(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵における代謝産物としてアルコールを生産するアルコール生産微生物を用いて有機物からアルコールを生産する方法において、
前記アルコール生産微生物と前記有機物とを含む培養液に電子媒体物質を添加し、前記電子媒体物質は前記アルコール生産微生物が還元可能な物質とし、前記アルコール生産微生物により還元されて生じる前記電子媒体物質の還元体を前記培養液に浸漬した電極に電位を与えて酸化させながら前記アルコール生産微生物を培養してアルコールを生産し、前記アルコール生産微生物としてアセトン・ブタノール・エタノール発酵（ＡＢＥ発酵）を行うクロストリジウム属の微生物を用い、前記電子媒体物質としてビオロゲン及びビオロゲン誘導体の少なくともいずれかを用いることを特徴とするアルコール生産方法。
【請求項２】
前記培養液に陰イオン交換膜を介して電解液を接触させ、前記電極と対をなす電極を前記電解液に浸漬する請求項１に記載のアルコール生産方法。
【請求項３】
前記培養液に陰イオン交換膜を介して前記電極と対をなす電極を接触させる請求項１に記載のアルコール生産方法。
【請求項４】
前記電極の電位を銀・塩化銀電極電位基準で＋０．３Ｖ〜＋０．９Ｖとして前記クロストリジウム属の微生物を高密度培養する請求項２または３に記載のアルコール生産方法。
【請求項５】
前記クロストリジウム属の微生物を対数増殖期に移行する前の菌体密度で前記培養液に含ませ、前記電極の電位を銀・塩化銀電極電位基準で＋０．３Ｖ〜＋１．２Ｖとして前記クロストリジウム属の微生物の生育段階を定常期に移行させた後、前記電極の電位を＋０．３Ｖ〜＋０．９Ｖとして前記クロストリジウム属の微生物を高密度培養する請求項２または３に記載のアルコール生産方法。
【請求項６】
前記クロストリジウム属の微生物を対数増殖期に移行する前の菌体密度で前記培養液に含ませ、前記電極の電位を銀・塩化銀電極電位基準で＋０．９Ｖ〜＋１．２Ｖとして前記クロストリジウム属の微生物の生育段階を定常期に移行させた後、前記電極の電位を＋０．３Ｖ〜＋０．６Ｖとして前記クロストリジウム属の微生物を高密度培養する請求項２または３に記載のアルコール生産方法。
【請求項７】
発酵における代謝産物としてアルコールを生産するアルコール生産微生物を用いて有機物からアルコールを生産する装置であって、
陰イオン交換膜によって仕切られた対電極槽及び密閉構造の培養槽と、前記培養槽に収容された培養液と、前記対電極槽に収容された電解液と、前記培養液に浸された作用電極と、前記電解液に浸された対電極と、前記作用電極と前記対電極とが結線された定電位設定装置と、前記培養槽にて生産されたアルコールを回収するアルコール回収手段とを有し、前記培養液に前記アルコール生産微生物と前記有機物と前記アルコール生産微生物が還元可能な電子媒体物質とを含ませて、前記アルコール生産微生物により還元されて生じる前記電子媒体物質の還元体を前記定電位設定装置で前記作用電極と前記対電極との間に電位差を与えて酸化させながら前記アルコール生産微生物を培養してアルコールを生産し、前記アルコール生産微生物がアセトン・ブタノール・エタノール発酵（ＡＢＥ発酵）を行うクロストリジウム属の微生物であり、前記電子媒体物質がビオロゲン及びビオロゲン誘導体の少なくともいずれかであることを特徴とするアルコール生産装置。
【請求項８】
発酵における代謝産物としてアルコールを生産するアルコール生産微生物を用いて有機物からアルコールを生産する装置であって、
培養槽としての密閉構造の容器と、前記容器に収容可能な対電極槽としての密閉構造の小容器と、前記培養槽に収容された培養液と、前記対電極槽に収容された電解液と、前記培養液に浸された作用電極と、前記電解液に浸された対電極と、前記作用電極と前記対電極とが結線された定電位設定装置と、前記培養槽にて生産されたアルコールを回収するアルコール回収手段とを有し、前記小容器は前記培養液と接触する位置の少なくとも一部に陰イオン交換膜を備えるものとし、前記培養液に前記アルコール生産微生物と前記有機物と前記アルコール生産微生物が還元可能な電子媒体物質とを含ませて、前記アルコール生産微生物により還元されて生じる前記電子媒体物質の還元体を前記定電位設定装置で前記作用電極と前記対電極との間に電位差を与えて酸化させながら前記アルコール生産微生物を培養してアルコールを生産し、前記アルコール生産微生物がアセトン・ブタノール・エタノール発酵（ＡＢＥ発酵）を行うクロストリジウム属の微生物であり、前記電子媒体物質がビオロゲン及びビオロゲン誘導体の少なくともいずれかであることを特徴とするアルコール生産装置。
【請求項９】
発酵における代謝産物としてアルコールを生産するアルコール生産微生物を用いて有機物からアルコールを生産する装置であって、
陰イオン交換膜を少なくとも一部に備える容器と、前記容器に収容された培養液と、前記培養液に浸された作用電極と、前記陰イオン交換膜の前記容器の外側の面の少なくとも一部に接触している対電極と、前記作用電極と前記対電極とが結線された定電位設定装置と、前記容器内で生産されたアルコールを回収するアルコール回収手段とを有し、前記陰イオン交換膜は前記容器の前記培養液と接触する位置に備えるものとし、前記培養液に前記アルコール生産微生物と前記有機物と前記アルコール生産微生物が還元可能な電子媒体物質とを含ませて、前記アルコール生産微生物により還元されて生じる前記電子媒体物質の還元体を前記定電位設定装置で前記作用電極と前記対電極との間に電位差を与えて酸化させながら前記アルコール生産微生物を培養してアルコールを生産し、前記アルコール生産微生物がアセトン・ブタノール・エタノール発酵（ＡＢＥ発酵）を行うクロストリジウム属の微生物であり、前記電子媒体物質がビオロゲン及びビオロゲン誘導体の少なくともいずれかであることを特徴とするアルコール生産装置。
【請求項１０】
前記作用電極の電位が銀・塩化銀電極電位基準で＋０．３Ｖ〜＋０．９Ｖに制御されて前記クロストリジウム属の微生物が高密度培養される請求項７〜９のいずれか１項に記載のアルコール生産装置。
【請求項１１】
前記クロストリジウム属の微生物は対数増殖期に移行する前の菌体密度で前記培養液に含まれ、前記作用電極の電位が銀・塩化銀電極電位基準で＋０．３Ｖ〜＋１．２Ｖに制御されて前記クロストリジウム属の微生物の生育段階が定常期に移行した後、前記作用電極の電位が銀・塩化銀電極電位基準で＋０．３Ｖ〜＋０．９Ｖに制御されて前記クロストリジウム属の微生物が高密度培養される請求項７〜９のいずれか１項に記載のアルコール生産装置。
【請求項１２】
前記クロストリジウム属の微生物は対数増殖期に移行する前の菌体密度で前記培養液に含まれ、前記作用電極の電位が銀・塩化銀電極電位基準で＋０．９Ｖ〜＋１．２Ｖに制御されて前記クロストリジウム属の微生物の生育段階が定常期に移行した後、前記作用電極の電位が銀・塩化銀電極電位基準で＋０．３Ｖ〜＋０．６Ｖに制御されて前記クロストリジウム属の微生物が高密度培養される請求項７〜９のいずれか１項に記載のアルコール生産装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を利用したアルコール生産方法及び装置に関する。さらに詳述すると、本発明は、アセトン・ブタノール・エタノール発酵（ＡＢＥ発酵）を行うクロストリジウム属の微生物を利用してアルコール生産を行うのに好適なアルコール生産方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物を利用した物質生産方法については古くから様々な研究が進められており、その代表的なものとして、サッカロミセス属の酵母等によるアルコール発酵を利用したアルコールの生産方法が知られている。また、近年では、次世代のバイオ燃料として期待されているブタノールを生産する方法として、クロストリジウム（Clostridium）属の微生物のアセトン・ブタノール・エタノール発酵（ＡＢＥ発酵）を利用したアルコール（ブタノール、エタノール）の生産方法が注目されている。
【０００３】
ＡＢＥ発酵の具体的な代謝経路として、クロストリジウム  アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）のＡＢＥ発酵の代謝経路を図２２に示す。ＡＢＥ発酵では、グルコース等の糖類等を消費して対数増殖期には主に酢酸や酪酸といった有機酸が生成され（有機酸生成期）、増殖の定常期には主にブタノール、アセトン及びエタノールが６：３：１の比で生成される（ソルベント生成期）。つまり、糖類等からアルコールとしてブタノールとエタノールを同時に生産することができ、特にブタノールを優占的に生産することが可能である（例えば、非特許文献１等参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】D.T.JONES.1981. Solvent Production and Morphological changes in Clostridium acetobutylicum. Applied and Environmental Microbiology
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、クロストリジウム属の微生物のＡＢＥ発酵を利用したアルコールの生産方法は、投入した糖類等の有機物に対してアルコールの生産量（収率）が低く、その改善が望まれていた。
【０００８】
そこで、本発明は、ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属の微生物を用いてアルコールを生産するに際し、アルコールの生産量（収率）を従来よりも大幅に向上させることのできる方法及び装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かかる課題を解決するため、本願発明者等が鋭意研究を行った結果、ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属の微生物であるクロストリジウム  アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）を利用してアルコールを生産する際に、培養液にメチルビオロゲンを添加することで、微生物の生育が阻害されるにもかかわらず、メチルビオロゲンを添加しない場合と比較して、投入した糖類等の基質に対するアルコールの生産量を向上できることを知見した。また、培養液に添加したメチルビオロゲンは培養過程において還元されていた。本願発明者等は、この知見から、メチルビオロゲンを培養液に添加することによって、メチルビオロゲンがＡＢＥ発酵の代謝経路から電子を引き抜き、その結果としてメチルビオロゲンが還元されると共にアルコール生産性が向上しているものと推定した。
【００１０】
本願発明者等は、アルコールの生産性をさらに高めるべく、上記知見に基づいてさらなる検討を行った。その結果、培養液に電極を浸漬し、電極の電位をある範囲に制御して、還元されたメチルビオロゲンを電気的に酸化させながらクロストリジウム  アセトブチリカムを培養することによって、アルコールの生産性が向上し、特にブタノールの生産性が大幅に向上することを知見するに至った。
【００１１】
本願発明者等は、上記知見に基づき、クロストリジウム  アセトブチリカムに限らず、ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属の微生物全般について、代謝経路から電子を引き抜くことのできる電子媒体物質を電気的に酸化させて発酵経路から電子を引き抜き続けながら培養を行うことで、アルコール生産性を大幅に向上できる可能性が導かれることを知見し、さらに種々検討を重ねて本願発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明のアルコール生産方法は、発酵における代謝産物としてアルコールを生産するアルコール生産微生物を用いて有機物からアルコールを生産する方法において、アルコール生産微生物と有機物とを含む培養液に電子媒体物質を添加し、電子媒体物質はアルコール生産微生物が還元可能な物質とし、アルコール生産微生物により還元されて生じる電子媒体物質の還元体を培養液に浸漬した電極に電位を与えて酸化させながらアルコール生産微生物を培養してアルコールを生産するようにしている。
【００１３】
ここで、本発明のアルコール生産方法は、培養液にイオン交換膜を介して電解液を接触させ、培養液に浸漬した電極と対をなす電極を電解液に浸漬することが好ましい。
【００１４】
培養液にイオン交換膜を介して電解液を接触させ、培養液に浸漬した電極と対をなす電極を電解液に浸漬する本発明のアルコール生産方法は、具体的には以下のアルコール生産装置により実施され得る。即ち、本発明のアルコール生産装置は、発酵における代謝産物としてアルコールを生産するアルコール生産微生物を用いて有機物からアルコールを生産する装置であって、イオン交換膜によって仕切られた対電極槽及び密閉構造の培養槽と、培養槽に収容された培養液と、対電極槽に収容された電解液と、培養液に浸された作用電極と、電解液に浸された対電極と、作用電極と対電極とが結線された定電位設定装置と、培養槽にて生産されたアルコールを回収するアルコール回収手段とを有し、培養液にアルコール生産微生物と有機物とアルコール生産微生物が還元可能な電子媒体物質とを含ませて、アルコール生産微生物により還元されて生じる電子媒体物質の還元体を定電位設定装置で作用電極と対電極との間に電位差を与えて酸化させながらアルコール生産微生物を培養してアルコールを生産するものとしている。
【００１５】
また、本発明のアルコール生産装置は、発酵における代謝産物としてアルコールを生産するアルコール生産微生物を用いて有機物からアルコールを生産する装置であって、培養槽としての密閉構造の容器と、容器に収容可能な対電極槽としての密閉構造の小容器と、培養槽に収容された培養液と、対電極槽に収容された電解液と、培養液に浸された作用電極と、電解液に浸された対電極と、作用電極と対電極とが結線された定電位設定装置と、培養槽にて生産されたアルコールを回収するアルコール回収手段とを有し、小容器は培養液と接触する位置の少なくとも一部にイオン交換膜を備えるものとし、培養液にアルコール生産微生物と有機物とアルコール生産微生物が還元可能な電子媒体物質とを含ませて、アルコール生産微生物により還元されて生じる電子媒体物質の還元体を定電位設定装置で作用電極と対電極との間に電位差を与えて酸化させながらアルコール生産微生物を培養してアルコールを生産するものとしている。
【００１６】
また、本発明のアルコール生産方法は、培養液にイオン交換膜を介して培養液に浸漬した電極と対をなす電極を接触させることが好ましい。
【００１７】
培養液にイオン交換膜を介して培養液に浸漬した電極と対をなす電極を接触させる本発明のアルコール生産方法は、具体的には以下のアルコール生産装置により実施され得る。即ち、発酵における代謝産物としてアルコールを生産するアルコール生産微生物を用いて有機物からアルコールを生産する装置であって、イオン交換膜を少なくとも一部に備える容器と、容器に収容された培養液と、培養液に浸された作用電極と、イオン交換膜の容器の外側の面の少なくとも一部に接触している対電極と、作用電極と対電極とが結線された定電位設定装置と、容器内で生産されたアルコールを回収するアルコール回収手段とを有し、イオン交換膜は容器の培養液と接触する位置に備えるものとし、培養液にアルコール生産微生物と有機物とアルコール生産微生物が還元可能な電子媒体物質とを含ませて、アルコール生産微生物により還元されて生じる電子媒体物質の還元体を定電位設定装置で作用電極と対電極との間に電位差を与えて酸化させながらアルコール生産微生物を培養してアルコールを生産するものとしている。
【００１８】
ここで、本発明のアルコール生産方法及び装置において、アルコール生産微生物はアセトン・ブタノール・エタノール発酵（ＡＢＥ発酵）を行うクロストリジウム属の微生物であることが好ましい。
【００１９】
また、本発明のアルコール生産方法及び装置において、電子媒体物質がビオロゲン及びビオロゲン誘導体の少なくともいずれかであり、イオン交換膜が陰イオン交換膜であり、アルコール生産微生物はアセトン・ブタノール・エタノール発酵（ＡＢＥ発酵）を行うクロストリジウム属の微生物であり、電極（作用電極）の電位を銀・塩化銀電極電位基準で＋０．３Ｖ〜＋０．９Ｖとしてクロストリジウム属の微生物を高密度培養することが好ましい。この場合、クロストリジウム属の微生物を高密度培養することにより生産されるブタノールの生産性が顕著に向上し、且つエタノールの生産性も向上する。
【００２０】
さらに、本発明のアルコール生産方法及び装置において、電子媒体物質としてビオロゲン及びビオロゲン誘導体の少なくともいずれかを用い、イオン交換膜として陰イオン交換膜を用い、アルコール生産微生物としてアセトン・ブタノール・エタノール発酵（ＡＢＥ発酵）を行うクロストリジウム属の微生物を用い、クロストリジウム属の微生物を対数増殖期に移行する前の菌体密度で培養液に含ませ、電極（作用電極）の電位を銀・塩化銀電極電位基準で＋０．３Ｖ〜＋１．２Ｖとしてクロストリジウム属の微生物を生育段階を定常期に移行させた後、電極（作用電極）の電位を銀・塩化銀電極電位基準で＋０．３Ｖ〜＋０．９Ｖとしてクロストリジウム属の微生物を高密度培養することが好ましい。この場合、クロストリジウム属の微生物を早期に定常期に移行させて高密度化させることができ、且つ有機酸の蓄積が抑えられてアルコール生産に適した状態が形成される。そして、電極（作用電極）の電位を＋０．３Ｖ〜＋０．９Ｖとして高密度培養を行うことで、ブタノールの生産性が顕著に向上し、且つエタノールの生産性も向上する。
【００２１】
ここで、本発明のアルコール生産方法及び装置において、電子媒体物質としてビオロゲン及びビオロゲン誘導体の少なくともいずれかを用い、イオン交換膜として陰イオン交換膜を用い、アルコール生産微生物としてアセトン・ブタノール・エタノール発酵（ＡＢＥ発酵）を行うクロストリジウム属の微生物を用い、クロストリジウム属の微生物を対数増殖期に移行する前の菌体密度で培養液に含ませ、電極（作用電極）の電位を銀・塩化銀電極電位基準で＋０．９Ｖ〜＋１．２Ｖとしてクロストリジウム属の微生物を生育段階を定常期に移行させた後、電極（作用電極）の電位を銀・塩化銀電極電位基準で＋０．３Ｖ〜＋０．６Ｖとしてクロストリジウム属の微生物を高密度培養することが特に好ましい。この場合、クロストリジウム属の微生物をより早期に定常期に移行させて高密度化させることができ、しかも最終到達菌体密度も高いものとでき、且つ有機酸の蓄積が抑えられてアルコール生産に適した状態が形成される。そして、電極（作用電極）の電位を＋０．３Ｖ〜＋０．６Ｖとして高密度培養を行うことで、ブタノールの生産性が極めて顕著に向上し、且つエタノールの生産性も向上する。
【００２２】
因みに、クロストリジウム属の微生物は偏性嫌気性菌であるため、酸化雰囲気（＋０．０４Ｖ以上）では、生育が阻害され、その増殖およびアルコール（ブタノール）生産には還元環境が好適との報告例がある（Mutharasan, G.R.a.R., Altered electron flow in a reducing environment inClostridium acetobutylicum Biotechnology Letters 1988. 10(2): p. 129-132）。これに対し、本発明では、電子媒体物質の還元体を電気的に酸化させるために酸化電位を印加して酸化雰囲気を形成している。このように酸化雰囲気下にてアルコール（ブタノール）生産が促進されたことを示す例は今までに全く報告されていない。また、酸化電位への制御によって、増殖過程において有機酸蓄積が抑制されてアルコール（ブタノール）生産に適した状態が形成されることや、定常期への早期移行が起こることは全く報告されていない。したがって、本発明は従来にない新規な知見に基づく発明である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のアルコール生産方法及びアルコール生産装置によれば、ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属の微生物を用いてアルコールを生産するに際し、投入した有機物に対するアルコールの生産量（収率）を従来よりも大幅に向上させることが可能となり、特に次世代バイオ燃料としての期待が高まりつつあるブタノールの生産量（収率）を従来よりも極めて顕著に向上させることが可能となる。したがって、投入した有機物のアルコールへの変換率、特にブタノールへの変換率を従来よりも高めて、アルコール生産にかかるコストを低減することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明のアルコール生産方法の概念を示す図である。
【図２】第一の実施形態Ａにかかるアルコール生産装置の一例を示す断面図である。
【図３】第一の実施形態Ｂにかかるアルコール生産装置の一例を示す断面図である。
【図４】第一の実施形態Ｃにかかるアルコール生産装置の一例を示す断面図である。
【図５】第一の実施形態Ｄにかかるアルコール生産装置の一例を示す断面図である。
【図６】第二の実施形態にかかるアルコール生産装置の一例を示す断面図である。
【図７】本発明のアルコール生産方法を実施するためのアルコール生産装置の他の構成の一例を示す断面図である。
【図８】各種電子媒体の添加によるクロストリジウム属細菌の増殖への影響を検討した結果を示す図である（実施例１）。
【図９】電子媒体添加によるクロストリジウム属細菌の代謝への影響について、グルコース濃度の経時変化を示す図である（実施例１）。
【図１０】電子媒体添加によるクロストリジウム属細菌の代謝への影響について、培養終了後の培養液の酢酸濃度、酪酸濃度、エタノール濃度及びブタノール濃度を示す図である（実施例１）。
【図１１】電子媒体添加によるクロストリジウム属細菌の代謝への影響について、培養終了後のバイアル瓶気相部の水素量と二酸化炭素量を示す図である（実施例１）。
【図１２】実施例４で使用した装置の概念図である。
【図１３】実施例２で使用した装置の概念図である。
【図１４】メチルビオロゲン（ＭＶ）の酸化還元特性を示す図である。
【図１５】電子媒体添加と電位印加によるクロストリジウム属細菌の代謝への影響について、グルコース濃度の経時変化を示す図である（実施例２）。
【図１６】電子媒体添加と電位印加によるクロストリジウム属細菌の代謝への影響について、ｐＨの経時変化を示す図である（実施例２）。
【図１７】電子媒体添加と電位印加によるクロストリジウム属細菌の代謝への影響について、酪酸濃度の経時変化を示す図である（実施例２）。
【図１８】電子媒体添加と電位印加によるクロストリジウム属細菌の代謝への影響について、酢酸濃度の経時変化を示す図である（実施例２）。
【図１９】電子媒体添加と電位印加によるクロストリジウム属細菌の代謝への影響について、ブタノール濃度の経時変化を示す図である（実施例２）。
【図２０】電子媒体添加と電位印加によるクロストリジウム属細菌の代謝への影響について、エタノール濃度の経時変化を示す図である（実施例２）。
【図２１】電子媒体添加と電位印加によるクロストリジウム属細菌の増殖への影響について、検討した結果を示す図である（実施例３）。
【図２２】クロストリジウム  アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）のＡＢＥ発酵の代謝経路を示す図である。
【図２３】電子媒体添加と電位印加によるクロストリジウム属細菌の増殖への影響について、検討した結果を示す図である（実施例４）。
【図２４】電子媒体添加と電位印加によるクロストリジウム属細菌の増殖及び代謝への影響について、グルコース濃度の経時変化を示す図である（実施例４）。
【図２５】電子媒体添加と電位印加によるクロストリジウム属細菌の増殖及び代謝への影響について、酢酸濃度の経時変化を示す図である（実施例４）。
【図２６】電子媒体添加と電位印加によるクロストリジウム属細菌の増殖及び代謝への影響について、酪酸濃度の経時変化を示す図である（実施例４）。
【図２７】電子媒体添加と電位印加によるクロストリジウム属細菌の増殖及び代謝への影響について、ブタノール濃度の経時変化を示す図である（実施例４）。
【図２８】電子媒体添加と電位印加によるクロストリジウム属細菌の増殖及び代謝への影響について、ガスパックに回収された水素量と二酸化炭素量を示す図である（実施例４）。
【図２９】ブタノール生産量のＭＶ濃度依存性を示す図である（実施例５）。
【図３０】実施例４の培養試験における培養液の自然電位変化を示す図である。
【図３１】実施例４の培養試験における電流値変化を示す図である。
【図３２】実施例２の培養試験における培養液の自然電位変化を示す図である。
【図３３】実施例２の培養試験における電流値変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明を実施するための形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【００２７】
図１に、本発明のアルコール生産方法の実施形態の一例を概念的に示す。本発明のアルコール生産方法は、発酵における代謝産物としてアルコールを生産するアルコール生産微生物２を用いて有機物からアルコールを生産する方法において、アルコール生産微生物２と有機物とを含む培養液に電子媒体物質を添加し、電子媒体物質はアルコール生産微生物２が還元可能な物質とし、アルコール生産微生物２により還元されて生じる電子媒体物質の還元体を培養液に浸漬した電極９（作用電極９）に電位を与えて酸化させながらアルコール生産微生物２を培養してアルコールを生産するようにしている。
【００２８】
アルコール生産微生物２としては、アルコール発酵を行うサッカロミセス等の各種酵母等、ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属の微生物等が挙げられ、特にＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム  アセトブチリカム等のクロストリジウム属の微生物等を用いることが好適であるが、発酵における代謝産物としてアルコールを生産するアルコール生産微生物であれば特に限定されるものではない。また、微生物は天然物に限らず、遺伝子組換え等の人為的操作が加えられた人工物としてもよい。
【００２９】
アルコール生産微生物２の培養液中の菌体密度は、増殖の定常期の菌体密度あるいはそれに近いものとすることが好適である。本発明のアルコール生産方法では、アルコール生産微生物２の１菌体当たりのアルコール生産量を向上させることができる。したがって、培養槽にて培養可能な最大限の菌数ないしはそれに近い菌数を培養液に添加することで、本発明によるアルコール生産量の向上効果を最大限に発揮させることができる。また、ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属の微生物を用いた場合、ＡＢＥ発酵では、増殖の定常期においてソルベント（アセトン、ブタノール、エタノール）が生産されるので、培養液の菌体密度を増殖の定常期に相当する菌体密度とすることで、培養（高密度培養）開始直後から微生物にアルコールを生産させることができる。
【００３０】
但し、アルコール生産微生物２の培養液中の菌体密度を、増殖の定常期の菌体密度あるいはそれに近いものとすることは必須条件ではなく、初期菌体密度を増殖の定常期未満、例えば対数増殖期未満として本発明のアルコール生産方法を実施するようにしてもよい。本発明のアルコール生産方法によれば、アルコール生産微生物の増殖を促進することもできるので、生育段階を早期に定常期に移行させることができる。また、生育段階にて蓄積される有機酸等の副産物の生成が抑えられることによって、アルコール生産に適した状態が形成される効果も相俟って、アルコール生産量の向上効果を最大限に発揮させることができる。例えば、ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属の微生物を用いた場合、培養液の菌体密度を定常期に移行する前の生育段階に相当する菌体密度、例えば対数増殖期に移行する前の生育段階に相当する菌体密度としたとしても、生育段階をソルベント生成期である定常期に早期に到達させ、且つ有機酸の蓄積を抑えてアルコールの生産に適した状態が形成されることによって、クロストリジウム属の微生物のアルコールの生産性を最大限に向上させてアルコール生産を実施することができる。本発明のアルコール生産方法では、このような実施の形態も含まれる。
【００３１】
有機物は、アルコール生産微生物２の発酵における代謝産物であるアルコールを得るための基質（アルコール生成源物質）であり、使用するアルコール生産微生物２に応じて適宜決定される。例えば、ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属の微生物を使用する場合には、グルコース等の単糖、デンプン・セルロース・キシラン等の多糖類を基質として使用できるのは勿論のこと、紙・小麦わら・稲わら等の植物繊維質、生ごみ、農産廃棄物、焼酎蒸留廃液、余剰汚泥（活性汚泥）の生ごみの混合物、デンプン廃液、廃パーム繊維などといった各種バイオマス系廃棄物を幅広く基質として使用することができる。このようなバイオマス系廃棄物を用いることで、アルコール生産にかかるコストをさらに低減することができる。
【００３２】
培養液への有機物の添加量は特に限定されるものではない。例えばＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属の微生物を用いる場合、グルコースを１０〜１００ｍＭ、好適には５０ｍＭ程度添加すればよいが、必ずしもこの添加量に限定されるわけではない。また、有機物の添加は、アルコールの生産開始前（アルコール生産微生物の開始前）に行ってもよいし、アルコールの生産中に行ってもよい。いずれの場合においても、アルコール生産微生物２に有機物が消費されてアルコールの生産が起こると共に、有機物のアルコールへの変換量の増大を図ることができる。
【００３３】
電子媒体物質は、アルコール生産微生物２の生育を阻害することなくアルコール生産微生物２が還元可能な物質であれば特に限定されるものではなく、使用するアルコール生産微生物２に応じて適宜決定されるが、アルコール生産微生物２の生育を阻害するものであっても、アルコール生産微生物２が還元可能な物質であれば使用できる場合もある。
【００３４】
例えば、ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属の微生物を使用する場合、電子媒体物質としてはビオロゲン及びビオロゲン誘導体の少なくともいずれかを用いることが好適である。ビオロゲン誘導体としては、メチルビオロゲン、エチルビオロゲン、ベンジルビオロゲン等を用いることができ、メチルビオロゲンを用いることが好適である。尚、これらの物質を用いることで、培養過程にてこれらの物質が還元されると共に、クロストリジウム属の微生物の生育は阻害されるが、生育阻害による悪影響以上に、アルコール生産性が顕著に向上する効果が奏され得る。また、生育の阻害（対数増殖期への移行の遅延）については、後述する増殖過程における酸化電位への制御によってキャンセルすることができる。したがって、増殖過程における酸化電位への制御によって、これらの物質を電子媒体物質として用いることによるアルコール生産性の顕著な向上効果のみを発揮させることができる。
【００３５】
また、アルコール発酵（エタノールを生産）を行うサッカロミセス属の酵母等について、ニュートラルレッドやメナジオン等の電子媒体物質を添加することで、グルコースを基質としたエタノールの生産性が変化することが報告されている（Analytica Chimica Acta 597(2007）67-74, Zhao et al, The defferent behaviors if three oxidative mediator in probing the redox activities of the yeast Saccharomyces cerevisiae）。したがって、アルコール発酵（エタノールを生産）を行うサッカロミセス属の酵母等を使用する場合、電子媒体物質としてニュートラルレッドやメナジオン等を用いることができる。
【００３６】
培養液への電子媒体物質の添加量は、電子媒体物質の種類、微生物の発酵反応効率、菌体密度等に応じてその最適量が適宜変化するが、。概ね０．５〜１０ｍＭまたは１〜１０ｍＭ、好適には０．５〜５ｍＭ、より好適には０．５〜２ｍＭ、さらに好適には数ｍＭとすればよい。電子媒体物質の濃度が低すぎると、アルコール生産性の向上効果が得られにくくなる。また、電子媒体物質の濃度が高すぎると、電子媒体物質の種類によっては生育が阻害され過ぎて、アルコール生産性の向上効果が得られにくくなる。例えば、電子媒体物質をビオロゲン誘導体とし、その濃度を０．５〜２ｍＭ、特に１〜２ｍＭとすることで、クロストリジウム属の微生物が極めて顕著なアルコール（ブタノール）生産性向上効果を奏し得る。
【００３７】
尚、電子媒体物質は、酸化体の形態、あるいは酸化体を含む形態（つまり酸化体と還元体とが併存している形態）のいずれかの形態で培養液に添加することが好適であるが、還元体の形態で培養液に添加しても構わない。即ち、還元体の形態で添加したとしても、培養液に浸漬している電極９によって当該還元体を酸化させることによって、酸化体が次々と生成され、アルコール生産微生物の発酵における代謝経路からの電子の引き抜きを生じさせることができる。
【００３８】
培養液の組成は、使用するアルコール生産微生物に応じて適宜決定されるが、上記電子媒体物質のように、電気的に酸化または還元反応を生じ得る物質が実質的に含まれていない培養液を使用することが好適である。例えば、ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属の微生物を使用する場合には、チオグリコレート培地やＴＹＡ培地等を用いればよい。例えば、ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属の微生物を増殖させて早期に定常期に移行させることを目的とする場合には、チオグリコレート培地を用いることが好適であり、ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属の微生物を定常期または定常期に近い菌体密度として直ちにアルコール生産を行わせることを目的とする場合には酢酸を含むＴＹＡ培地を用いることが好適であるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
培養液中の電子媒体物質は、アルコール生産微生物２の発酵における代謝経路から電子を引き抜く作用を有している。したがって、電子媒体物質の酸化体は、アルコール生産微生物２の培養の過程（アルコール生産過程）で全て還元体に変換（還元）されて枯渇することになる。本発明では、培養液に浸した電極９（作用電極９）に電位を与えることにより、アルコール生産微生物２の培養の過程（アルコール生産過程）で電子媒体物質の酸化体が変換（還元）されて生じた電子媒体物質の還元体を酸化させ、酸化体に再生させることによって、アルコール生産微生物２に電子媒体物質の酸化体を供給し続けるようにしている。これにより、アルコール生産微生物２の培養の過程（アルコール生産過程）において、アルコール生産微生物２の発酵における代謝経路から電子を引き抜き続けて、代謝反応に何らかの影響を与えることにより、アルコール生産性を向上させることができる。
【００４０】
電極９には、電子媒体物質の還元体を酸化することが可能な電極が適宜用いられる。具体的には、炭素板やグラッシーカーボン等の炭素電極、白金電極等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
電極９に与える電位は、アルコール生産微生物の種類、アルコール生産微生物の菌体密度（生育段階）、電子媒体物質の種類、電極９の材質等により変化し得るため、一概には規定できないが、例えば以下の手順により電極９の最小電位と最大電位を導き出すことができる。即ち、アルコール生産微生物を増殖の定常期に相当する菌体密度で含む培養液に電子媒体物質を添加すると共に電極９を接触させて、電子媒体物質の還元体が酸化される範囲の各種電位で高密度培養試験を行う。また、比較試験として、培養液に電子媒体物質を添加して電極９を接触させずに（電位を印加せずに）高密度培養試験を行う。そうすると、比較試験よりもアルコール生産量が増大する電位の範囲が明らかとなる。この電位の範囲の最小値がアルコール生産量を増大させるための最小電位であり、最大値がアルコール生産量を増大させるための最大電位である。また、アルコール生産微生物を対数増殖期に移行する前の菌体密度で含む培養液に電子媒体物質を添加すると共に電極９を接触させて、電子媒体物質の還元体が酸化される範囲の各種電位で培養試験を行う。また、比較試験として、培養液に電子媒体物質を添加して電極９を接触させずに（電位を印加せずに）培養試験を行う。そうすると、比較試験よりも増殖促進（対数増殖期への早期移行による定常期への早期移行）が起こる電位の範囲が明らかとなる。この電位の範囲の最小値がアルコール生産微生物の増殖が促進される最小電位であり、最大値がアルコール生産微生物の増殖が促進される最大電位である。
【００４２】
本発明者等の実験によると、ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属の微生物について、電子媒体物質としてビオロゲン誘導体を用い、クロストリジウム属の微生物を定常期の菌体密度で培養液に含ませ、電極９として炭素電極を用いた場合には、＋０．３Ｖ以上とすることでエタノール生産量の増大効果が得られること、及び＋０．６Ｖ以上とすることでブタノール生産量の顕著な増大効果とエタノール生産量の増大効果が得られることが確認されている。このことから、＋０．３Ｖ超〜＋０．６Ｖの間にブタノール生産量が比較試験よりも増大する最小電位が存在しているものと考えられる。したがって、この場合には、電極９の電位を＋０．３Ｖ以上とすればよく、＋０．３Ｖ超とすることが好ましく、＋０．６Ｖ以上とすることがより好適である。
【００４３】
また、ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属の微生物について、電子媒体物質としてビオロゲン誘導体を用い、クロストリジウム属の微生物を対数増殖期に移行する前の菌体密度で培養液に含ませ、電極９として炭素電極を用いた場合には、＋０．３Ｖ〜＋１．２Ｖでクロストリジウム属の微生物の増殖促進効果（対数増殖期への早期移行による定常期への早期移行効果）が見られることが確認されている。具体的には、電子媒体物質としてビオロゲン誘導体を用いることによる生育阻害効果（対数増殖期への移行の遅延）を、電極９の電位を＋０．３Ｖ〜＋１．２Ｖに制御しながら培養することで、キャンセルすることができ、対数増殖期への移行時期が、電子媒体物質としてビオロゲン誘導体を用いずに通電することなく培養した場合と同程度となる。特に＋０．９Ｖ〜＋１．２Ｖとすることで、ビオロゲン誘導体を用いずに通電することなく培養した場合よりも優れた増殖促進効果が得られ、さらにはビオロゲン誘導体を用いずに通電することなく培養した場合と同程度の最終菌体密度とすることができる。さらに着目すべきは、電子媒体物質としてビオロゲン誘導体を用い、電極の電位を＋０．３Ｖ〜＋１．２Ｖに制御しながら培養することによって、増殖の過程で蓄積する有機酸の生成が抑えられることである。このことによって、アルコール（ブタノール）の生産に極めて適した状態が形成される。換言すれば、定常期（ソルベント生成期）においてアルコール生産性を向上させることができる前駆状態が形成されることになる。以上、クロストリジウム属の微生物の増殖過程においては、電極９の電位を＋０．３Ｖ〜＋１．２Ｖとすることが好ましく、＋０．６Ｖ〜＋１．２Ｖとすることがより好ましく、＋０．９Ｖ〜＋１．２Ｖとすることがさらに好ましい。
【００４４】
そして、電極９の電位を制御してクロストリジウム属の微生物の増殖を促進させて定常期に移行させた後は、＋０．３〜＋０．９Ｖとすることでブタノール生産量を増大でき、＋０．３Ｖ〜＋０．６Ｖとすることでブタノール生産量を特に増大できることが確認されている。したがって、電極９の電位を制御してクロストリジウム属の微生物の増殖を促進させて定常期に移行させた後は、電極９の電位を＋０．３〜＋０．９Ｖとすればよく、＋０．３Ｖ〜＋０．６Ｖとすることが好ましい。尚、対数増殖期よりも菌体密度の低い状態から増殖過程を経て高密度状態に至るまで上記酸化電位を印加して培養を行うと、定常期（ソルベント生成期）において、＋０．３Ｖにおいてもブタノール生産性の顕著な向上効果が得られる。つまり、より低い電位に制御して投入電気エネルギーを減らしつつ、ブタノール生産性の向上効果を得ることができるというメリットが得られることになる。
【００４５】
尚、定常期（ソルベント生成期）において、電極９の電位を＋１．２Ｖとすると、電位を印加しない場合よりもブタノールの生産性が若干低下する傾向が見られた。その一方で、＋０．９Ｖでは電位を印加しない場合よりもブタノールの生産性を向上させることができることから、＋０．９Ｖ〜＋１．２Ｖ未満の間に電位を印加しない場合よりもブタノールの生産性が向上する境界となる電位が存在し得るものと考えられる。しかしながら、アルコール生産を行う上では、印加電位は低くした方がエネルギー的には有利であること、さらには、＋０．９Ｖよりも低い電位（例えば、＋０．６Ｖ）とした方がより顕著なブタノール生産性の向上効果が奏されることを考慮すれば、定常期における電極９の電位は＋０．９Ｖ以下とすることが望ましいと言える。
【００４６】
以上のことを纏めると、ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属の微生物について、電子媒体物質としてビオロゲン誘導体を用い、クロストリジウム属の微生物を高密度培養してアルコール生産を行う場合には、電極９の電位を、＋０．３Ｖ〜＋０．９Ｖとすればよいが、ブタノールの生産性を顕著に向上させる観点からは、０．３Ｖ超〜＋０．９Ｖとすることが好ましく、＋０．６Ｖ〜＋０．９Ｖとすることがより好ましく、＋０．６Ｖとすることがさらに好ましいと言える。
【００４７】
また、ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属の微生物について、電子媒体物質としてビオロゲン誘導体を用い、クロストリジウム属の微生物を対数増殖期に移行する前の菌体密度で培養液に含ませて定常期に移行させる場合には、電極９の電位を、＋０．３〜＋１．２Ｖとすればよいが、＋０．６Ｖ〜＋１．２Ｖとすることが好ましく、＋０．９〜＋１．２Ｖとすることがより好ましいと言える。そして、定常期に移行させた後の高密度培養によってアルコール生産を行う場合には、電極９の電位を、＋０．３Ｖ〜＋０．９Ｖとすることが好ましく、＋０．３Ｖ〜＋０．６Ｖとすることがより好ましいと言える。最も好ましくは、ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属の微生物について、電子媒体物質としてビオロゲン誘導体を用い、クロストリジウム属の微生物を対数増殖期に移行する前の菌体密度で培養液に含ませて定常期に移行させる場合には、電極９の電位を、＋０．９Ｖ〜＋１．２Ｖとし、定常期に移行させた後の高密度培養によってアルコール生産を行う場合には、＋０．３Ｖ〜＋０．６Ｖとすることである。この場合には、対数増殖期の早期化、最終到達菌体密度の向上及び有機酸の蓄積抑制の全ての効果が奏されてアルコール生産に極めて適した状態が形成され、その後の電位制御によってクロストリジウム属の微生物のアルコール生産性が向上し、これらの効果が相俟って、極めて顕著なアルコール生産性の向上効果が奏されることになる。
【００４８】
したがって、クロストリジウム属の微生物を利用し、流加培養等の連続的な培養によってアルコール（ブタノール）生産を極めて効率的に実施することが可能となる。
【００４９】
尚、電極９の材質による最小電位及び最大電位の変化は僅かと考えられることから、本発明におけるブタノール生産量の顕著な増大効果は、炭素電極以外の電極を用いた場合にも奏されるものと考えられる。
【００５０】
本発明のアルコール生産方法は、例えば図２〜６に示すアルコール生産装置を用いて実施される。以下、本発明のアルコール生産装置の第一の実施形態を図２〜図５に基づいて説明し、本発明のアルコール生産装置の第二の実施形態を図６に基づいて説明する。
【００５１】
＜第一の実施形態＞
第一の実施形態にかかるアルコール生産方法は、発酵における代謝産物としてアルコールを生産するアルコール生産微生物２を用いて有機物３からアルコールを生産する方法において、アルコール生産微生物２と有機物３とを含む培養液４に電子媒体物質５を添加し、電子媒体物質５はアルコール生産微生物２が還元可能な物質とし、アルコール生産微生物２により還元されて生じる電子媒体物質５の還元体を培養液４に浸漬した電極９（作用電極９）に電位を与えて酸化させながらアルコール生産微生物２を培養してアルコールを生産するようにしている。本実施形態では、培養液４にイオン交換膜６を介して電解液４ａを接触させ、作用電極９と対をなす電極１０（対電極１０）を電解液４ａに浸すようにしている。
【００５２】
第一の実施形態にかかるアルコール生産方法は、例えば図２〜図５に示すアルコール生産装置１により実施される。即ち、図２〜図５に示すアルコール生産装置１は、イオン交換膜６によって仕切られた二つの槽のうちの一方の槽を培養槽７とし、他方の槽を対電極槽８とし、培養槽７には培養液４が収容されると共に作用電極９と参照電極１１が浸され、対電極槽８には電解液４ａが収容されると共に対電極１０が浸され、作用電極９と対電極１０と参照電極１１は定電位設定装置１２に結線されている。そして、培養液４にアルコール生産微生物２と有機物３とアルコール生産微生物が還元可能な電子媒体物質５とを含ませて、定電位設定装置１２で作用電極の電位を３電極方式で制御することによりアルコール生産微生物２により還元されて生じる電子媒体物質５の還元体を酸化させながらアルコール生産微生物２を培養してアルコールを生産するものとしている。
【００５３】
このように、３電極方式で作用電極９の電位を制御することで、作用電極９の電位を厳密に設定電位に制御することができる。詳細には、定電位設定装置（ポテンシオスタット）１２により、作用電極９と参照電極１１との間の電位差を測定し、この電位差が設定電位に達するように作用電極９と対電極１０との間に電流を流し、基準となる参照電極１１には一切電流が流れないようにしている。尚、３電極方式による電位制御については、例えば、電気化学測定法（上）、技報動出版株式会社、第１版１５刷、２００４年６月発行の６〜９ページにその詳細が記載されている。但し、作用電極９と対電極１０の極間電圧のみで作用電極９の電位を制御できる場合には、３電極方式とせずともよい。
【００５４】
また、イオン交換膜６は、培養液４に含まれる微生物２、電子媒体物質５、有機物３を対電極槽８に透過させることなく、培養液４中に留まらせ、且つ培養液４に含まれるイオンまたは電解液４ａに含まれるイオンを透過させてイオン電流を生じさせ、作用電極９において生じる酸化反応を補完する還元反応を対電極１０で生じさせるものである。これにより、電子媒体物質５の還元体が長期に亘って安定に酸化され易くなる。イオン交換膜６としては、電子媒体物質５（酸化体と還元体）を透過させることの無いものを適宜選択して用いる。
【００５５】
ここで、ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属の微生物を用いてアルコール生産を行う場合、電子媒体物質としてビオロゲン及びビオロゲン誘導体の少なくともいずれかを用いることが好適であることは上記に述べた通りであるが、この場合には、イオン交換膜６として陰イオン交換膜を用いることが好ましい。プロトン交換膜や陽イオン交換膜を用いると、ビオロゲン及びビオロゲン誘導体がイオン交換膜６に吸着され、作用電極９上での酸化反応を行うことができなくなるが、陰イオン交換膜を用いた場合には、ビオロゲン及びビオロゲン誘導体がイオン交換膜６に吸着されることなく、イオン交換膜６に必要とされる上記機能が維持される。
【００５６】
尚、電子媒体物質５の種類によっては、印加する電位によっては、対電極１０での還元反応が生じない場合があるので、対電極１０での還元反応が生じない範囲で電位を印加する場合には、イオン交換膜６を省略しても良い。また、対電極１０での還元反応が生じたとしても、作用電極９側での酸化反応が生じ続ける限り、本発明の効果が奏され得るので、イオン交換膜６の設置は必須ではない。
【００５７】
また、図２〜図５に示すアルコール生産装置１では、培養槽７を密閉構造としている。これにより、培養槽７にて生産されるアルコールが揮発して容器外に拡散するのを防ぐことができる。また、培養槽７を密閉構造とすることで、培養液４の嫌気性雰囲気を制御し易いという利点もある。即ち、培養槽７を密閉構造とすることで、培養を開始する前に培養槽７の遊離酸素を実質的に無くせば、培養槽７への遊離酸素の進入が起こらないので、培養期間中は培養槽７内の嫌気雰囲気を維持し続けて発酵が良好に進行する。特にクロストリジウム属の微生物は嫌気環境下にてＡＢＥ発酵を行う微生物であることから、このように培養槽７を密閉構造とすることで、クロストリジウム属の微生物にＡＢＥ発酵を行わせる上で極めて有利な構成となる。
【００５８】
さらに、図２〜図５に示すアルコール生産装置１では、培養槽７内の培養液４の液面よりも下部に、培養槽７内の培養液４を培養槽７の外に導く培養液排出管１６ａを備え、この培養液排出管１６ａをバルブ１６ｂにより開閉可能とした培養液回収手段１６により、培養槽７内からアルコールを含む培養液４を採取するようにしている。培養液４に含まれるアルコールは蒸留等により適宜精製することで回収することができる。但し、培養液の回収方法は、この方法に限定されるものではない。例えば、培養槽７に開口部を設けて合成ゴム等の弾性材料で塞ぎ、注射器の注射針を刺してアルコールを含む培養液４を回収するようにしてもよい。または両端が開口された管の一端の注射器に接続し、他端を培養液４に浸けて、管を介してアルコールを含む培養液４を回収するようにしてもよい。
【００５９】
また、図２〜図５に示すアルコール生産装置１では、培養槽７を密閉構造とし、培養槽７の培養液４の液面よりも上部の空間（ヘッドスペース）に滞留するガスを培養槽７の外へ導くガス排出管１５ａを備え、このガス排出管１５ａをバルブ１５ｂにより開閉可能としたガス回収手段１５を有している。このガス回収手段１５により、ヘッドスペースに滞留し得るアルコールの揮発分を回収するようにしている。但し、ガス排出管１５ａのみでヘッドスペースに滞留するアルコールの揮発分を培養槽７の外へ導くようにしてもよいし、培養槽７の上部に開口部を設けて合成ゴム等（例えばシリコーンゴム）の弾性材料でこの開口部を塞ぎ、開口部を塞ぐ弾性材料に注射器の注射針を刺して、ヘッドスペースからアルコールの揮発分を回収するようにしてもよい。
【００６０】
本発明のアルコール生産装置では、培養液回収手段１６とガス回収手段１５を併せて、アルコール回収手段としているが、ヘッドスペースにアルコールが滞留しない場合には、ガス回収手段１５を省略し、培養液回収手段１６のみをアルコール回収手段としてもよい。逆に、培養液回収手段１６を省略し、ヘッドスペースに滞留するアルコールの揮発分のみを回収するようにしてもよい。
【００６１】
また、アルコール回収手段とは別に、培養液４に物質を添加・供給する手段を設けるようにしてもよい。具体的には、培養槽７の外部から培養液４に物質を添加・供給することのできる開閉可能な物質導入管を備えるようにしてもよい。この場合には、培養液４に栄養源、中和剤、物質生産に必要な物質等を必要に応じて添加することができる。勿論、微生物２をこの導入管から供給することもできるし、有機物３を導入することもできる。また、嫌気条件とするためのガス（窒素ガス等）を供給することもできる。但し、培養液４に物質を添加・供給する手段は必ずしも備える必要はなく、アルコール回収手段を培養液４に物質を添加・供給する手段として併用するようにしてもよい。また、上記のように注射器の注射針を弾性材料に差し込んで培養液４に物質を添加・供給するようにしてもよい。また、電解液４ａに物質を添加・供給する手段を設けるようにしてもよい。
【００６２】
また、図２〜図５に示すアルコール生産装置１では、対電極槽８を密閉構造とし、対電極槽８の電解液４ａの液面よりも上部の空間（ヘッドスペース）に滞留するガスを対電極槽８の外へ導くガス排出管１７ａを備え、このガス排出管１７ａをバルブ１７ｂにより開閉可能としたガス放出手段１７により、対電極１０から発生したガスを培養槽７に漏洩させることなく放出するようにしている。但し、対電極槽８におけるガス発生量が少ない場合には、ガス放出手段１７を設けずともよい。また、バルブ１７ｂを省略して、ガス排出管１７ａから常時ガスが放出される構成としても勿論よい。また、対電極槽８を密閉構造とすることは必須条件ではなく、培養槽７の密閉性を阻害しない範囲で開放構造としても構わない。
【００６３】
以下、図２に示すアルコール生産装置を用いた場合を第一の実施形態Ａとして説明し、図３に示すアルコール生産装置を用いた場合を第一の実施形態Ｂとして説明し、図４に示すアルコール生産装置を用いた場合を第一の実施形態Ｃとして説明し、図５に示すアルコール生産装置を用いた場合を第一の実施形態Ｄとして説明する。
【００６４】
（第一の実施形態Ａ）
図２に示すアルコール生産装置１は、密閉構造の容器２０を培養槽７とし、容器２０に収容可能な密閉構造の小容器２１を対電極槽８とし、小容器２１は少なくとも一部にイオン交換膜６を備え、培養槽７にはアルコール回収手段（ガス回収手段１５、培養液採取手段１６）を備えるものとしている。
【００６５】
容器２０に小容器２１を収容することで、容器２０に収容されている培養液４に小容器２１が浸され、小容器２１の少なくとも一部に備えられているイオン交換膜６は培養液４と接触する。換言すれば、培養液４はイオン交換膜６を介して電解液４ａと接触する。
【００６６】
培養槽７としての密閉構造の容器２０は、対電極槽８としての密閉構造の小容器２１を収容可能な大きさの容器であり、形状は特に限定されない。容器の材質としては、例えば、ガラス、プラスチック、絶縁処理を施した金属、コンクリート等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。また、ガス不透過性の膜材をヒートシール等により袋状に形成した容器を培養槽７として用いるようにしてもよい。
【００６７】
対電極槽８としての密閉構造の小容器２１は、培養槽７としての容器２０に収容可能な大きさの容器であり、少なくとも一部にイオン交換膜６を備えるものとしている。ここで、小容器２１はその全体をイオン交換膜６で形成した袋状の容器としてもよいが、袋状の容器の片面だけをイオン交換膜６で構成したり、一つの面のさらに一部分をイオン交換膜６のみで構成するようにしてもよい。部分的にイオン交換膜６を用いる場合には、その他の部分は容器２０と同様の上記材質で構成してもよいし、イオン交換膜６以外の膜材、例えばガス不透過性の膜材により構成し、小容器２１で発生するガスが容器２０の内部に漏洩しないようにしてもよい。
【００６８】
対電極１０としては、作用電極９における酸化反応を補完する還元反応が生じ得る材質の電極、例えば炭素電極等を用いることができるが、これに限定されるものではない。
【００６９】
図２に示すアルコール生産装置１によれば、アルコール生産微生物２によるアルコール生産量を増大させつつも、培養槽７にて生産されるアルコールを容器外に漏洩させることなくその全量を回収することができる。
【００７０】
（第一の実施形態Ｂ）
図３に示すアルコール生産装置１は、上方が開放されている容器２３をイオン交換膜６で仕切ることにより開放された二つの槽が形成され、培養槽７としての一方の槽の上方開放部がガス不透過膜またはガス不透過部材２４により塞がれているものとしている。同様に、対電極槽８としての他方の槽の上方開放部もガス不透過膜またはガス不透過性部材２４により塞がれているものとしている。培養槽７にはアルコール回収手段（ガス回収手段１５、培養液採取手段１６）を備えるものとしている。尚、図３に示すアルコール生産装置１においては、容器２３の密閉性が確保されていれば、培養槽７のヘッドスペースと対電極槽８のヘッドスペースとを完全に仕切る必要はない。
【００７１】
ガス不透過膜またはガス不透過部材２４としては、各種分野で一般に用いられているものを適宜用いることができる。例えば、ガス不透過部材としては、ガラス、プラスチック、絶縁処理を施した金属、コンクリート等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。また、ガス不透過膜としては、例えばイオン交換膜６を用いることができるがこれに限定されるものではない。
【００７２】
図３に示すアルコール生産装置１によれば、図２に示すアルコール生産装置１と同様、アルコール生産微生物２によるアルコール生産量を増大させつつも、培養槽７にて生産されるアルコールを容器外に漏洩させることなくその全量を回収することができる。
【００７３】
（第一の実施形態Ｃ）
図４に示すアルコール生産装置１は、収容される液体の液面よりも下部に開口部を備える二つの容器２５ａと２５ｂがイオン交換膜６を介して開口部で連結されてＵ字型の容器２５が形成され、一方の容器２５ａを密閉構造として培養槽７とし、他方の容器２５ｂも密閉して対電極槽８としている。この場合、培養液４と電解液４ａがイオン交換膜６を介して接触すると共に、培養槽７の培養液４の液面よりも上部の空間と対電極槽８の電解液４ａの液面よりも上部の空間とが容器２５自体のＵ字型構造によって隔てて配置される。図４に示すアルコール生産装置１によれば、図２に示すアルコール生産装置１と同様、アルコール生産微生物２によるアルコール生産量を増大させつつも、培養槽７にて生産されるアルコールを容器外に漏洩させることなくその全量を回収することができる。
【００７４】
（第一の実施形態Ｄ）
図５に示すアルコール生産装置１は、収容される液体の液面よりも下部に開口部を備える二つの容器２６ａと２６ｂがイオン交換膜６を介して開口部で連結されてＨ字型の容器２６が形成され、一方の容器２６ａを密閉構造として培養槽７とし、他方の容器２６ｂも密閉して対電極槽８としている。この場合にも、培養液４と電解液４ａがイオン交換膜６を介して接触すると共に、培養槽７の培養液４の液面よりも上部の空間と対電極槽８の電解液４ａの液面よりも上部の空間とが容器２６自体のＨ字型構造によって隔てて配置される。図５に示すアルコール生産装置１によれば、図２に示すアルコール生産装置１と同様、アルコール生産微生物２によるアルコール生産量を増大させつつも、培養槽７にて生産されるアルコールを容器外に漏洩させることなくその全量を回収することができる。
【００７５】
＜第二の実施形態＞
第二の実施形態にかかるアルコール生産方法は、発酵における代謝産物としてアルコールを生産するアルコール生産微生物２を用いて有機物３からアルコールを生産する方法において、アルコール生産微生物２と有機物３とを含む培養液４に電子媒体物質５を添加し、電子媒体物質５はアルコール生産微生物２が還元可能な物質とし、アルコール生産微生物２により還元されて生じる電子媒体物質５の還元体を培養液４に浸漬した電極９（作用電極９）に電位を与えて酸化させながらアルコール生産微生物２を培養してアルコールを生産するようにしている。本実施形態では、培養液４にイオン交換膜６を介して対電極９を接触させるようにしている。つまり、第二の実施形態におけるアルコール生産方法とは、電解液４ａを用いることなく対電極１０を直接イオン交換膜６に接触させている点が異なっている。しかしながら、第一の実施形態のように電解液４ａを用いずとも、作用電極９と対電極１０との間でイオン交換膜６を介してイオン電流は流れるので、第二の実施形態にかかるアルコール生産方法によれば、第一の実施形態と同様に作用電極９の電位を制御して、同様の効果を得ることが可能である。
【００７６】
第二の実施形態にかかるアルコール生産方法は、例えば図６に示すアルコール生産装置により実施される。図６に示すアルコール生産装置１は、イオン交換膜６を少なくとも一部に備える密閉構造の容器５０内に作用電極９と参照電極１１が配置され、容器５０の外側に対電極１０が配置され、容器５０に培養液４が収容されると共に作用電極９と参照電極１１が培養液４に浸され、容器５０のイオン交換膜６は容器５０に培養液４が収容されたときに少なくともその一部がイオン交換膜６と接触しうる位置に備えられ、イオン交換膜６の培養液４の接触面とは反対側の面の少なくとも一部に対電極１０が接触して配置されているものとしている。図６に示すアルコール生産装置１では、容器５０の培養液４の液面よりも下部に開口部５０ａが設けられ、開口部５０ａがイオン交換膜６で塞がれ、容器５０の外側のイオン交換膜６の表面の少なくとも一部に対電極１０が接触して配置されているものとしている。つまり、図６に示すアルコール生産装置１では、容器５０全体が培養槽７として機能することとなる。
【００７７】
したがって、図６に示すアルコール生産装置１によれば、容器５０を密閉構造としているので、第一の実施形態と同様、培養槽７にて生産されるアルコールが揮発して容器外に拡散するのを防ぐことができる。また、培養液４の嫌気性雰囲気を制御し易いという利点もある。
【００７８】
尚、図６に示すアルコール生産装置１では、第一の実施形態と同様に、アルコール回収手段として、ガス回収手段１５、培養液回収手段１６を備えるようにしているが、上記の通り、ガス回収方法、培養液採取方法は、これらの手段を利用したものには限定されない。また、ガス回収手段１５、培養液回収手段１６のいずれか一方を省略してもよい。さらに、第一の実施形態と同様、培養液４に物質を添加・供給する手段を設けるようにしてもよい。
【００７９】
以下、図６に示すアルコール生産装置１の詳細について説明する。但し、以下に説明する以外の構成については、第一の実施形態と実質的に同一であり、説明は省略する。
【００８０】
容器５０は、イオン交換膜６を少なくとも一部に備える密閉構造としている。容器５０の材質としては、例えば、ガラス、プラスチック、絶縁処理を施した金属、コンクリート等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。尚、図６では、密閉構造の容器５０の培養液４の液面よりも下部に設けられた開口部５０ａをイオン交換膜６により塞ぐようにしているが、容器５０の形態や構造は特に限定されない。例えば容器５０全体をイオン交換膜６で形成した袋状の容器としてもよいし、袋状の容器の片面だけをイオン交換膜６で構成してもよいし、一つの面のさらに一部分をイオン交換膜６のみで構成するようにしてもよい。部分的にイオン交換膜６を用いる場合には、その他の部分はガラス等の上記材質で構成してもよいし、イオン交換膜６以外の膜材、例えば培養液４と培養液４中の成分の双方を透過させることがない膜材により構成してもよい。要は、容器５０に収容される培養液４が容器５０の少なくとも一部を構成するイオン交換膜６と接触しうる構造の容器とすればよい。
【００８１】
対電極１０は、イオン交換膜６の培養液４との接触面とは反対側の面の少なくとも一部に接触させるようにしている。本実施形態において、対電極１０は板状の炭素電極としているが、対電極１０の形状と材質はこれに限定されるものではなく、要は、イオン交換膜６との接触が可能な形状であり、且つ作用電極９における酸化反応に対して電子の授受を補完する還元反応を進行させることが可能な材質の電極とすればよい。また、本実施形態では、対電極１０の面積をイオン交換膜６の面積よりも大きなものとしてイオン交換膜６全体を対電極１０で完全に覆うようにし、イオン交換膜６と対電極１０とを接触させるようにしているが、イオン交換膜６の培養液４との接触面とは反対側の面の少なくとも一部に対電極１０を接触させればよく、必ずしもイオン交換膜６全体を対電極１０で完全に覆うようにしてイオン交換膜６と対電極１０とを接触させずともよい。但し、イオン交換膜６全体を対電極１０で完全に覆うことで、対電極１０をイオン交換膜６の保護材としても機能させることができると共に、培養液４からのイオンの伝達面が増大する結果として、培養液４の電位制御性を高めることができる利点があり、好適である。イオン交換膜６全体を対電極１０で完全に覆う方法としては、例えば、容器５０の開口部５０ａの周囲に接着剤を塗布して対電極１０を接着することにより、開口部５０ａを塞ぐイオン交換膜６全体と対電極１０とを接触させるようにしてもよいし、容器５０の開口部５０ａの周囲に接着剤を塗布して対電極１０の表面の少なくとも一部に塗布形成されたイオン交換膜６を接着することにより、開口部５０ａをイオン交換膜６で塞ぎつつ、開口部５０ａを塞ぐイオン交換膜６全体と対電極１０とを接触させるようにしてもよい。イオン交換膜６を塗布形成するための薬剤としては、例えばナフィオン分散液が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、対電極１０の表面にナフィオン分散液を塗布し、ナフィオン分散液が乾燥する前にイオン交換膜６を貼り付けるようにしてもよい。この場合には、イオン交換膜６の対電極１０の表面への接着性と接触性とを十分なものとすることができる。
【００８２】
ここで、対電極１０は多孔質体とすることが好適である。この場合には、イオン交換膜６と対電極１０との接触面で発生したガスを接触面とは反対側の面に通過させやすくなる。尚、対電極１０を多孔質体とし、ナフィオン分散液を用いてイオン交換膜６を貼り付けることで、ナフィオン分散液の多孔質体の孔への侵入によりイオン交換膜６と対電極１０との接触面積を増大させて電気化学反応をより進行させやすくすることができ、好適である。
【００８３】
上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。
【００８４】
例えば、図７に示すように、培養液４と電解質４ａをイオン交換膜６ではなく、イオンや微生物を一切透過させることのない不透過部材４０で隔て、あるいは培養槽７と対電極槽８を別の容器で形成し、塩橋４１（寒天等にＫＣｌ等の飽和電解質溶液を入れたもの）を介して培養液４と電解質４ａを接触（液絡）させるようにしてもよい。この場合にも、塩橋４１によってイオン電流の流れが許容されると共に、電子媒体物質５の対電極槽８への透過を防ぐことができるので、上述の実施形態と同様の効果が得られる。
【実施例】
【００８５】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。
【００８６】
尚、本実施例における電極電位は、全て銀・塩化銀電極電位を基準とするものである。
【００８７】
（実施例１）
クロストリジウム属の微生物の増殖に対する電子媒体物質の影響について検討した。
【００８８】
１００ｍＬ容のガラスバイアル瓶に液状チオグリコレート培地を３０ｍＬ収容し、これにクロストリジウム  アセトブチリカム  ＮＢＣＲ１３９４８（Clostridium acetobutylicum NBCR13948）を初期菌体密度１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように添加した。以降の説明では、クロストリジウム  アセトブチリカム  ＮＢＣＲ１３９４８をクロストリジウム属細菌と呼ぶこととする。また、チオグリコレート培地には、グルコースが２７．８ｍＭ(5g/L)含まれている。使用したチオグリコレート培地の組成を以下に示す。
［チオグリコレート培地組成（ｇ／Ｌ）］
・Ｌ−システイン  ：０．５
・塩化ナトリウム  ：２．５
・グルコース      ：５．０
・酵母エキス      ：５．０
・カゼインペプトン：１５．０
・チオグリコール酸：０．５
・ｐＨ  ７．０    
【００８９】
そして、培地に以下の電子媒体物質２ｍＭを添加したときのクロストリジウム属細菌の増殖に対する影響について検討した。
・メチルビオロゲン（ＭＶ）
・アントラキノン−２，６−ジスルホン酸二ナトリウム（ＡＱＤＳ）
・チオニン
・Ｆｅ（III）−ＥＤＴＡ
・ニュートラルレッド
・２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン
・２，６−ジクロロフェノールインドフェノール
【００９０】
ガラスバイアル瓶内は窒素置換し、試験期間中はガラスバイアル瓶内を密閉して窒素雰囲気を維持した。また、試験は３０℃で実施した。尚、比較試験として電子媒体物質を添加せずに同様の試験を実施した。
【００９１】
試験結果を図８に示す。菌体密度は、培養過程において培養液を分取し、分光光度計Ｕ−３０１０（Ｈｉｔａｃｈｉ）もしくは顕微鏡観察による計測値から算出した。電子媒体物質として、ＡＱＤＳ、Ｆｅ（III）−ＥＤＴＡを用いた場合には、電子媒体物質を添加しなかった場合とほぼ同様の増殖傾向が得られた。これに対し、電子媒体物質としてニュートラルレッド、２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、２，６−ジクロロフェノールインドフェノールを用いた場合には、増殖が全く見られなかった（データ不図示）。電子媒体物質としてＭＶを添加した場合には、増殖開始時期が大きく遅延し、最終的な到達菌体密度も電子媒体非添加時の３７％に低下した。
【００９２】
また、電子媒体物質を添加せずに試験を実施した場合、試験前は薄茶色だった培地が試験後には菌体の高密度化に伴って黄色に変化した。一方、電子媒体物質としてＭＶを添加して試験を実施した場合には、試験前は薄茶色だった培地が試験後には緑色に変化した。ここで、ＭＶは、酸化型の形態においては無色であるが、還元型の形態においては青色となることから、試験後の培地の緑色への変化は、ＭＶの還元体による青色と菌体の高密度化に伴う黄色とが混合した結果として生じたものであると考えられた。このことから、電子媒体物質としてＭＶを添加してクロストリジウム属細菌を培養することで、クロストリジウム属細菌によりＭＶが還元されることがわかった。
【００９３】
次に、電子媒体物質を添加した場合と、電子媒体物質を添加しなかった場合について、上記試験中における培地のグルコース濃度、上記試験後における培地の酢酸濃度、酪酸濃度、エタノール濃度、ブタノール濃度の経時変化を液体クロマトグラフィー（Ｅｌｉｔｅ  Ｌａｃｈｒｏｍｅ、日立製）にて測定した。グルコース濃度変化を図９に示し、酢酸濃度、酪酸濃度、エタノール濃度及びブタノール濃度を図１０に示す。図１０のグラフは、左から順に、酢酸濃度、酪酸濃度、エタノール濃度、ブタノール濃度を表している。また、各条件における代謝産物の対糖収率（％、ｍｏｌ−Ｃ／ｍｏｌ／Ｃ）を表１に示す。
【００９４】
【表１】
0005730668.tif 000002
【００９５】
図９に示される結果から、電子媒体物質として、ＡＱＤＳ、Ｆｅ（III）−ＥＤＴＡを用いた場合には、電子媒体物質を添加しなかった場合とほぼ同様のグルコース消費傾向が見られることがわかった。これに対し、電子媒体物質としてＭＶを用いた場合には、電子媒体物質を添加しなかった場合と比較して、グルコースの消費開始時期に大きな遅延が見られることがわかった。
【００９６】
図１０に示される結果から、電子媒体物質とてＭＶを用いた場合には、電子媒体物質を添加しなかった場合と比較して、酢酸の生成量を０．５倍に抑えることができると共に、ブタノールの生成量を１．５倍に増加させることができることがわかった。また、酪酸の生成量も抑えられていた。尚、ＭＶ添加により最終到達菌体密度は低下したため、菌体あたりのブタノール生産量はＭＶ非添加時に対して４．６倍高いことになる。電子媒体物質として、ＡＱＤＳ、Ｆｅ（III）−ＥＤＴＡを用いた場合には、電子媒体物質を添加しなかった場合と比較して、ブタノール生産量が増大する傾向は見られなかった。
【００９７】
以上の結果から、クロストリジウム属細菌を用いたアルコール生産において、培地に電子媒体物質としてＭＶを添加することで、電子媒体物質を添加しない場合と比較して、クロストリジウム属細菌のＡＢＥ発酵における代謝産物である酪酸及び酢酸の蓄積量の抑制効果及びブタノールの生産量の増大効果が得られることが明らかとなった。
【００９８】
また、培養試験終了後、バイアル瓶内の気相部分のガスを回収し、ガスクロマトグラフィーＣＲ４９００（ＶＡＲＩＡＮ）、ＴＣＤ検出器にて水素と二酸化炭素の定量分析を行った。結果を図１１に示す。気相部分のガスの成分分析の結果、発生したガスは主に水素と二酸化炭素であった。二酸化炭素の発生量は、電子媒体の添加の有無及び種類によって大きな変化は見られなかった。一方、水素発生量は、ＡＱＤＳ及びＭＶを添加した条件下では非添加時と比較して大きく低下する傾向が見られた。
【００９９】
ここで、本実施例で使用したクロストリジウム属細菌においては、ブタノール生産経路において発生した還元力 (電子) は増殖期において主に水素生産に使用され、この水素生産への電子の流れを抑制することでブタノールの生産性を向上できることが報告されている（Carolis J. Paredes, S.W.J., Ryan S. Senger, Jacob R. Borden, Ryan Sillers, and Eleftherios T. Papoutsakis, Molecular Aspects of Butanol Fermentation. Bioenergy, 2008.）。ＭＶ添加による菌体密度の低下、酢酸及び酪酸の収率低下、水素生産量の低下という３つの結果から、ＭＶ添加条件におけるブタノール生産量の増加は菌体構成成分合成や酢酸・酪酸合成に使われていたグルコース由来の炭素および電子がブタノール生産へシフトしたためと推定された。以上より、ＭＶは生育阻害効果を示すが、電子の流れの調整に基づいて代謝を制御できる可能性を持つことが明らかとなった。
【０１００】
（実施例２）
実施例１において、クロストリジウム属細菌の代謝の過程におけるＭＶからの電子の引き抜きがアルコール（ブタノール）の生産性の向上に寄与しているものと考えられた。そこで、還元されたＭＶを電気的に酸化し、枯渇した酸化型ＭＶを再生して連続的に供給することにより、クロストリジウム属細菌のアルコール生産性にどのような影響が及ぼされるか検討した。
【０１０１】
本実施例において使用した実験装置の断面図を図１３に示す。２５０ｍＬ容の２つのガラスバイアル瓶（Ｄｕｒａｎ製）を下部開口部で陰イオン交換膜（（株）アストム製、型番ネオセプタAMX）を介して連結してＨ字型の容器２６とした。そして、ガラスバイアル瓶の一方を培養槽２６ａとし、他方を対電極槽２６ｂとした。培養槽２６ａ及び対電極槽２６ｂには蓋をし、蓋の上面にシリコーンゴム栓を設けて、電極（作用電極９、対電極１０）と定電位設定装置１２とを結線する配線を貫通させた際の容器内の密閉性を確保した。また、培養槽２６ａには培養液４を採取するための培養液採取部５２を設け、試験期間中に適宜培養液４を採取可能とした。
【０１０２】
培養槽２６ａには、グルコースを５０ｍＭ、ＭＶを２ｍＭ添加したＴＹＡ培地（自然電位＋０．１Ｖ）を２００ｍＬ収容し、作用電極９を浸漬させた。ＴＹＡ培地の組成は、以下の通りとした。
［ＴＹＡ培地の組成（ｇ／Ｌ）］
・グルコース              ：１０．０
・トリプトン              ：６．０
・酵母エキス              ：２．０
・酢酸アンモニウム        ：３．０
・リン酸二水素カリウム    ：０．５
・硫酸マグネシウム七水和物：０．３
・硫酸鉄七水和物          ：０．０１
・ｐＨ  ７．０
【０１０３】
対電極槽２６ｂには、電解液（ＮａＣｌ溶液：０．５８ｇ／Ｌ）を２００ｍＬ収容し、対電極１０を浸漬させた。
【０１０４】
培養槽２６ａの作用電極９からの配線と対電極槽２６ｂの対電極９からの配線は、シリコーンゴム栓を通して容器２６の外側に引き出し、それぞれ定電位設定装置１２に結線した。参照電極１１（RE-1B, ＢＡＳ株式会社）は、培養槽２６ａの電極差し込み部５１に差し込んで培養液４と接触させ、配線を定電位設定装置１２に結線した。このように、作用電極９と対電極１０と参照電極１１とを３電極式の定電位設定装置（ポテンシオスタット）１２に結線することで、作用電極９の電位を厳密に制御可能とした。
【０１０５】
まず、作用電極９を炭素電極（BAS社製）とし、対電極１０を白金棒電極（自作）として、上記実験装置を用いてサイクリックボルタンメトリーによりＭＶの酸化還元特性を測定した。結果を図１４に示す。図１４に示される結果から、作用電極の電位を−０．６Ｖよりもプラス側に大きく制御することで、還元されたＭＶを酸化できることが明らかとなった。
【０１０６】
次に、作用電極９と対電極１０を炭素電極とし、培養液４にクロストリジウム属細菌（Clostridium acetobutylicum NBCR13948）を増殖の定常期の菌体密度に相当する６．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように添加し、高密度培養試験を行った。培養条件は以下の通りとした。
・ｐＨ    ：  ６．５
・培養温度：  ３０℃
・培養期間：  １１４時間
・窒素雰囲気下
・静止菌実験
【０１０７】
印加電位条件は以下の通りとした。
・通電無し（ＭＶ無し）
・通電無し（ＭＶ有り）
・＋０．６Ｖ（ＭＶ有り）
・＋０．３Ｖ（ＭＶ有り）
・−０．３Ｖ（ＭＶ有り）
・−０．５Ｖ（ＭＶ有り）
【０１０８】
上記高密度培養試験中における培地のグルコース濃度、ｐＨ、酪酸濃度、酢酸濃度、ブタノール濃度、エタノール濃度の経時変化を液体クロマトグラフィー（Ｅｌｉｔｅ  Ｌａｃｈｒｏｍｅ、日立製）にて測定した。グルコース濃度変化を図１５に示し、ｐＨ変化を図１６に示し、酪酸濃度変化を図１７に示し、酢酸濃度変化を図１８に示し、ブタノール濃度変化を図１９に示し、エタノール濃度変化を図２０に示す。尚、図１５〜図２０において、◆が通電無し（ＭＶ無し）の実験結果を示し、■が通電無し（ＭＶ有り）の実験結果を示し、▲が＋０．６Ｖ（ＭＶ有り）の実験結果を示し、×が＋０．３Ｖ（ＭＶ有り）の実験結果を示し、*が−０．３Ｖ（ＭＶ有り）の実験結果を示し、●が−０．５Ｖ（ＭＶ有り）の実験結果を示している。
【０１０９】
図１５及び図１６に示される結果から、印加電位条件の違いによるクロストリジウム属細菌のグルコース消費速度、ｐＨ変化に殆ど差は見られなかった。
【０１１０】
図１７に示される結果から、印加電位条件を＋０．６Ｖ（ＭＶ有り）とすることで、他の印加電位条件と比較して酪酸の蓄積量が抑えられることが明らかとなった。
【０１１１】
図１８に示される結果から、ＭＶを添加した場合には、ＭＶを添加しない場合と比較して、電位の印加の有無によらず、酢酸蓄積量が抑えられることが明らかとなった。
【０１１２】
図１９に示される結果から、印加電位条件を＋０．６Ｖ（ＭＶ有り）とすることで、他の印加電位条件と比較してブタノール生産量が極めて顕著に向上することが明らかとなった。具体的には、通電無し（ＭＶ無し）と比較するとブタノール生産量が７倍となり、他の印加電位条件と比較するとブタノール生産量が２倍となることが明らかとなった。
【０１１３】
図２０に示される結果から、印加電位条件を＋０．６Ｖ（ＭＶ有り）とすることで、他の印加電位条件と比較してエタノール生産量が向上することが明らかとなった。具体的には、通電無し（ＭＶ無し）と比較するとエタノール生産量が２倍となり、他の印加電位条件よりも有意にエタノール生産量が増大することが明らかとなった。また、エタノール生産量については、印加電位条件を＋０．３Ｖ（ＭＶ有り）とした場合にも、エタノール生産量の向上効果が若干ではあるが得られることが明らかとなった。
【０１１４】
以上の結果から、クロストリジウム属細菌を用いたアルコール生産において、作用電極の電位を＋０．３Ｖに制御して、培養の過程でクロストリジウム属細菌に還元されたＭＶを電気的に酸化することで、クロストリジウム属細菌のエタノール生産性を向上させることができ、作用電極の電位を＋０．６Ｖに制御して、培養の過程でクロストリジウム属細菌に還元されたＭＶを電気的に酸化することで、エタノール生産性の向上に加えて、ブタノール生産性の顕著な向上効果が得られることが明らかとなった。
【０１１５】
以上の結果から、＋０．３Ｖ超〜＋０．６Ｖの間にブタノール生産性が向上し始める最小電位が存在し、＋０．６Ｖとすることで、顕著なブタノール生産性の向上効果が確実に得られ、さらにはエタノール生産性の向上効果も得られることがわかった。
【０１１６】
（実施例３）
クロストリジウム属細菌（Clostridium acetobutylicum NBCR13948）の初期菌体密度を１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとし、実施例２と同様の条件で培養試験を行い、印加電位条件によるクロストリジウム属細菌の増殖について検討した。
【０１１７】
印加電位条件は以下の通りとした。
・通電無し（ＭＶ有り）
・＋０．６Ｖ（ＭＶ有り）
・＋０．３Ｖ（ＭＶ有り）
・  ０．０Ｖ（ＭＶ有り）
・−０．３Ｖ（ＭＶ有り）
・−０．６Ｖ（ＭＶ有り）
【０１１８】
結果を図２１に示す。−０．６Ｖ（ＭＶ有り）では、クロストリジウム属細菌が増殖しなくなった。これに対し、＋０．６Ｖ（ＭＶ有り）、＋０．３Ｖ（ＭＶ有り）では、他の印加電位条件と比較して増殖速度が増大する傾向が見られ、その効果は特に＋０．６Ｖ（ＭＶ有り）で顕著であった。
【０１１９】
この結果から、印加電位を＋０．３Ｖ以上、より好ましくは＋０．６Ｖ以上として、クロストリジウム属細菌により還元されたＭＶを酸化しながら培養を行うことで、クロストリジウム属細菌の増殖速度を増大させて、増殖段階をソルベント（アセトン、ブタノール、エタノール）生成期である定常期に移行させる速度を向上できることが明らかとなった。即ち、クロストリジウム属細菌の増殖段階を定常期に移行させる速度を高めて、クロストリジウム属細菌を利用したアルコール生産槽の立ち上げ等を迅速且つスムーズに行うことが可能となることが明らかとなった。
【０１２０】
したがって、クロストリジウム属細菌の初期菌体密度を対数増殖期未満として、本発明のアルコール生産方法を実施することで、クロストリジウム属細菌の菌体密度を迅速に増殖の定常期の菌体密度に高めて、ソルベント生成期に移行させ、アルコール生産を効率よく行うことができることが明らかとなった。
【０１２１】
（実施例４）
実施例３の培養試験と類似の培養試験を行い、さらに詳細な検討を行った。
【０１２２】
図１２に示す電気培養装置を用いて実験を行った。培養槽７としての容器２０は２５０ｍＬ容のガラスバイアル瓶（Ｄｕｒａｎ製）とした。容器２０には蓋３０をした。蓋３０の上面３０ａにはシリコーンゴム栓を設けて、配線や電極、管を通した際の容器２０の密閉性を確保した。また、シリコーンゴム栓を設けることにより注射針の突き刺しを可能とし、且つ注射針の差し込みにより生じた孔が注射針を抜いた際に塞がるようにした。
【０１２３】
対電極槽８としての小容器２１は、１５ｍＬ容プラスチックチューブを縦に切断し、切断面に陰イオン交換膜６（（株）アストム製、型番ネオセプタAMX）を接着して半筒状に加工した。陰イオン交換膜６の面積は１２ｃｍ２であった。小容器２１の内部には電解液４ａを収容すると共に対電極１０を収容して電解液４ａに浸した。そして、小容器２１の上部をシリコン系接着剤で埋めて密閉した。
【０１２４】
小容器２１と作用電極９を培養液４に浸漬し、作用電極９と対電極１０の配線は蓋３０に設けたシリコーンゴム線を通して容器２０の外側に引き出した。銀・塩化銀参照電極１１（RE-1B, ＢＡＳ株式会社）は容器２０の側面に設けられた二つの開口部のうちの下方から差し込んで培養液４と接触させた。作用電極９と対電極１０と参照電極１１とを３電極式の定電位設定装置（ポテンシオスタット）１２に結線して、作用電極９の電位を厳密に制御可能とした。培養期間中に培養槽７から発生したガスを容器２０の上部に設置したアルミニウム製サンプリングバッグ３０（ジーエルサイエンス製、商品名：アルミニウムバッグ、１Ｌ）に回収した。
【０１２５】
作用電極９と対電極１０は共に炭素板（７．５ｃｍ×２．５ｃｍ）とした。
【０１２６】
培養液４は、実施例１で用いたチオグリコレート培地と同様のものにＭＶを２ｍＭ添加したものとした。
【０１２７】
電解液４ａは、実施例１で用いたチオグリコレート培地と同様のもの（ＭＶ非添加）とした。
【０１２８】
培養液４の電位が設定電位で安定した後、定常期のクロストリジウム属細菌（Clostridium acetobutylicum NBCR13948）を含む培養液（菌体密度：６．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を１％（２．５ｍＬ）植菌し、培養過程における通電の効果を検証した。また、対照試験として、ＭＶ添加及び非添加での通電無しの試験を実施した。
【０１２９】
実験は、培養液温度を３０℃とし、容器２０内を窒素雰囲気として実施した。
【０１３０】
印加電位条件は以下の通りとした。尚、電位印加条件では、ＭＶを添加した。
・通電無し（ＭＶ添加、非添加）
・＋１．２Ｖ
・＋０．９Ｖ
・＋０．６Ｖ
・＋０．３Ｖ
・−０．６Ｖ
・−０．８Ｖ
【０１３１】
菌体の増殖結果を図２３に示す。−０．６Ｖ、−０．８Ｖの電位を印加した場合には、クロストリジウム属細菌の生育が全く見られなかった。これに対し、酸化電位である＋０．３Ｖ〜＋１．２Ｖの電位を印加した場合には、クロストリジウム属細菌の増殖が約２０時間後から始まり、５１．５時間後に増殖が始まった通電無し（ＭＶ添加）と比べて増殖開始までに要する時間が大幅に短縮できた。このことから、ＭＶ添加によって阻害された増殖が、ＭＶ非添加時（通電無し）と同程度に回復することが明らかとなった。
【０１３２】
さらに、その中でも高電位を印加した場合（＋０．９Ｖ、＋１．２Ｖ）では、増殖開始時期は通電無し（ＭＶ非添加）のそれよりも僅かに早まり、最終的な到達菌体密度も通電無し（ＭＶ添加）の２倍、通電無し（ＭＶ非添加）と同程度であった。
【０１３３】
また、＋０．６Ｖ、＋０．３Ｖの電位を印加した場合には、増殖開始時期は通電無し（ＭＶ非添加）と同程度に回復したが、最終的な菌体密度は通電無し（ＭＶ添加）と同程度に抑制された。
【０１３４】
次に、培養試験中の培養液のグルコース濃度変化を図２４に示し、酢酸濃度変化を図２５に示し、酪酸濃度変化を図２６に示しブタノール濃度変化を図２７に示す。
【０１３５】
グルコース濃度は、増殖と同期した減少が見られ、その総消費量に培養条件による差異は見られなかった（図２４）。
【０１３６】
グルコースの主要な代謝産物としては、各条件とも酢酸、酪酸、ブタノールが検出された（図２５、図２６、図２７）。通電無し（ＭＶ非添加）では、代謝産物が酢酸と酪酸に集中し、ブタノール、エタノールの蓄積量は１ｍＭ未満であった。これに対し、通電無し（ＭＶ添加）では、蓄積開始時期は遅れたものの、酢酸と酪酸の蓄積が抑制され、ブタノール生産量の向上が確認された。
【０１３７】
また、ＭＶ存在下、酸化電位を印加した場合では、生育（増殖）の早期化に伴い、通電無し（ＭＶ添加）と比べて代謝産物の蓄積が開始するまでの期間が大幅に短縮することが明らかとなった。具体的には、通電無し（ＭＶ添加）においてはブタノール生産開始まで約６０時間を要していたのに対して、酸化電位（＋０．３Ｖ〜＋１．２Ｖ）では約２０時間後には生産が始まり、ブタノール生産に必要な時間を１／３に短縮できることが明らかとなった（図２７）。最終的に到達するブタノール濃度は、＋０．６Ｖ、＋０．３Ｖ印加時において最大であり、通電無し（ＭＶ非添加）の約７倍にあたる７ｍＭ程度まで上昇した。
【０１３８】
次に、試験終了後の培養液から対糖収率を算出した結果を表２に示す。
【０１３９】
【表２】
0005730668.tif 000003
【０１４０】
表２に示される結果から、通電無し（ＭＶ非添加）と比較して通電無し（ＭＶ添加）の方がブタノールの対糖収率が向上していることが確認できた。また、＋０．３Ｖ、＋０．６Ｖ、＋０．９Ｖの電位を印加することで、ブタノールの対糖収率のさらなる向上効果が得られ、その効果は特に＋０．３Ｖ、＋０．６Ｖにて顕著であることが明らかとなった。
【０１４１】
培養試験終了後、ガスバッグからガスを回収し、ガスクロマトグラフィーＣＲ４９００（ＶＡＲＩＡＮ）、ＴＣＤ検出器にて水素と二酸化炭素の定量分析を行った。結果を図２８に示す。各条件において二酸化炭素の発生量には大きな違いは見られなかったが、通電無し（ＭＶ添加）時および＋０．６Ｖ、＋０．３Ｖ印加時では水素発生量は低下し、実施例１と同様に、ＭＶ添加により水素生産への電子の流れが抑制されているものと推定された。一方で、＋０．９Ｖ、＋１．２Ｖ印加時ではＭＶ非添加時と同程度の水素生産量を示した。このことから、これらの条件においては、酸化型ＭＶが存在するにもかかわらず、水素生産経路への電子の流れはＭＶ非添加時と同様と考えられた。よって、ＭＶの有無だけでなく印加する電位の範囲によっても電子の流れのパターンが異なることが推定された。
【０１４２】
以上、ＭＶ添加（ＭＶ還元体）による菌体増殖の阻害効果を抑制し、ブタノール生産開始時期及び生産量の両側面からブタノール生産性をさらに向上させることに成功した。
【０１４３】
尚、＋０．６Ｖ、＋０．３Ｖ印加時では＋１．２Ｖ、＋０．９Ｖ印加時と比べ、酢酸・酪酸の蓄積が抑制されると共に、最終到達菌体密度が低く抑えられたため、それら抑制によって酢酸・酪酸の生産や菌体構成成分に使われなかった炭素およびエネルギーがブタノール生産へシフトするようになったと推定された。
【０１４４】
（実施例５）
実施例１と同様の試験を、以下の濃度のＭＶにて実施し、培養終了後の培養液のブタノール濃度を測定して、最適なＭＶ添加量を検討した。
・添加無し
・０．１ｍＭ
・０．５ｍＭ
１ｍＭ
２ｍＭ
５ｍＭ
・１０ｍＭ
【０１４５】
結果を図２９に示す。ＭＶ濃度０．５ｍＭ〜１０ｍＭにおいて、ＭＶ添加無しよりもブタノール濃度が高まることが明らかとなり、その効果は、０．５ｍＭ〜２ｍＭの範囲、特に１〜２ｍＭの範囲において顕著であった。一方、ＭＶ濃度０．１ｍＭでは、ＭＶ添加によるブタノール濃度向上効果は得られなかった。また、ＭＶ濃度を１０ｍＭよりも高濃度にしてもブタノール濃度向上効果は得られなかった。
【０１４６】
以上の結果から、ＭＶ濃度は、０．５ｍＭ〜１０ｍＭとすればよく、０．５ｍＭ〜５ｍＭとすることが好適であり、０．５〜２ｍＭとすることがより好適であり、１〜２ｍＭとすることがさらに好適であることが明らかとなった。
【０１４７】
（実施例６）
実施例２と実施例４について、培養試験中における電位の変化や電流値等に基づき、各種考察を行った。
【０１４８】
実施例４の培養試験における非通電時の培養液の自然電位の変化を図３０に示す。非通電時の培養液の自然電位はＭＶの添加・非添加に関わらず、培養開始時の−０．２Ｖから徐々に減少し、最終的には−０．５Ｖ付近でほぼ安定し、その後、培養後期にゆるやかな上昇を示した。
【０１４９】
尚、実施例４において、非通電時（ＭＶ添加）では増殖に伴い、約３０時間後からＭＶの還元色である青色への培地色の変化が見られた。通電時においては培地色の変化に電位ごとの差異が見られ、−０．６Ｖ、−０．８Ｖでは培養開始時より電気的な還元により培地は青色を呈し、＋０．６Ｖ、＋０．３Ｖではクロストリジウム属細菌の増殖に伴い青色への変化が見られた。一方、ＭＶの酸化還元電位に対し高電位（＋１．２Ｖ、＋０．９Ｖ）印加時では培地色の青色への変化は培養過程を通じて見られなかった。
【０１５０】
次に、実施例４の培養試験における電流値の変化を図３１に示す。電位印加時では増殖に同期した形で電流値の増加が見られ、電位に応じて大小の差異はあるものの、同様な電流値の変動傾向を示した。＋１．２Ｖ、＋０．９Ｖ印加時には多くの電流が流れ、電極上でのＭＶの酸化速度が大きく、クロストリジウム属細菌によるＭＶ還元速度よりも電極による酸化速度が上回った結果、培養液中のＭＶは培養期間を通じてほぼ酸化状態にあったことが推定された。＋０．６Ｖ、＋０．３Ｖでの電気培養時には酸化速度の差に起因し、一定のＭＶの酸化体と還元体が共存している状況であったと考えられる。ここで、還元型ＭＶは反応性が高く、ＤＮＡなどにダメージを与えるといった細胞毒性を呈するため（Monk, P.M.S., The Viologens: Physicochemical Properties, Synthesis and Applications of the Salts of 4,4'-Bipyridine, 1999.）培養開始時より還元型ＭＶが著量存在する−０．６Ｖ、−０．８Ｖでは生育は阻害されたと考えられた。
【０１５１】
次に、電気エネルギー投入に対するエネルギー（ブタノール）増産の効率を算出した。実施例４の電気培養期間を通して流れた電流値の積算から各通電条件において投入された電気エネルギー（ΔＷｉｎ）は、１６５９．６Ｊ（＋１．２Ｖ）、５２６．９Ｊ（＋０．９Ｖ）、６３．３Ｊ（＋０．６Ｖ）、３３．０Ｊ（＋０．３Ｖ）であった。培養終了時のブタノール生産量を非通電（ＭＶ添加）時と各通電条件間で比較した結果、ブタノール生産量の変動分から算出されるエネルギー（ΔＷｂｕｔａｎｏｌ）は−７３５．８Ｊ（＋１．２Ｖ）、７９１．８Ｊ（＋０．９Ｖ）、１２３４．６Ｊ（＋０．６Ｖ）、１３６４．６Ｊ（＋０．３Ｖ）であった。よって、実施例４の各通電条件におけるエネルギー効率はΔＷｂｕｔａｎｏｌ／ΔＷｉｎ＝−０．４４（＋１．２Ｖ）、１．５（＋０．９Ｖ）、１９．５（＋０．６Ｖ）、４１．３（＋０．３Ｖ）と算出され、＋１．２Ｖでは効率が負であったが、それより低い電位では通電することにより、投入電気エネルギーよりも大きなエネルギー増産効果を得ることができたといえる。実施例４において、ブタノール生産の観点からは＋０．３Ｖの印加が最適であり、通電による投入電気エネルギーの４１倍多いエネルギー（ブタノール）増産効果を示す効率的な培養手法であることが明らかとなった。
【０１５２】
尚、上記において、ＷｉｎとＷｂｕｔａｎｏｌは以下の式により求めた。また、上記におけるΔは、電位印加時と電位無印加時の差分という意味である。
Ｗｉｎ＝Ｅａｐ（極間電圧：Ｖ）×Ｃ（電気量：Ｃ）
Ｗｂｕｔａｎｏｌ＝
ブタノールの燃焼熱量（２６７５．９ｋＪ／ｍｏｌ）×ブタノール生産量（ｍｏｌ）
【０１５３】
次に、実施例２の培養試験における非通電時の培養液の自然電位の変化を図３２に示す。非通電時の培養液の自然電位はＭＶ添加では０Ｖ付近、非添加では０．１Ｖ付近であり、双方ともに徐々に減少し、ＭＶ添加では−０．５Ｖ付近となり、その後緩やかな上昇を示した。ＭＶ非添加では−０．４付近となり、その後上昇を続けた。
【０１５４】
次に、実施例２の培養試験における電流値の変化を図３３に示す。培養試験中に流れた電流値は実施例４におけるそれよりも小さかった。そして、試験終了までに流れた電流値の積算から、ブタノール増産効果の見られた＋０．６Ｖ印加時における投入電気エネルギーは０．２７Ｃ×１．３Ｖ＝０．３５Ｊと算出された。培養終了時、非通電（ＭＶ添加）条件に対して＋０．６  Ｖ印加によって増算されたブタノールに由来するエネルギー量は２３４１．８Ｊと算出されたことから、実施例２におけるエネルギー効率ΔＷｂｕｔａｎｏｌ／ΔＷｉｎ＝２１５８．１Ｊ／０．３５Ｊ＝６１６６と算出された。この結果から、本発明により、わずかな電気の投入により大きなエネルギーを獲得できることが明らかとなった。
【０１５５】
次に、試験期間中に流れた電流が全て還元型ＭＶの酸化に利用されたと仮定してＭＶ再生回数を算出した。計算結果を表３に示す。
【０１５６】
【表３】
0005730668.tif 000004
【０１５７】
表３に示される結果から、ＭＶ再生回数とブタノールの生産促進効果との間には正の相関は見られないことが明らかとなった。このことから、本発明におけるブタノール増産効果の増減は、酸化型ＭＶの継続的な供給のみでは説明できないことがわかった。
【符号の説明】
【０１５８】
１    アルコール生産装置
２    アルコール生産微生物
３    電子媒体物質
４    培養液
４ａ  電解液
５    有機物
６    イオン交換膜（陰イオン交換膜）
７    培養槽
８    対電極槽
９    作用電極
１０  対電極
１２  定電位設定装置
１５、１６  アルコール回収手段
【図２】
0005730668.tif 000005
【図３】
0005730668.tif 000006
【図４】
0005730668.tif 000007
【図５】
0005730668.tif 000008
【図６】
0005730668.tif 000009
【図７】
0005730668.tif 000010
【図１４】
0005730668.tif 000011
【図２２】
0005730668.tif 000012
【図１】
0005730668.tif 000013
【図８】
0005730668.tif 000014
【図９】
0005730668.tif 000015
【図１０】
0005730668.tif 000016
【図１１】
0005730668.tif 000017
【図１２】
0005730668.tif 000018
【図１３】
0005730668.tif 000019
【図１５】
0005730668.tif 000020
【図１６】
0005730668.tif 000021
【図１７】
0005730668.tif 000022
【図１８】
0005730668.tif 000023
【図１９】
0005730668.tif 000024
【図２０】
0005730668.tif 000025
【図２１】
0005730668.tif 000026
【図２３】
0005730668.tif 000027
【図２４】
0005730668.tif 000028
【図２５】
0005730668.tif 000029
【図２６】
0005730668.tif 000030
【図２７】
0005730668.tif 000031
【図２８】
0005730668.tif 000032
【図２９】
0005730668.tif 000033
【図３０】
0005730668.tif 000034
【図３１】
0005730668.tif 000035
【図３２】
0005730668.tif 000036
【図３３】
0005730668.tif 000037