(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式を有する化合物：
【化１】
0005777890.tif 000082
式中、
Ｒ１は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ２は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ３は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ４は、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニルまたは非置換ベンジルであり；
Ｒ５は、ＨまたはＯＨであり；
但し
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４がイソプロピルである場合、Ｒ５はヒドロキシルではなく、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の少なくとも１つはＨではなく；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の１つのみがメチルである場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の残りはＨではなく；
Ｒ４がメチルである場合、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３のうちの１つがメチルではなく；
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３が全てメチルである場合、Ｒ５はヒドロキシルではなく；
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３が全てＨであり、Ｒ５がヒドロキシルである場合、Ｒ４はエチルでも、ｎ−プロピルでも、ｎ−ブチルでも、アリルでも、ベンジルでもない。
【請求項２】
請求項１記載の１つまたは複数の化合物と担体とを含む組成物。
【請求項３】
少なくとも１つの遺伝子スイッチ；および
少なくとも１つの活性化リガンド
を含む組換え型遺伝子スイッチ組成物であって、前記活性化リガンドが、請求項１に記載の化合物であり、
前記遺伝子スイッチが、エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、変異体エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、トウヒノシントメハマキ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）エクジソン受容体リガンド結合ドメインのＶ３９０Ｉ／Ｙ４１０Ｅ変異体、またはトウヒノシントメハマキのエクジソン受容体リガンド結合ドメインのＥ２７４Ｖ／Ｖ３９０Ｉ／Ｙ４１０Ｅ変異体を含む、組成物。
【請求項４】
少なくとも２つの遺伝子スイッチを含む、請求項３記載の組換え型遺伝子スイッチ組成物。
【請求項５】
個々に機能的な複数の組換え型遺伝子スイッチを含む組成物であって、
個々に機能的な各組換え型遺伝子スイッチが
以下を含む第一のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドを含む、第一の組換え型カセット：
その発現がモジュレートされる関心対象遺伝子に機能的に連結された応答エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン；
エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、変異体エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、トウヒノシントメハマキ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）エクジソン受容体リガンド結合ドメインのＶ３９０Ｉ／Ｙ４１０Ｅ変異体、またはトウヒノシントメハマキのエクジソン受容体リガンド結合ドメインのＥ２７４Ｖ／Ｖ３９０Ｉ／Ｙ４１０Ｅ変異体；
以下を含む第二の組換え型カセット：
前記ＤＮＡ結合ドメインに対して結合することができる応答エレメント；
前記応答エレメントに機能的に連結したプロモーター；および
関心対象遺伝子
を含み、
前記組成物が複数のリガンドを含み、
少なくとも１つのリガンドが請求項１に記載の化合物である、前記組成物。
【請求項６】
各遺伝子スイッチが異なるリガンドによって制御される個々に機能的な複数の組換え型遺伝子スイッチを含む組成物であって、個々に機能的な各遺伝子スイッチが以下を含む、組成物：
Ａ）以下を含む１つまたは複数の遺伝子発現カセット：
以下を含む第一のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド：
トランス活性化ドメイン；
核内受容体リガンド結合ドメイン；
以下を含む、第二のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド：
その発現がモジュレートされる関心対象遺伝子に機能的に連結した応答エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン；
核内受容体リガンド結合ドメイン；
以下を含む第三のポリヌクレオチド：
前記ＤＮＡ結合ドメインに結合することができる応答エレメント；
前記応答エレメントに機能的に連結したプロモーター；および
前記関心対象遺伝子；および
Ｂ）請求項１に記載の化合物である、リガンド。
【請求項７】
少なくとも２つの遺伝子スイッチを含む、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
個々に機能的な各遺伝子スイッチが異なる関心対象遺伝子を制御する、請求項６記載の組成物。
【請求項９】
１つの関心対象遺伝子が関心対象治療遺伝子である、請求項６記載の組成物。
【請求項１０】
１つの関心対象遺伝子がサイトカインである、請求項６記載の組成物。
【請求項１１】
１つまたは複数の核内受容体リガンド結合ドメインがグループＨ核内受容体リガンド結合ドメインである、請求項６記載の組成物。
【請求項１２】
１つまたは複数の核内受容体リガンド結合ドメインがＵＳＰリガンド結合ドメイン、ＲＸＲリガンド結合ドメイン、ＲＸＲ相同体リガンド結合ドメイン、またはＲＸＲリガンド結合ドメインのキメラである、請求項６記載の組成物。
【請求項１３】
１つまたは複数の核内受容体リガンド結合ドメインがグループＨ核内受容体リガンド結合ドメインであり、１つまたは複数の核内受容体リガンド結合ドメインがＵＳＰリガンド結合ドメイン、ＲＸＲリガンド結合ドメイン、ＲＸＲ相同体リガンド結合ドメイン、またはＲＸＲリガンド結合ドメインのキメラである、請求項６記載の組成物。
【請求項１４】
グループＨ核内受容体リガンド結合ドメインが、エクジソン受容体、変異体エクジソン受容体、鱗翅目エクジソン受容体、変異体鱗翅目エクジソン受容体、トウヒノシントメハマキエクジソン受容体、トウヒノシントメハマキエクジソン受容体の置換変異体、トウヒノシントメハマキエクジソン受容体のＶ３９０Ｉ／Ｙ４１０Ｅ変異体、またはトウヒノシントメハマキのエクジソン受容体のＥ２７４Ｖ／Ｖ３９０Ｉ／Ｙ４１０Ｅ変異体に由来する、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
リガンドの有効量を投与することによって、組換え型遺伝子スイッチ系を活性化するインビトロの方法であって、該リガンドが、請求項１記載の化合物であり、前記組換え型遺伝子スイッチ系が、エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、変異体エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、トウヒノシントメハマキ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）エクジソン受容体リガンド結合ドメインのＶ３９０Ｉ／Ｙ４１０Ｅ変異体、またはトウヒノシントメハマキのエクジソン受容体リガンド結合ドメインのＥ２７４Ｖ／Ｖ３９０Ｉ／Ｙ４１０Ｅ変異体を含む、前記方法。
【請求項１６】
宿主細胞における関心対象遺伝子の発現をモジュレートするインビトロの方法であって、該宿主細胞が
集合的に以下を含む１つまたは複数のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドを含む、第一の組換え型カセット：
トランス活性化ドメイン；
その発現がモジュレートされる関心対象遺伝子に機能的に連結した応答エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン；
核内受容体リガンド結合ドメイン、グループＨ核内受容体リガンド結合ドメイン、エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、変異体鱗翅目エクジソン受容体、トウヒノシントメハマキエクジソン受容体、トウヒノシントメハマキエクジソン受容体リガンド結合ドメインの置換変異体、トウヒノシントメハマキエクジソン受容体リガンド結合ドメインのＶ３９０Ｉ／Ｙ４１０Ｅ変異体、またはトウヒノシントメハマキのエクジソン受容体リガンド結合ドメインのＥ２７４Ｖ／Ｖ３９０Ｉ／Ｙ４１０Ｅ変異体のドメイン；および
以下を含む第二の組換え型カセット：
前記ＤＮＡ結合ドメインに結合することができる応答エレメント；
前記応答エレメントに機能的に連結したプロモーター；および
前記関心対象遺伝子
を含み、
前記方法が、前記宿主細胞に請求項１記載の化合物を接触させる段階を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ステロイド化学および遺伝子発現制御の分野に関する。より具体的には、本発明は、天然のおよび変異した核内受容体に関するステロイドリガンド、ならびに核内受容体に基づく誘導型遺伝子発現系におけるその使用に関する。本発明はさらに、これらのリガンドおよび対応する遺伝子スイッチを用いて宿主細胞内で関心対象遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。本発明はさらに、1つまたは複数のステロイドリガンドを含有する組成物および治療組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本明細書において引用される全ての特許、特許出願、および刊行物は、その全内容物が完全に参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
遺伝子発現の正確な制御は、発達および他の生理プロセスを研究、操作、および制御するための貴重なツールである。遺伝子発現は、多数の特異的タンパク質-タンパク質相互作用を伴う。DNAのRNAへの転写は、遺伝子転写を制御するプロモーターの近位の転写活性化因子を伴う。典型的に、転写活性化因子は、遺伝子のプロモーター領域に存在する部位に結合するDNA結合ドメインを有するタンパク質に結合している。遺伝子発現が起こるためには、DNA結合ドメインおよびトランス活性化ドメインを含むタンパク質は、遺伝子のプロモーター領域における正確な位置に存在しなければならない。
【０００４】
1つのトランスジェニックアプローチは、トランスジーンの発現を駆動するために細胞型特異的プロモーターを利用する。トランスジーンを含有するDNA構築物を最初に宿主ゲノムに組み入れる。転写活性化因子によって誘発されると、トランスジーンの発現が所定の細胞型において起こる。
【０００５】
もう1つのアプローチは誘導型プロモーターを通してである。例には、PR1-aプロモーター、原核細胞リプレッサー-オペレーター系、免疫抑制性イムノフィリン系、およびステロイドホルモン受容体系などの高等真核細胞転写活性化系が含まれる。
【０００６】
熱ショック、インターフェロン、および重金属によって誘導されるプロモーターに基づく遺伝子調節系が記述されている（Wurn et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5414-5418；Arnheiter et al., 1990 Cell 62:51-61；Filmus et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:27550-27560）。しかし、これらの系は漏出性であり、非標的遺伝子の発現に対するその効果により制限を有する。
【０００７】
原核細胞リプレッサー-オペレーター系は、細菌のリプレッサータンパク質およびそれが結合する独自のオペレーターDNA配列を利用する。細菌である大腸菌（Escherichia coli）のテトラサイクリン（「Tet」）および乳糖（「Lac」）リプレッサー-オペレーター系はいずれも、植物および動物において遺伝子発現を制御するために用いられている。Tet系において、テトラサイクリンはTetRリプレッサータンパク質に結合して、それによってコンフォメーションの変化が起こってオペレーターからのリプレッサータンパク質を放出し、その結果転写を起こさせる。Lac系において、lacオペロンは、乳糖またはイソプロピル-β-D-チオガラクトシドなどの合成類似体の存在に応答して活性化される。植物および動物においてそのような系を用いることは、リガンド（テトラサイクリンおよび乳糖）の不安定な化学的性質、その毒性、それらが天然に存在すること、または誘導もしくは抑制のために比較的高レベルが必要とされることにより制限される。
【０００８】
FK506、ラパマイシン、およびシクロスポリンAなどの免疫抑制分子は、イムノフィリンFKBP12、シクロフィリン等に結合することができる。この情報を用いて、単に、FK506を2つのタンパク質の各々の上に配置することによって、またはFK506を一方に、およびシクロスポリンAをもう一方の上に配置することによって任意の2つのタンパク質を結びつける全般的戦略が考案されている。FK506の合成ホモ二量体（FK1012）またはFK506-シクロスポリンの融合に起因する化合物（FKCsA）を用いて、これらの分子の二量体化を誘導することができる（Spencer et al., 1993, Science 262:1019-24；Belshaw et al., 1996 Proc Natl Acad Sci U S A 93:4604-7）。FKBP 12に融合したGal4 DNA結合ドメインおよびシクロフィリンに融合したVP 16活性化因子ドメイン、ならびにFKCsA化合物を用いて、Gal4-結合部位を含有するプロモーターの制御下でレポーター遺伝子のヘテロ二量体化および活性化を示した。この系には、望ましくない副作用を有しうる免疫抑制剤が含まれ、そのため哺乳動物遺伝子スイッチ用途における有用性は限定的である。
【０００９】
ステロイドホルモン受容体系などの転写活性化系も同様に使用されている。ステロイドホルモン受容体は、核内受容体スーパーファミリーのメンバーであり、脊椎動物および無脊椎動物細胞において見いだされる。
【００１０】
昆虫における生育、脱皮、および発達は、エクジステロイドホルモン（脱皮ホルモン）および幼弱ホルモン（Dhadialla, et al., 1998. Annu. Rev. Entomol. 43: 545-569）によって調節される。昆虫におけるエクジステロイドの分子標的には、エクジステロイド受容体（EcR）およびウルトラスピラクルタンパク質（USP）が含まれる。EcRは、シグナチャーDNAおよびリガンド結合ドメイン、ならびに活性化ドメインによって特徴決定される核内ステロイド受容体スーパーファミリーのメンバーである（Koelle et al. 1991, Cell, 67:59-77）。EcR受容体は、ポナステロンAおよびムリステロンAなどの多数のステロイド化合物のみならず、市販のテブフェノジドおよびメトキシフェノジドが含まれる非ステロイド化合物に対して応答性である（PCT/EP96/00686およびUS 5,530,028を参照されたい）。
【００１１】
昆虫のエクジステロイド受容体（EcR）はウルトラスピラクル（USP、哺乳動物RXRの昆虫相同体）とヘテロ二量体を形成して、エクジステロイドに結合し、エクジステロイド受容体DNA応答エレメントに結合して、エクジステロイド応答遺伝子の転写を活性化する。EcR/USP/リガンド複合体は、昆虫の発達および生殖の際に重要な役割を果たす。EcRは、ステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーであり、5つのモジュールドメイン、すなわちA/B（トランス活性化）、C（DNA結合、ヘテロ二量体化）、D（ヒンジ、ヘテロ二量体化）、E（リガンド結合、ヘテロ二量体化、およびトランス活性化）、ならびにF（トランス活性化）ドメインを有する。A/B、CおよびEなどのこれらのドメインのいくつかは、それらが他のタンパク質に融合してもその機能を保持する。
【００１２】
厳密に調節された誘導型遺伝子発現系または「遺伝子スイッチ」は、遺伝子治療、細胞におけるタンパク質の大規模産生、細胞に基づくハイスループットスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクス、ならびにトランスジェニック植物および動物における形質の調節などの様々な用途にとって有用である。
【００１３】
EcRに基づく遺伝子スイッチの1つのバージョンは、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster ）EcR（DmEcR）およびハツカネズミ（Mus musculus）RXR（MmRXR）を用い、ステロイドであるポナステロンAの存在下でこれらの受容体が、哺乳動物細胞株およびトランスジェニックマウスにおいてレポーター遺伝子をトランス活性化することを示した（Christopherson K. S., Mark M.R., Baja J. V., Godowski P. J. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 6314-6318；No D., Yao T.P., Evans R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 3346-3351）。後にSuhr et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. 95:7999-8004は、テブフェノジドが、外因性のヘテロ二量体パートナーの非存在下でカイコガ（Bombyx mori）EcR（BmEcR）を通して哺乳動物細胞においてレポーター遺伝子のトランス活性化を誘導することを示した。
【００１４】
PCT/US97/05330（WO 97/38117）およびPCT/US99/08381（WO99/58155）は、外因性の遺伝子およびエクジステロイド応答エレメントを含むDNA構築物が、リガンドの存在下および任意でサイレントパートナーとして作用することができる受容体の存在下でエクジステロイド受容体によって活性化される、外因性の遺伝子の発現をモジュレートするための方法を開示している。エクジステロイド受容体は、キイロショウジョウバエから単離された。典型的に、そのような系は、最適な活性化を提供するために、レチノイドX受容体（RXR）などのサイレントパートナーを必要とする。哺乳動物細胞において、昆虫エクジステロイド受容体（EcR）はレチノイドX受容体（RXR）とヘテロ二量体を形成して、標的遺伝子の発現をリガンド依存的に調節する。PCT/US98/14215（WO 99/02683）は、カイコガから単離されたエクジステロイド受容体が、外因性の二量体パートナーを必要とすることなく哺乳動物系において機能的であることを開示している。
【００１５】
US 6,265,173 B1は、ステロイド／甲状腺受容体スーパーファミリーの様々なメンバーを、遺伝子発現系において用いるためにショウジョウバエUSPまたは少なくともUSPの二量体化ドメインを含むその断片と組み合わせることができることを開示している。US 5,880,333は、トランス活性化ドメインおよびDNA結合ドメインが2つの異なるハイブリッドタンパク質上に位置する植物において用いられるキイロショウジョウバエEcRおよびUSPヘテロ二量体系を開示している。これらのUSPに基づく系は、動物細胞において構成的であり、ゆえに、関心対象遺伝子の発現の調節にとって有効ではない。
【００１６】
これらの場合の各々において、トランス活性化ドメインおよびDNA結合ドメイン（PCT/US98/14215における本来のEcRとして、またはPCT/US97/05330における改変EcRのいずれかとして）は、1つの分子に組み入れられ、USPまたはRXRのいずれかである他のヘテロ二量体パートナーは、その本来の状態で用いられた。
【００１７】
上記のEcRに基づく遺伝子調節系の欠点には、リガンドの非存在下での大きなバックグラウンド活性が含まれ、ならびに植物および動物の双方において用いるためにはこれらの系は非適応性であることが含まれる（US 5,880,333を参照されたい）。
【００１８】
ゆえに、当技術分野において、植物および動物の双方における内因性または外因性の関心対象遺伝子の発現を正確にモジュレートするために改善されたEcRに基づく系が必要である。そのような改善された系は、遺伝子治療、タンパク質および抗体の大規模産生、細胞に基づくハイスループットスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクスおよびトランスジェニック動物における形質の調節などの用途にとって有用であろう。遺伝子治療などの一定の用途に関して、非ステロイドリガンドに良好に応答して、ステロイド、たとえば内因性のステロイドに非感受性である、誘導型遺伝子発現系を有することが望ましい可能性がある。このように、単純で、小型で、比較的安価で容易に入手可能なリガンドに依存し、および宿主に対して毒性が低い改善された系は、生物系を調節するために有用である。
【００１９】
トランス活性化およびDNA結合ドメインが、2つの異なるタンパク質上にそれらを配置することによって互いに離れている、核内受容体に基づく誘導型遺伝子発現系は、リガンドの非存在下でのバックグラウンド活性の大きな低減、およびリガンドの存在下でのバックグラウンドを超える有意な活性の増加をもたらすことが示されている（PCT/US01/09050）。この2-ハイブリッド系は、出願PCT/US97/05330およびPCT/US98/14215において開示される系と比較して有意に改善された誘導型遺伝子発現モジュレーション系である。2-ハイブリッド系は、DNA結合ドメインが遺伝子上のDNA結合部位に結合する場合に、トランス活性化ドメインがより有効にプロモーターを活性化するように、相互作用タンパク質対がトランス活性化ドメインをDNA結合ドメインに対してより都合のよい位置に持ってくることができることを利用する（たとえば、US 5,283,173を参照されたい）。簡単に説明すると、2-ハイブリッド遺伝子発現系は、2つの遺伝子発現カセット；すなわち1つは、核内受容体ポリペプチドに融合したDNA結合ドメインをコードし、もう1つは、異なる核内受容体ポリペプチドに融合したトランス活性化ドメインをコードするカセットを含む。リガンドの存在下での、第一のポリペプチドと第二のポリペプチドとの相互作用は、トランス活性化ドメインにDNA結合ドメインを有効に繋ぎ止める。DNA結合およびトランス活性化ドメインが、異なる2つの分子上に存在することから、リガンドの非存在下でのバックグラウンド活性は大きく低減される。
【００２０】
さらに、2ハイブリッドシステムは、非改変RXRをスイッチパートナーとして用いる場合にしばしば起こるRXRの過剰発現によるいくつかの副作用を回避する。2ハイブリッド系の1つの例において、EcRまたはRXRの本来のDNA結合およびトランス活性化ドメインは消去される。その結果、これらのハイブリッド分子は、細胞に存在する他のステロイドホルモン受容体との相互作用がより少なく、それによって副作用が低減される。
【００２１】
受容体に基づく遺伝子調節系の改善に伴い、既存のリガンドより高い活性を有するリガンドの需要が増加している。本明細書において、トランスジーンの発現のモジュレート能を有する新規ステロイドリガンドが開示される。Silvia Lapenna Dissertation, United Kingdomを参照されたい。
【００２２】
本出願人が所有するさらなる遺伝子スイッチ系には、その各々が参照により本明細書に組み入れられる、以下に記述される系が含まれる：US 7,091,038；WO2004078924；EP1266015；US20010044151；US20020110861；US20020119521；US20040033600；US20040197861；US20040235097；US20060020146；US20040049437；US20040096942；US20050228016；US20050266457；US20060100416；WO2001/70816；WO2002/29075；WO2002/066612；WO2002/066613；WO2002/066614；WO2002/066615；WO2005/108617；US6,258,603；US20050209283；US20050228016；US20060020146；EP0965644；US 7,304,162；US 7,304,161。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】エクジステロイドのO-アルキルエーテルの調製に関する保護／脱保護スキームを示す。エーテル化反応（E）の前に、20E（25）の2,3-および／または20,22-ジオール基を、対応する20,22-フェニルボロネート（25a）、2,3-アセトニド（25b）および2,3:14,22-ジアセトニド（25c）類似体への変換によって選択的に保護した。保護／脱保護条件：（a）フェニルホウ酸（PBA）、無水DMF、室温で1時間。（b）H2O2：THF 9：1（v/v）、pH＝7、室温で2.5時間。（c）1．2,2-ジメトキシプロパン（DMP）、無水アセトン、縮合p-TsOH、室温で3時間；2．H2O2/THF 9：1（v/v）、pH＝7、室温で2.5時間。（d）0.1 M HCl水溶液：1,4-ジオキサン 1：1、室温で2.5時間。（e）DMP、無水アセトン、融合p-TsOH、室温で6時間。（f）70％AcOH、1,4-ジオキサン、8時間還流。PoA（26）からのPoA 2,3-アセトニド（26a）の合成は類似の反応条件下で行われた。
【図２】エクジステロイドエーテル類似体（1〜23）および参照化合物（24〜30）の構造、名称、および番号付けを示す。
【図３】キイロショウジョウバエBIIバイオアッセイ（BII）、および野生型（WT）EcRまたはE274V/V390I/Y410E変異体EcRを用いるトウヒノシントメハマキ（Choristoneura fumiferana）EcRに基づく遺伝子スイッチアッセイによって測定した、O-アルキル化エクジステロイド（1〜23）および参照化合物（24〜30）の効果（potency）および有効度（efficacy）を示す。a RMFI＝相対最大誘導倍率（ジアシルヒドラジン30に対して）；b 3T3細胞株；平均バックグラウンド約1；参照FI（1μM）＝806（WT-CfEcR）、1012（E274V/V390I/Y410E変異体-CfEcR）。
【図４】図4A〜4Dは、マウス3T3線維芽細胞におけるE274V/V390I/Y410E変異体-CfEcR、野生型ネッタイシマカ（Aedes aegypti）EcR、キイロショウジョウバエEcR、およびVgEcR/RXR系に基づく遺伝子スイッチアッセイにおける、PoA 22-メチルエーテル、PoA、およびMuAの比較可能な用量反応曲線を示す。レポーター遺伝子はルシフェラーゼである；DMSO標準物質と比較した誘導倍率を左の軸上にプロットして、相対発光量（RLU）絶対値を右の軸上にプロットする。各リガンドおよびスイッチ系に関して計算されたEC50を図に示す。
【図５】3D-QSARモデルの統計学的概要を示す（CoMFA/CoMSIA相互作用場、leave-one-outクロスバリデーション分析、および従来のPLS分析）。省略語：最小σ＝カラムフィルター（Kcal mol-1）、SPRESS＝予測の標準誤差。r2＝従来の（非バリデーション）適合相関係数、S＝推定値の標準誤差、q2＝leave-one-outクロスバリデーション相関係数、PSA＝極性表面積。
【図６】エーテル官能基がBIIバイオアッセイにおいて測定されるエクジステロイド活性の一因であることを示す。活性の差を、表記の-OR置換基の存在または非存在のみが異なる化合物対のあいだのΔ-logEC50として表記する。
【図７】O-アルキルステロイドの組の、計算されたオクタノール-水分配係数、血液脳関門浸透、Caco-2細胞浸透、ヒト血清アルブミン（HSA）結合、および水溶性を示す。1 実験logD値：20-ヒドロキシエクジソン、0.01；ポナステロンA、1.95；ジアシルヒドラジン30、3.4。2 実験値：20-ヒドロキシエクジソン、6.7 mg/mL；ポナステロンA、0.18 mg/mL；ムリステロンA、＞2.9 mg/mL；ジアシルヒドラジン30 6.2μg/mL。
【図８】ネッタイシマカ（Aa）およびキイロショウジョウバエ（Dm）EcRに基づく遺伝子スイッチアッセイによって測定した、選択されたO-アルキル化エクジステロイドおよび参照化合物の効果および有効度を示す。a RMFI＝相対最大誘導倍率（ジアシルヒドラジン30と比較して）。
【図９】ヒドロキシル変化を有するステロイドを示す。
【図１０】側鎖変化を有するステロイドを示す。
【図１１】酸化状態の変化、ヒドロキシル化の程度、環系、および側鎖切断を有するステロイドを示す。
【図１２】カイコガ（silkworm）（カイコガ（Bombyx mori）、BmEcR）、タバコスズメガ（tabacco hornworm）（タバコスズメガ（Manduca sexta）、MsEcR）、ハマキガ（トウヒノシントメハマキ、CfEcRおよびE274V/V390I/Y410E変異体-CfEcR）、ショウジョウバエ（キイロショウジョウバエ、DmEcR）、黄熱病媒介蚊（ネッタイシマカ、AaEcR）、マダニ（Ixodid tick）（マダニ（Amblyomma americanum）、AmaEcR）、シルバーリーフコナジラミ（silverleaf whitefly）（シルバーリーフコナジラミ（Bemisia argentifolii）、BaEcR）、ヨコバイ（ツマグロヨコバイ（Nephotettix cincticeps）、NcEcR）、およびゴミムシダマシ（チャイロコメノゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）、TmEcR）のEcRリガンド-結合ドメインの配列アラインメントを示す。ヘリックス領域を配列アラインメントの上に示す。同一の残基を星印で示し；保存された残基をコロンで示す。黒丸（保存）または黒三角（非保存）で示される残基は、HvEcR-結合ポナステロンAの4.5Å以内（重原子のみ）に存在する。白丸で示される残基はHvEcR-結合ポナステロンAの6.5Å以内（重原子のみ）に存在する。E274V/V390I/Y410E変異体- CfEcRを下線の太字で示す。
【図１３】ネズミNIH 3T3線維芽細胞においてGAL4-EcR（DEF領域）、VP 16- RXR-USPキメラ、およびルシフェラーゼレポーターを用いる2-ハイブリッド系において、鱗翅目の（lepidopteran）EcRに対して測定されたステロイドに関する遺伝子スイッチのEC50値を示す。FI＝誘導倍率；RMFI、RSL1最大値に対する最大誘導倍率；「〜」、肉眼での検分によって査定されたEC50。EcR起源：BmEcR、カイコガ；MsEcR、タバコスズメガ；CfEcR、ハマキガ；E274V/V390I/Y410E変異体-CfEcR。
【図１４】ネズミNIH 3T3線維芽細胞においてGAL4-EcR（DEF領域）、VP 16- RXR-USPキメラ、およびルシフェラーゼレポーターを用いる2-ハイブリッド系において、非鱗翅目のEcRに対して測定されたステロイドに関する遺伝子スイッチのEC50を示す。BII細胞形質転換EC50値を比較のために含める。FI、誘導倍率；RMFI、相対最大誘導倍率；「〜」、肉眼での検分によって査定されたEC50。EcR起源：BII、ショウジョウバエ；DmEcR、ショウジョウバエ；AaEcR、黄熱病媒介蚊；AmaEcR、マダニ；BaEcR、シルバーリーフコナジラミ；NcEcR、ヨコバイ；TmEcR、ゴミムシダマシ。
【図１５】ネズミNIH 3T3線維芽細胞においてGAL4-EcR（DEF領域）、VP 16- RXR-USPキメラ、およびルシフェラーゼレポーターを用いる2-ハイブリッド系において、鱗翅目のEcRに対して測定されたステロイドに関する遺伝子スイッチのEC50値を示す。FI＝誘導倍率；RMFI、RSL1最大値に対する最大誘導倍率；「〜」、肉眼での検分によって査定されたEC50。EcR起源：BmEcR、カイコガ；MsEcR、タバコスズメガ；CfEcR、ハマキガ；E274V/V390I/Y410E変異体-CfEcR。
【図１６】ネズミNIH 3T3線維芽細胞においてGAL4-EcR（DEF領域）、VP 16- RXR-USPキメラまたはVgEcR/RXR系、およびルシフェラーゼレポーターを用いる2-ハイブリッド系において、非鱗翅目のEcRに対して測定されたステロイドに関する遺伝子スイッチのEC50を示す。BII細胞形質転換EC50値を比較のために含める。FI、誘導倍率；RMFI、相対最大誘導倍率；「〜」、肉眼での検分によって査定されたEC50。EcR起源：BII、ショウジョウバエ；DmEcR、ショウジョウバエ；VGECR/RXR、ショウジョウバエ；AaEcR、黄熱病媒介蚊；AmaEcR、マダニ；BaEcR、シルバーリーフコナジラミ；NcEcR、ヨコバイ；TmEcR、ゴミムシダマシ。
【図１７】系統発生順に整列させた、EcRの関数としての選択されたステロイド（-logEC50）の効果レベルを示す。鱗翅目のEcRを左に示す；非鱗翅目のものを右に示す。各々の水平線は異なるリガンドを表す。交差は、効果の逆転、すなわち交差のいずれかの側での2つのリガンドおよびEcRに関する直交性を示す。破線は、シアステロン/E274V/V390I/Y410E変異体-CfEcR//カネセンステロン/BaEcRおよびシアステロン/E274V/V390I/Y410E変異体-CfEcR//ポリポジンB/AaEcR直交性を示す。
【図１８】図18Aおよび18Bは、（a）E274V/V390I/Y410E変異体-EcRおよび（b）BaEcRによるシアステロン（黒丸）およびカネセンステロン（白丸）の用量反応を示す。誘導倍率（バックグラウンドRLUに対する試験用量RLUの比）を左の垂直な軸に示す；RLU測定の概算値を右の軸に示す。より高用量でのいくつかの点を省略する。
【図１９】図19Aおよび19Bは、（a）E274V/V390I/Y410E変異体-EcRおよび（b）AaEcRによるシアステロン（黒丸）およびポリポジンB（白三角）の用量反応を示す。誘導倍率（バックグラウンドRLUに対する試験用量RLUの比）を左の垂直な軸に示す；RLU測定の概算値を右の軸に示す。より高用量でのいくつかの点を省略する。
【図２０】E274V/V390I/Y410E変異体-CfEcR対BaEcRのステロイドの効果（-log(EC50)/-log(EC50)）のプロットを示す。
【発明の概要】
【００２４】
本発明は、核内受容体に基づく誘導型遺伝子発現モジュレーション系などの遺伝子スイッチと共に用いられるステロイドリガンド、および遺伝子スイッチと共にこれらのリガンドを用いて宿主細胞内の関心対象遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
【００２５】
本発明のある態様は、本発明のリガンドと共に遺伝子発現モジュレーション系を用いて宿主細胞における遺伝子発現をモジュレートする方法に関する。本発明のある局面は、以下の段階を含む、宿主細胞における関心対象遺伝子の発現をモジュレートする方法を提供する：a）本発明に従う遺伝子発現モジュレーション系を宿主細胞に導入する段階；b）以下を含む、遺伝子発現カセットを宿主細胞に導入する段階：i）遺伝子発現モジュレーション系の第一のハイブリッドポリペプチドからのDNA結合ドメインが結合するドメインを含む応答エレメント；ii）遺伝子発現モジュレーション系の第二のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター；およびiii）その発現がモジュレートされる関心対象遺伝子；ならびにc）宿主細胞にリガンドが導入されると、関心対象遺伝子の発現がモジュレートされる、宿主細胞にリガンドを導入する段階。
【００２６】
本発明のもう1つの局面には、複数の関心対象遺伝子の発現を独立して制御するための直交遺伝子スイッチが含まれる。本発明の直交遺伝子スイッチには、エクジソン受容体が含まれるステロイド受容体などの核内受容体に基づく遺伝子スイッチが含まれる。さらに、直交遺伝子スイッチには、野生型配列もしくは変異体配列、またはその組み合わせに基づく個々のスイッチが含まれる。
【００２７】
本発明のもう1つの局面には、グループH核内受容体リガンド結合ドメイン、エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、エクジソン受容体リガンド結合ドメインの置換変異体、トウヒノシントメハマキのエクジソン受容体リガンド結合ドメイン、トウヒノシントメハマキのエクジソン受容体リガンド結合ドメインのV390I/Y410E変異体、またはトウヒノシントメハマキのエクジソン受容体リガンド結合ドメインのE274V/V390I/Y410E変異体を含む遺伝子スイッチが含まれる。
【００２８】
本発明のもう1つの局面は、少なくとも1つの遺伝子スイッチと、本明細書において開示される化合物もしくは非ステロイド化合物、またはジアシルヒドラジン、アミドケトン、もしくはオキサジアゾリンの任意の1つまたは複数である、少なくとも1つの活性化リガンドとを含む組換え型遺伝子スイッチ系である。
【００２９】
本発明のもう1つの局面は、同じベクターポリヌクレオチドに存在する1つまたは複数の核酸によってコードされる複数の遺伝子スイッチを含む系である。
【００３０】
本発明のもう1つの局面は、個々に機能的な各遺伝子スイッチが異なる関心対象遺伝子を制御し；関心対象遺伝子が関心対象治療遺伝子、サイトカイン、および／または毒素である、組換え型遺伝子スイッチ系である。
【００３１】
本発明のもう1つの局面は、本明細書において開示される化合物の有効量を投与することによって、組換え型遺伝子スイッチ系を活性化する方法であって、組換え型遺伝子スイッチ系が該化合物に対して応答性である、方法である。
【００３２】
本発明のもう1つの局面は、1つまたは複数のステロイドリガンドを含有する組成物および治療組成物に関する。本発明の追加の局面には、ステロイドおよび／または非ステロイド構造の遺伝子スイッチリガンドを含む組成物が含まれる。そのような組成物は治療混合物を包含する。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明の態様は、宿主細胞における関心対象遺伝子の発現をモジュレートするために有用なステロイド受容体に基づく誘導型遺伝子発現系と共に用いるためのリガンドを提供する。1つの態様において、本発明は、低減されたレベルのバックグラウンド遺伝子発現を有し、マイクロモル未満の濃度のステロイドリガンドに応答する遺伝子スイッチ系を提供する。本発明は、市販の誘導型発現系の限界を克服して、遺伝子発現を制御するための有効な様式を提供する。
【００３４】
本発明は、遺伝子発現レベルの制御が望ましい、遺伝子治療、タンパク質および抗体の大規模産生、細胞に基づくハイスループットスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、およびトランスジェニック生物における形質の調節などの用途にとって有用である。本発明の長所は、発現レベルをユーザーの要求に適合するように調整できる点である。
【００３５】
本発明は、以下の式の化合物に関する：
0005777890.tif 000002
式中、
R1、R2、R3、およびR4は
a）H、(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロキシアルキル；(C1-C4)アルコキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、ヒドロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよい(C2-C6)アルケニル；ハロ、シアノ、ヒドロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよい(C2-C6)アルキニル；ハロ、シアノ、ヒドロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよい(C3-C5)シクロアルキル；ハロ、シアノ、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよいオキシラニルであるか、または
b）置換基が独立して、1〜5つのH、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、(C1-C6)アルキル、もしくは(C1-C6)アルコキシである、非置換もしくは置換ベンジルであり；ならびに
R5は、H；OH；F；Cl；または(C1-C6)アルコキシである。
【００３６】
1つの態様において、R1、R2、R3、およびR4がHである場合、R5はHでもヒドロキシでもない。
【００３７】
1つの態様において、R1、R2、R3、およびR4の少なくとも1つはHではない。もう1つの態様において、R1、R2、R3、およびR4の少なくとも2つはHではない。もう1つの態様において、R1、R2、R3、およびR4の少なくとも3つはHではない。もう1つの態様において、R1、R2、R3、およびR4の各々はHではない。
【００３８】
1つの態様において、
R1、R2、R3、およびR4がHである場合、R5はメトキシではなく、
R1、R2、R3、およびR4がイソプロピルである場合、R5はヒドロキシではなく、ならびに
R1、R2、およびR3がHであり、およびR5がヒドロキシである場合、R4はメチルでもエチルでもない。
【００３９】
特定の態様において、R1、R2、R3、およびR4は、
a）H、(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロキシアルキル；(C1-C4)アルコキシ(C1-C6)アルキル；(C2-C6)アルケニル；(C2-C6)アルキニル；ハロ、シアノ、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよいオキシラニルであるか；または
b）置換基が独立して1〜5つのH、ハロ、シアノ、もしくは(C1-C6)アルキルである、非置換または置換ベンジルであり；ならびに
R5は、H、OH、F、Cl、または(C1-C6)アルコキシである。
【００４０】
他の特定の態様において、R1、R2、R3、およびR4はH、(C1-C6)アルキル；(C2-C6)アルケニル；(C2-C6)アルキニル；2'-エチルオキシラニル、またはベンジルであり；ならびに
R5はH、OH、またはFである。
【００４１】
特定の態様において、
R1、R2、R3、およびR4がイソプロピルである場合、R5はヒドロキシルではなく、
R5がH、ヒドロキシル、メトキシ、またはフルオロである場合、R1、R2、R3、およびR4の少なくとも1つはHではなく；
R1、R2、R3、およびR4の1つのみがメチルであり、R5がHまたはヒドロキシルである場合、R1、R2、R3、およびR4の残りはHではなく；
R4と、R1、R2、およびR3のうちの1つの両方がメチルである場合、R5はHでもヒドロキシルでもなく；
R1、R2、R3、およびR4が全てメチルである場合、R5はヒドロキシルではなく；ならびに
R1、R2、およびR3が全てHであり、R5がヒドロキシルである場合、R4はエチルでも、n-プロピルでも、n-ブチルでも、アリルでも、ベンジルでもない。
【００４２】
本発明の態様はまた、
a）DNA結合ドメイン；
b）リガンド結合ドメイン；
c）トランス活性化ドメイン；および
d）リガンド
を含む核内受容体複合体を、
関心対象遺伝子；および
応答エレメント
を含むDNA構築物に接触させる段階を含む、関心対象遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、関心対象遺伝子が応答エレメントの制御下に置かれ、およびDNA結合ドメインがリガンドの存在下で応答エレメントに結合すると、関心対象遺伝子の活性化または抑制が起こる方法に関する。
【００４３】
1つの態様において、リガンドは以下の式の化合物である：
0005777890.tif 000003
式中
R1、R2、R3、R4およびR5は先の記述と同じ意味を有する。
【００４４】
本発明の特定の態様には、以下のステロイド遺伝子スイッチリガンドを用いることが含まれる：20-ヒドロキシエクジソン、2-メチルエーテル；20-ヒドロキシエクジソン、3-メチルエーテル；20-ヒドロキシエクジソン、14-メチルエーテル；20-ヒドロキシエクジソン、2,22-ジメチルエーテル；20-ヒドロキシエクジソン、3,22-ジメチルエーテル；20-ヒドロキシエクジソン、14,22-ジメチルエーテル；20-ヒドロキシエクジソン、22,25-ジメチルエーテル；20-ヒドロキシエクジソン、2,3,14,22-テトラメチルエーテル；20-ヒドロキシエクジソン、22-n-プロピルエーテル；20-ヒドロキシエクジソン、22-n-ブチルエーテル；20-ヒドロキシエクジソン、22-アリルエーテル；20-ヒドロキシエクジソン、22-ベンジルエーテル；20-ヒドロキシエクジソン、22-(28R,S)-2'-エチルオキシラニルエーテル；ポナステロンA、2-メチルエーテル；ポナステロンA、14-メチルエーテル；ポナステロンA、22-メチルエーテル；ポナステロンA、2,22-ジメチルエーテル；ポナステロンA、3,22-ジメチルエーテル；ポナステロンA、14,22-ジメチルエーテル；ダクリハイナンステロン（dacryhainansterone）、22-メチルエーテル。
【００４５】
本発明の追加の態様には、以下のステロイド遺伝子スイッチを用いることが含まれる：25,26-ジデヒドロポナステロンA、（イソ-スタキステロン（iso-stachysterone）C（Δ25(26)））、シダステロン（shidasterone）（スタキステロンD）、スタキステロンC、22-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン（タキシステロン（taxisterone））、ポナステロンA、ポリポルステロン（polyporusterone）B、22-デヒドロ-20-ヒドロキシエクジソン、ポナステロンA 22-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、プテロステロン（pterosterone）、(25R)-イノコステロン、(25S)-イノコステロン、ピンナタステロン（pinnatasterone）、25-フルオロポナステロンA、24(28)-デヒドロマキステロンA、24-エピ-マキステロンA、マキステロンA、20-ヒドロキシエクジソン-22-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-25-メチルエーテル、アブタステロン、22,23-ジ-エピ-ジェラジアステロン（geradiasterone）、20,26-ジヒドロキシエクジソン（ポドエクジソンC）、24-エピ-アブタステロン、ジェラジアステロン、29-ノルシアステロン、アジュガステロンB、24(28)[Z]-デヒドロアマラステロン（dehydroamarasterone）B、アマラステロンA、マキステロンC、ラピステロン（rapisterone）C、20-ヒドロキシエクジソン-22,25-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-22-エチルエーテル、カルタモステロン（carthamosterone）、24(25)-デヒドロプレシアステロン、ロイゼアステロン（leuzeasterone）、シアステロン、20-ヒドロキシエクジソン-22-アリルエーテル、24(28)[Z]-デヒドロ-29-ヒドロキシマキステロンC、20-ヒドロキシエクジソン-22-アセテート、ビチコステロン（viticosterone）E（20-ヒドロキシエクジソン 25-アセテート）、20-ヒドロキシエクジソン-22-n-プロピルエーテル、24-ヒドロキシシアステロン、20-ヒドロキシエクジソン-22-n-ブチルエーテル、ポナステロンA 22-ヘミスクシネート、22-アセトアセチル-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-22-ベンジルエーテル、カネセンステロン、20-ヒドロキシエクジソン-22-ヘミスクシネート、イノコステロン-26-ヘミスクシネート、20-ヒドロキシエクジソン-22-ベンゾエート、20-ヒドロキシエクジソン-22-β-D-グルコピラノシド、20-ヒドロキシエクジソン-25-β-D-グルコピラノシド、シレネオシドA（20-ヒドロキシエクジソン-22α-ガラクトシド）、3-デオキシ-1β,20-ジヒドロキシエクジソン（3-デオキシインテグリステロンA）、2-デオキシインテグリステロンA、1-エピ-インテグリステロンA、インテグリステロンA、シレネオシドC（インテグリステロンA 22α-ガラクトシド）、2,22-ジデオキシ-20-ヒドロキシエクジソン、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン-3-アセテート、2-デオキシ-20,26-ジヒドロキシエクジソン、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン-22-アセテート、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン-3,22-ジアセテート、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン-22-ベンゾエート、ポナステロンA 2-ヘミスクシネート、20-ヒドロキシエクジソン-2-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-2-アセテート、20-ヒドロキシエクジソン-2-ヘミスクシネート、20-ヒドロキシエクジソン-2-β-D-グルコピラノシド、2-ダンシル-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-2,22-ジメチルエーテル、ポナステロンA 3β-D-キシロピラノシド（リムナンテオシド（limnantheoside）B）、20-ヒドロキ���エクジソン-3-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-3-アセテート、20-ヒドロキシエクジソン-3β-D-キシロピラノシド（リムナンテオシドA）、20-ヒドロキシエクジソン-3-β-D-グルコピラノシド、シレネオシドD（20-ヒドロキシエクジソン-3α-ガラクトシド）、20-ヒドロキシエクジソン 3β-D-グルコピラノシル-[l-3]-β-D-キシロピラノシド（リムナンテオシドC）、20-ヒドロキシエクジソン-3,22-ジメチルエーテル、シアステロン-3-アセテート、2-デヒドロ-3-エピ-20-ヒドロキシエクジソン、3-エピ-20-ヒドロキシエクジソン（コロナタステロン（coronatasterone））、ラピステロンD、3-デヒドロ-20-ヒドロキシエクジソン、5β-ヒドロキシ-25,26-ジデヒドロポナステロンA、5β-ヒドロキシスタキステロンC、25-デオキシポリポジンB、ポリポジンB、25-フルオロポリポジンB、5β-ヒドロキシアブタステロン、26-ヒドロキシポリポジンB、29-ノルセンゴステロン、センゴステロン、6β-ヒドロキシ-20-ヒドロキシエクジソン、6α-ヒドロキシ-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-6-オキシム、ポナステロンA 6-カルボキシメチルオキシム、20-ヒドロキシエクジソン-6-カルボキシメチルオキシム、アジュガステロンC、ラピステロンB、ムリステロンA、アトロトステロン（atrotosterone）B、アトロステロンA、ツルケステロン-2-アセテート、プニステロン（punisterone）（ラポンチステロン（rhapontisterone））、ツルケステロン、アトロトステロンC、25-ヒドロキシアトロトステロンB、25-ヒドロキシアトロトステロンA、パキシロステロン、ツルケステロン-2,22-ジアセテート、ツルケステロン-22-アセテート、ツルケステロン-11α-アセテート、ツルケステロン-2,11α-ジアセテート、ツルケステロン-11α-プロピオネート、ツルケステロン-11α-ブタノエート、ツルケステロン-11α-ヘキサノエート、ツルケステロン-11α-デカノエート、ツルケステロン-11α-ラウレート、ツルケステロン-11α-ミリステート、ツルケステロン-11α-アラキデート、22-デヒドロ-12β-ヒドロキシノルセンゴステロン、22-デヒドロ-12β-ヒドロキシシアステロン、22-デヒドロ-12β-ヒドロキシセンゴステロン、14-デオキシ(14α-H)-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-14-メチルエーテル、14α-ペルヒドロキシ-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン 14,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-2,3,14,22-テトラメチルエーテル、(20S)-22-デオキシ-20,21-ジヒドロキシエクジソン、22,25-ジデオキシエクジソン、(22S)-20-(2,2'-ジメチルフラニル)エクジソン、(22R)-20-(2,2'-ジメチルフラニル)エクジソン、22-デオキシエクジソン、25-デオキシエクジソン、22-デヒドロエクジソン、エクジソン、22-エピ-エクジソン、24-メチルエクジソン（20-デオキシマキステロンA）、エクジソン-22-ヘミスクシネート、25-デオキシエクジソン-22-β-D-グルコピラノシド、エクジソン-22-ミリステート、22-デヒドロ-20-イソ-エクジソン、20-イソ-エクジソン、20-イソ-22-エピ-エクジソン、2-デオキシエクジソン、シレネオシドE（2-デオキシエクジソン 3β-グルコシド；ブレクノシド（blechnoside）A）、2-デオキシエクジソン-22-アセテート、2-デオキシエクジソン-3,22-ジアセテート、2-デオキシエクジソン-22-β-D-グルコピラノシド、2-デオキシエクジソン 25-β-D-グルコピラノシド、2-デオキシ-21-ヒドロキシエクジソン、3-エピ-22-イソ-エクジソン���3-デヒドロ-2-デオキシエクジソン（シレノステロン（silenosterone））、3-デヒドロエクジソン、3-デヒドロ-2-デオキシエクジソン-22-アセテート、エクジソン-6-カルボキシメチルオキシム、エクジソン-2,3-アセトニド、14-エピ-20-ヒドロキシエクジソン-2,3-アセトニド、20-ヒドロキシエクジソン-2,3-アセトニド、20-ヒドロキシエクジソン-20,22-アセトニド、14-エピ-20-ヒドロキシエクジソン-2,3,20,22-ジアセトニド、パキシロステロン-20,22-p-ヒドロキシベンジリデンアセタール、ポストステロン（poststerone）、(20R)-ジヒドロポストステロン、(20S)ジヒドロポストステロン、ポストステロン-20-ダンシルヒドラジン、(20S)-ジヒドロポストステロン-2,3,20-トリベンゾエート、(20R)-ジヒドロポストステロン-2,3,20-トリベンゾエート、(20R)ジヒドロポストステロン-2,3-アセトニド、(20S)ジヒドロポストステロン-2,3-アセトニド、(5α-H)-ジヒドロルブロステロン、2,14,22,25-テトラデオキシ-5α-エクジソン、5α-ケトジオール、ボンビコステロール（bombycosterol）、2α,3α,22S,25-テトラヒドロキシ-5α-コレスタン-6-オン、(5α-H)-2-デオキシ-21-ヒドロキシエクジソン、カスタステロン、24-エピ-カスタステロン、(5αα-H)-2-デオキシインテグリステロン（deoxyintegristerone）A、(5α-H)-22-デオキシインテグリステロンA、(5α-H)-20-ヒドロキシエクジソン、24,25-ジデヒドロダクリハイナンステロン、25,26-ジデヒドロダクリハイナンステロン、5-デオキシカラダステロン（ダクリハイナンステロン）、(14α-H)-14-デオキシ-25-ヒドロキシダクリハイナンステロン、25-ヒドロキシダクリハイナンステロン、ルブロステロン、(5β-H)-ジヒドロルブロステロン、ジヒドロルブロステロン-17β-アセテート、シジステロン（sidisterone）、20-ヒドロキシエクジソン-2,3,22-トリアセテート、14-デオキシ(14β-H)-20-ヒドロキシエクジソン、14-エピ-20-ヒドロキシエクジソン、9α,20-ジヒドロキシエクジソン、マラコステロン（malacosterone）、2-デオキシポリポジンB-3-β-D-グルコピラノシド、アジュガラクトン、ケイラントン（cheilanthone）B、2β,3β,6α-トリヒドロキシ-5β-コレスタン、2β,3β,6β-トリヒドロキシ-5β-コレスタン、14-デヒドロシダステロン、スタキステロンB、2β,3β,9α,20R,22R,25-ヘキサヒドロキシ-5β-コレスト-7,14-ジエン-6-オン、カラダステロン、(14β-H)-14-デオキシ-25-ヒドロキシダクリハイナンステロン、4-デヒドロ-20-ヒドロキシエクジソン、14-メチル-12-エン-シダステロン、14-メチル-12-エン-15,20-ジヒドロキシエクジソン、ポドエクジソン B、2β,3β,20R,22R-テトラヒドロキシ-25-フルオロ-5β-コレスト-8,14-ジエン-6-オン（25-フルオロポドエクジソン B）、カロニステロン（calonysterone）、14-デオキシ-14,18-シクロ-20-ヒドロキシエクジソン、9α,14α-エポキシ-20-ヒドロキシエクジソン、9βα,14β-エポキシ-20-ヒドロキシエクジソン、9α,14α-エポキシ-20-ヒドロキシエクジソン 2,3,20,22-ジアセトニド、28-ホモブラッシノリド、イソ-ホモブラッシノリド。
【００４６】
本発明の1つの局面は、遺伝子スイッチと組み合わせて関心対象遺伝子の発現を制御するために、本明細書において記述されるステロイド分子を利用することを包含する。本発明に従って関心対象遺伝子の発現を制御することができる遺伝子スイッチは、エクジソン受容体の少なくとも断片を含んでもよい。本発明に従う関心対象遺伝子の発現を制御することができる遺伝子スイッチは、あるいは、ステロイド分子が結合するもう1つの核内受容体の少なくとも断片を含んでもよい。
【００４７】
Rx基が明記されている場合であって、xが1〜4の数字を表し、同じRx基が同様に「(C1-C3)」などのアルキル基の鎖長と共に明記されている場合、明記された鎖長はRxがアルキルであってもよい場合のみを指し、RxがHまたはアリールなどの非アルキル基であってもよい場合に関係しないことが理解される。
【００４８】
「アルキル」という用語には、分岐および直鎖アルキル基の双方が含まれる。典型的なアルキル基には、たとえば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、n-ヘキシル、n-ヘプチル、イソオクチル、ノニル、およびデシルが含まれる。
【００４９】
「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードを指す。
【００５０】
「ハロアルキル」という用語は、たとえばクロロメチル、2-ブロモエチル、3-ヨードプロピル、トリフルオロメチル、およびペルフルオロプロピルなどの1つまたは複数のハロ基によって置換されたアルキル基を指す。
【００５１】
「シクロアルキル」という用語は、シクロプロピル、メチルシクロプロピル、シクロブチル、2-ヒドロキシシクロペンチル、シクロヘキシル、および4-クロロシクロヘキシルなどの、アルキル、ヒドロキシ、またはハロによって置換されてもよい環状脂肪族環構造を指す。
【００５２】
「ヒドロキシアルキル」という用語は、たとえばヒドロキシメチルおよび2,3-ジヒドロキシブチルなどの1つまたは複数のヒドロキシ基によって置換されるアルキル基を指す。
【００５３】
「アルキルスルホニル」という用語は、たとえば、メシル、およびn-プロピルスルホニルなどの、アルキル基によって置換されたスルホニル部分を指す。
【００５４】
「アルケニル」という用語は、たとえばビニル、アリル、1-ブテニル、2-ブテニル、イソプロペニル、および2-ペンテニルなどの、直鎖または分岐鎖の、1個または2個のエチレン結合を有するエチレン不飽和炭化水素基を指す。
【００５５】
「ハロアルケニル」という用語は、1つまたは複数のハロ基によって置換されたアルケニル基を指す。
【００５６】
「アルキニル」という用語は、たとえばエチニルおよびプロパルジルなどの、直鎖または分岐鎖の、1個または2個のアセチレン結合を有する、不飽和炭化水素基を指す。
【００５７】
「アルキルカルボニル」という用語は、アルキルケト官能基、たとえばアセチル、n-ブチリル等を指す。
【００５８】
「ヘテロシクリル」または「ヘテロサイクル」という用語は、1個、2個、または3個のヘテロ原子、たとえば酸素、窒素、およびイオウからなる群より独立して選択される1個または2個のヘテロ原子を含有する非置換または置換の、飽和、部分的不飽和、または不飽和の5または6員環を指す。ヘテロシクリルの例には、たとえばピリジル、チエニル、フリル、ピリミジニル、ピラジニル、キノリニル、イソキノリニル、ピロリル、インドリル、テトラヒドロフリル、ピロリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル、モルフォリニル、ピペラジニル、ジオキソラニル、およびジオキサニルが含まれる。
【００５９】
「アルコキシ」という用語には、末端酸素原子に付着した分岐および直鎖アルキル基の双方が含まれる。典型的なアルコキシ基には、たとえばメトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、およびtert-ブトキシが含まれる。
【００６０】
「ハロアルコキシ」という用語は、たとえばクロロメトキシ、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、およびペルフルオロイソブトキシなどの1つまたは複数のハロ基によって置換されたアルコキシ基を指す。
【００６１】
「アルコキシアルキル」という用語は、たとえばイソプロポキシメチルなどのアルコキシ基によって置換されたアルキル基を指す。
【００６２】
「非ステロイド化合物」または「非ステロイドリガンド」という用語は、遺伝子スイッチを活性化する1,2-シクロペンタノペルヒドロフェナントレン骨格
0005777890.tif 000004
に由来しない化合物を指す。たとえばAkhrem, A. A. and Yu. A. Titov. Total Steroid Sythesis. New York: Plenum Press, 1970を参照されたい。
【００６３】
「ジアシルヒドラジン」という用語は、N'-置換-N,N'-ジアシルヒドラジン核を有する化合物を指す。そのような化合物は、たとえば米国特許第4,985,461号、第5,225,443号、第5,354,762号、第5,117,057号、第6,013,836号、第5,424,333号、第5,344,958号、第5,530,028号、第5,482,962号、第7,456,315号、および第7,304,161号、ならびにWO 2008/153801において開示される。1つの態様において、「ジアシルヒドラジン」という用語は、以下の式を有する化合物を指す：
0005777890.tif 000005
式中R1はアルキルであり、Ar1およびAr2は独立して、ハロゲン、アルキル、およびアルコキシからなる群より選択される1〜3個の置換基を有するフェニルである。1つの態様において、R1は分岐C4-C8アルキル、たとえば-C(CH3)3、-C(CH3)C(CH3)3、-C(CH2CH3)C(CH3)3、または-C(CH2CH2CH3)C(CH3)3である。1つの態様において、フェニル置換基は独立してC1-C4アルキルまたはアルコキシであり、たとえばAr1は、2-エチル-3-メトキシフェニルであり、Ar2は3,5-ジメチルフェニルである。この態様に従う代表的なジアシルヒドラジンは、たとえばU.S. 7,456,315およびWO 2008/153801において開示されている。
【００６４】
「アミドケトン」という用語は、U.S. 7,365,093において開示されるように、以下の式を有する化合物を指す。
0005777890.tif 000006
【００６５】
「オキサジアゾリン」という用語は、U.S. 7,304,162において開示されるように、以下の式を有する化合物を指す。
0005777890.tif 000007
【００６６】
「担体」という用語は、当技術分野において公知の任意の標準的な担体を包含する。1つの態様において、担体は薬学的に許容される担体である。「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩液、水、および乳剤（油／水、または水／油乳剤などの）、および様々なタイプの湿潤剤および／またはアジュバントが含まれる、標準的な薬学的担体、緩衝剤、および賦形剤のうちの任意のものを包含する。適した薬学的担体およびその製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th ed. 1995において記述される。好ましい薬学的担体は、活性物質の意図される投与様式に依存する。
【００６７】
「シリカゲルクロマトグラフィー」は、関心対象の化学物質が、ガラス、プラスチック、または金属シリンダーに含有されるシリカゲルまたは化学改変シリカゲルの垂直カラムの上部に濃縮試料として適用されて、溶媒または溶媒混合物によってそのようなカラムから溶出される精製法を指す。
【００６８】
「フラッシュクロマトグラフィー」は、典型的に10〜50 psiの範囲の空気、アルゴン、または窒素圧下で行われるシリカゲルクロマトグラフィーを指す。
【００６９】
「勾配クロマトグラフィー」は、溶媒混合物の進行的に変化させた組成物によってカラムから化学物質が溶出するシリカゲルクロマトグラフィーを指す。
【００７０】
本明細書において用いられる用語は、当技術分野において用いられるその通常の意味を有すると意図される。
【００７１】
本発明の目的に関して「単離された」という用語は、その当初の環境（それが天然に存在する環境）から取り出されている生物材料（核酸またはタンパク質）を明示する。たとえば、植物または動物においてその天然の状態で存在するポリヌクレオチドは単離されていないが、それが天然に存在する隣接する核酸から分離されている同じポリヌクレオチドは「単離された」と見なされる。「精製された」という用語は、他の化合物の存在を除いて、材料が絶対的な純度を示す形で存在する必要はない。これはむしろ相対的な定義である。
【００７２】
ポリヌクレオチドは、開始材料または天然の材料の少なくとも1オーダー分、たとえば2、3、4または5オーダー分の精製後に、「精製された」状態となる。
【００７３】
「核酸」、「核酸分子」、または「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドと呼ばれる共有的に連結したサブユニットを含むポリマーである。核酸には、ポリリボ核酸（RNA）およびポリデオキシリボ核酸（DNA）が含まれ、そのいずれも一本鎖または二本鎖であってもよい。DNAには、cDNA、ゲノムDNA、プラスミドDNA、合成DNA、および半合成DNAが含まれるがこれらに限定されるわけではない。DNAは直線状、環状、または高次コイルであってもよい。核酸は、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、またはシチジン；「RNA分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン；「DNA分子」）のリン酸エステルポリマー型、または一本鎖型もしくは二本鎖らせんでのホスホロチオエートおよびチオエステルなどのその任意のホスホエステル類似体を指してもよい。二本鎖DNA-DNA、DNA-RNA、およびRNA-RNAらせんが可能である。この用語には、制限断片、プラスミド、および染色体が含まれる。DNAまたはRNA配列は、DNAの非転写鎖（すなわち、mRNAと相同な配列を有する鎖）に沿って5'から3'方向に配列を与える通常の慣例に従って記述されてもよい。「組換え型DNA分子」は、分子生物学操作を受けたDNA分子である。
【００７４】
「核酸断片」という用語は、参照核酸に対して低減された長さのヌクレオチド配列であり、共通の部分にわたって参照核酸と同一であるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を意味すると理解されるであろう。本発明に従うそのような核酸断片は、適当であれば、より大きいポリヌクレオチドの中に含まれてもよい。断片は、本発明に従う核酸の長さが少なくとも 6、8、9、10、12、15、18、20、21、22、23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、51、54、57、60、63、66、70、75、78、80、90、100、105、120、135、150、200、300、500、720、900、1000、または1500連続ヌクレオチドの範囲であってもよい。
【００７５】
本明細書において用いられる、「単離された核酸断片」は、任意で合成の、非天然の、または変更されたヌクレオチド塩基を含有する、一本鎖または二本鎖であるRNAまたはDNAのポリマーである。DNAのポリマー型での単離された核酸断片は、cDNA、ゲノムDNA、または合成DNAの1つまたは複数のセグメントを含んでもよい。
【００７６】
「遺伝子」は、ポリペプチドをコードする、または生物活性RNA分子をコードするヌクレオチドの集合体を指す。「遺伝子」という用語には、cDNAおよびゲノムDNA核酸が含まれる。「遺伝子」はまた、コード配列の前の（5'非コード配列）および後の（3'非コード配列）調節配列が含まれる特異的タンパク質またはポリペプチドを発現する核酸断片を指す。「本来の遺伝子」は、その自身の調節配列と共に天然において見いだされる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然において共に見いだされない調節配列および／またはコード配列を含む、本来の遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列を含んでもよく、または同じ起源に由来するが、天然において見いだされる場合とは異なる様式で整列される調節配列およびコード配列を含んでもよい。キメラ遺伝子は、異なる起源に由来するコード配列、および／または異なる起源に由来する調節配列を含んでもよい。「内因性の遺伝子」は、生物のゲノムにおけるその天然の位置での本来の遺伝子を指す。「外来」遺伝子または「異種」遺伝子は、宿主生物において通常見いだされないが、遺伝子移入によって宿主生物に導入されている遺伝子を指す。「トランスジーン」は、形質転換技法によってゲノムに導入されている遺伝子である。
【００７７】
「異種」DNAは、細胞、または細胞の染色体部位に天然において位置しないDNAを指す。1つの態様において、異種DNAには、細胞に対して外来の遺伝子が含まれる。
【００７８】
「ゲノム」という用語には、染色体のみならず、ミトコンドリア、葉緑体、およびウイルスDNAまたはRNAが含まれる。
【００７９】
核酸分子は、核酸分子の一本鎖型が温度および溶液イオン強度の適切な条件下で他の核酸分子にアニールすることができる場合、cDNA、ゲノムDNA、またはRNAなどのもう1つの核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である（Sambrook et al., 1989下記を参照されたい）。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、周知であり、Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989)、特にその中のChapter 11およびTable 11.1において例示されている（全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。
【００８０】
ストリンジェンシー条件は、遠縁の生物からの相同な配列などの中等度に類似の断片、近縁の生物からの機能的酵素を複製する遺伝子などの非常に類似の断片に関してスクリーニングするために調節されうる。相同な核酸の予備的スクリーニングに関して、Tm 55℃に対応する低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、たとえば5×SSC、0.1％SDS、0.25％乳汁、およびホルムアミドなし、または30％ホルムアミド、5×SSC、0.5％SDSを用いることができる。中等度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、たとえば5×または6×SSCを伴う40％ホルムアミドは、より高いTmに対応する。高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、たとえば5×または6×SCCを伴う50％ホルムアミドは、最高のTmに対応する。
【００８１】
ハイブリダイゼーションは、2つの核酸が相補的配列を含有することを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチが可能である。「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基間の関係を記述するために用いられる。たとえば、DNAに関して、アデノシンはチミンに対して相補的であり、シトシンはグアニンに対して相補的である。したがって、本発明には、本明細書において開示または用いられる完全な配列のみならず、実質的に類似の核酸配列と相補的である単離核酸断片が含まれる。本発明の特定の態様において、ポリヌクレオチドは、Tm 55℃でのハイブリダイゼーション段階を含むハイブリダイゼーション条件を使用する段階、および上記で述べた条件を利用する段階によって検出される。1つの例において、Tmは60℃である；もう1つの態様において、Tmは63℃であり；もう1つの態様において、Tmは65℃である。
【００８２】
ハイブリダイゼーション後の洗浄も同様にストリンジェンシー条件を決定する。1組の条件は、6×SSC、0.5％SDSで室温で15分間の洗浄によって開始した後2×SSC、0.5％SDSで45℃で30分間の洗浄を繰り返した後に、0.2×SSC、0.5％SDSで50℃で30分間を2回繰り返すことによる一連の洗浄を用いる。もう1つの組のストリンジェントな条件はより高い温度を用い、0.2×SSC、0.5％SDSにおける最後の2回の30分間の洗浄温度を60℃に増加させたことを除き、洗浄は上記と同一である。もう1つの組のより高いストリンジェントな条件は、65℃で0.1×SSC、0.1％SDSにおいて2回の最後の洗浄を用いる。ハイブリダイゼーションは、2つの核酸が相補的配列を含むことを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能である。
【００８３】
核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、当技術分野において周知の変数である核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。2つのヌクレオチド配列間の類似性または相同製の程度がより大きくなれば、それらの配列を有する核酸のハイブリッドのTm値はより大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いTmに対応する）は以下の順に減少する：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。長さが100ヌクレオチドより大きいハイブリッドに関して、Tmを計算するための等式が誘導されている（Sambrook et al., 前記、9.50-0.51を参照されたい）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置はより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さはその特異性を決定する（Sambrook et al.、前記、11.7-11.8を参照されたい）。
【００８４】
本発明の特定の態様において、ポリヌクレオチドは、500 mM未満の塩および少なくともセ氏37°でのハイブリダイゼーション段階、および2×SSPEで少なくともセ氏63°での洗浄段階を含むハイブリダイゼーション条件を使用することによって検出される。1つの態様において、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション段階に関して200 mM未満の塩と少なくともセ氏37°を含む。もう1つの態様において、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄段階の双方に関して2×SSPEとセ氏63°とを含む。
【００８５】
1つの態様において、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約10ヌクレオチドである；ハイブリダイズ可能な核酸の例としての最小の長さは少なくとも約15ヌクレオチドである；もう1つの長さは少なくとも約20ヌクレオチドであり；およびなおもう1つの長さは少なくとも30ヌクレオチドである。さらに、当業者は、温度および洗浄液の塩濃度が、プローブの長さなどの要因に応じて必要に応じて調節されてもよいことを認識するであろう。
【００８６】
「プローブ」という用語は、二本鎖分子を形成するために相補的一本鎖標的核酸と塩基対を形成することができる一本鎖核酸分子を指す。
【００８７】
本明細書において用いられる、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ゲノムDNA分子、cDNA分子、プラスミドDNA、またはmRNA分子とハイブリダイズ可能な核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、たとえば32Pヌクレオチドまたはそれに対してビオチンなどの標識が共有的にコンジュゲートされているヌクレオチドによって標識されうる。標識オリゴヌクレオチドは、核酸の存在を検出するためのプローブとして用いられうる。オリゴヌクレオチド（その1つまたは双方を標識してもよい）は、核酸の完全長もしくは断片をクローニングするために、または核酸の存在を検出するために、PCRプライマーとして用いられうる。オリゴヌクレオチドは、DNA分子と三重らせんを形成するために用いることができる。一般的に、オリゴヌクレオチドは、例として核酸シンセサイザーにおいて合成によって調製される。したがって、オリゴヌクレオチドは、チオエステル結合等などの天然に存在しないホスホエステル類似体結合によって調製されうる。
【００８８】
「プライマー」は、適した条件下でのDNA合成の開始点として機能しうる二本鎖核酸領域を作製するために標的核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。そのようなプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応において用いられてもよい。
【００８９】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はPCRとして省略され、特異的核酸配列を酵素的に増幅するためのインビトロ法を意味する。PCRは、各サイクルが次の3つの段階を含む一連の反復的な温度サイクルを含む：標的分子の鎖を分離するための鋳型核酸の変性、一本鎖PCRオリゴヌクレオチドプライマーを鋳型核酸にアニールさせる段階、およびアニールしたプライマーのDNAポリメラーゼによる伸長。PCRは、標的分子の存在を検出するための手段、および定量的または半定量的条件下で核酸の開始プール内でその標的分子の相対量を決定するための手段を提供する。
【００９０】
「逆転写ポリメラーゼ連鎖反応」は、RT-PCRと省略されて、RNA分子または複数の分子から標的cDNA分子または複数の分子を酵素的に産生した後、前述の標的cDNA分子または複数の分子内で特異的核酸配列または複数の配列を酵素的に増幅するためのインビトロ法を意味する。RT-PCRはまた、標的分子の存在を検出するための手段、および定量的または半定量的条件下で核酸の開始プール内でのその標的核酸の相対量を決定するための手段を提供する。
【００９１】
DNA「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合にインビトロまたはインビボで細胞においてポリペプチドに転写および／または翻訳される二本鎖DNA配列である。「調節配列」は、コード配列の上流（5'非コード配列）、配列内、またはその下流（3'非コード配列）に位置して、関連するコード配列の転写、RNAプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、RNAプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造が含まれてもよい。コード配列の境界は、5'（アミノ）末端での開始コドンおよび3'（カルボキシル）末端での翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には、原核生物配列、siRNA、マイクロRNA、shRNA、または他の生物活性RNA、mRNAからのcDNA、ゲノムDNA配列、および合成DNA配列さえも含まれうるがこれらに限定されるわけではない。コード配列が真核細胞における発現に関して意図されるタンパク質の配列である場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終止配列は通常、コード配列の3'に位置するであろう。
【００９２】
「ヘッドトゥーヘッド（head-to-head）」という用語は、本明細書において互いに対する2つのポリヌクレオチド配列の方向を記述するために用いられる。2つのポリヌクレオチドは、1つのポリヌクレオチドのコード鎖の5'端が他のポリヌクレオチドのコード鎖の5'端に隣接している場合、ヘッドトゥーヘッド方向に配置され、それによって各々のポリヌクレオチドの転写方向は、他のポリヌクレオチドの5'端から離れるように進行する。「ヘッドトゥーヘッド」という用語は、(5')-to-(5')と省略されてもよく、同様に記号（←→）または（3'←5'5→3'）によって示されてもよい。
【００９３】
「テールトゥーテール（tail-to-tail）」という用語は、本明細書において互いに対する2つのポリヌクレオチド配列の方向を記述するために用いられる。2つのポリヌクレオチドは、1つのポリヌクレオチドのコード鎖の3'端が他のポリヌクレオチドのコード鎖の3'端に隣接している場合、テールトゥーテール方向に配置され、それによって各々のポリヌクレオチドの転写方向は、他のポリヌクレオチドに向かうように進行する。「テールトゥーテール」という用語は、(3')-to-(3')と省略されてもよく、同様に記号（→←）または（5'→3'3'←5'）によって示されてもよい。
【００９４】
「ヘッドトゥーテール（head-to-tail）」という用語は、本明細書において互いに対する2つのポリヌクレオチド配列の方向を記述するために用いられる。2つのポリヌクレオチドは、1つのポリヌクレオチドのコード鎖の5'端が他のポリヌクレオチドのコード鎖の3'端に隣接している場合、ヘッドトゥーテール方向に配置され、それによって各々のポリヌクレオチドの転写方向は、他のポリヌクレオチドの方向と同じ方向に進行する。「ヘッドトゥーテール」という用語は、(5')-to-(3')と省略されてもよく、同様に記号（→→）または（5'→3'5'→3'）によって示されてもよい。
【００９５】
「下流」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して3'に位置するヌクレオチド配列を指す。特に、下流のヌクレオチド配列は一般的に、転写開始点に続く配列に関する。たとえば遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流に位置する。
【００９６】
「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して5'に位置するヌクレオチド配列を指す。特に、上流のヌクレオチド配列は一般的に、コード配列または転写開始点の5'側に位置する配列に関する。たとえば、ほとんどのプロモーターは転写開始部位の上流に位置する。
【００９７】
「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語は、二本鎖DNA内の特異的ヌクレオチド配列を切断する酵素を指す。
【００９８】
「相同組換え」は、外来DNA配列のもう1つのDNA分子への挿入、たとえば染色体におけるベクターの挿入を指す。たとえば、ベクターは、相同組換えのための特異的染色体部位を標的とする。特異的相同組換えに関して、ベクターは、ベクターの染色体への相補的結合および組み込みが起こるためには、染色体の配列に対して十分に長い相同性領域を含有するであろう。より長い相同性領域およびより大きい程度の配列類似性は、相同組換えの効率を増加させる可能性がある。
【００９９】
当技術分野において公知のいくつかの方法を用いて本発明に従うポリヌクレオチドを増やしてもよい。適した宿主系および生育条件が確立された後、組換え型発現ベクターを増やして多数調製することができる。本明細書において記述されるように、用いることができる発現ベクターには、以下のベクターまたはその誘導体が含まれるがこれらに限定されるわけではない：いくつか例を挙げれば、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスなどのヒトまたは動物ウイルス；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（たとえば、ラムダ）、ならびにプラスミドおよびコスミドDNAベクター。
【０１００】
「ベクター」は、宿主細胞への核酸のクローニングおよび／または移入のための任意の手段である。ベクターは、付着したセグメントの複製をもたらすためにもう1つのDNAセグメントが付着してもよいレプリコンであってもよい。「レプリコン」は、インビボでDNA複製の自律単位として機能する、すなわちその自身の制御下で複製することができる任意の遺伝的エレメント（たとえば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）である。「ベクター」という用語には、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで細胞に核酸を導入するためのウイルスおよび非ウイルス手段の双方が含まれる。当技術分野において公知の多数のベクターが、核酸を操作して、応答エレメントおよびプロモーターを遺伝子に組み入れる等のために用いられてもよい。可能性があるベクターには、たとえばラムダ誘導体などのバクテリオファージ、またはpBR322もしくはpUCプラスミド誘導体などのプラスミド、またはBluescriptベクターが含まれるプラスミドまたは改変ウイルスが含まれる。たとえば、応答エレメントおよびプロモーターに対応するDNA断片を適したベクターに挿入することは、相補的な付着末端を有する選ばれたベクターに適切なDNA断片をライゲーションすることによって達成されうる。または、DNA分子の端部を酵素的に改変してもよく、またはヌクレオチド配列（リンカー）をDNA末端にライゲーションすることによって任意の部位を産生してもよい。そのようなベクターは、細胞ゲノムにマーカーを組み入れた細胞の選択を提供する選択可能なマーカー遺伝子を含有するように工学操作されてもよい。そのようなマーカーによって、マーカーによってコードされるタンパク質を組み入れて発現する宿主細胞を同定および／または選択することができる。
【０１０１】
ウイルスベクター、および特にレトロウイルスベクターは、細胞のみならず生きている動物対象における広く多様な遺伝子送達用途において用いられている。用いることができるウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、鶏痘ウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン-バーウイルス、アデノウイルス、ジェミニウイルス、およびカリモウイルスベクターが含まれるがこれらに限定されるわけではない。非ウイルスベクターには、プラスミド、リポソーム、帯電脂質（サイトフェクチン）、DNA-タンパク質複合体、およびバイオポリマーが含まれる。核酸に加えて、ベクターはまた、1つまたは複数の調節領域、および／または核酸移入結果（組織への移入、発現期間等）を選択、測定、およびモニターするために有用な選択可能マーカーを含んでもよい。
【０１０２】
「プラスミド」という用語は、細胞の中心的な代謝の一部ではない遺伝子をしばしば運び、通常環状の二本鎖DNA分子の形状である染色体外エレメントを指す。そのようなエレメントは、その中で多数のヌクレオチド配列が、プロモーター断片および選択された遺伝子産物に関するDNA配列を適切な3'非翻訳配列と共に細胞に導入することができる独自の構築に接合または組換えされている、任意の起源に由来する、自律複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列、一本鎖または二本鎖DNAまたはRNAの直線状、環状、または高次コイル型であってもよい。
【０１０３】
「クローニングベクター」は、連続的に複製するDNAなどの核酸の単位長であり、付着したセグメントの複製をもたらすためにそれに対してもう1つの核酸セグメントが付着してもよいプラスミド、ファージ、またはコスミドなどの複製開始点を含む「レプリコン」である。クローニングベクターは、1つの細胞型において複製することができ、もう1つの細胞型において発現させることができてもよい（「シャトルベクター」）。
【０１０４】
ベクターは、当技術分野において公知の方法、たとえばトランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（ライソゾーム融合）、遺伝子銃の使用、またはDNAベクター輸送体によって所望の宿主細胞に導入されてもよい（たとえば、Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 963-967；Wu and Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263: 14621-14624；およびHartmut et al.の1990年3月15日に提出されたカナダ国特許出願第2,012,311号を参照されたい）。
【０１０５】
本発明に従うポリヌクレオチドはまた、リポフェクションによってインビボで導入されうる。リポソーム媒介トランスフェクションが遭遇する困難および危険を制限するように設計された合成陽イオン脂質を用いて、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製することができる（Felgner et al., 1987, PNAS 84:7413；Mackey, et al., 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8027-8031；およびUlmer et al., 1993, Science 259:1745-1748）。核酸を移入するために有用な脂質化合物および組成物は、WO95/18863、WO96/17823、およびUS 5,459,127において記述されている。標的化目的のために、脂質を他の分子に化学的にカップリングさせてもよい（Mackey, et al., 1988、前記）。標的化されるペプチド、たとえばホルモンもしくは神経伝達物質、および抗体などのタンパク質、または非ペプチド分子をリポソームに化学的にカップリングさせることができる。
【０１０６】
陽イオンオリゴペプチド（たとえば、WO95/21931）、DNA結合タンパク質に由来するペプチド（たとえば、WO96/25508）、または陽イオンポリマー（たとえば、WO95/21931）などの他の分子も同様に、インビボで核酸のトランスフェクションを容易にするために有用である。
【０１０７】
同様に、裸のDNAプラスミドとしてベクターをインビボで導入することも可能である（US 5,693,622、5,589,466、および5,580,859を参照されたい）。受容体媒介DNA送達アプローチも同様に用いることができる（Curiel et al., 1992, Hum. Gene Ther. 3: 147-154；およびWu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432）。
【０１０８】
「トランスフェクション」という用語は、細胞によるRNAまたはDNAの取り込みを意味する。細胞は、そのようなRNAまたはDNAが細胞内部に導入されている場合に、RNAまたはDNAによって「トランスフェクト」されている。細胞は、トランスフェクトしたRNAまたはDNAが表現型の変化をもたらす場合に、RNAまたはDNAによって「形質転換」されている。形質転換RNAまたはDNAは、細胞のゲノムを構成する染色体DNAに組み入れられうる（共有的に連結されうる）。
【０１０９】
「形質転換」は、宿主生物のゲノムへの核酸断片の移入を指し、それによって遺伝的に安定な遺伝が起こる。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」、「組換え型」、または「形質転換」生物と呼ばれる。
【０１１０】
「遺伝子領域」という用語は、ポリペプチドをコードする遺伝子を含む核酸分子またはヌクレオチド配列の領域を指すであろう。
【０１１１】
加えて、本発明に従うポリヌクレオチドを含む組換え型ベクターには、その中でその増幅もしくはその発現が求められる細胞宿主における1つもしくは複数の複製開始点、マーカー、または選択可能マーカーが含まれてもよい。
【０１１２】
「選択可能マーカー」という用語は、その効果が、関心対象核酸の遺伝を追跡するために、および／または関心対象核酸を遺伝した細胞または生物を同定するために用いられる、マーカー遺伝子の効果、すなわち抗生物質に対する抵抗性、除草剤に対する抵抗性、比色定量マーカー、酵素、蛍光マーカー等に基づいて選択することができる同定因子、通常、抗生物質または化学物質抵抗性遺伝子を意味する。当技術分野において公知で用いられる選択可能なマーカー遺伝子の例には、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ヒグロマイシン、ビアラフォス系除草剤、スルホンアミド等に対する抵抗性を提供する遺伝子；および表現型マーカーとして用いられる遺伝子、すなわちアントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子等が含まれる。
【０１１３】
「レポーター遺伝子」という用語は、その効果が、関心対象核酸の遺伝を追跡するために、関心対象核酸を遺伝した細胞または生物を同定するために、および／または遺伝子発現の誘導または転写を測定するために用いられる、レポーター遺伝子の効果に基づいて同定されることができる同定因子をコードする核酸を意味する。当技術分野において公知で用いられるレポーター遺伝子の例には：ルシフェラーゼ（Luc）、赤色蛍光タンパク質（RFP）、シアン蛍光タンパク質（CFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、β-ガラクトシダーゼ（LacZ）、β-グルクロニダーゼ（Gus）等が含まれる。選択可能なマーカー遺伝子はまたレポーター遺伝子であると見なされてもよい。
【０１１４】
「プロモーター」とは、コード配列または機能的RNAの発現を制御することができるDNA配列を指す。通常、しかし必ずしも常ではないが、コード配列はプロモーター配列の3'に位置する。プロモーターは、本来の遺伝子に由来してもよく、または天然において見いだされる異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されてもよく、または合成DNAセグメントさえ含んでもよい。異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発達段階で、または異なる環境もしくは生理的条件に応答して、遺伝子の発現を指示する可能性があることは当業者によって理解される。ほとんどの細胞型においてほとんどの時間遺伝子を発現させるプロモーターは、一般的に「構成的プロモーター」と呼ばれる。特定の細胞型において遺伝子を発現させるプロモーターは、一般的に「細胞特異的プロモーター」または「組織特異的プロモーター」である。発達または細胞分化の特定の段階で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般的に「発達特異的プロモーター」または「細胞分化特異的プロモーター」と呼ばれる。プロモーターを誘導する物質、生体分子、化学物質、リガンド、光等によって細胞が曝露または処置された後に誘導されて遺伝子を発現させるプロモーターは、一般的に「誘導型プロモーター」または「調節可能プロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合において、調節配列の正確な境界は完全には定義されていないことから、異なる長さのDNA断片が類似のプロモーター活性を有する可能性があるとさらに認識される。
【０１１５】
「プロモーター配列」は、細胞においてRNAポリメラーゼに結合することができ、下流の（3'方向の）コード配列の転写を開始することができるDNA調節領域である。本発明を定義する目的に関して、プロモーター配列は、その3'末端で転写開始部位を境界として、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するために必要な塩基またはエレメントの最小数を含めるように上流（5'方向）に伸びる。プロモーター配列において、転写開始部位（たとえばヌクレアーゼS1によるマッピングによって簡便に定義される）のみならず、RNAポリメラーゼの結合の原因であるタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見いだされるであろう。
【０１１６】
コード配列は、RNAポリメラーゼがコード配列をmRNAに転写して、次にトランス-RNAをスプライシングして（コード配列がイントロンを含有する場合）、コード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される場合に、細胞において転写および翻訳制御配列「の制御下である」または「に機能的に連結している」。
【０１１７】
「転写および翻訳制御配列」は、宿主細胞においてコード配列の発現を提供する、プロモーター、エンハンサー、ターミネータ等などのDNA調節配列である。真核細胞において、ポリアデニル化シグナルは制御配列である。
【０１１８】
「応答エレメント」という用語は、DNA結合ドメインとの相互作用を通してプロモーターに応答性を付与する1つまたは複数のシス作用DNAエレメントを意味する。応答エレメントは、回文構造（完全または不完全）であってもよく、または多様な数のヌクレオチドによって離れた配列モチーフおよびハーフサイト（half site）で構成されてもよい。ハーフサイトは、類似または同一であり得、直接もしくは逆反復配列として、または単一のハーフサイト、もしくは縦列に隣接するハーフサイトの多量体として整列されうる。応答エレメントは、応答エレメントが組み入れられる細胞または生物の性質に応じて、異なる生物から単離された最小プロモーターを含んでもよい。DNA結合ドメインは、応答エレメントのDNA配列に結合して、この応答エレメントの調節下で下流の遺伝子の転写を開始または抑制する。天然のエクジステロイド受容体の応答エレメントに関するDNA配列の例には、
0005777890.tif 000008
（Cherbas L., et. al., (1991), Genes Dev. 5, 120-131を参照されたい）；
0005777890.tif 000009
配列中、N(n)は、1つまたは複数のスペーサーヌクレオチド（SEQ ID NO:29）であり得る（D'Avino PP., et. al., (1995), Mol. Cell. Endocrinol, 113, 1-9を参照されたい）；および
0005777890.tif 000010
（Antoniewski C, et. al., (1994). Mol. Cell Biol. 14, 4465-4474を参照されたい）が含まれる。
【０１１９】
「機能的に連結した」という用語は、1つの機能がもう1つによって影響を受けるような1つの核酸断片上での核酸配列の結合を指す。たとえば、プロモーターは、それがそのコード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、コード配列に機能的に連結している（すなわち、コード配列はプロモーターの転写制御下にある）。コード配列はセンスまたはアンチセンス方向に調節配列に機能的に連結されうる。
【０１２０】
本明細書において用いられる、「発現」という用語は、核酸またはポリヌクレオチドに由来するセンス（mRNA）またはアンチセンスRNAの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、タンパク質またはポリペプチドへのmRNAの翻訳を指してもよい。
【０１２１】
「カセット」、「発現カセット」および「遺伝子発現カセット」という用語は、特異的制限部位でまたは相同組換えによって核酸またはポリヌクレオチドに挿入されうるDNAのセグメントを指す。DNAのセグメントは、関心対象ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部位は、転写および翻訳のための適当な読み取り枠でカセットの挿入を確実にするように設計される。「形質転換カセット」は関心対象ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドのほかに特定の宿主細胞の形質転換を容易にするエレメントを有する特異的ベクターを指す。本発明のカセット、発現カセット、遺伝子発現カセットおよび形質転換カセットはまた、宿主細胞において関心対象ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を増強させるエレメントを含んでもよい。これらのエレメントには：プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等が含まれてもよいがこれらに限定されるわけではない。
【０１２２】
本発明の目的に関して、「遺伝子スイッチ」という用語は、関心対象遺伝子が既定の応答エレメントおよびプロモーターに機能的に連結される、1つまたは複数のリガンドの存在下で少なくとも1つの関心対象遺伝子の発現をモジュレートするEcRに基づく系が含まれるがこれらに限定されるわけではない核内受容体に基づく系を指す。遺伝子スイッチは、ホモ二量体を形成するポリペプチドまたはヘテロ二量体を形成するポリペプチドを含有しうる。
【０１２３】
「モジュレートする」および「モジュレートする（modulates）」という用語は、核酸または遺伝子発現を誘導、低減、または阻害して、それによってタンパク質またはポリペプチド産生のそれぞれの誘導、低減、または阻害が起こることを意味する。
【０１２４】
本発明に従うプラスミドまたはベクターは、さらに、宿主細胞における遺伝子の発現を駆動するために適した少なくとも1つのプロモーターを含んでもよい。「発現ベクター」という用語は、宿主への形質転換後に挿入された核酸配列の発現を可能にするように設計されたベクター、プラスミド、またはビヒクルを意味する。クローニングされる遺伝子、すなわち挿入された核酸配列は通常、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー等などの制御エレメントの制御下に置かれる。所望の宿主細胞における核酸の発現を駆動するために有用である開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者に周知である。以下が含まれるがこれらに限定されるわけではない、これらの遺伝子を駆動することができる実質的にいかなるプロモーターも、本発明にとって適している：ウイルスプロモーター、細菌プロモーター、動物プロモーター、哺乳動物プロモーター、合成プロモーター、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発達特異的プロモーター、誘導型プロモーター、光調節プロモーター；CYC1、HIS3、GAL1、GAL4、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、アルカリホスファターゼプロモーター（酵母菌（Saccharomyces）における発現にとって有用）；AOX1プロモーター（ピチア（Pichia）における発現にとって有用）；β-ラクタマーゼ、lac、ara、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac、およびtrcプロモーター（大腸菌（Escherichia coli）における発現にとって有用）；光調節、種子特異的、花粉特異的、子房特異的、病因または疾患関連、カリフラワーモザイクウイルス35S、CMV 35S最小、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（CsVMV）、葉緑素a/b結合タンパク質、リブロース1,5-ビスホスフェートカルボキシラーゼ、苗条特異的、根特異的、キチナーゼ、ストレス誘導型、コメツングロ病ウイルス、植物スーパープロモーター、ジャガイモロイシンアミノペプチダーゼ、硝酸レダクターゼ、マンノピンシンターゼ、ノパリンシンターゼ、ユビキチン、ゼインタンパク質、およびアントシアニンプロモーター（植物細胞における発現にとって有用）；当技術分野において公知の動物および哺乳動物プロモーターには、SV40初期（SV40e）プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルス（RSV）の3'長末端反復（LTR）に含有されるプロモーター、アデノウイルス（Ad）のE1Aプロモーターまたは主要後期プロモーター（MLP）遺伝子、サイトメガロウイルス（CMV）初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（HSV）チミジンキナーゼ（TK）プロモーター、バキュロウイルスIE1プロモーター、伸長因子1α（EF1）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（PGK）プロモーター、ユビキチン（Ubc）プロモーター、アルブミンプロモーター、マウスメタロチオネイン-Lプロモーターおよび転写制御領域の調節配列、汎在するプロモーター（HPRT、ビメンチンα-アクチン、チューブリン等）、中間フィラメント（デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、GFAP等）のプロモーター、治療遺伝子（MDR、CFTR、または第VIII因子型等）のプロモーター、発病または疾患関連プロモーター、および膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼI遺伝子制御領域などの、組織特異性を示してトランスジェニック動物において利用されているプロモーター；膵臓β細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域、リンパ様細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣、乳腺、リンパおよび肥満細胞において活性なマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域；肝臓において活性なアルブミン遺伝子、Apo AIおよびApo AII制御領域、肝臓において活性なα-フェトプロテイン遺伝子制御領域、肝臓において活性なα1-アンチトリプシン遺伝子制御領域、骨髄細胞において活性なβ-グロビン遺伝子制御領域、脳における乏突起膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域、骨格筋において活性なミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域、および視床下部において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域、ピルビン酸キナーゼプロモーター、ビリンプロモーター、脂肪酸結合腸管タンパク質のプロモーター、平滑筋細胞α-アクチンのプロモーター等が含まれるがこれらに限定されるわけではない。加えて、これらの発現配列はエンハンサーまたは調節配列の付加等によって改変されてもよい。
【０１２５】
本発明の態様において用いられてもよいエンハンサーには、SV40エンハンサー、サイトメガロウイルス（CMV）エンハンサー、伸長因子1（EF1）エンハンサー、酵母エンハンサー、ウイルス遺伝子エンハンサー等が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０１２６】
終止制御領域、すなわちターミネーターまたはポリアデニル化配列も同様に宿主に対して本来の様々な遺伝子に由来してもよい。任意で、終止部位は不要であってもよい。本発明の1つの態様において、終止制御領域は、合成配列、合成ポリアデニル化シグナル、SV40後期ポリアデニル化シグナル、SV40ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（BGH）ポリアデニル化シグナル、ウイルスターミネーター配列を含んでもよく、またはそれらに由来してもよい。
【０１２７】
「3'非コード配列」または「3'非翻訳領域（UTR）」は、コード配列の下流（3'）に位置するDNA配列を指し、ポリアデニル化[ポリ(A)]認識配列およびmRNAプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードする他の配列を含んでもよい。ポリアデニル化シグナルは通常、mRNA前駆体の3'端へのポリアデニル酸路の付加に影響を及ぼすことによって特徴決定される。
【０１２８】
「調節領域」は、第二の核酸配列の発現を調節する核酸配列を意味する。調節領域には、天然において特定の核酸（相同領域）の発現の原因である配列が含まれてもよく、または異なるタンパク質の発現の原因である異なる起源の配列もしくは合成タンパク質（異種領域）さえも含まれてもよい。特に、配列は、特異的または非特異的に、および誘導的または非誘導的に遺伝子の転写を刺激または抑制する原核生物、真核生物、またはウイルス遺伝子の配列またはそれらに由来する配列でありうる。調節領域には、複製開始点、RNAスプライス部位、プロモーター、エンハンサー、転写終止配列、および標的細胞の分泌経路にポリペプチドを向けるシグナル配列が含まれる。
【０１２９】
「異種起源」からの調節領域は、発現された核酸に天然に結合しない調節領域である。異種調節領域には、異なる種からの調節領域、異なる遺伝子からの調節領域、ハイブリッド調節配列、および天然に存在しないが当業者によって設計される調節配列が含まれる。
【０１３０】
「RNA転写物」は、DNA配列のRNAポリメラーゼ触媒転写に起因する産物を指す。RNA転写物がDNA配列の完全な相補的コピーである場合、一次転写物と呼ばれるか、または一次転写物の転写後プロセシングに由来し、成熟RNAと呼ばれる、RNA配列であってもよい。「メッセンジャーRNA（mRNA）」は、イントロンを有しない、細胞によってタンパク質に翻訳されうるRNAを指す。「cDNA」は、mRNAと相補的であってmRNAに由来する二本鎖DNAを指す。「センス」RNAには、mRNAが含まれ、このように細胞によってタンパク質に翻訳されうるRNA転写物を指す。「アンチセンスRNA」は、標的一次転写物またはmRNAの全てまたは一部と相補的であり、標的遺伝子の発現を遮断するRNA転写物を指す。アンチセンスRNAの相補性は、特異的遺伝子転写物の任意の部分、すなわち5'非コード配列、3'非コード配列、またはコード配列との相補性であってもよい。「機能的RNA」または「生物活性RNA」は、翻訳されないが細胞プロセスに効果を有するアンチセンスRNA、リボザイムRNA、または他のRNAを指す。
【０１３１】
「ポリペプチド」は、共有的に連結されたアミノ酸残基を含むポリマー化合物である。
【０１３２】
アミノ酸は側鎖Rに基づいて7つの群に分類される：（1）脂肪族側鎖、（2）ヒドロキシル（OH）基を含有する側鎖、（3）イオウ原子を含有する側鎖、（4）酸性またはアミド基を含有する側鎖、（5）塩基性基を含有する側鎖、（6）芳香環を含有する側鎖、および（7）その中で側鎖がアミノ基に融合されるイミノ酸であるプロリン。
【０１３３】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、本明細書において互換的に用いられる。
【０１３４】
「単離されたポリペプチド」または「単離されたタンパク質」は、その本来の状態で通常それに結合している化合物（たとえば、他のタンパク質またはポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質）を実質的に含まないポリペプチドまたはタンパク質である。「単離された」とは、他の化合物との人工的もしくは合成混合物を除外しない、または生物活性を干渉しない、たとえば不完全な精製、安定化剤の付加、もしくは薬学的に許容される調製物への調合により存在する可能性がある不純物の存在を除外しないことを意味する。
【０１３５】
「置換変異体ポリペプチド」または「置換変異体」は、少なくとも1つの野生型または天然に存在するアミノ酸の、野生型または天然に存在するポリペプチドと比較して異なるアミノ酸への置換を含む、変異体ポリペプチドを意味すると理解されるであろう。置換変異体ポリペプチドは、唯一の野生型または天然に存在するアミノ酸置換を含んでもよく、「点突然変異体」または「一点変異体」ポリペプチドと呼ばれることがある。または、置換変異体ポリペプチドは、2つまたはそれより多い野生型または天然に存在するアミノ酸の、野生型または天然に存在するポリペプチドと比較して2つまたはそれより多いアミノ酸への置換を含んでもよい。本発明に従って、置換変異を含むグループHの核内受容体リガンド結合ドメインポリペプチドは、少なくとも1つの野生型または天然に存在するアミノ酸の、野生型または天然に存在するグループH核内受容体リガンド結合ドメインポリペプチドと比較して異なるアミノ酸への置換を含む。
【０１３６】
置換変異体ポリペプチドが、2つまたはそれより多い野生型または天然に存在するアミノ酸の置換を含む場合、この置換は、置換のために欠失された野生型または天然に存在するアミノ酸の同等数、すなわち2つの野生型または天然に存在するアミノ酸を2つの非野生型または天然に存在しないアミノ酸に交換すること、または置換のために欠失された野生型アミノ酸の非同等数、すなわち2つの野生型アミノ酸を1つの非野生型アミノ酸（置換＋欠失変異）に交換する、または2つの野生型アミノ酸を3つの非野生型アミノ酸に交換する（置換＋挿入変異）ことを含んでもよい。
【０１３７】
置換変異体は、参照ポリペプチド配列内で交換されたアミノ酸残基および数、ならびに新しく置換されたアミノ酸残基を示すために省略された命名系を用いて記述されてもよい。たとえば、ポリペプチドの20位のアミノ酸残基が置換される置換変異体は「x20z」と省略されてもよく、この場合「x」は交換されるアミノ酸であり、「20」はポリペプチド内のアミノ酸残基の位置または数であり、および「z」は新しい置換されたアミノ酸である。ゆえに、「E20A」または「Glu20Ala」として互換的に省略される置換変異体は、変異体が、ポリペプチドの20位でのグルタミン酸（一般的に当技術分野において「E」または「Glu」と省略される）の代わりにアラニン残基（一般的に当技術分野において「A」または「Ala」と省略される）を含むことを示している。
【０１３８】
置換変異は、インビトロ部位特異的変異誘発（Hutchinson, C, et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551；Zoller and Smith, 1984, DNA 3: 479-488；Oliphant et al., 1986, Gene 44: 177；Hutchinson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 710）、TAB（登録商標）リンカー（Pharmacia）の使用、制限エンドヌクレアーゼ消化／断片欠失および置換、PCR媒介／オリゴヌクレオチド特異的変異誘発等が含まれるがこれらに限定されるわけではない、当技術分野において公知の任意の変異誘発技術によって作出されてもよい。PCRに基づく技術は、部位特異的変異誘発にとって有用である（Higuchi, 1989, "Using PCR to Engineer DNA", in PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Chapter 6, pp. 61-70を参照されたい）。
【０１３９】
本発明に従う「ポリペプチドの断片」は、そのアミノ酸配列が参照ポリペプチドの配列より短く、これらの参照ポリペプチドとの全ての部分にわたって同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味すると理解されるであろう。そのような断片は、適切であれば、それらが一部であるより大きいポリペプチドに含まれてもよい。本発明に従うポリペプチドのそのような断片は、アミノ酸少なくとも2、3、4、5、6、8、10、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26、30、35、40、45、50、100、200、240、または300個の長さを有してもよい。
【０１４０】
ポリペプチドまたはタンパク質の「変種」は、ポリペプチドまたはタンパク質に由来して、ポリペプチドまたはタンパク質の少なくとも1つの生物学的特性を保持する任意の類似体、断片、誘導体、または変異体である。ポリペプチドまたはタンパク質の異なる変種が天然に存在する可能性がある。これらの変種は、タンパク質をコードする構造遺伝子のヌクレオチドの差を特徴とする対立遺伝子変種であってもよく、または識別的スプライシングもしくは翻訳後改変を伴ってもよい。当業者は、1つまたは多数のアミノ酸置換、欠失、付加、または交換を有する変種を産生することができる。これらの変種には、中でも：（a）1つまたは複数のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸によって置換される変種、（b）1つまたは複数のアミノ酸がポリペプチドまたはタンパク質に付加される変種、（c）1つまたは複数のアミノ酸に置換基が含まれる変種、および（d）ポリペプチドまたはタンパク質が血清アルブミンなどのもう1つのポリペプチドに融合される変種、が含まれてもよい。遺伝子（抑制、欠失、変異等）、化学的、および酵素的技術が含まれるこれらの変種を得るための技術は、当業者に公知である。
【０１４１】
「異種タンパク質」は細胞において天然に産生されないタンパク質を指す。
【０１４２】
「成熟タンパク質」は、翻訳後プロセシングされたポリペプチド、すなわち一次翻訳産物に存在する任意のプレまたはプロペプチドが除去されているポリペプチドを指す。「前駆体」タンパク質は、mRNAの翻訳の一次産物、すなわちプレおよびプロペプチドがなお存在する産物を指す。プレおよびプロペプチドは細胞内局在シグナルであってもよいがこれに限定されない。
【０１４３】
「相同性」という用語は、2つのポリヌクレオチドまたは2つのポリペプチド部分のあいだの同一性の百分率を指す。1つの部分からの配列ともう1つの部分からの配列のあいだの一致は、当技術分野において公知の技術によって決定されうる。たとえば、相同性は、配列情報を整列させて、および容易に入手可能なコンピュータープログラムを用いることによる2つのポリペプチド分子のあいだの配列情報の直接比較によって決定されうる。または、相同性は、相同な領域のあいだで安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションの後に、一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化および消化された断片のサイズ決定によって決定されうる。
【０１４４】
本明細書において用いられる、その全ての文法的な形および綴りの変化形における「相同な」という用語は、スーパーファミリーからのタンパク質（たとえば、免疫グロブリンスーパーファミリー）、および異なる種からの相同なタンパク質（たとえば、ミオシン軽鎖等）が含まれる、「共通の進化的起源」を保有するタンパク質間の関係を指す（Reeck et al., 1987, Cell 50:667）。そのようなタンパク質（およびそのコード遺伝子）は、その高い程度の配列類似性によって反映されるように配列相同性を有する。しかし、一般的な使用および本出願において、「高度に」などの副詞によって修飾された「相同な」という用語は、配列類似性を指してもよく、共通の進化的起源を指すのではない。
【０１４５】
したがって、その全ての文法的な形における「配列類似性」という用語は、共通の進化的起源を共有してもよく共有しなくてもよいタンパク質の核酸またはアミノ酸配列間の同一性または一致の程度を指す（Reeck et al., 1987, Cell 50: 667を参照されたい）。
【０１４６】
特定の態様において、2つのDNA配列は、DNA配列の既定の長さにわたってヌクレオチドの少なくとも約50％（例として、少なくとも約75％、90％、または95％）がマッチする場合に「実質的に相同」または「実質的に類似」である。実質的に相同である配列は、配列データバンクにおいて入手可能な標準的なソフトウェアを用いて配列を比較することによって、または特定の系に関して定義されるストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定されうる。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは当業者の範囲内である。たとえばSambrook et al., 1989、前記を参照されたい。
【０１４７】
本明細書において用いられる、「実質的に類似」とは、1つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化によって1つまたは複数のアミノ酸の置換が起こるが、DNA配列によってコードされるタンパク質の機能的特性には影響を及ぼさない核酸断片を指す。「実質的に類似」はまた、1つまたは複数のヌクレオチド塩基における変化がアンチセンスまたは共抑制技術によって遺伝子発現の変更を核酸断片が媒介する能力に影響を及ぼさない核酸断片を指す。「実質的に類似」はまた、得られた転写物の機能的特性に実質的に影響を及ぼさない1つまたは複数のヌクレオチド塩基の欠失または挿入などの、本発明の核酸断片の改変も指す。ゆえに、本発明は、特定の例示的配列より多くを包含すると理解される。提唱される改変の各々は、コードされる産物の生物活性の保持の決定と同様に、当業者の範囲内である。
【０１４８】
その上、当業者は、本発明によって包含される実質的に類似の配列が、ストリンジェントな条件下（0.1×SSC、0.1％SDS、65℃の後に2×SSC、0.1％SDSの後に0.1×SSC、0.1％SDSによる洗浄）での本明細書において例示される配列とのそのハイブリダイズ能によって定義されることを認識する。本発明の実質的に類似の核酸断片は、そのDNA配列が本明細書において報告される核酸断片のDNA配列と少なくとも70％同一である核酸断片である。本発明の実質的に類似の核酸断片には、そのDNA配列が本明細書において報告される核酸断片のDNA配列と少なくとも80％同一である核酸断片が含まれる。追加の実質的に類似の核酸断片には、本明細書において報告される核酸断片のDNA配列と少なくとも90％同一である核酸断片が含まれる。追加の実質的に類似の核酸断片には、本明細書において報告される核酸断片のDNA配列と少なくとも95％同一である断片が含まれる。
【０１４９】
2つのアミノ酸配列は、アミノ酸の約40％より多くが同一である場合、または60％より多くが類似（機能的に同一）である場合、「実質的に相同」または「実質的に類似」である。1つの態様において、類似または相同な配列は、たとえばGCG（Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin）パイルアッププログラムを用いるアラインメントによって同定される。
【０１５０】
「対応する」という用語は本明細書において、正確な位置が、類似性または相同性が測定される分子と同一であるまたは異なるかによらず、類似または相同な配列を指すために用いられる。核酸またはアミノ酸配列のアラインメントには空白が含まれてもよい。このように、「対応する」という用語は、配列類似性を指し、アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基の番号付けを指すのではない。
【０１５１】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、当業者による配列の手動での評価によって、または BLAST（Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S. F., et al., (1993) J. Mol. Biol. 215: 403-410；同様にwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/も参照されたい）などのアルゴリズムを用いるコンピューター自動化配列比較および同定によって、ポリペプチドまたは遺伝子を仮に同定するために、ポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を十分に含む。一般的に、ポリペプチドまたは核酸配列を公知のタンパク質または遺伝子に対して相同であると仮に同定するためには、10個もしくはそれより多い近接アミノ酸または30個もしくはそれより多いヌクレオチドの配列が必要である。その上、ヌクレオチド配列に関して、近接ヌクレオチド20〜30個を含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを、配列依存的な遺伝子同定（たとえば、サザンハイブリダイゼーション）および単離（たとえば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイチューハイブリダイゼーション）法において用いてもよい。加えて、プライマーを含む特定の核酸断片を得るために、12〜15塩基の短いオリゴヌクレオチドをPCRにおける増幅プライマーとして用いてもよい。したがって、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、配列を含む核酸断片を特異的に同定および／または単離するために十分な配列を含む。
【０１５２】
当技術分野において公知である「％同一性」という用語は、配列を比較することによって決定された、2つもしくはそれより多いポリペプチド配列、または2つもしくはそれより多いポリヌクレオチド配列間の関係である。当技術分野において、「同一性」はまた、場合によってはそのような配列のストリングのあいだでのマッチによって決定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」および「類似性」は、Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988)；Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993)；Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987)；およびSequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991)において記述される方法が含まれるがこれらに限定されるわけではない公知の方法によって容易に計算されうる。同一性を決定するための方法は、試験される配列間の最善のマッチを与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公共の入手可能なコンピュータープログラムにおいて暗号化される。配列アラインメントおよび％同一性の計算は、LASERGENEバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（DNASTAR Inc., Madison, WI）のMegalignプログラムを用いて行われてもよい。配列の多数のアラインメントは、デフォルトパラメータ（GAP PENALTY＝10、GAP LENGTH PENALTY＝10）を用いるClustalアラインメント法（Higgins and Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153）を用いて行われてもよい。Clustal法を用いる対応のあるアラインメントに関するデフォルトパラメータを選択してもよい： KTUPLE 1、GAP PENALTY＝3、WINDOW＝5、およびDIAGONALS SAVED＝5。
【０１５３】
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析にとって有用である任意のコンピューターアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販されているか、または独立して開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウェアには、GCGプログラムスイート（Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI）、BLASTP、BLASTN、BLASTX（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)）、およびDNASTAR（DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St., Madison, WI 53715 USA）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。本出願の状況において、配列分析ソフトウェアを分析のために用いる場合、分析結果は、特に明記されていなければ、参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくであろうと理解されるであろう。本明細書において用いられる、「デフォルト値」は、最初に初期化された場合のソフトウェアに最初からローディングされている値またはパラメータの任意の組を意味するであろう。
【０１５４】
「合成遺伝子」は、当業者に公知である技法を用いて化学合成されるオリゴヌクレオチド構築ブロックからアセンブルされうる。これらの構築ブロックをライゲーションしてアニールして遺伝子セグメントを形成し、これを次に酵素的にアセンブルして全遺伝子を構築する。DNAの配列に関連して「化学合成された」とは、インビトロで成分ヌクレオチドがアセンブルされたことを意味する。DNAの手動での化学合成は、十分に確立された技法を用いて達成してもよく、または市販の多くの機器の1つを用いて自動化学合成を行うことができる。したがって、遺伝子は、宿主細胞のコドンバイアスを反映するようにヌクレオチド配列の最適化に基づいて最適な遺伝子発現が得られるように調整されうる。当業者は、コドン使用が宿主にとって都合のよいコドンに偏向よれば、遺伝子発現が成功する可能性を認識する。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手可能である宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づくことができる。
【０１５５】
本明細書において用いられる、2つまたはそれより多い個々に機能的な遺伝子調節系は、a）選ばれた濃度でそのそれぞれのリガンドによる所定の系の各々のモジュレーションによって、その系の関心対象遺伝子の発現の大きさに測定可能な変化が起こる場合、およびb）変化が実際のモジュレーションの同時性または連続性によらず、細胞、組織、または生物において同時に機能的な他の全ての系の発現の変化とは統計学的に有意に異なる場合に、直交であると言われる。たとえば、個々に機能的な各遺伝子調節系のモジュレーションは、細胞、組織、または生物における他の全ての機能的な系より少なくとも2倍、5倍、10倍、100倍、または500倍大きい遺伝子発現の変化をもたらす。完全に直交の遺伝子スイッチ系は、それぞれのリガンドによる各スイッチ成分の独立したモジュレーションを行うことができる。系における1つのスイッチの関心対象遺伝子の発現の大きさの測定可能な変化は、細胞、組織、または生物において機能的な他の系における関心対象遺伝子の発現の測定可能な変化に影響を及ぼさない。本発明は、直交リガンドおよび直交受容体に基づく遺伝子発現系に関して探索するために有用である。
【０１５６】
「モジュレートする」という用語は、所定のリガンド／受容体複合体が関心対象遺伝子または複数の遺伝子の発現を誘導または抑制する能力を意味する。
【０１５７】
「外因性の遺伝子」という用語は、形質転換プロセスを通して対象に導入される遺伝子、内因性の変異遺伝子の非変異型、または内因性の非変異遺伝子の変異型である、対象にとって異物である遺伝子を意味する。外因性の遺伝子は、逆転写酵素による場合などのDNA中間体を通して機能する可能性があるDNAまたはRNAの形態で対象に導入される、天然または合成の遺伝子および治療遺伝子でありうる。そのような遺伝子は、標的細胞に導入されうる、対象に直接導入されうる、または形質転換細胞を対象に移入することによって間接的に導入されうる。「治療遺伝子」という用語は、そのような遺伝子が発現される宿主細胞に有益な機能を付与する遺伝子を意味する。治療遺伝子は、細胞の死の一因となる毒素または他の産物をコードする遺伝子であってもよい。そのような関心対象遺伝子は、たとえば癌治療において有用である。
【０１５８】
「受容体複合体」という用語は一般的に、エクジステロイド受容体（EcR）および／またはウルトラスピラクル（USP）タンパク質が含まれる核内受容体成分を含有するタンパク質複合体を指す（Yao, et. al. (1993) Nature 366, 476-479；Yao, et. al., (1992) Cell 71, 63-72を参照されたい）。機能的受容体複合体にはまた、イムノフィリンなどの追加のタンパク質が含まれてもよい。転写因子（DHR38、βFTZ-1または他の昆虫相同体などの）として知られるタンパク質のステロイド受容体ファミリーメンバーはまた、EcRおよび／またはUSPのリガンド依存的または非依存的パートナーであってもよい。受容体複合体はまた、エクジステロイド受容体タンパク質とウルトラスピラクルタンパク質の脊椎動物相同体であるレチン酸-X-受容体（「RXR」）タンパク質とのヘテロ二量体でありうる。受容体複合体にはまた、EcR-EcRホモ二量体、またはUSP-USPホモ二量体、またはRXR-RXRホモ二量体が含まれる。
【０１５９】
受容体複合体は、EcRが含まれるが複合体の他のタンパク質を除外しない複合体のタンパク質の1つに結合した活性なステロイドまたは非ステロイドリガンドによって活性化されうる。
【０１６０】
核内受容体複合体には、メンバーがアミノ末端トランス活性化ドメイン、DNA結合ドメイン（「DBD」）、およびヒンジ領域によって離れたリガンド結合ドメイン（「LBD」）の存在を特徴とするステロイド受容体スーパーファミリーメンバーであるタンパク質が含まれる。いくつかのファミリーメンバーはまた、LBDのカルボキシ末端側にもう1つのトランス活性化ドメインを有してもよい。DBDは2つのシステインジンクフィンガーの存在を特徴とし、そのあいだに応答エレメントに対して特異性を付与する2つのアミノ酸モチーフ、P-boxおよびD-boxが存在する。これらのドメインは、異種受容体タンパク質の異なるドメインの本来の、改変、またはキメラであってもよい。
【０１６１】
関心対象遺伝子を構成するDNA配列、応答エレメント、および受容体複合体を古細菌、大腸菌、枯草菌（Bacillus subtilis）、もしくは他の腸内細菌などの原核細胞、または植物もしくは動物細胞などの真核細胞に組み入れてもよい。細胞は、単細胞または多細胞生物の形であってもよい。関心対象遺伝子のヌクレオチド配列、応答エレメント、および受容体複合体はまた、RNA分子として、たとえばタバコモザイクウイルスなどの機能的ウイルスRNAの形で組み入れられうる。脊椎動物細胞は、本発明のリガンドに対する応答を付与する分子を天然に欠損することから、有利である。その結果、それらは本発明のリガンドに対して非感受性である。その結果、細胞は、リガンド自身の存在によって実質的に影響を受けずに、生育して所望の産物を発現することができる。
【０１６２】
「対象」という用語は、無傷の植物もしくは動物、または植物もしくは動物からの細胞を意味する。同様に、リガンドは、対象が真菌または酵母である場合にも等しく良好に作用するであろうと予想される。対象が無傷の動物である場合、動物には脊椎動物または哺乳動物が含まれる。
【０１６３】
本発明のリガンドは、受容体複合体と共に用いられる場合、受容体複合体が次に関心対象遺伝子に連結した応答エレメントに結合して、関心対象遺伝子の発現の外部からの時間的調節を提供する。様々な化合物が互いに結合する順序、すなわちリガンドから受容体複合体、および受容体複合体から応答エレメントという順序は、重要ではない。典型的に、関心対象遺伝子の発現のモジュレーションは、特異的な制御または調節DNAエレメントに対する受容体複合体の結合に対する応答である。エクジステロイド受容体タンパク質は、ステロイド受容体ファミリーの他のメンバーと同様、少なくとも3つのドメイン、すなわちトランス活性化ドメイン、DNA結合ドメイン、およびリガンド結合ドメインを保有する。この受容体はまた、ステロイド受容体ファミリーのサブセットと同様に、ヘテロ二量体化特性の原因であるあまりよく定義されていない領域も保有する。リガンドはホモ二量体複合体（たとえば、EcR-EcRまたはUSP-USP）に結合してもよい。受容体ドメインの1つまたは複数を、キメラ遺伝子スイッチを産生するように変化させることができる、典型的に、3つのドメインの1つまたは複数は、キメラ受容体が、トランス活性化活性、リガンドの相補的結合、および特異的応答エレメントの認識に関して、選ばれた宿主細胞または生物において最適化されるように、他のドメインの起源とは異なる起源から選ばれてもよい。加えて、応答エレメント自身は、酵母からのGAL-4タンパク質（Sadowski, et. al. (1988) Nature, 335, 563-564を参照されたい）、または大腸菌からのLexAタンパク質（Brent and Ptashne (1985), Cell, 43, 729-736を参照されたい）などの他のDNA結合タンパク質ドメインに関する応答エレメントによって改変または置換されうる。キメラ系のもう1つの長所は、所望の最終結果に従って関心対象遺伝子を駆動するために用いられるプロモーターを選ぶことができる点である。そのような二重制御は、特に細胞障害性タンパク質が産生される場合、発現のタイミングのみならず発現が起こる細胞の双方を制御できることから、遺伝子治療の領域において特に重要でありうる。配列は、適当な条件下で転写が特異的に開始されうる部位である。適したプロモーターに機能的に連結した関心対象の内因性または外因性の遺伝子を対象の細胞に導入する場合、遺伝子の発現は、本発明のリガンドの存在によって制御される。プロモーターは、構成的もしくは誘導的に調節されてもよく、または組織特異的（すなわち、特定の細胞型に限って発現される）もしくは生物の一定の発達段階に対して特異的であってもよい。
【０１６４】
本発明のもう1つの局面は、本発明の化合物を含むリガンドの有効量を対象に投与する段階を含む、対象における関心対象の1つまたは複数の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、対象の細胞が
a）以下を含む受容体複合体：
DNA結合ドメイン；
リガンド結合ドメイン；および
トランス活性化ドメイン；ならびに
b）以下を含むDNA構築物：
関心対象遺伝子；および
応答エレメント、
を含み、前記関心対象遺伝子が応答エレメントの制御下にあり、およびリガンドの存在下での応答エレメントに対するDNA結合ドメインの結合によって、関心対象遺伝子の活性化または抑制が起こる、方法である。
【０１６５】
本発明の関連する局面は、対象の細胞内でエクジステロイド受容体に本発明のリガンドを接触させる段階を含む、トランスジェニック対象における内因性または異種遺伝子発現を調節するための方法であって、該細胞がエクジステロイド受容体に関するDNA結合配列を含有し、エクジステロイド受容体-リガンド-DNA結合配列複合体の形成が遺伝子の発現を誘導する、方法である。
【０１６６】
細胞によるポリペプチド産生を一時的に制御する長所のみならず、本発明のこの局面は、ポリペプチドの発現が短期間に限定される可能性があるという点において、そのようなポリペプチドの蓄積が細胞に損傷を与えうる場合に、さらなる長所を提供する。そのような制御は、外因性の遺伝子が治療遺伝子である場合には特に重要である。治療遺伝子は、糖尿病患者におけるインスリンの産生などの必要な機能を制御するポリペプチドを産生するために求められる可能性がある。それらはまた、癌細胞に対して致死的であるタンパク質などの、障害性または致死性タンパク質さえ産生するために用いられてもよい。
【０１６７】
多様なポリペプチドをコードする多数のゲノムおよびcDNA核酸配列が当技術分野において周知である。本発明のリガンドと共に用いて有用な外因性の遺伝子材料または他の関心対象遺伝子には、中でもたとえば、分泌性タンパク質；毒性物質から非毒性物質へと、または不活性物質から活性物質へと基質を代謝することができる酵素が含まれる酵素；調節タンパク質；細胞表面受容体などの、関心対象の生物活性タンパク質をコードする遺伝子が含まれる。有用な遺伝子にはまた、血液凝固因子、ペプチドホルモン、インスリン、副甲状腺ホルモン、黄体形成ホルモン放出因子、αおよびβ精液インヒビン、およびヒト成長ホルモンなどのホルモンをコードする遺伝子；その非存在が異常な状態の発生に至る酵素などのタンパク質をコードする遺伝子；インターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、コロニー刺激因子-1、腫瘍壊死因子、およびエリスロポエチンなどのサイトカインまたはリンフォカインをコードする遺伝子；α1-アンチトリプシンなどの阻害剤物質をコードする遺伝子、ジフテリアおよびコレラ毒素などの薬物として機能する物質をコードする遺伝子が含まれる。有用な遺伝子にはまた、癌治療にとって有用なおよび遺伝子障害を処置するために有用な遺伝子が含まれる。当業者は、実質的に全ての公知の遺伝子に関する核酸配列情報に対するアクセスを有し、公共の寄託所、配列を公表した施設から核酸分子を直接得ることができ、または分子を調製するためにルーチン法を使用することができる。
【０１６８】
遺伝子治療で用いるために、本明細書において記述されるリガンドは、たとえば溶液、懸濁液、錠剤、カプセル剤、軟膏、エリキシル剤、および注射可能組成物などの薬学的に許容される担体において構成されてもよい。薬学的調製物は、リガンドの重量で0.01％〜99％を含有してもよい。調製物は1回投与または多数回投与剤形のいずれであってもよい。任意の特定の薬学的調製物におけるリガンドの量は、有効な用量、すなわち所望の遺伝子発現または抑制を誘発するために必要な用量に依存するであろう。
【０１６９】
薬学的調製物を投与する適した経路には、経口、直腸内、局所表面（皮膚、口腔内、および舌下が含まれる）、膣内、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内、および硬膜外が含まれる）および鼻-胃チューブが含まれる。好ましい投与経路は、処置される状態に依存して、レシピエントの状態などの要因に応じて変化してもよいことは当業者によって理解されるであろう。
【０１７０】
本明細書において記述されるリガンドはまた、他の薬学的活性化合物と共に投与されてもよい。本明細書において記述されるリガンドと共に用いられる薬学的に活性な化合物は、レシピエントに対する有害な効果または化合物間の望ましくない相互作用を回避するために選択されてもよいことは当業者によって理解されるであろう。リガンドと共に用いられてもよい他の薬学的活性化合物の例には、たとえば、AIDS化学療法剤、アミノ酸誘導体、鎮痛剤、麻酔剤、肛門直腸薬、制酸剤および抗鼓腸剤、抗生物質、抗凝固剤、解毒剤、抗線維素溶解剤、抗ヒスタミン剤、抗炎症剤、抗新生物剤、抗寄生虫剤、抗原虫薬、解熱剤、抗敗血症剤、抗痙攣剤および抗コリン作動剤、抗ウイルス剤、食欲抑制剤、関節炎の薬剤、生物応答改変剤、骨代謝調節剤、瀉下剤、心血管剤、中枢神経系刺激剤、脳代謝増強剤、耳垢水、コリンエステラーゼ阻害剤、風邪および咳用調製物、コロニー刺激因子、避妊剤、細胞保護剤、歯科用調製物、消臭剤、皮膚科用剤、解毒剤、糖尿病剤、診断剤、下痢用剤、ドーパミン受容体アゴニスト、電解質、酵素および消化剤、バッカク調製物、受胎用薬、線維添加剤、抗真菌剤、乳汁漏出阻害剤、胃酸分泌阻害剤、消化管運動改善剤、性腺刺激ホルモン阻害剤、毛髪生育刺激剤、造血剤、出血剤、止血剤、ヒスタミンH2受容体アンタゴニスト、ホルモン、高血糖剤、脂質低下剤、免疫抑制剤、緩下剤、抗らい菌剤、白血球搬出補助剤、肺界面活性物質、片頭痛用調製物、粘液溶解剤、筋弛緩アンタゴニスト、筋弛緩剤、麻薬アンタゴニスト、鼻腔内スプレー、悪心薬、ヌクレオシド類似体、栄養補助剤、骨粗鬆症調製物、子宮収縮剤、副交感神経遮断剤、副交感神経作用剤、パーキンソン病薬、ペニシリン補助剤、リン脂質、血小板阻害剤、ポルフィリン症剤、プロスタグランジン類似体、プロスタグランジン、プロトンポンプ阻害剤、そう痒症剤、向精神薬、キノロン、呼吸刺激剤、唾液刺激剤、塩代用物、硬化剤、皮膚創傷用調製物、禁煙補助剤、スルホンアミド、交感神経遮断剤、血栓溶解剤、ツレット症候群薬、振せん用調製物、結核用調製物、尿酸排泄剤、尿路剤、子宮収縮剤、子宮弛緩剤、膣用調製物、眩暈剤、ビタミンD類似体、ビタミン、および医学用造影剤が含まれる。いくつかの例において、リガンドは、薬物療法に対する補助剤として、たとえば特定の薬物を代謝する酵素を産生する遺伝子の「スイッチを切る」ために有用である可能性がある。
【０１７１】
農学的用途に関して、前述の用途のほかに、本発明のリガンドはまた、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）（Bt）毒素などの殺虫剤タンパク質の発現を制御するために用いられてもよい。そのような発現は組織または植物特異的であってもよい。加えて、特に植物害虫の制御が必要である場合、1つまたは複数の殺虫剤を本明細書に記載のリガンドと組み合わせてもよく、それによって殺虫剤が個別に適用される場合よりも少ない適用の合計が含まれる追加の長所および有効性を提供しうる。殺虫剤との混合物を使用する場合、組成物における各成分の相対的比率は、処置される作物、害虫、および／または雑草に関する各々の殺虫剤の相対的有効度および望ましい適用速度に依存するであろう。当業者は、殺虫剤の混合物が、単独で用いられる1つの殺虫剤より広いスペクトルの活性などの長所を提供する可能性があることを認識するであろう。本明細書において記述されるリガンドとの組成物において併用されうる殺虫剤の例には、殺真菌剤、除草剤、殺虫剤、殺ダニ剤、および殺菌剤が含まれる。
【０１７２】
本明細書において記述されるリガンドは、従来の高水圧スプレー、低水圧スプレー、エアブラスト、および空中散布などの一般的に使用される方法によって水性スプレーとして植物の葉に適用されうる。
【０１７３】
本発明の宿主細胞および非ヒト生物
本発明の遺伝子発現系をモジュレートするためのリガンドは、宿主細胞における遺伝子発現をモジュレートするために用いられてもよい。トランスジェニック宿主細胞における発現は、様々な関心対象遺伝子の発現にとって有用である可能性がある。本発明は、原核生物および真核生物宿主細胞における遺伝子発現のモジュレーションのためのリガンドを提供する。宿主細胞における発現は、中でもワクチンとして植物において産生される抗原、α-アミラーゼ、フィターゼ、グルカン、およびキシラナーゼのような酵素が含まれる酵素が含まれるがこれらに限定されるわけではない様々な関心対象ポリペプチドの発現、昆虫、線虫、真菌、細菌、ウイルスおよび非生物ストレス、抗原、栄養剤、薬剤、ビタミンに対する抵抗性遺伝子、アミノ酸含有量、除草剤抵抗性、低温、干ばつ、高温耐性、工業産物、油、タンパク質、炭水化物、抗酸化剤、雄性不稔植物、花、燃料、他の産物特性、治療ポリペプチド、経路中間体を改変するための遺伝子の発現；細胞に基づくアッセイ；機能的ゲノミクスアッセイ、生物治療タンパク質産生、プロテオミクスアッセイにとって有用である。
【０１７４】
宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、線虫細胞、昆虫細胞、魚細胞、植物細胞、鳥細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、またはヒト細胞であってもよい。なおもう1つの態様において、本発明は、置換変異を含む核内受容体リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを発現させる条件下で培養培地において前述の宿主細胞を培養する段階、および培養物から置換変異を含む核内受容体リガンド結合ドメインを単離する段階を含む、宿主細胞において遺伝子発現をモジュレートするためのリガンドに関する。
【０１７５】
特定の態様において、単離された宿主細胞は原核宿主細胞または真核宿主細胞である。もう1つの特定の態様において、単離された宿主細胞は無脊椎動物宿主細胞または脊椎動物宿主細胞である。そのような宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、線虫細胞、昆虫細胞、魚細胞、植物細胞、鳥細胞、動物細胞、および哺乳動物細胞から選択されてもよい。より具体的に、宿主細胞は、酵母細胞、線虫細胞、昆虫細胞、植物細胞、ゼブラフィッシュ細胞、ニワトリ細胞、ハムスター細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ウシ（bovine）細胞、ヤギ細胞、ウシ（cow）細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、類人猿（simian）細胞、サル（monkey）細胞、チンパンジー細胞、またはヒト細胞である。宿主細胞の例には、アスペルギルス属（Aspergillus）、トリコデルマ属（Trichoderma）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、ピチア属（Pichia）、カンジダ属（Candida）、ハンゼヌラ属（Hansenula）などの真菌もしくは酵母種、またはシネコシスチス属（Synechocystis）、シネココッカス属（Synechococcus）、サルモネラ属（Salmonella）、バシラス属（Bacillus）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、ストレプトミセス属（Streptomyces）、大腸菌属（Escherichia）、シュードモナス属（Pseudomonas）、メチロモナス属（Methylomonas）、メチロバクター属（Methylobacter）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）、シネコシスチス属（Synechocystis）、アナバエナ属（Anabaena）、チオバシラス属（Thiobacillus）、メタノバクテリウム属（Methanobacterium）、およびクレブシエラ属（Klebsiella）の種などの細菌種；動物；ならびに哺乳動物宿主細胞が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０１７６】
特定の態様において、宿主細胞は、シーエレガンス（Caenorhabditis elegans）線虫細胞である。
【０１７７】
もう1つの特定の態様において、宿主細胞は、ハムスター細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、ウシ細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、サル細胞、チンパンジー細胞、およびヒト細胞からなる群より選択される哺乳動物細胞である。
【０１７８】
宿主細胞形質転換は当技術分野において周知であり、電気穿孔、ウイルス感染症、プラスミド／ベクタートランスフェクション、非ウイルスベクター媒介トランスフェクション、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換、粒子衝突等が含まれるがこれらに限定されるわけではない多様な方法によって達成されてもよい。所望の遺伝子産物の発現は、適した条件下で形質転換宿主細胞を培養する段階、および形質転換遺伝子の発現を誘導する段階を伴う。原核細胞および真核細胞における培養条件および遺伝子発現プロトコルは、当技術分野において周知である。細胞を回収して、遺伝子産物に対して特異的なプロトコルに従って遺伝子産物を単離してもよい。
【０１７９】
加えて、挿入されたポリヌクレオチドの発現をモジュレートする、または望ましい特定の様式でポリペプチド産物を改変および処理する宿主細胞を選んでもよい。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プロセシングおよび改変のための特徴的で特異的な機序を有する。発現される外来タンパク質の所望の改変およびプロセシングを確実にするように適切な細胞株または宿主系を選ぶことができる。たとえば、細菌系における発現を用いて非グリコシル化コアタンパク質産物を産生することができる。酵母における発現は、グリコシル化産物を産生することができる。真核細胞における発現は、異種タンパク質の「本来の」グリコシル化およびフォールディングの可能性を増加させうる。その上、哺乳動物細胞における発現は、ポリペプチドの活性を再構成または構成するためのツールを提供しうる。さらに、異なるベクター／宿主発現系は、タンパク質分解による切断などのプロセシング反応に異なる程度に影響を及ぼす可能性がある。本発明はまた、本発明に従う単離された宿主細胞を含む非ヒト生物にも関する。
【０１８０】
特定の態様において、非ヒト生物は原核生物または真核生物である。もう1つの特定の態様において、非ヒト生物は、無脊椎生物または脊椎生物である。特定の態様において、非ヒト生物は非ヒト哺乳動物である。
【０１８１】
たとえば、非ヒト生物は、細菌、真菌、酵母、線虫、昆虫、魚、植物、鳥、動物、および哺乳動物からなる群より選択される。より具体的に、非ヒト生物は、酵母、線虫、昆虫、植物、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、ハムスター、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、類人猿、サル、またはチンパンジーである。もう1つの特定の態様において、非ヒト生物はハツカネズミマウスである。
【０１８２】
本発明の遺伝子発現モジュレーション系
本発明は、核内受容体に基づく誘導型遺伝子発現系において有用であるリガンドのグループに関する。特に、本発明は、グループH核内受容体などの核内受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞において発現されうる少なくとも1つの遺伝子発現カセットを含む遺伝子発現モジュレーション系のトランス活性化能を有するリガンドに関する。グループH核内受容体リガンド結合は、ステロイド受容体、エクジステロイド受容体、変異体エクジソン受容体、汎在する受容体、オーファン受容体1、NER-1、ステロイドホルモン受容体様タンパク質1、レチノイドX受容体相互作用タンパク質-15、肝X受容体βステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝X受容体、肝X受容体α、ファルネソイドX受容体、受容体相互作用タンパク質14、およびファルネソル受容体からの結合である。1つの態様において、グループH核内受容体リガンド結合ドメインは、エクジステロイド受容体からのドメインである。
【０１８３】
特定の態様において、遺伝子発現モジュレーション系は、トランス活性化ドメイン、その発現がモジュレートされる遺伝子に結合する応答エレメントを認識するDNA結合ドメイン、および置換変異を含むグループH核内受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセットを含む。遺伝子発現モジュレーション系はさらに、以下を含む第二の遺伝子発現カセットを含んでもよい：i）第一の遺伝子発現カセットのコードされるポリペプチドのDNA結合ドメインによって認識される応答エレメント；ii）第一の遺伝子発現カセットのコードされるポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター；およびiii）その発現がモジュレートされる関心対象遺伝子。
【０１８４】
もう1つの特定の態様において、遺伝子発現モジュレーション系は、以下を含む遺伝子発現カセットを含む：a）トランス活性化ドメイン、その発現がモジュレートされる遺伝子に結合する応答エレメントを認識するDNA結合ドメイン、および置換変異を含むグループH核内受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにb）脊椎動物レチノイドX受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドX受容体リガンド結合ドメイン、ウルトラスピラクルタンパク質リガンド結合ドメイン、および第一のポリペプチド断片が脊椎動物レチノイドX受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドX受容体リガンド結合ドメイン、またはウルトラスピラクルタンパク質リガンド結合ドメインからの断片であり、第二のポリペプチド断片が異なる脊椎動物レチノイドX受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドX受容体リガンド結合ドメイン、またはウルトラスピラクルタンパク質リガンド結合ドメインからの断片である、2つのポリペプチド断片を含むキメラリガンド結合ドメインからなる群より選択される第二の核内受容体リガンド結合ドメイン。遺伝子発現モジュレーション系はさらに、以下を含む第二の遺伝子発現カセットを含んでもよい：i）第一の遺伝子発現カセットのコードされるポリペプチドのDNA結合ドメインによって認識される応答エレメント；ii）第一の遺伝子発現カセットのコードされるポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター；およびiii）その発現がモジュレートされる関心対象遺伝子。
【０１８５】
もう1つの特定の態様において、遺伝子発現モジュレーション系は、その発現がモジュレートされる遺伝子に結合する応答エレメントを認識するDNA結合ドメインと核内受容体リガンド結合ドメインとを含む第一のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第一の遺伝子発現カセット、および核内受容体リガンド結合ドメインの1つが置換変異を含むグループH核内受容体リガンド結合ドメインである、トランス活性化ドメインと核内受容体リガンド結合ドメインとを含む第二のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第二の遺伝子発現カセットを含む。1つの態様において、第一のポリペプチドは、トランス活性化ドメインを実質的に含まず、第二のポリペプチドはDNA結合ドメインを実質的に含まない。本発明の目的に関して、「実質的に含まない」とは、問題となるタンパク質が活性化または結合活性を提供するために問題となるドメインの十分な配列を含有しないことを意味する。遺伝子発現モジュレーション系は、さらに、i）第一の遺伝子発現カセットの第一のポリペプチドのDNA結合ドメインによって認識される応答エレメント；ii）第二の遺伝子発現カセットの第二のポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター；およびiii）その発現がモジュレートされる関心対象遺伝子、を含む第三の遺伝子発現カセットを含んでもよい。
【０１８６】
唯一の核内受容体リガンド結合ドメインが、置換変異を含むグループHリガンド結合ドメインである場合、他の核内受容体リガンド結合ドメインは、置換変異を含むグループHリガンド結合ドメインと二量体を形成する任意の他の核内受容体からのドメインであってもよい。たとえば、置換変異を含むグループH核内受容体リガンド結合ドメインが、置換変異を含むエクジステロイド受容体リガンド結合ドメインである場合、他の核内受容体リガンド結合ドメイン（「パートナー」）は、ステロイド受容体、エクジステロイド受容体、脊椎動物レチノイドX受容体（RXR）、無脊椎動物RXR、ウルトラスピラクルタンパク質、または脊椎動物RXR、無脊椎動物RXR、およびUSP（PCT/US01/09050、PCT/US02/05235、およびPCT/US02/05706を参照されたい）から選択される少なくとも2つの異なる核内受容体リガンド結合ドメインポリペプチド断片を含むキメラ核内受容体からのドメインであってもよい。「パートナー」核内受容体リガンド結合ドメインはさらに、切断変異、欠失変異、置換変異、もしくはもう1つの改変、またはその組み合わせを含んでもよい。
【０１８７】
1つの態様において、脊椎動物RXRリガンド結合ドメインは、ヒト、マウス、ラット、ニワトリ、ブタ、カエル、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）、尾索類、またはクラゲであるトリペダリア・サイソフォーラ（Tripedalia cysophora）RXRからのドメインである。
【０１８８】
たとえば、無脊椎動物RXRリガンド結合ドメインは、トノサマバッタ（Locusta migratoria）ウルトラスピラクルポリペプチド（「LmUSP」）、マダニ（Amblyomma americanum）RXR相同体1（「AmaRXR1」）、マダニRXR相同体2（「AmaRXR2」）、シオマネキ（Celuca pugilator）RXR相同体（「CpRXR」）、甲虫であるチャイロコメノゴミムシダマシRXR相同体（「TmRXR」）、ミツバチ（Apis mellifera）RXR相同体（「AmRXR」）、アリマキ（Myzus persicae）RXR相同体（「MpRXR」）、または非双翅目／非鱗翅目RXRからのドメインである。
【０１８９】
キメラRXRリガンド結合ドメインは、脊椎動物種のRXRポリペプチド断片、無脊椎動物種のRXRポリペプチド断片、および非双翅目／非鱗翅目無脊椎動物種RXR相同体ポリペプチド断片から選択される少なくとも2つのポリペプチド断片を含んでもよい。本発明において用いるためのキメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも2つの異なる種のRXRポリペプチド断片を含んでもよく、または種が同じである場合、2つまたはそれより多いポリペプチド断片は、種RXRポリペプチド断片の2つまたはそれより多い異なるイソ型からの断片であってもよい。
【０１９０】
1つの態様において、キメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも1つの脊椎動物種RXRポリペプチド断片と1つの無脊椎動物種RXRポリペプチド断片とを含む。
【０１９１】
もう1つの態様において、キメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも1つの脊椎動物種RXRポリペプチド断片と1つの非双翅目／非鱗翅目無脊椎動物種RXR相同体ポリペプチド断片とを含む。
【０１９２】
特定の態様において、関心対象遺伝子は、宿主細胞に対して内因性の遺伝子である。もう1つの特定の態様において、関心対象遺伝子は宿主細胞に対して外因性の遺伝子である。
【０１９３】
特定の例において、グループH核内受容体のリガンド結合ドメインおよびその核内受容体リガンド結合ドメインパートナーに対するリガンドの結合は、遺伝子の発現または抑制を可能にする。特定の態様において、受容体ドメインの1つまたは複数は、ハイブリッド（キメラ）遺伝子スイッチを産生するように変化する。典型的に、3つのドメイン、すなわちDBD、LBD、およびトランス活性化ドメインの1つまたは複数は、トランス活性化活性、リガンドの相補的結合、特異的応答エレメントの認識に関して、ハイブリッド遺伝子および得られたハイブリッドタンパク質が選ばれた宿主細胞または生物において最適化されるように、他のドメインの起源とは異なる起源から選ばれてもよい。加えて、応答エレメント自身は、ハイブリッド受容体に適合させるために、酵母からのGAL-4タンパク質、または大腸菌からのLexAタンパク質などの他のDNA結合タンパク質ドメインに関する応答エレメント、またはそのような特異的相互作用に関して設計、改変、および選択されたタンパク質との標的化相互作用に対して特異的な合成応答エレメントによって改変または置換されうる（たとえば、Kim, et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94: 3616-3620を参照されたい）。2-ハイブリッド系のもう1つの長所は、所望の最終結果に従って遺伝子発現を駆動するために用いられるプロモーターを選ぶことができる点である。そのような二重制御は、遺伝子治療の領域において、特に細胞障害性タンパク質が産生される場合には、発現の時期のみならず発現が起こる細胞を制御できることから、特に重要でありうる。適したプロモーターに機能的に連結した遺伝子を対象の細胞に導入する場合、外因性の遺伝子の発現は、本発明の系の存在によって制御される。プロモーターは、構成的もしくは誘導的に調節されてもよく、または組織特異的（すなわち、特定のタイプの細胞に限って発現される）もしくは生物の一定の発達段階に対して特異的であってもよい。
【０１９４】
エクジステロイド受容体は、核内受容体スーパーファミリーのメンバーであり、サブファミリー1、グループHに分類される（本明細書において「グループH核内受容体」と呼ばれる）。各群のメンバーはE（リガンド結合）ドメインにおいて40〜60％のアミノ酸同一性を共有する（Laudet et al., A Unified Nomenclature System for the Nuclear Receptor Subfamily, 1999; Cell 97: 161-163）。この核内受容体サブファミリー1、グループHの他のメンバーには：汎在する受容体（UR）、オーファン受容体1（OR-1）、ステロイドホルモン核内受容体1（NER-1）、レチノイドX受容体相互作用タンパク質-15（RIP-15）、肝X受容体（β）（LXRβ）、ステロイドホルモン受容体様タンパク質（RLD-1）、肝X受容体（LXR）、肝X受容体α（LXRα）、ファルネソイドX受容体（FXR）、受容体相互作用タンパク質14（RIP-14）、およびファルネソル受容体（HRR-1）が含まれる。
【０１９５】
特に、本明細書において、置換変異を含むグループH核内受容体リガンド結合ドメインを含む遺伝子発現モジュレーション系において有用な新規リガンドが記述される。この遺伝子発現系は、その中でトランス活性化ドメイン、DNA結合ドメイン、およびリガンド結合ドメインが1つのコードされるポリペプチド上に存在する「単スイッチ」に基づく遺伝子発現系であってもよい。または、遺伝子発現モジュレーション系は、その中でトランス活性化ドメインとDNA結合ドメインが2つの異なるコードポリペプチド上に位置する「二重スイッチ」または「2-ハイブリッド」に基づく遺伝子発現モジュレーション系であってもよい。
【０１９６】
本発明のエクジステロイド受容体に基づく遺伝子発現モジュレーション系は、ヘテロ二量体またはホモ二量体のいずれであってもよい。機能的なEcR複合体は一般的に、核内受容体ファミリーのメンバーの2つ、すなわちエクジステロイド受容体タンパク質とウルトラスピラクルタンパク質またはUSPの脊椎動物相同体、すなわちレチノイドX受容体タンパク質とのヘテロ二量体タンパク質複合体を指す。しかし、複合体はまた、ホモ二量体であってもよい。転写因子（DHR38またはβFTZ-1などの）として知られるステロイド受容体ファミリータンパク質の追加のメンバーはまた、EcR、USP、および／またはRXRのリガンド依存的または非依存的パートナーであってもよい。
【０１９７】
エクジステロイド受容体複合体には典型的に、全てのメンバーが一般的にアミノ末端トランス活性化ドメイン、DNA結合ドメイン（「DBD」）、およびヒンジ領域によってDBDから離れたリガンド結合ドメイン（「LBD」）の存在を特徴とする核内受容体スーパーファミリーのメンバーであるタンパク質が含まれる。本明細書において用いられる、「DNA結合ドメイン」という用語は、DNA結合ドメインが応答エレメントに結合するように機能する限り、DNA結合タンパク質の完全長までのDNA結合タンパク質の最小のポリペプチド配列を含む。核内受容体スーパーファミリーのメンバーはまた、4つまたは5つのドメイン：A/B、C、D、E、およびいくつかのメンバーにおいてF、の存在を特徴とする（US 4,981,784およびEvans, Science 240:889-895 (1988)を参照されたい）。「A/B」ドメインは、トランス活性化ドメインに対応し、「C」はDNA結合ドメインに対応し、「D」はヒンジ領域に対応し、および「E」はリガンド結合ドメインに対応する。ファミリーのいくつかのメンバーはまた、「F」に対応するLBDのカルボキシ末端側においてもう1つのトランス活性化ドメインを有してもよい。
【０１９８】
DBDは、エクジステロイド応答エレメントに対する特異性を付与する2つのアミノ酸モチーフ、P-ボックスとD-ボックスのあいだの2つのシステインジンクフィンガーの存在を特徴とする。これらのドメインは、異種受容体タンパク質の未変性のもの、改変型、または異なるドメインのキメラのいずれかであってもよい。EcR受容体は、ステロイド受容体ファミリーのサブセットと同様に、ヘテロ二量体化特性の原因であるあまりよく定義されていない領域も保有する。核内受容体のドメインは、本質的にモジュール性であることから、LBD、DBD、およびトランス活性化ドメインは互換されてもよい。
【０１９９】
本発明の遺伝子発現をモジュレートする方法
本発明は、a）本発明に従う遺伝子発現モジュレーション系を宿主細胞に導入する段階；およびb）リガンドを宿主細胞に導入する段階を含む、宿主細胞における関心対象遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、関心対象遺伝子がi）遺伝子発現系のDNA結合ドメインによって認識されるドメインを含む応答エレメント；ii）遺伝子発現系のトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター；およびiii）その発現がモジュレートされる関心対象遺伝子、を含む遺伝子発現カセットの成分であり、それによってリガンドが宿主細胞に導入されると、関心対象遺伝子の発現がモジュレートされる方法を提供する。
【０２００】
本発明はまた、a）本発明に従う遺伝子発現モジュレーション系を宿主細胞に導入する段階；b）i）遺伝子発現系からのDNA結合ドメインによって認識されるドメインを含む応答エレメント；ii）遺伝子発現系のトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター；およびiii）その発現がモジュレートされる関心対象遺伝子を含む、本発明に従う遺伝子発現カセットを宿主細胞に導入する段階、ならびにc）宿主細胞にリガンドを導入する段階を含み、リガンドが宿主細胞に導入されると、関心対象遺伝子の発現がモジュレートされる、宿主細胞における遺伝子の発現をモジュレートする方法も提供する。
【０２０１】
本明細書において開示される方法を用いて宿主細胞において発現させるための関心対象遺伝子は、内因性の遺伝子または外因性の遺伝子であってもよい。所望の遺伝子またはタンパク質に関する核酸またはアミノ酸配列情報は、多くの公共のデータベース、たとえばGENBANK、EMBL、Swiss-Prot、およびPIRの1つに、または多くの学術雑誌に存在しうる。次に、そのような情報を用いて本明細書において記述される方法において用いられる遺伝子発現カセット内に関心対象遺伝子を挿入するための所望の構築物を構築することができる。
【０２０２】
関心対象遺伝子の例には、中でも、ワクチンとして植物において産生される抗原、α-アミラーゼ、フィターゼ、グルカン、およびキシラナーゼのような酵素、昆虫、線虫、真菌、細菌、ウイルス、および非生物性ストレス、栄養剤、薬剤、ビタミン剤に対する抵抗性に関する遺伝子、アミノ酸含有量、除草剤抵抗性、低温、干ばつおよび高温耐性、工業産物、油、タンパク質、炭水化物、抗酸化剤、雄性不稔植物、花、燃料、他の産物特性を改変するための遺伝子、モノクローナル抗体、酵素、プロテアーゼ、サイトカイン、インターフェロン、インスリン、エリスロポエチン、毒素、凝固因子、他の血液因子もしくは成分、遺伝子治療のためのウイルスベクター、ワクチンのためのウイルス、薬物発見のための標的、機能的ゲノミクス、およびプロテオミクス分析および応用などの、状態、疾患、障害、機能障害、遺伝的欠損を処置するために用いられる可能性がある治療的に望ましいポリペプチドまたは産物をコードする遺伝子が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０２０３】
遺伝子発現／転写を測定する
本発明の方法の1つの有用な測定は、mRNA種などのRNAの同一性および量が含まれる、細胞の転写状態の測定である。そのような測定は、いくつかの既存の遺伝子発現技術のいずれかによってcDNA量を測定することによって簡便に行われる。
【０２０４】
核酸アレイ技術は、識別的mRNA発現を決定するための有用な技術である。そのような技術には、たとえば、オリゴヌクレオチドチップおよびDNAマイクロアレイが含まれる。これらの技術は、異なる遺伝子に対応するDNA断片もしくはオリゴヌクレオチド、または固相支持体に固定されて、細胞、組織、もしくは生物全体から抽出された総mRNAプールから調製されたプローブにハイブリダイズしてcDNAに変換されるcDNAに依存する。オリゴヌクレオチドチップは、フォトリソグラフィー技術を用いて基板上に合成されたオリゴヌクレオチドのアレイである。DNAマイクロアレイは、DNA試料のアレイであり、典型的に顕微鏡スライドガラス上にロボットによってプリントされたPCR産物である。各々の遺伝子は完全または部分長の標的DNA配列によって分析される。
【０２０５】
本発明の方法のもう1つの有用な測定は、当技術分野において公知のプロセスを用いて、細胞に存在する構成的タンパク質種の量を測定することによって、細胞の翻訳状態を決定することである。
【０２０６】
様々な生理機能に関連する遺伝子の同定が望ましいが、その中で細胞の生育、アポトーシス、老化、分化、接着、特異的分子に対する結合、もう1つの細胞に対する結合、細胞組織化、器官形成、細胞内輸送、輸送の促進、エネルギー変換、代謝、筋発生、神経発生、および／または造血などの機能の変化が測定されるアッセイを使用してもよい。
【０２０７】
加えて、選択可能なマーカーまたはレポーター遺伝子発現を用いて本発明を用いる遺伝子発現モジュレーションを測定してもよい。
【０２０８】
遺伝子発現産物を検出するための他の方法は当技術分野において周知であり、これにはサザンブロット（DNA検出）、ドットもしくはスロットブロット（DNA、RNA）、ノザンブロット（RNA）、RT-PCR（RNA）、ウェスタンブロット（ポリペプチド検出）およびELISA（ポリペプチド）分析が含まれる。標識タンパク質を用いてそれがハイブリダイズする特定の核酸配列を検出することができる。
【０２０９】
いくつかの場合において、核酸配列の量を増幅することが必要である。これは、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（「PCR」）、リガーゼ連鎖反応（「LCR」）、鎖置換増幅（「SDA」）、転写に基づく増幅等が含まれる多数の適した方法の1つまたは複数を用いて行われてもよい。PCRは、核酸試料が、ハイブリダイズする条件下で熱安定なDNAポリメラーゼの存在下でオリゴヌクレオチドプライマー対によって処置される公知の技術に従って行われる。
【０２１０】
全般的方法
本明細書において用いられた標準的な組換えDNAおよび分子クローニング技術は、当技術分野において周知であり、Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) (Maniatis)によって、T. J. Silhavy, M. L. Bennan, and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1984) によって、およびAusubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc, and Wiley-Interscience (1987)によって記述されている。
【０２１１】
細菌培養物の維持および生育にとって適した材料および方法は、当技術分野において周知である。以下の実施例において用いるために適した技術は、Manual of Methods for General Bacteriology（Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg and G. Briggs Phillips, eds.）、American Society for Microbiology, Washington, DC. (1994)）、またはThomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989)において記述されるように見いだされるであろう。全ての試薬、制限酵素、および宿主細胞の生育および維持のために用いられた材料は、特に明記していなければ、Aldrich Chemicals（Milwaukee, WI）、DIFCO Laboratories（Detroit, MI）、GIBCO/BRL（Gaithersburg, MD）、またはSigma Chemical Company（St. Louis, MO）から入手した。
【０２１２】
遺伝子配列の操作は、Genetics Computer Group Inc.（Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI）から入手可能なプログラム一式を用いて達成してもよい。
【０２１３】
省略語の意味は以下のとおりである：「h」は時間を意味し、「min」は分を意味し、「sec」は秒を意味し、「d」は日を意味し、「μL」はマイクロリットルを意味し、「mL」はミリリットルを意味し、「L」はリットルを意味し、「μM」はマイクロモル濃度を意味し、「mM」はミリモル濃度を意味し、「M」はモル濃度を意味し、「mol」はモルを意味し、「mmol」はミリモルを意味し、「μg」はマイクログラムを意味し、「mg」はミリグラムを意味し、「A」はアデニンまたはアデノシンを意味し、「T」はチミンまたはチミジンを意味し、「G」はグアニンまたはグアノシンを意味し、「C」はシチジンまたはシトシンを意味し、「×g」は重力の倍数を意味し、「nt」はヌクレオチドを意味し、「aa」はアミノ酸を意味し、「bp」は塩基対を意味し、「kb」はキロベースを意味し、「k」はキロを意味し、「μ」はマイクロを意味し、「℃」はセ氏温度を意味し、化学等式の状況における「C」はセ氏を意味し、「THF」はテトラヒドロフランを意味し、「DME」はジメトキシエタンを意味し、「DMF」はジメチルホルムアミドを意味し、「NMR」は核磁気共鳴を意味し、「psi」はポンド/平方インチを意味し、「TLC」は薄層クロマトグラフィーを意味し、「approx」はおよそを意味し、「calc」は計算を意味し、「cm」はセンチメートルを意味し、「EC50」は50％応答を与える有効濃度を意味し、「eq」は等量を意味し、「g」はグラムを意味し、「i.d.」は内径を意味し、「[M]」は分子量を意味し、「μmol」はマイクロモルを意味し、「N」は規定数を意味し、「nm」はナノメートルを意味し、「NMR」は、核磁気共鳴分光法を意味し、「nOe」は核オーバーハウザー効果を意味し、「NP」は順相を意味し、「ppm」は百万分率を意味し、「Rf」は保持因子を意味し、「RP」は逆相を意味し、「r.t.」は室温を意味し、「R.t.」は保持時間を意味し、「UV」は紫外線を意味し、「v/v」または「v/v/v」は体積／体積比を意味し、「w/v」は重量／体積比を意味し、および「λ」は波長を意味する。
【０２１４】
化合物の調製
化学物質および試薬
酸化銀（Ag2O）、ヨードメタン（CH3I）、ヨードエタン（CH3CH2I）、1-ヨードプロパン（CH3CH2CH2I）、1-ヨードブタン（CH3CH2CH2CH2I）、臭化アリル（CH2=CHCH2Br）、臭化ベンジル（C6H5CH2Br）、l-ブロモ-2-ブタノン（CH3CH2COCH2Br）、無水N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）、2,2-ジメトキシプロパン（DMP）、フェニルホウ酸（PBA）、一水和パラトルエンスルホン酸（p-TsOH）、テトラヒドロフラン（THF）、1,4-ジオキサン、メチルトリフレート（CF3SO2OCH3）、2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルピリジン（C14H23N）、およびp-アニスアルデヒドはAldrichから購入した。Celite（登録商標）は、BDHから購入した。Minisart（登録商標）フィルターは、Sartoriusから購入した。過酸化水素（H2O2）100倍量、硫酸（H2SO4）、塩酸（HCl）、酢酸（AcOH）、水酸化ナトリウム（NaOH）、アセトン、酢酸エチル（AcOEt）、ならびにHPLC-等級のメタノール（MeOH）、エタノール（EtOH）、クロロホルム（CHCl3）およびジクロロメタン（CH2Cl2）は、Fisher Scientificから購入した。メタノール-d4はGoss Scientific Instruments Ltdから購入した。20-ヒドロキシエクジソン（20E）は、Dr. V. Volodin, Institute of Biology, Russian Academy of Sciences, Syktyvkar, Russiaによって供給された。ポナステロンA（PoA）は、Dr. Rene Lafont, Universite Pierre et Marie Curieによって供給された。無水アセトンは、4Åの分子ふるい上での溶媒の貯蔵後に蒸留によって得た。
【０２１５】
全般的反応条件
無水反応条件は、試薬を導入する前に、真空下でシュレンク反応管をフレームドライして窒素またはアルゴン雰囲気を導入することによって、無水溶媒および液体を移すためにカニューレを用いることによって、および開始材料として使用されるステロイドを凍結乾燥させることによって、得た。Ag2Oを伴う反応は、シュレンク管をアルミニウムホイルで覆うことによって光から保護された。反応物を薄層クロマトグラフィー（TLC）および／または高速液体クロマトグラフィー（HPLC）のいずれかによってモニターした。TLCは、Merck HPTLCアルミニウムシート20×20 cmシリカゲル60 F254を用いて行った。プレートを、5％p-アニスアルデヒド/5％H2SO4のEtOH溶液に浸して加熱した後にUV光の下で可視化した。化合物の移動度をRf値として表記する（Rf＝化合物が移動した距離／溶媒の先端が移動した距離）。HPLCによる反応のモニタリングは、一定間隔で反応容器から等量の反応混合物を採取して、試料をMeOHによって反応停止させて、遠心して上清をMinisart（登録商標）0.20μmフィルターを通して濾過する必要があった。濾液を減圧下で濃縮して、30％MeOHのH2O溶液（v/v）に溶解して、DAD（以下のカラムの詳細を参照されたい）を備えた分析用C18-HPLCに注入して、30％〜100％MeOHのH2O溶液の直線勾配で25分間溶出させて、その後アイソクラティック100％MeOHによって流速1 mL/分で10分間溶出させて、λ＝242およびλ＝300 nmの双方でモニターして、示される特徴的な保持時間（R.t.）に基づくのみならず、特異的ピークの完全なUVスペクトルの検分によって異なる産物を同定した。
【０２１６】
単離、精製、および定量
Waters Sep-Pak（登録商標）Vac 35cc C18-10gカートリッジを粗反応混合物のプレ精製のために用いた。試料を5％MeOHのH2O溶液として適用した後、溶媒強度を増加させる（典型的に、30％、80％、および100％MeOHのH2O溶液）段階的勾配を用いて洗浄して、関心対象化合物を選択的に溶出した。単離および精製は、RPまたはNP-HPLCのいずれかによって行い、Gilson 170ダイオードアレイ検出器（DAD）またはGilson単波長Holochrome/115 UV検出器のいずれかによって、流出液を、ステロイド発色団の存在に関して242 nmでモニターした。分析用HPLCは、C18カラム（Phenomenex Sphereclone ODS2、5 μm、150×4.60 mm、もしくはPhenomenex Prodigy ODS2、5 μm、250×4.60 mm）、C6カラム（Phenomenex Sphereclone、5 μm、150×4.60 mm）、ジオールカラム（Jones Apex II Diol、5 μm、150×4.60 mm 、もしくはGRACE Apex II Diol、5 μm、150×4.60 mm）、またはシリカカラム（Zorbax Sil、5 μm、250×4.60 mm）のいずれかによって流速1 mL/分で行った。セミ分取HPLCは、C18カラム（Phenomenex Sphereclone ODS2、5 μm、250×10 mm）、シリカカラム（Zorbax Sil、5 μm、250×9.40 mm）、またはジオールカラム（GRACE Apex II、5 μm、150×8.00 mm）のいずれかによって流速2 mL/分で行った。分取HPLCはC18カラム（Phenomenex Sphereclone ODS2、5 μm、250×21.20 mm）によって流速5 mL/分で行った。14α-ヒドロキシ-7-エン-6-オン部分（ε、242 nmでの吸光度係数：12400 Lmol-1cm-1）またはダクリハイナンステロン様共役系（299 nmでのε：14190 Lmol-1cm-1）のいずれかを含有する化合物に関しては、定量を、Shimadzu UV-2401PCにおいて紫外線分光法によって行った。濃度はランバート-ベール等式に従って計算した。
【０２１７】
分光技術およびバイオアッセイ
核磁気共鳴（NMR）スペクトルは、プロトン周波数400 MHzおよび炭素周波数100 MHzで操作するBruker Avance/DRX 400 NMR分光計において、またはプロトン周波数300 MHzおよび炭素周波数75 MHzで操作するBruker ACF 300 NMR分光計のいずれかにおいて記録した。試料を、内部標準としてテトラメチルシランと共に重水素化メタノールに溶解した。ケミカルシフトを百万分率（ppm）として表記する。高解像度質量分析を、化学イオン化モード（CIMS）または陽イオン高速原子衝突質量分析（FABMS）モードのいずれかで行った。CIMSは、いずれの場合においても、試薬ガスとしてメタンをおよび溶媒としてメタノールを用いて直接入口プローブを備えたMicromass GCT分光計または直接入口プローブを備えたJeol MS700分光計のいずれかにおいて記録した。FABMSは、試薬ガスとしてキセノンを用いておよびマトリクスとして「魔法の弾丸（Magic Bullet）」（1,4-ジチオ-L-スレイトールと1,4-ジチオエリスリトールの4：1混合物）を用いて、Jeol MS700分光計において、またはグリセロールマトリクスおよびメタノールを溶媒として用いてVG Quattro質量分析計において記録した。
【０２１８】
20E 2,3-アセトニドの調製
0005777890.tif 000011
20E（197.7 mg、411.9μmol）およびPBA（58.6 mg、480μmol）を無水DMF（4.5 mL）に溶解して、混合物を無水条件下で室温で1時間撹拌した。縮合p-TsOH（39.3 mg、0.5等量、窒素雰囲気下で融解状態に達するまでブンセンバーナーの火で緩やかに加熱することにより結晶水を除去することによって一水和p-TsOHから調製）およびDMP（2.3 mL）の無水アセトン溶液（4.6 mL）を加えて、混合物を3時間撹拌した。アセトンおよびDMPを減圧下で除去して、混合物をAcOEt（20 mL）によって希釈して、塩水（3×10 mL）によって洗浄し、有機溶媒を減圧下で除去した。THF/H2O2 9：1 v/v（0.1 N NaOHによって予め中和したH2O2、100容量）15 mLを残渣に加えて、混合物を中性pH（pHは自然に低下して、20E 2,3-アセトニドの20Eへの再変換を引き起こす）を維持しながら室温で2.5時間撹拌した。THFをロータリーエバポレーションによって除去して、混合物を25％MeOH/H2O溶液に懸濁して、0℃に冷却した。懸濁液をコットンウールを通して濾過することによって沈殿物を収集して、MeOHに溶解した後ロータリーエバポレーションによって残渣を回収すると純粋な20E 2,3-アセトニド（138.5 mg、収率＝65％）が得られた。
【０２１９】
20E 22-メチルエーテルの調製
0005777890.tif 000012
Ag2O（207.0 mg、10等量）およびCH3I（90μL、15等量）を20E 2,3-アセトニド（48.0 mg、92.3μmol）の無水DMF溶液1.3 mLに加えて、混合物を室温で無水条件で撹拌した。反応の2.5時間後、混合物を以下のように仕上げた（worked up）：AcOEt（25 mL）を加えて、混合物をCelite（登録商標）パッドを通して濾過して、パッドをAcOEt（150 mL）によって洗浄して、溶媒をロータリーエバポレートした。粗反応混合物をC18 Sep-Pak（登録商標）を用いてプレ精製して、産物を、セミ分取C18-HPLC系によってアイソクラティック70％MeOH/H2Oによって精製すると、22-メチルエーテル20E 2,3-アセトニド24.1 mg（49％）（R.t＝23分）が得られた。2,3-イソプロピリデン基の除去は以下のように行った：HCl水溶液（0.1 M、1.0 mL）を産物の1,4-ジオキサン（1.0 mL）溶液に滴下して加えて、混合物を室温で撹拌した。反応の2.5時間後、混合物を5％1,4-ジオキサン/H2O溶液に希釈してC18 Sep-Pak（登録商標）によってプレ精製した。次に、所望の産物をセミ分取C18-HPLC（58％MeOH/H2O）によって精製すると、20E 22-メチルエーテル（R.t＝17分）22 mg（48％）が得られた。完全な特徴決定は400MHz NMR分析（表3a〜3e）およびCIMSによって行った。
0005777890.tif 000013
【０２２０】
20E 2-メチルエーテルおよび20E 3-メチルエーテルの調製
0005777890.tif 000014
Ag2O（116.0 mg、10等量）を新たに調製した20E 20,22-フェニルボロネート（30 mg、53μmol）のDMF溶液（2 mL）に加えた。CH3I（258μL、44.7等量）を反応のあいだに4回に分けて加えて、混合物を無水条件で室温で撹拌した。4時間後、さらにAg2O（10等量）を加えて、混合物を全体で7.5時間撹拌し続けた。20E 2,3-アセトニドの調製に関して記載したように、反応物を仕上げて、フェニルボロネート基を除去した。予想産物を、セミ分取C18-HPLC系を用いてアイソクラティック50％MeOH/H2Oによって精製したところ、20E 3-メチルエーテルは20分後に溶出し（6 mg、25％）、20E 2-メチルエーテルは23分後に溶出した（13 mg、50％）。完全な特徴決定は、400 MHz NMR分析（表3a〜3e）およびCIMS（20E 2-メチルエーテル
0005777890.tif 000015
）によって行った。
【０２２１】
20E-2,3;20,22-ジアセトニドの調製
0005777890.tif 000016
20E（236 mg、492 μmol）を、無水条件で無水アセトン（10 mL）に溶解した。無水DMF（0.5 mL）も同様に溶解を助けるために加えた。縮合p-TsOH（51 mg、0.2等量；前述のように調製）およびDMP（0.2 mL）を反応容器に移して、混合物を窒素流において室温で6時間撹拌した。溶媒を減圧下で部分的に除去して、残りの溶液をAcOEt（100 mL）に加えて、H2O（50 mL）によって洗浄した後、飽和NaCl溶液（3×50 mL）によって洗浄した。有機相をTLC（CHCl3/MeOH；15：1、v/v；Rf 20E 2,3,20,22-ジアセトニド＝0.35；Rf 20E 20,22-モノアセトニド＝0.13）および分析用C18-HPLCによって分析すると、20E 2,3,20,22-ジアセトニド（R.t.＝23.2）および20E 20,22-モノアセトニド（R.t.＝19.5分）の双方で構成された。2つの産物の単離を、シリカゲル（Merck, Kieselgel 60）オープンカラム（内径2.5×25 cm）クロマトグラフィーによって行い、CH2Cl2/MeOH（17：1、v/v）によって前者の化合物79.7 mg（29％）が溶出し、CH2Cl2/MeOH（13：1、v/v）によって後者の化合物142.4 mg（52％）が溶出した。特徴決定はNMRおよびCIMS分析によって行い、データが文献値（ecdybase.org.）と一致していることを確認した。
【０２２２】
20E 14-メチルエーテルの調製
0005777890.tif 000017
Ag2O（324.4 mg、20等量）およびCH3I（260μL、60等量）を2,3,20,22-ジアセトニド（39.3 mg、70.2μmol）溶液に加えて、混合物を60℃で無水条件下で撹拌した。3時間後、20E 22-メチルエーテルに関して記載したように反応混合物を仕上げた。アセトニド基の除去は、粗反応混合物を1,4-ジオキサン（1 mL）に溶解する段階、70％AcOH水溶液（10 mL）を加える段階、および80℃で8時間還流する段階の後に、加熱をやめて反応物を終夜撹拌する段階によって行われた。次に、反応混合物をH2O（50 mL；1-ブタノールによって予め飽和）によって希釈した後、1-ブタノール（4×50 mL；H2Oによって予め飽和）によって洗浄した。合わせた有機相を減圧下で蒸発させて、残渣をC18-HPLC（50％MeOH/H2O）によって精製すると、20E 14-メチルエーテル（R.t.＝21分）4.5 mg（13％）が得られた。完全な特徴決定は、400 MHz NMR分析（表3a〜3e）およびCIMS
0005777890.tif 000018
によって行った。
【０２２３】
20E 25-メチルエーテルおよび20E 22,25-ジメチルエーテルの調製
0005777890.tif 000019
ジ-tert-ブチル-4-メチル-ピリジン（88.8 mg、6等量）およびメチルトリフレート（47μL、6等量）を20E 2,3-アセトニド（37.5 mg、72.1 μmol）の無水CH2Cl2溶液（3 mL）に加えて、混合物を無水条件下で室温で撹拌した。55時間後、メチルトリフレートを真空下で除去して、残渣を、中和および2,3-アセトニド基の除去のためにHCl（0.1 M）：1,4-ジオキサン1：1（v/v）によって処置した。所望の産物の精製を、アイソクラティック60％MeOH/H2Oを用いる分取C18-HPLC系によって行い、それにより20E 25-メチルエーテル（R.t.＝20.1分）11.15 mg（31％）および20E 22,25-ジメチルエーテル（R.t.＝42.0分）5.63 mg（15％）が収集された。2つの化合物の特徴決定は、300 MHz NMR分析（表3a〜3e）およびFAB-MS（20E 25-メチルエーテル
0005777890.tif 000020
）によって行った。
【０２２４】
20E 22-エチルエーテルの調製
0005777890.tif 000021
Ag2O（534 mg、40等量）およびCH3CH2I（92μL、20等量）を20E 2,3-アセトニド（30 mg、57.7μmol）の無水DMF溶液（2 mL）に加えて、反応物を室温にて無水条件下で撹拌した。28時間後、20E 22-メチルエーテルに関して記載したように、反応物を仕上げて2,3-アセトニド基を除去した。予想産物の精製をアイソクラティック70％MeOH/H2Oを用いるセミ分取C18-HPLCによって行うと、これはR.t.＝12分で溶出し、次にアイソクラティックCH2Cl2/イソプロパノール/H2O（125/30/2、v/v/v）を用いるセミ分取シリカカラムによって行うと、これはR.t.＝19.6分で溶出して、20E 22-エチルエーテル5.5 mg（19％）が得られた。完全な特徴決定は、400 MHz NMR分析（表3a〜3e）およびCIMS
0005777890.tif 000022
によって行った。
【０２２５】
20E 22-n-プロピルエーテルの調製
0005777890.tif 000023
Ag2O（208 mg、10等量）およびCH3(CH2)3I（187μL、20等量）を20E 2,3-アセトニド（50 mg、96.1μmol）の無水DMF（2 mL）溶液に加えて、反応物を無水条件下で室温で撹拌した。8時間後、さらにCH3CH2CH2I（20等量）を加えた。24時間後、20E 22-メチルエーテルに関して記載したように、反応物を仕上げて2,3-アセトニド基を除去した。予想産物の精製をアイソクラティック70％MeOH/H2Oを用いるセミ分取C18-HPLCによって行うと、これはR.t.＝18分で溶出して、20E 22-n-プロピルエーテル11.6 mg（23％）が得られた。完全な特徴決定は、400 MHz NMR分析（表3a〜3e）およびCIMS
0005777890.tif 000024
によって行った。
【０２２６】
20E 22-n-ブチルエーテルの調製
0005777890.tif 000025
Ag2O（649.7 mg、40等量）およびCH3(CH2)2I（239μL、30等量）を20E 2,3-アセトニド（36.4 mg、70.1μmol）の無水DMF（3 mL）溶液に加えて、反応物を無水条件下で室温で撹拌した。8時間後、さらにCH3CH2CH2I（20等量）を加えた。45時間後、20E 22-メチルエーテルに関して記載したように、反応物を仕上げて2,3-アセトニド基を除去した。予想産物の精製をアイソクラティック75％MeOH/H2Oを用いる分取C18-HPLCによって行うと、これはR.t.＝33分で溶出して、20E 22-n-ブチルエーテル11.1 mg（30％）が得られた。完全な特徴決定は、300 MHz NMR分析（表3a〜3e）およびFAB-MS
0005777890.tif 000026
によって行った。
【０２２７】
20E 22-(28R,S)-2'-エチルオキシラニルエーテルの調製
0005777890.tif 000027
Ag2O（790.0 mg、40等量）およびCH3CH2COCH2Br（391μL、45等量）を20E 2,3-アセトニド（44.3 mg、85.2μmol）の無水DMF（4 mL）溶液に加えて、反応物を無水条件下で室温で撹拌した。72時間後、20E 22-メチルエーテルに関して記載したように、反応物を仕上げて2,3-アセトニド基を除去した。予想産物の精製を、最初にアイソクラティック75％MeOH/H2O系を用いる分取C18-HPLCによって行うと、これはR.t.＝21分で溶出して、次にアイソクラティック70％MeOH/H2Oを用いて行うと、これはR.t.＝30分で溶出し、20E 22-(28R,S)-2'-エチルオキシラニルエーテル5.0 mg（11％）が得られた。完全な特徴決定は、300 MHz NMR分析（表3a〜3e）およびFAB-MS
0005777890.tif 000028
によって行った。
【０２２８】
20E 22-アリルエーテルの調製
0005777890.tif 000029
Ag2O（137.7 mg、10等量）およびCH2=CHCH2Br（75μL、15等量）を20E 2,3-アセトニド（30.9 mg、59.4μmol）の無水DMF（2 mL）溶液に加えて、反応物を無水条件下で室温で撹拌して、TLC（CHCl3/MeOH；10：1、v/v；Rf 20E 2,3-アセトニド＝0.16；Rf 22-アリル20E 2,3-アセトニド＝0.33）によってモニターした。26時間後、20E 22-メチルエーテルに関して記載したように、反応物を仕上げて2,3-アセトニド基を除去した。予想産物の精製をアイソクラティック70％MeOH/H2O系を用いる分取C18-HPLCによって行うと、これはR.t.＝26分で溶出して、20E 22-アリルエーテル11.6 mg（38％）が得られた。完全な特徴決定は、300 MHz NMR分析（表3a〜3e）およびFAB-MS
0005777890.tif 000030
によって行った。
【０２２９】
20E 22-ベンジルエーテルの調製
0005777890.tif 000031
Ag2O（139.5 mg、10等量）およびC6H5CH2Br（107μL、15等量）を20E 2,3-アセトニド（31.3 mg、60.2μmol）の無水DMF（2 mL）溶液に加えて、反応物を無水条件下で室温で撹拌して、TLC（CHCl3/MeOH；10：1、v/v；Rf 22-ベンジル20E 2,3-アセトニド＝0.36）によってモニターした。72時間後、20E 22-メチルエーテルに関して記載したように、反応物を仕上げて2,3-アセトニド基を除去した。予想産物の精製をアイソクラティック70％MeOH/H2O系を用いる分取C18-HPLCによって行うと、これはR.t.＝48分で溶出して、20E 22-ベンジルエーテル3.0 mg（9％）が得られた。完全な特徴決定は、400 MHz NMR分析（表3a〜3e）およびFAB-MS
0005777890.tif 000032
によって行った。
【０２３０】
20E 2,22-ジメチルエーテルおよび20E 3,22-ジメチルエーテルの調製
0005777890.tif 000033
Ag2O（538 mg、10等量）およびCH3I（210μL、15等量）を20E（108 mg、225μmol）の無水DMF（3 mL）溶液に加えて、反応物を無水条件下で室温で撹拌した。1.5時間後、さらにAg2O 10等量およびCH3I 15等量を加えて、5時間後、混合物を、20E 22-メチルエーテルに関して記載したように仕上げた。予想産物の精製をアイソクラティック60％MeOH/H2Oを用いるセミ分取C18-HPLCによって行うと、20E 3,22-ジメチルエーテルが21分後に溶出して（28.4 mg、25％）、20E 2,22-ジメチルエーテルが24分後（45.8 mg、40％）に溶出した。完全な特徴決定は、400 MHz NMR分析（表3a〜3e）およびCIMS（20E 2,22-ジメチルエーテル：
0005777890.tif 000034
20E 3,22-ジメチルエーテル：
0005777890.tif 000035
）によって行った。
【０２３１】
20E 14,22-ジメチルエーテルの調製
0005777890.tif 000036
Ag2O（84.7 mg、10等量）およびCH3I（48μL、20等量）を20E 2,3-アセトニド（19.0 mg、36.5μmol）の無水DMF（1.5 mL）溶液に加えて、反応物を無水条件下で室温で撹拌した。反応の21時間後、さらにAg2O（3×10等量）およびCH3I（3×20等量）を10時間の間隔で加えた。51時間後20E 22-メチルエーテルに関して記載したように、反応物を仕上げて2,3-アセトニド基を除去した。精製を、最初にアイソクラティック60％MeOH/H2Oを用いるセミ分取C18-HPLCによって行うと、R.t.＝18分で主要なピーク1.9 mgが収集され、その後アイソクラティックCH2Cl2/イソプロパノール/H2O（160：30：1.5、v/v/v）を用いるセミ分取シリカカラムによって精製を行うと、20E 14,22-ジメチルエーテルは16.3分後に溶出して、収率は1.0 mg（6％）であった。完全な特徴決定は、400 MHz NMR分析（表3a〜3e）およびCIMS
0005777890.tif 000037
によって行った。
【０２３２】
20E 2,3,14,22-テトラメチルエーテルの調製
0005777890.tif 000038
Ag2O（1.745 g、23等量）およびCH3I（1.175 mL、60等量）を20E（155 mg、324μmol）の無水DMF（4.0 mL）溶液に加えて、反応物を無水条件下で室温で撹拌した。12時間後、さらにAg2O 19等量およびCH3I 60等量を加えて、反応の20時間後にさらにCH3I 60等量を加えた。合計36時間後、反応物を、20E 22-メチルエーテルに関して記載したように仕上げた。精製をアイソクラティック70％MeOH/H2Oを用いるセミ分取C18-HPLCによって行うと、20E 2,3,14,22-テトラメチルエーテルが19分後に溶出して収率は51 mg（30％）であった。特徴決定は、400 MHz NMR分析（表3a〜3e）およびCIMS
0005777890.tif 000039
によって行った。nOe実験は、20Eと同様にC-14で立体化学を確認した（H-9での電磁波照射により14-OMeシグナルの2.2％の増強を生じた）。
【０２３３】
PoA 22メチルエーテルおよびPoA 14,22-ジメチルエーテルの調製
0005777890.tif 000040
Ag2O（960.0 mg、40等量）およびCH3I（129μL、20等量）をPoA 2,3-アセトニド（52.2 mg、135.5μmol）の無水DMF（3.5 mL）溶液に加えて、反応物を無水条件下で室温で撹拌した。23時間後、20E 22-メチルエーテルに関して記載したように、反応物を仕上げて2,3-アセトニド基を除去した。予想産物の精製をアイソクラティック65％MeOH/H2Oを用いるセミ分取C18-HPLCによって45分間行うと、PoA 22-メチルエーテル（R.t.＝42分）3.0 mg（6％）が収集されて、その後MeOH 5 mLを複数回注入すると、ジメチル化化合物が溶出して、これをアイソクラティック75％MeOH/H2Oを用いる分取C18-HPLCによって精製した（3.8 mg、8％）。完全な特徴決定は、300 MHz NMR分析（表3a〜3e）およびCIMS（PoA 22-メチルエーテル：
0005777890.tif 000041
PoA 14,22-ジメチルエーテル：
0005777890.tif 000042
）によって行った。
【０２３４】
ダクリハイナンステロン22-メチルエーテルの調製
0005777890.tif 000043
ダクリハイナンステロン22-メチルエーテルは、PoA 2,3-アセトニド（61.0 mg、121.0μmol）とAg2O（278.0 mg、10等量）およびCH3I（121μL、15等量）の無水DMF溶液（1.7 mL）との46時間のメチル化反応の副産物として得られた。ダクリハイナンステロン様共役系（λmax＝299 nm）がλ＝300 nmでのDADモニタリングを伴うHPLCによって検出された。産物をアイソクラティック75％MeOH/H2Oを用いる分取C18-HPLCによって精製した後（R.t.＝24.7分）、アイソクラティック65％MeOH/H2Oを用いるセミ分取C18-HPLCによって精製して（R.t.＝26.9分）、ダクリハイナンステロン22-メチルエーテル1.7 mg（3％）を得た。完全な特徴決定は、300 MHz NMR分析（表3a〜3e）およびCIMS（ダクリハイナンステロン22-メチルエーテル：
0005777890.tif 000044
によって行った。
【０２３５】
PoA 2-メチルエーテル、PoA 14-メチルエーテル、PoA 2,22-ジメチルエーテルおよびPoA 3,22-ジメチルエーテルの調製
0005777890.tif 000045
Ag2O（590.0 mg、10等量）およびCH3I（238μL、15等量）をPoA（118.1 mg、254.6 μmol）の無水DMF溶液（3.3 mL）に加えて、反応物を無水条件下で室温で撹拌した。反応を18時間後に停止させPoA 2,22-メチルエーテルを得るか、または46時間後に停止させて他の全ての産物を得た。全ての場合において、20E 22-メチルエーテルに関して記載したように仕上げた。予想産物の精製をアイソクラティック75％MeOH/H2Oを用いる分取C18-HPLCによって行うと、6％ PoA 2-メチルエーテル（R.t.＝20.2分）、2％PoA 14-メチルエーテル（R.t.＝24.7分）、16.0％PoA 2,22-メチルエーテル（R.t.＝39.7分）、および7％PoA 3,22-メチルエーテル（R.t.＝32.9分）が収集された。完全な特徴決定は、300 MHz NMR分析（表3a〜3e）およびCIMS（PoA 2-メチルエーテル：
0005777890.tif 000046
PoA 14-メチルエーテル：
0005777890.tif 000047
PoA 3,22-ジメチルエーテル：
0005777890.tif 000048
PoA 2,22-ジメチルエーテル：
0005777890.tif 000049
）によって行った。
【０２３６】
異なるHPLC溶媒系での20Eの様々なエーテル誘導体に関するHPLCの保持時間を表1および2に示す。合成された各化合物に関して得られたNMRデータを表3a〜3eに要約する。
【０２３７】
（表１）20Eアルキルエーテル誘導体のRP-およびNP-HPLC保持時間a
0005777890.tif 000050
a 保持時間を分で表す。
方法 A：C18-RP-HPLC（150×4.6 mm、5 mm粒子径、勾配30％〜100％メタノール/水で25分、流速＝1 mL/分、λ＝242 nm）
方法 B：C6-RP-HPLC（150×4.6 mm、5 mm粒子径、勾配30％〜100％メタノール/水で25分、流速＝1 mL/分、λ＝242 nm）
方法 C：ジオールNP-HPLC（150×4.6 mm、5 mm粒子径、勾配2％〜10％メタノール/ジクロロメタンで20分、流速＝1 mL/分、λ＝242 nm）
方法 D：ジオールNP-HPLC（150×4.6 mm、5 mm粒子径、勾配4％〜10％メタノール/ジクロロメタンで20分、流速＝1 mL/分、λ＝242 nm）。
【０２３８】
（表２）PoAアルキルエーテル誘導体のRP-およびNP-HPLC保持時間a
0005777890.tif 000051
a 保持時間を分で表す。
方法 A：C18-RP-HPLC（150×4.6 mm、5 mm粒子径、勾配30％〜100％メタノール/水で25分、流速＝1 mL/分、λ＝242 nmおよび300 nm）
方法 B：C6-RP-HPLC（150×4.6 mm、5 mm粒子径、勾配30％〜100％メタノール/水で25分、流速＝1 mL/分、λ＝242 nmおよび300 nm）
方法 C：Apex IIジオールNP-HPLC（150×4.6 mm、5 mm粒子径、アイソクラティック2％メタノールのジクロロメタン溶液、流速＝1 mL/分、λ＝242 nmおよび300 nm）。
【０２３９】
（表３ａ）モノメチル20E誘導体のNMRデータ
0005777890.tif 000052
0005777890.tif 000053
0005777890.tif 000054
試料をメタノール-d4に溶解した。ケミカルシフトを百万分率（ppm）で表記する。u.s.s.：溶媒シグナル下。
a ：400 MHzで収集した1H-NMR、100 MHzで収集した13C-NMR。
b ：300 MHzで収集した1H-NMR、75 MHzで収集した13C-NMR。
* ：20Eに関する文献データ（www.ecdybase.org）と比較して割付。
【０２４０】
（表３ｂ）20Eのマルチメチル誘導体のNMRデータ
0005777890.tif 000055
0005777890.tif 000056
0005777890.tif 000057
試料をメタノール-d4に溶解した。ケミカルシフトを百万分率（ppm）で表記する。u.s.s.：溶媒シグナル下。
a ：400 MHzで収集した1H-NMR、100 MHzで収集した13C-NMR。
b ：300 MHzで収集した1H-NMR、75 MHzで収集した13C-NMR。
* ：20Eに関する文献データ（www.ecdybase.org）と比較して割付。
【０２４１】
（表３ｃ）20Eの22-アルキル化誘導体のNMRデータ
0005777890.tif 000058
0005777890.tif 000059
試料をメタノール-d4に溶解した。ケミカルシフトを百万分率（ppm）で表記する。u.s.s.：溶媒シグナル下。
a ：400 MHzで収集した1H-NMR、100 MHzで収集した13C-NMR。
b ：300 MHzで収集した1H-NMR、75 MHzで収集した13C-NMR。
* ：20Eに関する文献データ（www.ecdybase.org）と比較して割付。
【０２４２】
（表３ｄ）20Eの他の22-置換誘導体のNMRデータ
0005777890.tif 000060
0005777890.tif 000061
0005777890.tif 000062
試料をメタノール-d4に溶解した。ケミカルシフトを百万分率（ppm）で表記する。u.s.s.：溶媒シグナル下。
a ：400 MHzで収集した1H-NMR、100 MHzで収集した13C-NMR。
b ：300 MHzで収集した1H-NMR、75 MHzで収集した13C-NMR。
* ：20Eに関する文献データ（www.ecdybase.org）と比較して割付。
【０２４３】
（表３ｅ）PoAのメチル化誘導体のNMRデータ
0005777890.tif 000063
0005777890.tif 000064
0005777890.tif 000065
300 MHzで収集した1H-NMR、75 MHzで収集した13C-NMR。試料をメタノール-d4に溶解した。ケミカルシフトを百万分率（ppm）で表記する。u.s.s.：溶媒シグナル下。
*：PoAに関する文献データ（www.ecdybase.org）と比較して割付。
**：ダクリハイナンステロンに関する文献データ（www.ecdybase.org）と比較して割付。
【０２４４】
バイオアッセイ
合成および精製された化合物を全て、エクジステロイド受容体に対するその親和性を査定するためにBIIバイオアッセイにおいて試験した。インビトロバイオアッセイにおけるステロイド応答性を、キイロショウジョウバエBII細胞株を用いて行った。アッセイは、代謝および輸送の曖昧さがほとんどないことが知られている。これは、エクジステロイド受容体複合体を発現しかつエクジステロイドに対して特徴的な応答を示すショウジョウバエのl(2)mbn腫瘍性血液細胞株に基づいており、この応答は濁度測定によって測定される。正常な条件では、細胞は有糸分裂を受けて均一な被膜の小さな細胞を形成する。ステロイドアゴニストに曝露されると、細胞は肥大して貪食を受け、密度の高い細胞塊のように見え；したがって吸光度が低下する。アンタゴニストはこの応答を阻止し、それにより細胞密度の増加をもたらし；吸光度は20E処置対照と比較して増加する。バイオアッセイを行うため、試験される化合物を10-3 M〜10-10 Mのいくつかの濃度の20μLアリコートで96ウェルマイクロタイタープレート（Nalge Nunc, Hereford, UK）のウェルに加える。アンタゴニスト活性に関して試験するために濃度5×10-8 Mの20Eの20μLアリコートをウェルに加えた。プレートを25℃で6〜7日間インキュベートして、405 nmでの吸光度を測定するプレートリーダー（Anthos htll, Anthos Labtec, Salzburg, Austria）を用いて応答を定量的に測定した。アッセイの結果を表4に示す。
【０２４５】
（表４）BIIバイオアッセイの結果
0005777890.tif 000066
【０２４６】
遺伝子発現カセットの調製
本実施例は、核内受容体に基づく誘導型遺伝子発現系において用いるためのグループH核内受容体ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む遺伝子発現カセットの構築を説明する。出願人は、ハマキガであるトウヒノシントメハマキEcR（CfEcR）に基づく遺伝子発現カセットを構築した。調製された受容体構築物は、EcRのリガンド結合ドメイン、またはヒト（Homo sapiens）RXRβ-LmUSPもしくはハツカネズミRXRβのキメラ、およびGAL4 DNA結合ドメイン（DBD）またはVP16トランス活性化ドメイン（AD）を含む。レポーター構築物には、Gal4 DBDが結合する対象であるGAL4応答エレメントを含む合成プロモーター構築物に機能的に連結した、レポーター遺伝子ルシフェラーゼが含まれる。
【０２４７】
3.1−GAL4CfEcR-DEF/VP16-βRXREF-LmUSPEF：ハマキガであるトウヒノシントメハマキEcRの野生型D、E、およびFドメイン（「CfEcR-DEF」：SEQ ID NO: 1）をGAL4 DNA結合ドメイン（「Gal4DNABD」または「Gal4DBD」；SEQ ID NO: 2）に融合させて、CMVプロモーター（SEQ ID NO: 3）の制御下に配置した。ヒトRXRβからのEFドメインのヘリックス1〜8（「HsRXRβ-EF」；SEQ ID NO:4のヌクレオチド1〜465位）およびトノサマバッタのウルトラスピラクルタンパク質のEFドメインのヘリックス9〜12（「LmUSP-EF」：SEQ ID NO:5のヌクレオチド403〜630位）をVP 16のトランス活性化ドメイン（「VP 16AD」：SEQ ID NO: 6）に融合させて、SV40eプロモーター（SEQ ID NO: 7）の制御下に配置した。5つのコンセンサスGAL4応答エレメント結合部位（「5XGAL4RE」：SEQ ID NO:8を含むGAL4REの5コピーを含む）を合成TATA最小プロモーター（SEQ ID NO:9）に融合させて、ルシフェラーゼレポーター遺伝子（SEQ ID NO:10）の上流に配置した。
【０２４８】
3.2−GAL4/変異体CfEcR-DEF/VP16-βRXREF-LmUSPEF：この構築物は、上記のスイッチ3.1と同じように調製されたが、ただし野生型CfEcR-DEFは、表5から選択される置換変異を含むリガンド結合ドメインを含む変異体CfEcR-DEFと交換した。
【０２４９】
3.3−GAL4/AaEcR-DEF/VP16-βRXREF-LmUSPEF：この構築物は、上記のスイッチ3.1と同じように調製されたが、ただし野生型CfEcR-DEFは、蚊のネッタイシマカEcRの野生型DEFドメイン（「AaECR-DEF」：SEQ ID NO: 11）と交換した。
【０２５０】
3.4−GAL4/AmaEcR-DEF/VP16-βRXREF-LmUSPEF：この構築物は、上記のスイッチ3.1と同じように調製されたが、ただし野生型CfEcR-DEFは、マダニであるマダニEcRの野生型DEFドメイン（「AmaEcR-DEF」；SEQ ID NO:12）と交換した。
【０２５１】
3.5−GAL4/BaEcR-DEF/VP16-βRXREF-LmUSPEF：この構築物は、上記のスイッチ3.1と同じように調製されたが、ただし野生型CfEcR-DEFは、コナジラミであるシルバーリーフコナジラミEcRの野生型DEFドメイン（「BaEcR-DEF」；SEQ ID NO:13）と交換した。
【０２５２】
3.6−GAL4/DmEcR-DEF/VP16-βRXREF-LmUSPEF：この構築物は、上記のスイッチ3.1と同じように調製されたが、ただし野生型CfEcR-DEFは、ショウジョウバエであるキイロショウジョウバエEcRの野生型DEFドメイン（「DmEcR-DEF」；SEQ ID NO:14）と交換した。
【０２５３】
3.7−GAL4/MsEcR-CDEF/VP16-βRXREF-LmUSPEF：この構築物は、上記のスイッチ3.1と同じように調製されたが、ただし野生型CfEcR-DEFは、タバコスズメガであるタバコスズメガEcRの野生型CDEFドメイン（「MsEcR-DEF」；SEQ ID NO:15）と交換した。
【０２５４】
3.8−GAL4/NcEcR-DEF/VP16-βRXREF：この構築物は、上記のスイッチ3.1と同じように調製されたが、ただし野生型CfEcR-DEFは、ヨコバイであるツマグロヨコバイEcRの野生型DEFドメイン（「NcEcR-DEF」；SEQ ID NO:16）と交換し、βRXREF-LmUSPEFは、ハツカネズミRXRβ（SEQ ID NO:18）と交換した。
【０２５５】
3.9−GAL4/TmEcR-DEF/VP16-βRXREF：この構築物は、上記のスイッチ3.1と同じように調製されたが、ただし野生型CfEcR-DEFは、ゴミムシダマシであるチャイロコメノゴミムシダマシEcRの野生型DEFドメイン（「TmEcR-DEF」；SEQ ID NO:17）と交換し、βRXREF-LmUSPEFは、ハツカネズミのRXRβ（SEQ ID NO:18）と交換した。
【０２５６】
（表５）トウヒノシントメハマキエクジステロイド受容体（「CfEcR」）リガンド結合ドメイン（LBD）の置換変異体
0005777890.tif 000067
【０２５７】
EcRリガンド結合を改変する努力において、分子モデリング分析に基づいてリガンド結合にとって重要であると予測されたEcRリガンド結合ドメイン内の残基を、異なるクラスの生物からのEcRにおいて変異させた。表5は、ステロイドおよび非ステロイド結合の改変のために変異させて調べたCfEcR（鱗翅目EcR）のリガンド結合ドメイン内のアミノ酸残基を示す。
【０２５８】
表5において記載されるアミノ酸置換変異の1つずつを、PCR媒介部位特異的変異誘発によってEcR cDNAにおいて構築した。CfEcRのアミノ酸V96をトレオニンに変異させて、CfEcRのアミノ酸V107をイソロイシンに変異させ、CfEcRのアミノ酸N119をフェニルアラニンに変異させ、およびCfEcRのアミノ酸Y127をグルタミン酸に変異させた。CfEcRの点突然変異体も同様に作出した：V96TおよびN119F置換を含む変異体（V96T＋N119F）と、V107IおよびY127E置換を含む第二の変異体（V107I＋Y127E）。
【０２５９】
PCR部位特異的変異誘発を、以下の反応条件およびサイクリングパラメータを用いてQuikchange部位特異的変異誘発キット（Stratagene, La Jolla, CA）を用いて行った。PCR部位特異的変異誘発は、1×反応緩衝液（製造元から供給）、dsDNA鋳型50 ng、フォワードプライマー（FP）125 ng、リバース相補的プライマー（RCP）125 ng、およびdNTPミクス（製造元から供給）1μLを用いて最終反応容積50μLで行った。各EcR変異体を産生するために用いられるフォワードプライマーおよびリバース相補的プライマーを、表6に表す。用いられるサイクリングパラメータは、95℃で30秒間の変性1サイクルの後に95℃で30秒間の変性16サイクル、55℃で1分間のアニール、および68℃で22分間の伸長からなった。
【０２６０】
（表６）置換変異体CfEcRリガンド結合ドメイン構築のためのPCRプライマー
0005777890.tif 000068
【０２６１】
変異体EcRリガンド結合ドメインをコードする、得られたPCR核酸産物それぞれを、次に上記の実施例3.2に記載のGAL4 DNA結合ドメインに融合させた。GAL4/変異体EcR受容体構築物を、本発明の様々なリガンドの存在下でVP16-ヘテロ二量体パートナーと共にNIH3T3細胞にトランスフェクトすることによって、活性に関して試験した。
【０２６２】
生物アッセイ
本発明の任意の化合物が哺乳動物トランス活性化アッセイにおけるレポーター遺伝子活性の誘導物質として作用しうるか否かを判定するために、これらの化合物を、pFRLUCレポーターおよび実施例3に記載の遺伝子発現カセット3.1〜3.9をトランスフェクトしたNIH3T3細胞において試験した。トランスフェクトした細胞を、0.01〜33μMの化合物濃度の存在下で生育させた。リガンド添加の48時間後、細胞を回収して、レポーター活性をDual Luciferaseアッセイキット（Promega Corporation）を用いてアッセイした。相対光量単位（RLU）の合計を示す。細胞の培養および維持に関する標準的な方法に従った。
【０２６３】
ステロイドリガンド20-ヒドロキシエクジソン（20E）およびポナステロンAは、Sigma Chemical CompanyおよびInvitrogenから購入した。リガンドは全てDMSOに溶解した。
【０２６４】
DNAを以下のようにマウスNIH3T3細胞（ATCC）にトランスフェクトした。標準的な細胞の培養および維持法に従った。細胞を回収して、96ウェルプレート内、10％ウシ胎児血清（FBS）を含有する増殖培地50μLにおいて細胞2,500個/ウェルで平板培養した。24時間後、細胞を、ジメチルスルホキシド（DMSO；対照）または0.01〜33μMの8種の用量のリガンドのDMSO溶液のいずれかを含有する無血清増殖培地35μLによって、処置した。次に、細胞をSuperfect（商標）（Qiagen Inc.）トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトした。各ウェルに関して、Superfect（商標）0.625μLを無血清増殖培地14.2μLと混合した。レポーター構築物0.16μgおよび各受容体構築物0.04μgをトランスフェクション試薬ミクスに加えた。トランスフェクションミクスの内容物をボルテックスミキサーにおいて混合して室温で30分間放置した。インキュベーションの終了時、トランスフェクションミクス15μLを細胞に加えた。細胞を37℃、5％CO2で5％FBSにおいて48時間維持した。
【０２６５】
レポーターアッセイ
ルシフェラーゼ活性を、 Promega CorporationのBright-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイ系を用いて製造元の説明書に従って処置後48時間で測定した。相対最大誘導倍率（Rel Max FI）は、任意の濃度で観察されたポナステロンA（PoA）および20-ヒドロキシエクジソン（20E）の最大誘導倍率に対する、任意の濃度で観察された試験リガンドの最大誘導倍率として、決定した。EC50値を、3パラメータロジスティックモデルを用いて用量反応データから計算した。アッセイの結果を表7に示す。
【０２６６】
（表７）レポーター遺伝子における相対誘導倍率（rel.max FI）を、20-ヒドロキシエクジソン（20E）、ポナステロンA（PoA）、または3,5-ジメチル-安息香酸N-tert-ブチル-N'-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジドを参照して表記する。
0005777890.tif 000069
0005777890.tif 000070
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0005777890.tif 000072
0005777890.tif 000073
0005777890.tif 000074
CF＝トウヒノシントメハマキ（Cf）EcR
AA＝ネッタイシマカ（Aa）EcR
AMA＝マダニ（Ama）EcR
BA＝シルバーリーフコナジラミ（Bamecia argentifoli）（Ba）EcR
DM＝キイロショウジョウバエ（Dm）EcR
MS＝タバコスズメガ（Ms）EcR
NC＝ツマグロヨコバイ（Nc）EcR
TM＝チャイロコメノゴミムシダマシ（Tm）EcR
【実施例】
【０２６７】
実施例1
遺伝子スイッチの半合成ステロイドモジュレータを開示する。代表的なエクジステロイドである20-ヒドロキシエクジソン（20E）およびポナステロンA（PoA）を、2位、3位、14位、22位、および25位で1メチル化およびマルチメチル化するか、または22位で1アルキル化した。半合成ステロイドを、キイロショウジョウバエ、トウヒノシントメハマキおよびネッタイシマカEcRおよび／またはその変異体を用いて、天然の昆虫系（ショウジョウバエBII細胞）と工学操作された遺伝子スイッチ系の双方においてアッセイした。遺伝子スイッチの効果は、22位でメチル化された20EおよびPoAに関して維持または増強される。アルキル化ステロイドのSARは、22-OHがH-結合アクセプターであり、25-OHはおそらくH-結合ドナーであり、ならびに2-OHおよび3-OHが互いに対しておよびEcRに対してドナーおよび／またはアクセプターであることを示している。全体として、膜相互作用（MI）-QSAR方法論を用いて計算されたADME特性は、logPまたは血漿タンパク質結合を過剰にモジュレートすることなく、より低い溶解度、より高い透過性、およびより高い血液脳関門浸透性に向けて望ましい傾向を示している。アルキル化により、遺伝子スイッチ技術の遺伝子治療用途のためのステロイド活性化剤の改善が実証される。
【０２６８】
EcRに基づく系などのリガンド誘導型遺伝子発現系は、遺伝子治療用途にとって十分に適している。タンパク質発現レベルの制御能により、遺伝子治療療法に遺伝子スイッチを組み入れることは、癌、心血管疾患、糖尿病、神経変性障害、運動ニューロン疾患、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、ニューロパシー疼痛、関節リウマチ、および変性医学疾患全般においてより有効な適応を提供する。加えて、遺伝子スイッチは、細胞に基づくアッセイおよび開発薬試験のための動物モデルのみならず、生物治療およびバイオマテリアル産生などの領域において診断的、生物薬学的および他の用途を有する。昆虫のエクジステロイド調節遺伝子スイッチは、ヒトの内因性ステロイドに対して不応性であり、非常に低い基底トランスジーン発現、高い誘導性、および広い用量反応性を示す。
【０２６９】
個別のまたはいくつかのステロイドヒドロキシル基を、メチル化するかまたはそうでなければアルキル化した。それによって、新規半合成ステロイド23個を合成、精製、および構造的に割付した。アルキル化の位置は、EcRとの相互作用を最大限にするように選ばれた。得られたステロイドを細胞遺伝子スイッチ系においてアッセイした。他の有利な特性には、膜透過性および代謝抵抗性の潜在的向上が含まれる。その非アルキル化相対物と比較した新しいステロイドのMI-QSAR ADME計算を行った。天然のショウジョウバエBII細胞系においてアッセイした既に知られているステロイドおよそ150個と組み合わせた多次元QSARによって試験した、これらのステロイドのCoMFA/CoMSIAモデリングも同様に行った。新規半合成ステロイドは、臨床遺伝子治療に関する遺伝子スイッチ活性化剤として有用である。
【０２７０】
合成−材料および方法
PoAは、Rene Lafont, Universite Pierre et Marie Curie, Parisによって供給された。20Eは、Dr. V. Volodin, Institute of Biology, Russian Academy of Sciences, Syktyvkar, Russiaから供給された。溶解度およびlogD測定のためのPoAをAxxora/ Alexis Corp.から購入したが、20EおよびムリステロンAは、Sigma-Aldrich Inc.から得た。他の試薬および溶媒は、Fisher ScientificおよびSigma-Aldrichから購入した。NMR分析のための重水素化溶媒は、Goss Scientific Instruments Ltd（Great Baddow, U.K.）から購入した。無水アセトンおよびCH2Cl2を使用前に蒸留した。HPLC用水を純度17オームの程度まで脱イオン化した。他の全てのHPLC溶媒を0.45μm（水溶液の場合）または0.5μm（有機溶液の場合）Waters Millipore（登録商標）フィルターを通しての吸引濾過によって使用直前に脱気した。無水反応条件は、シュレンク反応管を真空下でフレームドライすることおよび試薬の前に窒素またはアルゴン雰囲気を導入することによって、達成された。液体の移動にはカニューレを用いた。ステロイドを使用前に凍結乾燥した。酸化銀反応は、アルミニウムホイルで覆うことによって光から保護された。
【０２７１】
反応物を、Sphereclone ODS2カラム（5μm、150×4.60 mm；Phenomenex, Macclesfield, U.K.）を用いたGilson 170システム（Anachem Limited, Luton, U.K.）上のダイオードアレイ検出器（DAD）をインターフェースで接続したHPLCにおいて、30％〜100％メタノール水溶液の直線勾配に25分間供した後、アイソクラティック100％メタノールに流速1 mL/分で10分間供することによってモニターした。クロマトグラフィーモニタリングは、242 nmおよび300 nmでの波長（λ）で行った。等量の反応混合物を定期的な間隔で採取して、試料をメタノールによって反応停止させて、遠心して、上清をMinisart（登録商標）0.20 mmフィルター（Sartorius, Epsom, U.K.）によって濾過した。濾液を減圧下で濃縮して、溶解にとって必要な最少容量の30％メタノール水溶液（v/v）に調整し、注入した。
【０２７２】
粗反応混合物における個々のステロイドエーテルの分離は、以下の方法の1つまたは複数を伴う適したHPLC系の開発によって行われた。（A）流速2 mL/分のセミ分取C18-HPLC（Phenomenex Sphereclone ODS2；250×10 mm、5μm）；（B）分取C18-HPLC（Phenomenex Sphereclone ODS2；250×21.20 mm、5μm、流速＝5 mL/分）。（C1/C2）セミ分取シリカカラム（Kinesis Zorbax Sil；250×9.4 mm、5μm、流速＝2 mL/分）を、CH2Cl2：2-PrOH：H2O 160：30：1.5（C1）または125：30：2.0（C2）、v/v/vによってアイソクラティックに溶出した。
【０２７３】
化合物の純度を、異なる2つの逆相カラム（Phenomenex Sphereclone C18およびC6、5μm、150×4.60 mm）および1つの順相カラム（Kinesis-GRACE Apex II Diol、5μm、150×4.60 mm）を用いるHPLCによって確認して、λ＝300 nmを用いた22（λmax＝299 nm）を除き、全ての化合物に関してλ＝242 nmでの％総ピーク面積として表記する。
【０２７４】
産物の定量を、14α-ヒドロキシ-7-エン-6-オン部分（λmax＝242 nm、モル吸光度係数[ε]＝12,400 Lmol-1cm-1）または14α-ヒドロキシ-7,9(11)-ジエン-6-オン部分（λmax＝299 nm、ε＝14,190 Lmol-1cm-1）を含有する化合物に関して、Shimadzu UV- 2401PC（Shimadzu GB, Milton Keynes, U.K.）においてUV分光法によって行った。濃度をランベール・ベール等式に従って計算した。
【０２７５】
一次元（1Hおよび13C）および二次元（1H-1H COSY、1H-1H NOESY、1H-13C HMQC、および1H-13C HMBC）NMRスペクトルを、自動Bruker ACF-300分光計またはBruker AVANCE DRX-400分光計のいずれかにおいて記録した。試料を、内部標準としてテトラメチルシラン（TMS）を含有するメタノール-d4に溶解した。13Cスペクトルを49.00 ppmでのメタノール七重線の中央のシグナルによって較正した。1Hおよび13Cケミカルシフト（δ）を百万分率（ppm）で表記する。カップリング定数（J）および半値幅（w1/2）をヘルツ（Hz）で報告する。
【０２７６】
高分解能質量分析を化学イオン化モード（CIMS）または陽イオン高速原子衝撃モード（FABMS）のいずれかで行った。CIMSは、直接入口プローブを備えたMicromass GCT分光計において、または直接入口プローブを備えたJeol 700分光計において、いずれの場合も試薬ガスとしてCH4、溶媒としてメタノール、ソース温度200℃、およびプローブ温度500〜650℃を用いて記録された。FABMSも同様に、試薬ガスとしてXe、ソース温度30℃、およびマトリクスとして「魔法の弾丸（Magic Bullet）」（1,4-ジチオ-L-スレイトールと1,4-ジチオエリスリトールの4：1混合物）を用いてJeol 700分光計において記録した。
【０２７７】
2-OH、3-OH、14-OH、および／または22-OHでO-アルキルエーテル官能基を有するステロイドの合成
エーテル化の前に、開始エクジステロイドの2,3-および／または20,22-ジオール基を、対応する20.22-フェニルボロネート、2,3-アセトニド、または2,3,20,22-ジアセトニド類似体に転換することによって選択的に保護した（図1）。ステロイドエーテル1および2に関する合成技法を、説明実施例として以下に記載する。
【０２７８】
20-ヒドロキシエクジソン2-メチルエーテルおよび20-ヒドロキシ3-メチルエーテルの合成
Ag2O（116.0 mg、10等量）を新しく調製した20E 20,22-フェニルボロネート（25a；30 mg、53μmol）のDMF溶液（2 mL）の撹拌溶液に室温で無水条件下で加えた。CH3I（258μL、44.7等量）を反応の過程において4回に分けて加えて、追加のAg2O（10等量）を4時間後に加えた。反応物をHPLC-DADによってモニターした。7.5時間後、酢酸エチル（25 mL）を加えて、混合物を 多孔度4の焼結ガラスフィルター漏斗（Weiss-Gallenkamp, U.K.）に載せたCelite（登録商標）（BDH Chemical Ltd., Poole, U.K.）パッドによって濾過した。フィルターを追加の酢酸エチル（150 mL）によって洗浄して、溶媒を真空下で蒸発させた。粗反応混合物を、Sep-Pak（登録商標）Vac 35cc C18-10gカートリッジ（Waters, Elstree, U.K.）を用いて固相抽出によって予め精製した。産物をTHFとH2O2の9：1（v/v）混合物（100容量、0.1 N NaOHによって予め中和）に溶解して、室温および中性pHで2.5時間撹拌した後、H2Oによって希釈してTHFを蒸発させ、および固相抽出によって、フェニルボロネート基を除去した。粗産物を、アイソクラティック1：1 CH3OH/H2Oを用いるセミ分取C18-HPLC（Phenomenex Sphereclone ODS2、250×10 mm、5μm、流速＝2 mL/分、242 nm）によって精製すると、2が20分後に溶出して（6 mg、25％；純度＞99％）、1が23分後に溶出した（13 mg、50％；純度＞99％）。
【０２７９】
25-OHでO-アルキルエーテル官能基を有するステロイドの合成：20-ヒドロキシエクジソン25-メチルエーテルおよび22,25-ジメチルエーテル
DTBMP（88.8 mg、6等量）およびメチルトリフラート（47μL、6等量）を20E 2,3-アセトニド（25b、37.5 mg、72.1μmol）の無水CH2Cl2溶液（3 mL）に加えた。混合物を無水条件で室温で撹拌した。55時間後、メチルトリフラートを真空下で除去して、残渣を0.1 M HClと1,4-ジオキサンの1：1（v/v）混合物によって処置した。メチル化ステロイドを分取C18-HPLC（Phenomenex Sphereclone ODS2、250×21.20 mm、5μm、流速＝5 mL/分）によってアイソクラティック60％CH3OH/H2Oを用いて精製した。収量：10 は11.15 mg（31％；純度＞99％）および14は5.63 mg（15％；純度＞99％）であった。
【０２８０】
細胞遺伝子スイッチアッセイ−ショウジョウバエBII細胞の形態
キイロショウジョウバエBII細胞株バイオアッセイを用いてEcRリガンドの活性を試験した。アッセイを1試料あたり4個ずつ行った。簡単に説明すると、保存液（10-3 M〜10-10 M）のMeOH溶液を、試験化合物の各々に関して調製した。各希釈液のアリコート（20μL）を、マイクロタイタープレートのウェルに移して、溶媒を蒸発させた。細胞およそ2×105個/mLの細胞浮遊液（200μL）を各ウェルに加えて、蓋をしたプレートを25℃の湿潤環境で7日間インキュベートした。細胞の応答をステロイド濃度の関数として濁度測定（405 nm）によって測定する。
【０２８１】
細胞遺伝子スイッチアッセイ−工学操作されたEcR：USP/RXR系
マウス胚線維芽細胞（NIH3T3）に以下の構築物をトランスフェクトすることによって、細胞遺伝子スイッチアッセイを行った。（a）トウヒノシントメハマキEcR（CfEcR-DEF）、（b）E-ドメインにおいてE274V / V390I / Y410E変異を有するトウヒノシントメハマキEcR、（c）ネッタイシマカEcR（AaEcR-DEF）、および（d）キイロショウジョウバエEcR（DmEcR-DEF）の野生型のD-、E-、およびF-ドメインを、GAL4-DBDに融合させて、CMVプロモーターの制御下に配置した。ヒトRXRβおよびトノサマバッタRXRからのキメラRXRをVP-16-ADに融合させて、SV40eの制御下に配置した。誘導型ルシフェラーゼレポータープラスミドであるpFRLuc（Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA）は、5コピーのGAL4応答エレメントおよび1つの合成最小プロモーターを含有する。VP16活性化ドメインならびに非対称EcRおよびグルココルチコイド受容体応答エレメントを認識する3残基の変異DBDを有するハイブリッドEcRを使用するVgEcR/RXR遺伝子スイッチ系を、Invitrogen Inc.（Carlsbad, CA, USA）から得て、ルシフェラーゼレポーター-含有ベクターを用いてNIH3T3細胞における一過性のトランスフェクションによって類似のように使用した。
【０２８２】
NIH3T3細胞を、いずれもMediatech, Inc., Manassas, VAから得られた10％仔ウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）において37℃で5％CO2において維持した。細胞を96ウェルプレート上で増殖培地50μLにおいて2,500個/ウェルの密度で平板培養した。翌日、細胞をまず、ジメチルスルホキシド（DMSO；対照）またはリガンドを含有するDMSO溶液を含有する無血清DMEM 35μLによって処置した。次に、細胞に、EcR構築物0.04μg、RXR構築物0.04μg、およびルシフェラーゼレポーター構築物0.16μg/ウェルを含有する無血清DMEM 15μLを、SuperFectトランスフェクション試薬（Qiagen Inc., Valencia, CA, USA）を用いて、製造元の説明書に従ってトランスフェクトさせた。リガンドを0.01〜33μMの8種の用量で試験し、最終的なDMSO濃度は対照および処置ウェルの双方において0.33％であった。処置後およびトランスフェクションインキュベーションの48時間後、Bright-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Promega Corporation, Madison, WI, USA）を製造元の説明書に従って用い、細胞をルシフェラーゼ活性に関してアッセイした。
【０２８３】
3D-QSARトレーニングセットおよび試験セット
エクジステロイドおよび関連BII活性値のライブラリを用いて、3D-QSARモデルを生成またはバリデーションした。O-アルキル化ステロイド15個（1〜7、9〜15、および18）を分析に含めたが、他の化合物は、植物から単離したか、購入したか、または他の研究者から供与された。活性試験に供される全ての化合物に関して少なくとも97％の純度要件を設定した。試験したステロイドエーテルは、少なくとも98％純粋であった。QSARライブラリにおける構造および活性データの双方に関して、精度のチェックを行った。
【０２８４】
ステロイド20個を3D-QSARトレーニングセットから分配して、モデルの外部バリデーションのための独立した試験セットを生成した。試験セットの選択は、4D-フィンガープリント分子類似性行列に基づいて化学類似性スコアを計算する4DQSAR-MS方法論を用いて行われた。
【０２８５】
分子モデリングおよび3D-QSAR分析
SYBYL 7.0を用いて、分子モデリング、比較分子場解析（CoMFA）および比較分子類似性指数解析（CoMSIA）を行った。ニセアメリカタバコガ（Hv）EcR（PDBコード＝1R1K）に結合したPoAに関して報告された結晶構造をQSAR分子セットに関するコンフォメーション選択のための分子鋳型として用いた。任意のコンフォメーション決定を必要とする分子を個別に、HvEcRとの複合体におけるPoAに重ね合わせ、ステロイド足場構造における問い合わせ置換基を、リガンド結合ポケットにおける立体的容認性を最大限にするように手動で調節した。得られた化合物の3D-モデルをGasteiger-Huckel 電荷を有する標準的なTriposの力の場を用いてエネルギーを最小限にして、17-炭素ステロイドコアによって整列させ、SYBYL座標格子の中心に配置した。部分的な原子電荷を、MOPACインターフェースによってSYBYLにおいて計算した半経験的MNDO法（ESP適合）を用いて割付した。
【０２８６】
CoMFAに関して、Triposの標準の立体的静電場、および指標の立体的で静電的な水素結合場を計算した；CoMSIAに関して、立体的で静電的で疎水性の、H-結合ドナーおよびH-結合アクセプタ類似性指数を、SYBYLデフォルトパラメータ、2Å離れたグリッドおよびsp3 C+1プローブを用いて誘導した。leave-one-out（LOO）クロスバリデーションによる部分的最小二乗（PLS）分析または試料距離部分的最小二乗（SAMPLES）分析を用いて、CoMFA/CoMSIAの場の記述子と化合物のBII活性との関係を見いだした。シグナル対ノイズ比を改善するために0.5 kcal/molの最小σ（カラムフィルタリング）を適用した。得られたモデルの統計学的有意性をLOOクロスバリデーション相関係数q2、および予測の標準誤差SPRESSによって併せて判断した。ステロイドの最初のプール（トレーニングセット＝化合物140個）から7個の化合物を除去した後、対応するLOOクロスバリデーション分析の成分の最適な数を用いて誘導した非クロスバリデーションの従来のPLS分析によって最終モデルを生成した。モデルのバリデーションは、試験セットに関するBII活性値の予測および観察された値との比較を伴った。
【０２８７】
ADME特性
ステロイドO-アルキルエーテル類似体のオクタノール-水分配係数（MlogP）を、既に計算された非エーテルステロイドのMlogP値に対してスケーリングすることによって決定した。確立された膜-相互作用QSAR（MI-QSAR）モデルを用いて、Caco-2細胞透過性係数および血液脳関門分配係数を算出した。MI-QSAR分析には、QSARモデルの開発において用いられた記述子プールにおいて、リン脂質、この場合はジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）分子で構成されるモデル膜アセンブリを通してのトレーニングセットを含む各溶質（低分子有機化合物）の輸送のシミュレーションに明白に由来する特性および特色が含まれる。ヒト血清アルブミン（HSA）に対するステロイド結合の推定値は、3D-FEFF-QSAR分析を用いて得られた。このアプローチは、スコア関数としてスケーリングされたQSARモデルを用いて、ステロイドリガンドのHSAに対する結合の自由エネルギー、ΔGを計算する。ΔG＝RT ln(Ka)を用いてKa値を誘導した。Ka＝(1/Kb)であり、式中Kbは、結合がHSAのみに対して起こり、バイナリ複合体が形成されて、リガンドの濃度と比較して過剰量のHSA（[HSA]＝0.6 mM）が存在すると仮定した場合の、HSAに対する分子の結合親和性である。ステロイドO-アルキルエーテル類似体の水溶解度をAMSOL法およびソフトウェアを用いて決定した。
【０２８８】
物理化学的測定
LogDを Absorption Systems, Incによって測定した。ポナステロンAおよび20Eを、テストステロン標準物質を用いて1試料あたり2個ずつ1.5 mL振とうフラスコシステムにおいて等量のpH 7.4の緩衝液および水飽和オクタノール中、100μMで測定した。各々の振とうフラスコを室温で60分間撹拌した後、室温で1時間放置した。有機層および水層の連続希釈液を調製して、各希釈での試験化合物の濃度を、少なくとも4点較正曲線によって一般的なLC/MS/MS法を用いて計算した。水溶解度はRobertson-Microlit, Inc.によって測定された。PoA、20E、ムリステロンA、およびジアシルヒドラジンの飽和溶液試料をHPLC等級の水に溶解して、25℃で1、5、および10日間撹拌した後、0.45ミクロンフィルターを用いて濾過し、透明な溶液を得た。各基質に関して、UV吸収を、必要に応じて希釈して249、248、239 nmおよび219 nmの最大値で測定した。吸光度を、CH3OH中の同じステロイドの1〜2％溶液に対して同じ最大吸光度で、参照標準物質の吸光度と比較し、溶媒効果による最大シフト10 nMまでを許容した。
【０２８９】
合成
最も豊富な昆虫脱皮ホルモンである20E（25）、最も強力な天然のエクジステロイドの1つであるPoA（26）、珍しいコア構造を有する中等度に強いアゴニストであるダクリハイナンステロン（27）の誘導体が含まれる、ステロイドO-アルキルエーテル23個を合成した（図2）。20Eの誘導体は、2-OH、3-OH、14-OH、22-OH、または25-OHでのモノメチルエーテル5種類（1〜4、10）、22-OHならびに2-OH、3-OH、14-OH、および25-OHの各々1つでのジメチルエーテル4種類（11〜14）、およびテトラメチルエーテル1種類（15）である。PoA誘導体には、2-OH、14-OH、または22-OHでのモノ-O-メチルエーテル3種類（16〜18）、および二重エーテル官能性を有する類似体3種類（19〜21）が含まれる。メチルエーテルのほかにいくつかの20E-22-O-エーテル類似体を調製したが、これには炭素4個までの鎖を有するO-n-アルキル基（5、6、および8）、ならびにアリル（7）、ベンジル（8）、および2'-エチルオキシラニル（23）エーテル基を有する化合物が含まれる。個々のヒドロキシル位置へのメチル基の選択的導入は、2,3-シスおよび／または20,22-ジオール基のアセトニドまたはフェニルボロネート基への変換を伴う、図1において描写される保護／脱保護戦略を用いて得られた。1メチル化および多重メチル化類似体（16、17、19、20）の同時の調製は、非保護エクジステロイドによって開始する1ポット反応アプローチによって達成された。この方法は、反応時間の点において有利であるが、注意深いHPLCによる反応のモニタリングを必要とし、多重メチル化類似体対1メチル化類似体の比率が高くなる。Ag2OおよびCH3Iを伴うメチル化反応において、エクジステロイドヒドロキシル基の反応性の順序は、22-OH＞2-OH＞3-OH＞＞14-OHである。20Eの三級25-OHのメチル化は、Ag2O/CH3Iを用いて観察されなかったが、14-OHは、反応温度（60℃まで）または試薬量を増加させることによってCH3O基に変換された。しかし、Ag2Oに対する過剰なまたは持続的な曝露によって、脱水および／または発色団の変化などの産物の分解に至る。適例として、変化した発色団（7,9(11)-ジエン-6-オン基）を有するメチル化PoA誘導体であるDaH 22-メチルエーテル（22）の形成が、室温でのAg2O/CH3Iに対するPoAの持続的な曝露（46時間）後に観察された。仮定される反応機序は、Ag2Oによる2つの11-H原子のうち1つの消失に続き、共役に向けての二重結合移動を伴いうる。エクジステロイドなどの化学的感受性分子にとって適した代わりのO-メチル化法の探索において、本発明者らは、25℃における無水条件下で、メチルトリフラートおよびDTBMPの各6等量が、25-OH＞22-OH＞＞14-OHの反応シーケンスで、20E 2,3-アセトニド（25b）の25-OHメチル化を円滑におよび選択的に促進することを見いだした。このアプローチは、ポリヒドロキシル化ステロイドのO-メチル化のために新しく開発された技法を表す。本発明者らの実験の全てにおいて、20-OH位はメチル化に対して不応性のままであった。
【０２９０】
NMR
O-アルキルエクジステロイド1〜23の1Hおよび13Cスペクトルの割付は、親化合物（20E、PoA、またはDaH）のスペクトルと比較し、かつ1H-1H COSY、1H-13C HMQC、および1H-13C HMBCスペクトルにおけるJカップリング連結度を調べることによって行った。2位、3位、および／または22位での二級エーテル置換基の1Hシグナルは、およそ0.4 ppmの特徴的な高磁場シフトを示し、親エクジステロイドに対しておよそ10 ppm低磁場にシフトする13Cシグナルに対応した。14α-OCH3基を有するステロイドは、その1H-NMRスペクトル（9α-Hシグナルがおよそ0.3 ppmの高磁場シフトを示す（δH＝2.76〜2.78 ppm））から、およびその13C-NMRスペクトル（14-Cシグナルがおよそ6 ppmの低磁場シフトを示す（δC＝90.95〜90.98 ppm））から、容易に認識されうる。14-O-メチル基のα-立体化学は、NOESY実験において、9α-Hシグナルの電磁波照射によって確認され、14-OCH3シグナルの3％増強（2.97 ppm）および2α-Hシグナルの13％増強（3.53〜3.81 ppm）に至った。20E 25-メチルエーテル類似体は、20Eに関する25-Cシグナルに関しておよそ5 ppmの低磁場シフトを示し（76.16 ppm）、26-Cおよび27-Cシグナルに関しておよそ4 ppmの高磁場シフトを示した（25.52および25.27 ppm）。エクジステロイドメチルエーテル類似体の1H NMRスペクトルにおいて、2β-OCH3、3β-OCH3、14α-OCH3、22-OCH3および25-OCH3から生じた一重線はそれぞれ、3.39、3.40、2.97、3.50、および3.19 ppmで出現した。20E 22-エチル、プロピル、およびブチルエーテル類似体の1H-NMRスペクトルにおいて、22-OR基のα炭素に付着する2つのプロトンは、3.51〜3.75 ppmの範囲のδHでジアステレオトピックシグナルとして出現した。23の1H-NMRスペクトルにおいて、63.54 ppmでの13Cシグナルに対応する3.49 ppmおよび3.39 ppm（2J＝12 Hz）での2つの二重線は、22-エチルオキシラニル基の一対のオキシラニルプロトンに割付され；23のO-C-O基の4価の13Cシグナルは110.25 ppmに下落した。
【０２９１】
ショウジョウバエBII細胞アッセイ（図3）
キイロショウジョウバエBII細胞は天然で、本来のEcR-USP複合体を発現し、EcRアゴニストおよびアンタゴニストに対して特異的で定量的な応答を与える。O-アルキルステロイド1〜23は、分子中のエーテル置換基の数および位置に応じて、100μMから1 nMの範囲の濃度でBIIバイオアッセイにおいてアゴニスト効果を発揮した。特に、20Eの2-、3-、14-、および25-ヒドロキシル基のメチル化は、効果を低減させるが、20E 22-メチルエーテル（4）は、20Eの効果を維持する。22-エチルエーテル類似体（5）は、メチルよりわずかに弱いが、活性の差は、プロピル、アリル、およびブチル（6、7、8）とアルキル基が大きくなるに従って増大する。しかし、22-O-ベンジル置換基（9）は、20Eの効果をあまり増加させない。任意の位置でのPoAのO-アルキル化は、BIIバイオアッセイにおける効果を減少させる。
【０２９２】
工学操作されたEcR/RXR：USP遺伝子スイッチ
O-アルキルステロイドが遺伝子発現を作動させることができるか否かを、誘導系の成分を一過性にトランスフェクトしたマウス細胞株において調べた。主に、2つの遺伝子スイッチ型を用いた：一方は野生型ハマキガ（Cf）EcR（wt-CfEcR-DEF）に基づき、他方はこの受容体のE274V/V390I/Y410E変異体（変異体-CfEcR-DEF）に基づいた。いくつかのステロイドに関して、黄熱病媒介蚊（Aa）およびショウジョウバエ（Dm）EcRについて同じ遺伝子スイッチフォーマットで類似の実験を行った。ヒトRXRβとトノサマバッタの昆虫USP（LmUSP）とのキメラをVP 16-ADに融合させて、EcRに関するパートナータンパク質として用いた。
【０２９３】
ステロイドを効果（EC50）および有効度の双方によって評価した。後者であるRMFIは、その最適な試験濃度で同じアッセイ条件での非ステロイドジアシルヒドラジンEcRアゴニスト（30）の最大誘導倍率と比較した試験リガンドの最大誘導倍率として計算される。試験または参照リガンドの誘導倍率を、リガンドによって誘導される遺伝子発現とDMSO対照の遺伝子発現の比として定義する。
【０２９４】
wt-CfEcR遺伝子スイッチにおいて、PoA（26）は、試験したステロイドの中で最高の誘導活性を示したが（EC50＝0.19μM、RMFI＝約0.18）、ムリステロンAおよびポリポジンBはそれほど強くはなく（EC50＝それぞれ、7.4μMおよび約12）、20Eは不活性であった（EC50＞33μM）。PoA 22-メチルエーテル（18）およびダクリハイナンステロン22-メチルエーテル（22）は、PoAそのもの（RMFI＝約0.2）より高い誘導倍率（RMFI＝それぞれ、約0.6および約0.3）を提供したが、PoAの効果は任意の位置でのO-アルキル化によって減少した。具体的な20E O-アルキル化類似体である20E 22-エチルエーテル（5）は、およそ5μM濃度でレポーター遺伝子を最大誘導倍率の77％誘導した。
【０２９５】
E274V/V390I/Y410E変異体-CfEcR遺伝子スイッチにおいて、PoAおよびPoA 22-メチルエーテルは、最も成績のよいステロイドである（図4）：EC50値はPoAに関して0.1μMであり、PoA 22-メチルエーテルに関して0.7μMであり、RMFI値はそれぞれ、0.52および0.58であった。このスイッチにおいて、ムリステロンAは比較的弱く、EC50 1μMであった；同様に、ポリポジンBは約7μMである。20Eは非常に弱い作動物質であった（EC50＝20μM）。しかし、20Eの効果は、EC50（5に関して0.76μM；20Eに関して約20μM）およびRMFI（5に関して1.1；20Eに関して0.12）の双方に関して、22-エチル化によって実質的に改善された。より控えめではあるが、20E 22-n-プロピル（6）、22-ブチル（8）、22-ベンジル（9）、および25-メチル（10）エーテルも同様にその親化合物の性能を増強したが、20E 22-アリルエーテル（7）は、20Eと同じ活性を与えた。このように、CfEcR遺伝子スイッチの野生型およびE274V/V390I/Y410E変異体フォーマットの双方において、PoA 22-メチルエーテルは、最も強いO-アルキルエーテルであり、20E 22-エチルエーテルはそれに次いで強い。
【０２９６】
いくつかのO-アルキル化ステロイドを、E274V/V390I/Y410E変異体CfEcRおよびVgEcR/RXRに加えて、CfEcRを野生型AaEcRまたは野生型DmEcRで置換した、同じ一般的フォーマットの遺伝子スイッチにおいてさらに試験した。PoA 22-メチルエーテルの効果はムリステロンAより高く、AaEcR-およびDmEcR-に基づくアッセイの双方においてPoAよりいくぶん強力であった（EC50＝それぞれ、0.38 nMおよび66 nM）。AaEcR系は、PoA 22-メチルエーテルおよび試験した標準物質PoA（1.1 nM）およびムリステロンA（9 nM）のいずれに対しても効果の点ではCfEcRより感受性が高いが、有効度の点ではより感受性が低い（たとえば、PoA：1μMでFI＝166[AaEcR]に対して、1μMで約900[CfEcR]）。差のほとんどは単に、AaEcRスイッチの「オフ」状態におけるバックグラウンドレベルが、レポーター遺伝子の発現絶対値（RLU＝約1046 [AaEcR]に対して、540 [CfEcR]）が低くなればなるほどむしろ高くなる（FI＝7.6 [AaEcR] に対して、0.7 [CfEcR]）ことに起因する。AaEcRスイッチと比較して、DmEcRスイッチは、バックグラウンド転写に関してCfEcRスイッチに似ているが、有効度に関しては応答性が低い。3T3細胞において、既に開発されたVgEcR/RXRスイッチフォーマットは、PoAおよびムリステロンAによってそれぞれEC50＝0.641および0.851μMで誘導され、PoA 22-メチルエーテルによってEC50＝0.553μMで誘導された。比較すると、AaEcRおよびDmEcRに基づくスイッチは、低い（AaEcR）および中等度（DmEcR）のナノモル濃度でこれらのリガンドに対して応答性であり、実質的な効果の向上を示している。
【０２９７】
最終的な3D-QSARモデル
CoMFAの立体的静電場、CoMSIA H-結合ドナー、H-結合アクセプター、および疎水性場のみならず極性表面積（PSA）が含まれる分子場の多様な組み合わせを、エクジステロイドライブラリを最もよく表すように選んだ。得られた3D-QSARモデルの統計値を図5に要約する。
【０２９８】
遺伝子治療におけるステロイドおよびEcR遺伝子スイッチ
EcR遺伝子スイッチの使用は、細胞および組織培養の双方のみならず動物モデルにおいて証明されている。最も強力なリガンドは、主に2つの化学タイプ：合成ジアシルヒドラジンおよび天然の、通常は植物由来であるステロイドによって表される。双方の群からの代表的なリガンドは、モデル試験においてEcR遺伝子スイッチにおいて用いられて成功している。生物学的利用率の見通しから、ジアシルヒドラジンは、いくつかの容易に代謝可能な座を有するクラスII型ADME特徴（低い溶解度、高いlogP、高い透過性）を有するが、エクジステロイドはより溶解度が高く、logPがより低く、容易に代謝または共役されうる多くのヒドロキシル基を有する。
【０２９９】
合成
20E、PoA、およびDaHのO-アルキルエクジステロイド類似体23個を合成した。（a）22-メチル化と共にしか得られないPoAの3-メチルエーテル、および（b）20-ヒドロキシルが不活性であると証明されているので20メチルエーテルを除いて、20EおよびPoAの全てのモノメチルエーテルを、得た。合成全体は、2,3-および20,22-ジオール基それぞれに対する十分に確立されたケタールおよびボレートジオール保護戦略に依った。20E 22-メチルエーテル（4）および22-エチルエーテル（5）の合成、ならびに20E 25-メチルエーテル（ポリポドアウレイン10、シダであるダイオウウラボシ（Polypodium aureum L.）由来）の単離は、本研究の前に既に記載されているが、これらのいずれも遺伝子スイッチアッセイに供されていない。
【０３００】
細胞遺伝子スイッチアッセイ
エーテル1〜23の遺伝子スイッチ有効度を試験するために、2つの遺伝子スイッチフォーマットを用い、3番目はいくつかのリガンドを用いて簡単に調査した。1番目は天然のキイロショウジョウバエBII細胞株であった。BII細胞株は、腫瘍形成性血球変異体（l[2]mbn）の血球に由来する。BII細胞にステロイドを加えると、貪食を誘導するシグナルとして作用して、細胞は、均一な層の小さな細胞から、透明な領域に取り囲まれるより大きい細胞塊へと発達する。この応答を濁度測定によって定量することができる。
【０３０１】
2番目の遺伝子スイッチフォーマットは、工学操作されたヘテロ二量体対である。これは細菌GAL4 DNA結合ドメインに連結されたEcRリガンド結合ドメインを利用し、リガンドに曝露されると、ウイルスVP16活性化ドメインに連結されたハイブリッドバッタ-ヒトRXRに結合する。この複合体は次に、その発現が蛍光読み取り値を提供するルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流のGAL4応答エレメントに結合する。このスイッチ系全体をネズミ3T3細胞において一過性に発現させる。LBD配列がトウヒノシントメハマキ（ハマキガCfEcR）、ネッタイシマカ（蚊、AaEcR）、およびキイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ、DmEcR）に由来する、このスイッチのEcR-LBD変種を利用した（図8）。加えて、全体的なEcRリガンド感受性を増加させることが既に見いだされているCfEcRの変異体変種（E274V / V390I / Y410E）を試験した。各々の場合において、アッセイ系の他の全ての成分は、いくつかのステロイドを異なる3T3細胞株クローンにおいて試験したことを除き、同一のままであった。
【０３０２】
いくつかの化合物に関して用いられる3番目の遺伝子スイッチフォーマットは、インビボでネズミ試験において既に用いられたDmEcR由来VgEcR/RXR系である。
【０３０３】
ステロイドの定性的SAR - 22-O-アルキルエクジステロイドは、その親化合物の誘導活性を保持するかまたは向上させる
ステロイドを、所定の位置での1つまたは複数のメチルキャップの有無に従って対にして、ショウジョウバエBIIアッセイにおける効果の差を計算した（図6）。2位、3位、14位、22位および25位の範囲で1エーテル置換を有する20EおよびPoAエーテル誘導体（1〜10、16〜18、22〜23）により、効果の差と特定のOH基のキャッピングとのあいだの関係の直接導出が可能である。平均すると、各ヒドロキシル位置でのメチル化によって、効果の低下が起こり、これは以下のEC50の対数単位の低下順に従って序列化される効果：14-OH（2.12）、2-OH（1.67）、25-OH（1.09）、3-OH（1.06）、および22-OH（0.35）。しかし重大なことに、20E自体（4、-logEC50＝8.20）を含むステロイド9個中5個の22-メチル化は、わずかな効果増大をもたらす。多重メチル化は一般的にその効果に関して相加的である。
【０３０４】
工学操作された遺伝子スイッチ系は、効果およびSARの詳細においてやや異なる応答を示した。wt-CfEcRに関して試験したステロイドにおいて、20-E 22-O-エチルエーテル5のみが、このアッセイにおいて本質的に不活性なステロイドである20Eと比較して効果の明確な向上を示した（EC50＝4.85μM、RMFI＝0.77）。E274V/V390I/Y410E変異体CfEcR遺伝子スイッチアッセイにおいても、5は親20E（EC50＝約20μM、RMFI＝0.12）に対してかなり大幅な向上を示す（EC50＝0.76μM、RMFI＝1.10）。n-プロピルおよびベンジルなどの他の22-エーテルも同様に改善を示す。予想外であるが、ムリステロンAおよびポリポジンBはBIIアッセイよりもCfEcRフォーマットの遺伝子スイッチアッセイにおいて弱い。
【０３０５】
wt-CfEcRに対して、PoAは、ヒドロキシルのメチル化によって効果および有効度を失う。しかし、CfEcRのE274V/V390I/Y410E変異体に関して、非常に強力なPoA（EC50＝0.10μM、RMFI＝0.52）では効果の損失がかなり少なく、実際には22-メチル化によって有効度を獲得し（18、EC50＝0.70μM、RMFI＝0.58）、このことは望ましい効果、代謝、および透過性特徴をもたらす。この傾向は、マウス3T3細胞の同じ2-ハイブリッド系におけるAaEcRおよびDmEcRに関しても続く。18は、AaEcRに関して1.10 nMでPoAより強力であった（EC50＝0.38 nM）；DmECRに関して、約66 nMで同等の効果である。同様に、ショウジョウバエに基づくVgEcR/RXR系において、18は、PoAおよびムリステロンA（それぞれ、EC50＝533 nM/RMFI＝1.5対EC50＝641 nM/RMFI＝1.5、およびEC50＝851 nM/RMFI＝1.3）と等しいか、またはおそらくより強力であり、ゆえにこの系に関して最善のリガンドとして見なされうる。要約すると、PoAは22-位でメチル化されて、ヒドロキシル基が1個少ない構造を生じるが活性を維持することができる。その上、O-メチル化構造の物理化学特性は優れているので、治療的使用の可能性がPoAそのものより大きい可能性がある。本発明者らは、22 O-アルキル（Me、Et、Pr）および22-O-ベンジルステロイドがその親化合物の誘導活性を保持するかまたは向上させることを示した。
【０３０６】
ADME
エクジステロイドエーテルは、好ましいADMEプロフィールを有する。ADME特性のいくつかである、水溶解度、logP（MlogP）、血液脳関門（BBB）透過性、Caco-2細胞透過性、およびヒト血清アルブミン（HSA）結合を、例示的なステロイドエーテルおよび参照化合物に関して計算した（図7）。
【０３０７】
溶解度
PoAおよび20Eの水溶解度計算値は、経験的に得られた値（それぞれ、0.18 mg/mLおよび6.7 mg/mL）と一致する。一般的に、溶解度はヒドロキシル基の数と共に増加する（たとえば、ムリステロンA＞20E＞PoA）；これに対応してヒドロキシル基をキャッピングすると一般的に、溶解度は減少する。注目すべき例外は、20E 22-アルキルエーテルである。たとえば、ステロイド5（20E 22-O-エチルエーテル）および7（20E 22-O-アリルエーテル）の溶解度は、遊離の20,22-ジオールを有するその親化合物よりわずかに高い。1つの説明は20Eの20,22-ジオールの分子内水素結合であり、それによって、20-OHドナー/22-OHアクセプターの状況に限って関与し得かつしたがって溶媒との水素結合に対する熱力学的拘束がより強い、可溶性の分子間水素結合が、22-アルキル類似体と比較して減少する。同様にして、22-OH/25-OH分子内水素結合効果も同様に有意である可能性がある。20EのO-22でのメチル化により、22-OHドナー/25-OHアクセプターの状況において分子内H-結合が破壊され、ゆえに、20Eに対する20E 22-O-メチルエーテルの水溶解度の低下は、PoAに対する、25-OHを欠如しかつしたがってこの内部H-結合を形成することができないPoA 22-O-メチルエーテルの低下よりも、少ない。ジアシルヒドラジン30に関して、水溶解度の計算値（3.6 mg/mL）と実測値（6.2 μg/mL）のあいだには約3オーダー分の差が存在する。実験上、ジアシルヒドラジンは、容易に結晶化される材料である。おそらく、溶解度の矛盾は、MI-QSARモデルが原因ではない物理的挙動により現れている。
【０３０８】
Mlog P値
水溶解度と同様に、MlogP値は、アルキル化に伴い正に傾く。この場合も、22-アルキル化は例外である：この位置でのアルキル化は、水溶解度の傾向に関して引き合いに出したのと同じ分子内結合の理由から、MlogPを実際には低下させる。MlogPは実験値を過大評価する：20E logDexp＝0.01（logPcalc＝1.25）；PoA logDexp＝1.95（logPcalc＝2.19）。
【０３０９】
血液脳関門分離
分子のBBB通過能の測定値は、BBB分配係数の対数（logBB）であり、これはlog(Cbrain/Cblood)に等しく、式中Cbrainは化合物の脳内濃度であり、Cbloodは化合物の血液中濃度である。公表された実験的BBB分配データによれば、log(BB)値＞0.3は、脳に容易に分布する化合物に関連し、log(BB)値＜-1は、脳への分布が不十分な分子を指す。本発明者らのADME推定値は、20E、PoAおよびムリステロンAが脳内に中等度に分布することを示している（-0.89＜log(BB)＜-0.35）。他方、O-アルキルエーテルステロイド、特にPoA 2-メチルエーテル（16；log(BB)＝0.16）およびPoA 22-メチルエーテル（18：log(BB)＝0.23）は、増加したBBB通過能を示す。正のlog(BB)値は、可能性がある中枢神経系（CNS）治療物質にとって望ましい。同様に20E O-アルキルエーテル類似体は、20Eと比較して高いlog(BB) 計算値を有する。
【０３１０】
透過性
いくつかのステロイドのCaco-2細胞透過性係数（PCaco-2）を、確立されたCaco-2細胞透過性QSARモデルを用いて決定した。図7において示されるように、PCaco-2値は、ムリステロンAから20E、PoAまで連続的に増加するが、これに伴って分子の親油性（MlogP値）が増加して、水溶解度が減少する。PoA O-アルキルエーテル誘導体16、18および20は、親分子PoA（19×10-6 cm/秒）と等しいかまたはそれより高いPCaco-2値（20×10-6〜29×10-6 cm/秒）を示し、20E O-アルキルエーテル誘導体4、5、7、10、および14も同様に、親化合物20E（16.3×10-6 cm/秒）と等しくまたはそれより容易に（14〜24×10-6 cm/秒）Caco-2細胞を透過する。これらの結果は、O-エーテルエクジステロイド誘導体の経口での生物学的利用特性の改善を示している。
【０３１１】
エクジステロイドの測定された物理化学および吸収特性：
A）Caco II透過性アッセイ：Transwell（登録商標）ウェルにおいて21〜28日目のCaco-2細胞のコンフルエント単層（n＝2）に、pH 7.4±0.2で先端および基底外側の各々において試験ステロイドを投与した。各々の側面を120分に試料採取して、先端-基底外側（A-B）および基底外側-先端の透過性（B-A）を決定した。試験化合物の濃度を少なくとも4点の較正曲線によって一般的なLC/MS/MS法を用いて測定した。（Papp A→B）＜1.0×10-6 cm/sを特徴とする物質は低い透過性を有すると見なされる。この値より大きいと高い透過性である。物質は、流出＞3.0で（Papp B→A）＞1.0×10-6 cm/sである場合には、有意な流出を有すると見なされる；B）血漿タンパク質結合アッセイ：各透析ウェルの片面がpH 7.4のリン酸緩衝生理食塩液（PBS）を含有し、ウェルの片面が男女のヒト血漿を含有する透析ウェル（n＝2）に、試験ステロイドを投与した。37℃でおよそ24時間後、各ウェルの血漿および緩衝液面の試料を採取して、LC/MS/MSを用いて分析した。これらの実験はAbsorption Systems, Inc.で行われ、結果を表8に表す。
【０３１２】
（表８）
0005777890.tif 000075
【０３１３】
血漿タンパク質の結合
HSA結合親和性は、薬物の発見および開発において考慮される重要な薬物動態特性である。HSAとの結合によって、循環中で疎水性分子は可溶化する。血清アルブミンに対する化合物の結合強度は、標的組織に対する化合物の分布、およびゆえにその生物学的利用率を決定する主な要因の1つである。図7において示されるように、エクジステロイドは、2.1×10-4〜3.8×10-4（Ka値）の範囲の類似のHSA結合親和性を示す。この組におけるHSA結合が最も弱い化合物は20E 22-エチルエーテル（5）であり、これはまたこの組のエーテルのうち最も低いMlogP値および最も高い水溶性計算値を有する。HSA結合が最も強い化合物は、PoA 3,22-ジメチルエーテル（20）であり、これはまたこの組のエーテルのうち最も高いMlogP値を有し、エクジステロイドに対する水溶解度計算値が低い範囲にある。このように、エクジステロイドHSA結合と化合物の疎水性と水溶解度のあいだには一般的な相関がある。
【０３１４】
代謝および排泄  ヒトにおける20Eの推定半減期は9時間である。マウス、ラットおよびヒトにおける公知の代謝物には、デヒドロキシル化、B環の還元、C-3でのエピマー化、および20,22-ジオール切断の産物が含まれる。最初の原理のみならず、代謝安定性を増強させるアルキルキャピングの先の例から、エクジステロイドアルキルエーテルは、対応する非エーテルよりデヒドロキシル化、酸化的切断および共役反応に対する回復が早く；O-脱アルキル化段階は最初に起こらなければならないであろう。
【０３１５】
OHキャッピングは、物理化学特性、および特にエクジステロイドの代謝を改善する有効な方法である。全体的なバランスはアルキル化を通して達成される：過剰な特性（すなわち、水溶性および親水性）は、欠如している特性（代謝安定性、クリアランス）を増強するためにモジュレートされる。これは効果を犠牲にすることなく達成される。
【０３１６】
薬物としての半合成エクジステロイド
エクジステロイドが含まれるステロイドは、EcRに基づくスイッチ系においてもう1つの有用な化学タイプであるジアシルヒドラジンに加えて遺伝子スイッチリガンドを表す。
【０３１７】
本明細書において開示されるアルキル化戦略は、生物学的利用率および薬物送達パラメータを付与するADME特性をモジュレートする。22-O-アルキル化は、1つの改変を表す。そのようなアルキル化は、スイッチ活性化遺伝子治療のための改善されたステロイド性作動物質を提供する。特異的エクジステロイドヒドロキシル基のメチル化により、本発明者らは、選択されたEcRに対する効果を保持するかまたは向上させながら、エクジステロイドの薬理学的に関連する物理化学特性の改善を確立した。
【０３１８】
2位、3位、14位、20位および22位でのヒドロキシル基の付加は効果を次第に増加させるが、25位でのヒドロキシル化は効果を減少させる。それにもかかわらず、E274V/V390I/Y410E変異体-CfEcRのシアステロン活性化およびシルバーリーフコナジラミBaEcRのカネセンステロン活性化などのいくつかの域外値のリガンド/EcRの組み合わせは、相対的効果の逆転を示して、直交遺伝子スイッチを方向性に設計できることを例証する。これらの2つのリガンド／受容体対の効果の逆転は、BaEcRにおける2つのトレオニンに対応するE274V/V390I/Y410E変異体-CfEcRにおけるステロイド-尾接触残基V411およびM502によって説明される可能性がある。一般的に、鱗翅目と非鱗翅目は、CfEcR-V411位でのVからT/N/S変化によって互いに区別される。もう1つの効果の逆転はまた、CfEcRのE274V/V390I/Y410E変異体において機能的なシアステロンおよびネッタイシマカ（Aa）EcRを活性化するポリポジンBについて観察される。
【０３１９】
実施例2
本発明者らは、一般的な2-ハイブリッド遺伝子スイッチフォーマットにおいて9種の節足動物を表すEcR 10個の群に対して42個のステロイドの組をアッセイした；BIIアッセイおよびVGECR/RXR遺伝子スイッチからのデータを本文において解釈した。傾向および異常な効果の逆転も同様に作表した。EcR配列を整列させて、利用可能な結晶構造からの接触残基（鱗翅目ニセアメリカタバコガ（Heliothis virescens）[Hv]、半翅目タバココナジラミ（Bemisia tabaci）[Bt]、および甲虫コクヌストモドキ（Tribolium castaneum）[Tc]からのLBD）に注釈をつけて、リガンドに対する置換基の変化と受容体に対する残基パターンのあいだの効果の相関を書き留めた。SAR域外値は、リガンドデータセットにおいてリガンドを明らかにすることを提供する。効果の逆転は直交遺伝子スイッチの構築のために同定される。
【０３２０】
本発明者らは、新規ナノモルおよびナノモル下のステロイド/EcRの組み合わせを同定した。本発明者らはまた、いくつかのまれなステロイドについてのより十分なEcRスクリーニングデータを記載する。2-ハイブリッド遺伝子スイッチフォーマットにおけるEcR配列を、応答性、基底活性、およびダイナミックレンジに関して評価する。EcR LBD配列を考慮して、2つの予想外のステロイド/EcR直交性が同定および査定される。
【０３２１】
材料および方法
ステロイドの単離、精製、および合成
半合成ステロイド20E 2-メチルエーテル、20E 3-メチルエーテル、20E 22-メチルエーテル、20E 2,22-ジメチルエーテル、20E 3,33-ジメチルエーテル、20E 2,3,14,22-テトラメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン22-O-ピロールカルボキシレート、およびツルケステロン-11αプロピオネート、ツルケステロン-11αヘキサノエート、ツルケステロン-11αデカノエートを20Eまたはツルケステロンから調製した。20-ヒドロキシエクジソンから合成されたポナステロンAを除き、残りのステロイドは、植物材料から単離された。ムリステロンAは、AG Scientific Inc.（San Diego, CA）から購入した。以下の化合物は他の研究者によって提供された：2-デオキシエクジソン、エクジソン、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン、およびシアステロン（Prof. Rene Lafont）、タキシステロン、ポリポジンB、アジュガステロンC、(25S)-イノコステロン、(25R)-イノコステロン、マキステロンA、マキステロンC、カルタモステロン（carthamosterone）、インテグリステロンA（intergristerone A）（Dr. Juraj Harmatha）、20-ヒドロキシエクジソン（Dr. Vladimir Volodin）、ツルケステロン（Prof. Zyadilla Saatov）およびカネセンステロン（Prof. Apichart Suksamrarn）。合成／精製において用いられる試薬および溶媒はFisher ScientificおよびSigma-Aldrichから購入した。HPLC用水は、純度17 Wの程度にまで脱イオン化した。
【０３２２】
個々のステロイドの精製はHPLCによって行われ、以下の方法の1つまたは複数を伴った：（a）セミ分取C18-HPLC（Phenomenex Sphereclone ODS2；250×10 mm、5μm、流速＝2 mL/分）および（b）分取C18- HPLC（Phenomenex Sphereclone ODS2；250×21.20 mm、5μm、流速＝5 mL/分）、適したCH3OH/H2O混合物によってアイソクラティックに溶出；（c）セミ分取シリカカラム（Kinesis Zorbax Sil；250×9.4 mm、5μm、流速＝2 mL/分）、CH2Cl2：2-PrOH：H2O 160：30：1.5、または125：30：2.0、v/v/vによってアイソクラティックに溶出。
【０３２３】
試料は全て、RP-HPLCおよび／またはNP（ジオール）-HPLCによって少なくとも98％まで精製した。化合物の純度は、30％から100％までのCH3OH水溶液の直線勾配に25分間供した後、アイソクラティック100％CH3OHに10分間供した異なる2つの逆相カラム（Phenomenex Sphereclone C18およびC6、 5μm、150×4.60 mm；Phenomenex, Macclesfield, U.K.）、および、2％から10％まで、または4％から10％までのCH3OHのCH2Cl2溶液の直線勾配に、全て流速1 mL/分で波長（λ）242 nmおよび300 nmで供した1つの順相カラム（Kinesis-GRACE Apex II Diol、5μm、150×4.60 mm）を用いる、Gilson 170システム（Anachem Limited, Luton, U.K.）上のダイオードアレイ検出器（DAD）にインターフェースで接続したHPLCによって確認した。
【０３２４】
産物の定量は、14-α-ヒドロキシ-7-エン-6-オン部分（λmax＝242 nmモル吸収係数（ε）＝12,400 Lmol-1cm-1）または14α-ヒドロキシ-7,9(11)-ジエン-6-オン部分（λmax＝299 nm、ε＝14,190 Lmol-1cm-1）のいずれかを含有する化合物に関して、Shimadzu UV-2401PC（Shimadzu GB, Milton Keynes, U.K.）においてUV分光法によって行った。濃度はランバート・ベールの等式に従って計算した。
【０３２５】
（表９）
0005777890.tif 000076
0005777890.tif 000077
a ヌクレオチド配列
【０３２６】
細胞遺伝子スイッチアッセイ - ショウジョウバエBII細胞形態学
ショウジョウバエBII細胞株バイオアッセイを用いて、潜在的EcRリガンドの活性を試験した。アッセイは1試料あたり4個ずつ行った。保存液（10-3 M〜10-10 M）のメタノール溶液を、試験化合物の各々に関して調製した。各希釈液のアリコート（20μL）をマイクロタイタープレートのウェルに移して、溶媒を蒸発させた。ウェルに細胞浮遊液200μLをおよそ2×105個/mL培地で加えて、蓋をしたプレートを25℃の湿潤環境において7日間インキュベートした。ステロイド濃度の関数としての細胞の応答を405 nmでの濁度によって測定した。
【０３２７】
細胞遺伝子スイッチアッセイ−工学操作されたEcR：USP/RXRシステム
細胞遺伝子スイッチアッセイを、マウス胚線維芽細胞（NIH3T3）において以下の構築物をトランスフェクトすることによって行った。表9のEcRのD、E、およびFドメインをGAL4-DBDに融合させて、CMVプロモーターの制御下に配置した。プライマーおよびクローニング段階は上記の通りである。ヒトRXRβおよびトノサマバッタRXRのキメラRXRをVP 16-ADに融合させて、SV40eプロモーターの制御下に配置した。誘導型ルシフェラーゼレポータープラスミドpFRLuc（Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA）は、5コピーのGAL4応答エレメントおよび1つの合成最小プロモーターを含有した。VP 16活性化ドメインならびに非対称EcRおよびグルココルチコイド受容体応答エレメントを認識する3残基変異DBDを有するハイブリッドEcRを使用するVgEcR/RXR遺伝子スイッチ系を、Invitrogen Inc.（Carlsbad, CA, USA）から得て、NIH3T3細胞における一過性のトランスフェクションによって類似の様式で使用した。
【０３２８】
NIH3T3細胞（これらのNIH3T3細胞は、実施例1のNIH3T3細胞とは異なるクローン集団に由来する）を、いずれもMediatech, Inc., Manassas, VAから得た10％仔ウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）において37℃で5％CO2で維持した。細胞を96ウェルプレートにおいて2,500個/ウェルの密度で増殖培地50μLにおいて平板培養した。翌日、細胞をまず、ジメチルスルホキシド（DMSO；対照）またはリガンドを含有するDMSO溶液を含有する無血清DMEM 35μLによって処置した。次に、細胞を、製造元の説明書に従いSuperFectトランスフェクション試薬（Qiagen Inc., Valencia, CA, USA）を用いてウェルあたりEcR構築物0.04 μg、RXR構築物0.04μg、およびルシフェラーゼレポーター構築物0.16μgを含有する無血清DMEM 15μLにより、トランスフェクトした。リガンドを0.01〜33μMの8種の用量で試験して、DMSOの最終濃度は対照および処置ウェルの双方において0.33％であった。処置後およびトランスフェクションインキュベーションの48時間後、製造元の説明書に従ってBright-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Promega Corporation, Madison, WI, USA）を用いて、細胞をルシフェラーゼ活性に関してアッセイした。
【０３２９】
タンパク質配列はPubmedから得た。配列がヌクレオチドとしてしか入手できない場合（BaおよびNc）、EBI Transeqプログラム（http://www.ebi.ac.uk/emboss/transeq/）を用いて翻訳を行った。配列のアラインメントおよび系統発生推定をClustalW2（ウェブ上、ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/において利用可能）を用いて得た。1つより多いEcR変種が入手可能である場合、ClustalWを用いる予備的なアラインメントを行って、残基の変化がLBDの外側に位置することを証明した。
【０３３０】
分子モデリングはSYBYL 7.1および7.3を用いて行った。シアステロン/E274V/V390I/Y410E変異体-CfEcR//カネセンステロン/BaEcRの比較：PoAが結合したHvEcR（PDB：1R1K）、およびPoAが結合したBtEcR（BaEcRと同一のLBD、PDB：1Z5X）を、Sybyl 7.1において相同性により整列させて、C-α原子のアラインメントに基づいて重み付けRMS距離＝1.22を与えた。6.5Åの重原子半径内の残基を同定した。CfEcR V390およびY410をそれぞれ、IおよびEに変異させた。他の残基は全て検討対象から除いた。受容体の適合を最大限にするためにE274V/V390I/Y410E変異体-CfEcRにドッキングさせたシアステロン、およびBaEcRにドッキングさせたカネセンステロンを、ステロイド環系を混乱させることなく任意で側鎖の最小化（Gasteiger-Huckel電荷を加えたTripos Force Field）を行って、各々の結晶構造においてPoAから手動で改変させた。24S-カネセンステロンに関して、BaEcRのM301 C-C-S-Cのねじれを、カネセンステロンのピロールカルボニルとの立体的衝突を回避するために180°移動させたが、これは、a）M301がH7上にあってH11に向かって外部方向を向くこと、b）この移動が他の衝突を生じないこと、およびc）メチオニンシフトの先例がBYI06830:HvEcR結晶構造（PBD: 1R20）において見いだされることを考慮すると妥当な調節である。24R-カネセンステロンに関して、BaEcRのM301 C-C-S-Cねじれを、カネセンステロンのピロールカルボニルとの立体的衝突を回避するために10°移動させた。同様に、より良好なピロール環の位置を達成するために、ステロイドC23-24結合のねじれを10°調節した。要約すると、シアステロンおよびカネセンステロンをその各々の受容体に適合させるために、接触残基またはステロイド側鎖のごくわずかで妥当な調節しか必要ではなかった。次に、AaEcRおよびBtEcRの対応する結合ポケット残基を、同一性および配置に関して比較した。シアステロン/E274V/V390I/Y410E変異体-CfEcR//ポリポジンB/AaEcR比較：シアステロンを上記のように用いた。ポリポジンBをPoA：BtEcR複合体におけるPoAから改変した。直交リガンド認識に関連するAaEcR残基を以下のように同定した。PoA：BtEcR結晶構造（PDB 1Z5X）における6.5Å結合ポケット残基を同定して、BtEcR配列をAaEcRと整列させた。これらの結合ポケット残基において、2つの受容体のあいだで5個が異なった：Bt-H200/Aa-Q353、Bt-T287/Aa-N441、Bt-M389/Aa-Q545、Bt-T393/Aa-M549、およびBt-V404/Aa-L560。これらの5残基それぞれは、E274V/V390I/Y410E変異体-CfEcRにおけるそのアラインメント相対物と同一であることから、これらの5残基を直交の一因であるとして除去した。配置が同一で類似である2つの受容体のあいだの追加の残基も同様に除去した。BYI06830/カネセンステロンのオーバーレイ：PoAに結合させたHvEcR（PDB 1R1K）およびBYI06830（PDB 1R20）を相同性によって整列させた。PoAを先に得たようにカネセンステロンと交換した。以下の3Dモデルを生成した（データは示していない）：A．VY-CfEcR（緑色）にドッキングさせたシアステロン（炭素原子を藍色、酸素原子を赤色）と、BaEcR（オレンジ色）にドッキングさせた24S-カネセンステロン（炭素原子を黄色、酸素原子を赤色、窒素原子を青色、水素原子を白色）との重ね合わせ。VY-CfEcR残基は、VY-EcR-I390に変異させたHvEcR-V395、およびVY-CfEcR-E410に変異させたHvEcR-Y415を除き、PoA結合HvEcR結晶構造（PDBコード：1R1K）に由来する。リガンドの6.5Å（重原子距離）内で���り、かつ高効率であるか、または2つのEcRのあいだの同一性が異なるもしくはコンフォメーションが実質的に異なる、残基のみを記載する。青色の標識はVY-CfEcR残基を指し、茶色の標識はBaEcR残基を指す。画像は、ヘリックスH3およびH4の部分を前景に配置したβ-シートに向かう図である。カネセンステロンは、表面を静電電位によって着色して示される。24S-カネセンステロンとBaEcR残基（T337、T426）のあいだの選択された水素結合を赤の破線で示す。シアステロンは、類似のH-結合相互作用に関与しない。B．VY-CfEcR（緑色）にドッキングさせたシアステロン（藍色）とAaEcR（オレンジ色）にドッキングさせたポリポジンB（黄色）との重ね合わせ。ポリポジンBを静電電位によって表面を着色して示す。C．PoA：HvEcR結晶構造と類似のHvEcRにドッキングさせた24-S-カネセンステロン（黄色）と、HvEcR結晶構造において見いだされるジアシルヒドラジンBYI06830（藍色）の重ね合わせ。
【０３３１】
結果
42個のステロイドのスクリーニングセットを図9、10、および11に記載する。ステロイドの最大のサブセットは、2位、3位、5位、11位、14位、20位、22位、および25位でのヒドロキシル化状態、ならびに2位、3位、14位、および22位でのメチル化が多様である（図9）。ステロイドの第二のサブセットは、脱飽和、アルキル化、および鎖-環縮合が含まれる側鎖改変のセレクションを含む（図10）。第三および最終サブセットは、異常な構造の変動を有するステロイドおよび1つのブラシノステロイド（イソホモブラッシノリド）を含有する（図11）。
【０３３２】
異なる10個のEcRの各々から、2-ハイブリッドフォーマット−EcRの上流に融合したGAL4 DBDおよびRXR-USPキメラの上流に融合したVP16活性化ドメイン−を用いて構築した遺伝子スイッチ系（図12）を、pMおよびpVP16プラスミドをそれぞれ用いてネズミNIH3T3細胞に一過性にトランスフェクトした。ルシフェラーゼをレポーター遺伝子として使用して、ベクターpFRLUCを一過性にトランスフェクトした。42個のメンバーのステロイドセットに関して用量反応曲線を得た。EC50値を誘導して、図13（鱗翅目）および図14（非鱗翅目）に示す。6個のステロイドエーテルのサブセットからのデータを主に含むが第一のセットにおけるいくつかの天然のステロイドからのデータも含む、第二のステロイド遺伝子スイッチのEC50データセットも同様に、3T3細胞株における同じスイッチ系に関して記録した。これらのデータにはまた、図15および図16において示されるVgEcR/RXRシステムを用いるアッセイ結果が含まれる。
【０３３３】
有効度を3つの方法で測定した。最初の方法は、ルミノメーターから直接記録された相対発光量（RLU）である。第二の方法は、バックグラウンドRLUに対する試験リガンド濃度でのRLUの比、すなわち誘導倍率（FI）である。第三の方法は、ジアシルヒドラジンN-(2-エチル-3-メトキシベンゾイル)-N'-(3,5-ジメチルベンゾイル)-N'-tert-ブチルヒドラジンに関して観察された最大FIに対する任意の濃度での所定のリガンドに関して観察された最大FIの比である。これらの値を、図13〜16においてRMFI（相対最大誘導倍率）として入力する。各々のスイッチ系に関する基底発現の指標として、バックグラウンドRLUを各表の最後の列に入力する。
【０３３４】
PoA/NcEcRの組み合わせはEC50＝0.3 nM（RMFI＝1）を示した。さらに、PoA活性化BmEcRはEC50＝0.11μM、RMFI＝0.98を示し、ジアシルヒドラジン参照FI＝1776、バックグラウンドFI＝3を示した。PoA活性化E274V/V390I/Y410E変異体-CfEcRは、EC50＝0.11μM、RMFI＝0.52、ジアシルヒドラジン参照FI＝4393、バックグラウンドFI＝2を示した。しかし、20EはCfEcRに対して実質的に反応を示さなかった。
【０３３５】
ステロイド効果／受容体応答性の概要を、系統発生順に各々のEcRタイプに対して選択されたステロイドの-log(EC50)を描写する図17の重ねた折れ線グラフで与える。交差は、交差の反対側の2つのリガンド-受容体対のあいだの効果の逆転を示す。たとえば、シアステロン/E274V/V390I/Y410E変異体-CfEcRとカネセンステロン/BaEcR、およびシアステロン/E274V/V390I/Y410E変異体CfEcRとポリポジンB/AaEcR。これらの2つの系の用量反応曲線を図18および図19に示す。E274V/V390I/Y410E変異体-CfEcR/BaEcR対に関する-log(EC50)対-log(EC50)のグラフを図20に示す。
【０３３６】
収集されたスクリーニングセットは、ヒドロキシル化の数および位置、飽和直鎖C8側鎖、シス-A/B環接合、および7-エン-6-オン発色団における変動が含まれる構造および化学多様性を表す。植物ステロイド、カネセンステロンは、C24に付着したピロール2-カルボキシレート基を有する。この化合物は、ショウジョウバエBII細胞株に対して高い生物活性を有する（EC50＝5.3×10-10 M）。このバイオアッセイにおいて、試験したステロイドは全て何らかの活性を示し、EC50はほぼ6桁に及ぶ（図14）。
【０３３７】
20EおよびPoAの一連のメチルエーテルを多数の受容体に対してスクリーニングした（図15および16）。
【０３３８】
PoAおよび20Eはいずれも、鱗翅目より非鱗翅目受容体に対して強力である。鱗翅目E274V/V390I/Y410E変異体-CfEcRもまた、Y410E変異によりエクジステロイドテールに関して改変領域を有する。これによって、V390I変異と共に、E274V/V390I/Y410E変異体-CfEcRは、非鱗翅目EcRにより類似するようになる。
【０３３９】
PoA、ムリステロンA、スタキステロンC、およびイソスタキステロンCは、調べたEcRの組に対して活性なステロイドである（図13および14）。全てが疎水性のテールを有する。シアステロンは鱗翅目EcRに対していくぶん選択的であるが、カネセンステロンは、非鱗翅目EcRに対して選択的である。同様に、アジュガステロンCの活性は非鱗翅目種ではより高い。BaEcRを除き、カネセンステロンは一般的に弱い（AaEcRおよびAmaEcR）かまたは無効なRMFI値を有する。
【０３４０】
選択された天然のエクジステロイドと共に6個の半合成ステロイドエーテルを、代替的3T3線維芽細胞保存液（図15および16）において試験した。概して、以下の観察を行った：20E 3-O-メチルエーテルを有するE274V/V390I/Y410E変異体-CfEcRの場合、効果は維持されるか増加さえする。20E 3-メチルエーテル、20E 22-メチルエーテル、および20E 3,22-O-ジメチルエーテルを有するMsEcRなどの他のエーテルは効果を失う。
【０３４１】
ステロイドの効果および有効度は、工学操作されたEcRにおいてジアシルヒドラジン（N-(2-エチル-3-メトキシベンゾイル)-N'-(3,5-ジメチルベンゾイル)-N'-tert-ブチルヒドラジン）と同等である。たとえば、PoAおよびジアシルヒドラジンはいずれも、AaEcRの非常に強力な1桁台のnMの活性化剤である。しかし、PoAはNc、Aa、およびAma EcRに対して最も強力であるが（0.3〜2 nM）、ジアシルヒドラジンは鱗翅目受容体に対してより強力である（3〜20 nM）。ポナステロンは、試験した全てのEcRに対してマイクロモル下の効果を示すが、ジアシルヒドラジンは、BaEcRに対してマイクロモル濃度を有する（6μM）。AmaEcR、BaEcR、およびTmEcRを除き、ジアシルヒドラジンは、PoAよりいくぶん有効である。試験した受容体において、E274V/V390I/Y410E変異体-CfEcRおよび他の鱗翅目EcRは最善に最適化されるが、AmaEcRおよびTmEcRは、全体的な誘導倍率およびバックグラウンドにより、遺伝子スイッチ系としてあまり最適化されない。
【０３４２】
マルチリガンド/受容体相互作用
E274V/V390I/Y410E変異体-CfEcR//BaEcR対は、中等度に相関する（R2＝0.6、図4）。これに対応して、受容体-log(EC50)の重ねた折れ線グラフ（図17）は、相対効率（RMFI）の検討と共に、シアステロン（E274V/V390I/Y410E変異体-CfEcR＞BaEcR）とカネセンステロン（BaEcR＞E274V/V390I/Y410E変異体-CfEcR）のあいだで効果の逆転を示す。用量反応曲線（図18）は、直交性を例証する。
【０３４３】
効果の逆転は、シアステロン/E274V/V390I/Y410E変異体-CfEcR//ポリポジンB/AaEcR二重鎖によって起こる（図17）。E274V/V390I/Y410E変異体-CfEcR//AaEcR対も同様に中等度に相関する（R2＝0.6）。用量反応曲線（図19）を調べると、EC50のマージンは、シアステロンE274V/V390I/Y410E変異体-CfEcR//カネセンステロン/BaEcR系より狭い。
【０３４４】
遺伝子スイッチ用途
リガンド誘導型遺伝子発現系は、機能的ゲノミクス、薬物開発、生物治療タンパク質産生、トランスジェニック農作物および動物における形質発現、系統および合成生物学、細胞の工学操作、ならびに遺伝子治療にとって有用である。
【０３４５】
少なくとも2つのステロイドリガンド（PoAおよびムリステロンA）に関して、実現可能性が証明されている。非天然の、非ステロイド化合物において、アミドケトンおよびテトラヒドロキノリン化学タイプに関して効果が証明されている。ジアシルヒドラジンファミリーリガンドにおいて、いくつかは工学操作されたEcRに基づくスイッチをナノモルより低い濃度で活性化することができる。対照的に、ステロイドは、遊離のヒドロキシル基を有し、代謝的に壊れやすい。これらのヒドロキシル基のいくつかは、よりADMEに適したファーマコフォア要素に改造される。
【０３４６】
生物医学は多重スイッチを必要とする。癌においていくつかの有害な遺伝子機能を同時に制御することは疾患の抑制において重要でありうる。実際に、多重スイッチは、頑健でなければならず、単純な工学操作パラメータが許容される。EcRに基づくスイッチにおいて、ステロイド／ジアシルヒドラジンおよびTHQ/ジアシルヒドラジン二重鎖の基本成分が報告されている（Kumar et al. PNAS 2002 99:14710-15；Kumar et al. J Biol Chem 2004 279:27211-18）。本明細書において開示されるシアステロン/カネセンステロンおよびシアステロン/ポリポジンB系は、ステロイドに基づく直交遺伝子スイッチを表す。
【０３４７】
本発明は、本明細書に記載の特定の態様によってその範囲を限定されない。実際に、本
明細書に記載の改変に加えて本発明の様々な改変が、前述の説明および添付の図面から当
業者に明らかとなるであろう。そのような改変は添付の特許請求の範囲に含まれると意図
される。
本願は、以下の態様を含み得る。
［１］
以下の式を有する化合物：
【化１】
0005777890.tif 000078

式中、
R1、R2、R3、およびR4は
a）H、(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロ
キシアルキル；(C1-C4)アルコキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、ヒドロキシル、もし
くは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよい(C2-C6)アルケニル；ハロ、シアノ、ヒド
ロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよい(C2-C6)アルキニル；ハロ
、シアノ、ヒドロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよい(C3-C5)シ
クロアルキルであるか；または
b）置換基が独立して、1〜5つのH、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、(C1-C6)アル
キル、もしくは(C1-C6)アルコキシである、非置換もしくは置換ベンジルであり；ならび
に
R5は、H；OH；F；Cl；または(C1-C6)アルコキシであり；
但し
R1、R2、R3、およびR4がイソプロピルである場合、R5はヒドロキシルではなく、
R5がH、ヒドロキシル、メトキシ、またはフルオロである場合、R1、R2、R3、およびR4の
少なくとも1つはHではなく；
R1、R2、R3、およびR4の1つのみがメチルであり、R5がHまたはヒドロキシルである場合、
R1、R2、R3、およびR4の残りはHではなく；
R4と、R1、R2、およびR3のうちの1つの両方がメチルである場合、R5はHでもヒドロキシル
でもなく；
R1、R2、R3、およびR4が全てメチルである場合、R5はヒドロキシルではなく；
R1、R2、およびR3が全てHであり、R5がヒドロキシルである場合、R4はエチルでも、n-プ
ロピルでも、n-ブチルでも、アリルでも、ベンジルでもない。
［２］
請求項1記載の1つまたは複数の化合物と担体とを含む組成物。
［３］
少なくとも1つの遺伝子スイッチ；および
少なくとも1つの活性化リガンド
を含む組換え型遺伝子スイッチ組成物であって、前記活性化リガンドが以下である、組成
物：
20-ヒドロキシエクジソン、2-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、3-メチルエ
ーテル、20-ヒドロキシエクジソン、14-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、2,2
2-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、3,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキ
シエクジソン、14,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22,25-ジメチルエ
ーテル、20-ヒドロキシエクジソン、2,3,14,22-テトラメチルエーテル、20-ヒドロキシエ
クジソン、22-n-プロピルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-n-ブチルエーテル、2
0-ヒドロキシエクジソン、22-アリルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-ベンジル
エーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-(28R,S)-2'-エチルオキシラニルエーテル、ポ
ナステロンA、2-メチルエーテル、ポナステロンA、14-メチルエーテル、ポナステロンA、
22-メチルエーテル、ポナステロンA、2,22-ジメチルエーテル、ポナステロンA、3,22-ジ
メチルエーテル、ポナステロンA、14,22-ジメチルエーテル、ダクリハイナンステロン（d
acryhainansterone）、22-メチルエーテル、25,26-ジデヒドロポナステロンA、（イソ-ス
タキステロン（iso-stachysterone）C（Δ25(26)））、シダステロン（shidasterone）（
スタキステロンD）、スタキステロンC、22-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン（タキシ
ステロン（taxisterone））、ポナステロンA、ポリポルステロン（polyporusterone）B、
22-デヒドロ-20-ヒドロキシエクジソン、ジメチルフラニルエクジソン、(22R)-20-(2,2'-
ジメチルフラニル)エクジソン、22-デオキシエクジソン、25-デオキシエクジソン、22-デ
ヒドロエクジソン、エクジソン、22-エピ-エクジソン、24-メチルエクジソン（20-デオキ
シマキステロンA）、エクジソン-22- ヘミスクシネート、25-デオキシエクジソン-22-β-
D-グルコピラノシド、エクジソン-22-ミリステート、22-デヒドロ-20-イソ-エクジソン、
20-イソ-エクジソン、20-イソ-22-エピ-エクジソン、2-デオキシエクジソン、シレネオシ
ド（sileneoside）E（2-デオキシエクジソン 3β-グルコシド；ブレクノシド（blechnosi
de）A）、2-デオキシエクジソン-22-アセテート、2-デオキシエクジソン-3,22-ジアセテ
ート、2-デオキシエクジソン-22-β-D-グルコピラノシド、2-デオキシエクジソン 25-β-
D-グルコピラノシド、2-デオキシ-21-ヒドロキシエクジソン、3-エピ-22-イソ-エクジソ
ン、3-デヒドロ-2-デオキシエクジソン（シレノステロン（silenosterone））、3-デヒド
ロエクジソン、3-デヒドロ-2-デオキシエクジソン-22-アセテート、エクジソン-6-カルボ
キシメチルオキシム、エクジソン-2,3-アセトニド、14-エピ-20-ヒドロキシエクジソン-2
,3-アセトニド、20-ヒドロキシエクジソン-2,3-アセトニド、20-ヒドロキシエクジソン-2
0,22-アセトニド、14-エピ-20-ヒドロキシエクジソン-2,3,20,22-ジアセトニド、パキシ
ロステロン-20,22-p-ヒドロキシベンジリデンアセタール、ポストステロン（poststerone
）、(20R)-ジヒドロポストステロン、(20S)ジヒドロポストステロン、ポストステロン-20
-ダンシルヒドラジン、(20S)-ジヒドロポストステロン-2,3,20-トリベンゾエート、(20R)
-ジヒドロポストステロン-2,3,20-トリベンゾエート、(20R)ジヒドロポストステロン-2,3
-アセトニド、(20S)ジヒドロポストステロン-2,3-アセトニド、(5α-H)-ジヒドロルブロ
ステロン、2,14,22,25-テトラデオキシ-5α-エクジソン、5α-ケトジオール、ボンビコス
テロール（bombycosterol）、2α,3α,22S,25-テトラヒドロキシ-5α-コレスタン-6-オン
、(5α-H)-2-デオキシ-21-ヒドロキシエクジソン、カスタステロン、24-エピ-カスタステ
ロン、(5α-H)-2-デオキシインテグリステロン（deoxyintegristerone）A、(5α-H)-22-
デオキシインテグリステロンA、(5α-H)-20-ヒドロキシエクジソン、24,25-ジデヒドロダ
クリハイナンステロン、25,26-ジデヒドロダクリハイナンステロン、5-デオキシカラダス
テロン（deoxykaladasterone）（ダクリハイナンステロン）、(14α-H)-14-デオキシ-25-
ヒドロキシダクリハイナンステロン、25-ヒドロキシダクリハイナンステロン、ルブロス
テロン、(5β-H)-ジヒドロルブロステロン、ジヒドロルブロステロン-17β-アセテート、
シジステロン（sidisterone）、20-ヒドロキシエクジソン-2,3,22-トリアセテート、14-
デオキシ(14β-H)-20-ヒドロキシエクジソン、14-エピ-20-ヒドロキシエクジソン、9α,2
0-ジヒドロキシエクジソン、マラコステロン（malacosterone）、2-デオキシポリポジンB
-3-β-D-グルコピラノシド、アジュガラクトン、ケイラントン（cheilanthone）B、2β,3
β,6α-トリヒドロキシ-5β-コレスタン、2β,3β,6β-トリヒドロキシ-5β-コレスタン
、14-デヒドロシダステロン、スタキステロンB、2β,3β,9α,20R,22R,25-ヘキサヒドロ
キシ-5β-コレスト-7,14-ジエン-6-オン、カラダステロン、(14β-H)-14-デオキシ-25-ヒ
ドロキシダクリハイナンステロン、4-デヒドロ-20-ヒドロキシエクジソン、14-メチル-12
-エン-シダステロン、14-メチル-12-エン-15,20-ジヒドロキシエクジソン、ポドエクジソ
ン B、2β,3β,20R,22R-テトラヒドロキシ-25-フルオロ-5β-コレスト-8,14-ジエン-6-オ
ン（25-フルオロポドエクジソンB）、カロニステロン（calonysterone）、14-デオキシ-1
4,18-シクロ-20-ヒドロキシエクジソン、9α,14α-エポキシ-20-ヒドロキシエクジソン、
9β,14β-エポキシ-20-ヒドロキシエクジソン、9α,14α-エポキシ-20-ヒドロキシエクジ
ソン2,3,20,22-ジアセトニド、28-ホモブラッシノリド、イソ-ホモブラッシノリド、非ス
テロイドリガンド、または請求項1記載の化合物。
［４］
少なくとも2つの遺伝子スイッチを含む、請求項3記載の組換え型遺伝子スイッチ組成物
。
［５］
遺伝子スイッチの1つが非ステロイドリガンドによって活性化される、請求項4記載の組
換え型遺伝子スイッチ組成物。
［６］
非ステロイドリガンドが、ジアシルヒドラジン、アミドケトン、およびオキサジアゾリ
ンからなる群より選択される、請求項5記載の組換え型遺伝子スイッチ組成物。
［７］
各遺伝子スイッチが、同じベクターポリヌクレオチドに存在する1つまたは複数の核酸
によってコードされる、請求項4記載の組換え型遺伝子スイッチ組成物。
［８］
各遺伝子スイッチが、ヘテロ二量体受容体複合体を形成する、請求項4記載の組換え型
遺伝子スイッチ組成物。
［９］
各遺伝子スイッチのヘテロ二量体受容体複合体が共通の成分を有する、請求項8記載の
組換え型遺伝子スイッチ組成物。
［１０］
共通の成分がRXRリガンド結合ドメインまたはRXR/USPキメラリガンド結合ドメインを含
む、請求項9記載の組換え型遺伝子スイッチ組成物。
［１１］
個々に機能的な複数の組換え型遺伝子スイッチを含む組成物であって、
個々に機能的な各組換え型遺伝子スイッチが
以下を含む第一のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドを含む、第一の組
換え型カセット：
その発現がモジュレートされる関心対象遺伝子に機能的に連結された応答エレメント
を認識するDNA結合ドメイン；
エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、変異体エクジソン受容体リガンド結合ドメ
イン、トウヒノシントメハマキ（Choristoneura fumiferana）エクジソン受容体リガンド
結合ドメインのV390I/Y410E変異体、またはトウヒノシントメハマキのエクジソン受容体
リガンド結合ドメインのE274V / V390I / Y410E変異体；
以下を含む第二の組換え型カセット：
前記DNA結合ドメインに対して結合することができる応答エレメント；
トランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター；および
関心対象遺伝子
を含み、
前記組成物が複数のリガンドを含み、
少なくとも1つのリガンドが以下である、前記組成物：
20-ヒドロキシエクジソン、2-メチルエーテル、20- ヒドロキシエクジソン、3-メチル
エーテル、20-ヒドロキシエクジソン、14-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、2
,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、3,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロ
キシエクジソン、14,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22,25-ジメチル
エーテル、20-ヒドロキシエクジソン、2,3,14,22-テトラメチルエーテル、20-ヒドロキシ
エクジソン、22-n-プロピルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-n-ブチルエーテル
、20-ヒドロキシエクジソン、22-アリルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-ベンジ
ルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-(28R,S)-2'-エチルオキシラニルエーテル、
ポナステロンA、2-メチルエーテル、ポナステロンA、14-メチルエーテル、ポナステロンA
、22-メチルエーテル、ポナステロンA、2,22-ジメチルエーテル、ポナステロンA、3,22-
ジメチルエーテル、ポナステロンA、14,22-ジメチルエーテル、ダクリハイナンステロン
、22-メチルエーテル、25,26-ジデヒドロポナステロンA、（イソ-スタキステロンC（Δ25
(26)））、シダステロン（スタキステロンD）、スタキステロンC、22-デオキシ-20-ヒド
ロキシエクジソン（タキシステロン）、ポナステロンA、ポリポルステロンB、22-デヒド
ロ-20-ヒドロキシエクジソン、ポナステロンA 22-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジ
ソン、プテロステロン（pterosterone）、(25R)-イノコステロン、(25S)-イノコステロン
、ピンナタステロン（pinnatasterone）、25-フルオロポナステロンA、24(28)-デヒドロ
マキステロンA、24-エピ-マキステロンA、マキステロンA、20-ヒドロキシエクジソン-22-
メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-25-メチルエーテル、アブタステロン、22,23
-ジ-エピ-ジェラジアステロン（geradiasterone）、20,26-ジヒドロキシエクジソン（ポ
ドエクジソンC）、24-エピ-アブタステロン、ジェラジアステロン、29-ノルシアステロン
、アジュガステロンB、24(28)[Z]-デヒドロアマラステロン（dehydroamarasterone）B、
アマラステロンA、マキステロンC、ラピステロン（rapisterone）C、20-ヒドロキシエク
ジソン-22,25-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-22-エチルエーテル、カルタ
モステロン（carthamosterone）、24(25)-デヒドロプレシアステロン、ロイゼアステロン
（leuzeasterone）、シアステロン、20-ヒドロキシエクジソン-22-アリルエーテル、24(2
8)[Z]-デヒドロ-29-ヒドロキシマキステロンC、20-ヒドロキシエクジソン-22-アセテート
、ビチコステロン（viticosterone）E（20-ヒドロキシエクジソン 25-アセテート）、20-
ヒドロキシエクジソン-22-n-プロピルエーテル、24-ヒドロキシシアステロン、20-ヒドロ
キシエクジソン-22-n-ブチルエーテル、ポナステロンA 22-ヘミスクシネート、22-アセト
アセチル-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-22-ベンジルエーテル、
カネセンステロン、20-ヒドロキシエクジソン-22-ヘミスクシネート、イノコステロン-26
-ヘミスクシネート、20-ヒドロキシエクジソン-22-ベンゾエート、20-ヒドロキシエクジ
ソン-22-β-D-グルコピラノシド、20-ヒドロキシエクジソン-25-β-D-グルコピラノシド
、シレネオシドA（20-ヒドロキシエクジソン-22α-ガラクトシド）、3-デオキシ-1β,20-
ジヒドロキシエクジソン（3-デオキシインテグリステロンA）、2-デオキシインテグリス
テロンA、1-エピ-インテグリステロンA、インテグリステロンA、シレネオシドC（インテ
グリステロンA 22α-ガラクトシド）、2,22-ジデオキシ-20-ヒドロキシエクジソン、2-デ
オキシ-20-ヒドロキシエクジソン、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン-3-アセテート
、2-デオキシ-20,26-ジヒドロキシエクジソン、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン-22
-アセテート、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン-3,22-ジアセテート、2-デオキシ-20
-ヒドロキシエクジソン-22-ベンゾエート、ポナステロンA 2-ヘミスクシネート、20-ヒド
ロキシエクジソン-2-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-2-アセテート、20-ヒド
ロキシエクジソン-2-ヘミスクシネート、20-ヒドロキシエクジソン-2-βD-グルコピラノ
シド、2-ダンシル-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-2,22-ジメチル
エーテル、ポナステロンA 3β-D-キシロピラノシド（リムナンテオシド（limnantheoside
）B）、20-ヒドロキシエクジソン-3-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-3-アセ
テート、20-ヒドロキシエクジソン-3β-D-キシロピラノシド（リムナンテオシドA）、20-
ヒドロキシエクジソン-3β-D-グルコピラノシド、シレネオシドD（20-ヒドロキシエクジ
ソン-3α-ガラクトシド）、20-ヒドロキシエクジソン 3β-D-グルコピラノシル-[l-3]-β
-D-キシロピラノシド（リムナンテオシドC）、20-ヒドロキシエクジソン-3,22-ジメチル
エーテル、シアステロン-3-アセテート、2-デヒドロ-3-エピ-20-ヒドロキシエクジソン、
3-エピ-20-ヒドロキシエクジソン（コロナタステロン（coronatasterone））、ラピステ
ロンD、3-デヒドロ-20-ヒドロキシエクジソン、5β-ヒドロキシ-25,26-ジデヒドロポナス
テロンA、5β-ヒドロキシスタキステロンC、25-デオキシポリポジンB、ポリポジンB、25-
フルオロポリポジンB、5β-ヒドロキシアブタステロン、26-ヒドロキシポリポジンB、29-
ノルセンゴステロン、センゴステロン、6β-ヒドロキシ-20-ヒドロキシエクジソン、6α-
ヒドロキシ-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-6-オキシム、ポナステ
ロンA 6-カルボキシメチルオキシム、20-ヒドロキシエクジソン-6-カルボキシメチルオキ
シム、アジュガステロンC、ラピステロンB、ムリステロンA、アトロトステロン（atrotos
terone）B、アトロステロンA、ツルケステロン-2-アセテート、プニステロン（punistero
ne）（ラポンチステロン（rhapontisterone））、ツルケステロン、アトロトステロンC、
25-ヒドロキシアトロトステロンB、25-ヒドロキシアトロトステロンA、パキシロステロン
、ツルケステロン-2,22-ジアセテート、ツルケステロン-22-アセテート、ツルケステロン
- 11α-アセテート、ツルケステロン-2,11α-ジアセテート、ツルケステロン-11α-プロ
ピオネート、ツルケステロン-11α-ブタノエート、ツルケステロン-11α-ヘキサノエート
、ツルケステロン-11α-デカノエート、ツルケステロン-11α-ラウレート、ツルケステロ
ン-11α-ミリステート、ツルケステロン-11α-アラキデート、22-デヒドロ-12β-ヒドロ
キシノルセンゴステロン、22-デヒドロ-12β-ヒドロキシシアステロン、22-デヒドロ-12
β-ヒドロキシセンゴステロン、14-デオキシ(14α-H)-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒ
ドロキシエクジソン-14-メチルエーテル、14α-ペルヒドロキシ-20-ヒドロキシエクジソ
ン、20-ヒドロキシエクジソン 14,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-2,3,
14,22-テトラメチルエーテル、(20S)-22-デオキシ-20,21-ジヒドロキシエクジソン、22,2
5-ジデオキシエクジソン、(22S)-20-(2,2'-ジメチルフラニル)エクジソン、(22R)-20-(2,
2'-ジメチルフラニル)エクジソン、22-デオキシエクジソン、25-デオキシエクジソン、22
-デヒドロエクジソン、エクジソン、22-エピ-エクジソン、24-メチルエクジソン（20-デ
オキシマキステロンA）、エクジソン-22-ヘミスクシネート、25-デオキシエクジソン-22-
β-D-グルコピラノシド、エクジソン-22-ミリステート、22-デヒドロ-20-イソ-エクジソ
ン、20-イソ-エクジソン、20-イソ-22-エピ-エクジソン、2-デオキシエクジソン、シレネ
オシドE（2-デオキシエクジソン 3β-グルコシド；ブレクノシドA）、2-デオキシエクジ
ソン-22-アセテート、2-デオキシエクジソン-3,22-ジアセテート、2-デオキシエクジソン
-22-β-D-グルコピラノシド、2-デオキシエクジソン 25-β-D-グルコピラノシド、2-デオ
キシ-21-ヒドロキシエクジソン、3-エピ-22-イソ-エクジソン、3-デヒドロ-2-デオキシエ
クジソン（シレノステロン）、3-デヒドロエクジソン、3-デヒドロ-2-デオキシエクジソ
ン-22-アセテート、エクジソン-6-カルボキシメチルオキシム、エクジソン-2,3-アセトニ
ド、14-エピ-20-ヒドロキシエクジソン-2,3-アセトニド、20-ヒドロキシエクジソン-2,3-
アセトニド、20-ヒドロキシエクジソン-20,22-アセトニド、14-エピ-20-ヒドロキシエク
ジソン-2,3,20,22-ジアセトニド、パキシロステロン-20,22-p-ヒドロキシベンジリデンア
セタール、ポストステロン、(20R)-ジヒドロポストステロン、(20S)ジヒドロポストステ
ロン、ポストステロン-20-ダンシルヒドラジン、(20S)-ジヒドロポストステロン-2,3,20-
トリベンゾエート、(20R)-ジヒドロポストステロン-2,3,20-トリベンゾエート、(20R)ジ
ヒドロポストステロン-2,3-アセトニド、(20S)ジヒドロポストステロン-2,3-アセトニド
、(5α-H)-ジヒドロルブロステロン、2,14,22,25-テトラデオキシ-5α-エクジソン、5α-
ケトジオール、ボンビコステロール、2α,3α,22S,25-テトラヒドロキシ-5α-コレスタン
-6-オン、(5α-H)-2-デオキシ-21-ヒドロキシエクジソン、カスタステロン、24-エピ-カ
スタステロン、(5α-H)-2-デオキシインテグリステロンA、(5α-H)-22-デオキシインテグ
リステロンA、(5α-H)-20-ヒドロキシエクジソン、24,25-ジデヒドロダクリハイナンステ
ロン、25,26-ジデヒドロダクリハイナンステロン、5-デオキシカラダステロン（ダクリハ
イナンステロン）、(14α-H)-14-デオキシ-25-ヒドロキシダクリハイナンステロン、25-
ヒドロキシダクリハイナンステロン、ルブロステロン、(5β-H)-ジヒドロルブロステロン
、ジヒドロルブロステロン-17β-アセテート、シジステロン、20-ヒドロキシエクジソン-
2,3,22-トリアセテート、14-デオキシ(14β-H)-20-ヒドロキシエクジソン、14-エピ-20-
ヒドロキシエクジソン、9α,20-ジヒドロキシエクジソン、マラコステロン、2-デオキシ
ポリポジンB-3-β-D-グルコピラノシド、アジュガラクトン、ケイラントンB、2β,3β,6
α-トリヒドロキシ-5β-コレスタン、2β,3β,6β-トリヒドロキシ-5β-コレスタン、14-
デヒドロシダステロン、スタキステロンB、2β,3β,9α,20R,22R,25-ヘキサヒドロキシ-5
β-コレスト-7,14-ジエン-6-オン、カラダステロン、(14β-H)-14-デオキシ-25-ヒドロキ
シダクリハイナンステロン、4-デヒドロ-20-ヒドロキシエクジソン、14-メチル-12-エン-
シダステロン、14-メチル-12-エン-15,20-ジヒドロキシエクジソン、ポドエクジソン B、
2β,3β,20R,22R-テトラヒドロキシ-25-フルオロ-5β-コレスト-8,14-ジエン-6-オン（25
-フルオロポドエクジソン B）、カロニステロン、14-デオキシ-14,18-シクロ-20-ヒドロ
キシエクジソン、9α,14α-エポキシ-20-ヒドロキシエクジソン、9βα,14β-エポキシ-2
0-ヒドロキシエクジソン、9α,14α-エポキシ-20-ヒドロキシエクジソン 2,3,20,22-ジア
セトニド、28-ホモブラッシノリド、イソ-ホモブラッシノリド、個々に機能的な組換え型
遺伝子スイッチをモジュレートする非ステロイドリガンド、または以下の式の化合物：
【化２】
0005777890.tif 000079
式中、
R1、R2、R3、およびR4は
a）H、(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロ
キシアルキル；(C1-C4)アルコキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、ヒドロキシル、もし
くは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよい(C2-C6)アルケニル；ハロ、シアノ、ヒド
ロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよい(C2-C6)アルキニル；ハロ
、シアノ、ヒドロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよいC3-C5シク
ロアルキルであるか；または
b）置換基が独立して、1〜5つのH、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、(C1-C6)アル
キル、もしくは(C1-C6)アルコキシである、非置換もしくは置換ベンジルであり；ならび
に
R5は、H；OH；F；Cl；または(C1-C6)アルコキシである。
［１２］
各遺伝子スイッチが異なるリガンドによって制御される個々に機能的な複数の組換え型
遺伝子スイッチを含む組成物であって、個々に機能的な各遺伝子スイッチが以下を含む、
組成物：
A）以下を含む1つまたは複数の遺伝子発現カセット：
以下を含む第一のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド：
トランス活性化ドメイン；
核内受容体リガンド結合ドメイン；
以下を含む、第二のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド：
その発現がモジュレートされる関心対象遺伝子に機能的に連結した応答エレメントを
認識するDNA結合ドメイン；
核内受容体リガンド結合ドメイン；
以下を含む第三のポリヌクレオチド：
前記DNA結合ドメインに結合することができる応答エレメント；
前記応答エレメントに機能的に連結したプロモーター；および
前記関心対象遺伝子；
B）以下である、リガンド：
20-ヒドロキシエクジソン、2-メチルエーテル、20- ヒドロキシエクジソン、3-メチル
エーテル、20-ヒドロキシエクジソン、14-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、2
,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、3,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロ
キシエクジソン、14,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22,25-ジメチル
エーテル、20-ヒドロキシエクジソン、2,3,14,22-テトラメチルエーテル、20-ヒドロキシ
エクジソン、22-n-プロピルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-n-ブチルエーテル
、20-ヒドロキシエクジソン、22-アリルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-ベンジ
ルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-(28R,S)-2'-エチルオキシラニルエーテル、
ポナステロンA、2-メチルエーテル、ポナステロンA、14-メチルエーテル、ポナステロンA
、22-メチルエーテル、ポナステロンA、2,22-ジメチルエーテル、ポナステロンA、3,22-
ジメチルエーテル、ポナステロンA、14,22-ジメチルエーテル、ダクリハイナンステロン
、22-メチルエーテル、25,26-ジデヒドロポナステロンA、（イソ-スタキステロンC（Δ25
(26)））、シダステロン（スタキステロンD）、スタキステロンC、22-デオキシ-20-ヒド
ロキシエクジソン（タキシステロン）、ポナステロンA、ポリポルステロンB、22-デヒド
ロ-20-ヒドロキシエクジソン、ポナステロンA 22-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジ
ソン、プテロステロン、(25R)-イノコステロン、(25S)-イノコステロン、ピンナタステロ
ン、25-フルオロポナステロンA、24(28)-デヒドロマキステロンA、24-エピ-マキステロン
A、マキステロンA、20-ヒドロキシエクジソン-22-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジ
ソン-25-メチルエーテル、アブタステロン、22,23-ジ-エピ-ジェラジアステロン、20,26-
ジヒドロキシエクジソン（ポドエクジソンC）、24-エピ-アブタステロン、ジェラジアス
テロン、29-ノルシアステロン、アジュガステロンB、24(28)[Z]-デヒドロアマラステロン
B、アマラステロンA、マキステロンC、ラピステロンC、20-ヒドロキシエクジソン-22,25-
ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-22-エチルエーテル、カルタモステロン、2
4(25)-デヒドロプレシアステロン、ロイゼアステロン、シアステロン、20-ヒドロキシエ
クジソン-22-アリルエーテル、24(28)[Z]-デヒドロ-29-ヒドロキシマキステロンC、20-ヒ
ドロキシエクジソン-22-アセテート、ビチコステロンE（20-ヒドロキシエクジソン 25-ア
セテート）、20-ヒドロキシエクジソン-22-n-プロピルエーテル、24-ヒドロキシシアステ
ロン、20-ヒドロキシエクジソン-22-n-ブチルエーテル、ポナステロンA 22-ヘミスクシネ
ート、22-アセトアセチル-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-22-ベン
ジルエーテル、カネセンステロン、20-ヒドロキシエクジソン-22-ヘミスクシネート、イ
ノコステロン-26-ヘミスクシネート、20-ヒドロキシエクジソン-22-ベンゾエート、20-ヒ
ドロキシエクジソン-22-β-D-グルコピラノシド、20-ヒドロキシエクジソン-25-β-D-グ
ルコピラノシド、シレネオシドA（20-ヒドロキシエクジソン-22α-ガラクトシド）、3-デ
オキシ-1β,20-ジヒドロキシエクジソン（3-デオキシインテグリステロンA）、2-デオキ
シインテグリステロンA、1-エピ-インテグリステロンA、インテグリステロンA、シレネオ
シドC（インテグリステロンA 22α-ガラクトシド）、2,22-ジデオキシ-20-ヒドロキシエ
クジソン、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン
-3-アセテート、2-デオキシ-20,26-ジヒドロキシエクジソン、2-デオキシ-20-ヒドロキシ
エクジソン-22-アセテート、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン-3,22-ジアセテート、
2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン-22-ベンゾエート、ポナステロンA 2-ヘミスクシネ
ート、20-ヒドロキシエクジソン-2-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-2-アセテ
ート、20-ヒドロキシエクジソン-2-ヘミスクシネート、20-ヒドロキシエクジソン-2-βD-
グルコピラノシド、2-ダンシル-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-2,
22-ジメチルエーテル、ポナステロンA 3β-D-キシロピラノシド（リムナンテオシドB）、
20-ヒドロキシエクジソン-3-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-3-アセテート、
20-ヒドロキシエクジソン-3β-D-キシロピラノシド（リムナンテオシドA）、20-ヒドロキ
シエクジソン-3β-D-グルコピラノシド、シレネオシドD（20-ヒドロキシエクジソン-3α-
ガラクトシド）、20-ヒドロキシエクジソン 3β-D-グルコピラノシル-[l-3]-β-D-キシロ
ピラノシド（リムナンテオシドC）、20-ヒドロキシエクジソン-3,22-ジメチルエーテル、
シアステロン-3-アセテート、2-デヒドロ-3-エピ-20-ヒドロキシエクジソン、3-エピ-20-
ヒドロキシエクジソン（コロナタステロン）、ラピステロンD、3-デヒドロ-20-ヒドロキ
シエクジソン、5β-ヒドロキシ-25,26-ジデヒドロポナステロンA、5β-ヒドロキシスタキ
ステロンC、25-デオキシポリポジンB、ポリポジンB、25-フルオロポリポジンB、5β-ヒド
ロキシアブタステロン、26-ヒドロキシポリポジンB、29-ノルセンゴステロン、センゴス
テロン、6β-ヒドロキシ-20-ヒドロキシエクジソン、6α-ヒドロキシ-20-ヒドロキシエク
ジソン、20-ヒドロキシエクジソン-6-オキシム、ポナステロンA 6-カルボキシメチルオキ
シム、20-ヒドロキシエクジソン-6-カルボキシメチルオキシム、アジュガステロンC、ラ
ピステロンB、ムリステロンA、アトロトステロンB、アトロステロンA、ツルケステロン-2
-アセテート、プニステロン（ラポンチステロン）、ツルケステロン、アトロトステロンC
、25-ヒドロキシアトロトステロンB、25-ヒドロキシアトロトステロンA、パキシロステロ
ン、ツルケステロン-2,22-ジアセテート、ツルケステロン-22-アセテート、ツルケステロ
ン- 11α-アセテート、ツルケステロン-2,11α-ジアセテート、ツルケステロン-11α-プ
ロピオネート、ツルケステロン-11α-ブタノエート、ツルケステロン-11α-ヘキサノエー
ト、ツルケステロン-11α-デカノエート、ツルケステロン-11α-ラウレート、ツルケステ
ロン-11α-ミリステート、ツルケステロン-11α-アラキデート、22-デヒドロ-12β-ヒド
ロキシノルセンゴステロン、22-デヒドロ-12β-ヒドロキシシアステロン、22-デヒドロ-1
2β-ヒドロキシセンゴステロン、14-デオキシ(14α-H)-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒ
ドロキシエクジソン-14-メチルエーテル、14α-ペルヒドロキシ-20-ヒドロキシエクジソ
ン、20-ヒドロキシエクジソン 14,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-2,3,
14,22-テトラメチルエーテル、(20S)-22-デオキシ-20,21-ジヒドロキシエクジソン、22,2
5-ジデオキシエクジソン、(22S)-20-(2,2'-ジメチルフラニル)エクジソン、(22R)-20-(2,
2'-ジメチルフラニル)エクジソン、22-デオキシエクジソン、25-デオキシエクジソン、22
-デヒドロエクジソン、エクジソン、22-エピ-エクジソン、24-メチルエクジソン（20-デ
オキシマキステロンA）、エクジソン-22-ヘミスクシネート、25-デオキシエクジソン-22-
β-D-グルコピラノシド、エクジソン-22-ミリステート、22-デヒドロ-20-イソ-エクジソ
ン、20-イソ-エクジソン、20-イソ-22-エピ-エクジソン、2-デオキシエクジソン、シレネ
オシドE（2-デオキシエクジソン 3β-グルコシド；ブレクノシドA）、2-デオキシエクジ
ソン-22-アセテート、2-デオキシエクジソン-3,22-ジアセテート、2-デオキシエクジソン
-22-β-D-グルコピラノシド、2-デオキシエクジソン 25-β-D-グルコピラノシド、2-デオ
キシ-21-ヒドロキシエクジソン、3-エピ-22-イソ-エクジソン、3-デヒドロ-2-デオキシエ
クジソン（シレノステロン）、3-デヒドロエクジソン、3-デヒドロ-2-デオキシエクジソ
ン-22-アセテート、エクジソン-6-カルボキシメチルオキシム、エクジソン-2,3-アセトニ
ド、14-エピ-20-ヒドロキシエクジソン-2,3-アセトニド、20-ヒドロキシエクジソン-2,3-
アセトニド、20-ヒドロキシエクジソン-20,22-アセトニド、14-エピ-20-ヒドロキシエク
ジソン-2,3,20,22-ジアセトニド、パキシロステロン-20,22-p-ヒドロキシベンジリデンア
セタール、ポストステロン、(20R)-ジヒドロポストステロン、(20S)ジヒドロポストステ
ロン、ポストステロン-20-ダンシルヒドラジン、(20S)-ジヒドロポストステロン-2,3,20-
トリベンゾエート、(20R)-ジヒドロポストステロン-2,3,20-トリベンゾエート、(20R)ジ
ヒドロポストステロン-2,3-アセトニド、(20S)ジヒドロポストステロン-2,3-アセトニド
、(5α-H)-ジヒドロルブロステロン、2,14,22,25-テトラデオキシ-5α-エクジソン、5α-
ケトジオール、ボンビコステロール、2α,3α,22S,25-テトラヒドロキシ-5α-コレスタン
-6-オン、(5α-H)-2-デオキシ-21-ヒドロキシエクジソン、カスタステロン、24-エピ-カ
スタステロン、(5α-H)-2-デオキシインテグリステロンA、(5α-H)-22-デオキシインテグ
リステロンA、(5α-H)-20-ヒドロキシエクジソン、24,25-ジデヒドロダクリハイナンステ
ロン、25,26-ジデヒドロダクリハイナンステロン、5-デオキシカラダステロン（ダクリハ
イナンステロン）、(14α-H)-14-デオキシ-25-ヒドロキシダクリハイナンステロン、25-
ヒドロキシダクリハイナンステロン、ルブロステロン、(5β-H)-ジヒドロルブロステロン
、ジヒドロルブロステロン-17β-アセテート、シジステロン、20-ヒドロキシエクジソン-
2,3,22-トリアセテート、14-デオキシ(14β-H)-20-ヒドロキシエクジソン、14-エピ-20-
ヒドロキシエクジソン、9α,20-ジヒドロキシエクジソン、マラコステロン、2-デオキシ
ポリポジンB-3-β-D-グルコピラノシド、アジュガラクトン、ケイラントンB、2β,3β,6
α-トリヒドロキシ-5β-コレスタン、2β,3β,6β-トリヒドロキシ-5β-コレスタン、14-
デヒドロシダステロン、スタキステロンB、2β,3β,9α,20R,22R,25-ヘキサヒドロキシ-5
β-コレスト-7,14-ジエン-6-オン、カラダステロン、(14β-H)-14-デオキシ-25-ヒドロキ
シダクリハイナンステロン、4-デヒドロ-20-ヒドロキシエクジソン、14-メチル-12-エン-
シダステロン、14-メチル-12-エン-15,20-ジヒドロキシエクジソン、ポドエクジソン B、
2β,3β,20R,22R-テトラヒドロキシ-25-フルオロ-5β-コレスト-8,14-ジエン-6-オン（25
-フルオロポドエクジソン B）、カロニステロン、14-デオキシ-14,18-シクロ-20-ヒドロ
キシエクジソン、9α,14α-エポキシ-20-ヒドロキシエクジソン、9βα,14β-エポキシ-2
0-ヒドロキシエクジソン、9α,14α-エポキシ-20-ヒドロキシエクジソン 2,3,20,22-ジア
セトニド、28-ホモブラッシノリド、イソ-ホモブラッシノリド、個々に機能的な組換え型
遺伝子スイッチをモジュレートする非ステロイドリガンド、または以下の式の化合物：
【化３】
0005777890.tif 000080
式中、
R1、R2、R3、およびR4は
a）H、(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロ
キシアルキル；(C1-C4)アルコキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、ヒドロキシル、もし
くは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよい(C2-C6)アルケニル；ハロ、シアノ、ヒド
ロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよい(C2-C6)アルキニル；ハロ
、シアノ、ヒドロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよいC3-C5シク
ロアルキルであるか；または
b）置換基が独立して、1〜5つのH、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、(C1-C6)アル
キル、もしくは(C1-C6)アルコキシである、非置換もしくは置換ベンジルであり；ならび
に
R5は、H；OH；F；Cl；または(C1-C6)アルコキシである。
［１３］
少なくとも2つの遺伝子スイッチを含む、請求項12記載の組成物。
［１４］
遺伝子スイッチの1つが非ステロイドリガンドによって活性化される、請求項13記載の
組成物。
［１５］
非ステロイドリガンドがジアシルヒドラジン、アミドケトン、およびオキサジアゾリン
からなる群より選択される、請求項14記載の組成物。
［１６］
各遺伝子スイッチが、同じベクターポリヌクレオチドに存在する1つまたは複数の核酸
によってコードされる、請求項12記載の組成物。
［１７］
各遺伝子スイッチが、ヘテロ二量体受容体複合体を形成する、請求項12記載の組成物。
［１８］
各遺伝子スイッチのヘテロ二量体受容体複合体が共通の成分を有する、請求項17記載の
組成物。
［１９］
共通の成分がRXRリガンド結合ドメインまたはRXR/USPキメラリガンド結合ドメインを含
む、請求項18記載の組成物。
［２０］
個々に機能的な各遺伝子スイッチが異なる関心対象遺伝子を制御する、請求項12記載の
組成物。
［２１］
1つの関心対象遺伝子が細胞を殺すことができる、請求項12記載の組成物。
［２２］
細胞を殺すことができる関心対象遺伝子が毒素である、請求項21記載の組成物。
［２３］
1つの関心対象遺伝子が関心対象治療遺伝子である、請求項12記載の組成物。
［２４］
1つの関心対象遺伝子がサイトカインである、請求項12記載の組成物。
［２５］
1つまたは複数の核内受容体リガンド結合ドメインがグループH核内受容体リガンド結合
ドメインである、請求項12記載の組成物。
［２６］
1つまたは複数の核内受容体リガンド結合ドメインがUSPリガンド結合ドメイン、RXRリ
ガンド結合ドメイン、RXR相同体リガンド結合ドメイン、またはRXRリガンド結合ドメイン
のキメラである、請求項12記載の組成物。
［２７］
1つまたは複数の核内受容体リガンド結合ドメインがグループH核内受容体リガンド結合
ドメインであり、1つまたは複数の核内受容体リガンド結合ドメインがUSPリガンド結合ド
メイン、RXRリガンド結合ドメイン、RXR相同体リガンド結合ドメイン、またはRXRリガン
ド結合ドメインのキメラである、請求項12記載の組成物。
［２８］
グループH核内受容体リガンド結合ドメインが、エクジソン受容体、変異体エクジソン
受容体、鱗翅目エクジソン受容体、変異体鱗翅目エクジソン受容体、トウヒノシントメハ
マキエクジソン受容体、トウヒノシントメハマキエクジソン受容体のV390I/Y410E変異体
、またはトウヒノシントメハマキのエクジソン受容体のE274V / V390I / Y410E変異体に
由来する、請求項27記載の組成物。
［２９］
リガンドの有効量を投与することによって、組換え型遺伝子スイッチ系を活性化する方
法であって、該リガンドが、
20-ヒドロキシエクジソン、2-メチルエーテル、20- ヒドロキシエクジソン、3-メチル
エーテル、20-ヒドロキシエクジソン、14-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、2
,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、3,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロ
キシエクジソン、14,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22,25-ジメチル
エーテル、20-ヒドロキシエクジソン、2,3,14,22-テトラメチルエーテル、20-ヒドロキシ
エクジソン、22-n-プロピルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-n-ブチルエーテル
、20-ヒドロキシエクジソン、22-アリルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-ベンジ
ルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-(28R,S)-2'-エチルオキシラニルエーテル、
ポナステロンA、2-メチルエーテル、ポナステロンA、14-メチルエーテル、ポナステロンA
、22-メチルエーテル、ポナステロンA、2,22-ジメチルエーテル、ポナステロンA、3,22-
ジメチルエーテル、ポナステロンA、14,22-ジメチルエーテル、ダクリハイナンステロン
、22-メチルエーテル、25,26-ジデヒドロポナステロンA、（イソ-スタキステロンC（Δ25
(26)））、シダステロン（スタキステロンD）、スタキステロンC、22-デオキシ-20-ヒド
ロキシエクジソン（タキシステロン）、ポナステロンA、ポリポルステロンB、22-デヒド
ロ-20-ヒドロキシエクジソン、ポナステロンA 22-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジ
ソン、プテロステロン、(25R)-イノコステロン、(25S)-イノコステロン、ピンナタステロ
ン、25-フルオロポナステロンA、24(28)-デヒドロマキステロンA、24-エピ-マキステロン
A、マキステロンA、20-ヒドロキシエクジソン-22-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジ
ソン-25-メチルエーテル、アブタステロン、22,23-ジ-エピ-ジェラジアステロン、20,26-
ジヒドロキシエクジソン（ポドエクジソンC）、24-エピ-アブタステロン、ジェラジアス
テロン、29-ノルシアステロン、アジュガステロンB、24(28)[Z]-デヒドロアマラステロン
B、アマラステロンA、マキステロンC、ラピステロンC、20-ヒドロキシエクジソン-22,25-
ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-22-エチルエーテル、カルタモステロン、2
4(25)-デヒドロプレシアステロン、ロイゼアステロン、シアステロン、20-ヒドロキシエ
クジソン-22-アリルエーテル、24(28)[Z]-デヒドロ-29-ヒドロキシマキステロンC、20-ヒ
ドロキシエクジソン-22-アセテート、ビチコステロンE（20-ヒドロキシエクジソン 25-ア
セテート）、20-ヒドロキシエクジソン-22-n-プロピルエーテル、24-ヒドロキシシアステ
ロン、20-ヒドロキシエクジソン-22-n-ブチルエーテル、ポナステロンA 22-ヘミスクシネ
ート、22-アセトアセチル-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-22-ベン
ジルエーテル、カネセンステロン、20-ヒドロキシエクジソン-22-ヘミスクシネート、イ
ノコステロン-26-ヘミスクシネート、20-ヒドロキシエクジソン-22-ベンゾエート、20-ヒ
ドロキシエクジソン-22-β-D-グルコピラノシド、20-ヒドロキシエクジソン-25-β-D-グ
ルコピラノシド、シレネオシドA（20-ヒドロキシエクジソン-22α-ガラクトシド）、3-デ
オキシ-1β,20-ジヒドロキシエクジソン（3-デオキシインテグリステロンA）、2-デオキ
シインテグリステロンA、1-エピ-インテグリステロンA、インテグリステロンA、シレネオ
シドC（インテグリステロンA 22α-ガラクトシド）、2,22-ジデオキシ-20-ヒドロキシエ
クジソン、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン
-3-アセテート、2-デオキシ-20,26-ジヒドロキシエクジソン、2-デオキシ-20-ヒドロキシ
エクジソン-22-アセテート、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン-3,22-ジアセテート、
2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン-22-ベンゾエート、ポナステロンA 2-ヘミスクシネ
ート、20-ヒドロキシエクジソン-2-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-2-アセテ
ート、20-ヒドロキシエクジソン-2-ヘミスクシネート、20-ヒドロキシエクジソン-2-β-D
-グルコピラノシド、2-ダンシル-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-2
,22-ジメチルエーテル、ポナステロンA 3β-D-キシロピラノシド（リムナンテオシドB）
、20-ヒドロキシエクジソン-3-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-3-アセテート
、20-ヒドロキシエクジソン-3β-D-キシロピラノシド（リムナンテオシドA）、20-ヒドロ
キシエクジソン-3β-D-グルコピラノシド、シレネオシドD（20-ヒドロキシエクジソン-3
α-ガラクトシド）、20-ヒドロキシエクジソン 3β-D-グルコピラノシル-[l-3]-β-D-キ
シロピラノシド（リムナンテオシドC）、20-ヒドロキシエクジソン-3,22-ジメチルエーテ
ル、シアステロン-3-アセテート、2-デヒドロ-3-エピ-20-ヒドロキシエクジソン、3-エピ
-20-ヒドロキシエクジソン（コロナタステロン）、ラピステロンD、3-デヒドロ-20-ヒド
ロキシエクジソン、5β-ヒドロキシ-25,26-ジデヒドロポナステロンA、5β-ヒドロキシス
タキステロンC、25-デオキシポリポジンB、ポリポジンB、25-フルオロポリポジンB、5β-
ヒドロキシアブタステロン、26-ヒドロキシポリポジンB、29-ノルセンゴステロン、セン
ゴステロン、6β-ヒドロキシ-20-ヒドロキシエクジソン、6α-ヒドロキシ-20-ヒドロキシ
エクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-6-オキシム、ポナステロンA 6-カルボキシメチル
オキシム、20-ヒドロキシエクジソン-6-カルボキシメチルオキシム、アジュガステロンC
、ラピステロンB、ムリステロンA、アトロトステロンB、アトロステロンA、ツルケステロ
ン-2-アセテート、プニステロン（ラポンチステロン）、ツルケステロン、アトロトステ
ロンC、25-ヒドロキシアトロトステロンB、25-ヒドロキシアトロトステロンA、パキシロ
ステロン、ツルケステロン-2,22-ジアセテート、ツルケステロン-22-アセテート、ツルケ
ステロン- 11α-アセテート、ツルケステロン-2,11α-ジアセテート、ツルケステロン-11
α-プロピオネート、ツルケステロン-11α-ブタノエート、ツルケステロン-11α-ヘキサ
ノエート、ツルケステロン-11α-デカノエート、ツルケステロン-11α-ラウレート、ツル
ケステロン-11α-ミリステート、ツルケステロン-11α-アラキデート、22-デヒドロ-12β
-ヒドロキシノルセンゴステロン、22-デヒドロ-12β-ヒドロキシシアステロン、22-デヒ
ドロ-12β-ヒドロキシセンゴステロン、14-デオキシ(14α-H)-20-ヒドロキシエクジソン
、20-ヒドロキシエクジソン-14-メチルエーテル、14α-ペルヒドロキシ-20-ヒドロキシエ
クジソン、20-ヒドロキシエクジソン 14,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソ
ン-2,3,14,22-テトラメチルエーテル、(20S)-22-デオキシ-20,21-ジヒドロキシエクジソ
ン、22,25-ジデオキシエクジソン、(22S)-20-(2,2'-ジメチルフラニル)エクジソン、(22R
)-20-(2,2'-ジメチルフラニル)エクジソン、22-デオキシエクジソン、25-デオキシエクジ
ソン、22-デヒドロエクジソン、エクジソン、22-エピ-エクジソン、24-メチルエクジソン
（20-デオキシマキステロンA）、エクジソン-22-ヘミスクシネート、25-デオキシエクジ
ソン-22-β-D-グルコピラノシド、エクジソン-22-ミリステート、22-デヒドロ-20-イソ-
エクジソン、20-イソ-エクジソン、20-イソ-22-エピ-エクジソン、2-デオキシエクジソン
、シレネオシドE（2-デオキシエクジソン 3β-グルコシド；ブレクノシドA）、2-デオキ
シエクジソン-22-アセテート、2-デオキシエクジソン-3,22-ジアセテート、2-デオキシエ
クジソン-22-β-D-グルコピラノシド、2-デオキシエクジソン 25-β-D-グルコピラノシド
、2-デオキシ-21-ヒドロキシエクジソン、3-エピ-22-イソ-エクジソン、3-デヒドロ-2-デ
オキシエクジソン（シレノステロン）、3-デヒドロエクジソン、3-デヒドロ-2-デオキシ
エクジソン-22-アセテート、エクジソン-6-カルボキシメチルオキシム、エクジソン-2,3-
アセトニド、14-エピ-20-ヒドロキシエクジソン-2,3-アセトニド、20-ヒドロキシエクジ
ソン-2,3-アセトニド、20-ヒドロキシエクジソン-20,22-アセトニド、14-エピ-20-ヒドロ
キシエクジソン-2,3,20,22-ジアセトニド、パキシロステロン-20,22-p-ヒドロキシベンジ
リデンアセタール、ポストステロン、(20R)-ジヒドロポストステロン、(20S)ジヒドロポ
ストステロン、ポストステロン-20-ダンシルヒドラジン、(20S)-ジヒドロポストステロン
-2,3,20-トリベンゾエート、(20R)-ジヒドロポストステロン-2,3,20-トリベンゾエート、
(20R)ジヒドロポストステロン-2,3-アセトニド、(20S)ジヒドロポストステロン-2,3-アセ
トニド、(5α-H)-ジヒドロルブロステロン、2,14,22,25-テトラデオキシ-5α-エクジソン
、5α-ケトジオール、ボンビコステロール、2α,3α,22S,25-テトラヒドロキシ-5α-コレ
スタン-6-オン、(5α-H)-2-デオキシ-21-ヒドロキシエクジソン、カスタステロン、24-エ
ピ-カスタステロン、(5α-H)-2-デオキシインテグリステロンA、(5α-H)-22-デオキシイ
ンテグリステロンA、(5α-H)-20-ヒドロキシエクジソン、24,25-ジデヒドロダクリハイナ
ンステロン、25,26-ジデヒドロダクリハイナンステロン、5-デオキシカラダステロン（ダ
クリハイナンステロン）、(14α-H)-14-デオキシ-25-ヒドロキシダクリハイナンステロン
、25-ヒドロキシダクリハイナンステロン、ルブロステロン、(5β-H)-ジヒドロルブロス
テロン、ジヒドロルブロステロン-17β-アセテート、シジステロン、20-ヒドロキシエク
ジソン-2,3,22-トリアセテート、14-デオキシ(14β-H)-20-ヒドロキシエクジソン、14-エ
ピ-20-ヒドロキシエクジソン、9α,20-ジヒドロキシエクジソン、マラコステロン、2-デ
オキシポリポジンB-3-β-D-グルコピラノシド、アジュガラクトン、ケイラントンB、2β,
3β,6α-トリヒドロキシ-5β-コレスタン、2β,3β,6β-トリヒドロキシ-5β-コレスタン
、14-デヒドロシダステロン、スタキステロンB、2β,3β,9α,20R,22R,25-ヘキサヒドロ
キシ-5β-コレスト-7,14-ジエン-6-オン、カラダステロン、(14β-H)-14-デオキシ-25-ヒ
ドロキシダクリハイナンステロン、4-デヒドロ-20-ヒドロキシエクジソン、14-メチル-12
-エン-シダステロン、14-メチル-12-エン-15,20-ジヒドロキシエクジソン、ポドエクジソ
ン B、2β,3β,20R,22R-テトラヒドロキシ-25-フルオロ-5β-コレスト-8,14-ジエン-6-オ
ン（25-フルオロポドエクジソン B）、カロニステロン、14-デオキシ-14,18-シクロ-20-
ヒドロキシエクジソン、9α,14α-エポキシ-20-ヒドロキシエクジソン、9β,14β-エポキ
シ-20-ヒドロキシエクジソン、9α,14α-エポキシ-20-ヒドロキシエクジソン 2,3,20,22-
ジアセトニド、28-ホモブラッシノリド、イソ-ホモブラッシノリド、非ステロイドリガン
ド、または請求項1記載の化合物であり、前記組換え型遺伝子スイッチ組成物が該リガン
ドに応答性である、前記方法。
［３０］
宿主細胞における関心対象遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、該宿主細胞
が
集合的に以下を含む1つまたは複数のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチ
ドを含む、第一の組換え型カセット：
トランス活性化ドメイン；
その発現がモジュレートされる関心対象遺伝子に機能的に連結した応答エレメントを
認識するDNA結合ドメイン；
核内受容体リガンド結合ドメイン、グループH核内受容体リガンド結合ドメイン、エ
クジソン受容体リガンド結合ドメイン、トウヒノシントメハマキエクジソン受容体リガン
ド結合ドメインの置換変異体、トウヒノシントメハマキエクジソン受容体リガンド結合ド
メインのV390I/Y410E変異体、またはトウヒノシントメハマキのエクジソン受容体リガン
ド結合ドメインのE274V / V390I / Y410E変異体のドメイン；および
以下を含む第二の組換え型カセット：
前記DNA結合ドメインに結合することができる応答エレメント；
前記応答エレメントに機能的に連結したプロモーター；および
前記関心対象遺伝子
を含み、
前記方法が、前記宿主細胞に以下の式の化合物を接触させる段階を含む、前記方法：
【化４】
0005777890.tif 000081
式中、
R1、R2、R3、およびR4は
a）H、(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロ
キシアルキル；(C1-C4)アルコキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、ヒドロキシル、もし
くは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよい(C2-C6)アルケニル；ハロ、シアノ、ヒド
ロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよい(C2-C6)アルキニル；ハロ
、シアノ、ヒドロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよいC3-C5シク
ロアルキルであるか；または
b）置換基が独立して、1〜5つのH、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、(C1-C6)アル
キル、もしくは(C1-C6)アルコキシである、非置換もしくは置換ベンジルであり；ならび
に
R5は、H；OH；F；Cl；または(C1-C6)アルコキシであり；
但し、
R1、R2、R3、およびR4がイソプロピルである場合、R5はヒドロキシではなく、
R1、R2、R3、およびR4がHである場合、R5はメトキシではなく；
R1、R2、およびR3がHであり、R5がヒドロキシである場合、R4はメチルでもエチルでもな
く；
R1、R2、またはR4の1つ、2つ、または3つがメチルである場合、グループH核内受容体リガ
ンド結合ドメインは、野生型カイコガ（Bombyx mori）、タバコスズメガ（Manduca sexta
）、トウヒノシントメハマキ、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、
ネッタイシマカ（Aedes aegypti）、マダニ（Amblyomma americanum）、シルバーリーフ
コナジラミ（Bemisia argentifolii）、ツマグロヨコバイ（Nephotettix cincticeps）、
チャイロコメノゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）のリガンド結合ドメインではなく、
またはトウヒノシントメハマキリガンド結合ドメインのE274V / V390I / Y410E変異体で
もなく、
（1）R1、R2、R3、およびR4がHであり、R5がH、ヒドロキシル、またはフルオロである場
合、または（2）R1、R2、R3、およびR4の1つがメチルであり、残りがHであり、R5がHまた
はヒドロキシルである場合、または（3）R1、R2、およびR3の1つがメチルであり、R4がメ
チルであり、およびR5がHまたはヒドロキシルである場合、または（4）R1、R2、R3、およ
びR4が全てメチルであり、R5がヒドロキシルである場合、または（5）R1、R2、およびR3
が全てHであり、R4がn-プロピルまたはベンジルであり、R5がヒドロキシルである場合、
グループH核内受容体リガンド結合ドメインは、野生型トウヒノシントメハマキではなく
、トウヒノシントメハマキリガンド結合ドメインのE274V / V390I / Y410E変異体でもな
い。
［３１］
宿主細胞における関心対象遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、該宿主細胞
が、
以下を含む第一のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドを含む、第一の組
換え型カセット：
トランス活性化ドメイン；
グループH核内受容体リガンド結合ドメイン；
以下を含む第二のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドを含む、第二の組
換え型カセット：
その発現がモジュレートされる関心対象遺伝子に機能的に連結された応答エレメント
を認識するDNA結合ドメイン；
グループH核内受容体リガンド結合ドメイン、エクジソン受容体リガンド結合ドメイ
ン、エクジソン受容体リガンド結合ドメインの置換変異体、トウヒノシントメハマキのエ
クジソン受容体リガンド結合ドメインのV390I/Y410E変異体、またはトウヒノシントメハ
マキのエクジソン受容体リガンド結合ドメインのE274V / V390I / Y410E変異体；
以下を含む第三の組換え型カセット：
前記DNA結合ドメインに結合することができる応答エレメント；
前記応答エレメントに機能的に連結したプロモーター；および
前記関心対象遺伝子
を含み、
前記方法が、前記宿主細胞に以下を接触させる段階を含む、前記方法：
20-ヒドロキシエクジソン、2-メチルエーテル、20- ヒドロキシエクジソン、3-メチル
エーテル、20-ヒドロキシエクジソン、14-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、2
,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、3,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロ
キシエクジソン、14,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22,25-ジメチル
エーテル、20-ヒドロキシエクジソン、2,3,14,22-テトラメチルエーテル、20-ヒドロキシ
エクジソン、22-n-プロピルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-n-ブチルエーテル
、20-ヒドロキシエクジソン、22-アリルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-ベンジ
ルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-(28R,S)-2'-エチルオキシラニルエーテル、
ポナステロンA、2-メチルエーテル、ポナステロンA、14-メチルエーテル、ポナステロンA
、22-メチルエーテル、ポナステロンA、2,22-ジメチルエーテル、ポナステロンA、3,22-
ジメチルエーテル、ポナステロンA、14,22-ジメチルエーテル、ダクリハイナンステロン
、22-メチルエーテル、25,26-ジデヒドロポナステロンA、（イソ-スタキステロンC（Δ25
(26)））、シダステロン（スタキステロンD）、スタキステロンC、22-デオキシ-20-ヒド
ロキシエクジソン（タキシステロン）、ポナステロンA、ポリポルステロンB、22-デヒド
ロ-20-ヒドロキシエクジソン、ポナステロンA 22-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジ
ソン、プテロステロン、(25R)-イノコステロン、(25S)-イノコステロン、ピンナタステロ
ン、25-フルオロポナステロンA、24(28)-デヒドロマキステロンA、24-エピ-マキステロン
A、マキステロンA、20-ヒドロキシエクジソン-22-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジ
ソン-25-メチルエーテル、アブタステロン、22,23-ジ-エピ-ジェラジアステロン、20,26-
ジヒドロキシエクジソン（ポドエクジソンC）、24-エピ-アブタステロン、ジェラジアス
テロン、29-ノルシアステロン、アジュガステロンB、24(28)[Z]-デヒドロアマラステロン
B、アマラステロンA、マキステロンC、ラピステロンC、20-ヒドロキシエクジソン-22,25-
ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-22-エチルエーテル、カルタモステロン、2
4(25)-デヒドロプレシアステロン、ロイゼアステロン、シアステロン、20-ヒドロキシエ
クジソン-22-アリルエーテル、24(28)[Z]-デヒドロ-29-ヒドロキシマキステロンC、20-ヒ
ドロキシエクジソン-22-アセテート、ビチコステロンE（20-ヒドロキシエクジソン 25-ア
セテート）、20-ヒドロキシエクジソン-22-n-プロピルエーテル、24-ヒドロキシシアステ
ロン、20-ヒドロキシエクジソン-22-n-ブチルエーテル、ポナステロンA 22-ヘミスクシネ
ート、22-アセトアセチル-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-22-ベン
ジルエーテル、カネセンステロン、20-ヒドロキシエクジソン-22-ヘミスクシネート、イ
ノコステロン-26-ヘミスクシネート、20-ヒドロキシエクジソン-22-ベンゾエート、20-ヒ
ドロキシエクジソン-22-β-D-グルコピラノシド、20-ヒドロキシエクジソン-25-β-D-グ
ルコピラノシド、シレネオシドA（20-ヒドロキシエクジソン-22α-ガラクトシド）、3-デ
オキシ-1β,20-ジヒドロキシエクジソン（3-デオキシインテグリステロンA）、2-デオキ
シインテグリステロンA、1-エピ-インテグリステロンA、インテグリステロンA、シレネオ
シドC（インテグリステロンA 22α-ガラクトシド）、2,22-ジデオキシ-20-ヒドロキシエ
クジソン、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン
-3-アセテート、2-デオキシ-20,26-ジヒドロキシエクジソン、2-デオキシ-20-ヒドロキシ
エクジソン-22-アセテート、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン-3,22-ジアセテート、
2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン-22-ベンゾエート、ポナステロンA 2-ヘミスクシネ
ート、20-ヒドロキシエクジソン-2-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-2-アセテ
ート、20-ヒドロキシエクジソン-2-ヘミスクシネート、20-ヒドロキシエクジソン-2-β-D
-グルコピラノシド、2-ダンシル-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-2
,22-ジメチルエーテル、ポナステロンA 3β-D-キシロピラノシド（リムナンテオシドB）
、20-ヒドロキシエクジソン-3-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-3-アセテート
、20-ヒドロキシエクジソン-3β-D-キシロピラノシド（リムナンテオシドA）、20-ヒドロ
キシエクジソン-3β-D-グルコピラノシド、シレネオシドD（20-ヒドロキシエクジソン-3
α-ガラクトシド）、20-ヒドロキシエクジソン 3β-D-グルコピラノシル-[l-3]-β-D-キ
シロピラノシド（リムナンテオシドC）、20-ヒドロキシエクジソン-3,22-ジメチルエーテ
ル、シアステロン-3-アセテート、2-デヒドロ-3-エピ-20-ヒドロキシエクジソン、3-エピ
-20-ヒドロキシエクジソン（コロナタステロン）、ラピステロンD、3-デヒドロ-20-ヒド
ロキシエクジソン、5β-ヒドロキシ-25,26-ジデヒドロポナステロンA、5β-ヒドロキシス
タキステロンC、25-デオキシポリポジンB、ポリポジンB、25-フルオロポリポジンB、5β-
ヒドロキシアブタステロン、26-ヒドロキシポリポジンB、29-ノルセンゴステロン、セン
ゴステロン、6β-ヒドロキシ-20-ヒドロキシエクジソン、6α-ヒドロキシ-20-ヒドロキシ
エクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-6-オキシム、ポナステロンA 6-カルボキシメチル
オキシム、20-ヒドロキシエクジソン-6-カルボキシメチルオキシム、アジュガステロンC
、ラピステロンB、ムリステロンA、アトロトステロンB、アトロステロンA、ツルケステロ
ン-2-アセテート、プニステロン（ラポンチステロン）、ツルケステロン、アトロトステ
ロンC、25-ヒドロキシアトロトステロンB、25-ヒドロキシアトロトステロンA、パキシロ
ステロン、ツルケステロン-2,22-ジアセテート、ツルケステロン-22-アセテート、ツルケ
ステロン- 11α-アセテート、ツルケステロン-2,11α-ジアセテート、ツルケステロン-11
α-プロピオネート、ツルケステロン-11α-ブタノエート、ツルケステロン-11α-ヘキサ
ノエート、ツルケステロン-11α-デカノエート、ツルケステロン-11α-ラウレート、ツル
ケステロン-11α-ミリステート、ツルケステロン-11α-アラキデート、22-デヒドロ-12β
-ヒドロキシノルセンゴステロン、22-デヒドロ-12β-ヒドロキシシアステロン、22-デヒ
ドロ-12β-ヒドロキシセンゴステロン、14-デオキシ(14α-H)-20-ヒドロキシエクジソン
、20-ヒドロキシエクジソン-14-メチルエーテル、14α-ペルヒドロキシ-20-ヒドロキシエ
クジソン、20-ヒドロキシエクジソン 14,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソ
ン-2,3,14,22-テトラメチルエーテル、(20S)-22-デオキシ-20,21-ジヒドロキシエクジソ
ン、22,25-ジデオキシエクジソン、(22S)-20-(2,2'-ジメチルフラニル)エクジソン、(22R
)-20-(2,2'-ジメチルフラニル)エクジソン、22-デオキシエクジソン、25-デオキシエクジ
ソン、22-デヒドロエクジソン、エクジソン、22-エピ-エクジソン、24-メチルエクジソン
（20-デオキシマキステロンA）、エクジソン-22-ヘミスクシネート、25-デオキシエクジ
ソン-22-β-D-グルコピラノシド、エクジソン-22-ミリステート、22-デヒドロ-20-イソ-
エクジソン、20-イソ-エクジソン、20-イソ-22-エピ-エクジソン、2-デオキシエクジソン
、シレネオシドE（2-デオキシエクジソン 3β-グルコシド；ブレクノシドA）、2-デオキ
シエクジソン-22-アセテート、2-デオキシエクジソン-3,22-ジアセテート、2-デオキシエ
クジソン-22-β-D-グルコピラノシド、2-デオキシエクジソン 25-β-D-グルコピラノシド
、2-デオキシ-21-ヒドロキシエクジソン、3-エピ-22-イソ-エクジソン、3-デヒドロ-2-デ
オキシエクジソン（シレノステロン）、3-デヒドロエクジソン、3-デヒドロ-2-デオキシ
エクジソン-22-アセテート、エクジソン-6-カルボキシメチルオキシム、エクジソン-2,3-
アセトニド、14-エピ-20-ヒドロキシエクジソン-2,3-アセトニド、20-ヒドロキシエクジ
ソン-2,3-アセトニド、20-ヒドロキシエクジソン-20,22-アセトニド、14-エピ-20-ヒドロ
キシエクジソン-2,3,20,22-ジアセトニド、パキシロステロン-20,22-p-ヒドロキシベンジ
リデンアセタール、ポストステロン、(20R)-ジヒドロポストステロン、(20S)ジヒドロポ
ストステロン、ポストステロン-20-ダンシルヒドラジン、(20S)-ジヒドロポストステロン
-2,3,20-トリベンゾエート、(20R)-ジヒドロポストステロン-2,3,20-トリベンゾエート、
(20R)ジヒドロポストステロン-2,3-アセトニド、(20S)ジヒドロポストステロン-2,3-アセ
トニド、(5α-H)-ジヒドロルブロステロン、2,14,22,25-テトラデオキシ-5α-エクジソン
、5α-ケトジオール、ボンビコステロール、2α,3α,22S,25-テトラヒドロキシ-5α-コレ
スタン-6-オン、(5α-H)-2-デオキシ-21-ヒドロキシエクジソン、カスタステロン、24-エ
ピ-カスタステロン、(5α-H)-2-デオキシインテグリステロンA、(5α-H)-22-デオキシイ
ンテグリステロンA、(5α-H)-20-ヒドロキシエクジソン、24,25-ジデヒドロダクリハイナ
ンステロン、25,26-ジデヒドロダクリハイナンステロン、5-デオキシカラダステロン（ダ
クリハイナンステロン）、(14α-H)-14-デオキシ-25-ヒドロキシダクリハイナンステロン
、25-ヒドロキシダクリハイナンステロン、ルブロステロン、(5β-H)-ジヒドロルブロス
テロン、ジヒドロルブロステロン-17β-アセテート、シジステロン、20-ヒドロキシエク
ジソン-2,3,22-トリアセテート、14-デオキシ(14β-H)-20-ヒドロキシエクジソン、14-エ
ピ-20-ヒドロキシエクジソン、9α,20-ジヒドロキシエクジソン、マラコステロン、2-デ
オキシポリポジンB-3-β-D-グルコピラノシド、アジュガラクトン、ケイラントンB、2β,
3β,6α-トリヒドロキシ-5β-コレスタン、2β,3β,6β-トリヒドロキシ-5β-コレスタン
、14-デヒドロシダステロン、スタキステロンB、2β,3β,9α,20R,22R,25-ヘキサヒドロ
キシ-5β-コレスト-7,14-ジエン-6-オン、カラダステロン、(14β-H)-14-デオキシ-25-ヒ
ドロキシダクリハイナンステロン、4-デヒドロ-20-ヒドロキシエクジソン、14-メチル-12
-エン-シダステロン、14-メチル-12-エン-15,20-ジヒドロキシエクジソン、ポドエクジソ
ン B、2β,3β,20R,22R-テトラヒドロキシ-25-フルオロ-5β-コレスト-8,14-ジエン-6-オ
ン（25-フルオロポドエクジソン B）、カロニステロン、14-デオキシ-14,18-シクロ-20-
ヒドロキシエクジソン、9α,14α-エポキシ-20-ヒドロキシエクジソン、9β,14β-エポキ
シ-20-ヒドロキシエクジソン、9α,14α-エポキシ-20-ヒドロキシエクジソン 2,3,20,22-
ジアセトニド、28-ホモブラッシノリド、イソ-ホモブラッシノリド、非ステロイドリガン
ド、または請求項1記載の化合物。
【図１】
0005777890.tif 000083
【図２−１】
0005777890.tif 000084
【図２−２】
0005777890.tif 000085
【図３−１】
0005777890.tif 000086
【図３−２】
0005777890.tif 000087
【図４】
0005777890.tif 000088
【図５】
0005777890.tif 000089
【図６】
0005777890.tif 000090
【図７】
0005777890.tif 000091
【図８】
0005777890.tif 000092
【図９−１】
0005777890.tif 000093
【図９−２】
0005777890.tif 000094
【図１０】
0005777890.tif 000095
【図１１−１】
0005777890.tif 000096
【図１１−２】
0005777890.tif 000097
【図１２−１】
0005777890.tif 000098
【図１２−２】
0005777890.tif 000099
【図１３−１】
0005777890.tif 000100
【図１３−２】
0005777890.tif 000101
【図１４−１】
0005777890.tif 000102
【図１４−２】
0005777890.tif 000103
【図１４−３】
0005777890.tif 000104
【図１５】
0005777890.tif 000105
【図１６−１】
0005777890.tif 000106
【図１６−２】
0005777890.tif 000107
【図１７】
0005777890.tif 000108
【図１８】
0005777890.tif 000109
【図１９】
0005777890.tif 000110
【図２０】
0005777890.tif 000111
【配列表】
0005777890000001.app