(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象者における急性心不全(AHF)の診断、予知及び/又は予後予測を補助するデータの取得方法であって、該方法の検査段階が、対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量を測定することを含んでなる方法。
【請求項２】
以下の工程：
(ｉ)対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量を測定する工程；
(ii)(ｉ)で測定したクイエシンQ6量を、既知のAHF診断、予知及び/又は予後を表すクイエシンQ6量参照値と比較する工程；
(iii)(ｉ)で測定したクイエシンQ6量の参照値からの逸脱又は逸脱無しを発見する工程；
を含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
AHF無しの診断又は予知を表すか又はAHFについての良好な予後を表す参照値と比較して対象者からのサンプル中の上昇したクイエシンQ6量が、対象者がAHFを有しているか若しくはAHFを有するリスクにあることを示すか、又は対象者におけるAHFについての不良な予後を示す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
感度及び/又は特異性が少なくとも80％である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
対象者が、AHFである可能性を示す１以上の症状及び/又は徴候を示している請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
対象者が呼吸困難を示している請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
AHFを有しているか又はAHFを有するリスクにある対象者と、慢性心不全(CHF)を有しているか又はCHFを有するリスクにある対象者とを区別するための請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
対象者が心不全の病歴を有している請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
(ｉ)請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法を、１時点又は２以上の一連の時点で対象者のサンプルに適用し、それにより対象者におけるAHFの診断、予知及び/又は予後を補助するデータを該一連の時点で取得し；
(ii)(ｉ)で取得した前記一連の時点でのデータを比較し；そして
(iii)(ｉ)で取得した前記一連の時点でのデータ間の変化の有無を発見する
ことを含んでなる、対象者におけるAHFの診断、予知及び/又は予後を補助するデータの変化をモニターする方法。
【請求項１０】
対象者におけるAHFの診断、予知及び/又は予後を補助するデータの変化が該対象者の内科療法の経過中にモニターされる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
対象者からのサンプル中の、AHFの診断、予知及び/又は予後予測に有用な１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量を測定することを更に含んでなる請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
以下の工程：
(ｉ)対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量並びに前記１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量を測定する工程；
(ii)(ｉ)の測定値を、クイエシンQ6量並びに前記１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量についての対象者のプロフィールの確立に使用する工程；
(iii)(ii)の対象者のプロフィールを、クイエシンQ6量並びに前記１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量の参照プロフィールと比較する工程であって、該参照プロフィールが既知のAHF診断、予知及び/又は予後を表す、工程；
(iv)(ii)の対象者のプロフィールの参照プロフィールからの逸脱又は逸脱無しを発見する工程；
を含んでなる請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
AHFの診断、予知及び/又は予後予測に有用な前記他のバイオマーカーがＢ型ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、プロ-Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド(プロBNP)、アミノ末端プロ-Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド(NTプロBNP)及びそれらのいずれかのフラグメントからなる群より選択される請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
以下：
(ｉ)
(i a)AHFを有さないか、又はAHFを有するリスクにないか、又はAHFについて良好な予後を有する１以上の対象者からの１以上のサンプル中、或いは
(i b)AHFを有しているか、又はAHFを有するリスクにあるか、又はAHFについて不良な予後を有する１以上の対象者からの１以上のサンプル中
のクイエシンQ6量を測定し、そして
(ii)
(ii a)(i a)で測定したクイエシンQ6量を、AHF無しの診断若しくは予知を表すか又はAHFについての良好な予後を表す参照値として保存するか、或いは、
(ii b)(i b)で測定したクイエシンQ6量を、AHFの診断若しくは予知を表すか又はAHFについての不良な予後を表す参照値として保存する
ことを含んでなる、
(ａ)AHF無しの診断若しくは予知、又はAHFについての良好な予後を表すか、或いは
(ｂ)AHFの診断若しくは予知、又はAHFについての不良な予後を表す、
クイエシンQ6量についての参照値を確立する方法。
【請求項１５】
以下：
(ｉ)
(i a)AHFを有さないか、又はAHFを有するリスクにないか、又はAHFについて良好な予後を有する１以上の対象者からの１以上のサンプル中、或いは
(i b)AHFを有しているか、又はAHFを有するリスクにあるか、又はAHFについて不良な予後を有する１以上の対象者からの１以上のサンプル中
のクイエシンQ6量並びに１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量を測定し、
(ii)
(ii a)(i a)の測定値を、クイエシンQ6量並びに前記１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量のプロフィールの作成に使用するか、或いは、
(ii b)(i b)の測定値を、クイエシンQ6量並びに前記１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量のプロフィールの作成に使用し、
(iii)
(iii a)(ii a)のプロフィールを、AHF無しの診断若しくは予知を表すか又はAHFについての良好な予後を表す参照プロフィールとして保存するか、或いは、
(iii b)(ii b)のプロフィールを、AHFの診断若しくは予知を表すか又はAHFについての不良な予後を表す参照プロフィールとして保存する
ことを含んでなる、クイエシンQ6量並びにAHFの診断、予知及び/又は予後予測に有用な１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量についての参照プロフィールであって、
(ａ)AHF無しの診断若しくは予知、又はAHFについての良好な予後を表すか、或いは
(ｂ)AHFの診断若しくは予知、又はAHFについての不良な予後を表す、
参照プロフィールを確立する方法。
【請求項１６】
AHFの診断、予知及び/又は予後予測に有用な前記他のバイオマーカーがＢ型ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、プロ-Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド(プロBNP)、アミノ末端プロ-Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド(NTプロBNP)及びそれらのいずれかのフラグメントからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
(ｉ)対象者がAHFに罹患していない種々の時点で対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量を測定し、そして
(ii)対象者についてのクイエシンQ6のベースライン又は参照値である数値範囲又は平均値を算出する
ことを含んでなる、対象者におけるクイエシンQ6のベースライン又は参照値を確立する方法。
【請求項１８】
対象者がヒトである請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
対象者が、AHF、COPD若しくは肺炎により引き起こされた呼吸困難の徴候を示す患者集団、又は心不全共存症に罹患した患者集団の一部である請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
心不全共存症が糖尿病、冠動脈疾患、喘息、COPD及び/又は慢性腎疾患である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
クイエシンQ6量並びに/或いは１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量が、それぞれ、クイエシンQ6及び/又はそのフラグメントに特異的に結合し得る結合性物質並びに前記１以上の他のバイオマーカーに特異的に結合し得る結合性物質を用いて測定される請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
クイエシンQ6量並びに/或いは１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量が、直接ELISA、間接ELISA、サンドウィッチELISA、競合ELISA、マルチプレックスELISA、ラジオイムノアッセイ(RIA)若しくはELISPOT技術のようなイムノアッセイ技術、又は質量分析法、又はクロマトグラフィー法、又は前記方法の組合せを用いて測定される請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
参照値が請求項１４〜２２のいずれかに従って決定される請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量を測定する手段を含んでなる、対象者におけるAHFの診断、予知及び/又は予後予測のためのキット。
【請求項２５】
(ｉ)対象者からのサンプル中のクイエシンQ6を測定する手段；及び
(ii)既知のAHF診断、予知及び/又は予後を表すクイエシンQ6量の参照値、或いは該参照値を確立する手段
を含んでなる請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
対象者からのサンプル中のAHFの診断、予知及び/又は予後予測に有用な１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量を測定する手段を更に含んでなる請求項２４又は２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記他のバイオマーカーがBNP、プロBNP、NTプロBNP及びそれらのいずれかのフラグメントからなる群より選択される請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
以下：
(ｉ)対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量を測定する手段；
(ii)対象者からのサンプル中の前記１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量を測定する手段；
(iii)任意に、クイエシンQ6量並びに前記１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量についての対象者のプロフィールを確立する手段；及び
(iv)既知のAHF診断、予知及び/又は予後を表す、クイエシンQ6量並びに前記１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量についての参照プロフィール、又は該参照プロフィールを確立する手段
を含んでなる請求項２６又は２７に記載のキット。
【請求項２９】
クイエシンQ6量並びに/或いは１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量を測定する手段が、それぞれ、クイエシンQ6及び/又はそのフラグメントに特異的に結合し得る１以上の結合性物質並びに前記１以上の他のバイオマーカーに特異的に結合し得る１以上の結合性物質を含んでなる請求項２４〜２８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３０】
結合性物質が抗体、アプタマー、タンパク質、ペプチド、ペプチド擬似物質又は小分子である請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
ポータブルデバイスとして構成されている請求項２４〜３０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３２】
ポータブルデバイスがベッドサイドデバイスである請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
(ａ)クイエシンQ6及び/若しくはそのフラグメント；及び
(ｂ)AHFの診断、予知及び/又は予後予測に有用な１以上の他のバイオマーカー
を含んでなる、対象者におけるAHFを診断、予知及び/又は予後予測するための、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドのアレイ又はマイクロアレイ。
【請求項３４】
クイエシンQ6及び/又はそのフラグメントが既知量又は既知濃度で含まれる請求項３３に記載のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドのアレイ又はマイクロアレイ。
【請求項３５】
１以上の他のバイオマーカーが既知量又は既知濃度で含まれる請求項３３又は３４に記載のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドのアレイ又はマイクロアレイ。
【請求項３６】
１以上の他のバイオマーカーがBNP、プロBNP、NTプロBNP及びそれらのいずれかのフラグメントからなる群より選択される請求項３３〜３５のいずれか１項に記載のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドのアレイ又はマイクロアレイ。
【請求項３７】
(ａ)クイエシンQ6及び/又はそのフラグメントに特異的に結合し得る１以上の結合性物質；及び
(ｂ)AHFの診断、予知及び/又は予後予測に有用な１以上の他のバイオマーカーに特異的に結合し得る１以上の結合性物質、
を含んでなる、対象者におけるAHFを診断、予知及び/又は予後予測するための、結合性物質のアレイ又はマイクロアレイ。
【請求項３８】
前記クイエシンQ6及び/又はそのフラグメントに特異的に結合し得る結合性物質が既知量又は既知濃度で含まれる請求項３７に記載の結合性物質のアレイ又はマイクロアレイ。
【請求項３９】
前記他のバイオマーカーに特異的に結合し得る結合性物質が既知量又は既知濃度で含まれる請求項３７又は３８に記載の結合性物質のアレイ又はマイクロアレイ。
【請求項４０】
前記他のバイオマーカーがBNP、プロBNP、NTプロBNP及びそれらのいずれかのフラグメントからなる群より選択される請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の結合性物質のアレイ又はマイクロアレイ。
【請求項４１】
(ｉ)対象者からサンプルを取得する手段と、
(ii)前記サンプル中のクイエシンQ6量を測定する手段と、
(iii)サンプル中で測定したクイエシンQ6量を視覚化する手段と
(iv)既知のAHF診断、予知及び/又は予後を表すクイエシンQ6量の参照値、或いは該参照値を確立する手段
を含んでなり、前記視覚化手段が、サンプル中のクイエシンQ6量が前記参照値から逸脱しているのかしていないのかを表示することができる、対象者におけるAHFを診断、予知及び/又は予後予測するためのポータブル検査デバイス。
【請求項４２】
AHF無しの診断若しくは予知又はAHFについての良好な予後を表す参照値を含んでなるか、又は該参照値を確立する手段を含んでなり、該参照値と比較して対象者からのサンプル中のクイエシンQ6の上昇した量が、対象者はAHFを有しているか若しくはAHFを有するリスクにあることを示すか、又は対象者におけるAHFについての不良な予後を示す、請求項４１に記載のポータブル検査デバイス。
【請求項４３】
検出可能な標識を任意に含んでなる単離クイエシンQ6又はそのフラグメントの、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法におけるコントロール、標準物質又は較正物質としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、対象者における疾患又は病状の予知、診断及び/又は予後予測(prognosticating)において使用するための、タンパク質-及び/又はペプチド-ベースのバイオマーカー並びにこれらに特異的に結合する物質に関する。より具体的には、本願は、急性心不全の新たなバイオマーカーとしての特定のタンパク質及び/又はペプチド；該バイオマーカータンパク質及び/又はペプチドの測定に基づいて急性心不全を予知、診断及び/又は予後予測する方法；並びに該タンパク質及び/又はペプチドを測定し、及び/又は前記方法を実施するキット及びデバイスを開示する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多くの疾患及び病状において、予防的及び/又は治療的処置の好ましい転帰は、疾患又は病状の早期及び/又は正確な予知、診断及び/又は予後と強く相関している。したがって、処置の選択に指針を与える疾患及び病状の早期及び/又は正確な予知、診断及び/又は予後のための追加的で、好ましくは改善された様式に関する継続的な必要性が存在する。
心不全は、先進国における主要な公衆衛生上の問題であり、高齢者における相当な罹患率及び死亡率の原因である。心不全は、通常、呼吸障害の悪化を導く頻発性代償不全により特徴付けられる慢性疾患である。更に、診断の５年後、心不全患者の50％がこの疾患で死亡している。
【０００３】
急性心不全(AHF)は、心臓が突然、効率的にポンピングできなくなることであり、身体的酸素要求をもはや予見できない。AHFは、米国及び欧州で年に２百万を超える入院の原因であり、多くの人種で退院後１年以内の死亡率約20〜40％を示す。AHF入院の約90％が、代表的には、慢性心疾患を有する患者であり、残りの約10％が新規の患者である。心疾患及びAHFの臨床徴候はしばしば非特異的であり、このことにより明確な診断が要求されている。
AHFの共通症状は息切れ(呼吸困難)である。しかし、通常、入院に際して呼吸困難を示す対象者のほんの一部しかAHFに罹患していない。したがって、AHF患者を他の原因による呼吸困難を有する患者と適切に区別するために、迅速、正確で効果的なAHF処置が必要である。
【０００４】
現在、AHFの診断は、主に、ECG、胸部Ｘ線などのような臨床的徴候に基づいてなされる。AHFのこれら診断基準を補完するために(例えば、救急場面で)しばしば使用される１つのバイオマーカーは、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド(BNP)である。代表的には、100pg/mLより低いBNPは、心不全の「除外」基準と見なされる一方、400pg/mLより高いBNPは、AHFの「該当(rule-in)」基準と受け止められている。BNPは高感度であるが、特異性は比較的低く、100〜400pg/mLの「グレーゾーン」のために特に問題である。例えば、Chungら，2006 (Am Heart J 152(5): 949-55)は、100pg/mLのBNPカット点は100％の感度を有するが、AHF診断については僅か41％の特異性である一方、400pg/mLのカット点は87％の感度及び76％の特異性を有すると測定している。
【０００５】
また、BNPレベルは、年齢、性別、体重その他の医学的状態で変化し、そのことが診断を混乱させている。とりわけ、BNPレベルは、心不全及び腎不全の病歴を有する患者で上昇している傾向にある。例えば、Chungら，2006 (前出)は、呼吸困難を示す患者におけるAHF診断のBNP性能は、心不全の病歴を有する患者で顕著に減少することを示している。具体的には、AHFが原因でない呼吸困難を示す患者の約40％(心不全の病歴がある)が、現在臨床で使用されているAHFカットオフ点である400pg/mLを超えるBNP値を示した。結果的に、欧州心臓病学会のガイドライン2008(European Society of Cardiology (ESC) Guidelines 2008)もまた、BNPを、急性心不全のバイオマーカーとしてよりむしろ、心不全一般のバイオマーカーとして特徴付けている。
【０００６】
この点から、AHFの追加的な、好ましくは特異的なバイオマーカーに関する絶えざる必要性が存在する。このような新規なAHFバイオマーカーは、その特性の１以上、例えば感度及び/又は特異性、AHFであることを暗示している可能性のある症状(例えば、呼吸困難)を示す患者における信頼性、心不全及び他の心不全の頻繁な共存症(例えば、腎不全、肥満、冠動脈疾患など)の病歴を有する患者における信頼性が、既存のマーカー(例えばBNP)に匹敵し得るか又は既存のマーカーより改善され得る。例えばWO 2008/037720は、高血圧ラットモデルRen-2の心臓におけるクイエシン(Quiescin)Q6遺伝子の発現の減少は、心肥大の鬱血性心不全への進行のリスク増大に関連しているかもしれないことを示唆するが実証しない遺伝子発現スクリーニングを提示している。しかし、WO 2008/037720は、クイエシンQ6ポリペプチド、特にそのレベル増加の、急性心不全バイオマーカーとしての有用性については全く何も述べていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、AHFの更なるバイオマーカーを同定し、その使用を提供することによって、当該分野における上記の必要性に取り組む。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
多大な実験及び試験を行った結果、本発明者らは、ポリペプチドであるクイエシンQ6が急性心不全(AHF)の予知、診断及び/又は予後予測に特に有利である新たに実現したバイオマーカーであることを明らかにした。
詳細には、３つの医療センター、200人の被験者(緊急入院に際して呼吸困難を示した対象者並びに慢性心不全(CHF)患者及び年齢が適合する健常コントロールからの見込みサンプルコレクションを含む)の研究において、本発明者らは初めて、クイエシンQ6を、AHFを有さない呼吸困難患者、CHF患者又は健常コントロールと比較したときAHFを有する呼吸困難患者で有意なレベル変化を提示するバイオマーカーとして同定し、その後その正当性を証明した。加えて、本発明者らはまた、クイエシンQ6がAHFの進行のモニタリングに、すなわち、例えば、入院に際して(すなわち処置前)、処置の間及び退院に際して(すなわち処置後)に、例えば呼吸困難患者において、クイエシンQ6レベルを測定することによる、有用なバイオマーカーであり得ることに気付いた。
【０００９】
本発明者らは更に、多くの点でクイエシンQ6がBNP及びNT-プロBNPに優っていることを示した：
例えば、AHFを有する呼吸困難患者とAHFを有さない呼吸困難患者との区別について、AUC値(ROC曲線下面積；「ROC」は受信者動作特性の略語である)は、クイエシンQ6がBNP及びNT-プロBNPより高い。AUC値は感度及び特異性の組合せ尺度であり、より高いAUC値(すなわち、１への接近)は一般に当該検査の性能の向上を示す。
【００１０】
更に、AHFを有する患者とCHFを有する患者との区別について、クイエシンQ6のAUC値は、BNP及びNT-プロBNPのものより実質的に高い。よって、クイエシンQ6検査は、心不全の病歴を有する患者で、より信頼性が高い。
加えて、上記のように、BNPマーカー診断は、AHFの正確な診断を確立することができない値100〜400pg/mlに厄介な「グレーゾーン」を有する。BNP「グレーゾーン」のサンプルでのクイエシンQ6マーカーレベルの使用は、AHF呼吸困難患者と非AHF呼吸困難患者との間の明確な区別をもたらした(BNPについてのAUC 0.58に対して、クイエシンQ6についてのメジアンAUC 0.91)。
【００１１】
クイエシンQ6のこの総合診断性能は、急性呼吸困難集団においてAHF診断用の現時点での黄金標準のバイオマーカーであるBNP及びNT-プロBNPのものと等価な性能を示す。クイエシンQ6は、単一の比又は濃度カットオフで82％の診断正確性を達成する一方、BNPはその除外カットオフ(100pg/mL)で73％の正確性を有する。クイエシンQ6とBNPとの組合せは診断正確性に有意な影響を有し、使用したデータセットで88％の驚くべき正確性に達する。まとめると、本発明者らは、クイエシンQ6を、特に心不全の病歴を有するか又は呼吸困難を引き起こす他の非-AHF疾患に罹患している患者における、AHFの予知、診断及び/又は予後予測のための改善された更なるバイオマーカーとして同定し、その正当性を証明した。
【００１２】
驚くべきことに、BNPレベルとは異なり、クイエシンQ6マーカーレベルは、他の疾患パラメータ(例えば年齢、腎不全(クレアチニンレベルに基づく)、左心室駆出率、入院時診断、心不全及び冠動脈疾患の病歴並びにCOPD/喘息共存症)によって影響されない。クイエシンQ6レベルと列挙したパラメータのいずれとも有意な関連は検出できなかった。このことは、クイエシンQ6レベルが、現時点でのデータセットにおいては、心臓の急性代償不全以外のいずれのパラメータによっても影響されないことを示唆している。
クイエシンQ6レベルは、本発明において、腎不全とは無関係であることが示された一方、BNP及びNT-プロBNPは、クレアチニンレベルが増加した患者で明らかに上昇する。腎不全は心不全の頻繁な共存症であるので、新たなクイエシンQ6マーカーレベルがクレアチニンレベルと無関係であることは、重要な特徴であり、診断性能に対して大きく影響する。
【００１３】
AHF、呼吸困難であるが非-AHF及び安定なCHF集団におけるクイエシンQ6レベルの測定は、AHFを有する患者でのメジアンクイエシンQ6レベルがAHFを有さない呼吸困難患者より1.5倍高いことを示した。際立っていることに、呼吸困難であるが非-AHF患者におけるクイエシンQ6レベルは、安定なCHF患者のレベルに非常に匹敵している一方、BNPのベースラインレベルは安定なCHF患者で上昇している。
結果として、１つの観点で、本発明は、対象者において急性心不全(AHF)を予知、診断及び/又は予後予測する方法を提供し、該方法は、その方法の検査段階が前記対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量を測定することを含んでなることを特徴とする。疾患又は病状の予知、診断及び/又は予後の方法が、一般に、データを対象者から及び/又は対象者について収集する検査段階を含んでなることは理解される。
【００１４】
よって、本発明による、対象者においてAHFを予知、診断及び/又は予後予測する方法は、以下の工程：
(ｉ)対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量を測定する工程；
(ii)(ｉ)で測定したクイエシンQ6量を、AHFの既知の予知、診断及び/又は予後を表すクイエシンQ6量参照値と比較する工程；
(iii)(ｉ)で測定したクイエシンQ6量の参照値からの逸脱又は逸脱無しを発見する工程；
(iv)前記逸脱又は逸脱無しの発見を、対象者における特定のAHF予知、診断及び/又は予後に帰する工程
を含んでなり得る。
【００１５】
クイエシンQ6は、AHFと他の表現型(例えば、特にCHF)との間の改善された区別、更には実質的に完全な区別を提供する。したがって、本発明者らは、クイエシンQ6がまた、AHFを有しているか又はAHFを有するリスクにある対象者を選択する集団検診セットアップに有益であり得ると考える。そのような集団検診のためのBNPの使用は、特に、BNPの読取値(readout)に対する心臓病歴(例えばCHF病理)の混乱効果により困難である。このため、BNPは、特異性を欠きスクリーニングに使用できない。よって、１つの実施形態において、対象者においてAHFを予知、診断及び/又は予後予測する本発明の方法は、集団検診(例えば、一般集団又は１以上の基準、例えば、年齢、性別、家系、職業、AHFのリスクファクターの有無などに基づいて階層化した集団における検診のような集団検診)に用い得る。
【００１６】
実験の章で証明したように、本発明者らは、AHFの予知若しくは診断又はAHFの不良な予後がクイエシンQ6レベルの上昇と特に関連している可能性があることを示した。よって、本明細書中で教示される予知法、診断法及び/又は予後法の実施形態において、AHFでないことの予知若しくは診断を表すか又はAHFについての良好な予後を表す参照値と比較して対象者からのサンプルにおけるクイエシンQ6量の上昇は、対象者がAHFを有しているか若しくはAHFを有するリスクにあることを示すか又は対象者におけるAHFについての不良な予後を示す。
【００１７】
本発明者らはまた、クイエシンQ6をバイオマーカーとして使用する方法、特に(限定されないが)AHFを有する呼吸困難患者とAHFを有さない呼吸困難患者との間を区別する方法が、約80％以上の感度及び/又は約80％以上の特異性を達成できることを観察し、その正当性を証明した。よって、本明細書中で教示される予知、診断及び/又は予後の方法の１つの実施形態において、この方法の感度及び/又は特異性(好ましくは、感度及び特異性)は、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、又は少なくとも80％、例えば≧81％、≧82％、≧83％、≧84％、≧85％、≧86％若しくは≧87％、又は≧90％、又は≧95％(記号「≧」は「少なくとも」又は「以上」と同義である)、例えば、80％〜100％、又は81％〜95％、又は83％〜90％、又は84％〜89％、又は85％〜88％である。
【００１８】
更なる実施形態において、本明細書中で教示する予知、診断及び/又は予後の方法は、AHFを有しているか又はAHFを有するリスクにある対象者と慢性心不全(CHF)を有しているか又はCHFを有するリスクにある対象者との区別用であり得る。
本明細書中で教示される予知、診断及び/又は予後の方法の別の１つの実施形態において、対象者は、AHFを暗示し得る１以上の症状及び/又は徴候を示していてもよい。例えば、１つの実施形態において、対象者は、呼吸困難を示していてもよい。よって、１つの実施形態において、本方法は、AHFに起因する呼吸困難を示す対象者とAHF以外の又はAHFとは無関係の原因(例えば、COPD又は肺炎)に起因する呼吸困難を示す対象者との区別用であり得る。
【００１９】
本明細書中で教示される予知、診断及び/又は予後の方法の１つの更なる実施形態において、対象者は、心不全、例えばAHF及び/又はCHFの病歴を有していてもよい。説明したように、クイエシンQ6が関与する方法は、そのような対象者について、BNP又はNT-プロBNPを使用する方法より信頼性が高い傾向がある。
本明細書中で教示される予知、診断及び/又は予後の方法の１つの更なる実施形態において、対象者は腎不全を有していてもよい。クイエシンQ6が関与する方法は、そのような対象者について、BNP又はNT-プロBNPを使用する方法より信頼性が高いことが本明細書中で示されている。
【００２０】
本明細書中で教示される予知、診断及び/又は予後の方法の１つの更なる実施形態において、対象者は、AHFについての１以上のリスクファクター、例えば、遺伝学的素因、又は１以上の発育、環境若しくは行動上のリスクファクター、例えば、インスリン抵抗性(血糖障害)、体幹肥満、高血清低密度リポタンパク質(LDL)コレステロールレベル、低血清高密度リポタンパク質(HDL)コレステロールレベル、高血清トリグリセリドレベル及び高い血圧(高血圧)、以前の心筋梗塞、及び/又は１以上の共存症、例えば糖尿病、冠動脈疾患、喘息、COPD及び/又は慢性腎臓疾患を示していてもよい。
【００２１】
よって、種々の実施形態において、AHFを予知、診断及び/又は予後予測する本発明の方法は、AHFを有すると未だ診断されていない個体で(例えば、予防検診)、又はAHF若しくはCHFを有すると診断された個体で、又はAHF若しくはCHFを有すると疑われる個体(例えば、AHF若しくはCHFに特徴的な１以上の症状を示す個体)で、又はAHF若しくはCHFを発症するリスクにある個体(例えば、遺伝子素因；１以上の発育、環境若しくは行動上のリスクファクターの存在)で使用し得る。この方法はまた、AHFの進行又は重篤度の種々のステージを検出するために使用されてもよい。この方法はまた、例えば予防的若しくは治療的処置の間又は他の介入の間の異なる時点で本方法を実施することにより、予防的若しくは治療的処置又は他の介入に対するAHFの応答を検出するために使用されてもよい。
【００２２】
本発明は更に、対象者におけるAHFの予知、診断及び/又は予後の変化をモニターする方法を提供する。この方法は、以下：
(ｉ)上記で教示される予知、診断及び/又は予後の方法を、１時点又は２以上の一連の時点で対象者に適用し、それにより対象者におけるAHFの予知、診断及び/又は予後を該一連の時点で決定し；
(ii)(ｉ)で決定した前記一連の時点での対象者におけるAHFの予知、診断及び/又は予後同士を比較し；そして
(iii)(ｉ)で決定した前記一連の時点での対象者におけるAHFの予知、診断及び/又は予後間の変化の有無を発見することを含んでなる。
【００２３】
この観点により、対象者の病状の経時的モニタリングが可能になる。これにより、とりわけ、AHF事象の発生の予知又は対象者における疾患進行、疾患の悪化若しくは軽減、疾患再発、処置に対する応答、他の外部若しくは内部の因子、条件若しくはストレッサーに対する応答などのモニタリングが可能になる。有利には、対象者におけるAHFの予知、診断及び/又は予後の変化を、対象者の医学的処置、好ましくはAHFの処置を目的とした医学的処置の経過中にモニターし得る。このようなモニタリングは、例えば、患者(例えば、呼吸困難患者又はAHF患者)が退院しても良いのか又は更なる入院を必要としているかの決定形成に含まれ得る。
【００２４】
本発明の予知、診断及び/又は予後の方法において、クイエシンQ6の測定はまた、AHFに関連する１以上の更なるバイオマーカーの評価と組み合せてもよいと理解される。
結果として、検査段階が、対象者からのサンプル中の、AHFの予知、診断及び/又は予後予測に有用な１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量の測定を更に含んでなる方法もまた、本明細書中に開示される。
【００２５】
よって、対象者においてAHFを予知、診断及び/又は予後予測する方法が開示される。該方法は、以下の工程：
(ｉ)対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量並びに前記１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量を測定する工程；
(ii)(ｉ)の測定値を、クイエシンQ6量並びに前記１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量についての対象者のプロフィールを確立するために使用する工程；
(iii)(ii)の対象者のプロフィールを、クイエシンQ6量並びに前記１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量の参照プロフィールと比較する工程(該参照プロフィールは既知のAHF予知、診断及び/又は予後を表す)；
(iv)(ii)の対象者のプロフィールの参照プロフィールからの逸脱又は逸脱無しを発見する工程；
(ｖ)前記逸脱又は逸脱無しの発見を、対象者における特定のAHF予知、診断及び/又は予後に帰する工程
を含んでなる。
【００２６】
１つの実施形態において、AHFの予知、診断及び/又は予後予測に有用な前記他のバイオマーカーは、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、プロ-Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド(プロBNP)、アミノ末端プロ-Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド(NTプロBNP)及びそれらのいずれかのフラグメントからなる群より選択される。
上記のように、本方法は、他のバイオマーカーについて以前に用いられた公知の手順に従って確立され得るクイエシンQ6量についての参照値を用いてもよい。このような参照値は、本方法内で確立されてもよい(すなわち、本方法の１工程を構成してもよい)し、本方法外で確立されてもよい(すなわち、本方法の工程を構成しないくてもよい)。したがって、本明細書中で教示される方法の１つは、クイエシンQ6量についての参照値を確立する工程を含んでなり得る。ここで、該参照値は、(ａ)AHF無しの予知若しくは診断又はAHFについての良好な予後を表すか、或いは(ｂ)AHFの予知若しくは診断又はAHFについての不良な予後を表す。
【００２７】
更なる観点は、クイエシンQ6量についての参照値を確立する方法を提供し、ここで、該参照値は：
(ａ)AHF無しの予知若しくは診断又はAHFについての良好な予後を表すか、或いは
(ｂ)AHFの予知若しくは診断又はAHFについての不良な予後を表し、
該方法は、以下：
(ｉ)
(i a)AHFを有さないか又はAHFを有するリスクにないか又はAHFについて良好な予後を有する１以上の対象者からの１以上のサンプル中、或いは
(i b)AHFを有しているか又はAHFを有するリスクにあるか又はAHFについて不良な予後を有する１以上の対象者からの１以上のサンプル中
のクイエシンQ6量を測定し、そして
(ii)
(ii a)(i a)で測定したクイエシンQ6量を、AHF無しの予知若しくは診断を表すか又はAHFについての良好な予後を表す参照値として保存するか、或いは
(ii b)(i b)で測定したクイエシンQ6量を、AHFの予知若しくは診断を表すか又はAHFについての不良な予後を表す参照値として保存する
ことを含んでなる。
【００２８】
そうでなければ、本方法は、他のバイオマーカーについて以前に用いられた公知の方法に従って確立され得る、クイエシンQ6量並びにAHFの予知、診断及び/又は予後予測に有用な１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量についての参照プロフィールを用い得る。このような参照プロフィールは、本方法内で確立されてもよい(すなわち、本方法の１工程を構成してもよい)し、本方法外で確立されてもよい(すなわち、本発明の方法の工程を構成しなくてもよい)。したがって、本明細書中で教示される方法は、クイエシンQ6量並びに前記１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量についての参照プロフィールを確立する工程を含んでなり得る。ここで、該参照プロフィールは、(ａ)AHF無しの予知若しくは診断又はAHFについての良好な予後を表すか、或いは(ｂ)AHFの予知若しくは診断又はAHFについての不良な予後を表す。
【００２９】
更なる観点は、クイエシンQ6量並びにAHFの予知、診断及び/又は予後予測に有用な１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量についての参照プロフィールを確立する方法を提供し、ここで、該参照プロフィールは以下：
(ａ)AHF無しの予知若しくは診断又はAHFについての良好な予後、或いは
(ｂ)AHFの予知若しくは診断又はAHFについての不良な予後を表し、
該方法は、以下：
(ｉ)
(i a)AHFを有さないか又はAHFを有するリスクにないか又はAHFについて良好な予後を有する１以上の対象者からの１以上のサンプル中、或いは
(i b)AHFを有しているか又はAHFを有するリスクにあるか又はAHFについて不良な予後を有する１以上の対象者からの１以上のサンプル中
のクイエシンQ6量並びに前記１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量を測定し、
(ii)
(ii a)(i a)の測定値を、クイエシンQ6量並びに前記１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量のプロフィールの作成に使用するか、或いは
(ii b)(i b)の測定値を、クイエシンQ6量並びに前記１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量のプロフィールの作成に使用し、
(iii)
(iii a)(ii a)のプロフィールを、AHF無しの予知若しくは診断を表すか又はAHFについての良好な予後を表す参照プロフィールとして保存するか、或いは
(iii b)(ii b)のプロフィールを、AHFの予知若しくは診断を表すか又はAHFについての不良な予後を表す参照プロフィールとして保存する
ことを含んでなる。
【００３０】
１つの実施形態において、AHFの予知、診断及び/又は予後予測に有用な前記他のバイオマーカーは、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、プロ-Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド(プロBNP)、アミノ末端プロ-Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド(NTプロBNP)及びそれらのいずれかのフラグメントからなる群より選択され得る。
本発明は更に、対象者におけるクイエシンQ6のベースライン又は参照値を確立する方法を提供し、ここで該方法は以下：
(ｉ)対象者がAHFに罹患していない種々の時点で対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量を測定し、そして
(ii)対象者についてのクイエシンQ6のベースライン又は参照値である対象者の範囲又は平均値を算出する
ことを含んでなる。
【００３１】
上記方法のいずれか１つの好適な実施形態において、対象者はヒトであり得る。
呼吸困難はAHFにより引き起こされ得るが、AHF以外又はAHFに無関係の原因、例えばCOPD、肺炎、心房細動、中毒などに起因する他の患者にも存在する。本発明による診断方法は、呼吸困難の徴候を示す患者集団において特に良好に機能し、クイエシンQ6レベルに基づくAHFの特異的診断を可能にする。よって、本発明の上記方法のいずれか１つの好適な実施形態において、対象者は、呼吸困難の徴候を示すか又は心不全の病歴を有する患者集団の一部を形成する。
本明細書中で教示される方法において、クイエシンQ6量並びに/或いは１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量は、任意の適切な技術、例えば当該分野で公知であり得る技術により測定し得る。
１つの実施形態において、クイエシンQ6量並びに/或いは１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量は、それぞれ、クイエシンQ6及び/又はそのフラグメントに特異的に結合し得る結合性物質並びに前記１以上の他のバイオマーカーに特異的に結合し得る結合性物質を用いて測定し得る。
【００３２】
１つの実施形態において、結合性物質は、抗体、アプタマー、ホトアプタマー、タンパク質、ペプチド、ペプチド類似体又は小分子であり得る。
１つの更なる実施形態において、クイエシンQ6量並びに/或いは１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量は、イムノアッセイ技術、例えば直接ELISA、間接ELISA、サンドウィッチELISA、競合ELISA、マルチプレックスELISA、ラジオイムノアッセイ(RIA)又はELISPOT技術を使用して、又は質量分析法を使用して、クロマトグラフィー法を使用して、又は前記方法の組合せを使用して測定する。
【００３３】
別の観点は、対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量を測定する手段を含んでなる、対象者におけるAHFの予知、診断及び/又は予後予測のためのキットを開示する。
１つの実施形態は、対象者におけるAHFの予知、診断及び/又は予後予測のためのキットを提供し、該キットは以下：
(ｉ)対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量を測定する手段；及び
(ii)クイエシンQ6量の参照値、又は該参照値を確立する手段(ここで、該参照値はAHFの既知の予知、診断及び/又は予後を表す)
を含んでなる。
【００３４】
よって、キットは、以下：手段(ｉ)により、対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量を測定し；手段(ｉ)により測定したクイエシンQ6量を、(ii)の参照値又は手段(ii)により確立した参照値と比較し；手段(ｉ)により測定したクイエシンQ6量の、(ii)の参照値からの逸脱又は逸脱無しを発見し；そしてその結果として、前記逸脱又は逸脱無しの発見を、対象者における特定のAHF予知、診断及び/又は予後に帰することを可能にする。
１つの更なる実施形態は、対象者におけるAHFを予知、診断及び/又は予後予測するためのキットを提供し、該キットは、対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量を測定する手段と、対象者からのサンプル中の、AHFの予知、診断及び/又は予後予測に有用な１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量を測定する手段とを含んでなる。
【００３５】
１つの実施形態は、対象者におけるAHFを予知、診断及び/又は予後予測するキットを提供し、ここで該キットは以下：
(ｉ)対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量を測定する手段；
(ii)対象者からのサンプル中の、AHFの予知、診断及び/又は予後予測に有用な１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量を測定する手段；
(iii)任意に、クイエシンQ6量並びに前記１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量についての対象者のプロフィールを確立する手段；及び
(iv)クイエシンQ6量並びに前記１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量についての参照プロフィール、又は該参照プロフィールを確立する手段(ここで、該参照プロフィールは既知のAHF予知、診断及び/又は予後を表す)
を含んでなる。
【００３６】
よって、このようなキットは、以下：それぞれ手段(ｉ)及び(ii)により、対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量並びに前記１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量を測定し；前記測定値に基づいて、クイエシンQ6量並びに前記１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量についての対象者のプロフィールを(例えば、キットに含まれる手段又は適切な外部手段を用いて)確立し；該対象者のプロフィールを、(iv)の参照プロフィール又は手段(iv)により確立した参照プロフィールと比較し；前記参照プロフィールからの対象者のプロフィールの逸脱又は逸脱無しを発見し；そしてその結果として、前記逸脱又は逸脱無しの発見を、対象者における特定のAHF予知、診断及び/又は予後に帰することを可能にする。
【００３７】
上記キットの１つの実施形態において、AHFの予知、診断及び/又は予後予測に有用な前記他のバイオマーカーは、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、プロ-Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド(プロBNP)、アミノ末端プロ-Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド(NTプロBNP)及びそれらのいずれかのフラグメントからなる群より選択され得る。
上記キットの１つの更なる実施形態において、クイエシンQ6量並びに/或いは１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量を測定する手段は、それぞれ、クイエシンQ6及び/又はそのフラグメントに特異的に結合し得る１以上の結合性物質並びに前記１以上の他のバイオマーカーに特異的に結合し得る１以上の結合性物質を含み得る。
【００３８】
１つの実施形態において、前記１以上の結合性物質のいずれか１つは、抗体、アプタマー、ホトアプタマー、タンパク質、ペプチド、ペプチド類似体又は小分子であり得る。
１つの実施形態において、前記１以上の結合性物質のいずれか１つは、有利には、固相又は固体支持体に固定され得る。
上記キットの１つの更なる実施形態において、クイエシンQ6量並びに/或いは１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量を測定する手段は、イムノアッセイ技術、例えば直接ELISA、間接ELISA、サンドウィッチELISA、競合ELISA、マルチプレックスELISA、ラジオイムノアッセイ(RIA)若しくはELISPOT技術を用いてもよいし、又は質量分析技術を用いてもよいし、又はクロマトグラフィー技術を用いてもよいし、前記技術の組合せを用いてもよい。
【００３９】
よって、１つの実施形態は、以下：
(ａ)クイエシンQ6及び/又はそのフラグメントに特異的に結合し得る１以上の結合性物質；
(ｂ)好ましくは、既知量又は既知濃度のクイエシンQ6及び/又はそのフラグメント(例えば、コントロール、標準及び/又はキャリブレータとして使用するため)；
(ｃ)好ましくは、クイエシンQ6量の参照値又は該参照値を確立する手段
を含んでなる、AHFの予知、診断及び/又は予後予測のためのキットを開示する。
前記(ａ)及び/又は(ｃ)の成分は、本明細書中他の箇所で教示されるように、適切に標識化され得る。
【００４０】
別の１つの実施形態は、以下：
(ａ)クイエシンQ6及び/又はそのフラグメントに特異的に結合し得る１以上の結合性物質；
(ｂ)AHFの予知、診断及び/又は予後予測に有用な１以上の他のバイオマーカーに特異的に結合し得る１以上の結合性物質、ここで、好ましくは、該他のバイオマーカーはBNP、プロBNP、NTプロBNP及びそれらのいずれかのフラグメントからなる群より選択される；
(ｃ)好ましくは、既知量又は既知濃度のクイエシンQ6及び/又はそのフラグメント並びに既知量又は既知濃度の前記１以上の他のバイオマーカー(例えば、コントロール、標準及び/又はキャリブレータとして使用するため)；
(ｄ)好ましくは、クイエシンQ6量並びに前記１以上の他のバイオマーカーの有無及び/又は量についての参照プロフィール、或いは該参照プロフィールを確立する手段
を含んでなる、AHFの予知、診断及び/又は予後予測のためのキットを開示する。
前記(ａ)、(ｂ)及び/又は(ｃ)の成分は、本明細書中他の箇所で教示されるように、適切に標識化され得る
【００４１】
クイエシンQ6及び任意に本発明に関する１以上の他のAHF-関連バイオマーカーを測定するに有用な試剤及びツールもまた開示される。
例えば、更なる観点は、以下：
(ａ)クイエシンQ6及び/又はそのフラグメント、好ましくは既知量又は既知濃度の前記クイエシンQ6及び/又はそのフラグメント；及び
(ｂ)任意に、そして好ましくは、AHFの予知、診断及び/又は予後予測に有用な１以上の他のバイオマーカー、好ましくは既知量又は既知濃度の前記１以上の他のバイオマーカー(好ましくは、前記他のバイオマーカーは、BNP、プロBNP、NTプロBNP及びそれらのいずれかのフラグメントからなる群より選択される)
を含んでなる、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドのアレイ又はマイクロアレイに関する。
【００４２】
別の１つの観点は、以下：
(ａ)クイエシンQ6及び/又はそのフラグメントに特異的に結合し得る１以上の結合性物質、好ましくは既知量又は既知濃度の前記結合性物質；及び
(ｂ)任意に、そして好ましくは、AHFの予知、診断及び/又は予後予測に有用な１以上の他のバイオマーカーに特異的に結合し得る１以上の結合性物質、好ましくは既知量又は既知濃度の前記結合性物質(好ましくは、該他のバイオマーカーは、BNP、プロBNP、NTプロBNP及びそれらのいずれかのフラグメントからなる群より選択される)
を含んでなる結合性物質のアレイ又はマイクロアレイに関する。
【００４３】
自宅又は臨床設定での使用のためのポータブルデバイス(例えば、ベッドサイドデバイス)として構成された、上記で教示されるキットもまた開示される。
よって、関連する１つの観点は、以下：
(ｉ)対象者からのサンプルを取得する手段、
(ii)前記サンプル中のクイエシンQ6量を測定する手段、及び
(iii)サンプル中で測定したクイエシンQ6量を視覚化する手段
を含んでなる、対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量を測定し得るポータブル検査デバイスを提供する。
【００４４】
１つの実施形態において、(ii)及び(iii)の手段は同じであり得、よって(ｉ)対象者からのサンプルを取得する手段；及び(ii)前記サンプル中のクイエシンQ6量を測定し、サンプル中で測定したクイエシンQ6量を視覚化する手段を含んでなる、対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量を測定し得るポータブル検査デバイスを提供する。
１つの実施形態において、前記視覚化手段は、サンプル中のクイエシンQ6量が或る閾値レベルを上回っているか若しくは下回っているか及び/又はサンプル中のクイエシンQ6量がクイエシンQ6量の参照値から逸脱しているか否かを表示することができる。ここで、前記参照値は、(本明細書の他の箇所で教示するように)既知のAHF予知、診断及び/又は予後を表す。よって、１つの実施形態において、前記ポータブル検査デバイスは、適切には、前記参照値又は該参照値を確立する手段もまた含んでなり得る。
【００４５】
１つの実施形態において、閾値レベルは、該閾値レベルを上回るサンプル中のクイエシンQ6量が、対象者がAHFを有しているか若しくはAHFを有するリスクにあることを示すか又は対象者におけるAHFについての不良な予後を示し、前記閾値レベルを下回るサンプル中のクイエシンQ6量が、対象者がAHFを有していないか若しくはAHFを有するリスクにないことを示すか又は対象者におけるAHFについての良好な予後を示すように、選択される。
１つの実施形態において、ポータブル検査デバイスは、AHF無しの予知若しくは診断を表すか又はAHFについての良好な予後を表す参照値を含んでなるか、或いは該参照値を確立する手段を含んでなり、前記参照値と比較して上昇した対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量が、対象者がAHFを有しているか若しくはAHFを有するリスクにあることを示すか又は対象者におけるAHFについての不良な予後を示す。
【００４６】
別の１つの実施形態において、ポータブル検査デバイスは、AHFの予知若しくは診断を表すか又はAHFについての不良な予後を表す参照値を含んでなるか、或いは該参照値を確立する手段を含んでなり、前記参照値と比較して匹敵する対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量が、対象者がAHFを有しているか若しくはAHFを有するリスクにあることを示すか又は対象者におけるAHFについての不良な予後を示す。
【００４７】
１つの更なる実施形態において、ポータブル検査デバイスの測定(任意に、及び視覚化)手段は、近位端及び遠位端を有する固体支持体を含んでなり得、該固体支持体は以下：
−  近位端近傍のサンプル適用ゾーン；
−  サンプル適用ゾーンに対して遠位の反応ゾーン；及び
−  反応ゾーンに対して遠位の検出ゾーン；
−  任意に、クイエシンQ6タンパク質又はペプチドフラグメントを含んでなるコントロール標準、
を含んでなり、このことにより、前記支持体は、適用ゾーンに適用された流体サンプルの近位端から遠位端への向きのフローを導くキャピラリー特性を有し、
−  任意に、より粘性のサンプルのキャピラリーフローを向上させる流体供給源を含んでなる。
【００４８】
１つの実施形態において、反応ゾーンは、検出剤に接合したクイエシンQ6-特異的結合性分子の１以上のバンドを含んでなり得、このクイエシンQ6-特異的結合性分子接合体は、流体のキャピラリーフローと共に移動することができるように、固体支持体上に配置され；検出ゾーンは、固体支持体上に固定されたクイエシンQ6-特異的分子の集合を含んでなる１以上の捕捉バンドを含んでなる。
１つの実施形態において、反応ゾーンは、閾値量のクイエシンQ6-特異的結合性分子接合体が検出ゾーンに移動することを防止するに十分な量で、１以上のクイエシンQ6-特異的結合性分子捕捉バンドを追加的に含んでなり得る。代替の実施形態において、前記デバイスは、捕捉したクイエシンQ6-特異的結合性分子接合体の量を閾値と比較する手段を追加的に含んでなる。
これら及び更なる観点並びに好適な実施形態は、以下の章及び添付の特許請求の範囲に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、クイエシンQ6のイソフォーム１(Ａ)及び２(Ｂ)の配列を説明する。
【図２】図２は、クイエシンQ6のイソフォーム１と２との間の差異を説明する。イソフォーム２で存在しないＣ末端部分は、小文字で示されている。また、MASStermind発見ペプチド(MASStermind discovered peptide)(pept10012 - 太字、実線による下線：配列番号７；pept10014 - 太字、点線による下線：配列番号８；pept10055 - 太字、破線による下線：配列番号９)及び選択したMASSterclass定量化ペプチド(pept110 - 太字、二重下線：配列番号10)も示されている。MASStermind及びMASSterclassペプチドは、クイエシンQ6の両イソフォームを定量化することができる。
【図３】図３はプレプロBNP及びそれに由来するペプチドの配列を説明する。
【図４】図４は急性心不全発見実験セットアップの概略図を提供する。MASStermindを用いて、集団Ａ(救命救急部(ED)に入院時にAHF)、集団Ｂ(退院時の同じ患者)及び集団Ｈ(健常コントロール)のタンパク質プロフィールを比較した。MASSterclassを用いる標的化された方法で、集団Ｃ(慢性心不全)及びＤ(入院時にHFを有さなかった呼吸困難患者)における定量を行った。
【図５】図５はクイエシンQ6についてのMASStermind発見結果を示す。ボックスプロットは、MASStermindを用いて検出した３つの異なるクイエシンQ6特異的ペプチドに関して、分析した３つの集団についてMASStermind参照に従って測定した相対的ペプチドレベルを示す。
【図６】図６は、集団Ａ、Ｃ，Ｄ及びＨにおいてELISAにより測定したBNPの絶対レベル(左パネル)、及び対応するクイエシンQ6 pept110のMASSterclass定量(右パネル)を示す。
【図７Ａ】図７は、クイエシンQ6がAHF患者と呼吸困難非-急性心不全患者との区別においてＢ型ナトリウム利尿ペプチより良好な成績を示すことを説明する。(Ａ)EDにおける呼吸困難の心不全原因の診断について、クイエシンQ6と比較したBNP及びクイエシンQ6と比較したNT-プロBNPの受信者動作特性曲線。算出した曲線下面積(AUC)及び95％信頼区間を表に示す。
【図７Ｂ】(Ｂ)EDでの呼吸困難患者におけるAHF診断について、種々のカットオフ濃度で算出した感度及び特異性についてのBNP及びクイエシンQ6に関する正確性プロット。
【図８】図８は、急性非代償性心不全患者と安定な慢性心不全患者との区別に関する、クイエシンQ6と比較したBNP及びクイエシンQ6と比較したNT-プロBNPのROC曲線を示す。
【図９】図９は、クイエシンQ6がAHF患者と呼吸困難非-急性心不全患者との区別におけるＢ型ナトリウム利尿ペプチドに匹敵する性能を示すことを説明する。EDにおける呼吸困難の心不全原因の診断について、(Ａ)クイエシンQ6と比較したBNP及び(Ｂ)クイエシンQ6と比較したNT-プロBNPの受信者動作特性曲線。算出したメジアン曲線下面積(AUC)及び95％信頼区間を下記表２に示す。
【図１０】図10は、診断正確性に対するクイエシンQ6マーカー及びBNPマーカーの組合せの影響を説明する。標準ELISAにより測定したBNPレベルをＸ軸に示し、MASSterclassにより測定したクイエシンQ6レベルをＹ軸に示す。クイエシンQ6について算出した最良のカットオフ(水平の線)及びBNPについて慣用的に使用されるカットオフ(「グレーゾーン」を囲む２つの垂直な線)も示す。両独立マーカー及び両マーカーの組合せについて算出した正確性を下記の表３に示す。
【図１１】図11は、BNP診断のグレーゾーンにおけるクイエシンQ6の診断性能を示す。100〜400pg/mLのBNPレベルを有する患者について算出したメジアンAUC及び95％信頼区間を示す。
【図１２】図12は、クイエシンQ6レベルが腎不全とは無関係であることを説明する。ボックスプロットは、クレアチニンレベル(正常(＜ 150umol/L)又は増加(＞ 150umol/L))に従って群分けされた急性非代償性心不全(AHF)と診断された患者及び安定な慢性心不全(CHF)と診断された患者におけるNT-プロBNPレベル(上)及びクイエシンQ6レベル(下)を示す。
【図１３Ａ−１】図13は、AHF集団、呼吸困難非AHF集団及びCHF集団における、ELISAにより測定したBNPレベル及びMASSterclassにより測定したクイエシンQ6レベルを示す(Ａ)。
【図１３Ａ−２】図13A-1の続き。
【図１３Ｂ−１】(Ｂ)は、スキャッタープロットで示した同じデータを説明する。クイエシンQ6について算出した最良のカットオフ及びBNPについて慣用的に使用されるカットオフも示す。明らかに、CHF患者においても上昇しているBNPとは異なり、AHF患者では、クイエシンQ6レベルのみが上昇している(1.5倍)。
【図１３Ｂ−２】図13B-1の続き。
【図１４】図14：本発明による検査ストリップの平面図(Ａ)及び側面図(Ｂ)。
【図１５】図15：本発明による検査カートリッジの平面図。
【図１６】図16 A〜Bは、幾つかの検査パッドを含んでなる本発明による試剤ストリップのそれぞれ側面図及び上面図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
発明の詳細な説明
本明細書中で使用する場合、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈がそうでないことを明示していなければ、単数及び複数の両方の指示対象を含む。
本明細書で使用する場合、用語「含んでなる」及び「から構成される」は、「含む」又は「含有する」と同義であり、非排他的(inclusive)又は非限定的(open-ended)であって、追加の、言及していない部材、要素又は方法工程を排除しない。明らかなことに、用語 含んでなる はまた、その形態の１つとして、完結表現(closed wording)「からなる」を包含する。
【００５１】
端点による数値範囲への言及は、それぞれの範囲内に含まれる全ての数及び端数(fractions)並びに記載された端点を含む。
本明細書中で使用する用語「約」は、パラメータ、量、時間的期間などのような測定可能な値に言及する場合、そのばらつき/変動が開示発明における実施に適切である限りにおいて、特定値のばらつき及び特定値からの変動、詳細には±10％以下、好ましくは±５％以下、より好ましくは±１％以下、なおより好ましくは±0.1％以下の特定値のばらつき及び特定値からの変動を包含することを意味する。修飾語「約」が言及する値はまた、それ自体具体的に開示され、好ましいものとしても開示されていると理解すべきである。
【００５２】
本明細書中で引用した全ての文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特に明記しない限り、本発明の開示に使用される全ての用語(技術用語及び科学用語を含む)は、本発明が属する分野における通常の知識を有する者が一般的に理解する意味を有する。更なるガイダンスのために、本発明の教示をより良く理解するための用語の定義が含まれうる。
【００５３】
本発明は、クイエシンQ6が特に急性心不全(AHF)についての価値あるバイオマーカーであるという、本発明者らの高度に革新的な認識に由来する。用語「バイオマーカー」は、当該分野において広く知られており、対象者におけるその定性的及び/又は定量的評価が対象者の表現型及び/又は遺伝子型の１以上の観点に関して、例えば、所定の疾患又は病状についての対象者の状況に関して予見的であるか又は情報を提供する(例えば、予知、診断及び/又は予後に)生体分子及び/又はその検出可能部分を広く指称し得る。
【００５４】
本明細書中で使用する用語「心不全」、「急性心不全」及び「慢性心不全」は、それぞれの分野で確立された意味を有する。更なるガイダンスのために、本明細書中で使用する用語「心不全」とは、拡張期又は収縮期血流速度の障害、したがって心室から末梢器官への不十分な血流によって特徴付けられる病状を広く言う。
「急性心不全」又は「急性非代償性心不全」は、緊急治療の必要性をもたらす、異常な心機能に続発性の症状及び徴候の迅速な発症として定義され得る。AHFは、新規に(心機能不全が以前に知られていない患者における急性心不全の新たな発症)又はCHFの急性代償不全として急性に起こり得る。
【００５５】
心機能不全は収縮期又は拡張期の機能不全、心リズムの異常又は前負荷及び後負荷のミスマッチに関連し得る。これは、しばしば、命にかかわり、緊急処置を必要とする。確立された分類によれば、AHFは、症候性患者の幾つかの異なる臨床状態を含む：(Ｉ)急性非代償性鬱血性心不全、(II)高血圧/高血圧性クリーゼを伴うAHF、(III)肺浮腫を伴うAHF、(IVa)心臓性ショック/低心拍出量症候群、(IVb)重篤な心臓性ショック、(Ｖ)高心拍出量性心不全、及び(VI)右急性心不全。詳細な臨床的説明、AHFの分類及び診断、並びに更なるAHF分類体系(Killip分類、Forrester分類及び「臨床重篤度」分類を含む)の概要については、とりわけ、Nieminenら，2005 (「Executive summary of the guidelines on the diagnosis and treatment of acute heart failure: the Task Force on Acute Heart Failure of the European Society of Cardiology」 Eur Heart J 26: 384-416)及びその中の文献を参照。
【００５６】
用語「慢性心不全」(CHF)又は「鬱血性心不全」とは、一般に、非常にゆっくりと進行するので、種々の代償機序が当該疾患を平衡化するように機能する心不全の症例をいい得る。CHFの共通の臨床症状には、とりわけ、息切れ、運動能力の減退、疲労、嗜眠及び末梢浮腫の任意の１以上が含まれる。他のより共通性が少ない症状としては、動悸、記憶又は睡眠障害及び錯乱の任意の１以上が挙げられ、これは、通常、上記共通症状の１以上と同時に起こる。
本研究のような研究では、CHF集団は、CHF患者が急性代償不全を有さず、このため当該研究又は調査に使用される臨床サンプルを採取する時点でEDに対してそのことを説明しない点で、AHF集団と異なり得る。しかし、慢性心不全患者は、容易に代償不全になり、「急性心不全」に至り得る。
本研究のような研究において、心不全を有さない呼吸困難患者の集団は、例えば、AHF集団と同様な症状をEDに対して説明するが、呼吸困難の原因は急性非代償性心不全とは無関係である患者を含んでなり得る。代表例は、COPD又は肺炎の患者である。このような患者は、従来の診断手段を用いる最終診断を特に複雑にし得る基礎心不全の病歴を有していてもよいし、有していなくてもよい。
【００５７】
用語「予知」、「診断」及び「予後予測」又は「予後」は、医療及び臨床の実務において一般的な表現であり、十分に理解されている。更なる説明のために、限定されることなく、「予知」とは、一般に、(未だ)疾患又は病状を有していない対象者における当該疾患又は病状の事前の宣言、指摘又は予告をいう。例えば、対象者における疾患又は病状の予知は、対象者が例えば或る期間内に又は或る年齢までに前記疾患又は病状を発症する可能性、確率又はリスクを示し得る。前記可能性、確率又はリスクは、とりわけ、絶対値、範囲又は統計量として示されてもよいし、適切なコントロール対象者又は対象者集団(例えば、一般的な、正常又は健常対象者又は対象者集団)に関して相対的に示されてもよい。よって、対象者が疾患又は病状を発症する可能性、確率又はリスクは、有利には、適切なコントロール対象者又は対象者集団に関して、増加若しくは減少した又は何倍増加若しくは何倍減少したと示されてもよい。
【００５８】
本明細書中で使用する場合、用語 対象者における「AHFの予知」 はまた、特に、対象者がAHFの「陽性の」予知を有すること、すなわち、対象者がAHFを有するリスクにある(例えば、リスクが、コントロール対象者又は対象者集団に関して有意に増加している)ことを意味し得る。用語 対象者における「AHF無しの予知」 は、特に、対象者がAHFの「陰性の」予知を有すること、すなわち、AHFを有する対象者のリスクは、コントロール対象者又は対象者集団に関して有意には増加していないことを意味し得る。
用語「診断」とは、一般に、症状及び徴候に基づいて及び/又は種々の診断手順の結果から(例えば、診断する疾患又は病状に特徴的な１以上のバイオマーカーの存否及び/又は量を知ることから)対象者における疾患又は病状を認識、決定又は結論付けるプロセス又は行為をいう。
本明細書中で使用する場合、対象者における「AHFの診断」は、特に、対象者がAHFを有していること、よって対象者がAHFを有していると診断されることを意味し得る。対象者における「AHF無しの診断」は、特に、対象者がAHFを有していないこと、よって対象者がAHFを有していないと診断されることを意味し得る。対象者は、本明細書中で教示されるように、AHFを連想させる１以上の従来の症状又は徴候を示すにも関わらず、AHFを有していないと診断され得る。
【００５９】
用語「予後予測」又は「予後」とは、一般に、疾患又は病状の進行及び回復の見込み(例えば、確率、期間及び/又は程度)についての予見をいう。
AHFの良好な予後は、一般に、好ましくは受容可能な期間内での、AHFからの満足のいく部分的な又は完全な回復の予見を包含し得る。AHFの良好な予後は、より通常には、好ましくは所定の期間内での、心不全状態の更なる悪化(worsening又はaggravating)のないことの予見を包含し得る。
AHFの不良な予後は、一般に、低水準の回復及び/又は不満足に遅い回復の予見を包含し得、AHFの回復が実質的にないことやAHFの更なる悪化の予見さえも包含し得る。
【００６０】
本明細書中で教示する種々の観点及び実施形態は、対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量の測定及び任意に１以上の他の該当するバイオマーカー、例えば好ましくはBNP、プロBNP、NTプロBNP及び/又はそれらのいずれかのフラグメントの有無及び/又は量の測定に依存し得る。
本明細書中で使用する用語「対象者」又は「患者」は、代表的には、ヒトを指称するが、非-ヒト動物、好ましくは温血動物、より好ましくは哺乳動物、例えば非-ヒト霊長類、げっ歯類、イヌ科動物、ネコ科動物、ウマ科動物、ヒツジ科動物、ブタ科動物などへの言及も包含し得る。
【００６１】
本明細書中で使用する用語「サンプル」又は「生物学的サンプル」には、対象者から得られた任意の生物学的標本が含まれる。サンプルには、全血、血漿、血清、赤血球、白血球(例えば、末梢血単核細胞)、唾液、尿、糞便(すなわち、大便)、涙、汗、皮脂、乳頭吸引液、管洗浄液、腫瘍滲出物、滑液、脳脊髄液、リンパ、細針吸引液、羊水、任意の他の体液、細胞溶解物、細胞分泌物、炎症液(inflammation fluid)、精液及び膣分泌物が含まれるが、これらに限定されない。好適なサンプルとしては、クイエシンQ6を検出可能な量で含んでなるものが挙げられ得る。好適な実施形態において、サンプルは、全血若しくはその分画成分(例えば、血漿、血清)又は細胞ペレットであり得る。好ましくは、サンプルは最小限の侵襲法により容易に取得できる。また、サンプルとしては、組織サンプル及び生検、組織ホモジネートなどが挙げられ得る。１つの好適な実施形態において、サンプルは血漿サンプルである。用語「血漿」は、細胞を含有しないが、栄養素、糖類、タンパク質、ミネラル、酵素などを含有する、血球(赤血球、白血球、血小板など)がその中に懸濁される血液の無色な水状液を定義する。
【００６２】
分子若しくは分析物(例えば、タンパク質、ポリペプチド又はペプチド)又は２以上の分子又は分析物(例えば、２種以上のタンパク質、ポリペプチド又はペプチド)の群は、該分子若しくは分析物又は該分子若しくは分析物の群の有無及び/又は量が、好ましくは他の分子及び分析物を実質的に除外して、サンプル中で検出又は決定されるとき、サンプル中で「測定される」。
用語「量(quantigy又はamount)」及び「レベル」は、同義であり、当該分野において広く十分に理解される。本明細書中で使用するこの用語は、特に、サンプル中の分子若しくは分析物の絶対的な定量又はサンプル中の分子若しくは分析物の相対的な定量、すなわち、別の値に対する(例えば、本明細書中で教示される参照値に対する)か若しくはバイオマーカーのベースライン発現を示す値の範囲に対する相対的な定量をいい得る。これらの値又は範囲は、1人の患者又は患者群から取得することができる。
【００６３】
サンプル中の分子又は分析物の絶対量は、有利には、重量若しくはモル量として表わし得るか、又はより一般には濃度として、例えば重量/体積若しくはモル/体積として表し得る。
サンプル中の分子又は分析物の相対量は、有利には、前記別の値に対する、例えば本明細書中で教示する参照値に対する、増加若しくは減少として表し得るか又は何倍増若しくは何倍減として表し得る。第１及び第２のパラメータ(例えば、第１及び第２の量)の間の相対的比較の実施は、先ず、前記第１及び第２のパラメータの絶対値を決定してもよいが、そうしないでも済む。例えば、或る測定方法は、前記第１及び第２のパラメータについての定量化可能な読取値(例えば、シグナル強度)を作ることができる。ここで、前記読取値は前記パラメータの値の関数であり、該読取値を直接比較して第１のパラメータ 対 第２のパラメータについての相対値を作ることができ、実際、読取値を先ずそれぞれのパラメータの絶対値に変換する必要はない。
【００６４】
本明細書中で使用する場合、用語「クイエシンQ6」及び「スルフヒドリルオキシダーゼ１」は同義であり、当該分野においてこの呼称で通常知られるタンパク質及びポリペプチドをいう。
この用語は、それが見出される任意の生物、特に動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物(ヒト及び非-ヒト哺乳動物を含む)、更により好ましくはヒトの前記タンパク質及びポリペプチドを包含する。
この用語は、特に、天然型配列を有する前記タンパク質及びポリペプチド、すなわち、その一次配列が天然に見出されるか又は天然に由来するクイエシンQ6のものと同じである前記タンパク質及びポリペプチドを包含する。当業者は、クイエシンQ6の天然型配列が異なる種間で当該種間での遺伝的分岐(genetic divergence)に起因して異なり得ることを理解する。更に、クイエシンQ6の天然型配列は、所定の種内での通常の遺伝的多様性(変動)に起因して、同種の異なる個体間又は異なる個体内で異なり得る。また、クイエシンQ6の天然型配列は、転写後又は翻訳後修飾に起因して、同種の異なる個体間で又は異なる個体内でさえ異なり得る。したがって、天然に見出されるか又は天然に由来する全てのクイエシンQ6配列を「天然型」とみなす。
【００６５】
この用語は、生物、器官、組織又は細胞の一部を形成するとき、生物学的サンプルの一部を形成するとき及びこの様な供給源から少なくとも部分的に単離されたときのクイエシンQ6タンパク質及びポリペプチドを包含する。この用語はまた、組換え又は合成手段により製造されたときのタンパク質及びポリペプチドも包含する。
例示のクイエシンQ6としては、Uniprot/Swissprot (http://www.expasy.org/)アクセッション番号O00391 (2009年１月20日改訂のエントリーバージョン69；2001年６月１日作成の配列バージョン３)(オルタナティブスプライシングに起因して生じたイソフォーム１(アクセッション番号O00391-1)及びイソフォーム２(O00391-2)を含む)で記載される一次アミノ酸配列を有するヒトクイエシンQ6が挙げられるが、これに限定されない。クイエシンQ6の前記イソフォーム１及び２の配列を、それぞれ図1A (配列番号１)及び図1B (配列番号２)に示す。図２は、前記イソフォーム１及び２の間でのＣ末端領域の相違を説明する。当業者はまた、前記配列がクイエシンQ6の前駆体のものであり、プロセッシングされて成熟クイエシンQ6から切り離される部分を含み得ることも理解する。例えば、イソフォーム１の配列を参照して、Uniprot/Swissprotエントリーは、アミノ酸１〜29から構成されるシグナルペプチドを特定する。例示のヒトクイエシンQ6もまた、特に、Coppockら，1998 (Genomics 54: 460-468)に記載されている。
【００６６】
本明細書中におけるクイエシンQ6への言及はまた、クイエシンQ6のフラグメントを包含し得る。よって、本明細書中でのクイエシンQ6の測定又はクイエシンQ6量の測定への言及は、クイエシンQ6タンパク質又はポリペプチドの測定(例えば、クイエシンQ6の成熟イソフォーム１及び/又はイソフォーム２の測定)及び/又はクイエシンQ6の１以上のフラグメントの測定を包含し得る。例えば、クイエシンQ6及び/又はその１以上のフラグメントは、測定量が一纏りで測定した種の合計量に対応するように、一纏めに測定され得る。別の例では、クイエシンQ6及び/又はその１以上のフラグメントは、各個に測定され得る。
本発明の方法、キット及びデバイスの好適な実施形態において、クイエシンQ6タンパク質の検出は、血漿サンプルにおいて行われる。このことは、循環性クイエシンQ6タンパク質が、この循環性形態がクイエシンQ6のイソフォーム１又は２の可溶形態に対応するのか分解産物に対応するかに関わらず、検出されることを意味する。１つの好適な実施形態において、検出されるクイエシンQ6タンパク質又はフラグメントは、膜結合型でも細胞結合型でもない。用語「血漿」は、細胞を含有しないが、栄養素、糖類、タンパク質、ミネラル、酵素などを含有する、血球(赤血球、白血球、血小板など)がその中に懸濁される血液の無色な水状液を定義する。
【００６７】
本明細書中で使用する場合、用語「プロ-Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド」(「プロBNP」と略される)及び「アミノ末端プロ-Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド」(「NTプロBNP」と略される)及び「Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド」(「BNP」と略される)とは、当該分野においてこれらの呼称で通常知られているペプチドをいう。更なる説明としてであって限定ではないが、インビボで、プロBNP、NTプロBNP及びBNPは、ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｂプレプロタンパク質(プレプロBNP)に由来する。詳細には、プロBNPペプチドは、プレプロBNPからＮ-末端分泌シグナル(リーダー)配列が除去された後のプレプロBNPの部分に相当する。BNPは、プロBNPのアミノ酸76のＣ末端側での切断後の該プロBNPのＣ末端部分に相当し、NTプロBNPはＮ末端部分に相当する。
この用語は、それが見出される任意の生物、特に動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物(ヒト及び非-ヒト哺乳動物を含む)、更により好ましくはヒトに由来するペプチドを包含する。
【００６８】
本明細書中で使用する呼称 プロBNP、NTプロBNP及びBNPは、特に、天然型配列を有する前記ペプチド、すなわち、その一次配列が天然に見出されるか又は天然に由来するそれぞれプロBNP、NTプロBNP又はBNPのものと同じである前記ペプチドをいう。当業者は、プロBNP、NTプロBNP又はBNPの天然型配列が異なる種間で当該種間での遺伝的分岐に起因して異なり得ることを理解する。更に、プロBNP、NTプロBNP又はBNPの天然型配列は、所定の種内での通常の遺伝的多様性(変動)に起因して、同種の異なる個体間で又は異なる個体内でさえ異なり得る。また、プロBNP、NTプロBNP又はBNPの天然型配列は、転写後又は翻訳後修飾に起因して、同種の異なる個体間で又は異なる個体内でさえ異なり得る。したがって、天然に見出されるか又は天然に由来する全てのプロBNP、NTプロBNP又はBNP配列を「天然型」とみなす。
本明細書中で使用する呼称 プロBNP、NTプロBNP又はBNPは、生物、器官、組織又は細胞の一部を形成するとき、生物学的サンプルの一部を形成するとき、及びそのような供給源から少なくとも部分的に単離されたときのそれぞれのペプチドを包含する。この用語はまた、組換え又は合成手段により製造されたときのペプチドをも包含する。
【００６９】
例示のヒトプロBNPペプチドとしては、NIH Entrez Protein (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=protein)アクセッション番号NP_002512 (2009年１月25日改訂のversion NP_002512.1)で記載されるようなナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｂプレプロタンパク質配列のアミノ酸27位〜134位のペプチドが挙げられるが、これに限定されない。
NP_002512の配列を図3A(配列番号３)に、NP_002512からのプロBNPの例示配列を図3B(配列番号４)に示す。例示のヒトNTプロBNPペプチドとしては、前記NIH Entrez Proteinアクセッション番号NP_002512で記載されているナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｂプレプロタンパク質配列のアミノ酸27位〜102位のペプチドが挙げられるが、これに限定されない。NP_002512からのNTプロBNPの例示配列を図3Cに示す(配列番号５)。例示のヒトBNPペプチドとしては、前記NIH Entrez Proteinアクセッション番号NP_002512で記載されているナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｂプレプロタンパク質配列のアミノ酸103位〜134位のペプチドが挙げられるが、これに限定されない。NP_002512からのBNPの例示配列を図3Dに示す(配列番号６)。ヒトプレプロBNP由来ペプチド(プロBNP、NTプロBNP及びBNPを含む)の更なる例証については、Sudohら，1989 (Biochem Biophys Res Commun 159: 1427-1434)も参照。臨床実務におけるナトリウム利尿ペプチドレベルの使用に関しては、Maiselら，2008 (Eur J Heart Fail 10(9): 824-39)及びMillerら，2007 (Biomarkers Med 1(4): 503-512)もまた参照。
【００７０】
本明細書中におけるプロBNP、NTプロBNP及び/又はBNPへの言及はまた、プロBNP、NTプロBNP及び/又はBNPのいずれかのフラグメントを包含し得る。よって、本明細書中でのプロBNP、NTプロBNP及び/又はBNPの有無及び/又は量の測定への言及は、プロBNP、NTプロBNP及び/又はBNPペプチドの測定並びに/或いはプロBNP、NTプロBNP及び/又はBNPペプチドのいずれかの１以上のフラグメントの測定を包含し得る。例えば、プロBNP、NTプロBNP及び/又はBNPペプチド並びに/或いは１以上のそれらのいずれかのフラグメントは、測定量が一纏りで測定した種の合計量に対応するように、一纏めに測定され得る。別の例では、プロBNP、NTプロBNP及び/又はBNPペプチド並びに/或いはそれらのいずれかの１以上のフラグメントは、各個に測定され得る。
【００７１】
更に、文脈から明らかでない場合、本明細書中での任意のタンパク質、ポリペプチド又はペプチド(例えば、クイエシンQ6、プロBNP、NTプロBNP又はBNP)及びそのフラグメントへの言及は、一般に、前記タンパク質、ポリペプチド又はペプチド及びフラグメントの改変形態、例えば発現後修飾(例えば、リン酸化、グリコシル化、脂質化、メチル化、システイン化、スルホン化、グルタチオン化、アセチル化、メチオニンからメチオニンスルホキシド又はメチオニンスルホンへの酸化などを含む)を有する形態もまた包含し得る。
１つの実施形態において、クイエシンQ6及びそのフラグメント、又はプロBNP、NTプロBNP、BNP及びそのフラグメントは、ヒトであり得る。すなわち、その一次配列は、天然に存在するヒトクイエシンQ6及びそのフラグメント又はプロBNP、NTプロBNP、BNP及びそのフラグメントの一次配列又はそれらの中に存在する対応する一次配列と同じであり得る。よって、この関係で限定詞「ヒト」は、起源又は供給源よりむしろ、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又はフラグメントの一次配列に関する。例えば、このようなタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又はフラグメントは、ヒト対象者のサンプル中に存在していてもよいし、該サンプルから単離されていてもよく、又は他の手段(例えば、組換え発現、無細胞翻訳又は非生物学的ペプチド合成により)取得してもよい。
【００７２】
用語 タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの「フラグメント」は、一般に、Ｎ-末端及び/又はＣ-末端が欠失又は短縮化された形態の前記タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをいう。この用語は、任意の機序、限定されないが、例えばオルタナティブ翻訳、エキソ-及び/又はエンド-タンパク質分解並びに/或いは前記タンパク質又はポリペプチドの分解(例えばインビボ又はインビトロでの、例えば物理的、化学的及び/又は酵素的タンパク質分解による)によって生じるフラグメントを包含する。限定されないが、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドのフラグメントは、前記タンパク質、ポリペプチド又はペプチドのアミノ酸配列の少なくとも約５％、又は少なくとも約10％、例えば≧20％、≧30％又は≧40％、例えば≧50％、例えば≧60％、≧70％又は≧80％、更には≧90％又は≧95％を表し得る。
【００７３】
例えば、クイエシンQ6のフラグメントには、クイエシンQ6の≧５連続アミノ酸、又は≧10連続アミノ酸、又は≧20連続アミノ酸、又は≧30連続アミノ酸、例えば≧40連続アミノ酸、例えば≧50連続アミノ酸、例えば≧60、≧70、≧80、≧90、≧100、≧200、≧300、≧400、≧500又は≧600連続アミノ酸の配列が含まれ得る。
１つの実施形態において、クイエシンQ6のフラグメントは、成熟全長クイエシンQ6(例えば、イソフォーム１又は２)と比較して、Ｎ-末端及び/又はＣ-末端が１〜約20アミノ酸、例えば、１〜約15アミノ酸、又は１〜約10アミノ酸、又は１〜約５アミノ酸だけ短縮化されていてもよい。
１つの実施形態において、プロBNP、NTプロBNP又はBNPのフラグメントは、プロBNP、NTプロBNP又はBNPと比較して、Ｎ-末端及び/又はＣ-末端が１〜約20アミノ酸、例えば１〜約15アミノ酸、又は１〜約10アミノ酸、又は１〜約５アミノ酸だけ短縮化されていてもよい。例示として、バイオマーカーとして有用なプロBNP、NTプロBNP及びBNPフラグメントは、WO 2004/094460に開示されている。
【００７４】
１つの実施形態において、所定のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドのフラグメントは、有利にはサンプルからの検出可能なペプチドを取得するような、前記タンパク質、ポリペプチド又はペプチドのインビトロタンパク質分解により獲得されてもよい。
例えば、このようなタンパク質分解は、適切な物理的、化学的及び/又は酵素的因子により、例えば、プロテイナーゼ、好ましくはエンドプロテイナーゼにより、すなわちタンパク質、ポリペプチド又はペプチド鎖で内部切断するプロテアーゼにより行なわれてもよい。適切なエンドプロテイナーゼの非限定的なリストには、セリンプロテイナーゼ(EC 3.4.21)、スレオニンプロテイナーゼ(EC 3.4.25)、システインプロテイナーゼ(EC 3.4.22)、アスパラギン酸プロテイナーゼ(EC 3.4.23)、メタロプロテイナーゼ(EC 3.4.24)及びグルタミン酸プロテイナーゼが含まれる。
例示の非限定的エンドプロテイナーゼとしては、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、Lysobacter enzymogenesエンドプロテアーゼLys-C、Staphylococcus aureusエンドプロテアーゼGlu-C(エンドペプチダーゼV8)又はClostridium histolyticumエンドプロテイナーゼArg-C(クロストリパイン)が挙げられる。更なる公知の酵素又は未同定の酵素も使用し得る；当業者は、所望のペプチド形態を獲得するために、切断特異性及び頻度に基づいて、適切なプロテアーゼを選択することができる。
【００７５】
好ましくは、タンパク質分解は、トリプシン型のエンドペプチダーゼ(EC 3.4.21.4)、好ましくはトリプシン、例えば(限定されないが)ウシ膵臓、ヒト膵臓、ブタ膵臓からのトリプシン調製物、組換えトリプシン、Lys-アセチル化トリプシン、溶液状のトリプシン、固体支持体に固定化したトリプシンなどにより行い得る。トリプシンは、とりわけ高い特異性及び切断効率に起因して特に有用である。本発明はまた、任意のトリプシン-様プロテアーゼ、すなわち、トリプシンのものと同様な特異性を有するプロテアーゼの使用を企図する。
他に、化学試剤をタンパク質分解に使用してもよい。例えば、CNBrはMetで切断することができ；BNPS-skatoleはTrpで切断することができる。
処理条件、例えば、タンパク質濃度、酵素又は化学試剤濃度、pH、緩衝液、温度、時間は、用いる酵素又は化学試剤に依存して、当業者が決定することができる。
【００７６】
よって、１つの観点において、本発明はまた、上記のクイエシンQ6の単離フラグメントを提供する。このようなフラグメントは、生物学的サンプル中のクイエシンQ6の存在及び量についての有用な情報をもたらし得る。このために、前記フラグメントの検出が関心事になる。よって、本明細書中に開示されるクイエシンQ6フラグメントは有用なバイオマーカーである。
特定の成分(例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド又はそのフラグメント)に言及するときの用語「単離(された)」は、一般に、その成分が、その天然環境の１以上の他の成分から分離して存在していること−例えば、該他の成分から分離されているか又は該他の成分から分離して調製されていること−をいう。例えば、単離されたヒト又は動物タンパク質、ポリペプチド、ペプチド又はフラグメントは、それが天然に存在するヒト又は動物の身体から分離して存在する。
【００７７】
本明細書中で使用する用語「単離(された)」は、好ましくは、修飾語「精製(された)」も包含し得る。本明細書中で使用する場合、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド及び/又はそのフラグメントに言及する場合の用語「精製(された)」は、絶対的な純粋性を要求しない。代わりに、この用語は、そのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド及び/又はフラグメントが、他のタンパク質と比較しての豊富さ(簡便には、質量若しくは重量又は濃度で表現される)が生物学的サンプル中より大きい別個の環境にあることをいう。別個の環境は、単一の媒質、例えば単一の溶液、ゲル、沈殿物、凍結乾燥物などをいう。精製されたペプチド、ポリペプチド又はフラグメントは、例えば、実験室又は組換えの合成、クロマトグラフィー、調製用電気泳動、遠心分離、沈澱、アフィニティー精製などを含む公知の方法により取得してもよい。
【００７８】
精製されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチド及び/又はフラグメントは、別個の環境のタンパク質含量の、好ましくは≧10重量％、より好ましくは≧50重量％、例えば≧60重量％、尚より好ましくは≧70重量％、例えば≧80重量％、更により好ましくは≧90重量％、例えば≧95重量％、≧96重量％、≧97重量％、≧98重量％、≧99重量％を構成し得、100重量％を構成しさえしてもよい。タンパク質含量は、例えば、Lowry法(Lowryら，1951. J Biol Chem 193: 265)により、任意にHartree 1972 (Anal Biochem 48: 422-427)により記載された方法により決定してもよい。また、ペプチド又はポリペプチドの純度は、クーマシーブルー染色又は好ましくは銀染色を使用して、還元又は非還元条件下でSDS-PAGEにより決定してもよい。
【００７９】
１つの更なる実施形態は、検出可能な標識を含んでなる、単離されたクイエシンQ6又は本明細書中で教示される単離されたクイエシンQ6フラグメントを提供する。これは、そのようなフラグメントの素早い検出を容易にする。本明細書を通じて使用される用語「標識」は、検出可能で好ましくは定量化可能な読取値又は特性を提供するために使用することができ、興味対象の実体、例えばペプチド若しくはポリペプチド又は特異的結合性物質に付着することができるか又はこれらの一部となることができる任意の原子、分子、成分又は生体分子をいう。標識は、質量分析的、分光学的、光学的、比色定量的、磁気的、光化学的、生化学的、免疫化学的又は化学的手段により適切に検出可能であり得る。標識としては(限定されないが)、染料；放射性標識、例えば32P、33P、35S、125I、131I；高電子密度試剤；酵素(例えば、イムノアッセイで通常使用される西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ)；結合性成分、例えばビオチン-ストレプトアビジン；ハプテン、例えばジゴキシゲニン；発光性、リン光性又は蛍光性成分；質量タグ(mass tag)；及び単独又は蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)により発光スペクトルを抑制若しくはシフトさせることができる成分との組合せでの蛍光染料が挙げられる。
【００８０】
１つの実施形態において、単離されたクイエシンQ6又は本明細書中に教示される単離されたクイエシンQ6フラグメントは、質量改変標識により標識されてもよい。好ましくは、質量改変標識には、ペプチドの１以上のアミノ酸における、対応する非標識ペプチドに関して明確に区別できる安定なアイソトープの存在が含まれ得る。質量-標識ペプチドは、質量分析適用において、陽性コントロール、標準及びキャリブレータとして特に有用である。具体的には、１以上の明確に区別できるアイソトープを含むペプチドは、化学的にはそっくりであり、クロマトグラフィー及び電気泳動で同様に分離し、また同様にイオン化及びフラグメント化する。しかし、適切な質量分析機では、このペプチド及び任意に、選択されたそのフラグメント化イオンは、識別可能なm/z比を示し、このため識別することができる。識別可能な安定なアイソトープ対の例としては、HとD、12Cと13C、14Nと15N、又は16Oと18Oが挙げられる。通常、本発明において分析する生物学的サンプルのペプチド及びタンパク質は、自然界で高い普及率(prevalence)を有する一般的なアイソトープ、例えばH、12C、14N及び16Oを実質的に唯一含有し得る。この場合、質量-標識ペプチドは、天然での普及率が低い１以上の一般的でないアイソトープ、例えば、D、13C、15N及び/又は18Oで標識されてもよい。生物学的サンプルのペプチド又はタンパク質が１以上の一般的でないアイソトープを含む場合には、質量-標識ペプチドがそれぞれの通常のアイソトープを含んでなり得ることも考えられる。
【００８１】
アイソトープ標識した合成ペプチドは、とりわけ、１以上のアイソトープ標識アミノ酸基質を使用して該ペプチドを合成若しくは組換え産生することにより、又は非標識ペプチドを化学的若しくは酵素的に改変して１以上の明確に識別可能なアイソトープを導入することによって取得してもよい。例示として、D-標識ペプチドは、市販の重水素化L-メチオニンCH3-S-CD2CD2-CH(NH2)-COOH又は重水素化アルギニンH2NC(=NH)-NH-(CD2)3-CD(NH2)-COOHの存在下で合成又は組換え産生されてもよいが、これに限定されない。標識ペプチドの合成又は組換え産生のために、重水素化形態又は15N-若しくは13C-含有形態が存在する任意のアミノ酸が考えられ得ることが理解される。別の１つの非限定例において、ペプチドは、H216O又はH218O中でトリプシンで処理されてもよく、これは前記ペプチドのCOOH-末端への２つの酸素(それぞれ16O又は18O)の組込みを導く(例えば、US 2006/105415)。
【００８２】
したがって、検出可能な標識を任意に含んでなるクイエシンQ6及び本明細書中に教示される単離されたクイエシンQ6フラグメントの、クイエシンQ6の定性的又は定量的検出アッセイ(測定方法)における、特に本明細書中に教示される対象者におけるAHFを予知、診断及び/又は予後予測する方法における(陽性)コントロール、標準又はキャリブレータとしての使用もまた企図される。タンパク質、ポリペプチド又はペプチドは、任意の形態で、とりわけ沈殿物、真空乾燥物、凍結乾燥物として、液状若しくは凍結物として溶液で、又は固相上、例えば固相クロマトグラフィーマトリクス若しくはガラス若しくはプラスチック若しくは他の適切な表面上に共有結合的若しくは非共有結合的に固定されて(例えば、ペプチドのアレイ及びマイクロアレイの一部として)供給され得る。ペプチドは容易に調製され得、例えば、天然の供給源から単離されてもよいし、組換え的又は合成的に製造されてもよい。
【００８３】
本明細書中に教示される単離されたクイエシンQ6フラグメントの任意の１以上に特異的に結合し得る結合性物質もまた提供される。更に、本明細書中に教示される単離されたクイエシンQ6フラグメントの１つのみに特異的に結合し得る結合性物質も提供される。このような結合性物質としては、とりわけ、抗体、アプタマー、ホトアプタマー、タンパク質、ペプチド、ペプチド類似体又は小分子を挙げることができる。
本明細書を通じて使用される用語「特異的に結合する」は、物質(本明細書中で「特異的-結合性物質」とも指称される)が、他のランダムな分子若しくは無関係な分子を実質的に排除して、任意に構造的に関連する他の分子をも実質的に排除して、１以上の所望の分子又は分析物に、例えば１以上の興味対象のタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド又はそのフラグメントに結合することを意味する。
【００８４】
用語「特異的に結合する」は、物質がその意図する標的に排他的に結合することを必ずしも要求しない。例えば、物質は、結合条件下での当該意図する標的についての親和性が、非標的分子についての親和性より少なくとも約２倍大きい、好ましくは少なくとも約５倍大きい、より好ましくは少なくとも約10倍大きい、尚より好ましくは少なくとも約25倍大きい、更により好ましくは少なくとも約50倍大きい、尚更により好ましくは少なくとも約100倍又はそれ以上に大きい場合に、興味対象のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド及び/又はそのフラグメントに特異的に結合するといってもよい。
好ましくは、物質は、意図する標的に、KA ≧ １×106 M-1、より好ましくはKA ≧ １×107 M-1、尚より好ましくはKA ≧ １×108 M-1、更により好ましくはKA ≧ １×109 M-1、尚更により好ましくはKA ≧ １×1010 M-1又はKA ≧ １×1011 M-1(ここで、KA = [SBA_T]/[SBA][T]、SBAは特異的結合性物質を示し、Tは意図する標的を示す)の結合親和定数(KA)で結合し得る。KAの決定は、当該分野で公知の方法により、例えば、平衡透析及びScatchardプロット分析を用いて行うことができる。
【００８５】
本明細書を通じて使用する特異的-結合性物質は、とりわけ、抗体、アプタマー、ホトアプタマー、タンパク質、ペプチド、ペプチド類似体又は小分子を含み得る。
本明細書中で使用する場合、用語「抗体」はその最も広義の意味で使用され、一般には任意の免疫学的結合性物質をいう。この用語は、具体的には、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多価(例えば、二価、三価又はそれ以上の価)及び/又は多特異性抗体(例えば、二特異性又はそれ以上の特異性の抗体)、並びに所望の生物学的活性(特に、興味対象の抗原に特異的に結合する能力)を示す限りにおいて抗体フラグメント及びそのようなフラグメントの多価及び/又は多特異性複合物を包含する。用語「抗体」は、免疫化を含んでなる方法により生成される抗体を含むのみならず、興味対象の抗原上のエピトープに特異的に結合し得る少なくとも１つの相補性決定領域(CDR)を含んで作製される任意のポリペプチド、例えば組換え発現ポリペプチドもまた含む。よって、この用語は、インビトロで作製されるかインビボで産生されるかに関わらず、前記のような分子に適用される。
【００８６】
１つの実施形態において、抗体は、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMクラスのいずれかであり得、好ましくはIgGクラス抗体であり得る。
１つの実施形態において、抗体は、ポリクローナル抗体、例えば抗血清又はそれから精製された(例えばアフィニティー精製された)免疫グロブリンであり得る。
別の１つの好適な実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体の混合物であり得る。モノクローナル抗体は、特定の抗原又は抗原内の特定のエピトープをより高い選択性及び再現性で標的することができる。
例として、モノクローナル抗体は、Kohlerら，1975 (Nature 256: 495)により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製してもよく、組換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号のような)により作製してもよいが、これらに限定されない。モノクローナル抗体はまた、ファージ抗体ライブラリから、例えばClacksonら，1991(Nature 352: 624-628)及びMarksら，1991 (J Mol Biol 222: 581-597)により記載される技術を用いて単離されてもよい。
【００８７】
更なる実施形態において、抗体結合性物質は抗体フラグメントであり得る。「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の、抗原-結合性領域又は可変領域を含んでなる部分を含んでなる。抗体フラグメントの例としては、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv及びscFvフラグメント；ダイアボディ；リニア抗体；単鎖抗体分子；及び抗体フラグメントから形成された多価及び/又は多特異性抗体、例えばダイボディ、トリボディ及びマルチボディが挙げられる。上記呼称Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFvなどは、当該分野において確立された意味を有するものとする。
用語 抗体 は、任意の動物種、好ましくは脊椎動物種(例えば、トリ及び哺乳動物を含む)を起源とする抗体又は該動物種に由来する１以上の部分を含んでなる抗体を包含する。限定されないが、抗体はニワトリ、シチメンチョウ、ガン若しくはガチョウ、アヒル若しくはカモ、ホロホロ鳥、ウズラ又はキジであり得る。限定されないが、抗体はまた、ヒト、ネズミ(例えば、マウス、ラットなど)、ロバ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ラクダ(例えば、Camelus bactrianus及びCamelus dromaderius)、ラマ(例えば、Lama paccos、Lama glama又はLama vicugna)又はウマであり得る。
【００８８】
当業者は、抗体が１以上のアミノ酸の欠失、付加及び/又は置換(例えば、保存的置換)を、その変更がそれぞれの抗原の結合を保存する限り、含み得ることを理解する。抗体はまた、その構成要素たるアミノ酸残基の１以上の天然又は人工的改変(例えば、グリコシル化など)を含み得る。
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体並びにそれらのフラグメントの製造方法は当該分野で周知であり、組換え抗体又はそのフラグメントの製造方法も同様である(例えば、Harlow及びLane，「Antibodies: A Laboratory Manual」，Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1988；Harlow及びLane，「Using Antibodies: A Laboratory Manual」, Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1999, ISBN 0879695447；「Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques」，Zola編, CRC Press 1987, ISBN 0849364760；「Monoclonal Antibodies: A Practical Approach」，Dean & Shepherd編, Oxford University Press 2000, ISBN 0199637229；Methods in Molecular Biology, vol. 248: 「Antibody Engineering: Methods and Protocols」, Lo編, humana Press 2004, ISBN 1588290921を参照)。
【００８９】
用語「アプタマー」とは、標的分子(例えば、ペプチド)に特異的に結合することができる、一本鎖又は二本鎖のオリゴ-DNA、オリゴ-RNA又はオリゴ-DNA/RNA或いはそれらの任意のアナログをいう。有利には、アプタマーは、その標的に関して、かなり高い特異性及び親和性を提示することができる(例えば、１×109 M-1オーダーのKA)。アプタマーの作製は、とりわけ、米国特許第5,270,163号；Ellington & Szostak 1990 (Nature 346: 818-822)；Tuerk & Gold 1990 (Science 249: 505-510)；又は「The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and Their Applications」，Klussmann編, Wiley-VCH 2006, ISBN 3527310592(参照により本明細書中に組み込む)に記載されている。用語「ホトアプタマー」とは、標的分子と共有結合又は架橋することができる１以上の光反応性官能基を含有するアプタマーをいう。用語「ペプチド類似体」とは、対応するペプチドのトポロジーアナログ(topological analogue)である非-ペプチド物質をいう。ペプチドのペプチド類似体を合理的に設計する方法は、当該分野で公知である。例えば、硫酸化８-マーペプチドCCK26-33に基づく３つのペプチド類似体及び11-マーペプチドであるサブスタンスＰに基づく２つのペプチド類似体の合理的設計並びに関連するペプチド類似体の設計原理は、Horwell 1995 (Trends Biotechnol 13: 132-134)に記載されている。
【００９０】
用語「小分子」とは、医薬に一般的に使用される有機分子に匹敵するサイズを有する化合物、好ましくは有機化合物をいう。この用語は、生物学的巨大分子(例えば、タンパク質、核酸など)を包含しない。好適な小有機分子は、サイズが約5000Daまで、例えば、約4000Daまで、好ましくは3000Daまで、より好ましくは2000Daまで、更により好ましくは約1000Daまで、例えば、約900、800、700、600まで又は約500Daまでの範囲である。
(任意に提示キャリアに付着されていてもよい)本明細書中に教示されるクイエシンQ6フラグメントを用いて(すなわち、免疫抗原として用いて)、動物、例えば非-ヒト動物(例えば、実験動物又は家禽)を免疫する方法も提供される。免疫及び免疫血清からの抗体試剤の調製は、それ自体周知であり、本明細書の他の箇所で言及した文献に記載されている。免疫する動物には、任意の動物種、好ましくは温血種、より好ましくは脊椎動物種(例えば、トリ及び哺乳動物を含む)が包含され得る。限定されないが、抗体はニワトリ、シチメンチョウ、ガン若しくはガチョウ、アヒル若しくはカモ、ホロホロ鳥、ウズラ又はキジであり得る。限定されないが、抗体はまた、ヒト、ネズミ(例えば、マウス、ラットなど)、ロバ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ラクダ、ラマ又はウマであり得る。
【００９１】
用語「提示キャリア」又は「キャリア」は、一般に、第２の分子に結合されると、通常は追加のＴ細胞エピトープの提示を通じて、該第２の分子に対する免疫応答を増強する免疫原性分子を指称する。提示キャリアは、(ポリ)ペプチド性構造であってもよいし、非-ペプチド性構造、例えば、とりわけグリカン、ポリエチレングリコール、ペプチド模擬体、合成ポリマーなどであってもよい。例示の非限定的キャリアには、ヒトＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質、多重C3dドメイン、破傷風毒素フラグメントＣ又は酵母Ty粒子が含まれる。
本明細書中で教示した免疫により取得されたか又は取得され得る免疫血清は、本明細書中に開示されたクイエシンQ6フラグメントの１以上に特異的に結合する抗体試剤を生じさせるに特に有用であり得る。
本発明はまた、(ａ)本明細書中で教示される１以上のクイエシンQ6フラグメントに結合するが、(ｂ)クイエシンQ6及び/又は他のフラグメントには実質的に結合しない、特異的結合性物質を選択する方法を教示する。好都合には、この方法は、(ｂ)の下で、所望でないクイエシンQ6分子と交差反応又は交差結合する結合性物質を抜き取るか又は除去することに基づき得る。このような抜き取りは、種々の親和性分離法(例えば、アフィニティークロマトグラフィー、親和性固相抽出、親和性磁性抽出など)によって、当該分野で公知のように容易に実施し得る。
【００９２】
クイエシンQ6及び/又はそのフラグメント並びに任意にAHFに有用な１以上のバイオマーカーのサンプル中の有無(例えば、読取値が存在 対 存在しない；又は検出可能な量 対 検出不可能な量)及び/又は量(例えば、読取値は絶対的又は相対的量、例えば、絶対又は相対濃度)を測定するために、任意の既存、利用可能又は従来の分離法、検出法及び定量法を本明細書中で使用することができる(サンプル中でこのように測定されるべき任意の興味対象の分子又は分析物(クイエシンQ6及びそのフラグメントを含む)を、下記で、まとめて、バイオマーカーと呼ぶこともある)。
例えば、このような方法には、イムノアッセイ法、質量分析法若しくはクロマトグラフィー法又はそれらの組合せが含まれ得る。
用語「イムノアッセイ」とは、一般に、例えばサンプル中の１以上の興味対象の分子又は分析物を検出するための公知の方法をいう。ここで、興味対象の分子又は分析物に関するイムノアッセイの特異性は、特異的結合性物質(一般には抗体)と興味対象の分子又は分析物との間の特異的結合により与えられる。
イムノアッセイ技術には、直接ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、間接ELISA、サンドウィッチELISA、競合ELISA、マルチプレックスELISA、ラジオイムノアッセイ(RIA)、ELISPOT技術及び当該分野で公知の他の類似技術が含まれるが、これらに限定されない。これらイムノアッセイ法の原理は、当該分野で公知である(例えばJohn R. Crowther，「The ELISA Guidebook」，第１版，Humana Press 2000, ISBN 0896037282)。
【００９３】
更なる説明として、直接ELISAは、サンプル中の標的抗原に結合しそれにより該標的抗原を定量化する、マイクロウェルプレートのような固体支持体に固定化された標識一次抗体を利用するが、これに限定されない。間接ELISAは、標的抗原に結合する非標識一次抗体、及び抗原に結合した一次抗体を認識し、該抗体を定量化を可能にする二次標識抗体を使用する。サンドウィッチELISAでは、標的抗原は、抗原内の１つの抗原性部位に結合する固定化「捕捉」抗体を用いてサンプルから捕捉され、こうして捕捉された抗原が、非結合分析物の除去後に、前記抗原内の別の抗原性部位に結合する「検出」抗体を用いて検出される。ここで、検出抗体は、上記のように、直接標識されていてもよいし、間接的に検出可能であってもよい。競合ELISAは、一次抗体又は標的抗原のいずれかであり得る標識「競合物質」を使用する。一例では、固定された非標識一次抗体をサンプルとインキュベートし、この反応を平衡に到達させた後、標識標的抗原を加える。後者は、結合部位がサンプルの非標識標的抗原によって未だ占められていない限り、一次抗体に結合する。よって、結合した標識抗原の検出量は、サンプル中の非標識抗原の量と逆相関する。マルチプレックスELISAは、単一区画(例えば、マイクロプレートウェル)内で、通常、複数のアレイアドレスで、２以上の分析物の同時検出を可能にする(更なるガイダンスについては、例えば、Nielsen & Geierstanger 2004. J Immunol Methods 290: 107-20及びLingら，2007. Expert Rev Mol Diagn 7: 87-98を参照)。理解されるように、ELISA技術における標識は、通常、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ)の接合により、エンドポイントは、代表的には、比色、化学発光又は蛍光である。
【００９４】
ラジオイムノアッセイ(RIA)は競合-ベースの技術であり、既知量の放射活性標識(例えば、125I-又は131I-標識)標的抗原、前記抗原に対する抗体との混合、次いでサンプル由来の非標識又は「非放射性(cold)」抗原の添加、及び置き換わった標識抗原の量の測定を含む(ガイダンスのために、例えば「An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques」，Chard T編, Elsevier Science 1995, ISBN 0444821198を参照)。
更に、質量分析法がバイオマーカーの測定に適切である。
一般に、ペプチドの質量、好ましくは断片化及び/又は選択したペプチドの(部分的)アミノ酸配列に関する正確な情報を取得することができる任意の質量分析(MS)技術(例えば、タンデム質量分析ではMS/MS；ポストソース分解ではTOF MS)が本明細書中で有用である。適切なペプチドMS及びMS/MS技術及びシステムは、それ自体周知であり(例えば、Methods in Molecular Biology, vol. 146: 「Mass Spectrometry of Proteins and Peptides」，Chapman編, Humana Press 2000, ISBN 089603609x；Biemann 1990. Methods Enzymol 193: 455-79；又はMethods in Enzymology, vol. 402: 「Biological Mass Spectrometry」，Burlingame編, Academic Press 2005, ISBN 9780121828073を参照)、本明細書中で使用し得る。
【００９５】
バイオマーカーペプチド分析に適切なMSアレンジメント、装置及びシステムとしては、限定されないが、マトリクス-支援レーザ脱離/イオン化飛行時間型(MALDI-TOF) MS；MALDI-TOFポストソース分解(PSD)；MALDI-TOF/TOF；表面増強レーザ脱離/イオン化飛行時間型質量分析(SELDI-TOF) MS；エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)；ESI-MS/MS；ESI-MS/(MS)n (ｎは０より大きい整数)；ESI 3D又はリニア(2D)イオントラップMS；ESIトリプル四重極MS；ESI四重極直交TOF (Q-TOF)；ESIフーリエ変換MSシステム；シリコン上での脱離/イオン化(desorption/ionization on silicon；DIOS)；二次イオン質量分析(SIMS)；大気圧化学イオン化質量分析(APCI-MS)；APCI-MS/MS；APCI-(MS)n；大気圧光イオン化質量分析(APPI-MS)；APPI-MS/MS；及びAPPI-(MS)nが挙げられ得る。タンデムMS (MS/MS)アレンジメントでのペプチドイオン断片化は、例えば衝突誘起脱離(CID)のような当該分野において確立された様式を用いて達成され得る。
１つの実施形態において、質量分析によるバイオマーカーの検出及び定量には、多重反応モニタリング(MRM)、例えば、とりわけKuhnら，2004 (Proteomics 4: 1175-86)により記載されたものが含まれ得る。
１つの実施形態において、MSペプチド分析法は、有利には、例えば下記に記載されるクロマトグラフィー法その他の方法のような、上流のペプチド又はタンパク質の分離法又は断片化法と組み合わされ得る。
【００９６】
クロマトグラフィーもまた、バイオマーカーの測定に使用することができる。本明細書中で使用する場合、用語「クロマトグラフィー」は、当該分野においてそう呼ばれ、広範に利用可能である、化学物質を分離するための方法を包含する。好適なアプローチにおいて、クロマトグラフィーとは、液体又は気体の移動している流れ(「移動相」)により運ばれる化学物質(分析物)の混合物が、静止した液相又は固相(「固定相」)の周囲又は上部を流れるにつれ、該分析物が前記移動相と前記固定相との間で分別分布(differential distribution)する結果、成分に分離されるプロセスをいう。固定相は、通常、微粉化固体、フィルター材料のシート、固体表面上の液体の薄膜などであり得る。クロマトグラフィーはまた、例えば、アミノ酸、タンパク質、タンパク質のフラグメント又はペプチドなどのような、生物起源の化学化合物の分離に広く適用可能である。
本明細書中で使用するクロマトグラフィーは、好ましくはカラムクロマトグラフィー(すなわち、固定相がカラム中に堆積又は詰められている)、好ましくは液体クロマトグラフィー、より好ましくはHPLCであり得る。クロマトグラフィーの詳細は当該分野で周知であるが、更なるガイダンスのためには、例えばMeyer M., 1998, ISBN: 047198373X及び「Practical HPLC Methodology and Applications」, Bidlingmeyer, B. A., John Wiley & Sons Inc., 1993を参照。
【００９７】
例示のクロマトグラフィータイプとしては、限定されないが、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、順相HPLC (NP-HPLC)、逆相HPLC (RP-HPLC)、イオン交換クロマトグラフィー(IEC)、例えばカチオン又はアニオン交換クロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー(HILIC)、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)(ゲル濾過クロマトグラフィー又はゲル透過クロマトグラフィーを含む)、等電点電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、例えばイムノ-アフィニティー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーなどが挙げられる。
１つの実施形態において、クロマトグラフィー(一次元、二次元又は三次元クロマトグラフィーを含む)は、更なるペプチド分析法、例えば本明細書中の他の箇所に記載されるような下流の質量分析との組合せで、ペプチド断片化法として使用し得る。
本開示においてバイオマーカーの測定のために、上記の分析方法のいずれかと任意に組み合せて、更なるペプチド又はポリペプチドの分離法、同定法又は定量法を使用し得る。このような方法としては、限定されないが、化学抽出分配、等電点電気泳動(IEF)(キャピラリ等電点電気泳動(CIEF)、キャピラリ等速電気泳動(CITP)、キャピラリ通電クロマトグラフィー(CEC)などを含む)、一次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(2D-PAGE)、キャピラリゲル電気泳動(CGE)、キャピラリゾーン電気泳動(CZE)、ミセル動電クロマトグラフィー(MEKC)、フリーフロー電気泳動(FFE)などが挙げられる。
【００９８】
本明細書中で教示される種々の観点及び実施形態は、サンプル中で測定されたクイエシンQ6量とクイエシンQ6量の参照値との比較に更に基づき得る。ここで、前記参照値は既知のAHF予知、診断及び/又は予後を表す。
例えば、別の参照値は、AHFを有するリスク(例えば、異常に上昇したリスク)の予知 対 AHFを有するリスク無し又は通常のリスクの予知を表し得る。別の１つの例では、別の参照値は、AHFを有する異なる程度のリスクの予知を表し得る。
更なる１つの例では、別の参照値は、AHFの診断 対 AHF無しの診断(例えば、健常、CHF又はAHFからの回復の診断など)を表すことがある。別の１つの例では、別の参照値は、種々の重篤度のAHFの診断を表し得る。
更に別の１つの例では、別の参照値は、AHFについての良好な予後 対 AHFについての不良な予後を表し得る。更なる１つの例では、別の参照値は、AHFについて様々に(varyingly)好ましい又は好ましくない予後を表し得る。
【００９９】
このような比較には、一般に、比較する値又はプロフィール間の少なくとも１つの差異の有無及び任意に該差異のサイズを決定する任意の手段が含まれ得る。比較には、測定値の目視検査、算術又は統計学的比較が含まれ得る。このような統計学的比較には、ルールの適用が含まれるがこれに限定されない。値又はバイオマーカープロフィールが少なくとも１つの標準を含むとき、当該値又はバイオマーカープロフィール中の差異を決定するための比較は、バイオマーカーの測定値が内部標準の測定値に関連付けられるように、これら標準の測定値を含み得る。
クイエシンQ6量についての参照値は、他のバイオマーカーについて以前に使用された公知の手順に従って確立され得る。
例えば、特定のAHF予知、診断及び/又は予後についてのクイエシンQ6量の参照値は、前記特定のAHF予知、診断及び/又は予後により特徴付けられる(すなわち、前記AHFの予知、診断及び/又は予後が当てはまる)一個体又は個体集団からのサンプル中のクイエシンQ6量を決定することによって確立され得る。このような集団は、限定されないが、≧２、≧10、≧100、又は数百以上でさえある個体を含んでなり得る。
【０１００】
よって、例示として、AHFの診断 対 AHF無しの診断についてのクイエシンQ6量の参照値は、それぞれAHFを有していると又はAHFを有していないと(例えば、臨床的徴候及び症状、イメージング、ECGなどのような他の適切な確定的手段に基づいて)診断された一個体又は個体集団からのサンプル中のクイエシンQ6量を決定することによって確立され得る。
１つの実施形態において、本明細書中で意図されるような参照値は、クイエシンQ6の絶対量を知らせ得る。別の実施形態において、検査した対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量は、(例えば、増減又は何倍増減に関して)参照値と直接比較して決定され得る。有利には、このことにより、クイエシンQ6のそれぞれの絶対量を先ず決定する必要なく、対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量と参照値との比較(換言すれば、参照値に関する、対象者からのサンプル中のクイエシンQ6の相対的量の測定)が可能になり得る。
心不全又は他の心血管障害を有する患者において、バイオマーカーは、しばしば、臨床状態を追跡するために使用される。例えば、BNP又はNT-プロBNPレベルは、New York Heart Association Class (NYHAC)の症状分類体系に従う。症状の障害が大きいほど、同一群内の患者の平均BNPレベルは高い。しかし、クラス対応範囲は、広範な基礎原因疾患に順応するために非常に大きい。
【０１０１】
臨床状態に関連付けられる個体内(すなわち同一患者中)のバイオマーカー範囲及びその有意な変化は、NYHACのような交差集団範囲より、密接で正確な範囲である可能性が高い。したがって、個体内バイオマーカー変化はより感度の高いシグナルであり、臨床状態に関連付けるための異なる範囲又は変化を必要とする。患者は、更に、治療的介入又は臨床状態の良好化に起因して、バイオマーカーレベルの低下を示し得る。バイオマーカーレベルは、元の安定な患者レベルに復帰し得る。
マーカーは、症状(の出現、悪化又は改善)の変化無しに顕著に変動、増加又は減少し得る。そのような事象において、マーカー変化は、症状の変化に先行し、症状変化より高感度の尺度になる。治療的介入をより早く開始することができ、症状の悪化を待っているより効果的であり得る。症状は、(限定されないが)：息切れ、下肢の浮腫、心悸亢進、疲労などであり得る。より良性の病状での早期介入は自宅で安全に実施され得る。このことは、緊急治療室での重度に悪化した患者の治療からの大幅な改善である。
【０１０２】
よって、種々の時点で同じ患者のクイエシンQ6レベルを測定することにより、該患者の状態の連続モニタリングが可能になり、患者のAHFに関する病状の悪化又は改善の予知が導かれ得る。下記に示されるような自宅検査又はデバイスは、この連続モニタリングに使用することができる。ここで、前記参照値又は範囲は、事前に又はモニタリングプロセスの間に或る期間にわたって決定することができ、該患者に存在するクイエシンQ6のベースライン値又は範囲をもたらす。クイエシンQ6レベルの前記参照値からの突然の逸脱は、(例えば自宅での)患者の病状の悪化を予知することができ、患者は、直ぐに、すなわち(しばしば重篤な)症状を現実に感じるか又は観察する前に、医師又は救急サービスに連絡することができる。
したがって、本発明はまた、或る患者におけるクイエシンQ6マーカーレベルの有意な変化(臨床状態の変化(悪化又は改善)を示す)を決定する方法又はアルゴリズムを提供する。
１つの実施形態において、本方法は、そのような参照値を確立する工程を含み得る。１つの実施形態において、本キット及びデバイスは、特定のAHF予知、診断及び/又は予後についてのクイエシンQ6量の参照値を確立する手段を含み得る。この手段は、例えば、前記特定のAHF予知、診断及び/又は予後により特徴付けられる１以上の個体からの１以上のサンプル(例えば、別個の又はプールしたサンプル)を含んでなり得る。
【０１０３】
本明細書中で教示される種々の観点及び実施形態は、更に、対象者からのサンプル中で測定されるクイエシンQ6量と所定の参照値との間の逸脱又は逸脱無しの発見を必要とする。
第１の値の第２の値からの「逸脱(又は、ズレ；deviation)」は、一般に、いずれの方向(例えば、増加：第１の値＞第２の値；又は減少：第１の値＜第２の値)も、いずれの程度の変化も包含し得る。
例えば、逸脱は、限定されないが、比較がなされる第２の値に対し、第１の値の少なくとも約10％(約0.9倍以下)又は少なくとも約20％(約0.8倍以下)又は少なくとも約30％(約0.7倍以下)又は少なくとも約40％(約0.6倍以下)又は少なくとも約50％(約0.5倍以下)又は少なくとも約60％(約0.4倍以下)又は少なくとも約70％(約0.3倍以下)又は少なくとも約80％(約0.2倍以下)又は少なくとも約90％(約0.1倍以下)の減少を包含し得る。
例えば、逸脱は、限定されないが、比較がなされる第２の値に対し、第１の値の少なくとも約10％(約1.1倍以上)又は少なくとも約20％(約1.2倍以上)又は少なくとも約30％(約1.3倍以上)又は少なくとも約40％(約1.4倍以上)又は少なくとも約50％(約1.5倍以上)又は少なくとも約60％(約1.6倍以上)又は少なくとも約70％(約1.7倍以上)又は少なくとも約80％(約1.8倍以上)又は少なくとも約90％(約1.9倍以上)又は少なくとも約100％(約２倍以上)又は少なくとも約150％(約2.5倍以上)又は少なくとも約200％(約３倍以上)又は少なくとも約500％(約６倍以上)又は少なくとも約700％(約８倍以上)などの増加を包含し得る。
【０１０４】
好ましくは、逸脱とは、統計学的に有意な観察された変化をいい得る。例えば、逸脱とは、所定集団において参照値の許容誤差範囲外(例えば、標準偏差若しくは標準誤差、或いはそれらの所定倍、例えば≧１×SD若しくは≧２×SD又は≧１×SE若しくは≧２×SEで表される)の観察された変化をいい得る。逸脱とはまた、所定集団において値により規定される参照範囲外(例えば、前記集団における値の≧40％、≧50％、≧60％、≧70％、≧75％若しくは≧80％若しくは≧85％若しくは≧90％若しくは≧95％又は≧100％さえを含んでなる範囲の外)の値をいい得る。
１つの更なる実施形態において、観察された変化が所定の閾値又はカットオフを超える場合、逸脱と結論付けられる。このような閾値又はカットオフは、予知、診断及び/又は予後の方法の選択された感度及び/又は特異性、例えば、少なくとも50％又は少なくとも60％又は少なくとも70％又は少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％の感度及び/又は特異性を提供するように、当該分野で周知のように選択し得る。
【０１０５】
例えば、１つの実施形態において、AHF無しの予知若しくは診断を表すか又はAHFについての良好な予後を表す参照値と比較しての対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量の上昇−好ましくは少なくとも約1.1倍上昇又は少なくとも約1.2倍上昇、より好ましくは少なくとも約1.3倍上昇、更により好ましくは少なくとも約1.4倍上昇、なおより好ましくは少なくとも約1.5倍上昇、例えば約1.1倍〜３倍の上昇又は約1.5倍〜２倍の上昇−は、対象者がAHFを有しているか若しくはAHFを有するリスクにあることを示すか、又は対象者におけるAHFについての不良な予後を示す。
対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量と或るAHF予知、診断及び/又は予後を表す参照値との間に逸脱を発見したとき、該逸脱は、対象者におけるAHFの予知、診断及び/又は予後が該参照値によって表されるものとは異なるとの結論を示すか又は該結論に帰され得る。
対象者からのサンプル中のクイエシンQ6量と或るAHF予知、診断及び/又は予後を表す参照値との間に逸脱を発見しないとき、該逸脱が無いことは、対象者におけるAHFの予知、診断及び/又は予後が該参照値によって表されるものと実質的に同じであるという結論を示すか又は該結論に帰され得る。
【０１０６】
上記の考察は、バイオマーカープロフィールに同様に適用される。
２以上の異なるバイオマーカーが対象者において決定されるとき、それぞれの有無及び/又は量は、バイオマーカープロフィールとして共に表され得る。測定された各バイオマーカーについての値は、該プロフィールの一部をなす。本明細書中で使用する場合、用語「プロフィール」は、興味対象の病状に、例えば特定のAHF予知、診断及び/又は予後に関連する独特な特徴又は特性を表す任意のデータ組を含む。この用語は、一般に、とりわけ核酸プロフィール、例えば遺伝子型プロフィール(興味対象の病状と関連する１以上の遺伝子の遺伝子型を表す遺伝子型データ組)、遺伝子コピー数プロフィール(興味対象の病状に関連する１以上の遺伝子の増幅又は欠失を表す遺伝子コピー数データ組)、遺伝子発現プロフィール(興味対象の病状に関連する１以上の遺伝子のmRNAレベルを表す遺伝子発現データ組)、DNAメチル化プロフィール(興味対象の病状に関連する１以上の遺伝子のDNAメチル化レベルを表すメチル化データ組)、並びにタンパク質、ポリペプチド又はペプチドプロフィール、例えばタンパク質発現プロフィール(興味対象の病状と関連する１以上のタンパク質のレベルを表すタンパク質発現データ組)、タンパク質活性化プロフィール(興味対象の病状と関連する１以上のタンパク質の活性化又は不活化を表すデータ組)、タンパク質修飾プロフィール(興味対象の病状と関連する１以上のタンパク質の修飾を表すデータ組)、タンパク質切断プロフィール(興味対象の病状と関連する１以上のタンパク質のタンパク質分解性切断を表すデータ組)、並びにこれらの任意の組合せを包含する。
【０１０７】
バイオマーカープロフィールは、多くの方法で作成され得、比のような方法又は他のより複雑な関連付け方法若しくはアルゴリズム(例えば、ルール-ベースの方法)を用いて測定可能なバイオマーカー又はバイオマーカーの観点の組合せであり得る。バイオマーカープロフィールは、少なくとも２つの測定値を含んでなる。ここで、測定値は、同じ又は異なるバイオマーカーに対応させることができる。バイオマーカープロフィールはまた、少なくとも３、４、５、10、20、30又はそれより多い測定値を含んでなり得る。１つの実施形態において、バイオマーカープロフィールは、数百又は数千さえの測定値を含んでなる。
よって、例えば、独特な参照プロフィールは、AHFを有するリスク(例えば、異常に上昇したリスク)の予知 対 AHFを有する通常のリスク又はリスク無しの予知を表し得る。別の１つの例では、独特な参照プロフィールは、AHFを有するリスクの種々の程度の予知を表し得る。
更なる１つの例では、独特な参照プロフィールは、AHFの診断 対 AHF無しの診断(例えば、健常、CHF又はAHFからの回復などの診断)を表すことができる。別の１つの例では、独特な参照プロフィールは、種々の重症度のAHFの診断を表し得る。
更に別の例では、独特な参照プロフィールは、AHFについての良好な予後 対 AHFについての不良な予後を表し得る。更なる１つの例では、独特な参照プロフィールは、AHFについての種々の好ましいか又は好ましくない予後を表し得る。
【０１０８】
本明細書中で使用する参照プロフィールは、他のバイオマーカーについて以前に使用された公知の手順に従って確立され得る。
例えば、特定のAHF予知、診断及び/又は予後についてのクイエシンQ6量並びに１以上の他のAHF-関連バイオマーカーの有無及び/又は量の参照プロフィールは、前記特定のAHF予知、診断及び/又は予後によって特徴付けられる(すなわち、前記AHFの予知、診断及び/又は予後が当てはまる)１個体又は個体集団からのサンプル中でプロフィールを決定することにより確立し得る。このような集団は、限定されないが、≧２、≧10、≧100又は数百以上の個体さえ含んでなり得る。
よって、例示として、AHFの診断 対 AHF無しの診断についての参照プロフィールは、それぞれAHFを有していると診断されたか又はAHFを有していないと診断された１個体又は個体集団からのサンプル中でバイオマーカープロフィールを決定することによって確立し得る。
１つの実施形態において、本方法は、そのような参照プロフィールを確立する工程を含み得る。１つの実施形態において、本キット及びデバイスは、特定のAHF予知、診断及び/又は予後についての参照プロフィールを確立する手段を含み得る。このような手段は、例えば、前記特定のAHF予知、診断及び/又は予後によって特徴付けられる１以上の個体からの１以上のサンプル(例えば、別個の又はプールされたサンプル)を含んでなり得る。
【０１０９】
更に、当該分野で公知の多パラメータ分析を、必要な変更を加えて用いて、値の群間の逸脱及びそれから作成されるプロフィールを決定し得る(例えば、サンプルプロフィールと参照バイオマーカープロフィールとの間で)。
サンプルプロフィールと或るAHF予知、診断及び/又は予後を代表する参照プロフィールとの間に逸脱を発見すると、該逸脱は、前記対象者におけるAHFの予知、診断及び/又は予後が参照プロフィールによって代表されるものとは異なるとの結論を示しているか又は該結論に帰され得る。
サンプルプロフィールと或るAHF予知、診断及び/又は予後を代表する参照プロフィールとの間に逸脱を発見しないとき、該逸脱が無いことは、前記対象者におけるAHFの予知、診断及び/又は予後が参照プロフィールによって代表されるものと実質的に同じであるとの結論を示しているか又は該結論に帰され得る。
【０１１０】
本発明は更に、心不全、より具体的には急性心不全の診断用キット又はデバイスを提供する。このキット又はデバイスは、患者サンプル中のクイエシンQ6マーカーのレベルを検出する手段を含んでなる。より好適な実施形態において、本発明のキットは、臨床セッティング又は家庭で使用することができる。本発明によるキットは、急性心不全の診断に、或る薬剤でのAHF罹患対象者の処置の有効性のモニタリングに又は対象者におけるAHFの発症についての該対象者の予防検診に使用することができる。
キット又はデバイスは、臨床セッティングにおいてはベッドサイドデバイスの形態であり得、或いは緊急救命チームのセッティングにおいては、例えば救急車その他の救急救命移動手段の装置若しくはチームの装置の一部として又は応急処置キットの一部としてであり得る。診断キット又はデバイスは、医師、応急救助者(first-aid helper)又は看護士を補助して、観察中の患者が急性心不全を発症しているかどうかを決定することができ、その後適切な行為又は処置を行うことができる。
【０１１１】
家庭用検査キットにより、患者は、医師、応急救助者又は病院の救急部と連絡することができる読取り値を得られ、その後適切に行動することができる。このような家庭用検査デバイスは、心不全の病歴を有するか若しくは心不全に罹患するリスクにある人々(例えば慢性心不全患者)、又は例えば急性心不全、感染、肺疾患、敗血症などにより引き起こされ得る呼吸困難(息切れ)の病歴を有するか若しくは呼吸困難に罹患するリスクにある人々に特に重要である。心不全のリスクが高いか又は呼吸困難の病歴を有する対象者は、確かに、本発明による家庭用検査デバイス又はキットを家庭に有することの恩恵を受け得る。なぜならば、彼らは、急性心不全事象と呼吸困難を引き起こす別の事象とを容易に区別することができ、問題解決のためにとるべき行動を決定する容易な方法をもたらすからである。
【０１１２】
本発明による代表的なキット又はデバイスは以下のエレメント：
ａ)対象者からサンプルを取得する手段
ｂ)前記サンプル中のクイエシンQ6マーカーの量を測定し、前記サンプル中のクイエシンQ6マーカー量が或る閾値レベル又は値を下回っているのか又は上回っているのか(このことが、対象者が急性心不全に罹患しているのか否かを示す)を視覚化する手段又はデバイス
を含んでなる。
本発明の実施形態のいずれかにおいて、キット又はデバイスは、ｃ)人が急性心不全に罹患しているのか否かを示す、医師、病院の救急部又は応急処置所と直接連絡する手段を追加的に含んでなることができる。
用語「閾値レベル又は値」又は「参照値」は、同義語として互換的に使用され、本明細書で定義されるとおりである。この用語はまた、高度に類似する疾患状態を有する個々の患者又は患者群において決定される或る範囲のベースライン(例えば「乾燥重量(dry weight)」)値であり得る。
【０１１３】
本発明の実施形態のいずれかにおいて、本発明のデバイス又はキットは、前記患者のサンプル中の追加の心不全又は急性心不全マーカーのレベルを検出する手段を追加的に含んでなることができる。追加のマーカーは、例えば、BNP若しくはNT-プロ-BNP又はBNP若しくはNT-プロ-BNPのフラグメントであり得る。
本発明のキットにおいて、対象者からサンプルを取得する手段(ａ)は、当該分野で公知の対象者からサンプルを取得する任意の手段であり得る。例えば血液サンプルを取得するための例は当該分野で公知であり、任意の種類の指又は皮膚プリック又はランセットベースのデバイスであり得る。これらは、基本的には、皮膚に穴を開け、皮膚から放出される血液小滴を生じさせる。尿サンプルを使用するとき、対象者からサンプルを取得する手段は、当該分野で公知の家庭用妊娠検査で使用されるもののような吸収ストリップの形態であり得る。同様に、唾液サンプルは、当該分野で公知の綿球(mount swab)を用いて取得し得る。採血デバイス又は他の採取デバイスの例は、例えば、米国特許第4,802,493号、同4,966,159号、同第5,099,857号、同6,095,988号、同5,944,671号、同4,553,541号、同3,760,809号、同5,395,388号、同5,212,879号、同5,630,828号、同5,133,730号、同4,653,513号、同5,368,047号、同5,569,287号、同4,360,016号、同5,413,006号及び米国出願公開2002/1 11565、同2004/0096959、同2005/143713、同2005/137525、同2003/01 53900、同2003/0088191、WO9955232、WO2005/049107、WO2004/060163、WO02/056751、WO02/1 00254、WO2003/022330、WO2004/066822、WO97/46157、WO0l12330、WO2004/039429又はEP0364621、EP0078724、EP1212138、EP0081975又はEP0292928に与えられる。
【０１１４】
本発明のキットにおいて、サンプル中のクイエシンQ6マーカー量を測定する手段又はデバイス(ｂ)は、サンプル中のクイエシンQ6タンパク質の量を特異的に検出することができる任意の手段又はデバイスであることができる。例は、固相、例えば当該分野で周知の側方流動ストリップ又はディップスティックデバイスなどに付着させたクイエシンQ6-特異的結合性分子を含んでなるシステムである。生物医学的アッセイを実施するための１つの非限定的例は、膜の洗浄を必要としない組合せである、検査-ストリップ及び標識抗体を使用することである。検査ストリップは、例えば妊娠検査キット(該キットでは、抗-hCG抗体が支持体上に存在し、hCGと複合体化して、尿のフローにより固定第２抗体上へ運ばれて、視覚化される)の分野で周知である。このような家庭用検査デバイス、システム又はキットの他の非限定的例は、例えば以下のものに見出すことができる：米国特許第6,107,045号、同6,974,706号、同5,108,889号、同6,027,944号、同6,482,156号、同6,511,814号、同5,824,268号、同5,726,010号、同6,001,658号又は米国出願公開2008/0090305又は2003/0109067。
【０１１５】
１つの好適な実施形態において、本発明は側方流動デバイス又はディップスティックを提供する。このようなディプスティックは、ストリップの一方の端部(ここにサンプルが塗布される)から該ストリップの他方の端部(ここで前記サンプル中の分析物の存在を測定する)へのキャピラリーフローによるサンプルの移動を可能にする検査ストリップを含んでなる。
別の１つの実施形態において、本発明は試剤ストリップを含んでなるデバイスを提供する。このような試剤ストリップは、サンプルで湿らせたとき分析物の存在下に色変化を生じ及び/又は前記サンプル中の当該タンパク質の濃度を示す、１以上の検査パッドを含んでなる。
本発明のキットの１つの好適な実施形態において、サンプル(ｂ)中のタンパク質の量を測定する手段又はデバイス(１)は固体支持体(７)であり、該固体支持体は近位端(２)及び遠位端(３)を有し、以下：
−  近位端近傍のサンプル適用ゾーン(４)、
−  サンプル適用ゾーン(４)に対して遠位の反応ゾーン(５)、及び
−  反応ゾーン(５)に対して遠位の検出ゾーン(６)
を含んでなり(これにより、該支持体は、適用ゾーンに適用された流体サンプルの近位端から遠位端への向きのフローを導くキャピラリー特性を有する)、
−  任意に、前記手段又はデバイスは、例えばコンテナ、点滴ピペット又はバイアル中に、粘性サンプルがストリップを通ってより容易に流動することを可能にする流体の供給源も含んでなる。
【０１１６】
反応ゾーン(５)は、検出剤(例えばコロイド金)に接合したクイエシンQ6結合性分子の１以上のバンド(10)を含んでなる。ここで、クイエシンQ6結合性分子接合体は、流体のキャピラリーフローと共に移動することができるように、固体支持体上に配置する(すなわち、固定されていない)。検出ゾーン(６)は、固体支持体に固定されたクイエシンQ6結合性分子の集団を含んでなる１以上の捕捉バンド(11)を含んでなる。
サンプルは、サンプル適用ゾーン(４)に適用されると、キャピラリーフローにより反応ゾーン(５)へ向かって移動する。サンプル中に存在するクイエシンQ6が標識クイエシンQ6結合性分子接合体と反応し、そうして形成された複合体がキャピラリーフローにより検出ゾーン(６)へ運ばれる。検出ゾーン(６)は、その上にクイエシンQ6結合性分子が不可逆的に固定されており、複合体を捕捉し固定化する。これにより、接合体の局所的な濃縮を生じ、視覚化が可能になる。
本明細書に記載されるような２つのゾーン(５及び６)(一方のゾーンは非固定接合体を有し、他方のゾーンは固定された捕捉抗体を有する)は、一般に、重ならない。それらは、バンドの無い固体支持体の介在ギャップ有り又は無しで、隣接して配置され得る。バンドは、固体支持体上に、試剤が固定される必要があるかないかに依存して、任意の手段、例えば吸収、吸着、被覆、共有結合又は乾燥により配置され得る。
【０１１７】
サンプル中のクイエシンQ6タンパク質レベルが或る所定の閾値レベル又は値より高くなるとシグナルのみを生成する半定量検査ストリップを得るためには、固定されていない接合体化クイエシンQ6結合性分子を含んでなる反応ゾーン(５)はまた、所定量の固定されたクイエシンQ6捕捉抗体を含んでなり得る。これにより、サンプル中に存在する或る量(事前に決定した閾値レベル又は値に対応)のクイエシンQ6タンパク質を捕捉して除去することが可能になる。次いで、接合体化又は標識化された結合性分子が結合した残存量のクイエシンQ6タンパク質(あれば)が、検出ゾーン(６)に移動する。この場合、反応ゾーン(６)は、標識化結合性分子-クイエシンQ6複合体を受容するだけであり、サンプル中のクイエシンQ6タンパク質レベルが所定の閾値レベル又は値より高いときにのみ、その後シグナルを生成する。
サンプル中のクイエシンQ6タンパク質の量が或る閾値レベル又は値を下回っているか又は上回っているかを決定する別の可能性は、サンプル中に存在する全てのクイエシンQ6タンパク質を捕捉する一次捕捉抗体を、固相に結合されると或るシグナル又は色を発生する標識二次抗体と組み合せて使用することである。次いで、色又はシグナルの強度は参照の色又はシグナルチャートと比較され得る。シグナル強度が或る閾値シグナルを上回ると、検査は陽性である(すなわちAHFが切迫している)ことを示す。或いは、色又はシグナルの量又は強度は、例えば光吸収センサ又は光照射メータを含んでなる電子デバイスで測定することができる。これにより、生成されたシグナル強度又は色吸収の数値が得られ、その数値は、閾値を下回っていれば陰性結果の形で、閾値を上回っていれば陽性結果の形で対象者に提示され得る。
この実施形態は、患者におけるクイエシンQ6レベルを経時的にモニターするときに該当する。
【０１１８】
参照値又は範囲は、例えば、対象者がAHFを有していない期間に、家庭用デバイスを使用して決定することができる。これにより、患者に、ベースラインのクイエシンQ6レベルが示される。よって、家庭用検査デバイスの定期的使用により、対象者に、ベースラインレベルと比較してのクイエシンQ6レベルの突然の変化を注意喚起することができ、医師への連絡を可能にする。
或いは、参照値は、AHFに罹患している対象者において決定することができる。この参照値は、個人的なクイエシンQ6「リスクレベル」、すなわちAHF事象に曝されているか又は間もなく曝されることを示すクイエシンQ6レベルを示す。このリスクレベルは、疾患進行のモニタリング又は処置効果の評価に関して興味深い。リスクレベルと比較してのクイエシンQ6レベルの減少は、患者が快方に向かっている病状を示す。
【０１１９】
その原理が本発明による家庭用検査デバイスに使用され得る当該分野で公知の半定量検査の非限定的例は、Sanitoetsが販売しているHIV/AIDS検査又は前立腺ガン検査である。家庭用前立腺検査は、全血中４ng/mlより高い血中PSAレベルを検出する初期の半定量検査として意図された迅速検査である。代表的な家庭用自己検査キットは、以下の成分を含んでなる：血液サンプルが適用され、タンパク質レベルが或る閾値レベルを上回るとシグナルを生じる検査デバイス；例えばサンプル適用ゾーンからシグナル検出ゾーンへの分析物(すなわち興味対象のタンパク質)の移行を助ける点滴ピペット中の、或る量の希釈剤、任意に、血液標本採集用の空ピペット、指穿刺デバイス、任意に、穿刺領域を清浄するための滅菌綿棒、及びキットの使用指示書。
類似の検査もまた、例えば乳ガン検出用及び心臓リスクの家庭検査を考慮したCRP-タンパク質レベル検出用に知られている。後者の検査は、検査結果の検査機関への送付を包含し、そこで結果が技術専門家又は医療専門家により解釈される。このような患者病状の電話又はインターネットベースの診断は、当然のことながら、ほとんどのキットで可能であり、推奨される。なぜならば、検査結果の解釈はしばしば、検査の実施より重要であるからである。サンプル中に存在するタンパク質レベルの数値を提供する上記のような電子デバイスを使用するとき、この値は、当然のことながら、電話、携帯電話、衛生電話、電子メール、インターネットその他の通信手段で容易に通信でき、急性心不全に罹患していることを病院、医師又は応急処置チームに警告することができる。このようなシステムの非限定的例は、米国特許第6,482,156号に開示されている。
【０１２０】
下記の説明で、本発明の特定の実施形態を例示する図面への言及がなされる；図面は、限定を意図するものでは全くない。当業者は、当業者の共通の実務に従って、デバイス及び代わりの成分及び特徴を適応させ得る。
図14A及びBは、本発明の検査ストリップの１つの好適な実施形態を示す。ストリップ(１)は近位端(２)及び遠位端(３)を含む。サンプル適用ゾーン(４)は近位端(２)に設けられ、反応ゾーン(５)はそれに隣接し、検出ゾーン(６)は遠位端(３)近傍にある。サンプルは、固体支持体(７)上、適用ゾーン(４)に配置され、毛管作用により検出ゾーン(６)へ移行される。サンプル適用ゾーン(４)の領域を除き固体支持体(７)の片面又は両面を覆う保護層(８)を備えていてもよい。この保護層は、サンプル及びストリップの化学成分を汚染及び蒸発から保護する。固体支持体(７)のサンプル適用ゾーン(４)と毛管接触する１以上の吸収パッド(９)が、必要に応じて、サンプルを吸収及び放出し得る；このパッド(９)は、代表的には、サンプル適用ゾーン(４)と同じか又は反対の固体支持体(７)表面に配置される。図14Bにおいて、吸収パッド(９)はサンプル適用ゾーン(４)の部分である。１以上の他の吸収パッド(9')が、固体支持体(７)の検出ゾーン(６)に毛管接触して、いずれの捕捉バンド(11)、(14)に対しても遠位に配置され得る。これらパッド(9')は、固体支持体を通過した流体を吸収し得る；このパッド(9')は、代表的には、サンプル適用ゾーン(４)と同じか又は反対の固体支持体(７)表面に配置される。固体支持体(７)は、毛管作用特性を有する任意の適切な材料から作製され得、上記のものと同じ特性を有し得る。これは、物質(例えば非固定化クイエシンQ6結合性分子)を支持することもできるべきであり、該物質は、水和したとき、毛管作用による流体フローによって、固体支持体を横切って移動することができる。
【０１２１】
固体支持体(７)はまた、反応ゾーン(５)中、サンプル適用ゾーン(４)に対して遠位に位置するクイエシンQ6結合性分子接合体(10)のバンドを含んでなり得る。サンプル中のクイエシンQ6は、毛管作用によりこのバンド(10)に向かって運ばれ、そこで、クイエシンQ6は不可逆的に固定されたクイエシンQ6結合性分子接合体と反応する。
クイエシンQ6結合性分子接合体には、検出が容易となるように、検出剤が結合又は付着していてもよい。ラボ検出剤の例としては、限定されないが、発光標識；色素のような比色標識；蛍光標識；又は電気活性剤(例えば、フェロシアン化物)のような化学標識；酵素；放射活性標識；又は高周波標識が挙げられる。より一般的には、検出剤は粒子である。本発明の実施に有用な粒子の例としては、限定されないが、コロイド金粒子；コロイドイオウ粒子；コロイドセレン粒子；コロイド硫酸バリウム粒子；コロイド硫酸鉄粒子；ヨウ素酸金属粒子；ハロゲン化銀粒子；シリカ粒子；コロイド金属(含水)酸化物粒子；コロイド硫化金属粒子；コロイドセレン化鉛粒子；コロイドセレン化カドミウム粒子；コロイド金属リン酸塩粒子；コロイド金属フェライト粒子；有機層又は無機層で被覆した上記コロイド粒子のいずれか；タンパク質又はペプチド分子；リポソーム；又はポリスチレンラテックスビーズのような有機ポリマーラテックス粒子が挙げられる。好ましい粒子は、コロイド金粒子である。コロイド金は、G. Frens, 1973 Nature Physical Science, 241:20 (1973)に概説される方法のような任意の従来手段により作られ得る。代替法は、米国特許第5,578,577号、同第5,141,850号；同第4,775,636号；同第4,853,335号；同第4,859,612号；同第5,079,172号；同第5,202,267号；同第5,514,602号；同第5,616,467号；同第5,681,775号に記載され得る。
【０１２２】
固体支持体(７)は、検出ゾーン(６)に１以上の捕捉バンド(11)を更に含んでなる。捕捉バンドは、そこに不可逆的に固定されたクイエシンQ6結合性分子の集団を含んでなる。反応ゾーン(５)で形成されたクイエシンQ6:クイエシンQ6-結合性分子接合体の複合体は、検出ゾーン(６)に向かって移動し、そこで、前記バンド(11)が移動中の複合体を捕捉して濃縮する。こうして、肉眼によるか又は読取り装置を用いるかのいずれかでの視覚化が可能になる。反応ゾーン(５)及び検出ゾーン(６)に存在するクイエシンQ6結合性分子は、クイエシンQ6の同じ部分と反応してもよいし、クイエシンQ6の異なる部分と反応してもよい。
１以上のコントロールバンド(12)が固体支持体(７)上に存在してもよい。例えば、非固定化ペプチド(12)がサンプル適用ゾーン(４)に存在し得る。このペプチドは、クイエシンQ6結合性分子のいずれのバンド(13)及び(14)とも交差反応しない。サンプルを適用すると、該サンプルは反応ゾーン(５)に向かって移動する。そこには、抗-ペプチド抗体接合体が配置されており(13)、ペプチド-抗体複合体が形成される。該複合体は、検出ゾーン(６)に向かって移動し、そこには抗-ペプチド抗体の捕捉バンド(14)が固体支持体上に固定されており、これが該複合体を濃縮して視覚化を可能にする。コントロール捕捉バンド(14)は、クイエシンQ6捕捉バンド(11)とは別個に位置し、したがって、陽性反応は、アッセイが正しく機能したときに、検出反応とは別個に観察することができる。
【０１２３】
本発明によるコントロールの特定の利点は、それが内部コントロールであること−すなわち、クイエシンQ6測定結果と比較し得るコントロールが、個々の固体支持体上に存在することである。したがって、本発明によるコントロールは、例えば、固体支持体における可変性を補正するために使用され得る。このような補正は、例えば支持体の統計学的サンプリングに基づく外部コントロールでは実行不可能であろう。加えて、ロット毎、試行毎(run-to-run)の異なる支持体間の変動が、本発明によるコントロール結合性物質及びコントロール物質の使用によって最小化され得る。更に、非特異結合の影響が低減し得る。これら補正は全て、外部の、支持体上にないコントロールでは実施することが困難である。
アッセイの間、サンプルからのクイエシンQ6とクイエシンQ6結合性分子接合体とは、固体支持体(７)上で結合して濃縮する。この結合により、固体支持体(７)の背景色を超えて視覚化され得る化合物の濃縮が生じる。化合物は、反応及び検出ゾーンに結合した抗体、検出剤、その他の粒子を含む上記化合物の組合せから形成され得る。実施される特定のアッセイに基づいて、反応及び検出ゾーンは、線形又は非線形であり得る適切なダイナミックレンジを達成するように選択して提供され得る。
【０１２４】
アッセイを実施するための固体支持体(７)は、例えば図15に示すようなカートリッジ(20)内に収容され得る。カートリッジは、１以上の開口部を除き、好ましくは尿に対して防水性である。固体支持体(７)は、カートリッジの開口部(21)で曝されており、近位端(２)の適用ゾーン(４)を提供し、別の開口部(22)で曝されて、遠位端(３)近くの検出ゾーン(６)の読取りが可能である。カートリッジ(20)は、読取りデバイスとの通信用のセンサコード(23)を含み得る。
サンプル中のクイエシンQ6の存在及び/又は濃度は、クイエシンQ6結合性分子が固定されているチップを使用する表面プラズモン共鳴(SPR)、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)、生物発光共鳴エネルギー転移(BRET)、蛍光消光、蛍光偏光測定又は当該分野で公知のその他の手段により測定することができる。記載された結合アッセイのいずれも、サンプル中のクイエシンQ6の存在及び/又は濃度を決定するために使用することができる。そうするために、使用する結合アッセイに適切に、クイエシンQ6結合性分子をサンプルと反応させ、クイエシンQ6濃度を測定する。アッセイを検証及び較正するため、種々の濃度の標準クイエシンQ6及び/又はクイエシンQ6結合性分子を使用するコントロール反応を実施することができる。固相アッセイを用いる場合、インキュベーション後、洗浄工程を行って未結合のクイエシンQ6を除去する。所定の標識に適切なように結合クイエシンQ6を測定する(例えば、シンチレーションカウンティング、蛍光、抗体-色素など)。定性的な結果が望ましい場合、コントロール及び異なる濃度は必要ないかもしれない。当然のことながら、クイエシンQ6及びクイエシンQ6結合性分子の役割は、切り替わり得る；当業者は、クイエシンQ6結合性分子が種々の濃度のサンプルに適用されるように方法を適合させ得る。
【０１２５】
本発明によるクイエシンQ6結合性分子は、クイエシンQ6に特異的に結合する任意の物質である。本発明による有用なクイエシンQ6結合性分子の例としては、限定されないが、抗体、ポリペプチド、ペプチド、脂質、糖質、核酸、ペプチド-核酸、小分子、小有機分子、又は他の薬剤候補が挙げられる。クイエシンQ6結合性分子は、天然化合物又は合成化合物であり得、例えば合成小分子、動物、植物、細菌又は真菌細胞の抽出物並びに前記細胞からの条件付け培地に含有される化合物を含み得る。或いは、クイエシンQ6結合性分子は、クイエシンQ6の結合部位を有する工学的に操作されたタンパク質であり得る。本発明の１つの観点によれば、クイエシンQ6結合性分子は、10-6Ｍより良好な親和性でクイエシンQ6に特異的に結合する。適切なクイエシンQ6結合性分子は、クイエシンQ6の標準サンプルとの結合から決定することができる。クイエシンQ6結合性分子とクイエシンQ6との結合を決定する方法は、当該分野で公知である。本明細書中で使用する場合、用語 抗体 には、限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化又はキメラ抗体、工学的に操作した抗体及びタンパク質への結合に十分な生物学的に機能的な抗体フラグメント(例えばscFv、ナノボディ、Fvなど)が含まれる。この抗体は、例えばマウス、ラット、ヒト又はヒト化モノクローナル抗体のようなクイエシンQ6に対する市販の抗体であり得る。
本発明の１つの観点によれば、クイエシンQ6結合性分子は、別の物質(例えばプローブ結合性パートナー)での検出を可能にするタグで標識される。このタグは、例えば、ビオチン、ストレプトアビジン、his-タグ、mycタグ、マルトース、マルトース結合性タンパク質又は結合性パートナーを有する当該分野で公知の任意の種類のタグであり得る。プローブ：結合性パートナーの組合せに利用できる組の例は、任意であり、例えばビオチン：ストレプトアビジン、his-タグ：金属イオン(例えばNi2+)、マルトース：マルトース結合性タンパク質を含む。
【０１２６】
別の１つの実施形態において、本発明は、簡便で正確な比色試剤ストリップ及びサンプル中のクイエシンQ6の存在を決定する方法を提供する。より具体的には、本発明はまた、試剤ストリップを含んでなるデバイスに関する。本試剤ストリップは、サンプル中のクイエシンQ6の存在を測定するための少なくとも１つの検査パッドを備えた固体支持体を含んでなる。該検査パッドは、好ましくは、クイエシンQ6と相互作用して測定可能な応答、好ましくは視覚的に又は装置により測定可能な応答をすることができる試剤組成物が組み込まれたキャリアマトリクスを含んでなる。試剤ストリップは、任意のサイズ及び形状で製造されてよいが、一般に試剤ストリップは幅広より縦長である。固体支持体は、任意の適切な材料から構成されてもよく、好ましくは酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリカーボネート又はポリスチレンのような堅固な材料から作られる。一般には、キャリアマトリクスは、尿サンプルが毛管力に応答して該キャリアマトリクスを移動し、試剤組成物に接触して検出可能又は測定可能な色変化を生じさせることを可能とする吸収性材料である。キャリアマトリクスは、興味対象のアッセイを実施するに必要な化学試剤を組み込むことができる任意の物質であり得る(ただし、キャリアマトリクスが該化学試剤に対して実質的に不活性であり、液体の検査サンプルの可溶性成分に関して多孔性又は吸収性である限りにおいて)。表現「キャリアマトリクス」とは、水その他の生理学的流体に不溶であり、水その他の生理学的流体に曝されたとき構造的完全性を維持する吸水性又は非吸水性のマトリクスをいう。適切な吸水性マトリクスとしては、濾紙、スポンジ材料、セルロース、木、織布及び不織布などが挙げられる。非吸水性マトリクスとしては、グラスファイバー、高分子フィルム及び成形膜又は細孔膜が挙げられる。他の適切なキャリアマトリクスとしては、親水性無機粉体、例えばシリカゲル、アルミナ、珪藻土など；粘土質物質；布；親水性天然高分子材料、特にセルロースビーズのようなセルロース材料、及び特に濾紙又はクロマトグラフィー用紙のような繊維含有紙；架橋ゼラチン、酢酸セルロース、ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミド、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリスルホン、ポリエステル、ポリアクリレート、ポリウレタン、架橋デキストラン、アガロース及び他の架橋及び非架橋水不溶性親水性ポリマーのような合成ポリマー又は改変された天然に存在するポリマーが挙げられる。疎水性で非吸収性の物質は、本発明のキャリアマトリクスとしての使用に適切ではない。キャリアマトリクスは、種々の化学組成物又は化学組成物の混合物からなることができる。マトリクスはまた、硬度及び柔軟性と組み合せた平滑性及び粗さに関して変化し得る。しかし、あらゆる場合で、キャリアマトリクスは、親水性又は吸収性材料を含んでなる。キャリアマトリクスは、最も有利には、吸水性濾紙又は非吸水性高分子フィルムから構築される。好適なキャリアマトリクスは、セルロース誘導材料(例えば、紙、好ましくは濾紙)を含む親水性で吸水性のマトリクス、又は高分子フィルム(例えば、ポリウレタン又は架橋ゼラチン)を含む非吸水性マトリクスである。サンプル中のクイエシンQ6と反応したとき色変化を生じる試剤組成物を、キャリアマトリクス中に均一に組み込むことができ、キャリアマトリクスは、試剤組成物を該キャリアマトリクスを通じて均一に保持する一方、検査サンプルの所定成分による該キャリアマトリクスの浸透性を維持する。適切な試剤組成物の例として、例えば、抗体-ベース技術の場合にはクイエシンQ6結合性分子を挙げてもよく、酵素的検出の場合にはpH緩衝液を挙げてもよい。試剤組成物は、好ましくは、固体支持体の少なくとも一方の端部に付着した検査パッド上で、乾燥されて安定化される。試剤組成物が吸着し乾燥している検査パッドは、好ましくは、最小の背景色を示す膜材料から作られる。好ましくは、検査パッドは、背景色を最小にするために、酸又は塩基で洗浄した材料から構築され得る。別の実施形態において、試剤ストリップ上で乾燥されている試剤組成物は、検査パッドの脆性を減少させる湿潤剤を更に含んでなる。好適な湿潤剤の非限定的例としては、TritonX-100、Bioterg、グリセロール、0 Tweenなどが挙げられる。試剤組成物は、当該分野で公知の任意の方法によって試剤ストリップに適用することができる。例えば、検査パッドを作っているキャリアマトリクスは、当該分野で公知の技術に従って、試剤組成物の溶液中に浸漬して乾燥させてもよい。本発明による試剤ストリップは、尿サンプル中の１より多い分析物についてアッセイするために複数の検査パッドを備えて提供され得る。１以上の検査パッド(AHFマーカーBNP、NT-pro-BNP又はそのフラグメントのようなタンパク質、血液、白血球、亜硝酸塩、グルコース、ケトン、クレアチニン、アルブミン、ビリルビン、ウロビリノゲンを含んでなる群から選択される１以上の分析物の存在を測定するための検査パッド及び/又はpH検査パッド及び/又は比重を測定するための検査パッドを含む)を備えて提供される固体支持体を含んでなる試剤ストリップが提供され得る。
【０１２７】
本発明による試剤ストリップ101の可能な実施形態を図16A〜Bに図式的に示す。ストリップ101は近位端102及び遠位端103を備える。その上に試剤組成物が提供される種々の検査パッド109、109'、109''が、試剤ストリップの固体支持体107上、近位端102に提供される。ストリップは、十分に大量の(任意に血液又は唾液などのような粘性サンプルのキャピラリーフローを改善する生理学的流体で希釈された)サンプルで湿らせることができるように設計されなければならない。
本明細書中で規定される試剤ストリップは、以下のように使用される。簡潔には、本発明の試剤ストリップの１以上の検査パッド領域をサンプル中に浸漬させるか、又は少量のサンプルを試剤ストリップに検査パッド領域上で適用する。視覚的に又は反射率測定により分析することができる発色が、短時間のうちに、通常0.5〜10分以内に、試剤ストリップ上で起こる。クイエシンQ6との反応に際しての検査パッド上の試剤領域の色変化は、好ましくは、患者サンプル中のクイエシンQ6濃度に正比例する。検査パッド上で発色する色強度は、視覚的に又は例えば反射率ベースの読取器により決定されてもよい。検査パッド領域での発色を参照の色と比較して、サンプル中に存在するクイエシンQ6量の推定値を決定する。検査パッド上で発色する色強度を、補正因子の適用により決定した或る範囲のクイエシンQ6濃度に対応する少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つの標準色斑と比較する。
【０１２８】
試剤ストリップは、支持体ストリップに塗布されているか又は検査パッド中に組み込まれた蛍光色素又は赤外色素を更に含んでなり得る。これにより、検出可能又は測定可能な応答の検出系を有する装置中での試剤ストリップの適切な配置が確実になる。
別の１つの実施形態において、本発明はまた、サンプル中のクイエシンQ6の存在を測定する検査パッドに関する。好ましくは、該検査パッドは、クイエシンQ6と相互作用して測定可能な応答、好ましくは視覚的に又は装置により測定可能な応答を生じることができる試剤組成物が組み込まれたキャリアマトリクスを含んでなる。別の好適な実施形態において、本発明は、試剤ストリップ上、好ましくは本明細書に規定する試剤ストリップ上での使用のための、本明細書の規定による検査パッドを提供する。
本キット中の特異的結合性物質、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、バイオマーカーなどは、種々の形態、例えば、凍結乾燥形態、溶液中の遊離形態又は固相上に固定化された形態であり得る。これらは、例えば、マルチウェルプレート中に又はアレイ若しくはマイクロアレイとして提供されてもよいし、或いは別個に及び/又は個別に包装されていてもよい。これらは、本明細書中に教示されるように適切に標識されていてもよい。前記キットは、例えば、イムノアッセイ、ELISAアッセイ、質量分析アッセイなどのような本発明のアッセイ法の実施に特に適切であり得る。
上記の観点及び実施形態は以下の非限定的例によって更に支持される。
【実施例】
【０１２９】
実施例
実施例１:AHFの新たなバイオマーカーの発見のためのMASSTERMIND発見プラットフォーム
MASSTERMIND実験セットアップ
バイオマーカー発見のために、本発明者らは、以前に公表したCOFRADICTM技術プラットフォーム(とりわけ、WO 02/077016及びGevaertら，2003, Nat Biotechnol 21(5): 566-9に実質的に記載されたもの)を使用するタンパク質レベルの質量分析による検出を用いて、タンパク質発現の変化を分析した。
市販のアフィニティー-ベースクロマトグラフィーカラム(例えばAgilent Technologies)を使用して、全ての血漿サンプルから最も豊富なタンパク質を枯渇させた。ウェスタンブロット分析を使用して、アルブミン及び免疫グロブリンＧ(IgG)の枯渇効率を検証した。サンプルは、MASStermind分析用に、標準のＮ-末端COFRADIC手順に従って調製した。サンプル及びコントロールは、全てのトリプシン切断ペプチドのＣ末端での18O/16Oのトリプシン媒介組込みによって区別して標識した。Ｎ-末端ペプチドの選別後、NanoLC分離及びその後のMALDI標的上への直接スポッティングを行った。MALDI-TOF/TOF装置を使用してMSスペクトルを作成した。社内で開発したバイオインフォマティクスツール(例えば、ピーク認識及び脱同位体(deisotoping)、分析物と参照との間の比の決定、クラスタリング、サンプル間整列(inter-sample alignment)及び広範なサンプル品質制御のためのツール)を用いて、MSスペクトルを分析した。一旦、全てのサンプルを整列させ、品質を制御した後に、統計分析を開始した。
【０１３０】
MASSTERMIND統計分析
２つの集団を弁別する差別的特徴(又はペプチド)について選択するために、２つの異なる統計尺度を適用した：一基準分類(one-rule classifier)及びマイクロアレイの有意性分析(Significance Analysis of Microarrays；SAM)分析。概念上、差別的特徴を見出す最も単純な機械学習技術は、一基準分類である。この方法では、形式「比＜Ｘであれば、クラス＝Ａ、そうでなければクラス＝Ｂ」という単純なルールが各特徴について作成される。データについてのこのルールの性能は、leave-one-out cross-validationにより決定される。この分析で低い誤差率を示す特徴は、首位のバイオマーカー候補である。SAM (Tusherら，2001, PNAS 98: 5116-5121)は、False Discovery Rate (FDR)を制御しつつ、最も差別的な特徴を選択する方法である。この方法は、元来は、マイクロアレイ実験での使用のために開発され、Pronotaのデータマトリクスに適用可能であることが証明されている。一基準分類に優るこの方法の主たる利点は、これが、両クラス間の比の差が減少し始め、実験からのランダムノイズが候補マーカーの実際のレベルを不明瞭にし始めたとき、依然として有用な傾向を取り出すことが可能であることである。SAMは、２クラスのサンプル間の特徴の比の相対的差異を算出する。このスコアの有意性を推定するため、全サンプルのクラス割当の順序を変えて再スコア付けすることによって帰無分布を推定する。これにより、偶然によって同定されたタンパク質又は遺伝子産物の割合であるfalse discovery rate(FDR)の信頼性のある推定が得られる。MSシグナルの強度及び欠測値(missing value)について最適に説明するため、異なるデータサブセットに対して、これら値についての種々のカットオフを用いて完全なSAM分析を行った。全ての結果を最終報告にまとめた。
【０１３１】
実施例２：発見から導かれる候補マーカーの早期検証のためのMASSterclass標的化タンパク質定量
MASSTERCLASS実験セットアップ
MASSterclassアッセイは最終段階(end-stage)のペプチド定量系として安定な同位体を用いる標的化タンデム質量分析を使用する(多重反応モニタリング(MRM)及び単一反応モニタリング(SRM)とも呼ばれる)。標的化ペプチドは、興味対象の特異タンパク質に特異的(すなわち、プロテオティピック(proteotypic))である。すなわち、ペプチドの測定量は、元のサンプル中のタンパク質の量に直接関係する。複合サンプル中のバイオマーカー定量に必要とされる特異性及び感度に到達するためには、ペプチド分画を最終段階の定量工程より前に行う。
【０１３２】
適切なMASSTERCLASSアッセイは、以下の工程を含み得る：
−  血漿/血清サンプル
−  ProteoPrepスピンカラム(Sigma Aldrich)を用いる抗-アルブミン抗体及び抗-IgG抗体でのアフィニティー捕捉を使用するヒトアルブミン及びIgGの涸渇(タンパク質レベルでの複雑性の低減)
−  既知量のアイソトープ標識ペプチドのスパイキング。このペプチドは、興味対象のプロテオティピックペプチドと同じアミノ酸配列を有する(代表的には、１つのアイソトープ標識アミノ酸がその中に組み込まれて、質量差を生じている)。分子質量に基づく最終段階の定量工程の間を除きプロセス全体の間、該標識ペプチドは、内因性ペプチドと同一の化学的及びクロマトグラフィー的挙動を有する。
−  トリプシン消化物。涸渇血清/血漿サンプル中のタンパク質を、トリプシンを用いてペプチドに消化する。この酵素は、リジン又はアルギニンのＣ-末端側にプロリンが存在する場合を除き、リジン及びアルギニンのＣ-末端でタンパク質を切断する。消化の前に、タンパク質を煮沸により変性させる。これによって、タンパク質分子は、37℃にて16時間のインキュベーションの間、トリプシン活性が接近可能になる。
【０１３３】
−  第１のペプチド-ベース分画：フリーフロー電気泳動(FFE；BD Diagnostic)は、連続層流中を移動している荷電分子が該流れに垂直な電界により分離される、ゲルフリー流体分離技術である。電界により、pH勾配中で荷電粒子の等電点(pI)に従う分離が引き起こされる。モニターするペプチドを含有する画分のみを、更なる分画及びLC-MS/MS分析のために選択する。興味対象の各ペプチドがFFEチャンバーから特異的な分画数(合成ペプチドホモログを用いたタンパク質アッセイ開発の間に決定される。)で溶出する。特定の画分又は画分プール(複合化)を次レベルの分画に進める。
−  第２のペプチド-ベース分画：フェニルHPLC (XBridge Phenyl；Waters)は、ペプチドを、ペプチド配列中に存在するアミノ酸の疎水性及び芳香性に従って分離する。バックエンド(back-end)C18分離との直交性は、上昇したpH値(pH10)でカラムを稼動することによって達成される。Gilarら，2005, J Sep Sci 28(14): 1694-1703により証明されているように、pHは、RP-HPLCにおけるペプチド選択性を変化させる遥かに最も強烈なパラメータである。興味対象の各ペプチドは、フェニルカラムから、合成ペプチドホモログを用いるタンパク質アッセイ開発の間に決定される特定の保持時間で溶出する。サンプル分離のバッチ処理前に９つの標準ペプチドの混合物を分離する外部コントロール系の使用により、保持時間のシフトを補正するための画分採集の調整が可能になる。分画の程度は、サンプル中のタンパク質濃度及び該サンプルの複雑性に依存する。
【０１３４】
−  逆相(C18) nanoLC (PepMap C18；Dionex)及びMRM (4000 QTRAP；ABI)/SRM (Vantage TSQ；Thermo Scientific)モードを用いるMS/MS：タンデム質量分析での更なる分離を含むLC-MS/MSベースの定量。質量分析計の供給頭部(source head)に接続したエレクトロスプレーニードルに、LCカラムを接続する。物質がカラムから溶出するにつれ、分子はイオン化し、ガス相で質量分析計に入る。質量 対 荷電の比(m/z)に基づいて、モニターするペプチドが特異的に選択されて、第１の四重極子(Q1)を通る。次いで、選択したペプチドは、衝突小室として使用する第２の四重極子(Q2)でフラグメント化される。次いで、得られるフラグメントが第３の四重極子(Q3)に入る。(アッセイ開発期の間に決定される)装置セッティングに依存して、特定ペプチドフラグメント(いわゆる、トランジッション(transition))が検出のために選択される。
−  モニターするペプチドのm/zと該ペプチドのモニターするフラグメントのm/zとの組合せは、トランジッションと呼ばれる。このプロセスは、１回の実験の間に複数のトランジッションについて行うことができる。内因性ペプチド(分析物)及びその対応するアイソトープ標識合成ペプチド(内部標準)の両方が、同じ保持時間で溶出し、同じLC-MS/MS実験で測定される。
−  MASSterclassの読取値は、分析物に特異的なピーク下面積と合成アイソトープ標識アナログ(内部標準)に特異的なピーク下面積との間の比によって規定される。MASSterclass読取値は、サンプル中の元々のタンパク質濃度に直接関連する。したがって、MASSterclass読取値は、種々のサンプル間及びサンプル群間で比較することができる。
【０１３５】
本研究において従う代表的なMASSTERCLASSプロトコルを下記に示す：
−  結合/平衡緩衝液として20mM NH4HCO3を使用した以外は、製造業者のプロトコルに従って、25μLの血漿を、ヒトアルブミン及びIgG (ProteoPrepスピンカラム；Sigma Aldrich)の涸渇に供する。
−  涸渇サンプル(225μL)を15分間95℃にて変性させ、氷上で直ぐに冷却する。
−  500fmolのアイソトープ標識ペプチド(カスタムメイド「Heavy AQUA」ペプチド；Thermo Scientific)をサンプル中にスパイクする。
−  20μgトリプシンをサンプルに加え、16時間37℃にて消化する。
−  消化サンプルを先ず溶媒Ａ(0.1％ギ酸)中で1/8希釈し、次いで250amol/μLのアイソトープ標識された興味対象の全ペプチド(カスタムメイド「Heavy AQUA」ペプチド；Thermo Scientific)を含有する同じ溶媒中で1/20希釈した。
−  逆相NanoLCをMRM/SRMモードのオンラインMS/MSと併せて使用して20μLの最終希釈物を分離した：
−  カラム：PepMap C18、75μm I.D.×25cm L, 100Å孔径、５μm粒子サイズ
−  溶媒Ａ：0.1％ギ酸
−  溶媒Ｂ：80％アセトニトリル、0.1％ギ酸
−  勾配：30分；２％〜55％溶媒Ｂ
−  MRMモードのMS/MS：方法は、分析物及び合成標識ペプチドのトランジッションを含有する。
−  使用したトランジッションは、タンパク質アッセイ開発の間に実験的に決定して選択した。
−  興味対象のペプチドの決定した保持時間の３分前から始まり該保持時間の３分後に終わる期間、興味対象のトランジッションの各々を測定した。これにより、確実に、各ピークが少なくとも15のデータ点を有した。
−  LCQuanソフトウェア(Thermo Scientific)を使用して生データを分析し定量した：同じC18保持時間での分析物(＝クイエシンQ6ペプチド)ピーク下面積及び内部標準(標識合成クイエシンQ6ペプチド)ピーク下面積を、自動ピーク検出により決定した。これらを手作業で照合した。
−  MASSterclass読取値は、分析物ピーク面積と内部標準ピーク面積との比により規定した。
【０１３６】
MASSTERCLASS統計分析
測定した比はペプチドの示差量である。換言すれば、比は、規格化したペプチド濃度である。ペプチド濃度は、質量分析計で測定した比に比例する。
特異タンパク質の診断正確性を決定するために統計分析を行う。そうするため、サンプルクラスを２つ一組で比較する。分析は、２つのサンプル集団を弁別するタンパク質の能力を規定する。
受信者動作特性(ROC)曲線の曲線下面積(AUC)を測定することによって、特異タンパク質の診断正確性を決定した(Sullivan Pepe M, The statistical evaluation of medical tests for classification and prediction. 1993 Oxford University Press New York)。ノンパラメトリックアプローチ、すなわちブートストラッピング(Efron B, Tibshirani RJ. Nonparametric confidence intervals. An introduction to the bootstrap. Monographs on statistics and applied probability. 1993；57:75-90 Chapman & Hall New York)を使用して、AUCの推定値及び信頼区間も計算した。臨床変量及び疾患背景に対するマーカーレベルの依存性を、χ2検定及びウィルコクソンの順位和検定を用いて分析した(Cleophas T.J.,ら，2006, Statistics Applied to Clinical Trials, Springer)。
【０１３７】
実施例３：MASStermindを用いる新規AHFマーカーの不偏発見
MASStermindプロテオミック発見プラットフォームを使用して、患者血漿において直接、豊富性が低い新規なAHFタンパク質バイオマーカー候補を発見した。救急部への入院時に10人のAHF患者から先を見越して採集し、退院直前にも採集した連続血漿サンプルを、健常個体から採集した年齢及び性別が適合するコントロールサンプルと共に分析した(図４)。AHF患者のタンパク質プロフィールを入院時と退院時で比較することにより、治療モニタリング及び退院決定のためのバイオマーカー候補がもたらされる一方、AHF患者と健常適合コントロールとの比較により、診断正確性を改善する新たなバイオマーカー候補が提供される。
MASStermind手順後、AHF集団と健常集団とを及び/又は入院サンプルと退院サンプルとを弁別する示差的特徴を、種々の統計学的尺度により選択した(SAM及び一基準分類)。３群間で一貫したレベル変化を示す100を超えるタンパク質を同定した。そのうち60％までが古典的血漿タンパク質のウィンドウに入らない。クイエシンQ6は、AHF-健常比較についての高いSAM及び一基準分類スコアに基づいて選択した。全て同じ傾向を示す、クイエシンQ6の３つの異なるペプチドを同定した：AHF患者(入院時及び退院時)で、より高いレベル及び健常コントロール対象者で、より低いレベル(図５を参照)。メジアン倍差(Median fold difference)は、全てのペプチドについて1.5〜２倍である。
この３つの特異クイエシンQ6ペプチドは全て、当該タンパク質のＮ-末端細胞外領域に位置し、よって両クイエシンイソフォームに対応し得る(図１及び２)。
【０１３８】
実施例４：MASSterclassを用いる候補マーカー クイエシンQ6の診断的価値の検証
4A：臨床サンプルは、３つの異なる医療センターで、４つの異なる集団から先を見越して採集した：
−  救急部(ED)を受診した急性心不全に関連する呼吸困難患者、入院時(Ａ)及び退院直前(Ｂ)にサンプル採取
−  EDに受診した急性心不全とは無関係の呼吸困難患者(Ｄ)
−  安定な慢性心不全患者(Ｃ)
−  年齢及び性別が適合する健常ボランティア(Ｈ)
含まれる全ての患者について、包括的症例記録ファイル(CRF)は、医学的背景、入院診断及び投薬についての詳細を完備した。
図６は、各集団の40サンプルにおいてMASSterclassにより測定したクイエシンQ6の相対レベルを説明する。診断的問題について、AHF患者の退院時のレベルは関連性が低いので、残りの分析については排除した。AHF患者間のメジアンクイエシンQ6レベルは、AHFを有さない呼吸困難患者より1.5倍高かった。全ての患者集団においてサンプルの50％を表す四分位範囲は、1.5倍未満である。対照的に、AHF患者とＤ患者との間でのBNPについてのメジアン倍差はずっと大きく８倍までであるが、四分位範囲はこれら集団において８倍でもある。顕著なことに、Ｄ患者におけるクイエシンQ6レベルは、安定なCHF患者及び健常コントロールにおけるレベルに非常に匹敵している一方、BNPについてはAHF患者とCHF患者との間に有意差はない。
【０１３９】
受信者動作特性(ROC)分析によって、0.89の全体メジアンAUC (95％ CI 0.79-0.96)により示されるように、クイエシンQ6は、EDを受診した呼吸困難患者においてAHF診断に高感度で高特異的であることが証明された(図7A)。Ｂ型ナトリウム利尿ペプチドと比較すると、これは５〜９％の改善である(BNPはNT-プロBNPより僅かに良好に機能する）。感度が特異性と等しい単一比又は濃度カットオフポイントで、クイエシンQ6は、87％の算出感度及び特異性を有し、BNPと比較してAHF該当が７％増加した。正確性プロットは、95％までの所定の感度について、クイエシンQ6がBNPと比較してより高い特異性を与えることを証明している(図7B)。
図６中のボックスプロットは、文献のデータと一致して、BNPが急性心不全のマーカーというよりむしろ心不全のマーカーであることを示す。これは、緊急のAHF診断に関して重大な問題を構成する。なぜなら、BNPレベルは、HF背景を有する患者において既に上昇しているからである。対照的に、クイエシンQ6は、AHF患者 対 安定なCHF患者の間で有意で一貫した差異を確かに示す；CHF患者におけるレベルは、健常対象者におけるレベルに匹敵する。よって、ROC曲線分析もまた、AHF患者と安定な慢性心不全患者との弁別におけるクイエシンQ6の遥かに優れた性能を証明している：メジアンAUC：0.83、BNPについての0.65と比較(図８)。よって、クイエシンQ6は、基礎の心不全病歴に依存しない急性心不全事象の特異マーカーである。
【０１４０】
4B：同じプロトコル及び包含基準で採集したサンプルを用いて上記実験を拡大した。救急部(ED)を受診した、急性心不全に関連するか又は他の原因(＝呼吸困難非AHF)に関連する急性呼吸困難患者からの合計147サンプルが存在する。安定な慢性心不全患者(CHF；n=80)からのサンプルを外来患者セッティングから採集した。
含まれる全ての患者について、包括的症例記録ファイル(CRF)は、医学的背景、入院診断及び投薬についての詳細を完備した(表１)。
【表１】
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【０１４１】
受信者動作特性(ROC)分析によって、0.86の全体メジアンAUC (95％ CI 0.79-0.92)により示されるように、クイエシンQ6は、EDを受診した呼吸困難患者においてAHF診断に高度に高感度で高特異的であることが証明された(図９)。実際の結果を表２に示す。この診断性能は、急性呼吸困難集団におけるAHF診断について現時点で最も標準的なバイオマーカーであるBNP及びNT-プロBNPに等しい。単一比又は濃度カットオフで、クイエシンQ6は82％の診断正確性に達する一方、BNPは、除外カットオフ(100pg/mL)で、73％の正確性を有する。
【表２】
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【０１４２】
クイエシンQ6とBNPとの組合せは診断正確性に有意に影響し、現在のデータセットにおいて最大88％に達する(図10)。単一カットオフでのクイエシンQ6及びBNP並びにこの２つのマーカーの組合せの診断正確性を下記表３にまとめる。クイエシンQ6-BNP組合せの能力は、それらの相補性に、より具体的にはBNP診断のグレーゾーンにおけるクイエシンQ6の高い正確性に起因する。100pg/mLと400pg/mLとの間で、BNPは、呼吸困難患者について何らかの診断的価値を有しているとは言えない。このことはこのデータセットでも示されている：これら患者について、BNPは0.58のメジアンAUC (95％CI 0.42〜0.75)である一方、クイエシンQ6は0.91のメジアンAUC (0.8〜0.97)に達している(図11)。
【表３】
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【０１４３】
実施例５：クイエシンQ6マーカーレベルに対する臨床変量及び疾患背景の影響
実施可能な新たなAHF診断ツールを得るためには、良好な全体的診断性能に加えて、現在使用されている標準バイオマーカーを超える付加価値を示すことが鍵となる。性別、年齢、ボディマスインデックス、腎臓機能、心不全の病歴及び他の心臓疾患の病歴のような幾つかの因子が、循環性ナトリウム利尿ペプチドレベルに影響することが示されている。したがって、上記パラメータに依存しないマーカーは、迅速なAHF診断に追加的価値を有する。150人の呼吸困難患者及び80人の安定なCHF患者のこのデータセットにより、種々の臨床パラメータに対するクイエシンQ6の依存性についての最初の洞察が可能になる。
クイエシンQ6及び(NT-プロ)BNPレベルに対する臨床変量及び疾患背景の影響を、χ2統計量及びウィルコクソン順位和検定を用いて分析した。年齢、腎不全(クレアチニンレベルに基づく)、左心室駆出率、入院時診断、心不全及び冠動脈疾患の病歴並びにCOPD/喘息共存症(全てナトリウム利尿ペプチドレベルに影響することが知られている)を調べた。表４に、クイエシンQ6及び(NT-プロ)BNPの最も重要な関連性をまとめる。呼吸困難集団におけるAHF/AHF無しの診断以外、クイエシンQ6は列挙したパラメータのいずれとも有意な関連性を検出されない。このことは、クイエシンQ6レベルが、現行のデータセットにおいて、心臓の急性代償不全以外のいずれのパラメータによっても影響されないことを示唆している。
【０１４４】
図12は、クイエシンQ6レベルが腎不全に依存しない一方で、BNP及びNT-プロBNPはクレアチニンレベルが増加した患者で明らかに上昇することを示す。腎不全は心不全の頻度の高い共存症であるので、クレアチニンレベルに対するクイエシンQ6レベルの非依存性は、重要な特徴であり、診断性能に対して重大な影響を有する。
図13は、AHF集団、呼吸困難非-AHF集団及び安定なCHF集団において、MASSterclassにより測定したクイエシンQ6の相対的レベルを説明する。AHF患者間のメジアンクイエシンQ6レベルは、AHFを有さない呼吸困難患者より1,5倍高かった。顕著なことに、呼吸困難非AHF患者におけるクイエシンQ6レベルは、安定なCHF患者におけるレベルに非常に匹敵している一方で、BNPのベースラインレベルは、安定なCHF患者で上昇している。
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ−１】
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【図１３Ａ−２】
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【図１３Ｂ−１】
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【図１３Ｂ−２】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【配列表】
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