(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８［ＩＤＸ９０５９］の配列からなる単離および精製されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
少なくとも１つのヌクレオチドがリン酸骨格修飾を有することを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドが、
配列番号８［ＩＤＸ９０５９］の配列からなるものである、炎症部位への多形核細胞の動員および／または遊走を減少させる医薬製剤を製造するためのオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
炎症部位への多形核細胞の前記減少した動員および／または遊走が、受容体ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２からなる群から選択される少なくとも１つのダウンレギュレーションの結果であることを特徴とする請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
炎症部位への多形核細胞の前記減少した動員および／または遊走が、受容体ＢＬＴ１のダウンレギュレーションの結果であることを特徴とする請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドは以下の投与経路、すなわち皮下、腹腔内、粘膜、腸内、経口、静脈内、胃内、食道、口腔内、鼻腔内および肺内投与からなる群から選択される一つを介して与えられることを特徴とする請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドは炎症性疾患の治療におけるステップとして投与されることを特徴とする請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドは心筋梗塞に罹患している、または罹患していることが疑われる患者に投与されることを特徴とする請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドは、脳卒中に罹患している、または罹患していることが疑われる患者に投与されることを特徴とする請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドは、外傷もしくは熱傷を負っている、または手術を受ける予定の患者に投与されることを特徴とする請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドは、塞栓の除去の前、後もしくは実質的に同時に、または血栓溶解剤の投与の前もしくは後に塞栓症を有する患者に投与されることを特徴とする請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドは、ドナーからの摘出前のｉｎ  ｓｉｔｕ、レシピエントへの移植前の輸送中、または血流回復前もしくは回復時のｉｎ  ｖｉｖｏのどちらかで、移植用に指定された臓器に投与されることを特徴とする請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多形核細胞の動員および／または遊走を減少させる方法および化合物に関し、特に多形核細胞の特性および挙動が発病に役割を果たすさまざまな状態を予防、治療または軽減する化合物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、身体が免疫系の成分を動員しながら、感染、刺激および他の損傷に反応する機構の一般用語である。多形核細胞は炎症の初期段階で動員され、炎症部位に遊出する。ケモカインおよびそれらの受容体は他の化学誘引物質とともに、ＰＭＮ遊走の主要なメディエーターである。化学誘引物質の例はＩＬ−８およびＬＴＢ4であり、それぞれ受容体ＣＸＣＲ１／ＣＸＣＲ２およびＢＬＴ１に結合して、炎症部位へのＰＭＮの動員に重要な役割を果たす。重要なことには、炎症は、炎症性疾患に通常は分類される疾患のみならず、多数の状態に役割を果たす。
【０００３】
虚血は、器官への血液供給の絶対的または相対的不足であり、酸素および栄養素の欠乏による組織損傷をもたらす。心臓、脳、および腎臓は、不十分な血液供給に最も敏感な器官の一つである。種々の治療戦略が、病変臓器および虚血の原因に応じて使用される。一例では、急性心臓虚血（心筋梗塞）後、血栓溶解療法または初回経皮冠動脈インターベンションのどちらかが梗塞関連冠動脈における血流の回復（心筋再灌流）に使用されなければならない。しかし、虚血エピソード後の血液の回復は、心筋再灌流直前には生存可能であった心筋細胞の死の原因となる。この心筋損傷は致死的な再灌流傷害と呼ばれ、心筋梗塞の最終的なサイズを増加させる。心筋虚血および再灌流傷害は、さまざまな種類の細胞およびサイトカインに関わる炎症反応に関連があると考えられている（ＥｎｔｍａｎおよびＳｍｉｔｈ  １９９４年）。
【０００４】
もう一つの例は脳卒中、特に虚血性脳卒中である。虚血性脳卒中では、脳の１つまたは複数の部分への血液供給が減少し、これらの部分における脳組織の機能不全および壊死をもたらす。虚血性脳卒中には幾つかの根本原因がある。すなわち、血栓症（局所的に形成する血の塊による血管の閉塞）、塞栓症（身体の他の場所で形成された塞栓による血管の閉塞）、全身性低灌流（例えばショックの結果としての血液供給の全般的低下）および静脈血栓症である。
【０００５】
塞栓症は、塞栓から下流の器官または組織への血液供給が限られかねない深刻な状態である。脳卒中の１つの原因因子として上述した塞栓症は、他の器官における閉塞（しばしば肺、腎臓、または肝臓におけるものであるが、下肢におけるものもある）の原因となることが知られている。塞栓は、例えばプラック（ｐｌａｃｋ）が血管壁から転移および血流中で移動するときに自然発生的に形成され得る。塞栓は、例えば複雑骨折からの脂肪塞栓または出血部位からの血の塊（血栓）など、外傷の結果としても形成され得る。血栓および脂肪塞栓はいずれ外科的介入中に形成し得ることから、手術を受けている患者もリスクがある。また、不動、肥満および癌も、塞栓症に関連することが知られた危険因子である。
【０００６】
腸間膜虚血は、小腸の炎症および損傷が不十分な血液供給によって生じる医学的状態である。血流低下の原因には、体循環の変化（例えば低血圧）または血管収縮もしくは血の塊などの局所因子が含まれ得る。虚血をもたらす可能性のある他の腸の障害および状態には、腸閉塞、腸の拡張、腸重積、および腸捻転が含まれ、これらでは、腸の異常な向き、蠕動運動の途絶、および他の状態によって、血流の低下、炎症、および最終的には虚血がもたらされ得る。例えば腸閉塞は、腸部分が長期にわたり接触し線維性癒着を形成させることから、癒着形成を増加させ得、腸の拡張は漿膜損傷および虚血の原因となり得る。このような障害は、外傷、熱傷、ショックまたはさまざまな病因等の結果としての、手術中または回復中における、外科的介入の結果として生じ得、多臓器不全をもたらし得る。
【０００７】
多形核細胞（ＰＭＮ）、特に血液白血球の大部分を占める多形核好中球は、心筋再灌流の最初の６時間の間に化学誘引物質により梗塞域に引き寄せられ、次の２４時間の間に多形核好中球は心筋組織に遊走する。このプロセスは、細胞接着分子により促進される。好中球は血管塞栓を引き起こし、分解酵素および活性酸素種を放出する（Ｖｉｎｔｅｎ−Ｊｏｈａｎｓｅｎ  Ｊ、２００４年）。したがって好中球は、炎症の治療または予防目的の第一標的である。幾つかの介入は、心筋再灌流中に梗塞領域から好中球を減少させることを目的とした（例えば白血球を除去した血液、細胞接着分子に対する抗体、および補体活性化の薬理学的阻害剤）。しかし、対応する臨床研究は、このような介入の有意義な心臓保護効果をいずれも示していない（Ｙｅｌｌｏｎにおけるレビュー、２００７年）。
【０００８】
ＰＭＮ蓄積および活性化は、関節リウマチ、アテローム性硬化症、潰瘍性大腸炎、乾癬、および虚血性傷害といった種々の幅広い疾患状態の病因において中心的な役割を果たすことが示されている。故に好中球機能を調節することができる内因性調節機構の解明は、多分に治療上興味深い。広範な研究が薬剤候補の特定に費やされており、１つのアプローチは、αＭインテグリンＩドメインに結合しｐｒｏＭＭＰ−９による複雑な形成を阻害することで好中球遊走を阻止するペプチド化合物の使用に代表される（例えばＷＯ２００４／１１０４７７参照）。
【０００９】
別のアプローチは、炎症の動物モデルにおいて白血球動員およびＰＭＮ浸潤を阻害することが示された小さな親油性化合物であるリポキシンおよびリポキシン誘導体の使用である（例えばＷＯ２０００／０５５１０９参照）。
【００１０】
さらに別のアプローチは抗体の使用である。１９９０年代はじめに、β２インテグリン媒介接着を阻害することなく血管内皮、コラーゲン皮膜フィルターおよび腸上皮にわたりＰＭＮ遊走を阻害できることができる、強力なＣＤ４７特異的抗体（Ａｂ）であるＣ５／Ｄ５が特定された（Ｐａｒｋｏｓら、１９９６年）。同時に、抗ＣＤ４７は内皮単層にわたるＰＭＮ遊走も阻害することが示された（Ｃｏｏｐｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９２：３９７８頁、１９９５年）。ＣＤ４７ノックアウトマウスによる後続研究は、ＣＤ４７が感染部位へのＰＭＮ動員率を調節する役割を果たすことを示唆し、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＭＮ遊走におけるＣＤ４７の重要性を確認した（Ｌｉｎｄｂｅｒｇら、１９９６年）。
【００１１】
移植は、再灌流虚血の結果を検討しなければならない別の適用である。移植とは、細胞、組織または臓器の部分もしくは臓器全体の、ある位置から別の位置への移動を意味する。移植は自己移植、いわゆる自家移植片であり得、主に細胞が個人から採取され、およびこの同じ個人に戻される。より頻繁には、用語移植は、ドナーである１人の人間から採取され、レシピエントである別の人間に与えられる細胞、組織もしくは臓器に使用される。腎臓移植が最も一般的に行われている。心臓、肝臓および肺の移植も定期的に行われている。医学が進歩するにつれ、膵臓および小腸を含む他の重要な臓器も移植に使用されている。角膜、心臓弁、皮膚および骨などの組織も提供され得る。
【００１２】
実用的な理由のため、移植組織は、一定期間身体の外で保存され、輸送、機能検査、組織適合検査およびドナーとレシピエントの照合を可能にする必要がある。移植の登場以来、移植される臓器は冷虚血保存で保存されている。この方法は、輸送中の臓器損傷の程度を低減するのを助けることが意図されたが、著しい損傷は依然として生じている。時間が経過すればするほど、損傷は深刻になる。さまざまな技術的および化学的解決策が提案された。しかし、移植を必要とする人の数がドナー数をはるかに超えていること、および手順がきわめて複雑であり、費用がかかり、すべての当事者にとってストレスが多いことから、移植の成功機会を増やす改善は依然として必要である。保存および輸送中の臓器損傷を最小限に抑えることは重要な問題である。
【００１３】
ＷＯ２００５／０８０５６８は、哺乳動物における続発性虚血性傷害の程度を予防または減少させるＮＦ−ｋＢ阻害化合物の使用に関する。ＮＦ−ｋＢ阻害化合物は、アンチセンスＮＦ−ｋＢ  ｐ６５サブユニットオリゴヌクレオチド、ＮＦ−ｋＢ  ｐ６５サブユニットの優性阻害型、デコイ、リボソーム阻害剤、ＮＦ−ｋＢ  ｐ６５に対する酵素ＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡ構築物から成る群から選択される。
【００１４】
ＷＯ２００７／０３０５８０は、トール様受容体に結合および活性化する薬剤を含む組成物を被験者に投与する（場合によりＡＳＩＣ阻害剤の投与と併用して）ことを含む、細胞毒性損傷に対し細胞を保護する方法に関する。該方法は、神経および非神経系細胞の保護に適用可能であることが記載されている。例えば、興奮毒性脳損傷に対して神経系細胞を保護する方法が提供されている。興奮毒性損傷、虚血および／または低酸素症の予防的治療用の医薬品を調製する方法も提供される。
【００１５】
ＷＯ２００７／０３０５８１は、細胞毒性の攻撃から細胞を保護するための、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの投与に焦点をあてた、上記ＷＯ２００７／０３０５８０との並行出願である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】ＷＯ２００５／０８０５６８
【特許文献２】ＷＯ２００７／０３０５８０
【特許文献３】ＷＯ２００７／０３０５８１
【発明の概要】
【００１７】
本発明者らは、驚くべきことに特定のオリゴヌクレオチド化合物が多形核細胞の特性および挙動、特に炎症部位への多形核細胞の動員および／または遊走に影響を与えること、ならびにこれらの化合物がこの機構を介してさまざまな疾患の予防、治療および／または軽減に有用性を有することを示した。
【００１８】
本発明者らは、オリゴヌクレオチドならびに治療およびこの目的のための医薬組成物の製造におけるオリゴヌクレオチドの使用方法を提供する。炎症部位への多形核細胞の動員および／または遊走を阻止または減少させることが望ましい臨床状況には、気道炎症、胸膜炎、心筋梗塞、脳梗塞、脳卒中、組織または臓器移植に関連した再灌流傷害、ならびに外科的介入、塞栓症、創傷治癒、および外傷に関連した再灌流傷害が含まれるが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明の１つの態様は、新規化合物、ならびにさまざまな病因の疾患において炎症部位への多形核細胞の動員および／もしくは遊走を阻止または減少させる方法などの、該化合物の使用方法の提供である。本発明の他の態様は、これらの利点とともに、特許請求の範囲の記載を検討することによって当業者には明らかとなろう。
【００２０】
添付の図面を参照して、以下、発明を実施するための形態、非限定的な実施例、および特許請求の範囲により詳細に本発明を開示する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１ａ】図１ａは、ＯＶＡ誘発気道炎症マウスモデルにおける予防的プロトコルを示す図である。マウスは、０および１２日目に２回の水酸化アルミニウムゲル中ＯＶＡの腹腔内注射により感作した。治療は、１６および２１日目に試験薬剤またはビヒクルの２回の鼻腔内投与により行った。マウスを次いで４回のエアロゾルチャレンジに曝露した。実験は３５日目に終了した。
【図１ｂ】図１ｂは、図１ａによる治療後のＢＡＬ液由来細胞の平均値を示すヒストグラムである。ＩＤＸ９０５９による治療は白血球（主に好酸球）、およびリンパ球の減少をもたらした。バーは平均±標準偏差を示す。ボンフェローニ事後補正（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）を用いた一元配置分散分析によって、ＰＢＳ対照に対して、*Ｐ＜０．０５、***Ｐ＜０．００１。
【図２】図２は、マウスでのチオグリコレート誘発胸膜炎モデルにおける本発明の化合物による治療後のＰＭＮ蓄積の減少を示す図である。図２ａでは、ＩＤＸ９０１０が胸膜炎の誘発２０分前に投与され、胸腔へのＰＭＮの遊走の６８．２％の減少をもたらした。図２ｂでは、ＩＤＸ９０５９が胸膜炎の誘発２０分前に投与され、胸腔へのＰＭＮの遊走の２５．１％の減少をもたらした。バーは平均±標準偏差を示す。
【図３ａ】図３ａは、マウスでの精巣挙筋細静脈の生体顕微鏡検査モデルにおける任意の化学走化性因子で刺激をしない顕微鏡視野当たりの細胞のヒストグラムを示す図である。Ｒ＝ローリング細胞、Ａ＝接着細胞およびＴ＝遊出細胞。ｎ＝４、平均±標準偏差。非刺激細胞はＲ＞Ａ＞Ｔの細胞活性順序を明らかにした。ＩＤＸ９０５９による治療は、非刺激ＰＭＮ細胞のローリングおよび接着に対するダウンレギュレーション効果を示した。
【図３ｂ】図３ｂは、マウスでの精巣挙筋細静脈の生体顕微鏡検査モデルにおける走化性血小板活性化因子（ＰＡＦ）を添加後の顕微鏡視野当たりの細胞のヒストグラムを示す図である。Ｒ＝ローリング細胞、Ａ＝接着細胞およびＴ＝遊出細胞。刺激細胞では、（ＰＡＦ後の）活性順序はＴ＞Ａ＞Ｒ＞と逆転した。ＩＤＸ９０５９による治療は、ＰＭＮ細胞のローリングおよび接着ならびに遊出に対するダウンレギュレーション効果を示した。ｎ＝４、平均±標準偏差。
【図４−１】図４ａ〜ｃは、局所虚血のラットモデルにおける脳虚血誘発後の本発明の薬剤およびビヒクル（ＰＢＳ）による治療効果を示すための図である。  図４ａは、ＰＢＳ（スライドＥ）対ＩＤＸ９０５９（スライドＤ）を与えた非治療動物における虚血性傷害の程度の比較を示す２枚の写真である。オスのウィスターハノーバーラットでの虚血性脳傷害を誘発するのに、中大脳動脈の一過性閉塞を使用した。中大脳動脈（ＭＣＡ）の皮質血流を示すためレーザードップラーを使用した。閉塞の９０分後、線維が除去され、ＭＣＡで血液循環が継続し、皮質血流が回復した。物質は再循環後０および２４時間に腹腔内注射した。動物を手術の４８時間後に屠殺し、脳を摘出し、および２ｍｍ厚スライスにカットした。スライスは次いで、生存脳細胞（赤）を壊死細胞（青）と区別するためリン酸緩衝液中０．８％塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）でインキュベートした。スライスを撮影し、脳傷害をコンピュータ分析により評価した。
【図４−２】図４ｂは、局所虚血のラットモデルにおける脳虚血誘発後の本発明の薬剤およびビヒクル（ＰＢＳ）による治療効果を示すための図であって、全脳傷害のパーセンテージを示す棒グラフである。  図４ｃは、局所虚血のラットモデルにおける脳虚血誘発後の本発明の薬剤およびビヒクル（ＰＢＳ）による治療効果を示すための図であって、選択的神経壊死（ＳＮＮ）面積のパーセンテージを示す棒グラフである。選択的神経壊死は、わずかにピンクがかった、およびペナンブラ領域と考えられる部分の推定として示される。
【図４−３】図４ｄは、梗塞領域（虚血中心部）のパーセンテージを示す棒グラフである。データは平均±標準偏差として示されている（ｎ＝４〜８）。平均は棒で示されている。治療群対ＰＢＳ対照での対応のないｔ−試験により得られた*Ｐ＜０．０５。
【図５】図５は、心臓虚血の動物モデルにおける梗塞のパーセンテージを示す棒グラフである。ＩＤＸ９０５９（１μｇ／μｌ）またはプラセボを、心臓切除の２４時間前に皮下に与えた（１００μｌ）。心臓を回収し、および安定化のため２０分間灌流した。全虚血は灌流を止めて誘発し、この後１２０分の再灌流を行った。再灌流の最後に、心臓を除去し、左心室を４枚のスライスにカットし（各１ｍｍ厚）およびリン酸緩衝液中１％塩化トリフェニルテトラゾリウムでインキュベートして生存心筋細胞を識別した。スライスから写真を撮り、梗塞体積をコンピュータ分析により評価した。結果が梗塞傷害のパーセンテージを示す棒グラフに示されている。データは平均（ｎ＝８）および平均値の標準誤差を示す。*Ｐ＜０．０５はマン−ホイットニー検定により計算した。
【図６−１】図６ａ〜ｃは、腸虚血−再灌流マウスモデルにおけるＩＤＸ０１５０およびビヒクル（ＰＢＳ）による治療結果を示す図である。虚血は１５分間の腸間膜動脈結紮により誘発し、この後３時間の再灌流を行った。マウスは虚血誘発２０分前にＰＢＳ（図６ａ）、またはＩＤＸ０１５０（図６ｂ）を受けた。図６ａ〜ｂは、それぞれＰＢＳまたはＩＤＸ０１５０を投与後のマウス消化管の部分を示す（胃、左；小腸；盲腸および結腸）。
【図６−２】図６ｃには、ＩＤＸ０１５０で治療したマウス（スコア２）対ＰＢＳを受けているマウス（スコア６．５）の炎症スコアが示されている。
【図６−３】図６ｄ〜ｇは、腸虚血および再灌流傷害マウスモデルにおける腸および肺組織のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）レベルを示す図である。ＩＤＸ０１５０またはＰＢＳを、虚血誘発（図６ｄ、および、図６ｆ）の２０分前、または、再灌流（図６ｅ、および、図６ｇ）の開始直後に皮下投与した。再灌流の３時間、小腸（図６ｄ、および、図６ｅ）および肺（図６ｆ、および、図６ｇ）をホモジナイズし、ＭＰＯレベルをＥＬＩＳＡで分析した。結果は標準偏差とともに平均値として表されている。
【図６−４】図６−３の続きで、腸虚血および再灌流傷害マウスモデルにおける腸および肺組織のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）レベルを示す図である（図６ｆおよび図６ｇ）。
【図７−１】図７ａ〜ｆは、さまざまな試験物質による刺激後のヒト末梢ＰＭＮにおけるＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２発現の結果を示す図である。５人の健康な血液ドナー由来のヒトＰＭＮを、２５μＭの試験化合物または培地のみ（未処理）で３時間刺激した。細胞をこの後回収し、フローサイトメトリーによりＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２発現について分析した。ＣＸＣＲ１（図７ａ）およびＣＸＣＲ２（図７ｃ）に関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）の倍率変化、または、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ６６ｂ＋ＰＭＮ（図７ｂ）およびＣＸＣＲ２＋ＣＤ６６ｂ＋ＰＭＮ（図７ｄ）の％の倍率変化を、対応する未処理細胞のＭＦＩまたは％陽性ＰＭＮを１に正規化（黒い点線）して計算した。
【図７−２】図７ｅは、０．５、１０および２５μＭのＩＤＸ９０５２、ＩＤＸ９０５４およびＩＤＸ９０５９（ｎ＝５）による刺激後のＣＸＣＲ１＋ＰＭＮの相対ＭＦＩを示す。  図７ｆは、５人の健康な血液ドナー由来のＰＭＮを用いた別の実験における、１０μＭ  ＩＤＸ９０７４による刺激後のＣＸＣＲ１＋ＰＭＮの相対ＭＦＩを示す。結果は平均±平均値の標準誤差として表されている。ボンフェローニ事後補正対を用いた二元配置ＡＮＯＶＡによって、未処理細胞に対して、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１および***Ｐ＜０．００１が計算された。
【図７−３】図７ｇは、さまざまな時点にＩＤＸ９０５９で刺激したヒトＰＭＮでのＣＸＣＲ１発現を示す図である。３人の健康な血液ドナー由来のヒトＰＭＮを、１５分、３０分、１時間、２時間または３時間、１０μＭのＩＤＸ９０５９で刺激した。細胞をこの後回収し、各時点で固定化し、フローサイトメトリーによりＣＸＣＲ１発現について分析した。ＩＤＸ９０５９処理細胞におけるＣＤ６６ｂ陽性ＰＭＮのＣＸＣＲ１のＭＦＩの倍率変化を、対応する未処理細胞のＭＦＩを１に正規化して計算した。結果は平均値±平均値の標準誤差として表されている。
【図７−４】図７ｈは、ＣＸＣＲ１の表面発現に対するＣｐＧおよびオリゴＧ−オリゴヌクレオチドの重要性を示す図である。３人の健康な血液ドナー由来のヒトＰＭＮを、０．５、１０または２５μＭのＩＤＸ９０２２およびＩＤＸ９０５９ならびにそれぞれＩＤＸ９０２２およびＩＤＸ９０５９と同じ配列を有するがＣｐＧモチーフのない、修飾した対照オリゴヌクレオチドＩＤＸ０４８０およびＩＤＸ９１３４で３時間インキュベートした。細胞をこの後回収し、フローサイトメトリーによりＣＸＣＲ１発現について分析した。ＣＸＣＲ１＋ＣＤ６６ｂ＋ＰＭＮのＭＦＩの倍率変化を、未処理細胞のＭＦＩを１に正規化（黒い点線）して計算した。結果は平均値±平均値の標準誤差として表されている。
【図７−５】図７ｉは、本発明の化合物による処理後のＣＸＣＲ１表面発現のダウンレギュレーションに対するクロロキン効果を示す図である。４人の健康な血液ドナー由来のヒトＰＭＮを、１０μＭの試験化合物で３時間刺激する前に、０．５、５または１０μｇ／ｍｌのクロロキンとともに３０分間プレインキュベートした。細胞をこの後回収し、フローサイトメトリーによりＣＸＣＲ１発現について分析した。ＭＦＩの倍率変化を、対応する未処理細胞のＭＦＩを１に正規化（黒い点線）して計算した。結果は平均値±平均値の標準誤差として表されている。ボンフェローニ事後補正を用いた二元配置ＡＮＯＶＡによって、未処理細胞に対して、*Ｐ＜０．０５が計算された。
【図７−６】図７ｊ〜ｋは、異なる試験物質による刺激後のヒトＰＭＮでのＢＬＴ１表面発現の結果を示す図である。５人の健康な血液ドナー由来のヒトＰＭＮを、０．５、１０または２５μＭの本発明の化合物または培地のみ（未処理）で３時間刺激した。細胞をこの後回収し、フローサイトメトリーによりＢＬＴ１発現について分析した。ＭＦＩの倍率変化（図７ｊ）または％ＢＬＴ１＋ＣＤ６６ｂ陽性ＰＭＮ（図７ｋ）を、対応する未処理細胞のＭＦＩまたは％を１に正規化（黒い点線）して計算した。結果は平均値および平均値の標準誤差として表されている。ボンフェローニ事後補正を用いた二元配置ＡＮＯＶＡによって、未処理細胞に対して、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１および***Ｐ＜０．００１が計算された。
【図７−７】図７ｌ〜ｎは、ＰＭＮのＩＬ−８およびＬＴＢ4誘発走化性に対する本発明の化合物の効果を示す図である。５（図７ｌ）または４〜６（図７ｎ）人の健康な血液ドナー由来のヒトＰＭＮを、０．５、１０または２５μＭの本発明の化合物で１時間プレインキュベートした後、遊離化合物を洗浄し、ＩＬ−８（図７ｌ）またはＬＴＢ4（図７ｎ）に向かって遊走する能力について細胞を走化性アッセイで３時間調べた。結果は遊走ＰＭＮの平均数±平均値の標準誤差として表されている。Ｄｕｎｎｅｔｔの事後補正を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって、ＩＬ−８／ＬＴＢ4とともにインキュベートした未処理細胞に対して、*Ｐ＜０．０５および**Ｐ＜０．０１が計算された。図７ｍは、２人の健康な血液ドナー由来のＰＭＮを、０．５、１０または２５μＭのＩＤＸ９０４５とともに１時間プレインキュベートした後、化合物の非存在下でＩＬ−８に向かって遊走する能力について細胞を走化性アッセイで３時間調べた別の実験を示す。
【図７−８】図７−７の続きで、ＰＭＮのＩＬ−８およびＬＴＢ4誘発走化性に対する本発明の化合物の効果を示す図である（図７ｎ）。
【図７−９】図７ｏ〜ｑは、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２およびＢＬＴ１表面発現と本発明の化合物による刺激後のＰＭＮ遊走との間の相関を示す図である。本発明の化合物による刺激後のＰＭＮのＣＸＣＲ１（図７ｏ）、ＣＸＣＲ２（図７ｐ）およびＢＬＴ１（図７ｑ）のＭＦＩを、走化性アッセイでＩＬ−８（図７ｏおよび図７ｐ）またはＬＴＢ4（図７ｑ）に向かって遊走するＰＭＮの数に対してプロットした。曲線適合（ｒ2）は図中に指定されている。
【図７−１０】図７−９の続きで、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２およびＢＬＴ１表面発現と本発明の化合物による刺激後のＰＭＮ遊走との間の相関を示す図である（図７ｑ）。
【図８−１】図８ａ〜ｆは、異なる試験物質による刺激後のＭＳ患者から単離したヒト末梢ＰＭＮにおけるＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２およびＢＬＴ１発現の結果を示す図である。ＭＳ患者由来のヒトＰＭＮを、０．５、１０および２５μＭの試験化合物または培地のみ（未処理）で３時間刺激した。細胞をこの後回収し、フローサイトメトリーによりＣＸＣＲ１（ｎ＝４）、ＣＸＣＲ２（ｎ＝４）およびＢＬＴ１（ｎ＝２）発現について分析した。ＣＸＣＲ１（図８ａ）、ＣＸＣＲ２（図８ｃ）およびＢＬＴ１（図８ｅ）に関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）の倍率変化、または、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ６６ｂ＋ＰＭＮ（図８ｂ）、ＣＸＣＲ２＋ＣＤ６６ｂ＋ＰＭＮ（図８ｄ）、ＢＬＴ１＋ＣＤ６６ｂ＋ＰＭＮ（図８ｆ）の％の倍率変化を、対応する未処理細胞のＭＦＩまたは％陽性ＰＭＮを１に正規化（黒い点線）して計算した。結果は平均値±平均値の標準誤差として表されている。ボンフェローニ事後補正を用いた二元配置ＡＮＯＶＡによって、未処理細胞に対して、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１および***Ｐ＜０．００１が計算された。
【図８−２】図８−１の続きで、異なる試験物質による刺激後のＭＳ患者から単離したヒト末梢ＰＭＮにおけるＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２およびＢＬＴ１発現の結果を示す図である（図８ｃおよび図８ｄ）。
【図８−３】図８−２の続きで、異なる試験物質による刺激後のＭＳ患者から単離したヒト末梢ＰＭＮにおけるＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２およびＢＬＴ１発現の結果を示す図である（図８ｅおよび図８ｆ）。
【図８−４】図８ｇ〜ｉは、本発明の化合物による刺激後の喘息患者由来のヒト抹消ＰＭＮにおけるＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２およびＢＬＴ１発現の結果を示す図である。喘息患者由来のヒトＰＭＮを、０．５、１０および２５μＭの試験化合物または培地のみ（未処理）で３時間刺激した。細胞をこの後回収し、フローサイトメトリーによりＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２およびＢＬＴ１発現について分析した。ＣＸＣＲ１（図８ｇ）ＣＤ６６ｂ＋ＰＭＮ、ＣＸＣＲ２（図８ｈ）ＣＤ６６ｂ＋ＰＭＮ、および、ＢＬＴ１（図８ｉ）ＣＤ６６ｂ＋ＰＭＮに関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）の倍率変化を、対応する未処理細胞のＭＦＩを１に正規化（黒い点線）して計算した。
【図８−５】本発明の化合物による刺激後の喘息患者由来のヒト抹消ＰＭＮにおけるＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２およびＢＬＴ１発現の結果を示す図（図８ｉ）である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明が記載される前に、本発明の範囲は添付特許請求の範囲およびこの同等物によってのみ制限されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のみに使用され、制限的であるものではないことが理解されるべきである。
【００２３】
この明細書および添付特許請求の範囲で使用される通り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「この（ｔｈｅ）」は、文脈が特に明白に指示しない限り複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。
【００２４】
また、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、適用できる場合、任意の値の＋／−２％、好ましくは＋／−５％、および最も好ましくは数値の＋／−１０％の偏差を示すために使用される。
【００２５】
上記に加え、以下の用語が使用されるであろう。
【００２６】
用語「相同性(homology)」および「相同性の程度(degree of homology」は、２つの配列間の類似性または同一性を意味し、１００％相同性は配列が同一であること、およびより低い相同性は変異の存在を示していることを意味する。例えば、２０核酸塩基から成る配列では、別の配列は１８塩基が同一であれば９０％相同である。
【００２７】
「機能的に相同な(functionally homologous)」は、開示された配列と恐らくより低い構造的相同性を共有するが、健康なまたは罹患した生物のいずれにおいてもｉｎ  ｖｉｖｏで相同な機能を示す、例えば同じタンパク質または類似の細胞機能を有する高度に類似したタンパク質をコードする配列を意味する。
【００２８】
用語「治療(treatment)」、「治療(therapy)」、「治療的使用」、「医薬品」、および「医学的使用」は、ヒトおよび動物の両方または獣医学的適用を含む。
【００２９】
本発明者らは、特定のオリゴヌクレオチドは多形核細胞の特性および挙動、例えばこの内皮接着および遊出に影響を与えること、ならびにこれらの化合物が、この機構および場合により他の機構を介して異なる病因の疾患の予防および／または軽減に有用性を有することを見出した。これらの発見は、ドナー血液から単離されたＰＭＮで行われた動物実験およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験において確認されている。
【００３０】
【表１】
0005749651.tif 000002
【００３１】
本発明者らは新規のオリゴヌクレオチドを提供し、したがって本発明の１つの実施形態は、配列番号１〜１２、１４、１５、および１６、ならびに特に配列番号８［ＩＤＸ９０５９］、配列番号１４［ＩＤＸ９０５２］、配列番号７［ＩＤＸ９０５４］、配列番号６［ＩＤＸ９０４５］、配列番号１［ＩＤＸ９００５］、配列番号９［ＩＤＸ９０７４］、配列番号３［ＩＤＸ９０２２］、配列番号２［ＩＤＸ９０１０］、および配列番号４［ＩＤＸ９０３０］から成る群から選択される単離および実質的に精製されたオリゴヌクレオチドである。
【００３２】
好ましくは、上記の配列から選択される配列における少なくとも１つのヌクレオチドは、リン酸骨格修飾を有する。前記リン酸骨格修飾は、好ましくはホスホロチオエートまたはジチオリン酸修飾である。
【００３３】
本発明者らはまた、上記の配列から選択されるオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物も提供する。
【００３４】
本発明の１つの実施形態は、炎症部位への多形核細胞の動員および／または遊走を減少させる医薬製剤を製造するためのオリゴヌクレオチドの使用であり、オリゴヌクレオチドが、配列番号８［ＩＤＸ９０５９］、配列番号１４［ＩＤＸ９０５２］、配列番号７［ＩＤＸ９０５４］、配列番号６［ＩＤＸ９０４５］、配列番号１［ＩＤＸ９００５］、配列番号９［ＩＤＸ９０７４］、配列番号３［ＩＤＸ９０２２］、配列番号２［ＩＤＸ９０１０］、配列番号４［ＩＤＸ９０３０］、および配列番号１３［ＩＤＸ０１５０］から成る群から選択される。
【００３５】
好ましくは、本発明者らに現在入手できる結果によれば、炎症部位への多形核細胞の前記減少した動員および／または遊走は、受容体ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２の少なくとも１つのダウンレギュレーションの結果、または受容体ＢＬＴ１のダウンレギュレーションの結果である。
【００３６】
好ましい実施形態によれば、前記オリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号８［ＩＤＸ９０５９］、配列番号１４［ＩＤＸ９０５２］、および配列番号７［ＩＤＸ９０５４］の中で選択される。
【００３７】
上記の使用では、オリゴヌクレオチドは好ましくは、以下の投与経路、すなわち経皮、腹腔内、粘膜、腸内、経口、胃内、食道、口腔内、鼻腔内および肺内投与の一つを介して与えられる。
【００３８】
上記と自由に組み合わせ可能な好ましい実施形態によれば、オリゴヌクレオチドは炎症性疾患の治療におけるステップとして投与される。
【００３９】
上記と自由に組み合わせ可能な別の好ましい実施形態によれば、オリゴヌクレオチドは心筋梗塞に罹患している、または罹患していることが疑われる患者に投与される。
【００４０】
上記と自由に組み合わせ可能な別の好ましい実施形態によれば、オリゴヌクレオチドは脳卒中に罹患している、または罹患していることが疑われる患者に投与される。
【００４１】
上記と自由に組み合わせ可能な別の好ましい実施形態によれば、オリゴヌクレオチドは外傷もしくは熱傷を負っている、または手術を受ける予定の患者に投与される。
【００４２】
上記と自由に組み合わせ可能な別の好ましい実施形態によれば、オリゴヌクレオチドは、塞栓の除去の前、後もしくは実質的に同時に、または血栓溶解剤の投与の前もしくは後に塞栓症を有する患者に投与される。該化合物はポストコンディショニング効果も有することが示されたことから、塞栓の除去後、または集中治療設定で該化合物の有用性を著しく増加させるものである血栓溶解剤の投与後にも投与されることが企図される。
【００４３】
上記と自由に組み合わせ可能な別の好ましい実施形態によれば、オリゴヌクレオチドは、ドナーからの摘出前のｉｎ  ｓｉｔｕ、レシピエントへの移植前の輸送中、または血流回復前もしくは回復時のｉｎ  ｖｉｖｏのどちらかで、移植用に指定された臓器に投与される。
【００４４】
さらに、本発明者らは、患者の臓器における炎症部位への多形核細胞の動員および／または遊走を減少させる方法を提供し、配列番号８［ＩＤＸ９０５９］、配列番号１４［ＩＤＸ９０５２］、配列番号７［ＩＤＸ９０５４］、配列番号６［ＩＤＸ９０４５］、配列番号１［ＩＤＸ９００５］、配列番号９［ＩＤＸ９０７４］、配列番号３［ＩＤＸ９０２２］、配列番号２［ＩＤＸ９０１０］、配列番号４［ＩＤＸ９０３０］、および配列番号１３［ＩＤＸ０１５０］から成る群から選択されるオリゴヌクレオチドが、前記臓器に局所投与または前記患者に全身投与される。
【００４５】
あるいは、本発明者らは臓器における炎症部位への多形核細胞の動員および／または遊走を減少させる方法を提供し、オリゴヌクレオチドは、前記臓器の再灌流の前、同時、または後で前記臓器に局所投与されるまたは前記患者に全身投与され、オリゴヌクレオチドが、配列番号８［ＩＤＸ９０５９］、配列番号１４［ＩＤＸ９０５２］、配列番号７［ＩＤＸ９０５４］、配列番号６［ＩＤＸ９０４５］、配列番号１［ＩＤＸ９００５］、配列番号９［ＩＤＸ９０７４］、配列番号３［ＩＤＸ９０２２］、配列番号２［ＩＤＸ９０１０］、配列番号４［ＩＤＸ９０３０］、および配列番号１３［ＩＤＸ０１５０］から成る群から選択される。
【００４６】
治療の上記方法のどちらかでは、および本発明者らに現在入手できる結果によれば、炎症部位への多形核細胞の前記減少した動員および／または遊走は、受容体ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２の少なくとも１つのダウンレギュレーションの結果、受容体ＢＬＴ１のダウンレギュレーションの結果である。
【００４７】
治療の上記方法では、前記オリゴヌクレオチドは好ましくは、配列番号８［ＩＤＸ９０５９］、配列番号１４［ＩＤＸ９０５２］、および配列番号７［ＩＤＸ９０５４］の中で選択される。
【００４８】
本発明者らはまた、臓器における血流障害または遮断に罹患しているまたは罹患していることが疑われる、および治療が予定されている患者を調整する方法も企図し、前記臓器における炎症部位への多形核細胞の動員および／または遊走を減少させることができるオリゴヌクレオチドが、予定された治療の前、同時、または後で前記患者に投与され、オリゴヌクレオチドは、配列番号８［ＩＤＸ９０５９］、配列番号１４［ＩＤＸ９０５２］、配列番号７［ＩＤＸ９０５４］、配列番号６［ＩＤＸ９０４５］、配列番号１［ＩＤＸ９００５］、配列番号９［ＩＤＸ９０７４］、配列番号３［ＩＤＸ９０２２］、配列番号２［ＩＤＸ９０１０］、配列番号４［ＩＤＸ９０３０］、および配列番号１３［ＩＤＸ０１５０］から成る群から選択される。
【００４９】
上記方法の実施形態では、前記臓器は好ましくは心臓であり、ならびに前記臓器における炎症部位への多形核細胞の動員および／または遊走の前記減少は、虚血性傷害を減少する、および続発性再灌流傷害を予防または軽減するのに有効である。この実施形態では、前記続発性再灌流傷害は、血栓溶解剤の投与による心臓への血流の回復に続いて起こる損傷であり得る。あるいは、前記続発性再灌流傷害は、外科的介入、例えばバイパス手術による心臓への血流の回復に続いて起こる損傷である。あるいは、前記続発性再灌流傷害は、バルーン血管形成術による心臓への血流の回復に続いて起こる損傷である。あるいは、前記続発性再灌流傷害は、移植のレシピエントにおいて移植された臓器への血流の外科的回復に続いて起こる損傷である。
【００５０】
上記方法の別の実施形態では、前記臓器は脳であり、および前記虚血性傷害は続発性再灌流傷害である。この実施形態では、前記続発性再灌流傷害は、血栓溶解剤の投与による脳への血流の回復後の損傷であり得る。
【００５１】
上記方法のさらに別の実施形態では、前記臓器は肝臓、少なくとも１つの腎臓、腸またはこの部分、少なくとも１つの肺またはこの部分の中で選択され、および前記虚血性傷害が続発性再灌流傷害である。
【００５２】
方法の上記実施形態のいずれかでは、オリゴヌクレオチド以下の投与経路、すなわち全身、好ましくは経皮、腹腔内、粘膜投与（腸内、経口、胃内、食道、口腔内、鼻腔内、および肺内投与を含む）の一つを介して与えられる。
【００５３】
本発明者らはまた、心筋梗塞の治療のためのアジュバント法も提供し、配列番号８［ＩＤＸ９０５９］、配列番号１４［ＩＤＸ９０５２］、配列番号７［ＩＤＸ９０５４］、配列番号６［ＩＤＸ９０４５］、配列番号１［ＩＤＸ９００５］、配列番号９［ＩＤＸ９０７４］、配列番号３［ＩＤＸ９０２２］、配列番号２［ＩＤＸ９０１０］、配列番号４［ＩＤＸ９０３０］、および配列番号１３［ＩＤＸ０１５０］から成る群から選択されるオリゴヌクレオチドが、血栓溶解剤の投与の前、後または同時に投与される。
【００５４】
さらに、本発明者らは、脳卒中の治療のためのアジュバント法を提供し、配列番号８［ＩＤＸ９０５９］、配列番号１４［ＩＤＸ９０５２］、配列番号７［ＩＤＸ９０５４］、配列番号６［ＩＤＸ９０４５］、配列番号１［ＩＤＸ９００５］、配列番号９［ＩＤＸ９０７４］、配列番号３［ＩＤＸ９０２２］、配列番号２［ＩＤＸ９０１０］、配列番号４［ＩＤＸ９０３０］、および配列番号１３［ＩＤＸ０１５０］から成る群から選択されるオリゴヌクレオチドが、血栓溶解剤の投与の前、後または同時に投与される。
【００５５】
本発明の別の実施形態は、移植臓器の保存および／または輸送のための技術的解決策であり、前記解決策が、虚血性傷害の予防および／または軽減に十分な量で、多形核細胞の特性および挙動に影響する、例えば多形核細胞の内皮接着ならびに動員および／または遊走を抑制することができるオリゴヌクレオチドを含み、ならびに前記オリゴヌクレオチドは、配列番号８［ＩＤＸ９０５９］、配列番号１４［ＩＤＸ９０５２］、配列番号７［ＩＤＸ９０５４］、配列番号６［ＩＤＸ９０４５］、配列番号１［ＩＤＸ９００５］、配列番号９［ＩＤＸ９０７４］、配列番号３［ＩＤＸ９０２２］、配列番号２［ＩＤＸ９０１０］、配列番号４［ＩＤＸ９０３０］、および配列番号１３［ＩＤＸ０１５０］の中で選択される。
【００５６】
使用の上記方法、および治療方法では、オリゴヌクレオチドは治療有効量で投与される。「治療有効量」の定義は疾患および治療設定によって決まり、「治療有効量」は単独または他の治療との併用で患者の状態の測定可能な改善をもたらす用量である。当業者は、経験的に、または不当な負担なく行われる実験室実験に基づき、治療有効量を決定することができる。治療担当医師もまた、自身の経験に基づきならびに疾患の性質および重症度、ならびに患者の状態を考慮して、適切な用量を決定することができる。
【００５７】
１つの実施形態によれば、オリゴヌクレオチドは、約１から約２０００μｇ／ｋｇ体重、好ましくは約５から約１０００μｇ／ｋｇ体重の間の用量、最も好ましくは約１０から約５００μｇ／ｋｇ体重の間の用量で与えられる。
【００５８】
オリゴヌクレオチドは、単回投与または反復投与で投与されてよい。現在最も好ましい実施形態は、粘膜に投与される、例えばｋｇ体重当たり約２０００μｇ未満、好ましくは約５００μｇ未満、好ましくは約１００μｇの量で鼻腔内、経口、直腸内または膣内に与えられる、本発明によるオリゴヌクレオチドの１回の単回投与を伴う。
【００５９】
別の現在好ましい実施形態は、約２、約６、約１２、または約２４時間の時間に隔てられた、２または３用量でのオリゴヌクレオチドの投与である。
【００６０】
本発明の別の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドは、ドナーからの摘出前のｉｎ  ｓｉｔｕ、レシピエントへの移植前の輸送中、または血流回復前もしくは回復時のｉｎ  ｖｉｖｏのどちらかで、移植用に指定された臓器に投与される。好ましくはオリゴヌクレオチドは、ドナーからの摘出前に移植臓器を調整するのに使用される溶液中に約０．１から約２０００μｇ／ｌの濃度で存在する。あるいは、またはこれに加えて、オリゴヌクレオチドは、移植臓器を輸送するのに使用される溶液中に０．１から約１０００μｇ／ｌの濃度で存在する。あるいは、またはこれに加えて、オリゴヌクレオチドは、血流の回復前に移植臓器を調整するのに使用される溶液中に０．１から約１０００μｇ／ｌの濃度で存在する。
【００６１】
オリゴヌクレオチドは、血流の回復前だけでなく、回復と同時、または回復後でさえも投与され得る徴候がある。実施例４との関連では、プレコンディショニング、およびポストコンディショニングの可能性が説明される。結果は驚くべきことに、配列番号８［ＩＤＸ９０５９］による治療は、脳卒中の誘発後もポストコンディショニングの機能を果たすことができ、虚血損傷に対し脳を保護できることを示している。
【００６２】
上記の実施形態は、相互に包含的であり、異なる用量、投与方法および時間間隔が、列挙された実施形態内、および当業者に明らかとなる他の実施形態と自由に組み合わされ得ることを意味する。
【００６３】
上記の実施形態は、記載および例を研究する際に当業者に明らかとなる多くの利点を提供する。１つの利点は、オリゴヌクレオチドの使用が、現在使用されている薬剤に取って代わるまたはこれを補完する、ならび現在の薬剤および治療に関連した悪影響を減少させる可能性を提供する点である。
【実施例１】
【００６４】
ＯＶＡ誘発気道炎症マウスモデルにおける免疫調節オリゴヌクレオチド試験物質の鼻腔内投与
材料および方法
動物
Ｂ＆Ｋ  Ｓｏｌｌｅｎｔｕｎａ社、ストックホルム、スウェーデンから入手したメスのＢａｌｂ／ｃマウス（８週）を実験に使用した。マウスに完全ペレットげっ歯類食、Ｒ３６（Ｌａｋｔａｍｉｎ  ＡＢ社、ストックホルム、スウェーデン）および家庭飲用品質の水を適宜給餌した。動物は、動物飼育室で２１℃、±３℃および５５％±１５％の相対湿度で飼育した。換気システムは１時間当たり１０換気を与えるように設計した。部屋は、１２時間の明サイクルおよび１２時間の暗サイクルを与えるように照明した。明かりは０７：００から１９：００まで点灯した。マウスは、透明なポリカーボネート（Ｍａｃｒｏｌｏｎｅ型ＩＩＩ）ケージ（床面積：８２０ｃｍ2）で各ケージに５匹ずつ飼育した。ケージの床敷は４ＨＶアスペン床敷（Ｔａｐｖｅｉ社、フィンランド）であった。各ケージは、試験番号、群番号、性別および動物番号がマークされたケージカードにより識別した。
【００６５】
感作およびエアロゾルチャレンジ
マウスは、０および１２日目に２００μＬ  ＯＶＡ／水酸化アルミニウムゲル（１：３）で腹腔内感作した（図１ａ）。ＯＶＡ（鶏卵アルブミングレードＶ、Ｓｉｇｍａ社、セントルイス、ＭＯ）を生理食塩水で溶解し、および４℃で３時間回転させて５０μｇ／ｍＬの濃度まで水酸化アルミニウムゲルと混合した。２３、２６、３０および３３日目（図１ａ参照）に、マウスにＢａｔｅｌｌｅ曝露チャンバーを用いて３０分間エアロゾル化ＯＶＡを吸入して肺で曝露した。エアロゾルは、ＰＢＳに溶解した１０ｍｇ／ｍＬ  ＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ社、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）のネブライザー濃度を用いて気流７．４Ｌ／分で圧縮空気ネブライザー（Ｃｏｌｌｉｓｏｎ  ６ジェット）により生成した。非感作動物による対照群は、２３、２６、３０および３３日目のエアロゾル化ＯＶＡ以外の処理は受けなかった。エアロゾルチャレンジを受けなかった感作マウスの対照群もあった。
【００６６】
オリゴヌクレオチド
このＯＶＡモデル（図１ａ）では、選択したオリゴヌクレオチド、ＩＤＸ９０５９、（配列番号８、表１）を試験した。オリゴヌクレオチドはｂｉｏｍｅｒｓ．ｎｅｔ  ＧｍｂＨ社（ウルム、ドイツ）により合成され、および−２０℃で冷凍保存された。
【００６７】
調製
免疫調節オリゴヌクレオチドを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｆｌｕｋａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ  Ｕｌｔｒａ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ＵＳＡ）に溶解した。
【００６８】
ＯＶＡ誘発気道炎症の治療
この実験では、予防的設定で（図１ａ）１６および２１日目にＩＤＸ９０５９（１，２４７μｇ／μＬ）の鼻腔内注入を与えた。物質は、約５０μｇ／マウス（４９．８８μｇ／マウス）の用量を与える４０μＬ  ＰＢＳで投与した。２つの感作偽治療群は、１６および２１日目に試験化合物と同じ合計容積をＰＢＳで注入した。
【００６９】
気道炎症パラメータの分析
マウスを、最終ＯＶＡエアロゾルチャレンジの４２時間後に頸椎脱臼により屠殺した。気管にポリエチレン管（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、スパークス、ＭＤ、ＵＳＡ）によるカニューレを挿入し、４×１ｍＬアリコートの氷冷ハンクス平衡塩液（ＨＢＳＳ）（Ｓｉｇｍａ社、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いて気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行った。ＢＡＬ液を遠心分離し（４００ｇ、１０分、４℃）、上清を回収、および後の分析用に冷凍した。細胞を０．４ｍＬ  ＰＢＳに再懸濁し、白血球総数をＢｕｅｒｋｅｒチャンバーでトリパンブルー除外を用いてカウントした。ＢＡＬ液細胞の二重のサイトスピン（サイトスピン３、Ｓｈａｎｄｏｎ社、ランコーン、ＵＫ）調製物を、標準の形態学的基準を用いた白血球画分のためＭａｙ  Ｇｒｕｅｎｅｗａｌｄギムザ染色で染色した。
【００７０】
統計分析
統計比較は、感作ＰＢＳ処理した対照マウスと比較するため、Ｄｕｎｎｅｔｔの事後補正を用いて一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて行った（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４）。データは平均±標準偏差として示した。０．０５より低いＰ値を有意と見なした。
【００７１】
結果
オボアルブミン誘発アレルギー性喘息モデルは、喘息中に見出される気道好酸球、肺内炎症およびＩｇＥレベルの上昇を再現するのに広範に使用されるモデルである。このモデル分析は、浸潤炎症細胞の種類および量がそれぞれ特定およびカウントされるＢＡＬ分析などの喘息の一般的指標に依存している。
【００７２】
この結果、各マウス由来のＢＡＬ液細胞は記載の通りにカウントし、値は異なる群の平均値を提供する複合ヒストグラムとしてプロットした（図１ｂ）。
【００７３】
大まかに言えば、動物（ＰＢＳ群）の肺への４つの分析細胞種の大量流入により示される通り、誘発された気道炎症のレベルは高い。対照群は誘発炎症の徴候を示さず、動物がエアロゾルオボアルブミンタンパク質に対する自然なアレルギー反応を示さないこと、および使用したオボアルブミンタンパク質が例えば、ＬＰＳに汚染されていないことを裏付けた。
【００７４】
「非エアロゾル」対照群でいずれの炎症徴候も完全に欠如していたことは、ＯＶＡ免疫処置の実験手順自体は肺の炎症を誘発しないことを裏付けた。
【００７５】
鼻腔内治療後、試験物質配列番号８［ＩＤＸ９０５９］は炎症細胞、すなわち白血球（Ｐ＜０．００１）、好酸球（Ｐ＜０．００１）およびリンパ球（Ｐ＜０．０５）に対する減少効果を有した。
【００７６】
アレルギー性喘息のこのｉｎ  ｖｉｖｏモデルでは、白血球すなわちＰＭＮ（主に好酸球）は肺の炎症に重要な役割を果たす。本発明の化合物の配列番号８［ＩＤＸ９０５９］で治療した場合、ＢＡＬ液を浸潤する白血球、好酸球およびリンパ球数の統計学的に有意な減少が動物で観察された。これは、本発明の化合物がＰＭＮ浸潤の阻害により炎症を予防できることを示す。
【実施例２】
【００７７】
Ｃ５７／ＢＩ６マウスにおけるチオグリコレート誘発胸膜炎
材料および方法
細胞遊走および血管透過性に対する本発明の実施形態によるオリゴヌクレオチドの効果を試験するため、動物モデルを設定した。
【００７８】
マウスは、ケタミン（Ｋｅｔａｌａｒ（登録商標）Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ社、２５ｍｇ／ｍｌ）およびキシラジン（Ｎａｒｃｏｘｙｌ  ｖｅｔ．（登録商標）Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ  ＡＧ社、５ｍｇ／ｍｌ）の混合物０．１５〜０．２０ｍｌの腹腔内注射により麻酔した。
【００７９】
静脈内投与（ｉ．ｖ．）のため、左頸静脈にポリエチレン管（ＰＥ１０）によるカニューレを挿入した。皮膚切開は胸部右側で行った。下層の筋肉の切開後、１００μｌのチオグリコレート（Ｓｉｇｍａ社）の単回胸膜内注射により胸膜炎（肺嚢の炎症）を誘発した。滅菌ＰＢＳは陰性対照に使用した。ＰＢＳ中ＦＩＴＣ結合デキストラン（１００μｌ、３０ｍｇ／ｍｌ）をｉ．ｖ．注射した。４時間後、動物を麻酔の過剰投与により安楽死させ、胸部を慎重に開き、滲出液を吸引により除去し、および容量を記録した。胸部を次いでＰＢＳ中氷冷３ｍＭ  ＥＤＴＡ  １ｍｌですすいだ。赤血球細胞で汚染され滲出液は廃棄した。
【００８０】
滲出液およびリンス材料を１５００ｇで５分間遠心分離し、上清は蛍光光度計（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｃｓｅｎｔ、ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ社）での蛍光強度の測定に使用し、ＦＩＴＣ−デキストランのクリアランス容量を計算した。ペレットを１５分間、０．１％ＢＳＡとともにＰＢＳに再懸濁して非特異的抗体結合をブロックした。細胞懸濁液１０μｌをＢｕｅｒｋｅｒチャンバーでの白血球分画に使用した。
【００８１】
滲出液からの細胞を、好中球およびマクロファージ特異的抗体で染色し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｏｒｔ  ａｎｄ  ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア、ＢＤ）により分析した。分析は、前方および側方散乱での典型的な外観に基づく総白血球数を含んだ。ＰＭＮおよびマクロファージはさらに、それぞれＬｙ６ＧおよびＦ４／８０の発現により特定した。
【００８２】
本発明の実施形態によるＰＭＮ遊走の減少によるオリゴヌクレオチドの抗炎症効果を試験するため、試験化合物を、胸膜炎誘発の約２０分前に１００μｌ、すなわち５０μｇ／マウスの用量で腹腔内投与した。この試験では、ＩＤＸ９０１０、ＩＤＸ９０５４、ＩＤＸ９０５９、（それぞれ配列番号２、７、および８、表１）およびＩＤＸ０１５０（配列番号１３）を試験した。
【００８３】
結果
チオグリコレート誘発胸膜炎モデルは、開発中の新薬の実用的なスクリーニングのための最適モデルの一つであるが、該モデルは技術的に複雑であり、および時として個々の異なる値を示す場合がある。しかし、このモデルは、同時に試験できる動物の数が限られる。
【００８４】
結果は、胸膜腔へのＰＭＮの高い遊走および胸膜浮腫の蓄積により、動物が炎症誘発剤、チオグリコレートに反応することを示した。
【００８５】
ＩＤＸ９０１０を受け取るマウス（ｎ＝４）は、６８．２％のＰＭＮ数の減少を示した（図２ａ）が、浮腫の減少は示さなかった（データ不図示）。ＩＤＸ９０５４（ｎ＝４）を与えられたマウスは、ＰＭＮ数の減少は示さなかったが、浮腫を３６％減少させることができた（データ不図示）。ＩＤＸ９０５９は、７匹の動物群でＰＭＮ蓄積（２５．１％、図２ｂ）、および浮腫（３１％）の両方の減少を示した（データ不図示）。ＩＤＸ０１５０を与えられたマウス（ｎ＝５）は、ＰＭＮ数の４０．９％の減少、および浮腫の６８．２％の減少を示した（データ不図示）。結果は平均±標準偏差を表す。
【００８６】
抗ＰＭＮ抗体を用いた実験は、抗ＰＭＮ−ａｂが本発明の化合物と似たレベルまでＰＭＮおよび浮腫を等しく減少させることができることを示した（データ不図示）。チオグリコレート誘発胸膜炎への本発明の化合物の予防的投与は、胸膜腔へのＰＭＮ遊走の減少をもたらした。
【実施例３】
【００８７】
血管炎症マウスモデルにおける生体顕微鏡検査
マウスにおける白血球の血管外遊出に対するオリゴヌクレオチドＩＤＸ９０５９（配列番号８、表１）のｉｎ  ｖｉｖｏ、抗炎症効果を調べた。走化性刺激に反応して、炎症細胞は刺激勾配に向かって血管壁を遊出する。遊出には、細胞は先ず断続的に血管内壁に接着し（すなわちローリング（Ｒ））、この後よりしっかりと接着し始め（接着（Ａ））、次いで周囲組織に移動し（遊出（Ｔ））なければならない。血小板活性化因子（ＰＡＦ）を使用してこの炎症プロセスを誘発した。正常な非刺激血管では、これらのイベントの順序はＲ＞Ａ＞Ｔであった。ＰＡＦへの曝露後、この順序はＴ＞Ａ＞Ｒと逆転し、細胞が接着および遊出し始めたことを示した。
【００８８】
序論
白血球動員は炎症反応の必要条件である。血管では、白血球細胞と内皮との間の一連のイベントが、損傷または炎症部位での炎症細胞の蓄積をもたらす（Ｌｉｎｄｂｏｍ、１９８３年）。このイベントカスケードにおける１つの重要な細胞は多形核細胞（ＰＭＮ）である。ＰＭＮは血流で輸送される。血流は血管の中心でより高い速度を、周辺へ向かってより低いスピードを有し、ＰＭＮと血管壁との間の接触を可能にする。分子機構は内皮へのＰＭＮの接着を促す（Ｐｅｎｂｅｒｔｈｙら、１９９７年）。このような分子の１つの群はセレクチンと呼ばれる。最初は、この相互作用は部分的に過ぎず、内皮に沿ってＰＭＮを回転させる。炎症誘発性分子により刺激され、この接着はより強固になり内皮へのＰＭＮの接着（固着と呼ばれる現象）を引き起こす。固着は、ＰＭＮが内皮層を積極的に遊出および続いて結合組織へ進入できるようにし、さらに炎症因子の勾配により炎症の中心部に向けられる。
【００８９】
すべてのこれらのイベントは、生体顕微鏡検査によりｉｎ  ｖｉｖｏで試験することができる。生体顕微鏡検査は、小血管、および周囲結合組織での細胞試験を可能にする。
【００９０】
適切な細静脈は、例えばウサギの骨格筋（ｔｅｎｕｉｓｓｉｍｕｓ  ｍｕｓｃｌｅ）およびマウスの精巣挙筋で試験されている。
【００９１】
この例は、マウスの精巣挙筋での生体顕微鏡検査を取り上げる。精巣挙筋は、陰嚢の精巣温度をコントロールする筋肉である。この筋肉の血管系は、水浸対物レンズ下で容易に曝露され得、体温でリン酸緩衝生理食塩水により灌流され得る。走化性または炎症誘発性物質は、灌流緩衝液に添加することができ、薬理学的物質は灌流液または動物に添加することができる。
【００９２】
ローリング、固着および遊出は、この後、微速度録画を用いて試験することができ、記録は後に、細胞の定量化またはトランスバース距離の測定に使用することができる。
【００９３】
この試験の目的は、マウスにおけるＰＡＦ刺激後の細静脈での炎症細胞遊走に対する本発明の化合物ＩＤＸ９０５９の効果を試験することであった。
【００９４】
材料および方法
動物材料および条件：Ｓｃａｎｂｕｒ  ＡＢ社（ソレントゥナ、スウェーデン）製のＣ５７ＢＬ／６  ＳＰＦマウスは、各１２時間の明暗サイクルにより管理温度（２１±２℃）で動物飼育室で飼育し、および食餌および水に自由にアクセスできるようにした。
【００９５】
試験化合物：オリゴヌクレオチド配列番号８［ＩＤＸ９０５９］は、ｂｉｏｍｅｒｓ．ｎｅｔ  ＧｍｂＨ（ウルム、ドイツ）により非ＧＭＰ条件下で合成され、およびＰＢＳ溶液で提供された。オリゴヌクレオチドを貯蔵液として−２０℃で保存し、および実験開始２〜３日前に調製した。
【００９６】
調製：オリゴヌクレオチドを、室温でＰＢＳ（Ｆｌｕｋａ、Ｓｉｇｍａ社）にさらに希釈した。濃度は、所望の濃度に達するまで、９５％精度でＵＶ分光光度法（ＳｍａｒｔＳｐｅｃ（商標）３０００、ＢＩＯ−ＲＡＤ社、ハーキュリーズ、ＵＳＡ）を用いて調節した。
【００９７】
ＰＡＦ誘発炎症の治療：炎症誘発の約２０分前に、動物にＩＤＸ９０５９を皮下注射（５０μｇ／１００μｌ／マウス）により与えた。
【００９８】
白血球動員の生体顕微鏡検査：４匹のマウス群を使用した。マウスは、ケタミン（Ｋｅｔａｌａｒ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ  ＡＢ社（ソレントゥナ、スウェーデン）、２５ｍｇ／ｍｌ）およびキシラジン（Ｎａｒｃｏｘｙｌ  ｖｅｔ．（登録商標）、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂ．Ｖ．社（オランダ）、５ｍｇ／ｍｌ）の混合物０．１５〜０．２０ｍｌの腹腔内注射により麻酔した。麻酔の継続投与のため、左頸静脈にポリエチレン管（ＰＥ１０）によるカニューレを挿入した。腹部切開は右の陰嚢で行い、片方の精巣を取り出した。精巣挙筋を切開し（筋膜なし）、切り込みを入れ、および透明な台座に平らにピンアウトして透照させた。精巣は次いで側面をピンでとめた。調製物は、３７℃の温度管理重炭酸塩緩衝液の連続灌流により湿潤および温かく保ち、温度、ｐＨ、およびガス圧の生理学的レベルを維持した。白血球の血管外遊出は、血小板活性化因子（ＰＡＦ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ；１００ｎＭ）を６０分間、灌流溶液に添加して誘発した。ローリング、接着および遊出の測定は刺激の前後に行った。録画は２０〜５０μｍワイドの十分に明確な細静脈から得た。ローリングは、３０秒間に血流に垂直な基準線を通過する白血球数として判定した。血管内の細胞は、３０秒間を超える間、静止している場合に接着性として分類した。遊出細胞は、試験される血管から７０μｍの距離内の血管外組織でカウントした。
【００９９】
すべての顕微鏡観察は、Ｌｅｉｔｚ  ＳＷ２５水浸対物レンズを備えるＬｅｉｔｚ  Ｏｒｔｈｏｐｌａｎ生体顕微鏡（Ｌｅｉｔｚ  Ｗｅｔｓｌａｒ  ＧＭＢＨ社、ドイツ）を用いて行った。画像をテレビ画面に映し、およびＰａｎａｓｏｎｉｃ  ＷＶ−１５５０／Ｇ（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ社、日本）ビデオカメラを用いて録画した。
【０１００】
結果
遊出するには、細胞はローリングを開始し、この後、よりしっかりと接着し始め、次いで周囲組織に遊走する。血小板活性化因子（ＰＡＦ）を用いてこの炎症プロセスを誘発し、正常な非刺激血管では、これらのイベントの順序はＲ＞Ａ＞Ｔであった。化学誘引物質（ＰＡＦ）の非存在下では、配列番号８［ＩＤＸ９０５９］はローリングを８１．４％および接着を４１．９％減少させることができた（図３ａ）。
【０１０１】
ＰＡＦへの曝露後、イベント（ローリング、接着、および遊出）の順序はＴ＞Ａ＞Ｒと逆転し、細胞が接着および遊出し始めることを示した。これと一致して、結果は、ＰＡＦを添加した場合、１．７細胞／視野の基礎レベル（ＰＡＦ添加前、図３ａ）からの遊出細胞が、２０．６６に達した（ＰＡＦ添加後、図３ｂ）ことを示している。２２．３細胞／視野（ＰＡＦ添加前、図３ａ）から７．７（ＰＡＦ添加後、図３ｂ）へのローリング細胞の減少があり、および接着細胞は約１４細胞／視野のままであった。この条件で配列番号８［ＩＤＸ９０５９］は、ＰＡＦ曝露後にローリング、接着および遊出を減少させた。減少は、ローリング細胞が４８．４％、接着細胞が２８．５％および遊出細胞が５４．４％であり、異なる炎症レベルで有効になり得、および異なる炎症性メディエーターに作用し得る抗炎症特性を、配列番号８が有することを示した。
【０１０２】
まとめると、これらの結果は、配列番号８［ＩＤＸ９０５９］の抗炎症効果を示している。驚くべきことに、配列番号８は、走化性物質の非存在下でローリングおよび接着値に対する低下効果を示した。これは、この配列が、ＰＭＮ浸潤の阻害が好ましい臨床状況で使用される可能性を有する１つの徴候である。
【実施例４】
【０１０３】
実験ラットモデルにおける脳虚血性傷害に対する免疫調節オリゴヌクレオチドの阻害効果に関する試験
試験の目的は、脳虚血の実験ラットモデルにおいて、虚血性脳傷害に対する免疫調節オリゴヌクレオチドによる阻害効果を調べることであった。動物試験は、Ｆａｃｉｌｉｔｙ  ｆｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ルンド大学、ルンド、スウェーデンで行われた。
【０１０４】
序論
虚血損傷に対する耐性は、心臓、脳、および腎臓などのさまざまな器官でＴＬＲ４を介したＬＰＳにより誘発され得ることが示されている（Ｈｅｅｍａｎｎら  ２０００年、Ｒｏｗｌａｎｄら、１９９７年；Ｔａｓａｋｉら、１９９７年）。保護機構は十分に理解されていないが、パラダイムは、ＬＰＳ−プレコンディショニングによる小さな炎症反応が、より強力な続発性刺激を伴う炎症反応のこの後の損傷を軽減する、というものである。既知のＴＬＲシグナル経路の間には類似点および違いの両方があり、免疫系および中枢神経系の幾つかの細胞によりＴＬＲ４およびＴＬＲ９の両方が発現される（ＭｃＫｉｍｍｉｅ  ａｎｄ  Ｆａｚａｋｅｒｌｅｙ  ２００５年；Ｔａｎｇら、２００７年）。したがって、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、選択された細胞集団内でＴＬＲ９の活性化を引き起こして、先天性免疫を促しＴｈ１偏向適応免疫を誘発すると考えられる。
【０１０５】
この試験の１つの目的は、本発明者らにより特定された特異的化合物が、虚血性脳損傷に対するＬＰＳ誘発耐性と同じように脳の虚血損傷も低減できるかどうかを調べることであった。
【０１０６】
材料および方法
動物材料および条件：使用したラットは、Ｈａｒｌａｎ  Ｈｏｒｓｔ社（オランダ）から入手した近交系ウィスターハノーバーラットであった。各ラットの体重は約３５０〜４００グラムであった。ラットは、タイプＭａｃｒｏｌｏｎ３の標準的なオープンケージで維持した。ケージは、プラスチックカーテンの後ろの連続気流下のオープンラックに収容した。標準的な床敷はＳｃａｎｂｕｒ−ＢＫ社（ソレントゥナ、スウェーデン）から購入した。床敷は週に１回交換した。動物飼育室の温度は１８℃〜２２℃であり、実験室の周囲換気システムにより管理した。明サイクルは１２時間の暗および１２時間の明（０６：００に点灯）であった。
【０１０７】
ラットにはＳｃａｎｂｕｒ−ＢＫ社（ソレントゥナ、スウェーデン）から購入した通常のラット食餌を与えた。給水ボトルは順化および実験期間中、必要に応じて補給した。食餌および水は適宜投与した。
【０１０８】
ラットはＦＥＬＡＳＡ  ＳＰＦ状態を有し、畜舎および交換システムは、ＳＰＦ状態が試験中に確実に温存されるように設計された。教育を受けた人がラットを扱った。獣医学的専門知識はＬＵの獣医学部から急遽入手した。動物福祉に鑑みて毎日の記録および判断を行った。
【０１０９】
試験化合物：ＩＤＸ９０１０、ＩＤＸ９０５４、ＩＤＸ９０５９、およびＩＤＸ９０７４（それぞれ、表１の配列番号２、および７〜９）を、脳虚血実験ラットモデルにおける脳傷害を減少させるｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性について試験した。さらに、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ阻害剤［１，４−ジアミノ−２，３−ジシアノ−１，４−ビス（２−アミノフィニルチオ）ブタジエン；Ｃ18Ｈ16Ｎ6Ｓ2］（Ｕ０１２６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、およびＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）は、それぞれ陽性および陰性対照の役割を果たした。ＩＤＸ９０５９およびＵ０１２６の併用治療も、この試験の後の段階で使用した。ＩＤＸ物質はすべてＢｉｏｍｅｒｓ．ｎｅｔ  ＧｍｂＨ社（ウルム、ドイツ）により非ＧＭＰ条件下で合成され、およびＰＢＳ溶液で提供された。試験化合物は貯蔵液として−２０℃で保存した。Ｕ０１２６、および併用治療（Ｕ０１２６＋ＩＤＸ９０５９）を除いて、他の試験物質はすべて盲検法で与えた。
【０１１０】
調製：実験開始前に、化合物を室温でＰＢＳにさらに希釈して作用濃度（１μｇ／μｌ）を調製した。濃度は、９５％精度でＵＶ分光光度法（ＳｍａｒｔＳｐｅｃ（商標）３００、ＢＩＯ−ＲＡＤ社、ハーキュリーズ、ＵＳＡ）を用いて調節した。
【０１１１】
動物実験および用量：ラットは、ＮＯ2：Ｏ2（７０％：３０％）と混合したイソフルラン（４．５％）により麻酔した。レーザードップラーを用いて中大脳動脈（ＭＣＡ）の皮質血流をモニターした。フィラメントを内頸動脈に導入し、右ＭＣＡの血流を閉塞するまで前進させた。レーザードップラー信号（皮質血流）の８０％を超える減少が閉塞を裏付けた。
【０１１２】
血圧、血液ガスおよび血液糖は手術中に管理した。閉塞の９０分後、フィラメントを除去し、血液循環をＭＣＡで再開させ、皮質血流を回復させた（再灌流）。閉塞後、８０％を超える血流の減少、および皮質血流の高い再循環があった動物のみをこの試験に含めた。
【０１１３】
体温および神経学的挙動（スコア）は、手術中および再循環の０、１、２、２４、４８時間後に管理した。１００μｌの試験化合物を２００μｌのＰＢＳとともに、再循環の０および２４時間後にラットに腹腔内注射した。動物を手術終了の４８時間後に屠殺し、脳をすばやく摘出し重炭酸塩緩衝溶液で冷却した。脳の２ｍｍ厚冠状スライス（６スライス）を調製し、および生理食塩水溶液に溶解した１％２，３，５−塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）で染色した。梗塞体積は、台形公式を用いて各スライスの虚血面積の数値積分法により計算し、ソフトウェアプログラムＢｒａｉｎ  Ｄａｍａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ１．１（ＭＢ  Ｔｅｋｎｉｋｋｏｎｓｕｌｔ社、ルンド、スウェーデン）を用いてスライス中の全脳体積のパーセンテージで表した。
【０１１４】
統計：統計分析はＰｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ  ｖｅｒｓｉｏｎ４．０３、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。ノンパラメトリックなマン−ホイットニーｔ検定を用いて統計学的有意性を計算した。０．０５未満のＰ値を統計学的に有意と見なした（*）。
【０１１５】
結果
特定のオリゴヌクレオチドによる虚血性細胞死に対する耐性の誘発を、ウィスターハノーバーラットでの脳虚血ｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて調べた。
【０１１６】
この試験では合計７つの異なる群があった。合計約６０ラットをこの試験で使用し、手術による致死率は３０％であった。データは、手術と同時および追跡期間の両方で、実験の間中回収した。
【０１１７】
ＴＴＣ染色後、インタクトな脳組織は明るい赤であったのに対し、傷害領域は淡い青〜白であった（図４ａ）。脳を切片化し、各切片を撮影し画像プログラムで分析した（方法参照）。図は脳梗塞のさまざまな側面を説明している；全梗塞領域（図４ｂ）、境界域または選択的神経壊死（ＳＮＮ）（図４ｃ）、および虚血中心部（中心部と解釈される、図４ａに示された白い領域）（図４ｄ）。
【０１１８】
試験は、ＩＤＸ９０１０（物質Ａ）、ＩＤＸ９０７４（物質Ｂ）、ＩＤＸ９０５４（物質Ｃ）、ＩＤＸ９０５９（物質Ｄ）、およびＰＢＳ（物質Ｅ）について盲検法で行ったが、Ｕ０１２６または併用治療については盲検法を行わなかった。図４ｂおよび４ｄに見ることができるように、物質Ｄ（ＩＤＸ９０５９）および対照物質Ｕ０１２６による梗塞体積の著しい減少（３５〜４０％）があった。異なる物質によるＳＮＮ減少での有意な差はなかった（図４ｃ）。
【０１１９】
試験の非盲検化後、この試験に導入した最後の群はＩＤＸ９０５９およびＵ０１２６の組み合わせであった。減少は、期待したほど付加的ではなく、各物質単独により見られた減少より少なかった。
【０１２０】
実験中の生理学的パラメータおよび神経学的評価の結果を記録した。生理学的パラメータに群間差はなかった（データ不図示）。しかし、神経学的評価は配列番号８［ＩＤＸ９０５９］による改善と十分に相関した。
【０１２１】
結果は、脳卒中誘発後の配列番号８［ＩＤＸ９０５９］による治療が、ポストコンディショニングの機能を果たし得、および虚血損傷に対し脳を保護し得ることを示す。
【０１２２】
ＭＥＫ１／２阻害剤（Ｕ０１２６）は、梗塞サイズを３０〜４０％減少できることが以前に示されている（Ｈｅｎｒｉｋｓｓｏｎ  Ｍ、２００７年、Ｗａｎｇ  ＺＱ、２００４年）。本試験では、この物質は陽性対照の役割を果たし、およびｉ．ｐ．投与した場合、梗塞体積を３３％減少させた。また、４８時間でのＵ０１２６による改善という神経学的評価に関する良好な効果もあった。故に、この実験が他の研究者（Ｈｅｎｒｉｋｓｓｏｎら、２００７年）に一致して行われたことを裏付けている。
【０１２３】
最近、Ｓｔｅｖｅｎｓら（２００８年）は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドによるプレコンディショニングが虚血損傷に対する神経保護を誘発し得ること、この耐性はＴＮＦ−アルファ依存的であることを示した。この試験で使用した４つの本発明の化合物（ＩＤＸ９０１０、ＩＤＸ９０７４、ＩＤＸ９０５４、およびＩＤＸ９０５９）のうち、ＩＤＸ９０５９およびＩＤＸ９０７４は、より良好な神経保護効果を示した。しかし、４つのオリゴヌクレオチドは以前に、定量的ＰＣＲによるＴＮＦアルファ発現を評価するためのウィスターラット脾細胞試験に使用された。結果は、ＩＤＸ９０５４、およびＩＤＸ９０１０がＴＮＦアルファｍＲＮＡ発現を誘導することができるのに対し、ＩＤＸ９０５９、およびＩＤＸ９０７４はＴＮＦアルファを誘導しないことを示した。故に、ＴＮＦアルファの他に、共同で神経保護を提供する、必要とされる他の因子があることを示唆している可能性がある。さらに、Ｓｔｅｖｅｎｓら（２００８年）により行われたこの試験では、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの保護効果は、これが脳卒中誘発の１〜１４日前に予防的に投与された場合に見られたのみであった。本試験では、本発明の薬剤を脳卒中誘発の９０分後に治療的に与え、配列番号８［ＩＤＸ９０５９］の効力を明確に示した。
【０１２４】
本試験の非盲検化後、配列番号８［ＩＤＸ９０５９］は、脳の虚血性傷害の減少に最も有効であることが判明した。陽性対照物質Ｕ０１２６は同様に、虚血性傷害の減少に顕著な効果を有することから、Ｕ０１２６および配列番号８［ＩＤＸ９０５９］の併用治療も評価した。併用治療により得られた虚血損傷の減少は、期待したほどではなかった。この理由は不明である。しかし、２つの物質が互いの効果を拮抗することがあり得る。
【０１２５】
故に、このｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、脳虚血ラットモデルでの脳卒中の治療における本発明の化合物の神経保護効果を示した。
【実施例５】
【０１２６】
単離灌流ラット心臓モデルにおける心筋虚血性傷害に対する免疫調節オリゴヌクレオチドの阻害効果試験
この試験の目的は、単離、灌流されたラット心臓モデルにおける虚血性心臓傷害に対する免疫調節オリゴヌクレオチドの阻害効果の可能性を調べることであった。動物試験はＵｌｌｅｖａｌ大学病院動物部門（オスロ、ノルウェー）で行った。
【０１２７】
序論
冠再灌流の短時間のエピソードにより心筋再灌流を遮断して心筋梗塞サイズを減少させる能力は、虚血ポストコンディショニング（Ｉ  Ｐｏｓｔ）と呼ばれる現象である心臓保護の標的として再灌流段階での関心を集めている。虚血ポストコンディショニング−誘発保護機構は十分に理解されていないが、酸化ストレスの減少、細胞間Ｃａ2+過負荷の減少、内皮機能の改善、およびアポトーシス心筋細胞死の軽減による、致死的再灌流傷害の重要なメディエーターを標的にする手順が示されている（Ｙｅｌｌｏｎにおけるレビュー）。
【０１２８】
虚血プレコンディショニング（ＩＰＣ）介入も、持続性冠状動脈閉塞の前に、非致死的心筋虚血および再灌流の１つまたは複数のエピソードに心臓をさらして実験設定での心筋梗塞サイズを減少させるのに使用した。このようなプレコンディショニングは、心臓バイパス手術前の予防的治療として有益となろう（Ｙｅｌｌｏｎにおけるレビュー）。ポストおよびポストコンディショニングはいずれも、心臓または脳における虚血保護を媒介する、ＲＩＳＫ経路（再灌流損傷サルベージキナーゼ経路）での下流シグナル伝達カスケードの類似群を活性化する（Ｐｉｇｎａｔａｒｏ、２００８年）。しかし、ＩＰＣおよびＩＰｏｓｔはいずれも、心臓保護を達成するには心筋に直接適用される侵襲的治療を必要とし、幾つかの臨床設定では非実用的および有害となる場合がある。
【０１２９】
代わりのより適した戦略は、遠隔虚血プレコンディショニング（ＲＩＰＣ）現象に象徴されるアプローチである、心臓から離れた器官または組織に心臓保護刺激を適用することである。ある器官または組織での短い虚血および再灌流エピソードが、遠隔器官または組織での虚血−再灌流損傷のこの後の持続性傷害に対する保護を発揮する実際の機構は、現在不明である。
【０１３０】
オリゴデオキシヌクレオチドは、選択された細胞集団内でＴｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）の活性化を引き起こして、先天性免疫を促しＴｈ１偏向適応免疫を誘発する。オリゴヌクレオチドのこの特性は炎症を調節し、ならびに感性症および非感症に対する保護をもたらすことができる。オリゴヌクレオチドによるＴＬＲ９の活性化は、ＩＰｏｓｔおよびＩＰＣに似たＲＩＳＫ経路における一連のタンパク質キナーゼも標的にする（Ｓｕｎ−Ｈｅｙ  Ｌｅｅ  ２００７年）。以前の例（例４）では、本発明者らは、オリゴヌクレオチドＩＤＸ９０５９が脳での虚血−再灌流損傷を減少できることを示した。したがってこの試験の１つの目的は、以前の試験で脳損傷を減少させるのに使用したオリゴヌクレオチドが、心筋虚血−再灌流中の心臓保護効果も発揮できるかどうかを調べることであった。
【０１３１】
材料および方法
動物材料および条件：Ｓｃａｎｂｕｒ  ＡＳ社（ニッテダル、ノルウェー）から入手したオスのウィスターハノーバーラットをこの実験で使用した。ラットはＵｌｌｅｖａｌ大学病院の中央動物小屋で飼育した。適正に許可され教育を受けた人がラットを扱った。福祉に関して毎日記録を取った。各ラットの体重は約２５０〜３５０グラムであった。ラットは２つの実験群に無作為に割り付けた（試験および対照、各群ｎ＝８）。
【０１３２】
ラットは、標準的な床敷を備える標準的なオープンケージで維持した。動物飼育室の温度は１８℃〜２２℃であり、実験室の周囲換気システムにより管理した（湿度５５〜６０％）。明サイクルは１２時間の暗および１２時間の明（０６：００に点灯）であった。
【０１３３】
完全ペレット食ＲＭ３（Ｓｃａｎｂｕｒ  ＢＫ  ＡＳ社、ニッテダル、ノルウェー）を適宜供給し、ラットは新鮮な飲用水ボトルに自由にアクセスした。
【０１３４】
試験化合物：ＤＮＡベースのオリゴヌクレオチドＩＤＸ９０５９（配列番号８、表１）は、Ｂｉｏｍｅｒｓ．ｎｅｔ  ＧｍｂＨ（ウルム、ドイツ）（別表１）により非ＧＭＰ条件下で合成された。化合物はＰＢＳ溶液で提供され、到着時に貯蔵液として−２０℃で保存された。
【０１３５】
調製：実験開始前に、ＩｎＤｅｘ  ＳＯＰＢ０１５に従い、室温でＰＢＳ（Ｆｌｕｋａ、Ｓｉｇｍａ社）による貯蔵液のさらなる希釈により作用濃度（１μｇ／μｌ）を調製した。濃度は、９５％精度でＵＶ分光光度法（ＳｍａｒｔＳｐｅｃ（商標）３００、ＢＩＯ−ＲＡＤ社、ハーキュリーズ、ＵＳＡ）を用いて調節した。試験化合物は使用まで４℃で維持した。
【０１３６】
動物実験および用量：試験薬剤（１μｇ／μｌ）またはプラセボ（ＰＢＳ、試験薬剤のビヒクル）を、心臓単離の２４時間前に皮下に与えた（１００μｌ）。実験は盲検法で行った。
【０１３７】
ラットを５％ペントバルビタールナトリウム（６０〜８０ｍｇ  ｋｇ-1）の腹腔内注射により麻酔し、およびヘパリン処置した（５００  ＩＵ  ｉ．ｐ）。心臓を回収し、および灌流液（ｍｍｏｌ／Ｌ：ＮａＣｌ１１８．５；ＮａＨＣＯ3２５；ＫＣｌ４．７；ＫＨ2ＰＯ4１．２；ＭｇＳＯ4／７Ｈ2Ｏ１．２；糖／１Ｈ2Ｏ１１．１；  ＣａＣｌ2１．８）にＫｒｅｂｓ  Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液を用いて、７０ｍｍＨｇの定圧で安定化のため２０分間灌流した（改変Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆモード、３７℃）。緩衝液は、９５％Ｏ2および５％ＣＯ2によるガスを充填して酸素を供給し生理学的ｐＨで維持した。心臓温度は、加熱チャンバーから水で灌流した周りを囲むガラス管により実験中一定に維持した。液体充填ラテックスバルーン（Ｈｕｇｏ  Ｓａｃｈｓ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ−Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ＧｍｂＨ社、Ｈｕｇｓｔｅｔｔｅｎ、ドイツ）を左心室に挿入して、Ｐｏｗｅｒｌａｂ  ｓｙｓｔｅｍ（ＡＤ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ社、キャッスルヒル、ＮＳＷ２１５４、オーストラリア）により心室圧を測定した。左心室拡張終期圧（ＬＶＥＤＰ）を５〜１０ｍｍＨｇに設定し、ＬＶＥＤＰの変化を測定した。左心室発生圧（ＬＶＤｅｖＰ＝左心室収縮期圧（ＬＶＳＰ）−ＬＶＥＤＰ）ならびに最大および最小の左心室圧発生（ＬＶｄｐ／ｄｔｍａｘおよびＬＶｄｐ／ｄｔｍｉｎ）を計算した。冠血流（ＣＦ）は、冠流出液の時限収集（ｔｉｍｅｄ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）により測定した。不整脈は、再灌流の最初の３０分間のオールオアナッシング（ａｌｌ  ｏｒ  ｎｏｔｈｉｎｇ）の反応（不全収縮または心室細動）としてカウントし、および心拍数（ＨＲ）として圧力曲線から評価した。心筋温度は右心室に温度プローブを挿入して測定した。
【０１３８】
再灌流中、虚血または不可逆的不整脈前に３０分を超えてＬＶＳＰ≦１００ｍｍＨｇ、ＣＦ≦８または≧２０ｍｌ分−１、ＨＲ≦２２０拍（１分間当たり）である心臓は、試験から除外した。
【０１３９】
再灌流の最後に、心臓を４枚の１ｍｍ切片および３枚の２ｍｍ切片にカットした（ＡｇｎＴｈｏｒ’ｓ  ＡＢ社（Ｌｉｄｉｎｇｏｅ、スウェーデン）によるアクリルラット脳マトリックスに固定した心臓）。２ｍｍスライスは液体窒素で冷凍固定し、予定される後の分析用に保存した（ウェスタンブロット、リアルタイムＰＣＲ）。
【０１４０】
４枚の心室１ｍｍスライス（心尖部から５〜８ｍｍ）は、ＰＢＳ中１％塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）で３７℃、１５分間インキュベートした。インキュベーション後、スライスを２枚のガラスプレートの間でやさしく押し、撮影した（Ｎｉｋｏｎ社、Ｃｏｌｏｒｆｉｘ５４００）。梗塞領域を、総面積のパーセンテージとして測定し、Ａｄｏｂｅ  ＰｈｏｔｏｓｈｏｐおよびＳｃｉｏｎＩｍａｇｅ（Ｉｎｆａｒｃｔ  Ａｒｅａ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｍａｃｒｏファイル、著作権（著作権）１９９８  Ｒｏｂ  Ｂｅｌｌ、Ｈａｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＵＣＬ、ＵＫ）により計算した。
【０１４１】
主要評価項目としての壊死（梗塞サイズ）の拡張、および副次的評価項目としての心臓機能（ＬＶＥＤＰ、ＬＶＳＰ、ＬＶＤｅｖＰ、ＬＶｄｐ／ｄｔｍａｘ、ＬＶｄｐ／ｄｔｍｉｎ、ＨＲ、不整脈、ＣＦ）を評価した。
【０１４２】
統計：梗塞サイズについて：スチューデントｔ検定、連続データの反復測定分散分析のため
【０１４３】
結果
ＩＤＸ９０５９による虚血細胞死への耐性誘発を、単離ラット心臓のｅｘ  ｖｉｖｏモデルで調べた。材料および方法に記載の通り、心臓を切除し、Ｌｏｎｇｅｎｄｏｒｆｆモードで灌流し、虚血および再灌流エピソードにさらした。ＴＴＣ染色後、心臓を切片化し、各切片を撮影し画像プログラムで分析した（方法参照）。左心室の梗塞損傷は、ＰＢＳ（ビヒクル対照）で治療したラットと比べて、ＩＤＸ９０５９で治療したラットで３５％の減少を示した（図５）。再灌流中の心臓機能のさまざまな側面も調べたが、ＩＤＸ９０５９治療動物対対照では機能データに有意な差は観察されなかった（データ不図示）。
【０１４４】
結果は、ＩＤＸ９０５９によるラット皮下前治療が、全虚血性傷害の程度を著しく減少できる（ここでは３５％）ことを明らかに示している。
【０１４５】
本発明者らは、オリゴヌクレオチドＩＤＸ９０５９が、脳虚血ラットモデルで虚血中心部を減少させることを以前に観察した。本試験では、単離／灌流ラット心臓モデルでのＩＤＸ９０５９によるラットの前治療が、耐性を増加させ、虚血損傷の程度を減少させることを見出した。
【０１４６】
単離心臓モデルでは、白血球による効果など、有益となり得る因子の多くが存在していない。この結果、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、より顕著な効果をもたらす可能性があることが期待される。
【０１４７】
単離心臓では、ＩＤＸ９０５９の観察された保護は、心臓自体で開始された機構に起因する可能性がある。これは、ＩＤＸ９０５９による前治療後、シグナル伝達および効果の観点から、プレコンディショニング様刺激による心筋細胞での分子変化に起因すると考えることが妥当である。これは、熱ショックタンパク質、核因子カッパＢ、タンパク質キナーゼなどのさまざまな要素により媒介され得る（Ｈａｕｓｅｎｌｏｙら、２００５年、および２００７年、Ｖａｌｅｎ  Ｇ  ２００３年、および２００５年）。
【０１４８】
実験は、上記のさまざまな例においてＩＤＸ９０５９による治療がＰＭＮ遊走を減少させることを示し、試験化合物がプレコンディショニングなどの他の機構による保護効果も発揮することを示唆する。
【実施例６】
【０１４９】
免疫調節オリゴヌクレオチドによる腸間膜虚血での好中球蓄積の阻害
要約
腸虚血は、腸間膜動脈閉塞によりマウスで誘発した。再灌流後、小および大腸、ならびに肺に対する傷害を評価した。
【０１５０】
ＩＤＸ０１５０（配列番号１３、表１）の抗炎症効果を、組織学的検査、ＭＰＯアッセイ、テトラゾリウム減少および小腸液蓄積により調べた。
【０１５１】
試験は、ＩＤＸ０１５０が、ビヒクルを与えた対照動物と比べて虚血誘発の２０分前に投与した場合にのみ有意な改善効果を示すことを示した。
【０１５２】
結果は、ＩＤＸ０１５０が虚血における再灌流傷害の減少に有益となり得ることを示唆する。
【０１５３】
材料および方法
試験化合物
化合物はすべて貯蔵液として−２０℃で保存し、および実験開始の２〜３日前に調製した。
【０１５４】
調製
オリゴヌクレオチドを、室温でＰＢＳ（Ｆｌｕｋａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ  Ｕｌｔｒａ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ＵＳＡ）にさらに希釈した。濃度は、所望の濃度に達するまで、９５％精度でＵＶ分光光度法（ＳｍａｒｔＳｐｅｃ（商標）３０００、ＢＩＯ−ＲＡＤ社、ハーキュリーズ、ＵＳＡ）を用いて調節した（ＩｎＤｅｘ  ＳＯＰＢ０１５）。
【０１５５】
動物実験
動物部門（Ａｎｉｍａｌ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ）
ＭＴＣ動物部門はカロリンスカ研究所獣医学部により監視および監督されている。動物部門は質の高い動物施設を維持するため日常の仕事を定めている。動物試験は、非ＧＬＰ認定学術研究所で実施された。
【０１５６】
動物
メスのＢａｌｂ／ｃＪ  ＳＰＦマウス、１０〜３０週齢、（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（バーハーバー、メイン州、ＵＳＡ）由来はカロリンスカ研究所ＭＴＣのＣＦＧＲ部門（ストックホルム）で飼育した）。動物をグループ化しおよび実験開始の少なくとも１週間前に順化を許可した。動物は、１年に最低２回、ＦＥＬＡＳＡ規則（５）による試験を受けた監視員とともに飼育した。
【０１５７】
畜舎
動物は、動物飼育室で２１℃±３℃、および５５％±１５％の相対湿度で飼育した。換気システムは１時間当たり１０換気を与えるように設計してあった。部屋は、１２時間の明および１２時間の暗のサイクルを与えるように照明した。明かりは０６：００から１８：００まで点灯した。
【０１５８】
マウスは、透明なポリカーボネート（Ｍａｃｒｏｌｏｎｅ型ＩＩＩ、Ｓｃａｎｂｕｒ  ＡＢ社、ソレントゥナ、スウェーデン）ケージ（床面積：８１０ｃｍ2）で、各ケージに８匹ずつ飼育した。
【０１５９】
床敷
ケージの床敷はＳｃａｎｂｕｒ  Ｂｅｄｄｉｎｇ（Ｓｃａｎｂｕｒ  ＡＢ社、ソレントゥナ、スウェーデン）であった。
【０１６０】
環境エンリッチメント
環境エンリッチメントのため、動物にＳｉｚｚｌｅネストまたはＨａｐｐｉ−Ｍａｔ、（Ｓｃａｎｂｕｒ  ＡＢ社、ソレントゥナ、スウェーデン）の供給を与えた。
【０１６１】
食餌および飲用水
完全ペレットげっ歯類食、Ｒ３６（（Ｌａｎｔｍａｅｎｎｅｎ社、Ｋｉｍｓｔａｄ、スウェーデン）を適宜供給した。動物は、家庭用品質の飲用水を備えた飲用ボトルに自由にアクセスした。
【０１６２】
動物の識別、グループ化および治療
各ケージは、試験番号、群番号、および性別がマークされたケージカードにより識別した。動物は、パーマネントインクフェルトペンを用いて、動物番号に対応する横線で尾に個別にマークした。
【０１６３】
試験手順
虚血誘発および再灌流
マウスをイソフルラン（Ｆｏｒｅｎｅ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ  ＡＢ社、ソルナ、スウェーデン）で麻酔し、この後外科麻酔（Ｕｎｉｖｅｎｔｏｒ４００  麻酔ユニット、ＡｇｎＴｈｏ’ｓ  ＡＢ社、Ｌｉｄｉｎｇｏｅ、スウェーデン）で維持し、体温を３７℃に維持する直腸サーミスタにより制御された熱電対温度計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＡＢ社、ウプサラ、スウェーデン）に制御された加熱パッドの上に置いた。オペレーティング外科用実体顕微鏡（Ｌｅｉｔｚ  Ｗｉｌｄ社、ヴェッツラー、ドイツ）を用いて腹部に４〜５ｃｍ長の切り込みを作り、頭側（上）腸間膜動脈の位置を特定した。微小血管クランプ、Ｂｉｅｍｅｒクリップ、締めつけ力０．２０〜０．２５Ｎ、Ａｅｓｃｕｌａｐ−Ｗｅｒｋｅ  ＡＧ社、チューリンゲン、ドイツ）を、血流を完全に閉塞（脈動の欠如および青白さにより示唆される）するように動脈の上に置いた。腹部を閉じ、生理食塩（０．９％（ｗ／ｖ-1  ＮａＣｌ）溶液で浸したガーゼパッドを腹部の上に置いた。血流は１５分後に回復した（血管での脈拍および赤みにより示唆される）。腹部を留め金または外科縫合で閉じた。マウスに２ｍＬ滅菌生理食塩水をｓ．ｃ．に与えて生理学的状態を維持した。Ｂｕｐｒｅｎｏｒｐｈｉｎ（Ｔｅｍｇｅｓｉｃ（登録商標）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｃｏｒｐ．社、ニュージャージ、ＵＳＡ）、０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇを鎮痛のため与えた。３時間後、動物を麻酔し、血液を眼窩神経叢から採取した。組織学的検査および他の検査のため、試料を腸および肝臓から採取した。
【０１６４】
薬理的治療
５０μｇ／１００μＬ  ＩＤＸ０１５０の皮下（ｓ．ｃ．）注射を、虚血誘発の２０分前または再灌流の開始直後に動物の頸部に与えた。
【０１６５】
臨床徴候
各マウスは殺傷まで定期的に観察した。疾患、健康およびいずれかの挙動変化のすべての徴候を記録した。
【０１６６】
臨床パラメータ
炎症効果は炎症採点システムを用いて格付けした。腸の赤み：正常０、やや赤い１、赤い２、非常に赤い３；腸液：正常０、わずか１、多い２；動物の挙動：機敏０、不活発２。
【０１６７】
ＭＰＯ測定のための肺および腸組織のホモジナイゼーション
肺および小腸（１００〜２００μｇ）は、腸虚血および再灌流傷害を施した、ＩＤＸ０１５０およびＰＢＳ治療マウスから回収した。組織を、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含有する１ｍｌ  ＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）中Ｄｉｓｐｅｒｓｅｒ  Ｔ１０（ＩＫＡ（登録商標）−Ｗｅｒｋｅ  ＧＭＢＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ社、シュタウフェン、ドイツ）を用いて３０秒間氷上でホモジナイズした。試料をこの後、氷上で３０分間インキュベートした後、残屑は、２ラウンドの遠心分離、１０，０００×ｇ、１０分間、４℃によりホモジネートから除去した。上清を回収し、等分し、および後のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）測定用に−７０℃で冷凍した。ＭＰＯは、ＭＰＯ  ＥＬＩＳＡキット（Ｈｙｃｕｌｔ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ウーデン、オランダ）を用いて製造者の指示に従いホモジネートにおいて分析した。
【０１６８】
結果
虚血は、不活発および毛がけば立っているように見える重度の炎症反応を誘発した。剖検すると腸は体液を含んで肥大化し、および炎症を起こしていた（図６ａ）。ＩＤＸ０１５０治療動物では、腸は炎症が少なかった（図６ｂ）。採点システムにより、炎症を起こした動物はスコアが６．５であり、ＩＤＸ０１５０治療をｉ．ｐで受けた動物でのスコアの低さと対照的であった（図６ｃ）。
【０１６９】
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）は、多形核好中球で多量に発現するヘムタンパク質であり、好中球浸潤および活性化のマーカーに使用される（ＬａｕおよびＢａｌｄｕｓ、２００６年）。好中球は、虚血組織に浸潤する主な白血球であり、および誘発炎症に対する重要な寄与因子である。
【０１７０】
この試験では腸虚血および再灌流傷害マウスモデルにおける小腸および肺への好中球浸潤に対するオリゴヌクレオチド化合物ＩＤＸ０１５０（配列番号１３、表１）の効果を、ホモジナイズした組織でのＭＰＯを測定して調べた。腸（図６ｄ、およびｅ）および肺（図６ｆ、およびｇ）の両組織でのＭＰＯレベルは、ＰＢＳ治療対照と比べてＩＤＸ０１５０治療マウスで減少した。ＭＰＯのこの減少は、化合物を虚血誘発前（図６ｄ、およびｆ）および再灌流開始後（図６ｅ、およびｇ）に投与した場合に見られた。ＭＰＯで観察された減少は、本発明の化合物オリゴヌクレオチドに反応した虚血組織への好中球の浸潤の減少があることを示唆する。
【０１７１】
これらの結果は、炎症スコアの減少による臨床結果にも反映された。
【実施例７】
【０１７２】
多形核細胞でのケモカイン受容体発現に対する免疫調節オリゴヌクレオチドの効果
序論
ＩＬ−８は、炎症中に好中球の動員および活性化に重要な役割を果たす強力な炎症誘発性サイトカインである。ＩＬ−８は、２つの異なる種類の受容体（ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２）を介して好中球と反応する。ＩＬ−８への好中球の走化性は大部分がＣＸＣＲ１（７８％）により、残りがＣＸＣＲ２により媒介される。好中球に対する別の強力な化学誘引物質は、好中球表面で発現した受容体ＢＬＴ１に高親和性で結合するロイコトリエンＢ4（ＬＴＢ4）である。この試験の目的は、本発明の化合物がＣＸＣＲ１／２およびＢＬＴ１発現を減少できるか、およびこれによりＰＭＮ浸潤を減少させるかを調べることであった。
【０１７３】
材料および方法
試験化合物
ＩＤＸ９００５、ＩＤＸ９０１０、ＩＤＸ９０２２、ＩＤＸ９０３０、ＩＤＸ９０３１、ＩＤＸ９０４５、ＩＤＸ９０５２、ＩＤＸ９０５４、ＩＤＸ９０５９、ＩＤＸ９０７４、ＩＤＸ９０９２、ＩＤＸ９０９５、ＩＤＸ９０９６およびＩＤＸ０１５０（配列番号１〜１４、表１）を、健康な多形核細胞（ＰＭＮ）でのＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２表面発現に対するこれらの効果について調べた。本発明の化合物ＩＤＸ９０２２、ＩＤＸ９０５２、ＩＤＸ９０５４およびＩＤＸ９０５９（配列番号３、１４、７および８、表１）はさらに、健康なボランティア由来のＰＭＮにおけるＢＬＴ１表面発現に対するこれらの効果について調べた。Ａｖｅｃｉａ社（マンチェスター、英国）から注文したＩＤＸ０１５０を除いて、オリゴヌクレオチドはすべてＢｉｏｍｅｒｓ．ｎｅｔ（ウルム、ドイツ）により合成された。
【０１７４】
調製
オリゴヌクレオチドは、５００μＭの貯蔵濃度に達するようＵＶ分光光度法（ＳｍａｒｔＳｐｅｃ（登録商標）３０００、ＢＩＯ−ＲＡＤ社、ハーキュリーズ、ＵＳＡ）を用いてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、ＣＡ）で調整し、および使用まで−２０℃で保存した。
【０１７５】
細胞調製およびオリゴヌクレオチドによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激
健康な血液ドナー由来の全血をＰＭＮの調製に使用した。ＰＭＮは、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（商標）（Ａｘｉｓ−Ｓｃｈｉｅｌｄ社、オスロ、ノルウェー）を用いて密度遠心分離により単離した。細胞を次いでさらにＰＢＳで洗浄し、生存率および細胞数はトリパンブルー（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、ストックホルム、スウェーデン）で細胞をカウントして判定した。この後、細胞は、１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を追加したＲＰＭＩ  １６４０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００  Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）および５μｇ／ｍＬゲンタマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から成る完全細胞培地に再懸濁した。ＰＭＮは、０．５、１０μＭもしくは２５μＭの本発明の化合物、または総容量２００μｌ／ウェルの陰性対照として培地単独とともに、濃度２×１０6細胞／ｍＬで９６ウェル培養組織プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、フランクリンレイクス、ＮＪ）に培養した。細胞は、特に記載のない場合、５％ＣＯ2を有する加湿細胞培養インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ウォルサム、ＭＡ）で３７℃、３時間インキュベートした後、細胞を、下記の通りフローサイトメトリーを用いてＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２およびＢＬＴ１発現について分析した。
【０１７６】
ＣＸＣＲ１表面発現に対するオリゴヌクレオチドの効果の動力学的評価
健康な血液ドナー由来のヒトＰＭＮを、さまざまな時点（１５分、３０分、１時間、２時間および３時間）に、１０μＭのＩＤＸ９０５９（配列番号８、表１）または培地単独で刺激した。細胞をこの後回収し、各時点で２％パラホルムアルデヒドで固定化した後、下記の通りフローサイトメトリーによりＣＸＣＲ１発現について分析した。
【０１７７】
フローサイトメトリー
本発明の化合物とともにインキュベートした細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、２％ＦＣＳを追加したＰＢＳに再懸濁した。細胞は、蛍光色素標識マウスモノクローナル抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、サンノゼ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて４℃、３０分間、ＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ２またはＢＬＴ１とともに顆粒球マーカーＣＤ６６ｂを染色した。使用した抗体をアイソタイプマッチ対照（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）と比較した。ＰＢＳでの洗浄後、細胞をＦＡＣＳａｒｒａｙフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）により分析し、データはＦＡＣＳａｒｒａｙソフトウェアシステム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて分析した。試料当たり最低１５０００ゲートＰＭＮを分析した。
【０１７８】
クロロキンアッセイ
健康な血液ドナーから単離したＰＭＮは、さらに３時間１０μＭの試験物質で刺激する前に、０．５、５および１０μｇ／ｍｌのクロロキン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）で３０分間、３７℃で前処理した。ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２の表面発現を、次いで上記の通りフローサイトメトリーにより分析した。
【０１７９】
走化性アッセイ
ＰＭＮの走化性は、ＱＣＭ（商標）３μｍ  ２４ウェル比色分析走化性アッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、テメキュラ、ＣＡ）を用いて製造者の指示に従い調べた。簡単には、上記の通りＰＭＮは健康なドナー由来の全血から調製し完全細胞培地に再懸濁した。ＰＭＮは、５％ＣＯ2を有する加湿細胞培養インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で３７℃、１時間、０．５、１０または２５μＭの本発明の化合物とともに、ウェル当たり２５０μｌ細胞懸濁液を用いて、濃度１×１０6細胞／ｍＬで４８ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）でプレインキュベートした。細胞は次いで完全細胞培地で洗浄し、細孔径３μｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を有する２４ウェル細胞遊走プレートプレートアセンブリのトップインサートに細胞を移した。より下のチャンバーには、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）または５００ｎＭ  ＬＴＢ4（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）含有完全細胞培地を添加した。ＩＤＸ９０４５を試験する１つの実験では、細胞は走化性プレートのトップインサートに添加する前に洗浄せず、この場合ＩＬ−８をＩＤＸ９０４５とともに、トップインサートに使用したのと同じ濃度で、より下のチャンバーに添加した。これは化合物の勾配を作り出すリスクを排除するためであった。細胞は次いで、５％ＣＯ2を有する加湿細胞培養インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で３７℃、３時間、フィルターを通って化学誘引物質に向かって遊走できた。この後、より下のチャンバーからの細胞、すなわち遊走細胞を細胞生存性染色ＷＳＴ−１とともに１時間インキュベーションして検出し、続いてマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ，Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ社、スイス）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定して定量した。
【０１８０】
結果および考察
ＰＭＮは、虚血組織へ誘引される主な白血球である。ここで、好中球は、フリーラジカル、ミエロペルオキシダーゼなどのタンパク質分解酵素を遊離、および局所細胞からのサイトカイン放出を刺激して組織傷害を増大させ、炎症増加をもたらす。ＩＬ−８は、この受容体ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２、およびＬＴＢ4は、ＰＭＮ細胞表面のこの受容体ＢＬＴ１に結合して、炎症部位への好中球の動員に重要な役割を果たす（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、２００８年；ＴａｇｅｒおよびＬｕｓｔｅｒ、２００３年）。
【０１８１】
この試験では、健康な血液ドナーから単離したＰＭＮ上のＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２およびＢＬＴ１の表面発現に対するオリゴヌクレオチド化合物の効果を調べた。試験物質による刺激の３時間後、本発明の化合物の幾つかは、ＣＸＣＲ１の平均蛍光強度（ＭＦＩ）、すなわち細胞ごとに発現されるＣＸＣＲ１の量を減少させた（図７ａ）。ＣＸＣＲ１発現の最大の減少は、ＩＤＸ９０５２、ＩＤＸ９０５４、ＩＤＸ９００５、ＩＤＸ９０３０、ＩＤＸ９０５９、ＩＤＸ９０２２、およびＩＤＸ９０４５（配列番号１４、７、１、４、８、３、および６、表１）により誘発され、２５μＭで使用した場合、ＭＦＩがそれぞれ６８％、６２％、６１％、６０％、５３％、５２％および３０％減少した。さらに、ＩＤＸ９００５、ＩＤＸ９０２２、ＩＤＸ９０３０、ＩＤＸ９０５２、ＩＤＸ９０５４およびＩＤＸ９０５９（配列番号１、３、４、１４、７および８、表１）で刺激したＰＭＮではＣＸＣＲ１＋細胞のパーセンテージの若干の減少があったが、減少はＭＦＩほど大きくはなかった（図７ｂ）。ＣＸＣＲ２もまた、特にＰＭＮをＩＤＸ９０５２およびＩＤＸ９０５４（配列番号１４および７、表１）で刺激した場合に、本発明のオリゴヌクレオチド化合物に反応してダウンレギュレートされ（図７ｃ）、それぞれＣＸＣＲ２のＭＦＩの５０および３６％の減少を誘発した。ＩＤＸ９０５２およびＩＤＸ９０５４も、ＣＸＣＲ２＋ＰＭＮのパーセンテージの若干の減少を誘発した（図７ｄ）。ＣＸＣＲ発現の減少は用量依存的であり、最大効果は２５μＭのオリゴヌクレオチド化合物で見られ、および最小効果は１０および０．５μＭで見られた（図７ｅ）。さらに、健康な血液ドナー由来のＰＭＮを用いた別の実験では、ＩＤＸ９０７４（配列番号９、表１）はＣＸＣＲ１発現をダウンレギュレートすることができた（図７ｆ）。
【０１８２】
ＣＸＣＲ１ダウンレギュレーション動態を調べるため、ヒトＰＭＮを１０μＭのＩＤＸ９０５９（配列番号  ８、表１）で１５分間、３０分間、１時間、２時間および３時間刺激した後、ＣＸＣＲ１発現をフローサイトメトリーで調べた。１５分後には既に、ＣＸＣＲ１表面発現の若干の減少を観察することができ、２時間後にダウンレギュレーションは最大レベルに達し、３時間後はさらなる減少は見られなかった（図７ｇ）。
【０１８３】
本発明の化合物ＩＤＸ９０５２、ＩＤＸ９０５４、ＩＤＸ９０５９、ＩＤＸ９００５およびＩＤＸ９０４５（配列番号１４、７、８、１、および６）は、ＣＸＣＲ１／２発現の減少にいずれも非常に効果的であり、これらはすべて、５’および／または３’末端にＧフランク（Ｇ−ｆｌａｎｋ）を含有するという共通点を有する。これは、この構造モチーフがオリゴヌクレオチド配列とともに、オリゴヌクレオチドによるより効果的なＣＸＣＲ１／２減少能力に関連し得ることを示唆する。これをさらに裏付けため、健康な血液ドナー由来のＰＭＮを、それぞれＩＤＸ９０２２およびＩＤＸ９０５９と同じ配列を有するが、ＣｐＧモチーフのない対照オリゴヌクレオチドＩＤＸ０４８０（Ｔ*Ｇ*Ｃ*ＴＧＣＴＴＣＴＧＣＣＡＴＧＣＴＧ*Ｃ*Ｔ*Ｔ）およびＩＤＸ９１３４（Ｇ*Ａ*Ｔ*ＧＣＴＣＴＧ*Ｇ*Ｇ*Ｇ）とともにインキュベートした場合、ＩＤＸ０４８０は、ＩＤＸ９０２２について見られたようなＣＸＣＲ１表面発現を減少させることができなかったのに対し、ＩＤＸ９１３４は、ＣＸＣＲ１表面発現の減少においてＩＤＸ９０５９と同様に強力であった（図７ｈ）。いずれかの理論に制約されることを望むことなく、本発明者らは、これらの結果が、Ｇフランクを持たないＩＤＸ９０２２は、主にＣｐＧモチーフによるＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２減少効果を媒介するのに対し、Ｇフランクを含有するＩＤＸ９０５９はＣｐＧ非依存的効果を有することを示唆していると考える。
【０１８４】
試験物質により誘発されたＣＸＣＲ表面発現の減少におけるＴＬＲ９の役割を調べるため、ＰＭＮを試験物質による刺激前にクロロキンにより前処理した。クロロキンは、エンドソーム融合および酸性化を阻害し、ならびにＴＬＲ９活性化および下流代謝シグナル伝達経路を妨げる４−アミノキノリン剤である。クロロキンは、ＩＤＸ９０５９およびＩＤＸ９０２２（配列番号８および３、表１）により誘発されたＣＸＣＲ１表面発現の減少を用量依存的に阻害することができた（図７ｉ）。１０μｇ／ｍｌのクロロキンは、これら２つの化合物により誘発されたＣＸＣＲ１発現の減少をほぼ完全に阻害した（図７ｉ）。しかし、クロロキンは、ＩＤＸ９０５４またはＩＤＸ９０５２（配列番号７および１４、表１）に誘発されたＣＸＣＲ１表面発現の減少を阻害することはできなかった（図７ｉ）。これらの結果は、本発明の化合物の幾つかは、エンドソームＴＬＲ９活性化によるＣＸＣＲ減少効果を媒介するのに対し（すなわちＩＤＸ９０２２およびＩＤＸ９０５９）、他の化合物は媒介しない（すなわちＩＤＸ９０５２およびＩＤＸ９０５４）ことを示唆する。
【０１８５】
化学誘引物質ＬＴＢ4に対する受容体、ＢＬＴ１の用量依存的減少は、異なる濃度（０．５、１０および２５μＭ）の本発明の化合物とともにインキュベートした後も示すことができた（図７ｊ）。２５μＭで使用した場合、ＭＦＩの８７％、８０％、６４％および５７％減少が、それぞれ本発明の化合物ＩＤＸ９０５２、ＩＤＸ９０５４、ＩＤＸ９０５９およびＩＤＸ９０２２（配列番号１４、７、８および３、表１）で見られた。（図７ｊ）。さらに、ＩＤＸ９０５２およびＩＤＸ９０５４は、ＢＬＴ１陽性ＰＭＮのパーセンテージを著しく減少させた（図７ｋ）。図７ｊに示されている通り、５’および／または３’末端にＧフランクを含有する本発明の化合物、すなわちＩＤＸ９０５２、ＩＤＸ９０５４およびＩＤＸ９０５９（配列番号１４、７および８、表１）は、Ｇフランクを持たないＩＤＸ９０２２と比べて、ＢＬＴ１表面発現の減少により効果的であった。
【０１８６】
本発明の化合物に誘発されたＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２およびＢＬＴ１表面発現の減少が、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２リガンド（ＩＬ−８）またはＢＬＴ１リガンド（ＬＴＢ4）へのＰＭＮの遊走減少ももたらすかどうかを調べるため、健康な血液ドナー由来のＰＭＮを、本発明のオリゴヌクレオチド化合物とともに１時間プレインキュベートした。細胞を次いで走化性アッセイで３時間、ＩＬ−８またはＬＴＢ4へ遊走するままにした。遊走ＰＭＮ数の用量依存的減少は、両方ともＩＤＸ９０２２、ＩＤＸ９０５２、ＩＤＸ９０５４およびＩＤＸ９０５９（配列番号３、１４、７および８、表１）とともにプレインキュベーションした後に見られ、最も効果的な化合物は、２５μＭでＩＬ−８（図７ｌ）およびＬＴＢ4（図７ｎ）の両方へのＰＭＮ遊走を完全に阻害またはほぼ完全に阻害したＩＤＸ９０５２、ＩＤＸ９０５４およびＩＤＸ９０５９であった。さらに、２人の健康な血液ドナー由来のＰＭＮを用いた別の実験では、ＩＤＸ９０４５（配列番号６、表１）は、ＩＬ−８誘発ＰＭＮ遊走を用量依存的に減少させた（図７ｍ）。
【０１８７】
ＩＬ−８誘発走化性での遊走ＰＭＮ数は、ＬＴＢ4誘発走化性でのＢＬＴ１表面発現および遊走ＰＭＮ数と同様に、ＣＸＣＲ１および２表面発現と相関した（図７ｏ〜ｑ）。これは、ＰＭＮ遊走の減少が受容体の表面発現の低下に起因することを示す。
【０１８８】
本発明者らは、オリゴヌクレオチド化合物とともにインキュベートしたＰＭＮでのＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２およびＢＬＴ１発現の急速な減少を実証し、ＣＸＣＲ１発現の減少は刺激の１５分間後に既に開始することが示された。好中球は最終分化細胞であり、したがって短命であることから、これは非常に重要で、迅速に誘発される免疫調節効果が望まれる理由である。Ｈａｙａｓｈｉらは２００３年に、ＧＭ−ＣＳＦで前処理した細胞でのみＣｐＧ  ＤＮＡによるＰＭＮでのＣＸＣＲ１発現がダウンレギュレーションされることを実証した（Ｈａｙａｓｈｉら、２００３年）のに対し、この試験では、本発明のオリゴヌクレオチド物質は、サイトカイン前処理なしでＣＸＣＲ１および２の表面発現を減少させ、強力な免疫調節特性を明確に示した。
【０１８９】
本発明者らは、ＣＸＣＲ１、２およびＢＬＴ１の表面発現の減少を実証しただけでなく、遊走の低下をもたらす、化学誘引物質ＩＬ−８およびＬＴＢ4への細胞の反応性の減少をさらに実証した。これらの結果がｉｎ  ｖｉｖｏシナリオも反映し、この結果炎症組織へのＰＭＮの走化性低下をもたらすことを予測する理由がある。
【０１９０】
ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２およびＢＬＴ１の表面発現の低下、ならびに化学誘引物質ＩＬ−８およびＬＴＢ4への細胞の反応性の減少は、本発明の化合物で処理した健康なＰＭＮで観察された。オリゴヌクレオチド化合物のこれらの特性は、ＰＭＮの特性および挙動に影響を与える本発明の化合物の効力を明らかに示している。
【実施例８】
【０１９１】
喘息およびＭＳ患者由来の多型核細胞でのケモカイン受容体発現に対する免疫調節オリゴヌクレオチドの効果
序論
ＰＭＮは、虚血だけでなく、多くの他の炎症性障害の病因にも関与し、したがってＰＭＮ機能を阻害することは、多くの炎症性疾患で有益となるであろう。ＰＭＮ、すなわち好酸球および好中球による気道の細胞炎症は、喘息の特性である。ＰＭＮはまた、多発性硬化症（ＭＳ）の病因に関与することも記載されている。この試験の目的は、本発明の化合物が、健康な個人由来のＰＭＮだけでなく、この場合では喘息およびＭＳに例示される炎症状態を有する患者由来のＰＭＮでも、ＣＸＣＲ１／２およびＢＬＴ１発現を減少させることができるかを調べることであった。
【０１９２】
材料および方法
試験化合物
ＩＤＸ９０２２、ＩＤＸ９０５２、ＩＤＸ９０５４およびＩＤＸ９０５９（配列番号３、１４、７および８、表１）を、喘息およびＭＳ患者由来のＰＭＮでのＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２およびＢＬＴ１表面発現に対する効果について調べた。オリゴヌクレオチドはすべて、Ｂｉｏｍｅｒｓ．ｎｅｔ社（ウルム、ドイツ）により合成された。
【０１９３】
調製
オリゴヌクレオチドは、ＵＶ分光光度法（ＳｍａｒｔＳｐｅｃ（登録商標）３０００、ＢＩＯ−ＲＡＤ社、ハーキュリーズ、ＵＳＡ）を用いて５００μＭの貯蔵濃度に達するようリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、ＣＡ）で調整し、および使用まで−２０℃で保存した。
【０１９４】
細胞調製およびオリゴヌクレオチドによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激
喘息およびＭＳ患者由来の全血をＰＭＮの調製に使用した。ＰＭＮを単離し、カウントし、実施例７の材料および方法に記載した完全細胞培地に再懸濁した。ＰＭＮは、０．５、１０μＭもしくは２５μＭのオリゴヌクレオチド、または総容量２００μｌ／ウェルでの陰性対照として培地単独とともに、濃度２×１０6細胞／ｍＬで９６ウェル培養組織プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、フランクリンレイクス、ＮＪ）に培養した。細胞は、５％ＣＯ2を有する加湿細胞培養インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ウォルサム、ＭＡ）で３７℃、３時間インキュベートした後、細胞を、フローサイトメトリーを用いてＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２およびＢＬＴ１発現について分析した。
【０１９５】
フローサイトメトリー
オリゴヌクレオチドとともにインキュベートした細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、２％ＦＣＳを追加したＰＢＳに再懸濁した。細胞は、実施例７の材料および方法に記載した通りＣＸＣＲ１もしくはＣＸＣＲ２またはＢＬＴ１とともに顆粒球マーカーＣＤ６６ｂを染色した。細胞を次いでＦＡＣＳａｒｒａｙフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）により分析し、データはＦＡＣＳａｒｒａｙソフトウェアシステム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて分析した。試料当たり最低１５０００ゲートＰＭＮを分析した。
【０１９６】
結果および考察
ＰＭＮは、炎症反応中の組織損傷を媒介する主な細胞の一つである。ＰＭＮは、血液から、局所産生された化学誘引物質に反応して炎症部位へ遊走する。ＰＭＮ遊走の２つの主なメディエーターは、ＣＸＣケモカインＩＬ−８およびロイコトリエンＬＴＢ4である。この試験では、本発明者らは、本発明の化合物が炎症性疾患患者由来のＰＭＮ表面のＩＬ−８に対する受容体、すなわちＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２、ならびにＬＴＢ4に対する受容体、すなわちＢＬＴ１をダウンレギュレートできるかを調べようと試みた。
【０１９７】
ＭＳ患者由来の血液の使用は、本発明の化合物による刺激後のＰＭＮにおけるＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２およびＢＬＴ１の用量依存的減少を示唆した（図８ａ〜ｆ）。同様の結果が、喘息患者由来の血液を使用した場合に見られた（図８ｇ〜ｉ）。減少は大部分が、ＭＦＩ、すなわち細胞ごとに発現される受容体の量に対して見られた。ＩＤＸ９０５２、ＩＤＸ９０５４およびＩＤＸ９０５９（配列番号８、７および１４、表１）は、２５μＭで使用した場合、ＭＳ患者由来のＰＭＮ上のＣＸＣＲ１に対し、それぞれ４５％、５６％および４２％のＭＦＩの減少を誘発した（図８ａ）。さらに、ＩＤＸ９０５２、ＩＤＸ９０５４およびＩＤＸ９０５９は、それぞれ、ＣＸＣＲ２の表面発現を７６％、５８％および３９％（図８ｃ）、ならびにＢＬＴ１の表面発現を５０％、４７％および２６％減少させた（図８ｅ）。喘息患者由来のＰＭＮを本発明の化合物で刺激した場合、ＣＸＣＲ１に対するＭＦＩの減少は、ＩＤＸ９０５２、ＩＤＸ９０５４およびＩＤＸ９０５９（図８ｇ）でそれぞれ、５６％、７１％および６２％であった。ＩＤＸ９０５２、ＩＤＸ９０５４およびＩＤＸ９０５９はまた、それぞれ、喘息患者由来のＰＭＮ上のＣＸＣＲ２に対するＭＦＩを６９％、５０％および３７％（図８ｈ）、ならびにＢＬＴ１に対するＭＦＩを８５％、７７％および６４％（図８ｉ）減少させた。健康なドナー由来のＰＭＮで見られた通り、フランキングオリゴ−Ｇ配列、すなわちＩＤＸ９０５２、ＩＤＸ９０５４およびＩＤＸ９０５９（配列番号１４、７および８、表１）を含有する本発明の化合物は、ＭＳおよび喘息患者由来のＰＭＮにおいてもＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２およびＢＬＴ１表面発現の減少に最も効果的であった。
【０１９８】
ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２およびＢＬＴ１の表面発現の減少は、炎症性障害患者、すなわち喘息およびＭＳ患者由来のＰＭＮを本発明の化合物で処理した場合にも観察された。オリゴヌクレオチド化合物のこれらの特性は、炎症を起こした組織へのＰＭＮの浸潤を減少させるうえで有用となり得る。
【０１９９】
本発明は、本発明者らに現在既知の最良の形態を成す、好ましい実施形態に関して記載されているが、さまざまな変更および修正は、当業者に明らかであるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載の通り、本発明の範囲を逸脱することなく行われ得ることが理解されるべきである。
【０２００】
（参照文献）
《１》
Cooper, et al., Transendothelial migration of neutrophils involves integrin-associated protein (CD47), Proc Natl Acad Sci USA, 1995 Apr 25, 92(9): 3978-82
《２》
Entman ML, Smith CW. Postreperfusion inflammation: a model for reaction to injury in cardiovascular disease. Cardiovasc Res. 1994; 28(9):1301-11. Review.
《３》
Hausenloy, D. J., A. Tsang and D. M. Yellon. The Reperfusion Injury Salvage Kinase Pathway: A Common Target for Both Ischemic Preconditioning and Postconditioning. Trends Card Med. 2005; 15: 69-75.
《４》
Hausenloy DJ, Yellon DM. Preconditioning and postconditioning: united at reperfusion. Pharmacol Ther 2007;116:173-91.
《５》
Hayashi F, Means TK, and Luster AD. Toll-like receptors stimulate human neutrophil function. Blood. 2003;102: 2660-2669.
《６》
Heemann U, Szabo A, Hamar P, Mueller V, Witzke O, Lutz J, Philipp T. Lipopolysaccharide pretreatment protects from renal ischemia/reperfusion injury : possible connection to an interleukin-6-dependent pathway. Am J Pathol. 2000; 156:287-93.
《７》
Henriksson M, Stenman E, Vikman P, Edvinsson L. MEK1/2 inhibition attenuates vascular ETA and ETB receptor alterations after cerebral ischaemia. Exp Brain Res. 2007: 178(4):470-6.
《８》
Kobayashi, Y. The role of chemokines in neutrophil biology. Front Biosci, 2008 Jan 1; 13, 2400-2407.
《９》
Lee SH, Lee JG, Kim JR, Baek SH. Toll-like receptor 9-mediated cytosolic phospholipase A2 activation regulates expression of inducible nitric oxide synthase. Biochem Biophys Res Commun. 2007; 28;364(4):996-1001. 
《１０》
Lindberg et al., Decreased resistance to bacterial infection and granulocyte defects in IAP-deficient mice, Science, 1996 Nov 1;274(5288): 795-8
《１１》
Lindbom L. Microvascular blood flow distribution in skeletal muscle. An intravital microscopic study in the rabbit. Acta Physiol Scand Suppl.  1983;525:1-40.
《１２》
McKimmie CS, Fazakerley JK. In response to pathogens, glial cells dynamically and differentially regulate Toll-like receptor gene expression. J Neuroimmunol. 2005; 169:116-25. 
《１３》
Parkos, et al., CD47 mediates post-adhesive events required for neutrophil migration across polarized intestinal epithelia, J. Cell Biol., 1996 Feb; 132(3): 437-50
《１４》
Penberthy TW, Jiang Y, Graves DT. Leucocyte adhesion molecules. Crit Rev Oral Biol Med 1997 ;8(4) :380-388.
《１５》
Pignataro G, Meller R, Inoue K, Ordonez AN, Ashley MD, Xiong Z, Gala R, Simon RP. In vivo and in vitro characterization of a novel neuroprotective strategy for stroke: ischemic postconditioning. J Cereb Blood Flow Metab. 2008; 28(2):232-41. Epub 2007 Sep 19. Erratum in: J Cereb Blood Flow Metab. 2008; 28(2):440. Gala, Rosaria [added]. 
《１６》
Rowland RT, Meng X, Cleveland JC Jr, Meldrum DR, Harken AH, Brown JM. LPS-induced delayed myocardial adaptation enhances acute preconditioning to optimize postischemic cardiac function. Am J Physiol. 1997; 272:H2708-15.
《１７》
Stevens SL, Ciesielski TM, Marsh BJ, Yang T, Homen DS, Boule JL, Lessov NS, Simon RP, Stenzel-Poore MP. Toll-like receptor 9: a new target of ischemic preconditioning in the brain. J Cereb Blood Flow Metab. 2008; 28(5):1040-7. 
《１８》
Tager AM, and Luster AD. (2003). BLT1 and BLT2: the leukotriene B(4) receptors. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 2003; 69: 123-134.
《１９》
Tang SC, Arumugam TV, Xu X, Cheng A, Mughal MR, Jo DG, Lathia JD, Siler DA, Chigurupati S, Ouyang X, Magnus T, Camandola S, Mattson MP. Pivotal role for neuronal Toll-like receptors in ischemic brain injury and functional deficits. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007; 104:13798-803. 
《２０》
Tasaki K, Ruetzler CA, Ohtsuki T, Martin D, Nawashiro H, Hallenbeck JM. Lipopolysaccharide pre-treatment induces resistance against subsequent focal cerebral ischemic damage in spontaneously hypertensive rats. Brain Res. 1997; 748:267-70.
《２１》
Valen G. Cellular signalling mechanisms in adaptation to ischemia-induced myocardial damage. Ann  Med. 2003;35:300-7. 
《２２》
Valen G, Vaage J. Pre- and postconditioning in cardiac surgery. Bas Res Cardiol 2005;100:179-86.
《２３》
Vinten-Johansen J. Involvement of neutrophils in the pathogenesis of lethal myocardial reperfusion injury. Cardiovasc Res. 2004; 15;61(3):481-97. Review. 
《２４》
Wang ZQ, Chen XC, Yang GY, Zhou LF. U0126 prevents ERK pathway phosphorylation and interleukin-1beta mRNA production after cerebral ischemia. Chin Med Sci J. 2004 Dec;19(4):270-5. 
《２５》
Yellon DM, Hausenloy DJ. Myocardial reperfusion injury. N Engl J Med. 2007; 13;357(11):1121-35.
【図１ａ】
0005749651.tif 000003
【図１ｂ】
0005749651.tif 000004
【図２】
0005749651.tif 000005
【図３ａ】
0005749651.tif 000006
【図３ｂ】
0005749651.tif 000007
【図４−２】
0005749651.tif 000008
【図４−３】
0005749651.tif 000009
【図５】
0005749651.tif 000010
【図６−１】
0005749651.tif 000011
【図６−２】
0005749651.tif 000012
【図６−３】
0005749651.tif 000013
【図６−４】
0005749651.tif 000014
【図７−１】
0005749651.tif 000015
【図７−２】
0005749651.tif 000016
【図７−３】
0005749651.tif 000017
【図７−４】
0005749651.tif 000018
【図７−５】
0005749651.tif 000019
【図７−６】
0005749651.tif 000020
【図７−７】
0005749651.tif 000021
【図７−８】
0005749651.tif 000022
【図７−９】
0005749651.tif 000023
【図７−１０】
0005749651.tif 000024
【図８−１】
0005749651.tif 000025
【図８−２】
0005749651.tif 000026
【図８−３】
0005749651.tif 000027
【図８−４】
0005749651.tif 000028
【図８−５】
0005749651.tif 000029
【図４−１】
0005749651.tif 000030
【配列表】
0005749651000001.app