(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２から７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを、Ｆｃ結合性タンパク質のＣ末端側に付加した、タンパク質。
【請求項２】
Ｆｃ結合性タンパク質が、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上を他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質である、
請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
配列番号２から７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’末端側に付加した、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’末端側に付加するオリゴヌクレオチドが、配列番号１２、１３、１５、１７、１９、２０のいずれかに記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
Ｆｃ結合性タンパク質が、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上を他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質である、
請求項３または４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換体を培養することでタンパク質を製造する方法。
【請求項９】
請求項１または２に記載のタンパク質を担体に固定化して得られる抗体吸着剤
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生産性が向上したＦｃ結合性タンパク質、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換して得られる形質転換体、および前記形質転換体を用いた前記タンパク質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。Ｆｃレセプターはその結合する免疫グロブリンの種類によって分類されており、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）のＦｃ領域に結合するＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある（非特許文献１）。また各レセプターは、その構造の違いによりさらに細かく分類され、Ｆｃγレセプターの場合、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
Ｆｃγレセプターの一つであるＦｃγＲＩは単球とマクロファージ中で発現しており、好中球ではγインターフェロンにより誘導的に発現される（非特許文献１）。また、ＦｃγＲＩはＩｇＧに対する結合親和性が高く、その平衡解離定数（Ｋｄ）は１０−８Ｍ以下である（非特許文献２）。ＦｃγＲＩは、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞内領域に区分されるが、ＩｇＧとの結合は、ＩｇＧのＦｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こり、その後細胞質へとシグナルが伝達される。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わる分子量約４２０００のα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜と細胞外領域との境界で共有結合することでホモダイマーを形成している（非特許文献３）。
【０００４】
ヒトＦｃγＲＩのアミノ酸配列（配列番号１）および遺伝子配列はＥｘＰＡＳｙ（Ｐｒｉｍａｒｙ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ１２３１４）などの公的データベースに公表されている。また、ＦｃγＲＩの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。ヒトＦｃγＲＩα鎖の概略構造を図１に示す。ＦｃγＲＩα鎖はＮ末端側から、１５アミノ酸からなるシグナルペプチド領域（ＳＳ：配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１番目のメチオニンから１５番目のグリシンまでの領域）、２７７アミノ酸からなる細胞外領域（ＥＣ：配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２９２番目のヒスチジンまでの領域）、２１アミノ酸からなる細胞膜貫通領域（ＴＭ：配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２９３番目のバリンから３１３番目のイソロイシンまでの領域）、６１アミノ酸からなる細胞内領域（Ｃ：配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１４番目のアルギニンから３７４番目のスレオニンまでの領域）から構成される。
【０００５】
前述した通りＦｃγＲＩの細胞外領域を構成するタンパク質（以下、Ｆｃ結合性タンパク質という）は、高度な親和性のもと、ヒト抗体に対する優れた識別機能を有している。この高度な親和性に基づいて、Ｆｃ結合性タンパク質は、診断試薬、抗体医薬品の研究用ツールまたはＩｇＧなどの抗体医薬品の製造工程で利用されるアフィニティークロマトグラフィーのリガンドとして活用する方法が報告されている（特許文献１）。また近年になり見出されたＦｃ結合性タンパク質の予想外の免疫抑制的な生物学的特性により、自己免疫疾患または自己免疫症候群、移植物の拒絶および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある（非特許文献２）。
【０００６】
Ｆｃ結合性タンパク質の生産に関しては、大腸菌（特許文献１）、バチルス属細菌（特許文献２）、酵母（特許文献３）、麹菌（特許文献４）、動物細胞（非特許文献３）を宿主とした、遺伝子組換え技術による生産が報告されている。また、前記宿主により発現したＦｃ結合性タンパク質の工業的精製に関しては、Ｆｃ結合性タンパク質を発現する大腸菌の培養液からクロマトグラフィーにより精製する方法（特許文献５）が報告されている。しかしながらヒト由来のタンパク質であるＦｃ結合性タンパク質は、従来の方法では生産性が低く、そのことが産業利用上欠点となっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００４−５３０４１９号公報
【特許文献２】特開２００９−２０１４０３号公報
【特許文献３】特開２０１１−０７２２４６号公報
【特許文献４】特開２０１１−２００２０３号公報
【特許文献５】特開２０１１−１２６８２７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１
【非特許文献２】Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ  Ｔａｋａｉ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８，２００５
【非特許文献３】Ａ．Ｐａｅｔｚ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１８１１，２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述したように、ヒト由来のタンパク質であるＦｃ結合性タンパク質は、従来の方法では生産性が低いという課題があった。そこで本発明の目的は、生産性の高いＦｃ結合性タンパク質、および当該タンパク質の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意検討した結果、Ｆｃ結合性タンパク質のＣ末端側に特定のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを付加することで、生産性の高いＦｃ結合性タンパク質が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は以下の（Ａ）から（Ｉ）に記載の態様を包含する：
（Ａ）配列番号２から７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを、Ｆｃ結合性タンパク質のＣ末端側に付加した、タンパク質。
【００１２】
（Ｂ）Ｆｃ結合性タンパク質が、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上を他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質である、
（Ａ）に記載のタンパク質。
【００１３】
（Ｃ）配列番号２から７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’末端側に付加した、ポリヌクレオチド。
【００１４】
（Ｄ）Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’末端側に付加するオリゴヌクレオチドが、配列番号１２、１３、１５、１７、１９、２０のいずれかに記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである、（Ｃ）に記載のポリヌクレオチド。
【００１５】
（Ｅ）Ｆｃ結合性タンパク質が、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上を他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質である、
（Ｃ）または（Ｄ）に記載のポリヌクレオチド。
【００１６】
（Ｆ）（Ｃ）から（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【００１７】
（Ｇ）（Ｆ）に記載のベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【００１８】
（Ｈ）（Ｇ）に記載の形質転換体を培養することでタンパク質を製造する方法。
【００１９】
（Ｉ）（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質を担体に固定化して得られる抗体吸着剤。
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
本発明のタンパク質を得るのに用いるＦｃ結合性タンパク質は、必ずしもＦｃ結合性タンパク質（すなわち、ＦｃγＲＩの細胞外領域）の全領域でなくてもよく、Ｆｃ結合性タンパク質を構成するポリペプチドのうち、少なくとも抗体（ＩｇＧ）のＦｃ領域に結合する本来の機能を発現し得る領域のポリペプチドを含んでいればよい。本発明のタンパク質を得るのに用いるＦｃ結合性タンパク質の一例として、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質や、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質、
があげられる。前記（ｉｉ）の具体例として、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目から２８９番目までのアミノ酸を含み、かつ以下の（１）から（１６８）のいずれかに記載のアミノ酸置換を１つ以上含むＦｃ結合性タンパク質があげられる（特開２０１１−２０６０４６号公報）。
（１）配列番号１の２０番目のスレオニンがプロリンに置換
（２）配列番号１の２５番目のスレオニンがリジンに置換
（３）配列番号１の３８番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（４）配列番号１の４６番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（５）配列番号１の６２番目のアラニンがバリンに置換
（６）配列番号１の６３番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（７）配列番号１の６９番目のセリンがフェニルアラニンまたはスレオニンに置換
（８）配列番号１の７１番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（９）配列番号１の７７番目のバリンがアラニンまたはグルタミン酸に置換
（１０）配列番号１の７８番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（１１）配列番号１の９４番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（１２）配列番号１の１００番目のイソロイシンがバリンに置換
（１３）配列番号１の１１０番目のセリンがアスパラギンに置換
（１４）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがロイシンに置換
（１５）配列番号１の１２５番目のヒスチジンがアルギニンに置換
（１６）配列番号１の１３１番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（１７）配列番号１の１４９番目のトリプトファンがロイシンに置換
（１８）配列番号１の１５６番目のロイシンがプロリンに置換
（１９）配列番号１の１６０番目のイソロイシンがメチオニンに置換
（２０）配列番号１の１６３番目のアスパラギンがセリンに置換
（２１）配列番号１の１９５番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（２２）配列番号１の１９９番目のスレオニンがセリンに置換
（２３）配列番号１の２０６番目のアスパラギンがリジン、セリンまたはスレオニンに置換
（２４）配列番号１の２０７番目のロイシンがプロリンに置換
（２５）配列番号１の２１８番目のロイシンがバリンに置換
（２６）配列番号１の２４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（２７）配列番号１の２４８番目のロイシンがセリンに置換
（２８）配列番号１の２８３番目のロイシンがヒスチジンに置換
（２９）配列番号１の２８５番目のロイシンがグルタミンに置換
（３０）配列番号１の１７番目のバリンがグリシンまたはグルタミン酸に置換
（３１）配列番号１の１９番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（３２）配列番号１の２０番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（３３）配列番号１の２５番目のスレオニンがメチオニンまたはアルギニンに置換
（３４）配列番号１の２７番目のグルタミンがプロリンまたはリジンに置換
（３５）配列番号１の３５番目のグルタミンがロイシン、メチオニンまたはアルギニンに置換
（３６）配列番号１の３６番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（３７）配列番号１の４１番目のロイシンがメチオニンに置換
（３８）配列番号１の４２番目のヒスチジンがロイシンに置換
（３９）配列番号１の４４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（４０）配列番号１の４５番目のバリンがアラニンに置換
（４１）配列番号１の４６番目のロイシンがアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、セリンまたはトリプトファンに置換
（４２）配列番号１の４７番目のヒスチジンがグルタミン、ロイシンまたはアスパラギンに置換
（４３）配列番号１の４９番目のプロリンがセリンまたはアラニンに置換
（４４）配列番号１の５０番目のグリシンがアルギニンまたはグルタミン酸に置換
（４５）配列番号１の５１番目のセリンがアラニン、スレオニン、ロイシン、プロリンまたはバリンに置換
（４６）配列番号１の５２番目のセリンがグリシンに置換
（４７）配列番号１の５３番目のセリンがロイシン、スレオニンまたはプロリンに置換
（４８）配列番号１の５５番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４９）配列番号１の５７番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（５０）配列番号１の５８番目のロイシンがアルギニンに置換
（５１）配列番号１の６０番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（５２）配列番号１の６１番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（５３）配列番号１の６２番目のアラニンがグルタミン酸に置換
（５４）配列番号１の６３番目のスレオニンがロイシン、フェニルアラニンに置換
（５５）配列番号１の６４番目のグルタミンがプロリン、ヒスチジン、ロイシン、リジンに置換
（５６）配列番号１の６５番目のスレオニンがアラニンまたはバリンに置換
（５７）配列番号１の６６番目のセリンがスレオニンに置換
（５８）配列番号１の６７番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（５９）配列番号１の６９番目のセリンがアラニンに置換
（６０）配列番号１の７０番目のチロシンがヒスチジンまたはフェニルアラニンに置換
（６１）配列番号１の７１番目のアルギニンがチロシンに置換
（６２）配列番号１の７３番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（６３）配列番号１の７４番目のセリンがフェニルアラニンに置換
（６４）配列番号１の７６番目のセリンがアスパラギンに置換
（６５）配列番号１の７７番目のバリンがアスパラギン酸またはリジンに置換
（６６）配列番号１の７８番目のアスパラギンがセリンまたはグリシンに置換
（６７）配列番号１の８０番目のセリンがアラニンに置換
（６８）配列番号１の８４番目のアルギニンがセリンに置換
（６９）配列番号１の８８番目のグリシンがセリンに置換
（７０）配列番号１の８９番目のロイシンがグルタミンまたはプロリンに置換
（７１）配列番号１の９０番目のセリンがグリシンに置換
（７２）配列番号１の９２番目のアルギニンがシステインまたはロイシンに置換
（７３）配列番号１の９６番目のイソロイシンがバリンまたはリジンに置換
（７４）配列番号１の９７番目のグルタミンがロイシンまたはリジンに置換
（７５）配列番号１の１０１番目のヒスチジンがロイシンに置換
（７６）配列番号１の１０２番目のアルギニンがセリンまたはロイシンに置換
（７７）配列番号１の１０３番目のグリシンがアスパラギン酸またはセリンに置換
（７８）配列番号１の１１１番目のセリンがアラニンに置換
（７９）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがアラニン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニンまたはバリンに置換
（８０）配列番号１の１１５番目のスレオニンがイソロイシンまたはフェニルアラニンに置換
（８１）配列番号１の１１８番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（８２）配列番号１の１２１番目のアラニンがスレオニンまたはバリンに置換
（８３）配列番号１の１２８番目のリジンがアルギニンまたはグリシンに置換
（８４）配列番号１の１２９番目のアスパラギン酸がグリシンに置換
（８５）配列番号１の１３１番目のロイシンがグルタミンに置換
（８６）配列番号１の１３３番目のチロシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（８７）配列番号１の１３４番目のアスパラギンがセリンに置換
（８８）配列番号１の１３７番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（８９）配列番号１の１３８番目のチロシンがヒスチジンに置換
（９０）配列番号１の１３９番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（９１）配列番号１の１４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（９２）配列番号１の１４１番目のグリシンがアスパラギン酸またはバリンに置換
（９３）配列番号１の１４２番目のリジンがグルタミン酸またはアルギニンに置換
（９４）配列番号１の１４４番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
（９５）配列番号１の１４７番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（９６）配列番号１の１４８番目のヒスチジンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（９７）配列番号１の１４９番目のトリプトファンがアルギニンに置換
（９８）配列番号１の１５１番目のセリンがスレオニンに置換
（９９）配列番号１の１５２番目のアスパラギンがスレオニン、イソロイシンまたはプロリンに置換
（１００）配列番号１の１５４番目のスレオニンがセリンに置換
（１０１）配列番号１の１５６番目のロイシンがヒスチジンに置換
（１０２）配列番号１の１５７番目のリジンがアルギニンに置換
（１０３）配列番号１の１５９番目のアスパラギンがスレオニンまたはアスパラギン酸に置換
（１０４）配列番号１の１６０番目のイソロイシンがスレオニン、バリンまたはロイシンに置換
（１０５）配列番号１の１６１番目のセリンがスレオニンに置換
（１０６）配列番号１の１６５番目のスレオニンがメチオニンに置換
（１０７）配列番号１の１７１番目のメチオニンがスレオニンに置換
（１０８）配列番号１の１７３番目のリジンがアルギニンに置換
（１０９）配列番号１の１７４番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（１１０）配列番号１の１７７番目のスレオニンがセリンに置換
（１１１）配列番号１の１８１番目のイソロイシンがスレオニンに置換
（１１２）配列番号１の１８２番目のセリンがスレオニン、ロイシン、バリンまたはグルタミン酸に置換
（１１３）配列番号１の１８４番目のスレオニンがセリンに置換
（１１４）配列番号１の１９０番目のプロリンがセリンに置換
（１１５）配列番号１の１９３番目のバリンがロイシンに置換
（１１６）配列番号１の１９５番目のアスパラギンがアラニンに置換
（１１７）配列番号１の１９６番目のアラニンがセリンに置換
（１１８）配列番号１の１９８番目のバリンがグリシンまたはメチオニンに置換
（１１９）配列番号１の１９９番目のスレオニンがアラニンに置換
（１２０）配列番号１の２００番目のセリンがグリシンまたはアルギニンに置換
（１２１）配列番号１の２０２番目のロイシンがメチオニンに置換
（１２２）配列番号１の２０３番目のロイシンがヒスチジン、グルタミン、チロシン、アルギニン、プロリンに置換
（１２３）配列番号１の２０４番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１２４）配列番号１の２０７番目のロイシンがグルタミン、ヒスチジンまたはアルギニンに置換
（１２５）配列番号１の２０９番目のスレオニンがアラニンに置換
（１２６）配列番号１の２１１番目のセリンがアルギニンまたはグリシンに置換
（１２７）配列番号１の２１３番目のグルタミン酸がバリンまたはイソロイシンに置換
（１２８）配列番号１の２１５番目のリジンがアルギニンまたはグルタミン酸に置換
（１２９）配列番号１の２１７番目のロイシンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（１３０）配列番号１の２１８番目のロイシンがイソロイシン、メチオニンまたはリジンに置換
（１３１）配列番号１の２１９番目のグルタミンがプロリンまたはアルギニンに置換
（１３２）配列番号１の２２３番目のロイシンがアルギニン、グルタミンまたはメチオニンに置換
（１３３）配列番号１の２２４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１３４）配列番号１の２２５番目のロイシンがグルタミンに置換
（１３５）配列番号１の２２７番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
（１３６）配列番号１の２３０番目のチロシンがヒスチジンまたはフェニルアラニンに置換
（１３７）配列番号１の２３１番目のメチオニンがリジンまたはアルギニンに置換
（１３８）配列番号１の２３３番目のセリンがグリシンまたはアスパラギンに置換
（１３９）配列番号１の２３４番目のリジンがグルタミン酸に置換
（１４０）配列番号１の２４０番目のアスパラギンがグリシンに置換
（１４１）配列番号１の２４４番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１４２）配列番号１の２４５番目のチロシンがヒスチジンまたはグルタミン酸に置換
（１４３）配列番号１の２４６番目のグルタミンがアルギニンまたはリジンに置換
（１４４）配列番号１の２４８番目のロイシンがイソロイシンに置換
（１４５）配列番号１の２４９番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（１４６）配列番号１の２５０番目のアラニンがバリンに置換
（１４７）配列番号１の２５１番目のアルギニンがセリンに置換
（１４８）配列番号１の２５２番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（１４９）配列番号１の２５３番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（１５０）配列番号１の２５７番目のロイシンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（１５１）配列番号１の２６１番目のグルタミン酸がバリンまたはアラニンに置換
（１５２）配列番号１の２６２番目のアラニンがバリンに置換
（１５３）配列番号１の２６３番目のアラニンがセリンに置換
（１５４）配列番号１の２６４番目のスレオニンがセリンに置換
（１５５）配列番号１の２６５番目のグルタミン酸がアラニンまたはグリシンに置換
（１５６）配列番号１の２６８番目のアスパラギンがセリン、イソロイシンまたはスレオニンに置換
（１５７）配列番号１の２７０番目のロイシンがヒスチジン、アルギニンまたはバリンに置換
（１５８）配列番号１の２７１番目のリジンがアルギニンに置換
（１５９）配列番号１の２７２番目のアルギニンがグルタミンに置換
（１６０）配列番号１の２７７番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１６１）配列番号１の２７９番目のグルタミンがアルギニンまたはヒスチジンに置換
（１６２）配列番号１の２８２番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（１６３）配列番号１の２８３番目のロイシンがプロリンに置換
（１６４）配列番号１の２８５番目のロイシンがアルギニンまたはヒスチジンに置換
（１６５）配列番号１の２８６番目のプロリンがグルタミン、アルギニンまたはグルタミン酸に置換
（１６６）配列番号１の２８７番目のスレオニンがイソロイシン、プロリン、アラニンまたはバリンに置換
（１６７）配列番号１の２８８番目のプロリンがアラニン、セリンまたはスレオニンに置換
（１６８）配列番号１の２８９番目のバリンがアラニン、アスパラギン酸、グリシン、ロイシンまたはイソロイシンに置換
本発明のタンパク質を得るのに用いるＦｃ結合性タンパク質を得るには、直接ヒト細胞から抽出して得てもよいし、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを適切な宿主に導入し、得られた形質転換体を培養することで得てもよいが、前記タンパク質を安定的にかつ大量に得られる点で後者の方法が好ましい。
【００２２】
Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、直接ヒト細胞から抽出して得てもよいが、前記抽出物を核酸増幅することで得たり、既知のヌクレオチド配列を基に人工的に直接合成することで得たほうが好ましい。前記ポリヌクレオチドを人工的に合成するには、前記ポリヌクレオチドの全長をＤＮＡ自動合成機などで直接合成してもよいが、化学合成した数十塩基からなるオリゴヌクレオチド群をＰＣＲ法によりアッセンブリーさせることによって完全長の遺伝子を作製する、ＤＮＡＷｏｒｋｓ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，３０，ｅ４３，２００２）やＳｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．、４７、４４１−４４５、２００６）を用いると、より効率的な合成が可能である。
【００２３】
Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、Ｆｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列情報から変換して得る場合、アミノ酸配列として変化しない範囲であれば任意のヌクレオチド配列が選択できるが、好ましくは発現させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮の上変換するのが好ましい。コドンの使用頻度は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）を用いることで解析することができる。
【００２４】
本発明のタンパク質は、Ｆｃ結合性タンパク質のＣ末端側に配列番号２から７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを付加しているが、抗体結合活性を損なわない範囲であれば任意のオリゴペプチドをさらに付加してもよい。前記任意のポリペプチドの例として、６残基程度のヒスチジンからなるＨｉｓタグ配列やｃ−ｍｙｃ抗原配列といった分析や精製を容易にするためのタグ配列、微生物での分泌発現を促すためのシグナルペプチドなどがあげられる。Ｆｃ結合性タンパク質に前記タグ配列を付加する場合は、Ｎ末端側に付加してもよいし、抗体結合活性を失わない範囲であればタンパク質内に挿入してもよい。Ｆｃ結合性タンパク質に前記シグナルペプチドを付加する場合は、Ｎ末端側に付加すればよく、公知のシグナルペプチドの中から発現に用いる宿主に応じて適宜選択して用いればよい。宿主として大腸菌を用いる場合は、前記シグナルペプチドとしてｐｅｌＢ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０Ｃ１Ｃ１の１番目から２２番目までの領域、配列番号２１）、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ、ＴｏｒＴといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをあげることができる（特開２０１１−０９７８９８号）。また宿主として枯草菌や麹菌を用いる場合は、プロテアーゼやアミラーゼのシグナルペプチドがあげられる。
【００２５】
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、単に本発明のポリヌクレオチドとする）を用いて宿主を形質転換する際、本発明のポリヌクレオチドそのものを用いてもよいが、発現ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドやプラスミドなど）の適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入したものを用いると、より好ましい。なお、前記発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、大腸菌を宿主とする場合は、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクター、ｐＣＤＦプラスミドベクター、ｐＢＢＲプラスミドベクターなどが例示できる。また、前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で挿入すると好ましい。前記プロモータの例として、宿主が大腸菌の場合は、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータなどが例示できる。
【００２６】
前記方法により作製した本発明のポリヌクレオチドを挿入した発現ベクターで宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。例えば、宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物（大腸菌ＪＭ１０９株やＢＬ２１（ＤＥ３）株など）を選択する場合には、コンピテントセル法、ヒートショック法、エレクトロポレーション法などにより形質転換すればよい。
【００２７】
前述の方法で得られた本発明の形質転換体の保存方法については特に限定はなく、任意の培地に継代培養することで菌の活性を維持した状態で保存してもよいし、凍結法や凍結乾燥法により保存してもよい。なお、継代培養により保存する場合は菌が活発に増殖している状態で新たな培地に継代するのが好ましい。なお凍結法により保存する場合は本発明の形質転換体の培養液に凍結補助剤を添加して凍結すればよい。凍結補助剤としては、グリセロール、マンニトール、ジメチルスルフォキシドといった通常の微生物の保存に用いられるものの中から適宜選択すればよい。また、凍結補助剤の添加量は本発明の形質転換体の生存に影響のない範囲で用いればよく、例えばグリセロールの場合は培養液容量の１０分の１から３分の１容量添加すればよい。凍結温度は特に限定はないものの、可能な限り低温であることが好ましく、具体的には−２０℃以下、特に−８０℃以下が好ましい。
【００２８】
凍結乾燥法により保存する場合は、任意の凍結補助剤を添加し、可能な限り低温（−２０℃以下が好ましく、特に好ましくは−８０℃以下）で凍結後、減圧乾燥すればよい。凍結乾燥の場合の凍結補助剤としては前述したもののほかにスキムミルクなどがあげられる。凍結乾燥後の形質転換体は室温以下の温度で、好ましくは４℃以下で、さらに好ましくは−２０℃以下で保存すればよい。
【００２９】
本発明の形質転換体を培養する方法については特に限定はなく、通常の液体培地やそれを寒天で固めた固体培地を用いればよい。固体培地の形状にも限定はなく、斜面培地であってもよいし平板培地であってもよい。培地の組成としては、本発明の形質転換体が増殖し、かつＦｃ結合性タンパク質を発現し得るものであればよい。炭素源としては、糖蜜、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸などが用いられる。窒素源としては、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、ペプトン、コーンスティープリカー、酵母エキスなどが用いられる。無機塩としては、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウムなどのリン酸塩、塩化ナトリウムなどが用いられる。金属イオンとしては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム・二水和物、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガンなどが用いられる。ビタミン類としては、酵母エキス、ビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシンなどが用いられる。なお、固体培地を用いる場合には上記の組成の培地に寒天やジェランガムといった固形化剤を加熱溶解させた後に、培養に用いる試験管やシャーレに分注し、さらに目的の温度まで冷却して固形化することで得られる。
【００３０】
本発明の形質転換体の培養温度は１０℃から４０℃が好ましい。培養のｐＨは用いる宿主の性質に応じて設定され、大腸菌や枯草菌の場合にはｐＨは６から８が好ましく、酵母や麹菌ではより低いｐＨ４から７が好ましく用いられる。また、培養時間は任意に設定できるが、Ｆｃ結合性タンパク質が十分に生産される時間であることが好ましく、通常は数時間から２００時間の間に設定すればよい。なお宿主が麹菌の場合は、小麦麩麹等の固形培養法を行うことも可能である。この場合は小麦麩等を湿潤状態で加熱滅菌したのち、Ｆｃ結合性タンパクを含むプラスミドにて形質転換した菌を植菌し、１０℃から４０℃で培養する。培養中は培養容器を静置しておけば良いが、より好ましくは１日に１回以上、任意のスピードで任意の時間、容器内の麹を撹拌する。これにより、完全に静置した場合より高い生産性が得られる。撹拌の方法は、雑菌の混入が防げる方法であれば特に限定はされない。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドを含むベクターに誘導性のプロモータを含んでいる場合は、本発明のタンパク質が良好に発現できるような条件下で誘導すればよい。誘導剤としてはＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示することができる。宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、本発明のＦｃ結合性タンパク質の発現を誘導することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよいが、０．０１から０．５ｍＭ程度が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。
【００３２】
本発明の形質転換体の培養液から本発明のタンパク質を抽出するには、発現の形態によって適宜抽出方法を選択すればよい。培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明のタンパク質を抽出すればよい。一方、細胞内（原核生物においてはペリプラズムも含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤などを添加することにより菌体を破砕して、本発明のタンパク質を抽出すればよい。抽出物の中から本発明のタンパク質を分離・精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよい。一例として、液体クロマトグラフィーを用いた分離・精製があげられる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどがあげられる。これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことによって、本発明のタンパク質を高純度に調製することができる。
【００３３】
本発明の製造方法で得られたタンパク質の分析方法は、培養液から安定的にかつ効率的に定量できる方法であれば特に限定はなく、ＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着法）やウェスタンブロット法があげられる。
【発明の効果】
【００３４】
本発明のタンパク質は、特定のオリゴペプチド、具体的には配列番号２から７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを、Ｆｃ結合性タンパク質のＣ末端側に付加されていることを特徴しており、遺伝子工学的手法によりタンパク質を発現させる際、その発現量を向上させることができる。そのため、本発明はＦｃ結合性タンパク質の工業的な製造において有用である。さらに配列番号２から７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドは、共通してシステイン残基を一つ有している。そのため、当該残基を利用した特異的な化学修飾が可能である。
【００３５】
本発明のタンパク質は、そのまま、またはさらなる精製により、医薬品、臨床検査薬、バイオセンサーなど様々な用途に用いることができる。特に本発明のタンパク質は、Ｆｃ結合性タンパク質のＣ末端側にシステイン残基を一つ有したオリゴペプチドが付加されているため、当該残基を利用して不溶性担体と結合（固定化）させることで、抗体精製用吸着剤として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩの概略構造を示す図。
【図２】Ｆｃ結合性タンパク質生産の変異ライブラリー株による生産量のスクリーニング結果をコントロール株と比較した図。
【図３】取得したＦｃ結合性タンパク質高生産変異株（４２Ｈ１株および２１Ｆ１株）とコントロール株とでＦｃ結合性タンパク質生産量を比較した図。
【図４】取得したＦｃ結合性タンパク質高生産変異株（６Ｅ１１株、７Ｂ７株、４Ｅ４株、および５Ｅ１２株）とコントロール株とでＦｃ結合性タンパク質生産量を比較した図。
【図５】取得したＦｃ結合性タンパク質高生産変異株（４２Ｈ１株）とコントロール株とで高密度培養によるＦｃ結合性タンパク質生産量を比較した図。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３８】
実施例１  形質転換体のスクリーニング（その１）
（１）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃを発現可能なプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ６０ｃを鋳型ＤＮＡとし、配列番号８（５’−ＴＣＡＧ［ＣＣＡＴＧＧ］ＧＡＣＡＡＧＴＡＧＡＴＡＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＡ−３’；角かっこ内は制限酵素ＮｃｏＩサイト）および配列番号９（５’−ＣＣＧＧ[ＡＡＧＣＴＴ]ＡＭＮＮＧＣＡＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＧＣＣＡＣＣＣＧＡＧＣＣＡＣＣＧＡＣＣＧＧＧＧＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＣＡＣ−３’；角かっこ内は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイト、ＭはＡ／Ｃの混合塩基、ＮはＡ／Ｃ／Ｇ／Ｔの混合塩基）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして用いて、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実施した。ＰＣＲは表１に示す反応液組成のもと、９８℃２分間の加熱の後、９８℃で１０秒間の第１ステップ−５０℃で５秒間の第２ステップ−７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をアガロース電気泳動により分離し、目的サイズを有するＤＮＡバンドを抽出（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ：キアゲン社製）キットを用いて精製した。
【００３９】
【表１】
0005817550.tif 000002
なおＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃは、配列番号１に記載の記載のアミノ酸のうち、１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当し、かつＴｈｒ２０Ｐｒｏ（配列番号１の２０番目のスレオニンをプロリンに置換、以下同じ）、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙ、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔ、Ｈｉｓ４２Ｌｅｕ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒ、Ｓｅｒ５１Ａｌａ、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙ、Ｌｅｕ５８Ａｒｇ、Ｇｌｙ６０Ａｓｐ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｔｈｒ６５Ａｌａ、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ、Ｔｙｒ７０Ｐｈｅ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ、Ｔｈｒ７３Ａｌａ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ａｓｎ７８Ａｓｐ、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｓｅｒ１１１Ａｌａ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１１５Ｉｌｅ、Ａｌａ１２１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇ、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１３７Ｐｈｅ、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓ、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇ、Ｓｅｒ１５１Ｔｈｒ、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒ、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏ、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇ、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒ、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ、Ｔｈｒ１６５Ｍｅｔ、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇ、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１８４Ｓｅｒ、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏ、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌ、Ｌｅｕ２１７Ｇｌｎ、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅ、Ｔｙｒ２３０Ｐｈｅ、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓ、Ｓｅｒ２３３Ｇｌｙ、Ｌｙｓ２３４Ｇｌｕ、Ａｓｎ２４０Ａｓｐ、Ｔｈｒ２４９Ａｌａ、Ｌｅｕ２７０Ｖａｌ、Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓ、Ｌｅｕ２８５Ｇｌｎ、Ｖａｌ２８９Ａｓｐの置換を導入したＦｃ結合性タンパク質である（特開２０１１−２０６０４６号公報）。
（２）得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同制限酵素で消化したプラスミドｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−０９７８９８号公報）にライゲーション反応により挿入した。
（３）定法に従い、（２）のライゲーション生成物を用いて、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株（インビトロジェン社製）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地寒天プレート（トリプトン：１０ｇ／Ｌ、酵母エキス：５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：１０ｇ／Ｌ、寒天：１５ｇ／Ｌ）にて３７℃一晩静置培養した。
（４）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ培地（トリプトン：１６ｇ／Ｌ、酵母エキス：１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５ｇ／Ｌ）０．２ｍＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃にて一晩振とう培養した。一晩培養した前培養液５０μＬを２ＹＴ液体培地（ＩＰＴＧ：０．０５ｍＭ、グリシン：０．３％、カナマイシン：５０μｇ／ｍＬを含む）０．５ｍＬに植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃にて一晩振とう培養した。
（５）培養終了後、遠心分離操作により得られる培養上清を、以下に示したＥＬＩＳＡ法にてＦｃ結合性タンパクの生産量を測定した。なおコントロールとして、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃのＣ末端側に配列番号２７に記載の配列からなるオリゴペプチド（本発明のタンパク質においてＣ末端側に付加するオリゴペプチドとは異なるアミノ酸配列からなるオリゴペプチド：ＣＧ）を付加したタンパク質を発現する形質転換体（コントロール株）を、同様な方法で培養して得られる培養上清を用いた。
（５−１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌの濃度で固定し（４℃で１８時間）、固定化終了後、洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０（商品名）と１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄し、０．５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）によりブロッキングした。
（５−２）前記洗浄緩衝液にて洗浄後、調製したタンパク質抽出液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で適宜希釈し、固定化ガンマグロブリンと反応させた（３０℃で１時間）。
（５−３）反応終了後、洗浄緩衝液で再度洗浄し、Ａｎｔｉ−ｈＦｃγＲ１／ＣＤ６４抗体試薬（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を添加した（３０℃で１時間）。
（５−４）反応終了後、前記洗浄緩衝液で再度洗浄し、Ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識のＧｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ｈ＋ＩＨＲＰ抗体試薬（ＢＥＴＨＹＬ社製）を添加した。
（５−５）３０℃で１時間反応後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４０】
結果を図２に示す。今回スクリーニングした菌株のうち、菌株番号４２Ｈ１株（４５０ｎｍの吸光度０．３２）は、コントロール株（４５０ｎｍの吸光度０．２１）と比較し、Ｆｃ結合性タンパク質の生産量が向上していた。
【００４１】
実施例２  システインタグ配列の解析
実施例１の結果、Ｆｃ結合性タンパク質の生産量の高かった菌株（４２Ｈ１株）培養液から、定法に従いプラスミドを抽出し（ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ：キアゲン社製）、当該プラスミドに挿入されたポリヌクレオチドの配列解析を行なった。具体的には、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステム社製）にて解析した。なお、配列番号１０（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）および配列番号１１（５’−ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。
【００４２】
解析の結果、Ｆｃ結合性タンパク質の３’末端側に付加したオリゴヌクレオチドは、配列番号１２に記載の配列からなることが判明した。したがって、Ｆｃ結合性タンパク質のＣ末端側に付加したオリゴペプチドのアミノ酸配列は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号２）であることが判明した。
【００４３】
実施例３  Ｆｃ結合性タンパク質の生産
（１）実施例１の結果、Ｆｃ結合性タンパク質の生産量の高かった菌株（４２Ｈ１株）を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ培地３ｍＬで前培養した（３７℃で一晩）。一晩培養した培養液を２０ｍＬの２ＹＴ培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む）に接種し、３７℃にて振とう培養した。
（２）培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）の値が０．５になったところで、培養温度を２０℃に切り替えて３０分培養後、ＩＰＴＧを０．１ｍＭとなるように培養液に添加し培養した（２０℃で１８時間）。
（３）培養終了後、遠心分離操作により菌体を集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて菌体からＦｃ結合性タンパクを抽出し、得られたＦｃ結合性タンパク質の生産量をＥＬＩＳＡ法により評価した。
【００４４】
結果を図３に示す。４２Ｈ１株を用いたときのＦｃ結合性タンパク質の生産量は、コントロール株（配列番号２７に記載の配列からなるオリゴペプチドをＣ末端側に付加したＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体）を用いたときの生産量と比較し約４．８倍となった。
【００４５】
実施例４  形質転換体のスクリーニング（その２）
実施例１に記載のスクリーニング法を用いて、コントロール株と比較しＦｃ結合性タンパク質の生産量が向上した別の形質転換体（２１Ｆ１株）を取得した。実施例２に記載の方法で配列を解析した結果、Ｆｃ結合性タンパク質の３’末端側に付加したオリゴヌクレオチドは、配列番号１３に記載の配列からなることが判明した。したがって、Ｆｃ結合性タンパク質のＣ末端側に付加したオリゴペプチドのアミノ酸配列は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号３）であることが判明した。
【００４６】
実施例３に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質の生産性を評価した結果、コントロール株（配列番号２７に記載の配列からなるオリゴペプチドをＣ末端側に付加したＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体）を用いたときの生産量と比較し約２．２倍となった（図３）。
【００４７】
実施例５  形質転換体のスクリーニング（その３）
ＰＣＲプライマーとして、配列番号８および配列番号１４（５’−ＣＣＧＧ［ＡＡＧＣＴＴ］ＡＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＧＣＡＧＴＣＣＧＧＧＧＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＣＡＣ−３’；角かっこ内は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイト、ＭはＡ／Ｃの混合塩基、ＮはＡ／Ｃ／Ｇ／Ｔの混合塩基）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた他は、実施例１と同様な方法でスクリーニングを行ない、コントロール株と比較しＦｃ結合性タンパク質の生産量が向上した形質転換体（６Ｅ１１株）を取得した。実施例２に記載の方法で配列を解析した結果、Ｆｃ結合性タンパク質の３’末端側に付加したオリゴヌクレオチドは、配列番号１５に記載の配列からなることが判明した。したがって、Ｆｃ結合性タンパク質のＣ末端側に付加したオリゴペプチドのアミノ酸配列は、Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ（配列番号４）であることが判明した。
【００４８】
実施例３に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質の生産性を評価した結果、コントロール株（配列番号２７に記載の配列からなるオリゴペプチドをＣ末端側に付加したＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体）を用いたときの生産量と比較し約３．８倍となった（図４）。
【００４９】
実施例６  形質転換体のスクリーニング（その４）
ＰＣＲプライマーとして、配列番号８および配列番号１６（５’−ＣＣＧＧ［ＡＡＧＣＴＴ］ＡＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＧＣＡＭＮＢＭＮＢＭＮＢＭＮＢＭＮＢＧＴＣＣＧＧＧＧＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＣＡＣ−３’；角かっこ内は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイト、ＭはＡ／Ｃの混合塩基、ＮはＡ／Ｃ／Ｇ／Ｔの混合塩基、ＢはＣ／Ｇ／Ｔの混合塩基）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた他は、実施例１と同様な方法でスクリーニングを行ない、コントロール株と比較しＦｃ結合性タンパク質の生産量が向上した形質転換体（７Ｂ７株）を取得した。実施例２に記載の方法で配列を解析した結果、Ｆｃ結合性タンパク質の３’末端側に付加したオリゴヌクレオチドは、配列番号１７に記載の配列からなることが判明した。したがって、Ｆｃ結合性タンパク質のＣ末端側に付加したオリゴペプチド（システインタグ）のアミノ酸配列は、Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ（配列番号５）であることが判明した。
【００５０】
実施例３に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質の生産性を評価した結果、コントロール株（配列番号２７に記載の配列からなるオリゴペプチドをＣ末端側に付加したＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体）を用いたときの生産量と比較し約２．４倍となった（図４）。
【００５１】
実施例７  形質転換体のスクリーニング（その５）
ＰＣＲプライマーとして、配列番号８および配列番号１８（５’−ＣＣＧＧ［ＡＡＧＣＴＴ］ＡＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＧＣＡＧＣＣＡＣＣＣＧＡＧＣＣＡＣＣＧＴＣＣＧＧＧＧＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＣＡＣ−３’；角かっこ内は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイト、ＭはＡ／Ｃの混合塩基、ＮはＡ／Ｃ／Ｇ／Ｔの混合塩基）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた他は、実施例１と同様な方法でスクリーニングを行ない、コントロール株と比較しＦｃ結合性タンパク質の生産量が向上した形質転換体（４Ｅ４株）を取得した。実施例２に記載の方法で配列を解析した結果、Ｆｃ結合性タンパク質の３’末端側に付加したオリゴヌクレオチドは、配列番号１９に記載の配列からなることが判明した。したがって、Ｆｃ結合性タンパク質のＣ末端側に付加したオリゴペプチドのアミノ酸配列は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号６）であることが判明した。
【００５２】
実施例３に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質の生産性を評価した結果、コントロール株（配列番号２７に記載の配列からなるオリゴペプチドをＣ末端側に付加したＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体）を用いたときの生産量と比較し約２．５倍となった（図４）。
【００５３】
実施例８  形質転換体のスクリーニング（その６）
実施例５に記載のスクリーニング法を用いて、コントロール株と比較しＦｃ結合性タンパク質の生産量が向上した別の形質転換体（５Ｅ１２株）を取得した。実施例２に記載の方法で配列を解析した結果、Ｆｃ結合性タンパク質の３’末端側に付加したオリゴヌクレオチドは、配列番号２０に記載の配列からなることが判明した。したがって、Ｆｃ結合性タンパク質のＣ末端側に付加したオリゴペプチドのアミノ酸配列は、Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ（配列番号７）であることが判明した。
【００５４】
実施例３に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質の生産性を評価した結果、コントロール株（配列番号２７に記載の配列からなるオリゴペプチドをＣ末端側に付加したＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体）を用いたときの生産量と比較し約３．６倍となった（図４）。
【００５５】
実施例９  高密度培養法によるＦｃ結合性タンパク質生産
実施例１で得られた４２Ｈ１株を高密度培養法によりＦｃ結合性タンパク質を生産した。
【００５６】
（１）形質転換体の作製
（１−１）市販のｐＴｒｃ９９Ａプラスミドを基に、シグナル配列として配列番号２１にに記載のアミノ酸配列からなるｐｅｌＢシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０Ｃ１Ｃ１の１番目から２２番目までの領域、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｌａ）を導入したプラスミドｐＴｒｃｐｅｌＢを以下の方法で作製した。プラスミドＴｒｃ９９Ａプラスミドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号２２に記載の配列からなるｐｅｌＢ配列を含んだオリゴヌクレオチド（５’−ＧＣＡＴ[ＣＣＡＴＧＧ]ＣＣＡＴＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＴＣＧＧＣＡＧＣＡＧＧＴＡＴＴＴＣＡＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧ−３’：角かっこ内は制限酵素ＮｃｏＩサイト）、および配列番号２３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（５’−ＣＡＴＧＣ［ＡＡＧＣＴＴ］ＧＧＣＴＧＴＴＴＴＧＧＣＧＧＡＴＧＡＧＡＧＡＡＧＡＴＴＴＴＣ−３’：角かっこ内は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイト）をＰＣＲプライマーとして用いて、インバースＰＣＲを実施した。ＰＣＲは表１に示す反応液組成のもと、９８℃で２分間の加熱の後、９８℃で１０秒間の第１ステップ−５０℃で５秒間の第２ステップ−７２℃で４分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をアガロース電気泳動により分離し、抽出キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ：キアゲン社製）を用いて精製した。精製産物を制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩにより消化後、アガロース電気泳動により分離することで、約４ｋｂｐのｐｅｌＢ配列を含むｐＴｒｃベクター断片を取得した。
（１−２）実施例１で作製した４２Ｈ１株のプラスミドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号２４（５’−ＣＡＴＧ［ＣＣＡＴＧＧ］ＡＴＡＴＣＧＧＡＡＴＴＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＴＧＴＧＡＴＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡＣ−３’：角かっこ内は制限酵素ＮｃｏＩサイト）および配列番号２５（５’−ＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＡＣＴＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして用いて、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは表１に示す反応液組成のもと、９８℃で２分間の加熱の後、９８℃で１０秒間の第１ステップ−５０℃で５秒間の第２ステップ−７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をアガロース電気泳動により分離し、抽出キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ：キアゲン社製）を用いて精製した。前記断片を制限酵素ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、アガロース電気泳動により分離することで、約１ｋｂｐの本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む断片を取得した。
（１−３）（１−１）で調製したｐＴｒｃベクター断片と、（１−２）で調製したポリヌクレオチド断片とをライゲーション反応により結合した。
（１−４）ライゲーション反応後のプラスミドを用いて、大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ  ２７３２５）を定法により形質転換し、Ｆｃ結合性タンパク高生産変異株４２Ｈ１を発現する形質転換体（ｍ６０ｃ４２Ｈ１／ｐＴｒｃｐｅｌＢ／Ｗ３１１０）を得た。
【００５７】
（２）高密度培養
（２−１）（１）で得られた形質転換体を、１００ｍＬの２×ＹＴ培地（バクトトリプトン：１６ｇ／Ｌ、酵母エキス：１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム：５ｇ／Ｌ、アンピシリン：０．１ｍｇ／Ｌ）を入れた、５００ｍＬ容バッフル付三角フラスコに植菌し、３０℃で１６時間、毎分１３０回の回転速度、回転半径１インチにて前培養を行なった。
（２−２）表２に示す培地組成のうち、酵母エキス、リン酸三ナトリウム十二水和物およびリン酸水素二ナトリウム十二水和物を投入した培地約１．４Ｌを３Ｌの発酵槽に入れ、１２１℃で２０分間滅菌後、グルコース、硫酸鉄（ＩＩ）四水和物、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物および硫酸マグネシウム七水和物を表２に示す濃度にそれぞれなるよう添加し、さらに前記の前培養液９０ｍＬを添加して、本培養を行なった。培養装置はエイブル社製ＢＭＳ−０３ＰＩを使用し、通気した空気速度は１．８Ｌ／分に、培養温度は３０℃に、ｐＨは６．９から７．１にそれぞれ設定し、培養中におけるｐＨの変動は、１４％アンモニア水または５０％リン酸の添加により前記範囲に制御した。培養中はグルコース分析計（ＹＳＩ社製２７００）を用いて定期的にグルコース濃度を測定した。炭素源の供給には７００ｇ／Ｌのグルコースを、窒素源の供給には４００ｇ／Ｌの酵母エキス（オリエンタル酵母工業社製）を、それぞれ使用した。供給は、炭素源の溶液と窒素源の溶液を容量比１：１で混合して行なった。エイブル社製ＤＯ（溶存酸素）電極による信号を、エイブル社製培養制御プログラムをインストールしたパーソナルコンピューターにより検出することで、本培養初期に投入したグルコース（２０ｇ／Ｌ）が消費されたことを検知し、溶存酸素濃度が４０％飽和を超えた時点で流加ポンプを起動してグルコース３５０ｇ／Ｌ、酵母エキス２００ｇ／Ｌの混合液を供給した。供給にはワトソン・マーロウ社製定量ポンプ１０１Ｕの高速型を使用した。微生物の増殖は培養液の６００ｎｍの濁度（ＯＤ６００ｎｍ）により測定した。
【００５８】
【表２】
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（２−３）ＯＤ６００ｎｍが９０に達したとき、すなわち培養開始１０時間後に培養温度を２５℃に下げ、培養液にＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を終濃度０．５ｍＭとなるよう添加して、Ｆｃ結合性タンパクの生産誘導をかけた。
【００５９】
結果を図５に示す。４８時間培養を行なったところ、培養液の濁度は１６０に達した。予め求めた濁度と菌体密度の相関式より、乾燥菌体収量は培養液１Ｌあたり４６ｇと求められた。なお、グルコース濃度は、グルコースと酵母エキスの供給を開始した、培養開始８時間後から培養終了（４８時間後）までの期間中、０から０．１ｇ／Ｌに維持された。また、培養終了後の培養液に含まれるＦｃ結合性タンパクの生産量をＥＬＩＳＡ法により定量した結果、培養液１Ｌあたり約１５００ｍｇとなった。
【００６０】
比較例１
実施例で使用したコントロール株（ＦｃＲｍ６０ｃのＣ末端側に配列番号２７に記載の配列からなるオリゴペプチド（ＣＧ）を付加したタンパク質を発現可能な形質転換体）のプラスミドを用いて、実施例９と同様な方法により、形質転換体（ｍ６０ｃＣＧ／ｐＴｒｃｐｅｌＢ／Ｗ３１１０）の作製、および作製した形質転換体を用いた高密度培養によるＦｃ結合性タンパク質生産を実施した。培養終了後の培養液に含まれるＦｃ結合性タンパクの生産量をＥＬＩＳＡ法により定量した結果、培養液１Ｌあたり約３８０ｍｇとなった（図５）。図５より高密度培養においても、本発明のタンパク質により、Ｆｃ結合性タンパク質としての生産量が向上することが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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