(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を分化させた後、継代を少なくとも１回以上実施した後に誘導される細胞であって、未分化（多能性）細胞マーカーである、ＮＡＮＯＧ，  ＯＣＴ４，  ＭＹＣ，  ＬＩＮ２８Ａが陰性であり、内胚葉細胞マーカーである、ＣＸＣＲ４，  ＣＥＲ１，  ＨＨＥＸ，  ＧＡＴＡ４が陰性であり、腸内胚葉細胞マーカーである、ＣＤＸ２，  ＨＯＸＢ９が陽性であり、さらに、間葉系細胞マーカーであるブラキュリ（Ｔ）が陰性であり、膵細胞マーカーである、ＰＤＸ１が陰性であり、継代培養が可能で、かつ、少なくとも肝細胞、膵細胞及び腸細胞に分化しうる細胞。
【請求項２】
第１の段階で、ＳＦＤ及びＲｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの存在下で、第２の段階で、ＳＦＤ、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ及びＷｎｔ３ａの存在下で、第３の段階で、ＲＰＭＩ、ＳＦＤ、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＡｃｔｉｖｉｎ  Ａの存在下で、第４の段階で、ＳＦＤ、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＡｃｔｉｖｉｎ  Ａの存在下で、多能性幹細胞をフィーダー細胞非存在下で培養して分化させた後、継代を少なくとも１回以上実施することを含む、請求項１記載の細胞の作製方法。
【請求項３】
継代後の第１の段階で、Ｒｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの存在下で、その後は、ＳＦＤ、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、Ａ８３-０１及びＣｈｉｒ９９０２１の存在下で培養することを含む、請求項１記載の細胞の増幅方法。
【請求項４】
請求項１に記載の細胞を臓器細胞へ分化誘導することを含む、臓器細胞の作製方法。
【請求項５】
請求項１に記載の細胞を任意の段階で凍結・保存し、臓器細胞を製造するためのワーキングセルバンクを構築する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、原始腸内胚葉細胞及びその作製方法に関し、より詳細には、肝細胞、膵細胞及び腸細胞に分化可能な内胚葉細胞及びその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ｉＰＳ／ＥＳ細胞などの多能性幹細胞より誘導した組織・臓器を利用して、新たな医薬品を開発するための創薬スクリーニングや、失われた臓器の機能を補う再生医療を実現化することが注目されている（Ｔａｋｅｂｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４９９：  ４８１-４８４，  ２０１３（非特許文献１）、ＷＯ２０１３／０４７６３９：組織及び臓器の作製方法（特許文献１））。
【０００３】
ヒトｉＰＳ細胞を用いた肝疾患に対する再生治療を実現化するためには、「超大量」のヒト肝細胞のＧＭＰグレードの製造技術が必要となる。例えば、ヒト成体肝臓の約３０％の機能代替を可能とするためには、患者１人に対して肝細胞数として６×１０１０  ｃｅｌｌｓを移植し生着させることが必須条件である。一方、これら超大量のヒト肝細胞製造については、既存の先行技術による分化誘導プロトコルによって細胞調製を試みる場合、移植効率まで加味すると、１人の肝移植待機患者の治療に約９５億円という莫大なコストを要することが、我々のコスト試算により判明している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｔａｋｅｂｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４９９：  ４８１-４８４，  ２０１３
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１３／０４７６３９  Ａ１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
肝疾患に対する再生治療費用の大部分は、ヒトｉＰＳ細胞からの分化誘導に要するサイトカイン等の分化誘導因子であることから、大幅なコスト削減を目指す上では、ヒトｉＰＳ細胞から臓器細胞への分化過程における極めて重要な中間段階として、「原始腸内胚葉細胞（Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｇｕｔ  Ｅｎｄｏｄｅｒｍ  Ｃｅｌｌｓ：  ＰＧＥＣｓ）」を設定することが極めて有利な戦略と考えられる。つまり、分化誘導期間が大幅短縮されること、分化誘導毎のバラつきが最小化されることなどにより、ヒト臓器細胞を安価に安定的かつ大量に誘導するための技術基盤となる。
【０００７】
この様な技術的障壁を解決するアプローチとしては、近年、次の３つのアプローチが試みられている。（１）ｉＰＳ細胞より誘導した内胚葉前駆細胞（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  ２０１２  Ａｐｒ  ６；１０（４）：３７１-８４．、ＷＯ  ２０１２１７８２１５  Ａ１）、（２）前腸内胚葉細胞（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔ，  Ｖｏｌ１，  ２９３-３０６，  ２０１３）、（３）ダイレクトリプログラミングにより得た多能性内胚葉細胞（Ｎａｔｕｒｅ  ５０８，  ９３-９７，  ２０１４）。各々（１）〜（３）の方法によって作製した中間段階の細胞を増幅し、機能細胞の分化誘導に用いる方法である。しかし、（１）においては、マウス細胞をフィーダーとして用いるために臨床応用することが難しい。（２）においては、増幅した細胞から誘導した細胞の分化機能が著しく低いこと、（３）の方法においては、増幅する細胞の安全性に課題があること、すなわち、ＣＸＣＲ４などの転移などの癌の悪性度に関係するマーカー発現を認めるなどの問題から各々の細胞において、医療・産業応用に用いることは難しいのが現状であった。
【０００８】
本発明は、これら先行技術の問題点を解決することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意努力した結果、上記（１）、（３）の細胞と（２）の細胞の中間段階にある「原始腸内胚葉細胞（Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｇｕｔ  Ｅｎｄｏｄｅｒｍ  Ｃｅｌｌｓ：  ＰＧＥＣｓ）」の誘導を確立した。さらに、それらの細胞を増幅したのちに、機能細胞への分化誘導にも成功した。本発明の原始腸内胚葉細胞（ＰＧＥＣｓ）は、肝細胞、膵細胞及び腸細胞への分化が可能であり（分化機能が高い）（上記（２）の細胞に対する優位性）、ＣＸＣＲ４などの癌の悪性度に関係するマーカーを発現せず（安全性が高い）（上記（３）の細胞に対する優位性）、さらに、フィーダー細胞を用いることなく調製することができるので、臨床応用が容易である（上記（１）の細胞に対する優位性）という優位性を持つ。
【００１０】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）多能性幹細胞を分化させた後、継代を少なくとも１回以上実施した後に誘導される細胞であって、未分化（多能性）細胞マーカーである、ＮＡＮＯＧ，  ＯＣＴ４，  ＭＹＣ，  ＬＩＮ２８Ａが陰性であり、内胚葉細胞マーカーである、ＣＸＣＲ４，  ＣＥＲ１，  ＨＨＥＸ，  ＧＡＴＡ４が陰性であり、腸内胚葉細胞マーカーである、ＣＤＸ２，  ＨＯＸＢ９が陽性であり、さらに、間葉系細胞マーカーであるブラキュリ（Ｔ）が陰性であり、膵細胞マーカーである、ＰＤＸ１が陰性であり、少なくとも肝細胞、膵細胞及び腸細胞に分化しうる細胞。
（２）第１の段階で、ＳＦＤ及びＲｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの存在下で、第２の段階で、ＳＦＤ、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ及びＷｎｔ３ａの存在下で、第３の段階で、ＲＰＭＩ、ＳＦＤ、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＡｃｔｉｖｉｎ  Ａの存在下で、第４の段階で、ＳＦＤ、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＡｃｔｉｖｉｎ  Ａの存在下で、多能性幹細胞をフィーダー細胞非存在下で培養して分化させた後、継代を少なくとも１回以上実施することを含む、（１）記載の細胞の作製方法。
（３）継代後の第１の段階で、Ｒｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの存在下で、その後は、ＳＦＤ、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、Ａ８３-０１及びＣｈｉｒ９９０２１の存在下で培養することを含む、（１）記載の細胞の増幅方法。
（４）（１）記載の細胞を臓器細胞へ分化誘導することを含む、臓器細胞の作製方法。
（５）（１）に記載の細胞を任意の段階で凍結・保存し、臓器細胞を製造するためのワーキングセルバンクを構築する方法。
【発明の効果】
【００１１】
ヒトｉＰＳ細胞から分化中途段階に相当するＰＧＥＣｓを非フィーダー環境下で分化誘導することが可能となった。このＰＧＥＣｓは、大量調製が可能であり、この細胞を用いて、器官原基（Ｔａｋｅｂｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４９９：  ４８１-４８４，  ２０１３）を製造することができる。
【００１２】
誘導されたＰＧＥＣｓは、従来法で必須であったフィーダー細胞が非存在下においても２０回以上に渡って継代培養を行うことで１０１０倍に細胞を増幅することが可能であった。さらに、増幅された細胞は凍結保存によるストックが可能であった。
【００１３】
さらに、肝細胞、膵細胞、腸管細胞などのさまざまな機能細胞への分化能力を有しているＰＧＥＣｓは、従来法で課題であった継代を繰り返したのちでも、高い機能を有する機能細胞へと分化誘導された。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ヒトｉＰＳ細胞由来Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｇｕｔ  Ｅｎｄｏｄｅｒｍ  Ｃｅｌｌｓ  （ＰＧＥＣｓ）の誘導・増幅・分化法の概要を示す。本発明により増幅される細胞は、Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ＥｎｄｏｄｅｒｍやＥｎｄｏｄｅｒｍａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒと呼ばれる細胞よりも（腸管系に）分化したより下流の細胞であるＰｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｇｕｔ  Ｅｎｄｏｄｅｒｍ  Ｃｅｌｌ  （ＰＧＥＣ）という細胞である。本細胞は、内胚葉に由来するすべての細胞に分化可能な細胞である。細胞名（Ｈｕｍａｎ  ｉＰＳＣ／ＥＳＣ，Ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  （ＥＰ）／Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  Ｅｎｄｏｄｅｒｍ  （ＤＥ）、ＰＧＥＣｓ）の下又は右には、その細胞が発現するマーカーの種類を記載した。
【図２】ヒトｉＰＳ細胞から継代を挟まないＰＧＥＣの初期分化誘導プロセスと細胞の形態学的観察を示す。
【図３】Ｒｏｃｋ阻害剤の添加により、継代をした際の細胞の接着・生着が大幅に改善することを示す。
【図４】ＰＧＥＣ継代後の維持および増殖に有効なサイトカイン・添加因子組み合わせの検討。Ｍ１〜８は、条件の違いを示す。図５の結果と併せて、Ｍ２の条件が有効であることを示す。
【図５】左図は、Ｍ１〜８における遺伝子発現量の比較を、右図は、細胞増殖数の定量結果を示す。細胞が良好に増殖するＭ２，  Ｍ４，  Ｍ６〜８の条件のうち、ＰＧＥＣマーカーであるＣＤＸ２が発現増強し、ＣＸＣＲ４，  ＣＥＲ１の発現が低下する条件は、Ｍ２であることが示された。
【図６】継代１〜２０回目、および、継代５回目における細胞の形態学的変化を、顕微鏡観察した結果、長期的に継代を継続したのちも、細胞の形態が維持されることを示す。
【図７】継代１０回目において長期凍結保存を行い、解凍し細胞培養を継続したのちの形態観察の結果。解凍後、継代２０回繰り返したのちも、細胞の形態が維持されることを示す。
【図８】ヒトｉＰＳ細胞由来ＰＧＥＣｓの増殖曲線（図８、左）と細胞倍加時間（図８、右）を示す。
【図９】継代前（Ｐ０）および継代後（Ｐ５，  １０，  １５，  ２０）におけるヒトｉＰＳ細胞由来ＰＧＥＣマーカーの遺伝子発現解析の結果を示す。
【図１０】継代前（Ｐ０）および継代後（Ｐ５，  １５）におけるヒトｉＰＳ細胞由来ＰＧＥＣｓのＦＡＣＳ経時解析の結果を示す。
【図１１】継代前（Ｐ０）および継代後（Ｐ１，  １０，  １５）におけるヒトｉＰＳ細胞由来ＰＧＥＣｓの免疫学的解析の結果を示す。
【図１２】継代後（Ｐ５，  １０，  １５）におけるヒトｉＰＳ細胞由来ＰＧＥＣｓの免疫学的解析の結果を示す。
【図１３】ヒトｉＰＳ細胞由来ＰＧＥＣｓの主成分解析の結果を示す。
【図１４】ヒトｉＰＳ細胞由来ＰＧＥＣｓの階層的クラスタリング解析の結果を示す。
【図１５−１】増幅したヒトｉＰＳ細胞由来ＰＧＥＣ（Ｐ６）を段階的に分化誘導した肝細胞の形態変化（図１５-１、上段）と肝細胞分化マーカーの遺伝子発現解析の結果（図１５-１、下段）を示す。
【図１５−２】増幅したヒトｉＰＳ細胞由来ＰＧＥＣ（Ｐ６）を分化誘導した肝細胞の弱拡大像。広域にわたって均一な形態を示す成熟肝細胞が誘導されていることを示す。
【図１６】ヒトｉＰＳ細胞由来ＰＧＥＣｓから分化誘導した肝細胞（ＰＧＥＣ-ＭＨ）の免疫学的解析の結果（上段、左）、ＩＣＧ試験、ＰＡＳ染色の結果（上段、右）、肝細胞分化マーカーの発現（ｑＰＣＲ）を示す。
【図１７−１】ヒトｉＰＳ細胞由来ＰＧＥＣｓから分化誘導した肝細胞（ＰＧＥＣ-ＭＨ）の継代後（Ｐ２，  ４，  ６，  ９）の形態学的観察を示す。
【図１７−２】ヒトｉＰＳ細胞由来ＰＧＥＣｓから分化誘導した肝細胞（ＰＧＥＣ-ＭＨ）の継代後（Ｐ３，  ５）のマイクロアレイ解析の結果（左）及びヒトｉＰＳ細胞由来ＰＧＥＣｓから分化誘導した肝細胞（ＰＧＥＣ-ＭＨ）の継代前（Ｐ０）および継代後（Ｐ５，  １０）のＡＬＢ分泌能を示す。
【図１８】ヒトｉＰＳ細胞由来ＰＧＥＣｓから段階的に誘導した膵細胞の形態学的解析の結果を示す。
【図１９】ヒトｉＰＳ細胞由来ＰＧＥＣｓから分化誘導した膵細胞の免疫染色の結果を示す。
【図２０】ヒトｉＰＳ細胞由来ＰＧＥＣｓから分化誘導した膵細胞の遺伝子発現解析の結果を示す。
【図２１】ＰＧＥＣを用いた腸組織の段階的誘導の方法の概要を示す。
【図２２】ＰＧＥＣより誘導した腸組織の写真を示す。
【図２３】ＰＧＥＣ（Ｐ１以降）に特異的な陽性・陰性マーカー遺伝子の抽出。ヒトｉＰＳ細胞由来ＰＧＥＣｓ１継代目以降の特異的マーカーの発現量を相対定量したものを示す。陽性のものは、赤、陰性になるものは、青で示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明は、多能性幹細胞を分化させた後、継代を少なくとも１回以上実施した後に誘導される細胞であって、未分化（多能性）細胞マーカーである、ＮＡＮＯＧ，  ＯＣＴ４，  ＭＹＣ，  ＬＩＮ２８Ａが陰性であり、内胚葉細胞マーカーである、ＣＸＣＲ４，  ＣＥＲ１，  ＨＨＥＸ，  ＧＡＴＡ４が陰性であり、腸内胚葉細胞マーカーである、ＨＯＸＢ５，  ＨＯＸＢ６，  ＨＯＸＢ７，  ＨＯＸＢ８，  ＣＤＸ２，  ＨＯＸＡ９，  ＨＯＸＢ９，  ＨＯＸＣ９が陽性であり、さらに、間葉系細胞マーカーであるブラキュリ（Ｔ）が陰性であり、膵細胞マーカーである、ＰＤＸ１が陰性であり、少なくとも肝細胞、膵細胞及び腸細胞に分化しうる細胞（以下、本明細書において、原始腸内胚葉細胞、Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｇｕｔ  Ｅｎｄｏｄｅｒｍ  Ｃｅｌｌｓ、ＰＧＥ又はＰＧＥＣｓと記すこともある。）を提供する。
【００１７】
本発明の細胞（ＰＧＥＣｓ）は、多能性幹細胞を分化させた後、継代を少なくとも１回以上実施した後に誘導される。多能性幹細胞とは、生体の様々な組織に分化する能力（分化万能性）を潜在的に持つ細胞であり、具体的には、内胚葉、中胚葉、外胚葉の全てに分化可能である細胞を指し、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などを例示することができるが、これらに限定されることはない。多能性幹細胞は、ヒト由来のものであるとよいが、ヒト以外の動物、例えば、マウス、ラット、イヌ、ブタ、サル、ヒツジ、ウシ、トリなどの動物由来であってもよい。
【００１８】
多能性幹細胞を分化させるには、第１の段階で、ＳＦＤ及びＲｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの存在下で、第２の段階で、ＳＦＤ、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ及びＷｎｔ３ａの存在下で、第３の段階で、ＲＰＭＩ、ＳＦＤ、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＡｃｔｉｖｉｎ  Ａの存在下で、第４の段階で、ＳＦＤ、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＡｃｔｉｖｉｎ  Ａの存在下で、多能性幹細胞をフィーダー細胞非存在下で培養するとよく、例えば、培養初日をＤａｙ  ０として、Ｄａｙ  ０は、ＳＦＤ及びＲｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの存在下で、Ｄａｙ  １は、ＳＦＤ、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ及びＷｎｔ３ａの存在下で、  Ｄａｙ  ２  -  Ｄａｙ  ３は、ＲＰＭＩ、ＳＦＤ、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＡｃｔｉｖｉｎ  Ａの存在下で、Ｄａｙ  ４  -  Ｄａｙ  ５は、ＳＦＤ、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＡｃｔｉｖｉｎ  Ａの存在下で、フィーダー細胞非存在下で多能性幹細胞を培養するとよいが、分化の方法は、この方法に限定されるわけではない。
【００１９】
継代は少なくとも１回以上実施する。継代回数（Ｐａｓｓａｇｅ  Ｎｕｍｂｅｒ）は、本発明の細胞（ＰＧＥＣｓ）が得られる限り、特に限定されないが、好ましくは、１〜３０回であり、より好ましくは、１〜２０回である。多能性幹細胞を分化させた後、継代を始めるタイミングは、細胞が培養皿を占める割合（コンフルエンシー）が８０〜９０％程度の状態となったときがよい。この状態は、ＦＡＣＳで解析をすると、図１０のように、ｃ-ｋｉｔ、ＣＸＣＲ４という抗原が概ね（８０％以上）陽性の細胞集団である。しかし、本発明者らは、ｃ-ｋｉｔ、ＣＸＣＲ４が陰性のものもまとめて継代する方法をとっており（プロセスが単純・簡便）、分離をする必要性がない点も本方法の有利な点と言える。
【００２０】
継代は、ＳＦＤに、Ａ８３-０１、ＣＨＩＲ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ２を添加した培地にて行うとよいが、この培地に限定されるわけではない。
【００２１】
継代の後、ＣＤＸ２、ＨＯＸＢ９などのＨＯＸ遺伝子群が誘導されることが観察された。
【００２２】
細胞の培養は、３７℃，  ５％  ＣＯ２  の培養用インキュベータにて行なうとよい。
【００２３】
本発明の実施の態様として、例えば、ＳＦＤ培地（１．５-２  ｍｌ、好ましくは、２  ｍｌ）にＲｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（１-２０  μＭ、好ましくは、１０  μＭ）を添加した培地に多能性幹細胞（２〜６ｘ１０５個）を播種し（Ｄａｙ  ０）、１日間培養した後、ＳＦＤ培地（１．５-４  ｍｌ、好ましくは、２  ｍｌ）にＷｎｔ３ａ（１-１００  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、５０ｎｇ／ｍｌ）及びＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ（５０-１５０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地で培地交換を行い（Ｄａｙ  １）、更に１日間培養する。次いで、ＳＦＤ培地とＲＰＭＩ１６４０培地を１：１〜１：１０（好ましくは、１：９）の割合で混合し、その培地にＢＭＰ４（０．５-４  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、２ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（５-１０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（５-５０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌ）及びＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ（５０-１５０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地で培地交換を行い、２日間培養する（Ｄａｙ  ２-Ｄａｙ  ３）。その後更にＳＦＤ培地（１．５-２  ｍｌ、好ましくは、２  ｍｌ）にＢＭＰ４（０．５-５  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、２ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（５-１０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（８-２０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌ）及びＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ（５０-１５０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地で培地交換を行い、２日間培養する（Ｄａｙ  ４-Ｄａｙ  ５）。培養後の細胞をＰ０  細胞（ｐａｓｓａｇｅ  ０）とし、継代を行う。例えば、Ｐ０  細胞（５００〜４ｘ１０５個、好ましくは、１ｘ１０５個）をＰＧＥ維持培地に播種し、その後、培地交換を３〜４日に１回行う。ＰＧＥ維持培地は、ＳＦＤ培地（１．５-２  ｍｌ、好ましくは、２  ｍｌ）にＦＧＦ２（５-１０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、５  ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（８-２０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０  ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１０-４０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、２０  ｎｇ／ｍｌ）、Ａ８３-０１（０．１-１  μＭ、好ましくは、０．５  μＭ）、Ｃｈｉｒ９９０２１（１-５  μＭ、好ましくは、３  μＭ）を添加したものである。
【００２４】
本発明の細胞（ＰＧＥＣｓ）は、未分化（多能性）細胞マーカーである、ＮＡＮＯＧ，  ＯＣＴ４，  ＭＹＣ，  ＬＩＮ２８Ａが陰性であり、内胚葉細胞マーカーである、ＣＸＣＲ４，  ＣＥＲ１，  ＨＨＥＸ，  ＧＡＴＡ４が陰性であり、腸内胚葉細胞マーカーである、ＣＤＸ２，  ＨＯＸＢ９が陽性であり、さらに、間葉系細胞マーカーであるブラキュリ（Ｔ）が陰性であり、膵細胞マーカーである、ＰＤＸ１が陰性である。この他、腸内胚葉細胞マーカーである、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＡ９及びＨＯＸＣ９が陽性であり、間葉系細胞マーカーである、ＰＤＧＦＲＡが陰性であり、肝細胞マーカーである、ＡＬＢが陰性であることが好ましい。
【００２５】
本発明の細胞（ＰＧＥＣｓ）は、肝細胞、膵細胞、腸細胞などの臓器細胞に分化しうる。肝細胞、膵細胞又は腸細胞への分化誘導は、後述の実施例に記載の方法で実施することができる。臓器細胞が肝細胞である場合、例えば、ＦＢＳ、ＨＧＦ、ＯＳＭ及びＤＥＸの存在下で、本発明のＰＧＥＣｓを培養することで、肝細胞へ分化誘導することができる（後述の実施例参照）。臓器細胞が膵細胞である場合、例えば、Ｌ-ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、ｇｌｕｃｏｓｅ、ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ、ＳＢ４３１５４２、２-Ｍ  Ｉｎｓｕｌｉｎ及びＮｉｃｏｔａｎａｍｉｄｅの存在下で、本発明のＰＧＥＣｓを培養することで、膵細胞へ分化誘導することができる（後述の実施例参照）。臓器細胞が腸細胞である場合、例えば、Ｂ２７、Ｒ-Ｓｐｏｎｄｉｎ１、Ｎｏｇｇｉｎ及びＥＧＦの存在下で、本発明のＰＧＥＣｓを培養して、腸細胞へ分化誘導することができる（後述の実施例参照）。
【００２６】
本発明の細胞（ＰＧＥＣｓ）は、凍結保存が可能である。凍結保存のタイミングは特に限定されるものではないが、好ましくは、継代回数１〜２０回の後であり、より好ましくは、継代回数２〜１０回の後である。
【００２７】
一般的な細胞凍結・解凍の方法に準ずれば良いことが本細胞の利点であるが、特に、保存用溶媒に混合したのちに凍結するまでの作業、および、保存後の凍結細胞を融解する際の操作を迅速に行うことが重要である。
【００２８】
本発明の細胞（ＰＧＥＣｓ）は、凍結保存が可能であるので、臨床・創薬応用に用いる内胚葉に由来する細胞・組織・臓器を製造する際に、ワーキングセルバンクとしての利用が可能である。よって、本発明は、ＰＧＥＣｓ細胞を任意の段階で凍結・保存し、臓器細胞を製造するためのワーキングセルバンクを構築する方法も提供する。
【００２９】
本発明の細胞（ＰＧＥＣｓ）を作製するには、第１の段階で、ＳＦＤ及びＲｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの存在下で、第２の段階で、ＳＦＤ、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ及びＷｎｔ３ａの存在下で、第３の段階で、ＲＰＭＩ、ＳＦＤ、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＡｃｔｉｖｉｎ  Ａの存在下で、第４の段階で、ＳＦＤ、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＡｃｔｉｖｉｎ  Ａの存在下で、多能性幹細胞をフィーダー細胞非存在下で培養して分化させた後、継代を少なくとも１回以上実施するとよく、例えば、培養初日をＤａｙ  ０として、Ｄａｙ  ０は、ＳＦＤ及びＲｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの存在下で、Ｄａｙ  １は、ＳＦＤ、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ及びＷｎｔ３ａの存在下で、  Ｄａｙ  ２  -  Ｄａｙ  ３は、ＲＰＭＩ、ＳＦＤ、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＡｃｔｉｖｉｎ  Ａの存在下で、Ｄａｙ  ４  -  Ｄａｙ  ５は、ＳＦＤ、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＡｃｔｉｖｉｎ  Ａの存在下で、フィーダー細胞非存在下で多能性幹細胞を培養して分化させた後、継代を少なくとも１回以上実施するとよいが、本発明の細胞（ＰＧＥＣｓ）の作製方法は、この方法に限定されるわけではない。
【００３０】
継代については、前述した通りである。
【００３１】
細胞の培養は、３７℃，  ５％  ＣＯ２  の培養用インキュベータにて行なうとよい。
【００３２】
本発明の実施の態様として、例えば、ＳＦＤ培地（１．５-２  ｍｌ、好ましくは、２  ｍｌ）にＲｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（１-２０  μＭ、好ましくは、１０  μＭ）を添加した培地に多能性幹細胞（２〜６ｘ１０５個）を播種し（Ｄａｙ  ０）、１日間培養した後、ＳＦＤ培地（１．５-４  ｍｌ、好ましくは、２  ｍｌ）にＷｎｔ３ａ（１-１００  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、５０ｎｇ／ｍｌ）及びＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ（５０-１５０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地で培地交換を行い（Ｄａｙ  １）、更に１日間培養する。次いで、ＳＦＤ培地とＲＰＭＩ１６４０培地を１：１〜１：１０（好ましくは、１：９）の割合で混合し、その培地にＢＭＰ４（０．５-４  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、２ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（５-１０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（５-５０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌ）及びＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ（５０-１５０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地で培地交換を行い、２日間培養する（Ｄａｙ  ２-Ｄａｙ  ３）。その後更にＳＦＤ培地（１．５-２  ｍｌ、好ましくは、２  ｍｌ）にＢＭＰ４（０．５-５  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、２ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（５-１０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（８-２０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌ）及びＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ（５０-１５０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地で培地交換を行い、２日間培養する（Ｄａｙ  ４-Ｄａｙ  ５）。培養後の細胞をＰ０  細胞（ｐａｓｓａｇｅ  ０）とし、継代を行う。例えば、Ｐ０  細胞（５００〜４ｘ１０５個、好ましくは、１ｘ１０５個）をＰＧＥ維持培地に播種し、その後、培地交換を３〜４日に１回行う。ＰＧＥ維持培地は、ＳＦＤ培地（１．５-２  ｍｌ、好ましくは、２  ｍｌ）にＦＧＦ２（５-１０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、５  ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（８-２０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０  ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１０-４０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、２０  ｎｇ／ｍｌ）、Ａ８３-０１（０．１-１  μＭ、好ましくは、０．５  μＭ）、Ｃｈｉｒ９９０２１（１-５  μＭ、好ましくは、３  μＭ）を添加したものである。
【００３３】
また、本発明の細胞（ＰＧＥＣｓ）を増幅するには、継代後の第１の段階で、Ｒｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの存在下で、その後は、ＳＦＤ、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、Ａ８３-０１及びＣｈｉｒ９９０２１の存在下で培養するとよく、例えば、継代後の培養初日をＤａｙ  ０として、Ｄａｙ  ０は、Ｒｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの存在下で、その後は、ＳＦＤ、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、Ａ８３-０１及びＣｈｉｒ９９０２１の存在下で培養することにより、増幅するとよいが、本発明の細胞（ＰＧＥＣｓ）の増幅方法は、この方法に限定されるわけではない。
【００３４】
細胞の培養は、３７℃，  ５％  ＣＯ２  の培養用インキュベータにて行なうとよい。
【００３５】
本発明の実施の態様として、例えば、継代後の培養初日をＤａｙ  ０として、ＰＧＥＣ細胞（５００〜４ｘ１０５個、好ましくは、１ｘ１０５個）をＲｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ添加（１-１００  μＭ、好ましくは、１０  μＭ）ＰＧＥ維持培地に播種し（Ｄａｙ  ０）、翌日ＰＧＥ維持培地に培地交換をする。培地交換を３〜４日に１回行う。ＰＧＥ維持培地は、ＳＦＤ培地（１．５-２  ｍｌ、好ましくは、２  ｍｌ）にＦＧＦ２（５-１０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、５  ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（８-２０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０  ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１０-４０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、２０  ｎｇ／ｍｌ）、Ａ８３-０１（０．１-１  μＭ、好ましくは、０．５  μＭ）、Ｃｈｉｒ９９０２１（１-５  μＭ、好ましくは、３  μＭ）を添加したものである。
【００３６】
本発明の細胞（ＰＧＥＣｓ）を作製及び／又は増幅するには、ゲルなどの支持体上で培養するとよい。支持体としては、３０倍希釈マトリゲルを用いることが好ましいが、それに限定されることはない。他の支持体としては、例えば、ラミニンおよびその誘導体、ビトロネクチン、アガロースゲル、アクリルアミドゲル、ハイドロゲル、コラーゲンゲル、ウレタンゲルなどが例示できる
また、本発明は、本発明の細胞（ＰＧＥＣｓ）を用いて、肝細胞、膵細胞、腸細胞などの臓器細胞を作製する方法も提供する。肝細胞、膵細胞又は腸細胞への分化誘導は、後述の実施例に記載の方法で実施することができる。臓器細胞が肝細胞である場合、例えば、ＦＢＳ、ＨＧＦ、ＯＳＭ及びＤＥＸの存在下で、本発明のＰＧＥＣｓを培養することで、肝細胞へ分化誘導することができる（後述の実施例参照）。臓器細胞が膵細胞である場合、例えば、Ｌ-ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、ｇｌｕｃｏｓｅ、ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ、ＳＢ４３１５４２、２-Ｍ  Ｉｎｓｕｌｉｎ及びＮｉｃｏｔａｎａｍｉｄｅの存在下で、本発明のＰＧＥＣｓを培養することで、膵細胞へ分化誘導することができる（後述の実施例参照）。臓器細胞が腸細胞である場合、例えば、Ｂ２７、Ｒ-Ｓｐｏｎｄｉｎ１、Ｎｏｇｇｉｎ及びＥＧＦの存在下で、本発明のＰＧＥＣｓを培養して、腸細胞へ分化誘導することができる（後述の実施例参照）。本発明の細胞（ＰＧＥＣｓ）は、肝細胞、膵細胞及び腸細胞以外の臓器細胞、例えば、肺細胞、甲状腺細胞、消化管分泌腺細胞、腹膜細胞、胸膜細胞、喉頭細胞、耳管・気管・気管支細胞、尿路細胞へも分化しうる。本発明の細胞から臓器細胞を分化誘導するには、本発明の細胞をゲルなどの支持体上で培養するとよい。支持体としては、平面での分化誘導を試みる場合には、３０倍希釈マトリゲルを用いることが好ましく、立体で器官原基作製による分化誘導を試みる場合には、ゲル（例えば、原液〜４倍希釈マトリゲル（登録商標）、アガロースゲル、アクリルアミドゲル、ハイドロゲル、コラーゲンゲル、ウレタンゲルなど）を用いることが好ましい、それに限定されることはない。本発明の細胞から分化誘導された臓器細胞は、機能性が高いことに加え、従来の多能性幹細胞から分化誘導したものに加えて均質性が極めて高い（後述の実施例参照）。
【００３７】
本発明の細胞（ＰＧＥＣｓ）から作製した臓器細胞を用いて、組織や臓器を作製することができる。例えば、本発明の細胞（ＰＧＥＣｓ）から作製した臓器細胞を血管内皮細胞及び間葉系細胞と共培養して、器官芽を作製し、これを生体内に移植することで、組織や臓器を作製することができる（Ｔａｋｅｂｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４９９：  ４８１-４８４，  ２０１３（非特許文献１）、ＷＯ２０１３／０４７６３９：組織及び臓器の作製方法（特許文献１））。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
〔実施例１〕  ｉＰＳ細胞からＰＧＥＣの増幅法
〔実験方法〕
マトリゲルコーティング上で培養したｉＰＳ細胞（臍帯より独自に樹立したｉＰＳ細胞、および、ＴｋＤＡ３（東京大学より提供））をＡｃｃｕｔａｓｅにより剥離し回収した。ＳＦＤ培地にＲｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（１０ｕＭ）を添加した培地を用いてマトリゲルコーティングした６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに２〜６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、１日間培養した。培養後、ＳＦＤ培地にＷｎｔ３ａ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地で培地交換を行い、更に１日間培養した。次いで、ＳＦＤ培地とＲＰＭＩ１６４０培地を１：９の割合で混合し、その培地にＢＭＰ４（０．５ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（５ｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地で培地交換を行い、２日間培養した。その後更にＳＦＤ培地にＢＭＰ４（０．５ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地で培地交換を行い、２日間培養した。培養後の細胞をＰＧＥ  Ｐ０とし、ＰＧＥ維持培地にて継代を行った。
【００３９】
ＡｃｃｕｔａｓｅにてＰＧＥ  Ｐ０の細胞を剥離し、Ｐ０細胞を回収した。回収した細胞の２／３量の細胞をＲｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（１０μＭ）を添加したＰＧＥ維持培地を用いてマトリゲルコーティングした６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに播種した。翌日、細胞を再び回収し、Ｒｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（１０μＭ）を添加したＰＧＥ維持培地を用いて６０ｍｍ  ｄｉｓｈに全量播種した。翌日細胞を観察し、細胞が８０％コンフル以下の場合はＰＧＥ維持培地にて培地交換を行い、細胞が８０％コンフル以上の場合は継代を行った。継代はＰ５までは１／３〜１／２の割合で継代を行うことが望ましい。増殖が早い場合はそれ以下でも良い。継代する際はマトリゲルコーティングしたｄｉｓｈにＲｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（１０ｎＭ）を添加したＰＧＥ維持培地を用いて細胞を播種し、翌日ＰＧＥ維持培地に培地交換をした。培地交換は３〜４日に１回行った。１００ｍｍ  ｄｉｓｈ  に３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで播種すると３〜４日でコンフルとなった。ただし、継代のタイミングは、その時の細胞の状態を確認しながらタイミングを至適化する。
※なお、上記ＰＧＥ分化誘導及び肝臓分化誘導に使用する試薬を、次の表１〜３に示す。
【００４０】
【表１】
0005777127.tif 000002
【００４１】
２．ＰＧＥ分化誘導及び維持に必要な培地の調製
ＰＧＥ分化誘導及びＰＧＥ維持に必要な基礎培地（以下ＳＦＤ培地）及びＰＧＥ維持培地を調製する。表２及び表３にＳＦＤ培地、ＰＧＥ維持培地の組成を示す。
【００４２】
【表２】
0005777127.tif 000003
【００４３】
【表３】
0005777127.tif 000004
【００４４】
３．マトリゲルコーティング
マトリゲル  グロースファクターリデュースをＲＰＭＩで１／３０に希釈した。希釈した溶液を下記表４に従い必要量を培養皿に加え、全面にゆきわたらせた。室温で約２時間放置した。希釈溶液をチューブに回収し、ＲＰＭＩを希釈溶液と等量加えた（このコーティング作業を以下マトリゲルコーティングとする）。希釈液は、３回目まで使用可能であった。細胞を播種する際はマトリゲルコーティングを行った。
【００４５】
【表４】
0005777127.tif 000005
【００４６】
４．  ＰＧＥＣ細胞の凍結保存と解凍法
凍結保存
ＰＧＥＣが９０％コンフルエンスになった状態で（１００ｍｍ  ｄｉｓｈ  あたり  ３〜４  ｘ１０６  ｃｅｌｌ程度）、１００-ｍｍ  ｄｉｓｈあたり、３  ｍｌ  ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｃａ＋／Ｍｇ＋-ｆｒｅｅ  ＰＢＳで洗浄した。その後、１．５  ｍｌ  Ａｃｃｕｔａｓｅ  を加え、３７°Ｃ  、５％  ＣＯ２  インキュベーターの中で２〜５分処理を行った。そののち、ただちに９  ｍｌ  の  ＤＭＥＭ-Ｆ１２で中和した後５０ｍｌコニカルチューブに回収した。細胞をカウントののち  ８０〜９０ｇ，  ５ｍｉｎで遠心分離を行った。上清を廃棄の後、５  ｘ  １０５  ｃｅｌｌｓあたり１ｍｌになるように調製したセルバンカー  （ｃｅｌｌｂｌａｎｋｅｒ-１）で優しく懸濁し、１  ｍｌずつの細胞懸濁液を凍結保存用チューブに移した。イソプロパノールで満たされた１°Ｃの凍結用コンテナーにチューブを搭載し（蓋がきちんと閉まっていることを確認）、-８０°Ｃの冷凍庫で１日静置した。翌日、液体窒素タンクに移動し、保存を行った。本法においては長期的な保存が可能であるが、２年以上の保存が可能であると考えられる。
【００４７】
解凍
液体窒素タンクより取り出したＰＧＥＣ入り凍結チューブを取り出し、予め３７°Ｃに設定したウォーターバスにて急速融解した。凍結細胞が完全に解凍する直前になったら（＜  １  分以内）  ウォーターバスから取り出し、直ちに安全キャビネットの中で７０％エタノールで周囲を拭ったのち、細胞を予め温めたおいた９ｍｌのＤＭＥＭ-Ｆ１２とともに遠心用コニカルチューブに移した。８０〜９０ｇ、５分間の遠心により洗浄を行い、２  ｘ１０４  ｃｅｌｌｓあたり１ｍｌになるように調製した １０μＭ  Ｒｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  入りのＰＧＥ維持培地にて懸濁、Ｍａｔｒｉｇｅｌ  （ｇｒｏｗｔｈ-ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｄｕｃｅｄ）  （１：３０の稀釈）-コート済みの１００ｍｍ  ｄｉｓｈへ全量が  １０  ｍｌ  になるように播種を行った  （＝２  ｘ１０５  ｃｅｌｌｓ／１００ｍｍ  ｄｉｓｈ）  。３７°Ｃ  、５％  ＣＯ２  インキュベーターにて培養を行い、翌日からはＰＧＥ維持培地（Ｒｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒなし）にて２日おきに培地交換を行い増殖させた。
【００４８】
〔実験結果〕
（１）本実施例における概要を示す（図１）。本発明により増幅される細胞は、Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  Ｅｎｄｏｄｅｒｍ（Ｄ'Ａｍｏｕｒ，  Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，  １５３４-１５４１  （２００５）．、Ｉｗａｓｈｉｔａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｃｅｒｂｅｒｕｓ１  ａｓ  ａ  Ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  Ｅｎｄｏｄｅｒｍ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ８，  ｅ６４２９１  （２０１３）．、Ｓｉ‐Ｔａｙｅｂ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ-ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５１，  ２９７-３０５  （２０１０）．）やＥｎｄｏｄｅｒｍａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ（Ｃｈｅｎｇ，  Ｘ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｌｆ-ｒｅｎｅｗｉｎｇ  ｅｎｄｏｄｅｒｍａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｌｉｎｅｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  １０，  ３７１-３８４  （２０１２）．）と呼ばれる細胞よりも（腸管系に）分化したより下流の細胞であるＰｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｇｕｔ  Ｅｎｄｏｄｅｒｍ  Ｃｅｌｌ  （ＰＧＥＣ）という細胞である。本細胞は、内胚葉に由来するすべての細胞に分化可能な細胞である。
（２）ヒトｉＰＳ細胞から継代を挟まないＰＧＥＣの初期分化誘導プロセスの細胞の形態学的観察（図２）。ヒトｉＰＳ細胞の未分化性が十分に保たれていることをコロニーの形態・ＯＣＴ４，  ＳＯＸ２の免疫染色により確認した（Ｄａｙ０）。次に、未分化状態の保たれたｉＰＳ細胞をＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ  および記載の分化因子に順次曝露し、Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  Ｅｎｄｏｄｅｒｍへの誘導を行った。６日目には、多くの細胞が肥大化した核を有した敷石状のＤｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  Ｅｎｄｏｄｅｒｍ細胞へと分化誘導された。
（３）ＰＧＥＣの継代直後におけるＲＯＣＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの有用性の検討（図３）。写真（図３上）は、蛍光標識したＰＧＥＣ細胞を継代し、Ｄａｙ３時点における培養皿の全体像を撮影したもの。ＡＡＶＳ１：：ＥＧＦＰ-ｉＰＳ細胞（ＴｋＤＡ）を用いて誘導したＰＧＥＣを継代ののち、ＥＧＦＰの蛍光によって生存・接着・増殖の評価を実施した。プレーティングの初日にＲｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを添加することで細胞の生存・接着が亢進した。一方、Ｒｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  非存在下では、多くの細胞は生存することが出来なかった  （図３，  上）。プレーティング後３日目に細胞数を計数した結果、Ｒｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ曝露群では細胞数が著名に多く、増殖が亢進しているものと考えられた（図３，  下）。横軸は、ウェル毎のデータ（ｎ）を示す。
（４）継代後のＰＧＥＣの増幅に有用な液性因子の検討（図４，５）。誘導したｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  細胞を、異なるサイトカイン・低分子化合物を組み合わせた培地条件で培養を行い、最適な条件を探索した。３日目に得られた細胞の形態を図４に、遺伝子発現解析の結果を図５左、細胞数を図５右に示した。その結果、細胞が良好に増殖するためにはＣＨＩＲ９９０２１が、かつ、原始腸内胚葉（ＰＧＥＣ）マーカー（ＣＤＸ２）陽性・ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｍａｒｋｅｒ（ＣＸＣＲ４  ・ＣＥＲ１）陰性の細胞を誘導するためには、ＦＧＦ２，  ＢＭＰ４，  ＶＥＧＦ，  ＣＨＩＲ９９０２１  および  Ａ８３-０１  が必要であった。したがって、ＰＧＥＣの誘導には、ＦＧＦ２，  ＢＭＰ４，  ＶＥＧＦ，  ＣＨＩＲ９９０２１  および  Ａ８３-０１が必須であることが判明した。
【００４９】
＊Ｐ１：  ｐａｓｓａｇｅ  １、  Ｍ１-Ｍ８：  培地組成の違い（＃１-＃８）を示す。各培地組成は写真の直下に記載の通り。
【００５０】
（５）継代培養を繰り返したＰＧＥＣの形態学的観察（図６）。図６上段は、ＰＧＥＣ-Ｐ１，  Ｐ１０，  Ｐ２０の時点において継代後５日目の培養細胞の観察結果を示す。ＦＧＦ２，  ＢＭＰ４，  ＶＥＧＦ，  ＣＨＩＲ９９０２１  および  Ａ８３-０１の存在下で増幅を行った結果、２０回以上に渡り継代を重ねた状態であっても、増殖が継続するとともに、ＰＧＥＣに特徴的な上皮状の構造が保たれていることを確認した。図６下段は、Ｐ５の段階において、継代後１日目から５日目までの間に増殖する過程を示す。
＊Ｐ１：  ｐａｓｓａｇｅ  １、  Ｍ１-Ｍ８：  培地組成の違い（＃１-＃８）を示す。各培地組成は写真の直下に記載の通り。
【００５１】
また本細胞は、方法に記載の手順で、任意のタイミングで凍結保存が可能であり、Ｐ１０時点で３ヶ月間保存した細胞を解凍後、再度２０継代ほどの増幅が可能であることが明らかとなっている（図７）。図７上段は、Ｐ１０時点で凍結保存・解凍したＰＧＥＣを追加で、１継代（Ｐ１），  １０継代（Ｐ１０），  ２０継代（Ｐ２０）したものをＤａｙ  ０で増幅した後の形態を示す。いずれにおいても、凍結保存を挟まなかったＰＧＥＣと同様の上皮状の細胞増殖を確認することが出来た。図７下段は、Ｐ１０時点で凍結保存・解凍したＰＧＥＣを５継代（Ｐ５）したものをＤａｙ１，  ３，  ５で増幅した後の形態を示す。増殖能についても、良好に保たれていることが判明した。
【００５２】
（６）ヒトｉＰＳ細胞由来ＰＧＥＣの増殖曲線（図８、左）と細胞倍加時間（図８、右）。本結果から、少なくとも２０回以上の継代が可能であり、凍結（ｓｔｏｃｋ）ののちもこれらが２０回以上継代することが可能であった。
（７）継代前（Ｐ０）および継代後（Ｐ５，  １０，  １５，  ２０）におけるＰＧＥＣマーカーの遺伝子発現解析。継代後（Ｐ５，  １０，  １５，  ２０）の細胞は、ＣＤＸ２＋／ＣＥＲ１-／ＣＸＣＲ-であった（図９）。内胚葉マーカーであるＳＯＸ１７，  ＦＯＸＡ２は維持されていた。内胚葉マーカーであるＧＡＴＡ４は維持されていなかった。
（８）継代前（Ｐ０）および継代後（Ｐ１，  １０，  １５，  ２０）における細胞の特性解析。ＦＡＣＳ（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）解析の結果、継代前（Ｐ０，  Ｄａｙ５）の細胞は大部分がＥｎｄｏｄｅｒｍ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒまたは、Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  Ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ＭａｒｋｅｒであるＣ-ＫＩＴ、ＣＸＣＲ４共陽性であったのに対し、継代後（Ｐ５，  １５）の細胞は陰性であった（図１０）。ＰＧＥＣマーカーであるＣＤＸ２の免疫染色の結果、継代前（Ｐ０）では発現を認めなかったのに対し、継代後（Ｐ１，  １０，  １５）は陽性で維持されていた（図１１）。一方、内胚葉マーカーであるＦＯＸＡ２，ＳＯＸ１７，  ＨＮＦ４Ａは陽性であった。さらに、多能性幹細胞マーカーであるＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４  は陰性であった（図１２）。
（９）共培養の際（ＨＵＶＥＣｓ  （Ｌｏｎｚａ，  ｃａｔ．  ｎｏ．  １９１０２７），  ｈＭＳＣｓ  （Ｌｏｎｚａ，  ｃａｔ．  ｎｏ．  ＰＴ-２５０１））、培養液として内皮細胞培地ではなく、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  （ＸｅｎｏＴｅｃｈ）、あるいはＢＭＰ４及びＦＧＦ２を添加した肝細胞誘導培地（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，  ５１（１），  ２９７-３０５，２０１０）を用いた場合には、肝芽に特徴的な遺伝子発現の増強（Ａｌｂ、ＴＴＲなど）は認められなかった。
【００５３】
〔実施例２〕  マイクロアレイ解析による分化段階の詳細解析
〔実験方法〕
全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）を用いて、ヒトｉＰＳＣ-ＰＧＥＣ由来細胞（ＰＧＥＣ（Ｐ０），  ＰＧＥＣ（Ｐ１〜Ｐ１６の各種細胞）およびＰＧＥＣより分化誘導した肝細胞（ＰＧＥＣ-ＭＨ）（後述の実施例３で分化誘導した細胞。））から調製した。対照群として、ヒトｉＰＳＣ由来細胞  （ｈｉＰＳＣ，  ｉＰＳＣ-ＤＥ（Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  Ｅｎｄｏｄｅｒｍ），  ｉＰＳＣ-ＨＥ（Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｅｎｄｏｄｅｒｍ）  ｉＰＳＣ-ＩＨ（Ｉｍｍａｔｕｒｅ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）、  ｉＰＳＣ-ＭＨ（Ｍａｔｕｒｅ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ），  ｉＰＳＣ-ＬＢ（Ｌｉｖｅｒ  Ｂｕｄ）（各細胞の定義は以下の２つの論文に記載：Ｓｉ‐Ｔａｙｅｂ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ-ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５１，  ２９７-３０５  （２０１０）．、Ｔａｋｅｂｅ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ｉＰＳＣ-ｄｅｒｉｖｅｄ  ｏｒｇａｎ  ｂｕｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４９９，  ４８１-４８４  （２０１３）．、Ｔａｋｅｂｅ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ｉＰＳＣ-ｄｅｒｉｖｅｄ  ｏｒｇａｎ  ｂｕｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ９，  ３９６-４０９  （２０１４）．）および、ヒト成体肝臓  （Ｌｏｔ  Ｎｏ．：  Ｂ３０８１２１、Ｂｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  、Ｈａｙｗａｒｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）から得たＲＮＡを解析した。ｃＲＮＡを増幅し、Ｌｏｗ  Ｉｎｐｕｔ  Ｑｕｉｃｋ  Ａｍｐ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）を用いて標識し、４４Ｋの６０量体オリゴマイクロアレイ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ４ｘ４４Ｋ  ｖ２  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｋｉｔ；  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に製造者の指示に従ってハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたマイクロアレイスライドを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｈｉｇｈ-Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒを用いてスキャンした。Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  バージョン  １０．７．３．１  （Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、相対ハイブリダイゼーション強度およびバックグラウンドハイブリダイゼーション値を計算した。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが推奨する手順に従ってＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  １１．５．１  Ｓｏｆｔｗａｒｅ中のフラグ基準を用いて、生のシグナル強度および各プローブのフラグをハイブリダイゼーション強度およびスポット情報から計算した。さらに、サンプルの生シグナル強度をｌｏｇ２変換し、変位値アルゴリズムによって正規化した。我々は全てのサンプルに、「妥協した」（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）フラグを除きプローブを選択し、検出された遺伝子として３４，１８３個のプローブを得た。得られた発現データから、７５％  ｓｈｉｆｔｉｌｅ  ＆  ｍｅｄｉａｎ補正したデータを用いて、主成分解析、階層的クラスタリング法によってサンプルの分化段階を分類した。
【００５４】
〔実験結果〕
主成分解析の結果（図１３）および、階層的クラスタリングの結果（図１４）を示す。継代前のＰＧＥＣ（Ｐ０）は、ｉＰＳＣ-ＤＥ（Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ＥｎｄｏｄｅｒｍやＥｎｄｏｄｅｒｍａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）に相当する細胞であることが判明した。一方、継代後（Ｐ１〜Ｐ１５）の細胞は、ｉＰＳＣ-ＨＥに近い分化段階の細胞であり、それらはさらに分化したｉＰＳＣ-ＭＨや、ＰＧＥＣ-ＭＨ以前の分化状態にあることが示された。以上から、一度でも継代を挟むことで増幅される細胞は、ｉＰＳＣ-ＤＥとｉＰＳＣ-ＨＥの中間に位置する分化段階の細胞であることが明らかとなった。
【００５５】
〔実施例３〕  ＰＧＥＣから肝細胞への分化
〔実験方法〕
ＰＧＥＣ（Ｐ６）を翌日６０〜１００％コンフルになるようにＲｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（１０μＭ）を添加したＰＧＥ維持培地を用いてマトリゲルコーティングしたｄｉｓｈに播種した。翌日、細胞が６０〜１００％コンフルであることを確認し、ＰＧＥ維持培地にＡｃｔｉｖｉｎ（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地で培地交換し、２日間培養した（ＰＧＥＣ-２ｄ）。（６０％コンフル以下の場合はＰＧＥ維持培地で培地交換を行い、６０％コンフル以上になるまで培養する。）  培養後、ＳＦＤ培地にＤＭ３１８９８（２５０ｎＭ）、ＩＷＰ２（４μＭ）、ＰＤ０３２５９０１（５００ｎＭ）及びＲＡ（２μＭ）を添加した培地で培地交換して１日間培養した。更に、ＳＦＤ培地にＡ-８３-０１（１μＭ）、ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＷＰ２（４μＭ）、及びＲＡ（２μＭ）を添加した培地で培地交換を行い、３日間培養した（ＰＧＥＣ-ＨＥ）。その後、ノックアウトＤ-ＭＥＭ培地に２０％ＫＳＲ、１％ＤＭＳＯ、１％ＮＥＡＡ、２-ＭＥ（０．１ｍＭ）及びＬ-Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（１ｍＭ）を添加した培地で培地交換を行い３日間培養した。次いで、ＥＧＦを除いたＨＣＭを調製し、その培地に５％ＦＢＳ、ＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＯＳＭ（２０ｎｇ／ｍｌ）及びＤＥＸ（１００ｎＭ）を添加した培地で８日間培養し、肝細胞（ＰＧＥＣ-ＭＨ）へと終末分化誘導を行った。
【００５６】
〔実験結果〕
（１）増幅したＰＧＥＣ（Ｐ６）を段階的に分化誘導した肝細胞の形態変化（図１５-１、上段）と遺伝子発現解析（図１５-１、下段）。終末分化をしたＰＧＥＣ-ＭＨは、肝細胞様の形態を示しており、肝細胞マーカー遺伝子の発現が増強することが確認された。ＰＧＥＣ-ＭＨは、免疫染色の結果肝細胞マーカーの発現を認めた。さらに、ＩＣＧ試験、ＰＡＳ染色の結果からも代謝機能を持つ幹細胞であることが判明した（図１６，上段）。
（２）通常、ｉＰＳＣより誘導した肝細胞は均質に分化誘導することが困難であるが、ＰＧＥＣより分化した細胞は均質な形態学的特徴を有する肝細胞へと分化誘導することが可能であった（図１５-２）。したがって遺伝子発現解析の結果、ｉＰＳＣより誘導したＭＨ（ｉＰＳＣ-ＭＨ）と比較して、ＰＧＥＣ-ＭＨにおいて肝細胞マーカーが優位に高発現することが明らかとなった（図１６、下段）。
（３）継代後のＰＧＥＣの肝細胞分化誘導能の検討（図１７）。形態学的解析の結果、継代を繰り返した後も再現性良く、肝細胞を誘導できることが明らかとなった（図１７-１）。さらに、遺伝子発現解析および、ＥＬＩＳＡによるタンパク質分泌機能解析の結果、継代を繰り返したのちも高い肝細胞機能が発揮されることが判明し、それらは、ｉＰＳＣ-ＭＨと比較しても有意に高いことが明らかとなった（図１７-２）。興味深いことに、ＰＧＥＣ（Ｐ０）と比較して、ＰＧＥＣ（Ｐ５，  １０）の方が、ＡＬＢ分泌能が高く、肝細胞への分化能が高いものと考えられた（図１７-２、右）。
【００５７】
〔実施例４〕  ＰＧＥＣから膵細胞への分化
〔実験方法〕  ＰＧＥＣを用いた膵細胞の段階的誘導の方法（図１８）。
増幅を行ったＰＧＥＣをＲｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（１０ｎＭ）を添加したＰＧＥＣ維持培地を用いて、播種密度が翌日に６０〜１００％程度になるようマトリゲルコーティングしたｄｉｓｈに播種する。翌日、細胞が６０〜１００％コンフルであることを確認し、ＰＧＥＣ維持培地にＡｃｔｉｖｉｎ（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地で培地交換し、２日間培養した。（６０％コンフル以下の場合はＰＧＥ維持培地で培地交換を行い、６０％コンフル以上になるまで培養する。）  培養後、ＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地にＬ-ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  （２ｍＭ）、Ｂ２７  （１％）、ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  （５０μｇ／ｍｌ）、Ｎｏｇｇｉｎ  （２５ｎｇ／ｍｌ）、Ａ８３-０１  （１μＭ）、ＲＡ  （２μＭ）、ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ  （０．２５μＭ）を添加した培地で培地交換し、３日間培養した。更に、ＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地にＬ-ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  （２ｍＭ）、Ｂ２７  （１％）、ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  （５０μｇ／ｍｌ）、Ｎｏｇｇｉｎ  （２５ｎｇ／ｍｌ）、ＳＢ４３１５４２  （６μＭ）、Ｉｎｓｕｌｉｎ（８００ｐＭ）  及び  Ｎｉｃｏｔａｎａｍｉｄｅ  （１０ｍＭ）を添加した培地で培地交換を行い、１日間培養した。その後、ＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地にＬ-ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  （２ｍＭ）、ｇｌｕｃｏｓｅ  （２０ｍＭ）、ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  （５０μｇ／ｍｌ）、ＳＢ４３１５４２  （６μＭ）、２-Ｍ  Ｉｎｓｕｌｉｎ（８００ｐＭ）  及び  Ｎｉｃｏｔａｎａｍｉｄｅ  （１０ｍＭ）を添加した培地で１２日間培養し、膵細胞へと終末分化誘導を行った。
【００５８】
〔実験結果〕
（１）ＰＧＥＣから段階的に誘導した膵細胞の形態学的解析（図１８）。ＰＧＥＣ  から膵細胞、特に、インスリン分泌細胞への分化誘導プロトコルを記載した  （図１８）  。ＰＧＥ-２ｄを  Ｎｏｇｇｉｎ、  ＫＡＡＤ-ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ、ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  （ＮＣＲ）存在下で三日間培養することでＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を誘導した。さらに６日目から１２日目までは、Ｂ２７  など記載の因子を含むＨ２１  （ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）  培地にて培養を行い、１２日の段階において膵細胞を誘導されることを確認した。
（２）免疫染色の結果、ＰＧＥＣ由膵細胞は、膵臓前駆細胞マーカーであるＰＤＸ１、内分泌細胞マーカーであるＩＮＳＵＬＩＮ，  ＧＬＵＣＡＧＯＮ，  ＳＯＭＡＴＯＳＴＡＴＩＮ、外分泌細胞マーカーであるＡＭＹＬＡＳＥに陽性の細胞へと分化誘導された（図１９）。
（３）遺伝子発現解析の結果、ＩＮＳＵＬＩＮ、ＰＤＸ１の発現が増強し、β細胞への分化誘導が確認された（図２０）。
【００５９】
〔実施例５〕  ＰＧＥＣから腸組織への分化
〔実験方法〕  ＰＧＥＣを用いた腸組織の段階的誘導の方法（図２１）。
増幅を行ったＰＧＥＣをＲｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（１０ｎＭ）を添加したＰＧＥＣ維持培地を用いて、図２１に記載のとおり、予めＢ２７  １％、Ｒ-Ｓｐｏｎｄｉｎ１（５００ｎｇ／ｍｌ）、Ｎｏｇｇｉｎ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を含むマトリゲルをコーティングしたｄｉｓｈに播種を行った。そののち、細胞播種したあとにも、Ｂ２７  １％、Ｒ-Ｓｐｏｎｄｉｎ１（５００ｎｇ／ｍｌ）、Ｎｏｇｇｉｎ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を含むマトリゲルを再度添加し、包埋した上で、１〜２２日目までは、Ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、Ｌ-ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、  Ｂ２７  ２ｍｌ／５０ｍｌ、ＨＥＰＥＳ（１５ｍＭ）、Ｒ-Ｓｐｏｎｄｉｎ１（５００ｎｇ／ｍｌ）、Ｎｏｇｇｉｎ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、を各々含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２  ａｄｖａｎｃｅｄ培地で培養した。２２日目には、再度、Ｂ２７  １％、Ｒ-Ｓｐｏｎｄｉｎ１（５００ｎｇ／ｍｌ）、Ｎｏｇｇｉｎ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を含むマトリゲルを上から添加・包埋し、同様の培地で培養することにより腸組織の誘導を行った。培地交換は、２日に１回行った。得られた組織は、任意のタイミングで分散し、同様の手順で再播種することで腸組織を得ることが出来る。なお、腸組織を誘導するために必要なＰＧＥＣの細胞数は、単一ないし複数個のいずれからでも作製することが可能であった。
【００６０】
〔実験結果〕
（１）ＰＧＥＣからの腸組織誘導プロトコル（図２１）
（２）単一細胞より培養したＰＧＥＣは、顕微鏡観察の結果、積層化した上皮が敷き詰められた立体的なループ状構造を複数認める腸組織へと分化誘導されることが明らかとなった（図２２）。
【００６１】
実施例１〜４で用いた各種の測定方法。
・形態学的観察方法：図２、４、６、１５−１上、１５−２、１７−１、１８
位相差顕微鏡  （Ｏｌｙｍｐｕｓ）により観察を行った。
・マーカーの遺伝子発現解析：図５、９、１５−１下、１６−１、２０
Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰＣＲ  （ＱＲＴ-ＰＣＲ）  は、  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒａ  ４８０  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｒｏｃｈｅ）  ・ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒａ  ４８０  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ  （Ｒｏｃｈｅ）を用いて実験を行った。
・細胞の増殖曲線：図８左
増殖曲線は、継代・播種直後に１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ  （６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）  （Ｄ０）になるように播種を行い、３日後に細胞を剥離し細胞数をカウントする操作を繰り返すことにより作成した。  
・細胞倍化時間：図８右：  
増殖曲線より１次近似により得られた近似曲線における傾きから、任意の二つのタイミングでの細胞数をもとめ、以下の計算式に代入することにより求めた。（  （ｔ２  -  ｔ１）／３．３２  ｘ  （ｌｏｇ  ｎ２  -  ｌｏｇ  ｎ１）  ｗｈｅｒｅ  ｔ  ｉｓ  ｔｉｍｅ  ａｎｄ  ｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ．）
・ＦＡＣＳ解析：図１０
ＦＡＣＳ解析は、Ｔａｋｅｂｅ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ｉＰＳＣ-ｄｅｒｉｖｅｄ  ｏｒｇａｎ  ｂｕｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４９９，  ４８１-４８４  （２０１３）に記載の方法で実施した。剥離した細胞  （ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ／ＰＧＥＣ）を蛍光コンジュゲートモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）  で４℃、３０分、暗室でインキュベートしたのち、２％  ＦＢＳ  を含むＰＢＳ  で洗浄したのち、ＭｏＦｌｏ  （ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）によって解析を行った。使用した抗体は次のとおりである：ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ  （ＡＰＣ）-ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｈＣＤ１１７  （ｈＣ-ＫＩＴＡＰＣ）；  ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  （ＰＥ）-ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｈＣＤ１８４  （ｈＣＸＣＲ４ＰＥ）。
・マーカーの免疫染色：図１１、１２、１６、１９
培養した細胞をメタノール・３０  分・氷上固定を行い、１０％  ｎｏｒｍａｌ  ｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍ  （ＮＧＳ）にて６０分間ブロッキングを行った。次に、１次抗体  （１：２００）  を添加の後、４°Ｃ  ｏｖｅｒｎｉｇｈｔを行った。ＰＢＳによる洗浄操作ののち、適切な二次抗体（Ａｌｅｘａ-４８８，  -５５５，  ｏｒ  -６４７-ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  （１：５００；  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を調製・添加し、室温で６０分間反応させた。染色を行った細胞は、核染色  （ＤＡＰＩ）  をおこなったのち、  ＦＡ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｆｌｕｉｄにて封入を行った。写真は、Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅにて撮像した。
【００６２】
・ＰＡＳ  ｓｔａｉｎｉｎｇ：図１６右上
Ｇｉｅｍｓａ  ａｎｄ  Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ａｃｉｄ  Ｓｃｈｉｆｆ  （Ｗａｋｏ）  染色を、付属の説明書の方法にしたがって染色した。
・ＩＣＧ  ｕｐｔａｋｅ：図１６右下
ＤＭＳＯにて、２５ｍｇ／ｍｌになるようにストックされていたＣａｒｄｉｏｇｒｅｅｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ＃  Ｉ２６３３）  を、１ｍｇ／ｍｌ  （ｗｏｒｋｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）  になるように細胞培養用培地（ＤＭＥＭ）に希釈した。培養中のＰＧＥＣ-ＭＨを、先に調製したＤＭＥＭ培地（１ｍｇ／ｍｌ  ｃａｒｄｉｏｇｒｅｅｎ  （５００μｌ／２４ｗｅｌｌ））に３７℃、３〜６時間インキュベートした。そののち、通常の細胞培養用培地に交換した上で、顕微鏡観察によりＩＣＧの取り込みを確認した。
・ＡＬＢ分泌能の測定：図１７右
ＡＬＢ分泌の測定は、Ｔａｋｅｂｅ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ｉＰＳＣ-ｄｅｒｉｖｅｄ  ｏｒｇａｎ  ｂｕｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４９９，  ４８１-４８４  （２０１３）に記載の方法で実施した。培地交換後、１日目の培地を回収し、Ｈｕｍａｎ  Ａｌｂｕｍｉｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）  を用い、付属の説明書の方法にしたがって計測を行った。
【００６３】
〔実施例６〕１継代目以降の特異的マーカー
実施例２に記載の方法によって、取得した全遺伝子の網羅的発現解析の結果から、ｉＰＳＣ，  ＤＥ，  ＰＧＥＣ（Ｐ０）の３つに対して、ＰＧＥＣ（Ｐ１以降）で特異的に、最も大きく発現増加または、減少した遺伝子を抽出した（表５および、図２３）。すなわち、ＰＧＥＣ（Ｐ１以降）の全サンプルで共通して高発現ないし、低発現を示すマーカー遺伝子のリストを示す。
【００６４】
【表５】
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【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明により、組織・臓器を作製するための材料となる臓器細胞を、高品質かつ安定的に調製することが可能となった。本発明の技術は、創薬スクリーニングや再生医療へ応用できる。
【要約】
【課題】ヒト臓器細胞を安価に安定的かつ大量に誘導するための基盤技術を提供すること。
【解決手段】多能性幹細胞を分化させた後、継代を少なくとも１回以上実施した後に誘導される細胞であって、未分化（多能性）細胞マーカーである、ＮＡＮＯＧ，  ＯＣＴ４，  ＭＹＣ，  ＬＩＮ２８Ａが陰性であり、内胚葉細胞マーカーである、ＣＸＣＲ４，  ＣＥＲ１，  ＨＨＥＸ，  ＧＡＴＡ４が陰性であり、腸内胚葉細胞マーカーである、ＣＤＸ２，  ＨＯＸＢ９が陽性であり、さらに、間葉系細胞マーカーであるブラキュリ（Ｔ）が陰性であり、膵細胞マーカーである、ＰＤＸ１が陰性であり、少なくとも肝細胞、膵細胞及び腸細胞に分化しうる細胞。上記細胞の作製方法及び増幅方法、上記細胞を用いて臓器細胞を作製する方法、上記細胞を凍結・保存し、臓器細胞を製造するためのワーキングセルバンクを構築する方法も提供する。
【選択図】図１５−２【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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