(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析シーケンスによって複数の試料中の１種以上の被検体の濃度を決定する方法であって、分析シーケンスが、
各試料を、逐次、
（ａ）試料又は試料から導かれた溶液を、被検体を特異的に結合し得る化学種又は被検体結合化学種を保持するセンサー表面に接触させる段階と、
（ｂ）センサー表面への結合量を検出する段階と、
（ｃ）センサー表面を再生して次の分析サイクルのための準備をする段階と
を含む分析サイクルに供すことを含んでおり、前記分析シーケンスが、
分析シーケンスの異なる時点で現実の校正データを得るための２以上の校正サイクルであって、各校正サイクルが、既知の異なる濃度の被検体を含む２以上の校正用試料を分析サイクルに供して検出された結合量を現実の校正データとして記録する校正サイクルと、
現実の校正データをモデル関数に当てはめて、モデル関数から各分析サイクルについて仮想校正データを得ることによってから各分析サイクルについての仮想校正データを計算する段階と、
検出されたセンサー表面への結合量と、それぞれの分析サイクルに関して計算された仮想校正データとに基づいて、各試料中の被検体の濃度を決定する段階と
を含む、方法。
【請求項２】
仮想校正データが各サイクルに特有の校正曲線からなる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
サイクル特有の校正曲線が現実の校正データから各サイクルに関して予測された仮想濃度から計算される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
仮想濃度の予測が、既知の校正データをモデル関数に当てはめて各校正濃度に関するセンサー応答−サイクル数関係を求めることを含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
モデル関数がリガンド結合に関する標準型回帰曲線である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
モデル関数が指数関数である、請求項４記載の方法。
【請求項７】
仮想校正データが各サイクルに特有の校正係数からなる、請求項１記載の方法。
【請求項８】
現実の校正データから校正式が計算され、それから各サイクルに関する仮想校正係数が予測される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
仮想校正係数の予測が、校正データをモデル関数に当てはめて各サイクルに関するモデル関数の係数の値を求めることを含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
現実の校正データが、複数の試料の分析中に２回以上実施される校正からのデータからなる、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
各校正が２種以上の濃度を用いて実施される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
分析サイクルが、直接アッセイ、阻害アッセイ、競合アッセイ及びサンドイッチアッセイから選択されるアッセイフォーマットに基づいている、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
分析サイクルが直接型アッセイに基づいていて、被検体に特異的なリガンドがセンサー表面上に固定化される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
分析サイクルが阻害型アッセイに基づいていて、試料が一定量の検出分子と混合され、被検体又は被検体類似体がセンサー表面上に固定化される、請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガンド保持センサー表面への結合の検出を含む、被検体濃度の決定のためのアッセイに関し、さらに詳しくは、各分析サイクルごとにセンサー表面の再生を行いながら同一のリガンド保持センサー表面を用いて複数の試料を逐次に分析する上記のようなアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
分子の相互作用をリアルタイムでモニターし得る分析センサーシステムは、ますます多くの関心を集めつつある。これらのシステムは光学的バイオセンサーに基づくことが多く、通常は相互作用分析センサー又は生体特異的相互作用分析センサーといわれている。代表的なかかるバイオセンサーシステムは、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ（ウプサラ、スウェーデン）から販売されているＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）計測器であり、これは試料中の分子と感知表面上に固定化された分子構造との間の相互作用を検出するために表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用している。Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムによれば、標識を使用しなくても、試料中における特定の分子の存否や濃度ばかりでなく、例えば分子の相互作用に関する会合速度定数及び解離速度定数のような追加の相互作用パラメーターをリアルタイムで測定することが可能となる。
【０００３】
一般に、バイオセンサーアッセイにおいては、アッセイフォーマットに応じて被検体又は被検体結合リガンドがセンサー表面上の固定化リガンドに結合した場合、適当な流体で処理することで結合化学種を遊離させて新しい試料との接触のために表面を準備することが行われるが、このプロセスを再生という。通常、センサー表面はかなり多数の分析サイクルに供することができる。しかし、（例えばウイルス抗原のような）多くのリガンドは低い安定性を有する場合が多く、表面の被検体結合能力はサイクル数と共に減少し、定量目的のためのリガンドの使用を妨げることがある。結合能力のわずかな減少は頻繁な校正によって補償できることが多いが、これはスループットを顕著に減少させると共に、試薬の消費によるコストの増加をもたらす。
【０００４】
本発明の目的は、この問題に対する解決策を提供するもので、表面の結合能力のドリフト中における頻繁な校正の必要性を最小化すると共に定量測定の品質を顕著に向上させるアッセイ方法を提供することにある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
国際公開第２００６／０４１３９２号パンフレット
【発明の概要】
【０００６】
上述した目的並びに他の目的及び利点は、特有の仮想校正曲線（即ち、各分析サイクルについて得られる固有の校正曲線）又は特有の校正係数を用いて各分析サイクルを評価する基準化段階を含む方法によって達成される。かくして、その結合能力がセンサー表面で分析された試料の数に応じて顕著なドリフトを示すリガンド保持センサー表面の場合でも、必要な校正作業の数を最小化することができる。
【０００７】
したがって一態様では、本発明は、各試料を逐次に分析サイクルに供することによって複数の試料中の１種以上の被検体の濃度を決定する方法であって、試料又は試料から導かれた溶液を、被検体を特異的に結合し得る化学種又は被検体結合化学種を保持するセンサー表面に接触させる段階を含んでなる方法を提供する。センサー表面への結合量が検出され、次いでセンサー表面を再生して次の分析サイクルのための準備が行われる。検出されたセンサー表面への結合量に基づき、既知濃度の被検体を含む試料にセンサー表面を接触させることで得られた現実の校正データから各分析サイクルに関して計算される仮想校正データを用いて各試料中の被検体の濃度が決定される。
【０００８】
現実の校正データは、複数の試料の分析シーケンス中に２以上、好ましくは３以上の時点（例えば、シーケンスの開始時点、中間時点及び終了時点）で実施される校正サイクルによって得られる。各校正は、２種以上、好ましくは５種以上の濃度（サイクル）を用いて実施される。
【０００９】
一実施形態では、仮想校正データは各サイクルに特有の仮想校正曲線からなる。かかる特有の校正曲線は、現実の校正データから各サイクルに関して予測された仮想濃度から計算できる。仮想濃度の予測は、好ましくは、現実の校正データ又は曲線の既知濃度の各々を、通例はサイクル数をｘとしかつ応答をｙとしたセンサー応答に関するモデル関数に当てはめることで行われる。
【００１０】
別の実施形態では、仮想校正データが各サイクルに関する校正係数からなる。かかる校正係数は、現実の校正データから計算された校正式から予測できる。
【００１１】
センサー表面に固定化されるリガンドは、被検体に特異的なリガンド、被検体又は被検体類似体、或いは被検体に特異的なリガンドに結合する捕捉剤であり得る。直接アッセイ、阻害アッセイ、競合タイプアッセイ及びサンドイッチアッセイを含む様々なアッセイフォーマットが使用できる。
【００１２】
本発明並びにその追加の特徴及び利点の一層完全な理解は、以下の詳細な説明及び添付の図面を参照することで得られよう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、試料中に相異なるウイルス濃度を有する３つの場合（ａ〜ｃ）に関し、センサー表面上での阻害型ウイルスアッセイを示す模式図である。
【図２】図２は、３種のウイルス抗原がセンサー表面上のそれぞれの個別スポットに固定化され、各抗原に対して特異的な３種の抗体が定量のために使用される場合を示す、図１と同様な模式図である。
【図３】図３は、センサー表面上に固定化したインフルエンザウイルス抗原を用いる阻害型アッセイにおいて、実測された相対応答／安定度を様々なインフルエンザウイルス／抗血清混合物の濃度に対して示す図である。
【図４】図４は、固定化されたインフルエンザウイルス抗原を有するセンサー表面に対する複数の相異なるインフルエンザウイルス抗血清の結合に関し、実測された相対応答を分析サイクル数に対して示す図である。
【図５】図５は、固定化ウイルス抗原を有するセンサー表面上で実施される阻害型アッセイ中の４回の通常校正時において、７種の濃度（０．１５６、０．３１、０．６２５、１．２５、２．５、５及び１０μｇ／ｍｌ）のウイルス対照試料に関してサイクル数をｘとしかつ実測応答をｙとする当てはめ基準化曲線を示す図である。これらの基準化曲線は、各サイクルに関する仮想濃度を予測するために使用される。次いで、これらの仮想濃度は、仮想濃度をｘとしかつ既知濃度をｙとするサイクル特有の校正曲線を作成するために使用される。
【図６】図６は、固定化ウイルス抗原を有するセンサー表面上で実施される阻害型アッセイにおいて相異なるサイクル数で４回の通常校正を行いながら、２種の対照試料濃度に関して計算濃度を分析サイクル数に対して示す図である。
【図７】図７は、２種の対照試料濃度に関し、各サイクルに関する（図５に基づく）仮想校正曲線を図６と同じ生データに適用した場合を示す図である。
【図８】図８は、対照試料に関する実測結合データ及び各サイクルに関する仮想校正曲線によって基準化された対応データを示す、図７と同様な図である。
【図９Ａ】図９Ａは、３種のウイルスタイプの同時検出のためのアッセイにおいて作成した第１の校正曲線を示している。
【図９Ｂ】図９Ｂは、３種のウイルスタイプの同時検出のためのアッセイにおいて作成した第２の校正曲線を示している。
【図９Ｃ】図９Ｃは、３種のウイルスタイプの同時検出のためのアッセイにおいて作成した第３の校正曲線を示している。
【図１０】図１０は、仮想校正によって評価した被検体濃度のプロットした図を示している。
【図１１】図１１は、４パラメーター式の４つの係数がサイクル数と共に変動することを示している。
【図１２】図１２は、典型的な校正曲線の基礎をなす、ウイルス標準品に関する複数のセンサーグラムを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
簡単に述べれば、本発明は、センサー技術（通例はバイオセンサー技術）を用いて複数の試料中の被検体濃度を決定する方法であって、校正作業からのデータを用いて各分析サイクル（即ち、各試料）に関する仮想校正データを計算することで、実施される分析サイクルの数と共にセンサー表面の結合能力が実質的に減少する場合でも頻繁な校正が回避されかつ測定の品質が向上する方法に関する。
【００１５】
まず、バイオセンサー技術について述べれば、バイオセンサーは広義には、固体物理化学的トランスデューサーと直接に結合した状態で、或いはトランスデューサーと結合している可動担体ビーズ／粒子と共に分子認識用の構成成分（例えば、固定化抗体を有する層）を使用する装置として定義される。かかるセンサーは通例は固定化層に関する質量、屈折率又は厚さの変化を検出する無標識技法に基づいているが、何らかの種類の標識に依存するバイオセンサーも存在する。本発明の目的のための典型的なセンサーには、特に限定されないが、光学的方法及び圧電又は弾性波方法（例えば、表面弾性波（ＳＡＷ）法及び水晶微量てんびん（ＱＣＭ）法を含む）のような質量検出方法がある。代表的な光学的検出方法には、外部および内部反射法の両方を含む反射光学的方法のような質量表面濃度を検出する方法があり、これらは角分解、波長分解、偏光分解又は位相分解することができる。例えば、エバネセント波偏光解析法及びエバネセント波分光法（ＥＷＳ又は内部反射分光法）（これらはいすれも表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるエバネセント場の増強を含み得る）、ブルースター角屈折率測定、臨界角屈折率測定、フラストレーテッド全反射（ＦＴＲ）、散乱全内部反射（ＳＴＩＲ）（これは散乱を増強する標識を含み得る）、光導波路センサー、外部反射イメージング、エバネセント波に基づくイメージング（例えば、臨界角分解イメージング、ブルースター角分解イメージング、ＳＰＲ角分解イメージング）などがある。さらに、例えば表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）、エバネセント波蛍光発光法（ＴＩＲＦ）及びリン光発光法に基づく測光方法及びイメージング／顕微鏡検査方法（「それ自体」で又は反射方法と組み合わせて使用される）、並びに導波路干渉計、導波路リーキングモード分光法、反射干渉分光法（ＲＩｆＳ）、透過干渉測定、ホログラフィー分光法及び原子間力顕微鏡検査法（ＡＦＲ）が挙げられる。
【００１６】
ＳＰＲに基づくバイオセンサー装置並びに例えばＱＣＭを含む他の検出技法に基づくバイオセンサー装置は、いずれも１以上のフローセルを有する流通型装置及びキュヘット型装置として商業的に入手できる。複数の感知表面及び流通系を有する例示的なＳＰＲバイオセンサーには、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）及びＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲ３６システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）がある。これらのシステムは、結合リガンドと検査対象の被検体との間の表面結合相互作用をリアルタイムでモニターすることを可能にする。この文脈中では、「リガンド」は所定の被検体に対して既知又は未知の親和性を有する分子であって、表面上に固定化された任意の捕捉剤又はキャッチング剤を含む一方、「被検体」はそれに対する任意の特異的結合パートナーを含む。
【００１７】
ＳＰＲバイオセンサーに関して述べれば、ＳＰＲの現象は公知である。異なる屈折率を有する２種の媒体間の界面であって、通例は金又は銀の金属フィルムで被覆された界面において光がある条件下で反射された場合にＳＰＲが起こることを述べれば十分であろう。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムでは、媒体は試料及びミクロ流体流路系によって試料に接触させるセンサーチップのガラスである。金属フィルムはチップ表面上の金の薄層である。ＳＰＲは、特定の反射角における反射光の強度を低下させる。この最小反射光強度の角度は、反射光の反対側（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムでは試料側）の表面付近の屈折率に応じて異なる。システムからの出力は、検出器の応答を時間の関数としてプロットした「センサーグラム」である。
【００１８】
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）計測器の技術的側面及びＳＰＲの現象の詳細な論議は、米国特許第５,３１３,２６４号中に見出すことができる。バイオセンサーの感知表面のマトリックスコーティングに関する一層詳細な情報は、例えば、米国特許第５,２４２,８２８号及び同第５,４３６,１６１号に示されている。さらに、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）計測器に関連して使用されるバイオセンサーチップに関する技術的側面の詳細な議論は、米国特許第５,４９２,８４０号中に見出すことができる。上述した米国特許の全開示内容は、援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００１９】
以下の実施例では、本発明はＳＰＲ分光法（さらに詳しくはＢｉａｃｏｒｅ（商標）システム）に関連して例示されるが、本発明はこの検出方法に限定されないことを理解すべきである。それどころか、固定化リガンドに対する被検体の結合を定量的に表す感知表面での変化を測定できさえすれば、被検体のような結合化学種が感知表面上に固定化されたリガンドに結合する任意の親和性に基づく検出方法が使用できる。
【００２０】
本発明の方法は、センサー表面上でのドリフトを引き起こす顕著な不安定性を示す任意のリガンドに関して有利に使用できる。例示的なかかるリガンドには赤血球凝集素（ＨＡ）のようなウイルス抗原があり、したがって本方法はウイルス検出に関連して特別の重要性を有し得る。
【００２１】
以下、もっぱら例示目的のため、ウイルス抗原の検出及び定量のためのアッセイ、特に試料中の１種以上のインフルエンザウイルスの濃度、さらに詳しくは三価インフルエンザワクチン中の３種のウイルスタイプの赤血球凝集素（ＨＡ）の濃度を決定するための阻害型アッセイに関して本発明を一層詳しく説明するが、これに限定されるわけではない。
【００２２】
一般に、阻害型アッセイ（溶液競合アッセイともいう）では、既知量の検出分子（ここでは抗体）を試料（ここではウイルス）と混合し、混合物中の遊離検出分子の量を測定する。さらに詳しくは、本発明のバイオセンサーに関連した濃度測定のための阻害型アッセイは、通例、下記の段階を含み得る。
１．リガンドをセンサー表面に結合する。
２．（既知又は未知であってよい）一定濃度の検出分子を様々な濃度の校正物質溶液（被検体）に添加する。
３．混合物をセンサー表面に接触させ（流路系内の表面上に注入し）、応答を測定する。
４．校正曲線を計算する。
５．次いで、試料（被検体）を一定濃度の検出分子と混合することで測定を行う。試料をセンサー表面に接触させ（流路系内の表面上に注入し）、応答を測定する。
６．校正曲線を用いて試料中の被検体濃度を計算する。遊離検出分子の量は、試料中の被検体濃度と逆の関係にある。
７．表面を再生し、新しい試料を注入することができる。
【００２３】
説明すべき方法では、リガンドはウイルス抗原、好ましくは表面抗原（又は任意には全ウイルス）であるのに対し、被検体は抗原（ウイルス粒子、ウイルス粒子の一部又はワクチン）と通例は抗原に対する抗体である検出分子との混合物である。抗体はポリクローナル（例えば血清）又はモノクローナルであり得る。このような特定の場合に阻害型アッセイフォーマットを使用することの利点は、表面への大きいウイルス粒子（抗原）の拡散効果は回避されることである。アッセイが（典型的には）培養ウイルスからワクチンを精製するために使用される場合、抗原は精製プロセスの任意の部分から得られるものであってよく、全ウイルス又は表面抗原のみからなり得る最終ワクチンであってよい。
【００２４】
以下、添付の図面中の図１〜１２を参照しながら説明を行う。
【００２５】
図１ａに模式的に示される通り、参照番号１で表される精製ウイルスＨＡをバイオセンサーのセンサー表面２上に固定化する。ウイルス粒子３と抗体４を含む抗血清との混合物をセンサー表面２上に液体流れとして通過させる。図１ａに示される通り、抗体４はウイルス粒子又は固定化ＨＡ抗原に結合していることもあれば、溶液中に遊離していることもある。センサー表面への結合は、センサー表面からの応答信号を増加させる。
【００２６】
図１ｂは、試料中にウイルスが存在しない場合を示している。この場合には、最大量の抗体４がセンサー表面上のＨＡ抗原１に結合し、高い応答信号を生じる。
【００２７】
他方、図１ｃでは、高濃度のウイルス粒子３が少量の遊離抗体４を生み出し、したがって低い応答信号が測定される。このように、試料中のウイルスの濃度が高いほど、表面ＨＡに結合する抗体の量は少なくなり、低い応答レベルを生じる。
【００２８】
センサー表面が複数（例えば、３以上）の個別感知領域又は「スポット」を有するか、或いはそれを提供し得るならば、図２に示すように、例えば３種のＨＡを固定化することができる。この場合、（現行のインフルエンザワクチン中で通例使用される）ウイルスタイプＡ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２及びＢに対して特異的なＨＡがセンサー表面上のそれぞれのスポットに固定化されている。
【００２９】
下記に実証されるように、ＨＡに対する異なるウイルス抗血清の結合は選択性である。即ち、異なるウイルスタイプ又はサブタイプ間の交差反応性は存在しない。このような選択性のため、多価ワクチンのような試料中の２種以上のウイルス成分は同時に測定できる。
【００３０】
次に、上述した３種のウイルスタイプ／サブタイプＡ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２及びＢを含む試料に適用される本発明方法の例示的な実施形態を説明しよう。
【００３１】
３種のウイルスタイプからのＨＡを、センサー表面上の３つの異なるスポットに固定化する。
【００３２】
次いで、校正手続きを実施する。各ウイルスタイプに関する一定濃度の標準抗血清からなる校正物質を、測定すべき濃度範囲をカバーする様々な既知濃度のウイルス（又はウイルス抗原）と混合する。次いで、校正物質をセンサー表面のスポット上に（３種のタイプを別々に又は一緒に）注入し、応答を測定する。次いで、測定の結果から校正曲線を計算する。
【００３３】
例示のため、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムにより複数のウイルス標準品に関して得られたセンサーグラム（検出器の応答を時間に対してプロットした曲線）の例を図１２に示すが、これらをまとめて典型的な校正曲線が得られる。
【００３４】
次いで、各試料を一定濃度の抗血清（一度に１種ずつ又は好ましくは３種の抗血清のすべてを用いる）と混合することで試料中のウイルスＨＡ含有量の測定を実施する。試料をセンサー表面上に注入し、遊離抗血清濃度を測定する。校正曲線を用いて試料中のウイルス抗原濃度を計算する。
【００３５】
次いで、表面を再生し（即ち、表面を適当な再生溶液に接触させることで固定化ＨＡから結合抗体を解離させ）、新しい試料を表面上に流すことができる。
【００３６】
上述したように、固定化抗原は安定でないので、これはセンサー表面の能力を減少させる。したがって、対照品の測定／計算濃度は新しい校正作業が行われるまでに実施される分析サイクルの数（又はサイクル数）の関数として増加する。これは、阻害型アッセイフォーマットでは、校正曲線が結合能力の減少を試料中のＨＡ濃度の増加として解釈するからである。このようなドリフトは分析サイクル数の増加と共に増加し、普通は直線的でなく、通例は指数関数的である。本明細書中で使用される「分析サイクル」という用語は、固定化ＨＡを有するセンサー表面上にウイルスと検出抗体との混合物を流す段階、次いで表面を再生して次の分析サイクルの準備を行う段階を含んでいる。
【００３７】
したがって、本発明に従えば、（例えば、分析シーケンスの開始時点、中間時点及び終了時点で）実施される通常は複数の校正に基づき、各分析サイクルに特有となるように計算された「仮想」校正データを用いて各分析サイクルが評価される。これは、ドリフト中における頻繁な校正の必要性を効果的に最小化すると共に、例えば上述したＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムのようなバイオセンサーシステムを用いた定量測定の品質を顕著に向上させる。このような新しい校正ルーチンは様々なやり方で設計できる。
【００３８】
１つの変形例では、抗体作業からの生データを用いて各分析サイクルに関する仮想濃度を予測し、次いでサイクル特有の校正曲線の計算並びに試料及び対照品に関する濃度の予測を行う。
【００３９】
さらに詳しくは、適当な数の相異なる濃度を用いて実施された各校正に関し、得られた応答を、サイクル数をｘとしかつ応答をｙとするモデル関数に当てはめる。モデル関数又は式は、例えば、指数関数（例えば、二重指数関数）であってもよいし、或いは下記の実施例中に記載される「４パラメーター回帰曲線」（「４パラメーター式」ともいう）のようなリガンド結合に関する標準型回帰曲線モデルであってもよい。次いで、（各濃度に関して１つずつ）生成される式又は曲線を用いて各分析サイクルに関する仮想応答を計算する。次いで、これらの仮想応答データを用いて各サイクルに特有の校正曲線を計算するが、これは例えば上述した４パラメーター回帰曲線を用いて行うことができる。次いで、これらのサイクル特有の校正曲線を用いて試料及び対照品の濃度を予測する。
【００４０】
別の変形例では、現実の校正の各々に関して校正式を計算し、次いで各分析サイクルに特有の校正係数を予測する。次いで、これらの係数を用いて試料及び対照品の濃度を予測する。
【００４１】
さらに詳しくは、分析サイクルシーケンス中に様々な時点で得られた校正データを用いて、各校正に関する回帰曲線モデルの係数を計算する。回帰曲線モデルは、例えば、上述した「４パラメーター回帰曲線」のようなリガンド結合に関する標準型回帰曲線モデルであってよく、この場合には４つの係数が計算される。次いで、各係数に関し、サイクル数に応じたその変動を求めた後、使用した回帰曲線モデルから濃度を計算することができる。
【００４２】
上述した「４パラメーター回帰曲線」の４つの係数（パラメーター）の各々の変動の実例を、図１１Ａ（係数Ａ＝Ｒhigh及びＤ＝Ｒlow）並びに図１１Ｂ（係数Ｂ＝Ａ2及びｌｏｇＣ＝ｌｏｇＡ1）に示す。各曲線に関して示した式は、それぞれの係数をサイクル数の関数としてプロットすることで得られた。
【００４３】
必要な校正及び相異なる濃度の数は、一般に使用する回帰曲線モデルに依存する。少なくとも比較的小さい濃度範囲に関しては、２種の分析サイクル数での校正及び２種の濃度で十分であろうが（線形回帰曲線モデル）、３回以上（例えば、３回又は４回）の校正を実施し、かつ５種以上（通例は６〜８種）の濃度を使用することが好ましい（指数関数的又は「４パラメーター回帰曲線」）。
【００４４】
上述した第１の方法変形例は下記の実施例４及び実施例５に一層詳しく記載されるが、これは通例以下の段階を含んでいる。即ち、
分析シーケンス中の様々な時点で様々な濃度を用いて校正を実施して複数の校正曲線を得る段階、
各濃度に関し、サイクル数をｘとしかつ検出器の応答をｙとする４パラメーター式又は二重指数関数に校正曲線を当てはめて対応する応答−サイクル数曲線を得る段階、
それぞれの濃度に関する様々な応答−サイクル数曲線から各サイクルに関する仮想応答を計算する段階、
４パラメーター式に当てはめて各サイクルに特有の校正曲線を計算する段階、及び
それぞれのサイクル特有の校正曲線から各試料中の被検体濃度を決定する段階
を含んでいる。
【００４５】
第２の方法変形例は実施例６に一層詳しく記載されるが、これは通例以下の段階を含んでいる。即ち、
分析シーケンス中の様々な時点で様々な濃度を用いて校正を実施して複数の校正曲線を得る段階、
校正曲線を「４パラメーター式」に当てはめて各校正曲線に関する４つの係数の値を決定する段階、
すべての濃度に関し、係数値をサイクル数に対してプロットして各サイクルに関する仮想係数を得る段階、及び
サイクル特有の係数を用いて４パラメーター式から各試料中の被検体濃度を計算する段階
を含んでいる。
【００４６】
以下の実施例には、限定ではなく例示を目的として本発明の様々な態様を一層詳細に開示する。
【実施例】
【００４７】
計測機器
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウプサラ、スウェーデン）を使用した。この計測器はセンサーチップ上の金表面での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）検出に基づくもので、試料及び操作用緩衝液を４つの個別に検出されるフローセル（Ｆｃ１〜Ｆｃ４と表示する）に１つずつ又は連続して通過させるための微小流体系（一体化微小流体カートリッジ−ＩＦＣ）を使用している。ＩＦＣは、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００計測器内において合体機構によりセンサーチップに圧着されている。
【００４８】
センサーチップとしては、カルボキシメチル修飾デキストランポリマーの共有結合ヒドロゲルマトリックス（約１００ｎｍ）と共に金被覆（約５０ｎｍ）表面を有するシリーズＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウプサラ、スウェーデン）を使用した。
【００４９】
計測器からの出力は、（「共鳴単位」（ＲＵ）で測定された）検出器の応答を時間の関数としてプロットした「センサーグラム」である。１０００ＲＵの増加は、センサー表面上での約１ｎｇ／ｍｍ2の質量増加に相当している。
【００５０】
実施例１：インフルエンザウイルスＡ／Ｈ３Ｎ２／Ｗｙｏｍｉｎｇ、Ａ／Ｈ３Ｎ２／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びＢ／Ｊｉｌｉｎのアッセイ
材料
赤血球凝集素（ＨＡ）Ａ／Ｈ３Ｎ２，Ｗｙｏｍｉｎｇ／３／２００３、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ及びＮｅｗ Ｙｏｒｋは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．（メリデン、米国）から入手した。
ＨＡ Ａ／Ｈ１Ｎ１，Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９は、ＰｒｏｓＰｅｃ社（レホヴォト、イスラエル）から入手した。
ＨＢ／Ｊｉｌｉｎは、ＧｅｎＷａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．（サンディエゴ、米国）から入手した。
血清及びウイルス株は、ＮＩＢＳＣ−Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ポッターズバー、英国ハートフォードシャー州）から入手した。
アッセイ用及び試料用緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）。
界面活性剤Ｐ２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）。
【００５１】
方法
下記のように、アミンカップリングを用いて、ＨＡ（Ｈ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ１及びＢ）をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００の３つのそれぞれのフローセル内のＣＭ５センサーチップに固定化する。
Ｈ３Ｎ２／Ｗｙｏｍｉｎｇ及びＷｉｓｃｏｎｓｉｎ：１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０、０．０５％界面活性剤Ｐ２０中で１０μｇ／ｍｌ、７分間。
Ｈ３Ｎ２／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：１０ｍＭマレイン酸緩衝液、ｐＨ６．５、０．０５％界面活性剤Ｐ２０中で１０μｇ／ｍｌ、７分間。
Ｂ／Ｊｉｌｉｎ：１０ｍＭマレイン酸緩衝液、ｐＨ６．５、０．０５％界面活性剤Ｐ２０中で５μｇ／ｍｌ、２０〜３０分間。
固定化レベルは５０００〜１００００ＲＵである。
それぞれのウイルス株に対する血清を、約５００〜１５００ＲＵが得られるように希釈する。
血清を用いて３〜１０回の開始サイクルを実施する。
最初に供給者によって推奨されるようにＭＱで希釈され（この場合、ＨＡはアリコートに分けて凍結保存される）、次いでさらに血清で通例０．１〜１５μｇ／ｍｌに希釈されたウイルス抗原（ＨＡ）を用いて校正曲線を作成する。
標準品及び試料は４００秒の注入時間を有している。
再生は５０ｍＭ ＨＣｌ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０を用いて３０秒間実施し、次いで３０秒間の安定化を行う。
【００５２】
実施例２：同一ウイルスサブタイプの様々な株の検出の普遍性
Ｈ３Ｎ２株Ｗｙｏｍｉｎｇ ＨＡをＣＭ５センサーチップに固定化し、その表面を様々なウイルス／抗血清の組合せに接触させた。かかる組合せは、Ｗｙｏｍｉｎｇからのウイルス／抗血清（Ｗ／Ｗ）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋからのウイルス／抗血清（Ｎ．Ｙ．／Ｎ．Ｙ．）、Ｗｙｏｍｉｎｇウイルス及びＮｅｗ Ｙｏｒｋからの血清（Ｗ／Ｎ．Ｙ．）並びにＮｅｗ Ｙｏｒｋウイルス及びＷｙｏｍｉｎｇからの血清（Ｎ．Ｙ．／Ｗ）であった。それぞれの組合せを用いて校正曲線を作成した。結果を図３に示す。図から明らかな通り、異なるウイルス株間には交差反応性が存在する。したがって、Ｗｙｏｍｉｎｇ ＨＡ及びウイルス／抗血清はＮｅｗ Ｙｏｒｋ株の定量のために使用でき、その逆もまた正しい。
【００５３】
実施例３：様々なインフルエンザウイルスタイプ／サブタイプのＨＡに対する抗血清の結合の選択性
インフルエンザウイルスＡ／Ｈ３Ｎ２、Ａ Ｈ１Ｎ１及びＢの様々な株に対する２７種の抗血清を固定化Ｈ３Ｎ２ Ｗｙｏｍｉｎｇ ＨＡ上に注入し、その結合を検出した。結果及び使用した株のリストを図４に示す。図から明らかな通り、すべてのＨ３Ｎ２抗血清は１００ＲＵより高い信号をもって結合する一方、すべてのＨ１Ｎ１及びＢ抗血清は５０ＲＵ未満の信号を有している。これは、数種のウイルス株を同時に定量できること、及びＨ３Ｎ２の測定のためには１種又は若干種のＨＡのみが必要であることを表している。
【００５４】
実施例４：仮想校正手続き
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００及びＣＭ５センサーチップ上で複数（約１００回）のアッセイサイクルを実施したが、その間に７種の濃度（０．１５６、０．３１、０．６２５、１．２５、２．５、５及び１０μｇ／ｍｌ）の対照試料を用いて４回の通常校正を行った。７種の濃度の各々に関し、サイクル数をｘとし、応答をｙとし、かつａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅを当てはめパラメーターとする関数ｙ(ｘ)＝ａ*ｅｘｐ(−ｂ*ｘ)＋ｃ*ｅｘｐ(−ｄ*ｘ)＋ｅを当てはめた。結果を図５に示すが、図中で最上部の曲線は最も低い濃度（０．１５６μｇ／ｍｌ）の対照品（即ち、阻害アッセイでは最も高い応答）を表し、最下部の曲線は最も高い濃度（１０μｇ／ｍｌ）の対照品（即ち、最も低い応答）を表している。次いで、これらの式を用いて各サイクルに関する仮想応答を計算した。次いで、下記実施例６に記載される標準型の「４パラメーター回帰曲線」を使用しながら、これらの応答を用いて各サイクルに関する校正曲線を計算した。これらのサイクル特有の校正曲線から、図６及び図７を参照しながら下記に説明されるようにして、正にそのサイクルで試料及び対照品の予測を行った。
【００５５】
図６は、２種の対照品（１．０μｇ／ｍｌ及び０．５μｇ／ｍｌ）の計算濃度に関するドリフトを示している。多数のアッセイサイクルを実施し、二重波線矢印で表されるサイクル数で４回の中間校正を行った。各校正後に３つ（又は２つ）の対照品の濃度を最も近い先行校正曲線に対して計算した。波線矢印によって表されるように、校正までの距離の増加に伴って計算濃度の系統的な増加が存在している。このような計算濃度の増加は、対照試料からの信号の減少に原因している。これはまた、表面の結合能力がサイクル数の関数として減少し、校正曲線がかかる減少を濃度の増加として解釈することに原因している。このような結合能力の減少はまた、図３及び図４に見ることができる。
【００５６】
上述した仮想校正方法を図６の生データに適用すれば、０．５μｇ／ｍｌ及び１．０μｇ／ｍｌの対照品に関して図７に示す濃度推定値が得られるが、これは対照試料の濃度の予測における再現性の顕著な向上である。
【００５７】
実施例５：仮想校正手続きによる結合データの基準化
ＨＡ組換えタンパク質ＨＢ／Ｊｉｌｉｎ、Ｈ１Ｎ１／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ及びＨ３Ｎ２／Ｗｙｏｍｉｎｇを固定化した。校正曲線を得た。試料を希釈し、０．５〜１．５μｇ／ｍｌの範囲内の濃度を測定して再計算した。応答のドリフトを回避するため、上記実施例４に概述した基準化手続きを用いて結果を基準化し、各サイクルは固有の校正曲線を得た。図８は、２５０ＲＵの応答及び１．２％のＣＶを与える対照試料（５μｇ／ｍｌのＢ／Ｊｉａｎｇｓｕ／１０／２００３）に関する基準化前及び基準化後の結果を示している。
【００５８】
実施例６：３種のウイルスタイプの同時検出
３つのフローセルに、３種の組換えインフルエンザウイルスＨＡタンパク質、即ちＨ１Ｎ１／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ、Ｈ３Ｎ２／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ及びＢ／Ｊｉｌｉｎを固定化した。
【００５９】
３種のインフルエンザ株Ｈ１Ｎ１／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ、Ｈ３Ｎ２／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ及びＢ／Ｍａｌａｙｓｉａからのウイルス標準品を、各標準品の最終濃度が１６μｇ／ｍｌとなるように希釈して混合した。次いで、１６μｇ／ｍｌから０．５μｇ／ｍｌまでの２倍系列希釈液として校正曲線を作成した。
【００６０】
分析すべき３種のワクチンＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２及びＢを８倍、１６倍、３２倍及び６４倍に希釈した。
【００６１】
３種の血清（ＮＩＢＳＣからのＨ１Ｎ１／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ、Ｈ３Ｎ２／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ及びＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ）を、５００〜７００ＲＵの応答を与える濃度に希釈して混合した。
【００６２】
ワクチンを分析するためには、標準品及びワクチンの複製物をまず血清溶液と混合し、次いで「Ｍｅｔｈｏｄ Ｂｕｉｌｄｅｒ」で生み出された方法を用いてフローセル中に流した。
【００６３】
「Ｍｅｔｈｏｄ Ｂｕｉｌｄｅｒ」からの一般的方法は下記の通りであった。
開始（血清のみを用いて７サイクル、次いで再生）
校正曲線１（１４サイクル）
試料（１２サイクル）
校正曲線２（１４サイクル）
試料（１２サイクル）
校正曲線３（１４サイクル）
試料（１２サイクル）
各株に関する校正曲線１〜３を図９Ａ〜図９Ｃに示す。各図中において、校正曲線１は最上部の曲線であり、校正曲線２は中間の曲線であり、校正曲線３は最下部の曲線である。
【００６４】
次いで、３つの校正曲線について結果を基準化した。これは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムによる濃度測定のために通常使用される４パラメーター回帰曲線（式１）に校正曲線の４パラメーター当てはめを実施して４つの係数を決定することで行った。
【００６５】
【数１】
0005730192.tif 000002
式中、Ｒhighは低ウイルス濃度での応答であり、Ｒlowは低ウイルス濃度での応答であり、Ａ1（ＥＣ５０）及びＡ2（Ｈｉｌｌ勾配）は当てはめパラメーターであり、Ｘはウイルスの濃度である。
【００６６】
次いで、様々な濃度で４つの係数の各々に関して得られた値を分析サイクル数に対してプロットすることで、各係数に関する式を得た。上記の式１によって得られた係数を用いて、基準化濃度を計算した。
【００６７】
結果
【００６８】
【表１】
0005730192.tif 000003
製造者によれば、ワクチン中の各株のＨＡ濃度は、ＳＲＩＤで分析して３０μｇ／ｍｌのはずである。
【００６９】
実施例７：ＣＨＯ−ＨＣＰの測定
５０００ｎｇ／ｍｌの濃度を有するＣＨＯ−ＨＣＰ（チャイニーズハムスター卵巣宿主細胞タンパク質）の２０の試料の濃度を決定するための方法をＢｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００計測器に設定した。各標準曲線について６〜８種の濃度を使用しながら、開始時点、中間時点及び終了時点で３つの標準曲線を作成した。抗ＣＨＯ−ＨＣＰを固定化したセンサーチップ表面上に２０の試料を３００秒間注入した。１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ１．５を用いて再生を６０秒間実施した。仮想校正によって濃度の評価を行い、比較のために平均曲線及び最も近い先行校正曲線をそれぞれ使用した。結果を下記表及び図１０に示す。表中に見られる通り、仮想校正によって評価された濃度は４７９８ｎｇ／ｍｌの平均濃度及び１．４５のＣＶ（％）を有していた。平均曲線を用いた濃度の評価は、４７９５ｎｇ／ｍｌの平均濃度及び９．８７のＣＶ（％）を与えた。先行校正曲線を用いた試料の評価は、４４０８の平均濃度及び４．７６のＣＶ（％）を与えた。
【００７０】
【表２】
0005730192.tif 000004
【００７１】
【表３】
0005730192.tif 000005
【００７２】
【表４】
0005730192.tif 000006
【図１】
0005730192.tif 000007
【図２】
0005730192.tif 000008
【図３】
0005730192.tif 000009
【図４】
0005730192.tif 000010
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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