(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号１）という配列のペプチドであるオミガナンまたはその誘導体の製造方法であって、
活性化されたカルボキシ基および少なくとも２つのアミノ酸単位を有する第１のペプチド、または活性化されたカルボキシ基を有するＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、ＴｒｐおよびＰｒｏからなる群から選択されるアミノ酸と、遊離アミノ基および少なくとも２つのアミノ酸単位を有する第２のペプチドとを溶液中でカップリングする少なくとも１つのステップを含み、第１および第２のペプチドは異なり、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、およびＬｙｓからなる群から選択されるアミノ酸を、オミガナン中のＩｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（配列番号１）という配列で規定される順序で含む方法であって、
更に、Ａｒｇを含むペプチドのテトラフェニルホウ酸塩を生成するステップを含み、前記Ａｒｇを含むペプチドのテトラフェニルホウ酸塩は、前記カップリングステップで得られたＡｒｇを含むペプチドを含有するカップリングステップ反応媒体とテトラフェニルホウ酸アニオンの供給源とを接触させることによって生成されることを特徴とする、
方法。
【請求項２】
Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号２）またはその誘導体とＩｌｅ−Ｌｅｕ（Ｉｌｅのアミノ基はアミノ保護基で保護されている）をカップリングするステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号３）またはその誘導体とＡｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ（Ａｒｇのアミノ基は保護基で保護されている）をカップリングするステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号４）またはその誘導体とＴｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ（Ｎ末端のＴｒｐのアミノ基は保護基で保護されている）をカップリングするステップを含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記第２のペプチドが、ＮＨ２−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ（配列番号４）、ＮＨ２−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ（配列番号５）、ＮＨ２−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ（配列番号６）、ＮＨ２−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ（配列番号７）、ＮＨ２−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ（配列番号８）、ＮＨ２−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ（配列番号９）、ＮＨ２−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ（配列番号１０）、ＮＨ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ（配列番号１１）から選択される式を有し、式中、Ｘは、Ｌｙｓの側鎖アミノ基のための保護基であり、Ｒは、Ｌｙｓのカルボキシル基のためのカルボキシル保護基である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第２のペプチドが、０．１〜１重量％の（Ｄ）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ類似体を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第２のペプチドがＮＨ２−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒであり、式中、Ｘは、Ｌｙｓの側鎖アミノ基のための保護基であり、Ｒは、Ｌｙｓのカルボキシル基のためのカルボキシル保護基であり、前記第１のペプチドが、Ｙ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ、Ｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ、Ｙ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ（配列番号１２）、Ｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ（配列番号１３）、Ｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ（配列番号１４）、Ｙ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ（配列番号１５）、Ｙ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ（配列番号１６）、Ｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ（配列番号１７）、Ｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ（配列番号１８）の群から選択され、式中、Ｙは、アミノ保護基である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記カップリングが、ハロゲン化溶媒と非ハロゲン化溶媒との混合物中で実施される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｚ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＯＨとＨＣｌ．Ｈ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２をカップリングし、前記活性化剤がＨＯＯＢｔであり、前記溶媒がＤＭＡと塩化メチレンとの混合物であり、前記カップリングが、第１の期間を−５±５℃の温度で３から５時間、および第２の期間を＋５±５℃の温度で６から１０時間実施される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２のペプチドが、請求項７から９のいずれか一項に記載の方法で得られる、請求項５または６に記載の方法。
【請求項１１】
下記の式
Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨ
Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号２）
Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨ
（式中、Ｎ末端アミノ基は保護基で保護されている）
のペプチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載の化合物のテトラフェニルホウ酸塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドであるオミガナン（Ｏｍｉｇａｎａｎ）およびその中間体の製造方法、さらにオミガナンの製造方法における新規中間体に関する。
【背景技術】
【０００２】
オミガナンは、その５塩酸（５ＨＣｌ）塩の形で主に使用されるペプチドＨ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号１）の国際共通名称（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｎｏｍｉｎａｔｉｏｎ：ＣＩＤ）である。オミガナンは、カチオン性抗菌ペプチドである。最近の研究から、炎症反応においてある役割を果たすこともできることがわかった。オミガナンは、インビトロのアッセイにおいて、皮膚にコロニー形成し、炎症性障害の発生においてある役割を果たす可能性がある微生物に対して迅速な殺菌活性を示した。さらに、五塩化オミガナンは、現在、重度のざ瘡の治療における第ＩＩ〜ＩＩＩ相の段階にあり、中心静脈カテーテル関連血流感染の予防における第ＩＩＩ相臨床試験の段階にある。
【０００３】
オミガナンは、それぞれのアミノ酸を伸長中のペプチド鎖に連続して結合させる直鎖ペプチド合成により生成することができる。これらの方法は、所望のペプチドであるオミガナンの収率および純度に関して満足できるものではない。
【０００４】
今回、本発明によって、ペプチドであるオミガナンの改良された合成が利用可能になる。
【０００５】
（特許文献１）には、グアニジン基および非置換テトラフェニルホウ酸イオンを含む化合物のペプチド合成における中間体としての使用が開示されている。一例として、アルギニンおよびテトラフェニルボレート（ＴＰＢ）によって生成される化合物の合成、およびペプチドＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＯＨの合成におけるその使用が記載されている。
【０００６】
（特許文献２）には、オミガナンのアミノ酸配列を含むカチオン性ペプチドＭＢＩ  １１Ｂ２０ＣＮを含めてカチオン性ペプチドを含有する医薬組成物が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，２６２，５６７号明細書
【特許文献２】国際公開第９９／６５５０６Ａ号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明の目的は、ペプチドであるオミガナンが高収率および高純度で得られるオミガナン生成方法を提供することである。驚くべきことに、本発明による方法によって、前記ペプチドを限定された数のステップ、特に精製ステップで生成することが可能になり、したがって製造コストが大幅に低減される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明は、第１の態様において、Ｈ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号１）という配列のペプチドであるオミガナンまたはその誘導体の製造方法であって、活性化されたカルボキシ基および少なくとも２つのアミノ酸単位を有する第１のペプチド、または活性化されたカルボキシ基を有するＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、およびＴｒｐ、Ｐｒｏからなる群から選択されるアミノ酸と、遊離アミノ基および少なくとも２つのアミノ酸単位を有する第２のペプチドとを溶液中でカップリングする少なくとも１つのステップを含み、第１および第２のペプチドは異なり、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、およびＬｙｓからなる群から選択されるアミノ酸を、オミガナン中のＩｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（配列番号１）という配列で規定される順序で含む方法に関する。
【００１０】
本発明では、「ペプチド」という用語は、モノマーがアミノ酸であり、アミド結合を介して互いに共有結合しているポリマーを指す。ペプチドは、２個、またはしばしば２個以上のアミノ酸モノマー長である。さらに、ペプチド配列はすべて、左から右への方向が通常のアミノ末端からカルボキシ末端への方向である式で表わされる。
【００１１】
本発明では、「アミノ酸」という用語は、少なくとも１つのＮＲ１Ｒ２基、好ましくはＮＨ２基と少なくとも１つのカルボキシル基とを含む任意の化合物を表すよう意図されている。本発明のアミノ酸は、天然または合成とすることができる。グリシンを除いて、天然アミノ酸はキラル炭素原子を含む。別段の記載のない限り、Ｌ型配置の天然アミノ酸を含む化合物は好ましい。アミノ酸残基は、本明細書全体を通して以下の通り略されている。イソロイシンはＩｌｅである。ロイシンはＬｅｕである。アルギニンはＡｒｇである。トリプトファンはＴｒｐである。プロリンはＰｒｏである。リシンはＬｙｓである。
【００１２】
本発明では、ペプチドの「Ｃ末端」という用語は、遊離カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を末端に有するアミノ酸配列の末端である。一方、ペプチドの「Ｎ末端」という用語は、遊離アミノ基（−ＮＨ２）を有するアミノ酸を末端に有するアミノ酸配列の末端を指す。
【００１３】
本発明では、「カップリング」という用語は、アミノ酸のカルボキシル基または第１のペプチドのＣ末端と別のアミノ酸のアミノ基または第２のペプチドのＮ末端との反応を指す。言い換えれば、カップリング時に、２つのペプチド中間体断片、またはペプチド中間体断片と反応性アミノ酸とを、一般に適切な溶媒中、通常カップリング反応の効率および品質を促進する追加の試薬の存在下でカップリングする。ペプチド中間体断片は反応できるように配置され、したがって一方の断片のＮ末端が他方の断片のＣ末端に、またはその逆にカップリングされる。
【００１４】
本明細書では、「ペプチド誘導体」という用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応するＤ型異性体、または非天然アミノ酸残基もしくはその化学的誘導体で置換されている類似体を包含する。ペプチドの化学的誘導体としては、誘導体が、ペプチドの阻害活性を保持することを条件として、通常ペプチドの一部分でない追加の化学的部分を含む誘導体が挙げられるが、これに限定されるものではない。このような誘導体の例は、（ａ）アミノ末端または別の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、ここで、アシル基は、アセチル、ヘキサノイル、オクタノイルなどのアルカノイル基；アロイル基、例えばベンゾイルまたはビオチニルとすることができる、（ｂ）カルボキシル末端基、または別の遊離カルボキシル基もしくはヒドロキシ基のエステル、および（ｃ）アンモニアまたは適切なアミンとの反応で生成される、カルボキシル末端基または別の遊離カルボキシル基のアミドである。オミガナンおよびその中間体の誘導体は、例えばオミガナン配列の保護された断片およびペプチド、オミガナンおよびその中間体の無機酸または有機酸、好ましくは無機酸、最も好ましくは塩酸との塩でもある。使用することができる有機酸との塩の例は、酢酸、クエン酸、シュウ酸、トリフルオロ酢酸、テトラフェニルホウ酸、および酒石酸との塩である。
【００１５】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号２）またはその誘導体とＩｌｅ−Ｌｅｕをカップリングするステップを含み、Ｉｌｅのアミノ基はアミノ保護基で保護される。
【００１６】
本発明の方法は、Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号３）またはその誘導体とＡｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏをカップリングするステップを含み、Ａｒｇのアミノ基は保護基で保護されることがさらに好ましい。
【００１７】
好ましくは、本方法は、Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号４）またはその誘導体とＴｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏをカップリングするステップを含み、Ｎ末端のＴｒｐのアミノ基は保護基で保護される。
【００１８】
さらに、本発明は、第２の態様によれば、Ｈ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２の製造方法であって、
（ａ）Ｚ−Ａｒｇ−ＯＨ．ＣｌとＨ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２をカップリングするステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られたＺ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２を、好ましくはＰｄ触媒の存在下で水素化分解するステップと
を含む方法を対象とする。
【００１９】
「Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）」という用語は、アミノ基側鎖がＢｏｃ基で保護されているリシンを表すよう意図されている。
【００２０】
第３の態様において、本発明は、新規中間体Ｚ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２（配列番号２）を対象とする。
【００２１】
第４の態様において、本発明は、新規中間体Ｚ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨを対象とする。
【００２２】
第５の態様において、本発明は、Ｚ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨの製造方法であって、Ｈ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨとＺ−Ａｒｇ−ＯＨ．ＨＣｌをカップリングするステップを含む方法を対象とする。
【００２３】
第６の態様において、本発明は、新規中間体Ｚ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨを対象とする。
【００２４】
第７の態様において、本発明は、Ｚ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨの製造方法であって、Ｈ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨとＺ−Ｔｒｐ−ＯＳｕをカップリングするステップを含む方法を対象とする。
【００２５】
第８の態様において、本発明は、中間体Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨの製造方法であって、Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−ＮＣＡとＨ−Ｌｅｕ−ＯＨをカップリングするステップを含む方法を対象とする。
【００２６】
第９の態様において、本発明は、新規中間体Ｚ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２（配列番号４）を対象とする。
【００２７】
第１０の態様において、本発明は、新規中間体Ｚ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２（配列番号３）を対象とする。
【００２８】
本発明の方法において、保護基は、一般に関係するアミノ酸またはペプチド中間体における１つまたは複数のアミノ基に使用される。保護基の使用は、特に制限されている訳ではない。
【００２９】
例として、以下の保護基を、本発明の化合物において使用することができる：
アシル型保護基、特にホルミル、トリフルオロアセチル、フタロイル、４−トルエンスルホニル、ベンゼンスルホニル、および２−ニトロフェニルスルフェニル、
芳香族ウレタン型保護基、特に置換または非置換のベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、２−（４−ビフェニリル）プロピル（２）オキシカルボニル、２−（３，５−ジメチルオキシフェニル）、プロピル（２）オキシカルボニル、およびトリフェニルホスホノエチルオキシカルボニルなど、
脂肪族ウレタン型保護基、特にｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、２−メチルスルホニルエチルオキシカルボニル、および２，２，３−トリクロロエチルオキシカルボニル、
シクロアルキルウレタン型保護基、特にシクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−アミルオキシカルボニル、およびイソボルニルオキシカルボニルなど、
チオウレタン型保護基、特にフェニルチオカルボニル、
アルキル型保護基、特にトリフェニルメチル（トリチル）およびベンジルなど、
トリアルキルシランなどのトリアルキルシラン基。上記の保護基は、アミノ保護基として特に適している。
【００３０】
本発明の方法において、芳香族ウレタン型保護基および脂肪族ウレタン型保護基から選択される保護基とカップリングするステップ中で、アミノ酸基中の少なくとも１つのアミノ基が保護されることが好ましい。より好ましくは、前記保護基は、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基およびベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基から選択される。
【００３１】
本発明の方法の好ましい実施形態において、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基が、アミノ酸単位中の末端アミノ基のための保護基として使用され、アミノ酸単位はＡｒｇまたはＴｒｐである。
【００３２】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基が、Ｌｙｓの側鎖アミノ基および／またはＩｌｅ中のＮ末端アミノ基のための保護基として使用される。
【００３３】
特にカルボキシル基の保護に適した他の保護基としては、アルコキシ基、特にメチルエステル、エチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、およびベンジルエステルが挙げられる。好ましい実施形態において、Ｌｙｓのカルボキシル基がアミド、特にＣＯＮＨ２基として保護される。
【００３４】
本発明の方法において、第１のペプチドは、活性化されたカルボキシ基および一般に少なくとも２つのアミノ酸単位を有する。本発明の方法において、副反応を低減し、かつ／または反応効率を高める様々な活性化基を使用することができ、好ましくはカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、アシルハリド、ホスホニウム塩、およびウロニウム塩またはグアニジウム塩から選択される。例えば、ホスホニウム塩およびウロニウム塩は、第三級塩基、例えばジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）およびトリエチルアミン（ＴＥＡ）の存在下で、保護されたアミノ酸を活性化された種に変換することができる（例えば、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＨＢＴＵ、およびＴＢＴＵはすべて、ＨＯＢｔエステルを生成する）。ラセミ化の防止に役立つ他の試薬としては、追加の補助求核試薬（例えば、１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢＴ）、１−ヒドロキシ−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、またはＨＯＳｕ）を含むカルボジイミド（例えば、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、または水溶性カルボジイミド（ＷＳＣＤＩ））、またはそれらの誘導体が挙げられる。利用することができる別の試薬はＴＢＴＵである。例えば、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、ピバロイルクロリド（ＰｉｖＣｌ）、ｉ−ブチルクロロホルメート（ＩＢＣＦ）、ＨＢＴＵ（Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルアンモニウムウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、およびＥＥＤＱ（２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン）でよい結果が得られた。
【００３５】
本発明による好ましい活性化基は、ＤＣＣ、ＥＤＣ、およびＨＢＴＵである。
【００３６】
このようなカルボン酸活性化剤が使用されるとき、カップリング反応は、しばしば追加の試薬である塩基の存在下で実施される。したがって、本発明の別の特定の態様において、カップリング反応は塩基の存在下で実施される。塩基は、好ましくはＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）、ピリジン、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、またはそれらの混合物などの第三級およびヘテロ芳香族アミンから選択される。より好ましくは、Ｎ−メチルモルホリンおよびジイソプロピルエチルアミンから選択される。
【００３７】
これらの活性化基に加えて、添加剤を有利に使用することがある。好ましい添加剤は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｓｕｃ−ＯＨ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、または３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）およびそれらの誘導体である。これらの添加剤は、活性化対象のカルボキシル基の量に対して通常１から２当量の量で使用される。
【００３８】
本発明の別の特定の態様において、上記のペプチドカップリングは、少なくとも１つの極性有機溶媒の存在下で実施される。特定の好ましい実施形態において、極性有機溶媒によって、形成されたペプチド結合のラセミ化、ペプチドおよび／またはペプチド断片の溶解性、ならびにカップリング反応速度を特に効率的に制御することが可能になる。極性有機溶媒は、好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、酢酸エチル（ＡｃＯＥｔ）、酢酸イソプロピル、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、塩化メチレン、ピリジン、クロロホルム、アセトニトリル、ジメトキシエタン、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、またはそれらの混合物から選択される。より好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、またはそれらの混合物から選択される。最も好ましくは、極性有機溶媒はＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）である。好ましい混合物は、ＤＭＡ２０から８０％（体積）およびジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）８０から２０％（体積）、より好ましくはＤＭＡ５０から７０％（体積）およびジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）５０から３０％（体積）を含有する。
【００３９】
本明細書では、「カップリング」または「カップリングステップ」という用語は、特に異なるペプチドまたはアミノ酸をカップリングするステップを指す。
【００４０】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号２）またはその誘導体と保護されたＩｌｅ−Ｌｅｕまたはその誘導体とをカップリングするステップを含む。このステップにおいて、ＨＯＯＢｔが、好ましくは添加剤として使用される。さらに、このカップリングステップが、好ましくはＤＭＡ５０から７５％（体積）およびジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）２５から５０％（体積）を含有するＤＭＡ／ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）の混合物中で実施されることが好ましい。さらに好ましくは、カップリングステップはＥＤＣの存在下で実施される。
【００４１】
本発明による方法の特に好ましい実施形態において、第２のペプチドは、ＮＨ２−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ（配列番号４）  ＮＨ２−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ（配列番号５）、ＮＨ２−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ（配列番号６）、ＮＨ２−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ（配列番号７）、ＮＨ２−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ（配列番号８）、ＮＨ２−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ（配列番号９）、ＮＨ２−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ（配列番号１０）、ＮＨ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ（配列番号１１）から選択される式を有し、式中、Ｘは、Ｌｙｓの側鎖アミノ基のための保護基、好ましくはＢｏｃ基であり、Ｒは、Ｌｙｓのカルボキシル基のためのカルボキシル保護基、好ましくはアミド基である。
【００４２】
本発明によって、オミナガン（Ｏｍｉｎａｇａｎ）ペプチドの１０位におけるＡｒｇのＤ型鏡像異性体を含む生成物の存在を、合成全体を通して実際に制御および最小限に抑制することが可能になる。
【００４３】
この実施形態において、第２のペプチドは、ＮＨ２−Ｔｒｐ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ（配列番号４）、ＮＨ２−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ（配列番号５）、ＮＨ２−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ（配列番号６）、ＮＨ２−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ（配列番号７）、ＮＨ２−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ（配列番号８）、ＮＨ２−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ（配列番号９）、ＮＨ２−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ（配列番号１０）、ＮＨ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ（配列番号１１）、およびＮＨ２−（Ｄ）Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒ（配列番号１１）から選択されるペプチドを一般に０．１〜１重量％、有利には０．２〜０．９重量％、しばしば０．２〜０．７重量％含み、式中、ＸおよびＲは上記の通りである。本発明は、前記第２のペプチドにも関する。
【００４４】
さらに好ましい実施形態において、第２のペプチドは、ＮＨ２−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｒであり、式中、Ｘは、Ｌｙｓの側鎖アミノ基のための任意選択の保護基、好ましくはＢｏｃ基であり、Ｒは、Ｌｙｓのカルボキシル基のためのカルボキシル保護基、好ましくはアミド基であり、第１のペプチドは、Ｙ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ、Ｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ、Ｙ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ（配列番号１２）、Ｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ（配列番号１３）、Ｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ（配列番号１４）、Ｙ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ（配列番号１５）、Ｙ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ（配列番号１６）、Ｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ（配列番号１７）、Ｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ（配列番号１８）の群から選択され、式中、Ｙは、Ｎ末端アミノ基のためのアミノ保護基、特に上記に定義する通り、好ましくはＺ基である。
【００４５】
この特定の実施形態において、カップリングは、アリール環を有するオキソ−トリアジン活性化剤、好ましくはＨＯＯＢｔの存在下で実施されることが有利である。
【００４６】
この実施形態において、カップリングは、一般に−１０〜＋１０℃の温度で実施される。
【００４７】
この実施形態において、カップリングは、しばしばハロゲン化溶媒と非ハロゲン化溶媒との混合物、好ましくは塩素化溶媒とアミド型溶媒との混合物中で実施される。適切な塩素化溶媒としては、例えばクロロホルム、１，２−ジクロロエタン、好ましくはジクロロメタンが挙げられる。適切なアミド型溶媒としては、例えば、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドが挙げられる。塩化メチレンとＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドとの混合物によって、よい結果が得られた。
【００４８】
Ｚ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＯＨとＨＣｌ．Ｈ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２をカップリングすることが特に有利である。
【００４９】
この実施形態の最も好ましい態様において、Ｚ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＯＨとＨＣｌ．Ｈ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２をカップリングし、活性化剤はＨＯＯＢｔであり、溶媒はＤＭＡと塩化メチレンの混合物であり、カップリングは、第１の期間を−５±５℃の温度で３から５時間、および第２の期間を＋５±５℃の温度で６から１０時間実施される。
【００５０】
本発明による特に好ましい方法は、図１のスキームに従う。スキームのＸとＹは、同じでも異なってもよい。これらは、好ましくは異なる。Ｘがｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基であり、Ｙがベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基であるとき、よい結果が得られた。
【００５１】
本発明は、Ｈ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号１）という配列のペプチドであるオミガナンを製造するための脱保護方法であって、式Ｙ１−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｙ２）−ＮＨ２（配列番号１）の前駆体ペプチドと酸を実質的に無水の条件下で反応させるステップを含み、式中、Ｙ１とＹ２は同一もしくは異なるアミノ保護基、またはＨを表し、Ｙ１またはＹ２の少なくとも１つは酸に不安定なアミノ保護基である方法にも関する。
【００５２】
保護基Ｙ１およびＹ２は、例えば上記の概説に含まれるアミノ保護基とすることができる。Ｙ１とＹ２は共に、アミノ保護基であることが好ましい。より好ましくは、Ｙ１とＹ２が共にＢｏｃである。
【００５３】
本発明による脱保護方法において、酸はしばしばＨＣｌ、ＨＦ、ＨＢｒ、ＨＩ、トリフルオロ酢酸、およびトリフルオロメタンスルホン酸から選択される。より好ましくは、酸はＨＣｌである。特にこの場合、ペプチド１モル当たり好ましくは６から３２モル、より好ましくは１２から２４モルの酸が使用される。
【００５４】
本発明による脱保護方法の反応は、一般に有機溶媒、好ましくは脂肪族アルコール、特に第二級アルコール、より好ましくはイソプロパノール中で実施される。
【００５５】
本発明による脱保護方法において、例えば１０ｍｇ／ｋｇから１．５重量％、好ましくは５０ｍｇ／ｋｇから１重量％の水を含有する液体反応媒体中で反応を実施することによって、実質的に無水の条件が実現される。より好ましくは、反応媒体の含水率は１００ｍｇ／ｋｇから０．５重量％である。
【００５６】
特に、Ｙ１およびＹ２の少なくとも１つがＢｏｃであるとき、反応は、カルボカチオン、特にｔｅｒｔ−ブチルカチオンの捕捉剤、例えばチオアニソール、好ましくは４−（メチルチオ）フェノールの存在下で実施されることが有利である。
【００５７】
本発明による脱保護方法の反応は、一般に０℃から８０℃、好ましくは２５℃から４５℃の温度で実施される。
【００５８】
本発明による脱保護方法において、ペプチドであるオミガナンは、その五塩酸塩の形で回収されることが有利である。
【００５９】
本発明による脱保護方法において、前駆体ペプチドは、好ましくは本発明による方法で得られる。
【００６０】
脱保護方法の特に好ましい実施形態において、Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２（配列番号１）を脱保護して、５ＨＣｌ．Ｈ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号１）を得ることが、ＨＣｌと第二級アルコールの混合物中、好ましくはｔｅｒｔ−ブチルカルボカチオンの捕捉剤、例えば４−（メチルチオ）フェノールの存在下で行われる。最も好ましくは、ＨＣｌとイソプロパノールの混合物が使用される。このようにして得られた脱保護生成物を、特に経済的および効率的な方式で、かつとりわけ酢酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、ＨＦ、およびＨＢｒを用いた開裂を含めて他の可能な脱保護方法の場合より効率的に精製することができる。本出願人は、例えばＨＣｌ／イソプロパノールの混合物中、好ましくはｔｅｒｔ−ブチルカルボカチオンの捕捉剤の存在下で行うと、オミガナンのようなトリプトファンに富むペプチドに対してより多くの副生物の供給源であるトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて実施される手順よりよい結果が得られることを見出した。また、この特定の場合、脱保護は、上述されたように好ましくは水を実質的に含まない反応媒体中で実施される。また、この特定の場合、前記脱保護反応が、２０から８０℃、好ましくは２５から４５℃、より好ましくは３０から４０℃の温度で実施されることが有利である。
【００６１】
本発明の実施形態において、水素化分解は触媒の存在下で実施される。好ましくは、様々な担体、例えば炭素、ＳｉＯ２、Ｓｉ−Ａｌ化合物などと組み合わせて使用することができるＰｄ触媒が使用される。
【００６２】
特定の一実施形態において、本発明による方法は、Ａｒｇを含むペプチドのテトラフェニルホウ酸塩を生成するステップを含む。典型的には、前記Ａｒｇ含有ペプチドのテトラフェニルホウ酸塩は、通常本発明による方法に従ってカップリングステップによって得られるＡｒｇ含有ペプチドを含有するカップリングステップ反応媒体を、テトラフェニルホウ酸アニオンの供給源と接触させることによって形成される。テトラフェニルホウ酸塩は、テトラフェニルホウ酸アニオンの供給源として適切である。
【００６３】
したがって、好ましくは少なくとも１つのカップリングステップの完了後に添加されるテトラフェニルホウ酸塩（ＴＰＢ）の存在下で、少なくとも１ステップを行うことが好ましい。
【００６４】
テトラフェニルホウ酸（ＴＰＢ）塩のカチオンは、無機または有機とすることができる。有機イオンの例は、テトラエチルアンモニウム、ジイソプロピルエチルアンモニウム、Ｎ−エチルピペリジニウム、Ｎ−メチルモルホリニウム、Ｎ−エチルモルホリニウムである。適切な無機イオンは、例えばナトリウム（Ｎａ＋）またはリチウム（Ｌｉ＋）である。最も好ましくは、水溶液を生成することができるテトラフェニルホウ酸塩が使用される。ＬｉＴＰＢおよびＮａＴＰＢが好ましい。最も好ましく使用されるテトラフェニルホウ酸塩はＮａＴＰＢである。
【００６５】
ＴＰＢアニオンは、そのベンゼン環上で置換されていてもよく、または置換なしに使用することができる。好ましくは、ＴＰＢアニオンは置換されていない。適切な置換ＴＰＢアニオンの例としては、例えばテトラキス（３，５−ビストリフルオロメチルフェニル）ボレートが挙げられる。
【００６６】
テトラフェニルホウ酸塩の使用量は、広い制限内で異なり得る。好ましくは、Ａｒｇ含有ペプチド中の１Ａｒｇ単位当たり１から１０当量、好ましくは１から１．５当量のテトラフェニルホウ酸塩が使用される。
【００６７】
テトラフェニルホウ酸塩は、好ましくは本発明の方法において少なくとも１つのカップリングステップの完了後のワークアップ時に、溶媒または溶媒の混合物の存在下で使用される。適切な溶媒は、特にメタノール、メトキシエタノール、ジクロロメタン、ｎ−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、およびｔｅｒｔ−ブタノールである。メトキシエタノールを使用して、良好な結果が得られた。
【００６８】
この実施形態において、前記Ａｒｇ含有ペプチドのテトラフェニルホウ酸塩を、単離することなく少なくとも１つのその後の合成ステップにかけることができることは有利である。しばしば、前記Ａｒｇ含有ペプチドのテトラフェニルホウ酸塩を少なくとも脱保護ステップと、続いてカップリングステップにかける。
【００６９】
最も好ましい実施形態において、本発明は、以下のステップ（ａ）〜（ｄ）を含む、ペプチドであるオミガナンの製造方法を対象にする：
（ａ）Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ２またはその誘導体、特にＡｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２と、Ｎ保護Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＯＨまたはその誘導体、特にＺ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＯＨとをカップリングするステップ。
（ｂ）Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号４）またはその誘導体、特にＴｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２（配列番号４）と、Ｎ保護Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏまたはその誘導体、特にＺ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨとをカップリングするステップ。
（ｃ）Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号３）またはその誘導体、特にＴｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２（配列番号３）と、Ｎ保護Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏまたはその誘導体、特にＺ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨとをカップリングするステップ。
（ｄ）Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号２）またはその誘導体、特にＡｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２（配列番号２）と、Ｎ保護Ｉｌｅ−Ｌｅｕまたはその誘導体、特にＢｏｃ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨとをカップリングするステップ。
【００７０】
ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）を含む方法の最も好ましい実施形態を、図１のスキームで例示する。
【００７１】
本発明による方法において使用される操作条件は、一般に本発明にとってクリティカルでない。したがって、本方法が行われる圧力は、一般に反応媒体が液体状態に維持されるように０．１〜１０バールであることが有利である。大気圧で、よい結果が得られた。本方法が行われる温度は通常−５０℃〜１００℃であり、特定のステップにおける反応物質および最終的に調製されるよう意図されている化合物の性質に応じて変わることがある。好ましくは、温度は−４５℃以上、より好ましくは−２５℃以上である。一方、温度は、好ましくは６０℃以下、より好ましくは５０℃以下である。
【００７２】
特定のカップリングステップにおいて、より制限された好ましい温度範囲が適用され得る。例えば、Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号２）またはその誘導体と保護されたＩｌｅ−Ｌｅｕまたはその誘導体とをカップリングするステップにおいて、カップリング反応が、第１の期間を０℃±５℃の温度範囲で、好ましくは約３から５時間、および第２の期間を２０℃±５℃の温度範囲で、好ましくは約６から１０時間実施されることが好ましい。
【００７３】
本発明の方法の好ましい実施形態において、中間体であるＺ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２．２ＴＰＢ（配列番号４）が利用される。好ましくは、Ｚ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２．２ＴＰＢ（配列番号４）は、Ｚ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＯＨとＨＣｌ．Ｈ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２をカップリングすることによって得られる。好ましくは、このカップリングステップはＨＯＯＢｔの存在下で実施される。
【００７４】
このカップリングステップにおいて、温度は、好ましくは第１の期間を−５±５℃の範囲で約２から５時間、および第２の期間を５±５℃の温度範囲で約６から１０時間維持される。
【００７５】
Ｚ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＯＨとＨＣｌ．Ｈ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２のカップリングに続いて、好ましくはカップリングステップの反応媒体に、ＮａＴＰＢ塩を好ましくは水溶液で、より好ましくはＮａ２ＣＯ３の存在下で添加することを含むステップ（ワークアップステップとも呼ばれる）が行われる。
【００７６】
本発明のカップリングステップにおいて、一方のペプチドが、他方のペプチド１モル当たり好ましくはペプチド０．８から１．２モル、より好ましくは０．９から１．１モル、最も好ましくは０．９５から１．０５モルの量で使用される。
【００７７】
例えば、活性化されたカルボキシ基および一般に少なくとも２つのアミノ酸単位を有する第１のペプチドと遊離アミノ基および少なくとも２つのアミノ酸単位を有する第２のペプチドとを、第２のペプチド１モル当たり第１のペプチド０．８から１．２モル、より好ましくは０．９から１．１モルの量で使用してカップリングすることが好ましい。
【００７８】
本発明の第１の態様の方法は、多数の利点を有する：
−反応ステップの少ない非常に集中的な経路である。テトラフェニルホウ酸（ＴＰＢ）塩を使用する実施形態において、ＴＰＢ塩で選択的抽出を行った後、それらの塩を沈殿させ、または単離することなく合成を続けることが可能である。これによって、合成時に柔軟性の向上が実現する。側鎖の保護されたＡｒｇを処理する必要はない。
−トリプトファン単位のインドール環を合成時に保護する必要はない。トリプトファンは、強酸性の媒体に非常に高い感受性があることが知られている（インドール核のアルキル化、着色した副生物の生成）。これは、保護が高価であり、後の脱離が困難であることを考慮すると、重要な利点である。したがって、特定の好ましい実施形態において、本明細書の上記に開示される方法および断片においては、少なくとも１つのトリプトファン単位、および好ましくはすべてのトリプトファン単位は保護されていない。
−本発明の方法によって、Ａｒｇ  １０およびＬｅｕ  ２のラセミ化の量の低減も可能になり、より容易な最終精製が可能になる。
−最後に、本発明の方法によって、最終の脱保護、特に適切な場合にはＢｏｃ基の脱離反応のかなりスムーズな条件が可能になる。
−さらに、本発明の方法は、特にＣ末端のＰｒｏを有する第１のペプチドが使用されるいくつかの好ましい実施形態において、ラセミ化の危険がさらに低減されることを可能にし、より容易な最終精製が可能になる。
【００７９】
特に、本発明の第１の態様の方法によって、３つの主な副生物の量が大幅に低減された、すなわちＨ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号１）、Ｈ−Ｉｌｅ−（Ｄ）Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号１）の量が、カップリングステップにおけるラセミ化をよりよく制御することにより大幅に低減され、Ｈ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＯＨ（配列番号１）の量が、強酸性の水性媒体中で処理することを回避することにより大幅に低減されたオミガナンを得ることが可能になる。
【００８０】
本発明の方法に従って生成されたオミガナンは、一般にその後の精製ステップ、特に単一の精製ステップで精製される。
【００８１】
本発明は、ペプチドであるオミガナンの精製方法であって、不純物を含んだペプチドであるオミガナンを、水および有機溶媒を含む移動相を用いた液体クロマトグラフィー、特にＨＰＬＣクロマトグラフィーに供するステップを含む方法にも関する。ＨＰＬＣクロマトグラフィー技法の中で、逆相およびイオン交換相クロマトグラフィーが好ましい。逆相を使用して、優れた結果が得られた。様々な逆相カラム、特にＣ４、Ｃ８、Ｃ１８シリカ系逆相カラムを使用することができる。
【００８２】
この方法において、移動相は、好ましくはアセトニトリルを含む。この方法において、移動相は、緩衝液を含むことが有利である。アセテート緩衝液を使用して、よい結果が得られた。移動相として、アセトニトリルとアセテート緩衝液（ｐＨ５）とを含む系が特に好ましい。
【００８３】
本発明による精製方法は、しばしば対イオン交換ステップをさらに含む。例えば、精製ペプチドは、好ましくはクロマトグラフィーカラムを用いて、塩化物水溶液、特にＮａＣｌ水溶液と有機溶媒、特にアセトニトリルとの混合物で洗浄することができる。適切な場合には、イオン交換後の精製ペプチドを、カラムからアセトニトリルと水との混合物で溶出することができ、それによって、濃縮された精製オミガナン溶液を得ることができる。
【００８４】
本発明による精製方法は、結晶化ステップも含むことができる。
【００８５】
したがって、本発明による精製方法は、濃縮ステップ、および場合によっては凍結乾燥ステップをさらに含むことができる。
【実施例】
【００８６】
以下の実施例によって、本発明の方法を説明するが、本発明を限定するものと解釈されるべきでない。他に何も記載されていない場合、化合物の純度は９８重量％より高く、記載される比は体積比を指す。
【００８７】
１．  Ｚ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＮＨ２．ＴＰＢの合成
１．０２当量のＺ−Ａｒｇ−ＯＨ．ＨＣｌ（Ｍｗ＝３４４．８）をＤＭＡとＣＨ２Ｃｌ２（６／４）の混合物に室温で添加した。その後、１．０３当量のＨＯＢｔ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｍｗ＝１３５．１２）および１．００当量のＨ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２（Ｍｗ＝２４５．３；純度：９９％）を添加した。溶液を０±５℃に冷却した後、１．０３当量のＥＤＣ．ＨＣｌ（Ｍｗ＝１９１．７）を添加した。
【００８８】
０±５℃でさらに３０分間、次いで室温で少なくとも２時間撹拌を続けた。ＨＰＬＣで反応の完了を確認した後、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２／ｉｓｏ−ＢｕＯＨ（６／４）の混合物で希釈し、０．５当量のＨＣｌ溶液で抽出した。酸性の水相をＣＨ２Ｃｌ２／ｉｓｏ−ＢｕＯＨ（６／４）の混合物で２回抽出した。有機相を合わせて、まず１．０５当量のテトラフェニルホウ酸ナトリウム（ＴＰＢＮａ）（Ｍｗ＝３４２ｇ）を含有する５％（重量）のＮａ２ＣＯ３水溶液で洗浄し、次いで５％（重量）のＮａＣｌ水溶液で４回洗浄した。
【００８９】
有機相を真空中で濃縮した後、濃縮物に、メトキシエタノールを数回に小分けして添加して、微量のｉｓｏ−ブタノールを除去した。次いで、さらに蒸発させた。次いで、濃縮物を最後にメトキシエタノールで希釈し、５％（重量）の冷（０から５℃）ＮａＣｌ水溶液にゆっくりと添加した。ペプチドが沈殿し、それを低温で少なくとも３０分間維持し、次いで濾過した。
【００９０】
固体を冷（０±５℃）脱塩水で３回洗浄した。その後、固体をＭｅＯＨに再溶解し、わずかに濁った溶液が得られるまで撹拌した。溶液を部分濃縮し、次いで冷却した５％（重量）のＮａＣｌ水溶液に、メタノール性溶液をゆっくりと添加した。濾別する前に、沈殿物を低温で少なくとも３０分間維持した。最後に、固体を冷脱塩水（０℃±５℃）で３回洗浄し、真空乾燥した（４５℃）。灰色がかった白色固体が、最終的に得られた。内容物のＮＭＲ測定に基づく収率は、８９％であった。
【００９１】
２．  ＨＣｌ．Ｈ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２の合成
１．００当量のＴＰＢ．Ｚ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２（Ｍｗ＝５３５．６；純度＝６２．０％）のメタノール溶液を、メタノールで洗浄した樹脂ＩＲＡ  ９５８（Ｍｗ＝１０００；３．００当量）が入っているカラムに数回通した。ＨＰＬＣで交換を確認した後、樹脂を濾過し、メタノールで３回洗浄した。有機相を合わせて、真空中で部分濃縮した。濃縮された溶液を水で希釈した。
【００９２】
Ｐｄ触媒（Ｍｗ＝１０６．４；２重量％）を添加し、次いで懸濁液を３５±５℃で少なくとも５時間水素化した。触媒を濾別し、メタノール／水の混合物で２回洗浄した。濾液を真空中で蒸発させ、残渣をＤＭＡに懸濁し、微量の水を除去するために真空中で部分蒸発させた。含水率を確認した後、最終溶液をＨＣｌ（０．１Ｎ）で滴定し、その後精製することなく使用した。
【００９３】
収率（滴定に基づく）：９０％。
【００９４】
３．  Ｚ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＯＨの合成
２．００当量の水および１当量のＡｒｇ（Ｍｗ＝１７４．２）をＤＭＦと混合し、溶液が得られるまで室温で撹拌した。１．０３当量のＺ−Ｔｒｐ−ＯＳｕ（Ｍｗ＝４３５．４５；純度＝９８％）をＤＭＦに溶解し、アルギニン溶液に注いだ。次いで、撹拌を室温で少なくとも５時間続けた。反応の終了をＨＰＬＣで確認した後、冷アセトニトリル（０±５℃）をゆっくり添加することによって反応混合物が沈殿し、濾過する前に、この温度で少なくとも３０分間維持した。沈殿物をＣＨ３ＣＮ／ＩＰＥ（イソプロピルエーテル）（１／１）の混合物で３回、次いでＩＰＥで２回洗浄した。次いで、固体を真空中、４５℃で乾燥した。白色固体が、最終的に得られた。
【００９５】
収率（ＮＭＲ含有量に基づく）：８６％。
【００９６】
４．  Ｚ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２．２ＴＰＢ（配列番号４）の合成
１．００当量のＺ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＯＨ（Ｍｗ＝４９４．５；純度＝８５．０％）および１．１０当量のＨＯＯＢｔ（Ｍｗ＝１６３．１３）を、ＣＨ２Ｃｌ２で予め希釈しておいた１．１５当量のＨＣｌ．Ｈ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２（Ｍｗ＝４３７．５；純度＝２０．０％）のＤＭＡ溶液に添加した。溶液を−５±５℃に冷却した後、１．００当量のＨＣｌ／ジオキサン（４Ｎ）をゆっくりと注ぎ入れ、次いで１．１０当量のＥＤＣ（Ｍｗ＝１９１．７）を添加した。反応混合物を−５±５℃で少なくとも３時間撹拌し、次いで５±５℃で少なくとも８時間撹拌した。ＨＰＬＣで反応の完了を確認した後、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２／ｓｅｃ−ブタノール（６／４）の混合物で希釈し、まずＨＣｌ（０．５当量）を含有する５％（重量）のＮａＣｌ水溶液、次いで２．２当量のＮａＴＰＢ（Ｍｗ＝３４２）を含有する５％（重量）のＮａ２ＣＯ３水溶液１９００ｍｌ、最後に５％（重量）のＮａＣｌ水溶液で５回洗浄した。有機層を濃縮した後、残渣をメタノールに溶解し、次いで残留しているＣＨ２Ｃｌ２の大部分を除去するために真空中で濃縮した。この最終溶液をＮＭＲで滴定し、その後精製することなく使用した。
【００９７】
収率（滴定含量に基づく）＝８３％。
【００９８】
５．  ２ＨＣｌ．Ｈ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２（配列番号４）の合成
１．００当量の２ＴＰＢ．Ｚ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２（Ｍｗ＝８７８．１１）のメタノール溶液を、６．００当量のメタノールで洗浄した樹脂ＩＲＡ  ９５８（Ｍｗ＝１０００）が入っているカラムに数回通した。ＨＰＬＣで交換を確認した後、樹脂を濾過し、メタノールで３回洗浄した。有機相を合わせて、真空中で部分濃縮した。濃縮された溶液を水で希釈し、Ｐｄ触媒を添加した。次いで、懸濁液を３５±５℃で少なくとも３時間水素化した。触媒を濾別し、メタノールで２回洗浄した。濾液を真空中で蒸発させ、残渣をＤＭＡに溶解し、残留している水を除去するためにさらに濃縮した。含水率を確認した後、沈殿物をＤＭＡに溶解し、溶液の重量を適合させるために真空中で部分蒸発させた。最終溶液を０．１Ｎ  ＨＣｌで滴定し、その後精製することなく使用した。
【００９９】
収率（滴定に基づく）：９５％。
【０１００】
６．  Ｚ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨの合成
ＤＭＡ、１．０５当量のＤＩＰＥＡ（Ｍｗ＝１２９．２）、および１．０５当量のＨ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨ（Ｍｗ＝３０１．３；純度＝９１．０％）を、溶液が生成されるまで室温で少なくとも３０分間混合した。次いで、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、５±５℃に冷却した。この温度に到達すると、１．００当量のＺ−Ｔｒｐ−ＯＳｕ（Ｍｗ＝４３５．５；純度＝９８．０％）を添加し、溶液が再び室温まで温まる前に、撹拌を少なくとも３０分間続けた。反応の完了をＨＰＬＣで確認した後、０．２当量のＤＭＡＰＡ（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノプロピルアミン、Ｍｗ＝１０２．２ｇ／ｍｏｌ）を添加した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、２当量のＫＨＳＯ４を含有する５（重量）％のＮａＣｌ水溶液で洗浄した。有機相を、最初は５（重量）％のＮａＣｌ水溶液で、最後は水でさらに洗浄した。有機相を真空中で部分濃縮し、残渣を酢酸エチルに懸濁し、さらに残留している水を除去するために濃縮した。濃縮ペプチド溶液を少量ずつ、ＭＴＢＥ／石油エーテル（４５〜５５）（１／１）の冷（０±５℃）混合物に添加し、濾過する前に、沈殿物を０±５℃で少なくとも３０分間維持した。濾過した後、次いで石油エーテル（４５〜５５）で洗浄し、真空中４５℃で乾燥した。白色固体が、最終的に得られた。
【０１０１】
収率（ＮＭＲ含有量に基づく）＝８２％。
【０１０２】
７．  Ｚ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２．２ＴＰＢ（配列番号３）の合成
１．００当量のＺ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨ（Ｍｗ＝６２１．７；純度＝９４．０％）を、ＣＨ２Ｃｌ２で予め希釈した１．０５当量の２ＨＣｌ．ＨＴｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２（Ｍｗ＝８１６．９；純度＝１５．０％）のＤＭＡ溶液に添加した。次いで、１．２０当量のＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（Ｍｗ＝１２９．２）および１．０５当量の２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）（ＨＢＴＵ）（Ｍｗ＝３７９．２４）を添加した。反応混合物を室温で少なくとも１時間撹拌した。ＨＰＬＣで反応の完了を確認した後、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２／ｓｅｃ−ブタノール（８／２）の混合物で希釈し、まず５％（重量）のＮａＣｌ水溶液およびＨＣｌ（１．５当量）、次いで５％（重量）のＮａ２ＣＯ３水溶液および２．２当量のＮａＴＰＢ（Ｍｗ＝３４２ｇ／ｍｏｌ）、最後に５％（重量）のＮａＣｌ水溶液で３回洗浄した。有機層を濃縮した後、残留油をメトキシエタノールに数回溶解し、次いで残留しているｉｓｏ−ブタノールの大部分を除去するために真空中で濃縮した。ＧＣ制御した後、濃縮物を、５％（重量）の冷（０±５℃）ＮａＣｌ水溶液にゆっくりと注ぎ込むことによって沈殿させた。少なくとも１時間撹拌した後、懸濁液を濾過し、冷水で２回洗浄した。沈殿物を真空中、４５℃で乾燥した。白色固体が、最終的に得られた。
【０１０３】
収率（ＮＭＲ含有量に基づく）＝９８％。
【０１０４】
８．  ２ＨＣｌ．Ｈ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２（配列番号３）の合成
１．００当量の２ＴＰＢ．Ｚ−ＴｒｐＴｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２（配列番号３）（Ｍｗ＝１３４７．５；純度＝６４．０％）のメタノール溶液を、メタノールで洗浄した樹脂ＩＲＡ  ９５８（またはＡｍｂｅｒｊｅｔ  Ｃｌ  １０００；６．００当量）が入っているカラムに数回通した。ＨＰＬＣで交換を確認した後、樹脂を濾過し、３回洗浄した。有機相を合わせて、真空中で部分濃縮し、次いで水で希釈した。最後に、２％（重量）のＰｄ触媒を添加し、懸濁液を４０℃で少なくとも３時間水素化した。触媒を濾別し、メタノール／水の混合物で３回洗浄した。濾液を合わせて、真空中で蒸発させ、残渣をＤＭＡに懸濁し、残留している水を除去するためにさらに濃縮した。含水率を確認した後、溶液をＨＣｌ（０．１Ｎ）、ＡｇＮＯ３（０．１Ｎ）、またはＮＭＲで滴定し、その後精製することなく使用した。
【０１０５】
収率（滴定に基づく）＝８２％。
【０１０６】
９．  Ｚ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨの合成
ＤＭＡ、１．００当量のＤＩＰＥＡ、および１．００当量のＨ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨ（Ｍｗ＝３０１．３；純度＝９４．０％）を、溶液が得られるまで室温で少なくとも３０分間混合し、次いで溶液を１０±５℃に冷却した（溶液Ｎｏ．１）。ＤＭＡに、室温で１．００当量のＺ−Ａｒｇ−ＯＨ．ＨＣｌ（Ｍｗ＝３４４．８）を清澄な溶液が得られるまで添加した（溶液Ｎｏ．２）。溶液Ｎｏ．２を−１５±５℃に冷却しながら、１．０５当量のピリジン（Ｍｗ＝７９．１；純度＝９９．０％）および１．００当量のＤＩＰＥＡを添加した。この温度に到達すると、１．００当量のピバロイルクロリド（ＰｉｖＣｌ）（Ｍｗ＝１２０．５８）を反応混合物（溶液Ｎｏ．２）に注ぎ込み、約５分間さらに活性化した。さらに、活性化された溶液Ｎｏ．２に溶液Ｎｏ．１を添加し、冷却を止めた状態で反応混合物を少なくとも１時間さらに撹拌し、反応混合物を室温まで温まらせた。
【０１０７】
反応の完了をＨＰＬＣで確認した後、ペプチド溶液を真空中で濃縮した。残渣をアセトニトリルおよび水で希釈し、２Ｎ  Ｋ２ＣＯ３でｐＨを８．０±０．２に調整した。次いで、溶液を真空中で部分濃縮し、残渣を５±５℃に冷却して、沈殿させた。濾過する前に、撹拌を少なくとも３０分間続け、次いで沈殿物を水で洗浄した。白色固体が、最終的に得られた。
【０１０８】
収率（ＮＭＲ含有量に基づく）：９０％。
【０１０９】
１０．  Ｚ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２．３ＴＰＢ（配列番号２）の合成
１．００当量のＺ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨ（Ｍｗ＝５９１．６５；純度＝９６．０％）、１．００当量のＨＣｌ／ジオキサン（４Ｎ）、および１．０５当量のＨＯＢｔ（Ｍｗ＝１３５．１２；純度＝９８．０％）を、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈したＤＭＡに溶かした１．００当量の２ＨＣｌ．Ｈ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２（配列番号３）（Ｍｗ＝１２１３．４；純度＝８５．０％）に添加した。溶液を１０±５℃に冷却した後、１．０２当量のＥＤＣ（Ｍｗ＝１９１．７）を添加した。反応混合物を１０±５℃で３０分間撹拌し、次いで室温で少なくとも４時間撹拌した。ＨＰＬＣで反応の完了を確認した後、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２／ｉｓｏ−ブタノール（８／３）の混合物で希釈し、まずＨＣｌ（０．５当量）を含む５％（重量）のＮａＣｌ水溶液、次いで３当量のＮａＴＰＢ（Ｍｗ＝３４２）を含有する５％（重量）のＮａ２ＣＯ３水溶液、最後に５％（重量）のＮａＣｌ水溶液で２回洗浄した。有機層を濃縮した後、残留油をメトキシエタノールに数回溶解し、次いでｉｓｏ−ブタノールの大部分を除去するために真空中で濃縮した。ＧＣ制御した後、濃縮物を、５％（重量）の冷ＮａＣｌ水溶液にゆっくり注ぎ込むことによって沈殿させた。少なくとも１時間撹拌した後、懸濁液を濾過し、冷水で２回洗浄した。沈殿物を４０±５℃で乾燥した。灰色がかった白色固体が、最終的に得られた。
【０１１０】
収率（ＮＭＲ含有量に基づく）＝８７％。
【０１１１】
１１．  ３ＨＣｌ．Ｈ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２（配列番号２）の合成
１．００当量の３ＴＰＢ．Ｚ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＴｒｐＴｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２（Ｍｗ＝１７８７．１；純度＝５７．０％）のメタノール溶液を、メタノールで洗浄した樹脂ＩＲＡ  ９５８（Ｍｗ＝１０００、９．００当量）が入っているカラムに数回通した。ＨＰＬＣで交換を確認した後、樹脂を濾過し、メタノールで３回洗浄した。有機相を合わせて、真空中で部分濃縮した。次いで、濃縮された溶液を水で希釈し、Ｐｄ触媒を添加した。次いで、懸濁液を３５±５℃で少なくとも６時間水素化した。触媒を濾別し、メタノール／水の混合物で３回洗浄した。濾液を合わせて、真空中で蒸発させ、残渣をＤＭＡに懸濁し、残留している水を除去するためにさらに濃縮した。含水率を確認した後、溶液をＨＣｌ（０．１Ｎ）またはＮＭＲで滴定し、その後精製することなく使用した。
【０１１２】
収率（ＮＭＲ含有量測定に基づく）：９３％。
【０１１３】
１２．  Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨの合成
ジペプチドであるＢｏｃ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨの合成を、２つの経路に従って行った：
−Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨの活性化エステルＯＳｕを経由（経路Ａ）
−Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨのＵＮＣＡ（ウレタンＮ保護カルボキシ無水物）の使用を経由（経路Ｂ）。
【０１１４】
経路Ａ：Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＳｕの合成（比較）
撹拌下、１．００当量のＢｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ．１／２Ｈ２Ｏ（Ｍｗ＝２４０．３）および１．０５当量のＳｕｃ−ＯＨ（Ｍｗ＝１１５）を酢酸エチルに添加した。溶液を０±５℃に冷却し、次いで酢酸エチルに希釈した１．１０当量のＤＣＣ（Ｍｗ＝２０６．３）を溶液に注ぎ込んだ。懸濁液を０℃で少なくとも３０分間、さらに室温で少なくとも５時間撹拌した。酢酸２．４２ｇ（０．２０当量）を添加することによって、反応混合物をクエンチした後、ＤＣＵを濾過し、酢酸エチルで２回洗浄した。有機層を、０．５当量のＫＨＳＯ４を含有する５（重量）％のＮａＣｌ水溶液、５（重量）％のＮａＣｌ水溶液；０．５当量のＮａ２ＣＯ３を含有する５（重量）％のＮａＣｌ水溶液、最後に５（重量）％のＮａＣｌ水溶液で洗浄した。溶媒を真空中で濃縮した。濃縮した溶液を酢酸エチルで２回抽出し、残留している水を除去するために、真空中でさらに蒸発させた。濃縮した有機層を、シクロヘキサンまたはヘプタンで希釈した。沈殿した懸濁液を室温で少なくとも３０分間撹拌し、濾過し、最後に真空乾燥した（４５℃）。乾燥した沈殿物から、白色固体のＢｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＳｕが（ＮＭＲ含有量に基づいて）収率８９％で得られた。
【０１１５】
経路Ａ：Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨの合成
まず、２．１０当量のＴＭＡ（Ｍｗ＝１４５．１２）で、１．０１当量のＨ−Ｌｅｕ−ＯＨ（Ｍｗ＝１３１．２）を清澄な溶液が得られるまで約５０℃でシリル化した。溶液を室温に冷却し、酢酸イソプロピルで希釈した。次いで、シリル化されたＨ−Ｌｅｕ−ＯＨ溶液に、１．００当量の固体Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＳｕ（Ｍｗ＝３２８．２６；１００．０％）を添加した。さらに、反応混合物を室温で少なくとも８時間撹拌した。反応の完了をＨＰＬＣで確認した後、ＤＭＡＰＡおよび水を添加することによって溶液をクエンチし、５（重量）％のＮａＣｌ水溶液５００ｍｌにとかしたＫＨＳＯ４（１．００当量）；５（重量）％のＮａＣｌ水溶液５００ｍｌ、および水で洗浄した。酢酸イソプロピルを真空中で蒸発させた後、酢酸イソプロピルと共沸蒸留することによって過剰の水を除去した。濃縮中に、ペプチドが沈殿した。次いで、濃縮した懸濁液をシクロヘキサンに希釈した。沈殿物を室温で少なくとも１０分間撹拌し、濾過し、最後に真空中４５℃で乾燥した。乾燥した沈殿物から、白色固体のＢｏｃ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨが（ＮＭＲ含有量に基づいて）収率８０％で得られた。
【０１１６】
経路Ｂ：Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨの合成
ＤＭＳＯに懸濁した状態の１．１０当量のＨ−Ｌｅｕ−ＯＨ（Ｍｗ＝１３１．２）に、１．００当量のＢｏｃ−Ｉｌｅ−ＮＣＡ（Ｍｗ＝２５７．３）を添加した。次いで、懸濁液を６０±５℃で少なくとも２時間加熱した。変換率をＨＰＬＣで確認した後、反応混合物を酢酸イソプロピルで希釈し、５（重量）％のＮａＣｌ水溶液にとかしたＫＨＳＯ４（Ｍｗ＝１３６；１．００当量）、５（重量）％のＮａＣｌ水溶液、および水で洗浄した。酢酸イソプロピルを真空中で蒸発させた後、酢酸イソプロピルと共沸蒸留することによって過剰の水を除去した。濃縮中に、ペプチドが沈殿した。次いで、濃縮した懸濁液をシクロヘキサンに希釈した。沈殿物を室温で少なくとも１０分間撹拌し、濾過し、最後に真空中４５℃で乾燥した。乾燥した沈殿物から、白色固体のＢｏｃ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨが（ＮＭＲ含有量に基づいて）収率８９％で得られた。
【０１１７】
１３．  ３ＨＣｌ．Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２（配列番号１）の合成
１．００当量の３ＨＣｌ．Ｈ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２（Ｍｗ＝１６５２．９；純度＝８９．０％）をＤＭＡおよびＣＨ２Ｃｌ２にとかした冷（０±５℃）溶液に、１．０５当量のＢｏｃ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ（Ｍｗ＝３４４．４）および１．１０当量のＨＯＯＢｔ（Ｍｗ＝１６３．１３）を添加する。次いで、１．２０当量のＥＤＣ（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド；Ｍｗ＝１９１．７；純度＝１００．０％）を、反応混合物に添加し、さらに０±５℃で約４時間、次いで室温で少なくとも８時間撹拌した。反応の完了をＨＰＬＣで確認した後、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２／イソ−ブタノールの混合物（８／２）で希釈し、５（重量）％のＮａＣｌ水溶液＋ＨＣｌ（０．３当量）で洗浄した。有機層を濃縮した後、残留油を、冷（０±５℃）アセトニトリルにゆっくり注ぎ込むことによって沈殿させた。０±５℃で少なくとも３０分間撹拌した後、懸濁液を濾過し、冷ＭＴＢＥで２回洗浄した。沈殿物を４０±５℃で乾燥した。灰色がかった白色固体が、最終的に得られた。
【０１１８】
収率（ＮＭＲ含有量に基づく）＝８８％。
【０１１９】
１４．  ５ＨＣｌ．Ｈ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号１）の合成
１．００当量のＢｏｃ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２（配列番号１）（Ｍｗ＝１９８０；純度＝８９．０％）を、ペプチドに対して２４当量のＨＣｌ、および６当量の４−（メチルチオ）フェノール（Ｍｗ＝１２４．２）を含有するイソプロパノールにゆっくりと添加した。添加が完了した後、反応混合物をイソプロパノールで希釈した。反応混合物を３５±５℃で少なくとも２時間撹拌した。反応の完了をＨＰＬＣで確認した後、反応混合物を冷イソプロピルエーテルにゆっくりと注ぎ込んだ。沈殿物を０±５℃で少なくとも１５分間撹拌し、次いで濾過し、イソプロピルエーテルで３回洗浄し、最後に真空乾燥して、５ＨＣｌ．Ｈ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号１）を得た。
【０１２０】
１５．  ５ＨＣｌ．Ｈ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号１）の精製
実施例１４で得られた生成物をアセテート緩衝液に溶解し、０．５μｍのメンブランを用いて濾過した。得られた溶液を、ＨＰＬＣで以下のパラメータを使用して精製した：
−カラム：２．０＊２５ｃｍ（ＩＤ＊Ｌ）
−固定相：Ｃ１８シリカ；１０μｍ−１００Ａ
−移動相：Ａ＝アセテート緩衝液、ｐＨ５．０（０．１５Ｍ）
Ｂ＝アセトニトリル
−流量：１９ｍＬ／分
−波長：２５４ｎｍ
−グラジエント（分；Ｂ（％））：（０；１０）  （５；１０）  （６；１８）  （３６；３３）  （３６．１；６０）  （４３；６０）  （４３．１；１０）  （５２；１０）。
【０１２１】
オミガナンペプチド（配列番号１）が、９８％を超える純度で得られた。
【０１２２】
得られた高純度の分画を水で希釈し、同じカラムを使用し、以下の移動相を使用して、酢酸イオンをＣｌ−イオンに変更した：
−カラムの平衡用、水／アセトニトリル  ９５／５（ｖ／ｖ）
−イオン交換用、０．５Ｍ  ＮａＣｌ／ＭｅＣＮ  ９５／５（ｖ／ｖ）
−溶出用、水／ＭｅＣＮ  ６０／４０（ｖ／ｖ）。
【０１２３】
次いで、得られた生成物を濃縮し、凍結乾燥した。
【図１】
0005661032.tif 000002
【配列表】
0005661032000001.app