(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
IRAPタンパク質(「インスリン応答性アミノペプチダーゼ」)の細胞外ドメインの、哺乳動物の血清、血漿又は組織における分泌されたIRAPタンパク質細胞外ドメインの濃度のインビトロアッセイ法を実施するための使用であって、該インビトロアッセイが、配列番号７〜11の配列により規定されるIRAPタンパク質の循環性細胞外ドメイン及び/又はその１つのアイソフォーム及び/又はその１つの変形体を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いて実施される、使用。
【請求項２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載のIRAPタンパク質及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の細胞外ドメインの使用。
【請求項３】
GLUT4グルコース輸送体又は関連タンパク質の転位欠損に関連する病状のインビトロ診断及び/若しくは予後又はインビトロモニタリングを補助するデータを取得するための、請求項１又は２に記載のIRAPタンパク質及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の細胞外ドメインの使用。
【請求項４】
健常個体と比ベて患者におけるIRAP及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の原形質膜での過剰発現及び/又はその原形質膜への転位の増加に関連する病状のインビトロ診断及び/又は予後或いは健常個体と比べて患者におけるIRAP及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の原形質膜での過剰発現及び/又はその原形質膜への転位の増加に関連する病状のインビトロモニタリングを補助するデータを取得するための、請求項３に記載のIRAPタンパク質及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の細胞外ドメインの使用。
【請求項５】
健常個体と比ベて患者におけるIRAP及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の原形質膜での過少発現及び/又はその原形質膜への転位の減少に関連する病状のインビトロ診断及び/又は予後或いは健常個体と比ベて患者におけるIRAP及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の原形質膜での過少発現及び/又はその原形質膜への転位の減少に関連する病状のインビトロモニタリングを補助するデータを取得するための、請求項３に記載のIRAPタンパク質及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の細胞外ドメインの使用。
【請求項６】
抗癌剤に対する化学療法抵抗性のインビトロ診断及び/又は予後を補助するデータを取得するための、請求項３に記載のIRAPタンパク質の細胞外ドメインの使用。
【請求項７】
病状がインスリン抵抗性、２型糖尿病、妊娠糖尿病、妊娠誘発性高血圧(子癇前症)及び早期分娩のリスクに関連する病状からのものである、請求項１〜３及び５のいずれか１項に記載のIRAPタンパク質及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の細胞外ドメインの使用。
【請求項８】
病状が、卵巣腺癌、子宮内膜癌、絨毛上皮腫、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、直腸癌若しくは頭頸部癌のようなIRAP及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体が過剰発現し及び/又はそれらの膜への転位が増加する増殖性疾患、自己免疫疾患又は炎症性疾患である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のIRAPタンパク質及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の細胞外ドメインの使用。
【請求項９】
前記モノクローナル抗体がハイブリドーマにより産生される、請求項１〜８に記載のIRAPタンパク質及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の細胞外ドメインの使用。
【請求項１０】
IRAP(インスリン応答性アミノペプチダーゼ)タンパク質及び/又はその１つのアイソフォームの及び/又はその１つの変形体の循環性細胞外ドメイン又は細胞外ドメインのエピトープの１つを特異的に認識するモノクローナル抗体であって、前記細胞外ドメインが配列番号７〜11の配列により規定される抗体。
【請求項１１】
医薬として使用するため、卵巣腺癌、子宮内膜癌、絨毛上皮腫、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、直腸癌若しくは頭頸部癌のようなIRAP及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体が過剰発現し及び/又はそれらの膜への転位が増加する癌、自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療のため或いは化学療法への抵抗性の処置のための請求項１０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
以下：
−  CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France)に2009年７月２日、アクセッション番号CNCM I-4181で寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体、
−  CNCMに2009年７月２日、アクセッション番号CNCM I-4182で寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体、
−  CNCMに2009年７月２日、アクセッション番号CNCM I-4183で寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体、
−  CNCMに2009年７月２日、アクセッション番号CNCM I-4184で寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体、及び
−  CNCMに2009年７月２日、アクセッション番号CNCM I-4185で寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体
から選択される請求項１０又は１１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１３】
放射性核種、蛍光体、量子ドット、酵素標識、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤又はハプテンから選択される化合物で標識されている、請求項１０〜１２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１４】
ヒト化抗体である、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１５】
請求項１０〜１４に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１６】
ａ．CNCMに2009年７月２日、アクセッション番号CNCM I-4181で寄託されたハイブリドーマ、
ｂ．CNCMに2009年７月２日、アクセッション番号CNCM I-4182で寄託されたハイブリドーマ、
ｃ．CNCMに2009年７月２日、アクセッション番号CNCM I-4183で寄託されたハイブリドーマ、
ｄ．CNCMに2009年７月２日、アクセッション番号CNCM I-4184で寄託されたハイブリドーマ、及び
ｅ．CNCMに2009年７月２日、アクセッション番号CNCM I-4185で寄託されたハイブリドーマ
から選択される請求項１５に記載のハイブリドーマ。
【請求項１７】
哺乳動物の血清、血漿、赤血球又は組織においてIRAPタンパク質及び/又はその１つのアイソフォーム及び/又はその１つの変形体の細胞外ドメインの濃度を測定する工程を含んでなる、哺乳動物におけるIRAPタンパク質及び/又はその１つのアイソフォーム及び/又はその１つの変形体の濃度のインビトロアッセイ法。
【請求項１８】
酵素抗体法若しくは免疫組織化学法、又はRIA若しくはIRMAにより実施される、請求項１７に記載のアッセイ法。
【請求項１９】
以下：
ａ．請求項１０又は１２〜１４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を使用して、哺乳動物においてIRAPタンパク質及び/又はその１つのアイソフォーム及び/又はその１つの変形体の循環性細胞外ドメインの濃度をインビトロ測定する工程、
ｂ．工程ａ.で得られた濃度を健常哺乳動物でインビトロで得られた濃度と比較する工程、
を含んでなる、インスリン抵抗性、２型糖尿病、妊娠糖尿病、妊娠誘発性高血圧(子癇前症)及び早期分娩のリスクに関連する病状のインビトロ診断を補助するデータの取得法。
【請求項２０】
以下：
ａ．請求項１０又は１２〜１４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を使用して、哺乳動物においてIRAPタンパク質及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の循環性細胞外ドメインの濃度をインビトロ測定する工程、
ｂ．工程ａ.で得られた濃度をコントロール哺乳動物でインビトロで得られた濃度と比較する工程、
を含んでなる、卵巣腺癌のようなIRAP及び/又はその１つのアイソフォーム及び/又はその１つの変形体が過剰発現し又はそれらの膜への転位が増加する癌、自己免疫疾患又は炎症性疾患に関連する病状或いは化学療法への抵抗性のインビトロ診断を補助するデータの取得法。
【請求項２１】
少なくとも１つの緩衝液及び少なくとも１つの請求項１０又は１２〜１４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含んでなる、哺乳動物においてIRAPタンパク質及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の１つの循環性細胞外ドメインの濃度をインビトロ測定するためのキット。
【請求項２２】
IRAPタンパク質の基質及び前記モノクローナル抗体により認識されるペプチドも含んでなる請求項２１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断及び予後の方法を実施するためのIRAPタンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
IRAPタンパク質(インスリン調節性アミノペプチダーゼ；EC 3.4.11.3)は、胎盤ロイシンアミノペプチダーゼ(P-LAP)及びロイシン-シスチニルアミノペプチダーゼ(L-CAP)としても知られ、３つのアイソフォーム(Swiss-Prot：Q9UIQ6：1、2および3；それぞれ配列番号１〜３で表される)で存在する膜貫通亜鉛メタロプロテイナーゼタンパク質である。
【０００３】
これは原形質膜に挿入されると、その細胞外ドメインが切断されて分泌され得る。
IRAPと推定されるタンパク質の未特定アイソフォームの分泌部分が、血中で、メチオニンの存在下に非特異的合成基質L-ロイシン-ニトロアニリドを用いる酵素的方法によりアッセイされた(Mizutani, S., Yoshino, M.及びOya, M. (1976) Clin Biochem 9(1), 16-18)。
【０００４】
この方法を用いて、Mizutani, Oya及びTomodaは、妊娠女性の血清中で、濃度が妊娠中に増加するシスチニル-ロイシンアミノペプチダーゼを検出した(Yamahara, N., Nomura, S., Suzuki, T., Itakura, A., Ito, M., Okamoto, T., Tsujimoto, M., Nakazato, H.及びMizutani, S. (2000) Life Sci 66(15), 1401-1410)。このアミノペプチダーゼは、本質的に、胎盤起源であり、したがってP-LAPと呼ばれ(Tsujimoto, M., Mizutani, S., Adachi, H., Kimura, M., Nakazato, H.及びTomoda, Y. (1992) Arch Biochem Biophys 292(2), 388-392)、前記タンパク質の分泌ドメインに相当する。
【０００５】
この酵素は、オキシトシン(Naruki, M., Mizutani, S., Goto, K., Tsujimoto, M., Nakazato, H., Itakura, A., Mizuno, K., Kurauchi, O., Kikkawa, F.及びTomoda, Y. (1996) Peptides 17(2), 257-261)、バソプレッシン(Wallis, M. G., Lankford, M. F.及びKeller, S. R. (2007) Am J Physiol Endocrinol Metab 293(4), E1092-1102)、アンジオテンシンII及びIII(Matsumoto, H., Rogi, T., Yamashiro, K., Kodama, S., Tsuruoka, N., Hattori, A., Takio, K., Mizutani, S.及びTsujimoto, M. (2000) Eur J Biochem 267(1), 46-52)並びに一連の他のペプチド(Albiston, A. L., Peck, G. R., Yeatman, H. R., Fernando, R., Ye, S.及びChai, S. Y. (2007) Pharmacol Ther 116(3), 417-427)を分解する。このアミノペプチダーゼの血清濃度は、男性及び非妊娠女性では報告されていない。
【０００６】
クローニング時、P-LAPはIRAPタンパク質にもアンジオテンシンIVレセプターにも相当するように見えた(Keller, S. R., Scott, H. M., Mastick, C. C., Aebersold, R.及びLienhard, G. E. (1995) J Biol Chem 270(40), 23612-23618；Rogi, T., Tsujimoto, M., Nakazato, H., Mizutani, S.及びTomoda, Y. (1996) J Biol Chem 271(1), 56-61；Albiston, A. L., McDowall, S. G., Matsacos, D., Sim, P., Clune, E., Mustafa, T., Lee, J., Mendelsohn, F. A., Simpson, R. J., Connolly, L. M.及びChai, S. Y. (2001) J Biol Chem 276(52), 48623-48626)。
【０００７】
特許出願WO 2005/038462は、P-LAPタンパク質全体での免疫により得られる抗-P-LAPポリクローナル抗体を含んでなる、癌腫の診断及び/又は予後評価用試薬を記載している。異なるアミノペプチダーゼ間の強い相同性を考えると、この抗体は、おそらく、IRAPに特異的ではなく、他のアミノペプチダーゼも認識するはずである。したがって、この抗体によりIRAPの発現又は血漿濃度の変更に正確な様式で関連する病状を診断することが可能になるはずはない。
【０００８】
GLUT4は、インスリンに応答して筋肉及び脂肪組織による循環グルコースの取り込みを可能にするグルコース輸送体である。非刺激条件(基準条件)下で、GLUT4は、未知の保持機構によって、細胞内部で、細胞内区画(小胞)中に効果的に保持される。インスリン刺激に応答して、GLUT4は輸送された後、増加した転位により原形質膜中に挿入される。こうしてグルコースの細胞取込みが可能になる。
【０００９】
IRAPはグルコース輸送体GLUT4と共存し、化学量論的にGLUT4と同時転位する(Keller, S. R. (2004) Biol Pharm Bull 27(6), 761-764)。原形質膜へのこの転位は、GLUT4の転位と同じ様式で、インスリンによって刺激される(Karylowski, O., Zeigerer, A., Cohen, A.及びMcGraw, T. E. (2004) Mol Biol Cell 15(2), 870-882；Subtil, A., Lampson, M. A., Keller, S. R.及びMcGraw, T. E. (2000) J Biol Chem 275(7), 4787-4795)。
【００１０】
更に、IRAP-/-トランスジェニック動物でGLUT4レベルは50〜80％減少するので、IRAPの発現はGLUT4の発現を条件付けている(Keller, S. R., Davis, A. C.及びClairmont, K. B. (2002) J Biol Chem 277(20), 17677-17686)。
２型糖尿病で、筋肉及び脂肪組織におけるGLUT4発現の減少及び原形質膜へのGLUT4転位の減少の両方が見出されている(Kahn, B. B. (1992) J Clin Invest 89(5), 1367-1374)。
【００１１】
IRAPの細胞レベルは変更するが、その転位は同様に２型糖尿病の筋肉及び脂肪組織において減少する(Garvey, W. T., Maianu, L., Zhu, J. H., Brechtel-Hook, G., Wallace, P.及びBaron, A. D. (1998) J Clin Invest 101(11), 2377-2386；Maianu, L., Keller, S. R.及びGarvey, W. T. (2001) J Clin Endocrinol Metab 86(11), 5450-5456)。
【００１２】
更に、IRAPタンパク質と抗癌剤に対する化学療法抵抗性の発症との間の関係が証明されている(Kondo C.ら, Int J. Cancer, 118, 1390-1394, 2006)。この論文によれば、IRAPは、実際、アポトーシス-誘導因子の発現の阻害及びアポトーシス-阻害因子の発現の増大によって、抗癌剤に対する感受性を減少させる。
【００１３】
IRAPの細胞外ドメインは、ADAM9(SwissProt Q13443)及びADAM12(SwissProt O43184)を含むADAMファミリーにおそらく属するメタロプロティナーゼにより切断され(Ito, N., Nomura, S., Iwase, A., Ito, T., Kikkawa, F., Tsujimoto, M., Ishiura, S.及びMizutani, S. (2004) Biochem Biophys Res Commun 314(4), 1008-1013)、血液循環中に放出される。ADAM9(MDC9)は、骨格筋及び脂肪組織を含む種々の組織で発現し(Hotoda, N., Koike, H., Sasagawa, N.及びIshiura, S. (2002) Biochem Biophys Res Commun 293(2), 800-805)、ADAM12は本質的には筋肉で発現する。このファミリーの幾つかの他のメンバーもまた筋肉及び脂肪組織で発現する。
【００１４】
現時点で、生物学的媒体中でのIRAP細胞外ドメインの濃度と重篤な子癇前症及び早期分娩のリスクに関する病状との間の関係が唯一記載されている。これら２つの病状において、循環P-LAP濃度は、等しい妊娠期間のコントロール女性で観察される濃度より低い。しかし、先行技術に記載される方法は、非特異基質を用いるIRAP細胞外ドメインの酵素アッセイに基づいている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、循環IRAPの細胞外ドメインをアッセイすることを可能にする信頼性のある特異的方法を提供するという現実の必要性が存在する。
本発明の目的の１つは、哺乳動物の血清又は血漿又は組織中のIRAPタンパク質、具体的にはIRAPタンパク質の細胞外ドメインの濃度をアッセイするインビトロ法を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、IRAPタンパク質の異なるアイソフォームの細胞外ドメインに特異的なモノクローナル抗体を提供することである。
本発明の別の目的は、IRAPタンパク質濃度の過剰又は減少が関与する病状の診断方法を提供することである。
最後の目的は、治療観点から、IRAPタンパク質の異なるアイソフォームの細胞外ドメインに特異的なモノクローナル抗体及びそれらの酵素活性の阻害剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
結果として、本発明は、IRAPタンパク質(「インスリン応答性アミノペプチダーゼ」)の細胞外ドメインの、哺乳動物、特にヒトの血清、血漿又は組織における分泌されたIRAPタンパク質細胞外ドメインの濃度のインビトロアッセイ法を実施するための使用に関する。
【００１８】
IRAPタンパク質は異なる名称を有し得る。たとえば：「インスリン応答性アミノペプチダーゼ」、「インスリン調節性膜アミノペプチダーゼ」、「ロイシル-シスチニルアミノペプチダーゼ(L-CAP)」、「胎盤ロイシンアミノペプチダーゼ(P-LAP)」、「シスチニルアミノペプチダーゼ」、「オキシトシナーゼ」、「OTアーゼ」、「165kDaの小胞タンパク質」、「Vp165」又は「GP160」。これらは全て、Swiss-ProtデータベースにNo. Q9UIQ6 1、2及び3で登録されたタンパク質のアイソフォームの１以上に相当する。
これら異なる名称は、本明細書中の残りの部分で互換的に使用し得、同じタンパク質を指称する。
【００１９】
IRAPタンパク質は、アイソフォームに関わらず、原形質に存在する約110アミノ酸のＮ末端部分と、約20アミノ酸の膜貫通部分と、残るアミノ酸を含んでなる細胞外Ｃ末端部分とによって構成される。
上記のように、細胞外ドメインは切断され、分泌され得る。
結果的に、表現「細胞外ドメイン」は、細胞膜に依然として結合しておりその結果として組織中に見出される細胞外ドメインと、血液循環中に見出される循環性細胞外ドメイン(すなわち、切断及び分泌後の細胞外ドメイン)との両方を含む。
【００２０】
「哺乳動物」とは、約5400種からなる脊椎動物に含まれる分類群を意味する。前記の種は、Wilson, D. E.及びReeder, D. M.(編), Mammal Species of the World, Johns Hopkins University Press, 16/11/2005に規定されている。
【００２１】
したがって、本発明のインビトロアッセイ法の利点の１つは、哺乳動物におけるIRAPタンパク質の細胞外ドメイン、より具体的には：
−  血清又は血漿中を循環している細胞外ドメイン、又は
−  組織(赤血球を含む)中で膜に結合している細胞外ドメイン
の特異的アッセイを可能にするというものである。
【００２２】
１つの有利な実施形態において、本発明は、IRAPタンパク質の細胞外ドメインであって、該IRAPタンパク質がそのアイソフォーム、特に配列番号１〜３により規定されるアイソフォームの１つ又はその変形体、特に配列番号４〜６により規定される変形体の１つに相当する、配列番号７〜11で表される細胞外ドメインの使用に関する。
【００２３】
IRAPタンパク質は、少なくとも３つのアイソフォーム(Swiss-Prot：Q9UIQ6 1、2及び3；それぞれ配列番号１〜３で表される)並びにアイソフォーム１の幾つかの変形体：それぞれ配列番号４〜６で表される031616(S86P、86位でセリンがプロリンで置換)、012812(A763T、763位でアラニンがスレオニンで置換)及び031617(I963V；963位でイソロイシンがバリンに置換)で存在し得る。
【００２４】
各アイソフォーム１〜３の細胞外ドメインは、それぞれ配列番号７〜９で表され、変形体031616、0128412及び031617の細胞外ドメインは、配列番号７、10及び11で表される。
本明細書を通じて、用語IRAPは、単独で使用することもあるが、そのアイソフォーム及び/又は変形体も含む。
【００２５】
１つの有利な実施形態では、本発明は、上記のIRAPタンパク質及び/又は上記のその１つのアイソフォーム及び/又は上記のその１つの変形体の細胞外ドメインの、GLUT4グルコース輸送体又は関連タンパク質(IRAPを含む)の転位欠損に関連する病状のインビトロ診断及び/若しくは予後又はインビトロモニタリングのための使用に関する。
【００２６】
「インビトロ診断」とは、故障、問題又は疾患の原因(起源)のインビトロ同定に至る推論を意味する。
「インビトロ予後」とは、疾患の重篤度及びその後の進展(転帰を含む)のインビトロ評価を意味する。
上記のように、IRAPはGLUT4グルコース輸送体と共存し、化学量論的にGLUT4と同時転位する。
【００２７】
結果的に、血清若しくは血漿、赤血球又は組織中に存在する上記のIRAPタンパク質又はその１つのアイソフォーム若しくはその１つの変形体の濃度の測定により、転位が表され、したがってグルコースの輸送量が表される。
したがって、本発明のアッセイ法の別の利点は、グルコース輸送欠損の判定であり、その結果としての、病状の原因若しくは重篤度の同定又は病状及びその進展のモニタリングである。
【００２８】
１つの有利な実施形態において、上記アッセイ法は、治療前後で得られるIRAPタンパク質細胞外ドメインの濃度を比較することによって、当該疾患に向けられた治療の評価を可能にする。
グルコース輸送欠損に関係する病状は、インスリン抵抗性、２型糖尿病、妊娠糖尿病であり得るがこれらに限定されない。１つのより有利な実施形態によれば、上記のIRAPタンパク質及び/又は上記のその１つのアイソフォーム及び/又は上記のその１つの変形体の細胞外ドメインの使用により、健常個体と比ベてIRAP及び/又はそのアイソフォーム及び/若しくは変形体の原形質膜での過剰発現及び/又はその原形質膜への転位の増加に関連する病状のインビトロ診断及び/又は予後或いは健常個体と比ベて患者におけるIRAP及び/又はそのアイソフォーム及び/若しくは変形体の過剰発現に関連する病状のインビトロモニタリングが可能になる。
【００２９】
IRAPタンパク質の過剰発現及び/又はその原形質膜への転位の増加に関して、本発明のアッセイ法により患者で測定される分泌又は未分泌のIRAPタンパク質細胞外ドメインの濃度は、健常個体で得られる濃度より高い。このことはIRAPタンパク質の過剰発現を示している。
患者におけるIRAPタンパク質の過剰発現及び/又はその原形質膜への転位の増加に関連する病状のモニタリングに関して、本発明のアッセイ法により前記患者で治療中に測定したIRAPタンパク質細胞外ドメインの濃度が、治療前に測定したIRAPタンパク質細胞外ドメインの濃度に比べて減少していることにより、当該治療の効果の証明が可能になる。
【００３０】
逆に、前記患者で治療中に測定したIRAPタンパク質細胞外ドメインの濃度が、治療前に測定した分泌又は未分泌のIRAPタンパク質細胞外ドメインの濃度に比べて増加又は安定していることは、当該治療が効果のないことを示す。このため、使用する用量又は活性物質の変更が可能になる。
結果として、上記分泌又は未分泌のIRAPタンパク質の濃度の最大値が患者で25％以上増加しているとき、個体において、IRAPタンパク質の原形質膜での過剰発現及び/又はその原形質膜への転位増加が存在すると考えられる。
【００３１】
IRAPタンパク質の原形質膜での過剰発現及び/又はその原形質膜への転位の増加に関連する病状の例は、以下のものに限定されないが、増殖現象が関与する全ての疾患、特に癌、網羅的ではないが例えば、卵巣腺癌、子宮内膜癌、絨毛上皮腫、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、直腸癌又は頭頸部癌である。
【００３２】
より有利な実施形態によれば、上記IRAPタンパク質及び/又は上記のその１つのアイソフォーム及び/又は上記のその１つの変形体の細胞外ドメインの使用により、健常個体と比ベてIRAP及び/又はそのアイソフォーム及び/若しくは変形体の原形質膜での過少発現及び/又はその原形質膜への転位の減少に関連する病状のインビトロ診断及び/又は予後或いは患者におけるIRAP及び/又はそのアイソフォーム及び/若しくは変形体の原形質膜での過少発現及び/又はその原形質膜への転位の減少に関連する病状のインビトロモニタリングが可能になる。
【００３３】
IRAPタンパク質の原形質膜での過少発現及び/又はその原形質膜への転位の減少に関して、本発明のアッセイ法により患者で測定される分泌又は未分泌のIRAPタンパク質細胞外ドメインの濃度は、健常個体で得られる濃度より低い。このため、IRAPタンパク質の原形質膜での過少発現タンパク質及び/又はその原形質膜への転位の減少が示唆される。
患者におけるIRAPタンパク質の原形質膜での過少発現及び/又はその原形質膜への転位の減少に関連する病状のモニタリングに関して、本発明のアッセイ法により前記患者で治療中に測定したIRAPタンパク質細胞外ドメインの濃度が、治療前に測定したIRAPタンパク質細胞外ドメインの濃度に比ベて増加していることにより、当該治療の効果の証明が可能になる。
【００３４】
逆に、前記患者で治療中に測定したIRAPタンパク質細胞外ドメインの濃度が、治療前に測定したIRAPタンパク質細胞外ドメインの濃度に比べて減少又は安定していることは、当該治療が効果のないことを示す。このため、使用する用量又は活性物質の変更が可能になる。
上記IRAPタンパク質の濃度の最大値が25％以上減少しているとき、IRAPタンパク質の過少が存在すると考えられる。
【００３５】
１つの有利な実施形態では、上記IRAPタンパク質及び/又は上記のその１つのアイソフォーム及び/又は上記のその１つの変形体の細胞外ドメインの使用により、抗癌剤に対する化学療法抵抗性のインビトロ診断及び/又は予後が可能になる。
用語「化学療法抵抗性」とは、抗癌剤での化学療法の間の抗癌治療に対する感受性の減少又は完全な欠如を意味し、これは後天的又は先天的であり、抗癌治療の効果を制限するか又は完全に消失させる。
【００３６】
抗癌剤の例は、パクリタキセル(タキソール)、カルボプラチンなどであるが、これらに限定されない。
結果として、IRAP及び/又は上記のその１つのアイソフォーム及び/又は上記のその１つの変形体の細胞外ドメインのアッセイ(特に上記IRAPタンパク質の濃度の最大値が患者において25％以上増加しているとき、個体におけるIRAPタンパク質の原形質膜での過剰発現及び/又はその原形質膜への転位の増加を示す)により、化学療法に対する抵抗性の診断及び/又は予後が可能になる。
【００３７】
１つの有利な実施形態によれば、上記IRAPタンパク質及び/又は上記のその１つのアイソフォーム及び/又は上記のその１つの変形体の細胞外ドメインの使用により、GLUT4グルコース輸送体の転位欠損、特にIRAP及び/又はそのアイソフォーム及び/若しくは変形体の過少発現に関連する病状(インスリン抵抗性、２型糖尿病、妊娠糖尿病に関連する病状のうちからのもの)のインビトロ診断及び/若しくは予後又はインビトロモニタリングが可能になる。
【００３８】
インスリン抵抗性は、インスリンへの応答に際して感受性組織による不十分なグルコース取込みを導く。この疾患は、血中グルコースレベル(血糖)が正常値(絶食時110mg/dL及びグルコース75ｇ摂取の２時間後140mg/dL)を超えると現れる２型糖尿病に進展する。この血中グルコースレベルの増加は膵臓を過剰刺激し、膵臓は血糖増加を補償するためインスリン分泌を増加させる。
【００３９】
妊娠糖尿病は、糖尿病であることが以前には知られていなかった女性において妊娠の間に現れる、いずれかのグルコース不耐性状態(重篤度に関わらず)を表す。
子癇前症は、動脈性高血圧、蛋白尿及び浮腫を伴う体重増加の組合せによって特徴付けられる疾患である。
早期分娩のリスクは、子宮頸の短縮及び開口(妊娠36週目終了前の分娩を引き起こすことがある)を生じる子宮収縮により特徴付けられる。
【００４０】
結果的に、本発明の別の利点は、組織及び血清、血漿又は赤血球の両方でGLUT4グルコース輸送体の転位欠損に関連する病状のインビトロ診断及び/若しくは予後又はインビトロモニタリングを可能にすることである。
【００４１】
別の有利な実施形態によれば、上記IRAPタンパク質及び/又は上記のその１つのアイソフォーム及び/又は上記のその１つの変形体の細胞外ドメインの使用により、GLUT4グルコース輸送体の転位欠損に関連する病状、特に癌、特に卵巣腺癌、子宮内膜癌、絨毛上皮腫、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、直腸癌又は頭頸部癌のようなIRAP及び/又はそのアイソフォーム及び/若しくは変形体が過剰発現する癌、自己免疫疾患又は炎症性疾患のインビトロ診断及び/若しくは予後又はインビトロモニタリングが可能になる。
【００４２】
絨毛上皮腫は、絨毛膜絨毛が完全に消失した、細胞栄養層及び合胞体栄養層の細胞エレメントの並置により構成される高度に悪性の腫瘍である。
１つの有利な実施形態では、本発明の方法による文献WO 2005/038462で言及された癌の検出は、血清中で、また血漿中又は赤血球上でも行われる。
自己免疫疾患とは、その生物中に通常存在する物質又は組織に対する免疫系の活動亢進に起因する疾患、例えば自己免疫性甲状腺炎、慢性関節リウマチ、強直性脊椎炎、グジュロー‐シェーグレン症候群を意味する。
【００４３】
炎症性疾患の例は、限定されないが、以下のものである：
慢性関節リウマチ、エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症(全身性硬化症)、皮膚筋炎、多発性筋炎、リウマチ性多発性筋痛、変形性関節症、化膿性関節炎、痛風、偽痛風、脊椎関節症、強直性脊椎炎、ライター症候群、乾癬性関節症、腸疾患に基づく脊椎炎(spondylite enteropathique)、反応性関節症(arthropathie reactive)、クローン病、サルコイドーシスなど。
【００４４】
抗癌剤での治療に関して、IRAPは、アポトーシス促進因子の発現を阻害すること及びアポトーシス阻害因子の発現を増加させることによって、これら医薬に対する感受性を減少させる(Kondoら, Int. J. Cancer： 118, 1390-1394, 2006)。
【００４５】
より有利な実施形態によれば、上記IRAPタンパク質及び/又は上記のその１つのアイソフォーム及び/又は上記のその１つの変形体の細胞外ドメインを用いるインビトロアッセイ法の実施は、抗体を使用して行う。
用語「抗体」は、IRAPタンパク質の１つのアイソフォームの細胞外ドメインに特異的なポリクローナル又はモノクローナルの抗体を指称するために使用し、IRAPタンパク質の細胞外ドメインに特異的なモノクローナル抗体を模倣するフラグメント又は分子、特にエピトープに結合するフラグメントもまた含む。
フラグメント又分子は、モノクローナル抗体から、組換えDNA技術又は酵素的若しくは化学的方法により誘導することができ、抗原フラグメントに関するモノクローナル抗体の結合特性に類似する結合特性を有し得る。
【００４６】
本発明の抗体は、完全長の上記抗体並びに該抗体のエピトープ結合性フラグメントの両方を含む。以下で使用するように、表現「抗体フラグメント」は、完全長の抗体により認識されるエピトープに結合する能力を保持する抗体の任意の部分を含み、一般に、「エピトープ結合性フラグメント」と呼ばれる。
抗体フラグメントの例には、Fab、Fab'及びF(ab')2、Fd、単鎖Fv(scFv)、単鎖抗体、ジスルフィドブリッジで連結されたFv及びVL又はVH領域のいずれかを含んでなるフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。エピトープ結合性フラグメント(単鎖抗体を含む)は、可変領域を単独で又は以下のエレメントの全て若しくは一部との組合せで含んでなることができる：ヒンジ領域、CH1、CH2及びCH3ドメイン。
【００４７】
これらフラグメントは、Fabフラグメントの一方若しくは両方又はF(ab')2フラグメントを含有することができる。更に、フラグメントは、以下の免疫グロブリンカテゴリーのいずれかのメンバーであるか又は該メンバーを組合せることができる：IgG、IgM、IgA、IgD又はIgE及びそれらのサブクラス。
Fab及びF(ab')2フラグメントは、酵素、例えばパパイン(Fabフラグメント)又はペプシン(F(ab')2フラグメント)を使用するタンパク質分解性切断により製造することができる。
【００４８】
本発明の抗体は、細胞融合によりハイブリドーマを製造するための動物の免疫及び脾臓細胞の回収を含んでなる従来方法を使用して製造することができる。本発明の抗体は、有利には、モノクローナル抗体の混合物の形態で使用することができる。
１つの有利な実施形態によれば、上記抗体はポリクローナル抗体である。
【００４９】
「ポリクローナル抗体」とは、異なる複数のＢリンパ球細胞株を起源とする抗体を意味する。
１つの有利な実施形態では、上記ポリクローナル抗体は、インスリン抵抗性又は癌に関しては哺乳動物、特にヒトからの血清、血漿又は赤血球中、或いはインスリン抵抗性に関しては哺乳動物からの組織中の上記IRAPタンパク質及び/又は上記のその１つのアイソフォーム及び/若しくは変形体の濃度のインビトロアッセイ法を実施するために使用する。
【００５０】
別の有利な実施形態によれば、上記抗体はモノクローナル抗体である。
「モノクローナル抗体」とは、単一細胞クローン、すなわちハイブリドーマを起源とする抗体を意味する。
１つの有利な実施形態では、上記モノクローナル抗体は、インスリン抵抗性又は癌に関しては哺乳動物、特にヒトからの血清、血漿、赤血球又は組織中の上記IRAPタンパク質及び/又は上記のその１つのアイソフォーム及び/又はその１つの変形体の濃度のインビトロアッセイ法を実施するために使用する。
【００５１】
１つの有利な実施形態によれば、上記モノクローナル抗体はハイブリドーマにより産生される。
「ハイブリドーマ」とは、抗体を継続的に産生する融合細胞、すなわち無限に再生産することができ、哺乳動物の細胞と融合している腫瘍細胞を意味する。
【００５２】
別の観点によれば、本発明は、IRAP(インスリン応答性アミノペプチダーゼ)タンパク質及び/又はそのアイソフォーム、特に配列番号１〜３により規定されるアイソフォームの１つ及び/又はその変形体、特に配列番号４〜６により規定される変形体の１つの循環性細胞外ドメイン(配列番号７〜11の配列で規定される)又は該細胞外ドメインの１つのエピトープを特異的に認識する抗体に関する。
【００５３】
したがって、本発明の利点の１つは、IRAPタンパク質及び/又はその１つのアイソフォーム及び/又はその１つの変形体の細胞外ドメイン又は１つのエピトープに特異的な抗体、すなわち細胞外ドメインが細胞の原形質膜に依然として結合しているか又はADAMファミリー、特にADAM9及びADAM12に属するか若しくは属さないメタロプロティナーゼにより切断されており、よって循環しているいるかに関わらず、前記細胞外ドメイン又はその１つのエピトープを特異的に認識し、膜貫通部分も細胞内部分も認識しない抗体を提供することである。
【００５４】
結果として、本発明の抗体は、GLUT4トランスポーターとの同時転位後の前記細胞外ドメイン又はその１つのエピトープを特異的に認識し、したがってGLUT4グルコース輸送体又は関連タンパク質の転位の欠損に関連する病状のインビトロ診断及び/若しくは予後法又はインビトロモニタリング法を可能にする。
【００５５】
１つの有利な実施形態では、上記抗体は、医薬として、特に増殖性症候群及び癌、特にIRAP及び/又はそのアイソフォーム及び/若しくは変形体が過剰発現し及び/又はその原形質膜への転位が増加するもの、例えば、卵巣腺癌、子宮内膜癌、絨毛上皮腫、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、直腸癌又は頭頸部癌、自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療或いは化学療法に対する抵抗性の処置のための医薬として使用する。
【００５６】
本発明の抗体での、IRAPの原形質膜での発現及び/又はその原形質膜への転位の減少、すなわち正常に近い血清又は組織中濃度(すなわち癌病状の出現前の濃度)への復帰又はその活性の部分的若しくは全体的阻害により、癌の治療が可能になる。
同様に、IRAPタンパク質は上記のように抗癌剤に対する感受性の減少に関与するので、本発明の抗体により、IRAP濃度の減少又はその活性及び/又は原形質膜への転位の部分的若しくは完全な阻害が可能になり、したがって抗癌剤に対する感受性の減少をなくすことができる。このため、化学療法に対する抵抗性の処置及び結果的に抗癌剤の効果の向上が導かれる。
【００５７】
１つの有利な実施形態によれば、上記抗体はポリクローナル抗体である。
１つの有利な実施形態によれば、上記抗体はモノクローナル抗体である。
【００５８】
本発明の別の有利な実施形態は、以下から選択する上記モノクローナル抗体に関する：
−  CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France)に2009年７月２日、アクセッション番号CNCM I-4181で寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体、
−  CNCMに2009年７月２日、アクセッション番号CNCM I-4182で寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体、
−  CNCMに2009年７月２日、アクセッション番号CNCM I-4183で寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体、
−  CNCMに2009年７月２日、アクセッション番号CNCM I-4184で寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体、及び
−  CNCMに2009年７月２日、アクセッション番号CNCM I-4185で寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体。
【００５９】
以下、モノクローナル抗体No. CNCM I-4181は抗体17H10-3H5-3D8若しくは抗体17H10とも、モノクローナル抗体No. CNCM I-4182は抗体14A4-3H9-2B6若しくは抗体14A4とも、モノクローナル抗体No. CNCM I-4183は抗体4G6-3B6若しくは抗体4G6とも、モノクローナル抗体No. CNCM I-4184は抗体38E1-2G4-3A2若しくは抗体38E1とも、モノクローナル抗体No. CNCM I-4185は抗体40C10-2G8若しくは抗体40C10とも呼ぶ。
【００６０】
１つの有利な実施形態によれば、モノクローナル抗体は、放射性核種、蛍光体、量子ドット、酵素標識、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤又はハプテンから選択した化合物で標識する。
試験で使用する特定の標識又は検出可能基は、一般的には、アッセイに使用する抗体の特異的結合を妨げない限り、本発明の重要な観点ではない。検出可能基は、検出可能な物理的又は化学的性質を有する任意の物質であり得る。このような検出可能な標識は、免疫学的アッセイの分野で十分に開発されており、一般には、本発明の方法に適用可能な方法で有用であるほとんど全ての標識である。
【００６１】
よって、標識は、分光光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、放射線学的技術又は化学的手段により検出可能な任意の組成物である。本発明で有用な標識としては、磁性ビーズ(例えばDynabeadsTM)、蛍光色素(例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン)、放射活性標識した標識(例えば、3H、125I、35S、14C又は32P)、酵素(例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びELISA試験で一般に使用する他のもの)及び比色標識、例えば、コロイド金、着色ガラス又はプラスチックビーズ(例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど)及び量子ドットが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
標識は、当該分野において周知の方法に従って、所望の試験エレメントに直接又は間接にカップリングすることができる。上記のように、広範な標識が使用でき、標識の選択は、必要な感受性、化合物との接合の容易さ、安定性要件、利用可能な測定器具及び消失条件に依存する。放射活性標識は、しばしば、間接的手段により付着する。
【００６３】
通例、リガンド分子(例えばビオチン)を抗体に共有結合させる。その後、リガンドを、本来的に検出可能であるか又はシグナル系(例えば検出可能な酵素、蛍光化合物又は化学発光化合物)に共有結合している抗-リガンド(例えばストレプトアビジン)分子に結合させる。幾つかのリガンド及び抗-リガンドが使用可能である。リガンドは、天然に存在する抗-リガンド、例えばビオチン、チロキシン及びコルチゾールであるとき、標識した天然に存在する抗-リガンドとの組合せで使用することができる。或いは、ハプテン性又は抗原性の化合物を抗体との組合せで使用することができる。
【００６４】
抗体はまた、例えば酵素又は蛍光体との接合により、シグナル発生化合物に直接接合することができる。標識として使用する、関心を引く酵素は、主に加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼ及びグリコシダーゼ、又はオキシドレダクターゼ、特にペルオキシダーゼである。
蛍光化合物としては、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが挙げられる。化学発光化合物としては、ルシフェリン及び2,3-ジヒドロフタラジンジオン(例えばルミノール)及び量子ドットが挙げられる。標識又は他のシグナル生成系の概説は、米国特許第4,391,904号で入手可能である。
【００６５】
標識を検出する手段は当該分野において周知である。よって、例えば、標識が放射活性標識であるとき、検出手段としては、γ若しくはβシンチレーションカウンター又は例えばオートラジオグラフィー用フィルムのような写真フィルムが挙げられる。標識は、蛍光標識であるときは、適切な光又はレーザ波長で蛍光色素を励起し、生じる蛍光を検出することによって検出することができる。蛍光は、写真フィルム、電子検出器(例えば、電荷結合素子(CCD)又は光電子増倍管)の使用などにより視覚的に検出することができる。
同様に、酵素標識は、該酵素に適切な基質を提供し、生じる反応産物を検出することにより検出することができる。最後に、単純な比色標識は、標識に関連する色を観察することによって直接検出することができる。
【００６６】
１つの有利な実施形態によれば、上記モノクローナル抗体はヒト化抗体である。
「ヒト化抗体」とは、マウス抗体の最小限の部分がヒト抗体に組み込まれている遺伝子改変抗体を意味する；一般に、ヒト化抗体は、５〜10％のマウス抗体及び90〜95％のヒト抗体を含んでなる。
ヒト化抗体は、マウス又はキメラ抗体の使用で観察されるHAMA(ヒト抗-マウス抗体)及びHACA(ヒト抗-キメラ抗体)応答をブロックするという利点を有する。ヒト化抗体に対するヒト免疫系の応答は最小限にしか示されないか又は全く示されない。
【００６７】
別の観点によれば、本発明は、上記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。
本発明の別の有利な観点は、下記から選択する上記ハイブリドーマに関する：
-  CNCMに2009年７月２日、アクセッション番号CNCM I-4181で寄託されたハイブリドーマ、
-  CNCMに2009年７月２日、アクセッション番号CNCM I-4182で寄託されたハイブリドーマ、
-  CNCMに2009年７月２日、アクセッション番号CNCM I-4183で寄託されたハイブリドーマ、
-  CNCMに2009年７月２日、アクセッション番号CNCM I-4184で寄託されたハイブリドーマ、及び
-  CNCMに2009年７月２日、アクセッション番号CNCM I-4185で寄託されたハイブリドーマ。
これらハイブリドーマの製造は実施例に記載されている。
【００６８】
別の観点によれば、本発明は、哺乳動物の血清、血漿、赤血球又は組織中のIRAPタンパク質及び/又はその１つのアイソフォーム及び/若しくはその１つの変形体の細胞外ドメインの濃度を測定する工程を含んでなる、哺乳動物におけるIRAPタンパク質及び/又はその１つのアイソフォーム及び/若しくはその１つの変形体の濃度のインビトロアッセイ法に関する。
【００６９】
したがって、本発明の方法により、GLUT4グルコース輸送体との同時転位後のIRAPタンパク質細胞外ドメインの特異的アッセイが可能になり、よって関連する病状の原因であるIRAPタンパク質及び/又はその１つのアイソフォーム及び/若しくはその１つの変形体の過剰発現若しくは過少発現及び/又はその転位の増加若しくは減少を測定することが可能になる。
【００７０】
請求項１８に記載のアッセイ法では、アッセイは、酵素抗体法若しくは免疫組織化学法又はRIA若しくはIRMAにより実施する。
IRAPタンパク質の細胞外ドメインのアッセイは、酵素抗体アッセイ(実施例３)、又は免疫組織化学アッセイ(実施例４)、RIA(ラジオイムノアッセイ)若しくはIRMA(免疫放射線アッセイ)により行うことができる。後者の場合、アッセイは、ヨウ素125又は他の任意の適切な放射性同位体で標識した、抗体若しくはタンパク質又はそれらのフラグメントを用いて行う。
【００７１】
別の観点によれば、本発明は、インスリン抵抗性並びに２型糖尿病、妊娠糖尿病、妊娠誘発性高血圧(子癇前症)、早期分娩のリスクに関連する病状のインビトロ診断法に関し、該方法は、以下の工程を含んでなる：
ａ．哺乳動物において、上記抗体を用いて、IRAPタンパク質の循環性細胞外ドメイン(すなわち、赤血球の原形質膜で発現するものも)及び/又はその１つのアイソフォーム及び/若しくはその１つの変形体の濃度をインビトロ測定する工程、
ｂ．工程ａ.で得られた濃度を健常哺乳動物でインビトロで得られた濃度と比較する工程、
ｃ．工程ａ.で得られた濃度が工程ｂ.の濃度より低いとき、哺乳動物はインスリン抵抗性を有しているという事実を工程ｂ.から推論する工程。
【００７２】
したがって、本発明の別の利点は、IRAPタンパク質及び/又はその１つのアイソフォーム及び/若しくはその１つの変形体が過少発現している病状のインビトロ診断及び/若しくは予後法又はインビトロモニタリング法を提供することである。
【００７３】
別の観点によれば、本発明は、癌を含む増殖性症候群、特にIRAP及び/又はその１つのアイソフォーム及び/若しくはその１つの変形体が過剰発現し及び/又はその原形質膜への転位が増加するもの、例えば、卵巣腺癌、又は自己免疫若しくは炎症性疾患、又は化学療法に対する抵抗性に関連する病状のインビトロ診断法に関し、該方法は、以下の工程を含んでなる：
ａ．哺乳動物において、上記抗体を用いて、IRAPタンパク質の循環性細胞外ドメイン(すなわち、赤血球の原形質膜で発現するものも)及び/又はその１つのアイソフォーム及び/若しくはその１つの変形体の濃度をインビトロ測定する工程、
ｂ．工程ａ.で得られた濃度をコントロール哺乳動物でインビトロで得られた濃度と比較する工程、
ｃ．工程ａ.で得られる濃度が工程ｂ.の濃度より高いとき、哺乳動物は癌を有しているという事実を、工程ｂ.から推論する工程。
【００７４】
したがって、本発明の別の利点は、IRAPタンパク質及び/又はその１つのアイソフォーム及び/若しくはその１つの変形体が過剰発現しているか又はその原形質膜への転位が増加している病状のインビトロ診断及び/若しくは予後法又はインビトロモニタリング法を提供することである。
【００７５】
更に別の観点によれば、本発明は、哺乳動物におけるIRAPタンパク質及び/又はその１つのアイソフォーム及び/若しくは変形体の循環性細胞外ドメインの濃度のインビトロ測定のためのキットであって、少なくとも１つの緩衝液及び少なくとも１つの上記抗体を含んでなるキットに関する。
１つの好ましい実施形態では、上記キットはまた、IRAPタンパク質の基質及び抗体により認識されるペプチド又はIRAPのフラグメントを含んでなる。
基質の例は、L-ロイシン-ニトロアニリド、バソプレッシン、オキシトシン、メト-エンケファリンなどであるが、これらに限定されない。
「抗体により認識されるペプチド」とは、抗体により認識される、組換えIRAPタンパク質又はそのフラグメントを意味する。
【００７６】
別の観点によれば、本発明は、癌、特にIRAP及び/又はその１つのアイソフォーム及び/若しくはその１つの変形体が過剰発現しているか又はその原形質膜への転位が増大しているもの、例えば、卵巣腺癌、又は自己免疫若しくは炎症性疾患、又は化学療法に対する抵抗性に関連する病状のインビトロ診断法に関し、該方法は、以下の工程を含んでなる：
ａ．上記モノクローナル抗体の少なくとも１つ、優先的には上記モノクローナル抗体の２つ、特に抗体17H10及び4G6又は40C10を使用して、哺乳動物においてIRAPタンパク質及び/又はその１つのアイソフォーム及び/若しくはその１つの変形体の循環性細胞外ドメインの濃度をインビトロ測定する工程、
ｂ．工程ａ.で得られた濃度をコントロール哺乳動物でインビトロで得られた濃度と比較する工程、
ｃ．工程ａ.で得られた濃度が工程ｂ.の濃度より高いとき、哺乳動物は癌を有しているという事実を工程ｂ.から推論する工程。
【００７７】
別の観点によれば、本発明は、インスリン抵抗性及び２型糖尿病、妊娠糖尿病、妊娠誘発性高血圧(子癇前症)、早期分娩のリスクに関連する病状のインビトロ診断法に関し、該方法は以下の工程を含んでなる：
ａ．上記モノクローナル抗体の少なくとも１つ、優先的には上記モノクローナル抗体の２つ、特に抗体17H10及び4G6又は40C10を使用して、哺乳動物において、IRAPタンパク質及び/又はその１つのアイソフォーム及び/若しくはその１つの変形体の循環性細胞外ドメインの濃度をインビトロ測定する工程、
ｂ．工程ａ.で得られた濃度を健常哺乳動物でインビトロで得られた濃度と比較する工程、、
ｃ．工程ａ.で得られた濃度が工程ｂ.の濃度より低いとき、哺乳動物はインスリン抵抗性を有しているという事実を、工程ｂ.から推論する工程。
【００７８】
以下の図及び実施例は本発明をよりよく説明するが、本発明の範囲を限定するものではない。
【００７９】
図1A〜Eは、IRAPタンパク質に関するモノクローナル抗体17H10、14A4、4G6、38E1、40C10のアフィニティーの測定に対応するグラフを表す。
図1Aは、抗体4G6の濃度の関数として、IRAPタンパク質(■)又はIRAP His(◆)の検出を測定したグラフを示す。
図1Bは、抗体14H4の濃度の関数として、IRAPタンパク質(▲)又はIRAP His(Ｘ)の検出を測定したグラフを示す。
【００８０】
図1Cは、抗体17H10の濃度の関数として、IRAPタンパク質(●)又はIRAP His(＊)の検出を測定したグラフを示す。
図1Dは、抗体38E1の濃度の関数として、IRAPタンパク質(＋)又はIRAP His(−)の検出を測定したグラフを示す。
図1Eは、抗体40C10の濃度の関数として、IRAPタンパク質(◆)又はIRAP His(--)の検出を測定したグラフを示す。
【００８１】
図２は、モノクローナル抗体17H10を捕捉抗体として使用し、モノクローナル抗体4G6を検出抗体として使用したELISAにおけるIRAPの検出についての用量-応答曲線を表す。(◆)は組換えIRAPのアッセイを表し、(■)は妊娠女性の血清中のIRAPのアッセイを表し、(▲)は男性の血清中のIRAPのアッセイを表す。
【００８２】
図３は、モノクローナル抗体17H10を捕捉抗体として使用し、モノクローナル抗体40C10を検出抗体として使用したELISAにおけるIRAPの検出についての飽和用量曲線を表す。(◆)は組換えIRAPのアッセイを表し、(■)は、妊娠女性の血清中に希釈した組換えIRAPのアッセイを表し、(▲)は男性の血清中に希釈した組換えIRAPのアッセイを表す。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】IRAPタンパク質に関するモノクローナル抗体17H10、14A4、4G6、38E1、40C10のアフィニティーの測定に対応するグラフを表す。
【図２】モノクローナル抗体17H10を捕捉抗体として使用し、モノクローナル抗体4G6を検出抗体として使用したELISAにおけるIRAPの検出についての用量-応答曲線を表す。
【図３】モノクローナル抗体17H10を捕捉抗体として使用し、モノクローナル抗体40C10を検出抗体として使用したELISAにおけるIRAPの検出についての飽和用量曲線を表す。
【実施例】
【００８４】
実施例
実施例１：IRAPタンパク質の製造
１．クローニング：
昆虫ペプチドシグナル及びTEVプロテアーゼで切断可能なＮ末端６ヒスチジンタグに融合したIRAPの細胞外ドメインをコードする配列を含有する発現ベクターを構築し、Swiss-Protデータベース(Q9UIQ6)中の配列(pGTPb302-mel-His-Tev-PLAPextra, reference C640-CAP-06)との一致を配列決定により検証した。
組換えバクミド(bacmid)を製造し、作製したバクミド中での発現カセットの存在をPCRによりチェックした。
【００８５】
バクミドのSf9昆虫細胞株中へのトランスフェクションにより、組換えウイルスを作製した。
ウイルス増幅後、第２世代ウイルスをアッセイし、昆虫/バキュロウイルス細胞系における一連の発現試験に使用した。
【００８６】
２．IRAP又はその１つのアイソフォーム若しくはその１つの変形体の循環性細胞外配列の発現及び精製。３つの異なる方法を使用することができる：
−  第１の方法：適切なE. coli株によりIRAPタンパク質又はその１つのアイソフォームを発現。次いで、分泌されたIRAPタンパク質又はその１つのアイソフォームをNi++又はCo++マトリクス上でのアフィニティーにより精製する。
最後に、ポリ-His配列を、特異的プロテアーゼを用いて切断する。
【００８７】
−  第２の方法：バキュロウイルスにおける改変cDNAのクローニング後に、Sf9昆虫細胞によりIRAPタンパク質又はその１つのアイソフォーム若しくはその１つの変形体を発現。：発現試験は、２つの細胞株Sf9及びHighFiveにおいて、MOI(感染多重度)並びに感染の持続時間を変化させることにより行った。発現試験の分析は、感染の24、48及び72時間に採取した培養上清のサンプルについて抗Hisウェスタンブロットにより行った。最も生産性の高い条件は感染の48時間であった(HighFive MOI 0.1)。
次いで、分泌されたIRAPタンパク質又はその１つのアイソフォーム若しくはその１つの変形体を、Ni++又はCo++マトリクス上でのアフィニティーにより精製する。最後に、ポリ-His配列を、特異的プロテアーゼを用いて切断する。
【００８８】
実施例２：モノクローナル抗体の産生
一般的ポイント
プロトコルはハイブリドーマ技術(Kohler and Milstein protocol, 1976)に由来し、５つの工程に分割される：
-  工程１−  免疫：IRAPのアイソフォーム又はその１つの変形体の細胞外部分に共通する特異配列に対応する幾つかのペプチドをマウスへ皮下注射。これらペプチド配列は、哺乳動物の他のアミノペプチダーゼ中には見出されない。
精製組換えIRAPタンパク質又はその１つのアイソフォームに対して抗血清をELISAにより試験する。応答するマウスの脾臓をハイブリドーマの作製に使用する。次いで、ハイブリドーマにより産生された抗体を、IRAPタンパク質又はその１つのアイソフォーム並びに妊娠及び非妊娠女性の血清に対してELISAにより再試験する。
【００８９】
−  工程２−  融合：脾臓細胞を取り出し、これら細胞をミエローマ細胞とポリエチレングリコール(化学融合剤)の存在下で融合させる。各ウェルが平均して１未満のハイブリッド細胞を含有するような希釈率でマイクロプレートウェルに混合物を分配する。ハイブリッド細胞のみ増殖し生存する一方、骨髄腫細胞及び脾臓の非融合形質細胞は急速に死滅する選択培地中で細胞を培養。
【００９０】
−  工程３−  スクリーニング：各ウェル中での、組換えIRAPタンパク質又はその１つのアイソフォーム若しくはその１つの変形体を指向する抗体を探索。
−  工程４−  クローニング及び特徴付け：細胞クローンを得るために抗体産生ハイブリッド細胞を継代培養。液体窒素中で各クローンのコピーを保存。作製された抗体をイソタイプ決定。
【００９１】
−  工程５−  培養及び産生：抗-IRAP又はその１つのアイソフォーム若しくはその１つの変形体抗体を産生させるためにハイブリドーマを培養する２つの可能な方法：
o  細胞をインビトロ培養(培養培地中で抗体を産生)
o  マウス腹腔内への細胞の注射によるインビボ培養。これにより、注射域での腫瘍、炎症及び腹水産生の出現が引き起こされる。抗体を含有する腹水を採取(１〜10mg/mL)。
【００９２】
特異的ハイブリドーマ
１−  免疫
６匹の雌性OF1 Charles Riverマウス(18〜20g)に、配列番号７〜11のペプチドの混合物を、静脈内及び皮下注射により免疫した。５つのペプチドは、フロイント完全アジュバントの存在下で、KLH(キーホールリンペットヘモシアニン)にカップリングさせた。３匹のマウス(マウス１〜３)には50μgのペプチド混合物を注射し、２匹のマウス(マウス４及び５)には15μgのペプチド混合物を注射した。
第１の注射の３週間後、マウスに、フロイント不完全アジュバントの存在下に２つのペプチドの混合物を再注射した(第１の追加免疫)。
第２の注射の３週間後、マウスに、フロイント不完全アジュバントの存在下に２つのペプチドの混合物を再注射した(第２の追加免疫)。
【００９３】
第１の注射の１ヵ月後、注射したマウスの血清サンプルを採取し、配列番号７〜11のペプチドに対する抗体の存在について血清を試験した。
全てのマウスの血清が、少なくとも１つのペプチドを認識する抗体を有していた。よって全ての血清を保存した。
血清試験の10日後、３匹のマウスに、20μgのペプチド混合物を、腹腔内及び静脈内に追加免疫した。追加免疫の３日後に、脾臓を取り出した。
血清試験の１ヵ月後、残る３匹のマウスに、15μgのペプチド混合物を、腹腔内及び静脈内に追加免疫した。追加免疫の３日後に、脾臓を取り出した。
【００９４】
２−  細胞融合
マウスを放血させ、DMEMで滅菌様式に脾臓を取り出した。脾臓を破砕し、グリッドを通して濾過した。
並行して、マウスの腹腔をDMEMで洗浄し、マクロファージを含むDMEMを回収した。マクロファージをMalassez cell中で計数し、以下の培地中に104マクロファージ/mlの溶液を調製した：DMEM HAT 20％ FCS ATB (DMEM、４mMグルタミン、HAT(ヒポキサンチン100μM、アミノプテリン0.4μM、チミジン16μM)、20％補体除去胎仔ウシ血清、１％抗生物質(ペニシリン/ストレプトマイシン))。
【００９５】
次いで、得られた脾臓細胞をDMEMで３回洗浄した。
並行して、BalB/c Sp2/O Ag14マウスのミエローマ細胞(ATCC No. CRL 1581)をDMEM中で３回洗浄する。
脾臓細胞及びミエローマ細胞を５/１の脾臓細胞/ミエローマ比で混合し、244ｇで７分間遠心分離した。
上清を取り出し、１mlのPEG(37℃に加温した、ポリエチレングリコール(MW1500)の40％溶液)を添加した。
【００９６】
細胞を800rpm(108ｇ)で12分間遠心分離し、10mlの以下の培地DMEM HAT 20％ FCS(DMEM、４mMグルタミン、HAT(ヒポキサンチン100μM、アミノプテリン0.4μM、チミジン16μM)、20％補体除去胎仔ウシ血清)をゆっくりと加えた。
細胞を1200rpm(244ｇ)で７分間遠心分離し、上清を取り出し、容量ｖのDMEM HAT 20％ FCS培地を加え、
ｖ(ml) = 脾臓細胞の数/107(すなわち107細胞/ml)
となるようにペレット化した。試験管を周囲温度にて１時間放置した後、注意深く倒置して細胞を再懸濁させた。
【００９７】
100μl/ウェルの溶液を104マクロファージ/mlで96-ウェルプレートに加え、次いで100μl/ウェルの融合細胞を以下の希釈率で加えた：
希釈率1/10：105脾臓細胞/ウェルで３プレート
希釈率1/20：５×104脾臓細胞/ウェルで５プレート(２×50ml)
希釈率1/40：2.5×104脾臓細胞/ウェルで２プレート
プレートを37℃、５％ CO2のオーブン中に10日間置いた。
【００９８】
３−  ハイブリドーマの選択
10日間の融合産物の培養後、２つの選択試験を行う：
−  試験１：細胞がコンフルエンスに達したウェルを分析する：
−  最初の３匹のマウスの脾臓細胞を起源とする融合物については、1017ウェルを分析し、
−  最後の３匹のマウスの脾臓細胞を起源とする融合物については、714ウェルを分析した。
これらウェルの各々から100μlの上清を取り出し、ELISA試験を用いて上清を試験し、配列番号７〜11の１以上のペプチドに対する抗体を検出した(抗-IRAPハイブリドーマの上清のスクリーニングを参照)。
【００９９】
ELISA試験後、選択した細胞(配列番号７〜11の１以上のペプチドに対する抗体を分泌する細胞)を、24-ウェルプレートのウェル中0.4mlの培地に配置した。
細胞が増殖し始めたら(24〜48時間)、１mlの培地：15％ DMEM HAT FCS １％ HCF ATB(DMEM、４mMグルタミン、HAT(ヒポキサンチン100μM、アミノプテリン0.4μM、チミジン16μM)、15％補体除去胎仔ウシ血清、１％ HCF(ハイブリドーマクローニングファクターマクロファージ-様起源)、１％抗生物質(ペニシリン/ストレプトマイシン))を添加した。
111クローンを同様に選択して凍結させた
【０１００】
−  試験２：試験１により選択された111クローンを起源とする細胞がコンフルエンスに達したウェルを分析した：
−  最初の３匹のマウスの脾臓細胞を起源とする融合物については、24-ウェルプレートの39ウェルを分析し、
−  最後の３匹のマウスの脾臓細胞を起源とする融合物については、24-ウェルプレートの72ウェルを分析した。
【０１０１】
これらウェルの各々から100μlの上清を取り出し、ELISA検査を用いて上清を試験し、IRAPの分泌ドメインに対する抗体を検出した(抗-IRAPハイブリドーマの上清のスクリーニングを参照)。
23クローンを同様に選択して凍結させた。
【０１０２】
４−  抗-IRAPハイブリドーマの上清のスクリーニング
使用した抗原(Ag)：KLH-ペプチド 配列番号７〜11(第１のスクリーニング)及びHigh Five昆虫細胞で発現した組換えIRAPの分泌ドメイン(第２のスクリーニング)。
【０１０３】
【表１】
0005749643.tif 000002
【０１０４】
５−  抗体のイソタイプ決定
抗体のイソタイプを、SouthernBiotech SBA Clonotyping System/HRPキット(Cliniscience, Montrouge, France)を用いて下記のように決定した：
【０１０５】
１．プレートのコーティング
マウス抗-免疫グロブリン抗体を５μg/mlの濃度に希釈する。ウェルあたり50μlを堆積させ、37℃で１時間又は周囲温度で16時間インキュベートする。
２．洗浄
200μl/ウェルのPBS-Tween20 0.05％(v/v)で１回リンスする。
３．ブロッキング
各ウェルに150μlのPBS-乳2.5％(w/v)を加え、37℃で１時間インキュベートする。
４．洗浄
PBS-Tween20 0.05％(v/v)緩衝液で１回リンスする。
５．試験する抗体サンプルの準備
ハイブリドーマ培養上清をPBS-Tween20 0.05％(v/v)-BSA 0.5％(w/v)で1/10に希釈する。ウェルあたり50μlを堆積させ、周囲温度で２時間インキュベートする。
【０１０６】
６．洗浄
PBS-Tween20 0.05％(v/v)緩衝液で３回リンスする。
７．二次抗体
50μl/ウェルのペルオキシダーゼ(HRP)に接合した抗-マウスIgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3又はIgM抗体(PBS-Tween20 0.05％(v/v)-BSA 0.5％(w/v)で1/2000に希釈)を堆積し、周囲温度で１時間インキュベートする。
８．洗浄
PBS-Tween20 0.05％(v/v)緩衝液で３回リンスする。
９．基質との反応
50μl/ウェルのテトラメチルベンジジン(KPL, Inc.)を堆積させ、プレートを周囲温度で10分間インキュベートする。
10．反応の停止
50μlのH2SO4を各ウェルに加え、450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー(Dynex)で読み取る。
【０１０７】
６−  結果
図1A〜Eに示されるように、配列番号７〜11のペプチドの１つ及び組換えIRAPの分泌ドメインに関して優秀なアフィニティーのために、５つのハイブリドーマを保存した：17H10、14A4、4G6、38E1、40C10。
１mg/mLのIRAP又は２mg/mLの６Hisタグを付したIRAPを固相化したプレート上で、抗体17H10、14A4、4G6、38E1、40C10の各々をELISAにより試験した。抗体をプレート中でインキュベートし、モノクローナル抗体の定常部分を認識するペルオキシダーゼ(HRP)カップリング二次抗体を用いて検出を可視化した。標識IRAP-モノクローナル抗体-抗体免疫複合体を、TMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)、ペルオキシダーゼ色素原基質(この色は、過酸化水素の存在下で青色に変わり、硫酸の存在下(反応の停止)で黄色になる)を用いて可視化する。この反応は、450nmでの検出により定量化することができる。
【０１０８】
得られた結果は、選択したモノクローナル抗体が、サンドイッチELISAを用いるIRAP分泌ドメイン検出用抗体として使用できることを示している。用量-応答曲線は、抗体によるIRAP分泌ドメインの検出限界１〜100ng/mlを示している。
クローンを貯蔵し、96-ウェルプレートにおいて平均でウェルあたり10、５、３、１又は５細胞を含有する限界希釈物を作製することによりクローニングした。
クローニング産物を以下の培地DMEM HT FCS 15％ HCF １％ ATB (2)中で凍結させた：10％ DMSO(ジメチルスルホキシド)を備えた、DMEM、４mMグルタミン、HAT(ヒポキサンチン100μM、チミジン16μM)、15％補体除去胎仔ウシ血清、1％ HEF(ハイブリドーマ増強サプリメント)、１％抗生物質(ペニシリン/ストレプトマイシン)。
【０１０９】
実施例３：血清又は血漿における酵素抗体法によるIRAPタンパク質及び/又はその１つのアイソフォーム及び/若しくはその１つの変形体のアッセイ
血清又は血漿中で探索されるIRAPタンパク質及び/又はその１つのアイソフォームを、マルチ-ウェルプレート上に吸着させた特異抗体に結合させる。次いで、結合したIRAPタンパク質及びそのアイソフォーム(その１以上の変形体でさえ)を可視化し、20mMのL-メチオニンの存在下でL-ロイシン-パラニトロアニリドを基質として使用して酵素活性を測定することによって定量化する。定量化により、可能性のある他のアミノペプチダーゼによる夾雑物との交差反応を回避することができる(Yamahara, N., Nomura, S., Suzuki, T., Itakura, A., Ito, M., Okamoto, T., Tsujimoto, M., Nakazato, H.及びMizutani, S. (2000) Life Sci 66(15), 1401-1410)。
【０１１０】
酵素的方法、特にL-ロイシン-パラニトロアニリド基質を使用する酵素的方法により、10μg/mLの濃度からIRAPを検出することができる。免疫捕捉によるIRAPの富化によって検出閾値が１μg/mLに低下する。
しかしながら、この高い検出閾値は、血清中のIRAPの検出には然程適合しない。
また、非常に特異的なモノクローナル抗体を使用してIRAPを精製することは、検出限界を低下させるために不可欠である。
モノクローナル抗体の効力を確証するために、抗体17H10及び4G6を用いてサンドイッチELISAを行った。
【０１１１】
モノクローナル抗体17H10を15μg/mlで捕捉抗体として使用し、モノクローナル抗体4G6を検出抗体として使用する。17H10-IRAP-4G6複合体を、組換えIRAPのサンプル又は妊娠女性(14〜16週)若しくは男性の血漿サンプルから、マウスIgG2に対するペルオキシダーゼ(HRP)接合抗-イソタイプ抗体により可視化する。
結果を図２に示す。
この使用条件下で、抗体17H10-4G6-抗IgG2a/HRPの組合せにより、IRAPタンパク質の分泌ドメインを濃度0.1μg/mlまで検出することが可能になる。
この組合せは、試験した希釈率では、これら血漿中でのIRAPの検出を可能にしない。第４のアルカリホスファターゼ接合抗-HRP抗体の使用により、感度を１ng/mlまで増大させることができる。
【０１１２】
実施例４：ヒト組織における免疫組織化学的方法によるIRAPタンパク質及び/又はその１つのアイソフォーム及び/又はその１つの変形体のアッセイ
アビジン-ビオチン免疫ペルオキシダーゼ技術を用いて免疫組織化学的アッセイを行った。事前に採取したヒト組織の４μm厚切片を作製し、ストレプトアビジン/ビオチン/ペルオキシダーゼ法を用いて染色した。
パラフィンを除去した切片を0.01Ｍクエン酸緩衝液に入れ、マイクロ波オーブン中で90℃にて750Ｗで各回５分間３回処理した。
次いで、切片を過酸化水素中で20分間インキュベートした後、二次抗体の動物宿主の10％血清と10分間インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼ活性及び非特異的免疫グロブリンへの結合をブロックした。
【０１１３】
希釈率1：100の実施例２のモノクローナル抗体を組織切片に加え、湿潤チャンバ中で周囲温度で１時間インキュベートして、IRAP及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその１つの変形体をアッセイした。
抗体の結合を、ビオチン化マウス抗-Ig抗体に続く西洋ワサビペルオキシダーゼ接合ストレプトアビジンにより可視化した。
切片を3-アミノ-9-エチルカルバゾールに浸漬させることにより色素原発色を行った。
マイアーのヘマトキシリン対比染色により写真を分析した。
【０１１４】
実施例５：化学療法抵抗性の予後についてのIRAPタンパク質及び/又はその１つのアイソフォーム及び/又はその１つの変形体のアッセイ
化学療法抵抗性はIRAPの過剰発現の結果である。したがって、これは、実施例３若しくは４に従って又はRIA若しくはIRMAによりアッセイすることができる。
【０１１５】
実施例６：早期分娩の発生を測定するためのIRAPタンパク質及び/又はその１つのアイソフォーム及び/又はその１つの変形体のアッセイ
IRAPの濃度は妊娠中に増加する。したがって、これは、実施例３若しくは４に従って又はRIA若しくはIRMAによりアッセイしたIRAPの循環濃度が低下した場合、予想することができる。
【０１１６】
実施例７：IRAPの細胞外部分を指向するモノクローナル抗体の特異性
本発明の抗体の特異性を確証するために、IRAP-抗体相互作用の測定を、希釈血清又は未希釈血清の存在下に行った。
抗体-IRAP相互作用は、組換えIRAP濃度の関数又は男性若しくは妊娠女性の1/100希釈血清中で希釈した組換えIRAPの関数として、抗体17H10及び40C10を使用するELISAサンドイッチにより測定した。
結果を図３に示す。
これら結果は、IRAPが希釈血清中0.1μg/mLの濃度で検出可能であり、血清中に含まれる他のアミノペプチダーゼとの干渉がないことを示している。
これら結果は、モノクローナル抗体がIRAPに非常に特異的であることを示している。
【図１】
0005749643.tif 000003
【図２】
0005749643.tif 000004
【図３】
0005749643.tif 000005
【配列表】
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