(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
膀胱癌マーカー遺伝子―ＳＩＭ２（Ｕ８０４５６）−シングル−マインディドホモログ２（ショウジョウバエ）のプロモーターのメチル化されたＣｐＧ島を検出できるプライマー並びにバイサルファイト、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ及びメチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質からなる群より選択されるメチル化検出試薬を含有する、膀胱癌診断用キット。
【請求項２】
前記メチル化されたＣｐＧ島は少なくとも一つのメチル化されたＣｐＧジヌクレオチドを含有することを特徴とする請求項１に記載の膀胱癌診断用キット。
【請求項３】
前記プロモーターは配列番号４０で表されるＤＮＡ塩基配列であることを特徴とする請求項１又は２に記載の膀胱癌診断用キット。
【請求項４】
（１）ＣＤＸ２（ＮＭ＿００１２６５）−尾側型ホメオボックス転写因子２；
（２）ＣＹＰ１Ｂ１（ＮＭ＿０００１０４）−シトクロムＰ４５０、ファミリー１、サブファミリーＢ、ポリペプチド１；
（３）ＶＳＸ１（ＮＭ＿１９９４２５）−ビジュアルシステムホメオボックス１類似体、ＣＨＸ１０−類似（ゼブラフィッシュ）；
（４）ＨＯＸＡ１１（ＮＭ＿００５５２３）−ホメオボックスＡ１１；
（５）Ｔ（ＮＭ＿００３１８１）−Ｔ、ブラキュウリー類似体（マウス）；
（６）ＴＢＸ５（ＮＭ＿０８０７１７）−Ｔ−ボックス５；
（７）ＰＡＱＲ９（ＮＭ＿１９８５０４）−プロゲスチン及びアディポネクチン受容体ファミリーメンバーＩＶ；及び
（８）ＬＨＸ２（ＮＭ＿００４７８９）−Ｌｉｍホメオボックス２；
からなる群から選択される膀胱癌マーカー遺伝子のメチル化されたＣｐＧ島が検出できるプライマー並びにバイサルファイト、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ及びメチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質からなる群より選択されるメチル化検出試薬を、更に含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の膀胱癌診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は膀胱癌特異的なマーカー遺伝子を利用した膀胱癌診断用キット及び核酸チップに関し、より具体的には膀胱癌形質転換細胞においてプロモーター部位が特異的にメチル化される膀胱癌特異的マーカー遺伝子のプロモーターメチル化を確認できる膀胱癌診断用キット及び核酸チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
膀胱癌は泌尿器系癌のうち最も多発する癌であり、発生原因の多くは明らかになった。主に喫煙や多様な化学物質（革などの染色塗料、大気汚染物質、人工甘味料、硝酸塩）が体内に吸収された後、尿と共に排出され、膀胱壁を刺激して癌を誘発させると知られている。
【０００３】
伝統的な膀胱癌検査としては尿から非正常細胞を探し出す方法を使用しているが、これは正確度が低い。また、カテーテルを膀胱に挿入して疑わしい組織を回収して検査する膀胱鏡検査は侵襲的手法であり比較的正確度が高い。
【０００４】
一般に、膀胱癌は、早期診断されると患者の生存率が高くなるが、早期に膀胱癌を診断するのは容易ではないのが実情である。現在使用している膀胱癌診断法は、体の一部を切開する方法を利用しているが、これは膀胱癌を早期に診断するに当り困難がある。
【０００５】
膀胱癌は膀胱筋層浸潤の有無により表在性または浸潤性癌に分類し、平均的に診断当時３０％ほどの患者が浸潤性膀胱癌に該当する。従って、患者の生存期間を延ばすためには病変範囲が小さい時に早期診断するのが最良の方法であるため、既存の各種膀胱癌診断方法より効率的な診断方法、即ち、膀胱癌の早期診断が可能で、かつ大容量に検体を処理でき、感度及び特異性が高い膀胱癌特異的バイオマーカーの開発が強く求められるのが実情である。
【０００６】
そこで、近年ＤＮＡメチル化測定を通して癌を診断する方法が提示されているが、ＤＮＡメチル化は、主に特定遺伝子のプロモーター部位のＣｐＧ島（CpG island）のシトシン（cytosine）から生じ、それによって転写因子の結合が妨げられて特定の遺伝子の発現が遮断されるもので、腫瘍抑制遺伝子のプロモーターＣｐＧ島のメチル化を探すのが癌研究に大きな助けになり、これをメチル化特異ＰＣＲ（methylation specific PCR，以下、「ＭＳＰ」という）や自動塩基分析等の方法で検査して、癌の診断とスクリーニング等に利用しようとする試みが活発に行われている。
【０００７】
プロモーターＣｐＧ島のメチル化が発癌を直接誘発するのか、または発癌の２次的な変化を起こすのかについては様々な論議があるが、多くの癌から腫瘍抑制遺伝子（tumor suppressor gene）、ＤＮＡ修復遺伝子（DNA repair gene）、細胞周期調節遺伝子等が過剰メチル化（hyper-methylation）されており、これらの遺伝子の発現が遮断されていることが確認され、特に癌発生の初期段階において特定遺伝子のプロモーター部位に過剰メチル化が生じることが知られている。
【０００８】
従って、腫瘍関連遺伝子のプロモーターメチル化が癌の重要な指標であり、これを癌の診断及び早期診断、発癌危険の予測、癌の予後予測、治療後の追跡調査（follow-up）、抗癌療法に対する反応予測など、多方面において利用することができる。実際、血液や喀痰、唾、大便、尿等から腫瘍関連遺伝子のプロモーターメチル化を調べて、各種癌診療に使用しようとする試みが最近活発に行われている（Esteller, M. et al., Cancer Res., 59: 67, 1999; Sanchez-Cespedez, M. et al., Cancer Res., 60: 892, 2000; Ahlquist, D.A. et al., Gastroenterol., 119: 1219, 2000）。
【０００９】
そこで、本発明者らは膀胱癌を効果的に診断できる診断用キットを開発しようと鋭意努力した結果、膀胱癌細胞において特異的にメチル化されるメチル化関連遺伝子のプロモーターをバイオマーカーとして用い、メチル化の程度を測定することによって、膀胱癌を診断できることを確認して本発明の完成に至った。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Esteller, M. et al., Cancer Res., 59: 67, 1999
【非特許文献２】Sanchez-Cespedez, M. et al., Cancer Res., 60: 892, 2000
【非特許文献３】Ahlquist, D.A. et al., Gastroenterol., 119: 1219, 2000
【非特許文献４】Fraga et al., 2003, Nucleic Acid Res., 31: 1765-1774
【非特許文献５】Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY., 1989
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、膀胱癌マーカー遺伝子のメチル化されたプロモーター、またはエクソン部位を含有する膀胱癌診断用キットを提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記膀胱癌特異的マーカー遺伝子のＣｐＧ島を含む断片とハイブリダイゼーションできるプローブを含む膀胱癌診断用核酸チップを提供することである。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、臨床サンプル由来遺伝子のプロモーターまたはエクソン部位メチル化の有無を測定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記目的を達成するために、本発明は（１）ＣＤＸ２（ＮＭ＿００１２６５）−尾側型ホメオボックス転写因子２（caudal type homeobox transcription factor 2）；（２）ＣＹＰ１Ｂ１（ＮＭ＿０００１０４）−シトクロムＰ４５０，ファミリー１，サブファミリーＢ，ポリペプチド１（cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1）；（３）ＶＳＸ１（ＮＭ＿１９９４２５）−ビジュアルシステムホメオボックス１類似体，ＣＨＸ１０−類似（ゼブラフィッシュ）（visual system homeobox 1 homolog, CHX10-like (zebrafish)）；（４）ＨＯＸＡ１１（ＮＭ＿００５５２３）−ホメオボックスＡ１１（homeobox A11）；（５）Ｔ（ＮＭ＿００３１８１）−Ｔ，ブラキュウリー類似体（マウス）（T, brachyury homolog (mouse)）；（６）ＴＢＸ５（ＮＭ＿０８０７１７）−Ｔ−ボックス５（T-box 5）；（７）ＰＥＮＫ（ＮＭ＿００６２１１）−プロエンケファリン（proenkephalin）；（８）ＰＡＱＲ９（ＮＭ＿１９８５０４）−プロゲスチン及びアディポネクチン受容体ファミリーメンバーＩＶ（progestin and adipoQ receptor family member IV）；（９）ＬＨＸ２（ＮＭ＿００４７８９）−Ｌｉｍホメオボックス２（LIM Homeobox 2）；及び（１０）ＳＩＭ２（Ｕ８０４５６）−シングル−マインディドホモログ２（ショウジョウバエ）（single-minded homolog 2 (Drosophila)）からなる群から選択される膀胱癌マーカー遺伝子のメチル化されたプロモーター、またはエクソン部位を含有する膀胱癌診断用キットを提供する。
【００１５】
本発明は、また、（１）ＣＤＸ２（ＮＭ＿００１２６５）−尾側型ホメオボックス転写因子２（caudal type homeobox transcription factor 2）；（２）ＣＹＰ１Ｂ１（ＮＭ＿０００１０４）−シトクロムＰ４５０，ファミリー１，サブファミリーＢ，ポリペプチド１（cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1）；（３）ＶＳＸ１（ＮＭ＿１９９４２５）−ビジュアルシステムホメオボックス１類似体，ＣＨＸ１０−類似（ゼブラフィッシュ）（visual system homeobox 1 homolog, CHX10-like (zebrafish)）；（４）ＨＯＸＡ１１（ＮＭ＿００５５２３）−ホメオボックスＡ１１（homeobox A11）；（５）Ｔ（ＮＭ＿００３１８１）−Ｔ，ブラキュウリー類似体（マウス）（T, brachyury homolog (mouse)）；（６）ＴＢＸ５（ＮＭ＿０８０７１７）−Ｔ−ボックス５（T-box 5）；（７）ＰＥＮＫ（ＮＭ＿００６２１１）−プロエンケファリン（proenkephalin）；（８）ＰＡＱＲ９（ＮＭ＿１９８５０４）−プロゲスチン及びアディポネクチン受容体ファミリーメンバーＩＶ（progestin and adipoQ receptor family member IV）；（９）ＬＨＸ２（ＮＭ＿００４７８９）−Ｌｉｍホメオボックス２（LIM Homeobox 2）；及び（１０）ＳＩＭ２（Ｕ８０４５６）−シングル−マインディドホモログ２（ショウジョウバエ）（single-minded homolog 2 (Drosophila)）からなる群から選択される膀胱癌マーカー遺伝子のプロモーター、またはエクソン部位ＣｐＧ島を含む断片とハイブリダイゼーションできるプローブを含む膀胱癌診断用核酸チップを提供する。
【００１６】
本発明は、また、ＣＤＸ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＶＳＸ１、ＨＯＸＡ１１、Ｔ、ＴＢＸ５、ＰＥＮＫ、ＰＡＱＲ９、ＬＨＸ２及びＳＩＭ２からなる群から選択される臨床サンプル由来遺伝子のプロモーターまたはエクソンのメチル化を検出する方法を提供する。
本発明の他の特徴及び具現例は次の詳細な説明及び添付された特許請求範囲からより一層明白になる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】正常なヒトと膀胱癌患者の尿中の細胞からＣｐＧマイクロアレイ分析による、膀胱癌診断のためメチル化バイオマーカーを発見する過程を示した模式図である。
【図２】膀胱癌細胞株において１０個のメチル化バイオマーカーのパイロシーケンスによる定量的なメチル化の程度を示す。
【図３】１０個のバイオマーカー遺伝子の臨床試料でのメチル化指数を測定した。１０個の遺伝子を利用して、正常、膀胱炎、血尿、及び膀胱癌患者の尿中の細胞におけるメチル化の程度を測定した。
【図４】１０個のメチル化バイオマーカーの各々の膀胱癌診断に対する感度（sensitivity）及び特異性（specificity）を受信者動作特性（Receiver Operating Characteristic，ＲＯＣ）カーブ分析によって測定した。
【図５】正常なヒト及び膀胱癌患者尿中の細胞でのメチル化陽性頻度を示した。
【図６】ロジスティック回帰分析を利用して、１０個のバイオマーカーの中、膀胱癌診断のための最適６個のバイオマカーパネルのメチル化状態プロファイルと膀胱癌診断に対する感度及び特異性を示した。
【図７】メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質（ＭＢＤ）を利用して、膀胱癌メチル化バイオマーカーであるＳＩＭ２遺伝子のメチル化の有無を膀胱癌細胞株においてＰＣＲ方法により測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は一側面において、膀胱癌マーカー遺伝子のメチル化されたプロモーターまたはエクソン部位を含有する膀胱癌診断用キットに関する。
【００１９】
本発明は他の側面において、膀胱癌マーカー遺伝子のプロモーターまたはエクソン部位ＣｐＧ島を含む断片とハイブリダイゼーションできるプローブを含む膀胱癌診断用核酸チップに関する。
【００２０】
本発明において、前記プロモーターまたはエクソン部位は少なくとも一つのメチル化されたＣｐＧジヌクレオチドを含有するのを特徴とし、前記プロモーターまたはエクソン部位は配列番号３１〜配列番号４０で表されるＤＮＡ塩基配列のいずれか一つであることを特徴とする。
【００２１】
本発明において、前記プローブは望ましくは１０ｂｐ〜１ｋｂの大きさを有し、膀胱癌マーカー遺伝子のプロモーターまたはエクソン部位ＣｐＧ島を含む塩基配列とハイブリダイゼーションできるほどの相同性を有するのが望ましく、さらに望ましくは１０ｂｐ〜１００ｂｐの大きさを有し、膀胱癌マーカー遺伝子のプロモーターまたはエクソン部位ＣｐＧ島を含む塩基配列と厳格な条件でハイブリダイゼーションできるほどの相同性を有することを特徴とする。プローブの大きさが１０ｂｐ以下であると、非特異的ハイブリタイゼーション化が起き、１ｋｂ以上であると、プローブ同士の結合が発生して、ハイブリダイゼーション結果を読み取り難くなる。
【００２２】
本発明によるメチル化マーカー遺伝子をスクリーニングする方法は次の工程を含む：（ａ）形質転換細胞及び非形質転換細胞からゲノムＤＮＡを分離する工程；（ｂ）前記分離したゲノムＤＮＡからメチル化されたＤＮＡに結合する蛋白質と反応させてメチル化されたＤＮＡを分離する工程；及び（ｃ）前記メチル化されたＤＮＡを増幅させた後、ＣｐＧマイクロアレイにハイブリダイゼーションした後、正常細胞と癌細胞との間のメチル化の程度の差が最も大きい遺伝子をメチル化マーカー遺伝子として選定する工程。
【００２３】
前記メチル化バイオマーカー遺伝子の選別方法で膀胱癌だけでなく、膀胱癌へ進行中の多様な異形症段階（dysplastic stages）において多様にメチル化される遺伝子を探し出すことができ、選別された遺伝子は膀胱癌スクリーニング、危険性評価、予測、病名確認、疾病のステージング、及び治療ターゲットの選定にも使用できる。
【００２４】
膀胱癌及び多くの段階における異常からメチル化される遺伝子を確認することは、正確かつ効果的に膀胱癌を早期診断できるようにし、多重遺伝子を使用したメチル化データの確立及び治療のための新しいターゲットが同定できる。さらに、本発明によるメチル化データは他の非メチル化関連バイオマーカー検出方法と連係するとより一層正確な膀胱癌診断システムを確立できる。
【００２５】
本発明の前記方法で、検体から得られた一つ以上の核酸バイオマーカーのメチル化工程を決めることによって、多くの段階の膀胱癌進行を診断することができる。膀胱癌の各段階の検体から分離された核酸のメチル化工程を膀胱組織の細胞増殖性異常を持たない検体から得られた一つ以上の核酸のメチル化工程と比較して、検体の膀胱癌の特定段階を確認できる。前記メチル化工程はハイパーメチル化であってもよい。
【００２６】
本発明の一例において、核酸は遺伝子の調節部位においてメチル化できる。他の例において、メチル化は遺伝子の調節部位外から始まって、内部に進行されるため、調節部位外でメチル化を検出することにより細胞形質転換に係わる遺伝子を早期診断することができる。
【００２７】
他の例において、本発明においては次の例の中一つ以上の核酸のメチル化状態をキットまたは核酸チップを利用して検出することによって、検体に存在する膀胱組織の細胞成長性異常（異形症）を診断することができる：ＣＤＸ２（ＮＭ＿００１２６５、尾側型ホメオボックス転写因子２、caudal type homeobox transcription factor 2）；ＣＹＰ１Ｂ１（ＮＭ＿０００１０４、シトクロムＰ４５０，ファミリー１，サブファミリーＢ，ポリペプチド１、cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1）；ＶＳＸ１（ＮＭ＿１９９４２５、ビジュアルシステムホメオボックス１類似体，ＣＨＸ１０−類似（ゼブラフィッシュ）、visual system homeobox 1 homolog, CHX10-like (zebrafish)）；ＨＯＸＡ１１（ＮＭ＿００５５２３、ホメオボックスＡ１１、homeobox A11）；Ｔ（ＮＭ＿００３１８１、Ｔ，ブラキュウリー類似体（マウス）、T, brachyury homolog (mouse)）；ＴＢＸ５（ＮＭ＿０８０７１７、Ｔ−ボックス５、T-box 5）；ＰＥＮＫ（ＮＭ＿００６２１１、プロエンケファリ、proenkephalin）；及びＰＡＱＲ９（ＮＭ＿１９８５０４、プロゲスチン及びアディポネクチン受容体ファミリーメンバーＩＶ、progestin and adipoQ receptor family member IV）；ＬＨＸ２（ＮＭ＿００４７８９）−Ｌｉｍホメオボックス２（LIM Homeobox 2）；ＳＩＭ２（Ｕ８０４５６）−シングル−マインディドホモログ２（ショウジョウバエ）（single-minded homolog 2 (Drosophila)）；遺伝子及びこれらの組合せ。
【００２８】
本発明の診断用キットまたは核酸チップを利用すると検体の膀胱組織の細胞成長性異常指向（異形症進行度）を決められる。前記方法は検体から分離した一つ以上の核酸のメチル化状態を決めることを含み、前記一つ以上の核酸のメチル化工程は、膀胱組織の細胞成長性異常指向（異形症）がない検体から分離した核酸のメチル化工程と比較することを特徴とする。
【００２９】
例えば、核酸はＣＤＸ２（ＮＭ＿００１２６５、尾側型ホメオボックス転写因子２、caudal type homeobox transcription factor 2）；ＣＹＰ１Ｂ１（ＮＭ＿０００１０４、シトクロムＰ４５０，ファミリー１，サブファミリーＢ，ポリペプチド１、cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1）；ＶＳＸ１（ＮＭ＿１９９４２５、ビジュアルシステムホメオボックス１類似体，ＣＨＸ１０−類似（ゼブラフィッシュ）、visual system homeobox 1 homolog, CHX10-like (zebrafish)）；ＨＯＸＡ１１（ＮＭ＿００５５２３、ホメオボックスＡ１１、homeobox A11）；Ｔ（ＮＭ＿００３１８１、Ｔ，ブラキュウリー類似体（マウス）、T, brachyury homolog (mouse)）；ＴＢＸ５（ＮＭ＿０８０７１７、Ｔ−ボックス５、T-box 5）；ＰＥＮＫ（ＮＭ＿００６２１１、プロエンケファリン、proenkephalin）；及びＰＡＱＲ９（ＮＭ＿１９８５０４、プロゲスチン及びアディポネクチン受容体ファミリーメンバーＩＶ、progestin and adipoQ receptormember IV）；ＬＨＸ２（ＮＭ＿００４７８９）−Ｌｉｍホメオボックス２（LIM Homeobox 2）；ＳＩＭ２（Ｕ８０４５６）−シングル−マインディドホモログ２（ショウジョウバエ）（single-minded homolog 2 (Drosophila)）；遺伝子及びこれの組合せを挙げられる。
【００３０】
本発明のさらに他の実施の形態においては、前記メチル化遺伝子マーカーを利用して、膀胱癌を形成する可能性がある細胞の早期診断が可能である。癌細胞においてメチル化されると確認された遺伝子が臨床的、または形態学的に正常と見られる細胞でメチル化されると、前記正常と見られる細胞は癌化が進行している。従って、正常と見られる細胞での膀胱癌特異的遺伝子がメチル化を確認することで、膀胱癌を早期診断することができる。
【００３１】
本発明のメチル化マーカー遺伝子を利用すると、検体から膀胱組織の細胞成長性異常（異形成進行)を検出することができる。前記方法は検体から分離した一つ以上の核酸を含む試料を一つ以上のメチル化状態を決定できる試薬と接触させるのを含む。前記方法は一つ以上の核酸から一つ以上の部位のメチル化状態を確認することを含み、前記核酸のメチル化状態は膀胱組織の細胞成長性異常（異形性進行)を有しない検体の核酸での同じ部位のメチル化状態と差があることを特徴とする。
【００３２】
本発明のさらに他の実施の形態においては、前記キットまたは核酸チップを利用して、マーカー遺伝子のメチル化を調べることによって、形質転換された膀胱癌細胞を確認できる。
【００３３】
本発明のさらに他の実施の形態においては、前記キットまたは核酸チップを利用して、マーカー遺伝子のメチル化を調べることによって、膀胱癌を診断することができる。
【００３４】
本発明のさらに他の実施の形態においては正常表現型を表すサンプルを利用して、前記キットまたは核酸チップを利用して、マーカー遺伝子のメチル化を調べることによって、膀胱癌に進行される可能性を診断することができる。前記サンプルとしては固体または液体組織、細胞、尿、血清またはプラズマが用いることができる。
【００３５】
本発明はさらに他の側面において、臨床サンプル由来遺伝子プロモーターのメチル化を検出する方法に関する。
【００３６】
本発明において、前記メチル化測定方法は、ＰＣＲ、メチル化特異ＰＣＲ（methylation specific PCR）、リアルタイムメチル化特異ＰＣＲ（real time methylation specific PCR）、メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質を利用したＰＣＲ、定量ＰＣＲ、パイロシーケンス及びバイサルファイトシーケンシングからなる群から選択されることを特徴とし、前記臨床サンプルは、癌の疑いのある患者または診断対象由来の組織、細胞、血液または尿であることが好ましい。
【００３７】
本発明において、前記遺伝子のプロモーターメチル化の有無を検出する方法は次の工程を含む：（ａ）臨床サンプルからサンプルＤＮＡを分離する工程；（ｂ）前記分離したＤＮＡをＣＤＸ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＶＳＸ１、ＨＯＸＡ１１、Ｔ、ＴＢＸ５、ＰＥＮＫ、ＰＡＱＲ９、ＬＨＸ２及びＳＩＭ２からなる群から選択される遺伝子プロモーターのＣｐＧ島を含む断片を増幅できるプライマーを使用して増幅する工程；及び（ｃ）前記（ｂ）工程において増幅された結果の生成有無を基にプロモーターのメチル化の有無を決める工程。
【００３８】
本発明のさらに他の実施の形態においては膀胱癌から特異的にメチル化される遺伝子のメチル化頻度を調べ、膀胱癌進行の可能性を有する組織のメチル化頻度を定めることによって、組織の膀胱癌の発生の可能性を評価することができる。
【００３９】
本発明において使用した「細胞形質転換」は正常から非正常に、非腫瘍性から腫瘍性に、未分化から分化に、幹細胞から非幹細胞になどのように細胞の特徴がある形態から他の形態に変わることを意味する。さらに、前記形質転換は細胞の形態、表現型、生化学的性質などによって認識される。
【００４０】
本発明で癌の「早期診断」は、転移する前に癌の可能性を発見することであり、望ましくは検体組織または細胞において形態学的変化が観察される前に発見するものである。さらに、細胞形質転換の「早期診断」は、細胞が形質転換される形態になる前に初期工程において形質転換が生じる可能性が高いことをいう。
【００４１】
本発明において「ハイパーメチル化」はＣｐＧ島のメチル化を意味する。
本発明において、「サンプル」または「検体サンプル」は、遂行される分析の種類によって、一人一人、体液、細胞株、組織培養などから得られる全ての生物学的サンプルを含む幅広い範囲におけるサンプルを意味する。ほ乳動物から体液及び組織生検を獲得する方法は通常広く知られている。望ましいソースは膀胱の生検（biopsy）である。
【００４２】
メチル化調節バイオマーカーのスクリーニング
本発明においては、細胞または組織が形質転換されたり細胞の形態が異なる形態に変化する際にメチル化されるバイオマーカー遺伝子をスクリーニングした。ここで、「形質転換」細胞は正常形態が非正常形態に、非腫瘍性が腫瘍性に、未分化形態が分化形態に変わるなどの細胞または組織の形態が異なる形態に変化することを意味する。
【００４３】
本発明の一実施の形態においては、正常人及び膀胱癌患者の尿から尿中の細胞を分離した後、前記尿中の細胞からゲノムＤＮＡを分離した。ゲノムＤＮＡからメチル化されたＤＮＡだけを獲得するために、前記ゲノムＤＮＡをメチル化されたＤＮＡに結合するＭｃｒＢｔと反応させた後、ＭｃｒＢｔ蛋白質に結合するメチル化されたＤＮＡを分離した。前記分離したＭｃｒＢｔ蛋白質に結合するメチル化されたＤＮＡを増幅した後、正常人由来ＤＮＡはＣｙ３で、膀胱癌患者由来ＤＮＡはＣｙ５で標識した後、ヒトＣｐＧマイクロアレイにハイブリダイゼーションさせ正常人と膀胱癌患者との間のメチル化の程度の差が最も大きい１０個の遺伝子をバイオマーカーとして選択した。
【００４４】
本発明においては前記１０個のバイオマーカーがメチル化されたか否かを追加で確認するために、パイロシーケンスを行った。
【００４５】
即ち、膀胱癌細胞株ＲＴ−４、Ｊ８２、ＨＴ１１９７及びＨＴ１３７６からトータルゲノムＤＮＡを分離して、バイサルファイトで処理した。そして、バイサルファイトで転換されたゲノムＤＮＡを増幅した。以後、前記増幅されたＰＣＲ産物は、パイロシーケンス行われメチル化の程度を測定した。その結果、前記１０個のバイオマーカー遺伝子が全てメチル化されていたことを確認することができた。
【００４６】
膀胱癌に対するバイオマーカー
本発明においては膀胱癌診断のためのバイオマーカーを提供する。
【００４７】
膀胱癌に対するバイオマーカー−正常細胞との比較のための癌細胞の用途
本実施の形態において、「正常」細胞は非正常的細胞形態または細胞学的性質の変化を表さない細胞を意味する。「腫瘍」細胞は癌細胞を意味して、「非腫瘍」細胞は病症組織の一部であるが、腫瘍部位ではないと判断される細胞を意味する。
【００４８】
本発明は一側面において、膀胱癌と次に記載された１０個の遺伝子のプロモーターまたはエクソン部位ハイパーメチル化との間の関連性の発見に基づくものである：ＣＤＸ２（ＮＭ＿００１２６５、尾側型ホメオボックス転写因子２、caudal type homeobox transcription factor 2）；ＣＹＰ１Ｂ１（ＮＭ＿０００１０４、シトクロムＰ４５０，ファミリー１，サブファミリーＢ，ポリペプチド１、cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1）；ＶＳＸ１（ＮＭ＿１９９４２５、ビジュアルシステムホメオボックス１類似体，ＣＨＸ１０−類似（ゼブラフィッシュ）、visual system homeobox 1 homolog, CHX10-like (zebrafish)）；ＨＯＸＡ１１（ＮＭ＿００５５２３、ホメオボックスＡ１１、homeobox A11）；Ｔ（ＮＭ＿００３１８１、Ｔ，ブラキュウリー類似体（マウス）、T, brachyury homolog (mouse)）；ＴＢＸ５（ＮＭ＿０８０７１７、Ｔ−ボックス５、T-box 5）；ＰＥＮＫ（ＮＭ＿００６２１１、プロエンケファリン、proenkephalin）；及びＰＡＱＲ９（ＮＭ＿１９８５０４、プロゲスチン及びアディポネクチン受容体ファミリーメンバーＩＶ、progestin and adipoQ receptor family member IV）；ＬＨＸ２（ＮＭ＿００４７８９）−ＬＩＭホメオボックス２（LIM Homeobox 2）；ＳＩＭ２（Ｕ８０４５６）−シングル−マインディドホモログ２（ショウジョウバエ）（single-minded homolog 2 (Drosophila)）；遺伝子。
【００４９】
本発明の診断用キット及び核酸チップの他の用途として、検体から分離した一つ以上の核酸のメチル化工程を定めて、検体の膀胱組織の細胞成長性異常を早期診断することができる。前記一つ以上の核酸のメチル化工程は膀胱組織の細胞成長性異常を有しない検体から分離した一つ以上の核酸のメチル化状態と比較することを特徴とする。核酸はＣｐＧ島のようなＣｐＧ−含有核酸であることが望ましい。
【００５０】
本発明の診断用キット及び核酸チップの他の用途として、検体から分離した一つ以上の核酸のメチル化を決めることを含む検体の膀胱組織の細胞成長性異常素養を診断することができる。前記核酸はＣＤＸ２（ＮＭ＿００１２６５、尾側型ホメオボックス転写因子２、caudal type homeobox transcription factor 2）；ＣＹＰ１Ｂ１（ＮＭ＿０００１０４、シトクロムＰ４５０，ファミリー１，サブファミリーＢ，ポリペプチド１、cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1）；ＶＳＸ１（ＮＭ＿１９９４２５、ビジュアルシステムホメオボックス１類似体，ＣＨＸ１０−類似（ゼブラフィッシュ）、visual system homeobox 1 homolog, CHX10-like (zebrafish)）；ＨＯＸＡ１１（ＮＭ＿００５５２３、ホメオボックスＡ１１、homeobox A11）；Ｔ（ＮＭ＿００３１８１、Ｔ，ブラキュウリー類似体（マウス）、T, brachyury homolog (mouse)）；ＴＢＸ５（ＮＭ＿０８０７１７、Ｔ−ボックス５、T-box 5）；ＰＥＮＫ（ＮＭ＿００６２１１、プロエンケファリン、proenkephalin）；及びＰＡＱＲ９（ＮＭ＿１９８５０４、プロゲスチン及びアディポネクチン受容体ファミリーメンバーＩＶ、progestin and adipoQ receptor family IV）；ＬＨＸ２（ＮＭ＿００４７８９）−Ｌｉｍホメオボックス２（LIM Homeobox 2）；ＳＩＭ２（Ｕ８０４５６）−シングル−マインディドホモログ２（ショウジョウバエ）（single-minded homolog 2 (Drosophila)）；遺伝子及びそれらの組合せをコーディングすることを特徴にし、前記一つ以上の核酸のメチル化工程は膀胱組織の細胞成長性異常に対する素養を有しない検体から分離した一つ以上の核酸のメチル化状態と比較することを特徴とする。
【００５１】
前記「素養」は前記細胞成長性異常にかかりやすい性質を意味する。素養を有する検体は、まだ細胞成長性異常を有しないが、細胞成長性異常が存在したり、存在する傾向が増加した検体のことをいう。
【００５２】
本発明は他の側面において、検体の核酸を含む試料を試料のメチル化状態を決定できる試薬と接触させて、一つ以上の核酸の一つ以上の部位のメチル化を確認するのを含む検体の膀胱組織の細胞成長性異常を診断する方法を提供する。ここで、一つ以上の核酸の一つ以上の部位のメチル化の状態が、細胞成長性異常を持たない検体の同じ核酸の同じ部位のメチル化の状態と違ったことが指標となる。
【００５３】
本発明の方法は検体から分離した一つ以上の核酸の一つ以上の部位のメチル化を決める工程を含む。ここで、「核酸」または「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドを意味したり、又はこれらのいずれかの断片、単鎖または二重鎖のゲノム起原または合成起原のＤＮＡまたはＲＮＡ、センスまたはアンチセンス鎖のゲノム起原または合成起原のＤＮＡまたはＲＮＡ、ＰＮＡ（peptide nucleic acid）または自然起原または合成起原のＤＮＡ様またはＲＮＡ様物質をいう。核酸がＲＮＡであると、デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ及びＴの代わりに、各々リボヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ及びＵに代替されることは当該分野において通常の知識を有する者には明らかである。
【００５４】
互いに異なるようにメチル化されたＣｐＧ島の存在を検出できる核酸なら、いずれのものも使用できる。前記ＣｐＧ島は核酸配列においてＣｐＧが豊富な部位である。
【００５５】
メチル化（methylation）
本発明における精製されたり精製されない形態のいかなる核酸も使用され、ターゲット部位（例えば、ＣｐＧ−含有核酸）を含有する核酸配列を含有していたり含有すると疑われるいかなる核酸も使用可能である。差別的にメチル化できる核酸部位がＣｐＧ島であり、これは他のジヌクレオチドＣｐＧ核酸部位と比較して高いＣｐＧ密度を有する核酸配列である。二重（doublet）ＣｐＧはＧ＊Ｃ塩基対の割合で予測した時、脊椎動物ＤＮＡにおいてただ２０％程度の確率で現れる。特定部位において、二重ＣｐＧの密度はゲノムの他の部位と比較して、１０倍も高い。ＣｐＧ島は平均Ｇ＊Ｃ比が約６０％であり、普通のＤＮＡのＧ＊Ｃ比は平均４０％を示す。ＣｐＧ島は典型的に約１〜２ｋｂの長さを有し、ヒトゲノムには約４５，０００個のＣｐＧ島が存在する。
【００５６】
多様な遺伝子において、ＣｐＧ島はプロモーターのアップストリーム（upstream）から始まって、ダウンストリームの転写部位まで拡張される。プロモーターにおけるＣｐＧ島のメチル化は普通遺伝子の発現を抑制させる。ＣｐＧ島はさらに遺伝子コーディング部位の３’部位だけでなく、遺伝子コーディング部位の５’部位を囲める。従って、ＣｐＧ島はプロモーター部位を含む調節部位のコーディング配列アップストリーム、コーディング部位（例えば、エクソン領域）、コーディング部位のダウンストリーム、例えば、インヘンス部位及びイントロンを含む多様な部位において発見される。
【００５７】
通常、ＣｐＧ−含有核酸はＤＮＡである。しかし、本発明の方法は、例えば、ＤＮＡまたはＤＮＡとｍＲＮＡを含むＲＮＡを含有する試料を適用することができ、ここでＤＮＡまたはＲＮＡは単鎖または二重鎖であり、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含有した試料であることができる。
【００５８】
核酸混合物も使用できる。検出される特異的な核酸配列は大きい分子の分画であってもよく、最初から特異配列が全体核酸配列を構成する分離した分子形態で存在してもよい。前記核酸配列は純粋な形態で存在する核酸である必要はなく、核酸はトータルヒトＤＮＡが含まれているように複雑な混合物内の小さい分画であってもよい。試料に含まれた核酸のメチル化の程度を測定するのに使用されたり、メチル化されたＣｐＧ島を検出するのに使用される試料に含まれた核酸はＳａｍｂｒｏｏｋなど（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY., 1989）に記載された多様な方法で抽出される。
【００５９】
核酸は情報をコードしたり核酸の転写を調節するＤＮＡ部位の調節部位を含むことができる。調節部位は少なくとも一つのプロモーターを含む。「プロモーター」は転写を指示するための必要最小限の配列で、プロモーター依存性遺伝子において細胞タイプ特異的、組織特異的、または外部シグナルや試薬による誘導性を調節することができる。プロモーターは遺伝子の５’または３’部位に位置する。プロモーター部位の全体的または部分的な核酸数は、ＣｐＧ島部位のメチル化を測定するのに適用される。ターゲット遺伝子プロモーターのメチル化は外周辺から内部へ進行する。従って、細胞転換の初期工程はプロモーター部位の外周辺におけるメチル化を分析することによって検出することができる。
【００６０】
検体から分離した核酸は検体の生物学的試料によって得られる。膀胱癌や膀胱癌の進行工程を診断したいのなら、スクラップや生検で膀胱組織から核酸を分離しなければならない。このような試料は当該分野において知られている多様な医学的過程によって得られる。
【００６１】
本発明の一様態において、検体から得られたサンプルの核酸のメチル化の程度は膀胱組織の細胞成長性異常がない検体の同一核酸の部分と比較して、測定する。ハイパーメチル化は一つ以上の核酸でメチル化された対立遺伝子が存在することをいう。膀胱組織の細胞成長性異常がない検体は同一核酸を検査した時、メチル化対立遺伝子が現れない。
【００６２】
サンプル（sample）
本発明は膀胱癌の早期診断に対し記述しており、膀胱癌特異的遺伝子メチル化を利用している。膀胱癌特異的遺伝子のメチル化は腫瘍部位の付近組織においても起きた。従って、膀胱癌の早期診断方法は液体または固体組織を含む全てのサンプルで膀胱癌特異的遺伝子のメチル化の有無を確認できる。前記サンプルは組織、細胞、尿、血清またはプラズマを含むが、これに限定されない。
【００６３】
個別遺伝子及びパネル
本発明は診断または予測マーカーとして各遺伝子を個別的に使ったり、いくつかのマーカー遺伝子を組み合わせて、パネルディスプレイ形態にして使用でき、いくつかのマーカー遺伝子は全体的なパターンまたはメチル化された遺伝子の目録を通して、信頼性及び効率性を向上させることを確認できる。本発明において確認された遺伝子は個別的に、または本実施の形態において言及された遺伝子が組合わされた遺伝子セットとして使用できる。または、遺伝子は共にメチル化された遺伝子の数及びその重要度により順位付けして、重み付けられ、癌に発展する可能性のレベルを選定することができる。このようなアルゴリズムは本発明に属する。
【００６４】
メチル化検出方法
メチル化特異ＰＣＲ（methylation specific PCR）
ゲノムＤＮＡにバイサルファイトで処理された場合、５’−ＣｐＧ’−３部位のシトシンがメチル化された場合にはそのままシトシンとして残り、非メチル化された場合にはウラシルに変わるようになる。従って、バイサルファイト処理後変換された塩基配列を対象に５’−ＣｐＧ−３’塩基配列が存在する部位に該当するＰＣＲプライマーを作製した。この時、メチル化されたケースに該当するＰＣＲプライマーと非メチル化されたケースに該当する二つの種類のプライマーを作製した。ゲノムＤＮＡをバイサルファイトに変換させた後、前記二つの種類のプライマーを利用してＰＣＲを行うとメチル化された場合にはメチル化された塩基配列に該当するプライマーを使用したものからＰＣＲ産物が作られるようになり、逆に非メチル化である場合には非メチル化に該当するプライマーを利用したものからＰＣＲ産物が作られる。メチル化の有無はアガロース・ゲル電気泳動方法で定性的に確認できる。
【００６５】
リアルタイムメチル化特異ＰＣＲ（real time methylation specific PCR）
リアルタイムメチル化特異ＰＣＲはメチル化特異ＰＣＲ方法をリアルタイム測定方法に転換したもので、ゲノムＤＮＡにバイサルファイトで処理した後、メチル化されたケースに該当するＰＣＲプライマーをデザインして、これらプライマーを利用して、リアルタイムＰＣＲを行うものである。この時、増幅された塩基配列と相補的なＴａｎＭａｎプローブを利用して検出する方法とＳｙｂｅｒｇｒｅｅｎを利用して検出する方法の二つの方法がある。従って、リアルタイムメチル化特異ＰＣＲはメチル化されたＤＮＡだけを選択的に定量分析できる。この時、インビトロ・メチル化ＤＮＡサンプルを利用して、標準曲線を作成し、標準化のために塩基配列内に５’−ＣｐＧ−３’配列がない遺伝子を陰性対照群として共に増幅してメチル化の程度の定量分析を行った。
【００６６】
パイロシーケンス
パイロシーケンス法はバイサルファイトシーケンシング法を定量的なリアルタイムシーケンスに変換した方法である。バイサルファイトシーケンシング同様にゲノムＤＮＡをバイサルファイトを処理して、転換させた後、５’−ＣｐＧ−３’塩基配列がない部位に該当するＰＣＲプライマーを作製した。ゲノムＤＮＡをバイサルファイトで処理した後、前記ＰＣＲプライマーで増幅した後、シーケンスプライマーを利用して、リアルタイム塩基配列分析を行った。５’−ＣｐＧ−３’部位においてシトシンとチミンの量を定量的に分析してメチル化の程度をメチル化指数として示した。
【００６７】
メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質を利用したＰＣＲ、または定量ＰＣＲ及びＤＮＡチップ
メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質を利用したＰＣＲまたはＤＮＡチップ方法はメチル化ＤＮＡにだけ特異的に結合する蛋白質をＤＮＡと混ぜると、メチル化ＤＮＡにだけ特異的に蛋白質が結合するためメチル化ＤＮＡだけを選択的に分離することができる。ゲノムＤＮＡをメチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質と混ぜた後、メチル化されたＤＮＡだけを選択的に分離した。これら分離したＤＮＡをプロモーター部位に該当するＰＣＲプライマーを利用して増幅した後、アガロース電気泳動でメチル化の有無を測定した。
【００６８】
また、定量ＰＣＲ方法によってもメチル化の有無を測定可能で、メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質で分離したメチル化ＤＮＡは蛍光染料で標識して、相補的なプローブが集積されたＤＮＡチップにハイブリタイゼーションさせることでメチル化の有無を測定することができる。ここでメチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質はＭｃｒＢｔに限られない。
【００６９】
差別的メチル化の検出−メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ
差別的メチル化の検出はメチル化されないＣｐＧ部位だけを切断するメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼと核酸サンプルを接触させて非メチル化された核酸を切断することで遂行できる。
別の反応で、前記サンプルをメチル化及び非メチル化ＣｐＧ部位を全て切断するメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼのアイソシゾマー（isoschizomer）と接触させて、メチル化された核酸を切断した。
【００７０】
特異的プライマーを核酸サンプルに添加し、通常の方法で核酸を増幅させた。メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで処理したサンプルにおいて増幅産物が存在して、メチル化及び非メチル化ＣｐＧ部位を全て切断するメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼのアイソシゾマーで処理したサンプルにおいて増幅産物が存在しないことは、分析された核酸部位にメチル化が起きたはずである。しかし、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで処理したサンプルにおいて増幅産物が存在しなく、メチル化及び非メチル化ＣｐＧ部位を全て切断するメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼのアイソシゾマーで処理したサンプルにおいても増幅産物が存在しないということは、分析された核酸部位にメチル化が起きなかったことになる。
【００７１】
ここで、「メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ」は認識部位にＣＧを含み、Ｃがメチル化しなかった時と比較してＣがメチル化した時、変化した活性を有する制限酵素である（例えば、ＳｍａＩ）。メチレーション敏感性制限エンドヌクレアーゼの非制限的例として、ＭｓｐＩ、ＨｐａＩＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＵＩ及びＮｏｔＩが含まれる。前記酵素は単独または組み合わせで使用される。他のメチレーション感受性制限エンドヌクレオチドとしては、例えば、ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩが挙げられるがこれに限定されない。
【００７２】
メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼのイソシゾマーはメチレーション感受性制限エンドヌクレアーゼと同一認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼであるが、メチル化されたＣＧｓと非メチル化されたＣＧｓを全て切断し、例えば、ＭｓｐＩが挙げられる。
【００７３】
本発明のプライマーは増幅される遺伝子座の各鎖と「実質的に」相補性を持つように作製されて、前記説明した通り、適当なＧまたはＣヌクレオチドを含む。これは重合反応を行う条件でプライマーが対応する核酸鎖とハイブリダイゼーションされるに十分な相補性を有することを意味する。本発明のプライマーは増幅過程に使用され、前記増幅過程は、例えば、ＰＣＲと同じ、ターゲット遺伝子座が多くの反応工程を経ながら、幾何級数的に増加する酵素連続反応である。典型的には、一つのプライマー（アンチセンスプライマー）は遺伝子座のネガティブ（−）鎖に対し相同性を有し、残り一つのプライマー（センスプライマー）はポジティブ（＋）鎖に対し相同性を有する。変成された核酸にプライマーがアニーリングされると、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）及びヌクレオチドのような酵素及び反応物によって、鎖が伸張して、その結果、ターゲット遺伝子座配列を含有する＋と−の鎖が新しく合成される。前記新しく合成されたターゲット遺伝子座が鋳型としても使用され、変成、プライマーアニーリング及び鎖伸張のサイクルが繰り返されるとターゲット遺伝子座配列の幾何級数的な合成が進行される。前記連続反応の産物は反応に使用された特異プライマーの末端と対応する末端を有する独立的な二重鎖核酸である。
【００７４】
前記増幅反応は当該分野において普遍的に使用されているＰＣＲであることが望ましい。しかし、リアルタイムＰＣＲまたは等温酵素を使用した線形増幅のような代替方法も使用でき、マルチプレックス増幅反応も使用できる。
【００７５】
差別的メチル化の検出−バイサルファイトシーケンシング方法
メチル化ＣｐＧを含有した核酸を検出する他の方法は核酸を含有した試料を非メチル化シトシンを変形（modifies）させる試薬と接触させる工程及びＣｐＧ−特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、試料のＣｐＧ−含有核酸を増幅させる工程を含む。ここで、前記オリゴヌクレオチドプライマーは変形されたメチル化及び非メチル化核酸を区別してメチル化核酸を検出することを特徴にする。前記増幅工程は選択的であり、望ましいが必須ではない。前記方法は変形された（例えば、化学的に変形された）メチル化及び非メチル化ＤＮＡを区別するＰＣＲ反応に依存するものである。前記のような方法は米国特許５，７８６，１４６に開示されており、前記特許にはメチル化核酸の検出のためのバイサルファイト（bisulfite）シーケンシングと関連して記載されている。
【００７６】
基質
ターゲット核酸部位が増幅されると核酸配列の存在を検出するために、前記核酸増幅産物は固体支持体（基質）に固定された既知の遺伝子プローブとハイブリダイゼーションできる。
【００７７】
ここで、「基質」は物質、構造、表面、または材料、非生物学的で、合成されて、無生物、平面、球形、または特異的結合、平らな表面の物質を含む混合物手段であり、ハイブリダイゼーションまたは酵素認識部位または多くの他の認識部位または表面、構造または材料から構成された数多くの他の分子種を越える数多くの他の認識部位を含んでもよい。前記基質は、例えば、半導体、（有機）合成メタル、合成半導体、インシュレーター及びトーパント；金属、合金、元素、化合物及びミネラル；合成され、分解され、エッチングされ、リソグラフされ、プリントされ、マイクロファブリケイトされたスライド、装置、構造及び表面；産業的、ポリマー、プラスチック、メンブレン、シリコン、シリケート、ガラス、金属及びセラミック；木、紙、カードボード、綿、ウール、布、製織及び非製織繊維、材料及びファブリックであるが、これに限定されるのではない。
【００７８】
いくつかの形態のメンブレンは当該分野において核酸配列に対し付着力を有すると知られている。このようなメンブレンの特異的でかつ非制限的な例としてニトロセルロースまたはポリビニルクロライド、ジアゾ化された（diazotized）ペーパー及びＧＥＮＥＳＣＲＥＥＮ（商品名）、ＺＥＴＡＰＲＯＢＥ（商品名）（Ｂｉｏｒａｄ）及びＮＹＴＲＡＮ（商品名）などの商業的に使用されるメンブレンのように遺伝子発現検出用メンブレンが挙げられる。ビーズ、グラス、ウェハー及び金属基質も含まれる。このような目的物に核酸を付ける方法は当該分野においてよく知られている。これとは異なり、液相においてもスクリーニングを遂行できる。
【００７９】
ハイブリダイゼーション条件
核酸ハイブリダイゼーション反応において、厳格な特定水準を達成するために使用される条件はハイブリダイズされる核酸の性質により多様である。例えば、ハイブリダイゼーションされる核酸部位の長さ、相同性程度、ヌクレオチド配列組成（例えば、ＧＣ／ＡＴコンテンツ）及び核酸タイプ（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）などがハイブリダイゼーション条件を選択するのに考慮される。追加的な考慮条件は核酸が、例えば、フィルターなどに固定化されているか否かである。
【００８０】
非常に厳格に進行される条件は、例えば次のようになる：室温の２Ｘ  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（ハイブリダイゼーション条件）；室温の０．２Ｘ  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（厳格性が低い条件）；４２℃での０．２Ｘ  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（普通の厳格性を有する条件）；６８℃で０．１Ｘ  ＳＳＣ（高い厳格性を有する条件）。洗浄過程はこれらの中一つの条件を使用して遂行でき、例えば高い厳格性を有する条件、または前記条件を各々使用でき、前記記載された順に各々１０〜１５分ずつ、前記記載された条件を全部または一部繰り返して遂行できる。しかし前記に記述した通り、最適条件は、含まれた特別なハイブリダイゼーション反応に依存し多様であり、実験を通して決められる。一般に、重要なプローブのハイブリダイゼーションには高い厳格性を有する条件が使用される。
【００８１】
標識（Label）
重要なプローブは検出することができるように標識され、例えば放射線同位元素、蛍光化合物、バイオ発光化合物、化学発光化合物、金属キレートまたは酵素で標示される。前記のようなプローブを適当に標示するのは当該分野において広く知られた技術であり、通常の方法を通して遂行できる。
【００８２】
キット（Kit）
本発明によると、検体の細胞成長性異常を検出するのに有用なキットを提供している。本発明のキットはサンプルを入れる区切られたキャリア手段、非メチル化シトシンを鋭敏に切断する試薬を含有する１番目の容器、ＣｐＧ含有核酸を増幅するためのプライマーを含有する２番目の容器及び切断または切断されていない核酸の存在を検出する手段が含まれた３番目の容器を含む一つ以上の容器を含む。本発明により使用されるプライマーは配列番号１〜２０に記載された配列、機能的組合せ及びその断片を含む。機能的組合せ、または断片はゲノム上においてメチル化が起きたか否かを検出するプライマーとして使用される。
【００８３】
キャリア手段は、瓶、チューブのような一つ以上の容器を含有するのに適し、各容器は本発明の方法に使用される独立的構成要素を含有する。本発明の明細書において、当該分野の通常の知識を有する者は容器中の必要な試薬を容易に分配することができる。例えば、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼを含有する容器を一つの容器で構成することができる。一つ以上の容器は重要核酸遺伝子座と相同性を有するプライマーを含むことができる。また、一つ以上の容器はメチル化感受性制限酵素のアイソシゾマーを含むことができる。
【実施例】
【００８４】
以下、本発明を実施例によって、より一層詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されないことは当業界において通常の知識を有する者においては明白であろう。
【００８５】
［実施例１］膀胱癌特異的メチル化遺伝子の発見
膀胱癌から特異的にメチル化されたバイオマーカーを選別するために、膀胱癌患者１０人及び正常人１０人の尿を約２０ｍＬを各々４，２００×ｇで１０分間遠心分離（韓日科学）して、尿中の細胞を分離した。上層液を捨て、ＰＢＳ５ｍＬを利用して、細胞沈殿物を２回洗浄した後、前記細胞沈殿物からＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，ＵＳＡ）を使用してゲノムＤＮＡを分離した。前記分離したゲノムＤＮＡ５００ｎｇを超音波粉砕（Ｖｉｂｒａ  Ｃｅｌｌ，ＳＯＮＩＣＳ）して、約２００〜３００ｂｐのゲノムＤＮＡ切片を作製した。
【００８６】
ゲノムＤＮＡからメチル化されたＤＮＡだけを獲得するために、メチル化ＤＮＡに結合すると知られているメチル結合ドメイン（Methyl binding domain；ＭＢＤ）（Fraga et al., 2003, Nucleic Acid Res., 31: 1765-1774）を使用した。即ち、６Ｘ  ＨｉｓタグＭＢＤ２μｇを大腸菌ＪＭ１１０（韓国生命工学研究院生命資源センター，Ｎｏ．２６３８）ゲノムＤＮＡ５００ｎｇとプレインキュベーションさせた後、Ｎｉ−ＮＴＡマグネチックビーズ（Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）に結合させた。これに前記超音波粉砕された正常人及び膀胱癌患者尿中の細胞から分離したゲノムＤＮＡ５００ｎｇを結合反応溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、５％グリセロール、２５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）下で４℃、２０分間反応させた後、７００ｍ  ＭＮａＣｌが含まれた結合反応溶液５００ｍＬを利用して、３回洗浄した後、ＭＢＤに結合されたメチル化されたＤＮＡをＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，ＵＳＡ）を使用して分離した。
【００８７】
以後、前記ＭＢＤに結合されたメチル化されたＤＮＡをゲノム増幅キット（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＷＧＡ２）を利用して増幅した後、前記増幅されたゲノムＤＮＡ４μｇをバイオプライム・トータルジェノミック・ラベリングシステムＩ（BioPrime Total Genomic Labeling system I）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ）を利用して、正常人由来ＤＮＡはＣｙ３、膀胱癌患者由来ＤＮＡはＣｙ５で標識した。前記正常人及び膀胱癌患者のＤＮＡを混合した後、２４４ＫヒトＣｐＧマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＵＳＡ）にハイブリダイゼーションさせた（図１）。前記ハイブリダイゼーション後、一連の洗浄過程を経た後、アジレントスキャナー（Agilent scanner）を利用してスキャニングした。マイクロアレイイメージからシグナルの計算はフューチャーイクストラクションプログラム（Feature Extraction program）ｖ．９．５．３．１（Ａｇｉｌｅｎｔ）を利用して、正常人と膀胱癌患者試料との間シグナルの相対的な強度差を計算した。
【００８８】
正常においてメチル化されないスポットを選択するために、全体Ｃｙ３シグナル値の平均を求めた後、この平均の１０％以下のシグナルを有するスポットを正常人の試料からメチル化されないと見なした。その結果、Ｃｙ３シグナル値が６５以下である４１，６７４個のスポットを求めた。
【００８９】
前記スポットの中から再び膀胱癌患者の試料からメチル化されたスポットを求めるために、Ｃｙ５シグナル値が１３０以上のスポットを膀胱癌からメチル化されたスポットと見なした。その結果、Ｃｙ５シグナル値が１３０以上である６３１個のスポットを求めった。前記スポットからプロモーター部位に該当する２２７個の遺伝子を膀胱癌特異的メチル化遺伝子として確保した。
【００９０】
これから正常人と膀胱癌患者との間にメチル化の程度の相対的な差が最も大きい１０個の遺伝子（ＣＤＸ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＶＳＸ１６、ＨＯＸＡ１１、Ｔ、ＴＢＸ５、ＰＥＮＫ、ＰＡＱＲ９、ＬＨＸ２、ＳＩＭ２）を選択して、ＭｅｔｈＰｒｉｍｅｒ（http://itsa.ucsf.edu/~urolab/methprimer/index1.html）を利用して、前記１０個の遺伝子のプロモーター部位にＣｐＧ島が存在することを確認し、これらを膀胱癌診断のためメチル化バイオマーカーとして確保した。前記１０個の遺伝子リストと正常人対応膀胱癌患者尿中の細胞における相対的なメチル化の程度を表１に示す。
【００９１】
【表１】
0005820364.tif 000002
【００９２】
［実施例２］癌細胞株におけるバイオマーカー遺伝子のメチル化測定
前記１０個の遺伝子のメチル化状態を、更に確認するために、各々のプロモーターに対してバイサルファイトシーケンシングを行った。
【００９３】
バイサルファイト（bisulfite）を利用してメチル化されないシトシンをウラシルに変形するために、膀胱癌細胞株ＲＴ−４（（韓国細胞株銀行（ＫＣＬＢ）３０００２）、Ｊ８２（ＫＣＬＢ３０００１）、ＨＴ１１９７（ＫＣＬＢ２１４７３）及びＨＴ１３７６（ＫＣＬＢ２１４７２）からトータルゲノムＤＮＡを分離して、そのゲノムＤＮＡ２００ｎｇにＥＺ  ＤＮＡメチレーション−ゴールドキット（EZ DNA methylation-Gold kit）（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）を利用して、バイサルファイトで処理した。ＤＮＡをバイサルファイトで処理すると、非メチル化されたシトシンはウラシルに変形され、メチル化されたシトシンは変化なしに残るようになる。前記バイサルファイトで処理されたＤＮＡを滅菌蒸溜水２０μＬに溶解させてパイロシーケンス（pyrosequencing）を行った。
【００９４】
前記１０個の遺伝子に対するパイロシーケンスを行うためのＰＣＲ及びシーケンスプライマーはＰＳＱアッセイデザイン（PSQ assay design）プログラム（Ｂｉｏｔａｇｅ，ＵＳＡ）を利用して設計した。各遺伝子のメチル化測定のためＰＣＲ及びシーケンスプライマーは下記表２及び表３のようになる。
【００９５】
【表２】
0005820364.tif 000003
【００９６】
【表３】
0005820364.tif 000004
【００９７】
前記バイサルファイトで転換されたゲノムＤＮＡ２０ｎｇをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ反応溶液（バイサルファイトで転換されたゲノムＤＮＡ２０ｎｇ、１０Ｘ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，Ｋｏｒｅａ）５μＬ、Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，Ｋｏｒｅａ）５ｕｎｉｔｓ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｓｏｌｇｅｎｔ，Ｋｏｒｅａ）４μＬ、ＰＣＲプライマー２μＬ（１０ｐｍｏｌｅ／μＬ））を９５℃で５分間処理した後、９５℃で４０秒、６０℃で４５秒、７２℃で４０秒と合わせて４５回実施した後、７２℃で５分間反応させた。前記ＰＣＲ産物の増幅の有無は２．０％アガロース・ゲルを使用した電気泳動で確認した。
【００９８】
前記増幅されたＰＣＲ産物をＰｙｒｏＧｏｌｄ試薬（Ｂｉｏｔａｇｅ，ＵＳＡ）で処理した後、ＰＳＱ９６ＭＡシステム（Ｂｉｏｔａｇｅ，ＵＳＡ）を利用してパイロシーケンスを行った。前記パイロシーケンス後、メチル化指数（methylation index）を計算することによってメチル化の程度を測定した。メチル化指数は各ＣｐＧ部位においてシトシンが結合する平均率を求めて計算した。
【００９９】
図２は１０個のバイオマーカーの膀胱癌細胞株におけるメチル化の程度を、パイロシーケンス方法を利用して、定量的に示したものである。その結果、前記１０個のバイオマーカー遺伝子のすべてが少なくとも１個以上の細胞株において高い水準でメチル化されていることを確認した。表４では前記１０個の遺伝子のプロモーターの配列を示したものである。
【０１００】
【表４】
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【０１０１】
［実施例３］膀胱癌患者の尿中の細胞におけるバイオマーカー遺伝子のメチル化測定
前記１０個の遺伝子を膀胱癌診断用バイオマーカーとして使用できるのか検証するために、正常人２０人及び膀胱癌患者１９人の尿約２０ｍＬを４，２００×ｇで１０分間遠心分離（韓日科学）して、細胞を分離した。上層液を捨て、ＰＢＳ５ｍＬを利用して細胞沈殿物を２回洗浄した。前記洗浄された細胞からＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡミニキット（QIAamp DNA Mini kit）（ＱＩＡＧＥＮ，ＵＳＡ）を使用してゲノムＤＮＡを分離した後、前記分離したゲノムＤＮＡ２００ｎｇにＥＺ  ＤＮＡメチレーション−ゴールドキット（EZ DNA methylation-Gold kit）（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）を利用して、バイサルファイトで処理した後、滅菌蒸溜水２０μＬに湧出してパイロシーケンスに使用した。
【０１０２】
前記バイサルファイトで転換されたゲノムＤＮＡ２０ｎｇをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ反応溶液（バイサルファイトで転換されたゲノムＤＮＡ２０ｎｇ、１０Ｘ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μＬ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，Ｋｏｒｅａ）、Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ５ｕｎｉｔｓ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，Ｋｏｒｅａ）、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ４μＬ（Ｓｏｌｇｅｎｔ，Ｋｏｒｅａ）、ＰＣＲプライマー２μＬ（１０ｐｍｏｌｅ／μＬ））を９５℃で５分間処理した後、９５℃で４０秒、６０℃で４５秒、７２℃で４０秒と合わせて４５回実施した後、７２℃で５分間反応させた。前記ＰＣＲ産物の増幅の有無は２．０％アガロース・ゲルを使用した電気泳動で確認した。
【０１０３】
前記増幅されたＰＣＲ産物をＰｙｒｏＧｏｌｄ試薬（Ｂｉｏｔａｇｅ，ＵＳＡ）で処理した後、ＰＳＱ９６ＭＡシステム（Ｂｉｏｔａｇｅ，ＵＳＡ）を利用してパイロシーケンスを行った。パイロシーケンス後、メチル化の程度はメチル化指数（methylation index）を計算することによって測定した。メチル化指数は各ＣｐＧ部位においてシトシンが結合する平均率を求めて計算した。また、正常人と膀胱癌患者の尿中の細胞ＤＮＡにおけるメチル化指数を測定した後、膀胱癌患者診断のためメチル化指数カットオフ（cut-off）をＲＯＣ（receiver operating characteristic）カーブ分析によって決めた。
【０１０４】
図３は前記１０個のバイオマーカー遺伝子の尿中の細胞におけるメチル化を測定した結果である。正常に比べて膀胱癌患者の試料においてメチル化の程度が高く増加することが見られる。一方、膀胱炎患者と血尿患者においてはメチル化の程度が正常対照群と類似するか稀に正常より高い水準を見せる場合もある。図４は膀胱癌診断のためカットオフ値を求めるためのＲＯＣカーブ分析結果を示したものである。また、ＲＯＣカーブ分析の結果、計算された１０個のバイオマーカーに対するメチル化指数カットオフ値を表５に示した。
【０１０５】
【表５】
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【０１０６】
前記１０個のバイオマーカーのメチル化分析は各バイオマーカーの臨床試料におけるメチル化指数を求め、これからＲＯＣ（receiver operating characteristic）カーブ分析を通して得た膀胱癌を診断するためのメチル化指数が前記カットオフより高い場合をメチル化陽性と判定し、それ以下の場合には陰性と判定した。
【０１０７】
表６及び図５に示された通り、ＲＯＣカーブ分析の結果、得られたカットオフを基準にした場合、正常人の尿中の細胞においては１０個のバイオマーカー全部がメチル化陰性を示したが、膀胱癌患者では１２．５％〜６２．５％のメチル化陽性頻度を示した。また、統計的な分析を行った結果、１０種のバイオマーカーの中９個が正常に比べて、膀胱癌において有意に（ｐ＜０．０１）メチル化陽性を示すことが確認できた。これは前記１０個のメチル化バイオマーカー中９個は膀胱癌において統計的に有意に特異的にメチル化されて、膀胱癌の診断に有用性が非常に高いことを示す。
【０１０８】
【表６】
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【０１０９】
［実施例４］６個のバイオマカーパネル遺伝子の膀胱癌診断の能力評価
前記１０個のメチル化バイオマーカーを利用して、膀胱癌を診断するための最適のパネルの組合せをロジスティック回帰（logistic regression）分析を行って、６個の遺伝子のパネルを求めた。図６Ａは６個のメチル化バイオマーカー（ＣＹＰ１Ｂ１、ＨＯＸＡ１１、ＳＩＭ２、ＰＥＮＫ、ＬＨＸ２及びＴＢＸ５）のメチル化状態を示したものである。実施例３に記述された方法でメチル化陽性及び陰性を判定した場合、これら６個のバイオマーカー遺伝子は正常試料においては全くメチル化されていなく、膀胱癌試料だけにおいて特異的にメチル化陽性を示すことが分かる。特に早期膀胱癌においても高い頻度のメチル化陽性を示すことによって、早期診断に対する有用性が高いことが示された。これら６個の遺伝子をパネルとし、６個の遺伝子中少なくとも１個の遺伝子でもメチル化された場合に膀胱癌として診断する場合、早期膀胱癌に対する感度及び特異性は各々８４．０％と１００％と非常に優秀であった（図６Ｂ）。さらに、進行型膀胱癌診断に対する感度及び特異性は各々８５．７％と１００％と測定された（図６Ｂ）。また、早期及び進行型膀胱癌全体に対する感度及び特異性は８４．４％と１００％と測定されて、これら６個の遺伝子のメチル化を利用した膀胱癌早期診断の有用性が非常に高いことが示された。
【０１１０】
［実施例５］メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質を利用したバイオマーカー遺伝子のメチル化測定
膀胱癌で特異的にメチル化されるバイオマーカーのメチル化の有無を測定するために、膀胱癌細胞株ＲＴ２４及びＨＴ１１９７のゲノムＤＮＡ１００ｎｇを超音波粉砕（Ｖｉｂｒａ  Ｃｅｌｌ，ＳＯＮＩＣＳ）して、約２００〜４００ｂｐのゲノムＤＮＡ切片を取得した。
【０１１１】
前記ゲノムＤＮＡからメチル化されたＤＮＡだけを獲得するために、メチル化ＤＮＡに結合すると知られているＭＢＤを使った。即ち、６Ｘ  ＨｉｓタグＭＢＤ２μｇを大腸菌ＪＭ１１０（韓国生命工学研究院生命資源センター，Ｎｏ．２６３８）ゲノムＤＮＡ５００ｎｇとプレインキュベートさせた後、Ｎｉ−ＮＴＡマグネチックビーズ（Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）に結合させた。これに前記超音波粉砕されたゲノムＤＮＡ１００ｎｇを結合反応溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、５％グリセロール、２５ｍｇ／μＬ  ＢＳＡ）下で４℃、２０分間反応させた後、７００ｍＭ  ＮａＣｌが含まれた結合反応溶液５００μＬを利用して、３回洗浄した後、ＭＢＤに結合されたメチル化されたＤＮＡをＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，ＵＳＡ）を使用して分離した。
【０１１２】
以後、前記ＭＢＤに結合したメチル化されたＤＮＡをＳＩＭ２遺伝子のプロモーター部位（−６８４２〜−６７７５ｂｐ）に相応する配列番号４１及び配列番号４２のプライマーを利用してＰＣＲを行った。
【０１１３】
配列番号４１：5'-TTC TTA TTC TCA CCA GAC ATC TCA ACA CCC-3'
配列番号４２：5'-ATC TCC CAT CCT CCC TCC CAC TCT C-3'
【０１１４】
ＰＣＲ条件は９４℃で５分、９４℃で３０秒間処理した後、６２℃で３０秒、７２℃で３０秒と合わせて４０回実施した後、７２℃で５分間反応させた。前記ＰＣＲ産物の増幅の有無は２％アアガロース・ゲルを使用した電気泳動で確認した。
【０１１５】
その結果、ＳＩＭ２遺伝子はＲＴ２４細胞株ゲノムＤＮＡだけにおいて１６８ｂｐに該当する増幅産物が検出されてメチル化されたことが確認されたのに対して、ＨＴ１１９７細胞株においては増幅産物が検出されなくてメチル化されなかったと確認された（図７）。前記結果はパイロシーケンス方法で確認したメチル化の測定結果と一致する結果である。このような結果はＭＢＤを利用してメチル化ＤＮＡの検出が可能であることを示す。
【０１１６】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者には、このような具体的技術は単なる望ましい実施様態に過ぎなく、これによって、本発明の範囲が制限されるのではない点は明白であろう。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とそれらの等価物によって定義される。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
以上、詳細に説明したように、本発明は膀胱癌特異的マーカー遺伝子のＣｐＧ島のメチル化を診断できる膀胱癌診断用キット及び診断用核酸チップを提供する効果がある。
【０１１８】
本発明の診断用キット及び診断用核酸チップを利用すると、膀胱癌を初期形質転換段階において診断できて、早期診断が可能であり、通常の方法より正確かつ早く膀胱癌を診断することができる。
【０１１９】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者には、このような具体的技術は単なる望ましい実施様態に過ぎなく、これによって、本発明の範囲が制限されるのではない点は明白であろう。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とそれらの等価物によって定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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