(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳における５ＨＴＲ２Ｃ  ＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ  ｍＲＮＡ編集の病理的変化を評価するための方法であって、細胞を含有する末梢組織からなる生体サンプルの群から選択される単一の生体サンプルまたは２種類の異なる生体サンプルが用いられ、該方法が、
(i)患者が５ＨＴＲ２Ｃ ｍＲＮＡのＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ編集の機構の変更に関連する病状を呈するかどうか、または該病状を発症するリスクがあるかどうかをin vitroにおいて特定するため；
(ii)in vitroにおいて、患者により示される病状が５ＨＴＲ２Ｃ ｍＲＮＡのＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ編集の機構の変更に関連するかどうかを決定するため；
(iii)哺乳類においてin vivoで５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡのＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ編集を調節する薬剤をin vitroで特定するため；
(iv)５ＨＴＲ２Ｃ ｍＲＮＡのＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ編集の機構の変更に関連する病状の予防または治療のために用いられる薬剤の有効性をin vitroで決定するため；または
(v)患者が、５ＨＴＲ２Ｃ ｍＲＮＡのＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ編集の機構の変更をもたらす、またはそれにより誘発される病状の処置に応答するか応答しないかを決定するため
に用いられるものであり、
脳における５ＨＴＲ２Ｃ  ＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ  ｍＲＮＡ編集の病理学的変更の評価が、
−全血サンプル、白血球を含有する血液サンプルおよび皮膚サンプルからなる群から選択されるサンプルにおける、ＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性の増加
により決定される、方法。
【請求項２】
前記の細胞を含有する末梢組織が、白血球(blood white cells)を含有する血液サンプルおよび皮膚サンプルからなる群から選択される哺乳類生体組織であり、
脳における５ＨＴＲ２Ｃ  ＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ  ｍＲＮＡ編集の病理学的変更の評価が、
−白血球を含有する血液サンプルにおけるＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性、ならびに
−皮膚サンプルにおける、ある濃度の５ＨＴ２ｃＲ  ｍＲＮＡにおける５ＨＴ２ｃＲイソ型発現物分布の定量値
により決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、患者が５ＨＴＲ２Ｃ  ＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ  ｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連する病状を呈するかどうか、または該病状を発症するリスクがあるかどうかをin vitroにおいて特定するために用いられるものであり、
ａ）被験患者から得られた血液細胞を含有する生体サンプルにおける、ＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性を決定する工程；
ｂ）工程ａ）で得られた前記血液細胞サンプルにおけるＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性を、正常患者もしくはこのｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連する病状を示す患者から得られた特徴的な発現ＡＤＡＲプロフィールと比較することにより、患者がこのような病状を呈するかどうか、または病状を発症するリスクがあるかどうかを特定する工程
を含んでなり、
前記血液細胞サンプルにおけるＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性の増加が、前記患者をin vitroにおいて特定するためのマーカーである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ａ）被験患者から得られた血液細胞を含有する生体サンプルにおけるＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性を決定し、さらに、被験患者から得られた皮膚細胞を含有する生体サンプルにおける前記５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの少なくとも１つの編集形態または非編集形態の、ある濃度の５ＨＴ２ｃＲ  ｍＲＮＡにおける５ＨＴ２ｃＲイソ型発現物分布の定量値を決定する工程；
ｂ）前記血液細胞サンプルにおけるＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性、ならびに、前記皮膚細胞サンプルにおける前記５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡのこの編集形態または非編集形態の、ある濃度の５ＨＴ２ｃＲ  ｍＲＮＡにおける５ＨＴ２ｃＲイソ型発現物分布の定量値を、特徴的な発現ＡＤＡＲプロフィール、および５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの対照定量値と比較することにより、患者がこのような病状を呈するかどうか、または病状を発症するリスクがあるかどうかを特定する工程
を含んでなり、
ＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性の増加、および５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの前記定量値の有意な変更が、前記患者をin vitroにおいて特定するためのマーカーである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該病状が、精神病、統合失調症、鬱病、鬱性自殺または異常な摂食挙動からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
in vitroにおいて、患者により示される病状が５ＨＴＲ２ＣのＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ  ｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連するかどうかを決定するための請求項１に記載の方法であって、
ａ）該病状を示す患者から得られた血液細胞を含有する生体サンプルにおけるＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性を決定する工程；
ｂ）工程ａ）で得られた前記血液細胞サンプルにおけるＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性を、正常患者もしくはこのｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連しないことが知られている病状を示す患者から得られた特徴的な発現ＡＤＡＲプロフィールと比較することにより、患者がこのような病状を呈するかどうか、または病状を発症するリスクがあるかどうかを特定する工程
を含んでなり、
前記血液細胞サンプルにおけるＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性の増加が、in vitroにおいて、前記病状が５ＨＴＲ２ＣのＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ  ｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連するかどうかを決定するためのマーカーである、方法。
【請求項７】
ａ）前記病状を示す患者から得られた血液細胞を含有する生体サンプルにおけるＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性を決定し、さらに、前記病状を示す患者から得られた皮膚細胞を含有する生体サンプルにおける前記５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの少なくとも１つの編集形態または非編集形態の、ある濃度の５ＨＴ２ｃＲ  ｍＲＮＡにおける５ＨＴ２ｃＲイソ型発現物分布の定量値を決定する工程；
ｂ）前記血液細胞サンプルにおけるＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性、ならびに、前記皮膚細胞サンプルにおける前記５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡのこの編集形態または非編集形態の、ある濃度の５ＨＴ２ｃＲ  ｍＲＮＡにおける５ＨＴ２ｃＲイソ型発現物分布の定量値を、正常患者もしくはこのｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連しないことが知られている病状を示す患者から得られた特徴的な発現ＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２プロフィール、および５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの対照定量値と比較することにより、患者がこのような病状を呈するかどうか、または病状を発症するリスクがあるかどうかを特定する工程
を含んでなり、
ＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性の増加、および５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの前記定量値の有意な変更が、in vitroにおいて、前記病状が５ＨＴＲ２ＣのＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ  ｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連するかどうかを決定するためのマーカーである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
哺乳類においてin vivoで５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡのＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ編集を調節する薬剤をin vitroで特定するための、請求項１に記載の方法であって、
ａ）５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集の候補モジュレーターを投与された該哺乳類から得られた、血液細胞を含有する生体サンプル；
あるいは
ｂ）哺乳類血液細胞（この細胞は組換え細胞であり得る）を含有する生体サンプルを、前記５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集の候補モジュレーターと接触させることによって得られた生体サンプル
について、
該モジュレーターの、
−前記血液細胞におけるＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性に対する効果
を、
生体サンプルから得られたＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性を、特徴的な発現ＡＤＡＲプロフィールと比較することにより決定する工程
を含んでなり、
前記血液細胞サンプルにおけるＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性の増加が、前記薬剤をin vitroにおいて特定するためのマーカーである、方法。
【請求項９】
ａ）５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集の候補モジュレーターを投与された該哺乳類から得られた、血液細胞を含有する生体サンプルおよび皮膚細胞を含有する生体サンプル；
あるいは
ｂ）哺乳類血液細胞を含有する生体サンプルおよび哺乳類皮膚細胞を含有する生体サンプル（これらの細胞は組換え細胞であり得る）を、前記５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集の候補モジュレーターと接触させることによって得られた生体サンプル
について、
該モジュレーターの、
−前記血液細胞サンプルにおけるＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性に対する効果；および
−前記皮膚細胞サンプルにおける前記５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの少なくとも１つの編集形態または非編集形態の、ある濃度の５ＨＴ２ｃＲ  ｍＲＮＡにおける５ＨＴ２ｃＲイソ型発現物分布の定量値に対する効果
を、
血液細胞の前記生体サンプルにおけるＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性、ならびに皮膚細胞の前記生体サンプルにおける５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡのこの編集形態または非編集形態の、ある濃度の５ＨＴ２ｃＲ  ｍＲＮＡにおける５ＨＴ２ｃＲイソ型発現物分布の定量値を、それぞれ、該哺乳類の対照血液細胞サンプルにおけるＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性、ならびに対照皮膚細胞サンプルにおける５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの前記定量値と比較することにより決定する工程
を含んでなり、
ＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性の増加、および５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの前記定量値の有意な変更が、前記薬剤をin vitroにおいて特定するためのマーカーである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
患者における、５ＨＴＲ２ＣのＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ  ｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連する病状の予防または治療のために用いられる薬剤の有効性をin vitroで決定するための、請求項１に記載の方法であって、
ａ）被験患者から得られた血液細胞を含有する生体サンプルにおけるＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性を決定する工程；
ｂ）病状の予防または治療を意図した薬剤を投与された前記患者において、処置中または／および処置後に該患者から得られた血液細胞を含有する新たな生体サンプルについて、ＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性を決定する工程；および
ｃ）該薬剤の有効性を、工程ａ）の生体サンプルから得られたＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性を、工程ｂ）で得られたものと比較することにより決定する工程（正常患者で見られるものに近いまたは等しいＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性の調節が処置の有効性に重要である）
を含んでなる、方法。
【請求項１１】
ａ）被験患者から得られた血液細胞を含有する生体サンプルにおけるＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性を決定し、さらに、被験患者から得られた皮膚細胞を含有する生体サンプルにおける前記５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの少なくとも１つの編集形態または非編集形態の、ある濃度の５ＨＴ２ｃＲ  ｍＲＮＡにおける５ＨＴ２ｃＲイソ型発現物分布の定量値を決定する工程；
ｂ）病状の予防または治療を意図した薬剤を投与された前記患者において、処置中または／および処置後に該患者から得られた血液細胞を含有する新たな生体サンプルおよび皮膚細胞を含有する新たな生体サンプルについて、血液細胞の新たな生体サンプルにおけるＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性を決定し、さらに、皮膚細胞の新たな生体サンプルにおける前記５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの少なくとも１つの編集形態または非編集形態の、ある濃度の５ＨＴ２ｃＲ  ｍＲＮＡにおける５ＨＴ２ｃＲイソ型発現物分布の定量値を決定する工程；ならびに
ｃ）該薬剤の有効性を、工程ａ）の生体サンプルから得られたＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性ならびに５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの前記定量値を、工程ｂ）で得られたものと比較することにより決定する工程（正常患者で見られるものに近いまたは等しいＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性ならびに前記５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの前記定量値の調節が処置の有効性に重要である）
を含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
患者または哺乳類がヒト、マウスまたはラットである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
皮膚細胞がケラチノサイト、メラノサイト、繊維芽細胞、ランゲルハンス細胞およびメルケル細胞からなる群から選択され、皮膚組織が表皮および真皮からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ケラチノサイトがＨａＣａＴ細胞などのヒト不死化細胞に由来し、あるいはメラノサイトがヒト不死化細胞または黒色腫に由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ケラチノサイトが新生児の皮膚、真皮または毛包に由来し、メラノサイトが表皮または毛包に由来し、繊維芽細胞が真皮または乳頭毛包に由来する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
皮膚細胞、培養皮膚由来細胞または皮膚組織がまぶたまたは耳の皮膚に由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
編集率が該５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの編集および非編集形態総てに関して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
該５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの各編集および非編集形態の編集率が、
Ａ）皮膚細胞系統、培養皮膚由来細胞または皮膚組織の全ＲＮＡを抽出する工程；
Ｂ）工程Ａ）で抽出されたＲＮＡを逆転写する工程；および
Ｃ）工程Ｂ）で得られたｃＤＮＡを、編集され得る編集部位を含有する５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡフラグメントに特異的な少なくとも１対のプライマー（このプライマー対はＲＮＡ抽出物中に存在する可能性のある総ての編集形態および非編集形態を増幅し得るように選択される）を用いてＰＣＲ増幅する工程
を含む方法により決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
該５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの各編集および非編集形態の編集率が、
Ａ）皮膚細胞系統、培養皮膚由来細胞または皮膚組織の全ＲＮＡを抽出する工程；
Ｂ）工程Ａ）で抽出されたＲＮＡを逆転写する工程；および
Ｃ）工程Ｂ）で得られたｃＤＮＡを、編集され得る編集部位を含有する５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡフラグメントに特異的な少なくとも１対のプライマー（このプライマー対はＲＮＡ抽出物中に存在する可能性のある総ての編集形態および非編集形態を増幅し得るように選択される）を用いてＰＣＲ増幅する工程
（ここで、工程Ｂの逆転写は５ＨＴＲ２Ｃ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いることで行われる）
を含む方法により決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
工程Ｂ）において、５ＨＴＲ２Ｃ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーが配列5’-TTCGTCCCTCAGTCCAATCAC-3’（配列番号３４）を有する、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
工程Ｃ）において、ＰＣＲ増幅工程が２回のＰＣＲを含むネステッドＰＣＲであり、ここで、１回目のＰＣＲが２００ｂｐ〜３００ｂｐの間の長さを有するＰＣＲ核酸産物をもたらすプライマーセットにより行われ、２回目のＰＣＲが９０ｂｐ〜１６０ｂｐの間の長さを有する最終ＰＣＲ核酸産物をもたらすプライマーセットにより行われる、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２２】
工程Ｃ）において、ＰＣＲ増幅工程が２回のＰＣＲを含むネステッドＰＣＲであり、１回目のＰＣＲが次のプライマーセット：
マウスまたはラットでは、
フォワード：5’-TGTCCCTAGCCATTGCTGATATGC-3’、配列番号３５；
リバース：5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTAGTC-3’、配列番号３６；
ヒトでは、
フォワード：5’-TGTCCCTAGCCATTGCTGATATGC-3’、配列番号３５；
リバース：5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTAGTC-3’、配列番号３６、
により行われ、および
２回目のＰＣＲが以下のプライマーセット：
マウスまたはラットでは、
フォワード：5’-TTTGTGCCCCGTCTGGAT-3’、配列番号３９；
リバース：5’-GCCTTAGTCCGCGAATTG-3’、配列番号４０；および
ヒトでは、
フォワード：5’-ATGTGCTATTTTCAACAGCGTCCATC-3’、配列番号３７；
リバース：5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTA-3’、配列番号３８
により行われる、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２３】
該５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの各編集および非編集形態の編集率が、該ｍＲＮＡの編集および非編集型の個々の形態それぞれの編集プロフィールを提供し得るＳＳＣＰ法により決定され、該ＳＳＣＰ法が工程Ａ）、Ｂ）およびＣ）の後に
Ｄ）二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡへ解離させる工程；
Ｅ）キャピラリー電気泳動により一本鎖ＤＮＡを分離する工程；および
Ｆ）蛍光を読み取り、適当であれば、蛍光リーダーに関連づけた取り込み系の手段によりプロフィールデータを取得することにより編集プロフィールを得る工程
を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
患者が脳における５ＨＴＲ２Ｃ  ＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ  ｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連する病状を呈するかどうか、または病状を発症するリスクがあるかどうかをin vitroで特定するための、請求項１に記載の方法であって、
ａ）被験患者から得られた、細胞を含有する血液サンプルにおいて、血液サンプル細胞に含まれるＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の発現産物を決定する工程；および
ｂ）該患者がこのような病状を呈するかどうか、または病状を発症するリスクがあるかどうかを、被験患者で得られた発現したＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性を、正常患者またはこのｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連する病状を示す患者の血液サンプルで得られたＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の量および／または活性と比較することにより特定する工程
を含んでなり、
ＡＤＡＲ１−１５０、ＡＤＡＲ１−１１０および／またはＡＤＡＲ２の活性または／および量の増加が、前記患者が５ＨＴＲ２ＣのｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連する病状を呈するかどうか、または病状を発症するリスクがあるかどうかをin vitroで特定するためのマーカーである、方法。
【請求項２５】
ＡＤＡＲを発現する血液サンプル細胞が白血球(blood white cells)、白血球(leucocytes)またはバッフィーコート由来細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
ＡＤＡＲ発現産物がＡＤＡＲ  ｍＲＮＡである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ＡＤＡＲ  ｍＲＮＡの決定が、
Ａ）該血液サンプル細胞の全ＲＮＡを抽出する工程；
Ｂ）工程Ａ）で抽出されたＲＮＡを逆転写させる工程；および
Ｃ）工程Ｂ）で得られたｃＤＮＡを、定量および／または定性分析される各ＡＤＡＲ  ｍＲＮＡに特異的な、少なくとも１対のプライマーを用いてＰＣＲ増幅する工程
を含む方法により行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
工程Ｃ）において、ＡＤＡＲ  ｍＲＮＡ  ＰＣＲ増幅に特異的なプライマー対が、
ヒトＡＤＡＲ１−１５０イソ型ｍＲＮＡの増幅には：
ＥＸ１Ａ  ３４ｐフォワード：5’-GCCTCGCGGGCGCAATGAATCC-3’（配列番号４１）、
ＥＸ２  ５７８ｍリバース：5’-CTTGCCCTTCTTTGCCAGGGAG-3’（配列番号４２）；
ヒトＡＤＡＲ１−１１０イソ型ｍＲＮＡの増幅には：
ＥＸ１Ｂ  ５３４ｐフォワード：5’-CGAGCCATCATGGAGATGCCCTCC-3’（配列番号４３）、ＥＸ２  ８０４ｍリバース：5’-CATAGCTGCATCCTGCTTGGCCAC-3’（配列番号４４）；
ヒトＡＤＡＲ２  ｍＲＮＡの増幅には：
ＡＤＡＲ２  １２７４ｐフォワード：5’-GCTGCGCAGTCTGCCCTGGCCGC-3’（配列番号４５）、
ＡＤＡＲ２  １４８６ｍリバース：5’-GTCATGACGACTCCAGCCAGCAC-3’（配列番号４６）；
マウスＡＤＡＲ１−１５０イソ型ｍＲＮＡの増幅には：
ＥＸ１Ａ  １９ｐフォワード：5’-GTCTCAAGGGTTCAGGGGACCC-3’（配列番号４７）、
ＥＸ２  ６４６ｍリバース：5’-CTCCTCTAGGGAATTCCTGGATAC-3’（配列番号４８）；
マウスＡＤＡＲ１−１１０イソ型ｍＲＮＡの増幅には：
ＥＸ１Ｂ  ７２ｐフォワード：5’-TCACGAGTGGGCAGCGTCCGAGG-3’（配列番号４９）、
ＥＸ２  ６４６ｍリバース：5’-CTCCTCTAGGGAATTCCTGGATAC-3’（配列番号４８）；および
マウスＡＤＡＲ２  ｍＲＮＡの増幅には：
ＥＸ７  １２８１ｐフォワード：5’-GCTGCACAGTCTGCCTTGGCTAC-3’（配列番号５０）、ＥＸ９  １６２２ｍリバース：5’-GCATAAAGAAACCTGAGCAGGGAC-3’（配列番号５１）
からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＡＤＡＲ発現産物がＡＤＡＲタンパク質である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
工程ｂ）において、ＡＤＡＲタンパク質の決定が、
Ａ）血液サンプル細胞に含まれる全タンパク質を抽出する工程；および
Ｂ）血液サンプル細胞に含まれる各ＡＤＡＲタンパク質の存在および／または濃度を、該ＡＤＡＲタンパク質を特異的に認識することができる抗体の実現により決定する工程
を含む方法により行われる、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、患者において、特にセロトニン２Ｃ受容体（５ＨＴＲ２Ｃ）のＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ  ｍＲＮＡ編集というｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連する病状を、該ｍＲＮＡ（５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡなど）および／またはＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ(adenosine deaminases acting on RNA, ADAR)を発現する細胞を含有する末梢(peripherical)組織サンプル（皮膚および／または血液組織サンプルなど）から推定するためのin vitro法に関する。本発明はさらに、薬剤が脳組織においてin vivoで５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの編集を改変することができるかどうかを特定するため、または脳組織における５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連する病状の予防もしくは治療を意図した薬剤の有効性を制御するための方法を含み、これらの方法は該末梢(peripherical)組織マーカーの手段を含む。特定の態様において、本発明は、必要とされる場合に５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集率またはプロフィールが、編集部位を含む特定のｍＲＮＡフラグメントをＰＣＲ、好ましくはネステッドＰＣＲにより増幅した後に、一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）法によって決定され、与えられた分析条件下で、該末梢(peripherical)組織からこの編集された５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの編集率および／またはプロフィールを得ることを可能とする、このような方法に関する。最後に、本発明は、該ネステッドＰＣＲにおいて実現に寄与する特定の核酸プライマーに関する。
【０００２】
遺伝的関連研究、ノックアウトマウスおよび剖検は、神経精神疾患におけるセロトニン２Ｃ受容体（５ＨＴＲ２Ｃ）の関わりを示唆している。第一に、５ＨＴＲ２Ｃの機能的対立遺伝子多型（Ｃｙｓ２３Ｓｅｒ）は鬱病および双極性障害に関連している(Lerer et al., 2001, Mol. Psychiatry, 6:579-585)。第二に、５ＨＴ２Ｃセロトニン受容体を欠いたマウスは特発性痙攣、認知障害および摂食行動の異常な制御を示す(Tecott et al., 1995, Nature, 374:542-546)。これらの動物はまた、繰り返すストレスに対して過敏に反応する(Chou-green et al., 2003, Physiol. Behav., 79:217-226)。第三に、双極性障害または統合失調症に罹患している患者の剖検脳において、５−ＨＴ２Ｃセロトニン受容体のＲＮＡ発現はダウンレギュレーションされている(Iwamoto et al., 2004, Mol. Psychiatry, 9:406-416; Castensson et al., 2003, Biol. Psychiatry, 54:1212-1221)。
【０００３】
また、５ＨＴＲ２ＣのＲＮＡ編集も、精神病の病態生理学および抗鬱薬の作用に関与すると思われる(Seeburg, 2002, Neuron, 35:17-20)。５ＨＴＲ２Ｃの第二の細胞内ループをコードする領域では５つのアデノシン残基が編集され、この受容体配列の３つの異なる位置にアミノ酸置換をもたらし得る。これらのアミノ酸残基の組合せ置換は、異なるＧ共役効率を有する最大２４の異なる５ＨＴＲ２Ｃタンパク質イソ型を生じる(Price et al, 2001, J. Biol. Chem., 276:44663-44668)。マウスでは、Ｃ５７ＢＬ／６および１２９ｓｖ近交系に比べて、ＢＡＬＢ／ｃ系統は、それらのストレス反応性における違いの基礎となり得る、異なる前脳基底核新皮質５ＨＴＲ２Ｃプレ−ｍＲＮＡ編集パターンを示す。さらに、ＢＡＬＢ／ｃマウスは、抑鬱状態の自殺者の脳で検出されたものに似た、ストレスにより誘発される５ＨＴＲ２Ｃプレ−ｍＲＮＡ編集の変化を示す(Englander et al., 2005, J. Neurosci., 25:648-651)。実際、統合失調症、鬱病患者および自殺者で、剖検脳において、５ＨＴＲ２Ｃの変更されたＲＮＡ編集が報告されている(Niswender et al., 2001, Neuropsychopharmacology, 24:478-491; Sodhi et al., 2001, Mol. Psychiatry, 6:373-379; Gurevich et al., 2002, Neuron, 34:349-356)。さらに、インターフェロンはＣ型肝炎の治療に用いられるが、患者においてこの分子の副作用として鬱病の症状が見られる場合が多く、Yang et al.は、この分子が５ＨＴＲ２Ｃの編集を著しく変更することを示している（Tohda et al., 2006, J. Pharmacol. Sci., 100, 427-432参照）。
【０００４】
これまでの研究で、５ＨＴＲ２Ｃは主として脳、特に、脈絡膜叢、前頭皮質、大脳辺縁領域、基底核および視床下部で発現される(Tohda et al., 1996, Neurosci. Res., 24:189-193; Julius et al., 1988, 241:558-564; Pasqualetti et al., 1999, Neuroscience, 92:601-611)。この発現の脳特異的パターンは、５ＨＴＲ２Ｃ  ＲＮＡ編集と精神医学的症状の間にある潜在的関連の検討を死後研究に制限する。より容易に利用でき、ＣＮＳにおけるＨＴＲ２Ｃの編集状態をモニタリングすることができ、精神医学的状態の異なる患者において定量分析を可能とする組織の探索において、Marazzitiおよび共同研究者らは、休止中のリンパ球において５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの存在を検出した(Marazziti et al., 2001, Neuropsychobiology, 43:123-126)。残念ながら、これらの細胞では、ＲＴ−ＰＣＲ／サザンブロッティングによって明らかにされるような５ＨＴＲ２Ｃの発現レベルは、さらなる定量的ＲＮＡ編集分析のためには低すぎる。
【０００５】
最近、Slominskiおよび共同研究者らは、ヒト皮膚および培養皮膚由来細胞がＬ−トリプトファンをセロトニンへ変換し、セロトニンをＮ−アセチル−セロトニンとメラトニンへ代謝する能力を有することを示した(Slominski et al, 2002, FASEB J., 16:896-898)。彼らは、ネステッドＲＴ−ＰＣＲにより、この皮膚のセロトニン作動性／メラトニン作動性代謝経路の受容体をコードする遺伝子の発現をさらに試験した。完全なヒト皮膚ならびに正常および病的な培養皮膚細胞は主として、セロトニン受容体の５−ＨＴ２Ｂおよび５ＨＴ７イソ型をコードする遺伝子を発現する。他のセロトニン受容体イソ型の発現は優勢でなく、５ＨＴＲ２Ｃの検出はまれであった(Slominski et al., 2003, J. Cell. Phys., 196:144-153)。
【０００６】
ＡＤＡＲ（ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ）遺伝子ファミリーのメンバーは、アデノシン残基をイノシンへ変換するＲＮＡ編集の一形態に関与している。ＲＮＡ編集のプロセスは、ｍＲＮＡにおいて転写後塩基変化をもたらす、真核生物で広く見られる現象である。哺乳類では、部位選択的なアデノシンからイノシンへの修飾を特徴とする一種のＲＮＡ編集を受けることが確認される遺伝子の数が増えている。
【０００７】
Ａ−ｔｏ−Ｉ編集基質としては、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体（ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ４）ならびにＧタンパク質共役セロトニン受容体（５ＨＴＲ２Ｃなど）をコードする脳特異的転写物がある。ＧｌｕＲサブユニットＢ（ＧｌｕＲ−Ｂ）では、ある１つの編集場所（Ｑ／Ｒ部位）はイオンチャネルのＣａ２＋−透過性を制御し、別の場所（Ｒ／Ｇ部位）は受容体の脱感作速度を調節する。正常な脳機能にはこのＡＭＰＡ受容体の特性が重要である。正常な脳機能には正確なＲＮＡ編集が重要であるため、編集活性の調節欠如は、神経変性疾患または腫瘍形成（癲癇性認知症(epilepsie cognitif)、腫瘍、夢遊病(sleep waking)、気分障害性摂食）などの病態生理学的プロセスの進行に影響を及ぼし得る(Maas S et al. (1996) J. Biol. Chem 271, 12221-26; Sergeeva OA et al. (2007) Cell Mol Neurobiol. 27:669-680)。
【０００８】
ホスホジエステラーゼのイソ酵素としてＴ細胞のレベルで同定されている別のＡＤＡＲ  Ａ−ｔｏ−Ｉ編集基質がホスホジエステラーゼ８Ａ１である。６〜７部位の編集が確認されており、病態（紅斑性狼瘡）において、また、薬剤作用（インターフェロンα）の後に調節され得る。
【０００９】
このイソ酵素は脳に存在することに注目することが重要である(Orlowski RJ et al, 8A1 gene transcripts of systemic lupus erythematosus T lymphocytes. Immunology 2008 in press; Wang P et al., phosphodiesterase 8A (PDEA8) splice variants: cloning, gene organization and tissue distribution. (2001) Gene 280 183-194)。
【００１０】
これらのＡＤＡＲ脳特異的基質のうち、５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡのＡ−ｔｏ−Ｉ編集は、細胞内ループＩＩドメイン内に位置する３つのアミノ酸残基の置換をもたらし、受容体のＧタンパク質共役機能に劇的な変更をもたらす(Yang W et al., Brain Res Mol Brain Res. 2004, 124(1):70-78)。ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３およびＡＤＡＴ１と呼ばれる４つのＡ−ｔｏ−Ｉ  ＲＮＡ編集酵素が哺乳類からクローニングされている。ＡＤＡＲ１イソ型およびＡＤＡＲ２は、種々の細胞および組織で広く発現し、脳および脾臓で最も発現が高く、５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集に関与する必須のＡＤＡＲである（ＡＤＡＲ３は唯一脳で同定され、そのデアミナーゼ活性はまだ確認されておらず、ＡＤＡＴ１はｔＲＮＡを標的とする）。５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡは、５つの近接したアデノシン残基（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ編集部位と呼ばれる）で編集され、３２の異なるｍＲＮＡ変異体と非編集Ｉｌｅ１５６−Ａｓｎ１５８−  Ｉｌｅ１６０（ＩＮＩ）イソ型から完全編集Ｖａｌ１５６−Ｇｌｙ１５８−Ｖａｌ１６０（ＶＧＶ）イソ型まで、２４の異なるタンパク質イソ型を生じさせる。ＡＤＡＲ１単独がＡおよびＢ編集部位に関与し、ＡＤＡＲ１とＡＤＡＲ２の双方がＥおよびＣ編集部位に関与し、ＡＤＡＲ２単独がＤ編集部位に関与することが知られている(Dracheva et al., Molecular Psychiatry, 2007, 1-10)。
【００１１】
インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）は慢性ウイルス性肝炎に関して処置される患者に重篤な鬱病およびある種の悪性腫瘍をしばしば引き起こすことが知られている。ヒト膠芽腫細胞系統におけるＲＮＡ編集に対するＩＦＮ−αの効果が観察されている(Yang et al., Beyond the Identification of Transcribed Sequences: Functional, Evolutionary and Expression Analysis, 12th International Workshop, October 25-28, 2002, Washington, DC, Intracellular Trafficking of A Few Inflammation-Inducible ADARl Isoform)。in vivoにおいてＢａｌｂ／ｃマウスでも、in vitroにおいてヒト膠芽腫細胞系統でＡＤＡＲ１  １５０の発現の強力なアクチベーターであることが知られている(Yang W. et al., 2004)インターフェロンαの投与も背側前頭皮質における５ＨＴＲ２Ｃの編集プロフィールに結果としての変化を誘発することが見られた。
【００１２】
編集プロセスの一般的修飾の迅速かつバリデートされた予測パラメーターを可能とするためには、
ヒト脳組織において、被験患者から容易に得ることができる生体サンプルからこれらのＡＤＡＲ基質、特に、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体または５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの編集率またはプロフィールの変更を外挿することを可能とすること（ここで、この生体サンプルにおいて決定されたこれらのＡＤＡＲ基質の編集率またはプロフィールは脳生体サンプルから得られるものと相関させることができる）；および／または
被験患者から容易に得ることができる生体サンプルに存在するマーカーを同定すること（ここで、該サンプル中の該マーカーの定性的および／または定量的分析は、脳組織におけるこれらのＡＤＡＲ基質の編集率またはプロフィールの変更と相関させることができ、このような生体サンプルおよび会合したマーカーはＣＮＳ（中枢神経系）に見られる受容体編集のリポーターとして使用可能である）
がやはり望ましい。
【００１３】
これはまさに本発明の目的である。
【００１４】
本発明は、脳におけるｍＲＮＡ編集（該ｍＲＮＡ編集はＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ  ｍＲＮＡ編集である）の病理的変化を評価するための方法であって、細胞を含有する末梢(peripherical)組織からなる生体サンプルの群から選択される単一の生体サンプルまたは２種類の異なる生体サンプルが用いられる方法に関する。
【００１５】
本発明はまた、脳におけるｍＲＮＡ編集（該ｍＲＮＡ編集はＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ  ｍＲＮＡ編集である）の病理学的変更を評価するための方法であって、単一の、または会合したリポーターサンプルとして、
哺乳類由来の皮膚サンプルなどの、第一の、細胞を含有する末梢(peripherical)組織；または／および
哺乳類由来の血液サンプルなどの、第二の、細胞を含有する末梢(peripherical)組織、
が用いられる方法に関する。
【００１６】
好ましい実施態様では、その編集がＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ  ｍＲＮＡ編集である該編集ｍＲＮＡは、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体、Ｇタンパク質共役セロトニン受容体およびＰＤＥＡ８をコードするｍＲＮＡからなる群から選択されるｍＲＮＡである。
【００１７】
好ましい実施態様では、脳におけるｍＲＮＡ編集の病理学的変更の評価は、
該末梢(peripherical)生体サンプルにおける該ｍＲＮＡの編集率またはその編集形態のプロフィール；および／または
該末梢(peripherical)生体サンプルで発現されるＡＤＡＲの性質または／および量
により決定される。
【００１８】
より好ましい実施態様では、ＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ  ｍＲＮＡ編集を有する該ｍＲＮＡ  は５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡである。
【００１９】
本発明者らは、末梢（血液など）におけるＡＤＡＲ発現の変化の測定が脳における編集の重要な変更を推定できることを見出した。
【００２０】
本発明者らは、例えば５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集の決定および／または皮膚および／または血液組織サンプルなど、５ＨＴＲ２Ｃおよび／またはＡＤＡＲを発現する細胞を含有する末梢(peripherical)組織で発現されるＡＤＡＲ活性の決定が、脳組織における５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集の機構の変更のリポーターマーカーとして、従って、ＣＮＳで発現されるセロトニン作動系(serotinergic system)の多段階代謝経路の病理学的変更を評価するために使用可能である。
【００２１】
本発明者らは、哺乳類５ＨＴＲ２Ｃの編集を担う必須のＡＤＡＲ（２つのＡＤＡＲ１イソ型（以下、ＡＤＡＲ１−１５０ｋＤタンパク質およびＡＤＡＲ１−１１０ｋＤタンパク質としての「ＡＤＡＲ１−１５０」および「ＡＤＡＲ１−１１０」と呼ばれる）とＡＤＡＲ２である）は総て、該細胞を含有する末梢(peripherical)組織、特に、血液サンプル白血球で、定性的および／または定量的分析を行うのに、また、細胞を含有する末梢(peripherical)組織およびＡＤＡＲを、このＣＮＳで発現されるセロトニン作動系(serotinergic system)の多段階代謝経路の病理学的変更を評価するためのリポーターサンプルおよびマーカーとして使用するのに十分な量で発現されることを実証した。
【００２２】
本発明者らはまた、先行技術で皮膚サンプルに関して示されたもの(Slominski et al, 2003, J. Cell Phy., 196, 144-153)とは対照的に、皮膚サンプル細胞などの細胞を含有するある特定の末梢(peripherical)組織は、５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの編集率またはプロフィール、ならびに所望により含まれるＡＤＡＲの性質および／または量を評価するために検出および分析するのに十分な５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡを発現する。
【００２３】
結局のところ、
細胞を含有する皮膚および／または血液組織サンプルなど、これらのＡＤＡＲを発現する細胞を含有する末梢(peripherical)組織における、ＡＤＡＲ酵素、特に、ＡＤＡＲ１イソ型（特に、「ＡＤＡＲ１−１５０」および「ＡＤＡＲ１−１１０」）ならびにＡＤＡＲ２の変更されたまたは正常な発現の決定（性質および／または量）；および／または
細胞を含有する皮膚および／または血液組織サンプルなど、５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集を発現する細胞を含有する末梢(peripherical)組織における、５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの編集形態の５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集率またはプロフィールの決定
は、脳組織における５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集の機構の変更のリポーターマーカーとして、従って、患者のＣＮＳで発現されるセロトニン作動系(serotinergic system)の多段階代謝経路の病理学的変更を評価するためのリポーターサンプルとして使用可能である。
【００２４】
最後に、細胞を含有する皮膚および／または血液組織サンプルなど、細胞を含有する１以上の末梢(peripherical)組織サンプルにおいて、ＡＤＡＲ酵素の変更された、または正常な発現の決定は、単独で、または５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの編集形態の５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集率またはプロフィールの決定と組み合わせて、
in vitroにおいて患者がセロトニン２Ｃ受容体（５ＨＴＲ２Ｃ）のｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連する病状を呈するかどうか、または病状を発症するリスクがあるかどうかを決定するため；
in vitroにおいて患者により示される病状が５ＨＴＲ２ＣのｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連するかどうかを決定するため；
脳組織において５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集を調節し得る化合物、好ましくは、それを必要とする患者の脳組織において正常な５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集を回復させ得る化合物を選択するため；または
哺乳類においてin vitroで、５ＨＴＲ２ＣのｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連する病状の予防または治療に用いられる薬剤の有効性を決定するため
のリポーターサンプルおよびマーカーとして使用可能である。
【００２５】
細胞を含有する「末梢(peripherical)組織」とは、本明細書では、脳組織以外の、好ましくは、一般に、採取が容易な器官または組織の生検、皮膚サンプル、全血サンプル、尿サンプル、唾液サンプル、内部頬組織サンプル、膣もしくは内部頬剥離細胞診または塗沫標本などの採取が容易な組織を表すものとする。細胞を含有する皮膚および／または血液サンプルは、本発明の実現に寄与する好ましい末梢(peripherical)組織サンプルである。
【００２６】
これらの２つのマーカーの関連（ＡＤＡＲと５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集）とは、ＡＤＡＲ発現が５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集の決定に用いられる細胞と同タイプの細胞(例えば、皮膚細胞）で分析可能であること、またはＡＤＡＲ発現があるタイプの細胞（例えば、血液細胞サンプル）で分析可能であり、５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集の決定が別のタイプの細胞（例えば、皮膚細胞サンプル）で行われることを意図する。
【００２７】
各マーカーは単独で、そのマーカーの決定が、細胞を含有する皮膚および／または血液組織サンプルなどの細胞を含有する末梢(peripherical)組織サンプルにおいてその発現を脳組織における５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの編集率またはプロフィールと相関させるのに十分かどうかに使用することができる。
【００２８】
例えば、白血球などの血液組織サンプル細胞におけるＡＤＡＲの変更された、または正常な発現の決定は、脳組織における５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集の機構の変更のリポーターマーカーとして単独で使用可能である（得られる相関は単一のマーカーを用いれば十分である）。
【００２９】
別の例では、５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集率または５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの編集形態のプロフィールの決定、または５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡおよびＡＤＡＲを発現する細胞を含有する皮膚組織サンプルにおけるＡＤＡＲの変更された、または正常な発現の決定も、得られる、脳における５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集の機構の変更のリポーターマーカーとして単独で使用可能である（得られる相関は単一のマーカーを用いれば十分である）。
【００３０】
５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集を調節し得る化合物を選択するための方法を考えれば、このような化合物を評価および選択するための５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡおよび／またはＡＤＡＲを発現する末梢(peripherical)組織の細胞は、５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡおよび／またはＡＤＡＲの発現が、例えばこの５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡおよび／またはＡＤＡＲの病的発現を模倣するために変更されている細胞系統または組換え細胞系統であり得る。特にこの態様には、皮膚または血液組換え細胞または細胞系統が使用可能である。
【００３１】
特に、本発明は、脳などのＣＮＳで発現される５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集系の病理学的変更を評価するための単一の、または会合したリポーターサンプルとしての、哺乳類、好ましくはヒト、マウスまたはラット由来の皮膚サンプル（皮膚細胞または組織または生検）など、５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡおよび／またはＡＤＡＲを発現する１つの末梢(peripherical)組織の使用を含む。
【００３２】
より詳しくは、本発明は、
皮膚細胞などの末梢(peripherical)組織サンプルにおける５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの編集率または編集形態のプロフィールを決定すること；または所望により、また、会合マーカーとして用いる場合には、
該末梢(peripherical)組織サンプルで発現されるＡＤＡＲの性質または／および量を決定すること
による、脳などのＣＮＳで発現される５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集系の病理学的変更を評価するための単一の、または会合したリポーターサンプルとしての、哺乳類、好ましくはヒト、マウスまたはラット由来の皮膚サンプルなどの５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡおよび／またはＡＤＡＲを発現する１つの末梢(peripherical)組織の使用を含む。
【００３３】
別の特定の実施態様では、本発明は、脳などのＣＮＳで発現される５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集系の病理学的変更を評価するための単一の、または会合したリポーターサンプルとしての、哺乳類、好ましくはヒト、マウスまたはラット血液サンプル由来の全血サンプル、より好ましくは白血球などの第二の末梢(peripherical)組織サンプルの使用を含む。
【００３４】
より詳しくは、本発明は、
血液細胞などの第二の末梢(peripherical)組織サンプルにおける５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの編集率または編集形態のプロフィールを決定すること；または所望により、また、会合マーカーとして用いる場合には、
該第二の末梢(peripherical)組織サンプルで発現されるＡＤＡＲの性質または／および量を決定すること
により、脳などのＣＮＳで発現される５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集系の病理学的変更を評価するための単一の、または会合したリポーターサンプルとしての、哺乳類、好ましくはヒト、マウスまたはラット末梢(peripherical)組織サンプル由来の全血サンプルなど、該第二の末梢(peripherical)組織の使用を含む。
【００３５】
第一の態様において、本発明は、in vitroにおいて、患者が５ＨＴＲ２ＣのｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連する病状を呈するかどうか、または病状を発症するリスクがあるかどうかを特定するための方法に向けられ、この方法は、
ａ）被験患者から皮膚細胞および／または血液細胞などの細胞を含有する末梢(peripherical)組織を含有する生体サンプルを得る工程；
ｂ）該５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの少なくとも編集形態または非編集形態の編集率、および／または皮膚細胞および／または血液細胞などの細胞を含有する末梢(peripherical)組織の該サンプルで発現されるＡＤＡＲの性質または／および量を決定する工程；
ｃ）該患者がこのような病状を呈するかどうか、または病状を発症するリスクがあるかどうかを、該５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡのこの編集形態または非編集形態に関して工程ｂ）で得られた編集率を比較することにより、かつ／または該サンプル（細胞を含有する末梢(peripherical)組織）で発現されたＡＤＡＲの性質または／および量を、５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの特徴的な対照編集率、または正常患者もしくはこのｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連する病状を示す患者に関して得られた発現ＡＤＡＲプロフィールと比較することにより特定する工程を含む。
【００３６】
好ましい実施態様では、該病状は、精神病、統合失調症、鬱病、鬱性自殺または異常な摂食挙動からなる群から選択される。
【００３７】
第２の態様において、本発明は、in vitroにおいて、患者により示される病状が５ＨＴＲ２ＣのｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連するかどうかを決定する方法に関し、この方法は、
ａ）該病状を示す患者から皮膚細胞および／または血液細胞などの細胞を含有する末梢(peripherical)組織を含有する生体サンプルを得る工程；
ｂ）５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの少なくとも１つの編集形態または非編集形態の編集率、および／または皮膚細胞および／または血液細胞などの細胞を含有する末梢(peripherical)組織の該サンプルで発現されるＡＤＡＲの性質または／および量を決定する工程；
ｃ）該患者がこのような病状を呈するかどうか、または病状を発症するリスクがあるかどうかを、該５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡのこの編集形態または非編集形態に関して工程ｂ）で得られた編集率を比較することにより、かつ／または該末梢組織サンプルで発現されたＡＤＡＲの性質または／および量を、５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの特徴的な対照編集率、または正常患者もしくはこのｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連しないことが知られている病状を示す患者に関して得られた発現ＡＤＡＲプロフィールと比較することにより特定する工程
を含む。
【００３８】
一般的態様において、本発明は、
哺乳類においてin vitroで、患者がｍＲＮＡの編集（その編集はＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ編集である）の機構の変更に関連する病状を呈するかどうか、または病状を発症するリスクがあるかどうかを特定する方法；
哺乳類においてｍＲＮＡの編集（その編集はＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ編集である）を調節する薬剤をin vitroで特定する方法；
哺乳類において、患者においてin vitroで、ｍＲＮＡの編集（その編集はＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ編集である）の機構の変更に関連する病状の予防または治療のために用いられる薬剤の有効性を決定する方法；
哺乳類において、患者が、ｍＲＮＡの編集（その編集はＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ編集である）の機構の変更をもたらす、またはそれにより誘発される病状の処置に応答するか応答しないかを決定する方法であって、
ａ）被験患者から細胞を含有する末梢(peripherical)生体サンプル、特に、血液細胞を含有する生体サンプルを得る工程；
ｂ）該末梢(peripherical)生体サンプルで発現されるＡＤＡＲの性質または／および量を決定する工程；
ｃ）該サンプルで発現されるＡＤＡＲの性質または／および量を、正常患者またはこのｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連する病状を示す患者で得られる発現ＡＤＡＲプロフィールの特徴的な対照と比較する工程
を含む方法に向けられる。
【００３９】
本発明のこれら上記の方法の好ましい実施態様では、該編集ｍＲＮＡは、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体、Ｇタンパク質共役セロトニン受容体およびＰＤＥＡ８をコードするｍＲＮＡからなる群から選択されるｍＲＮＡである。
【００４０】
第三の態様において、本発明は、哺乳類においてin vivoで５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの編集を調節する薬剤をin vitroで特定する方法であって、
ａ）該哺乳類に５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集の候補モジュレーターを投与する工程；
ｂ）該哺乳類から、皮膚細胞および／または血液細胞などの細胞を含有する末梢(peripherical)組織を含有する生体サンプルを得る工程；および
ｃ）該モジュレーターの、
該５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの少なくとも１つの編集形態または非編集形態の編集率に対する；および／または
皮膚細胞および／または血液細胞などの該末梢(peripherical)組織サンプルで発現されるＡＤＡＲの性質または／および量
に対する効果を、
工程ｂ）の生体サンプルから得られたこの編集形態または非編集形態に関する編集率および／または発現されるＡＤＡＲの性質または／および量を、該哺乳類の細胞を含有する対照末梢(peripherical)組織から得られた編集率および／または発現されるＡＤＡＲの性質または／および量と比較することにより決定する工程
を含む方法に向けられる。
【００４１】
この第三の態様において、本発明はまた、哺乳類において５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの編集を調節する薬剤をin vitroで特定する方法であって、
ａ）皮膚細胞系統および／または血液細胞系統（所望により、これらの細胞は組換え細胞または細胞系統であり得る）などの細胞を含有する末梢(peripherical)組織を含有する生体サンプルを得る工程；
ｂ）該５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集の候補モジュレーターの存在下で該生体サンプルを接触させる工程；および
ｃ）該モジュレーターの、
該５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの少なくとも１つの編集形態または非編集形態の編集率に対する；および／または
該末梢(peripherical)組織サンプルで発現されるＡＤＡＲの性質または／および量
に対する効果を、
工程ｂ）の生体サンプルから得られたこの編集形態または非編集形態に関する編集率および／または発現されるＡＤＡＲの性質または／および量を、該哺乳類の皮膚細胞および／または血液細胞などの細胞を含有する対照末梢(peripherical)組織から得られた編集率および／または発現されるＡＤＡＲの性質または／および量と比較することにより決定する工程
を含む方法も含む。
【００４２】
この第三の態様において、本発明はまた、抗鬱薬、抗精神病薬、抗肥満薬、抗ウイルス感染薬などの処置、脳編集調節に対する有意な作用を提供し、自殺、治療耐性、誘発慢性などの特定されるリスクを誘発することが確認されている処置により誘発される調節の編集プロセスの変更を検出するためのこれら上記の方法の実行を含み得る。
【００４３】
第四の態様において、本発明は、哺乳類においてin vitroで、５ＨＴＲ２ＣのｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連する病状の予防または治療に用いられる薬剤の有効性を決定する方法であって、
ａ）該哺乳類から、皮膚細胞および／または血液細胞などの細胞を含有する末梢(peripherical)組織を含有する生体サンプルを得、該５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの少なくとも１つの編集形態または非編集形態に関する編集率、および／または皮膚細胞および／または血液細胞などの該末梢(peripherical)組織サンプルにおいて発現されるＡＤＡＲの性質または／および量を決定する工程；
ｂ）該哺乳類に病状の予防または治療を意図した薬剤を投与する工程；
ｃ）該哺乳類から処置中または／および処置後に該末梢(peripherical)組織サンプルの新たなサンプルを得、該５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの少なくとも１つの編集形態または非編集形態に関する編集率、および／または工程ａ）で選択されたサンプルにおいて発現されるＡＤＡＲの性質または／および量を決定する工程；および
ｄ）該薬剤の有効性を、工程ａ）の生体サンプルから得られた編集率および／または発現されるＡＤＡＲの性質または／および量を工程ｃ）で得られたものと比較することにより決定する工程（この編集率および／または発現されるの性質または／および量の調節は、処置の有効性に関して有意な正常患者で見られるものに近い、またはそれに相当する編集率および／または発現ＡＤＡＲの性質または／および量をもたらす）
を含む方法を含む。
【００４４】
この態様において、本発明は、患者が５ＨＴＲ２ＣのｍＲＮＡ編集の機構の変更をもたらす、またはそれを誘発する病態の処置に応答するか応答しないかを決定するための方法であって、
ｅ）処置期間（すなわち、１５日、３０日、２か月、６か月など）の後に編集率またはプロフィールおよび／または発現ＡＤＡＲの性質または／および量の修飾を、処置の開始前の編集率またはプロフィールおよび／または発現ＡＤＡＲの性質または／および量と比較することにより観察することにより、その患者がその処置に応答するか応答しないかを決定する工程をさらに含む方法に関する。
【００４５】
このような方法により、患者がその薬剤に応答しないことを迅速に決定する、または患者がその薬剤に応答する場合にはその処置を継続することができれば、薬剤の処置期間が不要に長引くことが避けられる。
【００４６】
編集とは、遺伝子に含まれる情報が転写後に修飾される機構である。一般用語「ｍＲＮＡ編集」には、翻訳の際にタンパク質に組み込まれるアミノ酸の性質または数に関して変化をもたらすこれらのｍＲＮＡの配列の修飾を含み、タンパク質配列は、その合成を指令する遺伝子からはもはや推測することはできない。５ＨＴＲ２ＣのプレメッセンジャーＲＮＡは、５ＨＴＲ２Ｃの第二の細胞内ループに位置するアミノ酸の組み込みを指令する最終的なｍＲＮＡとなるものの一部において、ある特定のアデノシン（Ａ）の特異的酵素修飾を受け得る。実際、主要転写物の５番目のエキソンの遠位および５番目のイントロンの近位は、２つの酵素酵素ＡＤＡＲ１とＡＤＡＲ２（二本鎖ＲＮＡ依存性アデノシンデアミナーゼ）により潜在的に認識されるステム−ループ構造を形成することができ、これにより、スプライシングされる前にプレメッセンジャーＲＮＡを編集することができる。この編集はＡの脱アミノ化により生じ、これらが次にイノシン（Ｉ）へと変換される。ひと度、スプライシングが完了すれば、編集を受けたＡを含んだｍＲＮＡの部分はこの時にはＩを含む。５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡが翻訳されると、ＩはＧと読まれると思われる。実際、ＡからＩへと脱アミノ化を受ける５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡからのｃＤＮＡのin vitro合成の際、逆転写酵素は通常はＡの反対側に組み込まれるはずのｄＴの代わりにＩの反対側にｄＣを組み込む。結局、二本鎖ｃＤＮＡの形成をもたらす第二鎖の合成の際に、第一鎖に組み込まれている各ｄＣの反対側にｄＧが導入される。このようにして得られた二本鎖ｃＤＮＡの配列決定により、編集を受けるｍＲＮＡにおけるＡからＩへの最初の脱アミノ化のためにｄＡのｄＧでの置換が見られ得る。結局、ｍＲＮＡの編集は、コドンの意味の改変をもたらし、ＡがＩに置換され、従って、Ｇとして読み取られると考えられる（より具体的には、ヒト５ＨＴＲ２Ｃの編集に関しては、Fitzgerald et al, Neuropsychopharmacology, 1999, 21(2S), 82S-90S参照）。
【００４７】
従って、皮膚サンプルにおける編集率の制御による５ＨＴＲ２ＣのｍＲＮＡ編集の機構の変更の決定は、皮膚で発現されるセロトニン作動系の多段階代謝経路の変更にも重要であり、脳で発現されるセロトニン作動系のリポーターとして使用可能である。
【００４８】
よって、第六の態様において、本発明はまた、ＡＤＡＲ１および／またはＡＤＡＲ２酵素などの５ＨＴＲ２ＣのｍＲＮＡ編集に関与するタンパク質の作用機構の変更を、皮膚サンプルまたは血液サンプルなどの細胞を含有する末梢(peripherical)組織由来のこの５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの編集率を、本発明の上記の方法で実行または記載されるような該５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの編集形態または非編集形態の編集率を決定するための方法により決定することにより制御するための方法を含む。
【００４９】
本発明は脳および／または末梢機能を変更する病状における推定可能な関わりを有するその調節の一般的変更を診断および追跡するための編集プロセスの末梢マーカーの使用に向けられる。この主な目標は、非排他的例として、収束的剖検または間接的臨床証拠（例えば、インターフェロン処置により誘発される抑鬱状態）のいずれかの後に、編集調節の変更がそれらの病状（例えば、鬱病および自殺の場合）に寄与することが示唆されている患者において治療を推定および方向付ける新たな能力に到達することである（特に、この目的の実現に寄与する戦略に関しては実施例１を参照）。
【００５０】
「編集ＲＮＡ」とは、本明細書において、少なくとも１つのアデノシンがアデノシンデアミナーゼによりイノシンへと脱アミノ化されているＲＮＡ配列を表すものとする。
【００５１】
「編集率」とは、同じサンプルに存在する編集形態および非編集形態のｍＲＮＡの総量に対して少なくとも１つの編集部位を含み得るｍＲＮＡの編集形態または非編集形態それぞれのパーセンテージを示すものとする。
【表１】
0005661458.tif 000002
0005661458.tif 000003
【００５２】
本発明の方法の好ましい実施態様では、患者または哺乳類はヒト、マウスまたはラット、好ましくはヒトである。
【００５３】
本発明の方法の好ましい実施態様では、皮膚細胞はケラチノサイト、メラノサイト、繊維芽細胞、ランゲルハンス細胞およびメルケル細胞からなる群から選択され、皮膚組織は表皮および真皮からなる群から選択される。
【００５４】
ケラチノサイトはＨａＣａＴ細胞などのヒト不死化細胞に由来してよく、あるいはメラノサイトはヒト不死化細胞または黒色腫に由来する。
【００５５】
本発明の方法の好ましい実施態様では、ケラチノサイトは新生児の皮膚、真皮または毛包に由来し、メラノサイトは表皮または毛包に由来し、繊維芽細胞は真皮または乳頭毛包に由来する。
【００５６】
本発明の方法のより好ましい実施態様では、皮膚細胞、培養皮膚由来細胞または皮膚組織はまぶたまたは耳の皮膚に由来する。
【００５７】
本発明の方法の好ましい実施態様では、５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの編集部位は、配列5’-AUA CGU AAU CCU AUU-3’（配列番号３３）を有するヒト５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡフラグメントの１、３、７、８および１３位に存在するヌクレオチドから選択される。
【００５８】
本発明の方法の好ましい実施態様では、編集率は、ヒト５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの編集および非編集形態のうち少なくとも１つ、好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３２に関して決定される。
【００５９】
より好ましい実施態様では、編集率は該５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの編集および非編集形態（３２形態）総てに関して決定される。
【００６０】
本発明の方法の好ましい実施態様では、該５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの各編集および非編集形態の編集率は、
Ａ）皮膚細胞系統、培養皮膚由来細胞もしくは皮膚組織などの皮膚細胞サンプル、または白血球などの血液細胞の全ＲＮＡを抽出し、その後、適当であればそのｍＲＮＡを生成する工程；
Ｂ）工程Ａ）で抽出されたＲＮＡを逆転写する工程；および
Ｃ）工程Ｂ）で得られたｃＤＮＡを、編集され得る編集部位を含有する５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡフラグメントに特異的な少なくとも１対のプライマー（このプライマー対はＲＮＡ抽出物中に存在する可能性のある総ての編集形態および非編集形態を増幅し得るように選択される）を用いてＰＣＲ増幅する工程
を含む方法により決定される。
【００６１】
本発明の方法のより好ましい実施態様では、該５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの各編集および非編集形態の編集率は、
Ａ）皮膚細胞系統、培養皮膚由来細胞もしくは皮膚組織などの皮膚細胞サンプル、または白血球などの血液細胞サンプルの全ＲＮＡを抽出し、その後、適当であればそのｍＲＮＡを生成する工程；
Ｂ）工程Ａ）で抽出されたＲＮＡを逆転写する工程；および
Ｃ）工程Ｂ）で得られたｃＤＮＡを、編集され得る編集部位を含有する５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡフラグメントに特異的な少なくとも１対のプライマー（このプライマー対はＲＮＡ抽出物中に存在する可能性のある総ての編集形態および非編集形態を増幅し得るように選択される）を用いてＰＣＲ増幅する工程
（ここで、工程Ｂの逆転写は５ＨＴＲ２Ｃ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いることで行われる）
を含む方法により決定される。
【００６２】
工程Ｂ）のより好ましい実施態様では、５ＨＴＲ２Ｃ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーは配列5’-TTCGTCCCTCAGTCCAATCAC-3’（配列番号３４）を有する。
【００６３】
本発明の方法の好ましい実施態様では、工程Ｃ）において、ＰＣＲ増幅工程は２回のＰＣＲを含むネステッドＰＣＲであり、ここで、１回目のＰＣＲは２００ｂｐ〜３００ｂｐの間、好ましくは２２５ｂｐ〜２７５ｂｐの間、より好ましくは２４０ｂｐ〜２６０ｂｐの間（２５０ｂｐが最も好ましい）の長さを有するＰＣＲ核酸産物をもたらすプライマーセットにより行われる。
【００６４】
本発明の方法のより好ましい実施態様では、工程Ｃ）において、ＰＣＲ増幅工程は２回のＰＣＲを含むネステッドＰＣＲであり、ここで、２回目のＰＣＲは９０ｂｐ〜１６０ｂｐの間、好ましくは１００ｂｐ〜１４０ｂｐの間、より好ましくは１１０ｂｐ〜１４０ｂｐの間の長さを有する最終ＰＣＲ核酸産物をもたらすプライマーセットにより行われる。１１０ｂｐ〜１３８ｂｐの間の配列長を有する最終ＰＣＲ産物が最も好ましい。
【００６５】
本発明の方法のさらにまた好ましい実施態様では、工程Ｃ）において、ＰＣＲ増幅工程は２回のＰＣＲを含むネステッドＰＣＲであり、ここで、１回目のＰＣＲは以下のプライマーセット：ヒトでは、
ＰＣＲ９フォワード：5’-TGTCCCTAGCCATTGCTGATATGC-3’、配列番号３５；
ＰＣＲ１０リバース：5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTAGTC-3’、配列番号３６；
また、マウスまたはラットでは、
ＰＣＲ９フォワード：5’-TGTCCCTAGCCATTGCTGATATGC-3’、配列番号３５；
ＰＣＲ１０リバース：5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTAGTC-3’、配列番号３６、
により行われ、２回目のＰＣＲは以下のプライマーセット：ヒトでは、
ＰＣＲ１８フォワード：5’-ATGTGCTATTTTCAACAGCGTCCATC-3’、配列番号３７；
ＰＣＲ２リバース：5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTA-3’、配列番号３８；
また、マウスまたはラットでは、
ＰＣＲ１フォワード：5’-TTTGTGCCCCGTCTGGAT-3’、配列番号３９；
ＰＣＲ４リバース：5’-GCCTTAGTCCGCGAATTG-3’、配列番号４０
により行われる。
【００６６】
ネステッドＰＣＲにより、ヒト編集および非編集ヒト５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの総てのイソ型を増幅するための用いられる以下の２つのプライマーセットが本発明に、好ましくは、２回目のＰＣＲに用いられるプライマーセットに含まれる：
１回目：
ＰＣＲ９フォワード：5’-TGTCCCTAGCCATTGCTGATATGC-3’（配列番号３５）；
ＰＣＲ１０リバース：5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTAGTC-3’（配列番号３６）；
および２回目：
ＰＣＲ１８フォワード：5’-ATGTGCTATTTTCAACAGCGTCCATC-3’（配列番号３７）；
ＰＣＲ２リバース：5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTA-3’（配列番号３８）。
【００６７】
１回のＰＣＲが存在する場合のＰＣＲ増幅工程で用いられる、または２回のＰＣＲを有するネステッドＰＣＲである場合に２回目に用いられるプライマーは好ましくは標識され、より好ましくは、Ｃ６−ＦＡＭ（ＭＷＧ）またはＶＩＣ(Applied Biosystem)などの蛍光団で標識される。
【００６８】
本発明の方法のさらにまた好ましい実施態様では、該５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの各編集および非編集形態の編集率は、該ｍＲＮＡの編集および非編集型の個々の形態それぞれの編集プロフィールを提供し得るＳＳＣＰ法により決定され、該ＳＳＣＰ法は工程Ａ）、Ｂ）およびＣ）の後に
Ｄ）適当であれば、工程Ｃ）で得られたＰＣＲ産物を精製する工程；
Ｅ）適当であれば、工程Ｄ）で得られたＰＣＲ産物を定量する工程；
Ｆ）特に加熱した後に急冷することにより、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡへ解離させる工程；
Ｇ）キャピラリー電気泳動により一本鎖ＤＮＡを分離する工程；および
Ｈ）蛍光を読み取り、適当であれば、蛍光リーダーに関連づけた取り込み系の手段によりプロフィールデータを取得することにより編集プロフィールを得る工程
を含むことを特徴とする。
【００６９】
５カ所の編集部位を含む５ＨＴＲ２Ｃ  ｃＤＮＡフラグメントの種々の編集形態に相当する種々の一本鎖ＤＮＡの電気泳動移動プロフィールを得ることを、本明細書では「編集プロフィール」と呼ぶ。
【００７０】
好ましい実施態様では、病状のリスク、５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集の変更に関連する病状または供試薬剤の効果を決定するための、請求項１〜４の工程ｃ）で用いられる５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの対照または標準編集率または編集プロフィールは、同じ方法および供試生体サンプルに用いたものと同じ与えられた条件下で該ｍＲＮＡの編集および非編集型の個々の形態のそれぞれに関して得られる特徴的な編集率またはプロフィールである。
【００７１】
一般的な方法では、供試生体サンプル中に存在する編集および非編集型の個々の形態それぞれの品質および／または量を、上記のＳＣＣＰ法などの同じ方法で、供試生体サンプルに用いたものと同じ条件下で得られる、これらの編集および非編集形態のそれぞれの既知の定性的および／または定量的混合物の編集率またはプロフィールと比較することにより評価することができる。
【００７２】
別の態様において、本発明は単離された核酸に向けられ、この核酸は、
配列ATGTGCTATTTTCAACAGCGTCCATC（配列番号３７）を含むか、または有し、好ましくは、多くて１００ヌクレオチド、より好ましくは、９０、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２９、２８、２７および２６ヌクレオチドを有するか；あるいは
配列番号３７のフラグメントｎｔ５〜ｎｔ１４、好ましくは配列番号３７のフラグメントｎｔ４〜ｎｔ１４、ｎｔ３〜ｎｔ１４、ｎｔ２〜ｎｔ１４、ｎｔ１−ｎｔ１４、ｎｔ５〜ｎｔ１５、ｎｔ５〜ｎｔ１６、ｎｔ５〜ｎｔ１７、ｎｔ５〜ｎｔ１６、ｎｔ５〜ｎｔ１７、ｎｔ５〜ｎｔ１８、ｎｔ５〜ｎｔ１９、ｎｔ５〜ｎｔ２０、ｎｔ５〜ｎｔ２１、ｎｔ５〜ｎｔ２２、ｎｔ５〜ｎｔ２３、ｎｔ５〜ｎｔ２４、ｎｔ５〜ｎｔ２５を含む。
【００７３】
さらなる実施態様において、本発明の単離された核酸は標識され、好ましくは蛍光団で標識される。
【００７４】
この態様において、本発明は、本発明の核酸の、プライマーまたはプローブとしての、好ましくは、ＰＣＲ増幅法におけるプライマーとしての、より好ましくは、ネステッドＰＣＲにおける第二のプライマーとしての使用を含む。
【００７５】
本発明は、好ましくはヒト、ラットまたはマウスにおいて、より好ましくはヒトにおいて哺乳類５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集率またはプロフィールを決定するためのキットに関し、該キットは本発明の核酸を含む。
【００７６】
本発明の方法の好ましい実施態様では、単独、または発現ＡＤＡＲの性質および／または量と組み合わせて決定するために選択される細胞は、白血球(blood white cells)または白血球(leucocytes)であるか、または遠心分離後に得られる全血サンプルのバッフィーコートに由来する。
【００７７】
好ましい実施態様では、工程ｂ）において、ＡＤＡＲ発現産物はＡＤＡＲ１、イソ型１５０および／または１１０であり、ＡＤＡＲ２遺伝子発現産物は好ましくは、ＤＡＲ１、イソ型１５０ｋＤおよび／または１１０ｋＤタンパク質、およびＡＤＡＲ２タンパク質をコードするマウス、ラットまたはヒト遺伝子の発現産物である。ヒトが最も好ましい。
【００７８】
タンパク質イソ型１５０ｋＤおよび１１０ｋＤをコードするＡＤＡＲ１  ｍＲＮＡ核酸配列、およびＡＤＡＲ２タンパク質をコードするＡＤＡＲ２  ｍＲＮＡ核酸配列およびそのアミノ酸配列はヒト、マウスまたはラットでは当業者に周知である。
【００７９】
例えば、受託番号の下、Ｇｅｎｂａｎｋに表される以下の配列が特に挙げられる：ＡＤＡＲ１では：
ヒト：ＮＭ＿００１１１１．３；ＮＭ＿００１０２５１０７．１
マウス：ＮＭ＿０１９６５５．２；ＮＭ＿００１０３８５８７．２、
ＡＤＡＲ２では：
ヒト：ＮＭ＿００１１１２．２；ＮＭ＿０１５８３３．２；ＮＭ＿０１５８３４．２およびＮＭ＿００１０３３０４９．１、
マウス：ＮＭ＿１３０８９５．２；ＮＭ＿０１０２４８３７；ＩＮＭ＿０１０２４８３８．１；ＮＭ＿０１０２４８４０．１およびＮＭ＿００１０２４８３９．１。
【００８０】
より好ましい実施態様では、工程ｂ）において、ＡＤＡＲ発現産物はＡＤＡＲ  ｍＲＮＡである。
【００８１】
よって、本発明は、工程ｂ）において、ＡＤＡＲ  ｍＲＮＡの決定が
Ａ）血液サンプル細胞の全ＲＮＡを抽出した後、適当であれば、ｍＲＮＡを精製する工程；
Ｂ）工程Ａ）で抽出されたＲＮＡを、オリゴｄＴプライマーによって逆転写させる工程；および
Ｃ）工程Ｂ）で得られたｃＤＮＡを、定量および／または定性分析される各ＡＤＡＲ  ｍＲＮＡに特異的な少なくとも１対のプライマーを用いてＰＣＲ増幅する工程
を含む方法によって行われる。
【００８２】
好ましい実施態様では、ＡＤＡＲ  ｍＲＮＡ  ＰＣＲ増幅に特異的なプライマー対は、
ヒトＡＤＡＲ１−１５０イソ型ｍＲＮＡの増幅には：
ＥＸ１Ａ  ３４ｐフォワード：5’-GCCTCGCGGGCGCAATGAATCC-3’（配列番号４１）、
ＥＸ２  ５７８ｍリバース：5’-CTTGCCCTTCTTTGCCAGGGAG-3’（配列番号４２）；
ヒトＡＤＡＲ１−１１０イソ型ｍＲＮＡの増幅には：
ＥＸ１Ｂ  ５３４ｐフォワード：5’-CGAGCCATCATGGAGATGCCCTCC-3’（配列番号４３）、
ＥＸ２  ８０４ｍリバース：5’-CATAGCTGCATCCTGCTTGGCCAC-3’（配列番号４４）；
ヒトＡＤＡＲ２  ｍＲＮＡの増幅には：
ＡＤＡＲ２  １２７４ｐフォワード：5’-GCTGCGCAGTCTGCCCTGGCCGC-3’（配列番号４５）、
ＡＤＡＲ２  １４８６ｍリバース：5’-GTCATGACGACTCCAGCCAGCAC-3’（配列番号４６）；
マウスＡＤＡＲ１−１５０イソ型ｍＲＮＡの増幅には：
ＥＸ１Ａ  １９ｐフォワード：5’-GTCTCAAGGGTTCAGGGGACCC-3’（配列番号４７）、
ＥＸ２  ６４６ｍリバース：5’-CTCCTCTAGGGAATTCCTGGATAC-3’（配列番号４８）；
マウスＡＤＡＲ１−１１０イソ型ｍＲＮＡの増幅には：
ＥＸ１Ｂ  ７２ｐフォワード：5’-TCACGAGTGGGCAGCGTCCGAGG-3’（配列番号４９）、
ＥＸ２  ６４６ｍリバース：5’-CTCCTCTAGGGAATTCCTGGATAC-3’（配列番号４８）；および
マウスＡＤＡＲ２  ｍＲＮＡの増幅には：
ＥＸ７  １２８１ｐフォワード：5’-GCTGCACAGTCTGCCTTGGCTAC-3’（配列番号５０）、
ＥＸ９  １６２２ｍリバース：5’-GCATAAAGAAACCTGAGCAGGGAC-3’（配列番号５１）
からなる群から選択される。
【００８３】
本発明の方法の第２の態様では、工程ｂ）において、ＡＤＡＲ発現産物はＡＤＡＲタンパク質である。
【００８４】
よって、本方法の好ましい実施態様では、ＡＤＡＲタンパク質の決定は、
Ａ）所望により、血液サンプル細胞に含まれる全タンパク質を抽出した後、適当であれば、タンパク質の精製工程を行う工程；および
Ｂ）血液サンプル細胞に含まれる各ＡＤＡＲタンパク質の存在、性質および／または濃度を、該ＡＤＡＲタンパク質を特異的に認識することができる抗体、好ましくは標識された抗体の実現により決定する工程
を含む方法により行われる。
【００８５】
この検出または／および定量に使用可能なこれらの抗体としては、限定されるものではないが以下の抗体：
ｓｃ−３３１７９抗ＡＤＡＲ１（Ｈ−１７６）ポリクローナル抗体-；または
ｓｃ−３３１８０抗ＡＤＡＲ２（Ｈ−９０）ポリクローナル抗体(Santa-Cruz)
が挙げられる。
【００８６】
生体サンプルにおいて特定のタンパク質発現を分析または定量するためにはウエスタンブロッティングまたはエライザ法が使用可能である。このような方法は当業者に周知である。
【００８７】
これらのブロットは、マウス、ヒトまたはラットＡＤＡＲ１−１５０またはＡＤＡＲ１−１１０、およびＡＤＡＲ２タンパク質の異なる特異的領域またはエピトープに特異的に向けられた抗体を用いて検出することができる。これらの抗体はポリクローナル抗体であっても、またはモノクローナル抗体であってもよく、必要であれば標識される。このような抗体は免疫原として組換えＡＤＡＲタンパク質またはそのフラグメントを用いて実験室で開発することができる。
【００８８】
以下の例およびまた以下の図面および凡例は本発明の実施および使用を可能とするために当業者に十分な説明を提供するよう選択されたものである。これらの例は、本発明者らがその発明であるとする範囲に限定されるものではなく、以下の実施例が行われたということだけを示すものである。
【実施例】
【００８９】
実施例１：実施戦略
かかる戦略の検証には以下を含めた：
１）マウスおよび／またはラットで得たコンバージェントな病理学的モデルにおいて行う、ある病状におけるヒト脳での編集プロセスの著しい変更の確認、ならびに死後観察による該病状におけるその病因関連性の検証。
２）診断上および治療上の調整に用いることができる非侵襲性レベルにおいて容易に利用できる末梢組織または細胞系統の同定。本発明ではこの戦略の検証を、Ａ−関連編集調節の総てまたは一部の編集プロセスについての適切なマーカー：５−ＨＴ２ｃＲ  ｍＲＮＡ編集プロフィール、編集酵素の異なるイソ型：ＡＤＡＲｌ  −１５０、ＡＤＡＲｌ−Ｉ  ｌＯ、ＡＤＡＲ２の発現についてのマーカーの測定：によって得た。
【００９０】
本発明を検証するために得た結果の一例として表Ｉにマーカーのセットを要約する。これらのマーカーは、ヒト被験体および実験動物または細胞系統由来の提示供給源でのそれらの同定後に提示されている：
【００９１】
表１：５ＨＴ２ｃＲおよび編集酵素の発現レベル。本発明者らは血液サンプルにおいて編集酵素の発現レベルを容易に決定することができることを特に言及する。皮膚サンプルでは５−ＨＴ２ｃＲは発現され、ＡＤＡＲ１および２の編集活性を受け、脳サンプルにおけるこの受容体の編集調節の全般的な状態の調査を完了することができる。
【表２】
0005661458.tif 000004
【００９２】
各マーカーについて、同じ組織または細胞サンプルからのウエスタンブロッティングによりｍＲＮＡの発現レベル、すなわち編集プロフィールの決定とタンパク質のマーカーの決定を果たす可能性を与えるためにサンプルを特に注意深く迅速に抽出する。
【００９３】
表２に使用バイオマーカーの発現レベルの決定に用いる好ましいプロセスを要約する。
【００９４】
【表３】
0005661458.tif 000005
【００９５】
次の実施例により典型的手法および結果を例示する。
【００９６】
実施例２：一脳組織サンプルの完全編集プロフィールの獲得（図１）
製造業者の仕様書に従って(Qiagen Rneasy, Mini Kit)組織または細胞抽出物から全ＲＮＡを抽出し、精製した。抽出したＲＮＡの量および純度を、GeneQuant分光光度計(PharmaciaBiotech)を用いて２６０ｎｍでの吸光度と２６０／２８０ｎｍ比の両方を測定することにより評価した。ゲノムＤＮＡによる汚染の可能性をなくすために、８μｌの各ＲＮＡ（８８ｎｇ〜１．３μｇ間）をさらに、最終用量１０μｌにおいて１単位のＤＮアーゼＩ(Invitrogen)を用いて室温で１５分間処理した。１μｌの２５ｍＭ  ＥＤＴＡを加えることによりこの反応を停止させ、その後、６５℃で１０分間加熱した。ＤＮアーゼＩで処理したＲＮＡ（１０μｌ）の逆転写を、１５単位のThermoScript逆転写酵素(ThermoScript RT-PCR System, Invitrogen)とオリゴ（ｄＴ）プライマーを終濃度２．５μＭで用いて行った。
【００９７】
１μｌの逆転写産物において、２５０ｂｐのフラグメントを生じる第１のＰＣＲ反応（最終用量  ２５μｌ）を、０．２単位のPlatinum Taq  ＤＮＡポリメラーゼ(ThermoScript RT-PCR system, Invitrogen)とヒト５−ＨＴ２ｃＲ  ｃＤＮＡのエキソンＩＶおよびエキソンＶそれぞれに配置される特異的プライマー（フォワードプライマー：5’-TGTCCCTAGCCATTGCTGATATGC-3’（配列番号３５）およびリバースプライマー：5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTAGTC-3’（配列番号３６）；終濃度各０．２μＭ）を用いてさらに行った。ＰＣＲは、９５℃で３分間の変性工程の後、３５サイクル（９５℃で１５秒；６０℃で３０秒；７２℃で２０秒）、および７２℃で２分の最終伸長工程を要した。増幅産物のアリコートを用いて、２％アガロース分析用ゲルにおいて増幅産物を調べた。
【００９８】
第２のＰＣＲおよびキャピラリー電気泳動（ＣＥ）による一本鎖ｃＤＮＡフラグメントの分離
追加のネステッドＰＣＲでは、ＲＴ−１ｓｔ  ＰＣＲ産物、すなわち３２のヒト５−ＨＴ２ｃＲ（または５ＨＴ２ＣＲ）イソ型標準を含む、プラスミドから増幅した２５０ｂｐ  ｃＤＮＡ、の１／５０希釈溶液１μｌを鋳型として用いた。これらの３２の標準は、ヒト５−ＨＴ２ｃＲの非編集（ＮＥ）および編集イソ型に相当する。増幅を最終容量２０μｌにおいてＨＰＬＣ精製蛍光プライマー（フォワードプライマー：FAM-ATGTGCTATTTTCAACAGCGTCCATC-3’（配列番号３７）；リバースプライマー：VIC-GC AATCTTCATGATGGCCTT A-3’（配列番号３８）；終濃度各０．２μＭ）と、０．２単位のPlatinum Pfx  ＤＮＡポリメラーゼ(Invitrogen)を用いて行った。
【００９９】
ＶＩＣ標識リバースプライマーは、ヒト、マウスおよびラットにおいて同一の５−ＨＴ２ｃ受容体の相補配列とハイブリダイズする。一方、ＦＡＭ標識フォワードプライマーの配列は、ヒトサンプルの場合に用いられるが、マウスのものとできる限り近いように設計した。より正確には、ヒトオリゴヌクレオチド配列の５番および６番の位置（ヒト参照Ｕ４９５１６の１１３３番および１１３４番の位置）にあるＴ残基をそれぞれ、ＧおよびＣへと変更した。
【０１００】
上記の２つのプライマーを用いて得たＰＣＲ産物の両鎖の確率的フォールディング経路のシミュレーションを、Ｋｉｎｅｆｏｌｄサーバー（ｋｉｎｅｆｏｌｄ．ｃｕｒｉｅ．ｆｒ）を用いて行った。これらのシミュレーションでは、フォワード鎖およびリバース鎖について得られる最小自由エネルギー構造−ステムループ構造のループ中に組み込まれ、ステムのフォールディング後に、構造全体の他の場所に位置する相補配列とハイブリダイズすることが可能な編集領域−が、マウスサンプルでの使用に成功したマウスネステッドＰＣＲ産物で算出したものと非常に近いことが示された。このプライマーセットは、一本鎖コンフォメーション多型（ＣＥ−ＳＳＣＰ）による非変性キャピラリー電気泳動によるヒト５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集のコンフォメーション解析に最適であることが示された。
【０１０１】
増幅フラグメントは１２７ｂｐ長である。ＲＴ−ＰＣＲに関しては、９４℃で５分の最初の変性工程の後、増幅反応に３５サイクル（９４℃で１５秒；５５℃で３０秒；６８℃で２０秒）および６８℃で２分の最終伸長工程を要した。３１００  Ａｖａｎｔジェネティックアナライザー(Applied Biosystem)での次の解析の前に、この場合も、１２７ｂｐ長の増幅フラグメントの質を２％アガロースゲルにおいて評価した。
【０１０２】
標準的なイソ型（ＤＥＰＣ処理水での１／１００希釈溶液１μｌ）に対応する蛍光ＰＣＲ産物および１１μｌの脱イオン化ホルムアミドで希釈したサンプル（１μｌの１／３０希釈溶液）を、電気泳動図の保持時間の全範囲にわたるＲＯＸ標識移動標準(MWG-BIOTECH, AG)（各０．５μｌ）の混合物に加えた。これらのＲＯＸ標準はＣＥキャリブレーションに、続いて標準およびサンプルのピークの正確な重ね合わせを得るために用いた。９５℃で２分の変性後、サンプルを直ちに氷上で冷却した。非変性ＣＥを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００−Ａｖａｎｔジェネティックアナライザー(Applied Biosystem)で、７％"POP Conformational Analysis Polymer" (Applied Biosystem)、ＩＸ  ＴＢＥを充填し、グリセロールを含まない８０ｃｍ長のキャピラリーを通じて行った。予備泳動を１５ｋＶで３分間実施した後に、サンプルを２ｋＶで１５秒間注入し、電気泳動を２０℃の制御温度において１５ｋＶで１０５分間実施した。これらの条件下で、ＦＡＭ標識またはＶＩＣ標識鎖のいずれかを用いて得られる単一ｓｓＤＮＡコンフォメーションの結果として３２の考えられるイソ型はそれぞれ明確に分解された。イソ型を明確に同定するために異なる保持時間を用いた。
【０１０３】
各脳サンプルにおける各イソ型の同定および相対定量
電気泳動シグナルを、インハウスソフトウエアを用いてさらに処理した。まず、各サンプルの電気泳動プロフィールの時間基準を、移動標準のＲＯＸ標識鎖を用いて調整した。これによってＦＡＭ標識鎖およびＶＩＣ標識鎖により標準およびサンプルのシグナルを独自の時間基準において正確にデコンボリュートすることが可能となった。次いで、バックグラウンドを調整し減じた後、各シグナル下の全面積をノーマライズ化した。
【０１０４】
各イソ型の相対的割合を、デコンボリュートしマーライズした脳サンプル解析シグナルそれぞれのベストフィッティングにより処理した。これは、３２の同様にデコンボリュートしノーマライズした標準解析シグナルにより表される積分シグナルの反復調整により実施した。計算は、ＳＳＣＰシグナル
【数１】
0005661458.tif 000006
（式中、Ｒｉ（ｔ）、ｉ∈｛1, ....,N}）
は標準シグナルおよびシグナルにおけるそれらそれぞれの％ｇｉであるという仮説Ｎに基づいた。ベストフィッティングは残差平方和（ＳＳＥ）
【数２】
0005661458.tif 000007
による平方和を最小にし、最小二乗統計解析により制御した。
【０１０５】
このベストフィッティングの結果を
【数３】
0005661458.tif 000008
（式中、ＳＳＭは
【数４】
0005661458.tif 000009
などの平均二乗和である）
などのｒ２値を計算した後に統計学的に評価した。最大理論ベスフィッティングではｒ２＝１となる。
【０１０６】
総ての試験をブラインド条件下で行い、ＲＴ−ＰＣＲおよび第２のＰＣＲ反応では総てのサンプルを同じバッチでアッセイした。ベストフィッティングの結果より個々のサンプルに特異的な編集プロフィールを得、そしてそれは全解析シグナルの各編集および非編集形態の割合によって決定した。統計解析にはこれらの初期値を用いた。
【０１０７】
この方法により、発現されたｍＲＮＡイソ型それぞれの割合を得、抽出物中に存在する５−ＨＴ２ｃ受容体の総数に占める割合として表される。
【０１０８】
本明細書では一例として３２のヒトイソ型の同定表を示し、それにおいては各ＦＡＭおよびＶＩＣ標識鎖により一連の保持時間を示している（図１参照）。２つの鎖の使用により３２の標準イソ型の全同定を解決することができることを言及するのは容易である。
【０１０９】
このプロセッシングの主な利点は、ある濃度の５ＨＴ２ｃＲ  ｍＲＮＡにおける５ＨＴ２ｃＲイソ型発現物分布（編集プロフィール）の完全定量を与えることである。これは、単独アッセイから得られ、ある状況下でのこのプロフィールの特徴を容易に決定することを可能にする。
【０１１０】
この技術を用いて、自殺したことのある６名の鬱病患者群において鬱病患者群を特徴付ける特異的なサインを立証することができた。このサインは、脳の背側前頭前野において起こる編集プロセスの調節異常についての興味深い情報を与え、鬱病患者の皮膚および血液サンプルにおいて編集酵素の定常状態を探査する重要性を強く裏付ける。
【０１１１】
実施例３：ヒトおよびマウス皮膚における５ＨＴ２ＣＲ発現
５−ＨＴ２ｃ受容体および編集酵素が皮膚に存在していることから、皮膚は末梢において５−ＨＴ２ｃＲ編集および編集酵素の発現レベルの両方を測定するための興味深い供給源であり得た。
【０１１２】
図２は、ヒト（Ａ）またはマウス（Ｂ）皮膚サンプルからのポリＡ＋ＲＮＡの抽出後に実施したＲＴＰＣＲの典型的な対照を表している。
【０１１３】
第２ネステッドＰＣＲ産物のＳＳＣＰ産物のキャピラリー電気泳動分離を適用することにより、ヒトおよびマウス皮膚では、ＡＤＡＲｌおよびＡＤＡＲ２編集酵素は活性があるということ、そして病理学的または生理病理学的状態はこの末梢組織において５−ＨＴ２ｃＲの編集調節を変更し得るということの証明が成し遂げられた。
【０１１４】
実施例４：ＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２イソ型の発現の位置および性質
先のバリデーション実験により推定されたように、ＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２の発現はマウスおよびヒト皮膚の皮膚サンプルで発現されることが分かった。
【０１１５】
図３は、ＡＤＡＲ１  １５０、ＡＤＡＲ１  １１０およびＡＤＡＲ２のＲＴ／ＰＣＲ同定の対照の一例を示す。
【０１１６】
ヒトにおいて、少量の血液を採取した後、編集酵素の発現のレベルを同定し、容易に定量することが可能であった。
【０１１７】
新鮮な採取血液１ｍｌ当たり１〜２×１０６の白血球の典型的収率で、５ｍｌ量で、逆転写反応に関して十分全ＲＮＡを単離することができる。血液サンプル（５ｍｌ）をヘパリン処理した試験管に採取する。以下のプロトコールステップは無菌条件下ですぐに行わなければならない。抗凝固サンプル材料を等量の０．９％ＮａＣｌ無菌溶液または１×ＰＢＳ無菌溶液、またはＲＰＭＩ  １６４０無菌培養培地で希釈する。分離媒体（例えば、フィコール−パークプラス、GE Healthcare Bio-Sciences AB、参照番号：１７−１４４０−０２または１７−１４４０−０３）を使用直前に室温まで温め、遮光しなければならない。１５ｍｌ  ＬｅｕｃｏＳｅｐ試験管（Greiner Bio-One、参照番号：１６３  ２８９または１６３  ２９０）に３ｍｌの分離媒体を入れる。室温、１０００ｇで３０秒遠心分離する（その後、分離媒体は試験管の有孔バリアの下へ行く）。予め分離媒体を入れたＬｅｕｃｏＳｅｐ試験管を用いると、上述のステップを取り消すことができる（参照番号：１６３  ２８８または２２７  ２８８）。これらの試験管を単にＲＴまで温める。上述の希釈材料サンプル（平衡塩溶液またはＲＰＭＩ１６４０中で１：２、上記参照）を１５ｍｌのＬｅｕｃｏＳｅｐ試験管に注意深く注ぐ。室温、１０００ｇで１０分、または室温、８００ｇで１５分間、スイングバケットローターで遠心分離する。
【０１１８】
遠心分離のスイッチオフ制御
遠心分離後、パスツールピペットにより富化細胞画分（リンパ球／ＰＢＭＣ＝ホワイトリング）を採取する。この富化細胞画分を１０ｍｌの１×ＰＢＳ無菌溶液で洗浄した後、２５０ｇで１０分遠心分離する。洗浄工程を２回繰り返す。最後の遠心分離では、ペレットを、１ｍｌ  １×ＰＢＳ無菌溶液に再懸濁させることによりマイクロ遠心管（１．５ｍｌエッペンドルフ管）に採取しなければならない。最後の遠心分離（室温、２５０ｇで１０分）後、上清を廃棄し、この富化細胞画分の「乾燥」ペレットをすぐにＲＮＡレーザーＲＮＡ安定化試薬（Qiagen、参照番号：７６１０４または７６１０６）で覆う。浸漬したペレットを２〜８℃で保存し、リンパ球／ＰＢＭＣ遺伝子発現プロフィールをこの温度で最大４週間安定化させることができる。ＲＮＡレーザー試薬中でサンプルを輸送する場合は、ペレットが常に試薬中に浸漬した状態を維持するように確保する。輸送の際は試験管をまっすぐ維持するか、または安定化溶液で試験管を完全に満たす。輸送中、試験管はブルーアイスパックを満たしたポリスチレンボックスで維持することができる。より良い溶液は１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen、参照番号：１５５９６−０２６）中に富化細胞画分のペレットをそのまま横たえ、室温で維持し、輸送することができる。この溶解試薬はフェノールを含み、サンプル試験管はしっかり密閉しなければならない。実際、備品供給者(Invitrogen)が記載しているように、ＴＲＩｚｏｌ試薬（上記参照）中の白血球溶解液は、後に、全ＲＮＡ（水相）およびタンパク質（有機相）の双方を抽出することが可能である。試験管は、室温またはドライアイス中で輸送することができる。
【０１１９】
バリデーションの一例を図４に示し、ヒト脳、皮膚およびＣＤ４およびＣＤ８血液細胞サンプルにおける編集酵素のＲＴＰＣＲ産物の対照が示されている。
【０１２０】
従って、ヒトにおいて、図５に示されている対照実験に表されているように、脳（剖検）、皮膚および血液サンプル（診断研究）における編集酵素の発現を正確に分析することができる。
【０１２１】
表２の総ての要素がバリデートされ、十分な生理病理学または薬理病理学的モデルから得られるディープバリデーションを用い、ヒトにおけるいくつかの病態の診断および処置におけるバイオマーカーとしての、血液および皮膚編集酵素発現および皮膚の５−ＨＴ２／Ｃ編集プロフィールの分析の厳密な条件および限界の解明が可能となる。
【０１２２】
実施例５：患者対照サンプルと比較した場合の、自殺鬱病患者剖検脳サンプルにおける５−ＨＴ２ｃ受容体のイソ型の分析
図１に示された分析プロセスは、剖検脳サンプルにおける５−ＨＴ２ｃ受容体の総てのイソ型の分析を可能とする。６人の対照患者および注意深く選択した自殺鬱病患者の研究は、（１）特異的な脳領域が編集型および非編集型５−ＨＴ２ＣＲイソ型の特異的分布パターンを示すこと、および（２）この分布パターンがヒト前側帯状皮質および背側前頭皮質で有意に変更され、これらが大鬱の病態生理学に関与していることを示した。イソ型の特徴におけるこれらの変化を表３に示し、これらは前側帯状皮質において見られる効果を示す。重要なことに、この技術は、対照と比べて増加方向または減少方向の双方でイソ型の優勢度の劇的変化を評価することができ、それらの変化の基礎にある潜在的な酵素の機能不全に洞察を与える。ここでは、例えば、ＡＤＡＲＩ活性（Ａ部位とＢ部位を特異的に編集し、Ｃ部位には特異性が低い）がアップレギュレーションされている。
【０１２３】
表３：対照および自殺鬱病患者患者で得られた編集プロフィール。両群（各ｎ＝６）の患者で全編集プロフィールを評価した。結果は、全イソ型のパーセントとしてのイソ型の優勢度を示し、平均±ＳＥＭで示される。全イソ型の分布と個々の編集部位に応じた分布、の徴候の２つの側面をＡＮＯＶＡ  ＩＩにより分析した。
【表４】
0005661458.tif 000010
【０１２４】
実施例６：マウスにおけるインターフェロンα２処置は血液におけるＡＤＡＲ１発現の有意な増加を誘発する。この末梢効果はまた皮膚および脳においても確認される。
この実験はＢａｌｂ／ｃＪマウスで行った。２０，０００ＩＵ用量のマウスαインターフェロンをＩＰ経路により注射し、注射後３時間、６時間および８時間の時点でマウス群（ｎ＝８）を犠牲にした。対照群（ｎ＝８）は０時間の時点で犠牲にした。血液、皮膚および脳は、ＲＮＡ分解を避けるためすぐに処理した。各組織サンプルから全ＲＮＡを抽出し、誘導型ＡＤＡＲ１をコードする特異的ｍＲＮＡを、参照としてＧＡＰＤＨ内因性遺伝子を用い、ＱＰＣＲにより定量した。これらの結果を図６にまとめる。それらは明らかに、インターフェロンで処置したマウスの血液サンプルにおいてＡＤＡＲ１発現の有意な増加が見られ、皮膚サンプルおよび前頭皮質でも増幅応答が見られることを示す。
【０１２５】
さらに、５−ＨＴ２ｃＲの編集プロフィールを、８時間目に犠牲にした対照およびインターフェロン処置マウスの前頭領域において従前に記載された（実施例２参照）方法に従って調べた。表４では、以下のことが容易に分かる。
１）これらの実験条件では、脳においてＡＤＡＲ１発現誘導がすぐに見られた後、５−ＨＴ２ｃＲの編集プロセスの有意な初期の変更が８時間目に見られる。ＡＢＣＤおよびＡＣＤイソ型を含む１２の編集イソ型の群では有意な増加が見られた。それらは全５−ＨＴ２ｃＲ  ｍＲＮＡの３０％を占める。
２）この群の編集部位の割合の分析は、明らかに、編集されていることが判明したＡ、ＢおよびＣ部位の割合において有意な増加を示す。それらは主としてＡＤＡＲ１のより大きな活性によるものであると解釈することができる。これは分析が、もっぱらＡＤＡＲ１によるものであるこの群のイソ型に限られた場合に確認されたものである。
【０１２６】
表４：インターフェロン処置後の５−ＨＴ２ｃＲ  ｍＲＮＡの編集プロフィールの変更の分析。それぞれにおいて、全編集プロフィールを、受容体の全特異的ｍＲＮＡにおける各編集イソ型の割合として評価した。表されている結果は注射後８時目に犠牲にした対照およびインターフェロン処置マウスの平均±ＳＥＭである。ｐ値はスチューデント検定から算出した。編集イソ型の合計からインターフェロン処置群で増加したことが分かり、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ部位の割合からこの群のイソ型で編集されたこと、およびもっぱらＡＤＡＲ１の特異的作用の結果であるこの群のイソ型により表されるｍＲＮＡの相対的割合が分かる。
【０１２７】
最後に、末梢（血液）におけるＡＤＡＲ発現における変化の評価は脳における編集の重要な変更の推定を可能とし、これはいくつかの治療分野ですでに用いられているいくつかの処置様式に対する二次的効果を説明し得るという提案が理にかなったものとなる。
【０１２８】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】ヒト被験体の対照群の個々の前側帯状皮質シグナルのそれぞれから算出された電気泳動ＳＳＣＰシグナルの平均（黒い線）（実験データ）。これらのシグナルの平均値＋ＳＥＭに相当する曲線も示す（緑の線）。横座標(abcissae)は、１００００点の時間基準（６．２点／秒）を表し、縦座標は全シグナルのノーマライゼーション後の任意の蛍光単位で示す。示されたシグナルは、ＦＡＭ（左の部分）およびＶＩＣ（右の部分）標識された鎖に相当する。個々の標準で見られた電気泳動シグナルのいくつかの典型例がそれらの対応するＦＡＭおよびＶＩＣ標識における陰性として表されている。図の左および右部分の表は、ユニークな基準時間に適用された、ＦＡＭ（左）またはＶＩＣ（右）プローブで標識された特定の編集イソ型の各標準一本鎖の異なる主要な電気泳動ピーク（最大値）の位置を表している。確認されたピークの２つの最大値は、それらの間隔が上記に定義した基準時間の１５以上の点であった場合には分離することができる。１つの標識鎖の電気泳動パターンからピークが分離できない場合があり、それ以外からは分離分解されたことに注意（これらの場合は同じ色で識別される）。
【図２】ヒトおよびマウス皮膚における５−ＨＴ２ｃＲ転写物の同定。（Ａ）ヒトまぶたポリＡ＋ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ（レーン１〜３）を、２つの特異的プライマーＰＣＲ９およびＰＣＲ１０を用いて１回目のＰＣＲにより増幅した。次に、これらの第一の産物に対してプライマーＰＣＲ１８およびＰＣＲ２を用いてネステッドＰＣＲを行った（レーン６〜８）。得られた産物を２％アガロースゲル上で分離した。増幅産物の推定サイズは１回目および２回目のＰＣＲでそれぞれ２５０ｂｐおよび１２７ｂｐ長である。各プライマーセットについて陰性対照（レーン４および９）および陽性対照（レーン５および１０）が示されている。１００ｂｐ  ＤＮＡラダー／マーカーがＭで示されている。（Ｂ）Ｂａｌｂ／ｃマウス皮膚ポリＡ＋ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡを、１回目のＰＣＲにより、２つの遺伝子特異的プライマーＰＣＲ９およびＰＣＲ１０を用いて増幅した（レーン１〜６）。次に、これらの最初の増幅物に対してプライマーＰＣＲ１およびＰＣＲ４を用い、２回目のＰＣＲを行った（レーン９〜１４）。各プライマーセットについて陰性対照（レーン７および１５）および陽性対照（レーン８および１６）が示されている。得られた産物を２％アガロースゲル上で分離した。増幅産物の推定サイズは１回目および２回目のＰＣＲでそれぞれ２５０ｂｐおよび１３８ｂｐ長である。Ｍは１００ｂｐ  ＤＮＡラダー／マーカーである。
【図３】Ｂａｌｂ／ｃマウス血液および皮膚においてＡＤＡＲイソ酵素のｍＲＮＡが明らかに同定される。（Ａ）全血ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ（レーン４）および皮膚ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ（３つの異なる時点、すなわち、それぞれ３０分、２時間および４時間の逆転写に相当するレーン１〜３）を、ＡＤＡＲ１の構成型（ｐ１１０）および誘導型（ｐ１５０）に特異的プライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した。２％アガロースゲル上で分離した、得られた増幅産物はそれぞれ６７４ｂｐ（ｐ１５０イソ型）および６８３ｂｐ（ｐ１１０イソ型）長である。陰性対照（レーン５）および１００ｂｐ  ＤＮＡラダー／マーカー（Ｍ）を示す。追加免疫対比は、全血細胞において転写された構成型のＡＤＡＲ１に相当する微弱なバンドの検出を可能とする（レーン４、ｐ１１０）。（Ｂ）（Ａ）と同様であるが、皮膚および全血におけるＡＤＡＲ２転写物に相当するＰＣＲ増幅が示される。ＰＣＲ産物は３６６ｂｐ長である。ここでもまた、全血で、構成型のＡＤＡＲ１に相当する極めて微弱なバンドが見られた（レーン４、ｐ１１０）。
【図４】ヒト白血球における誘導型ＡＤＡＲ１転写物の同定。（Ａ）ヒト末梢血白血球全ＲＮＡから（レーン１０）、またヒト血液画分によりノーマライズされたライブラリーから（レーン１〜９）調製されたｃＤＮＡを、誘導型のＡＤＡＲ１（ｐ１５０）特異的なプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。得られた産物を２％アガロースゲル上で分離した。増幅産物の推定サイズは５４４ｂｐ長である。レーン１および６；２および７；３および８はそれぞれ、休止中および活性型の単核細胞、休止中および活性型のＣＤ４＋、ならびに休止中および活性型のＣＤ８＋細胞に相当する。レーン４および５：休止中ＣＤ１４＋およびＣＤ１９＋細胞。レーン９：活性型ＣＤ１９＋細胞。レーン１１：対照として用いたヒト胎盤由来ｃＤＮＡ。１００ｂｐ  ＤＮＡラダー／マーカーがＭで示されている。ＰＣＲ陽性（ヒト胎盤ｃＤＮＡを伴うＧ３ＰＤＨプライマー、レーン１３）およびＰＣＲ陰性対照（レーン１２）を示す。（Ｂ）（Ａ）の繰り返し。レーン１〜９は（Ａ）のレーン１〜９と同じ。レーン１０：ヒト胎盤ｃＤＮＡ。
【図５】ヒト背側前頭皮質、皮膚およびＣＤ４＋およびＣＤ８＋血液細胞におけるＡＤＡＲ１  ｐ１１０、ＡＤＡＲ１  ｐ１５０およびＡＤＡＲ２転写物の同定。（Ａ）ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋血液画分によりノーマライズされたライブラリー由来のｃＤＮＡ（レーン１および２）；ＤＰＦＣ全ＲＮＡから調製したもの（レーン３および４）およびヒトまぶたポリＡ＋ＲＮＡから調製したもの（レーン５）をそれぞれＡＤＡＲ１  ｐ１１０およびＡＤＡＲ１  ｐ１５０用の２つの特異的プライマーセットＥＸ１Ｂ  ５３４ｐ／ＥＸ２  ８０４ｍおよびＥＸ１Ａ  ３４ｐ／ＥＸ２  ５７８ｍを用いてＰＣＲにより増幅した。得られた産物を１．７５％アガロースゲル上で分離した。増幅産物の推定サイズは２７０ｂｐ（ＡＤＡＲ１  ｐ１１０）および５６６ｂｐ（ＡＤＡＲ１  ｐ１５０）である。各プライマーセットについて陰性対照（レーン６）および陽性対照（レーン７、ヒト胎盤ｃＤＮＡ）が示されている。１００ｂｐ  ＤＮＡラダー／マーカーをＭで示す。（Ｂ）Ａ）と同様のｃＤＮＡを、それぞれＡＤＡＲ２およびＧ３ＰＤＨ（陽性対照）のために、遺伝子特異的プライマーセットＡＤＡＲ２  １２７４ｐ／ＡＤＡＲ２  １４８６ｍおよびＧ３ＰＤＨ−Ｆ／Ｇ３ＰＤＨ−Ｒを用いてＰＣＲにより増幅した。得られた産物を１．７５％アガロースゲルネガティブ上で分離した。ＡＤＡＲ２の推定サイズは２１２ｂｐ長である。
【図６】ｔ０におけるインターフェロンα２ａマウスインターフェロンの１回のＩＰ注射（２００００ＩＵ）後の前頭皮質（図６Ａ）、皮膚（図６Ｂ）および血液（図６Ｃ）サンプルにおいてＱＰＣＲにより測定された特異的ｍＲＮＡにおけるＡＤＡＲ１の濃度の上昇。効果は、１においてノーマライズされた対照値からの増加倍率として表されている。＊ｐ＜０．０５。
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図１】
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【配列表】
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