(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
敗血症の処置および／または予防において使用するための、哺乳動物において免疫応答を刺激し得るオクロバクトラム・インターメディウム ＬＭＧ３３０６由来のリポ多糖類。
【請求項２】
オクロバクトラム・インターメディウム株 ＬＭＧ３３０６細菌を、トリプチケースソイ培地を用いて培養し、
ａ）オクロバクトラム・インターメディウム株ＬＭＧ３３０６の不活化培養物を遠心し；
ｂ）得られた沈殿物を生理懸濁液に再懸濁し；
ｃ）精製水およびポリエチレングリコールを用いて透析し；
ｄ）４倍量のメタノールおよび１％の酢酸ナトリウム含有飽和メタノールを用いて沈殿させ；
ｅ）凍結乾燥させて、粗ＬＰＳを得る工程でリポ多糖類を抽出することを含む、
請求項１記載のリポ多糖類を製造する方法。
【請求項３】
粗ＬＰＳの精製工程：
ａ）所望により超音波を用いて、粗ＬＰＳを緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５）に溶解し；
ｂ）プロテイナーゼＫを添加して、室温でインキュベートし；
ｃ）精製したＬＰＳを超遠心分離により集め；
ｄ）サンプルを凍結乾燥する工程
をさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
請求項１記載のオクロバクトラム・インターメディウム ＬＭＧ３３０６由来のリポ多糖類および所望により１個またはそれ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、免疫応答を刺激するための組成物。
【請求項５】
オクロバクトラム・インターメディウム ＬＭＧ３３０６の化学的に純粋なＬＰＳを含むことを特徴とする、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
オクロバクトラム・インターメディウム株 ＬＭＧ３３０６由来のＬＰＳを０．５〜１２０μｇ／ｍｌ含むことを特徴とする、請求項４または５記載の組成物。
【請求項７】
リポ多糖類が、ミセル相が４℃で１年以上安定である均質な懸濁液形態で存在する、請求項４〜６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
組成物のｐＨが２〜１２である、請求項４〜７のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
哺乳動物における免疫応答の調節のための、請求項４〜８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０】
調節が、哺乳動物における免疫能力を増強することを含む、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
免疫応答の調節が、マクロファージの分化誘導、ＴＮＦ産生、ＩＬ−１２産生、脾臓リンパ球によるＩＦＮ−γ産生、および／またはウイルス特異的ＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞の活性化からなる、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
調節が、対象における炎症性サイトカインの産生を阻害することを含む、請求項１０記載の組成物。
【請求項１３】
炎症性サイトカインがＩＬ−１２である、請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
ワクチンに含まれる特定のウイルスおよび／または細菌に対して免疫を強化するためのワクチン用アジュバントとしての、請求項４〜８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１５】
敗血症の処置および／または予防のための、請求項４〜８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１６】
内毒素血症の処置および／または予防のための、請求項４〜８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１７】
感染症の処置および／または予防のための、請求項４〜８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１８】
免疫抑制動物における感染症の処置および／または予防のための、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
リーシュマニア原虫感染に対するワクチンにおけるアジュバントとしての、請求項１７または１８記載の組成物。
【請求項２０】
リーシュマニア原虫の皮膚感染に対するワクチンにおけるアジュバントとしての、請求項１９記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オクロバクトラム・インターメディウム（Ochrobactrum intermedium）株ＬＭＧ３３０６由来のリポ多糖類（ＬＰＳ）の単離、精製および特性化、ならびに哺乳動物の免疫刺激剤としてのそれらの使用、敗血症の処置および／または予防のための医薬化合物、ならびに免疫抑制動物における、およびリーシュマニア症に対するワクチン用アジュバントの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
オクロバクトラム属の細菌は、プロテオバクテリア門のアルファ２下位分類に含まれる。それらは、重症もしくは免疫不全患者または留置カテーテルを有する患者でのみ病原性となることが知られている主に土壌に生息する細菌である。オクロバクトラムが、髄膜炎、骨髄炎、菌血症、および敗血症を引き起こし得るような状況において、これらの細菌は、それら自体の慢性感染を確立することはできず、カテーテル除去後に正常な宿主から除去される（Cieslak, T. J., C. J. Drabick, and M. L. Robb. 1996. Pyogenic infections due to Ochrobactrum anthropi. Clin. Infect. Dis. 22:845−847.）
【０００３】
グラム陰性菌の外膜（ＯＭ)の主成分である全てのリポ多糖類の組成は、２−ケト−３−デオキシオクツロソン酸（ＫＤＯ）と称される特定の糖類を介して脂質Ａと称される脂質成分に結合された多糖を含むという一般原則に従うため（Rietschel, E. T., Schade, U., Jensen, M., Wollenweber, H. W., Luderitz, O. and Greisman, S. G. 1982. Bacterial endotoxins:chemical structure, biological activity and role in septicaemia. Scand. J. Infect. Dis. Suppl. 3:8）、全てのＬＰＳ分子が同一の生物学的効果を有すると推定されている。
【０００４】
しかしながら、この概念は、いくつかのＬＰＳ種のサイトカイン合成を生じる能力における大きな差異を示す研究によって修正され、この作用は、それらの脂質Ａ部分の構造上の特徴と関係している（Netea, M. G., van Deuren, M., Kullberg, B. J., Cavaillon, J. M. and van der Meer, J. W. M. 2002. Does the shape of lipid A determine the interaction of LPS with Toll−like receptors? Trends Immunol. 23:135.）。
【０００５】
グラム陰性通性細胞内細菌であるレジオネラニューモフィラは、そのＬＰＳの低い内毒素性および化学構造の両方に関してブルセラ菌と類似であり、腸内細菌のＬＰＳによって引き起こされる内毒素性より顕著に低い（Zahringer, U., Knirel, Y. A., Lindner, B., Helbig, J. H., Sonesson, A., Marre, R. and Rietschel, E. T. 1995. The lipopolysaccharide of Legionella pneumophila serogroup 1 (strain Philadelphia 1): chemical structure and biological significance. Prog. Clin. Biol. Res. 392:113. 26）。
【０００６】
オクロバクトラム・アンスロピ属は、既知のブルセラ菌の最も近縁種である（Velasco et al. International Journal of Systematic Bacteriology 48 (1998) 759−768）。それらの近縁の系統発生的関係にも関わらず、ブルセラ・アボルタスとオクロバクトラムは、ＯＭ特性が顕著に異なり、これらの大きな差異は、ＬＰＳにおけるわずかな変化によって少なくとも一部分引き起こされる（Velasco et al. Infection and Immunity 68 (2000)3210−3218）。
【０００７】
オクロバクトラム・インターメディウム ＬＭＧ３３０１由来のＬＰＳの完全なコア−脂質Ａ骨格およびオクロバクトラム・アンスロピ ＬＭＧ３３３１由来のＬＰＳのＯ型鎖が、決定された（Velasco et al. Carbohydrates Research 306 (1996)123−126; Velasco et al. Carbohydrates Research 306 (1998)283−290; Velasco et al. Infection and Immunity 68 (2000)3210−3218）。
【０００８】
オクロバクトラム・インターメディウム ＬＭＧ３３０６株は、Velascoらにより発表されたが（International Journal of Systematic Bacteriology 48 (1998) 759−768）、それにもかかわらず、オクロバクトラム・インターメディウム ＬＭＧ３３０６由来のＬＰＳは、未だ報告されていない。
【０００９】
一方、米国だけでも毎年およそ９００，０００症例の敗血症が発生し、その結果、およそ２１０，０００人が死亡し、約１７億ドルの費用がかかっている。敗血症は、罹患率が上昇しつつあり、死亡率２７−４８％の疾患である。敗血症性ショックは、敗血症の結果起こり、高い頻度で死に至る。敗血症罹患中に感染と共に生じる重篤な炎症は、いくつかの治療的介入の目標であった。それにもかかわらず、一般的な抗炎症剤を用いる２０年以上の臨床試験での敗血症の炎症面は、この手法があまり成功しなかったことを示した。
【００１０】
敗血症に至る病理学的機序は、複雑であって、理解が難しい。敗血症は、全身性炎症反応、その後の代償性抗炎症性反応を伴う。それらのバランスは宿主の生存に重要である。さらに、敗血症の動物モデルは、ヒト患者における敗血症のこの複雑な性質を容易には模倣し得ない。
【００１１】
近年、敗血症性ショックのほとんどの影響がエンドトキシン(ＬＰＳ)を循環させる大規模な放出によるものと考えられているため、トール様受容体(ＴＬＲ)アンタゴニストによるそれらの作用を処理するいくつかの試みがなされている。従って、ＴＬＲ４アンタゴニストとして作用するＬＰＳの脂質Ａ部分の構造類縁体であるエリトラン（Eritoran）は、フェーズIIの開発段階にあり、また重症敗血症患者の死亡率の低下を示した。さらに、ＴＡＫ−２４２はＴＬＲ４シグナル伝達阻害剤であり、それは、炎症性サイトカインレベルを低下させ、また高いＩＬ−６レベルを有する重症敗血症患者の下位集団における死亡率を低下させる。
【００１２】
今日でも、利用可能なワクチンがない多くの感染性疾患が存在する。これらの場合のいくつかにおいては、失敗の原因は、正確かつ適当な免疫反応を誘導するための正確なアジュバントの欠如にある。細胞内細菌、ウイルスおよびほとんどの原生動物のようないくつかの感染源に関して、防御免疫反応はＩＦＮγ産生に特徴付けられるＴヘルパー１型(ＴＨ１)のものである。対照的に、ほとんどの蠕虫に対する防御反応は、ＩＬ−４産生を特徴とする２型（ＴＨ２)のものである（Fresno, M., M. Kopf, and L. Rivas. 1997. Cytokines and infectious disease. Immunol Today 18:56−58）。多くのアジュバントの毒性およびＴｈ１誘導の悪化（exarcebated）により、ヒトワクチン剤形に利用可能なアジュバントはほとんどない。実際にアジュバントではないミョウバンが、ヒトワクチン剤形で最も使用されている。近年、トール様受容体(ＴＬＲ)のアゴニストが、大きな関心を集めている（Hoffman, Nature Reviews Drug Discovery 4, 879, 2005）（Kwissa; Expert Vaccine Rev., 6, G73, 2007）。いくつかの抗原は、種々のＴＬＲのいくつかのアゴニストと共に、現在分析されている。
【００１３】
最後に、既に承認されているものを含む何れかのワクチン剤形の主な問題の１つは、それらが免疫抑制された対象においてほとんど作用しないことである。その他に、それらのうちのいくつかは、患者に副次的影響を有する（Kwissa, et al 2007）。
【００１４】
オクロバクトラム・インターメディウム ＬＭＧ ３３０１由来の野生型ｄｅｅｐ−ｒｏｕｇｈ ＬＰＳ (Ｏ型鎖が存在せず、外核部分からのいくつかの単糖を欠くＬＰＳ) の完全なコア脂質Ａ骨格は、Velascoらの、Carbohydrates Research 306 (1998)283−290に記載され；オクロバクトラム・アンスロピ ＬＭＧ ３３３１ ＬＰＳ由来の野生型ｓｍｏｏｔｈ ＬＰＳ由来のＯ型鎖は、Velascoらの、Carbohydrates Research 306 (1996)123−126に発表され；完全ＬＰＳの分子量は、Velascoらの、Infection and Immunity 68 (2000)3210−3218に報告されている。
【００１５】
オクロバクトラム・インターメディウム ＬＭＧ ３３０６株は、Velascoらによって発表されているが（International Journal of Systematic Bacteriology 48 (1998) 759−768）、それにも関わらず、オクロバクトラム・インターメディウム ＬＭＧ ３３０６由来の野生型ｓｍｏｏｔｈ ＬＰＳは未だ報告されていない。
【発明の概要】
【００１６】
発明の概要
今日、オクロバクトラム・インターメディウム株 ＬＭＧ ３３０６のリポ多糖類(ＩＭ）が、敗血症の処置および／または予防に有用であり、ならびに免疫抑制された動物およびリーシュマニア症患者におけるワクチン用アジュバントとして有用であることを実証した。
【００１７】
故に、本発明の第一局面は、敗血症の処置および／または予防、ならびに免疫抑制された動物およびリーシュマニア症患者に対するワクチン用アジュバントのための医薬の製造における、オクロバクトラム・インターメディウム株 ＬＭＧ ３３０６のリポ多糖類（ＩＭ）の使用に関する。
【００１８】
本発明の一態様は、敗血症性ショックおよび内毒素ショックの処置および／または予防のための医薬の製造における、オクロバクトラム・インターメディウム株ＬＭＧ ３３０６（ＩＭ）のリポ多糖類の使用を提供する。
【００１９】
本発明の他の態様は、ヒトおよび動物の両方における感染症に対するワクチン用アジュバントとしてのオクロバクトラム・インターメディウム株 ＬＭＧ ３３０６のリポ多糖類（ＩＭ）の使用を提供する。
【００２０】
本発明の特定の態様は、免疫抑制されたヒトを含む動物における、感染症の処置および／または予防のための医薬の製造におけるＩＭの使用を提供する。
【００２１】
本発明により、オクロバクトラム・インターメディウム株 ＬＭＧ ３３０６のリポ多糖について記載されている使用は、ヒトおよび動物の両方に適用可能である。故に、本発明を通じて、動物における使用に関する記載は、ヒトもまた包含する。
【００２２】
まとめると、哺乳類の免疫刺激剤は、敗血症および内毒素血症を処置および予防し、免疫抑制された動物におけるワクチン用アジュバント特性を有し、また足蹠リーシュマニア症における実験マウスモデルでの防御および治療効果を有する。
【００２３】
ＩＭ（オクロバクトラム・インターメディウム株 ＬＭＧ３３０６由来のリポ多糖類）は、
−マクロファージにおいてＩＬ−１２産生を誘導すること、
−本発明のＬＰＳによって誘導されたＴＮＦのレベルは、腸のＬＰＳよりはるかに低く、病理学的効果を有さないこと、
−本発明のＬＰＳはＴヘルパー１（ＴＨ１）活性化およびγ−ＩＦＮ産生を誘導すること、
を含む、免疫刺激剤として広範な活性を有することが証明された。
【００２４】
本化合物は、哺乳動物における免疫応答を刺激する能力に関係している。故に、本発明は、オクロバクトラム・インターメディウム株 ＬＭＧ３３０６ リポ多糖類および所望により１種またはそれ以上の薬学的に許容される賦形剤を含んでいてよい免疫刺激組成物を提供する。好ましくは、免疫応答の調節とは、ヒトの免疫能を増強することである。
【００２５】
本発明は、敗血症および内毒素血症を予防および治療する化合物としての哺乳動物の免疫刺激剤であるＩＭの使用に関する。本発明は、特に、正常動物および実験的に免疫抑制された動物におけるワクチン効果を改善するためのアジュバントとしての使用に関する。この点で、そのアジュバント特性の例として、本発明は、特に、実験的なリーシュマニア感染症のためのワクチン用アジュバントとしての、およびリーシュマニア症、主に足蹠リーシュマニア症の実験マウスモデルを用いる皮膚リーシュマニア症の治療および防御効果としての、ＩＭの使用に関する。
【００２６】
本発明は、哺乳動物の免疫刺激剤として医薬分野で用いるための化合物としての、オクロバクトラム・インターメディウム株 ＬＭＧ３３０６由来のＬＰＳの製造方法に関する。
【００２７】
本発明の化合物は、ウシ、ブタ、乳牛およびマウスで行う実験的野外試験における免疫刺激剤として特異的な活性を発現する：
−本発明の化合物と合わせて特定のワクチン接種後のＩＢＲウイルスに対する中和抗体の増加の影響
−マクロファージ分化の誘導
−マクロファージにおけるＴＮＦの誘導
−マクロファージにおけるＩＬ−１２の誘導
−脾臓リンパ球によるＩＦＮ−γ産生の誘導
−ＴＬＲ４およびＴＬＲ２受容体による免疫刺激作用
−Ｔ細胞の刺激に対する用量依存的な影響。
【００２８】
従って、本発明は、オクロバクトラム・インターメディウム株 ＬＭＧ３３０６ リポ多糖類（ＬＰＳ）の、哺乳動物における免疫応答を刺激し得る能力に関する。故に、本発明は、オクロバクトラム・インターメディウム株 ＬＭＧ３３０６ リポ多糖類および所望により１種またはそれ以上の薬学的に許容される賦形剤を含んでいてよい免疫刺激組成物を提供する。好ましくは、免疫応答の調節とは、哺乳動物の免疫能を増強することである。
【００２９】
本発明はまた、オクロバクトラム・インターメディウム株 ＬＭＧ３３０６ ＬＰＳまたはそれを含む医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における免疫応答を調節する方法に関する。故に、本発明はまた、哺乳動物に一般的な細胞性免疫を誘導するための医薬の製造における免疫刺激組成物の使用に関する。
【００３０】
本発明はまた、オクロバクトラム・インターメディウム ＬＭＧ３３０６のＬＰＳを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるマクロファージの分化誘導、ＴＮＦ産生、ＩＬ−１２産生、脾臓リンパ球によるＩＦＮ−γ産生、およびウイルス特異的ＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ−細胞の活性化のための医薬の製造における本発明の免疫刺激組成物の使用に関する。
【００３１】
他の態様において、本発明の免疫刺激組成物は、ワクチン中に含まれる特定のウイルスおよび／または細菌に対してより免疫性にする（よりよい免疫化）ためのワクチン用アジュバントとして使用される。
【００３２】
これらの致死未満量または他の低毒素ＬＰＳによる内毒素ショックの予防に関するほとんどの研究が、予め接種が必要であることを示している（Hatao, F., et al., The induction of super − resistance using synthetic lipopolysaccharide receptor agonist rescues fatal endotoxemia in rats without excessive immunosuppression. Shock2005; 23 (4): 365−70）。本発明者らは、驚くべきことに、オクロバクトラム・インターメディウム株 ＬＭＧ３３０６のリポ多糖が、前もって脱感作期間を要せず、オクロバクトラム・インターメディウム株 ＬＭＧ３３０６のリポ多糖類と毒性作用を保護したＬＰＳを合わせた接種のみを要することを見出した。
【００３３】
また、ほとんどの公表データで、インビトロまたは細胞株でのＴＮＦの抑制とインビボでの脱感作作用との関係を見出されている（例えば、Lehner, MD, et al, lipopolysaccharide and Highly Purified Lipoteichoic Acid Via Different Toll −Like receptors Independent of Paracrine Mediators. 2,001. J. Immunol. 166: 5161−5167を参照）。しかしながら、本発明者らは、オクロバクトラム・インターメディウム株 ＬＭＧ３３０６のリポ多糖が、インビボでＬＰＳの作用を保護するが、マクロファージ株でも腹腔マクロファージまたは脾臓細胞においてもＴＮＦまたはＩＬ−１２の分泌を低下させないことを見出した。インビボでの予備的結果はまた、オクロバクトラム・インターメディウム株 ＬＭＧ ３３０６のリポ多糖（ＩＭ）が、何らかの機序で、ＬＰＳにより誘導されるＴＮＦレベルを大幅に減少させ得ることを示唆する。何れの場合も、ＴＮＦレベルと保護に直接的な関係はない。これらの結果は、驚くべきことである。
【００３４】
ＩＬ−１０またはＴＧＦ−βの増大した産生の脱感作作用に起因すると考える他の仮説がある（Randow, F. et al., Mechanism of endotoxin desensitization: involvement of 35 interleukin 10 and transforming growth factor beta. J. Exp. Med 1995. 181, 1887−1892）。しかしながら、ＩＬ−１０が、ＩＭによりインビトロでほとんど誘導されないという事実により、そのような場合はなく、実際に、何かが腹腔マクロファージまたは脾臓細胞中でのＩＬ−１０の産生を阻害し（けれども、それは有意ではない）、ＬＰＳにより誘導されるＩＬ−１０のレベルは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の脾臓細胞の場合を除いて、ＩＭにより顕著に増大されないようである。
【００３５】
他の興味のある局面は、病原体間の免疫応答を調節するＩＭの能力である。従って、リーシュマニア属の主な感染系を用いて、ＩＭが、ＣｐＧと同様の方法ではなく、免疫源性リーシュマニア抗原抽出物の作用を増強することが明らかになった。ＣｐＧは、ＴＬＲ９とのそれらの結合を介して、Ｔｈ１応答を増強する（それは、リーシュマニア属および多くの他の細菌のような病原体から保護する）公知の免疫調節剤であり、免疫調節剤およびワクチンアジュバントとして特許が取得されている。しかしながら、ＩＭは、インビボでＴｈ１／Ｔｈ２ プロフィールを変化させず、故に、ＣｐＧ以上に悪化させる。このことは、ＩＭが、体液性（Ｔｈ２）および細胞性（Ｔｈ１）の両方が防御に重要な役割を果たす感染における良好なＣｐＧアジュバントであり得ることを示唆し得る。防御反応だけでなく、ＩＭが防御を直接誘導し得て、すなわち、リーシュマニア属による感染に治療効果を有することを示すことを証明したことはおそらくより重要である。
【００３６】
本明細書および特許請求の範囲の全体にわたって、用語“含む”および該用語の変形は、他の技術的特徴、付加物、成分または工程を除外することを意図しない。さらなる発明の目的、利点および特徴は、当該記載の検討により当業者に明らかになり得るか、または本発明の実施により習得され得る。以下の実施例および図面は、説明を目的として提供され、それらは、本発明を限定することを意図しない。さらに、本発明は、本明細書に記載の特定かつ好ましい態様の全ての可能性のある組み合わせを包含する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、ＩＭの使用による、大腸菌のＬＰＳによって引き起こされる毒性作用の予防を示す。５匹のマウスの群を、ＬＰＳ（１．７５ｍｇ）またはＩＭ（オクロバクトラム・インターメディウムのＬＰＳ）０．６μｇ／Ｋｇ（用量６０）もしくは３μｇ／Ｋｇ（用量３００）単独、またはそれらの組合せで処理し、生存を評価した。
【図２】図２は、ＬＰＳ内毒素ショックの処置を示す。５匹の動物群をＬＰＳで処理する（２ｍｇ／動物）。２４時間後、それらにＩＭ（オクロバクトラム・インターメディウムのＬＰＳ）０．６μｇ／Ｋｇ（用量６０）または３μｇ／Ｋｇ（用量３００）を注入し、生存を評価した。
【図３】図３は、大腸菌性腹膜炎の予防を示す。５匹のマウスの群に大腸菌（コロニー形成のための１Ｅ７ユニット、ＣＦＵ）を注入し；２４時間後に、動物にＩＭ（オクロバクトラム・インターメディウムのＬＰＳ）０．６μｇ／Ｋｇ（用量６０）または６μｇ／Ｋｇ（用量６００）を注入し、生存（上パネル）および臨床症状（下パネル）を評価した。
【００３８】
【図４】図４は、大腸菌性腹膜炎の治療を示す。５匹のマウスの群に大腸菌（コロニー形成のための１Ｅ８ユニット、ＣＦＵ）を注入し；４時間後、動物にＩＭ（オクロバクトラム・インターメディウムのＬＰＳ）０．６μｇ／Ｋｇ（用量６００）を注入し、生存（上パネル）および臨床症状（下パネル）を評価した。
【図５】図５は、リーシュマニア症に対する防御免疫および作用経路の免疫図の一般的特徴を示す。図に示す通り、寄生虫とマクロファージの相互作用は免疫反応を生じ、それが主にＴｈ１ リンパ球活性化に基づくとき、寄生虫に対する反応は有効かつ成功裏であるが、主にＴｈ２の応答であるときは、感染が現れ得る。
【図６】図６は、リーシュマニア症に対するワクチンにおいて、可能性のあるアジュバント ＩＭ２５（オクロバクトラム・インターメディウム ＬＭＧ３３０６のリポ多糖類）を評価するための免疫化プロトコールを示す。５匹のマウスの群に、０日、１５日および３０日目にＳＬＡ抗原単独またはＣｐＧまたはＩＭをワクチン接種した。６０日目に、各動物の足蹠に１０００プロマスチゴート（promastigote）を注入し、病変部の変化および免疫パラメーターを評価した。
【００３９】
【図７】図７は、ＳＬＡおよびＳＬＡ−ＣｐＧ（上パネル）またはアジュバントとしてＳＬＡ−ＩＭをワクチン接種した動物における病変の変化を示す。感染による足蹠の腫れを定量する。
【図８】図８は、ＳＬＡおよびＳＬＡ−ＣｐＧ ＳＬＡ−ＩＭ 対 対照（ＰＢＳ）をワクチン接種した動物の足蹠における傷の巨視的状態を示す。図中、６週間の感染期間中の、対照群の動物、１匹のＳＬＡをワクチン接種した動物、１匹のＳＬＡ−ＣｐＧをワクチン接種した動物および６匹のＳＬＡ−ＩＭをワクチン接種した動物の写真が含まれる。
【図９】図９は、脾臓およびリンパ節（ＤＬＮ）中の寄生虫数の定量化を示し、ＳＬＡでのワクチン接種は、対照群に対して該臓器中で計数された寄生虫数の如何なる減少も生じないが、ＳＬＡ−ＣｐＧは、その数をおよそ２ｌｏｇ低下し、ＳＬＡ−ＩＭ群でも同様の低下を示す結果が得られた。
【００４０】
【図１０】図１０は、屠殺した動物の脾臓由来の細胞（単離され、インビトロでＳＬＡで刺激された細胞）におけるＴｈ１応答（ＩＦＮ−γ）および／またはＴｈ２（ＩＬ−４）の評価の結果を図示する。
【図１１】図１１は、特異的抗体アイソタイプＩｇＧ２ａ（Ｔｈ１）およびＩｇＧ１（Ｔｈ２）に関して、リーシュマニア属レベルの分析結果によって変わるＴｈ１／Ｔｈ２応答の評価を示す。
【図１２】図１２は、リーシュマニア症に実験的に感染させた動物における、ＩＭの治療効果を評価するプロトコールを示す。
【図１３】図１３（Ａ）は、ＩＭをワクチン接種した動物における病変部の評価を示す。感染による足蹠の腫れを定量する。（Ｂ）は、対照群（ＰＢＳ）と比較して、ＩＭをワクチン接種した動物の足蹠病変部の巨視的状態を示す。６週間の感染中の、１匹の対照群の動物、１匹のＣｐＧをワクチン接種した動物、および全ての６匹のＳＬＡ−ＩＭをワクチン接種した動物の写真が含まれる。（Ｃ）は、７週後の脾臓およびリンパ節（ＤＬＮ）中の寄生虫数の定量化を示す。
【００４１】
【図１４】図１４は、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比を含む、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体に対する、ＰＢＳ対照サンプル、ＣＰＧサンプルおよびＩＭサンプルの比較表を示す。
【図１５】図１５は、免疫抑制された動物におけるアジュバントＲＴの役割を分析するために用いるプロトコールの概要を示す。５匹の動物群を、デキサメサゾンで免疫抑制し、ＳＬＡ、ＳＬＡ−ＣｐＧまたはＳＬＡ−ＩＭをワクチン接種した。２４時間後、動物を感染させ、その後８日目に再感染させた。６０日目に屠殺後、病変部の変化および免疫パラメーターを評価した。
【図１６】図１６は、マウスの脾臓細胞における、ＳＬＡをワクチン接種した後のＩＭのアジュバント作用を示す。脾臓細胞を、抗原ＳＬＡ（１０ｇ／ｍｌ）の存在下または不存在下で７２時間培養し、細胞増殖を、７２時間の間のＤＮＡへのトリチウム化チミジンの挿入により評価する。結果は、各実験において６匹の動物を用いてトリプリケートで２回実験した平均を示す。
【００４２】
【図１７】図１７は、ワクチン接種した動物由来の脾臓細胞によるＩＬ−４産生への影響を示す。脾臓細胞を種々の動物から単離し、ＳＬＡ（１０ｇ／ｍｌ）で刺激し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−４の分泌を分析した。
【図１８】図１８は、ワクチン接種し、デキサメサゾン（ＤＥＸ）で処理したマウスの脾臓細胞によるＩＬ−４およびＩＦＮ−γの効果を示す。
【図１９】図１９は、ワクチン接種した動物におけるＳＬＡに対する細胞応答を示す。ＳＬＡのインビトロ添加後１７日目での、ＩＦＮ−γに対する特異的応答およびＳＬＡに対する応答を示す。ＩＦＮ−γ分泌（Ｔｈ１）／ＩＬ−４（Ｔｈ２）の比を示す。
【００４３】
【図２０】図２０は、生マクロファージにおける、大腸菌ＬＰＳと比較した、免疫刺激化合物の添加後のＪ７７４細胞の分化を示す。本発明の免疫刺激化合物は、Ｊ７７４マクロファージの分化の用量依存的阻害をもたらす。この作用は、Ｊ７７４または生マクロファージにおける重量／容量に基づく大腸菌由来のＬＰＳで観察されたものよりもおよそ５００倍低い（データ示さず）。
【図２１】図２１は、刺激していないマクロファージは、ＥＬＩＳＡにより検出可能なＴＮＦを合成しないことを示す。０．１−１０μｇ／ｍｌ用量の本発明の免疫刺激組成物は、Ｊ７７４ マクロファージ（図２１ａ）ならびに生細胞（データ示さず）において、用量依存的に４０００ｐｇ／ｍｌまでの有意なＴＮＦ産生反応レベルを誘導する。本発明の免疫刺激剤の効果は非常に有意であるが、大腸菌由来のＬＰＳよりおよそ５００倍低かった（図２１ｂ）。
【００４４】
【図２２】図２２は、本発明の免疫刺激組成物が、マウスのＢａｌｂ／ｃおよびＣ５７Ｂ１６株両方由来のマクロファージにおけるＴＮＦ産生を誘導するが、同じ濃度で大腸菌ＬＰＳより有効性が低いことを示す。
【図２３】図２３は、１０ｍμｇ／ｍｌの用量の本発明の免疫刺激剤は、Ｃ５７Ｂｌ／６およびＢａｌｂ／ｃの両方由来の腹膜マクロファージにおける、多量のＩＬ−１２を誘導することを示す。
【図２４】図２４は、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）刺激が、両株のマウス由来の脾臓細胞による多量のＩＦＮ−γ分泌を誘導することを示し、ＩＦＮγの産生により特徴付けられるＴｈ１応答を刺激することを示唆する。１−１０μｇ／ｍｌ用量の本発明の免疫刺激組成物は、Ｃ５７Ｂｌ／６およびＢａｌｂ／ｃの両方由来の脾臓リンパ球の多量のＩＦＮγを誘導する。
【００４５】
【図２５】図２５は、本発明の免疫刺激組成物が、Ｃ５７ＢＩ／６由来の腹腔マクロファージにおけるＴＮＦを誘導するが、マクロファージにおけるＴＬＲ−２欠失は単に部分的に活性を阻害するのみで、ＴＬＲ４の欠損は強く誘導を低下させることを示す。
【図２６】図２６は、本発明の免疫刺激組成物が、Ｃ５７ＢＩ／６由来の腹腔マクロファージにおいてＩＬ−１２を誘導するが、マクロファージにおけるＴＬＲ−２の欠失は、単に部分的に活性を阻害するのみで、ＴＬＲ４の欠損は強く誘導を低下させることを示す。
【図２７】図２７は、コンカナバリンＡ刺激がＩＦＮ−γ分泌を誘導し、それは、Ｃ５７Ｂｌ／６ ＴＬＲ２−／−由来の脾臓細胞で非常に低下し、Ｃ５７Ｂｌ／６ ＴＬＲ４−／− 細胞では、１０ｍｇの免疫刺激化合物を用いたとき、ほぼ完全に消失することを示す。
【図２８】図２８は、Ｂ６ Ｃ５７マウス由来の脾臓細胞をリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスで感染させた後、異なる刺激；左から右へ：非ペプチド；ＬＣＭＶＮＰ３９６ペプチド（ペプチドＮＰ３９６）；培地のみ；ＰＭＡ＋イオノマイシン；異なる濃度の免疫刺激化合物、の添加によって誘導されたＴ細胞応答性ＣＤ４（図２８ａ）またはＣＤ８（図２８ｂ）を示す。
【００４６】
特定の態様／例の詳細な説明
用語“免疫刺激組成物”は、本明細書で広義に定義され、該製品を接種された哺乳動物における免疫応答を刺激し得る投与可能な形態の任意の生物学的物質を意味する。
【００４７】
本明細書で用いる用語“精製した”は、それがＬＰＳと関係するとき、ＬＰＳが、それに限定されないが、上記の方法のような分画法または精製法により、種々の他の成分を除去され、組成物が実質的にその発現される生物学的活性を保持しないことを示す。用語“実質的に精製した”を用いるとき、この意味は、ＬＰＳが該組成物の主な非溶媒成分を形成する組成物を意味し得る。例えば、“実質的に精製したＬＰＳ”は、溶液または組成物の非溶媒成分の約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上が本発明のＬＰＳであることを示す。
【００４８】
本発明の好ましい態様に従い、免疫刺激組成物は、非溶媒成分は、０．２％以上の他の化合物（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、グルカン、脂質等）が混入してない、実質的に精製された形態のオクロバクトラム・インターメディウム株 ＬＭＧ３３０６のＬＰＳを含む。
【００４９】
“免疫学的有効量”は、哺乳動物における検出可能な細胞性または体液性免疫応答を誘導するのに十分な免疫源の量を意味する。
【００５０】
本明細書で用いる“防御免疫応答”は、特定の病原体により引き起こされる感染または疾患を予防または遅延する細胞性または体液性免疫応答を意味する。
【００５１】
本発明の化合物は、賦形剤、ｐＨおよび濃度に基づき常套的製造技術を用いて製造され得る。
【００５２】
本発明の態様に従い、リポ多糖類は、オクロバクトラム・インターメディウム ＬＭＧ３３０６から以下の工程で抽出される：
ａ）オクロバクトラム・インターメディウム ＬＭＧ３３０６の不活化培養物を遠心し；
ｂ）得られた沈殿物を再懸濁して生理懸濁液とし；
ｃ）精製水およびポリエチレングリコールを用いて透析し；
ｄ）４倍量のメタノールおよび１％の酢酸ナトリウム入り飽和メタノールで沈殿させ；
ｅ）凍結乾燥させて、粗ＬＰＳを得る。
【００５３】
好ましい態様に従い、一旦、粗ＬＰＳを凍結乾燥させて、それを以下の工程で精製する：
１． 粗ＬＰＳを、要すれば超音波を用いて、緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７，５）に溶解し；
２． プロテイナーゼＫを添加し、室温でインキュベートし；
３． 精製したＬＰＳを超遠心分離により集め；
４． サンプルを凍結乾燥させる。
【００５４】
本発明の免疫刺激化合物の製造方法の好ましい態様のより詳細な記載を、以下のフローチャートで表わす：
オクロバクトラム・インターメディウム ＬＭＧ３３０６ ＬＰの抽出法のフローチャート：
【表１】
0005730862.tif 000002
【００５５】
製造法は、以下の工程を含む：
ｉ）ワーキングシード細菌（ＬＭＧ３３０６株）の解凍
接種前準備：
１． Triptycase Soy Broth（ＴＳＢ）を１Ｌ準備する
２． ６０ｍｌのＴＳＢを含むチューブを準備する
３． ワーキングシード凍結バイアルから種菌(pearl)を取り出し、６０ｍｌのＴＳＢを含むチューブにそれを加える
４． ３７±０．１℃で２４時間、振とうしながらインキュベートする
５． 前接種源の制御：同定および純度制御：コロニーの形態および培養物の顕微鏡的形態の確認。
【００５６】
ｉｉ）制御発酵槽中の増殖：
接種物製造
１． スクロース ２‰を添加した培養培地ＴＳＢを準備する
２． スクロース ２‰を添加した５ＬのＴＳＢ（ｐＨ６．７５±０．１５）を含む接種ボトルを準備する
３． 培養培地を含む接種ボトル中で前接種源を接種する
４． ３７±０．１℃で２４時間、振とうしながらインキュベートする
５． 接種源の制御：同定および純度制御：コロニーの形態および培養物の顕微鏡的形態の確認。
【００５７】
培養
１． 発酵装置を浄化および滅菌する
２． スクロース ２‰を添加した４００ＬのＴＳＢを準備する
３． スクロース ２‰を添加し、ｐＨ６．７５±０．１５に合わせた４００ＬのＴＳＢを発酵装置に入れる
４． 培養培地を含む発酵装置に接種源を入れる
５． ３７±０．１℃で２４時間、最大５０ｒｐｍで振とうしながらインキュベートする
６． 培養物の制御：同定および純度制御：コロニーの形態および培養物の顕微鏡的形態の確認。
【００５８】
不活性化
１． 滅菌導管により不活性化タンクに培養物を移送する
２． ホルムアルデヒド溶液を、終濃度０．４％まで添加し、３７℃で１０ｒｐｍで振とうしながら３日間インキュベートする。
【００５９】
遠心分離
１． 発酵槽を連続遠心分離機に接続し、発酵槽の内容物を遠心する
２． １０リットル容量のプラスチックボトルに不活化培養物を入れ、使用まで４℃で貯蔵する。
【００６０】
ｉｉｉ）以下に記載の通り、ＬＰＳ抽出法を行う：
１−オクロバクトラム・インターメディウム ＬＭＧ３３０６の不活化培養物を遠心する。上清を除去する。
２−得られた沈殿物を再懸濁し生理懸濁液とする：２００ｇ／ｌ １５ｍＭ ＮａＣｌ。
３−６５℃で、水溶液に９０％でフェノールを添加する。
４−６５℃で２０分間振とうする。混合物を１０℃まで冷却する。
５−９０００ｘｇで２０分間遠心する。４℃で２４時間維持する。
６−初めに純水で、次いでポリエチレングリコールで透析する。
７−４倍量のメタノールおよび１％の酢酸ナトリウム含有飽和メタノールで沈殿させる。
８−９０００ｘｇで２０分間遠心する。上清を除去する。抽出物を純水で再懸濁し、振とうする。
９−工程７を繰り返す。
１０−サンプルを凍結乾燥して、粗ＬＰＳを得る。
【００６１】
ｉｖ）以下の方法によるＬＰＳの精製：
１． 超音波を用いて、１００ｍｇの粗ＬＰＳを２０（５ｍｇ／ｍｌ）の緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７，５）に溶解する。５−１０ｍｇのＬＰＳを対照として使用する。
２． ０．５ｍｌのプロテイナーゼＫ（１ｍｇのＬＰＳ当たり、５０μｇ／ｍｌまたは５μｇのプロテイナーゼ）を添加する。室温で１２時間、撹拌および軽く振とうしながらインキュベートする。
３． 純粋なＬＰＳを超遠心（１００．０００×ｇ、６時間）により集める。沈殿物を純水に再懸濁する。
４． サンプルを凍結乾燥させる。
【００６２】
ｖ）バルク溶液を以下の通り製造してＬＰＳ濃度を計測：
材料および反応材
１． １，２５ Ｎ Ｈ２ＳＯ４：Ｈ２Ｏ ＤＤ中、６，６６ｍｌの市販の反応材で１００ｍｌとする。
２． ０，０４２Ｎ 過ヨウ素酸：１００ｍｌの０，１２５Ｎ Ｈ２ＳＯ４中、０，４８ｇの過ヨウ素酸（パラ過ヨウ素酸、Ｈ１５ＩＯ６）
３． ０，５Ｎ ＨＣｌ中、２％ 亜ヒ酸ナトリウム（２００ｍｌ Ｈ２Ｏに８，３ｍｌ ＨＣｌ濃縮物）
４． チオバルビツール酸（Sigma）：０，３％ ｐＨ２（Ｈ２Ｏ ＤＤ中に溶解、５０℃）。１５日以内に使用する。
５． ジメチルスルホキシド
６． 標準：
Ｋｄｏ（分子量＝２５５，１）（Sigma、−２０℃で貯蔵）
デオキシリボース（分子量＝１３６）（Sigma、−２０℃で貯蔵）
７． 上記のバッチから定量したＬＰＳ
８． ビー玉（marble）が合致するガラス管（第二クロム混合物または等量物で浄化）。
９． 分光光度計。
【００６３】
方法
１． Ｋｄｏ標準（０．０５μｇ）、デオキシリボース標準（０．０２５μｇ）、上記のバッチから定量したＬＰＳ（０．２μｇ）およびブランク反応材（２００μｌ Ｈ２Ｏ）を含むチューブを準備し、
ａ）サンプルが抽出したＬＰＳであるとき、凍結乾燥させ、０．２μｇを計量し、１つのチューブに準備する。
ｂ）サンプルが最終生成物のとき、２００μｌを含むチューブを準備する。
チューブにＨ２Ｏを加えて２００μｌとする。
２． サンプルを含むチューブを氷上に置き、２０μｌの１．２５ Ｎ Ｈ２ＳＯ４を各チューブに加え、それらをビー玉で栓をして正確に２０分間沸騰させる。氷上で冷却する。この工程は、標準サンプルには行わない。
３． ０．２５ｍｌの過ヨウ素酸をサンプルおよび標準サンプルに迅速に加え、振とうし、それらを室温で２０分間インキュベートする（最初のチューブから計る）。過ヨウ素酸を加えるため、チューブをＨ２ＳＯ４が添加されたときと同じ順にしておく。測定されたＫｄｏの量は、Ｋｄｏの可溶化によって、また加水分解条件中のその分解によっても変わるため、加水分解時間を最適化しなければならない（２０分は、オクロバクトラム・インターメディウム ＬＭＧ３３０６ ＬＰＳにとって十分である）。
４． ３と同じ順のチューブを、０．５ｍｌの亜ヒ酸ナトリウムを添加し、ボルテックスして振とうし、最初のチューブへの添加から２分間待つ（試薬の添加により現れる黄色が、この時消失する）。
５． 各チューブに前と同じ順で２ｍｌのチオバルビツール酸を迅速に添加する。それらをビー玉で栓をして２０分間沸騰させる。
６． 各チューブに正確に１ｍｌのＤＭＳＯ（混濁の出現を避ける）を添加し、その後、それらを、水道水を入れたトレー中で冷却する。
７． 室温で３０分間インキュベートする。ランプを安定化させるために、初めの３０分間、分光光度計を点けておく。
８．各チューブを５５２ｎｍおよび５３６ｎｍ（Ｋｄｏおよびデオキシリボースそれぞれの最大吸収）で読み出す。プラスチックトレーを用い得る。
【００６４】
測定
Ｍｋ５５２＝Ａｂｓ５５２／μｍｏｌｋを、Ｍｋ５３６、Ｍｄ５５２ ｙ Ｍｄ５３６と同様に計算する
【化１】
0005730862.tif 000003
ｋ：ＫＤＯ；ｄ：デオキシリボース；Ａｂｓ：吸光度。
【００６５】
ｖｉ）以下に記載の最終プロセスまでのバッチの均質性：
定量化プロセスのこの均質性確認法は、製品製造中、ＥＭＥＡ／ＣＶＭＰ／５９８／９９“プロセスバリデーションのガイダンスノート”に従って２回用いられる：
−オクロバクトラム・インターメディウム ＬＭＧ３３０６不活性化培養物からのＬＰＳ抽出の終わりに、その濃度を知るために用いる。
−最終生成物中のＬＰＳの量を調べるために用いる。
【００６６】
該確認法は、抽出段階の終わりに適用されるプロセスである。分析法で用いられる量は、最終製品中で定量される量よりもはるかに多い。抽出されたＬＰＳの濃度を知るためにこの方法を用いる。
【００６７】
ＬＰＳ定量化は、その成分の１つであるＫｄｏの定量化で行う。Ｋｄｏは、ＬＰＳ分子の一部であり、特定のＬＰＳに常に一定量存在するが、異なる細菌ＬＰＳでは量が変わる。オクロバクトラム・インターメディウムにおいて、ＬＭＧ３３０６は、各ＬＰＳ分子について２分子のＫｄｏである。
【００６８】
定量化は、分光光度法によって行われる。
【００６９】
Ｋｄｏの定量化は、サンプルが抽出ＬＰＳであるとき、ＬＰＳの抽出および精製工程の最後に残る残渣デオキシリボース（ＤＮＡ成分）が、Ｋｄｏの最大吸収波長（５５２ｎｍ）での吸光度によるアッセイを妨げ得るため、明確ではない。
【００７０】
標準Ｋｄｏを用いるＫｄｏの定量化の確認は、Ｋｄｏが線形的に正確かつ正しく定量されることが証明され得る。ＬＰＳサンプルがデオキシリボース残渣の混入を含むとき、該方法の明確性の欠如は、補正式を用いて解決される。この式は、この干渉がサンプルに存在するとき、得られた理論的Ｋｄｏ値をデオキシリボース干渉を除去する実数値に合わせる。
【００７１】
デオキシリボース定量の直線性は、この成分が単独で直線性を示すだけでなく、ＬＰＳの汚染物質としても直線性を示すことを意味する。
【００７２】
この方法が使用される毎に、異なる濃度の標準Ｋｄｏを含むサンプル、異なる濃度のデオキシリボースを含むサンプル、異なる濃度の上記で定量したＬＰＳを含むサンプル、および異なる濃度の試験サンプルを含むサンプルを用い、またそれらは全て、デオキシリボース最大吸収波長（５５２ｎｍ）で測定され得る。
【００７３】
以下の工程を行って結果を得る:
−標準Ｋｄｏを含む標準直線：直線性を試験する。
−標準デオキシリボースを含む標準直線：直線性を試験する。
−上記の通り定量したＬＰＳを含む直線。方法をチェックする。直線性を試験する。
−標準Ｋｄｏ、上記の通り定量したＬＰＳおよび試験サンプルについて５５２ｎｍでの吸光度、ならびに標準デオキシリボースについて５３６ｎｍでの吸光度を分母として、各サンプルについて得られた吸光度値の商を計算する。
【００７４】
式を適用する際、選択された値が標準直線内である限り、商値が標準Ｋｄｏおよび標準デオキシリボースの濃度から得られた値に最も近い試験サンプルの濃度値を用いる。値が直線内でない場合、最も近い値を変わりに用いる。
【００７５】
式の適用は、試験サンプル中のＫｄｏマイクロモルを決定する。
【００７６】
本発明はさらに、本明細書で提供するＬＰＳ免疫刺激化合物を１種以上の薬学的に許容される担体または賦形剤と混合して含む医薬組成物を提供する。適当な担体は、投与経路と処置されるべき状態によって変わり得る。本発明の医薬組成物を、抗原に対する免疫応答を増大するか、または免疫系の細胞の活性を増強するためにアジュバントとして用い得るか、またはいくつかの例において、対象における特定の状態を予防または処置するために予防用または治療用組成物として用い得ることが理解され得る。
【００７７】
故に、一態様において、本発明は、本発明のＬＰＳおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供し、ここで、ＬＰＳは、免疫応答を調節するのに有効な量、所望の免疫応答を刺激し、疾患または状態を処置または阻害するという意味で所望の効果を達成するのに必要とされる化合物量で存在する。本医薬組成物はまた、抗原と共に投与されるとき、アジュバントとして作用する。
【００７８】
本発明の免疫刺激組成物は、広範な投与量および広範な比率で投与されたとき、強力な免疫刺激効果を示す。好ましい態様によれば、免疫刺激組成物は、０．５ないし１２０μｇ／ｍｌのＬＰＳを含む。より好ましくは、組成物は、０．５ないし１０μｇ／ｍｌのＬＰＳを含む。
【００７９】
好ましい態様に従い、リポ多糖類は、ミセル相が４℃で１年以上安定である均質な懸濁液形態である。
【００８０】
好ましくは、本発明の免疫刺激組成物のｐＨは、２−１２である。
【００８１】
ワクチン用量と共に投与された免疫刺激剤の量は、一般的に、それがワクチンと共に、典型的なワクチンにおける重大な副作用のない免疫保護応答を引き起こす量として選択される。かかる量は、どの特定の免疫源が使用され、かつそれらがどのように提示されるかによって大きく変わり得る。一般に、各用量は、約１−１０００μｇの抗原および０．１−２００μｇの免疫刺激剤を含み、最も典型的には、約２−１００μｇの抗原および０．５−１５０μｇの免疫刺激剤を含み、好ましくは約５−５０μｇの抗原調製物および１−７５μｇの免疫刺激剤を含むと予期される。もちろん、投与された投与量は、年齢、体重、もしあれば併用処置剤の種類、ならびに投与される抗原および免疫刺激剤の性質によって変わり得る。
【００８２】
本発明の免疫刺激組成物の投与経路は、一般的な免疫刺激剤を送達する何れかの好適な経路であり得る。しかしながら、免疫刺激組成物は、好ましくは筋肉内または皮下経路を介して非経腸的に投与される。より好ましくは、免疫刺激組成物は、皮下投与される。要すれば、他の投与経路も用いられ得て、故に本発明の組成物の例は、懸濁液、シロップまたはエリキシルのような、開口部用、例えば経口、経鼻、経肛門、経膣等の投与用液体調製物；および、滅菌懸濁液またはエマルジョンのような非経腸投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与または静脈内投与（例えば、注射可能投与）用調製物を含む。そのような組成物において、本発明の免疫刺激組成物は、好適な担体、希釈剤、または滅菌水、生理的食塩水、グルコースなどのような賦形剤と混合され得る。
【００８３】
適当な免疫保護剤およびかかる用量の非毒性用量は、当業者に容易に決定され得て、すなわち、本発明の製品中に含まれる本発明の菌株の適当な免疫保護かつ非毒性量は、有効量のＬＰＳの範囲内であり得る。適用に推奨される最低の年齢はなく、実際に１日で行ういくつかの実験が示される。
【００８４】
もちろん、必要ならば投与は適当な間隔を空けて繰り返され得る。
好ましくは、投与スケジュールは以下の通りである：
・皮下経路により０．１μｇ／Ｋｇ体重（ｂ．ｗ．）の第一投与。
・１５日後の同じ投与量での第二投与。
さらなる投与：６ヶ月−１年の適用がより推奨される（０．１μｇ／Ｋｇ ｂ．ｗ．皮下経路）。
【実施例】
【００８５】
実施例１．内毒素血症の処置および予防
これに関して、本発明者らは、Ｂａｌｂ／ｃマウスの急性モデルにおいて大腸菌由来のＬＰＳを用いる。
第一に、本発明者らは、６日間で１００％死亡率をもたらす大腸菌ＬＰＳの用量を決定する（致死量１００）。
大腸菌株Ｏ１１１：Ｂ４のＬＰＳを、SIGMA社（St. Louis, MO, USA）から購入した。全ての実験において、ＬＰＳの希釈剤としてリン酸塩緩衝液を用いる。全ての場合において、用いるビークルはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であった。生存実験用のＬＰＳの適当用量は、ＬＰＳの増大用量をメスＢＡＬＢ／ｃに腹腔内（ＩＰ）投与したときの用量応答曲線により決定した。
【００８６】
内毒素血症の致死作用の予防：
内毒素血症を有するメスＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＬＰＳ（大腸菌 Ｏ１１１：Ｂ４）暴露の前に２４時間、２つの異なる用量のＩＭ、０．６μｇ／Ｋｇ（用量６０）または３μｇ／Ｋｇ（用量３００）でＩＰ処理するか、または処理しなかった。ＬＰＳは、マウス１匹当たり１．７５ｍｇをＩＰ投与した。
敗血症の場合に等しい急速輸液を供するために、全ての注入は、同量であった。
【００８７】
ＩＭは両用量で、大腸菌のＬＰＳの内毒素ショックによる動物のＬＰＳ関連死を完全に予防した。さらに、ＩＭ処置した動物は、敗血症性ショックに関連した何らの徴候も示さなかった（図１）。用いたＬＰＳの用量は、ＩＭの用量よりもはるかに多かった。故に、ＩＭ（オクロバクトラム・インターメディウム ３３０６のＬＰＳ）は、ＬＰＳと競合され得るとは考えられない。
【００８８】
内毒素致死性ショックの処置：
敗血症の主な問題は、通常、その過程が始まるときに、その予防ではなく、むしろ処置である。この試験のために、５匹のマウスを、ＬＰＳ ＩＭ ０．６μｇ／Ｋｇ（用量６０）または３μｇ／Ｋｇ（用量３００）ＩＰで処置の２４時間後、動物１匹当たり２ｍｇのＬＰＳ（大腸菌 Ｏ１１１：Ｂ４）でＩＰ（腹腔内）感染させた。ＩＭは、ＬＰＳ誘導性死亡に保護効果を有する。故に、プラセボ処置後７２時間で、全ての動物が死亡する。しかしながら、ＩＭ処置は、２０％の動物の生存をもたらし、それらの死を顕著に遅延させたこのことは、ＩＭが、内毒素ショックを有するマウスを部分的に処置し得ることを示す（図２）．
【００８９】
驚くことに、ＩＭ処置した動物は、プラセボ群においてもより低レベルの血液凝固を示した。この事実は、過剰な凝固の問題が敗血症の現象と関係するため非常に重要であり、実際、この条件に最近承認された化合物のみが凝固の阻害作用を有する。
【００９０】
細菌性腹膜炎：
オクロバクトラム・インターメディウム ＬＭＧ ３３０６のリポ多糖類を、敗血症の他のモデルである大腸菌誘導性腹膜炎誘導性敗血症で試験した。
【００９１】
大腸菌性致死性腹膜炎の処置：
この実験に関して、メスＣ５７ＢＬ／６マウスを、動物を、ＬＰＳ ＩＭ、０．６μｇ／Ｋｇ（用量６０）または３μｇ／Ｋｇ（用量３００）、または単一のＩＰ投与を用いるプラセボで処置した２４または４時間後に、１０７または１０８の生存Ｏ２６：Ｂ６ 大腸菌コロニー形成単位（ＣＦＵ）を接種した。
【００９２】
生存および病理的症状（摂食障害、死亡率、脱毛、ｃｈｏｑｕｅｘｉａ、身体活動など）をその後に評価した。
大腸菌注入の２４時間後、１０７ ＣＦＵを最初接種した何匹かのマウスが死に（それらの２０％）、かつ敗血症の病的症状を示す（０から５段階で平均３）。
ＩＭでの処置は、用量応答的に動物の死を防ぎ、敗血症の病的症状を完全に回復させた（図３）。
【００９３】
１０８ ＣＦＵの大腸菌の用量が用いられたとき、全ての動物は２４時間で死亡する；故に、それらは大腸菌の摂取の４時間後にＩＭで処理された。それにも関わらず、その時、マウスは何れも死んでおらず、病理的症状の平均スコアは非常に高かった（５段階のうち４）。全ての大腸菌感染マウスが、１４時間で死んだ。それにも関わらず、ＩＭ ３μｇ／Ｋｇ（用量３００）は、ほとんどの動物の死を防ぎ（８０％生存率）、臨床的重症度を徐々に低下させた（図４）。
【００９４】
リーシュマニア症の実験的感染におけるアジュバント効果
足蹠感染におけるアジュバント効果：
この抗原は、Ｔｈ１保護応答を活性化し得ない（図５）ため、ＳＬＡ（可溶性リーシュマニア抗原）抗原抽出物が、主なリーシュマニア原虫での実験的感染に対する保護効果をもたらさないことは、よく知られている。しかし、ＳＬＡが、ＣｐＧとしてアジュバントと結合するとき（米国特許第７５２１０６３号）（ＴＬＲ９による免疫応答を刺激し、Ｔｈ１応答を増大させるためのワクチン用アジュバント）（Heeg, Int. J. Microbiol, 298, 33, 2008）、ＴＬＲ９（トール様受容体）を介して保護的Ｔｈ１（ＩＦＮ−γ）の活性化をもたらし得る（米国特許第６８９０５４２号）。
【００９５】
従って、このモデルは、実験的なリーシュマニア症に対するワクチン接種用のアジュバントとしてのＣＰＧのよく確立された使用と比較してＩＭを試験するのに非常に有用である。
図６で、本発明者らは、この目的のためのプロトコールを示す。
【００９６】
基本的に、ＳＬＡ抗原は、単独で、ＣＰＧと共に、またはＩＭと共に、０、１５および３０日目に接種される。
【００９７】
６０日目で、１，０００寄生虫（promastigote)を各マウスの足蹠に接種し、病変および免疫学的パラメーターを観察する。感染の進行は肉眼で観察され得て、寄生虫数と関係する。図７に示す通り、摂取後、対照群での感染が確認される。ＳＬＡ抗原は、何らかの保護効果を生じないが、ＳＬＡ＋ＣＰＧとＳＬＡ＋ＩＭ群の両方で顕著に病変を縮小する。
【００９８】
さらに、感染後６週の巨視的結果を図８に示し、ＳＬＡ単独で処理した動物の足蹠形と比較して、ＳＬＡ−ＣｐＧまたはＳＬＡ−ＩＭで処理した動物の病変の顕著な縮小を証明する。
【００９９】
さらに、寄生虫数を、足蹠および脾臓で定量した。感染後７週で、動物を屠殺し、脾臓およびドレインリンパ節（ＤＬＮ）に存在する寄生虫を決定した。ＳＬＡ免疫は、ＩＭおよびＣｐＧとは対照的に、寄生虫数の減少をもたらさない。ＣｐＧは、２ｌｏｇに近い数を減少させ、ＩＭは、少なくとも、全６匹の動物のうち４匹で同様の結果を示した（図９）。
【０１００】
簡単には、ＳＬＡは単独では保護しないが、ＣｐＧまたはＩＭとの組合せは感染に対する保護効果を有する。
屠殺した動物の脾臓細胞を集め、ＳＬＡで“インビトロ”で刺激し、Ｔｈ１（ＩＦＮ−γ）および／またはＴｈ２（ＩＬ−４）応答を評価した。
【０１０１】
感受性Ｂａｌｂ／ｃモデルにおけるリーシュマニア属の主な感染症は、ＩＦＮ−γレベルよりもＩＬ−４レベルを比較的増強することがよく記載されている。ＳＬＡワクチン接種はこのパターンを修正しないが、ＣｐＧとのその組合せは、ＩＦＮ−γの産生によって定量化されたＴｈ１応答を増大させ、それ故に、ＩＬ−４の相対的発現を低下させた。従って、ＩＦＮ−γ（応答Ｔｈ１）／ＩＬ−４（応答Ｔｈ２）比は、顕著に増加した（図１０）。
【０１０２】
驚くことに、ＩＭは、ＣｐＧと同様のより強い保護作用を有するが、免疫学的機序は異なる。その保護は、両方のパラメーターが同時に増大するため（図１０）、ＩＦＮ−γ（応答Ｔｈ１）／ＩＬ−４（応答Ｔｈ２）の比と厳密に関連しない。
【０１０３】
応答Ｔｈ１／Ｔｈ２を決定する第二の方法は、リーシュマニア症−特有のアイソタイプ抗体ＩｇＧ２ａ（Ｔｈ１）およびＩｇＧ１（Ｔｈ２）のレベルを分析することである。
【０１０４】
機序は明らかではないが、ＩｇＧ２ａレベルは、リーシュマニア症からの保護と関連する。ＳＬＡで処理しないか、またはそれのみで処理した動物において、ＩｇＧ２ａレベルは検出されなかった。しかしながら、ＩｇＧ２ａレベルは、ＣｐＧまたはＩＭで処理した動物で検出された。故に、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比は、ＳＬＡ−ＣｐおよびＳＬＡ−ＩＭ群の動物と対照的に、非処理動物またはＳＬＡでのみ処理した動物でより低い（図１１）。
【０１０５】
足蹠実験マウスモデルにおけるＩＭの予防および治療効果：
図１２において、リーシュマニア症を有する進行性実験的完成におけるＩＭの治療効果を評価するためのプロトコールを示す。
【０１０６】
これに関し、ＩＭを、２つの異なる用量でリーシュマニア原虫と同時に接種した：
１）ＩＭＦ−１、２および３群は、０．６μｇ／Ｋｇ（１８ｎｇ／マウス）を受容した。
２）ＩＭＦ−４、５および６は、１．２μｇ／Ｋｇ（３６ｎｇ／マウス）用量を受容した。
結果は、ＩＭが、リーシュマニア属による主な感染症から、ＣｐＧで得られた効力と同様の効力で保護し得ることを示す（図１３Ａ）。
【０１０７】
ＩＭで処理した動物は、顕著な病変を示さなかった（図１３Ｂ）。感染の７週間後、動物を屠殺し、脾臓およびリンパ節（ＬＮ）中の寄生虫数を定量した。同様の結果が、ＣｐＧおよびＩＭ群で得られ、リンパ節中で顕著に減少し（１０．０００倍）、脾臓において寄生虫は見られなかった（図１３Ｃ）。
【０１０８】
最後に、上記の実験に従って、ＣｐＧ群は、抗体ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１レベルの比に顕著な変化を示す。さらに、ＩＭ用量は、得られた上記の結果と一致して、この比に顕著な変化を示さない（図１４）。
【０１０９】
最終的な結論として、本発明者らは、ＩＭがＣｐＧと同様の特性を有するが、Ｔｈ１／Ｔｈ２またはＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１のプロフィールおよび比が変化しないため、免疫機序における最終結果が異なることを見出した。本発明において、ＩＭは、両方の（ＣｐＧで実証される通り、Ｔｈ１のみではない）応答の活性化による、より良好なアジュバントであり得る。
【０１１０】
ＩＭ（オクロバクトラム・インターメディウムのＬＰＳ）は、免疫抑制された動物におけるワクチンアジュバント特性を有する：
ＩＭは、抗原としてＳＬＡを用いて、リーシュマニア原虫感染に対してワクチンアジュバント作用を有することが既報である。
【０１１１】
この抗原は、免疫源性が低く、より重要なことには、防御作用であるＴｈ１応答（ＩｇＧ２ａ応答およびＩＦＮ−γ産生により特徴付けられる）ではなく、主にＴｈ２応答（ＩｇＧ１抗体の優位およびＩＬ−４産生により特徴付けられる）をもたらす。
【０１１２】
免疫抑制されたマウスに対するアジュバント作用を試験するために、Ｂａｌｂ／ｃメスを、動物１匹当たりコルチコステロイド・デキサメサゾ(Ｄｅｘ)２０μｇ ＩＰで処理し、２４時間後に、動物に、ＳＬＡを単独（１０μｇ／動物）で、またはＩＭ、０．６μｇ／Ｋｇ（用量６０）または３μｇ／Ｋｇ（用量３００）、もしくはＴｈ１応答をもたらすことが既報の化合物であるＣｐＧと共に接種した（用いたプロトコールについては図１５を参照のこと）。マウスに、１週間後にＳＬＡ単独を再び接種し、１７日目に動物を屠殺し、脾臓細胞を集め、血清中の抗ＳＬＡ抗体力価を評価した。
【０１１３】
図１６に示す通り、特定の抗ＳＬＡ抗体は、Ｄｅｘ単独の対照ではなくＳＬＡを注入された全ての動物で検出されたが、ほとんどの抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプであった。記載される通り、ＣｐＧアジュバントは、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比を増加させ、より重要なことには、ＩＭは、インビボでのＴｈ２からＴｈ１への切り替えを表すこの変更をＣＰＧよりも良好にもたらした。このことは、ＩＭが、免疫抑制された動物においてアジュバント活性を有し、より重要なことには、免疫抑制された動物においてさえも好ましいＴｈ１応答を維持し続けることを示した。
【０１１４】
加えて、異なる動物由来の脾臓細胞を得て、インビトロでＳＬＡで刺激し、増殖およびＩＦＮ−γ（リーシュマニア症に対する保護に必要なＴｈ１サイトカイン）を測定した。図７に示す通り、ＳＬＡは、Ｄｅｘ処理動物において増殖応答をもたらした。ＣｐＧ処理動物は、改善した増殖応答を有した。興味深いことに、ＩＭで処理した動物もまた、用量依存的に、ＳＬＡよりも良好な増殖応答を有する（図１７）。分裂促進物質に対する応答の相違は、全ての動物で観察されなかった（データ示さず）。
【０１１５】
本発明者らは、“インビトロ”での脾臓細胞のＳＬＡ処置後の脾臓細胞の上清に放出されたＩＦＮ−γ（Ｔｈ１サイトカイン）およびＩＬ−４（Ｔｈ２サイトカイン）を調べた。図１８に示す通り、ワクチン接種していないＤｅｘ対照動物は、インビトロでのＳＬＡ暴露によりＩＬ−４またはＩＦＮ−γの産生が検出不可能であった。ＳＬＡ接種された動物において、“インビトロ”でのＳＬＡ暴露は、ＩＬ−４産生を生じるが、ＩＦＮ−γは非常に少なく、同じ動物の血清におけるＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａデータと一致する。
【０１１６】
ＣｐＧ処理は、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γの比をほとんど変えることなく、両方の増加をもたらした(図１９)。興味深いことに、ＩＭのＬＰＳは、両サイトカインを増加させるが、ＩＬ−４よりもＩＦＮ−γが高い割合で増加した。これは、とりわけ、３μｇ／Ｋｇ（用量３００）で処理した動物で明らかであり、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−４比が１０倍増加した(図１９)。
【０１１７】
実施例２．製造方法
免疫刺激性ＬＰＳを、オクロバクトラム・インターメディウム株 ＬＭＧ３３０６から上記の製造法に従って得た。
１． 上記の工程（ｉｉ）（製造方法）の発酵バルク抗原を得るための方法
２． 上記の工程（ｉｉｉ）（製造方法）のＬＰＳ抽出方法
３． 上記の工程（ｉｖ）および（ｖ）（製造方法）の、ＬＰＳの精製およびＬＰＳ量の測定。
【０１１８】
生成物を、４℃で２４時間までにバッチの均質性を維持するために、予め滅菌し、連続撹拌システムを供するステンレススチール製タンク中で貯蔵した。生成物を、滅菌ガス管システムを用いて、該タンクから容器詰めする場所へ移した。
【０１１９】
容器詰めを、１００Ｂバックグラウンドを用いてクラス１００Ａの滅菌環境で行った。ゴム栓およびカプセル化を、同じ場所で行った。
【０１２０】
最終生成物を含むバイアルを、それらにラベルが付され包装されるまで４℃で貯蔵した。ラベル添付および包装を、別の場所で行い、そして各時間にその場所へ入れるのは、最終生成物およびその調整材料の１つのバッチのみである。販売までの最終貯蔵を、５±３℃で行った。
【０１２１】
実施例３．組成：
【表２】
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【０１２２】
実施例４．Ｋｄｏ試験：
本実験の主な目的は、上記のＫｄｏの比色法によって、ＬＰＳ１ｍｌ当たりのナノモル数の測定値の再現性を確認することである。
試験すべきパラメーターは、
１−アッセイ内の正確性
２−アッセイ間の正確性
３−バッチ間の正確性
である。
【０１２３】
１−アッセイ内の正確性の結果
このアッセイにおいて、本発明の生成物の１つのバッチ（Ａ００３Ａ）を用い、３つのサンプルを、サンプル１つ当たり１０回同様の操作を繰り返して、抗体力価を測定した。次いで、各サンプルの３つの希釈物（１／２、１／４および１／８）を、希釈物１つ当たり１０回同様の操作を繰り返して、該アッセイの再現性を確認した。
【０１２４】
【表３】
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【表４】
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【０１２５】
結果は、試験が再現性であることを示す; ＶＣは１０％未満である。
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【０１２６】
本発明者らは、各希釈物についてＶＣを調べた。得られた結果は、試験が再現性であることを示す; ＶＣは１０％未満である。
【０１２７】
２−アッセイ間の正確性
主に実験者の操作による変動を調べるため、本発明の製品の同じバッチを、３日の異なる日に滴定した。各日、全ての必要な溶液を新鮮に調製し、生成物サンプルを実験の最初から最終日まで４℃で貯蔵した。
このアッセイにおいて、本発明の生成物の１つのバッチ（Ａ００３Ａ）を、異なる３日に滴定し、３つの異なるサンプルをサンプル毎に１０個の複製物を用いて行った。
【０１２８】
【表９】
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【表１０】
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【０１２９】
得られた結果は、試験の再現性を示す; ＶＣは１０％未満である。
【０１３０】
３−バッチ間の正確性
バッチ製造の変動を調べる：
このアッセイにおいて、本発明の製造物の３つのバッチ（Ａ００１Ａ、Ａ００２ＡおよびＡ００３Ａ）を、滴定した。各バッチの３つのサンプルをサンプル毎に１０個の複製物を用いて行った。
【表１１】
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【表１２】
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【０１３１】
Ｋｄｏ活性の顕著な相違は、アッセイ内、アッセイ間および経時的アッセイにおいて観察されなかった。
【０１３２】
実施例５．ウイルス不活性化ワクチン用アジュバントとしての免疫源性試験
野外試験
この野外試験を、血清−陰性のウシにおける、常套的に不活性化したワクチン接種による免疫化によりもたらされる、血清、ウシヘルペスウイルス１（ＢＨＶ−１）または感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲ）に対する抗体全体および中和抗体に対する免疫応答（inmunitary answer）への免疫刺激剤の効力を評価するために行った。
【０１３３】
材料および方法
１．ウシ群の選択
試験群の選択のために、乳牛の他の５つの群からの１２０頭の動物を予め試験した。これらの５つの群中に血清−陽性の動物がいたため、サンプルを６つの群に分けた；試験した動物は、血清−陰性であって、この群を選択した。
【０１３４】
血清検査を、ＩＢＲウイルスに対する全抗体数を検出するＥＬＩＳＡ試験で行った。
【０１３５】
２．プロトコールの実施：処理、ワクチン接種およびサンプル収集
２．１．処理およびワクチン接種
試験を、ＩＢＲウイルスに感染していない２２頭の血清−陰性の若い雌牛で行った。新しい動物を試験中に群に加えなかった。
【０１３６】
若い雌牛を以下の群に分けた：
−群１．−１３頭の若い雌牛を、試験０日目および７日目に５ｍｌの免疫刺激化合物（６μｇ／ｍＬ）で処理し、７日目および２８日目に、不活性化ＩＢＲウイルスを含む５ｍｌの承認された市販のワクチンをワクチン接種した。両製品を、首の筋肉内深部に注射した。
−群２．−６頭の若い雌牛を、７日目および２８日目に、同様のワクチンおよび同様の方法でワクチン接種して免疫化した。
−群３．−３頭の若い雌牛を対照群とした；それらは、ウイルスが感染しなかった個とを確認するために、処理または免疫化しなかった。
【０１３７】
２．２．サンプル収集
各動物の血液サンプルを、試験０日目、７日目、２８日目および５８日目に得た。
【０１３８】
試験開発スキーム
【表１３】
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【０１３９】
３．ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ−１）中和血清抗体の検出
Ｉ．ウシヘルペスウイルス１中和抗体力価を、標準ウイルス中和試験により決定した；１００ ＤＩ５０ＣＴ／２５μｌのウシ腎臓由来のよく確立された細胞株である“Georgia bovine kidney”（ＧＢＫ）のＣｏｌｏｒａｄｏ株（Prof. Marcelino Alvarez, Dpto. Sanidad Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de Leon, Espanaにより提供される）を用いて行われ、各血清を４回試験した。
【０１４０】
血清を純粋な血清から滴定した。血清をウイルス（２５μｌの希釈した血清および２５μｌのウイルス懸濁液）と混合して希釈し、その抗体力価を、Spearman−Kaurber法（TRIMMED SPEARMAN−KARBER (TSK) PROGRAM VERSION 1.5, ECOLOGICAL MONITORING RESEARCH DIVISION ENVIRONMENTAL MONITORING SYSTEMS LABORATORY, U. S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY CINCINNATI, OHIO 45268）を用いて見出した。５０％保護する血清の最も高い希釈倍率の逆数として表される。
【０１４１】
ＩＩ．２つの実験群において、平均対数抗体力価が見出され、それはその逆対数の逆数として表される。血清転換を、２つの血清収集毎間の抗体の４倍増加として定義する。
【０１４２】
ＩＩＩ．異なる試験日に処理した、また処理しなかった動物群について得られた平均対数抗体力価間の統計的に関連する相違の存在を確認するために、統計分析(Kinskall−Wallis non−parameter test)を、Windows−environment EpiInfoソフトウェアを用いて行った。
【０１４３】
結果および考察
Ｉ．試験中に血清転換した動物はいなかった。
ＩＩ．７日目および２８日目での血清転換率は、処理群および非処理群のそれぞれで９２．３％および８３．３％であり、２８日目および５８日目では、処理群および非処理群のそれぞれで６９．２％および１６．７％であった。
【０１４４】
両方の場合において、血清転換率は、非処理動物群よりも処理動物群で高かった；しかし、それらの群間の相違は、２８日目と５８日目での血清転換率でのみ統計的に有意であった。
【０１４５】
ＩＩＩ．２８日目において、ＩＢＲ中和抗体の平均対数抗体力価は、処理動物群で３．５０であって、非処理動物群で得られた力価２．３７よりも顕著に高かった。
【０１４６】
５８日目において、ＩＢＲ中和抗体の平均対数抗体力価は、処理動物群で１２であって、非処理動物群で得られた力価４．８よりも顕著に高かった。
【０１４７】
処理動物群で得られたＩＢＲウイルス血清抗体力価は、非処理動物群より高く、２８日目および５８日目でそれぞれ１．５および２．５であった。
【０１４８】
結論
１．得られた結果により示される通り、免疫刺激化合物の投与は、ワクチン接種した動物における中和抗体および保護レベルとしての体液性応答を顕著に増大させた；故に、それは、ワクチン接種によって誘導される免疫応答の実現に重要な役割を果たした。
２．その適用は、
−その低廉な価格のために、ウシに適用される免疫化パターンとして推奨され、
−基本的に、動物が、ウシを太らせる場所のようなストレス下の状況にあるとき、これらの結果が子牛に乳を飲ませて草を食べさせる状況下で行われた他の野外試験で見出された他の臨床的および生産的結果を裏付けるために、
推奨される。
【０１４９】
実施例６．マクロファージ分化の誘導
多くの細菌種由来のＬＰＳを含む、トール様受容体（ＴＬＲ）リガンドのような免疫調節分子の特徴の１つは、増殖活性の減少に関係するマクロファージ細胞系の形態変化を誘導するそれらの能力である。
【０１５０】
このことを研究するために、Ｊ７７４（クローンＪ７７４Ａ１６８）および生２６４．７マウスマクロファージ細胞株を、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Sigma）、抗生物質、ゲンタマイシンおよび５％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（GIBCO, Gran Island, NY）中で培養した。実験のために、細胞を、０．５％ＦＣＳおよび異なる用量の本発明の免疫刺激化合物または大腸菌由来のＬＰＳを添加したＲＰＭＩ中で培養した。培養物を、３７℃で７２時間インキュベートし、細胞増殖を、培養の最後の１６時間での（３Ｈ）チミジン（New England Nuclear, Boston, MA）のＤＮＡへの挿入により評価した。細胞を、１μＣｉの（３Ｈ）チミジンを用いてパルス処理し、自動細胞ハーベスターを用いてガラス繊維フィルター中に捕捉した。放射性物質の挿入を、液体シンチレーション分光計中で測定した。該アッセイを、トリプリケート培養で行った。
【０１５１】
本発明の免疫刺激組成物は、生マクロファージにおける大腸菌ＬＰＳと比較して、図２０に示す通り、Ｊ７７４細胞の分化を誘導する。マクロファージの分化は、通常、細胞増殖の減少と関係する。本発明の免疫刺激組成物は、Ｊ７７４マクロファージの分化の用量依存的阻害を誘導する。この効果は、Ｊ７７４または生マクロファージにおいて、大腸菌由来のＬＰＳの重量／ｖｏｌで観察された効果のおよそ５００倍未満である。
【０１５２】
実施例７．マクロファージにおけるＴＮＦの誘導：
ＴＬＲ リガンドの活性を実験するための最も高感度のアッセイの１つは、マクロファージまたはマクロファージ細胞株により産生されるＴＮＦサイトカインを研究することである。この試験のために、Ｊ７７４（クローンＪ７７４Ａ１６８）および生２６４．７（ATCC TIB−71から購入）マウスマクロファージ細胞株を、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Sigma）、抗生物質、ゲンタマイシンおよび５％ ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（GIBCO, Gran Island, NY）中で培養した。実験のために、細胞を、０．５％ＦＣＳおよび異なる用量の本発明の免疫刺激化合物または大腸菌由来のＬＰＳを添加したＲＰＭＩ中で培養した。培養物を、３７℃、５％ ＣＯ２下で２４時間インキュベートし、上清を集めた。ＴＮＦを、２部位サンドイッチＥＬＩＳＡ（Endogen, Woburn, MA）により検出した。
【０１５３】
非刺激マクロファージは、ＥＬＩＳＡによって検出可能なＴＮＦを合成しない。用量０．１−１０μｇ／ｍｌの本発明の免疫刺激組成物は、用量依存的に、Ｊ７７４マクロファージ（図２１ａ）ならびに生細胞において、４０００ｐｇ／ｍｌまでの顕著なＴＮＦ産生反応レベルをもたらす。本発明の免疫刺激組成物の効果は顕著であるが、大腸菌由来のＬＰＳのおよそ５００倍未満であった（図２１ｂ）．
【０１５４】
さらに、腹膜マクロファージを、１０％チオグリコレート溶液（１ｍｌ；Difco Laboratories）の単回の腹膜注入の４日後に、ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７Ｂｌ／６、１２齢マウスから腹腔洗浄法により単離した。Ｔｈ１応答を増大する傾向にあるマウス株であるＣ５７Ｂｌ／６からのマクロファージおよび対照的にＴｈ２応答に主に作用すると考えられるＢａｌｂ／ｃからのマクロファージを、本発明緒免疫刺激組成物で処理した。細胞（１．５×１０６／ウェル）を、示した量のＬＰＳ（０２６．Ｂ６ 大腸菌血清型、Sigma）または本発明の免疫刺激組成物の存在下または不存在下で、新鮮なＲＰＭＩ／０．５％ ＦＣＳでコーティングした１２ウェルの平底プレート中に１時間接着させた。培養を、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートし、上清を集めた。ＴＮＦを、２部位サンドイッチＥＬＩＳＡ（Endogen, Woburn, MA）により検出した。
【０１５５】
本発明の免疫刺激組成物は、当量濃度の大腸菌ＬＰＳよりも低いが、マウスＢａｌｂ／ｃおよびＣ５７Ｂ１６株の両方由来のマクロファージでＴＮＦ産生を誘導する（図２２）。本発明の免疫刺激物質は、当量濃度で大腸菌ＬＰＳがＴＮＦを誘導するものの５００倍未満の効力であることが結論づけられ得る。故に、本発明の免疫刺激組成物は、免疫刺激用量のＴＮＦを誘導し得るが、毒性となり得る過剰用量ではなく、大腸菌由来のＬＰＳにより誘導される内毒素ショックに関与する。
【０１５６】
実施例８．マクロファージにおけるＩＬ−１２の誘導：
ＩＬ−１２は、ＴＣＲ リガンドを含む多くの刺激に応答してマクロファージにより主に分泌されるサイトカインである。ＩＬ−１２は、ＩＬ−１２がＴｈ１表現型へのＴヘルパー（Ｔｈ）分化を制御するため、最も重要なサイトカインの１つである。ＩＬ−１２は、ｐ３５／ｐ４０タンパク質鎖からなる７０ｋＤのヘテロ二量体である。
【０１５７】
これを試験するため、腹膜マクロファージを、１０％チオグリコレート溶液（１ｍｌ；Difco Laboratories）の単回の腹膜注入の４日後に、ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７Ｂｌ／６、１２齢マウスから腹腔洗浄法により単離した。細胞（１．５×１０６／ウェル）を、示した量のＬＰＳ（０２６．Ｂ６ 大腸菌血清型、Sigma）または本発明の免疫刺激組成物の存在下または不存在下で、新鮮なＲＰＭＩ／０．５％ ＦＣＳでコーティングした１２ウェルの平底プレート中に１時間接着させた。培養を、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートし、上清を集めた。Ｉｌ−１２をＥＬＩＳＡにより検出した。用量１０μｇ／ｍｌの本発明の免疫刺激物質は、Ｃ５７Ｂｌ／６およびＢａｌｂ／ｃの両方由来の腹膜マクロファージにおいて、多量のＩＬ−１２を誘導する（図２３）。
【０１５８】
実施例９．脾臓リンパ球によるＩＦＮ−γ産生の誘導：
脾臓細胞（ＳＣ）懸濁液を、マウスから製造した。ＳＣを、蒸留水を含む低張の溶解液により赤血球を除き、５％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００ｎｇ／ｍｌ）（GIBCO Laboratories, Grand Island, NY）を含むＲＰＭＩ−１６４０完全培地中に懸濁した。
【０１５９】
脾臓細胞（０．４ｘ１０６細胞／ウェル）を、９６ウェル平底培養プレート（Costar, Cambridge, MA）中、２５０μｌの培養培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５ｘ１０−５Ｍ ２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１μｇ／ｍｌストレプトマイシン）中、３７℃で５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。細胞を、示した量の免疫刺激化合物の存在下または不存在下、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて活性化した。
【０１６０】
マウスＩＦＮ−γを、ＣｏｎＡの存在下または不存在下で、脾臓細胞の培養物から得られた２４時間の上清で測定した。それらを、製造業者の指示に従い、特定のサンドイッチＥＬＩＳＡマウスＭｉｎｉＫｉｔ（Endogen）によりアッセイした。図２４に示す通り、ＣｏｎＡ刺激は、両方のマウス株由来の脾臓細胞による多量のＩＦＮ−γ分泌を誘導し、ＩＦＮγの産生により特徴付けられるＴｈ１応答を刺激することが示唆される。
【０１６１】
実施例１０．ＴＬＲ４およびＴＬＲ２受容体による免疫刺激作用：
本発明の免疫刺激物質により用いられると推定される受容体を明らかにするため、ＴＬＲ２またはＴＬＲ４受容体の何れかを欠失するマウス腹膜マクロファージまたは脾臓細胞を、上記のアッセイに用いた。
【０１６２】
腹膜マクロファージを、１０％チオグリコレート溶液（１ｍｌ；Difco Laboratories）の単回の腹膜注入の４日後に、Ｃ５７Ｂｌ／６またはＣ５７Ｂｌ／６ ｔｌｒ４−／−またはＣ５７Ｂｌ／６ ｔｌｒ２−／−（Sarna JR, Dyck RH, Whishaw IQ. 2000. The Dalila effect: C57BL6 mice barber whiskers by plucking. Behavioral Brain Research, 108(1):39−45. PubMedID: 10680755）、１２齢マウスから腹腔洗浄法により単離した。細胞（１．５×１０６／ウェル）を、示した量のＬＰＳ（０２６．Ｂ６ 大腸菌血清型、Sigma）または本発明の免疫刺激組成物の存在下または不存在下で、新鮮なＲＰＭＩ／０．５％ ＦＣＳでコーティングした１２ウェルの平底プレート中に１時間接着させた。培養を、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートし、上清を集めた。ＴＮＦおよびＩＬ−１２を、２部位サンドイッチＥＬＩＳＡにより検出した。マクロファージにおけるＴＬＲ４の欠失は、本発明の免疫刺激物質のＴＮＦ（図２５）およびＩＬ−１２（図２６）を誘導する能力を大幅に低減させたが、ＴＬＲ−２の欠失は、活性を一部分阻害したのみであった。
【０１６３】
脾臓細胞（ＳＣ）懸濁液を、マウスから製造した。ＳＣを、蒸留水を含む低張の溶解液により赤血球を除き、５％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００ｎｇ／ｍｌ）（GIBCO Laboratories, Grand Island, NY）を含むＲＰＭＩ−１６４０完全培地中に再懸濁した。
【０１６４】
脾臓細胞（０．４ｘ１０６細胞／ウェル）を、９６ウェル平底培養プレート（Costar, Cambridge, MA）中、２５０μｌの培養培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５ｘ１０−５Ｍ ２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１μｇ／ｍｌストレプトマイシン）中、３７℃で５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。細胞を、示した量の免疫刺激化合物の存在下または不存在下、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて活性化した。
【０１６５】
マウスＩＦＮ−γを、ＣｏｎＡ＋本発明の免疫刺激組成物の存在下または不存在下で、脾臓細胞の培養物から得られた２４時間の上清で測定した。それらを、製造業者の指示に従い、特定のサンドイッチＥＬＩＳＡマウスＭｉｎｉＫｉｔ（Endogen）によりアッセイした。図２７に示す通り、ＣｏｎＡ刺激は、多量のＩＦＮ−γ分泌を誘導し、それは、Ｃ５７Ｂｌ／６ ｔｌｒ２−／−由来の脾臓細胞で大幅に低下し、Ｃ５７Ｂｌ／６ ｔｌｒ４−／−細胞を用いたとき、ほぼ完全に消失した。
【０１６６】
故に、本発明の免疫刺激物質は、主にＴＬＲ４受容体を介して作用し、部分的にＴＬＲ２を介して作用する。
【０１６７】
実施例１１． Ｔ細胞は、オクロバクトラム・インターメディウム ＬＭＧ３３０６ ＬＰＳにより用量依存的に刺激される。
本発明者らは、ある特定の実験を行い、ＬＰＳの免疫刺激能を実験する。
Ｂ６ Ｃ５７マウスを、２ｘ１０５ ｐｆｕのリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）で感染させ、７日後に、ウイルスによって誘導されたＴ細胞応答を起こしたマウスを選択し、マウスを屠殺し、それらの脾臓細胞を単離し、その後、異なる刺激剤で数時間エクスビボ刺激した。
【０１６８】
ペプチド特異的刺激を実験するために、脾臓細胞を、培地のみまたはＬＣＭＶからの免疫優勢Ｈ２ｂ制限ＣＴＬエピトープの１つであるＬＣＭＶ ＮＰ３９６ ペプチドを含む培地と共に、ブレフェルジンＡ（ＩＦＮγ分泌を避けるため）の存在下で６時間インキュベートした（Denis Hudrisier, Joeulle Riond, and Jean Edouard Gairin, Molecular and Functional Dissection of the H−2Db−Restricted Subdominant Cytotoxic T−Cell Response to Lymphocytic Choriomeningitis Virus, J Virol. 2001 March; 75(5): 2468−2471）。
【０１６９】
この時点でのマウスにおける全ての活性化Ｔ細胞を検出するために（ペプチド特異性から独立して）、脾臓細胞を、最適濃度のホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）＋イオノマイシンの存在下または不存在下でインキュベートした。
【０１７０】
最後に、オクロバクトラム・インターメディウム ＬＰＳの刺激能を実験するために、化合物を異なる濃度：０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌで添加した。
【０１７１】
図２８に示す通り、０．１および１μｇ／ｍｌでの刺激は低かった。最大レベルの刺激には、１０μｇ／ｍｌ以上の濃度で達した。これらの濃度で、ほとんどの活性化ＣＤ８およびＣＤ４−Ｔ細胞は、少なくともＴ細胞刺激の“最適な”プロトコールと比較して、ＩＦＮγ発現が陽性であった。
【０１７２】
腸内細菌のそれとは異なる構造的特徴を有する脂質Ａ部分を含む、ブルセラ菌種およびオクロバクテリウム・アンスロピ由来のＬＰＳは、高濃度（１０μｇ／ｍｌ）でのみ、ＴＬＲ−４による生化学的シグナル伝達を誘発する。ＰＭＡ／イオノマイシンが、ＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ−細胞の両方に毒性であったが、ＬＰＳは用いた最大濃度でも毒性ではなかったことが分かった。これらの細胞の大部分は、ＰＭＡ／イオノマイシンの添加によりアポトーシスが起こり、結果として、Ｔ細胞数が遙かに少なかった。
【０１７３】
。
オクロバクトラム・インターメディウムのＬＰＳは、より古典的な使用によいアジュバントとなるだけでなく、ＤＮＡワクチンによって誘導される免疫応答を増加させるため、多くの特性を達成する。
【０１７４】
１．最適用量のＬＰＳを用いた本発明者らの実験で得られた結果は、ＤＮＡプラスミドにより誘導される免疫応答の、マウスで誘導される抗体応答を少なくとも増加させる改善である。
２．ＬＰＳは、インビトロで添加したとき、用量依存的にウイルス特異的ＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ−細胞の両方を活性化し得る。
３．ＰＭＡ／イオノマイシン（常用される）は、脾臓細胞にアポトーシスを誘導するが、１００μｇ／ｍｌで添加したときでさえ、全ての濃度で毒性ではない。
【０１７５】
それは、形質転換が容易な非病原性細菌によって生産される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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