(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
温度応答性ポリマー、ｐＨ応答性ポリマー及びイオン応答性ポリマーからなる群から選択される少なくとも１種のポリマーが共有結合により表面に固定化された細胞培養支持体の製造方法であって、
放射線照射により重合して前記ポリマーを形成し得るモノマーと、前記モノマーが重合してなるオリゴマー又はプレポリマーと、沸点１２０℃以下の有機溶媒とを含む組成物を、前記ポリマーと放射線照射により共有結合し得る材料を含む表面を備えた基材に５０ｍｇ／ｍ２〜４０ｇ／ｍ２の塗布量で塗布して、前記基材の表面上に結晶を含まない塗膜を形成する塗布工程と、
前記塗膜に放射線を照射して、重合反応及び基材表面と前記ポリマーとの結合反応を進行させる放射線照射工程と、
前記塗膜を乾燥させる乾燥工程とを含み、
前記オリゴマー又はプレポリマーの分子量がダイマー以上の分子量である、前記方法。
【請求項２】
前記乾燥工程が放射線照射工程の前に行われる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記組成物を基材に５０ｍｇ／ｍ２〜１０ｇ／ｍ２の塗布量で塗布する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記有機溶媒がメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール、２−ブタノール、及びｎ−ブタノールから選択される少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記乾燥工程後に、前記基材を細胞培養に適した形状に加工する基材加工工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記ポリマーが温度応答性ポリマーである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
温度応答性ポリマーがアクリル系ポリマー又はメタクリル系ポリマーである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
アクリル系ポリマーがポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が５×１０−３Ｐａ・ｓ〜１０Ｐａ・ｓの粘度を有する組成物である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記オリゴマー又はプレポリマーの分子量が３，０００以上である、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴマー又はプレポリマーの分子量が２万〜４０万である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記モノマーと、前記オリゴマー又はプレポリマーとの重量比が５００：１〜１：２０である、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物中のモノマーの含有量が５〜７０重量％である、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物中のオリゴマー又はプレポリマーの含有量が０．１〜２０重量％である、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
放射線照射工程が１回の放射線照射により行われる、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
放射線がγ線又は電子線である、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
放射線が５Ｍｒａｄ〜５０Ｍｒａｄの線量の電子線であるか、あるいは０．５Ｍｒａｄ〜５Ｍｒａｄの線量のγ線である、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
基材の形状がフィルム形状である、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
基材が、ポリスチレン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリウレタン、アクリル系樹脂、ポリアミド、ポリカーボネート、共役結合を持つ天然ゴム、共役結合を持つ合成ゴム、及びポリシリコンを含有するシリコンゴムからなる群から選択される少なくとも１種の材料からなる、請求項１〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
基材が、表面が易接着処理されたポリエチレンテレフタレート、表面がコロナ処理またはプラズマ処理された合成樹脂、及び表面がアクリル系樹脂により被覆された合成樹脂からなる群から選択される少なくとも１種の材料からなる、請求項１〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
前記オリゴマー又はプレポリマーの分子量が２万〜４０万であり、
前記基材が、ポリスチレン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリウレタン、アクリル系樹脂、ポリアミド、ポリカーボネート、共役結合を持つ天然ゴム、共役結合を持つ合成ゴム、及びポリシリコンを含有するシリコンゴムからなる群から選択される少なくとも１種の材料からなるか、又は
前記基材が、表面が易接着処理されたポリエチレンテレフタレート、及び表面がアクリル系樹脂により被覆された合成樹脂からなる群から選択される少なくとも１種の材料からなり、
前記放射線が１５Ｍｒａｄ〜５０Ｍｒａｄの線量の電子線であるか、あるいは０．５Ｍｒａｄ〜５Ｍｒａｄの線量のγ線である、請求項１〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
合成樹脂がナイロン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、及びポリスチレンからなる群から選択される少なくとも１種の材料である、請求項２０又は２１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞シートを安定的に量産作製するための細胞培養支持体に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞シートとは、細胞間結合で細胞同士が少なくとも単層で連結されたシート状の細胞集合体である。細胞シートは再生医療などで用いられる。細胞シートはシャーレなどの支持体上で細胞培養を行うことにより得られるが、支持体上で形成された細胞シートは接着分子などを介して支持体表面と強固に結合しているため、細胞−細胞間の結合を壊さずに培養支持体から細胞シートを迅速に剥離することは容易ではない。
【０００３】
そこで、細胞培養支持体から細胞シートを効率的に剥離する方法がこれまで検討されてきた。剥離方法は２つに大別できる。第一の方法は、酵素反応を用いて支持体と細胞間の結合を弱める方法である。第二の方法は、細胞接着力の弱い支持体や細胞接着力の変化する支持体を用いる方法である。
【０００４】
第一の方法は、具体的には、酵素を用いて、プロテアーゼ（タンパク質分解酵素）やコラーゲナーゼ（コラーゲン分解酵素）といった細胞間接着分子（密着結合、接着結合、デスモゾーム結合、ギャップ結合、ヘミデスモゾーム結合）を構成するタンパク質や、培養物の周囲を取り巻くコラーゲン結合織や、細胞と支持体間に形成される細胞外マトリクス（Extracellular Matrix: ECM）を分解する方法である。この方法では細胞−支持体表面の結合だけでなく、細胞−細胞間の結合も弱まる。この方法は細胞培養の分野で古くから使われている。この方法で分解される結合物質は、培養される細胞、組織、器官において作られる物質であるから、剥離後においても一定の条件と期間で分解された結合物質を再生することができる。
【０００５】
しかしながら、結合物質の再生には時間がかかるという問題がある。また、この方法では、細胞シートが少なからず損傷を受けるため、再生医療に用いられる細胞シートの作出方法としては望ましくないといえる。
【０００６】
そこで、細胞接着力の弱い支持体や細胞接着力の変化する支持体を用いる第二の方法が新たに開発されている。
【０００７】
細胞接着力の弱い支持体としては特許文献１や特許文献２に開示されているものが挙げられる。これらの文献には、支持体表面にナノピラーと呼ばれる極微小の柱を立て、その上で培養を行う技術が開示されている。この技術では支持体と培養材料は非常に小さい面積でしか接着されず、回収剥離が容易でダメージも少ないとされる。
【０００８】
しかしながら非特許文献１及び２に記載されているように、細胞接着や接着した細胞の挙動は平面に接着する場合と凹凸表面に接着する場合とでは異なり、ナノピラー上では細胞の接着、伸展が遅くなったり、細胞表面から仮足が発生するという問題がある。また凹部が２０μｍ以上の幅を有する場合には細胞が潜入してしまうという問題もある。
【０００９】
細胞接着力の変化する支持体として、細胞増殖表面を温度応答性ポリマーで被覆した支持体がある（特許文献３）。細胞接着力を変化させる目的には、温度応答性ポリマーを用いることが最も好ましいが、それ以外でもｐＨ応答性ポリマーや、イオン応答性ポリマーを用いることもできる。特許文献１及び２では温度応答性ポリマーをナノピラーを用いた培養に組合せることが言及されている。細胞培養において温度応答性ポリマーを用いることについては特許文献４にも言及がある。
【００１０】
特許文献３には、温度応答性ポリマー層の製造方法として、電子線照射により、モノマーの重合反応と、温度応答性ポリマーの少なくとも一端を基材を構成する分子に共有結合させて基材表面に温度応答性ポリマーを固定化する（グラフト化する）反応とを行うグラフト重合法が記載されている。しかし、特許文献４にも記載されるように、グラフト重合法により形成された温度応答性ポリマー層は電子線照射時の原材料の比率や電子線の照射条件が一定でないと温度応答性を示さないという問題があった。
【００１１】
特許文献４では、電子線照射前に基材表面に塗布する原料モノマー／溶媒混合物における溶媒残留量が低くなるよう溶媒の量を規定することが開示されている。しかしながら、特許文献４の実施例および比較例の方法では残留溶剤の量に再現性を確保するために恒温恒湿槽内における放置乾燥、窒素気流下での乾燥、真空乾燥、残存モノマーの重合に影響しない範囲内での加熱乾燥等の煩雑な工程管理が必要であった。また、特許文献４の実施例および比較例では、電子線エネルギーによる重合効率を良くする目的で被覆原料を溶解するための溶媒として沸点120℃以下のものを用いている。このような溶媒中にモノマー原料を溶解した組成物をディシュ上に被覆した場合、モノマーが結晶化しやすいという問題があった。肉眼で結晶が観察されなくても顕微鏡観察で微小結晶が存在することも確認されている。
【００１２】
本発明者らによる検討で明らかとなったことであるが、モノマー結晶が存在する塗膜に電子線を照射すると、結晶部分で重合が阻害されるため、十分な量の温度応答性ポリマーが被覆されないという問題があった。温度応答性ポリマーは放射線によるグラフト重合後、余分な遊離のポリマーを洗浄することでグラフト化されたポリマーのみを露出させ利用するが、被覆面の凹凸や洗浄時間を短くするために原料の塗布量を減らすことは、結晶化を促進させるので問題があった。
【００１３】
ところで本出願人は電子線材料による印刷塗膜技術の分野で防曇フィルムや化粧合板の多くの技術を有する。本出願人らは、電子線照射による印刷、コーティング、接着硬化に重合性オリゴマーやプレポリマーを添加した塗膜が優れた化粧塗膜特性を持っていることを見出している。（特許文献５）
【００１４】
放射線を用いて温度応答性ポリマーを基材表面にグラフト化させる場合の各種照射条件は、グラフト化されるポリマーが基材上に均一に存在するように決定される。しかしながら首尾よく基材表面上にポリマーが固定化され該ポリマーによる親疎水変化が起きても、基材を構成する材料によっては細胞シート剥離が進みにくいことがあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開２００４−１７０９３５号公報
【特許文献２】特開２００５−１６８４９４号公報
【特許文献３】特公平６−１０４０６１号公報
【特許文献４】特開平５−１９２１３０号公報
【特許文献５】特許第２８５６８６２号公報
【特許文献６】特許第３１２６６０号公報
【特許文献７】特許第３４９１９１７号公報
【特許文献８】特開平９−１２６５１号公報
【特許文献９】特開平１０−２４８５５７号公報
【特許文献１０】特開平１１−３４９６４３号公報
【特許文献１１】特開２００１−３２９１８３号公報
【特許文献１２】特開２００２−１８２７０号公報
【特許文献１３】特開平５−２４４９３８号公報
【特許文献１４】国際公開ＷＯ０１／０６８７９９号パンフレット
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】M. J. Dalby et al., Biomaterials 25 (2004) 5415-5422
【非特許文献２】C. C. Berry et al., Biomaterials 25 (2004) 5781-5788
【非特許文献３】W. D. Snyder et al., J. Am. Chem. Soc. 97, 4999（1967）
【非特許文献４】L. F. Fieser et al., “Reagents for Organic Synthesis”, Willey, New York, N.Y., 1967
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
上記の通り、細胞シートを作製するための従来の細胞培養支持体の製造方法では、基材表面に均一な温度応答性グラフトポリマー層を形成するためには、残留溶媒量の少ないモノマー／溶媒混合物を基材表面に塗布し、放射線照射を行う必要があった。しかしながら、溶媒量が少ない原料モノマー含有組成物を基材上に塗布して形成された塗膜中ではモノマーの微小結晶が形成されやすい。その結果、塗膜が、モノマー微小結晶とモノマー溶解液とからなる海島状となる。この塗膜に電子線を照射して重合反応とポリマーのグラフト化反応とを行うと、島状の結晶部分はグラフト化が進みにくいため細胞剥離機能が弱い部分となり、海状のモノマー溶解液部分はグラフト化が進みやすいため細胞剥離機能が強い部分となる。こうして得られるポリマー被覆細胞培養支持体上では、細胞が均一に接着又は増殖できないという問題があった。そして、細胞培養支持体上で細胞が均一にコンフルエントになりにくいという問題があった。そして、コンフレントな細胞を細胞シートとして得ようとしても、シートが剥離しない、シート剥離が遅い、シートが破損する、破損せず剥離してもシートに歪みができる、細胞にダメージが生ずる等問題があった。
【００１８】
また、モノマーの結晶化を避けるために、高沸点溶媒を用いて調製された原料モノマー／溶媒混合物を基材上に塗布すると、放射線効率が悪くなり、必要なグラフトポリマー量が得られないという問題があった。また原料モノマー／溶媒混合物の塗布量を増やすと長時間の洗浄が必要になるという問題に加えて、均一な乾燥や放射線照射が難しく、残留溶剤量の多い時同様に表面凹凸が発生し、培養基材としては平滑な表面が得られないという問題があった。温度変化による親疎水変化、そして細胞シート剥離という現象も、部分的に変化し難い島部分のポリマーを有するため、剥離の場所依存や全体としてのダイナミックな剥離を妨げるという問題があった。
【００１９】
また、特許文献３や４には、被覆が施される支持体の材質は通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の物質のみならず、一般に形態付与が可能である物質、例えば上記以外の高分子化合物、セラミックス、金属類など全て用いることができ、その形状はペトリディッシュに限定されることは無く、プレート、ファイバー、（多孔質）粒子、また、一般に細胞培養等に用いられる容器（フラスコ等）の形状を付与されていても構わない、と記載されている。しなしながら、実際には、汎用基材としてシャーレに用いたポリスチレン以外では、スライドガラス表面やガラス表面にシランカップリング剤処理をした基材等での研究報告・学会発表があるだけである。ガラス表面では、放射線による温度応答性グラフトポリマー表面が形成できることが解っているが、こうして形成された温度応答性グラフトポリマー表面はポリスチレンシャーレ表面のそれと比べ顕著な細胞シート剥離を示さないという問題があった。
【００２０】
本発明の予備実験でも汎用プラスチックであるポリエチレンテレフタレート基材上に形成された温度応答性グラフトポリマー表面は細胞シート剥離機能を有していないことが確認されている。また、ポリカーボネートを基材した場合においても、ポリスチレンを基材とした場合に比べ親疎水変化も細胞シート剥離も弱いものであった。
【００２１】
本発明は上記問題点を解消した細胞培養支持体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本出願は以下の発明を包含する。
（１）温度応答性ポリマー、ｐＨ応答性ポリマー及びイオン応答性ポリマーからなる群から選択される少なくとも１種のポリマーが共有結合により表面に固定化された細胞培養支持体の製造方法であって、放射線照射により重合して前記ポリマーを形成し得るモノマーと、前記モノマーが重合してなるオリゴマー又はプレポリマーと、有機溶媒とを含む組成物を、前記ポリマーと放射線照射により共有結合し得る材料を含む表面を備えた基材に塗布して、前記基材の表面上に塗膜を形成する塗布工程と、前記塗膜に放射線を照射して、重合反応及び基材表面と前記ポリマーとの結合反応を進行させる放射線照射工程と、前記塗膜を乾燥させる乾燥工程とを含む前記方法。
（２）前記ポリマーが温度応答性ポリマーである、（１）記載の方法。
（３）温度応答性ポリマーがアクリル系ポリマー又はメタクリル系ポリマーである、（２）記載の方法。
（４）アクリル系ポリマーがポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドである、（３）記載の方法。
（５）前記組成物が５×１０−３Ｐａ・ｓ〜１０Ｐａ・ｓの粘度を有する組成物である、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記オリゴマー又はプレポリマーの分子量が３，０００以上である、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記モノマーと、前記オリゴマー又はプレポリマーとの重量比が５００：１〜１：２０である、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）放射線照射工程が１回の放射線照射により行われる、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）放射線がγ線又は電子線である、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）放射線が５Ｍｒａｄ〜５０Ｍｒａｄの線量の電子線であるか、あるいは０．５Ｍｒａｄ〜５Ｍｒａｄの線量のγ線である、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）乾燥工程が放射線照射工程の前に行われる、（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）基材の形状がフィルム形状である、（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）基材が、ポリスチレン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリウレタン、アクリル系樹脂、ポリアミド、ポリカーボネート、共役結合を持つ天然ゴム、共役結合を持つ合成ゴム、及びポリシリコンを含有するシリコンゴムからなる群から選択される少なくとも１種の材料からなる、（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）基材が、表面が易接着処理されたポリエチレンテレフタレート、表面がコロナ処理またはプラズマ処理された合成樹脂、及び表面がアクリル系樹脂により被覆された合成樹脂からなる群から選択される少なくとも１種の材料からなる、（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１５）合成樹脂がナイロン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、及びポリスチレンからなる群から選択される少なくとも１種の材料である、（１４）記載の方法。
（１６）（１）〜（１５）のいずれかに記載の方法により製造された、温度応答性ポリマー、ｐＨ応答性ポリマー及びイオン応答性ポリマーからなる群から選択される少なくとも１種のポリマーが共有結合により表面に固定化された細胞培養支持体。
（１７）細胞培養支持体の表面に固定化された前記ポリマーの層の乾燥時の厚さが０．００１〜１０μｍである、（１６）記載の細胞培養支持体。
（１８）（１６）又は（１７）記載の細胞培養支持体上で細胞培養する工程を含む、細胞シートの作製方法。
（１９）（１８）記載の方法により作製された細胞シート。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係る細胞培養支持体は、放射線照射前に残留溶剤量を下げた場合でもモノマーの析出、結晶化が発生しないため、基材全面に各種ポリマーをグラフト化できる。
【００２４】
本発明に係る細胞培養支持体は、放射線照射前に残留溶剤量を下げた場合でもモノマーの析出、結晶化が発生しないため、薄膜コートが可能で、放射線照射後の洗浄時間を短縮できる。
【００２５】
本発明に係る細胞培養支持体を用いて細胞シートを作製した場合、不要なポリマーを含まないため、細胞接着、細胞増殖が早く、より短時間で基材表面全体にコンフレントな状態（隣接する細胞同士が隙間なく接着した、集合、群集した状態）またはそれに近い状態をつくれ、細胞シート剥離前の培養時間を短くできる。
【００２６】
本発明に係る細胞培養支持体を用いて細胞シートを作製した場合、部分的に培養の遅れる現象がなくコンフレント（コンフレントに近く）になるため、剥離した細胞シートに切れ目や損傷が少なく、均質な細胞シートが得られる。
【００２７】
本発明に係る細胞培養支持体がその表面に温度応答性グラフトポリマーの層を含むものである場合、温度に応じて表面の濡れ性が変化するとともに、可逆的に良好な細胞接着・剥離性を示す。
【００２８】
本発明に係る細胞培養支持体を用いて作製された細胞シートは表面の接着因子が損なわれていないため再生医療などへの利用に適する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（応答性ポリマー）
本発明は、温度応答性ポリマー、ｐＨ応答性ポリマー及びイオン応答性ポリマーからなる群から選択される少なくとも１種のポリマーが共有結合により表面に固定化（すなわちグラフト化）された細胞培養支持体の製造方法に関する。
【００３０】
応答性ポリマーとしては特に温度応答性ポリマーが好ましいがこれには限定されない。
【００３１】
本発明に好適に使用できる温度応答性ポリマーは細胞培養温度下（通常、３７℃程度）において疎水性を示し、培養した細胞シートの回収時の温度下において親水性を示すものである。なお、温度応答性ポリマーが、疎水性から親水性に変化する温度（水に対する臨界溶解温度（Ｔ））としては、特に限定されないが、培養後の細胞シートの回収の容易さの観点からは、細胞培養温度よりも低い温度であることが好ましい。このような温度応答性ポリマー成分を含むことで、細胞培養時においては、細胞の足場（細胞接着面）が充分に確保されるため細胞培養を効率よく行うことができる。その一方、培養後の細胞シートの回収時においては、疎水性部分を親水性に変化させ、培養された細胞シートを細胞培養基材から分離させることで、細胞シートの回収をより一層容易にすることができる。特に所定の臨界溶解温度未満の温度で親水性を示し、同温度以上の温度で疎水性を示す温度応答性ポリマーが好ましい。このような温度応答性ポリマーにおける臨界溶解温度を特に下限臨界溶解温度と呼ぶ。
【００３２】
本発明に好適に使用できる温度応答性ポリマーは具体的には下限臨界溶解温度Ｔが０〜８０℃、好ましくは０〜５０℃であるポリマーが好ましい。Ｔが８０℃を越えると細胞が死滅する可能性があるので好ましくない。またＴが０℃より低いと、一般に細胞増殖速度が極度に低下するか、または細胞が死滅してしまうため好ましくない。そのような好適なポリマーとしてはアクリル系ポリマー又はメタクリル系ポリマーが挙げられる。好適なポリマーは例えば特許文献３にも記載されている。具体的に適当なポリマーとしては、例えばポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド(Ｔ＝２１℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド(Ｔ＝約３５℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド(Ｔ＝約２８℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、及びポリ−Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)等が挙げられる。その他のポリマーとしては、例えばポリ−Ｎ−エチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−アクリロイルピロリジン、ポリ−Ｎ−アクリロイルピペリジン、ポリメチルビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のアルキル置換セルロース誘導体や、ポリポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドとのブロック共重合体等に代表されるポリアルキレンオキサイドブロック共重合体や、ポリアルキレンオキサイドブロック共重合体が挙げられる。
【００３３】
これらのポリマーを形成するためのモノマーとしては、例えばモノマーの単独重合体がＴ＝０〜８０℃を有するようなモノマーであって、放射線照射によって重合し得るモノマーが挙げられる。モノマーとしては例えば、(メタ)アクリルアミド化合物、Ｎ−(若しくはＮ,Ｎ−ジ)アルキル置換(メタ)アクリルアミド誘導体、環状基を有する(メタ)アクリルアミド誘導体、及びビニルエーテル誘導体等が挙げられ、これらの１種以上を使用してよい。モノマーが一種類単独で使用された場合、基材上に形成されるポリマーはホモポリマーとなり、モノマーが複数種一緒に使用された場合、基材上に形成されるポリマーはコポリマーとなるが、どちらの形態も本発明に包含される。また、増殖細胞の種類によってＴを調節する必要がある場合や、被覆物質と細胞培養支持体との相互作用を高める必要が生じた場合や、細胞支持体の親水・疎水性のバランスを調整する必要がある場合などには、上記以外の他のモノマー類を更に加えて共重合してよい。更に本発明に使用する上記ポリマーとその他のポリマーとのグラフトまたはブロック共重合体、あるいは本発明のポリマーと他のポリマーとの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質が損なわれない範囲で架橋することも可能である。
【００３４】
ｐＨ応答性ポリマーおよびイオン応答性ポリマーは作製しようとする細胞シートに適したものを適宜選択することができる。
【００３５】
（塗布用組成物）
本発明の方法には、放射線照射により重合して前記ポリマーを形成し得るモノマーと、前記モノマーが重合してなるオリゴマー又はプレポリマーと、有機溶媒とを含む塗布用組成物を用いる。この塗布用組成物はオリゴマー又はプレポリマーを含むことから、有機溶媒が少量の場合にも結晶化しにくい。このため、この塗布用組成物を基材表面に塗布し、放射線照射により重合を進行させると、基材表面の全面に亘り均一なポリマー層を形成することができる。
【００３６】
放射線重合成のモノマーについては上記の通りである。塗布用組成物にはモノマーが単独又は複数種含まれる。
【００３７】
塗布用組成物に含まれるオリゴマー又はプレポリマーの大きさはダイマー以上のものであれば特に限定されず、分子量約３，３００（典型的には２８分子ポリマー）より大きいものが好ましく、分子量５，７００以上のものがより好ましい。上限は特に限定されず、分子量１００万以上であってもよい。なお本発明において「プレポリマー」という用語は放射線照射前のポリマーを指す。
【００３８】
有機溶媒としてはモノマー、オリゴマー又はプレポリマーを溶解しうるものであれば特に限定されないが、常圧下に於いて沸点１２０℃以下、特に６０〜１１０℃のものが好ましい。好ましい溶媒としては、具体的にはメタノール、エタノール、ｎ(若しくはｉ)−プロパノール、２(若しくはｎ)−ブタノール、及び水等が挙げられ、それらの１種以上使用してよい。その他の溶媒、例えば１−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、２−ブトキシエタノール、及びエチレン(若しくはジエチレン)グリコール又はそのモノエチルエーテル、等も１種以上使用してよい。上記溶液にはその他添加剤として、硫酸等で代表される酸類、モール塩等を配合してよい。
【００３９】
使用するモノマーと、オリゴマー又はプレポリマーとの重量比は５００：1〜１：２０であることが最も好ましい。
【００４０】
塗布用組成物中のモノマーの含有量は５〜７０重量％であることが好ましい。
【００４１】
塗布用組成物中のオリゴマー又はプレポリマーの含有量は０．１〜２０重量％であることが好ましい。
【００４２】
塗布用組成物の粘度は５×１０−３Ｐａ・ｓ〜１０Ｐａ・ｓであることが好ましい。
【００４３】
（基材）
塗布用組成物が塗布される基材は、その表面が、前記応答性ポリマーと放射線照射により共有結合し得る材料を含むものである限り特に限定されない。表面のみが、前記応答性ポリマーと放射線照射により共有結合し得る材料を含むものであってもよいし、基材の全部がそのような材料を含むものであってもよい。このような基材の材料は、通常細胞培養に用いられるガラス類、プラスチック類、セラミックス、金属等が挙げられるが、細胞培養が可能な材料であれば特に限定されない。基材の表面または中間層に本発明の目的を妨げない限り任意の層を設けてもよいし、任意の処理を施してもよい。例えば、支持体表面にオゾン処理、プラズマ処理、スパッタリング等の処理技術を用いて親水化を施すことができる。
【００４４】
基材を構成する材料であって、それ自体が上記応答性ポリマーと共有結合を形成し得るものとしては、ポリスチレン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリウレタン、ウレタンアクリレート、ポリメチルメタクリレート等のアクリル系樹脂、ポリアミド(ナイロン)、ポリカーボネート、共役結合を持つ天然ゴム、共役結合を持つ合成ゴム、ポリシリコンを含有するシリコンゴム等が挙げられる。基材はこれらの材料を２種以上含むブレンドポリマー又はポリマーアロイからなるものであってもよい。
【００４５】
上記応答性ポリマーと共有結合するように表面処理された基材としては、表面が易接着処理されたポリエチレンテレフタレート、表面がコロナ処理またはプラズマ処理された合成樹脂、表面がウレタンアクリレート等のアクリル系樹脂により被覆された合成樹脂等が挙げられる。基材はこれらの材料を２種以上含むブレンドポリマー又はポリマーアロイからなるものであってもよい。合成樹脂としてはナイロン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、ポリプロピレン又はポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリスチレン等が挙げられる。合成樹脂はこれらの材料を２種以上含むブレンドポリマー又はポリマーアロイからなるものであってもよい。
【００４６】
基材の形状としては、ディッシュ形状や、フィルム形状などが挙げられる。フィルム形状基材を用いる場合、フィルム形状基材表面にグラフトポリマー層を形成した後、細胞培養に適した形状（例えばディッシュ形状）に加工することができる。加工の際は、必要に応じて他の材料からなる部材を前記基材と組み合わせて使用することもできる。ディッシュ形状基材を用いる場合、少なくとも細胞接着面となるディッシュ内底面部分がグラフトポリマー層により被覆されればよい。
【００４７】
（塗布工程）
本発明の方法は、前記塗布用組成物を、前記基材の表面に塗布してその表面上に塗膜を形成する塗布工程を含む。
【００４８】
本工程で形成される塗膜の塗布量はグラフトポリマーが機能（例えば温度応答性）を発揮する必要な塗布量である５０ｍｇ／ｍ２以上あればよい。塗布量の上限は特にないが、４０ｇ／ｍ２未満が好ましく、１０ｇ／ｍ２以下がより好ましい。塗布量が４０ｇ／ｍ２以上である場合には、厚みが増して塗膜厚が安定しないこと、厚みが増して放射線の貫通・照射量が安定しないこと、並びに照射エネルギーに由来する膜内の対流によりグラフトポリマーの被覆量にムラが生じることが本実施例中で確認されている。また、グラフトされない遊離のポリマーを洗浄するための洗浄時間を短くするためには塗膜量は１０ｇ／ｍ２以下が望ましい。
【００４９】
塗布用組成物の基材への小面積への塗布方法としては公知のいずれの方法でもよく、例えばスピンコーター、バーコーター等による塗布法、噴霧塗布法等が挙げられる。
大面積への塗布方法としてはブレードコーティング法、グラビアコーティング法、ロッドコーティング法、ナイフコーディング法、リバースロールコーティング法、オフセットグラビアコーティング法等が使用できる。
【００５０】
ベタ形成においては、グラビアコート法、ロールコート法、スロットコート法、キスコ−ト法、スプレーコート法、ファウンテンコーティング法等公知のコーティング法を用いて形成することが出来る。又、絵柄層のパターン形成においては、グラビア印刷法、スクリーン印刷法、オフセット印刷法等公知の印刷法を用いることが出来る。塗布用組成物の基材への塗布方法としては連続のコート法又は印刷法を使用することもできる。連続のコート法又は印刷法としては、具体的にはホットメルトコート、ホットラッカーコート、グラビアダイレクトコート、グラビアリバースコート、ダイコート、マイクログラビアコート、スライドコート、スリットリバースコート、カーテンコート、ナイフコート、エアコート、ロールコート等の塗布方法が使用できるが、これらは例示に過ぎず、当業者であれば暫時適用可能なものを使用することができる。
【００５１】
（放射線照射工程）
本発明の方法は、前記塗膜に放射線を照射して、重合反応及び基材表面と前記ポリマーとの結合反応（すなわちグラフト化）を進行させる放射線照射工程を含む。ここでいう結合反応（グラフト化）は、放射線照射による重合によってモノマー又はオリゴマーもしくはプレポリマーからin situで形成された遊離のポリマーが基材表面に結合する現象だけでなく、遊離のモノマーが基材表面に結合した後に当該モノマーを基点としてポリマー鎖が伸張する現象や、塗布用組成物に由来する遊離のプレポリマー又はオリゴマーが基材表面に結合する現象や、基材表面に結合したポリマー又はオリゴマーを基点としてポリマー鎖が伸張する現象などを包含する。
【００５２】
使用する放射線としては、α線、β線、γ線、電子線、紫外線等がある。所望のグラフトポリマーを作製するための合成にはγ線と電子線がエネルギー効率が良く、特に生産性の面からも電子線が好ましい。紫外線に関しては適当な重合開始剤や基材とのアンカー剤を組合せることで使用できる。
【００５３】
放射線の線量の範囲は、電子線であれば５Mｒａｄ〜５０Mｒａｄが好ましく、γ線であれば０．５Mｒａｄ〜５Mｒａｄが好ましい。
【００５４】
本発明の方法では、ある程度重合が進んだオリゴマー又はプレポリマーを含有する塗布用組成物を用いることから、１回のみの放射線照射によって、重合反応によるポリマーの形成と、基材表面とポリマーと間のグラフト化反応とを完了させることが可能である。
【００５５】
（乾燥工程）
本発明の方法は、前記塗膜を乾燥させて塗布用組成物に由来する有機溶媒を除去する乾燥工程を含む。
【００５６】
前記塗布工程で形成される塗膜は残留溶剤量の影響により結晶が形成されることがないため、乾燥前の塗膜に放射線を照射した後、乾燥を行ってもよいし、塗膜を乾燥した後に放射線を照射してもよい。ただし、乾燥前のウェットな状態の塗膜に放射線照射を行うと、環境変化や異物、塗膜厚変動等の影響を受ける可能性があることから、塗膜を乾燥した後に放射線を照射することが好ましい。
【００５７】
乾燥方法としては特に限定されないが、典型的にはドライエア乾燥法、熱風（温風）乾燥法、（遠）赤外乾燥法などが挙げられる。
【００５８】
（洗浄工程）
上述の各工程を経て形成された細胞培養支持体のポリマー層には、基材表面上に共有結合により固定化されたポリマー分子だけでなく、固定化されていない遊離のポリマー分子や、未反応のモノマー又はオリゴマー分子等が存在している。そこでこれらの遊離ポリマー或いは未反応物を除去するために洗浄を行う洗浄工程を更に含むことが好ましい。
【００５９】
洗浄方法としては特に限定されないが、典型的には浸漬洗浄、遥動洗浄、シャワー洗浄、スプレー洗浄、超音波洗浄等が挙げられる。また洗浄液としては典型的には各種水系、アルコール系、炭化水素系、塩素系、酸・アルカリ洗浄液が挙げられる。洗浄方法と洗浄液の組み合わせは洗浄される細胞培養支持体に応じて適宜選択すればよい。
【００６０】
（本発明の方法で製造された細胞培養支持体）
本発明はまた、本発明の方法により製造された細胞培養支持体に関する。本発明の細胞培養支持体は、原料モノマー／溶媒混合物を塗布用組成物として用いる従来法により製造された細胞培養支持体と比較してより均一なグラフトポリマー層を有することを特徴とする。
【００６１】
本発明の細胞培養支持体は、その表面に固定化されたグラフトポリマー層の乾燥時の厚さが０．００１〜１０μｍであることが好ましい。
【００６２】
また細胞培養支持体表面における各種応答性ポリマーの被覆量は、５〜８０μｇ／ｃｍ２であることが好ましく、６〜４０μｇ／ｃｍ２であることがより好ましい。ポリマー被覆量が８０μｇ／ｃｍ２を超過すると細胞は細胞培養支持体表面上に付着せず、逆に被覆量が５μｇ／ｃｍ２未満だと細胞は単層の状態で培養され組織状とならず、また培養細胞を支持体から剥離回収するのも困難となる。このようなポリマー被覆量は、例えばフーリエ変換赤外分光計全反射法（ＦＴ−ＩＲ−ＡＴＲ法）、被覆部若しくは非被覆部の染色や蛍光物質の染色による分析、更に接触角測定等による表面分析を単独或は併用して求めることが出来る。
【００６３】
（細胞培養シートの作成方法）
本発明の細胞培養支持体を用いて、種々の細胞、例えば生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン、グリア細胞、繊維芽細胞、生体の代謝に関係する肝実質細胞、非肝実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、種々組織に存在する幹細胞、さらには骨髄細胞、ＥＳ細胞等から細胞シートを作製することができる。こうして作製された細胞シートは表面の接着因子が損なわれていないことに加えて、細胞培養面に接した部分が均一な品質を有することから、再生医療などへの利用に適したものである。また、細胞シートを利用することでバイオセンサー等の検出デバイスへの応用へも展開できる。
【実施例】
【００６４】
各種分子量のポリイソプロピルアクリルアミドの調整
以下の分子量のポリイソプロピルアクリルアミドは市販のものを購入した。
【００６５】
【表１】
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【００６６】
レドックス合成ポリイソプロピルアクリルアミドの調整
500ｍＬセパラブルフラスコの中にＮ-イソプロピルアクリルアミド17.8ｇと純水150ｍＬを投入し、攪拌下、溶解・分散した。窒素ガス気流下、室温で過硫酸アンモニューム0.24ｇ、N,N,N',N',-テトラメチルエチレンジアミン0.30ｍＬを加えて重合を開始させた。重合終了後、加温してゲルを取り出し、100℃の電気乾燥器中で乾燥した。乾燥したゲルを粉砕して、ＮＭＰ溶媒でＧＰＣ分析したところ、市販の1、2および4比較で分子量約35〜40万であった。
【００６７】
連鎖移動剤使用のポリイソプロピルアクリルアミド合成
ｎ-ブチルメルカプタンを連鎖移動剤とした低分子量のポリイソプロピルアクリルアミドおよびイソプロピルアクリルアミドオリゴマーは非特許文献３のトレースによって合成した。ポリマー合成：１Ｌセパラブルフラスコの中にＮ-イソプロピルアクリルアミド11.3ｇとベンゼン300ｍＬを投入し、攪拌下、溶解・分散した。窒素ガス気流下、(a)4.31mLのｎ-ブチルメルカプタンおよび(b)40mLの0.1Mｎ-ブチルメルカプタンベンゼン溶液を加えたものを各々作製し、総量が400ｍＬになるように1.2gの過酸化ベンゾイルをベンゼンで溶かしたものを加え重合開始した。反応終了後、冷水抽出したものをファルマシア社のセファデックスＧ−２５ゲルでろ過し、ｎ-ブチルメルカプタンを除去、ポリマー分画のみを凍結乾燥して合成ポリマーを得た。脱硫は非特許文献４にも記載のあるレニーニッケル触媒を用いて行った。（ａ）条件から得たポリマーを５分子（分子量650）、（ｂ）条件から得たポリマーを28分子（分子量3300）として以下の実験を実施した。
【００６８】
細胞培養支持体の作製
（試験１）
実施例１〜８として、ＢＤ社１００８ペトリディッシュに表１の市販ポリイソプロピルアクリルアミド１〜５（実施例１〜５）、レドックス合成ポリイソプロピルアクリルアミド（実施例６）、連鎖移動剤使用の合成ポリイソプロピルアクリルアミド（ａ）（実施例７）、あるいは同（ｂ）（実施例８）がそれぞれ１ｗｔ％、イソプロピルアクリルアミドモノマーが40ｗｔ％になるようイソプロピルアルコールに溶解した液を室温２５℃、湿度60％で０．１ｍＬづつ添加した。比較例１として実施例のポリマーを含まない40ｗｔ％イソプロピルアクリルアミドモノマーのイソプロピルアルコール溶液を同様に添加したディッシュを作製した。この溶液を一時間放置したところ、表２に示すように比較例１では結晶が析出し、実施例１〜６および８では結晶は析出しなかった。実施例7では結晶が析出する場合としない場合があり、顕微鏡で観察すると微小な結晶が観察された。次にこの溶液の添加量を0.03ｍＬとし、デッシュを水平に静置して添加すると５秒以内にディッシュ底面は溶液で被覆されるが、１０分経過で比較例１では表２のように結晶が析出した。実施例１〜６および８では同様に結晶は析出しなかった。実施例7でも同様に結晶が析出する場合としない場合があり、顕微鏡で観察すると微小な結晶が観察された。
【００６９】
【表２】
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【００７０】
（試験２）
次に実施例１〜６について同様の溶液を作製し、130μｍ厚の二軸延伸ポリスチレンシート（ＯＰＳ／防曇品として普及しているため、事前にエタノールで防曇剤は除去・乾燥した）にワイヤーバー４番手で約５ｇ／ｍ２の塗工厚で塗工し、ドライヤー乾燥および40℃、1×10２Ｐａ、１分の減圧乾燥で乾燥面質を確認した。ドライヤー乾燥においては表３のように実施例１〜６の全ての塗工膜の面質は透明平滑で微結晶も析出しなかった。比較例１は結晶白化して一部平滑性も壊れていた。40℃、1×10２Ｐａ、１分の減圧乾燥においては、実施例１〜６の全てで塗工膜の面質は透明平滑であったが、実施例１のみ微結晶を観察した。比較例１では結晶白化してシートからほとんど浮いた状態であった。 実施例１のポリマー量を0.5％に下げた場合および２％、５％に上げた場合、微結晶の析出頻度はポリマー添加量に反比例した。
【００７１】
【表３】
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【００７２】
（試験３）
次に実施例１〜８および比較例１の溶液0.1ｍＬおよび0.03ｍＬをペトリディッシュに被覆したものに電子線を２回に分けて照射した。照射量を初回５Ｍｒａｄ、２回目２５Ｍｒａｄとした。電子線照射後、５℃のイオン交換水を用いて、ペトリディッシュを洗浄し、残留モノマーおよびペトリディッシュ表面に結合していないポリマーを取り除いた。クリーンベンチ内で乾燥させ、さらにエチレンオキサイド（ＥＯ）ガス滅菌を行い、さらに十分に脱気を行うことにより、最終的な製品である細胞培養支持体を得た。このものの被覆面の平滑性を光学顕微鏡下で表面に凹凸の有無を調べることにより検討した。結果を表４に示す。ウシ大動脈血管内皮細胞の培養は、得られた細胞培養支持体材料上にて、ウシ胎児血清(ＦＣＳ)を１０％含むダルベッコー改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)を培養として、５％二酸化炭素中、３７℃で行なった。十分に細胞が増殖したのを確認した後、培養液を支持体ごと２０℃、５％ＣＯ２下のチャンバー内に移し、３０分間放置して、付着／増殖細胞を剥離させ、増殖細胞剥離回収率を下式に従って求めた。結果を表４に示す。
増殖細胞剥離回収率(％)＝１００×剥離回収した細胞総数／増殖させた細胞総数  
その際、剥離回収した細胞総数および、増殖させた細胞総数を計測するためには、細胞を個々の状態にしなければならない。従って、剥離回収した細胞総数の測定は、２０℃に冷却、放置した後、回収した細胞塊に対し、トリプシン−ＥＤＴＡ処理を行ない細胞を個々の状態にして行なった。また増殖させた細胞総数は、上記方法で剥離回収した細胞総数に、２０℃に冷却、放置しても剥離しなかった細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ処理にて、個々の状態に剥離させた細胞総数を加え合わせることにより求めた。また、３７℃のチャンバー内で５日間培養し、ディッシュ周囲以外全体がコンフレントになった細胞シート状塊についても、メスでディッシュ周囲のサブコンフレント状態の細胞層に切れ目を入れて、培養液を支持体ごと２０℃、５％ＣＯ２下のチャンバー内に移し、細胞シートの剥離を観察した。
【００７３】
【表４】
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【００７４】
（試験４）
延伸ポリエチレンＯＰＳ上に実施例１〜６および比較例１と同様に作製した溶液をワイヤーバー塗工し、ドライヤー乾燥した塗工面に電子線を照射したものをペトリディッシュに被覆したもの同様に洗浄・乾燥し、ペトリディッシュ底面に両面テープで貼付した後、引き続き同様にＥＯＧ滅菌をして細胞培養支持体を得た。
【００７５】
電子線照射量は１５Ｍｒａｄおよび２５Ｍｒａｄの２通りで１回照射のみで行った。比較例１のペトリディシュに０．１ｍｌおよび０．０３ｍＬ被覆したものでも上記の照射量の１回照射を行い比較した。ＯＰＳに塗工した実施例１〜６は電子線照射量は１５Ｍｒａｄ、２５Ｍｒａｄともに塗工面は透明なままであったが、２５Ｍｒａｄの照射では熱によるシートの歪み・収縮が観察された。３０Ｍｒａｄでは両面テープの貼付に支障がある歪が観察された。細胞培養した細胞の回収率と細胞シート剥離は表５のようになった。結晶白化した比較例１からはどちらの照射量でも細胞も細胞シートも全く剥離しなかった。ディッシュに被覆してウェットな状態で照射したものでは、ディッシュの肉眼レベルの変形はどちらの照射量でも観察されなかったが、０．１ｍＬの被覆量ではどちらの照射量でも細胞が回収されたが、回収率が低く、細胞シートとしては剥離されなかった。０．０３ｍＬの被覆量ではどちらの照射量でも微結晶が析出し、細胞は回収されず、細胞シートも剥離しなかった。実施例１〜６については実施例１が細胞シート剥離に関して時間がかかったが、他は全て良好であった。
【００７６】
【表５】
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【００７７】
（試験５）
実施例２および６について、ポリマー含有量を０．５ｗｔ％、２ｗｔ％、５ｗｔ％にして４０ｗｔ％のモノマーを含むイソプロピルアルコール組成物を各１Ｋｇ調整し、粘着剤が塗工されて剥離フィルムで保護された易接着ＰＥＴのロール形状の連続ベースフィルムにグラビアダイレクトロールのベタ48線で９ｍｇ／ｍ２の塗工量を毎分５ｍ塗工し、連続の１ｍ、４５℃の熱風乾燥機で乾燥し、連続の電子線照射ユニットで酸素濃度50ppm以下の環境で電子線照射した。電子線の電子流量を変化させて照射量を１０、１２、１６、２０、２４Ｍｒａｄにした。各条件で作製した塗工フィルムを洗浄・乾燥し、ディッシュサイズに切り抜いたものを粘着剤でディッシュに固定してＥＯＧ滅菌して細胞培養支持体を得た。
【００７８】
各組成物で作製した細胞培養支持体は全て平滑透明な表面で細胞回収、細胞シート剥離は表５に示すように全てで良好であった。ポリマー含有量２ｗｔ％の組成物に関しては２００ｍの塗工を行い、４０分の塗工の最後で出来た塗工フィルムからも細胞培養支持体を作製したが、塗工初期のフィルムからの細胞培養支持体との細胞回収、細胞シート剥離性能に差異はなく、良好であった。
【００７９】
（試験６）
実施例９として上記実施例２の連続塗工・乾燥・電子線照射工程の連続塗工フィルム作製時に電子線を照射しない状態のサンプルを作製した。このフィルムにコバルト60からのγ線を室温、１．５Ｍｒａｄを２時間で照射した。これを上記同様に洗浄・乾燥して、切り抜き・貼付したディッシュをＥＯＧ滅菌して細胞培養支持体を得た。作製した細胞培養支持体は全て平滑透明な表面で細胞回収、細胞シート剥離は良好であった。
【００８０】
（試験７）
実施例１０〜１６として表６のベースフィルム上に実施例２の組成物をワイヤーバー（番手４）コートし、ドライヤー乾燥後、塗工面に電子線を照射したものをペトリディッシュに被覆したもの同様に洗浄・乾燥した。電子線照射量は１０Ｍｒａｄ、１５Ｍｒａｄおよび２５Ｍｒａｄの３通りで１回照射のみで行った。ポリスチレンフィルムは２５Ｍｒａｄの照射で基材が70℃になり、実施例１〜６の時同様、多少の歪を生じた。ＰＥＴとポリイミドも基材が70℃になったが、基材の耐熱性があり、歪は見られなかった。ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレンは基材温度が上がらず、歪は見られなかった。洗浄・乾燥したフィルムを円形に切り、塗工裏面とペトリディッシュの底を両面テープで貼り合せた。これをＥＯＧ滅菌をして細胞培養支持体を得た。実施例１２の自調製フィルムは、実施例１１のフィルムに表７の組成物をワイヤーバー（番手４）コートし、高圧水銀灯を用いて、１７０ｍＪ／ｃｍ2（３６５ｎｍ）の条件で紫外線照射してコート面を硬化させた。この硬化コート面を他フィルムと同様に用いた。比較例２のポリスチレンフィルムは、事前にエタノールで防曇剤を除去・乾燥して用いた。
【００８１】
【表６】
0005752164.tif 000007
【００８２】
【表７】
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【００８３】
実施例１〜８と同様の方法で細胞の回収率の測定と細胞シート剥離の観察を行った。結果は、以下の表８の通りでポリイミドでは細胞の回収も細胞シート剥離も見られず、ポリエステルではポリスチレンのそれより回収率、細胞シート剥離ともに機能性支持体として弱いものであった。易接着ＰＥＴ、ウレタンアクリレート、ナイロン、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）に関してはポリスチレンより低放射線量で作製した支持体から機能を示した。
【００８４】
【表８】
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