(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の単離されたポリヌクレオチド、又は配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドであって、α−ファルネセン合成酵素活性及びβ−ファルネセン合成酵素活性を備えたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
α−ファルネセン活性及びβ−ファルネセン合成活性を備えたポリペプチドをコードする、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドの断片。
【請求項３】
配列番号２の単離されたポリペプチド、又は配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、α−ファルネセン合成酵素活性及びβ−ファルネセン合成酵素活性を備えたポリペプチド。
【請求項４】
α−ファルネセン及びβ−ファルネセン合成酵素活性を有する、請求項３に記載の単離されたポリペプチドの断片。
【請求項５】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物。
【請求項６】
請求項３または４に記載のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームポリヌクレオチドを５’−３’方向に含む、遺伝子構築物。
【請求項７】
請求項３または４に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに相補的で動作可能なアンチセンスポリヌクレオチドを５’−３’方向に含む、遺伝子構築物。
【請求項８】
請求項５から７のいずれか一項に記載の遺伝子構築物を含む、ベクター。
【請求項９】
請求項５から７のいずれか一項に記載の遺伝子構築物を含む、宿主細胞。
【請求項１０】
請求項５から７のいずれか一項に記載の遺伝子構築物を含む、トランスジェニック植物又は植物細胞。
【請求項１１】
請求項１０に記載のトランスジェニック植物又は植物細胞由来の種子。
【請求項１２】
α−ファルネセン及びβ−ファルネセンの製造方法であって、増大したα−ファルネセン合成酵素及びβ−ファルネセン合成酵素活性を提供するために、請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを用いて遺伝子操作した細胞を培養する工程を含む、方法。
【請求項１３】
請求項３または４に記載のポリペプチド配列を有するα−ファルネセン合成酵素及びβ−ファルネセン合成酵素の発現を増大又は低減する工程を含む、植物のα−ファルネセン及びβ−ファルネセン生産を調節するための方法であって、前記増大又は低減が、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を変化させる遺伝子操作によって達成される、方法。
【請求項１４】
植物組織又はその核酸サンプルにおける請求項３または４に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在又は非存在を検出する方法であって、
ａ．植物組織サンプル又は核酸サンプルを得る工程、
ｂ．請求項３または４に記載のポリペプチドに結合する１又は複数のマーカーの存在又は非存在について、分子マーカーアッセイを使用してサンプルを分析する工程であって、前記マーカーアッセイが、配列番号１のポリヌクレオチド、又は配列番号１のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を検出する、工程
を含む、方法。
【請求項１５】
配列番号１のヌクレオチド配列又は配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列に関係する分子（ＤＮＡ）マーカーのマッピングのための、配列番号１のポリヌクレオチド、又は配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
新規ファルネセン合成酵素をトマトから単離した。前記ファルネセン合成酵素は、形成される最終生成物に関して驚くべき特性を有し、かつ、その遺伝子は、他の起源に由来する既知のファルネセン合成酵素遺伝子とは低い配列同一性をヌクレオチドレベルで有する。本発明は、単離したポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド、遺伝子構築物、ベクター、そのポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び遺伝子構築物を有する宿主、特に植物、並びにその植物由来の種子に関する。
【０００２】
本発明は、ファルネセン合成酵素、特に、α−ファルネセン合成酵素及び／又はβ−ファルネセン合成酵素に関する。本発明は、その酵素をコードするポリヌクレオチド配列にも関する。本発明は、核酸（又は遺伝子）構築物、ベクター、及び前記ポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞にも関する。本発明は、さらに、α−ファルネセン及び／又はβ−ファルネセンの生産並びにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ファルネセンという用語は、全てセスキテルペンである、一連の６つの密接に関連する化合物を指す。α−ファルネセン及びβ−ファルネセンは異性体であり、１つの二重結合の位置が異なる。α−ファルネセンは、３，７，１１−トリメチル−１，３，６，１０−ドデカテトラエンであり、β−ファルネセンは、７，１１−ジメチル−３−メチレン−１，６，１０−ドデカトリエンである。α−ファルネセンは、その３つの内部の二重結合のうちの２つの配置が異なる（立体異性体の第三の内部二重結合は同一である）４つの立体異性体として存在し得る。β−ファルネセンは、その中央の二重結合の配置における２つの立体異性体として存在する。異性体の特定の機能について、α−ファルネセン及びβ−ファルネセンの双方の各種の異性体の間の差異に関しての理解は限られている。
【０００４】
α−ファルネセンは、広範な種において構成的に存在しているか又は誘導される（Gapper et al., Postharvest Biology and Technology 42: (2006) 225-233）。α−ファルネセンは、カルボカチオン中間体を経て進行する反応においてファルネシルジホスフェート（ＦＤＰ）から合成されると解されており、酵素であるα−ファルネセン合成酵素によって触媒されると報告されている（Rupasinghe, et al. , J. Am. Soc. Hortic. Sci. 123,882-886 (1998)）。
【０００５】
β−ファルネセンは、植物及び動物の分類群において広範囲に存在する。この天然物の存在及び化学コミュニケーションにおける重要な伝達因子としてのその展開について、各種の論文が公開されている。β−ファルネセンは、カモミラ・レクティタ、ビニフェラ種、トウモロコシ、及びコショウを含む、裸子植物及び被子植物の双方の多数の種の精油において認められる。（Ｅ）−β−ファルネセン合成酵素は、トウモロコシの葉鞘及び葉の組織においてエジプト綿葉寄生虫（Ｅｇｙｐｔｉａｎ ｃｏｔｔｏｎ ｌｅａｆｗｏｒｍ）（ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ）の植食によって誘導されるが、根組織では誘導されない（Schnee et al., Plant Physiol., 2002, 130: 2049-2060）。ＷＯ １９９９／１８１１８に開示されているとおり、β−ファルネセンは、ジホスフェートエステルの二価金属イオンに支援されたイオン化及び得られたカルボカチオンのＣ−３メチルからの脱プロトン化を含む反応において、ＦＤＰから合成されると解されている
【０００６】
その機能の中で、α−ファルネセンは、昆虫誘引物質として開示され、マウス及び昆虫における性フェロモンとして働く。α−ファルネセンは、Ｐｒｏｒｈｉｎｏｔｅｒｍｅｓ ｃａｎａｌｉｆｒｏｎｓにおいて警報フェロモンとして働く（Sobotnfk et al. (2008) J. Chem. Ecol. 34(4):478-86）。α−ファルネセン及びその誘導体の他の使用は、強力な癌の予防剤としての使用及びプラスチックフィルム合成における使用である（ＵＳ２００６０１３７０３２）。Hernandez-ceruelos（Toxicol. Lett. 135: 103-110, 2005）らは、変異原性処理後のマウス骨髄細胞に対する、カモミール精油の主要成分であるβ−ファルネセンの抗変異原性効果について報告している。
【０００７】
β−ファルネセンは、キバナルピナスにおける花粉の臭気の主要成分として開示されており、マルハナバチの受粉行動を刺激する（Dobson et al. (1996) Am. J. Bot. 83, 877- 885）。より重要なことに、例えばワタアブラムシ（cotton aphid）（Jianwei et al., 2006, J. Econ. Entomol. 99 (5): 1636-1640; Kislow and Edwards, 1972, Nature 235: 108-109; Pickett and Griffiths, 1980, J. Chem. Ecol. 6: 349-360）及びモモアカアブラムシ（green peach aphid）（Edwards, LJ. , 1973, Nature 241 : 126-127）について、警報フェロモンとしてのアブラムシ種によるβ−ファルネセンの使用が開示されている。β−ファルネセンに曝露されたアブラムシは、扇動され、その宿主植物から散り散りに分散する（Wohlers (1981) Z Angew. Entomol. 92, 329-336）。β−ファルネセンは、１００ｎｇ／アブラムシの用量でアブラムシに対して急性毒性である（van Oosten et al. (1990) Acta Phytopathol. Entomol. Hung. 25, 331-342）。また、興味深いことに、β−ファルネセンの蒸気はコナジラミに対しても毒性である（Klijnstra et al. (1992) Meded Fac. Landbouwwet. 57, 485-491）。残念なことに、β−ファルネセンの作物に対する局所適用によってアブラムシの行動を制御する試みは、揮発性のため及び空気中ですぐに酸化によって不活性化されるため、あまり成功していない（Dawson et al. (1988) Pest. Sci. 22, 17-30）。
【０００８】
Schneeら（Plant Physiology Vol. 130, pp 2049 (2002)）は、（Ｅ）−β−ファルネセンの形成を触媒するテルペン合成酵素を開示している。ＷＯ ２００４／０３５７９１は、リンゴ（Malus domestica）由来のα−ファルネセン合成酵素を開示している。ＷＯ ９９／１８１１８は、セイヨウハッカ（Mentha piperita）由来の（Ｅ）−βファルネセン合成酵素を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ １９９９／１８１１８
【特許文献２】ＵＳ２００６０１３７０３２
【特許文献３】ＷＯ ２００４／０３５７９１
【特許文献４】ＷＯ ９９／１８１１８
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Gapper et al., Postharvest Biology and Technology 42: (2006) 225-233
【非特許文献２】Rupasinghe, et al. , J. Am. Soc. Hortic. Sci. 123,882-886 (1998)
【非特許文献３】Schnee et al., Plant Physiol., 2002, 130: 2049-2060
【非特許文献４】Sobotnfk et al. (2008) J. Chem. Ecol. 34(4):478-86
【非特許文献５】Hernandez-ceruelos, Toxicol. Lett. 135: 103-110, 2005
【非特許文献６】Dobson et al. (1996) Am. J. Bot. 83, 877- 885
【非特許文献７】Jianwei et al., 2006, J. Econ. Entomol. 99 (5): 1636-1640
【非特許文献８】Kislow and Edwards, 1972, Nature 235: 108-109
【非特許文献９】Pickett and Griffiths, 1980, J. Chem. Ecol. 6: 349-360
【非特許文献１０】Edwards, LJ. , 1973, Nature 241 : 126-127
【非特許文献１１】Wohlers (1981) Z Angew. Entomol. 92, 329-336
【非特許文献１２】van Oosten et al. (1990) Acta Phytopathol. Entomol. Hung. 25, 331-342
【非特許文献１３】Klijnstra et al. (1992) Meded Fac. Landbouwwet. 57, 485-491
【非特許文献１４】Dawson et al. (1988) Pest. Sci. 22, 17-30
【非特許文献１５】Plant Physiology Vol. 130, pp 2049 (2002)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第一の態様では、配列番号１のポリヌクレオチド及びその相同物を提供する。前記ヌクレオチドは、ファルネセン合成酵素活性、特に、α−ファルネセン合成酵素活性及び／又はβ−ファルネセン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードし得る。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、配列番号２のポリペプチド及びその相同物を提供する。前記ポリペプチドは、ファルネセン合成酵素活性、特に、α−ファルネセン合成酵素活性及び／又はβ−ファルネセン合成酵素活性を有し得る。
【００１３】
他のさらなる態様では、本発明は、遺伝子構築物、その遺伝子構築物を含むベクター、及びその遺伝子構築物を含む宿主細胞であって、前記遺伝子構築物が本発明に係るポリヌクレオチドを含むものを提供する。
【００１４】
他のさらなる態様では、本発明は、その遺伝子構築物を含むトランスジェニック植物又は植物細胞、及びその植物又は植物細胞由来の種子を提供する。
【００１５】
他のさらなる態様では、本発明に係るポリヌクレオチドの使用を含む、α−ファルネセン及び／又はβ−ファルネセンの製造方法を提供する。
【００１６】
他のさらなる態様では、本発明にかかるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの発現レベルの制御を含む、植物のα−ファルネセン及び／又はβ−ファルネセン生産を調節するための方法を提供する。
【００１７】
本発明のさらなる態様及び他の利点は、その説明を本明細書及び実施例に記載している添付の図面と組み合わせて、以下の詳細な記載及び実施例を参照することによってよりよく理解され、より容易に解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＳＩＳＳＴ３の配列と全てのプライマーの位置を示す。
【図２】図２は、発現ベクターのマップを示す。
【図３】図３は、ＳＩＳＳＴ３及びＭＹＢ転写因子を含むプラスミドを有する誘導及び非誘導細胞由来の全タンパク質のアクリルアミドゲルをクマシーブリリアントブルーで染色したゲルをスキャンしたものを示す。
【図４】図４は、ＳＩＳＳＴ３を含むプラスミドを有する誘導及び非誘導細胞の全タンパク質及び可溶性タンパク質画分についての、ケモルミネッセンスの図を示す。
【図５】図５は、４０２秒から４３６秒までの保持時間について拡大した、ＦＰＰでアッセイしたＮｉ−精製ＳＩＳＳＴ３及びＭｙｂ転写因子タンパク質のイオン６９のＧＣ−ＭＳスペクトルを示す。
【図６】純粋な（Ｅ）β−ファルネセンは、Ｄｒ．Ｗ．Ｂｏｌａｎｄ教授から頂いた。このセスキテルペンのマススペクトル及びピーク１のマススペクトルを図６ａに示す。（Ｚ，Ｅ）αファルネセン及び（Ｅ，Ｅ）α−ファルネセンの混合物をＳｉｇｍａ社から得た。（Ｚ，Ｅ）αファルネセン及びピーク２のマススペクトルは図６ｂに示され、図６ｃは、（Ｅ，Ｅ）α−ファルネセン及びピーク３のマススペクトルを示す。（Ｅ）ネロリドールはＳｉｇｍａから得た。このセスキテルペン及びピーク４のマススペクトルを図６ｄに示す。
【図７】図７は、ＦＰＰでアッセイしたトマトファルネセン合成酵素を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞由来のタンパク質抽出物のさらなるＧＣ−ＭＣクロマトグラムを示す。
【図８】図８では、定量ＲＴ−ＰＣＲで測定し、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの異なる組織由来のｃＤＮＡ上の構成的なＲＣＥ１の発現で修正した、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍのファルネセン合成酵素（本発明）の空間的発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下の詳細な説明及び実施例において、幾つかの用語を使用している。その様な用語の範囲を含む、明細書及び特許請求の範囲の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義を提供する。そうではないと本明細書で定義されない限り、使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解するものと同一の意味を有する。全ての文献、特許出願、特許、及び他の参考文献の開示は、それらの全体を参照によって本明細書に取り込む。
【００２０】
「ファルネセン合成酵素」は、ファルネシルジホスフェートをα−ファルネセン及び／又はβ−ファルネセンに変換することができる酵素である。
【００２１】
「ファルネセン合成酵素活性」は、α−ファルネセン、β−ファルネセン、又は双方のファルネシルジホスフェートからの形成を触媒する本発明のファルネセン合成酵素の能力である。活性は、酵素活性アッセイ、例えば、実施例に記載のアッセイにおいて測定する。本発明のファルネセン合成酵素のアミノ酸配列バリアントが、例えば、変化した反応速度、基質利用、生成物分布、又は立体化学などの他の特性を含む所望の変化した生物学的活性を有してよい。
【００２２】
「遺伝子構築物」は、ｃＤＮＡ分子などであるがそれらに限らない他のポリヌクレオチド分子（挿入ポリヌクレオチド）が挿入されている可能性がある、ポリヌクレオチド分子、通常は二本鎖ＤＮＡである。遺伝子構築物は、挿入ポリヌクレオチド分子の転写及び場合によっては転写物からポリペプチドへの翻訳を可能にする必要な因子を含んでよい。前記挿入ポリヌクレオチド分子は、宿主細胞に由来するか又は異なる細胞若しくは生物に由来してよく、及び／又は組換えポリヌクレオチドであってよい。宿主細胞の内部に入った時点で、前記遺伝子構築物は、宿主の染色体ＤＮＡに組み込まれてよい。前記遺伝子構築物は、ベクターに関係してよい。
【００２３】
用語「遺伝子」は、作動可能に適切な調節領域（例えば、プロモーター）に連結した、細胞中でＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）に転写される領域（転写領域）を含むＤＮＡ配列を意味する。かくして、遺伝子は、プロモーター、例えば翻訳開始に関与する配列を含む５’リーダー配列、（タンパク質）コード領域（ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、及び例えば転写終結部位を含む３’−非翻訳配列などの幾つかの作動可能に連結した配列を含んでよい。
【００２４】
「宿主細胞」は、原核又は有核細胞である。典型的な宿主原核細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉの各種の株を含む。典型的な宿主真核細胞は、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は動物細胞である。
【００２５】
「配列同一性％」は、２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列を並ばせてアラインメントする際に、同一の相対位置を占めるアミノ酸又はヌクレオチドの割合を意味する。核酸について比較する配列の長さは、一般的には、少なくとも１２０ヌクレオチド、好ましくは２００ヌクレオチド、より好ましくは３００ヌクレオチドであり、ポリペプチドについて比較する配列の長さは、一般的には、４０アミノ酸残基、好ましくは６５アミノ酸残基、より好ましくは１００アミノ酸残基である。好ましくは、「配列同一性％」は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメントを使用して決定される。ｖＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントは、ＣＬＣ Ｂｉｏ社（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）の「ＣＬＣ Ｆｒｅｅ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ ３」というソフトウェアプログラムを使用して実施した。このプログラムは、ウェブサイトhttp://www.clcbio.comから自由に入手可能である。ヌクレオチド及びアミノ酸アラインメントの双方に使用するパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ及び１のギャップエクステンションペナルティである。ギャップエンドは、全ての他のギャップとして解した。
【００２６】
本明細書で使用する「ポリヌクレオチオド」は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーを意味し、ＤＮＡ及びセンス及びアンチセンス配向の双方の対応するＲＮＡ分子を含み、また、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び組換えＤＮＡ、並びに全体又は部分的に合成されたポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、遺伝子全体又はその任意の一部からなってよい。動作可能なアンチセンスポリヌクレオチドは、対応するポリヌクレオチドの断片を含んでよく、したがって、「ポリヌクレオチド」の定義は、その様な全ての動作可能なアンチセンス断片を含む。
【００２７】
「単離されたポリヌクレオチド」は、同定され、かつ、通常は付随している少なくとも１つの混入タンパク質から分離されているヌクレオチド分子である。
【００２８】
本明細書で使用する「ポリペプチド」は、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質を含む。
【００２９】
「単離されたポリペプチド」は、同定され、かつ、分離又は回収されて、天然の環境の成分をほとんど含まないポリペプチドである。単離されたポリペプチドは、組換え細胞内のインサイチュポリペプチドを含む。しかしながら、一般的には、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００３０】
用語「遺伝子マーカー」又は「多型マーカー」又は「分子マーカー」は、染色体上の特定の位置を「標識」するために使用することができるゲノムＤＮＡ上の領域である。遺伝子マーカーが遺伝子に密接に関係する場合又は遺伝子マーカーが遺伝子「内」にある場合は、前記マーカーは、遺伝子が認められるＤＮＡを「標識」し、そのため、例えばマーカー育種／選抜技術（ＭＡＳ）において、遺伝子の存在を肯定的又は否定的に選択するための（分子）マーカーアッセイ（下述参照）において使用することができる。遺伝子マーカーの例は、ＡＦＬＰ（増幅断片長多型）、マイクロサテライト、ＲＦＬＰ（制限断片長多型）、ＳＴＳ（配列タグ部位）、ＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）、ＳＦＰ（単一特徴多型（single feature polymorphism）；Borevitz et al. 2003, Genome Research 13: 513-523を参照のこと）、ＳＣＡＲ（配列決定型増幅領域（sequence characterized amplified region））、及びＣＡＰＳマーカー（開裂増幅多型配列）などである。マーカーが遺伝子から離れるほど、マーカーと遺伝子との間で組換え（交差）が生じ、それによって関連（及びマーカーと遺伝子との同時分離）が失われる可能性が高い。遺伝子座間の距離は、組換え頻度で測定され、ｃＭ（センチモルガン；１ｃＭは、２つのマーカーの間の減数分裂組換え頻度が１％であることを示す）で与えられる。ゲノムサイズが種ごとで大きく変化し、組換えが発生する分布がゲノム全体にわたってランダムではないため、１ｃＭで表わされる実際の物理的距離（すなわち、キロベース、ｋｂ、２つのマーカーの間）は、種の間又は種の内で大きく変化する。マーカー及び「結合した」マーカーを参照する際は、遺伝子自体の「内部」におけるマーカーも包含すると解される。
【００３１】
「分子マーカーアッセイ」（又は試験）は、植物又は植物の一部における本発明に係るポリヌクレオチドの存在又は非存在を（直接的又は間接的に）示す（ＤＮＡに基づく）アッセイである。
【００３２】
本発明の１つの主題は、ファルネセン合成酵素をコードする新規ポリヌクレオチド配列、そのヌクレオチドにコードされる酵素、α−ファルネセン及び／若しくはβ−ファルネセンのインビトロ合成方法、並びに／又はα−ファルネセン及び／若しくはβ−ファルネセン活性のレベルを変化するために植物を遺伝子操作することを提供することであり、並びに利用可能な酵素における有用な選択肢を公衆に提供することである。
【００３３】
驚くべきことに、上述の課題は、配列番号１の単離されたポリヌクレオチド、又は配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを提供することによって解決できることを見出した。好ましくは、前記ポリヌクレオチドはファルネセン合成酵素、すなわち、適切な基質からα−ファルネセン及び／又はβ−ファルネセンを合成することができる酵素をコードする。したがって、他の実施態様では、ファルネセン合成酵素活性を備えたポリペプチドをコードする、本発明に係るポリヌクレオチドを提供する。
【００３４】
配列番号１の本発明のヌクレオチドは、方法の項目で詳細に記載しているとおり、植物であるトマト、すなわち、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｍｏｎｅｙ Ｍａｋｅｒから得られたファルネセン合成酵素をコードするファルネセン合成酵素遺伝子のコード配列である。以下により詳細に説明しているとおり、本発明のファルネセン合成酵素は、ポリヌクレオチドの配列同一性における差異に関してのみならず、重要なことには、そのようなポリヌクレオチドによってコードされるファルネセン合成酵素の活性に関して、当該技術分野において既知のファルネセン合成酵素と比較して驚くべき特性を有する。
【００３５】
当業者によって理解されるとおり、配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドも提供する。
【００３６】
本発明の背景において、配列同一性は、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを使用して決定することができ、かつ、決定した。ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントは、ＣＬＣ Ｂｉｏ社（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）の「ＣＬＣ Ｆｒｅｅ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ ３」というソフトウェアプログラムを使用して実施した。このプログラムは、ウェブサイトhttp://www.clcbio.comから自由に入手することができる。ヌクレオチド及びアミノ酸アラインメントの双方に使用するパラメータは、ギャップオープンペナルティが１０であり、ギャップエクステンションペナルティが１である。ギャップエンドは、全ての他のギャップと見なした。
【００３７】
前記ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを使用して、配列番号１のポリヌクレオチドが、トウモロコシから単離された既知のＥ−β−ファルネセン合成酵素（Ｓｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．２００２）に対して３６％の同一性、リンゴから単離された既知のα−ファルネセン合成酵素（ＷＯ ２００４／０３５７９１）に対して４６％の同一性、及びセイヨウハッカ由来の既知のＥ−β−ファルネセン合成酵素（ＷＯ ９９／１８１１８）に対して４８％の同一性（のみ）を示すことを算出した。
【００３８】
他の実施態様では、本発明は、配列番号１のポリヌクレオチド配列における挿入、欠失、又は置換によって、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１のヌクレオチドに関して配列番号１のポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドも提供する。そのような挿入、欠失、又は置換は、隣接ヌクレオチドに対してのものであってよいが、配列番号１のポリヌクレオチドの内部の、例えば、２、３、４、又は５つの異なる位置において存在してもよい。例えば、第一の位置のヌクレオチドが欠失され、第二の位置の２つのヌクレオチドが置換され、配列番号１のポリペプチドの内部の第三の位置で、１又は複数のヌクレオチドが挿入されてよい。
【００３９】
（単離された）本発明のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、対応するＲＮＡ、又は合成ポリヌクレオチドの形態であってよいが、イントロン及びエキソンの双方を含むポリヌクレオチドも含む。当業者によって理解されるとおり、本発明のポリヌクレオチドは、さらに、本発明のファルネセン合成酵素をコードする領域に加えて、プロモーター領域、好ましくは本発明のファルネセン合成酵素のプロモーター領域を含む調節配列を含んでよい。
【００４０】
本発明のポリヌクレオチドの断片がファルネセン活性を有するポリペプチドをコードする限りにおいて、本発明のポリヌクレオチドの断片も提供する。ファルネセン活性は、当該技術分野において既知の各種の方法によって測定され得るが、好ましくは、下記の実施例に詳細に記載するとおりに測定される。
【００４１】
上述のとおり、本発明のポリヌクレオチド、例えば、配列番号１のポリヌクレオチドは、ファルネセン活性を備えたポリヌクレオチドをコードすることが認められた。特に、本発明のポリペプチドは、α−ファルネセン及び／又はβ−ファルネセンを形成することができるポリペプチドをコードすることが認められた。当該実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、かくして、α−ファルネセン及び／又はβ−ファルネセンを形成するために使用することができる。
【００４２】
加えて、結果は、（＋）−バレンセンの存在を示し、本発明のポリペプチドは、（＋）−バレンセンを形成するためにも使用できることを示唆した。したがって、本明細書において、本発明のポリペプチドを記載する場合は、α−ファルネセン合成酵素活性及び／又はβ−ファルネセン合成酵素活性に加えて、本発明のポリペプチドは、（＋）−バレンセン合成酵素活性も示す、すなわち、（＋）−バレンセンを形成するであろう。
【００４３】
α−ファルネセンは、４つの異なる立体異性体：（Ｚ，Ｅ）−α−ファルネセン、（Ｚ，Ｚ）−α−ファルネセン、（Ｅ，Ｚ）−α−ファルネセン、及び（Ｅ，Ｅ）−α−ファルネセンの形態で存在し得る。β−ファルネセンは、２つの異なる立体異性体：（Ｅ）−β−ファルネセン及び（Ｚ）−β−ファルネセンで存在し得る。
【００４４】
さらなる実施態様では、α−ファルネセン合成酵素活性及びβ−ファルネセン合成酵素活性を備えたポリペプチドをコードする、本発明のポリヌクレオチドを提供する。
【００４５】
驚くべきことに、本発明のポリヌクレオチドが、実施例で示すとおり、α−ファルネセン及びβ−ファルネセンの双方を合成することができる本発明のポリヌクレオチドをコードし得ることを見出した。対照的に、出願人に既知の他のファルネセン合成酵素、例えば、ＷＯ ２００４／０３５７９１及びＷＯ ９９／１８１１８に開示されているものは、α−ファルネセン又はβ−ファルネセンのいずれかを形成するものとしてのみ開示されている。例えば、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、（Ｅ）−β−ファルネセン、（Ｚ，Ｅ）−α−ファルネセン、（Ｅ，Ｅ）−α−ファルネセン、及び（Ｚ，Ｚ）−α−ファルネセンを合成することができる本発明のポリヌクレオチドをコードし得る。
【００４６】
例えば、配列番号１のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、α−ファルネセン及びβ−ファルネセンの双方（特に、（Ｅ）−β−ファルネセン、（Ｚ，Ｅ）−α−ファルネセン、（Ｅ，Ｅ）−α−ファルネセン、及び（Ｚ，Ｚ）−α−ファルネセン）の合成に対して活性を有する。本発明のポリヌクレオチド、例えば、植物であるトマトＳｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｍｏｎｅｙ Ｍａｋｅｒ）から単離された本発明のポリヌクレオチドがα−ファルネセン及びβ−ファルネセンの異なる立体異性体の双方を合成する特性を有するポリペプチドをコードすることは、ここで初めて見出された。事実、そのような植物であるトマト、例えば、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｍｏｎｅｙ Ｍａｋｅｒにおけるα−ファルネセン及びβ−ファルネセンの双方の合成は、以前には開示されておらず、驚くべきことである。
【００４７】
これによって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、又はそれらの双方の形成に使用することができる本発明のポリヌクレオチドをここで初めて提供することが可能になった。加えて、これによって、ポリヌクレオチドとコードされるポリペプチドとの間の関係及び異なるファルネセンの合成に関するインビボ及びインビトロのその活性をさらに解明するためにそのようなポリヌクレオチド及びコードされるポリペプチドを使用することが初めて可能になった。例えば、（増大した）β−ファルネセン合成酵素活性を有するが、α−ファルネセン合成酵素活性を有しない（又は同活性が低減した）変異体を得ることができると解することができる。本発明のファルネセン合成酵素のアミノ酸配列バリアントが、例えば、変化した反応速度、基質利用、生成物分布、又は他の特徴、例えば、立体化学を含む、所望の変化した生物学的活性を有してもよい。
【００４８】
加えて、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドによって、単独のポリヌクレオチド又はポリペプチドを使用して、インビボ及びインビトロの双方で、α−ファルネセン及び／又はβ−ファルネセンの特定の混合物又はブレンドを合成することが可能になった。例えば、本発明のポリヌクレオチドを植物又は細菌に導入することができ、又はα−ファルネセン及び／又はβ−ファルネセンを合成するためのインビトロ系で本発明のポリペプチドを使用することができる。
【００４９】
例えば感受性植物の遺伝子型を形質転換して、異なるタイプのファルネセンの合成が変化した、遺伝的に形質転換された植物を生産するために使用することができるため、本発明のポリヌクレオチドによって、以下により詳細に説明するとおり、異なるファルネセンの合成を制御する効果的な手段を有することになる。
【００５０】
本発明のポリヌクレオチドの好ましい実施態様では、配列番号２のポリペプチド、又は配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００５１】
特に、配列番号２のポリペプチド、又は配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明の背景において有利に使用することができることが認められた。
【００５２】
他の実施態様では、α−ファルネセン合成酵素活性及び／又はβ−ファルネセン活性を備えたポリペプチドをコードする、好ましくは、α−ファルネセン活性及び／又はβ−ファルネセン合成酵素活性を備えたポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドの断片を提供する。
【００５３】
本発明の範囲を逸脱すること無く、上述のポリヌクレオチドに加えて、修飾ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの活性が実質的に悪化されることなく、本発明のポリヌクレオチドに対して数個の修飾が可能であると解されるであろう。例えば、既に説明したとおり、本発明のポリヌクレオチドは、コードされるポリペプチドの活性を実質的に妨げることなく、欠失、置換、及び挿入などの修飾を含むことができる。したがって、α−ファルネセン活性及び／又はβ−ファルネセン合成酵素活性（好ましくは、双方）を示すポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドの断片も、本発明で提供される。そのような断片は、α−ファルネセン活性及び／又はβ−ファルネセン合成酵素活性（好ましくは、双方）を有する限りにおいて、本発明のポリペプチドの特定のサイズ又は部分に制限されない。当業者は、実施例に記載の方法を適用するか又は当該技術分野で既知の任意の他の適切な方法によって、本発明のポリヌクレオチドのそのような断片が必要な活性を有するか否か容易に確立することができる。
【００５４】
他の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関する。特に、配列番号２のポリペプチド、又は上述のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントによって決定できる、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを提供する。
【００５５】
他の実施態様では、本発明は、配列番号２のポリペプチド配列における挿入、欠失、又は置換によって、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸に関して、配列番号２のポリペプチドと異なるポリペプチドも提供する。そのような挿入、欠失、又は置換は、隣接するアミノ酸に対してのものであってよいが、配列番号２のポリペプチドの内部の異なる、例えば、２、３、４、又は５の位置に存在してもよい。例えば、第一の位置の１つのアミノ酸が欠失されてよく、第二の位置の１つのアミノ酸が置換されてよく、配列番号２のポリペプチドの内部の第三の位置において、１又は複数のヌクレオチドが挿入されてよい。
【００５６】
好ましい実施態様では、本発明のそのようなポリペプチドは、ファルネセン合成酵素活性、好ましくは、α−ファルネセン活性及び／又はβ−ファルネセン合成酵素活性、より好ましくは、α−ファルネセン活性及びβ−ファルネセン合成酵素活性を有する。しかしながら、このことは、双方の活性を欠いている本発明のポリペプチド（変異体）を除外することは意図しない。
【００５７】
他の実施態様では、単離されたα−ファルネセン及びβ−ファルネセン合成酵素ポリペプチドを提供する。そのような本発明のポリペプチドは、例えば実施例に記載のとおり測定できるように、α−ファルネセン及びβ−ファルネセンの双方の合成に対して活性である。上述のとおり、そのようなポリペプチドを（植物であるトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｍｏｎｅｙ Ｍａｋｅｒ）から）単離したことは今回が初めてであり、そのポリペプチドは本明細書に記載のとおり有利に使用できる。
【００５８】
他の実施態様では、α−ファルネセン合成酵素活性及び／又はβ−ファルネセン活性、好ましくは、α−ファルネセン及びβ−ファルネセン合成酵素活性を有する、本発明のポリペプチドの断片を提供する。
【００５９】
本発明の範囲を逸脱すること無く、上述のポリペプチドに加えて、前記ポリペプチドに対する数個の修飾が、その様な修飾がポリペプチドの活性を実質的に悪化すること無く、可能である。例えば、既に説明しているように、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの活性を実質的に妨げること無く、アミノ酸の欠失、置換、及び挿入などの修飾を含むことができる。したがって、α−ファルネセン活性及び／又は（好ましくは、及び）β−ファルネセン合成酵素活性を有する、本発明のポリペプチドの断片も本発明によって提供される。そのような断片は、α−ファルネセン活性及び／又はβ−ファルネセン合成酵素活性を有する限りにおいて、本発明のポリペプチドの特定のサイズ及び部分に制限されない。当業者は、実施例に記載の方法を適用するか又は当該技術分野において既知の任意の他の適切な方法によって、そのような本発明の断片が必要な活性を有するか否かを容易に確立することができる。
【００６０】
本発明のポリペプチド又はその断片は、ファルネセン合成活性に加えて、例えば、それに対する抗体をもたらすために使用することができ、その抗体は、例えば植物中の、本発明のポリペプチドの検出に使用することができる。
【００６１】
本発明の他の態様では、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドのＤＮＡ配列、好ましくは、配列番号１のポリヌクレオチド配列又はその一部の一本鎖に対して相補的であり、かつ、相同遺伝子についてゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための、検出可能なように標識されている、ハイブリダイゼーションプローブとして使用することができるオリゴヌクレオチドを設計するために使用することができる。高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でプローブにハイブリダイズすることができ、かつ、ファルネセン合成酵素に関する、好ましくは、α−ファルネセン合成酵素及び／又はβ−ファルネセン合成酵素活性を有する遺伝子産物をコードする相同配列が、本発明の範囲内に含まれる。
【００６２】
一般的には、高ストリンジェントな条件は、少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは約２００以上のヌクレオチドの核酸配列を、特定の配列に、約６５℃で約１Ｍの塩を含む溶液、好ましくは６×ＳＳＣ又は同等のイオン強度を有する任意の他の溶液中で特定の配列にハイブリダイズさせ、約０．１Ｍ以下の塩を含む溶液、好ましくは０．２×ＳＳＣ又は同等のイオン強度を有する任意の他の溶液で６５℃において洗浄する、（サザン）ハイブリダイゼーション条件である（Sambrook, Maniatis, Fritsch, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CSHL Press, USA, 1987)）。これらの条件によって、約９０％以上の配列同一性を有する配列の検出が可能である。
【００６３】
本発明の他の態様では、本発明のポリヌクレオチドに基づいて、サザン分析におけるハイブリダイゼーションプローブとして使用できるようにオリゴヌクレオチドを設計する。これらのプローブは、本発明のファルネセン合成酵素を有する植物の遺伝子型と、そのようなファルネセン合成酵素を有しない植物の遺伝子型とを区別する分子マーカーとして使用することができる。そのようなプローブは、セレクションにおける追加のツールとして使用することができる。
【００６４】
例えば、それらは、
ａ．植物組織サンプル又は核酸サンプルを得る工程；
ｂ．配列番号１の配列、又は配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を検出する、本発明のポリペプチドに関係する１又は複数のマーカーの存在又は非存在についての分子マーカーアッセイを使用して、前記サンプルを分析する工程
を含む、植物組織又はその核酸サンプルにおける本発明のポリペプチドをコードする本発明のヌクレオチド配列の存在又は非存在を検出する方法において使用することができる。
【００６５】
本発明の好ましい実施態様では、増幅反応、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマーとして使用でき、それによる増幅産物の形成が、ある植物の遺伝子型におけるファルネセン合成酵素、好ましくは、本発明のファルネセン合成酵素の存在を示すように、本発明のポリヌクレオチドに基づいてオリゴヌクレオチドを設計する。
【００６６】
好ましい実施態様では、前記プライマーは、本発明のファルネセン合成酵素遺伝子に密接に関係する、ＡＦＬＰマーカーを同定するために選択的制限断片増幅において使用する。事実、非常に有用な技術が、ＡＦＬＰ技術であり、Vos, P. et al., in Nucleic Acids Research, 1995, Vol. 23, No. 21 : 4407-4414に開示されている。
【００６７】
分子マーカーは、事実、本発明のポリヌクレオチドに由来してよい。事実、提供されるヌクレオチド配列は、分子育種方法並びに遺伝資源スクリーニング及び／又は特性決定において使用するための遺伝子マーカーとして適用することができる。そのようなマーカーは、本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドを有する又は有しない植物のマーカー利用選抜に使用することができる。
【００６８】
したがって、配列番号１の少なくとも１５の連続したヌクレオチド又はそれに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列の分子マーカーとして、好ましくは配列番号１の単離されたポリヌクレオチド、又は配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドのための分子マーカーとして；又は好ましくはα−ファルネセン合成酵素活性及び／又はβ−ファルネセン合成酵素活性を有する、請求項７から１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのための分子マーカーとしての使用を提供する。
【００６９】
配列番号１のポリヌクレオチド；又は配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドの、本発明のヌクレオチド配列に関係する分子（ＤＮＡ）マーカーのマッピングのための使用も提供する。
【００７０】
当業者に解されるとおり、遺伝子（又は分子）マーカーが、染色体上の既知の位置にあり、かつ、特定の遺伝子又は形質遺伝子と関連する、遺伝子又はＤＮＡ配列である。それは、観察することができるゲノムの遺伝子座における変異又は変化によって生じる可能性がある変化として説明され得る。遺伝子マーカーは、短いＤＮＡ配列、例えば、１つの塩基対の変化（一塩基多型、ＳＮＰ）の周囲の配列、又は長いもの、例えばミニサテライトであってよい。
【００７１】
本発明では、マーカーは、配列番号１のポリヌクレオチド（の断片）、又は配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド（の断片）であってよい。
【００７２】
遺伝子中又はその近辺における遺伝子マーカーのマッピングは、分子生物学の分野の当業者には極めて容易に実施され得る手法であり、例えば、Lefebvre, V. & A. M. Chevre . Tools for marking plant disease and pest resistance genes: a review. Agronomie 15, 1995 (1): 3-19; Michelmore, R.W. Molecular approaches to manipulation of disease resistance genes. Annual Review of Phytopathology 33 (1995): 393-427; Michelmore, R.W., R.V. Kesseli & E.J. Ryder. Genetic mapping in lettuce. In: R. L. Phillips & I. K. Vasil (eds.) DNA-based markers in plants, Kluwer Acad. Publishers, Dordrecht, 1994, pp. 223-239; Winter.P. & G. Kahl. Molecular marker technologies for plant improvement. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 1995, 11 (4): 438-448に開示されている。
【００７３】
本発明は、試験中の遺伝子型における本発明のファルネセン合成酵素遺伝子の存在又は非存在の検出のための、本発明のオリゴヌクレオチドを含む、診断キットにも関する。そのような診断キットは、例えば、α−ファルネセン及び／又はβ−ファルネセンを形成するか否かについて遺伝子型をスクリーニングするための労力を要するアッセイを回避する。
【００７４】
さらに、本発明は、好ましくは本発明のファルネセン合成酵素、例えば、α−ファルネセン合成酵素活性及び／又はβ−ファルネセン活性を有するファルネセン合成酵素をコードする、本発明のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物に関する。そのような遺伝子構築物は、好ましくは、植物細胞中で機能的な調節配列を含み、プロモーターなどの前記調節配列は、ポリヌクレオチド、例えば、本発明の配列番号１のポリヌクレオチドのコード配列と同種又は異種である。
【００７５】
他の実施態様では、本発明のポリペプチドをコードする、オープンリーディングフレームポリヌクレオチドを５’−３’の方向に含む。さらなる実施態様では、前記遺伝子構築物は、好ましくはストリンジェントな条件で、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを５’−３’の方向に含む。
【００７６】
本発明は、本発明のＤＮＡ構築物を含むＤＮＡベクターにも関する。適切なベクターは、クローニングベクター、形質転換ベクター、及び発現ベクターなどであってよく、当業者によく知られている。
【００７７】
さらに、上述の遺伝子構築物を含む、例えば、配列番号１のポリヌクレオチド若しくはその一部又はその相同物を含むベクターを有する細胞が本発明の範囲内である。さらに、本発明の遺伝子構築物を有する細胞は本発明の範囲内である。
【００７８】
本発明の１つの好ましい実施態様では、遺伝的に形質転換された植物は、標準的な形質転換技術を使用して、本発明のポリヌクレオチドを前記植物のゲノムに導入することによって得られる。好ましくは、前記遺伝的に形質転換された植物は、本発明のファルネセン合成酵素、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するファルネセン合成酵素を機能的に発現する。
【００７９】
本発明の他の実施態様では、一般的に知られた形質転換技術を使用して、本発明のポリヌクレオチドを異種系、例えば、メロン、タバコ、シロイヌナズナ、ジャガイモ、サトウダイコン、菜種、キュウリ、コショウ、ナス、綿、トウモロコシ、カボチャ、スイカ、及びレタスに移すが、それらに限らない。細菌及び酵母などの系も含まれる。その様な系に本発明のポリヌクレオチドを導入することは、例えば、本発明のポリペプチドの生産及びファルネセン、好ましくはα−ファルネセン及びβ−ファルネセンの生産のための、そのようなペプチドのインビボ又はインビトロにおける利用を可能にする。
【００８０】
本発明の他の実施態様では、本発明のトランスジェニック植物又は植物細胞に由来し、かつ、例えば、本発明、例えば配列番号１のポリヌクレオチドを含む、種子を提供する。
【００８１】
他の態様では、増大したα−ファルネセン合成酵素及び／又はβ−ファルネセン合成酵素活性を提供する、本発明のポリヌクレオチドを用いて遺伝子操作された細胞を培養する工程；場合によってファルネシルジホスフェートを細胞に提供する工程；及び生成したα−ファルネセン及び／又はβ−ファルネセンを分離する工程を含む、α−ファルネセン及び／又はβ−ファルネセンの製造方法を提供する。当該方法は、トマト、特に実施例で使用したトマト由来の細胞を培養する工程も含む。
【００８２】
さらなる実施態様では、本発明のポリペプチド配列を有するファルネセン合成酵素の発現を増大又は低減する工程を含む、植物のα−ファルネセン及びβ−ファルネセン生産を調節するための方法であって、前記増大又は低減する工程が、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を変化する遺伝子操作によって達成される、方法を提供する。
【００８３】
本明細書に記載のとおり、好ましくはファルネセン合成酵素活性、好ましくはα−ファルネセン活性及び／又はβ−ファルネセン活性をコードするか又は有する、ポリヌクレオチド及びポリペプチド並びにそれらの断片には、その幾つかを本明細書に記載したが、それらに限らない各種の用途がある。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のファルネセン合成酵素を（過剰）発現する植物を作製するために使用することができ、アブラムシの行動の制御及び草食昆虫、例えば、コナジラミの撃退の改善を与えることができる。
【００８４】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドの単離の観点から実施例により詳細に説明する。以下の実施例は、本発明を実施するための現在企図される最良の対応を示すのみであり、本発明を限定すると解されるべきではない。
【実施例】
【００８５】
植物材料及び毛状突起、ＲＮＡ及びｍＲＮＡ単離
２３℃から１８℃の日中／夜間の温度において、１６／８時間の光／暗闇の体制で、４週間にわたって、植物であるトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｍｏｎｅｙ Ｍａｋｅｒ）を温室の土壌で育てた。同植物の分裂組織を有する茎を切断し、土壌に置いて、さらに３週間再び育てた。液体窒素中で凍結させた葉柄及び茎の部分をボルテックスすることによって、茎の毛状組織及び葉柄を５０ｍｌ試験管の底に回収した。
【００８６】
Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、植物細胞及び組織についての製造業者のプロトコールにしたがって、毛状突起のＲＮＡを単離した。添付されていたＲＬＴバッファーを使用して溶解を実施した。製造業者のプロトコールにしたがって、Ｐｒｏｍｅｇａ’ｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ） ＰｏｌｙＡｔｒａｃｔ ｍＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ＩＩＩを使用して、全ＲＮＡのプールからメッセンジャーＲＮＡを単離した。０．７１％の効率でｍＲＮＡを全ＲＮＡから単離した。
【００８７】
ｍＲＮＡ増幅及び二本鎖ｃＤＮＡ合成
Ａｍｂｉｏｎ社（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）製のＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ ＩＩ ａ ＲＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用して、毛状突起のｍＲＮＡを増幅した。増幅のための材料として、１００ｎｇのｍＲＮＡを使用した。製造業者のプロトコールにしたがって、増幅を実施した。増幅したＲＮＡの収量は１７１μｇであり、サイズ分布は期待されたとおり〜４００から３，０００塩基の範囲であった。
【００８８】
ランダムヘキサマープライマー（ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ社（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に注文）を使用して、２０μｌの反応において１０μｇのＲＮＡを使用するバッチにおいて、この増幅ＲＮＡから第一の鎖のｃＤＮＡを合成した。終濃度が６２．５ｎＭであるランダムプライマーを増幅したＲＮＡと組み合わせて、７０℃で５分間インキュベートし、その後に氷上に保存した。Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（Ｓｔ．Ｌｅｏｎ−Ｒｏｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製のＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｍ−ＭｕＩＶ逆転写酵素（２００単位）を添付のバッファーと組み合わせて添加した。ヌクレオチドを１ｍＭの終濃度まで添加した。ｃＤＮＡ合成を４２℃で９０分間にわたって実施した。その直後に、試験管を氷に移して、第二の鎖の合成をＦｅｒｍｅｎｔａｓ ＲＮａｓｅ Ｈ及びＥ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡポリメラーゼＩを使用して実施した。各２０μｌの反応管に対して、８μｌの添付のＤＮＡポリメラーゼＩ反応バッファーを、１単位のＲＮａｓｅ Ｈ及び３０単位のＤＮＡポリメラーゼＩとともに添加した。反応容量は水で１００μｌまで増加させた。全ての成分を添加して、第二の鎖の合成反応を１５℃で２時間にわたって実施した。
【００８９】
大規模同時パイロ配列決定及びデータ分析
ｄｓ−ｃＤＮＡの剪断、ライブラリーの調製、４５４−配列決定、及びコンティグアラインメントを、当該技術分野において開示されており、かつ、当業者に既知の方法にしたがって実施した。その処理には、５つの変異体の各々が個別のバーコードを有する、バーコードを付した４５４−配列決定アダプターを利用した（個別のバーコードがタグ又は識別子として開示されている、ＷＯ２００７０７３１６５、ＷＯ２００７０３７６７８、又はＷＯ２００７０７３１６５を参照のこと）。パイロ配列決定自体は、当該技術分野において既知であり、とりわけ、www.biotagebio.com；www.pyrosequencing.com / section technologyに開示されている。その技術は、例えば、参照によって本明細書に取込む、ＷＯ ０３/００４６９０、ＷＯ ０３/０５４１４２、ＷＯ ２００４/０６９８４９、ＷＯ ２００４/０７０００５、ＷＯ ２００４/０７０００７、及びＷＯ ２００５/００３３７５ （全て454 Life Sciences名義の出願である)においても適用されている。比較を目的とする配列のアラインメント方法は、当該技術分野においてよく知られている。各種のプログラム及びアラインメントアルゴリズムが、参照によって本明細書に取込む、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl . Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. MoI. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-244; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16:10881-90; Huang et al . (1992) Computer Appl. in the Biosci. 8:155-65; 及びPearson et al . (1994) Meth. MoI. Biol. 24:307-31に開示されている。Altschul et al . (1994) Nature Genet. 6:119-29 (参照によって本明細書に取込む)は、配列アラインメント方法及び相同性の計算についての詳細な検討を提示している。
【００９０】
トマトセスキテルペン合成酵素ＳＩＳＴＳ３の同定及びクローニング
７９３ｂｐの長さを有する、４５４−配列の読み取りから得られたコンティグの１つ（ｌｃｌ−ＣＬ１１７コンティグ１）は、とりわけ、ファビアナ（Ｆａｂｉａｎａ ｉｍｂｒｉｃａｔａ）セスキテルペン合成酵素（機能未知）ｍＲＮＡ（ＡＹ８６０８４７）に対して高度の同一性を有していた。このトマトｃＤＮＡの全長クローンを得るために、トマト毛状突起由来のｍＲＮＡで構築したｃＤＮＡライブラリーに対してＰＣＲ増幅を実施した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（Ｃｅｄａｒ Ｃｒｅｅｋ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）製のＨｙｂｒｉＺＡＰ−２．１ ＸＲライブラリー構築キット及びＨｙｂｒｉＺＡＰ−２．１ ＸＲ ｃＤＮＡ合成キットを製造業者のプロトコールにしたがって使用した。プライマリーｃＤＮＡライブラリーのサイズは、２．５×１０６プラーク形成単位（ＰＦＵ）／μｇファージアームであった。プライマリーライブラリーを製造業者のプロトコールにしたがって増幅した。増幅したｃＤＮＡライブラリーは、製造業者によるＭａｓｓ Ｅｘｃｉｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して切断した。この切断したライブラリーを使用して、プライマー１−６（下表１のプライマーリストを参照のこと）を用いたｃＤＮＡの３’及び５’部位のＰＣＲ増幅を実施した。
【００９１】
【表１】
0005777523.tif 000002
【００９２】
このｃＤＮＡの５’部位については、プライマー６Ｒ５Ｅ及びｐＡｃｔＦ（プライマーリストを参照のこと）を使用してＰＣＲを実施した。このｃＤＮＡの３’部位については、プライマー６Ｆ４Ｅ及びＴ７ｌｏｎｇを使用した。２５μｌの反応容量において、付属のバッファーとＦｉｎｎｚｙｍｅｓ社（Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）製の０．２５単位のＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔポリメラーゼ、０．４ｍＭの濃度の各プライマー、及び０．２ｍＭの濃度のｄＮＴＰとともに、切断したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用した。０．３ｍＭの終濃度でＭｇＣｌ２をＰＣＲミックスに添加した。Ｂｉｏｍｅｔｒａ社（Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製のＴ１サーモサイクラーを、以下のプログラムで使用した：
ステップ１．９８℃、１分間
ステップ２．９８℃、１０秒間
ステップ３．５６℃、３０秒間
ステップ４．７２℃、４５秒間
ステップ５．ステップ２に戻る；これを３４回繰り返す
ステップ６．７２℃、５分間
ステップ７．サーモサイクラーから取り出すまで４℃
【００９３】
反応産物を水で２０倍に希釈して、再増幅のための鋳型として使用した。プライマー６Ｒ４Ｅ及びｐＡｃｔＦを使用して５’部位の再増幅を実施し、プライマー６Ｆ３Ｅ及びＴ７ｌｏｎｇを使用して３’部位の再増幅を実施した。ＰＣＲ条件は、プライマリＰＣＲと同じであった。
【００９４】
再増幅反応のＰＣＲ産物をゲルから切り出して、製造業者のプロトコールにしたがってＱＩＡＧＥＮ社製のＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して単離した。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを使用してＰＣＲ産物の配列決定を実施した。
【００９５】
新しく配列決定したｃＤＮＡ断片とともに、オーバーラップ断片を集めることによって、４５４−配列から得られたコンティグを完全なコード配列にまで拡張できるであろう。切断したｃＤＮＡライブラリーからの完全なコード配列のＰＣＲ増幅に使用する新しいプライマーを設計した（プライマーＥ６ｆｌＲ２及びＥ６ｆｌＦ、プライマーリストを参照のこと）。上述のＦｉｎｎｚｙｍｅｓ社製のＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔポリメラーゼを使用して全長の増幅を実施した。
【００９６】
このＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ断片をゲルから切り出し、製造業者のプロトコールにしたがってＱＩＡＧＥＮ社製のＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して単離した。その後に、製造業者のプロトコールにしたがってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）製のＴＡクローニングキットを使用して、この精製した断片をｐＣＲ２．１クローニングベクターにクローニングした。プラスミドをＯｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（キットに同梱）に移した。液体培養を開始し、製造業者のプロトコールにしたがってＦｅｒｍｅｎｔａｓ社製のＧｅｎｅＪＥＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用してプラスミドをそこから単離し、プラスミド挿入断片の配列決定を実施した。図１は、この配列と全てのプライマーの位置を示す。
【００９７】
全長のコード配列を、上述のＰｈｕｓｉｏｎ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して、プライマーＥ６ＴｏｐｏＦ及びＥ６ＴｏｐｏＲでプラスミドから増幅した。ＰＣＲ断片を上述のとおりにゲルから単離した。製造業者のプロトコールにしたがってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＣｈａｍｐｉｏｎ ｐＥＴ２００ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＴＯＰＯ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、この全長ｃＤＮＡをｐＥＴ ＴＯＰＯベクターにクローニングした。発現ベクターのマップを図２に示す。
【００９８】
その後に、キットに同梱されていたＯｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞にプラスミドを移した。配列は、ｐＣＲ２．１クローニングベクターから配列決定した第一の全長ｃＤＮＡと同一であった。ＳＩＳＳＴ３のコード配列を配列番号１に示す。配列番号２は、推定されるアミノ酸配列を示す。
【００９９】
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＳＩＳＳＴ３タンパク質の発現
ＳＩＳＳＴ３を含むｐＥＴ２００プラスミドをＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３） Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に移した。液体培養を３７℃で一晩実施した。翌日、５０ｍｌの培地に２．５ｍｌの一晩培養したものを植菌して、０．５の６００ｎｍにおける光学密度になるまで増殖させた。培養物を室温に移し、１ｍＭの終濃度のＲｏｃｈｅ社（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）製のイソプロピルベータ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を使用して誘導した。ネガティブコントロールとして、ｐＥＴ２００でダミーの挿入断片（テルペン合成酵素活性を有しないＲ２Ｒ３タイプＭＹＢ転写因子（Ｇｅｎｂａｎｋ 受入番号ＡＹ７０５９７７））を使用した培養物を用いた。双方の培養物の非誘導コントロールも回収した。３時間の誘導の後に、１ｍｌの２つの一定分量を各培養物から回収して、残りの細胞は１５分間にわたる２０００ｇの４℃における遠心分離及びその後の培地の吸引によって回収した。細胞ペレットを液体窒素で凍結して、酵素アッセイを実施するまで−８０℃で保存した。
【０１００】
１ｍｌの一定分量の光学密度を６００ｎｍで測定した。細胞は、１０分間にわたる４℃の２０００ｇの遠心分離及び培地の吸引によって回収した。誘導したものの一定分量及び誘導していないものの一定分量の細胞を、ＯＤ単位あたり５０μｌのテルペン合成酵素バッファー（Van Schie et al. Plant MoI Biol. 2007 Jun;64(3):251-63に記載されている）に再懸濁した。３０分間にわたる氷上における１μｇのリソザイムとのインキュベート及び超音波処理によって細胞を破壊した後に、４℃の３０分間にわたる１２，０００ｇの遠心分離によって可溶性タンパク質画分を回収した。他の誘導又は非誘導細胞ペレットは、ＯＤ単位あたり５０μｌのＰＢＳＴ（0.8% NaCI (w/v), 0.02% KCI (w/v), 0.144% Na2HPO4 (w/v), 0.02% KH2PO4 (w/v), 及び0.02% (v/v) Tween-20）に再懸濁した。全タンパク質及び可溶性タンパク質画分の双方に対して、三分の一容量の４×サンプルバッファー（8% SDS (w/v), 40% グリセロール(w/v), 20% β−メルカプトエタノール (v/v) 240 mM Tris-HCI pH 6.8, 及び0.08% ブロモフェノールブルー (w/v)）を添加して、サンプルを沸騰した水に５分間入れた。１５μｌのタンパク質サンプルを１０％アクリルアミドゲルで電気泳動した。ＳＩＳＳＴ３及びＭＹＢ転写因子を含むプラスミドを有する誘導及び非誘導細胞由来の全タンパク質のアクリルアミドゲルをクマシーブリリアントブルー（0.25% CBB (w/v), 30% メタノール(v/v), 及び10% 酢酸）で染色した。この染色したゲルをスキャンしたものを図３に示す。
【０１０１】
ＳＩＳＳＴ３を含むプラスミドを有する誘導及び非誘導細胞の全タンパク質及び可溶性タンパク質画分を１０％アクリルアミドゲルに流した。サンプルの電気泳動の後に、タンパク質をニトロセルロースにブロットした。ブロットしたものを５％粉末ミルクのＰＢＳＴ溶液で１時間にわたってブロッキングした。ＱＩＡＧＥＮ社製のペンタＨｉｓ抗体（カタログ番号３４６６０、バッチ番号１３０１６７４５０）とともに５％粉末ミルクを含む１０ｍｌＰＢＳＴ中で、ブロットしたものを一晩にわたってインキュベートした。ブロットしたものをＰＢＳＴで三回洗浄し、その後に１時間にわたって５％（ｗ／ｖ）粉末ミルク及びＰｉｅｒｃｅ社（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）製のセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩＧＧ抗体を含むＰＢＳＴ中でインキュベートし、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。高感度ケミルミネッセンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、ペルオキシダーゼ活性を検出した。ケモルミネッセンスの図は図４において確認できる。
【０１０２】
ＳＩＳＳＴ３タンパク質の機能分析
培養物の残りの細胞ペレットは、セスキテルペン合成酵素活性についてアッセイした。セスキテルペン合成酵素アッセイは、参照によって本明細書に取込むVan Schie et al. Plant MoI Biol. 2007 Jun;64(3):251-63に開示されているとおりに実施した。
【０１０３】
反応産物の分析は、参照によって本明細書に取込むVan Schie et al. Plant MoI Biol. 2007 Jun;64(3):251-63又はAment et al (2004) Plant Physiol. 135:2025-2037に開示されているとおりに、ＤＢ−５カラムを備えるＧＣ−ＭＳ ＴＯＦでＮｉ−精製タンパク質を使用して実施した。
【０１０４】
図５は、４０２秒から４３６秒までの保持時間について拡大した、ＦＰＰでアッセイしたＮｉ−精製ＳＩＳＳＴ３及びＭｙｂ転写因子タンパク質のイオン６９のＧＣ−ＭＳスペクトルを示す。真正の標準物質を使用し、イオンスペクトル及び保持時間を比較することによって、ピーク１、２、３、及び４の産物は、（Ｅ）β−ファルネセン（ピーク１）、（Ｚ，Ｅ）α−ファルネセン（ピーク２）、（Ｅ，Ｅ）α−ファルネセン及び（Ｚ，Ｚ）α−ファルネセン（ともにピーク３）、及び（Ｅ）−ネロリドール（ピーク４）として同定した。
【０１０５】
図７は、ＦＰＰでアッセイしたトマトファルネセン合成酵素を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞由来のタンパク質抽出物のさらなるＧＣ−ＭＣクロマトグラムを示す。ピーク１：β−エレメン（*）、ピーク２：（Ｅ）β−ファルネセン、ピーク３：未知のセスキテルペン（*）、ピーク４：（Ｚ，Ｅ）α−ファルネセン、ピーク５：（＋）−バレンセン（*）、ピーク６：（Ｅ，Ｅ）α−ファルネセン、ピーク７：未知のセスキテルペン（*）、（*）を付して示したピークはマススペクトルに基づいて同定し、他の全ては、マススペクトル及び純粋な標準物質の保持時間の比較に基づく。
【０１０６】
純粋な（Ｅ）α−ファルネセンは、Ｄｒ．Ｗ．Ｂｏｌａｎｄ教授から頂いた。このセスキテルペンのマススペクトル及びピーク１のマススペクトルを図６ａに示す。（Ｚ，Ｅ）αファルネセン及び（Ｅ，Ｅ）α−ファルネセンの混合物をＳｉｇｍａ社から得た。（Ｚ，Ｅ）α−ファルネセン及びピーク２のマススペクトルは図６ｂに示され、図６ｃは、（Ｅ，Ｅ）α−ファルネセン及びピーク３のマススペクトルを示す。（Ｅ）ネロリドールはＳｉｇｍａ社から得た。このセスキテルペン及びピーク４のマススペクトルを図６ｄに示す。
【０１０７】
これらの結果は、トマト毛状突起ｃＤＮＡからクローニングしたＳＩＳＳＴ３が、（主に）β−ファルネセン合成酵素活性、及び、加えて、α−ファルネセン活性を有する、ファルネセン合成酵素をコードすることを示す。
【０１０８】
各種の組織及び器官におけるトマトファルネセン合成酵素の相対的な発現レベル
図８では、定量ＲＴ−ＰＣＲで測定し、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの異なる組織由来のｃＤＮＡ上の構成的なＲＣＥ１の発現で修正した、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍのファルネセン合成酵素（本発明）の空間的発現を示す。棒グラフによって、２つの独立した値の平均を表わす。最大値はエラーバーで示す。ｃＤＮＡは１．根、２．つぼみ、３．雄しべ、４．花弁、５．萼片、６．未熟な青い果実、７．ブレーカー（ｂｒｅａｋｅｒ）果実、８．ターニング（ｔｕｒｎｉｎｇ）果実、９．赤い果実、１０．葉柄、１１．茎、１２．植物先端、１３．若い葉、１４．成熟葉、１５．老化葉から単離されたＲＮＡから合成する。
【図２】
0005777523.tif 000003
【図３】
0005777523.tif 000004
【図５】
0005777523.tif 000005
【図６ａ】
0005777523.tif 000006
【図６ｂ】
0005777523.tif 000007
【図６ｃ】
0005777523.tif 000008
【図６ｄ】
0005777523.tif 000009
【図７】
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【図８】
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【図１】
0005777523.tif 000012
【図４】
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【配列表】
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