(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベル型の核を有する目的の異型核幹細胞を同定するための、又はベル型を有する１個以上の異型核幹細胞核を含む目的の多核合胞体を同定するための方法であって、前記方法は、細胞の試料を適切な酸−アルコール混合液で固定するステップ、及び前記試料を、外部からの、又は外因的に加えられた蛍光色素の不在下でフォイルゲン染色により処理するステップ、並びに異型核幹細胞の緑色光を放出する蛍光性バルーン状細胞質構造、又は前記合胞体内の１個以上の幹細胞核を取り囲む細胞質の緑色光を放出する蛍光を視覚化するステップを含み、ここで、前記蛍光を、蛍光顕微鏡を使用して検出し、前記目的の異型核幹細胞を同定する、又は１個以上のベル型の幹細胞核を含む前記目的の多核合胞体を同定する、方法。
【請求項２】
前記試料を固定するステップが、前記細胞の試料をカルノア固定液で処理することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞又は合胞体が、細胞培養物、前新生物病変、腫瘍試料若しくは組織試料から得られるか、又は細胞培養物、前新生物病変、腫瘍試料若しくは組織試料に含まれている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記異型核幹細胞又は多核合胞体が、前記組織試料、前新生物病変、又は腫瘍試料から単離される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記異型核幹細胞又は多核合胞体が、１つ以上の非対称な無糸核分裂複合体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
異型核幹細胞の増殖を阻害する薬剤を同定する方法であって、前記方法は、
ａ）インビトロで組織試料又は細胞試料を候補薬剤により処理するステップ、ここで前記組織試料又は細胞試料が、異型核幹細胞又は１個以上の幹細胞核を含む合胞体を含み、該幹細胞の核はベル型である、
ｂ）前記処理した組織試料又は細胞試料を適切な酸−アルコール混合液で固定するステップ、及び前記試料を、外部からの、又は外因的に加えられた蛍光色素の不在下でフォイルゲン染色により処理するステップ、
ｃ）異型核幹細胞の緑色光を放出する蛍光性バルーン状細胞質構造、又は合胞体内の１個以上の幹細胞核を取り囲む細胞質の緑色光を放出する蛍光の存在、強度、又は数を検出するステップ、並びに
ｄ）前記候補薬剤により処理した前記試料中の、異型核幹細胞の蛍光性バルーン状細胞質構造、又は前記合胞体内の１個以上の幹細胞核を取り囲む細胞質の蛍光の存在、強度、又は数を、対照と比較するステップ
を含み、蛍光性の幹細胞、又は１個以上の幹細胞核を含む合胞体の、数又は強度における減少又はそれらが増加しないことが、前記薬剤が異型核幹細胞の増殖を阻害することを示す、方法。
【請求項７】
前記処理した組織試料又は細胞試料を固定するステップが、細胞の試料をカルノア固定液で処理することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記対照が、プラセボで処理されたインビトロの組織試料又は細胞試料であり、前記組織試料又は細胞試料が異型核幹細胞又は１個以上の幹細胞核を含む合胞体を含み、前記幹細胞の核がベル型である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
抗腫瘍形成薬剤を同定する方法であって、前記方法は、
ａ）インビトロで腫瘍組織試料又は腫瘍細胞試料を候補薬剤により処理するステップ、
ｂ）前記処理した腫瘍組織試料又は腫瘍細胞試料を適切な酸−アルコール混合液で固定するステップ、及び前記試料を、外部からの、又は外因的に加えられた蛍光色素の不在下でフォイルゲン染色により処理するステップ、
ｃ）異型核幹細胞の緑色光を放出する蛍光性バルーン状細胞質構造、又は１個以上の幹細胞核を含む合胞体内の１個以上の幹細胞核を取り囲む細胞質の緑色光を放出する蛍光の存在、強度、又は数を検出するステップ、ここで該幹細胞の核はベル型である、並びに
ｄ）前記候補薬剤により処理した試料中の異型核幹細胞の蛍光性バルーン状細胞質構造、又は前記合胞体内の１個以上の幹細胞核を取り囲む細胞質の蛍光の存在、強度、又は数を、対照と比較するステップ
を含み、蛍光性幹細胞、又は１個以上の幹細胞核を含む合胞体の、数又は強度における減少又はそれらが増加しないことが、前記薬剤が抗腫瘍形成薬剤であることを示す、方法。
【請求項１０】
前記処理した腫瘍組織試料又は腫瘍細胞試料を固定するステップが、腫瘍細胞の試料をカルノア固定液で処理することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記対照が、プラセボで処理されたインビトロの腫瘍組織試料又は腫瘍細胞試料である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
幹細胞の増殖を阻害する薬剤を同定する方法であって、前記方法は、
ａ）候補薬剤で処置した被験哺乳動物由来の細胞又は組織の試料を固定するステップ、及び前記試料を、外部からの、又は外因的に加えられた蛍光色素の不在下でフォイルゲン染色により処理するステップ、ここで、前記細胞又は組織は、適切な酸−アルコール混合液で固定される、
ｂ）異型核幹細胞の緑色光を放出する蛍光性バルーン状細胞質構造、又は合胞体内の１個以上の幹細胞核を取り囲む細胞質の緑色光を放出する蛍光の存在、強度、又は数を検出するステップ、ここで該幹細胞の核はベル型である、並びに
ｃ）前記候補薬剤により処置した前記被験哺乳動物由来の細胞又は組織の前記試料中の、異型核幹細胞の蛍光性バルーン状細胞質構造、又は前記合胞体内の１個以上の幹細胞核を取り囲む細胞質の蛍光の存在、強度、又は数を、対照と比較するステップ
を含み、蛍光性の幹細胞、又は１個以上の幹細胞核を含む合胞体の、数又は強度における減少又はそれらが増加しないことが、前記薬剤が異型核幹細胞の増殖を阻害することを示す、方法。
【請求項１３】
前記処理した腫瘍組織試料又は腫瘍細胞試料を固定するステップが、腫瘍細胞の試料をカルノア固定液で処理することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記対照が、前記試験薬剤で処置する前に前記被験哺乳動物から採取された細胞又は組織の試料であり、又は前記対照が、プラセボで処置された被験哺乳動物由来の細胞又は組織の試料である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
抗腫瘍形成薬剤を同定する方法であって、前記方法は、
ａ）候補薬剤で処置した哺乳動物由来の腫瘍細胞又は腫瘍組織の試料を固定するステップ、及び前記試料を、外部からの、又は外因的に加えられた蛍光色素の不在下でフォイルゲン染色により処理するステップ、ここで、前記細胞又は組織は、適切な酸−アルコール混合液で固定される、
ｂ）異型核幹細胞の緑色光を放出する蛍光性バルーン状細胞質構造、又は合胞体内の１個以上の幹細胞核を取り囲む細胞質の緑色光を放出する蛍光の存在、強度、又は数を検出するステップ、ここで該幹細胞の核はベル型である、並びに
ｃ）前記候補薬剤により処置した前記哺乳動物由来の前記腫瘍細胞又は腫瘍組織の試料中の、異型核幹細胞の蛍光性バルーン状細胞質構造、又は前記合胞体内の１個以上の幹細胞核を取り囲む細胞質の蛍光の存在、強度、又は数を、対照と比較するステップ
を含み、蛍光性の幹細胞、又は１個以上の幹細胞核を含む合胞体の、数又は強度における減少又はそれらが増加しないことが、前記薬剤が抗腫瘍形成薬剤であることを示す、方法。
【請求項１６】
前記処理した腫瘍組織試料又は腫瘍細胞試料を固定するステップが、腫瘍細胞の試料をカルノア固定液で処理することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記対照が、前記候補薬剤で処置する前に前記哺乳動物から採取された腫瘍細胞又は腫瘍組織の試料であり、又は前記対照が、プラセボで処置された哺乳動物由来の細胞又は組織の試料である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記異型核幹細胞が、器官特異的幹細胞、癌幹細胞、胎児性小児性幹細胞及び成体幹細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００８年９月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／１９４，０７６号明細書の利益を主張する。
【０００２】
上記出願の教示全体が、参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
動物の胚、胎児、新生児及び小児において成長及び分化をもたらす過程は、腫瘍に先行し、及びそれを形成する細胞型の成長及び分化をもたらす過程と特定の特徴を共有している。腫瘍及び胎児における抗原分子を認識する方法から、胎児及び腫瘍の双方に、成体器官では観察されない分子を多く観察可能であることが示されている。１９世紀には、成体に遺残した胚細胞又は胎児細胞から腫瘍が生じるのではないかという議論があった。現在の見解では、直系遺伝において胚性幹細胞から遺伝的変化を起こし、腫瘍幹細胞を作り出す成体幹細胞となって腫瘍を生じる自己複製型の幹細胞が存在することが指摘されている。この議論は、要約すると、単一の正常な胎児性小児性組織幹細胞が前新生物幹細胞の前駆体である可能性があり、そのうちの１つが、次に腫瘍の基となる幹細胞を生じ、それが次にクローン性の転移及び移植腫瘍の基となる幹細胞を生じる。前新生物病変、腫瘍及び転移には、組織学的に区別可能な細胞型が明確に存在することに基づくと、及び胎生学的な成長及び発生から類推して、組織、前新生物病変、腫瘍及び転移の起源となる幹細胞は、分化並びに自己複製による成長が可能でなければならないと推論することができる。この腫瘍成長の幹細胞理論が正しいとすれば、腫瘍細胞を同定、選別、分類、及び操作する必要性が明らかに現前する。しかしながら、当該技術分野においてかかる細胞の同定又は単離については記載がなされていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ヒトを含む哺乳動物、細胞培養物、及び前新生物病変又は腫瘍試料を含む組織試料における器官特異的幹細胞及び／又は腫瘍幹細胞及び他の幹細胞型の同定法及び分類方法から導かれる。本発明は、幹細胞、又は１個以上の幹細胞核を含む合胞体の蛍光について、その存在若しくは不在を決定若しくは検出することによるか、又はその強度を決定若しくは計測することによる、幹細胞及び幹細胞核を含む合胞体の同定方法に関する。より詳細には、蛍光は幹細胞のバルーン状細胞小器官内に存在する。これらのバルーン状細胞小器官はまた、本明細書では細胞質構造又は細胞質組成物とも称される。本明細書で使用されるとき、細胞質構造又は細胞質組成物とは、細胞質の細胞質ゾル部分、細胞膜、細胞小器官及びそれらの組み合わせを含む。少なくとも１個の幹細胞核を含む（及びしばしば２個以上の幹細胞核を含む）目的の合胞体では、合胞体は、目的の合胞体の細胞質に（例えば、合胞体の核間空間に）１個以上の幹細胞核を取り囲み、又は包み込む蛍光性の細胞質（又は細胞質ゾル）を含む。本明細書にさらに記載されるとおり、「幹細胞核」とは、特に「ベル型の核」を指す。ベル型の核を含む幹細胞はまた、本明細書では異型核細胞（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｅ）とも称される。
【０００５】
本明細書で使用されるとき、蛍光性の幹細胞又は合胞体とは、外部からの、又は外因的に加えられた蛍光色素の不在下で蛍光を発する幹細胞又は合胞体である。異型核幹細胞及び／又は合胞体を同定する蛍光性は、その幹細胞及び／又は合胞体中に存在する物質と反応することによって蛍光生成物を作り出す外因性の非蛍光化学物質と反応することにより生じる。より詳細には、非蛍光化学物質はシッフ塩基を含む。幹細胞の細胞質には強い蛍光が存在する。ベル型の異型核幹細胞核には、特異的に蛍光が存在しない。
【０００６】
一実施形態において、蛍光性の幹細胞又は合胞体の検出は、酸−アルコール混合液などの好適な試薬を使用して固定し、続いて幹細胞又は合胞体の構成成分と反応して蛍光生成物を形成する非蛍光試薬で処理した後に行われる。幹細胞の固定に好適な酸−アルコール混合液としては、酢酸−エタノール；カルノア固定液；３：１メタノール−氷酢酸；６：３：１エタノール−クロロホルム−酢酸；３：１エタノール−酢酸；及び同様のものが挙げられる。好適な非蛍光試薬としては、シッフ塩基試薬、フォイルゲン試薬、フクシンなどが挙げられる。本明細書で使用されるとき、非蛍光試薬は、それ単独では蛍光を発しない（それ単独で蛍光を発する試薬の例としては、ＦＩＴＣ、緑色蛍光タンパク質、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄなどが挙げられる）。
【０００７】
別の実施形態において、蛍光性の幹細胞又は合胞体の検出は、非蛍光試薬（例えば、シッフ塩基試薬、フォイルゲン試薬、フクシンなど）で染色した後に行われる。
【０００８】
従って、本発明の一方法は、目的の異型核幹細胞、又は目的の多核合胞体であって、ベル型の核によって特徴付けられる１個以上の幹細胞核を含む目的の合胞体（例えば、多くの場合に目的の合胞体は２個以上の幹細胞核を含む）を、幹細胞内又は１個以上の幹細胞核を含む合胞体内の蛍光性バルーン状細胞小器官（細胞質構造又は細胞質組成物、但し核質ではない）を検出又は視覚化することによって同定することに基づく。
【０００９】
本明細書に記載される異型核細胞の幹細胞は、同様に拡がったバルーン状細胞質を有する、固定及びフクシンなどの好適なシッフ塩基試薬による染色を経て蛍光性にすることのできる杯細胞とは異なることに留意しなければならない。組織学及び医学テキストの文献に記載されるとおりの杯細胞は、杯細胞の細胞質中に多量に存在するムチンの産生に関連する肺及び結腸を含め、多くの組織に認められる。単一の異型核幹細胞の場合と同じく、杯細胞の核もまた、そのバルーン型の細胞質の一端に偏心して位置する。しかしながら、異型核幹細胞では、その特徴的なベル型の核がバルーン型の細胞質に物理的に近接しており、バルーン型の細胞質はベルの口によって部分的に包み込まれている。対照的に、杯細胞の核は回転楕円形又は卵形であり、通常、細胞質とは、ワイングラス又は「杯」にあるような狭い首部又は柄によって分離されている。この基本的な違いを強調することは重要である：杯細胞はベル型の核をもたず、ベル型の核をもつ異型核細胞の幹細胞とは細胞型が異なる。
【００１０】
一実施形態において、本明細書に記載されるとおりの、外部からの、又は外因的に加えられた蛍光色素又は試薬の不在下で蛍光を発する異型核細胞の幹細胞は、器官特異的幹細胞であり、消化系、呼吸系、神経系及び筋骨格系の器官を含め、全てではないが、発生中のヒト胎児器官の多くに認められ；癌幹細胞、胎児性−小児性幹細胞又は成体幹細胞である。具体的に、発生中のヒト血管系の静脈及び動脈の、ベル型の核を有する異型核細胞の幹細胞が、その細胞質内に、本明細書に記載されるとおりの外部からの、又は外因的に加えられた蛍光色素又は試薬の不在下で蛍光を発する物質を含むことは認められていない。従って、一実施形態において、本明細書に記載されるとおりの外部からの、又は外因的に加えられた蛍光色素又は試薬の不在下で蛍光を発する異型核細胞の幹細胞は、血管幹細胞ではない。
【００１１】
上記のとおり、目的の幹細胞及び合胞体は蛍光を発し、目的の幹細胞及び合胞体を視覚化するために試料に外部からの蛍光物質／色素を加えなくともよい。従って、外部からの蛍光物質／色素なしに幹細胞／合胞体が蛍光を発するという固有の特徴の発見により、腫瘍組織生検試料などの組織試料中の幹細胞／合胞体の同定が大幅に促進され得る。かかる試料は、外科病理学及び外科腫瘍学の診断用の手動、自動又は半自動蛍光走査技術によって高速で走査することができる。
【００１２】
米国特許第７，４２７，５０２号明細書「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｏｒｐｈｏｔｙｐｅｓ」（その教示は全体として本明細書に援用される）に記載されるとおり、細胞培養物、組織、前新生物病変又は腫瘍試料中のあらゆる細胞の中で幹細胞の指標となるのは、核形態型と、核分裂の様式と、多細胞凝集体及び多核合胞体における特定の形態型の核の関与とである。器官特異的幹細胞又は腫瘍幹細胞の同定は、特定の核形態型のみに基づき行うことができる。胎児組織、前新生物病変（結腸腺腫）及び新生物病変又は腫瘍（結腸腺癌、膵癌）では、複数の型（核形態型）の明確で且つ再現性のある非球形の核が観察されたが、それらは、結腸陰窩又は肝実質などの正常な成体組織には存在しなかった。米国特許第７，４２７，５０２号明細書に開示されるこれらの形態型は、これまでヒト組織の組織学又は病理学紀要において報告されたことのないサイズ及び形状の核を含む。注目すべき核形態型の一つは、開いた「口」を備えたカップ又はベルの形−「ベル型」と命名された−を有する。このようなベル型の核は、２個の積み重ねた紙カップの分離に似た、対称な核分裂として観察された。
【００１３】
このような「カップ・フロム・カップ（ｃｕｐ−ｆｒｏｍ−ｃｕｐ）」分裂はまた、それが無糸分裂であることも注目すべき点であり、例えば、有糸分裂のように全てのヒト染色体の凝縮及び分離が関与するわけではない。２つの見かけ上同一のベル型の核がカップ・フロム・カップ分裂から生じる限りにおいて、それは対称な核分裂である。このようなベル型の核はまた、非対称な無糸核分裂を行うことも観察され、ここでベル型の核は、他の核形態型のうちの１つの被包された核を生じるように見えた。この当初のベル型の核と別の形態型の核との産生が、非対称な核分裂において最初に目に見えるものである。ベル型の核が関与する非対称な無糸細胞分裂において、ベル型の核とは異なる異形の核形態型が出現することは本明細書の開示であり、これによりベル型の核を有する細胞の表現型とは異なる異形の核形態型を有する細胞を明確に定義する。非対称な核分裂は、正常な発生において必須の幹細胞の特徴と広く考えられている。胎児組織、前新生物形成及び新生物形成のいずれにも共通する核形態型の発見は、腫瘍が胎児の表現型、特に誘導される分化細胞の表現型を有するクローン集団を形成する幹細胞の再発現であるという仮説に関係する。
【００１４】
ここで、本明細書に記載されるとおり、核形態型に加えて、幹細胞に固有のさらなる特徴が発見されている。外部からの、又は外因的に加えられた蛍光色素の不在下における幹細胞及び幹細胞核を含む合胞体の蛍光性により、細胞及び組織試料中の幹細胞／合胞体を同定及び計数する高速の手段が提供される。
【００１５】
本発明の一実施形態において、外部からの、又は外因的に加えられた蛍光色素の不在下における蛍光性の幹細胞／合胞体の検出は、試料の由来組織に応じて、正常組織、前新生物組織、新生物組織又は転移性組織の指標となる。別の実施形態において、外部からの、又は外因的に加えられた蛍光色素の不在下における蛍光性の幹細胞／合胞体の存在は、前新生物形成又は新生物形成の指標となる。詳細な実施形態において、本発明に記載される方法に好適な組織／腫瘍試料は、外科的切除によって採取される。
【００１６】
典型的には、試料は、例えば、メタノールと酢酸とを含む固定剤であるカルノア固定液によって物理的又は化学的に固定された後、本明細書に記載されるとおりのフォイルゲン染色法においてシッフ塩基などの非蛍光試薬でさらに処理される。固定は、外科的に固定した後３０分未満で行わなければならず、その時間を過ぎると、ベル型の核の細胞分解が観察される。典型的には、組織／腫瘍試料の細胞は、組織浸軟及び展開により部分的に解離される。本発明の詳細な実施形態において、幹細胞／合胞体は、蛍光顕微鏡法を用いて検出される。（略語「幹細胞／合胞体（ｓｙｎｃｙｔｉｕｍ又はｓｙｎｃｙｔｉａ）」は、本明細書では、幹細胞のみならず、幹細胞核を含む合胞体、特にベル型の核を含む細胞及び合胞体を記載するために用いられる）。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、組織試料の発達段階又は病理段階を特徴付けるための方法に関し、これは、外部からの、又は外因的に加えられた蛍光色素の不在下で蛍光性の幹細胞／合胞体を検出するステップを含む。一実施形態において、発達段階は、胚、胎児、新生児、小児及び成体の発達段階からなる群から選択される。加えて、蛍光性の幹細胞／合胞体の検出は、特定の発達段階又は病理段階、例えば前新生物形成又は新生物形成の指標となる高分子マーカーの同定につながり得る。かかるマーカーは、抗原、細胞表面マーカー、核酸、タンパク質、リン酸化タンパク質、グリコサミノグリカン又は代謝産物であってもよい。別の実施形態において、ベル型の核に関連する蛍光性バルーン状構造は、タンパク質合成及び／又は翻訳後プロセシングの部位、例えば細胞質構造であると認められ得る。
【００１８】
本発明のさらなる実施形態は、幹細胞増殖を阻害する薬剤の同定方法を含む。かかる方法のステップとしては、幹細胞、又は幹細胞核を含む合胞体を含む培養された組織又は細胞試料を候補薬剤で処理するステップと；培養下の腫瘍又は細胞試料において、外部からの、若しくは外因的に加えられた蛍光色素の不在下における蛍光性幹細胞の、又は外部からの、若しくは外因的に加えられた蛍光色素の不在下における幹細胞核を含む蛍光性合胞体の、存在及び／又は強度若しくは数を決定するステップと、候補薬剤で処理された培養物中の細胞又は合胞体の蛍光の存在及び／又は強度を、候補薬剤で処理されていない培養物中の蛍光性の幹細胞又は幹細胞核を含む合胞体の存在及び／又は強度若しくは数と比較するステップとが含まれ、ここで、蛍光性の幹細胞の、又は幹細胞核を含む合胞体の、数又は強度の減少、又はその増加の停止が（例えば、細胞数は減少しないが、しかし増加もせず、すなわち、本質的に数が変化しないままである場合）、幹細胞の増殖を阻止又は阻害する有効な薬剤の指標となる。
【００１９】
別の実施形態は、抗腫瘍形成薬剤の同定方法を含み、これは、培養された腫瘍組織又は細胞試料を候補薬剤で処理するステップと、培養下の腫瘍又は細胞試料において、外部からの、若しくは外因的に加えられた蛍光色素の不在下における蛍光性幹細胞の、又は外部からの、若しくは外因的に加えられた蛍光色素の不在下における幹細胞核を含む蛍光性合胞体の、存在及び／又は強度若しくは数を決定するステップと；候補抗腫瘍形成薬剤で処理された培養物中の細胞又は合胞体の蛍光の存在及び／又は強度を、候補抗腫瘍形成薬剤で処理されていない培養物中の細胞又は合胞体の蛍光の存在及び／又は強度と比較するステップとを含み、ここで、蛍光性の幹細胞の、又は幹細胞核を有する合胞体の、数又は強度の減少が、有効な抗腫瘍形成薬剤の指標となる。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態は、幹細胞の増殖を阻害する薬剤の同定方法を含み、これは、被験哺乳動物を候補薬剤で治療するステップと；哺乳動物から採取された試料中に含まれる、外部からの、若しくは外因的に加えられた蛍光色素の不在下における蛍光性幹細胞の、又は外部からの、若しくは外因的に加えられた蛍光色素の不在下における幹細胞核を含む蛍光性合胞体の存在及び／又は強度若しくは数を決定するステップと；候補薬剤で治療された哺乳動物から採取された細胞又は合胞体の蛍光の存在及び／又は強度若しくは数を、候補薬剤で治療されていない哺乳動物から採取された細胞又は合胞体の蛍光の存在及び／又は強度と比較するステップとを含み、ここで蛍光を発する幹細胞の、又は幹細胞核を含む合胞体の、数又は強度が増加しないことが、幹細胞の増殖を阻害する有効な薬剤の指標となる。
【００２１】
また、抗腫瘍形成薬剤の同定方法も包含され、これは、腫瘍を有する哺乳動物を候補薬剤で治療するステップと、哺乳動物から採取された腫瘍試料中に含まれる、外部からの、若しくは外因的に加えられた蛍光色素の不在下における蛍光性幹細胞の、又は外部からの、若しくは外因的に加えられた蛍光色素の不在下における幹細胞核を含む蛍光性合胞体の、存在及び／又は強度を決定するステップと；候補抗腫瘍形成薬剤で治療された哺乳動物から採取された細胞又は合胞体の蛍光の存在及び／又は強度若しくは数を、腫瘍を有し、しかし候補抗腫瘍形成薬剤では治療されていない哺乳動物から採取された細胞又は合胞体の蛍光の存在及び／又は強度と比較するステップとを含み、ここで、蛍光を発する幹細胞の、又は幹細胞核を有する合胞体の、数又は強度の減少が、有効な抗腫瘍形成薬剤の指標となる。
【００２２】
このようなこれまで認識されてこなかった細胞を、その、外部からの、又は外因的に加えられた蛍光色素の不在下における蛍光性、核形態型、核分裂の様式及び／又は正常組織及び腫瘍組織における多核構造への関与により幹細胞として特異的に同定する、本発明に記載される方法の価値は、明らかである。これらの方法は、幹細胞、並びに他の胎児性の、及び腫瘍特異的な核形態型を特異的に認識することを可能にし、その単離及び研究を可能にし、及び癌に対する多くのもっともらしい予防又は治療レジメンのなかでどれが有効であるかを見出すための試験におけるその利用を提供する。本発明に記載される方法はまた、ヒト組織及び器官に対する再生及び移植治療（例えば、組織再建治療）用の特異的な幹細胞を見出す手段も提供する。
【００２３】
本特許又は出願ファイルは、少なくとも１つのカラーで作成された図面を含む。カラー図面を含む本特許又は特許出願公開の複写は当該当局から、請求を行い、必要な料金を支払うことで提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ヒト胚消化管、正常結腸粘膜、腺腫及び腺癌における中間期及び前期初期（Ｅ．Ｐ．）細胞で観察される核形態型を示す。＊  ベル型の核は、成体結腸の上皮陰窩ではほとんど観察されない。スケールバー、５μｍ。
【図２】胚消化管の顕微鏡画像を示す。図２Ａは、染色された核を伴う、低倍率（１４０×）での５〜７週胎児消化管と（左の画像）、別の消化管切片の位相差／蛍光画像と（右の画像）を示す。明確に、非球形の核が、位相差画像上の「管状」構造によって画定される直線的な整列状態で並んでいる（破線により指示される）。これらの管状構造は、観察した消化管切片全体にわたって見られ、他の細胞集団が管間に散在している。図２Ｂは、同じ消化管切片の位相差画像と（左のフレーム）、染色した核の画像と（中央）、それらを重ね合わせることで、核の見かけ上直線的な配向が、実際には、それ自体約５０ミクロンの直径である管状構造又は合胞体によって強制されていることを実証するものと（右）を示す。核の拡大像（２８０×）（中央のフレーム）は、これらの非球形の核がカップ又はベルの形に見えることを示す。図２Ｃは、直線的な配列の核の拡大画像（１４００×）を示す。これらの配列された核は、見かけ上中空の、再現性のあるベル型を有する。観察される全ての胚管で「ヘッド・ツー・トウ」配向のベルが保たれているが、管は、平行な管が局所的に逆平行となったベル型の核の配向を有し得るように、前後に蛇行している。スケールバー、低倍率で１００μｍ、及び高倍率で５μｍ。
【図３】ベル型の核の胚消化管の無糸分裂を示す。図３Ａ：対称な無糸分裂：見かけ上、ベル型の核がベル型の核から現れる。様々なベル型の形態型が観察されるが、それらの無糸分裂は、これらの３つの例に示されるとおり、ベルの口幅／長さ比などの区別のつかないベル型形態型の特徴を示す；図３Ｂ：非対称な無糸分裂：見かけ上、中実の核型がベル型の核の中から現れる。４つの画像が示され、ここでは球形の凝縮した核がベルの深いところに形成されていて、見かけ上、完全に分離する前にベルとの核質の接続部と共に現れることが分かる；図３Ｃ：ベル型の核の口から出る球形の凝縮していない核；図３Ｄ：ベルから現れる卵型の（「楕円形の」）核；図３Ｅ：ベルから現れるマメ型の（「腎臓型の」）核；図３Ｆ：ベルから現れる葉巻型の核。スケールバー、５μｍ。
【図４】正常な成体結腸陰窩を示す。図４Ａは、約２０００個の球形の核及び卵形核の陰窩を示し、これは時に（＜１／１００）陰窩の底部に位置する見分けのつくベル型の核（左下隅の矢印）を含む（右隅：核の拡大画像）。図４Ｂは陰窩基部を示し、その基部に特有の他の核形態型のなかの別のベル型の核を含む。図４Ｃは、十分に拡がった陰窩の壁及び管腔表面の間期核及び有糸分裂核の様々な形態型を示す。拡大画像は、（ｉ）球形及び卵形の間期核、（ｉｉ、ｉｉ）球形の核及び楕円形型の核の前期初期、及び（ｉｖ）後終期核を示す。スケールバー、低倍率画像について１００μｍ、及び高倍率画像について５μｍ。
【図５】腺腫の拡大画像を示す。図５Ａは、腺腫の大型の枝分かれした陰窩の特徴を示す。陰窩基部及び管腔開口が、正常な結腸切片と同じように規則的に並んでいる。図５Ｂは変則的な陰窩様構造を示し、これもまた腺腫試料全体にわたって観察された。典型的には２個、しかし時に１個、４個又はさらには８個のベル型の核（挿入部分）が、これらの大型の（４０００個超の細胞）変則的な陰窩の基部に見られる。図５Ｃは、１個のベル型の核を含む同様の核形態型の細胞集団を示す。これらの単純な集団は、合計１６個、３２個、６４個、及び１２８個の細胞を有する。左側のパネル：フォイルゲンギムザ染色。右側のパネル：位相差蛍光画像。図５Ｄは、ベル型の核が腺腫に出現する種々のコンテクストを示す：（ｉ）３１個の卵形の核と１個のベル型の核とを含む集団、（ｉｉ）「ショルダー・ツー・ショルダー」配置の複数のベル型の核、（ｉｉｉ）さらに大きい「環」のなかに「ショルダー・ツー・ショルダー」パターン（矢印）で並んだベル型の核、（ｉｉｉ）約２５０個の核の変則的な混合体、発生期の陰窩基部を示唆する数個のベル型の核が腺腫全体にわたって散在して認められる。図５Ｅは、見かけ上、基部にある１個のベル型の核（矢印）を含む５個の異なる核形態型の細胞のクローンパッチを含む変則的な陰窩様構造を示す。スケールバー、低倍率画像について１００μｍ、及び高倍率画像について５μｍ。
【図６】腺癌の拡大画像を示す。図６Ａは超大型の陰窩様構造（８０００個超の細胞）を示し、頻繁な切断点を有する分枝が含まれる。これらの構造の基部は、正常な結腸陰窩のものと比べて、腺腫の場合のように２個（典型的には）のベル型の核が存在することを除き、区別のつかないものであった。腺腫において保存されている陰窩様構造の管腔から基部への配向は、腺癌では観察されず、そこでは陰窩の配向はランダムであるように見える。矢印は、一般に腫瘍の表面近傍に認められる小さい約２５０個の細胞陰窩様構造を示す。図６Ｂは、腫瘍内部全体にわたって認められるベル型の核のショルダー・ツー・ショルダーとして分類されるものを示す。図６Ｃは内部腫瘍塊を示し、局所的にショルダー・ツー・ショルダー構成及びヘッド・ツー・トウ構成の双方に配向されているベル型の核の複数の例を含む。ヘッド・ツー・トウ配向は腫瘍内部にのみ認められ、ショルダー・ツー・ショルダー配向は内部にも、及び陰窩様構造間の腫瘍表面近傍にも認められる。ベル型の核は、腫瘍内部の全ての核のうち約０．２％を占める。スケール、低倍率画像について１００μｍ、及び高倍率画像について５μｍ。
【図７】腺癌における無糸分裂を表す拡大画像である。図７Ａは、変則的な陰窩において異なる形態の２個のベル型の核を作り出す対称な無糸分裂を示す。左の画像の矢印は、新しく生じた核のベルの底部を示す。図７Ｂは、球形の核を作り出す非対称な無糸分裂を示す。図７Ｃは、楕円形型の核を作り出す非対称な無糸分裂を示す。図７Ｄは、「葉巻」型の核を形成する対称な無糸分裂を示す。図７Ｅは、「ソーセージ」型の核を作り出す非対称な無糸分裂を示し、奇妙な暗染要素（上の矢印）が含まれ、これはベル型の核の口縁部にある凝縮した染色体のように見えるもの（下の矢印）とは異なる。スケール、５μｍ。
【図８】ヒト結腸上皮のフォイルゲンＤＮＡ染色した核を示す：ａ、ｂ：消化管のベル型の核；ｃ：結腸腺腫のベル型の核；ｄ：消化管のベル型の核の対称な核分裂；ｅ：非対称な核分裂；ｆ：結腸腺癌における非対称な核分裂（凝縮した球形の核がベル型の核から現れる）；ｇ：正常に見える陰窩の底部にあるベル型の核（矢印で示される）及びｈ：腺腫の「始まりの」陰窩全体にわたるベル型の核；ｉ：消化管における核の形態型の多様性。腺腫（ｋ）及び結腸腺癌（ｌ）から得られた細胞展開部内の矢印で示される葉巻型の核。「ｊ」に、成体の正常な結腸陰窩に典型的な球形の型の核が示される。バーサイズは５μｍである。
【図９】基本となる画像の概要を示す。（ａ）ヒト胎児消化管、正常な結腸粘膜、腺腫及び腺癌の中間期及び前期初期（Ｅ．Ｐ．）細胞で観察される核形態型の例。（Ｈ−ベル型の核は、成体の結腸ではほとんど観察されない）。（ｂ）胎児消化管のベル型の核の高解像度画像（１４００×）。凝縮したＤＮＡが円環を作り出し、それが中空のベル構造に至る開口を維持しているように見える。スケールバー、５μｍ。
【図１０】５〜７週の胚消化管の切片を示す：（ａ）位相差画像（左のフレーム）及び染色した核の画像（中央）及びそれらを合成した画像（右）が、約５０ミクロン直径の管状合胞体内における直線的な配列の核を示す；（ｂ）核の高解像度画像が、中空のベル型構造を示す。観察した全ての胚管においてベルのヘッド・ツー・トウ配向が保たれているが、管は、平行な管が局所的に逆平行となったベル型の核の配向を有し得るように、前後に蛇行している。スケールバー、低倍率画像で５０μｍ、及び高倍率画像で５μｍ。
【図１１】胎児消化管におけるベル型の核の核分裂を示す。ａ、ｂ：対称な核分裂：ベル型の核が、同様の形状のベル型の核から現れる。ｃ、ｄ：非対称な核分裂：ベル型の核から現れる球形の核、及び葉巻型の核。スケールバー、５μｍ。
【図１２】正常な成体結腸陰窩を示す：（ａ）約２０００個の回転楕円形、球形又は円板状の核の陰窩は、時に（＜１／１００）陰窩の底部に位置する見分けのつくベル型の核［矢印］を含んだ；（ｂ）別のベル型の核を示す陰窩基部；（ｃ）十分に拡がった陰窩の壁及び管腔表面の間期核及び有糸分裂核の形態型。拡大画像は：［ｉ］球形及び楕円形の間期核、［ｉｉ、ｉｉｉ］球形の核及び楕円形型の核の前期初期、及び［ｉｖ］後終期核を示す。スケールバー、低倍率画像について１００μｍ、及び高倍率画像について５μｍ。
【図１３】腺腫を示す。（ａ）腺腫の特徴的な大型の枝分かれした陰窩。（ｂ）腺腫全体にわたって認められる変則的な陰窩様構造。典型的には２個、しかし時に１個、４個又はさらには８個のベル型の核（挿入部分）が、これらの大型の（４０００個超の細胞）変則的な陰窩様構造の基部に見られる。（ｃ）１個のベル型の核を含む同様の核形態型の細胞集団。これらの集団の型は、正確に合計ｌ６個、３２個、６４個、及び１２８個の細胞を含む。左側のパネル、フォイルゲンギムザ染色。右側のパネル、位相差蛍光画像。（ｄ）腺腫にベル型の核が見られるコンテクスト：（ｉ）３１個の卵形の核と１個のベル型の核とを含む集団、（ｉｉ）ショルダー・ツー・ショルダー配置の複数のベル型の核、（ｉｉｉ）隣り合って並ぶパターン（矢印）で配列されたベル型の核、（ｉｉｉ）約２５０個の核の変則的な混合体、発生期の陰窩基部を示唆する数個のベル型の核が含まれる。（ｅ）見かけ上、基部にある１個のベル型の核［矢印］を含む５個の異なる核形態型の細胞のクローンパッチを含む変則的な陰窩様構造。スケールバー、１００μｍ（「ａ、ｂ」）及び５μｍ（「ｅ」）。
【図１４】腺癌を示す。（ａ）超大型の陰窩様構造（８０００個超の細胞）、頻繁な切断点を有する分枝が含まれる。矢印は、主に腫瘍の表面近傍に認められる約２５０個の細胞の陰窩様構造の例を示す。（ｂ）複数のベル型の核を含む内部腫瘍塊（２×１０−３個の全核形態型）。（ｃ）ヘッド・ツー・トウの合胞体及び非合胞体が隣り合って並ぶ構成で配向された（ｂ）におけるベル型の核。（ｄ）腺癌における対称な核分裂。（ｅ）腺癌における葉巻型の核を作り出すベルの非対称な核分裂。結腸の肝転移に同様の構造が認められている。スケールバー、５μｍ。
【図１５】（ａ）胚消化管、（ｂ）、結腸腺癌、（ｃ）結腸腫瘍の肝転移、（ｄ）膵腫瘍の、ヒト組織において明らかにされるとおりのベル型の核（紫色にフォイルゲンＤＮＡ染色した）の形態学的な類似性を示す。「ｄ」のベルの下半分に見られる凝縮したクロマチンの線は、膵腫瘍の全てのベル型の核に見られるが、結腸腫瘍では全く見られない。バースケール、５μｍ。
【図１６】本明細書に開示される組織学的手順（フォイルゲン染色法）によっては容易に検出され、５ミクロン切片のミクロトーム切片（ヘマトキシリン−エオシン染色（Ｈ＆Ｅ））を作成する標準的な組織学的手順によってはほとんど検出されない（いまだ一例のみ）ベル型の核を示す。同じ腫瘍、切除の３０以内に固定：左側のパネル：多数の非対称に分裂した細胞を含む膵腫瘍の縁端にコロニーとして存在する葉巻型の核を生じるベル型の核（矢印の頭）（左側に１００×拡大画像）。中央のパネル：並置された標準的な組織切片スライドで見ることのできるベル型及び楕円形型の核の、これまでに認められた唯一の例、最近の非対称な核分裂を示唆する。ベル型の核は、それをいまだ楕円形の核と結び付けているクロマチン鎖を有するように見える（矢印）。右側のパネル：この解釈を示す原版写真の略画。
【図１７】腫瘍中の分裂していない、及び分裂しているベル型の核を探索するＦＩＳＨの適用における「目的とする標的」の説明図である：（ａ）核において平方ミクロン当たりのＤＮＡ濃度が高いため一層暗染されるクロマチンは、２つの平行な環として並んだ前期染色体に似た、ベル型の形態の一部としての特有の構造を生じる。描画として示す（上部）これらの環から、結腸腫瘍中のベル型の核のこの特定の部位に特定の染色体が認められるのではないかという予測が示される、（ｂ）ベル型の核の非対称な分裂にわたって起こる仮想的な変形（ここではベル型の核から楕円形型の核への）に伴うクロマチン分布及び特定の染色体の位置変化。
【図１８】ＴＫ  ６ヒト細胞の球形の核における１１番染色体の蛍光インサイチュハイブリダイゼーションの結果を示す。（ａ）前期染色体の展開における２対の染色体、（ｂ）球形の核のＤＡＰＩ核染色、（ｃ）ＦＩＴＣ蛍光プローブとハイブリダイズした同じ染色体対、（ｄ）ＤＡＰＩとＦＩＴＣとの間期染色体染色を合成した画像。
【図１９】レーザー圧力射出システム（「レーザー圧力マイクロダイセクション」）による「標的」としてのベル型の核をまとめて示す：左上のパネル：顕微鏡と連結されたパルスＵＶ  Ａレーザーの前方に位置決めされた、細胞展開を有する顕微鏡スライド。左下のパネル：視野内のベル型の核を含む結腸腫瘍組織の細胞展開について示されるとおり、顕微鏡を通じて単一の核を見ることができる；右のパネル：染色していないスライドにおける、見分けのつく形態のベルを含む同じ核。
【図２０】ヒト胎児上皮において、全てのベル型の核が、ＤＮＡを含まない明るい蛍光を発するバルーン型の細胞質構造を伴うことを示す。１２週のヒト胎児結腸組織が示される。合胞体は胎児期の約１２週（器官形成の終わり）に消失する。ベル型の核は、成長組織全体に分布する。
【図２１】胎児上皮組織が、後に、蛍光のみで容易に見分けのつくこれらの細胞型を伴い自己組織化することを示す。この、及び他の例には、酢酸：エタノール固定試薬及びフォイルゲン試薬を利用した。本明細書に記載されるとおりのフォイルゲン（緑色）蛍光を示すヒト胎児小腸絨毛（９週）が示される。
【図２２】廃棄されたヒト１４〜１６週胎児の小腸の絨毛におけるベル型の核及び蛍光性「バルーン」の分布を示す。ベル型の核と物理的に関連したこれらの明るい蛍光を発するバルーン構造は、調査した全ての組織のヒト胎児上皮及び誘導された腺癌全体にわたり認められた（実施例５を参照）。
【図２３】各々が妊娠９週のヒト胎児脳由来のベル型の核を含む、明るい蛍光を発する合胞体の画像を示す。合胞体は、内胚葉、中胚葉又は外胚葉に由来する他の発生中の組織の場合と同じく、複数の合胞体の凝集体として配置され、複数の凝集体が脳内で非ランダムに分布していることに留意されたい。これらの調製物に蛍光物質は添加しておらず、単に、外科的に摘出し、続いてフォイルゲン試薬で処理した後に、酢酸：エタノールで固定したまでである。
【図２４】Ａ（左上）、個々のベル型の核を示す胎児マウス腸の明視野（蛍光性ではない）の画像を示し、ここではフォイルゲン染色によりＤＮＡを紫色に着色し、ベル型構造を核として同定する。Ｂ（中央上）、図２４Ａ（左上）と同じ視野を示すが、ここでは各ベル型の核を包み込む明るい蛍光を示す。これらの調製物に蛍光物質は添加しておらず、単に、外科的に摘出し、続いてフォイルゲン試薬で処理した後に、酢酸：エタノールで固定したまでである。Ｃ、（右上）図２４Ａ／図２４Ｂ（左上、中央上）と同じ視野を示すが、ここでは重ね合わせた画像を示し、ベル型の核は合胞体中に収まっていることが示される。これらの調製物に蛍光物質は添加しておらず、単に、外科的に摘出し、続いてフォイルゲン試薬で処理した後に、酢酸：エタノールで固定したまでである。Ｄ、（左下）胎児マウス脳における非対称な無糸核分裂により球形の核を生じるベル型の核の位相差画像を示す。Ｅ、（中央下）胎児マウス筋肉に由来する培養細胞株における非対称な無糸核分裂により球形の核を生じるベル型の核の画像を示す。フォイルゲン染色によりＤＮＡを紫色に着色し、透過照明により、すなわち蛍光顕微鏡法を用いることなく標準的な顕微鏡法で観察したとき、ベル型構造を核として同定する。Ｆ、（右下）蛍光性合胞体の凝集体を示し、ここでは発生中の胎児マウス器官においてベル型の核をフォイルゲン試薬によって紫色に染色する。
【図２５】Ａ、（左上）ヒト１２週胎児の小腸における、明るい蛍光を発する合胞体を示し、各々が、合胞体の凝集体を形成する複数のベル型の核を含む。これらの調製物に蛍光物質は添加しておらず、単に、外科的に摘出し、続いてフォイルゲン試薬で処理した後に、酢酸：エタノールで固定したまでである。Ｂ、（右上）ヒト１４週胎児の小腸における、低倍率で見ることのできる明るい蛍光を発するバルーン状構造を示す。これらの調製物に蛍光物質は添加しておらず、単に、外科的に摘出し、続いてフォイルゲン試薬で処理した後に、酢酸：エタノールで固定したまでである。個々の蛍光性構造の画像の強度及び鮮明度は、幹細胞の存在についての組織及び腫瘍調製物の自動走査、並びにそれらの計数を可能にするのに十分である。
【図２６】Ａ、（左）対称な核分裂を行う多核合胞体内の胎児組織の個々のベル型の核を示す明視野（蛍光ではない）のより高倍率の画像（ｍａｇｅ）を示し、ここではフォイルゲン染色によりＤＮＡを紫色に着色し、ベル型構造を核として同定する。Ｂ、（右）図２６Ａ（左）と同じ視野を示すが、ここでは各ベル型の核を包み込む明るい蛍光を発する物質を示す。アクチン・ミオシンのサルコメア構成の正確な離間距離で合胞体の壁にある線により、合胞体の壁が収縮要素を含むものとして同定されることに留意されたい。合胞体の蛍光画像の強度及び鮮明度は、自動でスライドを走査して前記合胞体を検出するのに十分である。これらの調製物に蛍光物質は添加しておらず、単に、外科的に摘出し、続いてフォイルゲン試薬で処理した後に、酢酸：エタノールで固定したまでである。
【図２７】Ａ、（左）１４週ヒト胎児の発生中の小腸におけるベル型の核に密接に関連するバルーン状構造の強い蛍光（緑色）を示す高解像度画像を示す。Ｂ、（右）１４週ヒト胎児の発生中の小腸における非対称な無糸核分裂を行っているベル型の核に密接に関連するバルーン状構造の強い蛍光（緑色）を示す高解像度画像を示す。誘導される「弾丸型」の核は、この段階では蛍光性バルーン状構造に被包されていることに留意されたい。
【図２８】本明細書に記載されるとおりインビトロで培養し、且つ同様に本明細書に記載されるとおり染色及びフォイルゲン染色法による固定を行ったＨＴ２９ヒト結腸腺癌細胞系の写真である。標準的な透過光学顕微鏡法による培養ＨＴ２９細胞の顕微鏡画像と、細胞の同じ視野を蛍光顕微鏡法を用いて観察したものとが示される。ベル型の核を有する細胞の蛍光性バルーン状構造は、合計で約１〜１０×１０−４個のＨＴ２９細胞に見られる。
【図２９】本明細書に記載されるとおり培養及び染色したＨＴ２９の高解像度写真である。左の写真は標準的な透過顕微鏡法による細胞を示し、核の紫色の染色を示す（ベル型の核に留意されたい）。右の写真は、同じ細胞を蛍光顕微鏡法を用いて観察したものである。見て分かるとおり、バルーン状構造の強い蛍光（緑色）は、異型核細胞のＨＴ２９細胞のベル型の核と密接に関連しているが、それとは別個のものである。
【図３０】本明細書に記載されるとおり培養及び染色したＨＴ２９の高解像度写真である。左の写真は標準的な透過顕微鏡法による細胞を示し、核の紫色の染色を示す（ベル型の核に留意されたい）。右の写真は、同じ細胞を蛍光顕微鏡法を用いて観察したものである。見て分かるとおり、バルーン状構造の強い蛍光（緑色）は、異型核細胞のＨＴ２９細胞のベル型の核と密接に関連しているが、それとは別個のものである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、独特のベル型の幹細胞核を含む異型核幹細胞及び合胞体が、一般的に用いられるフォイルゲン試薬中に存在するシッフ塩基フクシンなどの試薬で処理することにより、固定した外科的標本及び細胞培養物において強い蛍光を発するようになるという、予期せぬ発見に関する。前記蛍光は、外部からの、又は外因的に加えられた蛍光色素の不在下で生じるため、これは、外科的試料中の腫瘍幹細胞に対するような自動走査におけるバックグラウンド蛍光の難題を被ることがない。これらの幹細胞及び合胞体は、胎児消化管（５〜７週）、結腸腺腫、及び腺癌の全てに存在し、成体の結腸の正常な（非腫瘍性の）上皮陰窩にはほとんど認められない。これらの「異形核形態型」（例えば、成体器官における通常の回転楕円形又は卵形の細胞核と異なる核形態型）は胎児組織で観察され、成体組織ではそれほど観察されなかった。注目に値する核形態型の一つは、中空のベルのような形状の核を有する（高さが約１０〜１５ミクロン及びベル口の直径が約７〜１２ミクロン）。これらのベル型構造は、２つの紙カップの分離に似た無糸分裂過程によって対称的に分裂する。
【００２６】
特に、本明細書に記載されるとおり、物理的にバルーン状細胞質構造に関連するベル型の核は、酢酸：エタノールで固定した標本を、フォイルゲン試薬中に存在する非蛍光性のシッフ塩基フクシンで処理すると（外部からの、又は外因的に加えられた蛍光色素の不在下で）強い蛍光を発するようになる。さらに、幹細胞核（例えば、ベル型の核）を含む合胞体もまた、固定及びフォイルゲン試薬で処理する同じプロセスを経ると、蛍光を発する。これらのバルーン状細胞質構造及び合胞体は、ハロゲンランプにより送られる光で励起すると蛍光を発することが認められた。蛍光は、何らかの原子及び分子の、特定の波長の光を吸収し、続いてより長い波長の光を放出する特性である。ベル型の核を含むバルーン状細胞質構造及び合胞体が（外部からの、又は外因的に加えられた蛍光色素の不在下での）蛍光を発するという観察により、ベル型の核を有する細胞を高速で同定することが可能となる。従って、これらの幹細胞／合胞体の蛍光特性により、組織試料（例えば、新生物性のもの、前新生物性のもの）又は組織試料の発生段階（例えば、胎児期）を特徴付けるのに有用な方法でそれらを検出することがが可能となる。
【００２７】
本明細書に記載されるとおり、蛍光性の幹細胞又は合胞体とは、外部からの、又は外因的に加えられた蛍光色素の不在下で蛍光を発する幹細胞又は合胞体である。幹細胞を含む蛍光性合胞体は、固定のみを行った後の（例えば、カルノア固定液；３：１メタノール−氷酢酸；６：３：１エタノール−クロロホルム−酢酸；３：１エタノール−酢酸；及び同様のものを使用）、特定の自己蛍光程度によって検出することができる。蛍光性の幹細胞及び合胞体は、固定を行い（例えば、カルノア固定液；３：１メタノール−氷酢酸；６：３：１エタノール−クロロホルム−酢酸；３：１エタノール−酢酸；及び同様のものを使用）、さらに非蛍光試薬（例えば、シッフ試薬、フォイルゲン染色、フクシンなど）で染色した後の強い蛍光によって検出することができる。このように、一実施形態において、カルノア試薬で固定したときの妊娠第４週〜第１３週前後のヒト器官における、及びヒト腫瘍の、ベル型の核を含む管状合胞体は、外部からの、又は外因的に加えられた蛍光色素の不在下で中程度の蛍光を示す。さらなる実施形態において、カルノアで固定し、さらにフォイルゲン試薬で染色した妊娠第４週〜第１３週前後のヒト器官における、及びヒト腫瘍の、ベル型の核を含む管状合胞体は、強い蛍光を示すベル型の核を有する管状合胞体をもたらす。別の実施形態において、ベル型の核が付着する大型のバルーン型細胞質実体は、単にカルノア固定だけでは蛍光を発しないが、しかしフォイルゲン染色法で反応させると、バルーン型細胞質は極めて強い蛍光を発する。前記強い蛍光を発するバルーン型細胞質は、５週目以降の発生中のヒト器官において観察されており、１２週目〜１４週目には、ほぼ全ての実体がベル型の核を含む。これはまた、結腸ポリープなどのヒト前新生物病変及び広範な種類のヒト腫瘍にも当てはまる。
【００２８】
ベル型の核が特定の発生段階、例えば胎児組織の指標となる場合に、ベル型の核に関連するバルーン状構造及び／又は合胞体を、例えば、外部からの、又は外因的に加えられた蛍光色素の不在下でその蛍光を検出することによって同定すると、それは特定の発生段階の指標にもなり得る。或いは、解剖学的位置及び質量に基づき腫瘍形成能を有することが疑われる病変部の生検について、ベル型の核に関連するバルーン状構造／合胞体の検出は、新生物形成又は前新生物形成の指標となる。
【００２９】
加えて、ベル型の核を有する細胞は、非対称に分裂して、同じ胎児器官、前新生物病変又は新生物病変においていくつかの他の型の核形態型を生じることが観察されているため、こうした細胞は多能性である。多能性は幹細胞の顕著な特徴であるため、ベル型の核に関連するバルーン状構造の検出により、幹細胞を同定及び単離するための細胞の高速スクリーニングが可能となる。かかるバルーン状構造によって細胞を検出及び単離する方法、例えば、こうしたバルーン状構造を含む細胞の蛍光性に基づき選別及び単離する方法は、当該技術分野において公知である。このような方法で非新生物性組織から単離された細胞は、例えば再生組織治療及び創傷治癒において、非常に大きい可能性を有する。
【００３０】
上記のベル型の核に加え、少なくとも７種の他の核型が、非対称な無糸分裂でベル型の核から現れることが観察された。こうした派生的核型を含む細胞は、その後有糸分裂によって分裂し、胚、腺腫及び腺癌において同一の核形態型のクローン集団を形成する。従ってベル型の核を有する細胞は、胚消化管、腺腫及び腺癌における正味の成長及び分化の双方に関与し、胎児器官形成及び発癌における発生能を有する多能性幹細胞についての要件を満たす。成体組織に対照されるものとしての胎児／小児組織試料における正味の幹細胞成長及び分化に理論上必要とされる対称な無糸分裂及び非対称な無糸分裂の双方を示す細胞におけるベル型の核の出現の特定の違いにより、顕微組織学／病理学の当業者は、その核形態に従い細胞を幹細胞として、又は非幹細胞として分類することが可能となる。
【００３１】
胎生学及び腫瘍学の双方で共有される概念は、器官及び特定の器官に由来する腫瘍で観察される複数の細胞型が、細胞分裂が２つの同一の前駆体「幹」細胞を生じる対称な細胞分裂による正味の成長と、１つの前駆体「幹」細胞及び１つの分化細胞を生じる非対称な細胞分裂による分化とが可能な前駆体「幹」細胞から生じたことである。この分化細胞は、次にさらなる回数だけ分裂して多数の分化細胞を作り出すことができ、最終的にはそれらが非分裂性の最終段階に達し、それにプログラム細胞死が続く。細胞が２つのより高度な分化細胞に分化するとき、「消滅（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）」分裂が起こる。
【００３２】
用語「幹細胞」は、科学文献において多々の異なるレベルの定義を有する。一般にはこれは、未分化の、又は部分的に分化した表現型を維持するが、しかし特定の状況下では異なる表現型の細胞を生じることができる一群の細胞を含むことが意図される。本明細書に開示される教示を含む科学的観察に基づき、この総称及び本明細書で使用されるより具体的な用語を使用して幹細胞のタイプ間を区別する。
【００３３】
用語「胚性幹細胞」は、本明細書で使用されるとき、通常の有糸分裂によって分裂し、子宮環境に移植されると、完全な胎盤及び胎児を生じることのできる哺乳動物初期胚中の一群の細胞を含む。従ってこれらは、「全能性」として特徴付けられる。かかる細胞はエクスビボで培養することができ、有糸分裂により分裂して、非常に多数の胚性幹細胞を形成する−各々が、胎盤及び胎児を生じる能力を有する。任意の胚性幹細胞が、成長する哺乳動物の胎児、新生児、小児又は成体動物においてそのまま残存するか否かは不明である。成体哺乳動物の組織全体にわたり認められる特定の集団の未分化細胞が、全能性胚性幹細胞のコロニーに相当する可能性がある。核形態型に関して、この型の幹細胞は、ベル型ではない球形又はほぼ球形の核を含む。
【００３４】
用語「胎児性小児性幹細胞」は、本明細書で使用されるとき、妊娠５週目までのヒト胎児並びにヒト前新生物病変、新生物病変及び転移性病変に観察される、ベル型の核を含む一群の細胞及び多核合胞体を含む。本明細書で使用されるとき、「合胞体」は、細胞隔壁のない多核構造である。複数の核が存在するが、それらは膜によって合胞体内で個々の画室に分離されてはいない。胎児性小児性幹細胞は、２つの同一のベル型の核を作り出す対称な核分裂と、１つのベル型の核、並びに組織及び腫瘍試料に観察されるいくつかの異形核形態型のうちの１つの核、例えば、腎臓型、葉巻型、ソーセージ型、楕円形又は球形の核を作り出す非対称な核分裂との双方を行い、続いて有糸分裂により数が増す。ベル型の核の対称な核分裂及び非対称な核分裂の双方とも、一般的なベル型の核中の染色体としてのゲノムの凝縮がない限りにおいて、無糸分裂である。ベル型の核には紡錘体は形成されず、前期、中期、後期及び終期にあるような、一世紀以上にわたって観察され、且つ過去には卵形成及び精子形成の減数分裂を除き哺乳動物細胞（哺乳動物の腫瘍を含む）における唯一の関連する核分裂形式であると考えられていたような染色体の凝縮又は分離はない。対称な分裂により胎児性小児性幹細胞の正味の成長が可能となり、これがおそらく生涯のうち胎児、新生児及び小児の段階にわたる組織及び器官の成長を説明する。胎児性小児性幹細胞の非対称な分裂により代替的な表現型を有する細胞の形成が可能となり、これがおそらく発生中及び成長中の器官の実質を含む分化細胞型を説明する。核形態型が細胞及び／又は核の見分けのつく特徴である限りにおいて、核形態型が異なる細胞は、核形態型以外の特徴とは無関係に、細胞又は核表現型が異なるものとして特徴付けることができる。
【００３５】
用語「再生幹細胞」は、本明細書で使用されるとき、外傷又は疾患によって破壊された組織又は器官の一部分を再生する必要が生じるまで、胎児、小児及び成体組織において休眠状態にある理論上の細胞型を含む。必然的に対称及び非対称の双方であると予想され得る再生幹細胞の分裂が、実際に有糸分裂であるのか、又は無糸分裂であるのかは、不明である。
【００３６】
用語「維持幹細胞」は、本明細書で使用されるとき、規則的な非対称細胞分裂により最初の移行細胞を作り出し、続いてそれが有糸分裂し、最終的にプログラム細胞死することにより、例えば結腸陰窩などの分化細胞組織の分化した代謝回転単位を定義する理論上の細胞型を含む。代謝回転は胎児組織及び小児組織において起こるが、各代謝回転単位の維持幹細胞は、ベル型であるとともに、対称に分裂して新しい胎児性小児性維持幹細胞を作り出し、プログラム細胞死によって失われた小児細胞に置き換わると予想される。成体維持幹細胞の非対称な分裂もまた、分化した移行細胞（非幹細胞）及び新しい成体維持幹細胞を作り出し得る。陰窩の基部の観察される胎児性小児性幹細胞に特徴的なベル型の核をもつ結腸陰窩は、極めて少数しか観察されていないため、胎児性小児性幹細胞核は、生涯のなかで小児器官の正味成長が終わり、成体の段階が始まったことを特徴付ける変態を行うと結論付けるのが妥当である。成体維持幹細胞の非対称な分裂が実際に有糸分裂であるのか、又は無糸分裂であるのかは、不明である。
【００３７】
用語「前新生物幹細胞」は、本明細書で使用されるとき、腺腫様の結腸陰窩の基部に認められる観察されるベル型の核を含む単核細胞を表す。これらの細胞は、同一の核形態型の細胞の小さい凝集体と、かかる凝集体の大きい集団であって、その集団を形成する各凝集体が同じ形態型の核を含み、異なる凝集体は異なる形態型の核を含む集団と、結腸の前新生物病変の小領域とにおいて観察される。これらの細胞は、「ショルダー・ツー・ショルダー」関係で並んだ核を有し得る。ヒト結腸の前新生物病変ではベル型の核を含む合胞体は観察されておらず、また対称な核分裂においても個々のベル型の核は観察されておらず、これは、前新生物病変の成長が、そうした病変が由来する小児組織の成長速度、すなわち約６〜９年の倍増時間に近く緩徐であることと一致するものとして解釈される条件である。
【００３８】
用語「新生物幹細胞」又は「腫瘍幹細胞」は、本明細書で使用されるとき、癌性腫瘍、例えばヒト結腸の腺癌、結腸腫瘍の転移並びにヒト膵臓、肺、胸部及び卵巣の腫瘍に認められるベル型の核を含む。こうした新生物幹細胞は、それらが前新生物形成で観察される多細胞凝集体の全てに存在する点で前新生物幹細胞と区別されるが、加えて、多核の管状合胞体にも認められる。新生物幹細胞は合胞体の内部及び外部の双方において無糸核分裂を対称な「カップ・フロム・カップ」過程で行うとともに、ベル型の核から異形核が現れるように非対称に行うことが観察される。腫瘍に認められる合胞体は、初期の胎児消化管組織で観察されるものほど広範囲には及ばないが、対称な核分裂を行う合胞体及びベル型構造は、前新生物組織と新生物組織とを明確に区別する特徴であるように思われる。
【００３９】
本明細書に記載される異形核形態型はまた、例えば、組織試料又は培養下で成長する細胞に由来する細胞及び合胞体にも認めることができる。本発明に記載される方法は、任意の組織試料に適用して、異形核形態型を有する細胞又は合胞体を同定することができる。特に、腫瘍組織試料を使用すると、異形核形態型を同定及び計数することができる。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、「腫瘍」は、キャリアに有益な生理学的機能を何ら果たさない細胞の進行性の増殖によって生じる異常な組織成長を指す（「新生物」とも称される）。「良性」腫瘍は、発生部位に限定された、周囲組織に浸潤しない腫瘍である。悪性腫瘍は、周囲組織の浸潤及び転移によって展開することができ、又は実際に展開するものであり、一方、良性腫瘍は浸潤も転移もしない。本明細書で使用されるとき、「新生物性の」は、良性か、又は悪性かにかかわらず、急速な正味細胞成長によって致死的な腫瘍を生じる細胞状態を指す。新生物細胞は腫瘍に至り、但し必ずしも浸潤性又は転移性の腫瘍とは限らない。「癌」は、生体機能を妨害することによって死をもたらす１つ又は複数の細胞コロニーが急速に成長する疾患を指す。癌細胞は、原発腫瘍から離脱してリンパ管及び血管に浸透し、血流中を循環して、体内の別の場所にある正常な組織の新しい部位で成長（転移）することができる。
【００４１】
本明細書で使用されるとき、「前癌状態」は、検査しないままであれば癌（例えば、新生物の腫瘍）を生じる可能性がある、緩徐に成長するコロニーとして特徴付けられる。この状態は、例えば、結腸におけるポリープ又は成体組織試料中のベル型の核の存在などの、１つ又は複数の異常な微小解剖学的構造によって特徴付けられる。
【００４２】
「正味の幹細胞成長速度」は、組織、器官又は生体の正味の成長の要因となる対称な胎児性小児性幹細胞分裂の速度（単位時間当たりの分裂）である。一般に、幹細胞の正味の成長速度は、胎児、新生児及び小児の時期を通じて生体の発達が増すほど低下し、成体ではゼロになる。
【００４３】
腫瘍は、例えば結腸腺癌における結腸陰窩などの複雑な多細胞構造の形成を含め、腫瘍が由来する成体の器官／系の特徴の多くを呈する。腫瘍が、正味の成長と分化との双方の能力を有した単一の前駆細胞に由来している限りにおいて、「腫瘍幹細胞」が存在し、器官特異的幹細胞（特定器官の細胞及び組織を生じることが可能な部分的に未分化の細胞）の多くの特徴を共有しているに違いないと判断されてきた。例えば、白血病を生じる骨髄の細胞の場合、特定の抗原は、移植時に完全な血球細胞系を生じることが可能な１個又は少数の細胞を含む骨髄細胞の部分的集団の同定を可能にすることが認識されている。同様に、腫瘍細胞の一部は、何らかの腫瘍細胞によって発現する特異的な抗原によって認識され得る。この論理に従えば、このように認識される部分的な集団中のある細胞は、腫瘍細胞の混合物を実験的に移植したとき、新しい分化した腫瘍を生じる。この論法で進めれば、かかる抗原を発現する部分集団中に「器官特異的幹細胞」及び「腫瘍幹細胞」が存在する。それらの抗原は、少なくとも１個の多能性幹細胞を含む細胞集団の同定及び単離に用いられるが、幹細胞としては機能することのできない大多数の細胞もまた同定することになる。単離されたそれらの集団のいずれの細胞も、真の幹細胞又は器官及び腫瘍の「標語」と見なされる非対称な細胞分裂を行うことは認められていない。
【００４４】
本明細書には、実際に「器官特異的幹細胞」又は「腫瘍幹細胞」である、かかる細胞が豊富な器官又は腫瘍の一部分に対照されるものとしての細胞を同定する方法が提供される。この同定は、本明細書に記載される蛍光性及び異形核形態型及び核の分裂及び／又は配置に基づく。これらの方法によれば、かかる幹細胞を単離し、その特定の生化学及び分子生物学を見出すことが可能となり、ここでの目標は、器官再生を可能にする細胞の単離、前癌病変の成長の阻害及び／又は腫瘍の成長及び治療の試行後の再発に特異的に関与する細胞の死滅である。蛍光性バルーン状構造がベル型の核と関連付けられることで、適当な波長の光で励起することにより構造それ自体が蛍光を発するため、例えば、外因性の発蛍光団の不在下での幹細胞の同定及び単離が可能となり得る。
【００４５】
かかる器官特異的幹細胞及び腫瘍幹細胞は、胎児器官、腫瘍及び腫瘍転移において、過去に報告されたことのない、顕微鏡で見ることのできる２つの特異的な核分裂形式のクラスとして関与していることにより、さらに同定される。これらの２つの核分裂形式のうちの第一のものでは、一般的な染色体の凝縮及び有糸分裂装置の形成がない；代わりに１個のベル型の核が、２つの紙カップの分離と同じようにして、同一のベル型の核を生じるように見える。この対称な無糸分裂により、胎児及び腫瘍試料において幹細胞の正味の成長がもたらされる。第２の幹細胞に特異的な核分裂形式でも同様に、一般的な染色体の凝縮及び有糸分裂装置の形成がない；代わりに１個のベル型の核が、ベル型の核と、胎児組織及び腫瘍試料（ｓａｍｐｌｅｒ）において観察されるいくつかの核形態型のうちの１つを有する核の核（図３）を生じるように見える。しかしながら、非対称な核分裂によって現れる異形核により、有糸分裂前期において観察され得るのと同じように、染色体組が凝縮した。この非対称な無糸分裂が、胎児組織及び腫瘍において幹細胞による分化細胞の形成をもたらす。ベル型の核のない核の有糸分裂は、胎児組織及び腫瘍試料において、かかる試料中の全ての細胞の大多数を作り出すことが観察される。従って、この幹細胞の同定方法により、器官特異的幹細胞及び腫瘍特異的幹細胞として分類するのにいずれも必要な、対称な核分裂及び非対称な核分裂の双方を行うベル型の核を有する細胞を、直接観察することが可能となる。
【００４６】
かかる器官特異的幹細胞及び腫瘍幹細胞は、胎児器官、腫瘍及び腫瘍転移において、一組の積み重ねたカップのようにヘッド・ツー・トウの関係で保持された一連の別個の紙カップに似た方式で、ベル型の核が中に規則的に整列している長い管に似た、過去に報告されたことのない特異的な多核構造のクラスとして関与していることにより、さらに同定される。
【００４７】
これらの幹細胞に特異的な核形態型（ベル型）、特異的な核分裂形式（対称及び非対称な無糸核分裂）、及び多核構造への特異的な関与形態（長い多核の管）は、本質的に成体器官には存在しない。しかしながら、幹細胞に特異的な核形態型は前新生物病変の細胞中に観察され、及びまれに、単一の核として、成体器官に広く分散している（例えば、成体結腸陰窩の２００万個の核のうちベル型の核であるのは、１個よりやや少ないことが認められている）。
【００４８】
このような異形核形態型、及び幹細胞と正常な成体組織と腫瘍組織とにおけるそれらの出現の違いという予期せぬ発見から、当業者は、細胞をその蛍光又は核形態に従い分類することが可能となる。加えて、幹細胞を、その蛍光又は核形態に基づき単離することができ、抗腫瘍形成薬剤を、腫瘍に特異的な形態型の出現又は消失に基づき選別又は同定することができ、及び組織試料を、その組織の細胞中に存在する蛍光又は形態型を決定することによって分類（例えば、正常又は異常；新生物又は非新生物）することができる。この細胞分類の結果として、個々の潜在的な前新生物又は新生物病変が癌病変又は前癌病変であるか否かに関する診断を行うことができる。特定の方法によりこうした幹細胞の視覚化が可能であるが、蛍光又は核形態型の同定及び評価が可能な任意の方法が、細胞、組織及び試料の分類、並びに続く疾患の診断に好適であるとともに、抗腫瘍形成薬剤（例えば、腫瘍形成細胞の成長を阻害又は低減するのに有効な薬剤）の同定に用いられるアッセイの基礎も提供する。かかる方法としては、限定はされないが、位相差顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、二電子又は二波長顕微鏡法、ベル型の核に関連する蛍光性の構造／合胞体の直接検出、及び小角散乱フローサイトメトリーが挙げられる。
【００４９】
本発明の目的から、以下の実施例に記載されるとおり顕微鏡観察用として正常な成体ヒトの結腸上皮、結腸腺腫、結腸腺癌、及び胎児消化管の約０．５ｍｍ厚切片を調製した。組織シート層の厚さは、少なくとも一無傷細胞の厚さ（且つその細胞の単なる一切片又は一薄片ではないもの）でなければならない。全ての試料において、図１に要約されるとおり、一連の大きい回転楕円形及び非回転楕円形の核型が見られた。試料は全て、成体結腸陰窩の組織切片に通常観察される回転楕円形及び卵形の核を含んでいたが、過去に報告されたことのない特異な核形態型もまた含んでいた。胚組織は、ベル、先細になった葉巻、インゲンマメ、ソーセージ及び小さい球のような形状の核を含んでいた。正常な成体結腸陰窩は、時に陰窩基部にベル型の核を含んでいたが、圧倒的多数は大きい球及び卵形の構造であった。見方によっては、陰窩基部近傍の細胞核は「円板状」ともいえるように思われる。腺腫及び腺癌では、核の形状としては、回転楕円形及び卵形の核に加え、先細になった葉巻及び「弾丸型」と称される端部が噛み切られた葉巻のように見える別の形が含まれた。
【００５０】
陰窩構造を調製手順により保存し、それらは正常な結腸、腺腫及び腺癌において明確に観察された。用いた約０．５ｍｍの試料切片は、観察された最大の核型である長さ約４０ミクロンのソーセージ型よりはるかに厚かった。４ミクロンの「凝縮した球形の核」を除く全ての核構造が、病理学的評価で通常用いられる５ミクロン切片より長い少なくとも１本の内部軸を有した。さらに、核の間には、「ベル型」又は「葉巻型」等として分類することのできる相当な程度の形態学的変型があり、独立した系統及び生理機能が示唆される。
【００５１】
本明細書に記載されるベル型の核、それらの対称及び非対称な無糸分裂形式、又は成体組織、前新生物組織、新生物組織及び胚組織における一纏まりの核形態型といった現象は、これまで報告されていない。胚及び腺癌において直線的に配列されたベル型の核が管に包み込まれることもまた、一見したところでは新規の観察である。過去にこれらが観察されていない理由は、標準的な組織学的実施技法と、本明細書で使用及び開示される実施技法との違いにあり得る。２つの明白な手順上の違いが明らかである。第一に、固定する組織は全て、外科的に摘出してから短時間の間に（例えば、３０分以内に）薄切りし、固定した。慎重に組織を調製すれば分解は防ぎ得るものの、調製物は、３０分経つと核型の分解を示し始め得る。第二点目は、医科病理学で実践されている薄い切片の手順と、本明細書に開示される厚い切片の固定プロトコルとの違いである−こうした核の形状を維持する構造／状態を、後者は保存し、前者は一見したところでは破壊する。
【００５２】
無糸分裂は、現象としては、数多くの原生動物及び原始的後生動物において報告がなされている（Ｏｒｉａｓ，Ｅ．，１９９１，Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ．，３８：２１７−２２１；Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，Ｄ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：１３６−１４０）。しかしながら、核に割れ目が形成され、２つの別個のほぼ等しい核にちぎり分けられることによって原生動物の無糸核分裂が起こる限りにおいて、それらの無糸分裂は本明細書で報告されるものとは異なった（Ｆｕｊｉｕ，Ｋ．及びＮｕｍａｔａ，Ｏ．，２０００，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌ．Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，４６：１７−２７）。しかしながら、原生動物で見られるものと同様の種類の無糸分裂が、多数の様々な腫瘍において報告されている（Ｏｋｕｙａｍａ，Ｓ．１９９１，Ｔｏｈｏｋｕ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６４：２４７−２４９；Ｏｋｕｙａｍａ，Ｓ．，１９９２，Ｔｏｈｏｋｕ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６８：４４５−４４８；Ｅｌｉａｓ，Ｈ．及びＦｏｎｇ，Ｂ．，１９７８，Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．，９：６７９−６８４；Ｅｌｉａｓ，Ｈ．及びＨｙｄｅ，Ｄ．，１９８２，Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．，３：６３５−６３９）。
【００５３】
有糸分裂細胞の前期初期核における染色体の配置が間期核の形状を維持することを示す観察もまた、注目に値する。種々の染色体が、細胞の表現型の決定に大きい影響を及ぼし得る高度に構造化されたモザイクを形成するものと思われる。間期核における染色体の空間的配置と細胞の生理機能との間の関係は、盛んに調査されている領域である（Ｍｉｓｔｅｌｉ，Ｔ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１：８４３−８４７；Ｔｈｏｍａｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１９７２−１９７７；Ｐａｒａｄａ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２９６：６４−７０）。
【００５４】
以下に引用する観察に基づけば、ベル型の核を有する細胞は、例えば結腸直腸腫瘍、腺腫及び腺癌などの、発達及び成長する腫瘍及び前新生物病変の発生能を有する細胞に相当する多能性細胞である。従って、蛍光及びベル型の核形態型は多能性幹細胞の指標であり、成体組織試料における前新生物及び新生物組織についての診断基準として用いることができる。加えて、ベル型の核の（例えば、管状構造又はクモの巣様構造への）組織化が、腫瘍発達（例えば、新生物形成性又は転移性の腫瘍）の進行のさらなる指標となり得る。
【００５５】
ベル型の核の多能性は、非対称な無糸分裂においてベル型の核から現れる複数の核型の画像により実証される。卵型、ソーセージ型、腎臓型、弾丸型及び葉巻型の核がベル型の核から現れて観察され、他の核型は観察されない限りにおいて、それらの核は、それらが存在している組織の持続に必要な一群の機能に相当する。実際には、観察されるベル型の核における形態学的な変型により示唆されるとおり、ベル型の核を有する細胞型は複数あり得る。
【００５６】
ベル型の核を有する細胞の数及び対称な無糸分裂の頻度は、この仮説の発生能を有する要素と一致する。それらは胎児において多数観察され、新生物形成のない正常な成体結腸にはほとんどなく、数立方ミリメートルの腺腫には少数（例えば、約１，０００個）、及び数立方センチメートルの腺癌には多数（例えば、約１，０００，０００個未満）存在する。胎児及び腺癌におけるそれらの分裂速度は１年に約２０〜３０回の分裂であると推定され、結腸腺癌の正味の成長速度の推定と一致する（Ｈｅｒｒｅｒｏ  Ｊｉｍｅｎｅｚ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，４００：５５３−５７８）。腺腫におけるそれらの対称な無糸分裂の割合は１／１０００未満であり、これまでいずれも確認されていない。このネガティブな観察は、本質的に重要である。ヒト結腸前新生物病変における発生能を有する細胞又は「プロモーションのリスクがある細胞」についての細胞分裂の頻度は、計算上、およそ６〜９年に１回であると推定されている（Ｈｅｒｒｅｒｏ  Ｊｉｍｅｎｅｚ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，４４７：７３−１１６；Ｇｏｓｔｊｅｖａ，Ｅ．Ｖ．及びＷ．Ｇ．Ｔｈｉｌｌｙ，２００５，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２：２４３−２５２）。無糸分裂が３時間にわたり認識され得ると仮定すれば、６／１００，０００未満の頻度が予想されることになる。このように、腺腫の対称な無糸分裂が極めて低速であることは、結腸の前新生物形成における発生能を有する細胞についての予想と一致する。
【００５７】
ベル型の核を有する細胞は、小児成長の終わりに徐々に消失する可能性がある。幼児期初期に網膜芽細胞が網膜細胞に徐々に導入され、網膜芽細胞腫遺伝子ヘテロ接合体における網膜芽細胞腫のリスクを取り除く（Ｋｎｕｄｓｏｎ，Ａ．，１９７１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６８：８２０−８２３）。ＡＰＣなどの遺伝子の突然変異による結腸腫瘍の「惹起」が、この徐々に消失するプロセスを妨げることがあり得る。その場合、ベル型の核が新生児及び小児の結腸陰窩の基部に認められるはずである。
【００５８】
胚組織及び発癌組織におけるベル型の核の出現から、胚発生と発癌との関係を推論することができる。癌の研究者らは、１世紀以上にわたり、腫瘍が胚の特徴を反映すると考えてきた。Ｅｒｅｎｐｒｅｓｉａ，Ｊ．及びＨｅｌｍｔｒｕｄ，Ｉ．（１９９９，Ｍｅｃｈ．Ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，１０８：２２７−２３８）は、成体組織に不適切に遺残する胚組織又は胎児細胞から腫瘍が生じるという最初の仮説として、Ｊ．Ｃｏｈｎｈｅｉｍ（１８７５，Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ．，６５：６４；１８７７−１８８０，Ｖｏｒｅｌｅｓｕｎｇｅｎ  ｕｂｅｒ  ａｌｌｇｅｍｅｉｎｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ．Ｅｉｎ  Ｈａｎｄｂｕｃｈ  ｆｕｒ  Ａｒｔｚｔｅ  ｕｎｄ  Ｓｔｕｄｉｅｒｅｎｄｅ．Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｉｒｃｈｓｗａｌｄ  １  ２  ６９１Ｓ）を引用した。腫瘍において癌胚性抗原が発現すること、並びに胚及び／又は胎児にも同様に認められる広範な遺伝子産物、ｍＲＮＡ及びタンパク質が腫瘍に出現することにより、発癌には胚及び／又は胎児の定性的特徴を有する細胞の出現が関与するという広義の仮説が強化されている。多くの執筆者は、胚（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）と胎児（ｆｅｔａｌ）という用語を、１９世紀の独国の病理学者の多義的な翻訳を含め、同義的に用いていることに留意しなければならない。（本明細書では、我々はこの胚／胎児の境界を、有糸分裂の胚性幹細胞から、ベル型の核を有する無糸分裂の胎児性幹細胞への移行として、正確に記述する）。腺癌及び胎児結腸における型、無糸分裂及び有糸分裂の挙動が本質的に同一の形態学的細胞型の知見から、用語上、「癌胚性（ｃａｒｃｉｎｏ−ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）」仮説を「癌胎児性（ｃａｒｃｉｎｏ−ｆｅｔａｌ）」仮説と、Ｃｏｈｎｈｅｉｍに一層厳密に従い、且つ腫瘍幹細胞の存在を示すより最近の議論及び実験による実証を用いるように、より特定する形で言い換えることが求められる（Ｐａｒｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．，３：８９５−９０２）。
【００５９】
これらの新しい観察は、癌研究の本筋及び過去１３０年間の考えに組み込むと、最も発症が遅い（成体）結腸腺腫及び腺癌の起源及び特徴に関する単純な仮説を示唆する：腫瘍を惹起する突然変異、例えばＡＰＣ遺伝子の不活化が、ベル型の核を有する細胞において、その細胞型が小児期の途中又は終わりに徐々に消失する前に起こる。ベル型の核を有するかかる惹起された細胞は、単純に、小児の場合と同じ速度で分裂し続け、新しい結腸陰窩を作り出し得る（Ｈｅｒｒｅｒｏ  Ｊｉｍｅｎｅｚ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，４００：５５３−５７８；Ｈｅｒｒｅｒｏ  Ｊｉｍｅｎｅｚ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，４４７：７３−１１６）。結果として生じる局所的な密集が、「ポリープ」を作り出す。さらなる１つ若しくは複数の遺伝的変化（遺伝子刷り込みを含む）によって能動的に、又は成長する腺腫内で起こる生化学的変化によって受動的に、ベル型の核を有する単細胞が初期の胎児状態に戻るとともに、胎児の場合と同じく、胎児組織とほとんど区別のつかない急速に成長する一連の細胞を生じる。治療しないままこの成長が続くと、結腸閉塞及び／又は転移及び死亡に至る。
【００６０】
最も一般的な意味において、これらの観察からは発癌の高度に秩序立った性質が指摘され、そこでは、緩徐だが一定した小児の成長速度を保存している腺腫、並びに胎児の器官形成中に観察される細胞型と成長速度との秩序立った組み合わせを再現する腺癌における明確に非カオス的な挙動が観察される。既存の生物学的な型が、無数の退化した候補から選択されている（「あらゆる組み合わせを試行して」）という意味では、ヒトにおける発癌が、まれではあるが単純な小児成長の停止の失敗、及びそれに続く秩序立った胎児細胞状態へのまれな逆戻りに相当し得ることは、意外なことではないのかもしれない。
【００６１】
これらの観察は、ベル型の核を有する細胞が、より特異的な、従ってより効果的な形の腫瘍予防及び治療の標的となり得ることを示唆している。前新生物コロニーの正味の成長速度を５０％下げることができたならば、発症が最も遅い癌タイプは、人間の１００年の寿命中には出現しないであろう（Ｈｅｒｒｅｒｏ  Ｊｉｍｅｎｅｚ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，４００：５５３−５７８；Ｈｅｒｒｅｒｏ  Ｊｉｍｅｎｅｚ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，４４７：７３−１１６）。異形核形態型、例えばベル型の核を有する細胞は、結腸の腺腫及び腺癌においては腫瘍幹細胞であると考えるのが妥当であり、ＤＮＡの合成及び分離においてその特異的な特徴を付与する、正味の成長の対称な分裂における、又は有糸分裂によって分裂する細胞を提供するとともに腫瘍塊の大部分を提供する非対称な分裂における機序を標的とし得る。これらの細胞型又は管に包み込まれたベル型の核は異なる生化学的規則に従い機能すると思われ、それらはまた、理解されたならば、腫瘍の予防及び／又は治療にも利用される可能性があるものと思われる（例えば、胚／胎児、成体器官及び癌組織の間でミトコンドリアの生化学が著しく異なることを発見したＯｔｔｏ  Ｗａｒｂｕｒｇの知見を参照のこと）（Ｗａｒｂｕｒｇ，Ｏ．，１９５６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２３：３０９−３１４；Ｗａｒｂｕｒｇ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，１９６０，Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ  Ｂ．，１５Ｂ：３７８−３７９）。
【００６２】
無脊椎動物に関する基礎テキストを参照すると、繊毛原生動物のなかで大きいソーセージ型の核が存在することが分かり、例えば縁毛類（ｐｅｒｔｉｒｉｃｈ）のツリガネムシ属（Ｖｏｒｔｉｃｅｌｌａ）及び異毛類の「ラッパムシ属（Ｓｔｅｎｔｏｒ）は、数珠つなぎのビーズ鎖に似た顕著なタイプの大型核を有する．．．」（Ｂｕｃｈｓｂａｕｍ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９７１，Ａｎｉｍａｌｓ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｂａｃｋｂｏｎｅｓ，第３版，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｃａｇｏ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）。このような核変態の特徴は、進化の時間において有酸素以前の環境を生き残った細胞の生化学と関連付けることさえ、新血管新生が起こる前には酸素不足であると予想され得る局所環境にある発達中の器官、腺腫及び腺腫においてそれらが成長するように見える限りにおいては、可能である。アミノ酸が胎児及び腫瘍におけるＡＴＰ生成についての酸素還元等価物を提供することを示すＷａｒｂｕｒｇの発見は、酸素を制限栄養塩として処理する表現型の選択を示唆している。
【００６３】
従って異形核形態型（例えば、ベル型の核）は、進化生物学、器官形成及び発癌を結び付ける３重の生理学的関連性を表すように見える。ここで、減数分裂及び有糸分裂の遺伝的サイクルには、受精後の期間の有糸分裂と、動物の細胞塊のほとんどを作り出す有糸分裂と間に、直系遺伝の対称及び非対称な無糸分裂の段階が追加されるべきである。
【００６４】
本発明は、特に、蛍光、核形態、対称及び非対称な無糸分裂へのその関与及び多細胞凝集体におけるその関連性に基づいて細胞型を分類する方法に関する。例えば、哺乳動物から採取された組織試料は、外部からの、若しくは外因的に加えられた蛍光色素の不在下における蛍光性バルーン状細胞質構造の、又は異形核形態型（例えば、ベル型の核、葉巻型の核及び弾丸型の核）を含む合胞体の存在又は不在に基づき分類することができる。図１に示されるとおり、異形核形態型は種々の発達段階に存在し、また種々の腫瘍発達段階においても存在する。例えば、ベル型の核は胎児試料に認められ、成体試料ではほとんど認められず、腺腫及び腺癌試料では広く認められる。これは、異形核形態型を用いて胎児性小児性幹細胞並びに成体組織における新生物幹細胞を同定することができるという概念の裏付けとなる。これらの結果は、これまで文献に記載されたことのない胎児幹細胞と癌幹細胞との間の関係付けを実証している。従って、胎児において胎児性小児性幹細胞の指標となる異形核形態型は、同時に成体組織においては癌幹細胞の指標となる。
【００６５】
加えて、図２Ａ〜図２Ｃは、異形核形態型が管状構造内に整列することを示す。これらの管状構造は胎児試料中に存在し、且つ異形核形態型（例えば、ベル型の核、葉巻型の核及び弾丸型の核）を含むため、管状構造それ自体を、胎児性小児性幹細胞又は成体組織における新生物（例えば、腫瘍又は癌）幹細胞の指標として用いることができる。
【００６６】
或いは、図５Ａ〜図５Ｅに示されるとおりの異形核形態型が合胞体状に配列することは、腺腫と腺癌との違いの指標となる。従って、組織試料における多核構造中の核形態型の配置を用いることで、種々の病期にある新生物試料を区別することができる。
【００６７】
異形核形態型は他の成体組織及び腫瘍試料（例えば、肝臓）において観察されているため、当業者は、任意の成体組織における異形核形態型の存在に基づき前新生物又は新生物病変を認識し得る。
【００６８】
本発明はまた、幹細胞／合胞体の増殖を阻害する薬剤及び抗腫瘍形成薬剤を、固定及びフォイルゲン試薬中に見られるフクシンなどの好適な非蛍光試薬による処理後のその強い蛍光、蛍光の出現又は消失によって、すなわち外部からの、又は外因的に加えられた蛍光色素の不在下で同定される異型核幹細胞の数を減少させる、又はその数の増加を遅延させる前記薬剤の効果に基づき同定する方法にも関する。異型核幹細胞のこの同定方式は、任意の外科的試料又は細胞培養物において、前新生物又は新生物組織に特異的に関連する異形核形態型（例えば、ベル型の核、葉巻型の核及び弾丸型の核）を同時に同定することにより独立して検証することができる。幹細胞の成長／増殖を阻害又は遅延させる薬剤はまた、成体組織において幹細胞（例えば、腫瘍幹細胞）を同定した後には、腫瘍構成物の形成の予防にも有用である。候補薬剤は、例えばインビボで特定の動物モデル（例えば、哺乳動物モデル、例えばげっ歯類、例としてマウス又はラット）においてスクリーニングすることができる。候補抗腫瘍形成薬剤は、例えば臨床試験でスクリーニングして、それによりある試験的レジメンが、腫瘍中の細胞の９９％超を構成する非幹細胞集団に対照される腫瘍幹細胞成分を実際に破壊するかどうかを見出すことができる。本明細書に記載される方法によれば、候補抗腫瘍薬剤又は腫瘍予防薬剤は、実験動物において、ヒト腫瘍からの移植片又は実験動物にデノボで発生させる腫瘍を用いてスクリーニングすることができる。このように、細胞培養物中のベル型の核を有する細胞の対称又は非対称な分裂を阻止するか、遅延させるか、又は妨害する薬剤が、患者における腫瘍の予防又は治療の候補として認識され得る。
【００６９】
或いは、候補薬剤は、インビトロ又はエクスビボ（例えば、核形態が維持されている培養試料）でスクリーニングすることができる。初代培養物中で長期にわたり組織を保存する方法は、当該技術分野において公知である。抗腫瘍形成薬剤は、異形核形態型が保存されている培養試料において同定することができる。従って、かかる培養試料を候補抗腫瘍形成薬剤で処理し、異形核形態型の保有率が低下する場合、その候補抗腫瘍形成薬剤は、患者の生体内で腫瘍を治療するのに有用であると予想され得る。
【００７０】
以下の非限定的な例に関連して本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００７１】
実施例１：実験手順
細胞及び組織の由来源
全ての成体組織及び腫瘍標本は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの病理科及びＭＧＨ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈにおける外科廃棄物として入手した。各組織切片は直ちに新鮮な氷冷固定液に入れ、さらなる分析のためＭＩＴ細胞遺伝学研究所に輸送した。匿名の廃棄切片の使用は、ＭＧＨ及びＭＩＴの双方の施設内倫理委員会によって承認されていた。分析した胎児消化管切片は、この研究のために採取したものではなく、１９８５年のウクライナ国チェルノブイリでの原子炉の炉心溶融後に、発達中の胎児及び児童における遺伝子の放射線傷害の徴候を見出す任務を担当しているＣｈｅｒｎｏｂｙｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｘｐｅｄｉｔｉｏｎの記録保管用スライドコレクションから得た。癌とは無関係の手術後に廃棄された２つの正常な成体結腸（２つのＦＡＰＣ結腸の５個の直径約２〜１０ｍｍのポリープ、４つの結腸腫瘍、１つの膵腫瘍及び２人の患者からの肝臓の数個の独立した結腸直腸転移）を分析した。
【００７２】
組織切除、固定、展開及びＤＮＡ染色
この手順は、約０．５ｍｍ厚の固定及び染色した組織切片を使用し、ここでは組織を顕微鏡スライド上に整った形で展開することが可能となる程度まで、細胞接着が化学的に破壊される。この技法により、細胞についてその核内の構造的完全性を保持することが可能となる。組織展開に固有のゆがみはいくらか最小限あるにしても、染色された核などの小さい形態学的構造及び結腸陰窩などのより大きい構造がなお観察され得る。
【００７３】
核形態型は、特に結腸の外科廃棄物が切除直後（例えば、切除後１時間未満、より好ましくは、切除後約３０分又はそれ未満）に提供される場合に、見ることができる。剥離した結腸粘膜のシート（約１ｃｍ２）又は腺腫、腺癌及び／又は転移の１ｍｍ厚切片を、切開後直ちに、新しく調製した４℃のカルノア固定液（３：１、メタノール：氷酢酸）の中に置いた。固定液の容積は、組織試料の容積の少なくとも３倍である。合計３時間の固定中、４５分ごとに３回、新しい固定液を交換する。次にカルノア固定液を４℃の７０％メタノールに交換し、これは約−２０℃で最長１年間まで保管し得る。
【００７４】
展開及びＤＮＡ染色のため、固定した組織試料全体から約１ｍｍ２の断片（長さ×幅は切片厚さと異なる）を切除する。各断片は蒸留水でリンスし、２ｍＬの１Ｎ  ＨＣｌ中に６０℃で正確に８分間置くことで、高分子を部分的に加水分解させてＤＮＡを脱プリン化する。冷温の蒸留水で速やかにリンスして、加水分解を終了させる。リンスした試料を４５％酢酸（室温）に１５〜３０分間浸す。この最後の工程は、植物の細胞遺伝学において「組織浸軟」として知られており、これにより、続いて組織細胞の展開及び植物組織切片の観察を、顕微鏡スライド上において弱い圧力で行うことが可能となる（Ｇｏｓｔｅｖ，Ａ．及びＡｓｋｅｒ，Ｓ．，１９７８，Ｈｅｒｅｄｉｔａｓ，１０１：９８−１０４；Ｇｏｓｔｊｅｖａ，Ｅ．，１９９８，Ｇｅｎｅｔｉｋａ，３２：１７−２１）。この「浸軟された」固定組織試料は、直ちに顕微鏡スライド上への展開に用いられる。約１ｍｍ２の各浸軟切片を二等分し、固定された浸軟組織の約０．５×１ｍｍ断片を２つ形成する。各断片を清浄な顕微鏡スライド上の約５μＬの酢酸中に移し、２２×２２ｍｍのカバースリップで覆う。カバースリップの縁端を抑えて組織試料に軽い圧力を加え、それをスライドの中央に位置決めする。
【００７５】
展開工程のため、５層のろ紙を折り畳み、カバースリップを動かさないよう極めて慎重に注意を払いながらそれをカバースリップ上に置く。ピンセットの柄を、カバースリップを覆うろ紙に沿って一方向に、軽く均一な圧力で一定して動かす。「軽い」は、染色体の「押しつぶし」に用いられる圧力と比べて著しく低い圧力を意味する。展開の質は、個々の試料ごとに２０×位相差対物レンズを使用して確認する。良好な結腸組織展開の指標は、組織展開全体の縁端に損傷した核がなく、それと同時に、陰窩が圧迫されて、本質的に陰窩の形態学的な完全性を保つ単層になっていることである。良好に展開された各試料スライドは、直ちにドライアイス表面に置く。２分後、展開した組織試料が完全に凍ったところで、カバースリップの一つの縁端の下に、それを静かに持ち上げてカミソリ刃を挿入する。無塵環境でスライドを１時間以上乾燥させる。
【００７６】
染色手順は室温で実施する。スライドをコプリンジャーに入れてシッフ試薬（Ａｒｔ．９０３３、Ｍｅｒｃｋ）で満たし、核の部分的に脱プリン化したＤＮＡを染色する。スライドを染色溶液中に１時間浸漬し、同じコプリンジャー内において２×ＳＳＣ（クエン酸三ナトリウム８．８ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１７．５ｇ／Ｌ）で２回、３０秒間を１回と、素早く１回としてリンスする。次にスライドを蒸留水でリンスする。この段階のスライドは、定量的画像解析による核内又は凝縮染色体内のフォイルゲンＤＮＡ量の計測を含め、核内のＤＮＡの分布を観察するのに好適である（Ｈａｒｄｉｅ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，５０：７３５−７４９）。
【００７７】
間期核の優れた解像度及び画像化を実現するため、スライドをギムザでさらに染色してもよい。２×ＳＳＣでリンスした後、直ちにスライドを１％ギムザ溶液（Ｇｉｅｍｓａ、Ａｒｔ．９２０４、Ｍｅｒｃｋ）に５分間入れ、次に素早く、最初にゼーレンセン緩衝液（リン酸水素二ナトリウム二水和物１１．８７ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム９．０７ｇ／Ｌ）、次に蒸留水でリンスする。染色の耐食のため、温度計を振るかのようにしてスライドから水滴を振り落とす。スライドを無塵環境に置いて室温で１時間乾燥させる。次にスライドをキシレンで満たしたコプリンジャーに少なくとも３時間入れ、油脂分を除去する。カバースリップをＤｅＰｅｘ封入剤でスライドに接着して３時間乾燥させると、その時点でスライドは、高解像度走査の準備が整った状態となる。
【００７８】
顕微鏡及び画像処理システム
核の寸法及びＤＮＡ含量の定量分析をさらに行うため、ＫＳ  ４００  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）、バージョン３．０（Ｚｅｉｓｓ、独国）を使用して画像を観察及び記録した。このシステムは、電動式の光学顕微鏡Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ（商標）と、カラーＣＣＤカメラと、パーソナルコンピュータに接続されたＡｘｉｏＣａｍ（商標）（Ｚｅｉｓｓ、独国）とからなる。画像は、１．４／１００倍率の平面アポクロマート対物レンズの顕微鏡から、フォイルゲン染色法のみを用いた場合は可視光及び５６０ｎｍ（緑色）フィルタを使用して送った。フォイルゲン−ギムザ染色を用いた場合には、フィルタは使用しなかった。各走査セッションの前に、フレームグラバ及び最適露光量を調節した。核の画像は、０．０２２３×０．０２２３ｕｍの画素サイズで記録した。同じスライドの走査を再現できるようにするため、倍率、解像度及び露光量などの走査パラメータを保存した。
【００７９】
実施例２：ベル型の核の検出
胎児後腸
本明細書に記載される観察は２つの独立した胎児消化管切片によるものであり、図１、図２Ａ〜図２Ｃ及び図３Ａ〜図３Ｆに示される。３つの観察を行った。第一に、図１に要約される７種の異なる一連の核形態型があった。第二に、図２Ａ〜図２Ｃに示されるとおり長い（直径約２０〜５０ミクロン）の管内に組織化した、規則正しい直線的なヘッド・ツー・トウ配置のベル型の核があった。第三に、図３Ａ〜図３Ｆに示されるとおりの、ベル型の核が関わる特異な対称及び非対称無糸分裂形式があった。
【００８０】
同一の後腸切片の位相差画像（左のフレーム、図２Ｂ）と染色した核の画像（中央のフレーム、図２Ｂ）とを重ね合わせると（右のフレーム、図２Ｃ）、直線的に配向した核が、それ自体直径が約２０  ５０ミクロンの、過去に報告されたことのない管状構造内に含まれていることが分かった。２８０×倍率の核（中央のフレーム、図２Ｂ）は、これらの非球形の核がカップ又はベルの形であるように見えることを示す。直線的な配列の核のより高解像度の画像（１４００×）は、それらの核が見かけ上中空の再現性のあるベル型を有することを示す。「ヘッド・ツー・トウ」配向のベルは、観察した全ての胚管で保存されていたが、管は、平行な管が局所的に逆平行となったベル型の核の配向を有し得るように、前後に蛇行している。
【００８１】
ベル型の核は、管状構造内においてのみ対称又は非対称な無糸分裂を行うことが観察された。ベル型の核の対称な無糸分裂は、２つの積み重ねた紙カップの単純な分離に似ていた。最高の解像度では、分裂時のこれらのベルの上側の口縁部は、図３Ａ及び図３Ｂに見られるとおり、ベルの外縁部のおそらく３／４を取り囲む一対の凝縮した、又は部分的に凝縮した染色分体（図１を参照、矢印）を有するように見えた。様々な管内に様々な異なるベル型が認められ、これらの形態学的な変型は、対称な無糸分裂で忠実に再現された、図３Ａ。
【００８２】
ベル型の核の、この過去に見出されたことのない無糸核分裂形式は、当然ながら意外であった。しかし、胎児の切片については、これを上回る意外なことがあった。消化管切片全てにわたり、管状構造内のベル型の核が見かけ上核を「産む」ことが見られた。胎児の切片に認められた、図１に示す核型の各形の例は、ベル型の核から現れることが認められた。これらの特異な無糸分裂による非対称核分裂形式を、図３Ｃに示す。
【００８３】
ベル型以外の核形態型に関しては、全て有糸分裂を行い、同一の核形態型の局所的なコロニーを形成するように見えた。このような有糸分裂は、常に、ベル型の核を含む長い管の外側で起こった。奇妙なことに、前期には特定の核形態が保存されていたとともに、さらには同様に図１に示されるとおり、後終期の末期には染色体の会合によって再形成された。
【００８４】
正常結腸上皮
約０．５ｍｍの切片、組織浸軟（下記参照）、及び丁寧な展開が一体となり、それに核の特に鮮明な画像を作り出すＤＮＡ特異的染色が組み合わさったことで、三次元特徴の認識が可能となった。陰窩基部から管腔表面に至るまで、陰窩における全て、又はほぼ全ての核を観察することができた。多くの陰窩は、個々の核形状を判別することができるような形で割れているか、又は拡がっているかのいずれかであった。卵形又は回転楕円形の核を有する細胞が、上皮延長部の基部のすぐ上から管腔の中まで陰窩に列を作る。しかしながら、陰窩基部それ自体の最初の約２５個の細胞では、「円板状」（約２  ３ミクロン厚さ及び約１０ミクロン直径）として特徴付け得る核形態型が優勢であった。円板状の核のなかでベル型の核が判別されたのは陰窩基部の１％未満であり、そこでの細胞は十分に離れていた。同様のベル型の核の出現頻度の低さが、成体肝の調製物においても観察されている。新生物形成又は前新生物形成を示すものは何もない成体結腸では、約８００個の十分に拡がった陰窩の細胞毎の走査において他の核形態学的な変型は観察されなかった。
【００８５】
腺腫
腺腫は、正常な結腸陰窩と区別のつかない陰窩を多く含み、各々が約２０００個の細胞を有していた。これらは、多くの場合に図５Ａに示されるとおりの枝分かれした形で見られた。同じ回転楕円形及び卵形の核が、正常な結腸陰窩の場合と同様に陰窩壁に存在したが、多くの場合に陰窩基部に１個又は２個のベル型の核を見せた。変則的な陰窩様構造はまた、最高約８０００個の細胞を含むことも観察され、それらは組織浸軟による展開がより容易であった（図５Ｂ）。加えて、多くの多様な細胞及び集団が、陰窩構造及び陰窩様構造間に散在していた（図５Ｃ）。ある構造は、約２５０個、約５００個又は約１０００個の細胞を含むフルサイズの正常な陰窩に向かって成長しているように見えた（用いた展開技法は、一般に、数百個に至るまでの細胞についての構造内の正確な細胞計数を可能とするものであった）。多くの細胞群が、各々正確に８個、１６個、３２個、６４個及び１２８個の細胞の「環体」として確認された（図５Ｄ）。より高倍率で調べたところ、陰窩様構造の壁の細胞のほとんどは、正常な成体結腸陰窩の場合と同じように球形又は楕円形の核を有したが、一方、楕円形、葉巻型又は弾丸型のいずれかの核を有する細胞のコロニーは、陰窩壁の割れ目に見られたことが明らかとなった。楕円形及び葉巻型の核を有するコロニーは胎児消化管で観察されているが、「弾丸型」の核形態型は腺腫及び腺癌においてのみ確認された（図５Ｅ）。
【００８６】
「弾丸型」の核形態型もまた非対称な無糸分裂によってベル型の核から生じ、変則的な（「噛み切られた」）端部が最初に現れるように見えた。弾丸型の核を有する細胞の小さいコロニーが見られ、これらのコロニーは、奇妙な核形態が前期初期から後終期に至るまで保持されたという興味深い事実を別として、通常の有糸分裂を行う細胞を含んでいた。
【００８７】
ベル型の核は、正常な成体結腸にはほとんどなかったものの、腺腫において明らかに重要な役割を果たしていた。ベル型の核は様々な腺腫コンテクストで出現した。あるものは、図５Ｄに示すとおり、陰窩様構造間の空間に１〜１０個又はそれ以上の「ベル」として認められた。別のものは、多細胞の環状構造における単一の「ベル」として認められ、そこでは、図５Ｃ及び図５Ｄにあるとおり、球形又は他の形態の２ｎ−１個の細胞を有する環体中に１個のベル核が常に確認された。正常な結腸陰窩がそうであるように、展開条件下で凝集する小型乃至フルサイズの構造では、ベル型の核は陰窩様構造の基部カップ内で単一のベルとして現れ、さらに多くの場合に一対のベル又は時に４個若しくは８個のベルとして現れた。より大型の変則的な陰窩様構造では、ベル型の核は、他の核形態の細胞と混じり合った異常構造の壁と解剖学的に一体化していた。これらの大型の変則的陰窩様構造は、各々がその独自の核形態型を有する複数の異なる種類の集団の寄せ集めであるかのように見えた。
【００８８】
腺腫のベル型の核は、別の注目すべき形で他の核形態型及び胚におけるベル型の核とは異なっていた：個々の腺腫ではベル型の核は千個より少し多く観察されているが、胎児の切片に認められる対称な無糸分裂形式では、いかなる腺腫においてもベル型の核は１つとして観察されていない。また、核濃縮として説明することのできる状態のベル型の核は、走査した腺腫間では観察されなかったことも注目に値する。他の形態型の核は全て、全ての切片を走査したときほぼ等しい頻度（１  ５／核合計１０００個）で、有糸分裂又は核濃縮に多く認められた。小さい部分切片は、有糸分裂数及び核濃縮数に関して大幅に異なった。本明細書で使用されるとき、「核濃縮」は、瀕死の細胞の指標となる不規則な凝集塊において核が断裂し、且つクロマチンが凝縮した状態を指す。
【００８９】
腺癌
腺癌は質量がはるかに大きく、且つ弱い圧力による展開に抵抗する多くの個別の切片を有するが、陰窩と、より大型の変則的な陰窩様構造と、陰窩間にある１６個、３２個、６４個及び１２８個の細胞の環体の存在とを併せ持つことは、それよりはるかに小さい腺腫の場合と本質的に同じであった。陰窩様構造の壁の割れ目は、凝縮した前期染色体の三次元分布まで持続する同一の核形態を有する細胞のコロニーに関連していた。ベル型の核は、陰窩の基部カップにおいてシングレット、ペア又はより大きい数としてなお認められ、より大型の異常な陰窩様構造の壁にある複雑な渦巻き部に埋め込まれていた。図６Ａ〜図６Ｃは一連のこれらのベル型の核を示し、全て腺癌に見られるものの典型である。腺癌における一群の核形態型は、腺腫で確認される一群と同じであるように見える。特に、胎児性の切片又は成体結腸では観察されない「弾丸型」の核形態型が多く観察された。
【００９０】
腺腫と腺癌との識別し得る違いは、陰窩様構造の配向が無作為で、基部から管腔の方向が見かけ上、腫瘍表面に対してランダムに配向されていることであった。また、陰窩及び変則的な陰窩様構造は、多くの場合に腫瘍内部には認められなかったことから、それらは、小型の局所的に組織化された構造の折衷的な、しかし無秩序ではない集団として特徴付けたほうがよいといえる。このような種々の核型を有する細胞が散在したコロニーは、共生的な群生に相当する可能性がある。
【００９１】
腺癌が腺腫と区別される重要な特徴は、見かけ上組織化された数百個のベル型の核の集団が頻繁に出現したことであり、それらの多くは、しばしば（約１％）対称な無糸分裂に関与していた。低倍率では、それらは陰窩様構造間の空間に現れ、クモの巣状又は葉脈状の骨格のように見えた。より高倍率では、細い「脈」はベル型の核を有する細胞が部分的に整列した鎖であって、ベル型の核の「口」が軸から９０°の同じ方向に向けられている、すなわち、ショルダー・ツー・ショルダー配向という奇妙な特徴を備えた鎖であることが認められた（図６Ｃ）。さらに、腺癌の複数の切片による走査から、胎児消化管では観察されたが腺腫では観察されなかった「ヘッド・ツー・トウ」配向のベル型の核が見出された。これらの直線的に配列された核はまた、胎児に見られる管状構造（合胞体）内に収まっていた。時に、ベル型の核であった可能性もある核濃縮の像が観察されたが、ベル型の核間での対称な無糸分裂と比べるとはるかに低い頻度であった。
【００９２】
その他の観察
肝臓における結腸直腸腫瘍の転移は、一見すると腺癌と区別のつかない、核形態型、陰窩及び陰窩様構造のパターンを再現する。成体ヒト肝臓切片の走査切片からは、成体結腸陰窩で観察されたとおりのベル型の核が時に見られた。成体マウス結腸の走査においても、成体ヒトの場合と同様にベル型の核を有する細胞が陰窩基部に見られた。ベル型の核を有する培養細胞の潜在的に重要な成長観察及び研究では、マウス細胞培養物において約１／細胞１０，０００個の低頻度が認められており、幹様の挙動を仮定して対称及び対称な細胞分裂の動態に関する研究が行われている（Ｓｈｅｒｌｅｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９２：１３６−１４０；Ｍｅｒｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６２：６７９１−６７９５）。
【００９３】
実施例３：器官形成及び発癌
胎児結腸の後胚期を組織化する幹細胞を、開いた口のベル型の核形態型によって特異的に同定した。これらの特有の核は対称及び非対称の双方の核分裂を行い、通常の染色体凝縮はない。核分裂は、成体維持幹細胞への最終的な変態の前まで、胎児、新生児及び小児の時期を通じて正味の成長及び分化を駆動する。このようなベル型の核形態型は、成体結腸陰窩の基部ではほとんど認められないが、前新生物形成及び新生物形成では再び顕著に現れ、結腸腺腫、腺癌及び転移における正味の成長及び分化を駆動するように見える。
【００９４】
これらの観察を、歴史的な年齢特異的結腸直腸癌発病率、現在の年齢特異的結腸腺腫有病率及びヒト組織における遺伝的変化の直接的な計測の分析から導かれる推論と組み合わせると、結腸及びおそらくは他の部位における遅発性の発癌についての初期仮説が示唆される：小児幹細胞においては、その特有のＤＮＡ生化学及び分離様式に起因して、腫瘍を惹起するのに必要な腫瘍変異が成体維持幹細胞と比べて著しく高率で起こる。小児の高い突然変異率は、腫瘍惹起イベントを小児の時期に限定する効果を有する。惹起された小児幹細胞は局所的な小児組織パッチを作り続け、それらが最終的には結腸においてポリープとして観察されるとともに、それらの細胞は小児細胞に属する「ミューテーター」の表現型を維持する。前新生物コロニーが緩徐ではありながらも容赦なく成長する間、さらなる１つ又は複数の腫瘍変異及び／又は局所的な生化学的状態により、前新生物性の「小児」幹細胞のうちの１つが胎児幹細胞の表現型に切り換わり、それが致死的な腫瘍塊を急速に作り出す。
【００９５】
器官形成
器官形成は、対称な分裂の自己増殖により正味の成長が可能で、且つ幹細胞と別の細胞型とを生じる非対称な分裂によって分化に関与する幹細胞の線形カスケードにより達成されるという考えが、発生生物学者によって支持されている。移植すると生存胚を生じることが可能な胚盤胞の初期胚性幹細胞並びに造血系及び可能性としては他の器官を再構築することが可能な、動物の骨髄から単離されたものなどの幹細胞から、様々な型及び潜在能力の細胞のアイデンティティ及び機能を区別しようと試みると、混乱が生じる。成体幹細胞又は維持幹細胞は、結腸などの器官において代謝回転を行う多くの組織要素の再構築に関与するものと推測される。成体では、必要に応じて組織及び器官を再構築することが可能な幹細胞の小さい倉庫が想像され得る。また、最初の移行細胞を産生し、続いてそれが二分裂によって失われることで二次移行細胞となり分化した最終的な細胞に至る、間欠的な非対称分裂によるクローン性の代謝回転単位を定義する別の成体維持幹細胞型を想像することもできる。
【００９６】
本明細書には、対称な核分裂及び非対称な核分裂の双方を行うように見える容易に同定可能な核型を含む構造が開示される。それらの型は、５〜７週胎児ではヒト消化管の全ての核の約３０％を含むが、成体結腸陰窩の基部の頂点には１％未満しか認められないそのベル型の核形態型によって同定される。
【００９７】
発癌
発癌は、対称な分裂の自己増殖により正味の成長が可能で、且つ非対称な分裂によって分化に関与することにより、腺癌でエビデンスが示されている不均一性を生じる幹細胞の線形カスケードにより達成されるという考えが、それほど広範ではないが、支持されている。発癌を、初期胚形成で発現するものなどの遺伝子の一見ランダムな発現を伴う「細胞性制御の喪失」とする概念が、かなり広範に行き渡っている。しかしながら、白血球造血における器官回復性幹細胞の物理的な存在を実証するのと同様の希釈及び移植実験から、様々な細胞型を含む成長腫瘍を生じる能力を有する腫瘍細胞は、極めて小さい割合しか存在しないことが立証されている。腫瘍幹細胞が存在するというこのような実際的な実証は、癌を高度に変質した状態とする考えに反映させて、それが、器官形成と同じく、正常な幹細胞から腫瘍幹細胞への経路を定義する特異的な変化の発現である可能性を探ることが求められる。この考え方に関連するものとして、結腸ポリープ（腺腫、前新生物病変）及び腫瘍（腺癌、新生物形成）の双方並びに続く転移において、結腸の胚形成で認められるものと同じベル型の核が認められることが挙げられる。これらの核型及びその対称な核分裂の頻度を予備的に列挙することにより、前新生物形成の予想される低い分裂速度及び新生物形成の急速な分裂との比較が可能となる。
【００９８】
幹細胞生物学の年齢特異的癌発病率との関係
惹起された幹細胞は、ほぼ小児期の速度で成長して前新生物コロニー（腺腫、ポリープ）を形成し、そこから容赦なく現れた新生物幹細胞がほぼ胎児期の速度で成長し、致死的な腫瘍を形成するという仮説を推論することは、妥当である。新生物形成が胎児表現型の再発現であるという仮説に本発明者の独自性はなく、Ｃｏｈｎｈｅｉｍなどの１９世紀半ばの病理学者のものである。ヒト結腸における前新生物形成、腺腫又はポリープは、単に小児結腸の表現型の延長であるという仮説が生じる。
【００９９】
前新生物形成の成長速度に関するデータ及び導かれる推定が、年齢に伴う子供の体重の成長速度に関する偶然の発見によって強化された：男女の小児は平均体重が指数関数的に増加し、倍増時間は、約１．５歳から女児で１４．５歳までの、及び男児で１６．５歳までの約６年間である。これらの年齢区間における成長速度は、男児について０．１５８、女児について０．１６７である。結腸の成長速度を体重の成長速度と関係付けるには、体重２／３、又はこの場合には、結腸の前新生物の成長速度についての推定と等しい値の約０．１６２／３  約０．１１として増加するものとする、成長する球内にある円柱表面積のモデリングが必要であった。
【０１００】
結腸の前新生物病変の推定成長速度値は、小児結腸の推定成長速度とほぼ等しいため、前新生物形成が何らかの形で小児成長の状態を再現するという仮説を展開した。小児幹細胞の正味の成長は小児組織の成長に必要であると推定されるため、組織化された結腸の組織学的特性の多くを含む腺腫が、実際には、成長しない成体陰窩を背景とした、小児組織拡張のパッチに相当する可能性があるという考えが生まれた。この仮説を、計算により、惹起年齢を最大体重の年齢に限定して検証し、惹起の過程が小児期に限定されるならば、実際に年齢特異的結腸直腸癌発病率と一致するパラメータセットを得ることが可能であることが分かった。実際には、惹起を５歳以下に限定した場合、癌発病率データにフィットするパラメータを得ることができる。かかる計算は、惹起が小児期間内に限定されるという仮説が年齢特異的な癌発病率データと一致していることを実証するが、しかしながら、この仮説の有効性を実証するものではない。
【０１０１】
腺腫の年齢特異的検出
これらの理論構築は、腫瘍惹起が小児期によって制約されるという仮説に直接影響を与えるものと思われる重要な一群の臨床所見がなければ、未検証の仮説の領域に留まり得る。潜在的な新生物性の結腸腺腫を検出して摘出する直腸鏡検査の最適な年齢及び数を定義するように設計された研究において、フレキシブルＳ状結腸鏡検査によって検出可能な腺腫を有する人の割合は、ほぼ６０歳で一定の最高値に達することが認められた。一貫して高い腺腫検出記録を有する直腸病専門医による観察を分析したところ、男性の約１５％及び女性のほぼ約１０％が、平均して１個よりやや多い腺腫を有した。これらの臨床データから、以下のように推論することが妥当である：第一に、緩徐に成長する前新生物腺腫は、生涯のなかで６０歳よりはるかに早い時期にその起源があったはずである（０．１１の成長速度であれば、１歳で惹起された組織幹細胞は、６３歳までに２７＝１２８個の前新生物幹細胞にまでしか増加しなかった。かかる腺腫中の細胞総数は、はるかに多い百万個程度の全細胞数となり得る）；第二に、ポリープを有する男性の割合約１５％と、結腸癌の生涯リスクを有する男性（１８９０年代コホート）の推定最低割合１８〜２０％とが類似していることから、６０歳の腺腫を有する人と、生涯リスクを有する人とは同じであり得ることが示唆される（今後の分析でこの推論が確認されれば、それは２つの理由から重要となる：（ａ）結腸において最終的に前新生物病変から新生物病変に変化する際に、先天的又は遺伝的リスク要因についてはいかなる役割もなくなり得る、及び（ｂ）結腸直腸癌と共通のリスク要因に関して競合する形の死亡率についてはいかなる重要な役割もなくなり得る）；第三に、ポリープを有する人における平均して１個より多いポリープの出現は、男性の集団が、腫瘍惹起及び前新生物成長が起こる約２０％の部分集団と、腫瘍惹起及び／又は前新生物成長のいずれも起こらない約８０％の別個の異なる部分集団とからなることを含意する；第四に、前新生物の成長速度の計算の結果が男女で同じとなる限りにおいて、６０歳超のポリープを有する人の男／女比、並びにポリープの平均個数／ポリープを有する個人の性別による違いから、癌発病率の性別による違いの原因は、惹起し易い小児又は小児以前の時期を通じて形成された、惹起された結腸幹細胞の数に全面的に帰することができるという仮説が可能となる（例えば、腫瘍変異率が男女で同じであったなら、小児の時期に形成された予想上の前新生物コロニーの比は、単純に、女性では約１４．５歳及び男性では１６．５歳で成熟に至るまでに経た幹細胞年齢の比となり得る）。
【０１０２】
組織病理学
２０世紀を通じ、分子的、生化学的及び組織病理学的分析方法が並行して利用されてきたが、腫瘍及び胚の研究は独立していた。得られた豊富な広範囲のデータから、ヒトの成長及び発達に関連する多くの正常な個体発生の特徴が、生涯のなかではるか後になって異常な病理学的成長、すなわち癌として再び現れることが分かった。２１世紀初頭、科学者らは、胚と腫瘍との類似性（双方とも本来は単クローン性であり、双方とも細胞集団の明白な不均一性が明らかである）は、単一の論点、すなわち、幹細胞などの極めて特異的な細胞が、胚全体と、器官と、胚の、並びに大型腫瘍の組織とを生じることができるという点から説明することができるという仮説を提唱した。前記科学者らは、本明細書のように胚性幹細胞と胎児幹細胞とを区別することはしていない。
【０１０３】
表１は、ヒト初期発生における幹細胞の階層を示す。在胎期間４週（胚盤胞及び原腸形成の段階）と５〜１２週（器官形成の段階）との間に、胎児初期発生の各特定の段階に対応して幹細胞のカスケードが起こる。
【０１０４】
【表１】
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【０１０５】
個体発生上異なる幹細胞を区別することの重要性は、開示されるヒト胎児及び成体組織の細胞遺伝学的評価に由来している。
【０１０６】
胚盤葉上層の胚性幹細胞は、移植前の胚においては何にも関与しない細胞であり、有糸分裂によって分裂し、その核は単純な球形形状である。これは、細胞についても、又は核についても、極性を保持できるという証拠はない。体制プランの生成及び器官形成の段階で、細胞は、ヒトの左右対称な体を作り出すため細胞及び細胞層が空間的に「方向性を有する」移動を開始するのに必要であると考えられる極性を獲得し、それにより体腔における内臓器官の位置の概要を示す。
【０１０７】
消化管の器官形成の中期（５〜７週）は、それ以降に消化器系の全ての主要な器官が生じるようになる段階であり、単なる球形ではなく、多様な核形態型を有する核を含むＥＳ細胞を含む。一部の細胞の核は明らかな極性を有し、有糸分裂ではなく、「カップ・フロム・カップ」核分裂（図８）との関連性がより高い過程によって分裂する。この特定の観察から、器官形成の幹細胞が胚の割球で観察されるものとは全く異なり得るという結論が導かれている。
【０１０８】
子供の生後成長及びその後の小児期の成長においては、幹細胞が増殖することにより上皮組織が成長し続け、器官当たりの代謝回転単位数、及び代謝回転単位当たりの細胞数は、双方の特徴が成体の一生を通じて維持される器官特異的なサイズに達するまで増加する。この点で、小児期において器官の成長及び機能を引き継ぐ幹細胞は、小児幹細胞として、胎児の成長及び発生の幹細胞とは区別されなければならない。「癌幹細胞の分化段階と腫瘍型との間の関係」についてのＳｅｌｌの仮説が正しいならば、「成体」、「小児」、「胎児」又は「胚」の形態の単一の幹細胞を同定する能力は、癌の定量的及び定性的特性の分析における大幅な進歩となり得る（Ｓｅｌｌ，Ｓ．，２００４．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，５１：１−２８）。試験管で純粋な同型の幹細胞集団を同定して回収する技術的ツールは、明らかに有用である。
【０１０９】
発生中の胎児消化管の細胞内の核は、中空のベルのように組織化され得る（図８：ａ，ｂ）。かかる核を有する細胞は、胎児消化管において約３０％存在するのみならず、消化管組織内で極めて特有の配置パターンを有する：核は「ベルの上に重なったベル」のように一方向に向いている。これらはまた、管状合胞体に似た構造に被包されている。成体結腸上皮の正常な陰窩には、ベル型の核を有する細胞はほとんどなく、それらが存在する場合には、その数は陰窩当たり１個以下である。同じベル型の核を有する細胞は、腺腫では多数、正常な、又は異常な全ての陰窩に見られ（図８：ｇ、ｈを参照）、その後、腺癌の異常な陰窩及び腫瘍塊に高頻度で再び現れる（表１を参照）。
【０１１０】
ベル型の核を有する細胞は胎児に多数観察され、新生物形成のない正常な成体結腸にはほとんどなく、数立方ミリメートルの腺腫には少数（＜１０００）、及び数立方センチメートルの腺癌には多数（＞１，０００，０００）存在する。
【０１１１】
これらの細胞が幹細胞であり得るという意見は、ベル型の核の分裂についての、もう一つの同様に異例の観察によって支持されている。管状合胞体内においてベル型の核は、驚くことに、あたかも「テンプレート」となる対象物の複写写真のようにそれ自身の同一の３Ｄコピーを生じた。結果として起こるベル型の核の分離（２つの紙カップの分離のような）の段階は全て検出されており（図８：ｄ）、それらは、有糸分裂の染色体を形成する核凝縮及び典型的な有糸分裂装置が存在しないため、本明細書では「核分裂」と称される。この知見に従い、ヒト消化管の発生中にこれまでに認められた、ベル型の核から常に一方向に、すなわちベルの「口」から現れるとおりの全７つの核形態型の観察が行われている（図８：ｅ、ｉ）。異なる核形態型を有する細胞は表現型が異なり、異なる核形態型を有する細胞間の遺伝子発現及びタンパク質合成プロファイルの違いの検出が期待され得る。
【０１１２】
胚割球の細胞は、中空のベルの形状をした核は含まない；それらは球形の核を有し、「胚性幹細胞」である。同時に中空のベル型の核は、およそ妊娠５週ほどの早い時期に既に観察される。ヒトの生涯において胎児消化管の発生に続く、ベル型の核を有する細胞が再び多量に出現する次の段階は、成体結腸の病理学的状態、すなわち結腸腺腫である。結腸腫瘍では、胎児結腸のものと極めてよく似た、核形態型の明白な多様性もまた観察することができる。細胞及び核形態型の多様性は、腫瘍における細胞の「不均一性」のもう一つの現れである。腫瘍はまた、組織病理学者により、未成熟細胞を含むものとしても特徴付けられる。腫瘍の発達における種々の段階において、前新生物形成では単一の小児幹細胞及び新生物形成では単一の胎児幹細胞が、これら二つの不均一な表現型に、但し異なる割合の未成熟細胞を伴い寄与し得る（表２）。
【０１１３】
【表２】
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【０１１４】
実施例４：特性決定方法
本明細書には、定量的画像による血球計算及び／又は共焦点顕微鏡法により細胞及び合胞体のベル型の核における核構造、ＤＮＡ含量及び染色体の空間分布を特徴付ける方法が記載される。これらの方法は、形態、腫瘍型（結腸と、それに対する膵）及び腫瘍内ニッチが異なるベル型の核の間でＤＮＡ含量及び／又は染色体分布のばらつきを見出すことが可能となる。また、これらの方法により、対称な核分裂及びいくつかの形式の非対称な核分裂におけるベル型の核の有糸分裂に関連するＤＮＡ合成の経過及びタンパク質の存在を特徴付けることも可能となる。
【０１１５】
また、本明細書には、ベル型の核を有する細胞及び合胞体を均一試料として単離するのに有用な方法も記載される。かかる方法は、「カタパルト」圧力作動式レーザーマイクロダイセクションを使用した、代謝産物及び高分子の分析に利用され得る核形態が均一な細胞試料の作成を含む。
【０１１６】
本明細書には、ベル型の核がどのように空間的に組織化されているか、クロマチンが核内でどのように分散しているか、特定の染色体が核ラミナの内側にわたって特定の領域を占有しているか否かについての探索が記載され、それがより特異的な治療標的の研究を示唆し得るとともに、核形態型（形状）と遺伝子発現との間の関係のさらなる理解を提供し得る。かかる探索は、免疫細胞化学、分子生物学及び関連する科学の既存の方法によって行うことができる。
【０１１７】
胎児後腸、結腸腺腫及び腺癌において、一連の明確に閉じた核型が認められており、それらは当初から非対称な核分裂によってベル型の核から生じるように見えるが、しかし続いて有糸分裂により分裂し、アポトーシスにより死滅する。成体組織には存在しない、胎児及び腫瘍に共通する一群の核型は、腫瘍が成体器官における「胚性」成長であるという１９世紀の仮説を支持するものである（図９）。これらの知見をコンピュータベースの画像分析及びレーザー補助マイクロダイセクションと結び付けることで、特定の核形態を有する多量の細胞の認識及び採集が可能となる。ベル型の核を有する細胞内並びに腫瘍に特有の他の核形態型細胞内の一連の分子的及び生化学的成分を特徴付ければ、これまで予想もされなかった一群の潜在的な治療標的が提供されるはずである。
【０１１８】
個体発生に似た発癌は、直系遺伝により、拡大する一群の幹細胞を通じて進められるように見える。ヒト腫瘍由来の細胞のうち、免疫抑制されたげっ歯類において新しい腫瘍を異種移植片として形成する能力を有するのは、少しの割合しかない。限界希釈の異種移植片実験は、推定上の新生物形成細胞が、追加的な幹細胞を含む新しい腫瘍の形成能を有したとともに、当初の腫瘍に存在した表現型の混在する細胞集団の再形成能を有した点で、幹細胞様の特性を呈示したことを示しているものと解釈された（Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，２００４．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２３：７２６７−７２７３；Ｃｌａｒｋｅ，Ｍ．，２００５．Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，１１：１４−２６）。しかしながら、さらに最近になって異種移植した腫瘍は、高度に分化した組織型のヒト腺癌が生体内に欠けていることが認められたとともに、特にヒト腫瘍よりはるかに速く成長しており、異種移植腫瘍は、ベル型の核が存在しない点で注目に値する。異種移植片を形成する腫瘍幹細胞は、人体の経験上ではほとんど出現しない真の胚性の癌幹細胞型に相当すると仮定される。
【０１１９】
腫瘍が実際には適度に十分に組織化された不均一な胎児構造であるという仮説が現代において再提示されたことで、再考及び展開が行われている（Ｓｅｌｌ，Ｓ．，２００４．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，５１：１−２８）。「癌胎児性」幹細胞は、数が増し、腫瘍塊内に高度に不均一なニッチを備える分化細胞型を生じることが予想され得る。
【０１２０】
幹細胞分野全般で用いられている様々な抗原マーカーは、多くの場合に高い程度の組織又は腫瘍の再形成能を有する細胞の濃縮に使用されているが、濃縮された集団中の細胞は、それらを幹細胞として特徴付けるいかなる微視的な形態学的細胞特性も示していない。腫瘍が単一の幹細胞から生じることが正しいならば、分子的及び生化学的分析物を解析するのに十分な幹細胞の均一集団としてそれらを同定し、それらを採集する手段が必要となる。
【０１２１】
この目標を実現する一方法は、レーザー捕捉マイクロダイセクション（ＬＣＭ）に基づき、高分子の配列解析に必要とされる、腫瘍幹細胞を同定する顕微組織学的な特性に関して均一な数万個の細胞を選択及び採集するものである。或いは、腫瘍の幹細胞関連表面マーカーを有する分散細胞が、フローサイトメトリー及びセルソーティングにより不均一な細胞集団から濃縮されている（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９．Ｃｅｌｌ，９６：７３７−７４９；Ｓｕｚｕｋｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２００４．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５３：２１４３−２１５２）。
【０１２２】
別の方法は、マーカー又は蛍光標識の使用を伴わないものであり得る。ベル型の核は、外部からの、又は外因的に加えられた蛍光色素の不在下における蛍光性のバルーン状細胞質構造に関連するため、それらの蛍光性構造の検出及び単離に基づき細胞を分離及び選別する方法は、本明細書における方法に包含される。例えばハロゲンバルブにより発生する光によって励起すると、バルーン状構造は緑色光−腫瘍病理の同定において、又は幹細胞を同定及び単離するために利用することができる特性−を発する。
【０１２３】
既存の癌治療方法の主な標的は、細胞周期を移行する細胞である（Ｇｏｍｅｚ  Ｖｉｄａｌ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，２００４．Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４：１７５−２０２；Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｐ．及びＧｉａｎｅｌｌａ  Ｂｏｒｒａｄｏｒｉ，Ａ．，２００５．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ，１４：４５７−４７７）。プログラム細胞死及び腫瘍幹細胞によって失われた最終的な細胞の喪失を補完するため分裂して移行細胞を提供する成体維持幹細胞間を移行中の細胞に、違いはない。治療は、患者を死亡させることなく全ての腫瘍幹細胞を死滅させるという狭いウィンドウのレジメンを目標とするが、しかし成体維持幹細胞は、論理的には細胞成長が正味ゼロという特性を有し、一方で腫瘍幹細胞は、胎児幹細胞と同じく、定義上急速な正味の細胞成長を伴うものと予想され得る。必然的に、成体維持幹細胞分裂は、事実上非対称であり、新しい維持幹細胞と最初に分化した移行細胞とを生じるものと思われる。腫瘍幹細胞は、正味の腫瘍成長を補助するための連続的な対称核分裂が必要となり得る。対称な「カップ・フロム・カップ」の核分裂を行うベル型の核を腫瘍中に発見するなかで、細胞増殖抑制治療又は細胞破壊治療の特異的な標的が同定されている。
【０１２４】
これに対する支持を加える理論は、血管新生を妨げることにより腫瘍が窒息し得るという理論である（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．及びＩｎｇｂｅｒ，Ｄ．，１９９２．Ｓｅｍ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．，３：８８−９６）。腫瘍幹細胞が血管新生抑制戦術の緩和的な、しかし治癒的ではない効果に関係し、それを説明し得る限りでは、低酸素状態が生じることによって初期胚形成の状態が再び生じ得る。腫瘍における分化を阻止すると、正常な組織における分化が阻止され得るため、望ましくない結果となる。幹細胞が短期間で腫瘍を再構築するために現行の癌療法が最低限の効果しか有しないという理解は、成体維持幹細胞と対比したときの腫瘍幹細胞に特有の分子的及び生化学的特徴の探求を強力に刺激するものとなっている。腫瘍幹細胞のかかる分子的及び／又は生化学的特徴は、癌療法の標的となる。
【０１２５】
かかる理論の検証、並びに新生物幹細胞及び他の新生物細胞型の特性決定（分子的及び生化学的特性）における重要な側面は、それらを、定量的な化学及び生化学分析を可能とするのに十分な数及び純度で単離することである。かかる細胞単離物を得るためには、いくつかの手段を用いることができる。例えば、レーザー捕捉マイクロダイセクションは当該技術分野において公知の方法であり、これにより当業者は、結腸腫瘍及び膵腫瘍の未分化のニッチから１０，０００個のベル型の核のバッチを手動で選択し、顕微解剖することが可能となる。収容用バイアルに「発射された」細胞を顕微鏡スライド上に展開し、形態に基づき「ベル」、「ベル以外」又は「不確定」のスコアで評価する。妥当なレベルの濃縮に達した（単離した核のうち７５％超が「ベル」として評価された）とき、手順を変えて、後の分析用のｍＲＮＡ、タンパク質等を保存する。
【０１２６】
生存している結腸上皮細胞単離物を単離する既存のプロトコルは、構造上及び機能上の特徴を保存している細胞培養物における継続観察用に適合されている（Ｓｔｉｃｈ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２００３．Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．，１９９：４０５  ４０９；Ｍｉｃｋｅ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，２００４．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，２０２：１３０  １３８）。ベル型の核を有する細胞又は合胞体の単離物は、初期胚及び血管が新生していない腫瘍ニッチに予想される酸素レベルを再現する種々の酸素濃度の、ゆっくり撹拌されているマイクロキャリアフラスコに入れることができる。また、グルタミンを補充した、但しグルコースは「標準的な」細胞培養培地製剤より低い培地を使用して、これらのベル型の核を有する細胞及び合胞体の成長を促進し、従って制御された実験室条件下でそれらを研究することができる。こうした方法論の適用により、核形態、分裂様式及び／又は特殊な型の多細胞凝集体若しくは合胞体の存在に関して均一な細胞調製物が得られることが合理的に予想される。このような細胞はまた、それらを細胞又は組織培養物中で繁殖させて調べることができるような方法で単離することもできる。
【０１２７】
実施例５．ベル型の核に関連するバルーン状構造
細胞のベル型の核は、バルーン状細胞質構造に物理的に関連することが観察された。このようなバルーン状細胞質構造は、胚胎児組織試料及び腫瘍組織試料において観察された（図２０〜図２７を参照）。
【０１２８】
このようなバルーン状構造の、外部からの、又は外因的に加えられた蛍光色素の不在下での蛍光発光特性により、組織試料（例えば、新生物、前新生物）又は組織試料の発生段階（例えば、胚）を特徴付けるのに有用な方法においてそうした特性を検出することが可能となる。蛍光は、一部の原子及び分子の、特定の波長で光を吸収し、続いて蛍光寿命と称される短い間隔を置いた後、より長い波長の光を放出する特性である。バルーン状構造が蛍光を発する（それを外因性の発蛍光団で標識する必要はない）という観察により、ベル型の核を有する細胞を高速で同定することが可能となる。
【０１２９】
ベル型の核が特定の発生段階、例えば胎児組織の指標となる場合、例えばその蛍光を検出することによる、ベル型の核に関連するバルーン状構造の同定は、特定の発生段階の指標となる。或いは、成体組織では、ベル型の核に関連するバルーン状構造の検出は、疑わしい病変における新生物形成又は前新生物形成の指標となる。
【０１３０】
加えて、ベル型の核を有する細胞は非対称に分裂することが観察されているため、そうした細胞は多能性である。多能性は幹細胞の顕著な特徴であるため、ベル型の核に関連するバルーン状構造を検出することにより、幹細胞を同定及び単離するための高速の細胞スクリーニングが可能となる。かかるバルーン状構造を有する細胞を検出及び単離する方法、例えば、そうしたバルーン状構造による細胞の蛍光に基づき選別及び単離する方法は、当該技術分野において公知である。このような方法で単離した細胞により、例えば再生組織治療において、膨大な可能性がある。
【０１３１】
実施例６．異型カリオサイト（ｍｅｔａｋａｒｙｏｃｙｔｅ）の体外培養
ヒト結腸腺癌グレードＩＩ細胞系であるヒト癌細胞系ＨＴ２９を、ＭＥＭ中、グルコース又は重炭酸ナトリウムの不在下且つ５ｍＭフルクトース、２．５％又は５％ウマ血清の存在下で、培養雰囲気中にＣＯ２を含まず体外培養した。これらの条件下でのＨＴ２９細胞の体外培養は、約１〜１０×１０−４個の頻度で異型核細胞を有する［すなわち、１０，０００個のＨＴ２９細胞につき１〜１０個の細胞が異型核細胞である）（図２８を参照）。本明細書に記載されるとおり、且つ外部からの、又は外因的に加えられた蛍光試薬の不在下で固定及びフォイルゲン試薬（Ｆｅｕｇｌｅｎ'ｓ  ｒｅａｇｅｎｔ）による染色を行った体外培養ＨＴ２９細胞の代表的な高解像度写真を、図２９及び図３０に提供する。
【０１３２】
これらの条件下で成長させたＨＴ２９細胞系は、個々の細胞を細胞培養表面に分散させると小さいボタン型のコロニーを形成する。ほぼ全ての細胞が球形又は卵形の核を含み、有糸核分裂により分裂することが確認され得る。しかしながら、明らかに異なる少数の約１／１０００〜１／１０，０００個の細胞は、本発明に記載される方法によって強い蛍光を発するようになったバルーン型の細胞質に関連するベル型の核を含むことが観察される。前記ベル型の核を有する細胞は、位相差顕微鏡法においてその場で無糸核分裂を行うことが観察されており、固定されたＨＴ２９細胞培養標本においては、対称及び非対称の双方の無糸分核分裂の例が多数観察されている。
【０１３３】
本明細書に引用される全ての特許、公開出願及び文献の教示は、全体として参照により援用される。
【０１３４】
本発明は、特に、その例示的実施形態を参照して図示及び説明されているが、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、その形態及び詳細に様々な変更を加え得ることを、当業者は理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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