(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う、流路断面が長方形であり全体として円環状であり縦置き配置される環状容器と、
前記環状容器を形成する対向基板の一方の内面に配置される２つの電極からなり、反応液の流れの全幅に亘り、該流れに交差し、かつ、水平のギャップ中心線となるギャップを挟んで対向して配置される電極対と、
前記電極対に交流電圧を印加して反応液に交流電流を流すことによってジュール熱を発生させて、該反応液を上昇させると共に該反応液の温度を制御する制御手段と
を備えることを特徴とするＰＣＲ装置。
【請求項２】
ポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う、流路断面が長方形であり全体として円環状であり縦置き配置される環状容器と、
前記環状容器を形成する対向基板のそれぞれの内面に１つずつ配置される電極からなり、反応液の流れの全幅に亘り、該流れに交差し、かつ、水平のギャップ中心線となるギャップを挟んで対向して配置される電極対と、
前記電極対に交流電圧を印加して反応液に交流電流を流すことによってジュール熱を発生させて、該反応液を上昇させると共に該反応液の温度を制御する制御手段と
を備えることを特徴とするＰＣＲ装置。
【請求項３】
ポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う、流路断面が長方形であり全体として円環状であり縦置き配置される環状容器を形成する対向基板の一方の内面に配置される２つの電極からなり、反応液の流れの全幅に亘り、該流れに交差し、かつ、水平のギャップ中心線となるギャップを挟んで対向して配置される電極対を設け、該電極対に交流電圧を印加して反応液に交流電流を流すことによってジュール熱を発生させて、該反応液を上昇させると共に該反応液の温度を制御することを特徴とするＰＣＲ方法。
【請求項４】
ポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う、流路断面が長方形であり全体として円環状であり縦置き配置される環状容器を形成する対向基板のそれぞれの内面に１つずつ配置される電極からなり、反応液の流れの全幅に亘り、該流れに交差し、かつ、水平のギャップ中心線となるギャップを挟んで対向して配置される電極対を設け、該電極対に交流電圧を印加して反応液に交流電流を流すことによってジュール熱を発生させて、該反応液を上昇させると共に該反応液の温度を制御することを特徴とするＰＣＲ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction：ポリメラ−ゼ連鎖反応）装置及びＰＣＲ方法に関し、特に、チャネルの小容量化及び加熱均一化を図るＰＣＲ装置及びＰＣＲ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の反応液のジュール加熱によるＰＣＲ方法は、直流電流を反応液に流すものであるので、反応液が電気分解してしまい、電極の周辺に不要な気体の発生や、不要な酸性及びアルカリ性の溶液が発生してしまう。また、長いチャネルの両端に電圧を印加するものであるので、必要なジュール熱を発生させるためには高い電圧を印加しなければならならず、回路負担が大きかった。
【０００３】
そこで、例えば特許文献１には、ポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う容器の内面に、反応液の流れに沿うギャップを挟んで対向して配置される電極対を設け、該電極対に交流電圧を印加して反応液に交流電流を流すことによってジュール熱を発生させて前記反応液の温度を制御するＰＣＲ装置が記載されている。
【０００４】
図６は、特許文献１に記載のＰＣＲ装置の反応容器の正面図である。
図６に示すように、特許文献１に記載のＰＣＲ装置は、カバー板４１、排出口４２、注入口４３、チャネル４４、電極対４５、チャネル形成板４６、及び基板を備え、反応容器は鉛直方向に立っている。特許文献１に記載のＰＣＲ装置は、電極対４５の間のギャップにおいて反応液の中に電流を流して、そのジュール熱によって反応液を加熱してＰＣＲ増幅する。反応液は、環状のチャネル４４を循環することで、温度が上昇及び下降してＰＣＲサイクルの温度変化を受けてＰＣＲ増幅する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１-１１５１５９号公報（図４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載のＰＣＲ装置は、環状のチャネル４４に直線部分があるために小型化の妨げとなり、チャネルの小容量化は困難であった。
また、電極対４５が細く長いものとなるので、製造精度が高くなければならない。また、電流が流れる電極対４５のギャップがチャネル断面内の中央だけであるので、加熱される部分が断面内の中央だけになってしまって温度むらが発生していた。
【０００７】
本発明は、上記問題点に鑑み、チャネルの小型化、小容量化及び加熱均一化を図ることができるＰＣＲ装置及びＰＣＲ方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係るＰＣＲ装置は、ポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う、流路断面が長方形であり全体として円環状であり縦置き配置される環状容器と、前記環状容器を形成する対向基板の一方の内面に配置される２つの電極からなり、反応液の流れの全幅に亘り、該流れに交差し、かつ、水平のギャップ中心線となるギャップを挟んで対向して配置される電極対と、前記電極対に交流電圧を印加して反応液に交流電流を流すことによってジュール熱を発生させて、該反応液を上昇させると共に該反応液の温度を制御する制御手段とを備えることを特徴とする。
また、本発明に係るＰＣＲ装置は、ポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う、流路断面が長方形であり全体として円環状であり縦置き配置される環状容器と、前記環状容器を形成する対向基板のそれぞれの内面に１つずつ配置される電極からなり、反応液の流れの全幅に亘り、該流れに交差し、かつ、水平のギャップ中心線となるギャップを挟んで対向して配置される電極対と、前記電極対に交流電圧を印加して反応液に交流電流を流すことによってジュール熱を発生させて、該反応液を上昇させると共に該反応液の温度を制御する制御手段とを備えることを特徴とする。
【０００９】
本発明に係るＰＣＲ方法は、ポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う、流路断面が長方形であり全体として円環状であり縦置き配置される環状容器を形成する対向基板の一方の内面に配置される２つの電極からなり、反応液の流れの全幅に亘り、該流れに交差し、かつ、水平のギャップ中心線となるギャップを挟んで対向して配置される電極対を設け、該電極対に交流電圧を印加して反応液に交流電流を流すことによってジュール熱を発生させて、該反応液を上昇させると共に該反応液の温度を制御することを特徴とする。
また、本発明に係るＰＣＲ方法は、ポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う、流路断面が長方形であり全体として円環状であり縦置き配置される環状容器を形成する対向基板のそれぞれの内面に１つずつ配置される電極からなり、反応液の流れの全幅に亘り、該流れに交差し、かつ、水平のギャップ中心線となるギャップを挟んで対向して配置される電極対を設け、該電極対に交流電圧を印加して反応液に交流電流を流すことによってジュール熱を発生させて、該反応液を上昇させると共に該反応液の温度を制御することを特徴とする。
【００１０】
また、前記電極対は、前記環状容器を形成する対向基板の一方に配置される２つの電極からなることで、一方の基板にだけに電極を形成すれば済むので、製造コストを低減できる。
【００１１】
また、前記電極対は、前記環状容器を形成する対向基板のそれぞれに１つずつ配置される２つの電極からなることで、環状容器の幅方向だけでなく、深さ方向においても、均一に加熱することができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、チャネルの小型化、小容量化及び加熱均一化を図ることができるＰＣＲ装置及びＰＣＲ方法を実現する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施例１によるＰＣＲ装置の反応容器の構成を示す図である。
【図２】本発明の実施例１によるＰＣＲ装置の反応容器のリングチャネル及び電極対を示す斜視図である。
【図３】本発明によるＰＣＲ装置の反応容器を用いた増幅特性を示す図である。
【図４】本発明によるＰＣＲ装置の反応容器を用いた融解特性を示す図である。
【図５】本発明の実施例２によるＰＣＲ装置の反応容器の構成を示す図である。
【図６】従来例のＰＣＲ装置の反応容器の正面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、添付図面を参照しながら本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
【実施例１】
【００１５】
図１は、本発明の実施例１によるＰＣＲ装置の反応容器の構成を示す図であり、図１（ａ）は、その正面図、図１（ｂ）は、その底面図、図１（ｃ）は、その側面図である。
また、図２は、リングチャネル（Ring Channel）２０及び電極対２１を示す斜視図である。なお、本発明の実施例では、「上」は鉛直方向の上方、「下」は鉛直方向の下方、「水平」又は「水平方向」は鉛直方向と直交する方向とする。また、「前」は正面から見て手前方向、「後」は正面から見て後ろ方向、「左」は正面から見て左方向、「右」は正面から見て右方向、「垂直」は水平方向に直交する鉛直方向をいう。
まず、ＰＣＲ装置の構成について説明する。
【００１６】
図１に示すように、ＰＣＲ装置１の反応容器１０（環状容器）は、基板１１、チャネル形成板１２、及びカバー板１３を備える。基板１１とチャネル形成板１２とカバー板１３とによって環状の管状のリングチャネル２０を形成する。リングチャネル２０は、環状であり、例えば円環状のチャンバである。
【００１７】
図２に示すように、リングチャネル２０は、直径方向が水平面に対して垂直方向に立ち上がるように縦置き配置される。リングチャネル２０の外径Ｌは、好ましくは１〜３ｍｍ、例えば２ｍｍである。また、リングチャネル２０は、円形開口部２０ａを有し、リングチャネル２０の内径Ｌ１は、好ましくは０．５〜１．５ｍｍ、例えば１ｍｍである。すなわち、リングチャネル２０は、例えば外径２ｍｍと内径１ｍｍとの間に流路を有する円環チャンバである。なお、本実施例では、リングチャネル２０の中心点と円形開口部２０ａの中心点とを一致させているので、リングチャネル２０の外径と内径との間の流路の幅は全周にわたって等しい。当該中心点は多少はずれていても良い。リングチャネル２０の流路深さＤは、チャネル形成板１２の厚さによって決定され、好ましくは１００〜３００μｍ、例えば２００μｍである。また、リングチャネル２０の流路体積は、好ましくは０．３〜１．０μＬ、例えば０．４７μＬである。この場合、流路断面は５００μｍ×２００μｍの長方形である。
【００１８】
図１に示す基板１１は、ガラス製であり上面に薄いクロム、その上に金を蒸着して作成した電極対２１がパターニングされ、電極対２１からは引出し電極部２２がリングチャネル２０の外周側に引き出されている。電極対２１及び引出し電極部２２は、金蒸着により形成され、膜厚は極めて薄く、殆ど無視することができる。このため、基板１１上に電極対２１が形成されていても反応液の流れが妨げられることはない。
【００１９】
図１及び図２に示すように、電極対２１のギャップ幅Ｇは、好ましくは１０〜５００μｍ、例えば１００μｍ、ギャップ長ＧＬは、好ましくは０．２５〜１ｍｍ、例えば０．５ｍｍである。引出し電極部２２は、例えば４ｍｍである。図２に示すように、リングチャネル２０は、その直径方向が垂直方向に立ち上がるように配置されると共に、電極対２１はそのリングチャネル２０の左右の少なくとも一方に配置される。また、電極対２１のギャップの中心線（図２の一点鎖線参照）は、水平方向である。この例では、電極対２１のギャップは、リングチャネル２０の左側においてリングチャネル２０を水平に横断する。反応液は、電極対２１によってジュール加熱され変成温度にされると共に、ジュール加熱を受けて電極対２１の周辺で上昇流となる。この場合、リングチャネル２０の左側における電極対２１のギャップの位置で反応液流れは上昇である。これにより、電極対２１のギャップの中心線に交差する方向に反応液を上昇させて、環状のリングチャネル２０内において反応液を循環させる。
【００２０】
このように、リングチャネル２０は、電極対２１のギャップの中心線（図２の一点鎖線参照）が水平であり、その中心線に交差する方向に反応液を上昇させて、環状のリングチャネル２０内において反応液を循環させることができる。
【００２１】
本実施例は、電極対２１のギャップが水平にリングチャネル２０を横断するので、加熱領域が小さく、その分だけ加熱のパワーが小さいものの、リングチャネル２０自体が小さく、したがってリングチャネル２０内を循環する反応液が少ないので、十分にＰＣＲサイクルを実現することができる。また、電極対２１のギャップ長ＧＬがチャネル断面内の全幅にわたっているので、流れる溶液の断面全体を加熱することができる。
【００２２】
チャネル形成板１２は、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）製であり、基板１１の上に接着されて配置される。チャネル形成板１２は、基板１１とカバー板１３との間を所定距離に保つスペーサとしての機能を有し、その厚さ（例えば２００μｍ）はリングチャネル２０の流路深さＤとなる。チャネル形成板１２には、リングチャネル２０を形成する環状溝が設けられる。また、この環状溝の上端の電極対２１側に反応液の注入ウェル１５が、下端の電極対２１から離隔する側に反応液の排出ウェル１６がそれぞれ設けられる。
カバー板１３は、ガラス製であり、チャネル形成板１２の全面を覆うことよってリングチャネル２０を形成する。
【００２３】
リングチャネル２０の上下端の注入ウェル１５及び排出ウェル１６に接する基板１１の部分には、厚み方向に貫通孔（図示省略）が開けられ、この貫通孔にチューブ（図示省略）を接続して反応液の流入流出が行われる。
【００２４】
制御部３０（制御手段）は、ＰＣＲサイクルを行うために必要な交流電圧を電極対２１に印加する。交流の周波数は、１０ｋＨｚ〜１０ＭＨｚ、例えば１ＭＨｚである。リングチャネル２０内の僅かな量の反応液と比べて大きな電極を用いることができ、かつ反応液を直接加熱する構成を採用しているので、電圧印加に対する反応液温度応答の時定数は１秒以内とすることができる。
【００２５】
以下、上述のように構成されたＰＣＲ装置の動作について説明する。
ＰＣＲサイクルは、例えば次のステップを順に２０〜３０サイクル繰返し行う。
(1)  変性（≒９４℃）を２から１０秒
(2)  アニール（５４〜６６℃）を５秒
(3)  伸長（≒７２℃）を５から１５秒
【００２６】
実際には、アニールと伸長を同じ温度で行う２ステップのＰＣＲサイクルとして、反応容器１０を囲む環境をアニール・伸長温度に保ち、変成温度となるように電極対２１に対応する交流電圧を印加する。これにより、反応液に交流電流を流し、ジュール熱によって反応液を加熱することによって反応液の温度を制御して、ＰＣＲサイクルを行う。
【００２７】
本実施例は、反応液に交流電流を流すので、反応液を電気分解することはない。また、電極対２１のギャップに電流を流すので、ギャップを流れる電流は距離が短いから、負荷抵抗が小さく、低い印加電圧であってもＰＣＲサイクルの温度制御に十分なジュール熱を発生させることができる。
【００２８】
さらに、本実施例のリングチャネル２０を用いる場合、オンラインプロセスとして、前段又は後段のプロセスと連結できる。前段としては、細胞のすりつぶし、遺伝子の取り出しと精製、又は遺伝子の細分化などが考えられ、また後段としてしては、電気泳動分析、マイクロアレイ分析、又は質量分析装置への接続、さらにはチューブを介さずに直接マイクロチャネルで接続する一体型のデバイスとして、様々な遺伝子分析方法をつなげることができる。
【００２９】
ＰＣＲ装置１は、二本鎖ＤＮＡに特異的に挿入（インターカレート）して蛍光を発する色素を用いるリアルタイムＰＣＲ装置として構築可能である。リアルタイムＰＣＲ方法は、ＰＣＲの増幅量をリアルタイムでモニタし解析することができ、電気泳動が不要で迅速性と定量性に優れている。
【００３０】
次に、本実施例のＰＣＲ方法について説明する。
図１（ａ），（ｃ）に示すように、ＰＣＲ装置１の反応容器１０は、鉛直方向に立てて設置される。
注入ウェル１５から反応液を注入し、排出ウェル１６から排出する。反応液は、電極対２１によってジュール加熱され変成温度にされると共に、電極対２１の周辺で上昇流となって、リングチャネル２０内を循環し、ＰＣＲサイクルが行われる。ここでは２ステップＰＣＲサイクルを想定している。ＰＣＲが完了すると、反応液は排出ウェル１６から排出される。なお、図示しない外部ポンプ又はシリンジによって、反応容器１０へ反応液の注入・排出が行われる。
【００３１】
図２に示すように、反応容器１０は、電極対２１がリングチャネル２０の左右いずれか一方（この例では左側）に配置され、電極対２１のギャップの中心線は、リングチャネル２０の水平方向になるよう配置される。この構成により、リングチャネル２０の左右の一方側において電極対２１のギャップがリングチャネル２０を水平に横断することになる。
【００３２】
リングチャネル２０内には反応液が充填されていて、電極対２１のギャップのところで反応液の中に電流が流れる。すると、反応液の抵抗によってジュール熱が発生して反応液が加熱され、軽くなって上昇する（「加熱によるポンプ機能」）。これにより、反応液はチャネル内を循環する（この場合は時計方向回りに循環する）。同時に、リングチャネル２０内の反応液の温度が上昇し、また循環して非発熱部分に移動することにより温度が下降する。当該反応液は、温度変化を受け、それをＰＣＲサイクルのための温度変化にすることによってＰＣＲ増幅することができる。
【００３３】
特に図示はしていないが、リングチャネル２０は全体としてほとんどの部分を、別途、ヒータによって一定温度（アニール・伸長温度）に制御されている。したがって、反応液の流れはリングチャネル２０の円形に沿って流れ、電極対２１のギャップはそのリングチャネル２０の左右のいずれか（ここでは左側）において、リングチャネル２０を水平に横断する。なお、本実施例にいう「水平」とは、文字通りの鉛直方向に直交する水平のほか、上記「加熱によるポンプ機能」が実現できる程度の水平に近いやや傾きを持った水平状態を含む。
【００３４】
図２に示すように、リングチャネル２０の左側における電極対２１のギャップの位置において、反応液の流れは上昇であるから、電極対２１のギャップは反応液の流れを横断する、すなわち、流路の流れの全幅に亘る。電極対２１及び引出し電極部２２は、基板１１に蒸着されていて、この厚さは１μｍ以下なので反応液流れを妨げることはない。
【００３５】
以上説明したように、本実施例によるＰＣＲ装置１の反応容器１０は、基板１１とチャネル形成板１２とカバー板１３とによって形成された管状のリングチャネル２０を有する。リングチャネル２０は、リングチャネル２０の一方の側壁内面に、かつリングチャネル２０が水平面と交差する２つの断面のうちの一方にあるギャップを挟んで対向して配置される電極対２１を備え、鉛直方向に立っている。電極対２１のギャップ長は、リングチャネル２０断面内の全幅に亘っている。制御部３０は、電極対２１に交流電圧を印加して反応液に交流電流を流すことによってジュール熱を発生させて反応液の温度を制御する。
【００３６】
これにより、本実施例によるＰＣＲ装置１及びＰＣＲ方法は、下記の効果を得ることができる。
すなわち、従来例のＰＣＲ装置（図６参照）は、チャネル４４に沿って電極対４５間のギャップを設ける構成であったため、チャネル４４に所定の長さの直線部分が必要となり、環状といっても４角形になってしまっていた。チャネル４４に直線部分があるため、チャネル４４の大きさを小さくすることは困難であった。
【００３７】
これに対して、本実施例によるＰＣＲ装置１は、図１及び図２に示すように、リングチャネル２０の円環の一方側を横断するように電極対２１のギャップを配置する構成を採る。したがって、リングチャネル２０に従来例のような直線部分が必要なくなり、円形の環状内で反応液をスムーズに流すことができ、かつ、リングチャネル２０の全体の大きさを小さくすることができる。リングチャネル２０の小型化が可能になるので、この小型化によって、より少ない量の反応液でＰＣＲ増幅できるという効果を得ることができる。
【００３８】
また、従来例では、電極対４５（図６参照）が細く長いものとなり、製造精度が高くなければならず、かつ、電流が流れる電極対のギャップがチャネル４４（図６参照）断面内の中央だけなので、加熱される部分が断面内の中央だけになってしまって温度むらが発生していた。
【００３９】
これに対して、本実施例の電極対２１は、図２に示すように、リングチャネル２０の直径の半分程度の幅の電極の大きさにすることができる。電極対２１の大きさを大きく形成することができるので、電極対２１を形成する際の製造精度を低くすることができる。この製造精度の低減とは、具体的には位置合せ精度の緩和や組立労力の低減である。
【００４０】
また、電極対２１のギャップが、リングチャネル２０断面内の全幅に亘っているので、電極対２１のギャップに流れる反応液の断面全体を加熱することができる。さらに、流路と交差する横断面方向の温度差がないので、温度むらがなく均一に加熱でき、かつ加熱効率も高い。このように、本実施例では、電極対２１のギャップが水平にリングチャネル２０を横断するので、加熱領域が小さく、その分加熱のパワーを小さくすることができる。
【００４１】
ここで、上述したように、本実施例は、リングチャネル２０を小型化することができる。このため、小型化されたリングチャネル２０において、少ない反応液でＰＣＲ増幅でき、従来例に比べて小さい加熱力であっても十分にＰＣＲサイクルを実現することができる。すなわち、本実施例は、リングチャネル２０のサイズが小さいため、反応液の量が少なくても十分に循環させることができ、小さな加熱力でも十分に温度上昇させてＰＣＲ増幅することができる。
【００４２】
図３は、実施例１によるＰＣＲ装置１の反応容器１０（小型化流路）を用いた増幅特性を示す図であり、電圧印加時間[分]の検出蛍光量[A.U.（任意単位）]を示す。
増幅特性（図３）は、下記条件により得られた。
リングチャネル２０の流路体積：０．４７μＬ
印加電圧：１１．０Ｖ
チャネル形成板１２（スペーサ）厚み：０．３ｍｍ
撮影間隔：２０ｓｅｃ
マスターミックス：illustra（ＧＥヘルスケア社）
テンプレート：λｄｎａ  １．３１ｎｇ／２５μＬ
ターゲットｄｎａ：１９９ｂｐ
【００４３】
ポリメラーゼとその他ＰＣＲに必要な成分をメーカが調製したマスターミックスとしてＧＥヘルスケア社のillustraを用いた。このマスターミックスに、テンプレート遺伝子としてλｄｎａ、それとテンプレート遺伝子内の特定一部分（ターゲットｄｎａ）を切り出すためのプライマー、さらに遺伝子増幅観察用の蛍光染料としてBiotium社のEvaGreenを混合、調製して試料とした。プライマーとしてλｄｎａから１９９ｂｐのターゲットｄｎａを切り出す（さらに増幅する）塩基配列のプライマーを使用した。
図３の増幅特性に示すように、電圧印加時間に対して十分なＰＣＲ産物量を得ることが確認できた。
また、ここではテンプレートの濃度１．３１ｎｇ／２５μＬにおけるＰＣＲ増幅特性を示したが、ここでは示していない異なるテンプレート濃度における特性の曲線は、高濃度ならば早い方向（図３では左方向）へ、低濃度ならば遅い方向（図３では右方向）へ移動した同じ形の曲線であることを確認した。これはテンプレート濃度の定量的測定に用いられるリアルタイムＰＣＲと同様の性質である。本実施例によれば、リアルタイムＰＣＲが可能である。
【００４４】
図４は、増幅後の融解特性を示す図であり、印加電圧[Ｖ]に対する検出蛍光量[A.U.]（実線）、及び負の検出蛍光変化量[A.U.]（破線）を示す。増幅完了後に、アニール・伸長温度である環境温度はそのままにしておいて、電極間の印加電圧を下げてから、印加電圧を上げて、電極間ギャップ近傍領域における試料の温度を上げながら、その領域の蛍光輝度を観察することによって、融解特性を得ることができる。その際に、その領域の温度上昇に伴い、試料は再び循環を始めるが、増幅はすでに完了して飽和しており、更に増幅が進行することはなく、融解特性の観察に支障はない。融解するｄｎａの長さは温度に依存するので、融解特性を観察することによって、それぞれの長さのｄｎａの存在を検証することができる。図４に示すように、特異的産物（ターゲットｄｎａ）の融解温度に相当する電圧でピーク（図４符号ａ参照）が得られ、非特異的副産物は増幅されなかったことを確認できた。本実施例によるＰＣＲ方法は、リアルタイムＰＣＲが可能であって、電気泳動法が不要であるので試料回収も不要になる利点がある。このため、排出ウェル１６は必ずしも必要ない。
【００４５】
以下、本実施例の技術的要素を記述する。
ＰＣＲサイクル内の各ステップには最小限必要な時間がある。
一版に、ＰＣＲでは、(1)変性ステップ（９５℃〜９８℃）、(2)アニーリングステップ（温度は様々である）、(3)伸長ステップ（前２温度の間で、やはり一定ではない）の３ステップを用いる。近年では、高速化の要請から上記(2)と(3)を共通化して同じ温度で扱う２ステップの方法が用いられ、特にリアルタイムＰＣＲでは２ステップのファストＰＣＲと呼ばれる方法が良く用いられる。
【００４６】
ファストＰＣＲでは、(1)変性ステップに１〜５秒、上記(2)と(3)のステップにはターゲットｄｎａの長さに応じて最低限（１ｋｂｐ長さに対して１分という割合で比例すると言われる）の時間を設定する。
【００４７】
本発明者による実験では、(1)変性ステップは電極間ギャップを通過する一瞬の時間で十分であることを見出した。本実施例では、リングチャネル２０の流路の内壁１ｍｍφ、外壁２．５〜３ｍｍφを用いて実験した。その結果、従来例に比して、反応液がリングチャネル２０を周回する速度は約２／３位に遅くなるものの、予想よりＰＣＲ反応は意外と速いことが判明した。この知見は、流れの駆動源である浮力が弱くても、循環する流路の距離を短くすれば実用範囲内に入ってくるということを示す。形状的には、半導体プロセスで用いられる光リソグラフィーで流路を作成すれば、もっと小さく作製することができるので、更に早くなる可能性はある。すなわち、本発明は、非常に微量の試料体積でＰＣＲが実現するという今までに無かったメリットを提供することができるものである。現在、市販の一般的なＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲも含む）では、０．２ｍＬのμチューブ使い、試料は２０〜１００μＬほど必要となる。本実施例は、現在実験中のデバイスでも０．５μＬと少なくなる。しかも、これが最少限界ということではなく、更なる容量低減が可能である。
【実施例２】
【００４８】
実施例１では、一方の基板１１に電極対２１を設けていた。実施例２は、基板とその対向基板のそれぞれに１つずつの電極を設けて電極対とする例について説明する。
【００４９】
図５は、本発明の実施例１によるＰＣＲ装置の反応容器の構成を示す図であり、図５（ａ）は、その正面図、図５（ｂ）は、その底面図、図５（ｃ）は、その側面図である。実施例２の説明にあたり、図１及び図２と同一構成部分には同一符号を付して重複箇所の説明を省略する。
【００５０】
図５に示すように、ＰＣＲ装置１の反応容器１０Ａ（環状容器）は、基板１１、チャネル形成板１２、及び対向基板１３Ａを備え、反応容器１０Ａは鉛直方向に立っている。基板１１とチャネル形成板１２と対向基板１３Ａとによって環状の管状のリングチャネル２０を形成する。対向基板１３Ａは、実施例１のカバー板１３の機能を兼ねている。
【００５１】
基板１１と対向基板１３Ａは、チャネル形成板１２を挟んで固定される。電極対２１Ａの一方の電極２１１は基板１１内面に、他方の電極２１２は対向基板１３Ａ内面に配置され、反応液を挟み、リングチャネル２０中央の断面を水平方向に横切って電圧を印加する電極対２１Ａを構成する。図５（ｃ）に示すように、電極対２１Ａの一方の電極２１１と他方の電極２１２とが重ならないように配置されている。なお、電極対２１Ａである２つの電極２１１と電極２１２が対向する基板（基板１１と対向基板１３Ａ）のそれぞれに配置され、電流が一方の基板１１の電極２１１から対向基板１３Ａの電極２１２流れる。これにより、電流は、電極２１１のエッジから電極２１２のエッジに流れる、すなわち、一方の基板から他方の基板に流れるので、流路断面内を均一に電流が流れ、実施例１と比べても、より均一な加熱ができる。
【００５２】
反応液は、電極対２１Ａによってジュール加熱され変成温度にされると共に、電極対２１Ａの周辺で上昇流となって、平たいリングチャネル２０内を環状に循環し、ＰＣＲサイクルが行われる。ここでは２ステップＰＣＲサイクルを想定している。本実施例においてもジュール加熱による反応液の上昇流を利用する。
【００５３】
実施例１の場合には基板１１に沿って電流を流すので、加熱しても少なくない熱が基板から逃げてしまうが、本実施例の場合には基板１１から対向基板１３Ａへとリングチャネル２０の（厚み方向）中央に電流を流すので、逃げてしまう熱を減らして、効率よく温度制御することができる。また、本実施例の場合は、電極間ギャップの距離をチャネル形成板１２であるスペーサによって規定するので、高価な電極対のパターニングの必要がなく、安価かつ均一に製造することができる。
【００５４】
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではない。
各構成要素の材質は上述のものに限られず、一般的なマイクロチャネルに用いられる材質のものを採用することができる。
特に２つの電極が基板１１上に形成される実施例１では、カバー板１３はガラス製、チャネル形成板１２はＰＤＭＳ製と異なる材質として述べたが、両者の材質は同じでも良い。例えば同じ材質のＰＤＭＳである場合にはモ−ルディングによる一体成形が容易となり、量産に向いた製造方法としてメリットがある。
また、「交差」は直角に交差するものに限られない。
【符号の説明】
【００５５】
１  ＰＣＲ装置
１０，１０Ａ  反応容器（環状容器）
１１  基板
１２  チャネル形成板
１３  カバー板
１３Ａ  対向基板（カバー板）
１５  注入ウェル
１６  排出ウェル
２０  リングチャネル
２１，２１Ａ  電極対
２２  引出し電極部
２０ａ  円形開口部
３０  制御部（制御手段）
２１１，２１２  電極
Ｇ  電極対のギャップ幅
ＧＬ  電極対のギャップ長
Ｄ  リングチャネルの流路深さ
【要約】
【課題】チャネルの小型化、小容量化及び加熱均一化を図ることができるＰＣＲ装置及びＰＣＲ方法を提供すること。
【解決手段】ＰＣＲ装置１の反応容器１０は、基板１１とチャネル形成板１２とカバー板１３とによって形成された管状のリングチャネル２０を有する。リングチャネル２０は、リングチャネル２０の一方の側壁内面の直径方向に、水平方向のギャップを挟んで対向して配置される電極対２１を備え、鉛直方向に立っている。電極対２１のギャップ長は、リングチャネル２０断面内の全幅に亘っている。
【選択図】図１【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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