(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子発現ユニットに動作可能に接続されたエシェリキア属菌株由来フルクトキナーゼ遺伝子を含み、前記フルクトキナーゼ遺伝子がｃｓｃＫ又はｍａｋである、Ｌ−アミノ酸の生産のためのコリネバクテリウム属菌株。
【請求項２】
前記フルクトキナーゼ遺伝子が、配列番号１７又は配列番号１８のヌクレオチド配列を有するものである、請求項１に記載のＬ−アミノ酸の生産のためのコリネバクテリウム属菌株。
【請求項３】
前記遺伝子発現ユニットが、ベクターに作動可能に接続され、前記コリネバクテリウム微生物を形質導入されて含まれるか、又は前記のコリネバクテリウム微生物の染色体に挿入されて含まれるものである、請求項１に記載のＬ−アミノ酸の生産のためのコリネバクテリウム属菌株。
【請求項４】
前記遺伝子が、前記遺伝子発現ユニット内の遺伝子発現調節領域により過剰発現されるものである、請求項１に記載のＬ−アミノ酸の生産のためのコリネバクテリウム属菌株。
【請求項５】
前記遺伝子発現調節領域が、ｃｓｃＫプロモーター、ｍａｋプロモーター、ｐｃｊ７プロモーター、ｌｙｓＣＰ１プロモーター、ＥＦ−Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、及びａｃｅＡＢプロモーターで構成される群から選択されたプロモーターである、請求項４に記載のＬ−アミノ酸の生産のためのコリネバクテリウム属菌株。
【請求項６】
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン又はＬ−グルタミン酸である、請求項１に記載のＬ−アミノ酸の生産のためのコリネバクテリウム属菌株。
【請求項７】
スレオニン生合成及び排出関連遺伝子を含むベクターをさらに形質転換させたものである、請求項１に記載のＬ−アミノ酸の生産のためのコリネバクテリウム属菌株。
【請求項８】
前記スレオニン生合成関連遺伝子が、ｈｏｍ−ｔｈｒＢ又はｈｏｍ−ｔｈｒＣであり、スレオニン排出関連遺伝子がｈｏｍ−ｔｈｒＥである、請求項７に記載のＬ−アミノ酸の生産のためのコリネバクテリウム属菌株。
【請求項９】
前記コリネバクテリウム属菌株が、コリネバクテリウムグルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）からなる群から選択されたものである、請求項１に記載のＬ−アミノ酸の生産のためのコリネバクテリウム属菌株。
【請求項１０】
前記形質転換菌株が、受託番号KCCM11183Pである、請求項１に記載のＬ−アミノ酸の生産のためのコリネバクテリウム属菌株。
【請求項１１】
（ｉ）請求項１〜１０のいずれか一項のコリネバクテリウム属菌株を培養する段階、及び
（ｉｉ）前記培養物からＬ−アミノ酸を回収する段階を含む、Ｌ−アミノ酸の生産方法。
【請求項１２】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、Ｌ−スレオニン又はＬ−グルタミン酸である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ｉ）請求項１〜１０のいずれか一項のコリネバクテリウム属菌株を、スクロースを炭素源として含む培地で培養する段階、及び
（ｉｉ）前記培養物からＬ−アミノ酸を回収する段階を含む、Ｌ−アミノ酸の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エシェリキア属菌株に由来するフルクトキナーゼ遺伝子が導入されたコリネバクテリウム属菌株、及び該菌株を用いてＬ−アミノ酸を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コリネバクテリウム属菌株（Corynebacteria sp.）、特にコリネバクテリウムグルタミクム（Corynebacterium glutamicum）は、Ｌ−アミノ酸の生産に多く利用されているグラム陽性の微生物である。Ｌ−リジンのようなＬ−アミノ酸は、動物飼料、ヒトの医薬品及び製薬産業に広く使用されており、コリネバクテリア菌株を用いた遺伝子工学的方法で大量生産されている。産業の発達に伴うＬ−アミノ酸の需要の増加に応じて、より効果的かつ経済的にＬ−アミノ酸を生産するために改良されたコリネバクテリア菌株の開発が続けられている。
【０００３】
一般的に、コリネバクテリア菌株にＬ−アミノ酸生合成関連の遺伝子のような特定のＤＮＡを導入したり、その活性を向上させることで、コリネバクテリアのＬ−アミノ酸の生産性を増大させてきた。例えば、特許文献１及び特許文献２には、コリネバクテリウムグルタミクムに由来するｓｕｃＣ及びｓｕｃＤ遺伝子並びにｚｗａ２遺伝子を減衰発現させ、コリネバクテリアからＬ−アミノ酸の生産性を増大させる方法が開示されている。特許文献３には、コリネバクテリウムグルタミクムに由来するｚｗａ１遺伝子を過剰発現させることにより、コリネバクテリアからＬ−アミノ酸の生産性を増大させる方法が開示されている。特許文献４には、エシェリキアコリ（Escherichia coli）由来のクエン酸シンターゼ（citric acid synthase）をコードする遺伝子を導入する方法が開示されている。
【０００４】
一方、前記コリネバクテリウム属菌株は、炭素源としてスクロース（sucrose）、グルコース（glucose）及びフルクトース（fructose）を使用することができる。この中で、スクロースはホスホトランスフェラーゼ系（PTS）によってリン酸化され、細胞内に流入される。その後、リン酸化されたスクロースは、インベルターゼ（invertase）によってグルコース−６−リン酸及びフルクトースに加水分解される。前記生成されたグルコース−６−リン酸は、すぐに解糖作用（glcolysis）に利用されるが、リン酸化されないフルクトースは、細胞外に排出される。これは、ＰＴＳによってリン酸化された後、再び細胞内に流入され、解糖過程に使用される。コリネバクテリウム属菌株がフルクトキナーゼ（fructose kinase）活性を有さないため（非特許文献１）、このようにフルクトースは、炭素源として使用されるために、比較的複雑な経路を経るようになる。一方、フルクトキナーゼを発現する細菌では、スクロースがインベルターゼによってグルコース−６−リン酸及びフルクトースに加水分解された後、フルクトキナーゼによってフルクトースがリン酸化される。その後、グルコース−６−リン酸及びリン酸化されたフルクトースが、解糖過程に利用される。
【０００５】
このように、フルクトースをコリネバクテリウム属菌株の培養時の炭素原に利用する場合、複雑な代謝経路を経る過程で、エネルギーの無駄な消耗が発生するという問題があるため、このような問題を解決すべく様々な研究がなされている。例えば、本発明は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）又はバシラス・サブティリス（Bacillus subtilus）に由来するフルクトキナーゼ遺伝子をコリネバクテリウム属菌株に導入して製造した形質転換株を利用してＬ−リジンを生産する方法を開発した（特許文献５）。しかし、その後の研究により、前記フルクトキナーゼ遺伝子が導入されることによって形質転換されたコリネバクテリウム属菌株は、発現されるフルクトキナーゼの活性が非常に低く、スクロースを炭素源として利用して前記菌株を培養する場合、スクロースに由来するフルクトースの生成量のうち一部のみがフルクトース−６−リン酸に変換され、残りのフルクトースは、野生型菌株と同様に細胞外に排出された後、ホスホトランスフェラーゼ系によってリン酸化された後、再び細胞内に流入されることを確認し、フルクトキナーゼ遺伝子を導入した意図が十分に反映されないという欠点があることが分かった。したがって、コリネバクテリウム属菌株のフルクトースをフルクトース-6-リン酸に転換させるのに十分な活性を示すことができる他のフルクトキナーゼ遺伝子を探求する必要性が提示された。
【０００６】
望ましいフルクトキナーゼ遺伝子は、スクロースの同化能付与のためのスクロースの流入及び分解遺伝子に関連した研究の結果として明らかになっているが、サルモネラ（Salmonella）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumonia）及びエルウィニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）に存在するｓｃｒレギュロン（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、特許文献６）、及びエシェリキア属菌株由来のｃｓｃレギュロン（非特許文献７、特許文献７）、グラム陽性微生物であるストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来のｓｃｒレギュロンとｓａｃオペロン（非特許文献８）などが明らかにされている。この中で、エシェリキア属菌株から二種類のフルクトキナーゼ遺伝子（ｃｓｃＫ及びｍａｋ）が発見され、前記ｃｓｃＫは、ｃｓｃレギュロンに属するフルクトキナーゼ遺伝子としてｃｓｃＢ（proton symport-type sucrose permease）及びｃｓｃＡ（sucrose hydolase）と共にスクロース代謝に関連することが知られており（非特許文献９）、前記ｍａｋは、マンノキナーゼをコードする遺伝子として、マンノキナーゼはマンノース、フルクトース、グルコースなどを含むヘキソース（hexose）を６−ホスホ-エステル（6-phospho-ester）の形に変換する活性を示すことが知られている（非特許文献１０）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】大韓民国特許公開第2001-51915号
【特許文献２】大韓民国特許公開第2001-62279号
【特許文献３】大韓民国特許公開第2001-62272号
【特許文献４】日本特許広報第1995-121228号
【特許文献５】大韓民国特許登録第0564805号
【特許文献６】米国特許第7,179,623号
【特許文献７】米国特許第6,960,455号
【特許文献８】大韓民国特許登録第0620092号
【特許文献９】WO2009/096689
【特許文献１０】大韓民国特許登録第0159812号
【特許文献１１】大韓民国公開特許第2009-0107665号
【特許文献１２】大韓民国特許登録第0824457号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Appl Environ Microbiol.（1996）62:3878-3880
【非特許文献２】J. Bacteriol.、151:68-76、1982
【非特許文献３】Mol.  Microbiol.、2:1-8、1988
【非特許文献４】J. Bacterio.、173:7464-7470、1991
【非特許文献５】J. Gen.  Microbiol.、134:1635-1644、1988
【非特許文献６】J. Bacteriol.、182:5351-5358、2000
【非特許文献７】Appl. Environ. Microbiol.、58:2081-2088、1992
【非特許文献８】J. Bacteriol.、171:263-271、1989）
【非特許文献９】J. Bacteriol.、184：5307-5316、2002）
【非特許文献１０】Mol. Microbiol.、5:2913-2922、1991
【非特許文献１１】Chmiel、Bipprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik、Gustav Fischer Verlag、Stuttgart、1991
【非特許文献１２】Storhas、Bioreaktoren und periphere Einrichtungen、ViewegVerlag、Braunschweig/Wiesbaden、1994
【非特許文献１３】"Manual of Methods for General Bacteriology"by the American Society for Bacteriology、Washington DC、米国、1981）
【非特許文献１４】Microbiology（2002） 148:843-852）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明者らはエシェリキアのフルクトキナーゼ遺伝子（ｃｓｃＫ及びｍａｋ）を分離し、これらのコリネバクテリウム菌株に形質転換させ、アミノ酸の生産能が改善された菌株を提供することが可能となり、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的は、エシェリキア属菌株に由来するフルクトキナーゼ遺伝子が導入され、リン酸化されたスクロースの分解によって生成されたフルクトースを細胞外に排出した後、再流入させる過程を経ずにフルクトースをフルクトース−６−リン酸に転換させるのに十分な活性を示すことができるフルクトキナーゼが発現されることにより、エネルギーの無駄な消耗を防ぐことができるように形質転換されたコリネバクテリウム属菌株を提供することにある。
【００１１】
また、本発明の目的は、前記形質転換されたコリネバクテリウム属菌株を培養し、それからＬ−アミノ酸を回収する段階を含むＬ−アミノ酸の生産方法を提供することにある。
【００１２】
さらに、本発明の目的は、前記形質転換されたコリネバクテリウム属菌株をスクロースを炭素源として含む培地で培養し、それからＬ−アミノ酸を回収する段階を含むＬ−アミノ酸の生産方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の形質転換されたコリネバクテリウム属菌株は、エシェリキア由来のフルクトキナーゼ遺伝子から発現されるフルクトキナーゼによって、フルクトースの代謝時の不必要なエネルギーの消耗を防止することで、より経済的にＬ−アミノ酸を生産することができる。したがって、Ｌ−アミノ酸の効果的な生産に広く活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】フルクトキナーゼ遺伝子が導入され、形質転換されたコリネバクテリウムグルタミクム菌株を培養し、培地中に存在するスクロース及びフルクトースの量を定量した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
前記目的を達成するために、本発明の一実施形態によれば、本発明は、遺伝子発現ユニットに動作可能に接続されたエシェリキア属菌株由来のフルクトキナーゼ遺伝子を含むＬ−アミノ酸の生産のためのコリネバクテリウム属菌株を提供する。この時、前記フルクトキナーゼ遺伝子は特にそれに限定されないが、ｃｓｃＫ又はｍａｋを使用するのが好ましく、ｃｓｃＫを使用するのが最も好ましい。本発明の一実施例によれば、前記ｃｓｃＫは、配列番号１７のヌクレオチド配列を有し、前記ｍａｋは、配列番号１８のヌクレオチド配列を有する。
【００１６】
また、前記遺伝子発現ユニットは、ベクターに作動可能に接続され、好ましくは前記コリネバクテリウム微生物に形質導入されて挿入されたり、前記コリネバクテリウム微生物の染色体内に挿入されて含まれてもよい。前記遺伝子は、好ましくは遺伝子の発現調節領域の変形により過剰発現され得る。
【００１７】
たとえば、前記遺伝子の上流に位置した本来のプロモーターの代わりに異種プロモーターを接続することもできるが、前記異種プロモーターの例としては、ｐｃｊ７プロモーター、ｌｙｓＣＰ１プロモーター、ＥＦ−Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡプロモーター、ａｃｅＢプロモーターなどがあり、コリネバクテリウム由来のプロモーターであるｐｃｊ７プロモーター又はｌｙｓＣＰ１プロモーターを使用することが好ましく、最も好ましくはｐｃｊ７プロモーターを使用することができる。
【００１８】
本発明において用語、「発現ユニット」とは、蛋白質をコードするポリヌクレオチドが使用可能に接続されたプロモーターを含む断片を意味し、それに3'-UTL、5'-UTL、ポリＡ末端などがさらに含まれ得る。本発明における用語「発現ユニット」は「発現カセット」と混用することができる。
【００１９】
本発明において、用語「ｐｃｊ１プロモーター」とは、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス及びエシェリキアにおいて優れたプロモーター活性を示すようにするために発現され、コリネバクテリウムグルタミクムにおいても優れたプロモーター活性を示すプロモーターを意味する（特許文献８）。
【００２０】
本発明において、用語「ｌｙｓＣＰ１プロモーター」とはアスパラテートキナーゼ及びアスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のプロモーター部位の塩基配列置換により改良されたプロモーターとしてアスパルテートキナーゼ遺伝子の発現量の増大によって該当酵素の活性を野生型に比べて約５倍程度向上させることができる強力なプロモーターを意味する（特許文献９）。
【００２１】
本発明において、前記フルクトキナーゼ遺伝子が導入可能なコリネバクテリウム属菌株はコリネバクテリウム属に属し、Ｌ−アミノ酸の生産能を有するすべての菌株を含むことができる。前記菌株は、例えば、特に限定されないが、好ましくは、コリネバクテリウムグルタミクム（Corynebacterium glutamicum）（ATCC 13032）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）（FERM BP-1539）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）（ATCC14067）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）（ATCC 13869）などを含むことができ、より好ましくは、コリネバクテリウムグルタミクム（Corynebacterium glutamicum）KFCC10881（特許文献１０）、KFCC-11074、及びKFCC110011を含むことができる。
【００２２】
本発明において、用語「形質転換」とは、前記フルクトキナーゼ遺伝子を宿主細胞であるコリネバクテリウム属菌株内に導入し、前記宿主細胞内で発現されるようにする全般的な行為を意味する。この時、前記フルクトキナーゼ遺伝子は、フルクトキナーゼをコードすることができるポリヌクレオチドとしてＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記遺伝子は、宿主細胞内に導入されて発現され得るものであれば、どのような形でも導入することができる。例えば、前記遺伝子は、それ自体に前記遺伝子の発現に必要なすべての尿素（element）を含むポリヌクレオチド構造体の発現カセット（expression cassette）の形で宿主細胞内に導入することができる。前記発現カセットは、通常、前記遺伝子に作動可能に接続されたプロモーター、転写終止シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終止シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製が可能な発現ベクターの形であってもよい。また、前記遺伝子は、それ自体又はポリヌクレオチド構造体の形で宿主細胞に導入され、宿主細胞の発現に必要な配列と作動可能に接続されるものであってもよい。
【００２３】
一方、本発明の他の実施態様によれば、本発明は、前記エシェリキア属菌株に由来するフルクトキナーゼ遺伝子が形質転換されたコリネバクテリウム属菌株を培養する段階、及び前記培養物からＬ−アミノ酸を回収する段階を含む、Ｌ−アミノ酸の生産方法に関するものである。
【００２４】
このとき、Ｌ−アミノ酸は、すべての形態のＬ−アミノ酸であってもよく、好ましくは、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン又はＬ−グルタミン酸であってもよい。
【００２５】
前記のコリネバクテリウム属微生物の培養は、適切な培地で、当業界で公知の様々な培養方法で行うことができる（非特許文献１１、非特許文献１２）。前記培養方法の例には、回分式、連続式及び流加式培養が含まれる。前記流加式培養には、流加プロセス及び反復流加プロセスが含まれるが、これに限られるものではない。
【００２６】
また、培養に使用可能な培地は培養方法と菌株に応じて、当業界に公知の適切な培地を選択することができる（非特許文献１３）。本発明で使用される培地は、様々な炭素源、窒素源及び微量元素成分を含まれている。コリネバクテリウム微生物培養のための培地における炭素源としては、スクロース、グルコース、フルクトース、脂肪、脂肪酸、アルコール、有機酸など、いずれも使用できる。特に、本発明のコリネバクテリウム微生物は、フルクトキナーゼ活性を有するので、リン酸化されたスクロースの分解によって生成されたフルクトースを細胞外に排出した後、再流入させる過程を経ずに、細胞内でフルクトースがフルクトキナーゼによって直ちにリン酸化され、その過程で使用される。そのため、本発明のコリネバクテリウム微生物は既存のコリネバクテリウム微生物に比べ、より向上したスクロースの同化能を有する。これに使用することができる炭素源の具体例としては、スクロースを多量に含んだ糖蜜、グルコース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースなどの炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油のような脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール及びエタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。適量の炭素源は、多様に利用される。窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンステイーブリカー、及び大豆粉などの有機窒素源と尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムなどの無機窒素源がある。これらの窒素源は、単独又は組み合わせて使用することができる。前記培地には、リン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム及び対応するナトリウム塩類が含まれる。また、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄のような金属塩を含むことができる。さらに、アミノ酸、ビタミン、及び適切な前駆体などが含まれる。これらの培地又は前駆体は、培養物に回分式又は連続式で添加することができる。
【００２７】
培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化合物を培養物に適切な方法で添加し、培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して気泡の生成を抑制することができる。また、培養物の好気条件を維持するために、培養物内に酸素又は酸素含有ガス(例えば、空気)を注入する。培養物の温度は通常２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃である。培養期間は、目的のＬ−アミノ酸の生成量が得られるまで継続することができ、好ましくは１０〜１６０時間である。
【００２８】
培養物からのＬ−アミノ酸の分離は、当業界に公知の通常の方法によって分離することができる。このような分離方法は、遠心分離、ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、及び結晶化などの方法を用いられる。例えば、培養物を低速遠心分離してバイオマスを除去し、得られた上澄み液をイオン交換クロマトグラフィーを介して分離することができる。
【００２９】
本明細書の他の態様として、上述したコリネバクテリウム属菌株を、スクロースを含む培地で培養する段階、及び前記培養物からＬ−アミノ酸を分離する段階を含むＬ−アミノ酸を生産する方法に関するものである。ここで、前記Ｌ−アミノ酸の生産のためのコリネバクテリウム属菌株によって生産されるＬ−アミノ酸は特に限定されないが、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン又はＬ−グルタミン酸であってもよい。
【００３０】
本発明の一実施形態として、前記のＬ−リジンを生産する方法は、上述したコリネバクテリウム属菌株をスクロースを含む培地で培養する段階、及び前記培養物からＬ−アミノ酸を分離する段階を含む。
【００３１】
本発明の他の実施態様として、前記のＬ−スレオニンを生産する方法は、ｃｓｃＫプロモーターが接続されたフルクトキナーゼ遺伝子ｃｓｃＫを含む発現ベクターとスレオニンの生合成及び排出関連遺伝子を含むプラスミドベクターを、コリネバクテリウム・グルタミクムKFCC10881に導入して形質転換株を得て、これを培養し、その後前記培養物からＬ−スレオニンを回収する段階を含む。この特、前記ｃｓｃＫプロモーターが接続されたフルクトキナーゼ遺伝子ｃｓｃＫを含む発現ベクターは特に限定されないが、pDZTn-pcj7_cscK又はpDZTn-lysCP1_cscKを使用することが好ましく、前記スレオニン生合成及び排出関連遺伝子を含むプラスミドベクターは、特にこれらに限定されないが、pECCG117-homthrBCEを使用することが望ましい。
【００３２】
本発明の別の実施態様として、前記のＬ−グルタミン酸を生産する方法は、前記ｃｓｃＫプロモーターが接続されたフルクトキナーゼ遺伝子ｃｓｃＫを含む発現ベクターをグルタミン酸生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムKTCC10774に導入して形質転換菌株を得て、これを培養し、前記培養物からＬ−グルタミン酸を回収する段階を含む。このとき、前記ｃｓｃＫプロモーターが接続されフルクトキナーゼ遺伝子ｃｓｃＫを含む発現ベクターは、特に限定されないが、pDZTn-pcj7_cscK又はpDZTn-lysCP1_cscKを使用することが好ましい。
【００３３】
本発明の一実施例によれば、エシェリキア由来のフルクトキナーゼ遺伝子であるｃｓｃＫ又はｍａｋが導入された場合には、従来のクロストリジウム・アセトブチカリウム由来のフルクトキナーゼ遺伝子であるＣＦＫが導入された場合（特許文献５）よりも高いレベルでＬ−リジンを生産することができた。特に、フルクトキナーゼ遺伝子であるｃｓｃＫを、それ自体のプロモーターではない、外来のプロモーターであるｐｃｊ７又はｌｙｓＣＰ１に接続して導入する場合、その効果がさらに向上したことが確認された（表１）。また、プロモーターであるｐｃｊ７と接続されたフルクトキナーゼ遺伝子ｃｓｃＫが導入された形質転換株を、スクロースを炭素源として含む培地で培養する場合、培地にスクロースの分解産物であるフルクトースが放出されず、培地に存在するスクロースを細胞内で分解して生成したフルクトースをすべてリン酸化させ、その過程で利用可能にできることが分かった（図１）。それだけでなく、フルクトキナーゼ遺伝子が導入されていない場合に比べ、フルクトキナーゼ遺伝子が導入された場合には、フルクトキナーゼの活性度が１．９５〜４．２４倍増加し、フルクトキナーゼ遺伝子の中でもｃｓｃＫが導入された場合に、従来のフルクトキナーゼ遺伝子が導入された場合よりも、フルクトキナーゼの活性度が１．８０〜２．１６倍増することが確認された（表３）。
【００３４】
これらのエシェリキアに由来するフルクトキナーゼ遺伝子が導入された形質転換菌株は、単にＬ−リジンの生産性を増大させるだけではなく、他のＬ−アミノ酸であるＬ−スレオニン（表４）及びＬ−グルタミン酸（表５）を生成する場合にも、その生産性の向上が可能なので、本発明のエシェリキアに由来するフルクトキナーゼ遺伝子が導入された形質転換株は、全般的なＬ−アミノ酸の生産に活用できることが確認できた。
【００３５】
そこで、本発明者らは、最も効果が優れpDZTn-pcj7_cscKを形質転換して得られた形質転換体（KFCC-10881-Pcj7_cscK）をCorynebacterium glutamicum CA01-2012と命名し、２０１１年３月２８日付けで韓国微生物保存センター（Korean Culture center of Microorganisms、以下、「KCCM」と略称する）に受託番号KCCM11183Pで寄託した。
【００３６】
〔発明の実施のための形態〕
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は単に本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３７】
〔実施例１〕大腸菌由来フルクトキナーゼ遺伝子の取得とベクターの作製
大腸菌由来のフルクトキナーゼ遺伝子の塩基配列は既に明らかになっており、公開されている。米国国立衛生研究所のジーンバンク（NIH GenBank）から大腸菌（Echerichia coli）EC3231（登録番号X81461）に由来するｃｓｃＫ遺伝子（配列番号１７）の情報及びW3110（登録番号AC000091）に由来するｍａｋ遺伝子（配列番号１８）の情報を入手した。
【００３８】
報告された塩基配列に基づいて、5'-末端にＥｃｏＲＩ制限酵素部位を挿入したプライマーの3'-末端にＳｐｅＩ制限酵素部位を挿入したプライマーを合成し、アメリカ培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）から購入した大腸菌Ｗ菌株（ATCC9637）の染色体を鋳型として使用したＰＣＲによってプロモーター部位を含む約１２００ｂｐのｃｓｃＫ遺伝子(配列番号１及び２のプライマーを使用)及びｍａｋ遺伝子(配列番号３と４のプライマーを使用)を増幅した。この時、PCRは、９４℃で５分間変性した後、９４℃／３０秒の変性、５６℃／３０秒のアニーリング、７２℃／１分間の重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応させて行った。
配列番号１：5'-gcgaattcgaaaatggggataga-3'
配列番号２：5'-gcactagtattacctgcctgtcg-3'
配列番号３：5'-cagaattcacgtgcgttaacgcatcg-3'
配列番号４：5'-ctactagtcaccttttgtaggcctga-3'
増幅された２種のフルクトキナーゼ遺伝子のポリヌクレオチドを制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｅＩで処理した。それぞれのDNA切片を得た後、大腸菌とコリネバクテリウム属微生物のシャトルベクターであるpECCG117ベクターのＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩ部位に接続した。その後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシンを含むＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲにより遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別して、公知のプラスミド抽出法でプラスミドを取得し、それぞれ「pECCG117-cscK」と「pECCG117-mak」と命名した。
【００３９】
〔実施例２〕フルクトキナーゼ遺伝子のリジン生産菌株導入及びリジン生産能の比較
電気パルス法によってＬ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムKFCC10881をpECCG117-cscK又はpECCG117-makベクターで形質転換し、カナマイシン耐性を有するコロニーを選別した。
【００４０】
２種の大腸菌由来フルクトキナーゼが導入されたそれぞれの菌株と、上述したクロストリジウム−アセトブチリクム（Clostridium acetylbutylicum）由来のフルクトキナーゼであるＣＦＫ（特許文献５）が導入された菌株を一緒に培養してリジン生産能を比較した。
【００４１】
種培地２５ｍｌ（カナマイシン２５μｌ／ｍｌ添加)を含有する２５０ｍｌバッフル付き三角フラスコに各菌株を接種し、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振蘯培養した。この時、シード培地（ｐＨ７．０）の組成は以下の通りである。：スクロース２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、尿素５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4  ４ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4  ８ｇ、ＭｇＳＯ4  ７Ｈ2Ｏ  ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ  １０００μｇ（工程用水１リットル基準）。
【００４２】
その後、生産培地２４ｍｌ（カナマイシン２５μｌ／ｍｌ添加）を含有する２５０ｍｌバッフル付き三角フラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃で７２時間、２００ｒｐｍで振蘯培養した。この時、生産培地（ｐＨ ７．０）の組成は次の通りである：スクロース８０ｇ、糖蜜や前処理糖蜜（還元糖として）２０ｇ、コーンスティープリカー（Corn Steep Liquor）５ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4  ４０ｇ、尿素４ｇ、ＫＨ2ＰＯ4  １ｇ、ＮａＣｌ  ２．５ｇ、ＭｇＳＯ4  ７Ｈ2Ｏ  １ｇ、ＦｅＳＯ4  ７Ｈ2Ｏ  １０ｍｇ、ＭｎＳＯ4  ５Ｈ2Ｏ  １０ｍｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩２００μｇ、ＣａＣＯ3  ４０ｇ、必要に応じてＬ−ロイシン０．４ｇ、必要に応じてＬ−スレオニン０．１ｇ、必要に応じてＬ−メチオニン０．１ｇ（工程用水１リットル基準）。最後に、培養を終了後、ＨＰＬＣによりＬ−リジンの平均濃度を測定した（表１参照）。
【００４３】
【表１】
0005814459.tif 000002
表１に示すように、フルクトキナーゼ遺伝子が導入されていない場合（実験群１）に比べ、フルクトキナーゼ遺伝子が導入された場合（実験群２−４）には、Ｌ−リジンの平均濃度が増加した。フルクトキナーゼ遺伝子の中でもｃｓｃＫ又はｍａｋが導入された場合（実験群２と３）に、従来のフルクトキナーゼ遺伝子が導入された場合（実験群４）より高いレベルでＬ−リジンの平均濃度を示すことが確認できた。
【００４４】
したがって、より効率的にＬ−リジンを生産するためには、従来のフルクトキナーゼ遺伝子より大腸菌由来のフルクトキナーゼ遺伝子の使用が好ましい。
【００４５】
〔実施例３〕ｃｓｃＫ遺伝子のプロモーター交換及び染色体導入用組換えベクターの作製
大腸菌由来のフルクトキナーゼ遺伝子をコリネバクテリウムの染色体上に挿入するためにコリネバクテリウム属微生物からのトランスポゾン遺伝子が挿入されたベクターpDZTnベクター（特許文献１１）を基本ベクターとして使用した。２種の大腸菌由来フルクトキナーゼ遺伝子のリジン生産能の増加効果がさらに優れたｃｓｃＫ遺伝子を選択し、コリネバクテリウム由来の強力なプロモーターをｃｓｃＫ遺伝子開始コドンの上部に接続して、発現量の増加を誘導した。
【００４６】
配列番号１７に基づいてＯＲＦ部位のみを増幅することができ、5'-末端にＮｄｅＩ制限酵素部位と3'-末端にＳｐｅＩ制限酵素部位を有するプライマーを合成し（配列番号５及び６）、大腸菌Ｗ菌株（ATCC9637）の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを介してｃｓｃＫ遺伝子ＯＲＦ領域（約９００ｂｐ）を増幅した。この時、ＰＣＲは実施例１と同様の方法で行った。
配列番号５：5'-atgccatatgtcagccaaagtatg -3'
配列番号６：5'-atgcactagtattacctgcctgtcg -3'
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来のｐｃｊ７プロモーターを増幅することができ、5'-末端にＳｐｅＩ制限酵素部位と3'末端にＮｄｅＩ制限酵素部位を有するように考案したプライマー（配列番号７及び８）を合成し、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス菌株の染色体ＤＮＡを鋳型として使用したＰＣＲによって約３００ｂｐのプロモーター部位を増幅した。この時、PCRは、９４℃で５分間変性した後、９４℃／３０秒の変性、５６℃／３０秒のアニーリング  ７２℃／３０秒重合を３０回繰り返し、その後７２℃で７分間重合反応させた。
配列番号７：5'-atgcactagtatagggagcgttgac-3'
配列番号８：5'-atgccatatgtgtttcctttcg-3'
また、コリネバクテリウムグルタミクム由来のｌｙｓＣＰ１プロモーターを増幅することができ、5'-末端にＳｐｅＩ制限酵素部位を挿入したプライマーの3'-末端にＮｄｅＩ制限酵素部位を有するように考案したプライマー（配列番号９及び１０）を合成し、コリネバクテリウムグルタミクム菌株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを介して約３００ｂｐのプロモーター部位を増幅した。この時、ＰＣＲは実施例３と同様の方法で行った。
配列番号９  ：5'-ttcatatgtgtgcacctttcgatcta-3'
配列番号１０：5'-ttactagtgattgttaatgccgatgcta-3'
増幅されたフルクトキナーゼ遺伝子のポリヌクレオチドとプロモーター部位のポリヌクレオチドを制限酵素ＳｐｅＩとＮｄｅＩで処理して、それぞれのＤＮＡ切片を得た。pDZTnを制限酵素ＳｐｅＩで処理して得られたＤＮＡ切片にそれぞれのプロモーターとｃｓｃＫ遺伝子部位ＤＮＡ切片をＤＮＡ結合酵素を利用して接続して、pDZTn-pcj7_cscK及びpDZTn-lysCP1_cscKベクターを作製した。
【００４７】
〔実施例４〕ｃｓｃＫ遺伝子発現増加菌株によるリジン生産能の比較
前記実施例３で作製した２種の発現ベクターpDZTn-pcj7_cscKとpDZTn-lysCP1_cscKを、電気パルス法を用いてＬ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムKFCC10881にそれぞれ形質転換させた。染色体上のトランスポゾン部位にプロモーターが置換されたフルクトキナーゼ遺伝子を有する菌株を選択的に分離して実施例２と同様の方法で培養した。回収されたＬ−リジンの平均濃度を測定した（表２）。
【００４８】
【表２】
0005814459.tif 000003
前記表２の実験群５は、フルクトキナーゼ遺伝子が導入されていない菌株を培養して、そこから回収したＬ−リジンの平均濃度を示し、実験群６は、プロモーターｐｃｊ７と接続されたフルクトキナーゼ遺伝子ｃｓｃＫが導入された菌株を培養して、そこから回収したＬ−リジンの平均濃度を示し、実験群７は、プロモーターｌｙｓＣＰ１と接続されたフルクトキナーゼ遺伝子ｃｓｃＫが導入された菌株を培養して、そこから回収したＬ−リジンの平均濃度を示す。
【００４９】
表２に示すように、フルクトキナーゼ遺伝子が導入されていない場合（実験群５）に比べて、フルクトキナーゼ遺伝子が導入された場合（実験群６及び７）には、Ｌ−リジンの平均濃度が増加した。フルクトキナーゼ遺伝子に接続されたプロモーターの中でもｐｃｊ７プロモーターが接続された場合（実験群６）に、ｌｙｓＣＰ１プロモーターが接続された場合（実験群７）よりもＬ−リジンの平均濃度が高いレベルを示した。
【００５０】
したがって、より効率的にＬ−リジンを生産するために、大腸菌由来のフルクトキナ
ゼ遺伝子を導入する場合、ｐｃｊ７プロモーターを接続して使用するのがより好ましい。
【００５１】
〔実施例５〕ｃｓｃＫ遺伝子発現増加菌株におけるフルクトース利用能の測定
本実施例では、フルクトキナーゼ遺伝子が発現するように形質転換されたＬ−リジン生産菌株を対象に、細胞内フルクトキナーゼ活性の増加と同時にフルクトースの利用能が増加しているか否かを確認するために、実施例２の方法で、５６２ｎｍでの時間依存的吸光度と培地内のスクロース及びフルクトースの残余量を測定した（図１）。
【００５２】
図１は、フルクトキナーゼ遺伝子が導入され、形質転換されたコリネバクテリウムグルタミクム菌株を培養し、培地中に存在するスクロースとフルクトースの量を定量した結果を示すグラフであり、Ａは、フルクトキナーゼ遺伝子が導入されていない菌株を培養した結果を示し、Ｂはｐｃｊ７プロモーターが接続された従来のフルクトキナーゼ遺伝子ＣＦＫが導入された菌株を培養した結果を示し、Ｃはｐｃｊ７プロモーターが接続されたフルクトキナーゼ遺伝子ｃｓｃＫが導入された菌株を培養した結果を示し、ＤはｌｙｓＣＰ１プロモーターが接続されたフルクトキナーゼ遺伝子ｃｓｃＫが導入された菌株を培養した結果を示し、前記ＡＤで（丸）は、ＯＤ５６２の測定値を示し、（四角形）は、培地内に残留するスクロースの総量を示し、（三角形）は、培地内に残留するフルクトースの総量を示す。
【００５３】
図１に示すように、菌週間相対的な差があるとはいえ、KFCC10881(A)及びKFCC10881::pcj7_CFK(B)が導入された菌株では培養が進むにつれて、培地内にフルクトースが一定量蓄積された後、再び消耗される様相を示した。一方、KFCC10881::pcj7_cscK(C)及びKFCC10881::lysCP1_cscK(D)が導入された菌株では培養が行われている間、培地内のフルクトースが全く検出されないことが確認された。
【００５４】
したがって、本発明で使用したフルクトキナーゼ遺伝子によって発現されるフルクトキナーゼは、培地に存在するスクロースを細胞内で分解して生成されたフルクトースの全てリン酸化させ、それによってさらに解糖過程に利用されるので、コリネバクテリウムグルタミクム内のフルクトース代謝におけるエネルギーの不必要な消耗を防ぐことができるようにすることが分かった。
【００５５】
〔実施例６〕ｃｓｃＫ遺伝子発現増加菌株におけるフルクトキナーゼ活性の測定
本実施例では、Ｌ−リジン生産菌株の染色体上でコリネバクテリウム由来の強力な発現誘導活性を有するプロモーターにより、フルクトキナーゼ遺伝子が細胞内で過剰発現され、該当酵素の活性が存在するか否かを公知の方法で測定した（非特許文献１４）。菌株をＬＢ培地で１日培養し、遠心分離して菌体を得た。前記菌体を緩衝液に懸濁した後、超音波破砕法で菌体を破壊し、これを高速遠心分離して上澄液を得た。前記得られた上澄み液をフルクトース、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ及びＮＡＤＰ＋を含む反応液と反応させた後、生成されたＮＡＤＰＨの量を波長３４０ｎｍでの吸光度で測定し、間接的にフルクトースのフルクトース６−リン酸への変換程度を算出した（表３）。
【００５６】
【表３】
0005814459.tif 000004
表３に示すように、フルクトキナーゼ遺伝子が導入されていない場合（実験群８）に比べて、フルクトキナーゼ遺伝子が導入された場合（実験群９−１１）には、フルクトキナーゼの活性度が１．９５〜４．２４倍増加し、フルクトキナーゼ遺伝子の中でもｃｓｃＫが導入された場合（実験群９及び１０）に、従来のフルクトキナーゼ遺伝子が導入された場合（実験群１１）より、フルクトキナーゼの活性度が１．８０〜２．１６倍の増加を示すことが確認された。
【００５７】
よって、従来のフルクトキナーゼ遺伝子より、大腸菌由来のフルクトキナーゼ遺伝子を使用するのが好ましいことが示された。
【００５８】
前記実施例４〜６の結果から分かるように、プロモーターｐｃｊ７が接続されたフルクトキナーゼ遺伝子ｃｓｃＫが導入された菌株は、全ての面で最も優れた活性を示すことが確認された。したがって、前記pDZTn-pcj7_cscKを形質転換して得られた形質転換体（KFCC-10881-Pcj7_cscK）をCorynebacterium glutamicum CA01-2012と命名し、２０１１年３月２８日付けで韓国微生物保存センター（Korean Culture center of Microorganisms、以下、「 KCCM」と略称する）に受託番号KCCM11183Pで寄託した。
【００５９】
〔実施例７〕ｃｓｃＫ遺伝子発現増加菌株を利用したスレオニンの生産
前記実施例６において寄託されたKFCC10881菌株とKFCC10881：pcj7_cscK菌株にそれぞれスレオニン生合成及び排出関連遺伝子を含むプラスミドベクターpECCG117-homthrBCEを導入して、それぞれの形質転換体を生産し、これらの各スレオニン生産能を比較した。前記プラスミドベクターpECCG117-homthrBCEは、以下のように作製された：日本KEGGウエブサイト（ HYPERLINK "http://www.genome.jp/kegg/" www.genome.jp/kegg/）から得られたコリネバクテリウムグルタミクムATCC13032のスレオニン生合成遺伝子ｈｏｍ−ｔｈｒＢ（NCgl1136、1137、序列番号１９）、ｔｈｒＣ（NCgl2139、配列番号２０）及び排出遺伝子ｔｈｒＥ（NCgl2533、配列番号２１）の塩基配列に基づいて、それぞれのオペロン又は遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマーを作製した。ＰＣＲ増幅に使用した鋳型は、コリネバクテリウムグルタミクムATCC13032を親菌株でＮＴＧ（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine）を利用した人工変異法によりスレオニン類似物質であるＡＨＶ（2-amino-3-hydroxy-valerate）のに対して３ｇ／ｌの濃度まで耐性を付与した菌株から抽出した染色体ＤＮＡである。
【００６０】
ｈｏｍ−ｔｈｒＢオペロンを増幅するために、5 '両末端にＸｈｏＩ制限部位を含むプライマー（配列番号１１及び１２）を使用した。ＰＣＲの後、最終的に３ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この時、ＰＣＲは、９４℃で５分間変性した後、９４℃／３０秒の変性、５６℃／３０秒のアニーリング、７２℃／３分の重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応させて行われた。ＤＮＡ断片をＸｈｏＩで切断し、同制限酵素で切断した後、脱リン酸化したプラスミドベクターpECCG117に接続してpECCG117-homthrBベクターを作製した。
配列番号１１：5'-ttcctcgaggaggggaacttgatcagagga-3'
配列番号１２：5'-ttcctcgagctacacagctgcccatttgtg-3'
ｔｈｒＣ遺伝子を増幅するために、5'両末端にＳａｌＩ制限部位を含むプライマー（配列番号１３及び１４）を使用し、ＰＣＲの後、最終的に２．１ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この時、PCRは、９４℃で５分間変性した後、９４℃／３０秒の変性、５６℃／３０秒のアニーリング、７２℃／２分の重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応させて行った。DNA断片をＳａｌＩで切断し、同様の制限酵素で切断した後、脱リン酸化したプラスミドベクターpECCG117-homthrBに結紮してpECCG117-homthrBCベクターを作製した。
配列番号１３：5'-ttcgtcgacgattaaggatttcaactgcgg-3 '
配列番号１４：5'-ttcgtcgacgcaacgagcaattccgagagc-3 '
ｔｈｒＥ遺伝子を増幅するために、5'-末端にＢａｍＨＩ制限部位を有するプライマー（配列番号１５及び１６）を使用した。ＰＣＲの後、最終的に２．５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この時、ＰＣＲは実施例１と同様の方法で行った。ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩで切断した後、同様の制限酵素で切断し、その後脱リン酸化したプラスミドベクターpECCG117-homthrBCに結紮してpECCG117-homthrBCEベクターを作製した。
配列番号１５：5'-atcggatccaagatctagtcatcaatc-3'
配列番号１６：5'-cggcaaggatcctcctgagtg-3'
前記のベクターpECCG117-homthrBCEを電気パルス法を用いて、それぞれＬ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムKFCC10881又はKFCC10881：pcj7_cscK菌株に導入した。前記菌株は、実施例２と同様の方法で培養した。ｃｓｃＫ遺伝子の有無によるＬ−スレオニン生産量を分析した（表４）。
【００６１】
【表４】
0005814459.tif 000005
表４に示すように、フルクトキナーゼ遺伝子が導入されていない場合（実験群１２）に比べ、フルクトキナーゼ遺伝子が導入された場合（実験群１３）には、Ｌ−スレオニンの濃度が増加を示した。
【００６２】
よって、Ｌ−スレオニンの生産の際にも、大腸菌由来のフルクトキナーゼ遺伝子が導入された菌株を使用することが好ましいことが分かる。
【００６３】
〔実施例８〕ｃｓｃＫ遺伝子発現増加菌株のグルタミン酸生産能の比較
グルタミン酸生産菌株の染色体上にｃｓｃＫ遺伝子を挿入した形質転換菌株を作製し、そのグルタミン酸生産能を比較した。pDZTn-pcj7_cscKベクターを電気パルス法を用いて、グルタミン酸生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムKTCC10774（特許文献１２）菌株に導入し、形質転換体を生産した。その中で、染色体上のトランスポゾン部位にフルクトキナーゼ遺伝子が挿入された菌株を選別した。
【００６４】
種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌバッフル付き三角フラスコに、菌株を接種用ループでループ接種し、３０℃で２０時間、２２０ｒｐｍで振蘯培養した。
【００６５】
続いて、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌバッフル付き三角フラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃で４０時間、２２０ｒｐｍで振蘯培養した。この時、生産培地（ｐＨ７．１）の組成は次の通りである：スクロース３０ｇ、糖蜜又は前処理糖蜜（還元糖として）  １０ｇ、ＭｇＳＯ4  ７Ｈ2Ｏ  ０．４ｇ、ＫＨ2ＰＯ4  １ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4  ３ｇ、ＦｅＳＯ4  ７Ｈ2Ｏ  １０ｍｇ、ＭｎＳＯ4  ５Ｈ2Ｏ  １０ｍｇ、ビオチン５００μｇ、チアミン塩酸塩２ｍｇ、尿素１ｇ（工程用水１リットル基準）。最後に、培養を終了した後、ＨＰＬＣにより、Ｌ−グルタミン酸の生産量を測定した（表５）。
【００６６】
【表５】
0005814459.tif 000006
表５に示すように、フルクトキナーゼ遺伝子が導入されていない場合（実験群１４）に比べて、フルクトキナーゼ遺伝子が導入された場合（実験群１５）には、Ｌ−グルタミン酸の濃度が増加したことが分かる。
【００６７】
よって、Ｌ−グルタミン酸の生産にも、大腸菌由来のフルクトキナーゼ遺伝子が導入された菌株を使用するのが好ましいことが分かった。
【００６８】
【表６】
0005814459.tif 000007
【図１】
0005814459.tif 000008
【配列表】
0005814459000001.app