(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、DNA分子からヌクレオチド配列組成情報を入手する方法：
配列特異的一本鎖ニック部位をDNA分子に導入する工程；
前記DNA分子の前記ニック部位から終止部位に及ぶ領域に標識したヌクレオチドを組み入れる工程であって、ddNTP又は少なくとも2つの連続標識ヌクレオチドのいずれかが該終止部位に組み入れられる工程；
前記領域にすべてのヌクレオチドが組み入れられた後に前記DNA分子の前記領域に組み入れられた標識の量を定量して、前記領域についてのヌクレオチド配列組成情報を確認する工程；および
参照ゲノムから予想される標識の量と前記領域に組み込まれた標識の量とを比較して、前記DNA分子の領域の前記ヌクレオチド配列組成情報が参照ゲノムの対応する領域のヌクレオチド配列組成情報と同じであるかまたは前記と相違するかを決定する工程。
【請求項２】
以下の工程を含む、DNA分子の配列決定をすることなくDNA分子のヌクレオチド配列組成情報を評価する方法：
配列特異的一本鎖ニック部位をDNA分子に導入する工程；
前記DNA分子の前記ニック部位から終止部位に及ぶ領域に標識したヌクレオチドを組み入れる工程；
前記領域にすべてのヌクレオチドが組み入れられた後に前記領域に組み入れられた標識の量を定量して、前記領域についてのヌクレオチド配列組成情報を評価する工程。
【請求項３】
ニック部位がニック付加制限酵素によってDNAへ導入される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ニック付加制限酵素がNb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nb.BbvCI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BstNBI、Nt.SapIおよびNt.CviPIIから成る群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
標識ヌクレオチドがポリメラーゼによって組み入れられる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
標識ヌクレオチドがニック翻訳によって組み入れられる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
終止部位が少なくとも2つの連続して組み入れた標識ヌクレオチドによって特徴付けられる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
終止部位がターミネーターによって特徴付けられる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
前記方法が、更に
（ａ）導入工程の前にDNA分子の非配列特異的内因性ニック部位からの標識の組み入れを低下させるかまたは防止する工程、
（ｂ）DNA分子の前記領域の外側で標識分子タグを前記DNA分子に付加する工程、又は
（ｃ）DNA分子からタンパク質を除去する工程
を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）の標識の組み入れを低下させるかまたは防止する工程が、DNA分子の内因性ニックを修復する工程およびDNA分子の内因性ニックを封鎖する工程から成る工程群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ｂ）の標識分子が蛍光ＤＮＡ染色剤である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
蛍光ＤＮＡ染色剤が３−［ジメチル−［３−［４−［（Ｅ）−（３−メチル−１，３−ベンゾキサゾール−２−イリデン）メチル］キノリン−１−イウム−１−イル］プロピル］アザニウムイル］プロピル−ジメチル−［３−［４−［（Ｚ）−（３−メチル−１，３−ベンゾキサゾール−２−イリデン）メチル］キノリン−１−イウム−１−イル］プロピル］アザニウム；テトライオジド（YOYO-1）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
標識ヌクレオチドがAlexa Fluor（登録商標）-標識ヌクレオチドおよびCy（登録商標）5-標識ヌクレオチドから選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互引用
本出願は米国仮特許出願60/980,639号（2007年10月17日出願）の優先権を主張する。前記出願はあたかもその全体が説明されたかのように参照により本明細書に含まれる。
連邦政府の研究開発援助に関する記載
本発明は、以下の政府機関（NIH RO1 HG000225）により提供された合衆国政府の支援を受けて達成された。合衆国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は一般的に全ゲノムを分析する方法に関し、より具体的には、ニック部位と終止部位とによって仕切られたDNA分子の領域のヌクレオチド組成についての情報を確認する方法に関する。前記確認したヌクレオチド組成を参照ゲノムのヌクレオチド組成データと比較し、それによって、前記領域の配列を再度決定することなく、参照ゲノムの対応する領域との相違（存在するとしたら）を識別することができる。
【０００３】
（背景技術）
ヒトのゲノムは多くのタイプの遺伝的異常、例えば多形性を保有する。多形性は、単一ヌクレオチドレベルおよび構造的レベルで発現されるとともに、大規模事象（特に癌に付随する事象）で発現される。いくつかの異常、例えば単一ヌクレオチド多形性（SNP）は単一ヌクレオチドにのみに関与し、遺伝子のエキソンまたはイントロン内に存在するか、または遺伝子と遺伝子の間の異質染色質領域内に存在する。コード配列内のSNPは、遺伝暗号の縮退のために、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を必ずしも変化させない。しかしながら、SNPはDNA内の変異であるので、それらは疾患に関するマーカーおよびヌクレオチドの位置に関するマーカーとして役立つ。さらにまた、遺伝子間の異質染色質領域に存在するSNPもやはり遺伝子スプライシングまたは転写因子結合について重要であり得る。
他の遺伝的異常は2つ以上のヌクレオチドを含み、したがってDNAの中間構造物に影響を及ぼし得る。これらの遺伝的異常には増幅、挿入、欠失、倒置および再編成が含まれるが、ただしこれらに限定されない。典型的には、これらの異常は、古典的な細胞遺伝学により分析され、さらに最近は高密度オリゴヌクレオチドアレイから入手されるデータを用いて分析される。しかしながら、新しい配列決定システムで効力を発揮するか、または前記システムを補完する、全ゲノムの迅速簡便で包括的な低コスト分析方法が引き続き希求されている。
【０００４】
（発明の概要）
第一の特徴では、DNA分子から配列組成情報を入手する方法は以下の工程を含む：配列特異的一本鎖ニック部位を前記分子に導入する工程、ニック部位から終止部位に及ぶDNA領域（region of DNA extending from nick site to termination site）に標識ヌクレオチドを組み入れる工程、前記領域に組み入れたヌクレオチドを定量してそのヌクレオチド組成を確認（ascertain）する工程、および参照ゲノム（reference genome）のヌクレオチド組成データと前記確認したヌクレオチド組成を比較して、前記領域の組成が参照ゲノムと同じであるかまたは相違するかを決定する工程。
第一の特徴のいくつかの実施態様では、本発明はさらに、本方法で標識する領域の外側の1つまたは2つ以上の位置でDNA分子にタグを付加する工程（tagging DNA molecule）を含む。第一の特徴の他の実施態様では、本方法は場合によって、標識組み入れ工程でDNA分子の非配列特異的内因性ニック部位から標識の組み入れを低下させるかまたは防止する工程を含む。標識組み入れ工程を実施する前に、内因性ニック部位を修復（連結）するか、または封鎖してもよい。第一の特徴のさらに他の実施態様では、本方法は場合によって、DNAからタンパク質を除去する（すなわちヒストンまたはDNA（特にゲノムDNA）と結合することがある任意の他の天然のタンパク質を除去する）工程を含む。
【０００５】
記載した実施態様は、簡単な準備でゲノムDNAの分析を可能にすることおよび再度の配列決定による分析結果に匹敵する分析結果を有する配列情報の入手を含む、多くの利点を含む。本方法は、異種染色質領域の配列情報を入手し、ゲノムの構造的変種の位置を正確に示し、さらに癌ゲノムに付随する異常の特徴を決定することを可能にする。同様に、本方法は、一連の蛍光句読点マッピングにより、参照ゲノムとのアラインメントの実施前でもその識別を可能にする情報を提供する処理DNA分子を生じる。さらにまた、本方法は、全ての生化学的工程が1反応容器内で生じ（すなわち生化学工程は1つの表面でまたはそのような1つの装置内では実施されない）かつ複数サイクルの生化学工程を必要としないで生じることを可能にする。
本発明のこれらおよび他の特色、特徴並びに利点は以下の説明からいっそう容易に理解されるであろう。この説明では、添付の図面が参照され、これら図面は本明細書の部分を構成し、さらにこれら図面では本発明の実施態様が限定ではなく例示として示されている。好ましい実施態様の説明は、本発明を限定して全ての改変、等価物および変型をカバーしようとするものではない。したがって、本発明の範囲の解釈には本明細書に列挙した特許請求の範囲が考慮されなければならない。
【０００６】
本発明は、以下の詳細な説明を考慮したとき、理解がいっそう容易となり、上記で説明した特色、特徴および利点以外のものも明白となろう。そのような詳細な説明は以下の図面を参照しながら実施される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】基本的な配列決定体系のある態様を示す。前記は、ニック付加制限酵素を使用してニック部位を導入し、続いて終止部位へ進むニック翻訳により標識ヌクレオチドを組み入れる工程を含む。  本発明は多様な改変および種々の形態を受け入れることができるが、本発明の特定の実施態様を前記図面にて例示として示し、本明細書で詳細に説明する。しかしながら、特定の実施態様を本明細書で説明するのは、開示の具体的な形態に本発明を限定しようと意図したためではなく、反対に、その意図は、添付の特許請求の範囲で規定した本発明の真髄および範囲内に入る全ての改変、等価物および変型を包含しようとするものであることは理解されよう。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
DNA分子、特にゲノムDNA分子は、DNA分子の存続長が緩衝液のイオン強度に反比例して変化するために、低いイオン強度の緩衝液中で解かれさらに伸張される。米国特許出願公開2007/0161028（前記文献は参照によりあたかもその全体を説明したかのように本明細書に含まれる）を参照されたい。DNAを解くまた別の方法は当業者には一般的に知られている。例えば以下を参照されたい：Schwartz D & Koval M, "Conformational dynamics of individual DNA molecules during gel electrophoresis," Nature 338:520-522 (1989)；Guo X, et al., "Sizing single DNA molecules," Nature 359:783-784 (1992)；Schwartz D, et al., "Ordered restriction maps of Saccharomyces cerevisiae chromosomes constructed by optical mapping," Science 262:110-114 (1993)；Wang Y & Schwartz D, "Sequence-specific cleavage techniques," U.S. Biochem. 20:89-93 (1994)；Cai W, et al., "Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:5164-5168 (1995)；Meng X et al., "Optical Mapping of lambda bacteriophage clones using restriction endonucleases," Nature Genetics 9:432-438 (1995)；Morozov V, et al., "New polyacrylamide gel-based methods of sample preparation for optical microscopy:  immobilization of DNA molecules for optical mapping," J. Microscopy 183:205-214 (1996)；およびSchwartz D & Samad A, "Optical mapping approaches to molecular genomics," Curr. Opin. Biotechnol. 8:70-74 (1997)；Dimalanta E, et al., "A microfluidic system for large DNA molecule arrays," Anal. Chem., 2004, 76:5293-5301（前記文献の各々は参照によりあたかもその全体を説明したかのように本明細書に含まれる）。
【０００９】
配列特異的ニックは、解かれたDNA分子の一方の鎖上の１つの部位に導入される。前記DNA分子は任意の供給源に由来するDNA分子、例えばゲノムDNA分子、PCRアンプリコンまたはクローンであり得る。ニック部位は、分子をニック付加制限酵素（天然または操作エンドヌクレアーゼであって一本鎖のDNAの切断を触媒するが二本鎖DNAの切断は触媒しない）で切断することによって導入することができる。ニック付加制限酵素には、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nb.BbvCI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BstNBI、Nt.SapIまたはNt.CviPIIが含まれるが、ただしこれらに限定されない。他の公知のニック付加制限酵素も本記載方法に適合すると考えられる。さらにまた、二本鎖切断制限酵素を一本鎖ニック付加制限酵素に変換する公知の方法を用いて、本記載方法での使用に適した酵素を作製することができる。例えば以下を参照されたい：米国特許6,395,523号、米国特許7,081,358号および米国特許出願公開2005/0158834（前記文献の各々は参照によりあたかもその全体を説明したかのように本明細書に含まれる）。一本鎖ニックをDNAに導入する他の方法もまた本記載方法で用いることができる。前記には、DNAse消化、UV照射、HinPI、ガンマ線照射およびFenton反応（鉄（Fe2+）および過酸化水素（H2O2）を必要とする）が含まれる。例えば以下を参照されたい：D'Andrea A & Haseltine W, "Sequence specific cleavage of DNA by the antitumor antibiotics neocarzinostatin and bleomycin," PNAS 75:3608-3612 (1978)；Horton J, et al., "DNA nicking by HinP1I endonuclease:bending, base flipping and minor groove expansion," Nucleic Acids Res. 34:939-948 (2006)および米国特許6,306,596号（前記文献の各々は参照によりあたかもその全体を説明したかのように本明細書に含まれる）。
【００１０】
標識ヌクレオチドは、当業者に公知の任意の技術、例えばポリメラーゼによって導入することができる。例えば、鎖の置換反応でクレノーフラグメントまたはphi29 DNAポリメラーゼを用いて標識ヌクレオチドを導入できよう。また別には、ギャップ充填反応でT7エキソヌクレアーゼを用いて標識ヌクレオチドを導入することができる。さらに別には、予め標識したオリゴヌクレオチドをギャプ充填反応で用いて標識ヌクレオチドを導入してもよい。実際、ある1つのオリゴヌクレオチドをただ1つの蛍光色素で標識することができるが、さらに別の蛍光色素で標識してシグナルを増やしてもよい。さらにまた、ニック翻訳を用いて標識ヌクレオチドを導入することもできよう。
ニック翻訳では、標識ヌクレオチドはニック部位から反応中に導入され、ニック部位から終止部位へ向かって伸張する。標識領域は、本明細書では時に‘近傍部分’と称される。ニック部位の下流領域において2つ以上のヌクレオチドの内容についての情報が所望される場合、複数の別個の翻訳反応を実施することができ、この場合各反応は1つの標識ヌクレオチド（A、C、GまたはT）を含む。これらヌクレオチドを例えば蛍光色素で標識することができる（例えばAlexa Fluor-標識ヌクレオチド）。また別には、ヌクレオチドを改変して、組み入れ後に観察可能な標識の結合を促進する部分を組み入れることができる。例えばチオール化ヌクレオチドまたはα-Sヌクレオチドトリホスフェートは金ナノ粒子または金ナノクリスタルに直接結合することができよう。例えば以下を参照されたい：米国特許6,979,729号；Gelles J, et al., "Tracking kinesin-driven movements with nanometre-scale precision," Nature 1988, 331:450-453（前記文献の各々は参照によりあたかもその全体を説明したかのように本明細書に含まれる）。同様に、量子ドット、結晶および粒子もまた用いることができる。
【００１１】
ニック翻訳工程は2つの標識ヌクレオチドが組み入れられるまで進行する。すなわち、連続標識されたヌクレオチドはヌクレオチドとポリメラーゼ間に立体的障害を提供すると考えられている。例えば以下を参照されたい：Ramanathan A, et al., "High density polymerase-mediated incorporation of fluorochrome-labeled nucleotides," Anal. Biochem. 337:1-11 (2005); and Ramanathan A, et al., "An integrative approach for the Optical Sequencing of single DNA molecules," Anal. Biochem. 2004, 330:227-241（前記文献の各々は参照によりあたかもその全体を説明したかのように本明細書に含まれる）。したがって、使用されるポリメラーゼは、ニック翻訳が終了する前に付加されるヌクレオチド数に影響を与える。例えば、phi29ポリメラーゼは、ニック翻訳が終了する前に3つの標識ヌクレオチドを組み入れる。本方法のまた別の実施態様では、ニック翻訳工程は1つのddNTPの組み入れ時に終了することができる（すなわち、4つのヌクレオチド、もっぱらddNTPの1つを有する）。
【００１２】
ニック部位および終止部位は当該DNA分子の領域（すなわち近傍部分）の開始点および終末点を示す。当該領域に組み入れられる標識の量は、標識される配列に左右される。したがって、各領域は、当該領域内の定量可能な標識ヌクレオチド数によって特徴付けられる固有のシグナチャーを有する。領域内のヌクレオチドの内容は、当該領域に組み入れられた標識の量を既知の配列を有する参照ゲノムの対応する領域内の予想される量と比較することによって得られる。例えば、当該領域が標識dATPを用いてニック翻訳される場合、測定される標識の量子は組み入れられたAの数に比例する。同様に、当該領域が標識dCTPを用いてニック翻訳される場合、測定される標識の量子は組み入れられたCの数に比例する。各標識組み入れ工程で標識される領域の長さは、選択した標識ヌクレオチドの少なくとも2つの連続組み入れを当該分子の配列がいつ含むかに左右されるであろう。4つの別個の標識反応が実施される場合、標識領域の完全なヌクレオチド組成を確認することができ、前記ヌクレオチド組成は再度の配列決定の情報内容に匹敵する内容を提供する。しかしながら、単一反応を可能にする、弁別的に標識したヌクレオチドとの複合体形成を利用することもまた可能である。
【００１３】
場合によって本明細書に記載したように、当業者は、配列特異的ニックを導入する前に、DNAサンプル中の内因性ニックを修復または封鎖することによってニック翻訳の特異性を高めることができる。DNAリガーゼを用いてDNAから内因性ニックを除去してもよい。さらにまた、ニックは、ニック翻訳または鎖置換を介してddNTPを組み入れることによって封鎖することができる。同様に、標識された領域の外側に標識分子のタグを用いてDNAサンプルにタグを付加して、領域内の標識ヌクレオチドの可視化を強化することができる。例えば、DNA骨格をYOYO-1または任意の他の適切なDNA染色で染色することができる。DNA染色にはDAPI、TOTO、臭化エチジウムまたは臭化プロピジウムが含まれるが、ただしこれらに限定されない。さらにまた、ゲノムDNAサンプルからタンパク質を除去してもよい。このような工程および他の工程を採用して、標識を定量化する前にDNAを清浄にすることができる。したがって、細胞性タンパク質、非組み入れ蛍光色素または酵素を反応から除去することができる。
特段の指定がなければ、本明細書で使用される全ての技術的および学術的用語は、当業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載した方法および材料と同様のまたは等価のいずれの方法および材料も本発明の実施または試験で用いることができるが、好ましい方法および材料を本明細書で述べる。
本発明は以下の非限定的な実施例を熟考するときにより完全に理解されるであろう。
【実施例１】
【００１４】
“未加工”ゲノムDNAの配列獲得のためのプロセッシング
直鎖状または直鎖化ゲノムDNA分子（ただし任意のDNA分子を用いることができる）を調製するために開示した本明細書の方法によって、多重蛍光標識を有するDNA分子の作製が単純化される。1つの蛍光物質（すなわちドナー、例えばYOYO-1）が他の物質（すなわちアクセプター、例えば蛍光色素標識ヌクレオチド）を励起する光を発生させる蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）の使用によって二色画像化が可能になり、組み入れられていない色素の影響が、前記影響の範囲が限定されるために減少する。上記に特記したように、DNA分子内の各々画像化された標識領域上の蛍光標識プロフィルは前記DNA分子の“シグナチャー”である。標識領域内の標識の量を定量することによって、下記で説明するように参照ゲノムとの比較により標識領域の配列を容易に確認することができる。参照ゲノムとのアラインメントを実施したとき、ゲノム内のマッピングしたニック部位における単一ヌクレオチドまたは2つ以上のヌクレオチドレベルにおける変異を検出することができる。
直鎖化が要求されるか否かにかかわらず、DNAリガーゼを用いてDNA内の固有のニックを除去することができる。T4 DNAリガーゼによるDNAリガーゼ反応を室温で一晩実施する。一晩の反応により完全な連結が担保され、残留DNAリガーゼ活性を最少にすることができる。全ての固有のニックが除去されたことをさらに担保するために、大腸菌のポリメラーゼI（10単位）を、ddNTP（各々0.2μM）とともに37℃で30分添加する。ニックに組み入れられたddNTPはさらに別のポリメラーゼ反応を封鎖しランダム標識を回避する。
【００１５】
続いてニック付加酵素（例えばNb.BbvCI、20単位、
0005746507.tif 000002
またはNt.SapI、20単位、
0005746507.tif 000003
をデオキシヌクレオチドトリホスフェート（dNTP）およびddNTP（例えばAlexa Fluor 647-aha-dCTP（2μM）、Alexa Fluor 647-aha-dUTP（2μM）、dATP（20μM）、dCTP（1μM）、dGTP（20μM）またはdTTP（1μM）（いずれもInvitrogen（Carlsbad, CA）から入手可能な標識ヌクレオチド））とともに添加する。ニック付加制限酵素は一本鎖断裂を導入するだけであり、したがっていずれの切断フラグメントもそれらの順序を維持することを可能にする。ニック効率（したがって再現性）は、酵素およびDNA濃度、消化時間、緩衝液組成、温度、並びに酵素およびDNA調製物の純度を最適化することによって達成される。DNAポリメラーゼは内因性ニックの封鎖中に添加されるので、新たなDNAポリメラーゼはニック翻訳中には添加されない。ニック翻訳反応は37℃で30分間実施される。ニック翻訳の終了は近傍部分の他方の境界を規定し、蛍光色素-蛍光色素立体反応によって決定される。また別には、ニック翻訳は、特にニック部位の間隙が密であるときはddNTPの組み入れによって終了させることができる。一般的には、2つの連続的に組み入れられた蛍光色素標識ヌクレオチドによって仕切られたDNAの領域（すなわち近傍部分）の平均長は64塩基であり、一方、ddNTPによる終了時のDNAの仕切られた領域の平均長は4塩基である。
反応の停止のためにEDTA（pH8.0、20μM）を添加し、さらにプロテイナーゼK（100ng/mL）およびラウロイルサルコシン（0.1% w/v）を添加して全ての酵素を除去する。ゲノムDNAは表面と共有結合していないので、これらの反応のために前記に生化学的に接近することができる。ニック翻訳に続いて、DNAをYOYO-1（25μM；Molecular Probes, Eugene, OR）で対比染色する。DNA塩基対：YOYO-1の比はλDNAについては6：1であり、T4 DNAについては5：1である。
有利には、上記に記載の方法は単一反応チャンバーで実施され、これは工程が単純に付加されることを意味し、これによって、DNAを破壊するかまたは処理量に影響を及ぼす可能性がある移動が最小限にされる。目覚しいことには、続いて分析される標識領域の情報内容は再配列決定による情報内容に匹敵し、1つのヌクレオチドタイプをアッセイするときは使用に適した情報が得られる。
【実施例２】
【００１６】
標識ヌクレオチドの定量
DNAの標識領域に組み入れられた標識ヌクレオチドを定量する。DNA（1ng/mLのλDNAまたは0.78ng/mLのT4 DNA）、トリス-EDTA（TE）緩衝液（pH8.0）、β-メルカプトエタノールおよびPOP6（0.1％ w/v；Applied Biosystems, FosterCity, CA）を含むDNAサンプルを表面、例えば米国特許公開2007/0161028（前記文献は参照によりあたかもその全体が説明されたかのように本明細書に含まれる）に開示された表面にローディングする。TE緩衝液の濃度は1xTE（10mMトリスおよび1mMのEDTA）から0.01xTE（100μMトリスおよび10μMのEDTA）まで変動する。緩衝液のイオン強度は当該表面への添加の前および後の両方で変化させて、DNAの伸張に影響を与えることができる。
表面を定量のために顕微鏡スキャナーに置く。そのような顕微鏡スキャナーの１つはGenome Zephyrであり、前記は蛍光顕微鏡、載物台自動制御装置およびソフトウェアを含む画像化システムである。以下を参照されたい：Zhou S, et al., "A single molecule system for whole genome analysis," in New Methods for DNA Sequencing (K Mitchelson, ed. 2007)；およびDimalanta E, et al., "A microfluidic system for large DNA molecule arrays," Anal. Chem. 2004, 76:5293-5301（前記文献はあたかもその全体が説明されたかのように参照により本明細書に含まれる）。前記システムはアルゴンイオン、レーザー照射倒立Zeiss 135M顕微鏡を用いてDNA分子を画像化する。前記顕微鏡には、63xのZeiss Plan-Neofluar油浸対物レンズ、Dage SIT68GL低光量レベルビデオカメラ（DNA分子のビジュアル精査のためにソニーのモニターに連結されている）、並びに焦点および高解析画像を得るためのCCD（charge-couple device）カメラが搭載されている。Ludl Electronicsのx-yステージおよび0.1-m解像の焦点モーターをx-y-z平行移動のために用いる。2つの発光フィルター（YOYO-1発光フィルターXF3086およびAlexa Fluor 647発光フィルター）を前記顕微鏡に取り付ける。YOYO-1フィルターを用いてDNA骨格の画像を撮影し、一方、Alexa Fluor 647フィルターを用いて蛍光共鳴エネルギー伝達（FRET）画像を撮影する。完全なスキャニングシステムは例えばChannelCollectのソフトウェアの制御下にある（Zhouら（上掲書）およびDiamalantaら（上掲書）を参照されたい）。
【００１７】
もっとも簡単な編成では、2台のカメラは同一であり、搭載機器はアラインメントにおける以下の3つの誤差を導入するのみである：（1）カメラは互いに対してわずかに回転する；（2）カメラは正確な焦点面に配置されないで、小さいが測定可能な倍率の相違をもたらす；および（3）カメラは互いに対して水平に／垂直にずれる。
これらの想定の下で、2台のカメラで撮影される画像間の画像座標のマッピングは類似性変換（すなわち平行移動、回転およびスケール変化）によって記載することができる。2台のカメラによって捕捉される、多数の固有で詳細な特色を有する標的サンプルの画像ペアセットを採集することによりこれらの値を計算する。各画像ペアについて、一方の画像を固定し、他方の画像を回転させさらに種々の角度および倍率係数により縮尺を増減させて、一連の相関性を調べる。通例では、これによって放物線と適合し得る滑らかな二次元（回転対倍率）スペースが作られる。この曲線の頂点の座標は要求される回転およびスケーリングを決定する。平均的、全体的な画像ペアを用いてこれらの数字の精度を高める。いったん回転および倍率を計算したら、各画像ペアを相関させて、X/Yピクセルオフセットを見出すことができ、これらをまた平均してより正確な値を得る。
【００１８】
しかしながら通例では、このプロセスは本明細書に記載する目的のためには十分ではない。さらに、各カメラが、それが置かれている焦点面に対してわずかに上下に傾いている可能性もまたあり得る。さらにまた、これらカメラが正確に一致していない可能性もある。結果として、より一般的に適合する変換（すなわち平行移動、回転、スケーリングおよびシアリング）が計算に必要である。ここでは類似性変換を計算するために用いられる同じ画像ペアセットを用いる。各画像ペアについて、一方の画像を固定し、他方の画像を以前に計算した類似性変換を用いて変換する。続いて8x8グリッドを用いてこれらの画像を小区分に分割し、得られた64の部分画像ペアの各々において相関性を調べる。類似性変換を用い、部分画像ペアの各々で同時に生じる画像データの量を最大にすることによりこれらの相関性における誤差を最少にする。これによって、画像スペース全体にわたって均質に広がる、64のX/Yピクセルオフセット一式（各部分画像ペアの中心に対するもの）が得られる。64のX/Yピクセルオフセット一式は最初の画像ペアの各々について計算される。
Cn＝（x,y,l）をnth未変換部分画像の中心の均質な座標とすると、Dn＝（x+dX, y+dY, l）は対応する変換部分画像の中心の均質な座標である。さらに解は、D＝M*Cである。
直線回帰技術を用いる行列等式として、前記行列を続いて類似性変換と結合させて所望の適合する変換が得られる。
【００１９】
本質的には、上記で述べたシステムは、発光分割装置を搭載し、2つのフィルターおよびCCDカメラを収納する既存の画像採取ステーションの変型である。2つのCCDカメラ間の表示は、一方のカメラから他方のカメラまでのピクセル座標を地図に表す変換行列を計算することによって実施され、2つの工程で達成される。第一の工程では、ピクセルオフセットに沿って回転およびスケーリングが計算される。第二の工程では、この変換の精度を顕微鏡上の固定標的を用いて高めて、水平と垂直スケーリングで観察された変動および画像軸の非直交性を埋め合わせる。
回転およびスケーリングは、画像の1つを回転させ、一方で相対する画像をスケーリングしさらに一連の角度および倍率にわたってこれら画像の相関性を計算することによって計算する。相関性がその最大値に近い角度および倍率を用い、最良の回転角度およびスケール係数を概算する。ピクセルオフセットを計算するためのこの最良の角度およびスケールにより変換した画像で最終的な相関性を調べる。
潜在的な誤差発生源である時間経過による機械的アラインメントのいくらかの移動が発生する。十分な相関性を有する情報を含む部分画像のみが用いられたことを担保するために適切なチェックが実施されることを条件に、未加工画像群で部分画像アラインメント技術を用いてアラインメントが正確であることを立証することが可能である。
【００２０】
上記に記載したシステムは、その後でデータまたはマップファイルに変換される大きな画像ファイルを生じる。これは、機械による視覚のためのソフトウェア、例えばPathfinder（例えばZhouらの上掲書およびDimalantaらの上掲書を参照されたい）によって達成される。機械による視覚のためのソフトウェアは人間による対象物の認識と一致しないので、そのような分子の沈積パターンは極めて小さな形態学的変動を提示するだけであり、この機能は信頼性のある実施のために画像分析技術と協調的に働く。同じ親分子に由来すると決定された制限フラグメントの鎖の質量は、組み込まれた蛍光の強度および見かけの長さの測定の両方によって決定される。このソフトウェアの最終生成物はマップファイルであり、このファイルは続いてJPEGフォーマットに圧縮される。この整理された制限マップはバーコードおよびそのような機能と考えることができる。
画像がいったん記録されたら、次の工程は、使用したフィルターのバンドパスのために赤色（FRET）画像に存在する緑色（YOYO-1）シグナルを除去することである。アルゴリズムを介して閾値を緑色画像で計算し、このレベルよりも明るい全てのピクセルがDNA骨格に存在することを明らかにする。赤色画像内の対応するピクセルを用いて、各点における緑色から赤色へのブリードスルー比を計算する。これらの値の平均を画像セットのためのブリードスルー係数として用いる。赤色画像の各ピクセルを、ブリードスルー係数（〜0.025）×一致する緑色画像の対応するピクセルの値を差し引くことによって調整する。
【００２１】
続いて同じ閾値発見アルゴリズムを前記調整した赤色画像に適用する。前記閾値を越える連続ピクセルセットを用いて、句読点（すなわちニック付加制限酵素によってゲノムDNAサンプルに導入された可視化ニック）を識別する。各セットのもっとも明るいピクセルを用いて句読点の位置を示す。続いてこの句読点を緑色画像で見出される分子と相関させ、DNA骨格に沿って間隔を決定する。
最終工程として、句読点の強度が計算される。各句読点周囲の面積を用いて存在する骨格シグナルを決定する。続いてシステムノイズを含むモデルを用いて、各句読点を構成するピクセルにガウスピークをフィットさせる。ガウスフィットの高さおよび変動を用い、光学的配列決定のために開発されたソフトウェアおよび分析により句読点の強度を計算する。上掲書（Ramanathan et al., 2004）を参照されたい。
マップは2つの方法のうち1つで読み取る。例えば、コンピュータで構築した参照ゲノムのマップ（すなわちin silicoマップ）に対してマップをアラインメントする。また別には、de novoでマップを作製し、同じデータセットの他の単一分子マップまたはバーコードに対して前記マップをアラインメントする。しかしながら、第一のタイプのアラインメントは、参照ゲノムに対してもっとも“蓋然性”の高い配置を考えるアラインメントアルゴリズムを必要とする。
【００２２】
本明細書で用いられるアラインメントアルゴリズムは発見に役立つアッセンブラーであり、前記は、ペア毎にSmith-Watermanダイナミックプログラムのアルゴリズムを利用し、アッセンブリーのための問題をより小さな問題に下位分類して制限マップバーコードを識別する。アラインメントおよびアッセンブリー工程の両方のためのその後のコンピュータ作業は、したがってクラスターを形成するワークステーションの大きなネットワークに分配される。以下を参照されたい：Valouev A, et al., "Refinement of optical map assemblies," Bioinformatics 22:1217-1224 (2006)；Valouev A, et al., "Alignment of optical maps," J. Comput. Biol. 13:442-462 (2006)；Zhou et al. (2007) 上掲書；およびZhou S, et al., "Validation of rice genome sequence by optical mapping," BMC Genomics 8:278 (2007)。
ソフトウェアプログラムに組み入れられているアルゴリズムは、DNAまたはタンパク質配列のアラインメントと完全に類似する態様で、参照マップに対する可能なアラインメントの各々に付随する蓋然性に由来するスコア機能に依存する。この蓋然性の機能はそれ自体光学的マッピング誤差モデルに由来し、誤差削除のための条件を含む。アラインメントおよびアッセンブリー工程の両方のためのその後のコンピュータ作業は、したがってクラスターを形成するワークステーションの大きなネットワークに分配される。
【００２３】
アルゴリズムは反復され、この繰り返しの各工程の結果はゲノムの近似マップである。その後の工程では、この近似が参照マップとして用いられ、それに対してデータセット中の全ての光学マップがアラインメントされる。続いて、参照ゲノムに対するそれらのアラインメントの位置にしたがって、光学マップクラスターを形成し、それにより各クラスターを端末でアッセンブリングする。これらのアッセンブリーから生じるコンセンサスマップは次の工程のための参照マップをもたらす。ヒトゲノムアッセンブリーは、最初の参照としてヒト配列（NCBI Build 35）に由来するin silicoマップから開始し8回の繰り返しを用いる。このアプローチを用いて完全なマウスゲノムマップもまたアッセンブリングされた。
したがって、アラインメントプロセスは各分子の実体を明らかにするだけでなく、通常の制限マップの特色により特徴付けられる構造的変異（制限部位の存在不明または欠失、ゲノムの挿入および欠失を含む）もまた明らかにする。
一緒に局在する標識ヌクレオチドの数を数える必要があるので、同じ近傍部分の配列を再度完全に決定したら入手し得る情報と比較してこのデータの情報内容を評価することができる。この情報の比較は、カウント（すなわち蛍光色素カウント）が完全な配列の代わりに基礎となる配列の特徴を明らかにするという概念を定量化し、配列の読みと等価であって一定のより短い長さを有するものを提供する。
統計的エントロピーを利用する以下の情報比較が用いられた：
H＝Σx p(x) log p(x)、式中xはデータ（ある事例では再配列決定によるデータおよび他の事例ではフラッシュ配列決定によるデータ）であり、p(x)はデータxに付随する確率であってその合計はデータ全体の可能な認識であり、さらにlog p(x)は底が2の対数である。情報理論は、Jはデータの情報内容に関して直接的な解釈を有することを予測する。情報の量はHの増加とともに増加する。
【００２４】
例えば、サンプルゲノムの領域（Hf、緑色）は参照ゲノムの同じ領域（Hr、赤色）と等しいと仮定せよ（ただし目下の塩基を他の3つの塩基に均一に割り振る独立した点変異（その率qは各塩基に付きq＝1/500である）は除かれる）。蛍光色素の計測では領域内の完全な配列を保存できない。当然、情報の損失が存在し、Hf＜Hrである。この損失は、近傍部分のニック部位が長くなるにつれ大きくなる。しかしながら、本発明は、再配列決定から得られる情報の重要な部分に等しい情報を含むデータを生じる。例えば25塩基対を例に取れば、配列の代わりに塩基カウントを知ることは15塩基対の読みの情報に匹敵し、わずか2つの塩基のカウントを知ることは10塩基対の読みに匹敵し、さらにたった1つの塩基のカウントを知ることは5塩基対の読みに匹敵する。
本発明はまた、未だ配列が決定されていないゲノムにも適用される。本方法は、認識部位の各々および各認識部位の近傍部分の配列情報の入手を可能にする。分子が認識部位を有し、前記認識部位がmの塩基を含む場合、標識の存在は、m*n塩基対の配列情報を提供する。各近隣部分の蛍光色素のカウントはさらに追加される情報を含むデータを生じ、前記情報は、de novoの配列決定から得られる情報の重要な部分に等しい。前記追加される情報はIUPAC多義性コードを含む塩基対情報の提示に類似する。
【００２５】
これまでのところ、マップデータの閲覧および相互やり取りのためのインターフェースをユーザーに提供する2つのソフトウェアパッケージが利用可能である。１つはGenspectであり、他方はカスタムOptical Mappingを有するSanta Cruz Genome Browserである（上掲書（Zhou et al., 2007）を参照されたい）。前記は、公開データベースに直接リンクされたマップデータを提供し、それによって配列データおよび付随する注釈を提供する。リンクは特定のフラグメント上でクリックすることによってGenspect内の画像データにつながれる。Omari画像の閲覧者は、インタラクティブブラウジングのために自動的に対応する画像セットを提示する。ユーザーは、Pathfinderのマーカップ注釈およびフラグメントサイズが付された入手分子画像を見る。
ヒトゲノムの全ゲノムスキャン（光学マップとも称される）はほぼ100,000画像を生じる。上記に記載した画像加工および分析方法は、そのようなギガバイトサイズのファイルをコンパクトなマップデータファイルに縮小する。
これまで本発明をもっとも実際的で好ましい実施態様と考えられるものに関連して説明してきた。しかしながら本発明は例示として提示されてきたのであり、開示の実施態様に限定する意図はない。したがって、本発明が、添付の特許請求の範囲で示された本発明の範囲内の全ての改変および代替編成物を包含しようとすることは当業者には理解されよう。
本発明の好ましい態様は、下記の通りである。
〔１〕以下の工程を含む、DNA分子からヌクレオチド配列組成情報を入手する方法：
配列特異的一本鎖ニック部位をDNA分子に導入する工程；
前記DNA分子の前記ニック部位から終止部位に及ぶ領域に標識したヌクレオチドを組み入れる工程；
前記DNA分子の前記領域に組み入れたヌクレオチドを定量して、前記領域付近のヌクレオチド配列組成情報を確認する工程；および
参照ゲノムの対応する領域のヌクレオチド配列組成情報と前記確認したヌクレオチド配列組成情報を比較して、前記DNA分子の領域の前記確認した配列ヌクレオチド組成情報が参照ゲノムの対応する領域のヌクレオチド配列組成情報と同じであるかまたは前記と相違するかを決定する工程。
〔２〕ニック部位がニック付加制限酵素によってDNAへ導入される、前記〔1〕に記載の方法。
〔３〕ニック付加制限酵素がNb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nb.BbvCI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BstNBI、Nt.SapIおよびNt.CviPIIから成る群から選択される、前記〔2〕に記載の方法。
〔４〕標識ヌクレオチドがポリメラーゼによって組み入れられる、前記〔1〕に記載の方法。
〔５〕標識ヌクレオチドがニック翻訳によって組み入れられる、前記〔1〕に記載の方法。
〔６〕終止部位が少なくとも1つの組み入れた標識ヌクレオチドによって特徴付けられる、前記〔1〕に記載の方法。
〔７〕終止部位が少なくとも2つの組み入れた標識ヌクレオチドによって特徴付けられる、前記〔1〕に記載の方法。
〔８〕終止部位がターミネーターによって特徴付けられる、前記〔1〕に記載の方法。
〔９〕ターミネーターが組み入れたジデオキシヌクレオチドから選択されるか、または組み入れたジデオキシヌクレオチドおよび色素によって選択される、前記〔8〕に記載の方法。
〔１０〕導入工程の前にDNA分子の非配列特異的内因性ニック部位からの標識の組み入れを低下させるかまたは防止する工程をさらに含む、前記〔1〕に記載の方法。
〔１１〕標識の組み入れを低下させるかまたは防止する工程が、DNA分子の内因性ニックを修復する工程およびDNA分子の内因性ニックを封鎖する工程から成る工程群から選択される、前記〔10〕に記載の方法。
〔１２〕DNA分子の前記領域の外側で標識分子タグをDNA分子に付加する工程をさらに含む、前記〔1〕に記載の方法。
〔１３〕標識分子が包括的染色性蛍光色素である、前記〔12〕に記載の方法。
〔１４〕包括的染色性蛍光色素がYOYO-1である、前記〔13〕に記載の方法
〔１５〕さらにDNA分子からタンパク質を除去する工程を含む、前記〔1〕に記載の方法。
〔１６〕標識ヌクレオチドがAlexa-標識ヌクレオチドおよびCy5-標識ヌクレオチドから選択される、前記〔1〕に記載の方法。
〔１７〕以下の工程を含む、DNA分子のヌクレオチド配列組成情報を評価する方法：
配列特異的一本鎖ニック部位をDNA分子に導入する工程；
前記DNA分子の前記ニック部位から終止部位に及ぶ領域に標識したヌクレオチドを組み入れる工程；
前記領域に組み入れたヌクレオチドを定量して、前記領域付近のヌクレオチド配列組成情報を評価する工程。
〔１８〕ニック部位がニック付加制限酵素によってDNAへ導入される、前記〔17〕に記載の方法。
〔１９〕ニック付加制限酵素がNb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nb.BbvCI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BstNBI、Nt.SapIおよびNt.CviPIIから成る群から選択される、前記〔18〕に記載の方法。
〔２０〕標識ヌクレオチドがポリメラーゼによって組み入れられる、前記〔17〕に記載の方法。
〔２１〕標識ヌクレオチドがニック翻訳によって組み入れられる、前記〔17〕に記載の方法。
〔２２〕終止部位が少なくとも1つの組み入れた標識ヌクレオチドによって特徴付けられる、前記〔17〕に記載の方法。
〔２３〕終止部位が少なくとも2つの組み入れた標識ヌクレオチドによって特徴付けられる、前記〔17〕に記載の方法。
〔２４〕終止部位がターミネーターによって特徴付けられる、前記〔17〕に記載の方法。
〔２５〕ターミネーターが組み入れたジデオキシヌクレオチドから選択されるか、または組み入れたジデオキシヌクレオチドおよび色素によって選択される、前記〔24〕に記載の方法。
〔２６〕導入工程の前にDNA分子の非配列特異的内因性ニック部位からの標識の組み入れを低下させるかまたは防止する工程をさらに含む、前記〔17〕に記載の方法。
〔２７〕標識の組み入れを低下させるかまたは防止する工程が、DNA分子の内因性ニックを修復する工程およびDNA分子の内因性ニックを封鎖する工程から成る工程群から選択される、前記〔26〕に記載の方法。
〔２８〕DNA分子の前記領域の外側で標識分子タグを前記DNA分子に付加する工程をさらに含む、前記〔17〕に記載の方法。
〔２９〕標識分子が包括的染色性蛍光色素である、前記〔28〕に記載の方法。
〔３０〕包括的染色性蛍光色素がYOYO-1である、前記〔29〕に記載の方法
〔３１〕さらにDNA分子からタンパク質を除去する工程を含む、前記〔17〕に記載の方法。
〔３２〕標識ヌクレオチドがAlexa-標識ヌクレオチドおよびCy5-標識ヌクレオチドから選択される、前記〔17〕に記載の方法。
【図１】
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