(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウム（ＳＫ４）チャネルを発現するマクロファージ細胞の細胞融合を阻害するためのインビボ方法における使用のためのＳＫ４チャンネルインビヒターを含む組成物であって、該方法は、該細胞と、有効量のＳＫ４チャネルインヒビターとを接触させる工程を含み、該細胞融合が阻害される組成物。
【請求項２】
細胞融合が同型または異型融合である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
ＳＫ４チャネルインヒビターが、阻害性核酸、モノクローナル抗体および低分子インヒビターからなる群より選択される、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
阻害性核酸が、配列番号２記載の配列を含むＳＫ４チャネルの発現を標的にする、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
モノクローナル抗体が、ＳＫ４チャネルの孔領域または低分子結合ドメインを認識する、請求項３記載の組成物。
【請求項６】
低分子インヒビターが、１−［（２−クロロフェニル）−ジフェニルメチル］−１Ｈ−イミダゾール；２，２−ビス（４−フルオロフェニル）−２−フェニルアセトアミド；１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（２−フルオロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（４−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（２−フルオロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；および１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−テトラゾールからなる群より選択される、請求項３記載の組成物。
【請求項７】
低分子インヒビターが１−［（２−クロロフェニル）−ジフェニルメチル］−１Ｈ−イミダゾールである、請求項３記載の組成物。
【請求項８】
低分子インヒビターが２，２−ビス（４−フルオロフェニル）−２−フェニルアセトアミドである、請求項３記載の組成物。
【請求項９】
低分子インヒビターが１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈピラゾールである、請求項３記載の組成物。
【請求項１０】
細胞内におけるＳＫ４チャネルの発現または活性をアッセイする工程をさらに含む、請求項３記載の組成物。
【請求項１１】
有効量のＳＫ４チャネルインヒビターが、異常な細胞融合が生じているか、または異常なマクロファージ細胞融合が生じていると思われる被験体に提供される治療上有効な量である、請求項１〜１０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１２】
該組成物が、被験体に同時提供するための治療上有効な量の抗炎症剤、抗骨喪失剤、免疫抑制剤または化学療法剤をさらに含む、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
該組成物が、マクロファージに由来する多核細胞により媒介される疾患又は障害の予防又は治療における使用のためである、請求項１１又は１２に記載の組成物。
【請求項１４】
該疾患又は障害が、骨喪失に関連する疾患、自己免疫疾患又は炎症性疾患、移植物又は移植片の拒絶、又は癌転移である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウム（ＳＫ４）チャネルを発現するマクロファージ細胞の細胞融合を阻害するためのインビボでの方法における使用のための医薬の製造におけるＳＫ４チャンネルインビヒターの使用であって、該方法は、該細胞と、有効量のＳＫ４チャネルインヒビターとを接触させる工程を含み、該細胞融合が阻害される、使用。
【請求項１６】
細胞融合が同型または異型融合である、請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
ＳＫ４チャネルインヒビターが、阻害性核酸、モノクローナル抗体および低分子インヒビターからなる群より選択される、請求項１５又は１６記載の使用。
【請求項１８】
阻害性核酸が、配列番号２記載の配列を含むＳＫ４チャネルの発現を標的にする、請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
モノクローナル抗体が、ＳＫ４チャネルの孔領域または低分子結合ドメインを認識する、請求項１７記載の使用。
【請求項２０】
低分子インヒビターが、１−［（２−クロロフェニル）−ジフェニルメチル］−１Ｈ−イミダゾール；２，２−ビス（４−フルオロフェニル）−２−フェニルアセトアミド；１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（２−フルオロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（４−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（２−フルオロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；および１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−テトラゾールからなる群より選択される、請求項１７記載の使用。
【請求項２１】
低分子インヒビターが１−［（２−クロロフェニル）−ジフェニルメチル］−１Ｈ−イミダゾールである、請求項１７記載の使用。
【請求項２２】
低分子インヒビターが２，２−ビス（４−フルオロフェニル）−２−フェニルアセトアミドである、請求項１７記載の使用。
【請求項２３】
低分子インヒビターが１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈピラゾールである、請求項１７記載の使用。
【請求項２４】
細胞内におけるＳＫ４チャネルの発現または活性をアッセイする工程をさらに含む、請求項１７記載の使用。
【請求項２５】
有効量のＳＫ４チャネルインヒビターが、異常な細胞融合が生じているか、または異常なマクロファージ細胞融合が生じていると思われる被験体に提供される治療上有効な量である、請求項１５〜２４のいずれか１項記載の使用。
【請求項２６】
該医薬が、被験体に同時提供するための治療上有効な量の抗炎症剤、抗骨喪失剤、免疫抑制剤または化学療法剤をさらに含む、請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
該医薬が、マクロファージに由来する多核細胞により媒介される疾患又は障害の予防又は治療における使用のためである、請求項２５又は２６に記載の使用。
【請求項２８】
該疾患又は障害が、骨喪失に関連する疾患、自己免疫疾患又は炎症性疾患、移植物又は移植片の拒絶、又は癌転移である、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウム（ＳＫ４）チャネルを発現するマクロファージ細胞の細胞融合を阻害するためのインビトロ方法であって、該方法は、前記細胞と、有効量のＳＫ４チャネルインヒビターとを接触させる工程を含み、該細胞融合が阻害される方法。
【請求項３０】
細胞融合が同型または異型融合である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
ＳＫ４チャネルインヒビターが、阻害性核酸、モノクローナル抗体および低分子インヒビターからなる群より選択される、請求項２９又は３０記載の方法。
【請求項３２】
阻害性核酸が、配列番号２記載の配列を含むＳＫ４チャネルの発現を標的にする、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
モノクローナル抗体が、ＳＫ４チャネルの孔領域または低分子結合ドメインを認識する、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
低分子インヒビターが、１−［（２−クロロフェニル）−ジフェニルメチル］−１Ｈ−イミダゾール；２，２−ビス（４−フルオロフェニル）−２−フェニルアセトアミド；１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（２−フルオロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（４−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（２−フルオロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；および１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−テトラゾールからなる群より選択される、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
低分子インヒビターが１−［（２−クロロフェニル）−ジフェニルメチル］−１Ｈ−イミダゾールである、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
低分子インヒビターが２，２−ビス（４−フルオロフェニル）−２−フェニルアセトアミドである、請求項３１記載の方法。
【請求項３７】
低分子インヒビターが１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈピラゾールである、請求項３１記載の方法。
【請求項３８】
細胞内におけるＳＫ４チャネルの発現または活性をアッセイする工程をさらに含む、請求項３１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、細胞間融合（セロサイトーシス（cellocytosis）とも呼ばれる）を調節するための組成物および方法、より具体的には、マクロファージの同型および異型細胞間融合を調節するための組成物および方法に関する。したがって、本発明は、各種疾患または障害に関連する細胞融合、ならびに破骨細胞の分化および機能を調節するための組成物および方法を提供する。
【０００２】
背景技術
細胞融合は、様々な発生およびホメオスタシスプロセスにとって不可欠である基本的な生物学的事象である。オルガネラ輸送中の細胞内の膜融合についてはよく理解されているが、精子−卵母細胞間融合、筋芽細胞−筋芽細胞間融合およびマクロファージ−マクロファージ間融合を媒介する細胞間融合についてはあまり知られていない。Vignery (2000) Int. J. Exp. Pathol. 81:291-304を参照されたい。
【０００３】
マクロファージに関しては、これらの細胞は、組織内で自身と融合して（即ち、同型融合）巨細胞を形成することができ、これは慢性炎症性疾患に関与している。MacLauchlan et al.(2009) J. Leukoc. Biol. 85:617-626;および前記Vignery (2000)を参照されたい。さらに、マクロファージは、骨内で自身と融合して破骨細胞を形成することができ、これは骨吸収を媒介する。より最近では、マクロファージは、体細胞または癌細胞と融合することができる（即ち、異型融合）と考えられている。Vignery (2005) Trends Cell Biol. 15:188-193を参照されたい。
【０００４】
残念なことに、マクロファージが自身および他の細胞と融合する機序の大部分は未だ特徴づけられていない。前記MacLauchlan et al.(2009);および前記Vignery (2005)を参照されたい。このプロセスを理解することは、マクロファージ機能を調節し、そしてまた、これらの細胞が不適当であるかまたは制御されていない様式で融合するときに、炎症性および感染性疾患で引き起こされる損傷を限定的にするのに役立つ可能性がある。前述の理由のために、マクロファージ融合を阻害するための組成物および方法が必要とされている。
【０００５】
破骨細胞は、単球−マクロファージ細胞株の細胞融合により形成される。破骨細胞は、多核、そして高濃度の小胞および液胞を特徴とする大型細胞である。破骨細胞は、骨質マトリックスの除去を促進する骨吸収が活発に行われている部位で特殊な細胞膜を形成する。このような機序により、骨粗鬆症または骨減少症（正常よりも低いが、骨粗鬆症として分類されるほどは低くない骨塩密度を有する）が生じる。関節リウマチは、多くの場合破骨細胞による骨吸収の増加に起因して全身化した骨減少症によって悪化する。したがって、破骨細胞の分化および機能を調節するための、特に阻害するための組成物および方法も必要とされている。
【０００６】
概要
本発明は、広くは、中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル（ＳＫ４チャネル、またはＩＫチャネル、またはＫＣＮＮ４チャネル、またはＫＣａ３．１チャネル、またはＩＫＣａ１チャネル）の発現、活性、または機能を調節する剤を使用することにより、細胞間融合を調節するための組成物および方法に関する。本発明の組成物は、有効量のＳＫ４チャネル調節剤（インヒビターまたはアクチベーター）を単独で、または他の治療剤と組み合わせて含む。１つの態様では、本発明の方法は、細胞を融合させる能力を有する細胞、または活発に融合している細胞に有効量のＳＫ４チャネルインヒビターを提供することを含む。場合により、前記方法は、ＳＫ４チャネルインヒビターと共に治療剤を同時提供することを含む。また、細胞間融合を阻害することができるＳＫ４チャネルインヒビターを同定する方法も含む。
【０００７】
別の態様では、本発明には、細胞間融合の活性化について記載される。このように、前記方法は、細胞を融合させる能力を有する細胞、または活発に融合している細胞に、有効量のＳＫ４チャネルアクチベーターを提供することを含む。また、細胞間融合を促進することができるＳＫ４チャネルアクチベーターを同定する方法も含む。
【０００８】
いくつかの態様では、本発明の組成物および方法は、マクロファージの細胞融合の調節を提供する。他の態様では、前記組成物および方法は、破骨細胞の阻害を含む、破骨細胞の分化および機能の調節を提供する。
【０００９】
本発明の組成物および方法は、破骨細胞、巨細胞または転移癌細胞に関連する疾患を含む、マクロファージに由来する多核細胞により媒介される疾患または障害の予防または治療における用途が見出される。
【００１０】
本発明は以下の態様を包含する。
１．中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウム（ＳＫ４）チャネルを発現する細胞の細胞融合を調節するための方法であって、前記細胞と、有効量のＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターとを接触させる工程を含み、細胞融合が調節される方法。
２．細胞融合が阻害される、態様１記載の方法。
３．細胞が血球系細胞である、態様１記載の方法。
４．細胞が、マクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞からなる群より選択される、態様１記載の方法。
５．細胞がマクロファージである、態様１記載の方法。
６．細胞融合が同型または異型融合である、態様１記載の方法。
７．ＳＫ４チャネルインヒビターが、阻害性核酸、モノクローナル抗体および低分子インヒビターからなる群より選択される、態様１記載の方法。
８．阻害性核酸が、配列番号２記載の配列を含むＳＫ４チャネルの発現を標的にする、態様７の方法。
９．モノクローナル抗体が、ＳＫ４チャネルの孔（ポア）領域または低分子結合ドメインを認識する、態様７記載の方法。
１０．低分子インヒビターが、１−［（２−クロロフェニル）−ジフェニルメチル］−１Ｈ−イミダゾール；２，２−ビス（４−フルオロフェニル）−２−フェニルアセトアミド；１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈピラゾール；１−［（２−フルオロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（４−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（２−フルオロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；および１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−テトラゾールからなる群より選択される、態様７記載の方法。
１１．低分子インヒビターが１−［（２−クロロフェニル）−ジフェニルメチル］−１Ｈ−イミダゾールである、態様７記載の方法。
１２．低分子インヒビターが２，２−ビス（４−フルオロフェニル）−２−フェニルアセトアミドである、態様７記載の方法。
１３．低分子インヒビターが１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈピラゾールである、態様７記載の方法。
１４．細胞内におけるＳＫ４チャネルの発現または活性をアッセイする工程をさらに含む、態様７記載の方法。
１５．方法がインビボにおける方法であり、そしてＳＫ４チャネルインヒビターの有効量が、異常な細胞融合が生じているか、または異常な細胞融合が生じていると思われる被験体に提供される治療上有効な量である、態様１記載の方法。
１６．治療上有効な量の抗炎症剤、抗骨喪失剤、免疫抑制剤または化学療法剤を被験体に同時提供する工程をさらに含む、態様１５記載の方法。
１７．破骨細胞の分化および機能を調節するための方法であって、破骨細胞または破骨細胞前駆体と、有効量の中間コンダクタンスカリウム活性化カリウム（ＳＫ４）チャネルインヒビターまたはアクチベーターとを接触させる工程を含む方法。
１８．破骨細胞形成が阻害される、態様１７記載の方法。
１９．ＳＫ４チャネルインヒビターが、阻害性核酸、モノクローナル抗体および低分子インヒビターからなる群より選択される、態様１７記載の方法。
２０．モノクローナル抗体が、ＳＫ４チャネルの孔領域または低分子結合ドメインを認識する、態様１９記載の方法。
２１．低分子インヒビターが、１−［（２−クロロフェニル）−ジフェニルメチル］−１Ｈ−イミダゾール；２，２−ビス（４−フルオロフェニル）−２−フェニルアセトアミド；１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（２−フルオロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（４−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（２−フルオロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；および１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈテトラゾールからなる群より選択される、態様１９記載の方法。
２２．低分子インヒビターが１−［（２−クロロフェニル）−ジフェニルメチル］−１Ｈ−イミダゾールである、態様１９記載の方法。
２３．低分子インヒビターが２，２−ビス（４−フルオロフェニル）−２−フェニルアセトアミドである、態様１９記載の方法。
２４．低分子インヒビターが１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈピラゾールである、態様１９記載の方法。
２５．方法がインビボにおける方法であり、有効量のＳＫ４チャネルインヒビターが、異常な破骨細胞の分化または機能が生じているか、または異常な破骨細胞の分化または機能が生じていると思われる被験体に提供される治療上有効な量である、態様１７記載の方法。
２６．治療上有効な量の抗炎症剤、抗骨喪失剤、免疫抑制剤または化学療法剤を被験体に同時投与することをさらに含む、態様２５記載の方法。
２７．骨喪失が生じやすいか、または骨喪失が生じている被験体の骨喪失を予防または治療するための方法であって、治療上有効な量の中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウム（ＳＫ４）チャネルインヒビターを前記被験体に投与して、破骨細胞の形成を阻害する工程を含み、被験体の骨喪失が予防または治療される方法。
２８．ＳＫ４チャネルインヒビターが、阻害性核酸、モノクローナル抗体および低分子インヒビターからなる群より選択される、態様２７記載の方法。
２９．モノクローナル抗体が、ＳＫ４チャネルの孔領域または低分子結合ドメインを認識する、態様２８記載の方法。
３０．低分子インヒビターが、１−［（２−クロロフェニル）−ジフェニルメチル］−１Ｈ−イミダゾール；２，２−ビス（４−フルオロフェニル）−２−フェニルアセトアミド；１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（２−フルオロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（４−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（２−フルオロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；および１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈテトラゾールからなる群より選択される、態様２８記載の方法。
３１．低分子インヒビターが１−［（２−クロロフェニル）−ジフェニルメチル］−１Ｈ−イミダゾールである、態様２８記載の方法。
３２．低分子インヒビターが２，２−ビス（４−フルオロフェニル）−２−フェニルアセトアミドである、態様２８記載の方法。
３３．低分子インヒビターが１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈピラゾールである、態様２８記載の方法。
３４．治療上有効な量の抗炎症剤、抗骨喪失剤、免疫抑制剤または化学療法剤を被験体に同時投与する工程をさらに含む、態様２７記載の方法。
３５．炎症性または自己免疫疾患に罹患しやすいか、または炎症性または自己免疫疾患に罹患している被験体の、巨細胞形成を特徴とする炎症性または自己免疫疾患を予防または治療するための方法であって、治療上有効な量の中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウム（ＳＫ４）チャネルインヒビターを前記被験体に投与して、巨細胞の形成を阻害する工程を含み、前記被験体の炎症性または自己免疫疾患が予防または治療される方法。
３６．ＳＫ４チャネルインヒビターが、阻害性核酸、モノクローナル抗体および低分子インヒビターからなる群より選択される、態様３５記載の方法。
３７．モノクローナル抗体が、ＳＫ４チャネルの孔領域または低分子結合ドメインを認識する、態様３６記載の方法。
３８．低分子インヒビターが、１−［（２−クロロフェニル）−ジフェニルメチル］−１Ｈ−イミダゾール；２，２−ビス（４−フルオロフェニル）−２−フェニルアセトアミド；１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（２−フルオロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（４−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（２−フルオロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；および１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈテトラゾールからなる群より選択される、態様３６記載の方法。
３９．低分子インヒビターが１−［（２−クロロフェニル）−ジフェニルメチル］−１Ｈ−イミダゾールである、態様３６記載の方法。
４０．低分子インヒビターが２，２−ビス（４−フルオロフェニル）−２−フェニルアセトアミドである、態様３６記載の方法。
４１．低分子インヒビターが１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈピラゾールである、態様３６記載の方法。
４２．治療上有効な量の抗炎症剤、抗骨喪失剤、免疫抑制剤または化学療法剤を前記被験体に同時投与する工程をさらに含む、態様３５記載の方法。
４３．被験体内に位置する部位に移植物または移植片を有する被験体の移植物または移植片拒絶反応を予防するための方法であって、治療上有効な量の中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウム（Ｋ）チャネルインヒビターを前記被験体に投与して、前記部位または前記部位近傍における巨細胞の形成を阻害する工程を含み、前記被験体の移植物または移植片拒絶反応が予防される方法。
４４．ＳＫ４チャネルインヒビターが、阻害性核酸、モノクローナル抗体および低分子インヒビターからなる群より選択される、態様４３記載の方法。
４５．モノクローナル抗体が、ＳＫ４チャネルの孔領域または低分子結合ドメインを認識する、態様４４記載の方法。
４６．低分子インヒビターが、１−［（２−クロロフェニル）−ジフェニルメチル］−１Ｈ−イミダゾール；２，２−ビス（４−フルオロフェニル）−２−フェニルアセトアミド；１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（２−フルオロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（４−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（２−フルオロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；および１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−テトラゾールからなる群より選択される、態様４４記載の方法。
４７．低分子インヒビターが１−［（２−クロロフェニル）−ジフェニルメチル］−１Ｈ−イミダゾールである、態様４４記載の方法。
４８．低分子インヒビターが２，２−ビス（４−フルオロフェニル）−２−フェニルアセトアミドである、態様４４記載の方法。
４９．低分子インヒビターが１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈピラゾールである、態様４４記載の方法。
５０．治療上有効な量の抗炎症剤、または免疫抑制剤を前記被験体に同時投与する工程をさらに含む、態様４３記載の方法。
５１．移植片が細胞、器官または組織の移植片である、態様４３記載の方法。
５２．癌に罹患している被験体の癌転移を予防する方法であって、治療上有効な量の中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウム（ＳＫ４）チャネルインヒビターを前記被験体に投与して、転移癌細胞の形成を阻害する工程を含み、被験体の癌転移が予防される方法。
５３．ＳＫ４チャネルインヒビターが、阻害性核酸、モノクローナル抗体および低分子インヒビターからなる群より選択される、態様５２記載の方法。
５４．モノクローナル抗体が、ＳＫ４チャネルの孔領域または低分子結合ドメインを認識する、態様５３記載の方法。
５５．低分子インヒビターが、１−［（２−クロロフェニル）−ジフェニルメチル］−１Ｈ−イミダゾール；２，２−ビス（４−フルオロフェニル）−２−フェニルアセトアミド；１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（２−フルオロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（４−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（２−フルオロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；および１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−テトラゾールからなる群より選択される、態様５３記載の方法。
５６．低分子インヒビターが１−［（２−クロロフェニル）−ジフェニルメチル］−１Ｈ−イミダゾールである、態様５３記載の方法。
５７．低分子インヒビターが２，２−ビス（４−フルオロフェニル）−２−フェニルアセトアミドである、態様５３記載の方法。
５８．低分子インヒビターが１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾールである、態様５３記載の方法。
５９．治療上有効な量の抗炎症剤、抗骨喪失剤、免疫抑制剤または化学療法剤を被験体に同時投与することをさらに含む、態様５２記載の方法。
６０．細胞間融合を阻害する中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウム（ＳＫ４）チャネルインヒビターを同定する方法であって：
細胞集団とＳＫ４チャネルインヒビターの候補とを接触させる工程；および
前記候補剤が細胞集団内の細胞間融合を阻害するかどうかを判定する工程；
を含む方法。
６１．細胞集団がマクロファージを含み、ＳＫ４チャネルインヒビターがマクロファージの細胞間融合を阻害する、態様６０記載の方法。
６２．細胞集団が少なくとも２種類の細胞型を含み、そのうちの１種がマクロファージである、態様６０記載の方法。
６３．有効量の中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウム（ＳＫ４）チャネルインヒビター；および
抗炎症剤、抗骨喪失剤、免疫抑制剤および化学療法剤からなる群より選択される治療剤
を含む組成物。
６４．ＳＫ４チャネルインヒビターが、阻害性核酸、モノクローナル抗体および低分子インヒビターからなる群より選択される、態様６３記載の組成物。
６５．モノクローナル抗体が、ＳＫ４チャネルの孔領域または低分子結合ドメインを認識する、態様６４記載の組成物。
６６．低分子インヒビターが、１−［（２−クロロフェニル）−ジフェニルメチル］−１Ｈ−イミダゾール；２，２−ビス（４−フルオロフェニル）−２−フェニルアセトアミド；１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（２−フルオロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（４−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（２−フルオロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；および１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−テトラゾールからなる群より選択される、態様６４記載の組成物。
６７．低分子インヒビターが１−［（２−クロロフェニル）−ジフェニルメチル］−１Ｈ−イミダゾールである、態様６４記載の組成物。
６８．低分子インヒビターが２，２−ビス（４−フルオロフェニル）−２−フェニルアセトアミドである、態様６４記載の組成物。
６９．低分子インヒビターが１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾールである、態様６４記載の組成物。
７０．薬学的に許容しうる担体をさらに含む、態様６３の組成物。
７１．細胞間融合を活性化する中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウム（ＳＫ４）チャネルアクチベーターを同定する方法であって：
細胞集団とＳＫ４チャネルアクチベーターの候補とを接触させる工程；および
前記候補剤が細胞集団内の細胞間融合を活性化するかどうかを判定する工程；
を含む方法。
７２．細胞集団がマクロファージを含み、ＳＫ４チャネルアクチベーターがマクロファージの細胞間融合を活性化する、態様７１記載の方法。
７３．細胞集団が少なくとも２種類の細胞型を含み、そのうちの１種がマクロファージである、態様７１記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
以下の詳細な記載を考慮すれば、本発明がより一層理解され、そして上記以外の特徴、局面および利点が明らかになるであろう。このような詳細な記載は、以下の図面を参照する。
【図１Ａ】図１Ａは、新たにプレーティングしたラットの肺胞マクロファージの写真を示し；図１Ｂは、融合条件下で５日間培養した後に、融合したラットの肺胞マクロファージから形成された多核細胞の写真を示す。
【図１Ｂ】図１Ａは、新たにプレーティングしたラットの肺胞マクロファージの写真を示し；図１Ｂは、融合条件下で５日間培養した後に、融合したラットの肺胞マクロファージから形成された多核細胞の写真を示す。
【図２】図２は、融性条件下のラットの肺胞マクロファージにおける２４時間までのＳＫ４チャネルｍＲＮＡ発現のアップレギュレーションを示し、これは、５日目まで持続した（ｘ軸は、０時間目、１時間目、２４時間目または１２０時間目における複製肺胞マクロファージサンプルを表す）。データは、３つの個体サンプルの平均シグナル（＋標準偏差）として示され、Affymetrix（登録商標）Genechip（登録商標）RAT230 Plus Array experiments (Probe ID 1368930_at)によって得られた。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｍ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬ刺激下における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の破骨細胞への分化中のＳＫ４チャネル発現のアップレギュレーションを示す（ｘ軸は、０時間目、３日目、７日目、１４日目または２１日目における複製ヒトＰＢＭＣサンプルを表す）。データは、４つの個体サンプルの平均シグナル（＋標準偏差）として表され、Affymetrix（登録商標）Genechip（登録商標）U133 Plus 2 Array chipsによって得られた。
【図３Ｂ】図３Ｂは、Genechip（登録商標）のデータが、TaqMan（登録商標）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりさらに確認されたことを示す（ｘ軸は、０時間目、３日目、７日目、１４日目または２１日目における複製ヒトＰＢＭＣサンプルを表す）。
【図３Ｃ】図３Ｃは、他の細胞と比較したとき、ヒトＢ細胞、樹状細胞およびマクロファージにおけるＳＫ４／ＩＫのｍＲＮＡが高発現していることを示す。図３Ｃのデータは、Affymetrix（登録商標）Genechip（登録商標）RAT230 Plus Array chipsから得たものであり、細胞サンプルの平均シグナルとして示される。反復数と共に、サンプリングされた細胞を図３Ｃに示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ヘテロ接合体（ｓｋ４＋／−）およびホモ接合体ノックアウト（ｓｋ４−／−）マウスの脾細胞から作成された破骨細胞様細胞（すなわちＴＲＡＰ＋）の、７日間Ｍ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬ下で培養されたＳＫ４チャネルが、ホモ接合体野生型（ＷＴ；ｓｋ４＋／＋）マウスと比較して少ないことを示す。図４Ｂは、ＷＴマウスと比較したとき、これらの細胞の表面積が少ないことを示す。
【図４Ｂ】図４Ａは、ヘテロ接合体（ｓｋ４＋／−）およびホモ接合体ノックアウト（ｓｋ４−／−）マウスの脾細胞から作成された破骨細胞様細胞（すなわちＴＲＡＰ＋）の、７日間Ｍ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬ下で培養されたＳＫ４チャネルが、ホモ接合体野生型（ＷＴ；ｓｋ４＋／＋）マウスと比較して少ないことを示す。図４Ｂは、ＷＴマウスと比較したとき、これらの細胞の表面積が少ないことを示す。
【図５】図５は、ＳＫ４チャネルの欠損が、ＷＴ（ｓｋ４＋／＋）マウス（上方パネル）と比較して、ホモ接合体ノックアウト（ｓｋ４−／−）マウス（下方パネル）由来のマクロファージの相対的比率に有意な影響を与えないことを示す。ＦＡＣＳグラフは、左から右に、異なる組み合わせ（すべての細胞、ＣＤ１１ｂ／Ｆ４８０、ＣＤ１１Ｃ／Ｆ４８０、ＣＤ１１Ｃ／ＣＤ１１ｂ）として提示する。
【図６Ａ】図６Ａは、７日間融合条件（Ｍ−ＣＳＦ＋ＲＡＮＫＬ）下で培養されたホモ接合体ノックアウト（ｓｋ４−／−）マウスの骨髄に由来するマクロファージから作成された破骨細胞様細胞（すなわちＴＲＡＰ＋）が、ＷＴ（ｓｋ４＋／＋）マウスと比較して少ないことを示す。図６Ｂは、ＷＴマウスと比較したとき、これらの細胞の全表面積が少ないことを示す。
【図６Ｂ】図６Ａは、７日間融合条件（Ｍ−ＣＳＦ＋ＲＡＮＫＬ）下で培養されたホモ接合体ノックアウト（ｓｋ４−／−）マウスの骨髄に由来するマクロファージから作成された破骨細胞様細胞（すなわちＴＲＡＰ＋）が、ＷＴ（ｓｋ４＋／＋）マウスと比較して少ないことを示す。図６Ｂは、ＷＴマウスと比較したとき、これらの細胞の全表面積が少ないことを示す。
【図７】図７Ａ〜Ｂは、ＷＴマウスの骨髄に由来するマクロファージにおいて、用量依存的に２つの異なるＳＫ４チャネルインヒビター（ＩＣＡ−１７０４３、図７Ａ；およびＴＲＡＭ−３４、図７Ｂ）が破骨細胞の形成を妨げることを示す。ＴＲＡＰ＋破骨細胞様細胞の表面積を評価した（ＰＯＣは、化合物不含対照に対する百分率である）。データは５つの複製物から得たものであり、そしてエラーバーは標準偏差を表す。図７Ｃは、ＩＣＡ−１７０４３処理されたサンプルのＴＲＡＰで染色された画像を示す。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｂは、抗コラーゲン抗体誘導性関節炎モデルにおいて、ホモ接合体ノックアウト（ｓｋ４−／−）マウス（雄（Ｍ）および雌（Ｆ））の関節炎スコアが、ＷＴマウス（ＭおよびＦ）と比較して、有意に減じられることを示す。２つの独立した実験のデータを示す。各試験群の動物数を図８Ａ〜Ｂに示し、エラーバーは平均の標準誤差を表す。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｂは、抗コラーゲン抗体誘導性関節炎モデルにおいて、ホモ接合体ノックアウト（ｓｋ４−／−）マウス（雄（Ｍ）および雌（Ｆ））の関節炎スコアが、ＷＴマウス（ＭおよびＦ）と比較して、有意に減じられることを示す。２つの独立した実験のデータを示す。各試験群の動物数を図８Ａ〜Ｂに示し、エラーバーは平均の標準誤差を表す。
【図９Ａ】図９Ａは、抗コラーゲン抗体誘導性関節炎モデル（図８の実験２）において、ホモ接合体ノックアウト（ｓｋ４−／−）マウス（雌（Ｆ））の足関節の硬骨損傷、軟骨損傷、パンヌスおよび炎症の組織学スコアが、ＷＴマウスと比較して有意に低下することを示す。図９Ｂは、抗コラーゲン抗体誘導性関節炎モデルにおいて、ホモ接合体ノックアウト（ｓｋ４−／−）マウス（雄（Ｍ））の硬骨損傷が、ＷＴマウスと比較して有意に減少することを示す。
【図９Ｂ】図９Ａは、抗コラーゲン抗体誘導性関節炎モデル（図８の実験２）において、ホモ接合体ノックアウト（ｓｋ４−／−）マウス（雌（Ｆ））の足関節の硬骨損傷、軟骨損傷、パンヌスおよび炎症の組織学スコアが、ＷＴマウスと比較して有意に低下することを示す。図９Ｂは、抗コラーゲン抗体誘導性関節炎モデルにおいて、ホモ接合体ノックアウト（ｓｋ４−／−）マウス（雄（Ｍ））の硬骨損傷が、ＷＴマウスと比較して有意に減少することを示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜Ｂは、Ｍ−ＣＳＦ＋ＲＡＮＫＬ刺激下で、ヒトＰＢＭＣにおいて、用量依存的に２つの異なるＳＫ４チャネルインヒビター（それぞれ、ＩＣＡ−１７０４３およびＴＲＡＭ−３４、図１０Ａおよび１０Ｂ）が破骨細胞の形成を妨げることを示す。ＴＲＡＰ＋破骨細胞様細胞の表面積を評価した（ＰＯＣは、化合物不含対照に対する百分率である）。データは４つの複製物から得た、そしてエラーバーは標準偏差を表す。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜Ｂは、Ｍ−ＣＳＦ＋ＲＡＮＫＬ刺激下で、ヒトＰＢＭＣにおいて、用量依存的に２つの異なるＳＫ４チャネルインヒビター（それぞれ、ＩＣＡ−１７０４３およびＴＲＡＭ−３４、図１０Ａおよび１０Ｂ）が破骨細胞の形成を妨げることを示す。ＴＲＡＰ＋破骨細胞様細胞の表面積を評価した（ＰＯＣは、化合物不含対照に対する百分率である）。データは４つの複製物から得た、そしてエラーバーは標準偏差を表す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＳＫ４欠損破骨細胞による骨塩の再吸収が不完全であることを示す。ｓｋ４＋／＋およびｓｋ４−／−マウス由来の骨髄に由来するマクロファージを、カルシウム−リン酸塩結晶で作製された人工骨でコーティングしたBioCoat（商標）Osteologic（商標）スライド上において２０日間Ｍ−ＣＳＦ（２０ng/ml）およびＲＡＮＫＬ（１００ng/ml）の存在下で培養した。１ウェル当りの溶解したカルシウム−リン酸塩表面積を記録することにより、破骨細胞の活性を評価した。結果は、３つの独立した実験（ｎ＝３；ＳＤ）を代表するものである。ｓｋ４＋／＋およびｓｋ４−／−マウスの再吸収窩の代表的な画像を図１１Ｂに示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａは、ＳＫ４欠損破骨細胞による骨塩の再吸収が不完全であることを示す。ｓｋ４＋／＋およびｓｋ４−／−マウス由来の骨髄に由来するマクロファージを、カルシウム−リン酸塩結晶で作製された人工骨でコーティングしたBioCoat（商標）Osteologic（商標）スライド上において２０日間Ｍ−ＣＳＦ（２０ng/ml）およびＲＡＮＫＬ（１００ng/ml）の存在下で培養した。１ウェル当りの溶解したカルシウム−リン酸塩表面積を記録することにより、破骨細胞の活性を評価した。結果は、３つの独立した実験（ｎ＝３；ＳＤ）を代表するものである。ｓｋ４＋／＋およびｓｋ４−／−マウスの再吸収窩の代表的な画像を図１１Ｂに示す。
【図１２】図１２は、ＳＫ４欠損マウスの骨梁骨密度が増加していたことを示す。雄および雌のｓｋ４−／−マウスの大腿遠位は、ｓｋ４＋／＋マウスよりも高い骨梁密度を有する。８週齢の雄および雌のｓｋ４−／−およびｓｋ＋／＋マウス由来の大腿遠位を、ｐＱＣＴ（ｎ＝８；ＳＤ）を使用してスキャニングした。
【図１３】図１３は、マウス頭部の側背の解剖を示す。矢印は、インビボにおける破骨細胞形成アッセイにおいて、頭蓋冠上にリポ多糖（ＬＰＳ）を局所皮下注射した部位を示す。このＬＰＳの注射は、硬骨を再吸収する破骨細胞の形成を導く炎症反応を、局所的、迅速、そして効率的に誘導する。
【図１４】図１４は、ＳＫ４が存在しないことにより、頭蓋冠上へのＬＰＳの局所皮下注射に応答して、劇的に骨の再吸収が妨げられることを示す。８週齢のｓｋ４＋／＋およびｓｋ４−／−の雄および雌マウスの、右頭蓋冠の骨膜中に（図１３を参照されたい）、２μlの体積のＬＰＳ２５μgを注射した。頭部をマイクロＣＴによりスキャニングした。ＳＫ４欠損マウスがＬＰＳに対して応答しないことに留意されたい。（ｎ＝５）。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜Ｃは、頭蓋冠上へのＬＰＳの局所皮下注射に応答する、ｓｋ４＋／＋対ＳＫ４欠損（ｓｋ４−／−）の頭蓋冠の３Ｄパラメータのインビボ応答を示す。頭蓋冠骨表面密度（骨体積に対する骨表面積、図１５Ａ）；骨厚さ（図１５Ｂ）；および骨密度（図１５Ｃ）。ＳＫ４欠損マウスは、ＬＰＳ注射の５日後、より厚い頭蓋冠の骨厚さおよびより高い骨密度を維持し、そしてより少ない再吸収された骨表面を維持する。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜Ｃは、頭蓋冠上へのＬＰＳの局所皮下注射に応答する、ｓｋ４＋／＋対ＳＫ４欠損（ｓｋ４−／−）の頭蓋冠の３Ｄパラメータのインビボ応答を示す。頭蓋冠骨表面密度（骨体積に対する骨表面積、図１５Ａ）；骨厚さ（図１５Ｂ）；および骨密度（図１５Ｃ）。ＳＫ４欠損マウスは、ＬＰＳ注射の５日後、厚い頭蓋冠の骨厚さおよび高い骨密度を維持し、そして少ない再吸収された骨表面を維持する。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜Ｃは、頭蓋冠上へのＬＰＳの局所皮下注射に応答する、ｓｋ４＋／＋対ＳＫ４欠損（ｓｋ４−／−）の頭蓋冠の３Ｄパラメータのインビボ応答を示す。頭蓋冠骨表面密度（骨体積に対する骨表面積、図１５Ａ）；骨厚さ（図１５Ｂ）；および骨密度（図１５Ｃ）。ＳＫ４欠損マウスは、ＬＰＳ注射の５日後、厚い頭蓋冠の骨厚さおよび高い骨密度を維持し、そして少ない再吸収された骨表面を維持する。
【００１２】
詳細な説明
本発明は、細胞間融合中、特にマクロファージが関与する同型および異型融合中の中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウム（ＳＫ４またはＫＣＮＮ４またはＩＫ）チャネル発現の増加の確認に関する。本発明は、細胞間融合を調節するためのＳＫ４インヒビターまたはアクチベーターの使用を含む。すなわち、ＳＫ４チャネルの発現、活性または機能の調節を介して細胞間融合を調節するための組成物および方法を提供する。このように、それぞれ細胞間融合を減少させる（すなわち、阻害する）か、または増加させるために、ＳＫ４チャネルの発現、活性または機能を、低下させる（すなわち、阻害する）か、または上昇させることができる。マクロファージが関与する細胞間融合の調節が特に対象となる。
【００１３】
例えば、マクロファージなどの細胞の融合は、骨の発生、再形成および修復に関与する多核破骨細胞の形成を導くことができる。破骨細胞活性の機能不全は、骨粗鬆症および関節リウマチなどの骨疾患の原因になりえる。同様に、マクロファージの融合は、病原体または移植物などの異物に応答して形成される多核巨細胞の形成を導く場合がある。したがって、本発明は、マクロファージ融合におけるＳＫ４チャネルの役割に注目する。
【００１４】
いくつかの態様では、本発明は、細胞間融合、特にマクロファージが関与する細胞間融合を阻害するための方法を提供する。このような態様では、ＳＫ４チャネルの発現、活性、または機能、ひいては細胞間融合は、例えば、対象細胞と有効量のＳＫ４チャネルインヒビターとを接触させることにより減少させる（すなわち、阻害する）ことが可能である。適切な対照と比較したとき、ＳＫ４チャネルの発現、活性または機能は、対象細胞中において、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％を含むが、これらに限定されない統計的に有意な量減少させうる。
【００１５】
他の態様では、細胞間融合を増加させる、例えば、マクロファージ細胞融合を増加させることが所望である場合もある。したがって、例えば、マクロファージ細胞融合の増加および多核破骨細胞の形成は、異常に増加した骨密度に対抗するか、または慢性感染症もしくは大理石骨病を治療するために所望である場合もある。このような態様では、マクロファージ細胞のＳＫ４チャネルの発現、活性または機能は、例えば、マクロファージ細胞と、有効量のＳＫ４チャネル発現、活性または機能のアクチベーターとを接触させることにより増加させることができる。細胞間融合の増加が所望の結果である場合、適切な対照と比較したとき、ＳＫ４チャネルの発現、活性または機能は、対象細胞中において、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、またはそれ以上を含むが、これらに限定されない統計的に有意な量増加させうる。
【００１６】
本発明の組成物および方法は、破骨細胞および／または破骨細胞前駆体のＳＫチャネルの発現、活性または機能の調節を介して、破骨細胞分化および機能を調節することに用途が見出される。破骨細胞は、その石灰化されたマトリックスの除去により骨組織を可溶化する、同型の、特殊化、多核化されたマクロファージに由来する細胞である。マクロファージ細胞などの破骨細胞前駆体からの破骨細胞形成を調節することによって、破骨細胞形成、ひいては破骨細胞数および／または破骨細胞表面積を変化させて、破骨細胞機能全体を変化させることが可能である。破骨細胞の機能を調節して、例えば、これらの細胞の骨塩再吸収活性を変化させることが可能である。したがって、いくつかの態様では、本発明は、破骨細胞および／または破骨細胞前駆体と、有効量のＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターとを接触させることを含む、破骨細胞の分化および機能を調節するための方法を提供する。
【００１７】
いくつかの態様では、破骨細胞の分化および／または機能は、ＳＫチャネルインヒビターを使用して阻害される。したがって、所望の結果が破骨細胞分化および／または機能の低下である場合、マクロファージなどの破骨細胞前駆体のＳＫ４チャネル発現、活性または機能を阻害して、マクロファージ細胞融合を減少させ、それによって、破骨細胞形成を減少させることができ（破骨細胞数および／または破骨細胞表面積の減少を含む）、これは破骨細胞の機能を全体的に低下させる。破骨細胞のＳＫ４チャネル発現、活性または機能を阻害して、それによって、例えば、破骨細胞骨塩再吸収活性の低下を含む破骨細胞の機能を低下させることができる。適切な対照と比較したとき、ＳＫ４チャネルの発現、活性または機能は、破骨細胞および／または破骨細胞前駆体において、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％を含むが、これらに限定されない統計的に有意な量低下させうる。
【００１８】
本発明の他の態様では、ＳＫチャネルアクチベーターを使用して、破骨細胞分化および／または機能を向上させるための方法を提供する。したがって、例えば、破骨細胞分化および／または機能の向上は、異常に増加した骨密度に対抗するか、または慢性感染症もしくは大理石骨病を治療するために所望である場合もある。したがって、所望の結果が破骨細胞分化および／または機能の向上である場合、マクロファージなどの破骨細胞前駆体のＳＫ４チャネル発現、活性または機能を向上させて、マクロファージ細胞融合を増加させ、それによって、破骨細胞形成を増加させることができ（破骨細胞数および／または破骨細胞表面積の増加を含む）、これは、例えば、破骨細胞骨塩再吸収活性の向上を含む、破骨細胞の機能を全体的に向上させる。破骨細胞のＳＫ４チャネル発現、活性または機能を向上させて、それによって、例えば、破骨細胞骨塩再吸収活性の向上など、破骨細胞の機能を向上させることができる。適切な対照と比較したとき、ＳＫ４チャネルの発現、活性または機能は、破骨細胞および／または破骨細胞前駆体において、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、またはそれ以上を含むが、これらに限定されない統計的に有意な量増加する場合がある。
【００１９】
細胞間融合の阻害
任意の特定の理論に縛られることを意図するものではないが、ＳＫ４チャネルインヒビターは、破骨細胞、巨細胞または転移癌細胞などの、活発に融合している細胞および／または新たに融合した多核細胞のＳＫ４チャネル発現、ＳＫ４チャネル活性、あるいは、上流または下流のＳＫ４チャネルエフェクターを調節する。そのため、ＳＫ４チャネルインヒビターを用いて細胞間融合を阻害するのための、より詳しくは、破骨細胞、巨細胞および転移癌細胞の形成につながる同型および異型融合を含むマクロファージ細胞融合を阻害するための組成物と方法について記載する。
【００２０】
したがって、ＳＫ４チャネルインヒビターは、細胞間融合を阻害するためにインビボまたはインビトロで提供されうる。インビトロで提供した場合、ＳＫ４チャネルインヒビターを使用して、細胞間融合を阻害したり、または細胞間融合を調節する剤をスクリーニングしたりすることができる。インビボで提供した場合、ＳＫ４チャネルインヒビターを使用して、マクロファージに由来する多核細胞、特に破骨細胞、巨細胞または転移癌細胞が関係する様々な疾患または障害を予防および／または治療することができる。詳しくは、ＳＫ４チャネルインヒビターを使用して、骨再吸収／骨喪失を予防または低減したり、自己免疫または炎症性の疾患または障害を予防または治療したり、移植物または移植片拒絶反応を予防したり、あるいは癌転移を予防したりすることができる。
【００２１】
本明細書で使用するとき、「中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル（単数または複数）」または「ＳＫ４チャネル（単数または複数）」は、１００pS未満、または約１２pS〜約５０pS（例えば、それぞれ、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれるChristopherson (1991) J. Membr. Biol. 119:75-83;およびTharp & Bowles (2009) Cardiovasc. Hematological Agents Med. Chem. 7:1-11を参照されたい）であるが、典型的には約３０pS〜約４０pSのコンダクタンスを有する、電圧非依存性で、内向き整流性のカリウムチャネルを意味する。ＳＫ４チャネルは、マイクロモル濃度以下の細胞内カルシウム濃度（約１００nmol/L〜約３００nmol/L）により活性化され、クロトリマゾール、ＴＲＡＭ−３４およびＩＣＡ−１５４５１などのカリブドトキシンおよびトリアリールメタンによりブロックされるが、イベリオトキシン、アパミンまたはケトコナゾールによってはブロックされない。ＳＫ４チャネルは、中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質４、ガルド、ｆＩＫ、ｈＩＫ、ｍＩＫ、ＩＫ、ＩＫ１、ＩＫＣａ１、ＩＫＣＡ１、ＩｍＫ、ＫＣａ４、ＫＣＡ４、ＫＣａ３．１、ＫＣＮＮ４またはＳＫ４チャネルのように当技術分野において様々に公知である。例えば、Cho et al. (2008) Expert Rev. Mol. Diagn. 8:179-187;およびReich et al. (2005) Eur. J. Immunol. 35:1027-1036を参照されたい；これらはそれぞれ、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。したがって、本発明の目的のために、用語「ＳＫ４チャネル」は、ＫＣＮＮ４およびＳＫ４チャネルを含む、これらのチャネルが知られている様々な名称を包含することを意図する。
【００２２】
マウス、ラットおよびヒトなど多くの種でＳＫ４チャネルモノマーの核酸およびアミノ酸配列が公知である。例えば、Joiner et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11013-11018; Logsdon et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:32723-32726; Neylon et al. (1999) Circ. Res. 85:E33-E43; Vandorpe et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:21542-21553; Warth et al. (1999) Pflugers Arch. 438:437-444;ならびに米国特許第６，６９２，９３７号および同第６，８９４，１４７号を参照されたい；これらはそれぞれ、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる；また、配列番号１〜６も参照されたい。ＳＫ４チャネルモノマーは、６つの膜貫通領域（Ｓ１〜Ｓ６）、およびカリウム選択性アミノ酸配列ＧＹＧを含むＳ５とＳ６との間の１つの孔モチーフを有する。また、ＳＫ４チャネルモノマーは、孔モチーフ近傍にＮ結合型糖鎖付加部位を有する。
【００２３】
ＳＫ４チャネルのＮ末端は小胞体保留シグナル（前記Tharp & Bowles (2009)）を含み、Ｃ末端は、細胞内のカルシウムを感知するカルモデュリン結合ドメインを含む（Fanger et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:5746-5754;およびJoiner et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:37980-37985;これらはそれぞれ、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる）。また、Ｃ末端は、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）およびプロテインキナーゼＧ（ＰＫＧ）によるリン酸化のための多数のコンセンサス配列(Joiner et al.(1997),前記)に加えて、チロシンリン酸化のコンセンサス配列（ＲＬＬＱＥＡＷＭＹ；配列番号７；Tharp & Bowles (2009)、前記）を含む。ＳＫ４チャネルモノマーは、ホモテトラマーを形成して、カリウムイオンの流出をレギュレーションする。
【００２４】
ＳＫ４チャネルは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、小グリア細胞、赤血球、平滑筋細胞、内皮細胞および上皮細胞を含む多くの細胞型において発現するが、チャネルの発現のタイミングおよび役割はこれらの細胞において異なる場合がある。しかし、融合している細胞、または最近融合した細胞におけるＳＫ４チャネルの発現および役割は、これまで報告されていない。
【００２５】
本明細書で使用するとき、「マクロファージ（単数または複数）」は、先天性および後天性免疫に加えて組織ホメオスタシスにおいても機能するＣＤ６８＋（ヒト）またはＦ４／８０＋（マウス）単核白血球を意味する。また、マクロファージはＣＤ１１ｂ＋である場合もある。形態学的には、マクロファージは、円形の核を有する大型細胞（約２５μm〜５０μm）のように見え、１〜２つの核小体、集合クロマチン、液胞を備えた豊富な細胞質、および多数のアズール顆粒を含む。マクロファージは、身体組織全体にわたって存在し、循環血液中の単球に由来する（すなわち、血液由来の単核白血球）。マクロファージには、食作用および抗原提示という２つの主な役割がある。
【００２６】
食細胞として、マクロファージは、細胞残屑および病原体（例えば細菌、真菌、原生動物、ウイルスおよび酵母）を貪食し、次いで、消化し、そして、リンパ球および他の免疫細胞を刺激してこれらの病原体に応答する。抗原提示細胞として、マクロファージは、食菌した病原体の抗原を処理し、リンパ球および他の免疫細胞の表面上に提示する。また、マクロファージは、酵素、補体タンパク質、およびインターロイキン１および腫瘍壊死因子−αなどの制御因子を含む一連のモノカインを分泌する。さらに、マクロファージは、リンホカイン用レセプターを有し、前記レセプターは、病原体攻撃性および腫瘍破壊細胞へマクロファージを活性化させる。
【００２７】
いくつかのマクロファージは、特定の器官または組織、特に病原体侵入または塵埃の蓄積が生じる可能性が高い領域に局在する（すなわち、定着する）。定着性マクロファージの機能は不均一であり、サイトカインおよび病原性産物などの微環境刺激に左右されると考えられる。定着性マクロファージの例を表１に列挙する。
【表１】
0005783903.tif 000002
【００２８】
マクロファージ（およびその単球前駆体）の同定、単離および培養に必須の方法および材料は、当技術分野において公知である。例えば、Alabraba et al. (2007) J. Immunol. Methods 326:139-144; Borgmann et al., "Isolation and HIV-1 infection of primary human microglia from fetal and adult tissue," 49-70 In:  Methods in Molecular Biology (Zhu ed., Humana Press Inc. 2005); Buckley et al. (1985) J. Immunol. 134:2310-2315; Buckley et al., "Human osteoclast culture from peripheral blood monocytes," 55-68 In:  Methods in Molecular Medicine (Picot ed., Humana Press Inc. 2nd ed. 2005); Cline (1994) Blood 84:2840-2853; Davies & Gordon, "Isolation and culture of human macrophages," 105-116 In:  Basic Cell Culture Protocols (Helgason & Miller eds., Humana Press Inc. 3rd ed. 2005); Davies & Gordon, "Isolation and culture of murine macrophages," 91-103 In:  Basic Cell Culture Protocols (Helgason & Miller eds., Humana Press Inc. 3rd ed. 2005); Fels & Cohn (1986) J. Applied Physiology 60:353-369; Gordon & Taylor (2005) Nat. Rev. Immunol. 5:953-964; Havenith et al. (1998) Glia 22:348-359; Rogler et al. (1998) Clin. Exp. Immunol. 112:205-215; Schuenke & Gelman (2003) J. Neurovirol. 9:346-357; St-Laurent et al. (2009) J. Asthma 46:1-8; Taylor et al. (2005) Ann. Rev. Immunol. 23:901-944;およびWilson & Stewart, "Glomerular epithelial and mesangial cell culture and characterization," 269-282 In:  Methods in Molecular Medicine (Picot ed., Humana Press Inc. 2nd ed. 2005)を参照されたい。これらはそれぞれ、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２９】
上述のように、マクロファージは自身（すなわち同型融合）または他の細胞（すなわち異型融合）と融合することにより多核細胞を形成することができる。前記Vignery (2005)を参照されたい。マクロファージが融合する機序は完全には理解されていないが、ＳＫ４チャネルのアップレギュレーションおよび活性が関与しており、そしてこのようなアップレギュレーションまたは活性をブロックすると細胞間融合が阻害されることを以下に示す。本明細書において特に対象となるマクロファージに由来する多核細胞は、破骨細胞、巨細胞および転移癌細胞である。
【００３０】
本明細書で使用するとき、「同型融合」は、マクロファージなどの同種の少なくとも２個の細胞間の細胞間融合を意味する。マクロファージの同型融合の例は、巨細胞、筋芽細胞、破骨細胞および合胞体栄養細胞を含むが、これらに限定されない。対照的に、「異型融合」は、少なくとも１つの細胞がマクロファージである異なる系統の少なくとも２個の細胞間の細胞間融合を意味する。マクロファージとの異型融合の例は、転移癌細胞を含むが、これらに限定されない。同上を参照されたい。
【００３１】
本明細書で使用するとき、「破骨細胞（単数または複数）」は、その石灰化されたマトリックスの除去により骨組織を可溶化する、同型の、特殊化、多核化されたマクロファージに由来する細胞を意味する。このような細胞はＣＤ２００、ＣＴレセプターまたはＤＣ−ＳＴＡＭＰを発現することができる。形態学的には、破骨細胞は、ほぼ同じ大きさである多数の別々の核（約２〜約５０個）を含む、大きく、不規則に形作られた細胞である。また、破骨細胞は、ビトロネクチンおよびカルシトニン受容体の発現に加えて、酒石酸塩耐性の酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）およびカテプシンＫの高発現を特徴とする。破骨細胞は、典型的に骨組織に存在し、少なくともＮＦκβアクチベーター（ＲＡＮＫ）リガンド（ＲＡＮＫＬ）およびマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）によって刺激されたとき、マクロファージから形成される。
【００３２】
本明細書で使用するとき、「巨細胞（単数または複数）」は、組織ホメオスタシスにおいて機能する同型の、特殊化、多核化されたマクロファージに由来する細胞を意味する。このような細胞はＣＤ２００、またはＤＣ−ＳＴＡＭＰを発現することができる。形態学的に、巨細胞は、多数の別々の核を有する、大きく、不規則に形作られた細胞であるという点で破骨細胞に非常に類似している。巨細胞は、マクロファージの防御能力を増強し、大きな異物、特に医療用移植物および、病原体への慢性炎症に加えて、肉芽腫性疾患に応答してマクロファージから形成される。インターロイキン−４またはインターロイキン−１３は、巨細胞形成に必要であると考えられる。
【００３３】
本明細書で使用するとき、「転移癌細胞（単数または複数）」は、異型の、多核化されたマクロファージおよび癌に由来する細胞を意味する。典型的に、前記細胞は、マクロファージの運動能力および癌細胞の分裂能力を有するハイブリッドである。そのため、転移癌細胞は、腫瘍形成の原発部位から離れて遊走し、身体の他の領域に定着することができる。
【００３４】
本明細書で使用するとき、「マクロファージに由来する多核細胞（単数または複数）」は、マクロファージの同型または異型融合に起因する少なくとも２つ以上の核を有する細胞を意味する。マクロファージに由来する多核細胞の例は、乳癌細胞、多発性骨髄腫細胞、破骨細胞、巨細胞、および特定の転移癌細胞を含むが、これらに限定されない。
【００３５】
本明細書に記載された組成物および方法は、マクロファージに由来する多核細胞、特に破骨細胞、巨細胞および転移癌細胞が関与する様々な疾患または障害の治療および／または予防に用途が見出される。具体的には、ＳＫ４チャネルインヒビターを使用して、骨再吸収／骨喪失を予防または低減したり、自己免疫または炎症性の疾患または障害を予防または治療したり、移植物または移植片拒絶反応を予防したり、あるいは癌転移を予防したりすることができる。
【００３６】
したがって、本発明のいくつかの態様では、前記組成物および方法は、骨喪失および骨喪失に関連する疾患の治療または予防において使用するための組成物および方法である。骨喪失疾患に関して、異常な破骨細胞形成が生じる場合があり、それによって過度に硬骨が再吸収され、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）が低下する。本発明の組成物および方法を用いて予防または治療することができる骨喪失疾患の例は、骨粗鬆症、骨軟化、パジェット病、歯槽膿漏症、他の病理学的条件（すなわちアルコール中毒、セリアック病、慢性腎臓病、慢性肝炎、癲癇、胃腸疾患、上皮小体機能亢進症、甲状腺機能亢進症、性腺機能低下症、白血病、リンパ腫、関節リウマチ、壊血病、ビタミンＤ欠乏）に付随して起こる骨喪失などを含むが、これらに限定されない。
【００３７】
本発明の他の態様では、前記組成物および方法は、特に巨細胞形成が関与している自己免疫疾患の治療または予防において使用するための組成物および方法である。自己免疫疾患に関して、巨細胞形成は、免疫系が自身の構成要素を自己と認識しないことに応答して生じる場合があり、それにより細胞および組織の破壊が生じる。異常な免疫反応は、特定の器官に限定される（すなわち、局在する；例えば甲状腺炎において）場合もあり、異なる場所の特定の組織（例えば、肺および腎臓の両方の基底膜を冒す場合があるグッドパスチャー病）に関与する場合もあり、全身性である場合もある。したがって、自己免疫疾患における巨細胞形成を予防するか、調節するか、または阻害する（すなわち低減）ことにより、細胞および組織損傷を寛解させることができる。
【００３８】
本発明の組成物および方法を用いて予防または治療することができる自己免疫疾患の例は、急性散在性脳脊髄膜炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、脱毛、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性内耳疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、シャガス病、慢性閉塞性肺疾患、セリアック病、クローン病、皮膚筋炎、１型糖尿病、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン−バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本病、川崎病、特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、乾癬、原発性胆汁性肝硬変、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」としても知られている）、潰瘍性大腸炎、脈管炎などを含むが、これらに限定されない。
【００３９】
本発明のさらに他の態様では、前記組成物および方法は、特に巨細胞形成が関与している炎症性疾患の治療または予防において使用するための組成物および方法である。炎症性疾患に関して、身体の免疫系が病原体、損傷細胞または刺激原などの刺激に対して過剰反応したとき、巨細胞形成が生じる場合がある。過剰反応性免疫反応は、炎症を引き起こし、健常細胞および組織を破壊する、多核巨細胞を含む炎症細胞の残存により特徴付けることができる。したがって、炎症性疾患における巨細胞形成を阻止または阻害することにより、炎症、ならびに細胞破壊および組織損傷を寛解させることができる。
【００４０】
本明細書に記載される組成物および方法を用いて予防または治療することができる炎症性疾患の例は、ざ瘡、喘息、関節硬化症、クロム酸閉塞性肺疾患、大腸炎、皮膚炎、糸球体腎炎、炎症性腸感染、湿疹、ケロイド、狼瘡、腎炎、変形性関節症、骨盤炎症性疾患、乾癬、関節リウマチ、腱炎などを含むが、これらに限定されない。明瞭にするために述べると、上記のいくつかの自己免疫疾患は、自己免疫および炎症性疾患の両方として分類しうる。
【００４１】
本発明の他の態様では、前記組成物および方法は移植物および移植片拒絶反応の予防において使用するための組成物および方法である。巨細胞形成は、移植物または移植細胞、器官または組織に応答して生じる場合がある。レシピエントの免疫系は、移植物（すなわち、ペースメーカーなどの医療機器）または移植細胞、器官もしくは組織を異物として認識し、拒絶する場合があり、前記拒絶は、細菌およびウイルスなどの起炎菌を破壊するかのように、移植物を攻撃して移植物の分解または機能不全を引き起すか、または移植細胞／器官／組織を攻撃する、巨細胞を含む炎症細胞の残存を特徴とする。したがって、移植物または移植片の部位における巨細胞形成を予防することにより、拒絶反応を予防または寛解させることができる。
【００４２】
本明細書で使用するとき、「移植物拒絶反応」とは、埋め込まれた医療機器が移植レシピエントの身体に受け入れられない免疫状態を意味する。対象移植物は、蝸牛装置、人工膝関節、人工股関節、ボーンセメント、乳房移植物、心臓移植物（例えば人工弁、細動除去器、左室補助装置、ペースメーカー）、皮膚移植物、胃バンドまたはバルーン、留置カテーテル、インシュリンポンプ、子宮内器具、神経刺激物、眼の移植物、整形外科的移植物、陰茎勃起性人工器官、ステント、尿道スリング、音声人工器官などを含むが、これらに限定されない。前述のものを考慮して、本明細書に記載された組成物で移植可能な装置をコーティングするか、または前記組成物に含浸して、拒絶反応の可能性を阻止または減少させうることも考えられる。
【００４３】
本明細書で使用するとき、「移植片拒絶反応」は、移植された細胞、組織または器官が移植レシピエントの身体によって受け入れられない免疫状態を意味する。移植片拒絶反応においては、レシピエントの免疫系は、移植された器官／組織を破壊しようとしてそれを異物として攻撃する。
【００４４】
移植片拒絶反応の例は、硬骨および骨髄移植片、角膜移植片、心臓および心臓弁移植片、腸移植片、腎臓移植片、肢移植片、肝臓移植片、肺移植片、膵臓移植片、血小板輸血、赤血球輸血、皮膚移植片、幹細胞移植片、移植腱、血管移植片、白血球輸血などを含むが、これらに限定されない。
【００４５】
本発明の他の態様では、前記組成物および方法は、転移細胞形成および癌転移の予防において使用するための組成物および方法である。転移に関して、転移細胞は、マクロファージと癌細胞との融合から形成され、次に、身体における原巣（すなわち一次腫瘍）から身体の他の部分へ広がり得る。事実上、すべての癌で転移が発生する可能性があり、転移は、３つの方法で広がる場合がある：（１）腫瘍から周囲の組織への局所伸展を通して、（２）血流を通じて遠位部位へ、または（３）リンパ系を通じて近傍または遠位リンパ節に。したがって、転移癌細胞の形成を妨げることにより、有益に癌転移を予防することができる。
【００４６】
本発明の組成物および方法を用いて転移を予防することができる癌の例は、骨癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、腸癌、肝臓癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、胃癌、喉頭癌、子宮癌などを含むが、これらに限定されない。
【００４７】
本発明は、マクロファージに由来する多核細胞によって媒介される疾患または障害を治療するための、有効量のＳＫ４チャネルインヒビターおよび場合により治療剤を有する組成物を含む。１つの態様では、有効量のＳＫ４チャネルインヒビターおよび治療剤を含む組成物が提供される。他の態様では、治療的に有効な量のＳＫ４インヒビターおよび治療剤に加えて薬学的に許容しうる担体を含む薬学的組成物が提供される。
【００４８】
本明細書で使用するとき、「ＳＫ４チャネルインヒビター」または「ＳＫ４チャネル阻害剤」は、ＳＫ４チャネル発現（すなわち、翻訳または転写）、ＳＫ４チャネル活性（すなわち、コンダクタンス）、または上流および下流のＳＫ４チャネルエフェクター（すなわち、プロモーターアクチベーター、インデューサー、サプレッサー、リプレッサー、キナーゼなど）に影響を与える剤を意味する。いくつかの態様では、ＳＫ４チャネルインヒビターは、阻害性核酸配列、抗ＳＫ４チャネル抗体、またはＳＫ４チャネルに結合して、それらの機能（すなわち脱分極化または再分極させる能力）を調節するよう設計された他のタンパク質でありうる。あるいは、ＳＫ４チャネルインヒビターは、ＳＫ４チャネルに特異的に結合して、それらの活性または機能をブロックする低分子でありうる。
【００４９】
ＳＫ４チャネルインヒビターの厳密な性質を問わず、ＳＫ４チャネルインヒビターは、ＳＫ４チャネルの発現、活性または機能のうちの一つ以上を減少させる。発現、活性または機能は、適切な対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％。９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を含むが、これらに限定されない統計的に有意な量低下する。好ましくは、ＳＫ４チャネルの発現、活性または機能は、少なくとも約１０％以上低下する。逆に、ＳＫ４チャネルインヒビターは、ＳＫ４チャネル発現、活性または機能を統計的に増加させないはずである。
【００５０】
ＳＫ４チャネルの発現に影響を与える剤は、ＳＫ４チャネルモノマーの発現を阻害する阻害性核酸分子を含みうる。阻害性核酸分子は、ＳＫ４チャネルモノマーをコードするメッセンジャーＲＮＡの翻訳を妨げる（例えば、センスサプレッション／コサプレッション；アンチセンスサプレッション；低分子干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又は低分子ヘアピン型ＲＮＡを介した二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）干渉；アンプリコン介在性干渉；およびリボザイム）ことにより、直接モノマーの発現を阻害することも、またはＳＫ４チャネルモノマーをコードする遺伝子または核酸配列の転写または翻訳を阻害するポリペプチドをコードすることにより、間接的にモノマーの発現を阻害することもできる。哺乳動物細胞における遺伝子産物の発現を阻害したり、または発現しないようにする方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意のこのような方法を使用して、ＳＫ４チャネルモノマーの発現を阻害することができる。
【００５１】
センスサプレッション／コサプレッションでは、発現カセットは、「センス」配位でＳＫ４チャネルモノマーをコードするネイティブな遺伝子または核酸（例えば、配列番号１、３、もしくは５を含む遺伝子もしくは核酸配列、または配列番号１、３、もしくは５と実質的に同一の配列）に対応するコサプレッション核酸分子を発現するよう設計してもよい。コサプレッション核酸分子は、ＳＫ４チャネルモノマーをコードする遺伝子または核酸のすべてまたは一部、ＳＫ４チャネルモノマーをコードする遺伝子または核酸の５’および／または３’非翻訳領域のすべてまたは部分、あるいはＳＫ４チャネルモノマーをコードする遺伝子または核酸のコード配列および非翻訳領域のすべてまたは一部に相当し得る。一般的に、コサプレッション核酸分子は、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、８５０、または１０００個のヌクレオチドを含むことができるか、あるいはＳＫ４チャネルモノマーの完全長核酸配列以下の任意の大きさでありえる。コサプレッション核酸分子がＳＫ４チャネルモノマーのコード領域のすべてまたは一部を含む場合、機能性ＳＫ４チャネルモノマーがコサプレッション核酸分子から転写されないように、開始コドンを有しないよう発現カセットを設計してもよい。コサプレッション核酸分子の過剰発現は、ＳＫ４チャネルモノマーをコードする遺伝子または核酸の発現を低下させることができる。哺乳類のイオンチャネルを阻害するためにコサプレッションを使用する方法は、当技術分野において周知である。例えば、Bingham (1997) Cell 90:385-387；および国際公開公報第１９９９／０６３０８１号を参照されたい；これらはそれぞれ、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５２】
アンチセンスサプレッションでは、発現カセットは、ＳＫ４チャネルモノマーをコードするネイティブな遺伝子または核酸のすべてまたは一部に相補的なアンチセンス核酸分子を発現するよう設計してもよい。アンチセンス核酸分子は、ＳＫ４チャネルモノマーをコードする遺伝子または核酸の相補体のすべてまたは一部、ＳＫ４チャネルモノマーをコードする遺伝子または核酸の５’および／または３’非翻訳領域の相補体のすべてまたは一部、あるいはＳＫ４チャネルモノマーをコードする遺伝子または核酸配列のコード配列および非翻訳領域の両方の相補体のすべてまたは一部に相当し得る。また、アンチセンス核酸分子は、ＳＫ４チャネルモノマーをコードする遺伝子または核酸に対して完全に相補的であってよく（すなわち、ターゲット核酸配列の相補体と１００％同一）、または部分的に相補的であってもよい（すなわち、ターゲット核酸配列の相補体と１００％未満同一）。アンチセンス核酸分子の発現は、ＳＫ４チャネルモノマーをコードする遺伝子または核酸の発現を低下させることができる。
【００５３】
用いられるアンチセンス核酸分子の種類にかかわらず、少なくとも２５個のヌクレオチド、５０、１００、２００、３００、４００、４５０、５００、５５０個、またはそれ以上のヌクレオチドの配列を使用することができる。アンチセンス核酸分子を使用して、哺乳類のイオンチャネルの発現を阻害するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、Eigel & Hadley (2001) Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281:H2184-H2190; Meiri et al.(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4430-4434; Sasamura et al. (2002) Jpn. J. Pharmacol. 90:164-172; Si et al. (2006) Brit. J. Pharmacol. 148:909-917; Tao et al. (2008) Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295:C1409-C1416; Tharp et al. (2006) Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291:H2493-H2503; Wang et al. (2007) Oncogene 26:5107-5114;およびWaterhouse & Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38を参照されたい；これらはそれぞれ、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５４】
アンチセンス配列の３’およびポリアデニル化シグナルの５’の位置における発現カセットにポリ−ｄＴ領域を含めることにより、アンチセンスサプレッション効率を高めることができる。米国特許出願公開第２００２／００４８８１４号を参照されたい；これは、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５５】
ｄｓＲＮＡ干渉では、コサプレッションについて上に記載されたようなセンス核酸分子、および前記センス核酸配列に対して完全にまたは部分的に相補的なアンチセンス核酸分子は、同じ細胞中で発現して、ＳＫ４チャネルモノマーをコードするネイティブな遺伝子または核酸の発現を阻害する。ＳＫ４チャネルモノマーをコードする核酸のセンスおよびアンチセンス配列の両方を含むように発現カセットを設計することにより、センスおよびアンチセンス核酸の分子を発現させることができる。あるいは、センスおよびアンチセンスの核酸分子に対して別々の発現カセットを使用してもよい。
【００５６】
ｄｓＲＮＡ干渉に用いられる核酸分子の種類にかかわらず、少なくとも２５個のヌクレオチド、５０、１００、２００、３００、４００、４５０、５００、５５０個、またはそれ以上のヌクレオチドの配列を使用することができる。ｄｓＲＮＡ干渉を使用して、哺乳類のイオンチャネルの発現を阻害するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、Cotella et al.(2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 330:555-560;およびPalmer et al. (2006) Cell Biochem. Biophys. 46:175-191を参照されたい；これらはそれぞれ、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５７】
アンプリコン介在性干渉では、ＳＫ４チャネルモノマーをコードするネイティブな遺伝子または核酸のすべてまたは一部を含むウイルスに由来する配列を含む核酸配列を有するアンプリコン発現コンストラクトを設計してもよい。アンプリコン発現カセットの転写産物中に存在するウイルス配列は、転写産物がそれ自身の複製を導くことを可能にする。アンプリコンによって生成された転写物は、ＳＫ４チャネルをコードする遺伝子または核酸配列に対してセンスであってもアンチセンスであってもよい。
【００５８】
用いられる核酸分子の種類にかかわらず、少なくとも２５個のヌクレオチド、５０、１００、２００、３００、４００、４５０、５００、５５０個、またはそれ以上のヌクレオチドの配列を使用することができる。アンプリコンを使用して、哺乳類のイオンチャネルの発現を阻害または減弱する方法は、当技術分野において周知である。例えば、White et al. (2002) J. Neurophysiol. 87:2149-2157を参照されたい；これは、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５９】
リボザイムでは、発現コンストラクトは、ＳＫ４チャネルをコードするネイティブな遺伝子または核酸配列によって発現されたｍＲＮＡに対する触媒活性を有する核酸分子を発現するよう設計してもよい。触媒性核酸分子は、ＳＫ４チャネルをコードするｍＲＮＡまたは核酸の分解を引き起こして、ＳＫ４チャネルの発現を減少させる。
【００６０】
用いられる触媒性核酸分子の種類にかかわらず、少なくとも２５個のヌクレオチド、５０、１００、２００、３００、４００、４５０、５００、５５０個、またはそれ以上のヌクレオチドの配列を使用することができる。リボザイムを使用して、哺乳類のイオンチャネルの発現を阻害または減弱する方法は、当技術分野において周知である。例えば、Liu et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:8711-8718;および米国特許第４，９８７，０７１号を参照されたい；これらはそれぞれ、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６１】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）干渉では、ｍｉＲＮＡは、転写されるが、ＳＫ４チャネルモノマーに翻訳されないように（すなわち、非コードＲＮＡ）、ＳＫ４チャネルモノマーをコードするネイティブな遺伝子または核酸配列に相補的な核酸分子を発現するように発現コンストラクトを設計してもよい。一次転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）はそれぞれ、プレｍｉＲＮＡと呼ばれる短いステムループ構造に、そして最終的に機能的なｍｉＲＮＡにプロセシングされる。ｍｉＲＮＡは、約２２〜約２３個のリボヌクレオチドからなる。成熟ｍｉＲＮＡは、ＳＫ４チャネルモノマーをコードする遺伝子または核酸分子の発現の阻害において非常に効率的である。成熟ｍｉＲＮＡ分子は、ＳＫ４チャネルモノマーをコードする一つ以上の核酸分子に対して部分的に相補的であるので、ＳＫ４チャネルモノマーをコードする核酸分子の翻訳を阻害するか、または時に前記核酸分子の切断を促進することにより、遺伝子発現をダウンレギュレーションする。ｍｉＲＮＡ分子を使用して、哺乳類のイオンチャネルの発現を阻害する方法は、当技術分野において周知である。例えば、Lee et al. (1993) Cell 75:843-854;およびXiao et al. (2007) J. Biol. Chem. 282:12363-12367を参照されたい；これらはそれぞれ、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６２】
低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）干渉では、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするために使用することができる、密着したヘアピンカーブを作製する、ＳＫ４チャネルモノマーをコードするネイティブな遺伝子または核酸に相補的な核酸分子を発現するように発現カセットを設計してもよい。ｓｈＲＮＡ干渉は、また、発現カセットが、ヘアピン構造を有するイントロンがスプライシングされたＲＮＡをコードする核酸を発現するように設計されてもよい、イントロン含有ヘアピンＲＮＡ（ｉｈｐＲＮＡ）干渉であってもよい。
【００６３】
用いられるｓｈＲＮＡ分子の種類にかかわらず、少なくとも２５個のヌクレオチド、５０、１００、２００、３００、４００、４５０、５００、５５０個、またはそれ以上のヌクレオチドの配列を使用することができる。ｓｈＲＮＡ分子を使用して、哺乳類のイオンチャネルをコードする遺伝子の発現を阻害する方法は、当技術分野において周知である。例えば、Weaver et al. (2006) Glia 54:223-233を参照されたい；これは、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６４】
また、センス配列およびアンチセンス配列がＳＫ４チャネルをコードする核酸配列に相当しないように、ｓｈＲＮＡ干渉用の発現カセットを設計してもよい。代わりに、センスおよびアンチセンス配列は、ＳＫ４チャネルモノマーをコードする核酸配列のすべてまたは一部に相当するヌクレオチド配列を含むループ配列に隣接する。したがって、ループ領域は、ＲＮＡ干渉の特異性を決定する。例えば、国際公開公報第０２／００９０４号を参照されたい；これは、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６５】
さらに、ヘアピンの逆方向反復配列が、サイレンシングされるＳＫ４チャネルモノマーをコードする遺伝子または核酸のプロモーター領域と配列同一性を共有している場合、ｓｈＲＮＡ分子の使用を通じて、転写レベルでの遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）を行うことができる。同種のプロモーター領域と相互作用することができる短いＲＮＡへのｓｈＲＮＡのプロセシングは、分解またはメチル化をトリガーして、サイレンシングを生じさせる（Aufsatz et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99:16499-16506;およびMette et al. (2000) EMBO J. 19:5194-5201;を参照されたい；これらは、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００６６】
ＳＫ４チャネルの活性または機能に影響を与える更なる剤は、ＳＫ４チャネルの活性または機能を調節するペプチド、タンパク質または低分子を含んでよい。前記ペプチド、タンパク質または低分子は、ＳＫ４チャネルのコンダクタンス、または、例えば、ＳＫ４チャネルをレギュレーションするカルモジュリン（Fanger et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:5746-575を参照されたい；これは、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる）またはキナーゼ（Gerlach et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:585-598を参照されたい；これは、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる）の活性を阻害することができる。あるいは、前記ペプチド、タンパク質または低分子は、ＳＫ４チャネルの活性化によってそれ自体がレギュレーションされるアクセサリ分子の活性または機能を調節することができる。
【００６７】
阻害性ペプチドまたはタンパク質では、ＳＫ４チャネルモノマーまたはＳＫ４チャネルホモテトラマーに結合する抗体であってもよい。本明細書で使用するとき、「抗体（単数または複数）」は、特定の抗原または前記抗原のエピトープと免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子を意味する。また、前記用語は、キメラ抗体（例えばヒト化マウス抗体）およびヘテロコンジュゲート抗体（例えば二重特異性抗体）などの遺伝子的に改変された形態を含む。前記用語は、さらに、二価または二重特異性分子、ダイアボディ、トリアボディおよびテトラボディを含む。二価および二重特異性分子は、例えばKostelny et al. (1992) J. Immunol. 148:1547-1553; Pack & Pluckthun (1992) Biochemistry 31:1579-1584; Zhu et al. (1997) Protein Sci. 6:781-788; Hu et al. (1996) Cancer Res. 56:3055-3061; Adams et al. (1993) Cancer Res. 53:4026-4034;およびMcCartney et al. (1995)Protein Eng. 8:301-314に記載されており；これらはそれぞれ、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６８】
抗体は、また、抗原結合能を備えたフラグメント（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびｒＩｇＧ）を含む抗体の抗原結合形態を含む。パパインおよびペプシンなどのタンパク質分解酵素により抗体を処理して、これらの抗体のフラグメント、特に抗ＳＫ４チャネル抗体のフラグメントを作成する。抗体は、また組換え単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）を指す。好ましくは、本明細書に記載される方法を実施するために使用される抗体は、１０７Ｍ−１以上の親和性（会合定数）でそのターゲットタンパク質に結合する。
【００６９】
抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体であってよく、任意の抗体クラス（すなわちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡなど）に属していてよい。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製する方法は、当技術分野において周知である。例えば、当業者は、リンパ球を単離し、骨髄細胞と融合させて、ハイブリドーマを生成することにより、モノクローナル抗体を作製することができる。例えば、Milstein, In: Handbook of Experimental Immunology (Blackwell Scientific Publishing 1986);およびGoding, In: Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (Academic Press 1983)を参照されたい；これらはそれぞれ、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。次いで、クローニングされたハイブリドーマを、例えば、抗ＳＫ４チャネルモノマー、またはホモテトラマー抗体（すなわちＳＫ４チャネルモノマー、ホモテトラマー、またはそれらのフラグメントに優先的に結合する抗体）の産生についてスクリーニングする。したがって、このような産生がインサイチュで行われようと行われまいと、モノクローナル抗体は、抗体が生成される方法によって限定されない。
【００７０】
あるいは、抗体は、細菌、酵母、植物、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株における発現を含むが、これらに限定されない組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。例えば、当業者は、（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）従来の手順を使用して、モノクローナル抗体をコードする核酸配列を容易に単離および配列決定することができる。ハイブリドーマ細胞は、核酸配列用のＤＮＡの好適な供給源として機能し得る。一旦単離したら、核酸配列を発現ベクターに入れ、次に、前記発現ベクターを、トランスフェクションされなければ抗体を産生しない大腸菌（E.coli）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ミエローマ細胞または植物細胞などのホスト細胞へトランスフェクションして、組換えホスト細胞中でモノクローナル抗体を合成させることができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組み換え発現についての総論は、以下を含む：Skerra (1993) Curr. Opin. Immunol. 5:256-262;およびPhickthun (1992) Immunol. Rev. 130:151-188;これらはそれぞれ、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７１】
あるいは、抗体は、ＣＨＯ細胞株などの細胞株中で産生することができる。例えば、米国特許第５，５４５，４０３号；同第５，５４５，４０５号、および同第５，９９８，１４４号を参照されたい;これらはそれぞれ、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。簡潔に述べると、当業者は、それぞれ軽鎖および重鎖を発現することができるベクターで細胞株をトランスフェクションすることができる。別々のベクター上の２つのタンパク鎖をトランスフェクションすることによって、キメラ抗体を産生することができる。ＣＨＯ細胞を使用する別の利点は、抗体が正確にグリコシル化されることである。
【００７２】
同様に、ポリクローナル抗体を作製する方法は、当技術分野において周知である。例えば、当業者は、例えば、ウサギなどの適切なホスト動物を免疫原（例えばＳＫ４チャネルモノマー、ＳＫ４チャネルホモテトラマーまたはそれらのフラグメント）で免疫し、適切に希釈された血清を用いるか、または血清から免疫グロブリンを単離することにより、ポリクローナル抗体を作製することができる。したがって、前記動物に免疫原を接種し、続いて前記動物から血液を除去し、ＩｇＧフラクションを精製することができる。他の適切なホスト動物は、ニワトリ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ラットまたはマウスを含む。所望であれば、免疫原は、例えばそのアミノ酸残基のうちの１つの側鎖を介して、免疫原が適切な担体にカップリングしているコンジュゲートとして投与してもよい。担体分子は、典型的に生理学的に許容しうる担体である。得られた抗体は、最高約７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の純度に精製することができる。
【００７３】
抗ＳＫ４チャネルモノマーまたはホモテトラマー抗体を作製する方法は、当技術分野において公知である。例えば、Boettger et al. (2002) Brain 125:252-263; Furness et al. (2004) Autonom. Neurosci. 112:93-97; Ghanshani et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:37137-37149;およびHoffman et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7366-7371を参照されたい；これらはそれぞれ、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。同様に、市販されている抗ＳＫ４チャネル抗体は、本明細書における使用に適切であり、例えば、それぞれAlomone Labs (Jerusalem, Israel);Millipore (Billerica, MA)、Sigma Aldrich (St. Louis, MO)、およびSanta Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)から入手することができる。また、Sandow et al. (2006) J. Anat. 209:689-698;およびWulff et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:32040-32045を参照されたい。
【００７４】
あるいは、ＳＫ４チャネルインヒビターは、ＳＫ４チャネルモノマーまたはホモテトラマーと結合するように設計されたタンパク質であってもよい。本明細書で使用するとき、「ＳＫ４チャネルモノマーまたはホモテトラマーと結合するように設計されたタンパク質」は、上述のように、ＳＫ４チャネルモノマーまたはホモテトラマーと結合するように設計されたタンパク質であって、この結合によりＳＫ４チャネルの発現、活性または機能が阻害される（すなわち、低下する）タンパク質を意味する。阻害性ペプチドは、当技術分野において周知である。例えば、Wulff et al. (2007) Curr. Med. Chem. 14:1437-1457を参照されたい；これは、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７５】
あるいは、ＳＫ４チャネルインヒビターは、ＳＫ４チャネルモノマーと結合して、前記モノマーがホモテトラマーの一部を形成するのを妨げるか、またはホモテトラマーと結合して、その活性または機能を妨げる低分子であってもよい。本明細書で使用するとき、「ＳＫ４チャネルモノマーと結合する低分子」、または「ＳＫ４ホモテトラマーと結合する低分子」は、ＳＫ４チャネルモノマーまたはホモテトラマーの発現、活性または機能を阻害する医薬品において一般的に用いられる分子に匹敵する大きさの分子を意味する。好ましい低分子は、約５０００Da以下、好ましくは約２０００Da以下、最も好ましくは約１０００Da以下の大きさで変動してもよい。
【００７６】
本明細書において使用するための低分子の非限定的な例は、化学物質（化合物）、無機分子、有機分子、無機成分を含有する有機分子、放射性原子を含む分子、合成分子、およびペプチド模倣物（例えば、α−ヘリックスまたはβ−シートなどの、最も一般的なペプチドモチーフを模倣する短いペプチドフラグメント）を含む。ＳＫ４チャネルインヒビターとして、低分子は、巨大分子よりも細胞に対する浸透性が高く、分解されにくく、不所望の免疫反応を誘発しにくい場合もある。
【００７７】
低分子については、ＳＫ４チャネルモノマーまたはホモテトラマーに結合することができる化合物であってもよい。本明細書において有用な低分子の１つのクラスは、トリアリールメタンである。トリアリールメタンは、以下：
【化１】
0005783903.tif 000003
［式中、Ｘ、Ｙ、およびＺは、同じであっても異なってもよく、ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１、Ｎ＝ＣＨ、ＣＨ＝Ｎ、およびＲ２−Ｃ＝Ｃ−Ｒ３から、独立に選択してよく；
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、トリハロアルキル、ヒドロキシ、アシルオキシ、アルコキシ、アルケニルオキシ、チオ、アルキルチオ、ニトロ、シアノ、ウレイド、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、Ｎ−（Ｒ４）（Ｒ５）、ならびに炭素数１〜２０の飽和または不飽和、キラルまたはアキラル、環式または非環式、直鎖または分岐鎖のヒドロカルビル基であってよく、場合によりヒドロキシ、ハロゲン、トリハロアルキル、アルキルチオ、アルコキシ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、オキソアルキル、シアノおよびＮ（Ｒ４）（Ｒ５）基で置換されており；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アシルおよびアロイルであってよく、場合によりヒドロキシ、アミノ、置換アミノ、シアノ、アルコキシ、ハロゲン、トリハロアルキル、ニトロ、チオ、アルキルチオ、カルボキシおよびアルコキシカルボニル基で置換されており；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈであってよく、または結合して飽和もしくは不飽和の炭素環もしくは複素環を形成してよく、場合により一つ以上のＲ基で置換されており；
Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルおよびアシルであってよく、あるいは、Ｒ４およびＲ５は、結合して環を形成してよく、ここで炭素は場合によりＯ、ＳまたはＮ−Ｒ６−から選択されるヘテロ原子により置換されてもよく；
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシアルキルまたはカルボキシアルキルであってよく；ｎは１〜５であってよく；ｍは、１または２であってもよいが、但しｍが１でありうる場合、ＱはＯＨ、ＣＮ、カルボキシアルキル，Ｎ−（Ｒ７）（Ｒ８）（式中、Ｒ７およびＲ８は、Ｈ、低級アルキル（１−４Ｃ）、シクロアルキル、アリール、アシル、アミドであってもよいか、またはＲ７およびＲ８が結合して飽和もしくは不飽和の複素環を形成してよく、そして場合によりＮ、ＯおよびＳなどの３個以下の追加のヘテロ原子で置換されている）；あるいは−ＮＨ−複素環であってよく、ここで複素環は、チアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピリミジンおよびプリンであってよく；ｍが２でありうる場合、Ｑは、フェニルなどの直鎖もしくは分岐鎖、キラルもしくはアキラル、環式もしくは非環式、飽和もしくは不飽和炭化水素基として２〜１０個の炭素のスペーサーになりえる］の構造式を有してもよい。
【００７８】
本明細書において有用なトリアリールメタンの例は、１−［（２−クロロフェニル）−ジフェニルメチル］−１Ｈ−イミダゾール(クロトリマゾール；Ishii et al. (1997), 前記; Joiner et al. (1997), 前記;およびLogsdon et al. (1997),前記)；２，２−ビス（４−フルオロフェニル）−２−フェニルアセトアミド (ICA-17043; Stocker et al. (2003) Blood 101:2412-2418 );１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール (TRAM-34; Wulff et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:8151-8156;これは、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる）；１−［（２−フルオロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（４−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；１−［（２−フルオロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール；および１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−テトラゾールを含むが、これらに限定されない。さらなる低分子が、当技術分野において公知である。McNaughton-Smith et al. (2008) J. Med. Chem. 51:976-982; Wulff (2007), 前記;および国際公開公報第２００７／０３３３０７号を参照されたい。これらはそれぞれ、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７９】
対象化合物は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開公報第０３／０５９８７３（米国特許第７，２０８，５２７Ｂ２号が付与されている）および同第０９／０２７２９２号に記載されている、２，２−ビス−（４−フルオロフェニル）−３−メチル−ブチルアミド（以下）：
【化２】
0005783903.tif 000004
を含んでよい。
【００８０】
本発明のＫＡＴＰチャネルブロッカーは、以下の式で表される化合物：
【化３】
0005783903.tif 000005
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して以下から選択してもよい：アダマンチル、水素、炭素数１〜８（１と８を含める）のアルキル、炭素数５〜８（５と８を含める）のシクロアルキル、フェニル、アルキルが炭素数１〜３（１と３を含める）であってよいフェナルキル、およびモノ−またはジ−置換フェニルまたはフェナルキルのフェニル部分、ここで前記置換基は、同じであっても異なってもよく、そして、炭素数１〜３（１と３を含める）のアルキル、ハロゲン、トリフルオロメチル、および炭素数１〜３（１と３を含める）のアルコキシ、ハロ、およびトリフルオロメチル；水素および炭素数１〜８（１と８を含める）のアルキル、炭素数５〜８（５と８を含める）のシクロアルキルからなる群より選択してもよく、それらが結合している窒素原子と一緒にメチレン、あるいは水素と結合している窒素、または炭素数１〜３（１と３を含める）のアルキル、酸素；または硫黄を含む飽和複素環を形成してもよい。複素環がメチレンを含むとき、複素環は４〜６つの炭素原子を有することができる。複素環が酸素または硫黄を含むとき、複素環は、ピペラジノ、Ｎ−アルキルピペラジノ、モルホリノ、または、チオモルホリノ、およびそれらの薬学的に許容しうる酸付加塩であってもよい］を含んでよい。
【００８１】
これらのＫＡＴＰチャネルブロッカーは、以下から選択されるものを含んでよい：２，３−ブタンジオンモノオキシム；４−アミノピリジン（４−ＡＰ）；５−ヒドロキシデカノアート；７ニトロインダゾール；８−オキソ−ベルベリン；Ａ−１８４２０９；アセカイニド；アデノシン（ＡＴＰ）；アフラトレム；アガトキシンω型（ω−アガトキシン）；アジトキシン−１；アジトキシン−２；アジトキシン−３；ＡＬ  ２７５；アリニジンＳＴ５６７；アルモカラントＨ  ２３４／０９；α−デンドロトキシン；ＡＭ９２０１６；アンバシリド；アンバシリドＬＵ４７１１０；ＡＮ１３２；酸化防止剤；アパミン；ＡＲＨ  ０５０６４２；ＡＴＩ  ２０４２；ＡＴＰ；ＡＷＤ  １２−２６０；ＡＷＤ  １６０２７５；ＡＷＤ  ２３−１１１；ＡＺＤ  ７００９；ＡＺＤＦ  ２６５；アジミリド；塩化バリウム；Ｂａｙ  Ｋ８６４４（Ｒ）（＋）−型；ＢＤＳ−Ｉ；ＢＤＳ−ＩＩ；ベプリジル；ベルランビン；ベルトサミル；ベータブンガロトキシン（ベータ−ＢｕＴＸ）；ベータ−デンドロトキシン；ＢＨＡ  ０３８８；ＢＭＳ  ２０８７８２；ＢＭＳ  ２０８７８３；ＢＲＢＩ  ２８；ブレチリウム；ＢＲＬ  ３２８７２；ブロミドデンドロトキシン；ＢＴＳ  ６７５８２；ブピバカイン；カルサトリンスクシナートＲＷＪ  ２４５１７；カリアキン；ＣＧＸ  １００７；カングロリンピロゾリン；カリブドトキシン；カリルオトキシン（Charylotoxin）；グリベンクラミドのＣＨＦ  １５２２シクロデキストリン錯体；クロルプロパミド；クロマノール２９３異性体；クロマノール２９３Ｂ；シベンゾリン；シクラジンドール；クラミカラントＨＭＲ１０９８；クラミカラントＨＭＲ１８８３；クラウセンアミド（−型）；クラウセンアミド（ラセミ体）；クロフィリウムＬＹ１５０３７８；クロフィリウムトシラート；クロトリマソール；クロトリマゾール；ＣＮＳ  １２３７；ＣＰ  ３０８４０８；ＣＰ  ３３９８１８；ＣＰ  ３６６６６０；ＣＰ  ９２７１３；ＣＰＵ  ８６０１７；シアノグアニジン；デンドロトキシン（ＤＴＸ）；デンドロトキシンＩ（ＤＴＸ−Ｉ）；デンドロトキシンＫ（ＤＴＸ−Ｋ）；塩化デクアンリニウム；デキスソタロルＢＭＹ；０５７６３１Ｄ  ｄ−ソタロール；ジセントリン；ジメチルスルホキシド；ＤＫＡＨ  ２６９；ＤＭＰ  ５４３；ドフェチリド；ＤＰＣ  ５４３；ＤＰＩ  ２０１１０６；ドロネダロンＳＲ  ３３５８９；ＤＴＸ，α型（α−ＤＴＸ）；ＤＴＸ，β型（β−ＤＴＸ）；ＤＴＸ，γ型（γ−ＤＴＸ）；ＤＴＸ，σ型（σ−ＤＴＸ）；Ｅ−４０３１；エファロキサン；ＥＧＩＳ  ７２２９；エングリタゾン；エルセンチリド（＋／−型）；エルセンチリド（Ｓ型）；エタノール；エボジアミン（Ｓ）；ファンプリジン４−アミノピリジンＥＬ  ９７０；ホシノプリラト；ガンマ−デンドロトキシン；ＧＥＡ  ８５７；グレマンセリンＭＤＬ  １１９３９；ＧＬＧ  Ｖ  １３；グリベンクラミド；グリメピリド；グリピジド（ＧＬＰ）；グリピジドＫ  ４０２４；グリピジドＴＫ  １３２０；グルカゴンアンタゴニスト；グリベンクラミド；グリブリド；グアネチジン；グアニジン部分；ＧＹＫＩ  １６６３８；ＨＡ  ７；ＨＭＲ  １３７２；ＨＭＲ  １４０２；ＨＭＲ  １５５６；ＨＭＲ  １８８３；ヒドロキ��；イベリオトキシン；イブチリド；イブチリドＵ  ７０２２６；ＩＣＡ  １７０４３；ＩＣＩ  １８１０３７；ＳＫ４チャネルブロッカー；ＩＭＩＤ−１Ｍ；ＩＭＩＤ−２６Ｆ；ＩＭＩＤ−４Ｆ；ＩＭＩＤ−４Ｆ塩酸塩；イミダゾリン部分；ルパジリド(lpazilide)  ＷＩＮ  ５４１７７；イピダクリンＮＩＫ  ２４７；イバブラジン；ＪＫＬ  １０７３Ａ  オキシ−ベルベリン；ＪＴＶ  ５１９；カリオトキシン；ＫＣＢ  ３２８；ＫＭＣ  ＩＶ  ８４；ＫＷ  ３４０７；Ｌ  ６９１１２１；Ｌ  ７０２９５８；Ｌ  ７０６０００；Ｌ  ７３５８２１；Ｌ  ７４２０８４；Ｌ  ７６８６７３；Ｌ７５５８６０および関連化合物；レボセモチアジルＳＡ  ３２１２；レボセモチアジルＳＤ  ３２１２；リンバトキシン（Limbatoxin）；リンバツストキシン（Limbatustoxin）；リリオデニン；Ｌｑ２；ＬＱＥ  ９０８ピノカラント；ＬＹ１９０１４７；ＬＹ９７２４１；マルガトキシン；ミチグリニドＫＡＤ  １２２９  Ｓ−２１４０３；ＭＫ  ４９９；Ｎ  ３６０１；Ｎ−ａｌｌｙ）セコボルジン；ナテグリニド；ナテグリニドＡＹ  ４１６６；神経ペプチドＹ；ニベンタン；ニフェカラントＭＳ  ５５１；ニグルジピン塩酸塩Ｓ（＋）−型；ＮＩＰ  １４２；ＮＯＳインヒビター；ノキシウストキシン；ＮＳ  ００４；ＮＳ  １５４６；ＯＰＣ  ８８１１７；ＯＲＧ  ２０７８１；パンジノトキシン−Ｋα（Pandinotoxin-Kα）；パスパリトレム；パキシリン；ＰＤ  １５７６６７；ペニトレムＡ；ＰＧＥ  ８４４３８４；フェンシクリジン；フェントラミン；フェントラミン；ピルメノールＣｌ８４５；ピロシキサン（Pirocixan）；ＰＮＵ  １８１７７Ａ；ＰＮＵ  ３７８８３Ａ；ＰＮＵ  ８９６９２；ＰＮＵ  ９４１２６；ＰＮＵ  ９４１５８；ＰＮＵ  ９４５６３；ＰＮＵ  ９４７５０；ＰＮＵ  ９６１７９；ＰＮＵ  ９６２９３；ＰＮＵ  ９７０２５Ｅ；ＰＮＵ  ９９９６３；ピリドトリアゾール；キニジン；キニーネ；キニーネヘミ硫酸塩；レパグリニドＡＧＥＥ  ６２３；レパグリニドＮＮ  ６２３；レパグリニド；リモナバンＳＲ  １４１７１６；リソチリド；Ｒｏ０３４５６３；ロピバカインＡＬ  ２８１；ロピバカインＬＥＡ  １０３；ＲＰ  ５８８６６；ＲＰ  ６６７８４  ＲＳＤ  １０００；ＲＳＤ  １０１９；ルテカルピン；ＲＷＪ  ２８８１０；ＲＸ  ８７１０２４；Ｓ  １６２６０；Ｓ  ９９４７；サリチルアルドオキシム；サキシトキシン；ＳＢ  ２３７３７６；シラトキシン；ＳＤＺ  ＤＮＪ  ６０８；セマチリド；セマチリドＣＫ  １７５２；セマチリドＺＫ  １１０５１６；シノメニン；ナトリウム５−ヒドロキシデカノアート；ソタロール；ＳＰＭ  ９２８；スプリアドイルン（Spriadoilne）；ＳＳＲ  １４９７４４Ｂ；ハタゴイソギンチャク毒素(Stichodactyla toxin)；スルホニル尿素；ＴＥＡ（テトラエチルアンモニウム）；テジサミル；テジサミルＫＣ  ８８５７；テリカラントＲＰ  ６２７１９；テルチアピン；テルチアピン−Ｑ；塩化テトラエチルアンモニウム；テトラエチルアンモニウムイオン；テトロドトキシン；ＴＨ  ９１２１；ＴＨ  ９１２２；チチウストキシンＫ；チチウストキシンＫα；ＴＭＢ−８；ＴＮ  ８７１；トラザミド；トルブタミド；毒素ベースの治療薬ＢＲＩ  ６９０６；ＴＲＡＭ  ３０；トログリタゾン；Ｕ  ３７８８３Ａ；Ｕ  ５０４���８Ｈ；Ｕ−３７８８３Ａ；Ｕ−４５１９４Ａ；ＵＣＬ  １４３９；ＵＣＬ  １５３０；ＵＣＬ  １５５９；ＵＣＬ１６０８；ＵＣＬ  １６８４；ＵＫ  ６６９１４；ＵＫ  ７８２８２；ＷＡＹ  １２３２２３；ＷＡＹ  １２３３９８；ＷＩＮ  １７３１７−３；ＷＩＮ  ６１７７３；ＸＥ  ９９１；Ｙ  ３９６７７；ＹＭ  ０２６；ＹＭ  １９３４８ラセミ体；ＹＭ  １９３４８９−Ｒ；ＹＭ  １９３４８９−Ｓ；ＹＴ  １；ザテブラジン；ＺＭ  １８１０３７；ＺＭ  １８１０３７；ＺＭ  ２４４０８５。参照により本明細書に組み込まれる国際公開公報第２００７／００９４６２号を参照されたい。
【００８２】
また、対象化合物は、以下の式：
【化４】
0005783903.tif 000006
［式中、ｍ、ｎおよびｐは、独立して、０および１から選択することができ、そして、ｍ、ｎおよびｐの少なくとも１つは１であってよい］を有するものを含むことができる。
【００８３】
例示的な態様では、ｍ、ｎおよびｐがすべて１である場合、環１、および環２におけるフルオロ置換基は、独立して、アセトアミド置換基に対してオルト、アセトアミド置換基に対してメタ、およびアセトアミド置換基に対してパラから選択される位に位置し、そして環３における置換基は、アセトアミド置換基に対してオルト、およびアセトアミド置換基に対してパラから選択される位に存在する。別の例示的な態様では、ｐが０であり、ｍが１であり、そしてｎが１である場合、環１におけるフルオロ置換基は、アセトアミド置換基に対してパラであり、環２における置換基は、アセトアミド置換基に対してオルト、およびアセトアミド置換基に対してパラから選択される位に位置する。参照により本明細書に組み込まれる国際公開公報第２００７／０７５８４９号を参照されたい。
【００８４】
また、対象化合物は、式：
【化５】
0005783903.tif 000007
［式中、環系Ｚは、置換または非置換のアリール基、および置換または非置換の５員複素環であってもよい。記号Ａは、−ＮＨＳ（０）２−、−Ｓ（０）２ＮＨ−、−Ｃ（Ｒ３Ｒ４）Ｓ（０）ｎ−、または−Ｓ（０）ｎＣ（Ｒ３Ｒ４）−を表し、ここでＲ３およびＲ４は、独立して、水素、置換または非置換の低級アルキル、ＯＲ５および−ＣＦ３から選択される。記号Ｒ５は、水素、置換または非置換の低級アルキルまたはＣＦ３を表わす。整数ｎは、０〜２から選択される。記号Ｒ１は、置換または非置換のアリール、置換または非置換のヘテロアリール基、置換または非置換の（Ｃ５−Ｃ７）炭素環、あるいは置換または非置換の（Ｃ５−Ｃ７）複素環を表す］；
【００８５】
【化６】
0005783903.tif 000008
［式中、環系Ｚは置換または非置換のアリール基、ならびに置換および非置換５員複素環から選択できる。記号Ｒ１は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のヘテロアリール基、置換または非置換の（Ｃ５−Ｃ７）炭素環、あるいは置換または非置換の（Ｃ５−Ｃ７）複素環を表す。記号Ｒ２は、ＣＯＯＲ６、置換または非置換の２−フラン、置換または非置換の２−チアゾール、あるいは
【化７】
0005783903.tif 000009
を表す。
記号Ｒ６は、置換または非置換のＣ１−Ｃ４アルキル基、例えばメチル、エチル、およびＣＦ３を表す。Ｘは−Ｎ＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ７）−、−Ｃ（Ｒ７Ｒ８）−Ｃ（Ｒ７Ｒ８）−または−Ｃ（Ｒ７）＝Ｃ（Ｒ８）−を表し、ここでＲ７およびＲ８は、独立して、水素、置換および非置換の低級アルキル、または−ＣＦ３を表す。記号Ｙは、０、ＮＲ９またはＳを表し、ここでＲ９は、Ｈ、低級アルキル、またはＣＦ３である］；
【００８６】
【化８】
0005783903.tif 000010
【００８７】
【化９】
0005783903.tif 000011
［式中、ｍ、ｎおよびｐは、独立して、０および１から選択してよく、そして、ｍ、ｎおよびｐの少なくとも１つは１であり；ｍ、ｎおよびｐがすべて１である場合、環１および環２におけるフルオロ置換基は、独立して、アセトアミド置換基に対してオルト、アセトアミド置換基に対してメタ、およびアセトアミド置換基に対してパラから選択される位に位置し、そして環３における置換基は、アセトアミド置換基に対してオルト、およびアセトアミド置換基に対してパラから選択される位に存在してよく、ｐが０であり、ｍが１であり、そしてｎが１である場合、環１におけるフルオロ置換基は、アセトアミド置換基に対してパラであり、環２における置換基は、アセトアミド置換基に対してオルト、およびアセトアミド置換基に対してパラから選択される位に位置する］；
【００８８】
【化１０】
0005783903.tif 000012
［式中、ｍ、ｎおよびｐは、独立して、０および１から選択してよく、そして、ｍ、ｎおよびｐの少なくとも１つは１である］；
【００８９】
【化１１】
0005783903.tif 000013
［式中、ｍは０または１のいずれかである］；
【００９０】
【化１２】
0005783903.tif 000014
を有するものを含んでよい。
【００９１】
また、対象化合物は、以下の式：
【化１３】
0005783903.tif 000015
［式中、環系Ｚは、置換または非置換のアリール、５〜７員の非置換炭素環、４〜８員の置換または非置換の炭素環、４〜８員の置換または非置換の複素環、４〜８員の置換または非置換のヘテロアリールから選択してよく；Ｘは、−ＮＨＳ（０）２−、−Ｓ（０）２ＮＲ３−、およびＮＨＣ＝ＮＲ３の群より選択される要素であってよく（式中、Ｒ３は、Ｈ、及び置換または非置換の（Ｃ１−Ｃ４）アルキルから選択してもよい）；
【００９２】
Ｒ１は、置換または非置換のアリール、置換または非置換のヘテロアリール、置換または非置換の（Ｃ５−Ｃ７）炭素環、および置換または非置換の（Ｃ５−Ｃ７）複素環から選択してよく；Ｒ２は、−Ｃｌ、−ＣＦ３、−ＣＯ２Ｒ４、置換または非置換のアリール、５〜６員の置換または非置換の複素環、および５〜６員の置換または非置換のヘテロアリールから選択される要素であってよく（式中、Ｒ４は置換または非置換の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基であってよく、これは、場合により環系Ｚに結合して５〜７員を有するラクトンを形成してもよい）；そして、＊の印のついた２つの炭素間の二重結合は、環系Ｚの環内であってもよい］を有するものを含んでよい。参照により本明細書に組み込まれる国際公開公報第０３／０７４０３８号を参照されたい。
【００９３】
本発明で使用されるカルボニルアミノ誘導体は、式：
【化１４】
0005783903.tif 000016
、任意のその鏡像体、任意の鏡像異性体混合物、またはその薬学的に許容しうる付加塩［式中、Ａは、ＣＨまたはＮであってよく；Ｒは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルコキシまたはＣＦ３であってよく；Ｙは水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキルまたは以下の式：
【化１５】
0005783903.tif 000017
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、互いに独立して、水素、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２またはＣＦ３であってよく；Ｉは、０、１、２、３、４または６であってよく；そして、ｍ、ｎおよびｏは、互いに独立して、０、１または２であってよい。）で表される基を表す］を含む。
【００９４】
あるいは、ｍ、ｎおよびｏ、互いに独立して、０または１であってもよい。
【００９５】
【化１６】
0005783903.tif 000018
［式中、Ｉ、ｍ、ｎ、Ｙ、Ｒ、ＲｌおよびＲ２は、上に定義されたとおりである］
【００９６】
あるいは、本発明のカルボニルアミノ誘導体は式IIの化合物［式中、Ｙは、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキル−アルキルまたはアルケニルであってよく；Ｉは０であってよく；ｍおよびｎは、互いに独立して、０または１であってよく；そして、Ｒは水素を表す］であってよい。
【００９７】
あるいは、式IIのカルボニルアミノ誘導体は、Ｎ−ペンチル−２，２−ジフェニル−アセトアミド；Ｎ−ヘキシル−２，２−ジフェニル−アセトアミド；Ｎ−シクロプロピルメチル−２，２−ジフェニル−アセトアミド；または、Ｎ−ヘキサ−２−エニル−２，２−ジフェニル−アセトアミド；またはそれらの薬学的に許容しうる付加塩であってよい。
【００９８】
【化１７】
0005783903.tif 000019
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は上に定義されたとおりである］
【００９９】
あるいは、本発明のカルボニルアミノ誘導体は、式IIIのトリアリールメタン［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、互いに独立して、水素またはフルオロであってよい］であってよい。
【０１００】
あるいは、トリアリールメタン誘導体は、２，２，２−トリフェニル−アセトアミド；２−（２−フルオロ−フェニル）−２，２−ジフェニル−アセトアミド；２−（２−フルオロ−フェニル）−２，２−ジフェニル−アセトアミド；２−（４−フルオロ−フェニル）−２，２−ジフェニル−アセトアミド；２，２−ビス−（２−フルオロ−フェニル）−２−フェニル−アセトアミド；２−フェニル−２−（２−フルオロ−フェニル）−２−（４−フルオロ−フェニル）−アセトアミド；２，２−ビス−（２−フルオロ−フェニル）−２−フェニル−アセトアミド；２，２−ビス−（４−フルオロ−フェニル）−２−フェニル−アセトアミド；またはそれらの薬学的に許容しうる付加塩から選択してもよい。
【０１０１】
【化１８】
0005783903.tif 000020
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は上に定義されるとおりである］
【０１０２】
あるいは、本発明のトリアリールメタンは、式ＩＶ［式中Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、互いに、水素またはフルオロを表す］であってよい。
【０１０３】
あるいは、本発明のトリアリールメタン誘導体は、２，２，２−トリ−（２−フルオロ−フェニル）−アセトアミド；２，２−ビス−（２−フルオロ−フェニル）−２−（４−フルオロ−フェニル）−アセトアミド；２，２−ビス−（４−フルオロ−フェニル）−２−（２−フルオロ−フェニル）−アセトアミド；２，２，２−トリ−（４−フルオロ−フェニル）−アセトアミド；または、その薬学的に許容しうる付加塩から選択してもよい。
【０１０４】
【化１９】
0005783903.tif 000021
［式中、Ｉ、ｍ、ｎ、Ｙ、Ｒ、Ｒ１およびＲ２は、上に定義されたとおりである］
【０１０５】
あるいは、本発明のカルボニルアミノ誘導体は、式Ｖ［式中、Ｙは、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキル−アルキルまたはアルケニルを表し；Ｉは０であってよく；ｍおよびｎは、互いに独立して、０または１であってよく；Ｒは水素であってよく；そして、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、水素またはフルオロであってよい］であってよい。
【０１０６】
したがって、カルボニルアミノ誘導体は、（ＲＳ）−Ｎ−シクロプロピルメチル−２−フェニル−２−ピリジン−２−イル−アセトアミド；（ＲＳ）−２−（３，４−ジフルオロ−フェニル）−Ｎ−ヘキシル−２−ピリジン−２−イル−アセトアミド；または（ＲＳ）−Ｎ−ヘキシル−２−（４−ニトロフェニル）−２−ピリジン−３−イル−アセトアミド；または、それらの薬学的に許容しうる付加塩から選択してもよい。参照により本明細書に組み込まれる国際公開公報第０３／００４１０１号を参照されたい。
【０１０７】
また、対象化合物は、以下の式：
【化２０】
0005783903.tif 000022
［式中、ｍ、ｎおよびｐは、独立して、０および１から選択してよく、そして、ｍ、ｎおよびｐの少なくとも１つは１であり；ｍ、ｎおよびｐがすべて１である場合、環１および環２におけるフルオロ置換基は、独立して、アセトアミド置換基に対してオルト、アセトアミド置換基に対してメタ、およびアセトアミド置換基に対してパラから選択される位に位置してよく、そして環３における置換基は、アセトアミド置換基に対してオルトおよびアセトアミド置換基に対してパラから選択される位に存在してよく、ｐが０であり、ｍが１であり、そしてｎが１である場合、環１におけるフルオロ置換基は、アセトアミド置換基に対してパラであってよく、環２における置換基は、アセトアミド置換基に対してオルト、およびアセトアミド置換基に対してパラから選択される位に位置してもよい］、
【０１０８】
【化２１】
0005783903.tif 000023
［式中、ｍ、ｎおよびｐは、独立して、０および１から選択してよく、そして、ｍ、ｎおよびｐの少なくとも１つは１である］、
【０１０９】
【化２２】
0005783903.tif 000024
［式中、ｍは、０または１のいずれかであってよい］を有するものを含んでよい。参照により本明細書に組み込まれる国際公開公報第００／５００２６号を参照されたい。
【０１１０】
本発明で有用な他の低分子は次のものを含んでよい：マウロトキシン（Castle et al. (2003) Mol. Pharmacol. 63:409-418）。本明細書において有用なさらに他の低分子は、国際公開公報第９７／０３４５８９号、国際公開公報第９９／０２６６２８号、国際公開公報第９９／０２６９２９号、国際公開公報第２０００／０５００２６号、国際公開公報第２０００／０６９４３９号、国際公開公報第２０００／０６９７９４号、国際公開公報第２０００／０６９８２３号、国際公開公報第２００１／０４９６６３号、国際公開公報第２００４／０１６２２１号、国際公開公報第２００５／００３０９４号、国際公開公報第２００５／００３１４３号、国際公開公報第２００６／０８４０３１号および国際公開公報第２００９／０２７２９２号に開示されているものを含んでもよく；これらはそれぞれ、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１１】
本明細書で使用するとき、「有効量」または「治療上有効な量」（すなわち投薬量）は、それぞれインビトロ又はインビボで提供される、ＳＫ４チャネルをコードする核酸と接触して機能的に複合体化するか、ＳＫ４チャネルサブユニットポリペプチドまたはホモテトラマーと接触して機能的に複合体化するか（共有結合または非共有結合のいずれかで）、またはＳＫ４チャネルの上流（例えば、エンハンサー、プロモーターなど）もしくは下流（例えばキナーゼ（ＭＥＫ／ＥＲＫ）、ホスファターゼまたはホスホリラーゼ）のエフェクタと接触して機能的に複合体化するのに十分なＳＫ４チャネルインヒビターの量を意味する。さらに、有効量または治療上有効な量のＳＫ４チャネルインヒビターは、ＳＫ４チャネルのｍＲＮＡ減少、ＳＫ４チャネルの活性低下、またはＳＫ４チャネルの下流のエレメントの機能低下などの所望の効果を得るのに十分な量である。例えば、これは、関節炎、アレルギーまたは喘息などの様々な免疫不全を予防するかまたは克服するのに有用なＳＫ４チャネルインヒビターの量でありえる。治療上有効な量のＳＫ４チャネルインヒビターは、治療されている被験体、障害または疾患の重症度および投与の方法に依存する。あるいは、この量は、インビトロで所望の効果をもたらす濃度と同程度のターゲット組織濃度を達成する量でありえる。
【０１１２】
治療上有効な量のＳＫ４チャネルインヒビターに関しては、インビトロまたはインビボにおける動物実験によって決定することができる。治療上有効な量（すなわち投薬量）を被験体に投与して、動物アッセイにおいて有効であることが示されている濃度と同程度のターゲット組織濃度を提供することができる。遺伝的に改変されている動物が、ＳＫ４チャネルの発現、活性および機能を強めるのに有用でありうることが考えられる。使用することができる遺伝的に改変されている動物の例は、ＳＫ４−／−動物などを含むが、これらに限定されない。例えば、Begenisich et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:47681-47687を参照されたい；これは、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１３】
有効量および治療上有効な量のＳＫ４チャネルインヒビターは、提供される剤の種類に依存して、変化する可能性があり、変化するであろう。例えば、治療上有効な量の抗ＳＫ４チャネル抗体または低分子インヒビターは、免疫系障害の治療において１日当たり、約０．０００１mg／kg（体重）〜約２００mg／kg（体重）、または１被験体当たり１日約０．１mg〜約２０ｇであってよい。例えば、骨粗鬆症は、１日当たり、体重１kg当たり約０．００１mg〜約１００mg、または１被験体当たり１日約０．５mg〜約１０ｇのトリアリールメタンなどの低分子を投与することにより有効に処置することができる。
【０１１４】
上述のように、組成物は、また、治療剤またはその組み合わせを含んでよい。治療剤の例は、抗骨喪失剤、抗炎症剤、免疫抑制剤および化学療法剤を含むが、これらに限定されない。
【０１１５】
抗骨喪失剤の例は、カルシウムおよびビタミンＤ；ビスホスホナート（例えばナトリウムアレンドロナート（Fosamax（登録商標）; Merck & Co., Inc.; Whitehouse Station, NJ）、リセドロナート（Actonel（登録商標）; Procter & Gamble Pharmaceuticals; Cincinnati, OH）およびイバンドロナート（Boniva（登録商標）; Hoffman-La Roche Inc.; Nutley, NJ））；エストロゲン代償療法；副甲状腺ホルモンおよびテリパラチド（Forteo（登録商標）; Eli Lilly & Co.; Indianapolis, IN）；ラネリック酸ストロンチウム（Protelos（登録商標）またはProtos（登録商標）; Servier Laboratories; Neuilly, France）；ラロキシフェン（Evista（登録商標）; Eli Lilly & Co.）などの選択的エストロゲンレセプターモジュレータなどを含むが、これらに限定されない。
【０１１６】
抗炎症剤の例は、グルココルチコイド（例えば、コルチゾール、プレドニゾン、プレドニゾロンおよびヒドロコルチゾン）などのステロイド；アセトアミノフェン、アスピリン、イブプロフェン、インドメタシン、ジクロフェナク、ジフェンピラミド、フェンブフェン、フルフェナム酸、ケトプロフェン、メクロフェナム酸ナトリウム、メフェナム酸、ナブメトン、ナプロキセン、ピロキシカム、スプロフェンおよびチアプロフェン酸などの非ステロイド性抗炎症剤；ヒソップ、ショウガ、ウコン、アルニカ・モンタナ（ヘレナリン、セスキテルペンラクトンを含有する）、ヤナギ樹皮（サリチル酸を含有する）などの抗炎症品質を有する薬草などを含むが、これらに限定されない。
【０１１７】
免疫抑制剤の例は、シクロスポリンおよびタクロリムスなどのカルシニューリンインヒビター；カルシトニン遺伝子関連ペプチド（両方とも参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６３５，４７８号および同第５，８５８，９７８号を参照されたい）；シロリムスおよびエベロリムスなどのｍＴＯＲインヒビター；アザチオプリンおよびミコフェノール酸などの抗増殖剤；プレドニゾロンおよびヒドロコルチゾンなどのコルチコステロイド；モノクローナル抗−ＩＬ−２Ｒαレセプター抗体（例えばBasiliximab（Simulect（登録商標）; Novartis Pharmaceutical Corp.; East Hanover, NJ）、およびダクリズマブ（Zenapax（登録商標）; Hoffman-La Roche Inc.）などの抗体；ポリクローナル抗Ｔ細胞抗体；抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）；抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）などを含むが、これらに限定されない。
【０１１８】
化学療法剤の例は、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、クロラムブチル、メクロレタミンおよびオキサリプラチンなどのアルキル化剤；腫瘍抗原に対する抗体；アザチオプリンおよびメルカプトプリンなどの代謝拮抗物質；ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシンおよびバルルビシンなどのアントラサイクリン；ポドフィロトキシン、タキサン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビンおよびビンデシンなどの植物アルカロイド；Ｉ型トポイソメラーゼインヒビター（例えばカンプトテシン（camptothecin）、イリノテカンおよびトポテカン）およびII型トポイソメラーゼインヒビター（例えばアムサクリン、エトポシド、エトポシドリン酸塩およびテニポシド）などのトポイソメラーゼインヒビター；ダクチノマイシン、ブレオマイシンおよび他のものなどの他の抗腫物剤などを含むが、これらに限定されない。
【０１１９】
細胞間融合の活性化
いくつかの例では、特に、融合した細胞（破骨細胞）を増加させることが有用であり得る状況においては、ＳＫ４チャネル活性または機能がＳＫ４チャネルアクチベーターにより刺激されて、細胞融合を促進する場合がある。そのような状況は、骨密度の異常に増加している患者、慢性感染症の患者、または大理石骨病の患者を含む。骨化石症およびアルバース−シェンバーグ病とも知られる大理石骨病は、骨が硬化し、そして密度が高くなるまれな遺伝病である。大理石骨病の患者の骨は、正常よりも脆い傾向がある。
ＳＫ４チャネル活性または機能のアクチベーターの例は、１−エチル−２−ベンズイミダゾリノンを含むが、これらに限定されない。
【０１２０】
本発明は、マクロファージに由来する多核細胞によって媒介される疾患または障害を処置するための、有効量のＳＫ４チャネルアクチベーターおよび場合により治療剤を有する組成物を含む。１つの態様では、有効量のＳＫ４チャネルアクチベーターおよび治療剤を含む組成物が提供される。他の態様では、治療上有効な量のＳＫ４アクチベーターおよび治療剤に加えて薬学的に許容しうる担体を含む薬学的組成物が提供される。
【０１２１】
本明細書で使用するとき、「ＳＫ４チャネルアクチベーター」または「ＳＫ４チャネル活性化剤」は、ＳＫ４チャネル発現（すなわち翻訳または転写）、ＳＫ４チャネル活性（すなわちコンダクタンス）、または上流および下流のＳＫ４チャネルエフェクター（すなわちプロモーター、アクチベーター、インデューサー、サプレッサー、リプレッサー、キナーゼなど）に影響を与えてＳＫ４チャネル活性を促進する剤を意味する。いくつかの態様では、ＳＫ４チャネルアクチベーターは、ＳＫ４チャネルに結合し、その機能（すなわち脱分極化するか、または再分極する能力）を調節するように設計されたタンパク質であってよい。あるいは、ＳＫ４チャネルアクチベーターは、ＳＫ４チャネルに特異的に結合して、それらの活性または機能を促進する低分子であってよい。
【０１２２】
ＳＫ４チャネルアクチベーターの厳密な性質を問わず、それは、ＳＫ４チャネルの発現、活性または機能のうちの一つ以上を向上させる。前記発現、活性または機能は、適切な対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％を含むが、これらに限定されない統計的に有意な量向上する。好ましくは、ＳＫ４チャネルの発現、活性または機能は、少なくとも約１０％以上向上する。逆に、ＳＫ４チャネルアクチベーターは、ＳＫ４チャネルの発現、活性または機能を統計的に低下させないはずである。
【０１２３】
インヒビターまたはアクチベーターを含む薬学的組成物
組成物が薬学的組成物であるとき、前記組成物は、また、薬学的に許容しうる担体を含んでよい。本明細書で使用するとき、「薬学的に許容しうる担体」は、生物学的に、生理学的に、または他の点で不所望ではない物質を意味する、すなわち、前記物質は、任意の不所望の生物学的または生理的作用を引き起こさず、またはそれが含有されている組成物の如何なる成分とも有害な方法で相互作用することなく、調合物または組成物で被験体に投与することができる。
【０１２４】
使用される薬学的に許容しうる担体は、固体、液体または気体であってよい。固体担体の例は、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸を含むが、これらに限定されない。液体担体の例は、糖シロップ、落花生油、オリーブオイル、水および生理食塩水を含むが、これらに限定されない。気体担体の例は、二酸化炭素および窒素を含むが、これらに限定されない。
【０１２５】
薬学的に許容しうる担体に加えて、薬学的組成物は、必要に応じて、希釈剤、バッファ、香料、結合剤、界面活性剤、増粘剤、滑沢剤、保存剤（酸化防止剤を含む）などの一つ以上のさらなる添加剤を含んでよい。さらに、静脈内投与では調合物を被験体の血液と等張にするために他の佐剤を含んでよい。
【０１２６】
望ましい添加剤は、アルギニン、水酸化ナトリウム、グリシン、塩酸、クエン酸などのｐＨ調整剤を含むが、これらに限定されない。さらに、局所麻酔薬（例えばベンジルアルコール）、等張化剤（例えば塩化ナトリウム、マンニトールまたはソルビトール）、吸着防止剤（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）８０）、溶解促進剤（例えばシクロデキストリンおよびその誘導体）、安定剤（例えば血清アルブミン）、還元剤（例えばグルタチオン）および保存剤（例えば抗菌剤および酸化防止剤）を含んでよい。
【０１２７】
経口投薬用の薬学的組成物は、当技術分野において公知である任意の形態で調製することができる。例えば、水、グリコール、油、アルコール、香料、保存剤、着色料などを用いて、懸濁剤、エリキシル剤および液剤などの経口液状製剤を形成することができ、一方、デンプン、砂糖、微結晶性セルロース、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などの担体を用いて、散剤、カプセル剤および錠剤などの経口固形製剤を形成することができる。
【０１２８】
錠剤では、ＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターは、場合により一つ以上の副成分または佐剤と共に、圧縮または成形することによって調製することができる。圧縮錠剤は、適切な機械中で、散剤または顆粒剤などの易流動性形態のＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターを圧縮することにより調製することができ、場合により結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、界面活性剤もしくは分散剤、または他のそのような賦形剤と混合される。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤；造粒剤および崩壊剤（例えばトウモロコシデンプン、またはアルギン酸）；結合剤（例えばデンプン、ゼラチン、アラビアゴム）；ならびに滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルク）であってよい。錠剤は、コーティングされていなくてもよく、または胃腸管における崩壊および吸収を遅らせるために公知技術によってコーティングされることにより、特に炎症性腸感染（ＩＢＤ）または過敏性大腸症候群（ＩＢＳ）などの免疫系障害の治療のために、より長時間にわたって持続する作用を提供することもできる。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延物質を使用してもよい。
【０１２９】
硬ゼラチンカプセルでは、ＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターは、不活性の固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはカオリンと混合されてもよい。逆に、軟ゼラチンカプセル剤では、ＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターは、水または油媒体、例えば落花生油、流動パラフィン、またはオリーブオイルと混合されてもよい。湿製錠剤は、適切な機械中にて、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末状のＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターの混合物を成型することにより作製することができる。
【０１３０】
ほんの一例として、ヒト被験体への経口投与を意図した薬学的組成物は、全組成物の約５％〜約９５％で変化しうる適切かつ好都合な量の薬学的に許容しうる担体とともに調合された、約０．５mg〜約５ｇのＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターを含有することができる。単位剤形は、一般に、約１mg〜約２ｇのＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーター、典型的に、約２５mg、５０mg、１００mg、２００mg、３００mg、４００mg、５００mg、６００mg、７００mg、８００mg、９００mgまたは１０００mgのＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターを含有する。
【０１３１】
非経口投与用薬学的組成物は、ＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターの水溶液または水懸濁液として調製することができる。例えばヒドロキシプロピルセルロースなどの適切な界面活性剤を含んでよい。薬学的組成物は、また、油中のグリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物で調製することができる。あるいは、薬学的組成物はリポソームの中で調製してもよい。例えば、Langer (1990) Science 249:1527-1533;およびTreat et al., 353-365 In: Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer (Lopez-Berestein & Fidler eds., Liss, N.Y. 1989)を参照されたい。さらに、微生物の有害な増殖を防ぐために保存剤を含んでよい。
【０１３２】
同様に、注射用薬学的組成物は、無菌水溶液または分散液として調製することができる。または、組成物は、無菌注射剤溶液または分散液のための無菌粉末の形態であってよい。完成注射剤形態は無菌でなければならず、そして容易に投与するために有効に流動性でなければならない。薬学的組成物は、製造および保存条件下で安定でなければならないため、好ましくは、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されるべきである。そのため、薬学的に許容しうる担体は、例えば、水、エタノール、多価アルコール（例えばグリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、植物油、およびその適切な混合物を含有している溶媒または分散媒であってよい。
【０１３３】
ほんの一例として、ヒト被験体への非経口投与または注射を意図した薬学的組成物は、全組成物の約５％〜約９５％で変化しうる適切で便利な量の薬学的に許容しうる担体とともに調合された、約０．５mg〜約５ｇのＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターを含有することができる。単位剤形は、一般に、約１mg〜約２ｇのＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーター、典型的に、約２５mg、５０mg、１００mg、２００mg、３００mg、４００mg、５００mg、６００mg、７００mg、８００mg、９００mgまたは１０００mgのＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターを含有する。
【０１３４】
局所投与用薬学的組成物は、例えば、エアロゾル、クリーム、軟膏剤、ローション剤、散粉剤などとして調製することができる。あるいは、薬学的組成物は、経皮的手段で使用するのに適している形態であってよい。これらの薬学的組成物は、当技術分野において周知の方法によって調製することができる。例えば、クリームまたは軟膏剤は、約５wt％〜約１０wt％の結合剤と共に水を混合して、望ましい粘稠度を有する乳剤または軟膏剤を生成することにより調製することができる。
【０１３５】
ほんの一例として、ヒト被験体への局所投与を意図した薬学的組成物は、全組成物の約５％〜約９５％で変化しうる適切で便利な量の薬学的に許容しうる担体とともに調合された、約０．５mg〜約５ｇのＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターを含有することができる。単位剤形は、一般に、約１mg〜約２ｇのＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーター、典型的に、約２５mg、５０mg、１００mg、２００mg、３００mg、４００mg、５００mg、６００mg、７００mg、８００mg、９００mgまたは１０００mgのＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターを含有する。
【０１３６】
直腸投与用薬学的組成物は、固体の薬学的に許容しうる担体を用いて調製することができる。好ましくは、その混合物は単位用量坐剤を形成する。適切な薬学的に許容しうる担体は、当技術分野において一般に用いられているカカオ脂、および他の増粘剤を含む。坐剤は、まず、組成物と軟化または融解した薬学的に許容しうる担体とを混合し、次いで型の中で冷却および成形することにより、好都合に形成することができる。
【０１３７】
ほんの一例として、ヒト被験体への直腸投与を意図した薬学的組成物は、全組成物の約５％〜約９５％で変化しうる適切で好都合な量の薬学的に許容しうる担体とともに調合された、約０．５mg〜約５ｇのＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターを含有することができる。単位剤形は、一般に、約１mg〜約２ｇのＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーター、典型的に、約２５mg、５０mg、１００mg、２００mg、３００mg、４００mg、５００mg、６００mg、７００mg、８００mg、９００mgまたは１０００mgのＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターを含有する。
【０１３８】
吸入投与用薬学的組成物は、当技術分野において公知の形態で、当技術分野において公知の担体を利用して調製することができる。例えば、Zeng et al., In: Particulate Interactions in Dry Powder Formulations for Inhalation (Informa HealthCare 1st ed. 2000)を参照されたい。
【０１３９】
ほんの一例として、ヒト被験体への吸入投与を意図した薬学的組成物は、全組成物の約５％〜約９５％で変化しうる適切で好都合な量の薬学的に許容しうる担体とともに調合された、約０．５mg〜約５ｇのＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターを含有することができる。単位剤形は、一般に、約１mg〜約２ｇのＳＫ４チャネル阻害結合剤、典型的に、約２５mg、５０mg、１００mg、２００mg、３００mg、４００mg、５００mg、６００mg、７００mg、８００mg、９００mgまたは１０００mgのＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターを含有する。
【０１４０】
以下でより詳細に論じられるように、組成物および薬学的組成物は、ＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターに加えて、基礎疾患または障害を処置するために一つ以上の他の治療剤を含んでよい。本明細書において使用するための他の治療剤の例は、抗炎症剤（すなわち、ステロイドおよび非ステロイド性の抗炎症剤）、抗骨喪失剤および化学療法（すなわちアルキル化剤、代謝拮抗物質、植物アルカロイド、ならびにテルペノイドおよびトポイソメラーゼインヒビター）を含むが、これらに限定されない。
【０１４１】
組成物および薬学的組成物は、ＳＫ４チャネル遺伝子に突然変異を有する、突然変異マクロファージを含んでもよく、ここで前記突然変異は、ＳＫ４チャネルモノマーの発現を低下もしくはなくすか、またはコードされたＳＫ４チャネルモノマーの活性を阻害する。
【０１４２】
本発明の組成物の前述の議論に関して、用語「約」は、規定の濃度範囲、投薬量または組成物中の成分の量などの値の統計的に意味のある範囲内を意味する。このような範囲は、所与の値または範囲の桁内、典型的に２０％以内、より典型的に１０％以内、さらにより典型的に５％以内でありうる。用語「約」に包含される許容偏差は、前記用語が用いられる特定の状況に依存し、当業者に容易に理解される。
【０１４３】
細胞間融合を調節する方法、ならびにその治療及びスクリーニング用途
いくつかの態様では、本発明の方法は、マクロファージ細胞と、有効量のＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターとを接触させ、それにより、それぞれマクロファージ細胞融合を減少または増加させることを含む。上述のように、ＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターは、ＳＫ４チャネルの発現、活性または機能を有効に低下させるか、または向上させる限りにおいて、ＳＫ４チャネル発現（すなわち翻訳または転写）、ＳＫ４チャネル活性（すなわちコンダクタンス）、あるいは上流または下流のＳＫ４チャネルエフェクター（すなわちプロモーター、アクチベーター、インデューサー、サプレッサー、リプレッサー、キナーゼなど）に影響を与えるものであってよい。
【０１４４】
ＳＫ４活性の阻害において、如何なる理論または作用機序にも縛られるものではないが、融合する能力を有するか、または融合が進行中であるマクロファージ細胞内のＳＫ４チャネルの発現、活性または機能に対するＳＫ４チャネルインヒビターの阻害作用により、マクロファージ細胞融合が減少する。「融合する能力」とは、マクロファージ細胞が、マクロファージ細胞融合の助けになる環境設定内に存在することを意図する。例えば、スクリーニング法（例えば、本明細書において下記に記載されるスクリーニング法）で使用される条件などの、インビトロ条件下において、融合する能力を有するマクロファージ細胞は、これまで融合は進行していなかったが、現在融合条件（すなわち、本明細書において以下に記載されるように、マクロファージ細胞の融合を促進または助長する条件）に曝露されているマクロファージ細胞の集団を含む。インビボ条件下では、融合する能力を有するマクロファージ細胞は、マクロファージ細胞の融合を促進または助長するインビボ環境に曝露されるようになる、それまで融合していないマクロファージ細胞の任意の集団を含む。したがって、融合する能力を有するマクロファージ細胞は、前記インビボ環境内に位置する静止（すなわち、定着）マクロファージ細胞であってよく、または前記インビボ環境へ遊走しているマクロファージであってよい。同様に、環境がマクロファージ細胞の融合を促進または助長するインビボ条件下では、融合が進行中であるマクロファージ細胞は、前記インビボ環境内に存在する静止マクロファージ、および／または前記インビボ環境へ移動しているマクロファージを含みうる。
【０１４５】
本明細書において記載される任意のＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターは、インビトロまたはインビボ設定のいずれかにおいて、マクロファージ細胞の融合を減少（すなわち、阻害）させるか、または増加させるために、本発明の方法で有利に使用することができる。マクロファージ細胞の融合をインビボ設定において阻害する場合、細胞間融合の減少の標的となるマクロファージ細胞を、治療上有効な量のＳＫ４チャネルインヒビターと接触させるが、この場合、治療上有効な量は、望ましい結果（例えばマクロファージに由来する多核細胞によって媒介される疾患または障害の処置）により決定する。同様に、マクロファージ細胞の融合をインビボ設定において増加または活性化させる場合、細胞間融合の増加の標的となるマクロファージ細胞を、治療上有効な量のＳＫ４チャネルアクチベーターと接触させるが、この場合、治療上有効な量は、所望の結果により決定する。
【０１４６】
したがって、本発明のいくつかの態様では、マクロファージ細胞の融合を阻害するための方法は、融合する能力を有するマクロファージ細胞に、有効量のＳＫ４チャネルインヒビターを提供し、それにより、これらの細胞の融合を阻止または低減することを含む。他の態様では、マクロファージ細胞の融合を阻害するための方法は、融合が進行中であるマクロファージ細胞に、有効量のＳＫ４チャネルインヒビターを提供し、それにより、これらの細胞のさらなる融合を阻止または低減することを含む。マクロファージ細胞の融合を阻害するための方法は、静止（すなわち、定着）マクロファージおよび／または特定のインビボ環境へ遊走しているマクロファージを対象とすることもでき、マクロファージの同型または異型融合を対象とすることもできる。したがって、これらの方法は、破骨細胞（骨中の）および巨細胞（多数の種類の他の組織中の）の形成において生じるような、マクロファージ−マクロファージ細胞融合をターゲッティングしてよく、または転移癌細胞を形成する、マクロファージ細胞と癌細胞との融合などのマクロファージと他の細胞型との融合をターゲティングしてもよい。
【０１４７】
いくつかの態様では、適切な対照試料が、ＳＫ４チャネルインヒビターが存在しない同一の環境条件下において同等のマクロファージ細胞を含む場合、有効量のＳＫ４チャネルインヒビターは、適切な対照試料と比較したとき、マクロファージ細胞融合を少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％または５５％減少させる。他の態様では、有効量のＳＫ４チャネルインヒビターは、適切な対照試料と比較したとき、マクロファージ細胞融合を少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％減少させる（すなわち、マクロファージ細胞融合を妨げる）。マクロファージ細胞融合のアッセイ方法は、当技術分野において周知である。例えば、前記Vignery (2000); MacLauchlan et al. (2009) J. Leukoc. Biol. 85:617-626；および以下の本明細書の実験の章に記載されるアッセイを参照されたい。
【０１４８】
本明細書において上述したように、不適当または調節されていない（すなわち、異常な）マクロファージ細胞融合は、炎症性および感染性疾患における細胞および組織の損傷に関連している場合がある。本明細書において記載されたマクロファージ細胞の融合を阻害するための方法は、異常な破骨細胞形成（例えば骨粗鬆症）、巨細胞形成（例えば慢性炎症性疾患）および癌転移をトリガーする恐れのある転移癌細胞の形成と関係する疾患を含む、マクロファージに由来する多核細胞によって媒介される疾患の予防または治療を目的とする治療方法に使用できる。
【０１４９】
本明細書で使用するとき、「予防する」または「予防」などは、被験体が疾患または病状に対する素因を有し、前記被験体が疾患や病状を発症するのを防ぐことを目的とする場合、ＳＫ４チャネルインヒビターの前記被験体への適用または投与、あるいはＳＫ４チャネルインヒビターを含む薬学的組成物の前記被験体への適用または投与を意味する。例えば、移植物または移植片手術の拒絶反応を防ぐ目的で、移植物または移植片手術を受けている、将来受ける被験体にＳＫ４チャネルインヒビター、またはＳＫ４チャネルインヒビターを含む薬学的組成物を投与してもよい。別の例として、過度の骨喪失および骨粗鬆症の発生を防ぐ目的で、骨粗鬆症に罹患しやすい被験体にＳＫ４チャネルインヒビターを投与することもできる。
【０１５０】
ＳＫ４チャネルを活性化するための態様では、前記方法は、マクロファージ細胞に有効量のＳＫ４チャネルアクチベーターを提供して、細胞の融合を増加させることを含む。マクロファージ細胞の融合を活性化するための方法は、静止マクロファージおよび／または特定のインビボ環境へ遊走しているマクロファージを対象とするができ、マクロファージの同型または異型融合を対象としてすることもできる。有効量のＳＫ４チャネルアクチベーターは、適切な対照と比較したとき、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％または１５０％、マクロファージ細胞の融合を増加させる。マクロファージ細胞融合のアッセイ方法は、上に開示したように当技術分野において周知である。
【０１５１】
本明細書で使用するとき、「治療する」または「治療」は、被験体が疾患または疾患の症状を有し、疾患または疾患の症状を直す、緩和する、取り除く、変化させる、処置する、寛解させる、改善する、または影響を与えることを目的とする場合、ＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターの個体への適用または投与、あるいはＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターを含む薬学的組成物の前記被験体への適用または投与を意味する。
【０１５２】
本発明のいくつかの態様では、マクロファージ細胞の融合を阻害するための方法は、インビボにおける破骨細胞の形成阻害に関するものであり、治療目的は、骨喪失の予防または治療である。本明細書において上述したように、破骨細胞形成の阻害によって、破骨細胞数および／または破骨細胞表面積は減少して、破骨細胞機能が全体的に低下する。更に、破骨細胞のＳＫ４発現、活性または機能の阻害によって、破骨細胞の機能を変化させる（例えば破骨細胞の骨塩再吸収活性を低下させる）ことができる。破骨細胞の形成および機能を低下させることによって、骨密度および／または骨厚さを有利に増加させることができる。このように、本発明は、骨喪失に罹患しやすいか、または骨喪失に罹患している被験体の骨喪失を予防または治療する方法であって、被験体に治療上有効な量のＳＫ４チャネルインヒビターを投与して、破骨細胞形成を阻害し、それによって被験体の骨喪失を予防または低減することを含む方法を提供する。この治療方法は、骨密度が低下しやすいか、または骨密度が低下している被験体において骨密度を維持することに使用できる。関連する態様では、骨喪失を予防または治療する方法は、少なくとも１つの抗骨喪失剤との併用療法を含んでもよい。ＳＫ４チャネルインヒビターおよび抗骨喪失剤（単数または複数）の投与経路は、骨喪失の素因または実際の骨喪失の根本原因により影響を受けるが、経口、静脈内、さらには骨への直接送達でありうる。
【０１５３】
本発明の方法を用いて被験体の骨喪失を予防または治療することができる例示的な状態は、骨粗鬆症、骨軟化、パジェット病、歯槽膿漏症、および他の病理学的条件（すなわちアルコール中毒、セリアック病、慢性腎臓病、慢性肝炎、癲癇、胃腸疾患、甲状腺機能亢進症、性腺機能低下症、白血病、リンパ腫、関節リウマチ、壊血病、およびビタミンＤ欠乏）に付随して起こる骨喪失などを含むが、これらに限定されない。
【０１５４】
本発明の他の態様では、マクロファージ細胞の融合を阻害するための方法は、インビボにおける巨細胞形成の阻害に関するものであり、治療目的は、被験体の自己免疫または炎症性疾患または障害の予防または治療である。このように、本発明は、自己免疫または炎症性疾患に罹患しやすいか、または前記疾患に罹患している被験体の自己免疫または炎症性疾患または障害を予防または治療する方法であって、被験体に、治療上有効な量のＳＫ４チャネルインヒビターを投与して、巨細胞の形成を阻害し、それによって、被験体の自己免疫または炎症性疾患または障害を予防または治療することを含む方法を提供する。関連する態様では、自己免疫または炎症性疾患または障害を予防または治療する方法は、少なくとも１つの抗炎症剤との併用療法を含んでよい。ＳＫ４チャネルインヒビターおよび抗炎症剤の投与経路は、例えば、自己免疫または炎症性疾患または障害に関する素因あるいは実際の自己免疫または炎症性疾患または障害の根本原因により影響を受けるが、経口、静脈内、局所、さらには例えば、炎症部位への直接注射でありうる。
【０１５５】
本発明の方法を用いて自己免疫疾患または障害を予防または治療することができる例示的な状態は、急性散在性脳脊髄膜炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、脱毛、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫内耳疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、シャガス病、慢性閉塞性肺疾患、セリアック病、クローン病、皮膚筋炎、１型糖尿病、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン−バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本病、川崎病、特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、乾癬、原発性胆汁性肝硬変、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」としても知られている）、潰瘍性大腸炎、脈管炎などを含むが、これらに限定されない。本発明の方法を用いて炎症性疾患または障害を予防または治療することができる例示的な状態は、ざ瘡、喘息、関節硬化症、クロム酸閉塞性肺疾患、大腸炎、皮膚炎、糸球体腎炎、炎症性腸感染、ケロイド、腎炎、変形性関節症、骨盤炎症性疾患、乾癬、関節リウマチ、腱炎などを含むが、これらに限定されない。
【０１５６】
本発明の他の態様では、マクロファージ細胞の融合を阻害するための方法は、インビボにおける巨細胞形成の阻害に関するものであり、治療目的は、被験体の移植物または移植片拒絶反応の予防である。このように、本発明は、移植物または移植片手術を受けているか、または受けるであろう被験体の移植物または移植片拒絶反応を予防するための方法であって、被験体に治療上有効な量のＳＫ４チャネルインヒビターを投与して巨細胞の形成を阻害し、それによって、移植物または移植片拒絶反応を予防することを含む方法を提供する。関連する態様では、この治療方法は、少なくとも１つの免疫抑制剤との併用療法を含んでよい。適用可能な場合には、これらの方法のいずれかは、例えば、移植物が硬骨関連の疾患または障害の治療を目的とする場合、少なくとも１つの抗骨喪失剤との併用療法を含むことができる。ＳＫ４チャネルインヒビターならびに免疫抑制剤（単数または複数）および／または抗骨喪失剤（単数または複数）の投与経路は、移植物または器官／組織移植片の種類によって影響を受けるが、経口、静脈内、局所、直接送達によって、または移植物のコーティングもしくは含浸でありうる。。
【０１５７】
本発明の方法を用いて拒絶反応を予防することができる例示的な移植物は、蝸牛装置、人工膝関節、人工股関節、ボーンセメント、乳房移植物、心臓移植物（例えば人工弁、細動除去器、左室補助装置、およびペースメーカー）、皮膚移植物、胃バンドまたはバルーン、留置カテーテル、インシュリンポンプ、子宮内器具、神経刺激物、眼の移植物、整形外科的移植物、陰茎勃起性人工器官、ステント、尿道スリング、音声人工器官などを含むが、これらに限定されない。本発明の方法を用いて拒絶反応を予防することができる例示的な移植片は、硬骨および骨髄移植片、角膜移植片、心臓および心臓弁移植片、腸移植片、腎臓移植片、肢移植片、肝臓移植片、肺移植片、膵臓移植片、血小板輸血、赤血球輸血、皮膚移植片、幹細胞移植片、移植腱、血管移植片、白血球輸血などを含むが、これらに限定されない。
【０１５８】
本発明の他の態様では、マクロファージ細胞の融合を阻害するための方法は、インビボにおける転移細胞形成の阻害に関するものであり、治療目的は被験体の癌転移の予防である。このように、本発明は、転移癌に罹患しやすい被験体の癌転移を予防するための方法であって、被験体に治療上有効な量のＳＫ４チャネルインヒビターを投与して転移癌細胞の形成を阻害し、それによって、癌転移を予防することを含む方法を提供する。関連する態様では、この治療方法は、抗癌療法、例えば、手術または外科的処置、あるいは別の抗癌治療剤の投与、例えば化学療法剤、抗癌抗体、低分子ベースの癌治療、ワクチン／免疫療法に基づいた癌治療のうち少なくとも１つの他の形態との併用療法を含むことができる。ＳＫ４チャネルインヒビター、および投与される場合、他の抗癌治療剤（単数または複数）の投与経路は、一次腫瘍および転移の潜在的な部位の種類および位置によって影響を受けるが、経口、静脈内、局所または一次腫瘍への直接送達であってよい。
【０１５９】
本発明の方法を用いて転移を予防することができる代表的な癌は、骨癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、腸癌、肝臓癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、胃癌、喉頭癌、子宮癌などを含むが、これらに限定されない。
【０１６０】
治療を受ける疾患または障害によって、単独でまたは別の治療剤またはレジメンと組み合わせられた、ＳＫ４チャネルインヒビターまたはＳＫ４チャネルアクチベーターに対する臨床反応は、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャニング、ｘ−放射線画像診断、マイクロＣＴ、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャニング、生物発光画像診断、例えば、ルシフェラーゼ画像診断、骨スキャン画像診断、骨髄吸引（ＢＭＡ）を含む腫瘍生検標本サンプリング、フローサイトメトリーまたは蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）分析、組織診断、肉眼所見、およびＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、クロマトグラフィーなどによって検出可能な変化を含むが、これらに限定されない、血液化学などのスクリーニング手法を含むが、これらに限定されない当技術分野において公知の任意の許容しうる方法を用いて評価することができる。
【０１６１】
上記任意の治療方法では、治療上有効な量のＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターは、拡大投与量または負荷投与量レジメン（例えば、負荷投与量が維持投与量よりも多い）において、治療期間を通じておよそ同じ治療上有効な量（すなわち投与量）を投与することができる。あるいは、治療上有効な量のＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターは、治療される被験体の状態、治療に対する明らかな応答および／または当業者に判断されるような他の要因に基づいて治療過程中に変更してもよい。治療上有効な量のＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターを用いた長期治療も考えられる。
【０１６２】
更に、本発明の方法が併用療法レジメンを含む場合、これらの治療は同時に行うことができる、すなわち、ＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターは、他の治療レジメンと同時に、または他の治療レジメン同じ時間枠内に投与される（すなわち、治療は同時に行われるが、ＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターは別の治療と正確に同時に投与される訳ではない）。あるいは、ＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターは、他の治療の前または後に投与されてもよい。併用療法がＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターと、少なくとも１つの他の治療剤との同時投与を含む場合、ＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーター、および他の治療剤（単数または複数）は、別々の薬学的組成物として投与されるか、または一緒に調剤されて単一の薬学的組成物として投与されてもよい。
【０１６３】
さらに、被験体が、疾患または障害に罹患していると診断されるか、または疑われるとき、ＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターの投与を開始することができる。許容しうる治療上有効な量のＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターについては、上で論じられたとおりであり、被験体の年齢および体重、治療されている具体的な疾患または障害、治療されている疾患または障害の重症度、および投与経路に依存して変化する。本発明の治療方法は、治療上有効な量のＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターの単回投与、または治療上有効な量のＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーターの複数回投与を含んでよい。
【０１６４】
明瞭にするために述べると、本発明の方法に従って治療される被験体は、喘息または鎌型赤血球症に罹患している被験体であることを意図しない。
【０１６５】
本発明は、また、中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル（ＳＫ４チャネル）の発現、活性または機能の阻害を介して細胞間融合を阻害する剤を同定するための方法、または細胞間融合を活性化する剤を同定するための方法を提供する。前記方法は、細胞集団をＳＫ４チャネルインヒビターまたはアクチベーター候補と接触させることと、前記候補剤が細胞集団内の細胞間融合を阻害または活性化するかどうかを判定することを含む。マクロファージ細胞融合を阻害し、それにより破骨細胞、巨細胞および転移癌細胞を含むが、これらに限定されない、マクロファージに由来する多核細胞の形成を阻害するＳＫ４チャネルインヒビターの同定が特に対象となる。したがって、いくつかの態様では、細胞の集団はマクロファージ細胞を含む；他の態様では、細胞の集団は、少なくとも２つの細胞型を含み、そのうちの１つはマクロファージである。いくつかの態様では、細胞の集団はマクロファージを含み、また、集団内に存在する第２の細胞型は体細胞または癌細胞である。 Vignery, "Methods to fuse macrophages in vitro," 383-395 In: Methods in Molecular Biology, Cell Fusion (Chen ed., Humana Press 2008)を参照されたい；これは、全文が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６６】
好ましくは、このスクリーニング法は融合条件下で実行される。本明細書で使用するとき、「融合条件」は、細胞、特にマクロファージの同型または異型融合を助長する条件を意味する。融合条件は、Ｍ−ＣＳＦ、ＲＡＮＫＬ、および／またはＩＬ−４の存在下で細胞を培養することを含みうる。
【０１６７】
本発明は、以下の非限定的実施例を考慮してより完全に理解される。
【０１６８】
実施例
ゲノムワイドなｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、融合機構に属する遺伝子を同定し、破骨細胞および巨細胞中で、マクロファージの融合開始時にのみであったが、ＫＣＮＮ４／ＳＫ４が高発現していることを同定した。
【０１６９】
材料および方法
動物および細胞。既に記載されているように、交配した１２９Ｊ／Ｃ５７ＢＬ６を遺伝的背景に持つｓｋ４−／−マウスを作成し、飼育し、遺伝子型を同定した (Begenisich et al. (2004) J. Biol. Chem. 279(46):47681-47687)。この動物を、１２時間の光サイクルの標準的なケージに収容し、げっ歯類用の餌（Harlan Teklad #2018）および水に自由にアクセスさせた。マウスは、８週齢で安楽死させた。動的組織形態計測分析のために、屠殺の８日前及び１日前に、マウスにカルセイン（５mg／kg／日）を２回ｉ．ｐ注射した。
【０１７０】
試薬。ＭＳＣ−ＦおよびＲＡＮＫＬは、PreproTech (Rocky Hill, NJ)から購入した。Phalloidin-Alexa fluor 568は、Invitrogen (Carlsbad, CA)から、骨組織スライドは、BD (Franklin Lakes, NJ)から購入した。組織培養のためのすべての供給品および試薬は、内毒素を含んでいなかった。特に明記しない限り、すべての化学製品はSigma Chemical Co. (St Louis, MO)製であった。
【０１７１】
慢性炎症性関節炎（ＣＩＡ）。０日目にArthrogen ＣＩＡモノクローナル抗体（ＡｒｔｈｏＭＡＢ）ブレンド(Millipore; Billerica, MA)７mg（７００μl）を腹腔内注射することにより、２月齢のマウスでＣＩＡを誘導した。このモノクローナル抗体のカクテルは、II型コラーゲンの領域ＣＢ１１の中で認識されるエピトープに対するものである。３日目に、リポ多糖類（ＬＰＳ）５０μg（体積＜１００μl）を腹腔内に投与した。４日目から始めて、ＣＩＡの発症および発病について動物を毎日モニタし、各動物の注射部位を、熱、発赤、及び／又は滲出などの感染の徴候について評価した。ＬＰＳに応答して悪液質を経験している可能性が高い、「寒さ」を感じたマウスに、温リンゲル液５００μlをｓ．ｃ．（皮下）投与した。視覚的採点法を使用して、関節炎の重症度を毎日モニタした。採点法は、以下のとおりである：０＝正常；１＝１〜２本の指における紅斑および浮腫；２＝＞２本の指における紅斑および浮腫、または通常足根関節における軽度の紅斑および浮腫；３＝足根関節を包囲する中程度の紅斑および浮腫；４＝足根関節および中足骨関節を包囲する重篤な紅斑および浮腫。
【０１７２】
ＣＩＡの組織病理学評価。ホルマリン固定した関節（右および左の前足および後足、両方の足首および両方の膝）を２〜３日間５％のギ酸中で脱石灰化し；組織を整え、パラフィン包埋のために処理し、８μmの切片にし、トルイジンブルーで染色した。両方の後足、両方の前足、および両方の膝を包埋し、前額面で切片化し、一方、足首は、矢状面で切片化したが、前額面で後足を切片化してもよい。治療群についての情報を知らずに、すべての切片を採点した。その後以下のように群を同定した。関節炎の病変を有するマウスの足または足首を採点するとき、冒されている個々の関節の数に加えて変化の重症度も考慮しなければならない。可能性のある多数の中手骨／中足骨／指または足根骨／脛骨−足根骨関節うちの足または足首の１〜３個の関節のみが冒されているとき、変化の重症度に依存して、下記のパラメータに対し、最大で１、２または３の最高点を任意に割り当てた。３つを超える関節を含んでいた場合、下記の基準を最も重篤に冒されている関節／関節の大部分に適用した。炎症：０＝正常；１＝患部関節の関節滑膜および関節周囲組織における炎症細胞の最小限の浸潤；２＝炎症細胞の軽度浸潤。足に言及する場合、一般的に患部関節（１〜３個の患部）に限定される；３＝中程度の浮腫を伴う中程度の浸潤。足に言及する場合、患部関節、一般的に３〜４個の関節＋手首または足首に限定される；４＝顕著な浮腫を伴う大部分の領域を冒している顕著な浸潤、１つまたは２つの罹患していない関節が存在する場合もある；５＝関節および関節周囲組織をすべて冒している重篤な浮腫を伴う重篤なびまん性浸潤。パンヌス：０＝正常；１＝軟骨および軟骨下骨、辺縁帯中のパンヌスの最小限の浸潤；２＝患部関節における硬組織の辺縁帯破壊を伴う軽度の浸潤；３＝患部関節における中程度の硬組織破壊を伴う中程度の浸潤；４＝大部分の関節を冒している、関節構造の顕著な破壊を伴う顕著な浸潤；５＝すべての関節を冒す、関節構造全体またはほぼ全体の破壊を伴う重篤な浸潤。軟骨損傷：０＝正常；１＝患部関節における明らかな軟骨細胞喪失またはコラーゲン崩壊を伴わないトルイジンブルー染色の最小限〜概ね最小限〜軽度の喪失；２＝軽度＝いくつかの患部関節における病巣領域の軟骨細胞喪失および／またはコラーゲン崩壊を伴うトルイジンブルー染色のｖ軽度の喪失；３＝中程度＝患部関節における多病巣性の軟骨細胞喪失および／またはコラーゲン崩壊を伴うトルイジンブルー染色の概ね中程度の喪失、いくつかのマトリックスは、重篤なマトリックス喪失領域を有する任意の患部表面に留まる；４＝顕著＝膝の１つの表面で軟骨の全てまたはほぼ全てが喪失している場合、大部分の関節における多病巣性の顕著な（深層の深さまで）軟骨細胞喪失および／またはコラーゲン崩壊を伴うトルイジンブルーの顕著な喪失；５＝重篤＝膝の２つ以上の表面で軟骨の全てまたはほぼ全てが喪失している場合、すべての関節における多病巣性の重篤な（タイドマーク（tide mark）の深さまで）軟骨細胞喪失および／またはコラーゲン崩壊を伴うトルイジンブルーの重篤なびまん性喪失；骨再吸収：０＝正常；１＝最小限＝小さな領域の再吸収、低倍率では容易に明らかではない、患部関節において破骨細胞は稀、辺縁帯に限定；２＝軽度＝より多数の領域の再吸収、低倍率では容易に明らかではない、患部関節におけるより多数の破骨細胞、辺縁帯に限定；３＝中程度＝皮質全層の欠損を伴わない、髄骨梁および皮質骨の明らかな再吸収、いくつかの髄骨梁の喪失、低倍率で明らかな病変、患部関節におけるより多数の破骨細胞；４＝顕著＝皮質骨全層の欠損、多くの場合皮質表面に留まるプロファイルの変形を伴う、髄骨の顕著な喪失、多数の破骨細胞、大部分の関節が罹患；５＝重篤＝皮質骨全層の欠損、およびすべての関節の関節構造の破壊。各動物について、炎症、パンヌス、軟骨損傷および硬骨損傷スコアを、試験した８つの関節各々について判定した。合計（８つの関節すべて）動物スコアおよび８つの関節の平均動物スコアに加えて、個々のパラメータの各々について合計及び平均を決定した。次に、ｐ≦０．０５が有意であると設定したスチューデントｔ検定または他の適切な分析法を使用して、様々な群のパラメータを群Ａ（ビヒクル）と比較した。
【０１７３】
頭蓋冠のＬＰＳ／インビボ骨再吸収アッセイ。インビボにおける破骨細胞形成および活性を評価するために、リポ多糖類（２μl中２５μg；Sigma）を単回局所皮下頭蓋冠注射により投与した（図１３を参照されたい）。５日後にマウスを屠殺し、頭蓋冠をマイクロＣＴ、次いで、組織形態計測分析に供して、頭蓋冠／マウス当たりの侵食された骨質面積の百分率、頭蓋冠の密度および厚さを記録した。該当する場合、週末および休日を含む実験中５日間の継続期間、動物を毎日チェックした。疼痛（例えば、もしあれば、熱および体重減少を誘導する恐れがあるＬＰＳの投与に伴って予期される副作用の結果としての食欲不振、傾眠、ケージ仲間からの孤立）の徴候を示した動物に、獣医との相談に基づいて鎮痛剤を投与した。
【０１７４】
硬骨Ｘ線撮影。切除した大腿骨を、３秒間３０ｋＶでMX-20（Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL）を用いてＸ線に供した。Epson Perfection 4870を使用して、Ｘ線をスキャニングした。
【０１７５】
骨密度および微小構造。成長板の０．２５mm近位の大腿遠位の仮想の１mmの断面の末梢骨定量的コンピュータ断層撮影（pQCT; XCT Research M; Norland Medical Systems, Fort Atkinson, WI)によって、既に記載されているように（Ballica et al. (1999) J. Bone Mineral Res. 14:1067-1074）骨密度を決定した。さらに、２，０４８×２，０４８のマトリックス、およびボクセルサイズ１２μmの９ｍ３の等方性分解能を備えたマイクロＣＴスキャナ(MicroCT 40; Scanco, Bassersdorf, Switzerland）で大腿遠位をスキャニングした。既に記載されているように（Li et al. (2005) J. Exp. Med. 201:1169-1177）、二次海綿質中の三次元骨梁測定を直接行った。
【０１７６】
ＤＮＡマイクロアレイ。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（Qiagen；Hilden, Germany）を使用して細胞サンプルから全ＲＮＡを単離し、Affymetrix (Santa Clara, CA)製のジーンチップを使用して、マイクロアレイハイブリダイゼーションに使用した。Affymetrixの発現プロトコールを使用して、全ＲＮＡからｃＲＮＡを合成した。１０μgの標識及び断片化されたｃＲＮＡを、製造業者の指示に従ってHG-U133Plus2.0 ArrayまたはRAT230 Plus Arrayにハイブリダイゼーションさせ、シグナルを検出した。
【０１７７】
組織形態計測。発明者らが既に記載しているように（(Baron et al. (1982) in Bone Histomorphometry: Techniques and Interpretation, ed. Recker et al. (CRC Press, Inc., Boca Raton, FL), pp. 13-35)、ｓｋ４＋／＋およびｓｋ４−／−マウスの大腿骨および脛骨を漸増（graded）エタノール系で脱水し、メタクリル酸メチル中で脱石灰することなしに包埋した。成長板に０．２５mm近位の４μmの厚さの大腿遠位の横断切片を、組織形態分析のためにVillanueva Mineralized Bone Stainで染色したが、８μmの厚さの切片は動的パラメータの分析のために染色しなかった。Osteomeasureソフトウェア(Osteometrics, Atlanta, GA）を使用して、組織形態計測を行なった。以下のパラメータを測定した：骨の占める相対的組織表面（Ｂ．Ａｒ／Ｔ．Ａｒ；％）；１mm当たりの骨梁数（Ｔｂ．Ｎ／mm）；骨梁によって占められた骨の相対的な表面（Ｔｂ．Ａｒ；％）；骨梁間の距離／間隔（μm）；総骨表面当たりの破骨細胞の数（Ｏｃ／Ｔ．Ａｒ）；総硬骨周囲長当たりの破骨細胞の周囲長（Ｏｃ．Ｐｍ／Ｂ．Ｐｍ）；総硬骨周囲長当たりの骨芽細胞の周囲長（Ｏｂ．Ｐｍ／Ｂ．Ｐｍ）、石灰化表面（ＭＳ／ＢＳ）、無機質付着速度（ＭＡＲ）、および骨形成速度（ＢＦＲ／ＢＶ）。
【０１７８】
骨髄および脾臓に由来するマウス破骨細胞。既に記載されているように、４〜１２週齢のｓｋ４＋／＋およびｓｋ４−／−マウスからこれらの細胞を作成した(Cui et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:14436-14441; Epub 2007 August 28)。骨髄および脾臓細胞を単離し、機械的に解離させ、１０％の加熱不活性化ウシ胎児血清（HyClone, Logan, UT）、１００単位／mlのペニシリン−ストレプトマイシン（Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA）、１％のＭＥＭビタミン、１％のグルタミンおよび３０ng／mlのＭ−ＣＳＦ（PeproTech, Inc. Rocky Hill, NJ）を含有しているＭＥＭ中にて１cm2当たり１．３３×１０６細胞の密度で培養した。４０ng／mlの濃度のＲＡＮＫＬ（PeproTech, Inc.）を添加した。３日ごとに培地を交換した。破骨細胞活性の目印であるアクチン環の形成を評価するために、８日間、スライドガラス上にて、Ｍ−ＣＳＦ（２０ng／ml）およびＲＡＮＫＬ（４０ng／ml）の存在下で細胞を培養し、固定し、phalloidin-Alexa 568およびTopro-3と反応させた。さらに再吸収活性を評価するために、リン酸カルシウム結晶で作製された人工骨でコーティングした骨組織スライド上で細胞を培養した。８日後、供給業者の指示に従って細胞を溶解させ、硝酸銀で基質を染色した。組織形態計測により、スライド上の再吸収された面積を記録した。
【０１７９】
ヒト破骨細胞。正常末梢血血液（Allcells, Emeryville, CA）を使用して、これらの細胞を作成した。Ficoll-Paqueを使用して末梢血単球を単離し、１０％のＦＣＳ、組換え型ヒトＭ−ＣＳＦ（２５ng／ml）および組換え型ヒトＲＡＮＫＬ（４０ng／ml）を添加したＭＥＭＥ中で３×１０６細胞／mlの濃度で培養した。週に一度培地を交換した。
【０１８０】
ウエスタンブロット解析。７日間培養した後、破骨細胞を２時間血清飢餓状態にし、指示した試薬で刺激した。次に、プロテアーゼインヒビター（Complete Tablets; Roche Molecular Biochemicals）、フッ化ナトリウムおよびホスファターゼインヒビターカクテルＩＩを添加したLaemmliサンプルバッファの中で細胞を溶解させた。溶解産物を超音波処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、Immobilon-Pメンブレンに転写し、増強化学発光（Amersham Pharmacia Biotechnology; Sunnyvale, CA）を使用して、免疫ブロッティングに供した。
【０１８１】
フローサイトメトリー。一次抗体で細胞を染色し、氷上で３０分間培養し、洗浄バッファ（５％のＦＣＳ／ＰＢＳ）で２度洗浄した。二次抗体を加えて、氷上で３０分間細胞をインキュベーションした。インキュベーション後、洗浄バッファで２度細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ分析用洗浄バッファに懸濁させ、FACS Calibur（BD Bioscience; Franklin Lakes, NJ）を使用してＦＡＣＳ分析を実施した。
【０１８２】
リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＰＣＲ）。製造業者の指示に従って、全ＲＮＡをTrizol（Invitrogen; Carlsbad, CA）に抽出した。１μgの全ＲＮＡおよびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素を使用して、第１の鎖のｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応用プライマー対を表２に提供する。
【表２】
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【０１８３】
統計分析。データは平均±１標準偏差（ＳＤ）を表す。分散分析を使用して、処理群を比較した。チューキー多重比較手順を使用して、処理群の間の対比較ｐ値を調整した。両側ｐ値が＜０．０５である場合、統計的に有意であるとした。ＳＰＳＳを使用して、全ての計算を行なった。
【０１８４】
結果
インビトロマクロファージ融合アッセイ。
新たに単離されたラット肺胞マクロファージは、複数の別個の細胞のように見えた（図１Ａ）。融合条件下（すなわち、Ｍ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの存在下）で３日間培養した後、マクロファージは多核細胞へ融合した（図１Ｂ）。有利なことに、このアッセイではほとんどドナーに差異が生じず、ＲＡＮＫＬ刺激の効果が全く示されなかった。
【０１８５】
中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルの発現は、ラットの破骨細胞形成中にアップレギュレーションされる。
ラットの肺胞マクロファージの融合におけるＳＫ４チャネルメッセージは、０時間処理マクロファージと比較した場合、１時間後には変化がなかったが、２４時間後には著しく増加し（図２）、最高５日間増加した状態が保たれた。
【０１８６】
中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルの発現は、ヒトの破骨細胞形成中にアップレギュレーションされる。
これらの結果は、上記マクロファージ融合アッセイにおいてヒトマクロファージ／ＰＢＭＣを使用することができ、融合しているマクロファージ／ＰＢＭＣにおいてＳＫ４チャネルの発現がアップレギュレーションされたことを示す。
【０１８７】
新たに単離されたヒトマクロファージ／ＰＢＭＣは、複数の別個の細胞のように見え、破骨細胞へ融合した。Affymetrix（登録商標）U133 Plus 2.0 GeneChip（登録商標）（図３Ａ）およびTaqMan（登録商標）Gene Expression System（図３Ｂ）により測定したとき、ＳＫ４（ＳＫ４）チャネルの発現は融合条件下で７日間培養した後に増加し、２１日目まで増加した状態が保たれた。他の血球および血液関連細胞におけるＳＫ４チャネル発現の評価は、Ｂ細胞および樹状細胞における有意な発現増加を示した（図３Ｃ）。したがって、ヒト細胞は、ラット細胞と同様に、融合条件下でＳＫ４チャネル発現の増加を示す。
【０１８８】
マウスの破骨細胞形成および破骨細胞における中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルの役割。
結果は、ＳＫ４−／−ノックアウトマウスおよび薬理学的阻害を用いることにより、破骨細胞形成中のＳＫ４チャネル（ＳＫ４）の役割を実証する。
【０１８９】
ＳＫ４−／−マウスの脾細胞は、これらの細胞がＳＫ４＋／−またはＷＴマウス由来の破骨細胞の細胞と同じ数または大きさを形成しなかったので、破骨細胞形成の欠陥を示した（図４Ａ〜Ｂ）。しかし、ＳＫ４チャネルのみの欠損は、ＳＫ４−／−マウスにおいてＢ細胞（Ｂ２２０）、Ｔ細胞（ＣＤ４およびＣＤ８）、マクロファージ／顆粒球（ＧＲ１、ＣＤ１１ｂ）、マクロファージ（Ｆ４８０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ）または樹状細胞（ＭＨＣＩＩ、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ）の相対的比率に影響を与えなかった（図５）
【０１９０】
同様にＳＫ４−／−マウスの骨髄に由来するマクロファージは、脾細胞に由来する細胞で観察されたものと同様に破骨細胞形成の欠陥を示した（図６Ａ〜Ｂ）。ＳＫ４−／−マウスのマクロファージにおけるＳＫ４チャネルの不足は、不完全なＳＫ４チャネル活性を示したパッチクランプ試験によって確認された（データは示さない）。
【０１９１】
興味深いことに、ＳＫ４−／−ノックアウトマウスは骨梁骨密度の増加を示した（データは示さない）。雄および雌のＳＫ４−／−ノックアウトマウスは両方とも、ホモ接合体の野性型マウスと比較したとき、骨浸食を８７％保護した。さらに、ＳＫ４−／−ノックアウトマウス由来の破骨細胞は、ＷＴマウス由来の破骨細胞と比較して、リン酸カルシウム基質を効率的に再吸収しなかった（データは示さない）。
【０１９２】
２つのＳＫ４チャネルインヒビター、ＩＣＡ−１７０４３およびＴＲＡＭ−３４を用いて、破骨細胞形成におけるＳＫ４チャネルの役割を確認した。これらのインヒビターは、ＷＴマウス（すなわちＳＫ４＋／＋）の骨髄に由来するマクロファージにおいて用量依存的に破骨細胞形成を減じた（図７Ａ〜Ｂ）。図７Ｃは、ＩＣＡ−１７０４３処理サンプルのＴＲＡＰで染色した画像を示し、ここでは、０．３６μMで細胞融合が有意に阻害された。
【０１９３】
関節リウマチのマウスモデルにおける中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルの役割。
これらの結果は、マウスにおけるＳＫ４チャネルの欠損または薬理学的阻害が、関節リウマチにおける骨の再吸収を妨げたことを示す。
【０１９４】
反復研究では、ＷＴマウスと比較したとき、ＳＫ４欠損マウスは関節炎スコアが著しく低下し（図８Ａ〜Ｂ）、骨浸食に対する実質的な保護を示した。さらに、ＳＫ４欠損マウスは、足の硬骨損傷が有意に少なかった（図９Ａ〜Ｂ）。一方、雌のＳＫ４欠損マウスは、炎症、パンヌスおよび軟骨損傷も有意に少なかった（図９Ａ）。
【０１９５】
更なる研究は、ＳＫ４欠損マウスの破骨細胞の骨塩の再吸収が不完全であったことを示した（図１１Ａ）が、これは恐らくＳＫ４−／−細胞が、十分な数の破骨細胞を形成しなかったためである（図１１Ｂ）。したがって、ＳＫ４欠損マウス中の破骨細胞の減少は、骨梁密度の増加を表す。雄および雌のＳＫ４−／−マウスの大腿遠位は、ＳＫ４＋／＋マウスよりも骨梁密度が高かった（図１２）。
【０１９６】
ヒト末梢血単核細胞において中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルインヒビターは融合を減じる。
この実施例は、実施例４においてマウス細胞について示したものに類似の方法で、ＳＫ４チャネルインヒビターがヒト細胞の融合を妨げることを実証する。
【０１９７】
ＩＣＡ−１７０４３およびＴＲＡＭ−３４は、用量依存的にインビトロにおいてヒトの破骨細胞形成を阻害した（図１０Ａ〜Ｂ）。ＩＣＡ−１７０４３は０．３μMのＩＣ５０で細胞融合を阻害した；一方、ＴＲＡＭ−３４は０．８μMのＩＣ５０で細胞融合を阻害した；同様に、ＩＣＡ−１７０４３およびＴＲＡＭ−３４は、用量依存的な方法で破骨細胞数だけでなく破骨細胞の表面積も減少させた。
【０１９８】
頭蓋冠のＬＰＳ／インビボ骨吸収アッセイ。
これらの結果は、ＳＫ４欠損（ＳＫ４−／−）マウスが局所ＬＰＳ頭蓋冠注射に応答して、インビボにおいて破骨細胞形成を減少させることを実証する。
【０１９９】
関節リウマチを引き起こす炎症におけるＳＫ４の役割を明らかにするために、頭蓋冠上にリポ多糖類（ＬＰＳ）を局所的に皮下注射して、骨を再吸収する破骨細胞の形成を導く炎症反応を局所、迅速、そして効率的に誘導した。解剖学的に、表在する血管および神経が存在せず、配置が容易である頭蓋冠を、縫合糸によって分離する（図１４を参照されたい）。図１４および１５Ａ〜Ｃに結果を示す。
【０２００】
ＳＫ４、ひいてはＳＫ４チャネルが存在しないと、ＬＰＳの局注に応答して骨吸収が劇的に妨げられた（図１４）。ＳＫ４＋／＋マウスの頭蓋冠硬骨中の破骨細胞により穴が作製されるが、ＳＫ４欠損マウスの頭蓋冠硬骨中では作製されない場合、骨表面が増大することに留意されたい。ＳＫ４欠損マウスは、ＬＰＳ注射の５日後に、厚い頭蓋冠骨厚さおよび高い骨密度を維持する（図１５Ａ〜Ｃを参照されたい）。
【０２０１】
特に明記されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものに類似しているか、または等価である任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が本明細書に記載されている。
【０２０２】
前述の記載および関連する図面において示された教示の利点を有する本明細書に記載される発明の、多くの変更および他の態様を当業者は思い浮かべるであろう。したがって、本発明は、開示された特定の態様に限定されるものではなく、また、変更および他の態様が、添付の特許請求の範囲および本明細書に開示される態様の一覧の範囲内に含まれることを意図することが理解されるべきである。特定の用語が本明細書において使用されるが、それらは、限定する目的ではなく包括的および記述的な意味のみで使用される。
【０２０３】
明細書の中で言及された刊行物および特許出願はすべて、本発明が属する分野の当業者のレベルを示す。個々の刊行物または特許出願が、具体的かつ個別に参照により組み込まれることが指示されたかのように、同程度にすべての刊行物および特許出願が参照により組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
0005783903.tif 000027
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【配列表】
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