(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄接着間質細胞を、神経系傷害又は疾患の部位への移植後に神経回復及び／又は神経再生を刺激することができる細胞に変換する方法であって、
（ｉ）前記骨髄接着間質細胞におけるＰＩＴＸ２、ＤＮＭＴ３ｂ、ＩＧＦ２Ｒ及びＳＤＦ４遺伝子のメチル化を増加させること、並びに
（ii）ＲＯＰＮ１Ｌ及びＴＭＥＭ１７９遺伝子のメチル化を減少させること
を含み、
ここで前記骨髄接着間質細胞及びその子孫細胞のいずれも、Notch細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチドでトランスフェクトされていない、方法。
【請求項２】
in vitroでの培養をとおして骨髄接着間質細胞に由来する細胞であって、ここで：
（ａ）神経組織の成長及び／又は再生を援助し；
（ｂ）ＰＩＴＸ２、ＤＮＭＴ３ｂ、ＩＧＦ２Ｒ及びＳＤＦ４遺伝子のメチル化が前記骨髄接着間質細胞と比べて増加しており；
（ｃ）ＲＯＰＮ１Ｌ及びＴＭＥＭ１７９遺伝子のメチル化が前記骨髄接着間質細胞と比べて減少しており；並びに
（ｄ）in vitroでの培養中、上記骨髄接着間質細胞及びその子孫のいずれも、Notch細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチドでトランスフェクトされていない、
細胞。
【請求項３】
上記ＰＩＴＸ２、ＤＮＭＴ３ｂ、ＩＧＦ２Ｒ及びＳＤＦ４遺伝子のメチル化状態が、前記骨髄接着間質細胞をメチル化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを含む１又は複数の融合タンパク質と、又はメチル化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする１又は複数の核酸と接触させることにより増加されており、ここで上記ＤＮＡ結合ドメインは、上記ＰＩＴＸ２、ＤＮＭＴ３ｂ、ＩＧＦ２Ｒ及びＳＤＦ４遺伝子の各々の中の１又は複数の配列に結合するように改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記ＲＯＰＮ１Ｌ及びＴＭＥＭ１７９遺伝子のメチル化状態が、前記骨髄接着間質細胞を脱メチル化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを含む１又は複数の融合タンパク質と、又は脱メチル化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする１又は複数の核酸と接触させることにより減少されており、ここで上記ＤＮＡ結合ドメインは、上記ＲＯＰＮ１Ｌ及びＴＭＥＭ１７９遺伝子の各々の中の１又は複数の配列に結合するように改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記ＰＩＴＸ２、ＤＮＭＴ３ｂ、ＩＧＦ２Ｒ及びＳＤＦ４遺伝子のメチル化状態が、前記骨髄接着間質細胞をメチル化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを含む１又は複数の融合タンパク質と、又はメチル化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする１又は複数の核酸と接触させることにより増大されており、ここで上記ＤＮＡ結合ドメインは、上記ＰＩＴＸ２、ＤＮＭＴ３ｂ、ＩＧＦ２Ｒ及びＳＤＦ４遺伝子の各々の中の１又は複数の配列に結合するように改変されている、請求項２に記載の細胞。
【請求項６】
上記ＲＯＰＮ１Ｌ及びＴＭＥＭ１７９遺伝子のメチル化状態が、前記骨髄接着間質細胞を脱メチル化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを含む１又は複数の融合タンパク質と、又は脱メチル化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする１又は複数の核酸と接触させることにより減少されており、ここで上記ＤＮＡ結合ドメインは、上記ＲＯＰＮ１Ｌ及びＴＭＥＭ１７９遺伝子の各々の中の１又は複数の配列に結合するように改変されている、請求項２に記載の細胞。
【請求項７】
神経系傷害又は疾患の部位への移植後に神経回復及び／又は神経再生を刺激することができる、骨髄接着幹細胞に由来する子孫細胞の同定方法であって、細胞におけるＰＩＴＸ２、ＤＮＭＴ３ｂ、ＩＧＦ２Ｒ、ＳＤＦ４、ＲＯＰＮ１Ｌ及びＴＭＥＭ１７９遺伝子のメチル化状態を分析することを含み、ここで、
（ｉ）ＰＩＴＸ２、ＤＮＭＴ３ｂ、ＩＧＦ２Ｒ及びＳＤＦ４遺伝子のメチル化が増加し、並びに
（ii）ＲＯＰＮ１Ｌ及びＴＭＥＭ１７９遺伝子のメチル化が減少している細胞を、上記子孫細胞として同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は神経障害のための細胞治療及び遺伝子発現及び分化の後成的な調節の分野におけるものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞分化は部分的には遺伝子発現の調節により制御されている。転写の調節；すなわち、ｍＲＮＡ分子の合成のための鋳型としてのＤＮＡの使用は遺伝子発現が調節される機構の一つである。遺伝子発現の転写調節は例えば、クロマチン構造の変化及び／又は上記遺伝子内の又は上記遺伝子近辺の特定のＤＮＡ配列への転写調節タンパク質の結合から起こりうる。
【０００３】
遺伝子発現の転写制御が成し遂げられる他の方法はＤＮＡの化学的改変による。この型の調節の最も広く研究されている局面はＤＮＡメチル化である。真核生物ゲノムでは、ＤＮＡメチル化の基本的な型はいくつかの細胞メチルトランスフェラーゼの１つの活性をとおした、シトシンの５‐メチル‐シトシンへの変換である。ほとんどの場合、メチル化Ｃ残基はＧ残基の上流に直接的に局在している。一般的に、遺伝子内の又は遺伝子近辺のＣ残基のメチル化は上記遺伝子の減少された発現と相関している。ほとんどの場合、ＣｐＧメチル化はそれ自体、遺伝子の転写抑制の近因ではないが、遺伝子調節タンパク質によりはじめに仲介される転写抑制を永続させるための機構であるように見える。
【０００４】
ある非細胞型特異的脊椎動物遺伝子（すなわち、ハウスキーピング遺伝子）の上流領域におけるＣＧジヌクレオチド配列の頻度は上記ゲノムのＧＣ含有量に基づいて予想されるであろうよりずいぶん高い；上記領域はＣｐＧ島として知られている。ＣｐＧ島はＣ残基のメチル化状態が関連遺伝子の転写に影響しうる部位である。逆に、特定の遺伝子に関連するＣｐＧ島又は他の領域におけるＣ残基のメチル化状態はその遺伝子の転写状態の有力な指標として及び／又は特定の細胞型を特徴づける診断マーカーとして使用されうる。例えば、ＷＯ２００６／０９４８３６を参照のこと。
【発明の概要】
【０００５】
要約
神経系傷害又は疾患の部位への移植後に神経回復及び／又は神経再生を刺激することができる細胞が本明細書中に開示されている。ある態様において、上記細胞は骨髄接着幹細胞（ＭＡＳＣｓ）に由来しているが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの処理及び培養後にある遺伝子のメチル化状態において改変している。したがって、本発明者は、１又は複数の遺伝子のメチル化状態の改変は前駆細胞を上記前駆細胞が有さなかった神経再生特性を有する子孫細胞に変換しうることを発見した。
【０００６】
この発見の結果として、本開示はとりわけ、以下の態様を含む：
１．細胞内の遺伝子のメチル化状態の改変方法であって：
（ａ）Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列を含むポリヌクレオチドで上記細胞をトランスフェクトすること；及び
（ｂ）上記細胞又は上記細胞の１又は複数の子孫における遺伝子のメチル化状態がトランスフェクトされていない細胞における上記遺伝子と比較して改変されており、それにより上記遺伝子のメチル化状態が改変されている、上記トランスフェクトされた細胞を培養すること
を含む方法。
２．上記遺伝子がＰＩＴＸ２遺伝子である、態様１の方法。
３．上記遺伝子がＤＮＭＴ３ｂ遺伝子である、態様１の方法。
４．上記遺伝子がＩＧＦ２Ｒ遺伝子である、態様１の方法。
５．上記遺伝子がＳＤＦ４遺伝子である、態様１の方法。
６．上記遺伝子がＲＯＰＮ１Ｌ遺伝子である、態様１の方法。
７．上記遺伝子がＴＭＥＭ１７９遺伝子である、態様１の方法。
８．上記遺伝子のメチル化が上記子孫細胞において増加している、態様１〜５のいずれかの方法。
９．上記遺伝子のメチル化が上記子孫細胞において減少している、態様１、６又は７のいずれかの方法。
１０．配列Ｃ‐Ａ‐Ｔ‐Ｃme‐Ｇ‐Ｃ‐Ｃ‐ＣがＣ‐Ａ‐Ｔ‐Ｃ‐Ｇ‐Ｃ‐Ｃ‐Ｃに変換されている、態様９の方法。
１１．上記細胞が骨髄接着間質細胞（ＭＡＳＣ）である、態様１〜１０のいずれかの方法。
１２．遺伝子のメチル化状態が改変されている子孫細胞の作出方法であって：
（ａ）Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列を含むポリヌクレオチドで前駆細胞をトランスフェクトすること；
（ｂ）上記トランスフェクトされた細胞を培養すること；及び
（ｃ）上記トランスフェクトされた細胞の子孫の中から、上記遺伝子のメチル化状態が改変されている１又は複数の子孫細胞を得ること
を含む方法。
１３．上記遺伝子がＰＩＴＸ２遺伝子である、態様１２の方法。
１４．上記遺伝子がＤＮＭＴ３ｂ遺伝子である、態様１２の方法。
１５．上記遺伝子がＩＧＦ２Ｒ遺伝子である、態様１２の方法。
１６．上記遺伝子がＳＤＦ４遺伝子である、態様１２の方法。
１７．上記遺伝子がＲＯＰＮ１Ｌ遺伝子である、態様１２の方法。
１８．上記遺伝子がＴＭＥＭ１７９遺伝子である、態様１２の方法。
１９．上記遺伝子のメチル化が上記前駆細胞と比較して上記子孫細胞において増加している、態様１２〜１６のいずれかの方法。
２０．上記遺伝子のメチル化が上記前駆細胞と比較して上記子孫細胞において減少している、態様１２又は１７又は１８のいずれかの方法。
２１．配列Ｃ‐Ａ‐Ｔ‐Ｃme‐Ｇ‐Ｃ‐Ｃ‐ＣがＣ‐Ａ‐Ｔ‐Ｃ‐Ｇ‐Ｃ‐Ｃ‐Ｃに変換されている、態様２０の方法。
２２．上記前駆細胞が骨髄接着間質細胞（ＭＡＳＣ）である、態様１２〜２１のいずれかの方法。
２３．前駆細胞を神経再生細胞に変換する方法であって、上記原種細胞中の１又は複数の遺伝子のメチル化状態を改変することを含む方法。
２４．上記遺伝子がＰＩＴＸ２遺伝子である、態様２３の方法。
２５．上記遺伝子がＤＮＭＴ３ｂ遺伝子である、態様２３の方法。
２６．上記遺伝子がＩＧＦ２Ｒ遺伝子である、態様２３の方法。
２７．上記遺伝子がＳＤＦ４遺伝子である、態様２３の方法。
２８．上記遺伝子がＲＯＰＮ１Ｌ遺伝子である、態様２３の方法。
２９．上記遺伝子がＴＭＥＭ１７９遺伝子である、態様２３の方法。
３０．上記遺伝子のメチル化が上記前駆細胞と比較して、上記神経再生細胞において増加している、態様２３〜２７のいずれかの方法。
３１．上記遺伝子のメチル化が上記前駆細胞と比較して、上記神経再生細胞において減少している、態様２３、２８又は２９のいずれかの方法。
３２．配列Ｃ‐Ａ‐Ｔ‐Ｃme‐Ｇ‐Ｃ‐Ｃ‐ＣがＣ‐Ａ‐Ｔ‐Ｃ‐Ｇ‐Ｃ‐Ｃ‐Ｃに変換されている、態様３１の方法。
３３．上記前駆細胞が骨髄接着間質細胞（ＭＡＳＣ）である、態様２３〜３２のいずれかの方法。
３４．上記遺伝子のメチル化状態が：
（ａ）Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列を含むポリヌクレオチドで上記前駆細胞をトランスフェクトすること；
（ｂ）上記トランスフェクトされた細胞を培養すること；及び
（ｃ）上記トランスフェクトされた細胞の子孫の中から、上記遺伝子のメチル化状態が改変されている１又は複数の子孫細胞を得ること；
により改変されており、ここで上記遺伝子のメチル化状態が改変されている前記子孫細胞は神経再生細胞である、態様２３の方法。
３５．上記遺伝子のメチル化状態が上記前駆種細胞をメチル化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質と又はメチル化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸と接触させることにより改変されており、ここで上記ＤＮＡ結合ドメインは上記遺伝子内の１又は複数の配列に結合するように作出されている、態様３０の方法。
３６．上記遺伝子のメチル化状態が上記前駆細胞を脱メチル化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質と又は脱メチル化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸と接触させることにより変換されており、ここで上記ＤＮＡ結合ドメインは上記遺伝子内の１又は複数の配列に結合するように作出されている、態様３１の方法。
３７．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養をとおして前駆細胞に由来する細胞であって、ここで：
（ａ）上記細胞が神経組織の成長及び／又は再生を援助する；
（ｂ）上記細胞における１又は複数の遺伝子のメチル化状態が上記前駆細胞に比較して改変されている；及び
（ｃ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養中、上記前駆細胞もその子孫のいずれもＮｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチドでトランスフェクトされていない、
細胞。
３８．上記遺伝子がＰＩＴＸ２遺伝子である、態様３７の細胞。
３９．上記遺伝子がＤＮＭＴ３ｂ遺伝子である、態様３７の細胞。
４０．上記遺伝子がＩＧＦ２Ｒ遺伝子である、態様３７の細胞。
４１．上記遺伝子がＳＤＦ４遺伝子である、態様３７の細胞。
４２．上記遺伝子がＲＯＰＮ１Ｌ遺伝子である、態様３７の細胞。
４３．上記遺伝子がＴＭＥＭ１７９遺伝子である、態様３７の細胞。
４４．上記遺伝子のメチル化が上記前駆細胞と比較して、上記神経再生細胞において増加している、態様３７〜４１のいずれかの細胞。
４５．上記遺伝子のメチル化が上記前駆細胞と比較して、上記神経再生細胞において減少している、態様３７、４２又は４３のいずれかの細胞。
４６．配列Ｃ‐Ａ‐Ｔ‐Ｃme‐Ｇ‐Ｃ‐Ｃ‐ＣがＣ‐Ａ‐Ｔ‐Ｃ‐Ｇ‐Ｃ‐Ｃ‐Ｃに変換されている、態様４５の細胞。
４７．上記前駆細胞が骨髄接着間質細胞（ＭＡＳＣ）である、態様３７〜４６のいずれかの細胞。
４８．上記遺伝子のメチル化状態が上記前駆細胞をメチル化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質と又はメチル化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸と接触させることにより改変されており、ここで上記ＤＮＡ結合ドメインは上記遺伝子内の１又は複数の配列に結合するように作出されている、態様３７の細胞。
４９．上記遺伝子のメチル化状態が上記前駆細胞を脱メチル化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質と又は脱メチル化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸と接触させることにより改変されており、ここで上記ＤＮＡ結合ドメインは上記遺伝子内の１又は複数の配列に結合するように作出されている、態様３７の細胞。
５０．神経再生細胞の同定方法であって、上記細胞における１又は複数の遺伝子のメチル化状態を分析することを含む方法であって、ここで上記分析された遺伝子のメチル化状態における変化は神経再生細胞を表している、方法。
５１．上記分析が上記１又は複数の遺伝子の増加されたメチル化についてである、態様５０の方法。
５２．上記分析が上記１又は複数の遺伝子の減少されたメチル化についてである、態様５０の方法。
５３．上記分析が１又は複数の第一の遺伝子の増加されたメチル化について及び１又は複数の第二の遺伝子の減少されたメチル化についてである、態様５０の方法。
５４．上記１以上の遺伝子（単数又は複数）がＰＩＴＸ２、ＲＯＰＮ１Ｌ、ＤＮＭＴ３ｂ、ＩＧＦ２Ｒ、ＴＭＥＭ１７９及びＳＤＦ４から成る群から選択される、態様５０の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
適用なし。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
詳細な説明
診断としてのメチル化状態
問題の１又は複数の遺伝子内の又は問題の１又は複数の遺伝子近辺の特定のＣｐＧ配列のＤＮＡメチル化状態における変化の分析は細胞を同定するために及び異なるＤＮＡメチル化パターンを有する他の細胞からそれを区別するために使用されうる。例えば、幹細胞又は他の型の前駆細胞において、特定のＣｐＧ配列がそのＣ残基上でメチル化され、そしてさらなる分化に際して、上記Ｃ残基が脱メチル化される場合、そのＣ残基の脱メチル化はその分化段階についてのマーカーとして使用されうる。逆に、Ｃ残基のメチル化は分化についてのマーカーとしてはたらきうる。メチル化状態における全体的な全か無かの変化は必要ではない；特定のＣｐＧ配列でのメチル化頻度における変化もまた診断でありうる。
【０００９】
本分野において知られるいくつかの方法はメチル化シトシン残基を非メチル化シトシン残基から区別するために使用されうる。これらは、非限定的に、重亜硫酸塩でのＤＮＡの処理、及びメチル化感受性及びメチル化依存性制限酵素でのＤＮＡ切断の分析を含む。重亜硫酸塩（ＳＯ3）処理は非メチル化シトシンを脱アミノ化し、それを、複製に際して伸長中のＤＮＡ鎖中でアデノシン残基の鋳型となるデオキシウリジンに変換する。したがって、重亜硫酸塩処理はＣ‐Ｇ塩基対のＴ‐Ａ塩基対への結果として起こる変換をもたらし；そして上記変化は標準のＤＮＡシークエンシング法により検出されうる。メチル化Ｃ残基は重亜硫酸塩処理により影響されない；それゆえ、Ｃme‐Ｇ塩基対は変換されないままである。
【００１０】
制限酵素を用いたメチル化状態の分析のために、それらの認識部位に配列ＣＧを有する酵素が使用されうる。配列ＣＧを含むある認識部位について、上記部位を認識する酵素は、上記Ｃ残基がメチル化されている場合、それを切断することができないであろうが、その酵素の等分裂体（すなわち、上記同じ配列を認識する酵素）はＣ残基がメチル化されていようとされていまいと、上記部位を切断するであろう。例えば、ＨｐａＩＩ及びＭｓｐＩの両方とも配列ＣＣＧＧを認識する。ＭｓｐＩは二番目のＣ残基がメチル化されているかどうかにかかわらず、上記部位を切断する。しかしながら、ＨｐａＩＩは二番目のＣ残基がメチル化されていない場合のみ上記部位を切断するであろう。したがって、両方の酵素によるＣＣＧＧ配列の切断は上記部位内の二番目のＣ残基がメチル化されていない（すなわち、上記部位は配列Ｃ‐Ｃ‐Ｇ‐Ｇを有する）ことを示す；一方でＭｓｐＩのみによる切断は二番目のＣ残基がメチル化されている（すなわち、上記部位は配列Ｃ‐Ｃme‐Ｇ‐Ｇを有する）ことを示す。
【００１１】
実際には、特定のＣｐＧ配列のメチル化状態の分析は問題のＣｐＧを含むより長い配列の同定に関連する。しばしばアンプリコンと表示されるこの配列は一般的に、それが（メチル化状態が異なる細胞型で異なりうる）１又は複数のＣｐＧジヌクレオチド配列を含み、そして例えば、ポリメラーゼ鎖反応による増幅に好適であるように選択される。上記アンプリコン配列は一般的に哺乳類サイズのゲノム中で独特であるのに十分な長さである。
【００１２】
メチル化分析及びＤＮＡメチル化の分析に使用されうる例示的なアンプリコンに関する追加の詳細及び他の情報はＷＯ  ２００６／０９４８３６（Ｓｅｐｔ．１４，２００６）中に見られ、その開示をメチル化分析及びＤＮＡメチル化の分析に使用されうる例示的なアンプリコンに関する追加の詳細及び他の情報を提供する目的のために援用する。
前駆細胞
ある遺伝子のメチル化状態を改変することにより神経再生細胞に変換されうる前駆細胞はどんな型の非最終分化細胞でもありうる。例えば、例えば米国特許第５，８４３，７８０号；第６，２００，８０６号及び第７，０２９，９１３号中に開示される全能幹細胞は前駆細胞として使用されうる。全能幹細胞は培養され（例えば、米国特許第６，６０２，７１１号及び第７，００５，２５２号）、そして開示された方法の実施において前駆細胞としてまた使用されうるさまざまな型の多能性細胞（例えば、米国特許第６，２８０，７１８号；第６，６１３，５６８号及び第６，８８７，７０６号）に分化されうる。
【００１３】
他の例示的な型の前駆細胞は骨髄間質細胞（ＢＭＳＣｓ）、骨髄接着幹細胞及び間葉幹細胞としても知られる、骨髄接着間質細胞（ＭＡＳＣｓ）である。ＭＡＳＣｓの例示的な開示は米国特許出願公開公報第２００３／０００３０９０号；Ｐｒｏｏｋｏｐ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：７１‐７４及びＪｉａｎｇ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：４１‐４９中に提供されている。ＭＡＳＣｓの単離及び精製方法は例えば、米国特許第５，４８６，３５９号；Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１４３‐１４７及びＤｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：１７７１‐１７７６中に見られうる。ヒトＭＡＳＣｓは商業的に入手可能である（例えば、Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）又は例えば、骨髄吸引、続いて接着性骨髄細胞の選択によりドナーから得られうる。例えば、ＷＯ  ２００５／１００５５２を参照のこと。
【００１４】
ＭＡＳＣｓは臍帯血からもまた単離されうる。例えば、Ｃａｍｐａｇｎｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９８：２３９６‐２４０２；Ｅｒｉｃｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｒ．  Ｊ．  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  １０９：２３５‐２４２及びＨｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ７８：２５６‐２６１を参照のこと。
Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン
Ｎｏｔｃｈタンパク質は細胞内シグナリングをとおして細胞分化に影響する、全ての後生動物中に見られる膜貫通型受容体である。Ｎｏｔｃｈ細胞外ドメインのＮｏｔｃｈリガンド（例えば、Ｄｅｌｔａ，  Ｓｅｒｒａｔｅ，  Ｊａｇｇｅｄ）との接触はＮｏｔｃｈタンパク質の２のタンパク質分解切断をもたらし、そのうちの二番目のものはγ‐セクレターゼにより触媒され、そしてＮｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）を細胞質に放出する。マウスＮｏｔｃｈタンパク質では、この切断はアミノ酸ｇｌｙ１７４３及びｖａｌ１７４４の間で起こる。ＮＩＣＤは核に移動し、そこでそれは転写因子としてはたらき、追加の転写調節タンパク質（例えば、ＭＡＭ、ヒストンアセチラーゼ）を補充し、さまざまな標的遺伝子（例えば、Ｈｅｓ１）の転写抑制を緩和する。
【００１５】
Ｎｏｔｃｈシグナリングについての追加の詳細及び情報は例えば、Ａｒｔａｖａｎｉｓ‐Ｔｓａｋｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：２２５‐２３２；Ｍｕｍｍ  ａｎｄ  Ｋｏｐａｎ（２０００）Ｄｅｖｅｌｏｐ．  Ｂｉｏｌ．  ２２８：１５１‐１６５及びＥｈｅｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ  ２００６（３６４），ｃｍ７［ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｔｋｅ．３６４２００６ｃｍ７］中に見られる。
【００１６】
前駆細胞（例えば、ＭＡＳＣｓ）のヒトＮｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする核酸でのトランスフェクション、続いてトランスフェクトされた細胞の薬物選択及びさらなる培養による拡充はそれらのゲノム中に改変されたＤＮＡメチル化を有する神経再生細胞の生成をもたらす。追加の詳細のために下記実施例２を参照のこと。
細胞培養及びトランスフェクション
細胞培養のための標準の方法は本分野において知られている。例えば、Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  “Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，”  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００５を参照のこと。
【００１７】
外因性ＤＮＡの細胞への導入方法（すなわち、トランスフェクション）もまた本分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，”  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７及び定期的なアップデートを参照のこと。
【００１８】
トランスフェクション及び培養についての例示的な方法は下記実施例１及び２中に提供されている。
ＤＮＡメチル化の標的化改変の方法
前駆細胞の神経再生細胞への変換には、ある遺伝子のメチル化状態における変化が付随するので；メチル化状態の標的化改変は前駆細胞を神経再生細胞に変えるために使用されうる。
【００１９】
特定のＣ残基でのメチル化状態の改変方法は本分野において知られている。特定の配列のメチル化を増加させるために、ＤＮＡ結合ドメイン及びメチル化ドメインを含む融合タンパク質が使用されうる。例えば、Ｂｅｓｔｏｒ  Ｕ．  Ｓ．  ２００２／０１８８１０３（Ｄｅｃ．  １２，  ２００２）及びＷＯ  ９７／１１９７２（Ａｐｒｉｌ  ３，  １９９７）を参照のこと。メチル化ドメインの源としてはたらきうる例示的なＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素は上記に挙げられる引用文献中に開示されている。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼは特定のＤＮＡ配列をメチル化することができるタンパク質であり、その特定のＤＮＡ配列はＣｐＧでありうる。このタンパク質は変異ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、野生型ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、天然ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、天然ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの変形、切り取られたＤＮＡメチルトランスフェラーゼ又はＤＮＡをメチル化することができるＤＮＡメチルトランスフェラーゼの切片でありうる。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼは哺乳類ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、細菌ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、Ｍ．  ＳｓｓＩ  ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ及びＤＮＡをメチル化する能力を有する他のタンパク質又はポリペプチドを含みうる。
【００２０】
融合タンパク質の構築のためにメチル化ドメインの源としてはたらきうる例示的なＤＮＡメチルトランスフェラーゼは、非限定的に、シトシンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ｄａｍメチルトランスフェラーゼ、ｄｃｍメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ２、ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３ｂ、ＣｐＧメチラーゼ、Ｍ．  ＳｓｓＩ、Ｍ．  ＣｖｉＰＩ、ＨｈａＩメチルトランスフェラーゼ、ＨｐａＩＩメチルトランスフェラーゼ、ＭｓｐＩメチルトランスフェラーゼ、ＴａｑＩメチルトランスフェラーゼ、ＢａｍＨＩメチルトランスフェラーゼ、ＥｃｏＲＩメチルトランスフェラーゼ、ＨａｅＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、ＡｌｕＩメチルトランスフェラーゼ、及びＳｓｓＩメチルトランスフェラーゼを含む。
【００２１】
特定のＤＮＡ配列のメチル化の程度を減少させるために、ＤＮＡ結合ドメイン及び脱メチル化ドメインの融合体が使用されうる。例示的なＤＮＡ脱メチル化ドメインは示されている。例えば、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３９７：５７９‐５８３；  Ｃｅｒｖｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：８３６３‐８３６６を参照のこと。
【００２２】
問題の配列のメチル化の程度を減少させるための他の例示的な方法は細胞内で（問題の配列に結合する）ＤＮＡ結合ドメイン及び５‐メチルシトシンＤＮＡ‐グリコシラーゼの融合体を発現させることである。上記融合タンパク質は細胞ＤＮＡ修復酵素によりシトシンで置換されるように、ＤＮＡ糖リン酸骨格からメチル化シトシン塩基を除去する。
【００２３】
問題のＤＮＡ配列の脱メチル化は複製中に維持メチラーゼのその配列へのアクセスをブロックし；それにより新規に複製されたヘミメチル化ＤＮＡの非メチル化鎖のメチル化を妨げることによってもまた達成されうる。複製のさらなるラウンドは問題の配列でメチル化されていない娘ＤＮＡ二重鎖をもたらすであろう。上記妨害は問題の配列に結合するように作出された亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインの細胞内発現により達成されうる（以下を参照のこと）。
【００２４】
メチル化ドメイン又は脱メチル化ドメインの活性はメチル化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質（又は上記融合タンパク質をコードする核酸）を構築することにより特定のＣ残基に標的化されることができ、ここで上記ＤＮＡ結合ドメインは選択されたＣ残基の配列又は選択されたＣ残基近辺の配列に自然に結合する又は選択されたＣ残基の配列又は選択されたＣ残基近辺の配列に結合するように作出されている。上記ＤＮＡ結合ドメインは天然ＤＮＡ結合ドメイン又は非天然の作出されたＤＮＡ結合ドメインでありうる。
【００２５】
この点で、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、亜鉛フィンガータンパク質を選択したどんなＤＮＡ配列にも結合するように作出することが可能であるので、有用である。亜鉛フィンガー結合ドメインは１以上の亜鉛フィンガー構造を含む。Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ  ４：１６０９‐１６１４；  Ｒｈｏｄｅｓ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ：５６‐６５；米国特許第６，４５３，２４２号。典型的に、単一の亜鉛フィンガーは約３０アミノ酸の長さであり、そして４つの亜鉛配位結合アミノ酸残基を含む。構造研究は、規範的な（Ｃ2Ｈ2）亜鉛フィンガーモチーフは（一般的に２の亜鉛配位結合システイン残基を含むベータターン中に保持されている）２つのベータシート及び（一般的に２つの亜鉛配位結合ヒスチジン残基を含む）１つのアルファヘリックスを含むことを示している。
【００２６】
亜鉛フィンガーは規範的なＣ2Ｈ2亜鉛フィンガー（すなわち、亜鉛イオンが２つのシステイン及び２つのヒスチジン残基により配位結合されているもの）及び例えば、Ｃ3Ｈ亜鉛フィンガー（亜鉛イオンが３つのシステイン残基及び１つのヒスチジン残基により配位結合されているもの）及びＣ4亜鉛フィンガー（亜鉛イオンが４つのシステイン残基により配位結合されているもの）の如き非規範的亜鉛フィンガーの両方を含む。非規範的亜鉛フィンガーはシステイン又はヒスチジン以外のアミノ酸がこれらの亜鉛配位結合残基の１つと置換されているものもまた含みうる。例えば、ＷＯ  ０２／０５７２９３（Ｊｕｌｙ  ２５，  ２００２）及びＵＳ  ２００３／０１０８８８０（Ｊｕｎｅ  １２，  ２００３）を参照のこと。
【００２７】
亜鉛フィンガー結合ドメインは選択した配列に結合するように作出されうる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：１３５‐１４１；  Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７０：３１３‐３４０；  Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６‐６６０；  Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２‐６３７；  Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  １０：４１１‐４１６を参照のこと。亜鉛フィンガー結合ドメインは天然亜鉛フィンガータンパク質に比較して、新しい結合特異性を有するように作出される。作出方法は、非限定的に、合理的な設計及びさまざまな型の経験的な選択方法を含む。合理的な設計は例えば、各三重鎖又は四重鎖ヌクレオチド配列が特定の三重鎖又は四重鎖配列と結合する亜鉛フィンガーの１以上のアミノ酸配列と関連している三重鎖（又は四重鎖）ヌクレオチド配列及び個々の亜鉛フィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを用いることを含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号；第６，４５３，２４２号；第６，５３４，２６１号；第６，６１０，５１２号；第６，７４６，８３８号；第６，８６６，９９７号；第７，０６７，６１７号；米国特許出願公開公報第２００２／０１６５３５６号；第２００４／０１９７８９２号；第２００７／０１５４９８９号；第２００７／０２１３２６９号；及び国際特許出願公開公報ＷＯ  ９８／５３０５９及びＷＯ  ２００３／０１６４９６を参照のこと。
【００２８】
ファージディスプレイ、インターラクショントラップ、ハイブリッド選択及びツーハイブリッドシステムを含む例示的な選択方法は米国特許第５，７８９，５３８号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，１４０，４６６号；第６，２００，７５９号；第６，２４２，５６８号；第６，４１０，２４８号；第６，７３３，９７０号；第６，７９０，９４１号；第７，０２９，８４７号及び第７，２９７，４９１号；並びに米国特許出願公開公報第２００７／０００９９４８号及び第２００７／０００９９６２号；ＷＯ  ９８／３７１８６；ＷＯ  ０１／６０９７０及びＧＢ２，３３８，２３７中に開示されている。
【００２９】
亜鉛フィンガー結合ドメインについての結合特異性を高めることは例えば、米国特許第６，７９４，１３６号（Ｓｅｐｔ．  ２１，  ２００４）中に示されている。フィンガー内リンカー配列についての亜鉛フィンガー作出の追加の局面は米国特許第６，４７９，６２６号及び米国特許出願公開公報第２００３／０１１９０２３号中に開示されている。Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１ａ）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８：１４３２‐１４３６；  Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１ｂ）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８：１４３７‐１４４１及びＷＯ  ０１／５３４８０もまた参照のこと。
【００３０】
「ＤＮＡメチル化の標的化改変の方法」と題されたこの節中に引用されている全ての引用文献は例示的なメチル化ドメイン及び脱メチル化ドメイン（野生型及び変異体）、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインの設計、選択及び作出のための本分野で認識されている方法、及びメチル化ドメイン及び／又は亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質の構築を開示する目的のためにそれらを全体として本明細書中に援用する。
【実施例】
【００３１】
実施例１：骨髄接着間質細胞（ＭＡＳＣｓ）の調製
ヒトドナーから得られた骨髄吸引物を５０ｍｌ管中に１２．５ｍｌ等分に分け、そして１２．５ｍｌの生育培地（ペニシリン／ストレプトマイシン及び２ｍＭ  Ｌ‐グルタミンで補充したαＭＥＭ中の１０％ＦＢＳ）を各管に添加した。上記管の内容物を反転により混合し、そして上記管を２００×ｇで８分間遠心分離した。上部の透明な相を捨て、下部相の体積を新しい生育培地で２５ｍｌに合わせ、そして上記管を再び混合し、そして遠心分離した。上部層を再び除去した。各管中の下部相の体積を２５ｍｌに再び合わせ、そして全ての管の内容物を１つの２５０ｍｌ管中に集めた。Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ除外及び有核細胞カウントの決定による細胞濃度の決定後、細胞を１フラスコ当たり１００×１０6総有核細胞の密度で１フラスコ当たり４０ｍｌの生育培地中のＴ２２５フラスコ中にまいた。上記フラスコをＣＯ2インキュベーター内で３７℃で３日間インキュベートし、その間ＭＡＳＣｓは上記フラスコに接着した。
【００３２】
３日後、接着していない細胞を上記フラスコを揺り動かし、そして上記培養培地を引くことにより除去した。各フラスコをペニシリン／ストレプトマイシンで補充した４０ｍｌのαＭＥＭで３回洗浄し；その後４０ｍｌの事前に温めた（３７℃）生育培地を各フラスコに添加し、そして上記細胞をＣＯ2インキュベーター内で３７℃で培養した。この間、上記培地を３〜４日毎に４０ｍｌの新しい生育培地で置き換え、そして細胞をコロニーの生育及び細胞密度についてモニターした。
【００３３】
上記培養物が２５〜３０％コンフルエンスを達成したとき（通常１コロニー当たり１０，０００〜２０，０００細胞及び１０〜１４日以内）、ＭＡＳＣｓ（Ｍ０代）をさらなる継代のために回収した。ＭＡＳＣｓを一度に１０までのＴ‐２２５フラスコから回収した。培地を上記フラスコから除去し、そして上記接着細胞を２０ｍｌのＤＰＢＳ  ｗ／ｏ  Ｃａ／Ｍｇ（ＤＰＢＳ  −／−，ＨｙＣｌｏｎｅ）で２回すすいだ。１０ｍｌの０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を各フラスコに添加し、そしてフラスコを室温で約５分間インキュベートした。細胞がはずれ、そして上記コロニーが分散して単一の細胞になったとき、上記トリプシンを１０ｍｌの生育培地の添加及び穏やかな混合により不活性化した。上記細胞懸濁物を上記フラスコから引き、そして２５０ｍｌ管中に集めた。上記管を２００×ｇで８分間の遠心分離にかけた。上記上清を慎重に除去し、そして湿った細胞ペレットを約１×１０6細胞／ｍｌの見積もり細胞濃度になるように生育培地中に再懸濁した。生存細胞カウントを決定し、そして細胞を生育培地中に１フラスコ当たり２×１０6細胞の濃度でＴ２２５フラスコ中にまいた（Ｍ１代）。細胞を２〜３日毎に培地を交換しながら、３〜５日間又は８５〜９０％コンフルエントまで生育させた。８５〜９０％コンフルエンスで、Ｍ１代細胞をトリプシン処理により回収し、そして上記に示されているように１つのＴ２２５フラスコ当たり２×１０6細胞で再びまき、Ｍ２代培養物を作出した。Ｍ２培養物に、必要な場合、３日毎に新しい培地を与えた。Ｍ２代培養物が８５〜９０％コンフルエンスに達したとき（通常３〜５日以内）、それらをＮＲＣｓを作出するためのトランスフェクションのために回収し（以下の実施例２）又はさらなる使用のために凍結した。
実施例２：神経再生細胞（ＮＲＣｓ）の調製
ＮＲＣｓ又はＳＢ６２３細胞としても知られる、神経再生細胞を以下のように、Ｍ２代培養物から回収したＭＡＳＣｓから調製した。
Ａ．トランスフェクション混合物の調製
神経再生細胞をＮｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードするプラスミドでのＭ２代ＭＡＳＣｓのトランスフェクションにより作出した。上記プラスミド（ｐＮ２）は、細胞内ドメインをコードする、ヒトＮｏｔｃｈ‐１タンパク質のアミノ酸１７０３‐２５０４をコードする配列をマルチクローニング部位に導入した、ｐＣＩ‐ネオ骨格（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を含んだ。ＭＡＳＣｓの各フラスコについて、４０μｇのプラスミド及び０．２ｍｌのＦｕｇｅｎｅ６（商標）溶液を含む５ｍｌのトランスフェクション混合物を使用した。上記トランスフェクション混合物を作出するために、（トランスフェクトされるべき細胞のフラスコの数に因り）適切な量のＦｕｇｅｎｅ（商標）溶液をガラスピペットを用いて滅菌２５０ｍｌ管中のαＭＥＭに添加した。上記溶液を穏やかに混合し、そして室温で５分間インキュベートした。適切な量のプラスミドＤＮＡをその後Ｆｕｇｅｎｅ（商標）／αＭＥＭ混合物に一滴ずつ添加し、穏やかに混合し、そして室温で３０分間インキュベートした。
【００３４】
ｐＮ２  ＤＮＡのＦｕｇｅｎｅ（商標）／ＭＥＭ混合物への添加前に、５ｍｌを除去し、そして１５ｍｌ管に入れ、その管に４０μｇのｐＥＧＦＰプラスミドを添加した。この溶液をトランスフェクション効率についてのコントロールとして、１フラスコの細胞をトランスフェクトするために使用した。
Ｂ．トランスフェクション
トランスフェクションのために、Ｍ２代ＭＡＳＣｓを（実施例１中に示されているような）トリプシン処理により回収し、そして１のＴ２２５フラスコ当たり４０ｍｌの生育培地中に２．５×１０6細胞の密度でまいた。上記細胞が５０〜７０％コンフルエンスに達したとき（通常１８〜２４時間以内）、それらを、それらの生育培地を１フラスコ当たり３５ｍｌのトランスフェクション培地（ペニシリン／ストレプトマイシンを含まないαＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）で置き換えることにより、トランスフェクションのために準備した。
【００３５】
トランスフェクション培地の導入３時間後、５ｍｌの上記トランスフェクション混合物（上記節Ａ）を、上記生育表面に接触しないで上記培地に直接的にピペッティングすることにより各Ｔ‐２２５フラスコに添加し、続いて穏やかに混合した。コントロールＴ‐２２５フラスコをトランスフェクション効率の決定のために、４０μｇのｐＥＧＦＰプラスミドでトランスフェクトした。
【００３６】
培養物をトランスフェクション培地中で３７℃で２４時間インキュベートした後、上記トランスフェクション培地をαＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋ペニシリン／ストレプトマイシンで置き換えた。
Ｃ．トランスフェクトされた細胞の選択
プラスミドＤＮＡを組み込んだ細胞を、上記培地を１フラスコ当たり４０ｍｌの選択培地（１００μｇ／ｍｌ  Ｇ‐４１８を含む生育培地）で置き換えることによりトランスフェクション４８時間後に選択した。新しい選択培地を、選択を開始した３日後、及び再び５日後に提供した。７日後、選択培地を除去し、そして上記細胞に４０ｍｌの生育培地を与えた。上記培養物をその後新しい生育培地を２〜３日毎に再び与えながら、約３週間（１８〜２１日間の範囲）生育させた。
【００３７】
選択を開始した約３週間後、生存細胞がコロニーを形成しはじめたとき、細胞を回収した。培地を吸引ピペットを用いて上記フラスコから除去し、そして室温のＣａ2+／Ｍｇ2+を含まない２０ｍｌのＤＰＢＳを各フラスコに添加した。上記培養物表面を穏やかにすすぎ、上記洗浄溶液を吸引により除去し、そして上記すすぎ段階を繰り返した。その後１０ｍｌの事前に温めた（３７℃）０．２５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡを各フラスコに添加し、生育表面にわたりすすぎ、そして上記フラスコを室温で５〜１０分間インキュベートした。培養物を細胞の完全な分離を確実にするために顕微鏡でモニターした。分離が完了したとき、トリプシンを１フラスコ当たり１０ｍｌの生育培地の添加により不活性化した。上記混合物を上記培養物表面にわたりすすぎ、１０ｍｌピペットで４〜５回ピペッティングすることにより混合し、そして上記懸濁物を滅菌５０ｍｌ円錐形遠心分離管に移した。いくつかのフラスコから回収した細胞は単一の管に集められうる。凝集塊が存在した場合、それらを沈殿させ、そして上記懸濁物を新しい管に除去した。
【００３８】
上記細胞懸濁物を室温で８００ｒｐｍ（２００×ｇ）で８分間遠心分離した。上清を吸引により除去した。細胞ペレットを上記管を軽くたたくことによりゆるめ、Ｃａ2+／Ｍｇ2+を含まない約１０ｍｌのＤＰＢＳを各管に添加し、そして細胞を１０ｍｌピペットで４〜５回穏やかにピペッティングすることにより再懸濁し、均一な懸濁物を得た。
Ｄ．トランスフェクトされた細胞の拡充
細胞数を形質転換され選択された細胞の懸濁物について決定し、そして上記細胞を１フラスコ当たり２×１０6細胞（生存細胞の約３０％シーディングを提供する）でＴ‐２２５フラスコ中にまいた。この培養物をＭ２Ｐ１（＃１代）と呼ぶ。Ｍ２Ｐ１培養物に２〜３日毎に新しい培地を与え、そして細胞が９０〜９５％コンフルエンスに達したとき（通常継代後４〜７日）、それらを回収し、そして１フラスコ当たり２×１０6細胞で再びまき、Ｍ２Ｐ２代を作出した。Ｍ２Ｐ２培養物が９０〜９５％コンフルエンスに達したとき、それらをさらなる分析のために回収した。
実施例３：ＭＡＳＣｓ及びＮＲＣｓのメチル化パターンの比較
ＭＡＳＣｓを上記実施例１中に示されているように、３つの独立したヒトドナー（Ｄ３３、Ｄ３９及びＤ４１と呼ばれる）各々から調製した。各ＭＡＳＣｓ調製物の一部を上記実施例２中に示されているように、神経再生細胞を調製するために使用した。ゲノムＤＮＡをこれらの６つの細胞調製物の各々から単離し、そして上記３つのドナーの各々について、神経再生細胞からのＤＮＡのメチル化状態をそれらのＭＡＳＣ前駆細胞からのＤＮＡのそれと比較した。
【００３９】
そのメチル化状態が分析された遺伝子を３つの基準：
１．ＭＡＳＣｓ及び間葉細胞系についての既知のＤＮＡメチル化マーカー
２．ディファレンシャルメチル化ハイブリダイゼーションを用いたゲノムワイドなスクリーニングにおいてＭＡＳＣｓについてのメチル化マーカーとして同定された遺伝子；及び
３．胚幹細胞分化に対して影響を有することが文献中で報告されている遺伝子
にしたがって選択した。
【００４０】
メチル化状態の分析のために、重亜硫酸塩シークエンシングを上記に列挙される基準にしたがって選択された遺伝子の選択部分（アンプリコン）について行った。ある遺伝子はＭＡＳＣｓ及びＮＲＣｓの間でメチル化状態における顕著な差異を示さなかった。これらの遺伝子は表１中に列挙されている。いくつかの遺伝子はＭＡＳＣｓ及びＮＲＣｓの間でメチル化状態における差異を示したアンプリコンを含んだ。これらは表２中に列挙されている。これらのうち、そのメチル化の差異がＭＡＳＣｓからＮＲＣｓを区別することにおいて有用であるのに十分顕著であるのは５つの遺伝子であった。これらはＰＩＴＸ２（下垂体ホメオボックス２；ＲＩＥＧビコイド関連ホメオボックス転写因子としてもまた知られる）、ＲＯＰＮ１Ｌ（Ｒｏｐｐｏｒｉｎ１様タンパク質；ＡＫＡＰ関連精子タンパク質）、ＤＮＭＴ３ｂ（ＤＮＡ  Ｃ５‐Ｎ‐メチルトランスフェラーゼ３ｂ）、ＩＧＦ２Ｒ（インスリン様成長因子２受容体）及びＳＤＦ４（間質細胞由来因子４）であった。これらの５つの遺伝子中の選択されたアンプリコンについてのメチル化の差の詳細は表３〜７中に提供されている。
【００４１】
表３〜７は各アンプリコン中のいくつかのＣｐＧ配列でのメチル化状態を示す。「コントロール細胞」はＭＡＳＣｓをいい、そして「標的細胞」はＮＲＣｓをいう。細胞を３つの異なるドナーから得、そしてＭＡＳＣｓ及びＮＲＣｓの両方を各ドナーから調製した。ＳＢ１０１  ＭＡＳＣｓ及びＳＢ１０２  ＮＲＣｓを同じドナーから；ＳＢ１０３  ＭＡＳＣｓ及びＳＢ１０４  ＮＲＣｓを第二のドナーから得、そしてＳＢ１０５  ＭＡＳＣｓ及びＳＢ１０６  ＮＲＣｓを第三のドナーから得た。各表は異なるアンプリコンについて得られた結果を示す。各表中のカラム２〜７はＭＡＳＣｓ（カラム２〜４）及びＮＲＣｓ（カラム５〜７）中の（カラム１中のコロンにしたがう数により同定される）上記アンプリコン中の特定のＣｐＧ部位についてのメチル化値を示す。分析された各ＣｐＧについての平均メチル化値はＭＡＳＣｓについてカラム８中に及びＮＲＣｓについてカラム９中に提供されており、そしてＭＡＳＣｓ及びＮＲＣｓの間の平均メチル化値における差はカラム１０中に示されている。
【００４２】
カラム１１は分析された各ＣｐＧ配列についての「Ｆｉｓｈｅｒスコア」を示す。上記Ｆｉｓｈｅｒスコアを以下のように計算した：
［平均メチル化値（ＭＡＳＣｓ）−平均メチル化値（ＮＲＣｓ）］2／［［標準偏差（ＭＡＳＣｓ）］2＋［標準偏差（ＮＲＣｓ）］2］
上記Ｆｉｓｈｅｒ基準は特定のＣｐＧ部位でのメチル化値における変動性を示す。１超のＦｉｓｈｅｒスコアは有意であると考えられる。
【００４３】
これらのデータはＰＩＴＸ２、ＤＮＭＴ３ｂ、ＩＧＦ２Ｒ及びＳＤＦ４遺伝子におけるＣｐＧ配列のメチル化はＭＡＳＣｓに比較してＮＲＣｓにおいて増加されていることを示す。対照的に、ＲＰＯＮ１Ｌ遺伝子におけるＣｐＧ配列のメチル化はＭＡＳＣｓに比較してＮＲＣｓにおいて減少されている。同様に、ＴＭＥＭ１７９のメチル化は減少されている。特に、アンプリコン５４９中の位置２９２でのメチル化Ｃ残基の脱メチル化はそれらのＭＡＳＣｓ前駆細胞に比較してＮＲＣｓにおいて顕著な差を示す。
【００４４】
したがって、これらのメチル化変化はＮＲＣｓについての診断である；さらに、他の手段により同じメチル化変化を達成することはＮＲＣｓを調製するために有用でもある。
【００４５】
【表１】
0005746016.tif 000002
【００４６】
【表２】
0005746016.tif 000003
【００４７】
【表３】
0005746016.tif 000004
【００４８】
【表４】
0005746016.tif 000005
【００４９】
【表５】
0005746016.tif 000006
【００５０】
【表６】
0005746016.tif 000007
【００５１】
実施例４：ＲＯＰＮ１Ｌ遺伝子のメチル化状態における変化
ＭＡＳＣｓに比較して、ＮＲＣｓにおいてＲＯＰＮ１Ｌ遺伝子中にメチル化状態の変化を含むアンプリコンのヌクレオチド配列をそのメチル化状態が改変されているヌクレオチドを正確に同定するために分析した。この分析の結果は表８中に示されている。
【００５２】
【表７】
0005746016.tif 000008
【００５３】
実施例５：改変されたＤＮＡメチル化を有するＮＲＣｓの神経再生特性
実施例３及び４中に示されているメチル化変化を有する、実施例２中に示されているように調製された神経再生細胞は中枢及び末梢神経系のさまざまな障害の治療において有用である。例えば、その開示を全ての目的のためにそれらを全体として本明細書中に援用する、共同所有のＷＯ  ２００９／０２３２５１（Ｆｅｂ．  １９，  ２００９）を参照のこと。
【００５４】
本開示中に示されており、そして特徴づけられている細胞は、さらなる処理後に、神経細胞及び神経前駆細胞の特性を有する細胞にもまた変換されうる。例えば、上記例示的な処理、及びそのように処理された細胞の特性を開示する、その開示を本明細書中に援用する、米国特許出願公開公報第２００６／０１６６３６２号（Ｊｕｌｙ  ２７，  ２００６）を参照のこと。そのように処理された細胞の追加の特性を開示する、その開示を本明細書中に援用する、米国特許出願公開公報第２００６／０２１６２７６号（Ｓｅｐｔ．  ２８，２００６）もまた参照のこと。