(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６〜８のうちの少なくとも一つで示されるアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記抗体が、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体は:
（ａ）配列番号１３、１４、および１５で示される配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに、配列番号１６、１７、および１８で示される配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；あるいは
（ｂ）配列番号１９、２０、および２１で示される配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに、配列番号２２、２３、および２４で示される配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
前記抗体は:
（ａ）軽鎖および重鎖が、それぞれ、配列番号９および１１を含むアミノ酸配列、あるいは
（ｂ）軽鎖および重鎖が、それぞれ、配列番号１０および１２を含むアミノ酸配列
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
被験体に由来する試料におけるＨｅｒ−３または複合体化したＨｅｒ−３の存在および／または量を測定および／または定量化する方法であって、配列番号６〜８のうちの少なくとも一つで示されるアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合するＨｅｒ−３抗体を用いて、前記試料におけるＨｅｒ−３および／または複合体化したＨｅｒ−３の存在および／または量を決定するステップを含む方法。
【請求項６】
前記Ｈｅｒ−３抗体は、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
全Ｈｅｒ−３、Ｈｅｒ−３ホモ二量体、またはＨｅｒ−３ヘテロ二量体のうちの少なくとも一つの存在および／または量を測定および／または定量化するステップを含む、請求項５〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料が腫瘍試料である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記試料が、乳がん試料、結腸直腸がん試料、卵巣がん試料、非小細胞肺がん試料、または胃がん試料である、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が、乳がん試料である、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が、早期乳がん試料または転移性乳がん試料である、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料が、Ｈｅｒ−２陽性乳がん試料である、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料が、ＦＦＰＥ試料または可溶化ＦＦＰＥ試料である、請求項５〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記測定が、広範なダイナミックレンジにわたり定量的であり得る、請求項５〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｈｅｒ−３抗体は:
（ａ）配列番号１３、１４、および１５で示される配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに、配列番号１６、１７、および１８で示される配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；あるいは
（ｂ）配列番号１９、２０、および２１で示される配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに、配列番号２２、２３、および２４で示される配列を有するそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
を含む、請求項５〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｈｅｒ−３抗体は:
（ａ）軽鎖および重鎖が、それぞれ、配列番号９および１１を含むアミノ酸配列、あるいは
（ｂ）軽鎖および重鎖が、それぞれ、配列番号１０および１２を含むアミノ酸配列
を含む、請求項５〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）（ｉ）前記被験体由来の前記試料と；（ｉｉ）有効近接距離を有する、Ｈｅｒ−３に結合することが可能な近接プローブと；（ｉｉｉ）Ｈｅｒ−３に結合することが可能であり、１つ以上のシグナル伝達分子が結合している少なくとも１つの結合化合物とを混合するステップであって、ここで、前記有効近接距離内において前記近接プローブおよび前記結合化合物が結合すると、前記Ｈｅｒ−３および／または複合体化したＨｅｒ−３の存在および／または量と相関するシグナルが分子タグから生成される、ステップ；
（ｂ）前記分子タグからの前記シグナルを検出して、Ｈｅｒ−３および／または複合体
化したＨｅｒ−３の存在および／または量を決定するステップ
を含む、請求項５〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記近接プローブおよび／または前記結合化合物が、Ｈｅｒ−３または少なくとも１つの他の検体に特異的に結合することが可能である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記近接プローブおよび／または前記結合化合物が、前記Ｈｅｒ−３抗体を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記近接プローブは、切断誘導部分を有する切断プローブを含み、前記少なくとも１つの結合化合物は、切断可能な結合により前記結合化合物に結合した１つ以上の分子タグを有し、前記切断可能な結合が前記有効近接距離内において切断されることにより、Ｈｅｒ−３の存在および／または量と相関するシグナルが生成され得る、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
請求項５〜１７のいずれか一項に記載の方法であって、前記方法は、
（ａ）前記試料を、タグ化Ｈｅｒ−３結合組成物と接触させるステップであって、前記タグ化Ｈｅｒ−３結合組成物は、Ｈｅｒ−３に特異的に結合し、そして切断可能な結合により前記タグ化Ｈｅｒ−３結合組成物に結合した１つ以上の分子タグを有する、ステップ；
（ｂ）前記試料を、切断剤と接触させるステップ；
（ｃ）前記タグ化Ｈｅｒ−３結合組成物の切断可能な結合を切断し、それにより前記１つ以上の分子タグを放出する工程；および
（ｄ）前記放出した分子タグを定量化して、前記試料中のＨｅｒ−３の存在および／または量を決定する工程
を含み、ここで、前記タグ化Ｈｅｒ−３結合組成物は前記Ｈｅｒ−３抗体を含む、方法。
【請求項２２】
免疫組織化学によりＨｅｒ−３の存在および／または量を測定および／または定量化するステップを含む、請求項５〜１７、および２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
Ｈｅｒ−３のレベルを、がんを有する被験体が、標的化療法による治療に応答する可能性があるかどうかの、疾患の時間経過の、そして／または前記被験体のがんの時間経過における重要事象の可能性の指標とする方法であって、前記方法は、
配列番号６〜８のうちの少なくとも一つで示されるアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合するＨｅｒ−３抗体を用いて、前記被験体のがん由来の生物学的試料中で、Ｈｅｒ−３の量を測定するステップ
を含み、ここで、
Ｈｅｒ−３の前記量は、前記被験体が、標的化療法による治療に応答する可能性があるかどうかと、前記被験体の疾患の時間経過と、そして／または前記被験体のがんの時間経過における重要事象の可能性と相関付けられ、そして
前記生物学的試料中の高レベルのＨｅｒ−３は、前記被験体が、標的化療法に応答する可能性がより低く、長い時間経過を有する可能性がより低く、かつ重要事象を有する可能性がより高いことの指標であり、前記生物学的試料中の低レベルのＨｅｒ−３は、前記被験体が、標的化療法に応答する可能性がより高く、長い時間経過を有する可能性がより高く、重要事象を有する可能性がより低いことの指標である、方法。
【請求項２４】
前記Ｈｅｒ−３抗体が、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記被験体のがんが、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、非小細胞肺がん、または胃がんである、請求項２３〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記被験体のがんが、乳がんである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記被験体のがんが、早期乳がんまたは転移性乳がんである、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記被験体のがんが、Ｈｅｒ−２陽性乳がんである、請求項２３〜２５、および２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記生物学的試料が、ＦＦＰＥ試料または可溶化ＦＦＰＥ試料である、請求項２３〜２５、２７、および２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的化療法が、少なくとも１つのＨｅｒファミリー標的化剤を含む、請求項２３〜２５、および２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも１つのＨｅｒファミリー標的化剤が、多重標的化剤または単一標的化剤である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも１つのＨｅｒファミリー標的化剤が、二重キナーゼ阻害剤または二重特異性抗体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも１つのＨｅｒファミリー標的化剤が、トラスツズマブ、ラパチニブ、ペルツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、エルロチニブ、またはゲフィチニブを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも１つのＨｅｒファミリー標的化剤が、トラスツズマブを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
応答する可能性、長い時間経過を有する可能性、および／または重要事象を有する可能性が、全生存率、無増悪期間、無病生存期間、無増悪生存期間、再発までの長い期間、ハザード比のうちの少なくとも一つとして、そして／または客観的腫瘍応答、またはＲＥＣＩＳＴ基準を用いる臨床的利益として測定される、請求項２３〜２５、および２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
全Ｈｅｒ−３、Ｈｅｒ−３ホモ二量体、またはＨｅｒ−３ヘテロ二量体のうちの少なくとも一つの存在および／または量を測定および／または定量化するステップを含む、請求項２３〜２５、２７〜３０、および３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｈｅｒ−３抗体は:
（ａ）配列番号１３、１４、および１５で示される配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに、配列番号１６、１７、および１８で示される配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３をそれぞれ含む重鎖可変領域；あるいは
（ｂ）配列番号１９、２０、および２１で示される配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに、配列番号２２、２３、および２４で示される配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む、請求項２３〜２５、２７〜３０、３５、および３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｈｅｒ−３抗体は:
（ａ）軽鎖および重鎖が、それぞれ、配列番号９および１１を有するアミノ酸配列、あるいは
（ｂ）軽鎖および重鎖が、それぞれ、配列番号１０および１２を有するアミノ酸配列
を含む、請求項２３〜２５、２７〜３０、および３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記Ｈｅｒ−３の量を測定するステップが、以下：
（ａ）（ｉ）前記被験体由来の前記試料と；（ｉｉ）有効近接距離を有する、Ｈｅｒ−３に結合することが可能な近接プローブと；（ｉｉｉ）Ｈｅｒ−３に結合することが可能であり、１つ以上のシグナル伝達分子が結合している少なくとも１つの結合化合物とを混合するステップであって、ここで、前記有効近接距離内において前記近接プローブおよび前記結合化合物が結合すると、前記Ｈｅｒ−３および／または複合体化したＨｅｒ−３の存在および／または量と相関するシグナルが前記分子タグから生成される、ステップ；
（ｂ）前記分子タグからの前記シグナルを検出して、Ｈｅｒ−３および／または複合体化したＨｅｒ−３の存在および／または量を決定するステップ
を含む、請求項２３〜２５、２７〜３０、および３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記近接プローブおよび／または前記結合化合物が、Ｈｅｒ−３または少なくとも１つの他の検体に特異的に結合することが可能である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記近接プローブおよび／または前記結合化合物が、前記Ｈｅｒ−３抗体を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記近接プローブは、切断誘導部分を有する切断プローブを含み、前記少なくとも１つの結合化合物は、切断可能な結合により前記結合化合物に結合した１つ以上の分子タグを有し、前記切断可能な結合が前記有効近接距離内において切断されることにより、Ｈｅｒ−３の存在および／または量と相関するシグナルが生成され得る、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
請求項２３〜２５、２７〜３０、および３５〜３９のいずれか一項に記載の方法であって、前記方法は、
（ａ）前記試料を、タグ化Ｈｅｒ−３結合組成物と接触させるステップであって、前記タグ化Ｈｅｒ−３結合組成物は、Ｈｅｒ−３に特異的に結合し、そして切断可能な結合により前記タグ化Ｈｅｒ−３結合組成物に結合した１つ以上の分子タグを有する、ステップ；
（ｂ）前記試料を、切断剤と接触させるステップ；
（ｃ）前記タグ化Ｈｅｒ−３結合組成物の切断可能な結合を切断し、それにより前記１つ以上の分子タグを放出する工程；および
（ｄ）前記放出した分子タグを定量化して、前記試料中のＨｅｒ−３の存在および／または量を決定する工程
を含み、ここで、前記タグ化Ｈｅｒ−３結合組成物は前記Ｈｅｒ−３抗体を含む、方法。
【請求項４４】
免疫組織化学によりＨｅｒ−３の存在および／または量を測定および／または定量化するステップを含む、請求項２３〜２５、２７〜３０、３５〜３９、および４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
請求項２３〜２５、２７〜３０、３５〜３９、４３、および４４のいずれか一項に記載の方法であって、前記方法は、
前記生物学的試料中のｐ９５の量を測定するステップ
をさらに含み、Ｈｅｒ−３およびｐ９５の量は、前記被験体が、標的化療法による治療に応答する可能性があるかどうかと、前記被験体の疾患の時間経過と、そして／または前記被験体のがんの時間経過における重要事象の可能性と相関付けられ、そして、
前記生物学的試料中のＨｅｒ−３およびｐ９５のレベルが高い場合、前記被験体は、標的化療法に応答する可能性がより低く、長い時間経過を有する可能性がより低く、かつ重要事象を有する可能性がより高く、そして、前記生物学的試料中のＨｅｒ−３およびｐ９５のレベルが低い場合、前記被験体は、標的化療法に応答する可能性がより高く、長い時間経過を有する可能性がより高く、かつ重要事象を有する可能性がより低い、方法。
【請求項４６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含む組成物であって、前記組成物は、被験体由来のサンプル中のＨｅｒ−３または複合体化したＨｅｒ−３の存在および／または量を測定および/または定量化するために使用されることを特徴とする、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２００９年５月８日に出願された米国仮特許出願第６１／１７６，６３０号、２００９年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／１８７，９６２号、および２００９年１月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／１４５，０２９号の利益を主張し、これらの米国仮特許出願の全体は、本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
バイオマーカーは、一般に、正常な生物学的過程、病理学的過程、または治療的介入の薬理学的反応の指標として、客観的に測定および評価し得る特徴を示す。非特許文献１を参照されたい。バイオマーカーは、性質、測定の容易さ、および目的の生理的状態との関連が多様に異なる。非特許文献２を参照されたい。新たに検証されたバイオマーカーを開発すると、ヘルスケアおよび薬剤開発の費用が大幅に軽減されると共に、多種多様の疾患および状態に対する治療が大幅に改善されると、広く考えられている。したがって、新たな技法を用いて、新たなクラスのバイオマーカーを見出すことに、多大の努力が向けられている。例えば、非特許文献３；ならびに非特許文献４；  非特許文献５；  非特許文献６；  非特許文献７；  非特許文献８を参照されたい。
【０００３】
細胞表面の膜構成要素による相互作用は、正常な生理状態および疾患状態において、細胞外シグナルを細胞へと伝達するのに重要な役割を果たしている。特に、多くの種類の細胞表面受容体が、細胞外のイベントまたはシグナルを、例えば、増殖、遺伝子発現の上昇または低下などのような細胞反応へと伝達することと関連して、二量体化、オリゴマー化、またはクラスター化を受ける。例えば、非特許文献９；  非特許文献１０；  非特許文献１１；  および非特許文献１２を参照されたい。癌などの疾患におけるこのようなイベントの役割が、集中的な研究の対象となっており、これにより、複数の新たな薬剤および薬剤候補物質が開発されている。例えば、非特許文献１３；  非特許文献１４；  非特許文献１５；  ならびに非特許文献１６を参照されたい。
【０００４】
乳癌におけるＨｅｒ−２など、個々の細胞表面受容体の発現レベルが、とりわけ、患者の予後診断、または特定の治療が患者に奏効するかしないかを判定するためのバイオマーカーとして用いられている。加えて、上皮増殖因子受容体ファミリーメンバーなど、発癌性のチロシンキナーゼも、薬物開発の標的となっている。しかし、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ−２を標的とするチロシンキナーゼ阻害剤が示す臨床的有効性は、有望な前臨床試験から予期される有効性よりも劣り、一部は、バイオマーカーとしての予後診断的価値のために、そして一部は、新たな薬物標的の可能性をもたらす他のファミリーメンバーとの相互作用のために、Ｈｅｒ−３など、他のＥＧＦＲファミリーメンバーに対する関心を引き起こしている。非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９非特許文献２０；ならびに非特許文献２１を参照されたい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ａｔｋｉｎｓｏｎら、２００１年、Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ６９巻：８９〜９５頁
【非特許文献２】Ｆｒａｎｋら、２００３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２巻：５６６〜５８０頁
【非特許文献３】Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎら、２００２年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、１巻：６８３〜６９５頁
【非特許文献４】Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ、２００２年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ２巻：２１０〜２１９頁
【非特許文献５】ＬｕｄｗｉｇおよびＷｅｉｎｓｔｅｉｎ、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ５巻：８４５〜８５６頁
【非特許文献６】Ｌｅｅら、２００７年、Ａｄｖ．  Ｃａｎｃｅｒ．  Ｒｅｓ．、９６巻：２６９〜２９８頁
【非特許文献７】ＤｈａｎｉおよびＳｉｕ、２００８年、  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．  ２７巻：３３９〜３４９頁
【非特許文献８】Ｃａｒｄｅｎら、２００９年、Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ８５巻：１３１〜１３３頁
【非特許文献９】Ｇｅｏｒｇｅら、２００２年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １巻：８０８〜８２０頁
【非特許文献１０】Ｍｅｌｌａｄｏら、２００１年、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９巻：３９７〜４２１頁
【非特許文献１１】Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、２０００年、Ｃｅｌｌ  １０３巻：２１１〜２２５頁
【非特許文献１２】Ｙａｒｄｅｎ、２００１年、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ３７巻：Ｓ３〜Ｓ８頁
【非特許文献１３】ＨｅｒｂｓｔおよびＳｈｉｎ、２００２年、Ｃａｎｃｅｒ  ９４巻：１５９３〜１６１１頁
【非特許文献１４】ＹａｒｄｅｎおよびＳｌｉｗｋｏｗｓｋｉ、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２巻：１２７〜１３７頁
【非特許文献１５】ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、１９９９年、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９巻：５３〜５６頁（１９９９年）
【非特許文献１６】Ｂｌｕｍｅ−ＪｅｎｓｅｎおよびＨｕｎｔｅｒ、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１巻：３５５〜３６５頁
【非特許文献１７】ＭｅｎｅｎｄｅｚおよびＬｕｐｕ、２００７年、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９巻：１１１頁
【非特許文献１８】Ｌｅｅ−Ｈｏｅｆｌｉｃｈら、２００８年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８巻：５８７８〜５８８７頁
【非特許文献１９】Ｆｕｃｈｓら、２００６年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２６巻：４３９７〜４４０２頁
【非特許文献２０】；Ｓｅｒｇｉｎａら、２００７年、Ｎａｔｕｒｅ  ４４５巻：４３７〜４４１頁
【非特許文献２１】Ｔｏｖｅｙら、２００６年、Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ２１０巻：３５８〜３６２頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
Ｈｅｒ−３は、場合によって、乳癌、結腸直腸癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、喉頭癌、膵臓癌、食道癌、神経膠腫、胆道癌、胆管癌、胃癌、子宮内膜癌、胆嚢癌、扁平上皮癌、または基底細胞癌において過剰発現することがある。Ｈｅｒ−３の過剰発現を検出するには、従来の免疫組織化学（ＩＨＣ）解析または蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析が用いられている。残念ながら、ＩＨＣおよびＦＩＳＨは、必ずしも正確でなく、また、異なる検査室員によって異なる解釈がされる傾向があるため、診断ツールとしては一定の限界がある。現在のところ、Ｈｅｒ−３レベルを正確に評価する方法は存在しない。Ｈｅｒ−３を測定する定量的方法が出現すれば、癌患者の予後、および／または特定の治療が患者に奏効する可能性があるかどうかを正確に判定することが容易にできるようになる。Ｍｏｓｅｓｓｏｎら、２００４年、Ｓｅｍｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ．  Ｂｉｏｌ．  １４巻：２６２〜２７０頁を参照されたい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第一の態様では、本発明が、試料におけるＨｅｒ−３および／または複合体化したＨｅｒ−３の存在および／または量を測定および／または定量化する方法であって、試料を供給するステップと、該試料におけるＨｅｒ−３および／または複合体化したＨｅｒ−３の存在および／または量を決定するステップを含む方法を対象とする。特定の実施形態では、試料を、そのＨｅｒ−３（例えば、全Ｈｅｒ−３、および／またはＨｅｒ−３ホモ二量体、および／またはＨｅｒ−３ヘテロ二量体）量が「高」量であるものとして層別化するようなＨｅｒ−３量が、第１の閾値を上回る。一部の実施形態では、Ｈｅｒ−３についての第１の閾値が、≧０．１５８の全Ｈｅｒ−３（Ｈ３Ｔ）であり、この閾値未満を低いＨｅｒ−３値とする。あるいは、患者コホートおよび／またはモニタリングされる重要事象に応じて、他の範囲も用いることができる。したがって、本明細書に記載される閾値および／または閾値範囲の各々は、対数目盛で約０．５ｌｏｇ単位以下、かつ／または線形目盛（ｌｉｎｅａｒ  ｓｃａｌｅ）で約２５％以下（すなわち、本明細書で開示される具体的な範囲より≦２５％大きく、かつ／または≦２５％小さい）、もしくは約２０％以下、もしくは約１５％以下、もしくは約１０％以下、もしくは約５％以下変化し得る。
【０００８】
好ましい実施形態では、試料が、生物学的試料である。好ましい実施形態では、試料が、組織試料である。好ましい実施形態では、試料が、新鮮な組織試料、固定試料、凍結試料、または溶解物である。好ましい実施形態では、試料が、腫瘍試料である。好ましい実施形態では、試料が、凍結腫瘍組織試料である。好ましい実施形態では、試料が、新鮮な腫瘍試料または凍結腫瘍試料に由来する腫瘍溶解物を含む。好ましい実施形態では、試料が、ＦＦＰＥ試料または可溶化ＦＦＰＥ試料である。好ましい実施形態では、試料が、乳癌試料を含む。好ましい実施形態では、乳癌が、早期乳癌（すなわち、アジュバント療法）または転移性乳癌である。
【０００９】
本明細書で開示される本発明の各々の方法および／または態様の特定の実施形態では、方法が、試料における他のバイオマーカーの検出を含む。例えば、Ｈｅｒ−２および／またはｐ９５など、他のバイオマーカーを測定することができる。または、他のバイオマーカーは、ＦＯＸＭ１、ＰＲＡＭＥ、Ｂｃ１２、ＳＴＫ１５、ＣＥＧＰ１、Ｋｉ−６７、ＧＳＴＭ１、ＣＡ９、ＰＲ、ＢＢＣ３、ＮＭＥ１、ＳＵＲＶ、ＧＡＴＡ３、ＴＦＲＣ、ＹＢ−１、ＤＰＹＤ、ＧＳＴＭ３、ＲＰＳ６ＫＢ１、Ｓｒｃ、Ｃｈｋ１、ＩＤ１、ＥｓｔＲ１、ｐ２７、ＣＣＮＢ１、ＸＩＡＰ、Ｃｈｋ２、ＣＤＣ２５Ｂ、ＩＧＦ１Ｒ、ＡＫ０５５６９９、Ｐ１３ＫＣ２Ａ、ＴＧＦＢ３、ＢＡＧＩ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＣ、ｐＳ２、ｈＥＮＴ１、ＷＩＳＰ１、ＨＮＦ３Ａ、ＮＦＫＢｐ６５、ＢＲＣＡ２、ＥＧＦＲ、ＴＫ１、ＶＤＲ、Ｃｏｎｔｉｇ５１０３７、ｐＥＮＴ１、ＥＰＨＸ１、ＩＦ１Ａ、ＣＤＨ１、ＨＩＦｌα、ＩＧＦＢＰ３、ＣＴＳＢ、Ｈｅｒ３、もしくはＤＩＡＢＬＯのうちの少なくとも１つであり得る。特定の実施形態では、他のバイオマーカーが、ＶＥＧＦ、ＣＤ３１、ＫＤＲ、ｐ９５、またはＨｅｒ−２であり得る。
【００１０】
本明細書で開示される本発明の各々の方法および／または態様の特定の実施形態では、乳癌におけるＨｅｒ−２の発現レベルが高い。特定の実施形態では、高いＨｅｒ−２発現が、ｌｏｇ１０Ｈ２Ｔ≧約１．１４〜１．２５である。特定の実施形態では、高いＨｅｒ−２発現が、極めて高い発現、および／または中程度に高い発現を含む。特定の実施形態では、極めて高いＨｅｒ−２発現が、ｌｏｇ１０Ｈ２Ｔ≧約１．８４〜２．２１である。本明細書で開示される各々の方法の特定の実施形態では、中程度に高い発現が、１．１４〜１．２５と、１．８４〜２．２１との間である（すなわち、≧１．１４〜１．２５かつ≦１．８４〜２．２１）。あるいは、患者コホートおよび／またはモニタリングされる重要事象に応じて、他の範囲も用いることができる。したがって、本明細書に記載される閾値および／または閾値範囲の各々は、対数目盛で約０．５ｌｏｇ単位以下、かつ／または線形目盛で約２５％以下（すなわち、本明細書で開示される具体的な範囲より≦２５％大きく、かつ／または≦２５％小さい）、もしくは約２０％以下、もしくは約１５％以下、もしくは約１０％以下、もしくは約５％以下変化し得る。
【００１１】
また、本明細書で開示される本発明の各々の方法および／または態様の特定の実施形態では、ｐ９５レベルも、高レベルまたは低レベルとして評価することができる。一部の実施形態では、ｐ９５についての第１の閾値が、≧９０の全ｐ９５値（線形目盛において）であり、この閾値未満を低ｐ９５値とする。あるいは、患者コホートおよび／またはモニタリングされる重要事象に応じて、他の範囲も用いることができる。したがって、本明細書に記載される閾値および／または閾値範囲の各々は、対数目盛で約０．５ｌｏｇ単位以下、かつ／または線形目盛で約２５％以下（すなわち、本明細書で開示される具体的な範囲より≦２５％大きく、かつ／または≦２５％小さい）、もしくは約２０％以下、もしくは約１５％以下、もしくは約１０％以下、もしくは約５％以下変化し得る。
【００１２】
特定の実施形態では、Ｈｅｒ−３レベルが高ければ、標的化療法が患者に奏効する可能性が低いかまたはその可能性がない。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−３レベルが低ければ、標的化療法が該患者に奏効する可能性がある。特定の実施形態では、該療法が、Ｈｅｒ作用剤である。特定の実施形態では、該療法が、Ｈｅｒ−２作用剤またはＨｅｒ−３標的化剤のうちの少なくとも１つである。
【００１３】
したがって、本明細書で開示される本発明の各々の方法および態様の特定の実施形態では、方法が、被験体の癌に由来する生物学的試料においてＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を測定するステップを含み、該Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が中程度に高く、Ｈｅｒ−３発現が低いならば、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性があり、かつ／または該患者は長い時間経過を有する。特定の実施形態では、方法が、被験体の癌に由来する生物学的試料においてＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を測定するステップを含み、該Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が中程度に高く、Ｈｅｒ−３発現が高ければ、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性がなく、かつ／または該患者は短い時間経過を有する。
【００１４】
加えて、かつ／または代替的に、本明細書で開示される本発明の各々の方法および態様の特定の実施形態では、方法が、被験体の癌に由来する生物学的試料においてｐ９５の量を測定するステップを含み、該ｐ９５およびＨｅｒ−３発現の量が低いならば、治療作用剤が患者に奏効する可能性があり、かつ／または該患者は長い時間経過を有する。ある実施形態ではまた、患者のＨｅｒ−２レベルも高い（または中程度に高い）。特定の実施形態では、方法が、被験体の癌に由来する生物学的試料においてＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を測定するステップを含み、該Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が高く、および／または中程度に高く、Ｈｅｒ−３発現および／またはｐ９５発現が高ければ、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性がなく、かつ／または該患者は短い時間経過を有する。
【００１５】
好ましい実施形態では、試料が、血液試料、血漿試料、またはリンパ試料である。好ましい実施形態では、血液試料または血漿試料が、循環腫瘍細胞を含有する。好ましい実施形態では、試料が、細胞系を含む。好ましい実施形態では、測定が、広範なダイナミックレンジにわたり定量的であり得る。
【００１６】
好ましい実施形態では、方法が、試料を結合化合物と混合するステップと、Ｈｅｒ−３および／または複合体化したＨｅｒ−３に結合した該結合化合物の存在および／または量を決定するステップを含む。好ましい実施形態では、結合化合物が、Ｈｅｒ−３に特異的に結合する。好ましい実施形態では、結合化合物が、抗体を含む。好ましい実施形態では、抗体が、実施例２に記載され、図２Ａに示される、配列番号１〜８を有するペプチドのうちの１つに対して産生させた抗体である。好ましい実施形態では、抗体が、（ａ）それぞれ、配列番号１３、１４、および１５に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）それぞれ、配列番号１６、１７、および１８に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；ならびに／または（ａ）それぞれ、配列番号１９、２０、および２１に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）それぞれ、配列番号２２、２３、および２４に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体である。好ましい実施形態では、抗体が、軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ、表１（「発明を実施するための形態」を参照されたい）に示される配列番号９および１１を有する抗体、ならびに／または軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ、表１（「発明を実施するための形態」を参照されたい）に示される配列番号１０および１２を有する抗体である。好ましい実施形態では、方法が、（ｉ）Ｈｅｒ−３および／または複合体化したＨｅｒ−３を含有し得る試料と；（ｉｉ）有効近接距離（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）を有する、Ｈｅｒ−３に結合することが可能な近接プローブと；（ｉｉｉ）Ｈｅｒ−３に結合することが可能であり、１つ以上のシグナル伝達分子が結合している、少なくとも１つの結合化合物とを混合するステップを含み、有効近接距離内において該近接プローブおよび該結合化合物が結合すると、Ｈｅｒ−３および／または複合体化したＨｅｒ−３の存在および／または量と相関するシグナルが分子タグから生成される。好ましい実施形態では、近接プローブおよび／または結合化合物が、Ｈｅｒ−３または少なくとも１つの他の検体に特異的に結合することが可能である。好ましい実施形態では、近接プローブおよび／または結合化合物が、抗体をさらに含み、各抗体が、Ｈｅｒ−３における特定のエピトープに結合し得る。好ましい実施形態では、抗体が、実施例２に記載され、図２Ａに示される、配列番号１〜８を有するペプチドのうちの１つに対して産生させた抗体である。好ましい実施形態では、抗体が、（ａ）それぞれ、配列番号１３、１４、および１５に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）それぞれ、配列番号１６、１７、および１８に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；ならびに／または（ａ）それぞれ、配列番号１９、２０、および２１に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣ���Ｒ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）それぞれ、配列番号２２、２３、および２４に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体である。好ましい実施形態では、抗体が、軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ、表１（「発明を実施するための形態」を参照されたい）に示される配列番号９および１１を有する抗体、ならびに／または軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ、表１（「発明を実施するための形態」を参照されたい）に示される配列番号１０および１２を有する抗体である。好ましい実施形態では、試料が、生物学的試料である。好ましい実施形態では、試料が、組織試料である。好ましい実施形態では、試料が、固定試料、凍結試料、または溶解物である。好ましい実施形態では、試料が、腫瘍試料である。好ましい実施形態では、試料が、凍結腫瘍組織試料である。好ましい実施形態では、試料が、腫瘍溶解物を含む。好ましい実施形態では、試料が、乳癌試料を含む。好ましい実施形態では、試料が、ＦＦＰＥ試料または可溶化ＦＦＰＥ試料である。好ましい実施形態では、試料が、血液試料、血漿試料、またはリンパ試料である。好ましい実施形態では、血液試料または血漿試料が、循環腫瘍細胞を含有する。好ましい実施形態では、試料が、細胞系を含む。好ましい実施形態では、測定が、広範なダイナミックレンジにわたり定量的であり得る。好ましい実施形態では、広範なダイナミックレンジが、約２ｌｏｇである。より好ましい実施形態では、広範なダイナミックレンジが、乳癌試料において約１〜１．５ｌｏｇである。好ましい実施形態では、方法が、Ｈｅｒ−３発現の定量的連続体を提供する。好ましい実施形態では、測定または量（ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔｙ）が、十分に特徴づけられた細胞系モデルと、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーなどの交差検証法とを用いる正確度試験により決定される通り、少なくとも細胞１個当たりの受容体約１０００個〜細胞１個当たりの受容体約２００，０００個の感度である。好ましい実施形態では、測定または量が、少なくとも細胞１個当たりの受容体約５０００個〜細胞１個当たりの受容体約２００，０００個の感度である。好ましい実施形態では、測定または量が、少なくとも細胞１個当たりの受容体約１０，０００個〜細胞１個当たりの受容体約２００，０００個の感度である。好ましい実施形態では、測定または量が、少なくとも細胞１個当たりの受容体約２５，０００個〜細胞１個当たりの受容体約２００，０００個の感度である。好ましい実施形態では、アイソタイプの対照抗体、および従来のＩＨＣ法との比較を用いて決定される測定が特異的である。
【００１７】
さらに好ましい実施形態では、近接プローブが、抗体と第１の核酸とを含み、結合化合物が、抗体と第２の核酸とを含み、第１および第２の核酸が互いに対して相補的であり、ハイブリダイズして有効近接距離を決定することが可能であり、ハイブリダイゼーションを介して直接的または間接的にシグナルを発生させる。好ましい実施形態では、近接プローブおよび／または結合化合物が、Ｈｅｒ−３に特異的に結合することが可能である。好ましい実施形態では、結合化合物および／または近接プローブが、抗体をさらに含み、各抗体が、Ｈｅｒ−３における異なるエピトープに結合する。好ましい実施形態では、抗体が、実施例２に記載され、図２Ａに示される、配列番号１〜８を有するペプチドのうちの１つに対して産生させた抗体である。好ましい実施形態では、抗体が、（ａ）それぞれ、配列番号１３、１４、および１５に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）それぞれ、配列番号１６、１７、および１８に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；ならびに／または（ａ）それぞれ、配列番号１９、２０、および２１に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）それぞれ、配列番号２２、２３、および２４に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体である。好ましい実施形態では、抗体が、軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ、表１（「発明を実施するための形態」を参照されたい）に示される配列番号９および１１を有する抗体、ならびに／または軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ、表１（「発明を実施するための形態」を参照されたい）に示される配列番号１０および１２を有する抗体である。好ましい実施形態では、試料が、生物学的試料である。好ましい実施形態では、試料が、組織試料である。好ましい実施形態では、試料が、固定試料、凍結試料、または溶解物である。好ましい実施形態では、試料が、腫瘍試料である。好ましい実施形態では、試料が、凍結腫瘍組織試料である。好ましい実施形態では、試料が、腫瘍溶解物を含む。好ましい実施形態では、試料が、乳癌試料を含む。好ましい実施形態では、試料が、ＦＦＰＥ試料または可溶化ＦＦＰＥ試料である。好ましい実施形態では、試料が、血液試料、血漿試料、またはリンパ試料である。好ましい実施形態では、血液試料または血漿試料が、循環腫瘍細胞を含有する。好ましい実施形態では、試料が、細胞系を含む。好ましい実施形態では、測定が、広範なダイナミックレンジにわたり定量的であり得る。好ましい実施形態では、広範なダイナミックレンジが、約２ｌｏｇである。より好ましい実施形態では、広範なダイナミックレンジが、乳癌試料において約１〜１．５ｌｏｇである。好ましい実施形態では、方法が、Ｈｅｒ−３発現の定量的連続体を提供する。好ましい実施形態では、測定または量が、十分に特徴づけられた細胞系モデルと、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーなどの交差検証法とを用いる正確度試験により決定される通り、少なくとも細胞１個当たりの受容体約１０００個〜細胞１個当たりの受容体約２００，０００個の感度である。好ましい実施形態では、測定または量が、少なくとも細胞１個当たりの受容体約５０００個〜細胞１個当たりの受容体約２００，０００個の感度である。好ましい実施形態では、測定または量が、少なくとも細胞１個当たりの受容体約１０，０００個〜細胞１個当たりの受容体約２００，０００個の感度である。好ましい実施形態では、測定または量が、少なくとも細胞１個当たりの受容体約２５，０００個〜細胞１個当たりの受容体約２００，０００個の感度である。好ましい実施形態では、アイソタイプの対照抗体、および従来のＩＨＣ法との比較を用いて決定される測定が特異的である。
【００１８】
好ましい実施形態では、近接プローブは、切断誘導部分を有する切断プローブを含み、少なくとも１つの結合化合物は、切断可能な結合により１つ以上の分子タグが結合しており、該切断可能な結合が該有効近接距離内において切断されることにより、Ｈｅｒ−３の存在および／または量と相関するシグナルが生成され得る。好ましい実施形態では、切断プローブおよび／または結合化合物が、Ｈｅｒ−３に特異的に結合することが可能である。好ましい実施形態では、結合化合物および／または近接プローブが、抗体をさらに含み、各抗体が、Ｈｅｒ−３における異なるエピトープに結合する。好ましい実施形態では、抗体が、実施例２に記載され、図２Ａに示される、配列番号１〜８を有するペプチドのうちの１つに対して産生させた抗体である。好ましい実施形態では、抗体が、（ａ）それぞれ、配列番号１３、１４、および１５に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）それぞれ、配列番号１６、１７、および１８に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；ならびに／または（ａ）それぞれ、配列番号１９、２０、および２１に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）それぞれ、配列番号２２、２３、および２４に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体である。好ましい実施形態では、抗体が、軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ、表１（「発明を実施するための形態」を参照されたい）に示される配列番号９および１１を有する抗体、ならびに／または軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ、表１（「発明を実施するための形態」を参照されたい）に示される配列番号１０および１２を有する抗体である。好ましい実施形態では、試料が、生物学的試料である。好ましい実施形態では、試料が、組織試料である。好ましい実施形態では、試料が、固定試料、凍結試料、または溶解物である。好ましい実施形態では、試料が、腫瘍試料である。好ましい実施形態では、試料が、凍結腫瘍組織試料である。好ましい実施形態では、試料が、腫瘍溶解物を含む。好ましい実施形態では、試料が、乳癌試料を含む。好ましい実施形態では、試料が、ＦＦＰＥ試料または可溶化ＦＦＰＥ試料である。好ましい実施形態では、試料が、血液試料、血漿試料、またはリンパ試料である。好ましい実施形態では、血液試料または血漿試料が、循環腫瘍細胞を含有する。好ましい実施形態では、試料が、細胞系を含む。好ましい実施形態では、測定が、広範なダイナミックレンジにわたり定量的であり得る。好ましい実施形態では、広範なダイナミックレンジが、約２ｌｏｇである。より好ましい実施形態では、広範なダイナミックレンジが、乳癌試料において約１〜１．５ｌｏｇである。好ましい実施形態では、方法が、Ｈｅｒ−３発現の定量的連続体を提供する。好ましい実施形態では、測定または量が、十分に特徴づけられた細胞系モデルと、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーなどの交差検証法とを用いる正確度試験により決定される通り、少なくとも細胞１個当たりの受容体約１０００個〜細胞１個当たりの受容体約２００，０００個の感度である。好ましい実施形態では、測定または量が、少なくとも細胞１個当たりの受容体約５０００個〜細胞１個当たりの受容体約２００，０００個の感度である。好ましい実施形態では、測定または量が、少なくとも細胞１個当たりの受容体約１０，０００個〜細胞１個当たりの受容体約２００，０００個の感度である。好ましい実施形態では、測定または量が、少なくとも細胞１個当たりの受容体約２５，０００個〜細胞１個当たりの受容体約２００，０００個の感度である。好ましい実施形態では、アイソタイプの対照抗体、および従来のＩＨＣ法との比較を用いて決定される測定が特異的である。
【００１９】
第二の態様では、標的化療法による治療が、癌を有する被験体に奏効する可能性があるかどうかを決定し、疾患の時間経過を予測し、かつ／または該被験体の癌の時間経過において重要事象が生じる確率を予測する方法であって、該被験体の癌に由来する生物学的試料においてＨｅｒ−３の量を測定するステップを含み、Ｈｅｒ−３レベルに依存する方法を、本発明が対象とする。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−３レベルが高ければ、標的化療法が患者に奏効する可能性が低いかまたはその可能性がない。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−３レベルが低ければ、標的化療法が該患者に奏効する可能性がより高い。本明細書でより詳細に記載される通り、特定の実施形態では、該療法が、Ｈｅｒ作用剤である。さらなる実施形態では、該療法が、Ｈｅｒ−２作用剤またはＨｅｒ−３標的化剤のうちの少なくとも１つである。特定の実施形態では、試料を、そのＨｅｒ−３（例えば、全Ｈｅｒ−３、および／またはＨｅｒ−３ホモ二量体、および／またはＨｅｒ−３ヘテロ二量体）量が「高」量であるものとして層別化するようなＨｅｒ−３量が、第１の閾値を上回る。一部の実施形態では、Ｈｅｒ−３についての第１の閾値が、≧０．１５８の全Ｈｅｒ−３（Ｈ３Ｔ）であり、この閾値未満を低いＨｅｒ−３値とする。あるいは、患者コホートおよび／またはモニタリングされる重要事象に応じて、他の範囲も用いることができる。したがって、本明細書に記載される閾値および／または閾値範囲の各々は、対数目盛で約０．５ｌｏｇ単位以下、かつ／または線形目盛で約２５％以下（すなわち、本明細書で開示される具体的な範囲より≦２５％大きく、かつ／または≦２５％小さい）、もしくは約２０％以下、もしくは約１５％以下、もしくは約１０％以下、もしくは約５％以下変化し得る。
【００２０】
好ましい実施形態では、被験体の癌が、乳癌、結腸直腸癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、喉頭癌、膵臓癌、食道癌、神経膠腫、胆道癌、胆管癌、胃癌、子宮内膜癌、胆嚢癌、扁平上皮癌、または基底細胞癌である。好ましい実施形態では、被験体の癌が、乳癌、黒色腫、滑膜癌（ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、結腸直腸癌、または卵巣癌である。好ましい実施形態では、被験体の癌が、Ｈｅｒ−２陽性乳癌である。特定の実施形態では、乳癌が、早期乳癌（すなわち、アジュバント療法）または転移性乳癌である。
【００２１】
上記で言及した通り、特定の実施形態では、方法が、試料における他のバイオマーカーの検出を含む。例えば、Ｈｅｒ−２および／またはｐ９５などの、他のバイオマーカーを測定することができる。または、他のバイオマーカーは、ＦＯＸＭ１、ＰＲＡＭＥ、Ｂｃ１２、ＳＴＫ１５、ＣＥＧＰ１、Ｋｉ−６７、ＧＳＴＭ１、ＣＡ９、ＰＲ、ＢＢＣ３、ＮＭＥ１、ＳＵＲＶ、ＧＡＴＡ３、ＴＦＲＣ、ＹＢ−１、ＤＰＹＤ、ＧＳＴＭ３、ＲＰＳ６ＫＢ１、Ｓｒｃ、Ｃｈｋ１、ＩＤ１、ＥｓｔＲ１、ｐ２７、ＣＣＮＢ１、ＸＩＡＰ、Ｃｈｋ２、ＣＤＣ２５Ｂ、ＩＧＦ１Ｒ、ＡＫ０５５６９９、Ｐ１３ＫＣ２Ａ、ＴＧＦＢ３、ＢＡＧＩ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＣ、ｐＳ２、ｈＥＮＴ１、ＷＩＳＰ１、ＨＮＦ３Ａ、ＮＦＫＢｐ６５、ＢＲＣＡ２、ＥＧＦＲ、ＴＫ１、ＶＤＲ、Ｃｏｎｔｉｇ５１０３７、ｐＥＮＴ１、ＥＰＨＸ１、ＩＦ１Ａ、ＣＤＨ１、ＨＩＦｌα、ＩＧＦＢＰ３、ＣＴＳＢ、Ｈｅｒ３、もしくはＤＩＡＢＬＯのうちの少なくとも１つであり得る。特定の実施形態では、他のバイオマーカーが、ＶＥＧＦ、ＣＤ３１、ＫＤＲ、ｐ９５、またはＨｅｒ−２であり得る。
【００２２】
特定の実施形態では、乳癌におけるＨｅｒ−２の発現レベルが高い。特定の実施形態では、高いＨｅｒ−２発現が、ｌｏｇ１０Ｈ２Ｔ≧約１．１４〜１．２５である。特定の実施形態では、高いＨｅｒ−２発現が、極めて高い発現、および／または中程度に高い発現を含む。特定の実施形態では、極めて高いＨｅｒ−２発現が、ｌｏｇ１０Ｈ２Ｔ≧約１．８４〜２．２１である。本明細書で開示される各々の方法の特定の実施形態では、中程度に高い発現が、１．１４〜１．２５と、１．８４〜２．２１との間である（すなわち、≧１．１４〜１．２５かつ≦１．８４〜２．２１）。あるいは、患者コホートおよび／またはモニタリングされる重要事象に応じて、他の範囲も用いることができる。したがって、本明細書に記載される閾値および／または閾値範囲の各々は、対数目盛で約０．５ｌｏｇ単位以下、かつ／または線形目盛で約２５％以下（すなわち、本明細書で開示される具体的な範囲より≦２５％大きく、かつ／または≦２５％小さい）、もしくは約２０％以下、もしくは約１５％以下、もしくは約１０％以下、もしくは約５％以下変化し得る。
【００２３】
また、特定の実施形態では、ｐ９５のレベルも、高レベルまたは低レベルのいずれかとして評価することができる。一部の実施形態では、ｐ９５についての第１の閾値が、＞９０または≧９０の全ｐ９５値（線形目盛において）であり、この閾値未満を低ｐ９５値とする。あるいは、患者コホートおよび／またはモニタリングされる重要事象に応じて、他の範囲も用いることができる。したがって、本明細書に記載される閾値および／または閾値範囲の各々は、約２５％以下（すなわち、本明細書で開示される具体的な範囲より≦２５％大きく、かつ／または≦２５％小さい）、もしくは約２０％以下、もしくは約１５％以下、もしくは約１０％以下、もしくは約５％以下変化し得る。
【００２４】
特定の実施形態では、Ｈｅｒ−３レベルが高ければ、標的化療法が患者に奏効する可能性が低いかまたはその可能性がない。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−３レベルが低ければ、標的化療法が該患者に奏効する可能性がより高い。特定の実施形態では、該療法が、Ｈｅｒ作用剤である。特定の実施形態では、該療法が、Ｈｅｒ−２作用剤またはＨｅｒ−３標的化剤のうちの少なくとも１つである。
【００２５】
したがって、特定の実施形態では、方法が、被験体の癌に由来する生物学的試料においてＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を測定するステップを含み、該Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が中程度に高く、Ｈｅｒ−３発現が低いならば、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性があり、かつ／または該患者は長い時間経過を有する。特定の実施形態では、方法が、被験体の癌に由来する生物学的試料においてＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を測定するステップを含み、該Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が中程度に高く、Ｈｅｒ−３発現が高ければ、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性がなく、かつ／または該患者は短い時間経過を有する。
【００２６】
加えて、かつ／または代替的に、特定の実施形態では、方法が、被験体の癌に由来する生物学的試料においてｐ９５の量を測定するステップを含み、該ｐ９５およびＨｅｒ−３発現の量が低いならば、治療作用剤が患者に奏効する可能性があり、かつ／または該患者は長い時間経過を有する。ある実施形態ではまた、患者のＨｅｒ−２レベルも高い（または中程度に高い）。特定の実施形態では、方法が、被験体の癌に由来する生物学的試料においてＨｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量を測定するステップを含み、該Ｈｅｒ−２および／またはＨｅｒ−２ホモ二量体の量が高く、および／または中程度に高く、Ｈｅｒ−３発現および／またはｐ９５発現が高ければ、Ｈｅｒ−２作用剤が患者に奏効する可能性がなく、かつ／または該患者は短い時間経過を有する。
【００２７】
好ましい実施形態では、標的化療法が、少なくとも１つのＨｅｒファミリー標的化剤である。好ましい実施形態では、Ｈｅｒファミリー標的化剤が、複数標的化剤または単一標的化剤である。好ましい実施形態では、複数標的化剤が、二重キナーゼ阻害剤または二重特異性抗体である。好ましい実施形態では、Ｈｅｒファミリー標的化剤が、トラスツズマブ、ラパチニブ、またはペルツズマブである。好ましい実施形態では、少なくとも１つのＨｅｒファミリー標的化剤が、少なくとも２つの薬剤であり、該少なくとも２つの薬剤が、１つ以上のＨｅｒ−２標的化モノクローナル抗体、ならびに／またはＥＧＦＲ標的化モノクローナル抗体、ならびに／またはＥＧＦＲおよびＨｅｒ−２に対する二重キナーゼ阻害剤である。好ましい実施形態では、モノクローナル抗体が、トラスツズマブである。好ましい実施形態では、ＥＧＦＲ標的化モノクローナル抗体が、セツキシマブまたはパニツムマブである。好ましい実施形態では、二重キナーゼ阻害剤が、ラパチニブ、エルロチニブ、またはゲフィチニブである。好ましい実施形態では、標的化療法が、Ｈｅｒ−３作用剤またはＨｅｒ−３シグナル伝達経路作用剤である。好ましい実施形態では、Ｈｅｒ−３標的化剤またはＨｅｒ−３シグナル伝達経路標的化剤が、Ｈｅｒ−３モノクローナル抗体、Ｈｅｒ−３二量体化阻害剤、Ｈｅｒ−３リン酸化阻害剤、ならびに／または、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、およびＥＲＫ１／２からなる群から選択されるＨｅｒ−３シグナル伝達経路メンバーに対する阻害剤である。好ましい実施形態では、奏効する可能性、長い時間経過を有する可能性、および／または重要事象が生じる可能性を、全生存率として、無増悪期間（ｔｉｍｅ  ｔｏ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）として、無病生存期間として、無増悪生存期間として、かつ／またはＲＥＣＩＳＴ基準を用いる腫瘍縮小効果（ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｎｓｅ）として測定する。
【００２８】
好ましい実施形態では、癌がＨｅｒ−２陽性であるかどうかを、ＩＨＣ、ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、定量的ｍＲＮＡ、ハイブリダイゼーションアレイ、またはＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）により判定する。好ましい実施形態では、Ｈｅｒ−３レベルの決定が、ＩＨＣ、ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、定量的ｍＲＮＡ、ハイブリダイゼーションアレイ、またはＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）を用いて実施される。
【００２９】
好ましい実施形態では、本方法は更に、本発明の方法による治療が奏功する可能性がないＨｅｒ−２陽性癌に被験体が罹患していることを判定し、次いで、有効量の異なる治療剤を該被験体に投与する、治療の選択肢について、医療従事者に助言するステップを含む。
【００３０】
第三の態様では、本発明が、Ｈｅｒ−３に結合する精製抗体を対象とする。好ましい実施形態では、抗体が、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。好ましい実施形態では、抗体が、モノクローナル抗体である。好ましい実施形態では、抗体が、実施例２に記載され、図２Ａに示される、配列番号１〜８を有するペプチドのうちの１つに対して産生させた抗体である。好ましい実施形態では、抗体が、（ａ）それぞれ、配列番号１３、１４、および１５に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）それぞれ、配列番号１６、１７、および１８に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；ならびに／または（ａ）それぞれ、配列番号１９、２０、および２１に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）それぞれ、配列番号２２、２３、および２４に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体である。好ましい実施形態では、抗体が、軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ、表１（「発明を実施するための形態」を参照されたい）に示される配列番号９および１１を有する抗体、ならびに／または軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ、表１（「発明を実施するための形態」を参照されたい）に示される配列番号１０および１２を有する抗体である。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
患者に由来する試料におけるＨｅｒ−３または複合体化したＨｅｒ−３の存在および／または量を測定および／または定量化する方法であって、試料を供給するステップと、前記試料におけるＨｅｒ−３および／または複合体化したＨｅｒ−３の存在および／または量を決定するステップを含む方法。
（項目２）
Ｈｅｒ−３レベルが高ければ、標的化療法が前記患者に奏効する可能性が低い、項目１に記載の方法。
（項目３）
Ｈｅｒ−３レベルが低ければ、前記標的化療法が前記患者に奏効する可能性がある、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記試料が腫瘍試料である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記試料が、ＦＦＰＥ試料または可溶化ＦＦＰＥ試料である、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記試料が、乳がん試料を含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記測定が、広範なダイナミックレンジにわたり定量的であり得る、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記試料を結合化合物と混合するステップと、Ｈｅｒ−３および／または複合体化したＨｅｒ−３に結合した前記結合化合物の存在および／または量を決定するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記結合化合物が、Ｈｅｒ−３に特異的に結合する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記結合化合物が、抗体を含む、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記抗体が、配列番号１〜８を有するペプチドのうちの１つに対して産生させた抗体である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記抗体が、（ａ）それぞれ、配列番号１３、１４、および１５に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）それぞれ、配列番号１６、１７、および１８に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；または（ａ）それぞれ、配列番号１９、２０、および２１に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）それぞれ、配列番号２２、２３、および２４に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体のうちの少なくとも１つである、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記抗体が、前記軽鎖および前記重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号９および１１を有する抗体、または前記軽鎖および前記重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ、表１に示される配列番号１０および１２を有する抗体のうちの少なくとも１つである、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
（ｉ）Ｈｅｒ−３および／または複合体化したＨｅｒ−３を含有し得る試料と；（ｉｉ）有効近接距離を有する、Ｈｅｒ−３に結合することが可能な近接プローブと；（ｉｉｉ）Ｈｅｒ−３に結合することが可能であり、１つ以上のシグナル伝達分子が結合している少なくとも１つの結合化合物とを混合するステップを含み、ここで、前記有効近接距離内において前記近接プローブおよび前記結合化合物が結合すると、前記Ｈｅｒ−３および／または複合体化したＨｅｒ−３の存在および／または量と相関するシグナルが分子タグから生成される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記近接プローブおよび／または前記結合化合物が、Ｈｅｒ−３または少なくとも１つの他の検体に特異的に結合することが可能である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記近接プローブおよび／または前記結合化合物が、抗体をさらに含み、各抗体が、Ｈｅｒ−３における特定のエピトープに結合し得る、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記近接プローブは、切断誘導部分を有する切断プローブを含み、前記少なくとも１つの結合化合物は、切断可能な結合により１つ以上の分子タグが結合しており、前記切断可能な結合が前記有効近接距離内において切断されることにより、Ｈｅｒ−３の存在および／または量と相関するシグナルが生成され得る、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
標的化療法による治療が、がんを有する被験体に奏効する可能性があるかどうかを判定し、疾患の時間経過を予測し、かつ／または前記被験体のがんの時間経過において重要事象が生じる確率を予測する方法であって、前記被験体のがんに由来する生物学的試料においてＨｅｒ−３の量を測定するステップを含み、ここで、前記方法が、Ｈｅｒ−３レベルに依存する、方法。
（項目１９）
前記Ｈｅｒ−３レベルが高ければ、標的化療法が前記患者に奏効する可能性が低い、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記Ｈｅｒ−３レベルが低ければ、前記標的化療法が前記患者に奏効する可能性がある、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記被験体のがんが、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、非小細胞肺がん、または胃がんである、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記被験体のがんが、早期乳がん（すなわち、アジュバント療法）または転移性乳がんのうちの少なくとも１つである、項目１８に記載の方法。
（項目２３）
前記標的化療法が、少なくとも１つのＨｅｒファミリー標的化剤である、項目１８に記載の方法。
（項目２４）
前記Ｈｅｒファミリー標的化剤が、多重標的化剤または単一標的化剤である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記Ｈｅｒファミリー標的化剤が、二重キナーゼ阻害剤または二重特異性抗体である、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記Ｈｅｒファミリー標的化剤が、トラスツズマブ、ラパチニブ、またはペルツズマブである、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
奏効する可能性、増悪までの期間が長い可能性、および／または重要事象が生じる可能性を、全生存率として、無増悪期間として、無病生存期間として、無増悪生存期間として、かつ／またはＲＥＣＩＳＴ基準を用いる腫瘍縮小効果として測定する、項目１８に記載の方法。
（項目２８）
本発明の方法による治療が奏功する可能性がないＨｅｒ−２陽性がんに被験体が罹患していることを判定し、次いで、前記被験体に、有効量の、異なる治療剤を投与する前記治療の選択肢について、医療担当者に助言するステップをさらに含む、項目１８に記載の方法。
（項目２９）
配列番号１〜８を有するペプチドのうちの１つに対して産生させた抗体。
（項目３０）
（ａ）それぞれ、配列番号１３、１４、および１５に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）配列番号１６、１７、および１８に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；または（ａ）それぞれ、配列番号１９、２０、および２１に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）それぞれ、配列番号２２、２３、および２４に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体のうちの少なくとも１つである、項目２９に記載の抗体。
（項目３１）
軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号９および１１を有する抗体、または前記軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号１０および１２を有する抗体である、項目２９に記載の抗体。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、ＨＥＲ３発現ベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓細胞）の数種の安定的にトランスフェクトされたクローンにおける、Ｈｅｒ−３  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）によって決定されたＨｅｒ−３発現レベルを示す図である。発現ベクターの構築については実施例１に記載している。高レベルのＨＥＲ３を発現した１つのクローン、２９３Ｈ３−クローン１を、最適化されたＨＥＲ３  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイにおいて使用するための対照として選択した。
【図２Ａ】図２Ａは、Ｈｅｒ−３に特異的な抗体を産生させるためにマウスを免疫するために使用したペプチド配列の一覧である。配列番号１はＬＧＳＡＬＳＬＰＶＬＮＲＰＲＧＴＧＱＳＬＬＳＰであり、配列番号２はＳＡＹＨＳＱＲＨＳＬＬＴＰＶＴＰＬＳＰであり、配列番号３は、ＶＧＳＤＬＳＡＳＬＧＳＴＱＳＣＰＬＨＰＶＰＩであり、配列番号４はＣＱＧＰＧＨＱＡＰＨＶＨＹＡＲＬＫＴＬＲＳであり、配列番号５はＬＥＥＶＥＬＥＰＥＬＤＬＤＬＤＬＥＡＥであり、配列番号６はＣＦＤＮＰＤＹＷＨＳＲＬＦＰＫＡＮＡであり、配列番号７はＣＰＤＹＷＨＳＲＬＦＰＫＡＮＡＱＲＴであり、配列番号８はＣＦＰＫＡＮＡＱＲＴである。ペプチド配列は、Ｈｅｒ−３のＣ末端領域からの異なるエピトープを表している（各ペプチドの長さおよびタンパク質のＮ末端に対する位置が示されている）。各ペプチドに対して産生させた抗体を４番目の列に列挙している。各抗体は、ＥＬＩＳＡ、ＩＨＣおよびＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイにおいて検査陽性が確認されている。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｈｅｒ−３ペプチドの１つに対して産生されたＨｅｒ−３に特異的な抗体であるＢ９Ａ１１、ＨＥＲ−２に特異的な抗体であるＡｂ８（ＨｅｒｃｅｐｔＴｅｓｔ（商標））、および対照抗体であるＩＴＣ−ＩｇＧ２ａを用いて２つの細胞系をスクリーニングしたＩＨＣ試験の結果を示す図である。一方の細胞系、ＳＫＯＶ３（上のパネル）は、高レベルのＨＥＲ２および低レベルのＨＥＲ３を発現することが公知である。他方の細胞系、２９３Ｈ３−クローン１（下のパネル）は、ＨＥＲ３を過剰発現するが、低レベルのＨＥＲ２を発現することが実施例１に記載され、図１に示されている、安定的にトランスフェクトされた細胞系である。ＩＨＣの結果は、予想された通り、２９３Ｈ３−クローン１細胞ではＢ９Ａ１１の強いシグナルを示しているが、ＳＫＯＶ３細胞では示していない。
【図３】図３は、４つの異なる細胞系からのＦＦＰＥブロックにおけるＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）によって決定されたＨＥＲ３レベルの、３つの他のアッセイ（ＩＨＣ、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリー）からのデータとの交差検定を示す図である。これらの試験のために、様々なレベルのＨＥＲ３を発現している細胞系を選択した：２９３Ｈ３−クローン１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡＭＢ−４６８およびＳＫＯＶ３（後の３つはＡＴＣＣからのものである）。細胞系は、２ｌｏｇ超にわたるＨＥＲ３レポーターレベルを表すように選択した。ＨＥＲ３  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイおよびＩＨＣで試験するために、実施例３に記載の通りＦＦＰＥブロックを調製した。同ロットからの細胞の一部を、ＨＥＲ３レポーター数についてフローサイトメトリーを用いて試験した。さらに、ＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ  ＥｒｂＢ３−ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ：Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）でＨＥＲ３を定量化するために、全細胞溶解物を同じロットの細胞から調製した。データは、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイに対して広範なダイナミックレンジを示し、結果は３つの他の方法論のすべてと一致している。
【図４】図４は、患者の腫瘍試料の例を示す図であり、会認定の（ｂｏａｒｄ−ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ）病理学者によって腫瘍領域が丸で囲まれている。
【図５】図５は、ＨＥＲ３  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイの使用機器およびワークフローを示す図である。まずＦＦＰＥ試料を、一連の溶媒を使用して脱パラフィンし、再水和させる（上のパネル１）。圧力釜（ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃｏｏｋｅｒ）  内で１×ＤＡＫＯ（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ）を使用して抗原の回復を実現する（上のパネル２）。次いで、試料を水ですすぎ、疎水性ペンを使用して試料の周りに円を描き、スライドに試薬を保持する。次いで、試料をブロッキングし、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）をコンジュゲートしたＡｂ−６（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ）およびビオチンをコンジュゲートしたＢ９Ａ１１の混合物で処理する（上のパネル３）。インキュベートし洗浄したあと、ストレプトアビジンをコンジュゲートしたメチレンブルー試薬を加え、インキュベートし、洗浄し、その後フルオレセインを含有するイルミネーションバッファーおよび２種のキャピラリー電気泳動内部マーカー（ＭＦおよびＭＬ、それぞれ、最初のマーカーと最後のマーカー）を加える。結合したＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）を、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）の切断を光活性化するＬＥＤアレイを使用して遊離させる（上のパネル４）。水酸化ホウ素ナトリウムを使用してＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）中間体を定量化可能な形態に還元し、キャピラリー電気泳動を用いてＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）レポーターを分離し、検出する（ＡＢＩ３１３０  ＣＥ機器、上のパネル５）。
【図６】図６は、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイのダイナミックレンジを最大にするための最適な抗体濃度を同定するために設計した実験からの結果を示す図である。アッセイのダイナミックレンジ全体にわたる細胞系を選択した：２９３Ｈ３−クローン１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＫＯＶ３。抗体Ｂ９Ａ１１−ビオチンおよびＡｂ−６  Ｐｒｏ−１１の濃度を以下の通り変化させた（表の列１）：それぞれ、行４、行５および行６における、１ｍｇ／ｍＬのＢ９Ａ１１−ビオチンと１ｍｇ／ｍＬのＡｂ−６  Ｐｒｏ−１１、１ｍｇ／ｍＬのＢ９Ａ１１−ビオチンと２ｍｇ／ｍＬのＡｂ−６  Ｐｒｏ−１１、および２ｍｇ／ｍＬのＢ９Ａ１１−ビオチンと１ｍｇ／ｍＬのＡｂ−６  Ｐｒｏ−１１。各細胞系についての結果を棒グラフで示している。対比較について予想された倍率変化は、同じ細胞系のＦＦＰＥブロック調製物からのＨＥＲ３フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡの結果に基づいた。表の行２に示した予想される倍率変化と比較したＨＥＲ３の正確な検出に基づいて、最良の動作のために最適な濃度である２ｍｇ／ｍＬのＢ９Ａ１１−ビオチンと１ｍｇ／ｍＬのＡｂ−６  Ｐｒｏ−１１を選択した（丸で囲んだ）。ここで示されたダイナミックレンジはおよそ２ｌｏｇである。
【図７】図７は、４つのよく特徴付けられた細胞系（２９３Ｈ３−クローン１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＳＫＯＶ３）からの成功した複製物３つを使用したＨＥＲ３  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイの正確度を示すグラフである。ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）の測定値を、自家で生成したフローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡのデータと比較した。結果の１００％が、２９３Ｈ３−クローン１＞ＭＤＡ−ＭＢ−４５３＞ＭＤＡ−ＭＢ４６８＞ＳＫＯＶ３という点においてフローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡからの自家のデータと一致した。４つの細胞系試料のいずれについてもシグナルレベル間にオーバーラップは観察されなかった。
【図８】図８は、ＨＥＲ３  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイの感度を実証するグラフである。低いＨＥＲ３発現の対照細胞系であるＭＤＡ−ＭＢ−４６８の８つの複製物を含有する１バッチを、低／陰性ＨＥＲ３発現の対照細胞系であるＳＫＯＶ３の８つの複製物と比較して感度を決定した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８とＳＫＯＶ３との間で対比較したすべて（６４／６４）について、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８がＳＫＯＶ３よりも高レベルのＨＥＲ３を有するという結果になった。
【図９】図９は、ＨＥＲ３  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイのアッセイ間の再現性を示すグラフである。４つのよく特徴付けられた細胞系である２９３Ｈ３−クローン１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＳＫＯＶ３に対して、種々のＣＥイルミネーター、数人のオペレーターを使用し、４週間にわたって別の日に、８つの別々のＨＥＲ３トータルＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイを行った。バッチ正規化の手順後、データを８バッチにわたって比較して再現性を確認した。ダイナミックレンジにわたる変動係数は、８〜１５％であった。値を、正規化した相対ピーク面積／腫瘍面積の対数であるＬｏｇ１０  ｎｏｒｍＲＰＡで表し、次いで期待値を使用してバッチを正規化した。
【図１０】図１０は、ＨＥＲ３  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイの精度を示すグラフである。ＨＥＲ３  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイのアッセイ内再現性を、３つの対照細胞系、２９３Ｈ３−クローン１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ４６８のそれぞれの１５個の複製物の動作を比較することによって実証した。各バッチの１５個の複製物について対比較を行ってアッセイの精度を決定した。２９３Ｈ３−クローン１のデータの９５％が１．２倍以内であり、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８のデータの９５％が１．３７倍以内であった。各細胞系の１５個の複製物についてのＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）データ（正規化ＲＰＡで示されている）を、各パネルの右側の１５本の棒で示している。中レベル〜高レベルのＨＥＲ３を発現している３つの細胞系、および低／陰性ＨＥＲ３発現細胞系であるＳＫＯＶ３についての対照データを各パネルの左側に示している。
【図１１】図１１は、種々の試料サイズを使用した、ＨＥＲ３  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイの直線性を示すグラフである。３つのよく特徴付けられた細胞系、２９３Ｈ３−クローン１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８のそれぞれからのサイズを減少させた試料（１×、１／２×、１／４×、１／１６×）をＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイで試験し、データを対様式で比較してアッセイの直線性を評価した。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞系は、元の試料サイズのおよそ１／１６に至るまで直線性を示し、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８は、元の試料サイズのおよそ１／２に至るまで直線性を示した。
【図１２】図１２は、アイソタイプ対照によって決定されたＨＥＲ３  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイの特異性を示すグラフである。アイソタイプ対照抗体を、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイフォーマットで試験してアッセイの非特異的なバックグラウンドを確認した。ＨＥＲ３  Ａｂ−６−Ｐｒｏ１１抗体に対して、アイソタイプ対照はＩｇＧ１−Ｐｒｏ１１であった。ＨＥＲ３  Ｂ９Ａ１１−ビオチン抗体に対して、アイソタイプ対照はＩｇＧ１−ビオチンであった。これらのアイソタイプ対照を使用して導かれたシグナルは抗原特異的ではなく、したがって非特異的なバックグラウンドを表している。各パネルにおいて、ＨＥＲ３  Ａｂ６−Ｐｒｏ１１抗体およびＢ９Ａ１１−ビオチン抗体を使用した通常のアッセイフォーマットについて、「対照」と表示された棒でＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）の結果を示している。左のパネルにおいて、ＨＥＲ３  Ａｂ６−Ｐｒｏ１１抗体およびＩｇＧ１−ビオチン抗体について、「ＩｇＧ−ｂｉｏ」と表示された棒でＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）のデータを示している。右のパネルにおいて、ＨＥＲ３  Ｂ９Ａ１１−ビオチン抗体およびＩｇＧ１−Ｐｒｏ１１抗体について、「ＩｇＧ−Ｐｒｏ１１」と表示された棒でＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）のデータを示している。標準の細胞系対照（２９３Ｈ３−クローン１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ４６８、ＳＫＯＶ３およびＴ４７Ｄ）ならびにいくつかの腫瘍試料（４１７７６Ｂ１、３２７１２Ａ２、３０３４５Ｃ２、１０６３０５Ａ２、および１０６３４１Ａ２）を含めたＦＦＰＥ試料のアレイに対して各抗体対を試験した。単位は正規化ＲＰＡ＊ＩＢ／ＴＡである。
【図１３−１】図１３は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｅｒｕｍ  Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ  ｔｒｉａｌからの腫瘍試料に対するＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）のデータを示すグラフである。この患者コホート（ｎ＝１０５）は、１９９９年〜２００６年にトラスツズマブで治療されている間、前向きに観察された。全患者についてＩＨＣまたはＦＩＳＨのいずれかによってＨｅｒ−２陽性であることが決定され、また全患者はこの試験前にトラスツズマブに曝露されていなかった。８つの別々のバッチにおいてＨＥＲ３  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイを使用して、ＨＥＲ３レベルについて試料を評価した。結果を本図の８つのパネルに示す。各パネルは、５つの対照細胞系：２９３Ｈ３−クローン１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＳＫＯＶ３およびＴ４７Ｄについての結果も含む（各パネルの左側に示されている）。結果はｌｏｇ１０正規化ＲＰＡ単位で示されている。
【図１３−２】図１３は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｅｒｕｍ  Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ  ｔｒｉａｌからの腫瘍試料に対するＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）のデータを示すグラフである。この患者コホート（ｎ＝１０５）は、１９９９年〜２００６年にトラスツズマブで治療されている間、前向きに観察された。全患者についてＩＨＣまたはＦＩＳＨのいずれかによってＨｅｒ−２陽性であることが決定され、また全患者はこの試験前にトラスツズマブに曝露されていなかった。８つの別々のバッチにおいてＨＥＲ３  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイを使用して、ＨＥＲ３レベルについて試料を評価した。結果を本図の８つのパネルに示す。各パネルは、５つの対照細胞系：２９３Ｈ３−クローン１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＳＫＯＶ３およびＴ４７Ｄについての結果も含む（各パネルの左側に示されている）。結果はｌｏｇ１０正規化ＲＰＡ単位で示されている。
【図１４】図１４は、トラスツズマブ（すなわちハーセプチン）への反応に対する最適なカットオフを決定するために使用した位置走査分析からのデータを示すグラフである。左側のパネルにおいて、統計的に有意なカットオフ（矢印参照）を上回る患者は、そのカットオフを下回る患者と比較して好ましくない無増悪期間（ＴＴＰ）を有した（ハザード比＝２．３；ｐ＝０．０００４）。右側のパネルにおいて、有意なカットオフを決定することはできなかったが、ＴＴＰに対して見出されたカットオフを使用して、そのカットオフ（矢印で示されている）を上回る患者において全生存期間（ＯＳ）が悪化するトレンドが観察された（ハザード比＝１．７；ｐ＝０．０５９）。
【図１５】図１５は、トラスツズマブ治療を受けた患者８２人のコホートを、最初に全ＨＥＲ２レベル（Ｈ２Ｔ）によって層別化し、次に全ＨＥＲ３レベル（Ｈ３Ｔ）によってさらに層別化した、カプラン・マイヤープロットを示すグラフである。左上のパネルにおいて、カプラン・マイヤープロットは、（以前報告されたカットオフに基づいて）ＨＥＲ２正常群とＨＥＲ−２過剰発現群とに細分された２つの患者群についての無増悪生存期間（月）の患者のパーセンテージを示す。次に、ＨＥＲ２過剰発現群を、図１４に示したカットオフを使用して、ＨＥＲ３のレベルに基づいて２つのサブグループにさらに細分した。これら２つのサブグループのカプラン・マイヤープロットを右上に示す。下のパネルは、上のパネルからの結果の３セットを示す：正常ＨＥＲ２群（ｌｏｇ（Ｈ２Ｔ）＜１．１４）、高いＨＥＲ２、低いＨＥＲ３群（ｌｏｇ（Ｈ２Ｔ）＞１．１４、Ｈ３Ｔ＜０．１５８）および高いＨＥＲ２、高いＨＥＲ３群（ｌｏｇ（Ｈ２Ｔ）＞１．１４、Ｈ３Ｔ＞０．１５８）。ＨＥＲ３過剰発現サブグループを検討する単変量コックス比例ハザード分析により、無増悪期間の最も重要な予測因子としてＨ３Ｔ（高対低）が同定された（ＴＴＰ；ＨＲ＝２．９８、ｐ＝０．０００４）。
【図１６】図１６は、滑膜癌、結腸癌および卵巣癌におけるＨＥＲ３  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイの結果を示すグラフである。上のパネルは、滑膜癌試料のパネルについての結果を示している。左側の４本の棒は、対照試料（左から右にそれぞれ、２９３Ｈ３−クローン１３、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡＭＢ−４６８およびＳＫＯＶ３）である。真ん中のパネルは結腸癌試料のパネルについての結果を示している。同じ対照細胞系を使用した（左側の４本の棒で示されている）。下のパネルは、卵巣腫瘍試料のパネルにおいてＨＥＲ２発現とＨＥＲ３発現を比較した結果を示している。結果は正規化ＲＰＡ単位で示されている。これらの腫瘍試料のダイナミックレンジは、癌に応じて０．５〜１．５にわたる。
【図１７】図１７は、高いＨＥＲ２（Ｈ２Ｔ）群（ｌｏｇ１０Ｈ２Ｔ＞１．２５または線形目盛で＞１３．８）を用いて、ｐ９５が高いか低いか（ｐ９５＞９０またはＰ９５≦９０）およびＨＥＲ３（Ｈ３Ｔ）が高いか低いかに基づいて患者を異なる群に細分できることにより、ＴＴＰ中央値によって測定された臨床転帰をさらに層別化できることを示すグラフである。ｐ９５サブグループおよびＨ３Ｔサブグループの単変量ＫＭ分析を組み合わせて、本図においてＫＭプロットで結果を示している。これらのデータにより、ＨＥＲｍａｒｋ／ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）によって評価されたＨＥＲ２陽性の乳癌患者（すなわち高Ｈ２Ｔ、すなわち、ｌｏｇ１０Ｈ２Ｔ＞１．２５または線形目盛で＞１３．８）を、トラスツズマブによる治療後の転帰が異なる少なくとも４つのサブグループに分類できることが示唆されている。ＫＭにおいて、低Ｈ３Ｔ（ＨＥＲ３アッセイの世代１において、Ｈ３Ｔ＜０．１５８）かつ低ｐ９５（ｐ９５＜９０）である群は、低Ｈ３Ｔ（Ｈ３Ｔ＜０．１５８）かつ高ｐ９５（ｐ９５＞９０）である群の９．３ヵ月に比べ；高Ｈ３Ｔ群（ＨＥＲ３アッセイの世代１においてＨ３Ｔ＞０．１５８）および低ｐ９５群の６．４ヵ月に比べ、また、高Ｈ３Ｔ（Ｈ３Ｔ＞０．１５８）かつ高ｐ９５（ｐ９５＞９０）の３．２ヵ月と比べ、１５ヵ月のＴＴＰ中央値を有する。群間の差異のトレンドは有意である（ｐ＜０．０００１）。
【図１８】図１８は、総ＨＥＲ２（高Ｈ２Ｔまたは低Ｈ２Ｔ）、ｐ９５ＨＥＲ２（高ｐ９５または低ｐ９５）、および総ＨＥＲ３（Ｈ３Ｔ）が高いこと（Ｈ３Ｔアッセイの世代１においてＨ３Ｔ＞０．１５８）または低Ｈ３Ｔ（Ｈ３Ｔアッセイの世代１においてＨ３Ｔ≦０．１５８）のＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）測定値を組み合わせることによって定義された、リプトンコホートからの種々のサブグループの、ｘ軸の時間に関するｙ軸の無増悪（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−ｆｒｅｅ）パーセントを比較した（無増悪期間、ＴＴＰ）カプラン・マイヤー（ＫＭ）分析を示すグラフである。カットオフは位置走査分析における最低ｐ値で同定された。高Ｈ２Ｔ＝（ｌｏｇ１０Ｈ２Ｔ＞１．２５または線形目盛で＞１３．８）である。低Ｈ２Ｔ＝ｌｏｇ１０Ｈ２Ｔ≦１．２５または線形目盛で≦１３．８である。低ｐ９５＝ｐ９５≦９０であり、高ｐ９５＝ｐ９５＞９０であり（線形目盛）、Ｈ３Ｔｈｉは線形目盛で＞０．１５８であり、Ｈ３Ｔｌｏは線形目盛で≦０．１５８である）。ＫＭ分析により、ＦＩＳＨ陽性、高Ｈ２Ｔ、ｐ９５ｌｏ（低）かつＨ３Ｔｌｏ（低）である患者は、同じようにならなかった他の４群と比べて、１４．７ヵ月のＴＴＰ中央値を有することが実証された。直線をほぼ重ねることができる３群（すなわち、ＦＩＳＨ陰性／Ｈ２Ｔｌｏ群−ＴＴＰ中央値＝４．５、ＦＩＳＨ陽性／Ｈ２Ｔｌｏ（低）群−ＴＴＰ中央値＝３．７、およびＦＩＳＨ陽性／Ｈ２Ｔｈｉ（高）／ｐ９５ｈｉ（高）／Ｈ３Ｔｈｉ（高）−ＴＴＰ中央値＝３．２）はすべて、ＦＩＳＨ陽性／高Ｈ２Ｔ／ｐ９５ｌｏ／Ｈ３Ｔｌｏ−ＴＴＰ中央値＝１５群よりも短いＴＴＰ中央値を有した。ＦＩＳＨ陽性／Ｈ２Ｔｈｉ（高）／かつ高ｐ９５または高Ｈ３Ｔで定義される群は、ＴＴＰ中央値＝９．３を有し、それは、最良のＴＴＰ中央値を持つ群（ＦＩＳＨ陽性／高Ｈ２Ｔ／ｐ９５ｌｏ／Ｈ３Ｔｌｏ）と赤／青および黒の３群との間であった。したがって、ＨＥＲｍａｒｋアッセイにより、トラスツズマブに基づく療法において、ＴＴＰによって測定された、様々な臨床転帰を伴うＨＥＲ２陽性患者の複数のサブグループが同定された。ＨＥＲ２過剰発現の規模も、これらのサブグループについての転帰も、ＦＩＳＨ／ＣＥＰ１７コピー数からは予測できなかった。高ｐ９５および／または高Ｈ３Ｔを伴うＨＥＲ２  ＦＩＳＨ陽性のＭＢＣ患者は、トラスツズマブに対するデノボ耐性を持つ患者サブセットを表し得る。本出願人はどんな特定の機械論にも制限されないことを望むが、これらのサブグループにおいて観察されるトラスツズマブに対する反応不良を説明し得る可能な機構として、トラスツズマブの不足および／またはトラスツズマブ結合標的（すなわちｐ９５）の欠乏、およびトラスツズマブによって完全に抑制されないヘテロ二量体の形成を介したシグナル伝達の増加が挙げられる。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本明細書で用いられる「実施形態」および「態様」という用語は、互換的に用いられる。
【００３３】
「抗体」とは、特定の空間的および極性的構成を有する別の分子に結合し、したがって、これと相補的なものとして定義される、免疫グロブリンを意味する。抗体は、モノクローナル抗体の場合もあり、ポリクローナル抗体の場合もあり、組換え抗体の場合もあり、宿主の免疫および血清の回収など、当技術分野で周知の技法により調製することもでき（ポリクローナル抗体）、ハイブリッドの継代細胞系（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を調製して、分泌されるタンパク質を回収することにより調製することもでき（モノクローナル抗体）、または、少なくとも、結合に必要とされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列またはそれらの変異誘発異形をクローニングして発現させることにより調製することもできる。抗体は、完全免疫グロブリンを包含する場合もあり、その断片を包含する場合もあり、これらの免疫グロブリンは、ＩｇＡ；ＩｇＤ；ＩｇＥ；ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３；ＩｇＭなど、各種のクラスおよびアイソタイプを包含する。これらの断片には、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'などが含まれ得る。抗体はまた、単鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または、特定の結合部位に対して特異的な結合活性を保持する、当業者に公知の他の任意の抗体誘導体でもあり得る。加えて、適切な場合は、特定の結合部位に対する結合親和性が維持される限りにおいて、免疫グロブリンまたはそれらの断片の凝集体、ポリマー、およびコンジュゲートを用いることもできる。放出可能な分子タグ（下記で説明される）を用いるアッセイなどを含め、イムノアッセイにおいて用いられる抗体および抗体誘導体を作製および選択する際の指針は、容易に入手可能な教科書およびマニュアル、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８年、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  ＨｏｗａｒｄおよびＢｅｔｈｅｌｌ、２００１年、「Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ」、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｗｉｌｄ編、１９９４年、「Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにおいて見出すことができる。
【００３４】
「結合化合物」とは、目的の別の分子に結合することが可能な分子を指すものとする。結合化合物とは、抗体、ペプチド、細胞表面受容体に対するペプチドリガンドもしくはペプチド以外のリガンド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸などのオリゴヌクレオチド類似体、レクチン、または、標的分子もしくは標的複合体に特異的に結合することが可能な他の任意の分子実体であり得る。一実施形態では、標的分子が、タンパク質またはタンパク質複合体である。別の実施形態では、結合化合物が、近接プローブをさらに含む。一実施形態では、結合化合物が、結合部分に結合している１つ以上の分子タグを含む。別の実施形態では、該結合化合物に第２の結合化合物を結合させ、これを、標的タンパク質に結合した結合化合物の存在に相関するものとして、測定または定量化することができる。別の具体例として、第１または第２の結合化合物が、有効近接距離を有する近接プローブと共に作用するエフェクター分子を生成することにより、標的タンパク質の存在と相関するシグナルが生成され得る。さらに、別の実施形態では、結合化合物が分子タグを有し、これらが有効近接距離内で互いに相互作用して複合体を形成することによりシグナルを発生させ、これを、標的タンパク質の存在と相関する様式で検出および測定することができる。より具体的には、標的タンパク質または標的複合体は、Ｈｅｒ−３の場合もあり、複合体化したＨｅｒ−３の場合もある。
【００３５】
「結合部分」とは、分子タグを直接的または間接的に結合させ得る任意の分子であって、検体に結合することが可能な分子を意味する。結合部分には、抗体、ペプチド、タンパク質、核酸、ならびに、分子量が最大で約１０００ドルトンであり、水素、炭素、酸素、窒素、硫黄、およびリンからなる群から選択される原子を含有する有機分子が含まれるがこれらに限定されない。結合部分は、抗体であることが好ましい。
【００３６】
「細胞系」とは、それらの元の組織から分離され、クローンで複製され、かつ／または培養物で維持されている細胞を指す。具体例として、細胞系は、各種の癌に由来し得、複数の異なる細胞系が、同じ種類の癌試料に由来し得る。異なる種類の細胞系の例には、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、またはＴ−４７Ｄなどの乳癌細胞系、またはＳＫＯＶ３もしくはＨＥＫ２９３など、他の組織に由来する細胞系が含まれるがこれらに限定されない。
【００３７】
「化学療法剤」とは、状態、特に、癌を治療するのに用いられる化学物質を意味する。
【００３８】
本明細書で用いられる「切断可能な結合」とは、切断されると、切断可能な結合で結合部分に連結されている検出可能な分子タグを放出し得る化学結合基を指す。
【００３９】
本明細書で用いられる「切断誘導部分」または「切断剤」とは、切断可能な結合を切断することが可能な活性種をもたらす基である。好ましくは、活性種とは、切断誘導作用が、その生成部位の近傍にのみ存在するように、短寿命の活性を示す化学種である。
【００４０】
本明細書で用いられる「切断プローブ」とは、本明細書で定義される切断誘導部分と、抗体、ペプチド、細胞表面受容体に対するペプチドリガンドもしくはペプチド以外のリガンド、ストレプトアビジンなどのタンパク質、ビオチンなどの低分子、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸などのオリゴヌクレオチド類似体、レクチン、あるいは、標的タンパク質もしくは標的分子、または安定的な標的分子複合体に結合することが可能な他の任意の分子実体などの結合化合物を含む試薬を指す。
【００４１】
「二重キナーゼ阻害剤」とは、例えば、ラパチニブなど、ＥＧＦＲキナーゼ活性およびＨｅｒ−２キナーゼ活性の両方に対する阻害剤であるがこれに限定されない、２つ以上のキナーゼを阻害する分子を指す。
【００４２】
本明細書で用いられる「有効近接距離」とは、標的分子の存在を示す検出可能なシグナルを発生させるのに十分な、２つの結合化合物間の距離のことを指す。例えば、有効近接距離内において、Ｈｅｒ−３に（または目的の別の検体と）結合した近接プローブおよび結合化合物は、検出可能なシグナルを発生させることにより、Ｈｅｒ−３および／またはＨｅｒ−３複合体の存在を示し、かつ／または定量化する。多くの検出系では、有効近接距離の範囲が２００ｎＭ未満であることが好ましく、５０ｎＭ未満であることがより好ましい。
【００４３】
「ＥＧＦＲ」、「ＥｒｂＢ１」、「ｅｒｂＢ−１」、「ＨＥＲ１」、「ｈｅｒ−１」、および「Ｈｅｒ−１」は、例えば、ＯｎｏおよびＫｕｗａｎｏ（ＯｎｏおよびＫｕｗａｎｏ（２００６年）、Ｃｕｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １２巻：７２４２〜７２５１頁）；ならびにＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ００５３３により記載される通り、上皮増殖因子受容体と、その対立遺伝子変異体とを指す。別段に示さない限り、本明細書で用いられる「ＥＧＦＲ」、「ＥｒｂＢ１」、「ｅｒｂＢ−１」、「ＨＥＲ１」、「ｈｅｒ−１」、「Ｈｅｒ−１」という用語は、ヒトタンパク質を指す。
【００４４】
「エピトープ」とは、分子、通常は、抗体分子または他の結合化合物が結合するタンパク質の表面における部位を指す。一般に、タンパク質は、また、抗原決定基とも呼ばれる、数種または多くの異なるエピトープを有し、異なる特異性を有する抗体と反応する。
【００４５】
「ＦＦＰＥ」とは、固定された、特に、従来のホルマリンで固定されたパラフィン包埋試料である、一群の細胞またはある量の組織を指す。このような試料は、顕微鏡のスライドまたは同等の表面に載せた固定組織の、例えば、３〜１０μｍの厚さである、薄い切片の形態で、例えば、限定されないが、受容体複合体についてのアッセイで用いられることが典型的である。このような試料はまた、アッセイによる測定の一部として、またはその準備として、従来の再水和手順、および、場合によって、抗原回復手順を受けることが典型的である。
【００４６】
特定の代替的な実施形態では、本明細書で用いられる「〜以上」（すなわち、≧または＞＝）が、「〜より大きい」（＞）を意味する場合もある。また、特定の代替的な実施形態では、本明細書で用いられる「〜以下」（すなわち、≦または＜＝）が、「〜より小さい」（＜）を意味する場合もある。
【００４７】
本明細書では、「Ｈｅｒ−２」、「ＥｒｂＢ２」、「ｃ−Ｅｒｂ−Ｂ２」、「ＨＥＲ２」、「Ｈｅｒ２」、および「ｎｅｕ」が互換的に用いられ、例えば、Ｓｅｍｂａら、１９８５年、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ＵＳＡ  ８２巻：６４９７〜６５０頁；およびＹａｍａｍｏｔｏら、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ  ３１９巻：２３０〜２３４頁；ならびにＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ０３３６３において説明される通り、天然のＨｅｒ−２と、その対立遺伝子変異体とを指す。別段に示さない限り、本明細書で用いられる場合の「Ｈｅｒ−２」、「ＥｒｂＢ２」、「ｃ−Ｅｒｂ−Ｂ２」、「ＨＥＲ２」、および「Ｈｅｒ２」という用語は、ヒトタンパク質を指す。本明細書では、Ｈｅｒ２をコードする遺伝子を、「ｅｒｂＢ２」と称する。
【００４８】
本明細書で用いられる「Ｈｅｒ−２作用剤」とは、Ｈｅｒ−２、またはＨｅｒ−２発現細胞、またはＨｅｒ−２陽性癌細胞の生物学的活性を変化させ得る化合物を指す。このような生物学的活性には、二量体化、自己リン酸化、別の受容体のリン酸化、シグナル伝達などが含まれるがこれらに限定されない。生物学的活性には、細胞の生存および細胞の増殖が含まれ得るがこれらに限定されず、Ｈｅｒ−２作用剤によるこのような活性の阻害は、直接的または間接的な細胞殺滅（例えば、ＡＤＣＣ）、タンパク質複合体の破壊もしくはタンパク質複合体の形成、タンパク質輸送の調節、または酵素阻害であり得る。生物学的活性にはまた、本出願に記載の患者の反応（ｐａｔｉｅｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）も含まれ得る。例示的なＨｅｒ−２作用剤には、高分子である４Ｄ５、ペルツズマブ、およびトラスツズマブ、ならびにＡＥＥ−７８８およびラパチニブなどの低分子が含まれるがこれらに限定されない。Ｈｅｒ−２複合体は、Ｈｅｒ−２が構成要素であるヘテロ二量体など、タンパク質の複合体を記載するのに用いられる。Ｈｅｒ−２複合体には、Ｈｅｒ−２ホモ二量体、またはＨｅｒ−２を包含するヘテロ二量体（例えば、Ｈｅｒ−２／Ｈｅｒ−３ヘテロ二量体）が含まれ得る。
【００４９】
本明細書では、「Ｈｅｒ−３」、「ＥｒｂＢ３」、「ｃ−ｅｒｂ−Ｂ３」、「ｅｒｂＢ−３」、「ＨＥＲ３」、および「Ｈｅｒ３」が互換的に用いられ、例えば、Ｋｒａｕｓ  ＭＨら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６巻：９１９３〜９１９７頁；およびＰｌｏｗｍａｎ  ＧＤら（１９９０年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ８７巻：４９０５〜４９０９頁；ならびにＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ２１８６０において記載される通り、天然のＨｅｒ−３と、その対立遺伝子変異体とを指す。別段に示さない限り、本明細書で用いられる場合の「Ｈｅｒ−３」、「ＥｒｂＢ３」、「ｃ−ｅｒｂ−Ｂ３」、「ｅｒｂＢ−３」、「ＨＥＲ３」、および「Ｈｅｒ３」という用語は、ヒトタンパク質を指す。本明細書では、Ｈｅｒ３をコードする遺伝子を、「ｅｒｂＢ３」と称する。
【００５０】
「Ｈｅｒ−３複合体」は、Ｈｅｒ−３が構成要素であるヘテロ二量体など、タンパク質の複合体について記載するのに用いる。Ｈｅｒ−３を含めたヘテロ二量体の例には、Ｈｅｒ−１／Ｈｅｒ−３およびＨｅｒ−２／Ｈｅｒ−３が含まれるがこれらに限定されない。
【００５１】
「Ｈｅｒ−３標的化剤」または「Ｈｅｒ−３シグナル伝達経路標的化剤」とは、Ｈｅｒ−３またはＨｅｒファミリーシグナル伝達経路メンバーの生物学的活性を変化させる治療剤を指す。このような生物学的活性には、二量体化、自己リン酸化、別の受容体のリン酸化、シグナル伝達などが含まれるがこれらに限定されない。生物学的活性には、細胞の生存および細胞の増殖が含まれ得るがこれらに限定されず、Ｈｅｒ−３作用剤またはＨｅｒ−３シグナル伝達経路メンバー作用剤によるこのような活性の阻害は、直接的または間接的な細胞殺滅（例えば、ＡＤＣＣ）、タンパク質複合体の破壊もしくはタンパク質複合体の形成、タンパク質輸送の調節、または酵素阻害であり得る。生物学的活性はまた、本出願に記載の患者の反応も含まれ得る。例示的なＨｅｒ−３作用剤またはＨｅｒ−３シグナル伝達経路メンバー作用剤には、Ｈｅｒ−３、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、ＥＲＫ１／２、またはＰＹＫ２を標的とする高分子（抗体など）、または低分子（低分子のキナーゼ阻害剤など）が含まれ得るがこれらに限定されない。
【００５２】
「高い（ｈｉｇｈ）」とは、量（ｍｅａｓｕｒｅ）が正常の量より大きいこと、所定の量などの標準の量より大きいこと、またはあるサブグループの量が別のサブグループの量より比較的大きいことを指す。例えば、高いＨｅｒ−３とは、Ｈｅｒ−３量が、正常のＨｅｒ−３量より大きいことを指す。正常のＨｅｒ−３量は、当業者に利用可能な任意の方法により決定することができる。高いＨｅｒ−３はまた、量が、所定のカットオフ値など、所定の量以上であることも指す場合がある。高いＨｅｒ−３はまた、高いＨｅｒ−３サブグループが、別のサブグループよりも相対的に高いＨｅｒ−３レベルを有する、Ｈｅｒ−３の量を指すことがある。例えば、限定されないが、本明細書に従い、中央値などの、これに限定されない、数学的に決定された点の近傍で試料を分割し、このようにして、その量が高い（すなわち、中央値より高い）サブグループと、その量が低い別のサブグループとを創出することにより、２つの異なる患者サブグループを創出することができる。例えば、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）または任意の標準的な免疫組織化学（ＩＨＣ）法などであるがこれらに限定されない、当業者に公知の任意の方法を用いることにより、Ｈｅｒ−３を測定することができる。いくつかの場合、「高い」発現レベルは、極めて高い発現範囲と、「中程度に高い」発現範囲とを含んでいてよく、この場合、中程度に高いレベルとは、正常レベルよりは大きいが、「極めて高いレベル」より少ない発現レベルである。本明細書では、高いＨｅｒ−２発現（極めて高いＨｅｒ−２発現および中程度に高いＨｅｒ−２発現を含む）、および／または高いＨｅｒ−３発現、および／または高いｐ９５発現の例示の範囲が示される。
【００５３】
「ＩＨＣ、ＦＩＳＨ、およびＣＩＳＨ」は、細胞または組織における分子実体の存在を検出するのに用いられる方法（それぞれ、免疫組織化学、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、および発色ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）である。例えば、これらの方法を用いて、Ｈｅｒ−３および／または他のＥＧＦＲファミリーメンバーの受容体などの膜受容体を検出することができる。
【００５４】
「アイソタイプの対照抗体」とは、結合化合物として用いられる特異的抗体と同じ免疫グロブリン基本構造を有するが、標的とされるエピトープに対する特異性は示さない抗体を指す。アイソタイプの対照抗体を用いると、非特異的結合に起因する任意の結合を観察することが可能となる。
【００５５】
本明細書で用いられる「〜する可能性がある」（および「〜する可能性がない」）とは、項目、対象、事柄、または患者（ｐｅｒｓｏｎ）が生じる確率が高い（または低い）ことを指す。したがって、一例では、トラスツズマブによる治療が奏効する可能性がある被験体は、参照の被験体または被験体群と比べて、トラスツズマブによる治療が奏効する確率が高い。
【００５６】
本明細書で用いられる「長い」とは、期間である量が正常の量より長いこと、所定の量などの標準の量より長いこと、またはあるサブグループの量が別のサブグループの量より相対的に長いことを指す。例えば、患者の寿命との関連で、増悪までの期間が長いとは、代表的な（ｎｏｒｍａｌ）無増悪期間（ｔｉｍｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）よりも長い無増悪期間を指す。増悪までの期間が長いかどうかは、当業者に利用可能な任意の方法により決定することができる。一実施形態では、「長い」とは、疾患において重要事象が生じるのに必要な時間経過の中央値より大きい時間を指す。
【００５７】
「低い」とは、量が正常の量より小さいこと、所定の量などの標準の量より小さいこと、またはあるサブグループの量が別のサブグループの量より比較的小さいことを指す用語である。例えば、低いＨｅｒ−３とは、特定の患者試料セットにおいて、正常のＨｅｒ−３量より小さいＨｅｒ−３の量を指す。正常のＨｅｒ−３量は、当業者に利用可能な任意の方法により決定することができる。低いＨｅｒ−３はまた、所定のカットオフなど、所定の量より小さい量も意味する場合がある。低いＨｅｒ−３はまた、低いＨｅｒ−３であるサブグループが、別のサブグループより相対的に低い場合の量も指すことがある。例えば、限定されないが、本明細書に従い、中央値などの、これに限定されない、数学的に決定された点の近傍で試料を分割し、このようにして、その量が高い（すなわち、中央値より大きい）別の群と比べて、その量が低い（すなわち、中央値より小さい）群を創出することにより、２つの異なる患者サブグループを創出することができる。例えば、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）法または任意の標準的な免疫組織化学（ＩＨＣ）法などであるがこれらに限定されない、当業者に公知の任意の方法を用いることにより、Ｈｅｒ−３を測定することができる。本明細書では、低いＨｅｒ−３発現値、低いＨｅｒ−２発現値、および低いｐ９５発現値の例示的な範囲が提供される。
【００５８】
「溶解物」とは、細胞の細胞膜が、物理的方法または化学的方法により破壊されるときに生成される溶液を指す。例えば、「腫瘍溶解物」は、タンパク質マーカー、酵素、核酸、およびタンパク質複合体、ならびに、その後各種のアッセイで測定され得る他の分子が含まれるがこれらに限定されない、腫瘍を含む細胞の代表的構成要素を含有することが典型的である。
【００５９】
本明細書で用いられる「分子タグ」とは、分離される分子間における、電気泳動移動度、分子量、形状、溶解性、ｐＫａ、疎水性、電荷、電荷／質量比、極性などが含まれるがこれらに限定されない、１つ以上の、物理的、化学的、または光学的差違に基づき、直接的または間接的に測定することができ、他の分子から識別することができる分子を指す。一実施形態では、複数の分子タグまたは分子タグのセットが、電気泳動移動度および光学的検出特性において異なり、電気泳動により分離することができる。別の実施形態では、複数の分子タグまたは分子タグのセットが、分子量、形状、溶解性、ｐＫａ、疎水性、電荷、極性において異なり、正相もしくは逆相のＨＰＬＣ、イオン交換ＨＰＬＣ、キャピラリー電気クロマトグラフィー、質量分析、気相クロマトグラフィーなどの技法により分離することができる。
【００６０】
分子タグの測定はまた、Ｈｅｒ−３または複合体化したＨｅｒ−３など、検体の存在および／または量に相関するものとして作用する測定可能なシグナルを、さらなる修飾を伴うかまたは伴わずに検出するか、増強するか、または増幅する、第２の分子間相互作用の使用も伴い得る。一実施形態では、２つ以上の分子タグのセットが、有効近接距離内で相互作用することにより、測定可能なシグナルが生成され得る。分子タグとして測定可能なシグナルは、例えば、相補的な配列が有効近接距離内にある場合にハイブリダイズする、２つの相補的な核酸配列を検出することにより発生させることができる。測定可能なシグナルを発生させるか、または当技術分野で公知の検出法を用いて測定され得る他の例には、ＦＲＥＴ、ＢＲＥＴ、ＢｉＦＣ、ＬＣＩ、およびＱＰＣＲが含まれるがこれらに限定されない。
【００６１】
「全生存期間」または「ＯＳ」とは、治療の開始から死亡または打切りまでに測定される期間を指す。打切りは、試験の終了または治療の変更から生じ得る。全生存期間とは、例えば、治療の開始から死亡または打切りまでの期間である特定の期間において生存する、キャプラン−マイヤープロットで表される場合の確率などの確率を指す場合がある。
【００６２】
本明細書で用いられる「所定のカットオフ値」とは、２つ以上の属性カテゴリー間の最良の識別を可能とする、特定の属性を示す被験体についての所定の量を指す。例えば、高いＨｅｒ−３発現および低いＨｅｒ−３発現などの、全生存期間を決定するための２つのカテゴリー間の識別を可能とする、所定のカットオフを用いることができる。所定のカットオフを用いて、所定のカットオフより低い値、またはこれより高い値を有す被験体を分けて、予測モデルを最適化することができる。
【００６３】
本明細書で用いられる「近接プローブ」とは、有効近接距離内において結合化合物における分子タグに作用して、検出可能なシグナルを発生させることが可能な部分、および抗体、ペプチド、細胞表面受容体に対するペプチドリガンドもしくはペプチド以外のリガンド、ストレプトアビジンなどのタンパク質、ビオチンなどの低分子、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸などのオリゴヌクレオチド類似体、レクチン、あるいは、標的タンパク質もしくは標的分子、または安定的な標的複合体に特異的に結合することが可能な他の任意の分子実体を含む試薬を指す。例えば、分子タグを伴うＨｅｒ−３標的化抗体からなる近接プローブは、１つ以上の分子タグが結合している、１つ以上のＨｅｒ−３結合化合物に対して有効距離内にあるＨｅｒ−３に結合することが可能であり得る。一実施形態では、近接プローブが、結合分子と、第１の核酸とを含み、結合分子が、抗体と、第２の核酸とを含み、第１の核酸と第２の核酸とが互いに相補的であり、それらの核酸が互いの有効近接距離内にある場合にそれらがハイブリダイズするように、各々が所定の長さである。ハイブリダイゼーションは、当業者に公知の任意の方法により測定することができる。例えば、ハイブリダイゼーションの指標として、フルオロフォアを、核酸に結合させることができる。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションが、例えば、ローリングサークル増幅法（例えば、Ｌｉｚａｒｄｉら（１９９８年）、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．  １９巻：２２５〜２３２頁を参照されたい）などであるがこれらに限定されない核酸増幅法により測定される。
【００６４】
「ＲＥＣＩＳＴ」とは、「固形腫瘍における効果の評価判定基準」を意味するものとし、これは、治療期間において、癌患者が、改善する場合（「奏効」）、同じ状態にとどまる場合（「安定」）、または増悪する場合（「増悪」）を定義する一連の公表規則である。ＲＥＣＩＳＴ基準により定義される効果（ｒｅｓｐｏｎｓｅ）は、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、９２巻、３号、２０００年２月２日において公表されており、ＲＥＣＩＳＴ基準は、他の同様に公表された定義および規則のセットを包含し得る。
【００６５】
本明細書で用いられる通り、治療が「奏効する」、およびこの動詞の他の形態は、薬剤による治療に対する被験体の反応を指す。例として、被験体における腫瘍の増殖が約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上遅延すれば、治療が被験体に奏効する。別の例では、被験体における腫瘍が、任意の適切な量、例えば、質量または容量により決定したときに約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上縮小すれば、治療が被験体に奏効する。別の例では、被験体の寿命が、治療を施さない場合に予測される寿命より約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上長くなれば、Ｈｅｒ−２作用剤による治療が被験体に奏効する。別の例では、被験体の全生存期間または無増悪期間が長くなれば、薬剤による治療が被験体に奏効する。本明細書に記載の通り、ＲＥＣＩＳＴ基準を含め、数種の方法を用いて、治療が患者に奏効するかどうかを判定することができる。
【００６６】
「試料」または「組織試料」または「患者試料」または「患者の細胞試料もしくは組織試料」または「被検物」は各々が、被験体または患者の組織から得られる類似細胞の回収物を指す。組織試料の供給源は、新鮮組織、凍結および／もしくは保存した器官もしくは組織、または生検もしくは吸引物などに由来する固体組織；血液または任意の血液構成成分、脳脊髄液、羊水、腹水、または間質液などの体液、または被験体の妊娠または発育の任意の時点に由来する細胞の場合もある。組織試料は、防腐剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定剤、栄養物、抗生物質など、天然の組織と天然では混合しない化合物を含有し得る。細胞は、ＦＦＰＥ様式などの従来の様式で固定することができる。
【００６７】
本明細書で用いられる「短い」とは、期間である量が正常の量より短いこと、所定の量などの標準の量より短いこと、またはあるサブグループの量が別のサブグループの量より相対的に短いことを指す。例えば、患者の寿命との関連で、増悪までの期間が短いとは、正常の増悪までの期間より短いか、または予測される増悪までの期間より短い増悪までの期間を指す。増悪までの期間が短いかどうかは、当業者に利用可能な任意の方法により決定することができる。一実施形態では、「短い」とは、疾患において重要事象が生じるのに必要な時間経過の中央値より短い期間を指す。
【００６８】
本明細書で用いられる「シグナル伝達経路」とは、細胞外のシグナル伝達分子が、細胞表面の受容体に結合することにより、細胞内におけるイベントが誘発される過程、および／または細胞内の相互作用を介して、細胞内のシグナル伝達カスケードが誘発され得る過程を指す。例えば、受容体チロシンキナーゼは、細胞表面から、増殖、分化、新脈管形成、およびアポトーシスの阻害など、重要な機能を制御する細胞内過程へと、増殖因子によるシグナルを伝搬させる膜貫通タンパク質である。癌では、これらのシグナル伝達経路が、腫瘍の増殖および転移を促進するのに用いられることが多い。受容体チロシンキナーゼのこのようなファミリーの１つは、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーである。ＥＧＦＲファミリーメンバーである、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４は、多種多様な腫瘍で過剰発現している。
【００６９】
本明細書で用いられる「重要事象」とは、当業者により重要であると判定される、患者の疾患における事象を指すものとする。重要事象の例には、例えば、初回の診断、死亡、再発、患者の疾患が転移性であるという判定、患者の疾患の再発、または患者の疾患が上記で言及した病期のうちの任意の１つから別の病期へと進行することが含まれるがこれらに限定されない。重要事象とは、ＯＳ、ＴＴＰを評価するのに用いられ、かつ／または当業者により判定される通り、ＲＥＣＩＳＴもしくは他の効果判定基準を用いてＯＳ、ＴＴＰを評価するのに用いられる任意の重要な事象であり得る。
【００７０】
本明細書で用いられる「被験体」および「患者」という用語は、互換的に用いられる。本明細書で用いられる「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」および「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔｓ）」は、動物、好ましくは霊長動物以外（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ロバ、ヤギ、ラクダ、ネコ、イヌ、モルモット、ラット、マウス、またはヒツジ）と、霊長動物（例えば、カニクイザルなどのサル、ゴリラ、チンパンジー、またはヒト）とを含めた哺乳動物を指す。
【００７１】
「標的化療法」とは、正常細胞を害するかまたは変化させることなく、疾患に関与する特定の細胞を同定し治療しようと試みる治療的処置を指す。標的化治療剤は、ラパチニブおよびイレッサ／グリベックなどの低分子、トラスツズマブなどのモノクローナル抗体、または疾患過程に関与する遺伝子産物の発現を遮断するのに用いられるｓｉＲＮＡなどの核酸からなり得るがこれらに限定されない。標的化療法は、癌など、多くの疾患過程を治療するのに有用である。
【００７２】
本明細書で用いられる「時間経過」とは、初期事象と後続事象との間の期間の量を指すものとする。例えば、患者の癌の場合、時間経過は、患者の疾患に関し、疾患の進行における重要事象を判断することにより測定することが可能であり、例えば、最初の事象が診断であり、後続事象が転移であり得る。
【００７３】
「無増悪期間」または「ＴＴＰ」とは、治療の開始から癌の増悪または打切りまでに測定される期間を指す。打切りは、試験の終了から生じる場合もあり、治療の変更から生じる場合もある。無増悪期間はまた、例えば、キャプラン−マイヤープロットなどにおける確率としても表すことができ、この場合、無増悪期間は、治療の開始から増悪または打切りまでの間の期間である特定の期間にわたり無増悪である確率を表し得る。
【００７４】
「治療」およびこの語の他の形態は、薬剤を投与して、癌の増殖などの疾患を阻害し、癌の重量もしくは容積を縮小させ、被験体の予測生存期間、および／または腫瘍の無増悪期間を延長させることなどを指す。治療はまた、当業者、例えば、治療する医師が適切であると見なす任意のコースを指す場合がある。
【００７５】
「ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）」という用語は、単一アッセイならびに多重アッセイおよび多重標識アッセイ、試薬、分析手順、およびこれらのアッセイに関連するソフトウェアが含まれるがこれらに限定されない、このようなアッセイを実施および利用するための材料、方法、および技法を指す。ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）、ｖＴａｇ、およびＥＴＡＧ（登録商標）という用語は、互換的に用いられるものとする。
【００７６】
第一の態様では、本発明が、試料におけるＨｅｒ−３および／または複合体化したＨｅｒ−３の存在および／または量を測定および／または定量化する方法であって、試料を供給するステップと、該試料におけるＨｅｒ−３および／または複合体化したＨｅｒ−３の存在および／または量を決定するステップを含む方法を対象とする。好ましい実施形態では、試料が、生物学的試料である。好ましい実施形態では、試料が、組織試料である。好ましい実施形態では、試料が、新鮮な組織試料、固定試料、凍結試料、または溶解物である。好ましい実施形態では、試料が、腫瘍試料である。好ましい実施形態では、試料が、凍結腫瘍組織試料である。好ましい実施形態では、試料が、新鮮な腫瘍試料または凍結腫瘍試料に由来する腫瘍溶解物を含む。好ましい実施形態では、試料が、ＦＦＰＥ試料または可溶化ＦＦＰＥ試料である。好ましい実施形態では、試料が、乳癌試料を含む。好ましい実施形態では、乳癌が、早期乳癌（すなわち、アジュバント療法）または転移性乳癌である。特定の実施形態では、乳癌におけるＨｅｒ−２の発現レベルが高い。特定の実施形態では、高いＨｅｒ−２発現が、ｌｏｇ１０Ｈ２Ｔ≧約１．１４〜１．２５である。特定の実施形態では、高いＨｅｒ−２発現が、極めて高い発現、および／または中程度に高い発現を含む。特定の実施形態では、極めて高いＨｅｒ−２発現が、ｌｏｇ１０Ｈ２Ｔ≧約１．８４〜２．２１である。あるいは、患者コホートに応じて、他の範囲も用いることができる。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−３レベルが高ければ、標的化療法が患者に奏効する可能性が低いかまたはその可能性がない。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−３レベルが低ければ、標的化療法が該患者に奏効する可能性がある。特定の実施形態では、本明細書により詳細に記載される通り、該療法が、Ｈｅｒ作用剤である。さらなる実施形態では、該療法が、Ｈｅｒ−２作用剤またはＨｅｒ−３標的化剤のうちの少なくとも１つである。
【００７７】
好ましい実施形態では、試料が、血液試料、血漿試料、またはリンパ試料である。好ましい実施形態では、血液試料または血漿試料が、循環腫瘍細胞を含有する。好ましい実施形態では、試料が、細胞系を含む。好ましい実施形態では、測定が、広範なダイナミックレンジにわたり定量的であり得る。
【００７８】
好ましい実施形態では、方法が、試料を結合化合物と混合するステップと、Ｈｅｒ−３および／または複合体化したＨｅｒ−３に結合した該結合化合物の存在および／または量を決定するステップを含む。好ましい実施形態では、結合化合物が、Ｈｅｒ−３に特異的に結合する。好ましい実施形態では、結合化合物が、抗体を含む。好ましい実施形態では、抗体が、実施例２に記載され、図２Ａに示される、配列番号１〜８を有するペプチドのうちの１つに対して産生させた抗体である。好ましい実施形態では、表１Ｂに示す通り、抗体が、（ａ）それぞれ、配列番号１３、１４、および１５に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）それぞれ、配列番号１６、１７、および１８に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；ならびに／または（ａ）それぞれ、配列番号１９、２０、および２１に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）それぞれ、配列番号２２、２３、および２４に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体である。好ましい実施形態では、抗体が、軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ、表１Ａに示される配列番号９および１１を有する抗体、ならびに／または軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ、表１Ｂに示される配列番号１０および１２を有する抗体である。
【００７９】
（表１Ａ）
【００８０】
【表１Ａ】
0005746051.tif 000002
（表１Ｂ）
【００８１】
【表１Ｂ】
0005746051.tif 000003
表１Ａおよび１Ｂ：Ｈｅｒ３、Ｈｅｒ３．Ｂ９Ａ１１．Ｈ１、およびＨｅｒ３．Ｆ９Ｂ１０．３に結合する２つの抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を、表１Ａに示す。配列が由来するクローン単離物を示し、相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を付す。「＿ＬＣ」または「＿ＨＣ」により、それぞれ、軽鎖および重鎖を示す。表１Ｂは、それぞれ、Ｂ９Ａ１１．Ｈ１の軽鎖および重鎖、ならびにＦ９Ｂ１０．３の軽鎖および重鎖の３つのＣＤＲを示す。
【００８２】
好ましい実施形態では、方法が、（ｉ）Ｈｅｒ−３および／または複合体化したＨｅｒ−３を含有し得る試料と；（ｉｉ）有効近接距離を有する、Ｈｅｒ−３および／または少なくとも１つの他の検体に結合することが可能な近接プローブと；（ｉｉｉ）Ｈｅｒ−３に結合することが可能であり、１つ以上のシグナル伝達分子が結合している、少なくとも１つの結合化合物とを混合するステップを含み、ここで、有効近接距離内において該近接プローブおよび該結合化合物が結合すると、Ｈｅｒ−３および／または複合体化したＨｅｒ−３の存在および／または量と相関するシグナルが分子タグから生成される。好ましい実施形態では、近接プローブおよび／または結合化合物が、Ｈｅｒ−３に特異的に結合することが可能である。好ましい実施形態では、近接プローブおよび／または結合化合物が、抗体をさらに含み、各抗体が、Ｈｅｒ−３における特定のエピトープに結合し得る。好ましい実施形態では、抗体が、実施例２に記載され、図２Ａに示される、配列番号１〜８を有するペプチドのうちの１つに対して産生させた抗体である。好ましい実施形態では、抗体が、（ａ）それぞれ、配列番号１３、１４、および１５に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）それぞれ、配列番号１６、１７、および１８に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；ならびに／または（ａ）それぞれ、配列番号１９、２０、および２１に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）それぞれ、配列番号２２、２３、および２４に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体である（表１Ｂ）。好ましい実施形態では、抗体が、軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ、表１Ａに示される配列番号９および１１を有する抗体、ならびに／または軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ、表１Ａに示される配列番号１０および１２を有する抗体である。好ましい実施形態では、試料が、生物学的試料である。好ましい実施形態では、試料が、組織試料である。好ましい実施形態では、試料が、固定試料、凍結試料、または溶解物である。好ましい実施形態では、試料が、腫瘍試料である。好ましい実施形態では、試料が、凍結腫瘍組織試料である。好ましい実施形態では、試料が、腫瘍溶解物を含む。好ましい実施形態では、試料が、本明細書で論じられる乳癌試料を含む。例えば、特定の実施形態では、乳癌が、早期乳癌（すなわち、アジュバント療法）または転移性乳癌である。特定の実施形態では、乳癌におけるＨｅｒ−２の発現レベルが高い。特定の実施形態では、高いＨｅｒ−２発現が、ｌｏｇ１０Ｈ２Ｔ≧約１．１４〜１．２５である。特定の実施形態では、高いＨｅｒ−２発現が、極めて高い発現、および／または中程度に高い発現を含む。特定の実施形態では、極めて高いＨｅｒ−２発現が、ｌｏｇ１０Ｈ２Ｔ≧約１．８４〜２．２１である。あるいは、患者コホートに応じて、他の範囲も用いることができる。
【００８３】
好ましい実施形態では、試料が、ＦＦＰＥ試料または可溶化ＦＦＰＥ試料である。好ましい実施形態では、試料が、血液試料、血漿試料、またはリンパ試料である。好ましい実施形態では、血液試料または血漿試料が、循環腫瘍細胞を含有する。好ましい実施形態では、試料が、エクソソームおよび／または他の小胞を含有する。好ましい実施形態では、試料が、細胞系を含む。好ましい実施形態では、測定が、広範なダイナミックレンジにわたり定量的であり得る。好ましい実施形態では、広範なダイナミックレンジが、約２ｌｏｇである。より好ましい実施形態では、広範なダイナミックレンジが、乳癌試料において約１〜１．５ｌｏｇである。好ましい実施形態では、方法が、Ｈｅｒ−３発現の定量的連続体を提供する。好ましい実施形態では、測定または量が、十分に特徴づけられた細胞系モデルと、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーなどの交差検証法とを用いる正確度試験により決定される通り、少なくとも細胞１個当たりの受容体約１０００個〜細胞１個当たりの受容体約２００，０００個の感度である。好ましい実施形態では、測定または量が、少なくとも細胞１個当たりの受容体約５０００個〜細胞１個当たりの受容体約２００，０００個の感度である。好ましい実施形態では、測定または量が、少なくとも細胞１個当たりの受容体約１０，０００個〜細胞１個当たりの受容体約２００，０００個の感度である。好ましい実施形態では、測定または量が、少なくとも細胞１個当たりの受容体約２５，０００個〜細胞１個当たりの受容体約２００，０００個の感度である。好ましい実施形態では、アイソタイプの対照抗体、および従来のＩＨＣ法との比較を用いて決定される測定が特異的である。
【００８４】
好ましい実施形態では、Ｈｅｒ−３に結合した結合化合物の存在および／または量を決定するステップが、Ｈｅｒ−３に結合した結合化合物に特異的に結合することが可能な第２の結合化合物を供給するステップと、Ｈｅｒ−３に結合した結合化合物の存在および／または量に相関するものとしての第２の結合化合物の存在および／または量を決定するステップとをさらに含む。好ましい実施形態では、第２の結合化合物が抗体である。
【００８５】
第１の結合化合物に特異的に結合することが可能であり、１つ以上の分子タグを有する第２の結合化合物の使用は、実用的な利点を有し得る。例えば、１つ以上の分子タグが結合している単一の第２の結合化合物を用いて、Ｈｅｒ−３特異性の複数の第１の結合化合物を調べることにより、Ｈｅｒ−３特異性の複数の第１の結合化合物の各々に分子タグを結合させる必要をなくすことができる。好ましい実施形態では、第１の結合化合物がマウス抗体であり、第２の結合化合物が、切断可能な分子タグを結合させた、マウス以外の種において産生させた抗マウス抗体（例えば、ヤギ抗マウス抗体）である。
【００８６】
第２の結合化合物は、検出に有用なプローブにより標識するのが典型的である。第２の結合化合物を検出するのに一般に用いられる検出系には、本明細書に記載される切断可能な分子タグ；放射性標識（すなわち、Ｉ−１２５などの放射性同位元素）；化学物質を、測定可能な比色シグナル、蛍光シグナル、または電気化学シグナルへと転換する酵素（例えば、ペルオキシダーゼ）、および蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、およびその多くの誘導体）が含まれるがこれらに限定されない。
【００８７】
抗体は、モノクローナル抗体の場合もあり、ポリクローナル抗体の場合もあり、組換え抗体の場合もあり、当技術分野で周知の技法により調製することができる。抗体は、完全免疫グロブリンまたは、その断片を包含してよく、これらの免疫グロブリンは、例えばＩｇＡ；ＩｇＤ；ＩｇＥ；ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３；ＩｇＭなど、各種のクラスおよびアイソタイプを包含する。これらの断片には、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’などが含まれ得る。抗体はまた、単鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または、特定の結合部位に対して特異的な結合活性を保持する、当業者に公知の他の任意の抗体誘導体でもあり得る。加えて、適切な場合は、結合親和性が維持される限りにおいて、免疫グロブリンまたはそれらの断片の凝集体、ポリマー、およびコンジュゲートを用いることもできる。
【００８８】
生物学的試料におけるＨｅｒ−３を測定する方法の開発を容易とするために、Ｈｅｒ−３特異的モノクローナル抗体が創出された。Ｈｅｒ−３に由来するペプチドに対してマウスを免疫し（図２Ａに示す）、本明細書でさらに記載され、当業者に公知である標準的な方法を用いて、ハイブリドーマを作製した。モノクローナル抗体を創出および作製するには、例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒら（１９７５年）、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６巻：４９５〜４９７頁により最初に記載されたハイブリドーマ法、または文献（Ｇｏｄｉｎｇ，  ＪＷ（１９８０年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３４巻：２８５〜３０８頁；  Ｈａｒｌｏｗ  ＥおよびＬａｎｅ  Ｄ（１９８８年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ中の６章；  Ｋｅｎｎｅｔｔ  ＲＨら（１９８０年）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｚｏｌａ  Ｈ（１９８７年）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）において記載されている他の方法など、多くの方法が公知である。
【００８９】
一実施形態では、ハイブリドーマを創出する方法が、マウスなどの宿主動物を免疫し、目的のペプチドまたはタンパク質（複数可）を標的とする抗体を生成させるリンパ球の生成を誘発することにより始まる。リンパ球はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでも免疫することができる。用いられる抗原は、ペプチドの場合もあり、タンパク質の場合もあり、細胞表面に抗原を提示する細胞の場合もある。リンパ球を回収し、次いで、化学的方法（例えば、ＰＥＧによる）または電気的方法（例えば、電気融合）により、骨髄腫細胞と融合させ、典型的には、親骨髄腫細胞の増殖および／または生存を阻止する条件下において、ハイブリドーマ細胞を形成する。融合した細胞は、培地における生存を促進する酵素を含有するため、増殖することが可能となる。好ましい実施形態では、培地が、ヒポキサンチンキニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を欠く細胞の増殖を防止する、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含有する（ＨＡＴ培地）。融合細胞にはリンパ球パートナーによりＨＰＲＴが供給されることにより、ハイブリドーマの生存は可能となるが、ＨＰＲＴを欠く親骨髄腫細胞の生存は防止される。
【００９０】
ハイブリドーマが増殖する培地（すなわち、馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ））は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ；  Ｅｎｇｖａｌｌ  Ｅ（１９７７年）、「Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、ＴＭＳ  Ｃｈａｎｇ編、２巻：８７〜９６頁、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ；  Ｓｏｎｋｓｅｎ  ＰＨ（１９７４年）、Ｂｒｉｔ．  Ｍｅｄ．  Ｂｕｌｌ．  ３０巻：１〜１０３頁を参照されたい）；ウェスタンブロット；またはフローサイトメトリーなど、免疫沈澱アッセイまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける結合アッセイが含まれるがこれらに限定されない各種の技法（Ｖｏｌｌｅｒら（１９７８年）、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ３１巻：５０７〜５２０頁を参照されたい）を用いて、抗原に対して向けられたモノクローナル抗体の生成についてアッセイすることが典型的である。ハイブリドーマに由来する馴化培地は、ＥＬＩＳＡ（図１）、ウェスタンブロット（図２）、およびフローサイトメトリー（図３）を含めた一連のアッセイにおいてプロファイリングした。好ましい実施形態では、天然の固定細胞および透過性にした固定細胞の両方を用いる試験を実施して、免疫組織化学（ＩＨＣ）など、固定細胞または固定組織を用いる適用において良好に動作得る抗体を同定する。限定希釈または単一細胞フローサイトメトリーにより、目的のクローンをサブクローニングすることができる。
【００９１】
当業者に公知である通り、ハイブリドーマクローン（またはサブクローン）によって分泌されるモノクローナル抗体は、透析、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、またはプロテインＡ−セファロース（またはプロテインＬ−アガロース）クロマトグラフィーなどであるがこれらに限定されない、従来の精製手順を用いて精製することができる。
【００９２】
Ｈｅｒ−３に由来するペプチドであるＣＦＤＮＰＤＹＷＨＳＲＬＦＰＫＡＮＡ（配列番号６）に対して産生した、作製した１つの抗体であるＢ９Ａ１１（すなわち、配列番号９および１１）を選択して、本明細書に記載するＨｅｒ３−ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイ実験において用いた。抗体Ｂ９Ａ１１およびＦ９Ｂ１０を産生するハイブリドーマ細胞系は、ブダペスト条約の条項下において、２０１０年１月１２日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、バージニア州  ２０１１０，マナサス，ユニバーシティー  ブールーバ−ド  １０８０１に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５７４およびＰＴＡ−１０５７５を付与された。
【００９３】
分析のための生物学的試料を調製するには、多くの方法および試薬を用いることが一般的である。本明細書では数種の方法が概説または参照され、他の多くの方法が当業者に公知である。バイオマーカーとして用いるのに適するＨｅｒ−３を含有する試料は、細胞培養物、動物組織または植物組織、患者の生検、血液などを含め、多種多様な供給源に由来し得る。試料は、ヒト患者試料であることが好ましい。試料は、試料がそこから採取される供給源に依存し得る、従来の技法を用いて、本発明のアッセイのために調製する。生検および医学的被験物については、以下の参考文献：  Ｂａｎｃｒｏｆｔ  ＪＤおよびＳｔｅｖｅｎｓ  Ａ編、１９７７年、Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ；  Ｐｅａｒｓｅ、１９８０年、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｅｄ、第４版、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈにおいて、指針が示されている。
【００９４】
用い得る患者組織試料の例には、乳房組織、前立腺組織、卵巣組織、結腸組織、肺組織、子宮内膜組織、胃組織、唾液腺組織、または膵臓組織が含まれるがこれらに限定されない。組織試料は、手術による切除、吸引、または生検を含め、各種の手順により得ることができる。組織は、新鮮試料の場合もあり、凍結試料の場合もある。一実施形態では、生物学的試料が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて培養され、遠心分離により細胞ペレットとして回収される細胞であり得る。一実施形態では、試料が、患者の血液試料の場合もあり、特定の血液細胞型の場合もあり、血液細胞型のサブセット（例えば、バフィーコート）の場合もある。一実施形態では、生物学的試料が、エクソソームの場合もあり、エクソソームを含有する試料の場合もある。エクソソームは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、腫瘍細胞（Ｍｉｇｎｏｔら（２００６年）、Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  １０巻：３７６〜３８８頁を参照されたい）を含めた大半の細胞型により分泌され得る小型の（３０〜２００ｎｍ）小胞である。腫瘍に由来するエクソソームは、腫瘍が免疫系に浸潤する能力において役割を果たし、診断的適用および治療的適用の両方に対する可能性を有すると考えられており（ＴａｙｌｏｒおよびＢｌａｃｋ（１９８５年）、Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ７４巻：８５９〜８６７頁を参照されたい）、したがって、目的の生物学的試料である。
【００９５】
好ましい実施形態では、試料が、腫瘍試料である。腫瘍試料の種類の例には、癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、および混合種の癌などであるがこれらに限定されない癌が含まれる。一実施形態では、癌が、骨癌、例えば、ユーイング肉腫、骨肉腫、および横紋筋肉腫、ならびに他の軟組織肉腫である。別の実施形態では、癌が、脳腫瘍、例えば、希突起神経膠腫、上衣腫、髄膜腫、リンパ腫、神経鞘腫、または髄芽腫である。別の実施形態では、癌が、乳癌である。別の実施形態では、癌が、内分泌系癌、例えば、副腎癌、膵臓癌、副甲状腺癌、下垂体癌、および甲状腺癌である。別の実施形態では、癌が、消化器癌、例えば、肛門癌、結腸直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、肝癌、および小腸癌である。別の実施形態では、癌が、婦人科癌、例えば、子宮頚癌、子宮内膜癌、子宮癌、卵管癌、妊娠性絨毛疾患、絨毛癌、卵巣癌、膣癌、または外陰癌である。別の実施形態では、癌が、頭頚部癌、例えば、喉頭癌、口腔咽頭癌、副甲状腺癌、または甲状腺癌である。別の実施形態では、癌が、黒色腫、扁平上皮癌、または基底細胞癌である。別の実施形態では、癌が、白血病、例えば、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、毛様細胞白血病、または骨髄増殖性障害である。別の実施形態では、癌が、肺癌、例えば、中皮腫または非小細胞肺癌である。別の実施形態では、癌が、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキン病、または非ホジキン病などのリンパ腫である。別の実施形態では、癌が、転移性癌である。別の実施形態では、癌が、骨髄腫、例えば、多発性骨髄腫である。別の実施形態では、癌が、陰茎癌である。別の実施形態では、癌が、前立腺癌である。別の実施形態では、癌が、精巣癌である。別の実施形態では、癌が、甲状腺癌、例えば、甲状腺乳頭癌、甲状腺濾胞癌、甲状腺髄様癌、または甲状腺未分化（ａｎａｐｌａｓｔｉｃまたはｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）癌である。別の実施形態では、癌が、尿路癌、例えば、膀胱癌、腎癌、または尿道癌である。
【００９６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて培養した細胞を、新鮮試料、凍結試料、または固定試料として調製する方法は、当業者に公知であり、例示的な方法は、本明細書において記載されている。一実施形態では、固定され、パラフィンに包埋された組織試料に対して本発明のアッセイを実施し、脱パラフィンのステップを実施することができる。従来の方法論により、組織試料を固定（すなわち、保存）することができる。例えば、Ｌｅｅ  Ｇ．  Ｌｕｎａ，  ＨＴ（ＡＳＣＰ）編、１９６０年、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ」、第３版、Ｔｈｅ  Ｂｌａｋｓｔｏｎ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｕｌｒｅｋａ  Ｖ．  Ｍｉｋｅｌ編、１９９４年、「Ｔｈｅ  Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ」、Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．を参照されたい。当業者は、組織を組織学的に染色するか、または他の方法で分析する目的により、固定剤の選択が決定されることを理解する。当業者はまた、固定化の長さが、組織試料のサイズ、および用いられる固定剤に依存することも理解する。
【００９７】
一般に、まず、組織試料を固定し、次いで、濃度を上昇させた一連のアルコールにより脱水し、組織試料を切片化し得るように、パラフィンまたは他の切片化媒体を浸透させてこれにより包埋する。代替的に、組織を切片化し、得られた切片を固定することもできる。例示目的で、従来の技法による従来の方法によって、または本明細書に記載される通りに、組織試料をパラフィンに包埋および加工する。組織試料を包埋したら、従来の技法により、ミクロトームにより試料を切片化することができる。切片は、厚さが約３ミクロン〜約１２ミクロンの範囲であり、約５ミクロン〜約１０ミクロンの厚さであることが好ましい。一実施形態では、切片が、約１０ｍｍ２〜約１ｃｍ２の面積であり得る。切断したら、数種の標準的な方法により、切片をスライドに付着させることができる。スライド接着剤の例には、シラン、ゼラチン、およびポリ−Ｌ−リシンが含まれるがこれらに限定されない。パラフィン包埋された切片は、正に帯電したスライド、および／またはポリ−Ｌ−リシンによりコーティングされたスライドに付着させることができる。
【００９８】
パラフィンを包埋材料として用いた場合は、一般に、バイオマーカーを検出する前に、組織切片を脱パラフィンおよび再水和する。従来の数種の標準的な方法により、組織切片を脱パラフィンすることができる。例えば、本明細書に記載の参考文献により説明される従来の技法により、キシレンと、段階的に濃度を低下させる一連のアルコールとを用いることができる。代替的に、Ｈｅｍｏ−Ｄｅ（登録商標）（テキサス州、ヒューストン、ＣＭＳ社製）など、市販の非有機の脱パラフィン剤を用いることもできる。
【００９９】
従来の細胞溶解法（例えば、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．６）、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、および、必要に応じてプロテアーゼ阻害剤ならびに／またはホスファターゼ阻害剤）により、哺乳動物組織培養細胞の細胞溶解物または新鮮組織もしくは凍結組織を調製することができる。新鮮な哺乳動物組織の場合、試料調製はまた、粉砕（ｃｒｕｓｉｎｇ）、ミンチ化（ｍｉｎｃｉｎｇ）、すりつぶし（ｇｒｉｎｄｉｎｇ）、または超音波処理など、組織の脱凝集（ｔｉｓｓｕｅ  ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）ステップも包含する。
【０１００】
多様なレベルのＨｅｒ−３を発現する安定的な細胞系を作製した。多様なレベルの対象のタンパク質を安定的に発現する細胞系は、抗体の最適濃度、正確度（ａｃｃｕｒａｃｙ）、感度、再現性、精度（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）、直線性、特異性、およびダイナミックレンジなど、多くのパラメータについて、Ｈｅｒ−３  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイなど、新規のアッセイを検証するのに有用である。ＨＥＫ  ２９３細胞を用いて、安定的なＨｅｒ−３発現細胞系を創出した。ＨＥＫ  ２９３細胞は、元来、アデノウイルスのＤＮＡにより形質転換したヒト胚性腎細胞に由来する特定の細胞系である（Ｇｒａｈａｍら（１９７７年）、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ３６巻：５９〜７４頁を参照されたい）。ＨＥＫ  ２９３細胞は、培養物での増殖が容易であり、トランスフェクするのも容易であり、多年にわたり、細胞生物学の研究の他、バイオテクノロジー産業のためのタンパク質作製に広く用いられてきた。Ｈｅｒ−３発現細胞系の作製については実施例１に記載し、これらの細胞系の各々におけるＨｅｒ−３レベルを決定するＥＬＩＳＡアッセイの結果を図１に示す。
【０１０１】
さらに好ましい実施形態では、近接プローブが、抗体と第１の核酸とを含み、結合化合物が、抗体と第２の核酸とを含み、第１および第２の核酸が互いに対して相補的であり、ハイブリダイズして有効近接距離を決定することが可能であり、ハイブリダイゼーションを介して直接的または間接的にシグナルを発生させる。好ましい実施形態では、近接プローブおよび／または結合化合物が、Ｈｅｒ−３に特異的に結合することが可能である。好ましい実施形態では、結合化合物および／または近接プローブが、抗体をさらに含み、各抗体が、Ｈｅｒ−３における異なるエピトープに結合する。好ましい実施形態では、抗体が、実施例２に記載され、図２Ａに示される、配列番号１〜８を有するペプチドのうちの１つに対して産生させた抗体である。好ましい実施形態では、抗体が、（ａ）それぞれ、配列番号１３、１４、および１５に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）それぞれ、配列番号１６、１７、および１８に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；ならびに／または（ａ）それぞれ、配列番号１９、２０、および２１に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）それぞれ、配列番号２２、２３、および２４に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体である（表１Ｂ）。好ましい実施形態では、抗体が、軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ、表１Ａに示される配列番号９および１１を有する抗体、ならびに／または軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ、表１Ａに示される配列番号１０および１２を有する抗体である。好ましい実施形態では、試料が、生物学的試料である。好ましい実施形態では、試料が、組織試料である。好ましい実施形態では、試料が、固定試料、凍結試料、または溶解物である。好ましい実施形態では、試料が、腫瘍試料である。好ましい実施形態では、試料が、凍結腫瘍組織試料である。好ましい実施形態では、試料が、腫瘍溶解物を含む。好ましい実施形態では、試料が、本明細書に記載される乳癌試料を含む。好ましい実施形態では、試料が、ＦＦＰＥ試料または可溶化ＦＦＰＥ試料である。好ましい実施形態では、試料が、血液試料、血漿試料、またはリンパ試料である。好ましい実施形態では、血液試料または血漿試料が、循環腫瘍細胞を含有する。好ましい実施形態では、試料が、エクソソームおよび／または他の小胞を含有する。好ましい実施形態では、試料が、細胞系を含む。好ましい実施形態では、測定が、広範なダイナミックレンジにわたり定量的であり得る。好ましい実施形態では、広範なダイナミックレンジが、約２ｌｏｇである。より好ましい実施形態では、広範なダイナミックレンジが、乳癌試料において約１〜１．５ｌｏｇである。好ましい実施形態では、方法が、Ｈｅｒ−３発現の定量的連続体を提供する。好ましい実施形態では、測定または量が、十分に特徴づけられた細胞系モデルと、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーなどの交差検証法とを用いる正確度試験により決定される通り、少なくとも細胞１個当たりの受容体約１０００個〜細胞１個当たりの受容体約２００，０００個の感度である。好ましい実施形態では、測定または量が、少なくとも細胞１個当たりの受容体約５０００個〜細胞１個当たりの受容体約２００，０００個の感度である。好ましい実施形態では、測定または量が、少なくとも細胞１個当たりの受容体約１０，０００個〜細胞１個当たりの受容体約２００，０００個の感度である。好ましい実施形態では、測定または量が、少なくとも細胞１個当たりの受容体約２５，０００個〜細胞１個当たりの受容体約２００，０００個の感度である。好ましい実施形態では、アイソタイプの対照抗体、ならびに従来のＩＨＣ法との比較を用いて決定される測定が特異的である。本明細書に記載の近接プローブおよび結合化合物の例は、例えば、任意の図面を含め、その各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第７，３０６，９０４号；同第７，３２０，８６０号；および同第７，３５１，５２８号において見出すことができる。
【０１０２】
近接アッセイは、分子複合体の生物学的役割を理解する他、バイオマーカーについて調べるにもますます有用である。例えば、Ｈｅｒ−３または複合体化したＨｅｒ−３に特異的に結合する結合化合物を、多くの異なる検出系と連結し、Ｈｅｒ−３または複合体化したＨｅｒ−３の存在および／または量を測定することができる。Ｈｅｒ−３または複合体化したＨｅｒ−３の量を決定するのに有用であることが当業者に公知の任意の方法を、本発明に従って用いることができる。このような方法には、Ｆｏｅｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法、生体分子蛍光補完法、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）法、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）法、およびローリングサークル増幅（ＲＣＡ）法、または核酸の相補鎖を有する結合プローブと、核酸の相補鎖を有する近接プローブとが近接することにより形成される核酸二重鎖を検出する他の任意の方法が含まれるがこれらに限定されない。
【０１０３】
本発明の方法を実施するには、被験試料と、結合化合物と、場合によって、近接プローブとを含めた、アッセイ成分の組み合わせ物を作製する。一般に、アッセイ成分は、任意の順序で組み合わせることができる。しかし、特定の適用では、添加の順序が重要となり得る。例えば、定量的アッセイなどにおいて、競合的結合についてモニタリングしたい場合がある。あるいは、構築した複合体の安定性をモニタリングしたい場合もある。このような適用では、反応物を段階的に構築することができる。
【０１０４】
各試薬の量は、一般に、経験的に決定することができる。アッセイで用いられる試料の量は、存在することが予測される標的複合体の数と、アッセイのシグナルをモニタリングするのに用いられる分離および検出の手段とにより決定される。一般に、結合化合物および近接プローブの量は、試料において予測される標的分子の量と比べたモル過剰、一般に、少なくとも約１．５モルの過剰、より望ましくは約１０倍以上のモル過剰で供給することができる。特定の適用において、用いられる濃度は、結合化合物または近接プローブの親和性、および単一の細胞において存在することが予測される標的分子の数に応じて高濃度の場合もあり、低濃度の場合もある。
【０１０５】
アッセイ混合物は、通常、約１０〜２００ｍＭの範囲の濃度のバッファーにより維持される、一般に、生理的ｐＨ（細胞が培養されるｐＨと同等のｐＨ）にある水性媒体において、細胞表面分子へのプローブの結合をもたらす条件下で混合およびインキュベートすることができる。従来のバッファーの他、必要に応じて、塩、増殖媒体、安定化剤など、他の従来の添加物も用いることができる。一般に、生理的な一定温度を用いる。インキュベーション温度は、一般に、約４℃〜７０℃、通常約１５℃〜４５℃であり、より通常の場合には、約２５℃〜３７℃である。
【０１０６】
好ましい実施形態では、近接プローブは、切断誘導部分を有する切断プローブを含み、少なくとも１つの結合化合物は、切断可能な結合により１つ以上の分子タグが結合しており、ここで、該切断可能な結合が該有効近接距離内において切断されることにより、Ｈｅｒ−３の存在および／または量と相関するシグナルが生成され得る。好ましい実施形態では、切断プローブおよび／または結合化合物が、Ｈｅｒ−３に特異的に結合することが可能である。好ましい実施形態では、結合化合物および／または近接プローブが、抗体をさらに含み、各抗体が、Ｈｅｒ−３における異なるエピトープに結合する。好ましい実施形態では、抗体が、実施例２に記載され、図２Ａに示される、配列番号１〜８を有するペプチドのうちの１つに対して産生させた抗体である。好ましい実施形態では、抗体が、（ａ）それぞれ、配列番号１３、１４、および１５に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）それぞれ、配列番号１６、１７、および１８に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；ならびに／または（ａ）それぞれ、配列番号１９、２０、および２１に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）それぞれ、配列番号２２、２３、および２４に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体である。好ましい実施形態では、抗体が、軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ、表１Ａに示される配列番号９および１１を有する抗体、ならびに／または軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ、表１Ａに示される配列番号１０および１２を有する抗体である。好ましい実施形態では、試料が、生物学的試料である。好ましい実施形態では、試料が、組織試料である。好ましい実施形態では、試料が、固定試料、凍結試料、または溶解物である。好ましい実施形態では、試料が、腫瘍試料である。好ましい実施形態では、試料が、凍結腫瘍組織試料である。好ましい実施形態では、試料が、腫瘍溶解物を含む。好ましい実施形態では、試料が、本明細書に記載される乳癌試料を含む。好ましい実施形態では、試料が、ＦＦＰＥ試料または可溶化ＦＦＰＥ試料である。好ましい実施形態では、試料が、血液試料、血漿試料、またはリンパ試料である。好ましい実施形態では、血液試料または血漿試料が、循環腫瘍細胞を含有する。好ましい実施形態では、試料が、細胞系を含む。好ましい実施形態では、測定が、広範なダイナミックレンジにわたり定量的であり得る。好ましい実施形態では、広範なダイナミックレンジが、約２ｌｏｇである。より好ましい実施形態では、広範なダイナミックレンジが、乳癌試料において約１〜１．５ｌｏｇである。好ましい実施形態では、方法が、Ｈｅｒ−３発現の定量的連続体を提供する。好ましい実施形態では、測定または量が、十分に特徴づけられた細胞系モデルと、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーなどの交差検証法とを用いる正確度試験により決定される通り、少なくとも細胞１個当たりの受容体約１０００個〜細胞１個当たりの受容体約２００，０００個の感度である。好ましい実施形態では、測定または量が、少なくとも細胞１個当たりの受容体約５０００個〜細胞１個当たりの受容体約２００，０００個の感度である。好ましい実施形態では、測定または量が、少なくとも細胞１個当たりの受容体約１０，０００個〜細胞１個当たりの受容体約２００，０００個の感度である。好ましい実施形態では、測定または量が、少なくとも細胞１個当たりの受容体約２５，０００個〜細胞１個当たりの受容体約２００，０００個の感度である。好ましい実施形態では、アイソタイプの対照抗体、および従来のＩＨＣ法との比較を用いて決定される測定が特異的である。
【０１０７】
２つの抗体近接アッセイを最適化した。Ｈｅｒ−３の細胞質側末端に対するエピトープ特異性を示すＨｅｒ−３特異的モノクローナル抗体であるＡｂ−６（ＬａｂＶｉｓｉｏｎ社製）を、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）受容体（Ｐｒｏ  １１）にコンジュゲートし、近接プローブ（Ａｂ−６−Ｐｒｏ  １１）として用いた。所有のモノクローナル抗体であるＢ９Ａ１１は、ビオチンにコンジュゲートして（Ｂ９Ａ１１−ビオチン）、ストレプトアビジン−メチレンブルーと複合体化させて切断プローブ（「分子ばさみ」）として用いた。アッセイの方法を、実施例５に記載する。極めて高いレベル（２９３Ｈ３−クローン１と呼ばれる、安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ  ２９３細胞系のうちの１つにおける）から、中程度〜低レベル（それぞれ、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３）を経て、低いＨｅｒ−３〜検出不能のＨｅｒ−３（ＳＫＯＶ３細胞における）までの範囲にわたる多様なレベルのＨｅｒ−３を発現する数種の細胞系を、最適化試験で用いた。最適化過程には、ダイナミックレンジを最大化する最適抗体濃度の決定（実施例７および図６を参照されたい）、アッセイの正確度（ａｃｃｕｒａｃｙ）の決定（実施例８および図７を参照されたい）、アッセイの感度、再現性、および精度（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）の検定（それぞれ、実施例９／図８、実施例１０／図９、および実施例１１／図１０を参照されたい）、試料サイズが異なる場合におけるアッセイの直線性（実施例１２および図１１を参照されたい）、ならびにアイソタイプ対照を用いて非特異的結合について調べることによるアッセイの特異性（実施例１３および図１２を参照されたい）が含まれた。
【０１０８】
アイソタイプ対照は、結合の結果が、個々の抗体に起因するのではなく、特定の抗体アイソタイプに起因する可能性を除外するために実施することが典型的である。加えて、アイソタイプ対照において見られる任意のシグナル「ノイズ」を、全シグナルから差し引くことにより、潜在的により精密な結果をもたらし得ることを、当業者は理解する。アイソタイプ対照による実験を実施したところ、非特異的結合による寄与は、極めて低いことが観察された（図１２を参照されたい）。
【０１０９】
放出可能な分子タグを用いてＨｅｒ−３または複合体化したＨｅｒ−３を測定することにより、放出された分子タグをアッセイ混合物から分離することにより、バックグラウンドの大幅な低下による、感度の有意な増大が得られ、ならびに分離および検出により、受容体複合体の複数の成分を同じアッセイで同時に容易に測定し得るような、簡便な多重化能（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ  ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ）がもたらされることを含む、多くの利点がもたらされる。このようなタグを用いるアッセイは、各種の形態を取ることが可能であり、以下の参考文献：それらの各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１０５，３０８号；同第６，６２７，４００号；同第７，４０２，３９７号；同第７，４０２，３９８号；および同第７，４０２，３９９号、ならびに国際特許公開第ＷＯ２００４／０１１９００号において開示されている。電気泳動移動度、分子量、形状、溶解性、ｐＫａ、疎水性、電荷、電荷／質量比、または極性を含め、分離される分子間における、１つ以上の、物理的、化学的、または光学的差違に基づき分子を識別し得る、多種多様な分離法を用いることができる。一実施形態では、複数の分子タグまたは分子タグのセットが、電気泳動移動度および光学的検出特性において異なり、電気泳動により分離される。別の実施形態では、複数の分子タグまたは分子タグのセットが、分子量、形状、溶解性、ｐＫａ、疎水性、電荷、極性において異なり得、正相もしくは逆相のＨＰＬＣ、イオン交換ＨＰＬＣ、キャピラリー電気クロマトグラフィー、質量分析、または気相クロマトグラフィーより分離される。
【０１１０】
結合化合物から放出された後で、分離法により異なるバンドまたはピークへと分離され得る、分子タグのセットが供給される。このようなピークを同定および定量化することにより、Ｈｅｒ−３の存在および／または量の尺度またはプロファイルがもたらされる。セット内における分子タグは、化学的に多様であり得る；しかし、簡便のため、分子タグのセットは、通常、化学的に類縁である。例えば、それらがすべてペプチドの場合もあり、それらが同じ基本的構成要素（ｂａｓｉｃ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）または単量体の異なる組合せからなる場合もあり、または、それらを、異なる置換基を有して異なる分離特性を付与する、同じ基本的足場（ｂａｓｉｃ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）を用いて合成する場合もある。複数の分子タグの数は、用いられる分離方式、検出用分子タグにおいて用いられる標識、結合部分の感度、および切断可能な結合が切断される効率を含め、複数の因子に応じて変化し得る。
【０１１１】
組織試料に対して直接なされた測定は、試料における全細胞数、および／または試料における特定の細胞亜型の数を表す細胞標的または組織標的についての測定を組み入れることにより、正規化することができる（例えば、任意の図面を含め、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第ＵＳ２００９／０１９１５５９号を参照されたい）。実質的な割合で正常細胞を含み得る患者試料、特に、腫瘍試料においては、細胞および組織が不均質性であるため、さらなる測定が好ましい場合もあり、さらに必要な場合もある。
【０１１２】
一実施形態では、結合化合物を、以下の式：
Ｂ−（Ｌ−Ｅ）ｋ
［式中、Ｂは、結合部分であり；Ｌは、切断可能な結合であり；Ｅは、分子タグである］により表すことができる。ホモジニアスアッセイでは、切断可能な結合Ｌが、易酸化結合であり得、より好ましくは、それが一重項酸素により切断され得る結合である。部分「−（Ｌ−Ｅ）ｋ」は、単一の結合化合物が、切断可能な結合を介して複数の分子タグを結合させ得ることを示す。一態様では、ｋが１以上の整数であるが、他の実施形態では、ｋが数百を超える、例えば、１００〜５００の場合もあり、または、ｋが数百を超えて最大数千もの数である、例えば、５００〜５０００である。通常、複数の異なる種類の結合化合物の各々は、異なる分子タグＥを有する。切断可能な結合、例えば、易酸化結合と、分子タグＥとは、通常の化学反応によりＢに結合している。
【０１１３】
Ｂは、Ｈｅｒ−３などの標的に特異的に結合する抗体であることが好ましい。Ｈｅｒ−３エピトープに特異的な抗体は、本明細書に記載の実施例で示される。抗体組成物は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である多種多様な市販の抗体から容易に形成することもでき、本明細書で開示される方法により容易に形成することもできる。
【０１１４】
切断可能な結合Ｌは、放出される分子タグＥの構造を分解しないし、その検出特性に影響を与えることのない条件下で切断され得る、実質的に任意の化学結合基であってもよい。ホモジニアスアッセイフォーマットで切断プローブを用いる場合は常に、切断可能な結合Ｌが、近接プローブの有効近接距離内にある切断可能な結合だけを切断するように、作用距離が短い切断プローブにより作製される切断剤により切断される。拡散して、切断可能な結合へと至り、切断に影響を及ぼす短命の活性種が、このような薬剤によりもたらされるように、反応混合物に物理的または化学的な変化をもたらすことにより、その薬剤を活性化しなければならないことが典型的である。
【０１１５】
非ホモジニアスフォーマットでは、特異的に結合した結合化合物が、結合しなかった結合化合物から分離されるため、切断可能な結合および切断剤のより広い選択を用いることが可能である。切断可能な結合には、過酸化水素、一重項酸素など、局所的に作用する反応種との反応を受けやすい結合だけでなく、塩基に不安定な結合、光により切断可能な結合、還元により切断可能な結合、酸化により切断される結合、酸に不安定な結合、および特定のプロテアーゼにより切断可能なペプチド結合など、反応混合物全体に作用する薬剤に対して不安定な結合も含まれる。多くのこのような結合について記載する参考文献には、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ、１９９１年、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、１９９６年、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ならびに米国特許第５，５６５，３２４号が含まれる。
【０１１６】
ガスクロマトグラフィーまたは質量分析により複数の分子タグを分離する場合、本発明における分子タグＥは、以下の参考文献（例えば、それらの各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｚｈａｎｇら、２００２年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １３巻：１００２〜１０１２頁；  Ｇｉｅｓｅ、１９８３年、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２巻：１６５〜１６８頁；ならびに米国特許第４，６５０，７５０号；同第５，３６０，８１９号；同第５，５１６，９３１号；および同第５，６０２，２７３号を参照されたい）において記載される電気泳動タグを含み得る。
【０１１７】
分子タグＥは、活性種、とりわけ、一重項酸素に対して安定であり、検出基またはレポーター基を包含する、水溶性の有機化合物であることが好ましい。その他の点において、Ｅは、サイズおよび構造が多種多様に変化し得る。一実施形態では、Ｅの分子量が、約５０〜約２５００ドルトン、より好ましくは、約５０〜約１５００ドルトンの範囲にある。Ｅは、電気化学シグナル、蛍光シグナル、または発色シグナルを発生させる検出基を含み得る。質量による検出を用いる実施形態では、Ｅが、検出の目的で別個の部分を有し得ない。検出基は、蛍光シグナルを発生させることが好ましい。
【０１１８】
複数の分子タグは、各々が、同じ複数タグの他のメンバーに対して、固有の分離特性および／または固有の光学特性を有するように選択される。一実施形態では、クロマトグラフィーまたは電気泳動における分離特性が、当技術分野における従来の標準的な一連の分離条件（例えば、電圧、カラム圧、カラム種類、移動相、または電気泳動の分離媒体）下における保持時間である。別の実施形態では、光学特性が、所与の波長または波長バンドにおける発光スペクトル、蛍光寿命、または蛍光強度など蛍光特性である。蛍光特性は、蛍光強度であることが好ましい。複数の分子タグのうちの１または２以上の分子タグは、同一の移動時間または保持時間を有し得るが、分子の分離および蛍光の測定を組み合わせることにより、該複数の分子タグのうちのすべてのメンバーが識別可能であるように、それらは、固有の蛍光特性、例えば、スペクトル分解可能な発光スペクトルを有す。
【０１１９】
放出された分子タグは、電気泳動による分離、および検出基による蛍光発光によって検出することが好ましい。このような実施形態では、分離条件下で、電気泳動図において異なるピークが形成されるように、実質的に同一の蛍光特性を示す分子タグが、異なる電気泳動移動度を有す。本発明による複数の分子タグは、従来のふるい分けマトリックス（ｓｉｅｖｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）が存在する場合も、これが不在の場合も、従来のキャピラリー電気泳動装置により分離することが好ましい。電気泳動による分離中において、またはその後において、蛍光シグナルおよび分離される化合物の移動時間（または移動距離）を記録することにより、または相対蛍光発光および分子タグの移動順序についてのチャート（例えば、電気泳動図としての）を構築することにより、分子タグを検出または同定する。分子タグの存在、不在、および／または量は、１つ以上の標準品を用いることにより測定することが好ましい。
【０１２０】
切断誘導部分または切断剤とは、好ましくは酸化により、切断可能な結合を切断することが可能な活性種を生成させる基である。活性種とは、その切断誘導効果が、その発生部位の近接距離内だけにおいて存在するように、短寿命の活性を示す化学種である。活性種が創出される近接距離を越えて顕著なバックグラウンドを創出しないように、活性種を固有の形で短命とするか、またはその発生部位からの短距離を越えて、切断可能な結合と反応することが可能でないように、活性種を効果的に除去するスカベンジャーを用いる。例示的な活性種には、一重項酸素、過酸化水素、ＮＡＤＨおよびヒドロキシルラジカル、フェノキシラジカル、スーパーオキサイドなどが含まれる。酸化を引き起こす活性種に対する例示的な抑制剤には、ポリエン類、カロテノイド類、ビタミンＥ、ビタミンＣ、チロシン、ヒスチジン、およびグルタチオンのアミノ酸−ピロールＮ−コンジュゲートが含まれる。例えば、Ｂｅｕｔｎｅｒら、２０００年、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ３１９巻：２２６〜２４１頁を参照されたい。
【０１２１】
切断誘導部分および切断可能な結合を用いるアッセイをデザインする際の１つの考慮点は、受容体複合体と結合したとき、切断誘導部分により生成される活性種が切断可能な結合を効果的に切断することが不可能となる程度に遠く、切断誘導部分および切断可能な結合が、互いから引き離されないようにすることである。一実施形態では、切断可能な結合が、結合した切断誘導部分の約１０００ｎｍ以内にあることが好ましく、約２０〜２００ｎｍ以内にあることが好ましい。一重項酸素を発生させる、光増感剤の切断誘導部分の場合は、切断可能な結合が、受容体複合体内において光増感剤の約２０〜１００ｎｍ以内にあることがより好ましい。当業者は、特定の増感剤の有効近接距離が、特定のアッセイデザインの詳細に依存する場合があり、日常的な実験により決定または改変され得ることを認識する。
【０１２２】
増感剤とは、反応中間体、または、通常一重項酸素である種を発生させるように誘導され得る化合物である。本発明により用いられる増感剤は、光増感剤であることが好ましい。本発明の範囲内に包含される他の増感剤は、熱、光、イオン化放射、または化学的活性化により励起されると、一重項酸素分子を放出する化合物である。このクラスの化合物のうちで最も周知のメンバーには、１，４−ビスカルボキシエチル−１，４−ナフタレンエンドペルオキシド、９，１０−ジフェニルアントラセン−９，１０−エンドペルオキシド、および５，６，１１，１２−テトラフェニルナフタレン−５，１２−エンドペルオキシドなどのエンドペルオキシド類が含まれる。これらの化合物を加熱するか、またはこれらの化合物が直接的に光を吸収すると、一重項酸素が放出される。さらなる増感剤については、Ｄｉ  Ｍａｓｃｉｏら、１９９４年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３５５巻：２８７頁；およびＫａｎｏｆｓｋｙ、１９８３年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５８巻：５９９１〜５９９３頁；  Ｐｉｅｒｌｏｔら、２０００年、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ３１９巻：３〜２０頁により開示されている。
【０１２３】
光増感剤は、共有結合または非共有結合により、直接的または間接的に抗体と結合し得る。このような組成物を構築するための指針は、例えば、光線力学療法、免疫診断学などの分野の文献において得られる。例示的な指針は、Ｕｌｌｍａｎら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１巻、５４２６〜５４３０頁；  Ｓｔｒｏｎｇら、１９９４年、Ａｎｎ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ７４５巻：２９７〜３２０頁；  Ｙａｒｍｕｓｈら、１９９３年、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．  １０巻：１９７〜２５２頁；ならびに米国特許第５，７０９，９９４号；同第５，３４０，７１６号；同第６，２５１，５８１号；および同第５，５１６，６３６号において見出すことができる。
【０１２４】
光増感剤を光活性化して一重項酸素を発生させるには、多種多様な光源が利用できる。光源が、実用的な時間内で十分な一重項酸素を生成させるのに十分な強度を示す限りにおいて、多色光源および単色光源の両方を用いることができる。照射の距離は、光増感剤の性質、切断可能な結合の性質、照射光源の出力、および試料からの照射光源の距離に依存する。一般に、照射時間は、約１秒間未満〜最長約３時間であり、通常、１５分間〜２時間の範囲内である。例示的な光源には、例えば、ヘリウム−ネオンレーザー、アルゴンレーザー、ＹＡＧレーザー、Ｈｅ／Ｃｄレーザー、およびルビーレーザー；光ダイオード；水銀灯、ナトリウム灯、およびキセノン灯；ならびに、例えば、タングステン灯およびタングステン／ハロゲン灯および閃光灯などの白熱灯が含まれる。本発明の方法において用いるのに適する例示的な光活性化デバイスは、任意の図面を含め、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ０３／０５１６６９号において開示されている。このような実施形態では、光活性化デバイスが、９６ウェルプレートのすべてのウェルを同時に照射することが可能な、ハウジング内に搭載された発光ダイオード（ＬＥＤ）のアレイである。
【０１２５】
本発明において用い得る光増感剤の例は、上記の特性を有する増感剤、ならびに、任意の図面を含め、それらのすべてが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５３６，８３４号；同第５，７６３，６０２号；同第５，５６５，５５２号；同第５，７０９，９９４号；同第５，３４０，７１６号；同第５，５１６，６３６号；同第６，２５１，５８１号；および同第６，００１，６７３号；欧州特許出願公開第０４８４０２７号；  Ｍａｒｔｉｎら、１９９０年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８６巻：６３５〜６４５頁；およびＹａｒｍｕｓｈら、１９９３年、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．  １０巻：１９７〜２５２頁により開示される増感剤である。増感剤の場合と同様、特定の実施形態では、固相支持体の表面へと共有結合または非共有結合により結合させるか、または固相支持体の本体へと組み込むことにより、光増感剤を、固相支持体と会合させることができる。一般に、光増感剤は、必要量の一重項酸素を達成するのに必要な量で、支持体と会合させる。一般に、光増感剤の量は、日常的な方法により、経験的に決定される。
【０１２６】
次いで、切断後、試料を解析して、放出された分子タグを識別することができる。複数の結合化合物を用いるアッセイを用いる場合は、一般に、分子タグの分離が、それらの検出に先行する。分離および検出のいずれの方法も、アッセイのために分子タグをデザインする過程で決定される。好ましい分離方式では電気泳動が用いられ、そこでは、各種のタグが、それらの電気泳動移動度における公知の差違に基づき分離される。
【０１２７】
第二の態様では、本発明が、癌を有する被験体に、標的化療法による治療が奏効する可能性があるかどうかを決定し、疾患の時間経過を予測し、かつ／または該被験体の癌の時間経過において重要事象が生じる確率を予測する方法であって、該被験体の癌に由来する生物学的試料においてＨｅｒ−３の量を測定するステップを含み、Ｈｅｒ−３レベルに依存する方法を対象とする。
【０１２８】
特定の実施形態では、Ｈｅｒ−３レベルが高ければ、標的化療法が患者に奏効する可能性が低いかまたはその可能性がない。特定の実施形態では、Ｈｅｒ−３レベルが低ければ、標的化療法が該患者に奏効する可能性がある。本明細書により詳細に記載される通り、特定の実施形態では、該療法が、Ｈｅｒ作用剤である。さらなる実施形態では、該療法が、Ｈｅｒ−２作用剤またはＨｅｒ−３標的化剤のうちの少なくとも１つである。
【０１２９】
特定の実施形態では、乳癌が、早期乳癌（すなわち、アジュバント療法）または転移性乳癌である。特定の実施形態では、乳癌におけるＨｅｒ−２の発現レベルが高い。特定の実施形態では、高いＨｅｒ−２発現が、ｌｏｇ１０Ｈ２Ｔ≧約１．１４〜１．２５である。特定の実施形態では、高いＨｅｒ−２発現が、極めて高い発現、および／または中程度に高い発現を含む。特定の実施形態では、極めて高いＨｅｒ−２発現が、ｌｏｇ１０Ｈ２Ｔ≧約１．８４〜２．２１である。または、患者コホートに応じて、他の範囲も用いることができる。
【０１３０】
好ましい実施形態では、患者の疾患の経過における重要事象間の期間を決定することにより、時間経過を測定し、測定により、患者の増悪までの期間が長いかどうかが予測される。好ましい実施形態では、重要事象が、初回の診断から死亡までの増悪である。好ましい実施形態では、重要事象が、初回の診断から転移性疾患までの増悪である。好ましい実施形態では、重要事象が、初回の診断から再発までの増悪である。好ましい実施形態では、重要事象が、手術から死亡までの増悪である。好ましい実施形態では、重要事象が、手術から再発までの増悪である。好ましい実施形態では、重要事象が、手術から転移までの増悪である。好ましい実施形態では、重要事象が、転移性疾患から死亡までの増悪である。好ましい実施形態では、重要事象が、転移性疾患から再発までの増悪である。好ましい実施形態では、重要事象が、再発から死亡までの増悪である。好ましい実施形態では、全生存率、無増悪期間との関連で、かつ／またはＲＥＣＩＳＴ基準もしくは他の効果判定基準を用いて、時間経過を測定する。
【０１３１】
Ｈｅｒ−３  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイを用いて、国際血清Ｈｅｒ−３／ｎｅｕ研究グループ試験の患者コホートにおけるＨｅｒ−３レベルを検討した。これらの患者（ｎ＝１０５）は、単一の病理学者により、中心の場所（ｃｅｎｔｒａｌ  ｌｏｃａｔｉｏｎ）において実施された、Ｈｅｒ−２陽性についてのＩＨＣにより主に選択され、これらすべてにトラスツズマブを施した。Ｈｅｒ−２過剰発現腫瘍（＞１０％腫瘍細胞がＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔによりＩＨＣ  ３＋と判定された）および／またはＥｒｂＢ２が増大した（ＩＣＨ  ２＋症例のすべてについて、必須のＦＩＳＨ試験で陽性を示す）転移性乳癌を有する患者だけを、本試験に組み入れた（さらなる詳細については、実施例１４を参照されたい）。これらの患者試料に対してＨｅｒ−３  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイを実施したところ、アッセイを実施した１０５例の試料のうち、８５例が、検出限界を上回る、測定可能なＨｅｒ−３レベルを有した（８例は検出可能な腫瘍を有さず、１例の試料はフルオレセインの不成功（ｆａｉｌｕｒｅ）を示し、８例の試料は検出限界を下回り、そのアッセイにおいて低レベル／陰性と考えられた）。結果を、図１３に示す。
【０１３２】
Ｈｅｒ−３レベル、および、特に、Ｈｅｒ−２陽性腫瘍におけるＨｅｒ−３レベルは、疾患増悪の時間経過および全生存期間の他、治療への反応、ならびに、特に、ＥＧＦＲファミリー標的化治療剤からの逸脱に関して予後診断価値を有することに関係している。Ｓｅｒｇｉｎａら（２００７年）、Ｎａｔｕｒｅ  ４４５巻：４３７〜４４１頁；  Ｏｓｉｐｏら（２００７年）、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．  ３０巻：５０９〜５２０頁；  Ｄｅ  Ａｌａｖａら（２００７年）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌ．  ２５巻：２６５６〜２６６３頁；  ＭａおよびＢｏｓｅ（２００８年）、「ＨＥＲ１  ａｎｄ  ＨＥＲ２  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ」、電子改訂版、２巻；  Ｔｏｖｅｙら（２００６年）、Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ２１０巻：３５８〜３６２頁；  ＭｅｎｅｎｄｅｚおよびＬｕｐｕ（２００７年）、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ９巻：１１１頁；  Ｆｕｃｈｓら（２００６年）、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２６巻：４３９７〜４４０２頁；  Ｌｅｅ−Ｈｏｅｆｌｉｃｈら（２００８年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６８巻：５８７８〜５８８６頁を参照されたい。
【０１３３】
ＥＧＦＲファミリーメンバーを標的とする治療剤（例えば、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ラピチニブ（ｌａｐｉｔｉｎｉｂ）、セツキシマブ、ゲフィチニブ、およびエルロチニブ）、ならびに化学療法剤により治療される患者の腫瘍を含め、多くの癌において、Ｈｅｒ−３発現が調査されている。Ｈｅｒファミリーメンバーのレベルを、臨床転帰と比較すると、データにより、とりわけ、Ｈｅｒ−３発現ならびに／またはＨｅｒ−２およびＨｅｒ−３の相対量が、卵巣癌（Ａｍｉｅｒら（２００８年）、Ｊ  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２６巻：要約、５５５２頁；  Ａｍｉｅｒら（２００８年）、集会：２００８  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍａｒｋｅｒｓ、、要約、２５頁；およびＸｕら（１９９９年）、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５巻：３６５２〜３６６０頁を参照されたい）および非小細胞肺癌（Ｃａｐｐｕｚｚｏら（２００５年）、Ｂｒｉｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ９３巻：１３３４〜１３４０頁）における予後診断的および予測的な診断のバイオマーカーとして有用であり得ることが示唆される。好ましい実施形態では、方法が、Ｈｅｒ−２陽性患者の試料群を、高量のＨｅｒ−３を有すサブグループと、低量のＨｅｒ−３を有す少なくとも１つの他のサブグループを含む、少なくとも２つのサブグループへと分割することにより、Ｈｅｒ−３レベルが高いかまたは低いかを決定するステップをさらに含み、ここで、Ｈｅｒ−３が低レベルであれば、Ｈｅｒ−２標的化療法が患者に奏効する可能性があり、疾患の時間経過が長くなる可能性があり、患者が重要事象を示す可能性がない。好ましい実施形態では、被験体の癌が、乳癌、結腸直腸癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、喉頭癌、膵臓癌、食道癌、神経膠腫、胆管癌（ｂｉｌｅ  ｄｕｃｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胆道癌、胆管癌（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胃癌、子宮内膜癌、胆嚢癌、扁平上皮癌、または基底細胞癌である。好ましい実施形態では、被験体の癌が、乳癌、黒色腫、結腸直腸癌、または卵巣癌である。好ましい実施形態では、被験体の癌が、Ｈｅｒ−２陽性乳癌である。好ましい実施形態では、被験体の乳癌が、早期乳癌（すなわち、アジュバント療法）または転移性乳癌である。
【０１３４】
好ましい実施形態では、標的化療法が、少なくとも１つのＨｅｒファミリー標的化剤である。好ましい実施形態では、Ｈｅｒファミリー標的化剤が、多重標的化剤または単一標的化剤である。好ましい実施形態では、多重標的化剤が、二重キナーゼ阻害剤または二重特異性抗体である。好ましい実施形態では、Ｈｅｒファミリー標的化剤が、トラスツズマブ、ラパチニブ、またはペルツズマブである。好ましい実施形態では、少なくとも１つのＨｅｒファミリー標的化剤が、少なくとも２つの薬剤であり、該少なくとも２つの薬剤が、１もしくは複数のＨｅｒ−２標的化モノクローナル抗体、ならびに／またはＥＧＦＲ標的化モノクローナル抗体、ならびに／またはＥＧＦＲおよびＨｅｒ−２に対する二重キナーゼ阻害剤である。好ましい実施形態では、モノクローナル抗体が、トラスツズマブである。好ましい実施形態では、ＥＧＦＲ標的化モノクローナル抗体が、セツキシマブまたはパニツムマブである。好ましい実施形態では、ＥＧＦＲ標的化モノクローナル抗体が、ザルツムマブ、ニモツズマブ、およびマツズマブである。好ましい実施形態では、二重キナーゼ阻害剤が、ラパチニブ、エルロチニブ、またはゲフィチニブである。好ましい実施形態では、標的化療法が、Ｈｅｒ−３作用剤またはＨｅｒ−３シグナル伝達経路作用剤である。好ましい実施形態では、Ｈｅｒ−３標的化剤またはＨｅｒ−３シグナル伝達経路標的化剤が、Ｈｅｒ−３モノクローナル抗体、Ｈｅｒ−３二量体化阻害剤、Ｈｅｒ−３リン酸化阻害剤、ならびに／または、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、ＥＲＫ１／２、もしくはＰＹＫ２からなる群から選択されるＨｅｒ−３シグナル伝達経路のメンバーに対する阻害剤である。好ましい実施形態では、奏効する可能性、長い時間経過を有する可能性、および／または重要事象が生じる可能性を、全生存率として、無増悪期間として、無病生存期間として、無増悪生存期間として、かつ／またはＲＥＣＩＳＴ基準を用いる腫瘍縮小効果として測定する。シグナル伝達とは、細胞により、１つの種類のシグナルが別の種類のシグナルへと転換される任意の過程を指す。典型的には、これには、細胞表面におけるある種類のシグナル（例えば、細胞表面受容体に対するリガンドの結合）が関与し、それに続いて酵素により進められる、細胞内部における生化学反応のカスケードが関与し、この結果、シグナル伝達経路（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙまたはｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ）がもたらされることにより、多くの細胞機能が達成される。チロシンキナーゼ受容体のＥＧＦＲファミリーの場合、該ファミリー内の４つの受容体の各々が、二量体化ドメインおよびリガンド結合ドメインの両方を含む細胞外ドメインの他、チロシンキナーゼ活性を有する膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを有する（Ｂｕｒｇｅｓｓら（２００３年）、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．１２巻：５４１〜５４２頁を参照されたい）。Ｈｅｒ−３の場合、キナーゼドメインは機能性でないが、他のファミリーメンバーとの二量体化を介して、Ｈｅｒ−３が、重要なシグナル伝達経路作用を発揮することができる。細胞の形質転換を開始するには、複数のＥｒｂＢ受容体およびリガンドの協同作用が必���であることを、証拠は示唆している。活性化されると、この受容体ファミリーは、シグナル伝達経路の複雑なネットワークを維持する。各種の癌では、ＥＧＦＲファミリーのすべてのメンバーが、発現および／または変化することが判明しており、これらは、増殖、アポトーシス、および転移を含めた腫瘍の発達において、重要な役割を果たし得る（Ｂｕｒｇｅｓｓ（２００８年）、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ２６巻：２６３〜２７４頁；およびＮｏｒｍａｎｎｏら（２００６年）、Ｇｅｎｅ  ３６６巻：２〜１６頁を参照されたい）。ＥＧＦＲファミリーメンバー（Ｂｉａｎｃｏら（２００７年）、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３９巻：１４１６〜１４３１頁を参照されたい）、特に、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ−２の標的化に対する強い関心は、数種の標的化療法の承認を結果としてもたらしている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ両方の試験モデルにおける有望な前臨床データに基づくと、臨床試験における結果は、ある意味で失望をもたらすものであり、この結果、Ｈｅｒ−３など他のファミリーメンバー、ならびに下流におけるシグナル伝達経路のメンバーに対する関心が増大している。
【０１３５】
Ｈｅｒ−３のシグナル伝達は癌と関連しており、特に、Ｈｅｒ−２／Ｈｅｒ−３二量体の形成は、Ｈｅｒ−２を過剰発現する腫瘍の浸潤の増大にとって重要であり得、二量体形成、ならびにＨｅｒ−３により活性化される下流経路を阻害する標的化治療剤に対する関心を惹き起こしている。Ｈｅｒ−３が、ホスホイノシチド３'−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）に対する６つの結合部位を有し、ＰＩ３Ｋが、タンパク質キナーゼＢ（また、ＡＫＴとも呼ばれる）を活性化するため、Ｈｅｒ−３は、特に、シグナル伝達にたけている。「ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ」シグナル伝達経路は、極めて広範にわたる細胞活性（とりわけ、細胞の増殖および生存）に必要とされることが示されており、Ｈｅｒ−３ならびに下流のシグナル伝達経路のメンバーの両方を標的とし、新規の標的化治療剤を創出するか、または現行のＥＧＦＲファミリー標的化治療剤の治療的価値を強化することに対する関心を呼び起こしている。（総説については、Ｓｔｅｒｎ（２００８年）、Ｊ  Ｍａｍｍａｒｙ  Ｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  １３巻：２１５〜２２３頁；  ＳｉｔｈａｎａｎｄａｍおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ（２００８年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １５巻：４１３〜４４８頁；ならびにＡｒｋｉｎおよびＭｏａｓｓｅｒ（２００８年）、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．  Ｄｒｕｇｓ  ９巻：１２６４〜１２７６頁を参照されたい）。
【０１３６】
好ましい実施形態では、癌がＨｅｒ−２陽性であるかどうかを、ＩＨＣ、ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、定量的ｍＲＮＡ、ハイブリダイゼーションアレイ、またはＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）により判定する。好ましい実施形態では、Ｈｅｒ−３レベルの決定が、ＩＨＣ、ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、定量的ｍＲＮＡ、ハイブリダイゼーションアレイ、またはＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）を用いて実施される。好ましい実施形態では、その方法は、被験体の癌におけるＨｅｒ−３の量を、予め決定されたカットオフと比較することにより、Ｈｅｒ−３タンパク質の量が低いかどうかを決定するステップをさらに含む。好ましい実施形態では、その方法は、Ｈｅｒ−２陽性患者の試料群を、高量のＨｅｒ−３を有するサブグループと、低量のＨｅｒ−３を有する少なくとも１つの他のサブグループを含む、少なくとも２つのサブグループへと分割することにより、Ｈｅｒ−３レベルを決定するステップをさらに含み、ここで、Ｈｅｒ−３が高レベルであれば、Ｈｅｒ−２標的化療法が患者に奏効する可能性がなく、疾患の時間経過が短い可能性があり、および／または患者が重要事象を示す可能性がある。
【０１３７】
好ましい実施形態では、この方法はさらに、本発明の方法による治療が奏功する可能性がないＨｅｒ−２陽性癌に被験体が罹患していることを判定し、次いで、該被験体に、有効量の、異なる治療剤を投与する治療の選択肢について、医療担当者に助言するステップを含む。
【０１３８】
第三の態様では、本発明が、Ｈｅｒ−３に結合する精製抗体を対象とする。好ましい実施形態では、抗体が、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。好ましい実施形態では、抗体が、モノクローナル抗体である。好ましい実施形態では、抗体が、実施例２に記載され、図２Ａに示される、配列番号１〜８を有するペプチドのうちの１つに対して産生させた抗体である。好ましい実施形態では、抗体が、（ａ）それぞれ、配列番号１３、１４、および１５に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）それぞれ、配列番号１６、１７、および１８に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；ならびに／または（ａ）それぞれ、配列番号１９、２０、および２１に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）それぞれ、配列番号２２、２３、および２４に示される配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体である（表１Ｂ）。好ましい実施形態では、抗体が、軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ、表１Ａに示される配列番号９および１１を有する抗体、ならびに／または軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、それぞれ、表１Ａに示される配列番号１０および１２を有する抗体である。
【０１３９】
好ましい実施形態では、本発明が、抗体をコードするＤＮＡを対象とする。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、クローニング技術分野の当業者には一般に公知の技法を用いて単離および配列決定される。単離したら、該ＤＮＡを発現ベクターにライゲーションし、適切な宿主細胞内へとトランスフェクトし、培養細胞から組換え抗体を得ることができる（Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ（１９９２年）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖ．  １３０巻：１５１〜１８８頁を参照されたい）。
【０１４０】
当業者は、抗体のアミノ酸配列を改変することができ、治療、解析、または診断に用いられる抗体の特性を増強するには、改変が望ましい場合があることを理解する。さらに、抗体の結合特性を大きく減じることなしに、挿入、欠失、または置換により、これらの抗体の１つ以上のアミノ酸を変化させ得ることが理解される。例示的なアミノ酸変化は、類似の分子特徴を示すアミノ酸を用いる置換（すなわち、保存的置換、例えば、以下の、芳香族アミノ酸、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、またはアミドもしくは硫黄を有するアミノ酸のサブグループ内に由来するアミノ酸の変化）である。分子の完全性または結合特性を大きく変化させずに、他の非保存的置換または挿入も行い得る。さらに、一部のアミノ酸変化またはアミノ酸変化の集合により、より良好な結合親和性、より大きな安定性（例えば、プロテアーゼに対する耐性）、選択性、および／または作製の容易さが含まれるがこれらに限定されない抗体の特性が増強される。アミノ酸配列を変化させ、かつ／または特性がより良好な分子を選択する方法は、当業者に公知である。完全抗体の場合、改変後の配列同一性の程度は、少なくとも５０％であることが好ましく、少なくとも７５％であることがより好ましく、少なくとも９０〜９５％であることが最も好ましい。これらの抗体の各々が、意図される発明の範囲内にあることを意図する。
【０１４１】
好ましい実施形態では、Ｈｅｒ−３を標的とする抗体を用いて、さらなるＨｅｒ−３標的化分子を開発することができる。本明細書に記載される抗体の改変は、エフェクター機能の増大、免疫原性の低下、安定性の増大、血清半減期など、薬理学的特性の改善、ならびに作製の容易さおよび収量に対する支援が含まれるがこれらに限定されない品質を改善するのに望ましい場合がある。これらの標的分子の各々が、意図される発明の範囲内にあることを意図する。
【０１４２】
好ましい実施形態では、ヒトフレームワーク内に、本明細書に記載される、抗体の抗原結合領域（表１Ａを参照されたい）を含む、ヒト化抗体を治療的適用のために用いることができる。ヒト化抗体についての数種の方法が報告されている（Ｊｏｎｅｓら（１９８６年）、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１巻：５２２〜５２５頁；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８年）、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２巻：３２３〜３２７頁；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９巻：１５３４〜１５３６頁を参照されたい）。ヒト軽鎖可変ドメイン配列およびヒト重鎖可変ドメイン配列の全レパートリーに対して、可変ドメインの非ヒト配列をコンピュータによりスクリーニングして、げっ歯動物配列に最も近いヒト可変フレームワーク配列を見出すことが典型的である（Ｓｉｍｓら（１９９３年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５１巻：２２９６〜２３０８頁；  Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １８６巻：９０１〜９１７頁を参照されたい）。代替的に、コンセンサスフレームワークも用いることができる（Ｃａｒｔｅｒら（１９９２年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９巻：４２８５〜４２８９頁；およびＰｒｅｓｔａら（１９９３年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５１巻：２６２３〜２６３２頁を参照されたい）。好ましい実施形態では、コンピュータ支援によるデザインを用いて、安定性を付与し、結合特性を保持または改善する配列を選択する。これらの各々が、意図される発明の範囲内にあることを意図する。
【０１４３】
別の実施形態では、抗体のＣＤＲを用いて、Ｈｅｒ−３の同じエピトープに結合するが、天然抗体ではないフレームワークに含有される標的化結合分子を創出することができる。例えば、フレームワークが、抗体の一部であり得る結合分子、例えば、ｓｃＦｖまたはＦ（ａｂ'）２を創出する方法が利用可能であることを、当業者は理解する（これらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ９３／１６１８５；およびＣａｒｔｅｒら（１９９２年）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０巻：１６３〜１６７頁のそれぞれを参照されたい）。当業者はまた、完全に非類縁のタンパク質（細菌性ベータラクタマーゼなど）が、結合化合物を形成するための結合ドメイン（複数可）を適正に提示し得ることも理解することができる。この意味で、本明細書で定義される類縁抗体が、本発明の範囲内にあることを意図する。
【０１４４】
抗体は、結合だけを介して治療的に作用する場合もあり、他の特性（例えば、酵素活性または毒素の弾頭）を介して治療的に作用する場合もある。一実施形態では、標的化タンパク質を改変して、抗原依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を介する治療効果またはより大きな治療効果を及ぼすことができる。別の実施形態では、抗体または標的化タンパク質に毒素をコンジュゲートすることもできる。例示的な低分子毒素には、メイタンシン、カリケアマイシン、およびＣＣ−１０６５が含まれるがこれらに限定されない（例えば、ＣａｒｔｅｒおよびＳｅｎｔｅｒ（２００８年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．  １４巻：１５４〜１６９頁を参照されたい）。加えて、抗体に放射性標識を連結して、標的化治療剤を創出することもできる。生物学的毒素もまた、標的化タンパク質に連結することができ、これらには、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属外毒素、アブリン、およびリシンが含まれるがこれらに限定されない（Ｋｒｅｉｔｍａｎ（２００６年）、ＡＡＰＳ  Ｊ．  １８巻：Ｅ５３２〜５５１頁を参照されたい）。
【０１４５】
さらなる実施形態では、標的化抗体（またはそれらの断片）を酵素に融合させて、抗体指向性酵素プロドラッグ療法に用いることができる（ＡＤＥＰＴ；Ｂａｇａｓｈａｗｅ（１９８７年）、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ５８巻：７００〜７０３頁；およびＳｅｎｔｅｒら（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５巻：４８４２〜４８４６頁を参照されたい）。別の実施形態では、抗体または標的化タンパク質を、血清半減期などの薬理学的特性を増強する、ポリエチレングリコールなどの分子に融合することができる（ＨａｒｒｉｓおよびＣｈｅｓｓ（２００３年）、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ２巻：２１４〜２２１頁を参照されたい）。
【実施例】
【０１４６】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することにより、よりよく理解され得る。
【０１４７】
（実施例１）
様々なレベルのＨＥＲ３タンパク質を発現している安定な細胞系の生成
全長ＨＥＲ３（ＮＭ＿００１９８２．２）に対する市販のｃＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を制限酵素Ｎｏｔ  ＩおよびＸｂａ  Ｉで消化し、得られた断片をｐｃＤＮＡ．３  １  Ｚｅｏｃｉｎ選択発現ベクターにサブクローニングした。得られたプラスミドを細菌に導入して形質転換し、スクリーニングして正しい挿入を検証した。陽性クローンを配列検証し、細菌で増殖させ、プラスミドをＱｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉ−ｐｒｅｐキットを使用して精製した。ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入し、５％ＣＯ２中、３７℃において、１０％ＦＢＳ、１×ペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｘは１０，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン−Ｇと１０，０００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンである）、およびＧｌｕｔａｍａｘ（ＧＩＢＣＯ）を補充したＤＭＥＭで維持した。トランスフェクトするより前の日に、細胞をおよそ２５〜３０％集密に分割し、ペニシリン−ストレプトマイシンを含まない培地で一晩インキュベートした。次いで細胞を、製造者の説明書に従ってＦｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）でトランスフェクトした。次の日に培地を新鮮な完全培地と交換し、細胞を完全培地で４８時間インキュベートした後、４００ｍｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。Ｚｅｏｃｉｎの濃度は、トランスフェクトされたプラスミドを含まない野生型２９３細胞に対して様々な濃度のＺｅｏｃｉｎを使用して死滅曲線を実行することによって決定した。クローニングリングを使用しておよそ１６個のＺｅｏｃｉｎ耐性クローンを単離し、液体窒素で凍結させた。元のクローンのサブセットを首尾よく増殖させることができ、
ＨＥＲ３特異的ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）を使用して、製造者の説明書に従って試験し、過剰発現しているＨＥＲ３を検証した（図１）。ＥＬＩＳＡによって実証された、ＨＥＲ３を高度に発現している１つのクローン（２９３−Ｈ３クローン１）を、最適化アッセイに使用するための対照として選択した。
【０１４８】
（実施例２）
ＨＥＲ３に対する抗体の生成およびスクリーニング
ＨＥＲ３の細胞質末端に対してエピトープ特異性を持つＨＥＲ３特異的なモノクローナル抗体（Ａｂ−６）をＬａｂＶｉｓｉｏｎから購入した。ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）レポーター（Ｐｒｏ１１）およびストレプトアビジンをコンジュゲートしたメチレンブルー（「分子はさみ」）を以前記載されたプロトコールに従って合成し、精製した（例えば、任意の図を含め、上記、および本明細書に参照により組み込まれている米国特許第７，１０５，３０８号を参照されたい）。抗体−ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）コンジュゲートおよび抗体−ビオチンコンジュゲート、すなわち、Ａｂ６−Ｐｒｏ１１およびＢ９Ａ１１−ビオチンを、ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を製造者のプロトコールに従ってリンカーとして使用して作製し、コンジュゲート産物をＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって精製した。一連の所有の抗体を以下の通り生成した。固定した２９３クローン１３細胞またはＨＥＲ３タンパク質のＣ末端領域に含有される種々のエピトープを提示している一連のペプチドでマウスを免疫した（図２Ａ）。免疫の期間中、各マウスに、４週間にわたって数回の免疫を受けさせた。ハイブリドーマを作出し、限界希釈物を用いてクローンを単離した。ＣｅｌｌＳｐｏｔ（商標）またはＥＬＩＳＡスクリーニングを含めた一連のアッセイによって個々のクローンからの馴化培地をプロファイリングし、その後目盛アップし、次いで免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）によってさらにスクリーニングし（図２Ｂ）、その後、最終的に化学物質遊離法（メチレンブルー）（図２Ｃ）または二重抗体光遊離法（図２Ｄ）のいずれかを用いたＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）技術によってスクリーニングした。これらの方法を使用してうまく機能したいくつかの抗体を、図２Ａに記載している。とりわけ１つの抗体、Ｂ９Ａ１１は最も強力であり、最大のダイナミックレンジと感受性を示し、実施例５において下記されているアッセイの最終フォーマットの開発へ進展させた。
【０１４９】
（実施例３）
ＦＡＣＳおよびＥＬＩＳＡによる、様々なレベルのＨＥＲ３を発現している細胞系パネルからのブロックおよびＦＦＰＥ切片の生成
ＨＥＲ３タンパク質の発現が様々である３つの細胞系、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＳＫＯＶ−３を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞系を、３７℃、５％ＣＯ２において、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ））、１０％ＦＢＳ、１×ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１×Ｇｌｕｔａｍａｘで維持した。ＳＫＯＶ３細胞を、３７℃、５％ＣＯ２において、１０％ＦＢＳ、１×ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（ＧＩＢＣＯ）を補充したマッコイ５ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５ａ  Ｍｅｄｉａ）で維持した。２９３−Ｈ３クローン１細胞を、３７℃、５％ＣＯ２において１０％ＦＢＳ、１×ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１×Ｇｌｕｔａｍａｘを補充したＤＭＥＭで維持した。各細胞系に対して少なくとも１０個の５００ｍｍの培養皿において、細胞をほぼ集密になるまで増殖させた。培地を取り除いた後、細胞を冷たい１×ＰＢＳで１回洗浄し、各皿に１×Ｐｅｎ−ｆｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１５ｍＬを加えた。細胞を掻き取り細胞溶液を４℃で一晩（＞１６時間）固定した。一晩固定した後、細胞を３２００×ｇで１５分間遠心分離した。細胞ペレットをゴム製のＯリングに移し、濾紙で包み、処理カセットに置いた。処理するために自動Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ処理装置を使用した。簡単に記載すると、細胞ペレットを、濃度を次第に上昇させたアルコール、Ｃｌｅａｒ−ｒｉｔｅ（キシレン代替品）、そしてパラフィンに曝露させた。処理後、パラフィン包埋ステーション（ｐａｒａｆｆｉｎ  ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ  ｓｔａｔｉｏｎ）を使用してペレットをブロックに包埋した。細胞ペレットを処理するために使用したすべての溶媒は、Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。以下の方法によってフローサイトメトリーを用いて、ＨＥＲ３受容体数について同じロットの細胞の割合を試験した。市販のＥＬＩＳＡキットを使用し、製造者の推奨に従うことにより（Ｈｕｍａｎ  ＥｒｂＢ３−ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＨＥＲ３受容体のレベルを定量化するために細胞の調製物から全細胞溶解物を調製した。ミクロトーム（ＬＥＩＣＡ）を用いて厚さ７μｍの切片を切り取り、正電荷を帯びたガラススライド（ＶＷＲ）に置いた。スライドを３０分間風乾し、次いで７０℃に設定した加熱したオーブンで１．５時間焼いた。すべての試料スライドを将来のアッセイのために４℃で貯蔵した。ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ＩＨＣおよびＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）比較の結果を図３に示す。
【０１５０】
（実施例４）
市販の乳癌ＦＦＰＥ切片からの切片の生成
ＦＦＰＥ乳癌ブロックをＡｓｔｅｒａｎｄから購入した。ミクロトーム（ＬＥＩＣＡ）を用いて厚さ５μｍの切片を切り取り、正電荷を帯びたガラススライド（ＶＷＲ）に置いた。切片を３０分間風乾し、次いでオーブンで、７０℃で１．５時間焼いた。すべての試料スライドを将来のアッセイのために４℃で貯蔵した。臨床材料から以前切片化された乳腺腫瘍もこれらの試験に使用した。ガラススライドでＨ＆Ｅ染色した腫瘍の例を図４に示す。
【０１５１】
（実施例５）
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）された細胞系および乳房組織における、Ｈｅｒ−３  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイ
ＦＦＰＥ試料を、一連の溶媒を使用して脱パラフィン／再水和させた。簡単に記載すると、スライドをキシレン（２×、５分）、１００％エタノール（２×、５分）、７０％エタノール（２×、５分）および脱イオン水（２×、５分）に順次浸漬した。再水和した試料の熱誘導性エピトープ回復（Ｈｅａｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）を、圧力釜（Ｂｉｏｃａｒｅ）を使用して、１×ＤＡＫＯ（ｐＨ９．０）（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ）２５０ｍＬを含有するスライドホルダーで行った。室温で３０分間冷却した後、スライドを脱イオン水で１回すすいだ。疎水性ペン（Ｚｙｍｅｄ）を使用してスライドに疎水性の円を描いて試薬をスライド上に保持した。次いで、１×ＰＢＳ中１％マウス血清、１．５％ＢＳＡおよびプロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤のカクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有するブロッキングバッファーで試料を１時間ブロッキングした。吸引してブロッキングバッファーを取り除いた後、ブロッキングバッファーで調製した、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）をコンジュゲートした抗体（Ａｂ−６：ＬａｂＶｉｓｉｏｎ、１μｇ／ｍＬ）およびビオチンをコンジュゲートした抗体（Ｂ９Ａ１１；Ｍｏｎｏｇｒａｍ  ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ、２μｇ／ｍＬ）の混合物を加え、結合反応物を加湿チャンバー内、４℃で振とうしながら一晩インキュベートした。抗体混合物を吸引し、試料を、１×ＰＢＳ中０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する洗浄バッファーで洗浄し、ストレプトアビジンをコンジュゲートしたメチレンブルーを１×ＰＢＳ中、２．５μｇ／ｍＬの濃度で加えた。室温で１時間インキュベートした後、過剰のストレプトアビジン−メチレンブルー試薬を吸引し、試料を洗浄バッファーで１回洗浄した後、脱イオン水を３回交換して洗浄した。０．０１×ＰＢＳ中、３ｐＭのフルオレセインおよび２種のＣＥ内部マーカー（ＭＦおよびＭＬ）を含有するイルミネーションバッファー（Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）を試料切片に加えた。電子冷却ブロック（Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えた自家ＬＥＤアレイイルミネーターを使用して、結合したＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）を約４℃で光活性化切断によって遊離させた。照射後、水酸化ホウ素ナトリウムを加えることによってＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）中間体を還元して、定量化可能な形態にする。遊離したＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）レポーターを含有するＣＥ試料を上記スライド上の組織切片上から回収し、ＣＥ試料における遊離したＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）レポーターを、３０℃で６ｋＶ、５０秒のＣＥ注入条件下、ＡＢＩ３１３０  ＣＥ機器（２２ｃｍのキャピラリーアレイ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分離し、検出した。臨床検査室における一般的なＨ３Ｔアッセイのワークフローを図５に示す。
【０１５２】
（実施例６）
ＣＥピークの分析、腫瘍面積の正規化およびバッチの正規化
ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）Ｉｎｆｏｒｍｅｒソフトウェアを使用してＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）の同定および定量化を行った（例えば、米国特許出願公開第２００７−０２０３４０８−Ａ１号を参照されたい）。未加工のＣＥ電気泳動図においてＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）シグナルを分析するために、２種のＣＥ内部マーカー、ＭＦ（最初のマーカー）およびＭＬ（最後のマーカー）を使用して、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）ピークを、それらの電気泳動移動度、または２種のマーカーに対する移動時間ｔ、すなわち［ｔ（ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標））−ｔ（ＭＦ）］／［ｔ（ＭＬ）−ｔ（ＭＦ）］に従って同定した。次いで、同定されたＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）ピークを、各ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）についてピーク面積を算出することによって定量化した。組織切片からのＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）回収におけるばらつき、およびキャピラリーアレイにわたるＣＥ注入効率および／または検出感度における処理のばらつきを補正するために、フルオレセイン（３ｐＭ）をイルミネーションバッファーに含め、各試料の処理における内部参照対照として一緒に電気泳動した。次いで、各ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）ピークの面積を、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）ピーク（ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）ピーク面積）を内部フルオレセインピーク（フルオレセインピーク面積／３ｐＭに対して面積正規化することによってＲＦＵまたはＲＰＡとして報告した。これは、可変腫瘍試料に対するＲＰＡ＊ＩＢ  容積／ＴＡ（＝相対ピーク面積×試料切片にローディングされたイルミネーションバッファーの容積（ＩＢ）÷腫瘍面積ｍｍ２（ＲＰＡ＊ＩＢ  容積／ＴＡ＝ｐモル／Ｌ＊Ｌ／ｍｍ２＝ｐモル／ｍｍ２）として定量化される。詳細には、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）レポーターのＣＥ蛍光シグナル強度、またはピーク面積（ＰＡＶｅｒａＴａｇ（登録商標））は、時間に対して積分した相対蛍光単位（シグナルの高さ）で得られる（ＲＦＵ−Ｓ／Ｓ）。相対ピーク面積（ＲＰＡＶｅｒａＴａｇ（登録商標））は、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）ピーク面積（ＰＡＶｅｒａＴａｇ（登録商標））を既知濃度の内部フルオレセイン標準（ＰＡＦ）に関して正規化することによって測定することができ、したがって、測定される検体の最初の濃度に比例する。ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイのシグナルは腫瘍含量に比例する定量的な読み出し情報であるので、臨床試料にわたってＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイシグナルを正確に比較するには、このパラメータにおける差異を調整する必要がある。したがって、試料のＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイシグナルデータ収集に対して腫瘍含量を測定し、その腫瘍含量を使用してＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイの結果を正規化する。腫瘍試料が非常に小さいまたは非常に大きい場合、反応体積（すなわち、抗体、ストレプトアビジンをコンジュゲートしたメチレンブルーおよびイルミネーションバッファー試薬の体積）を調整し、この調整を腫瘍含量の正規化に反映させることに注意するべきである。移動時間、フルオレセイン、イルミネーションバッファーおよび腫瘍面積についてＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）ピーク面積を調整した後、対照および試料を���それらの調整されたピーク面積にそれぞれの算出されたバッチ正規化係数（ＢＮＦ）を掛けることによって正規化する。調整されたＲＰＡ値のそれぞれに、それぞれのＢＮＦを掛けて正規化ＲＰＡ値を得る。この正規化ＲＰＡ値は定義上単位をもたないので、その値はＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）単位で示される。所与の試料についての報告できる（役に立ち、飽和していない）正規化された値すべてを平均してその試料についての最終的な値を決定する。
【０１５３】
種々の品質管理チェックを開発した。それによりデータが最高品質のものであることを確実にする。
【０１５４】
１．範囲外のフルオレセイン。フルオレセインが範囲外である試料追跡は役に立たない。フルオレセインの範囲は、調整されたフルオレセイン値＋／−ＸＸ％の中央値を使用することによって算出する。ＸＸ％の値、一般には２０〜４０％は調整可能であり、個々のテンプレートに関連する。試料のピークの絶対的な高さが、飽和ピークと称される７０００単位を超える場合、その試料ピークは役にたたない。
【０１５５】
２．ＲＰＡは０．０３以上でなければならない。
【０１５６】
３．無希釈の変換されたピーク試料が、ＲＰＡが＜０．０３であるために役に立たない場合、対応する変換されたピーク希釈試料すべても役に立たない。
【０１５７】
４．進行するために、少なくとも２つの変換されたピーク対照が、変換されたピークバッチ正規化についての値を必要としなければならない。
【０１５８】
５．追跡品質が不十分な試料または対照は役に立たない。
【０１５９】
６．イルミネーションバッファーのみの対照が混入を有するならば、追跡品質が影響を受ける可能性がある場合、例えば、混入ピークが遊離ピークとオーバーラップする場合は、試料は役に立たない可能性がある。
【０１６０】
７．バッチ正規化が不十分なバッチは役に立たない。
【０１６１】
８．バッチ正規化係数が異常に高いバッチは役に立たない。
【０１６２】
各試料について、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイの後にＨ＆Ｅ（ヘマトキシリンおよびエオシン）染色および評価を行って、腫瘍細胞の存在を確実にし、腫瘍面積の推定を可能にした。これらのスライドを脱パラフィンし、水和させ、染色し、その後、標準の手順を用いて脱水し、マウントした後、顕微鏡で検査する。
【０１６３】
（実施例７）
ダイナミックレンジを増大させるための抗体濃度の最適化
Ａｂ−６抗体およびＢ９Ａ１１抗体の最適濃度を、アッセイのダイナミックレンジ全体にわたる細胞系パネル（２９３Ｈ３−クローン１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＳＫＯＶ３）に対するＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）ＨＥＲ３トータルアッセイ（上記）における最終濃度を変化させることによって決定した。次いで、これらの結果を、同じ細胞系のＦＦＰＥブロック調製物からのＨＥＲ３のフローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡの結果に基づいて予想される倍率変化と比較した。２：１のＢ９Ａ１１対Ａｂ−６の比を丸で囲んだ図６に示した通り、同じ細胞系セットにおけるＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーと比較して予想される倍率変化と比較したＨＥＲ３の正確な検出に基づいて、最適濃度、２ｍｇ／ｍＬのＢ９Ａ１１−ビオチンおよび１ｍｇ／ｍＬのＡｂ−６  Ｐｒｏ−１１が、実行するために選択された。
【０１６４】
（実施例８）
ＨＥＲ３トータルＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイの正確度
４つのよく特徴付けられた細胞系（２９３Ｈ３−クローン１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＫＯＶ３）から首尾よく複製された３つの複製物を使用して、１バッチのＨＥＲ３トータルＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイを行い、次いでＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）測定の正確度を自家で生成したフローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡのデータと比較した。結果の１００％が、２９３Ｈ３−クローン１＞ＭＤＡ−ＭＢ−４５３＞ＭＤＡ−ＭＢ４６８＞ＳＫＯＶ３という点においてフローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡからの自家データと一致した。４つの細胞系試料のいずれについてもシグナルレベル間にオーバーラップは観察されなかった、すなわち、各細胞系が完全に分離された。ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーの両方によりＨＥＲ３の総レベルに対する内部データセットを生成した。４つの正確度の細胞系についての結果を図７に示す。ＨＥＲ３のフローサイトメトリーからの結果とＨＥＲ３のＥＬＩＳＡからの結果は、これらの交差検定技術を使用することによって同じ順位序列（ｓａｍｅ  ｒａｎｋ  ｏｒｄｅｒ）保存性が実証されたという点において、非常に類似していた。
【０１６５】
（実施例９）
ＨＥＲ３トータルＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイの感度
ＨＥＲ３トータルＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイの感度を、低いＨＥＲ３発現の対照細胞系であるＭＤＡ−ＭＢ−４６８の８つの複製物を含有する１バッチを、低／陰性ＨＥＲ３発現の対照細胞系であるＳＫＯＶ３の８つの複製物と比較することによって決定した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８の各複製物についての値を、対比較によってＳＫＯＶ３複製物と比較して感度を決定した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８とＳＫＯＶ３との間で対比較したうちの１００％（６４／６４）が、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８＞ＳＫＯＶ３という結果になった（図８）。
【０１６６】
（実施例１０）
ＨＥＲ３トータルＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイの再現性
アッセイ間の再現性を、４つのよく特徴付けられた細胞系（２９３Ｈ３−クローン１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＳＫＯＶ３）に対して、種々の機器類（ＣＥ、イルミネーター）、数人のオペレーターを使用し、４週間にわたってアッセイを行って、上記の通りＨＥＲ３トータルＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイを８つの別々のバッチで行うことによって決定した。バッチ正規化の手順の後、データを８バッチにわたって比較して再現性を確認した。ダイナミックレンジにわたる再現性は、８〜１５％であった（図９参照）。
【０１６７】
（実施例１１）
ＨＥＲ３トータルＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイの精度
アッセイ内の再現性を、１バッチ／細胞系のＨＥＲ３トータルＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイを行い、３つの対照細胞系（２９３Ｈ３−クローン１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）のそれぞれの１５個の複製物の動作を比較することによって決定した。各バッチの１５個の複製物について対比較を行ってアッセイの精度を決定した。２９３Ｈ３−クローン１のデータの９５％が１．２倍以内であり、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３のデータの１００％が１．２３倍以内であり、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８のデータの９５％が１．３７倍以内であった。結果を図１０に示す。
【０１６８】
（実施例１２）
ＨＥＲ３トータルＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイの直線性
ＨＥＲ３  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）の結果の直線性を、よく特徴付けられた細胞系対照である２９３Ｈ３−クローン１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）を取得し、連続的な「縮小（ｃｕｔ−ｄｏｗｎ）」実験を行って以下の寸法、１、１／２、１／４、１／１６のＦＦＰＥ切片を創出することによって決定した。次いで、切片サイズに関してアッセイの直線性を理解するために、これらの「縮小」切片を、Ｈ３Ｔ  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイにおいて処理し、最終的な切片面積の正規化データを対様式で比較した（図１１）。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３は、元の切片サイズのおよそ１／１６に至るまで直線であり、一方ＭＤＡ−ＭＢ−４６８は、元の切片サイズのおよそ１／２であるはずのところに至るまで直線であった。結果を図１１に示す。
【０１６９】
（実施例１３）
ＨＥＲ３トータルＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイの特異性
患者由来の腫瘍試料および細胞系対照を、ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）ＨＥＲ３トータルアッセイを用いて、アイソタイプ対照抗体を使用して処理した。ＨＥＲ３  Ａｂ−６−Ｐｒｏ１１に対して、一致したアイソタイプ対照はＩｇＧ１−Ｐｒｏ１１であった。ＨＥＲ３  Ｂ９Ａ１１−ビオチンに対して、一致したアイソタイプ対照は同様にＩｇＧ１−ビオチンであった。これらの反応からのシグナルは抗原特異的ではなく、非特異的なバックグラウンドを表す。試料を、以下の３つのフォーマットのそれぞれにおいて処理し、同じバッチ内で並列に処理した：
フォーマット１：ＨＥＲ３  Ａｂ６−Ｐｒｏ１１／Ｂ９Ａ１１−ビオチン（通常のフォーマット）
フォーマット２：ＨＥＲ２  Ａｂ６−Ｐｒｏ１１／ＩｇＧ１−ビオチン
フォーマット３：ＩｇＧ１−Ｐｒｏ１１／Ｂ９Ａ１１−ビオチン
各ＩｇＧ１フォーマット（フォーマット２およびフォーマット３）からの試料の結果を、各バッチに存在する陰性対照であるＳＫＯＶ３（比較パラメータＡ）と比較した。試料の結果を、それぞれの実際のＨＥＲ３総シグナル（フォーマット１）とも比較した。結果を図１２に示す。
【０１７０】
（実施例１４）
臨床的な乳腺腫瘍の測定とダイナミックレンジ
試験集団は、１９９９〜２００６年の間の単一の施設におけるトラスツズマブに基づく療法（ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｅｒｕｍ  Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ  ｔｒｉａｌ）の間に前向きに観察された患者（ｎ＝１０５）で構成された。ＨＥＲ−２／ｎｅｕを過剰発現している（ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ；ＤＡＫＯ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｕｓｔｒｉａによって決定された腫瘍細胞ＩＨＣ３＋が＞１０％）および／またはＥＲＢＢ２が増幅した（すべてのＩＨＣ２＋の症例において義務があるＦＩＳＨ試験で陽性を示す）ＭＢＣを持つ外来患者（ＥＣＯＧ  ＰＳ  ０〜２、年齢＞１８歳、推定寿命＞１２週間）のみを含めた。さらに、患者にはトラスツズマブ未処置であり、治療開始前４週間以内に２次元的に測定可能な疾患の進行を有すること（以前に放射線照射した病変は除外）が要求された。この試験群の試行実験からの試料を、８つの別々のバッチでのＨ３Ｔ  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイにおいて処理した。各バッチについて、腫瘍面積分析の他にＣＥピーク分析も行い、それに応じてバッチを正規化した。アッセイにおいて処理した１０５個の患者試料のうち、８５個の試料が、検出限界を超える測定可能なＨ３Ｔレベルを有し、８つの患者試料が検出可能な腫瘍を有さず、１つの試料について、データを除いてフルオレセイン不足が実証され、最終的に、８つの患者試料がアッセイの検出限界を下回り、低／陰性Ｈ３Ｔ発現と見なされた。結果を図１３に示す。
【０１７１】
（実施例１５）
トラスツズマブへの反応に対する最適なカットオフの決定
位置走査分析を用いて最適なカットオフを決定し、それにより、統計的に有意なカットオフを上回る患者は、このカットオフを下回る患者と比較して好ましくない無増悪期間（ＴＴＰ）を有した（図１４）。カットオフは、試験した集団の結果のおよそ中央値であった（０．１５８、ＨＲ＝２．３、ｐ＝０．０００４。ＴＴＰは、トラスツズマブを含有する治療の開始から増悪（ＳＷＯＧ）または打ち切りまでの時間として定義され、ＯＳはトラスツズマブを含有する治療の開始から死亡または打ち切りまでの時間として定義された。この患者集団の全生存期間に着目した場合、有意なカットオフを決定することはできなかったが、０．１５８カットオフを使用したＯＳにトレンドがあった（ＨＲ＝１．７；ｐ＝０．０５９）。
【０１７２】
（実施例１６）
ＴＴＰについてのカプラン・マイヤー（ＫＭ）分析
以前報告されたＨ２Ｔカットオフ（ｌｏｇＨ２Ｔ≧１．１４）を使用して、患者を、ＨＥＲ２正常群（Ｎ＝２６、ＴＴＰ中央値＝４．１ｍｏｓ）とＨＥＲ２過剰発現群（Ｎ＝５５、ＴＴＰ中央値＝１１．１ｍｏｓ、ＨＲ＝０．４３、ｐ＝０．０００２）とに細分した。ＨＥＲ２過剰発現群において、位置走査によって定義された最適なカットオフ（Ｈ３Ｔ＞０．１５８；図１４）を上回るＨ３Ｔ発現のレベルでは、カットオフを下回るＨ３Ｔ発現（Ｎ＝３０、ＴＴＰ中央値＝１３．１ｍｏｓ、ＨＲ＝２．７、ｐ＝．０００２）と比較して短い無増悪期間中央値（Ｎ＝２５、ＴＴＰ中央値＝６．１ｍｏｓ）が予測された。ＨＥＲ２過剰発現サブグループを調査する単変量コックス比例ハザード分析により、ＴＴＰの最も重要な予測因子としてＨ３Ｔが同定された（特定のカットオフを上回る対下回る）（ＨＲ＝２．９８、ｐ＝０．０００４）。これらの結果を図１５に示す。
【０１７３】
（実施例１７）
他の悪性腫瘍におけるＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）によるＨＥＲ３の総発現
Ｈ３Ｔ  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイを、結腸腫瘍、卵巣腫瘍、滑膜の腫瘍を含めた乳癌以外の多くの異なる悪性腫瘍に対して行った（図１６）。これらの癌のすべてについて、以下の範囲の順位序列で同様のダイナミックレンジが観察された：卵巣癌＞滑膜癌≧結腸癌。これらの腫瘍におけるダイナミックレンジは、癌に応じて０．５〜１．５ｌｏｇにわたる。
【０１７４】
（実施例１８）
Ｐ９５と併せたＨＥＲ３の測定およびトラスツズマブへの反応との相関
以前報告されたＰ９５のカットオフ（米国特許出願第１２／６２９，０３７号）を使用して、上記のＨＥＲ−２が過剰発現している患者を、そのＨＥＲ３レベルに基づいて最初に細分した後、さらに層別化して、図１７に示した４つの患者サブグループを生じさせた。位置走査によって予測された適切なカットオフを下回ると定義された、Ｐ９５およびＨＥＲ３が低レベルである患者は、他のどのサブグループよりも長い無増悪期間中央値（ＴＴＰ＝１５．０ｍｏｓ）を有した（トレンドに対するログランク検定、ｐ＜０．０００１）。Ｐ９５およびＨＥＲ３が高レベルである患者は、最短の無増悪期間中央値（ＴＴＰ＝３．２ｍｏｓ）を有した。結果を図１７に示す。
【０１７５】
（実施例１９）
ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＰ９５の測定ならびにトラスツズマブへの反応との相関
実施例１７における患者集団を、図１８に示した通り、そのＨＥＲ２、Ｐ９５およびＨＥＲ３のレベルによって細分した。位置走査の方法論によって定義された、高いＨＥＲ２、低Ｐ９５および低いＨＥＲ３である患者は、高レベルのＨＥＲ２および高レベルのＨＥＲ３またはＰ９５またはその両方を有する患者よりも長い無増悪期間を有し、後者はＨ２Ｔ  ＶＥＲＡＴＡＧ（登録商標）アッセイによって決定された、低いＨＥＲ２値を有する患者と同様の無増悪期間を示した。ＨＥＲ２発現レベルが正常であるサブグループ（Ｈ２Ｔｌｏ）内で、ＦＩＳＨ陽性群およびＦＩＳＨ陰性群は同様の無増悪期間を経験した。
【０１７６】
本明細書に記載のすべての刊行物および他の材料は、本発明を照らすため、または実施についての付加的な詳細を提供するために使用され、その全体が参照により組み込まれている。
【図２Ａ】
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【図４】
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【図１】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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