(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示される配列からなるポリペプチドを含有する、エンテロコッカス・フェシウムによる細菌感染症を治療又は予防するオプソニン抗体及び／又は防御抗体誘導用薬剤。
【請求項２】
ポリペプチドが免疫担体、又はタンパク質、炭水化物及び／若しくは糖複合体と共有結合した、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
薬学的に許容可能なアジュバントを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の薬剤。
【請求項４】
ワクチンであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項５】
請求項１に記載の薬剤の調製のための、配列番号１に示される配列からなるポリペプチドの使用。
【請求項６】
ポリペプチドが免疫担体と共有結合した、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
エンテロコッカス・フェシウムによる細菌感染症を治療又は予防するオプソニン抗体及び／又は防御抗体の調製のための、配列番号１に示される配列からなるポリペプチドの使用。
【請求項８】
ポリペプチドが免疫担体と共有結合した、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
配列番号１に示される配列からなるポリペプチド、又は免疫担体と共有結合的に連結した前記ポリペプチドと特異的に反応するポリクローナル抗体である、オプソニン抗体及び／又は防御抗体。
【請求項１０】
配列番号１に示される配列からなるポリペプチド、又は免疫担体と共有結合的に連結した前記ポリペプチドと特異的に反応するモノクローナル抗体である、オプソニン抗体及び／又は防御抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸球菌由来のポリペプチド、及びワクチン接種のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸球菌（Enterococci：エンテロコッカス）は最も一般的な３種類の院内病原体の中に含まれており、その多数の抗生物質に対する耐性により、特に集中治療患者及び免疫不全患者において、相当な罹患率及び死亡率を引き起こす。ここ１０年で複数の新たな抗生物質が導入されたが、これらの新たな薬物に対する耐性が生じ、急速に拡散している。耐性株により引き起こされる心内膜炎等の生命を脅かす全身性疾患は、時として治療不可能な場合がある。したがって、病院及び養護施設における多剤耐性クローンの発生に対抗するための代替的な治療及び予防の戦略が、世界中で切に必要とされている。種々の腸球菌の細胞表面構造をより十分に理解することが、新たな治療上の、及び予防上のアプローチを標的とするのに役立つであろう。
【０００３】
全てのグラム陽性細菌（また、エンテロコッカス属に属するもの）が、細胞壁中に複数の特定の炭水化物及びタンパク質を含有することが知られている。本発明の過程において、細胞外壁の主要成分（すなわちペプチドグリカン）の動的平衡において役割を果たし得る１種類のタンパク質が同定された。このファミリーに属するタンパク質は、成長及び細胞分裂時に、細菌のペプチドグリカンを分解する細胞壁ペプチダーゼとして作用することができる。驚くべきことに、細菌細胞の外表面上に位置し得るポリペプチドをワクチンの製造のために使用することができることが見出された。これは上記ポリペプチドの部分に指向性を有する防御抗体が同定されたためである。
【０００４】
液性免疫応答は、血漿細胞により分泌される抗体分子により媒介される。Ｂ細胞抗原受容体と結合する抗原はＢ細胞にシグナルを伝達し、同時に内部移行し、結合した（armed）ヘルパーＴ細胞を活性化するペプチドへとプロセシングされる。結合した抗原由来の、及びヘルパーＴ細胞由来のシグナルは、Ｂ細胞が、増殖し、特異的な抗体を分泌する血漿細胞に分化するように誘導する。これらの抗体は、３つの主な様式で感染症から宿主を防御する。第１に、上記抗体は、病原体と結合することにより該病原体の毒性効果又は感染性を阻害することができる。かかる抗体は中和抗体と称される。第２に、病原体を被覆することにより、上記抗体は、複数の（arrays of）抗体のＦｃ部分を認識するアクセサリー細胞が病原体を摂取及び殺傷することを可能とすることができる。このプロセスはオプソニン化と称される。第３に、抗体は、補体系の活性化を誘起することができる。補体タンパク質は、オプソニン化を強く増強することができ、又は或る特定の細菌細胞を直接殺傷することができる。
【０００５】
ワクチンの製造のためには、抗原が、病原微生物の病原活性を阻害する抗体を誘発することが重要である。したがって、ワクチンにより誘発される防御抗体は中和、オプソニン化及び補体活性化の効果を有し、特定の抗原により誘導される抗体は該防御活性のうち２つ又はさらには３つを有する場合もある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、ポリペプチド又はその一部分であって、上記ポリペプチド又は上記ポリペプチドの一部分に対する防御抗体、好ましくはＩｇＧ抗体を産生するのに使用することができる、ポリペプチド又はその一部分を提供することが、本発明の目的の１つである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって本発明は、以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する：
MKKSLISAVMVCSMTLTAVASPIAAAADDFDSQIQQQDQKIADLKNQQADAQSQIDALESQVSEINTQAQDLLAKQDTLRQESAQLVKDIADLQERIEKREDTIQKQAREAQVSNTSSNYIDAVLNADSLADAIGRVQAMTTMVKANNDLMEQQKQDKKAVEDKKAENDAKLKELAENQAALESQKGDLLSKQADLNVLKTSLAAEQATAEDKKADLNRQKAEAEAEQARIREQQRLAEQARQQAAQEKAEKEAREQAEAEAQATQASSTAQSSATEESSATQSSMTEESSSATQSSATEESTTPESSTEESTAPESSATEESTTAPESSATEESTTVPESSATEESTTVPESSTTEESTTPAPTTPSTDQSVDTGNGTGSSTPAPTPTPTPEQPKPVTPAPAPSGSVNGAAIVAEAYKYIGTPYVWGGKDPSGFDCSGFTRYVYMQVTGRDIGGWTVPQESAGTKISVSQAKAGDLLFWGSQGGTYHVAIALGGGQYIHAPQPGESVKVGSVQWFAPDFAVSM（配列番号１）
【０００８】
Fang Teng et al.は（Fang Teng et al. AnEnterococcus faecium Secreted Antigen, SagA, Exhibits Broad-Spectrum Binding toExtracellular Matrix Proteins and Appears Essential for E. faecium Growth,Infection and Immunity, September 2003, p. 5033-5041, Vol. 71, No. 9において）、成長に必須であるようであり、ＥＣＭタンパク質への広域スペクトルの結合を示し、オリゴマーを形成し、感染時に抗原性を有する、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）の細胞外の分泌性ＳａｇＡタンパク質を開示している。さらに、組換えＳａｇＡに対して産生される抗体が記載されている。該タンパク質は分泌性抗原として記載されているが、宿主におけるオプソニン抗体及び／又は防御抗体の形成に関してはもちろん、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳａｇＡの実際の抗原性に関する開示も存在しない。この刊行物には、細胞壁ヒドロラーゼ活性を有し、病原性に関与することも示されているリステリア・モノサイトゲネス（L. monocytogenes）のＰ６０（５２％の類似性）を含む、「様々なタンパク質中に見出されるものと類似性を有する」ＳａｇＡのＣ末端ドメインしか記載されていない。したがってこの刊行物は、ＳａｇＡの機能的特徴付けに限定されている。
【０００９】
さらに、表面露出型タンパク質の存在が、宿主におけるオプソニン抗体及び／又は防御抗体の形成を自動的にもたらす訳ではない。実際に本発明者らの知る限りでは、今までのところエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）においては、２種類のタンパク質抗原のみが防御抗体の標的として確認されている：Burnie及びその同僚により記載されたＡＢＣトランスポーター（Burnie etal. Identification of ABC transporters in vancomycin-resistant Enterococcusfaecium as potential targets for antibody therapy. FEMS Immunol Med Microbiol(2002) vol. 33 (3) pp. 179-89）、並びに最近になってコラーゲンアドヘシンＡＣＥ（Singhet al. Importance of the collagen adhesin ace in pathogenesis and protectionagainst Enterococcus faecalis experimental endocarditis. PLoS Pathog (2010)vol. 6(1) pp. e1000716）。２種類の他の表面タンパク質、すなわち腸球菌の凝集物質（McCormicket al. Antibodies to a surface-exposed, N-terminal domain of aggregationsubstance are not protective in the rabbit model of Enterococcus faecalisinfective endocarditis. Infect Immun (2001) vol. 69 (5) pp. 3305-14）、及び腸球菌の表面タンパク質Ｅｓｐ（Sava et al.、投稿中）が、防御性でないことが示されている。病原性に関与するものとして、複数の他のタンパク質抗原に関する研究が文献中で報告されているが、受動免疫又は能動免疫の防御効果は実証されていない。したがって現在まで、エンテロコッカス・フェシウムにおいてはワクチン標的（タンパク質性又は炭水化物の）は同定されていない。したがって本発明は、配列番号１のポリペプチドを使用してかかるワクチン標的を提供することができるという驚くべき発見に基づくものである。
【００１０】
当業者は、ワクチンの製造のために必ずしもポリペプチド全体を使用しなければならない訳ではないことを知っている。ポリペプチドのさらに短い断片を使用することができる。かかる断片は、通常配列番号１のうち少なくとも６個の連続する（contiguous）アミノ酸からなるエピトープを含む。しかしながら、好ましくは、上記ポリペプチドは、配列番号１の少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１５個、より好ましくは少なくとも２０個の連続するアミノ酸を有する。
【００１１】
特に好ましい１つの実施の形態では、ポリペプチドは、配列番号１の少なくとも３０個、より好ましくは少なくとも５０個、特に好ましくは少なくとも１００個の連続するアミノ酸を有する。
【００１２】
当業者は、好適なコンピュータプログラムによりポリペプチドの領域の疎水性及び親水性を決定することができることを認識している。したがって、ワクチンの調製のためにはポリペプチドの一部分が、フォールディングしたポリペプチドの外側の領域上に位置するのが好ましいため、好ましい断片は主に親水性を有する。
【００１３】
さらに、より長いポリペプチド部分を使用する場合、直線状エピトープが断片内に存在するだけでなく、ポリタンパク質（polyprotein）の３次元フォールディングの過程において生じる立体構造エピトープも存在する可能性がより高い。
【００１４】
好ましい１つの実施の形態では、配列番号１のポリペプチド又はその断片を、抗原が免疫担体（immunocarrier）と共有結合した複合体として使用する。かかる免疫担体は、抗原に対する免疫応答の誘導に関するＴ細胞とＢ細胞との間の相互作用を改善するポリペプチド、又はタンパク質、又は炭水化物を含有する分子（例えば、莢膜多糖類又は糖複合体等）であり得る。これは、免疫系の活性が低減した患者における使用を意図したワクチンにとって好ましい場合がある。腸球菌の感染は多くの場合病院及び養護施設における問題であるため、かかる複合体は、かかる患者にとって特に好ましい。本発明による好適な免疫担体は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）毒素Ａ、又はその誘導体を含む。
【００１５】
炭水化物（Carbodydrate）を含有する分子、例えば莢膜多糖類又はタイコ酸も、上で言及したポリペプチド又はその断片に対する複合体形成パートナーとして働く場合がある。特に好ましい１つの実施の形態では、免疫応答を刺激する免疫担体のかかる断片を治療対象の患者において使用するが、非改変形態で使用した場合にかかるタンパク質が誘発し得る望ましくない副作用はもたらされない。
【００１６】
抗原と免疫担体との共有結合を、直接的な化学結合により、又はスペーサーを介してもたらすことができる。共有結合的に連結した分子を生成するために、両方の末端上に２つの反応性基を有する短い分子を抗原及び免疫担体と反応させることもある。
【００１７】
代替的には、ワクチンとして使用する分子（抗原及び免疫担体）を、好適な遺伝子断片を共に連結し、適当なベクター中に挿入する組換えにより生成することができる。ベクターを好適な宿主細胞に導入し、該宿主細胞（例えば大腸菌、桿菌、酵母又は昆虫細胞）により、上で規定したようなポリペプチド又はその断片が免疫担体と共に１つの分子として産生される。
【００１８】
単独の又は免疫担体と結合したポリペプチド又はその断片を、細菌感染症を治療又は予防するために使用することができる。したがって本発明の別の態様は、本明細書で記載されるような薬剤に基づいて細菌感染症、特に腸球菌、より好ましくはエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）の細菌感染症を治療又は予防する方法である。好ましくは上記薬剤は、好ましくは薬学的に許容可能なアジュバントも含むワクチンである。アジュバントは、防御性ＩｇＧサブタイプ抗体を促進する。代表的なアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、アラム（alum）、及びヒトでの使用に好適な他のアジュバント（例えばウイルス様粒子）が挙げられる。デキストラン硫酸等の高分子が細菌細胞表面抗原に対するＩｇＧ抗体の強力な刺激因子であることも示されている。
【００１９】
活性なワクチンを、好ましくは感染が起こる前に患者に対して投与する。したがって、かかるワクチン接種を、リスクを有する患者（例えば高齢者、実質臓器又は骨髄の移植前の患者）に対して、該患者の免疫応答を刺激し、病院又は養護施設における感染を回避するために定期的に適用することができる。
【００２０】
しかしながら特定の状況下では、エンテロコッカス属に属する細菌を不活性化する防御抗体を誘発するために、感染症の初期段階でワクチンを適用することができる可能性もある。好ましい１つの実施の形態では、本発明のワクチンは、種々のエンテロコッカス・フェシウムに対する、及びまた可能性としてエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）株に対する防御をもたらすが、これはこれらの種の間には広範な配列相同性が存在するためである。
【００２１】
配列番号１のタンパク質により誘導される抗体又はその好適な断片は、防御性であり、食作用を容易にする。かかる防御抗体、特にオプソニン抗体が好ましいため、オプソニン特性を有する抗体を誘発する配列番号１のポリペプチドのこれらの部分を使用することが望ましい。
【００２２】
ワクチンとして使用される薬剤の薬学的配合物は当業者に既知であり、各文献に記載されている。通常、免疫担体と結合している場合がある抗原の溶液を、緩衝液等の生理学的に許容可能な溶液に溶解する。免疫学的に活性な化合物の望ましくない沈殿を回避するために、溶液を安定化しなければならない。好ましくはワクチンを、注射、好ましくは筋肉内注射に適した溶液の形態で製造する。抗原が免疫系と十分に接触し、特異的な抗体の形成が誘発されるならば、薬学的配合物の他の形態、例えば硬膏剤又は噴霧剤も許容可能である。
【００２３】
一方、免疫系が激しく損なわれているため、活性なワクチンにより患者を治療することが不可能なこともある。これらの状況においては、上で規定したような配列番号１のポリペプチド又はその断片を使用して、腸球菌と結合する、又はこれをオプソニン化するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を産生することができる。当業者は、どのようにすればかかる抗体を調製することができるかを十分に認識している。
【００２４】
ポリクローナル抗体産生のための接種材料は通常、生理食塩水等の生理学的に耐容性を有する希釈剤中に抗原又は抗原−免疫担体複合体を分散させて、水性組成物を形成させることにより調製する。免疫賦活量の接種材料を好ましくはアジュバントと共に哺乳動物に対して投与し、その後、抗原が防御性抗腸球菌抗体を誘導するのに十分な期間、接種された哺乳動物を維持する。好適な期間（２週間〜４ヶ月）の後、追加免疫用の用量の抗原−免疫担体を適用することができ、抗原力価をモニタリングする。好適な時点で、中和抗体又はオプソニン抗体の力価がそのピークである時に、抗体を収集する。かかる抗体は、一般的に使用される様々な動物（例えばマウス、ヤギ、霊長類、ロバ、ウサギ又はウマ）、及びヒト（献血血液から抗体が単離される）由来の抗体調製物を含み得る。
【００２５】
哺乳動物中で誘導された抗体を、回収し、単離し、既知の技法により、例えばアルコール分画及びカラムクロマトグラフィにより、又は好ましくは免疫親和性クロマトグラフィ（抗原がクロマトグラフィカラムと結合している）により所望の程度まで精製する。抗血清を特異的な抗体が保持されているカラムに通し、血清の他の成分を全て洗い流す。その後、精製された抗体を好適なグラジエントにより溶出させる。さらなる精製が必要となる場合がある。
【００２６】
代替的に、モノクローナル抗体を、当業者に既知の技法により調製することができる。好適なモノクローナル抗体が得られる場合、結合領域を同定することができ、抗体分子全体、及び該抗体の誘導体、例えば抗体断片又は小断片を提供することができる。モノクローナル抗体を産生する一般的な技法は、教科書に十分に記載されている。ライブラリ又は遺伝子操作により作製した動物からハイブリドーマを作製した後、又はモノクローナル抗体を選択した後、このモノクローナル抗体が配列番号１のポリペプチドのどの部分と結合するかを決定しなければならない。その後、この抗体がオプソニン抗体及び／又は防御抗体であるかどうかを、好ましくはｉｎ  ｖｉｖｏで調べなければならない。
【００２７】
抗体という用語は、組換え抗体、例えば組換えヒト抗体及び組換えヒト化抗体、並びに（組換え）抗体断片、例えばｓｃＦｖ断片をさらに含む。
【００２８】
ここで本発明を、以下の実施例において添付の図面及び配列リストを参照してさらに記載するが、本発明はこれらに限定されない。本発明のために、本明細書に引用された全ての参考文献は、その全体が参照により援用される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】エンテロコッカス・フェシウムＥ１５５株に対してウサギにおいて産生されたポリクローナル抗血清のオプソニン殺傷（opsonic killing）を示す図である。種々の血清希釈物を試験し、高い希釈率でも、産生された抗体のオプソニン活性を相当程度観察することができた。
【図２】相同株由来のタンパク質と反応させたエンテロコッカス・フェシウムＥ１５５株に対する抗体のウエスタンブロットを示す図である。レーン１は分子量マーカーである。レーン２にはエンテロコッカス・フェシウムＥ１５５細胞の溶解物を適用した。レーン３にはエンテロコッカス・フェシウムＥ１５５培養物の上清を適用した。
【図３】組換えにより発現させ精製した配列番号１を有するポリペプチドによるウエスタンブロットを示す図である。精製したポリペプチドは、元はエンテロコッカス・フェシウムＥ１５５株に由来するものである。適当なプライマーを使用して、遺伝子をＰＣＲにより増幅させ、グラム陰性細菌に対する発現ベクター中にクローニングした。宿主細胞により産生されたタンパク質を、Ｈｉｓタグを用いてＮｉカラムにより精製した。精製したタンパク質を、ウサギにおけるポリクローナル抗体の産生のために使用した。抗体を、図３に示したようにウエスタンブロットに使用し、オプソニン活性に関して試験した。特異性又はオプソニン抗体が、精製したタンパク質による吸収により確認された。
【図４】精製した配列番号１を有するポリペプチドを用いて、並びにそれとの比較として熱失活させた細菌に対して産生された血清（αＥ１５５）及び正常ウサギ血清（ＮＳＡ）を用いて行ったＥＬＩＳＡ試験の結果を示す図である。
【図５】配列番号１を有するポリペプチドにより得られたオプソニン作用の（opsonophagocytic）阻害の結果を示す図である。
【図６】配列番号１を有するポリペプチドに対する抗体の防御の有効性を、エンテロコッカス・フェシウムＥ１５５によるマウスの菌血症で示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
配列番号１は、エンテロコッカス・フェシウムＥ１５５株由来の本発明によるポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【実施例】
【００３１】
実施例１：
エンテロコッカス・フェシウム中におけるオプソニン抗体の標的を同定する試みにおいて、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の院内発生と関連するクローン複合体（clonal complex）１７（ＣＣ１７）（Top, J. et al.,(2008). Emergence of CC17 Enterococcus faecium: from commensal tohospital-adapted pathogen. FEMS Immunol Med Microbiol 52:2997-308）に属する熱殺傷したエンテロコッカス・フェシウムＥ１５５株（Leavis, H.L. et al. (2007). Insertion sequence-drivendiversification creates a globally dispersed emerging multiresistant subspeciesof E.faecium. PLoS Pathog 3:e7）により、ウサギを免疫した。細菌を６５℃で１時間熱殺傷し、１用量当たり１．４×１０１２ｃｆｕの最終濃度のものを、１週間に３回、計３週間静脈内注射した。得られた血清は、相同株に対してオプソニン性を有していた（血清希釈率１：１００で殺傷率７７.８％）。結果を図１に示す。
【００３２】
実施例２：
ウエスタンブロット分析により、細胞抽出物中に存在し、培養上清中においてさらにより明白である約５４ｋＤａの明確なタンパク質バンドが示された（結果を図２に示す）。
【００３３】
実施例３：
試験した５種類全てのエンテロコッカス・フェシウム株が、ウサギ免疫血清により検出されたものと同じサイズのタンパク質バンドを発現した（データは示していない）。クマシーブルー染色したゲルバンドのナノＬＣ−ＥＳ−ＭＳ／ＭＳ分析により、ＮＣＢＩ及びＭＡＳＣＯＴデータベースと比較される配列データが得られた。相同性の最高値（スコア１２５３）が、エンテロコッカス・フェシウムＤＯ（アクセッション番号Ｇｉ│６９２４５４３６）由来の５５ｋＤａのタンパク質であるＮＬＰ／Ｐ６０（Anantharaman, V. et al. (2003). Evolutionary history, structuralfeatures and biochemical diversity of the NIpC/P60 superfamily of enzymes.Genome Biol 4:R11）により得られた。
【００３４】
引き続き、エンテロコッカス・フェシウムＥ１５５由来の遺伝子をＰＣＲにより増幅させ、ｈｉｓタグ発現ベクター（Ｃｈａｍｐｉｏｎ  ｐＥＴ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ、Invitrogen）中にクローニングした。発現されたタンパク質を変性条件下でニッケルカラムで精製し、精製したタンパク質が、エンテロコッカス・フェシウムＥ１５５の全細胞に対して産生されたウサギ血清との反応性を有することが示された（結果を図３に示す）。
【００３５】
実施例４：
ウサギを、精製したタンパク質により免疫した（不完全フロイント（Freud's）アジュバントと混合して皮下に（ＳＣ）２回（１０μｇ）、及び２週間空けて第３週目にアジュバントを用いず静脈内に３回（５μｇ））。最後の注射の２週間後、力価をＥＬＩＳＡにより（図４を参照されたい）、及びオプソニン作用アッセイにより（図５を参照されたい）調べた。
【００３６】
実施例５：
特異性を確認するためにオプソニン作用阻害アッセイを行い、１００μｇの精製したタンパク質が殺傷をほぼ１００％阻害することができるが、より低い量では用量依存的に殺傷が阻害されることを示した（図５を参照されたい）。オプソニン作用アッセイを他で記載された（Theilacker, C. et al. Opsonic antibodies to Enterococcus faecalisstrain 12030 are directed against lipoteichoic acid. Infect Immun (2006) 74:5703-12）ように行った。簡潔に述べると、乳児ウサギ血清（希釈率１：１５）、ヒトＰＭＮ、及び適当な血清希釈物を、対数期まで成長した細菌と混合した（細菌対ＰＭＮの比率１：１）。混合物をローターラック上で３７℃でインキュベートした。９０分後に白血球を溶解し、適当な希釈物をトリプシン大豆寒天プレート上にプレーティングした。プレートを終夜インキュベートし、翌日コロニーを計数した。
【００３７】
要約すると、これらのデータにより、エンテロコッカス・フェシウム由来の配列番号１を有するポリペプチドが、バンコマイシン耐性を有するエンテロコッカス・フェシウムの臨床分離株に対するオプソニン抗体を誘導するワクチン候補であることが確認される。
【００３８】
実施例６：
配列番号１を有するポリペプチドに対する抗体の防御の有効性を、マウス菌血症モデルにおいて示した（図６）。雌性のｂａｌｂ／ｃマウス（１群当たりマウス８匹）に、２００μｌの正常ウサギ血清（ＮＲＳ）、又は配列番号１を有するポリペプチドに対して産生された血清（ＩＲＳ）を投与した。２４時間後に動物にエンテロコッカス・フェシウムＥ１５５（１．１８×１０１０ｃｆｕ／マウス）を負荷し、接種の２時間後に２回目の用量２００μｌのウサギ血清（ＮＲＳ又はＩＲＳ）を投与した。感染の８時間後にマウスを屠殺し、血液中のコロニー数を決定した。これらの結果により、マウスにＩＲＳを投与した場合に、血液でのコロニー数の統計的に有意な低減が示される。
【００３９】
エンテロコッカス・フェシウムは、培養培地中に分泌され、熱殺傷されたエンテロコッカス・フェシウムで免疫されたウサギにおいて特異的な抗体を誘導するおよそ５４ｋＤの細胞表面に結合したタンパク質を有する。該タンパク質をナノＬＣ−ＥＳ−ＭＳ／ＭＳ分析により同定し、ＰＣＲにより増幅させ、グラム陰性発現ベクター中にクローニングした。精製した組換えタンパク質を使用してウサギを免疫し、得られた抗血清が該タンパク質と特異的に結合することをＥＬＩＳＡにより示した。ウサギ血清は１：１０の血清希釈率で相同株を殺傷し（＞５０％）、精製した抗原により殺傷活性を完全に吸収することができた。血清の２回の適用（接種の２４時間前及び２時間後）により、マウスの血液中のコロニー数が統計的に低減され、この抗原がバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）による菌血症に対する有望なワクチン標的であることが確認された。
【符号の説明】
【００４０】
図１
Opsonickilling of rabbit serum against E. faecium E155  エンテロコッカス・フェシウムＥ１５５に対するウサギ血清のオプソニン殺傷
% killing  殺傷率（％）
serumdillution  血清希釈率
図２
Western blotwith E155 serum against the homologue strain  相同株に対するＥ１５５血清によるウエスタンブロット
Molecularweight marker  分子量マーカー
E. faeciumE155 cells  エンテロコッカス・フェシウムＥ１５５細胞
E. faeciumE155 supernatant  エンテロコッカス・フェシウムＥ１５５上清
図３
Western blotwith purified polypeptide having SEQ ID NO:1  精製した配列番号１を有するポリペプチドによるウエスタンブロット
lane 1:molecular weight marker  レーン１：分子量マーカー
lane 2: partiallypurified protein  レーン２：部分的に精製したタンパク質
lane 3:purified polypeptide  レーン３：精製したポリペプチド
図４
ELISA withpurified polypeptide having SEQ ID NO:1  精製した配列番号１を有するポリペプチドによるＥＬＩＳＡ
Sera  血清
Alpha E155  αＥ１５５
Alpha SEQ IDNO:1  α配列番号１
Serum titer  血清力価
rabbit serumbefore immunization  免疫前のウサギの血清
serum raisedagainst heat-killed bacteria  熱殺傷した細菌に対して産生された血清
serum raisedagainst recombinant protein  組換えタンパク質に対して産生された血清
図５
Opsonophagocyticinhibition with polypeptide having SEQ ID NO:1  配列番号１を有するポリペプチドによるオプソニン作用の阻害
% killing  殺傷率（％）
inhib  阻害因子
図６
MouseBacteremia with E. faecium E155  エンテロコッカス・フェシウムＥ１５５によるマウスの菌血症
unpairedt-test  独立ｔ-検定
【図１】
0005661744.tif 000002
【図２】
0005661744.tif 000003
【図３】
0005661744.tif 000004
【図４】
0005661744.tif 000005
【図５】
0005661744.tif 000006
【図６】
0005661744.tif 000007
【配列表】
0005661744000001.app