(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）少なくとも２０％〜７０％の植物リン脂質を含むリン脂質組成物と、脂質アシルトランスフェラーゼと、フィトステロール及び／又はフィトスタノールと、任意で水とを混合することによって、少なくとも２％ｗ／ｗの水を含む反応組成物を調製する工程、並びに
ｂ）少なくとも１つのフィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルを単離又は精製する工程
を含み、前記フィトステロール及び／又はフィトスタノールが、反応混合物全体の少なくとも１０％の量で添加される、フィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルを生産する方法。
【請求項２】
フィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルが、食料品又は食物成分と混合される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
フィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルが、薬学的な希釈剤、担体、若しくは賦形剤、又は化粧品用の希釈剤、担体、若しくは賦形剤と混合される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ａ）少なくとも２０％〜７０％の植物リン脂質を含むリン脂質組成物、ｂ）少なくとも２％の水、並びにｃ）添加されたフィトステロール及び／又はフィトスタノールを含む反応組成物中でフィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルを生産するための、脂質アシルトランスフェラーゼの使用であって、前記フィトステロール及び／又はフィトスタノールが、反応混合物全体の少なくとも１０％の量で添加される使用。
【請求項５】
フィトステロール及び／又はフィトスタノールが、
ｉ）３−β−ヒドロキシ基若しくは３−α−ヒドロキシ基、及び／又は
ii）ｃｉｓ位のＡ：Ｂ環、若しくはｔｒａｎｓ位のＡ：Ｂ環、若しくはＣ５−Ｃ６が飽和していない
という構造的特徴の１又は２以上を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法、又は請求項４に記載の使用。
【請求項６】
フィトステロールが、α−シトステロール、β−シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、カンペステロール、５，６−ジヒドロステロール、ブラシカステロール、α−スピナステロール、β−スピナステロール、γ−スピナステロール、δ−スピナステロール、フコステロール、ディモステロール、アスコステロール、セレビステロール、エピステロール、アナステロール、ハイポステロール、コンドリラステロール、デスモステロール、カリノステロール、ポリフェラステロール、クリオナステロール、ステロール配糖体、並びに他の天然又は合成の異性体及び誘導体からなる群から選択される１又は２以上である、請求項１〜３若しくは５のいずれかに記載の方法、又は請求項４若しくは５に記載の使用。
【請求項７】
リゾリン脂質もまた生産される、請求項１〜３若しくは５〜６のいずれかに記載の方法、又は請求項４〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
リゾリン脂質が精製又は単離される、請求項７に記載の方法又は使用。
【請求項９】
脂質アシルトランスフェラーゼが、ＧＤＳＸモチーフ及び／又はＧＡＮＤＹモチーフを含む、請求項１〜３若しくは５〜８のいずれかに記載の方法、或いは請求項４〜８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
脂質アシルトランスフェラーゼが、アシルトランスフェラーゼ活性を保有しアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含む酵素として特徴付けされ、前記モチーフにおいて、Ｘが、以下のアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、又はＳの１又は２以上である、請求項１〜３若しくは５〜９のいずれかに記載の方法、又は請求項４〜９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
脂質アシルトランスフェラーゼが、「アシルトランスフェラーゼ活性％を決定するためのプロトコル」を用いて試験された場合に少なくとも１５％のトランスフェラーゼ活性を有する、請求項１〜３若しくは５〜１０のいずれかに記載の方法、又は請求項４〜１０のいずれかに記載の使用であって、
前記アシルトランスフェラーゼ活性％を決定するためのプロトコルの条件が、
反応組成物の、リン脂質組成物とフィトステロール及び／又はフィトスタノールと脂質アシルトランスフェラーゼとを含む、プロトコル反応組成物を調製すること、
前記反応組成物及び前記プロトコル反応組成物の、リン脂質組成物とフィトステロール及び／又はフィトスタノールとを含み、かつ脂質アシルトランスフェラーゼを含まない、プロトコル対照組成物を調製すること、
前記プロトコル反応組成物及び前記プロトコル対照組成物の各々から有機相を抽出すること、
前記プロトコル反応組成物及び前記プロトコル対照組成物の各々において、遊離脂肪酸とステロールエステル及び／又はスタノールエステルとの量を決定すること、並びに
トランスフェラーゼ活性を、全酵素活性に対するパーセンテージとして計算することを含むものであって、
トランスフェラーゼ活性％＝Ａ×１００／（Ａ＋Δ脂肪酸％）／（Ｍｖ脂肪酸）であり、
Δ脂肪酸％＝脂肪酸（プロトコル反応組成物）％−脂肪酸（プロトコル対照組成物）％であり、
Ｍｖ脂肪酸＝前記プロトコル反応組成物及び前記プロトコル対照組成物中の脂肪酸の平均分子量であり、
Ａ＝ステロールエステル％／Ｍｖステロールエステルであり、
ステロールエステル％＝ステロールエステル及び／又はスタノールエステル％（プロトコル反応組成物）−ステロールエステル％及び／又はスタノールエステル（プロトコル対照組成物）であり、並びに
Ｍｖステロールエステル＝ステロールエステル及び／又はスタノールエステルの平均分子量である、
方法又は使用。
【請求項１２】
脂質アシルトランスフェラーゼが、バチルス・リケニフォルミスにおけるヌクレオチド配列の発現によって得られ得るポリペプチドである、請求項１〜３若しくは５〜１１のいずれかに記載の方法、又は請求項４〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
リン脂質組成物が、食用油又は食用原油の脱ガムによって得られるガム相である、請求項１〜３若しくは５〜１２のいずれかに記載の方法、又は請求項４〜１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
食用油又は食用原油の脱ガムが、化学的脱ガム、酵素的脱ガム、全脱ガム、超脱ガム、水による脱ガム、又はその２以上の組合せである、請求項１３に記載の方法又は使用。
【請求項１５】
リン脂質組成物が、酸及び／又はアルカリで食用原油又は食用油を処理する工程、並びにソーダ油さい画分を単離する工程によって得られるソーダ油さいである、請求項１〜３若しくは５〜１４のいずれかに記載の方法、或いは請求項４〜１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
アルカリが水酸化ナトリウムである、請求項１５に記載の方法又は使用。
【請求項１７】
ガム相又はソーダ油さいが、それを脂質アシルトランスフェラーゼ並びにフィトステロール及び／又はフィトスタノール、並びに任意で水と混合する前に、精製、乾燥、又は溶媒分画されるか、又はその２以上の組合せである、請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１８】
請求項１〜３若しくは５〜１７のいずれかに記載の方法、又は請求項４〜１７のいずれかに記載の使用によって得られるフィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステル、並びに任意で化粧品用の希釈剤、賦形剤、又は担体を含む、パーソナルケア組成物。
【請求項１９】
化粧品である、請求項１８に記載のパーソナルケア組成物。
【請求項２０】
少なくとも１つのフィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルを食料品及び／又は食材に添加し、それによりフィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルを含む食品を製造するステップを含む、請求項１〜３又は５〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つのフィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルをさらなるパーソナルケア製品の成分に添加し、それによりパーソナルケア製品を製造するステップを含む、請求項１〜３又は５〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
パーソナルケア製品が化粧品である、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質アシルトランスフェラーゼを用いてフィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルを生産するためのプロセスに関するものである。本発明はさらに、フィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルを生産するための脂質アシルトランスフェラーゼの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
主として、フィトステロールエステルはコレステロール低減作用を有するため、これをマヨネーズ及びマーガリンのような食品に組み込むことが定着している。フィトステロールエステル又はフィトスタノールエステルを強化した食品は、しばしば、「機能性食品」（すなわち、強化マーガリン）と呼ばれる。フィトスタノールエステル及びフィトステロールエステルはまた、パーソナルケア製品（化粧品）産業において用いられている。ステロールエステル及び／又はスタノールエステルの方が安定であるため、食物及び他の用途において、遊離ステロール又は遊離スタノールよりも、ステロールエステル及び／又はスタノールエステルを用いる方が好ましい。
【０００３】
ステロールエステル及び／又はスタノールエステルは、従来、対応するステロール／スタノール化合物を脂肪酸で化学的にエステル化することによって生産されている。ステロールエステルを調製するための酵素的手順は知られているが、典型的には、有機溶媒及び／又は分子篩を必要とする。ステロールエステル及び／又はスタノールエステルを生産するための既知の方法において、それをある用途において、特に食物の用途において用い得るようにする前に、いくつかの精製ステップが必要であることが多い。
【０００４】
消費者及び企業は、持続可能で、化学物質及び有機溶媒系を用いるステロールエステル及び／又はスタノールエステルの生産と比較して環境に優しく、且つ効率的な製品及び生産プロセスを得るべく努力している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明の１つの目的は、より持続可能で、環境に優しく、且つ効率的な、フィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルを生産するためのプロセスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の態様は、特許請求の範囲及び以下の説明において示される。
【０００７】
驚くべきことに、フィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルを生産するための有効で効果的な方法が、少なくとも約１０％〜約７０％の植物リン脂質と少なくとも約５％の水とを包含するリン脂質組成物を、アシルトランスフェラーゼ並びにフィトステロール及び／又はフィトスタノールと組み合わせることによって、水性環境で脂質アシルトランスフェラーゼを用いることによって達成され得ることが明らかになった。
【０００８】
この方法は、持続可能で、環境に優しく、且つ効率的な、フィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルを生産するためのプロセスを提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の第１の態様に従うと、
ａ）少なくとも約１０％〜約７０％の植物リン脂質を包含するリン脂質組成物と、脂質アシルトランスフェラーゼと、フィトステロール及び／又はフィトスタノールと、場合によって水とを混合することによって、少なくとも２％ｗ／ｗの水を包含する反応組成物を調製する工程、並びに
ｂ）少なくとも１つのフィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルを単離又は精製する工程
を包含する、フィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルを生産する方法が提供される。
【００１０】
本発明の別の態様に従うと、
ａ）少なくとも約１０％〜約７０％の植物リン脂質及び少なくとも約２％の水を包含するリン脂質組成物と、脂質アシルトランスフェラーゼと、フィトステロール及び／又はフィトスタノールとを混合する工程、並びに
ｂ）前記混合物から少なくとも１つのフィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルを単離又は精製する工程
を包含する、フィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルを生産する方法が提供される。
【００１１】
本発明のさらなる態様は、ａ）少なくとも約１０％〜約７０％の植物リン脂質を包含するリン脂質組成物、ｂ）少なくとも約２％の水、並びにｃ）添加されたフィトステロール及び／又はフィトスタノールを包含する反応組成物中でフィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルを生産するための、脂質アシルトランスフェラーゼの使用を提供する。
【００１２】
さらなる態様において、少なくとも約１０％〜約７０％の植物リン脂質及び少なくとも約５％の水を包含するリン脂質組成物においてフィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルを生産するための、脂質アシルトランスフェラーゼの使用が提供され、この使用において、フィトステロール及び／又はフィトスタノールが、前記リン脂質組成物に添加される。
【００１３】
本発明はさらに、別の態様において、フィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルを包含する食料品を生産する方法を提供し、この方法は、本発明の方法及び／又は使用のいずれかによって得られたフィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルを食料品及び／又は食材に添加するステップを包含する。
【００１４】
さらなる実施形態において、フィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルを包含するパーソナルケア製品（例えば、化粧品）を生産する方法が提供され、この方法は、本発明の方法及び／又は使用のいずれかによって得られたフィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルをさらなるパーソナルケア製品（例えば、化粧品）の構成物に添加するステップを包含する。
【００１５】
本発明の別の態様は、本発明の方法及び／又は使用のいずれかによって得られたフィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルを包含する組成物を提供する。
【００１６】
本発明のさらなる態様において、本発明の方法及び／又は使用のいずれかによって得られたフィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルを包含する食料品が提供される。
【００１７】
本発明はさらに、本発明の方法及び／又は使用のいずれかによって得られるフィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルと、場合によって化粧品用の希釈剤、賦形剤、又は担体とを包含するパーソナルケア製品（例えば、化粧品）組成物を提供する。
【００１８】
好ましくは、フィトステロール及び／又はフィトスタノールは、反応組成物、混合物全体、又は組成物全体の、少なくとも５％の量で添加される。
【００１９】
１つの実施形態において、好ましくは、フィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルは、食料品又は食物成分と混合される。
【００２０】
別の実施形態において、好ましくは、フィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルは、薬学的な希釈剤、担体、若しくは賦形剤、又は化粧品用の希釈剤、担体、若しくは賦形剤と混合される。
【００２１】
好ましくは、フィトステロール及び／又はフィトスタノールは、
ｉ）３−β−ヒドロキシ基若しくは３−α−ヒドロキシ基、及び／又は
ii）ｃｉｓ位のＡ：Ｂ環、若しくはｔｒａｎｓ位のＡ：Ｂ環、若しくはＣ５−Ｃ６が飽和していない
という構造的特徴の１又は２以上を包含する。
【００２２】
１つの実施形態において、好ましくは、フィトステロールは、α−シトステロール、β−シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、カンペステロール、５，６−ジヒドロステロール、ブラシカステロール、α−スピナステロール、β−スピナステロール、γ−スピナステロール、δ−スピナステロール、フコステロール、ディモステロール（dimosterol）、アスコステロール、セレビステロール、エピステロール、アナステロール、アベナステロール、クリオナステロール、ハイポステロール（hyposterol）、コンドリラステロール、デスモステロール、カリノステロール、ポリフェラステロール、クリオナステロール、ステロール配糖体、並びに他の天然又は合成の異性体及び誘導体の１又は２以上からなる群から選択される。
【００２３】
１つの実施形態において、好ましくは、フィトスタノールは、α−シトスタノール、β−シトスタノール、スチグマスタノール、エルゴスタノール、カンペスタノール、５，６−ジヒドロスタノール、ブラシカスタノール、α−スピナスタノール、β−スピナスタノール、γ−スピナスタノール、δ−スピナスタノール、フコスタノール、ディモスタノール（dimostanol）、アスコスタノール、セレビスタノール、エピスタノール、アナスタノール、アベナスタノール、クリオナスタノール、ハイポスタノール（hypostanol）、コンドリラスタノール、デスモスタノール、カリノスタノール、ポリフェラスタノール、クリオナスタノール、スタノール配糖体、並びに他の天然又は合成の異性体及び誘導体の１又は２以上からなる群から選択される。
【００２４】
適切には、本発明において用いるためのフィトスタノールは、ステロールの水素化から得ることができる（例えば、米国特許第６，８６６，８３７号明細書を参照されたい）。
【００２５】
１つの態様において、リン脂質組成物に添加されるか又は前記組成物と混合されるフィトステロール及び／又はフィトスタノールは、１若しくは２以上のフィトステロール、１若しくは２以上のフィトスタノール、又は少なくとも１つのフィトステロールと少なくとも１つのフィトスタノールとの混合物であり得る。
【００２６】
好ましくは、リン脂質組成物において、フィトステロール及び／又はフィトスタノールは外因性である（すなわち、天然に生じたのものではない）。言い換えると、フィトステロール及び／又はフィトスタノールは、リン脂質組成物に添加される。したがって、本明細書において用いられる「添加されたフィトステロール」又は「添加されたフィトスタノール」という用語は、フィトステロール及び／又はフィトスタノールが、リン脂質組成物内に天然に存在しない外因性のフィトステロール及び／又はフィトスタノールであることを意味する。いくつかのフィトステロール及び／又はフィトスタノールがリン脂質内に天然に存在しても、好ましくは、さらなる外因性のフィトステロール及び／又はフィトスタノールがリン脂質組成物に添加されるか又は前記組成物と混合される。適切には、１つの態様において、添加されるフィトステロール及び／又はフィトスタノールの量は、反応組成物、例えば、反応混合物及び／又は反応組成物が、植物リン脂質及びフィトステロール／フィトスタノールを１：１の比率で包含するようなものであり得る。このようにして、リン脂質もフィトステロール／フィトスタノールも、反応速度を制限するものとはならない。
【００２７】
好ましくは、フィトステロール及び／又はフィトスタノールは、反応組成物又は混合物全体又は組成物全体の少なくとも約５％（又は少なくとも約１０％、又は少なくとも約１５％、又は少なくとも約２０％）の量で添加される。
【００２８】
１つの態様において、フィトステロール及び／又はフィトスタノールは、反応組成物又は混合物全体又は組成物全体の約３０％未満、適切には約２５％未満、適切には約２１％未満の量で添加され得る。
【００２９】
１つの実施形態において、本発明の方法及び使用において用いられるフィトステロール及び／又はフィトスタノールは、例えば大豆油脱臭剤蒸留物（ＳＯＤＤ、soybean oil deodorizer distillate）などの、フィトステロール及び／又はフィトスタノールの天然源であり得る。
【００３０】
好ましくは、リゾリン脂質もまた、本発明の方法又は使用において生産される。
【００３１】
リゾリン脂質も生産される場合、好ましくは、リゾリン脂質は精製又は単離される。
【００３２】
本発明に従った「リン脂質組成物」は、少なくとも約１０％〜約７０％の植物リン脂質を包含する、あらゆる組成物であり得る。
【００３３】
適切には、リン脂質組成物は、１又は２以上の植物リン脂質を包含し得る。１つの実施形態において、リン脂質組成物は、２以上の、好ましくは３以上の植物リン脂質の混合物である。
【００３４】
１つの実施形態において、リン脂質組成物は、約１０％〜約６５％の、又は約１０％〜約５０％の、又は約１０％〜約４０％の植物リン脂質を包含する。
【００３５】
１つの態様において、リン脂質組成物は、少なくとも約１０％の植物リン脂質、少なくとも約２０％の植物リン脂質、又は少なくとも約３０％の植物リン脂質を包含する。
【００３６】
１つの態様において、リン脂質組成物は、最大約７０％の植物リン脂質、最大約６０％の植物リン脂質、又は最大約５０％の植物リン脂質、又は最大約４０％の植物リン脂質を包含する。
【００３７】
１つの実施形態において、本発明に従った「リン脂質組成物」は、少なくとも約１０％〜約７０％の植物リン脂質及び少なくとも約２％の水を包含する、あらゆる組成物であり得る。
【００３８】
１つの実施形態において、リン脂質組成物は、少なくとも５％の水、又は少なくとも１０％の水、又は少なくとも２０％の水を包含し得る。
【００３９】
１つの態様において、リン脂質組成物は、最大３０％の水、又は最大４０％の水、又は最大５０％の水を包含し得る。
【００４０】
リン脂質及び水と同様に、リン脂質組成物は、例えばトリグリセリド（複数可）又は遊離脂肪酸などの、１又は２以上のさらなる構成物を包含し得る。
【００４１】
本明細書において用いられる「植物リン脂質」という用語は、植物から得られるか又は得ることができるリン脂質を意味する。適切には、植物リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、及びホスファチジルグリセロールからなる群から選択されるリン脂質の１又は２以上であり得る。
【００４２】
リン脂質組成物は、その構成要素を混合することによって調製することができる。
【００４３】
適切には、リン脂質組成物は、あらゆる植物又は植物油、例えば、大豆油、キャノーラ油、コーン油、綿実油、パーム油、ココナッツ油、ぬか油、ピーナッツ油、オリーブ油、べにばな油、パーム核油、菜種油、及びひまわり油の１又は２以上に由来する、植物リン脂質を包含し得る。
【００４４】
好ましくは、リン脂質組成物内の植物リン脂質は、大豆油、コーン油、ひまわり油、及び菜種油（キャノーラ油と呼ばれることがある）の１又は２以上から得られるか又は得ることができる。
【００４５】
より好ましくは、リン脂質組成物内の植物リン脂質は、大豆油、ひまわり油、又は菜種油の１又は２以上から得ることができるか又は得られる。
【００４６】
最も好ましくは、リン脂質組成物内の植物リン脂質は、大豆油から得ることができるか又は得られる。
【００４７】
本発明は、植物の処理の副産物を開始材料として利用し得るため、特に有利である。
【００４８】
例えば、本発明において用いられるリン脂質組成物は、粗植物油の脱ガムの副産物であり得、このプロセスにおいて、粗植物油は、脱ガムされた食用油及びガム相（副産物）を生産するための純化の前又は最中に脱ガムされる。このプロセスにおいて、粗油は脱ガムされて（例えば、化学的脱ガム、酵素的脱ガム、水による脱ガム、全脱ガム、及び超脱ガムの１又は２以上によって）、油からフォスファチド、すなわち、極性脂質（特にリン脂質）の混合物が除去され、したがって、ガム相は、極性脂質、特にリン脂質の混合物（例えば、水、トリグリセリド、及び遊離脂肪酸などの他の構成物との）である。ガム組成物（又はガム相）における水分含有量は、１０〜４０％ｗ／ｗの範囲であり得る。ガム組成物（又はガム相）におけるリン脂質の含有量は、１０〜７０％ｗ／ｗの範囲であり得る。したがって、１つの実施形態において、本発明に従ったリン脂質組成物は、植物油の脱ガムから得られるか又は得ることができる「ガム相」又は「ガム組成物」であり得る。
【００４９】
代替的に、又はさらに、本発明において用いられるリン脂質組成物は、粗植物油の純化の異なる副産物、すなわちソーダ油さいであり得る。ソーダ油さいは、酸及び／又はアルカリ（水酸化ナトリウムなど）で粗植物油を処理することによって得られる副産物である。典型的には、生じる混合物は、食用油及びソーダ油さいを単離するために遠心分離される。したがって、ソーダ油さいは、極性脂質、特にリン脂質の混合物（例えば、水、トリグリセリド、及び遊離脂肪酸の塩などの他の構成物との）である。ソーダ油さいにおける水分含有量は、１０〜６５％又は１０〜７０％ｗ／ｗの範囲であり得る。ソーダ油さいにおけるリン脂質の含有量は、１０〜７０％の範囲であり得る。したがって、１つの実施形態において、本発明に従ったリン脂質組成物は、植物油の酸及びアルカリ処理から得られるか又は得ることができるソーダ油さいであり得る。
【００５０】
リン脂質組成物がガム組成物（すなわち、ガム相）又はソーダ油さいである場合、適切には、ガム組成物は又はソーダ油さいは、それを脂質アシルトランスフェラーゼ並びにフィトステロール及び／又はフィトスタノール、並びに場合によっては水と混合する前に、精製することができるか、又は乾燥することができるか、又は溶媒分画することができるか、又はその２以上の組合せであり得る。
【００５１】
いくつかの実施形態において、本明細書において用いられるリン脂質組成物は、水を包含しないか又はほとんど包含しない乾燥組成物である。このようなリン脂質組成物は、乾燥ガム相組成物又は乾燥ソーダ油さいを包含し得る。このような実施形態において、反応組成物に水を添加して、反応組成物に少なくとも２％、好ましくは少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％の水を確実に包含させることができる。
【００５２】
他の実施形態において、リン脂質組成物は、それ自体（すなわち天然に）、いくらかの水を包含し得、例えば、リン脂質組成物は、少なくとも２％の水（好ましくは、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％の水）を包含し得る。このようなリン脂質組成物には、乾燥されていないガム相組成物及びソーダ油さい組成物が含まれる。このような実施形態において、リン脂質組成物自体に十分な水が存在して反応組成物内に少なくとも２％の水が存在する場合には、反応組成物にさらなる水を添加する必要がない場合がある。しかし、必要であれば、反応組成物の水分含有量を増大させるために、さらなる水を反応組成物に添加することができる。反応組成物は、少なくとも２％の水（好ましくは少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％の水）を包含していなくてはならない。
【００５３】
適切には、リン脂質組成物は、リン脂質組成物を脂質アシルトランスフェラーゼ及び／又はフィトステロール若しくはフィトスタノールと混合する前に植物リン脂質及び水を含有する組成物からなる。１つの実施形態において、水は、リン脂質と酵素並びに／又はフィトステロール及び／若しくはフィトスタノールとの混合と同時に、又はその後に、リン脂質組成物を形成するためにリン脂質と混合され得る。
【００５４】
誤解を避けるために、本発明に従ったリン脂質組成物は、粗油、例えば粗植物油（典型的には、０．２％未満の水分含有量及び３％以下のリン脂質含有量を有する）でも、純化された食用油（典型的にはリン脂質を有さない−又は有していてもごくわずか、典型的には１００ｐｐｍ未満）でもない。
【００５５】
適切には、リン脂質組成物は、約３０〜約７０℃、好ましくは約４０〜約６０℃、好ましくは約４０〜約５０℃、好ましくは約４０〜約４５℃で、脂質アシルトランスフェラーゼと共にインキュベート（又は混合）することができる。
【００５６】
別の実施形態において、適切には、本発明に従ったプロセス及び／又は使用は、約６０℃未満、好ましくは約６５℃未満、好ましくは約７０℃未満で実施することができる。
【００５７】
適切には、リン脂質組成物及び／又は反応組成物の温度は、酵素がそれと混合される場合には、所望の反応温度であり得る。
【００５８】
リン脂質組成物並びに／又はフィトステロール及び／若しくはフィトスタノール並びに／又は水は、酵素の添加の前及び／又は最中に、所望の温度まで加熱及び／又は冷却することができる。したがって、１つの実施形態において、本発明に従ったプロセスのさらなるステップが、リン脂質組成物並びに／又はフィトステロール及び／若しくはフィトスタノール並びに／又は水の冷却及び／又は加熱であり得ることが想定される。
【００５９】
好ましくは、本発明に従ったプロセスのための、又はリン脂質組成物若しくは反応組成物のための水分含有量は、少なくとも約２％ｗ／ｗであり得る。１つの実施形態において、好ましくは、本発明に従った反応組成物又はリン脂質組成物のための水分含有量は、少なくとも約５％ｗ／ｗ、又は少なくとも約１０％ｗ／ｗ、又は少なくとも約２０％ｗ／ｗであり得る。
【００６０】
いくつかの実施形態において、本発明に従ったプロセス、又はリン脂質組成物のための水分含有量は、約２％ｗ／ｗ〜約６０％ｗ／ｗ、例えば約５％ｗ／ｗ〜約５０％ｗ／ｗであり得る。
【００６１】
適切には、好ましくは撹拌を伴う反応時間（すなわち、混合物が保持される時間）は、植物リン脂質の少なくとも１つのアシル基がフィトステロール及び／又はフィトスタノールに転移し、それによって１又は２以上のフィトスタノールエステル及び／又はフィトステロールエステルが生じるために十分な時間のものである。
【００６２】
好ましくは、反応時間は、少なくとも５％のトランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも１０％のトランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも１５％、２０％、２５％、２６％、２８％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８５％、又は９５％のトランスフェラーゼ活性が生じることが確実となるように効果的である。トランスフェラーゼ活性％（すなわち、全酵素活性に対するパーセンテージとして示されるトランスフェラーゼ活性）は、以下に教示されるプロトコルによって決定することができる。
【００６３】
本発明におけるフィトステロールの変換％は、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％である。
【００６４】
好ましくは、反応時間は、混合物又は反応組成物内のフィトステロール及び／又はフィトスタノールの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％をエステル化するために十分な時間のものである。いくつかの実施形態において、好ましくは、反応時間は、混合物又は反応組成物内のフィトステロール及び／又はフィトスタノールの少なくとも９５％又は少なくとも９８％がエステル化されるものである。
【００６５】
１つの実施形態において、本発明におけるフィトステロールの変換％は、少なくとも５％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％である。
【００６６】
適切には、フィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステル）を単離又は精製する前の、好ましくは撹拌を伴う反応時間（すなわち、反応組成物又は混合物が保持される時間）は、約１０分間〜約６日間、適切には約１２時間〜約５日間であり得る。
【００６７】
いくつかの実施形態において、反応時間は、約１０分間〜約１８０分間、好ましくは約１５分間〜約１８０分間、より好ましくは約１５分間〜約６０分間、さらに好ましくは約１５分間〜約３５分間、好ましくは約３０分間〜約１８０分間、好ましくは約３０分間〜約６０分間であり得る。
【００６８】
１つの実施形態において、好ましくは、反応時間は、１日間（２４時間）〜５日間であり得る。１つの実施形態において、プロセスは、好ましくは、約ｐＨ４．５超、約ｐＨ５超、又は約ｐＨ６超で実施される。
【００６９】
好ましくは、プロセスは、約ｐＨ４．６〜約ｐＨ１０．０、より好ましくは約ｐＨ５．０〜約ｐＨ１０．０、より好ましくは約ｐＨ６．０〜約ｐＨ１０．０、より好ましくは約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０、より好ましくは約ｐＨ５．０〜約ｐＨ６．５、さらに好ましくは約ｐＨ５．５〜ｐＨ６．０で実施される。
【００７０】
１つの実施形態において、プロセスは、約５．３〜８．３のｐＨで実施することができる。
【００７１】
１つの実施形態において、プロセスは、約６〜６．５、好ましくは約６．３のｐＨで実施することができる。
【００７２】
適切には、ｐＨは、本発明の方法及び／又は使用では、中性（約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０）であり得る。
【００７３】
１つの実施形態において、「単離する」という用語は、反応混合物及び／又は反応組成物における少なくとも１つの他の構成要素の少なくともいくつか（好ましくは全て）からフィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルを分離することを意味し得る。
【００７４】
１つの態様において、フィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルは、反応混合物又は反応組成物の他の構成物の１又は２以上から単離又は分離することができる。この点で、「単離された」又は「単離する」という用語は、フィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルが、反応混合物若しくは反応組成物中で見られる少なくとも１つの他の構成要素から少なくとも実質的に遊離されるか、又は、反応混合物若しくは反応組成物中で見られる少なくとも１つの他の構成要素から少なくとも実質的に遊離されるように処理されることを意味し得る。
【００７５】
１つの態様において、フィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルは、単離されているか、又は単離された形態である。
【００７６】
さらなる態様において、フィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルは、精製されているか、又は精製された形態であり得る。
【００７７】
１つの態様において、「精製する」という用語は、フィトスタノールエステル及び／又はフィトステロールエステルが、比較的純粋な状態、例えば、少なくとも約５１％の純度、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％の純度、又は少なくとも約９５％の純度、又は少なくとも約９８％の純度となるように処理されることを意味する。
【００７８】
混合物の他の構成物からのフィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルの単離又は精製は、あらゆる従来の方法によって実施することができる。好ましくは、単離又は精製は、抽出、ｐＨ調整、分画、洗浄、遠心分離、及び／又は蒸留の１又は２以上などの、異なる単位操作によって実施される。
【００７９】
１つの実施形態において、リン脂質組成物、酵素、並びにフィトステロール及び／又はフィトスタノールは、同時に又はほぼ同時に、ミキサーを介して流れの中に、そして保持タンク内に送り込むことができる。
【００８０】
適切には、酵素は、プロセスの最中及び／又は最後に不活化することができる。
【００８１】
酵素は、フィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルの分離（又は単離又は精製）の前又は後に不活化することができる。
【００８２】
適切には、酵素は、７５〜８５℃又は９２℃超で１０分間にわたり加熱することによって、熱不活性化することができる。
【００８３】
適切には、酵素は、リン脂質組成物１ｇ当たり約０．０１〜１００ＴＩＰＵ−Ｋの範囲で投与することができ、適切には、酵素は、約０．０５〜１０ＴＩＰＵ−Ｋ／ｇ、好ましくは、リン脂質組成物１ｇ当たり約０．０５〜１．５ＴＩＰＵ−Ｋの範囲、より好ましくは、リン脂質組成物１ｇ当たり０．２〜１ＴＩＰＵ−Ｋで投与することができる。
【００８４】
脂質アシルトランスフェラーゼは、適切には、油１ｇ当たり約０．０１ＴＩＰＵ−Ｋ単位〜リン脂質組成物１ｇ当たり５ＴＩＰＵ−Ｋ単位の範囲で投与することができる。１つの実施形態において、脂質アシルトランスフェラーゼは、リン脂質組成物１ｇ当たり約０．１〜約１ＴＩＰＵ−Ｋ単位の範囲で投与することができ、より好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼは、リン脂質組成物１ｇ当たり約０．１〜約０．５ＴＩＰＵ−Ｋ単位の範囲で投与することができ、より好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼは、リン脂質組成物１ｇ当たり約０．１〜約０．３ＴＩＰＵ−Ｋ単位の範囲で投与することができる。
【００８５】
ホスホリパーゼ活性、ＴＩＰＵ−Ｋ：
基質：５０ｍｍのHepes（ｐＨ７．０）に溶解した、１．７５％のＬ−植物ホスファチジルコリン９５％（441601、Avanti Polar Lipids社製）、６．３％のTriton X-100（#T9284、Sigma社製）、及び５ｍＭのＣａＣｌ２。
アッセイ手順：試料、較正、及び対照を、１０ｍＭのHEPES（ｐＨ７．０）、０．１％のTriton X-100（#T9284、Sigma社製）内に希釈した。分析は、Konelab Autoanalyzer（Thermo社製、フィンランド）を用いて実施した。アッセイは、３０℃で実行した。３４μＬの基質を１８０秒間にわたりサーモスタットにかけ、その後、４μＬの試料を添加した。酵素化を６００秒間続けた。酵素化の間に遊離した遊離脂肪酸の量を、NEFA Cキット（999-75406、WAKO社製、独国）を用いて測定した。１１３μＬのNEFA Aを添加し、混合物を３００秒間にわたりインキュベートした。その後、５６μＬのNEFA Bを添加し、混合物を３００秒間にわたりインキュベートした。次に、５２０ｎｍでのＯＤを測定した。酵素活性（μｍｏｌ ＦＦＡ／分・ｍＬ）を、標準酵素調製物に基づいて計算した。酵素活性ＴＩＰＵ−Ｋを、アッセイ条件下で１分当たりに生産された遊離脂肪酸（ＦＦＡ、free fatty acid）のμｍｏｌとして計算した。
【００８６】
参照を容易にするために、本発明のこれらの及びさらなる態様を、以下の適切な節の見出しの元で論じる。しかし、各節の元での教示は、必ずしも、それぞれの特定の節に限定されるわけではない。
【００８７】
利点
本発明は、ステロールエステル及び／又はスタノールエステルを生産するための、持続可能で環境に優しい手段を提供する。
【００８８】
本発明の１つの利点は、反応が、ステロールエステル及び／又はスタノールエステルを生産するための従来の方法と比較して低い温度で生じるということである。
【００８９】
本発明の別の利点は、反応が、水性系（すなわち、水ベースの系）で生じることである。したがって、本発明のプロセスにおいては有機溶媒を用いる必要はない。これは、ステロールエステル及び／又はスタノールエステルを生産するための従来の方法と比較して、非常に有利である。特に、本発明の混合物は、それ自体、食物組成物若しくは餌組成物又はパーソナルケア製品（例えば、化粧品）組成物などの産業用組成物における直接的な使用に適していないと考えられる構成物を有していないことが多いため、水性系を用いることによって、過剰な精製及び単離（すなわち、全ての有機溶媒を除去すること）の必要性が低減される。したがって、本発明のプロセスは、ステロールエステル及びスタノールエステルが、使用の前に簡単に濃縮され得るという利点を有する。
【００９０】
本発明のさらなる利点は、プロセスが、他の植物処理の副産物を利用し得、したがって、廃棄物が低減され、価値の低い組成物から価値のあるステロールエステル及び／又はスタノールエステルが形成されることである。例えば、本発明において用いるためのリン脂質組成物は、ガム組成物又はソーダ油さい（共に、食用油の純化の副産物である）であり得る。さらに、又は代替的に、本発明において用いられるフィトステロール及び／又はフィトスタノールは、大豆油脱臭剤蒸留物（ＳＯＤＤ）であり得る。
【００９１】
別の利点は、本発明によって、ステロールエステル及び／又はスタノールエステルの酵素的形成の際に有機溶媒を用いることなく、高収量及び産業規模の量のステロールエステル及びスタノールエステルの生産が可能になることである。
【００９２】
本発明のさらなる利点は、ステロールエステル又はスタノールエステルを生産するためのプロセスが、ステロールエステル又はスタノールエステルの従来の生産プロセスにおいて用いられる温度よりも低い温度で実施され得ることである。したがって、利点は、ステロール、ステロールエステル、スタノール、又はスタノールエステルが曝される酸化ストレスが、従来のプロセスで生産されるステロール、スタノール、ステロールエステル、又はスタノールエステルと比較して少ないということである。したがって、１つの利点は、本発明に従って生産されるステロールエステル及び／又はスタノールエステルが生産される際の、例えばステロール、ステロールエステル、スタノール、又はスタノールエステルの熱分解及び酸化的分解から生産される副産物が、化学的に触媒された反応と比較して少ないことである。この結果、精製及び単離プロセスが、より簡素化する。
【００９３】
脂質アシルトランスフェラーゼ
あらゆる脂質アシルトランスフェラーゼを本発明において用いることができる。
【００９４】
例えば、本発明において用いるための脂質アシルトランスフェラーゼは、国際公開第２００４／０６４５３７号パンフレット、国際公開第２００４／０６４９８７号パンフレット、国際公開第２００５／０６６３４７号パンフレット、国際公開第２００６／００８５０８号パンフレット、又は国際公開第２００８／０９０３９５号パンフレットにおいて記載されているものであり得る。参照することによって、これらの文書を本明細書に組み込む。
【００９５】
本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼは、天然の脂質アシルトランスフェラーゼ又はバリアント脂質アシルトランスフェラーゼであり得る。
【００９６】
本明細書において用いられる「脂質アシルトランスフェラーゼ」という用語は、好ましくは、アシルトランスフェラーゼ活性（通常は、Ｅ．Ｃ．２．３．１．ｘ、例えば２．３．１．４３と分類される）を有する酵素を意味し、この活性によって、酵素は、脂質のアシル基を、アシル受容体分子であるステロール及び／又はスタノール、好ましくはフィトステロール及び／又はフィトスタノールに転移させ得る。
【００９７】
適切には、脂質アシルトランスフェラーゼは、酵素命名分類の元で分類されるもの（Ｅ．Ｃ．２．３．１．４３）である。
【００９８】
好ましくは、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼは、リン脂質（本明細書において定義される）のアシル基をフィトステロール及び／又はフィトスタノールに転移させ得る脂質アシルトランスフェラーゼである。
【００９９】
好ましくは、本発明に従った「アシル受容体」は、水ではない。
【０１００】
適切には、アシル受容体のいくつかは、リン脂質組成物において天然に見ることができる。或いは（及び好ましくは）、アシル受容体は、リン脂質組成物に付加することができる（例えば、アシル受容体は、リン脂質組成物に対して外来性又は外因性であり得る）。このことは、アシル受容体の量がアシルトランスフェラーゼ反応の速度を制限するものである場合に、特に重要である。
【０１０１】
好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼが作用する対象である脂質基質は、リン脂質、例えばレシチン、例えばホスファチジルコリン及び／又はホスファチジルエタノールアミンという脂質の、１又は２以上である。
【０１０２】
この脂質基質は、本明細書において、「脂質アシル供与体」と呼ばれ得る。本明細書において用いられるレシチンという用語は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、及びホスファチジルグリセロールを包含する。
【０１０３】
本発明において用いるための好ましい脂質アシルトランスフェラーゼは、水性環境における、リン脂質に対する高いリン脂質トランスフェラーゼ活性などの、高い活性を有するものとして同定され、最も好ましくは、本発明において用いるための脂質アシルトランスフェラーゼは、リン脂質からフィトステロール及び／又はフィトスタノールへの高いトランスフェラーゼ活性を有する。
【０１０４】
本発明の方法及び／又は使用における使用に適した酵素は、以下の「トランスフェラーゼアッセイ（ステロール：リン脂質）（ＴｒＵ）」を用いて決定される脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有し得る。
【０１０５】
トランスフェラーゼ活性の決定
「トランスフェラーゼアッセイ（ステロール：リン脂質）」（ＴｒＵ）
基質：５０ｍｇのβ−シトステロール（Sigma社製、S5753）、及び４５０ｍｇの大豆ホスファチジルコリン（ＰＣ、phosphatidylcholine）、Avanti社製、#441601を、クロロホルム内に溶解し、クロロホルムを真空下で４０℃で蒸発させる。
【０１０６】
３００ｍｇの、９：１のＰＣ：β−シトステロールを、１０ｍｌの５０ｍＭのHEPES緩衝液（ｐＨ７）内に４０℃で分散させる。
【０１０７】
酵素化：
２５０μｌの基質を、蓋を有するグラス内に４０℃で添加する。
２５μｌの酵素溶液を添加し、４０℃で１０分間にわたり、撹拌しながらインキュベートする。
【０１０８】
添加する酵素は、アッセイにおけるβ−シトステロールの２〜５％をエステル化するものでなくてはならない。
【０１０９】
酵素溶液の代わりに２５μｌの水を有するブランクも分析する。
【０１１０】
１０分後、５ｍｌの３：２のヘキサン：イソプロパノールを添加する。
【０１１１】
β−シトステロールエステルの量を、較正のためにステアリン酸コレステリル（Sigma社製、C3549）標準を用いて、ＨＰＴＬＣによって分析する。
【０１１２】
トランスフェラーゼ活性を、アッセイ条件下での１分間当たりのβ−シトステロールエステルの形成の量として計算する。
【０１１３】
１トランスフェラーゼ単位（ＴｒＵ、Transferase Unit）は、上記に記載されたトランスフェラーゼアッセイに従って４０℃及びｐＨ７で１分間当たりに生産された、β−シトステロールエステルのμｍｏｌとして定義される。
【０１１４】
好ましくは、本発明の方法及び使用において用いられる脂質アシルトランスフェラーゼは、少なくとも酵素タンパク質１ｍｇ当たり２５ＴｒＵの、酵素１ｍｇ当たりの特定のトランスフェラーゼ単位（ＴｒＵ）を有する。
【０１１５】
適切には、本発明において用いるための脂質アシルトランスフェラーゼは、リン脂質組成物１ｇ当たり０．０５〜５０ＴｒＵの量、適切にはリン脂質組成物１ｇ当たり０．５〜５ＴｒＵの量で投与することができる。
【０１１６】
より好ましくは、本発明の方法及び／又は使用における使用に適した酵素は、以下のプロトコルによって定義される脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有する。
【０１１７】
アシルトランスフェラーゼ活性％を決定するためのプロトコル：
本発明に従った脂質アシルトランスフェラーゼ（及びある量のステロール／スタノール）が添加されているリン脂質組成物は、２：１のＣＨＣｌ３：ＣＨ３ＯＨとの酵素反応後に抽出することができ、脂質材料を含有する有機相は、以下に詳述される手順に従って、ＧＬＣ及びＨＰＬＣによって単離及び分析される。ＧＬＣ及びＨＰＬＣ分析から、遊離脂肪酸、及びステロール／スタノールエステルの１又は２以上の量が決定される。本発明に従った酵素が添加されていない対照リン脂質組成物は、同一の方法で分析される。
【０１１８】
計算：ＧＬＣ及びＨＰＬＣ分析の結果から、遊離脂肪酸及びステロール／スタノールエステルの増大を計算することができる。
Δ脂肪酸％＝脂肪酸（酵素）％−脂肪酸（対照）％、
Ｍｖ脂肪酸＝脂肪酸の平均分子量、
Ａ＝Δステロールエステル％／Ｍｖステロールエステル（式中、Δステロールエステル％＝ステロール／スタノールエステル（酵素）％−ステロール／スタノールエステル（対照）％であり、Ｍｖステロールエステル＝ステロール／スタノールエステルの平均分子量である）。
トランスフェラーゼ活性は、全酵素活性に対するパーセンテージとして計算され、
トランスフェラーゼ活性％＝Ａ×１００／（Ａ＋Δ脂肪酸％／（Ｍｖ脂肪酸））
【０１１９】
アッセイでは、用いられる酵素投与量は、好ましくは、リン脂質組成物１ｇ当たり０．２ＴＩＰＵ−Ｋ、より好ましくは、リン脂質組成物１ｇ当たり０．０８ＴＩＰＵ−Ｋ、好ましくは、油１ｇ当たり０．０１ＴＩＰＵ−Ｋである。リン脂質組成物内に存在するリン脂質のレベル及び／又はステロールの変換％は、好ましくは０．５、１、２、４、及び２０時間後、より好ましくは２０時間後に決定される。
【０１２０】
好ましくは、本発明において用いるための脂質アシルトランスフェラーゼは、「アシルトランスフェラーゼ活性％を決定するためのプロトコル」を用いて試験した場合、少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％のトランスフェラーゼ活性を有する。
【０１２１】
リン脂質組成物におけるトランスフェラーゼ活性％の評価（上記）に加え、又はその代わりに、本発明の方法において用いるための最も好ましい脂質アシルトランスフェラーゼ酵素を同定するために、「脂質アシルトランスフェラーゼを同定するためのプロトコル」という表題の以下のアッセイを採用することができる。
【０１２２】
脂質アシルトランスフェラーゼを同定するためのプロトコル
本発明に従った脂質アシルトランスフェラーゼは、
ｉ）植物ステロール（１％）、水（１％）、及びホスファチジルコリン（２％）油を補った大豆油内に存在するリン脂質の除去（用いる方法：植物ステロール、水、及びホスファチジルコリンを、撹拌しながら９５℃まで加熱することによって大豆油内に溶解した。次に油を４０℃まで冷却し、酵素を添加した。試料を、磁気撹拌しながら４０℃で維持し、試料を０．５、１、２、４、及び２０時間後に採取し、ＴＬＣによって分析した）、
並びに／又は
ii）添加したステロールからステロールエステルへの変換（変換％）（上記のｉ）で教示される方法を用いる）
をもたらすものである。
【０１２３】
アッセイでは、用いられる酵素投与量は、油１ｇ当たり０．２ＴＩＰＵ−Ｋ、好ましくは、油１ｇ当たり０．０８ＴＩＰＵ−Ｋ、好ましくは、油１ｇ当たり０．０１ＴＩＰＵ−Ｋであり得る。油内に存在するリン脂質のレベル及び／又はステロールの変換（変換％）は、好ましくは０．５、１、２、４、及び２０時間後、より好ましくは２０時間後に決定される。
【０１２４】
いくつかの態様において、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼは、ＧＤＳＸモチーフ及び／又はＧＡＮＤＹモチーフを包含し得る。
【０１２５】
好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、アシルトランスフェラーゼ活性を保有しアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを包含する酵素として特徴付けされ、前記モチーフにおいて、Ｘはアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、又はＳの１又は２以上である。
【０１２６】
適切には、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列又は脂質アシルトランスフェラーゼは、エロモナス属（Aeromonas）、ストレプトミセス属（Streptomyces）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、デスルフィトバクテリウム属（Desulfitobacterium）、バチルス属（Bacillus）、カンピロバクター属（Campylobacter）、ビブリオナセエ属（Vibrionaceae）、キシレラ属（Xylella）、スルフォロブス属（Sulfolobus）、アスペルギルス属（Aspergillus）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、リステリア属（Listeria）、ナイセリア属（Neisseria）、メソリゾビウム属（Mesorhizobium）、ラルストニア属（Ralstonia）、ザントモナス属（Xanthomonas）、及びカンジダ属（Candida）の１又は２以上に属する生物から得ることができるか、又は好ましくは得られる。好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼは、エロモナス属に属する生物から得ることができるか、好ましくは得られる。
【０１２７】
本発明の１つの態様において、脂質アシルトランスフェラーゼは、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであり、このポリペプチドは、
ａ）配列番号４９として示されるヌクレオチド配列を包含するヌクレオチド配列、若しくはそれと７５％以上の同一性（好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である）を有するヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号１６で示されるポリペプチド配列若しくは配列番号６８で示されるポリペプチド配列と少なくとも７０％同一である（好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である）前記ポリペプチドをコードする核酸、
ｃ）中度の（又は高い）ストリンジェンシー条件下で、配列番号４９として示されるヌクレオチド配列を包含する核酸プローブにハイブリダイズする核酸、又は
ｄ）ａ）、ｂ）、若しくはｃ）において特定された核酸配列の断片である核酸
を発現させることによって得ることができる。
【０１２８】
１つの実施形態において、好ましくは、本発明において用いるための脂質アシルトランスフェラーゼは、ヌクレオチド配列、特に配列番号４９として本明細書において示されるヌクレオチド配列をバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）において発現させることによって得ることができるポリペプチドである。
【０１２９】
１つの態様において、好ましくは、本発明において用いるための脂質アシルトランスフェラーゼは、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであり、このポリペプチドは、配列番号６８、配列番号１６、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３４、配列番号３５として示されるアミノ酸配列又はそれと７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列のいずれか１つを包含する。
【０１３０】
好ましい態様において、好ましくは、本発明において用いるための脂質アシルトランスフェラーゼは、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであり、このポリペプチドは、配列番号６８若しくは配列番号１６として示されるアミノ酸配列を包含するか、又は、それと少なくとも７５％以上の同一性、好ましくはそれと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０１３１】
１つの実施形態において、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号４９で示されるヌクレオチド配列によってコードされるか、又は、それと少なくとも７５％の同一性、好ましくはそれと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１３２】
さらに、又は代替的に、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６８として示されるアミノ酸配列又はそれに対する７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を包含し得る脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。適切には、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６８として示されるアミノ酸配列を包含し得る脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。
【０１３３】
１つの実施形態において、好ましくは、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼは、バチルス・リケニフォルミスを、配列番号４９で示されるヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７５％（より好ましくはそれと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性）を有するヌクレオチド配列で形質転換し、前記バチルス・リケニフォルミスを培養し、そこで生産された脂質アシルトランスフェラーゼ（複数可）を単離することによって、前記バチルス・リケニフォルミスにおいて発現される、脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０１３４】
本発明のいくつかの態様において、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３５として示されるエロモナス・サルモニシダ（Aeromonas salmonicida）の脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列におけるＮ−８０に対応する位置でアスパラギン酸残基を包含する脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。
【０１３５】
本発明のいくつかの態様において、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号３５として示されるエロモナス・サルモニシダの脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列におけるＮ−８０に対応する位置でアスパラギン酸残基を包含する脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０１３６】
上記で詳述したように、本発明の方法における使用に適した他のアシルトランスフェラーゼは、ｐＦａｍ００６５７コンセンサス配列（配列番号２）のアラインメント及び／又はＧＤＳＸアシルトランスフェラーゼ、例えば配列番号１６に対するアラインメントによってＧＤＳＸ、ＧＡＮＤＹ、及びＨＰＴブロックの存在を同定することによって同定することができる。本発明に対するそれらの適合性を評価するために、すなわち、全酵素活性の少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９８％のトランスフェラーゼ活性を有する酵素を同定するために、このようなアシルトランスフェラーゼを、上記で詳述した「アシルトランスフェラーゼ活性％を決定するためのプロトコル」アッセイを用いて試験する。
【０１３７】
好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、
脂質アシル供与体の本来のエステル結合のアシル部分をアシル受容体に転移させて新たなエステルを形成するエステル転移活性と定義され得る、アシルトランスフェラーゼ活性を保有する酵素であること、及び
Ｘがアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、又はＳの１又は２以上である、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを包含する酵素であること、
という基準を用いて特徴付けすることができる。
【０１３８】
好ましくは、ＧＤＳＸモチーフのＸは、Ｌ又はＹである。より好ましくは、ＧＤＳＸモチーフのＸはＬである。したがって、好ましくは、本発明に従った酵素は、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＬを包含する。
【０１３９】
ＧＤＳＸモチーフは、４つの保存されたアミノ酸からなる。好ましくは、モチーフ内のセリンは、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の触媒性セリンである。適切には、ＧＤＳＸモチーフのセリンは、Brumlik & Buckley（Journal of Bacteriology Apr. 1996, Vol. 178, No. 7, p 2060-2064）において教示されている、エロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素におけるＳｅｒ−１６に対応する位置に存在し得る。
【０１４０】
タンパク質が本発明に従ったＧＤＳＸモチーフを有しているかどうかを決定するために、配列は、好ましくは、参照することによって本明細書に組み込まれる国際公開第２００４／０６４５３７号パンフレット又は国際公開第２００４／０６４９８７号パンフレットにおいて教示されている手順に従って、ｐｆａｍデータベースの隠しｍａｒｋｏｖモデルプロフィール（ＨＭＭプロフィール、hidden markov modelプロフィール）と比較される。
【０１４１】
好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列を用いてアラインすることができる（完全な説明については、国際公開第２００４／０６４５３７号パンフレット又は国際公開第２００４／０６４９８７号パンフレットを参照されたい）。
【０１４２】
好ましくは、ｐｆａｍ００６５７ドメインファミリーの隠しｍａｒｋｏｖモデルプロフィール（ＨＭＭプロフィール）との正の適合は、ＧＤＳＬドメイン又はＧＤＳＸドメインが存在することを示す。
【０１４３】
好ましくは、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列とアラインする場合、本発明の方法又は使用において用いるための脂質アシルトランスフェラーゼは、ＧＤＳＸブロック、ＧＡＮＤＹブロック、ＨＰＴブロックの少なくとも１つの、好ましくは２以上の、好ましくは３以上を有し得る。適切には、脂質アシルトランスフェラーゼは、ＧＤＳＸブロック及びＧＡＮＤＹブロックを有し得る。或いは、酵素は、ＧＤＳＸブロック及びＨＰＴブロックを有し得る。好ましくは、酵素は、少なくとも１つのＧＤＳＸブロックを包含する。さらなる詳細については、国際公開第２００４／０６４５３７号パンフレット又は国際公開第２００４／０６４９８７号パンフレットを参照されたい。
【０１４４】
好ましくは、ＧＡＮＤＹモチーフの残基は、ＧＡＮＤＹ、ＧＧＮＤＡ、ＧＧＮＤＬから選択され、最も好ましくはＧＡＮＤＹである。
【０１４５】
ｐｆａｍ００６５７のＧＤＳＸドメインは、このドメインを保有するタンパク質を他の酵素から区別する固有の同定要素である。
【０１４６】
ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列は、図３において配列番号２として示される。これは、本明細書においてｐｆａｍ００６５７．６とも呼ばれる、ｐｆａｍファミリー００６５７、データベースバージョン６の同定に由来するものである。
【０１４７】
コンセンサス配列は、ｐｆａｍデータベースのさらなるリリースを用いることによってアップデートすることができる（例えば、国際公開第２００４／０６４５３７号パンフレット又は国際公開第２００４／０６４９８７号パンフレットを参照されたい）。
【０１４８】
１つの実施形態において、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、
（ｉ）脂質アシル供与体の本来のエステル結合のアシル部分をアシル受容体に転移させて新たなエステルを形成するエステル転移活性と定義され得る、アシルトランスフェラーゼ活性を保有する酵素であること、
（ii）Ｘがアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、又はＳの１又は２以上である、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを包含する酵素であること、
（iii）図２及び４（配列番号１又は配列番号３）に示されるエロモナス・ハイドロフィラの脂質アシルトランスフェラーゼ酵素におけるＨｉｓ−３０９に対応する位置にＨｉｓ−３０９を包含する酵素であるか、又はヒスチジン残基を包含する酵素であること
という基準を用いて特徴付けされ得る脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０１４９】
好ましくは、ＧＤＳＸモチーフのアミノ酸残基はＬである。
【０１５０】
配列番号３又は配列番号１において、最初の１８個のアミノ酸残基は、シグナル配列を形成する。シグナル配列を含むタンパク質である完全長配列のＨｉｓ−３０９は、タンパク質の成熟部分、すなわちシグナル配列を有さない配列の、Ｈｉｓ−２９１と同等である。
【０１５１】
１つの実施形態において、本発明の方法及び使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、Ｓｅｒ−３４、Ａｓｐ−３０６、及びＨｉｓ−３０９という触媒３残基（catalytic triad）を包含するか、又は、図４（配列番号３）若しくは図２（配列番号１）において示されるエロモナス・ハイドロフィラの脂質アシルトランスフェラーゼ酵素におけるＳｅｒ−３４、Ａｓｐ−３０６、及びＨｉｓ−３０９に対応する位置に、それぞれセリン残基、アスパラギン酸残基、及びヒスチジン残基を包含する、脂質アシルトランスフェラーゼである。上述したように、配列番号３又は配列番号１において示される配列において、最初の１８個のアミノ酸残基は、シグナル配列を形成する。シグナル配列を含むタンパク質である完全長配列のＳｅｒ−３４、Ａｓｐ−３０６、及びＨｉｓ−３０９は、タンパク質の成熟部分、すなわちシグナル配列を有さない配列の、Ｓｅｒ−１６、Ａｓｐ−２８８、及びＨｉｓ−２９１と同等である。ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列において、図３（配列番号２）において示されるように、活性部位の残基は、Ｓｅｒ−７、Ａｓｐ−３４５、及びＨｉｓ−３４８に対応する。
【０１５２】
１つの実施形態において、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、
第１の脂質アシル供与体の本来のエステル結合のアシル部分をアシル受容体に転移させて新たなエステルを形成するエステル転移活性と定義され得る、アシルトランスフェラーゼ活性を保有する酵素であること、並びに
少なくともＧｌｙ−３２、Ａｓｐ−３３、Ｓｅｒ−３４、Ａｓｐ−１３４、及びＨｉｓ−３０９を包含するか、又は、配列番号３若しくは配列番号１において示されるエロモナス・ハイドロフィラの脂質アシルトランスフェラーゼ酵素におけるＧｌｙ−３２、Ａｓｐ−３３、Ｓｅｒ−３４、Ａｓｐ−３０６、及びＨｉｓ−３０９に対応する位置に、それぞれグリシン残基、アスパラギン酸残基、セリン残基、アスパラギン酸残基、及びヒスチジン残基を包含する酵素であること
という基準を用いて特徴付けされ得る脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０１５３】
適切には、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、
（ａ）配列番号３６として示されるヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号３８として示されるヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号３９として示されるヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号４２として示されるヌクレオチド配列、
（ｅ）配列番号４４として示されるヌクレオチド配列、
（ｆ）配列番号４６として示されるヌクレオチド配列、
（ｇ）配列番号４８として示されるヌクレオチド配列、
（ｈ）配列番号４９として示されるヌクレオチド配列、
（ｉ）配列番号５０として示されるヌクレオチド配列、
（ｊ）配列番号５１として示されるヌクレオチド配列、
（ｋ）配列番号５２として示されるヌクレオチド配列、
（ｌ）配列番号５３として示されるヌクレオチド配列、
（ｍ）配列番号５４として示されるヌクレオチド配列、
（ｎ）配列番号５５として示されるヌクレオチド配列、
（ｏ）配列番号５６として示されるヌクレオチド配列、
（ｐ）配列番号５７として示されるヌクレオチド配列、
（ｑ）配列番号５８として示されるヌクレオチド配列、
（ｒ）配列番号５９として示されるヌクレオチド配列、
（ｓ）配列番号６０として示されるヌクレオチド配列、
（ｔ）配列番号６１として示されるヌクレオチド配列、
（ｕ）配列番号６２として示されるヌクレオチド配列、
（ｖ）配列番号６３として示されるヌクレオチド配列、
（ｗ）又は、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、若しくは配列番号６３として示される配列のいずれか１つと７０％以上、好ましくは７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列
というヌクレオチド配列の１つによってコードされ得る。
【０１５４】
適切には、ヌクレオチド配列は、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、又は配列番号６３として示される配列のいずれか１つと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有し得る。
【０１５５】
適切には、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、
（ｉ）配列番号６８として示されるアミノ酸配列、
（ii）配列番号３として示されるアミノ酸配列、
（iii）配列番号４として示されるアミノ酸配列、
（iv）配列番号５として示されるアミノ酸配列、
（ｖ）配列番号６として示されるアミノ酸配列、
（vi）配列番号７として示されるアミノ酸配列、
（vii）配列番号８として示されるアミノ酸配列、
（viii）配列番号９として示されるアミノ酸配列、
（ix）配列番号１０として示されるアミノ酸配列、
（ｘ）配列番号１１として示されるアミノ酸配列、
（xi）配列番号１２として示されるアミノ酸配列、
（xii）配列番号１３として示されるアミノ酸配列、
（xiii）配列番号１４として示されるアミノ酸配列、
（xiv）配列番号１として示されるアミノ酸配列、
（xv）配列番号１５として示されるアミノ酸配列、
（xvi）配列番号１６として示されるアミノ酸配列、
（xvii）配列番号１７として示されるアミノ酸配列、
（xviii）配列番号１８として示されるアミノ酸配列、
（xix）配列番号３４として示されるアミノ酸配列、
（xx）配列番号３５として示されるアミノ酸配列、又は
配列番号６８、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、若しくは配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号３４、若しくは配列番号３５として示される配列のいずれか１つと７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列
というアミノ酸配列の１又は２以上を包含する脂質アシルトランスフェラーゼであり得る。
【０１５６】
１つの態様において、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ、lecithin:cholesterol acyltransferase）又はそのバリアント（例えば、分子の進化によって生じるバリアント）であり得る脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０１５７】
適切なＬＣＡＴは、当技術分野において知られており、例えば哺乳動物、ラット、マウス、ニワトリ、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、シロイヌナズナ及びオリザ・サティバ（Orysa sativa）を含む植物、線虫、真菌、並びに酵母という生物の１又は２以上から得ることができる場合がある。
【０１５８】
本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、エロモナス属種（Aeromonas spp）、好ましくはエロモナス・ハイドロフィラ又はエロモナス・サルモニシダ、最も好ましくはエロモナス・サルモニシダから単離される脂質アシルトランスフェラーゼ、又はそのバリアントであり得る。
【０１５９】
当業者には、アシルトランスフェラーゼのシグナルペプチドがトランスフェラーゼの発現の間に切断されていることが好ましいことが認識されよう。配列番号１、３、４、１５、及び１６のシグナルペプチドは、アミノ酸１〜１８である。したがって、最も好ましい領域は、配列番号１及び配列番号３（エロモナス・ハイドロフィラ）ではアミノ酸１９〜３３５であり、配列番号４、配列番号１５、及び配列番号１６（エロモナス・サルモニシダ）ではアミノ酸１９〜３３６である。アミノ酸配列の相同性又は同一性を決定するために用いる場合、本明細書において記載されるアラインメントでは成熟配列を用いることが好ましい。
【０１６０】
したがって、相同性（同一性）を決定するために最も好ましい領域は、配列番号１及び３（エロモナス・ハイドロフィラ）ではアミノ酸１９〜３３５であり、配列番号４、１５、及び１６（エロモナス・サルモニシダ）ではアミノ酸１９〜３３６である。配列番号３４及び３５はそれぞれ、エロモナス・ハイドロフィラ及びエロモナス・サルモニシダの脂質アシルトランスフェラーゼの成熟タンパク質配列であり、これは、さらなる翻訳後修飾を受けていてもいなくてもよい。
【０１６１】
本発明の方法及び使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、サーモビフィダ（Thermobifida）、好ましくはサーモビフィダ・フスカ（T. fusca）からも単離され得る脂質アシルトランスフェラーゼであり得、最も好ましくは、配列番号２７、２８、３８、４０、若しくは４７で示され得るか、又は、配列番号３９若しくは４８のヌクレオチド配列を包含する核酸によってコードされ得る。
【０１６２】
本発明の方法及び使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、ストレプトミセス、好ましくはストレプトミセス・アベルミティリス（S. avermitis）からも単離され得る脂質アシルトランスフェラーゼであり得、最も好ましくは、配列番号３２を包含し得る。本発明において用いるための、ストレプトミセスから得られる、他の考えられる酵素には、配列番号５、６、９、１０、１１、１２、１３、１４、２６、３１、３３、３６、３７、４３、若しくは４５として示される配列、又は配列番号５２、５３、５６、５７、５８、５９、６０、若しくは６１として示されるヌクレオチド配列によってコードされる配列を包含するものが含まれる。
【０１６３】
本発明において用いるための酵素はまた、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、好ましくはコリネバクテリウム・エフィシエンス（C. efficiens）からも単離され得、最も好ましくは、配列番号２９若しくは配列番号４１で示される配列を包含し得るか、又は、配列番号４２で示されるヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０１６４】
１つの実施形態において、本発明に従った脂質アシルトランスフェラーゼは、それぞれ受託番号ＮＣＩＭＢ４１２２６及びＮＣＩＭＢ４１２２７で、２００４年６月２３日に、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の下で、Danisco A/S、Langebrogade 1、DK-1001 Copenhagen K、デンマークによってNational Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria (NCIMB)、23 St. Machar Street、Aberdeen、Scotland、英国に寄託された、ストレプトミセス株Ｌ１３０又はＬ１３１から得ることができる、好ましくは得られる、脂質アシルトランスフェラーゼであり得る。
【０１６５】
１つの実施形態において、本発明に従った酵素は、好ましくは、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２として分類されるホスホリパーゼＡ１又はＥ．Ｃ．３．１．１．４として分類されるホスホリパーゼＡ２などのホスホリパーゼ酵素ではない場合がある。
【０１６６】
バリアント脂質アシルトランスフェラーゼ
好ましい実施形態において、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、バリアント脂質アシルトランスフェラーゼである脂質アシルトランスフェラーゼをコードし得る。
【０１６７】
増大した加水分解活性及び／又は増大したトランスフェラーゼ活性などの、リン脂質に対する増大した活性、好ましくはリン脂質に対する増大したトランスフェラーゼ活性を有するバリアントを用いることができる。
【０１６８】
好ましくは、バリアント脂質アシルトランスフェラーゼは、以上に定義した脂質アシルトランスフェラーゼの１又は２以上のアミノ酸修飾によって調製される。
【０１６９】
適切には、本発明の方法及び使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼは、バリアント脂質アシルトランスフェラーゼであり得る脂質アシルトランスフェラーゼであり得、このケースにおいて、酵素は、Ｘがアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、又はＳの１又は２以上である、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを包含することで特徴付けされ得、バリアント酵素は、セット２又はセット４又はセット６又はセット７（国際公開第２００５／０６６３４７号パンフレット及び以下に定義される）において定義されるアミノ酸残基のいずれか１又は２以上での、親配列と比較して１又は２以上のアミノ酸修飾を包含する。
【０１７０】
例えば、バリアント脂質アシルトランスフェラーゼは、Ｘがアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、又はＳの１又は２以上である、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを包含する酵素であることによって特徴付けされ得、バリアント酵素は、親配列を本明細書において定義されるＰ１０４８０の構造モデルと構造的にアラインすることによって同定される、セット２又はセット４又はセット６又はセット７（国際公開第２００５／０６６３４７号パンフレット及び以下に定義される）において詳述されるアミノ酸残基のいずれか１又は２以上での、前記親配列と比較して１又は２以上のアミノ酸修飾を包含し、前記同定は、好ましくは、国際公開第２００５／０６６３４７号パンフレット及び以下において定義されるように、Ｐ１０４８０結晶構造の座標を、１ＩＶＮ．ＰＤＢ及び／又は１ＤＥＯ．ＰＤＢと構造的にアラインすることによって得られる。
【０１７１】
さらなる実施形態において、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼは、Ｘがアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、又はＳの１又は２以上である、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを包含する酵素であることによって特徴付けされ得るバリアント脂質アシルトランスフェラーゼであり得、バリアント酵素は、セット２において教示されるアミノ酸残基のいずれか１又は２以上での、親配列と比較して１又は２以上のアミノ酸修飾を包含し、これは、国際公開第２００５／０６６３４７号パンフレット及び以下において定義されるように、前記親配列をｐｆａｍコンセンサス配列（配列番号２−図３）に対してアラインし、Ｐ１０４８０の構造モデルに従って修飾して、最良のフィットオーバーラップを確実なものにすることで同定される。
【０１７２】
適切には、本発明の方法及び使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号３４との配列アラインメントによって同定されるセット２又はセット４又はセット６又はセット７（国際公開第２００５／０６６３４７号パンフレット及び以下において定義される）において定義されるアミノ酸残基のあらゆる１又は２以上での１又は２以上のアミノ酸修飾を除いて、配列番号３４、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、又は配列番号３５として示されるアミノ酸配列を包含し得る、バリアント脂質アシルトランスフェラーゼであり得る。
【０１７３】
或いは、脂質アシルトランスフェラーゼは、前記親配列を本明細書において定義されるＰ１０４８０の構造モデルと構造的にアラインすることによって同定される、国際公開第２００５／０６６３４７号パンフレット及び以下において定義されるセット２又はセット４又はセット６又はセット７において定義されるアミノ酸残基のあらゆる１又は２以上での１又は２以上のアミノ酸修飾を除いて、配列番号３４、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、又は配列番号３５として示されるアミノ酸配列を包含する、バリアント脂質アシルトランスフェラーゼ酵素であり得、前記同定は、好ましくは、国際公開第２００５／０６６３４７号パンフレット及び以下において教示されるように、Ｐ１０４８０結晶構造の座標を、１ＩＶＮ．ＰＤＢ及び／又は１ＤＥＯ．ＰＤＢと構造的にアラインすることによって得られる。
【０１７４】
或いは、脂質アシルトランスフェラーゼは、セット２において教示されるアミノ酸残基のあらゆる１又は２以上での１又は２以上のアミノ酸修飾を除いて、配列番号３４、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、又は配列番号３５として示されるアミノ酸配列を包含する、バリアント脂質アシルトランスフェラーゼ酵素であり得、これは、国際公開第２００５／０６６３４７号パンフレット及び以下において教示されるように、前記親配列をｐｆａｍコンセンサス配列（配列番号２）に対してアラインし、Ｐ１０４８０の構造モデルに従って修飾して、最良のフィットオーバーラップを確実なものにすることで同定される。
【０１７５】
好ましくは、親酵素は、配列番号３４及び／又は配列番号１５及び／又は配列番号３５として示されるアミノ酸配列を包含するか又は前記配列に相同である酵素である。
【０１７６】
好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼは、国際公開第２００５／０６６３４７号パンフレット及び以下において定義されるセット２又はセット４又はセット６又はセット７において定義されるアミノ酸残基のいずれかの１又は２以上での１又は２以上のアミノ酸修飾を除いて、配列番号３４又は配列番号３５として示されるアミノ酸配列を包含するバリアント酵素であり得る。
【０１７７】
本発明の方法／使用において用いるための他の適切なバリアント脂質アシルトランスフェラーゼは、ＰＣＴ／ＩＢ２００９／０５４５３５において記載されているものである。
【０１７８】
脂質アシルトランスフェラーゼの三次構造によって、脂質アシルトランスフェラーゼをよりうまく操作することを可能にする、独特で興味深い構造が明らかにされている。特に、脂質アシルトランスフェラーゼの三次構造によって、穴（cave）構造や谷（canyon）構造が明らかにされており、これらの構造を形成する残基は以下に記載される。
【０１７９】
穴領域における改変によって、（例えば）例えば酵素の基質鎖長特異性が改変され得る。
【０１８０】
谷における改変（特に、いくつかの好ましい鍵となる修飾）が、例えば酵素の基質特異性の増強又は変化において重要であることが見出されている。
【０１８１】
特に、本発明者らによって、谷には、順位が高く、且つ特性が向上した興味深いバリアントを生じさせる、多くの修飾が存在することが見出されており、これらは、３１位、２７位、８５位、８６位、１１９位、及び１２０位で見られ得る。いくつかの実施形態において、３１位及び／又は２７位が非常に好ましい。
【０１８２】
これらのバリアント脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、親脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ得、且つ、コードされるアミノ酸配列における、ａ）酵素の谷領域、及び／又はｂ）挿入部位１、及び／又はｃ）挿入部位２に位置するアミノ酸（複数可）に対応する位置（複数可）に、少なくとも１つの修飾（適切には、少なくとも２つの修飾）を包含し、酵素の谷領域、挿入部位１、及び／又は挿入部位２は、一次構造又は三次構造に基づいてアラインされた場合に、以下に記載される配列番号１６又は配列番号６８として本明細書において示される酵素の谷領域、挿入部位１、又は挿入部位２に対応する領域として定義される。
【０１８３】
１つの実施形態において、好ましくは、谷及び／又は挿入部位１及び／又は挿入部位２に位置する一位置における修飾（複数可）は、コードされるアミノ酸配列における、谷領域及び／又は挿入部位１及び／又は挿入部位２の外側に位置するアミノ酸に対応する位置での、少なくとも１つの修飾と組み合わされる。
【０１８４】
１つの実施形態において、脂質アシルトランスフェラーゼは、コードされるアミノ酸配列における、２７位、３１位、８５位、８６位、１２２位、１１９位、１２０位、２０１位、２４５位、２３２位、２３５位、及び／又は２３６位（好ましくは２７位、３１位、８５位、８６位、１１９位、及び／又は１２０位、より好ましくは２７位及び／又は３１位）に位置するアミノ酸（複数可）に対応する位置（複数可）での、少なくとも１つの修飾（適切には、少なくとも２つの修飾）を包含し、ここで、位置の番号付けは、一次構造又は三次構造に基づいてアラインされた場合に、配列番号１６として本明細書において示される酵素の同一の位置に対応する位置として定義される。
【０１８５】
さらなる実施形態において、バリアント脂質アシルトランスフェラーゼは、少なくとも１つのさらなる修飾と組み合わされた、コードされるアミノ酸配列における、２７位及び／又は３１位に位置するアミノ酸（複数可）に対応する位置（複数可）での、少なくとも１つの修飾を包含し、ここで、位置の番号付けは、一次構造又は三次構造に基づいてアラインされた場合に、配列番号１６として本明細書において示される酵素の同一の位置に対応する位置として定義される。
【０１８６】
適切には、少なくとも１つのさらなる修飾は、８５位、８６位、１２２位、１１９位、１２０位、２０１位、２４５位、２３位、８１位、８２位、２８９位、２２７位、２２９位、２３３位、３３位、２０７位、１３０位の１又は２以上にあり得、ここで、位置の番号付けは、一次構造又は三次構造に基づいてアラインされた場合に、配列番号１６として本明細書において示される酵素の同一の位置に対応する位置として定義される。
【０１８７】
本発明において用いるための脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、少なくとも１つの修飾（適切には、少なくとも２つの修飾）が、コードされるアミノ酸配列における、ａ）酵素の谷領域、及び／又はｂ）挿入部位１、及び／又はｃ）挿入部位２に位置するアミノ酸（複数可）に対応する位置（複数可）に生じるような、修飾された骨格を包含し得、酵素の谷領域、挿入部位１、及び／又は挿入部位２は、一次構造又は三次構造に基づいてアラインされた場合に、配列番号１６又は配列番号６８として本明細書において示される酵素のそれぞれ谷領域、挿入部位１、又は挿入部位２に対応する領域として定義される。
【０１８８】
１つの実施形態において、好ましくは、谷及び／又は挿入部位１及び／又は挿入部位２の位置での修飾（複数可）は、コードされるアミノ酸配列における、谷領域及び／又は挿入部位１及び／又は挿入部位２の外側に位置するアミノ酸に対応する位置での、少なくとも１つの修飾と組み合わされる。
【０１８９】
好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列の骨格は、少なくとも１つの修飾（適切には、少なくとも２つの修飾）が、コードされるアミノ酸配列における、２７位、３１位、８５位、８６位、１２２位、１１９位、１２０位、２０１位、２４５位、２３２位、２３５位、及び／又は２３６位（好ましくは、２７位、３１位、８５位、８６位、１１９位、及び／又は１２０位、より好ましくは２７位及び／又は３１位）に位置するアミノ酸（複数可）に対応する位置（複数可）に生じるように、修飾されており、ここで、位置の番号付けは、一次構造又は三次構造に基づいてアラインされた場合に、配列番号１６として本明細書において示される酵素の同一の位置に対応する位置として定義される。
【０１９０】
さらに好ましい実施形態において、脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列の骨格は、少なくとも１つのさらなる修飾と組み合わされた、コードされるアミノ酸配列における、２７位、３１位に位置するアミノ酸（複数可）に対応する位置（複数可）に少なくとも１つの修飾（適切には、少なくとも２つの修飾）を包含し、ここで、位置の番号付けは、一次構造又は三次構造に基づいてアラインされた場合に、配列番号１６として本明細書において示される酵素の同一の位置に対応する位置として定義される。
【０１９１】
適切には、少なくとも１つのさらなる修飾は、８５位、８６位、１２２位、１１９位、１２０位、２０１位、２４５位、２３位、８１位、８２位、２８９位、２２７位、２２９位、２３３位、３３位、２０７位、１３０位の１又は２以上にあり得、ここで、位置の番号付けは、一次構造又は三次構造に基づいてアラインされた場合に、配列番号１６として本明細書において示される酵素の同一の位置に対応する位置として定義される。
【０１９２】
さらに、配列番号１６又は６８として本明細書において示されるエロモナス・サルモニシダの脂質アシルトランスフェラーゼに少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を包含する、本発明において用いるための改変された脂質アシルトランスフェラーゼ又はバリアント脂質アシルトランスフェラーゼが提供され、前記改変された脂質アシルトランスフェラーゼの触媒３残基のＡｓｐ残基のＮ末端にすぐ接して存在する基質鎖長特異性決定セグメントは、配列番号１６又は６８として本明細書において示されるエロモナス・サルモニシダの前記脂質アシルトランスフェラーゼと比較して改変された長さを有する。
【０１９３】
好ましくは、改変は、前記基質鎖長特異性決定セグメントにおけるアミノ酸の挿入又は欠失を包含し、例えば、前記親酵素の前記基質鎖長特異性決定セグメントが、異なる脂質アシルトランスフェラーゼの基質鎖長特異性決定セグメントで置換されて、前記改変された脂質アシルトランスフェラーゼが生産される。好ましくは、前記改変によって、前記脂質アシルトランスフェラーゼによって転移され得るアシル鎖の長さが増大する。
【０１９４】
好ましくは、改変された脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号１６又は６８として本明細書において示されるエロモナス・サルモニシダの脂質アシルトランスフェラーゼに少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を包含する。
【０１９５】
修飾前のバリアント脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６９、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号６２、配列番号６３、若しくは配列番号２４として本明細書において示されるヌクレオチド配列であるか、又は、配列番号６９、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号６２、配列番号６３、若しくは配列番号２４として本明細書において示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性（好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するヌクレオチド配列であるか、又は、遺伝暗号の縮重により配列番号６９、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号６２、配列番号６３、若しくは配列番号２４に関連するヌクレオチド配列であるか、又は、中度のストリンジェンシー条件下若しくは高いストリンジェンシー条件下で、配列番号６９、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号６２、配列番号６３、若しくは配列番号２４として本明細書において示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列である。
【０１９６】
好ましい実施形態において、バリアント脂質アシルトランスフェラーゼは、中度のストリンジェンシー条件下若しくは高いストリンジェンシー条件下で配列番号４９若しくは配列番号６９又は配列番号４９若しくは配列番号６９の相補配列のほぼ全長にわたりハイブリダイズする核酸（好ましくは、単離された又は組換えられた核酸）配列によってコードされ、コードされるポリペプチドは、３１位のＱ、Ｈ、Ｎ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、又はＣ、８６位のＲ、Ｙ、Ｓ、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｔ、Ｍ、Ｆ、Ｃ、又はＬ、２７位のＲ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｙ、Ｄ、Ｎ、Ｖ、Ｃ、Ｑ、Ｌ、Ｅ、Ｓ、又はＦ、８５位のＨ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、１１９位のＴ又はＩ、１２０位のＫ又はＥ、１２２位のＳ、Ｌ、Ａ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｈ、Ｍ、又はＣ、２０１位のＲ、２４５位のＳ、２３５位のＡ又はＶ、２３２位のＧ又はＳ、２３６位のＧ又はＥから選択される１又は２以上のアミノ酸残基を包含し、位置は、配列番号１６に関して同等なアミノ酸位置である。
【０１９７】
バリアント脂質アシルトランスフェラーゼは、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有し、且つ配列番号１６又は６８として示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％（好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％）同一であるアミノ配列を包含し、且つ２７位、３１位、８５位、８６位、１２２位、１１９位、１２０位、２０１位、２４５位、２３２位、２３５位、及び／又は２３６位（好ましくは２７位、３１位、８５位、８６位、１１９位、及び／又は１２０位、より好ましくは２７位及び／又は３１位）の位置の１又は２以上に１又は２以上の修飾を包含する、プロペプチド又はポリペプチドを包含し得る。
【０１９８】
１つの実施形態において、バリアントは、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有し、且つ、２７位、３１位、８５位、８６位、１２２位、１１９位、１２０位、２０１位、２４５位、２３２位、２３５位、及び／又は２３６位（好ましくは２７位、３１位、８５位、８６位、１１９位、及び／又は１２０位、より好ましくは２７位及び／又は３１位）の位置の１又は２以上での１又は２以上の修飾を除き、配列番号１６又は６８として示されるアミノ酸配列を包含する、プロペプチド又はポリペプチドを包含する。
【０１９９】
別の実施形態において、脂質アシルトランスフェラーゼは、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有し、且つ配列番号１６又は６８として示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％（好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％）同一であるアミノ配列を包含し、且つ少なくとも１つのさらなる修飾と組み合わされた、２７位及び／又は３１位での１又は２以上の修飾を包含する、プロペプチド又はポリペプチドを包含し、ここで、位置の番号付けは、一次構造又は三次構造に基づいてアラインされた場合に、配列番号６として本明細書において示される酵素の同一の位置に対応する位置として定義される。
【０２００】
適切には、少なくとも１つのさらなる修飾は、８５位、８６位、１２２位、１１９位、１２０位、２０１位、２４５位、２３位、８１位、８２位、２８９位、２２７位、２２９位、２３３位、３３位、２０７位、１３０位の１又は２以上にあり得、ここで、位置の番号付けは、一次構造又は三次構造に基づいてアラインされた場合に、配列番号１６として本明細書において示される酵素の同一の位置に対応する位置として定義される。
【０２０１】
好ましい実施形態において、脂質アシルトランスフェラーゼは、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有し、且つ、少なくとも１つのさらなる修飾と組み合わされた、２７位及び／又は３１位の１又は２以上での１又は２以上の修飾を除き、配列番号１６又は６８として示されるアミノ酸配列を包含する、プロペプチド又はポリペプチドを包含する。
【０２０２】
適切には、少なくとも１つのさらなる修飾は、８５位、８６位、１２２位、１１９位、１２０位、２０１位、２４５位、２３位、８１位、８２位、２８９位、２２７位、２２９位、２３３位、３３位、２０７位、及び／又は１３０位の１又は２以上にあり得、ここで、位置の番号付けは、一次構造又は三次構造に基づいてアラインされた場合に、配列番号１６として本明細書において示される酵素の同一の位置に対応する位置として定義される。
【０２０３】
脂質アシルトランスフェラーゼは、成熟ペプチド、すなわち脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドへのさらなる翻訳後修飾を受けるプロペプチドであり得る。例示に限定すると、配列番号６８は、いくつかのアミノ酸、より具体的には３８個のアミノ酸を除去するための翻訳後及び／又は転写後修飾を受けていることを除けば、配列番号１６と同一である。したがって、配列番号１６として本明細書において示されるポリペプチドは、いくつかの状況（すなわち、いくつかの宿主細胞）において、翻訳後及び／又は転写後修飾によって成熟ペプチドにさらにプロセシングされる、プロペプチドであると考えられ得る。翻訳後及び／又は転写後修飾に関する、詳細な修飾、例えば、切断部位（複数可）は、宿主の種に応じてわずかに変化し得る。いくつかの宿主種において、翻訳後及び／又は転写後修飾がない場合があり、その場合、プロペプチドは、成熟ペプチド（すなわち、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド）に等しい。理論に束縛されるものではないが、切断部位（複数可）は、配列番号６８と配列番号１６との比較を参照することによって示されるように、数残基（例えば、１、２、又は３残基）分、切断部位と比較していずれかの方向にずれ得る。言い換えると、例えば２３５位−ＡＴＲから２７３位（ＲＲＳＡＳ）での切断よりも、例えば残基２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、又は２３８で切断が開始し得る。さらに、又は代替的に、切断は、例えば残基２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、又は２７６で終了し得る。さらに、又は代替的に、切断は、約３８個のアミノ酸の除去をもたらし得、いくつかの実施形態において、切断は、３０〜４５個の残基、例えば３４〜４２個の残基、例えば３６〜４０個の残基、好ましくは３８個の残基の除去をもたらし得る。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、一次構造に対する相同性を確証するために、脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を、配列番号１６又は６８として本明細書において示される脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の一次配列と、特に、配列が知られている全ての又はほとんどの脂質アシルトランスフェラーゼにおける、インバリアントであることが知られている残基のセットと、直接的に比較する。保存される残基をアラインして、アラインメントを維持するために必要な挿入及び欠失を可能にした（すなわち、無作為な欠失及び挿入を介した保存される残基の排除を避けた）後、配列番号１６又は６８の一次配列における特定のアミノ酸に同等な残基を定義する。好ましい実施形態において、保存される残基のアラインメントは、このような残基の１００％を保存する。しかし、保存される残基の７５％超、又はわずか５０％のアラインメントもまた、同等の残基を定義するために適切である。好ましい実施形態において、触媒性セリン残基及びヒスチジン残基の保存が維持される。保存される残基は、他のエロモナス種及びあらゆる他の生物のものなどの、他の脂質アシルトランスフェラーゼにおける、配列番号１６又は６８として示される脂質アシルトランスフェラーゼの対応する同等なアミノ酸残基を定義するために用いられる。
【０２０５】
親脂質アシルトランスフェラーゼを配列番号１６又は配列番号６８（参照配列）とアラインするために、ペアワイズアラインメントなどの配列アラインメントを用いることができる（http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html）。これによって、配列番号６８又は配列番号１６を基準にして定義されたアミノ酸の１又は２以上に対応する、別の親脂質アシルトランスフェラーゼポリペプチドにおける同等なアミノ酸を、決定及び修飾することができる。当業者には容易に理解されるように、ｅｍｂｏｓｓペアワイズアラインメントを用いる場合、標準的な設定で通常は十分である。両配列の全長をカバーするアラインメントを行うためには、対応する残基は、「ｎｅｅｄｌｅ」を用いて同定することができる。しかし、「ｗａｔｅｒ」を用いて、２つの配列間の類似性の最良の領域を見出すことも可能である。
【０２０６】
或いは、特に、親脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号１６又は配列番号６８と、低い一次配列相同性を有する場合には、配列番号１６又は配列番号６８を基準にして定義されるアミノ酸の１又は２以上に対応する、別の親脂質アシルトランスフェラーゼにおける対応するアミノ酸配列は、配列番号６８又は配列番号１６、好ましくは配列番号６８の構造モデルとの構造的アラインメントによって決定することができる。
【０２０７】
したがって、同等な残基は、三次構造がＸ線結晶学によって決定されている脂質アシルトランスフェラーゼに対して三次構造レベルで相同性を決定することによって定義することができる。これに関連して、「同等な残基」は、配列番号１６又は６８として本明細書において示される脂質アシルトランスフェラーゼの特定のアミノ酸残基の主鎖原子の２以上の原子座標が、アラインメント後に、０．１３ｎｍ以内、好ましくは０．１ｎｍ以内である残基として定義される（Ｎに対してＮ、ＣＡに対してＣＡ、Ｃに対してＣ、及びＯに対してＯ）。アラインメントは、配列番号１６又は６８として本明細書において示される脂質アシルトランスフェラーゼに対する、問題の脂質アシルトランスフェラーゼの水素以外のタンパク質原子の原子座標の最大のオーバーラップをもたらすように、最良モデルを方向付け及び位置決定することで達成される。当技術分野において知られているように、最良モデルは、利用可能な最大の分解能での実験的な回析データについて、最低のＲ因子をもたらす結晶学モデルである。配列番号１６又は６８として本明細書において示される脂質アシルトランスフェラーゼの特定の残基に機能的及び／構造的に類似である同等な残基は、タンパク質構造を改変、修飾、又は調節して基質の特徴に変化をもたらすような立体構造を選択的に採用する、脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸として定義され、前記基質の特徴は、例えば、定義された様式の、且つ配列番号１６又は６８として本明細書において示される脂質アシルトランスフェラーゼの特定の残基に起因する、基質の結合及び／又は触媒である。さらに、これらの残基は、所与の残基の主鎖原子が、相同位置の占有に基づく同等性の基準を満たさなくても、残基の少なくとも２つの側鎖原子の原子座標が、配列番号１６又は６８として本明細書において示される脂質アシルトランスフェラーゼの対応する側鎖原子の０．１３ｎｍ以内に存在するという範囲で、類似位置を占める、（三次構造がｘ線結晶学によって得られたケースにおける）脂質アシルトランスフェラーゼの残基である。
【０２０８】
配列番号６８として本明細書において示される脂質アシルトランスフェラーゼ（Ｎ８０Ｄ突然変異を包含するエロモナス・サルモニシダの脂質アシルトランスフェラーゼである）の三次元構造の座標は、ＰＣＴ／ＩＢ２００９／０５４５３５において記載されており、三次構造のレベルで同等な残基の決定における使用が考えられる。
【０２０９】
エロモナス・サルモニシダのアシルトランスフェラーゼにおいて、構造的に類似の大腸菌（E. coli）のチオエステラーゼと比較して、最後のβ鎖とＡＳＰ−Ｘ−Ｘ＿ＨＩＳモチーフとの間に大きな挿入が存在する。この挿入によって、大きな空洞（以下、アシル酵素中間体の脂肪族鎖を結合する「穴」と呼ぶが生じる。この領域の配列及びサイズを調節することによって、アシル酵素中間体の脂肪族鎖、すなわち酵素によって転移するアシル鎖のための、より小さな又はより大きな「穴」又は空洞が生じる。したがって、このファミリーの酵素を操作して、異なる長さのアシル鎖が選択的に転移するようにすることができる。
【０２１０】
大腸菌のチオエステラーゼと比較して、４つの挿入が、エロモナス・サルモニシダの脂質アシルトランスフェラーゼにおいて見られ（ＰＤＢエントリー１ＩＶＮ）、これは、両方の構造に共通の、共通の二次構造エレメントを連結する。
【０２１１】
配列番号６８として本明細書において示される脂質アシルトランスフェラーゼにおけるこれらの挿入のアミノ酸座標を、以下の表に列挙する。
【０２１２】
表：脂質アシルトランスフェラーゼにおける挿入
挿入      残基
挿入１    ２２〜３６
挿入２    ７４〜８８
挿入３    １６２〜１６８
挿入４    ２１３〜２８１
【０２１３】
ＰＣＴ／ＩＢ２００９／０５４５３５において詳述されているように、脂質アシルトランスフェラーゼにおいて、Ｓｅｒ１６及びＨｉｓ２９１によって分離されている２つの領域内に分けられ得る、基質が結合するための大きな表面が存在し、Ｓｅｒ１６及びＨｉｓ２９１は、Ａｓｐ２８８と共に、特徴的な触媒３残基を形成する。これらの２つの領域は、分子内を貫く囲まれた空洞又は「谷」に通じる、深いチャネル又は「谷」（以下、「谷」と呼ぶ）であると特徴付けされ得る。
【０２１４】
谷を形成する残基を、以下の表に列挙する。
【０２１５】
表：谷の残基
挿入１            Ｍ２３、Ｍ２７、Ｙ３０、Ｌ３１
セグメント１      Ｆ４２、Ｇ６７、Ｇ６８
挿入２            Ｄ８０、Ｐ８１、Ｋ８２、Ｑ８４、Ｖ８５、Ｉ８６
セグメント２ａ    Ｙ１１７、Ａ１１９、Ｙ１２０
挿入４            Ｇ２２９、Ｙ２３０、Ｖ２３１
【０２１６】
穴を形成する残基を、以下の表に列挙する。
【０２１７】
表：穴の残基
セグメント１    Ｄ１５、Ｓ１６、Ｌ１８
セグメント２    Ｗ１１１、Ａ１１４、Ｌ１１５、Ｌ１１８
セグメント３    Ｐ１５６、Ｄ１５７、Ｌ１５８、Ｑ１６０、Ｎ１６１
セグメント４    Ｆ２０６、Ａ２０７、Ｅ２０８、Ｍ２０９、Ｌ２１０
セグメント５    Ｍ２８５、Ｆ２８６、Ｖ２９０、Ｈ２９１、Ｐ２９２、Ｖ２９５
【０２１８】
セグメント３及び４は、それぞれ挿入３及び４の前にあり、セグメント５は挿入４の直後にある。挿入４及び５はまた、穴を生じさせる過剰な囲い込みに寄与し、したがって、挿入１及び２が谷の内側を形成する一方で挿入３及び４が覆い構造を形成するという点で、穴は谷と異なる。挿入３及び挿入４は穴を覆う。
【０２１９】
１つの実施形態において、本発明において用いるための脂質アシルトランスフェラーゼは、谷、穴、挿入１、挿入２、挿入３、又は挿入４の１又は２以上におけるアミノ酸残基を修飾することによって改変することができる。
【０２２０】
１つの実施形態において、本発明において用いるための脂質アシルトランスフェラーゼは、谷、挿入１、又は挿入２の１又は２以上におけるアミノ酸残基を修飾することによって改変することができる。
【０２２１】
１つの実施形態において、脂質アシルトランスフェラーゼの、アシル鎖を結合する空洞の直径は、より大きな穴を形成する変化をアミノ酸残基にもたらすことによって改変することができる。これは、上記の二次構造の共通の特徴を連結する領域のサイズを調節することによって行うことができる。特に、穴のサイズは、酵素の最後の（５番目の）β鎖と、触媒３残基の一部を形成するＡｓｐ−Ｘ−Ｘ−Ｈｉｓモチーフとの間の領域におけるアミノ酸を変化させることによって改変することができる。
【０２２２】
脂質アシルトランスフェラーゼの基質鎖長特異性決定セグメントは、酵素のβ５β鎖と、酵素の触媒３残基のＡｓｐ残基（Ａｓｐ残基は、Ａｓｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｈｉｓモチーフの一部である）との間に存在する連続するアミノ酸からなる領域である。
【０２２３】
βシートが５つの平行な鎖からなる、三層のα／β／α特徴的構造をそれぞれ示す、エロモナス・サルモニシダの脂質アシルトランスフェラーゼ及び大腸菌チオエステラーゼ（受託番号１ＩＶＮ＿ＡとしてＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベースとして寄託されている、ＧＩＤ：３３３５７０６６）の三次構造によって、各脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の基質鎖長特異性決定セグメントの決定が可能になる。
【０２２４】
エロモナス・サルモニシダの脂質アシルトランスフェラーゼの基質鎖長特異性決定セグメントは、酵素の触媒３残基のＡｓｐ残基に対してＮ末端にすぐ接して存在する。しかし、基質鎖長特異性決定セグメントの長さは、Ａｓｐ残基と酵素のβ５β鎖との間の距離に従って変化し得る。例えば、脂質アシルトランスフェラーゼの基質鎖長特異性決定セグメントは、それぞれ、約１３アミノ酸長、１９アミノ酸長、及び約７０アミノ酸長である。このように、脂質アシルトランスフェラーゼに応じて、基質鎖長特異性決定セグメントは、１０〜７０アミノ酸長の範囲、例えば、１０〜３０アミノ酸長、３０〜５０アミノ酸長、又は５０〜７０アミノ酸長の範囲であり得る。
【０２２５】
以下の表に、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の基質鎖長特異性決定セグメントについての例示的な配列を示す。
【０２２６】
エロモナス・サルモニシダの脂質アシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）
AEMLRDPQNFGLSDVENPCYDGGYVWKPFATRSV  配列番号７３
STDRQLSASPQERLAIAGNPLLAQAVASPMARRSA
SPLNCEGKMF
【０２２７】
ある実施形態において、基質鎖長特異性決定セグメントのアミノ酸配列は、野生型酵素のアミノ酸配列であってもなくてもよい。ある実施形態において、基質鎖長特異性決定セグメントは、野生型脂質アシルトランスフェラーゼの基質鎖長特異性決定セグメントに対して少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し得る。
【０２２８】
適切には、バリアント酵素は、部位特異的突然変異誘発を用いて調製することができる。
【０２２９】
好ましい修飾は、Ｌ０３１位、Ｉ０８６位、Ｍ０２７位、Ｖ０８５位、Ａ１１９位、Ｙ１２０位、Ｗ１２２位、Ｅ２０１位、Ｆ２３５位、Ｗ２３２位、Ａ２３６位、及び／又はＱ２４５位の１又は２以上に位置する。
【０２３０】
特に、鍵となる修飾には、Ｌ３１Ｑ、Ｈ、Ｎ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、若しくはＣ （好ましくは、Ｌ３１Ｑ）、Ｍ２７Ｒ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｙ、Ｄ、Ｎ、Ｖ、Ｃ、Ｑ、Ｌ、Ｅ、Ｓ、若しくはＦ（好ましくは、Ｍ２７Ｖ）、Ｖ８５Ｈ、Ｒ、Ｄ、若しくはＥ、Ｉ８６Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｔ、Ｍ、Ｆ、Ｃ、若しくはＬ（好ましくは、Ｉ８６Ｓ又はＡ）、Ａ１１９Ｔ若しくはＩ、Ｙ１２０Ｋ若しくはＥ、Ｗ１２２Ｓ、Ｌ、若しくはＡ（好ましくは、Ｗ１２２Ｌ）、Ｅ２０１Ｒ、Ｑ２４５Ｓ、Ｆ２３５Ａ若しくはＶ、Ｗ２３２Ｇ若しくはＳ、及び／又はＡ２３６Ｇ若しくはＥという修飾の１又は２以上が含まれる。
【０２３１】
１つの実施形態において、少なくとも１つの修飾が谷において生じる場合、修飾（複数可）は、３１位、２７位、８５位、８６位、１１９位、１２０位の１又は２以上で生じる。
【０２３２】
特に、谷における鍵となる修飾には、Ｌ３１Ｑ、Ｈ、Ｎ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、又はＣ（好ましくは、Ｌ３１Ｑ）、Ｍ２７Ｒ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｙ、Ｄ、Ｎ、Ｖ、Ｃ、Ｑ、Ｌ、Ｅ、Ｓ、又はＦ（好ましくは、Ｍ２７Ｖ）、Ｖ８５Ｈ、Ｒ、Ｄ、又はＥ、Ｉ８６Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｔ、Ｍ、Ｆ、Ｃ、又はＬ（好ましくは、Ｉ８６Ｓ又はＡ）、Ａ１１９Ｔ又はＩ、Ｙ１２０Ｋ又はＥという修飾の１又は２以上が含まれ、これらは、互いに組み合わされ得、且つ／又はさらなる修飾と組み合わされ得る。
【０２３３】
１つの実施形態において、好ましくは、修飾が挿入部位１において生じる場合、修飾は、１又は２以上の３１位及び／又は２７位で生じる。適切には、修飾は、Ｌ３１Ｑ、Ｈ、Ｎ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、若しくはＣ（好ましくは、Ｌ３１Ｑ）、及び／又はＭ２７Ｒ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｙ、Ｄ、Ｎ、Ｖ、Ｃ、Ｑ、Ｌ、Ｅ、Ｓ、若しくはＦ（好ましくは、Ｍ２７Ｖ）であり得る。
【０２３４】
１つの実施形態において、好ましくは、修飾が挿入部位２において生じる場合、修飾は、０８５位、０８６位で生じる。適切には、修飾は、Ｖ８５Ｈ、Ｒ、Ｄ、若しくはＥ、及び／又はＩ８６Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｔ、Ｍ、Ｆ、Ｃ、若しくはＬであり得る。
【０２３５】
１つの実施形態において、好ましくは、修飾が挿入部位４において生じる場合、修飾は、２４５位で生じる。適切には、修飾は、Ｑ２４５Ｓであり得る。
【０２３６】
１つの実施形態において、好ましくは、修飾は少なくとも挿入部位１において生じる。
【０２３７】
別の実施形態において、好ましくは、修飾は、挿入部位２及び／若しくは４におけるさらなる修飾と組み合わされて、且つ／又は１１９位、１２０位、１２２位、２０１位、７７位、１３０位、８２位、１２０位、２０７位、１６７位、２２７位、２１５位、２３０位、２８９位の１若しくは２以上で、少なくとも挿入部位１において生じる。
【０２３８】
さらなる実施形態において、好ましくは、修飾は、挿入部位４におけるさらなる修飾と組み合わされて、且つ／又は１２２位、２０１位、７７位、１３０位、８２位、１２０位、２０７位、１６７位、２２７位、２１５位、２３０位、２８９位の１若しくは２以上で、少なくとも谷領域において生じる。
【０２３９】
好ましい修飾は、
Ｒ１３０Ｒ、Ｖ、Ｑ、Ｈ、Ａ、Ｄ、Ｌ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｃ、Ｙ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、若しくはＭ、
Ｋ８２Ｒ、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ｌ、Ｅ、Ｔ、Ｍ、若しくはＧ、
Ｇ１２１Ｓ、Ｒ、Ｇ、Ｅ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｖ、Ｑ、若しくはＡ、
Ｙ７４Ｙ若しくはＷ、
Ｙ８３Ｆ若しくはＰ、
Ｉ７７Ｔ、Ｍ、Ｈ、Ｑ、Ｓ、Ｃ、Ａ、Ｅ、Ｌ、Ｙ、Ｆ、Ｒ若しくはＶ、
Ａ２０７Ｅ、
Ｑ１６７Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｇ、Ｌ若しくはＭ、
Ｄ２２７Ｌ、Ｃ、Ｓ、Ｅ、Ｆ、Ｖ、Ｉ、Ｔ、Ｙ、Ｐ、Ｇ、Ｒ、Ｄ、Ｈ若しくはＡ、
Ｎ２１５Ｇ、
Ｙ２３０Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｓ、Ｎ、Ｈ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、又は
Ｎ２８９Ｐ
という特定の部位で生じる。
【０２４０】
３１位、２７位、８５位、８６位、１１９位、１２０位、１２２位、２０１位、２４５位、２３５位、２３２位、及び／又は２３６位での１又は２以上の修飾（例えば、修飾は、Ｌ３１Ｑ、Ｈ、Ｎ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、若しくはＣ（好ましくは、Ｌ３１Ｑ）、Ｍ２７Ｒ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｙ、Ｄ、Ｎ、Ｖ、Ｃ、Ｑ、Ｌ、Ｅ、Ｓ、若しくはＦ（好ましくは、Ｍ２７Ｖ）、Ｖ８５Ｈ、Ｒ、Ｄ、若しくはＥ、Ｉ８６Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｔ、Ｍ、Ｆ、Ｃ、若しくはＬ（好ましくは、Ｉ８６Ｓ又はＡ）、Ａ１１９Ｔ若しくはＩ、Ｙ１２０Ｋ若しくはＥ、Ｗ１２２Ｓ、Ｌ、若しくはＡ（好ましくは、Ｗ１２２Ｌ）、Ｅ２０１Ｒ、Ｑ２４５Ｓ、Ｆ２３５Ａ若しくはＶ、Ｗ２３２Ｇ若しくはＳ、及び／又はＡ２３６Ｇ若しくはＥの１又は２以上であり得る）と組み合わせて、適切には、バリアント脂質アシルトランスフェラーゼは、１３０位、８２位、１２１位、７４位、８３位、７７位、２０７位、１６７位、２２７位、２１５位、２３０位、２８９位の１又は２以上でさらに修飾され得（例えば、さらなる修飾は、Ｒ１３０Ｒ、Ｖ、Ｑ、Ｈ、Ａ、Ｄ、Ｌ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｃ、Ｙ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、若しくはＭ、Ｋ８２Ｒ、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ｌ、Ｅ、Ｔ、Ｍ、若しくはＧ、Ｇ１２１Ｓ、Ｒ、Ｇ、Ｅ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｖ、Ｑ、若しくはＡ、Ｙ７４Ｙ若しくはＷ、Ｙ８３Ｆ若しくはＰ、Ｉ７７Ｔ、Ｍ、Ｈ、Ｑ、Ｓ、Ｃ、Ａ、Ｅ、Ｌ、Ｙ、Ｆ、Ｒ、若しくはＶ、Ａ２０７Ｅ、Ｑ１６７Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｇ、Ｌ、若しくはＭ、Ｄ２２７Ｌ、Ｃ、Ｓ、Ｅ、Ｆ、Ｖ、Ｉ、Ｔ、Ｙ、Ｐ、Ｇ、Ｒ、Ｄ、Ｈ、若しくはＡ、Ｎ２１５Ｇ、Ｙ２３０Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｓ、Ｎ、Ｈ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、及び／又はＮ２８９Ｐの１又は２以上であり得る）、好ましくは、バリアント脂質アシルトランスフェラーゼは、１３０位、８２位、７７位、又は２２７位の少なくとも１又は２以上でさらに修飾され得る。
【０２４１】
誤解を避けるために、脂質アシルトランスフェラーゼの骨格は、配列番号１６として本明細書において示される脂質アシルトランスフェラーゼ酵素とアラインした場合（一次構造又は三次構造に基づいて）、好ましくは、８０位にＤを有する。したがって、本発明者らは、本明細書において教示される組合せの多くにおいて、Ｎ８０Ｄを修飾として示している。Ｎ８０Ｄが適切な修飾であると述べられておらず、親骨格が８０位にＤを包含しない場合には、バリアントが８０位にＤを包含することを確実にするために、Ｎ８０Ｄのさらなる修飾がバリアント脂質アシルトランスフェラーゼに組み込まれなくてはならない。
【０２４２】
骨格脂質アシルトランスフェラーゼ又は親脂質アシルトランスフェラーゼが既にＮ８０Ｄ修飾を含有している場合、他の修飾は、Ｎ８０Ｄ修飾を参照することなく表すことができ、すなわち、例えば、Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｗ１２２Ｌは、Ｌ３１Ｑ、Ｗ１２２Ｌと表されていてよい。
【０２４３】
しかし、Ｎ８０Ｄ修飾が好ましい修飾であり、既に８０位にアミノ酸Ｄを保有する骨格酵素又は親酵素が好ましくは用いられることに留意することは重要である。しかし、適切な位置にアミノ酸Ｄを含有しない骨格が用いられる場合（例えば配列番号１、３、４、１５、３４、又は３５として本明細書において示される脂質アシルトランスフェラーゼの１又は２以上など）、好ましくは、さらなるＮ８０Ｄの修飾が含まれる。
【０２４４】
適切には、親配列と配列番号６８又は配列番号１６とのアラインメントによって同定される３１位での置換は、Ｑ、Ｈ、Ｙ、及びＦからなる群から選択されるアミノ酸残基への置換であり得、好ましくはＱであり得る。
【０２４５】
適切には、バリアントポリペプチドは、２７位、７７位、８０位、８２位、８５位、８５位、８６位、１２１位、１２２位、１３０位、１６７位、２０７位、２２７位、２３０位、及び２８９位のアミノ酸残基位置のあらゆる１又は２以上で１又は２以上のさらなる修飾（複数可）を包含し、この位置は、親配列と配列番号６８とのアラインメントによって同定される。適切には、１又は２以上のさらなる修飾（複数可）の少なくとも１つは、８６位、１２２位、又は１３０位のアミノ酸残基位置であり得、この位置は、親配列と配列番号６８とのアラインメントによって同定される。
【０２４６】
適切には、バリアント脂質アシルトランスフェラーゼは、Ｉ８６（Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｒ、Ｉ、又はＹ）、Ｗ１２２（Ｓ、Ａ、Ｆ、Ｗ、Ｃ、Ｈ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、又はＹ）、Ｒ１３０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｒ、Ｆ、又はＹ）という置換の１若しくは２以上、又はそのあらゆる組合せを包含する。
【０２４７】
バリアント脂質アシルトランスフェラーゼは、
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ、Ｗ１２２Ｆ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｗ１２２Ｌ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｖ、Ｗ１２２Ｌ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｉ、Ｗ１２２Ｌ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ、Ｒ１３０Ｒ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｋ８２Ｒ、Ｉ８６Ａ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ、Ｗ１２２Ｗ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ、Ｗ１２２Ｙ
Ｍ２７Ｖ、Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ａ、Ｗ１２２Ｌ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｗ１２２Ｌ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ、Ｇ１２１Ｓ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｋ８２Ｒ、Ｉ８６Ｓ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ、Ｗ１２２Ｌ、Ｒ１３０Ｙ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ、Ｗ１２２Ｌ、Ｒ１３０Ｖ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｔ、Ｗ１２２Ｌ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ、Ｗ１２２Ｌ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｗ１２２Ｌ、Ｒ１３０Ｑ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ、Ｗ１２２Ｌ、Ｒ１３０Ｒ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｇ１２１Ｒ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ａ
Ｍ２７Ｃ、Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ
Ｍ２７Ｑ、Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｇ１２１Ｓ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ、Ｗ１２２Ｒ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｒ１３０Ｑ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ、Ｗ１２２Ｈ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｍ、Ｗ１２２Ｌ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｒ１３０Ｎ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ、Ｗ１２２Ｌ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｋ８２Ｎ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ、Ｗ１２２Ｍ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｗ１２２Ｌ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｋ８２Ｈ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｒ１３０Ｈ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｒ１３０Ａ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｇ１２１Ｓ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ、Ｗ１２２Ｌ、Ｒ１３０Ｄ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｍ
Ｌ３１Ｑ、Ｙ７４Ｙ、Ｎ８０Ｄ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｒ１３０Ｌ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｙ８３Ｆ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｋ８２Ｓ
Ｌ３１Ｑ、Ｉ７７Ｔ、Ｎ８０Ｄ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ、Ｗ１２２Ｌ、Ｒ１３０Ｉ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ、Ｗ１２２Ｌ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｆ、Ｗ１２２Ｌ
Ｍ２７Ｎ、Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｙ８３Ｐ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｒ１３０Ｋ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｋ８２Ｒ、Ｉ８６Ｓ、Ｗ１２２Ｌ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｋ８２Ｌ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ、Ｇ１２１Ｇ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ａ、Ｒ１３０Ｑ
Ｍ２７Ｈ、Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｗ１２２Ｌ、Ａ２０７Ｅ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｗ１２２Ｌ、Ｒ１３０Ｌ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｋ８２Ｅ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｇ１２１Ｅ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｗ１２２Ｌ、Ｒ１３０Ｒ
Ｌ３１Ｑ、Ｉ７７Ｍ、Ｎ８０Ｄ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｋ８２Ｔ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｗ１２２Ｌ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｗ１２２Ｈ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｑ１６７Ｔ
Ｌ３１Ｑ、Ｉ７７Ｈ、Ｎ８０Ｄ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｇ１２１Ｋ
Ｌ３１Ｑ、Ｉ７７Ｑ、Ｎ８０Ｄ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｗ１２２Ｌ、Ｒ１３０Ｎ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｗ１２２Ｌ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｇ１２１Ｄ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｒ１３０Ｔ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｒ１３０Ｔ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｋ８２Ｍ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｑ１６７Ｈ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｔ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｑ１６７Ｉ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｃ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｑ１６７Ｇ
Ｍ２７Ｌ、Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ、Ｇ１２１Ｒ
Ｌ３１Ｑ、Ｉ７７Ｓ、Ｎ８０Ｄ
Ｌ３１Ｑ、Ｉ７７Ｃ、Ｎ８０Ｄ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｇ１２１Ｎ
Ｌ３１Ｑ、Ｉ７７Ａ、Ｎ８０Ｄ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｒ１３０Ｍ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｗ１２２Ｆ
Ｍ２７Ｇ、Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｋ８２Ｇ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ、Ｗ１２２Ｌ、Ｒ１３０Ｋ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｒ１３０Ａ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｉ
Ｌ３１Ｑ、Ｉ７７Ｅ、Ｎ８０Ｄ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｄ２２７Ｌ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｖ８５Ｈ、Ｎ２１５Ｇ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ａ、Ｗ１２２Ｌ、Ｒ１３０Ｎ
Ｌ３１Ｑ、Ｉ７７Ｒ、Ｎ８０Ｄ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｆ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｙ、Ｗ１２２Ｌ
Ｍ２７Ｋ、Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｄ２２７Ｃ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｒ１３０Ｌ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｃ、Ｗ１２２Ｌ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｑ１６７Ｌ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｖ８５Ｈ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｑ１６７Ｍ
Ｍ２７Ｄ、Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｌ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｙ２３０Ａ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｗ１２２Ｒ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｙ２３０Ｇ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｄ２２７Ｓ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｗ１２２Ｌ、Ａ２０７Ｅ、Ｎ２８９Ｐ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｗ１２２Ｙ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｌ、Ｗ１２２Ｌ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｋ８２Ｒ、Ｉ８６Ｓ、Ｇ１２１Ｓ、Ｒ１３０Ｑ
Ｌ３１Ｑ、Ｙ７４Ｗ、Ｎ８０Ｄ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｒ１３０Ｆ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｇ１２１Ｖ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｗ１２２Ｌ、Ｒ１３０Ｍ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｒ１３０Ｖ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｙ２３０Ｖ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｎ２１５Ｇ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ、Ｗ１２２Ｌ、Ｒ１３０Ｎ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｙ２３０Ｒ
Ｍ２７Ｅ、Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｙ２３０Ｉ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ、Ｗ１２２Ｌ、Ｒ１３０Ｓ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｋ８２Ｒ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｄ２２７Ｅ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｋ８２Ｒ、Ｉ８６Ａ、Ｇ１２１Ｓ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｒ１３０Ｇ
Ｌ３１Ｑ、Ｉ７７Ｖ、Ｎ８０Ｄ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｇ１２１Ｇ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｙ２３０Ｔ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｋ８２Ｒ、Ｉ８６Ｓ、Ｒ１３０Ｎ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｄ２２７Ｆ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ａ、Ｇ１２１Ｒ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ、Ｒ１３０Ｎ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｗ１２２Ｃ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｙ２３０Ｓ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｒ１３０Ｙ
Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｒ１３０Ｃ
Ｌ３１Ｑ、Ｉ７７Ｌ、Ｎ８０Ｄ
Ａ１１９Ｔ、Ｎ８０Ｄ
Ａ１９９Ａ、Ｎ８０Ｄ
Ｇ６７Ａ、Ｎ８０Ｄ、Ｖ８５Ｈ
という修飾の組合せの１つを包含し得（親骨格は既に８０位にアミノ酸Ｄを包含しており、修飾は、Ｎ８０Ｄを参照することなく表すことができる）、
前記位置は、親配列と配列番号６８又は配列番号１６とのアラインメントによって同定される。
【０２４８】
適切には、バリアント脂質アシルトランスフェラーゼは、３１位での修飾を除いて、場合によっては２７位、７７位、８０位、８２位、８５位、８５位、８６位、１２１位、１２２位、１３０位、１６７位、２０７位、２２７位、２３０位、及び２８９位というアミノ酸残基位置のあらゆる１又は２以上での１又は２以上のさらなる修飾（複数可）を除いて、親脂質アシルトランスフェラーゼと同一であり得、前記位置は、親配列と配列番号６８又は配列番号１６とのアラインメントによって同定される。
【０２４９】
適切には、バリアント脂質アシルトランスフェラーゼは、３１位での修飾を除いて、場合によっては８６位、１２２位、又は１３０位というアミノ酸残基位置のあらゆる１又は２以上での１又は２以上のさらなる修飾（複数可）を除いて、親脂質アシルトランスフェラーゼと同一であり得、前記位置は、親配列と配列番号６８又は配列番号１６とのアラインメントによって同定される。
【０２５０】
１つの実施形態において、親配列が配列番号１６若しくは配列番号６８である場合、又は親配列が配列番号４９若しくは配列番号６９によってコードされる場合、バリアントポリペプチドは、８０位での修飾を除いて、上記に詳述した修飾のいずれか１つを有する。これに関して、前記位置が親配列と配列番号１６とのアラインメントによって同定される場合、配列番号１６、配列番号６８、又は配列番号４９若しくは配列番号６９によってコードされるポリペプチドは既に、８０位にアスパラギン酸を有している。
【０２５１】
適切には、バリアント脂質アシルトランスフェラーゼ又はバリアント脂質アシルトランスフェラーゼは、親脂質アシルトランスフェラーゼと少なくとも７５％の同一性を有し得、適切には、バリアント脂質アシルトランスフェラーゼは、親脂質アシルトランスフェラーゼと少なくとも７５％又は少なくとも８０％又は少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％又は少なくとも９８％の同一性を有し得る。
【０２５２】
本発明はまた、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するバリアントポリペプチドにも関するものであり、バリアントは、親脂質アシルトランスフェラーゼと比較して、少なくとも３１位に修飾を包含し、３１位は、配列番号６８又は配列番号１６とのアラインメントによって同定される。
【０２５３】
１つの実施形態において、好ましくは、バリアント脂質アシルトランスフェラーゼは、
−  Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｗ１２２Ｌ（これは、骨格酵素が既に８０位にＤを有している場合には、Ｌ３１Ｑ、Ｗ１２２Ｌと表すことができる）、
−  Ｍ２７Ｖ、Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ（これは、骨格酵素が既に８０位にＤを有している場合には、Ｎ２７Ｖ、Ｌ３１Ｑと表すことができる）、
−  Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｋ８２Ｒ、Ｉ８６Ａ（これは、骨格酵素が既に８０位にＤを有している場合には、Ｌ３１Ｑ、Ｋ８２Ｒ、Ｉ８６Ａと表すことができる）、及び／又は
−  Ｌ３１Ｑ、Ｎ８０Ｄ、Ｉ８６Ｓ、Ｗ１２２Ｆ（これは、骨格酵素が既に８０位にＤを有している場合には、Ｌ３１Ｑ、Ｉ８６Ｓ、Ｗ１２２Ｆと表すことができる）
という修飾を有し、且つ／又は、この修飾は、本発明の方法で生じる。
【０２５４】
向上した特性
本発明において用いるためのバリアント脂質アシルトランスフェラーゼは、親（すなわち骨格）脂質アシルトランスフェラーゼ又は修飾されていない脂質アシルトランスフェラーゼと比較して、少なくとも１つの向上した特性を有する。
【０２５５】
本明細書において用いられる「向上した特性」という用語には、ａ）脂質アシルトランスフェラーゼの改変した基質特異性、例えば、例にすぎないが、ｉ）特定の化合物を受容体として用いる、酵素の改変された能力、例えば、炭水化物エステルを生産する酵素の能力を向上させるための、炭水化物を受容体分子として用いる、向上した能力）、又はii）飽和脂肪酸若しくは不飽和脂肪酸を基質として用いる、改変された能力、又はiii）バリアント脂質アシルトランスフェラーゼが脂質基質のＳｎ１位若しくはＳｎ２位の脂肪酸を選択的に利用するような、変化した特異性、又はiv）バリアント酵素における改変された基質鎖長特異性、ｂ）酵素の改変された反応速度、及び／或いはｃ）アシルトランスフェラーゼ反応を実施する酵素の能力を維持又は増強する一方での、加水分解反応を実施する、バリアント脂質アシルトランスフェラーゼの低下した能力が含まれ得る。
【０２５６】
他の向上した特性は、例えば、ｐＨ及び／若しくは温度に対する安定性並びに／又は洗浄及び／若しくは酸化に対する安定性における向上並びに／又は変化に関連し得る。実際、これらの特徴（ｐＨ、温度、タンパク質分解に対する安定性、洗浄に対する安定性、及び／又は酸化に対する安定性）の１又は２以上において様々な程度の安定性を有する酵素が本発明に従って調製され得ると考えられる。
【０２５７】
野生型（例えば、親脂質アシルトランスフェラーゼ）のタンパク質及び突然変異体（例えば、バリアント脂質アシルトランスフェラーゼ）のタンパク質の特徴付けは、あらゆる適切な手段を介して行われ、好ましくは、所望の特性の評価に基づく。
【０２５８】
いくつかの実施形態において、バリアント酵素は、親酵素と比較すると、増大したトランスフェラーゼ活性、及び同一の又は低下した加水分解活性を有し得る。言い換えると、適切には、バリアント酵素は、親酵素と比較して、高い、加水分解活性に対するトランスフェラーゼ活性（例えば、トランスフェラーゼ：加水分解活性）を有し得る。適切には、バリアント酵素は、脂質を単に加水分解するよりも、脂肪（リン脂質、ガラクト脂質、又はトリアシルグリセロールを含む）のアシル基をアシル受容体に選択的に転移させ得る。
【０２５９】
適切には、本発明において用いるための脂質アシルトランスフェラーゼは、親酵素と比較して、極性脂質、好ましくはリン脂質及び／又は糖脂質に対する増強した酵素活性を有するバリアントであり得る。好ましくは、このようなバリアントはまた、溶解極性脂質に対する低い活性を有するか、又は活性を有さない。極性脂質、好ましくはリン脂質及び／又は糖脂質に対する増強した活性は、加水分解及び／若しくはトランスフェラーゼ活性又は両者の組合せの結果であり得る。好ましくは、極性脂質に対する増強した活性は、トランスフェラーゼ活性の結果である。
【０２６０】
本発明において用いるためのバリアント脂質アシルトランスフェラーゼは、親酵素と比較して、トリグリセリド及び／又はモノグリセリド及び／又はジグリセリドに対する低下した活性を有し得る。
【０２６１】
適切には、バリアント酵素は、トリグリセリド及び／又はモノグリセリド及び／又はジグリセリドに対して活性を有さない場合がある。
【０２６２】
セットの定義
アミノ酸のセット１：
アミノ酸のセット１（これらは１ＩＶＮにおけるアミノ酸であることに留意されたい−図５３及び図５４）
Ｇｌｙ８、Ａｓｐ９、Ｓｅｒ１０、Ｌｅｕ１１、Ｓｅｒ１２、Ｔｙｒ１５、Ｇｌｙ４４、Ａｓｐ４５、Ｔｈｒ４６、Ｇｌｕ６９、Ｌｅｕ７０、Ｇｌｙ７１、Ｇｌｙ７２、Ａｓｎ７３、Ａｓｐ７４、Ｇｌｙ７５、Ｌｅｕ７６、Ｇｌｎ１０６、Ｉｌｅ１０７、Ａｒｇ１０８、Ｌｅｕ１０９、Ｐｒｏ１１０、Ｔｙｒ１１３、Ｐｈｅ１２１、Ｐｈｅ１３９、Ｐｈｅ１４０、Ｍｅｔ１４１、Ｔｙｒ１４５、Ｍｅｔ１５１、Ａｓｐ１５４、Ｈｉｓ１５７、Ｇｌｙ１５５、Ｉｌｅ１５６、Ｐｒｏ１５８
【０２６３】
ＧＤＳｘ及び触媒性残基などの、高度に保存されたモチーフは、セット１から除外した（下線を引いた残基）。誤解を避けるために、セット１は、１ＩＶＮモデルの活性部位におけるグリセロールの中心炭素原子の１０Å以内にあるアミノ酸残基を定義する。
【０２６４】
アミノ酸のセット２：
アミノ酸のセット２（アミノ酸の番号付けは、Ｐ１０４８０成熟配列におけるアミノ酸を参照することに留意されたい）
Ｌｅｕ１７、Ｌｙｓ２２、Ｍｅｔ２３、Ｇｌｙ４０、Ａｓｎ８０、Ｐｒｏ８１、Ｌｙｓ８２、Ａｓｎ８７、Ａｓｎ８８、Ｔｒｐ１１１、Ｖａｌ１１２、Ａｌａ１１４、Ｔｙｒ１１７、Ｌｅｕ１１８、Ｐｒｏ１５６、Ｇｌｙ１５９、Ｇｌｎ１６０、Ａｓｎ１６１、Ｐｒｏ１６２、Ｓｅｒ１６３、Ａｌａ１６４、Ａｒｇ１６５、Ｓｅｒ１６６、Ｇｌｎ１６７、Ｌｙｓ１６８、Ｖａｌ１６９、Ｖａｌ１７０、Ｇｌｕ１７１、Ａｌａ１７２、Ｔｙｒ１７９、Ｈｉｓ１８０、Ａｓｎ１８１、Ｍｅｔ２０９、Ｌｅｕ２１０、Ａｒｇ２１１、Ａｓｎ２１５、Ｌｙｓ２８４、Ｍｅｔ２８５、Ｇｌｎ２８９及びＶａｌ２９０。
【０２６５】
セット２と比較した、セット１において選択された残基を表１に示す。
【０２６６】
【表１】
0005752675.tif 000002
0005752675.tif 000003
表１
【０２６７】
アミノ酸のセット３：
アミノ酸のセット３はセット２と同一であるが、エロモナス・サルモニシダ（配列番号３５）のコード配列を参照しており、すなわち、アミノ酸残基の番号は、セット３においては１８大きく、これは、シグナル配列（配列番号４）を含むタンパク質と比較した、成熟タンパク質（配列番号３５）におけるアミノ酸の番号付けの間の差を反映しているためである。
【０２６８】
エロモナス・サルモニシダのＧＤＳＸ（配列番号３５）の成熟タンパク質及びエロモナス・ハイドロフィラのＧＤＳＸ（配列番号３４）の成熟タンパク質は、５つのアミノ酸が異なる。これらは、Ｔｈｒ３Ｓｅｒ、ＬＹＳ１８２Ｇｌｎ、Ｇｌｕ３０９Ａｌａ、Ｔｈｒ３１０Ａｓｎ、及びＧｌｙ３１８−であり、ここでは、サルモニシダの残基が先に列挙され、ハイドロフィラの残基が最後に列挙される。ハイドロフィラのタンパク質は、わずか３１７アミノ酸長であり、３１８位の残基を欠く。エロモナス・サルモニシダのＧＤＳＸは、エロモナス・ハイドロフィラのタンパク質よりも、ガラクト脂質基質などの極性脂質に対して非常に高い活性を有する。部位スキャニングを全ての５つのアミノ酸位置で行った。
【０２６９】
アミノ酸のセット４：
アミノ酸のセット４は、Ｓ３、Ｑ１８２、Ｅ３０９、Ｓ３１０、及び−３１８である。
【０２７０】
アミノ酸のセット５：
Ｆ１３Ｓ、Ｄ１５Ｎ、Ｓ１８Ｇ、Ｓ１８Ｖ、Ｙ３０Ｆ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６Ｅ、Ｄ１５７Ｎ、Ｙ２２６Ｆ、Ｄ２２８Ｎ、Ｙ２３０Ｆ。
【０２７１】
アミノ酸のセット６：
アミノ酸のセット６は、Ｓｅｒ３、Ｌｅｕ１７、Ｌｙｓ２２、Ｍｅｔ２３、Ｇｌｙ４０、Ａｓｎ８０、Ｐｒｏ８１、Ｌｙｓ８２、Ａｓｎ８７、Ａｓｎ８８、Ｔｒｐ１１１、Ｖａｌ１１２、Ａｌａ１１４、Ｔｙｒ１１７、Ｌｅｕ１１８、Ｐｒｏ１５６、Ｇｌｎ１５９、Ｇｌｎ１６０、Ａｓｎ１６１、Ｐｒｏ１６２、Ｓｅｒ１６３、Ａｌａ１６４、Ａｒｇ１６５、Ｓｅｒ１６６、Ｇｌｎ１６７、Ｌｙｓ１６８、Ｖａｌ１６９、Ｖａｌ１７０、Ｇｌｕ１７１、Ａｌａ１７２、Ｔｙｒ１７９、Ｈｉｓ１８０、Ａｓｎ１８１、Ｇｌｎ１８２、Ｍｅｔ２０９、Ｌｅｕ２１０、Ａｒｇ２１１、Ａｓｎ２１５、Ｌｙｓ２８４、Ｍｅｔ２８５、Ｇｌｎ２８９、Ｖａｌ２９０、Ｇｌｕ３０９、Ｓｅｒ３１０、−３１８である。
【０２７２】
セット６におけるアミノ酸の番号付けは、Ｐ１０４８０（配列番号３）におけるアミノ酸残基を参照しており、他の配列骨格における対応するアミノ酸は、Ｐ１０４８０及び／又は１ＩＶＮに対する相同性アラインメント及び／又は構造アラインメントによって決定することができる。
【０２７３】
アミノ酸のセット７：
アミノ酸のセット７は、Ｓｅｒ３、Ｌｅｕ１７、Ｌｙｓ２２、Ｍｅｔ２３、Ｇｌｙ４０、Ａｓｎ８０、Ｐｒｏ８１、Ｌｙｓ８２、Ａｓｎ８７、Ａｓｎ８８、Ｔｒｐ１１１、Ｖａｌ１１２、Ａｌａ１１４、Ｔｙｒ１１７、Ｌｅｕ１１８、Ｐｒｏ１５６、Ｇｌｙ１５９、Ｇｌｎ１６０、Ａｓｎ１６１、Ｐｒｏ１６２、Ｓｅｒ１６３、Ａｌａ１６４、Ａｒｇ１６５、Ｓｅｒ１６６、Ｇｌｎ１６７、Ｌｙｓ１６８、Ｖａｌ１６９、Ｖａｌ１７０、Ｇｌｕ１７１、Ａｌａ１７２、Ｔｙｒ１７９、Ｈｉｓ１８０、Ａｓｎ１８１、Ｇｌｎ１８２、Ｍｅｔ２０９、Ｌｅｕ２１０、Ａｒｇ２１１、Ａｓｎ２１５、Ｌｙｓ２８４、Ｍｅｔ２８５、Ｇｌｎ２８９、Ｖａｌ２９０、Ｇｌｕ３０９、Ｓｅｒ３１０、−３１８、Ｙ３０Ｘ（Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷから選択される）、Ｙ２２６Ｘ（Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷから選択される）、Ｙ２３０Ｘ（Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷから選択される）、Ｓ１８Ｘ（Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｗ、又はＹから選択される）、Ｄ１５７Ｘ（Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹから選択される）である。
【０２７４】
セット７におけるアミノ酸の番号付けは、Ｐ１０４８０（配列番号３）におけるアミノ酸残基を参照しており、他の配列骨格における対応するアミノ酸は、Ｐ１０４８０及び／又は１ＩＶＮへの相同性アラインメント及び／又は構造アラインメントによって決定することができる）。
【０２７５】
適切には、バリアント酵素は、親酵素と比較して、
Ｓ３Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｙ、Ｒ、Ｐ、Ｎ、Ｔ、又はＧ
Ｅ３０９Ｑ、Ｒ、又はＡ、好ましくはＱ又はＲ
−３１８Ｙ、Ｈ、Ｓ、又はＹ、好ましくはＹ
というアミノ酸修飾の１又は２以上を包含する。
【０２７６】
好ましくは、ＧＤＳＸモチーフのＸはＬである。したがって、好ましくは、親酵素はアミノ酸モチーフＧＤＳＬを包含する。
【０２７７】
適切には、前記第１の親脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号３４、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５というアミノ酸配列のいずれか１つを包含し得る。
【０２７８】
適切には、前記第２の関連する脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号３、配列番号３４、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５というアミノ酸配列のいずれか１つを包含し得る。
【０２７９】
バリアント酵素は、親酵素と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を包含していなくてはならない。いくつかの実施形態において、バリアント酵素は、親酵素と比較して、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも３つの、好ましくは少なくとも４つの、好ましくは少なくとも５つの、好ましくは少なくとも６つの、好ましくは少なくとも７つの、好ましくは少なくとも８つの、好ましくは少なくとも９つの、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸修飾を包含し得る。
【０２８０】
本明細書における特異的なアミノ酸残基を参照する場合、番号付けは、バリアント配列と配列番号３４又は配列番号３５として示される参照配列とのアラインメントから得られる。
【０２８１】
１つの態様において、好ましくは、バリアント酵素は、
Ｓ３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｌ１７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｓ１８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｋ２２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｍ２３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｙ３０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、若しくはＷ、及び／又は
Ｇ４０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｎ８０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｐ８１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｋ８２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｎ８７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｎ８８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｗ１１１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｖ１１２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ａ１１４Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｙ１１７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、若しくはＷ、及び／又は
Ｌ１１８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｐ１５６Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｄ１５７Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｇ１５９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｑ１６０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｎ１６１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｐ１６２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｓ１６３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ａ１６４Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｒ１６５Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｓ１６６Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｑ１６７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｋ１６８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｖ１６９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｖ１７０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｅ１７１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ａ１７２Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｙ１７９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、若しくはＷ、及び／又は
Ｈ１８０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｎ１８１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｑ１８２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、好ましくはＫ、及び／又は
Ｍ２０９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｌ２１０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｒ２１１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｎ２１５Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｙ２２６Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、若しくはＷ、及び／又は
Ｙ２３０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、若しくはＷ、及び／又は
Ｋ２８４Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｍ２８５Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｑ２８９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｖ２９０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｅ３０９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、及び／又は
Ｓ３１０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ
というアミノ酸置換の１又は２以上を包含する。
【０２８２】
さらに、又は代替的に、１又は２以上のＣ末端伸長が存在し得る。好ましくは、さらなるＣ末端伸長は、１又は２以上の脂肪族アミノ酸、好ましくは無極性アミノ酸、より好ましくはＩ、Ｌ、Ｖ、又はＧからなる。したがって、本発明はさらに、３１８Ｉ、３１８Ｌ、３１８Ｖ、３１８ＧというＣ末端伸長の１又は２以上を包含するバリアント酵素を提供する。
【０２８３】
好ましいバリアント酵素は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）などのリン脂質に対する、低下した加水分解活性を有し得、また、リン脂質からの増大したトランスフェラーゼ活性も有し得る。
【０２８４】
好ましいバリアント酵素は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）などのリン脂質からの増大したトランスフェラーゼ活性を有し得、これらはまた、リン脂質に対する、増大した加水分解活性も有し得る。
【０２８５】
Ｓ３、Ｄ１５７、Ｓ３１０、Ｅ３０９、Ｙ１７９、Ｎ２１５、Ｋ２２、Ｑ２８９、Ｍ２３、Ｈ１８０、Ｍ２０９、Ｌ２１０、Ｒ２１１、Ｐ８１、Ｖ１１２、Ｎ８０、Ｌ８２、Ｎ８８、Ｎ８７
という残基の１又は２以上の修飾によって、リン脂質に対する増大した完全なトランスフェラーゼ活性を有するバリアント酵素が生じ得る。
【０２８６】
リン脂質からの向上したトランスフェラーゼ活性を有するバリアント酵素をもたらし得る、特定の好ましい修飾は、
Ｓ３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＮ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｐ、又はＭ、最も好ましくはＳ３Ａ、
Ｄ１５７Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＤ１５７Ｓ、Ｒ、Ｅ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｖ、Ｑ、Ｋ、又はＣ、
Ｓ３１０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＳ３１０Ｔ、−３１８Ｅ、
Ｅ３０９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＥ３０９Ｒ、Ｅ、Ｌ、Ｒ、又はＡ、
Ｙ１７９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷ、好ましくはＹ１７９Ｄ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ｋ、Ｑ、又はＳ、より好ましくはＥ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ｋ、又はＱ、
Ｎ２１５Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＮ２１５Ｓ、Ｌ、Ｒ、又はＹ、
Ｋ２２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＫ２２Ｅ、Ｒ、Ｃ、又はＡ、
Ｑ２８９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＱ２８９Ｒ、Ｅ、Ｇ、Ｐ、又はＮ、
Ｍ２３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ  Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＭ２３Ｋ、Ｑ、Ｌ、Ｇ、Ｔ、又はＳ、
Ｈ１８０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＨ１８０Ｑ、Ｒ、又はＫ、
Ｍ２０９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＭ２０９Ｑ、Ｓ、Ｒ、Ａ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、Ｖ、又はＬ、
Ｌ２１０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＬ２１０Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、Ｉ、Ｗ、又はＭ、
Ｒ２１１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＲ２１１Ｔ、
Ｐ８１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＰ８１Ｇ、
Ｖ１１２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＶ１１２Ｃ、
Ｎ８０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＮ８０Ｒ、Ｇ、Ｎ、Ｄ、Ｐ、Ｔ、Ｅ、Ｖ、Ａ、又はＧ、
Ｌ８２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＬ８２Ｎ、Ｓ、又はＥ、
Ｎ８８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＮ８８Ｃ、
Ｎ８７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、若しくはＹ、好ましくはＮ８７Ｍ、又はＧ
の１又は２以上から選択することができる。
【０２８７】
Ｓ３Ｎ、Ｒ、Ａ、Ｇ
Ｍ２３Ｋ、Ｑ、Ｌ、Ｇ、Ｔ、Ｓ
Ｈ１８０Ｒ
Ｌ８２Ｇ
Ｙ１７９Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ｋ、又はＱ
Ｅ３０９Ｒ、Ｓ、Ｌ、又はＡ
という残基の１又は２以上の好ましい修飾によって、リン脂質に対する増大した完全なトランスフェラーゼ活性を有するバリアント酵素が生じる。
【０２８８】
１つの好ましい修飾はＮ８０Ｄである。これは特に、骨格として配列番号３５の参照配列を用いるケースである。したがって、参照配列は、配列番号１６であり得る。この修飾は、１又は２以上のさらなる修飾と組み合わせることができる。したがって、本発明の好ましい実施形態において、本発明の方法及び使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３５、又は配列番号３５と７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、若しくはさらに好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を包含する脂質アシルトランスフェラーゼをコードし得る。
【０２８９】
上述したように、本明細書における特定のアミノ酸残基を参照する場合、番号付けは、バリアント配列と配列番号３４又は配列番号３５として示される参照配列とのアラインメントから得られる。
【０２９０】
好ましくは、本発明の方法及び使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６として示されるアミノ酸配列、若しくは配列番号６８として示されるアミノ酸配列、又は配列番号１６若しくは配列番号６８と７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、若しくはさらに好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を包含する脂質をコードし得る。この酵素はバリアント酵素とされ得る。
【０２９１】
好ましい実施形態において、バリアント酵素は、配列番号７０、配列番号７１、又は配列番号７２の１つを包含する。
【０２９２】
同一性の程度は、同一である配列エレメントの数に基づく。アミノ酸配列に対する、本発明に従った同一性の程度は、Vector NTI 10（Invitrogen Corp.社製）などの、当技術分野において知られているコンピュータプログラムによって適切に決定することができる。ペアワイズアラインメントでは、用いられるスコアは、好ましくは、１０．０のギャップオープニングペナルティー及び０．１のギャップ伸長ペナルティーを有するBLOSUM62である。
【０２９３】
適切には、アミノ酸配列に関する同一性の程度は、少なくとも２０個の連続するアミノ酸にわたり、好ましくは少なくとも３０個の連続するアミノ酸にわたり、好ましくは少なくとも４０個の連続するアミノ酸にわたり、好ましくは少なくとも５０個の連続するアミノ酸にわたり、好ましくは少なくとも６０個の連続するアミノ酸にわたり決定される。
【０２９４】
適切には、アミノ酸配列に関する同一性の程度は、配列全体にわたり決定することができる。
【０２９５】
適切には、本発明において用いるための脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列又は脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、エロモナス属、ストレプトミセス属、サッカロミセス属、ラクトコッカス属、マイコバクテリウム属、ストレプトコッカス属、ラクトバチルス属、デスルフィトバクテリウム属、バチルス属、カンピロバクター属、ビブリオナセエ属、キシレラ属、スルフォロブス属、アスペルギルス属、シゾサッカロミセス属、リステリア属、ナイセリア属、メソリゾビウム属、ラルストニア属、ザントモナス属、カンジダ属、サーモビフィダ属、及びコリネバクテリウム属の１又は２以上の属の生物から得ることができるか、好ましくは得られてよい。
【０２９６】
適切には、本発明において用いるための脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列又は脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、エロモナス・ハイドロフィラ、エロモナス・サルモニシダ、ストレプトミセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトミセス・リモーサス（Streptomyces rimosus）、マイコバクテリウム、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、乳酸連鎖球菌（Lactococcus lactis）、化膿連鎖球菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトミセス・サーモサッカリ（Streptomyces thermosacchari）、ストレプトミセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、デスルフィトバクテリウム・デハロゲナンス（Desulfitobacterium dehalogenans）、バチルス属種（Bacillus sp）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、ビブリオ科（Vibrionaceae）、キシレラ・ファスティディオーサ（Xylella fastidiosa）、スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、リステリア・イノキュア（Listeria innocua）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）、ラルストニア・ソラナセラム（Ralstonia solanacearum）、ザントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、ザントモナス・アクソノポディス（Xanthomonas axonopodis）、カンジダ・パラシローシス（Candida parapsilosis）、サーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）、及びコリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）という生物の１又は２以上から得ることができるか、好ましくは得られてよい。
【０２９７】
１つの態様において、好ましくは、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、エロモナス属種、エロモナス・ハイドロフィラ、又はエロモナス・サルモニシダの１又は２以上から得ることができ、好ましくは、得られるか又は由来する。
【０２９８】
１つの態様において、好ましくは、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼは、エロモナス属種、エロモナス・ハイドロフィラ、又はエロモナス・サルモニシダの１又は２以上から得ることができる、好ましくは、得られるか又は由来する、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素である。
【０２９９】
本発明に従った脂質アシルトランスフェラーゼとして機能する酵素は、通常、以下に教示されるアッセイを用いて同定することができる。
【０３００】
本明細書において用いられる「トランスフェラーゼ」という用語は、「脂質アシルトランスフェラーゼ」という用語とほぼ同じ意味で用いられる。
【０３０１】
適切には、本明細書において定義される脂質アシルトランスフェラーゼは、エステル交換、エステル転移、アルコール分解、加水分解という反応の１又は２以上を触媒する。
【０３０２】
「エステル交換」という用語は、脂質供与体と脂質受容体との間でのアシル基の酵素的に触媒される転移を言い、脂質供与体は、遊離アシル基ではない。
【０３０３】
本明細書において用いられる「エステル転移」という用語は、脂質供与体（遊離脂肪酸以外）からアシル受容体（水以外）へのアシル基の酵素的に触媒される転移を意味する。
【０３０４】
本明細書において用いられる場合、「アルコール分解」という用語は、アルコールＲＯＨとの反応によって酸誘導体の共有結合を酵素的に切断して、生成物の１つがアルコールのＨと結合し、他の生成物がアルコールのＯＲ基と結合することを言う。
【０３０５】
本明細書において用いられる場合、「アルコール」という用語は、ヒドロキシル基を含有するアルキル化合物を言う。
【０３０６】
本明細書において用いられる場合、「加水分解」という用語は、脂質から水分子のＯＨ基へのアシル基の酵素的に触媒される転移を言う。
【０３０７】
本明細書において用いられる、「遊離脂肪酸を増大させることなく又は実質的に増大させることなく」という用語は、好ましくは、本発明に従った脂質アシルトランスフェラーゼが１００％のトランスフェラーゼ活性（すなわち、加水分解活性を伴わずに、アシル供与体からアシル受容体にアシル基の１００％を転移させる）を有することを意味するが、酵素は、脂質アシル供与体に存在するアシル基の１００％未満をアシル受容体に転移させる場合もある。このケースにおいて、好ましくは、アシルトランスフェラーゼ活性は、全酵素活性の少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、そしてより好ましくは少なくとも９８％を占める。トランスフェラーゼ活性％（すなわち、全酵素活性に対するパーセンテージとして示されるトランスフェラーゼ活性）は、上記の「トランスフェラーゼ活性についてのアッセイ」に従って決定することができる。
【０３０８】
本発明のいくつかの態様において、本明細書において用いられる「遊離脂肪酸を実質的に増大させることなく」という用語は、本発明に従った脂質アシルトランスフェラーゼで処理された食用油における遊離脂肪酸の量が、本発明に従った脂質アシルトランスフェラーゼ以外の酵素を用いた場合に食用油内に生じる遊離脂肪酸の量よりも、例えば、従来のホスホリパーゼ酵素、例えば、Lecitase Ultra（商標）（Novozymes A/S社製、デンマーク）を用いた場合に生じる遊離脂肪酸の量と比較して、少ないことを意味する。
【０３０９】
組合せ
本発明に従った使用のための酵素は、１又は２以上の他の適切な酵素と共に用いることができる。したがって、本発明において用いるための脂質アシルトランスフェラーゼ酵素に加え、少なくとも１つの他の酵素が反応組成物内に存在することは、本発明の範囲内である。このようなさらなる酵素には、デンプン分解酵素、例えばエンドアミラーゼ又はエキソアミラーゼ、プルラナーゼ、脱分枝酵素、キシラナーゼ、セルラーゼ、オキシドレダクターゼを含むヘミセルラーゼ、例えばペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、スルフィドリルオキシダーゼ、又は炭水化物オキシダーゼ、例えば、マルトースを酸化するもの、例えば、ヘキソースオキシダーゼ（ＨＯＸ、hexose oxidase）、リパーゼ、ホスホリパーゼ、グリコリパーゼ、ガラクトリパーゼ、及びプロテアーゼが含まれる。
【０３１０】
１つの実施形態において、脂質アシルトランスフェラーゼは、グリコリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６、トリアシルグリセロールリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）、ホスホリパーゼＡ２活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４）、又はホスホリパーゼＡ１活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２）というリパーゼ活性の１又は２以上を有するリパーゼと組み合わせて存在する。適切には、脂肪分解酵素は、当技術分野において周知であり、これには、例えばLIPOPAN（登録商標）F、LIPOPAN（登録商標）XTRA、及び／又はLECITASE（登録商標）ULTRA （Novozymes A/S社製、デンマーク）、ホスホリパーゼＡ２（例えば、Biocatalysts社製のLIPOMOD（商標）22LのホスホリパーゼＡ２、Genencor社製のLIPOMAX（商標））、LIPOLASE（登録商標）（Novozymes A/S社製、デンマーク）、YIELDMAX（商標）（Chr. Hansen社製、デンマーク）、PANAMORE（商標）（DSM社製）、国際公開第０３／９７８３５号パンフレット、欧州特許第０９７７８６９号明細書、又は欧州特許第１１９３３１４号明細書において教示されているリパーゼという脂肪分解酵素が含まれる。
【０３１１】
脂質アシルトランスフェラーゼの使用はまた、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＢ、ホスホリパーゼＣ、及び／又はホスホリパーゼＤなどのホスホリパーゼの存在下であり得る。
【０３１２】
脂質アシルトランスフェラーゼ及びもう１つの他の適切な酵素の使用は、連続的に又は同時に行うことができ、例えば、脂質アシルトランスフェラーゼでの処理は、もう１つの他の適切な酵素での酵素処理の前に、前記酵素処理と同時に、又は前記酵素処理の後に行うことができる。
【０３１３】
連続的な酵素処理のケースでは、いくつかの実施形態において、用いる第１の酵素を、例えば熱不活性化によって、又は固定化酵素の使用によって、第２の（及び／又は第３などの）酵素での処理の前に除去することが有利であり得る。
【０３１４】
さらなる酵素の存在が、酵素の意図的な添加の結果であり得ること、或いは、さらなる酵素が、リン脂質組成物が曝された事前のプロセスの結果生じる汚染物質として又は残留物のレベルで存在し得ることをさらに理解されたい。
【０３１５】
転写後及び翻訳後修飾
適切には、本発明に従った脂質アシルトランスフェラーゼは、本明細書において教示されるヌクレオチド配列のいずれか１つによってコードされ得る。
【０３１６】
用いられる宿主細胞に応じて、転写後及び／又は翻訳後修飾が生じ得る。本方法及び／又は使用において用いるための脂質アシルトランスフェラーゼが、転写後及び／又は翻訳後修飾を受けている脂質アシルトランスフェラーゼを包含することが想定される。
【０３１７】
例示にすぎないが、宿主細胞（例えばバチルス・リケニフォルミスなど）における、配列番号４９（図４５を参照されたい）として本明細書において示されるヌクレオチド配列の発現によって、転写後及び／又は翻訳後修飾が生じ、これによって、配列番号６８として本明細書において示されるアミノ酸配列がもたらされる。
【０３１８】
配列番号６８は、いくつかのアミノ酸、より具体的には３８個のアミノ酸を除去するための転写後及び／又は翻訳後修飾を受けていることを除いて、配列番号１６と同一である。特に、分子のＮ末端部分及びＣ末端部分は、２つのシステイン間のＳ−Ｓ架橋によって共有結合している。配列番号３８のアミノ酸残基２３６及び２３６は、翻訳後修飾の後に共有結合していない。形成された２つのペプチドは、１又は２以上のＳ−Ｓ架橋によって結びついている。
【０３１９】
翻訳後及び／又は転写後修飾に関する詳細な切断部位（複数可）はわずかに変化し得、その結果、例示にすぎないが、除去される（配列番号１６と比較した配列番号６８において示されるように）３８個のアミノ酸がわずかに変化し得る。理論に束縛されるものではないが、切断部位は、配列番号６８と配列番号１６との比較を参照することによって示されるように、数残基（例えば、１、２、又は３残基）分、切断部位と比較していずれかの方向にずれ得る。言い換えると、例えば２３５位−ＡＴＲから２７３位（ＲＲＳＡＳ）での切断よりも、例えば残基２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、又は２３８で切断が開始し得る。さらに、又は代替的に、切断は、約３８個のアミノ酸の除去をもたらし得、いくつかの実施形態において、切断は、３０〜４５個の残基、例えば３４〜４２個の残基、例えば３６〜４０個の残基、好ましくは３８個の残基の除去をもたらし得る。
【０３２０】
単離
１つの態様において、脂質アシルトランスフェラーゼは、回収／単離された脂質アシルトランスフェラーゼである。したがって、生産される脂質アシルトランスフェラーゼは、単離された形態であり得る。
【０３２１】
別の態様において、本発明において用いるための脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、単離された形態であり得る。
【０３２２】
「単離された」という用語は、配列又はタンパク質が、天然において配列又はタンパク質と関連している、また天然において見られるように配列又はタンパク質と関連している、少なくとも１つの他の構成要素から、少なくとも実質的に遊離していることを意味する。
【０３２３】
１つの態様において、フィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルは、反応混合物又は反応組成物の他の構成物から単離又は分離され得る。これに関して、「単離された」又は「単離する」という用語は、フィトエステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルが、反応混合物若しくは反応組成物中で見られる少なくとも１つの他の構成要素）から少なくとも実質的に遊離しているか、又は、反応混合物若しくは反応組成物中で見られる少なくとも１つの他の構成要素から少なくとも実質的に遊離するように処理されることを意味する。
【０３２４】
１つの態様において、フィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルは、単離された形態である。
【０３２５】
精製
１つの態様において、脂質アシルトランスフェラーゼは、精製された形態であり得る。
【０３２６】
別の態様において、本発明において用いるための脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、精製された形態であり得る。
【０３２７】
さらなる態様において、フィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルは、精製された形態であり得る。
【０３２８】
「精製された」という用語は、酵素又はフィトスタノールエステル若しくはフィトステロールエステルが、比較的純粋な状態、例えば、少なくとも約５１％の純度、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％の純度、又は少なくとも約９５％の純度、又は少なくとも約９８％の純度であることを意味する。
【０３２９】
１つの態様において、「精製する」という用語は、フィトスタノールエステル及び／又はフィトステロールエステルが、比較的純粋な状態、例えば、少なくとも約５１％の純度、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％の純度、又は少なくとも約９５％の純度、又は少なくとも約９８％の純度となるように処理されることを意味する。
【０３３０】
食料品
本明細書において用いられる「食料品」という用語は、ヒト及び／又は動物の摂取に適した物質を意味する。したがって、本明細書において用いられる「食物」又は「食料品」という用語には、「餌」及び「飼料」が含まれる。
【０３３１】
適切には、本明細書において用いられる「食料品」という用語は、すぐ摂取できる形態である食料品を意味し得る。しかし、代替的に、又はさらに、本明細書において用いられる食料品という用語は、食料品の調製において用いられる１又は２以上の食材を意味し得る。例示にすぎないが、食料品という用語は、生地から生産される焼かれた食品、及び前記焼いた食品の調製において用いられる生地の両方を包含する。
【０３３２】
好ましい態様において、本発明は、上記に定義した食料品を提供し、食料品は、卵、限定はしないがマヨネーズ、サラダ用ドレッシング、ソース、アイスクリーム、卵粉、加工された卵黄、及びそれから作られる製品を含む卵製品、パン、ケーキ、甘い生地製品、層状生地、液体バター、マフィン、ドーナッツ、ビスケット、クラッカー、及びクッキーを含む焼いた食品、チョコレート、キャンディー、キャラメル、ハラワ、無糖ガムと加糖ガムとを含むガム、バブルガム、ソフトバブルガム、チューイングガム、及びプリンを含む菓子、ソルベを含む冷凍食品、好ましくはアイスクリーム及びアイスミルクを含む冷凍乳製品、チーズ、バター、ミルク、コーヒークリーム、ホイップクリーム、カスタードクリーム、乳飲料、及びヨーグルトを含む乳製品、ムース、植物性ホイップクリーム、食肉加工品を含む食肉製品、食用油及び食用脂肪、空気を含ませた、及び空気を含ませていないホイップ製品、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、マーガリン、ショートニング、及び低脂肪及び超低脂肪のスプレッドを含むスプレッド、ドレッシング、マヨネーズ、ディップ、クリームベースのソース、クリームベースのスープ、飲料、スパイスエマルジョン、並びにソースの１又は２以上から選択される。
【０３３３】
適切には、本発明に従った食料品は、ケーキ、ペストリー、菓子、チョコレート、ファッジなどを含む、「高付加価値食品」であり得る。
【０３３４】
１つの態様において、本発明に従った食料品は、パンなどの生地製品又は焼いた製品、揚げ物、スナック、ケーキ、パイ、ブラウニー、クッキー、麺類、スナック品、例えば、クラッカー、グラハムクラッカー、プレッツェル、及びポテトチップス、並びにパスタであり得る。
【０３３５】
さらなる態様において、本発明に従った食料品は、小麦粉、プレミックス、油、脂肪、ココアバター、コーヒー用クリーム、サラダ用ドレッシング、マーガリン、スプレッド、ピーナッツバター、ショートニング、アイスクリーム、料理用油などの、植物に由来する食品であり得る。
【０３３６】
別の態様において、本発明に従った食料品は、バター、ミルク、クリーム、様々な形態の（細切りチーズ、ブロックチーズ、スライスチーズ、又は粉チーズを含む）ナチュラルチーズ、プロセスチーズ、及びイミテーションチーズなどのチーズ、クリームチーズ、アイスクリーム、フローズンデザート、ヨーグルト、ヨーグルトドリンク、バター脂肪、無水乳脂肪、他の乳製品などの乳製品であり得る。
【０３３７】
別の態様において、本発明に従った食料品は、食肉加工品、料理用油、ショートニングなどの、動物由来の成分を含有する食品であり得る。
【０３３８】
さらなる態様において、本発明に従った食料品は、飲料、果物、ミックスフルーツ、野菜、又はワインであり得る。いくつかのケースにおいて、飲料は、最大２０ｇ／ｌのさらなるフィトステロールエステルを含有し得る。
【０３３９】
別の態様において、本発明に従った食料品は、動物用の餌であり得る。動物用の餌は、フィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステル、好ましくはβ−シトステロール／スタノールエステルを強化され得る。適切には、動物用の餌は、家禽用の餌であり得る。食料品が家禽用の餌である場合、本発明は、本発明に従った食料品を与えられた家禽によって産卵された卵のコレステロール含有量を下げるために用いることができる。
【０３４０】
１つの態様において、食料品は、卵、マヨネーズ、サラダ用ドレッシング、ソース、アイスクリーム、卵粉、加工された卵黄、及びそれから作られる製品を含む卵製品の１又は２以上から選択することができる。
【０３４１】
さらなる態様において、食料品は、好ましくは、マーガリン又はマヨネーズである。
【０３４２】
本明細書において用いられる「食材」という用語は、食料品の少なくとも１つの構成要素又は少なくとも１つの成分を意味する。
【０３４３】
パーソナルケア製品
フィトステロール及びフィトスタノールは、強力な皮膚科学的（抗炎症性及び抗紅斑性）活性及び生物学的（低コレステロール血症性）活性を有する化合物であり、皮膚用化粧品及び栄養製品として所望のものである。
【０３４４】
本発明の方法及び使用によって調製されるフィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルには、石鹸、スキンクリーム、フェースクリーム、フェースマスク、スキンクリーナー、歯磨き粉、リップスティック、香水、メイクアップ用化粧品、ファンデーション、頬紅、マスカラ、アイシャドー、日焼け止め用ローション、ヘアコンディショナー、及びヘアカラーを含む、ヒトへの使用のためのあらゆる化粧品又は化粧用エマルジョンが含まれる。
【０３４５】
医薬組成物
本発明はまた、本発明の方法又は使用によって生産されるステロールエステル及び／又はスタノールエステルと薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤（その組合せを含む）とを包含する薬学的組成物を提供する。
【０３４６】
薬学的組成物は、ヒト用及び獣医用医薬品における、ヒト又は動物への利用のためのものであり得、典型的には、薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤のあらゆる１又は２以上を包含する。治療的使用のための、許容される担体又は希釈剤は、薬学的分野において周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)において記載されている。医薬担体、賦形剤、又は希釈剤の選択肢は、意図された投与経路及び標準的な薬学的慣例に関して選択することができる。薬学的組成物は、担体、賦形剤、若しくは、希釈剤として、又はそれに加えて、適切な結合剤（複数可）、潤滑剤（複数可）、懸濁剤（複数可）、被覆剤（複数可）、可溶化剤（複数可）を包含し得る。
【０３４７】
保存料、安定剤、着色料、及びさらに香料を薬学的組成物に加えることもできる。保存料の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシベンゼン酸のエステルが含まれる。防腐剤及び懸濁剤もまた用いることができる。
【０３４８】
異なる送達系に応じて、異なる組成物／製剤の要件が存在し得る。例えば、本発明の薬学的組成物は、例えば吸入のための鼻腔用スプレー若しくはエアロゾル又は摂取可能な溶液として、小型ポンプを用いて、又は粘膜経路によって送達されるように、或いは、非経口的に送達されるように製剤することができ、後者の場合、組成物は、例えば静脈内経路、筋肉内経路、又は皮下経路によって送達されるように、注射可能な形態によって製剤される。或いは、製剤は、両経路によって送達されるように設計することができる。
【０３４９】
作用物質が、胃腸粘膜を通って粘膜から送達される場合、作用物質は、胃腸管を通過する間に安定であり続けられなくてはならず、例えば、作用物質は、タンパク質分解による分解に対して耐性であり、酸性のｐＨで安定であり、且つ胆汁の洗浄効果に対して耐性でなくてはならない。
【０３５０】
可能であれば、薬学的組成物は、吸入によって、坐剤若しくはペッサリーの形態で、ローション、溶液、クリーム、軟膏、若しくは散布剤の形態で局所的に、皮膚パッチを用いて、デンプン若しくは乳糖などの賦形剤を含有する錠剤の形態で経口的に、単独で若しくは賦形剤と混合してカプセル若しくは卵形剤で経口的に、香料若しくは着色料を含有するエリキシル、溶液、若しくは懸濁液の形態で、投与することができるか、又は、非経口的に、例えば、静脈内、筋肉内、又は皮下に注射することができる。非経口投与では、組成物は、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするために十分な塩又は単糖を含有し得る、無菌の水性溶液の形態で、最良に使用することができる。口腔投与又は舌下投与では、組成物は、従来の様式で製剤することができる錠剤又はトローチの形態で投与することができる。
【０３５１】
好ましくは、薬学的組成物は、経口送達に適した形態である。
【０３５２】
本発明に従ったポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のクローニング
本明細書において定義される特定の特性を有するポリペプチド又は修飾に適したポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、前記ポリペプチドを生産するあらゆる細胞又は生物から単離することができる。ヌクレオチド配列を単離するための様々な方法が、当技術分野内で周知である。
【０３５３】
例えば、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリーを、ポリペプチドを生産する生物の染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用いて構築することができる。ポリペプチドのアミノ酸配列が知られている場合、標識されたオリゴヌクレオチドプローブを合成し、生物から調製されたゲノムライブラリーからポリペプチドをコードするクローンを同定するために用いることができる。或いは、別の既知のポリペプチド遺伝子に相同な配列を含有する、標識されたオリゴヌクレオチドプローブを、ポリペプチドをコードするクローンを同定するために用いることができた。後者のケースでは、低いストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション及び洗浄の条件が用いられる。
【０３５４】
或いは、ポリペプチドをコードするクローンは、プラスミドなどの発現ベクター内にゲノムＤＮＡの断片を挿入し、得られたゲノムＤＮＡライブラリーで酵素陰性細菌を形質転換し、次に、形質転換された細菌を、ポリペプチドによって阻害される酵素を含有する寒天上に播種し、それによってポリペプチドを発現するクローンの同定を可能にすることによって同定することができた。
【０３５５】
さらなる代替において、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、確立された標準的な方法、例えば、Beucage S.L. et al (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869によって記載されているホスホロアミダイト法、又はMatthes et al (1984) EMBO J. 3, p 801-805によって記載されている方法によって、合成によって調製することができる。ホスホロアミダイト法では、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成装置において合成され、精製され、アニーリングされ、ライゲーションされ、且つ適切なベクター内にクローニングされる。
【０３５６】
ヌクレオチド配列は、標準的な技術に従って合成由来、ゲノム由来、又はｃＤＮＡ由来（必要に応じて）の断片をライゲーションすることによって調製される、ゲノム由来と合成由来との混合、合成由来とｃＤＮＡ由来との混合、又はゲノム由来とｃＤＮＡ由来との混合であり得る。それぞれのライゲーションされた断片は、全ヌクレオチド配列の様々な部分に対応する。ＤＮＡ配列はまた、例えば米国特許第４，６８３，２０２号明細書又はSaiki R K et al (Science (1988) 239, pp 487-491)において記載されているように、特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、polymerase chain reaction）によって調製することができる。
【０３５７】
ヌクレオチド配列
本発明はまた、本明細書において定義される特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。本明細書において用いられる「ヌクレオチド配列」という用語は、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、並びにそのバリアント、ホモログ、断片、及び誘導体（その部分など）を言う。ヌクレオチド配列は、センス鎖に相当してもアンチセンス鎖に相当しても、二本鎖又は一本鎖であり得る、ゲノム由来又は合成由来又は組換え由来のものであり得る。
【０３５８】
本発明に関連する「ヌクレオチド配列」という用語には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＲＮＡが含まれる。好ましくは、前記用語は、ＤＮＡを意味し、より好ましくは、コード配列のためのｃＤＮＡを意味する。
【０３５９】
好ましい実施形態において、本明細書において定義される特定の特性を有するポリペプチドを自らがコードするヌクレオチド配列は、自らの天然に関連する配列（複数可）に連結し、そしてこの天然に関連する配列もまた自らの天然の環境にある場合には、自らの天然の環境にある天然のヌクレオチド配列を網羅しない。参照を簡単にするために、この好ましい実施形態を「非天然のヌクレオチド配列」と呼ぶことにする。これに関して、「天然のヌクレオチド配列」という用語は、自らの天然の環境にあり且つ自らが天然に関連するプロモーター全体に機能可能に連結している場合のヌクレオチド配列全体を意味し、前記プロモーターもまた自らの天然の環境にある。したがって、本発明のポリペプチドは、自らの天然の生物内にあるヌクレオチド配列によって発現され得るが、このヌクレオチド配列は、その生物内の、このヌクレオチド配列が天然に関連するプロモーターの制御下にはない。
【０３６０】
好ましくは、ポリペプチドは、天然のポリペプチドではない。これに関して、「天然のポリペプチド」という用語は、自らの天然の環境にあり且つ自らの天然のヌクレオチド配列によって発現されている場合のポリペプチド全体を意味する。
【０３６１】
典型的には、本明細書において定義される特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて調製される（すなわち、組換えＤＮＡ）。しかし、本発明の別の実施形態において、ヌクレオチド配列は、全体又は一部が、当技術分野において周知の化学的方法を用いて合成され得る（Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23、及びHorn T et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232を参照されたい）。
【０３６２】
分子の進化
酵素をコードするヌクレオチド配列が単離されると、又は推定される、酵素をコードするヌクレオチド配列が単離されると、選択されたヌクレオチド配列を修飾することが望ましい場合があり得、例えば、本発明に従った酵素を調製するために配列を突然変異させることが望ましい場合がある。
【０３６３】
突然変異は、合成オリゴヌクレオチドを用いて導入することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の突然変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含有する。
【０３６４】
適切な方法は、Morinaga et al (Biotechnology (1984) 2, p646-649)において開示されている。酵素をコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入する別の方法は、Nelson and Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p 147-151)において記載されている。
【０３６５】
上記のような部位特異的突然変異生成の代わりに、例えばStratagene社製のGeneMorph ＰＣＲ突然変異生成キット又はClontech社製の多様化ＰＣＲランダム突然変異生成キットなどの市販のキットを用いて、ランダムに突然変異を導入することができる。欧州特許第０５８３２６５号明細書は、ＰＣＲに基づいた突然変異生成を最適化する方法に言及しており、これはまた、欧州特許第０８６６７９６号明細書において記載されているような変異原性ＤＮＡアナログの使用と組み合わせることができる。変異性ＰＣＲ技術は、好ましい特徴を有する脂質アシルトランスフェラーゼのバリアントの生産に適している。国際公開第０２０６４５７号パンフレットは、リパーゼの分子進化に言及している。
【０３６６】
新規な配列を得るための第３の方法は、あらゆる数の制限酵素又はDnase Iなどの酵素を用い、機能的タンパク質をコードする完全なヌクレオチド配列を再構築することによって、同一でないヌクレオチド配列を断片化することである。或いは、１又は２以上の同一でないヌクレオチド配列を用い、完全なヌクレオチド配列の再構築の間に突然変異を導入することができる。ＤＮＡシャッフリング技術及びファミリーシャッフリング技術は、好ましい特徴を有する脂質アシルトランスフェラーゼのバリアントの生産に適している。「シャッフリング」を行うための適切な方法は、欧州特許第０７５２００８号明細書、欧州特許第１１３８７６３号明細書、欧州特許第１１０３６０６号明細書において見ることができる。シャッフリングはまた、米国特許第６，１８０，４０６号明細書及び国際公開第０１／３４８３５号パンフレットにおいて記載されているような、他の形態のＤＮＡ突然変異生成と組み合わせることができる。
【０３６７】
したがって、インビボ又はインビトロで、ヌクレオチド配列内に多くの部位特異的突然変異又はランダム突然変異を生じさせること、及び、その後、様々な手段によって、コードされるポリペプチドの向上した機能性についてスクリーニングすることが可能である。例えば、インシリコでの、及び外部で仲介される組換え方法（国際公開第００／５８５１７号パンフレット、米国特許第６，３４４，３２８号明細書、米国特許第６，３６１，９７４号明細書を参照されたい）を用いることで、生産されたバリアントが既知の酵素又はタンパク質に対して非常に低い相同性を維持する分子進化が行われ得る。このようにして得られたこのようなバリアントは、既知のトランスフェラーゼ酵素に対して顕著な構造的類似性を有し得るが、非常に低いアミノ酸配列相同性を有する。
【０３６８】
非限定的な例として、さらに、ポリヌクレオチドの突然変異又は天然のバリアントを野生型又は他の突然変異若しくは天然のバリアントと組換えて、新たなバリアントを生じさせることができる。このような新たなバリアントもまた、コードされるポリペプチドの向上した機能性についてスクリーニングすることができる。
【０３６９】
上記の適用及び同様の分子進化法によって、タンパク質の構造又は機能について事前の知識を全く有さずに、好ましい特徴を有する本発明の酵素のバリアントを同定及び選択すること、並びに、予測不可能であるが有益な突然変異又はバリアントを生じさせることが可能になる。当技術分野において、酵素活性を最適化又は改変するための、分子進化の適用の多くの例が存在し、このような例には、限定はしないが、好ましい環境条件、例えば、温度、ｐＨ、基質における、宿主細胞又はインビトロでの最適化された発現及び／又は活性、増大した酵素活性、改変した基質及び／又は生成物の特異性、増大又は低下した酵素的又は構造的安定性、改変した酵素活性／特異性の１又は２以上が含まれる。
【０３７０】
当業者には明らかであろうが、分子進化ツールを用いて、酵素を改変して酵素の機能性を向上させることができる。
【０３７１】
適切には、本発明において用いられる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、バリアント脂質アシルトランスフェラーゼをコードし得、すなわち、脂質アシルトランスフェラーゼは、親酵素と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失、又は付加を含有し得る。バリアント酵素は、親酵素と少なくともの１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％の同一性を維持する。適切な親酵素には、エステラーゼ又はリパーゼ活性を有するあらゆる酵素が含まれ得る。好ましくは、親酵素は、ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列にアラインする。
【０３７２】
好ましい実施形態において、バリアント脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、ＧＤＳＸ、ＧＡＮＤＹ、及びＨＰＴブロックにおいて見られるｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列のアミノ酸残基の少なくとも１又は２以上を維持するか又は組み込む。
【０３７３】
水性環境において脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有さないか又は低い脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するリパーゼなどの酵素を、分子進化ツールを用いて突然変異させて、トランスフェラーゼ活性を組み込むか又は増強させ、それによって本発明の組成物及び方法における使用に適した顕著なトランスフェラーゼ活性を有する脂質アシルトランスフェラーゼ酵素を生産することができる。
【０３７４】
適切には、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、親酵素と比較した場合、極性脂質、好ましくはリン脂質に対する増強した酵素活性を有するバリアントであり得る、脂質アシルトランスフェラーゼをコードし得る。
【０３７５】
或いは、バリアント酵素は、増大した熱安定性を有し得る。
【０３７６】
脂質アシルトランスフェラーゼのバリアントは知られており、このようなバリアントの１又は２以上が、本発明に従った方法及び使用における使用、並びに／又は本発明に従った酵素組成物における使用に適し得る。例示にすぎないが、Hilton & Buckley J Biol. Chem. 1991 Jan 15: 266 (2): 997-1000、Robertson et al J. Biol. Chem. 1994 Jan 21; 269(3):2146-50、Brumlik et al J. Bacteriol 1996 Apr; 178 (7): 2060-4、Peelman et al Protein Sci. 1998 Mar; 7(3):587-99において記載されている脂質アシルトランスフェラーゼのバリアントを、本発明に従って用いることができる。
【０３７７】
アミノ酸配列
本発明はまた、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つにおいて用いるための脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の使用を包含する。
【０３７８】
本明細書において用いられる場合、「アミノ酸配列」という用語は、「ポリペプチド」という用語及び／又は「タンパク質」という用語と同義である。いくつかの場合において、「アミノ酸配列」という用語は、「ペプチド」という用語と同義である。
【０３７９】
アミノ酸配列は、適切な源から調製／単離することができるか、又は合成により作製することができるか、又は組換えＤＮＡ技術の使用によって調製することができる。
【０３８０】
適切には、アミノ酸配列は、標準的な技術によって、本明細書において教示される単離されたポリペプチドから得ることができる。
【０３８１】
単離されたポリペプチドからアミノ酸配列を決定するための１つの適切な方法は、以下のものである。
【０３８２】
精製されたポリペプチドは、凍結乾燥することができ、１００μｇの凍結乾燥した材料は、８Ｍの尿素及び０．４Ｍの炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．４）の混合物５０μｌに溶解することができる。溶解されたタンパク質は、窒素で覆い、４５ｍＭのジチオトレイトール５μｌを添加した後、５０℃で１５分間にわたり変性及び還元することができる。室温まで冷却した後、１００ｍＭのヨードアセトアミド５μｌを添加して、窒素下の暗所で、室温で１５分間にわたり、システイン残基を誘導体化することができる。
【０３８３】
１３５μｌの水、及び５μｌの水中の５μｇのエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃを、上記の反応混合物に添加することができ、２４時間にわたり窒素下で、３７℃で消化を行うことができる。
【０３８４】
得られたペプチドを、溶媒Ａ：水中の０．１％ＴＦＡ及び溶媒Ｂ：アセトニトリル内の０．１％ＴＦＡを用いて、VYDAC C18カラム（０．４６×１５ｃｍ、１０μｍ、The Separation Group社製、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）上で、逆相ＨＰＬＣによって分離することができる。選択されたペプチドを、同一の溶媒系を用いて、Develosil C18カラム上で再びクロマトグラフィーにかけ、その後、Ｎ末端の配列決定を行うことができる。配列決定は、製造者の指示に従って、パルス化液体高速サイクルを用いて、Applied Biosystems 476Aシーケンサーを用いて行うことができる（Applied Biosystems社製、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）。
【０３８５】
配列同一性又は配列相同性
ここで、「ホモログ」という用語は、対象アミノ酸配列及び対象ヌクレオチド配列と一定の相同性を有するものを意味する。ここで、「相同性」という用語は、「同一性」と等しく扱われ得る。
【０３８６】
相同なアミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列は、酵素の機能的活性を維持し、且つ／又は酵素の活性を増強する、ポリペプチドを提供し、且つ／又はコードしなくてはならない。
【０３８７】
この関連において、相同な配列は、対象配列に少なくとも７５、８５、又は９０％同一であり得る、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であり得るアミノ酸配列を含むようにされる。典型的には、ホモログは、対象アミノ酸配列と同一の活性部位などを包含する。相同性はまた、類似性の観点から考えることもできるが（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）、本発明の関連においては、配列同一性の観点から相同性を表すことが好ましい。
【０３８８】
この関連において、相同配列は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（対象配列）に少なくとも７５、８５、又は９０％同一であり得る、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であり得るヌクレオチド配列を含むようにされる。典型的には、ホモログは、対象配列と同一の、活性部位などをコードする配列を包含する。相同性はまた、類似性の観点から考えることもできるが（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）、本発明の関連においては、配列同一性の観点から相同性を表すことが好ましい。
【０３８９】
相同性の比較は、目視によって、又はより一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムを用いて行うことができる。これらの市販されているコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の相同性％を計算することができる。
【０３９０】
相同性％は、連続する配列にわたって計算することができ、すなわち、１残基ずつ、１つの配列を他の配列とアラインし、１つの配列内の各アミノ酸を他の配列内の対応するアミノ酸と直接的に比較する。これは、「ギャップのない」アラインメントと呼ばれる。典型的には、このようなギャップのないアラインメントは、比較的少ない数の残基にわたってのみ行われる。
【０３９１】
これは非常に単純で着実な方法であるが、この方法は、例えば、１つの挿入又は欠失が、それ以外は同一な配列対において、それ以降のアミノ酸残基をアラインメントから除外し、その結果、全体的なアラインメントが行われた場合に相同性％が大きく低減する可能性があるということを、考慮することができない。そのため、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性スコアに不当に不利益をもたらすことなく、考えられる挿入及び欠失を考慮して最適なアラインメントをもたらすように設計されている。これは、局所的な相同性を最大にするようにするために、配列のアラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。
【０３９２】
しかし、これらのより複雑な方法は、アラインメントにおいて生じる各ギャップに「ギャップペナルティー」を割り当て、その結果、同数の同一アミノ酸では、可能な限り少ないギャップを有する（このことは、２つの比較される配列間に、より高い関連性があることを反映する）配列アラインメントが、多くのギャップを有するものよりも高いスコアとなる。ギャップの存在に比較的高いコストを課し、ギャップ内のそれぞれのその後の残基については小さめのペナルティーを課す、「アフィンギャップコスト」が、典型的に用いられる。これは、最も一般的に用いられるギャップスコアリング系である。高いギャップペナルティーは、当然のことながら、より少ないギャップを有する最適なアラインメントをもたらす。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティーを変更することが可能である。しかし、このようなソフトウェアを配列の比較に用いる場合は、デフォルトの値を用いることが好ましい。
【０３９３】
したがって、最大の相同性％の計算には、第１に、ギャップペナルティーを考慮して、最適なアラインメントをもたらすことが必要である。このようなアラインメントを実施するための、適切なコンピュータプログラムは、Vector NTI Advance（商標）11（Invitrogen Corp.社製）である。配列の比較を行い得る他のソフトウェアの例には、限定はしないが、BLASTパッケージ（Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18を参照されたい）、及びFASTA（Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410）が含まれる。BLAST及びFASTAは共に、オフライン及びオンラインでの検索に利用可能である（Ausubel et al 1999, pages 7-58 to 7-60を参照されたい）。しかし、いくつかの適用では、Vector NTI Advance（商標）11プログラムを用いることが好ましい。BLAST 2配列と呼ばれる新たなツールもまた、タンパク質配列及びヌクレオチド配列を比較するために利用可能である（FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50、及びFEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8を参照されたい）。
【０３９４】
最終的な相同性％は、同一性に関して測定することができるが、アラインメントプロセス自体は、典型的には、全か無かの対比較に基づくものではない。その代わり、化学的類似性又は進化距離に基づいてスコアを各ペアワイズ比較に割り当てる、スケーリングされた類似性スコアのマトリクスが、通常用いられる。一般的に用いられるこのようなマトリクスの例は、プログラムのBLASTパッケージソフトのデフォルトのマトリクスである、BLOSUM62マトリクスである。Vector NTIプログラムは通常、公開されているデフォルト値、又は提供されている場合には特別な記号比較表を用いる（さらなる詳細については、ユーザマニュアルを参照されたい）。いくつかの適用では、Vector NTI Advance（商標）11パッケージにデフォルトの値を用いることが好ましい。
【０３９５】
或いは、相同性パーセンテージは、CLUSTAL（Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244）に類似したアルゴリズムに基づいて、Vector NTI Advance（商標）11（Invitrogen Corp.社製）において複数のアラインメント特徴を用いて計算することができる。
【０３９６】
ソフトウェアが最適なアラインメントを生じさせると、相同性％、好ましくは配列同一性％を計算することが可能である。ソフトウェアは、典型的には、配列比較の一部としてこれを行い、数値的な結果を生じさせる。
【０３９７】
配列同一性を決定する場合にギャップペナルティーを用いる場合、好ましくは、ペアワイズアランメントに、プログラムのデフォルトのパラメータを用いる。例えば、以下のパラメータが、BLAST2でのペアワイズアラインメントのための現在のデフォルトのパラメータである。
【０３９８】
【表２】
0005752675.tif 000004
【０３９９】
１つの実施形態において、好ましくは、ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列についての配列同一性は、上記に定義したスコアリングパラメータのセットを用いて、BLAST2（blastn）を用いて決定することができる。
【０４００】
本発明の目的では、同一性の程度は、同一である配列エレメントの数に基づく。アミノ酸配列に対する、本発明に従った同一性の程度は、Vector NTI Advance（商標）11（Invitrogen Corp.社製）などの、当技術分野において知られているコンピュータプログラムによって適切に決定することができる。ペアワイズアラインメントでは、用いられるスコアリングパラメータは、好ましくは、１１のギャップ存在ペナルティー及び１のギャップ伸長ペナルティーを有するBLOSUM62である。
【０４０１】
適切には、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、少なくとも２０個の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも３０個の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも４０個の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも５０個の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも６０個の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも１００個の連続するヌクレオチドにわたり決定される。
【０４０２】
適切には、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、配列全体にわたり決定することができる。
【０４０３】
配列はまた、サイレントな変化をもたらし、機能的に同等な物質を生じさせる、アミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換を有し得る。意図的なアミノ酸の置換は、物質の二次的な結合活性が維持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の性質における類似性に基づいて行うことができる。例えば、負に帯電したアミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に帯電したアミノ酸には、リジン及びアルギニンが含まれ、類似の親水性値を有する帯電していない極性頭部基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが含まれる。
【０４０４】
保存的な置換は、例えば以下の表に従って生じ得る。第２欄の同一のブロックにおける、好ましくは第３欄の同一の列におけるアミノ酸が、互いに置換され得る。
【０４０５】
【表３】
0005752675.tif 000005
【０４０６】
本発明はまた、生じ得る相同な置換（置換及び置換除去は共に、本明細書において、既存のアミノ酸残基を別の残基と交換することを意味するために用いられる）、すなわち、塩基性には塩基性、酸性には酸性、極性には極性などの、同種置換も包含する。非相同な置換、すなわち、１つのクラスの残基から別の残基への置換、或いは、オルニチン（以下、Ｚと呼ぶ）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂと呼ぶ）、ノルロイシンオルニチン（以下、Ｏと呼ぶ）、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、及びフェニルグリシンなどの、非天然アミノ酸の含有も伴う置換も生じ得る。
【０４０７】
置換除去はまた、非天然アミノ酸によってもなされ得る。
【０４０８】
バリアントアミノ酸配列には、グリシン残基又はβ−アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加え、メチル基、エチル基、又はプロピル基などのアルキル基を含む、配列のあらゆる２つのアミノ酸残基の間に挿入され得る適切なスペーサー基が含まれ得る。ペプトイド形態の１又は２以上のアミノ酸残基の存在を伴う、変形のさらなる形態は、当業者に良く理解されよう。誤解を避けるために、「ペプトイド形態」は、α炭素置換基が残基のα炭素ではなく窒素原子上にある、バリアントアミノ酸残基を言うために用いられる。ペプトイド形態のペプチドを調製するためのプロセスは、当技術分野、例えば、Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371、及びHorwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134において知られている。
【０４０９】
本発明において用いるためのヌクレオチド配列、又は本明細書において定義される特定の特性をするポリペプチドをコードするヌクレオチド配列には、合成ヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドが含まれ得る。オリゴヌクレオチドに対する、多くの異なるタイプの修飾が、当技術分野において知られている。これらには、メチルホスホン酸及びホスホロチオエート骨格、並びに／又は分子の３’及び／若しくは５’末端でのアクリジン鎖若しくはポリリジン鎖の付加が含まれる。本発明の目的では、本明細書において記載されるヌクレオチド配列は、当技術分野において利用可能なあらゆる方法によって修飾することができることを理解されたい。このような修飾は、ヌクレオチド配列のインボでの活性又は寿命を増強させるために行うことができる。
【０４１０】
本発明はまた、本明細書において論じられる配列に対して相補的なヌクレオチド配列、又はそのあらゆる誘導体、断片、若しくは誘導体の使用も包含する。配列が、その断片に相補的である場合、その配列は、他の生物などにおける類似のコード配列を同定するためのプローブとして用いることができる。
【０４１１】
本発明の配列に１００％相同ではないが本発明の範囲内にあるポリヌクレオチドは、多くの手段で得ることができる。本明細書において記載される配列の他のバリアントは、例えば、広範な個体、例えば、異なる集団に由来する個体から作製されるＤＮＡライブラリーを探査することによって得ることができる。さらに、他のウイルス性／細菌性、又は細胞性のホモログ、特に哺乳動物細胞（例えば、ラット、マウス、ウシ、及び霊長類の細胞）において見られる細胞性のホモログを得ることができ、このようなホモログ及びその断片は通常、本明細書における配列表において示される配列に選択的にハイブリダイズすることができる。このような配列は、他の動物種から作製されるｃＤＮＡライブラリー又は他の動物種に由来するゲノムＤＮＡライブラリーを探査することによって、及び中度から高いストリンジェンシーの条件下で、添付の配列表の配列のいずれか１つの全て又は一部を包含するプローブを用いてこのようなライブラリーを探査することによって、得ることができる。類似の考慮が、本発明のポリペプチド配列又はヌクレオチド配列の種ホモログ及び対立遺伝子バリアントの取得に当てはまる。
【０４１２】
バリアント及び株／種ホモログはまた、本発明の配列内の保存されたアミノ酸配列をコードするバリアント及びホモログ内の配列を標的化するように設計されたプライマーを用いる縮重ＰＣＲを用いて得ることができる。保存された配列は、例えば、いくつかのバリアント／ホモログのアミノ酸配列をアラインすることによって予測することができる。配列のアラインメントは、当技術分野において知られているコンピュータソフトウェアを用いて行うことができる。例えば、GCG Wisconsin PileUpプログラムが広く用いられている。
【０４１３】
縮重ＰＣＲにおいて用いられるプライマーは、１又は２以上の縮重位置を含有し、既知の配列に対する単一の配列プライマーを用いる配列のクローニングに用いられるものよりも低いストリンジェンシー条件で用いられる。
【０４１４】
或いは、このようなポリヌクレオチドは、特徴付けされた配列の部位特異的突然変異生成によって得ることができる。これは、例えば、ポリヌクレオチド配列を発現させようとしている特定の宿主細胞に対してコドン選択性を最適化するために、サイレントなコドン配列の変化が必要である場合に、有用であり得る。制限ポリペプチド認識部位を導入するため、又はポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特性若しくは機能を改変するためには、他の配列の変化が望ましい場合がある。
【０４１５】
本発明のポリヌクレオチド（ヌクレオチド配列）は、プライマー、例えば、ＰＣＲプライマー、別の増幅反応のためのプライマー、プローブ、例えば、放射性若しくは非放射性標識を用いる従来の手段によって顕示標識で標識されたプローブを生産するために用いることができるか、又は、ポリヌクレオチドをベクター内にクローニングすることができる。このようなプライマー、プローブ、及び他の断片は、少なくとも１５ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも２０クレオチド長、例えば、少なくとも２５、３０、又は４０ヌクレオチド長であり、また、本明細書において用いられる本発明のポリヌクレオチドという用語によって包含される。
【０４１６】
本発明に従ったＤＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチド及びプローブは、組換えによって、合成によって、又は当業者が利用可能なあらゆる手段によって生産することができる。それらはまた、標準的な技術によってクローニングすることができる。
【０４１７】
通常、プライマーは、１ヌクレオチドずつ所望の核酸配列を段階的に製造することを伴う合成手段によって生産される。自動化された技術を用いる、これを達成するための技術は、当技術分野において容易に利用可能である。
【０４１８】
より長いポリヌクレオチドは、通常、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いる、組換え手段を用いて生産される。これは、クローニングしたい脂質標的化配列の一領域に隣接するプライマー対（例えば、約１５〜３０ヌクレオチドのもの）を作製し、プライマーを動物細胞又はヒト細胞から得られたｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと接触させ、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅された断片を単離し（例えば、アガロースゲル上で反応混合物を精製することにより）、そして増幅されたＤＮＡを回収することを伴う。プライマーは、適切な制限酵素認識部位を含有するように設計することができ、その結果、増幅されたＤＮＡは、適切なクローニングベクター内にクローニングされ得る。
【０４１９】
ハイブリダイゼーション
本発明はまた、本発明の配列に相補的な配列又は本発明の配列若しくはそれに相補的な配列にハイブリダイズし得る配列の使用を包含する。
【０４２０】
本明細書において用いられる「ハイブリダイゼーション」という用語には、「塩基対合を介して核酸の鎖を相補鎖と結びつけるプロセス」及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術において実施される増幅のプロセスが含まれる。
【０４２１】
本発明はまた、本明細書において論じられる対象配列に相補的な配列、又はそのあらゆる誘導体、断片、若しくは誘導体にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列の使用を包含する。
【０４２２】
本発明はまた、本明細書において論じられるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る配列に相補的な配列を包含する。
【０４２３】
ハイブリダイゼーション条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA)において教示されているような、ヌクレオチド結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づくものであり、以下に説明するような定義された「ストリンジェンシー」をもたらす。
【０４２４】
最大のストリンジェンシーは、典型的には、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍの５℃下）で生じ、高いストリンジェンシーはＴｍの約５℃〜１０℃下で生じ、中度のストリンジェンシーは約１０℃〜２０℃下で生じ、低いストリンジェンシーはＴｍの約２０〜２５℃下で生じる。当業者には理解されるように、最大のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションは、同一なヌクレオチド配列を同定又は検出するために用いることができ、一方、中度（又は低い）ストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションは、類似の又は関連するポリヌクレオチド配列を同定又は検出するために用いることができる。
【０４２５】
好ましくは、本発明は、本明細書において定義される特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に高いストリンジェンシー条件下又は中度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る配列に相補的な配列の使用を包含する。
【０４２６】
より好ましくは、本発明は、本明細書において定義される特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に高いストリンジェンシー条件（例えば、６５℃及び０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ、ｐＨ７．０｝）下でハイブリダイズし得る配列に相補的な配列の使用を包含する。
【０４２７】
本発明はまた、本明細書において論じられるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列（本明細書において論じられるものの相補的配列を含む）の使用に関する。
【０４２８】
本発明はまた、本明細書において論じられるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る配列に相補的なヌクレオチド配列（本明細書において論じられるものの相補的配列を含む）の使用に関する。
【０４２９】
また、本発明の範囲には、中度から最大のストリンジェンシー条件下で本明細書において論じられるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド配列の使用が含まれる。
【０４３０】
好ましい態様において、本発明は、ストリンジェントな条件（例えば、５０℃及び０．２×ＳＳＣ）下で本明細書において論じられるヌクレオチド配列又はその相補配列にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列の使用を網羅する。
【０４３１】
より好ましい態様において、本発明は、高いストリンジェンシー条件（例えば、６５℃及び０．１×ＳＳＣ）下で本明細書において論じられるヌクレオチド配列又はその相補配列にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列の使用を網羅する。
【０４３２】
ポリペプチドの発現
本発明において用いるための、又は本明細書において定義される特定の特性を有するポリペプチドをコードするためのヌクレオチド配列を、組換え複製ベクター内に組み込むことができる。ベクターは、適合する宿主細胞内で、及び／又は前記宿主細胞から、ヌクレオチド配列をポリペプチド形態で複製及び発現させるために用いることができる。発現は、プロモーター／エンハンサー及び他の発現調節シグナルを含む制御配列を用いて制御することができる。原核細胞のプロモーター及び真核細胞において機能的なプロモーターを用いることができる。組織特異的又は刺激特異的なプロモーターを用いることができる。上記の２以上の異なるプロモーターの配列エレメントを包含するキメラプロモーターもまた用いることができる。
【０４３３】
ヌクレオチド配列の発現によって宿主組換え細胞により生産されたポリペプチドは、用いられる配列及び／若しくはベクターに応じて、分泌され得るか、又は細胞内に含有され得る。コード配列は、物質をコードする配列の、特定の原核細胞膜又は真核細胞膜を介する分泌を指示する、シグナル配列を用いて設計することができる。
【０４３４】
構築物
「コンジュゲート」、「カセット」、及び「ハイブリッド」などの用語と同義である、「構築物」という用語には、プロモーターに直接的又は間接的に付着した、本発明に従った使用のための、本明細書において定義される特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が含まれる。間接的な付着の例は、プロモーターと本発明のヌクレオチド配列との間に介在する、Ｓｈ１−イントロン又はＡＤＨイントロンなどのイントロン配列などの、適切なスペーサー基の提供である。同一のことが、直接的又は間接的な付着を含む、本発明に関する「融合された」という用語にも当てはまる。いくつかのケースにおいて、この用語は、ヌクレオチド配列が、野生型の遺伝子プロモーターに通常関連するタンパク質をコードし、そして前記ヌクレオチド配列と遺伝子プロモーターとが共にその天然の環境にある場合には、前記ヌクレオチド配列の天然の組合せは網羅しない。
【０４３５】
構築物は、遺伝子構築物の選択を可能にするマーカーをさらに含有し得るか又は発現し得る。
【０４３６】
いくつかの適用では、好ましくは、構築物は、本発明の少なくとも１つのヌクレオチド配列、又はプロモーターに機能可能に連結した、本明細書において定義される特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。
【０４３７】
生物
本発明に関連する「生物」という用語には、本発明に従ったヌクレオチド配列、若しくは本明細書において定義される特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及び／又はそれから得られる生成物を包含し得る、あらゆる生物が含まれる。
【０４３８】
本発明に関連する「トランスジェニック生物」という用語には、本明細書において定義される特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及び／若しくはそれから得られる生成物を包含するあらゆる生物が含まれ、且つ／又は、プロモーターは、生物内における、本明細書において定義される特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を可能にし得る。好ましくは、ヌクレオチド配列は、生物のゲノム内に組み込まれている。
【０４３９】
「トランスジェニック生物」という用語は、天然のヌクレオチドコード配列が、自らの天然の環境にある、前記コード配列の天然のプロモーターの制御下にある場合、自らの天然の環境にある前記コード配列は網羅しない。
【０４４０】
したがって、本発明のトランスジェニック生物には、本明細書において定義される特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、本明細書において定義される構築物、本明細書において定義されるベクター、本明細書において定義されるプラスミド、本明細書において定義される細胞、又はその生成物の、いずれか１つ、又はその組合せを包含する生物が含まれる。例えば、トランスジェニック生物はまた、天然の脂質アシルトランスフェラーゼをコードする配列に関連しないプロモーターの制御下にある、本明細書において定義される特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含し得る。
【０４４１】
宿主細胞
脂質アシルトランスフェラーゼは、宿主生物におけるヌクレオチド配列の発現によって生産することができ、宿主細胞は、原核生物又は真核生物であり得る。
【０４４２】
本発明の１つの実施形態において、本発明に従った脂質アシルトランスフェラーゼは、宿主細胞、例えば細菌細胞、例えばバチルス属種、例えばバチルス・リケニフォルミス宿主細胞において発現する（参照することによって本明細書に組み込まれる、国際公開第２００８／０９０３９５号パンフレットにおいて教示されている）。
【０４４３】
別の宿主細胞は、例えば、真菌、酵母、又は植物であり得る。
【０４４４】
宿主細胞／生物の形質転換
宿主生物は、原核生物又は真核生物であり得る。
【０４４５】
適切な原核宿主の例には、大腸菌及びバチルス・リケニフォルミスなどの細菌が含まれ、好ましくはバチルス・リケニフォルミスである。脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列でのバチルス・リケニフォルミスの形質転換は、参照することによって本明細書に組み込まれる、国際公開第２００８／０９０３９５号パンフレットにおいて教示されている。
【０４４６】
他の原核宿主の形質転換についての教示は、当技術分野において多く文献に記載されており、例えば、Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)を参照されたい。原核宿主が用いられる場合、ヌクレオチド配列は、形質転換の前に、イントロンの除去などによって、適切に修飾される必要があり得る。
【０４４７】
別の実施形態において、トランスジェニック生物は、酵母であり得る。
【０４４８】
糸状菌細胞を、プロトプラストを形成し、プロトプラストを形質転換し、その後、既知の様式で細胞壁を再生することを伴うプロセスなどの、当技術分野において知られている様々な方法を用いて形質転換することができる。宿主微生物としてのアスペルギルスの使用は、欧州特許第０２３８０２３号明細書において記載されている。
【０４４９】
別の宿主生物は、植物であり得る。植物を形質転換するために用いられる一般的な技術の概説は、Potrykus（Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225）及びChristou（Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27）による記事で見ることができる。植物の形質転換についてのさらなる教示は、欧州特許公開第０４４９３７５号公報において見ることができる。
【０４５０】
以下、以下の図面及び実施例を参照して本発明を説明するが、これは例示にすぎない。
【図面の簡単な説明】
【０４５１】
【図１】Ａｓｎ８０Ａｓｐ（特に、アミノ酸８０は成熟配列内にある）の突然変異を有する突然変異体エロモナス・サルモニシダの成熟脂質アシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）のアミノ酸配列を示す図である（配列番号１６）。
【図２】エロモナス・ハイドロフィラ（ＡＴＣＣ＃７９６５）の脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１）。
【図３】データベースバージョン６のｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列を示す図である（配列番号２）。
【図４】生物エロモナス・ハイドロフィラから得られたアミノ酸配列（配列番号３）（Ｐ１０４８０、ＧＩ：１２１０５１）を示す図である。
【図５】生物エロモナス・サルモニシダから得られたアミノ酸配列（配列番号４）（ＡＡＧ０９８４０４、ＧＩ：９９６４０１７）を示す図である。
【図６】生物ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）から得られたアミノ酸配列（配列番号５）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿６３１５５８）を示す図である。
【図７】生物ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）から得られたアミノ酸配列（配列番号６）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号:ＣＡＣ４２１４０）を示す図である。
【図８】生物サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）から得られたアミノ酸配列（配列番号７）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ４１７３４）を示す図である。
【図９】生物ラルストニアから得られたアミノ酸配列（配列番号８）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号:ＡＬ６４６０５２）を示す図である。
【図１０】配列番号９を示す図である。Ｓｃｏｅ１  ＮＣＢＩタンパク質受託コードＣＡＢ３９７０７．１  ＧＩ：４５３９１７８の保存された仮想タンパク質［ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）］。
【図１１】配列番号１０として示されるアミノ酸を示す図である。Ｓｃｏｅ２  ＮＣＢＩタンパク質受託コードＣＡＣ０１４７７．１  ＧＩ：９７１６１３９の保存された仮想タンパク質［ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）］。
【図１２】アミノ酸（配列番号１１）を示す図である。Ｓｃｏｅ３  ＮＣＢＩタンパク質受託コードＣＡＢ８８８３３．１  ＧＩ：７６３５９９６の推定分泌タンパク質［ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）］。
【図１３】アミノ酸（配列番号１２）を示す図である。Ｓｃｏｅ４  ＮＣＢＩタンパク質受託コードＣＡＢ８９４５０．１  ＧＩ：７６７２２６１の推定分泌タンパク質［ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）］。
【図１４】アミノ酸（配列番号１３）を示す図である。Ｓｃｏｅ５  ＮＣＢＩタンパク質受託コードＣＡＢ６２７２４．１  ＧＩ：６５６２７９３の推定リポタンパク質［ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）］。
【図１５】アミノ酸（配列番号１４）を示す図である。Ｓｒｉｍ１  ＮＣＢＩタンパク質受託コードＡＡＫ８４０２８．１  ＧＩ：１５０８２０８８のＧＤＳＬ−リパーゼ［ストレプトミセス・リモーサス］。
【図１６】エロモナス・サルモニシダ亜種サルモニシダ（Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida）（ＡＴＣＣ＃１４１７４）の脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１５）を示す図である。
【図１７】配列番号１９を示す図である。Ｓｃｏｅ１  ＮＣＢＩタンパク質受託コードＣＡＢ３９７０７．１  ＧＩ：４５３９１７８の保存された仮想タンパク質［ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）］。
【図１８】エロモナス・ハイドロフィラの脂質アシルトランスフェラーゼ遺伝子の突然変異生成に用いられる融合構築物のアミノ酸配列（配列番号２５）を示す図である。下線を引いたアミノ酸はキシラナーゼシグナルペプチドである。
【図１９】ストレプトミセスの脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチド配列を示す図である（配列番号２６）。
【図２０】サーモビフィダの脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチド配列を示す図である（配列番号２７）。
【図２１】サーモビフィダの脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチド配列を示す図である（配列番号２８）。
【図２２】コリネバクテリウム・エフィシエンスＧＤＳｘの脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の３００個のアミノ酸のポリペプチドを示す図である（配列番号２９）。
【図２３】ノボスフィンゴビウム・アロマチシボラン（Novosphingobium aromaticivorans）ＧＤＳｘの脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の２８４個のアミノ酸のポリペプチドを示す図である（配列番号３０）。
【図２４】ストレプトミセス・セリカラーＧＤＳｘの脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の２６９個のアミノ酸のポリペプチドを示す図である（配列番号３１）。
【図２５】ストレプトミセス・アベルミティリス＼ＧＤＳｘの脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の２６９個のアミノ酸のポリペプチドを示す図である（配列番号３２）。
【図２６】ストレプトミセスの脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチドを示す図である（配列番号３３）。
【図２７】生物エロモナス・ハイドロフィラから得られたアミノ酸配列（配列番号３４）（Ｐ１０４８０、ＧＩ：１２１０５１）（特に、これは成熟配列である）を示す図である。
【図２８】突然変異体生物エロモナス・サルモニシダ成熟脂質アシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）のアミノ酸配列（配列番号３５）（特に、これは成熟配列である）を示す図である。
【図２９】ストレプトミセス・サーモサッカリのヌクレオチド配列（配列番号３６）を示す図である。
【図３０】ストレプトミセス・サーモサッカリのアミノ酸配列（配列番号３７）を示す図である。
【図３１】サーモビフィダ・フスカ／ＧＤＳｘの５４８個のアミノ酸のアミノ酸配列（配列番号３８）を示す図である。
【図３２】サーモビフィダ・フスカのヌクレオチド配列（配列番号３９）を示す図である。
【図３３】サーモビフィダ・フスカ／ＧＤＳｘのアミノ酸配列（配列番号４０）を示す図である。
【図３４】コリネバクテリウム・エフィシエンス／ＧＤＳｘの３００個のアミノ酸のアミノ酸配列（配列番号４１）を示す図である。
【図３５】コリネバクテリウム・エフィシエンスのヌクレオチド配列（配列番号４２）を示す図である。
【図３６】ストレプトミセス・セリカラー／ＧＤＳｘの２６８個のアミノ酸のアミノ酸配列（配列番号４３）を示す図である。
【図３７】ストレプトミセス・セリカラーのヌクレオチド配列（配列番号４４）を示す図である。
【図３８】ストレプトミセス・アベルミティリスのアミノ酸配列（配列番号４５）を示す図である。
【図３９】ストレプトミセス・アベルミティリスのヌクレオチド配列（配列番号４６）を示す図である。
【図４０】サーモビフィダ・フスカ／ＧＤＳｘのアミノ酸配列（配列番号４７）を示す図である。
【図４１】サーモビフィダ・フスカ／ＧＤＳｘのヌクレオチド配列（配列番号４８）を示す図である。
【図４２】Ｌ１３１とストレプトミセス・アベルミティリス及びサーモビフィダ・フスカのホモログとのアラインメントを示す図であり、これは、ＧＤＳｘモチーフ（Ｌ１３１及びストレプトミセス・アベルミティリス及びサーモビフィダ・フスカにおけるＧＤＳＹ）、ＧＧＮＤＡ又はＧＧＮＤＬのいずれかであるＧＡＮＤＹボックス、及びＨＰＴブロック（保存された触媒性ヒスチジンであると考えられる）の保存を説明する。これらの３つの保存されたブロックが強調されている。
【図４３】カンジダ・パラシローシスの脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列である配列番号１７を示す図である。
【図４４】カンジダ・パラシローシスの脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列である配列番号１８を示す図である。
【図４５】シグナル配列（ｐｒｅＬＡＴ−１〜８７位）を含む、エロモナス・サルモニシダのヌクレオチド配列（配列番号４９）を示す図である。
【図４６】生物エロモナス・ハイドロフィラから得られた、本発明に従った脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号５０）を示す図である。
【図４７】生物エロモナス・サルモニシダから得られた、本発明に従った脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号５１）を示す図である。
【図４８】生物ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）から得られた、本発明に従った脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号５２）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３８８８．１：８３２７４８０．．８３２８３６７）を示す図である。
【図４９】生物ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）から得られた、本発明に従った脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号５３）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＬ９３９１３１．１：２６５４８０．．２６６３６７）を示す図である。
【図５０】生物サッカロミセス・セレビシエから得られた、本発明に従った脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号５４）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｚ７５０３４）を示す図である。
【図５１】生物ラルストニアから得られた、本発明に従った脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号５５）を示す図である。
【図５２】ＮＣＢＩタンパク質受託コードＣＡＢ３９７０７．１  ＧＩ：４５３９１７８の保存された仮想タンパク質［ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）］をコードする、配列番号５６として示されるヌクレオチド配列を示す図である。
【図５３】Ｓｃｏｅ２  ＮＣＢＩタンパク質受託コードＣＡＣ０１４７７．１  ＧＩ：９７１６１３９の保存された仮想タンパク質［ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）］をコードする、配列番号５７として示されるヌクレオチド配列を示す図である。
【図５４】Ｓｃｏｅ３  ＮＣＢＩタンパク質受託コードＣＡＢ８８８３３．１  ＧＩ：７６３５９９６の推定分泌タンパク質［ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）］をコードする、配列番号５８として示されるヌクレオチド配列を示す図である。
【図５５】Ｓｃｏｅ４  ＮＣＢＩタンパク質受託コードＣＡＢ８９４５０．１  ＧＩ：７６７２２６１の推定分泌タンパク質［ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）］をコードする、配列番号５９として示されるヌクレオチド配列を示す図である。
【図５６】Ｓｃｏｅ５  ＮＣＢＩタンパク質受託コードＣＡＢ６２７２４．１  ＧＩ：６５６２７９３の推定リポタンパク質［ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）］をコードする、配列番号６０として示されるヌクレオチド配列を示す図である。
【図５７】Ｓｒｉｍ１  ＮＣＢＩタンパク質受託コードＡＡＫ８４０２８．１  ＧＩ：１５０８２０８８のＧＤＳＬ−リパーゼ［ストレプトミセス・リモーサス］をコードする、配列番号６１として示されるヌクレオチド配列を示す図である。
【図５８】エロモナス・ハイドロフィラ（ＡＴＣＣ＃７９６５）の脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号６２）を示す図である。
【図５９】エロモナス・サルモニシダ亜種サルモニシダ（ＡＴＣＣ＃１４１７４）の脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号６３）を示す図である。
【図６０】キシラナーゼシグナルペプチドを含むエロモナス・ハイドロフィラの酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号２４）を示す図である。
【図６１】Ａｓｎ８０Ａｓｐ（特に、アミノ酸８０は成熟配列である）の突然変異を有し、且つ翻訳後修飾を受けた後の、突然変異体エロモナス・サルモニシダ成熟脂質アシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）のアミノ酸配列（配列番号６８）を示す図であり、配列番号６８のアミノ酸残基２３５及び２３６は、翻訳後修飾の後に共有結合していない。形成される２つのペプチドは、１又は２以上のＳ−Ｓ架橋によって結びついている。配列番号６８におけるアミノ酸２３６は、本明細書において示される配列番号１６のアミノ酸残基番号２７４に対応する。
【図６２】ステロールガム相の反応生成物のＴＬＣ分析を示す図である。
【図６３】エロモナス・サルモニシダの脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号６９）を示す図である。
【図６４】配列番号１６として本明細書において示されるＡｓｎ８０Ａｓｐ（特に、アミノ酸８０は成熟配列である）の突然変異を有し、且つ配列番号７０として翻訳後修飾を受けた後の突然変異体エロモナス・サルモニシダ成熟脂質アシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）のアミノ酸配列を示す図であり、配列番号７０のアミノ酸残基２３５及び２３６は、翻訳後修飾の後に共有結合しておらず、形成される２つのペプチドは、１又は２以上のＳ−Ｓ架橋によって結びついており、配列番号７０におけるアミノ酸２３６は、本明細書において示される配列番号１６のアミノ酸残基番号２７５に対応する。
【図６５】配列番号１６として本明細書において示されるＡｓｎ８０Ａｓｐ（特に、アミノ酸８０は成熟配列である）の突然変異を有し、且つ配列番号７１として翻訳後修飾を受けた後の突然変異体エロモナス・サルモニシダ成熟脂質アシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）のアミノ酸配列を示す図であり、配列番号７１のアミノ酸残基２３５及び２３６は、翻訳後修飾の後に共有結合しておらず、形成される２つのペプチドは、１又は２以上のＳ−Ｓ架橋によって結びついており、配列番号７１におけるアミノ酸２３６は、本明細書において示される配列番号１６のアミノ酸残基番号２７６に対応する。
【図６６】配列番号１６として本明細書において示されるＡｓｎ８０Ａｓｐ（特に、アミノ酸８０は成熟配列である）の突然変異を有し、且つ配列番号７２として翻訳後修飾を受けた後の突然変異体エロモナス・サルモニシダ成熟脂質アシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）のアミノ酸配列を示す図であり、配列番号７２のアミノ酸残基２３５及び２３６は、翻訳後修飾の後に共有結合しておらず、形成される２つのペプチドは、１又は２以上のＳ−Ｓ架橋によって結びついており、配列番号７２におけるアミノ酸２３６は、本明細書において示される配列番号１６のアミノ酸残基番号２７７に対応する。
【図６７】活性部位にグリセロールを有する、１ＩＶＮ．ＰＤＢ結晶構造のリボン状の描写を示す図である。この図は、Deep View Swiss-PDBビューアーを用いて作製した。
【図６８】活性部位にグリセロールを有する、Deep View Swiss-PDBビューアーを用いた、１ＩＶＮ．ＰＤＢ結晶構造の側面図を示す図であり、活性部位のグリセロールから１０Å以内の残基は黒く色付けされている。
【図６９】活性部位にグリセロールを有する、Deep View Swiss-PDBビューアーを用いた、１ＩＶＮ．ＰＤＢ結晶構造の上面図を示す図であり、活性部位のグリセロールから１０Å以内の残基は黒く色付けされている。
【図７０】アラインメント１を示す図である。
【図７１】アラインメント２を示す図である。
【図７２】Ｐ１０４８０に対する１ＩＶＮのアラインメントを示す図であり（Ｐ１０４８０は、エロモナス・ハイドロフィラ酵素についてのデータベース配列である）、このアラインメントは、ＰＦＡＭデータベースから得、モデル構築プロセスにおいて用いた。
【図７３】Ｐ１０４８０に対する１ＩＶＮのアラインメントを示す図であり（Ｐ１０４８０は、エロモナス・ハイドロフィラ酵素についてのデータベース配列である）、このアラインメントは、ＰＦＡＭデータベースから得、モデル構築プロセスにおいて用いた。
【図７４】Ｐ１０４８０がエロモナス・ハイドロフィラについてのデータベース配列である、アラインメントを示す図である。この配列は、モデル構築及び部位選択に用いられる（完全なタンパク質（配列番号２５）が描写されており、成熟タンパク質（配列番号３４に同等）が残基１９で開始することに留意されたい。Ａ．ｓａｌはエロモナス・サルモニシダ（配列番号４）ＧＤＳＸリパーゼであり、Ａ．ｈｙｄはエロモナス・ハイドロフィラ（配列番号３４）ＧＤＳＸリパーゼであり、コンセンサス配列は、列挙される配列間で異なる位置で＊を含有する）。
【実施例１】
【０４５２】
フィトステロールエステル及びフィトスタノールエステルは、産業においていくつかの用途があり、これには、コレステロールを低下させる効果を有する機能的成分としての食品産業における用途が含まれる。
【０４５３】
化学触媒によるフィトステロールエステル及びフィトスタノールエステルの合成は、有機溶媒を用いて行われることが多く且つ形成されたエステルを単離するいくつかの精製ステップを必要とすることが多い場合、非常に複雑である。
【０４５４】
本発明者らは、脂質アシルトランスフェラーゼを、フィトステロールからのフィトステロールエステルの合成及びフィトスタノールからフィトスタノールエステルの合成のための酵素触媒として用いることができることを見出した。
【０４５５】
脂質供与体は、リン脂質組成物である。適切には、リン脂質組成物は、水による大豆油の脱ガムから得られるガム相であり得る。好ましくは、フィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルは、反応組成物又は反応混合物から単離又は精製され、単離されたフィトステロールエステル及び／又はフィトスタノールエステルとして用いられる。しかし、特に、反応組成物又は反応混合物は、有害な構成物（有機溶媒など）を典型的には包含しておらず、したがって、フィトステロールエステル又はフィトスタノールエステルの複雑な精製及び／単離の必要性が避けられ得る。
【０４５６】
材料及び方法：
−  ＫＬＭ３’−グリセロリン脂質コレステロールアシルトランスフェラーゼ（FoodPro LysoMax Oil）（ＫＴＰ０８０１５）−活性１３００ＬＡＴＵ／ｇ（Danisco A/S社から入手可能）
−  ブラジル産の大豆（オルフスのSolae社からＳＹＰと呼ばれる）の水による脱ガムから得られるガム相
−  乾燥ガム相、回転蒸発器で乾燥させたＳＹＰ
−  フィトステロール−独国のHenkel社のGenerol 122 N
【０４５７】
ＨＰＬＣ分析
フィトステロール及びフィトステロールエステルの試料を、ＨＰＴＬＣを用いて分析した。
【０４５８】
アプリケーター：自動ＴＬＣサンプラー４、ＣＡＭＡＧ
ＨＰＴＬＣプレート：２０×１０ｃｍ、Merck社番号１．０５６４１。使用する前に、１６０℃で１０分間活性化する。
適用：
ガムとフィトステロールとの０．２ｇの反応混合物を、３ｍｌの３：２のヘキサン：イソプロパノール内に溶解した。
０．３又は０．５又は１μｌの試料をＨＰＴＬＣプレートにアプライした。
０．１％オレイン酸、０．１％コレステロール、及び０．１％コレステロールエステルを含有する標準溶液（１７番）をアプライし（０．１、０．３、０．５、０．８、及び１．５μｌ）、反応混合物内のフィトステロール及びフィトステロールエステルを計算するために用いた。
【０４５９】
ＴＬＣアプリケーター
ランニングバッファー５番：７０：３０：１のＰ−エーテル：メチルＴｅｒｔブチルケトン：酢酸
溶出：プレートを、Camag社製のAutomatic Developing Chamber ADC2を用いて７ｃｍ溶出した。
【０４６０】
展開：
プレートを、Camag社製のTLC Plate Heater IIIで、１６０℃で６分間にわたり乾燥させ、冷却し、１６％Ｈ３ＰＯ４内の６％酢酸銅内に浸した。１６０℃で１０分間さらに乾燥し、直接的に評価した。
ＴＬＣプレート上の構成要素の密度を、Camag社製のTLC Scanner 3によって分析した。
【０４６１】
実験：
フィトステロールエステルの酵素的合成を、表１に示す分量で行った。
【０４６２】
表１  ステロールエステルを合成するための分量
【表４】
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【０４６３】
ガム相及びGenerol 122Nのそれぞれを共に混合した。試料１において、フィトステロールのほとんどは溶解した。試料２において、フィトステロールは部分的に可溶化しただけであった。酵素（及び、添加する場合には水）を添加し、試料を５５℃でインキュベートし、試料を１日後及び４日後に採取した。４日後、試料１は、フィトステロールを含まない均質な液体であった。試料２もまたほぼ均質であったが、液体ではなかった。
【０４６４】
試料１の反応混合物内の全水分含有量は、約２．２％Ｗ／Ｗの水であり、試料２の反応混合物内の全水分含有量は、約２８．５％Ｗ／Ｗの水であった。
【０４６５】
試料をＴＬＣによって分析し、フィトステロールの変換を計算し、その結果を表２及び図６２に示す。
【０４６６】
表２  反応時間に応じたエステル化されたフィトステロールの％
【表５】
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【０４６７】
図６２は、フィトステロールのガム相の反応生成物のＴＬＣ分析を示す。
【０４６８】
表２の結果は、脂質アシルトランスフェラーゼ（例えば、ＫＬＭ３’）が、両試料において、フィトステロールからフィトステロールエステルへの非常に高い変換をもたらすことを裏付けるものである。９０％を超える変換が試料１において観察され、生成物は、全てのステロールエステルが可溶化された均質な液体生成物となる。フィトステロールからフィトステロールエステルへの良好な変換はまた、試料２においても観察された。
【０４６９】
酵素投与量の適切な調節によって、さらに高い変換及び短いインキュベート時間とすることが可能である。
【０４７０】
ステロールエステルは、あらゆる従来の単離又は精製方法を用いて単離又は精製することができる。その後、ステロールエステルは、当技術分野において知られている食品組成物若しくは食料品又はパーソナルケア製品において用いることができる。
【０４７１】
いくつかの実施形態において、１００℃への熱処理を用いて酵素を不活化することができ、ステロールエステルリン脂質試料を、ステロールの強化のために、食品用途又はパーソナルケア製品において直接的に用いることができる（例えば、単離又は精製を全く伴わずに）。
【０４７２】
結論：
実験によって、脂質アシルトランスフェラーゼによって触媒される酵素反応によって、フィトステロール及びリン脂質組成物（例えば、水による油の脱ガムから得られるガム相）からフィトステロールエステルを生産することが可能であることが示された。フィトステロールからフィトステロールエステルへの９０％を超える変換が可能である。
【実施例２】
【０４７３】
【表６】
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【０４７４】
水による脱ガムから得られるガム相を５５℃まで加熱する。樹木から単離された植物スタノールを、撹拌しながら添加する。脂質アシルトランスフェラーゼ（ＫＬＭ３’）を添加し、反応混合物を撹拌しながら５５℃でインキュベートする。２０時間後、反応混合物を９５℃まで加熱して、酵素を不活化し、試料をスタノール及びスタノールエステルについてＨＰＴＬＣによって分析する。試料番号１及び３において、スタノールの５０％超がエステル化され、試料番号２においては、スタノールエステルは形成されなかった。
【０４７５】
上記の明細書において述べられた全ての刊行物は、参照することによって本明細書に組み込まれる。本発明の範囲及び趣旨から逸脱することのない、本発明の記載された方法及び系の様々な修飾及び変更は、当業者に明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して記載されてきたが、特許請求の範囲に記載された発明は、このような特定の実施形態に不当に限定されるわけではないことを理解されたい。実際、生化学及びバイオテクノロジー並びに関連の分野における当業者には自明の、本発明を実施するための記載された方法の様々な修飾は、以下の特許請求の範囲内にあるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２−１】
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【図７２−２】
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【図７３】
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【図７４】
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【配列表】
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