(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した枯草菌を用いた、異種タンパク質又は異種ポリペプチドの製造方法であって、当該枯草菌のｍａｌＰ遺伝子の発現量を、２３ＳｒＲＮＡに対して０．４×１０-5〜２．５×１０-5のレベルに調節することを特徴とし、
前記ｍａｌＰ遺伝子が、五炭糖若しくは六炭糖又はそれらの誘導体の添加によりその活性が制御される異種プロモーターに作動可能に連結され、
前記異種プロモーターが、ラクトース誘導性プロモーター、ガラクトース誘導性プロモーター、キシロース誘導性プロモーター、アラビノース誘導性プロモーター又はラムノース誘導性プロモーターであり、
前記調節が、前記五炭糖若しくは六炭糖又はそれらの誘導体を適宜添加して、枯草菌のｍａｌＰ遺伝子の発現量を、親株におけるｍａｌＰ遺伝子の発現量に対して５〜２９％のレベルに調節することによりなされる、
前記異種タンパク質又は異種ポリペプチドの製造方法。
【請求項２】
前記異種プロモーターが、キシロース誘導性プロモーター、Ｐｓｐａｃプロモーター又はアラビノース誘導性プロモーターである、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記異種プロモーターが、キシロース誘導性プロモーターである、請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
キシロースを最終濃度０〜０．００８％（ｗ／ｖ）で添加する、請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
前記枯草菌が、ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域が欠失したゲノム構造を有する、請求項１から４のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項６】
更に、ｙｂｂＵ−ｙｂｆＩ領域、ｙｄｊＭ−ｃｏｔＡ領域、ｙｅｆＡ−ｙｅｓＸ領域、ｙｆｉＢ−ｙｆｉＸ領域、ｙｈｃＥ−ｙｈｃＵ領域、ｙｈａＵ−ｙｈａＬ領域、ｙｊｂＸ−ｙｊｌＢ領域、ｘｋｄＡ−ｙｋｃＣ領域、ｂｐｒ−ｙｌｍＡ領域、ｆｌｇＢ−ｃｈｅＤ領域、ｙｎｆＦ−ｐｐｓＡ領域、ｙｏｘＣ−ｙｏｂＯ領域、ｓｐｏＶＡＦ−ｓｐｏＩＩＡＡ領域、ｓｐｏＩＩＩＡＨ−ｙｑｈＶ領域、ｙｔｖＢ−ｙｔｑＢ領域、ｙｔｅＡ−ｙｔａＢ領域、ｙｕａＪ−ｙｕｇＯ領域、ｙｕｓＪ−ｍｒｇＡ領域、ｇｅｒＡＡ−ｙｖｒＩ領域、ｙｖａＭ−ｙｖｂＫ領域、ａｒａＥ−ｙｖｅＫ領域、ｙｖｄＥ−ｙｖｃＰ領域、ｇｅｒＢＡ−ｙｗｓＣ領域、ｙｗｒＫ−ｙｗｑＭ領域、ｓｐｏＩＩＩＤ−ｙｗｏＢ領域、ｓｌｐ−ｙｌａＦ領域、ｌｉｃＨ−ｓｉｇＹ領域、ｙｑｅＦ−ｙｒｈＫ領域、ｙｕｚＥ−ｙｕｋＪ領域及びｙｎｃＭ−ｙｎｄＮ領域のうちの１つ又は２つ以上が欠失したゲノム構造を有する、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる１以上の領域が作動可能に連結されている、請求項１から６のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項８】
異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が作動可能に連結されている、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
前記分泌シグナル領域が、バチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、前記転写開始制御領域及び前記翻訳開始制御領域が、当該セルラーゼ遺伝子の上流０．６〜１ｋｂ領域由来のものである、請求項７又は８記載の製造方法。
【請求項１０】
前記転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号４で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列からなるＤＮＡ断片である、請求項８記載の製造方法。
【請求項１１】
前記異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子が、バチルス属細菌のアルカリセルラーゼ遺伝子である、請求項１から１０のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項１２】
前記アルカリセルラーゼ遺伝子が、配列番号４で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子、又は当該塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片である、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１３】
異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した枯草菌であって、当該枯草菌のｍａｌＰ遺伝子の上流に五炭糖若しくは六炭糖又はそれらの誘導体の添加によりその活性が制御される異種プロモーターが作動可能に連結されており、前記異種プロモーターが、ラクトース誘導性プロモーター、ガラクトース誘導性プロモーター、キシロース誘導性プロモーター、アラビノース誘導性プロモーター又はラムノース誘導性プロモーターである、前記枯草菌。
【請求項１４】
前記異種プロモーターが、キシロース誘導性プロモーター、Ｐｓｐａｃプロモーター又はアラビノース誘導性プロモーターである、請求項１３記載の枯草菌。
【請求項１５】
前記異種プロモーターが、キシロース誘導性プロモーターである、請求項１３記載の枯草菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドを効率的に製造する枯草菌及び当該枯草菌を用いた有用なタンパク質又はポリペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品の醸造をはじめとして、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等の工業的生産など、多岐に渡って実施されている。またその用途も、食品をはじめとして、医薬、洗剤、化粧品等の日用品、あるいは各種化成品原料に至るまで、幅広い分野に広がっている。
【０００３】
微生物を用いた有用物質の工業的生産における一つの重要課題として、当該有用物質の生産性向上が挙げられる。従来、当該課題を解決するため、突然変異等の遺伝学的手法による高生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いた、より効率的な高生産菌の育種が行われている。更に、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受け、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用する試みもなされている。例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｎｏ．１６８系統株など、宿主微生物として安全かつ優良と認められた微生物菌株に更に改良を加えた菌株が開発されている。
【０００４】
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において、マルトースは、フォスフォエノールピルビン酸依存性の糖トランスポーター（ＰＴＳ：Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ）の一つであるＭａｌＰにより細胞内に取り込まれる（非特許文献１）。マルトースはトランスポーターＭａｌＰにより取り込まれる際にリン酸化され、マルトース６リン酸に変換される。更に、マルトース６リン酸は、６−ホスホ−α−グルコシダーゼ活性を有するＭａｌＡによりグルコース及びグルコース６リン酸へと分解され、解糖系で代謝される。ＭａｌＰ及びＭａｌＡをコードする遺伝子ｍａｌＰ及びｍａｌＡは同一オペロン上に存在し、ｍａｌＡ−ｇｌｖＲ−ｍａｌＰオペロンを構成する。ｍａｌＡ−ｇｌｖＲ−ｍａｌＰオペロンは、マルトース６リン酸存在下において、ｇｌｖＲによりコードされる転写因子ＧｌｖＲにより活性化されることが知られている（非特許文献２）。
【０００５】
本出願人は、過去の特許出願（特許文献１）において、枯草菌１６８株（野生株）を親株としてｍａｌＰ（当時の名称はｇｌｖＣ）及びｇｌｖＲをそれぞれ欠失させた株で酵素セルラーゼ及びα−アミラーゼの生産量が向上することを報告している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−１５１９８３号公報
【特許文献２】特開２００７−１３００１３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊ．ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８８，１１，ｐ．３９１１−３９２２，２００６
【非特許文献２】Ｊ．ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８３，１７，ｐ．５１１０−５１２１，２００１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、異種タンパク質又はポリペプチドの遺伝子を導入して作製した組換え枯草菌を用いた、より効率的なタンパク質又はポリペプチドの製造方法の提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子を導入してなる組換え枯草菌において、当該枯草菌のｍａｌＰ遺伝子の発現量を適切に調節することにより、当該異種タンパク質又はポリペプチドの生産量が顕著に向上することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、以下の（１）から（２４）に係るものである。
（１）  異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した枯草菌を用いた、異種タンパク質又は異種ポリペプチドの製造方法であって、当該枯草菌のｍａｌＰ遺伝子の発現量を、２３ＳｒＲＮＡに対して０．４×１０-5〜２．５×１０-5のレベルに調節することを特徴とする、前記異種タンパク質又は異種ポリペプチドの製造方法。
（２）  前記調節が、枯草菌のｍａｌＰ遺伝子の発現量を、親株におけるｍａｌＰ遺伝子の発現量に対して５〜２９％のレベルに調節することによりなされる、上記（１）記載の製造方法。
（３）  ｍａｌＰ遺伝子へ異種プロモーターを作動可能に連結することにより、ｍａｌＰ遺伝子の発現量を調節する、上記（１）又は（２）記載の製造方法。
（４）  ｍａｌＰ遺伝子へ異種プロモーターを作動可能に連結し、更に前記異種プロモーターの活性を制御することにより、ｍａｌＰ遺伝子の発現量を調節する、上記（１）又は（２）記載の製造方法。
（５）  前記異種プロモーターが、発現誘導物質の添加によりその活性が制御される発現誘導型プロモーターである、上記（３）又は（４）記載の製造方法。
（６）  前記発現誘導型プロモーターが、五炭糖若しくは六炭糖又はそれらの誘導体の添加によりその活性が制御されるプロモーターである、上記（５）記載の製造方法。
（７）  前記発現誘導型プロモーターが、キシロース誘導性プロモーター、Ｐｓｐａｃプロモーター又はアラビノース誘導性プロモーターである、上記（６）記載の製造方法。
（８）  前記発現誘導型プロモーターが、キシロース誘導性プロモーターである、上記（６）記載の製造方法。
（９）  キシロースを最終濃度０〜０．００８％（ｗ／ｖ）で添加する、上記（８）記載の製造方法。
（１０）  前記枯草菌が、ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域が欠失したゲノム構造を有する、上記（１）から（９）のいずれか１項記載の製造方法。
（１１）  更に、ｙｂｂＵ−ｙｂｆＩ領域、ｙｄｊＭ−ｃｏｔＡ領域、ｙｅｆＡ−ｙｅｓＸ領域、ｙｆｉＢ−ｙｆｉＸ領域、ｙｈｃＥ−ｙｈｃＵ領域、ｙｈａＵ−ｙｈａＬ領域、ｙｊｂＸ−ｙｊｌＢ領域、ｘｋｄＡ−ｙｋｃＣ領域、ｂｐｒ−ｙｌｍＡ領域、ｆｌｇＢ−ｃｈｅＤ領域、ｙｎｆＦ−ｐｐｓＡ領域、ｙｏｘＣ−ｙｏｂＯ領域、ｓｐｏＶＡＦ−ｓｐｏＩＩＡＡ領域、ｓｐｏＩＩＩＡＨ−ｙｑｈＶ領域、ｙｔｖＢ−ｙｔｑＢ領域、ｙｔｅＡ−ｙｔａＢ領域、ｙｕａＪ−ｙｕｇＯ領域、ｙｕｓＪ−ｍｒｇＡ領域、ｇｅｒＡＡ−ｙｖｒＩ領域、ｙｖａＭ−ｙｖｂＫ領域、ａｒａＥ−ｙｖｅＫ領域、ｙｖｄＥ−ｙｖｃＰ領域、ｇｅｒＢＡ−ｙｗｓＣ領域、ｙｗｒＫ−ｙｗｑＭ領域、ｓｐｏＩＩＩＤ−ｙｗｏＢ領域、ｓｌｐ−ｙｌａＦ領域、ｌｉｃＨ−ｓｉｇＹ領域、ｙｑｅＦ−ｙｒｈＫ領域、ｙｕｚＥ−ｙｕｋＪ領域及びｙｎｃＭ−ｙｎｄＮ領域のうちの１つ又は２つ以上が欠失したゲノム構造を有する、上記（１０）記載の製造方法。
（１２）  異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる１以上の領域が作動可能に連結されている、上記（１）から（１１）のいずれか１項記載の製造方法。
（１３）  異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が作動可能に連結されている、上記（１２）記載の製造方法。
（１４）  前記分泌シグナル領域が、バチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、前記転写開始制御領域及び前記翻訳開始制御領域が、当該セルラーゼ遺伝子の上流０．６〜１ｋｂ領域由来のものである、上記（１２）又は（１３）記載の製造方法。
（１５）  前記転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号４で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、又は当該塩基配列のいずれかと７０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片である、上記（１３）記載の製造方法。
（１６）  前記異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子が、バチルス属細菌のアルカリセルラーゼ遺伝子である、上記（１）から（１５）のいずれか１項記載の製造方法。
（１７）  前記アルカリセルラーゼ遺伝子が、配列番号４で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子、又は当該塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、又は当該塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片である、上記（１６）記載の製造方法。
（１８）  異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した枯草菌であって、当該枯草菌のｍａｌＰ遺伝子の上流に異種プロモーターが作動可能に連結されており、それにより当該ｍａｌＰ遺伝子の発現量が、２３ＳｒＲＮＡに対して０．４×１０-5〜２．５×１０-5のレベルに調節される、前記枯草菌。
（１９）  異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した枯草菌であって、当該枯草菌のｍａｌＰ遺伝子の上流に異種プロモーターが作動可能に連結されており、更に当該異種プロモーターの活性を制御することにより、当該ｍａｌＰ遺伝子の発現量が、２３ＳｒＲＮＡに対して０．４×１０-5〜２．５×１０-5のレベルに調節される、前記枯草菌。
（２０）  前記調節が、ｍａｌＰ遺伝子の発現量を、親株におけるｍａｌＰ遺伝子の発現量に対して５〜２９％のレベルに調節することによりなされる、前記枯草菌。
（２１）  前記異種プロモーターが、発現誘導物質の添加によりその活性が制御される発現誘導型プロモーターである、上記（１８）から（２０）のいずれか１項記載の枯草菌。
（２２）  前記発現誘導型プロモーターが、五炭糖若しくは六炭糖又はそれらの誘導体の添加によりその活性が制御されるプロモーターである、上記（２１）記載の枯草菌。
（２３）  前記発現誘導型プロモーターが、キシロース誘導性プロモーター、Ｐｓｐａｃプロモーター又はアラビノース誘導性プロモーターである、上記（２２）記載の枯草菌。
（２４）  前記発現誘導型プロモーターが、キシロース誘導性プロモーターである、上記（２２）記載の枯草菌。
【発明の効果】
【００１１】
本願発明の製造方法によれば、目的の異種タンパク質又はポリペプチドを効率よく大量生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＳＯＥ−ＰＣＲによる遺伝子欠失用ＤＮＡ断片の調製、及び当該ＤＮＡ断片を用いて標的遺伝子を欠失させる（薬剤耐性遺伝子と置換する）方法を模式的に示した図。
【図２】キシロースによる発現制御領域及びｍａｌＰ遺伝子を枯草菌ゲノム上のａｍｙＥ部位に挿入するＤＮＡ断片の調製方法を模式的に示した図。
【図３】枯草菌ＭＧＢ８７４株及びその変異株の細胞増殖、培養上清の糖濃度、セルラーゼ生産量を示すグラフ。左から使用した菌株、キシロース添加量（終濃度）、細胞増殖、培養上清中の糖濃度、セルラーゼ生産量を示す図。数値はそれぞれ培養を３回行い得られた値の平均値を示し、エラーバーは標準偏差を示す（Ｎ＝３）。
【図４】培養１日目におけるｍａｌＰ発現量を示す図。左から使用した菌株、キシロース添加量（終濃度）、ｍａｌＰ発現量（棒グラフ）を示す。ｍａｌＰ発現量は、細胞内で非常に安定に発現する２３ＳｒＲＮＡに対する相対値を用いて測定した。数値はそれぞれ培養を３回行い得られた値の平均値を示し、エラーバーは標準偏差を示す（Ｎ＝３）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の第一の態様は、異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した枯草菌を用いた、異種タンパク質又は異種ポリペプチドの製造方法であって、宿主となる枯草菌のｍａｌＰ遺伝子の発現量を０．４×１０-5〜２．５×１０-5の範囲に調節することを特徴とする製造方法である。また本発明の第二の態様は、異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した枯草菌であって、当該枯草菌のｍａｌＰ遺伝子の上流に異種プロモーターが作動可能に連結されており、それにより当該ｍａｌＰ遺伝子の発現量が、２３ＳｒＲＮＡに対して０．４×１０-5〜２．５×１０-5のレベルに調節される枯草菌である。以下これらについて説明する。
【００１４】
前記ｍａｌＰ遺伝子の発現量は、通常２３ＳｒＲＮＡのコピー数（又はモル数）に対して０．４×１０-5〜２．５×１０-5、好ましくは０．７×１０-5〜１．６×１０-5のレベルに調節すればよく、当該調節は具体的には、親株におけるｍａｌＰ遺伝子の発現量（コピー数又はモル数）に対して５〜２９％、好ましくは８〜１９％のレベルに調節することにより実施できる。また、目的とする異種タンパク質又はポリペプチドの種類や希望する生産量に応じて、それらの範囲内で適宜ｍａｌＰ遺伝子の発現量を調節しうる。ここで、親株とは、本願発明に係る異種タンパク質又は異種ポリペプチドの製造方法の宿主として用いられる枯草菌株であって、ｍａｌＰ遺伝子の発現調節及び／又はｍａｌＰ遺伝子の発現調節を行うための遺伝子操作がなされていない枯草菌株のことであり、例えば、後述する枯草菌１６８株や枯草菌ＭＧＢ８７４株等が挙げられる。
【００１５】
枯草菌は、グルコース、スクロースあるいはマルトースなどの糖を消費することにより、生育に必要な、細胞内の各種反応を行うためのエネルギーを得る。ゆえに糖の消費に関与するｍａｌＰ遺伝子の発現量は、枯草菌の細胞増殖や細胞内の各種代謝活性に影響を与える主な要因であり、組換えタンパク質をコードする遺伝子を導入した組換え枯草菌を用いて当該組換えタンパク質を生産する場合においてもその生産性に影響を及ぼすと考えられる。しかしながら、ｍａｌＰ遺伝子の発現量を、上記のような低いレベルとなるよう調節した場合に、組換えタンパク質の生産性が向上したのは、全く予想外のことであった。
【００１６】
本発明において発現量を調節するｍａｌＰ遺伝子（ＢＳＯＲＦ  Ｇｅｎｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｎｏ．：ＢＧ１１８４８、ＥＣ２．７．１．６９）とは、マルトースの枯草菌体内への選択的な膜透過を媒介するＭａｌＰタンパク質をコードする遺伝子である。
【００１７】
前記ｍａｌＰ遺伝子の発現量を上記のレベルに調節するための手段としては、ｍａｌＰ遺伝子へ異種プロモーターを作動可能に連結する手段や、ｍａｌＰ遺伝子へ異種プロモーターを作動可能に連結した上で前記異種プロモーターの活性を調節する手段が挙げられる。
【００１８】
ここで、異種プロモーターとは、ｍａｌＰ遺伝子の固有のプロモーターとは異なる他のプロモーターのことを指す。また、作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）とは、制御配列（プロモーターなど）と当該コード配列とが適切な位置関係で配置された結果、当該制御配列の機能により当該コード配列でコードされたタンパク質の発現が制御される状態のことを指す。
【００１９】
前記異種プロモーターは、ｍａｌＰ遺伝子の固有のプロモーターと比較し活性の低い公知のプロモーターから適宜選択して用いてもよい。ｍａｌＰ遺伝子の発現量は、遺伝子からのｍＲＮＡへの転写量や、ｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質又はポリペプチドの生産量を測定することで把握できる。ｍＲＮＡの転写量の測定方法としては、ノーザンブロット法、リボヌクレアーゼ活性保護法又は定量的ＲＴ−ＰＣＲ法等が挙げられる。あるいは、タイリングアレイ法（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社）を用いてもよい。タイリングアレイ法とは、解読済みのゲノムデータから等間隔に抜き出した塩基配列を検出用プローブとしてタイル状に並べたＤＮＡチップ（タイリングアレイ）を用いた遺伝子発現解析方法のことを指し、これに、ｉｎ  ｖｉｖｏで転写されたＲＮＡを鋳型として作った標識ｃＤＮＡをハイブリダイズさせると、ＲＮＡに相補的なプローブからシグナルを検出できるため、未知遺伝子の塩基配列の解析・存在の推定、既知遺伝子との比較、各種遺伝子発現量の検出・比較、遺伝的多型の検出などに使用できる。また、タンパク質又はポリペプチドの生産量の測定方法としては、分光光度計を用いた光学的方法、酵素活性を指標にした生化学的方法、ＥＬＩＳＡやウェスタンブロッティングなどの免疫学的方法などが挙げられる。
【００２０】
例えば、上記のような活性の低いプロモーターの選抜は、Ｍｏｒｉｍｏｔｏらの論文（ＤＮＡ  Ｒｅｓ１５：７３−８１（２００８）のＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｄａｔａに列挙されている全ての遺伝子から、タイリングアレイにより、ｍａｌＰ遺伝子の発現量に対して所定の範囲の低い発現量（５〜２９％、好ましくは８〜１９％のレベル）を示すプロモーターを抽出することにより実施できる。なお、かかる選抜基準は、枯草菌に求められる性能や使用目的等に応じて適宜調整してもよい。
【００２１】
これらの遺伝子又はこれらの遺伝子を含むオペロンのプロモーター領域の推定は、枯草菌の転写制御因子に関するデーターベースＤＢＴＢＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００８，３６（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ９３−Ｄ９６）にその塩基配列が記載されており、それらを固有のプロモーターとして利用できる。
【００２２】
あるいは、上記異種プロモーターとして、人為的な操作により活性を低いレベルに調節できる公知のプロモーターを用いてもよく、より好ましくは、発現誘導物質の添加によりプロモーター活性が制御されるプロモーター、すなわち発現誘導型プロモーターを用いる。
【００２３】
ｍａｌＰ遺伝子に作動可能に連結された上記発現誘導型プロモーターの活性を調節する手段としては特に限定されないが、枯草菌の増殖に対する影響や資化性、枯草菌に対する毒性、あるいは操作の簡便性等の観点から、糖を発現誘導物質として添加することにより調節するのが好ましい。かかる糖としては、例えばリボース、リキソース、キシロース、アラビノース、アピオース、リブロース及びキシルロースなどの五炭糖、アロース、タロース、グロース、グルコース、アルトロース、マンノース、ガラクトース、イドース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトースなどの六炭糖、並びにそれらの誘導体（イソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）等）などが挙げられ、また、上記の異種プロモーターも、これらの五炭糖若しくは六炭糖又はそれらの誘導体の添加によりその活性が制御されるプロモーターであるのが好ましい。
【００２４】
前記五炭糖若しくは六炭糖又はそれらの誘導体の添加によりその活性が制御されるプロモーターの例としては、ラクトース誘導性プロモーター（ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｐｓｐａｃプロモーター等）、ガラクトース誘導性プロモーター（ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ４プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ｍｅｌ１プロモーター等）、キシロース誘導性プロモーター（ｘｙｌＡプロモーター、ｘｙｌＢプロモーター等）、アラビノース誘導性プロモーター（ａｒａＢプロモーター等）、ラムノース誘導性プロモーター（ｒｈａＢＡＤプロモーター等）等が挙げられるが、適度なレベルでの発現誘導とする観点から、キシロース誘導性プロモーター、Ｐｓｐａｃプロモーター又はアラビノース誘導性プロモーターが好ましく、中でもキシロースの資化に関連する遺伝子であるｘｙｌＡ遺伝子（ＢＳＯＲＦ  Ｇｅｎｅ  Ｅｎｔｒｙ：ＢＧ１０８０６、ＥＣ５．３．１．５）のプロモーター、すなわちキシロース誘導性プロモーター（ｘｙｌＡプロモーター）がより好ましい。
【００２５】
あるいは、枯草菌の増殖に対する影響や資化性等に悪影響を及ぼさない限り、ＥＣＦシグマ因子特異的プロモーター（Ｊ．Ｈｅｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍｏｒａｎ  Ｊｒ．，“Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｌｏｓｅｓｔ  ｒｅｌａｔｉｖｅｓ．”ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，２００２，ｐｐ２８９−３１２）、Ｍｇ及びＣｕの２成分によって誘導されるプロモーター等の、五炭糖若しくは六炭糖又はそれらの誘導体の添加によりその活性が制御されるプロモーター以外のプロモーターを用いることも可能である。
【００２６】
発現誘導型プロモーターを用いる場合には、発現誘導物質を、前記ｍａｌＰ遺伝子の発現量が上記のレベルとなる濃度で枯草菌に対して添加すればよく、例えば発現誘導型プロモーターとして五炭糖若しくは六炭糖又はそれらの誘導体の添加によりその活性が制御されるプロモーターを用いる場合には、前記ｍａｌＰ遺伝子の発現量が上記のレベルとなる濃度で、枯草菌に対して五炭糖若しくは六炭糖又はそれらの誘導体を添加すればよい。より具体的な例として、ｘｙｌＡプロモーターを用いてｍａｌＰ遺伝子の発現量を調節する場合、キシロースを最終濃度０〜０．００８％（ｗ／ｖ）で添加すればよく、異種タンパク質又はポリペプチドの生産性をより高めるためには、キシロースを最終濃度０．０００３〜０．００８％（ｗ／ｖ）となるよう添加するのが好ましい。
【００２７】
あるいは、前記ｍａｌＰ遺伝子の発現量を減少させるための他の手段として、例えばＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡレベルの抑制、コドン使用頻度の改変による翻訳効率の低減、ｍａｌＰの発現を制御する転写因子（ＧｌｖＲ及びＣｃｐＡ）の変異、紫外線、エチルメチルスルホン（ＥＭＳ）及びエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）からなる群から選択される１つ以上の変異原による枯草菌の処理などが挙げられる。
【００２８】
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）とは、好気性のグラム陽性桿菌で、芽胞を形成する真正細菌の一種である。枯草菌は、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されており、またタンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有するため、本願発明における宿主として有用な微生物といえる。
【００２９】
本願発明において用いる枯草菌の親株は特に限定されないが、例えば枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）、及び枯草菌１６８株から、そのゲノムの大領域を欠失させて構築した枯草菌ＭＧＢ８７４株が挙げられる（特許文献２）。大領域とはすなわち、ｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｙｒａＫ）領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域のことであり、これらの欠失領域はまた、以下の表１に示す一対のオリゴヌクレオチドセットにより挟み込まれる領域として表すことができる。
【００３０】
【表１】
0005796951.tif 000002
【００３１】
枯草菌１６８株の全塩基配列及び遺伝子は既に報告されており、またインターネット公開されている（Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６，１９９７及びＢＳＯＲＦ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ［ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／］；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＬ００９１２６．２［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／３８６８０３３５］）。当業者は、これらの情報源から得た枯草菌１６８株のゲノム情報、例えばＧｅｎＢａｎｋ：ＡＬ００９１２６．２［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／３８６８０３３５］に基づいて、ＭＧＢ８７４株のゲノムから欠失させるべき上記表２に示した遺伝子領域を見出すことができる。ここで、欠失させるべき遺伝子領域は、公開されている枯草菌１６８株の遺伝子の塩基配列に対して１又は複数個の塩基における天然又は人工的に引き起こされた欠失、置換、挿入、付加等の変異を含み得る塩基配列を有し得る。変異し得る塩基の個数の範囲は、枯草菌１６８株のゲノムとの対応関係が認識できる限り特に限定されないが、例えば、枯草菌１６８株のゲノム領域の塩基配列に対して５０％以上の同一性、好ましくは６０％以上の同一性、より好ましくは７０％以上の同一性、更に好ましくは８０％以上の同一性、更により好ましくは９０％以上の同一性、なお好ましくは９５％以上の同一性を有する範囲が挙げられる。上記「付加」には、塩基配列の一末端及び両末端への塩基の付加が含まれる。
【００３２】
本願発明において用いる枯草菌の親株は、上記枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株のゲノム領域から、更にゲノム領域を欠失させたゲノム構造を有してもよい。具体的には、当該親株は、枯草菌１６８株のゲノム上における表２に示す遺伝子領域のうちの少なくとも１つを、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株のゲノム領域から更に欠失させたゲノム構造を有してもよい。当該欠失領域としては、表２に示される遺伝子領域及び当該領域に相当する領域が挙げられる。
【００３３】
【表２】
0005796951.tif 000003
【００３４】
ｍａｌＰ遺伝子に異種プロモーターを作動可能に連結する手段としては、特に限定されないが、かかる組換え枯草菌を作製する際の操作の簡便性の観点から、既に報告された方法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２３，２６８（１９９０）等）に基づく相同組換えを繰り返すことにより、ゲノム中のｍａｌＰ遺伝子を含む固有の領域を削除し、更に、異種プロモーターに作動可能に連結されたｍａｌＰ遺伝子を含む別のＤＮＡ断片をゲノム中の当該領域に挿入するのが好ましい。
【００３５】
かかる削除方法の具体例として、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，７７，６１，（１９８９））によって調製される削除用ＤＮＡ断片を用いた二重交差法による削除方法について説明するが、本発明における遺伝子削除方法はこの方法に限定されるものではない。
【００３６】
本方法で用いる削除用ＤＮＡ断片は、削除対象遺伝子の上流に隣接する約０．２〜３ｋｂ断片と、同じく下流に隣接する約０．２〜３ｋｂ断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を挿入して構築した断片である。まず、１回目のＰＣＲによって、削除対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の３断片を調製するが、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側１０〜３０塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側１０〜３０塩基対配列が付加されるようにデザインされたプライマーを用いる（図１）。
【００３７】
次いで、１回目に調製した３種類のＰＣＲ断片を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて２回目のＰＣＲを行うことによって、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列において、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニーリングが生じ、ＰＣＲ増幅の結果、上流側断片と下流側断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子が挿入されたＤＮＡ断片が得られる（図１）。
【００３８】
表３に示すプライマーセットと適当な鋳型ＤＮＡを用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のＰＣＲ用酵素キット等を用いて、“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｂ．Ａ．Ｗｈｉｔｅ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ２５１（１９９３）、Ｇｅｎｅ，７７，６１，（１９８９）等に示される通常の条件によりＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、各遺伝子の削除用ＤＮＡ断片が得られる。
【００３９】
かくして得られた削除用ＤＮＡ断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、削除対象遺伝子の上流及び下流の、上記削除用ＤＮＡ断片との相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、削除対象遺伝子が薬剤耐性遺伝子で置換された細胞を、薬剤耐性マーカーによる選抜により単離できる（図１）。即ち、表３に示すプライマーセットを用いて調製した削除用ＤＮＡ断片を導入した場合、薬剤を含む寒天培地上に生育するコロニーを単離し、目的の遺伝子が削除されて薬剤耐性遺伝子と置換していることを、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法などによって確認すればよい。
【００４０】
上記の組換え枯草菌を用いて異種タンパク質又はポリペプチドを製造する場合、上記の異種タンパク質又はポリペプチドの遺伝子の上流に、当該遺伝子の転写、翻訳、分泌を制御する制御領域を、適切な形で結合させるのが望ましい。かかる制御領域としては、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域並びに分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域などが挙げられる。特に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域であるものが、異種タンパク質又はポリペプチド遺伝子と作動可能に連結されていることが望ましい。例えば、特開２０００−２１００８１号公報や特開平４−１９０７９３号公報等に記載されているバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、すなわちＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）、ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８８６）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が目的のタンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と作動可能に連結されていることが望ましい。より具体的には、前記転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号４で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、又は当該塩基配列のいずれかと７０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、上記の異種タンパク質又はポリペプチド遺伝子と作動可能に連結していることが望ましい。ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片とは、上記塩基配列の一部を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているＤＮＡ断片を意味する。また、ここで、作動可能に連結されている（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）とは、上記の制御配列が機能してコード配列によりコードされた目的タンパク質の発現が制御されうる位置関係で、当該制御配列と当該コード配列とが配置していることを指す。具体例としては、プロモーターとそれに隣接する目的遺伝子とが、当該プロモーターの方向に沿って、当該遺伝子が発現しうる状態で配置していることを指す。また、ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）］に記載の条件等が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハート液及び１００ｍｇ／ｍＬ  ニシン精子ＤＮＡを含む溶液中で、プローブと共に６５℃で８〜１６時間インキュベートし、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００４１】
異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を細胞内で発現させるためには、当該遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適切なベクターに挿入した発現プラスミドを構築し、当該発現プラスミドを宿主に導入して形質転換する必要がある。当該発現ベクターとしては、枯草菌体内で自立複製可能なベクターが好適であり、例えばシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられるが、特に限定されない。
【００４２】
ポリペプチドとは一般に、直鎖状に連結したアミノ酸のポリマーを指し、タンパク質とは一般に、５０以上のアミノ酸からなる１つ以上のポリペプチド鎖のことを指すが、本願においてはこれらの用語は交換可能に用いられるものとする。
【００４３】
本発明の組換え枯草菌を用いて生産する異種タンパク質又はポリペプチドとしては、例えば食品用、医薬用、化粧用、洗浄用、繊維処理用、検査用に用いられる各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが挙げられる。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素（オキシドレダクターゼ）、転移酵素（トランスフェラーゼ）、加水分解酵素（ヒドロラーゼ）、脱離酵素（リアーゼ）、異性化酵素（イソメラーゼ）、合成酵素（リガーゼ／シンセターゼ）等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素が挙げられ、より好ましくはセルラーゼが挙げられる。
【００４４】
セルラーゼとしては、例えば、多糖加水分解酵素の分類（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８０，３０９，１９９１）中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、好ましくはバチルス属細菌由来のセルラーゼが好適に挙げられる。より具体的な例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）由来のアルカリセルラーゼ、又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８８６）由来のアルカリセルラーゼ、あるいは当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、セルラーゼ活性を有するタンパク質、又は配列番号５又は配列番号７で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セルラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００４５】
α−アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、好ましくはバチルス属細菌由来の液化型アミラーゼが好適に挙げられる。より具体的な例として、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌ＫＳＭ−Ｋ３８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９４６）由来のアルカリアミラーゼ、あるいは当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、アミラーゼ活性を有するタンパク質、又は配列番号８で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、アミラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００４６】
プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、好ましくはバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が好適に挙げられる。より具体的な例として、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌ＫＳＭ−ＫＰ４３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５３２）由来のアルカリプロテアーゼ、あるいは当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりプロテアーゼ活性を有するタンパク質、又は配列番号９で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなりプロテアーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００４７】
本発明において、アミノ酸配列及び塩基配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算される。より具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００４８】
本発明の枯草菌は、上記の異種タンパク質又はポリペプチド遺伝子を含むＤＮＡ断片と適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法によって宿主となる枯草菌変異株に取り込ませることによって得られる。また、当該ＤＮＡ断片に宿主ゲノムとの適当な相同領域を結合したＤＮＡ断片を用い、宿主ゲノムに直接組み込むことによって本発明の組換え枯草菌を得てもよい。
【００４９】
上記の組換え枯草菌を用いた異種タンパク質又はポリペプチドの製造は、上記異種タンパク質又はポリペプチドの遺伝子を上記のとおり宿主となる枯草菌変異株に導入して得られる菌株を、例えば同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種して培養して行うことができる。培養方法は、原則的には一般的な微生物の培養方法であってもよく、通常、液体培養による振盪培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で実施するのが好ましい。培養終了後、培養液を遠心分離し、得られる上清又は菌体から、目的の異種タンパク質又はポリペプチドを、硫安沈殿やクロマトグラフィなどを適宜組み合わせ、常法に従い抽出・精製することにより得ることができる。
【００５０】
以下の実施例において、本発明の組換え枯草菌の構築方法及び当該組換え枯草菌を用いたタンパク質の製造方法について説明するが、本願発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５１】
以下に、本発明の組換え微生物の構築方法及び当該組換え微生物を用いたタンパク質の製造方法について具体的に説明する。
【００５２】
以下の実施例におけるＤＮＡ断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）と付属の試薬類を用いた、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）によるＤＮＡ増幅により行った。ＰＣＲ反応液は、適宜希釈した鋳型ＤＮＡを１μＬ、センス及びアンチセンスプライマーを各々２０ｐｍｏｌ、及びＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを２．５Ｕ添加し、更に総反応液量を５０μＬとすることにより調製した。ＰＣＲ反応条件は、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１〜５分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は１ｋｂあたり１分間）の３段階の温度変化を３０サイクル繰り返した後、７２℃で５分間反応、とした。
【００５３】
また、以下の実施例において、遺伝子の上流及び下流とは、複製開始点からの位置を指すのではなく、上流とは各操作・工程において対象となる遺伝子の開始コドンの５’側に続く領域を指し、一方下流とは各操作・工程において対象となる遺伝子の終止コドンの３’側に続く領域を指すものとする。
【００５４】
更に、以下の実施例における各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６，（１９９７）で報告され、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ  ＤＢ）としてインターネットで公開された枯草菌ゲノムデータ（ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／２００４年３月１０日更新）に基づき記載する。
【００５５】
枯草菌の形質転換は、コンピテントセル法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９３，１９２５（１９６７））により行った。すなわち、枯草菌株をＳＰＩ培地（０．２０％  硫酸アンモニウム、１．４０％  リン酸水素二カリウム、０．６０％  リン酸二水素カリウム、０．１０％  クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％  グルコース、０．０２％  カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｍＭ  硫酸マグネシウム、０．２５μＭ  塩化マンガン、５０μｇ／ｍＬ  トリプトファン）中で、３７℃で、生育度（ＯＤ６００）の値が約１となるまで振盪培養し、振盪培養後、培養液の一部を９倍量のＳＰＩＩ培地（０．２０％  硫酸アンモニウム、１．４０％  リン酸水素二カリウム、０．６０％  リン酸二水素カリウム、０．１０％  クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％  グルコース、０．０１％  カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｍＭ  硫酸マグネシウム、０．４０μＭ  塩化マンガン、５μｇ／ｍＬ  トリプトファン）に接種し、更に生育度（ＯＤ６００）の値が約０．４となるまで振盪培養することにより、枯草菌株のコンピテントセルを調製した。
【００５６】
次いで調製したコンピテントセル懸濁液（ＳＰＩＩ培地における培養液）１００μＬに、各種ＤＮＡ断片を含む溶液（ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液等）を５μＬ添加し、３７℃で１時間振盪培養後、適切な薬剤を含むＬＢ寒天培地（１％  トリプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、１．５％  寒天）に全量を塗沫した。３７℃での静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲを行い、目的とするゲノム構造の改変がなされたことを確認した。
【００５７】
目的のタンパク質を発現するプラスミドの宿主微生物への導入は、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８，１１１（１９７９））により行った。組換え枯草菌によるタンパク質生産用の培養として、ＬＢ培地（１％  トリプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ）、及び２×Ｌ−マルトース培地（２％  トリプトン、１％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、７．５％  マルトース、７．５ｐｐｍ  硫酸マンガン４〜５水和物）を用いた。
【００５８】
実施例１  （ｍａｌＰ欠失株の構築）
マルトース特異的透過酵素ＭａｌＰをコードする遺伝子ｍａｌＰの欠失株は以下の方法により構築した。枯草菌ＭＧＢ８７４株（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４６：１６９−１７８，２００７）（ＤＮＡ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５，７３−８１  ２００８）から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として表３に示すプライマーｍａｌＰ．ＦＷとｍａｌＰ／Ｎｍ．Ｒ、及びｍａｌＰ／Ｎｍ．ＦとｍａｌＰ．ＲＶの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のｍａｌＰ遺伝子領域（配列番号１の塩基番号６４から１２４４）の上流に隣接する１．０ｋｂｐ断片（Ａ）、及び下流に隣接する１．４ｋｂｐ断片（Ｂ）をそれぞれ調製した。また、ネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドｐＵＢ１１０（Ｐｌａｓｍｉｄ  １５：９３−１０３．（１９８６））を鋳型として、表３に示すｎｅｏｆ及びｎｅｏｒのプライマーセットを用いて、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｃ）を調製した。次に、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）３断片を混合して鋳型とし、ｍａｌＰ．ＦＷ２とｍａｌＰ．ＲＶ２のプライマーを用いてＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，７７，６１，１９８９）を行ない、３断片が（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）の順となるよう結合させ、遺伝子欠失用のＤＮＡ断片を得た（図１参照）。このＤＮＡ断片を用いて、コンピテントセル法により枯草菌ＭＧＢ８７４株の形質転換を行い、ネオマイシン（１０ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として単離した。得られた形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによって、ｍａｌＰ遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子と置換されていることを確認した。以上のようにして得られた変異株を８７４ΔｍａｌＰ株とした。
【００５９】
【表３】
0005796951.tif 000004
【００６０】
実施例２（ｍａｌＰ発現制御株の構築）
ｍａｌＰの発現制御可能な株の構築は、図２を参考として以下の方法により行った。図２は、キシロースによる発現制御領域及びｍａｌＰ遺伝子を枯草菌ゲノム上のａｍｙＥ部位に挿入するＤＮＡ断片の調製方法を模式的に示したものである（図中のａｍｙＥはα−アミラーゼ、ｘｙｌＡ’はキシロースイソメラーゼの一部、ｘｙｌＲはｘｙｌＡ転写抑制因子、ｃａｔはクロラムフェニルコールアセチルトランスフェラーゼ、ｍａｌＡは６‐ホスホ‐α‐グルコシダーゼ、ｇｌｖＲはｍａｌＡ転写抑制因子、ｍａｌＰはマルトース特異的透過酵素をそれぞれコードする遺伝子である。また、ＰxylAはｘｙｌＡプロモーター領域、ＴmalPはｍａｌＰターミネーター領域を示す。）。
【００６１】
まず、キシロース誘導性の染色体挿入型プラスミドｐＸを鋳型として、表４に示すプライマーｐｘ．ｕｐ−Ｆとｐｘ−ｍａｌＰ．ｕｐ−Ｒ、及びｐｘ−ｍａｌＰ．ｄｏｗｎ−Ｆとｐｘ．ｄｏｗｎ−Ｒの各プライマーセットを用いてＤＮＡ断片（フラグメント１及びフラグメント２）をＰＣＲにより調製した。プラスミドｐＸは、Ｂａｙｒｅｕｔｈ大学のＷｏｌｆｇａｎｇ  Ｓｃｈｕｍａｎｎ博士により開発されたキシロース発現誘導用プラスミドである（Ｇｅｎｅ  １８１：７１−７６．（１９９６））。プラスミドｐＸは枯草菌のα―アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＥ）の５’−断片と３’−断片の間にはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のキシロース資化オペロン（転写抑制因子ＸｙｌＲをコードする遺伝子、ＸｙｌＲにより抑制されるプロモーターＰｘｙｌＡ及びキシロースイソメラーゼｘｙｌＡをコードする遺伝子の一部）が挿入されている。ＸｙｌＲはキシロース存在下で不活性化することが知られており、ＰｘｙｌＡの下流に目的遺伝子を挿入することで、目的遺伝子の発現をキシロース添加により制御することが可能である。α―アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＥ）の５’−断片と３’−断片の間にはマーカー遺伝子であるｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）が挿入されており、キシロース誘導領域は形質転換により染色体上のａｍｙＥ領域に挿入される。
【００６２】
なお、本発明にて使用するＭＧＢ８７４株は、キシロース資化経路を担うキシロースイソメラーゼ及びキシルロースキナーゼをコードする遺伝子が欠失しており、キシロースを資化できない。したがって、キシロースの添加は生育等には影響を与えず、目的の遺伝子の誘導にのみ寄与すると考えられる。
【００６３】
次に、枯草菌ＭＧＢ８７４株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表４に示したｍａｌＰ．ｆ及びｍａｌＰ．ｒのプライマーセットを用いて、ｍａｌＰ遺伝子及びｍａｌＰターミネーター領域を含むＤＮＡ断片（フラグメント３；配列番号３）を調製した。次に、得られた３断片（フラグメント１）（フラグメント２）（フラグメント３）を混合して鋳型とし、ｐｘ．ｕｐ−Ｆ及びｐｘ．ｄｏｗｎ−Ｒを用いてＳＯＥ−ＰＣＲを行ない、３断片が（フラグメント１）−（フラグメント３）−（フラグメント２）の順となるよう結合させ、遺伝子欠失用のＤＮＡ断片を得た（図２参照）。このＤＮＡ断片を用いて、コンピテント法により実施例１にて構築した枯草菌８７４ΔｍａｌＰ株の形質転換を行い、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として単離した。得られた形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによって目的の形質転換体が得られたことを確認した。以上のようにして得られたｍａｌＰ発現制御株を８７４Ｐｘｙｌ−ｍａｌＰ株とした。
【００６４】
【表４】
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【００６５】
実施例３  （ｍａｌＰ及びａｍｙＥ  ２重欠失株の構築）
実施例２にて構築したｍａｌＰ制御株（８７４Ｐｘｙｌ−ｍａｌＰ株）は、枯草菌ゲノム上のａｍｙＥ遺伝子の内部にキシロースによる発現制御領域等が挿入されており、ａｍｙＥ遺伝子自体の機能は失われている。そこで、８７４Ｐｘｙｌ−ｍａｌＰ株の比較対照株として８７４ΔｍａｌＰ株のａｍｙＥ遺伝子を欠失させた株（８７４ΔｍａｌＰΔａｍｙＥ株）を構築した。まず、枯草菌８７４ΔｍａｌＰ株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表５に示すａｍｙＥ．ＦＷとａｍｙＥ／ＣｍＦＷ．Ｒ、及びａｍｙＥ／ＣｍＲＶ．ＦとａｍｙＥ．ＲＶの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のａｍｙＥ遺伝子の上流に隣接する１．０ｋｂｐ断片（Ａ）、及び下流に隣接する１．３ｋｂｐ断片（Ｂ）をそれぞれ調製した。更に、表５に示すＣｍＦＷ及びＣｍＲＶのプライマーセットを用いて、プラスミドｐＣ１９４（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５０（２），８１５（１９８２））のクロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃ）を増幅した。次に、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の３断片を混合して鋳型とし、ａｍｙＥ．ＦＷ２とａｍｙＥ．ＲＶ２のプライマーを用いてＰＣＲを行ない、３断片を（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）の順となるよう連結させ、遺伝子欠失用のＤＮＡ断片を得た（図１参照）。このＤＮＡ断片を用いて、コンピテントセル法により実施例１にて作製した８７４ΔｍａｌＰ株の形質転換を行い、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。更に得られた形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによってａｍｙＥ遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換されていることを確認した。以上のようにして８７４ΔｍａｌＰΔａｍｙＥ株を構築した。
【００６６】
【表５】
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【００６７】
実施例４  （セルラーゼ生産量評価）
実施例１から実施例３にて構築した８７４ΔｍａｌＰ株、８７４Ｐｘｙｌ−ｍａｌＰ株、８７４ΔｍａｌＰΔａｍｙＥ株及び枯草菌ＭＧＢ８７４株に、アルカリセルラーゼ遺伝子を導入した。具体的には、バチルス属細菌  ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）由来のＳ２３７セルラーゼ（特開２０００−２１００８１号公報参照）（配列番号６）をコードするＤＮＡ断片（３．１ｋｂ；配列番号５の塩基番号１３〜３１２４）を鋳型として、表６に示されるプライマーＥｇｌ−Ｓ２３７．Ｆ及びプライマーＥｇｌ−Ｓ２３７．Ｒのプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、シャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫのＢａｍＨＩ制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を構築し、プロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。
【００６８】
得られた菌株を５ｍＬのＬＢ培地で３０℃において１５時間振盪培養し、更にこの培養液０．６ｍＬを３０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％  トリプトン、１％  酵母エキス、１％  塩化ナトリウム、７．５％  マルトース、７．５ｐｐｍ  硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍ  テトラサイクリン、任意の濃度のキシロースを添加）に接種し、３０℃で４日間振盪培養した（この際、測定誤差を算出する目的で培養を３回行った）。８７４Ｐｘｙｌ−ｍａｌＰ株を培養する際には、ｍａｌＰの発現を誘導するためキシロースを終濃度０．０００３％（ｗ／ｖ）、０．００１６％（ｗ／ｖ）、０．００８％（ｗ／ｖ）、０．０４％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）及び１．０％（ｗ／ｖ）となるよう添加した。サンプリングは１日ごとに行い、培養液濁度（ＯＤ600）を測定した。また、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清の糖濃度及びアルカリセルラーゼ活性を測定した。糖濃度は、Ｆ−キット  Ｄ−グルコース／ショ糖／麦芽糖（株式会社ジェイ・ケイ・インターナショナル製）を用いて測定した。セルラーゼ活性は、１／７．５Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４  和光純薬社製）で適宜希釈したサンプル溶液５０μＬに０．４ｍＭ  ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロトリオシド（生化学工業社製）を５０μＬ添加して混合し、３０℃で反応させた際に遊離するｐ−ニトロフェノール量を４２０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ420）変化を解析することにより測定した。アルカリセルラーゼの活性値は、１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１Ｕと定義した。培養の結果を図３に示す。また、表７に、培養４日目の各株のセルラーゼ生産量を、比較対照株である８７４ΔｍａｌＰΔａｍｙＥ株の生産量に対する相対値として示す（表７；表の値は平均値±標準偏差（Ｎ＝３）を示す）。
【００６９】
以上の結果、８７４Ｐｘｙｌ−ｍａｌＰ株を用いた場合、キシロースを最終濃度０〜０．００８％で添加した場合、比較対照である８７４ΔｍａｌＰΔａｍｙＥ株より１０％以上高いアルカリセルラーゼ生産性を示すことが明らかとなった（表７）。一方、ＭＧＢ８７４株の場合、並びにキシロースの添加が最終濃度０．２％以上の場合では、糖の消費速度が高く、アルカリセルラーゼの生産性が低いことが明らかとなった（表７、図３）。
【００７０】
【表６】
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【００７１】
【表７】
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【００７２】
実施例５  （リアルタイムＰＣＲによるｍａｌＰ転写量の測定）
リアルタイムＰＣＲを行い、ＭＧＢ８７４株及び８７４Ｐｘｙｌ−ｍａｌＰ株のｍａｌＰ発現量を測定した。まず、実施例４に示す方法でＭＧＢ８７４株及び８７４Ｐｘｙｌ−ｍａｌＰ株にアルカリセルラーゼ遺伝子を導入した後、実施例４と同様の方法にて培養を行い、培養１日目の菌体を遠心集菌により分離・回収した。Ｒ．Ｌｏｓｉｃｋらの論文（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９１：６１５−６２４，１９８６）に記載された方法と同様の手法にて菌体よりＲＮＡを抽出後、ｃＤＮＡへの逆転写反応を行った。Ｔｈｅ  ＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔ  ＱＰＣＲ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用い、抽出したＲＮＡ  ５μｇを含む５０μＬの反応溶液（１×ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ，１５ｎｇ／μＬ  ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒｓ及び２．５μＬ  ＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ／ＲＮａｓｅ  Ｂｌｏｃｋ  ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ）を、２５℃で５分間、４２℃で４５分間、９５℃で５分間反応させ、逆転写反応を行った。ＤＮＡの混入を測定する目的で、全てのＲＮＡサンプルでは逆転写酵素であるＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ／ＲＮａｓｅ  Ｂｌｏｃｋ  ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘｔｕｒｅを含まない状態で同様の反応を行った。反応後の溶液を必要に応じて希釈し、定量解析に用いた。
【００７３】
Ｍｘ３０００Ｐシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ＩＩ  Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＱＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲ解析を行った。ｍａｌＰの転写量測定には表８に示すプライマーｍａｌＰｔＦＷ及びｍａｌＰｔＲＶを使用し、発現量のノーマライゼーションに使用する２３ＳｒＲＮＡの転写量測定には表８に示すプライマーＢ．ｓｕｂ−２３Ｓ．Ｆ及びＢ．ｓｕｂ−２３Ｓ．Ｒを使用した。２５μＬの反応溶液（１×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ、各０．４μＭ、ｆｏｒｗａｒｄプライマー及びｒｅｖｅｒｓｅプライマー、３．２μＭ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｄｙｅ、１０μＬ  ｓａｍｐｌｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用い、９５℃で２分間反応した後、９５℃で５秒間、６０℃で２０秒間のサイクルを４０回繰り返してＰＣＲ反応を行った。反応終了後のサンプルを９５℃で１分間、５５℃で３０秒間反応させた後、０．２℃／秒で９５℃まで温度を上昇させ、連続的に蛍光強度を測定することで解離曲線を作成し、単一のピークであることを確認した。Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ（Ｃｔ値）はＭｘ３０００Ｐのソフトウェア内のＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄで設定した。測定する遺伝子に対応するプライマーを用いて、枯草菌ゲノムを鋳型とし、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片を、ｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入してスタンダードサンプルを作製し、段階的に希釈したスタンダードサンプル中に含まれるコピー数と対応するＣｔ値から得られた検量線をもとに、各サンプル中に含まれる対象遺伝子のコピー数を算出した。ｃＤＮＡサンプル中のコピー数から逆転写を行わなかったサンプルのコピー数を引いた値を各遺伝子の発現量とし、サンプル間のノーマライゼーションには２３ＳｒＲＮＡの発現量を用いた。各発現量の測定は、全ての条件において、培養の時点から、独立して３回（Ｎ＝３）行った。
【００７４】
定量解析の結果を表９及び図４に示す（表９の平均及び標準偏差は、３回の実験による平均及び標準偏差を示す。図４は、左から、使用した菌株、キシロース添加量、ｍａｌＰ発現量を示し、ｍａｌＰ発現量は２３ＳｒＲＮＡの転写量に対する相対値を示す）。表９及び図４から、ｍａｌＰはキシロース非添加時にもわずかに発現しており（親株であるＭＧＢ８７４株のｍａｌＰ遺伝子の発現量に対する相対発現量：５％、２３ＳｒＲＮＡに対する相対発現量：０．４×１０-5）、キシロースの添加により段階的に発現量が増加することが確認された。実施例４の表７及び実施例６の図４より、ｍａｌＰの２３ＳｒＲＮＡに対する相対発現量が０．４×１０-5〜１．６×１０-5に相当するとき、ｍａｌＰ欠失株（８７４ΔｍａｌＰΔａｍｙＥ株）と比較して、セルラーゼ生産量が１０％以上向上することが明らかとなった。また、対応する表９より、ＭＧＢ８７４株のｍａｌＰ遺伝子の発現量（１００％）に対する相対発現量が５〜１９％であるとき、セルラーゼ生産量が１０％以上向上することが明らかとなった。
【００７５】
【表８】
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【００７６】
【表９】
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【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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