(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
頭部および頸部癌の治療のために放射線と組み合わせて使用するサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤であり、
そのＣＤＫ阻害剤は、以下の式Iによって表わされる、ＣＤＫ阻害剤。
【化１】
0005730288.tif 000016
ここで、Ａｒは、塩素、臭素、フッ素またはヨウ素から選択されるハロゲン基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１〜Ｃ４のアルキル基、または、トリフルオロメチル基から選択される１または２の異なる置換基によって置換されているフェニル基、または、その薬学的に許容可能な塩である。
【請求項２】
請求項１の頭部および頸部癌の治療のために放射線と組み合わせて使用するＣＤＫ阻害剤であって、ＣＤＫ阻害剤は、以下の式IAで表されるような、式Iの化合物の（＋）‐トランス異性体である。
【化２】
0005730288.tif 000017
ここで、Ａｒは、塩素、臭素、フッ素またはヨウ素から選択されるハロゲン基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１〜Ｃ４のアルキル基、または、トリフルオロメチル基から選択される１または２の異なる置換基によって置換されているフェニル基、または、その薬学的に許容可能な塩である。
【請求項３】
請求項１または請求項２の頭部および頸部癌の治療のために放射線と組み合わせて使用するＣＤＫ阻害剤であって、式Iの化合物によって表わされるＣＤＫ阻害剤は、（＋）‐トランス‐２‐（２‐クロロ‐フェニル）‐５，７‐ジヒドロキシ‐８‐（２‐ヒドロキシメチル‐１‐メチル‐ピロリジン‐３‐イル）‐クロメン‐４‐オンまたはその薬学的に許容可能な塩である。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項の頭部および頸部癌の治療のために放射線と組み合わせて使用するＣＤＫ阻害剤であって、用いられる放射線は、ガンマ線照射である。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項の頭部および頸部癌の治療のために放射線と組み合わせて使用するＣＤＫ阻害剤であって、放射線の治療上効果的な量と、式Iまたはその薬学的に許容可能な塩のＣＤＫ阻害剤の治療上効果的な量とは、同時または逐次的に投与される。
【請求項６】
請求項５の頭部および頸部癌の治療のために放射線と組み合わせて使用するＣＤＫ阻害剤であって、放射線の治療上効果的な量と、式Iまたはその薬学的に許容可能な塩のＣＤＫ阻害剤の治療上効果的な量とは、逐次的に投与される。
【請求項７】
請求項６の頭部および頸部癌の治療のために放射線と組み合わせて使用するＣＤＫ阻害剤であって、放射線の治療上効果的な量は、式Iまたはその薬学的に許容可能な塩のＣＤＫ阻害剤の治療上効果的な量よりも先に、投与される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療のための組み合わせに関するものであって、その組み合わせは相乗的な効果を示す。その組み合わせは、放射線と、式I（この中に記載されたように）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物から選択される、少なくとも１つのサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤とを備える。本発明は、また、癌、特に頭部および頸部癌の治療方法に関し、その方法は、そのような治療を必要とする患者に、組み合わせの治療上効果的な量を投与することを備える。本発明は、また、癌、特に頭部および頸部癌の治療のための放射線治療の効果を増大する放射線増感剤としての、式Iの化合物から選択されるＣＤＫ阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の治療に有用な多くの放射線増感物質は、これらの物質の相互作用の分子基盤の十分な知識なしに、経験的な実験室または臨床での観察から識別されている。放射線の効果を増大させる取り組みは、放射線の効果および耐性の機構を開発することに基づいている。６つの一般的な機構は、以下の通りである：低酸素感作、ＤＮＡ損傷の増大、減少したＤＮＡ修復、ＤＮＡ損傷に起因する増加したアポトーシス細胞死、腫瘍血管系への影響および細胞周期への影響（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ,２００７、４（５）,２８２〜２９４）。数十年の間、放射線の耐性の１つの原因として、腫瘍低酸素の問題に研究が集中していた（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ,２０００、８３（３）,３５４〜３５９）。低酸素細胞は、イン・ビトロおよびイン・ビボにおいて、放射線に対して耐性を示す。初期の実験では、放射線が投与される際の適度の酸素の量が、ＤＮＡ損傷に必要とされることを示していた。しかしながら、酸素の閾値が存在していた（たとえば、通常の組織でのような）時点で、酸素をより与えても、放射線の影響はそれ以上増大しないであろう。酸素は、ＤＮＡ損傷が誘導されるフリーラジカルを介した放射線にとって必要である。抵抗性の低酸素細胞集団は、治療の失敗の主な原因になることが可能であるとともに、これは、酸素供給の増大させること、または、酸素分子のようにふるまう薬物を投与することによって、克服されることが可能であることが提案されていた。マイトマイシンやチラパザミンのような、選択的に低酸素腫瘍細胞を殺す薬物は、潜在的な利益を示すとともに、研究されている。
【０００３】
低酸素の現象の重要性にも関わらず、腫瘍低酸素に対処する取り組みは成功していない。この失敗のいくつかの潜在的な理由には、投薬を制限するような物質の毒性と、分割放射線治療中に起きる低酸素の自己補正、それによって、正常酸素圧細胞の死によりかつて低酸素細胞であった細胞に酸素が到達することと、耐性遺伝子の低酸素を介した発現上昇と、低酸素の存在が攻撃性の原因というよりも抵抗性腫瘍のためのマーカーであるという事実とが含まれている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２００７,４（５）,２８２〜２９４）。
【０００４】
低酸素を克服することの限られた成功は、放射線の効果を増大するために発展された他の接近方法によって導き出されている。腫瘍低酸素と戦うために、最も研究され臨床で成功した研究方法は、放射線と併用される細胞毒性化学療法の投与である。この組み合わせにより改善した結果になる機構は、下記のものを含んでいる：殺細胞に対する単独で独立した付加的な影響、細胞周期（たとえば、Ｇ２〜Ｍ）の放射過敏部分での細胞の抑止、低酸素細胞や細胞周期の耐性部分における細胞のような耐性集団を攻撃目標とすること、および、放射線誘導性のＤＮＡ損傷を増大することまたはその修復を阻止すること。加えて、腫瘍は、放射線の細胞毒性の影響の大部分を中和することが可能な成長率の放射線によって増殖することが可能である。この増殖は急速再増殖といわれており、改善した栄養素と、生存した細胞または放射線耐性細胞の残りの集団への血液供給との結果として起こることが可能である。この増殖反応は、放射線に加えて細胞毒性物質を用いることによって克服される可能性がある。化学療法は、癌の治療における放射線治療の治療指数の最適化を目指して、放射線治療と組み合わされている。癌に対する放射線治療の効果を増大させ、それにより、より低い、放射線の投与量、潜在的な標的特異性、および、臨床的に許容可能な毒性が認められるような放射線増感剤に発展させることが望ましい。
【０００５】
ＰＣＴ特許公報番号  ＷＯ２００４００４６３２（米国特許７，２７２，１９３に対応する）およびＰＣＴ特許公報番号  ＷＯ２００７１４８１５８には、異なる型の癌の治療に有用性があるＣＤＫ阻害剤として、フラボンに置換されたピロリジンが記載されている。ＣＤＫ阻害剤は、毒性が低く、それゆえに、人間の癌での放射線感受性を増大させることに対する、ＣＤＫ阻害剤の効果および可能な機構を評価することに有利であろう。これは、放射線を介した癌の治療に非常に有益であろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一の局面において、本発明は、放射線と、式I（この中に記載されたように）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物から選択される、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤とを備える組み合わせに関し、その組み合わせは、癌の治療において、相乗的な効果を示す。
【０００７】
別の局面において、本発明は、放射線と、式Iの化合物またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物から選択される、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤とを備え、癌の治療のための同時または逐次的な投与のための組み合わせに関する。
【０００８】
さらなる局面において、本発明は、放射線と、式Iの化合物またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物から選択される、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤とを備える組み合わせの、癌の治療のための使用に関する。
【０００９】
別の局面において、本発明は癌治療の方法に関し、その方法は、式Iの化合物またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物から選択される、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤の治療上効果的な量と組み合わせて、放射線の治療上効果的な量を、それを必要とする被験者に投与することを備える。
【００１０】
よりさらなる局面において、本発明は、癌の治療のための放射線治療の効果を増大する放射線増感剤としての、式Iの化合物から選択されるＣＤＫ阻害剤の使用に関する。
【００１１】
本発明のその他の局面および適用可能なさらなる範囲は、次に続く詳細な記載から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ＦａＤｕ細胞株（３５００細胞／プレート）での放射線感受性における１μＭの化合物Ａ（４８時間処理）の効果を示す。
【図２】図２は、ＦａＤｕ細胞株（３５００細胞／プレート）での放射線感受性における１μＭの化合物Ａ（９６時間処理）の効果を示す。
【図３】図３は、ＦａＤｕ細胞株（１５００細胞／プレート）での放射線感受性における１μＭの化合物Ａ（７２時間処理）の効果を示す。
【図４】図４は、ＦａＤｕ細胞株（１５００細胞／プレート）での放射線感受性における１μＭの化合物Ａ（９６時間処理）の効果を示す。
【図５】図５は、放射線、化合物Ａ、組み合わせおよびコントロール（対照）の投与の期間に亘っての平均的な群の体重を示す。
【図６】図６は、放射線、化合物Ａ、組み合わせおよびコントロール（対照）の投与の期間に亘っての頭部および頸部癌（ＦａＤｕ）異種移植片の平均％腫瘍重量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、放射線と、式I（この中に記載されたように）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物から選択されるＣＤＫ阻害剤とを備え、癌、特に頭部および頸部癌の治療に用いられる際に相乗的な効果を示す、組み合わせに関する。
【００１４】
下記の式Iで表わされるＣＤＫ阻害剤は、ＰＣＴ特許公報番号  ＷＯ２００４００４６３２（米国特許７，２７２，１９３に対応する）およびＰＣＴ特許公報番号  ＷＯ２００７１４８１５８に開示されており、参照としてここに組み入れられている。式Iの化合物は、多くの癌細胞の増殖を阻害するＣＤＫ阻害剤である。本発明で用いられるような式Iの化合物は、様々な固体および血液の癌に対して効果的である。本発明の発明者は、式IのＣＤＫ阻害剤に放射線を組み合わせることで、アポトーシス、または、プログラム細胞死が増加することを観察した。
【００１５】
特に明記しない限り、前述および後述する一般的な用語は、この開示の文脈の範囲内で下記の意味を持つのが好ましい。
【００１６】
単数形の「ある（ａ）」「ある（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確にそれ以外を示していない限り、複数形の参照も含む。
【００１７】
この中で用いられるように、「相乗的」という用語は、この発明の方法および組み合わせによって成し遂げられる効果が、放射線、および、式Iまたはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物のＣＤＫ阻害剤を、同一の投薬量の条件の下で、別途用いることによる効果の合算よりも大きいことを意味している。有利なことに、そのような相乗効果は、同一の投薬量においてより大きな効果をもたらし、加えて／または、多剤耐性の蓄積を抑制または遅らせる。
【００１８】
この中で用いられるように、「治療上効果的な量」という用語は、非増殖性の細胞への最小限の毒性で、増殖性の細胞の最大限のアポトーシスをもたらす放射線または式IのＣＤＫ阻害剤の量に関する。
【００１９】
この中で用いられている「治療上の相乗効果」という用語は、放射線と式IのＣＤＫ阻害剤との組み合わせ治療の許容される投与計画によって得られる治療上の効果であって、放射線またはＣＤＫ阻害剤単独を用いる単独治療のどの許容される投与量において得られる最適な効果を越える、治療上の効果を意味している。
【００２０】
「アポトーシス」という用語は、ある細胞での一連の分子の段階がその死を導く、細胞死の一種に関する。これは、不要または異常な細胞を取り除くための人体の通常の手段である。アポトーシスのプロセスは、癌細胞では妨げられている可能性がある。アポトーシスは、プログラム細胞死にも関連している。この中で用いられている「増加するアポトーシス」という用語は、プログラム細胞死の割合の増加として定義されている。すなわち、放射線単独またはＣＤＫ阻害剤単独のいずれかによる暴露（接触）と比較して、より多くの細胞が死のプロセスに導かれている。
【００２１】
この中で用いられている「被験者」という用語は、治療、観察および実験の対象である、動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくは人間に関する。
【００２２】
頭部および頸部癌は、唇、口腔、鼻腔、副鼻腔、咽頭および喉頭を含む上気道に由来する生物学的に類似した癌の群に関する。頭部および頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ’ｓ）は、頭部および頸部癌の大部分を構成しており、この解剖領域に渡って粘膜面から生じる。これらは、鼻腔、副鼻腔、口腔、鼻咽頭、中咽頭、下咽頭および喉頭の腫瘍を含んでいる。
【００２３】
頭部および頸部の癌は、それらが始まる場所によって識別される。
１．口腔：扁平上皮細胞癌は、内唇、舌、口腔底部、歯肉および硬口蓋を含む口腔において共通している。
２．鼻咽頭：鼻咽頭癌は、鼻腔と耳管とが喉の上部で接続する領域である鼻咽頭に生じる。
３．中咽頭：中咽頭癌は、舌の付け根である軟口蓋と扁桃腺とを含む喉の中央部である中咽頭において始まる。扁桃腺の扁平上皮細胞癌は、頭部および頸部の他の領域の癌よりも、ヒト・パピローマウイルス感染とより強く関連している。
４．下咽頭：下咽頭は、梨状陥凹、後咽頭壁および輪状後部を含んでいる。下咽頭の腫瘍は、頻繁に診断で進行期であるとされ、咽頭癌の中で最も多くの予後不良がある。それらは、喉頭の周囲の広範囲のリンパ管のネットワークに起因して、早期に転移する傾向にある。
５．喉頭：喉頭癌は、喉頭において始まる。癌は、声帯自体（「声門の」癌）、または、真帯の上下の組織（それぞれ、「声門上の」および「声門下の」癌）に現れる可能性がある。
６．気管：気管の癌は、頭部および頸部癌と多くの点で生物学的に類似することが可能であるまれな悪性であり、しばしば、そのように分類される。
【００２４】
ＨＮＳＣＣ’ｓの患者の治療方法は、病気の位置、段階および患者の全体的な健康状態次第である。外科的な切除および放射線治療は、大半の頭部および頸部癌の治療の主力であるとともに、大半の場合、標準的治療のままである。放射線治療のみが行われている、切除不可能なおよび／または手術不可能な、局所的に進行した頭部および頸部癌の患者が得る不満足な結果から、化学療法−放射線治療の併用が研究されている。
【００２５】
本発明で用いられるＣＤＫ阻害剤は、以下の式Iによって表わされる化合物から選択される。
【００２６】
【化１】
0005730288.tif 000002
ここで、Ａｒは、置換されていないか、または、塩素、臭素、フッ素またはヨウ素から選択されるハロゲン基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１〜Ｃ４のアルキル基、トリフルオロメチル基、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ４のアルコキシ基、カルボキシ基、Ｃ１〜Ｃ４のアルコキシカルボニル基、ＣＯＮＨ２基、および、Ｒ１およびＲ２が水素またはＣ１〜Ｃ４のアルキル基から各々独立して選択されるＮＲ１Ｒ２基から選択される１、２、または３の同一もしくは異なる置換基によって置換されているフェニル基群である。
【００２７】
一の態様では、ＣＤＫ阻害剤は、以下の式IAで示されるような、式Iの化合物の（＋）−トランス異性体である。
【００２８】
【化２】
0005730288.tif 000003
ここで、Ａｒは、置換されていないか、または、塩素、臭素、フッ素またはヨウ素から選択されるハロゲン基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１〜Ｃ４のアルキル基、トリフルオロメチル基、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ４のアルコキシ基、カルボキシ基、Ｃ１〜Ｃ４のアルコキシカルボニル基、ＣＯＮＨ２基、および、Ｒ１およびＲ２が水素またはＣ１〜Ｃ４のアルキル基から各々独立して選択されるＮＲ１Ｒ２基から選択される１、２、または３の同一もしくは異なる置換基によって置換されているフェニル基群である。
【００２９】
式Iの化合物は、参照としてここに組み入れられている、ＰＣＴ特許公報番号  ＷＯ２００４００４６３２およびＰＣＴ特許公報番号  ＷＯ２００７１４８１５８に開示された方法によって調合される可能性がある。次のスキーム１で記載された方法は、式（VIA）の中間物を調合するために用いられうる。
【００３０】
【化３】
0005730288.tif 000004
【００３１】
式（II）の化合物から始まる式Vの化合物への調合ステップは、参照としてここに組み入れられている、ＵＳ４９００７２７に記載されている。１−メチル−４−ピペリドン（式IIIの化合物）が、氷酢酸中の１，３，５−トリメトキシベンゼン（式IIの化合物）の溶液と反応させられることによって、１−メチル−４−（２，４，６−トリメトキシフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（式IVの化合物）が産出する。式IVの化合物は、式Vの化合物を得るために、ボロントリフルオリドジエチルエーテラート、水素化ホウ素ナトリウムおよびテトラヒドロフランと反応させられる。上記スキームでの式Vの化合物の式VIの化合物への変換においては、トリエチルアミン、ピリジン、炭酸カリウムまたは炭酸ナトリウムのような酸素求核剤の存在下で、ｐ−トルエンスルホニルクロリド、メタンスルホニルクロリド、トリフルオロメタンスルホン酸無水物または五塩化リンなどのような適切な試薬による処理によって、ピペリジンの環のヒドロキシル官能基が、トシル基、メシル基、トリフラートまたはハロゲン化物のような離脱基に変換される可能性があり、その後、イソプロパノール、エタノールまたはプロパノールのようなアルコール溶媒中の、酢酸ナトリウムまたは酢酸カリウムのような酸素求核剤の存在下で、環縮小が起こる。このステップで関わる環縮小は、上記スキームで記載したようなフラボンの形成前に達成されるか、または、望ましい置換を有するフラボンの形成後に行われてもよい。
【００３２】
鏡像異性的に純粋な、式VIAに定義されている中間化合物の（−）−トランス鏡像異性体は、鏡像異性的に純粋な式Iの化合物の調合に用いられる。高い鏡像異性的な純度を有する中間体をプロセスの出発物質として用いることによって、結果物である、そのプロセスによって製造された式Iにより表わされるフラボンに置換されたピロリジンの（＋）−トランス鏡像異性体は、それに応じて、高い鏡像異性的な純度を有する。
【００３３】
光学分割された、鏡像異性的に純粋な式VIAの中間化合物の（−）−トランス鏡像異性体から、鏡像異性的に純粋な式Iの化合物の（＋）−トランス鏡像異性体、またはその薬学的に許容可能な塩を調合するためのプロセスは、以下のステップを備えている。
【００３４】
（ａ）光学分割された、鏡像異性的に純粋な式VIAの中間化合物の（−）−トランス鏡像異性体
【化４】
0005730288.tif 000005
を、ルイス酸触媒の存在下で、無水酢酸により処理することによって、光学分割され、かつ、アセチル化された式VIIAの化合物を得ること。
【００３５】
【化５】
0005730288.tif 000006
【００３６】
（ｂ）光学分割され、かつ、アセチル化された式VIIAの化合物を、基剤と溶媒との存在下で、Ａｒが上記したものである、式ＡｒＣＯＯＨの酸、または、式ＡｒＣＯＣｌの酸塩化物、または、式（ＡｒＣＯ）２Ｏの酸無水物、または、式ＡｒＣＯＯＣＨ３のエステルと反応させることによって、光学分割された式VIIIAの化合物を得ること。
【００３７】
【化６】
0005730288.tif 000007
【００３８】
（ｃ）光学分割された式VIIIAの化合物を、適切な溶媒内で基剤により処理することによって、それに応じて光学分割された式IXAのβ−ジケトン化合物を得ること。
【００３９】
【化７】
0005730288.tif 000008
ここで、Ａｒは上記したものである。
【００４０】
（ｄ）光学分割された式IXAのβ−ジケトン化合物を塩酸のような酸により処理することによって、それに応じて環化した式XAの化合物を得ること。
【００４１】
【化８】
0005730288.tif 000009
【００４２】
（ｅ）式XAの化合物を、脱アルキル化物質と共に１２０〜１８０℃の範囲の温度で熱して脱アルキル化することによって、式Iの化合物の（＋）−トランス鏡像異性体を得ること、および、任意に、主な化合物をその薬学的に許容可能な塩に変換すること。
【００４３】
上記ステップ（ａ）で用いられるルイス酸触媒は、ＢＦ３、Ｅｔ２Ｏ、塩化亜鉛、塩化アルミニウムおよび塩化チタンから選択されうる。
【００４４】
上記プロセスステップ（ｂ）で用いられる基剤は、トリエチルアミン、ピリジンおよびＤＣＣ−ＤＭＡＰ組み合わせ（Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドと４−ジメチルアミノピリジンとの組み合わせ）から選択されうる。
【００４５】
式VIIIAの化合物からそれに応じた式IXAのβ−ジケトン化合物への転位が、ベーカー・ベンカタラマン転位として知られていることは、技術分野に精通した当業者にとって明らかであろう（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．,１３８１（１９３３）およびＣｕｒｒ．Ｓｃｉ．,４,２１４（１９３３））。
【００４６】
上記プロセスステップ（ｃ）で用いられる基剤は、リチウムヘキサメチルジシラジド、ナトリウムヘキサメチルジシラジド、カリウムヘキサメチルジシラジド、水素化ナトリウムおよび水素化カリウムから選択されうる。好ましい基剤は、リチウムヘキサメチルジシラジドである。
【００４７】
上記プロセスステップ（ｅ）で用いられる、式IXAの化合物の脱アルキル化のための脱アルキル化物質は、ピリジン塩酸塩、三臭化ホウ素、三フッ化ホウ素エーテラートおよび三塩化アルミニウムから選択されうる。好ましい脱アルキル化物質は、ピリジン塩酸塩である。
【００４８】
一の態様では、ＣＤＫ阻害剤は式Iの化合物であり、フェニル基群が塩素、臭素、フッ素またはヨウ素のようなハロゲン基、Ｃ１〜Ｃ４のアルキル基またはトリフルオロメチル基から選択される１、２、もしくは３の同一もしくは異なる置換基によって置換されている。
【００４９】
別な態様では、ＣＤＫ阻害剤は式Iの化合物であり、フェニル基群が塩素、臭素、フッ素またはヨウ素から選択される１、２、もしくは３のハロゲン基によって置換されている。
【００５０】
別な態様では、ＣＤＫ阻害剤は式Iの化合物であり、フェニル基群が塩素によって置換されている。
【００５１】
薬学的に許容可能な塩および溶媒和物の形で存在する可能性がある、式Iの化合物の製造、および、上記化合物を含有する経口、および／または、非経口の医薬組成物の製造は、ＰＣＴ特許公報番号  ＷＯ２００４００４６３２およびＰＣＴ特許公報番号  ＷＯ２００７１４８１５８に開示されている。これらのＰＣＴ特許公報は、式Iで表されるＣＤＫ阻害剤が多くの癌細胞の増殖を阻害することを開示する。上記に示されているように、式IのＣＤＫ阻害剤は、それらの塩または溶媒和物の形で用いられてもよい。好ましい式Iの化合物の塩には、塩酸塩、メタンスルホン酸塩およびトリフルオロ酢酸塩が含まれる。
【００５２】
式Iの化合物は、少なくとも２つのキラル中心を含み、それゆえに、２つの異なる光学異性体の形状（たとえば、（＋）または（−）の鏡像異性体）が存在する。ラセミ混合物を含む、それら鏡像異性体およびその混合物の全ては、発明の範囲内に含まれている。式Iの化合物の鏡像異性体は、上記したような、ＰＣＴ特許公報番号  ＷＯ２００４００４６３２、ＷＯ２００８００７１６９およびＷＯ２００７１４８１５８に開示された方法によって、得られることが可能である。または、式Iの化合物の鏡像異性体は、キラルＨＰＬＣや酵素分割のような、その技術分野においてよく知られた方法によっても、得られることが可能である。あるいは、式Iの化合物の鏡像異性体は、光学的に活性な出発物質を用いることによって合成されることが可能である。したがって、式IのＣＤＫ阻害剤の定義には、すべての可能な立体異性体とその混合物とが含まれている。式Iの定義には、ラセミ体と、特定の活性を有する分離された光学異性体とが含まれる。
【００５３】
本発明の組み合わせで用いられる放射線は、ガンマ線照射である。一の態様では、ガンマ線照射のために用いられる線源は、コバルト−６０、イリジウム−１９２またはセシウム−１３７である。好ましい態様としては、ガンマ線照射のために用いられる線源は、コバルト−６０である。
【００５４】
一の態様では、許容可能なガンマ線照射の投与量の範囲は、１日あたり１から２５グレイ（Ｇｙ）である。
【００５５】
１つの態様では、組み合わせは放射線とＣＤＫ阻害剤とを備え、前記ＣＤＫ阻害剤は、式Iで表されるか、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物である。
【００５６】
別な態様では、組み合わせは放射線とＣＤＫ阻害剤とを備え、前記ＣＤＫ阻害剤は、式IAで表されるような、式Iの化合物の（＋）−トランス異性体、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物である。
【００５７】
さらに別な態様では、組み合わせは放射線とＣＤＫ阻害剤とを備え、前記ＣＤＫ阻害剤は、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン、またはその薬学的に許容可能な塩である。
【００５８】
１つの態様では、放射線と式IのＣＤＫ阻害剤とを備える組み合わせは、個別の投与を許可するようなものや、組み合わせの最大限の効果を得るために、同時、逐次的または一定期間の間隔をあけるものを包含している。
【００５９】
本発明の目的のために、式Iの化合物から選択されるＣＤＫ阻害剤は、たとえば、放射線より先に、後に、または、同時に投与される可能性がある。本発明のより好ましい態様では、放射線は、下記の投与量の範囲内で、式Iまたはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物のＣＤＫ阻害剤の投与よりも先に投与される。しかしながら、与えられた状況下における放射能およびＣＤＫ阻害剤の投与のための最適な方法および順序は、以下の常用技術と本明細書に含まれる情報とによって、技術分野に精通した当業者に適切に選択されうる。
【００６０】
１つの態様では、式IのＣＤＫ阻害剤は、その最適な血中濃度を発生させ、かつ、維持するために、経口または非経口のいずれかで投与される可能性がある。
【００６１】
経口で用いるために、式IのＣＤＫ阻害剤は、たとえば、錠剤もしくはカプセル、粉末、分散性顆粒、もしくはカシェ剤、または水溶液もしくは懸濁液の形で投与される可能性がある。経口で用いるための錠剤の場合、一般的に使用される担体は、ラクトース、コーンスターチ、炭酸マグネシウム、タルクおよび砂糖を含むとともに、ステアリン酸マグネシウムのような平滑剤が一般的に加えられる。カプセルの形での経口投与のための有用な担体は、ラクトース、コーンスターチ、炭酸マグネシウム、タルクおよび砂糖を含んでいる。
【００６２】
筋肉内、腹腔内、皮下および静脈内での使用のために、ＣＤＫ阻害剤の減菌溶液が通常採用されるとともに、その溶液のｐＨは、適切に調整および緩衝させられていなくてはならない。
【００６３】
１つの態様では、本発明の組み合わせは、頭部および頸部癌、頚部癌、乳癌、肺癌（小および非小細胞肺癌ならびに肺腺癌を含む）、卵巣癌、膵臓癌（膵外分泌性癌を含む）、胃癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、多発性骨髄腫、マントル細胞リンパ腫および悪性黒色腫からなる群から選択される癌の治療に用いられる。
【００６４】
より好ましい態様では、本発明の組み合わせは、頭部および頸部癌の治療に用いられる。
【００６５】
一の態様では、本発明の組み合わせは、治療上の相乗効果を示す。
【００６６】
別な態様では、本発明は、癌の治療のための方法に関し、その方法は、そのような治療を必要とする被験者に、組み合わせの治療上効果的な量を投与することを備えている。それゆえ、本発明の方法では、式Iの化合物またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療上効果的な量と組み合わせて、癌を治療するために効果的な放射線の治療量を被験者に投与することによって、相乗効果が生じ、癌が被験者において治療される。
【００６７】
一の態様では、本発明は、癌の治療のための方法に関し、その方法は、そのような治療を必要とする被験者に、（式IAで表されるような）式Iの化合物の（＋）−トランス異性体またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療上効果的な量と組み合わせて、癌を治療するために効果的な放射線の治療量を投与することを備え、相乗効果が生じる。
【００６８】
別な態様では、本発明は、癌の治療のための方法に関し、その方法は、そのような治療を必要とする被験者に、ＣＤＫ阻害剤の治療上効果的な量と組み合わせて、癌を治療するために効果的な放射線の治療量を投与することを備え、前記ＣＤＫ阻害剤は、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン、またはその薬学的に許容可能な塩である。
【００６９】
一の態様では、本発明は、頭部および頸部癌、頚部癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、多発性骨髄腫、マントル細胞リンパ腫および悪性黒色腫の治療方法をもたらし、その方法は、そのような治療を必要とする被験者に、ＣＤＫ阻害剤の治療上効果的な量と組み合わせて、癌を治療するために効果的な放射線の治療量を投与することを備えている。
【００７０】
別な態様では、本発明は、頭部および頸部癌の治療方法をもたらし、その方法は、そのような治療を必要とする被験者に、ＣＤＫ阻害剤の治療上効果的な量と組み合わせて、癌を治療するために効果的な放射線の治療量を投与することを備えている。
【００７１】
ここで前述したように、放射線とＣＤＫ阻害剤とは、同時または逐次的に投与されることが可能である。
【００７２】
１つの態様では、癌の治療方法は、そのような治療を必要とする被験者に、ＣＤＫ阻害剤の治療量と同時に、放射線の治療量を投与することを備えている。
【００７３】
別な態様では、癌の治療方法は、そのような治療を必要とする被験者に、放射線の治療量およびＣＤＫ阻害剤の治療量の逐次的投与を含んでいる。
【００７４】
別な態様では、癌の治療方法は、そのような治療を必要とする被験者に、ＣＤＫ阻害剤の投与よりも先に放射線の治療量の投与を含んでいる。
【００７５】
１つの態様では、本発明は、頭部および頸部癌、頚部癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、多発性骨髄腫、マントル細胞リンパ腫および悪性黒色腫の治療のための放射線治療の効果を増大する放射線増感剤としての、式Iの化合物またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物によって表わされる、ＣＤＫ阻害剤の使用に関する。
【００７６】
別な態様では、本発明は、頭部および頸部癌、頚部癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、多発性骨髄腫、マントル細胞リンパ腫および悪性黒色腫の治療のための放射線治療の効果を増大する放射線増感剤としての、式Iの化合物の（＋）−トランス異性体またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物から選択される、ＣＤＫ阻害剤の使用に関する。
【００７７】
別な態様では、本発明は、頭部および頸部癌、頚部癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、多発性骨髄腫、マントル細胞リンパ腫および悪性黒色腫の治療のための放射線治療の効果を増大する放射線増感剤としての、ＣＤＫ阻害剤の使用に関し、前記ＣＤＫ阻害剤は、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オンまたはその薬学的に許容可能な塩である。
【００７８】
さらに別な態様では、本発明は、頭部および頸部癌の治療のための放射線治療の効果を増大する放射線増感剤としての、式IのＣＤＫ阻害剤の使用に関する。
【００７９】
１つの態様では、本発明は、頭部および頸部癌、頚部癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、多発性骨髄腫、マントル細胞リンパ腫および悪性黒色腫の治療のための放射線治療の効果を増大するための物質（または医薬）を調合するための、式IのＣＤＫ阻害剤の使用に関する。
【００８０】
より好ましい態様では、本発明は、頭部および頸部癌の治療のための放射線治療の効果を増大させるための物質（または薬剤）を調合するための、式Iの前記ＣＤＫ阻害剤の使用に関する。
【００８１】
１つの態様では、本発明の組み合わせは、頭部および頸部癌、頚部癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、多発性骨髄腫、マントル細胞リンパ腫および悪性黒色腫の治療のためであり、放射線治療に用いられる前記ＣＤＫ阻害剤を備える医薬である。
【００８２】
より好ましい態様では、本発明の組み合わせは、頭部および頸部癌の治療のためであり、放射線治療に用いられる式IのＣＤＫ阻害剤を備える医薬である。
【００８３】
その組み合わせに含有される活性成分の実際の投与量は、患者の要求および治療されている状態の重大性次第で変えられる可能性がある。特定の状況のための適切な投与量の決定は、技術分野の能力の範囲内である。一般的に、治療は、化合物の最適な投与量よりも少ない、より少ない投与量から始められる。その後、各々の成分の投与量は、その状況下で最適な効果に到達するまで少量ずつ増加される。しかしながら、組み合わせ内の各々の成分の量は、通常は、単独で投与された場合に治療上の効果を生じるだろう量よりも少なくなるだろう。より好ましい態様では、ガンマ線照射は、１から２５Ｇｙ／日の範囲、好ましくは、１から１０Ｇｙ／日の範囲内で相乗的に効果的な量投与されるとともに、ＣＤＫ阻害剤は、５ｍｇから７５０ｍｇの範囲、好ましくは、１００ｍｇから５００ｍｇの範囲内で、相乗的に効果的な投与量投与されるように、ガンマ線照射および式Iの化合物またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物によって表わされるＣＤＫ阻害剤は、逐次的に投与される。
【００８４】
ガンマ線照射または式IのＣＤＫ阻害剤の選択された投与量レベルは、用いられるＣＤＫ阻害剤の活性、投与のその経路、投与の時間、用いられるＣＤＫ阻害剤の排出割合、治療の持続時間、その他の薬物、用いられるＣＤＫ阻害剤と組み合わせて用いられる化合物および／または材料、治療される癌の型および段階、年齢、性別、体重、状態、全体的な健康、および、治療される患者の以前の病歴、ならびに、医学分野でよく知られた因子のようなものを含む様々な因子次第だろう。
【００８５】
この発明によってもたらされる組み合わせは、ある検定システムや、イン・ビトロのいくつかの異なる投与計画により評価されている。実験の詳細は、ここの以下に記載されている。ここに示されたデータは、明らかに、放射線は、式IのＣＤＫ阻害剤と組み合わされた際に、相乗的な効果を示すことを示している。化合物Ａとしてここで設計された式Iの代表的化合物であるＣＤＫ阻害剤が、頭部および頸部の癌細胞に対するイン・ビトロの分析において、相乗的に放射線の細胞毒性を増大させたことを、表１〜４に記載されたデータから明らかに観察することが可能である。
【００８６】
代表的化合物であり、薬理検定で用いられる化合物Ａは、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩に関するとともに、参照としてここに組み入れられている、発行されたＰＣＴ特許公報番号  ＷＯ２００４００４６３２およびＷＯ２００７１４８１５８内に開示された化合物の１つであった。本発明のガンマ線照射とＣＤＫ阻害剤との組み合わせの相乗的な効果は、現在、その好ましい態様を参照して、より詳細に説明されている。これらは単なる例として示されているだけであって、発明を限定する意図はないことに注意すべきである。例１から１０は、化合物Ａ（例１０の化合物）の合成について示しており、例１１および１２は、イン・ビトロにおける化合物Ａと放射線治療との組み合わせの研究を示している。例１３は、イン・ビボでの実施要綱を示しており、例１４は、臨床における実施要綱を示している。
【００８７】
次の略語および用語がここにおいて用いられている。：
ＡＴＣＣ：      アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関
ＢＦ３：        三フッ化ホウ素
ＣＨＣｌ３：    クロロホルム
ＣＯ２：        二酸化炭素
ＤＢＴＡ：      ジベンゾイル酒石酸
ＤＭＳＯ：      ジメチルスルホキシド
ＥｔＯＡｃ：    酢酸エチル
Ｇｙ：          グレイ
ＨＣｌ：        塩酸
ＩＰＡ：        イソプロピルアルコール
ＫＢｒ：        臭化カリウム
ＭｅＯＨ：      メタノール
ＭＴＴ：        ３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド
Ｎａ２ＣＯ３：    炭酸ナトリウム
Ｎａ２ＳＯ４：    硫酸ナトリウム
ＮａＢＨ４：      水素化ホウ素ナトリウム
ＮａＯＨ：      水酸化ナトリウム
ＴＦＡ：        トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：        テトラヒドロフラン
【実施例】
【００８８】
例１：
１−メチル−４−（２，４，６−トリメトキシフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリジンの調合
【００８９】
反応混合物の温度を４０℃以下に維持した状態で、１−メチル−４−ピペリドン（３４０ｇ,３．０ｍｏｌ）は、氷酢酸（６００ｍＬ）中の１，３，５−トリメトキシベンゼン（５００ｇ,２．９７ｍｏｌ）の溶液に徐々に加えられた。濃ＨＣｌ（４５０ｍＬ）が、２０分間に亘って加えられた。温度は８５〜９０℃に上昇し、そして反応混合物は３．５時間攪拌された。粉砕された氷（４ｋｇ）が投入されて２０分間攪拌されることによって、４０℃まで冷却された。未反応の１，３，５−トリメトキシベンゼンの沈殿物がろ過により取り除かれた。ろ過液は、１０℃以下で５０％のＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨ１１〜１２にまで塩基性化された。得られたオフホワイトの固体は、化合物、１−メチル−４−（２，４，６−トリメトキシ−フェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリジンを得るために、ろ過され、水で洗浄され、乾燥された。
【００９０】
収率：５８０ｇ（７４％）；融点：１１２〜１１４℃；ＩＲ（ＫＢｒ）：３０４５,２９００,２８３７,１６００,１５８５ｃｍ−１；１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３,３００ＭＨｚ）：δ６．１５（ｓ,２Ｈ）,５．５５（ｓ,１Ｈ）,３．８５（ｓ,３Ｈ）,３．７５（ｓ,６Ｈ）,３．１０（ｄ,２Ｈ）,２．５５（ｔ,２Ｈ）,２．４０（ｓ,３Ｈ）,２．３５（ｍ,２Ｈ）；ＭＳ（ＥＩ）：ｍ／ｚ２６３（Ｍ＋）。
【００９１】
例２：
（±）−トランス−１−メチル−４−（２，４，６−トリメトキシフェニル）−ピペリジン−３−オルの調合
【００９２】
窒素雰囲気下で、かつ、０℃で、三フッ化ホウ素ジエチルエーテレート（３００ｍＬ,２．３６ｍｏｌ）は、ドライＴＨＦ（２．５５Ｌ）中の例（１）の化合物（３００ｇ,１．１４ｍｏｌ）とＮａＢＨ４（７５ｇ,１．９７ｍｏｌ）との溶液に、攪拌されながら徐々に加えられた。反応混合物の温度は、徐々に５５℃まで上昇し、そして、１．５時間攪拌された。それは３０℃まで冷却された。氷冷却水（１００ｍＬ）が徐々に加えられて、その後、濃ＨＣｌ（３７５ｍＬ）によって酸性化された。反応混合物は５０〜５５℃で１時間攪拌された。それは３０℃まで冷却され、５０％のＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨ１１〜１２にまで塩基化された。過酸化水素（３０％,２２５ｍＬ）が０．５時間に亘って加えられた。その反応混合物は５５〜６０℃で１．５時間攪拌された。それは３０℃まで冷却され、沈殿した塩を溶解するために十分な水が加えられた。有機層は分離され、そして水の部分は酢酸エチル（２×１Ｌ）によって抽出された。有機抽出液は乾燥されて（無水Ｎａ２ＳＯ４）そして濃縮された。得られた粗製粘性褐色オイルは、４Ｎ  ＨＣｌ（１．２Ｌ）によって処理され、酢酸エチル（２×５００ｍＬ）によって抽出された。水の部分は、冷却され、５０％の水酸化ナトリウム水溶液を用いて塩基化され、そして酢酸エチル（２×１Ｌ）を用いて抽出された。有機抽出液は、化合物、（±）−トランス−１−メチル−４−（２，４，６−トリメトキシ−フェニル）−ピペリジン−３−オルを与えるために、乾燥されて（無水Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮された。
【００９３】
収率：２１０ｇ（６５．６％）；融点：９６〜９７℃；ＩＲ（ＫＢｒ）：３５８２,３３７４,３０１７ｃｍ−１；１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３,３００ＭＨｚ）：δ６．１５（ｓ,２Ｈ）,４．４０（ｍ,１Ｈ）,３．７９（ｓ,３Ｈ）,３．７４（ｓ,６Ｈ）,３．２０（ｄｄ,１Ｈ）,３．００（ｍ,１Ｈ）,２．８０（ｍ,１Ｈ）,２．４０（ｍ,１Ｈ）,２．３７（ｓ,３Ｈ）,２．００（ｍ,１Ｈ）,１．９０（ｔ,１Ｈ）,１．５２（ｍ,１Ｈ）；ＭＳ（ＣＩ）：ｍ／ｚ２８２（Ｍ＋１）。
【００９４】
例３：
（±）−トランス−酢酸−１−メチル−３−（２，４，６−トリメトキシフェニル）−ピロリジン−２−イルメチルエステルの調合
【００９５】
メタンスルホニルクロリド（３０．２７ｍＬ,４４．８ｇ,０．４ｍｏｌ）が、ドライＴＨＦ（１．０Ｌ）中の例（２）の化合物（１００ｇ,０．３５ｍｏｌ）とトリエチルアミン（７１．８８ｇ,０．７ｍｏｌ）との冷却および攪拌された溶液に、滴下によって加えられた。反応混合物は、０℃でさらに４５分間攪拌された。塩酸トリエチルアミンの沈殿物は、ろ過され、ドライＴＨＦ（２×１００ｍＬ）によって洗浄された。ろ過液は、２−プロパノール（１．０Ｌ）中の酢酸ナトリウム（１１５ｇ,１．４０ｍｏｌ）の還流された懸濁液に、滴下によって加えられた。反応混合物は、さらに１５分間還流され、ＥｔＯＡｃ（１．０Ｌ）によって希釈され、塩がろ過された。塩の混合物は、ＥｔＯＡｃ（２×１００ｍＬ）によって洗浄された。組み合わされた、ろ過液は、濃縮されて粘性物質になった。ろ過された固体を得るために、水（５０ｍＬ）が攪拌されながら粘性物質に加えられ、そして化合物、（±）−トランス−酢酸  １−メチル−３−（２，４，６−トリメトキシ−フェニル）−ピロリジン−２−イルメチルエステルを産出するために乾燥された。
【００９６】
収率：９０ｇ（８１％）；融点：７４〜７７℃；１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３,３００ＭＨｚ）：δ６．１３（ｓ,２Ｈ）,４．００（ｍ,２Ｈ）,３．８１（ｍ,１Ｈ）,３．７９（ｓ,３Ｈ）,３．７６（ｓ,６Ｈ）,３．２０（ｍ,１Ｈ）,２．７５（ｍ,１Ｈ）,２．６９（ｍ,１Ｈ）,２．４７（ｓ,３Ｈ）,２．００（ｍ,２Ｈ）,１．９９（ｓ,３Ｈ）。
【００９７】
例４：
（±）−トランス−［１−メチル−３−（２，４，６−トリメトキシフェニル）−ピロリジン−２−イル］−メタノールの調合
【００９８】
１０％のＮａＯＨ水溶液（５９６ｍＬ）が、メタノール（５９６ｍＬ）中の例（３）の化合物（２４１ｇ,０．７５ｍｏｌ）の溶液に加えられた。反応混合物は５０℃で４５分間攪拌された。それは濃縮されて粘性物質になり、その後、氷冷却水（２Ｌ）中に注ぎ込まれた。結果としての固体は、化合物、（±）−トランス−［１−メチル−３−（２，４，６−トリメトキシ−フェニル）−ピロリジン−２−イル］−メタノールを得るためにろ過された。
【００９９】
収率：１９８ｇ（９４％）；融点：８２〜８５℃；ＩＲ（ＫＢｒ）：３４２１,３００９,１６０７ｃｍ−１；１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３,３００ＭＨｚ）：δ６．１５（ｓ,２Ｈ）,３．９２（ｍ,１Ｈ）,３．８０（ｓ,９Ｈ）,３．６０（ｄｄ,１Ｈ）,３．４５（ｄ,１Ｈ）,３．２０（ｍ,１Ｈ）,２．７８（ｍ,１Ｈ）,２．５０（ｍ,１Ｈ）,２．４２（ｓ,３Ｈ）,２．００（ｍ,１Ｈ）,１．９２（ｍ,１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ２８２（Ｍ＋１）。
【０１００】
例５：
（−）−トランス−［１−メチル−３−（２，４，６−トリメトキシフェニル）−ピロリジン−２−イル］−メタノールの調合
【０１０１】
（−）−ＤＢＴＡ（３２１．７ｇ,８９７．７ｍｍｏｌ）が、例（４）の化合物（２５０ｇ,８８９．６ｍｍｏｌ）に加えられ、メタノール（１７１５ｍＬ）が追加された。混合物は１０分間還流され、室温で３時間徐々に攪拌された。結晶化した塩がろ過され、そして乾燥された。
【０１０２】
収率：１８５ｇ（３０％）；融点：１０２〜１０５℃；［α］Ｄ２５＝−８２．６６°（ｃ＝０．７,メタノール）。
【０１０３】
塩が１０％のＮａ２ＣＯ３水溶液（７６５ｍｍｏｌ）およびＥｔＯＡｃ（２００×３ｍＬ）と共に攪拌されることによって、ＥｔＯＡｃ層内に遊離塩基を得た。化合物、（−）−トランス−［１−メチル−３−（２，４，６−トリメトキシ−フェニル）−ピロリジン−２−イル］−メタノールを得るために、ＥｔＯＡｃ層が濃縮された。
【０１０４】
収率：８０ｇ（９８．３％）；［α］Ｄ２５＝−２０．０°（ｃ＝０．７,メタノール）；１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３,３００ＭＨｚ）：δ６．１３（ｓ,２Ｈ）,３．９０（ｍ,１Ｈ）,３．７９（ｓ,９Ｈ）,３．５７（ｄｄ,１Ｈ）,３．３８（ｄ,１Ｈ）,３．１３（ｍ,１Ｈ）,２．６９（ｍ,１Ｈ）,２．４７（ｍ,１Ｈ）,２．３４（ｓ,３Ｈ）,２．００（ｍ,１Ｈ）,１．９３（ｍ,１Ｈ）。
【０１０５】
この化合物はキラルＨＰＬＣに供された。キラルＨＰＬＣは、カラム  Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＤ−Ｈ（２５０×４．６ｍｍ）と、ＴＦＡ（０．４％）を含むハキサン：エタノール（９２：０８）の溶媒系とを用いて行われた。結果は、１ｍＬ／分の溶媒流量により２６４ｎｍで記録された。図１に示すように、キラルＨＰＬＣは、化合物、（−）−トランス−［１−メチル−３−（２，４，６−トリメトキシ−フェニル）−ピロリジン−２−イル］−メタノールの１００％の鏡像体過剰率を示した。
【０１０６】
例６：
（−）−トランス−酢酸−３−（３−アセチル−２−ヒドロキシ−４，６−ジメトキシフェニル）−１−メチル−ピロリジン−２−イルメチルエステルの調合
【０１０７】
０℃で、かつ、窒素雰囲気下で、ＢＦ３−エーテラート（２５．２ｇ,１７８ｍｍｏｌ）が攪拌されながら、無水酢酸（１９．４８ｍＬ,１７６ｍｍｏｌ）中の例（５）の化合物（１０ｇ,３５．５８ｍｍｏｌ）の溶液に、滴下によって加えられた。反応混合物は室温で２時間攪拌された。それに粉砕された氷（１ｋｇ）が投入され、飽和Ｎａ２ＣＯ３水溶液を用いて塩基化され、そしてＥｔＯＡｃ（３×２００ｍＬ）を用いて抽出された。有機抽出液は、化合物、（−）−トランス−酢酸  ３−（３−アセチル−２−ヒドロキシ−４，６−ジメトキシ−フェニル）−１−メチル−ピロリジン−２−イルメチルエステルを得るために、塩水によって洗浄され、乾燥され（無水Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮された。
【０１０８】
収率：１０ｇ（８３％）；１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３,３００ＭＨｚ）：δ１４．２０（ｓ,１Ｈ）,５．９６（ｓ,１Ｈ）,４．１０（ｄ,２Ｈ）,３．９０（ｓ,３Ｈ）,３．８９（ｓ,３Ｈ）,３．８５（ｍ,１Ｈ）,３．２６（ｍ,１Ｈ）,２．８２（ｍ,１Ｈ）,２．７４（ｍ,１Ｈ）,２．６６（ｓ,３Ｈ）,２．５２（ｓ,３Ｈ）,２．２１（ｍ,２Ｈ）,２．１０（ｓ,３Ｈ）。
【０１０９】
例７：
（−）−トランス−１−[２−ヒドロキシ−３−（２−ヒドロキシメチル−１−メチルピロリジン−３−イル）−４，６−ジメトキシフェニル）−エタノンの調合
【０１１０】
室温で、メタノール（２５ｍＬ）中の例（６）の化合物（１０ｇ,２８．４ｍｍｏｌ）の溶液に、１０％のＮａＯＨ水溶液（２５ｍＬ）が攪拌されながら加えられた。反応混合物の温度は、４５分の間に５０℃まで上昇した。それは室温まで冷却されて、濃ＨＣｌを用いて酸性化され、そしてメタノールを除去することによって濃縮された。それは飽和Ｎａ２ＣＯ３水溶液を用いて塩基性化された。化合物、（−）−トランス−１−[２−ヒドロキシ−３−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−４，６−ジメトキシ−フェニル）−エタノンは、ろ過され、水によって洗浄されて、そして乾燥された。
【０１１１】
収率：７．１４ｇ（８２％）；ＩＲ（ＫＢｒ）：３４００,３１２１,３００１,１６２９,１５９０ｃｍ−１；
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３,３００ＭＨｚ）：δ５．９６（ｓ,１Ｈ）,３．９３（ｍ,１Ｈ）,３．９０（ｓ,３Ｈ）,３．８８（ｓ,３Ｈ）,３．５９（ｄｄ,１Ｈ）,３．３７（ｄ,１Ｈ）,３．１３（ｍ,１Ｈ）,２．７５（ｍ,１Ｈ）,２．６１（ｓ,３Ｈ）,２．５９（ｍ,１Ｈ）,２．３７（ｓ,３Ｈ）,２．００（ｍ,２Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ３１０（Ｍ＋１）。
【０１１２】
例８：
（＋）−トランス−２−（２−クロロフェニル）−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチルピロリジン−３−イル）−５，７−ジメトキシ−クロメン−４−オンの調合
【０１１３】
０℃で、かつ、窒素雰囲気下で、水素化ナトリウム（５０％,０．５４ｇ,１１．２５ｍｍｏｌ）が、乾燥ＤＭＦ（１５ｍＬ）中の例（７）の化合物（０．７ｇ,２．２ｍｍｏｌ）の溶液に一部ごとに攪拌されながら加えられた。１０分後、メチル−２−クロロベンゾアート（１．１５ｇ,６．７５ｍｍｏｌ）が加えられた。反応混合物は２５℃で２時間攪拌された。メタノールが２０℃以下で慎重に加えられた。反応混合物に粉砕された氷（３００ｇ）が投入され、１：１ＨＣｌ（ｐＨ２）とともに酸性化され、そしてＥｔＯＡｃ（２×１００ｍＬ）を用いて抽出された。水層は、飽和Ｎａ２ＣＯ３水溶液（ｐＨ１０）を用いて塩基性化され、ＣＨＣｌ３（３×２００ｍＬ）を用いて抽出された。有機層は、乾燥され（無水Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮された。残留物に濃ＨＣｌ（２５ｍＬ）が加えられ、室温で２時間攪拌された。反応混合物に粉砕された氷（３００ｇ）が投入され、飽和Ｎａ２ＣＯ３水溶液を用いて塩基性にされた。混合物はＣＨＣｌ３（３×２００ｍＬ）を用いて抽出された。有機抽出物は、化合物、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−５，７−ジメトキシ−クロメン−４−オンを得るために、水によって洗浄され、乾燥され（無水Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮された。
【０１１４】
収率：０．６７ｇ（６４％）；融点：９１〜９３℃；［α］Ｄ２５＝＋５．８°（ｃ＝０．７,メタノール）；
ＩＲ（ＫＢｒ）：３４３１,１６４８,１５９８,１５７１ｃｍ−１；１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３,３００ＭＨｚ）：δ７．７０（ｄｄ,１Ｈ）,７．５２（ｍ,１Ｈ）,７．４５（ｍ,２Ｈ）,６．５０（ｓ,１Ｈ）,６．４４（ｓ,１Ｈ）,４．１７（ｍ,１Ｈ）,４．００（ｓ,３Ｈ）,３．９７（ｓ,３Ｈ）,３．６４（ｄｄ,１Ｈ）,３．４０（ｄ,１Ｈ）,３．１５（ｍ,１Ｈ）,２．７４（ｄ,１Ｈ）,２．５２（ｍ,１Ｈ）,２．３２（ｓ,３Ｈ）,２．００（ｍ,２Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ４３０（Ｍ＋１）。
【０１１５】
例９：
（＋）−トランス−２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オンの調合
【０１１６】
溶融ピリジン塩酸塩（４．１ｇ,３５．６ｍｍｏｌ）が例（８）の化合物（０．４ｇ,０．９ｍｍｏｌ）に加えられ、１．５時間、１８０℃に熱せられた。反応混合物は、２５℃まで冷却され、ＭｅＯＨ（１０ｍL）によって希釈され、そしてＮａ２ＣＯ３を用いてｐＨ１０に塩基性化された。混合物はろ過され、そして有機層が濃縮された。残留物は、化合物、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オンを得るために、水（５ｍＬ）の中に懸濁され、３０分間攪拌され、ろ過され、乾燥された。
【０１１７】
収率：０．２５ｇ（７０％）；ＩＲ（ＫＢｒ）：３４２２,３１３５,１６６４,１６２３,１５５９ｃｍ−１；
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３,３００ＭＨｚ）：δ７．５６（ｄ,１Ｈ）,７．３６（ｍ,３Ｈ）,６．３６（ｓ,１Ｈ）,６．２０（ｓ,１Ｈ）,４．０２（ｍ,１Ｈ）,３．７０（ｍ,２Ｈ）,３．１５（ｍ,２Ｈ）,２．８８（ｍ,１Ｈ）,２．５８（ｓ,３Ｈ）,２．３５（ｍ,１Ｈ）,１．８８（ｍ,１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ４０２（Ｍ＋１）；分析：Ｃ２１Ｈ２０ＣｌＮＯ５  Ｃ,６２．２４（６２．７１）；Ｈ,５．０７（４．９７）；Ｎ,３．６０（３．４８）；Ｃｌ,９．０１（８．８３）。
【０１１８】
例１０：
（＋）−トランス−２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（化合物Ａ）の調合
【０１１９】
例（９）の化合物（０．２ｇ,０．４８ｍｍｏｌ）はＩＰＡ（５ｍＬ）の中に懸濁され、３．５％ＨＣｌ（２５ｍＬ）が加えられた。懸濁液が熱せられることによって、透明な溶液が得られた。その溶液は冷却され、化合物、（＋）−トランス−２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩または化合物Ａを得るために、固体がろ過された。
【０１２０】
収率：０．２１ｇ（９７％）；融点：１８８〜１９２℃；［α］Ｄ２５＝＋２１．３°（ｃ＝０．２,メタノール）；
１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ,３００ＭＨｚ）：δ７．８０（ｄ,１Ｈ）,７．６０（ｍ,３Ｈ）,６．５３（ｓ,１Ｈ）,６．３７（ｓ,１Ｈ）,４．２３（ｍ,１Ｈ）,３．８９（ｍ,２Ｈ）,３．６３（ｍ,１Ｈ）,３．５９（ｄｄ,１Ｈ）,３．３８（ｍ,１Ｈ）,２．９０（ｓ,３Ｈ）,２．４５（ｍ,１Ｈ）,２．３５（ｍ,１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ４０２（Ｍ＋１）（遊離塩基）。
【０１２１】
この化合物はキラルＨＰＬＣに供された。キラルＨＰＬＣは、カラム  Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＤ−Ｈ（２５０×４．６ｍｍ）と、ＴＦＡ（０．４％）を含むハキサン：エタノール（９２：０８）の溶媒系とを用いて行われた。結果は、１ｍＬ／分の溶媒流量により２６４ｎｍで記録された。図３に示すように、キラルＨＰＬＣは、化合物、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシ−メチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩の１００％の鏡像体過剰率を示した。
【０１２２】
例１１：
イン・ビトロでのＭＴＳ検定
【０１２３】
その検定は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ,２００７,６（９）に記載された方法によって行われ、その開示は、その検定の教示のために参照として組み入れられている。
【０１２４】
ＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ,Ｃａｔ♯Ｇ１１１１）は、増殖、細胞毒性または化学的感受性の検定において、生存細胞の数を決定するための比色分析法において用いるための、テトラゾリウム化合物（（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム,分子内塩；ＭＴＳ）である。これは、電子カップリング試薬ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）と共に用いられる。ＭＴＳは、細胞によって生還元され、組織培養培地の中で溶解可能なホルマザンになる。４９０ｎｍでのホルマザンの吸光度は、９６ウェル検定プレートから追加の工程なしに直接的に計測されることが可能である。代謝的に活動的な細胞の中に見られるデヒドロゲナーゼ酵素は、水溶性のホルマザンへのＭＴＳの変換を成し遂げる。４９０ｎｍの吸光度で測定されるようなホルマザン生産物の量は、直接的に培養内の生存細胞の数に比例する。
【０１２５】
ＦａＤｕ（人間の頭部および頚部癌、ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）細胞の放射線感受性における化合物Ａの効果を試験する前に、化合物Ａ単独での投与量依存性の細胞毒性が、ＭＴＳ検定を用いて決定された。腫瘍細胞は、化合物Ａの様々な濃度の存在下で４８時間培養され、ＭＴＳ検定を受けた。ＦａＤｕ細胞での化合物ＡのＩＣ３０、ＩＣ５０およびＩＣ７０は、それぞれ、０．７、１．０および２μＭであると確認された。放射線単独も同様に細胞生存において投与量依存性の減少の原因となった。
【０１２６】
実施要綱
ＦａＤｕ（人間の頭部および頚部癌,ＡＴＣＣ,ＵＳＡ）細胞は、組織培養等級９６−ウェルプレート内の１８０μＬのＭＥＭ（最小必須培地）中に１５００細胞／ウェルの密度で植え付けられ、３７±１℃で、加湿された５％ＣＯ２培養器内で、２４時間成長させられた。
【０１２７】
３つの同一の細胞群が作成された。植え付け後２４時間の時間間隔の後、第１および第２の細胞群の異なるウェルが、室温で、それぞれ、２、４、６、８および１０Ｇｙにおいて放射線照射された。第２の群は、放射線照射後２４時間（すなわち、実験の３日目に）、化合物ＡのＩＣ３０の濃度でさらに処理された。第３の群は、実験の３日目に、化合物Ａ単独のＩＣ３０の濃度で処理された。
【０１２８】
どのウェルにおいても化合物ＡのＩＣ３０の濃度（０．７μＭ）を得るために、１０×ＩＣ３０の濃度（すなわち、７μＭ）の貯蔵溶液のうちの２０μＬをウェルに加え（まずＤＭＳＯに溶解させ、その後、細胞培地の中で最終的なＤＭＳＯ濃度が０．５％を超えるべきではない）、ＭＥＭによって２００μＬに希釈された。ウェルは、３７±１℃で、加湿された５％ＣＯ２培養器内で、それぞれ、４８時間および９６時間培養された。それぞれ４８時間および９６時間の終了後、培地は、すべてのウェルから取り除かれ、新たなＭＥＭが加えられ、そして、プレートが、さらに追加の４〜６日の間、または、実験の開始から合計の８〜１０日の間培養された。実験の最後に、培地が全てのウェルから取り除かれ、２０μＬのＭＴＳ（リン酸緩衝生理食塩水中に２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ６〜６．５、および、滅菌されたフィルタ）と、１μＬのＰＭＳ（ＰＢＳ中に３ｍＭ、ｐＨ７．３、および、滅菌されたフィルタ）とが、合計体積が２００μＬ／ウェルになるように、細胞培地と共に各々のウェルに加えられた。プレートは、３７±１℃で、加湿された５％ＣＯ２培養器内で、２〜４時間培養された。プレートは、分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ,Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ,ＵＳＡ）において４９０ｎＭで読まれ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘのソフトウェアであるＳｏｆｔＭａｘを用いて、百分率細胞毒性が計算された。
【０１２９】
上記実験は、化合物ＡのＩＣ５０およびＩＣ７０の濃度を用いて繰り返された。
【０１３０】
参照としてここに組み入れられている、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ,２００６,５８,６２１〜６８１に記載された、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙによるＣｏｍｐｕＳｙｎソフトウェアを用いて評価されたような、ＦａＤｕ細胞株での放射線効果の増大。組み合わせ指標（ＣＩ）は、その組み合わせが付加的、相乗的または拮抗的であるかどうかを評価するために用いられる。ＣＩ＜１は相乗的であり、ＣＩ＝１は付加的であり、ＣＩ＞１は拮抗的である。たとえば、化合物ＡのＩＣ７０の濃度による４８時間の処理では、放射線のすべての投与量において、組み合わせは相乗的（ＣＩ＝０．７）であった。双方の場合、すなわち、９６時間の処理の化合物ＡのＩＣ３０およびＩＣ５０における、組み合わせ指標は、放射線のすべての投与量において、付加的（ＣＩ＝１）であった。化合物ＡのＩＣ７０の濃度による９６時間の処理では、２、４および６Ｇｙにおいて、組み合わせは相乗的（ＣＩ＜１）であった。
【０１３１】
結果は、表１、表２および表３に示される。
【０１３２】
【表１】
0005730288.tif 000010
【０１３３】
【表２】
0005730288.tif 000011
【０１３４】
【表３】
0005730288.tif 000012
【０１３５】
結論
ＭＴＳ検定は、６、８および１０Ｇｙにおいて、放射線の後の４８時間の化合物ＡのＩＣ３０およびＩＣ５０の暴露で相乗的であったＦａＤｕ細胞株での放射線効果の増大を示した。臨床的に関連する２，４および６Ｇｙ単独の投与量においてでさえ、かなりの放射線感受性の増大が観察された。同様に、化合物ＡのＩＣ７０の濃度において、組み合わせは放射線のすべての投与量において相乗的であった。
【０１３６】
放射線感受性の増大は、化合物Ａの処理のＩＣ７０の９６時間の場合においても観察された。双方の場合、すなわち、化合物ＡのＩＣ３０およびＩＣ５０の場合の組み合わせ指標が、すべての投与量で付加的であったとしても、６Ｇｙにおいて非常に重要な放射線感受性の増大があったことが明らかに認められる。同様に、化合物ＡのＩＣ７０で、組み合わせは２、４および６Ｇｙにおいて相乗的であった。
【０１３７】
例１２：
イン・ビトロでのクローン検定
【０１３８】
その検定は、Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ,２００４,７１,２１３〜２２１に記載された方法によって行われ、その開示は、検定の教示のために参照として組み入れられている。
【０１３９】
臨床、および、放射増大能力を有する新規の物質の発展における化学放射線治療での増加する関心の結果として、放射線と化学療法の物質との相互作用に対する、臨床前の調査の需要が高まっている。クローン検定は、一般的に、イン・ビトロでの放射線研究のための最適化試験システムであると考えられている。実際、放射線感受性試験のために、テトラゾリウム（ＭＴＴ／ＭＴＳ）やスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）検定のような比色分析検定が、クローン検定に置き換えられている。しかしながら、放射線感受性試験のためには、クローン検定は、まだ、代表的な検定である。比色分析検定は、検定の短い持続時間のため、放射線の感受性を計測することに適していないと考えられている。放射線処理の後、まもなく死ぬ細胞であっても、まだ、１回またはさらなる細胞分裂を行うことが可能である。それゆえ、これらの放射線照射を受けた細胞が放射線誘発損傷を現すまでに、かなりの時間がかかる。
【０１４０】
実施要綱
指数増殖期の培養からのＦａＤｕ細胞は、トリプトン処理によって採取され、計数され、６−ウェルプレート内に１５００細胞／ウェルの細胞密度で置かれ、４つの同一の群が作成された。第１の群は処理されていないコントロール（対照）の役とした。植え付け後２４時間の第２および第３の群の異なるウェルが、室温で、それぞれ、２、４、６、８および１０Ｇｙの投与量で放射線照射された。第３の群は、放射線照射後２４時間（すなわち、実験の３日目）に、化合物ＡのＩＣ５０の濃度でさらに処理された。第４の群は、実験の３日目に、化合物Ａ単独のＩＣ５０の濃度で処理された。
【０１４１】
それぞれ、７２時間および９６時間終了後、実験の最初の日（すなわち、細胞植え付け日）から合計１２〜１４日間培養された全てのウェルおよびプレートにおいて、少なくとも５０個の細胞のコロニーを形成するのに十分な時間を細胞に与えるために、培地は変えられた。培地は吸引されて、コロニーはメタノールと酢酸とが２：１の割合で混合された混合物によって固定された。その固定手順は水ですすいだ後に繰り返された。プレートは、乾燥され、コロニーは、０．１％のクリスタル・バイオレットにより５分間着色された。ウェルは、最終的に水ですすがれ、乾燥された。コロニーは、計数され、その結果は、表４に示される。
【０１４２】
実験は、最初に、３５００細胞／ウェルを用いて行われ、かつ、１μＭの投与量の化合物Ａによる処理が、４８時間および９６時間の両方で行われた。しかしながら、コントロール（対照）内のコロニー数が多すぎて、それゆえ、コロニーを計数することができなかった。しかしながら、放射線感受性の視覚的な増大は、図１および図２に見られるように観察された。図３および図４は、ＦａＤｕ細胞株（植え付け密度：１５００細胞／プレート）の化合物Ａの１μＭの投与量での放射線感受性の視覚的な増大を示している。
【０１４３】
【表４】
0005730288.tif 000013
【０１４４】
結論
７２時間および９６時間の両方での１μＭの投与量の化合物Ａによる処理は、４および６Ｇｙの両方において、これらの細胞の放射線感受性を増大させた。
【０１４５】
例１３：
イン・ビボでの研究
【０１４６】
その検定は、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３,９，６０５２〜６０６１に記載された方法によって行われることが可能であり、その開示は、検定の教示のために参照として組み入れられている。
【０１４７】
イン・ビボでの研究は、以下に記載した方法によるＣＢｙＳｍｎ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊの種族の重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスの異種移植モデルを用いることによって行われることが可能である。群（ｎ＝６）あたりの統計的に有意なマウスの数が、研究データを統計的に評価することを可能にするために選択される。６から８週齢のＳＣＩＤマウスが用いられた。頭部および頸部癌が、３７℃で、５％ＣＯ２培養器内で、１０％のウシ胎仔血清を含むＭＥＭ培地内で培養された。細胞は、１０分間の１０００ｒｐｍでの遠心分離によって、ペレット状に形成された。細胞が生理食塩水内に再懸濁されることによって、１ｍＬあたり３０×１０６個の細胞が得られ、この細胞の懸濁液の０．２ｍＬが、ＳＣＩＤマウスの右脇腹から皮下の経路によって投入された。マウスには、毎日、触知可能な腫瘍塊が観察された。腫瘍が直径５〜１０ｍｍの大きさに達した際、動物は、薬物／放射線処理と賦形剤（生理食塩水）処理との各群に、無作為に抽出された。化合物Ａ（腹腔内）および放射線は腫瘍計測が行われるすべての日の予定通りに投与された。全期間において、すべての群の体重が記録された。腫瘍の大きさと、毒性（外部）のその他の兆候とが毎日記録された。腫瘍の重量（ｍｇ）は、偏長回転楕円体の公式：｛長さ（ｍｍ）×［幅（ｍｍ）２］×０．５｝によって見積もられる。化合物処理動物での腫瘍の成長は、Ｔ／Ｃ（処理／コントロール（対照））×１００％として算出され、成長阻害割合（ＧＩ％）は［１００−Ｔ／Ｃ％］であった。
【０１４８】
研究群の割り当て
腫瘍の大きさが直径５〜１０ｍｍの大きさに到達した際に、マウスはコントロール（対照）用および処理群に無作為に抽出された。
【０１４９】
研究計画
放射線の分割投与が用いられた。用いられた総放射線投与量は１５Ｇｙであった。
分割された放射線投与は１週間に２回、３Ｇｙであり、その後に、１８日間毎日、３５ｍｐｋ（ミリグラム／ｋｇ）の化合物Ａが続けられた。
【０１５０】
投与計画
全てのマウスには腹腔内の経路を経由してＣＤＫ阻害剤が投与された。対照（未処理）の動物には生理食塩水が投入された。処理は、研究計画で述べたように、１８日間続けられた。
【０１５１】
観察と計測
下記のパラメータが観察された。
１．  全ての動物の健康−毎日
２．  体重−毎日
３．  腫瘍計測１日おき
ミリグラムでの腫瘍の重量が、偏長回転楕円体の公式を用いて計算される。：
腫瘍の重量（ｍｇ）＝長さ（ｍｍ）×［幅（ｍｍ）２］×０．５
特定の日でのコントロール（対照物）に対する処理の比率（Ｔ／Ｃ％）は公式を用いて計算される。：
Ｘ日でのＴ／Ｃ％＝ 
腫瘍の大きさ化合物Ａｘ日目 -腫瘍の大きさ化合物Ａ０日目
×１００
対照物の腫瘍の大きさｘ日目 -対照物の腫瘍の大きさ０日目
４．  成長阻害（ＧＩ）は、Ｘ日でのＧＩ＝１００−Ｘ日でのＴ／Ｃ％、として計算される。
ＣＤＫ阻害が非常に活動的なＧＩ％≧７５％
ＣＤＫ阻害が適度に活動的なＧＩ％≧５０％
ＣＤＫ阻害が弱々しく活動的なＧＩ％＝３０〜５０％
ＣＤＫ阻害が非活動的なＧＩ％≦３０％
【０１５２】
終わりの手順
実験の終わりには、動物は、ペントバルビタールナトリウムの高い投与量（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内／静脈内）または二酸化炭素ガスの暴露を用いることによって、安楽死させた。
【０１５３】
結果
結果は表５に示される。図５は、プロットされた薬物投与の期間に亘っての平均的な群の体重を示している。図６は、１８日の期間に亘っての頭部および頸部癌（ＦａＤｕ）異種移植片の平均％腫瘍重量を示している。
【０１５４】
【表５】
0005730288.tif 000014
【０１５５】
結論
放射線と後に続く化合物Ａとの組み合わせは、人体のＦａＤｕ異種移植片モデルにおいて、放射線または化合物Ａ単独よりも有意なイン・ビボでの効果を示した。
【０１５６】
例１４：
臨床における実施要綱：
【０１５７】
臨床研究は下記の方法によって行われることが可能である。
【０１５８】
第１の目的：
頭部および頸部の、再発したおよび／または局所的に進行した、扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）の被験者での、放射線との組み合わせにおける化合物Ａの最大耐量（ＭＴＤ）と（複数の）容量制限毒性（ＤＬＴ／ｓ）とを決定すること。
【０１５９】
第２の目的：
１．研究母集団において、化合物Ａと放射線との組み合わせの投与計画の、安全性および忍容性を評価すること。
２．研究母集団において、化合物Ａの薬物動態（ＰＫ）を分析すること。そして、
３．研究母集団において、化合物Ａと放射線との組み合わせの投与計画の効果を評価すること。
【０１６０】
研究計画：
これは、頭部および頸部の、再発したおよび／または局所的に進行した、扁平上皮癌の被験者での、放射線との組み合わせにおける化合物Ａの安全性および効果を評価するための第１／第２相の非盲検試験である。約２２から２８人の被験者が研究に参加するだろうことが期待されている。
【０１６１】
第１相の構成要素では、その後で安全性評価が行われる２１日間のサイクル内で、群ごとに３人の被験者が化合物Ａと放射線とによって治療される。投与計画が第１のサイクルで耐用性があるならば、次の３人の被験者の群において、化合物Ａの投与量増加が行われる。
【０１６２】
化合物Ａの投与量の増加は以下のように進められる。：
１）３人の被験者は投与量レベル１（３０分間静脈内投入で１００ｍｇ／ｍ２／日）に入れられる。
２）３人の被験者のいずれもサイクル１の間ＤＬＴを経験しないならば、投与量の増加は計画設計の通り続けられる。
３）３人の被験者の１人が第１サイクルＤＬＴを経験するならば、最大３人の追加の被験者がこの群に加えられ（最大６人）、３人の追加の被験者のいずれもＤＬＴを経験しないならば、投与量の増加が認められる。
４）推奨される第２相の投与量（ＲＰＴＤ）が被験者の１／６以下がＤＬＴを経験した際の前回の投与量であるのと同様に、当初または拡大された群の中の２人の被験者（６人中の２人）が第１サイクルＤＬＴを経験するならば、この投与量は最大限の投与量（ＭＡＤ）およびＭＴＤとされる。臨床の効果を評価するとともに、さらに投与計画の安全性プロフィールを定義するために、第２相の構成要素において、１０人の追加の被験者がＲＰＴＤで参加させられる。
【０１６３】
第１相の構成要素としての化合物Ａの投与レベルは、以下の表６に示されている。：
【０１６４】
【表６】
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【０１６５】
被験者内の投与量増加はない。
【０１６６】
この研究（１００ｍｇ／ｍ２／日）において、化合物Ａの当初の投与量は、化合物Ａの単独物質ＲＰＴＤのおおよそ半分である。投与量計画は、ＲＰＴＤの決定のための第１相研究において用いられているようなものである。
【０１６７】
研究治療：
化合物Ａは、各々の２１日間のサイクルの中で、１日目から５日目まで３０分間に亘る５％のブドウ糖の静脈内注入と同時に、上記したような投与量で投与される。すべての被験者は、さらに、一般的な従来の分割、すなわち、１日あたり２グレイ（Ｇｙ）、週５日、６０グレイ（Ｇｙ）の総放射線投与量を用いることによって、関係領域への外部光線の放射線治療を受けている。脊髄への総放射線投与量は４６Ｇｙよりも少ない。化合物Ａと放射線治療とは、６週間、すなわち、化合物Ａの２サイクルおよび放射線の６０分割が投与される。組み合わせの投与計画の１つの２１日間のサイクルは、１日目から５日目までの化合物Ａの投与と、１日目から５日目まで、８日目から１２日目まで、および、１５日目から１９日目までの放射線治療（１日あたり２Ｇｙ）とを備えている。被験者は、病気の進行の結果（臨床的または客観的）、または、許容できない毒性で中止される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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