(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料における特定のマイクロＲＮＡ分子の増幅のための方法であって：
ａ）試料におけるＲＮＡ分子の集合にポリＡテールを添加する工程；
ｂ）逆転写反応において伸展プライマーを使用して、ポリＡテール化したＲＮＡ分子のｃＤＮＡ分子を生成する工程；及び
ｃ）上記特定のマイクロＲＮＡ分子に特異的である、順方向プライマー及び逆方向プライマーをいずれも使用して、ＰＣＲによってｃＤＮＡ分子を増幅する工程、
を含んでなり、ここで上記伸展プライマーが
式ＩＩＩ：
Ｒ1−（Ｔ）ｙ−Ｒ2（ＩＩＩ）
（式中、
Ｒ1が、５’末端ヌクレオチド配列であり、
（Ｔ）ｙは、ｙ個連続したチミン残基の中央部分であり、ここでｙが５〜５０の整数であり、そして
Ｒ2が、２つ又は３つの３’末端ヌクレオチド残基からそれぞれ成る配列モチーフＶＮ又はＶＮＮであり、
Ｖはアデニン残基、グアニン残基、又はシトシン残基であり、Ｎはアデニン残基、グアニン残基、シトシン残基又はチミン残基である）
のヌクレオチド配列であり、
逆方向プライマーが、式ＩＩ：
Ｒ3−（Ｔ）ｘ−Ｒ4（ＩＩ）
（式中、
Ｒ3は、５’末端ヌクレオチド配列であり、
（Ｔ）ｘは、ｘ個連続したチミン残基の中央部分であり、ここでｘが５〜５０の整数であり、
Ｒ4が、標的マイクロＲＮＡ分子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成する３’末端ヌクレオチド配列である）
のヌクレオチド配列であり、
順方向プライマー又は逆方向プライマーのＲ4が、少なくとも１つのＬＮＡを含む、方法。
【請求項２】
前記順方向プライマー及び逆方向プライマーのＲ4がともに、少なくとも１つのＬＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｙが、５〜２１の整数である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記伸展プライマーが、少なくとも１つのＬＮＡを含んでなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記式（ＩＩ）のｘが、式（ＩＩＩ）のｙと同等である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記順方向プライマーが、標的ＲＮＡ分子の相補的ＤＮＡ分子と特異的にハイブリッド形成するようにデザインされる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｒ4が、標的ＲＮＡの３’末端と特異的にハイブリッド形成するようにデザインされる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
生物由来の試料における標的マイクロＲＮＡの量を測定するための方法であって：
ａ）請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法に従って、標的マイクロＲＮＡを増幅する工程、
ｂ）増幅されたＤＮＡ分子の量を測定する工程、
を含んでなる方法。
【請求項９】
標的マイクロＲＮＡの検出に特異的な少なくとも１つのプライマーセットを含んでなる、少なくとも１つの標的マイクロＲＮＡを検出するためのキットであって、
上記プライマーセットが：
ａ）式ＩＩＩ：
Ｒ1−（Ｔ）ｙ−Ｒ2（ＩＩＩ）
（式中、
Ｒ1は、５’末端ヌクレオチド配列であり、
（Ｔ）ｙは、ｙ個連続したチミン残基の中央部分であり、ここでｙが５〜５０の整数であり、
Ｒ2が、２つ又は３つの３’末端ヌクレオチド残基からそれぞれ成る配列モチーフＶＮ又はＶＮＮであり、
Ｖはアデニン残基、グアニン残基、又はシトシン残基であり、Ｎはアデニン残基、グアニン残基、シトシン残基又はチミン残基である）
の伸展プライマー
ｂ）式ＩＩ：
Ｒ3−（Ｔ）ｘ−Ｒ4（ＩＩ）
（式中、
Ｒ3は、５’末端ヌクレオチド配列であり、
（Ｔ）ｘは、ｘ個連続したチミン残基の中央部分であり、ここでｘが５〜５０の整数であり、
Ｒ4が、標的ＲＮＡ分子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成する、３’末端ヌクレオチド配列である）
の逆方向プライマー、並びに
ｃ）順方向プライマー、
を含んでなり、
順方向プライマー及び逆方向プライマーのＲ4がともに、少なくとも１つのＬＮＡを含み、
前記式（ＩＩ）のｘが、式（ＩＩＩ）のｙと同等である、キット。
【請求項１０】
前記伸展プライマーが、少なくとも１つのＬＮＡを含んでなる、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
標的マイクロＲＮＡの検出に特異的な少なくとも１つのプライマーセットを含んでなる、少なくとも１つの哺乳類標的マイクロＲＮＡを検出するための、請求項９又は１０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、定量的逆転写ＰＣＲ（qRT-PCR）技術を使用した低分子非翻訳領域ＲＮＡ分子の増幅及び定量化のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
マイクロＲＮＡは、約２２個のヌクレオチド非翻訳領域ＲＮＡの豊富なクラスであり、動物、植物及びウイルスの発生において重要な制御的役割を果たす。マイクロＲＮＡは約１５年前にｌｉｎ−４の発見によって、線形動物Ｃ．エレガンスの生活環及び幼生の発生におけるタイミング及び進行に関与する低分子ＲＮＡをコードすることが認識されたが（Lee et al. 1993 Cell 75:843-854, Wightman et al.1993 Cell 75:855362）、最近になってやっと、マイクロＲＮＡが動物において広範の制御機能を有する主要クラスのリボレギュレーターを形成することが認められた（Lagos-Quintana et al. 2001 Science 294:853858, Lau et al. 2001 Science 294:858-862, Lee and Ambros. 2001 Science 294:862-86）。それ以降、マイクロＲＮＡの研究における革命が生じ、今日ｍｉＲＢａｓｅ データベースバージョン１２．０（http://microrna.sanqer.ac.uk/）には８６６人のヒトマイクロＲＮＡが含まれ、ＰｕｂＭｅｄデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.αov/pubmed/）には３９００個のマイクロＲＮＡ関連論文が含まれ、これらはマイクロＲＮＡの関心及び重要性を反映している。
【０００３】
マイクロＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ標的の翻訳の低下又はグロックすることによって転写後のレベルにおいて遺伝子発現の制御に関与し、約３０％のヒトゲノムはマイクロＲＮＡによって制御されると推測されている。マイクロＲＮＡの重要性はまた、発生、成長及び増殖、アポトーシス、分化、並びに様々なヒトの疾患（http://www.mir2disease.org/）、例えば癌及び糖尿病を含む様々な細胞プロセスにおけるこれらの関与に起因して明らかである。
【０００４】
癌におけるマイクロＲＮＡの重要性は、最近の論文（Barbarotto et al 2008 Int. J. Cancer. 122:969-977）で強調されており、ヒトの癌におけるｍｉＲＮＡの関与に関する主要なパラダイムを要約している。従って、（i）ｍｉＲＮＡは各タイプの分析されたヒトの癌において変化を受け；（ii）ｍｉＲＮＡは癌遺伝子及び腫瘍抑制因子として機能し；（iii）ｍｉＲＮＡ変化は、癌素因を生じ；（iv）ｍｉＲＮＡプロファイリングは、癌患者のための新たな診断ツールであり、（v）ｍｉＲＮＡプロファイリングは癌患者のための予後ツールを表す。従って、癌患者由来の細胞及び体液中のマイクロＲＮＡの発現プロファイリング及び定量化のための方法は、非常に重要である。この必要性に取り組むために、本発明はマイクロＲＮＡ測定のための新たなロバスト且つ信頼性のあるｑＲＴ−ＰＣＲアッセイの開発を説明する。
【０００５】
ｑＲＴ−ＰＣＲ法によるマイクロＲＮＡの定量化は、２１〜２５個のヌクレオチドのみの小型のマイクロＲＮＡのために非常に困難であり、この大きさはＰＣＲのために通常使用されるプライマーのサイズである。この課題に対する解決は、Ｒａｙｍｏｎｄ等のＲＮＡ．２００５ Ｎｏｖ；ｌｌ（11）：１７３７〜４４，Ｇｉｌａｄ等のＰＬｏＳ ＯＮＥ．２００８ Ｓｅｐ ５；３（9）：ｅ３１４８及びＳｈａｒｂａｔｉ−Ｔｅｈｒａｎｉ等のＢＭＣ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ．２００８，９：３４に発表されている。Ｒａｙｍｏｎｄ等は、遺伝子特異的逆転写工程、続くロックド核酸（LNA）分子及びユニバーサル逆方向プライマーを含む遺伝子特異的順方向プライマーを使用したＳＹＢＲ（登録商標）ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ工程を含むｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを説明する。Ｇｉｌａｄ等は、ポリアデニル化工程、非特異的逆転写工程、並びに遺伝子特異的順方向プライマー、遺伝子特異的ＴａｑＭａｎプライマー及びユニバーサル逆方向プライマーを含むｑＰＣＲ工程を含むｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを報告する。Ｓｈａｒｂａｔｉ−Ｔｅｈｒａｎｉ等は、遺伝子特異的逆転写工程、続く遺伝子特異的順方向プライマー及び２個のユニバーサルプライマーを使用したＳＹＢＲ（登録商標）ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ工程を含むｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを開発した。
【０００６】
しかしながら、ｑＲＴ−ＰＣＲによるマイクロＲＮＡの定量化のための現存する技術はマイクロＲＮＡアッセイに関する現在の必要性を満たさず、密接に関係したマイクロＲＮＡ間の識別を可能にする高特異性、高感度、低バックグラウンド及び比較的単純な手順が必要である。
【０００７】
本発明は、試料中の全てのマイクロＲＮＡのためのたった１つの逆転写反応を特徴とし、さらに低分子ＲＮＡ分子、例えばマイクロＲＮＡ等の正確な定量化のために使用することができる、比類のないほどの特異性を有する非常に高感度のＰＣＲ方法を供する。
【発明の概要】
【０００８】
様々なヒト疾患、例えば癌と関連したマイクロＲＮＡ制御不全のパターンを確立及び理解するには、ヒト細胞及び体液中のマイクロＲＮＡの検出及び定量化のための新規の、改良された技術が必要である。本発明は、この目的のために新たな高感度且つ特異的アッセイを紹介する。
【０００９】
一態様において、本発明は、試料中のマイクロＲＮＡ分子を増幅及び定量化するための手順を供し：手順の第一工程において、１つのチューブ内反応（one-tube-reaction）における２つの酵素の協調作用によって、試料中のマイクロＲＮＡの相補的ＤＮＡ（cDNA）を生成する。第一に、ポリ（A）ポリメラーゼを使用してポリＡテールをマイクロＲＮＡの３’終端に添加し、次に伸展プライマーをポリＡテールとハイブリッド形成させ、マイクロＲＮＡをテンプレートとして使用して逆転写酵素によってｃＤＮＡを生成する。第一工程は非特異的であり、試料中に存在する全マイクロＲＮＡのｃＤＮＡを生成する。手順の第二工程において、ＬＮＡ単量体を含む順及び逆方向プライマーのマイクロＲＮＡ特異的プライマーセットを使用してｑＰＣＲ反応において特異的ｃＤＮＡを増幅し定量化する。
【００１０】
他の態様において、本発明は、表１８（配列番号1〜配列番号128）に収載されるオリゴヌクレオチドプライマーを供する。
【００１１】
本発明のプライマーは、本発明の方法を使用して、哺乳類マイクロＲＮＡを検出するために使用することができる。
【００１２】
他の態様において、本発明は、哺乳類マイクロＲＮＡの検出のためのキットであって、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡのサブセット若しくは全ての周知のマイクロＲＮＡの定量化のためのユニバーサル伸展プライマー並びにマイクロＲＮＡ特異的順及び逆方向プライマーセットを含んでなるキットを供する。
【００１３】
本発明は、信頼性があり且つ特異的な定量的マイクロＲＮＡアッセイに有用であり、当該アッセイには、単一のアッセイ又はロボットプラットフォーム上での高処理量の適用を使用した、疾患、例えば癌を診断及び予後診断するためのアッセイを含む。生物、例えば哺乳類及び植物に由来する様々な細胞型、並びにウイルス感染細胞を含む様々な細胞型から抽出されたＲＮＡ含有試料は、本発明の方法を使用して分析されてよい。
【００１４】
本発明はマイクロＲＮＡの定量化のための方法を供することを主たる目的とするが、全タイプのＲＮＡ、特に全タイプの低分子非翻訳領域ＲＮＡの検出及び／又は定量化に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の特異的ｑＲＴ−ＰＣＲに関する工程を示す。原理を説明するために、マイクロＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲは一例として役立つものであり、当該方法によって分析されるＲＮＡは同様に任意の他の低分子ＲＮＡ分子又はｍＲＮＡであってよい。工程１は、試料中に存在する全マイクロＲＮＡのための１つのチューブ内反応である。工程２は、特異的マイクロＲＮＡのための順及び逆方向プライマーペアを使用したマイクロＲＮＡ特異的ｑＰＣＲである。卵形の記号は、順及び逆方向プライマー中のＬＮＡの挿入を示す。方法を実際に実施する場合、試料中に存在するｍｉＲＮＡは、まずポリ（A）ポリメラーゼを使用してポリＡテール化され（tailed）、アデニン残基がＲＮＡ分子の３’末端に添加される。次に、ポリ−Ｔコアヌクレオチド配列、３’末端ＶＮ−縮重モチーフ及び５’末端テールを有する伸展プライマーを、伸展プライマーのＶＮ−ポリ−Ｔ配列（N=C, G, A 及びT; V= C, G, 及びA）とのハイブリッド形成法を介して、ポリＡテール化したｍｉＲＮＡとアニーリングする。このプライマーは、ユニバーサルＲＴプライマーと呼ぶ。続いて、ｍｉＲＮＡをテンプレートとして使用して、逆転写反応において伸展プライマーを伸展した。これらの反応は全て１つのチューブ内反応において実施した。生じた第一の伸展生成物は伸展プライマー及び新たに合成されたＤＮＡから成り、これは試料中の全ｍｉＲＮＡに相補的なｃＤＮＡである。次の工程において、ｍｉＲＮＡ特異的ＰＣＲを実施する。ｍｉＲＮＡ特異的な順方向プライマーを、新たに合成されたｃＤＮＡの３’末端とアニーリングし、第一の伸展生成物をテンプレートとして使用して、ＤＮＡ重合反応において順方向プライマーを伸展することによって上鎖（upper-strand）合成を実施する。ｍｉＲＮＡ特異的３’末端配列、ポリ−Ｔ−伸展及び５’末端テールから成る、ｍｉＲＮＡ特異的逆方向プライマーを、続いて上鎖とハイブリッド形成させ、下鎖を逆方向プライマーの伸展によって合成する。本発明の方法の様々な実証を実施例セクションで説明する。
【図２】図２は、順方向プライマー５’−ｔｔｍＣａｃｃａｃｃｔｔｃｔｃｃａ（配列番号1）及び逆方向プライマー５’−ｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔＧｃｔｇｇｇｔ（配列番号2）でのｈｓａ−ｍｉＲ−１９７（実施例1）の増幅を示す。合成テンプレート：ポリＡテール化（Tailing）／ＲＴのために合成ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７の１０７個のコピーを使用した。１０５個のコピーに相当する量をＰＣＲに使用した。総ヒトＲＮＡ：１００ｎｇの総ヒトＲＮＡをポリＡテール化／ＲＴに使用した（工程1）。１ｎｇに相当する量をＰＣＲに使用した。負の対照：ＲＴ反応における水の対照及びポリＡポリメラーゼ欠乏の総ヒトＲＮＡ対照。黒線は合成テンプレートで得られた結果を指定し、一方灰色線は総ヒトＲＮＡでテンプレートとして得られた結果を示す。合成テンプレート及び総ヒトＲＮＡで得られた結果の融解曲線はほぼ同一である。
【図３】図３は、実施例２の融解曲線の増幅曲線及び一次導関数を示す。
【図４】図４は、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａと変異体ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅとの間の識別を説明する、実施例４の増幅プロットを示す。負の対照由来の増幅シグナルもまた示す。
【図５Ａ】図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、ＰＣＲ増幅及び成熟ｍｉＲ、プレｍｉＲ及びプリｍｉＲの間の識別を可能にする方法及びプロセスを示す。実施例６、７及び８を参照されたい。Ａ）全てのＲＮＡ３’末端のポリアデニル化。Ｂ）ユニバーサルＲＴプライマーを使用したポリアデニル化ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写（N=C, G, A及びT; V=C, G, 及びA）。Ｃ）遺伝子特異的プライマーを使用したマイクロＲＮＡ特異的ＰＣＲ増幅。遺伝子特異的逆方向プライマーとの組合せにおけるポリアデニル化の部位によって、分子成熟ｍｉＲ、プレｍｉＲ及びプリｍｉＲそれぞれの特異的検出が確実となることに留意されたい。図５Ａは、成熟ｍｉＲをアッセイするために使用したアッセイを説明する。
【図５Ｂ】図５Ｂは、プレｍｉＲをアッセイするために使用したアッセイを説明する。
【図５Ｃ】図５Ｃは、プリｍｉＲをアッセイするために使用したアッセイを説明する。
【図６】図６は、（A）プレｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０３及び非テンプレート対照（NTC）上のプレｍｉｒ−２０３アッセイの増幅曲線を示す。（B）プレｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０３及び非テンプレート対照（NTC）上の（A）のｍｉＲ−２０３アッセイの増幅曲線を示す。
【図７】図７は、心臓及び肝臓中の選択したｍｉＲＮＡ遺伝子のパネルの異なる発現を示す。データは、心臓及び肝臓間のクロッシングポイント（crossing point）（Cp）値（ΔCp）の違いとして示し、表１５を参照されたい。
【図８】図８は、本発明の方法によってアッセイし、試料中に存在する全てのマイクロＲＮＡに関して１つのチューブ内反応として逆転写を実施した市販の方法（球に結合している灰色線）と比較した、収載された４個のｍｉＲそれぞれの検出を示す（ひし形に結合している黒線）。図は、テンプレート濃度に応じたクロッシングポイント（Cp）値を表す。各値を３通り示している。
【００１６】
定義
「低分子ＲＮＡ分子」は、生細胞中の小さなＲＮＡ分子、例えば低分子の「非翻訳領域ＲＮＡ分子」、すなわちタンパク質に翻訳されない分子を意味する。非翻訳領域ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ、例えばマイクロＲＮＡ（miRNA）、低分子干渉ＲＮＡ（siRNA）、低分子核内ＲＮＡ（snRNA）、低分子核小体ＲＮＡ（snoRNA）、小分子ＲＮＡ（stRNA）、アンチジーンＲＮＡ（agRNA）及びＰｉｗｉ結合ＲＮＡ（piRNA）を含む。
【００１７】
用語「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」及び「ｍｉＲ」は同意語として使用し、生物、例えば動物及び植物の内在性遺伝子に由来する、２１〜２５のヌクレオチド非翻訳領域ＲＮＡを意味する。これらのいわゆる成熟ｍｉＲＮＡは、生物学的に活性があり、約７５のヌクレオチド長を有しプレｍｉＲＮＡ（プレmiR）と呼ばれる長いヘアピン様前駆体からプロセシングされる。プレｍｉＲＮＡの前駆体は、５００〜３０００ヌクレオチド長のプリｍｉＲＮＡ（プリmiR）である。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＰと呼ばれる複合体中に集合し、メッセンジャーＲＮＡへの結合及び翻訳効率の干渉によって、重要な生物プロセスに主要な制御因子として機能する。本発明の標的マイクロＲＮＡは、周知の全マイクロＲＮＡ、例えば科学文献及びパブリックデータベース、例えばＳａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＵＫによって管理されるＷｅｂ上のマイクロＲＮＡデータのホームページであるｍｉＲＢａｓｅデータベース（http://microrna.sanger.ac.uk/）から周知のマイクロＲＮＡを意味する。ｍｉＲＢａｓｅ ｒｅｌｅａｓｅ １２は、明細書中で参照により取り込まれ、その中で開示される全ての成熟ｍｉＲＮＡ及びプレ成熟ｍｉＲＮＡ配列を含む。「マイクロＲＮＡプロファイリング」は、特定疾患、例えば癌疾患に関してマイクロＲＮＡサインを構築するために試料、例えば腫瘍試料中の全マイクロＲＮＡの発現レベルを測定する、広域的分析を説明する。
「ポリＡテールの添加」、「ポリ−Ａテール化」及び「ポリアデニル化」は、ＲＮＡ分子の３’終末におけるポリ（A）テールの合成、全塩基がアデニンであるＲＮＡの伸展を意味する。ポリアデニル化は、生物における自然の生物プロセスであるが、様々なポリメラーゼ、例えば市販の大腸菌ポリ（A）ポリメラーゼＩ（E-PAP）を使用して、インビボ（in vitro）で実施することもまた可能である。
【００１８】
「伸展プライマー」及び「ＲＴプライマー」は、標的デオキシリボ核酸及び／又はリボ核酸配列中の配列、例えば標的リボ核酸配列における成熟マイクロＲＮＡ又は低分子非翻訳領域ＲＮＡの３’末端に相補的な認識配列、並びにＰＣＲによって生じる増幅に必須のアンカー配列を含んでなるオリゴヌクレオチドプライマーを意味する。当該伸展プライマーは、プライマー伸展生成物又はｃＤＮＡを生じるための逆転写反応におけるアンカードプライマーとして使用する。
【００１９】
「ｃＤＮＡ」は、逆転写酵素を使用してＲＮＡテンプレートの逆転写によって生成される相補的ＤＮＡを意味する。ｃＤＮＡ分子を合成するために、任意の逆転写酵素、例えばモロニーマウス白血病ウイルス（M-MuLV）逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（AMV）逆転写酵素、ウシ白血病ウイルス（BLV）逆転写酵素、ラウス肉腫ウイルス（RSV）逆転写酵素及びヒト免疫不全ウイルス（HIV）逆転写酵素に由来する逆転写酵素を使用することができる。
【００２０】
「プライマー」は、通常約２０〜３０塩基長を有する、短く、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを意味する。これらは、標的ＤＮＡとハイブリッド形成し、続いて相補的ＤＮＡ鎖を生成するためにＤＮＡポリメラーゼによって複製される。「順方向プライマー」及び「逆方向プライマー」は、ＰＣＲにおいて使用される「ＰＣＲプライマーセット」を構成し、ＰＣＲにおいてこれらは相補的ＤＮＡ鎖とハイブリッド形成し、互いの方への直接的複製は上鎖及び下鎖を生じ、それぞれ標的ＤＮＡ断片における指数関数的増加に繋がっている。ＰＣＲプライマーのテンプレート由来の伸展は、任意のＤＮＡポリメラーゼ、例えば、サーマスアクアチクス（Thermus aquaticus）由来のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ピュロコックスフリオスス（Pyrococcus furiosus）由来のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカスリトラリス（Thermococcus litoralis）由来のＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼを含む細菌性耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、又は組換えＤＮＡポリメラーゼ、例えばＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼによって実施することができる。
【００２１】
用語「増幅」、「ＰＣＲ」、「ＰＣＲ反応」及び「ＰＣＲ増幅」は、核酸増幅システムの使用を示すために使用する互換的用語であり、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用して標的核酸を増加する。
【００２２】
「ｑＰＣＲ」及び「リアルタイム定量的ＰＣＲ」は、標的ＤＮＡ分子を増幅し同時に定量化するためのＰＣＲの使用を意味する。ＤＮＡインプットに基準化される場合、ｑＰＣＲによって、ＤＮＡ試料中のコピーの数、又は特異的配列の相対量の検出及び定量化のどちらも可能である。増幅されたＤＮＡは各増幅サイクルの後にリアルタイムで反応中に蓄積するので、定量化される。二本鎖ＤＮＡとインターカレート（intercalate）する蛍光染料、例えばＳＹＢＲ（登録商標）ｇｒｅｅｎ、及び増幅プロセス中に蛍光シグナルを放出する蛍光レポーターオリゴヌクレオチドプローブ、例えばＴａｑｍａｎプローブを含む様々なアッセイ化学を使用して定量化は達成される。
【００２３】
「ｑＲＴ−ＰＣＲ」は、逆転写反応において生成されたｃＤＮＡが増幅プロセスのための初回のＤＮＡテンプレートとして役立ち、続いて特定の細胞又は組織タイプの試料中のＲＮＡ分子、例えばマイクロＲＮＡの低含量を定量化するためにｑＰＣＲと組合せた、定量的逆転写ＰＣＲを意味する。ｑＰＣＲ及びｑＲＴ−ＰＣＲのための方法は、「定量的ＰＣＲのＡ〜Ｚ」において説明され（Bustin, SA (ed) International University Line (La JoIIa, CA, USA), 2004）、これは全体において明細書中で参照により取り込まれる。
【００２４】
「ハイブリッド形成法」は、２つの相補的一本鎖核酸ポリマー（例えば、オリゴヌクレオチド）、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、又はヌクレオチド類似体を含んでなる又はから成るポリマー（例えば、LNAオリゴヌクレオチド）の結合を意味する。ハイブリッド形成法は高特異的であり、塩濃度及び温度の制御によって制御されてよい。ハイブリッド形成法は、相補的配列間で生じるが、ミスマッチを含んでなる配列間で生じてもよい。従って、本発明の方法で使用するオリゴヌクレオチドは、標的分子に対して１００％相補的であってよい。あるいは、一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１又は２つのミスマッチを含んでよい。
【００２５】
用語オリゴヌクレオチドの「Ｔｍ」又は「融解温度」は、明細書中では、オリゴヌクレオチド、及び１１５ｍＭ Ｎａ＋、ホルムアミドの非存在下で決定されるその完全な相補的ＤＮＡ鎖間に形成される二重鎖の安定性の尺度である。一般的にＴｍは、オリゴヌクレオチド及び相補ヌクレオチド鎖間に形成される二重鎖の５０％が一本鎖に解離される温度として定義される。長さ及びヌクレオチド組成、例えばヌクレオチドの配列及びオリゴヌクレオチドのＧ及びＣヌクレオチドの量は、Ｔｍに影響する重要な因子である。通常のＡ、Ｇ、Ｃ及びＴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド中の対応するＬＮＡ分子との置換は、Ｔｍを増加する。同様に、塩濃度、オリゴヌクレオチド濃度、及び変性剤（例えば、ホルムアミド若しくはDMSO）の存在によって規定されるハイブリッド形成法条件は、Ｔｍに影響する。分子生物学の当業者にとって、理論上のＴｍの計算のための有用な式が、ＰＣＲ、サザン及びノーザンブロット、並びにインサイツハイブリダイゼーションのためのオリゴヌクレオチドのＴｍを評価するために開発されていることは周知である。Ｔｍカリキュレーターの例は、ＯｌｉｇｏＣａｌｃ（W. A. Kibbe (2007) Nucleic Acids Res Volume 35, Web Server issue W43-W46）及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｉｑｏｎ．ｃｏｍ／ｏｌｉａｏ−ｔｏｏｌｓのＬＮＡプローブＴｍ Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒである。
【００２６】
明細書中で使用される用語「塩基」は、自然発生の核酸塩基アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）、チミン（T）及びウラシル（U）並びに非自然発生の核酸塩基、例えばキサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ６，Ｎ６−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニル−シトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、シュードイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イソシン及びＢｅｎｎｅｒ等の、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，４３２，２７２並びにＳｕｓａｎ Ｍ． Ｆｒｅｉｅｒ及びＫａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ Ａｌｔｍａｎｎの、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：４４２９〜４４４３，１９９７に記載される「非自然発生の」核酸塩基を包含する。従って、用語「核酸塩基」は、周知のプリン及びピリミジン複素環だけでなく、複素環類似体及びこれらの互変異性体を含む。さらに、自然発生及び非自然発生の核酸塩基は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．３，６８７，８０８；ｉｎ ｃｈａｐｔｅｒ １５ ｂｙ Ｓａｎｇｈｖｉ，ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ ａｎｄ Ｂ．Ｌｅｂｌｅｕ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３；ｉｎ Ｅｎｇｌｉｓｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３〜７２２，１９９１において開示されるものを含む（特に、ページ622及び623, 並びにthe Concise Encyclopedia of Plymer Science and Engineering, J. I. Kroschwitz Ed., John Wiley & Sons, pages 858-859, 1990, Cook, Anti-Cancer DrugDesign 6: 585-607, 1991を参照されたい。そしてこれらは全体において各々明細書中で参照により組み込まれる。）。
【００２７】
オリゴヌクレオチドに取り込まれるヌクレオチドは、ヌクレオチド残基と呼ばれる。
【００２８】
さらに、用語「ヌクレオシド塩基」又は「核酸塩基類似体」は、標準的な意味でヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基として機能することができる一定の「ユニバーサル塩基」を含む、様ヌクレオシド塩基として機能する複素環化合物を含むことを目的とする。特に、３−ニトロピロール又は５−ニトロインドールをユニバーサル塩基として言及する。他の好適な化合物には、ピレン及びピリジルオキサゾール誘導体、ピレニル、ピレニルメチルグリセロール誘導体等が含まれる。他の好適なユニバーサル塩基には、ピロ−ル、ジアゾール又はトリアゾール誘導体、当技術分野で周知のこれらのユニバーサル塩基が含まれる。
【００２９】
「ロックド核酸」、「ＬＮＡ」、「ＬＮＡモノマー」又は「ＬＮＡ分子」（例えば、LNAヌクレオシド若しくはLNAヌクレオチド）或いはＬＮＡオリゴマー（例えば、オリゴヌクレオチド若しくは核酸）は、少なくとも１つのＬＮＡ単量体を含むヌクレオシド又はヌクレオチド類似体を意味する。
【００３０】
ＬＮＡと本明細書中で示されるオリゴヌクレオチド配列を含むＬＮＡ中の自然発生のヌクレオチド残基とを識別するために、ＬＮＡを大文字、一方自然発生のヌクレオチド残基を小文字によって示し：ｍＣはＬＮＡメチルシトシンを意味する。
【００３１】
ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ９９／１４２２６において開示されるようなＬＮＡ単量体が、本発明のオリゴヌクレオチド中への組み込みに通常特に望ましい修飾核酸である。さらに、核酸は、当技術分野で周知の任意のタイプの修飾によって３’及び／又は５’末端において修飾されてよい。例えば、どちらかまたは両方の末端が保護基でキャップされ、フレキシブルな連結基に付着され、基質表面への付着に役立つために反応基に付着されてよく、例えば望ましいＬＮＡ単量体及びこれらの合成方法はまたＷＯ９８／３９３５２に開示される。
【００３２】
「ｏｘｙ−ＬＮＡ」とも呼ばれる好適なＬＮＡ単量体は、ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ０３／０２０７３９に開示されるように二環性化合物を含むＬＮＡ単量体であり、下記の式（I）と共に示されるようにＲ４’とＲ２’との間の架橋は−ＣＨ２−Ｏ−又は−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−を指定する。
【化１】
0005749656.tif 000002
【００３３】
明細書中の核酸ユニット、核酸残基、ＬＮＡ単量体、又は同様の用語への言及は、個々のヌクレオシドユニット及びヌクレオチドユニット並びにオリゴヌクレオチド中のヌクレオシドユニット及びヌクレオチドユニットいずれをも含むことを理解されたい。
【００３４】
「修飾された塩基」又は他の同様の用語は、天然の塩基（例えば、アデニン, グアニン, シトシン, ウラシル, 及び/又はチミン）とペアを形成することができ且つ／又は非自然発生のヌクレオチド又はヌクレオシド塩基とペアを形成することができる組成物（例えば、非自然発生のヌクレオチド又はヌクレオシド塩基）を意味する。望ましくは、修飾された塩基は、明細書中で記載されるように、１５、１２、１０、８、６、４、又は２度或いはそれ以下のＴｍ差を供する。好例の修飾された塩基は、ＥＰ１ ０７２ ６７９及びＷＯ９７／１２８９６に記載される。
【００３５】
用語「化学部分」は、分子の一部を意味する。従って、「化学部分によって修飾された」は、異常な化学構造を含む標準的な分子構造の修飾を意味する。当該構造の付着は共有結合性又は非共有結合性であってよい。
【００３６】
従って、オリゴヌクレオチドプローブ中の用語「化学部分の包含」は、分子構造の付着を意味する。例えば、化学部分には、不斉シアン染料、ＤＡＰＩ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＩＩ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、チアゾールオレンジ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、臭化エチジウム、１−Ｏ−（ｌ−ピレニルメチル）グリセロール及びＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８から成る群から選択される、共有結合及び／又は非共有結合で結合したマイナーグルーブ結合剤（MGB）及び／又は挿入核酸（INA）が含まれるが、これらに限定されない。他の化学部分は、修飾ヌクレオチド、ヌクレオシド塩基又はＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを含む。
【００３７】
「オリゴヌクレオチド類似体」は、特定の標的ヌクレオチド配列を認識する能力がある核酸結合分子を意味する。特定のオリゴヌクレオチド類似体は、オリゴヌクレオチドの糖リン酸がタンパク質様骨格と置換されるペプチド核酸（PNA）である。ＰＮＡにおいて、核酸形態と同形である、キメラシュードペプチド核酸構造を生じているヌクレオチドは無電荷ポリアミド骨格に付着される。
【００３８】
「高親和性ヌクレオチド類似体」又は「親和性増強ヌクレオチド類似体」は、少なくとも１つのこのような高親和性ヌクレオチド類似体と置換される場合に、オリゴヌクレオチドプローブの相補的認識配列に対する「結合親和性」を増大する非自然発生のヌクレオチド類似体を意味する。
【００３９】
明細書中で使用されるように、同一の配列を含んでなるが安定化ヌクレオチドを含まないプローブと比較して増大した「認識配列に関する結合親和性を有するプローブは、プローブ認識断片の結合定数（Ka）が二本鎖分子の相補鎖の結合定数より高いプローブを意味する。他の好適な実施形態において、プローブ認識断片の結合定数は、二本鎖分子の標的配列における認識配列の相補鎖の解離定数（Kd）より高い。
【００４０】
単量体は、ワトソンクリック塩基対ルール（例えば、GとC, AとT又はAとU）又は他の水素結合モチーフ、例えばＴとのジアミノプリン、Ｇとの５−メチルＣ、Ａとの２−チオチミジン、Ｃとのイソシン、Ｇとのシュードイソシトシン等の水素結合を形成することができるヌクレオチドを含む場合に、「相補的」であると言う。
【００４１】
「オリゴヌクレオチド」、「オリゴマー」又は「オリゴ」は、ヌクレオシド間の連鎖を介して結合した単量体（例えば、複素環塩基のグリコシド）の連続する鎖を意味する。オリゴ中の２つの連続する単量体間の連鎖は、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲＨ−、＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ＝ＮＲＨ、＞Ｃ＝Ｓ、−Ｓｉ（Ｒ’’）２−、−ＳＯ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｐ（Ｏ）２−、−ＰＯ（ＢＨ３）−、−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−、−Ｐ（Ｓ）２−、−ＰＯ（Ｒ’’）−、−ＰＯ（ＯＣＨ３）−、及び−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−から選択される、２〜４個、望ましくは３個の基／原子から成り、式中ＲＨは水素及びＣ１−４−アルキルから選択され、Ｒ’’はＣ１−６−アルキル及びフェニルから選択される。このような連鎖の説明的な例としては、
【化２】
0005749656.tif 000003
であり、式中、ＲＨは水素及びＣ１−４−アルキルから選択され、Ｒ’’はＣ１−６−アルキル及びフェニルから選択されることが特に望ましい。さらなる説明的な例は、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ等のＣｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９５，５，３４３〜３５５及びＳｕｓａｎ Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ及びＫａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ ＡｌｔｍａｎｎのＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，ｖｏｌ ２５，ｐｐ４４２９〜４４４３に記載される。ヌクレオシド間の連鎖の左側は、３’位の置換基Ｐ*として５員環に結合され、一方右側は前記の単量体の５’位に結合される。
【００４２】
用語「続く単量体」は、５’末端方向に隣接する単量体に関し、「前記の単量体」は、３’末端方向に隣接する単量体に関する。ＤＮＡ及びＲＮＡの天然合成が５’から３’方向に進行する一方で、多くの化学合成スキームは３’から５’方向に進行することに留意すべきである。
【００４３】
定量的ＰＣＲを実施する場合、試料由来の蛍光が閾値を通過するサイクルを「サイクル閾値」又はＣｔと呼ぶ。テンプレートの定量化のためにＣｔを使用する。
【００４４】
「クロッシングポイント」又はＣｐ値は、Ｃｔの使用に多少似た、テンプレートの定量化のために使用することができる、わずかに異なるが関連する値である。Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ソフトウェアは、全体の増幅曲線の二次導関数を算出し、この値はどこで最大であるかを決定する。この値（クロッシングポイント, Cp）は、蛍光の増加が最大であり、ＰＣＲの対数増殖期が始まるサイクルを表す。用語Ｃｔ及びＣｐはいずれも、Ｂｕｓｔｉｎ，ＳＡ（ed.）「定量的ＰＣＲのＡ〜Ｚ」Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｌｉｎｅ（La JoIIa, California, USA），２００４においてさらに説明され、これは明細書中で参照により含まれる。
【００４５】
適切には、「標的」又は「標的核酸」或いは「標的リボ核酸」は、例えば対象又はヒトに由来する、単一の特異的配列、例えば生物核酸の任意の関連核酸を意味する。ｍｉＲＮＡを検出するために本発明で使用されるオリゴヌクレオチド及び検出プローブの文脈の中で、「標的」はヒトｍｉＲＮＡ又はこの前駆体であるか、或いは一実施形態において、その中で得られる遺伝配列情報、例えばヌクレオチドの配列又はこの逆相補配列の全部又は（十分な）一部を保持する分子である。
【００４６】
「標的配列」は、任意の標的核酸内の特異的核酸配列（又は対応する核酸塩基配列）を意味する。
【００４７】
用語「プライマーデザイン」は、方法、例えば下記で供される方法を意味する。プライマーデザインは、順及び逆方向プライマーにおけるヌクレオチドの配列をデザインするために使用される体系的アプローチであり、従って標的マイクロＲＮＡへのプローブ特異性及び結合効率を保証する。次のルールはｍｉＲ特異的ｑＰＣＲのためのプライマーのデザインのために使用されている：
【００４８】
順方向プライマーデザイン：
好適には、順方向プライマーは、ｍｉＲ配列の５’末端の１２〜１８個の塩基と同一であるようにデザインされる。好適には、順方向プライマーのＴｍは、５５℃〜６５℃の範囲内とすべきであるが、しかしながら、５５℃以下及び６５℃以上のＴｍもまた容認可能である。プライマーのＴｍは好適には５５℃〜６５℃の範囲内であることを確実にするために、１又は複数のＬＮＡ単量体を天然のヌクレオチドを置換している配列に挿入してよい。人工のヌクレオチド配列もまた、Ｔｍが５５℃〜６５℃の範囲内であることを確かめるために、順方向プライマーの５’末端に添加してよい。
【００４９】
逆方向プライマーデザイン：
逆方向プライマーは、式ＩＩ：
Ｒ３−（Ｔ）ｘ−Ｒ４（ＩＩ）
（式中、
Ｒ３は、５’末端ヌクレオチド配列であり、
（Ｔ）ｘは、量ｘで連続したチミン残基である中央部分であり、ここでｘは１〜１００の整数であり、
そしてＲ４が、マイクロＲＮＡ分子の一部と特異的にハイブリッド形成する３’末端のヌクレオチド配列である）のものである。
Ｒ４は、好適には、特異的ｍｉＲＮＡの３’末端からデザインされた１〜１０個のヌクレオチドのヌクレオチド配列である。Ｒ４は、対応するｍｉＲＮＡ特異的順方向プライマーの伸展によって生成されるＤＮＡ鎖（すなわち、上鎖）と特異的にハイブリッド形成することができる。ｍｉＲＮＡ特異性を確実にし、且つプライマーのＴｍが好適には５５℃〜６５℃の範囲内であることを確かめるために、１又は複数のＬＮＡ単量体は対応する天然のヌクレオチドを置換しているＲ４配列に挿入してよい。
【００５０】
（Ｔ）ｘ中央部分は、好適には、対応するｍｉＲＮＡ特異的順方向プライマーから生成されたＤＮＡ鎖のポリＡテール部分とハイブリッド形成する、約１５の連続したチミンヌクレオチド残基の伸展である。
【００５１】
逆方向プライマーのＲ３配列は、典型的には１〜２０ヌクレオチドの長さを有する。例えば、Ｒ３は１７ヌクレオチド長、８、７又は６ヌクレオチド長或いはたった１のヌクレオチド長であってよい。本発明のある実施形態において、Ｒ３配列は５’−ＴＧＡＣＡＣＧＧＡＧＧＴＡＣＴＡＧ−３’（配列番号3）である。５５℃〜６５℃の好適な範囲に逆方向プライマーのＴｍを調節するために、Ｒ３配列の長さは５’末端から減少させてよい。Ｒ３配列は、伸展プライマーのＲ１配列（式(III)）と同一又はこの配列の一部への重複を少なくとも１つ有する。
【００５２】
逆方向プライマーをデザインするための手順は、以下に記載される。
【００５３】
Ａ．次の条件：
１）ｍｉＲヌクレオチド配列の３’末端から全アデニン残基を除去する。これらはポリＡテールの一部を形成するであろう。
２）アデニン残基の除去後、ｍｉＲの３’末端塩基に逆相補的な配列から始まり、１塩基が順方向プライマーと重なるまで続ける。
３）逆方向プライマーの３’末端配列がシトシン残基であり、順方向プライマーの３’末端がグアニン残基の場合、逆方向プライマーの３’末端から１塩基を除去する。
４）配列がグアニン残基であり、順方向プライマーの３’末端がシトシン残基である場合、プライマーの３’末端から１塩基を除去する。
５）最後の２つの塩基が、順方向プライマーの（３’末端から）最後の２つの塩基と重複している場合、プライマーの３’末端から１塩基を除去する。
６）条件が満たされるまで、このプロセスを繰り返す。
７）条件を満たすプライマーが存在しない場合、ルール＃２及び３に構わず、ＡＡ、ＡＴ、ＴＡ又はＴＴをコードする配列に関して２つの塩基を重ねる（しかし、それ以上は重ねない）。
８）条件を満たすプライマーが存在しない場合、他の順方向プライマーデザインを試す。
を満たす多数のプライマーをデザインする。
【００５４】
Ｂ．次の条件を満たす最も長い逆方向プライマーを選択する：
１）少なくとも４塩基長。
２）プライマーの３’末端における最後６塩基中、５個以下のシトシン残基及びグアニン残基。
３）最後又は最後から２番目の塩基がアデニン残基又はチミン残基の場合を除き、プライマーの３’末端における最後の５塩基中、４以下のシトシン残基及びグアニン残基。
４）可能であれば、３’末端において２以下のアデニン残基又はチミン残基。
５）当該条件を満たすプライマーが存在しない場合、他の順方向プライマーデザインを試す。
【００５５】
Ｃ．次のルールに従って１つのＬＮＡ単量体を任意に挿入する：
１）逆方向プライマーのＲ４部分の５’末端から第一のシトシン残基又はグアニン残基において、ＬＮＡを挿入する。
２）３つ又はそれ以上連続したシトシン残基又はグアニン残基を有する配列中にＬＮＡが存在しない。
３）ＬＮＡは、プライマーの３’末端から４位又はそれ以上の位置に存在すべきである。
４）当該条件を満たすことができない場合、逆方向プライマーのＲ４部分の５’末端から第一のアデニン残基又はチミン残基においてＬＮＡを挿入する。
５）ＬＮＡは、プライマーの３’末端から４位又はそれ以上の位置に存在すべきである。
６）当該条件を満たすことができない場合、プライマーのＲ４部分の３’末端においてＬＮＡチミン（LNA-T）を挿入する。
【００５６】
Ｄ．テール化：
式、
Ｒ３−（Ｔ）ｘ、
の配列を逆方向プライマーの５’末端に添加する。本発明の一定の実施形態におけるヌクレオチド配列：
５’−ＴＧＡＣＡＣＧＧＡＧＧＴＡＣＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号4）を逆方向プライマーの５’末端に添加する。
【００５７】
逆方向プライマーのｍｉＲ特異的部分にＬＮＡ−Ｔを添加した場合（工程C6）、決して１５個以上連続したチミン残基が存在すべきでないので、１つのチミン残基をテールから除去する。
【００５８】
最終的に、プライマーのＴｍを微調整するために、逆方向プライマーの５’末端からヌクレオチドを除去する。
【００５９】
ＲＮＡの「試料」は、例えばＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ及びＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ プロトコール（Rapley, Ralph; Manning, David L. (Eds) 1998）に記載される当業者に周知の通常の手順に従って、或いは市販のキット、例えばｍｉＲＮｅａｓｙ（QIAGEN GmbH, Hilden, Germany）又はｍｉＲＶａｎａ（Ambion Inc., Austin, TX, US）を使用して、生物由来の細胞、組織又は体液から得られた組成物を含んでなるＲＮＡを意味する。ＲＮＡ画分の単離のためのソースは、生物から単離された細胞、又は組織或いは体液の試料であり、例えば、皮膚、血漿、血清、髄液、リンパ液、滑液、尿、涙液、血球、器官、腫瘍、及び（細胞培養培地における細胞の成長から生じた条件培地、組換え細胞及び細胞成分を含むがこれに限定されない）インビボ（in vitro）における細胞培養構成物の試料を含むがこれに限定されない。「試料」はまた、ＲＮＡ画分又は人工的に合成したＲＮＡを含んでなる組成物を含んでなる同等のＲＮＡの事前濃縮なしに、ｑＲＴ−ＰＣＲプロセスにおいて、直接に使用することができる細胞又は体液を意味する。
【００６０】
細胞又は細胞型はまた、真核生物、原核生物及び古細菌起源の任意の細胞を意味する。
【００６１】
「生物」は、生存しているものを意味し、例えば、ヒト、マウス、ラット、ショウジョウバエ、シーエレガンス、酵母、シロイヌナズナ、トウモロコシ、コメ、ゼブラフィッシュ、霊長類、家畜等を含むがこれに限定されない。
【００６２】
好適な実施形態の詳細な説明
αＲＴ−ＰＣＲ反応及び関連のプライマーの詳細な概略：
本発明は、試料中のマイクロＲＮＡ分子の増幅のための方法を供し、当該方法は、図１に模式的に記載される工程を含んでなり：
（a）試料中のＲＮＡ分子の集合にポリＡテールを添加する工程；
（b）逆転写反応において伸展プライマーを使用して、ポリＡテール化されたＲＮＡ分子のｃＤＮＡ分子を生成する工程；及び
（c）当該ＲＮＡ分子に特異的な順方向プライマー及び逆方向プライマーをいずれも使用して、ＰＣＲによってｃＤＮＡ分子を増幅する工程、
を含んでなる。
【００６３】
実際に当該方法を実施する場合、分析するための全ＲＮＡに普遍的な１つの協調反応として工程（a）及び（b）を典型的に実施するので、従ってニックネームを：「ユニバーサルＲＴ」と呼ぶ。マルチプルリアルタイムＰＣＲアッセイに関してテンプレートとして使用するたった１つの第一鎖のｃＤＮＡ合成反応（又はRT反応）の利点は、貴重な試料をセーブし、実験室において技術的変動を減少し且つかかる時間を減少することである。
【００６４】
方法の工程（c）中、個々の（又は個々の群の）ＲＮＡは、特異的順及び逆方向プライマーを使用して特異的にＰＣＲ増幅される。典型的には、１又は複数のＬＮＡヌクレオチド類似体をプライマーの配列中に導入することによってプライマーを最適化し、そして典型的にはＰＣＲは定量的リアルタイムＰＣＲである。実施例から理解することができるように、方法は１）非常に関連したＲＮＡ配列間の識別を可能にする優れた特異的なアッセイ、及び２）非常に低いＲＮＡレベルの正確な定量化を可能にする非常に低いバックグラウンドをもたらす。
【００６５】
当該方法は、低分子ＲＮＡを定量化するために広範に使用される。好適な実施形態において、低分子ＲＮＡは、低分子非翻訳領域ＲＮＡ、例えば低分子干渉ＲＮＡ（siRNA）、成熟マイクロＲＮＡ及びプレマイクロＲＮＡを含んでなる。また、高分子ＲＮＡ、例えばプレマイクロＲＮＡの前駆体、プライマリーｍｉＲＮＡ（プリmiR）及びｍＲＮＡを、当該方法によって評価する。
【００６６】
最も好適には、低分子ＲＮＡはマイクロＲＮＡである。
【００６７】
伸展プライマーは、１０〜１００ヌクレオチドの範囲における長さ、例えば１５〜４５ヌクレオチドの範囲における長さであってよい。好適には、伸展プライマーは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する。
【００６８】
好適な実施形態において、伸展プライマーは式ＩＩＩ：
Ｒ１−（Ｔ）ｙ−Ｒ２（ＩＩＩ）
（式中、
Ｒ１が、５’末端ヌクレオチド配列であり、
（T）ｙが、量ｙで連続したチミン残基の中央部分であり、ここでｙが１〜１００の整数であり、
Ｒ２が３’末端ヌクレオチド配列である。）のプライマーである。
【００６９】
典型的には、Ｒ１の５’末端は１〜３０ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド配列である。例えば、Ｒ１配列は、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド長であってよい。Ｒ１配列は、後のｍｉＲＮＡ特異的ｑＰＣＲにおいて使用する式ＩＩ（下記参照）の逆方向プライマーにおいて、少なくともＲ３配列のためのハイブリッド形成配列を含む。
【００７０】
好適には、式ＩＩＩ中のｙは５〜５０、より好適にはｙは５〜２１である。例えばｙは、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８である。最も好適には、ｙは１５である。
【００７１】
特に好適な実施形態において、式（III）のｙは式（II）のｘと同等である。
【００７２】
好適な実施形態において、Ｒ２は、２つの３’末端ヌクレオチド残基を含んでなる、縮重アンカー配列モチーフＶＮであり、ここでＶは天然の塩基の１つを除く全てのものと塩基対（例えば、アデニン以外のグアニン, シトシン, ウラシル及びチミンとの塩基対）を形成することができる塩基を含んでなる残基の選択を指定し、典型的にはＶは任意のプライマー分子中の塩基がアデニン、グアニン及びシトシンからランダムに選択される塩基であることを指定し、式中Ｎが任意の天然の塩基（例えば、アデニン, グアニン, シトシン, ウラシル及びチミン）と塩基対を形成することができる塩基を指定し、典型的にはＮはアデニン、グアニン、シトシン又はチミン残基からランダムに選択される塩基であってよい。
【００７３】
他の好適な実施形態において、Ｒ２は、３つの３’末端ヌクレオチド残基を含んでなる縮重配列モチーフＶＮＮであり、式中Ｖは、天然の塩基の１つを除く全てと塩基対を形成する（例えば、アデニン以外のグアニン, シトシン, ウラシル及びチミンと塩基対を形成する）ことができる塩基を含んでなる残基の選択を指定し、典型的にはＶは、塩基がアデニン、グアニン及びシトシンからランダムに選択される塩基であることを指定し、式中Ｎは、任意の天然の塩基（例えば、アデニン, グアニン, シトシン, ウラシル及びチミン）と塩基対を形成することができる塩基を指定し、典型的には、Ｎは、アデニン、グアニン、シトシン又はチミン残基からランダムに選択される塩基であってよい。
【００７４】
好適な実施形態において、伸展プライマーは少なくとも１つのＬＮＡを含んでなる。
【００７５】
本発明の一定の実施形態において、伸展プライマーは、配列５’−ＧＧＴＡＣＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ−３’（配列番号5）を有する。
【００７６】
好適には、順方向プライマーは、１０〜１００ヌクレオチドの範囲内の長さ、例えば１２〜２２又は１３〜２０或いは１４、１５、１６、１７、１８若しくは１９ヌクレオチドを有する。特定の実施形態に関する表１８を参照されたい。
【００７７】
順方向プライマーは、１、２、又はそれ以上のＬＮＡを含んでよい。
【００７８】
好適な実施形態において、順方向プライマーのヌクレオチド配列は、「プライマーデザイン」の定義（定義セクションを参照されたい）において記載したプライマーデザインルールを使用して、特異的マイクロＲＮＡ分子の相補的ＤＮＡ分子に、特異的にハイブリッド形成するようにデザインする。
【００７９】
好適には、逆方向プライマーは、式ＩＩ：
Ｒ３−（Ｔ）ｘ−Ｒ４（ＩＩ）
（式中、
Ｒ３が、５’末端ヌクレオチド配列であり、
（T）ｘが、量ｘで連続したチミンヌクレオチドの中央部分であり、ここでｘが、１〜１００の整数であり、
Ｒ４が、標的ＲＮＡ分子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成する３’末端ヌクレオチド配列である。）
のプライマーである。
【００８０】
好適には、式ＩＩの逆方向プライマーの５’末端ヌクレオチド配列Ｒ３は、１〜３０ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド配列である。
【００８１】
好適には、式ＩＩのｘは、５〜５０、より好適にはｘは５〜２１である。例えばｘは、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８である。最も好適には、ｘは１５である。
【００８２】
特に好適な実施形態において、式（II）のｘは式（III）のｙと同等である。
【００８３】
好適な実施形態において、式ＩＩの逆方向プライマーの３’末端ヌクレオチド配列Ｒ４は、１〜１０ヌクレオチドの範囲内の長さを有する。
【００８４】
実施例２において説明されるように、ＬＮＡは著明な効果を有する。従って、好適な実施形態において、式ＩＩの逆方向プライマーの３’末端部分、Ｒ４は、少なくとも１つのＬＮＡを含んでなる。より好適には、式ＩＩの逆方向プライマーの３’末端部分のＲ４は、たった１つのＬＮＡを含有する。特に好適な実施形態において、ＬＮＡは、逆方向プライマーのＲ４部分の５’位又は５’位に隣接した位置に位置する。
【００８５】
好適な実施形態において、逆方向プライマーのヌクレオチド配列は、「プライマーデザイン」において記載されるプライマーデザインルール（定義セクションを参照されたい）を使用して、特異的マイクロＲＮＡ分子と特異的にハイブリッド形成するようにデザインされる。
【００８６】
プライマーのデザイン
本発明はまた、本発明において使用される順方向プライマー及び逆方向プライマーのヌクレオチド配列をデザインするための方法を供する。プライマーの体系的アプローチ及び実験評価を実施例３のセクションに示す。
【００８７】
本発明の適用の実施例
本発明は、実施例５及び９において記載されるように、ヒト又は他の生物から生じる様々な細胞又は組織における、低分子ＲＮＡ分子、例えば、マイクロＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの増幅及び定量化に有用である。実施例１０において説明されるように、本願の方法は、多少類似する市販の１つのチューブ内ｃＤＮＡ合成アプローチと比較した場合に、感度及び特異性に関して優れている。
【００８８】
従って、本発明の一態様は、生物由来の試料中の標的マイクロＲＮＡ量を測定するための方法であり、当該方法は：
ａ）請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法に従って、標的マイクロＲＮＡを増幅する工程、
ｂ）増幅されたＤＮＡ分子の量を測定する工程、
を含んでなる。
【００８９】
増幅されたＤＮＡ分子の量は、ＰＣＲサイクル数に応じて、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）ｇｒｅｅｎ蛍光をモニターすることによって、蛍光ベースの定量的リアルタイムＰＣＲを使用して典型的に測定される。
【００９０】
従って、本発明は、生物内の異なる細胞及び組織タイプのマイクロＲＮＡプロファイリングのためのツールとして使用することができる。従って、異なる細胞及び組織タイプに存在する特異的マイクロＲＮＡの数及び特異的マイクロＲＮＡの量は、本発明を使用して測定することができる。同様に、本発明は、成熟マイクロＲＮＡ又はその前駆体を標的としている適当なプライマーを使用することによって、異なる細胞及び組織タイプ中の成熟マイクロＲＮＡ、プレマイクロＲＮＡ及びプリマイクロＲＮＡのレベル間を識別するために使用することができる（図5を参照されたい）。
【００９１】
他の態様において、本発明は、様々な疾患、例えば癌を患う患者のマイクロＲＮＡプロファイリングのためのツールとして使用することができる。実施例を通して、本発明を使用して様々な癌組織のマイクロＲＮＡｏｍｅを確立することができる。
【００９２】
さらに他の態様において、本発明は、通常の個体及び疾患を患う個体由来の組織及び体液におけるマイクロＲＮＡ発現を測定することによって、様々な疾患、例えば癌の診断のために使用し、続いてマイクロＲＮＡプロファイルにおける違いを分析することができる。
【００９３】
他の実施形態において、本発明は、医薬品、例えば化学療法剤、及び手術による疾患に罹患した個体の治療に応答した、特異的マイクロＲＮＡの量における変化を測定するために使用してよい。
【００９４】
他の実施形態において、本発明は、疾患、例えば癌疾患を患う患者の再発のない生存と相関する、特異的な予測マイクロＲＮＡバイオマーカーを測定するために使用してよい。
【００９５】
その単純性：１つの「ユニバーサル−ＲＴ」工程及び１つの特徴的なＰＣＲ工程に起因して、本発明はまた、単一マイクロＲＮＡの定量化又はマイクロＲＮＡの収集を対象にするロボットプラットフォーム上の高処理量方法に適する。従って、当該方法は、実施例５、９及び１０において記載されるように、個々のマイクロＲＮＡのマルチプルの続くＰＣＲ反応に特に適する。
【００９６】
一定の実施形態において、本発明の方法は、対応するプレｍｉＲからの干渉なしに試料中の成熟マイクロＲＮＡの量を定量的に測定するために使用してよく、逆の場合も同様であり、実施例６、７及び８において記載されるように、プレｍｉＲの量は成熟マイクロＲＮＡからの干渉なしに測定することができる。
【００９７】
他の実施形態において、本発明の方法は、実施例４において記載されるように、単一ヌクレオチドの違いを有する標的間の識別のために使用してよい。
【００９８】
他の態様において、本発明は、少なくとも１つの標的マイクロＲＮＡを検出するためのキットを供し、当該キットは、標的マイクロＲＮＡの検出に特異的な１又は複数のプライマーセットを含んでなり、各プライマーセットは、第一に、標的マイクロＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ分子を生成するためのユニバーサル伸展プライマー、次にｃＤＮＡ分子を増幅するための標的ｍｉＲＮＡの５’末端に特異的な順方向プライマー、及び標的ｍｉＲＮＡの３’末端に特異的な逆方向プライマーを含んでなるＰＣＲプライマーセットを含んでなる。
【００９９】
従って、本発明の一態様において、少なくとも１つの標的ＲＮＡを検出するためのキットが供される。当該キットは、標的ＲＮＡの検出に特異的な少なくとも１つのプライマーセットを含んでなり、当該プライマーセットは：
ａ）式Ｉ：Ｒ１−（Ｔ）ｙ−Ｒ２（ＩＩＩ）
（式中、
Ｒ１は、５’末端ヌクレオチド配列であり、
（Ｔ）ｙは、量ｙで連続したチミン残基である中央部分であり、ここでｙが１〜１００の整数であり、
Ｒ２が、３’末端ヌクレオチド配列である）
の伸展プライマー、
ｂ）式ＩＩ：Ｒ３−（Ｔ）ｘ−Ｒ４（ＩＩ）
（式中、
Ｒ３は、５’末端ヌクレオチド配列であり、
（Ｔ）ｘは、量ｘで連続したチミン残基である中央部分であり、ここでｘが１〜１００の整数であり、
Ｒ４が、標的ＲＮＡ分子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成する、３’末端ヌクレオチド配列である）
の逆方向プライマー、並びに
ｃ）順方向プライマー、
を含んでなる。
一実施形態において、キットは、標的マイクロＲＮＡの検出に特異的な少なくとも１つのプライマーセットを含んでなる、少なくとも１つの哺乳類標的マイクロＲＮＡを検出するためにデザインされる。
【０１００】
好適には、伸展、逆方向及び順方向プライマーは、定義セクションの「プライマーデザイン」パート及び他の箇所において示されるデザインルールに従ってデザインされ、少なくとも１つのＬＮＡ分子を含む順及び逆方向プライマーが特に好適な実施形態である。
【０１０１】
伸展プライマーの非制限的な実施例を配列番号５として示す。
【０１０２】
当該キットに含まれる順及び逆方向プライマーは、明細書中に記載される方法に従って、任意の哺乳類標的マイクロＲＮＡを検出するためにデザインされてよい。順及び逆方向プライマーの非制限的な実施例は、表１６に収載される。
【０１０３】
ある実施形態において、キットは、様々な哺乳類マイクロＲＮＡ標的、例えば２つのマイクロＲＮＡ標的〜数百のマイクロＲＮＡ標的を検出するために使用されるマルチプルプライマーセットを含む。
【０１０４】
本発明のキットはまた、実施例９において示されるように、ロボットハンドリングに適する、マイクロタイターｑＰＣＲプレート、例えば９６、７６８、８６９、１５３６又は３４５６−ウェルマイクロタイターｑＰＣＲプレート中に送達された一連のプライマーを供する。
【０１０５】
本発明のキットはまた、ポリＡテール化、プライマー伸展及びＰＣＲ反応に必要な試薬、例えばバッファー、塩、還元剤、デオキシヌクレオシド三リン酸塩、ヌクレオシド三リン酸塩、及び酵素を含む。ｑＰＣＲの検出試薬、例えばＳＹＢＲ（登録商標）ｇｒｅｅｎもまた含まれる。同様に、ＲＮＡ単離のためのキットもまた含まれる。
【０１０６】
本発明のさらなる態様は、本発明の方法を使用し且つ自動化されたもの（an automated）を組み込むことによって、生物由来の試料中の特異的な標的マイクロＲＮＡの量を測定するための高処理量方法であって、結合されたポリＡテール化及び逆転写反応物（reaction）を、順及び逆方向プライマーのマイクロＲＮＡ特異的プライマーセットを含んでなるマイクロタイタープレートの個々のウェル中に分注する方法であって、結果として：
ａ）試料における低分子ＲＮＡ分子の集合へポリＡテールを添加し、逆転写反応において伸展プライマーを使用してポリＡテール化された低分子ＲＮＡ分子のｃＤＮＡ分子を生成する工程、
ｂ）結合されたポリＡテール化及び逆転写反応物の一定分量を、マイクロタイタープレートの個々のウェル中にピペットする工程、
ｃ）マイクロＲＮＡ特異的プライマーセットを含むマイクロタイタープレートの個々のウェル中で、特異的標的マイクロＲＮＡを増幅する工程、並びに
ｄ）個々のウェル中で特異的マイクロＲＮＡ分子の量を測定する工程、
を含んでなり、高処理量の実験装置に適合する様式で実施されることを特徴とする方法である。
例えば、装置は、典型的には１又は複数のピペットロボットを含んでなる。
【実施例】
【０１０７】
実施例１：ｍｉＲ特異的ｑＰＣＲを使用した特異的ＤＮＡ分子の生成
この実施例において、本発明のｍｉＲ特異的定量的逆転写ＰＣＲ（qRT-PCR）を使用して、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７をヒトＲＮＡ試料から増幅した。
【０１０８】
以下を氷上で混合した：
・１μｌ １０ｘ ポリ（A）ポリメラーゼバッファー（New England Biolabs）
・１μｌ １ｍＭ ＡＴＰ
・１μｌ １０μＭ ＲＴプライマー（＝伸展プライマー）（Ｌ２ＴＡ：５’−ｇｇｔａｃｔａｇｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｖｎ(配列番号5), vはシトシン, グアニン及びアデニン残基を指定し, nはシトシン, グアニン, アデニン及びチミン残基を指定する）。
・１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰの１μｌ混合
・０,５μｌ（200U/μｌ）ＭｕＬＶ逆転写酵素（New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, US）
・０．２μｌ（5U/μｌ）ポリ（A）ポリメラーゼ（New England Biolabs）
・１μｌ ＲＮＡ試料（全てAmbion, Austin, TX, US由来の、総ヒトRNA試料＝25ngヒト心臓RNA, 25ngヒト脳RNA, 25ngヒト肝臓RNA及び25ngヒト肺RNAの100ngの混合物。TE中の10ng/μｌファージMS2 RNAにおいて, 合成テンプレートを調製し,約107コピーを反応に添加した。Integrated DNA technology Inc., Coralville, IA, US.から合成テンプレートを得た。）
・１０μｌまでの水
【０１０９】
負の対照：ＲＴ反応においてポリＡポリメラーゼなしの水対照及び総ヒトＲＮＡ対照。
【０１１０】
４２℃で１時間、続いて９５℃で５分間、混合物をインキュベートした。
【０１１１】
ｑＰＣＲのために、１μｌ又はそれ以下のポリＡテール化／ＲＴ反応物（図1上の工程1）を、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７に関する遺伝子特異的順及び逆方向プライマーでの各ＰＣＲ反応のために使用した；順方向プライマー５’ｔｔｍＣａｃｃａｃｃｔｔｃｔｃｃａ（配列番号1）、及び逆方向プライマー５’−ｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔＧｃｔｇｇｇｔ（配列番号2）（ヌクレオチド配列において、小文字は自然発生のヌクレオチドを指定し、大文字はＬＮＡを指定し, ｍＣはＬＮＡメチルシトシンを意味する）。
【０１１２】
ＰＣＲサイクル数に応じたＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ 蛍光をモニターすることによる、ＡＢＩ７５００（登録商標）ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, US）上でのリアルタイムＰＣＲを行った。典型的なＰＣＲ反応混合物は：
・１０μｌ ２ｘ ＰＣＲｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Roche cat#04 673 484 001, Roche Diagnostics A/S, Hvidovre, Denmark）
・１μｌ以下のＲＴ反応物
・２．５μＭ ｍｉＲ特異的順方向プライマー及び２．５μＭ ｍｉＲ特異的逆方向プライマーを有する１μｌ ＴＥバッファー（TEバッファー: 10mM Tris/HCI (pH 8.0), 1mM EDTA）
・２０μｌまでの水
を含んだ。
【０１１３】
混合物を、９５℃で１０分間インキュベートし、続いて蛍光の測定を行いながら９５℃で５秒間；６０℃で６０秒間を４０サイクル行った。
【０１１４】
ＰＣＲ生成物の融解曲線プロファイルを、合成テンプレートの増幅によって得られたＰＣＲ生成物の融解曲線プロファイルと比較することによって、正確な生成物の増幅を測定した（図2）。負の対照でシグナルは得られなかった。実験は、工程１においてテンプレートとして総ヒトＲＮＡ試料及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９７どちらを使用しても、同一且つ正確なｈｓａ−ｍｉＲ−１９７ＰＣＲ生成物が得られたことを示す。
【０１１５】
実施例２：逆方向プライマーにおけるＬＮＡの効果
工程２のｍｉＲ特異的ＰＣＲプライマーの異なるデザインの効果は、逆転写反応の生成物として同一の配列を有する人工のＤＮＡテンプレート上でテストすることができる。ＰＣＲに人工のＤＮＡテンプレートを使用する重要な利点は、逆転写工程の効率における実験変動が排除されることである。
【０１１６】
Ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａＤＮＡテンプレート：
【化３】
0005749656.tif 000004
サーモンＤＮＡ：ＴＥバッファー中に２ｎｇ／μｌ
ｍｉＲ特異的順方向プライマー：
Ｆ７ａ：５’−ｔＧａＧｇｔａｇｔａｇｇｔｔｇ（配列番号7）（小文字は自然発生のヌクレオチドを指定し、大文字はＬＮＡを指定す）。
ｍｉＲ特異的逆方向プライマー：
【化４】
0005749656.tif 000005
ＰＣＲｍｉｘを調製した：
・５５０μｌ ２ｘ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Roche cat#04 673 484 001）
・４４０μｌの水、及び表１に記載する通り。
【０１１７】
【表１】
0005749656.tif 000006
【０１１８】
ＰＣＲサイクル数に応じて、ＳＹＢＲ（登録商標）ｇｒｅｅｎ 蛍光をモニターすることによって、ＡＢＩ７５００（登録商標）ｔｈｅｒｍｏｃｙｄｅｒ上でリアルタイムＰＣＲを実施した。
【０１１９】
混合物を、９５℃で１０分間インキュベートし、続いて蛍光の測定を行いながら９５℃で５秒間；６０℃で６０秒間を４０サイクル行った。
【０１２０】
ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Applied Biosystems, Foster City, CA, US）の製造者からの推奨に従って、正確な生成物の増幅を測定した。手短に言えば、ＰＣＲ反応を６０℃で１分インキュベートし、温度の９５℃までの緩増加中蛍光を測定した。融解曲線の一次導関数を図３に示す：
【０１２１】
結果は、ＬＮＡ（r7a.2）欠乏の逆方向プライマーは、負の対照において正のシグナルを示し、一方ＬＮＡ（r7a.7）を有する逆方向プライマーは正のシグナルを示さない（図3）。従って、負の対照反応において生じた非特異的ＰＣＲ生成物を回避するために、ｒ７ａ.７におけるＬＮＡ塩基は必要である。いずれのプライマーも正の対照テンプレートを増幅する。
【０１２２】
表２から分かるように、逆方向プライマーのｍｉＲ特異的配列における１つのＬＮＡの包含は、ＰＣＲにおけるバックグラウンドシグナルを低減することが明らかとなった。
【０１２３】
【表２】
0005749656.tif 000007
【０１２４】
実施例３：ｍｉＲのためのプライマーのマニュアルプライマーデザイン及び検証
定義セクションの「プライマーデザイン」部分に示されるデザインルールに従って、プライマーを手作業でデザインした。
【０１２５】
プライマー検証：
プライマーデザインルールを使用することによって、リアルタイムＰＣＲ実験において次の検証基準に従って＞７０％成功率を有するＰＣＲプライマーを達成することが可能である：
４つの逆転写（RT）試料のためのＲｔｍｉｘの調製：
１．水
２．１００ｎｇの総ヒトＲＮＡｍｉｘ*（デフォルトとして、我々はAmbion由来の各心臓, 脳, 肝臓及び肺の総RNAの25ngの混合を使用する）。
*ＲＮＡ混合物：１μｌ １μｇ／μｌ心臓ＲＮＡ、１μｌ １μｇ／μｌ脳ＲＮＡ、１μｌ １μｇ／μｌ肝臓ＲＮＡ、１μｌ １μｇ／μｌ肺ＲＮＡ、３６μｌＴＥ。−８０℃で１μｌ一定分量で保存。
３．ポリＡテール化なしの１００ｎｇ総ヒトＲＮＡ混合物。
４．ＴＥにおける１０ｎｇファージＭＳ２ ＲＮＡ中の合成ｍｉＲの１０７コピー（合成ｍｉＲをIntegrated DNA technologies Inc., Coralville, IA, US. から得た）。ｍｉＲを、少なくとも２０個のｍｉＲまで含んでなるプールとして添加することができる。
【０１２６】
【表３】
0005749656.tif 000008
【０１２７】
【表４】
0005749656.tif 000009
【０１２８】
【表５】
0005749656.tif 000010
【０１２９】
受け入れ基準：
試料１：＃２及び４の指数関数エリアと比較して４０以上上回るサイクル閾値（Ct）。５０００下回る融解ピークの導関数。
試料２：３５下回るＣｔ
釣鐘状の融解曲線上の１ピーク、言い換えればピークは６９℃〜８０℃の間に位置すべきことが最もである。試料４と同一温度（+/- 0.5℃）においてピークとなる。
指数関数的エリアにおいて、１０倍のデルタＲｎにおけるクロッシングポイント（crossing point）からデルタＲｎにおけるクロッシングポイントを引いたものが、３．２〜４．４の間に存在すべきである：３．２＜（C10T-CT）＜４．４
試料３：＃２及び４の指数関数的エリアと比較して４０以上上回るＣｔ。
５０００下回る融解ピークの導関数。
試料４：釣鐘状の融解曲線上の１ピーク、言い換えればピークは６９℃〜８０℃の間に位置すべきことが最もである。試料２と同一温度（+/- 0.5℃）においてピークとなる。
【０１３０】
【表６】
0005749656.tif 000011
【０１３１】
結果（表３を参照されたい）：プライマーデザインルールに従って、１７個のプライマーペアをデザインした。１７個のアッセイの内１２個が、検証プロトコールに従ってうまく検証され、成功率は７１％に相当する。
【０１３２】
【表７】
0005749656.tif 000012
【０１３３】
結果（表４を参照されたい）：プライマーデザインルールに従って、１５個のプライマーペアをデザインした。１５個のアッセイの内１２個が、検証プロトコールに従ってうまく検証され、成功率は８０％に相当する。
【０１３４】
実施例４：単一ヌクレオチドの違いでの標的間の識別
ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの配列から１つのヌクレオチドのみ異なる３つのｍｉＲが存在する（下記の表）。
【０１３５】
【表８】
0005749656.tif 000013
【０１３６】
ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａのためのｑＰＣＲプライマーが、単一ヌクレオチドの違いを有するｍｉＲを検出するかをテストするために、次のｍｉＲ特異的ｑＰＣＲ実験を実施した：
氷上で混合した：
ＲＴ ｍｉｘ：
・１μｌ １０ｘＰＡＰバッファー（Epicentre Biotechnologies，Madison, WI, US.）
・１μｌ １ｍＭ ＡＴＰ
・１μｌ １０μＭ ＲＴプライマー（L2TA：5’-ggtactagtttttttttttttttvn（配列番号５），vはc, g及びaを指定し、nはc, g, a及びtを指定する。））
・１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰの１μｌの混合
・０，５μｌ ２ユニット／μｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ（Roche Diagnostics A/S, Hvidovre, Denmark, cat# 03 531 295 001）。
・０，２μｌ（5U/μl）ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（Epicentre）
・４．５μｌの水
【０１３７】
次の試料を調製し、４２℃で１時間、続いて９５℃で５分間インキュベートした：
【０１３８】
【表９】
0005749656.tif 000014
【０１３９】
１ＴＥ中の１０ｎｇ／μｌファージＭＳ２ ＲＮＡにおいて合成テンプレートを調製した。合成テンプレートは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳから得られる。
【０１４０】
ｑＰＣＲのために、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの順方向プライマー５’−ｔＧａＧｇｔａｇｔａｇｇｔｔｇ（配列番号7）及び逆方向プライマー５’−ｃｇｇａｇｇｔａｃｔａｇｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔＡａｃｔａｔ（配列番号94）での各ＰＣＲ反応のために、１μｌのポリＡテール化／ＲＴ反応物を使用した。
【０１４１】
ＰＣＲサイクル数に応じて、ＳＹＢＲ（登録商標）ｇｒｅｅｎ 蛍光をモニターすることによって、ＡＢＩ７５００ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ上でリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応混合物は：
・１０μｌ ２ｘ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Roche cat#04 673 484 001）
・１μｌ以下のＲＴ反応物
・２．５μＭ ｍｉＲ特異的順方向プライマー及び２．５μＭ ｍｉＲ特異的逆方向プライマーを有する１μｌＴＥ
・２０μｌまでの水
を含む。
【０１４２】
混合物を、９５℃で１０分間インキュベートし、続いて蛍光の測定を行いながら９５℃で５秒間；６０℃で６０秒間を４０サイクル行った。
【０１４３】
ＰＣＲ生成物の融解曲線プロファイルを、合成テンプレートの増幅によって得られたＰＣＲ生成物の融解曲線プロファイルと比較することによって、正確な生成物の増幅を測定した。
【０１４４】
標準的な方法に従って、リアルタイムＰＣＲ実験の結果を分析した（Bustin, SA (ed.) 「定量的ＰＣＲのＡ〜Ｚ」International University Line (La JoIIa, California, USA), 2004）。
【０１４５】
結果を表６に示し、且つ図４において増幅プロットとして示す。
【０１４６】
【表１０】
0005749656.tif 000015
【０１４７】
実施例５：ヒト脳総ＲＮＡにおけるｍｉＲの定量化
この実施例において、総ヒト脳ＲＮＡ（Ambion）におけるｍｉＲ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９５のコピー数を測定した。
氷上で混合した：
ＲＴ ｍｉｘ：
・１μｌ １０ｘ ＰＡＰバッファー（New England Biolabs）
・１μｌ １ｍＭ ＡＴＰ
・１μｌ １０μＭ ＲＴ−プライマー（L2TA: 5'-ggtactagtttttttttttttttvn (配列番号5), vはシトシン, グアニン及びアデニン残基を指定し，nはシトシン, グアニン, アデニン及びチミン残基を指定する）。
・１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰの１μｌの混合
・０．５μｌ ２ユニット／μｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ（Roche cat# 03 531 295 001, Roche Diagnostics A/S,Hvidovre, Denmark）。
・０．５μｌ（5U/μｌ）ポリ（A）ポリメラーゼ（New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, US）
・３μｌの水
【０１４８】
次の試料を調製し、４２℃で１時間、続いて９５℃で５分間インキュベートした：
【０１４９】
【表１１】
0005749656.tif 000016
【０１５０】
合成テンプレート：等量（コピーの数）の（Integrated DNA technology Inc. から得られた）ＴＥにおける１０ｎｇ／μｌファージＭＳ２ ＲＮＡ中の合成ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９５。
ＴＥ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（pH 8.0）、１ｍＭ ＥＤＴＡ。
【０１５１】
ｑＰＣＲのために、遺伝子特異的プライマーでの各ＰＣＲ反応のために１μｌのポリＡテール化／ＲＴ反応物を使用した：
【０１５２】
【表１２】
0005749656.tif 000017
【０１５３】
ＰＣＲサイクル数に応じて、ＳＹＢＲ（登録商標）ｇｒｅｅｎ蛍光をモニターすることによって、ＡＢＩ７５００（登録商標）ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ上でリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応混合物は：
・１０μｌ ２ｘ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Roche cat#04 673 484 001）
・１μｌ以下のＲＴ反応物
・２．５μＭ ｍｉＲ特異的順方向プライマー、及び２．５μＭ ｍｉＲ特異的逆方向プライマーを有する１μｌＴＥ
・２０μｌまでの水
を含んだ。
【０１５４】
混合物を、９５℃で１０分間インキュベートし、続いて蛍光の測定を行いながら９５℃で５秒間；６０℃で６０秒間を４０サイクル行った。
【０１５５】
ＰＣＲ生成物の融解曲線プロファイルを、合成テンプレートの増幅によって得られたＰＣＲ生成物の融解曲線プロファイルと比較することによって、正確な生成物の増幅を測定した。
【０１５６】
各ｍｉＲのために、標準的な方法（Bustin, SA (ed.) 「定量的ＰＣＲのＡ〜Ｚ」International University Line (La JoIIa, California, USA),, 2004）に従ってリアルタイムＰＣＲ実験の結果を分析し、そして標準曲線を構築するためにヒト脳ＲＮＡを含まない試料由来のＣｔ値を使用した。
【０１５７】
試料中のｍｉＲの数を測定するために、標準曲線とヒト脳ＲＮＡの試料のＣｔを比較した（Bustin, SA (ed.) 「定量的ＰＣＲのＡ〜Ｚ」International University Line (La JoIIa, California, USA), 2004）。
【０１５８】
結果：
【０１５９】
【表１３】
0005749656.tif 000018
【０１６０】
実施例６：プレｍｉＲ ｑＰＣＲアッセイのデザイン
この実施例は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａアッセイが対応するプレｍｉＲ、ｈｓａ−プレｍｉＲ−１０ａを検出しないことを示す。同様に、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａではなく、ｈｓａ−プレｍｉＲ−１０ａを検出するアッセイを行うためのプライマーデザインを使用することが可能である。
氷上で混合した：
ＲＴ ｍｉｘ：
・１μｌ １０ｘ ＰＡＰバッファー（New England Biolabs）
・１μｌ １ｍＭ ＡＴＰ
・１μｌ １０μＭ ＲＴ−プライマー（L2TA: 5'-ggtactagtttttttttttttttvn (配列番号5), vはシトシン, グアニン及びアデニン残基を指定し，nはシトシン, グアニン, アデニン及びチミン残基を指定する）。
・１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰの１μｌの混合
・０．５μｌ ２ユニット／μｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ（Roche cat# 03 531 295 001）。
・０．５μｌ（5U/μｌ）ポリ（A）ポリメラーゼ（New England Biolabs）
・３μｌの水
【０１６１】
次の試料を調製し、４２℃で１時間、続いて９５℃で５分間インキュベートした：
【０１６２】
【表１４】
0005749656.tif 000019
【０１６３】
ｑＰＣＲのために、表９における特異的プライマーでの各ＰＣＲ反応のために１μｌのポリＡテール化／ＲＴ反応物を使用した。
【０１６４】
【表１５】
0005749656.tif 000020
【０１６５】
ＰＣＲサイクル数に応じて、ＳＹＢＲ（登録商標）ｇｒｅｅｎ蛍光をモニターすることによって、ＡＢＩ７５００ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ上でリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応混合物は：
・１０μｌ ２ｘ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Roche cat#04 673 484 001）
・１μｌ以下のＲＴ反応物
・２．５μＭ ｍｉＲ特異的順方向プライマー及び２．５μＭ ｍｉＲ特異的逆方向プライマーを有する１μｌＴＥ
・２０μｌまでの水
を含んだ。
【０１６６】
混合物を、９５℃で１０分間インキュベートし、続いて蛍光の測定を行いながら９５℃で５秒間；６０℃で６０秒間を４０サイクル行った。
【０１６７】
各ｍｉＲのために、標準的な方法に従ってリアルタイムＰＣＲ実験の結果を分析した（Bustin, SA (ed.)「定量的ＰＣＲのＡ〜Ｚ」 International University Line, 2004）。
【０１６８】
【表１６】
0005749656.tif 000021
【０１６９】
結果は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ及びｈｓａ−プレｍｉＲ−１０ａアッセイはいずれも正確な標的を検出し、プレｍｉＲ−１０ａ又はｍｉＲ−１０ａの交差反応は存在しないことをそれぞれ示す。
【０１７０】
実施例７：ｑＰＣＲによるプレｍｉＲの検出
この実施例において、総ヒトＲＮＡ中のｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ及び対応するプレｍｉＲ、ｈｓａ−プレｍｉＲ−１０ａを検出した。
氷上で混合した：
ＲＴ ｍｉｘ：
・１μｌ １０ｘ ＰＡＰバッファー（New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, US）
・１μｌ １ｍＭ ＡＴＰ
・１μｌ １０μＭ ＲＴ−プライマー（L2TA: 5'-ggtactagtttttttttttttttvn (配列番号5), vはシトシン, グアニン及びアデニン残基を指定し，nはシトシン, グアニン, アデニン及びチミン残基を指定する）。
・１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰの１μｌの混合
・０．５μｌ ２ユニット／μｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ（Roche cat# 03 531 295 001）。
・０．５μｌ（5U/μｌ）ポリ（A）ポリメラーゼ（New England Biolabs）
・３μｌの水
【０１７１】
次の試料を調製し、４２℃で１時間、続いて９５℃で５分間インキュベートした：
【０１７２】
【表１７】
0005749656.tif 000022
【０１７３】
ａＴＥ中の１μｇ／μｌ心臓ＲＮＡの１μｌ、１μｇ／μｌ脳ＲＮＡの１μｌ、１μｇ／μｌ肝臓ＲＮＡの１μｌ、１μｇ／μｌ肺ＲＮＡの１μｌ、１μｇ／μｌ腎臓ＲＮＡの１μｌ、１μｇ／μｌリンパＲＮＡの１μｌ、１μｇ／μｌ空腸ＲＮＡの１μｌ、１μｇ／μｌ結腸ＲＮＡの１μｌ、１μｇ／μｌ乳房ＲＮＡの１μｌ及び１μｇ／μｌ白血病ＲＮＡの１μｌの混合物。
ＴＥバッファー：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（pH 8.0）、１ｍＭ ＥＤＴＡ。
【０１７４】
ｑＰＣＲのために、１μｌのポリＡテール化／ＲＴ反応物を、表１１の特異的プライマーでの各ＰＣＲ反応のために使用した。
【０１７５】
【表１８】
0005749656.tif 000023
【０１７６】
ＰＣＲサイクル数に応じて、ＳＹＢＲ（登録商標）ｇｒｅｅｎ蛍光をモニターすることによって、ＡＢＩ７５００ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ上でリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応混合物は：
・１０μｌ ２ｘ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Roche cat#04 673 484 001）
・１μｌ以下のＲＴ反応物
・２．５μＭ ｍｉＲ特異的順方向プライマー及び２．５μＭ ｍｉＲ特異的逆方向プライマーを有する１μｌＴＥ
・２０μｌまでの水
を含んだ。
【０１７７】
混合物を、９５℃で１０分間インキュベートし、続いて蛍光の測定を行いながら９５℃で５秒間；６０℃で６０秒間を４０サイクル行った。
【０１７８】
各ｍｉＲのために、標準的な方法に従ってリアルタイムＰＣＲ実験の結果を分析した（Bustin, SA (ed.) 「定量的ＰＣＲのＡ〜Ｚ」International University Line, 2004）。結果を表１２に示す。
【０１７９】
【表１９】
0005749656.tif 000024
【０１８０】
結果は、総ＲＮＡ試料は、ＣΤがｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａの１０６コピーを有する試料のＣΤ以下なので、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａの１０６以上のコピーを含み、一方総ＲＮＡ試料は、ＣΤがｈｓａ−プレｍｉＲ−１０ａの１０６コピーを有する試料のＣΤ以下なので、ｈｓａ−プレｍｉＲ−１０ａの１０６以下のコピーを含むことを示す。
【０１８１】
実施例８：プレｍｉＲＮＡの特異的検出
実験の目的：この出願において記載されるユニバーサル逆転写酵素定量的ＰＣＲ方法論（UniRT qPCR）が、対応する成熟ｍｉＲの共検出なしに特異的にプレｍｉＲを検出するために使用することができるかを決定すること。
【０１８２】
材料：テスト対象として、合成ｍｉＲ２０３ＲＮＡ（5'-gugaaauguuuaggaccacuag）（配列番号103）及びプレｍｉＲ２０３ＲＮＡ（5'-agugguucuuaacaguucaacaguucugu-agcgcaauugugaaauguuuaggaccacuag）（配列番号104）を選択した。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳによって、合成ＲＮＡを合成した。ＴＥＭＳ２（TEバッファー(10mM Tris HCI pH8, 及び10ng/μｌMS2ウイルスRNA (Roche Applied Science Inc)と混合した0.1mM EDTA）中で、１*１０６分子／μｌまでＲＮＡを希釈した。使用したプライマーは、ｍｉＲ−２０３．Ｒｅｖ（5'-tgacacggaggtactagtttttttttttttttCtag）（配列番号105）、ｍｉＲ−２０３．Ｆｗｄ（5'-gtGaaatGtttaggacca）（配列番号106）及びプレｍｉＲ−２０３．Ｆｗｄ（5'-cagttcaacagttctgtagc）（配列番号107）であった。プレｍｉＲ−２０３分子のループ構造において、プレｍｉＲ−２０３Ｆｗｄプライマーをデザインした。ユニバーサルｃＤＮＡ合成キット（Exiqon AS, Cat.no #203300）を使用して、成熟ｍｉＲ−２０３テンプレート及びプレｍｉＲ−２０３を逆転写に供した。
【０１８３】
Ｍｉｘ：
・合成ＲＮＡ １*１０６分子
・５ｘ ＵｎｉＲＴ反応バッファー ２μｌ
・１０ｘ 酵素混合物 １μｌ
・１０μｌまでの水
４２℃で６０分間インキュベートし、８５℃で５分間熱変性する。水中で１０ｘ希釈する。
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，ＵｎｉＲＴ（Exiqon AS, Cat.No. 203400）でのｑＰＣＲ
Ｍｉｘ：
・プライマーｍｉｘ（それぞれ3uM）  １μｌ
・ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ  ５μｌ
・ｃＤＮＡテンプレート  １μｌ
・水  ３μｌ
２つのプライマーの混合を使用した：１）ｍｉＲ−２０３（miR-203. Fwd及びmiR-203.Revプライマー）及び２）プレｍｉＲ−２０３（プレmiR-203. Fwd及びmiR-203. Revプライマー）。使用したテンプレートは、ｍｉｒ−２０３及びプレｍｉｒ−２０３であった。テンプレート対照（NTC）ｑＰＣＲはまた、各ＰＣＲアッセイのために行わなかった。全てのｑＰＣＲを、２通り行った。
【０１８４】
次のＰＣＲプロトコールを使用して、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（Roche Diagnostics）機器において３８４ウェルプレート中でｑ−ＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。
１．９５℃で１０分間
２．９５℃で１０秒間
３．６０℃で分間
ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ（HRM dye）でのシグナル検出を開始した。工程２〜３を４５回繰り返し、続いて融解曲線分析を行った。
【０１８５】
結果及び考察
標準ｍｉＲ−２０３プライマーは、Ｃｐ値２８，８６でｍｉＲ−２０３テンプレートを良好に検出する。また、ｍｉＲ−２０３アッセイは、ｍｉＲはプレｍｉｒ−２０３の３’末端に位置するので、特にプレｍｉＲ−２０３を検出する（30,125のCp）。プレｍｉＲ−２０３アッセイデザインは、Ｃｐ値２５，７でプレｍｉＲを検出するが、成熟ｍｉＲ−２０３はプレｍｉＲ−２０３特異的アッセイで検出されない（Cp=40）。このデータは、プレｍｉｒ特異的アッセイをプレｍｉＲ分子を特異的に標的にするようデザインすることができることを明確に示す。
【０１８６】
【表２０】
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【０１８７】
実施例９：心臓及び肝臓組織中で異なって発現されたマイクロＲＮＡ
実験の目的は、心臓及び肝臓組織間で異なって発現される、良好に発現されたｍｉＲＮＡを、本発明のＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ユニバーサル逆転写酵素定量的ＰＣＲ（UniRT qPCR）方法に基づいたｑＰＣＲアレイを使用して識別することができるかを決定することである。
【０１８８】
材料及び方法
肝臓及び全心臓由来の総ＲＮＡはＡｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．から購入し、ヌクレアーゼ非含有の水中で濃度１０ｎｇ／μｌまで希釈し、−８０℃で貯蔵した。我々は、文献（例えば: Liang, Y., et al. (2007) BMC Genomics. 8: ppl66 and Landgraf P., et al.(2007) Nature Biotechnol. (9): pp 996-7) を参照されたい）から、心臓及び肝臓組織試料において異なって発現されることが知られる数個のｍｉＲＮＡを選択した。選択したｍｉＲは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６及びｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（心臓）並びにｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２*、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４及びｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（肝臓）であった。
【０１８９】
【表２１】
0005749656.tif 000026
【０１９０】
各組織及び酵素非含有の対照（NEC）に関して、ユニバーサルｃＤＮＡ合成キット（Exiqon AS, Cat.no #203300）でＲＴ反応を３通り実施した。
・総ＲＮＡ２０ｎｇ
・５ｘ ＵｎｉＲＴ反応バッファー  ４μｌ
・酵素混合物  ２μｌ
・２０μｌまでの水
４２℃で６０分間インキュベートし、８５℃で５分間熱変性する。ヌクレアーゼ非含有水中でｃＤＮＡ１／１００を希釈する。
【０１９１】
定量的ポリメラーゼ連鎖反応（q-PCR）、プロトコールの工程２を次の通り実施した：
５μｌの希釈したｃＤＮＡを、下記の７つのｍｉＲアッセイの乾燥したプライマーセットで３８４ウェルプレート中で、５μｌのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ＵｎｉＲＴ（Exiqon AS, Cat.No. 203400）と混合した。プレートを密閉し、増幅及び分析のために直接ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒの上に置いた。
【０１９２】
次のＰＣＲプロトコールを使用してＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（Roche Diagnostics）中でｑ−ＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した：
１．９５℃で１０分間
２．９５℃で１０秒間
３．６０℃で１分間
【０１９３】
ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ（HRM dye）でのシグナル検出を開始した。工程２〜３を４５回繰り返し、続いて融解曲線分析を行った。
【０１９４】
供給されたデータ分析ソフトウェア（Roche Diagnostics）を使用して、標準データ分析をＬＣ４８０生データに実施した。Ｃｐ値をＡｂｓ Ｑｕａｎｔ／二次導関数最大値として収集した。
【０１９５】
肝臓及び心臓いずれからも良好に発現されたｍｉＲＮＡ遺伝子の実施例から判断するこの実験のために、規準化又は較正なしに生データＣｐ値の平均値を使用した。組織間の規準化は異なるソース由来のｍｉＲを評価するのに大して正確な方法ではないので、これを行う。続いて、ΔＣｐ値に関して２つの組織の違いを比較する。Ｃｐ値の１の違いが発現において約２倍の違いを表すことに留意されたい。
【０１９６】
結果及び考察
我々は、心臓及び肝臓組織間で異なって発現するように、文献により以前から周知の計７個のｍｉＲＮＡを選択した。表１５及び図７に結果を示す。得られたデータは、３つの遺伝子ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３ｂ及び１２６が全て、肝臓試料よりも心臓試料において多量の発現を示していることを示した。同様に、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４及びｍｉＲ−１２２並びに１２２*は、心臓よりも肝臓において多量の発現を示している。違いは、２．６〜１２．９Ｃｐの範囲に渡っており、これは発現における５倍〜１０００倍以上の違いの範囲に相当する。一般的に、文献から記載される異なって発現されたｍｉＲは、本明細書に記載されるアッセイを使用して、容易にＵｎｉＲＴ発現プラットフォームによって識別される。
【０１９７】
【表２２】
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【０１９８】
実施例１０：本発明においてデザインされたｍｉＲ特異的アッセイの、純粋なＤＮＡプライマーを使用した競合方法との比較
本発明において記載されるＬＮＡベースのデザインを、市販のＤＮＡベースの生成物、ｍｉＳｃｒｉｐｔ逆転写キット（Qiagen, Cat. no. 218060, QIAGEN GmbH, Hilden, Germany）と比較した。このＤＮＡベースの生成物はまた、ｍｉＲＮＡ３’末端ポリアデニル化工程、続くＤＮＡベースのポリｄＴプライマーの逆転写に依存しており、ここでいずれの反応も１つのチューブ内反応中で生じる。これらの方法はいずれも同一の酵素工程を使用するため、ｍｉＳｃｒｉｐｔはプライマー中にＬＮＡを含まないので比較は非常に良好に本発明のＬＮＡベースの方法の驚くべき利点を説明する。他の違いは、ｍｉＳｃｒｉｐｔはＲＴプライマーと共に添加されるユニバーサルなタグに特異的な逆方向プライマーを使用し、一方本願の方法のＬＮＡベースの逆方向プライマーは検出されているｍｉＲＮＡに特異的なことである。
【０１９９】
【表２３】
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【０２００】
【表２４】
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【０２０１】
第一工程
製造者の使用説明書に従ってユニバーサルｃＤＮＡ合成キット（Exiqon A/S, Vedbaek, Denmark., Prod. No. 203300）又はｍｉＳｃｒｉｐｔ逆転写キット（Qiagen, Cat. no. 218060, QIAGEN GmbH, Hilden, Germany）を使用して、（Integrated DNA technology Inc., Coralville, IA, US. から得た）合成ｍｉＲＮＡ標的の希釈系列上で、１０ｎｇ／μｌ ＭＳ２バクテリオファージＲＮＡ（Roche Applied Science, Catalog Number 10165948001）のバックグラウンドで逆転写を実施した。
【０２０２】
第二工程
ユニバーサルｃＤＮＡ合成キット（Exiqon, Prod. No. 203300）を使用して得られたｃＤＮＡ上で、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ、ユニバーサルＲＴ（Exiqon, Prod. No. 203400）及び表１７に記載されたプライマーセットを使用してｑＰＣＲを実施した。ｍｉＳｃｒｉｐｔ逆転写キット（Qiagen, Cat. no. 218060）を使用して得られたｃＤＮＡ上で、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキット（Qiagen, Cat. no. 218073）を使用してｑＰＣＲを実施した。いずれの場合においても、製造者によって説示されるサイクル条件を使用して、Ｒｏｃｈｅ ＬＣ４８０ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Roche Diagnostics A/S, Hvidovre, Denmark）上で増幅及び検出を実施した。各ｃＤＮＡ／アッセイの組合せを３通り行った。
【０２０３】
結果
図８は、４つのテストした各ｍｉＲＮＡに関して、実験において得られたテンプレート濃度に対する３通りのＣｐ値を示す。比較したアッセイの４つ全てにおいて、本発明の方法（ひし形に結合している黒線）は、本発明のアッセイで一貫して得られた低Ｃｐ値によって示される通り、ｍｉＳｃｒｉｐｔアッセイ（球に結合している灰色線）より感度が高かった。ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの場合、定量的に検出された最低コピー数として測定された、本発明のアッセイは１０倍の改良された感度を有した。ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３及びｈｓａ−ｍｉＲ−１５５に関しては、感度における違いは、本発明のアッセイの使用によって１００倍となった。非常に低いｇｃ量（表16を参照されたい）且つそれ故低融解温度であるｈｓａ−ｍｉＲ−１に関して、ＲＮＡの最高濃度においてさえ代替のアッセイを、テンプレートを検出するために使用することができなかった。本発明においてデザインされたアッセイは、ＰＣＲ反応においてわずか１０ｍｉＲＮＡコピーを定量的に検出した。このデータは、本発明のアッセイが驚くことに感度が高いことを明確に示す。この感度における改善が、５’「タグ配列」（R１）及び３’「アンカー配列」（R２）いずれも含んでなる伸展プライマーのデザインに部分的に、並びにＬＮＡを含むｑＰＣＲ反応のテンプレート特異的（例えば、miR特異的）順及び逆方向プライマーのテンプレート特異的（例えば、miR特異的）順及び逆方向プライマーデザインに部分的に基づくと、我々は考えている。我々の結果は、順及び逆方向プライマーの遺伝子特異的デザインによって、ユニバーサル逆方向プライマーを使用した純粋なＤＮＡプライマーによるものよりも、より高い感度検出が可能であることを示す。
【０２０４】
【表２５】
0005749656.tif 000030
【表２６】
0005749656.tif 000031
【表２７】
0005749656.tif 000032
【表２８】
0005749656.tif 000033
【表２９】
0005749656.tif 000034
【表３０】
0005749656.tif 000035
【図１】
0005749656.tif 000036
【図２】
0005749656.tif 000037
【図３】
0005749656.tif 000038
【図４】
0005749656.tif 000039
【図５Ａ】
0005749656.tif 000040
【図５Ｂ】
0005749656.tif 000041
【図５Ｃ】
0005749656.tif 000042
【図６】
0005749656.tif 000043
【図７】
0005749656.tif 000044
【図８】
0005749656.tif 000045
【配列表】
0005749656000001.app