(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
システイン残基による置換である少なくとも１つの変異を、７（ＶＨ）、２０（ＶＬ）、２２（ＶＬ）、２５（ＶＨ）、１２５（ＣＨ１）、２４８（ＣＨ２）、２５４（ＣＨ２）、２８６（ＣＨ２）、２９８（ＣＨ２）、および３２６（ＣＨ２）から成る群から選択される残基に有する免疫グロブリンと、前記システイン残基にコンジュゲートされた原子または分子とを含む免疫グロブリンコンジュゲート。
【請求項２】
前記少なくとも１つの変異が、７（ＶＨ）、２０（ＶＬ）、２２（ＶＬ）、および１２５（ＣＨ１）から成る群から選択される残基にある、請求項１に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
【請求項３】
前記少なくとも１つの変異が、２４８（ＣＨ２）および３２６（ＣＨ２）から成る群から選択される残基にある、請求項１に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
【請求項４】
前記少なくとも１つの変異が、２５（ＶＨ）および２８６（ＣＨ２）から成る群から選択される残基にある、請求項１に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
【請求項５】
前記少なくとも１つの変異が、２５４（ＣＨ２）および２９８（ＶＨ）から成る群から選択される残基にある、請求項１に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
【請求項６】
前記免疫グロブリンがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
【請求項７】
前記免疫グロブリンがＩｇＧ１を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
【請求項８】
ヒトＣＨ１ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
【請求項９】
ヒトＣＨ２ドメインを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
【請求項１０】
ヒトＣＨ３ドメインを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
【請求項１１】
ヒトＣＬドメインを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
【請求項１２】
ヒトＶＨドメインを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
【請求項１３】
ヒトＶＬドメインを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
【請求項１４】
少なくとも２つの反応部位を有するリンカー分子をさらに含み、第１の反応部位は、前記免疫グロブリンの前記システイン残基に結合しており、第２の反応部位は、前記原子または分子に結合している、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
【請求項１５】
前記リンカー分子が、ヒドラゾン、ジスルフィド、ペプチド、キレート化剤、およびマレイミドから成る群から選択される、請求項１４に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
【請求項１６】
前記原子または分子が、放射性核種、化学療法剤、微生物毒素、植物毒素、ポリマー、炭水化物、サイトカイン、蛍光標識、発光標識、酵素−基質標識、酵素、ペプチド、ペプチド模倣薬、ヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡミメティック、およびアプタマーから成る群から選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
【請求項１７】
前記原子または分子が、９０Ｙ、１３１Ｉ、６７Ｃｕ、１７７Ｌｕ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、マイタンシノイド、オーリスタチン、アントラサイクリン、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシンＡ、ジフテリア毒素、リシン、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、およびマンノシル残基から成る群から選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
【請求項１８】
前記原子または分子が、非変異免疫グロブリンの免疫原性を低下させる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
【請求項１９】
前記原子または分子が、非変異免疫グロブリンの免疫原性を増加させる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
【請求項２０】
非変異免疫グロブリンの抗原結合活性の少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセント、少なくとも１１０パーセント、少なくとも１２０パーセント、または少なくとも１３０パーセントである抗原結合活性をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
【請求項２１】
免疫グロブリンコンジュゲートを産生する方法であって、
（ａ）以下：
（ｉ）システイン残基による置換である少なくとも１つの変異を、７（ＶＨ）、２０（ＶＬ）、２２（ＶＬ）、２５（ＶＨ）、１２５（ＣＨ１）、２４８（ＣＨ２）、２５４（ＣＨ２）、２８６（ＣＨ２）、および３２６（ＣＨ２）から成る群から選択される残基に含む、改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン；
（ｉｉ）前記少なくとも１つの変異が７（ＶＨ）、２０（ＶＬ）、２２（ＶＬ）、および１２５（ＣＨ１）から成る群から選択される残基にある、（ｉ）の改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン；
（ｉｉｉ）前記少なくとも１つの変異が２４８（ＣＨ２）、および３２６（ＣＨ２）から成る群から選択される残基にある、（ｉ）の改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン；
（ｉｖ）前記少なくとも１つの変異が２５（ＶＨ）、および２８６（ＣＨ２）から成る群から選択される残基にある、（ｉ）の改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン；
（ｖ）前記少なくとも１つの変異が残基２５４（ＣＨ２）にある、（ｉ）の改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン；
（ｖｉ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む群から選択される、（ｉ）〜（ｖ）のいずれかの改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン；
（ｖｉｉ）ＩｇＧ１を含む、（ｉ）〜（ｖ）のいずれかの改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン；
（ｖｉｉｉ）ヒトＣＨ１ドメインを含む、（ｉ）〜（ｖｉｉ）のいずれかの改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン；
（ｉｘ）ヒトＣＨ２ドメインを含む、（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）のいずれかの改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン；
（ｘ）ヒトＣＨ３ドメインを含む、（ｉ）〜（ｉｘ）のいずれかの改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン；
（ｘｉ）ヒトＣＬドメインを含む、（ｉ）〜（ｘ）のいずれかの改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン；
（ｘｉｉ）ヒトＶＨドメインを含む、（ｉ）〜（ｘｉ）のいずれかの改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン；
（ｘｉｉｉ）ヒトＶＬドメインを含む、（ｉ）〜（ｘｉｉ）のいずれかの改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン；
（ｘｉｖ）非変異免疫グロブリンの抗原結合活性の少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセント、少なくとも１１０パーセント、少なくとも１２０パーセント、または少なくとも１３０パーセントである抗原結合活性をさらに含む、（ｉ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれかの改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン；
からなる群より選択される免疫グロブリンを提供するステップ、
（ｂ）還元剤で１つ以上の置換システイン残基を還元して、還元システイン残基を形成させるステップ、および
（ｃ）前記還元システイン残基と反応性である原子または分子と共に前記免疫グロブリンをインキュベートして、免疫グロブリンコンジュゲートを形成させるステップを含む、方法。
【請求項２２】
免疫グロブリンコンジュゲートの高濃縮医薬製剤中の免疫グロブリンの表面露出システイン間の架橋を低下させる方法であって、（ａ）免疫グロブリンを提供するステップ、（ｂ）７（ＶＨ）、２０（ＶＬ）、２２（ＶＬ）、および１２５（ＣＨ１）から成る群から選択される残基をシステイン残基で置換するステップ、（ｃ）還元剤で前記１つ以上の置換システイン残基を還元して、還元システイン残基を形成させるステップ、（ｄ）前記還元システイン残基と反応性である原子または分子と共に前記免疫グロブリンをインキュベートして、免疫グロブリンコンジュゲートを形成させるステップ、ならびに（ｅ）濃度が、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌである、前記免疫グロブリンコンジュゲートの高濃縮液体製剤を生成するステップを含む、方法。
【請求項２３】
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ１を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記免疫グロブリンが、ヒトＣＨ１ドメインを含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫グロブリンが、ヒトＣＨ２ドメインを含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫グロブリンが、ヒトＣＨ３ドメインを含む、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記免疫グロブリンが、ヒトＣＬドメインを含む、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫グロブリンが、ヒトＶＨドメインを含む、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記免疫グロブリンが、ヒトＶＬドメインを含む、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記免疫グロブリンコンジュゲートが、非変異免疫グロブリンの抗原結合活性の少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセント、少なくとも１１０パーセント、少なくとも１２０パーセント、または少なくとも１３０パーセントである抗原結合活性を含む、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
高濃縮液体製剤を含む医薬の調製における、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲートの使用であって、前記免疫グロブリンコンジュゲートが、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌである、使用。
【請求項３３】
前記医薬が、自己免疫疾患、免疫学的疾患、感染症、炎症性疾患、神経学的疾患、ならびに癌を含む腫瘍疾患および新生物疾患の治療のためのものである、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記医薬が、鬱血性心不全（ＣＨＦ）、血管炎、酒さ、ざ瘡、湿疹、心筋炎および心筋の他の状態、全身性エリテマトーデス、糖尿病、脊椎症、滑膜線維芽細胞、ならびに骨髄間質；骨損失；パジェット病、骨巨細胞腫；乳癌；非活動性骨減少症；栄養障害、歯周疾患、ゴーシェ病、ランゲルハンス細胞組織球症、脊髄損傷、急性化膿性関節炎、骨軟化症、クッシング症候群、単骨性線維性形成異常、多骨性線維性骨形成異常、歯根膜の再構成、および骨折；サルコイドーシス；溶骨性骨癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、および直腸癌；骨転移、骨痛管理、および体液性悪性高カルシウム血症、強直性脊椎炎、ならびに他の脊椎関節症；移植拒絶反応、ウイルス感染症、血液新生物、および新生物様の状態、たとえばホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ性白血病、菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、辺縁層リンパ腫、ヘアリーセル白血病、およびリンパ形質細胞性白血病）、Ｂ細胞の急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫およびＴ細胞の急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫を含むリンパ球前駆細胞の腫瘍、胸腺腫、末梢Ｔ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫、および大顆粒リンパ性白血病を含む成熟Ｔ細胞およびＮＫ細胞の腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球症、成熟を伴うＡＭＬ、分化を伴わないＡＭＬを含む急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、および急性単球性白血病などの骨髄新生物、骨髄異形成症候群および慢性骨髄性白血病を含む慢性骨髄増殖性疾患、中枢神経系の腫瘍、たとえば脳腫瘍（神経膠腫、神経芽腫、星細胞腫、髄芽細胞腫、脳室上衣細胞腫、および網膜芽細胞腫）、固形腫瘍（鼻咽頭癌、基底細胞癌、膵癌、胆管癌、カポジ肉腫、精巣癌、子宮癌、膣癌、もしくは子宮頚癌、卵巣癌、原発性肝癌、または子宮内膜癌、ならびに血管系の腫瘍（血管肉腫および血管周囲細胞腫）、骨粗鬆症、肝炎、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、脊椎関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、敗血症および敗血症性ショック、クローン病、乾癬、強皮症、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、同種異系島移植片拒絶、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの血液系悪性疾患、腫瘍、末梢神経損傷、または脱髄症と関連する炎症の治療のためのものである、請求項３２に記載の使用。
【請求項３５】
前記医薬が、斑状乾癬、潰瘍性大腸炎、非ホジキンリンパ腫、乳癌、結腸直腸癌、若年性特発性関節炎、黄斑変性症、呼吸器合胞体ウイルス、クローン病、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、骨粗鬆症、治療誘発性の骨損失、骨転移、多発性骨髄腫、アルツハイマー病、緑内障、および多発性硬化症の治療のためのものである、請求項３２に記載の使用。
【請求項３６】
前記医薬が、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３７】
前記製剤が、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントが、オリゴマー化されていない単量体である免疫グロブリンコンジュゲートを含む、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３８】
前記単量体の百分率が、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって測定される、請求項３７の使用。
【請求項３９】
非オリゴマー化医薬品活性成分としての、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲートの使用。
【請求項４０】
診断ツールとしての、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲートの使用。
【請求項４１】
高分子量タンパク質についての標準物質としての、請求項５〜１６のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲートの使用。
【請求項４２】
高分子量タンパク質についての標準物質としての免疫グロブリンコンジュゲートの使用であって、前記免疫グロブリンコンジュゲートが、システイン残基による置換である少なくとも１つの変異を残基４４０（ＣＨ３）に有する免疫グロブリンと、前記システイン残基にコンジュゲートされた原子または分子とを含む、使用。
【請求項４３】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲートおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項４４】
前記免疫グロブリンコンジュゲートが、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記免疫グロブリンコンジュゲートの少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントが、オリゴマー化されていない単量体である、請求項４３または請求項４４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、改善された免疫グロブリンおよび免疫グロブリンコンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体は、実験用および治療用に非常に有益である。遺伝子操作された部位特異的な蛍光特性または結合特性を有する抗体誘導体は、開発されており、長年使用されてきた。より最近では、抗体はまた、治療剤として開発されており、最も急成長しているクラスの医薬品を現在提供している［１（非特許文献１）］。抗体は、ジスルフィド結合によって相互に保持される２つの軽鎖および２つの重鎖のマルチドメインタンパク質である。可変領域は、特定の抗原への結合を特定し、定常領域の一部は、免疫細胞の表面のＦｃ受容体への結合を介してエフェクター機能を担う。様々な疾患の治癒におけるそれらの潜在力のために、抗体は、現在、ヒト治療薬のうちで最も急速に成長しているクラスとなる（非特許文献１）。２００１年以来、それらの市場は、３５％の平均年間成長率で成長しており、これは、すべてのカテゴリーのバイオテク薬剤の中で最も高い率である（非特許文献２）。
【０００３】
抗体コンジュゲートの工学技術は、抗体適用の多用途性をさらに増加させてきた。多くの実験室技術では、酵素または蛍光プローブは、アッセイ機能、たとえば抗原存在量の定量化を果たすために、抗体にコンジュゲートされる。標的療法の場合では、毒性の小分子は、患部の細胞上のバイオマーカーに特異的に結合する抗体に付着される［２〜４（非特許文献３〜５）］。抗体コンジュゲーションに対する様々なアプローチ、たとえば、表面リジンへの［５］、Ｆｃ炭水化物への［６］、または部分的に還元された鎖間ジスルフィドへの［７］付着が、探究されてきた。
【０００４】
工学的に作製された表面システインへの抗体コンジュゲーションは、ほとんどの抗体が、鎖内および鎖間ジスルフィド結合において使われるもの以外に、システインを有していないので、非常に魅力的な選択肢である。小分子は、マレイミドなどのチオール反応性の化学的作用を介してシステイン置換の特定の部位で付着することができる［８〜１４］。ＣＨ１およびＣＨ３ドメインにおける工学技術は、可変領域の抗原結合およびＣＨ２のエフェクター機能に対する干渉を回避するために好まれてきた。工学的に作製されたシステインを介して抗体コンジュゲーションを成功させるために様々な基準が考慮されてきた。たとえば、変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）を実行するための抗体ドメイン、変異部位の露出、置換されることとなるアミノ酸は、考慮に入れるべきいくつかの変数である。システイン工学技術およびコンジュゲーションに適している部位の同定に対するハイスループットスクリーニングアプローチが、開発されてきた［１５］。抗体システイン変異体と関連する最も共通の問題のうちの２つは、オリゴマー化および不十分な標識化である。しかし、抗体システイン変異体が安定し、効率的にコンジュゲートされるかどうかを予測するための一般的なツールはない。さらに、システイン変異体は、現在、ＣＬ、ＣＨ１、およびＣＨ３ドメインについてのみ存在する［８、９、１１、１２、１５］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃａｒｔｅｒ，  Ｐ．Ｊ．，  Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｂｙ  ｄｅｓｉｇｎ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２００６．  ６（５）：  ｐ．  ３４３〜５７
【非特許文献２】Ｓ．  Ａｇｇａｒｗａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ＢｉｏＴｅｃｈ．  ２００７年、２５巻（１０号）１０９７頁
【非特許文献３】Ｐｏｌａｋｉｓ，  Ｐ．，  Ａｒｍｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，  ２００５．  ５（４）：  ｐ．  ３８２〜７
【非特許文献４】Ｋａｍｉｎｓｋｉ，  Ｍ．Ｓ．ら、Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｗｉｔｈ  ［１３１Ｉ］ａｎｔｉ−Ｂ１  （ａｎｔｉ−ＣＤ２０）  ａｎｔｉｂｏｄｙ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，  １９９３．  ３２９（７）：  ｐ．  ４５９〜６５
【非特許文献５】Ｋｉｎｇ，  Ｄ．Ｊ．ら、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎｉｓｅｄ  Ａ３３  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，  １９９５．  ７２（６）：  ｐ．  １３６４〜７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、安定した免疫グロブリンコンジュゲートの生成に使用することができる、さらなる免疫グロブリンシステイン変異体が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この必要性を満たす、低下した架橋を示す改善された免疫グロブリンおよび免疫グロブリンコンジュゲートが、本明細書において記載される。
【０００８】
したがって、一態様は、システイン残基による置換である少なくとも１つの変異を、７（ＶＨ）、２０（ＶＬ）、２２（ＶＬ）、２５（ＶＨ）、１２５（ＣＨ１）、２４８（ＣＨ２）、２５４（ＣＨ２）、２８６（ＣＨ２）、２９８（ＣＨ２）、および３２６（ＣＨ２）から成る群から選択される残基に有する免疫グロブリンと、該システイン残基にコンジュゲートされた原子または分子とを含む免疫グロブリンコンジュゲートを含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの変異は、７（ＶＨ）、２０（ＶＬ）、２２（ＶＬ）、および１２５（ＣＨ１）から成る群から選択される残基にある。特定の実施形態では、少なくとも１つの変異は、２４８（ＣＨ２）および３２６（ＣＨ２）から成る群から選択される残基にある。特定の実施形態では、少なくとも１つの変異は、２５（ＶＨ）および２８６（ＣＨ２）から成る群から選択される残基にある。特定の実施形態では、少なくとも１つの変異は、２５４（ＣＨ２）および２９８（ＶＨ）から成る群から選択される残基にある。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む群から選択される。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１を含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンコンジュゲートは、ヒトＣＨ１ドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンコンジュゲートは、ヒトＣＨ２ドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンコンジュゲートは、ヒトＣＨ３ドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンコンジュゲートは、ヒトＣＬドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンコンジュゲートは、ヒトＶＨドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンコンジュゲートは、ヒトＶＬドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンコンジュゲートは、少なくとも２つの反応部位を有するリンカー分子をさらに含み、第１の反応部位は、免疫グロブリンの該システイン残基に結合しており、第２の反応部位は、該原子または分子に結合している。リンカー分子を有する前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、リンカー分子は、ヒドラゾン、ジスルフィド、ペプチド、キレート化剤、およびマレイミドから成る群から選択される。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、該原子または分子は、放射性核種、化学療法剤、微生物の毒素、植物性毒素、ポリマー、炭水化物、サイトカイン、蛍光標識、発光標識、酵素−基質標識、酵素、ペプチド、ペプチド模倣薬、ヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡミメティック、およびアプタマーから成る群から選択される。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、該原子または分子は、９０Ｙ、１３１Ｉ、６７Ｃｕ、１７７Ｌｕ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｉｓｏｉｄ）、オーリスタチン、アントラサイクリン、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシンＡ、ジフテリア（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒素、リシン、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、およびマンノシル残基から成る群から選択される。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、該原子または分子は、非変異免疫グロブリンの免疫原性を低下させる。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、該原子または分子は、非変異免疫グロブリンの免疫原性を増加させる。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンコンジュゲートは、非変異免疫グロブリンの抗原結合活性の少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセント、少なくとも１１０パーセント、少なくとも１２０パーセント、または少なくとも１３０パーセントである抗原結合活性をさらに含む。
【０００９】
他の態様は、システイン残基による置換である少なくとも１つの変異を、７（ＶＨ）、２０（ＶＬ）、２２（ＶＬ）、２５（ＶＨ）、１２５（ＣＨ１）、２４８（ＣＨ２）、２５４（ＣＨ２）、２８６（ＣＨ２）、および３２６（ＣＨ２）から成る群から選択される残基に含む改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリンを含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの変異は、７（ＶＨ）、２０（ＶＬ）、２２（ＶＬ）、および１２５（ＣＨ１）から成る群から選択される残基にある。特定の実施形態では、少なくとも１つの変異は、２４８（ＣＨ２）および３２６（ＣＨ２）から成る群から選択される残基にある。特定の実施形態では、少なくとも１つの変異は、２５（ＶＨ）および２８６（ＣＨ２）から成る群から選択される残基にある。特定の実施形態では、少なくとも１つの変異は、残基２５４（ＣＨ２）にある。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む群から選択される。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１を含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリンは、ヒトＣＨ１ドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリンは、ヒトＣＨ２ドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリンは、ヒトＣＨ３ドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリンは、ヒトＣＬドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリンは、ヒトＶＨドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリンは、ヒトＶＬドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、非変異免疫グロブリンの抗原結合活性の少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセント、少なくとも１１０パーセント、少なくとも１２０パーセント、または少なくとも１３０パーセントである抗原結合活性をさらに含む。
【００１０】
他の態様は、前の改変免疫グロブリンの態様ならびに前の実施形態の任意のおよびすべての組合せの免疫グロブリンをコードする、単離ポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、該ポリヌクレオチドは、ベクター中にある。特定の実施形態では、ベクターは発現ベクターである。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、誘導プロモーターは、該ポリヌクレオチドに作動可能に連結される。他の態様は、前の実施形態のいずれかのベクターを有する宿主細胞を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、該ポリヌクレオチドによってコードされる免疫グロブリンを発現することができる。
【００１１】
他の態様は、免疫グロブリンを産生する方法であって、前の態様の宿主細胞を含む培養培地を提供するステップおよび免疫グロブリンが発現される条件に培養培地を置くステップを含む方法を含む。特定の実施形態では、該方法は、発現される免疫グロブリンを単離するためのさらなるステップを含む。
【００１２】
他の態様は、免疫グロブリンコンジュゲートを産生する方法であって、前の改変免疫グロブリンの態様ならびに前の実施形態の任意のおよびすべての組合せの免疫グロブリンを提供するステップ、還元剤で１つ以上の置換システイン残基を還元して、還元システイン残基を形成させるステップ、ならびに還元システイン残基と反応性である原子または分子と共に免疫グロブリンをインキュベートして、免疫グロブリンコンジュゲートを形成させるステップを含む方法を含む。
【００１３】
他の態様は、免疫グロブリンコンジュゲートの高濃縮医薬製剤中の免疫グロブリンの表面露出システイン間の架橋を低下させる方法であって、免疫グロブリンを提供するステップ、７（ＶＨ）、２０（ＶＬ）、２２（ＶＬ）、および１２５（ＣＨ１）から成る群から選択される残基をシステイン残基で置換するステップ、還元剤で１つ以上の置換システイン残基を還元して、還元システイン残基を形成させるステップ、還元システイン残基と反応性である原子または分子と共に免疫グロブリンをインキュベートして、免疫グロブリンコンジュゲートを形成させるステップ、ならびに免疫グロブリンコンジュゲート濃度が、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌである免疫グロブリンコンジュゲートの高濃縮液体製剤を生成するステップを含む方法を含む。特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む群から選択される。特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１を含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣＨ１ドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣＨ２ドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣＨ３ドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣＬドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＶＨドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＶＬドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンコンジュゲートは、非変異免疫グロブリンの抗原結合活性の少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセント、少なくとも１１０パーセント、少なくとも１２０パーセント、または少なくとも１３０パーセントである抗原結合活性を含む。
【００１４】
他の態様は、高濃縮液体製剤を含む医薬の調製における前の免疫グロブリンコンジュゲートの態様ならびに前の実施形態の任意のおよびすべての組合せの使用であって、免疫グロブリンコンジュゲートは、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌである、使用を含む。特定の実施形態では、医薬の使用は、自己免疫疾患、免疫学的疾患、感染症、炎症性疾患、神経学的疾患、ならびに癌を含む腫瘍疾患および新生物疾患の治療のためのものである。特定の実施形態では、医薬の使用は、鬱血性心不全（ＣＨＦ）、血管炎、酒さ、ざ瘡、湿疹、心筋炎および心筋の他の状態、全身性エリテマトーデス、糖尿病、脊椎症、滑膜線維芽細胞、ならびに骨髄間質；骨損失；パジェット病、骨巨細胞腫；乳癌；非活動性骨減少症；栄養障害、歯周疾患、ゴーシェ病、ランゲルハンス細胞組織球症、脊髄損傷、急性化膿性関節炎、骨軟化症、クッシング症候群、単骨性線維性形成異常（ｍｏｎｏｏｓｔｏｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｕｓ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、多骨性線維性骨形成異常、歯根膜の再構成、および骨折；サルコイドーシス；溶骨性骨癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、および直腸癌；骨転移、骨痛管理、および体液性悪性高カルシウム血症、強直性脊椎炎（ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ  ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓａ）、ならびに他の脊椎関節症；移植拒絶反応、ウイルス感染症、血液新生物、および新生物様の状態、たとえばホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ性白血病、菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、辺縁層リンパ腫、ヘアリーセル白血病、およびリンパ形質細胞性（ｌｙｍｐｈｏｐｌａｍａｃｙｔｉｃ）白血病）、Ｂ細胞の急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫およびＴ細胞の急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫を含むリンパ球前駆細胞の腫瘍、胸腺腫、末梢Ｔ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫、および大顆粒リンパ性白血病を含む成熟Ｔ細胞およびＮＫ細胞の腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球症（ｈｉｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、成熟を伴うＡＭＬ、分化を伴わないＡＭＬを含む急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、および急性単球性白血病などの骨髄新生物、骨髄異形成症候群および慢性骨髄性白血病を含む慢性骨髄増殖性疾患、中枢神経系の腫瘍、たとえば脳腫瘍（神経膠腫、神経芽腫、星細胞腫、髄芽細胞腫、脳室上衣細胞腫、および網膜芽細胞腫）、固形腫瘍（鼻咽頭癌、基底細胞癌、膵癌、胆管癌、カポジ肉腫、精巣癌、子宮癌、膣癌、もしくは子宮頚癌、卵巣癌、原発性肝癌、または子宮内膜癌、ならびに血管系の腫瘍（血管肉腫および血管周囲細胞腫）、骨粗鬆症、肝炎、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、脊椎関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、敗血症および敗血症性ショック、クローン病、乾癬、強皮症（ｓｃｈｌｅｒａｄｅｒｍａ）、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、同種異系島移植片拒絶、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの血液系悪性疾患、腫瘍、末梢神経損傷、または脱髄症と関連する炎症の治療のためのものである。特定の実施形態では、医薬の使用は、斑状乾癬（ｐｌａｑｕｅ  ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、潰瘍性大腸炎、非ホジキンリンパ腫、乳癌、結腸直腸癌、若年性特発性関節炎、黄斑変性症、呼吸器合胞体ウイルス、クローン病、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、骨粗鬆症、治療誘発性の骨損失、骨転移、多発性骨髄腫、アルツハイマー病、緑内障、および多発性硬化症の治療のためのものである。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、医薬は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、製剤は、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントが、オリゴマー化されていない単量体である免疫グロブリンコンジュゲートを含む。特定の実施形態では、単量体の百分率は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって測定される。
【００１５】
他の態様は、非オリゴマー化の薬学的活性成分としての、前の免疫グロブリンコンジュゲートの態様ならびに前の実施形態の任意のおよびすべての組合せの使用を含む。
【００１６】
他の態様は、診断ツールとしての、前の免疫グロブリンコンジュゲートの態様ならびに前の実施形態の任意のおよびすべての組合せの使用を含む。
【００１７】
他の態様は、高分子量タンパク質についての標準物質としての、前の免疫グロブリンコンジュゲートの態様ならびに前の実施形態の任意のおよびすべての組合せの使用を含む。他の態様は、高分子量タンパク質についての標準物質としての免疫グロブリンコンジュゲートの使用であって、免疫グロブリンコンジュゲートは、システイン残基による置換である少なくとも１つの変異を残基４４０（ＣＨ３）に有する免疫グロブリンと、該ステイン残基にコンジュゲートされた原子または分子とを含む使用、を含む。
【００１８】
他の態様は、前の免疫グロブリンコンジュゲートの態様ならびに前の実施形態の任意のおよびすべての組合せの免疫グロブリンコンジュゲートおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を含む。特定の実施形態では、免疫グロブリンコンジュゲートは、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンコンジュゲートの少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントは、オリゴマー化されていない単量体である。
【００１９】
他の態様は、システインへの変異のための免疫グロブリンの残基を選択する方法であって、免疫グロブリンの表面の第１のアミノ酸残基の空間的凝集傾向（ｓｐａｔｉａｌ−ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ−ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ）を計算するステップ、第１の残基のごく近傍内の免疫グロブリンの複数の残基の空間的凝集傾向を計算するステップ、ならびに第１のアミノ酸残基の空間的凝集傾向が、０および−０．１１の値に等しいまたは０および−０．１１の値の間にある場合および複数の残基が０未満の空間的凝集傾向を有する場合、システインへの変異のための第１のアミノ酸残基を選択するステップを含む方法を含む。特定の実施形態では、複数の残基は、第１の残基の１５Å内にある。特定の実施形態では、複数の残基は、第１の残基の１０Å内にある。特定の実施形態では、複数の残基は、第１の残基の７．５Å内にある。特定の実施形態では、複数の残基は、第１の残基の５Å内にある。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、残基の空間的凝集傾向の計算は、残基中の原子を中心にする半径を有する球状の領域についての空間的凝集傾向の計算を含む。特定の実施形態では、球状の領域の半径は、少なくとも５Åである。
【００２０】
他の態様は、表面露出残基からシステインへの少なくとも１つの変異を含む改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリンであって、該残基の空間的凝集傾向は、０および−０．１１の値に等しいまたは０および−０．１１の値の間にあり、第１の残基のごく近傍内の免疫グロブリンの複数の残基の空間的凝集傾向は、０未満の空間的凝集傾向を有する、改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリンを含む。特定の実施形態では、複数の残基は、第１の残基の１５Å内にある。特定の実施形態では、複数の残基は、第１の残基の１０Å内にある。特定の実施形態では、複数の残基は、第１の残基の７．５Å内にある。特定の実施形態では、複数の残基は、第１の残基の５Å内にある。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、空間的凝集傾向は、残基中の原子を中心にする半径を有する球状の領域について計算される。特定の実施形態では、半径は、少なくとも５Åである。
【００２１】
他の態様は、システインへ変異させるための免疫グロブリンの残基を選択する方法であって、免疫グロブリンの複数のアミノ酸残基を選ぶステップであって、複数の残基は、免疫グロブリンの表面に露出しているステップ、複数の残基のうちの１つの残基をシステイン残基に変異させるステップ、原子または分子に該システイン残基をコンジュゲートさせて、免疫グロブリンコンジュゲートを形成させるステップ、架橋傾向について免疫グロブリンコンジュゲートを試験し、免疫グロブリンコンジュゲートに架橋傾向値を割り当てるステップ、ならびに架橋傾向値がＩまたはＩＩである場合に、システインへの変異のための残基を選択するステップを含む、方法を含む。特定の実施形態では、該方法は、免疫グロブリンコンジュゲートの５％未満が二量体を形成し、免疫グロブリンコンジュゲートが三量体を形成しない場合に、免疫グロブリンコンジュゲートにＩＩの架橋傾向値を割り当てるステップをさらに含み、二量体および三量体の形成は、非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを比較することによって測定される。特定の実施形態では、該方法は、免疫グロブリンコンジュゲートの１％未満が二量体を形成する場合に、免疫グロブリンコンジュゲートにＩの架橋傾向値を割り当てるステップをさらに含み、二量体の形成は、非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを比較することによって測定される。
【００２２】
本明細書は、例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
システイン残基による置換である少なくとも１つの変異を、７（ＶＨ）、２０（ＶＬ）、２２（ＶＬ）、２５（ＶＨ）、１２５（ＣＨ１）、２４８（ＣＨ２）、２５４（ＣＨ２）、２８６（ＣＨ２）、２９８（ＣＨ２）、および３２６（ＣＨ２）から成る群から選択される残基に有する免疫グロブリンと、前記システイン残基にコンジュゲートされた原子または分子とを含む免疫グロブリンコンジュゲート。
（項目２）
前記少なくとも１つの変異が、７（ＶＨ）、２０（ＶＬ）、２２（ＶＬ）、および１２５（ＣＨ１）から成る群から選択される残基にある、項目１に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
（項目３）
前記少なくとも１つの変異が、２４８（ＣＨ２）および３２６（ＣＨ２）から成る群から選択される残基にある、項目１に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
（項目４）
前記少なくとも１つの変異が、２５（ＶＨ）および２８６（ＣＨ２）から成る群から選択される残基にある、項目１に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
（項目５）
前記少なくとも１つの変異が、２５４（ＣＨ２）および２９８（ＶＨ）から成る群から選択される残基にある、項目１に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
（項目６）
前記免疫グロブリンがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む群から選択される、項目１〜５のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
（項目７）
前記免疫グロブリンがＩｇＧ１を含む、項目１〜５のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
（項目８）
ヒトＣＨ１ドメインを含む、項目１〜７のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
（項目９）
ヒトＣＨ２ドメインを含む、項目１〜８のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
（項目１０）
ヒトＣＨ３ドメインを含む、項目１〜９のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
（項目１１）
ヒトＣＬドメインを含む、項目１〜１０のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
（項目１２）
ヒトＶＨドメインを含む、項目１〜１１のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
（項目１３）
ヒトＶＬドメインを含む、項目１〜１２のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
（項目１４）
少なくとも２つの反応部位を有するリンカー分子をさらに含み、第１の反応部位は、前記免疫グロブリンの前記システイン残基に結合しており、第２の反応部位は、前記原子または分子に結合している、項目１〜１３のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
（項目１５）
前記リンカー分子が、ヒドラゾン、ジスルフィド、ペプチド、キレート化剤、およびマレイミドから成る群から選択される、項目１４に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
（項目１６）
前記原子または分子が、放射性核種、化学療法剤、微生物毒素、植物毒素、ポリマー、炭水化物、サイトカイン、蛍光標識、発光標識、酵素−基質標識、酵素、ペプチド、ペプチド模倣薬、ヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡミメティック、およびアプタマーから成る群から選択される、項目１〜１５のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
（項目１７）
前記原子または分子が、９０Ｙ、１３１Ｉ、６７Ｃｕ、１７７Ｌｕ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、マイタンシノイド、オーリスタチン、アントラサイクリン、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシンＡ、ジフテリア毒素、リシン、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、およびマンノシル残基から成る群から選択される、項目１〜１５のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
（項目１８）
前記原子または分子が、非変異免疫グロブリンの免疫原性を低下させる、項目１〜１７のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
（項目１９）
前記原子または分子が、非変異免疫グロブリンの免疫原性を増加させる、項目１〜１７のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
（項目２０）
非変異免疫グロブリンの抗原結合活性の少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセント、少なくとも１１０パーセント、少なくとも１２０パーセント、または少なくとも１３０パーセントである抗原結合活性をさらに含む、項目１〜１９のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲート。
（項目２１）
システイン残基による置換である少なくとも１つの変異を、７（ＶＨ）、２０（ＶＬ）、２２（ＶＬ）、２５（ＶＨ）、１２５（ＣＨ１）、２４８（ＣＨ２）、２５４（ＣＨ２）、２８６（ＣＨ２）、および３２６（ＣＨ２）から成る群から選択される残基に含む改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン。
（項目２２）
前記少なくとも１つの変異が、７（ＶＨ）、２０（ＶＬ）、２２（ＶＬ）、および１２５（ＣＨ１）から成る群から選択される残基にある、項目２１に記載の改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン。
（項目２３）
前記少なくとも１つの変異が、２４８（ＣＨ２）および３２６（ＣＨ２）から成る群から選択される残基にある、項目２１に記載の改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン。
（項目２４）
前記少なくとも１つの変異が、２５（ＶＨ）および２８６（ＣＨ２）から成る群から選択される残基にある、項目２１に記載の改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン。
（項目２５）
前記少なくとも１つの変異が、残基２５４（ＣＨ２）にある、項目２１に記載の改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン。
（項目２６）
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む群から選択される、項目２１〜２５のいずれか一項に記載の改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン。
（項目２７）
ＩｇＧ１を含む、項目２１〜２５のいずれか一項に記載の改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン。
（項目２８）
ヒトＣＨ１ドメインを含む、項目２１〜２７のいずれか一項に記載の改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン。
（項目２９）
ヒトＣＨ２ドメインを含む、項目２１〜２８のいずれか一項に記載の改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン。
（項目３０）
ヒトＣＨ３ドメインを含む、項目２１〜２９のいずれか一項に記載の改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン。
（項目３１）
ヒトＣＬドメインを含む、項目２１〜３０のいずれか一項に記載の改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン。
（項目３２）
ヒトＶＨドメインを含む、項目２１〜３１のいずれか一項に記載の改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン。
（項目３３）
ヒトＶＬドメインを含む、項目２１〜３２のいずれか一項に記載の改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン。
（項目３４）
非変異免疫グロブリンの抗原結合活性の少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセント、少なくとも１１０パーセント、少なくとも１２０パーセント、または少なくとも１３０パーセントである抗原結合活性をさらに含む、項目２１〜３３のいずれか一項に記載の改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン。
（項目３５）
項目２１〜３４のいずれか一項に記載の免疫グロブリンをコードする単離ポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目３６）
項目３５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（項目３７）
前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結された誘導プロモーターをさらに含む、項目３６に記載のベクター。
（項目３８）
項目３６または項目３７に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目３９）
免疫グロブリンを産生する方法であって、
（ａ）項目３８に記載の宿主細胞を含む培養培地を提供するステップおよび
（ｂ）前記免疫グロブリンが発現される条件下に前記培養培地を置くステップを含む、方法。
（項目４０）
（ｃ）前記免疫グロブリンを単離するステップをさらに含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
免疫グロブリンコンジュゲートを産生する方法であって、
（ａ）項目２１〜３４のいずれか一項に記載の免疫グロブリンを提供するステップ、
（ｂ）還元剤で１つ以上の置換システイン残基を還元して、還元システイン残基を形成させるステップ、および
（ｃ）前記還元システイン残基と反応性である原子または分子と共に前記免疫グロブリンをインキュベートして、免疫グロブリンコンジュゲートを形成させるステップを含む、方法。
（項目４２）
免疫グロブリンコンジュゲートの高濃縮医薬製剤中の免疫グロブリンの表面露出システイン間の架橋を低下させる方法であって、
（ａ）免疫グロブリンを提供するステップ、
（ｂ）７（ＶＨ）、２０（ＶＬ）、２２（ＶＬ）、および１２５（ＣＨ１）から成る群から選択される残基をシステイン残基で置換するステップ、
（ｃ）還元剤で前記１つ以上の置換システイン残基を還元して、還元システイン残基を形成させるステップ、
（ｃ）原子または前記還元システイン残基と反応性である分子と共に前記免疫グロブリンをインキュベートして、免疫グロブリンコンジュゲートを形成させるステップ、ならびに（ｄ）濃度が、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌである、前記免疫グロブリンコンジュゲートの高濃縮液体製剤を生成するステップを含む、方法。
（項目４３）
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む群から選択される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ１を含む、項目４２に記載の方法。
（項目４５）
前記免疫グロブリンが、ヒトＣＨ１ドメインを含む、項目４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記免疫グロブリンが、ヒトＣＨ２ドメインを含む、項目４２〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記免疫グロブリンが、ヒトＣＨ３ドメインを含む、項目４２〜４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記免疫グロブリンが、ヒトＣＬドメインを含む、項目４２〜４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記免疫グロブリンが、ヒトＶＨドメインを含む、項目４２〜４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記免疫グロブリンが、ヒトＶＬドメインを含む、項目４２〜４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記免疫グロブリンコンジュゲートが、非変異免疫グロブリンの抗原結合活性の少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセント、少なくとも１１０パーセント、少なくとも１２０パーセント、または少なくとも１３０パーセントである抗原結合活性を含む、項目４２〜５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
高濃縮液体製剤を含む医薬の調製における、項目１〜２０のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲートの使用であって、前記免疫グロブリンコンジュゲートが、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌである、使用。
（項目５３）
前記医薬が、自己免疫疾患、免疫学的疾患、感染症、炎症性疾患、神経学的疾患、ならびに癌を含む腫瘍疾患および新生物疾患の治療のためのものである、項目５２に記載の使用。
（項目５４）
前記医薬が、鬱血性心不全（ＣＨＦ）、血管炎、酒さ、ざ瘡、湿疹、心筋炎および心筋の他の状態、全身性エリテマトーデス、糖尿病、脊椎症、滑膜線維芽細胞、ならびに骨髄間質；骨損失；パジェット病、骨巨細胞腫；乳癌；非活動性骨減少症；栄養障害、歯周疾患、ゴーシェ病、ランゲルハンス細胞組織球症、脊髄損傷、急性化膿性関節炎、骨軟化症、クッシング症候群、単骨性線維性形成異常、多骨性線維性骨形成異常、歯根膜の再構成、および骨折；サルコイドーシス；溶骨性骨癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、および直腸癌；骨転移、骨痛管理、および体液性悪性高カルシウム血症、強直性脊椎炎、ならびに他の脊椎関節症；移植拒絶反応、ウイルス感染症、血液新生物、および新生物様の状態、たとえばホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ性白血病、菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、辺縁層リンパ腫、ヘアリーセル白血病、およびリンパ形質細胞性白血病）、Ｂ細胞の急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫およびＴ細胞の急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫を含むリンパ球前駆細胞の腫瘍、胸腺腫、末梢Ｔ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫、および大顆粒リンパ性白血病を含む成熟Ｔ細胞およびＮＫ細胞の腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球症、成熟を伴うＡＭＬ、分化を伴わないＡＭＬを含む急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、および急性単球性白血病などの骨髄新生物、骨髄異形成症候群および慢性骨髄性白血病を含む慢性骨髄増殖性疾患、中枢神経系の腫瘍、たとえば脳腫瘍（神経膠腫、神経芽腫、星細胞腫、髄芽細胞腫、脳室上衣細胞腫、および網膜芽細胞腫）、固形腫瘍（鼻咽頭癌、基底細胞癌、膵癌、胆管癌、カポジ肉腫、精巣癌、子宮癌、膣癌、もしくは子宮頚癌、卵巣癌、原発性肝癌、または子宮内膜癌、ならびに血管系の腫瘍（血管肉腫および血管周囲細胞腫）、骨粗鬆症、肝炎、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、脊椎関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、敗血症および敗血症性ショック、クローン病、乾癬、強皮症、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、同種異系島移植片拒絶、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの血液系悪性疾患、腫瘍、末梢神経損傷、または脱髄症と関連する炎症の治療のためのものである、項目５２に記載の使用。
（項目５５）
前記医薬が、斑状乾癬、潰瘍性大腸炎、非ホジキンリンパ腫、乳癌、結腸直腸癌、若年性特発性関節炎、黄斑変性症、呼吸器合胞体ウイルス、クローン病、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、骨粗鬆症、治療誘発性の骨損失、骨転移、多発性骨髄腫、アルツハイマー病、緑内障、および多発性硬化症の治療のためのものである、項目５２に記載の使用。
（項目５６）
前記医薬が、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、項目５２〜５５のいずれか一項に記載の使用。
（項目５７）
前記製剤が、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントが、オリゴマー化されていない単量体である免疫グロブリンコンジュゲートを含む、項目５２〜５６のいずれか一項に記載の使用。
（項目５８）
前記単量体の百分率が、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって測定される、項目５７の使用。
（項目５９）
非オリゴマー化医薬品活性成分としての、項目１〜２０のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲートの使用。
（項目６０）
診断ツールとしての、項目１〜２０のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲートの使用。
（項目６１）
高分子量タンパク質についての標準物質としての、項目５〜１６のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲートの使用。
（項目６２）
高分子量タンパク質についての標準物質としての免疫グロブリンコンジュゲートの使用であって、前記免疫グロブリンコンジュゲートが、システイン残基による置換である少なくとも１つの変異を残基４４０（ＣＨ３）に有する免疫グロブリンと、前記システイン残基にコンジュゲートされた原子または分子とを含む、使用。
（項目６３）
項目１〜２０のいずれか一項に記載の免疫グロブリンコンジュゲートおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
（項目６４）
前記免疫グロブリンコンジュゲートが、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である、項目６３に記載の医薬組成物。
（項目６５）
前記免疫グロブリンコンジュゲートの少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントが、オリゴマー化されていない単量体である、項目６３または項目６４に記載の医薬組成物。
（項目６６）
システインへの変異のための免疫グロブリンの残基を選択する方法であって、
（ａ）前記免疫グロブリンの表面の第１のアミノ酸残基の空間的凝集傾向を計算するステップ、
（ｂ）前記第１の残基のごく近傍内の前記免疫グロブリンの複数の残基の空間的凝集傾向を計算するステップ、ならびに
（ｃ）前記第１のアミノ酸残基の空間的凝集傾向が、０および−０．１１の値に等しいまたは０および−０．１１の値の間にある場合および前記複数の残基が０未満の空間的凝集傾向を有する場合、システインへの変異のための前記第１のアミノ酸残基を選択するステップを含む、方法。
（項目６７）
前記複数の残基が、前記第１の残基の１５Å内にある、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記複数の残基が、前記第１の残基の１０Å内にある、項目６６に記載の方法。
（項目６９）
前記複数の残基が、前記第１の残基の７．５Å内にある、項目６６に記載の方法。
（項目７０）
前記複数の残基が、前記第１の残基の５Å内にある、項目６６に記載の方法。
（項目７１）
残基の空間的凝集傾向の計算が、前記残基中の原子を中心にする半径を有する球状の領域についての空間的凝集傾向の計算を含む、項目６６〜７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
前記球状の領域の前記半径が、少なくとも５Åである、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
表面露出残基からシステインへの少なくとも１つの変異を含む改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリンであって、前記残基の空間的凝集傾向が、０および−０．１１の値に等しいまたは０および−０．１１の値の間にあり、前記第１の残基のごく近傍内の前記免疫グロブリンの複数の残基の空間的凝集傾向が、０未満の空間的凝集傾向を有する、改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン。
（項目７４）
前記複数の残基が、前記第１の残基の１５Å内にある、項目７３に記載の改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン。
（項目７５）
前記複数の残基が、前記第１の残基の１０Å内にある、項目７３に記載の改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン。
（項目７６）
前記複数の残基が、前記第１の残基の７．５Å内にある、項目７３に記載の改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン。
（項目７７）
前記複数の残基が、前記第１の残基の５Å内にある、項目７３に記載の改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン。
（項目７８）
前記空間的凝集傾向が、前記残基中の原子を中心にする半径を有する球状の領域について計算される、項目７３〜７７のいずれか一項に記載の改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン。
（項目７９）
前記半径が、少なくとも５Åである、項目７８に記載の改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリン。
（項目８０）
システインへの変異のための免疫グロブリンの残基を選択する方法であって、
（ａ）前記免疫グロブリンの複数のアミノ酸残基を選ぶステップであって、前記複数の残基が、前記免疫グロブリンの表面に露出しているステップ、
（ｂ）前記複数の残基のうちの１つの残基をシステイン残基に変異させるステップ、
（ｃ）原子または分子に前記システイン残基をコンジュゲートさせて、免疫グロブリンコンジュゲートを形成させるステップ、
（ｄ）架橋傾向について前記免疫グロブリンコンジュゲートを試験し、前記免疫グロブリンコンジュゲートに架橋傾向値を割り当てるステップ、ならびに
（ｅ）前記架橋傾向値がＩまたはＩＩである場合に、システインへの変異のための前記残基を選択するステップを含む、方法。
（項目８１）
前記免疫グロブリンコンジュゲートの５％未満が二量体を形成し、前記免疫グロブリンコンジュゲートが三量体を形成しない場合に、前記免疫グロブリンコンジュゲートにＩＩの架橋傾向値を割り当てるステップをさらに含み、二量体および三量体の形成は、非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを比較することによって測定される、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記免疫グロブリンコンジュゲートの１％未満が二量体を形成する場合に、前記免疫グロブリンコンジュゲートにＩの架橋傾向値を割り当てるステップをさらに含み、二量体の形成は、非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを比較することによって測定される、項目８１に記載の方法。
発明のさらなる態様および実施形態は、本明細書の全体にわたって見出され得る。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本開示は、低下した架橋を示す、改善された免疫グロブリンおよび免疫グロブリンコンジュゲートに関する。特定の実施形態では、本開示の免疫グロブリンは、システインとの置換によって特異的な残基で改変される。本開示は、改変免疫グロブリンおよび改変免疫グロブリンコンジュゲート、そのような免疫グロブリンおよび免疫グロブリンコンジュゲートを作製する方法、そのような免疫グロブリンを含む多価分子または多特異的分子、ならびに本開示の免疫グロブリン、免疫グロブリンコンジュゲート、または二重特異性分子を含有する医薬組成物を提供する。
【００２４】
定義
本明細書において言及される用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、抗体全体および任意の抗原結合断片（つまり「抗原結合部分」）またはその単鎖を含む。天然に存在する「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。重鎖はそれぞれ、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと省略される）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３から構成される。軽鎖はそれぞれ、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと省略される）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が挿入された相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される、超可変性の領域にさらに細分することができる。ＶＨおよびＶＬはそれぞれ、以下の順でアミノ末端からカルボキシ末端に整列した、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（たとえばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または宿主因子への免疫グロブリンの結合を媒介してもよい。
【００２５】
本明細書において言及される用語「抗体コンジュゲート」または「免疫グロブリンコンジュゲート」は、原子または分子に化学的にまたは生物学的に連結された、任意の免疫グロブリン、抗原結合断片、またはその単鎖を含む。原子または分子は、たとえば、細胞毒、放射性薬剤、抗腫瘍剤、または治療剤を含んでいてもよい。抗体コンジュゲートは、免疫グロブリンまたは抗原結合断片の免疫反応性を保持する、つまり、抗体コンジュゲートの免疫グロブリンまたは抗原結合断片は、原子または分子とのコンジュゲーション前の免疫グロブリンの抗原結合活性の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも１００パーセント、少なくとも１１０パーセント、少なくとも１２０パーセント、または少なくとも１３０パーセントを有する。
【００２６】
本明細書において使用される用語、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗原部分」）は、抗原に特異的に結合するための能力を保持する、完全長の抗体または抗体の１つ以上の断片および重鎖または軽鎖の定常領域の少なくとも１つの部分を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実行することができることが示されてきた。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合断片の例は、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインから成る一価断片であるＦａｂ断片；ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ）２断片；ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片；ならびに抗体の単一のアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインから成るＦｖ断片を含む。
【００２７】
さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、それらを、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価分子を形成する単一のタンパク質鎖として作製することを可能にする合成リンカーによって、組換え法を使用してつなぐことができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知である；たとえばＢｉｒｄら、１９８８年  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２巻：４２３〜４２６頁；およびＨｕｓｔｏｎら、１９８８年  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８５巻：５８７９〜５８８３頁を参照されたい）。そのような単鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合領域」という用語内に包含されるように意図される。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を使用して得られ、断片は、完全な抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
【００２８】
本明細書において使用される「単離」抗体または免疫グロブリンは、かかる抗体または免疫グロブリンが天然では他の構成要素中に見出される、該構成要素を実質的に含まない抗体または免疫グロブリンを指す。さらに、単離抗体または免疫グロブリンは、他の細胞物質および／または化学物質が実質的になくてもよい。
【００２９】
本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、典型的に、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および結合親和性を示す。
【００３０】
本明細書において使用される用語「ヒト抗体」は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体を含むように意図される。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もまた、そのようなヒト配列、たとえばヒト生殖系列配列もしくはヒト生殖系列配列の変異バージョンまたはＫｎａｐｐｉｋら（２０００年  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６巻、５７〜８６頁）において記載されるヒトフレームワーク配列分析に由来するコンセンサスフレームワーク配列を含有する抗体に由来する。
【００３１】
本開示のヒト抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基（たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発によってまたはｉｎ  ｖｉｖｏの体細胞変異によって導入される変異）を含んでいてもよい。しかしながら、本明細書において使用される用語「ヒト抗体」は、マウスなどの他の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むようには意図されない。
【００３２】
本明細書において使用される用語「ヒトドメイン」は、ヒト起源の配列、たとえばヒト生殖系列配列もしくはヒト生殖系列配列の変異バージョンまたはＫｎａｐｐｉｋら（２０００年  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６巻、５７〜８６頁）において記載されるヒトフレームワーク配列分析に由来するコンセンサスフレームワーク配列を含有する抗体に由来する免疫グロブリン定常領域ドメインを含むように意図される。
【００３３】
本明細書において使用される用語「組換えヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックもしくはトランスクロモソームである動物（たとえばマウス）から単離される抗体またはそれから調製されるハイブリドーマから単離される抗体、ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、たとえばトランスフェクトーマから単離される抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、およびヒト免疫グロブリン遺伝子のすべてまたは一部の配列を他のＤＮＡ配列へスプライシングすることを含む任意の他の手段によって調製される、発現される、作り出される、または単離される抗体など、組換え手段によって調製される、発現される、作り出される、または単離されるヒト抗体をすべて含む。そのような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発（またはヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物が使用される場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞変異誘発）にかけることができ、したがって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、それらと関係するが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しなくてもよい配列である。
【００３４】
「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なるもしくは改変されたクラス、エフェクター機能、および／もしくは種の定常領域またはキメラ抗体に新しい特性を与える完全に異なる分子、たとえば酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬剤などに連結されるように、定常領域またはその部分が置換された、改変された、または置き換えられた；または（ｂ）可変領域もしくはその部分が、異なるもしくは改変された抗原特異性を有する可変領域と置換された、改変された、もしくは置き換えられた、抗体分子である。たとえば、マウス抗体は、その定常領域を、本明細書において開示される改変を含むヒト免疫グロブリンに由来する定常領域と置換することによって改変することができる。ヒト定常領域との置換により、もとのマウス抗体または本明細書において開示される改変を有していないキメラ抗体と比較して、全体的に、ヒトにおいて低下した抗原性および低下した凝集を有しながら、キメラ抗体は、その特異性を保持することができる。
【００３５】
「ヒト化」抗体は、ヒトにおいてそれほど免疫原性でないが、非ヒト抗体の反応性を保持する抗体である。これは、たとえば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、抗体の残りの部分をそれらのヒト相当物（つまり定常領域および可変領域のフレームワーク部分）と置換することによって達成することができる。たとえばＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８１巻：６８５１〜６８５５頁、１９８４年；ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＯｉ、Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４４巻：６５〜９２頁、１９８８年；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁、１９８８年；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎ．、２８巻：４８９〜４９８頁、１９９１年；およびＰａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎ．、３１巻：１６９〜２１７頁、１９９４年を参照されたい。ヒト工学技術の他の例は、米国特許第５，７６６，８８６号において開示されるＸｏｍａ技術を含むが、これらに限定されない。
【００３６】
本明細書において使用される用語「リンカー」、「リンカー単位」、または「リンク」は、共有結合をなす化学成分または抗体を薬剤成分もしくは他の分子に共有結合する原子の鎖を指す。リンカーは、アルキルジイル、アリーレン、ヘテロアリーレンなどの二価のラジカル、−−（ＣＲ２）ｎＯ（ＣＲ２）ｎ−−、アルキルオキシ（たとえばポリエチレンオキシ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｏｘｙ）、ＰＥＧ、ポリメチレンオキシ）およびアルキルアミノ（たとえばポリエチレンアミノ、Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ（商標））の反復単位；ならびにスクシネート、スクシンアミド、ジグリコレート、マロネート、およびカプロアミドを含む二価酸エステルおよびアミドなどの成分を含む。
【００３７】
本明細書において使用される用語「標識」は、抗体に共有結合することができ、（ｉ）検出可能なシグナルを提供する；（ｉｉ）第２の標識と相互作用して、第１または第２の標識によって提供される検出可能なシグナルを改変する、たとえばＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）；（ｉｉｉ）抗原もしくはリガンドとの相互作用を安定化するまたは抗原もしくはリガンドとの結合の親和性を増加させる；（ｉｖ）電荷、疎水性、形状、もしくは他の物理的パラメーターによって移動度、たとえば電気泳動移動度もしくは細胞透過性に影響を与える、または（ｖ）リガンド親和性、抗体／抗原結合、もしくはイオン複合体形成を調整するために捕捉成分を提供するように機能する任意の成分を指す。
【００３８】
本明細書において使用される用語「Ｈｕｍａｎｅｅｒｉｎｇ」は、非ヒト抗体を工学的に作製されたヒト抗体に変換する方法を指す（たとえばＫａｌｏＢｉｏｓのＨｕｍａｎｅｅｒｉｎｇ（商標）技術を参照されたい）。
【００３９】
本明細書において使用されるように、「アイソタイプ」は、本明細書において開示される凝集傾向のモチーフを有する（そのため、凝集を低下させる、本明細書において開示される改変を受けやすい）重鎖定常領域遺伝子によって提供される任意の抗体クラスを指す（たとえばＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２などのＩｇＧ）。
【００４０】
本明細書において使用されるように、用語「親和性」は、単一の抗原部位での抗体および抗原の間の相互作用の強度を指す。それぞれの抗原部位内で、抗体「アーム」の可変領域は、多数の部位で、抗原と、弱い非共有結合作用を通して相互作用し、相互作用が多いほど、親和性は強くなる。本明細書において開示される改変は、好ましくは、本明細書において開示される免疫グロブリンもしくは抗体の親和性を低下させないまたは親和性は、３０パーセント未満、２０パーセント未満、１０パーセント未満、もしくは５パーセント未満低下する。本明細書において使用されるように、本明細書において開示される改変が親和性を低下させるかどうかを決定する場合、改変を有する免疫グロブリンまたは抗体および改変を欠くが、任意の無関係な変異を含む同じ免疫グロブリンの間で比較がなされる。
【００４１】
本明細書において使用されるように、用語「被験体」は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。
【００４２】
用語「非ヒト動物」は、脊椎動物、たとえば、非ヒト霊長動物、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、雌ウシ、ニワトリ、両生動物、爬虫類動物などの哺乳動物および非哺乳動物をすべて含む。
【００４３】
本明細書において使用される用語「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物を指す。化学療法剤の例は、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍ．）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（商標）、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（商標）、Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ）、スーテント（ＳＵ１１２４８、Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ  ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（商標）、Ｓａｎｏｆｉ）、５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）、ロイコボリン、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（商標）、Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＧＳＫ５７２０１６、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ロナファーニブ（ＳＣＨ  ６６３３６）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６、Ｂａｙｅｒ  Ｌａｂｓ．）、およびゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（商標）、Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ）、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ  ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（商標）シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびトリメチロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（とりわけブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン合成類似体、カルゼルシン合成類似体、およびビセレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９、およびＣＢ  １−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビキン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）などのニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）；エンジイン抗生物質などの抗生物質（たとえばカリケアマイシン、とりわけカリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．（１９９４年）３３巻：１８３〜１８６頁）；ジネマイシンＡを含むジネマイ��ン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラマイシン；ならびにネオカルチノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジンアナログ；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトーテン、トリロスタンなどの抗副腎薬；フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸補充物；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン；エフロルニチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；エリプチニウムアセテート；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシンおよびアンサミトシンなどのマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトザントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（ＴＭ）多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（とりわけＴ−２毒素、ベラクリンＡ（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ  Ａ）、ロリジンＡ（ｒｏｒｉｄｉｎ  Ａ）、およびアングイジン）；ウレタン；ビン���シン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、たとえば、ＴＡＸＯＬ（商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）クレモフォールなし、パクリタキセルのアルブミン結合（ａｌｂｕｍｉｎ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌｌ．）、およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（商標）ドセタセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；ＧＥＭＺＡＲ（商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトザントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；ならびに上記のもののうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体を含む。
【００４４】
「化学療法剤」のこの定義において、（ｉ）たとえばタモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびＦＡＲＥＳＴＯＮトレミフェンを含む、抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭ）などの、腫瘍におけるホルモン作用を調節するまたは阻害するように作用する抗ホルモン剤；（ｉｉ）たとえば４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（商標）エキセメスタン、ホルメスタン（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（商標）レトロゾール、およびアリミデックス（商標）アナストロゾールなどの、副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤；（ｉｉｉ）フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン剤；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；（ｉｖ）アロマターゼ阻害剤；（ｖ）プロテインキナーゼ阻害剤；（ｖｉ）脂質キナーゼ阻害剤；（ｖｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、たとえばＰＫＣ−アルファ、Ｒａｌｆ、およびＨ−Ｒａｓなどの、異常な細胞増殖に関係するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの；（ｖｉｉｉ）ＶＥＧＦ発現阻害剤（たとえばＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（商標）リボザイム）およびＨＥＲ２発現阻害剤などのリボザイム；（ｉｘ）遺伝子療法ワクチン、たとえばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（商標）ワクチンなどのワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（商標）ｒｍＲＨ；（ｘ）ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）などの抗脈管形成剤；ならびに（ｘｉ）上記のもののうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体もまた含まれる。
【００４５】
本明細書において使用されるように、用語「サイトカイン」は、細胞間媒介物質として他の細胞に対して作用する、ある細胞集団によって放出されるタンパク質についての総称である。そのようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン（ｐｒｏｒｅｌａｘｉｎ）；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝臓増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−αおよび−β；ミュラー管抑制因子；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮細胞増殖因子；インテグリン；トロンボポイエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βなどの神経増殖因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなどの形質転換増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリトロポイエチン（ＥＰＯ）；骨誘導（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ）因子；インターフェロン−α、−β、および−γなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２などのインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子がサイトカインの中に含まれる。本明細書において使用されるように、サイトカインという用語は、天然源または組換え細胞培養物に由来するタンパク質および天然の配列のサイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。
【００４６】
本明細書において使用されるように、用語「最適化された」は、ヌクレオチド配列が、産生細胞または生物、一般に真核細胞、たとえばＰｉｃｈｉａの細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、またはヒト細胞において好ましいコドンを使用するアミノ酸配列をコードするように改変されていることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、「親」配列としても知られている出発ヌクレオチド配列によってもともとコードされるアミノ酸配列を完全にまたはできるだけ多く保持するように工学的に作製される。他の真核細胞におけるこれらの配列の最適化された発現もまた、本明細書において想定される。最適化されたヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列もまた、最適化されたと表される。
【００４７】
本明細書において使用されるように、用語「抗原結合活性」は、その標的抗原に対する免疫グロブリンまたは免疫グロブリンコンジュゲートの結合特異性を指す。たとえば、抗原結合活性は、細胞ベースのバイオアッセイ（たとえばレポーター遺伝子アッセイ）、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）、または当業者に公知の任意の他の技術によって測定されてもよい。
【００４８】
本明細書において使用されるように、用語「架橋傾向」（ＣＬＰ）は、システインとの置換である変異を含有する改変免疫グロブリンまたは免疫グロブリンコンジュゲートが、置換システイン残基のところで、様々な免疫グロブリンの間で架橋する傾向を指す。たとえば、ＣＬＰは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーを用いる静的もしくは動的レーザー光散乱、または当業者に公知の任意の他の技術によって測定されるように、オリゴマー化のレベルによって決定することができる。クラスＩは、単量体であり、標識化後に安定したままである変異体を含む。クラスＩＩの変異体は、標識化前および後にわずかなパーセントの二量体を含有する。クラスＩＩＩ変異体は、いくつかの三量体の形成を含めてオリゴマー化するより明白な傾向を有する。クラスＩＶ変異体は、とりわけ標識化後の、三量体よりも大きな凝集体の存在によって証明されるように、オリゴマー化するさらに高い傾向を有する。クラスＶは、クラスＩＶの変異体と同様に、精製濃縮試料の断片化または着色などのさらなる構造の異常と共に、高いオリゴマー化傾向の変異体を含む。
【００４９】
用語「エピトープ」は、抗体への特異的な結合ができるタンパク質決定基を意味する。エピトープは、普通、アミノ酸または糖側鎖などの、分子の化学的に活性な表面群から成り、普通、特異の三次元構造の特徴および特異の電荷特徴を有する。高次構造エピトープおよび非高次構造エピトープは、後者ではなく前者への結合が変性溶媒の存在下において失われるという点で区別される。
【００５０】
用語「保存的改変変異体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的改変変異体は、同一のもしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードするそれらの核酸を指す、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重のために、多くの機能的に同一の核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。たとえば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定されるすべての位置で、コドンは、コードポリペプチドを改変することなく、記載される対応するコドンのいずれかに改変することができる。そのような核酸変異（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、保存的改変変異の一種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書におけるすべての核酸配列はまた、核酸のすべての可能なサイレント変異を示す。当業者は、核酸におけるそれぞれのコドンを（通常、メチオニンについての唯一のコドンであるＡＵＧおよび通常、トリプトファンについての唯一のコドンであるＴＧＧ以外は）、機能的に同一の分子を得るために改変することができることを認識する。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変異はそれぞれ、それぞれの記載される配列において潜在的に含まれる。
【００５１】
ポリペプチド配列については、「保存的改変変異体」は、化学的に類似するアミノ酸とのアミノ酸の置換をもたらす、ポリペプチド配列に対する個々の置換、欠失、または付加を含む。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野において周知である。そのような保存的改変変異体は、本開示の多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子に加えてのものであり、それらを排除するものではない。以下の８つの群が、互いに保存的置換となるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（たとえばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４年）を参照されたい）。
【００５２】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列との関連における用語「同一の」またはパーセント「同一性」は、同じである２つ以上の配列または部分配列を指す。２つの配列が、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用してまたは手動のアライメントおよび目視検査によって測定されるように、比較ウィンドウまたは指定領域に関して、比較され、一致を最大にするようにアライメントされた場合に、特定の百分率の同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する場合（つまり、特定の領域に関してまたは特定されない場合、全配列に関して６０％の同一性、必要に応じて６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性）、２つの配列は「実質的に同一である」。必要に応じて、同一性は、長さが少なくとも約５０ヌクレオチド（もしくは１０アミノ酸）である領域にわたってまたはより好ましくは、長さが１００〜５００もしくは１０００以上のヌクレオチド（または２０、５０、もしくは２００以上のアミノ酸）である領域にわたって存在する。
【００５３】
配列比較については、典型的に、一方の配列は、試験配列がそれに対して比較される参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列は、コンピューターに入力され、必要ならば部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。デフォルトプログラムパラメーターを使用することができるまたは代替パラメーターを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比べた試験配列についてのパーセント配列同一性を計算する。同一性について２つの配列を比較する場合、配列は、隣接する必要はないが、いかなるギャップも、全体的なパーセント同一性を低下させるペナルティーをそれに課す。ｂｌａｓｔｎについては、デフォルトパラメーターは、ギャップオープニングペナルティー＝５およびギャップエクステンションペナルティー＝２である。ｂｌａｓｔｐについては、デフォルトパラメーターは、ギャップオープニングペナルティー＝１１およびギャップエクステンションペナルティー＝１である。
【００５４】
本明細書において使用される「比較ウィンドウ」は、２０〜６００、普通約５０〜約２００、より普通では約１００〜１５０を含むが、これらに限定されない、隣接する位置の数のうちいずれか１つのセグメントに対する言及を含み、配列は、２つの配列が最適にアライメントされた後に、同数の隣接する位置の参照配列と比較されてもよい。比較のための配列のアライメントの方法は、当技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、たとえばＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９７０年）Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２巻：４８２ｃの局所的相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８巻：４４３頁、１９７０年の相同性アライメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５巻：２４４４頁、１９８８年の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または手動のアライメントおよび目視検査によって（たとえばＢｒｅｎｔら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（ｒｉｎｇｂｏｕ編、２００３年）を参照されたい）、行うことができる。
【００５５】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適しているアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻：３３８９〜３４０２頁、１９７７年；およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５巻：４０３〜４１０頁、１９９０年において記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列における同じ長さのワードとアライメントした場合に、正の値の閾値スコアＴと一致するまたはそれを満たす、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することによって、ハイスコアリング配列ペア（ＨＳＰ）を最初に同定することを伴う。Ｔは、近接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上掲）。これらの最初の近接ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見つけるために検索を始める種としての役割を果たす。ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加する限り、それぞれの配列に沿って両方向に拡張する。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（一致する残基のペアについてのリワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスは、累積スコアを計算するために使用される。それぞれの方向におけるワードヒットの拡張は、累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ減少した場合に；１つ以上の負のスコアリング残基アライメントの蓄積により累積スコアが０以下になった場合に；または一方の配列の末端に到達した場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列については）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長および１０の期待値（Ｅ）および５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９巻：１０９１５頁、１９８９年を参照されたい）アライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較をデフォルトとして使用する。
【００５６】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性の統計分析をも実行する（たとえばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０巻：５８７３〜５７８７頁、１９９３年を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間のマッチが偶然生じる確率の指標を提供する最も小さな確率の和（Ｐ（Ｎ））である。たとえば、参照核酸に対する試験核酸の比較における最も小さな確率の和が、約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は、参照配列に類似していると考えられる。
【００５７】
上記に述べられる配列同一性の百分率以外に、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという他の指標は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、下記に記載されるように、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して得られる抗体と免疫学的に交差反応性であるということである。したがって、ポリペプチドは、典型的に、たとえば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという他の指標は、２つの分子またはそれらの相補体が下記に記載されるように、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするということである。さらに、２つの核酸配列が実質的に同一であるという他の指標は、配列を増幅するために同じプライマーを使用することができるということである。
【００５８】
用語「作動可能に連結する」は、２つ以上のポリヌクレオチド（たとえばＤＮＡ）セグメントの間の機能的な関係を指す。典型的に、それは、転写配列との転写調節配列の機能的な関係を指す。たとえば、プロモーター配列またはエンハンサー配列は、それが、適切な宿主細胞または他の発現系において、コード配列の転写を刺激するまたは調整する場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写配列に作動可能に連結されているプロモーター転写調節配列は、転写配列に物理的に隣接している、つまり、それらはシス作用性である。しかしながら、エンハンサーなどのいくつかの転写調節配列は、それらがその転写を増強するコード配列のすぐ近くに物理的に隣接するまたは配置する必要がない。
【００５９】
用語「ベクター」は、それが連結された他のポリヌクレオチドを輸送することができるポリヌクレオチド分子を指すように意図される。ベクターの１つのタイプは、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントがその中にライゲーションされてもよい環状二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの他のタイプは、ウイルスベクターであり、これは、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムの中にライゲーションされてもよい。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製ができる（たとえば細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（たとえば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞へ導入すると宿主細胞のゲノムの中に組み込むことができ、それによって、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが作用的に連結される遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と本明細書において呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態をしていることが多い。本明細書では、プラスミドが最も共通して使用される形態のベクターであるので、「プラスミド」および「ベクター」は、区別なく使用され得る。しかしながら、本開示は、等価な機能を果たす、ウイルスベクター（たとえば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）など、発現ベクターの他のそのような形態を含むように意図される。
【００６０】
用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入される細胞を指す。そのような用語が特定の対象細胞だけでなくそのような細胞の子孫も指すように意図されることが理解されたい。ある種の改変が変異または環境上の影響に起因して続く世代に生じるかもしれないので、そのような子孫は、実際、親細胞と同一でない場合があるが、本明細書において使用されるように用語「宿主細胞」の範囲内になお含まれる。
【００６１】
用語「標的抗原」は、それに対して親免疫グロブリンが起されるまたは別の方法で生成される（たとえばファージディスプレーによって）抗原を指す。
【００６２】
用語「非変異免疫グロブリン」は、システイン残基による置換である少なくとも１つの変異を含まない免疫グロブリンを指す。本明細書において使用されるように、非変異免疫グロブリンは、変異を有するおよび有していない免疫グロブリンのオリゴマー化傾向またはコンジュゲーション効率の比較のための仮想の構築物であってもよい。例として、ヒト化変異およびコンジュゲーションの目的のためのシステインへの変異を含むネズミ抗体は、非変異免疫グロブリンではない。非変異免疫グロブリンは、ヒト化変異を有するが、システインへの変異を有していない抗体とする。変異が、コンジュゲーションのための部位を提供することを含む１超の目的を果たすように意図される場合、非変異免疫グロブリンは、そのような変異を含まない。
【００６３】
用語「凝集モチーフ」は、以下のプロセスに基づいて、グループ化された残基のセットを指す。最初に、０．１５を超えるＳＡＰ（５Å半径）を有する残基が同定され、次いで、０．１５を超えるＳＡＰ（５Å半径）を有するそれぞれの残基の５Å内の残基がすべて同定される。モチーフは、次いで、０．１５を超えるＳＡＰ（５Å半径）を有する残基および０．１５を超えるＳＡＰ（５Å半径）を有する残基の５Å内の０．０を超えるＳＡＰ（５Å半径）を有するすべての残基となる。共通の残基を有する残りのモチーフがなくなるまで、共通の少なくとも１つの残基を有するいかなるそのようなモチーフも、繰り返し、合体して、より大きなモチーフになる。これらの残りのモチーフまたは残基のセットは凝集モチーフを構成する。
【００６４】
免疫グロブリン残基が、本明細書において番号によって表される場合、残基番号は、被験体の免疫グロブリン配列がヒトＩｇＧ１免疫グロブリンに対してアライメントされる場合に、ＩｇＧ１分子における対応する残基のＫａｂａｔの番号を指す。参考として、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４定常ドメインをアライメントする。
【００６５】
【化１】
0005739880.tif 000002
【００６６】
【化２】
0005739880.tif 000003
【００６７】
【化３】
0005739880.tif 000004
ＶＨドメインおよびＶＬドメインのアライメントは、Ｅｗｅｒｔ、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ、およびＰｌｕｅｃｈｔｈｕｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３４巻（２００４年）１８４〜１９９頁において見つけることができる。
【００６８】
本発明の免疫グロブリンコンジュゲート
本明細書における本発明は、免疫グロブリンの表面の残基の少なくとも１つの変異を有する免疫グロブリンを含む免疫グロブリンコンジュゲートであって、該変異が、システイン残基による置換である、免疫グロブリンコンジュゲートに関する。置換システイン残基は、例として細胞傷害剤（たとえばドキソルビシンもしくは百日咳毒素などの毒素）、フルオレセインもしくはローダミンのような蛍光色素などの蛍光体、画像化もしくは放射線療法用の金属用のキレート化剤、ペプチジルもしくは非ペプチジル標識もしくは検出タグ、またはポリエチレングリコールの様々な異性体などの浄化改変剤（ｃｌｅａｒａｎｃｅ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、第３の成分に結合するペプチド、または他の炭水化物もしくは親油性剤であってもよい原子または分子にコンジュゲートされる。さらなる実施形態では、分子は、酵素、ペプチド、ペプチド模倣薬、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびＲＮＡミメティックを含むＲＮＡ分子などのヌクレオチド、またはアプタマーであってもよい。
【００６９】
標識免疫グロブリンコンジュゲート
特定の実施形態では、本発明の改変免疫グロブリンは、反応性のシステインチオール基を通して免疫グロブリンに共有結合することができる、任意の標識成分とコンジュゲートされてもよい（Ｓｉｎｇｈら（２００２年）Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３０４巻：１４７〜１５頁；Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ．およびＬａｎｅ，  Ｄ．（１９９９年）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；Ｌｕｎｄｂｌａｄ  Ｒ．  Ｌ．（１９９１年）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、第２版  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．）。付着した標識は、たとえば、（ｉ）検出可能なシグナルを提供する；（ｉｉ）たとえばＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）を生ずるように、第１または第２の標識によって提供される検出可能なシグナルを改変するために第２の標識と相互作用する；（ｉｉｉ）抗原もしくはリガンドとの相互作用を安定化するまたは抗原もしくはリガンドとの結合の親和性を増加させる；（ｉｖ）電荷、疎水性、形状、もしくは他の物理的パラメーターによって移動度、たとえば電気泳動移動度もしくは細胞透過性に影響を与える、または（ｖ）リガンド親和性、抗体／抗原結合、もしくはイオン複合体形成を調整するために捕捉成分を提供するように機能することができる。
【００７０】
標識免疫グロブリンコンジュゲートは、たとえば、特異的な細胞、組織、または血清において被験体の抗原の発現を検出するための診断アッセイに有用であってもよい。診断の適用のために、免疫グロブリンは、典型的に、検出可能な成分を用いて標識されるであろう。以下の典型的なカテゴリーに一般に分類することができる多数の標識が入手可能である：
（ａ）３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、または２１３Ｂｉなどの放射性同位体（放射性核種）。放射性同位体標識免疫グロブリンは、受容体標的画像化実験に有用である。免疫グロブリンは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１および２巻、Ｃｏｌｉｇｅｎら編  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、Ｐｕｂｓ．（１９９１年）において記載される技術を使用して、放射性同位体金属に結合する、該金属とキレート化する、またはそうでなければ該金属と複合体を形成するリガンド試薬であって、工学的に作製された免疫グロブリンのシステインチオールと反応性があるリガンド試薬を用いて、免疫グロブリンを標識することができる。金属イオンと複合体を形成してもよいキレート化リガンドは、ＤＯＴＡ、ＤＯＴＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＴＰＡ、およびＴＥＴＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ、Ｄａｌｌａｓ、Ｔｅｘ．）を含む。放射性核種は、本発明の抗体−薬剤コンジュゲートとの複合体形成を介して標的にすることができる（Ｗｕら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３巻（９号）：１１３７〜１１４６頁）。
【００７１】
画像化実験のための免疫グロブリン標識として適している金属キレート複合体が開示される：米国特許第５，３４２，６０６；５，４２８，１５５；５，３１６，７５７；５，４８０，９９０；５，４６２，７２５；５，４２８，１３９；５，３８５，８９３；５，７３９，２９４；５，７５０，６６０；５，８３４，４５６；Ｈｎａｔｏｗｉｃｈら（１９８３年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５巻：１４７〜１５７頁；Ｍｅａｒｅｓら（１９８４年）Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １４２巻：６８〜７８頁；Ｍｉｒｚａｄｅｈら（１９９０年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １巻：５９〜６５頁；Ｍｅａｒｅｓら（１９９０年）Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  １９９０年、Ｓｕｐｐｌ．１０：２１〜２６頁；Ｉｚａｒｄら（１９９２年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ３巻：３４６〜３５０頁；Ｎｉｋｕｌａら（１９９５年）Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ２２巻：３８７〜９０頁；Ｃａｍｅｒａら（１９９３年）Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ２０巻：９５５〜６２頁；Ｋｕｋｉｓら（１９９８年）Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ３９巻：２１０５〜２１１０頁；Ｖｅｒｅｌら（２００３年）Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ４４巻：１６６３〜１６７０頁；Ｃａｍｅｒａら（１９９４年）Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ２１巻：６４０〜６４６頁；Ｒｕｅｇｇら（１９９０年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５０巻：４２２１〜４２２６頁；Ｖｅｒｅｌら（２００３年）Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ４４巻：１６６３〜１６７０頁；Ｌｅｅら（２００１年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１巻：４４７４〜４４８２頁；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，ら（２００３年）Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ４４巻：１１０５〜１１１２頁；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら（１９９９年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １０巻：１０３〜１１１頁；Ｍｉｅｄｅｒｅｒら（２００４年）Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ４５巻：１２９〜１３７頁；ＤｅＮａｒｄｏら（１９９８年）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４巻：２４８３〜９０頁；Ｂｌｅｎｄら（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  １８巻：３５５〜３６３頁；Ｎｉｋｕｌａら（１９９９年）Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ４０巻：１６６〜７６頁；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら（１９９８年）Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ３９巻：８２９〜３６頁；Ｍａｒｄｉｒｏｓｓｉａｎら（１９９３年）Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ２０巻：６５〜７４頁；Ｒｏｓｅｌｌｉら（１９９９年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、１４巻：２０９〜２０頁。
【００７２】
（ｂ）希土類キレート（ユウロピウムキレート）、ＦＩＴＣ、５−カルボキシフルオレスセイン、６−カルボキシフルオレセインを含むフルオレセイン型；ＴＡＭＲＡを含むローダミン型；ダンシル；リサミン；シアニン；フィコエリトリン；テキサス赤色；およびそのアナログなどの蛍光標識。蛍光性標識は、たとえばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、前掲において開示される技術を使用して、免疫グロブリンにコンジュゲートすることができる。蛍光色素試薬および蛍光標識試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）およびＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）から市販で入手可能であるものを含む。
【００７３】
ｃ）様々な酵素−基質標識は入手可能であるまたは開示されている（米国特許第４，２７５，１４９号）。酵素は、一般に、様々な技術を使用して測定することができる発色性基質の化学変換を触媒する。たとえば、酵素は、基質における変色を触媒し得、これは、分光光度的に測定することができる。その代わりに、酵素は、基質の蛍光または化学発光を改変し得る。蛍光における変化を定量化するための技術は、上記に記載されている。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起するようになり、次いで、測定することができる（たとえばケミルミノメーターを使用して）光を放射し得るかまたは蛍光受容体にエネルギーを提供する。酵素標識の例は、ルシフェラーゼ（たとえばホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ（たとえばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ヘテロ環式オキシダーゼ（ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなど）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどを含む。抗体に酵素をコンジュゲートするための技術は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら（１９８１年）「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．（編Ｊ．  Ｌａｎｇｏｎｅ  ＆  Ｈ．  Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、７３巻：１４７〜１６６頁において記載されている。
【００７４】
酵素−基質の組合せの例は、たとえば、（ｉ）基質として過酸化水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を用いるホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、過酸化水素は、色素前駆体を酸化する（たとえばオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））；（ｉｉ）発色性基質としてパラ−ニトロフェニルホスフェートを用いるアルカリホスファターゼ（ＡＰ）；および（ｉｉｉ）発色性基質（たとえばｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ））または蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドを用いるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）を含む。多数の他の酵素−基質の組合せは、当業者に入手可能である。一般的な総説については、米国特許第４，２７５，１４９号および第４，３１８，９８０号を参照されたい。
【００７５】
標識は、本発明の改変免疫グロブリンと間接的にコンジュゲートされてもよい。たとえば、免疫グロブリンは、ビオチンとコンジュゲートすることができ、上記に言及される３つの広範囲のカテゴリーの標識のいずれも、アビジンもしくはストレプトアビジンとコンジュゲートすることができるまたはその逆も成立する。ビオチンは、ストレプトアビジンに選択的に結合し、したがって、標識は、この間接的な方法において免疫グロブリンとコンジュゲートすることができる。その代わりに、免疫グロブリン変異体との標識の間接的なコンジュゲーションを達成するために、免疫グロブリン変異体は、小さなハプテン（たとえばジゴキシン）とコンジュゲートし、上記に言及される様々なタイプの標識のうちの１つを、抗ハプテンポリペプチド変異体（たとえば抗ジゴキシン抗体）とコンジュゲートする。したがって、免疫グロブリン変異体との標識の間接的なコンジュゲーションは、達成することができる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，  Ｇ．（１９９６年）ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）。
【００７６】
本発明の改変免疫グロブリンおよび免疫グロブリンコンジュゲートは、ＥＬＩＳＡ、競合結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイなどの任意の公知のアッセイ方法において使用されてもよい（Ｚｏｌａ（１９８７年）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４７〜１５８頁、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）。
【００７７】
検出標識は、結合事象または認識事象の場所を突き止める、視覚化する、および定量するのに有用であり得る。本発明の標識免疫グロブリンコンジュゲートは、細胞表面受容体を検出することができる。検出可能に標識された免疫グロブリンコンジュゲートについての他の使用は、蛍光標識抗体とビーズをコンジュゲートすることおよびリガンドの結合に際して蛍光シグナルを検出することを含む、ビーズベースの免疫捕捉法である。類似する結合検出方法は、抗体−抗原相互作用を測定し、検出するために表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）効果を利用する。
【００７８】
蛍光色素および化学発光色素などの検出標識（Ｂｒｉｇｇｓら（１９９７年）「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｄｙｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  Ａｍｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，」Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｔｒａｎｓ．  １巻：１０５１〜１０５８頁）は、検出可能なシグナルを提供し、一般に、好ましくは以下の特性を有する免疫グロブリンを標識するのに適用可能である：（ｉ）少量の免疫グロブリンを無細胞および細胞ベースのアッセイの両方において感度良く検出することができるように、標識免疫グロブリンは、低バックグラウンドと共に非常に高いシグナルを生成するべきである；ならびに（ｉｉ）蛍光シグナルが、著しい光退色を伴うことなく観察され、モニターされ、記録され得るように、標識抗体は、光安定性であるべきである。膜または細胞表面、とりわけ生きた細胞への標識抗体の細胞表面結合を含む適用については、標識は、好ましくは、（ｉｉｉ）有効なコンジュゲート濃度および検出感度を達成するために良好な水溶性を有するならびに（ｉｖ）細胞の正常な代謝プロセスを破壊しないまたは早発性の細胞死を引き起こさないように生細胞に対して無毒性である。
【００７９】
細胞の蛍光強度の直接定量および蛍光標識事象、たとえばペプチド−色素コンジュゲートの細胞表面結合の計数は、生きた細胞またはビーズを用いる非放射性アッセイである、混合および読み取りを自動化するシステム（ＦＭＡＴ（商標）８１００  ＨＴＳ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）上で行われてもよい（Ｍｉｒａｇｌｉａ、「Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｃｅｌｌ−  ａｎｄ  ｂｅａｄ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ  ａｓｓａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（１９９９年）Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ４巻：１９３〜２０４頁）。標識免疫グロブリンの使用はまた、細胞表面受容体結合アッセイ、免疫捕捉アッセイ、蛍光連結免疫吸着アッセイ（ＦＬＩＳＡ）、カスパーゼ切断（Ｚｈｅｎｇ「Ｃａｓｐａｓｅ−３  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｂｏｔｈ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｖｅｎｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｆａｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」（１９９８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５巻：６１８〜２３頁；米国特許第６，３７２，９０７号）、アポトーシス（Ｖｅｒｍｅｓ「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ｅａｒｌｙ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ」（１９９５年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４巻：３９〜５１頁）、および細胞傷害性アッセイをも含む。蛍光比色微容量アッセイ技術は、細胞表面を標的にする分子によってアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを同定するために使用することができる（Ｓｗａｒｔｚｍａｎ「Ａ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ  ａｓｓａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（１９９９年）Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２７１巻：１４３〜５１頁）。
【００８０】
本発明の標識免疫グロブリンコンジュゲートは、（ｉ）ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）；（ｉｉ）ＭｉｃｒｏＣＴ（コンピューター連動断層撮影）；（ｉｉｉ）ＳＰＥＣＴ（シングルフォトンエミッションコンピューター連動断層撮影）；（ｉｖ）ＰＥＴ（ポジトロンエミッション断層撮影）Ｃｈｅｎら（２００４年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １５巻：４１〜４９頁；（ｖ）生物発光；（ｖｉ）蛍光；および（ｖｉｉ）超音波などの生物医学的イメージングおよび分子イメージングの様々な方法および技術による画像化バイオマーカーおよびプローブとして有用である。免疫シンチグラフィは、放射性物質を用いて標識された抗体が、動物またはヒト患者に投与され、抗体が局在化する体内の部位で写真が撮られる画像化手順である（米国特許第６，５２８，６２４号）。画像化バイオマーカーは、客観的に測定され、正常な生物学的プロセス、病原性プロセス、または治療的介入に対する薬理学的反応の指標として評価されてもよい。バイオマーカーは、いくつかのタイプがあり得る：タイプ０は、疾患の自然経過マーカーであり、公知の臨床的指数、たとえば関節リウマチにおける滑膜炎症のＭＲＩ評価と長期的に相関する；タイプＩマーカーは、たとえ、メカニズムが臨床的結果と関連し得なくても、作用のメカニズムに従って介入の効果を得る；タイプＩＩマーカーは、代替エンドポイントとして機能し、バイオマーカーにおける変化によりまたはバイオマーカーに由来するシグナルにより、ＣＴで関節リウマチに測定される骨びらんなどの標的にされる応答を「検証する」という、臨床的有益性が予測され、バイオマーカーの画像化は、したがって、（ｉ）標的タンパク質の発現、（ｉｉ）標的タンパク質への治療薬の結合、つまり選択性、ならびに（ｉｉｉ）クリアランスおよび半減期の薬物動態学的データに関する薬力学的（ＰＤ）治療情報を提供することができる。実験室ベースのバイオマーカーに比べてｉｎ  ｖｉｖｏでのバイオマーカー画像化の利点には、非侵襲性の治療、定量化できる全身評価、反復、つまり複数の時点での投薬および評価、ならびに前臨床（小動物）結果を臨床（ヒト）結果に潜在的に移すことができる効果、が挙げられる。いくつかの適用では、バイオイメージングは、前臨床研究における動物実験に取って代わるまたはその数を最小限にする。
【００８１】
放射性核種イメージング標識は、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、または２１３Ｂｉなどの放射性核種を含む。放射性核種金属イオンは、ＤＯＴＡなどのキレート化リンカーと複合体を形成することができる。ＤＯＴＡ−マレイミド（４−マレイミドブチルアミドベンジル−ＤＯＴＡ）（４−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒａｍｉｄｏｂｅｎｚｙｌ−ＤＯＴＡ）などのリンカー試薬は、Ａｘｗｏｒｔｈｙら（２０００年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７巻（４号）：１８０２〜１８０７頁）の手順に従って、クロロギ酸イソプロピル（Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて活性化される４−マレイミド酪酸（Ｆｌｕｋａ）とのアミノベンジル−ＤＯＴＡの反応によって調製することができる。ＤＯＴＡ−マレイミド試薬は、改変免疫グロブリンの遊離システインアミノ酸と反応し、抗体に対して金属複合体形成リガンドを提供する（Ｌｅｗｉｓら（１９９８年）Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．  ９巻：７２〜８６頁）。ＤＯＴＡ−ＮＨＳ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸モノ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）などのキレート化リンカー標識試薬は、市販で入手可能である（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ、Ｄａｌｌａｓ、Ｔｅｘ．）。放射性核種標識抗体を用いる受容体標的画像化は、腫瘍組織における抗体の進行性の蓄積の検出および定量によって経路活性化のマーカーを提供することができる（Ａｌｂｅｒｔら（１９９８年）Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  ８巻：１２０７〜１２１０頁）。コンジュゲートされた放射性金属は、リソソーム分解後に細胞内にとどまり得る。
【００８２】
ペプチド標識方法は、周知である。Ｈａｕｇｌａｎｄ、２００３年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．；Ｂｒｉｎｋｌｅｙ、１９９２年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ３巻：２頁；Ｇａｒｍａｎ（１９９７年）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ；Ｍｅａｎｓ（１９９０年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １巻：２頁；Ｇｌａｚｅｒら（１９７５年）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｔ．  Ｓ．  ＷｏｒｋおよびＥ．  Ｗｏｒｋ編）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｌｕｎｄｂｌａｄ，  Ｒ．  Ｌ．およびＮｏｙｅｓ，  Ｃ．  Ｍ．（１９８４年）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、第ＩおよびＩＩ巻、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ，  Ｇ．（１９８５年）「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｈ．  Ｔｓｃｈｅｓｃｈｅ編、Ｗａｌｔｅｒ  ＤｅＧｒｙｔｅｒ、ＢｅｒｌｉｎおよびＮｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＷｏｎｇ（１９９１年）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．）；Ｄｅ  Ｌｅｏｎ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら（２００４年）Ｃｈｅｍ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  １０巻：１１４９〜１１５５頁；Ｌｅｗｉｓら（２００１年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １２巻：３２０〜３２４頁；Ｌｉら（２００２年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １３巻：１１０〜１１５頁；Ｍｉｅｒら（２００５年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １６巻：２４０〜２３７頁を参照されたい。
【００８３】
十分に近くで、２つの成分、蛍光レポーターおよびクエンチャーを用いて標識されたペプチドおよびタンパク質は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を受ける。レポーター基は、典型的に、一定の波長の光によって励起される蛍光色素であり、最大の明るさの放射に適切なストークスシフトを伴い、受容体またはクエンチャー基にエネルギーを転移する。蛍光色素は、フルオレセインおよびローダミンならびにそれらの誘導体などの、拡張された芳香族性を有する分子を含む。蛍光レポーターは、インタクトなペプチドにおいてクエンチャー成分によって部分的にまたは著しく消光されてもよい。ペプチダーゼまたはプロテアーゼによるペプチドの切断に際して、蛍光における検出可能な増加が測定されてもよい（Ｋｎｉｇｈｔ，  Ｃ．（１９９５年）「Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２４８巻：１８〜３４頁）。
【００８４】
本発明の標識抗体はまた、親和性精製試薬として使用されてもよい。このプロセスでは、標識抗体は、当技術分野において周知の方法を使用して、セファデックス樹脂または濾紙のような固相上に固定される。固定された抗体は、精製されることとなる抗原を含有する試料と接触させ、その後、支持体は、固定されたポリペプチド変異体に結合する精製されることとなる抗原以外の、試料中の物質を実質的にすべて除去する、適当な溶媒を用いて洗浄される。最後に、その支持体は、ポリペプチド変異体から抗原を放出する、グリシンバッファー、ｐＨ５．０などの他の適している溶媒を用いて洗浄される。
【００８５】
標識試薬は、典型的に、（ｉ）標識抗体を形成するように、改変免疫グロブリンのシステインチオールと直接、（ｉｉ）リンカー標識中間物を形成するように、リンカー試薬と、または（ｉｉｉ）標識抗体を形成するように、リンカー抗体と反応し得る、反応性の官能基を持つ。標識試薬の反応性の官能基は、他の官能基もまた使用することができるが、マレイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドスクシンイミジルエステル（たとえばＮＨＳ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、イソチオシアネート、塩化スルフォニル、２，６−ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステル、およびホスホルアダイトを含む。
【００８６】
典型的な反応性の官能基は、検出可能な標識、たとえばビオチンまたは蛍光色素のカルボキシル基置換基のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）である。標識のＮＨＳエステルは、前もって形成され得、単離され得、精製され得、および／もしくは特徴付けられ得るかまたはそれは、ｉｎ  ｓｉｔｕで形成され、抗体の求核基と反応し得る。典型的に、標識のカルボキシル形態は、いくつかの組合せのカルボジイミド試薬、たとえばジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミドまたはウロニウム試薬、たとえばＴＳＴＵ（Ｏ−−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、もしくはＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）などの活性化剤、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応することによって活性化され、標識のＮＨＳエステルを生ずる。いくつかの場合では、標識および抗体は、１ステップで、標識のｉｎ  ｓｉｔｕ活性化および抗体との反応によってカップルされ、標識抗体コンジュゲートを形成し得る。他の活性化試薬およびカップリング試薬は、ＴＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾ−１−イル）−１−１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＴＦＦＨ（Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラメチルウロニウム２−フルオロ−ヘキサフルオロホスフェート）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ＥＥＤＱ（２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロ−キノリン）、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）；ＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイミド）、ＭＳＮＴ（１−（メシチレン−２−スルフォニル）−３−ニトロ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール、およびアリールスルフォニルハライド、たとえばトリイソプロピルベンゼンスルフォニルクロリドを含む。
【００８７】
したがって、本発明の目的は、診断ツールとしての、段落［０００７］において議論される免疫グロブリンコンジュゲートならびにそれらの実施形態の任意のおよびすべての組合せの使用を提供することである。
【００８８】
したがって、本発明の目的は、高分子量タンパク質についての標準物質としての、段落［０００７］において議論される免疫グロブリンコンジュゲートならびにそれらの実施形態の任意のおよびすべての組合せの使用を提供することである。
【００８９】
免疫グロブリンポリマーコンジュゲート
さらなる実施形態では、本発明はまた、免疫グロブリンがポリマーと連結される免疫グロブリンコンジュゲートをも想定する。典型的に、ポリマーは、免疫グロブリン成分が、生理的環境などの水性環境において沈殿しないように、水溶性である。適しているポリマーの例は、アシル化のための活性なエステルまたはアルキル化のためのアルデヒドなどの、単一の反応性基を有するように改変されたものである。このように、重合度は、制御することができる。反応性のアルデヒドの例は、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはモノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ、またはそのアリールオキシ誘導体である（たとえばＨａｒｒｉｓら、米国特許第５，２５２，７１４号を参照されたい）。ポリマーは、分岐または非分岐であってもよい。さらに、ポリマーの混合物は、抗体成分とのコンジュゲートを産生するために使用することができる。
【００９０】
適している水溶性ポリマーは、限定を伴うことなく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ＰＥＧ、モノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−ＰＥＧ、アリールオキシ−ＰＥＧ、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ＰＥＧ、トレシルモノメトキシＰＥＧ、ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ビス−炭酸スクシンイミジルＰＥＧ、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（たとえばグリセロール）、ポリビニルアルコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマーを含む。適しているＰＥＧは、たとえば、５，０００、１２，０００、２０，０００、および２５，０００を含む、約６００〜約６０，０００の分子量を有していてもよい。コンジュゲートはまた、そのような水溶性ポリマーの混合物を含むことができる。
【００９１】
実例として、ポリアルキルオキシド成分は、免疫グロブリン成分のＮ末端に付着することができる。ＰＥＧは、１つの適しているポリアルキルオキシドである。たとえば、免疫グロブリンは、ＰＥＧを用いて改変されてもよい（「ＰＥＧ化」として公知のプロセス）。免疫グロブリンのＰＥＧ化は、当技術分野において公知のＰＥＧ化反応のうちのいずれかによって実行することができる（たとえば欧州特許第０  １５４  ３１６号、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ９巻：２４９頁（１９９２年）、ＤｕｎｃａｎおよびＳｐｒｅａｆｉｃｏ、Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．  ２７巻：２９０頁（１９９４年）、およびＦｒａｎｃｉｓら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ６８巻：１頁（１９９８年）を参照されたい）。たとえば、ＰＥＧ化は、反応性のポリエチレングリコール分子を用いるアシル化反応またはアルキル化反応によって実行することができる。代替アプローチでは、免疫グロブリンコンジュゲートは、活性化ＰＥＧを縮合することによって形成され、ＰＥＧの末端のヒドロキシ基またはアミノ基は、活性化リンカーと置換されている（たとえばＫａｒａｓｉｅｗｉｃｚら、米国特許第５，３８２，６５７号を参照されたい）。
【００９２】
アシル化によるＰＥＧ化は、典型的に、免疫グロブリンとＰＥＧの活性エステル誘導体を反応させることを必要とする。活性化ＰＥＧエステルの例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドにエステル化されたＰＥＧである。本明細書において使用されるように、用語「アシル化」は、免疫グロブリンおよび水溶性ポリマーの間の以下のタイプの連結を含む：アミド、カルバメート、ウレタンなど。アシル化によってＰＥＧ化抗ＢＣＭＡ−ＴＡＣＩ免疫グロブリンを調製する方法は、典型的に、（ａ）１つ以上のＰＥＧ基が免疫グロブリンに付着する条件下で、ＰＥＧ（ＰＥＧのアルデヒド誘導体の反応性エステルなど）と免疫グロブリンを反応させるステップおよび（ｂ）反応産物（複数可）を得るステップを含む。一般に、アシル化反応のための最適な反応条件は、公知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて決定される。たとえば、ＰＥＧ：抗体成分の比が大きいほど、ポリＰＥＧ化抗体成分産物の百分率は大きくなる。
【００９３】
アシル化によるＰＥＧ化の産物は、典型的に、ポリＰＥＧ化免疫グロブリン産物であり、リジンε−アミノ基が、アシル連結基を介してＰＥＧ化される。接続する連結の例は、アミドである。典型的に、より高次のＰＥＧ化を有するいくつかの種が反応条件に依存して形成されてもよいが、結果として生じる免疫グロブリン成分は、少なくとも９５％がモノ、ジ、またはトリペグ化されたものである。ＰＥＧ化された種は、透析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなどのような標準的な精製法を使用して、コンジュゲートされていない免疫グロブリン成分から分離することができる。
【００９４】
アルキル化によるＰＥＧ化は、一般に、還元剤の存在下において免疫グロブリン成分とＰＥＧの末端アルデヒド誘導体を反応させることを伴う。ＰＥＧ基は、−−（ＣＨ２）−−ＮＨ基を介してポリペプチドに付着することができる。
【００９５】
モノＰＥＧ化産物を産生するための還元アルキル化を介しての誘導体化は、誘導体化に利用可能な様々なタイプの第一級アミノ基の特異な反応性を利用する。典型的に、反応は、リジン残基のε−アミノ基およびタンパク質のＮ末端残基のα−アミノ基の間のｐＫａ差を利用することを可能にするｐＨで実行される。そのような選択的な誘導体化によって、タンパク質への、アルデヒドなどの反応性基を含有する水溶性ポリマーの付着が、制御される。ポリマーとのコンジュゲーションは、リジン側鎖アミノ基などの他の反応性基の著しい改変を伴うことなく、タンパク質のＮ末端で主に生じる。
【００９６】
モノポリマー抗体成分コンジュゲート分子の実質的に均質の集団を産生するための還元アルキル化は、（ａ）抗体成分のアミノ末端のα−アミノ基の選択的な改変を可能にするのに適しているｐＨでの還元アルキル化条件下で、反応性のＰＥＧと抗体成分を反応させるステップおよび（ｂ）反応産物（複数可）を得るステップを含むことができる。還元アルキル化に使用される還元剤は、水溶液中で安定であるべきであり、好ましくは、還元アルキル化の最初のプロセスにおいて形成されるシッフ塩基のみを還元し得るべきものである。好ましい還元剤は、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、およびピリジンボランを含む。
【００９７】
モノポリマー免疫グロブリンコンジュゲートの実質的に均質の集団については、還元アルキル化反応条件は、免疫グロブリンのＮ末端への水溶性ポリマー成分の選択的な付着を可能にするものである。そのような反応条件は、一般に、リジンアミノ基およびＮ末端のα−アミノ基の間のｐＫａ差を提供する。ｐＨはまた、使用されることとなるタンパク質に対するポリマーの比に影響を与える。一般に、Ｎ末端α−基が反応性でないほど、より多くのポリマーが最適条件を達成するために必要となるので、ｐＨがより低いほど、タンパク質に対してポリマーが大過剰であることが所望される。ｐＨがより高い場合、より多くの反応性基が利用可能であるので、ポリマー：抗体成分は、多量である必要がない。典型的に、ｐＨは、３〜９または３〜６の範囲内にある。
【００９８】
ポリペプチド成分および水溶性ポリマー成分を含むコンジュゲートを産生するための一般的な方法は、当技術分野において公知である。たとえばＫａｒａｓｉｅｗｉｃｚら、米国特許第５，３８２，６５７号、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、米国特許第５，７３８，８４６号、Ｎｉｅｆｏｒｔｈら、Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ５９巻：６３６頁（１９９６年）、Ｍｏｎｋａｒｓｈら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４７巻：４３４頁（１９９７年））を参照されたい。
【００９９】
免疫グロブリン薬剤コンジュゲート
さらなる実施形態では、本発明は、免疫グロブリンが薬剤または細胞傷害性成分にコンジュゲートされる免疫グロブリンコンジュゲートを含む。免疫グロブリン薬剤コンジュゲートの薬剤成分は、たとえば、細胞傷害性効果または細胞増殖抑制性効果を有する任意の化合物、成分、または基を含んでいてもよい。薬剤成分は、限定を伴うことなく、（ｉ）微小管阻害剤、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはＤＮＡ挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）として機能し得る化学療法剤；（ｉｉ）酵素的に機能し得るタンパク毒素；および（ｉｉｉ）放射性同位体を含む。
【０１００】
典型的な薬剤成分は、マイタンシノイド、オーリスタチン、ドラスタチン、トリコテセン、ＣＣ１０６５、カリケアマイシンおよび他のエンジイン抗生物質、タキサン、アントラサイクリン、ならびにその立体異性体、同配体、アナログ、または誘導体を含むが、これらに限定されない。
【０１０１】
マイタンシノイド薬剤成分としての使用に適しているメイタンシン化合物は、当技術分野において周知であり、公知の方法に従って天然源から単離することができる、遺伝子工学技術を使用して産生することができる（Ｙｕら（２００２年）ＰＲＯＣ．  ＮＡＴ．  ＡＣＡＤ．  ＳＣＩ．（ＵＳＡ）９９巻：７９６８〜７９７３頁を参照されたい）、またはメイタンシノールおよびメイタンシノール類似体は、公知の方法によって合成により調製することができる。
【０１０２】
典型的なマイタンシノイド薬剤成分は、Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号）（アンサミトシンＰ２の水素化アルミニウムリチウム還元によって調製される）；Ｃ−２０−ヒドロキシ（またはＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号および第４，３０７，０１６号）（ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓもしくはＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓを使用する脱メチル化またはＬＡＨを使用する脱塩素化によって調製される）；ならびにＣ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（塩化アシルを使用するアシル化によって調製される）および他の位置に改変を有するものなどの改変芳香環を有するものを含む。
【０１０３】
典型的なマイタンシノイド薬剤成分はまた、Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（Ｈ２ＳまたはＰ２Ｓ５とのメイタンシノールの反応によって調製される）；Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２  ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）；Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）（Ｎｏｃａｒｄｉａから調製される）；Ｃ−−Ｉ  ５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓによるメイタンシノールの変換によって調製される）；Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号および第４，３１５，９２９号）（Ｔｒｅｗｉａ  ｎｕｄｌｆｌｏｒａから単離される）；Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号および第４，３２２，３４８号）（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓによるメイタンシノールの脱メチル化によって調製される）；ならびに４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（メイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元によって調製される）などの改変を有するものをも含む。メイタンシン化合物上の多くの位置は、連結のタイプに依存して、連結位置として有用であることが公知である。たとえば、エステル結合を形成するのに、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルを用いて改変されるＣ−１４位、ヒドロキシル基を用いて改変されるＣ−１５位、およびヒドロキシル基を有するＣ−２０位はすべて、適している。
【０１０４】
メイタンシン化合物は、微小管タンパク質、チューブリンの重合の阻害を通して、有糸分裂中に微小管の形成を阻害することによって細胞増殖を阻害する（Ｒｅｍｉｌｌａｒｄら（１９７５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １８９巻：１００２〜１００５頁）。メイタンシンおよびマイタンシノイドは、非常に細胞傷害性であるが、癌治療におけるそれらの臨床的使用は、主として腫瘍に対するそれらの不十分な選択性に起因するそれらの激しい全身性副作用によって、非常に制限されている。メイタンシンを用いる臨床試験は、中枢神経系および胃腸系に対する深刻な有害作用により中止された（Ｉｓｓｅｌら（１９７８年）Ｃａｎ．  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．  Ｒｅｖ．  ５巻：１９９〜２０７頁）。
【０１０５】
マイタンシノイド薬剤成分は、免疫グロブリン薬剤コンジュゲートにおいて魅力的な薬剤成分である、なぜなら、それらは、（ｉ）発酵または化学改変、発酵産物の誘導体化によって調製するのに比較的利用可能であり、（ｉｉ）抗体への、非ジスルフィドリンカーを通してのコンジュゲーションに適している官能基を用いる誘導体化に適用可能であり、（ｉｉｉ）血漿中で安定しており、かつ（ｉｖ）様々な腫瘍細胞系に対して有効であるからである（米国特許出願公開第２００５／０１６９９３３号；ＷＯ  ２００５／０３７９９２；米国特許第５，２０８，０２０号）。
【０１０６】
他の薬剤成分でのように、マイタンシノイド薬剤成分の立体異性体はすべて、本発明の化合物として想定される。
【０１０７】
免疫グロブリン薬剤コンジュゲートの薬剤成分はまた、ドラスタチンならびにそれらのペプチドアナログおよび誘導体であるオーリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号；第５，７８０，５８８号）をも含む。ドラスタチンおよびオーリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、ならびに核分裂および細胞分裂に干渉し（Ｗｏｙｋｅら（２００１年）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ４５巻（１２号）：３５８０〜３５８４頁）、抗癌活性（米国特許第５，６６３，１４９号）および抗真菌活性（Ｐｅｔｔｉｔら（１９９８年）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ４２巻：２９６１〜２９６５頁）を有することが示された。ドラスタチンまたはオーリスタチンの薬剤成分の様々な形態は、ペプチド薬剤成分のＮ（アミノ）末端またはＣ（カルボキシル）末端を通して抗体に共有結合され得る（ＷＯ  ０２／０８８１７２；Ｄｏｒｏｎｉｎａら（２００３年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１巻（７号）：７７８〜７８４頁；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら（２００３年）Ｂｌｏｏｄ  １０２巻（４号）：１４５８〜１４６５頁）。
【０１０８】
典型的なオーリスタチンの実施形態は、ＷＯ２００５／０８１７１１；Ｓｅｎｔｅｒら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第４５巻、Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ６２３、２００４年３月２８日に発表、において開示される、Ｎ末端連結モノメチルオーリスタチン薬剤成分ＤＥおよびＤＦを含み、それぞれの開示は、それらの全体が参照によって明らかに組み込まれる。
【０１０９】
典型的に、ペプチドベースの薬剤成分は、２つ以上のアミノ酸および／またはペプチド断片の間でペプチド結合を形成することによって調製することができる。そのようなペプチド結合は、たとえば、ペプチド化学の分野において周知である液相合成方法に従って調製することができる（Ｅ．  ＳｃｈｒｏｄｅｒおよびＫ．  Ｌｕｉｂｋｅ「Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、第１巻、７６〜１３６頁、１９６５年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。
【０１１０】
薬剤成分は、カリケアマイシンならびにそのアナログおよび誘導体を含む。カリケアマイシンファミリーの抗生物質は、ピコモル以下の濃度で二本鎖ＤＮＡ切断をもたらすことができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５，７１２，３７４号；第５，７１４，５８６号；第５，７３９，１１６号；第５，７６７，２８５号；第５，７７０，７０１号、第５，７７０，７１０号；第５，７７３，００１号；第５，８７７，２９６号を参照されたい。使用されてもよいカリケアマイシンの構造類似体は、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ、およびθＩ１を含むが、これらに限定されない（ＨｉｎｍａｎらＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３巻：３３３６〜３３４２頁（１９９３年）、ＬｏｄｅらＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８巻：２９２５〜２９２８頁（１９９８年）。
【０１１１】
タンパク毒素は、たとえば、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに由来する）、リシンＡ鎖（Ｖｉｔｅｔｔａら（１９８７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８巻：１０９８頁）、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）（ＷＯ  ９３／２１２３２）を含む。
【０１１２】
治療用の放射性同位体は、たとえば、３２Ｐ、３３Ｐ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、１５３Ｓｍ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、およびＬｕの放射性同位体を含む。
【０１１３】
放射性同位体または他の標識は、公知の方法においてコンジュゲート中に組み込まれてもよい（Ｆｒａｋｅｒら（１９７８年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ８０巻：４９〜５７頁；「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」Ｃｈａｔａｌ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９年）。炭素１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性核種のコンジュゲーションのための典型的なキレート化剤である（ＷＯ  ９４／１１０２６）。
【０１１４】
リンカー
本発明の特定の実施形態では、免疫グロブリンコンジュゲートは、少なくとも２つの反応部位を有するリンカー分子を含む。一方の反応部位は、免疫グロブリンの置換システイン残基に結合しており、他方の反応部位は、原子または分子に結合している。「リンカー」は、免疫グロブリンコンジュゲートを形成するために１つ以上の薬剤成分および免疫グロブリンユニットを連結するために使用することができる二官能成分または多官能成分である。免疫グロブリンコンジュゲートは、薬剤または他の分子および免疫グロブリンに結合するための反応性の官能基を有するリンカーを使用して好都合に調製することができる。システインへの置換を有する改変免疫グロブリンのシステインチオールは、リンカー試薬、薬剤成分、または薬剤−リンカー中間体の官能基と結合を形成することができる。
【０１１５】
一態様では、リンカーは、抗体上に存在する求核システインに対して反応性の求電子基を有する反応部位を有する。抗体のシステインチオールは、リンカー上の求電子基と反応性であり、リンカーに対して共有結合を形成する。有用な求電子基は、マレイミド基およびハロアセトアミド基を含むが、これらに限定されない。
【０１１６】
本発明の改変免疫グロブリンは、Ｋｌｕｓｓｍａｎら（２００４年）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５巻（４号）：７６５〜７７３頁の７６６頁のコンジュゲーション方法によれば、マレイミドまたはα−ハロカルボニルなどの求電子官能基を有するリンカー試薬または薬剤−リンカー中間体と反応する。
【０１１７】
リンカーは、アミノ酸残基を含んでいてもよい。アミノ酸ユニットは、存在する場合、免疫グロブリンを本発明の免疫グロブリン薬剤コンジュゲートの薬剤成分に連結する。
【０１１８】
アミノ酸リンカーは、たとえば、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチド、またはドデカペプチドユニットであってもよい。アミノ酸ユニットを含むアミノ酸残基は、天然に存在するものならびにシトルリンなどの微量アミノ酸および天然に存在しないアミノ酸アナログを含む。
【０１１９】
アミノ酸ユニットは、薬剤成分を遊離するために、腫瘍関連プロテアーゼを含む１つ以上の酵素によって酵素的に切断することができる。
【０１２０】
他の実施形態では、リンカーは、抗体への、分岐多官能リンカー成分を通しての１つを超える薬剤成分の共有結合のための樹状タイプのリンカーであってもよい（Ｓｕｎら（２００２年）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２巻：２２１３〜２２１５頁；Ｓｕｎら（２００３年）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１巻：１７６１〜１７６８頁）。樹状リンカーは、抗体に対する薬剤のモル比、つまり負荷を増加させることができ、これは、免疫グロブリン薬剤コンジュゲートの効能と関係する。したがって、改変免疫グロブリンが、わずか１つの反応性のシステインチオール基しか持たない場合、多くの薬剤成分は、樹状リンカーを通して付着されてもよい。
【０１２１】
他の実施形態では、リンカーは、可溶性または反応性が調整された基と置換されてもよい。たとえば、スルホネート（−−ＳＯ３−）またはアンモニウムなどの荷電置換基は、免疫グロブリンコンジュゲートを調製するために使用される合成経路に依存して、試薬の水可溶性を増加させ得、そして、免疫グロブリンもしくは薬剤成分とのリンカー試薬のカップリング反応を促進し得るか、または薬剤成分との免疫グロブリン−リンカー中間体もしくは免疫グロブリンとの薬剤−リンカー中間体のカップリング反応を促進し得る。
【０１２２】
本発明の化合物は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｃｕｓｔｏｍｅｒ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １１７、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．６１１０５  Ｕ．Ｓ．Ａ、Ｕ．Ｓ．Ａ  １−８００−８７４−３７２３、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＋８１５−９６８−０７４７から市販で入手可能であるビス−マレイミド試薬：ＤＴＭＥ、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＭ（ＰＥＯ）３、およびＢＭ（ＰＥＯ）４を含む、リンカー試薬：ＢＭＰＥＯ、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、およびスルホ−ＳＭＰＢならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾアート）を用いて調製される免疫グロブリンコンジュゲートを明らかに想定するが、これらに限定されない。２００３〜２００４年  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｏｇの４６７〜４９８頁を参照されたい。ビス−マレイミド試薬は、連続してまたは同時に、チオール含有薬剤成分、標識、またはリンカー中間体へのシステインのチオール基の付着を可能にする。システイン、薬剤成分、標識、またはリンカー中間体のチオール基と反応性である、マレイミドを除いた他の官能基は、制限無しに、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネート、およびイソチオシアネートを含む。
【０１２３】
したがって、本発明の目的は、システイン残基による置換である少なくとも１つの変異を７（ＶＨ）、２０（ＶＬ）、２２（ＶＬ）、２５（ＶＨ）、１２５（ＣＨ１）、２４８（ＣＨ２）、２５４（ＣＨ２）、２８６（ＣＨ２）、２９８（ＣＨ２）、および３２６（ＣＨ２）から成る群から選択される残基に有する免疫グロブリンと、該システイン残基にコンジュゲートされた原子または分子とを含む免疫グロブリンコンジュゲートを提供することである。特定の実施形態では、少なくとも１つの変異は、７（ＶＨ）、２０（ＶＬ）、２２（ＶＬ）、および１２５（ＣＨ１）から成る群から選択される残基にある。特定の実施形態では、少なくとも１つの変異は、２４８（ＣＨ２）および３２６（ＣＨ２）から成る群から選択される残基にある。特定の実施形態では、少なくとも１つの変異は、２５（ＶＨ）および２８６（ＣＨ２）から成る群から選択される残基にある。特定の実施形態では、少なくとも１つの変異は、２５４（ＣＨ２）および２９８（ＶＨ）から成る群から選択される残基にある。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む群から選択される。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１を含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンコンジュゲートは、ヒトＣＨ１ドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンコンジュゲートは、ヒトＣＨ２ドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンコンジュゲートは、ヒトＣＨ３ドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンコンジュゲートは、ヒトＣＬドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンコンジュゲートは、ヒトＶＨドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンコンジュゲートは、ヒトＶＬドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンコンジュゲートは、少なくとも２つの反応部位を有するリンカー分子をさらに含み、第１の反応部位は、免疫グロブリンのシステイン残基に結合しており、第２の反応部位は、原子または分子に結合している。リンカー分子を有する前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、リンカー分子は、ヒドラゾン、ジスルフィド、ペプチド、キレート化剤、およびマレイミドから成る群から選択される。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、原子または分子は、放射性核種、化学療法剤、微生物毒素、植物毒素、ポリマー、炭水化物、サイトカイン、蛍光標識、発光標識、酵素−基質標識、酵素、ペプチド、ペプチド模倣薬、ヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡミメティック、およびアプタマーから成る群から選択される。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、原子または分子は、９０Ｙ、１３１Ｉ、６７Ｃｕ、１７７Ｌｕ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、マイタンシノイド、オーリスタチン、アントラサイクリン、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシンＡ、ジフテリア毒素、リシン、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、およびマンノシル残基から成る群から選択される。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、原子または分子は、非変異免疫グロブリンの免疫原性を低下させる。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、原子または分子は、非変異免疫グロブリンの免疫原性を増加させる。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンコンジュゲートは、非変異免疫グロブリンの抗原結合活性の少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセント、少なくとも１１０パーセント、少なくとも１２０パーセント、または少なくとも１３０パーセントである抗原結合活性をさらに含む。
【０１２４】
したがって、本発明の目的は、システイン残基による置換である少なくとも１つの変異を、７（ＶＨ）、２０（ＶＬ）、２２（ＶＬ）、２５（ＶＨ）、１２５（ＣＨ１）、２４８（ＣＨ２）、２５４（ＣＨ２）、２８６（ＣＨ２）、および３２６（ＣＨ２）から成る群から選択される残基に含む改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリンを提供することである。特定の実施形態では、少なくとも１つの変異は、７（ＶＨ）、２０（ＶＬ）、２２（ＶＬ）、および１２５（ＣＨ１）から成る群から選択される残基にある。特定の実施形態では、少なくとも１つの変異は、２４８（ＣＨ２）、および３２６（ＣＨ２）から成る群から選択される残基にある。特定の実施形態では、少なくとも１つの変異は、２５（ＶＨ）、および２８６（ＣＨ２）から成る群から選択される残基にある。特定の実施形態では、少なくとも１つの変異は、残基２５４（ＣＨ２）にある。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む群から選択される。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１を含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリンは、ヒトＣＨ１ドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリンは、ヒトＣＨ２ドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリンは、ヒトＣＨ３ドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリンは、ヒトＣＬドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリンは、ヒトＶＨドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリンは、ヒトＶＬドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、非変異免疫グロブリンの抗原結合活性の少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセント、少なくとも１１０パーセント、少なくとも１２０パーセント、または少なくとも１３０パーセントである抗原結合活性を含む。
【０１２５】
免疫グロブリン薬剤コンジュゲートの調製
一態様では、本発明は、免疫グロブリンコンジュゲートを産生する方法を含む。免疫グロブリン薬剤コンジュゲートは、（１）共有結合を介して免疫グロブリン−リンカー中間体を形成するためのリンカー試薬との改変免疫グロブリンのシステイン基の反応、その後に続く活性化薬剤成分との反応；および（２）共有結合を介して薬剤−リンカー中間体を形成するためのリンカー試薬との薬剤成分の求核基の反応、その後に続く改変免疫グロブリンのシステイン基との反応を含む、当業者に公知の有機化学反応、条件、および試薬を用いて、いくつかの経路によって調製されてもよい。コンジュゲーション方法（１）および（２）は、本発明の免疫グロブリン薬剤コンジュゲートを調製するために、様々な改変免疫グロブリン、薬剤成分、およびリンカーと共に用いられてもよい。
【０１２６】
抗体システインチオール基は、求核性であり、（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸エステル、および酸ハロゲン化物などの活性エステル；（ｉｉ）ハロアセトアミドなどのアルキルおよびベンジルハロゲン化物；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、およびマレイミド基；ならびに（ｉｖ）スルフィドの置き換えを介してのピリジルジスルフィドを含むジスルフィドを含む、リンカー試薬および薬剤−リンカー中間体上の求電子基と共有結合を形成するように反応することができる。薬剤成分上の求核基は、リンカー成分およびリンカー試薬上の求電子基と共有結合を形成するように反応することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジド基を含むが、これらに限定されない。
【０１２７】
メイタンシンは、たとえば、Ｍａｙ−ＳＳＣＨ３に変換されてもよく、これは、遊離チオール、Ｍａｙ−ＳＨに還元することができ、改変抗体と反応して（Ｃｈａｒｉら（１９９２年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２巻：１２７〜１３１頁）、ジスルフィドリンカーを有するマイタンシノイド抗体−イムノコンジュゲートを生成することができる。ジスルフィドリンカーを有する抗体−マイタンシノイドコンジュゲートは報告されている（ＷＯ  ０４／０１６８０１；米国特許第６，８８４，８７４号；米国特許出願公開第２００４／０３９１７６  Ａ１号；ＷＯ  ０３／０６８１４４；米国特許出願公開第２００４／００１８３８  Ａ１；米国特許第６，４４１，１６３号、第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号；ＷＯ  ０１／０２４７６３）。ジスルフィドリンカーＳＰＰは、リンカー試薬Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエートを用いて構築される。
【０１２８】
特定の条件下で、改変免疫グロブリンは、ＤＴＴ（クリランド試薬、ジチオトレイトール）もしくはＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩；Ｇｅｔｚら（１９９９年）Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  第２７３巻：７３〜８０頁；Ｓｏｌｔｅｃ  Ｖｅｎｔｕｒｅｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）などの還元剤または当業者に公知の他の還元剤を用いる処理によって、リンカー試薬とのコンジュゲーションのために反応性にされ得る。
【０１２９】
したがって、本発明の目的は、段落［０００８］または［００１９］において議論されるとおり改変免疫グロブリンまたは単離免疫グロブリンならびにそれらの実施形態のいずれかおよびすべての組合せを提供し、還元剤で１つ以上の置換システイン残基を還元して、還元システイン残基を形成させ、還元システイン残基と反応性である原子または分子と共に免疫グロブリンをインキュベートして、免疫グロブリンコンジュゲートを形成させることによって、免疫グロブリンコンジュゲートを産生することにより免疫グロブリンコンジュゲートを生産する方法を提供することである。
【０１３０】
空間的凝集傾向
一態様では、本明細書における本発明は、タンパク質表面の残基を選択してシステインに変異させるためのおよび改変免疫グロブリンまたは免疫グロブリンコンジュゲートの架橋を還元する方法に関する。本発明は、架橋する傾向が低下した免疫グロブリンおよび免疫グロブリンコンジュゲートを生成するために適用されてもよい、つまり、濃縮溶液中の免疫グロブリンまたは免疫グロブリンコンジュゲートは、より高次の凝集した多量体ではなく、主として、単量体形態のままである。本明細書における方法は、タンパク質が架橋する傾向を評価するための算出方法の能力の進歩を示すものである。特に、該方法は、ＳＡＡ（溶媒接触可能面積）の計算に少なくとも部分的に基づくものであり、ＳＡＡは、タンパク質の表面を特徴付けるために当技術分野において公知である。ＳＡＡは、溶媒と接触しているそれぞれのアミノ酸またはタンパク質構造物の表面積を示す。ＳＡＡは、典型的に、プローブ球体がタンパク質表面、つまりタンパク質構造モデルの表面を転がるときのプローブ球体の中心の位置を算出することによって計算され得る。プローブ球体は、水分子と同じ半径、Ｒ＝１．４Åを有する。下記に記載される、ＳＡＡを計算するための代替方法は、当技術分野において公知であり、本明細書において記載される方法と互換性がある。ＳＡＡは、タンパク質表面を特徴付けるのに実に有用であるが、以下の欠点のために、潜在的に凝集傾向であるタンパク質表面の疎水性パッチを特徴付けるのに適切であるとは認められなかった。
１．ＳＡＡは、疎水性領域および親水性領域を区別しない。
２．ＳＡＡは、残基の疎水性に対して正比例しない（たとえば、ＭＥＴは、ＬＥＵよりも多くの表面積を有するが、それほど疎水性ではない）。
３．ＳＡＡは、いくつかの疎水性残基がすぐ近くにあり、したがって、特定の領域の疎水性を増強し得るかどうかを示さない。これらの残基は、一次配列においてまたはたとえこれらの残基が一次配列において離れていても三次構造において、のいずれかですぐ近くにあり得る。いずれかの方法で、それらは、抗体表面の特定のパッチの疎水性を増強し得る。
【０１３１】
本明細書において記載される１つの尺度、有効−ＳＡＡ（Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ−ＳＡＡ）は、下記の式に従って、露出アミノ酸の画分の疎水性を計算することによって得られる。
【０１３２】
【化４】
0005739880.tif 000005
有効−ＳＡＡのさらなる実施形態は、一次タンパク質配列において隣接している少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６つ（たとえば２、３、４、５、６など）のアミノ酸残基にわたる有効−ＳＡＡを合計するステップをさらに含む。有効−ＳＡＡは、基本的なＳＡＡに関して改善を示すが、それにもかかわらず、それは、折り畳まれたタンパク質の構造およびタンパク質配列において隣接していないアミノ酸が、タンパク質の折り畳まれた二次、三次、四次構造において互いにすぐ近くに存在し得るという事実を完全に考慮に入れる能力を欠く。そのようなタンパク質の折り畳みは、一次構造のみでは現われないまたは折り畳まれたタンパク質構造物をよりしっかりと分析することによってのみ検出され得る凝集傾向の領域を形成し得る。
【０１３３】
本発明は、タンパク質表面の特定のパッチまたは領域の有効な疎水性を強調する、空間的凝集傾向と称される、新しい、より進歩した手段を提供する。空間的凝集傾向は、タンパク質構造モデルの原子上のまたはその近くの指定された空間的領域について計算される。
【０１３４】
この文脈では、「指定された空間的領域」は、タンパク質構造物上のまたはその近くの局所的な物理的構造物および／または化学的環境を得るために選ばれる三次元空間または体積である。特に好ましい実施形態では、空間的凝集傾向は、タンパク質における原子（たとえばタンパク質構造モデルにおける原子）を中心にする半径Ｒを有する球状の領域について計算される。空間的凝集傾向はまた、化学結合を中心にする半径Ｒを有する球状の領域または構造モデルの近くの空間に位置する球状の領域について計算されてもよい。したがって、他の実施形態では、ＳＡＰは、ある原子の近くに中心をおく、たとえば、特定の原子または化学結合の中心から１〜１０Å、１〜５Å、または１〜２Åの間にある空間におけるある点に中心をおく指定された空間的領域について計算されてもよい。
【０１３５】
特定の実施形態では、選ばれる半径Ｒは、１Å〜５０Åの間にある。特定の実施形態では、選ばれる半径は、少なくとも１Å、少なくとも３Å、少なくとも４Å、少なくとも５Å、少なくとも６Å、少なくとも７Å、少なくとも８Å、少なくとも９Å、少なくとも１０Å、少なくとも１１Å、少なくとも１２Å、少なくとも１５Å、少なくとも２０Å、少なくとも２５Å、または少なくとも３０Åである。特定の実施形態では、選ばれる半径は、５Å〜１５Åの間、５Å〜１２Åの間、または５Å〜１０Åの間にある。特定の実施形態では、選ばれる半径は、５Åまたは１０Åである。
【０１３６】
他の実施形態では、空間的凝集傾向が計算される領域は、球状ではない。領域の可能な形状は、立方体、円柱、円錐体、楕円形の球状体、錐体、半球、または空間の一部を囲むために使用されてもよい任意の他の形状をさらに含んでいてもよい。そのような実施形態では、領域のサイズは、半径以外の手段、たとえば形状の中心から面または頂点までの距離を使用して選ばれてもよい。
【０１３７】
特定の実施形態では、ＳＡＰは、タンパク質が架橋する傾向を増加させることなく、システインで置換し得る、タンパク質、特に抗体または免疫グロブリン中の残基を選択するために使用されてもよい。本発明は、架橋する傾向を増加させることなくシステインで置換することができる残基を同定するためのプロセスを効率化することが期待される。
【０１３８】
したがって、一般的な用語では、タンパク質中の特定の原子の空間的凝集傾向を計算する方法は、（ａ）タンパク質を示す構造モデル中の１つ以上の原子を同定するステップであって、１つ以上の原子は、特定の原子にまたは特定の原子の近くに中心をおく、指定された空間的領域内に存在するステップ；（ｂ）指定された空間的領域における１つ以上の原子のそれぞれについて、完全に露出している同一の残基中の原子のＳＡＡに対する上記原子の溶媒接触可能面積（ＳＡＡ）の比を計算するステップ；（ｃ）それぞれの比に１つ以上の原子の原子疎水性を掛けるステップ；ならびに（ｄ）ステップ（ｃ）の産物を合計するステップを含み、それにより、その合計は、特定の原子についてのＳＡＰとなる。
【０１３９】
関連する実施形態では、ＳＡＰは、（ａ）タンパク質を示す構造モデル中の１つ以上のアミノ酸残基を同定するステップであって、１つ以上のアミノ酸残基は、特定の原子にまたは特定の原子の近くに中心をおく、指定された空間的領域内に少なくとも１つの原子を有するステップ；（ｂ）同定された１つ以上のアミノ酸残基のそれぞれについて、完全に露出している同一の残基中の原子のＳＡＡに対する上記アミノ酸残基中の原子の溶媒接触可能面積（ＳＡＡ）の比を計算するステップ；（ｃ）それぞれの比に、アミノ酸疎水性尺度によって決定される１つ以上のアミノ酸残基の疎水性を掛けるステップ；ならびに（ｄ）ステップ（ｃ）の産物を合計するステップを含む、異なる方法に従って計算されてもよく、それにより、合計は、特定の原子についてのＳＡＰとなる。好ましい実施形態では、構造モデルは、構造モデルを分子動力学シミュレーションにおいて溶媒と相互作用させることによって、ステップ（ａ）前に処理される。アミノ酸が、指定された空間的領域内に少なくとも１つの原子を有するとして同定される場合、少なくとも１つの原子は、アミノ酸側鎖中の原子に限ることが必要とされてもよい。その代わりに、それは、主鎖原子であることが必要とされる原子であってもよい。
【０１４０】
他の実施形態では、この方法は、必要に応じて、ステップ（ａ）前に、分子動力学シミュレーションを行うステップおよびステップ（ａ）〜（ｄ）を繰り返すステップ、複数回のステップで、毎回、さらなる分子動力学シミュレーションを行い、それによって、ステップ（ｄ）における複数の合計をもたらすステップ、ならびに合計の平均値を計算するステップをさらに含んでいてもよく、それにより、計算された平均値は、特定の原子についてのＳＡＰとなる。
【０１４１】
当業者は、分子動力学シミュレーションに関して計算された値の平均値を用いる本発明の実施形態が、より計算上強力になることを十分に理解する。そのような実施形態はまた、ある場合には、空間的凝集傾向のより正確なまたは高度に分析されたマップをも提供する。しかしながら、本明細書において議論される実験は、分子動力学相加平均が用いられない場合に、方法が、なお高度に正確であることを示した。好ましい一実施形態では、空間的凝集傾向値は、データベース、たとえばプロテインデータバンク（ＰＤＢ）中のすべてのタンパク質構造物について計算されてもよく、それによって、すべての公知のタンパク質構造物上の疎水性残基およびパッチを速やかに同定してもよい。この方法は、タンパク質の大きなセットの迅速なスクリーニングにより、潜在的凝集傾向領域および／またはタンパク質相互作用部位を同定することを可能にする。
【０１４２】
好ましい適用では、空間的凝集傾向は、
以下の式によって記載される。
【０１４３】
ＳＡＰ原子＝Σシミュレーション平均値（Σ原子のＲ内の原子（（ＳＡＡ−Ｒ／ＳＡＡ−ｆｅ）＊原子−ｈｂ）
式中、
１）ＳＡＡ−Ｒは、それぞれのシミュレーションスナップショットで算出される半径Ｒ内の側鎖原子のＳＡＡであり、ＳＡＡは、好ましくは、プローブ球体がタンパク質表面を転がるときのプローブ球体の中心の位置を算出することによってシミュレーションモデルにおいて計算される。プローブ球体は、水分子と同じ半径、Ｒ＝１．４Ａを有する。当業者は、ＳＡＡを算出するための他の方法が、ＳＡＰを計算するためのここで記載される方法と互換性があるということを十分に理解する。たとえば、ＳＡＡは、アミノ酸側鎖原子のみについて計算されてもよい。ＳＡＡはまた、アミノ酸主鎖原子のみについて計算されてもよい（つまり、ペプチドバックボーンのそれらの原子および関連する水素）。その代わりに、ＳＡＡは、関連する水素を除外して、アミノ酸主鎖原子のみについて計算されてもよい；
２）ＳＡＡ−ｆｅは、好ましい実施形態では、トリペプチド「Ａｌａ−Ｘ−Ａｌａ」の完全に延ばされた高次構造における真中の残基の側鎖のＳＡＡの計算によって得られる、完全に露出している残基の側鎖のＳＡＡである（アミノ酸「Ｘ」について言う）；ならびに
３）原子−ｈｂは、ＢｌａｃｋおよびＭｏｕｌｄの疎水性尺度を使用して上記に記載されるように得られる原子疎水性である（ＢｌａｃｋおよびＭｏｕｌｄ、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９１年、１９３巻、７２〜８２頁）。尺度は、グリシンがゼロの疎水性を有するように標準化される。そのため、グリシンよりも疎水性であるアミノ酸は疎水性尺度が正であり、グリシンより疎水性が低いアミノ酸は疎水性尺度が負である。
【０１４４】
「完全に露出している」残基は、トリペプチドＡｌａ−Ｘ−Ａｌａの完全に延ばされた高次構造中の残基Ｘである。そのような残基ＸについてのＳＡＡの計算が、利用可能な最大の溶媒接触可能面積を生み出すように、この配置が設計されていることを、当業者は十分に理解する。したがって、アラニンを除いた他の残基は、結果を全く混乱させることなくまたは変更することなく、計算に使用されてもよいことが想定される。
【０１４５】
上記に記載されるように、本発明の方法は、上記と同じ式を使用して、Ｘ線構造を含む、あらゆるタンパク質構造モデルに適用されてもよい。
【０１４６】
同様に、Ｘ線構造が入手可能でない場合、同じ空間的凝集傾向パラメーターは、相同性モデリングを通して生成された構造物に適用することができ、ＳＡＰパラメーターは、上記と同じ式を使用して計算され得る。
【０１４７】
特定の実施形態では、空間的凝集傾向は、タンパク質構造モデルにおけるすべての原子について計算される。いくつかの実施形態では、原子の（ａｔｏｍｉｓｔｉｃ）空間的凝集傾向値は、それぞれの個々のタンパク質残基に関してまたは残基の小さな群に関して平均されてもよい。
【０１４８】
ＳＡＰ方法論の使用
一態様では、本発明は、タンパク質における、疎水性アミノ酸の残基、領域、またはパッチを同定するために上記に記載されるように使用されてもよい。特定の閾値に固定されることを望むものではないが、空間的凝集傾向＞０を有する原子またはアミノ酸残基は、疎水性であるまたは凝集傾向領域にあると考えられる。タンパク質のタイプ、特定の構造、およびそれが存在する溶媒に依存して、たとえば、−０．１、−０．１５、−０．２などを超える空間的凝集傾向を有する原子または残基を選ぶことによって、わずかに０未満である、カットオフを使用して原子または残基を同定することが望ましい場合がある。あるいは、最も強力な疎水性の原子、残基、またはパッチを選ぶためによりストリンジェントなカットオフ、たとえば０、０．０５、０．１、０．１５、０．２などを用いることが望ましい場合がある。さらに、アルゴリズムが、パッチの中心の残基に対してより高い数を与えるので、カットオフを満たす残基の３Ａ、４Ａ、５Ａ、７．５Ａ、または１０Ａ内の残基はまた、凝集を低下させるために、それより疎水性が低い残基への変異のために選択することができる。他の実施形態では、連続して（つまりタンパク質配列に沿って）または好ましい実施形態では空間的に（つまり三次元構造で）近くにある原子または残基よりも大きな空間的凝集傾向を有する原子または残基を単に選択することは有利であり得る。疎水性パッチにおける原子または残基を選択するための１つの好ましい方法は、それらが由来するタンパク質構造モデル上に、たとえばカラーコーディングまたは数的なコーディングを使用して、計算された空間的凝集傾向値をマッピングし、したがって、タンパク質表面にわたる空間的凝集傾向の差を視覚化し、よって、疎水性のパッチまたは残基の容易な選択を可能にすることである。特に好ましい実施形態では、空間的凝集傾向についての計算は、半径について選ばれた２つの値、より高い解像度、たとえば５Ａのものおよびより低い解像度、たとえば１０Ａのものを使用して、別々に実行される。そのような実施形態では、より大きなまたはより広範囲の疎水性パッチは、より低い解像度のマップを用いてタンパク質構造物上で調べられてもよい。一度、対象の疎水性パッチが低解像度マップ上で選択されたら、それらのパッチは、いくつかの実施形態では、当業者が、変異させるまたは改変するための残基をより容易にまたはより正確に選ぶことを可能にしてもよいより高い解像度のマップでさらに詳細に考察されてもよい。たとえば、より高い解像度のマップにおいて疎水性パッチを考察する場合、最も高いＳＡＰスコアを有するまたは最も疎水性である残基（たとえば、ＢｌａｃｋおよびＭｏｕｌｄ、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９１年、１９３巻、７２〜８２頁の尺度に従ってパッチにおいて最も疎水性の残基）を変異のために選択することが望ましい場合がある。
【０１４９】
特定の実施形態では、タンパク質における凝集傾向領域を同定する方法は、（ａ）タンパク質中の原子について本明細書において記載される方法のいずれかに従って計算されるとおりのＳＡＰを構造モデル上にマッピングするステップ；および（ｂ）ＳＡＰ＞０を有する複数の原子を有するタンパク質中の領域を同定するステップを含み、ここで、凝集傾向領域は、上記の複数の原子を含むアミノ酸を含む。そのような実施形態では、ＳＡＰは、タンパク質中のすべての原子または原子の一部について計算されてもよい。特定の残基または対象の残基の群についてＳＡＰを計算するのみであってもよいことが想定される。
【０１５０】
類似する実施形態では、原子のＳＡＰスコア（またはアミノ酸残基にわたって平均されるＳＡＰスコア）をプロットすることは有益であり得る。タンパク質の原子または残基に沿ってＳＡＰスコアを示すそのようなプロットは、置換の候補を示し得るピークの容易な同定を可能にする。特に好ましい実施形態では、タンパク質中の原子または残基に沿ったＳＡＰスコアは、グラフ中にプロットされ、曲線下面積（ＡＵＣ）が、グラフ中のピークについて計算される。そのような実施形態では、より大きなＡＵＣを有するピークは、より大きなまたはより疎水性の凝集傾向領域を示す。特定の実施形態では、ピーク中に存在するまたはより好ましく、大きなＡＵＣを有するピーク中に存在するとして同定される１つ以上の残基を置換のために選択することは望ましい。
【０１５１】
特定の実施形態では、本発明は、システインへの変異のための免疫グロブリンの残基を選択するために使用されてもよい。本明細書において使用されるように、免疫グロブリンの表面の第１のアミノ酸残基のＳＡＰ値が計算される。ＳＡＰ値が、０および−０．１１の値に等しいまたは０および−０．１１の値の間にある場合、第１の残基は、システインへの変異のために選択される。さらなる実施形態では、第１の残基のごく近傍内の免疫グロブリンの複数の残基のＳＡＰ値が計算される。複数の残基が０未満のＳＡＰ値を有する場合、第１の残基は、システインへの変異のために選択される。
【０１５２】
免疫グロブリン変異体は、部位特異的変異誘発および他の組換えＤＮＡ技術を含む当技術分野において公知の任意の方法によって作製されてもよい。たとえば、米国特許第５２８４７６０号；第５５５６７４７号；第５７８９１６６号；第６８７８５３１号、第５９３２４１９号；および第６３９１５４８号を参照されたい。
【０１５３】
特定の実施形態では、本発明は、本明細書において記載される方法のいずれかによって同定される免疫グロブリンの表面で露出している少なくとも１つのアミノ酸残基を、免疫グロブリンを原子または分子へコンジュゲートするために使用することができる天然アミノ酸残基、改変アミノ酸残基、まれなアミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、またはアミノ酸アナログもしくは誘導体で置換することによって原子または分子にコンジュゲートすることができる免疫グロブリン変異体を作製するために使用されてもよい。好ましい実施形態では、免疫グロブリンの表面に露出しているアミノ酸残基は、システインで置換される。他の実施形態では、アミノ酸残基は、リジン、アスパルテート、またはピロールリジン（ｐｙｒｏｒｌｙｓｉｎｅ）で置換される。
【０１５４】
非天然アミノ酸の合成は、当業者に公知であり、たとえば米国特許出願公開第２００３−００８２５７５号においてさらに記載される。一般に、刊行物Ｌｉａｏ  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．  ２００７年  １〜２月；２３巻（１号）：２８〜３１頁；ＲａｊｅｓｈおよびＩｑｂａｌ．  Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００６年８月；７巻（４号）：２４７〜５９頁；Ｃａｒｄｉｌｌｏら  Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  ２００６年３月；６巻（３号）：２９３〜３０４頁；Ｗａｎｇら  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．  ２００６年；３５巻：２２５〜４９頁；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ．  ２００５年３月；２２巻（３号）：８３〜９３頁において記載されるまたは参照される方法を含むが、これらに限定されない、非天然アミノ酸、改変アミノ酸、またはまれなアミノ酸を合成するまたはそれをタンパク質の中に組み込むための当技術分野において公知の任意の方法が、用いられてもよい。さらなる例として、Ａｍｂｒｘ  ＲｅＣＯＤＥ（商標）技術は、本明細書において記載される方法によって示されるように、非天然アミノ酸またはまれなアミノ酸を開発し、タンパク質の中に組み込むために用いられてもよい。
【０１５５】
本発明による免疫グロブリン変異体および免疫グロブリンコンジュゲートは、たとえば、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるように、増強されたまたは改善された安定性を示すことができる。
【０１５６】
したがって、本発明の目的は、段落［０００８］および［００１９］において議論されるとおり改変免疫グロブリンをコードする単離ポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドならびにそれらの実施形態のいずれかおよびすべての組合せを提供することである。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ベクター中にある。特定の実施形態では、ベクターは発現ベクターである。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、誘導プロモーターは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結される。他の態様は、前の実施形態のいずれかのベクターを有する宿主細胞を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、ポリヌクレオチドによってコードされる免疫グロブリンを発現することができる。
【０１５７】
したがって、本発明の目的は、架橋する傾向が低下した免疫グロブリンを産生する方法であって、前の段落の宿主細胞を含む培養培地を提供するステップおよび免疫グロブリンが発現される条件に培養培地を置くステップを含む方法を提供することである。特定の実施形態では、方法は、発現される免疫グロブリンを単離するさらなるステップを含む。
【０１５８】
したがって、本発明の目的は、システインへの変異のための免疫グロブリンの残基を選択する方法であって、免疫グロブリンの表面の第１のアミノ酸残基の空間的凝集傾向を計算するステップ、第１の残基のごく近傍内の免疫グロブリンの複数の残基の空間的凝集傾向を計算するステップ、および第１のアミノ酸残基の空間的凝集傾向が、０および−０．１１の値に等しいまたは０および−０．１１の値の間にある場合および複数の残基が０未満の空間的凝集傾向を有する場合、システインへの変異のための第１のアミノ酸残基を選択するステップを含む方法を提供することである。特定の実施形態では、複数の残基は、第１の残基の１５Å内にある。特定の実施形態では、複数の残基は、第１の残基の１０Å内にある。特定の実施形態では、複数の残基は、第１の残基の７．５Å内にある。特定の実施形態では、複数の残基は、第１の残基の５Å内にある。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、残基の空間的凝集傾向の計算は、残基中の原子を中心にする半径を有する球状の領域についての空間的凝集傾向の計算を含む。特定の実施形態では、球状の領域の半径は、少なくとも５Åである。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の方法に従ってＳＡＰを決定するためのコンピューターコードにさらに関する。他の実施形態では、本発明は、本発明の方法を実行する専用のコンピューター、スーパーコンピューター、またはコンピューターのクラスターに関する。他の態様では、本発明は、タンパク質の残基を選択してシステインに変異させるためのウェブベースの、サーバーベースの、またはインターネットベースのサービスであって、ユーザからタンパク質（たとえばタンパク質構造モデル）に関するデータを受け取るステップ（たとえばインターネットを通じて）または必要に応じてタンパク質の動的構造を提供するためのタンパク質の分子動力学モデリングを含めて、サービスプロバイダーがタンパク質の静的構造物を生成する、検索する、もしくはアクセスすることができるように、データベースからそのようなデータを検索するステップ、そのように生成された静的または動的構造物に基づいてタンパク質の原子または残基についてのＳＡＰを決定するステップ、およびたとえばサービスプロバイダーによってＳＡＰデータを用いてマッピングした構造モデルとして、ＳＡＰデータをユーザに送り返すステップを含むサービスを提供する。いくつかの実施形態では、ユーザは、人である。他の実施形態では、ユーザは、コンピューターシステムまたは自動化されたコンピューターアルゴリズムである。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、本発明は、インターネットを通してユーザ端末にＳＡＰを計算するためのウェブサービスを提供するためのウェブサーバー；計算方法、アミノ酸疎水性などについての一般的な情報を記憶するためのデータベース、ならびにデータベースにおける情報およびユーザによってインターネットを通して提供されるまたは送信される情報に基づいてＳＡＰ計算を実行するための計算サーバーを含むＳＡＰ計算システムを提供する。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、ウェブサーバーおよび計算サーバーは、同じコンピューターシステムである。いくつかの実施形態では、コンピューターシステムは、スーパーコンピューター、クラスターコンピューター、または単一のワークステーションもしくはサーバーである。関連する実施形態では、ＳＡＰ計算システムのウェブサーバーは、全オペレーションを制御するための制御装置、インターネットへの接続のためのネットワーク接続ユニット、およびインターネットを通して接続しているユーザ端末に、ＳＡＰを計算するためのウェブサービスを提供するためのウェブサービスユニットをさらに含む。
【０１６２】
さらに、本発明の実施形態は、様々なコンピューターにより実現されるオペレーションを実行する、たとえば、構造モデルについてＳＡＰを計算する、ＳＡＡを計算する、有効−ＳＡＡを計算する、構造モデルを操作する、分子動力学シミュレーションを実現する、関連するデータを編成し、記憶する、または本明細書において記載される他のオペレーションを実行するためのプログラムコードを含有するコンピューター読取り可能媒体を有するコンピューター記憶装置製品にさらに関する。コンピューター読取り可能媒体は、コンピューターシステムによってその後読み取ることができるデータを記憶することができる任意のデータ保存デバイスである。コンピューター読取り可能媒体の例は、ハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、フラッシュドライブ、光ディスク（たとえばＣＤ、ＤＶＤ、ＨＤ−ＤＶＤ、ブルーレイディスクなど）、および特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）またはプログラム可能論理デバイス（ＰＬＤ）などの特別に構成されたハードウェアデバイスを含むが、これらに限定されない。コンピューター読取り可能媒体はまた、コンピューター読取り可能コードが、配布様式で記憶され、実施されるように、つながれたコンピューターシステムのネットワークを通じて搬送波で具現されるデータ信号として配布することもできる。上記に記載されるハードウェアおよびソフトウェアエレメントは、標準的な設計および構成のものであることが当業者によって十分に理解される。上記に記載されるコンピューター、インターネット、サーバー、およびサービスに関する実施形態は、ＳＡＡおよび有効−ＳＡＡならびにＳＡＰにさらに適用されてもよい。
【０１６３】
免疫グロブリンおよび免疫グロブリンコンジュゲートを含有する医薬組成物
他の態様では、本発明は、本発明の方法によって産生され、薬学的に許容されるキャリアと一緒に製剤化される１つ以上の免疫グロブリンコンジュゲートを含有する組成物、たとえば医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物はまた、併用療法において、つまり、他の剤と組み合わせて投与することができる。たとえば、併用療法は、少なくとも１つの他の抗癌剤と組み合わせられた本発明の免疫グロブリンコンジュゲートを含むことができる。
【０１６４】
本明細書において使用されるように、「薬学的に許容されるキャリア」は、任意のおよびすべての溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに生理学的に適合するその他同種のものを含む。好ましくは、キャリアは、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、または表皮投与（たとえば注射もしくは注入によって）に適している。投与経路に依存して、活性化合物、つまり本発明の免疫グロブリンまたはその変異体は、酸の作用および化合物を不活化し得る他の天然の条件から化合物を保護するための材料中にコーティングされてもよい。
【０１６５】
本発明の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される塩を含んでいてもよい。「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望まれない毒物学的な影響を与えない塩を指す（たとえばＢｅｒｇｅ，  Ｓ．Ｍ．ら（１９７７年）Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ６６巻：１〜１９頁を参照されたい）、そのような塩の例は、酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸、およびその他同種のものなどの無毒性無機酸に由来する酸付加塩ならびに脂肪族モノカルボン酸および脂肪族ジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族スルホン酸および芳香族スルホン酸、ならびにその他同種のものなどの無毒性有機酸に由来する酸付加塩を含む。塩基付加塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、およびその他同種のものなどのアルカリ土類金属に由来する塩基付加塩ならびにＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン、およびその他同種のものなどの無毒性有機アミンに由来する塩基付加塩を含む。
【０１６６】
本発明の医薬組成物はまた、薬学的に許容される酸化防止剤を含んでいてもよい。薬学的に許容される酸化防止剤の例は、（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、およびその他同種のものなどの水溶性酸化防止剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロール、およびその他同種のものなどの油溶性酸化防止剤；ならびに（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸、およびその他同種のものなどの金属キレート化剤を含む。
【０１６７】
本発明の医薬組成物中に用いられてもよい、適している水性キャリアおよび非水性キャリアの例は、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびその他同種のものなど）、ならびにその適切な混合物、オリーブオイルなどの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機酸エステルを含む。たとえば、適切な流動性は、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散物の場合に必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。
【０１６８】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの佐剤を含有していてもよい。微生物の存在の予防は、無菌処理ならびに様々な抗菌剤および抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸、およびその他同種のものの包含の両方によって保証されてもよい。組成物の中に、糖、塩化ナトリウム、およびその他同種のものなどの等張剤を含むこともまた望ましい場合がある。さらに、注射可能な医薬形態の吸収の延長は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる剤の包含によってもたらされてもよい。
【０１６９】
薬学的に許容されるキャリアは、無菌水溶液または分散液および、無菌注射液剤または分散物の即時の調製のための無菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および剤の使用は、当技術分野において公知である。任意の従来の媒体または剤も活性化合物と不適合である場合を除き、本発明の医薬組成物におけるその使用が想定される。補足の活性化合物もまた、組成物の中に組み込むことができる。
【０１７０】
典型的な製剤は、本発明の少なくとも１つの免疫グロブリンコンジュゲートを含み、本明細書において開示される方法に加えて、免疫グロブリンの架橋を予防するまたは減らすために使用することができる、より低濃度の安定化剤を含むことができる。したがって、架橋を予防するために使用される従来の方法は、本発明の方法によって産生される免疫グロブリンコンジュゲートを含有する医薬組成物の開発において用いられてもよい。たとえば、様々な安定化化合物または脱凝集化合物は、それらの意図される使用およびそれらの生物学的毒性に依存して、本発明の医薬組成物中に含まれていてもよい。そのような安定化化合物は、たとえばシクロデキストリンおよびその誘導体（米国特許第５７３０９６９号）、アルキルグリコシド組成物（米国特許出願第１１／４７４，０４９号）、シャペロン分子の使用（たとえばＬＥＡ（Ｇｏｙａｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ２００５年、３８８巻（Ｐｔ  １）：１５１〜７頁；米国特許第５６８８６５１号の方法）、ベタイン化合物（Ｘｉａｏ、Ｂｕｒｎ、Ｔｏｌｂｅｒｔ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  ２００８年５月２３日）、界面活性剤（たとえばＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、Ｔｗｅｅｎ  ２０）（Ｗｅｉら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．  ２００７年、３３８巻（１−２号）：１２５〜１３２頁））、ならびに米国特許第５６９６０９０号、第５６８８６５１号、および第６４２０１２２号において記載される方法を含んでいてもよい。
【０１７１】
さらに、タンパク質および特に抗体は、賦形剤、たとえば、（１）二糖（ｄｉｓａｃｃａｒｉｄｅ）（たとえばサッカロース、トレハロース）またはポリオール（たとえばソルビトール、マンニットール）は選択的な排除によって安定剤として役割を果たし、また、凍結乾燥の間に凍結防止剤として作用することもできる、（２）界面活性剤（たとえばポリソルベート（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔ）８０、ポリソルベート（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔ）２０）は、液体／氷、液体／物質表面、および／または液体／空気界面のような界面におけるタンパク質の相互作用を最小限にすることによって作用する、ならびに（３）バッファー（たとえば、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン）は、製剤ｐＨを制御し、維持するように支援する、からの様々なクラスの組合せを使用して製剤中で安定化される。したがって、そのような二糖  ポリオール、界面活性剤、およびバッファーは、さらに免疫グロブリンを安定化し、かつそれらの凝集を予防するために本発明の方法に加えて使用されてもよい。
【０１７２】
治療用組成物は、典型的に、製造および保存の条件下で無菌でかつ安定していなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高薬剤濃度に適している他の規則構造物として製剤化することができる。キャリアは、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールならびにその他同種のもの）ならびにその適している混合物を含有する溶媒または分散媒とすることができる。たとえば、適切な流動性は、レシチンなどの被覆剤の使用によって、分散物の場合に必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合では、組成物中に、等張剤、たとえば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の吸収の延長は、組成物中に、吸収を遅延させる剤、たとえばモノステアリン酸塩、およびゼラチンを含ませることによってもたらすことができる。
【０１７３】
無菌注射液剤は、必要に応じて、上記に列挙される成分のうちの１つまたはその組合せと共に、適切な溶媒中に、必要とされる量の活性化合物を組み込み、その後に無菌化微細濾過を行なうことによって、調製することができる。一般に、分散物は、塩基性分散媒を含有する無菌ビヒクルに活性化合物および上記に列挙されたものからの必要とされる他の成分を組み込むことによって調製される。無菌注射液剤の調製のための無菌粉末の場合には、調製の好ましい方法は、そのあらかじめ無菌濾過された溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【０１７４】
単一剤形を生産するためにキャリア材料と組み合わせることができる活性成分の量は、治療されている被験体および投与の特定のモードに依存して変動する。単一剤形を産生するためにキャリア材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす組成物のその量となる。一般に、１００パーセントのうち、この量は、薬学的に許容されるキャリアと組み合わせて、約０．０１パーセント〜約９９パーセントの活性成分、好ましくは約０．１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセント〜約３０パーセントの活性成分の範囲となる。
【０１７５】
したがって、本発明の目的は、免疫グロブリンコンジュゲートの高濃縮医薬製剤中の免疫グロブリンの表面露出システイン間の架橋を低下させる方法であって、免疫グロブリンを提供するステップ、７（ＶＨ）、２０（ＶＬ）、２２（ＶＬ）、および１２５（ＣＨ１）から成る群から選択される残基をシステイン残基で置換するステップ、還元剤で１つ以上の置換システイン残基を還元して、還元システイン残基を形成させるステップ、原子または還元システイン残基と反応性である分子と共に免疫グロブリンをインキュベートして、免疫グロブリンコンジュゲートを形成させるステップ、ならびに免疫グロブリンコンジュゲート濃度が、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌである、免疫グロブリンコンジュゲートの高濃縮液体製剤を生成するステップを含む、方法を提供することである。特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む群から選択される。特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１を含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣＨ１ドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣＨ２ドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣＨ３ドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣＬドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＶＨドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＶＬドメインを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンコンジュゲートは、非変異免疫グロブリンの抗原結合活性の少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセント、少なくとも１１０パーセント、少なくとも１２０パーセント、または少なくとも１３０パーセントである抗原結合活性を含む。
【０１７６】
したがって、本発明の目的は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度の、段落［０００７］において議論される免疫グロブリンコンジュゲートならびにそれらの実施形態の任意のおよびすべての組合せから作製することができる改変免疫グロブリン製剤を提供することである。特定の実施形態では、免疫グロブリンコンジュゲートは、オリゴマー化に対する高い傾向を有することが公知の免疫グロブリンコンジュゲートが、同じ条件下で濃縮液体溶液中でオリゴマーを形成する濃度を超える濃度で存在する。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンコンジュゲートの少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントは、オリゴマー化されていない単量体である。前の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、製剤は、薬学的に許容される賦形剤を含む。前の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリン製剤は、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントが、オリゴマー化されていない単量体である免疫グロブリンコンジュゲートを含む。
【０１７７】
したがって、本発明の目的は、非オリゴマー化の薬学的活性成分としての、段落［０００７］において議論される免疫グロブリンコンジュゲートならびにそれらの実施形態の任意のおよびすべての組合せの使用を提供することである。
【０１７８】
したがって、本発明の目的は、段落［０００７］において議論される免疫グロブリンコンジュゲートを含む医薬組成物ならびにそれらの実施形態の任意のおよびすべての組合せならびに薬学的に許容される賦形剤を提供することである。特定の実施形態では、免疫グロブリンは、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である。特定の実施形態では、免疫グロブリンコンジュゲートは、オリゴマー化に対する高い傾向を有することが公知の免疫グロブリンコンジュゲートが、同じ条件下で濃縮液体溶液中でオリゴマーを形成する濃度を超える濃度で存在する。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンコンジュゲートの少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントは、オリゴマー化されていない単量体である。前の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリン製剤は、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントが、オリゴマー化されていない単量体である免疫グロブリンコンジュゲートを含む。前の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、オリゴマー化は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定される。
【０１７９】
投与計画は、最適な所望の応答（たとえば治療反応）を提供するために調節される。たとえば、単一のボーラスが投与されてもよく、いくつかの分割された用量がある期間にわたって投与されてもよく、または用量は、治療状況の要件によって示されるように、比例して低下させてもよいもしくは増加させてもよい。投与の容易さおよび投薬量の均一性のために投薬量単位形態で非経口組成物を製剤化することはとりわけ有利である。本明細書において使用される投薬量単位形態は、治療されることとなる被験体に対して単一投薬量として適した物理的に別々の単位を指し、単位はそれぞれ、必要とされる薬学的キャリアと組み合わせて、所望の治療効果をもたらすように計算された、活性化合物の所定の数量を含有する。本発明の投薬量単位形態についての規格は、（ａ）活性化合物の独自の特徴および達成すべき特定の治療効果ならびに（ｂ）個人を治療感受性にするために、そのような活性化合物を調合することに関する当技術分野における生来の制約によって決定され、それらに直接依存する。
【０１８０】
免疫グロブリンコンジュゲートの投与については、投薬量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ宿主体重、および、より普通では０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲である。たとえば、投薬量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内とすることができる。典型的な治療計画は、１週間当たりに一度、２週間ごとに一度、３週間ごとに一度、４週間ごとに一度、月に一度、３か月ごとに一度、または３〜６か月ごとに一度の、投与を必要とする。本発明の免疫グロブリンコンジュゲートについての好ましい投与計画は、静脈内投与を介しての１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重を含み、抗体は、以下の投薬スケジュールのうちの１つを使用して与えられる：（ｉ）６回の投薬について４週間ごと、次いで３か月ごと；（ｉｉ）３週間ごと；（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重、一度、その後に続いて３週間ごとに１ｍｇ／ｋｇ体重。
【０１８１】
その代わりに、本発明の免疫グロブリンコンジュゲートは、徐放性製剤として投与することができ、この場合には、必要とされる投与は頻度がより少ない。投薬量および頻度は、患者における、投与された物質の半減期に依存して変動する。一般に、ヒト抗体は、最長の半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体が後に続く。投薬量および投与の頻度は、治療が予防的なものか治療なものかどうかに依存して変動し得る。予防的な適用では、比較的低用量が、長い期間、比較的まれな間隔で投与される。何人かの患者は、残りの人生の間、治療を受け続ける。治療の適用では、疾患の進行が低下するまたは終了するまで、好ましくは、患者が疾患の症状の部分的なまたは完全な改善を示すまで、比較的短い間隔での比較的高用量が、ときに必要とされる。その後、患者に、予防的な治療計画を施すことができる。
【０１８２】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬レベルは、患者に対して毒性となることなく、特定の患者、組成物、および投与のモードについて所望の治療反応を達成するのに有効である、活性成分の量を得るように変えられてもよい。選択された投薬レベルは、用いられる本発明の特定の組成物またはそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いられている特定の化合物の排出速度、治療期間、他の薬剤、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される化合物および／または材料、治療されている患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康状態、および先の病歴、ならびに医学分野において周知の同様の因子を含む様々な薬物動態学的因子に依存する。
【０１８３】
本発明の免疫グロブリンコンジュゲートの「治療有効投薬量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の減少、疾患症状がない期間の頻度および持続期間の増加、または疾患罹患による機能障害もしくは障害の予防をもたらす。たとえば、腫瘍の治療については、「治療有効投薬量」は、好ましくは、未治療被験体に比べて少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約８０％、細胞増殖または腫瘍増殖を阻害する。化合物が腫瘍増殖を阻害する能力は、ヒト腫瘍における効力を予測する動物モデル系において評価することができる。その代わりに、組成物のこの特性は、化合物が阻害する能力を検査することによって評価することができ、そのような阻害は、当業者に公知のアッセイによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価することができる。治療用化合物の治療有効量は、被験体において腫瘍サイズを減少させるまたはそうでなければ症状を回復させることができる。当業者は、被験体のサイズ、被験体の症状の重症度、選択される特定の組成物または投与経路などの因子に基づいてそのような量を決定することができる。
【０１８４】
本発明の組成物は、当技術分野において公知の様々な方法の１つ以上を使用して、投与の１つ以上の経路を介して投与することができる。当業者によって十分に理解されるように、投与経路および／または投与モードは、所望の結果に依存して変動する。本発明の結合成分を投与する好ましい経路は、たとえば注射もしくは注入による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、または他の非経口投与経路を含む。本明細書において使用される語句「非経口投与」は、通常、注射による、経腸的および局所的投与以外の投与のモードを意味し、限定することなく、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内注射および注入を含む。
【０１８５】
その代わりに、本発明の免疫グロブリンコンジュゲートは、投与の局所的経路、表皮経路、粘膜経路など非経口でない経路を介して、たとえば、鼻腔内に、経口的に、経膣的に、直腸に、舌下に、または局所的に投与することができる。
【０１８６】
活性化合物は、埋没物（ｉｍｐｌａｎｔ）、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化された送達系を含む制御放出製剤などのように、急速な放出から化合物を保護するキャリアと共に調製することができる。エチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生物分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製の多くの方法は、特許が与えられており、一般に当業者に公知である。たとえばＳｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８年を参照されたい。
【０１８７】
治療用組成物は、当技術分野において公知の医療デバイスを用いて投与することができる。たとえば、好ましい実施形態では、本発明の治療用組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号；第５，３８３，８５１号；第５，３１２，３３５号；第５，０６４，４１３号；第４，９４１，８８０号；第４，７９０，８２４号；または第４，５９６，５５６号において開示されるデバイスなどの針がない皮下注射デバイスを用いて投与することができる。本発明において有用な周知の埋没物およびモジュールの例は：制御された速度で薬品を供給するための移植可能なマイクロ注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を通して医薬を投与するための治療用デバイスを開示する米国特許第４，４８６，１９４号；正確な注入速度で薬品を送達するための薬品注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号；連続的な薬剤送達のための可変的な流出量の移植可能な注入器を開示する米国特許第４，４４７，２２４号；マルチチャンバーコンパートメントを有する浸透性（ｏｓｍｏｔｉｃ）薬剤送達系を開示する米国特許第４，４３９，１９６号；および浸透性薬剤送達系を開示する米国特許第４，４７５，１９６号を含む。
【０１８８】
したがって、本発明の目的は、高濃縮液体製剤を含む医薬の調製における段落［０００７］において議論される免疫グロブリンコンジュゲートの使用ならびにそれらの実施形態の任意のおよびすべての組合せを提供することであり、免疫グロブリンコンジュゲート濃度は、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌである。特定の実施形態では、医薬の使用は、自己免疫疾患、免疫学的疾患、感染症、炎症性疾患、神経学的疾患、ならびに癌を含む腫瘍疾患および新生物疾患の治療のためのものである。特定の実施形態では、医薬の使用は、鬱血性心不全（ＣＨＦ）、血管炎、酒さ、ざ瘡、湿疹、心筋炎および心筋の他の状態、全身性エリテマトーデス、糖尿病、脊椎症、滑膜線維芽細胞、ならびに骨髄間質；骨損失；パジェット病、骨巨細胞腫；乳癌；非活動性骨減少症；栄養障害、歯周疾患、ゴーシェ病、ランゲルハンス細胞組織球症、脊髄損傷、急性化膿性関節炎、骨軟化症、クッシング症候群、単骨性線維性形成異常、多骨性線維性骨形成異常、歯根膜の再構成、および骨折；サルコイドーシス；溶骨性骨癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、および直腸癌；骨転移、骨痛管理、および体液性悪性高カルシウム血症、強直性脊椎炎、ならびに他の脊椎関節症；移植拒絶反応、ウイルス感染症、血液新生物（ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ）、および新生物様の状態、たとえばホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ性白血病、菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、辺縁層リンパ腫、ヘアリーセル白血病、およびリンパ形質細胞性白血病）、Ｂ細胞の急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫およびＴ細胞の急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫を含むリンパ球前駆細胞の腫瘍、胸腺腫、末梢Ｔ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫、および大顆粒リンパ性白血病を含む成熟Ｔ細胞およびＮＫ細胞の腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球症、成熟を伴うＡＭＬ、分化を伴わないＡＭＬを含む急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、および急性単球性白血病などの骨髄新生物、骨髄異形成症候群および慢性骨髄性白血病を含む慢性骨髄増殖性疾患、中枢神経系の腫瘍、たとえば脳腫瘍（神経膠腫、神経芽腫、星細胞腫、髄芽細胞腫、脳室上衣細胞腫、および網膜芽細胞腫）、固形腫瘍（鼻咽頭癌、基底細胞癌、膵癌、胆管癌、カポジ肉腫、精巣癌、子宮癌、膣癌、もしくは子宮頚癌、卵巣癌、原発性肝癌、または子宮内膜癌、ならびに血管系の腫瘍（血管肉腫および血管周囲細胞腫）、骨粗鬆症、肝炎、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、脊椎関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、敗血症および敗血症性ショック、クローン病、乾癬、強皮症、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、同種異系島移植片拒絶、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの血液系悪性疾患、腫瘍、末梢神経損傷、または脱髄症と関連する炎症の治療のためのも���である。特定の実施形態では、医薬の使用は、斑状乾癬、潰瘍性大腸炎、非ホジキンリンパ腫、乳癌、結腸直腸癌、若年性特発性関節炎、黄斑変性症、呼吸器合胞体ウイルス、クローン病、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、骨粗鬆症、治療誘発性の骨損失、骨転移、多発性骨髄腫、アルツハイマー病、緑内障、および多発性硬化症の治療のためのものである。前の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、医薬の使用は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。前の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、医薬における免疫グロブリンコンジュゲートは、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントのオリゴマー化されていない単量体を示す。特定の実施形態では、オリゴマー化は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定される。
【実施例】
【０１８９】
本明細書において記載される実施例は、本発明の特定の非限定的な実施形態を指す。
【０１９０】
（実施例１）
抗体システイン変異体の設計、発現、およびコンジュゲーション
それぞれの免疫グロブリンフォールドドメインを代表するように、ＩｇＧ１システイン変異体のセットを設計した（表１）。変異体１〜１３は、抗体−１のＸ線構造物から設計した。変異体１４は、抗体−１に関して相同性モデリングによって構築した他のＩｇＧ１、抗体−２の構造から選択した。部位はすべて、抗体表面に露出させた。セリンおよびトレオニンおよびアルギニンなどの極性残基またはリジンなどの荷電残基は、システインで置換した。軽鎖および重鎖の遺伝子は、ベクターｇＷＩＺ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）中にサブクローニングし、哺乳動物細胞の一時的なトランスフェクションによってタンパク質発現について工学的に作製した。抗体変異体は、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成し（ＧｅｎｅＡｒｔ）または部位特異的変異誘発ＰＣＲによって生成し、配列決定によって確証した。抗体野生型および変異体は、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ＨＥＫ  ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の一時的なトランスフェクションによって１０〜１００ｍｇのレベルで発現させた。細胞培養上清は、トランスフェクションの７〜１０日後に収集した。抗体は、プロテインＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で精製し、５０ｍＭシトレートバッファー、ｐＨ３．５を用いて溶出し、バッファーは、蛍光標識のために１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０バッファーに置き換えた。
【０１９１】
抗体変異体の発現および精製に続いて、工学的に作製した表面システインをほとんど酸化した。たとえば、変異体４および６の両方は、工学的に作製した表面システインを有する抗体について予想される２．０とは対照的に、抗体１分子当たり０．３未満の遊離チオールを有した。本発明者らは、クラスＩに由来する変異体およびクラスＩＶに由来する変異体に対する、穏やかな還元剤、ＴＣＥＰ（トリス［２−カルボキシエチル］ホスフィンハイドロクロライド）およびより強力な還元剤、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）の効果を比較した。最初に、非オリゴマー化変異体４は、抗体当たり０．１３の遊離チオールを示し、高度にオリゴマー化している変異体６は、抗体当たり０．２５の遊離チオールを有した。野生型、変異体４、および変異体６の一定量を、５つの異なる条件において処理した：１）還元剤なし、２）ＴＣＥＰ、１０×、１時間、３）ＴＣＥＰ、２０×、１時間、４）ＤＴＴ、５×、１５分間、および５）ＤＴＴ、１０×、１５分間。還元剤の除去後に、試料は、非還元ＰＡＧＥ上で分析し、遊離チオールについて定量化した。野生型および変異体についての結果の比較は、ＴＣＥＰ処理は、オリゴマー化されていない形態（変異体４）においてシステインを還元するのに十分であり、ＷＴに対してわずかな効果を有したことを示した。しかしながら、オリゴマー（変異体６）に由来するシステインは、より苛酷な処理後にのみ還元された。ＤＴＴを用いる処理は、低レベルでさえ、ＷＴおよび両方の変異体について抗体断片化をもたらす。表面システインを導入した部位は、コンジュゲーションのために工学的に作製したシステインを無効にする（ｄｅｃａｐ）能力に対して強い影響を有した。
【０１９２】
様々な方法を、標識化前に、工学的に作製した表面チオールの特異的な還元について試験した。ＴＣＥＰおよびＤＴＴは、使用した試薬のうちの２つであり、遊離チオールのレベルは、エルマン試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して定量化した。本発明者らは、Ｌ−システインが、部位特異的標識実験において最も作用することを見出し、したがって、以下の２段階のプロトコールを使用した。第１に、変異体は、３７℃で４時間、１００〜２００倍過剰のＬ−システインと共にインキュベートし、その後に続いて、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡにバッファーを置き換えた。第２に、試料は、室温で、１時間、５〜１０倍過剰のＡｌｅｘａ４８８マレイミド色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にまたは室温で、１２時間、１０倍過剰のピレンマレイミド色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベートした。遊離色素を除去し、バッファーを５０ｍＭリン酸バッファー  ｐＨ７．０に置き換えた後、タンパク質標識化の効率は、製造業者のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってタンパク質のモル当たりの色素のモルとして計算した。
【０１９３】
（実施例２）
工学的に作製した抗体システイン変異体の特徴付け
非標識および標識抗体試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。７．５％、１０％、および１２％のゲルを非還元分析に使用した。１２％のゲルは、ＤＴＴを用いる加熱試料の還元分析に使用した。普通、５〜１０μｇの試料を、レーン当たりにロードした。蛍光画像は、クマシーブルーを用いて染色する前にＵＶ光下で撮った。抗体消化は、ＧｌｕＣ（１：２０の抗体重量当たりの酵素重量、２５℃で１２〜２４時間）およびプロナーゼ（１：２０の抗体重量当たりの酵素重量、３７℃で１時間）によって実行した。
【０１９４】
非還元ゲルは、単量体ならびに二量体、三量体、いくつかの場合ではさらに高次のオリゴマーの存在を示す。還元ゲルは、表面システインがどこで工学的に作製されたかに依存して、軽鎖または重鎖の排他的な標識化を示す。標識変異体および非標識変異体１〜６はまた、抗原結合特異性についても分析した。変異体は、野生型の８０％および１３０％以内の活性を保持し、標識化に際して活性をいくらか損失した。非標識変異体１は、野生型の活性のおよそ１１０％を保持したのに対して、標識変異体１は、およそ８０％保持した。非標識変異体２は、野生型のおよそ１０５％の活性を保持したのに対して、標識変異体２は、１００％をわずかに下回る活性を保持した。非標識および標識変異体３は、共に、野生型の活性のおよそ１１０％を保持した。非標識変異体４は、野生型の活性のおよそ１２５％を保持したのに対して、標識変異体４は、活性のおよそ９５％を保持した。非標識変異体５は、野生型の活性のおよそ１２０％を保持したのに対して、標識変異体６は、活性のおよそ１００％を保持した。最後に、非標識変異体６は、野生型の活性のおよそ１１５％を保持したのに対して、標識変異体６は、活性のおよそ９０％を保持した。標識変異体６は、その非標識同等物に類似して、高いオリゴマー化傾向を示した。
【０１９５】
ほとんどの変異体は、抗体１モル当たり２．０モル色素のおよそ最適な効率で標識した（抗体１分子当たり同一の２つのシステイン）。２．０よりも高い標識化効率は、それが鎖内ジスルフィドの部分的な破壊および標識化を示唆するので、望ましくない。変異体６、変異体１１、および変異体５など、高いオリゴマー化傾向を有する変異体は、同じように効率的に標識されなかった。他の変異体の中でさえ、すべての工学的に作製したシステインがコンジュゲーションに等しく適用可能だとは限らなかったので、反応時間およびタンパク質に対する色素の比などの標識化条件を個々に基づいて最適化しなければならなかった。変異体１〜１４は、工学的に作製したシステインを有する鎖のところで特異的に標識した。プロナーゼを用いる変異体のタンパク分解性の処理により、ほとんどの変異体については様々な蛍光パターンが得られたが、変異体３および１２など、近隣の置換を有する変異体については類似するパターンが得られた。したがって、ほとんどの変異体は、効率的にかつ特異的に標識された。
【０１９６】
５つのクラスの架橋傾向を、システイン変異体のこのセットについて区別した（表１）。クラスＩは、単量体であり、標識化後に安定したままである変異体を含む。クラスＩＩの変異体は、標識化前および後にわずかなパーセントの二量体を含有した。クラスＩＩＩ変異体は、いくつかの三量体の形成を含めてオリゴマー化するより明白な傾向を有した。クラスＩＶ変異体は、とりわけ標識化後の、三量体よりも大きな凝集体の存在によって証明されるように、オリゴマー化するさらに高い傾向を有した。クラスＶは、クラスＩＶの変異体と同様に、精製濃縮試料の断片化または着色などのさらなる構造の異常と共に、高いオリゴマー化傾向の変異体を含んだ。
【０１９７】
（実施例３）
工学的に作製した抗体システイン変異体の適用
低架橋傾向を有するシステイン変異体（変異体１〜４、７、１０、１２〜１４）は、高い特異性および効率ならびにわずかなオリゴマー化で標識された。マレイミド色素を用いる標識化は、これらの抗体変異体への部位特異的なコンジュゲーションのたった１つの例である。結合特異性または毒性などの他の多くの機能性を有する分子は、等しく付着することができる。したがって、変異体のこのセットは、標的療法におけるペイロードビヒクルとしてまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光分析のために果たすための抗体変異体のレパートリーを広げる。
【０１９８】
変異体のうちの１つの蛍光の適用を例証するために、本発明者らは、蛍光体ピレンとコンジュゲートした変異体の放射パターンを分析した。２つのピレン分子がともに近接している場合、エキシマー蛍光として公知の４６５ｎｍでの放射の特徴的な増加が起こる。本発明者らは、ピレンマレイミドを用いて変異体４および７を標識し、放射スペクトルをモニターした。変異体４は４６５ｎｍで基底レベルの放射を示したが、変異体７は強力なエキシマー蛍光を示した。Ｆａｂドメインの内側の、変異体７についてのＣＨ１における工学的に作製したシステインの位置を考慮すると、観察された結果は、Ｆｃに関してのＦａｂの公知のシザリング（ｓｃｉｓｓｏｒｉｎｇ）効果と相関する。したがって、この変異体は、抗体ドメイン動力学の分析において使用することができる。
【０１９９】
変異体６の高いオリゴマー化傾向は、より詳細に調査した抗体システイン変異体の他の有用性を示唆した。標識変異体６は、オリゴマーから単量体を分離するためにゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、タンパク質含有画分は、７．５％非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、クマシーブルーを用いる染色の前および後に分析した。変異体６に対するゲル濾過分析は、標識化および架橋の間の競合：種のＭＷが高いほど、標識効率は低くなる（蛍光のレベルによって示される）ということを示した。最も高いＭＷ種は、０．５の標識化効率を有したが、単量体種は、１．０の標識化効率を有し、もとの標識試料は、標識化効率が０．８であった。複数のオリゴマーを有する抗体変異体、変異体６は、抗体オリゴマー化についての優れた対照を提供し、およびそれが部位特異的に標識され得る、さらなる機能性を有する高分子量タンパク質についての適切な標準物質を提供する。
【０２００】
（実施例４）
システイン変異体の架橋傾向（ＣＬＰ）および空間的凝集傾向（ＳＡＰ）の間の相関
架橋傾向（ＣＬＰ）および空間的凝集傾向（ＳＡＰ）は、特異的なアミノ酸をシステインで置換したシステイン変異体について比較した。変異体はそれぞれ、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づいてＣＬＰを割り当てた。変異させた残基についてのＳＡＰ値は、５Åの半径を用いる計算された結果に由来する。本発明者らは、ＳＡＰコード化抗体−１構造物に工学的に作製したシステイン変異体を重ねた。
【０２０１】
以下の相関が観察された。システインで置換したアミノ酸はすべて、−０．２７〜０．００の範囲の負のＳＡＰ値である。これは、置換のための極性または荷電アミノ酸の選択と一致している。ＣＬＰクラスＩの変異体はすべて、０．００および−０．１１の間のＳＡＰを有し（変異体３、４、７、１０、１２）、ＣＬＰクラスＩＩの変異体はすべて、−０．１２および−０．２３の間のＳＡＰを有する（変異体１、２、１３）。しかしながら、高いＣＬＰを有し、それらの範囲のＳＡＰを有する変異体がある（たとえば変異体８、９、および１１）。高度に架橋する変異体、変異体８および１１は高ＳＡＰ部位に隣接する。ＣＬＰ  ＩＩＩを有する変異体５は、ＣＨ２において高ＳＡＰ部位に隣接しているが、ＣＬＰ  ＩＩの変異体２は隣接していない。しかしながら、ＣＨ３において変異体６および変異体１０の間にならびにＶＨにおいて変異体９および１４の間にそのような相関はない。
【０２０２】
さらなる観察を、変異体１４について行った。変異体１４は、近くに高ＳＡＰの領域がある場合、発現しないのに対して、変異体１４は、この高ＳＡＰ領域が低ＳＡＰの領域により置換された場合に発現する。自然の抗体−２バックグラウンドにおける変異体１４の収量（０．３４ｍｇ／Ｌ）と比較して、安定化された抗体−２における変異体１４の１００倍高い収量が観察された（３５．６ｍｇ／Ｌ培養物）。様々なバックグラウンドにおける変異体１４の相対的な収量は、システインが高ＳＡＰ値の領域の近くのタンパク質の表面に導入される場合、構造上の問題を示した。その問題は、工学的に作製されたシステインに隣接している疎水性パッチにおける２つの疎水性アミノ酸がリジンで置換された場合に、解決された。
【０２０３】
要約すると、システイン変異体の安定性およびＳＡＰの間に相関が存在する：１）低架橋傾向を有するシステイン変異体はわずかに負のＳＡＰを有する（０．００〜−０．１１）、２）より負のＳＡＰ（−０．１２〜−０．２３）を有するシステイン変異体は、より架橋の傾向がある、および３）高ＳＡＰのパッチのすぐ近くにあるシステイン変異体は、より架橋しそうであるか、または構造異常を有する。結論１および２は、完全に露出した残基が、架橋に対してより感受性であり得るという、前に明らかにされた概念と一致している［９］。
【０２０４】
（実施例５）
結論
本発明者らは、免疫グロブリンフォールドドメイン当たり少なくとも１つの変異体を抗体分子上に広く分布させたヒトＩｇＧ１システイン変異体のセットを設計した。ほとんどのこれらの変異体は、安定しており、抗原結合活性の著しい損失を伴うことなく効率的に特異的にコンジュゲートすることができる。したがって、安定した抗体変異体は、ペイロード分子の部位特異的なコンジュゲーションのための変異体のレパートリーを増やす。蛍光体が工学的に作製したシステインに付着された場合、特定のドメインの動力学を分析することができる。高度にオリゴマー化する変異体は、多数の多量体が、抗体凝集体のためのおよびに一般に、高分子量タンパク質のための好都合な標準物質を提供するので、同様に有益である。
【０２０５】
本明細書で記載される抗体システイン変異体の架橋傾向およびＳＡＰ方法の間の相関は、還元架橋を用いるコンジュゲーション部位をスクリーニングするために、ＳＡＰ方法論が用いられてもよいことを実証する。ＳＡＰ技術は、コンピューターベースのものであり、そのため、それは、変異体設計における時間および実験作業を低減させる。ＣＬＰ／ＳＡＰの比較は、部分的に露出したおよび完全にではないが露出したアミノ酸の置換により最も安定した変異体が得られることを示した。さらに、比較は、隣接する疎水性パッチを回避するべきであることを示した。
【０２０６】
本明細書で記載される、工学的に作製されたヒトＩｇＧ１表面システイン変異体は、治療用抗体の部位特異的なコンジュゲーションのための新しい部位を提供しおよびさらなる変異体を同定する方法を提供する。わずかな架橋傾向を有する変異体は、標的化療法のための抗体を開発するのに最も大きな有用性を有する。本明細書において開示されるシステイン変異体は、前に示されたドメイン（ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ３）および前に示されていないドメイン（ＶＬ、ＶＨ、ＣＨ２）の新しい部位を含む。
【０２０７】
さらに、標識変異体は、部位特異的蛍光抗体マーカーのセットとしてｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ実験室研究に使用することができる。蛍光標識製品は、研究団体に抗体および他のタンパク質試薬を提供するバイオテクノロジー企業（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなど）を介して商品化することができる。
【０２０８】
高度に架橋する変異体６は、有用なタンパク質−ゲルまたは他のクロマトグラフィー技術の標準物質となる。タンパク質試薬を提供する会社（たとえばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、およびＰｉｅｒｃｅ）はそれを市場へ出すことができる。
【０２０９】
ＣＬＰおよびＳＡＰの間の相関は、本発明者らが前に記載したＳＡＰ技術の商業的な適用をさらに示唆した。ＳＡＰの考慮により、部位特異的なコンジュゲーションのための安定した抗体システイン変異体の設計を改善することができる。
【０２１０】
【表１】
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参考文献
【０２１１】
【化５】
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【配列表】
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