(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトのメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、パラインフルエンザウイルス３（ＰＩＶ−３）及び呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）からなる群から選択される異なるパラミクソウイルスの少なくとも２つのＦタンパク質抗原を含んでなり、
前記少なくとも２つのパラミクソウイルスのＦタンパク質抗原がそれぞれ、パラミクソウイルスのＦタンパク質ポリペプチドのＦ２ドメインおよびＦ１ドメインを含んでなるＦタンパク質ポリペプチドを含んでなり、
ｈＭＶＰおよびＰＩＶ−３のＦタンパク質ポリペプチドは、天然に存在するＦタンパク質前駆体（Ｆ０）に存在するフリン切断部位を消失させる少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失又は置換を含んでなり、ヘテロコイルドコイル三量体化ドメインをさらに含んでなり、
ＲＳＶのＦタンパク質ポリペプチドは、膜貫通ドメインを欠いており、かつ、天然に存在するＦタンパク質前駆体（Ｆ０）に存在するフリン切断部位を消失させるｐｅｐ２７の欠失、少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失又は置換を含んでなり、ヘテロコイルドコイル三量体化ドメインをさらに含んでなる、
免疫原性組成物。
【請求項２】
前記ヘテロ三量体化ドメインが、Ｆ１ドメインのＣ末端に位置する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記Ｆタンパク質ポリペプチドの少なくとも１つが、前記Ｆ２ドメインと前記Ｆ１ドメインの間に未変化の融合ペプチドを含んでなる、請求項１または２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記Ｆタンパク質ポリペプチドの少なくとも１つが、
（ａ）少なくとも１つの酵素切断部位の欠失、
（ｂ）Ｆタンパク質の細胞外ドメインの疎水性ドメインにおける親水性アミノ酸の少なくとも１つの置換又は付加、及び
（ｃ）グリコシル化を変化させるアミノ酸置換
から選択される少なくとも１つの修飾を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記少なくとも２つのパラミクソウイルスのＦタンパク質抗原が、ヒト呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）のＦタンパク質抗原と、ヒトのメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）のＦタンパク質抗原及びパラインフルエンザウイルス３（ＰＩＶ−３）のＦタンパク質抗原のうち少なくとも１つとを含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記少なくとも２つのパラミクソウイルスのＦタンパク質抗原が、ヒトのメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）のＦタンパク質抗原及びパラインフルエンザウイルス３（ＰＩＶ−３）のＦタンパク質抗原を含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記Ｆタンパク質ポリペプチドの少なくとも１つが、天然に存在するＦタンパク質前駆体（Ｆ０）に存在するフリン切断部位を消失させる少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失又は置換を含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記Ｆタンパク質ポリペプチドの少なくとも１つが、グリコシル化を変化させる少なくとも１つの修飾をさらに含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記少なくとも２つのパラミクソウイルスのＦタンパク質抗原の１以上が、
（ａ）配列番号１０を含んでなるか、又はそれからなるＲＳＶのＦタンパク質ポリペプチド、配列番号１２を含んでなるか、又はそれからなるｈＭＰＶのＦタンパク質ポリペプチド、及び配列番号１４を含んでなるか、又はそれからなるＰＩＶ−３のＦタンパク質ポリペプチド、
（ｂ）配列番号９によってコードされるＲＳＶのＦタンパク質ポリペプチド、配列番号１１によってコードされるｈＭＰＶのＦタンパク質ポリペプチド、配列番号１３によってコードされるＰＩＶ−３のＦタンパク質ポリペプチド、及び配列番号９、１１及び１３の少なくとも１つにストリンジェントな条件下で実質的に全長にわたってハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるＰｒｅＦタンパク質ポリペプチド；並びに
（ｃ）配列番号１０と少なくとも８９％の配列同一性を持つＰｒｅＦポリペプチド、配列番号１２と少なくとも９４％の配列同一性を持つＰｒｅＦポリペプチド、及び配列番号１４と少なくとも９５％の配列同一性を持つＰｒｅＦポリペプチド
からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記Ｆタンパク質抗原の少なくとも１つが、ポリペプチドの多量体を含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記Ｆタンパク質抗原の少なくとも１つが、ポリペプチドの三量体を含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
キャリア又は賦形剤をさらに含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
アジュバントをさらに含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記免疫原性組成物が、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ−３及びＲＳＶのうち２以上による感染を軽減する又は予防する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記免疫原性組成物が、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ−３及び／又はＲＳＶによる感染に続く病的な症状又は疾患を軽減する又は予防する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組換えパラミクソウイルスＦタンパク質抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる、組換え核酸。
【請求項１７】
前記核酸が、
（ａ）配列番号９、配列番号１１及び配列番号１３を含んでなるか、又はそれらからなるポリヌクレオチド配列；
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下で実質的に全長にわたってハイブリダイズするポリヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を持つポリヌクレオチド配列
から選択されるポリヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１６に記載の組換え核酸。
【請求項１８】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＦタンパク質抗原または請求項１６又は１７に記載の核酸を含んでなる、ＲＳＶ感染の治療に用いるための医薬組成物。
【請求項１９】
ｈＭＰＶ、ＰＩＶ−３及びＲＳＶのうち１以上による感染を予防的に治療する目的で投与される、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
対象においてｈＭＰＶ、ＰＩＶ−３及びＲＳＶのうち１以上に対する免疫応答を誘発することに用いるための請求項１〜１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
前記免疫応答がＴｈ１優位の免疫応答である、請求項２０に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
前記免疫応答が、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ−３及びＲＳＶのうち１以上による感染を軽減する又は予防する防御的免疫応答を含んでなる、請求項２０又は２１に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
医薬に使用するための請求項１〜１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
ＲＳＶに関連する疾患の予防又は治療に使用するための請求項１〜１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その開示が参照によって本明細書に組み入れられる、２００９年６月２４日に出願された米国特許仮出願番号６１／２１９，９５８の出願日の利益を主張する。
【０００２】
本特許文書の開示の一部には著作権防御の対象となるものが含まれる。著作権の所有者は、米国特許商標局の特許ファイル又は記録に出現するような特許文書又は特許開示のファクシミリ再生に反対するものではないが、どんなものであれ、著作権をすべて保有する。
【背景技術】
【０００３】
本開示は免疫学の分野に関する。さらに詳しくは、本開示は、下部気道感染の原因を統制することによって感染及び／又は感染の症状を抑える免疫応答を誘発する組成物及び方法に関する。
【０００４】
ヒトの呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトのメタニューモウィルス（ｈＭＰＶ）及びパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ１〜４）は、１歳未満の幼児における下部気道感染（ＬＲＩ）の最も一般的な原因である。これらのウイルスが原因となる疾患のスペクトルには、鼻炎及び耳炎から肺炎及び細気管支炎までの幅広い呼吸器症状が含まれ、後者の２疾患は、考慮すべき罹患率及び死亡率と関連している。
【０００５】
ヒトの呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）は、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ亜科、Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ属の病原性ウイルスである。ＲＳＶのゲノムは、１１のタンパク質をコードするマイナス鎖ＲＮＡ分子である。ウイルスのＮタンパク質とのＲＮＡゲノムの堅い会合によってウイルスのエンベロープ内で包まれるヌクレオカプシドが形成される。Ｇ糖タンパク質の抗原性に基づいて、ヒトＲＳＶ株の２つの群、Ａ群及びＢ群が記載されている。
【０００６】
ヒトの呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）に似たヒトのメタニューモウィルス（ｈＭＰＶ）は、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科のＰｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ亜科に分類される。しかしながら、ｈＭＰＶは、鳥類のメタニューモウィルス（以前は、七面鳥鼻気管炎ウイルスと呼ばれた）に遺伝的には最も密接に関係する。これら２つのウイルスはＭｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ属に分類され、ｈＭＰＶはこの属では初めてヒトでの疾患の原因となった。ｈＭＰＶはオランダの研究者によって２００１年に最初に記載され、以来、南極大陸を除いてあらゆる大陸での国々で特定されている。ｈＭＰＶはマイナス単鎖のＲＮＡ内包型ウイルスである。今日までｈＭＰＶの２つの主な群（Ａ及びＢ）及び４つの亜群が特定されている。
【０００７】
ヒトのパラインフルエンザウイルスは、幼児の下部気道疾患の原因として呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）に次ぐ位置にあるパラミクソウイルスの一群である。ヒトのパラインフルエンザウイルスは、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ科、Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ属に分類される。ＲＳＶと同様に、ヒトのパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）は、生涯にわたって何回も感染を起こすことができる。これらの感染は普通、上部気道の病気（たとえば、風邪又は喉の痛み）によって顕在化する。ＨＰＩＶはまた、特に高齢者及び欠陥のある免疫系を持つ患者の間で反復感染（肺炎、気管支炎、細気管支炎を含んでなる）によって重篤な下部気道疾患を引き起こすこともできる。４つのＨＰＩＶ（血清型１〜４）のそれぞれは、異なった臨床的な及び疫学的な特徴を有する。ＨＰＩＶ−１及びＨＰＩＶ−２の最も独特の特徴は、クループ（咽頭気管気管支炎）である。ＨＰＩＶ−３は、細気管支炎及び肺炎を含んでなる重篤な下部呼吸器疾患に関連することが最も多い。ＨＰＩＶ−４は重篤な疾患に関連することは少ない。
【０００８】
健常な集団及びリスクのある集団で耐久性のある防御的免疫応答を産生する、これら呼吸器ウイルスに対する安全で且つ有効なワクチンを生成する尽力にて様々なアプローチが試みられている。しかしながら、これらのウイルスが原因となる下部呼吸器感染（ＬＲＩ）を含んでなる感染を防ぐ及び／又は疾患を軽減する若しくは防ぐ目的にてワクチンとして安全で且つ有効であることが分かっていると今日評価されている候補はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本開示は、ヒトにおいて下部気道感染の先導的な原因ウイルスから選択される少なくとも２つのパラミクソウイルスＦタンパク質抗原を含んでなる免疫原性組成物に関する。本明細書で開示される免疫原性組成物は、メタニューモウィルス（ｈＭＰＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）及び呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）から選択される少なくとも２つのＦタンパク質抗原を含んでなる。組み合わせにおける抗原は、三量体の前融合立体構成を安定化するように修飾されている組換えＦタンパク質である。また開示されるのは、組換え抗原をコードする核酸及びこれらのウイルスの少なくとも２つに特異的な免疫応答を誘発するために、たとえば、感染及び／又は感染が原因で生じる疾患に対してこれらの剤で防御するために抗原を産生し、使用する方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１Ａは、ＲＳＶのＦタンパク質の構造的特徴を強調する模式図であり、図１Ｂは、例となるＲＡＶの前融合Ｆ（ＰｒｅＦ）抗原の模式図である。
【図２】ＲＳＶ、ｈＭＰＶ及びＰＩＶの例となるＦタンパク質ポリペプチド間の配列配置を示す図である。
【図３】図３Ａは、ｈＭＰＶの例となる株の同系性を説明する系統樹を示す図であり、図３Ｂは、％同一性の対ごとの比較を提供する要約表を示す図である。
【図４】図４Ａは、ＰＩＶ−３の例となる株の同系性を説明する系統樹を示す図であり、図４Ｂは、％同一性の対ごとの比較を提供する要約表を示す図である。
【図５】図５Ａは、ＲＳＶの例となる株の同系性を説明する系統樹を示す図であり、図５Ｂは、％同一性の対ごとの比較を提供する要約表を示す図である。
【図６】図６Ａ及び図６Ｂは、ＰｒｅＦ抗原によって引き出されたＲＳＶに特異的なＩｇＧ及び中和抗体の力価を示す棒グラフである。
【図７】マウスにおいてＲＳＶのＰｒｅＦ抗体によって提供された負荷に対する防御を示すグラフである。
【図８】図８Ａ及び図８Ｂは、パラミクソウイルスＦタンパク質抗原の組み合わせを含んでなる免疫原性組成物の成分に特異的なＩｇＧ及び中和抗体の力価を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
序論
幼児や小児における細気管支炎や肺炎のような重篤な兆候を含んでなる下部気道感染の３つの主要な原因は、大きい順に、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトのメタニューモウィルス（ｈＭＰＶ）、及びパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）ファミリーのメンバーである。本開示は、パラミクソウイルスファミリーのウイルス病原体に対して防御し、免疫スケジュールの最適化を提供して日常の免疫付与に匹敵するワクチン接種スケジュールに従って乳児の防御を増強する組み合わせワクチンを記載する。
【００１２】
ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００２２７７は、三量体の前融合立体構成を安定化するように修飾されている組換えＲＳＶのＦタンパク質を含んでなる新規の抗原の設計、産生及び利用を開示している。開示された組換え抗原は、優れた免疫原性を示し、ＲＳＶの感染及び／又は疾患に対する防御のための免疫原性組成物（たとえば、ワクチン）として特に好ましく採用される。また開示されるのは、組換え抗原をコードする核酸、抗原を含有する免疫原性組成物、抗原を産生し、使用するための方法である。本開示は、これらの教示をヒトの呼吸器の感染及び疾患に関わるそのほかのパラミクソウイルスに拡大する。さらに具体的には、本開示は、三量体の前融合立体構成で同様に安定化される組換えのｈＭＰＶ及びＰＩＶ（たとえば、ＰＩＶ−３）のタンパク質を提供する。これらの抗原は、２以上のパラミクソウイルスによる感染の影響に対して防御する又は影響を軽減する免疫応答を誘発するために抗原の組み合わせを含有する組成物で特に有用である。
【００１３】
本開示の一態様は、ヒトのメタニューモウィルス（ｈＭＰＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）及び呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）の群から選択される少なくとも２つのパラミクソウイルスＦタンパク質抗原を含んでなる免疫原性組成物に関する。パラミクソウイルスＦタンパク質抗原は、パラミクソウイルスＦタンパク質ポリペプチドのＦ２ドメイン及びＦ１ドメインを含んでなり、膜貫通ドメイン（たとえば、可溶性）を欠き、ヘテロ三量体化ドメインによって三量体の前融合立体構成で安定化される組換えＦタンパク質ポリペプチドである。たとえば、ヘテロ三量体化ドメインは、コイルド／コイルドメイン、たとえば、イソロイシンジッパーを含んでなることができ、配列番号１５のアミノ酸配列によって例示される。発現の際、Ｆタンパク質ポリペプチドは、多量体、好ましくは三量体を形成する。
【００１４】
Ｆタンパク質ポリペプチドは通常、Ｆ２ドメイン及びＦ１ドメインを含んでなり、介在フリン切断部位を含まない。プロセッシングの間及び成熟形態にてＦ２ドメイン及びＦ１ドメインが切断されないように、Ｆタンパク質ポリペプチドはＦ２ドメイン及びＦ１ドメインの間に未変化の融合ペプチドを保持する。通常、ヘテロ三量体化ドメインは、Ｆ１ドメインのＣ末端に位置する（たとえば、天然に存在するパラミクソウイルスＦタンパク質にて膜貫通ドメインが存在する位置のＮ末端の約２０アミノ酸の代わりに又はその範囲内で）。
【００１５】
通常、Ｆタンパク質ポリペプチドはシグナルペプチド（成熟抗原から切断され得る）を含んでなる。シグナルペプチドは、同一のパラミクソウイルスＦタンパク質から、異なったパラミクソウイルスＦタンパク質から、又は全く異なったタンパク質からであり得る。たとえば、シグナルペプチドは、選択された宿主細胞での産生を促進するために熟練者の裁量で選択され得る。
【００１６】
Ｆタンパク質ポリペプチドは、前融合立体構造を維持するように操作される三量体を安定して形成する。任意で、Ｆタンパク質ポリペプチドはまた、前融合立体構造の安定性を高める１以上の修飾も含んでなる。たとえば、好ましい修飾には、Ｆタンパク質の細胞外ドメイン（たとえば、ＨＲＡ及び／又はＨＲＢ）の疎水性ドメインにおける親水性アミノ酸の置換又は付加；グリコシル化を変化させるアミノ酸の置換が挙げられる。任意で、Ｆタンパク質ポリペプチドは、ポリヒスチジン配列又はそのほかのタグを含んで精製を円滑にする。
【００１７】
特定の実施形態では、免疫原性組成物はまた、少なくとも１つのパラミクソウイルスＧタンパク質ポリペプチド又はその免疫原性断片も含んでなる。Ｇタンパク質ポリペプチドは、完全長の組換えＧタンパク質、又は単離された免疫原性断片又はキメラ（若しくは「融合」）タンパク質（Ｆタンパク質ポリペプチド又は別の融合相手との）であリ得る。断片が選択される場合、断片は通常、少なくとも１つの免疫優勢エピトープ、たとえば、ＲＳＶのＧタンパク質のアミノ酸１８４〜１９８を保持する。
【００１８】
特定の実施形態では、免疫原性組成物は、２つのパラミクソウイルスＦタンパク質抗原を含んでなる。たとえば、特定の一実施形態では、免疫原性組成物は、ｈＭＰＶタンパク質に相当するＦタンパク質ポリペプチド及びＰＩＶ（たとえば、ＰＩＶ−３）に相当するＦタンパク質ポリペプチドを含んでなる。他の実施形態では、免疫原性組成物は、ｈＭＰＶのＦタンパク質ポリペプチド又はＰＩＶタンパク質ポリペプチド、又はｈＭＰＶ及びＰＩＶのタンパク質ポリペプチド双方との組み合わせでＲＳＶのＦタンパク質ポリペプチドを含んでなる。他の実施形態では、免疫原性組成物は、少なくとも２つのパラミクソウイルスＦタンパク質抗原に加えて、少なくとも１つの追加の抗原を含んでなる。たとえば、ＲＳＶ、ｈＭＰＶ及び／又はＰＩＶに相当するＦタンパク質ポリペプチドに加えて、免疫原性組成物は、たとえば、異なったＲＳＶ株に相当するＦタンパク質ポリペプチドのような追加的なパラミクソウイルス抗原を含んでなることもできる。或いは、免疫原性組成物は、たとえば、組成物がＰＩＶ−３及びＰＩＶ−１の抗原を含んでなるように、異なった血清型のＰＩＶに相当するＦタンパク質ポリペプチドのような第２の（それ以上の）ＰＩＶのＦタンパク質抗原を含んでなることができる。他の実施形態では、免疫原性組成物は、気道感染にも関与するインフルエンザ（オルソミクソウイルス）、アデノウイルス又はＳＡＲＳのようなウイルスからの第３の又はそれに続く抗原を含んでなる。たとえば、免疫原性組成物は、ｈＭＰＶのＦタンパク質ポリペプチド及びＰＩＶタンパク質ポリペプチド及び／又はＲＳＶのＦタンパク質ポリペプチドに加えて、インフルエンザＨＡ抗原を含んでなることができる。
【００１９】
特定の好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、少なくとも１つのキャリア又は賦形剤（たとえば、緩衝液）も含んでなる。免疫原性組成物は好ましくは、アジュバント、好ましくは、Ｔｈ１優位の免疫応答を誘発するアジュバントと共に製剤化される。アジュバントは通常、標的集団、たとえば、新生児及び乳児において過度の反応誘発性をもたらさずに防御的な免疫応答を高めるように選択される。
【００２０】
対象又は対象の集団に投与する場合、本明細書で開示される免疫原性組成物は、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ及びＲＳＶの２以上、及び任意で１以上の追加の呼吸器病原体による感染、それらが原因で生じる病理反応を軽減し、又は防ぐ。従って、本開示は、本明細書で開示される免疫原性組成物を対象（たとえば、ヒト対象）に投与することによってｈＭＰＶ、ＰＩＶ及びＲＳＶの１以上に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。開示される免疫原性組成物の投与は、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ及びＲＳＶの少なくとも２つによる感染を軽減する又は予防するＴｈ１優位の免疫応答を好都合に誘発する。従って、本開示は、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ及びＲＳＶの２つによる感染を治療する（たとえば、予防する）ための医薬の調製におけるパラミクソウイルスＦタンパク質抗原の使用に関する。たとえば、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ及びＲＳＶの１以上が原因で生じる感染を予防的に治療する目的での医薬の調製にてＦタンパク質抗原（又は核酸）が使用される。
【００２１】
本開示の別の態様は、本明細書で開示されるパラミクソウイルスＦタンパク質抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる組換え核酸に関する。そのような核酸は、選択される宿主での発現についてコドンが最適化されることが多い。核酸は、たとえば、原核細胞ベクター、真核細胞ベクター、発現ベクターのようなベクターに挿入することができる。特定の実施形態では、核酸は宿主細胞に導入される。宿主細胞は好都合には、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞及び哺乳類細胞の中から選択される。
用語
【００２２】
特に説明されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はすべて本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。分子生物学での一般用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，１９９４（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）に見い出すことができる。
【００２３】
単数用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は文脈が明瞭に示さない限り、複数の指示対象を含んでなる。同様に、語「又は」は、文脈が明瞭に示さない限り、「及び」を含んでなる。用語「複数の」は、２以上を指す。核酸又はポリペプチドに対して与えられる塩基のサイズ、アミノ酸のサイズはすべて、及び分子量又は分子質量はすべて近似であり、記載に対して提供される。さらに、抗原のような物質の濃度又はレベルに関して与えられる数値限界は近似であることが意図される。従って、濃度が少なくとも（たとえば）、２００ｐｇであると示される場合、濃度は少なくともおよそ（又は約又は〜）２００ｐｇであると理解される。
【００２４】
本明細書で記載されるものに類似の又は同等の方法及び物質が本開示の実践又は試験で使用され得るが、好適な方法及び物質は以下に記載される。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」は「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」を意味する。従って、文脈が必要としない限り、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」及びその変異体「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は、言及された化合物若しくは組成物（たとえば、核酸、ポリペプチド、抗原）若しくは工程、又は化合物若しくは工程の群の包含を暗示するように理解されるが、他の化合物、組成物、工程、又はそれらの群の排除を暗示しないように理解される。略記「ｅ．ｇ．」はラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａに由来し、本明細書では非限定例を指すように使用される。従って、略記「ｅ．ｇ．」は用語「たとえば」と同義である。
【００２５】
本開示の種々の実施形態の概説を円滑にするために、以下の用語の説明が提供される。本開示の文脈で追加の用語及び説明が提供され得る。
【００２６】
用語「Ｆタンパク質」又は「融合タンパク質」又は「Ｆタンパク質ポリペプチド」又は「融合タンパク質ポリペプチド」は、パラミクソウイルスの融合タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全部又は一部を有するポリペプチド又はタンパク質を指す。同様に用語「Ｇタンパク質」又は「Ｇタンパク質ポリペプチド」は、パラミクソウイルスの連結タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全部又は一部を有するポリペプチド又はタンパク質を指す。多数のパラミクソウイルスの融合及び連結タンパク質ポリペプチドが記載されており、当業者に既知である。ＷＯ２００８１１４１４９は、本開示の提出日時点で公的に利用可能な例となるＲＳＶのＦ及びＧタンパク質の変異体（たとえば、天然に存在する変異体）を提示している。ｈＭＰＶのＦタンパク質の例となる株は、ｈＭＶＰ配列の開示について参照によって本明細書に組み入れられ、付属１として本明細書に添付されるＢｏｉｖｉｎら、Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１０：１１５４−１１５７（２００４）でカタログ化されている。例となるＰＩＶ（たとえば、ＰＩＶ−３）のＦタンパク質の配列は、ＰＩＶ配列の開示について参照によって本明細書に組み入れられ、付属２として本明細書に添付されるＰｒｉｎｏｓｋｉら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：５５−６９（１９９１）に提供されている。これらの参考文献のそれぞれは、例となるＦタンパク質配列を開示する目的で、参照によって本明細書に組み入れられる。さらに、これらの配列の多くは、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（２００９年６月２４日時点）にて公的に利用可能である。
【００２７】
核酸又はポリペプチド（たとえば、パラミクソウイルスのＦ又はＧのタンパク質の核酸又はポリペプチド又は類似体）を指す場合の「変異体」は、参照の核酸又はポリペプチドとは異なる核酸又はポリペプチドである。普通、変異体と参照の核酸又はポリペプチドとの間の差異は、指示対象に比べて比率的に少数の差異を構成する。
【００２８】
ポリペプチド又はタンパク質のドメインは、ポリペプチド又はタンパク質の中で構造的に定義された要素である。たとえば、「三量体化ドメイン」は、ポリペプチドの三量体への集合を促進するポリペプチド内のアミノ酸配列である。たとえば、三量体化ドメインは他の三量体化ドメイン（同一の又は異なったアミノ酸配列を持つ追加のポリペプチドの）との会合を介して三量体への集合を促進することができる。用語は、そのようなペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すのにも使用される。
【００２９】
用語「天然の」及び「天然に存在する」は、天然のままと同一状態で存在するたとえば、タンパク質、ポリペプチド、又は核酸のような要素を指す。すなわち、要素は人工的に修飾されていない。この開示の文脈で、たとえば、ＲＳＶの天然に存在する株又は単離体から得られるような、ＲＳＶタンパク質又はポリペプチドの多数の天然に存在する変異体があることが理解されるであろう。
【００３０】
用語「ポリペプチド」は、モノマーがアミド結合を介して一緒に連結されるアミノ酸残基であるポリマーを指す。用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は本明細書で使用されるとき、アミノ酸配列を包含し、糖タンパク質のような修飾された配列を含んでなることが意図される。用語「ポリペプチド」は特に、組換え的に又は合成的に製造されるものと同様に天然に存在するタンパク質を網羅することが意図される。用語「断片」は、ポリペプチドに関してポリペプチドの一部（すなわち、部分列）を指す。用語「免疫原性の断片」は、完全長の参照のタンパク質又はポリペプチドの少なくとも１つの優勢な免疫原性のエピトープを保持するポリペプチドの断片を指す。ポリペプチド内の方向は、個々のアミノ酸のアミノ部分とカルボキシ部分の方向によって定義される、Ｃ末端方向に向かうＮ末端にて一般に言及される。ポリペプチドは、Ｎ末端又はアミノ末端からＣ又はカルボキシ末端に向かって翻訳される。
【００３１】
「シグナルペプチド」は、たとえば、小胞体の膜に対して及びそれを介して新しく合成された分泌タンパク質又は膜タンパク質を指示する短いアミノ酸配列（たとえば、およそ１８〜２５アミノ酸の長さ）である。シグナルペプチドはポリペプチドのＮ末端に位置することが多いが、普遍的ではなく、タンパク質が膜を交差した後、シグナルペプチダーゼによって切断されることが多い。シグナル配列は通常、３つの一般的な特徴：Ｎ末端の極性塩基性領域（ｎ−領域）、疎水性コア及び親水性ｃ−領域を含有する。
【００３２】
用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸配列」は、少なくとも１０塩基の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又はいずれかのヌクレオチドの修飾された形態であり得る。該用語は、ＤＮＡの単鎖形態及び二本鎖形態を含んでなる。「単離されたポリヌクレオチド」によって、由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて直接隣接する（５’末端の１つ及び３’末端の１つ）コーディング配列の双方と直接隣接しないポリヌクレオチドを意味する。一実施形態では、ポリヌクレオチドはポリペプチドをコードする。核酸の５’及び３’の方向は、個々のヌクレオチド単位の接続性を参照して定義され、デオキシリボース（又はリボース）糖鎖の炭素部分に従って指定される。ポリヌクレオチド配列の情報（コーディング）内容は５’から３’の方向で読み取られる。
【００３３】
「組換え」核酸は、天然に存在しない配列を有し、又は配列の２つの分離した断片の人工的な組み合わせによって作製された配列を有するものである。この人工的な組み合わせは、化学的な合成によって、さらに一般的には、たとえば、遺伝子操作技法による核酸の単離された断片の人工的な操作によって達成することができる。「組換え」タンパク質は、たとえば、細菌細胞又は真核細胞のような宿主細胞に導入された非相同（たとえば、組換え）の核酸によってコードされるものである。核酸は、導入された核酸によってコードされるタンパク質を発現することが可能であるシグナルを有する発現ベクターに導入することができ、又は核酸は宿主細胞の染色体に統合することができる。
【００３４】
用語「非相同の」は、核酸、ポリペプチド又は別の細胞成分に関して、通常天然に見つからない成分が存在する、及び／又は異なった供給源若しくは種を起源とする成分が存在することを示す。
【００３５】
用語「精製」（たとえば、病原体又は病原体を含有する組成物に関して）は、望ましくない存在を組成物から取り除く工程を指す。精製は相対的な用語であり、微量な望ましくない成分のすべてが組成物から取り除かれることを必要としない。ワクチン生産の文脈では、精製は、たとえば、遠心、透析、イオン交換クロマトグラフィ、及びサイズ排除クロマトグラフィ、アフィニティ精製又は沈殿のような工程を含んでなる。従って、用語「精製される」は、絶対的な純度を必要とせず、むしろ、それは相対的な用語として意図される。従って、たとえば、精製された核酸の調製物は、一般的な環境、たとえば、細胞又は生化学的な反応器における核酸よりも特定のタンパク質が濃縮されるものである。実質的に純粋な核酸又はタンパク質は、所望の核酸が、調製物の全核酸含量の少なくとも５０％を表すように精製することができる。特定の実施形態では、実質的に純粋な核酸は、調製物の全核酸含量の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上を表す。
【００３６】
「単離された」生物構成成分（たとえば、核酸分子、タンパク質又は細胞小器官）は、構成成分、たとえば、そのほかの染色体の及び染色体外のＤＮＡ及びＲＮＡ、タンパク質及び細胞小器官が天然に存在する生物の細胞におけるそのほかの生物構成成分から実質的に分離され、又は精製されている。「単離された」核酸及びタンパク質は、標準の精製方法によって精製された核酸及びタンパク質を含んでなる。該用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製される核酸及びタンパク質、並びに化学的に合成される核酸及びタンパク質も包含する。
【００３７】
「抗原」は、動物に注射される、吸収される又はさもなければ導入される組成物を含んでなる、動物にて抗体の産生及び／又はＴ細胞反応を刺激することができる化合物、組成物又は物質である。用語「抗原」は、関連する抗原性エピトープすべてを含んでなる。用語「エピトープ」又は「抗原決定基」は、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞が応答する抗原の部位を指す。「優勢な抗原性エピトープ」又は「優勢なエピトープ」は機能的に有意な宿主の免疫応答、たとえば、抗体反応又はＴ細胞反応が為されるエピトープである。従って、病原体に対する防御免疫応答に関して、優勢な抗原性エピトープは、宿主の免疫系によって認識されると病原体が原因で生じる疾患からの防御を生じる抗原性部分である。用語「Ｔ細胞エピトープ」は、適切なＭＨＣ分子に結合すると、Ｔ細胞によって（Ｔ細胞受容体を介して）特異的に結合されるエピトープを指す。「Ｂ細胞エピトープ」は、抗体（又はＢ細胞受容体分子）によって特異的に結合されるエピトープである。
【００３８】
「アジュバント」は、非特異的に免疫応答を高める剤である。一般的なアジュバントには、抗原が吸着した鉱物（ミョウバン、水酸化アルミナム、リン酸アルミナム）の懸濁液；油中水及び水中油型（及びその変異体、二重エマルション及び逆エマルションを含んでなる）を含んでなるエマルション、リポ糖類、リポ多糖類、免疫賦活核酸（たとえば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）、リポソーム、Ｔｏｌｌ様受容体作動薬（特に、ＴＬＰ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７／８、及びＴＬＲ９の作動薬）、並びにそのような成分の種々の組み合わせが挙げられる。
【００３９】
「免疫原性組成物」は、たとえば、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ（たとえば、ＰＩＶ−３、ＰＩＶ−１）及び／又はＲＳＶのような病原体に対して特異的な免疫応答を誘発することが可能である、ヒト又は動物対象（たとえば、実験設定で）に投与するのに好適なものの組成物である。そのようなものとして、免疫原性組成物は、１以上の抗原（たとえば、ポリペプチド抗原）又は抗原性エピトープを含んでなる。免疫原性組成物はまた、たとえば、賦形剤、キャリア及び／又はアジュバントのような、免疫応答を誘発する又は高めることが可能である追加の１以上の成分を含んでなることができる。特定の例では、免疫原性組成物を投与して、病原体によって誘導される症状又は状態に対して対象を防御する免疫応答を誘発する。場合によっては、病原体が原因で生じる症状又は疾患は、病原体に対する対象の暴露に続く病原体（ｈＭＰＶ、ＰＩＶ及び／又はＲＳＶ）の複製を阻害ずることによって防がれる（又は軽減される又は改善される）。本開示の文脈では、用語、免疫原性組成物は、病原体に対する予防的な又は緩和的な免疫応答を誘発する目的で対象又は対象の集団への投与を意図される組成物を包含することが理解されるであろう（すなわち、ワクチン組成物又はワクチン）。
【００４０】
「免疫応答」は、免疫系の細胞、たとえば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、又は単球の刺激への応答である。免疫応答は、抗原特異的な中和抗体のような特異的抗体の産生を生じるＢ細胞の応答であることができる。免疫応答は、たとえば、ＣＤ４＋応答又はＣＤ８＋応答のようなＴ細胞の応答であることもできる。場合によっては、応答は特定の抗原に特異的である（すなわち、「抗原特異的応答」）。抗原が病原体に由来するのであれば、抗原特異的応答は、「病原体特異的応答」である。「防御免疫応答」は、病原体の有害な機能又は活性を抑え、病原体による感染を低減し、病原体による感染の結果生じる症状（死亡を含んでなる）を減らす免疫応答である。防御免疫応答は、たとえば、プラーク低減アッセイ若しくはＥＬＩＳＡ中和アッセイにおけるウイルス複製若しくはプラーク形成の阻害によって、又は生体内での病原体負荷に対する耐性を測定することによって測定することができる。
【００４１】
「Ｔｈ１」優位の免疫応答は、ＩＬ−２及びＩＦＮγを産生するのでＩＬ−２及びＩＦＮγの分泌又は存在によるＣＤ４＋ヘルパー細胞の存在を特徴とする。それに対して、「Ｔｈ２」優位の免疫応答は、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３を産生するＣＤ４＋ヘルパー細胞の優勢を特徴とする。
【００４２】
「免疫学的に有効な量」は、組成物又は組成物中の抗原に対して対象にて免疫応答を誘発するのに使用される組成物（通常、免疫原性組成物）の量である。一般に、所望の成績は、病原体に対して対象を防御することが可能である又はそれに寄与する抗原特異的（たとえば、病原体特異的）免疫応答の産生である。しかしながら、病原体に対する防御免疫応答を得ることは、免疫原性組成物の複数の投与を必要とし得る。従って、本開示の文脈では、用語、免疫学的に有効な量は、前の又は後に続く投与との組み合わせで防御免疫応答を達成することに寄与する小部分の用量を包含する。
【００４３】
形容詞「薬学上許容可能な」は、指示対象が対象（たとえば、ヒト又は動物対象）への投与に好適であることを指す。Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版（１９７５）は、免疫原性組成物を含んでなる、治療用及び／又は予防用の組成物の薬学送達に好適な組成物及び製剤（希釈剤を含んでなる）を記載している。
【００４４】
用語「調節する」は、免疫応答のような応答に関して、応答の発症、程度、持続期間又は特徴を変える又は変化させることを意味する。免疫応答を調節する剤は、その投与に続く免疫応答の発症、程度、持続期間又は特徴の少なくとも１つを変える、又は参照剤に比べて発症、程度、持続期間又は特徴の少なくとも１つを変える。
【００４５】
用語「軽減する」は、剤の投与に続いて応答又は状態が定量的に低下するならば、又は参照剤に比べて剤の投与に続いてそれが低下するのであれば、剤が応答又は状態を軽減するように、相対的な用語である。同様に用語「予防する」は、応答又は状態の少なくとも１つの特徴が除去される限り、剤が応答又は状態を完全に除去することを必ずしも意味しない。従って、病的応答、たとえば、ワクチンが増強するウイルス性疾患のような感染又は応答を軽減する又は予防する免疫原性組成物は、感染又は応答が、剤の非存在下での又は参照剤と比べた感染又は応答の、たとえば、少なくとも約５０％、たとえば、少なくとも約７０％、約８０％、さらに約９０％（すなわち、１０％未満まで）測定上低下する限り、そのような感染又は応答を完全に除去することができるが、必ずしも完全には除去しない。
【００４６】
「対象」は、生きている多細胞の脊椎生物である。本開示の文脈では、対象は、たとえば、非ヒト動物、たとえば、マウス、コットンラット又は非ヒト霊長類のような実験用対象であり得る。或いは、対象はヒト対象であり得る。
【００４７】
ＰｒｅＦ抗原
本来、パラミクソウイルスのＦタンパク質は、Ｆ０と命名された単一のポリペプチド前駆体として発現される。生体内で、Ｆ０は、小胞体にてオリゴマー化され、フリンプロテアーゼによってタンパク分解処理を受けて、２つのジスルフィド結合断片からなるオリゴマーを生成する。ＲＳＶのＦのＦ０前駆体が２つのフリン認識部位で切断されてｐｅｐ２７と命名された介在ペプチドを放出するのに対して、ほかのパラミクソウイルス（ＰＩＶ及びｈＭＰＶのタンパク質を含んでなる）のＦタンパク質は、単一部位で切断される。フリン切断によって生じる２つの断片の小さい方はＦ２と呼ばれ、Ｆ０前駆体のＮ末端を起源とする。大きい方のＣ末端Ｆ１断片は、２４アミノ酸の細胞質尾部に隣接する疎水性アミノ酸の配列を介して膜にてＦタンパク質を固定する。略記、Ｆ０、Ｆ１及びＦ２は科学文献では一般にＦ０、Ｆ１及びＦ２と示されることが当業者によって認識されるであろう。
【００４８】
３つのＦ２−Ｆ１二量体が会合して成熟Ｆタンパク質を形成し、それは、標的細胞膜との接触の際、立体構造変化を受けるきっかけとなる準安定的な前融合形成（「前融合」）の立体構造を取る。この立体構造変化は、融合ペプチドとして知られる疎水性配列を剥き出しにし、それは、宿主細胞の膜と会合し、標的細胞膜とのウイルス又は感染細胞の膜の融合を促進する。
【００４９】
Ｆ１断片は、ＨＲＡ及びＨＲＢと命名され、それぞれ融合ペプチド及び膜貫通アンカードメインの近傍に位置する少なくとも２つの７個反復ドメインを含有する。前融合の立体構造では、Ｆ２−Ｆ１二量体は、球形の頭部及び茎構造を形成し、そこでＨＲＡドメインは球形の頭部における断片化（伸長した）構成の中にある。それに対して、ＨＲＢドメインは、頭部領域から伸びる三本鎖のコイルドコイルの茎を形成する。前融合から後融合の立体構造への転移の間、ＨＲＡドメインは崩壊し、ＨＲＢドメインの近傍にもたらされ、逆平行の６らせん束を形成する。後融合の状態で、融合タンパク質及び膜貫通ドメインは、並置されて膜の融合を円滑にする。
【００５０】
上記で提供された立体構造の記載は、結晶学データの分子モデル化に基づくが、前融合及び後融合の立体構造の構造的な識別は、結晶学への手段なしでモニターできる。たとえば、その技術的教示の目的で、参照によって本明細書に組み入れられるＣａｌｄｅｒらのＶｉｒｏｌｏｇｙ，２７１：１２２−１３１（２０００）及びＭｏｒｔｏｎらのＶｉｒｏｌｏｇｙ，３１１：２７５−２８８によって明らかにされたように、電子顕微鏡を用いて前融合及び後融合（代わりに指定された前融合及び融合）の立体構造の間を区別することができる。また、その技術的教示の目的で、参照によって本明細書に組み入れられるＣｏｎｎｏｌｌｙらのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：１７９０３−１７９０８（２００６）により記載されたようなリポソーム会合アッセイによって前融合の立体構造を融合（後融合）の立体構造から区別することができる。さらに、パラミクソウイルスＦタンパク質の前融合形態又は融合形態の１つ又はその他に存在するが、他の形態には存在しない立体構造エピトープを特異的に認識する抗体（たとえば、モノクローナル抗体）を用いて前融合の立体構造及び融合の立体構造を区別することができる。そのような立体構造のエピトープは、分子の表面における抗原決定基の優先的な暴露による。或いは、立体構造のエピトープは、直鎖ポリペプチドで隣接しないアミノ酸の並置から生じ得る。
【００５１】
本明細書で開示されるＰｒｅＦ抗原は、発現されたタンパク質の集団にて発現されたタンパク質の集団の実質的な部分が、前融合（前融合）の立体構造にあるように（たとえば、構造的な及び／又は熱動態的なモデル化によって予測されるように又は上記で開示された方法の１以上によって評価されるように）、パラミクソウイルスＦタンパク質の前融合の立体構造を安定化させ、維持するように設計される。安定化する修飾は、天然（又は合成）のＦタンパク質、たとえば、配列番号２の例となるＲＳＶタンパク質、配列番号６の例となるｈＭＰＶタンパク質及び／又は配列番号８の例となるＰＩＶタンパク質に導入される。開示される安定化する修飾の導入は、細胞環境又は細胞外環境（たとえば、対象への投与に続く生体内での）へのＰｒｅＦ抗原の導入に続く前融合の立体構造の主な免疫原性エピトープの維持を生じる。
【００５２】
先ず、Ｆ０ポリペプチドの膜アンカードメインを置き換えるためにヘテロ安定化ドメインを構築物のＣ末端に置くことができる。この安定化ドメインは、ＨＲＢの不安定性を代償し、前融合の配座異性体を安定化するのを助けると予測される。例となる実施形態では、ヘテロ安定化ドメインはタンパク質多量体化ドメインである。そのようなタンパク質多量体化ドメインの特に好都合な一例は、三量体化ドメインである。例となる三量体化ドメインは、コイルドコイルドメインを有する複数のポリペプチドの三量体への集合を促進するそのようなコイルドコイルに折り畳む。三量体化ドメインの好都合な一例は、イソロイシンジッパーである。例となるイソロイシンジッパーは、ＨａｒｂｕｒｙらのＳｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４０１−１４０７（１９９３）によって記載された操作された酵母ＧＣＮ４イソロイシン変異体である。好適なイソロイシンジッパードメインの配列の１つは配列番号１５で表されるが、コイルドコイル安定化ドメインを形成する能力を保持するこの配列の変異体も同様に好適である。代わりの安定化コイルドコイル三量体化ドメインには、ＴＲＡＦ２（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号．Ｑ１２９３３［ｇｉ：２３５０３１０３］；アミノ酸２９９−３４８）；Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ１（受入番号．ＰＯ７９９６［ｇｉ：１３５７１７］；アミノ酸２９１−３１４）；Ｍａｔｒｉｌｉｎ−４（受入番号．Ｏ９５４６０［ｇｉ：１４５４８１１７］；アミノ酸５９４−６１８；ＣＭＰ（ｍａｔｒｉｌｉｎ−１）（受入番号．ＮＰ＿００２３７０［ｇｉ：４５０５１１１］；アミノ酸４６３−４９６；ＨＳＦ１（受入番号．ＡＡＸ４２２１１［ｇｉ：６１３６２３８６］；アミノ酸１６５−１９１；及びＣｕｂｉｌｉｎ（受入番号．ＮＰ＿００１０７２［ｇｉ：４５５７５０３］；アミノ酸１０４−１３８が挙げられる。好適な三量体ドメインは、発現されたタンパク質の実質的な部分の三量体への集合を生じることが期待される。たとえば、三量体化ドメインを有する組換えＰｒｅＦポリペプチドの少なくとも５０％が三量体を形成する（たとえば、ＡＦＦ−ＭＡＬＳによって評価されるように）。通常、発現されたポリペプチドの少なくとも６０％、さらに好都合には少なくとも７０％、最も望ましくは少なくとも約７５％が三量体として存在する。
【００５３】
安定性をさらに高めるために、ＨＲＢ内の中性残基（たとえば、ロイシン、イソロイシン又はバリン）を極性残基（たとえば、リジン、アルギニン又はグルタミン）で置換することができる。たとえば、ＲＳＶのＦ抗原の文脈では、ＰｒｅＦの５１２位（天然のＦ０タンパク質に対して）に位置するロイシン残基をリジンで置換することができる（配列番号１０の例となるＰｒｅＦ抗原のＬ４８２Ｋ）。この置換は、コイルドコイル疎水性残基の周期性を改善する。同様に、１０５位のアミノ酸に続いてリジンを付加することができる。相当する又は匹敵する残基は、ｈＭＶＰ及びＰＩＶ−３にて当業者が選択することができる。
【００５４】
加えて、フリン切断モチーフの欠失（ｈＭＶＰ及びＰＩＶの場合は１つ、ＲＳＶの場合は１つ又は両方）はさらに前融合の配座異性体を安定化する。この設計によって、融合タンパク質はＦ２から切断されず、前融合の配座異性体の球形頭部からの放出を妨げ、すぐ近くの膜への接近性を妨げる。融合タンパク質と膜界面との間の相互作用が前融合状態の不安定性における主な課題であると予測される。融合工程の間、融合ペプチドと標的膜の間の相互作用は、球形頭部構造内からの融合ペプチドの暴露を生じ、前融合状態の不安定性を高め、後融合の配座異性体に折り畳む。この立体構造の変化によって膜融合の工程が可能になる。フリン切断部位の１つ（又はＲＳＶの場合、任意で両方）の除去は、融合ペプチドのＮ末端部分への膜接近性を妨げ、前融合状態を安定化させると予測される。ＲＳＶのＦタンパク質の場合、ｐｅｐ２７と命名された２つのフリン切断部位の間の配列を取り除くことができる。従って、本明細書で開示される例となる実施形態では、フリン切断モチーフの除去は、未変化の融合ペプチドを含んでなるＰｒｅＦ抗原を生じ、それは、プロセッシング及び集合の間又はそれに続いてフリンによって切断されない。
【００５５】
任意で、たとえば、１以上のアミノ酸の置換によって少なくとも１つの非フリン切断部位を取り除くことができる。たとえば、実験的証拠は、特定のメタロプロテイナーゼによる切断につながる条件下では、ＲＳＶのＦタンパク質はアミノ酸１１０〜１１８の近傍で切断され得る（たとえば、ＰｒｅＦ抗原のアミノ酸１１２と１１３の間；配列番号２の参照Ｆタンパク質ポリペプチドの１４２位のロイシンと１４３位のグリシンの間で切断が生じる）。従って、この領域内での１以上のアミノ酸の修飾は、ＰｒｅＦ抗原の切断を低下させ得る。たとえば、１１２位のロイシンは、たとえば、イソロイシン、グルタミン又はトリプトファンのような異なったアミノ酸で置換することができる。代わりに又はさらに、１１３位のグリシンは、セリン又はアラニンによって置換することができる。ｈＭＰＶ及びＰＩＶのＰｒｅＦ抗原の産生の間に、非フリンプロテアーゼによる切断が認められる事象において同様の修飾が為され得る。
【００５６】
任意で、ＰｒｅＦ抗原は、たとえば、天然のＦタンパク質ポリペプチドに存在する１以上のグリコシル化部位でグリコシル化された分子の比率を上げる又は下げることによって、グリコシル化のパターン又は状況を変える１以上の修飾を含んでなることができる。たとえば、配列番号２の天然のＲＳＶタンパク質ポリペプチドは、２７位、７０位及び５００位（配列番号１０の例となるＰｒｅＦ抗原の２７位、７０位及び４７０位に相当する）でのアミノ酸にてグリコシル化されると予測される。一実施形態では、修飾は、５００位のアミノ酸（Ｎ４７０と命名）でのグリコシル化部位の近傍に導入される。たとえば、５００位（参照配列の、例となるＰｒｅＦ抗原の４７０位の配置に相当する）のアスパラギンの代わりにグルタミン（Ｑ）のようなアミノ酸を置換することによってグリコシル化部位を取り除くことができる。好都合には、このグリコシル化部位でグリコシル化効率を高める修飾が導入される。好適な修飾の例には、５００〜５０２位にて以下のアミノ酸配列：ＮＧＳ；ＮＫＳ；ＮＧＴ；ＮＫＴが挙げられる。興味深いことに、高いグリコシル化を生じるこのグリコシル化部位の修飾はまた実質的に高いＰｒｅＦ産生を生じる。従って、特定の実施形態では、ＰｒｅＦ抗原は、参照ＰｒｅＦ配列（配列番号２）のアミノ酸５００に相当する位置で、たとえば、配列番号１０によって例示されるＰｒｅＦ抗原の４７０位にて修飾されたグリコシル化部位を有する。好適な修飾には、参照Ｆタンパク質配列の５００〜５０２位に相当するアミノ酸での、配列：ＮＧＳ；ＮＫＳ；ＮＧＴ；ＮＫＴが挙げられる。同様に、ｈＭＶＰ及びＰＩＶのＰｒｅＦ抗原にて、たとえば、配列番号６の参照ｈＭＶＰタンパク質ポリペプチドの５７位、１７２位及び／又は３５３位の１以上に相当するアミノ酸にて、及び／又はたとえば、配列番号８の参照ＰＩＶ−３タンパク質ポリペプチドの２３８位、３５９位及び／又は４４６位の１以上に相当するアミノ酸にてグリコシル化部位を修飾することができる。
【００５７】
本明細書で開示される安定化の修飾、たとえば、好ましくはＰｒｅＦ抗原のＣ末端に位置する、たとえば、コイルドコイル（たとえば、イソロイシンジッパードメイン）のような非相同の安定化ドメインの付加；疎水性ＨＲＢドメインにおけるロイシンからリジンへのような残基の修飾；フリン切断モチーフの除去；非フリン切断部位の除去；及び／又はグリコシル化部位の修飾のいずれか１つを、ほかの安定化修飾の１以上との組み合わせにて（又は全部くるめた組み合わせまで）採用することができる。たとえば、ＲＳＶのＰｒｅＦ抗原において、非相同のコイルドコイル（又はそのほかの非相同の安定化ドメイン）を単独で利用することができ、又は疎水性領域の修飾及び／又はｐｅｐ２７の除去及び／又はフリン切断部位の１つ若しくは両方の除去及び／又は非フリン切断部位の除去及び／又はグリコシル化部位の修飾のいずれかと組み合わせて利用することができる。特定の特殊な実施形態では、ＲＳＶのＰｒｅＦ抗原は、Ｃ末端のコイルドコイル（イソロイシンジッパー）ドメイン、ＨＲＢ疎水性ドメインにおける安定化置換、及びフリン切断部位双方の除去を含んでなる。そのような実施形態は、ｐｅｐ２７を欠き、フリン切断によって除去されない未変化の融合ペプチドを含んでなる。特定の一実施形態では、ＰｒｅＦ抗原はまた５００位のアミノ酸にて修飾されたグリコシル化部位を含んでなる。ｈＭＰＶ及び／又はＰＩＶのＰｒｅＦ抗原では、非相同のコイルドコイル（又は他の非相同の安定化ドメイン）を単独で利用することができ、又は疎水性領域の修飾及び／又はフリン切断部位の除去及び／又は非フリン切断部位の除去及び／又はグリコシル化部位の修飾のいずれかと組み合わせて利用することができる。特定の特殊な実施形態では、ｈＭＰＶ又はＰＩＶのＰｒｅＦ抗原は、Ｃ末端のコイルドコイル（イソロイシンジッパー）ドメイン、ＨＲＢ疎水性ドメインにおける安定化置換、及びフリン切断部位の除去を含んでなる。そのような実施形態は、フリン切断によって除去されない未変化の融合ペプチドを含んでなる。任意で、ｈＭＰＶ又はＰＩＶのＰｒｅＦ抗原は、修飾されたグリコシル化部位も含んでなる。
【００５８】
天然のＦタンパク質ポリペプチドは、ＰｒｅＦ抗原が所望されるパラミクソウイルスの任意のＦタンパク質から選択することができる。たとえば、ＲＳＶの場合、ＲＳＶのＡ株又はＲＳＶのＢ株又はそれらの変異体（上記と同義）を選択することができる。特定の例となる実施形態では、Ｆタンパク質ポリペプチドは、配列番号２で表されるＦタンパク質である。異なったＲＳＶ株に由来するＦタンパク質ポリペプチドの多数の追加の例は、ＷＯ２００８／１１４１４９（ＲＳＶのＦ及びＧのタンパク質配列の追加の例を提供する目的で参照によって本明細書に組み入れられる）に開示されている。
【００５９】
ｈＭＶＰの場合、Ａ株はＢ株（たとえば、Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２）又はそれらの変異体（上記と同義）を選択することができる。特定の例となる実施形態では、ｈＭＰＶのＦタンパク質ポリペプチドは、配列番号６で表されるＦタンパク質である。異なったｈＭＰＶ株に由来するＦタンパク質ポリペプチドの多数の追加の例は、ＢｏｉｖｉｎらのＥｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１０：１１５４−１１５７（２００４）に開示されており、例となるｈＭＰＶのＦタンパク質の配列を開示する目的で参照によって本明細書に組み入れられる。例となる核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースを参照して容易に特定することができる。
【００６０】
ＰＩＶの場合、血清型１〜４又はそれらの変異体（上記と同義）から選択される株を選択することができる。たとえば、下部気道疾患を防ぐように設計された組成物では、ＰＩＶは最も一般的にはＰＩＶ−３である。特定の例となる実施形態では、ＰＩＶのＦタンパク質ポリペプチドは、配列番号８で表されるＦタンパク質である。追加のＰＩＶ（たとえば、ＰＩＶ−３）の融合タンパク質の配列は、ＰｒｉｎｏｓｋｉらのＶｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：５５−６９（１９９１）で提供されており、例となるＰＩＶのＦタンパク質の配列を開示する目的で参照によって本明細書に組み入れられる。例となる核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースを参照して容易に特定することができる。
【００６１】
本開示の理解を円滑にするために、アミノ酸残基の位置は、株にかかわりなく、例となるＦタンパク質の１つのアミノ酸の位置（すなわち、相当するアミノ酸残基の位置に関して与えられる。ほかのパラミクソウイルスの匹敵するアミノ酸の位置は、容易に利用でき、周知の配置アルゴリズム（たとえば、ＢＬＡＳＴ、たとえば、初期設定パラメータを用いて）を用いて例となる配列と共に選択されたウイルスのＦタンパク質のアミノ酸配列を並べることによって当業者によって容易に決定することができる。これら又はそのほかのパラミクソウイルスのＦタンパク質の追加の変異体は、遺伝的浮動によって生じることができ、又は部位特異的若しくは無作為の突然変異誘発を用いて人為的に作出することができ、又は２以上の既存の変異体の組換えによって作出することができる。そのような追加の変異体も本明細書で開示されるＰｒｅＦ（及びＰｒｅＦ−Ｇ）の文脈で好適である。
【００６２】
Ｆタンパク質の選択するＦ２及びＦ１のドメインでは、当業者は、Ｆ２及び／又はＦ１のドメイン全体を厳格に含んでなる必要はないことを認識するであろう。通常、Ｆ２ドメインの配列（又は断片）を選択する場合、立体構造の考慮が重要である。従って、Ｆ２ドメインは通常、ポリペプチドの集合及び安定性を円滑にするＦ２ドメインの部分を含んでなる。ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００２２７７で開示されたように、ＲＳＶのＦタンパク質が関与する特定の実施形態では、Ｆ２ドメインはアミノ酸２６〜１０５を含んでなる。ＰＩＶのＦタンパク質が関与する特定の例となる実施形態では、Ｆ２ドメインはアミノ酸１９〜１０５を含んでなる。しかしながら、長さにおける瑣末な修飾（１以上のアミノ酸の付加又は欠失による）を有する変異体も可能である。
【００６３】
通常、Ｆ１ドメインの少なくとも部分列（又は断片）は、Ｆタンパク質の免疫優勢エピトープを含んでなる安定な立体構造を維持するように選択され、設計される。ＲＳＶのＦタンパク質が関与する例となる実施形態では、Ｆ１ドメインのポリペプチドは、ＲＳＶのＦタンパク質ポリペプチドの少なくとも約２６２〜４３６のアミノ酸を含んでなる。本明細書で提供される非限定の一例では、Ｆ１ドメインは、天然のＦタンパク質ポリペプチドのアミノ酸１３７〜５１６を含んでなる。当業者は、追加のさらに短い配列を熟練者の裁量で使用できることを認識するであろう。ｈＭＶＰのＦタンパク質が関与する例となる実施形態では、Ｆ１ドメインは、アミノ酸１０３〜４８０（たとえば、１０３〜４８１）を含んでなり、ＰＩＶのＦタンパク質が関与する例となる実施形態では、Ｆ１ドメインは、アミノ酸１１０〜４８１（たとえば、１１０〜４８４）を含んでなる。
【００６４】
立体構造の考慮に加えて、Ｆ２又はＦ１のドメインの部分列を選択する場合（又は特定のＰｒｅＦ−Ｇ抗原のＧタンパク質成分に関して以下で議論するように）、追加の免疫原性エピトープの包含に基づいて配列（たとえば、変異体、部分列まど）を選択することが望ましくてもよい。たとえば、当該技術で既知の、たとえば、神経網又は多項式決定のようなアンカーモチーフ又はそのほかの方法を用いて、追加のＴ細胞エピトープを特定することができ、たとえば、ＲＡＮＫＰＥＰ（ウエブサイト：ｍｉｆ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／Ｔｏｏｌｓ／ｒａｎｋｐｅｐ．ｈｔｍｌで利用可能）；ＰｒｏＰｒｅｄＩ（ウエブサイト：ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｐｒｏｐｒｅｄＩ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで利用可能）；Ｂｉｍａｓ（ウエブサイト：ｗｗｗ−ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで利用可能）；及びＳＹＦＰＥＩＴＨ（ウエブサイト：ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ＭＨＣＳｅｒｖｅｒ．ｄｌｌ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍで利用可能）を参照のこと。たとえば、アルゴリズムを用いてペプチドの「結合閾値」を決定し、特定の親和性で結合するＭＨＣ又は抗体の高い確率をそれらに与えるスコアを持つものを選択する。アルゴリズムは、特定の位置での特定のアミノ酸のＭＨＣ結合に対する効果、特定の位置での特定のアミノ酸の抗体結合に対する効果、又はモチーフを含有するペプチドの特定の置換の結合に対する効果のいずれかに基づく。免疫原性ペプチドの文脈の範囲内で、「保存された残基」は、ペプチドの特定の位置で無作為な分布で予想されるものより有意に高い頻度で出現するものである。アンカー残基はＭＨＣ分子との接触点を提供する保存された残基である。そのような予測方法で特定されるＴ細胞エピトープは、特定のＭＨＣタンパク質への結合を測定することによって、及びＭＨＣタンパク質の背景で提示される場合Ｔ細胞を刺激するその能力によって確認することができる。
【００６５】
好都合には、ＰｒｅＦ抗原（以下で議論されるＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含んでなる）は、発現系に相当するシグナルペプチド、たとえば、哺乳類又はウイルスのシグナルペプチド、たとえば、ＲＳＶのＦ０の天然のシグナル配列（たとえば、配列番号２のアミノ酸１〜２５又は配列番号１０のアミノ酸１〜２５）、又はｈＭＰＶ若しくはＰＩＶの天然のシグナル配列（たとえば、配列番号６又は８のアミノ酸１〜１８）を含んでなる。通常、シグナルペプチドは、組換え発現で選択される細胞に適合するように選択される。たとえば、バキュロウイルスのシグナルペプチド又はメリチンシグナルペプチドのようなシグナルペプチドは、昆虫細胞における発現について置換され得る。植物の発現系が好まれるのであれば、好適な植物シグナルペプチドが当該技術で既知である。多数の例となるシグナルペプチドが当該技術で既知であり（たとえば、多数のヒトのシグナルペプチドを記載しているＺｈａｎｇ  ＆  Ｈｅｎｚｅｌ,  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ.,  １３：２８１９-２８２４  （２００４）を参照）、古細菌、原核生物及び真核生物のシグナル配列を含んでなるＳＰｄｂシグナルペプチドデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｌｉｎｅ．ｂｉｃ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｓｐｄｂ／）にてカタログ化されている。任意で、先行の抗原のいずれかが追加の配列、又はＨｉｓタグのようなタグを含んで精製を円滑にすることができる。
【００６６】
任意で、ＰｒｅＦ抗原は追加の免疫原性成分を含んでなることができる。特定の特に好都合な実施形態では、ＰｒｅＦ抗原はパラミクソウイルスのＧタンパク質の抗原性成分を含んでなる。ＲＳＶに由来するＰｒｅＦ及びＧの成分を有する例となるキメラタンパク質は、ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００２２７７に詳細に記載されているが、例となるキメラＰｒｅＦ−Ｇタンパク質の詳細な記載に関してその全体が本明細書に組み入れられる。匹敵するＰｒｅＦ−Ｇタンパク質が、特にｈＭＯＶ及びＰＩＶ（たとえば、ＰＩＶ−３）を含んでなるパラミクソウイルスについて設計され、製造され得る。
【００６７】
たとえば、天然に存在する株に相当する配列の選択に関して、１以上のドメインが、たとえば、Ａ２若しくはロングと命名された一般の研究室単離体、又はそのほかの天然に存在する株若しくは単離体（前述のＷＯ２００８／１１４１４９で開示されたような）のようなＲＳＶのＡ株又はＢ株に配列では相当し得る。同様に、たとえば、ｈＭＰＶ及びＰＩＶを含んでなるそのほかの天然に存在するパラミクソウイルス（前述のそれぞれＢｏｉｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ.  Ｅｍｅｒｇ.  Ｉｎｆｅｃｔ.  Ｄｉｓ.１０：１１５４-１１５７  （２００４）  ａｎｄ  Ｐｒｉｎｏｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ.  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：５５-６９  （１９９１）にて開示されたような）に相当する配列が選択される。例となるＰｒｅＦタンパク質ポリペプチドは、配列番号１０、１２及び１４（それぞれ、ＲＳＶ、ｈＭＰＶ及びＰＩＶ）で提供される。
【００６８】
そのような天然に存在する又は単離される変異体に加えて、前述の配列及び配列類似性を共有する操作された変異体もＰｒｅＦ（ＰｒｅＦ−Ｇを含んでなる）抗原の文脈で採用され得る。ポリペプチド（及び一般にヌクレオチド配列）に関してＰｒｅＦ抗原ペプチド（及び以下に記載されるポリヌクレオチド配列）間の類似性は、配列同一性を参照して配列間での類似性という点で表現され得る。配列同一性は、同一性（又は類似性）比率という点で測定されることが多く；比率が高ければ高いほど、２つの配列の一次構造はよく類似する。一般に、２つのアミノ酸（又はポリヌクレオチド）の配列の一次構造が似ていれば似ているほど、折り畳み及び集合の結果生じる高次構造も類似する。ＰｒｅＦポリペプチド（又はポリヌクレオチド）配列の変異体は通常、１又は少数のアミノ酸の欠失、付加又は置換を有するが、それでもなお、非常に高い比率でアミノ酸、一般にはそのポリヌクレオチド配列を共有する。さらに重要なことに、変異体は、本明細書で開示される参照配列の構造的な特性、従って立体構造の特性を保持する。従って、配列番号１０、１２及び１４の例となるＰｒｅＦ配列の１つに比べて１，２，３，４，５又は１０までのアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換を有するＰｒｅＦタンパク質ポリペプチドも本明細書で開示されるようなＰｒｅＦタンパク質ポリペプチドの実施形態である。たとえば、好適な実施形態は、グリコシル化部位（上記のような）を修飾するアミノ酸置換を伴ったＲＳＶ、ｈＭＰＶ及び／又はＰＩＶのＰｒｅＦタンパク質（たとえば、配列番号１０、１２及び１４）を含んでなる。同様に、好適な実施形態は、配列番号１０、１２及び１４に関して内部ペプチダーゼ切断部位（上記で議論したような）を変化させるアミノ酸の置換を含んでなることができる。特定の実施形態では、ＰｒｅＦポリペプチドは配列番号１０、１２及び１４に対して双方のそのような修飾を含んでなる。
【００６９】
配列同一性を決定する方法は当該技術で周知であり、ＰｒｅＦ抗原ポリペプチド、並びにそれをコードする核酸に適用可能である（たとえば、下記のように）。種々のプログラム及び配置アルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ，７３：２３７，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６：１０８８１，１９８８；並びにＰｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４，１９８８に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．６：１１９，１９９４は、配列配置法及び相同性算出の詳細な考察を提示している。ＮＣＢＩ基本的な局在配置検索ツール（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ.,  Ｊ.    Ｍｏｌ.    Ｂｉｏｌ.    ２１５：４０３,  １９９０）は、配列解析プログラム、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘと関連して使用するために、全米バイオテクノロジー情報センター（ＭＤ州、ベセスダ、ＮＣＢＩ）を含んでなる幾つかの供給源、及びインターネットにて利用可能である。このプログラムを用いて配列同一性の決定の仕方の記載はインターネットのＮＶＢＩウエブサイトで利用可能である。
【００７０】
一部の例では、ＰｒｅＦ抗体は、それが由来する天然に存在する株のアミノ酸配列に比べて１以上のアミノ酸修飾を有する（たとえば、前述の安定化修飾に加えて）。そのような差異は、１以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換であり得る。変異体は通常、アミノ酸残基の約１％又は２％又は３％又は４％又は５％又は６％又は１０％又は１５％又は２０％以下異なる。たとえば、変異体ＰｒｅＦ（ＰｒｅＦ−Ｇを含んでなる）ポリペプチド配列は、配列番号１０の例となるＰｒｅＦ抗原ポリペプチド配列；又はｈＭＰＶ及び／又はＰＩＶの配列（たとえば、配列番号１２及び１４の例となる配列）に基づく類似のＰｒｅＦ抗原と比べて、１又は２又は５までの又は約１０までの、又は約１５までの、又は約５０までの又は約１００までのアミノ酸の差異を含んでなり得る。従って、Ｆ又はＧのタンパク質又はＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含んでなる）の文脈では、変異体は通常、参照タンパク質との、又は本明細書で開示される例となるＰｒｅＦ抗原のいずれかとの、少なくとも８０％、又は８５％、さらに一般的には、少なくとも約９０％以上、たとえば、９４％、又は９５％又は９６％又は９７％又はさらに９８％又は９９％の配列同一性を共有する。本開示の特徴として含まれる追加の変異体には、ＷＯ２００８／１１４１４９（ＲＳＶ）、ＢｏｉｖｉｎらのＥｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１０：１１５４−１１５７（２００４）（ｈＭＰＶ）及びＰｒｉｎｏｓｋｉらのＶｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：５５−６９（１９９１）（ＰＩＶ）で開示された天然に存在する変異体から選択されるヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の全部又は一部を含んでなるＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含んでなる）である。たとえば、特定の実施形態では、ＲＳＶのＰｒｅＦポリペプチドは、配列番号１０に少なくとも８９％の配列同一性を有し、ｈＭＶＰのＰｒｅＦポリペプチドは、配列番号１２に少なくとも９４％の配列同一性を有し、ＰＩＶのＰｒｅＦポリペプチドは、配列番号１４に少なくとも９５％の配列同一性を有する。追加の変異体は、遺伝的浮動によって生じることができ、又は部位特異的若しくは無作為の突然変異誘発を用いて人為的に作出することができ、又は２以上の既存の変異体の組換えによって作出することができる。そのような追加の変異体も本明細書で開示されるＰｒｅＦ（及びＰｒｅＦ−Ｇ）の文脈で好適である。たとえば、修飾は、得られるＰｒｅＦ抗原の立体構造又は免疫原性エピトープを変化させない１以上の（たとえば、２つのアミノ酸、３つのアミノ酸、４つのアミノ酸、５つのアミノ酸、１０までのアミノ酸、以上）の置換であり得る。
【００７１】
代わりに又はさらに、修飾は、１以上のアミノ酸の欠失及び／又は１以上のアミノ酸の付加を含んでなることができる。実際、所望であれば、１以上のポリペプチドドメインは、単一株に一致しないが、複数株、又はさらにパラミクソウイルスのポリペプチドの複数の株を並べることによって推定されるコンセンサス配列に由来する成分部分列を含んでなる合成ポリペプチドであり得る。特定の実施形態では、その後の処理又は精製を円滑にするタグを構成するアミノ酸配列の付加によって１以上のポリペプチドドメインが修飾される。そのようなタグは抗原性タグ、又はエピトープタグ、酵素タグ又はポリヒスチジンタグであり得る。通常、タグは、たとえば、抗原又は融合タンパク質のＣ末端又はＮ末端のようなタンパク質の一方又は他方の末端に位置する。
【００７２】
ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸
本開示の別の態様は、上述のようなＰｒｅＦ抗原をコードする組換え核酸に関する。さらに明確には、そのような核酸は、パラミクソウイルスのＦタンパク質ポリペプチドのＦ２ドメイン及びＦ１ドメインを含んでなるＦタンパク質ポリペプチド抗原を含んでなるポリペプチドをコードし、それは、（ｉ）ヘテロ三量体化ドメインを含んでなるアミノ酸配列の付加、（ｉｉ）少なくとも１つのフリン切断部位の欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つの非フリン切断部位の欠失、及び（ｉｖ）Ｆタンパク質の細胞外ドメインの疎水性ドメインにおける親水性アミノ酸の少なくとも１つの置換又は付加から選択される少なくとも１つの修飾を含んでなる。任意で、そのようなポリヌクレオチドはグリコシル化部位で修飾を伴うＰｒｅＦ抗原をコードする。さらに、ＲＳＶのＰｒｅＦ抗原の場合、修飾は、ｐｅｐ２７ドメインの１以上のアミノ酸の欠失も含んでなる。そのようなポリペプチドの性質及び構造の詳細は上記で詳細に開示している。当業者は、配列表で提供される、さもなければ本開示に（たとえば、参照による組み入れによって）含まれる例となる配列を含んでなる本明細書での教示に基づいた記載されるポリペプチド配列のいずれか及びすべてをコードするヌクレオチド配列を容易に決定することができる。
【００７３】
特定の実施形態では、組換え核酸は、選択される原核又は真核の宿主細胞での発現についてコドンが最適化される。ＰｒｅＦ抗原をコードし、哺乳類、たとえば、ＣＨＯ細胞での発現についてコドンが最適化されているコドン最適化核酸の詳細は、参照によって本明細書に組み入れられるＰＣＴ／ＣＡ２００８／００２２７７で提供される。複製及び発現を円滑にするために、核酸を、たとえば、原核又は真核の発現ベクターのようなベクターに組み入れることができる。組換えのパラミクソウイルスＰｒｅＦ抗原をコードする核酸を含んでなる宿主も本開示の特徴である。好都合な宿主細胞には、たとえば、大腸菌のような原核生物（すなわち、細菌）の宿主細胞、並びに真菌（たとえば、酵母）細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞（たとえば、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ及びＨＥＫ２９３細胞）が挙げられる。
【００７４】
複製及び発現を円滑にするために、核酸を、たとえば、原核又は真核の発現ベクターのようなベクターに組み入れることができる。本明細書で開示される核酸を種々のベクター（たとえば、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミド及びファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、たとえば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鳥ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルスなどのようなウイルスＤＮＡを含んでなる）に含めることができるが、最も一般的には、ベクターはポリペプチドの発現産物を生成するのに好適な発現ベクターである。発現ベクターでは、ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸は通常、ｍＲＮＡ合成に向かう適切な転写制御配列（プロモータ及び任意で１以上のエンハンサ）の近傍に且つその方向で配置される。すなわち、当該のポリヌクレオチド配列は、適切な転写制御配列に操作可能に連結される。そのようなプロモータの例には、ＣＭＶの即時早期プロモータ、ＬＴＲ又はＳＶ４０のプロモータ、バキュロウイルスの多面体プロモータ、大腸菌のｌａｃ又はｔｒｐプロモータ、ファージＴ７及びラムダＰＬプロモータ、及び原核細胞又は真核細胞又はウイルスにおける遺伝子の発現を制御する既知のそのほかのプロモータが挙げられる。発現ベクターは通常、翻訳開始及び転写停止のためのリボソーム結合部位も含有する。ベクターは任意で発現を増幅するための適当な配列を含んでなる。加えて、発現ベクターは任意で、１以上の選択可能なマーカー遺伝子を含んで、形質転換した宿主細胞の表現型形質を提供するが、たとえば、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元酵素又はネオマイシン耐性、又は大腸菌におけるカナマイシン耐性、テトラサイクリン耐性若しくはアンピシリン耐性である。
【００７５】
発現ベクターは、たとえば、翻訳の効率を改善するための追加の発現要素も含んでなることができる。これらのシグナルには、たとえば、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列が挙げられる。場合によっては、たとえば、翻訳開始コドン及び関連する配列要素を当該ポリヌクレオチド配列（たとえば、天然の開始コドン）と同時に適当な発現ベクターに挿入する。そのような場合、追加の翻訳制御シグナルは必要とされない。しかしながら、ポリペプチドをコードする配列又はその一部のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを含んでなる外因性の翻訳制御シグナルがＰｒｅＦ抗原をコードする核酸の翻訳に提供される。開始コドンを正しい読み取りフレームに置いて当該ポリヌクレオチド配列の翻訳を確保する。外因性の転写要素及び開始コドンは種々の起源、天然及び合成由来であってもよい。所望であれば、使用中の細胞系に適したエンハンサを含めることによって発現の効率をさらに高めることができる（Ｓｃｈａｒｆ  ｅｔ  ａｌ.  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ  ２０：１２５-６２  （１９９４）；  Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ.  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５３：５１６-５４４  （１９８７））。
【００７６】
一部の例では、ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸（たとえば、ベクター）は、宿主に導入された際、ＰｒｅＦをコードする核酸の発現を高める及び／又は最適化するように選択される１以上の追加の配列要素を含んでなる。たとえば、特定の実施形態では、ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸は、たとえば、ヒトのヘルペスウイルス５イントロン配列のようなイントロン配列を含んでなる。イントロンは、組換え構築物にて適切に配置されるとホモ及びヘテロの核酸の発現を高めることが繰り返し明らかにされている。発現を高める別の部類の配列には、マトリクス連結領域（又はＭＡＲ）のような遺伝子外要素、又はＳＴＡＲ要素（たとえば、Ｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ.,  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.  Ｐｒｏｇ.  ２３：８０１‐８０７,  ２００７で開示されたようなＳＴＡＲ）のような類似の遺伝子外要素が挙げられる。理論に束縛されないで、ＭＡＲは核マトリクスへの標的ＤＮＡ配列の固定の介在し、ヘテロクロマチンのコアから外に向かって延びるクロマチンループドメインを生成すると考えられている。ＭＡＲは明瞭なコンセンサス配列又は認識可能な配列を含有しないが、その最も一貫した特徴は、全体的に高いＡ／Ｔ含量と一方の鎖で優勢なＣ塩基であると思われる。これらの領域は、鎖を分離する傾向がある湾曲二次構造を形成すると思われ、鎖分離の核生成点として作用し得るコア巻き戻し要素を含んでなり得る。幾つかの単純なＡＴ−リッチ配列モチーフは、ＭＡＲ配列：たとえば、Ａ−ボックス、Ｔ−ボックス、ＤＮＡ巻き戻しモチーフ、ＳＡＴＢ１結合部位（Ｈ−ボックス、Ａ／Ｔ／Ｃ２５）及び脊椎動物又はショウジョウバエのためのコンセンサストポイソメラーゼＩＩ部位と関連している。例となるＭＡＲ配列は、公開された米国特許出願第２００７０１７８４６９号及び国際特許出願ＷＯ０２／０７４９６９（参照によって本明細書に組み入れられる）に記載されている。ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸の発現を高めるのに使用することができる追加のＭＡＲ配列には、ＧｉｒｏｄらのＮａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，４：７４７−７５３，２００７で開示されたニワトリのリゾチームＭＡＲ，ＭＡＲｐ１−４２、ＭＡＲｐ１−６、ＭＡＲｐ１−６８及びＭＡＲｐｘ−２９（それぞれＧｅｎＢａｎｋ受入番号、ＥＡ４２３３０６、ＤＩ１０７０３０、ＤＩ１０６１９６、ＤＩ１０７５６１及びＤＩ１０６５１２）が挙げられる。当業者は、ＭＡＲ１〜９で報告されているように、中程度のレベルの増強を生じるＭＡＲを選択することによって発現をさらに調節できることを十分に理解するであろう。所望であれば、たとえば、ＭＡＲ−ファインダー（ウエブ：ｆｕｔｕｒｅｓｏｆｔ．ｏｒｇ／ＭａｒＦｉｎｄｅｒにて利用可能）、ＭＡＲテスト（ウエブ：ｇｅｎｏｍａｔｉｘ．ｄｅで利用可能）又はＳＭＡＲスキャンＩ（Ｌｅｖｉｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ.,  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １５：５８２‐５９２,  １９９９）のようなソフトウエアを用いて配列データベースを検索することによって、ＰｒｅＦ抗原の発現を高める代替のＭＡＲ配列を特定することができる。特定の実施形態では、ＭＡＲは、ＰｒｅＦ抗原をコードする配列と同じ核酸（たとえば、ベクター）上で宿主細胞に導入される（たとえば、形質移���される）。代替の実施形態では、ＭＡＲは、ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列及び操作可能に同時統合することができる別の核酸（たとえば、トランスで）上で導入される。
【００７７】
組換えＰｒｅＦ抗原核酸の産生を介して当業者を導くのに十分な例となる手順は、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９；ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，２００１；ＡｕｓｕｂｅｌらのＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９９２（及び２００３年の補足）；並びにＡｕｓｕｂｅｌらのＳｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に見い出すことができる。
【００７８】
ＰｒｅＦ抗原をコードする例となる核酸は配列番号９によって及びＰＣＴ／ＣＡ２００８／００２２７７にて表される。たとえば、配列番号２の５００位に相当するアミノ酸にてグリコシル化部位に修飾を含んでなる変異体は、１４０８〜１４１４位（たとえば、配列番号１のポリヌクレオチドに比べて）の近傍でヌクレオチドを変える（たとえば、変異させる）ことによって作出することができる。グリコシル化の変異体（たとえば、グリコシル化効率を高める）をコードするヌクレオチドの好適な配列には、ａａｃｇｇｇｔ、ａａｃａａｇｔ、ａａｃｇｇｇａ及びａａｃａａｇａが挙げられる。グリコシル化部位を除去する、たとえば、ｃａｇｃａｇｔのような代替配列も可能である。たとえば、ＷＯ２００８／１１４１４９で開示されたような既知の（若しくはその後）発見されたパラミクソウイルス、又はＢｏｉｖｉｎらのＥｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１０：１１５４−１１５７（２００４）（ｈＭＰＶ）及びＰｒｉｎｏｓｋｉらのＶｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：５５−６９（１９９１）（ＰＩＶ）で開示されたような変異体をコードするものから選択される類似のＦ及びＧのタンパク質ポリペプチド配列を組み合わせることによって追加の変異体を作出することができる。ｈＭＰＶ及びＰＩＶのＰｒｅＦタンパク質をコードする例となるポリヌクレオチド配列はそれぞれ、配列番号１１及び１３に提供される。例となる変異体及び配列同一性を共有する追加の配列変異体は当業者によって作出することができる。通常、核酸変異体は、アミノ酸残基の１％又は２％又は５％又は１０％又は１５％又は２０％以下で異なるポリペプチドをコードする。すなわち、コードされたポリペプチドは、配列番号９、１１及び１３の１つと少なくとも８０％、又は８５％、さらに一般的には少なくとも９０％以上、たとえば、９５％又はさらに９８％又は９９％の配列同一性を共有する。ＰｒｅＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、遺伝子コードの重複性のために自体低い配列同一性を共有することは当業者によって直ちに理解される。一部の例では、ＰｒｅＦ抗原は、それが由来する天然に存在する株のアミノ酸配列に比べて１以上のアミノ酸修飾を有する（たとえば、前述の安定化修飾に加えて）。そのような差異は、それぞれ１以上のヌクレオチド又はアミノ酸の付加、欠失又は置換であり得る。変異体は通常、ヌクレオチド残基の約１％又は２％又は５％又は１０％又は１５％又は２０％以下で異なる。たとえば、変異体ＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇを含んでなる）の核酸は、配列番号９の例となるＰｒｅＦ抗原核酸、又は配列番号１１及び１３の例となるｈＭＰＶ又はＰＩＶの類似の核酸と比べて、１又は２、又は５までの、又は約１０までの、又は約１５までの、又は約５０までの、又は約１００までのヌクレオチドの差異を含んでなることができる。従って、ＲＳＶのＦ又はＧのタンパク質又はＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含んでなる）の核酸は通常、配列番号９、１１又は１３で説明されるＰｒｅＦタンパク質ポリペプチドとの少なくとも８０％、又は８５％、さらに一般的には少なくとも９０％以上、たとえば、９５％又はさらに９８％又は９９％の配列同一性を共有する。���加の変異体は、遺伝的浮動によって生じることができ、又は部位特異的若しくは無作為の突然変異誘発を用いて人為的に作出することができ、又は２以上の既存の変異体の組換えによって作出することができる。そのような追加の変異体も本明細書で開示されるＰｒｅＦ（及びＰｒｅＦ−Ｇ）の文脈で好適である
【００７９】
上述した変異体核酸に加えて、配列番号９、１１又は１３によって表される例となる核酸の１以上とハイブリダイズする核酸もＰｒｅＦ抗原をコードする核酸の文脈で使用することができる。当業者は、上記で議論した％配列同一性の測定に加えて、２つの核酸の間の配列類似性の別の証は、ハイブリダイズする能力であることを十分に理解するであろう。２つの核酸の配列が似ていればいるほど、それらがハイブリダイズする条件はさらにストリンジェントである。ハイブリダイズ条件のストリンジェント性は、配列に依存し、異なった環境パラメータのもとで異なる。従って、ストリンジェント性の特定の程度を生じるハイブリダイズ条件は、選択するハイブリダイズ方法の性質及び組成物及びハイブリダイズする核酸配列の長さによって変化する。一般に、洗浄回数もストリンジェント性に影響するが、ハイブリダイズの温度及びハイブリダイズ緩衝液のイオン強度（特にＮａ＋及び／又はＭｇ＋＋の濃度）がハイブリダイズのストリンジェント性を決定する。一般に、ストリンジェントな条件は、定義したイオン強度とｐＨにて特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）よりも約５〜２０℃低いように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が好ましく一致したプローブとハイブリダイズする温度（定義したイオン強度とｐＨにて）である。核酸のハイブリダイズの条件及びストリンジェント性の算出は、たとえば、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１；Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，ＮＹ，ＮＹ，１９９３及びＡｕｓｕｂｅｌらのＳｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９に見い出すことができる。
【００８０】
本開示の目的で、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイズ分子と標的配列の間で２５％未満のミスマッチがある場合ハイブリダイズが生じる条件を包含する。さらに正確な定義のためにストリンジェント性の特定のレベルに「ストリンジェントな条件」を分類することができる。従って、本明細書で使用されるとき、「穏やかなストリンジェント性」の条件は、２５％を超える配列ミスマッチを持つ分子はハイブリダイズしないものであり、「中程度のストリンジェント性」の条件は、１５％を超える配列ミスマッチを持つ分子はハイブリダイズしないものであり、「高いストリンジェント性」の条件は、１０％を超える配列ミスマッチを持つ分子はハイブリダイズしないものである。「非常に高いストリンジェント性」の条件は、６％を超える配列ミスマッチを持つ分子はハイブリダイズしないものである。それに対して、「低いストリンジェント性」の条件でハイブリダイズする核酸には、非常に低い配列同一性を持つもの又は核酸のほんの短い配列のみの配列同一性を持つものが挙げられる。従って、本開示に包含される核酸の種々の変異体は、少なくとも、Ｆタンパク質のＦ２ドメインとＦ１ドメインをコードする部分にわたって、配列番号１、３及び５の少なくとも１つとハイブリダイズできることが理解されるであろう。たとえば、そのような核酸は、配列番号９、１１及び／又は１３の少なくとも１つの実質的に全長にわたってハイブリダイズすることができる。
【００８１】
特定の例では、原核細胞、たとえば、大腸菌細胞での導入及び発現に好適なベクターを介して細胞に導入される。たとえば、ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる核酸は、たとえば、発現ベクターのｐＥＴシリーズ（たとえば、ｐＥＴ９６及びｐＥＴ２ｄ）のような種々の市販の又は独占所有権のあるベクターに導入することができる。コーディング配列の発現はＩＰＴＧによって誘導可能であり、高いレベルのタンパク質発現を生じる。ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列は、ファージＴ７プロモータのもとで転写される。熱誘導可能なラムダｐＬプロモータを含んでなるｐＵＲＶ２２のような代替ベクターも好適である。
【００８２】
発現ベクターを好適な細菌宿主に導入する（たとえば、エレクトロポレーションによって）。多数の好適な大腸菌株が利用可能であり、当業者によって選択することができる（たとえば、Ｒｏｓｅｔｔａ株及びＢＬ２１（ＤＥ２）株は、ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含有する組換えベクターの発現に好都合であることが分かっている）。
【００８３】
さらに通常、ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチドは、真核細胞（たとえば、昆虫細胞又は哺乳類細胞）での導入及び発現に好適である発現ベクターに導入される。好都合には、そのような核酸は、選択されるベクター／宿主細胞での発現についてコドンが最適化される。例となる一実施形態では、ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列は、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社によって開発されたｐＥＥ１４ベクターのようなベクターに導入される。たとえば、即時早期ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモータのような構成的なプロモータのもとでポリペプチドが発現される。ポリペプチドを発現する安定的に形質移入された細胞の選抜は、グルタミン源の非存在下で増殖する形質移入細胞の能力に基づいて為される。上手くｐＥＥ１４を統合した細胞は、ｐＥＥ１４ベクターがＧＳ（グルタミン合成酵素）酵素を発現するので、外因性グルタミンの非存在下で増殖することができる。選抜された細胞はクローンで増殖し、所望のＰｒｅＦポリペプチドの発現を特徴とする。
【００８４】
別の例では、ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列は、バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）を用いて昆虫細胞に導入される。昆虫細胞を感染させることが可能な組換えバキュロウイルスは、たとえば、ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅからのＢＤ  ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ系のような市販のベクター、キット及び／又は系を用いて生成することができる。手短には、抗原をコードするポリヌクレオチド配列をｐＡｖＳＧ２転移ベクターに挿入する。次いで、ｐＡｖＳＧ２キメラプラスミドと、バキュロウイルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ（ＡｃＮＰＶ）の線状化ゲノムＤＮＡを含有するＢＤ  ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄによって宿主細胞ＳＦ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）に同時形質移入する。形質移入に続いて、ｐＡｖＳＧ２プラスミドとバキュロウイルスゲノムの間で相同組換えが生じて組換えウイルスを生成する。一例では、ＰｒｅＦ抗原は多面体プロモータ（ｐＨ）の通常制御のもとで発現される。他のプロモータ、たとえば、塩基性（Ｂａ）プロモータ及びｐ１０プロモータを用いて同様の転移ベクターを作出することができる。同様に、たとえば、Ｓｆ９に密接に関連するＳＦ２１及びイラクサギンウワバＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉに由来するハイファイブ細胞株のような代替の昆虫細胞を採用することができる。
【００８５】
形質移入及び発現誘導（選択したプロモータ及び／又はエンハンサ又はそのほかの調節性要素に従って）に続いて、発現されたポリペプチドを回収し（たとえば、精製又は濃縮し）、抗原性で活性のある前融合の立体構造への折り畳みを確保するように復元する。
【００８６】
ＲＳＶ抗原性ポリペプチドの製造方法
組換えタンパク質の発現及び精製について定評のある手順を用いて、本明細書で開示されるＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原及び適宜、Ｇ抗原も含んでなる）を製造する。当業者を導くのに十分な手順は以下の文献で見つけることができる：ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００；及びＡｕｓｕｂｅｌらのＳｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，９９９。追加の及び特定の詳細は以下に提供される。
【００８７】
ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸（上述のような）は、ベクター及び宿主細胞の選択に応じて、種々の周知の手順、たとえば、エレクトロポレーション、リポソーム介在性形質移入（たとえば、市販のリポソーム形質移入剤、たとえば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００又はＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（商標）を用いた）、リン酸カルシウム沈殿、感染、形質移入などによって、宿主細胞に導入される。
【００８８】
組換えＰｒｅＦ抗原をコードする核酸を含んでなる宿主細胞も従って本開示の特徴である。好都合な宿主細胞には、たとえば、大腸菌のような原核細胞（たとえば、細菌）宿主細胞、並びに真核細胞（たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＰｉｃｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母）、昆虫細胞、植物細胞及び哺乳類細胞（たとえば、ＣＨＯ細胞及びＨＥＫ２９３細胞）を含んでなる多数の真核宿主細胞が挙げられる。組換えＰｒｅＦ抗原をコードする核酸は、たとえば、発現ベクターのようなベクターを介して宿主細胞に導入される（たとえば、形質伝達、形質転換又は形質移入される）。上述のように、ベクターは最も通常ではプラスミドであるが、そのようなベクターは、たとえば、ウイルス粒子やファージ等であり得る。適切な発現宿主の例には、たとえば、大腸菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのような細菌細胞；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａのような真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのような昆虫細胞；３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３又はＢｏｗｅｓメラノーマのような哺乳類細胞；藻類細胞を含んでなる植物細胞が挙げられる。
【００８９】
プロモータを活性化し、形質転換体を選抜し、挿入したポリヌクレオチド配列を増幅するのに適するように改変された従来の栄養培地にて宿主細胞を培養することができる。温度、ｐＨ等の培養条件は、通常、発現のために選択された宿主細胞と共に以前使用されたものであり、たとえば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第３版、Ｗｉｌｅｙ−  Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ及びそれに引用された文献を含んでなる本明細書で引用された文献にて当業者に明らかであろう。本発明の核酸に相当する発現産物は、たとえば、植物、酵母、真菌、細菌等のような非動物細胞での産生することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｂｅｒｇｅｒ及びＡｕｓｕｂｅｌに加えて、細胞培養に関する詳細は、Ｐａｙｎｅらの（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ及びＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）並びにＡｔｌａｓ及びＰａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬで見つけることができる。
【００９０】
細菌の系では、発現される産物の用途に応じて多数の発現ベクターを選択することができる。たとえば、抗体の産生について大量のポリペプチド又はその断片を必要とする場合、精製しやすい融合タンパク質の高レベル発現を指向するベクターを好都合に採用する。そのようなベクターには、当該コーディング配列、たとえば、上述のような本発明のポリヌクレオチドがアミノ末端翻訳開始メチオニン及び触媒上活性のあるβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を生じるβ−ガラクトシダーゼの７残基についての配列を伴ってインフレームでベクターに連結され得るＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のような多機能の大腸菌のクローニング及び発現のベクター；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４：５５０３−５５０９）；ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）が挙げられるが、これらに限定されず、その中では、アミノ末端メチオニンがフレーム内でヒスチジンタグ等に連結される。
【００９１】
同様に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母では、α因子、アルコールオキシダーゼ及びＰＧＨのような構成的な又は誘導可能なプロモータを含有する多数のベクターが所望の発現産物の製造に使用される。概説については、Ｂｅｒｇｅｒ，Ａｕｓｕｂｅｌ、及びたとえば、Ｇｒａｎｔらの（１９８７；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６−５４４）を参照のこと。哺乳類の宿主細胞では、プラスミド及びウイルスに基づいた系の双方を含んでなる多数の発現系を利用することができる。
【００９２】
挿入した配列の発現を調節する能力又は発現されたタンパク質を所望の方法で処理する能力について宿主細胞を任意で選択する。そのようなタンパク質の修飾には、グリコシル化（同様に、たとえば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化）が挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、前駆体形態をタンパク質の成熟形態に切断する（たとえば、フリンプロテアーゼによって）翻訳後プロセッシングは、宿主細胞の文脈で任意で実施される。３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８等のような様々な宿主細胞はそのような翻訳後活性について特定の細胞性の機構及び特徴的なメカニズムを有し、導入される外来タンパク質の正確な修飾を確保するように選択することができる。
【００９３】
本明細書で開示される組換えＰｒｅＦＦ抗原の長期間の高収率の産生のために、安定的な発現系が通常使用される。たとえば、ウイルスの複製開始点又は内因性発現要素及び選択可能なマーカー遺伝子を含有する発現ベクターを用いて、ＰｒｅＦ抗原ポリペプチドを安定的に発現する細胞株が宿主細胞に導入される。ベクターの導入に続いて、選抜培地に移す前に細胞を強化培地で１〜２日間増殖させる。選択可能なマーカーの目的は、選抜に対する耐性を付与することであり、その存在によって、導入配列を上手く発現する細胞の増殖及び回収が可能になる。たとえば、細胞種に適した組織培養法を用いて、安定的に形質転換された細胞の耐性群又は耐性コロニーを増殖させることができる。細胞培養からのコードしたタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で、ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸で形質転換された宿主細胞を任意に培養する。
【００９４】
好適な細胞株の形質伝達及び適当な細胞密度への宿主細胞の増殖に続いて、選択したプロモータを適当な手段（たとえば、温度シフト又は化学誘導）によって誘導し、細胞をさらなる期間培養する。任意で、培地は、プロテイナーゼによる発現タンパク質の分解を低下させる成分及び／又は添加剤を含んでなる。たとえば、ＰｒｅＦ抗原を産生する細胞を培養するのに使用される培地は、たとえば、キレート剤又は小分子阻害剤（たとえば、ＡＺ１１５５７２７２、ＡＳ１１１７９３等）のようなプロテアーゼ阻害剤を含んで細胞性の又は細胞外（たとえば、マトリクス）のプロテイナーゼによる望ましくない切断を減らす又は消失させることができる。任意で、無血清（及び／又は動物産物を含まない）培地にて細胞を培養する。たとえば、振盪器、フラスコ又は生物反応器にて目的によって好都合な規模で細胞を増殖させることができる。
【００９５】
分泌されたポリペプチド産物を次いで培養培地から回収する。或いは、遠心によって細胞を回収し、物理的な又は化学的な手段によって粉砕し、得られた粗抽出物をさらなる精製のために保持することができる。タンパク質の発現で採用した真核細胞又は微生物細胞は、凍結融解の繰り返し、機械的粉砕、又は細胞溶解剤の使用、又は当業者に周知のそのほかの方法を含んでなる従来の方法によって粉砕することができる。
【００９６】
硫安沈殿又はエタノール沈殿、酸抽出、濾過、限外濾過、遠心分離、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィ、リンセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ（たとえば、本明細書で言及されるタグ方式を使用した）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、及びレクチンクロマトグラフィを含んでなる当該技術で周知の多数の方法によって、組換え細胞培養から、発現されたＰｒｅＦ抗原を回収し、精製することができる。所望のように、成熟タンパク質の立体構造を完成することにおいてタンパク質の再折り畳み工程を使用することができる。最終的に、最終精製工程にて高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を採用することができる。上記で言及された参考文献に加えて、たとえば、Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；及びＢｏｌｌａｇらの（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，Ｈａｒｒｉｓ及びＡｎｇａｌ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ及びＲｙｄｅｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第２版、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ；並びにＷａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪで言及されたものを含んでなる種々の精製方法が当該技術で周知である。
【００９７】
例となる一実施形態では、ＰｒｅＦタンパク質は、以下の精製スキームに従って細胞から回収される。ＰｒｅＦポリペプチドをコードする組換え核酸のＣＨＯ細胞への導入に続いて、一時的に形質移入された宿主細胞又は導入されたポリヌクレオチドを含んでなる増殖した安定な集団を培地にて、所望の目的に許容できる規模で増殖に好適な条件下で増殖させる（たとえば、一般にＦｒｅｓｈｎｅｙ  （１９９４）  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ,  ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ,  Ｗｉｌｅｙ−  Ｌｉｓｓ,  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ及びそこで引用された文献に記載されたように）。通常、細胞は、振盪フラスコ又は生物反応器にて無血清培地で増殖させ、２〜３日間隔で継代する。これらの条件で増殖した細胞から樹立した新しい培養を通常生物反応器にて無血清培地で実施し、ＰｒｅＦ抗原を産生させるために２０％にて維持されたｐＯ２と共に２７℃にて５〜７日間インキュベートする。
【００９８】
組換えＰｒｅＦ抗原を回収するには、細胞培養物を遠心し、細胞培養上清をさらなる使用までマイナス７０℃にて保存する。培養上清の融解に続いて、上清をＭｉｌｌｉＱ水にて２倍に希釈し、ＨＣｌでｐＨ６．０に調整する。２０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ６．０で平衡化したＢＰＧ１４０／５００カラムに詰めた３ＬＣＭセラミックＨｙｐｅｒＤＦＦ樹脂に希釈した上清を７５ｃｍ／時間で負荷する。試料の負荷後、平衡緩衝液をカラムに通し、ＵＶのベースラインに戻す。２５ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０のカラム容積（ＣＶ）の５倍で洗浄した後、０．１ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０を用いて溶出を行う。
【００９９】
ＣＭＨｙｐｅｒＤ溶離液を２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で３．３倍に希釈し、２０ｍＭのＰＯ４（Ｎａ）緩衝液ｐＨ７．０で平衡化した２７０ｍｌのハイドロキシアパタイト２型カラム（ＸＫ５０に詰めた）にて５０ｍＬ／分で処理する。平衡緩衝液（〜３ＣＶ）でカラムを洗浄した後、０．５ＭのＮａＣｌを含有する２０ｍＭのＰＯ４（Ｎａ）緩衝液ｐＨ７．０を用いて溶出を行う。
【０１００】
２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化した１５０ｍｌのＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅカラム（ＸＫ２６に詰めた）にてＨＡ溶離液を１５ｍｌ／分（樹脂との１０分間の接触に留意して）で処理する。０．１Ｍのアルギニン緩衝液を含有する１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０の５ＣＶで洗浄した後、０．６Ｍのアルギニン緩衝液を含有する１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０を用いて溶出を行う。
【０１０１】
次いで、分取用サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）カラムで処理するためにＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ溶離液を約１０倍に濃縮する。５０ｋＤのペリコンポリエーテルスルホン膜を用いて濃縮を行う。ＳＥＣカラムで処理する前に、ウイルス清浄工程で用いたＰＬＡＮＯＶＡ  ２０Ｎ  １００  ｃｍ２のフィルターを介して物質を濾過する。このナノ濾過工程は、ペリコン膜での濃縮の前又は後のいずれかに置くことができる。
【０１０２】
次いで５００ｍＬのＳｕｐｅｒｄｅｘＳ２００カラムと移動相としての１０ｍＭのリン酸塩（Ｎａ／Ｋ２）、１６０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５緩衝液（最終緩衝液に相当する）を用いて分取用ＳＥＣを行う。ＳＥＣカラム容積の５％に相当する濃縮ＰｒｅＦの容積を約２．６ｍｌ／分で樹脂に負荷する。通常、１０ｍｌの分画を回収する。ＨＣＰレベルをできるだけ抑える一方で収率を最適化するのが所望であれば、銀染色によるＳＤＳゲル及び抗ＨＣＰ（宿主細胞タンパク質）のウエスタンブロットにて分画の分析プールを分析することができる。
【０１０３】
０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘフィルター（代わりにＳｔｅｒｉｖｅｘフィルターを使用することができる）での濾過の後、精製されたバルクが得られる。所望であれば、精製したＰｒｅＦ抗原調製物を使用に先立ってマイナス７０℃で保存することができる。
【０１０４】
或いは、ＰｒｅＦタンパク質はポリヒスチジン（たとえば、６個のヒスチジン）を含んでなることができ、それを用いて精製を円滑にすることができる。そのようなヒスチジンのタグを付けたＰｒｅＦポリペプチドについては、以下の精製プロトコールが採用される。固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）を用いた精製に先立って、細胞培養上清を緩衝液Ａ（２０ｍＭのビシン、ｐＨ８．５）で２倍に希釈し、ｐＨを８．５に合わせる。予め緩衝液Ａで平衡化した２３ｍｌのカラム容量のＱセファロースＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に得られた溶液を負荷する。一部の宿主細胞の混入と共にＰｒｅＦタンパク質をカラムに捕捉させる。ＩＭＡＣ精製工程を妨害する培養培地成分は保持されず、流水中で排除される。タンパク質は分離され、２００ｍＭ、４００ｍＭ、６００ｍＭ、８００ｍＭ及び１ＭのＮａＣｌの段階的溶出によって溶出される。当該のＰｒｅＦタンパク質は、２００ｍＭのＮａＣｌでの最初の段階の間に溶出される。任意で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びタグ付いたＰｒｅＦタンパク質を検出する抗Ｈｉｓ−タグ抗体を用いたウエスタンブロットを用いて回収をモニターすることができる。精製を継続するのに先立って分画をプールすることができる。
【０１０５】
（プールされた）ＰｒｅＦタンパク質を含有する溶離液を緩衝液Ｂ（２０ｍＭのビシン、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．３）で３倍に希釈し、ｐＨを８．３に合わせる。予め緩衝液Ｂで平衡化した（たとえば、５ｍｌのカラム容量）、塩化ニッケルを負荷したＩＭＡＣセファロースＦＦ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に得られた溶液を負荷する。ＰｒｅＦは樹脂に結合し、宿主細胞の混入物の大半は流水で溶出される。弱く結合した混入物を除くために２０ｍＭのイミダゾールでカラムを洗浄する。２５０ｍＭのイミダゾールの一段階でＰｒｅＦタンパク質を溶出する。クマシーブルーで染色するＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ＨＩｓタグのウエスタンブロットを行って陽性分画を特定する。
【０１０６】
次いでセントリコン濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＩＭＡＣからのプールを少なくとも１５０μｇ／ｍｌの濃度に濃縮することができ、５００ｍＭのＬ−アルギニンを補完したＰＢＳ緩衝液にてタンパク質を透析することができる。得られたタンパク質を、ＲＣＤＣタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて定量し、使用まで−７０℃又は−８０℃で保存する。
【０１０７】
免疫原性組成物及び方法
本明細書で開示されるＰｒｅＦ抗原は、免疫原性組成物の製剤化、特に、幼児における重篤な下部呼吸器疾患を含んでなる呼吸器疾患の有意な原因である少なくとも２つの異なったパラミクソウイルスに由来する抗原との組み合わせを含んでなるものの製剤化で有用である。通常そのような免疫原性組成物は、少なくとも２つのパラミクソウイルス及び薬学上許容可能なキャリア又は賦形剤を含んでなる。たとえば、特定の実施形態では、免疫原性組成物は、ｈＭＰＶ抗原及び、たとえば、ＰＩＶ−３抗原又はＰＩＶ−１抗原のようなＰＩＶ抗原を含んでなる。他の実施形態では、免疫原性組成物は、ＲＳＶ抗原及び、ｈＭＰＶ抗原又はＰＩＶ抗原（たとえば、ＰＩＶ−３抗原又はＰＩＶ−１抗原）のいずれかを含んでなる。他の実施形態では、免疫原性組成物は、３つの抗原を含んでなる。たとえば、特定の実施形態では、免疫原性組成物は、ｈＭＰＶ抗原、ＰＩＶ抗原、及びＲＳＶ抗原（たとえば、ｈＭＰＶ抗原、ＰＩＶ−３抗原、及びＲＳＶ抗原）を含んでなる。別の実施形態では、免疫原性組成物は、ｈＭＰＶ抗原と２つの異なったＰＩＶ抗原（たとえば、ＰＩＶ−３抗原及びＰＩＶ−１抗原）を含んでなる。そのような組成物は任意でＲＳＶ抗原を含んでなることもできる。好ましくは、本明細書で開示されるように、抗原はパラミクソウイルスのＰｒｅＦ抗原である。
【０１０８】
特定の実施形態では、免疫原性組成物は、ｈＭＶＰ、ＰＩＶ（たとえば、ＰＩＶ−３）及びＲＳＶの少なくとも２つによる感染を軽減する又は防ぐワクチンである。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、ｈＭＶＰ、ＰＩＶ（たとえば、ＰＩＶ−３）及びＲＳＶの少なくとも２つによる感染に続く病理学的応答を軽減する又は防ぐワクチンである。任意で、異なったパラミクソウイルスから選択される（たとえば、ｈＭＶＰ、ＰＩＶ及びＲＳＶから選択される）少なくとも２つのＰｒｅＦ抗原を含有する免疫原性組成物は、異なった病原性ウイルスの少なくとも１つの追加の抗原と共に製剤化される。たとえば、病原性生物は、パラミクソウイルスの別の株（たとえば、ＰＩＶの最初の株がＰＩＶ−３である場合のＰＩＶ−１）であることができ、又はパラミクソウイルス以外の、たとえば、インフルエンザウイルスのような気道のウイルス性病原体であることができる。他の実施形態では、追加の剤が選択されて、複数の感染性生物に対して対象を防御するのに必要とされる投与を円滑にする又は接種の回数を減らす。たとえば、抗原は、とりわけ、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、ジフテリア、破傷風、百日咳、インフルエンザ、ポリオウイルス、球菌又は肺炎球菌の１以上に由来することができる。
【０１０９】
特定の実施形態では、通常、ＰｒｅＦ抗原がＧタンパク質成分を含まない実施形態では、免疫原性組成物は、１以上の単離された組換えの及び／又は精製されたパラミクソウイルスＧタンパク質と共に製剤化することができる。多数の好適なＧタンパク質が当該技術で記載されており、完全長の組換えＧタンパク質及びＧタンパク質の一部（たとえば、アミノ酸１２８〜２２９又は１３０〜２３０）で構成されるキメラタンパク質及び融合相手（たとえば、チオレドキシン）又は発現及び／又は精製を円滑にするシグナル配列及び又はリーダー配列が挙げられる。ＰｒｅＦ抗原との混合物で使用するための例となるＲＳＶのＧタンパク質は、ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００２２７７、ＷＯ２００８１１４１４９、米国特許第５，１４９，６５０号、同第６，１１３，９１１号、米国公開出願２００８０３００３８２及び米国特許第７，３６８，５３７号にて見つけることができ、そのそれぞれは参照によって本明細書に組み入れられる。
【０１１０】
薬学上許容可能なキャリア及び賦形剤は当業者に周知であり、当業者によって選択され得る。たとえば、キャリア又は賦形剤は好都合には緩衝液を含んでなることができる。任意で、キャリア又は賦形剤は、溶解性及び又は安定性を安定化させる少なくとも１つの成分も含有する。可溶化剤／安定剤の例には界面活性剤、たとえば、ラウレルサルコシン及び／又はツイーンが挙げられる。代替の可溶化剤／安定剤には、アルギニン及びガラス形成ポリオール（たとえば、スクロース、トレハロース等）が挙げられる。多数の薬学上許容可能なキャリア及び／又は薬学上許容可能な賦形剤が当該技術で既知であり、たとえば、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第５版（１９７５）に記載されている。
【０１１１】
従って、好適な賦形剤及びキャリアが当業者によって選択され、選択された投与経路によって対象に送達するために好適な製剤を製造することができる。
【０１１２】
好適な賦形剤には、限定しないで、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ソルビトール、トレハロース、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、Ｌ−プロリン、非界面活性剤スルホベタイン、塩酸グアニジン、尿素、酸化トリメチルアミン、ＫＣｌ、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋及びそのほかの二価のカチオン関連塩、ジチオスレイトール、ジチオエリトール、及びβ−メルカプトエタノールが挙げられる。そのほかの賦形剤は、界面活性剤（ツイーン８０、ツイーン２０、トリトンＸ−１００、ＮＰ−４０、エンピゲンＢＢ、オクチルグルコシド、ラウロイルマルトシド、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−０８、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−０、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−２、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−４、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−６、ＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウムを含んでなる）であり得る。
【０１１３】
任意で、免疫原性組成物はアジュバントも含んでなる。ＲＳＶに対する防御免疫応答を誘発する目的で対象に投与するのに好適な免疫原性組成物の文脈で、アジュバントを選択してＴｈ１優位の免疫応答を誘発する。
【０１１４】
通常、アジュバントを選択して、組成物が投与される対象又は対象の集団においてＴｈ１優位の免疫応答を高める。たとえば、ＲＳＶ感染に感受性の（又はリスクが高い）特定の年齢群の対象に免疫原性組成物を投与すべき場合、対象及び対象の集団にて安全で且つ効果的であるようにアジュバントを選択する。従って、高齢者対象（たとえば、６５歳を超える対象）での投与用にＲＳＶのＰｒｅＦ抗原を含有する免疫原性組成物を製剤化する場合、高齢者対象にて安全で且つ効果的であるようにアジュバントを選択する。同様に、ＰｒｅＦ抗原を含有する免疫原性組成物が、新生児又は乳児の対象（出生から２歳までの対象）に投与することを意図される場合、新生児及び乳児にて安全で且つ効果的であるようにアジュバントを選択する。
【０１１５】
さらに、免疫原性組成物が投与される投与の経路を介して投与される場合、アジュバントは通常、Ｔｈ１免疫応答を高めるように選択される。たとえば、鼻内投与用にＰｒｅＦ抗原を含有する免疫原性組成物を製剤化する場合、プロテオソーム及びプロトリンが好都合なＴｈ１優位のアジュバントである。それに対して、免疫原性組成物を筋肉内投与用に製剤化する場合、１以上の３Ｄ−ＭＰＬ、スクワレン（たとえば、ＱＳ２１）、リポソーム及び／又は油と水のエマルションを含んでなるアジュバントが好都合に選択される。
【０１１６】
ＰｒｅＦ抗原との併用で使用するために好適なアジュバントの１つは、非毒性の細菌性リポ多糖類誘導体である。脂質Ａの好適な非度屈性誘導体の例は、モノホスホリル脂質Ａ、さらに詳しくは３−脱アセチル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）である。３Ｄ−ＭＰＬは、ＭＰＬの名称のもとでＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｎ．Ａ．によって販売され、文書全体を通してＭＰＬ又は３Ｄ−ＭＰＬと呼ばれる。米国特許第４，４３６，７２７；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号及び同第４，９１２，０９４号を参照のこと。３Ｄ−ＭＰＬは、ＩＦＮ−γ（Ｔｈ１）表現型を持つＣＤ４＋Ｔ細胞の応答を促進する。３Ｄ−ＭＰＬは、ＧＢ２２２０２１１Ａで開示された方法に従って製造することができる。化学的には、それは、３，４，５又は６のアシル化鎖を持つ３−脱アセチル化モノホスホリル脂質Ａの混合物である。本発明の組成物では、小粒子３Ｄ−ＭＰＬを使用することができる。小粒子３Ｄ−ＭＰＬは、０．２２μｍのフィルターを介して無菌濾過できるような粒度を有する。そのような調製物はＷＯ９４／２１２９２に記載されている。
【０１１７】
３Ｄ−ＭＰＬのようなリポ多糖類は、免疫原性組成物のヒト用量当たり１〜５０μｇの量で使用することができる。そのような３Ｄ−ＭＰＬは、約２５μｇのレベルで、たとえば、２０〜３０μｇの間で、好適には２１〜２９μｇの間で、又は２２〜２８μｇの間で、又は２３〜２７μｇの間で、又は２４〜２６μｇの間で、又は２５μｇで使用することができる。別の実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、約１０μｇのレベルで、たとえば、５〜１５μｇの間で、好適には６〜１４μｇの間で、たとえば、７〜１３μｇの間で、又は８〜１２μｇの間で、又は９〜１１μｇの間で、又は１０μｇのレベルで３Ｄ−ＭＰＬを含んでなる。さらなる実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、約５μｇのレベルで、たとえば、１〜９μｇの間で、又は２〜８μｇの間で、好適には３〜７μｇの間で、又は５μｇのレベルで３Ｄ−ＭＰＬを含んでなる。
【０１１８】
他の実施形態では、リポ多糖類は、米国特許第６，００５，０９９号及び欧州特許第０７２９４７３Ｂ１号に記載されたようにβ（１〜６）グルコサミン二糖類であり得る。当業者は、これらの参考文献の教示に基づいて３Ｄ−ＭＰＬのような種々のリポ多糖類を容易に製造することができる。それにもかかわらず、これら参考文献のそれぞれは、参照によって本明細書に組み入れられる。前述の免疫賦活剤（ＬＰＳ又はＭＰＬ又は３Ｄ−ＭＰＬに似た構造の）に加えて、ＭＰＬの上記構造の一部であるアシル化された単糖類及び二糖類の誘導体も好適なアジュバントである。他の実施形態では、アジュバントは脂質Ａの合成誘導体であり、その一部は、ＴＬＲ−４作動薬として記載され、ＯＭ１７４（２−デオキシ−６−ｏ−［２−デオキシ−２−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラ−デカノイルアミノ］−４−ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−β−Ｄ−グルコピラノシルジヒドロゲノホスフェート）、（ＷＯ９５／１４０２６）；ＯＭ２９４ＤＰ（３Ｓ，９Ｒ）−３−［（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９（Ｒ）−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ジオール、１，１０−ビス（ジヒドロゲノホスフェート）（ＷＯ９９／６４３０１及びＷＯ００／０４６２）；及びＯＭ１９７ＭＰ−ＡｃＤＰ（３Ｓ−，９Ｒ）−３−（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ｄｉｏｌ、１−ジヒドロゲノホスフェート１０−（６−アミノヘキサノエート）（ＷＯ０１／４６１２７）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
使用することができるそのほかのＴＬＲ４リガンドは、たとえば、ＷＯ９８／５０３９９又は米国特許第６，３０３，３４７号で開示された（ＡＧＰの調製方法も開示されている）もののようなアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰｓ）であり、好適には、ＲＣ５２７若しくはＲＣ５２９、又は米国特許第６，７６４，８４０号で開示されたようなＡＧＳの薬学上許容可能な塩である。一部のＡＧＰはＴＬＲ４の作動薬であり、一部はＴＬＲ４の拮抗剤である。双方共アジュバントとして有用であると思われる。
【０１２０】
ＴＬＲ−４を介したシグナル伝達反応（Ｓａｂｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ,  ＪＩ  ２００３ ｐ１６３０−５）を起こすことが可能であるそのほかの好適なＴＬＲ−４リガンドは、たとえば、グラム陰性細菌に由来するリポ多糖類及びその誘導体又はその断片、特にＬＰＳの非毒性誘導体（たとえば、３Ｄ−ＭＰＬ）である。そのほかの好適なＴＬＲ作動薬は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）１０、６０、６５、７０、７５又は９０；界面活性剤プロテインＡ、ヒアルロナンオリゴ糖、ヘパラン硫酸断片、フィブロネクチン断片、フィブリノーゲンペプチド及びｂ−デフェンシン−２、及びムラミルジペプチド（ＭＤＰ）である。一実施形態では、ＴＬＲ作動薬はＨＳＰ６０，７０又は９０である。ほかの好適なＴＬＲ−４リガンドは、ＷＯ２００３／０１１２２３及びＷＯ２００３／０９９１９５に記載されており、たとえば、ＷＯ２００３／０１１２２３の４〜５ページ又はＷＯ２００３／０９９１９５の３〜４ページで開示された化合物Ｉ、化合物ＩＩ及び化合物ＩＩＩ、特にＥＲ８０３０２２、ＥＲ８０３０５８、ＥＲ８０３７３２、ＥＲ８０４０５３、ＥＲ８０４０５７、ＥＲ８０４０５８、ＥＲ８０４０５９、ＥＲ８０４４４２、ＥＲ８０４６８０及びＥＲ８０４７６４としてＷＯ２００３／０１１２２３で開示されたそれら化合物である。たとえば、好適なＴＬＲ−４リガンドの１つはＥＲ８０４０５７である。
【０１２１】
追加のＴＬＲ作動薬もアジュバントとして有用である。用語「ＴＬＲ作動薬」は、直接的なリガンドとして又は内因性若しくは外因性のリガンドの生成を介して間接的に、ＴＬＲシグナル伝達経路を介したシグナル伝達反応を起こすことが可能である剤を指す。そのような天然の又は合成のＴＬＲ作動薬は、代わりの又は追加のアジュバントとして使用することができる。アジュバント受容体としてのＴＬＲの役割の手短な概説は、Ｋａｉｓｈｏ及びＡｋｉｒａ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１５８９：１−１３，２００２に提供されている。これらの潜在的なアジュバントには、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及びＴＬＲ９についての作動薬が挙げられるが、これらに限定されない。従って、一実施形態では、アジュバント及び免疫原性組成物はさらに、ＴＬＲ−１作動薬、ＴＬＲ−２作動薬、ＴＬＲ−３作動薬、ＴＬＲ−４作動薬、ＴＬＲ−５作動薬、ＴＬＲ−６作動薬、ＴＬＲ−７作動薬、ＴＬＲ−８作動薬、ＴＬＲ−９作動薬又はこれらの組み合わせからなる群から選択されるアジュバントを含んでなる。
【０１２２】
本発明の一実施形態では、ＴＬＲを介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬が使用される。好適には、ＴＬＲを介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、トリアシル化リポペプチド（ＬＰｓ）；フェノール可溶性モジュリン；結核菌ＬＰ；Ｓ−（２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２−ＲＳ）−プロピル）−Ｎ−パルミトイル−（Ｒ）−Ｃｙｓ−（Ｓ）−Ｓｅｒ−（Ｓ）−Ｌｙｓ（４）−ＯＨ、細菌性リポタンパク質のアシル化アミノ末端を模倣するトリヒドロクロリド（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）ＬＰ及びＢｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ由来のＯｓｐＡ  ＬＰから選択される。
【０１２３】
代替の実施形態では、ＴＬＲ−２を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬が使用される。好適には、ＴＬＲ−２を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、Ｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｂ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ又はＴ  ｐａｌｌｉｄｕｍに由来するリポタンパク質、ペプチドグリカン、細菌性リポペプチド；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを含んでなる種に由来するペプチドグリカン；リポタイコ酸、マンヌロン酸、ナイセリアポリン、細菌性フィムブリエ、エルシニア毒性因子、ＣＭＶビリオン、麻疹血液凝集素及び酵母由来のザイモサンの１以上である。
【０１２４】
代替の実施形態では、ＴＬＲ−３を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬が使用される。好適には、ＴＬＲ−３を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又はポリイノシン−ポリシチジン酸（ポリＩＣ）、ウイルス感染に関連する分子核酸パターンである。
【０１２５】
代替の実施形態では、ＴＬＲ−５を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬が使用される。好適には、ＴＬＲ−５を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、細菌性フラジェリンである。
【０１２６】
代替の実施形態では、ＴＬＲ−６を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬が使用される。好適には、ＴＬＲ−６を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、抗酸菌性リポタンパク質、脱アシル化ＬＰ、及びフェノール可溶性モジュリンである。追加のＴＬＲ６作動薬はＷＯ２００３／０４３５７２に記載されている。
【０１２７】
代替の実施形態では、ＴＬＲ−７を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬が使用される。好適には、ＴＬＲ−７を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、ロキソリビン、Ｎ７位及びＣ８位におけるグアノシン類似体、又はイミダゾキノリン化合物若しくはその誘導体である。一実施形態では、ＴＬＲ作動薬はイミキモドである。さらなるＴＬＲ７作動薬はＷＯ２００２／０８５９０５に記載されている。
【０１２８】
代替の実施形態では、ＴＬＲ−８を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬が使用される。好適には、ＴＬＲ−８を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、抗ウイルス活性を持つイミダゾキノリン分子、たとえば、レシキモド（Ｒ８４８）であり；レシキモドもＴＬＲ−７による認識が可能である。使用することができるそのほかのＴＬＲ−８作動薬には、ＷＯ２００４／０７１４５９に記載されたものが挙げられる。
【０１２９】
代替の実施形態では、ＴＬＲ−９を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬が使用される。一実施形態では、ＴＬＲ−９を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、ＨＳＰ９０である。或いは、ＴＬＲ−９を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、細菌性又はウイルス性のＤＮＡであり、ＤＮＡは、特にＣｐＧモチーフとして知られる配列の文脈にて非メチル化ＣｐＧ分子を含有する。ＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチドはＴｈ１反応を優勢に誘導する。そのようなオリゴヌクレオチドは周知であり、たとえば、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８及び米国特許第６，００８，２００号及び同第５，８５６，４６２号に記載されている。好適には、ＣｐＧヌクレオチドはＣｐＧオリゴヌクレオチドである。本発明の免疫原性組成物で使用するのに好適なオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つ、好適には少なくとも６つ以上のヌクレオチドによって分離される２以上のジヌクレオチドＣｐＧモチーフを任意で含有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。ＣｐＧモチーフは、グアニンヌクレオチドが後に続くシトシンヌクレオチドである。本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは通常、デオキシヌクレオチドである。特定に実施形態では、ホスホジエステル結合及びそのほかのヌクレオチド間結合は本発明の範囲内であるが、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチド間はホスホロジチオエート結合又は好適にはホスホロチオエート結合である。また本発明の範囲内に含まれるのは混合されたヌクレオチド間結合を伴うオリゴヌクレオチドである。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド又はホスホロジチオエートを作製する方法は、米国特許第５，６６６，１５３号、同第５，２７８，３０２号及びＷＯ９５／２６２０４に記載されている。
【０１３０】
たとえば、それ自体に又は３Ｄ−ＭＰＬとの組み合わせでＰｒｅＦ抗原を伴う免疫原性組成物で使用することができるそのほかのアジュバントは、たとえば、ＱＳ２１のようなサポニンである。
【０１３１】
サポニンは、Ｌａｃａｉｌｌｅ−Ｄｕｂｏｉｓ，Ｍ及びＷａｇｎｅｒ，Ｈ．（１９９６.  Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｓａｐｏｎｉｎｓ.  Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｖｏｌ  ２  ｐｐ  ３６３‐３８６）にて教示されている。サポニンは、植物界及び海洋動物界に広く分布するステロイド又はトリテルペングリコシドである。サポニンは、振盪すると泡立つコロイド状水溶液を形成し、コレステロールを沈殿させることについて言及される。サポニンは細胞膜の近傍にあると、膜を破裂させる膜における孔様の構造を創る。赤血球の溶血はこの現象の例であり、それは、サポニンすべてではないが、特定のサポニンの特性である。
【０１３２】
サポニンは、全身性投与用のワクチンでアジュバントとして知られる。個々のサポニンのアジュバント活性及び溶血活性は当該技術で広範に研究されている（Ｌａｃａｉｌｌｅ−Ｄｕｂｏｉｓ  ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ、上記）。たとえば、クイルＡ（南米の樹木Ｑｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａの樹皮に由来する）及びその分画は米国特許第５，０５７，５４０号及び“Ｓａｐｏｎｉｎｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ”、Ｋｅｎｓｉｌ，Ｃ．Ｒ．，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ，１９９６，１２（１−２）：１−５５；及びＥＰ０３６２２７９Ｂ１に記載されている。クイルＡの分画を含んでなる免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）と呼ばれる粒子状の構造は、溶血性であり、ワクチンの製造に使用されている（Ｍｏｒｅｉｎ,  Ｂ.,  ＥＰ  ０  １０９  ９４２  Ｂ１；  ＷＯ  ９６／１１７１１；  ＷＯ  ９６／３３７３９）。溶血性のサポニンＱＳ２１及びＱＳ１７（クイルＡのＨＰＬＣ精製した分画）は、強力な全身性アジュバントとして記載されており、その製造方法は、米国特許第５，０５７，５４０号及びＥＰ０３６２２７９Ｂ１に記載されており、それらは参照によって本明細書に組み入れられる。全身性ワクチンの研究で使用されているそのほかのサポニンには、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ及びＳａｐｏｎａｒｉａ（Ｂｏｍｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ.,  Ｖａｃｃｉｎｅ,  １０（９）：５７２‐５７７,  １９９２）のような植物種に由来するものが挙げられる。
【０１３３】
ＱＳ２１は、Ｑｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａの樹皮に由来するＨＰＬＣ精製した非毒性の分画である。ＱＳ２１の製造方法は、米国特許第５，０５７，５４０に開示されている。ＱＳ２１を含有する非反応源性のアジュバント製剤はＷＯ９６／３３７３９に記載されている。前述の参考文献は参照によって本明細書に組み入れられる。ＱＳ２１のような前記免疫学的に活性のあるサポニンは、免疫原性組成物のヒト用量当たり１〜５０μｇの量で使用することができる。有利なことに、ＱＳ２１は、約２５μｇのレベルで、たとえば、２０〜３０μｇの間で、好適には２１〜２９μｇの間で、又は２２〜２８μｇの間で、又は２３〜２７μｇの間で、又は２４〜２６μｇの間で、又は２５μｇで使用することができる。別の実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、約１０μｇのレベルで、たとえば、５〜１５μｇの間で、好適には６〜１４μｇの間で、たとえば、７〜１３μｇの間で、又は８〜１２μｇの間で、又は９〜１１μｇの間で、又は１０μｇのレベルでＱＳ２１を含んでなる。さらなる実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、約５μｇのレベルで、たとえば、１〜９μｇの間で、又は２〜８μｇの間で、好適には３〜７μｇの間で、又は５μｇのレベルでＱＳ２１を含んでなる。ＱＳ２１及びコレステロールを含んでなるそのような製剤は、抗原と共に製剤化されると功を奏するＴｈ１刺激性アジュバントであることが示されている。従って、たとえば、ＱＳ２１及びコレステロールの組み合わせを含んでなるアジュバントを伴った免疫原性組成物にてＰｒｅＦポリペプチドを好都合に採用することができる。
【０１３４】
任意で、アジュバントはまた、たとえば、アルミニウム塩又はカルシウム塩、特に水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及びリン酸カルシウムのような鉱物塩を含んでなることができる。たとえば、アルミニウム塩（たとえば、水酸化アルミニウム又は「アラム」）との組み合わせで３Ｄ−ＭＰＬを含有するアジュバントは、ヒト対象に投与するためのＰｒｅＦ抗原を含有する免疫原性組成物での製剤化に好適である。
【０１３５】
ＰｒｅＦ抗原と共に製剤化するのに使用するために好適なＴｈ１優位のアジュバントの別の部類には、ＯＭＰに基づく免疫賦活組成物が挙げられる。ＯＭＰに基づく免疫賦活組成物は、たとえば、鼻内投与用の粘膜アジュバントとして特に好適である。ＯＭＰに基づく免疫賦活組成物は、細菌性又はウイルス性の抗原のような免疫原のためのキャリアとして又は組成物にて有用である、たとえば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種（たとえば、Ｌｏｗｅｌｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：６５８，１９８８；Ｌｏｗｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：８００，１９８８；Ｌｙｎｃｈら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．４５：１０４，１９８４；Ｌｏｗｅｌｌ，ｉｎ  “Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ”第２版、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｂａｓｉｌ，Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ，ｐａｇｅ  １９３，１９９７；米国特許第５，７２６，２９２号；同第４，７０７，５４３号を参照）のような、しかし、これらに限定されないグラム陰性細菌に由来する外膜タンパク質（一部のポリンを含んでなるＯＭＰ）の調製物に属する。一部のＯＭＰに基づく免疫賦活組成物は、「プロテオソーム」と呼ぶことができ、それは疎水性であり、ヒトでの使用に安全である。プロテオソームは、約２０ｎｍ〜約８００ｎｍの小胞又は小胞様のＯＭＰクラスターに自己形成する能力を有し、タンパク質抗原（Ａｇ）、特に親水性部分を有する抗原と非共有性に取り込み、配位し、会合し（たとえば、静電気的に又は疎水性に）、又はさもなければ共同する。複数の分子膜構造又は１以上のＯＭＰの溶融球状ＯＭＰ組成物を含んでなる小胞形態又は小胞様形態で外膜成分を生じる任意の調製方法は、プロテオソームの定義の範囲内に含まれる。たとえば、当該技術（たとえば、米国特許第５，７２６，２９２号又は同第５，９８５，２８４号）に記載されたようにプロテオソームを調製することができる。プロテオソームはまた、ＯＭＰポリンを製造するのに使用される細菌（たとえば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種）を起源とする内因性のリポ多糖類又はリポオリゴ糖類（ＬＰＳ又はＬＯＳ）を含有することができ、それらは一般にＯＭＰ調製物全体の２％未満である。
【０１３６】
プロテオソームはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓから化学的に抽出された外膜タンパク質（ＯＭＰ）（ほとんど、クラス４のＯＭＰと同様にポリンＡ及びＢ）から主として構成され、界面活性剤によって溶液で維持される（Ｌｏｗｅｌｌ  ＧＨ.  Ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｎａｓａｌ,  Ｏｒａｌ,  ｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ.  Ｉｎ：  Ｌｅｖｉｎｅ  ＭＭ,  Ｗｏｏｄｒｏｗ  ＧＣ,  Ｋａｐｅｒ  ＪＢ,  Ｃｏｂｏｎ  ＧＳ,  ｅｄｓ,  Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ.  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ,  Ｉｎｃ.  １９９７；  １９３‐２０６）。プロテオソームは、たとえば、透析濾過又は従来の透析工程によって、本明細書で開示されるＰｒｅＦポリペプチドを含んでなるウイルス供給源に由来する精製された又は組換えのタンパク質のような種々の抗原と共に製剤化することができる。界面活性剤を徐々に取り除くことによって約１００〜２００ｎｍの直径の粒子状疎水性の複合体を形成することができる（Ｌｏｗｅｌｌ  ＧＨ.  Ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｎａｓａｌ,  Ｏｒａｌ,  ｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｉｎ：  Ｌｅｖｉｎｅ  ＭＭ,  Ｗｏｏｄｒｏｗ  ＧＣ,  Ｋａｐｅｒ  ＪＢ,  Ｃｏｂｏｎ  ＧＳ,  ｅｄｓ,  Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ,  Ｉｎｃ.  １９９７；  １９３‐２０６）。
【０１３７】
「プロテオソーム：ＬＰＳ又はプロトリン」は、本明細書で使用されるとき、少なくとも１種のリポ多糖類による外因性添加によって混合されてＯＭＰ−ＬＰＳ組成物（免疫原性組成物として機能することができる）を提供するプロテオソームの調製物を指す。従って、ＯＭＰ−ＬＰＳ組成物は、（１）たとえば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓのようなグラム陰性細菌から調製されるプロテオソームの外膜タンパク質調製物（たとえば、プロジュバント）と（２）１以上のリポ糖類の調製物を含んでなる、プロトリンの２つの基本成分で構成することができる。リポオリゴ糖は、外因性であることができ（たとえば、ＯＭＰプロテオソーム調製物に天然に含有される）、外因性に調製されたリポオリゴ糖（たとえば、ＯＭＰ調製物とは異なった培養物又は微生物から調製された）と混合することができ又は組み合わせることができ、又はそれらの組み合わせであることができる。そのような外因性に添加されるＬＰＳは、ＯＭＰ調製物が作製されたのと同じグラム陰性細菌に由来することができ、又は異なったグラム陰性細菌に由来することができる。プロトリンはまた、任意で脂質、糖脂質、糖タンパク質、小分子等を含んでなることが理解されるべきである。プロトリンは、たとえば、米国特許出願公開第２００３／００４４４２５号に記載されたように調製することができる。
【０１３８】
上述のもののような異なったアジュバントの組み合わせもＰｒｅＦ抗原との組み合わせで使用することができる。たとえば、すでに言及したように、ＱＳ２１を３Ｄ−ＭＰＬと一緒に製剤化することができる。ＱＳ２１：３Ｄ−ＭＰＬの比率は通常、たとえば、１：５〜５：１のような１：１０〜１０：１の桁であり、実質的に１：１であることが多い。通常、比率は、２．５：１〜１：３の３Ｄ−ＭＰＬ：ＱＳ２１の範囲である。別の組み合わせアジュバントの製剤には、３Ｄ−ＭＰＬと、たとえば、水酸化アルミニウムのようなアルミニウム塩が挙げられる。組み合わせで製剤化する場合、この組み合わせが抗原特異的なＴｈ１免疫応答を高めることができる。
【０１３９】
一部の例では、アジュバント製剤には、水中油型エマルション、又はたとえば、カルシウム塩又はアルミニウム塩、たとえば、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム及び水酸化アルミニウムのような鉱物塩が挙げられる。
【０１４０】
一部の実施形態では、アジュバントは、油及び水のエマルション、たとえば、水中油型エマルションを含んでなる。水中油型エマルションの一例は、水性キャリア中に代謝可能な油、たとえば、スクアレン、トコフェロールのようなトコール、たとえば、α−トコフェロール、及びたとえば、トリオレイン酸ソルビタン（スパン８５（商標））又はモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ツイーン８０（商標））のような界面活性剤を含んでなる。特定の実施形態では、水中油型エマルションは、追加の免疫賦活剤を含有しない（特に３Ｄ−ＭＰＬのような非毒性脂質Ａ誘導体又はＱＳ２１のようなサポニンを含有しない）。水性キャリアは、たとえば、リン酸緩衝生理食塩水であり得る。さらに、水中油型エマルションは、スパン８５及び／又はレシチン及び／又はトリカプリリンを含有することができる。
【０１４１】
本発明の別の実施形態では、抗原又は抗原組成物及び水中油型エマルションを含んでなるアジュバント組成物と任意で１以上のさらなる免疫賦活剤を含んでなるワクチン組成物が提供され、前記水中油型エマルションは、０．５〜１０ｍｇの代謝可能な油（好適にはスクアレン）、０．５〜１１ｍｇのトコール（好適には、α−トコフェロールのようなトコフェロール）及び０．４〜４ｍｇの乳化剤を含んでなる。
【０１４２】
特定の一実施形態では、アジュバント製剤は、水中油型エマルションのようなエマルション形態で調製された３Ｄ−ＭＰＬを含んでなる。場合によっては、エマルションはＷＯ９４／２１２９２で開示されたように直径２μｍ未満の小さな粒度を有する。たとえば、３Ｄ−ＭＰＬの粒子は、２２μｍの膜を介して無菌濾過されるのに十分なくらい小さくてもよい（欧州特許第０６８９４５４号に記載されたように）。或いは、３Ｄ−ＭＰＬはリポソーム製剤に調製することができる。任意で、３Ｄ−ＭＰＬ（又はその誘導体）を含有するアジュバントは、追加の免疫賦活成分も含んでなる。
【０１４３】
アジュバントは、免疫原性組成物が投与される集団にて安全で且つ有効であるように選択される。成人集団及び高齢者集団については、製剤は通常、幼児製剤で通常見られるアジュバント成分より多くを含んでなる。特にエマルションのような水中油型エマルションを用いた製剤は、たとえば、コレステロール、スクアレン、α−トコフェロール及び／又はたとえば、ツイーン８０若しくはスパン８５のような界面活性剤のような追加の成分を含んでなることができる。例となる製剤では、そのような成分は、以下の量：約１〜５０ｍｇのコレステロール、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のα−トコフェロール、０．３〜３％のツイーン８０で存在することができる。通常、スクアレン：α−トコフェロールの比率は、これがさらに安定なエマルションを提供する場合、等しいか又は１未満である。場合によっては、製剤は安定剤も含有することができる。
【０１４４】
たとえば、ＰｒｅＦポリペプチドを伴う免疫原性組成物を幼児に投与するために製剤化する場合、アジュバントの投与量は、幼児対象で有効であり、相対的に反応源性ではないように決定される。一般に、幼児製剤におけるアジュバントの投与量は、成人（たとえば、６５歳以上の成人）への投与で設計される製剤で使用されるものより低い。一般に、幼児製剤におけるアジュバントの投与量は、成人（たとえば、６５歳以上の成人）への投与で設計される製剤で使用されるものより低い（たとえば、用量は、成人に投与される製剤で提供される用量の画分であってもよい）。たとえば、３Ｄ−ＭＰＬの量は通常、用量当たり１μｇ〜２００μｇ、たとえば、１０〜１００μｇ又は１０〜５０μｇである。幼児用量は通常、この範囲、たとえば、約１μｇ〜約５０μｇの低い方の端であり、たとえば、約２μｇ、又は約５μｇ、又は約１０μｇ、又は約２５μｇまで又は約５０μｇまでである。通常、ＱＳ２１が製剤で使用される場合、範囲は同程度である（及び上記比率に従って）。油及び水のエマルション（たとえば、水中油型エマルション）の場合、小児又は幼児に提供されるアジュバントの用量は、成人対象に投与される用量の画分であり得る。たとえば、３Ｄ−ＭＰＬとの組み合わせでアラムが存在する場合、量は通常、用量当たり約１００μｇ〜１ｍｇの間、たとえば、約１００μｇ又は約２００μｇ〜約７５０μｇ、たとえば、約５００μｇである。
【０１４５】
免疫原性組成物は通常、免疫防御量（又はその画分用量）の抗原を含有し、従来の技法で調製することができる。ヒト対象への投与用のものを含んでなる免疫原性組成物の調製は、一般に、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６１，Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ−ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，Ｐｌｅｎｕｒｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５．Ｎｅｗ  Ｔｒｅｎｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｖｏｌｌｅｒら、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｒｋ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．１９７８に記載されている。リポソーム内へのカプセル化は、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎによる米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。高分子へのタンパク質の抱合は、たとえば、Ｌｉｋｈｉｔｅによる米国特許第４，３７２，９４５号及びＡｒｍｏｒらによる同第４，４７４，７５７号に開示されている。
【０１４６】
通常、免疫原性組成物の各用量におけるタンパク質の量は、典型的な対象にて重大な有害な副作用なしで免疫防御の応答を誘導する量として選択される。この文脈での免疫防御は、感染に対する完全な防御を必ずしも意味するものではなく；症状又は疾患、特にウイルスに関連した重篤な疾患に対する防御を意味する。抗原の量は、どの特定の免疫原が採用されるかによって変化し得る。一般に、各ヒト用量は、１〜１０００μｇのタンパク質、たとえば、約１μｇ〜約１００μｇ、たとえば、約１μｇ〜約５０μｇ、たとえば、約１μｇ、約２μｇ、約５μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、又は約５０μｇを含んでなることが予想される。免疫原性組成物で利用される量は、対象集団（たとえば、幼児又は高齢者）に基づいて選択される。特定の組成物の任意の量は、対象における抗体力価及びそのほかの応答の所見を含んでなる標準的な検討によって確定することができる。最初のワクチン接種に続いて、約４週間以内に対象は追加免疫を受けることができる。
【０１４７】
選択されるアジュバントにかかわりなく、最終製剤の濃度は、標的集団で安全且つ有効であるように算出されることに留意すべきである。たとえば、ヒトにおいてパラミクソウイルス、たとえば、ＲＳＶ、ｈＭＰＶ及びＰＩＶに対して免疫応答を誘発するための免疫原性組成物は、好都合には幼児（最初の投与の年齢が、たとえば、出生〜１年の間、たとえば、０〜６ヵ月）に投与される。パラミクソウイルス、たとえば、ＲＳＶ、ｈＭＰＶ及びＰＩＶに対して免疫応答を誘発するための免疫原性組成物はまた、高齢者のヒトにも好都合に投与される（たとえば、単独で、又はインフルエンザ抗原及び／又はＣＯＰＤに関連する抗原若しくはそのほかの病原体との組み合わせで）。アジュバントの選択は、これらの異なった適用で異なることができ、各状況の最適なアジュバント及び濃度は当業者によって経験的に決定され得ることが十分に理解されるであろう。
【０１４８】
従って、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ及びＲＳＶの２以上による暴露又は感染（その後の治療的な又はそれに先立つ予防的な）を治療するための医薬の調製におけるＰｒｅＦ抗原又はそれをコードする核酸の使用も本開示の特徴である。同様に、対象においてｈＭＰＶ、ＰＩＶ及び／又はＲＳＶに対する免疫応答を誘発する方法は本開示の特徴である。そのような方法には、免疫的に有効な量の、ＰｒｅＦ抗原を含んでなる組成物をヒト対象のような対象に投与することが含まれる。一般に、組成物はＴｈ１優位の免疫応答を誘発するアジュバントを含んでなる。組成物は、これら病原体のいずれか１つとの接触に続くウイルス性疾患を促進することなく、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ及び／又はＲＳＶに特異的な免疫応答を誘発するように製剤化される。すなわち、組成物は、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ及び／又はＲＳＶによる感染を軽減する又は予防する、及び／又はこれらパラミクソウイルスによる感染に続く病的応答を軽減する又は予防するＴｈ１優位の免疫応答を生じるように製剤化される。組成物は種々の異なった経路によって投与することができるが、最も一般的には免疫原性組成物は、筋肉内又は鼻内の経路によって送達される。
【０１４９】
免疫原性組成物は通常、免疫防御量（又はその画分用量）の抗原を含有し、従来の技法によって調製することができる。ヒト対象への投与用のものを含んでなる免疫原性組成物の調製は、一般に、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６１，Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ−ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，Ｐｌｅｎｕｒｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５．Ｎｅｗ  Ｔｒｅｎｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｖｏｌｌｅｒら、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｒｋ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．１９７８に記載されている。リポソーム内へのカプセル化は、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎによる米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。高分子へのタンパク質の抱合は、たとえば、Ｌｉｋｈｉｔｅによる米国特許第４，３７２，９４５号及びＡｒｍｏｒらによる同第４，４７４，７５７号に開示されている。
【０１５０】
通常、免疫原性組成物の各用量におけるタンパク質の量は、典型的な対象にて重大な有害な副作用なしで免疫防御の応答を誘導する量として選択される。この文脈での免疫防御は、感染に対する完全な防御を必ずしも意味するものではなく；症状又は疾患、特にウイルスに関連した重篤な疾患に対する防御を意味する。抗原の量は、どの特定の免疫原が採用されるかによって変化し得る。一般に、各ヒト用量は、１〜１０００μｇのタンパク質、たとえば、約１μｇ〜約１００μｇ、たとえば、約１μｇ〜約５０μｇ、たとえば、約１μｇ、約２μｇ、約５μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、又は約５０μｇを含んでなることが予想される。免疫原性組成物で利用される量は、対象集団（たとえば、幼児又は高齢者）に基づいて選択される。特定の組成物の任意の量は、対象における抗体力価及びそのほかの応答の所見を含んでなる標準的な検討によって確定することができる。最初のワクチン接種に続いて、約４〜１２週間以内に対象は追加免疫を受けることができる。たとえば、ＰｒｅＦ抗原を含有する免疫原性組成物を幼児対象に投与する場合、最初の接種とそれに続く接種は、この期間に投与されるワクチンと合うように投与することができる。
【０１５１】
以下の実施例を提供して特定の特別な特徴及び／又は実施形態を説明する。これらの実施例は、記載される特別な特徴又は実施例に本発明を限定するように解釈されるべきではない。
【０１５２】
実施例
実施例１：例となるＰｒｅＦ抗原
呼吸器多核体ウイルス
例となるパラミクソウイルスＰｒｅＦ抗原は、あらゆる目的で本明細書に組み入れられるＰＣＴ／ＣＡ２００８／００２２７７で記載されたようにＲＳＶのＦタンパク質に基づいて作出した。Ｆの前融合立体構造に対して生成される免疫応答が、膜の融合に関与する結合、立体構造シフト及び／又はそのほかの事象を妨げる抗体を優先的に含んでなり、それによって防御的応答の有効性を高めるという予測に基づいて、前融合立体構造でタンパク質を安定化するためにＲＳＶのＦタンパク質にて修飾を行った。
【０１５３】
図１ＡとＢは、ＲＡＶのＦ０と例となるＰｒｅＦ組換え抗原の特徴を模式的に説明する。図１ＡはＲＳＶのＦ０タンパク質の説明である。Ｆ０は５７４のアミノ酸からなるプレタンパク質である。Ｆ０プレタンパク質は翻訳に続いてタンパク分解処理され、グリコシル化される。その後シグナルペプチダーゼによって取り除かれるシグナルペプチドは小胞体（ＲＥ）へのＦ０プレタンパク質の翻訳を標的とする。ＲＥにおける初期のペプチドは複数の部位（三角によって示される）で次いでグリコシル化される。Ｆ０のフリン切断はＦ２ペプチドドメイン及びＦ１ペプチドドメインを生じ、それらは、Ｆ２−Ｆ１へテロ二量体の３量体（すなわち、Ｆ２−Ｆ１の３倍）として一緒に折り畳まれ、形成する。天然の状態では、Ｆタンパク質は、Ｃ末端領域の膜貫通螺旋によって膜に固定される。Ｆ０ポリペプチドのさらなる特徴には、１５システイン残基、４の特徴的な中性エピトープ、２つのコイルドコイル領域、及び脂質化モチーフが挙げられる。図１Ｂは、例となるＰｒｅＦ抗原の特徴を説明する。ＰｒｅＦ抗原を構築するには、Ｆタンパク質の前融合立体構造を安定化するようにＦ０ポリペプチドを修飾し、それによって、宿主細胞に結合及び融合する前にＲＳＶウイルスによって示されるようなＦタンパク質の優勢な免疫原性エピトープを保持する。以下の安定化する変異を、Ｆ０ポリペプチドに対するＰｒｅＦ抗原に導入した。第１に、安定化するコイルドコイルドメインをＦ０ポリペプチドの細胞外ドメインのＣ末端に置き、Ｆ０の膜に固定するドメインを置き換えた。第２に、ｐｅｐ２７ペプチド（天然のタンパク質のＦ２とＦ１のドメインの間に位置する）を取り除いた。第３に、双方のフリンモチーフを除いた。代替の実施形態では（ＰｒｅＦ＿Ｖ１及びＰｒｅＦ＿Ｖ２と命名した）、ＲＳＶタンパク質の免疫的に活性のある部分（たとえば、アミノ酸１４９〜２２９）をＣ末端ドメインに付加した。例となるＲＳＶのＰｒｅＦ抗原の配列は配列番号１０によって表される。
【０１５４】
ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００２２７７に詳細に開示されたように、例となるＰｒｅＦ抗原はＲＳＶに特異的な強固な免疫応答を誘発することが示された。図６Ａ及び６Ｂは、特徴的なＩｇＧ及び中和抗体の応答を説明する。図７は例となるＰｒｅＦ抗原の投与によって付与されたＲＳＶ感染に対する防御を説明する。
【０１５５】
ヒトのメタニューモウィルス（ｈＭＰＶ）及びパラインフルエンザウイルス３（ＰＩＶ−３）
ｈＭＰＶ及びＰＩＶ−３の融合タンパク質に相当する追加のＰｒｅＦ抗原を作出した。これらのＰｒｅＦポリペプチドの配列はそれぞれ配列番号１２及び１４によって表される。ＲＳＶのＰｒｅＦ抗原で示したように、ｈＭＰＶ及びＰＩＶ−３のＰｒｅＦポリペプチドは溶液中で三量体に自己形成する。
【０１５６】
ｈＭＰＶ及びＰＩＶ−３のＰｒｅＦポリペプチドの免疫原性を確認するために、及びパラミクソウイルスによる感染を防ぐ組み合わせワクチンでの使用について抗原としての好適性を明らかにするために、表１に示すように、１以上のＰｒｅＦポリペプチドのみ及び二重及び三重の組み合わせでそれらを含んでなる免疫原性組成物でマウスを免疫した。
【表１】
0005796011.tif 000002
【０１５７】
ＥＬＩＳＡによって個々の血清試料について抗原特異的なＩｇＧ抗体の力価を測定した。手短には、ＲＳＶ、ｈＭＰＶ又はＰＩＶタンパク質（０．５μｇ）のＰｒｅＦの１つで３シリーズの９６穴プレートを被覆し、４℃で一晩インキュベートした。１：２００で出発してブロッキング緩衝液で血清試料を連続希釈し、室温で２時間インキュベートした。西洋ワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合した抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、ＯＮ）によって、結合した抗体を検出した。３，３Ａ，５，５Ａ−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、ＢＤ  Ｏｐｔ  ＥＩＡＴＭ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＯＮ）をＨＲＰの基質として使用した。５０μｌの１ＭのＨ２ＳＯ４を各ウェルに加えて反応を止めた。ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）によって４５０ｎｍにて各ウェルについて吸収値を検出した。結果を幾何平均力価（ＧＭＴ±９５％ＣＬ）として表す。説明に役立つ結果を図８Ａに示す。
【０１５８】
３種のＰｒｅＦ抗原は、単独又は二重及び三重の組み合わせのいずれもＥＬＩＳＡで検出される有意なＩｇＧ抗体力価を引き出した。
【０１５９】
高い力価の中和抗体の存在は、パラミクソウイルス感染に対する防御と相関することが示されている。ＰｒｅＦポリペプチドが防御的免疫応答を誘発することが可能であることを明らかにするために、三価、二価及び一価のＡＳ０３で免疫したマウスの血清をウイルスに対する中和能について評価した。中和抗体を検出するアッセイはＴＣＩＤ５０法に基づいた。
【０１６０】
９６穴プレート（２０μｌ／ウェル）にて培地で１：１６の希釈から開始して、個々の免疫動物の血清を連続希釈した。対照のウェルは、培地のみ又はウイルス特異的抗体を含有した。中和アッセイに先立ってウイルスの滴定を行った。異なったウイルス間の標準化は、Ｖｅｒｏ細胞の感染度に基づいた。２０μｌ／ウェルのウイルスストック（以下の力価）をプレートに加えた。
ＲＳＶ→２．６７×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ
ｈＭＰＶ→２．８１×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ
ＰＩＶ−３→２．１１×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ
【０１６１】
プレートを３３℃で２０分間インキュベートし、予め１×１０５個／ｍｌのＶｅｒｏ細胞を播いた９６穴平底プレートに混合物を移した。３３℃（５％ＣＯ２）にて４日後、上清を取り除き、ＰＢＳでプレートを洗浄し、ＰＢＳ中１％のパラホルムアルデヒドで付着細胞を固定した。間接免疫蛍光（ＲＳＶ；ｈＭＰＶ）又は細胞変性効果（ＰＩＶ−３）によって感染をモニターした。
【０１６２】
Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ（ＳＫ）法を用いて５０％組織培養感染用量（ＴＩＣＤ５０）の計算を行い、以下のようにＮＩの比率を算出した。
｛［中和力価（０μｇ／ｍｌの阻害剤］−［中和力価（２５μｇ／ｍｌの阻害剤］｝／［中和力価（０μｇ／ｍｌの阻害剤］×１００
【０１６３】
図８Ｂに示すように、ＰｒｅＦ抗原は、単独又は組み合わせのいずれもウイルス複製を阻害することが可能である特異的な中和抗体を引き出した。
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【配列表】
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