(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ω−アミノアルキルグリカンをアクリル酸誘導体の蛍光標識された活性化ポリマーと定量的に反応させて、アクリル酸誘導体の糖複合ポリマー又はコポリマーを提供する工程、  蛍光標識された活性化ポリマーをε−トリフルオロアセチルで保護したリシンと反応させる工程、及び
蛍光標識され及びリシン基が結合されたアクリル酸誘導体の糖複合ポリマー又はコポリマーをエポキシ化基質に共有結合性付着する工程
を含む、グリカンアレイを作製する方法。
【請求項２】
ω−アミノアルキルグリカンが、グリカンのω−アミノアルキルＯ−又はＮ−誘導体である、請求項１の方法。
【請求項３】
ω−アミノアルキルグリカンが、グリカンのω−アミノ−Ｃ１−６−アルキルＯ−又はＮ−誘導体である、請求項２の方法。
【請求項４】
グリカンのω−アミノ−Ｃ１−６−アルキルＯ−又はＮ−誘導体が、Ｇｌｙｃ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、Ｇｌｙｃ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２及びＧｌｙｃ−ＮＨＣＯＣＨ２ＮＨ２からなる群から選択される、請求項３の方法。
【請求項５】
グリカンが
【化１−１】
0005796086.tif 000024
【化１−２】
0005796086.tif 000025
【化１−３】
0005796086.tif 000026
【化１−４】
0005796086.tif 000027
【化１−５】
0005796086.tif 000028
からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項の方法。
【請求項６】
アクリル酸誘導体の活性化ポリマーが、ポリ（４−ニトロフェニルアクリレート）又はポリ（Ｎ−オキシスクシンイミジルアクリレート）である、請求項１の方法。
【請求項７】
蛍光標識がフルオレセインの蛍光団である、請求項１の方法。
【請求項８】
蛍光標識がフルオレセインカダベリンである、請求項１の方法。
【請求項９】
アクリル酸誘導体の糖複合ポリマー又はコポリマーが、１モル％以下の蛍光団を含む、請求項１の方法。
【請求項１０】
アクリル酸誘導体の糖複合ポリマー又はコポリマーが、０．１〜４０モル％の範囲のグリカンを含む、請求項１〜９のいずれか一項の方法。
【請求項１１】
共有結合性付着が複数の結合によるものである、請求項１の方法。
【請求項１２】
基質が、ガラス又はプラスチックからできている、請求項１の方法。
【請求項１３】
基質が、ガラス又はプラスチックスライドである、請求項１２の方法。
【請求項１４】
式
【化２】
0005796086.tif 000029
（上記式中、
Ｒ２はリシンであり、Ｒ１はＮＨ２、ＯＨ又はＨＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨである）
のアクリル酸誘導体の蛍光標識されたコポリマーを介してエポキシ化基質に共有結合性付着したω−アミノアルキルグリカンを含む、グリカンアレイ。
【請求項１５】
蛍光標識の蛍光団が、フルオレセインの蛍光団である、請求項１４のグリカンアレイ。
【請求項１６】
蛍光標識が、フルオレセインカダベリンである、請求項１４のグリカンアレイ。
【請求項１７】
アクリル酸誘導体の糖複合ポリマー又はコポリマーが、１モル％以下の蛍光団を含む、請求項１４のグリカンアレイ。
【請求項１８】
アクリル酸誘導体の糖複合ポリマー又はコポリマーが、０．１〜４０モル％の範囲のグリカンを含む、請求項１４のグリカンアレイ。
【請求項１９】
共有結合性付着が複数の結合によるものである、請求項１４のグリカンアレイ。
【請求項２０】
基質が、ガラス又はプラスチックからできている、請求項１４のグリカンアレイ。
【請求項２１】
基質が、ガラス又はプラスチックスライドである、請求項２０のグリカンアレイ。
【請求項２２】
グリカンアレイの作製での使用のための、アクリル酸誘導体の蛍光標識されたω−アミノアルキルグリカン複合ポリマーであって、該ポリマーが、式
【化３】
0005796086.tif 000030
（上記式中、
Ｒ３はリシンである）
のものである、該ポリマー。
【請求項２３】
蛍光標識の蛍光団が、フルオレセインの蛍光団である、請求項２２の、グリカンアレイの作製に使用するための、アクリル酸誘導体の蛍光標識されたω−アミノアルキルグリカン複合ポリマー。
【請求項２４】
蛍光標識がフルオレセインカダベリンである、請求項２２の、グリカンアレイの作製に使用するための、アクリル酸誘導体の蛍光標識されたω−アミノアルキルグリカン複合ポリマー。
【請求項２５】
アクリル酸誘導体の糖複合ポリマーが１モル％以下の蛍光団を含む、請求項２３の、グリカンアレイの作製に使用するための、アクリル酸誘導体の蛍光標識されたω−アミノアルキルグリカン複合ポリマー。
【請求項２６】
アクリル酸誘導体の糖複合ポリマーが０．１〜４０モル％の範囲のグリカンを含む、請求項２２の、グリカンアレイの作製に使用するための、アクリル酸誘導体の蛍光標識されたω−アミノアルキルグリカン複合ポリマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、グリカンアレイ及びその作製方法に関する。詳細には、本発明は、定量化されたレベルのグリカン発現を有するグリカンアレイ及びその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
癌などの様々な病変に特有なグリカンターゲットに対するリガンド結合の定量的評価は、正確な診断の本質的な側面である。リガンド結合の信頼性のない定量的評価は、誤診とその結果としての患者の健康に対する悪影響を生じることがある。グリカンアレイは、グリカンに対するリガンド結合を評価する目的で開発されたものである。グリカンアレイは、基質上に典型的にはドットの形態で堆積したグリカンのアレイからなっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
グリカンアレイの通常の作製には、堆積される推定的グリカンターゲットの範囲が必要である  ［Ｂｌｉｘｔ  ａｎｄ  Ｈｅａｄ  （２００５）  高効率グリカンマイクロアレー（Ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｌｙｃａｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）  公開番号ＷＯ  ２００５／０８８３１０号；  Ｂｌｉｘｔ  ｅｔ  ａｌ  （２００４）  様々なグリカン結合タンパク質のリガンドプロファイリングのための共有結合性グリカンアレイプリント（Ｐｒｉｎｔｅｄ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｇｌｙｃａｎ  ａｒｒａｙ  ｆｏｒ  ｌｉｇａｎｄ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｇｌｙｃａｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．  Ａｃａ．  Ｓｃ．  ＵＳ  １０１，  １７０３３−１７０３８］。
【０００４】
異なるグリカンは、異なる効率及び収率で堆積されることがあり、従って定量した後にグリカンアレイを診断に確実に及び日常的に用いることができるようにする必要がある。自動化した高効率スクリーニングのためには、グリカンアレイの作製は、ドット位置（予め決められた位置）及び形態に関しても一致していなければならない。これらのパラメーターが変動すると、自動化系によってリガンド結合を評価することが不可能になる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記の問題は、グリカン結合リガンドの範囲の定量的評価が必要な病変の診断の情況に特に関係している。これらの問題は、リガンドターゲットとの多価相互作用に関与するグリカン結合リガンドによって更に悪化する。本発明の目的は、グリカンアレイを作製する改良方法又は少なくとも有用な選択を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の説明
第一の態様では、本発明は、
１．  ω−アミノアルキルグリカンをアクリル酸誘導体の活性化ポリマーと定量的に反応させて、アクリル酸誘導体の糖複合ポリマー又はコポリマーを提供する工程、及び
２．  アクリル酸誘導体の糖複合ポリマー又はコポリマーを官能化基質に共有結合性付着（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ａｔｔａｃｈｉｎｇ）する工程
を含む、グリカンアレイを作製する方法を提供する。
【０００７】
好ましくは、ω−アミノアルキルグリカンは、グリカンのω−アミノアルキルＯ−又はＮ−誘導体からなる群から選択される。更に好ましくは、ω−アミノアルキルグリカンは、グリカンのω−アミノ−Ｃ１−６−アルキルＯ−又はＮ−誘導体からなる群から選択される。最も好ましくは、グリカンのω−アミノ−Ｃ１−６−アルキルＯ−又はＮ−誘導体は、Ｇｌｙｃ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、Ｇｌｙｃ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２及びＧｌｙｃ−ＮＨＣＯＣＨ２ＮＨ２からなる群から選択される。
【０００８】
好ましくは、グリカン（Ｇｌｙｃ）は、
【化１−１】
0005796086.tif 000002
【化１−２】
0005796086.tif 000003
【化１−３】
0005796086.tif 000004
【化１−４】
0005796086.tif 000005
【化１−５】
0005796086.tif 000006
からなる群から選択される。
【０００９】
好ましくは、アクリル酸誘導体の活性化ポリマーは、ポリ（４−ニトロフェニルアクリレート）及びポリ（Ｎ−オキシスクシンイミジルアクリレート）からなる群から選択される。
【００１０】
好ましくは、アクリル酸誘導体の糖複合ポリマー又はコポリマーは、蛍光標識されている。更に好ましくは、蛍光標識の蛍光団は、フルオレセインの蛍光団から選択される。最も好ましくは、蛍光標識は、フルオレセインカダベリン（ｆｌｕｏ）からなる群から選択される。
【００１１】
好ましくは、アクリル酸誘導体の糖複合ポリマー又はコポリマーは、１モル％以下の蛍光団を含む。
【００１２】
好ましくは、アクリル酸誘導体の糖複合ポリマー又はコポリマーは、０．１〜２０モル％の範囲のグリカンを含む。
【００１３】
好ましくは、共有結合性付着は、複数の結合によるものである。
【００１４】
好ましくは、官能化基質は、アミノ化及びエポキシ化基質からなる群から選択される。
【００１５】
好ましくは、基質は、ガラス及びプラスチックからなる群から選択される。更に好ましくは、基質は、ガラス及びプラスチックスライドからなる群から選択される。
【００１６】
第二の態様では、本発明は、アクリル酸誘導体のポリマー又はコポリマーを介して官能化基質に共有結合性付着したω−アミノアルキルグリカンを含むグリカンアレイを提供する。
【００１７】
好ましくは、グリカンアレイは、式
【化２】
0005796086.tif 000007
（上記式中、
ｘは１〜ｎの整数であり、Ｒｘは、アルキルグリカン、及びリシン、アミノ化ＰＥＧ又は基質からなる群から選択される少なくとも１つから選択され、Ｒ１はＮＨ２、ＯＨ又はＨＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨである）
のアクリル酸誘導体のコポリマーを介して官能化基質に共有結合性付着したω−アミノアルキルグリカンを含む。
【００１８】
好ましくは、アクリル酸誘導体の糖複合ポリマーは、蛍光標識されている。更に好ましくは、蛍光標識の蛍光団は、フルオレセインの蛍光団からなる群から選択される。最も好ましくは、蛍光標識は、フルオレセインカダベリン（ｆｌｕｏ）からなる群から選択される。
【００１９】
好ましくは、アクリル酸誘導体の糖複合ポリマーは、１モル％以下の蛍光団を含む。
【００２０】
好ましくは、アクリル酸誘導体の糖複合ポリマーは、０．１〜２０モル％の範囲のグリカンを含む。
【００２１】
好ましくは、共有結合性付着は、複数の結合によるものである。
【００２２】
好ましくは、官能化基質は、アミノ化及びエポキシ化基質からなる群から選択される。
【００２３】
好ましくは、基質は、ガラス及びプラスチックからなる群から選択される。更に好ましくは、基質は、ガラス及びプラスチックスライドからなる群から選択される。
【００２４】
第二の態様の第一の実施形態では、本発明は、式
【化３】
0005796086.tif 000008
（上記式中、
ｘは１〜ｎの整数であり、Ｒｘは、アルキルグリカン、フルオレセインカダベリン（ｆｌｕｏ）又は基質のいずれかであり、Ｒ１は、ＮＨ２、ＯＨ又はＨＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨである）
のアクリル酸誘導体の蛍光標識されたコポリマーを介してアミノ化基質に共有結合性付着したω−アミノアルキルグリカンを含むグリカンアレイを提供する。
【００２５】
第二の態様の第二の実施形態では、本発明は、式
【化４】
0005796086.tif 000009
（上記式中、
ｘは１〜ｎの整数であり、Ｒｘは、アルキルグリカン、フルオレセインカダベリン（ｆｌｕｏ）又はアミノ化ＰＥＧであり、官能化基質は、エポキシ化基質であり、Ｒ１は、ＮＨ２、ＯＨ又はＨＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨである）
のアクリル酸誘導体の蛍光標識されたコポリマーを介して官能化基質に共有結合性付着したω−アミノアルキルグリカンを含むグリカンアレイを提供する。
【００２６】
第二の態様の第三の実施形態では、本発明は、式
【化５】
0005796086.tif 000010
（上記式中、
ｘは１〜ｎの整数であり、Ｒｘは、アルキルグリカン、フルオレセインカダベリン（ｆｌｕｏ）又はリシンのいずれかであり、官能化基質はエポキシ化基質であり、Ｒ１は、ＮＨ２、ＯＨ又はＨＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨである）
のアクリル酸誘導体の蛍光標識されたコポリマーを介して官能化基質に共有結合性付着したω−アミノアルキルグリカンを含むグリカンアレイを提供する。
【００２７】
第三の態様では、本発明は、グリカンアレイの作製に使用するために包装され及び確認された（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ）、アクリル酸誘導体の蛍光標識されたω−アミノアルキルグリカン複合ポリマーであって、該ポリマーが、式
【化６】
0005796086.tif 000011
（上記式中、
ｘは１〜ｎの整数であり、Ｒｙは、ω−アミノアルキルグリカン、及び４−ニトロフェニル、Ｎ−オキシスクシンイミジル、リシン及びアミノ化ＰＥＧからなる群からの少なくとも一つから選択される）
のものであることを特徴とする、該ポリマーを提供する。
【００２８】
好ましくは、蛍光標識の蛍光団は、フルオレセインの蛍光団からなる群から選択される。最も好ましくは、蛍光標識は、フルオレセインカダベリン（ｆｌｕｏ）からなる群から選択される。
【００２９】
好ましくは、アクリル酸誘導体の糖複合ポリマーは、１モル％以下の蛍光団を含む。
【００３０】
好ましくは、アクリル酸誘導体の糖複合ポリマーは、０．１〜２０モル％の範囲のグリカンを含む。
【００３１】
本明細書の説明及び特許請求の範囲において、下記の頭辞語、用語及び熟語には、下記の意味が提供されている。すなわち、「ＢＳＡ」は、ウシ血清アルブミンを意味し、「ＣＨＡＰＳ」は、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネートを意味し、「共有結合性（Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ）」は、化学結合が形成され、２個以上の原子がその核と１個以上の電子対との相互作用によって互いに保持され、且つ具体的にはビオチンとアビジン又はストレプトアビジンとの間に形成された結合は除外することを意味し、「ＤＭＦ」は、ジメチルホルムアミドを意味し、「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドを意味し、「Ｅｔ３Ｎ」はトリエチルアミンを意味し、「蛍光団」は、特定波長のエネルギーを吸収して異なる波長でエネルギーを再放射する化学残基を意味し、「蛍光標識した」は、蛍光団誘導体が共有結合性付着していることを意味し、及び「蛍光標識する」とは、対応する意味を有し、「ガラス基質」とは、ガラススライド又はガラス表面を有する他の同様な基質を意味し、「グリカンアレイ」とは、グリカンが複数の別個且つ所定の位置に堆積する基質を意味し、「ｍ．ｗ．」とは、分子量を意味し、「ｐＮＰＡ３０」とは、３０ｋＤａのポリ（４−ニトロフェニルアクリレート）を意味し、「ｐＮＳＡ２０００」とは、２０００ｋＤａのポリ（Ｎ−オキシスクシンイミジルアクリレート）を意味し、「ＰＡＡ」とは、ポリ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルアクリルアミド）を意味し、「Ａｔｒｉ」とは、ＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌを意味し、「Ｂｔｒｉ」とは、Ｇａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌを意味し、「ｆｌｕｏ」とは、フルオレセインカダベリン残基を意味し、「Ｇｌｙｃ」及び「グリカン」とは、モノ−、ジ−、トリ−又はオリゴ−糖残基を意味し、「ＯＳ」とは、オリゴ糖を意味し、「ＰＥＧ」とは、ポリエチレングリコールを意味し、「アクリル酸誘導体のポリマー」とは、式
【化７】
0005796086.tif 000012
（上記式中、
ＲはＨ以外であり、ｎはメディアンポリマー数（ｍｅｒ）である）
のポリマーを意味し、「コポリマー」とは、式
【化８】
0005796086.tif 000013
（上記式中、
Ｒは２種類以上の異なる置換基である）
のポリマーを意味する。
【００３２】
「定量的反応」とは、理論的最大量の百分率としての生成物の収率が、生成物が誘導される（複数の）試薬の濃度の範囲にわたって実質的に同一である反応を意味し（「定量的に反応する」とは、対応する意味を有し）、「ω−アミノアルキルグリカン」とは、Ｇｌｙｃ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、Ｇｌｙｃ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２及びＧｌｙｃ−ＮＨＣＯＣＨ２ＮＨ２などの第一級アミノ基を有するグリカンのアミノアルキル誘導体を意味する。
【００３３】
発明の説明及び特許請求の範囲において定義された主題の元素、特徴又は整数に関して用いられる又は本発明の代替実施形態に関して用いられる「第一」、「第二」「第三」などの用語は、優先の順序を意味しようとするものではない。本発明を、次に実施形態又は実施例及び添付の図面ページの図に関して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】蛍光標識してω−アミノアルキルグリカン誘導体形成した活性化ポリアクリル酸の固定化に続く洗浄前（明シェーディング）及び後（暗シェーディング）の蛍光シグナル比の比較。
【図２】複数の別個且つ所定の位置における蛍光標識してω−アミノアルキルグリカン誘導体形成した活性化ポリアクリル酸の固定化に続くグリカンアレイのマイクロフルオログラフ（８スポット）。グリカンアレイは、最終洗浄後にスキャンした（倍率：ｘ５０（Ａ）及びｘ１５０（Ｂ））。
【図３】健康なドナー血清（血液群０）の抗体の、固定したＡｔｒｉ−ＰＡＡ３０−ｆｌｕｏ、Ｂｔｒｉ−ＰＡＡ３０−ｆｌｕｏ、Ａｔｒｉ−ＰＡＡ２０００−ｆｌｕｏ及びＢｔｒｉ−ＰＡＡ２０００−ｆｌｕｏとの結合。グリカンアレイの現像は、蛍光標識した二次抗体を用いて行った。バックグラウンド（炭水化物リガンドを持たないポリアクリルアミドを含むドット由来のシグナル）を差し引いた。
【図４】（ｉ）アビジン化ガラススライド上に固定したポリアクリレートの蛍光標識しビオチン化したω−アミノアルキルグリカン（Ａｔｒｉ）誘導体及び（ｉｉ）アミノ化ガラススライド上に固定したポリアクリルアミドの蛍光標識したω−アミノアルキルグリカン（Ａｔｒｉ）誘導体由来のシグナルの比較。グリカンアレイの現像は、蛍光標識した二次抗体を用いて行った。バックグラウンド（炭水化物リガンドを持たないポリアクリルアミドを含むドット由来のシグナル）を差し引いた。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
詳細な説明
本発明は、二段階法による蛍光標識されたグリコポリマーの官能化基質への共有結合性付着にある。この方法により、グリカンのポリマーへの定量的付着に続いてグリコポリマーの基質への定量的付着が可能になる。本発明の方法により、グリコポリマーの機能性（グリカン及び蛍光団）に有害でない条件下で制御される基質へのグリカンの付着が可能になる。アミド化又はエポキシ化基質を使用することによって、均一なバックグラウンドを有し、アビジン化基質の望ましくない不整合や反応性のないグリカンアレイが提供される。この方法は、所定の位置へのグリカンの付着を既知の付着方法を用いて得られるよりも大きく制御する。既知の方法の問題点の幾つかは、Ｂｏｖｉｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｎａｒｅｖ（２００８）［生物分析装置及び方法（Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ）  公表番号：  ＵＳ  ２００８／００７６６１３７］によって示唆されたように、蛍光標識のグリコポリマーへの組込みとアッセイ結果の規格化によって克服することができるが、共有結合による基質上への標的グリカンの定量的堆積が好ましい。
【実施例】
【００３６】
材料及び方法
ＢＳＡ、Ｔｗｅｅｎ商標２０、ＤＭＳＯ、Ｅｔ３Ｎ、ＡｃＯＨ及びエタノールアミンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国）製であった。スペーサー結合したオリゴ糖は、Ｌｅｃｔｉｎｉｔｙ（モスクワ、ロシア）製であった。フルオレセイン−カダベリンは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（米国）製であった。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ商標６４７ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）及びＩｇＭ（μ鎖）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ商標（米国）製であった。アミノ化ＵｌｔｒａＧＡＰＳ商標ガラススライドは、Ｃｏｒｎｉｎｇ（米国）製であった。  バンテージエポキシ活性化したスライドは、ＣＥＬ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（米国）製であった。ｐＮＰＡ３０［Ｂｏｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎ−置換ポリアクリルアミドを基剤とするポリマー性ネオ糖複合体の合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎｅｏｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｎ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｓ）  Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  １０，  １４２−１５１］及びｐＮＳＡ２０００［Ａｄａｌｓｔｅｉｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）共有結合により固定化されたタンパク質と強磁性流体を含むポリアクリルアミドゲルの調製及び磁気濾過（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ａ  ｆｅｒｒｏｆｌｕｉｄ）  Ｊ  Ｍｏｌｅｃ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ６，  １９９−２２５］は、これらの著者によって記載された方法で合成した。健康なドナーからの血清試料は、Ｓｋｌｉｆｏｓｏｖｓｋｙ  Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（モスクワ，ロシア連邦）から入手した。静脈内ＩｇＧは、ＬＦＢ（フランス）製であった。植物レクチンは、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ（米国）製であった。アミノ化ＰＥＧ（２ｋＤａ）は、ＩＲＩＳ  Ｂｉｏｔｈｅｃｈ（ドイツ）製であった。
【００３７】
フルオレセイン含有糖複合体の合成
【００３８】
例１−  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化ポリアクリル酸誘導体
ｐＮＳＡ２０００５．１ｍｇ（３０ｍｇ当量）をＤＭＳＯ５００μｌに溶解したものを、フルオレセイン−カダベリン０．３μモルをＤＭＳＯ４４μｌに溶解したものに加えた後、トリエチルアミン６μｌを加え、３７℃にて一晩インキュベーションした。この混合物を、次に♯１、♯２及び♯３と確認される３等分量に分割した。分割量♯１（ネガティブコントロール）には、何も加えなかった。Ｂｔｒｉ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２１．１ｍｇ（２μモル）を追加のトリエチルアミン５μｌを含むＤＭＳＯ５００μｌに溶解したものを、分割量♯２に加えた。Ａｔｒｉ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２１．２ｍｇ（２μモル）を追加のトリエチルアミン５μｌを含むＤＭＳＯ５００μｌに溶解したものを、分割量♯３に加えた。混合物を３７℃にて２４時間インキュベーションした。総ての反応混合物を、−２０℃に保持した。
【００３９】
例２−  ｐ−ニトロフェニル活性化ポリアクリル酸の誘導体
ｐＮＰＡ３０５．７ｍｇ（２０ｍｇ当量）をＤＭＳＯ５００μｌに溶解したものを、フルオレセイン−カダベリン０．２μモルをＤＭＳＯ４４μｌに溶解したものに加えた後、トリエチルアミン６μｌを加え、３７℃にて一晩インキュベーションした。この混合物を、次に♯１、♯２及び♯３と確認される３等分量に分割した。分割量♯１（ネガティブコントロール）には、何も加えなかった。Ｂｔｒｉ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２１．１ｍｇ（２μモル）を追加のトリエチルアミン５μｌを含むＤＭＳＯ５００μｌに溶解したものを、分割量♯２に加えた。Ａｔｒｉ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２１．２ｍｇ（２μモル）を追加のトリエチルアミン５μｌを含むＤＭＳＯ５００μｌに溶解したものを、分割量♯３に加えた。混合物を３７℃にて２４時間インキュベーションした。総ての反応混合物を、−２０℃に保持した。
【００４０】
例３−  ＰＥＧ化したＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化ポリアクリル酸の誘導体
ｐＮＳＡ２０００５．１ｍｇ（３０ｍｇ当量）をＤＭＳＯ５００μｌに溶解したものを、フルオレセイン−カダベリン０．２μモル及びアミノ化ＰＥＧ０．０２〜０．２０を総容積が４４μｌのＤＭＳＯに溶解したものに加えた後、トリエチルアミン６μｌを加え、３７℃で一晩インキュベーションした。この混合物を、次に♯１、♯２及び♯３と確認される３等分量に分割した。分割量♯１（ネガティブコントロール）には、何も加えなかった。分割量♯２には、Ｂｔｒｉ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２１．１ｍｇ（２μモル）を追加のトリエチルアミン５μｌを含むＤＭＳＯ５００μｌに溶解したものを加えた。、分割量♯３には、Ａｔｒｉ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２１．２ｍｇ（２μモル）を追加のトリエチルアミン５μｌを含むＤＭＳＯ５００μｌに溶解したものを加えた。混合物を３７℃にて２４時間インキュベーションした。総ての反応混合物を、−２０℃に保持した。
【００４１】
例４−  ＰＥＧ化したｐ−ニトロフェニル活性化ポリアクリル酸の誘導体
ｐＮＰＡ３０５．７ｍｇ（３０ｍｇ当量）をＤＭＳＯ５００μｌに溶解したものを、フルオレセイン−カダベリン０．３μモル及びアミノ化ＰＥＧ０．０３〜０．３０を総容積が４４μｌのＤＭＳＯに溶解したものに加えた後、トリエチルアミン６μｌを加え、３７℃で一晩インキュベーションした。この混合物を、次に♯１、♯２及び♯３と確認される３等分量に分割した。分割量♯１（ネガティブコントロール）には、何も加えなかった。Ｂｔｒｉ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２１．１ｍｇ（２μモル）を追加のトリエチルアミン５μｌを含むＤＭＳＯ５００μｌに溶解したものを、分割量♯２に加えた。Ａｔｒｉ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２１．２ｍｇ（２μモル）を追加のトリエチルアミン５μｌを含むＤＭＳＯ５００μｌに溶解したものを、分割量♯３に加えた。混合物を３７℃にて２４時間インキュベーションした。総ての反応混合物を、−２０℃に保持した。
【００４２】
例５−  アミノ化ｐ−ニトロフェニル活性化ポリアクリル酸の誘導体
ｐＮＰＡ３０７．８ｍｇ（４１．１ｍｇ当量）をＤＭＳＯ４００μｌに溶解したものを、ε−トリフルオロアセチルで保護したリシン０．４２〜１．２μモルをＤＭＳＯ１００μｌに溶解したものに加えた。この混合物を、次に♯１、♯２及び♯３と確認される３等分量に分割した。分割量♯１（ネガティブコントロール）には、何も加えなかった。Ｂｔｒｉ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２１．５ｍｇ（２．７μモル）をＤＭＳＯ１００μｌに溶解したものを、分割量♯２に加えた。Ａｔｒｉ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２１．６ｍｇ（２．７μモル）をＤＭＳＯ１００μｌに溶解したものを、分割量♯３に加えた。混合物を、４０℃にて２４時間インキュベーションした。次いで、２７μｌの容積のエタノールアミンをそれぞれの分割量に加え、反応を３７℃にて２４時間行った。３００μｌの容積の再蒸留水を加えた後、混合物を室温に一晩保持した。反応の副生成物を、ＰＢＳに続いて水に対して透析し、複合体を凍結乾燥した。
【００４３】
例６−  アミノ化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化ポリアクリル酸の誘導体
ｐＮＳＡ２０００６．９ｍｇ（４１．１ｍｇ当量）をＤＭＳＯ４００μｌに溶解したものを、ε−トリフルオロアセチルで保護したリシン０．４２〜１．２μモルをＤＭＳＯ１００μｌに溶解したものに加えた。この混合物を、次に♯１、♯２及び♯３と確認される３等分量に分割した。分割量♯１（ネガティブコントロール）には、何も加えなかった。Ｂｔｒｉ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２１．５ｍｇ（２．７μモル）をＤＭＳＯ１００μｌに溶解したものを、分割量♯２に加えた。Ａｔｒｉ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２１．６ｍｇ（２．７μモル）をＤＭＳＯ１００μｌに溶解したものを、分割量♯３に加えた。混合物を、４０℃にて２４時間インキュベーションした。次いで、２７μｌの容積のエタノールアミンをそれぞれの分割量に加え、反応を３７℃にて２４時間行った。３００μｌの容積の再蒸留水を加えた後、混合物を室温に一晩保持した。反応の副生成物を、ＰＢＳに続いて水に対して透析し、複合体を凍結乾燥した。
【００４４】
グリカンアレイの作製
【００４５】
例７−  ２個のグリカン及びネガティブコントロールからなるグリカンアレイ
４種類の活性化したポリアクリル酸糖複合体（ｐＮＳＡ２０００のフルオレセイン誘導体を含むＡｔｒｉ及びＢｔｒｉ（実施例１）、ｐＮＰＡ３０のフルオレセイン誘導体を含むＡｔｒｉ及びＢｔｒｉ（実施例２）、ＰＥＧ化したｐＮＳＡ２０００を含むＡｔｒｉ及びＢｔｒｉ（実施例３）及びＰＥＧ化したｐＮＰＡ３０を含むＡｔｒｉ及びＢｔｒｉ（実施例４））、及び２種類の対応する炭水化物不含活性化ポリマーを、１％（ｖ／ｖ）Ｅｔ３Ｎを含むＤＭＳＯで１０及び５０μΜグリカン濃度まで希釈した。６種類のポリマー総てを、３２ピンの手動操作アレイヤー（Ｖ＆Ｐ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（米国））を用いて又は接触ロボット装置（ＡｒｒａｙＩｔ）によってアミノ化ガラススライドに室温で６個の複製を印刷した。印刷したスライドを、１％（ｖ／ｖ）Ｅｔ３Ｎを含むＤＭＳＯ雰囲気中で３７℃にて１時間インキュベーションした。インキュベーションしたスライドを、蛍光の存在について５μｍのスキャン解像度（レーザー出力：９０％、ＰＭＴゲイン：７０％）を有するマイクロアレイスキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（米国））を用いてスキャンニングした。蛍光画像は、ＴＩＦＦファイルの形態でセーブし、後続段階のコントロールとして用いた。ポリマーの活性基を、５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）中５０ｍＭエタノールアミンを用いて室温にて１時間消光した。次いで、糖チップを水で洗浄し、遠心分離により乾燥した。スライドを再度スキャンニングし、ソフトウェア解析（ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ３．０）、固定化度評価及び品質管理の目的でＴＩＦＦファイルとしてセーブした。
【００４６】
例８−  アミノ化ポリアクリルアミド複合体を含むグリカンアレイ
アミノ化ポリアクリル酸糖複合体（実施例５及び実施例６）及び２種類の対応する炭水化物不含活性化ポリマーを、０．００５％ＣＨＡＰＳ又は０．００１％ＴｗｅｅｎＴＭ  ２０を含む１５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）で１０及び５０μＭグリカン濃度まで希釈した。総てのポリマーを、３２ピンの手動操作アレイヤー（Ｖ＆Ｐ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（米国））を用いて又は接触ロボット装置（ＡｒｒａｙＩｔ）によってエポキシ活性化ガラススライドに５０％湿度で６個の複製を印刷した。印刷したスライドを、加湿チャンバー（７５％湿度）中で室温にて１時間インキュベーションした。スライドを、蛍光の存在について５μｍのスキャン解像度（レーザー出力：９０％、ＰＭＴゲイン：７０％）を有するマイクロアレイスキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（米国））を用いてスキャンニングした。蛍光画像は、ＴＩＦＦファイルの形態でセーブし、後続段階のコントロールとして用いた。スライド上の活性基を、５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）中５０ｍＭエタノールアミンを用いて室温にて１時間消光した。次いで、糖チップを水で洗浄し、遠心分離により乾燥した。スライドを再度スキャンニングし、ソフトウェア解析（ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ３．０）、固定化度評価及び品質管理の目的でＴＩＦＦファイルとしてセーブした。
【００４７】
グリカン結合タンパク質による糖チップ染色
【００４８】
例９−  レクチン又は抗体
糖チップを、０．１％Ｔｗｅｅｎ商標２０を含むＰＢＳ中で１５分間加湿した直後に、希釈した試料をボルテックスした。０．１％Ｔｗｅｅｎ商標２０（及び抗体の場合にはＢＳＡ３％）を含むＰＢＳにレクチン又は抗体１〜１００μｇ／ｍｌを溶解したものの適当な容積の試料をスライドに塗布し、加湿チャンバー（７５％湿度）中で室温又は３７℃にて１時間緩やかに振盪しながらインキュベーションした。０．１％Ｔｗｅｅｎ商標２０を含むＰＢＳでスライドを洗浄した後、０．００１％Ｔｗｅｅｎ商標２０を含むＰＢＳで洗浄した。洗浄したスライドを、ビオチン化レクチン及び抗体の場合には適当な蛍光団ストレプトアビジン、あるいは蛍光団を標識した二次抗体を０．１％Ｔｗｅｅｎ商標２０（典型的な希釈度１：１０００）を含むＰＢＳ中で加え、７５％湿度で室温にて１時間緩やかに振盪しながらインキュベーションすることによって標識した。０．１％Ｔｗｅｅｎ商標２０を含むＰＢＳ、次いで０．００１％Ｔｗｅｅｎ商標２０を含むＰＢＳ溶液で２回の後に水で洗浄した後、蛍光強度を５μｍのスキャン解像度（レーザー出力：９０％、ＰＭＴゲイン：７０％）を有するマイクロアレイスキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（米国））を用いて測定した。蛍光画像は、ＴＩＦＦファイルの形態でセーブし、ソフトウェア（ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ３．０）を用いて分析した。
【００４９】
例１０−  血清インキュベーション
糖チップを、０．１％ＴＷＥＥＮ商標２０を含むＰＢＳ中で１５分間加湿した後、直ちに希釈した試料をボルテックスした。血清（ヒト、マウスなど）の試料を３％ＢＳＡ、１％Ｔｗｅｅｎ商標２０及びボルテックスした溶液を含むＰＢＳで１：１００に希釈し、３７℃で１５分間予備インキュベーションした後、遠心分離した（３分間、１２５００ｒｐｍ）。適当な容積の血清試料をスライドに加え、３７℃にて緩やかに振盪しながら７５％湿度で１．５時間インキュベーションした。スライドを、０．１％Ｔｗｅｅｎ商標２０を含むＰＢＳで洗浄した後、０．００１％Ｔｗｅｅｎ商標２０を含むＰＢＳ溶液で２回洗浄した。典型的には３％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ商標２０を含むＰＢＳで１：２００に希釈した蛍光団を標識した二次抗体（抗ＩｇＧ、Ｍ、Ａ又はそれらのカクテル）を、次にチップに加え、７５％湿度で緩やかに振盪しながら３７℃で１時間インキュベーションした。０．１％Ｔｗｅｅｎ商標２０を含むＰＢＳ、次いで０．００１％Ｔｗｅｅｎ商標２０を含むＰＢＳ溶液で２回の後に水で洗浄し、遠心分離により乾燥した後、蛍光強度を５μｍのスキャン解像度（レーザー出力：９０％、ＰＭＴゲイン：７０％）を有するマイクロアレイスキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（米国））を用いて測定した。蛍光画像は、ＴＩＦＦファイルの形態でセーブし、ソフトウェア（ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ３．０）を用いて分析した。
【００５０】
グリカンアレイは、様々な品質及び出力でスキャンニングすることができる。ＰＭＴ、レーザー出力及び解像度を変化させることによって、この装置は、そのダイナミックレンジ内でできるだけ多くのシグナルを有する画像を生成することができる。
【００５１】
結果
活性化ｐＮＰＡ３０及びｐＮＳＡ２０００のアミノ化ポリスチレン上への非定量的固定化は、以前に明らかにされている［Ｓｈｉｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ  （２００５）固相アッセイのための高分子量ネオ糖複合体（Ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｎｅｏｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ａｓｓａｙｓ）  Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ  ２２，  ４３−５１］。この方法を用いるグリカンアレイは、アッセイに許容できないバックグラウンドシグナルを示すことも見出された。
【００５２】
本発明の方法は、ω−アミノアルキルグリカンとｐＮＰＡ３０及びｐＮＳＡ２０００のような活性化ポリアクリルアミドポリマーとの反応が温和な条件下でＤＭＳＯ及びＤＭＦＡ中で定量的に進行するという観察を活用している。重要なことには、２０％モルまでのポリマーの定量的改良は、マイクロスケール及び半調製用（１００〜１０００ｍｇスケール）のいずれでも起こる。次いで、活性基の残り（８０％モル）を用いて、グリコポリマーをアミノ化ガラス基質上に同様に温和な条件下で固定することができる。温和な条件では、既知のバイオコンジュゲーション（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）化学を用いて、蛍光団のような一連のレポーター基でポリマーを予め定量的に標識することができる。蛍光団は、バイオアレイに対するリガンド結合の蛍光発生的検出を補完するように選択される。蛍光標識した活性化グリコポリマーの固定化の程度は、印刷及び洗浄直後の蛍光強度の測定によってモニターした。洗浄前後の蛍光強度シグナルの比は、固定化の程度を表している。この比は、活性化グリコポリマーの固定化が約１００％（スキャンニング誤差範囲内）の収率で進行することを示していた。活性化グリコポリマーの定量的固定化は、２桁の大きさ（１００倍の差）の濃度範囲にわたって行うことができた。ある範囲の濃度で多価相互作用に関与することができるグリカンを固定化する能力は、グリカンアレイデザイン及び作製の重要な特徴である。本発明の方法の第一及び第二段階の定量的性質（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｎａｔｕｒｅ）は、大きく、分岐し及び負に帯電したグリカン並びにＡｔｒｉａｎｄＢｔｒｉのような小さな中性のグリカンのいずれについても明らかにされた。更に、Ｓｈｉｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ（２００５）［固相アッセイのための高分子量ネオ糖複合体（Ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｎｅｏｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ａｓｓａｙｓ）  Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ  ２２，  ４３−５１］のグリカンアレイの許容できないバックグラウンドシグナルは、本発明の方法によって回避され又は少なくとも許容できるレベルまで減少することが明らかにされた。図４に示した結果は、アミノ化ガラスを基質として選択するときに得られるシグナル検出の向上を示している。前記の利点に加えて、アミノ化又はエポキシ化スライドを選択すると、以前に報告されたようなグリカンアレイ作製の制限の幾つかも回避される［Ｂｏｖｉｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｎａｒｅｖ（２００８）生物分析装置及び方法（Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ）  公表番号：  ＵＳ  ２００８／００７６６１３７］。アミノ化又はエポキシ化基質は、アビジン化基質より廉価に及び堅実に製造することができ、基質のアミノ化度における小さな変動は、アビジン又はストレプトアビジン及びアビジン化表面の製造に用いた結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）の品質の変動よりグリコポリマーの固定化に対する影響が少ない。ビオチン−ストレプトアビジン相互作用対共有結合性付着によって固定化したグリコポリマーについて得られた蛍光シグナルの比較を示す（図４）。
【００５３】
本発明を実施形態又は実施例に関して説明してきたが、本発明の範囲から離反することなくこれらの実施形態又は実施例に対して変化及び変更を行うことができることを理解すべきである。既知の同等物が特定の特徴に対して存在する場合には、このような同等物は本明細書において具体的に言及されたものとして組込まれる。
さらに、他の記載と重複するかもしれないが、本願発明を以下に記す。
［発明１］
ω−アミノアルキルグリカンをアクリル酸誘導体の活性化ポリマーと定量的に反応させて、アクリル酸誘導体の糖複合ポリマー又はコポリマーを提供する工程、及び
アクリル酸誘導体の糖複合ポリマー又はコポリマーを官能化基質に共有結合性付着する工程
を含む、グリカンアレイを作製する方法。
［発明２］
ω−アミノアルキルグリカンが、グリカンのω−アミノアルキルＯ−又はＮ−誘導体からなる群から選択される、発明１の方法。
［発明３］
ω−アミノアルキルグリカンが、グリカンのω−アミノ−Ｃ１−６−アルキルＯ−又はＮ−誘導体からなる群から選択される、発明２の方法。
［発明４］
グリカンのω−アミノ−Ｃ１−６−アルキルＯ−又はＮ−誘導体が、Ｇｌｙｃ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、Ｇｌｙｃ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２及びＧｌｙｃ−ＮＨＣＯＣＨ２ＮＨ２からなる群から選択される、発明３の方法。
［発明５］
グリカン（Ｇｌｙｃ）が
【化９−１】
0005796086.tif 000014
【化９−２】
0005796086.tif 000015
【化９−３】
0005796086.tif 000016
【化９−４】
0005796086.tif 000017
【化９−５】
0005796086.tif 000018
からなる群から選択される、発明１〜４のいずれか一の方法。
［発明６］
アクリル酸誘導体の活性化ポリマーが、ポリ（４−ニトロフェニルアクリレート）及び  ポリ（Ｎ−オキシスクシンイミジルアクリレート）からなる群から選択される、発明１の方法。
［発明７］
アクリル酸誘導体の糖複合ポリマーが蛍光標識されている、発明１の方法。
［発明８］
蛍光標識の蛍光団がフルオレセインの蛍光団からなる群から選択される、発明７の方法。
［発明９］
蛍光標識がフルオレセインカダベリン（ｆｌｕｏ）からなる群から選択される、発明８の方法。
［発明１０］
アクリル酸誘導体の糖複合ポリマー又はコポリマーが、１モル％以下の蛍光団を含む、発明９の方法。
［発明１１］
アクリル酸誘導体の糖複合ポリマー又はコポリマーが、０．１〜４０モル％の範囲のグリカンを含む、発明１〜１０のいずれか一の方法。
［発明１２］
共有結合性付着が複数の結合によるものである、発明１の方法。
［発明１３］
官能化基質が、アミノ化及びエポキシ化基質からなる群から選択される、発明１の方法。
［発明１４］
基質が、ガラス及びプラスチックからなる群から選択される、発明１３の方法。
［発明１５］
基質が、ガラス及びプラスチックスライドからなる群から選択される、発明１４の方法。
［発明１６］
アクリル酸誘導体のポリマー又はコポリマーを介して官能化基質に共有結合性付着したω−アミノアルキルグリカンを含む、グリカンアレイ。
［発明１７］
グリカンアレイが、式
【化１０】
0005796086.tif 000019
（上記式中、
ｘは１〜ｎの整数であり、Ｒｘは、アルキルグリカン、及びリシン、アミノ化ＰＥＧ又は基質からなる群から選択される少なくとも１つから選択され、Ｒ１はＮＨ２、ＯＨ又はＨＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨである）
のアクリル酸誘導体のコポリマーを介して官能化基質に共有結合性付着したω−アミノアルキルグリカンを含む、発明１６のグリカンアレイ。
［発明１８］
アクリル酸誘導体の糖複合ポリマー又はコポリマーが、蛍光標識されている、発明１６のグリカンアレイ。
［発明１９］
蛍光標識の蛍光団が、フルオレセインの蛍光団からなる群から選択される、発明１８のグリカンアレイ。
［発明２０］
蛍光標識が、フルオレセインカダベリン（ｆｌｕｏ）からなる群から選択される、発明１９のグリカンアレイ。
［発明２１］
アクリル酸誘導体の糖複合ポリマー又はコポリマーが、１モル％以下の蛍光団を含む、発明１６のグリカンアレイ。
［発明２２］
アクリル酸誘導体の糖複合ポリマー又はコポリマーが、０．１〜４０モル％の範囲のグリカンを含む、発明１６のグリカンアレイ。
［発明２３］
共有結合性付着が複数の結合によるものである、発明１６のグリカンアレイ。
［発明２４］
官能化基質が、アミノ化及びエポキシ化基質からなる群から選択される、発明１６のグリカンアレイ。
［発明２５］
基質が、ガラス及びプラスチックからなる群から選択される、発明２４のグリカンアレイ。
［発明２６］
基質が、ガラス及びプラスチックスライドからなる群から選択される、発明２５のグリカンアレイ。
［発明２７］
式
【化１１】
0005796086.tif 000020
（上記式中、
ｘは１〜ｎの整数であり、Ｒｘは、アルキルグリカン、フルオレセインカダベリン（ｆｌｕｏ）又は基質のいずれかであり、Ｒ１はＮＨ２、ＯＨ又はＨＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨである）
のアクリル酸誘導体の蛍光標識されたコポリマーを介してアミノ化基質に共有結合性付着したω−アミノアルキルグリカンを含む、グリカンアレイ。
［発明２８］
式
【化１２】
0005796086.tif 000021
（上記式中、
ｘは１〜ｎの整数であり、Ｒｘは、アルキルグリカン、フルオレセインカダベリン（ｆｌｕｏ）又はアミノ化ＰＥＧのいずれかであり、Ｒ１はＮＨ２、ＯＨ又はＨＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨであり、官能化基質はエポキシ化基質である）
のアクリル酸誘導体の蛍光標識されたコポリマーを介して官能化基質に共有結合性付着したω−アミノアルキルグリカンを含む、グリカンアレイ。
［発明２９］
式
【化１３】
0005796086.tif 000022
（上記式中、
ｘは１〜ｎの整数であり、Ｒｘは、アルキルグリカン、フルオレセインカダベリン（ｆｌｕｏ）又はリシンのいずれかであり、Ｒ１はＮＨ２、ＯＨ又はＨＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨであり、官能化基質はエポキシ化基質である）
のアクリル酸誘導体の蛍光標識されたコポリマーを介して官能化基質に共有結合性付着したω−アミノアルキルグリカンを含む、グリカンアレイ。
［発明３０］
グリカンアレイの作製での使用のために包装され及び確認された（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ）、アクリル酸誘導体の蛍光標識されたω−アミノアルキルグリカン複合ポリマーであって、該ポリマーが、式
【化１４】
0005796086.tif 000023
（上記式中、
ｘは１〜ｎの整数であり、Ｒｙは、ω−アミノアルキルグリカン、及び４−ニトロフェニル、Ｎ−オキシスクシンイミジル、リシン及びアミノ化ＰＥＧからなる群からの少なくとも一つから選択される）
のものであることを特徴とする、該ポリマー。
［発明３１］
蛍光標識の蛍光団が、フルオレセインの蛍光団からなる群から選択される、発明３０の、グリカンアレイの作製に使用するために包装され及び確認されたアクリル酸誘導体の蛍光標識されたω−アミノアルキルグリカン複合ポリマー。
［発明３２］
蛍光標識がフルオレセインカダベリン（ｆｌｕｏ）からなる群から選択される、発明３１の、グリカンアレイの作製に使用するために包装され及び確認されたアクリル酸誘導体の蛍光標識されたω−アミノアルキルグリカン複合ポリマー。
［発明３３］
アクリル酸誘導体の糖複合ポリマーが１モル％以下の蛍光団を含む、発明３２の、グリカンアレイの作製に使用するために包装され及び確認されたアクリル酸誘導体の蛍光標識されたω−アミノアルキルグリカン複合ポリマー。
［発明３４］
アクリル酸誘導体の糖複合ポリマーが０．１〜４０モル％の範囲のグリカンを含む、発明３０の、グリカンアレイの作製に使用するために包装され及び確認されたアクリル酸誘導体の蛍光標識されたω−アミノアルキルグリカン複合ポリマー。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は、グリカンアレイを作製する方法を提供する。
【図１】
0005796086.tif 000031
【図２】
0005796086.tif 000032
【図３】
0005796086.tif 000033
【図４】
0005796086.tif 000034