(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロゲルの形態のキトサン組成物であって、前記組成物は、４０％〜６０％の範囲でアセチル化度を有する高アセチル化キトサンと、２０％以下のアセチル化度を有する高脱アセチル化キトサンを含み、２５℃およびｐＨ７．０±０．２で前記組成物は２０ｒｐｍのせん断速度で少なくとも１００ｍＰａ・ｓの粘度を有し、高脱アセチル化キトサンは非均一に脱アセチル化し、高アセチル化キトサンは均一に再アセチル化してなり、高アセチル化キトサンおよび高脱アセチル化キトサンは、全組成物の０．２％〜３％ｗ／ｖの濃度でそれぞれ存在するキトサン組成物。
【請求項２】
高脱アセチル化キトサンは少なくとも１００ｋＤａの分子量を有し、高アセチル化キトサンは少なくとも２００ｋＤａの分子量を有する請求項１に記載のキトサン組成物。
【請求項３】
高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンは、全組成物の０．５％〜２％ｗ／ｖの濃度でそれぞれ存在し、前記組成物における高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンの割合は、１：１，１：２，１：３および１：４から成る群から選択される請求項１に記載のキトサン組成物。
【請求項４】
多糖、リン脂質およびそれら組み合わせから成る群から選択される少なくとも１個の負に帯電した物質をさらに含む請求項１に記載のキトサン組成物。
【請求項５】
負に帯電した多糖は、動物由来の多糖、植物由来の多糖、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、ケラタン硫酸およびそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項４に記載のキトサン組成物。
【請求項６】
薬物、ポリペプチド、動物細胞および植物細胞の少なくとも１個をさらに含む請求項１〜５のいずれかに記載のキトサン組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の組成物を有する埋め込み型装置。
【請求項８】
外科的接着の予防または治療、創傷治癒、組織再生および組織交換から成る群から選択される少なくとも１つの用途のための薬剤を調製するための請求項１〜６のいずれかに記載のキトサン組成物の使用。
【請求項９】
注射可能な溶液の形態のキトサン組成物であって、前記組成物は、４０％〜６０％の範囲でアセチル化度を有する高アセチル化キトサン、および２０％以下のアセチル化度を有する高脱アセチル化キトサンを有し、２５℃および中性領域未満のｐＨで前記組成物は５０ｒｐｍのせん断速度で１５０ｍＰａ・ｓ以下の粘度を有し、高アセチル化キトサンおよび高脱アセチル化キトサンは全組成物の０．２％〜３％ｗ／ｖの濃度でそれぞれ存在するキトサン組成物。
【請求項１０】
高脱アセチル化キトサンは少なくとも１００ｋＤａの分子量を有し、高アセチル化キトサンは少なくとも２００ｋＤａの分子量を有する請求項９に記載のキトサン組成物。
【請求項１１】
高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンは、全組成物の０．５％〜２％ｗ／ｖの濃度でそれぞれ存在し、前記組成物における高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンの割合は、１：１，１：２，１：３および１：４から成る群から選択される請求項９に記載のキトサン組成物。
【請求項１２】
多糖、リン脂質およびそれらの組み合わせから成る群から選択される少なくとも１個の負に帯電した物質をさらに含む請求項９に記載のキトサン組成物。
【請求項１３】
負に帯電した多糖は、動物由来の多糖、植物由来の多糖、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、ケラタン硫酸およびそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項１２に記載のキトサン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐＨ依存および温度感受性の方法でヒドロゲルを形成するキトサンの組み合わせ、このようなヒドロゲルを形成するために用いる水溶液、およびその使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロゲルは、水または他の生体液において分散する高く水和した、高分子ネットワークである。ヒドロゲルは、温度が上昇すると粘度が高くなる温度感受性（または熱硬化性）である。このようなヒドロゲルは、非温度感受性のヒドロゲルと比較して適用部位で好ましい適用性および長期の生存期間を有し、これによって持続放出薬物送達システムに対する媒体として有利である。
【０００３】
キトサンを含む様々なポリマーは、ヒドロゲルの調製に用いることができる。キトサンは、部分的にキチンの実質的なＮ−脱アセチル化で得られるポリマーの族として発生し、後者は、β−１，４連鎖におけるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の直鎖多糖である。キチンは、無脊椎動物、とくにクラスタシィアン（例えば、エビ、カニ、ロブスター）の外骨格において多量に存在する。キトサン生成に用いる商業的な脱アセチル化プロセスには、一般的に、濃縮したアルカリ溶液、通常水酸化ナトリウムでの食用貝類の加工廃棄物の処理を含む。その生成の間に達成した脱アセチル化にしたがって、キトサンは、Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮ）およびＧｌｃＮＡｃのヘテロポリマーである、またはＧｌｃＮのみから形成したホモポリマーである。様々な技術が、脱アセチル化の程度を変化させるために、また、所定のアセチル化の程度を有するキトサンを得るための再アセチル化に利用できる。脱アセチル化の結果、ポリマー鎖に沿って遊離アミノ基ができ、選択した酸性システムにおいて溶解するポリマーを提供する。所定の程度の脱アセチル化であるキトサンの溶解度は、ポリマー分子量、温度および酸溶媒の濃度および性質等、多岐のパラメータに依存する。
【０００４】
したがって、キトサンを特徴付けるために用いる一つのパラメータは、ＧｌｃＮ単位に対するＧｌｃＮＡｃ単位の割合であり、アセチル化の程度（ＤＡ）、または脱アセチル化の逆の程度（ＤＤもしくはＤＤＡ）として表す。キトサンの構造は、さらに、ポリマー鎖内のＧｌｃＮＡｃおよびＧｌｃＮの分布様式によって特徴付けられ、例えば、非均一に脱アセチル化したキトサンは、様々な大きさおよび／または鎖における場所のブロックにおいて起こるが、均一に脱アセチル化したキトサンは、ポリマー鎖に沿って乱雑に分布した脱アセチル化の単位を有する。さらに、分子量は重要なパラメータであり、アセチル化の程度および分布様式と共に、溶解度、生分解性および粘度等のキトサンの特性を規定する。
【０００５】
キトサンは、生体接着性、生体適合性、非毒性、および非免疫原性であり、医学、薬学、化粧品および組織工学の分野において用いることができる。例えば、局所的な眼球用途、眼球内注射および網膜の近辺における移植に対するキトサンの用途が開示された（Felt et al., 1999; Patashnik et al., 1997; Song et al., 2001）。さらに、電気湿式スピニングによる均一なサブミクロンのキトサンファイバーおよび人工筋肉、バイオセンサー、および人工臓器コンポーネントの応用における用途が開示されている（Lee et al., 2006）。キトサンは、例えばリゾチーム等の特定の酵素によって特異的に認識され、開裂するため、生体内分解性および生分解性である（Muzzarelli, 1997; Koga, 1998）。
【０００６】
架橋したキトサンおよび／またはさらなるポリマーと組み合わせたキトサンを有する様々なヒドロゲルが既知であり、例えば、ゲニピンと架橋したキトサン塩化物またはキトサングルタミン酸塩（Mwale et al., 2005）、椎間板細胞をカプセル化する骨格として有効であることが報告され（Roughley et al., 2006）；キトサングラフトポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、軟骨細胞および半月板細胞を取り込むのに有効であると報告され（Chen et al., 2006）；キトサン／ポリ（アクリル酸）ｐＨ−感受性ヒドロゲル（Shi et al., 2004）；キトサン，β−グリセロールリン酸塩およびヒドロキシエチルセルロース（Li et al., 2002）；キトサン／ポリビニルピロリジンｐＨ感受性ヒドロゲル（Risbud et al., 2000）；Ｎ−アセチルキトサンおよびトロップコラーゲン（Hirano et al., 2000）；コンドロイチン硫酸およびキトサン（Sechriest et al., 2000）；パルミトイルグリコールキトサン（Noble et al., 1999）；ポリ（カプロラクトン）−コーポリ（エチレングリコール）−コ−ポリ（カプロラクトン）ジアクリル酸塩およびキトサン（Zhu et al., 2005）；酸化およびＮ−カルボキシエチルキトサン（Weng et al, 2007）がある。
【０００７】
特許文献１は、０．１〜５．０重量％のキトサン；および１．０〜２０重量％のポリオールまたは砂糖の一リン酸二塩基塩を有する多糖ベースのゲル溶液を開示し、前記ゲル溶液は、６．５〜７．４のｐＨおよび２０℃以下の温度で溶液であり、２０〜７０℃の温度範囲内でゲルを形成する。この開示によると、温度感受性のキトサンヒドロゲルは、β−グリセリンリン酸で約８０％脱アセチル化したキトサンを中和することによって調製する。
【０００８】
β−グリセリンリン酸を含む温度感受性キトサンヒドロゲルには、軟骨欠損および軟骨修復を行う商標BST-CarGel（商標）；創傷治療するBST-DermOn（商標）；および膝の痛みを治療するBST-InPod（商標）がある。
【０００９】
前述の先行技術製品および関連する多くの不利益には、制限された分解率、およびグリセリンリン酸または類似の可塑化塩の使用によって与えられる制限があり、β−グリセリンリン酸は、正に帯電した薬品と反応することができる負に帯電した分子的実体であり、それらの沈殿を導く、またはヒドロゲルからのそれらの放出のかく乱を導く。したがって、β−グリセリンリン酸の存在は、キトサン／β−グリセリンリン酸ヒドロゲルを用いることができる薬品の範囲を減少させる。
【００１０】
さらに、ゲル化時間および粘度等のヒドロゲルの特徴の調節は、グリセリンリン酸の濃度に依存し、したがって、β−グリセリンリン酸の溶解度によって制限される。とくに、β−グリセリンリン酸の濃度は、短いゲル化時間に必要であり、投与後のヒドロゲルの迅速排除を避けるのにも必要である。しかし、高濃度のβ−グリセリンリン酸もヒドロゲルの粘度を減少させる。したがって、これらのヒドロゲルは、短いゲル化時間および高粘度の望ましい組み合わせを欠如する。さらに、高濃度のβ−グリセリンリン酸には、投与部位でヒドロゲルの沈殿がある。加えて、キトサン／β−グリセリンリン酸ゲルは、混濁度よって阻止されるため、眼球または典型的な投与等の特定の投与に対して不適切となる。
【００１１】
脱アセチル化および無水酢酸再アセチル化したキトサンを用いる透明なキトサン／β−グリセリンリン酸ヒドロゲルの調製が開示されている（Berger et al., 2004）。この文献によると、キトサン／β−グリセリンリン酸ヒドロゲルの混濁は、キトサンの脱アセチル化の程度および再アセチル化の間の媒体の均一性によって調節し、グルコースアミンモノマーの分散モードに影響を与える。したがって、透明なキトサン／β−グリセリンリン酸ヒドロゲルの調製は、３０〜６０％の脱アセチル化の程度の均一に再アセチル化下キトサンを必要とすると報告されている。
【００１２】
特許文献２は、疑似熱硬化性の中和キトサン化合物を開示し、全化合物を基にして０．１〜２．０重量％、好ましくは０．５〜１重量％有し、８０〜９０％の脱アセチル化の程度を有するキトサン由来の均一に再アセチル化したキトサンから成り、２００ｋＤａより大きい、好ましくは６００ｋＤａより大きい分子量を有し、ＮａＯＨ等の水酸化塩基で中和した、３０〜６０％、好ましくは４５〜５５％の脱アセチル化の程度であり、前記化合物は、５℃より高い温度でリン酸のない透明なヒドロゲルを形成する。この文献によると、キトサンのアセチル化および脱アセチル化モノマーの均一な分布は、対象のヒドロゲルを得るために重要な基準である。さらに、対象のヒドロゲルの整合性は、ジオール、とくに１，３−プロパノールを加えることによって改善される。
【００１３】
特許文献３は、アンジオテンシン変換酵素阻害剤およびアスコルビン酸からセンタ木下薬品をキトサンと組み合わせて有する、制御放出製剤を開示し、ゲル様の複合体は、薬品および中性から酸性の範囲の環境におけるキトサンから成る。この文献によると、キトサンは、８０〜９０％脱アセチル化され、約５〜７０重量％の濃度で製剤において存在する。
【００１４】
特許文献４は、３次元粒子において分散した生存分子で、熱可塑性の半透性膜においてカプセル化した本質的には架橋していないキトサン核マトリクスを有するカプセル化装置を開示し、キトサン核マトリクスは、前記細胞を含むキトサン溶液の沈殿によって形成される。この開示によると、キトサン沈殿物は、一価のイオンを有する緩衝溶液におけるキトサン含有カプセルの置換またはキトサン溶液のｐＨ調整等の十分な数の遊離アミノ基の電荷を除去または隠すいずれかの方法によって達成できる。
【００１５】
特許文献５は、キトサンおよび望ましくない組織接着を防ぐためキトサンに固定化したヘパリンを有する薬剤の組み合わせの用途を開示している。この開示によると、キトサンは、約９０％ものＮ−アセチル化の程度を有し、この薬剤はとりわけ溶液またはゲルの形態で用いる。
【００１６】
特許文献６は、約４０％より小さい、好ましくは約２〜約６％のアセチル化の程度を有し、慢性または急性の創傷の皮膚病変の回復および瘢痕形成に用いる組成物を開示している。
【００１７】
特許文献７は、溶液またはヒドロゲルの形態のイオン性キトサンヨード複合体を開示し、キトサンまたはその誘導体、水溶性運搬体；元素状ヨード；およびヨード源を有する。この開示によると、キトサンは、１０〜１０００ｋＤａ、好ましくは１００〜８００ｋＤａ、および最も好ましくは２５０〜７５０ｋＤａの平均分子量および４０〜９５％、好ましくは６０〜９０％の脱アセチル化の程度を有する。
【００１８】
特許文献８は、異なる程度の脱アセチル化を有するキトサンの断片を有する薬物放出ファイバーおよびそれらの製造方法を開示する。この文献は、特定のキトサンの脱アセチル化の程度を示していない。特許文献９は、接着剤としての遺伝子組み換えヒト血清アルブミンおよび架橋剤としての二機能および多機能アルデヒドを有する生物組織に対する接着剤を開示している。この文献によると、接着剤は、さらなる成分、とりわけ５０％アセチル化キトサン等の部分的にアセチル化したキトサンを有し、さらに、接着剤の水溶液を使用する前に凍結乾燥し、水または注射生理食塩水で再構成する。
【００１９】
特許文献１０は、例えば１０Ｎ  アルカリ等の水溶液で低温膨張させる特定のキチンを少なくとも３６時間投与し、その後、高温でアルカリ溶液と特定の膨張したキトサンを反応させて脱アセチル化を起こすことによってキトサンを調製する方法を開示している。この文献によると、膨張は最高３０℃で行い、脱アセチル化は膨張の段階よりも少なくとも５℃、好ましくは少なくとも２５℃高い温度で行い、また、アセチル化は、０．２〜０．７、とくに０．４５〜０．６の程度を有するキトサン生成物を与えるようにする。この開示された方法は、さらに、脱アセチル化の後に洗浄するステップを有し、この生成物は随意的にはさらに例えばゲルまたは溶液の形態によって修正される。この開示によると、完全に水溶性であり、すなわち、重量９７％であるキトサン生成物は、希釈酸性溶液において溶解する。
【００２０】
特許文献１１は、持続放出または粘膜接着剤および生理活性剤を有する製剤組成物を開示し、この持続放出または粘膜接着剤は、異なる程度のアセチル化（ＦＡ）を有する少なくとも２個のキトサンを有し、少なくとも１個のキトサンは、０．２５〜０．８０（例えば、０．３０〜０．６０または０．３３〜０．５５）の範囲のＦＡ値を有する。また文献は、少なくとも０．１、および好ましくは少なくとも０．２異なるＦＡを有する２個以上のキトサンの混合物を開示し、このキトサンは組成物の重量で５〜９８％を有する。この文献によると、この組成物は、消化管、例えば口腔または直腸的に投与するために適切な形態であり、ゲル等がある。
【００２１】
特許文献１２は、栄養物質および０．２５〜０．８０のアセチル化の程度（ＦＡ）を有するキトサンまたはキトサンの混合物を有する食品を開示している。
【００２２】
特許文献１１および１２は、注射可能な溶液またはゲル形態の溶液を提示していない。これらの文献は、規定の粘度のキトサンヒドロゲルを提示せず、また、キトサンの混合物からのヒドロゲルの調製を開示していない。事実、特許文献１１および１２において記載した組成物および生成物は、中性領域におけるｐＨ値で沈殿するため生理学的条件下でヒドロゲルを形成できない高脱アセチル化キトサン、または中性ｐＨおよび３７℃で溶解できるままの高アセチル化キトサンのいずれかを有する。
【００２３】
特許文献１３は、本発明の優先日の後に開示され、約３０％〜約６０％の範囲のアセチル化の程度を有する少なくとも１種類のキトサンを有するキトサン組成物を開示し、少なくとも１種類のキトサンは、少なくとも７０％のアセチル化の程度を有し、その組成物は、ヒドロゲルからｐＨおよびインド依存性のゲル化を行う。この文献によると、高く脱アセチル化したおよび高アセチル化キトサンのそれぞれの分子量は、１０ｋＤａ〜約４００ｋＤａの範囲であり、高脱アセチル化キトサンは好ましくは約２００ｋＤａより大きい分子量を有し、高アセチル化キトサンは好ましくは約６０ｋＤａより大きい分子量を有する。
【００２４】
粘度、機械的強度、好ましいゲル形成の割合、生理学的条件下での分解および予測可能な薬物放出プロファイルの特性を組み合わせるキトサン組成物を形成するヒドロゲルに対する満たされていないニーズがあり、遅延放出薬物製剤の開発および骨格および再生医療に対する移植に利用できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２５】
【特許文献１】米国特許第６３４４４８８号明細書
【特許文献２】国際公開２００５／０９７８７１号
【特許文献３】米国特許第４７３８８５０号明細書
【特許文献４】米国特許第６１４００８９号明細書
【特許文献５】米国特許第６４８６１４０号明細書
【特許文献６】米国特許公開第２００５／００４２２６５号明細書
【特許文献７】米国特許第６５２１２４３号明細書
【特許文献８】米国特許第６８５８２２２号明細書
【特許文献９】米国特許第６３２９３３７号明細書
【特許文献１０】国際公開第０３／０１１９１２号
【特許文献１１】国際公開第２００４／０６９２３０号
【特許文献１２】国際公開第２００４／０６８９７１号
【特許文献１３】国際公開第２００８／０７２２３０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
本発明は、キトサン組成物を形成するｐＨおよび温度依存性ヒドロゲル、キトサンの混合物を有するゲルおよびそれらの用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明は、部分的に、アセチル化／脱アセチル化の程度に関して異なる２個の異なるキトサンを有する組成物が、特定の分子量の範囲を有し、ｐＨおよび温度の生理学的条件でヒドロゲルを形成するが、中性領域以下のｐＨ値および／または低温、例えば冷凍以下の温度で液体状態にあることに基づくものである。
【００２８】
とくに、組成物は、約２０％以下の範囲のアセチル化の程度を有する第１種類のキトサン（「高脱アセチル化したキトサン」または「タイプ１キトサン」として本願明細書でほとんど同じ意味で示す）；および約４０％〜約６０％の範囲でアセチル化の程度を有する第２種類目のキトサン（「高アセチル化したキトサン」または「タイプ２キトサン」として本願明細書でほとんど同じ意味で示す）を有する。言い換えれば、第１および第２種類のキトサンそれぞれの脱アセチル化の程度は、それぞれ、約８０％〜約１００％の範囲、および約４０％〜約６０％の範囲である。
【００２９】
本発明のキトサンヒドロゲルは、先行技術の１種類のキトサンを有するキトサンゲル形成組成物より有利である。とくに、本願明細書で示すキトサンの組み合わせを用いると、１種類のキトサンを有するゲルまたはヒドロゲルと比較して、その結果できるヒドロゲルの物理的、化学的および薬学的特性が改善される。
【００３０】
いずれかの理論または作用機構に制約されることなく、本発明は、高脱アセチル化キトサンと相互作用する高アセチル化キトサンの能力を利用し、これによって、高アセチル化キトサンの比存在下で同じｐＨ条件下で通常起こる高脱アセチル化キトサンの沈殿を避ける。より詳細には、高脱アセチル化キトサンは遊離アミノ基のプロトン化のために約６．５より高いｐＨ値で水溶液中で沈殿し、したがって、ヒドロゲル形成に対してヒト対象にそれのみで注入するのが不適切である。一方、高アセチル化キトサンは、機械的強度および硬度を与えるためヒドロゲル形成に有利であり、リゾチームに対して低い基質であるため比較的長い時間安定性を示し、それによってゆっくり分解される。高アセチル化キトサンは、高脱アセチル化キトサンの特性を補完するために用いることができるが、これは前者が、生理学的ｐＨで溶解でき、それらを含むヒドロゲルに弾力性および軟性を与え、またリゾチームによってより敏速に分解されるためである。高アセチル化キトサンの高脱アセチル化キトサンとの相互作用は、水素結合、疎水性結合およびファンデルワールス力の組み合わせを介していると考えられ、中性領域におけるｐＨ値で安定なヒドロゲルの形成を可能にし、そのマイクロ環境のｐＨが高脱アセチル化キトサンのｐＫａ値よりも大きいときでさえもその溶解性を維持できる。組成物を形成する開示したヒドロゲルは、様々な医学用途、とくに、遅延放出薬物製剤、骨関節症等の変性状態の粘弾性治療および、組織再生に対する移植および骨格において利用できる。
【００３１】
一つの態様によると、本発明は、約４０％〜約６０％の範囲内におけるアセチル化度を有する高アセチル化キトサンおよび約２０％未満のアセチル化度を有する高脱アセチル化キトサンを有するキトサン組成物を提供し、２５℃および中性領域におけるｐＨで、この組成物は、５０ｒｐｍのせん断速度で少なくとも約１００ｍＰａ・ｓの粘度を有する。特定の実施形態によると、２５℃および中性領域におけるｐＨで、この組成物は、２００ｒｐｍのせん断速度で約７０ｍＰａ・ｓ未満の粘度を有する。
【００３２】
本願明細書で用いる中性ｐＨは、ｐＨ７．０±０．２を示す。
【００３３】
特定の実施形態において、２５℃および中性領域におけるｐＨで、この組成物は、２０ｒｐｍのせん断速度で少なくとも約４００ｍＰａ・ｓの粘度を有し、１００ｒｐｍのせん断速度で約２００ｍＰａ・ｓ未満の粘度を有する。
【００３４】
特定の実施形態において、２５℃および中性領域におけるｐＨで、この組成物は、ｐＨ６．０の同じ組成物の少なくとも２分の１、好ましくは少なくとも３分の１の粘度を有し、この粘度は２０ｒｐｍのせん断速度で規定するものとする。
【００３５】
特定の実施形態によると、１℃および中性領域におけるｐＨで、この組成物は液体の形態である。
【００３６】
特定の実施形態によると、２５℃およびｐＨ６．５±０．２以下で、この組成物は液体の形態である。
【００３７】
他の態様によると、本発明はさらにヒドロゲルの形態のキトサンを提供し、この組成物は、約４０％〜約６０％の範囲内におけるアセチル化度を有する高アセチル化キトサンおよび約２０％未満のアセチル化度を有する高脱アセチル化キトサンを有するキトサン組成物を提供し、２５℃およびｐＨ７．０±０．２で、この組成物は、２０ｒｐｍのせん断速度で少なくとも約１００ｍＰａ・ｓの粘度を有する。
【００３８】
特定の実施形態によると、２５℃およびｐＨ７．０±０．２で、この組成物は、５０ｒｐｍのせん断速度で少なくとも約１００ｍＰａ・ｓの粘度を有する。特定の実施形態によると、２５℃およびｐＨ７．０±０．２で、この組成物は、５０ｒｐｍのせん断速度で少なくとも約２００ｍＰａ・ｓの粘度を有する。特定の実施形態によると、２５℃およびｐＨ７．０±０．２で、この組成物は、２０ｒｐｍのせん断速度で少なくとも約４００ｍＰａ・ｓの粘度を有する。
【００３９】
さらに他の実施形態によると、本発明はさらに、注射可能な溶液の形態のキトサン組成物を提供し、この組成物は、約４０％〜約６０％の範囲内におけるアセチル化度を有する高アセチル化キトサンおよび約２０％未満のアセチル化度を有する高脱アセチル化キトサンを有するキトサン組成物を提供し、２５℃および中性領域以下のｐＨで、この組成物は、５０ｒｐｍのせん断速度で約１５０ｍＰａ・ｓ未満の粘度を有する。
【００４０】
特定の実施形態によると、２５℃および中性領域以下のｐＨで、この組成物は５０ｒｐｍのせん断速度で約１００ｍＰａ・ｓ未満の粘度を有する。
【００４１】
特定の実施形態によると、高アセチル化キトサンは約４５％〜約５５％の範囲内におけるアセチル化度を有し、高脱アセチル化キトサンは約１５％以下のアセチル化度を有する。
【００４２】
特定の実施形態によると、高アセチル化キトサンは均一に再アセチル化したキトサンである。特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは、非均一に脱アセチル化したキトサンである。
【００４３】
特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは少なくとも約１００ｋＤａの分子量を有し、高アセチル化キトサンは少なくとも約２００ｋＤａの分子量を有する。
【００４４】
特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは約１００ｋＤａ〜約２０００ｋＤａの分子量を有し、高アセチル化キトサンは約２００ｋＤａ〜約２０００ｋＤａの分子量を有する。
【００４５】
特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは約１００ｋＤａ〜約７００ｋＤａ、例えば約１００ｋＤａ〜約４００ｋＤａまたは約４００ｋＤａ〜約７００ｋＤａの分子量を有し；高アセチル化キトサンは約２００ｋＤａ〜約２５０ｋＤａの分子量を有する。
【００４６】
特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは約４００ｋＤａ〜約７００ｋＤａの分子量を有し、高アセチル化キトサンは約２００ｋＤａ〜約２５０ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは約１００ｋＤａ；約４００ｋＤａ、および約６５０ｋＤａから成る群から選択される分子量を有し；高アセチル化キトサンは約２００ｋＤａ〜約２５０ｋＤａの分子量を有する。
【００４７】
特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンは、全組成物の約０．２％〜約３％ｗ／ｖの濃度でそれぞれ存在する。他の特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンは、全組成物の約０．５％〜約２％ｗ／ｖの濃度でそれぞれ存在する。他の特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンは、全組成物の約１％〜約１．２％ｗ／ｖの濃度でそれぞれ存在する。
【００４８】
特定の実施形態によると、組成物における高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンの割合は、１：１，１：２，１：３および１：４から成る群から選択する。
【００４９】
特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンはそれぞれ、全組成物の約１％〜約１．２％ｗ／ｖの濃度で存在し、組成物における高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンの割合は、１：１である。
【００５０】
特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは約４００ｋＤａ〜約７００ｋＤａの分子量を有し、高アセチル化キトサンは約２００ｋＤａ〜約２５０ｋＤａの分子量を有し、高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンはそれぞれ、全組成物の約１％〜約１．２％ｗ／ｖの濃度で存在し；組成物における高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンの割合は、１：１である。
【００５１】
特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは約２０００ｋＤａの分子量を有し、高アセチル化キトサンは約２００ｋＤａ〜約２５０ｋＤａの分子量を有し、高脱アセチル化キトサンの濃度は全組成物の０．５％ｗ／ｖであり、高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンの割合は、１：２，１：３および１：４から成る群から選択する。
【００５２】
特定の実施形態によると、ヒドロゲルは、約５０％未満のヒドロゲルはその形成後４日で分解される分解プロファイルを有する。
【００５３】
特定の実施形態によると、この組成物はさらにリゾチーム阻害剤を有し、リゾチーム阻害剤は、タンパク質および単糖から成る群から選択する。特定の実施形態によると、単糖はトリ−Ｎ−アセチル−グルコサミンである。特定の実施形態によると、リゾチーム阻害剤は、高アセチル化キトサンに結合する。特定の実施形態によると、組成物は、高アセチル化キトサンに結合したトリ−Ｎ−アセチル−グルコサミンを有する。
【００５４】
特定の実施形態によると、キトサン組成物はさらに、多糖、リン脂質およびそれら組み合わせから選択した少なくとも１つの負に帯電した物質を有する。特定の実施形態によると、負に帯電した多糖は、動物由来の多糖、植物由来の多糖、グリコサミノグリカンおよびそれら組み合わせから成る群から選択する。特定の実施形態によると、グリコサミノグリカンは、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、ケラタン硫酸から成る群から選択する。
【００５５】
特定の実施形態によると、リン脂質は、ホスファチジルコリンである。特定の実施形態によると、キトサン組成物はさらに、ヒアルロン酸を有し、ホスファチジルコリンは、滑液の交換および／または例えば骨関節症の治療等の粘弾性の治療において用いる。
【００５６】
特定の実施形態によると、組成物は、薬物をカプセル化するキトサンおよび／またはゲルにおいて組み込んだ電気スピンしたキトサンのマイクロスフェアを有する。
【００５７】
特定の実施形態によると、組成物はさらに少なくとも１個の薬物、ポリペプチドおよび細胞（動物細胞または植物細胞等）を有する。
【００５８】
特定の実施形態によると、組成物はさらに乳化剤を有する。特定の実施形態において、キトサンおよび乳化剤はナノ粒子の形である。特定の実施形態において、ナノ粒子はヒドロゲルにおいてカプセル化する。
【００５９】
特定の実施形態によると、組成物は直接的な点滴、注射および内視鏡投与から選択した経路によって投与するように製剤する。
【００６０】
特定の実施形態によると、埋め込み型装置は、ヒドロゲルの形態の組成物を有する。この埋め込み型装置は、組織修復、組織再構築、組織高知己、および組織置換から選択した用途がある。
【００６１】
特定の実施形態によると、抗接着装置は本発明の組成物を有し、心臓胸郭部の手術および腹部の手術等の用途において用いる。
【００６２】
特定の実施形態によると、薬物送達装置またはシステムは本発明の組成物を有する。薬物送達装置またはシステムは、包埋剤の遅延放出のためにある。このシステムにおいて用いる薬物の非限定的な実施例には、例えば、ＡＣＥ−阻害剤、抗炎症薬、眼薬、泌尿器薬等のタンパク質および非タンパク質剤がある。他の実施形態において、化粧品送達装置は本発明の組成物を有する。適切な化粧品の実施例には、皺取り剤がある。薬物送達装置もしくはシステム、または化粧品送達装置はまた、随意的に、１個以上のミネラル、ビタミン、食品添加物またはて植物由来の抽出物等の天然抽出物を有する。ヒドロゲルその物は、随意的に活性成分と共に、食品添加物として用いることができる。
【００６３】
特定の実施形態において、薬物、化粧品、ミネラル、ビタミン、食品添加物または天然抽出物はいずれもナノ粒子の形であり、ナノ粒子は本発明のヒドロゲルにおいてカプセル化する。
【００６４】
特定の実施形態によると、３次元ゲル構築物は本発明の組成物を有し、ヒドロゲルは細胞の支持体である。特定の実施形態によると、細胞は、内生細胞または外生細胞であり、構築物は随意的にさらに外生増殖因子を有する。特定の実施形態によると、細胞積載人工マトリクスは本発明のヒドロゲルを有する。特定の実施形態によると、細胞は軟骨細胞、線維軟骨細胞、靭帯線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、腱細胞、筋線維芽細胞、筋原線維芽細胞、間充織幹細胞および角化細胞から成る群から選択する。
【００６５】
特定の実施形態によると、本発明の組成物の用途に、踵痛を治療する薬剤の調製を提供する。特定の実施形態によると、本発明の組成物の用途に、創傷を治療する薬剤の調製を提供する。特定の実施形態によると、本発明の組成物の用途に、細胞膜を分裂させる薬剤の調製を提供する。特定の実施形態によると、本発明の組成物の用途に、手術接着を予防または治療する薬剤の調製を提供する。特定の実施形態によると、本発明の組成物の用途に、鍵板断裂等の腱板損傷を治療する薬剤の調製を提供し、その薬剤は随意的にはさらに自己細胞を有する。特定の実施形態によると、本発明の組成物の用途に、骨関節症を治療する薬剤の調製を提供し、組成物は随意的にはさらに本願明細書で示すように滑液としてヒアルロン酸およびホスファチジルコリンを有する。
【００６６】
いくつかの実施形態によると、キトサンヒドロゲルは、膣萎縮、乾燥眼、乾燥結膜炎、乾燥鼻後の呼吸器系感染症等の状態を治療する平滑剤、および様々な擦り傷に対する一般的な鎮静剤として用いる。
【００６７】
さらなる態様によると、本発明は、約１００ｋＤａ〜約４０００ｋＤａ、例えば約１００ｋＤａ〜約２０００ｋＤａの範囲内における分子量および約２０％未満のアセチル化度を有する高脱アセチル化キトサンおよび約２００〜約２００００Ｄａの範囲の分子量の単糖オリゴマーを有するキトサン組成物を提供し、組成物は水溶液の形態である。
【００６８】
特定の実施形態によると、単糖オリゴマーは、キトサンオリゴマー；Ｄ−グルコサミンオリゴマーおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンオリゴマーから成る群から選択する。特定の実施形態において、キトサンオリゴマーは、約２０％未満のアセチル化の程度を有する高脱アセチル化キトサンオリゴマー、および約４０％〜約６０％のアセチル化の程度を有する高アセチル化キトサンオリゴマーから成る群から選択する。特定の実施形態によると、高アセチル化キトサンオリゴマーは約４５％〜約５５％の範囲のアセチル化度を有する。特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンオリゴマーは、約１５％以下のアセチル化度を有する。特定の実施形態によると、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンオリゴマーは、最大約７単位を有する。特定の実施形態によると、Ｄ−グルコサミンオリゴマーは、３〜約１００単位を有する。特定の実施形態によると、Ｄ−グルコサミンオリゴマーは、３〜約５０単位を有する。
【００６９】
特定の実施形態によると、単糖オリゴマーおよび約１００ｋＤａ〜約２０００ｋＤａの範囲の分子量を有する高脱アセチル化キトサンの割合は、１：１より大きい。
【００７０】
特定の実施形態において、割合は約２：１〜２０：１である。
【００７１】
特定の実施形態において、２５℃および中性領域以下のｐＨで、組成物は５０ｒｐｍのせん断速度で１５０ｍＰａ・ｓ未満の粘度を有する。特定の実施形態において、２５℃および中性領域以下のｐＨで、組成物は５０ｒｐｍのせん断速度で１００ｍＰａ・ｓ未満の粘度を有する。特定の実施形態において、２５℃および中性領域におけるｐＨで、組成物は２００ｒｐｍのせん断速度で７０ｍＰａ・ｓ未満の粘度を有する。
【００７２】
他の態様によると、本発明は安定なヒドロゲルの生成方法を提供し、この方法は、約４０〜約６０％の範囲内におけるアセチル化度を有する少なくとも１個の高アセチル化キトサン、および約２０％未満のアセチル化度を有する少なくとも１個の高脱アセチル化キトサンを酸性水溶液において溶解させ、複合溶液を形成するステップと；複合溶液のｐＨを値６．５〜７．２に調整するステップと；ｐＨを値７．０から７．６まで上げる間に複合溶液の温度を３７℃まで上昇させるステップとをし、２５℃で５０ｒｐｍのせん断速度で少なくとも１００ｍＰａ・ｓの粘度を有するヒドロゲルを形成する。
【００７３】
断りのない限り、本願明細書で用いるすべての技術的および／または科学的用語は本発明の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味である。本願明細書で記載するのと類似または等価の方法および材料は、本発明の実施形態の実践または試験において用いることができるが、例示的な方法および／または材料を以下で説明する。対立の場合には、定義を含め、明細書を制御する。加えて、材料、方法、および実施例は、ただの例示に過ぎず、必ずしも限定されることはない。
【００７４】
本発明のいくつかの実施形態を、添付の図面につき実施例として本願明細書で記載する。本願明細書で詳細な図面についての詳細と共に、特定に示すものは、実施例および本発明の実施形態の例示的説明の目的である。これに関連して、図面を用いた説明によって、当業者が本発明の実施形態をどのように実践するか理解できる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、２種類の異なるキトサンを有する液体組成物からの本発明のいくつかの実施形態に従ってヒドロゲルの形成を示す。
【図２Ａ】図２は、タイプ１およびタイプ２のキトサンの組み合わせから形成した異なるヒドロゲル組成物の経時分解を示す。図２Ａは、１：１（ダイアモンド印）；１：２（四角印）；および１：３（三角印）の割合でタイプ１キトサン（ＭＷ６５ｋＤａ；ＤＡ１５）と組み合わせたタイプ２キトサン（ＭＷ２２０ｋＤａ；ＤＡ５０）を有する組成物の分解を示し、未分解のままのゲルの重量のパーセンテージで表す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、１：１の割合でタイプ２キトサン（ＭＷ２２０ｋＤａ；ＤＡ５０）および６５ｋＤａおよびＤＡ１５（三角印）または１００ｋＤａおよびＤＡ９（四角印）のいずれかのタイプ１キトサンの組み合わせから形成したヒドロゲル組成物の経時分解を示す。
【図３】図３は、タイプ１キトサン（ＭＷ６５ｋＤａ；ＤＡ１５）およびタイプ２キトサン（ＭＷ２２０ｋＤａ；ＤＡ５０）の組み合わせから形成したヒドロゲル組成物からのヘモグロビンの放出を示し、溶離液におけるタンパク質の量（μｇ／ｍL）によって測定する。ダイアモンド、四角、三角、星、およびアスタリスクによって示したこのシステムは実験の反復を示し、丸印は実験の平均を示す。
【図４】図４は、タイプ１キトサン（ＭＷ６５ｋＤａ；ＤＡ１５）およびタイプ２キトサン（ＭＷ２２０ｋＤａ；ＤＡ５０）の組み合わせから形成したヒドロゲル組成物からのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の放出を示し、溶離液の光学濃度（ＯＤ）によって測定する。ダイアモンド、四角、三角、星、およびアスタリスクによって示したこのシステムは実験の反復を示し、丸印は実験の平均を示す。
【図５】図５は、タイプ１キトサン（ＭＷ６５ｋＤａ；ＤＡ１５）およびタイプ２キトサン（ＭＷ２２０ｋＤａ；ＤＡ５０）の組み合わせから形成したヒドロゲル組成物からのＢＳＡの放出を示す棒グラフである。
【図６】図６は、ＢＳＡを含む（四角印）または含まない（ダイアモンド印）のいずれかの、タイプ１キトサン（ＭＷ６５ｋＤａ；ＤＡ１５）およびタイプ２キトサン（ＭＷ２２０ｋＤａ；ＤＡ５０）の組み合わせから形成したヒドロゲル組成物からの経時分解を示し、未分解のゲルの重量のパーセンテージで示す。
【図７】図７は、タイプ１キトサン（ＭＷ６５ｋＤａ；ＤＡ１５）およびタイプ２キトサン（ＭＷ２２０ｋＤａ；ＤＡ５０）およびＢＳＡの組み合わせから形成したヒドロゲル組成物からの分解プロファイル（三角印）とのＢＳＡの放出プロファイル（四角印）との統合を示す。
【図８】図８は、タイプ１キトサン（ＭＷ６５ｋＤａ；ＤＡ１５）およびタイプ２キトサン（ＭＷ２２０ｋＤａ；ＤＡ５０）の組み合わせから形成したヒドロゲル組成物で処理した（図８Ａ）または未処理（図８Ｂ）のいずれかのラットから取った創傷床の生体検査の組織病理形態を示す。
【図９】図９は、タイプ１キトサン（ＭＷ６５ｋＤａ；ＤＡ１５）およびタイプ２キトサン（ＭＷ２２０ｋＤａ；ＤＡ５０）の組み合わせから形成したヒドロゲル組成物およびアセチルグルコサミンオリゴマー（Ｇｅｌ）での糖尿病ラットにおける創傷の治療の結果を示し、生体検査後７日目の創傷床生体検査の表面積で示す。対照群の動物において、傷は、ギブス包帯で覆う（対照＋カバー）または覆わないままにする（覆わない対照）のいずれかであった。
【図１０】図１０は、鍵板損傷のラットに行ったｉｎ  ｖｉｖｏの実験の結果を示す。縫合後の骨髄細胞を含むキトサンヒドロゲルで処理したラットからの組織スライス（図１０Ａ）は、炎症細胞の移動および欠陥部における回復を示すが、縫合後未処理のラットからのスライス（図１０Ｂ）は、回復の兆しのない空の欠陥部を示す。
【図１１】図１１は、摩擦係数を測定する概略的な図面を示す。
【図１２】図１２は、正常な軟骨の２層間で測定した静止摩擦係数を示し、生理食塩水；高脱アセチル化キトサン（ＭＷ６６０ｋＤａ；ＤＡ１５）および高アセチル化キトサン（ＭＷ２２０ｋＤａ；ＤＡ５０）の組み合わせから形成したヒドロゲル組成物（組み合わせ）；さらにコンドロイチン硫酸を含む同じキトサンの組み合わせ（＋ＣＳ）；さらにコンドロイチン硫酸およびホスファチジルコリンを含む同じキトサンの組み合わせ（＋ＣＳ／ＰＣ）；またはヒアルロン酸（ＨＡ）を用いる。
【図１３】図１３は、２５℃で測定したｐＨの機能として様々なキトサン組成物の粘度を示す。高アセチル化キトサン（ＭＷ２２０ｋＤａ；ＤＡ５０）および高脱アセチル化キトサン（ＭＷ４２０ｋＤａ；ＤＡ９）を含む組成物は、そのものまたは組み合わせのいずれかである。
【図１４】図１４は、２５℃で測定したｐＨの機能として２種類のキトサンを有する組成物の粘度を示す。組成物は、１：１の割合の高脱アセチル化キトサン（ＭＷ６５ｋＤａ；ＤＡ１５）および高アセチル化キトサン（ＭＷ２２０ｋＤａ；ＤＡ５０）の組み合わせ、または１：１の割合の高脱アセチル化キトサン（ＭＷ１００ｋＤａ；ＤＡ９）および高アセチル化キトサン（ＭＷ２２０ｋＤａ；ＤＡ５０）の組み合わせを含む。
【図１５】図１５は、２５℃および様々なせん断速度で測定したときの異なるｐＨ値での２種類のキトサンを有する組成物の粘度を示す。組成物は、様々なｐＨ値での１：１の割合の高脱アセチル化キトサン（ＭＷ１００ｋＤａ；ＤＡ９）および高アセチル化キトサン（ＭＷ２２０ｋＤａ；ＤＡ５０）の組み合わせ（図１５Ａ）；または様々なｐＨ値での１：１の割合の高脱アセチル化キトサン（ＭＷ６５ｋＤａ；ＤＡ１５）および高アセチル化キトサン（ＭＷ２２０ｋＤａ；ＤＡ５０）の組み合わせ（図１５Ｂ）を含む。
【図１６】図１６は、１℃および様々なせん断速度で測定したときの異なるｐＨ値での２種類のキトサンを有する組成物の粘度を示す。組成物は、様々なｐＨ値での１：１の割合の高脱アセチル化キトサン（ＭＷ１００ｋＤａ；ＤＡ１５）および高アセチル化キトサン（ＭＷ２２０ｋＤａ；ＤＡ５０）（ＳＫ１０：５０）の組み合わせ；または様々なｐＨ値での１：１の割合の高脱アセチル化キトサン（ＭＷ６５ｋＤａ；ＤＡ１５）および高アセチル化キトサン（ＭＷ２２０ｋＤａ；ＤＡ５０）の組み合わせ（ＦＶＬ１０：５０）を含む。
【図１７】図１７は、様々なせん断速度で、１℃（図１７Ａ）または２５℃（図１７Ｂ）で、共に様々なｐＨ値で測定したときの、１：１の割合の高脱アセチル化キトサン（ＭＷ１００ｋＤａ；ＤＡ９）および高アセチル化キトサン（ＭＷ２２０ｋＤａ；ＤＡ５０）の組み合わせを有する組成物の粘度を示す。
【図１８】図１８は、様々なせん断速度で、１℃（図１８Ａ）または２５℃（図１８Ｂ）で、共に様々なｐＨ値で測定したときの、１：１の割合の高脱アセチル化キトサン（ＭＷ６５ｋＤａ；ＤＡ１５）および高アセチル化キトサン（ＭＷ２２０ｋＤａ；ＤＡ５０）の組み合わせを有する組成物の粘度を示す。
【図１９】図１９は、２５℃および様々なせん断速度で測定したときの、異なるｐＨ値での２種類のキトサンを有する組成物の粘度を示す。組成物は、様々なｐＨ値で、１：１の割合の高脱アセチル化キトサン（ＭＷ６６０ｋＤａ；ＤＡ１５）および高アセチル化キトサン（ＭＷ２２０ｋＤａ；ＤＡ５０）の組み合わせを有する。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
本発明のｐＨ依存性および温度感受性キトサンヒドロゲルは、１種類のキトサンを有する先行技術のキトサンゲル形成組成物より有利である。とくに、本願明細書で示すキトサンの組み合わせの用途は、１種類のキトサンを有するゲルまたはヒドロゲルと比較して、その結果できたヒドロゲルの物理的、化学的および薬物動態的に改善した特性を示す。本願明細書で用いるように、「１種類のキトサンを有する」組成物は、高脱アセチル化キトサンまたは高アセチル化キトサンのいずれかが組成物において存在する唯一のキトサンである組成物を示す。とくに、例えば国際特許第２００５／０９７８７１号パンフレットにおいて開示されたような、高アセチル化キトサンのみを含むヒドロゲルは、おそらくゲル形成に関与する異なる相互作用のために本発明のヒドロゲルよりも機械的にずっと弱い。加えて、高アセチル化キトサンのみから形成したゲルは、ゲル形成に影響を与える高いキトサン濃度を必要とする、および／または例えば国際特許第２００５／０９７８７１号パンフレットにおいて開示されているように、ゲルの粘弾性挙動を改善するように１，３−プロパンジオール等の添加剤が必要である。さらに、いくつかの場合において、高アセチル化キトサンのみを含む組成物は、低温でしかゲルを形成せず、ｉｎ  ｖｉｖｏ用途で価値がない。最後に、高アセチル化キトサンのみから形成したゲルは、好ましい基質である、リゾチーム等の血清酵素によって敏速に酵素分解される。したがって、このようなゲルは本発明のヒドロゲルと比較してｉｎ  ｖｉｖｏで比較的短い半減期を有し、また、したがって、前者は長期的な回復力および安定性を必要とする遅延放出薬物製剤、移植および装置の準備に対して適切でない。
【００７７】
加えて、高脱アセチル化キトサン自信がそれらのｐＫａより大きいｐＨ値で沈殿し、したがって、例えば米国特許第６３４４４８８号明細書において開示されているように、中性領域におけるｐＨ値でそれらの安定性およびゲル化に影響を与えるβ−グリセロリン硫酸等の添加剤が必要である。このゲルは、背景技術において記載したように、分解速度、ゲル化時間および粘度に関する制限によって阻害される。
定義
【００７８】
本願明細書で用いるように、数値で示して用いるときの用語「約」は、値±１０％を意味する。
【００７９】
本願明細書で用いるように、本発明の組成物に関連する用語「疑似熱硬化性」は、温度は、組成物のゲル化を誘導することはないが、温度が上昇したときにゲル化時間を劇的に短縮する触媒として機能することを意味する。
【００８０】
本願明細書で用いるように、用語「ヒドロゲル」は、少なくとも９０％の水和度を有する３次元高分子ネットワークを示し、定常状態においてほとんど流れを見せない。本発明のキトサンヒドロゲルは、一般的に約６．５以上のｐＨおよび約４℃以上の温度で定常状態に到達する。明確に理解されることには、本発明に従ったキトサンヒドロゲルは、膨張状態において高脱アセチル化キトサン等の１種類のキトサンから形成したキトサンゲルを含まない。
【００８１】
本願明細書で用いるように、用語「粘度」は、せん断力または伸長応力のいずれかによって変形した流体抵抗の測定を示す。ニュートン流体は、幅広いせん断速度で一定の粘度を示す、すなわち、せん断速度から独立しているが、（ポリマーゲル等の）非ニュートン流体は、異なるせん断速度に対して異なる粘度を示す。非ニュートン流体は、せん断力およびせん断速度間の異なる相互作用を示す。一般的に、非ニュートン流体の粘度は、高いせん断速度で減少し（すきばさみとして既知の現象）、また粘度は低いせん断速度で増加する。
【００８２】
動的粘度のＳＩ物理単位は、パスカル−秒（Ｐａ・ｓ）であり、ｋｇ・ｍ−１・ｓ−１と同一である。ミリパスカル（ｍＰａ・ｓ）は０．０１Ｐａ・ｓである。他の単位は平衡における粘度を示すために使用し、パスカル−秒および平衡の間の関係は１０Ｐ＝１ｋｇ・ｍ−１・ｓ−１＝１Ｐａ・ｓである。非ニュートン流体の粘度は、血流計で測定し、特定の応力場または流体に対して変形させ、その結果の変形または力をモニタリングする。
【００８３】
本願明細書で用いるように、キトサンに関連した用語「非均一な脱アセチル化」は、Ｄ−グルコサミンの脱アセチル化単位が様々な大きさおよび／または分布のブロックにおいて起きていることを意味する。本願明細書で用いるように、キトサンに関連した用語「均一な脱アセチル化」は、Ｄ−グルコサミンの脱アセチル化単位はポリマーにおいて乱雑に分布することを意味する。
【００８４】
本願明細書で用いるように、キトサンに関連した用語「均一な再アセチル化」は、脱アセチル化したキトサンが、Ｎ−アセチルＤ−グルコサミン単位およびＤ−グルコサミン単位がポリマーにおいて乱雑に分布するように再アセチル化していることを意味する。
【００８５】
本願明細書で用いるように、用語「中性ｐＨ」、「中性領域におけるｐＨ」、「中性化」「生理学的ｐＨ」等は７．０±０．２のｐＨを意味する。
【００８６】
本願明細書で用いるように、用語「単糖オリゴマー」は、３〜約１００の単量体の重合度を有する単糖を意味する。オリゴマーは、例えばＤ−グルコサミン単位のみの１種類の単糖から形成する、またはキトサンオリゴマーのように例えばＤ−グルコサミン単位およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位等の異なる種類の単糖単位を含む。
【００８７】
用語「有する」、「含む」「持つ」およびそれら類語は、「含むが限定しない」を意味する。
【００８８】
用語「から成る」は、「含むが限定しない」を意味する。
【００８９】
用語「主にから成る」は、組成物、方法または構造がさらなる成分、ステップおよび／もしくは部分を有するが、さらなる成分、ステップおよび／もしくは部分が請求項の組成物、方法または構造の基本的および新規の特徴を材料的に変えることができないときのみである。
【００９０】
本願明細書で用いるように、単数形「ａ」［ａｎ］および［ｔｈｅ］は、とくに断りがない限り複数形を含む。例えば、用語「化合物」または「少なくとも１個の化合物」は、それら混合物を含む、複数の化合物を含む。
【００９１】
購入可能なキトサン等の約７０〜１００％の脱アセチル化の程度（本願明細書でＤＤまたはＤＤＡと示す）まで脱アセチル化したキトサン（すなわち、最大約３０％のアセチル化度、ＤＡ）は、本願明細書でタイプ１キトサンまたはキトサンタイプ１と表す。これらのキトサンは生理学的ｐＨで不溶であり、リゾチームによって認識されにくい。このようなキトサンは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて用いるとき、比較的遅い生分解によって一般的に特徴づけられ、脱アセチル化の程度に依存して、数日から数カ月続く。この種類のキトサンによって形成したゲルは、低いアセチル化度を有し、遊離アミン基は、多くの疎水性相互作用との高密度の水素結合をする。
【００９２】
キトサンの分解速度は、脱アセチル化の程度の機能を示す。キトサンの分解は、細胞増殖およびリモデリングに影響を与える。
【００９３】
高均一に脱アセチル化または再アセチル化したキトサン（約３０％〜約６０％のアセチル化度を有する）は、本願明細書でタイプ２キトサンまたはキトサンタイプ２で表す。このキトサンは、リゾチームによって容易に消化／分解され、したがって、例えば薬物カプセル化の制御された薬物放出を可能にする。
【００９４】
キトサンの脱アセチル化の程度が３０％未満であれば、キトサンは、酸性条件で不溶であり本発明の実施形態において用いるために不適切なキトサンに近いポリマーとなる。７０％以上の脱アセチル化度で、キトサンの沈殿が起こる。
【００９５】
キトサンの脱アセチル化度は、例えば、R.A. Muzarelli and R. Richetti [Carbohydr. Polym. 5, 461-472, 1985 or R.A. Muzarelli and R. Richetti in "Chitin in Nature and Technology", Plenum Press 385-388, 1986] において開示されているような分光光度法によって規定する。簡単に言えば、例えば後者の方法において、キトサンを１％酢酸において溶解し、ＤＤをＮ−アセチル−Ｄ−グルタミン溶液を標準液として用いて２００，２０１，２０２，２０３および２０４でＵＶによってＮ−アセチル−グルコサミンの量を測定することによって測定する。
【００９６】
一つの実施形態によると、本発明は、約４０％〜約６０％の範囲内におけるアセチル化度を有する少なくとも１個の高アセチル化キトサン（タイプ２）および約２０％未満のアセチル化度を有する少なくとも１個の高脱アセチル化キトサン（タイプ１）の組み合わせを有する多糖キトサン組成物に関連する。高くアセチル化したタイプ２キトサンは、高脱アセチル化キトサンタイプ１と静電気の、水素および疎水性相互作用を通して相互作用する。相互作用の程度は、ｐＨの上昇に伴って増加する。両タイプのキトサンの溶液を有する組成物は、グリセロリン酸エステルを必要とすることなく、生理学的ｐＨで安定なゲルを形成することができる。したがって、得られた組成物はグリセロリン酸エステルを欠如している。
【００９７】
したがって、記載するキトサン組成物は、水溶液またはヒドロゲルの形態のいずれかである。液体状態からヒドロゲルへの転移は、約６．５以上のｐＨ条件で起こる。ヒドロゲルは、生理学的条件、すなわち中性領域におけるｐＨおよび３７℃において安定である。
【００９８】
本願明細書で記載する組成物は、室温またはそれ未満の温度（例えば４℃）でゲルを形成することに留意されたい。それにも関わらず、この条件でのゲル形成は遅く、数日から数カ月続くため、水溶液として組成物を保管および転移することができる。
【００９９】
未保護状態におけるタイプ１のキトサンは、生理学的条件ｐＨ以下の約６．５のｐＨで沈殿する。高く疎水性で均一にアセチル化したキトサタイプ２のキトサンタイプ１との相互作用は、水素および疎水性結合の形成によって非均一にアセチル化したタイプ１キトサンのこの沈殿を妨げ、安定な準固体のヒドロゲルが中性領域におけるｐＨ７．０での形成を可能にする。
【０１００】
形成した第２結合は、非均一なキトサン鎖のカプセル化を可能にし、そのｐＫａより大きいｐＨでの溶解度を維持する。一般的に、この第２鎖相互作用は、ゲル形成に関与する主な分子力である（Chenite et al.3 2000; Berger et al., 2005）。
【０１０１】
タイプ１キトサンは、主にゲルの安定性、強度および硬度に寄与し、分解を遅くするが、タイプ２キトサンは、ゲルの軟性、弾力性および速い溶解に寄与する。タイプ１およびタイプ２キトサンを有する組成物の分解プロファイルは、以下の実施例２においてさらに記載し、図２において示す。とくに、本発明は、約１００ｋＤａの分子量を有するタイプ１キトサンおよび２００〜２５０ｋＤａの範囲内の分子量を有するタイプ２キトサンから形成したヒドロゲルは、ほぼ線形の分解速度を提供するが、少なくとも５０％のヒドロゲルがゲル形成後４日間未分解のままである（図２Ｂ）。逆に、低分子量の同じタイプ２キトサンおよびタイプ１キトサンから形成したゲルは、あまり望ましくない２相の分解パターンを示す（図２Ａ）。タイプ２キトサンは、「保護基」または「コーティング」として認識され、タイプ１キトサンの周りに殻を提供し、沈殿を妨げる。
【０１０２】
さらに、タイプ２キトサンはリゾチームによって認識される。この特徴は、本願明細書で記載する組成物から形成したヒドロゲルの分解速度の制御を可能にする。例えば、リゾチーム阻害剤のタイプ２との結合は、タンパク質または単糖であり、形成したヒドロゲルの分解速度を遅くする。リゾチーム阻害剤の適切な実施例は、単糖トリ−Ｎ−アセチルグルコサミンである。代案として、組成物は、実施例４において記載するように、例えば創傷治癒において比較的速い分解速度を有する。
【０１０３】
記載する組成物から形成したヒドロゲルの物理的および化学的特性は、キトサンの分子量および／もしくはアセチル化度を増減する、または異なるソースからのキトサンの自然なアセチル化の多様性ことによって変えることができる。ゲルの特性はさらに、再アセチル化の種類の選択によって（すなわち、均一または非均一）、または脱アセチル化／アセチル化状態の分布パターンを描くことによって制御することができる。
【０１０４】
好ましくは、高アセチル化キトサンは、均一に再アセチル化する。さらに好ましくは、高く脱アセチル化下キトサンは非均一に脱アセチル化する。
【０１０５】
一般的に、購入可能なキトサンは、乾燥キチンフレークの脱アセチル化によって産業的に調製する（Muzzarelli, 1986）。脱アセチル化は、好ましくは、フレークの表面でキチン分子の非晶質領域において起こり、その結果、様々なブロックの大きさの脱アセチル化単位の分布を有する非均一な単量体となる。比較すると、均一条件下の再アセチル化したキトサンは、脱アセチル化した単量体の乱雑な分布を可能にし、キトサンの結晶度を減少させ、逆にその溶解度も減少させる（Aiba, 1991, 1994; Ogawa and Yui, 1993 ; Milot et. al., 1998）。
【０１０６】
非均一な脱アセチル化の方法は、例えば、U.S. Patent No. 4,195,175; Varum et al., pages 127- 136 in "Advances in chitin chemistry", Ed. C. J. Brine, 1992; Ottoy et al., Carbohydrate Polymers 29:17-24 (1996); Sannan et al., Macromol. Chem. 176:1191-1195 (1975); Sannan et al, Macromol. Chem. 177: 3589-3600 (1976); Kurita et al., Chemistry Letters 1597-1598 (1989); and CA 2,101,079において開示されている。
【０１０７】
キトサンの均一な再アセチル化は、アミン基をアセチル基で置換することによって疎水部位の数を増加させる効果を有し、また、キトサンを折れやすくする結晶構造を減少させ、キトサンの上昇した溶解度において堆積する。再アセチル化は、ポリマーの再折り畳みを妨げ、直鎖を維持するため、ｐＨ依存の溶解度の減少を妨げる。一般的に、医薬品グレードおよび十分な分子量の商品であるキトサンはいずれも、再アセチル化したキトサンの調製において用いることができる。均一な再アセチル化の方法は、例えばWO 2005/097871 およびWO 03/011912において開示されている。
【０１０８】
再アセチル化後、生成物を、例えばＵＶ方法（Muzarelli et al. in "Chitin in Nature and Technology", Plenum Press, New York, 385- 388, (1986)）によって測定する脱アセチル化度に関して、および例えばサイズ排除クロマトグラフィー（Felt et al. Int. J. Pharm. 180:185-193 (1999) ）によって規定する分子量に関して特徴づける。
【０１０９】
特定の実施形態において、本願明細書で記載するキトサン組成物は、組成物が２５℃および中性領域におけるｐＨにあるとき５０ｒｐｍのせん断速度で少なくとも１００ｍＰａ・ｓの粘度を有する。より高い２００ｒｐｍのせん断速度で、組成物が同じ温度およびｐＨ条件であるとき、粘度は７０ｍＰａ・ｓを超えない。他の実施形態によると、２５℃およびｐＨ７．０±０．２で、組成物は２０ｒｐｍのせん断速度で少なくとも１００ｍＰａ・ｓの粘度を有する。他の実施形態によると、２５℃および中性領域におけるｐＨで、組成物は２０ｒｐｍのせん断速度で少なくとも４００ｍＰａ・ｓの粘度を有する。他の実施形態によると、２５℃および中性領域におけるｐＨで、組成物は１００ｒｐｍのせん断速度で２００ｍＰａ・ｓ未満の粘度を有する。他の実施形態によると、２５℃およびｐＨ７．０±０．２でヒドロゲル組成物は２０ｒｐｍのせん断速度で少なくとも１００ｍＰａ・ｓの粘度を有する。他の実施形態によると、２５℃およびｐＨ７．０±０．２でヒドロゲル組成物は５０ｒｐｍのせん断速度で少なくとも１００ｍＰａ・ｓ、または少なくとも２００ｍＰａ・ｓの粘度を有する。好ましくは、２５℃および中性領域におけるｐＨで、粘度を２０ｒｐｍのせん断速度で規定するとき、組成物はｐＨ６．０での同じ組成物よりも少なくとも２倍の粘度を有する。また好ましくは、２５℃および中性領域におけるｐＨで、粘度を２０ｒｐｍのせん断速度で規定するとき、組成物はｐＨ６．０での同じ組成物よりも少なくとも３倍の粘度を有する。他の実施形態によると、２５℃および中性領域以下のｐＨで、液体組成物は５０ｒｐｍのせん断速度で約１５０ｍＰａ・ｓ未満の粘度を有する。他の実施形態によると、２５℃および中性領域以下のｐＨで、液体組成物は５０ｒｐｍのせん断速度で約１００ｍＰａ・ｓ未満の粘度を有する。
【０１１０】
例えば図１９において示すように、せん断力が弱くなるにつれて組成物の粘度が高くなる実証は、ヒドロゲルを含むゲルの特性である非ニュートン流体の挙動を示すことである。すなわち、この組成物が未分配の状態のときに、固体のような特性を有するゲルに「なる」が、これは事実、固体と比較して液体により類似した密度を有する高く水和した状態のためである。さらに、この組成物により強い力が加わったとき、ほぼ液体状態のままを維持する。さらに、実施例９において記載するように、本発明のキトサンヒドロゲルは、組成物が中性ｐＨ領域にあるときのみ形成され、低いｐＨ値では加わるせん断力とほぼ独立である低い粘度を示す。言い換えれば、中性領域未満のｐＨでは、組成物はほぼ液体状態であり、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏのゲル形成に対する注射等の投与前に液体状態における低いｐＨおよび／または冷蔵保存に対して安定であることを示す。キトサンの分子量の増加は、その粘度を高くし、このポリマーは高く水和され、また高い疎水性である。これは、例えば、６６０ｋＤａの分子量のタイプ１のキトサンを有する組成物ＦＭ８０：５０  １：１の粘度が組成物ＳＫ１０：５０  １：１よりもずっと高いことを示す実施例９および図１９において実証され、後者は、１００ｋＤａの分子量のタイプ１キトサンを有する。より具体的には、ゲル状態において、これらの組成物はそれぞれ、約４２０および約１１０ｍＰａ・ｓの粘度を示す。したがって、本発明は、様々な強度および水分保持のヒドロゲルの形成を可能にする。これは、当業者も選択した分解速度、薬物放出、および機械的強度のヒドロゲルを生成することができる。
【０１１１】
好ましくは、高アセチル化キトサンおよび高脱アセチル化キトサンのそれぞれは、約１００ｋＤａよりも大きい分子量を有する。特定の実施形態において、高脱アセチル化キトサンは、少なくとも約１００ｋＤａの分子量を有し、高アセチル化キトサンは少なくとも約２００ｋＤａの分子量を有する。他の特定の実施形態において、高脱アセチル化キトサンは、約１００ｋＤａ〜約２０００ｋＤａの範囲内の分子量を有し、高アセチル化キトサンは、約２００ｋＤａ〜約２０００ｋＤａの範囲内の分子量を有する。特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは、約１００ｋＤａ〜約７００ｋＤａ、例えば、約１００ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、または約４００ｋＤａ〜約７００ｋＤａ等の範囲内の分子量を有し、高脱アセチル化キトサンは、約２００ｋＤａ〜約２５０ｋＤａの範囲内の分子量を有する。特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは、約４００ｋＤａ〜約７００ｋＤａの範囲内の分子量を有し、高アセチル化キトサンは、約２００ｋＤａ〜約２５０ｋＤａの範囲内の分子量を有する。特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは、約１００ｋＤａ；約４００ｋＤａ、および約６５０ｋＤａから成る群から選択される分子量を有し、高アセチル化キトサンは、約２００ｋＤａ〜約２５０ｋＤａの範囲内の分子量を有する。
【０１１２】
キトサンの分子量は、例えばO. Felt, P. Purrer, J. M. Mayer, B. Plazonnet, P. Burri and R. Gurny in Int. J. Pharm. 180, 185- 193 (1999)において報告されているように、サイズ排除クロマトグラフィーによって規定する。ＭＷの上限は、必要な投与の簡便性によって規定し、これは選択した用途に依存する。
【０１１３】
アセチル化の程度が高い結果、０〜３０％ＤＡ、高値で４０〜６０％の範囲において疎水性が増加し、ポリマーはＤＡが増加するにつれてより溶解しやすくなる。さらに、Ｎ−アセチルグルコサミンの数が増加すると、リゾチームに対する認識部位の増加によって体内における分解速度が増加する。こうして、ヒドロゲルからの薬物の放出速度はキトサンアセチル化の変化によって制御できる。
【０１１４】
分子量の変化、脱アセチル化の程度およびアセチル化部位の分布、２個以上のキトサンの濃度および割合は、ゲル形成が起こる条件（ｐＨ，温度など）に影響を与え；溶解度；生分解性；タンパク質との結合性；活性薬物成分または他の化学物質；疎水性／親水性；水和度；ゲルの生物学的および生体適合特性、細胞成長、増殖および生存への効果、炎症または抗炎症メディエータとしての機能のキトサンの能力、おとび創傷治癒の加速または減速に対するキトサンの効果等である。
【０１１５】
例えば、高分子量のタイプ１のキトサンは、高い疎水性および高い粘度を有し、その結果高い分子間相互作用によってより強いゲルができる。高いＤＤＡのタイプ１キトサンは、低い分解速度を有する。高い結晶性を有するタイプ１キトサンは、結晶形が不溶であるため低い分解速度を有する。こうして当業者は、その結果できたゲル混合物の特性を予測し、したがって異なる種類のキトサンの独特の組み合わせを用いて所定の特性を有するゲルを形成することができる。
【０１１６】
実施例７および９において示すように、用いるキトサンの分子量の変化、それらの濃度およびタイプ１キトサンおよびタイプ２キトサン間の割合は、ゲル形成が起こる条件に影響を与える。こうして、当業者は、生理学的条件下でヒドロゲルを生成するように適切なパラメータを選択することができる。
【０１１７】
好ましくは、高アセチル化キトサンおよび高脱アセチル化キトサンはそれぞれ、全組成物の約０．２％〜３％ｗ／ｖの濃度で存在する。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、高アセチル化キトサンおよび高脱アセチル化キトサンはそれぞれ、全組成物の約０．５％〜２％ｗ／ｖの濃度で存在する。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、高アセチル化キトサンおよび高脱アセチル化キトサンはそれぞれ、全組成物の約１％〜１．２％ｗ／ｖの濃度で存在する。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、高アセチル化キトサンおよび高脱アセチル化キトサンが、上述の濃度は高アセチル化キトサンおよび高脱アセチル化キトサンのそれぞれに対するものであるように、１：１である。
【０１２１】
他の実施形態において、例えば、用いるキトサンの分子量およびそれら濃度に依存して、割合は２：１、３：１および４：１でもよい。また、１．１：１，１．２：１，１．５：１，１．８：１および１：１〜４：１の範囲でいずれの割合でもよいことが考えられる。
【０１２２】
特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンは全組成物の約１％〜１．２％ｗ／ｖの濃度で存在し、組成物における高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンの割合は１：１である。
【０１２３】
特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは約４００ｋＤａ〜約７００ｋＤａの範囲で分子量を有し、高アセチル化キトサンは約２００ｋＤａ〜約２５０ｋＤａの範囲で分子量を有し、高アセチル化キトサンおよび高脱アセチル化キトサンは全組成物の約１％〜１．２％ｗ／ｖの濃度で存在し；組成物における高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンの割合は１：１である。
【０１２４】
特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは約２０００ｋＤａの範囲で分子量を有し、高アセチル化キトサンは約２００ｋＤａ〜約２５０ｋＤａの範囲で分子量を有し、高脱アセチル化キトサンの濃度は組成物の０．５％ｗ／ｖであり、組成物における高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンの割合は１：２，１：３および１：４である。
【０１２５】
一般的に、ヒドロゲルを形成するために用いるいずれかのキトサン、とくにタイプ１キトサンのＭＷが増加すると、逆にその濃度が下がり、キトサンのＭＷの減少は、ヒドロゲルを形成するためにそれらの高い濃度が必要となることが推測される。
【０１２６】
本願明細書で記載する組成物は、例えば、前述したキトサン／β−グリセロリン酸ヒドロゲルと比較して、形成したヒドロゲルの特性、例えば、ヒドロゲル強度、分解速度、および放出速度等を制御する可能性が必要である。
【０１２７】
本発明のヒドロゲルは、異なる分子量または脱アセチル化度を有するタイプ１またはタイプ２のいずれかから選択した第３キトサンを有し、その結果できたヒドロゲルを制御する。
【０１２８】
本発明に従った多糖ヒドロゲルは、随意的にはさらに、負に帯電した多糖または負に帯電したリン脂質等の負に帯電した物質を有する。負に帯電した多糖は、様々な動物由来の多糖、植物由来の多糖、グルコサミノグリカンおよびそれら組み合わせがある。グリコサミノグリカンには、例えば、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、ケラタン硫酸およびそれら組み合わせがある。
【０１２９】
例示的に適切なリン脂質は、ホスファチジルコリンである。特定の実施形態によると、キトサン組成物はさらにヒアルロン酸およびホスファチジルコニンを有する。この組成物は、骨関節症の治療における滑液の置換として用いることができ高く有効であり、実施例６において記載するように、軟骨表面間の摩擦を軽減する。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、本願明細書で記載するキトサン生成物はさらにグリコサミノグリカンおよびリン脂質の両方を有する。
【０１３１】
このように、これらの２種類のキトサンを基にした異なる組成物および混合物は、広範囲の用途に対して適切な特性を有するヒドロゲルを提供するために用いる。例示的な用途には、限定することはないが、例えば、薬剤または薬物の遅延放出、様々な濃度の足場に対する、薬物送達システムがあり、細胞成長を支持するまたは骨格構造支持に対するゲルもあり；滑液回復；組織再構築；傷跡の残らない治療およびマクロファージ活性化を促進する創傷被覆剤；人工皮膚の製造；人工腎臓膜；骨充填；および踵痛回復および滑液回復組成物がある。
【０１３２】
ヒドロゲルは、そのまま（ｉｎ  ｖｉｖｏ）皮下、腹腔内、筋肉内または生物学的に関連のある組織、骨欠損、骨折、関節腔、体内管、眼袋、または充実性腫瘍において形成する。
【０１３３】
多糖溶液は、動物またはヒト体内に注射または内視鏡投与によって導入する。
【０１３４】
薬物、ポリペプチド、マイクロ生物体、動物またはヒト細胞は、ゲル化する前に多糖溶液内に取り入れる。
【０１３５】
本発明に従うと、本願明細書で記載する組成物から形成した多糖ゲルを、化粧品、薬学、医学および／または手術において用いる生体適合性の分解可能な材料を生成する用途も提供する。
【０１３６】
ここで、ヒドロゲルは、これらの溶液を本願明細書で記載する生理学的条件に露呈するとき、本願明細書で記載するキトサン水溶液から形成した準固体ゲルを包囲する。ヒドロゲルは、好ましくは、キトサン組成物を投与するときｉｎ  ｖｉｖｏで形成するが、代案として、例えば移植等に利用する前にｅｘ  ｖｉｖｏで形成する。
【０１３７】
ゲルは、全体を、または構成物として、動物もしくはヒトのいずれかにおける、移植可能な装置もしくは回復するための移植、組織および／もしくは臓器の再構築および／または再置換に組み込む。
【０１３８】
ゲルは、全体を、または構成物として、移植可能な、経皮的もしくは皮膚的薬物送達システムに用いる。
【０１３９】
ゲルは、全体を、または構成物として、眼科移植または薬物送達システムに用いる。
【０１４０】
ゲルは、同様の生物工学ハイブリッド材料および組織のエンジニアリングおよび培養に用いる細胞搭載（cell-loaded）人工材料を生成するために用いる。
【０１４１】
搭載した細胞は、軟骨細胞（人工滑液）、線維軟骨肉腫（メニスカス）、靭帯線維芽細胞（靭帯）、皮膚線維芽細胞（皮膚）、腱細胞（腱）、筋線維芽細胞（筋肉）、間充織幹細胞、ケラチノサイト（皮膚）、および神経と、含脂肪細胞または骨髄細胞から成る群から選択する。事実、増殖することができるいずれかの組織からの細胞は、随意的にこの構築物において組み込むことができる。
【０１４２】
創傷治癒の主な損傷は、生物膜の存在である。生物膜は、少なくとも８０パーセント存在する、キトサンに類似した通常正に帯電した細胞外高分子から成る。キトサンは随意的には生物膜妨害物として使用し、創傷を衛生にし、バクテリアを破壊するときの生体膜の阻害効果を制限する。ラクトフェリンと混合したキトサンゲルは、随意的にはいずれかの慢性的な創傷または慢性的になる創傷における生体膜を破壊する遅延放出保有宿主として機能する。キシリトールと混合したキトサンゲルも、随意的には特異的な生体膜妨害物となる。
【０１４３】
本発明によると、動物もしくはヒトの生理学的場所での骨様、線維軟骨様、または滑液様のｉｎ  ｓｉｔｕ形成に対する支持体、キャリア、再構成装置または置換体として機能する注射可能なまたは移植可能なゲルバイオ材料としての搭載した多糖ゲルの用途も提供する。
【０１４４】
例えば、本発明に従ったキトサンゲルは、眼の治療に対する持続送達薬物システムとして有効である。キトサン化合物の眼球刺激テストを基にした結果は、キトサン調製物がそれらの優れた耐久力を基にした眼科ゲルとして用いるために適切であることを示す（Molinaro et. al., 2002）。
【０１４５】
本発明のさらなる実施形態によると、遅延放出薬物送達ヒドロゲルシステムは、高くアセチル化したタイプ１キトサンおよび高く脱アセチル化したタイプ２キトサンを有するように提供する。
【０１４６】
本発明のいずれの薬物送達システムは、様々な薬物の送達に使用でき、限定することはないが、鎮痛剤、麻酔薬、抗ニキビ剤、老化防止剤、抗バクテリア剤、構成物質、抗火傷剤、抗鬱剤、抗皮膚炎剤、抗浮腫剤、抗ヒスタミン剤、抗蠕虫感染剤、抗コレステロール症用薬、抗炎症薬、抗刺激剤、抗脂質異常症薬、抗菌剤、抗真菌薬、抗酸化剤、かゆみ止め薬、抗脂質異常症薬、抗酒さ剤、抗脂漏薬、防腐剤、抗膨張剤、抗ウイルス剤、抗酵母剤、心・血管作動薬、化学療法薬、コルチコステロイド、抗カビ剤、ホルモン、ヒドロキシ酸、角質溶解薬、ラクタム、マイトサイド、非ステロイド抗炎症薬、シラミ駆除剤、プロゲスチン、治療薬、疥癬虫殺虫剤、および血管拡張剤がある。
【０１４７】
他の態様によると、本発明は安定なヒドロゲルの生成方法を提供するが、この方法は、酢酸水溶液に約４０〜約６０％の範囲でアセチル化度を有する少なくとも１個の高アセチル化キトサンおよび約２０％以上のアセチル化度を有する少なくとも１個の高脱アセチル化キトサンを溶解し、複合溶液を形成するステップと；複合溶液のｐＨを６．５〜７．２の値に調整するステップと；複合溶液の温度を３７℃まで上げ、ｐＨ値を７．０〜７．６まで上げるステップを有し、２５℃で５０ｒｐｍのせん断速度で少なくとも１００ｍＰａ・ｓの粘度を有するヒドロゲルを形成する。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、高アセチル化キトサンおよび高脱アセチル化キトサンの溶解は、同じ容器において同時に行う。
【０１４９】
随意的には、高アセチル化キトサンおよび高脱アセチル化キトサンの溶解は、別々の溶液において行い２種類の溶液を生成する。この実施形態において、このプロセスはさらに、これらの２種類の溶液を混合して複合溶液を生成するステップを有する。
【０１５０】
さらに本発明のいくつかの実施形態によると、本願明細書で記載するプロセスによって形成したｐＨ依存および温度依存のヒドロゲルを提供する。
【０１５１】
本発明はさらに、高脱アセチル化キトサンおよびキトサンオリゴマー等の様々な単糖オリゴマーの混合物も本願明細書で記載するように所定の特性を有するヒドロゲルを形成することもわかる。
【０１５２】
このように、本発明のさらなる態様によると、約１００〜約４０００ｋＤａ、例えば約１００ｋＤａ~ｙａｋｕ  ２０００ｋＤａ（キトサンポリマー）の範囲で分子量および約２０％以上のアセチル化度を有する少なくとも１個の高脱アセチル化キトサンと、約２００〜約２０００ｋＤａの範囲で分子量を有する少なくとも１個のキトサンオリゴマーを有するキトサン組成物を提供し、この組成物は、水溶液の形である。キトサンオリゴマーは、約２０％以上のアセチル化度を有する高脱アセチル化キトサンオリゴマーである、または代案として、約４０％〜約６０％、例えば約４５％〜約５５％の範囲でアセチル化度を有する高アセチル化キトサンオリゴマーである。特定の実施形態において、高脱アセチル化キトサンオリゴマーは、約１５％以下のアセチル化度を有する。特定の実施形態によると、単糖オリゴマーは３〜約１００の間のＤ−グルコサミンオリゴマーである。特定の実施形態において、Ｄ−グルコサミンオリゴマーは、３〜約５０単位を有する。特定の実施形態において、単糖オリゴマーは最大７単位を有するＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンオリゴマーである。いくつかの実施形態において、単糖オリゴマーおよび高脱アセチル化キトサンポリマー間の割合は１：１であり、とりわけ、高アセチル化キトサンおよびキトサンオリゴマーのＭＷに依存して、２：１〜２０：１の範囲もよい。
【０１５３】
したがって、高アセチル化キトサンの濃度は、例えば、１％、２％、４％、１０％であり、いずれの濃度も１〜２０％（ｗ／ｗ）の範囲内である。
【０１５４】
オリゴマーの濃度は所定の割合にしたがって選択する。
【０１５５】
単糖キトサンオリゴマーは、ｐＨ６．５およびそれ以上で水溶性であり、高アセチル化キトサンの「保護基」として機能し、本願明細書で記載するように高アセチル化キトサンによって影響された類似体と同様である。
【０１５６】
特定の実施形態において、２５℃および中性領域におけるｐＨで、組成物は５０ｒｐｍのせん断速度で少なくとも１００ｍＰａ・ｓの粘度を有する。特定の実施形態において、２５℃および中性領域におけるｐＨで組成物は２００ｒｐｍのせん断速度で７０ｍＰａ・ｓ未満の粘度を有する。
【０１５７】
キトサンポリマーおよびキトサンオリゴマーの組み合わせを有するヒドロゲルは、本願明細書で記載するいずれかの用途において利用でき、実施例８において記載するように調製する。
【０１５８】
本明細書を通して、本発明の様々な実施形態は範囲フォーマットにおいて存在する。範囲フォーマットにおける記載は、単に利便性および簡潔のためであり、本発明の融通のきかない制限として解釈されない。したがって、範囲の説明は、詳細に説明したすべての可能な部分的な範囲および範囲内のそれぞれの数値を有すると考えられる。例えば、１〜６等の範囲の説明は、１〜３，１〜４，１〜５２〜４，２〜６，３〜６などの具体的に説明した部分的な範囲および例えば１，２，３，４，５および６の範囲内のそれぞれの数字として考えられる。これは、範囲の幅に関係なく適応する。
【０１５９】
数の範囲を本願明細書に示す時はいつでも、示した範囲内のいずれかの示した数字（分数または整数）を含むことを意味する。第１数字および第２数字の「間の範囲」および第１数字「から」第２数字「まで」の「範囲」は、本願明細書で置換可能であり、第１および第２数字をおよびすべてのそれらの間の分数および整数を含むことを意味する。
【０１６０】
本願明細書で用いるように、用語「方法」は、与えられたタスクを達成するための方法、手段、技術および手順を意味し、限定することはないが、化学的、薬学的、生物学的、生化学的および医学的技術者の熟練者に既知の、または方法、手段、技術および手順によって容易に応用できるかのいずれかのそれらの方法、手段、技術および手順を示す。
【０１６１】
本願明細書で用いるように、用語「処理」は、状態の進行を無効にする、ほぼ阻害する、遅延するまたは回復させる、状態の臨床的または美観的症状をほぼ改善する、または症状状態の臨床的または美観の症状の発症をほぼ予防することを含む。
【０１６２】
別々の実施形態の内容において明らかに記載するように、本発明の特定の特徴も、一つの実施形態の組み合わせにおいて提供する。逆に、一つの実施形態のないようにおいて簡単のため説明するように、本発明の様々な特徴も、本発明のいずれかの他の示した実施形態において別々にまたは適切な組み合わせにおいて提供する。様々な実施形態の内容において記載した特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしで効果がない限り、それらの実施形態の重要な特徴と考えられる。
【０１６３】
上述したようにおよび以下の請求項において示すように本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例において実験的な支持をされる。
【実施例】
【０１６４】
実施例１
キトサンヒドロゲルの調製
アセチル化度１５％および分子量６５ｋＤａのキトサン（Koyo, Japan）を、０．９％  ＨＣｌと２４時間混合することによって溶解し、３％（ｗ／ｖ）のキトサン濃度を有するタイプ１キトサン溶液を生成した。
【０１６５】
５１％脱アセチル化度および２２０ｋＤａの分子量の均一に脱アセチル化したキトサン（Koyo, Japan)を０．９％  ＨＣｌと２４時間混合することによって溶解し、３％（ｗ／ｖ）のキトサン濃度を有するタイプ２キトサン溶液を生成した。
【０１６６】
タイプ１およびタイプ２キトサン溶液を、タイプ１のタイプ２に対する割合が１：１，１：２および１：３となるように混合し、ｐＨ６．８で滴定し、２４時間４℃で放置し、その後さらに、水酸化ナトリウムでｐＨ７．３まで４℃で滴定した。
【０１６７】
その結果できた組成物は室温で液体であった。温度が３７℃まで上昇しｐＨ７．４まで上昇したとき、液体溶液は図１に示すような安定な準固体ヒドロゲルを生成した。
【０１６８】
実施例２
キトサンヒドロゲルの分解プロファイル
疑似熱硬化性ヒドロゲル（３％ｗ／ｖ）を、上述の実施例１において記載したように、均一にアセチル化したタイプ２キトサンおよび非均一に脱アセチル化したタイプ１キトサンを用いて調製した（ヒドロゲルＡ）。ヒドロゲルＡは、１：１，１：２および１：３の割合で調製した。異なるヒドロゲル（ヒドロゲルＢ）をヒドロゲルＡに対して用いたのと同じタイプ２キトサンおよび分子量１００ｋＤａのタイプ１非均一キトサンを用いて調製した。
【０１６９】
各ゲル１グラムは、３重の５０ｍLのプラスチックチューブに入れた。
【０１７０】
１０％ウシ血清培養液３ｍLアリコートを各チューブに予め定めた時間間隔で（１，２，３，４，５，６および７日目）加えた。各時間間隔の最後に、繰り返し５０ｍLの精製水を加え、数時間室温に放置し、また、水を除去することによって２４時間以上３回洗浄した。洗浄プロセスは、ゲルからのすべての可溶な材料を除去した。
【０１７１】
その後、ゲルを凍結、凍結乾燥および重量を測定した。重量分解は、時間間隔の関数として、サンプルの重量における変化から計算した。
【０１７２】
血清酵素によるヒドロゲルの分解を図２Ａにおいて示す。
【０１７３】
２種類の異なる分解動態は、図２Ａにおいて示した各組成物によって示し；最初の急速相は３〜６日内に終結し、遅い相は、１４日後に部分的な分解を示す。ゲルの分解速度は、タイプ１に対するタイプ２の高い割合を有する組成物においてより敏速であり、すなわち、１：１組成物は１：３組成物より敏速に分解する。急速相は、高い可溶性で容易にタイプ２キトサンの分解に反映し、血清酵素によって容易に認識される。遅延動態相は、キトサンタイプ１に関連し、血清酵素によって容易に認識されず消化されない。
【０１７４】
グルコサミンポリマーの再アセチル化の制御は、リゾチームによるキトサンの認識の程度を操作し、また、その結果ヒドロゲル分解の速度を操作するのに非常に重要なツールである。酵素活性を制御する主な要因は、ポリマーにおけるＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌＮＡｃ）のパーセンテージである（Ran et al., 2005）。この理由は、キトサンタイプ２における再アセチル化度が５０％から３５％への減少が、分解速度を非常に減少させ、その結果ずっと浅い傾きとなる。一方、タイプ１キトサンのアセチル化度が増加すると、その結果、ポリマーの分解が速くなる。２種類のキトサンの適切な組み合わせの選択は、図２Ａにおいて示した２個の傾きの代わりに、経時の１個の線形分解カーブとなる。加えて、タイプ１キトサンの分子量の少なくとも１００ｋＤａまでの増加は、組成物の分解速度を減少させ、図２Ｂにおいて示すように、分解の線形速度となる。
【０１７５】
実施例３
キトサンヒドロゲルによるタンパク質の遅延放出
本願明細書で遅延放出運搬体として示したキトサン疑似熱硬化性ヒドロゲルの潜在力を研究するため、ヘモグロビンおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を溶質として用いた。これらの化合物は、タンパク質標準としてよく用いられる。
【０１７６】
上述の実施例１において記載したキトサン混合物を含み、両キトサンの最終濃度が３．５％である１ｍLの溶液に、ＢＳＡ２５μｌアリコートおよび４０μｌヘモグロビンを加え、その結果、ヒドロゲルにおける最終濃度がそれぞれ４ｍｇ／ｍLおよび１ｍｇ／ｍLとなるようにした。タンパク質含有ヒドロゲルを３ｍLＰＢＳにおいて１週間３７°
で培養した。培地を毎日交換し、図３〜７において示すように、ヒドロゲルから放出されたタンパク質の量を測定した。
【０１７７】
図３において示すように、すべての試験において、多量のヘモグロビンが最初に放出され、放出速度は時間とともに減少した。最初の破裂が示さなかった。
【０１７８】
ＢＳＡはヘモグロビンと同じプロファイルを示した（図４および５）。ほぼ線形の傾きを得た（図４）。ＢＳＡのゲルとの混合は、ゲルの安定性を改善し、キトサン混合物のみと比較してタンパク質放出速度は減少した。
【０１７９】
放出したＢＳＡの量対分解したゲルの量の割合の比較（図７）は、タンパク質の放出速度がゲル分解速度よりも速いことを示した。
【０１８０】
図７において示したデータは、タイプ１キトサンのアセチル化度および分子量に関連し、その結果タンパク質放出プロファイルにおいて毎日放出速度が減少した。しかし、２種類のキトサンのアセチル化度および分子量等のさらなる変数の適切な選択によって、ゲルの特性を規定でき、また、キトサン構造に対するタンパク質薬物の親和性を改良することができる。この特定の組み合わせは、特定の薬物の放出速度を一定にできることが期待され、拡散およびマトリクス分解速度の組み合わせに反映する。
【０１８１】
実施例４
創傷被覆材としてのキトサンヒドロゲルのｉｎ  ｖｉｖｏ研究
デブスナラットは、高脂肪の食事で飼育して育ったとき糖尿病症状を発症することで知られており、２型糖尿病のモデルとして用いた。これらの動物は、重度の感染症、壊疽および敗血症を発症しやすく、病的状態および死さえも引き起こすため、糖尿病の慢性皮膚潰瘍を刺激する、また皮膚創傷治癒の研究に優れたモデルとして考えられる。
【０１８２】
皮膚を評価し創傷を回復させる共通のパラメータには、
１．修復組織において見られる新血管形成の時間
２．好中球活性の減少
３．加速したマクロファージ活性
４．創傷の完全上皮形成による創傷の閉鎖の時間
５．ケラチン生成細胞単分子層の形成
６．線維芽細胞−堆積細胞外マトリクスネットワークによる上皮および真皮相の結合
がある。
【０１８３】
キトサン混合物の組成物は、高脱アセチル化キトサン（６６０ｋＤａ，ＤＡ１５）、高アセチル化キトサン（２２０ｋＤａ，ＤＡ５０）および１〜７単位のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンオリゴマー（Koyo, Osaka, Japan）の混合物を含む。製剤は、それぞれ、１：０．８：０．２の割合の３個の成分を有する。
【０１８４】
２５匹のメス成熟デブスナラット、それぞれ体重１５０〜１６０グラムを用いた。
【０１８５】
１３匹は、０日目の前に４〜６週間開始した高脂肪の食事の投与後糖尿病を発症した。
【０１８６】
正常な血糖値（正常血糖）を有する６匹は、高脂肪食事を与えたとき糖尿病に対して抗体を有し、第１対照として使用し、正常の低脂肪、低カロリーの食事を与えたときの正常血糖を有する６匹を第２対照として使用した。
【０１８７】
０日目に、２ｍｍ直径の丸い貫通パンチ生検を、Ｍｅｔｒｉｃｏｎｖｅｎｔｅｒ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ装置を用いて首の毛を剃った皮膚に、表皮、真皮および筋肉までの皮下組織に施した。
【０１８８】
７匹の糖尿病動物の怪我を、実施例１のキトサンベースのゲルを創傷範囲に投与することによって処理し、さらに６匹の動物を未処理とした。ゲルは、処理群の創傷範囲に毎日再塗布した。対照群における半分の動物において、ギブス包帯を創傷全体に覆い、残りの半分は覆わなかった。
【０１８９】
７日間、すべての動物は超接写写真を撮り、創傷の大きさを３日おきに測定した。体重および血中グルコース濃度をデジタルグルコメーター（Ascensia Elite of Bayer）を用いて、ラットの尾をカットして垂れた血液を吸うことによって１週間に１回測定した。
【０１９０】
７日後、動物を殺し、貫通生検を実行した。皮膚を収集し固定化溶液に入れた。皮膚サンプルをさらに組織学的および免疫組織化学染色し、処理および未処理の創傷の違いを評価した。
【０１９１】
得られた結果は、ゲルで処理したラットが創傷表面面積によって評価すると創傷治癒において統計学的に大きく増加したことを示す（図９）。代表的な組織学的サンプルは、図８Ａにおいて示す滑らかな表面に示すように、創傷治癒を証明するが、対照の未処理のサンプル（図８Ｂ）は創傷治癒を証明しない。
【０１９２】
実施例５
腱板回復
腱板裂傷は、肩痛の一般的な原因である。腱板損傷の発生は、年齢とともに増加し、最も頻度が高いのは、スポーツまたは外傷よりも腱の変性によって起こる。提案される治療は、リハビリテーションから裂傷した腱の手術まで幅広い。最良の治療は、全患者に対して異なり、実際に多くの患者はそれらの怪我の満足な回復を得られていない。
【０１９３】
本発明は、いくつかの実施形態において、自己細胞を超音波診断装置コントロール下で腱板裂傷に送達することができる注射可能な生成物を提供することによって背景技術のこれらの欠点を克服する。他の実施形態において、注射可能な生成物は、例えば組織治癒等の骨髄細胞の移植を可能にする。
【０１９４】
好ましくは、この手順は、外来患者または局所麻酔が必要な外来患者に行う。
【０１９５】
ゲルの最初の液体特性によって腱裂傷範囲にすべて接着させることができる。
【０１９６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験を、腱損傷および回復のためにラットに行った（外科的に損傷させた腱）。損傷した腱を縫合し、本願明細書で示すキトサンヒドロゲルおよび骨髄細胞で処理した；対照の動物は縫合しただけである。２０匹の動物を３カ月実験した。組織学的に、腱の回復および筋肉萎縮の防止が共に達成された。
【０１９７】
さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験を外科的に腱板損傷したラットに行った。この損傷を上述したように処理した。手術後６週間の組織の組織学的スライスは、反対側の肩におけるみ未処理の対照欠陥と比較して、内因性細胞が隣り合う組織から捕捉され、損傷部位の状態を改良したことを示す。例示的な結果を図１０Ａ（処理）および図１０Ｂ（未処理）において示す。
【０１９８】
実施例６
キトサン混合物を、プロテオグリカン（例えばコンドロイチン硫酸）、ヒアルロン酸、および／またはリン脂質（例えばホスファチジルコリン）等の負に帯電した物質の保有宿主として機能するように設計した。この混合物は、正常の滑液を刺激するレオロジー特性を有し、軟骨再生および関節機構の是正、および例えば骨関節症における用途が可能である。
【０１９９】
これらの組成物の特性を評価するため、静止摩擦係数をｉｎ  ｖｉｔｒｏで２個の平坦な軟骨表面間で測定し、様々な試験組成物を用いた。組成物の使用後、軟骨表面を他方の上に一方を載せ、一端をゆっくり徒手で持ち上げた。運動が開始した正確な角度をデジタル傾斜計で測定した。規定を３回にわたって行い、平均静止摩擦係数μを、http://www.pa.uky.edu/~phy211/Friction_book.htmlにおいて開示され図１１において示すように数式μ≦ｔａｎ（傾斜角度）に従って計算した。
【０２００】
図１２は、正常軟骨の２層間の静止摩擦係数を表し：ヒドロゲルを用いていない対照システム（「Ｓａｌｉｎｅ（生理食塩水）」で示す）；キトサンタイプ１（６６０ｋＤａのＭW；ＤＡ１５）およびキトサンタイプ２（２２０ｋＤａのＭＷ；ＤＡ５０）を有するキトサンヒドロゲルの組み合わせ（「Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（組み合わせ）」で示す）；前述したキトサンヒドロゲルの組み合わせにさらに０．１％コンドロイチン硫酸を有する（＋ＣＳと示す）、前述したキトサンヒドロゲルの組み合わせにさらに０．１％コンドロイチン硫酸および０．１％ホスファチジルコリンを有する（＋ＣＳ／ＰＣと示す）、および１％ヒアルロン酸溶液（ＨＡと示す）に対して測定した。
【０２０１】
得られたデータは、コンドロイチン硫酸およびホスファチジルコリンと組み合わせたタイプ１およびタイプ２キトサンを有するヒドロゲル組成物の組み合わせが滑液様の摩擦係数となることを明らかに示す。
【０２０２】
実施例７
キトサンヒドロゲルの形成条件の制御
キトサンポリマー（またはオリゴマー）は、その分子量、その脱アセチル化度、その結晶度およびそのアセチル基の分布モードによって規定する。
【０２０３】
水溶液に脱アセチル化キトサンの溶解は限度がある。例えば、ＨＣｌ０．１５Ｎを用いると、２００ｋＤａ以上のＭＷを有するキトサンは、約１０％（ｗ／ｖ）未満の濃度の溶液となり、分子量が増加すると、最高溶液濃度は生理学的ＮａＣｌ濃度となる。高濃度のＨＣｌ（または酢酸等の他の酸）は、高濃度のキトサン溶液が可能である。
【０２０４】
最も一般的な購入可能なキトサンは、５〜３０％の低ＤＡ（アセチル化度）を有し、本願明細書ではタイプ１キトサンと表す。タイプ１キトサンは、６．５以上のｐＨで溶液から沈殿する。したがって、生理学的環境でタイプ１キトサン溶液は存在せず、キトサンの実施等の現在の用途は、様々な種類の固体キトサンを用いる。
【０２０５】
５０％まで均一に脱アセチル化したまたは３０〜６０％まで均一に再アセチル化したキトサンをタイプ２キトサンと表す。このキトサンは、高脱アセチル化キトサン（タイプ１）と比較して、水溶液において優れた溶解性を有し、また、一般的にその濃度に依存して中性および生理学的ｐＨで溶解する。２２０ｋＤａのＭＷおよび３％（ｗ／ｖ）以上の濃度を有する例示的なこのキトサンは、７．５以上のｐＨでゲルを形成する。
キトサンポリマーの混合物を用いたヒドロゲル形成
【０２０６】
タイプ１キトサンおよびタイプ２キトサンを生理学的ｐＨおよび特定の条件下で混合すると、ポリマーの沈殿は観察されず、その代わり混合物はヒドロゲルを形成する。ヒドロゲル形成には、タイプ１キトサンのタイプ２キトサンによる「被覆」（または「保護」）があり、２種類のキトサン間の親和性によって影響され、それらの間の相互作用をもたらす（例えば、ヒドロゲル結合、疎水性相互作用および／またはファンデルワールス力）。
【０２０７】
ゲル化プロセスは、数分間または何日もかかり、システムの粘度の連続的な増加によって証明される。
【０２０８】
行った（ｅｘ  ｖｉｖｏ）実験において、ヒドロゲル形成は、側面に最初の溶液を有するガラス管を回転させ、溶液が流れるか、またはその代わりに準固体のゲルが形成してガラス管の底に堆積しているかどうかを評価することによって規定する。ゲル形成は、チューブの種類、形態およびパラメータ（例えば直径）および評価時間に依存する。
【０２０９】
この実験において、ヒドロゲル形成は以下のように規定した；１ｍLの溶液を１４ｍｍ（直径）丸底ガラスフラスコにおいて、３７℃で一晩培養した。その後、ガラス管を水平にし、液体の流れがあるかないかを規定した。液体の流れがないことはハイドゲルが形成したことを示す。ヒドロゲルは、全量の水を含みおよび準固体状態において硬いままであった。流れが存在するが「よく区別できない」構造も、ヒドロゲルが形成したことを示す。液体流れの存在および／または２つの異なる相、固体および液体の形成は、ヒドロゲルが形成していないことを示す。
ヒドロゲル形成の制御
材料
【０２１０】
２個の購入可能な高く脱アセチル化したポリマー（キトサンタイプ１）をこの実験において用いた：
ＦＭ（登録商標）８０（ＭＷ＝６６０ｋＤａ；８５％ＤＤＡ（脱アセチル化度）；および
ＦＭ（登録商標）８０Ｓ（ＭＷ＝４２０ｋＤａ；９１．３％ＤＤＡ）を、共にＫｏｙｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎから購入した。
【０２１１】
高アセチル化キトサン（キトサンタイプ２）、ＤＡＣ（登録商標）５０（ＭＷ＝２２０ｋＤａ；５０％ＤＤＡ）もＫｏｙｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎから購入した。
分析プロトコール
【０２１２】
貯蔵液の調製。キトサンポリマー（粉末）をＨＣｌ  ０．１５Ｎで混合し、溶液を２４時間室温で撹拌した。以下のように貯蔵液を作成した：
ＦＭ（登録商標）８０−２  ２％（ｗ／ｖ）溶液
ＦＭ（登録商標）８０Ｓ−２  ２％（ｗ／ｖ）ＤＡＣ（登録商標）５０−３  ３％（ｗ／ｖ）
【０２１３】
混合物生成。上述の貯蔵溶液を用いて、各キトサンの所定の最終濃度（ｗ／ｖ）および所定のそれらの割合を有する混合物を調製した。例示的な混合物は、ＦＭ（登録商標）８０：ＤＡＣ（登録商標）５０が１．２：１．２であり、各キトサンは最終濃度１．２％（ｗ／ｖ）であり、それらの割合が１：１である。
【０２１４】
滴定。上述の混合物を、氷浴で（０℃）ＮａＯＨ（２Ｎ，１Ｎおよび０．５Ｎ濃度）で約７．３のｐＨとなるまでゆっくり滴定した。１ｍLのサンプルをその後混合物から滴定間連続的に取り、各サンプルを１４ｍｍガラス管に入れた。サンプルを密封し、３７℃で一晩培養した。
【０２１５】
ゲル形成試験。各ガラス管を水平にし、ゲル形成を上述のように規定した。
【０２１６】
結果。以下の表１は、様々なＦＭ（登録商標）８０：ＤＡＣ（登録商標）５０混合物に対して得られた結果を示す。
【０２１７】
【表１】
0005746617.tif 000002
【０２１８】
この結果は、１５％ＤＡの６６０ｋＤａキトサンタイプ１（およびＦＭ（登録商標）８０と類似の結晶度）およびＤＡＣ（登録商標）５０の等しい（１：１）ｗ／ｗ割合の混合物は、各キトサンの最終濃度が０．８％（ｗ／ｖ）となるとき、ｐＨ７．５付近でゲルを形成することを示す。
【０２１９】
この混合物は、各キトサンの最終濃度１．２％（ｗ／ｖ）で、各キトサンの最終濃度１％（ｗ／ｖ）の混合物と比較して（７．６〜７．７）、広いｐＨ領域でヒドロゲルを形成し（７．４２〜７．６６）、したがって、最終濃度が高いとヒドロゲル形成に対するｐＨ領域が広くなることを示す（本願明細書で記載する）。
【０２２０】
ＦＭ８０：ＤＡＣ５０割合が１：１より高いとき（例えば１：０．６）、ヒドロゲルは形成されない。
【０２２１】
以下の表２は、様々なＦＭ（登録商標）８０Ｓ：ＤＡＣ（登録商標）５０混合物に対して得られた結果を示す。
【０２２２】
【表２】
0005746617.tif 000003
【０２２３】
これらの結果はさらに、各ポリマーの約１％の最低濃度が示した条件下ｐＨ７．５付近でヒドロゲル形成するために必要であることを支持する。
【０２２４】
これらの実験は、試験したシステムにおいてヒドロゲル形成に影響を与えるパラメータには、ｐＨ，キトサンタイプ１およびタイプ２ポリマーの相対割合（ｗ／ｗ）、各キトサンポリマーの分子量（ＭＷ）、各キトサンポリマーの最終濃度および温度があることを示す。
【０２２５】
ｐＨ。ゲル形成はｐＨ依存であり、溶液混合物は特定のｐＨ領域でのみヒドロゲルを形成する。このｐＨ領域は、キトサンの最終濃度が高くなるほど広くなる。絶対ｐＨ値は、キトサン最終濃度が低くなるほど増加する。
【０２２６】
例えば、４２０ｋＤａのＭＷを有するキトサンタイプ１および２２０ｋＤａのＭＷを有するタイプ２キトサンは、それぞれ１〜１．２％の濃度で１：１ｗ／ｗ割合であり、ゲルが４℃で形成されるｐＨ領域は７．４〜７．７である。高いｐＨ値では、沈殿が観察される。
【０２２７】
４℃でのｐＨ値は、２５℃で０．５低いｐＨ値と相互に関連することに留意されたい。したがって、４℃でのｐＨは、２５℃でｐＨ６．９となる。
【０２２８】
タイプ１キトサンの最終濃度。タイプ１キトサンは、ヒドロゲルの骨格と考えられる。したがって、ヒドロゲル形成は、タイプ１キトサンの最終濃度に依存する。タイプ１キトサンのＭＷが増加すると、組成物における最終濃度が減少し、逆に、すなわち、ＭＷが減少すると組成物における最終濃度が高くなる。
【０２２９】
タイプ１キトサンの分子量。高いＭＷのタイプ１キトサンの使用は、ｐＨ機能領域、すなわちヒドロゲル形成が可能な領域を減少させる。例えば、ＭＷ６６０ｋＤａのタイプ１キトサンを有する組成物は、ｐＨ領域７．４〜７．７においてヒドロゲルを形成するが、ＭＷ２０００ｋＤａのタイプ１キトサンを有する組成物は、ｐＨ領域７．０〜７．３においてヒドロゲルを形成する。さらに、タイプ１キトサンのＭＷが増加すると、必要なタイプ２キトサンの相対濃度が増加する。さらに、タイプ１キトサンの濃度が高くなると（例えば０．５％まで）、ヒドロゲル形成が起こるｐＨ領域が７．２〜７．４までシフトする（４℃で）。
【０２３０】
さらに、タイプ１キトサンのＭＷが減少すると（例えば４２０ｋＤａから２００ｋＤａまで）、ヒドロゲル形成に必要なキトサンの濃度は増加する。２００ｋＤａ以下のＭＷのタイプ１キトサンに必要な例示的な濃度は、１．２〜１．５％（ｗ／ｖ）以上である。この条件下で、ヒドロゲル形成に対するｐＨ値は、７．５〜７．８にシフトする（４℃で）。
【０２３１】
タイプ２キトサンの濃度。タイプ１キトサンおよびタイプ２キトサンの最小相対濃度がヒドロゲル形成に必要である（例えば１：１割合）。加えて、一定の最終濃度にタイプ１キトサンを維持し、タイプ２キトサン濃度を増やすと、ヒドロゲル形成に対する他のパラメータの範囲が広がる（例えば、ｐＨ機能領域が増加する）。タイプ２キトサン濃度の増加は、さらにヒドロゲルが形成するｐＨを低くする。
【０２３２】
タイプ２キトサンの分子量。２２０ｋＤａより高いＭＷのタイプ２キトサンを用いると、混合物におけるタイプ２キトサンの相対濃度が低くなる。高いＭＷのタイプ２キトサンによって、高い保護が起こり、キトサンタイプ１の安定性が改良される（広範囲のタイプ１キトサンのＭＷ）。この条件で、ヒドロゲル形成するｐＨ領域は広がる。
【０２３３】
例えば、ＭＷ２０００ｋＤａのタイプ２キトサンおよびＭＷ６６０ｋＤａのキトサンを用いると、ヒドロゲル形成するｐＨは約７．８であるが、２０００ｋＤａのタイプ２キトサンおよび２０００ｋＤａのタイプ１キトサンを用いると、ヒドロゲル形成するｐＨは約７．６である。
【０２３４】
温度。温度は、ヒドロゲル形成速度に線形的に影響を与える。したがって、３７℃で、ヒドロゲルは室温または４℃よりも速く形成される。
【０２３５】
タイプ１キトサンおよびタイプ２キトサンの相対割合。ヒドロゲル形成に必要な割合は、各キトサンのＭＷに依存する。例えば、タイプ１キトサンのＭＷが増加すると（例えば２０００ｋＤａまで）、必要な濃度は約０．５％まで減少する可能性がある。しかし、タイプ２およびタイプ１間の割合が、例えば２：１，３：１、および４：１まで増加すると推定される。
【０２３６】
タイプ２キトサンのＭＷが２２０ｋＤａから例えば２０００ｋＤａまで増加すると、ヒドロゲル形成に必要な最低濃度は、例えば０．５％（１％の代わり）まで減少し、これは高いＭＷのタイプ１キトサンを用いて割合が約１：１であるときである。
【０２３７】
実施例８
高アセチル化および高脱アセチル化キトサンオリゴマーおよび高脱アセチル化キトサンポリマーから形成したキトサンヒドロゲル
高脱アセチル化キトサンのオリゴマーは、同じ脱アセチル度を有する高脱アセチル化キトサンポリマーと異なり、６．５より高いｐＨで可溶である。したがって、高脱アセチル化キトサンポリマー（例えば２００〜２０００ｋＤａの分子量）のキトサンオリゴマー（例えば２００〜２０００ｋＤａのＭＷ）を組み合わせた混合物からのヒドロゲルの形成を試験した。
【０２３８】
タイプ１キトサンポリマー（ＭＷ６６０）の溶液を、ヒドロゲル形成を評価するため、高く脱アセチル化したオリゴマー（ＭＷ２００〜１５００Ｄａ）の溶液とそれぞれ混合した。高く脱アセチル化したオリゴマーは、溶液において最終濃度１％、２％、４％および１０％で存在し、高く脱アセチル化したポリマーは最終濃度１％で存在した。試験した割合（オリゴマー対ポリマー）は１：１，２：１，４：１および１０：１であった。
【０２３９】
１：１溶液を除いた、すべての試験混合物はキトサンヒドロゲルを形成し、驚くべきことに、高脱アセチル化キトサンの高脱アセチル化キトサンポリマーおよび高脱アセチル化キトサンオリゴマーの混合物はヒドロゲルを形成した。
【０２４０】
同様に、ヒドロゲル形成は、タイプ１キトサンポリマー（ＭＷ４２０；ＤＡ９）および高脱アセチル化キトサンオリゴマー（ＭＷ２００〜２０００Ｄａ）の組み合わせで様々な割合を用いて評価した。加えて、キトサンオリゴマーの位置における異なる単糖を用いた組み合わせを試験した。表３において示すように、その結果は、キトサンヒドロゲルは：単糖およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのオリゴマー；単糖およびＤ−グルコサミンのオリゴマー；フルクトース；メチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロースで形成することを示す。逆に、ヒドロゲル形成はオリゴマーデンプン、ラミナリンまたはイヌリンを用いて観察されなかった。
【０２４１】
【表３】
0005746617.tif 000004
【０２４２】
同様の結果は、すなわち、ヒドロゲル形成は、高脱アセチル化キトサンポリマー（例えばＭＷ２００〜２０００ｋＤａ）および高アセチル化キトサンオリゴマー（例えばＭＷ１０００〜２００００Ｄａ）の混合物に対して得られる。
【０２４３】
実施例９
高アセチル化および高脱アセチル化キトサンポリマーから形成したキトサンヒドロゲルの粘度実験
実施例７において記載した主旨を、キトサンポリマーから形成した様々なヒドロゲルの粘度実験において立証した。
【０２４４】
材料および方法
この実験において用いたキトサンポリマーを、すべてＫｏｙｏ（Osaka, Japan）から購入し、表４において示す。
【０２４５】
【表４】
0005746617.tif 000005
【０２４６】
組み合わせたキトサン溶液を２つのいずれかの方法で調製した。一つの方法では、タイプ１およびタイプ２キトサンの貯蔵溶液をそれぞれ、実施例７において示したように、所定の濃度で調製した。１℃または２５℃のいずれかでＮａＯＨで遅滴の滴定を、所定のｐＨとなるまで行った。代案の方法では、予め重さをはかった粉末のタイプ１およびタイプ２キトサンを、例えばＨＣｌ（０．１５Ｎ）または酢酸（０．２５Ｎ）等の酸性溶液と混合した。可溶化した後、溶液を１℃または２５℃のいずれかで所定のｐＨとなるまでＮａＯＨでゆっくり滴定した。
【０２４７】
ＦＭＬ（登録商標）、ＳＫ（登録商標）１０またはＦＭ（登録商標）８０のいずれかとＤＡＣ（登録商標）５０との混合物を有する溶液を、それぞれ１：１（それぞれＦＶＬ：５０  １：１；ＳＫ１０：５０  １：１およびＦＭ８０：５０  １：１）の割合で調製した。サンプル（０．５ｍL）を５１７８０の範囲係数を有するコーンスピンドルに取り付けたBrookfield RVDV-II+ Pro viscometerにおいて分析した。範囲係数を回転速度（ＲＰＭ）によって分けると、センチポアズ（ｃＰ）において測定した最大粘度を規定する。したがって、例えば、２００ＲＰＭでこのシステムにおいて最大２５０ｃＰの粘度が測定できる。
結果
【０２４８】
図１３は、ＤＡＣ（登録商標）５０を１％（ダイアモンド印）または２％（四角印）；またはＦＭ（登録商標）８０を１％（アスタリスク印）；またはＦＭ（登録商標）８０およびＤＡＣ（登録商標）５０を１：１の割合（楕円印）有する組成物から得た結果を示す。
【０２４９】
図１３において示すように、タイプ１キトサン（ＦＭ（登録商標）８０ＳまたはＦＭ（登録商標）８０）の１％溶液は２５℃で約４．５〜６．５の試験したｐＨ領域において低い粘度を有する。高いｐＨ値まで滴定すると、これらの組成物の粘度は、キトサンが沈殿するため規定できず、明らかにキトサンのｐＫａを超える。これらの結果によって、１個の高脱アセチル化キトサンを有する溶液はｉｎ  ｖｉｖｏの用途に適切でないことがわかる。タイプ２キトサンＤＡＣ（登録商標）５０の１％溶液は、２５℃で約５．４〜約７．６の試験したｐＨ領域においても可溶であり、ｉｎ  ｖｉｖｏで用いることができることに匹敵するが、低い粘度を示しヒドロゲルを形成しない。逆に、溶液ＦＭ８０：５０の１：１の組み合わせの溶液は、図１３において示すように、約６．５のｐＨおよび２５℃で液体から準固体のゲルに転移する。とくに、このｐＨで、組成物は非ニュートン挙動を示し始め、さらにｐＨが高くなるとその粘度が高くなる、すなわち、ｐＨ６．９で約１７５ｍＰａ・ｓの粘度となる。これらの結果は、分子量６６０ｋＤａの１５％アセチル化した（すなわち高く脱アセチル化した）キトサンおよび分子量２２０ｋＤａの５０％アセチル化した（すなわち高くアセチル化した）キトサンの１：１の混合物が生理学的条件でヒドロゲルを形成するために適切なことを示す。
【０２５０】
図１４は、高脱アセチル化キトサンＦＶＬ（登録商標）および高アセチル化キトサンＤＡＣ（登録商標）５０の１：１の割合の組み合わせ（ダイアモンド印）；まあは高脱アセチル化キトサンＳＫ（登録商標）１０およびＤＡＣ（登録商標）５０の１：１の割合の組み合わせ（四角印）を有する組成物で得られた結果を示す。図１４は、各混合物ＦＶＬ：５０  １：１およびＳＫ１０：５０  １：１は中性に近いｐＨ値で粘度が大きく増加し、準固体のヒドロゲルを形成することを示す。これらの結果は、高アセチル化キトサンの高脱アセチル化キトサンとの組み合わせが、中性ｐＨで後者の沈殿を防ぎ、ヒドロゲル形成を可能にすることを確証する。加えて、ＳＫ１０：５０の１：１の粘度は、ｐＨ値全体でＦＶＬ：５０  １：１よりもずっと高い。とくに、ｐＨ約７で、これらの混合物はそれぞれ約５５および４２ｍＰａ・ｓの粘度を示す。これらの混合物は、高脱アセチル化キトサンの分子量のみが異なる、すなわちそれぞれ１００および６５０ｋＤａであるため、高脱アセチル化キトサンの分子量が、本発明のヒドロゲル組成物の粘度および非ニュートン流体の挙動を規定するためにｐＨとともに重要な要素であることを示す。
【０２５１】
これらの結論はさらに、ＳＫ（登録商標）１０およびＤＡＣ（登録商標）５０の１：１の割合の組み合わせで（図１５Ａ）ｐＨ５．１３（ｘ印）；５．６７（白四角印）；６（白三角印）；６．２４（白ダイアモンド印）；６．５１（アスタリスク印）；６．６５（黒丸印）；６．７５（白丸印）；６．８７（黒ダイアモンド印）および７（黒四角印）；またはＦＶＬ（登録商標）およびＤＡＣ（登録商標）５０の１：１の割合の組み合わせで（図１５Ｂ）ｐＨ５．４５（白ダイアモンド印）；５．７（黒四角印）；６．０４（白三角印）；６．３（ｘ印）；６．５６（アスタリスク印）；６．６８（黒丸印）；６．８２（黒三角印）；６．８８（黒ダイアモンド印）および７．０３（白四角印）を有する組成物で得た、図１５における結果によって支持される。
【０２５２】
図１５Ａは、溶液のｐＨ値が中性領域、すなわち６．８７および７のとき、ＳＫ１０：５０の１：１の粘度はせん断速度が減少すると劇的に増加するが、低いｐＨ値では、同じ組成物はせん断速度の減少に伴う粘度の増加を示さないことを示す。すなわち、ＳＫ１０：５０の１：１は、中性領域未満のｐＨ値でニュートン流体挙動を示し、中性領域におけるｐＨで非ニュートン流体挙動を示す。逆に、ＦＶＬ：５０の１：１は、中性ｐＨでせん断速度が減少するとき粘度が少ししか増加せず、液体状態のままであり（図１５Ｂ）、ＳＫ１０：５０  １：１における１０５ｍＰａ・ｓと比較して約３５ｍＰａ・ｓのピーク粘度となる。
【０２５３】
図１６は、低温、すなわち１℃で、本発明の組成物におけるｐＨ誘起粘度増加を縮小させたことを示す。この図における結果は、ＳＫ（登録商標）１０およびＤＡＣ（登録商標）５０（ＳＫ１０：５０）の１：１の割合の組み合わせでｐＨ５．３５（黒丸印）；５．９２（黒ダイアモンド印）；６．２２（アスタリスク印）；６．８１（黒四角印）；６．９５（黒三角印）および７．０１（ｘ印）；またはＦＶＬおよびＤＡＣ（登録商標）５０（ＦＶＬ１０：５０）の１：１１の割合の組み合わせでｐＨ５．８５（白ダイアモンド印）；６．２（グレー四角印）；６．４４（白三角印）；６．７６（グレー三角印）；６．９４（白四角印）および７．００（白丸印）を有する組成物で得られた。
【０２５４】
１℃で、ＳＫ１０：５０  １：１は、２５℃で観察された劇的な増加と比較して、粘度のゆるやかな増加しか示さない。より具体的には、１℃でおよび低いせん断速度で、ＳＫ１０：５０  １：１の粘度は、ｐＨが約５．３から約７まで増加すると、５０から６５ｍＰａ・ｓまで増加するが（すなわち３０％増加）、２５℃および低いせん断速度で、同じ組成物の粘度は、ｐＨが同じように増加すると、２０から１１０ｍＰａ・ｓまで増加する（すなわち５５％増加）（図１５Ａ）。これは、本発明に従ったキトサン組成物は、液体または比較してゲル化していない状態において保存するために低い温度で保管することを提案する。注意されたいのは、中性ｐＨおよび低いせん断速度で、ＦＶＬ：５０  １：１は、２５℃と比較して１℃で大きな粘度を示し（図１５Ｂと図１６の比較）、室温およびそれ以上の温度までの温度が上がると粘度が減少する傾向があるため、この組成物のｉｎ  ｖｉｖｏでのヒドロゲル形成に対する用途を提案する。
【０２５５】
図１７は、様々なせん断速度および１℃で測定したときのＳＫ（登録商標）１０およびＤＡＣ（登録商標）５０の１：１の割合の組み合わせを有する組成物で（図１７Ａ）、組成物は、ｐＨ５．３５（縦棒記号）；５．９２（丸記号）；６．２２（アスタリスク印）；６．４５（ｘ印）；６．８１（三角印）；６．９５（四角印）および７．０１（ダイアモンド印）；または２５℃で（図１７Ｂ）、組成物はｐＨ５．１３（ｘ印）；５．６７（白四角印）；６（白三角印）；６．２４（白ダイアモンド印）；６．５１（アスタリスク印）；６．６５（黒丸印）；６．７５（白丸印）；６．８７（黒ダイアモンド印）および７（黒四角印）を有する組成物で得た結果を示す。１℃および２５℃共に、ＳＫ１０：５０  １：１は、５．３５〜６．８のｐＨ値領域全体でニュートン流体挙動を示し、粘度はせん断力に関わりなく粘度が比較的変化しない、すなわち、せん弾力２００〜５０ｒｐｍ間で粘度の変化が見られないことを示す。しかし、約６．８以上のｐＨ値で、組成物はせん断力が増加したとき粘度の増加を示し、非ニュートン流体挙動を示す。この増加は、とくに２５℃で明らかであり、ｐＨ７でせん断力が２００から５０ｒｐｍまで減少するとき粘度は６５から１１０ｍＰａ・ｓまで増加する（図１７、パネルＢ）。これらの条件下で（ｐＨ７、２５℃）、組成物は粘度を増加し続け、時間とともにヒドロゲル形成を行う。逆に、１℃で、粘度は約５５から約６５ｍＰａ・ｓまでしか増加しない（図１７、パネルＡ）。留意するべき事に、ｐＨ６．８およびそれ以下のｐＨを有する組成物は、１℃での同じ組成物と比較して２５℃で低い粘度を示し、生理学的ｐＨおよび温度の状態がヒドロゲル形成に最適であることが示唆される。
【０２５６】
図１８は、約１００ｋＤａ未満の分子量の高脱アセチル化キトサンを有する組み合わせたキトサン組成物が、生理学的条件下でゲル形成に適切でないことを示す。この図における結果は、ＦＶＬ（登録商標）およびＤＡＣ（登録商標）５０を１：１の割合で組み合わせたもので、様々なせん断速度および１℃で（図１８Ａ）測定し、組成物はｐＨ５．８５（丸印）；６．２（アスタリスク印）；６．４４（ｘ印）；６．７６（三角印）；６．９４（四角印）および７．００（ダイアモンド印）；または２５℃で測定し（図１８Ｂ）。組成物は５．４５（白ダイアモンド印；５．７（白四角印）；６．０４（白三角印）；６．３（ｘ印）；６．５６（アスタリスク印）；６．６８（丸印）；６．８２（黒三角印）；６．８８（黒ダイアモンド印）および７．０３（黒四角印）を有する。
【０２５７】
示すように、ＦＶＬ：５０  １：１は、ｐＨが中性に近づくにつれて粘度が増加するが、ゲル形成は１℃（図１８Ａ）でも２５℃でも（図１８Ｂ）でもゲルは形成されない。事実、前述したように、この組成物は、２５℃と比較して１℃で高い粘度を示す（中性ｐＨ，低せん断速度）。この結果は、高脱アセチル化キトサンの分子量が本発明の組成物におけるゲル形成を規定するために重要なパラメータであることを示す。
【０２５８】
図１９は、高脱アセチル化キトサンの分子量の増加がそれらの粘度を改善する子を示し、ＦＭ（登録商標）８０およびＤＡＣ（登録商標）５０の１：１の割合の組み合わせでｐＨ４．８１（ダイアモンド印）；５．９３（四角印）；６．２４（トライアングル印）；６．４３（ｘ印）；６．６４（アスタリスク印）および６．９１（丸印）を有する組成物を示す。２５℃で、ＦＭ８０：５０  １：１は、ＳＫ１０：５０  １：１（約６．８〜約６．９）と比較して低いｐＨで（約６．４〜約６．６）ヒドロゲル形成を開始する（図１７Ｂ参照）。さらに、中性ｐＨで達した粘度は、高い分子量のタイプ１キトサンを有する組成物において非常に高く、すなわち、ＦＭ８０：５０  １：１に対して４２０ｍＰａ・ｓであるのに対し、ＳＫ１０：５０  １：１で約１１０ｍＰａ・ｓである。これらの結果は、タイプ１キトサンの分子量は用途によって異なるが、それでもヒドロゲル形成できることを示す。例えば、より粘度の高いヒドロゲルは、ｉｎ  ｖｉｖｏの持続的な耐久性を必要とする移植に望ましいが、低い粘度のヒドロゲルは、遅延放出薬物製剤の所定の放出特性を達成するために十分である。
【０２５９】
本発明を特定の実施形態に基づいて記載したが、多くの代替案、修正および変化が当業者には明らかである。したがって、このすべての代替案、修正および変化は、添付の請求項の範囲内であるとする。
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【図１】
0005746617.tif 000006
【図２Ａ】
0005746617.tif 000007
【図２Ｂ】
0005746617.tif 000008
【図３】
0005746617.tif 000009
【図４】
0005746617.tif 000010
【図５】
0005746617.tif 000011
【図６】
0005746617.tif 000012
【図７】
0005746617.tif 000013
【図８Ａ】
0005746617.tif 000014
【図８Ｂ】
0005746617.tif 000015
【図９】
0005746617.tif 000016
【図１０】
0005746617.tif 000017
【図１１】
0005746617.tif 000018
【図１２】
0005746617.tif 000019
【図１３】
0005746617.tif 000020
【図１４】
0005746617.tif 000021
【図１５】
0005746617.tif 000022
【図１６】
0005746617.tif 000023
【図１７】
0005746617.tif 000024
【図１８】
0005746617.tif 000025
【図１９】
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