(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一酸化炭素及び水素の濃度が通常条件の１１％という低濃度である合成ガス発酵リアクタにおいて、クロストリジウム（Clostridium）属の培養を持続させるための方法であって;
（i）二酸化炭素及びエタノールを添加する工程;及び
（ii）遊離酢酸濃度を5g/L未満の遊離酢酸に維持する工程; を含み
（iii）上述の工程（i）及び（ii）を30分以内に行う、前記方法。
【請求項２】
微生物培養を持続させる前記工程（i）及び（ii）が、0-30時間の持続期間を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
pHが、3.5-5.6の範囲に維持される、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
重炭酸塩溶液を添加して、pHを制御する、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
更に、栄養素を前記リアクタに添加する工程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
更に、水を前記リアクタに添加する工程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記水が、新鮮な水、蒸留水、脱イオン水又はこれらの組み合わせである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
更に、前記リアクタを不活性ガスでパージする工程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
更に、撹拌を維持して、懸濁液中の固形分を保持する工程を含む、請求項1に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも1つの酢酸生成微生物を含有する少なくとも1つの還元ガスを含有するガス状基質からアルコールを生成させる微生物発酵方法の改良に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物培養を持続させるための従来の方法が多数存在する。しかしながら、これらの方法は、多くの非効率の欠点をもつ。合成ガス発酵プロセスにおいて種々の基質の存在しない微生物培養を持続させるための追加のより有効な方法が依然として求められている。
3つの酢酸生成微生物の菌株(Drake、1994): ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム(Butyribacterium methylotrophicum)(Grethlein et al, 1990年; Jain et al, 1994)、クロストリジウム・オートエタノゲヌム(Clostridium autoethanogenum)(Abrini et al, 1994)、クロストリジウム・リュングダーリイ(Clostridium ljungdahlii)(Arora et al, 1995; Barik et al, 1988; Barik et al, 1990; 及びTanner et al, 1993)が、合成ガスからの液体燃料製造に用いるのに記載されている。これらのうち、クロストリジウム・リュングダーリイ及びクロストリジウム・オートエタノゲヌムは、COをエタノールに変換させることが知られている。
Gaddy et alの米国特許第5,173,429号には、ATCC No. 49587のクロストリジウム・リュングダーリイ、合成ガス中のCO及びH2O及び/又はCO2及びH2からエタノールと酢酸塩を生成させる嫌気性微生物が開示されている。
Jain et alの米国特許第5,192,673号には、クロストリジウム・アセトビチリクム(Clostridium asetbytylicum)の変異株及びその変異株によるブタノールの製造方法が開示されている。
Gaddy et alの米国特許第5,593,886号には、ATCC No. 55380のクロストリジウム・リュングダーリイが開示されている。この微生物は、廃ガス(例えば、カーボンブラック廃ガス)を基質として用いて酢酸塩とエタノールを嫌気的に生成させることができる。
【０００３】
Gaddy et alの米国特許第5,807,722号には、クロストリジウム・リュングダーリイATCC No. 55380のような嫌気性細菌を用いて廃ガスを有機酸やアルコールのような有益な生成物に変換するための方法と装置が開示されている。
Gaddy et alの米国特許第6,136,577号には、クロストリジウム・リュングダーリイATCC No. 55988及び55989のような嫌気性細菌を用いて廃ガスを有機酸やアルコール(特にエタノール)のような有益な生成物に変換するための方法及び装置が開示されている。
Gaddy et alの米国特許第6,136,577号には、クロストリジウム・リュングダーリイの嫌気性菌株を用いて廃ガスを有機酸やアルコール(特に酢酸)のような有益な生成物に変換するための方法及び装置が開示されている。
Gaddy et alの米国特許第6,753,170号には、酢酸の生成のための嫌気性微生物発酵プロセスが開示されている。
Gaddy et alの米国特許第7,285,402号には、アルコールの生成のための嫌気性微生物発酵プロセスが開示されている。
酢酸生成微生物の他の菌株、例えば、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム (Grethlein et al, 1990, Appl. Biochem. Biotech. 24/24:875-884); クロストリジウム・オートエタノゲヌム(Abrini et al, 1994, Arch. Microbiol. 161:345-351)もまた、合成ガスからの液体燃料製造に用いるのに記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
種々の基質が低濃度であるか又は存在しない合成ガス発酵プロセスにおいて培養物を保存することが当該技術において依然として求められている。アルコール製造の工業プロセスにおいて様々な中断の場合に培養を持続することが求められている。特に、種々の濃度にCO、H2、又はCOとH2が低下する場合に、微生物培養を持続させることが依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、種々の基質が低濃度であるか又は存在しない合成ガス発酵リアクタにおいて微生物培養を持続させるための方法であって: 二酸化炭素を加え、更に必要によりアルコールを加えてもよい工程; 遊離酢酸濃度を維持する工程; 及び上述の工程を指定された時間内で行う工程を含む、前記方法に関する。
本発明は、更に、種々の基質が低濃度であるか又は存在しない合成ガス発酵リアクタにおいて微生物培養の急速な損失を防止するための方法であって: 二酸化炭素を加え、更に必要によりアルコールを加えてもよい工程; 温度を操作温度から低下させる工程; 遊離酢酸濃度を維持する工程; 及び上述の工程を指定された時間内で行う工程を含む、前記方法を企図する。
本発明は、更に、供給ガス供給量中の種々の基質が低濃度であるか又は存在しないことによる合成ガス発酵リアクタにおける微生物培養を持続させるための方法であって: 二酸化炭素を加え、更に必要によりアルコールを加える工程; 温度を操作温度から低下させる工程; 遊離酢酸濃度を維持する工程; 及び上述の工程を指定された時間内で行う工程を含む、前記方法を提供する。
本発明の実施態様として、アルコールを基質として用いることができる。別のいくつかの増殖基質が試されたが、いずれもアルコールのように行われず、いずれもアルコールほど容易に利用可能ではない。合成ガス供給量が回復する場合、微生物培養は、容易に再び合成ガスを利用する。更に、実施態様として、酢酸塩/アルコール経路のみを用いると、培養ブイヨン又はプロセス配管に存在することができる他の競合細菌が増殖する機会を与えない。一方、グルコースのような増殖基質は、増殖のために存在するいかなる生物体にも容易に利用できる。
従来技術は、遊離酢酸濃度を低く維持するために培養ブイヨンの調整を含む。これらは、pHを上昇させるとともに液体の流れを増大させて、アセチルを流出させることを含む。実施態様として、培養活性を低下させるために温度を下げ、生成物エタノール及び二酸化炭素を用いてエネルギーを培養物に戻して、生存能力を維持する。更に、新規な別の基質の概念を含む。
ガス化装置の供給原料の供給、装置の運搬、装置の乾燥、ガス浄化又はガス供給ラインに沿った他のいかなるユニットの中断によりガスの供給が中断されるときがあることから、これはプロセスに対する改善となる。本発明の他の適用は、種菌を1つの部位から他の部位へ運搬することを含む。運搬中、培養物は合成ガス供給を有し得ないので、別の基質が要求される。生存能力を12時間以上維持する能力を有することによって、プロセス能力が改良される。それ故、経済的且つ技術的に実行可能な代替物を有することによって、アルコール製造における中断及び/又は下降、加えてプラントの始動及び再始動が最小になる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】本発明の通常操作中に企図される全体のプロセスフローの実施態様を示す概略図である。図にエタノールが示されているが、他のアルコールもまた、本発明により企図される。
【図２】二酸化炭素添加、アルコール消費、及び培養物回復の傾向を示す本発明の実施態様を示す概略図である。
【図３】アルコール消費がないこと及び培養物回復がないことを示す、本発明の比較を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
定義
他に定義されない限り、本明細書を通して用いられる以下の用語は、次のように定義される。
いかなる量をも修飾する用語“約”は、例えば、実験室、パイロットプラント、又は製造設備におけるような、微生物培養を持続させる現実世界の条件において遭遇するその量の変動を意味する。例えば、混合物に使われる成分の量は、“約”で修飾されるとき、製造プラント又は実験室の実験条件で測定時に典型的に使われる変動量と注意の程度を含む。例えば、生成物の成分の量が“約”で修飾されるとき、プラント又は実験室での複数の実験でのバッチ間の変動量及び分析手法の固有の変動量を含む。“約”で修飾されるか否かによらず、その量は、それらの量に等しい量を含む。本明細書に記載され且つ“約”で修飾されたいかなる量もまた、“約”で修飾されない量として本発明で使うことができる。
他に記載されない限り、用語“酢酸塩”は、発酵ブイヨンに存在する分子又は遊離酢酸と酢酸塩の混合物を記載するために用いられる。分子酢酸と酢酸塩との比は、システムのpH、即ち、一定の“酢酸塩”濃度では、pHが低くなるにつれて、酢酸塩に対して分子酢酸濃度が高くなる。
用語“酢酸生成微生物”又は“酢酸生成微生物の”は、嫌気呼吸の生成物として酢酸塩を生じる細菌を意味する。このプロセスは、酢酸塩発酵とは異なるが、双方とも無酸素下で起こり、酢酸塩を生成する。全ての既知の酢酸生成微生物は細菌であることから、これらの生物体は酢酸生成菌とも呼ばれる。酢酸生成微生物は、一般的には嫌気的な(酸素のない)様々な環境で見られる。酢酸生成微生物は、エネルギー源及び炭素源として種々の化合物を用いることができ; 最も研究されている酢酸生成代謝は、炭素源として二酸化炭素、エネルギー源として水素の使用を必要とする。
【０００８】
用語“バイオリアクタ”、“リアクタ”又は“発酵バイオリアクタ”は、連続撹拌タンクリアクタ(CSTR)、固定化細胞リアクタ(ICR)、トリクルベッドリアクタ(TBR)、気泡塔、ガスリフト発酵槽、静的ミキサ、又は気液接触に適当な他のデバイスを含む、1つ以上の容器及び/又はタワー又は配管装置からなる発酵デバイスを含む。好ましくは、本発明の方法については、発酵バイオリアクタは、生成物のほんど、エタノールが生成される第2の発酵バイオリアクタに発酵ブイヨンを供給する増殖リアクタを備えている。
本明細書中の“細胞濃度”は、試料1リットル当たりの細菌の乾燥質量に基づく。細胞濃度は、直接的に又は光学密度の相関で較正することによって測定される。
本明細書に用いられる用語“連続方法”は、連続の栄養素供給、基質供給、バイオリアクタ内の細胞生成、バイオリアクタからの細胞の除去(又はパージ)、及び生成物の除去を含む発酵方法を意味する。この連続の供給、除去又は細胞生成は、同じ流れで生じてもよく、異なる流れで生じてもよい。連続のプロセスにより、バイオリアクタ内での定常状態が達成されることになる。“定常状態”は、これらの測定できる変数(即ち、供給速度、バイオリアクタ内に維持された基質及び栄養素濃度、バイオリアクタ内の細胞濃度、及びバイオリアクタからの細胞除去、バイオリアクタからの生成物除去だけでなく、温度及び圧力のような条件変数)の全てが、経時一定であることを意味する。
“エタノール生産性”は、定常状態のエタノール濃度と連続システムでの液体保持時間(LRT)との比、又はエタノール濃度とバッチシステムでその濃度を生成するために必要な時間との比として計算されるエタノールの容積生産性である。語句“高エタノール生産性”は、1日10g/Lを超えるエタノールの容積生産性を記載している。
【０００９】
“過剰のH2”は、供給ガス中のH2モル数と、変換されたCOモル数の2倍と変換されたCO2モル数の3倍の合計との比が、1.0を超えるときに、エタノール生産に利用できる。この比が1.0未満である場合には、過剰のH2は、利用できず、エタノールは異なる制御機構によってのみ生成され得る。
用語“発酵”は、COのアルコール及び酢酸塩への発酵を意味する。多くの嫌気性細菌が、COの、ブタノール及びエタノールを含むアルコールの、酢酸への発酵を行うことができることが知られており、本発明のプロセスで用いるのに適している。本発明で用いるのに適したこのような細菌の例は、国際公開第00/68407号、欧州特許第117309号、米国特許第5,173,429号、5,593,886号、6,368,819号、国際公開第98/00558号及び国際公開第02/08438号に記載されたものを含む、クロストリジウム・リュングダーリイ、及びクロストリジウム・オートエタノゲヌム(Aribini et al, Archives of Microbiology 161: pp 345-351)の菌株のようなクロストリジウム属の細菌が挙げられる。他の適当な細菌は、モーレラ(Moorella) sp HUC22-1(Sakai et al, Biotechnology Letters 29: pp 1607-1612)を含むモーレラ属のもの、及びカーボキシドサーマス(Carboxydothermus)属(Svetlichny, V. A., Sokolova, T. G. et al (1991), Systematic and Applied Microbiology, 14: 254-260)のものを含む。これらの文献の各々の開示は、全体として本願明細書に含まれるものとする。更に、当業者は、本発明のプロセスで用いるために、他の酢酸生成嫌気性細菌を選ぶことができる。また、2つ以上の細菌の混合培養物を本発明のプロセスに用いることができることも理解される。本発明に用いるのに適切な1つの微生物は、DSMZから商業的に入手可能で寄託番号DSMZ10061のDSMZの識別特性を有するクロストリジウム・オートエタノゲヌムである。発酵は、連続撹拌タンクリアクタ(CTSR)、気泡塔リアクタ(BCR)又はトリクルベッドリアクタ(TBR)のような適切ないかなるバイオリアクタ内で行うことができる。また、本発明のある好ましい実施態様において、バイオリアクタは、微生物が培養される第1の成長リアクタと、成長リアクタからの発酵ブイヨンが供給され、且つ発酵生成物(エタノール及び酢酸塩)のほとんどが生成される第2の発酵リアクタを有する。
【００１０】
本明細書に用いられる“ガス状基質”は、CO単独、CO及びH2、CO2及びH2、又はCO、CO2及びH2を意味し、必要により、気体状態の窒素やメタンを含む、他の元素又は化合物を混合されていてもよい。このようなガス状基質には、典型的には、ガス又は流れが含まれ、これらは直接に又は燃焼によって雰囲気に放出されるか又は排出される。この方法のいくつかの実施態様において、ガス状基質は、COを含む。この方法の他の実施態様において、ガス状基質は、CO2及びH2を含む。更に他の実施態様において、ガス状基質は、CO及びH2を含む。特に好ましい実施態様において、ガス状基質は、CO、CO2及びH2を含む。本発明の更に他の基質には、上述の成分と窒素、CO2、エタン及びメタンの少なくとも1つのガスとが含まれてもよい。従って、このような基質には、(メタンを含む)炭素生成物のガス化から“合成ガス”又は合成ガスだけでなく、種々の工業方法から廃ガスと通例呼ばれるものも含まれる。
語句“高濃度のエタノール”は、発酵ブイヨン中10g/Lを超える、好ましくは15g/Lを超えるエタノール又はエタノールと酢酸塩との生成物比5:1以上を意味する。
用語“制限基質”又は“制限栄養素”は、バイオリアクタにおける細菌の培養増殖の間、バイオリアクタにおける定常状態又は安定な細菌増殖をもはや支持しないレベルまで培養によって減少している栄養素培地又はガス状基質中の物質を定義する。従って、栄養培地又はガス状基質中の他のすべての物質は、過度に存在し、“非制限”である。制限の証明は、制限基質の培養物への添加速度、即ち、栄養素供給速度又はガス供給速度の増加が細胞密度の増加によるガス取り込み速度の対応する増大を引き起こすことである。
【００１１】
用語“微生物”には、細菌、真菌、古細菌、原生生物; 顕微鏡的植物(緑藻類と呼ばれる); プランクトン、プラナリア、アメーバのような動物が含まれる。ウイルスを含む人もいれば、これらを非生物とみなす人もいる。微生物は、土壌を含む液体水、海底上の、大気圏内では高く且つ地殻の中の岩の内部では深い熱水泉がある、生物圏のすべての部分に生存する。微生物は、それらが分解するものとして作用するように、生態系における栄養再循環に重要である。微生物は、また、バイオテクノロジーにおける、従来の食品及び飲料調製双方における、及び遺伝子工学に基づく現代的なテクノロジーにおける人々によって開発されている。種々の微生物の菌株を含有しても含有しなくてもよい混合菌株微生物が本発明において利用されることが想定される。更に、組み換えDNA技術が既存の微生物の選択された菌株を用いて微生物を作成することができることも想定される。本発明のいくつかの実施態様において、C.リュングダーリイのいくつかの例示的菌株は、菌株PETC(米国特許第5,173,429号); 菌株ERI2(米国特許第5,593,886号)及び菌株C-01及びO-52(米国特許第6,136,577号)を含む。これらの菌株は、各々、受託番号: それぞれ55383(以前の受託番号49587)、55380、55988及び55989としてアメリカンタイプカルチュアコレクション、10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209に寄託されている。C.リュングダーリイの菌株の各々は、約22モル%のグアニンとシトシン(G+C)ヌクレオチド含量を有する嫌気性グラム陽性菌である。これらの細菌は、増殖のために種々の基質を用いるが、メタノールも乳酸塩も用いない。これらの菌株は、CO許容量、特定のガス取り込み速度及び特定の生産性が異なる。実際に見いだされる“野生”株においては、ごくわずかなエタノール生産しか認められない。C.リュングダーリイの菌株は、37℃で理想的に作用し、典型的には、“野生”状態で約1:20(アセチル20部に対してエタノール1部)のエタノールとアセチル(即ち、遊離酢酸又は分子酢酸及び酢酸塩の双方を意味する)生成物との比を生じる。エタノール濃度は、典型的にわずか1-2g/Lである。エタノールを生成するこの能力は興味があるが、エタノール生産性が低いことから、“野生”細菌は商業ベースでエタノールを経済的に生成させるために使用することができない。微少の栄養素操作については、上述のC.リュングダーリイを、1:1(等量のエタノールとアセチル)の生成物比を有するエタノールとアセチルを生成させるために用いたが、エタノール濃度は、10g/L未満、1日10g/Lより低い低生産性を生じるレベルである。更に、培養安定性が、主にエタノールの存在と組み合わせて比較的高い(8-10g/L)濃度のアセチル(2.5-3g/Lの分子酢酸)による問題である。更にまた、より多くのエタノールを生成させる努力としてガス速度を増加するので、培養が最初に分子酢酸によって、次に、COによって阻止される。結果として、培養が不安定になり、ガスを取り込み且つ追加の生成物を生成させない。更に、本発明者による初期の研究から、定常状態操作において2:1を超えるエタノールとアセチルとの比を生成させることが難しいことが示された。例えば、特に、Klasson et al., 1990 Applied Biochemistry and Biotechnology, Proceedings of the 11.sup.th Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals, 24/25: 857; Phillips et al., 1993 Applied Biochemistry and Biotechnology, Proceedings of the 14.sup.th Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals, 39/40: 559を参照のこと。多くの文献には、溶媒を生成するためにCO、CO2及びH2を消費しない糖類の発酵においてC.リュングダーリイ以外の嫌気性細菌の使用が記載されている。高収量のエタノールを得る試みとして、以下を含む種々のパラメーターが変えられている: 栄養素のタイプ、微生物、還元剤の特定の添加、pHの変動、及び外因性ガスの添加。例えば、Rothstein et al, 1986 J. Bacteriol., 165(1):319-320; Lovitt et al, 1988 J. Bacteriol., 170(6):2809; Taherzadeh et al, 1996 Appl. Microbiol. Biotechnol., 46:176を参照のこと。
【００１２】
用語“混合菌株”は、2つ以上の微生物の混合培養物を意味する。上文に挙げた微生物のこのような“混合菌株”は、本発明の方法に用いられる。
用語“自然状態”は、通常存在する追加の電子又はプロトンを有しない化合物、元素、又は経路を記載する。逆に、用語“還元状態”は、1つ以上の電子の過剰を有する化合物、元素又は経路を記載する。“還元状態”は、“自然状態”に1つ以上の電子を加えることによって、即ち、発酵ブイヨンのレドックス電位を低下させることによって達成される。
“栄養培地”は、一般的には選択された対象細菌の増殖を可能にするのに充分なビタミン及びミネラルを含有する従来の細菌増殖培地を記載するために用いられる。糖類は、これらの培地に含まれない。本発明の使用に適切な種々の栄養培地の成分は、本発明者らのものを含む、以前の文献において知られ報告されている。例えば、国際出願公開第08/00558号; 米国特許第5,807,722号; 同第5,593,886号及び同第5,821,111号、並びに上で確認された文献に記載された栄養培地配合物を参照のこと。本発明によれば、CO、CO2及びH2からの酢酸塩生産に典型的な実験用栄養培地は、0.9mg/Lのパントテン酸カルシウムを含有する。しかしながら、CO、CO2及びH2からのエタノール生産に典型的な実験用栄養培地は、0.02mg/Lのパントテン酸カルシウムを含有する。
【００１３】
用語“還元ガス”は、CO又はH2のいずれか又は双方を意味する。語句“細菌の増殖に必要とされる量を超える還元ガスの量”は、細菌が増殖又は代謝に使用し得る量を超える還元ガスの量が栄養培地成分に与えられることを意味する。この量は、正味の量の還元ガスを増加させることによって又は重要な栄養素成分を減少させることによって達成させることができるので、過剰のガスがガスを増加させずに、又は細菌へのガス送達速度を増加させることによって達成される。細菌が増殖に必要とされるより多くの還元ガスにさらされる場合、細菌はエタノールを生成を増加させることによって応答する。“対象細菌”は、酢酸生成嫌気性(又は通性)細菌であり、これらはCOと水又はH2とCO2をエタノール及び酢酸生成物に変換することができる。本発明に有効な細菌としては、アセトゲニウム・キブイ(Acetogenium kivui)、アセトバクテリウム・ウッディ(Acetobacterium woodii)、アセトアネロビウム・ノテレ(Acetoanaerobium noterae)、クロストリジウム・アセチクム(Clostridium aceticum)、ブチリバクテリウム・メチロトロフィクム(Butyribacterium methylotrophicum)、C.アセトブチリクム(acetobutylicum)、C.テルモアセチクム(thermoaceticum)、ユーバクテリウム・リモスム(Eubacterium limosum)、C.リュングダーリイ PETC、C. リュングダーリイ ERI2、C. リュングダーリイ C-01、C. リュングダーリイ O-52、及びペプトストレプトコッカス・プロダクツス(Peptostreptococcus productus)が挙げられるがこれらに限定されない。他の酢酸生成嫌気性細菌は、当業者がこれらの方法に用いるように選ばれる。
用語“合成ガス”は、種々の量の一酸化炭素と水素を含有するガス混合物に与えられる名称である合成ガスを意味する。生産方法の例としては、いくつかのタイプの廃棄物エネルギーガス化設備において水素を生成させる天然ガス又は液体炭化水素の水蒸気改質が挙げられる。名称は、合成天然ガス(SNG)を生成させるための中間体及びアンモニア又はメタノールを生成させるための中間体としての使用に由来する。合成ガスは、また、フィッシャー-トロブシュ合成、以前はモービルのメタノールのガソリンへのプロセスによって燃料又は潤滑剤として用いられる合成石油を生成させる際の中間体として用いられる。合成ガスは、主に水素、一酸化炭素、及び非常に多くの場合いくらかの二酸化炭素からなり、天然ガスのエネルギー密度の半分未満を有する。合成ガスは、燃焼性であり、しばしば、燃料源として又は他の化学薬品の製造のための中間体として用いられる。
【００１４】
発明の詳細な実施態様
本発明は、種々の基質の濃度が低いか又は存在しない合成ガス発酵リアクタにおいて微生物培養を持続させる方法であって: 二酸化炭素を添加し、更に必要によりアルコールを添加してもよい工程; 遊離酢酸濃度を5g/L未満の遊離酢酸に維持する工程; 及び上述の工程を0-30分以内、0-15分以内、15-30分以内に行う工程を含む、前記方法に関する。
本発明は、更に、種々の基質の濃度が低いか又は存在しない合成ガス発酵リアクタにおいて微生物培養の急速な損失を防止するための方法であって: 二酸化炭素を添加し、更に必要によりアルコールを添加してもよい工程; 温度を0-25℃に維持しつつ操作温度から0-25℃に温度を低下させる工程; 遊離酢酸濃度を5g/L未満の遊離酢酸に維持する工程; 及び上述の工程を0-30分以内、0-15分以内、15-30分以内に行う工程を含む、前記方法を企図する。
本発明は、更に、供給ガス供給量中の種々の基質の濃度が低いか又は存在しない合成ガス発酵リアクタにおいて微生物培養物を持続させる方法であって: 二酸化炭素を添加し、更に必要によりアルコールを添加してもよい工程; 温度を0-25℃に維持しつつ操作温度から0-25℃に温度を低下させる工程; 遊離酢酸濃度を5g/L未満の遊離酢酸に維持する工程; 及び上述の工程を0-30分以内、0-15分以内、15-30分以内に行う工程を含む、前記方法を提供する。
実施態様として、微生物培養を持続させる前記工程は、約0-30時間の持続期間を含む。実施態様として、pHは、約3.5-5.6の範囲に維持され得る。重炭酸塩溶液を添加して、pHを制御することが更に企図される。重炭酸塩溶液は、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、及び/又は重炭酸カリウムを含むことができる。本発明の実施態様は、必要により前記二酸化炭素を前記リアクタへ取り出してもよい方法を提供する。更にまた、実施態様として、必要により前記リアクタに栄養素を添加してもよい工程が提供される。本発明は、必要により栄養素を前記リアクタに添加してもよい工程を提供する。
【００１５】
本発明の実施態様は、更に、以下の1つ以上を含むアルコールを供給する: エタノール、ブタノール、エタノール及びブタノール。
必要により、温度を0-25℃に維持しつつ、温度を操作温度から0-25℃に下げてもよく; 必要により、水が前記リアクタに添加されてもよい。この水は、新鮮な水、補給水、再循環水、蒸留水、脱イオン水又はこれらの組み合わせを含むことができる。
本発明は、前記微生物培養が少なくとも1つの酢酸生成菌を含有する方法を企図する。微生物培養は、クロストリジウム(Clostridium)、ムーレラ(Moorella)及びカーボキシドサーマス(Carboxydothermus)又はこれらの遺伝子修飾物より選ばれる1つ以上の菌株を含むことができる。
実施態様として、微生物は、PETC、ERI-2、O-52及びC-01又はこれらの組み合わせからなる菌株より選ばれるクロストリジウム・リュングダーリイを含むことができる。
本発明は、また、微生物培養が合成ガスの添加を含む懸濁条件前に戻される方法を提供する。
必要により、実施態様として、本発明は以下を提供してもよい: 透過物を取り出す工程; 前記リアクタを不活性ガスでパージする工程; 又は低撹拌を維持して、固形分を懸濁液中に保持する工程。
本発明の他の態様及び利点は、更に以下詳細な説明に記載される。
一酸化炭素及び/又は水素及び二酸化炭素(合成ガス)を利用してアルコールを生成させる酢酸生成独立栄養細菌は、アルコールを生成するためにガスの一定の供給を必要とする。エタノール生産における中間生成物は酢酸であり、これは細胞間及び細胞外であり得る。充分な合成ガス供給なしで制限されたアルコールは、酢酸を支持して生成される。
中間生成物、酢酸の生成に利用可能な合成ガスが減少するか又はまったくない場合の条件の間、培養により、二酸化炭素の存在下にアルコールを酢酸に変換することができる。エタノールは、培養ブイヨンにすでに存在し、合成ガスが制限された又はまったくない場合には容易に利用可能である。必要に応じて追加のアルコールが供給され得る。二酸化炭素は、CO2ガスを培養内に吹き込むことによって添加することができるか又は重炭酸塩の添加によって培養ブイヨン中に形成させることができる。望ましいpHを維持するために重炭酸ナトリウムを発酵に用いることができ、それ故容易に利用可能である。酸性培養ブイヨンにおいて、重炭酸バッファが反応して二酸化炭素を形成する。次に、形成された二酸化炭素は細菌が利用でき、アルコールを酢酸に変換する。
【００１６】
二酸化炭素の存在下にアルコールの遊離酢酸への変換は、比較的速いプロセスである。クロストリジウム・リュングダーリイのような微生物は、培養ブイヨンにおいて耐えられ得る遊離酢酸の濃度に制限される。合成ガスの減少又は低下の間、遊離酢酸の濃度を制御する工程を必要とする。このような一制御方法は、温度操作によるものである。中温範囲内の温度上昇は、培養活性速度を増加させる。一方、発酵ブイヨン中の温度低下は、これらの速度を低下させる。それ故、温度を低下させると、ガス条件の低下した又はまったくない間、培養の活性を遅らせるのに有効であり、酸の生産がより緩慢になる。遊離酢酸制御の他の方法は、培養pHを変えることである。アセチルと酢酸との平衡は、pHによって部分的に制御される。合成ガス供給中断の間、pHを上げることにより、より低い遊離酸の濃度を維持しつつ総アセチル濃度、アセチルと酢酸をより高くすることが可能になる。
遊離酸濃度を制御する可能性を有する第3の方法は、システムを通る液体の流れの増加である。遊離酸の濃度が増加するにつれて、透過物パージの増加のよるシステムへの液体流の流れを増加させると、不必要な細胞流出を防止しつつ培養からより多くの遊離酸が洗浄される。システムへの追加の液体は、追加の水流であっても栄養素供給流の流れの増加であってもよい。
【００１７】
標準操作条件下のプロセスの詳細な説明
本発明は、少なくとも1つの還元ガス、特に工業廃棄物のガス状成分及び合成ガス(例えば、CO、CO2及びH2)を含有するガス状基質をエタノールに嫌気性発酵させる方法を必要とする。これらの方法により、対象細菌の生物学的経路を操作することによって1日10g/Lより大きいエタノール生産性が得られる。本発明の一方法は、NAD(P)より多量のNAD(P)Hを引き起こすものである。NAD(P)HのNAD(P)への酸化によって、培養によって生成される酢酸がエタノールに還元される。或はまた、本発明の嫌気性発酵において高濃度のエタノールを生産する他の方法は、発酵ブイヨンのレドックス電位を低下させ、それによって酢酸をエタノールに還元させることを必要とする。本発明の方法は、高エタノール濃度(即ち、約10g/Lより大きい、好ましくは約15g/Lより大きい)及び低酢酸塩濃度(即ち、バイオリアクタにおいて約5g/L未満の遊離酢酸)を生じる。これらの方法は、また、エタノール及び酢酸の連続生産の方法条件を維持し且つ制御して、システムを方法の不調から急速に回復させるのを助ける。更に、本発明の方法は、培養性能に有害であり得る、低栄養素濃度に対して培養順化を防止するのを助ける。本発明は、エタノール生産の実行可能な商業的方法を提供する。
【００１８】
標準操作条件下に本発明の方法に用いられる生物学的経路
理論によって縛られることを望まないが、本発明者らは、本明細書に記載される方法からエタノールの嫌気性生産を増加させる方法は、独立栄養増殖のための酢酸生成経路の基本的な経路サイクルにおいてNAD(P)HのNAD(P)への変換を必要とする生物学的経路に基づくと理論づける。本発明は、安定な操作条件下に低酢酸塩濃度を有する高濃度のエタノールの連続生産及び維持を可能にするためにこれらの経路を操作し、それによって、工業用ガスからエタノール生産に商業的に有効な方法を提供することを必要とする。生物学的経路におけるNADH(P)とNAD(P)との本質的な関係は、以下のように記載される: CO、CO2、及びH2のようなガス状成分からエタノールの生産は、3工程の生物学的方法において行われる。第1の工程において、基質CO及びH2は、酸化され、この際に、NAD(P)Hを放出する: NAD(P) → NAD(P)H CO+H2+H2O → CO2+4H+
次に、工程1の生成物は、酢酸に変換され、工程にはNAD(P)Hを必要とする: NAD(P)H → NAD(P) CO+CO2+6H+ → CH3COOH+H2O
最後に、工程1の反応が工程2の反応より速い速度で進行することから過剰のNAD(P)Hが利用可能である場合には、酢酸はエタノールに還元される。NAD(P)H → NAD(P) CH3COOH+4H+ → C2H5OH+H2O
従って、基質から過剰のNAD(P)Hの利用可能性の酸化は、酢酸からエタノールの生産につながる。
【００１９】
酢酸生成経路には2つの既知の基本的な経路サイクルがある: (1)アセチル-CoAサイクル及び(2)THFサイクル、ここで、CO2はメチル基に還元される。そこからエタノール及び酢酸の生成のための順序は、J. R. Phillips et al, 1994 Applied Biochemistry and Biotechnology, 45/46:145に示されている。アセチル-CoAサイクルは、本明細書においてCOサイクルと呼ばれる内部サイクルを有する。COサイクルは通常時計回りに反応するので、フェレドキシンが還元される。フェレドキシンは、酵素ヒドロゲナーゼにより酸化されるのでH2によって還元され得る。結果として、アセチル-CoAサイクルも時計回りに反応し、フェレドキシンが酸化される。内部COサイクルとアセチル-CoAサイクルが同じ速度で反応する場合には、フェレドキシンはレドックス状態の平衡にある。しかしながら、これらの2つのサイクルが同じ速度で行われない、即ち、COサイクルがアセチル-CoAサイクルより速い速度で反応する場合には、還元フェレドキシンが蓄積される。また、過剰のH2については、還元フェレドキシンも過度に生成され得る。この過剰の還元フェレドキシンは、NAD(P)をNAD(P)Hに再生(還元)させ、これが平衡状態に軽減されなければならない過剰となり、その際に酢酸をエタノールに還元させる。
THFサイクルは、細胞増殖に機能し、連続培養に必要であり; それ故、それを完全に停止することができない。THFサイクル速度を低下させることは、より高いNAD(P)HとNAD(P)との比を引き起こすのに役に立つ。NAD(P)Hは、2つの場所において酸化される。この酸化を制限し、全細胞のNAD(P)HとNAD(P)との比を平衡に保つことによって、NAD(P)Hが酢酸をエタノールへ還元するのに用いられる。
酢酸をエタノールに還元させる第2の基本的な方法は、発酵ブイヨンのレドックス電位を直接低下させることによる。培養物の自然状態より充分に低い低下状態は、NAD(P)Hを豊富にさせるとともに酢酸のエタノールへの還元を促進させる。
【００２０】
標準操作の方法
この方法の基本的な工程は、以下を含む: 生成物回収を有する連続発酵方法は、図1によって記載される。少なくとも一つの還元ガス、例えば、CO又はH2を含むガス状基質1の連続流は、選択されたガス供給速度で供給され、選択された栄養素供給速度の液相栄養培地2の連続流は、対象細菌を含有する発酵バイオリアクタ3に供給される。バイオリアクタ3において、培地及びガス状基質は、細菌によって発酵され、エタノール及び酢酸を生成させる。安定な細胞濃度が定常状態条件下で達成されると、バイオリアクタ内の遊離酢酸濃度を5g/L未満に保持しつつ、発酵ブイヨンにおいて、連続システムの成分を処理して、レドックス電位が低下するか、又はNAD(P)HとNAD(P)との比が増加する。本発明の方法は、1:1〜20:1のエタノールと酢酸塩との比においてエタノール生産性が1日10g/Lより大きいように発酵ブイヨンにおけるエタノール及び酢酸塩の生産を可能にし且つ維持するように設計される。一実施態様において、その比は3:1より大きい。他の実施態様において、その比は5:1より大きい。更に他の実施態様において、その比は10:1より大きい。更に他の実施態様において、その比は15:1より大きい。又は、本発明の方法は、良好な方法安定性を有するCO、CO2及びH2から高エタノール濃度(15-35g/Lのエタノール)及び低酢酸塩濃度(0-5g/Lの酢酸塩)、即ち、エタノールと酢酸塩生成物との比3:1以上の安定な連続(定常状態)生産を増強するのに有効である。
定期的に、本発明の方法の過程で、ブイヨンの試料を取り出して、従来の分析法によって比を決定する。例えば、例えば、遠心分離によって、細胞を試料から分離し、次に、無細胞試料を分析法、例えば、ガスクロマトグラフィの好ましい方法にかける。しかしながら、他の従来の分析法は、当業者によって選択される。方法の追加の選択的工程は、比を達成し更に/又は維持するように加えられる。
【００２１】
システム成分を操作し且つ望ましいエタノール生産性又はエタノールと酢酸塩との比を維持し更に/又は達成するために用いられる工程は、次の工程の少なくとも1つ、望ましく組み合わせを含む: 栄養培地含量、栄養素の供給速度、水の供給速度、操作圧を変える工程、pH、ガス状基質含量、ガス供給速度、発酵ブイヨン撹拌速度を作動させる工程、生成物阻止段階を避ける工程、バイオリアクタにおける細胞密度を減少させる工程、又は基質阻止を防止する工程。ある好ましい操作は、バイオリアクタに液相栄養素(パントテン酸塩又はコバルト)制限、供給ガス中わずかに過剰のCO及びH2を供給する工程、酢酸塩濃度を最小限にする工程、低液相栄養素濃度に対して培養順化を避ける工程、培養物を比較的速い速度で適切な細胞濃度にする工程、培養物のpHを4.5より上げる工程、バイオリアクタから細菌の細胞をバイオリアクタにおいてすべての還元ガス又は栄養素基質を利用する安定な定常状態濃度より低い細胞濃度までパージする工程及び発酵バイオリアクタブイヨンに存在する酢酸塩の遊離酢酸部分が2g/Lを超える場合、水の供給速度を増加させ、それによって、遊離酢酸の濃度の望まれていない増加を阻止する工程を含む。これらの工程の全てを以下に詳細に記載する。
CO、CO2及びH2以外のガスを含有する排出ガス4及びリアクタから変換されていないCO、CO2及びH2をリアクタから排気し、それらの燃料に用いられる。制御機序として過剰のH2が使われる場合には、出口ガスにおけるH2分圧及び流出ガスにおけるH2分圧とCO2分圧との比はその工程によってエタノールと酢酸塩との比の制御を確認するために用いられる。細胞再循環は、バイオリアクタ内部で細胞の濃度を増加させるので、CO、CO2及びH2変換に対してより多くの生体触媒を供給するために用いられる(が、必要とされない)。細胞再循環については、リアクタ5から液体溶出液が、細胞7及び透過物(細胞を含まない液体) 8が分離される細胞分離器6に送られる。細胞7はバイオリアクタに戻され、透過物8は生成物回収に送られる。
【００２２】
細胞分離は、連続遠心分離機、中空繊維又はスパイラル型ろ過システム、セラミックろ過システム又は他の固体/液体分離器)を用いることにより達成される。エタノールは、蒸留や吸着を含む種々の技術によって、透過物(又は、細胞分離が使われない場合にはリアクタ5からの溶出液)から回収され得る。透過物8は、蒸留塔において分離されて、95%エタノール塔頂留出物10、及びリアクタ3に再循環するための水11が得られる。再循環水11は発酵において用いられない過剰の栄養素を含有するが、発酵又は細胞溶解から過剰のビタミンは熱蒸留によって破壊される。95%エタノール塔頂留出物10は分子ふるい12に送られ、ここで、無水エタノール13、望ましい最終生成物が蒸留塔9に戻される希エタノール14から分離される。
増殖、死滅及び細胞パージの連続組み合わせは、エタノール(及び少量の酢酸)を生成させるのに用いられる連続法が追加の培養補充をせずに栄養素とともにCO、CO2及びH2を供給させることによって数ヶ月間作動させることができるように、一定細胞濃度を維持する。本発明の方法は、連続エタノール及び酢酸生産のための条件を維持するとともに制御し、更に方法の不調を防止するか又は急速に修正する。本発明の方法は、また、培養性能に有害であり得る、低栄養素濃度に対して培養順化を防止するのを助ける。下記の説明で及び実施例で、特にことわらない限り、用いられる圧力は1気圧であり、用いられる温度は36-41℃である。望ましい温度と圧力は当業者によって決定されてもよく、バイオリアクタに用いるのに選ばれる微生物に左右される。
以下に詳しく記載される、本発明の基本的な工程に加えられる種々の操作は、エタノールの増強された生産を可能にする。好ましくは、液相栄養素制限(パントテン酸塩又はコバルト)又は過剰のH2又はCOの使用は、以下に詳述される、望ましいエタノール生産性を達成するとともに維持し且つ発酵ブイヨンにおいて安定な濃度及びエタノールと酢酸塩との比の生産を可能にする。これらの条件は、発酵ブイヨンにおいて安定な濃度のエタノールと酢酸塩の生産を可能にする。好ましい実施態様において、発酵ブイヨンにおいて生成されるエタノールと酢酸塩生成物比は10:1より大きく、エタノール濃度は15g/Lより大きい。
【００２３】
A. パントテン酸カルシウムの制限
本発明の個々の一実施態様において、エタノール生産を支持するとともに酢酸生産を制限する生物学的経路を操作するための方法は、栄養素培地中のパントテン酸カルシウムの量を供給されるパントテン酸カルシウムを完全に利用する安定な定常状態濃度で細菌を維持するのに必要とされるより少ない量に制限することを必要とする。パントテン酸塩はアセチル-CoAの成分であり、それ故、栄養素培地中のパントテン酸カルシウムを制限することによって、アセチル-CoAサイクル速度がCOサイクル速度に相対して低下する。これは、還元フェレドキシンの蓄積及びNAD(P)のNAD(P)Hへの減少を引き起こし、それによって最終産物としてエタノールの生産を増加させる。
パントテン酸塩の制限は、リアクタ内に与えられる細胞(乾燥質量)1グラム(g)当たりのリアクタに供給されるパントテン酸カルシウムのマイクログラム(μg)が0.5〜100の範囲にある場合に認められる。より望ましいパントテン酸塩の制限は、リアクタ内に与えられる乾燥細胞1グラム(g)当たりのパントテン酸カルシウム2〜75μgの範囲にある。更に好ましいパントテン酸塩の制限は、リアクタ内に与えられる細胞1グラム(g)当たりのパントテン酸カルシウム0.5〜50μgの範囲にある。この制限の他の実施態様は、リアクタに与えられる細胞の粒子(g)当たりパントテン酸カルシウム約1-25μgである。この制限の他の実施態様は、リアクタ内に与えられる細胞1グラム(g)当たりのパントテン酸カルシウム約10-30μgである。この栄養素の量は、酢酸塩生産に優先したエタノール生産を維持する。
【００２４】
この方法の他の態様において、低制限パントテン酸カルシウム濃度に対する発酵バイオリアクタ内の細菌の順化は、発酵パラメーターを調節するか又は調整することによって避けられるので、一定のパントテン酸カルシウム濃度が維持され、ガス供給速度、液体供給速度、撹拌速度、又はH2分圧の少なくとも1つ、しばしば1つを超えるパラメーターが調整される。栄養素の主な変化は避けられるが、比較的一定の栄養素供給濃度は維持される。培養物を低液相制限栄養素に順化させることを可能にする場合には、1.0gエタノール/g酢酸塩以下の不充分な生成物比が不可逆的な方法で生じる。従って、リアクタを停止し、再植菌が必要である。好ましくは、生物学的経路は、最初に供給ガス中過剰のH2をバイオリアクタに供給し、次に、上記のように栄養培地中パントテン酸カルシウムを制限することによって、エタノール生産を支持するとともに酢酸生産を制限するように制御される。
実際に、始動時、通常制限する液相栄養素パントテン酸カルシウムは、低栄養素濃度、過剰のH2が使われない場合には非常に不充分な性能及び1日10g/Lを超える高エタノール生産性を達成する培養物の能力の消失がもたらされ得る条件に対する順化を避けるために過度に保持される。
【００２５】
B. コバルト制限
本発明の他の実施態様において、エタノール生産を支持するとともに酢酸生産を制限する生物学的経路を操作するための方法は、栄養培地中のコバルトの量を供給されるコバルトを完全に利用する安定な定常状態濃度で細菌を維持するために必要とされるより少ない量に制限することを必要とする。コバルト制限は、バイオリアクタ内に与えられる細胞(乾燥質量)1グラム(g)当たりのリアクタに供給されるコバルトのマイクログラム(μg)が5〜100の範囲にある場合に認められる。好ましくは、コバルトの制限は、リアクタ内に与えられる細胞1グラム当たりリアクタへコバルト約20〜50μgを供給することを必要とする。このコバルト量は、プロセスにおいて酢酸塩に優先してエタノール生産を維持する。
発酵ブイヨン中のコバルトを制限することにより、アセチル-CoAサイクル速度も低下することになる。コバルトがTHFサイクルからアセチル-CoAサイクルにメチル基を移動させるために用いられることから、発酵ブイヨン中のコバルト量を制限することにより移動を可能にしないことによってTHFサイクル機能も低下する。コバルト制限はTHFサイクル速度を低下させ、これはより高いNAD(P)HとNAD(P)との比を引き起こし、それによってエタノールが得られる。
この方法は、更に、低制限コバルト濃度に対する順化を防止することによって操作される。低パントテン酸濃度に対する順化が避けられるのとほぼ同じ方法において、発酵パラメーター(ガス速度、液体速度、撹拌速度、CO2含量、及びH2ガス分圧)の1つ以上を調整しつつ一定のコバルト濃度が維持される。栄養素の主な変化が避けられるが、代わりに比較的一定の栄養素供給濃度が維持される。
好ましくは、生物学的経路は、上記の通り最初に過剰のH2をリアクタに供給し、次に栄養培地中のコバルトを制限することによりエタノール生産を支持するとともに酢酸生産を制限するように制御される。始動時に、制限液相栄養素コバルトは低栄養素濃度、極めて不充分な培養性能及び1:1より大きい生成物比を生じる培養物の能力の損失が得られる条件に対する順化を避けるために過度に保持される。
【００２６】
C. 水素の過剰供給
更に他の実施態様において、エタノール生産を支持するとともに酢酸生産を制限する生物学的経路を操作するための方法は、供給ガス中過剰のH2を供給するか又は過剰のH2になり、次に生物学的経路によって用いられる気体状炭素を制限することを必要とする。好ましくは、H2還元ガスはCOに相対して過度であり、過剰のH2によって細菌が発酵ブイヨン中高いエタノールと酢酸塩との比を生じる。H2(供給されたガスのモル数)と変換されたCO(ガスのモル数)の2倍及び変換されたCO2(ガスのモル数)の3倍の合計との比が1を超える場合には、発酵槽は炭素が制限される。出口ガスに存在するH2分圧は、好ましくは0.4気圧である。最後に、H2分圧とCO2分圧との比は、充分なH2がすべてのCO2を用いるのに利用可能であることを確実にするために3.0を超えなければならない。CO2分圧が0.1気圧より大きい場合には、増殖が制限されているということである。
始動の間、過剰のH2の使用は、主に制御が容易であるために、栄養素の制限より好ましい。過剰のH2を使う利点は、過剰の酢酸生産を避けることであり、これは不充分な生成物比及び潜在的な酢酸阻止だけでなく、低栄養素濃度に対する順化につながり得る。
【００２７】
D. 一酸化炭素の過剰供給
この方法の成分を操作する他の方法は、経路に用いられるガス状基質において、発酵ブイヨンにおける酸化還元電位を直接低下させるのに役立つ、還元ガス、COを過剰供給することを必要とする。従って、この実施態様によれば、バイオリアクタにCOを含むガス状基質を供給し、ここで、バイオリアクタ内に存在するCOの量は供給されるCOを完全に利用する安定な定常状態濃度で細菌を維持するのに必要とされる量より大きい。CO過剰供給は、比CO取り込み率(リアクタ内の細胞(乾燥質量)1グラム当たりのCOミリモル毎分、又はミリモル/g細胞毎分)が0.3を超える場合、酢酸生産よりエタノール生産を支持する方法である。より好ましくは、この工程は、0.5を超える比CO取り込み率を必要とする。このことは、各細胞が平均して少なくとも0.3ミリモル/g毎分の速度で、又はより理想的には少なくとも0.5ミリモル/g毎分の速度で代謝においてCOを利用していることを意味する。好ましくは、COは、CO取り込みが0.3〜2ミリモルCO/グラム細菌の細胞(乾燥質量)/分である速度で供給される。他の実施態様において、COは、0.5〜1.5ミリモルCO/グラム細菌の細胞(乾燥質量)/分の速度で供給される。他の実施態様において、COは、約1ミリモルCO/グラム細菌の細胞(乾燥質量)/分の速度で供給される。
このCO取り込み率は、酢酸塩生産よりエタノール生産を維持する。発酵ブイヨン中の溶存COがガス圧又は非常に良好な物質移動によって有意であるようにCOが供給される場合には、発酵ブイヨンはより減少する。COの過剰供給は、2つの追加の利点を有する。過剰のCOはCOサイクルをより速い速度で作動させることができ、アセチル-CoAサイクルが別の方法で制限され且つCOサイクルについていくことができない場合には、還元フェレドキシンが蓄積する。COは、また、基質阻止により3工程法における工程2(中間体酢酸の生産)を遅らせることができる。工程1に関して工程2のこの速度低下は、過剰のNAD(P)Hを生じ、これは酢酸を支持してエタノール生産につながる。
過剰のCOによって発酵ブイヨンのレドックス電位を直接低下させてエタノール生産が増加し得るが、過剰のCOよってCO-デヒドロゲナーゼを阻止して増殖も阻止され、それ故、H2の取り込みも阻止される。過剰COの存在は、また、残念なことに、H2変換が不充分になり、これは経済的に有利ではありえない。基質阻止によって拡張した操作の結果は、不充分なH2取り込みである。これにより、最終的には細胞溶解及びリアクタの必要な再開が引き起こされる。この方法が培養物の最初の増殖の間又はその後、CO基質阻止(利用可能な細胞に対してあまりに多くのCOの存在)の予想外の結果を有する場合、基質阻止が軽減されるまでガス供給速度及び/又は撹拌速度が低下する。
【００２８】
E. 追加の操作工程
上記の主な方法を強化する工程に加えて、方法のいくつかの工程がエタノール生産法に含まれることが望ましい。
1. 物質移動の増加 
このような追加の一実施態様は、ガス供給から液体発酵ブイヨンへのCO又はH2の物質移動が溶存ガスを利用する細菌の能力より速いことを確実にすることを必要としている。例えば、C.リュングダーリイを含有するバイオリアクタをCO、CO2及びH2を供給するとともに栄養素(例えば、パントテン酸塩又はコバルト)に対する制限又は過剰のH2の存在なしに作動させる場合には、細胞増殖は液相に移される気体量によって制限され且つシステムは生成物として酢酸を生成する。培養物に培養増殖に必要とされるものを超えて微量のCO又はH2を供給する場合には、エタノールを生じる。しかしながら、培養物が用いる液相にあまりに多くのガスが移される場合には、基質阻止が生じ、これは培養不調や細胞死につながり得る。従って、過剰の物質移動を有する非常に狭い範囲の操作がある。
アセチル-CoAサイクルに関して、過剰の還元フェレドキシンが生成されるために、COサイクル又はヒドロゲナーゼによるフェレドキシンの還元は、アセチル-CoAサイクルより急速に行われなければならない。本明細書に記載される方法は、必須栄養素、例えば、パントテン酸カルシウム又はコバルト、又は他の基質、例えば、CO2ガスが細菌に利用可能である速度を限定することによって、又は過剰の基質、H2又はCOを培養物に供給することによって生物体が溶存ガスを利用し得る速度を制限する。
他の制限なしでさえ、細菌が基質を使用し得る速度より高速である物質移動の理論的速度が算出される。その速度が達成される場合、生物体の自然増殖速度によって制限される。それ故、最も生産的な実施態様は、物質移動(ガス流量又は撹拌速度)が、可能な最高濃度の細胞が制限なしで基質を利用し得る速度より速い場合である。基質阻止が細胞死及び培養物に毒性である得られた副生成物濃度を急速に引き起こし得るので、非常に狭い作動範囲がある。
【００２９】
2. 過剰のCO及びH2の供給
本発明の方法の他の実施態様において、高エタノール濃度の安定性/制限された酢酸生成は、コバルト又はパントテン酸カルシウムを制限するか、又は豊富なH2又はCOを与える方法において達成される。この工程によれば、培養物が炭素及びエネルギー源として気体の基質CO、H2及びCO2を用いるので、CO及びH2はわずかに過度に供給される。わずかに過剰のCO及びH2は、着実な操作を獲得し、次にCO及びH2の変換がちょうど減少し始めるまでガス供給速度及び/又は撹拌速度(10%以下の増加分)を徐々に増加させることによって達成される。これは、酢酸生産を支持する物質移動の制限を避け、且つNAD(P)をNAD(P)Hに還元するとともにエタノールを生産するために過剰の還元型フェレドキシン供給する1つの手段である。CO及びH2がわずかに過度に供給されない場合には、物質移動制限が生じ、経路は均衡が保たれる。これにより、エタノールと酢酸塩生成物の不充分な比(高酢酸塩濃度)が生じる。酢酸塩濃度が高いと、H2を利用する細菌の能力を制限する、最終的に酢酸阻止が生じることになり、結局は培養の失敗につながることになる。
物質移動制限を避ける工程は、液体相により多くのCO及びH2を移すために撹拌速度又はガス速度の増加を含むので、わずかな過剰のCO及びH2の存在に戻す。生成物阻止が物質移動制限の結果として生じる場合には、得られたより低い酢酸塩濃度まで希釈することによって、液体供給速度を増加して酢酸阻止を取り除くことが必要である。培地供給速度を増加させるとμgパントテン酸塩又はコバルト/g生成された細胞が増加されるので、これが簡単に行われなければならないだけであるか又は培地濃度を調整するか又は水供給速度を増加させることによって過剰のパントテン酸塩又はコバルトが除去されなければならない。
【００３０】
3. 酢酸生成物阻止の調節
上記の方法において、あまりに多くの分子酢酸、即ち、＞2g/Lがバイオリアクタ内に蓄積して、細胞増殖、更にエタノール生産を可能にする場合には、酢酸生成物阻止が行われ得る。他の操作工程は、培養の失敗を避けるために用いられる。1つの変更は、簡単には液体又は水の供給速度を増加させて、酢酸を阻止する液相濃度を2g/L未満より低く下げることを必要とする。
【００３１】
4. 水の再循環工程
本発明の方法において正味の酢酸生成のない唯一の生産物としてエタノールを生産させる安定な培養物を維持するための更に他の選択的方法工程は、蒸留から発酵リアクタへの水の再循環を加えることを必要とする。前に述べたように、(5g/Lまでの酢酸塩を含有する)水の再循環は、正味の酢酸が生成されないように生成された酢酸塩をリアクタへ戻って再循環する利点を有する。従って、リアクタ内でエタノールと酢酸塩の間に平衡が確立される。結果として、リアクタに供給され且つ生成物に変換されるすべてのCO、CO2及びH2により、培養維持に用いられるものを除いて、エタノール生産が得られる。
【００３２】
5. 細胞密度の低下
この方法に用いられる更に他の操作工程は、バイオリアクタから細菌細胞の周期的又は連続のパージを開始して、バイオリアクタ内の細胞濃度を低下させることである。この操作は、細胞濃度をバイオリアクタ内のすべての還元ガス又は栄養素基質を利用する安定な定常状態の細胞濃度より低く低下させるのに役立つものである。このように細胞密度を変えることにより、エタノールの生産は、バイオリアクタ内では酢酸塩の生産より好ましい。
【００３３】
6. 2段階CSTR
培地が制限されたエタノール生産と関連している問題の1つは、最終的には条件を制限するものに適合し且つ数ヶ月の操作後にはエタノールを生産し続けない培養物の能力又は傾向である。代わりに、酢酸塩が最終的には優位な生成物に入る。低制限栄養素濃度に対するこの順化は、エタノール(1.0以下のエタノールと酢酸塩生成物との比)より多くの酢酸を生産する培養物になり、低エタノール濃度(しばしば1g/L程度)を生じる。始動の間、培養物が充分な栄養素を与えられない場合に適応が生じやすく、ここで、増殖速度がエタノール生産速度より重要である。更に、特に制限栄養素濃度が酢酸塩の反応システムを除くために下向きに調整されるので、培養物が定常状態操作の間、低制限栄養素濃度に順化され得る危険がある。
上のパントテン酸塩又はコバルト制限工程を用いる場合にこの適応を避けるために、培養物が利用可能な栄養素によって増殖できること、及び上述した危険の代わりに、他の変更の方法を使うことができる。主に良好な培養増殖がわずかに過剰の制限栄養素により第1の段階で生じ(おそらく、酢酸生産が付随している)、第1の段階からの培養物が制限栄養素によってここで制限され且つ高濃度のエタノールを生産するために用いられる生産段階が続く2段階CSTRシステムは、他の変更の方法である。この変更は、安定な培養物の維持を可能にし、低パントテン酸塩又はコバルト濃度に順化しない。この変更は、2段階CSTR、増殖リアクタ(段階1)からエタノール生産の大部分が行われる生産リアクタ(段階2)までを作動させることを必要とする。増殖リアクタは上記栄養素制限工程によって作動されないので、培養物は制限条件に対して順化を受けやすいものではない。
【００３４】
2段階CSTRの実施態様によれば、増殖段階は、約24時間の液体保持時間(LRT)で作動させる。増殖段階CSTR 1は、培地2において充分なパントテン酸塩又はコバルトを供給して、健康的な培養物が得られる(更に多少の酢酸も生成され得る)。従って、過剰の酢酸がリアクタ内に生成されるが、安定性が大きい。このパントテン酸塩又はコバルト濃度は、エタノールを生産するために用いられる単一のCSTRに通常供給されるものを超えている。このリアクタに供給されるガスは生産段階4からの未反応ガス3であり、液体供給物は新鮮な培地2である。増殖段階のCSTRは、細胞再循環なしで作動させる。この増殖段階リアクタの目的は、低パントテン酸塩濃度に対して順化しない後のエタノール生産のために健康的な培養物を供給することである。
生産段階のリアクタ4は、20時間未満の適度なLRTで作動させる。細胞再循環を有するこのCSTRは、新鮮なガス供給量5を供給し、変換が低くなり得る。新鮮な培地供給物6だけでなく、増殖段階からの培養供給物7が供給される。増殖段階から過度に利用可能であるので、最小限のパントテン酸塩又はコバルトがこのリアクタに供給される。リアクタ9に戻される細胞から最も多くの生産を得るためにこのリアクタにおいて細胞再循環8が用いられる。液体生成物10の出口エタノール濃度は、20g/Lより大きくなければならない。2段階CSTRシステムの特徴は、低パントテン酸塩又はコバルト濃度に対する順化; 30時間以下の全体のLRT; 同一サイズの単一のCSTRより予想されるより大きいエタノール生産性及びより高いエタノール濃度のための変化をほとんど含まない。
【００３５】
7. 始動の変更
本発明の実施に好ましく用いられる更に他の方法工程は、発酵培養の最初の始動に細胞生産を必要とする。CO、CO2及びH2を供給してエタノール及び酢酸を生成させるバイオリアクタの始動は、保存培養物からのバッチ植菌によって又は培養物が供給される既存のリアクタから連続植菌物を使うことによって達成される。以前に述べたように、低パントテン酸塩又はコバルト濃度に対する培養順化を避ける説明では、栄養素を制限するが過剰のH2を培養物に供給する前に培養物を高細胞濃度にすることが最も望ましい。この急速な開始によって、培養順化が避けられ且つ良好な生成物比(高エタノール濃度と低酢酸塩濃度)が得られる。急速な始動が使われない場合には、不充分な生成物比が生じることになり、培養物が低い液相栄養素濃度に順化するとともにリアクタ再植菌を必要とすることになる。
リアクタは、低撹拌速度(おそらく実験用New Brunswick Scientific Bioflo.RTM.リアクタの400-600rpm)及び望ましいpHで、バッチ液相(液体培地は最初はリアクタに連続して供給されない)から開始される。従って、リアクタ内の液相は、このように、適度な濃度の制限栄養素、パントテン酸カルシウムか又はコバルト(20μg/Lのパントテン酸塩又は75ppbのコバルト)と共にビタミン類と塩を含有する栄養培地のバッチからなる。既存のリアクタから連続植菌物が使われる場合には、バッチ液相操作はおそらく必要ではない。この場合、ガスは、緩慢な速度で最初の始動の間、リアクタに連続して供給される。理想的には、始動時の気相はCO2がなく、H2が多量であり、ガス速度と撹拌速度はCO基質阻止を避けるために低レベルで保持される。
CO、CO2及びH2から商業的に生存可能なエタノール濃度を生じ且つ持続させるための例示的な一般始動プロトコールは、3つの異なった相からなる: (a)細胞生産が重要である最初の始動; (b)生産速度が重要に始動; 及び(c)定常状態操作。本質的に、最初の始動は、望ましいpH(典型的には4.5-5.5)でコバルト(75ppb)又はパントテン酸カルシウム(20μg/L)より選ばれる適度な制限栄養素でバッチ液を植菌することを特徴とする。始動を容易にするために、ガス供給速度及び撹拌速度が優先的に低く保持され、H2が過度に供給される。始動の間のエタノール生産の原因は、過剰のH2である; 栄養素の制限は、後に行われる。従って、低栄養素に不必要な培養順化を避けるために、始動の間、過剰の液体栄養素が実際に存在する。発酵が植菌後数時間をかけて進行するので、CO2が生成され、H2が消費される。これらの速度の変化から、撹拌速度が物質移動制限を避けるためにゆっくりと(おそらく実験用リアクタで200-300rpmだけ、2-3日間かけて)適度に増加しなければならないことが示された。
【００３６】
CO2生産のこの開始は、保存培養からバッチ植菌とは反対に、連続植菌を使うシステムにおいて非常により急速に行われる。しかしながら、撹拌速度があまりに急速に増加する場合には、CO基質阻止が生じる。撹拌速度を適度に増加しつつH2変換(又はCO2生産)を見るこの手順は、目標撹拌速度に達するまで比較的急速な速度で行われる。バッチ液体培養内で撹拌速度を増加させるこの時間の間、生成物形成でない細胞生産が最重要である。
目標撹拌速度に達する(実験用New Brunswick Scientific Bioflo.RTM.において800-1000rpm)と、培養はH2取り込みを確認するために安定させておく。始動は、生産速度が重要になる方式に変わる。酢酸塩及び遊離分子の酢酸濃度を制限しつつ、エタノール生産を確実にするために流出ガス(少なくとも0.55気圧)において80%を超えるCO変換及び高H2分圧を有することが望ましい。次に、液体培地供給速度を作動させて(保存培養からバッチ植菌を有するシステムについて)連続液体供給を開始し、ガス速度を目標流量に対して10%増加分で増加させる。H2は、過剰の酢酸生産を避けるために過度のままである。ガス速度が増加するのにつれて、液相栄養素を制限し(パントテン酸カルシウム又はコバルト)、このような制限の効果は、目標生産において、H2変換の小さな減少である。
定常状態操作で、15-35g/Lのエタノール及び0-5g/Lの酢酸塩の生産に到達する。この段階で、制限栄養素、液体供給速度及びガス供給速度の小さな調整が必要であり、当該技術に現存している知識だけでなく本発明の教示に対して手段をもつ当業者によって選ばれる。細胞再循環がエタノール生産方法に加えられる場合には、この時点でガス速度(増加)及び栄養素濃度(低下)の調整と共に加えられる。
安定な操作条件下で低副生成物酢酸塩濃度と共に高濃度のエタノールを連続して生産し且つ維持する上記方法は、エタノール生産のための商業的な規模に対して対象細菌の使用を増強する。上の方法で示される工程は、CO、CO2及びH2から商業的なエタノール生産のために対象細菌を用いる制限を克服する。バッチ及び流加発酵法も用いられるが、おそらく大規模なエタノール生産のためには経済的に実行可能でなく、連続バイオリアクタを使う方法が好ましい。
以下の実施例は、本明細書に開示される発明のある種の特定の実施態様を具体的に示すのに役立つものである。しかしながら、これらの実施例は、当業者が認識するように、開示された本発明の精神から逸脱することなくそれに行うことができる多くの変更があるように、新規な本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきでない。
【実施例】
【００３７】
最初の実験は、C.リュングダーリイの生存能力を維持するためのエネルギー源としてエタノール及び二酸化炭素を用いて調べるために行われた。この実験において、培養物に吹き込まれるガスとして二酸化炭素を供給した。遊離酸の濃度は、温度を25℃に低下させるとともにpH設定点を上げることによって制御した。合成ガスを停止し、二酸化炭素を約30ml/分でゆっくりと吹き込むことに置き換えた。撹拌は、リアクタ内に熱と液体の添加を分配するのに充分なだけ混合させる低レベルに低下させた。pHは、4.5から4.7に上げた。リアクタは中空繊維膜を用いた細胞再循環ループを有し、これは実験の間、細胞損失を防止するために透過物パージを用いることを可能にした。透過物フローは、システムへの培地のフローと同じであった。液体保持時間は変化させず、30時間維持した。
合成ガス供給のない12時間後、測定されたエタノール濃度と総アセチル濃度は、予想されたように変化した。エタノールレベルが24.0から12.8g/Lに低下し、総アセチルレベルが4.2から10Ag/Lに増大した。温度設定点を38℃に戻した。培養物が加熱するのにつれて、撹拌を実験の前に用いられた同じレベルに増加した; 二酸化炭素を実験の前に用いられた流量の50パーセントの合成ガスフローに置き換えた。
透過物パージを停止した。培養物をこの条件に14時間維持した。この時間の間、一酸化炭素取り込みは安定なままであり、水素の取り込みは徐々に改善された。水素の取り込みが充分に改善すると、ガス流量が段階的に増加して、予備実験流量に達した。47.5時間以内に合成ガス流量が予備実験流量に戻った。供給ガスフローが増加するのにつれて、総アセチル濃度が減少し、エタノール濃度が増加した。32時間以内に総アセチル濃度が予備実験レベルに戻った。70.5時間以内にエタノール濃度が予備実験レベル近くに達した。
【００３８】
この実験において、二酸化炭素を7.7%重炭酸ナトリウム溶液の連続流によって培養物に供給した。温度を25℃に下げた。遊離酢酸濃度を、温度を25℃に下げ、pHを増加させ、培養物を通る液体の流れを増加させることによって制御した。合成ガスを停止し、7.7%重炭酸ナトリウムの連続流に置き換えた。酸性環境の存在下、重炭酸ナトリウムをナトリウムイオン、水及び二酸化炭素に分解させるので、エタノールの遊離酸への変換に必要な二酸化炭素を得る。撹拌は、リアクタへの熱及び液体添加を分配するのに充分なだけ混合させる低レベルに減少させた。pH設定点は制御されなかったが、重炭酸塩が培養物に添加されたので、遊離酸の濃度を制御するのを援助する実験全体にpHがゆっくりと増加した。リアクタは中空繊維膜を用いた細胞再循環ループを有し、これは実験の間、細胞損失を防止するために透過物パージが用いられることを可能にした。透過物フローは、システムへの培地のフローと重炭酸ナトリウムの追加のフローと同じであった。特別な重炭酸塩フローは、29から21時間へ液体保持時間を減少させた。
実験の間、総アセチル濃度が徐々に増加するのにつれてエタノール濃度が低下した。5.5時間以内に、エタノール濃度が21.0から14.1g/Lに低下し、総アセチルレベルが4.4から9.1g/Lに増大した。測定されたpHも4.48から4.84に増大した。酸濃度を制御する努力において、実験の開始の5.6時間後、栄養素流の流量は、1.33mL/分から2.81mL/分に増加した。不必要な細胞流出を防止するために透過物パージも1.86から3.48mL/分に増加した。これらの変化は、液体保持時間を21から12時間に減少させた。これは、酸の濃度を保持させる望ましい効果を有した。液体の流れの変化の2時間後、総アセチル濃度はわずか9.4g/Lに増加した。しかしながら、エタノール濃度は、14.1から10.7g/Lにより速い速度で低下した。合成ガス供給のない8時間後、測定されたエタノールと総アセチル濃度は、予想されたように変化した。エタノールレベルが21.0から10.7g/Lに減少し、総アセチルレベルが4.4から9.4g/Lに増加した。温度設定点を38℃に戻した。培養物が加熱するのにつれて、撹拌を実験の前に用いられた同じレベルに増加した; 重炭酸ナトリウム添加を停止し、合成ガスフローを実験の前に用いられた流量の50パーセントで開始した; 更に透過物パージを停止した。培養物を50分間だけその条件に維持した。ガス流量を前の流量に達するように段階的に増加させた。29.2時間以内に合成ガス流量が予備実験速度に戻った。供給ガスフローが増加するのにつれて、43.2時間以内に総アセチル濃度が低下するとともにエタノール濃度が予め実験濃度まで増大した。このように、すでに発酵槽内にあるエタノールは、合成ガス中断の間、培養物生存能力を維持するために二酸化炭素と共に用いられ得る。
【００３９】
実施例1
エネルギーにエタノール及びCO2変換を用いた微生物ガス低下実験
微生物実験の目的は、長時間(＞30分)供給ガス減少の場合に培養を持続させる方法を求めることであった。この実施例では、培養が合成ガスの減少の間、エネルギーを得る方法として、エタノールの遊離酸への変換のためのCO2添加に集中した。
ある種の酢酸精製微生物がCO2を用いてエタノールを酢酸に戻すことができることはかなり知られていたが、利用可能な合成ガスがなかった場合にこのプロセスが長期間培養を持続させるために使用し得るかを決定する試験は行われていない。エタノール及びCO2(重炭酸ナトリウムの形で)が正常なバイオリアクタ操作による使用に容易に利用可能であるので、本発明の実施態様は供給ガスの低下を存続するための溶液を供給する。エタノールを酸に変換するためにCO2を添加するのに加えて、培養活性を遅らせる方法として、実験の一部の間、培養温度を下げた。より遅い細胞活性は、必要なエネルギーの量、必要とされるCO2及びエタノールの量及び生成される酸の量を減少させるにちがいない。
これらの実験について、バイオリアクタは、細胞再循環と培養の冷却コイルループを有する直線状CSTRとして処理した。実験の間、不必要な細胞損失を防止するために透過パージ物は用いたが、パージ流は廃棄物に迂回し、バイオリアクタに戻って再循環されなかった。正常なバイオリアクタ操作の間、培養温度を38℃に保ち; 撹拌を400rpmとし; その培養容積を2.4Lとし; 培養pH設定点を4.5とした。7.7% NaHCO3溶液をpH対照に用いた。供給ガスは、15%H2、45%N2、30%CO及び10% CO2を含有する合成ガスとした。合成ガス供給速度を約475mL/分とした。培地を、約1.30-1.35mL/分、又は1870-1940mL/日でリアクタに供給した。液体及び細胞保持時間は、25-30時間であった。用いられる培地は、C-01培養物のために定期的に用いられる1×EtOH培地とした。培地成分及びこれらの濃度を以下の表1に示す。
【００４０】
正常な操作の間、CL細菌は、炭素及びエネルギー、又は電子、供給源のための基質として合成ガス成分CO、H2及びCO2を用いる。それのため、培養物を持続させるためにその基質の損失を防止するために注意しなければならない。しかしながら、供給ガスの供給が妨害される場合は、以下の式(1)でわかるように、細菌はエタノール及びCO2を利用することによって生存して、酢酸が生成し得る。
2 CH3-CH2-OH + 2 CO2 ⇔ 3 CH3-COOH       式(1)
この反応によって、細胞は、有利には、アルコールの酸化からカルボン酸の形まで生存のための電子を得ることができる。供給ガスが妨害される場合には、培養は典型的には電子を獲得するが、炭素を獲得しないので、細胞増殖が減少する。それ故、最適化された生産ではないが、このプロセスが培養生存の手段を与えると考えられる。供給ガス低下の間、細胞密度を維持するために細胞流出、又はシステムからのいかなる細胞の除去も避けなければならない。
このプロセスは、酸の蓄積につながる。遊離酢酸レベルが阻止濃度(≦5g/L)より低い濃度レベルに維持されることを確実するために工程が用いられなければならない。これは、pH設定点を5.1-5.3の範囲に上げ、システムを通る液体の流れを増加させるのでLRTを15-20時間まで短縮させることによって、また、利用可能なCO2及び/又はエタノールを制限することにより又は温度低下による培養代謝を低下させることにより酸の生産を制限することによって達成され得る。
酸の生産は、リアクタ内のエタノール濃度を減少させる。これらの条件下、培養が減少したエタノール生産を示しているので、エタノール濃度はそれが過剰に減少しないこと確実にするためにモニタされなければならない。エタノールは、システムに添加されるか又は供給ガスを増加させずに時間の長さとして補足されることを必要としてもよい。これらの実験の間、バイオリアクタ内のエタノール濃度は、培養には有害に作用せずに4g/L程度の低い濃度まで減少した。
【００４１】
必要により、細胞の代謝速度を制御する方法として培養温度がこのプロセスにおいて致命的な役割を果たしてもよい。温度が低下するにつれて、細胞の代謝速度は遅くなる。それにより、次には、酸の生産及びエタノールとCO2の使用が遅くなる。リアクタが供給ガスを含まない場合に温度を低下させると、培養が生存し得る時間が延長される。逆に、温度が38℃で保持される場合には、酸の生産速度が最も高いときであり、酸のレベル及びエタノールのレベルの注意深い監視が培養物を健康的に保つのに必要とされる。実験は約25℃まで培養温度を低下させ、供給ガスなしで約30時間細胞生存能力をうまく維持させる。
本発明の実施態様は、NaHCO3添加を含むCO2の制御された量の送達方法を提供する。重炭酸ナトリウムが発酵ブロスのような酸環境に導入される場合、下記式2に示されるようにCO2が生成される。重炭酸ナトリウムがCO2を添加するだけでなく、培養物のpHを約5.1までも増大させることから、システムにCO2を添加するこの方法が培養物にCO2をスパージするより有利であり、遊離酸のレベルのバランスをとることによって酸のシステム生産を補償するのを助けると考えられる。
NaHCO3 + H+ ⇔ Na+ + H2CO3 ⇔ Na+ + H2O + CO2(g)       式2
エタノールの酸への変換は、供給ガスの減少後、ほとんど直ちに、又は数秒で起こり始める。約400-450mL/分の高N2フローを用いて培養内に存在する溶存CO2をストリッピングすることによって供給ガス減少の開始時に酸の急速で大量の蓄積を防止することが可能である。供給ガスフローが減少した後にできる限り早く約0-15分間培養まで窒素をスパージしなければならず、これが急速に行われるほど本発明にとって有利である。最初の5分以内の窒素フローは、本発明の実施態様である。一旦溶存CO2の残量が除去されると、制御された供給速度を用いてNaHCO3添加が始められ得る。
【００４２】
CO2を形成するためにNaHCO3添加を用いることにより、培養物のpHを増大させることができる。細胞が利用可能な重炭酸ナトリウムのすべてを利用して活性のままである場合には、pHは約5.1まで増大させなければならず、それからそこでのままでなければならない。これは、望ましい副次的効果であり、防止されてはならない。pHの緩慢で着実な増大は、点検で遊離酸のレベルを保つことによって増加する酸の生産に対処するのを助ける。しかしながら、細胞活性を妥協する場合には、pHは約5.3を超えて増加し、培養物が変性し得るか又は機能的に低下し得る兆候が示される。
供給ガスが利用可能な場合、重炭酸ナトリウム添加は停止されなければならず、供給ガスの物質移動はできる限り急速に増加しなければならないが、細胞を圧倒しないように注意しなければならない。約10-15分間をかけて、供給ガス減少の前に用いられる同じ設定に撹拌を戻すとともに最初の供給速度の約50%まで供給ガス流量を戻さなければならない。基質の利用可能性及び高レベルの全アセチルのために培養物は酸をエタノールに徐々に変換する。これは、pHの増大に反映されることになり、予想される。正常ないかなるリアクタ操作においても、この間の発酵槽の供給ガス流量に対する変化はガス変換に基づいて行われなければならない。
供給ガスフローが再開されると、すべてが細胞の生存能力を保存するのにうまくいった場合には、供給ガス流量は約20-26時間以内に正常な操作設定に達することができなければならない。エタノール及び酸の濃度は、正常な操作レベルに達するのにより長くかかり得る、約26-72時間。
バイオリアクタ全体に温度分布を維持するとともに培養物のpHを維持するために最少撹拌が必要とされる。最少撹拌は、液体を保つのに充分なだけの混合と定義さられる。これは、正常な操作の間に用いられる400rpmのような高速度と比較すると、約50rpm、又は40-60rpmであり得る。実際にはこの撹拌は、また、懸濁された細胞も保つ。細胞は、CO2及びエタノールと絶えず接触させて必要とされた反応を行うために懸濁されなければならないと考えられる。
【００４３】
酢酸生成微生物は、細胞増殖に必要な電子及び炭素を獲得するためにCO又はH2及びCO2を必要とする。供給ガスのない時間の間、COもH2も細胞増殖プロセスで利用可能でない。供給ガス減少のこれらの時間の間、細胞増殖が懸濁されると考えられる。供給ガスの供給が制限され得る時間の間、供給ガスのより少ない供給が培養物生存に用いられ得ると推測されることができる。供給される供給ガスの減少した量は、酸の生産方式に培養を復帰させる。基質供給速度が低下した場合、培養は酸のエタノールへの変換を自動的に停止し、エタノールと酸との比の低下が更に引き起こされる。このガス減少プロセスが完全に理解されると、最良の作用過程がより低速度の基質を供給することからなおさら供給ガス生産の困難の時間の間、完全に供給ガスの供給を停止することが望ましいことであり得る。基質供給速度を低下させることが好ましいことが決定される場合には、酸の増加に対処するために作用させなければならない。このような作用は、システムを通る液体の流れを増加させて酸を除去すること、培養物のpHを増大させて、許容できる遊離酸のレベルを維持すること及び/又は最小限の酸の生産のための細胞比まで健康的なガスの取り込みを維持するためにシステムから大部分の細胞を除去することを必要とする。
【００４４】
表1. 培地成分及び1×EtOH培地中の濃度
0005777889.tif 000002
*  Na+濃度は、NaClだけからである。これは、Na2WO4・2H2Oのようなその他の成分からのNa+を含まない。
**  Ca+2濃度は、パントテン酸、カルシウム塩からのカルシウムを含まない。
【００４５】
表2は、実験の前後の培養パラメーター、例えば、pH、レドックス、エタノール及び酢酸を詳述する。一般に、培養が生存のためのエタノール及びCO2を用いる場合、エタノールレベルは酸濃度と培養物pHが増大するにつれて低下する。表2は、また、実験の間に測定された高レベルの遊離酸だけでなく最初のガス供給速度に回復する実験の終了後の時間数を記載する。供給ガス減少の間の培養物生存の鍵成分が遊離酸濃度〈5.0g/Lの維持であることを記憶されなければならない。酸が生成されているので、より高い培養物pH及びより速い酸の除去速度が酸の阻止を防止するのに必要である。酸が生成されているので、より高い培養物pH及びより速い酸の除去速度が酸の阻止を防止するのに必要である。
表3は、培養内の細胞1グラム当たりのミリモル/分での培養物へのCO2添加を詳述する。計算は、重炭酸ナトリウムの供給速度とバイオリアクタ内の細胞の合計数に基づいたものである。25℃において、0.014ミリモル/分・gのCO2供給速度が供給ガスなしで12時間培養物を持続させるのに充分であった。実験時間が24時間まで増加したとき、0.034ミリモル/分・gの平均CO2供給速度が健康的な培養物生存のために必要とされた。興味深いことに、培養温度が38℃まで増大したとき、健康的な培養物を維持するために培養物は0.114ミリモル/分・gの最小CO2供給速度を必要とした。38℃において、細胞の代謝は、生存のためにより多くのエネルギー、従って、酸に対するより多くのエタノール変換をより大きく必要としている。
【００４６】
実施例2
供給ガスのない17及び24時間の培養物の生存
実験条件:
供給ガスなしで16.9時間
温度を25℃に下げた
培地添加は実験に変化がなかった
細胞1グラム当たり0.030ミリモル/分のCO2供給速度
透過物パージを用いて、細胞内で保持した
実験の開始時に培養ブイヨンからCO2を除去しなかった
実験の開始前の培養細胞密度は3.7g/Lであった; pHは4.44であった; レドックスは-440mVであった; CO及びH2の取り込みは、それぞれ5.0及び1.2ミリモル/分であった; CO及びH2変換は、それぞれ86及び40%であった; エタノールは23.5g/Lであった; 且つ酸は3.9g/Lであった。
t = 9511.6時間において、供給ガス流量を474mL/分から53mL/分に減少させた。撹拌を約400から約50rpmまで低下させ、リアクタについての温度設定点を約12分以内に38から25℃に下げた。冷却が行われると、0.57mL/分で開始した38.5g/Lの重炭酸ナトリウムは細胞1グラム当たり0.030ミリモル/分のCO2供給速度を得た; 供給ガスフローを停止した; 透過物パージを1.95mL/分で開始し、培地フローを1.37mL/分に保った。窒素をリアクタの上部にできた空間にゆっくりと添加し、真空がリアクタ内に生じるのを防止した。培養物をその条件で16.9時間放置した。
【００４７】
実験の間、培養物pH、細胞密度、生産物及び細胞形態をモニタするために約2時間毎に液体試料を採取した。培養物pHは、実験の終了頃に5.07に達するように実験全体で徐々に増加した。エタノール濃度は、実験の終了までに23.5から7.0g/Lに徐々に低下した。総アセチル濃度は、3.9から8.2g/Lまで徐々に増加した。実験までの約12時間細胞のわずか5-10%を示した培養形態は、粒状又は中空体であった。細胞長さは、平均的であり、柔らかいものからそったり又は曲がったりしていないものであった。
t = 9528.5時間において、リアクタについての温度設定点を約38℃に戻した; 培地B及び透過物パージを停止した; 更に、リアクタの上部にできた空間へのN2フローを停止した。温度が約28.0℃に達したとき、供給ガス流量を143mL/分まで増加した。約30.0℃において、供給ガスフローを再び236mL/分、又は50%又は最初のガス流量に増加した。約32.0℃において、撹拌を200rpmまで増大した。約34℃において、撹拌を約400rpmまで増大した。
ガス、撹拌及び温度を増加した約40分後の最初の変換は、47%H2及び88%COで良好であった。約15分後、変換は、47%H2及び87%COでなお非常に良好であった。ガス流量をすぐに開始した。実験の開始前に用いられた最大ガスフローに達するのに約18.3時間かかった。ガス流量が増加するのにつれて、pHは下がり続け、約18.3時間以内に約4.60に達した。実験の終了の40.6時間後にエタノールが20.0g/Lに戻り、酸が24.9時間後に3.4g/Lまで下がった。
【００４８】
実施例3
実験条件:
供給ガスなしで約24時間
温度を約25℃に下げた
培地添加は実験に変化がなかった
細胞1グラム当たり0.035ミリモル/分のCO2供給速度
透過物パージを用いて、細胞内で保持した
実験の開始時に培養ブイヨンからCO2を除去しなかった
実験の開始前の培養細胞密度は3.2g/Lであった; pHは4.50であった; レドックスは-425mVであった; CO及びH2の取り込みは、それぞれ4.7及び1.5ミリモル/分であった; エタノールは17.7g/Lであった; 且つ酸は2.93g/Lであった。
t = 1888時間において、供給ガス流量を474mL/分から53mL/分に減少した。撹拌を約400から約50rpmまで下げ、リアクタについての温度設定点を約14分以内に38から25℃に下げた。冷却が行われると、0.58mL/分の約38.5g/L NaHCO3フローを用いて重炭酸ナトリウムの添加を開始して、細胞1グラム当たり0.035ミリモル/分のCO2供給速度を得た; 供給ガスフローを停止した; 透過物パージを1.81mL/分で開始し、培地フローを1.30mL/分に保った。窒素をリアクタの上部にできた空間にゆっくりと添加し、真空がリアクタ内に生じるのを防止した。培養物をその条件で約24時間放置した。
実験までの約15.5時間リアクタ条件は以下を示した: 約2.4g/Lの細胞密度; 約4.96のpH; 約6.06g/LのEtOH; 酸は約7.87g/Lであった。細胞の5-10%を示した細胞形態は、粒状又はほぼ粒状であった。リアクタ内で放置した低エタノール濃度のため、t =1904時間において、115mLのGem Clearグレインアルコールを、約10g/Lのエタノール濃度のために9Lの培地Aに添加した。培地供給速度は同じままであり、細胞1グラム当たり0.037ミリモル/分のエタノール供給速度を得た。
【００４９】
24時間の終了時に、培養条件は、以下を示した: 約2.9g/Lの細胞密度; 約5.04のpH; 約4.10g/lのEtOH;酸は、約8.68g/Lであった。細胞の約5-10%を示した培養形態は、粒状又はほぼ粒状であった。
t = 1912時間において、リアクタについての温度設定点を約38℃に戻し; 供給ガスを約53ml/分で再開し; 培地B及び透過物パージを停止し; 更にリアクタの上部にできた空間へのN2フローを停止した。培地を、エタノールを添加していない1×EtOH標準培地に変えた。供給ガス及び撹拌を、温度が段階的に増大するのにつれて一定間隔で増加した。温度が約28.0℃に達したとき、供給ガス流量を約179mL/分まで増加した。約30.0℃において、供給ガスフローを、約248ml/分又は50%又は最初のガス流量まで再び増加した。約32.0℃において、撹拌を約200rpmまで増加した。約34℃において、撹拌を約400rpmまで増加した。
実施態様として、ガス、撹拌及び温度の増加の約35分後の最初の変換は、60%H2及び84%COであった。実施態様として、約15分後に、変換は、以下を得た: 62%H2及び91%CO。ガス流量の増加を、直ちに導入した。この場合、実験の開始前に用いられた最大ガスフローに達するのに約19.5時間かかった。
【００５０】
実施例4
実験条件:
供給ガスなしで23.5時間
温度を25℃に下げた
培地添加を正常なフローの半分に減少させた; システイン濃度は、培地中2倍にした
細胞1グラム当たり0.039ミリモル/分のCO2供給速度
透過物パージを用いて、細胞を保持した
実験の開始時にCO2を培養ブイヨンから除去しなかった
実施態様において、24時間のガス減少実験は、細胞1グラム当たりの0.035ミリモル/分のCO2を添加しながら、培養物が供給ガスなしで約24時間の非常に良く生存し得ることを示した。実験の間のリアクタへの培地と重炭酸ナトリウムのフローは、流出による細胞損失を防止するために取り出すのに約2.6Lの透過物を必要とした。それは、2.4Lをわずかに超える培養容積である。ラボ規模において、必要な液体の流れと培養容積とのその比は、充分に許容される。しかしながら、工業規模での廃水量は、モニタされなければならず、必要ならば、減少されなければならない。この実験において、すべてのパラメーターは、培地流量を半分だけ減少させて、必要とされる透過物パージの量を減少させることを除く前の実験と同様に保持した。システイン供給速度の低下が実験を妨害し得ることを示す過去の実験においていくつかの兆候があったので、この実験の間、培地中のシステイン濃度をシステイン供給速度を保持するために2倍にした。
【００５１】
実験の開始の前の培養細胞密度は2.5g/Lであった; pHは4.50であった; レドックスは約-440mVであった; CO及びH2の取り込みは、それぞれ4.8及び約1.2ミリモル/分であった; エタノールは約21.3g/Lであった; 且つ酸は約2.96g/Lであった。
t = 2008.5時間において、供給ガス流量は、474mL/分から53mL/分に減少させた。撹拌を約400から約50rpmに低下させ、リアクタについての温度設定点を13分以内に38から25℃に下げた。冷却が行われると、重炭酸ナトリウム添加を38.5g/L NaHCO3溶液を用いて0.57mL/分で開始させ; 供給ガスフローを停止し; 透過物パージを1.20mL/分で開始し、培地フローを0.68mL/分に下げた。窒素をリアクタの上部にできた空間にゆっくりと添加して、真空がリアクタ内に生じるのを防止した。システイン濃度は、培地A中の5g/Lまで増加した。CO2を、細胞1グラム当たり0.039ミリモル/分で提供した。培養物をその条件で16.9時間放置した。
実験の間、培養pH、細胞密度、生産物及び細胞形態をモニタするために、液体試料を約2時間毎に採取した。予想したようにpHは実験全体に徐々に増加して、実験終了時に5.14に達した。エタノール濃度は、実験の終了までに21.3から6.03g/Lに徐々に低下した。総アセチル濃度は、2.96から10.38g/Lに徐々に増加した。約24時間後に、細胞の約10-20%を示した培養形態は、粒状又はほぼ粒状であった。
t = 2032時間において、リアクタ上の温度設定点を約38℃に戻した; 供給ガスを約53ml/分で再開した; 重炭酸ナトリウム添加と透過物パージを停止した; 且つリアクタの上部にできた空間へのN2フローを停止した。培地流量を1.37ml/分に戻した。培養物が加熱するのにつれて、供給ガスフローを248ml/分に戻し、撹拌を段階的に約400rpmまで上げた。
ガス、撹拌及び温度の増加の約30分後の最初の変換は、50%H2及び87%COであった。ガス流量の増加は、すぐに開始した。実験の開始前に用いられた最大ガスフローに達するのに約24時間かかった。
【００５２】
実施例5
25℃で12時間培養物生存の間のCO2の最小化
実験条件:
供給ガスなしで12時間
温度を25℃に下げた
培地添加は実験に変化がなかった
細胞1グラム当たり0.014ミリモル/分のCO2供給速度
透過物パージを用いて細胞を保持した
実験の開始時に培養ブイヨンからCO2を除去しなかった
この実験は、培養を25°で12時間持続させるのに必要な最小CO2添加速度を評価する。実施態様として、すべての他の実験パラメーターを同じに保ちながら培地Bとして用いられるNaHCO3溶液の濃度を低下させた。この実験において、NaHCO3濃度を約19.3g/Lに下げ、リアクタ内の細胞1グラム当たり約0.014ミリモル/分CO2のCO2供給速度を得た。これは、培養生存における低供給速度である。
実験の開始の前の培養細胞密度は4.0g/Lであった; pHは4.43であった; レドックスは約-430mVであった; CO及びH2の取り込みは、それぞれ約4.9及び約1.3ミリモル/分であった; CO及びH2変換は、それぞれ約86及び約44%であった; エタノールは約18.9g/Lであった; 且つ酸は約3.8g/Lであった。
2015、t = 9580.7時間において、供給ガス流量を約474mL/分から約53mL/分に減少させた。撹拌を約400から50rpmに下げ、リアクタについての温度設定点を約12分以内に約38から約25℃に下げた。冷却が達成されると、重炭酸ナトリウムフローを0.56mL/分に開始した; 供給ガスフローを停止した; 透過物パージを1.96mL/分に開始し、培地フローを1.36mL/分に保持した。窒素をリアクタの上部にできた空間にゆっくりと添加して、真空がリアクタ内に生じることを防止した。培養をその条件で約12時間維持した。
【００５３】
実験の間、培養物pH、細胞密度、生産物及び細胞形態をモニタするために約2時間毎に液体試料を採取した。実験全体で、培養物pHは、実験の終了頃に4.72に達するように実験全体で徐々に増加した。エタノール濃度は、実験の終了までに約18.9から約10.7g/Lに徐々に低下した。総アセチル濃度は、約3.8から約6.0g/Lに徐々に増加した。細胞密度は、約4.0から約2.8g/Lに低下した。約12時間後、細胞の約95+%を示した培養形態は、粒状又は中空体であった。
t = 9592.7時間において、リアクタについての温度設定点を約38℃に戻した; 供給ガスを約53mL/分で再開した; 培地B及び透過物パージを停止した; 更に、リアクタの上部にできた空間へのN2フローを停止した。培養物を次に15分間かけて加温している間に、供給ガス流量と撹拌を段階的に増加した。温度が約28.0℃に達したとき、供給ガス流量を178mL/分まで増加した。培養物のpHが徐々に低下し、培養物活性を示した。約30.0℃において、供給ガスフローを再び236mL/分、又は50%又は最初のガス流量に増加した。約32.0℃において、撹拌を200rpmまで増大した。約34℃において、撹拌を約400rpmまで増大した。
ガス、撹拌及び温度を増加した約50分後の最初の変換は、53%H2及び89%COを示した。ガス流量をすぐに開始した。実験の開始前に用いられた最大ガスフローに達するのに約14.6時間かかった。ガス流量が増加するのにつれて、実験の終了の49.4時間後にエタノール濃度が23.7g/Lに戻り、酸が9.3時間後に3.5g/Lまで下がった。
【００５４】
実施例6
38℃で12時間培養物生存の間のCO2の最小化
実験条件:
供給ガスなしで6時間
温度を38℃に維持した
培地添加は、実験に変化がなかった
細胞1グラム当たり0.014ミリモル/分のCO2供給速度
透過物パージを用いて細胞を保持した
実験の開始時にN2を用いて培養ブイヨンからCO2を除去した
実験の開始の前の培養細胞密度は2.76g/Lであった; pHは4.60であった; レドックスは約-440mVであった; CO及びH2の取り込みは、それぞれ約4.5及び約1.2ミリモル/分であった; CO及びH2変換は、それぞれ約86及び約44%であった; エタノールは約19.0g/Lであった; 且つ酸は約2.43g/Lであった。
t = 3080.5時間において、供給ガス流量を約475mL/分から約53mL/分に減少させた。高N2フローを供給ガススパージャによって開始し、培養からCO2を取り除くためになお約400rpmで約3分間撹拌した。CO2を取り除きつつ、pH制御を停止して、重炭酸ナトリウム添加を止めた。約3分後、N2フローを低下させ、N2入口をスパージャよりもむしろ上部にできた空間に変えた。撹拌を約400から50rpmに下げた。リアクタについての温度設定点を約12分以内に約38から約25℃に下げた。CO2添加を約77g/LのNaHCO3を用いて約0.82mL/分で開始して、リアクタ内の細胞1グラム当たり約0.114ミリモル/分のCO2得た。培地流量を約1.34mL/分で放置し、2.25ml/分の透過物パージフローを開始した。
【００５５】
酸が高いため実験をt = 3086.5時間の6時間後に停止した。重炭酸ナトリウム添加、透過物パージ及び上部にできた空間へのN2添加を停止した。供給ガスフローを53mL/分で再開した。前の実験において培養物が約38℃に温められているときにガスと撹拌を増加させるために用いられるのとほぼ同じ間隔で供給ガス及び撹拌を増加した。実験を停止した2分後に、供給ガスフローを約170mL/分まで増加した。実験が停止した約4分後、供給ガスフローを約248mL/分(最初のガス流量の50%)まで増加した。実験を停止した約6分後、撹拌を200rpmに増加した。実験を停止した約8分後、撹拌を約400rpmに増加した。
CO2添加及び低撹拌による約6時間後、pHは約5.08であった。液体分析により、生産物が約10.4g/Lのエタノール及び約8.21g/Lの酸であることを示した。培養物形態は、細胞の約3%が粒状であり、追加の約22%がほぼ粒状であった。
実験を停止した約30分後の最初の変換は、約47% H2及び約87% COであった。ガス流量の増加をすぐに開始した。最初の供給ガス流量は、t = 3108時間、又は実験が終了した約21.5時間後に到達した。
【００５６】
表2. 撹拌及び最初のGFRの少なくとも50%を用いて培養を再開した場合の約25℃と約38℃におけるガス減少実験における培養パラメータ
0005777889.tif 000003
【００５７】
表2(続き)
0005777889.tif 000004
【００５８】
表3.重炭酸塩添加、供給ガス減少実験w/既知のCO2添加速度に対するリアクタ内の細胞1グラム当たりの算出CO2供給速度(ミリモル/分g)
0005777889.tif 000005
【００５９】
表3(続き)
0005777889.tif 000006
【００６０】
表4. 供給ガス減少実験の間のCO2供給速度、EtOH取り込み速度及び酸生産速度
0005777889.tif 000007
【００６１】
実施例7
比較例: 本発明の例示的方法
CO及び/又は二酸化炭素/気体の水素を含有する合成ガス又は廃ガスを、ビタミン、微量金属及び塩を含有する従来の液体培地と共に、C.リュングダーリイの菌株を含有する撹拌槽バイオリアクタに連続して導入する。
10%以下の培養植菌物を用いた方法の開始の間、リアクタをバッチ液体相によって操作し、ここで、液体培地をリアクタに連続して供給しない。このように、リアクタ内の液体相は、適度な濃度の制限する栄養素、パントテン酸カルシウムか又はコバルトを有する栄養培地のバッチからなる。或はまた、酵母エキス、トリプチカーゼ又は他の複合栄養素を含有する富栄養培地を使うこともできる。
理想的には、始動時の気相は、CO2を含まず、過剰H2を含有する。ガス速度及び撹拌速度を低レベルに保ち(New Brunswick Scientific Bioflo.RTM.の発酵バイオリアクタにおいて500rpm未満)、COとH2をわずかに過剰量で得、同時に基質阻止が避けられる。1リットルの実験用New Brunswick Scientific Bioflo.RTM.発酵バイオリアクタにおいて、一例として、供給ガス組成が63% H2、32% CO及び5%CH4である場合、始動を開始する撹拌速度は400rpmであり、ガス速度は20ml/分である。始動の間のエタノール生産の原因は、過剰のH2であり; 栄養に対する制限は、後に生じる。このように、過剰の液体栄養素(パントテン酸塩、コバルト)を、始動の間、実際に存在させ、低栄養素に不必要な培養順化を避ける。
発酵が植菌後数時間かけて進行するので、COの変換からCO2が生成され、H2がCO2と共に消費され、これはガス物質移動の制限を避けるために撹拌速度を適度に増加させるシグナルである。New Brunswick Scientific Scientific Bioflo.RTM. CSTRにおいて、流出ガスは、25% CO、67% H2、2% CO2及び6%CH4である。撹拌速度をあまりに急速に増加させる場合には、撹拌の増加後のメタン濃度の低下によって証明されたように、CO基質阻止が生じる。このように、撹拌速度は、典型的には、24時間で200rpmだけ増加させることがあり得る。適度に撹拌速度を増加させつつCO2生産(又はH2変換)をモニタするこの手順は、目標撹拌速度に達するまで比較的速い速度で行われる。New Brunswick Scientific Bioflo.RTM.発酵バイオリアクタにおける典型的な目標撹拌速度は、900rpmである。バッチ液体培養において撹拌速度を増加させるこの時間の間、生成物形成の代わりの細胞生産が最も重要である。このように、約1.5g/Lの細胞濃度が得られ、典型的な生成物濃度はバッチ培養から10g/Lのエタノール及び2g/Lの酢酸塩である。
【００６２】
目標撹拌速度に達すると、システムは最大H2取り込みまで増大させることを可能にする。酢酸生成を制限しつつ、エタノール生成を確実にするために非常に高いH2出口濃度(典型的には＞60%)を有することが望ましい。次に、液体培地の供給を作動させて(保存培養物からのバッチ植菌を有するシステムのために)、連続液体供給を開始させ、ガス供給速度を目標流量に対して増加させる。実験用New Brunswick Scientific Bioflo.RTM.発酵バイオリアクタにおいて、液体供給速度は典型的には0.5mL/分であり、ガス流量は125mL/分の目標速度に対して24時間毎に10〜15%だけ増加させる。
過剰の酢酸生成を避けるために供給ガス中過剰のH2を供給することが重要である。ガス流量が増加するのにつれて、目標生産性においてH2変換の少しの減少によって証明されるようにリアクタが最終的には液体相栄養素(パントテン酸カルシウム又はコバルト)に制限されるまで細胞生産が増加する。New Brunswick Scientific Bioflo.RTM. CSTRにおいて、これは、1日20g/Lの目標生産性においてH2変換の10%減少によって認識される。
次に、生産法及びリアクタシステムは、定常状態で維持され、栄養素、液体速度及びガス速度を制限するのに時々わずかな調整をして、生成物として15〜35g/Lのエタノール及び0〜5g/Lの酢酸塩が生成する。細胞再循環なしで実験用New Brunswick Scientific Bioflo.RTM.発酵バイオリアクタにおける典型的な定常状態条件は、20分間のガス保持時間(ガス流量/リアクタ液体容積)、30時間の液体保持時間(液体流量/リアクタ液体容積)及び900rpmの撹拌速度であり、パントテン酸塩を制限して92%のCO変換及び60%のH2変換が得られる。
細胞再循環がリアクタシステムに加えられるこの方法の実施態様においては、ガス速度(増加させる)及び栄養素濃度(低下させる)の調整と共にこの時点で加えられる。New Brunswick Scientific Bioflo.RTM. CSTRにおける細胞再循環によって、ガス保持時間は典型的には8分間であり、液体保持時間は12時間であり、細胞保持時間は40時間であり、撹拌速度は900rpmである。これらの条件により、典型的には、92%のCO変換及びパントテン酸塩を制限して50%のH2変換が得られる。
【００６３】
実施例8
比較例: 厳格な方法の不調からの回復
ガス及び液体栄養素を連続して供給し且つ定常状態で15-35g/Lのエタノールと0-5g/Lの酢酸塩を生成するC.リュングダーリイ、菌株C-01を含有する細胞再循環を有するCSTRは、方法条件の思いがけない変化、例えば、リアクタ内の機械的問題のために調子が悪い。リアクタシステムに対する不調は、短期基質阻止を引き起こすガス速度の簡単な増加のような小さいものか、又は最終的には酢酸生成の増加及びより厳格な分子酢酸生成物阻止につながるガス速度のより長期の増加のような大きなものであり得る。
短期不調は、単に不調パラメーター(例えば、ガス速度を最初のレベルに低下させる)を再調整し、不調がより長期の問題につながらないことを確実にするためにリアクタの進行をモニタするだけで、容易に修正される。
しかしながら、酢酸生成物阻止は、更に厳しい問題である。過剰の分子酢酸が長期基質阻止、過剰の栄養素添加、CO2蓄積又は多くのタイプの機械的問題の結果として培養物によって生じる場合には、過剰の酢酸につながった問題が最初に修正されなければならない。次に、生成物阻止に急速につながる過剰の酢酸は、システムから酢酸(及び残念なことにエタノール)を洗浄するために液体速度を増加させることによってシステムから取り除かれる。酢酸塩レベルが3-5g/L未満であると、液体速度は再設定され、リアクタは過剰のH2供給、又はビタミン又はコバルト制限(細胞再循環の有無にかかわらず)の下に置かれる。リアクタの回復には、基質阻止を避けるようにガス速度を低下させ更に/又は細胞流出及び溶解が生じる前に撹拌速度を低下させることが必要である。次に、撹拌速度又はガス速度を増加させる。
特定の一例において、CO、CO2及びH2からエタノール及び酢酸を生成するC.リュングダーリイ、菌株C-01を含有する細胞再循環を有するCSTRは、機械的問題に応答して酢酸を生成し始めた。2100mlリアクタを15分間のガス保持時間で62% H2、31% CO及び7% C2H6を含有するガスを供給し、600rpmの撹拌速度及び4.86のpHで操作した。液体保持時間は23時間であり、細胞保持時間は68時間であった。B-ビタミン溶液(50.5mg/lのパントテン酸カルシウム、20.6mg/Lのd-ビオチン及び50.6mg/LのチアミンHClの水性混合物)を、培地1リットル当たり0.4mlのビタミン溶液の濃度で塩とビタミンを含有する液体栄養培地中に存在した(表2を参照のこと)。リアクタを作動させるのに安定でもなく、エタノール生産に経済的でもない条件、エタノール濃度は7g/Lに低下し、酢酸塩濃度が7g/Lまで増大した。細胞濃度は2.4g/Lであり、CO変換は85%であり、H2変換は25%であった。
【００６４】
リアクタを回復させるのに用いられる方策は、最初にリアクタへのガス供給速度を激減させ、次に、過剰のH2の存在下にリアクタを漸次回復させることからなった。酢酸塩濃度がほとんど高くなかったことから、この実施例においてリアクタへの液体速度は生成物阻止を取り除くのに低下させなかった。代わりに、酢酸塩濃度は、ガス流量の減少により非阻止レベルまでより徐々に減少させ、次に過剰のH2の存在下に作動させることを可能にした。リアクタを回復させる際の個々の手順を以下に述べる。
細胞再循環を停止させ、23〜30時間(t=0)まで液体保持時間をわずかに調整しながら、ガス速度を62分間のガス保持時間に70%だけ激減させた。培地中のビタミン濃度は変えなかった。ガス速度のこの変化においては、CO変換は98%に増加し、H2変換は80%に増加した。より重要なことに、19から5%に出口ガスにおけるCO2の低下によって証明されるように、システムは過剰のH2が存在した。過剰のH2の開始においては、酢酸塩濃度は低下し、エタノール濃度は増加した。t=66時間において(細胞再循環を停止させた66時間後)、例えば、酢酸塩濃度は4g/Lまで低下し、エタノール濃度は7.5g/Lに僅かに増加した。
過剰のH2(及び酢酸塩濃度の低下)の存在は、速度として最初にゆっくりと、次により高速での続いての増加を可能にした。t=215時間までに、ガス保持は29分であり、エタノール濃度は12g/Lであり、酢酸塩濃度は3g/Lであった。エタノール生産性は、1日8g/Lであった。CO2は6%で出口ガスに存在し、CO変換は98%であり、H2変換は80%であった。t=315時間までに、エタノール濃度は16g/Lであり、酢酸塩濃度は4g/Lであり、再びガス変換が良好であり、20分間のガス保持時間を有した。エタノール生産性は、1日11g/Lであった。t=465時間までに、エタノール濃度は20g/Lに達し、3.5-4g/Lの酢酸塩も存在した。エタノール生産性は、1日16g/Lであった。ガス保持時間は16分間まで落ち、CO及びH2変換は、それぞれ95及び73%であった。これらの条件は連続操作のほぼ200時間維持され、リアクタシステムがエタノールを生成する能力を回復し、前の操作条件を本質的に保持したことが示された。
公開されたすべての文献は、本明細書に含まれるものとする。本発明の多くの修正及び変更は、上で確認された明細書に含まれ、当業者には明らかであると予想される。本発明の組成物及び方法に対するこのような修正及び変更は、これに添付される特許請求の範囲に包含されると考えられる。
【図１】
0005777889.tif 000008
【図２】
0005777889.tif 000009
【図３】
0005777889.tif 000010