(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘電性基板（５２；１５２；２５２）、及び
前記基板上に設けられた金属層（５３；１５３；２５３）であって、該金属層中は少なくとも１個のナノ空隙（５４；１５４；２５４）を備え、Ｌ−ＳＰＲを支持するようになっており、このナノ空隙（５４；１５４；２５４）が深度、開口部（５６；１５６）及び閉じられた底部（５８；１５８）を有し、かつ開口部から底部へ向けて広がることによって該開口部の周りに強電界を形成するようになっている、金属層（５３，１５３；２５３）から成るセンサ装置であって、
各空隙（５４；１５４）の前記底部（５８；１５８）上には誘電材から成るベッド（６２；１６２）が設けられて見掛け深度（ｄＡ）が減じられ、及びベッド表面（６３；１６３）は受容体部分（６４；１６４）と結合するように機能化されていること；
該誘電体ベッド表面は分析対象物が該受容体部分に結合された時、該分析対象物の少なくとも一部が該強電界内に位置することを特徴とするセンサ装置。
【請求項２】
前記空隙（５４）が開口部から底部へ向けて円錐台形あるいは台形に形状化されることを特徴とする請求項１記載のセンサ装置。
【請求項３】
前記空隙（１５４）の拡がりが連続状、あるいは段階状であることを特徴とする請求項１または２記載のセンサ装置。
【請求項４】
前記空隙がそれらの底部において誘電材で閉じられることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のセンサ装置。
【請求項５】
前記ベッドの厚さが前記空隙の深度よりも小さいことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のセンサ装置。
【請求項６】
前記ベッド（６２；１６２）の高さが、前記見掛け深度（ｄＡ）が開口部（５６）から１０〜３０ｎｍの範囲内、好ましくは１５〜２５ｎｍの範囲内となるように構成されることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のセンサ装置。
【請求項７】
前記ベッド（６２；１６２）が、少なくともその表面において機能化された誘電材から成ることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のセンサ装置。
【請求項８】
前記ベッドが単一の誘電性ポリマーから、あるいは２以上の誘電材層から作製され、その最上層が機能化された誘電性ポリマーから成ることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のセンサ装置。
【請求項９】
前記金属層（５３；１５３；２５３）の厚さが１００ｎｍ以上、好ましくは１２０ｎｍ以上であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のセンサ装置。
【請求項１０】
前記金属層（５３；１５３）が、金、銀、銅、白金、アルミニウム、またはこれら金属の１または２以上から成る合金から選択される金属から作製されることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のセンサ装置。
【請求項１１】
前記空隙の開口部の幅が５０〜２５０ｎｍの範囲内であり、底部幅が１００〜４５０ｎｍの範囲内であり、及び空隙深度が１００〜２００ｎｍの範囲内であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載のセンサ装置。
【請求項１２】
前記少なくとも１個の空隙アレイの周期性が２００〜１０００ｎｍの範囲内であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載のセンサ装置。
【請求項１３】
前記金属層が一層の抗汚材層（１７２）で被覆されることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載のセンサ装置。
【請求項１４】
ベッド表面へ取り付けられた受容体部分（６４；１６４）を含んでいる請求項１〜１３のいずれかに記載のセンサ装置。
【請求項１５】
前記金属層（２５３）の上部へ設けられ，かつ試験サンプルが空隙２５４の各アレイと選択的に接触状態となるように運ばれるように配置されるチャネルを含むマイクロ流動層（２８０）が含まれて構成されることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載のセンサ装置。
【請求項１６】
前記基板が誘電材及びまたは半導体材料から成ることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかに記載のセンサ装置。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載のセンサ装置、
ＳＰＲを励起させるように選定された条件下で前記センサ装置のＬ−ＳＰＲ支持金属層を照射するための試験光ビーム（２９０）を１以上発する入力光学モジュール（２９２）、
センサ表面において共鳴状態をモニターするように、センサ装置によって伝送あるいは反射される前記少なくとも１つの試験光ビームの光特性を測定するための出力光学モジュール（２９４）から構成されるＳＰＲ感知システム。
【請求項１８】
前記センサ装置が、誘電性基板（２５２）側から、前記少なくとも１つの試験光ビームで照射されることを特徴とする請求項１７記載のＳＰＲ感知システム。
【請求項１９】
ＳＰＲ、ＳＥＲＳ、蛍光及びＳＡＬＤＩの１または２以上に基づく検知方法における請求項１〜１６のいずれかに記載のセンサ装置の使用。
【請求項２０】
前記感知システムが、ＳＰＲ、ＳＥＲＳ、蛍光及びまたはＳＡＬＤＩに基づく化学、分子、生化学あるいは生体分子検知を行うように構成されていることを特徴とする請求項１〜１６のいずれかに記載のセンサ装置を含んで成る感知システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概略的には表面プラズモン共鳴に基づく感知システムに関し、より具体的には化学、生化学、生物学、生体医学、薬理学及び物理学に関する試験への利用に適するナノ構造を備えるＳＰＲセンサ装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
センサ表面に近接するサンプルにおける屈折率変化を検知するために用いられる、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance : ＳＰＲ）センサと呼ばれる, 表面プラズモン励起を利用するセンサとして多数のものが公知である。かかるＳＰＲセンサは、例えば化学、生化学、生物学、生物医学あるいは薬理学的研究、臨床、食品分析、あるいは環境測定（例えばガスあるいは排水の検知）等における物質濃度の定量に用いられる。多くのＳＰＲセンサは迅速、並列、大量検査の実施が可能であり、それゆえこれらセンサは分子相互作用の定量、とりわけ２以上の相互作用分子同士の親和性及びリアルタイム反応速度論（反応動力学）の研究にも有用である。
【０００３】
ＳＰＲセンサは周知のＳＰＲ現象に依存するものであり、この現象には金属材料（典型例として金あるいは銀）と誘電性材料間の界面を伝搬する１または２以上の表面結合電磁波が関与している。金属誘電材料界面における自由電子の集中的振動によって、各表面結合電磁波はその最高強度で該界面に平行に伝搬し、該界面から離れるにつれて指数関数的に減衰する。
【０００４】
ＳＰＲの励起に最も普通に用いられる技術ではプリズムがクレッチマン配置で用いられる。かかる場合、該プリズムは表面プラズモンを支持するための貴金属層で被覆され、及びＳＰＲは該プリズムを介して光学的に励起される。実際、入射光の界面平行成分とＳＰＲの表面結合電磁波の双方が整合周波数及び整合波長を有するならば、光によって金属・誘電材界面に表面プラズモンの共鳴が励起される。この共鳴状態において、前記入射光は前記金属・誘電材界面によって吸収され表面結合電磁波と結合される。その際、金属・誘電材界面によって伝播あるいは反射される光の例えば強度の減少を検知することによって、この吸収を確認することが可能である。光と表面プラズモン波間の結合状態が金属・誘電材界面に近接する誘電材媒体の屈折率変化に対して敏感であることから、ＳＰＲセンサはこの共鳴結合状態における感度を利用して金属・誘電材界面がＳＰＲ励起波長によって照射される間にそれから反射される光強度の減少を測定することによって誘電材媒体の屈折率変化の検知を行う。
【０００５】
ＳＰＲには、生体センサシステムにおいて、生体分子または生化学分子間の相互作用、例えば抗原と抗体間、酵素と基質間、内分泌物と受容体間、核酸と核酸間等の相互作用、を検知できる特殊な用法があることが見出されている。特に、多くのＳＰＲ生体センサシステムには、それらセンサ表面上に生体受容体が配置備えられ、これらセンサにより、生化学分子あるいは生体分子が生体受容体と相互作用（結合）した時のそれらセンサ表面における屈折率変化によって生ずる光・ＳＰＲ結合状態の変化が検知される。かかる生体センサシステムは、例えば溶液中の生体分子あるいは生化学分子の濃度の測定に適している。
【０００６】
現在において、ＳＰＲ感知に基づく試験装置は多数存在する。米国特許第２００９／０２１，７２７号にはクレッチマン配置に基づく生体センサが開示されている。
【０００７】
生化学分子検知のための別のＳＰＲ生体センサシステムも米国特許第２００８／３１６，４９０号において既知であり、この特許においてはプリズムに代えて金属格子が採用されている。
【０００８】
より最近になって、局在 (local) 表面プラズモン共鳴（Ｌ−ＳＰＲ）現象が発見され、さらに金属サブ波長周期構造を介しての透過の増大によって、高スループット用途を支える検知アレイサイズの大幅な増大が期待されてきた。Ｌ−ＳＰＲの適用にとって、広範囲技術の中から検討された最も万能な技術は、所謂ナノホールアレイ感知構成である。その典型的アプローチにおいて、ＳＰＲセンサは貴金属層で被覆された誘電物質から構成され、該層中にはナノホール、すなわちサブ波長サイズに形成されたホールから成る周期アレイが形成されている。
【０００９】
かかるナノホールアレイを備えるＬ−ＳＰＲ型センサについては、例えばＷＯ２００８／０３９２１２、ＷＯ２０１０／１３００４５、及びParsons, Jらによる「周期非回析性金属ナノ粒子及びナノホールアレイにおける局部表面プラズモン共鳴」に記載がある。
Giudicatli, S. etal.  の「コロイダル  リソグラフィーによるナノ構造金/ポリマー表面のプラズモン共鳴」PHYSICA STATUS SOLIDI (A)、２９７巻、２０１０年４月、９３５〜９４２頁は、２次元六角形アレー内に配置されたポリマーピラーによって穿孔された金フィルムからなるＬＳＰＲ支持構造を提供するコロイダル  リソグラフィー方式が記載されている。
ＳＰＲセンサーの準備においてコロイダル  リソグラフィーの利用は又、EP２２６４４３８及びMannelli et al.による「高度に有効な親和力センサー用脱着マトリックス内の生体接着性マノエリア」、PROCEEDINGS OF THE SPIE, USA ７０３５巻、２００８年、７０３５０Y-１〜７０３５０Y-１０頁に記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は感知性能が増強されたナノホールアレイ型ＳＰＲ感知方式に基づくセンサ装置を提供することを目的とする。
本発明の目的は請求項１項記載のセンサ装置によって達成される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の検討過程において、本発明者らは、従来の技術はナノホール配置を調節してナノホールの電磁波反応を適合させることを可能とするものではあっても、得られた配置では生物学的検知に関しては最適化されていないことを認識するに至った。特に、本発明者らは、金属上及びホール中に設けられた生体分子受容体の位置が最も効率的な検知を確保するためには多くの場合において不適切であることを見出した。
【００１２】
かかる課題を考慮し、本発明者らは、配位子／分析対象物の受容体への結合が強電界密度を有する領域内において確実に起こる構造を有するプラズモンセンサ装置を考案した。
【００１３】
その結果、本発明に係るセンサ装置、特にＳＰＲセンサ装置は、誘電材料と、Ｌ−ＳＰＲ（局在ＳＰＲ）を支持するように適合した該材料上の金属層から構成される。該金属層には該層中に少なくとも１つの空隙アレイが設けられ、該空隙のそれぞれには深度、開口部及び閉じられた底部が備えられ、さらに該空隙は開口部から底部へと拡がる形状とされている。
【００１４】
誘電材から成るベッドが各空隙の底部上の全体に亘って設けられることから、該空隙によってその開口部からの深度（見掛けの深さ）が減じられ、ベッド表面は受容体への結合親和性をもつように機能化されている。
【００１５】
注意すべき第一点は、空隙の開口部周囲における電界の増強を許容する該空隙の拡がり形状である。第二点は、結合がこの強密度領域中に起こるように受容体をさらにこの領域へ近づけるために、空隙の底部へ空隙の見掛け深度を減ずるベッドを形成するための誘電材が充填されることである。この結果、見掛け深度は、空隙の頂部／開口部とベッド表面間に得られる残存深度に相当する。
【００１６】
さらに、前記ベッドの機能化された表面により、検定及び試験中に、試験下にあるサンプル中に存在する可能性のある対応分析対象物／配位子と結合する受容体部分を該表面上へ取り付けることが可能とされる。
【００１７】
このように受容体部分を取り付けることにより、前記受容体部分は強電界へ近づき、またそれに結合する分析対象物は実際にこの強電界領域中に存在するようになる。
【００１８】
従って本発明に従って設計することにより、空隙を望ましい電磁気仕様に設計することが可能とされ、他方最適検知のため、受容体部分及び使用中に形成される複合体の位置を同時に最適化することが可能とされる。
【００１９】
ここで用いられている用語「受容体部分」とは、プローブ物質としてセンサへ取り付けられ、かつ検知される分析対象物に対して一定の結合特異性を有するいずれかの種の物質をいう。受容体はいずれかの分子、化学物質、天然物、あるいはそれらの一部であってもよく、生物学的検定に関しては、受容体部分は抗原／抗体、酵素、タンパク質、オリゴヌクレオチドなどから成る。用語「分析対象物」は、分析対象物のセンサ装置上へ取り付けられた受容体部分との結合特異性の結果として本発明センサを用いて検知される、いずれかの分子、化学物質、生体分子、あるいは構成物質をいう。この分析対象物とは、いずれかの種の配位子、分子、生物学的物質、例えばタンパク質、酵素、ペプチド、有機及び無機化学物質、オリゴヌクレオチド、抗体等をいうが、広義には特定の生化学反応によって認識可能ないずれかの種の分子をいう。
【００２０】
ナノ空隙の形状としては、連続状あるいは段階状の円錐台形または台形が好ましい。しかしながら、当業者であれば、頂部から底部へ拡がって空隙開口部周囲に強電界パターンを生ずるいずれか適当な形状を案出可能である。
【００２１】
空隙の見掛け深度は、受容体及び分析対象物のタイプの機能に適合し、特にその長さに依存することが理解されるよう。従って、空隙中の誘電材ベッドの厚さは、受容体への分析対象物の結合に際して分析対象物が少なくとも部分的に強電界領域中に位置するように有利に設計される。このことは、受容体の結合先端が強電界領域へ接触あるいは部分的に貫入することを示している。これにより、ベッドの厚さ（あるいは高さ、すなわち空隙底部からベッド表面までの距離）は、空隙深度（または高さ）より一般的に小さいことが理解されよう。
【００２２】
生物学的用途においては、ベッドの厚さは好ましくは見掛け深度が開口部から１０〜３０ｍｍの範囲内、さらに好ましくは１５〜２５ｍｍの範囲内となる厚さに設定される。
【００２３】
前記ベッドは、対象とされる分析対象物の検出に適合した受容体を用いて、あるいは該受容体に対して機能化の可能ないずれか適する誘電材から作製可能である。
【００２４】
前記ベッドは単一材料から、あるいは２以上の誘電材層から構成可能であり、各層の厚さはベッドの全体厚の一要素となることから、これら層の厚さによって空隙の見掛け深度を調節することが可能なことにも注意すべきである。かかる場合において、最上層には機能化能力が備えられていなければならない。例えば、厚さがｔ１であるｐｐＡＡあるいはナイロン等の誘電材第一層を形成し、いずれか適当な機能化された誘電材、例えばハイドロゲルを含む多孔性誘電材から成る厚さがｔ２の次層を前記第一層上に形成可能である。ベッドの全体厚ＴはＴ＝ｔ１＋ｔ２以上であり、ここで金属層中の空隙の深度はｄＣで示され、見掛け深度ｄＡは式ｄＡ＝ｄＣ−Ｔから算出される。
【００２５】
上記において、機能化された層には受容体部分を形成する分子／部分を含ませることが可能なため、基質の使用前に受容体部分を基質上へ配置することは必要とされない。
【００２６】
本発明の一実施態様では、金属層の厚さは１００ｎｍ、好ましくは１２０ｎｍ以上とされる。実用場面において、金属層の厚さを１００〜２００ｎｍの範囲内とすることも可能である。
【００２７】
空隙の寸法はナノメーター範囲内であるが、表面プラズモンを刺激するため、空隙は波長以下の寸法、すなわち入射光の波長以下の寸法とされる。
【００２８】
金属層中の空隙は典型例としては貫通孔であり、空隙の閉じた底部は基質面によって形成される。金属層中の空隙の深さは好ましくは１００ｎｍ以上、さらに好ましくは１００〜２００ｎｍの範囲内である。
【００２９】
さらに、ＵＶ−ＶＩＳ−ＮＩＲスペクトルから選択されるプローブ光を用いた全般的操作のため、空隙は開口部の幅（直径または直径相当）が５０〜２５０ｎｍ、他方底部幅が１００〜４５０ｎｍとなるように設計することも可能である。
【００３０】
これに関連して、ナノ空隙アレイの周期性、すなわち２つの空隙中心間の距離を２００〜１０００ｎｍの範囲内とすることが可能である。
【００３１】
Ｌ−ＳＰＲ（局在ＳＰＲ）に適合するいずれの金属もＬ−ＳＰＲ支持金属層として使用可能である。かかる金属としては、金、銀、銅、白金、アルミニウム、あるいはこれら金属の１または２以上から成る合金から選択して用いることが可能である。
【００３２】
有利な態様として、金属層はタンパク質の付着を防止するため薄抗汚層で被覆される。その結果、誘電材ベッド表面への受容体の取り付けがさらに容易に行える。また、試験中、タンパク質及び分析対象物の付着がより少なくなり、信号のノイズ比が改善される。
【００３３】
本発明において、基質及びベッドに対して用いられる用語「誘電性」とは、「導体」ではなく、プラズモン界によって分極化可能な物質を包み込む性質を意味し、従って、サファイア、ガラスあるいはポリマー等の誘電性物質及び適する半導体材料が含まれる。
【００３４】
使用を容易にするため、当該分野では通例であるように、ミクロ流動層を金属層の上部へ設けることが可能である。かかるミクロ流動層には、通常試験サンプルを選択的に各空隙アレイと接触状態にするチャネルが含められる。
【００３５】
典型例として、１つの空隙アレイには１つの型の受容体が結合される。従って、金属層は多数の空隙アレイから成っていることから、各空隙アレイには各種型の受容体が含められる。
【００３６】
本発明センサは、光検知器構成あるいは画像システムを備えるものであっても、従来照明を用いるＳＰＲ分析システム及び光分析システムにおいて使用可能である。
【００３７】
これに関して、ＳＰＲ撮像／顕微鏡検査において用いる場合、本発明ＳＰＲは従来型ＳＰＲ及びＬ−ＳＰＲセンサに優る実質的に強化された性能をもつことが理解されよう。従来型センサを用いる場合、プローブ光は感度と側方分解能との瓦換性において選択されることが既知である。それに対し、ナノ空隙アレイを用いる本発明のＳＰＲセンサにおいては、プラズモンは微細な側方分解能（典型的には１００〜５００ｎｍ）を与える狭いエリア中に閉じ込められることが認識されよう。さらに、本発明における空隙深度を減ずるベッドを用いる空隙構造によって、最大感度を得るために標的部分を強電界中に位置取りさせることも可能である。その結果として、高側方分解能かつ高感度でＳＰＲイメージングを行うことが可能とされる。
【００３８】
本発明によるセンサ装置は、ベッド面に取り付けられる受容体に従って多くのＳＰＲ分析において利用可能である。とりわけ、本発明ＳＰＲセンサ装置は、化学、生化学、生物学、生体医学、薬理学、及び物理学分野における試験用途に利用可能である。本発明ＳＰＲセンサは、より具体的には、例えば化学、生化学、生物学、生体医学あるいは薬理学研究、臨床あるいは食品分析、あるいは環境測定（例えばガスあるいは排水の検知）における物質濃度の定量に利用可能である。
【００３９】
さらに、本発明センサ装置の機構は、表面プラズモン検知システム以外の分子、化学及び生化学分析技術においても重要なことが認識されよう。特に、本発明センサは、本発明によって可能とされる電磁波界の局在及び増強が光、温度、電気等の検知信号の増強に反映される検知／分析技術においても有利に利用可能である。かかる技術の例として下記技術が挙げられる。
ａ）表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）
標準的ラマン分光法においては、レーザーからの単色光によって分子の振動形態が励起される。これら振動形態は反射光のスペクトル中に正のピークとして観察される。これらピーク（ラマンピーク）のスペクトル位置は指紋のように分子によって特有である。ラマン分光法は化合物中に存在する異なる分子の存在及び量を直接測定する特有な方法である。従来のＳＥＲＳの場合、ナノ構造センサによって低濃度で物質の測定を可能とするラマン信号（通常極めて微弱）が増強される。本発明に従ったセンサ装置はＳＥＲＳにおいて有利に利用可能である。その場合、ＳＥＲＳ増強は、空隙の頂部において（表面プラズモン共鳴技術におけるのと同様に）起こり、また空隙のサイズ及び形状の向きを変えることによって位置決めすることも可能である。Ｌ−ＳＰＲ分析の場合と同様に、本発明センサ装置を用いることにより、ＳＥＲＳ増強が最大であり、それによって信号感度が向上されている部分へ分析対象分子を正確に位置付けることが可能である。
ｂ）蛍光分光法
標準的蛍光分光法においては、蛍光分子（蛍光色素分子）がレーザー光によって励起され種々波長の蛍光を放出する。この技術は分子、タンパク質、ＤＮＡ等の濃度測定のための定量分析法として利用される。本発明を用いて、（二次抗体あるいは認識機能をもつＤＮＡ配列と共役した）蛍光色素分子を電界が最大である領域中に位置づけ、感度（すなわち蛍光強度）を大幅に増強させることが可能である。
ｃ）マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）及び表面支援レーザー脱離イオン化（ＳＡＬＤＩ）においては、質量分析計で分析可能なイオンを生成するために、高密度レーザビームを用いて表面からの分析対象物の脱離が誘導される。この方法は、あらゆる分子濃度の直接測定に極めて高感度、かつ極めて正確な分析技術である。ＳＡＬＤＩにおいて本発明センサ装置を利用する場合、分析対象分子はレーザー光の強度（脱離誘導）が最大となる部分へ配置されるため分析効率が増大となる。
【００４０】
これら種々分析技術においても、表面プラズモンは入射光によって局部的に刺激され、ＳＰＲのみによる分析と同様に、空隙の特有な形状によって空隙開口部において増強された電界が得られることが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ナノホールアレイを有する従来型ＳＰＲセンサの原理を示した図である。
【図２】本発明によるＳＰＲセンサ装置の設計原理を説明するスケッチ図である。
【図３】誘電性ベッドを有しない空隙底部における受容体の位置を説明するための比較スケッチ図である（本発明ＳＰＲセンサの実施態様ではない）。
【図４】本発明ＳＰＲセンサの一実施態様に従ったナノ構造のレイアウト図である。
【図５】ナノ構造の内部及び周囲の電界強度パターンの説明図である。
【図６】ＳＰＲ検知システムの一実施態様における原理図である。
【発明を実施するための手段】
【００４２】
次に本発明について、実施例を用い、添付図面を参照しながらさらに詳細に説明する。
ａ）従来型Ｌ−ＳＰＲセンサ設計
当業者には既知であるように、ＳＰＲ効果に基づくセンサは２つの型のプラズモン共鳴作用に依存している。
１）誘電材と貴金属間の界面における移動波である表面プラズモンポラリトン（ＳＰＰ）に基づくセンサ。
２）貴金属材料中の誘電性ナノ空隙内部に存在する定在波、あるいは誘電性媒体中または誘電性媒体上の貴金属ナノ構造内部に存在する同等な定在波である局在表面プラズモン共鳴（Ｌ−ＳＰＲ）に基づくセンサ。
【００４３】
もちろん上記両センサとも、金属界面における屈折率変動を検知することも可能である。
【００４４】
ＳＰＲバイオセンサでは、微視的（または局部的）感度によってセンサ全体の感度が決まることに注意すべきである。この局部感度は金属を取り囲む誘電材中におけるプラズモン共鳴の電界の拡がり長さに相関する。
【００４５】
典型例として、Ｌ−ＳＰＲの貫入深度は１０ｎｍのオーダーである。数字によるシミュレーションによってプラズモンナノ構造周囲の電界強度分布パターンの評価及び研究が可能とされる。
【００４６】
例えば図１に示したような従来設計のナノホールアレイを有するＬ−ＳＰＲ型センサにおいては、誘電性基板６上に置かれるプラズモン共鳴支持金属層４中に円筒形ホール／空隙２が（例えばイオンビームを用いて）穴あけされる。この場合、空隙２中の電界パターンは、図１において垂直暗灰色矩形８で示される円筒形壁に沿って最大となる。この最も強い電界の壁からの典型的間隔は約１０ｎｍである。
【００４７】
バイオセンサに適用する場合、受容体部分 (受容体半体: receptor moieties)、例えばタンパク質が通常空隙中に固定され、これら受容体部分にはサンプル中の検出対象となる分析対象物に対して特異的結合能がある。従って、通常受容体部分は電界が最大となる空隙壁上へ固定される。
【００４８】
しかしながら、受容体部分は微細であり、例えば抗体ではその長さが多くの場合１０〜２０ｎｍ程度である。
従って、電界が約１０ｎｍである場合、実用上受容体はプラズモン共鳴の電界が最大となる領域中に配置されることが理解されよう。
【００４９】
分析対象物が空隙に達すると、バイオプローブによって認識され、そしてバイオプローブ受容体自体上へ固定されて複合体が生成される。
【００５０】
しかしながら、分析対象物は最大強度電界の外側となる空隙２の領域中に位置されるため、最適感度では感知されないであろう。
【００５１】
かかる状態は図１に示した通りであり、図中受容体部分を形成する符号１０で示される抗体は空隙２の側壁上へ固定される。抗体１０の拡張は強電界８の領域幅と同等と見做すことができる。符号１２は受容体である抗体１０へ結合した抗原を示す。この試験サンプル中に存在する分析対象物１２には抗体１０に対する特異的な結合特性があり、抗体と結合して複合体を生成する。しかしながら、強電界の拡がりが小さいため、この結合は該強電界外に生じている。
【００５２】
ｂ）本発明センサの作動原理
本発明概念によるセンサ設計について図２に示す。Ｌ−ＳＰＲセンサの感度最適化のため、本発明者は空隙の一領域において強／増強電界パターンが得られるように空隙を形状化し、また受容体部分を強電界領域に近接して、あるいは強電界領域と部分的に重なり合うように取り付けて、受容体へ結合する分析対象物をこの強電界中、すなわち最大／増強感度領域中に位置させる手段を見出した。
【００５３】
図２に示す本発明に係るＳＰＲセンサ装置５０は、誘電性基板５２と、該誘電性基板上にあって、かつナノ空隙５４のアレイを貴金属層中に有する（図には簡略して２個の空隙５４のみ示している）該貴金属層５３から成るＬ−ＳＰＲ支持層から構成されている。空隙５４の大きさは一般的に「サブ波長」と呼ばれる。すなわちそれら空隙の大きさはプローブ光ビームの波長より小さい。空隙５４は非対称的にデザインされ、すなわちそれら空隙の断面は、入射光ビームの方向に対して非対称となるように空隙深度の全体に亘って一定になっていない。より具体的には、空隙５４はその開口部５６からその底部５８に向けて広くなるように形状化され、空隙底部は下方にある基板５２の表面によって形成され、閉じられている。前記拡がりは図２に示すように連続状に形成でき、例えば台形あるいはピラミッド形状、あるいは階段状の輪郭に形状化可能である。符号ｄＣで示される空隙５４の深度は、開口部５６から底部５８までの縦方向距離を示す。ＳＰＲセンサが基板方向から、すなわち最も広い底部５８側から適当な角度及び波長のプローブ光で照射されると、プラズモン共鳴が励起される。表面プラズモンポラリトンの電界強度は、図２の矩形６０で示されるように、空隙の開口部分５６において強く、最大レベルに達する。
【００５４】
ナノホールアレイの磁気反応が調整可能なことは当該分野において既知である（例えば、Li, J.ら、２次元金属ナノボトルアレイのプラズモン特性の研究、APPLIED PHYSICS LETTERS 92, 213106 (2008)を参照）。実際、表面プラズモンポラリトンの励起及び放射は高度に幾何学的形状に依存しており、共鳴は金属ナノ構造のサイズ及び形状に依存している。表面プラズモンポラリトンのスペクトル位置がナノ空隙のアレイの周期に主として依存し、他方電界強度及びパターンが金属層中に配される空隙の実際の形状に強く依存することも示されている。
【００５５】
既に述べたように、空隙５６の非対称な形状（開口部から底部へ向けて広がる形状）によって、空隙開口部５６周囲において電界密度が最も高くなる。従って、空隙５４の形状／寸法は望ましい電磁波反応が得られるように選定される。
【００５６】
本発明センサ装置５０にはさらに、空隙５４の底部５８上へ置かれる誘電材から成るベッド６２が含まれ、このベッドにより空隙５４の見掛け深度が減じられている。そのため、金属層５３中のホールの深度は猶ｄＣであっても（空隙は金属層の厚さに相当するスルーホールである）、空隙底部には誘電材が詰められているため、深度は開口部５６からベッド６２の表面までの距離ｄＡとなっている。このベッド６２により一種の支持構造あるいは台座が形成され、該台座の表面６３上へ受容体を強電界領域に近接して取り付けることが可能となる。従って、対応する分析対象物が受容体へ結合する時には、該分析対象物は最大感度領域中に位置することになる。別の言い方をすれば、空隙５４は部分的にベッド６２を構成する誘電材で部分的に満たされ、空隙は金属層の頂部から開口し、見掛け深度ｄＡに相当する深度に亘って中空となっている。
【００５７】
かかる構成は図２に示した通りである。図中、受容体抗体６４はベッド６２の表面６３へ取り付けられ、該抗体は強電界パターン６０領域とインターフェースをなす反対側端部を有している。抗体６４との結合に基づき、適切な抗原６６は最大電界領域６０中へと、従って最大感度領域中へと延びる。
【００５８】
比較のため、図３に、図２のセンサに類似する円錐形空隙５４’を有するように設計されているが誘電材ベッドを欠くＳＰＲセンサ構造を示す。図から分かるように、抗体６４’は空隙のまったく底部に配置され、結合して生成される複合体は強電界６０’の領域からかなり離れている。かかるナノ構造においては、ホール深度ｄＣは通常１００ｎｍ未満であり、他方抗体の通常のサイズは１５ｎｍであることに留意しなければならない。
【００５９】
図２に示した本発明センサに戻る。受容体の取り付けはベッド６２を形成する材料の機能化された面を通して効率的に達成される。前記材料の機能化は望ましいタイプの受容体へ結合するように行われ、該受容体は実施される試験の対象に従って選定される。機能化ポリマーとして用いることに適する材料は、ポリアクリル酸あるいは標的受容体の最適な取り付けに適する機能性をもつ誘電性ポリマーである。
【００６０】
図２及び図３ではベッド６２が単一層として示されているが、ベッドは誘電材から成る２または３層に構成されてもよい。例えば、誘電材から成る第一層を空隙底部全体に亘って設け、誘電材から成る第二層を前記第一層上へ形成することができる。かかる場合、第二層（最上層）の上面でベッド表面が形成され、該ベッドの厚さは各層の個々の厚さの総和となる。第二層（上層）の誘電材にはプローブ（受容体）を取り付けるのに望ましい機能化が為され、第ニ層／上層にハイドロゲルを含む多孔性誘電材を用いることも可能である。
【００６１】
次に本発明センサ装置の実用的実施態様を図４に示す。本図においては図２と同様な特徴は図２に示した符号に百を加えて示されている。本実施態様によるセンサ装置１５０は上述した設計原理に従って構成される。本センサ装置１５０にはガラスから成る誘電性基板１５２が含まれる。貴金属、本例では金、から成る層が符号１５３で示され、ガラス基板１５２上へ配置されている。この金から成る層中には空隙アレイ１５４が含まれる。図には簡略化して該アレイは１個のみ示されている。金属中の空隙１５４の深度はｄＣで示されている。空隙は段階的に拡がる３部分から成る断面を備え、開口部分の半径はＲ１、中間部分の最大半径はＲ２、及び最終部分の最大半径はＲ３で示されている。空隙の開口部１５６は金属層１５３の表面上へ若干突き出す襟状に構成されていることが理解されよう。
【００６２】
空隙１５４はベッド１６２を形成する誘電材で部分的に満たされ、そのため該空隙の見掛け深度は深度ｄＡまで減じられている。ベッド１６２の表面には、図４に示された抗体１６４で示される受容体部分が取り付けられるように機能化されている。
【００６３】
例示として以下に材料及び寸法について述べるが、これらの例示が限定的なものであると解釈されてはならない。ガラス基板１５２に代えて、他の透明な誘電性材料、例えば透明なポリスチレンあるいはＰＭＭＡ、あるいはポリカーボネートを用いることも可能である。また、それらに代えて、好ましくは低ドープ処理された半導体材料を用いることも可能である。また、金に代えて、他の金属、例えば銀及び白金等の貴金属あるいはアルミニウムを用いることも可能である。ベッド１６２の誘電材は、ｐｐＡＡあるいは他の適当な機能性ポリマーであってもよい。前記金層の空隙開口部周囲における厚さは１２０ｎｍレベルとされ、従って空隙深度ｄＣは１２０ｎｍとされる。ベッド１６２の厚さは１００ｎｍとされ、他方見掛け深度ｄＡは２０ｎｍとされる。前記開口部の半径Ｒ１は５０ｎｍとされ、他方空隙底部の半径Ｒ３は２００ｎｍとされる。繰り返すが、これらの寸法は例示であって、いかなる場合においても限定的と解釈されてはならない。
【００６４】
図４のナノ構造に関して、プラズモン共鳴下での電界パターンは数的シミュレーションによって決定され、電界分布は図５に示されている。図から分かるように、形状及び寸法に関する上記仮定のもとでは、強電界領域は空隙の開口部分に存在し、ベッドの高さゆえに、従って受容体の位置ゆえに、受容体へ結合するいかなる分析対象物も最大感度領域中に位置することになる。
【００６５】
好ましくは、金属表面（従ってベッド表面上ではない）の全体に亘って防汚材料１７２から成る薄層が形成される。既知のように、防汚材は抗付着状態で作用し、化学あるいは生化学分子等の非特異的吸収等の望ましくない相互作用を防止あるいは低減する。これにより、センサ表面における望ましくない化学あるいは生化学分子の相互作用あるいは結合によって生ずるノイズ信号が減じられる。
【００６６】
ｃ）センサの製作
本発明センサはリソグラフィー技術を用いて容易に製作可能である。可能な製作技術について以下に説明する。ガラス基板上へポリアクリル酸（ｐｐＡＡ）層を沈積させ、さらにｐｐＡＡ層上へポリスチレンビード（ＰＳ）層を沈積させる。ｐｐＡＡ層及びＰＳ層をＯ２プラズマでエッチングして、サブミクロン的間隔で分離され規則的に間隔を空けられたｐｐＡＡピラーから成る格子構造を形成する。これらピラーはその基部から頂部へ向けて先細に形状化される。次いでピラー上へ金を沈積させ隣接ピラー間の隙間を埋め、かつPSマイクの残りを除去し、周期的な金のナノ格子を得る。誘電性ピラーとして用いることができる他の材料としてポリスチレン、ポリメチルメタクリル酸等が挙げられる。
【００６７】
この段階では、空隙はピラーの誘電性材料で完全に埋められることが理解できよう。受容体部分を取り付け及び配置するためのベッドを伴う空隙を形成するためには、次いでピラーの頂部を下方へ望まれる見掛け深度ｄＡまで（金に対して）選択的にエッチングするだけで十分である。この技術の長所は、極めて正確に、すなわち約±２ｎｍの正確度をもってｐｐＡＡエッチングを行えることである。
【００６８】
次いで、防汚材（例えば防汚性ハイドロゲル、すなわちポリエチレングリコール）から成る薄層を露出されている金表面へ選択的に沈積させることが可能である。
【００６９】
ｄ）ＳＰＲセンサシステムにおける利用
図６は、上述したＳＰＲセンサ装置を含んで構成されるＳＰＲセンサシステムを模式的に示した図である。操作に際して、センサは、プローブ光が基板２５２側から入射するように、従って最も広くなっている底部側、すなわち開口部の対向側から空隙２５４を照らすように定位される。通常、このセンサ装置には、Ｌ−ＳＰＲを支持し、かつ上述した電界パターンを達成するように、本発明原理に従って設計された空隙（複数）２５４から成るアレイが少なくとも１つ含まれる。
【００７０】
かかる実用的実施態様においては、金属層２５３は、空隙２５４の各アレイと接触状態で試験サンプルを選択的に持ち運ぶことを可能とするチャネルを含んで成るマイクロ流動系(micro-fluidic system)２８０によって被覆される。かかる場合、各アレイを、異なる受容体から構成して異なる物質を検知することができるように作製することが可能である。マイクロ流動系２８０は、金属層２５３の頂部上に、当該技術分野で既知なチャネル２８２が内部に形成されたエラストマー層あるいは他の材料（例えばＰＤＭＳ、ＰＭＭＡ、ガラス、エポキシなど）から成る層を形成することによって構成可能である。
【００７１】
使用に際し、本発明ＳＰＲセンサ装置は、入力光モジュールから発出される試験光ビーム２９０（プローブビーム）によって図示したように基板側から照射される。試験光ビーム２９０には、センサ表面においてＳＰＲを励起させることが既知な周波数及び入射角が与えられる。ナノ空隙アレイを照射する試験光ビーム２９０は、一定の極性形成を与える既知方式に構成可能なことに注意すべきである。ＳＰＲを励起させるため、試験光ビーム２９０には、センサナノ構造において表面結合電磁波の１または２以上の許容周波数と適合する１または２以上の周波数が与えられる。好ましくは、センサは、ＳＰＲの許容周波数が光の可視／近赤外スペクトルに典型的に一致するように設計される。試験光ビームがＳＰＲを励起させると、センサ表面において試験光ビームの少なくとも一部が吸収される。この吸収程度はセンサ表面における入射光の周波数に依存する。センサ表面において吸収されなかった試験光ビームの光は反射され、出力光学モジュール２９４において受光される。伝送モードでの操作も可能なことが理解されよう。
【００７２】
そして、反射された試験光ビームの光特性、特にその強度が出力光学モジュール２９４において感知（測定）され、測定された光特性の実測値が決定される。この数値で表面プラズモンの励起レベルが表わされるので、この数値に基づいて表面プラズモンの励起レベルを表わす実際値が測定できるか、あるいは先に保存／取得されたデータに関して確立された共鳴状態あるいは共鳴条件の変化を評価することが可能とされる。既知であるように、共鳴条件によってセンサ表面における光の吸収による試験光ビームの反射光の測定強度の低下が通常引き起こされ、またセンサ表面に近接するサンプルの屈折率の変更によって共鳴条件の変化が引き起こされる。
【００７３】
出力光モジュールにおける検知／測定は、光検知器あるいは画像アレイを用いて実施可能なことは当業者の理解するところである。
【００７４】
ｄ）他のセンサ技術における利用
上記説明した通り、本発明センサ装置は他の検知技術においても有利に利用可能である。実際、Ｌ−ＳＰＲ作用（ナノ空隙のまさに周囲に局在する貴金属層の電子の振動）により、ナノ空隙の先細形状と組み合わされて、空隙開口部周囲に増強電界が生成される。かかる効果は、ラマン／ＳＥＲＳ、蛍光分光法、ＳＡＬＤＩ等の他分析技術においても有益に利用される。
実際に、かかる電界はこれら適用分野において下記役割を果たしている。
−ラマン分光法（ＳＥＲＳ）においては、電界によってラマン放射強度、従ってラマン信号及び感度が測定される。
−蛍光分光法においては、（特定の波長において）電界によって蛍光分子が励起されて発光が起こる。それゆえ、電界が最大となる空隙頂部上への蛍光分子の配置は発光増強及び感度増強に有効である。
−ＳＡＬＤＩにおいては、質量分析対象とされるタンパク質が、局部的に温度を高める高エネルギーレーザを用いて誘導脱着される。レーザビームのエネルギー（従って表面へ放出できる熱出力）は電界強度に比例する。本発明センサを用いることにより、分子が局在する電界を集中させて脱着を最適化させることが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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