、顕微鏡の光学撮像システムと、第２の態様による波面制御デバイスのリレー光学系とを備えることになる。代替として、第３の態様による３次元位置特定デバイスは場合によっては、リレー光学系を有さない非モジュール式設計を有する。
【００２５】
どちらの場合も、第３の態様による３次元位置特定デバイスの、波面を空間的に変調するためのデバイスは、前記撮像システムの瞳と光学的に共役させられる補正面を含むと有利である。たとえば、光を空間的に変調するためのデバイスは変形可能なミラーである。モジュール式デバイスの場合、補正面を顕微鏡の光学撮像システムの射出瞳と共役させると有利である。
【００２６】
一実施形態では、第３の態様による３次元位置特定のためのデバイスは、前記制御手段に接続された、光学的欠点を分析するためのデバイス、たとえばシャック−ハルトマン分析器をさらに備える。代替として、前記制御手段は、形成された放射粒子の像の質の程度に基づいてすべてまたは一部の光学的欠点を確実に繰り返し補正する。
【００２７】
一実施形態では、第３の態様による３次元位置特定のためのデバイスは、少なくとも１つの放射粒子を励起するための１条または複数条の光線を放出し、前記粒子が所定の範囲内の波長を有する光信号を放出するのを可能にするためのデバイスをさらに備える。
【００２８】
検出器は、マトリックス検出器、たとえばＥＭＣＣＤ増幅カメラであると有利である。
【００２９】
本発明の他の利点および特徴は、以下の図によって例示される説明を読んだときに明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】位置特定方法の２つのステップにおける本発明の好ましい実施形態による粒子の３Ｄ位置特定のためのデバイスを示す概略図である。
【図１Ｂ】位置特定方法の２つのステップにおける本発明の好ましい実施形態による粒子の３Ｄ位置特定のためのデバイスを示す概略図である。
【図２Ａ】サンプルに起因する収差によって生じる点広がり関数の質の低下および本発明によるデバイスによる収差の補正を示す図である。
【図２Ｂ】サンプルに起因する収差によって生じる点広がり関数の質の低下および本発明によるデバイスによる収差の補正を示す図である。
【図２Ｃ】サンプルに起因する収差によって生じる点広がり関数の質の低下および本発明によるデバイスによる収差の補正を示す図である。
【図３Ａ】補正を行わない構成、補正を行う構成、および補正を行うとともに非点収差を制御しながら導入する構成の３つの構成における蛍光ビードの超解像顕微鏡検査点広がり関数を示す実験画像である。
【図３Ｂ】補正を行わない構成、補正を行う構成、および補正を行うとともに非点収差を制御しながら導入する構成の３つの構成における蛍光ビードの超解像顕微鏡検査点広がり関数を示す実験画像である。
【図３Ｃ】補正を行わない構成、補正を行う構成、および補正を行うとともに非点収差を制御しながら導入する構成の３つの構成における蛍光ビードの超解像顕微鏡検査点広がり関数を示す実験画像である。
【図４Ａ】図３Ａ〜図３Ｃの実験構成における横方向測定精度を示す概略図である。
【図４Ｂ】図３Ａ〜図３Ｃの実験構成における横方向測定精度を示す概略図である。
【図４Ｃ】図３Ａ〜図３Ｃの実験構成における横方向測定精度を示す概略図である。
【図５Ａ】制御された非点収差の存在下（図３Ｃの実験条件）でのビードの軸方向位置の関数としての点広がり関数の横方向次元を与える関数の実験曲線およびモデル化曲線を示す図である。
【図５Ｂ】制御された非点収差の存在下（図３Ｃの実験条件）でのビードの軸方向位置の関数としての点広がり関数の横方向次元を与える関数の実験曲線およびモデル化曲線を示す図である。
【図６Ａ】光子の数およびビードの軸方向位置の関数としての様々な非点収差値についてのビードの軸方向位置の精度（図３Ｃの実験条件）を示す実験曲線ならびにサンプル中のビードの動きの関数としての測定された軸方向位置を示す曲線を示す図である。
【図６Ｂ】光子の数およびビードの軸方向位置の関数としての様々な非点収差値についてのビードの軸方向位置の精度（図３Ｃの実験条件）を示す実験曲線ならびにサンプル中のビードの動きの関数としての測定された軸方向位置を示す曲線を示す図である。
【図６Ｃ】光子の数およびビードの軸方向位置の関数としての様々な非点収差値についてのビードの軸方向位置の精度（図３Ｃの実験条件）を示す実験曲線ならびにサンプル中のビードの動きの関数としての測定された軸方向位置を示す曲線を示す図である。
【図７】本発明の一実施形態による位置特定方法によって得られる膜貫通タンパク質の動きを示す実験曲線である。
【図８Ａ】テトラフォイル波面の一例の位相の図である。
【図８Ｂ】ベストフォーカス面の前の面における図８Ａに示す波面の得られたＰＳＦの形状の図である。
【図８Ｃ】ベストフォーカス面における図８Ａに示す波面の得られたＰＳＦの形状の図である。
【図８Ｄ】ベストフォーカス面の後の面における図８Ａに示す波面の得られたＰＳＦの形状の図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
読みやすいように、様々な図において同一の要素は同じ参照符号によって示されている。
【００３２】
図１Ａおよび図１Ｂは、本発明の一例による１つまたは複数の放射粒子の３次元位置特定のためのデバイス１００を示す。
【００３３】
「放射粒子」という表現は、本説明では、光信号を自発的にまたは活性化によって、たとえば光源（光活性化）によって放出することのできる任意の粒子を意味すると理解される。粒子は、たとえば、周知の技術を使用して、光信号を放出することのできるプローブ、たとえば蛍光プローブによってタグ付けされた、タンパク質またはタンパク質の集合によって形成される反応ユニットまたは高分子複合体である。平均サイズは通常、小さい複合体の場合の数ナノメートルから最大の構造の場合の約１００ナノメートルまでの範囲である。大部分の分子複合体はサイズが１０ｎｍから３０ｎｍの間である。いずれの場合も、像を形成するのに使用される光学系の回折限界よりも小さいサイズの放射粒子を位置特定することが望ましい。位置特定することが望ましい粒子は、支持体、たとえば液体または固体であってもよくあるいはたとえばゲルの形をとってもよい生体媒質内に含まれる。支持体は、サンプルホルダ上に直接配置されてもよく、またはプレート上に堆積してもよく、または２枚のプレート、たとえばガラス板の間に保持されてもよい。「サンプル」（１０、図１Ａ、図１Ｂ）という用語は、支持体および支持体に含まれる放射粒子、ならびに必要に応じて１つまたは複数の保持板を指定するのに使用される。
【００３４】
図１Ａおよび図１Ｂの例における３次元位置特定デバイス１００は、モジュール式であり、顕微鏡１３０と、検出器１１０と、参照符号２００で示されている波面制御デバイスとを備える。図１Ａおよび図１Ｂの例では、デバイス１００は、検出器１１０、有利にはマトリックス検出器、たとえば電子倍増型ＣＣＤ（ＥＭＣＣＤ）型の増幅カメラの検出面１１１上に放射粒子の像を形成することのできる撮像システムを備える。この例では、撮像システムは、たとえば、像を中間検出面１１２上に形成するのを可能にする、チューブレンズと呼ばれる対物レンズ１２３に関連する無限焦点光学作動構成について補正される顕微鏡対物レンズ１２１を備える。顕微鏡対物レンズ／チューブレンズアセンブリは従来の顕微鏡光学系を形成する。さらに、撮像システムは、中間検出面１１２の像を検出器１１０の検出面１１１上に形成するのを可能にするリレー対物レンズ１２４、１２５を備える。放射粒子のサイズが非常に小さい（撮像システムの回折限界よりも小さい）ので、撮像システムの点広がり関数またはＰＳＦによる対象の畳み込みである像は、ここでは点広がり関数に実質的に等しい。顕微鏡対物レンズの選択が所望の拡大に整合するようにするために、顕微鏡対物レンズ１２１は、複数の前記対物レンズを受け入れることのできるカルーセル１２２に取り付けられると有利である。電動プラットフォーム１３１は、サンプル１０を受け入れるようになっているサンプルホルダ（図示せず）が顕微鏡対物レンズの光学軸に垂直なｘ−ｙ平面において移動するのを可能にする。機械的軸方向合焦デバイス（図示せず）は、サンプルの軸方向位置を顕微鏡対物レンズ１２１の対物焦点面、したがって、撮像すべき関心対象領域に対して調整するのを可能にする。サンプルホルダ、電動プラットフォーム、軸方向合焦デバイス、顕微鏡対物レンズ１２１、およびチューブレンズ１２３は、周知の種類の顕微鏡本体１３０内に配置される。顕微鏡本体は、いわゆる蛍光顕微鏡法に適合され、特に放射粒子を励起するための１条または複数条の光線を放出するための光源１４１を備える、サンプルを照明するためのデバイスを備えると有利である。図１Ａおよび図１Ｂの例では、照明デバイスは、励起光線１を対物レンズ１２１の方へ反射させるのを可能にするダイクロイックミラー１４３をさらに備える（いわゆる落射顕微鏡法）。照明される場をサンプルの関心対象領域に限定するために視野絞り１４２を設けると有利である。この例では、放射粒子の放射信号２はダイクロイックミラー１４３によって透過させられ、次いで配向ミラー１３２によってチューブレンズ１２３および検出器の方へ送られる。さらに、顕微鏡本体は、従来のように、接眼レンズ１３３と、集光レンズ１３５と組み合わされた、サンプルを照明するための光源１３４とを備えてもよい。接眼レンズは、照明光源１３４によって上から照明されるサンプルを最初に肉眼で位置付けるのを可能にする。配向ミラー１３２は、可動デバイスに取り付けられてよく、サンプルを肉眼で観察するのが望ましいときにサンプルの観察軸を接眼レンズの方へ切り替えるか、または放射粒子の位置特定を続行するために検出器１１０の方へ切り替えるのを可能にする。さらに、デバイス１００は、波面を空間的に変調するためのデバイス１５０と、前記空間変調デバイスを制御するための手段１８０とを備える。デバイス１００の動作については以下に詳しく説明する。
【００３５】
図１Ａおよび図１Ｂに示すような本発明による３次元位置特定デバイスでは、波面を空間的に変調するためのデバイス１５０、たとえば変形可能なミラーは、前記放射粒子によって放出され、たとえばミラー１５２によってデバイス１５０の変調面１５１に送られた波面２を変調するのを可能にする。次に、変調された波３は検出器１１０の検出面１１１の方へ送られる。変調面１５１は、顕微鏡対物レンズ１２１およびチューブレンズ１２３を備える顕微鏡の光学撮像システムの出射瞳と光学的に共役すると有利である。波面制御デバイス２００が超解像顕微鏡検査システム１３０に接続されるようになっているモジュール式システムの例では、変調面１５１は、顕微鏡１３０の光学撮像システムの出射瞳面と一致するようになっている制御デバイスの入射瞳面と光学的に共役することになる。図１Ａおよび図１Ｂの例では、光学系１２４は、瞳面同士が共役するのを可能にする。これらの図では、顕微鏡の光学撮像システムの出射瞳面は仮想平面であり、無限に投影される。波面を空間的に変調するためのデバイスの制御手段１８０は、放射粒子と検出面１１１との間に存在する光学的欠点のうちの少なくとも一部を補正するのを可能にする。制御手段はまた、波面の制御された変形を導入するように変調デバイス１５０を制御する。この制御された変形の目的は、検出面１１１における放射粒子の像の形状と、以下により詳しく説明するように、顕微鏡検査撮像システムによって検出面１１１と光学的に共役させられる平面として定義される対物面に対する放射粒子の軸方向位置との間に全単射関係を確立することである。
【００３６】
一実施形態では、放射粒子と検出面との間に存在するすべてまたは一部の光学的欠点が、制御手段１８０に接続された、光学的欠点を分析するためのデバイス１６０によって補正される。光学的欠点を分析するためのデバイス１６０は、たとえば、分析面１６１を形成するマイクロレンズのマトリックスと実質的に前記マイクロレンズの焦点面に位置するマトリックス検出器１６２とを備えるシャック−ハルトマンデバイスである。分析面１６１は、撮像システムの瞳と光学的に共役すると有利である。光学的欠点を分析するためのデバイスは、たとえばＩｍａｇｉｎｅ  Ｏｐｔｉｃ（登録商標）ＨＡＳＯ（登録商標）３−３２である。放射粒子の３次元位置特定のための方法の第１のステップでは、粒子の媒質と検出面との間に存在する光学的欠点が分析器１６０によって分析される。このことを実施するために、引き込み可能なミラー１７０が、１つまたは複数の放射粒子によって放出された光線２を分析器１６０（図１Ｂ）に送るのを可能にする。実際には、光学的欠点の分析は、サンプルに挿入され、蛍光の強度が、光学的欠点を良好な精度で分析するのを可能にするのに十分である「人工星」を形成する蛍光ビードによって実施されてもよい。制御手段１８０は次いで、分析器によって実施される測定から撮像システムに存在する光学的欠点を算出する。図１Ｂに示す位置特定方法の第２のステップでは、制御手段は、補正制御信号を変調デバイス１５０、たとえばＩｍａｇｉｎｅ  Ｅｙｅｓ（登録商標）Ｍｉｒａｏ  ５２−ｅ変形可能ミラーに送り、測定された光学的欠点をできるだけ補正し、波面の制御された変形を組み込む。このステップでは、引き込み可能なミラーの位置によって、変調された光線３を検出面１１１に送ることができる。
【００３７】
代替として、特に蛍光ビードを放射粒子の媒質に挿入することが困難であるかまたは不可能であるとき、たとえば、媒質が生物組織または生体であるときは、放射粒子の像および像の画質の程度に基づいて繰り返し補正方法を使用して光学的欠点を補正してもよい。この場合、制御手段は、検出器１１０によって生成される情報に基づいて変調デバイス１５０に送る補正制御信号を決定する。
【００３８】
したがって、図１Ａおよび図１Ｂの例では、３次元位置特定デバイスは、顕微鏡１３０と、検出器１１０と、図１Ａおよび図１Ｂにおいて参照符号２００で示され、特に波面変調デバイス１５０、制御手段１８０、リレー対物レンズ１２４、１２５、および光学的欠点を分析するための任意選択のデバイス１６０を備える波面制御デバイスとを備える、３つの主要モジュールから形成される。制御デバイス２００は、前記波面制御デバイスを一方では「顕微鏡」モジュール１３０に接続し、他方では「検出器」モジュール１１０に接続するのを可能にする機械的インターフェース（図示せず）を備えてもよい。そのようなモジュール式構成は、既存の超解像顕微鏡検査システムに適合可能であるという利点を有する。
【００３９】
一実施形態では、３次元位置特定デバイスは単一のモジュールから形成されてもよい。この場合、リレー対物レンズ１２４、１２５は、機能が特に、中間焦点面１１２上に形成された像を検出焦点面１１１に搬送することであるので、もはや不要である。デバイスが既存の顕微鏡検査システムに取り付けられるように設計されず、その代わりに完全な３次元位置特定デバイスの一部を形成する場合、中間焦点面の存在に関する設計制約はもはや存在せず、設計は図１Ａおよび図１Ｂに示す設計とは異なる。特に、放射粒子を検出器１１０の検出面１１１に撮像するのを可能にする光学系は、当業者に周知の任意の数の光学的構成に配置されてもよい。
【００４０】
図２Ａ〜図２Ｃは、サンプルに起因する収差によって生じる点広がり関数の質の低下、および本発明によるデバイスによるそれらの補正を概略的に示す。図１Ａおよび図１Ｂと同様に、２枚のガラスストリップ１０３（図２にはそのうち一方だけが示されている）の間に配置された媒質１０２に含まれる放射粒子１０１によって放出された光線が参照符号２で示されており、アセンブリ１０１、１０２、１０３がサンプル１０を形成している。検出面（図２には示されていない）上に放射粒子の像を形成する撮像デバイスは参照符号１２０で示されている。図２Ａの例では、撮像デバイスの対物焦点面がサンプルの表面に配置されているので、波面２がサンプルによって劣化されることはない。図２Ｂの例では、放出された光線２がサンプル１０の媒質１０２の一部を通過し、材料の屈折率が不均一であるため光線の位相がずれ、得られる点広がり関数（ＰＳＦ）の質が低下する。図２Ｃの例では、波面の位相を変調するためのデバイス１５０（たとえば、変形可能なミラーＤＭ）が、サンプルに起因する欠点を補正するのを可能にする。変調された光線３は、サンプルによって導入された収差が補正され、ＰＳＦの質が復元される。実際には、多くの因子がＰＳＦの劣化および解像度の損失に寄与する可能性がある。これらの因子は、サンプル自体によって導入される収差だけでなく、撮像システムのすべての光学構成要素によって導入される光学的欠点も含む。
【００４１】
超解像顕微鏡検査の位置特定性能は、放射粒子によって放出され検出器によって受け取られる光線の光学的品質に対する依存度が高い。しかしながら、この光学的品質は、図２Ａ〜図２Ｃによって示したように調査されたサンプルに起因する光学収差によって劣化されるが、撮像システムのすべての構成要素、特に顕微鏡対物レンズ、液浸対物レンズの場合の浸液（すなわち、オイル）、チューブレンズ、対物レンズ１２４、１２５、さらに撮像システムのあらゆるフィルタ、ビームスプリッタ、またはその他の構成要素に起因する収差によっても劣化される。実際、非常に小さい振幅非点収差（通常、ピークツーバレー振幅が２００ｎｍから４００ｎｍの間、すなわち、約ラムダ／４からラムダ／２であり、この場合、ラムダは放射粒子の発光波長である）を付加することによって、従来技術のＰＡＬＭ／ＳＴＯＲＭシステムにおいて放射体の軸方向位置特定を可能にする焦点（ＰＳＦ）の修正が実現される。しかし、撮像システムは同じ程度の光学収差を導入し、サンプルは著しく大きい振幅の収差を導入する。この場合、ＰＳＦの形状が、任意の形状を有する寄生修正および所望の形状と同等であるかまたはそれよりも大きい振幅によって「汚染」されているのでこの形状の修正を適切に制御することができないことが理解されよう。したがって、放射粒子を含む媒質と検出面との間にある撮像システムのすべてまたは一部の光学的欠点を補正するのを可能にする波面変調デバイスの導入は、粒子を位置特定できる精度をかなり高めるのを可能にする。
【００４２】
システムが光学的欠点に関してできるだけ補正された後、制御手段に関連する波面変調デバイスはさらに、制御された変形、たとえば非点収差を導入するのを可能にし、焦点面から点放射体までの距離に応じて点放射体のＰＳＦの形状を修正するのを可能にする
【００４３】
図３Ａ〜図３Ｃは、ビードの様々な軸方向位置に関して、補正を行わない構成（図３Ａ）、補正を行う構成（図３Ｂ）、および補正を行うとともに非点収差を制御しながら導入する構成（図３Ｃ）の３つの構成において蛍光ビードによって形成される放射粒子の超解像顕微鏡検査点広がり関数（ＰＳＦ）を示す実験画像を示す。図３Ａ〜図３Ｃの測定値は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液中に配置されガラスストリップ上に堆積された直径４０ｎｍの蛍光ビードによって得られている。ビードを位置特定するためのデバイスは、図１Ａおよび図１Ｂに示す種類のデバイスである。照明源１４１は、励起光線（１）を５９０ｎｍで放出し、蛍光ビードによって放出される光線（２）は６０５ｎｍで放出される。これらの測定に使用される顕微鏡は、開口数が１．４９である１００倍油浸対物レンズを有するＮｉｋｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＩ（登録商標）全内部反射蛍光顕微鏡である。使用される波面分析器１６０はＳｈａｃｋ−Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ｉｍａｇｉｎｅ  Ｏｐｔｉｃ（登録商標）ＨＡＳＯ（登録商標）３−３２であり、波面変調器はＩｍａｇｉｎｅ  Ｅｙｅｓ（登録商標）Ｍｉｒａｏ  ５２−ｅ変形可能ミラーである。マトリックス検出器は増幅ＥＭＣＣＤカメラであり、より正確に言えば、この例ではＡｎｄｏｒ（登録商標）ｉＸｏｎ（登録商標）ＤＵ８９７カメラである。これらの図では、画像３１、３２、３３はそれぞれ、撮像システムの対物面に対するビードの３つの軸方向位置（それぞれ＋３００ｎｍ、０ｎｍ、および−３００ｎｍ）について検出面（光学ｚ軸を横切るｘ−ｙ平面）上で測定されたＰＳＦを示す。対物面は、撮像システムによって検出面と光学的に共役させられる平面として定義される。画像３４および３５は、光学軸を含むｘ−ｚ平面において測定されたＰＳＦを示し、これらの画像は、様々な軸方向位置について検出面において測定された一連の画像を再構成することによって得られる。非点収差を導入しないと（図３Ａ、３Ｂ）、ビードの軸方向位置の関数として実質的に一定のＰＳＦが観測される。しかし、補正を行うことによって（図３Ｂ）ＰＳＦの質の向上が観測され、それにより、蛍光ビードによって放出される光線が集光される検出器画素が少なくなり、したがって、感度を向上させることができる。図３Ｃの画像３６および３７はそれぞれ、ｘ−ｚ平面およびｙ−ｚ平面において測定されたＰＳＦを示す。観測される非対称性はビードの軸方向位置の特徴である。
【００４４】
図４Ａ〜図４Ｃは、光子の数の関数としての、ビードの所定の軸方向位置について、図３Ａ〜図３Ｃの実験構成（補正を行わない構成、補正を行う構成、および補正を行うとともに非点収差を制御しながら導入する構成）において実施された測定のｘおよびｙの精度（それぞれ、ｘ−ＬＡおよびｙ−ＬＡと示されている）を示す。精度は、検出面におけるＰＳＦの横次元の測定値の偏差を所定の測定回数、通常約５０００回測定することによって得られる。横方向位置特定の精度については、補正を行う光学構成と補正を行わない光学構成（図４Ａおよび図４Ｂ）との間でほとんど変化がないことは注目に値する。具体的には、変形可能なミラーおよび追加のレンズ１２４、１２５が存在することによって光束が失われるにもかかわらず、収差を補正することによって、横方向位置特定の精度は実質的に変化しない。曲線４Ｃは、ビードの軸方向位置に関する追加の情報を収集するのを可能にする非点収差を導入したにもかかわらず横方向精度の損失が非常に小さかったことを示す。
【００４５】
図５Ａは、ビードの軸方向位置の関数としての、収差を補正した後に０．４μｍＰ−Ｖ（ピークツーバレー）非点収差を導入した後のＰＳＦの横次元を示す実験測定値（ｘ軸およびｙ軸に沿った横次元をそれぞれＷｘおよびＷｙで表す）を示す。これらの曲線は図３Ｃと同様の実験構成によって得られる。これらの測定値は、それぞれ測定値ＷｘおよびＷｙに対応し、予期される理論曲線に完全に対応する曲線５１および５２によって近似される。図３Ｃを参照する場合、ＰＳＦの横ｘ次元は−４００ｎｍとｐ＋４００ｎｍの間で減少するのが観測され（画像３６）、この減少は、横ｘ次元をビードの軸方向ｚ位置の関数として示す曲線５１（図５Ａ）に現れている。これに対して、ＰＳＦの横ｙ次元の増大が観測され（画像３７）、この増大は、横ｙ次元をビードの軸方向ｚ位置の関数として示す曲線５２（図５Ａ）に見られる。曲線５１と曲線５２が対物焦点面の位置に対応する点ｚ＝０に対して非常に良好な対称性を示すことは注目に値する。この対称性は、放射粒子と検出面との間に存在する撮像システムのすべての構成要素に起因する収差が事前に補正されている結果であり、粒子の軸方向位置を高い精度で求めるのを可能にする。曲線５１および曲線５２は、それぞれＭｉｎ  ＷｘおよびＭｉｎ  Ｗｙとして示される各横次元の最小値を示し、ＰＳＦの横ｘ次元および横ｙ次元はこれらの最小値よりも大きくなる。ビード軸方向位置がこれらの最小値を超えている場合、ｘとｙの両方でＰＳＦの横次元が大きくなるので位置特定精度が大幅に低下することが示され得る。したがって、この２つの最小値間の軸方向距離Δｚをｚにおける放射粒子の位置特定範囲として定義することが可能である。
【００４６】
したがって、図５Ｂは、それぞれ３つの非点収差値０．２μｍＰ−Ｖ、０．３μｍＰ−Ｖ、および０．４μｍＰ−Ｖについての横ｘ次元と横ｙ次元との差（Ｗｘ−Ｗｙ）の値を示す曲線５３、５４、および５５を示す。ビードの軸方向位置を求めることを目的として横次元の差Ｗｘ−Ｗｙを検討すると、測定値とビードの軸方向位置との間に全単射関係が形成されるだけでなく、粒子が完全な点光源ではないとき、すなわち、粒子のサイズがＰＳＦに対してもはや無視できなくなったときに生じる作用を回避することが可能になる。差Ｗｘ−Ｗｙと対物焦点面（図５Ｂにおけるｚ＝０に対応する）に対するビードの軸方向位置との間に存在する全単射関係によって、以後の放射粒子位置特定測定のために位置特定システムを較正することが可能になる。非点収差が増大するにつれて関数Ｗｘ−Ｗｙがより急速にかつより顕著に変動し、このことはＰＳＦの形状がより顕著に変動することによって説明される。しかし、非点収差値があるしきい値を超えた場合、ＰＳＦは過度に多くの画素に拡散し、放射粒子の良好な３Ｄ位置特定を可能にするほど高い信号対雑音比が得られる。したがって、放射粒子の性質に依存する利用可能な「光子量」に応じて波面変調デバイスによって導入される変形の振幅を調節すると有利である。
【００４７】
図６Ａ〜図６Ｃは、光子の数の関数としての、様々な非点収差値に関するビードの軸方向位置の測定精度（図３Ｃの実験条件）を示す実験曲線（図６Ａ）およびビードの軸方向位置の関数としての、様々な非点収差値に関するビードの軸方向位置の測定精度を示す実験曲線（図６Ｂ）と、取得数の関数として測定されたビードの軸方向位置、すなわち、１００回取得するたびに５０ｎｍ変化するビードの位置を示す曲線（図６Ｃ）を示す。図６Ａは、精度が光子の数が増加するとともに向上することを立証している。さらに、ビードの軸方向位置特定の精度は、非点収差値が大きいほど向上し、理論上のＰＳＦの横次元の測定値の差はより大きくなる。この傾向は、図６Ｂによって立証され、図６Ｂにおいて、各点は、非点収差が０．４μｍＰ−Ｖである場合に得られる実験測定値を表し、一方、各曲線は、ビードの軸方向ｚ位置の関数としての、３つの非点収差値について算出された近似値を表している。図６Ｃでは、非点収差が０．４μｍＰ−Ｖである場合に測定されたビードの軸方向位置の値（測定値は点によって表されている）と理論曲線（実線）との間に完全な相関が観測される。
【００４８】
図７は、ヒーラ細胞、すなわち、細胞生物学および医学研究において頻繁に使用される細胞株の膜を横切って拡散する膜貫通タンパク質に付着させた量子ドットを追跡することによって得られた実験結果を３次元で示す。量子ドットは、経時的に追跡することのできる蛍光プローブとして働く。各実験点は、図３Ａ〜図３Ｃを参照して説明したデバイスと同一のデバイス、すなわち、量子ドットの軸方向位置を測定する場合、収差補正後に０．４μｍＰ−Ｖの制御された非点収差を導入するのを可能にする波面変調デバイスによって得られている。量子ドットの経路は、記録され、次いで点Ａと点Ｂの間に３Ｄにプロットされ、２つの点の間の取得周波数は１０Ｈｚである。生体媒質中に含まれるタンパク質に固定された量子ドットに関するこれらの実験結果は、本発明による３次元位置特定方法によって高い精度が実現可能であることを示している。
【００４９】
図７は、本方法を経路測定に適用した例を示す。ＰＡＬＭ技術またはＳＴＯＲＭ技術を使用して高分子複合体に付着させた放射粒子のｘ位置およびｙ位置を求め、かつ上述のような制御された波面変調を使用して放射粒子の（ｚ方向の）軸方向位置特定を行う場合、構造、たとえばニューロン膜の３次元再構成のような他の用途も可能である。
【００５０】
放射粒子によって放出される波面に空間変調を施すことは特に、精度が向上することに関する上述の利点と、波面の制御された変形を選択することによって利用可能な「光子量」が最適化されることに関する上述の利点とを有する。
【００５１】
特に、上述の例では、制御された非点収差が導入されたが、ＰＳＦの軸方向対称性を破ることによってＰＳＦの形状と粒子の軸方向位置との間に全単射関係が形成されるのであれば、他の制御された変形も可能である。
【００５２】
たとえば、偶数次方位角のゼルニケ多項式の組合せに基づいて波面に任意の変形を施すと、周知のように、ＰＳＦに軸方向非対称性を導入することが可能になる。これらのゼルニケ多項式は、２次方位角のゼルニケ多項式であってよく、すなわち、すべてのゼルニケ多項式がｃｏｓ（２θ）またはｓｉｎ（２θ）における多項式であってよい。ｒ２ｃｏｓ（２θ）およびｒ２ｓｉｎ（２θ）における３次収差が最も一般的であるが、たとえば（４ｒ２−３）ｒ２ｃｏｓ（２θ）および（４ｒ２−３）ｒ２ｓｉｎ（２θ）における５次の収差ならびに７次、９次、１１次などの収差のような、任意のより高次の収差を使用することも構想され得る。４次方位角のゼルニケ多項式の任意の組合せを使用することを構想することも可能である。これらの多項式は、たとえばｒ４ｃｏｓ（４θ）およびｒ４ｓｉｎ（４θ）の多項式を含むテトラフォイル族の一部を形成する。
【００５３】
一例として、図８Ａは、次式によって極座標で表されたテトラフォイル波面の位相φ（ｒ，θ）を示す。
φ（ｒ，θ）＝０．２＊ｒ４＊ｃｏｓ（４＊θ）−０．２＊（６＊ｒ２−５）＊ｒ４＊ｃｏｓ（４＊θ）
【００５４】
図８Ｂ〜図８Ｄはそれぞれ、ベストフォーカス面の前の面（＋０．４ミクロンのピークツーバレーデフォーカス曲率を波面の位相に加えた）、ベストフォーカス面、およびベストフォーカス面の後の面（−０．４ミクロンのピークツーバレーデフォーカス曲率を波面の位相に加えた）における、波長が５００ｎｍの場合のＰＳＦの形状を示す。したがって、これらの図は、ＰＳＦの軸方向対称性を破るのを可能にする、放射粒子によって放出される波面の変形をどのように導入すればよいかを示す。
【００５５】
より一般的には、たとえばＧｅｒｃｈｂｅｒｇ−Ｓａｘｔｏｎアルゴリズムのようなある周知のアルゴリズムは、所望のＰＳＦ形状を得るのに必要な波面変形を求めるのを可能にする。Ｇ．ホワイトらによる論文（「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｔｈｒｅｅ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｌｉｇｈｔ  ｓｈａｐｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｇｅｒｃｈｂｅｒｇ−Ｓａｘｔｏｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ」、Ｎｅｗ  Ｊ．Ｐｈｙｓ．７、１１７（２００５））では、このアルゴリズムの適用例について説明している。しかし、これらのアルゴリズムは、かなり複雑であり、位相ジャンプを含む波面の位相の変形、すなわち、液晶位相変調器でしか生成できない不連続な位相に基づく解を一般に返す。多項式または偶数次方位角のゼルニケ多項式の組合せを使用することの１つの利点は、偶数次方位角のゼルニケ多項式の組合せが、連続的な膜を有する変形可能なミラーによって容易に生成することのできる連続的な位相および連続的に導出可能な位相によって波面変形を得るのを可能にすることである。
【００５６】
上述のような空間変調器によって波面に空間変調を施すと、本発明による３次元位置特定デバイスによって他の機能を実現することができる。たとえば、制御されたデフォーカスを波面に導入することによって動的合焦を実現することが可能である。動的合焦のいくつかの考えられる用途がある。たとえば、動的合焦は放射粒子を動的に追跡するのを可能にする。このことを実現するには、放射粒子にリアルタイムに合焦させるのを可能にする補正制御信号を、たとえば変形可能なミラーである波面変調器に送る。これによって、サンプルを移動させる必要なしに、適用される焦点の修正を測定することによって粒子を追跡することができ、特に広い動作範囲にわたって粒子を追跡することができる。より一般的には、動的合焦は、サンプル自体を移動させずにサンプルの関心対象領域を移動させるのを可能にする。動的合焦は、放射粒子の軸方向位置を求めるために導入される制御された変形の選択と組み合わされてもよい。たとえば、第１のステップでは、大きい非点収差を導入してもよく、それによって、広い△ｚ範囲における放射粒子の位置を特定することができる。次いで、制御されたデフォーカスを導入してサンプルのより小さい関心対象領域に合焦することが可能であり、それにより、ＰＳＦのサイズがより小さくなることによって、測定に必要な非点収差値を小さくし画素当たり光子量を増やすことができる。
【００５７】
本発明による３次元位置特定方法およびこの方法を実施するためのデバイスについていくつかの実施形態によって説明したが、この方法およびデバイスは、当業者には自明であろう様々な変形例、修正例、および改良例を含む。これらの様々な変形例、修正例、および改良例が、以下の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の範囲に含まれることが理解されよう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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