(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＤ９３水溶性断片に特異的な抗体を有効成分として含む抗炎症用薬学的組成物。
【請求項２】
前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の断片、組換え抗体及び化学的に修飾された抗体からなる群から選択された一つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の抗炎症用薬学的組成物。
【請求項３】
前記抗体の断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ／ｃ、抗体をタンパク質切断酵素で切断して得られた抗体または遺伝子組換え技術によって得られた抗体であることを特徴とする、請求項２に記載の抗炎症用薬学的組成物。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体が、
１）ヒトを除く哺乳動物に、ＣＤ９３水溶性断片及び全長のＣＤ９３タンパク質からなる群から選択された免疫源を免疫させて抗体産生細胞を採取する工程と、
２）前記抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを製造する工程、及び
３）前記ハイブリドーマから前記モノクローナル抗体を得る工程とを含む方法によって製造されることを特徴とする、請求項２に記載の抗炎症用薬学的組成物。
【請求項５】
前記ポリクローナル抗体が、
１）ヒトを除く哺乳動物に、ＣＤ９３水溶性断片及び全長のＣＤ９３タンパク質からなる群から選択された免疫源を免疫させる工程、及び
２）前記免疫された哺乳動物から採取した血液からＣＤ９３水溶性断片に特異的な抗体を分離する工程とを含む方法によって製造されることを特徴とする、請求項２に記載の抗炎症用薬学的組成物。
【請求項６】
前記ＣＤ９３水溶性断片が、ＣＤ９３タンパク質が細胞培養後放出された細胞外部分（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）で９５ｋＤａであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の抗炎症用薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＣＤ９３またはその可溶性断片に特異的に結合する抗体を用いた抗炎症性組成物、炎症性疾患診断方法、及び炎症性疾患診断キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＣＤ９３（Ｃ１ｑＲｐ、ＡＡ４．１（ｍｏｕｓｅ））は、染色体の２０番、ｐ１１．２１に位置したタイプ１膜通過糖蛋白質である（非特許文献１、２、３）。前記タンパク質は、Ｂ細胞発達において細胞・細胞間相互作用と食作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）に関連することが報告されている（非特許文献２、４、５、６）。
【０００３】
ＣＤ９３は、総６５２個アミノ酸で構成され、リーダー配列、ｃタイプ炭水化物認知ドメイン、５個のＥＧＦ類似ドメイン、ムチンドメイン、一つの膜通過ドメイン、４７個アミノ酸の細胞内ドメインを含んでいる（非特許文献２、７、８）。また、ＣＤ９３は、骨髄系、造血母細胞、ＮＫ細胞、血小板、小膠細胞及び血管内皮細胞などで発現する（非特許文献９〜１４）。また異なる研究結果では、ＣＤ９３が大食細胞では発現しないが、血管内皮細胞では多く発現すると報告されている（非特許文献１５〜１７）。ＣＤ９３は元来、抗ＣＤ９３抗体を用いた結果において食作用のＣ１ｑ−媒介増強（Ｃ１ｑ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）に関与するとされ、Ｃ１ｑに対する受容体としての可能性が提議されてきた。しかし、後続の実験でＣ１ｑと直接結合しないことが多くのグループから報告された（非特許文献８、１８、１９）。
【０００４】
ＣＤ９３ノックアウトマウス実験では、ＣＤ９３の不在によって死滅細胞の除去機能に問題が起こることが明かされ、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）実験ではそのような機能異常がみられない、相反した結果が導出された（非特許文献５、２０）。このような食作用機能は、免疫反応において初期に重要な役割を担当していて、細胞死滅した細胞の除去に重要な役割をしている（非特許文献２１）。
【０００５】
このような機能に対する糸口を解く最近の研究結果として、ＣＤ９３がＴＮＦ−ａ、ＬＰＳなど炎症の初期段階で細胞外部分（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）が切断される断片化（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）が起きるという報告があった（非特許文献７、２２、２３）。また、ＣＤ９３と同じ系列細胞であるＵ９３７細胞で、ＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ−１２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ−１３−ａｃｅｔａｔｅ）処理によって断片化が起きて可溶性断片で切断されるという報告もあった（非特許文献２９）。同時に、特許文献１には、ＣＤ９３−関連多形体が第１型糖尿病と赤斑性狼瘡の診断に有用であると記載している。しかし、ＣＤ９３を炎症性疾患治療または診断に使用し報告はない。
【０００６】
それで、本発明者等は、ＣＤ９３またはその可溶性断片の炎症との関連性を研究した結果、ＣＤ９３の可溶性断片が優秀な抗炎症効能を有して、ＣＤ９３またはその可溶性断片が炎症誘導物質または炎症性環境で過発現することを確認することによって、ＣＤ９３の可溶性断片は抗炎症性組成物の有効成分として用いることができ、ＣＤ９３またはその可溶性断片は、炎症性疾患診断用マーカーとして用いられることを明らかにして本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開特許ＷＯ２００８／０８２５１９号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍａｌｈｏｔｒａ，Ｒ．等，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３年，第７８巻，ｐ．３４１−３４８
【非特許文献２】Ｎｅｐｏｍｕｃｅｎｏ，Ｒ．Ｒ．等，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９７年，第６巻，ｐ．１１９−１２９
【非特許文献３】Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．等，Ｂｉｏｌ．２００２年，第７１巻，ｐ．１３３−１４０
【非特許文献４】Ｐｅｔｒｅｎｋｏ，Ｏ．等，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９９年，第１０巻，ｐ．６９１−７００
【非特許文献５】Ｎｏｒｓｗｏｒｔｈｙ，Ｐ．Ｊ．等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４年，第１７２巻，ｐ．３４０６−３４１４
【非特許文献６】ＭｃＧｒｅａｌ，Ｅ．Ｐ．等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２年，第１６８巻，ｐ．５２２２−５２３２
【非特許文献７】Ｐａｒｋ，Ｍ．等，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００３年，第１９６巻，ｐ．５１２−５２２
【非特許文献８】Ｎｅｐｏｍｕｃｅｎｏ，Ｒ．Ｒ．等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９年，第１６２巻，ｐ．３５８３
【非特許文献９】Ｎｅｐｏｍｕｃｅｎｏ，Ｒ．Ｒ．等，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９７年，第６巻，ｐ．１１９
【非特許文献１０】Ｎｅｐｏｍｕｃｅｎｏ，Ｒ．Ｒ．等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８年，第１６０巻，ｐ．１９２９
【非特許文献１１】Ｄａｎｅｔ  Ｇ．Ｈ．等，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００２年，第９９巻，ｐ．１０４４１−５
【非特許文献１２】Ｌｏｖｉｋ  Ｇ．等，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０００年，第３０巻，ｐ．３３５５−６２
【非特許文献１３】Ｆｏｎｓｅｃａ  Ｍ．Ｉ．等，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ，２００１年，第７０巻，ｐ．７９３−８００
【非特許文献１４】Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｓ．Ｄ．等，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．２０００年，第６７巻，ｐ．１０９
【非特許文献１５】Ｐｅｔｒｅｎｋｏ，Ｏ．等，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９９年，第１０巻，ｐ．６９１
【非特許文献１６】Ｄｅａｎ，Ｙ．Ｄ．等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第３１巻，ｐ．１３７０
【非特許文献１７】Ｆｏｎｓｅｃａ，Ｍ．Ｉ．等，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．２００１年，第７０巻，ｐ．７９３
【非特許文献１８】ＭｃＧｒｅａｌ，Ｅ．Ｐ．等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２年，第１６８巻，ｐ．５２２２
【非特許文献１９】Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．等，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．２００２年，第７１巻，ｐ．１３３
【非特許文献２０】Ｇｕａｎ，Ｅ．等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４年，第１５２巻，ｐ．４００５−４０１６
【非特許文献２１】Ｂｒｏｗｎ，Ｅ．Ｊ．Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，１９９５年，第１７巻，ｐ．１０９−１１７
【非特許文献２２】Ｓｕｚａｎｎｅ  Ｓ．Ｂｏｈｌｓｏｎ等，Ｊ．ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５年，第１７５巻，ｐ．１２３９−１２４７
【非特許文献２３】Ｉｋｅｗａｋｉ  Ｎ．，Ｔａｍａｕｃｈｉ  Ｈ．，ａｎｄ  Ｉｎｏｋｏ  Ｈ．Ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ＣＤ９３ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（Ｕ９３７）ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｖａｒｉｏｕｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００７年，第５１（１２）巻，ｐ．１１８９−１２００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ＣＤ９３の可溶性断片を用いた抗炎症性組成物を提供することである。
【００１０】
本発明のまた別の目的は、ＣＤ９３またはその可溶性断片を用いた炎症性疾患診断用キット、及びそれを用いた炎症性疾患診断方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＤ９３水溶性断片に対する特異的な抗体を有効成分として含む抗炎症性組成物を提供する。
【００１２】
また、本発明は配列番号４の塩基配列からなるＣＤ９３遺伝子の発現を抑制することができる、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの発現ベクターからなる群から選択された一つ以上を有効成分として含む抗炎症性組成物を提供する。
【００１３】
また、本発明は前記組成物を炎症にかかった個体に投与する工程を含む炎症の治療方法を提供する。
【００１４】
また、本発明は前記組成物を個体に投与する工程を含む炎症の予防方法を提供する。
【００１５】
また、本発明はＣＤ９３またはその可溶性断片に特異的に結合する抗体またはアプタマーを含む炎症性疾患診断用キットを提供する。
【００１６】
同時に、本発明は前記炎症性疾患診断用キットを用いて炎症性疾患を診断する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、ＣＤ９３の可溶性断片に対する抗体を有効成分として含む抗炎症性薬学的組成物を提供することができ、前記組成物を用いて炎症性疾患の予防または治療に有用に用いることができる。また、本発明は、ＣＤ９３またはその可溶性断片を炎症性疾患の診断マーカーとしての用途を提供することができ、前記マーカーを用いて炎症性疾患のモニタリングまたは診断に有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】全長のＣＤ９３タンパク質のアミノ酸配列（図１Ａ）とｓＣＤ９３タンパク質のアミノ酸配列（図１Ｂ）を示した図である。
【図２】ＨＥＫ２９３Ｅ細胞でｓＣＤ９３＿Ｆｃを発現及び精製した後の電気泳動写真である。ここで、Ｎは還元されない状態のタンパク質で、Ｒは還元された状態のタンパク質である。
【図３】ｓＣＤ９３タンパク質のＴＨＰ−１細胞の大食細胞への分化誘導効果を示した結果で、ＴＨＰ−１細胞がディッシュ（ｄｉｓｈ）表面に付着した程度を示した写真である。
【図４】ｓＣＤ９３タンパク質のＴＨＰ−１細胞の大食細胞への分化誘導効果を示した結果で、ＴＨＰ−１細胞の付着率を示したグラフである。
【図５】ｓＣＤ９３タンパク質のＴＨＰ−１細胞の大食細胞への分化誘導効果を示した結果で、ＴＨＰ−１細胞が大食細胞に分化した程度を示した写真である。
【図６】ｓＣＤ９３タンパク質のＴＨＰ−１細胞の大食細胞への分化誘導効果を示した結果で、大食細胞分化標識の発現程度を示したグラフである。
【図７】ｓＣＤ９３タンパク質のＭＡＰＫ信号活性化効果を示した結果で、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｋ  １／２、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８及び全体ｐ３８をウエスタンブロットで定量化した電気泳動写真である。
【図８】ｓＣＤ９３タンパク質のＭＡＰＫ信号活性化効果を示した結果で、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｋ  １／２がｓＣＤ９３タンパク質処理後の時間によって定量化した電気泳動写真である。
【図９】ｓＣＤ９３タンパク質のＭＡＰＫ信号活性化効果を示した結果で、ｓＣＤ９３タンパク質処理後、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６の発現量をＲＮＡ水準で測定した結果である。
【図１０】ｓＣＤ９３タンパク質のＭＡＰＫ信号活性化効果を示した結果で、ｓＣＤ９３タンパク質処理後、ＩＬ−１β及びｉＮＯＳの発現量をタンパク質水準で測定した結果である。
【図１１】ｓＣＤ９３タンパク質のＭＡＰＫ信号活性化効果を示した結果で、ｓＣＤ９３タンパク質処理後、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１２、ＳＰＨＫ−１及びＣＬＥＣ４Ａの発現量をタンパク質水準で測定した結果である。
【図１２】ｓＣＤ９３タンパク質処理後、ＴＮＦ−αの発現量をタンパク質水準で測定した結果である。
【図１３】ｓＣＤ９３タンパク質が基質金属タンパク質プロテアーゼ（ＭＭＰ）の発現に及ぼす影響を示した電気泳動写真である。
【図１４】ｓＣＤ９３タンパク質の食作用の誘導効果を示した写真である。
【図１５】ｓＣＤ９３タンパク質の食作用の誘導効果を示したＦＡＣＳ分析グラフである。
【図１６】ＣＤ９３タンパク質抗体のＴＮＦ−α生成阻害効果を示したグラフである。
【図１７】ＣＤ９３遺伝子に対するｓｉＲＮＡのＴＮＦ−ａ及びＩＬ−６の生成阻害効果を示したグラフである。
【図１８】ヒト単核球細胞であるＴＨＰ−１細胞にＬＰＳ、ＴＮＦ−ａまたはＰＭＡを処理した後、細胞表面でのＣＤ９３発現様相をＦＡＣＳで分析した結果を示したグラフである。
【図１９】ＴＨＰ−１細胞にＬＰＳ、ＴＮＦ−ａまたはＰＭＡを処理した後、細胞表面でのＣＤ９３発現様相とその可溶性断片をウエスタンブロットで観察した結果を示した図である。
【図２０】ＴＨＰ−１細胞にＬＰＳまたはＰＭＡを処理した後、細胞表面でのＣＤ９３ｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲで測定して定量した結果を示したグラフである。
【図２１】マウスにＰＢＳ、チオグリコレート、ＬＰＳを注射した後、マウスＣＤ９３の発現様相を腹膜大食細胞でＦＡＣＳで分析した結果を示したグラフである。
【図２２】マウスにＰＢＳ、チオグリコレート、ＬＰＳを注射した後、マウスＣＤ９３の発現様相をＰＢＭＣと腹膜大食細胞からウエスタンブロットで観察した結果を示した図である。
【図２３】マウスにＰＢＳ、チオグリコレート、ＬＰＳを注射した後、マウスＣＤ９３可溶性断片の量を血清と腹膜液でサンドイッチＥＬＩＳＡ方法で測定した結果を示したグラフである。
【図２４】リウマチ性関節炎患者（ＲＡ）と退行性関節炎患者（ＯＡ）から得た滑膜組織をＣＤ９３抗体で染色してその発現様相を免疫組織化学方法で分析した結果を示した図である。
【図２５】リウマチ性関節炎患者（ＲＡ）と退行性関節炎患者（ＯＡ）から得た滑膜液に存在するＣＤ９３可溶性断片の量をサンドイッチＥＬＩＳＡ方法で測定した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
[発明の実施のための最善の形態]
以下、本発明を詳しく説明する。
【００２０】
本発明は、ＣＤ９３水溶性断片のｓＣＤ９３に対する特異的な抗体を有効成分として含む抗炎症性組成物を提供する。
【００２１】
また、本発明は、ＣＤ９３水溶性断片のｓＣＤ９３に対する特異的な抗体を抗炎症性組成物の製造に用いる用途を提供する。
【００２２】
本発明者等は、ｓＣＤ９３をヒト由来単核球細胞であるＴＨＰ−１細胞に処理した時、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化が媒介されてＴＨＰ−１細胞がマクロファージに分化して食作用が誘導され、またＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６等の炎症性サイトカインの分泌が増加して、基質金属蛋白質分解酵素（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＭＭＰ）の分泌が促進されるなど炎症反応が誘導されることを確認することができた。
【００２３】
前記でＭＡＰＫは、細菌性脂質多糖類など炎症誘発物質によって活性化して炎症性サイトカインの分泌などを促進することが知られていて、ＭＭＰは炎症反応が誘導される過程でその分泌が促進されることが知られている。
【００２４】
本発明者等は、このようなｓＣＤ９３の炎症反応誘導効果に着眼して、それの抗体をＴＨＰ−１細胞に処理した時、活性化した単核細胞や大食細胞によって一次的に生成されることが知られたサイトカインであるＴＮＦ−ａが減少することも確認することができた。
【００２５】
本発明は、このような実験結果に基づいて提供されるもので、本発明の抗炎症性薬学的組成物は、ｓＣＤ９３に対する特異的な抗体を有効成分として含むことを特徴とする。
【００２６】
本明細書で、「ｓＣＤ９３」は全長のＣＤ９３タンパク質から離れたＣＤ９３タンパク質の水溶性断片を意味し、それのアミノ酸配列と塩基配列は＜図１のＢ＞及び＜配列番号１及び２＞に開示されている。本明細書で標的タンパク質は、特別に異なる言及がない限りｓＣＤ９３を意味する。全長のＣＤ９３タンパク質の配列は、＜図１のＡ＞及び＜配列番号３＞に開示されていて、前記タンパク質遺伝子の塩基配列は、＜配列番号４＞に開示されている。
【００２７】
本明細書で、「抗炎症性」の意味は、炎症や炎症性疾患の予防、改善、治療、及び発病遅延を含む意味である。
【００２８】
本明細書で、前記「炎症性疾患」というのは、外部の物理または化学的刺激またはバクテリア、かび、ウイルス、各種アレルギー誘発物質など外部感染源の感染に対する局所的または全身的生体防御反応で特定される状態として定義され得る。このような反応は、各種炎症媒介因子と免疫細胞と関連する酵素（例えば、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２等）活性化、炎症媒介物質の分泌（例えば、ＮＯ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＰＧＥ２の分泌）、体液浸潤、細胞移動、組織破壊などの一連の複合的な生理的反応を伴って、赤斑、痛み、むくみ、発熱、身体の特定機能の低下または喪失などの症状によって外的に現れる。前記炎症性疾患は、急性、慢性、潰瘍性、アレルギー性または壊死性を帯びることができるので、ある疾患が前記のような炎症性疾患の定義に含まれる限りそれが急性でも、慢性でも、潰瘍性でも、アレルギー性でもまたは壊死性であっても構わない。具体的に前記炎症性疾患には、喘息、アレルギー性及び非アレルギー性鼻炎、慢性及び急性鼻炎、慢性及び急性胃炎または腸炎、潰瘍性胃炎、急性及び慢性腎臓炎、急性及び慢性肝炎、慢性閉鎖性肺疾患、肺線維症、過敏性大腸症侯群、炎症性痛み、偏頭痛、頭痛、腰痛、繊維筋肉痛、筋膜疾患、ウイルス感染（例えば、Ｃ型感染）、バクテリア感染、かび感染、やけど、外科的または歯科的手術による傷、プロスタグランジンＥ過多症侯群、アテローム性動脈硬化症、痛風、関節炎、リウマチ性関節炎、強直性脊柱炎、ホジキン病、膵臓炎、結膜炎、紅彩炎、鞏膜炎、ぶどう膜炎、皮膚炎、湿疹、多発性硬化症などが含まれる。
【００２９】
本明細書で「有効成分」というのは、単独に目的とする活性を示すかまたはそれ自体は活性がない薬学的に許容される担体などとともに活性を示すことができる成分を意味する。前記「薬学的に許容される」の意味に対しては下記で説明する。
【００３０】
本明細書で、「特異的結合」の意味は、抗体がその標的タンパク質であるｓＣＤ９３と抗原抗体結合体を形成して、異なるタンパク質とは実質的にそのような結合体を形成しない場合を意味する。ここで、「実質的に」というのは、程度は低いが非特異的な結合体は形成することができるということを意味する。前記「特異的結合」の意味は、別の表現ではその結合がタンパク質の特定構造すなわち抗原の決定部位であるエピトープによって決定される結合であると表現することもできる。
【００３１】
本明細書で、「エピトープ」というのは、標的タンパク質であるｓＣＤ９３で抗原性または免疫原性を有する部分のアミノ酸領域（抗原決定基）を示す。エピトープは通常少なくとも１０個のアミノ酸を含む。このようなエピトープは、当業界の公知されたエピトープ解釈法、例えば、ファージ提示法、逆免疫遺伝学（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）などによって同定することができる。
【００３２】
本明細書で、「抗体」は標的タンパク質であるｓＣＤ９３に特異的に結合するものならすべての形態の物を含む意味である。したがって、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（すなわち二つ以上の抗原または二つ以上のエピトープに対して結合特異性を有する抗体であり、例えば二特異的抗体などをいう）、ヒト化抗体、ヒト抗体を含むこと以外に、標的タンパク質であるｓＣＤ９３に特異的に結合することができる能力を保有する抗体の断片、組換え抗体、化学的に修飾された抗体を含む。
【００３３】
前記ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリンの相補性決定領域（ＣＤＲ）がマウス、うさぎ、ねずみ、霊長類など非ヒト種のＣＤＲで代替された抗体であり免疫拒否反応を最小化した抗体をいい、このような抗体の製造方法は当業界に公知されている。詳細な内容は、文献［Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．等，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８年，第３３２巻，ｐ．３２３−３２７］、文献［Ｎａｋａｔａｎｉ  Ｔ．等，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９４年，第７巻，ｐ．４３５−４４３］、文献［Ｊｏｎｅｓ等，Ｎａｔｕｒｅ，１９８６年，第３２１巻，ｐ．５２２−５２５］、文献［Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１９９２年，第２巻，ｐ．５９３−５９６］などを参照することができる。
【００３４】
前記ヒト抗体は、内因性免疫グロブリンを産生することができる遺伝子を破壊したマウスなどの動物にヒト免疫グロブリン遺伝子を導入させて、その動物に特定抗原を免疫させて得られる抗体をいう。具体的な内容は、文献［Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ等，Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．米国，１９９３年，第９０巻，ｐ．２５５１］、文献［Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ等，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３年，第３６２巻，ｐ．２５５−２５８］、文献［Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ等，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，１９９３年，第７巻，ｐ．３３］、文献［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９１年，第２２７巻，ｐ．３８１；Ｍａｒｋｓ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，１９９１年，第２２２巻，ｐ．５８１−５９７］などを参照することができる。
【００３５】
前記抗体の断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（重鎖や軽鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させた抗体）、Ｆｖ断片、Ｆａｂ／ｃ（１個のＦａｂと完全なＦｃを有する抗体）、線形抗体（Ｚａｐａｔａ等，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１９９５年，第８（１０）巻，ｐ．１０５７−１０６２）、抗体をタンパク質切断酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理して得られた抗体断片、断片に対する遺伝子を後述のように遺伝子組換え方法で宿主細胞に導入及び発現させて得られる抗体断片を含む意味である。前記抗体のグロブリン類型も標的タンパク質であるｓＣＤ９３に特異的に結合するものなら特別に限定されず、そのグロブリン類型は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＹ及びＩｇＤ中でいずれか一つであり得る。
【００３６】
一方、ポリクローナル抗体は、鳥類（例えば、ニワトリなど）、哺乳動物（例えば、うさぎ、やぎ、馬、ひつじ、なずみ、非ヒト霊長類（さる、チンパンジー、ゴリラなど）に標的タンパク質であるｓＣＤ９３を免疫させることで製造することができる。通常、最終免疫日から６〜６０日後に酵素免疫測定法（ＥＩＡ及びＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）などで抗体価を測定して、最大抗体価を示す時に採血する過程を踏むようになる。抗体は、免疫された動物の血液から当業界の公知または慣用の方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、親和度クロマトグラフィーなどの方法を用いて精製することができる。
【００３７】
モノクローナル抗体は、標的タンパク質であるｓＣＤ９３に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株によって得ることができる。このようなハイブリドーマ細胞株を産生するための方法として、例えば動物（例えば、マウス）を標的タンパク質であるｓＣＤ９３で免疫させて、その免疫させた動物から脾臓細胞を採取して、その脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させて、それによってハイブリドーマ細胞を生成して、そして目的とするモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞株を同定する方法を挙げることができる。そのような細胞株からモノクローナル抗体の分離または回収は、当業界の公知または慣用の技術によって可能である。
【００３８】
このようなモノクローナル抗体の製造に対して、下記により詳しく説明する。
【００３９】
まず、モノクローナル抗体を得るためには、免疫源の標的タンパク質であるｓＣＤ９３を哺乳動物、例えばラット、マウス、うさぎ、さる、やぎ、非ヒト霊長類（さる、チンパンジー、ゴリラ）などに投与する必要がある。免疫源の１回投与量は、当業者が免疫動物の種類、投与経路などを考慮してその通常の能力範囲内で適切に決定することができる。通常は、動物１匹当たり約５０〜２００μｇである。投与は、通常、免疫源をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水などで適量希釈または懸濁して、通常のアジュバントを混合して乳化した後に皮下、腹腔内に注入して行なうことができる。このような投与は、初めの投与後、数日から数週の間隔で、好ましくは１〜４週間間隔で２〜１０回、好ましくは３〜４回にわたって行なわれる。免疫源の投与を継続しながらＥＬＩＳＡ方法などによって免疫動物の血清中の抗体価を測定して抗体価が頂点（ｐｌａｔｅａｕ）に到達した時は、最終的に免疫源を静脈内または腹腔内に投与して、その最終投与日から２〜５日後に抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞では、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞などを挙げることができるが、脾臓細胞またはリンパ節細胞が好ましい。
【００４０】
抗体産生細胞を採取した後には、投与された免疫源すなわち本発明の標的タンパク質であるｓＣＤ９３に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を製造する。このようなハイブリドーマは、当業界の公知または慣用の技術によって産生して同定することが可能である。通常は、抗体産生細胞、好ましくは脾臓細胞を免疫された動物から採取して、その脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させてハイブリドーマ細胞を製造して、免疫源に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定する工程を経ることになる。抗体産生細胞と融合するのに用いられる骨髄腫細胞株は、マウスなどの動物に由来した細胞株を使用することができるが、このような細胞株は商業的に入手可能である。好ましい骨髄腫細胞株は、免疫動物と同種系の動物に由来して、抗生剤などに対する薬剤選択性を有して、脾臓細胞と融合されない状態では、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミンを含むＨＡＴ選択培地で生存することができず、脾臓細胞と融合した状態でのみ生存することができる特性を有することが好ましい。骨髄腫細胞株の具体的な例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＨＧＰＲＴ（ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎｅ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｏｒｉｂｏｓｙｌ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損細胞株であるＰ３Ｘ６３（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ９）などを挙げることができる。
【００４１】
抗体産生細胞である脾臓細胞と骨髄腫細胞株の融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で抗体産生細胞と骨髄腫細胞株を適正な割合（約１：１〜２０：１の割合）で混合して、細胞融合促進剤の存在下で融合反応を遂行することで成立つようになる。細胞融合促進剤として平均分子量１５００〜４０００ダルトンのポリエチレングリコールなどを約１０〜８０％の濃度で使用することができる。また、場合によっては融合効率を高めるため、ジメチルスルホキシドなどの補助剤を併用することもできる。また、市販されている細胞融合装置を用いて融合させることもできる。
【００４２】
細胞融合処理後、目的とするハイブリドーマを選別しなければならない。通常細胞懸濁液を牛胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などに適当に希釈した後、マイクロタイタープレート上に細胞をウェル当り２００万個程度で分注して、各ウェルに選択培地を添加して、以後同一な選択培地に適切に交換して新鮮な培地を供給しながら培養する。培養温度は、通常２０〜４０℃である。骨髄腫細胞株がＨＧＰＲＴ欠損株またはチミジンキナーゼ欠損株の場合には、ヒポキサンチン、アミノプテリンまたはチミジンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）を用いることで、抗体産生細胞と骨髄腫細胞株のハイブリドーマのみを選択的に培養して増殖させることができる。それで選択培地で培養開始後約１４日前後で生育した細胞をハイブリドーマとして得ることができる。続いて、増殖されたハイブリドーマの上澄み培養物から目的とする抗体の存在有無をスクリーニングする。このようなハイブリドーマのスクリーニングは、当業界の公知または慣用の技術にしたがってなされ得る。そのよう技術として例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ：Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙ及びＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法などを挙げることができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法などによって行なうことができる。
【００４３】
クローニングされたハイブリドーマは、１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、無血清培地など動物細胞培養培地で通常の培養条件（例えば、３７℃、５％  ＣＯ２濃度）で培養すれば良い。培養期間は２〜１０日程度である。モノクローナル抗体は、その上澄み培養物から得ることができる。
【００４４】
モノクローナル抗体は、当業界の公知または慣用の技術を用いて回収することができる。そのような当業界の公知または慣用の技術としては、硫酸アンモニウム塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、親和度クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの方法またはこれらを組み合わせた方法などを挙げることができる。
【００４５】
本発明のモノクローナル抗体の産生には、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングして適当なベクターに挿入させてそれを適当な宿主細胞に導入及び発現させて得る遺伝子組換え技術を用いることもできる（Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９０年，第１９２巻，ｐ．７６７−７７５）。
【００４６】
具体的に本発明の抗体を産生するハイブリドーマから本発明の抗体の可変領域（Ｖ領域）を暗号化するｍＲＮＡを得る。このよなｍＲＮＡの収得は、当業界の公知または慣用の方法、例えばグアニジン超遠心分離法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，１９７９年，第１８巻，ｐ．５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．等，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第１６２巻，ｐ．１５６−１５９）などを用いて全体ＲＮＡを収得して、その全体ｍＲＮＡからｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）などを用いて目的とするｍＲＮＡを収得することで成される。代案的には、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製品）を用いることで、ｍＲＮＡを直接収得することもできる。
【００４７】
収得されたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体可変領域のｃＤＮＡを合成する。必要ならｃＤＮＡ合成または増幅にＲＡＣＥ  ＰＣＲ方法などを適用することもできる。このように得られた可変領域を暗号化するｃＤＮＡを抗体の不変領域（Ｃ領域）を暗号化するＤＮＡを含む発現ベクターに挿入する。このような発現ベクターは、本発明の標的タンパク質であるｓＣＤ９３のＤＮＡ組換え産生方法と関連して後述するようにプロモーター、エンハンサー、複製開示点、ポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位など調節配列を含むことができる。この発現ベクターが宿主細胞に形質転換されると抗体の産生が可能になる。抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）を暗号化するＤＮＡをそれぞれ発現ベクターに組換えして宿主細胞を同時形質転換させても構わず、または重鎖及び軽鎖を暗号化するＤＮＡを単一の発現ベクターに挿入して宿主細胞を形質転換させても構わない（ＷＯ９４／１１５２３号公報）。
【００４８】
一方、本発明の抗体を得るために用いた免疫源としての本発明の標的タンパク質であるｓＣＤ９３は、当業界の公知または慣用のＤＮＡ組換え技術によって得ることができる。一般的には、本発明の標的タンパク質であるｓＣＤ９３のｃＤＮＡを製作してそのｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、その発現ベクターを原核または真核宿主細胞に形質転換させてその形質転換された宿主細胞を適当な培地で培養して、その培養液または細胞から得るようになる。前記ｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋなどの遺伝子／タンパク質データベースが提供する遺伝子配列または本明細書が提供する配列に基づいて当業者の通常の能力範囲内で製作可能である。
【００４９】
このようなｃＤＮＡの製造には、ホスホアミダイト法などを用いるＤＮＡ合成装置、ＲＴ−ＰＣＲ法、ｃＤＮＡライブラリから目的とするｃＤＮＡを得るための混成化方法などを用いることができ、必要によってはＰＣＲ方法などによって目的とするｃＤＮＡを増幅することもできる。
【００５０】
前記で発現ベクターは、バイオテクノロジーの会社、例えばノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社、ダカラ酒造、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社、ロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ）社、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社、ジェネティクスインスティチュート（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）社などから商業的に入手可能である。
【００５１】
このような発現ベクターには、本発明の標的タンパク質であるｓＣＤ９３をコードするＤＮＡ以外に調節エリメント、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、リボソーム、結合部位、複製開示点、ターミネーター、選択マーカー、単離または精製を容易にするための標識ペプチド配列（例えば、ヒスチジン反復配列を暗号化する塩基配列）などを含むことができる。
【００５２】
宿主細胞は、細菌などの原核細胞（例えば、大腸菌、枯草菌）、及び酵母（例えば、サッカロマイセスセレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ細胞）、ホ乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ）などの真核細胞を使用することができる。
【００５３】
宿主細胞またはその培養物から本発明の標的タンパク質の精製には、限外ろ過、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、親和度クロマトグラフィー（標識ペプチドが結合された場合）、ＨＰＬＣ、疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどの方法やこれらを組み合わせる方法を用いることができる。
【００５４】
ＤＮＡ組換え技術による本発明の標的タンパク質の産生に対しては、本明細書の記載内容以外に「Ｓａｍｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，米国（１９８９年）」、「Ａｕｓｕｂｅｌ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｎ  Ｗｉｌｌｅｙ  ＆ Ｓｏｎｓ，米国（１９９３年）」及び「Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆ Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．著，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１年１月１５日発行の第１巻ｐ．７．４２〜７．４５，第２巻，ｐ．８．９〜８．１７」などの文献を参照することができる。これらの文献は、本明細書の一部として見なされる。
【００５５】
本発明の抗体を産生するための免疫源としての本発明の標的タンパク質は、その断片（ｓＣＤ９３の断片）や全長のタンパク質（ＣＤ９３自体）を用いることもできる。断片や全長のタンパク質を用いて得られる抗体も、本発明の標的タンパク質に特異的に結合する能力を保有する可能性があるからである。
【００５６】
また、本発明は、配列番号４の塩基配列からなるＣＤ９３遺伝子の発現を抑制することができるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの発現ベクターからなる群から選択された一つ以上のものを有効成分として含む抗炎症性組成物を提供する。
【００５７】
また、本発明は、前記ＣＤ９３遺伝子の発現を抑制することができるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの発現ベクターからなる群から選択された一つ以上のものを抗炎症性組成物の製造に用いる用途を提供する。
【００５８】
本発明者等は、ＣＤ９３遺伝子に対するｓｉＲＮＡをＴＨＰ−１に処理した時、炎症誘発物質であるＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）処理時に増加する炎症性サイトカインであるＴＮＦ−ａ及びＩＬ−６の発現量を減少させることを確認した。
【００５９】
特定遺伝子に対する短い二重ＲＮＡであるｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）やｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｒｉｐｉｎ  ＲＮＡ）が細胞内に導入される場合、リボヌクレアーゼであるダイサー（ｄｉｃｅｒ）によってプロセッシングされてＲＩＳＣ（ＲＮＡ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｃｉｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）に結合することでＲＮＡｉを誘導することが知られている（Ｎａｔｕｒｅ，１９９８年，第３９１巻，ｐ．８０６−８１１；Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００１年，第１５巻，ｐ．４８５−４９０；Ｎａｔｕｒｅ，２００１年，第４１１巻，ｐ．４９４−４９８；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００年，第２８７巻，ｐ．２４９４−２４９７；Ｃｅｌｌ，２０００年，第１０１巻，ｐ．２５−３３）。このようなＲＮＡｉには、ヘリカーゼとエンドヌクレアーゼが関与するが、ヘリカーゼによってｓｉＲＮＡの二重鎖のＲＮＡが解かれてその中のアンチセンスは標的遺伝子のｍＲＮＡに結合するが、この結合された部位はエンドヌクレアーゼによって加水分解されるようになる（Ｃｅｌｌ，２０００年，第１０１巻，ｐ．２５−３３；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２年，第２９６巻，ｐ．１２６５−１２６９、２００２；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３年２月２８日，第２７８（９）巻，ｐ．７１０８−１８）。
【００６０】
本明細書で、「ｓｉＲＮＡ」はその標的遺伝子のＲＮＡに対してＲＮＡｉ現象を誘導することができる１０〜４０塩基対を有する二重鎖ＲＮＡ、好ましくは１５〜３０の塩基対を有する二重鎖ＲＮＡ、さらに好ましくは２０〜２２塩基対を有する二重鎖ＲＡＮを意味する。このようなｓｉＲＮＡは、ブラント（ｂｌｕｎｔ）末端を有するか突出（ｏｖｅｒｈａｎｇ）末端を有することができ、突出末端を有する場合それは、３’末端と５’末端の両方で可能である。好ましくは３’末端が突出した場合である。突出した末端の塩基数は１〜５で、２〜３塩基であることが好ましい。
【００６１】
本明細書で、「ｓｈＲＮＡ」は２〜１０塩基のループ領域を有するヘアピン構造の二重鎖ＲＮＡをいう。このようなループ領域の塩基は、当業界に公知されたものなどを使用することができる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００２年，第９９（８）巻，ｐ．５５１５−５５２０；Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００２年，第２０巻，ｐ．５０５−５０８；Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０２年，第２０巻，ｐ．５００−５０５；Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２００３年，第５巻，ｐ．４８９−４９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国，２００２年，第９９（９）巻，ｐ．６０４７−６０５２）。ｓｈＲＮＡの二重鎖部分は、前記ｓｉＲＮＡと同一に構成することができるので、ｓｉＲＮＡと関連した説明がそのまま適用できる。
【００６２】
本明細書で、「ｓｈＲＮＡの発現ベクター」は、ｓｈＲＮＡのコード配列を含むことによって、細胞内でｓｈＲＮＡを発現させることができるベクターを意味する。前記ｓｈＲＮＡコード配列は、ＣＤ９３遺伝子の一部配列とループ領域を構成するスペーサー（ｓｐａｃｅｒ）配列及びそのＣＤ９３遺伝子の一部配列に相補的な配列で構成されるが、ｓｈＲＮＡコード配列は、用いる発現ベクターによってＲＮＡやＤＮＡであり得、発現ベクターの調節配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナルなど）に作動可能に連結されるようになる。発現ベクターは、プラスミド由来の発現ベクターまたはレンチウイルスベクターであることができる。プラスミド由来の発現ベクターは、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社（Ｃａｔ  Ｎｏｓ．Ｃ８７５０、Ｃ８７６０、Ｃ８７７０、Ｃ８７８０、Ｃ８７９０、Ｃ７８００等）、ゲンスクリプト（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）社（（Ｃａｔ．Ｎｏｓ．ＳＤ１２０１、ＳＤ１２０２、ＳＤ１２０７）など生命工学会社が市販するものを購入して使用するか自己製作して使用することができる。レンチウイルスベクターの利用に対して国際特許第ＷＯ２００４／０６５５４９号の開示内容を参照することができる。
【００６３】
一方、本発明の組成物は、ｓＣＤ９３に対する抗体やｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどを含む以外に、一般的に製薬上許容される担体を含むことができる。ここで「製薬上許容される」の意味は、有効成分の活性を抑制せずに適用（処方）対象が適応可能以上の毒性を持たない（充分に低い毒性）意味である。このような担体の例としては、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エチルアルコール、ポリアルコール（例、マンニトール、ソルビトール）、塩化ナトリウムなどを挙げることができる。
【００６４】
本発明の組成物は、その保存寿命を延長したり有効性を保存したりするために、保存剤、抗酸化剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、非イオン系界面活性剤などを含むこともできる。このような保存剤、抗酸化剤、湿潤剤などとして適当なものは当業界で公知されている。
【００６５】
本発明の組成物は、多様な形態に剤形化することができ、例えば液状溶液、懸濁液、シロップ、錠剤、丸薬などに剤形化することができるが、これに限定されるのではない。
【００６６】
本発明の組成物は、ヒトを含むホ乳動物に経口または非経口で投与することができるが、通常は抗体を有効成分として含むバイオ医薬品と同じく静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内注射によって投与することができるが、これに限定されるのではない。
【００６７】
本発明の組成物の投与量は、前記組成物の有効成分の含有量、疾病の重症度、患者の体重、薬物形態、投与経路、投与期間によって医学的専門家によって決定されるが、通常は１日に０．０１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲内で決定することができるが、これに限定されるのではない。
【００６８】
また、本発明は、ＣＤ９３またはその可溶性断片を有効成分として含む炎症性疾患診断用マーカーを提供する。
【００６９】
前記ＣＤ９３は、配列番号３３で表わされるアミノ酸配列を有することが好ましいが、これに限定されない。
【００７０】
前記ＣＤ９３可溶性断片は、膜通過タンパク質であるＣＤ９３タンパク質が細胞培養後放出された細胞外部分（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）であり、９５ｋＤａ程度の断片であることが好ましいが、これに限定されない。
【００７１】
本発明によるＣＤ９３の発現が、ヒト単核球細胞であるＴＨＰ−１細胞でＬＰＳ、ＴＮＦ−ａによって増加し、ＰＭＡ処理によってはあまり増加しない。しかし、ＣＤ９３可溶性断片の量は、ＬＰＳ、ＴＮＦ−ａ、ＰＭＡ処理によってすべて増加する。また、マウスにＰＢＳ、チオグリコレート、ＬＰＳを注射した後、腹膜細胞中の大食細胞でのマウスＣＤ９３発現は、ＬＰＳ処理によって最も大きく増加して、チオグリコレート処理によっても類似に増加する。また、血清内ＣＤ９３可溶性断片の量は、ＬＰＳやチオグリコレートによって大きく変化しないが、腹膜液内のＣＤ９３可溶性断片の量は、ＬＰＳやチオグリコレート処理によって顕著に増加する。
【００７２】
また、退行性関節炎患者から得た滑膜組織よりリウマチ性関節炎患者から得た滑膜組織でＣＤ９３の発現が顕著に高く示されて、リウマチ性関節炎患者から得た滑膜液内でのＣＤ９３可溶性断片の量が退行性関節炎患者群より顕著に高く示される。
【００７３】
前記のように、本発明によるＣＤ９３またはその可溶性断片は、炎症誘導物質による、または炎症性環境でＣＤ９３発現が増加してＣＤ９３可溶性断片の量が増加する。したがって、本発明によるＣＤ９３またはその可溶性断片は、炎症性疾患の診断マーカーとして有用に用いることができる。
【００７４】
前記炎症性疾患は、喘息、アレルギー性及びに非アレルギー性鼻炎、慢性及び急性鼻炎、慢性及び急性胃炎または腸炎、潰瘍性胃炎、急性及び慢性腎臓炎、急性及び慢性肝炎、慢性閉鎖性肺疾患、肺線維症、過敏性大腸症侯群、炎症性痛み、偏頭痛、頭痛、腰痛、繊維筋肉痛、筋膜疾患、ウイルス感染、バクテリア感染、かび感染、やけど、外科的または歯科的手術による傷、プロスタグランジンＥ過多症侯群、アテローム性動脈硬化症、痛風、退行性関節炎、リウマチ性関節炎、強直性脊柱炎、ホジキン病、膵臓炎、結膜炎、紅彩炎、腹膜炎、ぶどう膜炎、皮膚炎、湿疹、多発性硬化症などを含むが、これに限定されない。
【００７５】
また、本発明は、ＣＤ９３またはその可溶性断片に特異的に結合する抗体またはアプタマーを含む炎症性疾患診断キットを提供する。
【００７６】
また、本発明は、ＣＤ９３またはその可溶性断片に特異的に結合する抗体またはアプタマーを炎症性疾患診断用キットの製造に用いる用途を提供する。
【００７７】
前記炎症性疾患診断キットは、本発明のＣＤ９３またはその可溶性断片マーカーを用いて当業界で一般的に用いる製造方法によって容易に製造することができる。前記アプタマーは、それ自体で安定した三次構造を有しながら標的分子に高い親和性と特異性で結合することができる特徴を有した単一鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡまたは変形核酸）である。
【００７８】
前記炎症性疾患診断キットは、ＣＤ９３またはその可溶性断片に特異的に結合する抗体、基質との反応によって発色する標識体が接合された２次抗体接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、前記標識体と発色反応する発色基質溶液、洗浄液及び酵素反応停止溶液などを含むことができる。
【００７９】
また、本発明は、本発明のＣＤ９３またはその可溶性断片マーカーを用いて炎症性疾患を診断する方法を提供する。
【００８０】
具体的に、前記方法は、下記の工程で遂行することが好ましいが、これに限定されない：
１）生物学的試料及び対照群のタンパク質を固定体にコーティングさせる工程、
２）前記固定体に炎症性疾患診断用マーカーであるＣＤ９３またはその可溶性断片に特異的に結合する抗体を添加して抗原抗体結合反応を遂行する工程、
３）前記抗原抗体結合反応を通じて生成された抗原抗体結合反応物を２次抗体接合体の標識体及び発色基質溶液を用いて検出する工程、及び
４）生物学的試料と対照群に対する検出結果とを比較する工程。
【００８１】
前記生物学的試料は、組織、細胞、血液、血清、腹膜液、滑膜液、唾液、小便及び大便からなる群から選択されるいずれか一つ以上であることが好ましいが、これに限定されない。
【００８２】
前記方法において、２次抗体接合体の標識体は、発色反応をする通常の発色剤が好ましく、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）、塩基性脱リン酸化酵素（アルカリホスファターゼ）、コロイドゴールド（ｃｏｌｏｉｄ  ｇｏｌｄ）、ＦＩＴＣ（ポリ−Ｌ−リジン−フルオレセインイソチオシアネート）、ＲＩＴＣ（ローダミン−Ｂ−イソチオシアネート）などの蛍光物質、及び色素などを用いることができる。
【００８３】
前記方法において、発色基質溶液は標識体によって使用することが好ましく、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）、ＡＢＴＳ［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）］、ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン）などを使用することができる。ここで、発色基質は緩衝溶液（０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５）に溶解された状態で提供することがさらに好ましい。
【００８４】
前記洗浄液は、リン酸塩緩衝溶液、ＮａＣｌ及びツイーン２０を含むことが好ましく、０．０２Ｍリン酸塩緩衝溶液、０．１３Ｍ  ＮａＣｌ、及び０．０５％ツイーン２０で構成された緩衝溶液（ＰＢＳＴ）がさらに好ましい。洗浄液は、抗原抗体結合反応後、抗原抗体結合体に２次抗体を反応させた後、適量を固定体に加えて３回ないし６回洗浄することが好ましいが、これに限定されない。反応停止溶液は、硫酸溶液を用いることができる。
【００８５】
本発明は、生物学的試料でＣＤ９３またはその可溶性断片に特異的に結合する抗体を用いた抗原抗体結合反応を通じてＣＤ９３またはその可溶性断片を検出して、炎症性疾患の診断または予後を早期に予測することができる。前記生物学的試料は、組織、細胞、血液、血清、腹膜液、滑膜液、唾液、小便または大便を含むが、これに限定されない。具体的には、生物学的試料内のＣＤ９３またはその可溶性断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動して分画して固定体に移して固定させた後、固定されたＣＤ９３またはその可溶性断片に特異的に結合する抗体を加えて抗原抗体結合反応を遂行して、ＣＤ９３またはその可溶性断片の発現水準を測定する。すなわち、生物学的試料でＣＤ９３またはその可溶性断片の発現水準が高ければ、炎症性疾患を有すると診断するか、炎症性疾患の可能性を有すると予測するものである。
【００８６】
前記方法において、抗原抗体結合反応のための固定体では、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜（ポリビニリデン・ジフルオライド膜）、ポリビニル樹脂またはポリスチレン樹脂で合成された９６ウェルプレート、及びガラス製のスライドガラスなどを用いることができる。
【００８７】
前記方法において、抗原抗体結合反応は通常の酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、放射能免疫分析法（ＲＩＡ）、サンドイッチＥＬＩＳＡ法、ノーザンブロット、ウエスタンブロット、免疫沈降法、免疫組織化学染色法、蛍光免疫法、酵素基質発色法、抗原抗体凝集法、ＳＰＲ（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）、バイオチップ（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、電気泳動法、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲなどの方法を用いて測定することができる。
［発明の実施のための形態］
【００８８】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。
【００８９】
しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供するものであって、実施例によって本発明の内容が限定されるのではない。
＜実施例１＞ｓＣＤ９３タンパク質の準備
＜１−１＞ｐＹＷ６００の製作
＜１−１−１＞ｏｒｉＰの挿入
まず、ｏｒｉＰをクローニングするため、ｐＭＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を鋳型に正方向プライマー（５’−ｇｔａｇａｔｃｔｇｃａｇｇａａａａｇｇａｃａａｇｃ−３’；配列番号２７）及び逆方向プライマー（５’−ｃｇａｇａｔｃｔｇｇｔｔｇａｃｔｔｃｃｃｔａａｔｇｔ−３’；配列番号２８）を用いて９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分、３０サイクルの条件でＰＣＲ反応を遂行した後、２１８７ｂｐの大きさのＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を用いて精製した。その後、前記ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）で切断した後、切断産物をまた精製した。前記精製された切断断片をｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）のＣＭＶプロモーター上部に存在するＢｇｌＩＩ認識部位にＢｇｌＩＩ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を用いて線形化したベクターに挿入した後、大腸菌に形質転換させて形質転換体を収得した（ｐｃＤＮＡ３．１−ｏｒｉＰ）。前記形質転換体からプラスミドを通常の方法で抽出した後、塩基配列分析を通じてｏｒｉＰが正しく挿入されたかどうか確認した。
＜１−１−２＞ヒト抗体Ｆｃをコードするポリヌクレオチドの挿入
前記製造したｏｒｉＰが挿入されたｐｃＤＮＡ３．１ベクターにヒト抗体Ｆｃをコードするポリヌクレオチドを挿入するため、ｐＬＣＮ−ＭｏＨベクター（韓国登録特許第４５０２６６号）を鋳型に、「Ｂａｍ  ＨＩ−ＳｆｉＩ−ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｃ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ」で構成された正方向プライマー（５’−ｃｇｇ  ｇａｔ  ｃｃ  ｇ  ｇｃｃ  ｇｔｇ  ｇｇｇ  ｇｃｃ  ｇａｃ  ａａａ  ａ  ｃｔ  ｃａｃ  ａｃａ  ｔｇｃ  ｃ−３’：配列番号２９）と「ＸｂａＩ−ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｃ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ」で構成された逆方向プライマー（５’−ｃｇａｇｔｃ  ｔｃａ  ｔｔｔ  ａｃｃ  ｃｇｇ  ａｇａ  ｃａｇ  ｇｇａ−３’：配列番号３０）を用いてＰＣＲ反応を遂行した（９４℃、４分処理後、９５℃、３０秒、６０℃、３０秒、７２℃、１分過程を３０回反復した後７２℃、１０分間延長）。
【００９０】
続いて、ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を用いて精製した。前記精製されたＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで切断した後、どうようにＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで切断した前記で製造したｏｒｉＰが挿入されたｐｃＤＮＡ３．１ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ｏｒｉＰ）に挿入して、ｐｃＤＮＡ３．１−ｏｒｉＰ−Ｆｃを製造した。以後、前記のように製造された組換えプラスミドで大腸菌（ＤＨ５ａ）を形質転換させて、形質転換体を分離した後、プラスミドを収得して、Ｆｃをコードするポリヌクレオチドが正しく挿入されたかどうか確認した。このようにしてｐＹＷ６００が完成された。
＜１−１−３＞ｓＣＤ９３＿Ｆｃの発現精製
ｓＣＤ９３＿Ｆｃを動物細胞であるＨＥＫ２９３Ｅ細胞で発現／精製するためにｓＣＤ９３＿Ｆｃを発現させることができる発現ベクターを製作した。
【００９１】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片を含んだ自己製作された前記ｐＹＷ６００をＳｆｉＩで切断した後、ＰＣＲを通じて得られたＣＤ９３断片をＳｆｉＩで切断した後、挿入した。ＣＤ９３断片を増幅するために、ＣＤ９３プラスミド（Ｋｕｇｉ分譲，ｈＭＵ００３９９３，Ｋｕｇｉ  Ｎｏ．ＩＲＡＴ−４９−Ａ０６）を鋳型に用い、正方向プライマーに５’−ＣＡＧＧＧＧＧＣＣＧＴＧＧＧＧＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＣＴＧＡＣＡＣＧＧＡＧＧＣ−３’（配列番号３１）を、逆方向プライマーに５’−ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＡＡＧＴＣＣＡＣＡＣＡＧＴＣＣＡＧＣＴＧＡＣ−３’（配列番号３２）を用いた。ＣＤ９３ＰＣＲ時の鋳型は１００ｎｇを、それぞれのプライマーは１０ｐｍｏｌ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５ｕｎｉｔ／μｌ）０．５μｌ、全体５０μｌを反応させた。ＣＤ９３のＰＣＲ反応条件は、次のとおりである。初期変性過程で９４℃で２分間処理した後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分間を３０回反復し、７２℃で１０分間延長反応を遂行した。ＰＣＲ産物は、ＳｆｉＩで切断させＣＭＶ  Ｉ．Ｅエンハンサー／プロモーターとリーダー配列が前にあって、ＣＤ９３遺伝子が入った後、６Ｘ  Ｈｉｓ  ｔａｇ、Ｆｃ、Ｍｙｃ、８Ｘ  Ｈｉｓ  ｔａｇが順次に作られるｐＹＫ６０２ベクターで挿入してｐＹＫ−ＣＤ９３＿Ｆｃベクターを作った。
【００９２】
前記製作されたｐＣＤ９３＿Ｆｃ  ２０μｇとポリエチレンイミン（ＰＥＩ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）４０μｇを混合して１５０ｍｍディッシュにあらかじめ育てておいたＨＥＫ２９３Ｅ細胞に導入した。培養液を総８日間２日ごとに集めてフィルターリングした後、タンパク質Ａセパロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて精製した。精製した試料をＰＩＥＲＣＥ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｒｅａｇｅｎｔ）で定量してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけてそのサイズを確認した（図２）。還元された状態（Ｒｅｄｕｃｅｄ；Ｒ）でｓＣＤ９３＿Ｆｃは、７０ｋＤａ程度であり、還元されない状態（Ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｅｄ；Ｎ）では１４０〜１５０ｋＤａ程度だった。
＜実施例２＞ｓＣＤ９３タンパク質のＴＨＰ−１細胞の大食細胞への分化誘導効果実験
ヒト由来の急性単球性白血病細胞であるＴＨＰ−１細胞は、ＰＭＡなどの化学物質によって付着、広がり（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）、成熟過程を経て大食細胞に分化する。本実験では、ｓＣＤ９３がＴＨＰ−１細胞の大食細胞への分化誘導効果を実験した。
【００９３】
まず、５×１０３ＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣから購入）を９６ウェルプレートに移した。それぞれの陰性対照群にＰＢＳ、Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）、正常ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ，５μｇ／ｍｌ）を添加して、陽性対照群にはＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ，０．１μｇ／ｍｌ）を処理し、実験群にはｓＣＤ９３＿Ｆｃを５、１、０．２、０．０４μｇ／ｍｌ濃度で処理した。処理後３０分間３７℃培養室に放置した後再び取り出して、付着した細胞が落ちないようにタッピング（ｔａｐｐｉｎｇ）で付着しない細胞を除去した。ＰＢＳで２回さらに洗浄した後、光学顕微鏡（Ｌｅｉｋａ）で写真を撮った（図３）。付着しない細胞を集めた培養上澄み液にヘマサイトメータ（Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、その数を計算した。初めに入れた細胞数から付着しない細胞数を引いた残りを百分率で示した。ＴＨＰ−１細胞は、陰性対照群では付着しないが、ｓＣＤ９３＿Ｆｃを処理した実験群では濃度依存的に付着程度（％）が高くなることを観察することができた（図４）。
【００９４】
その次に前記と同一な方式を、ＴＨＰ−１細胞でｓＣＤ９３＿Ｆｃの分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｉａｔｉｏｎ）効果調べた。陰性対照群にＰＢＳ（−）、ｈＩｇＧ  ５μｇ／ｍｌを処理して、陽性対照群はＰＭＡ  ０．１μｇ／ｍｌを処理した。実験群にはｓＣＤ９３＿Ｆｃを５μｇ／ｍｌの濃度で処理してそれぞれを３日間培養して光学顕微鏡で写真を撮影した。陰性対照群は分化しなかったし、ｓＣＤ９３＿Ｆｃを入れたＴＨＰ−１細胞はＰＭＡと類似にマクロファージ様細胞に分化した（図５）。
【００９５】
このようなＴＨＰ−１細胞の分化による単核球細胞であるＴＨＰ−１細胞が、実際に大食細胞（マクロファージ）に分化するかどうかを調べるため、すでに知られた大食細胞及び樹枝状細胞、そして好中球分化マーカーであるＣＤ１４、ＣＤ１ａ及びＣＤ６４のＲＮＡ発現量を測定するためにリアルタイムＰＣＲを遂行した。ＴＨＰ−１細胞に陰性対照群としてＰＢＳ（−）、ｈＩｇＧ  ５μｇ／ｍｌを処理して、陽性対照群はＰＭＡ０．１μｇ／ｍｌを処理した。また実験群ではｓＣＤ９３＿Ｆｃ  ５μｇ／ｍｌを処理して２４時間が経過した後、ＬＰＳによる感受性を調べるためにＬＰＳを処理した。処理後さらに２４時間が経過した後、ＲＮＡを分離精製した（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉＴ）。精製されたＲＮＡ１μｇを逆転写（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）（ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）してｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡに対して下記＜表１＞のプライマー、ｉＧ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）及びＣＦＸ−９６  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて定量−ＰＣＲを遂行した。
【００９６】
その結果、ｓＣＤ９３処理によってＴＨＰ−１細胞が大食細胞に分化することが分かり、ＬＰＳ処理によって分化マーカーであるＣＤ１４のＲＮＡ水準がより高くなることが分かった（図６）。
【００９７】
【表１】
0005752052.tif 000002
【００９８】
＜実施例３＞ｓＣＤ９３タンパク質のミトゲン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性誘導効果実験
このようなＴＨＰ−１細胞の分化が分子的にどのように起きるのかを調べるため、ＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ）信号経路を中心に調べた。
【００９９】
具体的に、ＴＨＰ−１細胞に陰性対照群としてＰＢＳ（−）、Ｆｃ  ５μｇ／ｍｌ、ｈＩｇＧ  ５μｇ／ｍｌを処理して、陽性対照群はＰＭＡ０．１μｇ／ｍｌを処理した。実験群はｓＣＤ９３＿Ｆｃを５、１、０．２、０．０４μｇ／ｍｌの濃度で処理した。処理後３０分間３７℃の培養室に放置して再び取り出して、溶解緩衝溶液で溶解させた後、ウエスタンブロットを実施した。１次抗体としてｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｋ  １／２（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８（１次抗体）、そして定量のためにｔｏｔａｌ−ｐ３８（１次抗体）をそれぞれブロッティングした。ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｋ  １／２とｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８の量が、ｓＣＤ９３＿Ｆｃ処理によって濃度依存的に増加することが分かった（図７）。
【０１００】
また、時間的変化によるｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｋ  １／２量を観察するため、前記と同一な方法でｓＣＤ９３＿Ｆｃ  ５μｇ／ｍｌを０、１０、３０、６０、１８０分間それぞれ処理してウエスタンブロットを実施した。陽性対照群としてＰＭＡ０．１μｇ／ｍｌとＬＰＳ  １μｇ／ｍｌをそれぞれ同一な方法で処理してウエスタンブロットを実施した。ｓＣＤ９３＿Ｆｃ処理によって１０分経過後からｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｋ  １／２の量が増加し始めて、３０分で最も大きく増加し、６０分から若干減少する傾向を示した（図８）。
【０１０１】
このようなＴＨＰ−１細胞の分化とＭＡＰＫ信号の変化によるサイトカインの変化を調べるため、いろいろなよく知られた前炎症サイトカインの発現変化をＲＮＡ水準で調べた。ＴＨＰ−１細胞に陰性対照群としてＰＢＳ（−）、ｈＩｇＧ  ５／ｍｌを処理して、陽性対照群はＰＭＡ０．１μｇ／ｍｌを処理し、また実験群ではｓＣＤ９３＿Ｆｃを処理した。２４時間が経過した後、ＬＰＳによる感受性を調べるためにＬＰＳを処理した。ＬＰＳ処理後さらに２４時間が経過した後、ＲＮＡを分離精製した（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉＴ）。精製されたＲＮＡ１を逆転写（ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）してｃＤＮＡを合成した。前記ｃＤＮＡに対しての下記＜表２＞のプライマー配列、ｉＧ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とＣＦＸ−９６リアルタイムシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて定量−ＰＣＲを遂行した。ｓＣＤ９３＿Ｆｃ処理によって炎症性サイトカインであるＴＮＦ−ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６等が、ＲＮＡ水準で若干増加し、ＬＰＳを追加処理することで顕著にさらに増加することが分かった（図９ないし図１１）。
【０１０２】
【表２】
0005752052.tif 000003
【０１０３】
次に、このようなＴＨＰ−１細胞の分化とＭＡＰＫ信号の変化にしたがって炎症性サイトカインの中でＴＮＦ−ａの発現がどのように変化するかをタンパク質水準で測定した。
【０１０４】
具体的に、ＴＨＰ−１細胞に陰性対照群としてＰＢＳ（−）、ｈＩｇＧ  ５μｇ／ｍｌを処理して、陽性対照群はＰＭＡ０．１μｇ／ｍｌを処理し、また実験群にはｓＣＤ９３＿Ｆｃを処理した。２４時間が経過した後、ＬＰＳによる感受性を調べるためにＬＰＳを処理した。ＬＰＳ処理後さらに２４時間が経過した後、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＴＮＦ−ａ分析キット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて培養上澄み液に含まれたＴＮＦ−ａ量を測定した。ｓＣＤ９３＿Ｆｃのみ処理した実験群でＴＮＦ−ａの量が少し増加し、ｓＣＤ９３＿ＦｃとＬＰＳを処理した実験群では、ＬＰＳのみ処理した実験群に比較して、ＴＮＦ−ａが比較的高く測定されることが分かった。これは、ｓＣＤ９３＿ＦｃによってＴＨＰ−１細胞が大食細胞に分化して、ＴＬＲ信号に対する感受性が増加したことを示すものである（図１２）。
＜実施例４＞ｓＣＤ９３タンパク質の基質金属タンパク質分解酵素（ＭＭＰ）の発現誘導効果実験
その次に、ｓＣＤ９３＿Ｆｃ処理によるＴＨＰ−１細胞の基質金属蛋白質分解酵素（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ，ＭＭＰ）発現に対する影響を調べた。ＴＨＰ−１細胞に陰性対照群としてｈＩｇＧ  ５μｇ／ｍｌを処理して、陽性対照群はＰＭＡ０．１μｇ／ｍｌを処理した。実験群ではｓＣＤ９３＿Ｆｃを５、１、０．２μｇ／ｍｌの濃度で処理した。処理後２４時間が経過した後、ゼラチンザイモグラフィ分析法を用いて培養上澄み液に含まれたＭＭＰ−９（９２ｋＤａ）とＭＭＰ−２（７２ｋＤａ）の発現変化を観察した。ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）最終濃度が２ｍｇ／ｍｌになるように８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを作った後、２４時間の間培養した上澄み液をかけてクマシーブルーで染色した後、脱染色溶液で弱く色抜きした後、ゲルを写真撮影した。
【０１０５】
その結果、ＭＭＰ−９の量がｓＣＤ９３＿Ｆｃ処理によって濃度依存的に増加することが分かった（図１３）。
＜実施例５＞ｓＣＤ９３タンパク質の食作用誘導効果実験
このようなＴＨＰ−１細胞の大食細胞類似（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｌｉｋｅ）細胞への分化による食作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）効果調べるため、ｍＲＦＰを発現しているバクテリア（Ｅ．ｃｏｌｉ）を用いて食作用を測定した。ＴＨＰ−１細胞にｓＣＤ９３＿Ｆｃ  ５μｇ／ｍｌを処理して３日間培養した後、あらかじめ育てておいたＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）発現ベクターで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを分化したＴＨＰ−１細胞に入れた。再び、１２時間が経過した後、蛍光顕微鏡でバクテリアが分化したＴＨＰ−１細胞によって食作用されたことを確認し（図１４）、この細胞を細胞分離緩衝溶液（ｃｅｌｌ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（ＥＤＴＡ緩衝溶液）で分離してＦＡＣＳ（Ｃｏｏｌｔｅｒ）分析を実施した（図１５）。
【０１０６】
その結果、ｓＣＤ９３＿Ｆｃ処理によって分化された細胞の食作用が、陰性対照群のｈＩｇＧ処理によるものよりずっと増加して蛍光が示されることが分かった。
＜実施例６＞ＣＤ９３タンパク質抗体のＴＮＦ−ａ生成阻害効果実験
このようなｓＣＤ９３＿Ｆｃの炎症効果と大食細胞分化効果に対して、それに対する抗体の抗炎症剤としての開発可能性を調べるため、ＣＤ９３に対する抗体処理によってこのような効果が抑制されるのかどうか調べた（図１６）。ＴＨＰ−１細胞に陰性対照群としてＰＢＳ（−）、ｈＩｇＧ  ５μｇ／ｍｌを処理して、陽性対照群はＰＭＡ０．１μｇ／ｍｌを処理し、また実験群ではｓＣＤ９３＿Ｆｃ  ５μｇ／ｍｌと抗ＣＤ９３ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）１０μｇ／ｍｌを処理した。２４時間が経過した後、ＬＰＳ  １μｇ／ｍｌによる感受性を調べるためにＬＰＳを処理した。ＬＰＳ処理後、さらに２４時間が経過した後、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＴＮＦ−ａ分析キット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて培養上澄み液に含まれたＴＮＦ−ａ量を測定した。
【０１０７】
その結果、ｓＣＤ９３＿Ｆｃのみを処理した実験群でＴＮＦ−ａの量が少し増加し、ｓＣＤ９３＿ＦｃとＬＰＳを処理した実験群ではＬＰＳのみ処理した実験群と比較して比較的高くＴＮＦ−ａが測定されることが分かった。しかし、抗ＣＤ９３抗体処理によってこのようなＴＮＦ−ａの増加が５０〜６０％以上阻害されることが分かった。
＜実施例７＞ｓｉＲＮＡを用いた多様な炎症促進性サイトカイン発現変化実験
ＴＨＰ−１細胞でＣＤ９３に対するｓｉＲＮＡ阻害技法を用いてＣＤ９３をノックダウンさせた時のさまざまなサイトカインの変化量をリアルタイムＰＣＲを用いて実験した。
【０１０８】
まず、ＴＨＰ−１細胞２×１０５（培地：１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）＋ＲＰＭＩ１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ社））を２４ウェルに入れて置いた後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μｌとＣＤ９３ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＤ９３）（Ｂｉｏｎｅｅｒ社）１０ｐｍｏｌｅを混合した後、１０分間放置した後、あらかじめ入れて置いたＴＨＰ−１細胞に形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた。陰性対照群にはネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社）を用い、陽性対照群には全長ＣＤ９３（ＣＤ９３＿Ｆｕｌｌ）遺伝子（Ｋｕｇｉ分譲、ｈＭＵ００３９９３，Ｋｕｇｉ  Ｎｏ．ＩＲＡＴ−４９−Ａ０６）を用いて同一な方法で形質感染させた。１２時間の間ＣＯ２インキュベーターに保管した後、ＬＰＳを処理し、以後追加で２４時間さらに培養した。以後、実施例２と３で説明したのと同じ方法でＴＮＦ−ａとＩＬ−６に対してリアルタイムＰＣＲを遂行した。
【０１０９】
その結果、ｓｉＣＤ９３処理によって二つの炎症促進性サイトカインの量が減り、ＬＰＳによって増加した量も減少した。これとは反対に、ＣＤ９３を過発現したＣＤ９３＿Ｆｕｌｌ処理群はむしろＴＮＦ−ａやＩＬ−６の量を増加させ、ＬＰＳ処理によってより一層増加する様相を示した（図１７）。
＜実施例８＞ヒト単核球細胞であるＴＨＰ−１細胞でのＣＤ９３発現及びＣＤ９３可溶性断片量の測定実験（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
様々な炎症誘導物質によるまたは炎症性環境でのＣＤ９３発現とその断片化様相を調べるために、ヒト単核球細胞であるＴＨＰ−１細胞でのＣＤ９３発現と培養上澄み液内でのＣＤ９３可溶性断片の量を測定した。
＜８−１＞ヒト単核球細胞であるＴＨＰ−１細胞でのＣＤ９３発現様相：ＦＡＣＳ実験
ＴＨＰ−１細胞は、１０％牛胎児血清、ペニシリンＧ（１００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１．０ｍＭ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３７℃の細胞培養器で培養した。培養されたＴＨＰ−１細胞をＰＢＳ、ＬＰＳ（１．０μｇ／ｍｌ）、ＴＮＦ−ａ（０．５μｇ／ｍｌ）またはＰＭＡ（０．１μｇ／ｍｌ）で２４時間の間処理して、４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。ＰＢＳで１回洗浄して３％ＮＧＳ（ｎｏｒｍａｌ  ｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍ）を用いて３０分間遮断した後、再び３回洗浄した。そこにヤギ抗ヒトＣＤ９３抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を１時間の間冷たく冷却して反応させた。ＰＢＳでまた３回洗浄した後、抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ抗体で１時間の間冷たく冷却して蛍光染色した。対照群には、それぞれの実験群に対して抗ＣＤ１４−ＦＩＴＣ抗体で別に蛍光染色した。それぞれ染色した細胞を流細胞分析機（ＥＰＩＣＳ  Ｅｌｉｔｅ（Ｃｏｕｌｔｅｒ））を用いて分析した。
【０１１０】
その結果、図１８に示されたように、ＴＨＰ−１細胞でＣＤ９３の細胞表面発現がＬＰＳ、ＴＮＦ−ａによって増加し、ＰＭＡ処理によってはあまり増加しなかった（図１８）。また、対照群に用いたＣＤ１４の細胞表面の発現は、ＬＰＳ、ＴＮＦ−ａ、ＰＭＡ処理によってすべて減少したが、これはＣＤ１４の断片化によるものと考慮される。ＣＤ１４の断片化は、単核球大食細胞活性化を下向き調節（ｄｏｗｎ−ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）するのにおいて重要なメカニズムであると知られている（Ｓｃｈｕｔｔ，Ｃ．１９９９．Ｃｄ１４．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３１：５４５．２３．Ｌｅ−Ｂａｒｉｌｌｅｃ，Ｋ．，Ｍ．Ｓｉ−Ｔａｈａｒ，Ｖ．Ｂａｌｌｏｙ，ａｎｄ  Ｍ．Ｃｈｉｇｎａｒｄ．１９９９．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ＣＤ１４  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｅｌａｓｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１０３９．Ｂａｚｉｌ，Ｖ．，ａｎｄ  Ｊ．Ｌ．Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ．１９９１．Ｓｈｅｄｄｉｎｇ  ａｓ  ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｄｏｗｎ−ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ１４  ｏｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１５６７）。今までの多くの研究結果によると、コラゲナーゼ、ニュ−ロピルエラスターゼ（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｌａｓｔａｓｅ）とカテプシンＧなどが細胞表面のＣＤ１４分子を断片化させることが報告されられている（Ｂｒｙｎｉａｒｓｋｉ，Ｋ．，Ｋ．Ｍａｒｅｓｚ，Ｍ．Ｓｚｃｚｅｐａｎｉｋ，Ｍ．Ｐｔａｋ，ａｎｄ  Ｗ．Ｐｔａｋ．２００３．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−６  ａｎｄ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ（ＲＯＩｓ）ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｓ  ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ２７：３３３．Ｌｅ−Ｂａｒｉｌｌｅｃ，Ｋ．，Ｍ  Ｓｉ−Ｔａｈａｒ，Ｖ．Ｂａｌｌｏｙ，ａｎｄ  Ｍ．Ｃｈｉｇｎａｒｄ．１９９９．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ＣＤ１４  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｅｌａｓｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１０３９．Ｃｏｙｎｅ，Ｃ．Ｐ．，Ｔ．Ｈｏｗｅｌｌ  ＩＩＩ，Ｈ．Ｓｍｏｄｌａｋａ，Ｃ．Ｗｉｌｌｅｔｔｏ，Ｂ．Ｗ．Ｆｅｎｗｉｃｋ，ａｎｄ  Ｅ．Ｃｈｅｎｎｅｙ．２００２．Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＣＤ１４  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｌｉｂｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ＣＤ１４  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｉｎ  ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｌｅ���ｋｏｃｙｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌ／ａｓｐａｒｔａｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ．Ｊ．Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ．Ｒｅｓ．８：２７３．）。
＜８−２＞ウエスタンブロット実験
ＴＨＰ−１細胞は、１０％牛胎児血清、ペニシリンＧ（１００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００／）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１．０ｍＭ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３７℃の細胞培養器で培養した。培養されたＴＨＰ−１細胞をＰＢＳ、ＬＰＳ（１．０μｇ／ｍｌ）、ＴＮＦ−ａ（０．５μｇ／ｍｌ）またはＰＭＡ（０．１μｇ／ｍｌ）で２４時間の間処理した後、溶解物（ｌｙｓａｔｅ）と培養上澄み液を得た。５分間試料を沸かした後、冷凍保管した。試料を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにローディングした後、電気泳動した。ゲルを再びニトロセルロース膜に移した後、４％脱脂牛乳で遮断した。以後、ヤギ抗ＣＤ９３抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を０．５μｇ／ｍｌに希釈して常温で１時間の間反応させた。また、ＰＢＳＴで３回洗浄した後、抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ）を０．５μｇ／ｍｌにして常温で１時間の間反応させた。内部対照群に抗βアクチン（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ）と抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ）を用いた。以後、ＥＣＬキット（ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，米国）を製造社の方法にしたがって処理した。
【０１１１】
その結果、図１９に示されたように、ＣＤ９３分子の自体発現はＦＡＣＳ結果と同様にＬＰＳ、ＴＮＦ−ａ処理によって増加したが、ＰＭＡ処理によっては増加しなかった。しかし、ＣＤ９３可溶性断片の量は、ＬＰＳ、ＴＮＦ−ａ、ＰＭＡ処理によってすべて増加した（図１９）。前記結果によって、炎症性環境あるいは炎症誘導物質によってＴＨＰ−１細胞とジャーカット細胞での発現増加という側面からみると、ＣＤ９３自体の発現も増加して、特にＣＤ９３可溶性断片の量も増加するという点を考慮すれば、ＣＤ９３またはその可溶性断片が炎症性疾患の診断マーカーとしての活用が可能であると考慮される。
＜８−３＞ＲＴ−ＰＣＲ実験
ＴＨＰ−１細胞を６ウェルプレートに培養した後、それぞれＰＢＳ、ＬＰＳ（１．０μｇ／ｍｌ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、ＰＭＡ（０．１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を処理した。処理２４時間後にＲＮＡ同定キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＲＮＡを同定した。逆転写のために逆転写酵素（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とｄＮＴＰを混合して４２℃で１時間の間反応させてそれぞれのｃＤＮＡを得た。リアルタイムＰＣＲ分析のためにＣＦＸ９６  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた。９５℃で３分間初期変性して、続いて９５℃で１５秒間アニーリング、６０℃で１分間の伸長化を４０〜４５周期にしてＰＣＲを遂行した。蛍光測定は、各アニーリング工程で記録されて、データは工程ごとに自動保存された。具体的には、２μｌのｃＤＮＡ鋳型とＣＤ９３プライマーを２３のｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と混合して反応させた。すべての反応は、２回反復した。相対的ｍＲＮＡ発現を測定するために、平均Ｃｔ（ａｖｅｒａｇｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）値を基準値にした。すべてのＣｔ値の基準は、ＧＡＰＤＨを用いて標準化した。プライマーセットは、次のとおりである［ＣＤ９３：正方向プライマーＣＴＣ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＴＡＣ  ＴＧＧ  ＴＣＴ  ＡＴＣ（配列番号：３４）、逆方向プライマーＴＧＴ  ＣＧＧ  ＡＣＴ  ＧＴＡ  ＣＴＧ  ＧＴＴ  ＣＴＣ（配列番号：３５）；ＧＡＰＤＨ：正方向プライマーＣＡＴ  ＧＴＴ  ＣＧＴ  ＣＡＴ  ＧＧＧ  ＴＧＴ  ＧＡＡ（配列番号：３６）、逆方向プライマーＧＧＡ  ＣＴＧ  ＴＧＧ  ＴＣＡ  ＴＧＡ  ＧＴＣ  ＣＴＴ（配列番号：３７）］。
【０１１２】
その結果、図２０に示されたように、ＴＨＰ−１細胞でのＣＤ９３発現はＬＰＳとＰＭＡ処理によって有意に増加した（図２０）。
＜実施例９＞マウス末梢血液単核細胞と腹膜細胞でのＣＤ９３発現様相及び血清と腹膜液でのＣＤ９３可溶性断片量の測定実験（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
前記試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）実験でのＣＤ９３発現様相に対して、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）実験でも同じ発現様相と断片化現象が起きるのかどうかを確認するために、下記のような実験を遂行した。すなわち、マウスに腹膜炎を起こすか炎症誘発物質（チオグリコレートまたはＬＰＳ）を注射した後、マウス末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と腹膜細胞でのＣＤ９３発現様相、及び血清と腹膜液（ＰＬＦ）でのＣＤ９３可溶性断片量を測定した。
＜９−１＞マウス末梢血液単核細胞と腹膜細胞でのＣＤ９３発現様相：ＦＡＣＳ実験
６週齢のｂａｌｂ／Ｃマウスに、１ｍｌのＰＢＳ、４％チオグリコレートまたは０．１ｍｇ／ｍｌのＬＰＳを注射した後、３日間維持した。３日後、マウスから後眼窩静脈（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ  ｖｅｉｎ）を通じてヘパリンコーティングされたガラス毛細管チューブを用いて血液を採血して、遠心分離して血清とＰＢＭＣ細胞を得た。直ちにマウスを犠牲にして、腹腔内から腹膜液（ＰＬＦ）と腹膜細胞（大部分腹腔内大食細胞）を得た。それぞれの細胞に含まれた赤血球を除去するために、１０ｍｌの赤血球溶解バッファー（Ｓｉｇｍａ）を３７℃で１０分間二度反応させて完全に赤血球を除去した。その次に、前記実施例＜８−１＞前述したのと同一な方法で蛍光染色した。但し、抗体の場合、羊抗マウスＣＤ９３抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）と抗羊ＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いた。また、大食細胞の分化程度を調べるために、分化マーカーであるＣＤ１１ｂ抗体（ＢＤ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、二重染色をした。
【０１１３】
その結果、図２１に示されたように、腹膜細胞の中で大食細胞でのマウスＣＤ９３発現は、ＬＰＳ処理によって最も多い増加を示し、チオグリコレート処理によっても類似に増加した（図２１）。したがって、マウスにチオグリコレートとＬＰＳ処理によってＰＢＭＣに存在した大食細胞が腹膜に移ったことが分かる。
＜９−２＞ウエスタンブロット実験
前記＜９−１＞で使用して残った半分の細胞を溶解させた後、ウエスタンブロットを遂行した。マウスＣＤ９３を検出するために羊抗マウスＣＤ９３抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）と抗羊ＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いたことを除き、前記実施例＜８−２＞の方法と同一にしてウエスタンブロット実験を遂行した。また、大食細胞の分化程度を調べるために、分化マーカーであるＣＤ１１ｂ抗体（ＢＤ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて二重染色を行なった。内部対照群として抗βアクチン（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ）と抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ）を用いた。以後、ＥＣＬキット（ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，米国）を製造社の方法にしたがって処理した。
【０１１４】
その結果、図２２に示されたように、前記ＦＡＣＳ結果と同一にマウスにチオグリコレートとＬＰＳ処理によって、腹膜細胞でＣＤ９３分子の発現が顕著に増加した（図２２）。
＜９−３＞ＣＤ９３可溶性断片の量測定：サンドイッチＥＬＩＳＡ実験
ＦＡＣＳとウエスタンブロット実験によってＣＤ９３分子自体の量が増加したことを観察した後、ＣＤ９３可溶性断片がどのように変化するかを確認するために、サンドイッチＥＬＩＳＡ方法を用いて血清と腹膜液（ＰＬＦ）でのＣＤ９３可溶性断片の量を測定した。
【０１１５】
まず、９６ウェルファルコンプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に１００ｎｇ／ｗｅｌｌのラット抗マウスＣＤ９３抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を一晩中コーティングした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、３％脱脂牛乳で常温で３０分間遮断した。また、ＰＢＳＴで３回洗浄した後、集めておいたそれぞれのマウス血清と腹膜液を１００μｌずつローディングした後、２時間の間放置した。定量のための標準物質には、マウスＣＤ９３可溶性断片を用いた。また、３回洗浄した後、１μｇ／ｍｌの羊抗マウスＣＤ９３抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）で１時間放置しておき、まもなく１μｇ／ｍｌの抗羊ＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ）にまた１時間の間反応させた。ＰＢＳＴにまた３回洗浄した後、ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ）を用いて発色した後、分光光度計（ＶＥＲＳＡｍａｘ  ｔｕｎａｂｌｅ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてＯＤ値を測定した。測定した値は、それぞれ標準曲線を用いて絶対定量を実施した。
【０１１６】
その結果、図２３に示されたように、血清内ＣＤ９３可溶性断片の量は、ＬＰＳやチオグリコレートによって大きく変化しなかった。しかし、腹膜液内のＣＤ９３可溶性断片の量は、ＬＰＳやチオグリコレート処理によって顕著に増加した（図２３）。したがって、ＣＤ９３可溶性断片は炎症性疾患の診断マーカーとして活用できると考えられる。
＜実施例１０＞滑膜組織内でのＣＤ９３発現及び滑膜液内でのＣＤ９３可溶性断片量の測定
＜１０−１＞滑膜組織内でのＣＤ９３発現：免疫組織化学方法
３人のリウマチ性関節炎（ＲＡ）患者と２人の退行性関節炎（ｏｓｔｅｏ−ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＯＡ）患者から得た滑膜組織を４％パラホルムアルデヒドで一晩中固定した。以後、アルコールで脱水してパラフィンでエンベディング（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）して切断を実施した。以後、内在したペルオキシダーゼ活性を無くすためにメタノリックＨ２Ｏ２で反応させた。また、非特異的反応を無くすために３％ＮＧＳ（ｎｏｒｍａｌ  ｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍ）で２時間遮断した。以後、組織をヤギ抗ヒトＣＤ９３抗体（Ｒ＆Ｄ）とビオチニル化された抗ヤギＩｇＧ、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ、Ｐｅｔｅｒｂｏｒｅｄｇｈ，ＵＫ）を順に各１時間ずつ反応させた。染色された組織は、再びヘマトキシリンで対比染色して、オリンパス顕微鏡（Ｔｏｋｙｏ，日本）で観察した。
【０１１７】
その結果、図２４に示されたように、退行性関節炎患者から得た滑膜組織よりリウマチ性関節炎患者から得た滑膜組織で、ＣＤ９３の発現が顕著に高く示された（図２４）。特に、リンパ球の浸潤が起きる潤滑膜（ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｌｉｎｉｎｇ）、下内層（ｓｕｂｌｉｎｉｎｇ）、及び血管周囲領域（ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｇｉｏｎ）でＣＤ９３分子の発現が顕著に高く示された。
＜１０−２＞滑膜液内でのＣＤ９３可溶性断片量の測定：サンドイッチＥＬＩＳＡ方法
８人のリウマチ性関節炎患者と８人の退行性関節炎患者から得た滑膜液内でのＣＤ９３可溶性断片量をサンドイッチＥＬＩＳＡ方法を用いて測定した。
【０１１８】
まず、９６ウェルファルコンプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に１００ｎｇ／ｗｅｌｌのラット抗ヒトＣＤ９３抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を一晩中コーティングした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、３％脱脂牛乳で常温で３０分間遮断した。また、ＰＢＳＴで３回洗浄した後、集めておいたそれぞれのリウマチ性関節炎患者と８人の退行性関節炎患者の滑膜液（ＳＦ）を１００μｌずつローディングした後、２時間の間放置しておいた。定量のための標準物質には、ヒト可溶性ＣＤ９３を用いた。再び、３回洗浄した後、１μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＣＤ９３抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）で１時間放置しておき、続いて１μｇ／ｍｌの抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ）に再び１時間の間反応させた。ＰＢＳＴで再び３回洗浄した後、ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ）を用いて発色して、分光光度計を用いてＯＤ値を測定した。測定した値は、それぞれ標準曲線を用いて絶対定量を実施した。
【０１１９】
その結果、図２５に示されたように、リウマチ性関節炎患者から得た滑膜液内でのＣＤ９３可溶性断片の量が退行性関節炎患者群より顕著に高いことを確認した（図２５）。
【０１２０】
したがって、ＣＤ９３分子またはその可溶性断片は、炎症性疾患の診断マーカーとしての活用が可能であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
前記のように、本発明は多様な炎症性疾患の治療剤及び診断キットを開発するのに有用に用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１２２】
配列番号５：ＣＤ１４新正方向プライマー
配列番号６：ＣＤ１４新逆方向プライマー
配列番号７：ＣＤ６４新正方向プライマー
配列番号８：ＣＤ６４新逆方向プライマー
配列番号９：ＣＤ１ａ新正方向プライマー
配列番号１０：ＣＤ１ａ新逆方向プライマー
配列番号１１：ＩＬ-６正方向プライマー
配列番号１２：ＩＬ-６逆方向プライマー
配列番号１３：ＩＬ-１２正方向プライマー
配列番号１４：ＩＬ-１２逆方向プライマー
配列番号１５：ｉＮＯＳ正方向プライマー
配列番号１６：ｉＮＯＳ逆方向プライマー
配列番号１７：ＣＸＣＬ１１正方向プライマー
配列番号１８：ＣＸＣＬ１１逆方向プライマー
配列番号１９：ＣＬＥＣ４Ａ正方向プライマー
配列番号２０：ＣＬＥＣ４Ａ逆方向プライマー
配列番号２１：ＳＰＨＫ-１正方向プライマー
配列番号２２：ＳＰＨＫ-１逆方向プライマー
配列番号２３：ＩＬ-１β正方向プライマー
配列番号２４：ＩＬ-１β逆方向プライマー
配列番号２５：ＴＮＦ-α正方向プライマー
配列番号２６：ＴＮＦ-α逆方向プライマー
配列番号２７：ｐＭＥＰ４正方向プライマー
配列番号２８：ｐＭＥＰ４逆方向プライマー
配列番号２９：Ｂａｍ  ＨＩ  Ｓｆｉｌ  ヒト免疫グロブリンＦｃ  Ｎ末端配列正方向プライマー
配列番号３０：Ｘｂａｌ  Ｓｔｏｐ  Ｃｏｄｏｎ  ヒト免疫グロブリンＦｃ  Ｃ末端配列逆方向プライマー
配列番号３１：ＣＤ９３プラスミド正方向プライマー
配列番号３２：ＣＤ９３プラスミド逆方向プライマー
配列番号３４：ＣＤ９３正方向プライマー
配列番号３５：ＣＤ９３逆方向プライマー
配列番号３６：ＧＡＰＤＨ正方向プライマー
配列番号３７：ＧＡＰＤＨ逆方向プライマー
【図１】
0005752052.tif 000004
【図２】
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【図３】
0005752052.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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