(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体チロシンキナーゼ（「ＲＴＫ」）のリン酸化を判定する方法であって、
該方法は、
（ａ）細胞を利用するステップと、
（ｉ）前記細胞は、第１の酵素断片とＣ末端において融合したＲＴＫの融合体を発現する第１の発現コンストラクトを備え、
（ｉｉ）前記細胞は、第２の酵素断片と融合したホスホチロシン結合ペプチドの融合体を発現する第２の発現コンストラクトとを備え、前記第１および第２の酵素断片は、互いに親和性が低いβ‐ガラクトシダーゼの断片であり、
（ｂ）前記ＲＴＫが自己リン酸化せず且つ内因性活性サイトゾルチロシンキナーゼが存在しない場合は、前記ＲＴＫをリン酸化するサイトゾルチロシンキナーゼを発現する第３の発現コンストラクトも含む該細胞を利用するステップと、
（ｃ）（ｉ）第１の酵素断片とＣ末端において融合した前記ＲＴＫの融合体が、リン酸化ＲＴＫを形成するために、リン酸化するのに十分な時間であり、（ｉｉ）第２の酵素断片と融合した前記ホスホチロシン結合ペプチドが、前記リン酸化ＲＴＫに結合するのに十分な時間であり、且つ、（ｉｉｉ）前記ＲＴＫが前記ホスホチロシン結合ペプチドに結合することによって前記第１および第２の酵素断片同士が互いに近接するときに、前記第１および第２の酵素断片が弱く複合体を形成して活性β−ガラクトシダーゼ酵素を形成するのに十分な時間で、前記細胞を培養するステップと、
（ｄ）検出可能な産物を形成するβ‐ガラクトシダーゼ基質を前記細胞に加えるステップと、
（ｅ）前記産物を前記ＲＴＫのリン酸化の指標として検出するステップとを含む方法。
【請求項２】
前記第１の断片は、５０未満のアミノ酸を有するβ‐ガラクトシダーゼの小断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記小断片は突然変異体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞は哺乳類細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記検出するステップの前に前記細胞を溶解させる追加的なステップを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
受容体チロシンキナーゼ（「ＲＴＫ」）のリン酸化に対する候補化合物の影響を判定する方法であって、
該方法は、
（ａ）細胞を利用するステップと、
（ｉ）前記細胞は、第１の酵素断片とＣ末端において融合したＲＴＫの融合体を発現する第１の発現コンストラクトを備え、
（ｉｉ）前記細胞は、第２の酵素断片と融合したホスホチロシン結合ペプチドの融合体を発現する第２の発現コンストラクトとを備え、前記第１および第２の酵素断片は、互いに親和性が低いβ‐ガラクトシダーゼの断片であり、
（ｂ）前記ＲＴＫが自己リン酸化せず且つ内因性活性サイトゾルチロシンキナーゼが存在しない場合は、前記ＲＴＫをリン酸化するサイトゾルチロシンキナーゼを発現する第３の発現コンストラクトも含む該細胞を利用するステップと、
（ｃ）前記細胞を前記候補化合物と接触させるステップと、
（ｄ）（ｉ）第１の酵素断片とＣ末端において融合した前記ＲＴＫの融合体が、リン酸化ＲＴＫを形成するために、リン酸化するのに十分な時間であり、（ｉｉ）第２の酵素断片と融合した前記ホスホチロシン結合ペプチドが、前記リン酸化ＲＴＫに結合するのに十分な時間であり、且つ、（ｉｉｉ）前記ＲＴＫが前記ホスホチロシン結合ペプチドに結合することによって前記第１および第２の酵素断片同士が互いに近接するときに、前記第１および第２の酵素断片が弱く複合体を形成して活性β−ガラクトシダーゼ酵素を形成するのに十分な時間で、前記細胞を培養するステップと、
（ｅ）検出可能な産物を形成するβ‐ガラクトシダーゼ基質を前記細胞に加えるステップと、
（ｆ）形成された産物を前記ＲＴＫのリン酸化の指標として検出するステップとを含む方法。
【請求項７】
前記第１の酵素断片は、５０未満のアミノ酸を有するβ‐ガラクトシダーゼの小断片である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記小断片は突然変異体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞は哺乳類細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出するステップの前に前記細胞を溶解させる追加的なステップを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記産物は化学発光体である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記候補化合物はアンタゴニストとして試験され、前記ＲＴＫのリガンドは前記候補化合物を加える前に加えられる、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
試料内の受容体チロシンキナーゼ（「ＲＴＫ」）の活性リガンドの存在を判定する方法であって、
該方法は、
（ａ）細胞を利用するステップと、
（ｉ）前記細胞は、第１の酵素断片とＣ末端において融合したＲＴＫの融合体を発現する第１の発現コンストラクトを備え、
（ｉｉ）前記細胞は、第２の酵素断片と融合したホスホチロシン結合ペプチドの融合体を発現する第２の発現コンストラクトとを備え、前記第１および第２の酵素断片は、互いに親和性が低いが、前記ホスホチロシン結合ペプチドの前記ＲＴＫの結合により互いに結合されたときに活性β‐ガラクトシダーゼを形成するβ‐ガラクトシダーゼの断片であり、
（ｂ）前記ＲＴＫが自己リン酸化せず且つ内因性活性サイトゾルチロシンキナーゼが存在しない場合は、前記ＲＴＫをリン酸化するサイトゾルチロシンキナーゼを発現する第３の発現コンストラクトも含む該細胞を利用するステップと、
（ｃ）前記細胞を前記試料と接触させるステップと、
（ｄ）（ｉ）第１の酵素断片とＣ末端において融合した前記ＲＴＫの融合体が、リン酸化ＲＴＫを形成するために、リン酸化するのに十分な時間であり、且つ、（ｉｉ）第２の酵素断片と融合した前記ホスホチロシン結合ペプチドが、前記リン酸化ＲＴＫに結合するのに十分な時間で、前記細胞を培養するステップと、
（ｅ）検出可能な産物を形成するβ‐ガラクトシダーゼ基質を前記細胞に加えるステップと、
（ｆ）形成された産物を前記ＲＴＫの活性リガンドの存在の指標として検出するステップとを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明者）
ウェイ  フェン、  ウィリアム  ラーブ、  フィリップ  アカコソ、  トーマス  ウェーマン、  キース  アール  オルソン
（関連出願の相互参照）
本願は、２００８年８月１８日に出願した米国仮特許出願第６１／０８９７９９号の優先権を主張する。この仮特許出願の内容全体を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
（政府の援助に関する説明）
該当なし。
【０００３】
（配列表、コンピュータプログラムまたはコンパクトディスクの参照）
本出願人は、配列表の紙コピーと添付のコンピュータファイルで確認されるコンピュータ読み取り可能な形態の配列表とが同一であることを主張する。本出願人は配列表の内容全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
【０００４】
本発明の分野は、受容体チロシンキナーゼ上のチロシンのリン酸化の判定およびリン酸化に影響を及ぼす化合物のスクリーニングに関する。
【背景技術】
【０００５】
以下、詳細な説明で言及する技術的特徴に関連し得る本発明のいくつかの態様の背景情報を提示するが、必ずしも詳細には説明しない。本明細書で省略する可能性がある特定の文言については、これらの情報を調べることで確認することができる。結論部で述べるように、これらの情報は参照により本明細書に援用する。下記の説明は、提示する情報が添付の特許請求の範囲と関連性を有すること、または本明細書に記載した物質の従来技術の効果と関連性を有することの容認として解釈すべきではない。
【０００６】
製薬学的低分子薬剤の発見は、受容体またはサイトゾルタンパク質と結合してアゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニストまたはモジュレータとして作用する化合物の発見に基づく。受容体チロシンキナーゼ（receptor tyrosine kinase：「ＲＴＫ」）として知られるタンパク質の１つの重要なクラスは、多数の疾患関連パスウェイを誘発する働きをする故に魅力的な標的である。製薬学的創薬の重要な焦点は、タンパク質、例えば受容体、キナーゼまたはリン酸化パスウェイ内の他のタンパク質の代理リガンドの同定にある。特に関心が高い点は、受容体チロシンキナーゼとして知られる細胞表面受容体タンパク質のサブクラスである。タンパク質の別の重要なクラスはサイトゾルキナーゼであり、サイトゾルキナーゼは一つ以上のＲＴＫをリン酸化することができる。これらのキナーゼを活性化するまたは阻害することにより、サイトゾルキナーゼのＲＴＫ標的の活性化を阻害することができる。
【０００７】
ＲＴＫファミリーは、細胞成長、細胞の分化、粘着、移行およびアポトーシスの調節機能を果たす（Blume-Jensen and Hunter 2001 Nature 411:355-65）、（Ullrich and Schlessinger 1990 Cell 61:203-12）、（Schlessinger 2000 Cell 103:: 211-25）、（Hubbard and Till 2000 Annu Rev Biochem 69:373-98）。いくつかの人間の疾患はＲＴＫの変化と結び付けられる（Akin and Metcalfe 2004 J Allergy Clin Immunol 114:13- 9）、（Verheul and Pinedo 2003 Drugs Today （Barc） 39 Suppl C: 81-93）、（Corfas et al., 2004 Nat Neurosci 7:575-80）。形質転換レトロウイルス中の癌遺伝子または人間の癌として多数のＲＴＫが特定されている（Hunter 2000 Cell 100: 113-27）、（Shawver et al., 2002）、（Muller-Tidow et al., 2004）。最近の報告では、ほぼすべてのタイプの人間の癌でＲＴＫが極めて重要な役割を果たす可能性あることが示されている（Shawver et al., 2002 Cancer Cell 1:117-23）、（Prenzel et al., 2000 Breast Cancer Res 2:184-90）、（Mass 2004 Int J Radiat Oncol Biol Phys 58:932-40）。従って、ＲＴＫ活性およびシグナリングを調整する天然リガンドおよび人工リガンドには癌および他の疾患に関する治療的見地から多大な関心が寄せられるはずである。（Haluska and Adjei 2001 Curr Opin Investig Drugs 2:280-6）、（Sawyer et al., 2003 BioTechniques Suppl: 2-10, 12-5）。迅速且つ効率的且つ効果的な特定の活性に関する膨大な化合物ライブラリをスクリーニングする能力を提供することが製薬産業の目標となっている。望ましいことに、これらの方法は単なる情報の寄せ集めではなく、多くの場合スクリーニング対象化合物の生物学的プロセスが発生する細胞全体を利用する。
【０００８】
多くのサイトカイン受容体は内因性キナーゼ活性を有さない。しかしながら、そのようなサイトカイン受容体もチロシンリン酸化の細胞内カスケードを開始する。これを行うために、サイトカイン受容体は、それぞれサイトゾル内に存在する非受容体チロシンキナーゼ（non-receptor tyrosine kinase：ＮＲＴＫ）と呼ばれる別々のタンパク質と相互作用する。ＪＡＫキナーゼのようなこれらのタンパク質は、サイトカイン受容体の細胞内領域と結合する。サイトカイン受容体によってリガンドがオリゴマーと結合すると、それによってＪＡＫタンパク質同士が近接し、それらのＪＡＫタンパク質および関連受容体のトランスリン酸化が（ＪＡＫタンパク質によって）開始される。
【０００９】
ハイスループットスクリーニングは、化合物の膨大な化学ライブラリから特定の活性を有する新規化合物を特定するために一般に利用される戦略である。多くの場合、ハイスループットスクリーニングアッセイは、定義された分子標的と結合する化合物の測定、または化合物／受容体間の相互作用から得られる機能的出力の測定に基づく。しかしながら、結合アッセイにも機能アッセイにも制限がある。例えば結合アッセイは、様々な技術上の理由から非生理的条件下で実施される。人工の非生理的条件は受容体の薬理作用に大きな影響を与える可能性があり、その結果データの信頼性が低下しデータの正確な解釈が困難となる恐れがある。このアッセイの性質上、受容体結合しか測定しないため別の欠点も生じる。従って、結合競合アッセイでは、リガンドがアゴニストとして機能するのかそれともアンタゴニストとして機能するのか等、リガンドの生理的機能に関する情報が提供されない。唯一の得られる情報は結合であり、従って結合が必ずしも標的部位で起こらない場合は多くの偽陽性が示される可能性がある。
【００１０】
機能アッセイは、結合競合アッセイに関連する制限の多くを克服するものである。通常は、アッセイプロトコルの一部としてアゴニストの結合に反応する能力を有する細胞が利用される。従って、このアッセイは結合から得られる活性の測定値を提供することができ、活性／濃度の判定が可能となる。細胞内の生理的条件下でアッセイを実施すれば、生体内で予想され得る結果により近い結果が得られる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５，６６７，９８０号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７７３，２３７号明細書
【特許文献３】米国特許第５，９７６，８９３号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８９１，６５０号明細書
【特許文献５】米国特許第５，９１４，２３７号明細書
【特許文献６】米国特許第６，０２５，１４５号明細書
【特許文献７】米国特許第６，２８７，７８４号明細書
【特許文献８】米国特許第６，４１３，７３０号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２００４／００３８２９８号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００４／０１６１７８７号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００６／０１９９２２６号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００８／０１０３１０７号明細書
【特許文献１３】米国特許第７，１３５，３２５号明細書
【特許文献１４】米国特許出願公開第２００７／０２７５３９７号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Blume-Jensen and Hunter 2001 Nature 411:355-65
【非特許文献２】Ullrich and Schlessinger 1990 Cell 61:203-12
【非特許文献３】Schlessinger 2000 Cell 103::211-25
【非特許文献４】Hubbard and Till 2000 Annu Rev Biochem 69:373-98
【非特許文献５】Akin and Metcalfe 2004 J Allergy Clin Immunol 114:13- 9
【非特許文献６】Verheul and Pinedo 2003 Drugs Today (Barc) 39 Suppl C: 81-93
【非特許文献７】Corfas et al., 2004 Nat Neurosci 7:575-80
【非特許文献８】Hunter 2000 Cell 100: 113-27
【非特許文献９】Shawver et al., 2002
【非特許文献１０】Muller-Tidow et al., 2004
【非特許文献１１】Shawver et al., 2002 Cancer Cell 1:117-23
【非特許文献１２】Prenzel et al., 2000 Breast Cancer Res 2:184-90
【非特許文献１３】Mass 2004 Int J Radiat Oncol Biol Phys 58:932-40
【非特許文献１４】Haluska and Adjei 2001 Curr Opin Investig Drugs 2:280-6
【非特許文献１５】Sawyer et al., 2003 BioTechniques Suppl:2-10, 12-5
【非特許文献１６】Olive 2004 Expert Rev Proteomics 1:327-41
【非特許文献１７】Dupriez et al., 2002 Receptors Channels 8:319-30
【非特許文献１８】Mosmann 1983 J Immunol Methods 65:55-63
【非特許文献１９】Bellamy 1992 Drugs 44;690- 708
【非特許文献２０】Sambrook, Fritsch & Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
【非特許文献２１】"DNA Cloning: A Practical Approach," Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985)
【非特許文献２２】"Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait ed. 1984)
【非特許文献２３】"Nucleic Acid Hybridization" [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)]
【非特許文献２４】"Transcription And Translation" [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]
【非特許文献２５】"Animal Cell Culture" [R. I. Freshney, ed. (1986)]
【非特許文献２６】"Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]
【非特許文献２７】B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記では受容体チロシンキナーゼに関するいくつかの機能アッセイについて説明した。典型的なアッセイとしてはＲＴＫの自己リン酸化の定量化（Olive 2004 Expert Rev Proteomics 1:327-41）、ＲＴＫおよび下流シグナリング分子のリン酸化の測定（同書）、細胞内カルシウム放出の測定（Dupriez et al., 2002 Receptors Channels 8:319-30）、またはＲＴＫ依存性細胞増殖の測定（Mosmann 1983 J Immunol Methods 65:55-63）、（Bellamy 1992 Drugs 44;690-708）が挙げられる。ＲＴＫのリガンド評価のための多種多様なアッセイが開発されているにも関わらず、プロトコルの性質、アッセイを実施する技術者の関与、結果がエラーとなる可能性があるステップの数、機器の選択、有機溶媒の効果、ダイナミックレンジおよび分析の感度に関して利点をもたらし得る追加的なアッセイの必要性は依然として高い。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
下記の少なくとも２つの遺伝子発現コンストラクト、すなわちβ‐ガラクトシダーゼの一対の断片の第１のメンバーと融合したＲＴＫの第１のコンストラクトと、β‐ガラクトシダーゼの２つ目の断片と融合したリン酸化ＲＴＫと結合するポリペプチドの第２のコンストラクト（「ホスホチロシン結合ペプチド」）と、必要に応じてチロシン受容体キナーゼをリン酸化するサイトゾルキナーゼを発現する第３のコンストラクトとを備える哺乳類細胞を提供する。ＲＴＫを刺激すると、第２のコンストラクトの発現産物がリン酸化したＲＴＫと結合し、それによって２つの断片同士が近接し、活性β‐ガラクトシダーゼを形成する。この場合、リン酸化はＲＴＫまたはサイトゾルキナーゼによって発生させることができる。２つの断片は互いに親和性が低いため、それらの２つの発現産物の結合がなければβ‐ガラクトシダーゼの形成量は比較的低くなる。検出可能な産物を生産するβ‐ガラクトシダーゼ基質を加えることにより、これらの２つの発現産物の結合度の読み出し（readout）を実施する。これらのペプチドおよびキナーゼの例は後述する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】神経成長因子（ＮＧＦ）の追加に対する、β‐ガラクトシダーゼの低親和性小断片と融合したトロポミオシン関連キナーゼＡ（Tropomyosin‐Related Kinase A：ＴｒｋＡ‐ＰＫ）および補完的なβ‐ガラクトシダーゼ断片と融合した形質転換タンパク質１を含有するＳｒｃホモロジー２（ＳＨＣ１‐ＥＡ）のＵ２ＯＳ細胞内の反応を示す棒グラフである。この棒グラフは、Ｕ２ＯＳ細胞内のＴｒｋＡ‐ＰＫの活性化によりＳＨＣ１‐ＥＡホスホチロシン結合ペプチドが補充され、その結果更なる酵素活性がもたらされることを示している。ＴｒｋＡ‐ＰＫとＳＨＣ１‐ＥＡの融合タンパク質を発現するＵ２ＯＳ細胞を３８４ウェルプレートの各ウェル内の０．１％ＦＢＳを含む無血清培地に入れて１０Ｋ／ウェルで平板培養した。翌日、これらの細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦまたは１％ＢＳＡを添加したＰＢＳにより室温で異なる期間にわたって処理し、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ試薬を使用して検定した。
【図２】ＮＧＦの追加に対するＴｒｋＡ‐ＰＫおよびＳＨＣ１‐ＥＡのＵ２ＯＳ細胞の用量反応を示すグラフである。このグラフは、Ｕ２ＯＳ  ＴＲＫＡ  ＳＨＣ１細胞がＮＧＦに対する用量反応を呈することを示している。５Ｋ／ウェルのＵ２ＯＳ  ＴＲＫＡ  ＳＨＣ１二重安定細胞を３８４ウェルプレートの各ウェル内の０．１％ＦＢＳを含む無血清培地に入れて平板培養した。翌日、これらの細胞を異なる濃度のＮＧＦにより室温で１時間処理した。次いでＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ化学発光基質を加え、１時間後にシグナルを読み取った。９．３ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０および７．８のアッセイウィンドウが得られた。
【図３】ＴｒｋＡ‐ＰＫおよびＳＨＣ１‐ＥＡのＵ２ＯＳ細胞に阻害剤を加え、その後ＮＧＦを加えることに起因する用量反応を示すグラフである。このグラフは、ＴＲＫ阻害剤がＮＧＦ刺激後のアッセイシグナルを阻害することを示す。５Ｋ／ウェルのＵ２ＯＳ  ＴＲＫＡ  ＳＨＣ１二重安定細胞を３８４ウェルプレートの各ウェル内の０．１％ＦＢＳを含む無血清培地に入れて平板培養した。翌日、これらの細胞を異なる濃度のＴｒｋＡ阻害剤またはＫ‐２５２ａにより室温で１０分間処理し、その後２０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦにより室温で１時間刺激した。次いでＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ化学発光基質を加え、１時間後にシグナルを読み取った。ＴｒｋＡ阻害剤からは１８ｎＭのＩＣ５０および６．７のアッセイウィンドウが与えられた。Ｋ‐２５２ａからは３７ｎＭのＩＣ５０および７．６のアッセイウィンドウが与えられた。
【図４】血小板由来成長因子ＡＢ（ＰＤＧＦ‐ＡＢ）による処理の後、異なるＳＨ２（Ｓｒｃ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ２）ドメイン‐ＥＡ結合体を有するβ‐ガラクトシダーゼの低親和性小断片と融合した血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲＢ‐ＰＫ）のＵ２ＯＳの用量反応を示す棒グラフである。この棒グラフは、ＰＤＧＦＲＢが異なるＳＨ２ドメイン含有細胞質タンパク質（ホスホチロシン結合ペプチド）と相互作用することを示している。５Ｋ／ウェルのＰＤＧＦＲＢ‐ＰＫ  ＳＨ２含有タンパク質‐ＥＡの二重安定細胞を３８４ウェルの各ウェルに入れて平板培養した。翌日、これらの細胞に１００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ‐ＡＢを加えて（黒棒）または加えずに（白棒）室温で１時間処理した。次いでＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）化学発光基質を加え、２時間後にシグナルを読み取った（「ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ」はＤｉｓｃｏｖｅＲｘ社（カリフォルニア州フリーモント）の登録商標）。
【図５】β‐ガラクトシダーゼの低親和性小断片と融合したＩＧＦ１Ｒ（ＩＧＦ１Ｒ‐ＰＫ）のＵ２ＯＳ細胞の用量反応を示すグラフである。細胞を３８４ウェルプレートに入れて１０，０００細胞／ウェルで平板培養し、指定のアッセイ手順に従ってＩＦＧ１Ｒの既知のリガンドであるＩＧＦ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社（ニュージャージー州ロッキーヒル、カタログ番号：ＡＦ‐１００‐１１）により室温で３時間刺激した。刺激後に検出試薬を加え、１時間後にＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（９３‐０００１）を使用してシグナルを検出した。４．４倍のアッセイウィンドウが観察され、リガンドＩＧＦ１のＥＣ５０は１７ｎｇ／ｍｌであった。
【図６】β‐ガラクトシダーゼ（ＩＮＳＲ‐ＰＫ）の低親和性小断片と融合したインスリン受容体（ＩＮＳＲ）のＵ２ＯＳ細胞内における用量反応を示すグラフである。細胞を３８４ウェルプレートに入れて１０，０００細胞／ウェルで平板培養し、指定のアッセイ手順に従ってＩＮＳＲの既知のリガンドであるインスリンにより室温で３時間刺激した。刺激後に検出試薬を加え、１時間後にＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（９３‐０００１）を使用してシグナルを検出した。７．６倍のアッセイウィンドウが観察され、リガンドインスリンのＥＣ５０は２．０ｎｇ／ｍｌであった。
【図７】β‐ガラクトシダーゼ（ＴｒｋＢ‐ＰＫ）の低親和性小断片と融合したＴｒｋＢのＵ２ＯＳ細胞の用量反応を示すグラフである。細胞を３８４ウェルプレートに入れて１０，０００細胞／ウェルで平板培養し、指定のアッセイ手順に従ってＴｒｋＢの既知のリガンドであるＢＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、カタログ番号：４５０‐０２）により室温で３時間刺激した。刺激後に検出試薬を加え、１時間後にＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（９３‐０００１）を使用してシグナルを検出した。４．０倍のアッセイウィンドウが観察され、リガンドＢＤＮＦのＥＣ５０は４．２１ｎｇ／ｍｌであった。
【図８】β‐ガラクトシダーゼ（ＴｒｋＣ‐ＰＫ）の低親和性小断片と融合したＴｒｋＣのＵ２ＯＳ細胞の用量反応を示すグラフである。細胞を３８４ウェルプレートに入れて１０，０００細胞／ウェルで平板培養し、指定のアッセイ手順に従ってＴｒｋＣの周知のリガンドであるＮＴ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ  ＃／４５０‐０３）により室温で３時間刺激した。刺激後に検出試薬が加えられ、１時間後にＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（９３‐０００１）を使用してシグナルを検出した。８．１倍のアッセイウィンドウが観察され、リガンドＮＴ３のＥＣ５０は７ｎｇ／ｍｌであった。
【図９】β‐ガラクトシダーゼ（ＣＳＦ３Ｒ‐ＰＫ）の低親和性小断片と融合したＧ‐ＣＳＦＲのＵ２ＯＳ細胞の用量反応を示すグラフである。上側の曲線はＪａｋ２の過発現の存在下の反応であり、下側の曲線（四角）はＪａｋ２の過発現の不存在下の反応である。細胞を３８４ウェルプレートに入れて１０，０００細胞／ウェルで平板培養し、指定のアッセイ手順に従って１％ＢＳＡが添加されたＰＢＳ中のＧ‐ＣＳＦＲの既知のリガンドであるＧ‐ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ３００‐２３）により室温で３時間刺激した。刺激後に検出試薬を加え、１時間後にＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（９３‐０００１）を使用してシグナルを検出した。７倍のアッセイウィンドウが観察され、リガンドＧ‐ＣＳＦのＥＣ５０は４ｎｇ／ｍｌであった。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
ＲＴＫのリン酸化を判定するための方法を提供する。２つまたは随意選択で３つの発現コンストラクト、すなわち、（１）ＲＴＫのサイトゾルＣ末端におけるＲＴＫと酵素断片対のメンバーとの融合体と、（２）酵素断片対の相補メンバーと融合するリン酸化ＲＴＫ（ホスホチロシン結合ドメイン）と結合したポリペプチド配列と、ＲＴＫが自己リン酸化しない場合は、（３）一般に過発現のための強力なプロモータを有する非受容体チロシンキナーゼとを備える二重安定または三重安定形質転換細胞を利用する。この酵素対はβ‐ガラクトシダーゼに由来するものであり、各断片は、独立して複合体をつくることで活性酵素を形成することが相対的にできない、すなわち互いに親和性が弱いが、それらが融合するタンパク質同士が結合したときに活性β‐ガラクトシダーゼを形成することができる。
【００１７】
本方法を実施する際は適切な培地で細胞を成長させる。これらの細胞を一般に利用される条件を使用してウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む基本培地に播種する。候補化合物がアゴニストであるのかインバースアゴニストであるのかを判定するには、推定アゴニストを加え、細胞を反応が生じるのに十分な時間だけ培養する。候補化合物がアンタゴニストであるのかどうかを判定するには、まず細胞をアンタゴニストが結合するのに十分な時間だけ推定アンタゴニストで培養し、その後アゴニストを加え、反応が生じるのに十分な時間だけ培養する。候補化合物がモジュレータであるのかどうかを判定するには、まず細胞を限界濃度のアゴニストまたはアンタゴニストで培養し、その後反応の変化を評価するために提案のモジュレータで培養する。次いで、検出可能なシグナルを発する市販のβ‐ガラクトシダーゼ基質を加え、随意選択で基質と溶解剤（lysing agent）とを組合せ、アゴニストまたはアンタゴニストの結合活性の測定値としてシグナルを検出する。
【００１８】
培地は、使用する特定の細胞に関して従来どおりのものであり、例えばＣＨＯ細胞にはＦ‐１２を、Ｕ２ＯＳ細胞には改変イーグル培地（ＭＥＭ）を、ＨＥＫ細胞には標準的なＤＭＥＭ等を使用する。便宜上、アッセイはマイクロタイターウェルプレートで実施する。この場合、体積は約４〜１００μｌ、より一般的には１０〜２５μｌの範囲で変動する可能性がある。一般に、このアッセイでは１０μｌ当たり約２〜２０×１０３個の細胞、より一般的には１０μｌ当たり３〜１０×１０３個の細胞を利用する。
【００１９】
温度は一般に約１０〜４０℃である。アゴニストアッセイを用いる場合は周囲温度が好都合であり、アンタゴニストアッセイを用いる場合は生理温度（３７℃）が好都合である。リガンドによって利用される培養時間は頑健な結果をもたらし、一般的には約５分間〜２時間、より一般的には約１０分間〜１時間の範囲となるはずである。この場合、リガンドは、ＲＴＫと結合し、リン酸化を生じさせ、ＰＴＢ含有タンパク質とリン酸化ＲＴＫとの十分な数の結合を生じさせるのに十分な時間を有する（「ＰＴＢ」とは、ホスホチロシンドメイン、ＳＨ２ドメイン、人工設計ドメイン、単鎖（例えばＦａｂや抗体）等と呼ばれるドメインを含めたすべてのホスホチロシン結合ドメインを指す）。少なくとも実質的な最適化を達成するために利用する厳密な時間は、経験的に決定することができる。
【００２０】
細胞膜を横切る（cross）ことが可能なβ‐ガラクトシダーゼ基質を用いる場合は、基質を溶解固体としてまたは溶液中に加える。代案として、試薬溶液は細胞の透過化または溶解（lysis）および細胞中に形成された複合体のアッセイ培地への放出を実現することもできる。基質とのβ‐ガラクトシダーゼ反応に干渉しない任意の従来の溶解緩衝液を利用することができる。ＰＢＳやＨＥＰＥＳのような便利な緩衝液では１〜５％、一般的には３％を超えない割合でＣＨＡＰＳのような様々なイオン緩衝液を利用することができるが、当技術分野では他の様々な代用物が知られている。試薬溶液の体積は、一般的にアッセイ培地の体積の約０．５〜２倍である。β‐ガラクトシダーゼ基質を追加した後、溶液を通常５〜２００分間、一般的には１０〜１５０分間培養し、シグナルを読み取る。温度は一般に培養培地の温度または便宜上約２０〜４０℃の範囲とする。
【００２１】
β‐ガラクトシダーゼ基質は蛍光産物または発光産物を提供する。蛍光または化学発光リーダをそれぞれ使用してシグナルを読み取る。望ましくは、発光試薬および随意選択でシグナルエンハンサーを利用する。発光試薬は、形成される可能性が高いβ‐ガラクトシダーゼの最大量に対して過剰となる。便宜上、ＡＢＩ社からＧａｌａｃｔｏｎ  Ｓｔａｒ（登録商標）として販売される発光基質と、Ｅｍｅｒａｌｄ  ＩＩ（商標）エンハンサーを併用する。任意の等価な発光基質組成物を利用することができる。基質は約１〜１０質量パーセント、エンハンサーは約１０〜３０質量パーセントで試薬溶液中に存在する。これらの量は利用する特定の基質組成物に応じて異なる可能性がある。試薬溶液を販売用に５〜２０倍以上の濃度として調製すること、または固形物を粉末として提供し適切な割合で水に溶解させることができる。
【００２２】
通常は標準物質を使用する。これによりシグナルを候補化合物と同じ条件下で実施する既知の刺激物質の濃度と関係付ける。標準化合物の濃度の変化と共にシグナルの変化を示すグラフを作成することができる。このアッセイは、候補化合物のナノモル以下のＥＣ５０、一般には約１μＭ未満、殆どの場合約５００ｎＭ未満、しばしば１００ｎＭ未満のＥＣ５０に対して感受性があり、多くの場合５０ｎＭ未満のＥＣ５０を検出することができる。Ｓ／Ｂ（シグナル／バックグラウンド）比は、一般的には少なくとも約２倍、より一般的には少なくとも約３倍であるが、約５０倍を超える可能性もある。
【００２３】
化合物のアゴニストまたはアンタゴニスト活性、例えば活性リガンドをスクリーニングする代わりに、生理学的試料または他の試料のリガンド活性を、すなわち診断ツールとしてスクリーニングすることができる。候補化合物の代わりに試料を使用し、アッセイを同様の手法で実行する。生理学的試料には血液、血漿、唾液、ＣＳＦ、組織、溶解細胞等が含まれる可能性がある。試料は濾過、遠心分離、シトレーション（citration）、加熱、沈殿等の前処理にかけることができる。試料の量はアゴニストまたはアンタゴニストの想定レベルに依存する。本方法は、構成成分のエピトープ部位ではなくＲＴＫの活性結合をもたらす構成成分だけを測定する際に、イムノアッセイよりも優れた利点を有する。
【００２４】
便宜のためにキットを提供することができる。本アッセイでは、細胞内に導入すべきＥＡの発現のためのコンストラクトとしてＥＡ融合タンパク質を形成すること、または細胞内にＥＡを提供するように適宜改変した細胞を形成することができる。一般に、このようなキットはアッセイを実施するための指示書を含む挿入物を含む。指示書は、印刷物または電子回路、例えばＣＤまたはフロッピー（登録商標）ディスクであり得る。これらのキットの用途は産物の販売、ならびに研究および商用設定のためのアッセイの利用促進である。
【００２５】
このアッセイでは既知の様々な細胞株を利用することができる。利用する細胞株にはＵ２ＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＨＥＫ等が含まれる。
【００２６】
ＲＴＫは、自己リン酸化受容体と独立キナーゼを必要とする受容体とに分けることができ、ＲＴＫを活性化したときにそれぞれリン酸化する比較的狭いレパートリのＲＴＫを有するサイトゾルキナーゼが多数知られている。従って、本アッセイを用いればＲＴＫのリガンドまたはサイトゾルキナーゼの活性剤もしくは阻害剤である化合物の活性を調査することが可能となる。ＲＴＫがサイトゾルキナーゼによってリン酸化されることは既知である。
【００２７】
いくつかの異なるパスウェイの起点となるＲＴＫが多数存在し、新たなＲＴＫが発見される可能性が高い。ＲＴＫは下記のいくつかのクラスに分けられている。ＲＴＫクラスＩ（ＥＧＦ受容体ファミリー）、ＩＩ（インスリン受容体ファミリー）、ＩＩＩ（ＰＤＧＲ受容体ファミリー）、ＩＶ（ＦＧＦ受容体ファミリー）、Ｖ（ＶＥＧＦ受容体ファミリー）、ＶＩ（ＨＧＦ受容体ファミリー）、ＶＩＩ（Ｔｒｋ受容体ファミリー）、ＶＩＩＩ（ＡＸＬ受容体ファミリー）、ＩＸ（ＡＸＬ受容体ファミリー）、Ｘ（ＬＴＫ受容体ファミリー）、ＸＩ（ＴＩＥ受容体ファミリー）、ＸＩＩ（ＲＯＲ受容体ファミリー）、ＸＩＩＩ（ＤＤＲ受容体ファミリー）、ＸＶ（ＫＬＧ受容体ファミリー）、ＸＶＩ（ＲＹＫ受容体ファミリー）およびＸＶＩＩ（ＭｕＳＫ受容体ファミリー）。
【００２８】
各ＲＴＫは、ホスホチロシン結合（「ＰＴＢ」）ドメインを有する一つ以上のポリペプチドと結合する。タンパク質の大きいクラスはＳＨ２（Ｓｒｃホモロジー２）ドメインと呼ばれるものである。これらのタンパク質としては、Ａｂ１、ＧＲＢ２、ＲａｓＧＡＰ、ＳＴＡＴタンパク質、ＺＡＰ７０、ＳＨＰ２、ＰＩ３Ｋ、ホスホリパーゼＣγフォーム、ＣＲＫ、ＳＯＣＳ、ＳｈｃおよびＳｒｃが挙げられる。他のタンパク質にはＦＲＳ２、ＦＥ６５、Ｘ１１／ＭＩＮＴ、ＮＵＭＢ、ＥＰＳ８、ＲＧＳ１２、ＤＡＢ、ＯＤＩＮ、ＪＩＰ‐１、ＡＲＨおよびＩＣＡＰ１が含まれる（これらのタンパク質に関する詳細情報は、Pubmedおよび／またはgenenames.org/cgi‐bin/hgnc_search.plで提供される省略形を含むシンボルを検索することによって確認することができる）。本明細書で使用する遺伝子シンボルの完全な配列情報および注釈は、当業者ならＯＭＩＭまたはＳｗｉｓｓ‐Ｐｒｏｔから取得することもできるだろう。
【００２９】
ＰＴＢタンパク質は、それ自体が頑健なアッセイを実施するのに十分な結合親和性を有する限り、必ずしもＲＴＫと同じ種に由来するものである必要はない。利用する断片がＰＴＢドメインを含み、ＲＴＫホスホチロシン部位にとって所望の親和性レベルを有する限り、必ずしもＰＴＢタンパク質全体を使用する必要はない。
【００３０】
サイトゾル受容体に依存するＲＴＫとしては、ＴおよびＢ細胞受容体、インテグリン、インターフェロン受容体、インターロイキン受容体、ＧＰ１３０関連タンパク質等が挙げられる。本発明で利用する受容体の例示的なファミリーを以下に示す。単鎖：ＥＰＯＲ、ＧＨＲ、ＣＦＳＲ、ＰＲＬＲ、ＭＰＬ；ＩＦＮファミリー：ＩＦＮＡＲ１，２、ＩＦＮＧＲ１，２；γＣファミリー：ＩＬ２ＲＡ，Ｂ，Ｇ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ２ＲＧ（１型受容体）、ＩＬ４Ｒ‐ＩＬ１３ＲＡ１（２型受容体）、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ１０ＲＡ，Ｂ、ＩＬ１２ＲＢ１，２、ＩＬ１３ＲＡ１；ＩＬ３ファミリー：ＩＬ３ＲＡ、ＣＳＦ２ＲＡ，Ｂ、ＩＬ５ＲＡ；ＧＰ１３０ファミリー：ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１１ＲＡ、ＬＩＦＲ、ＯＳＭＲ、ＩＬ６ＧＴ、ＣＮＴＦＲ、ＩＬ６ＳＴおよびＬＩＦＲ。
【００３１】
前段に提示したＲＴＫおよびＰＴＢドメインを有するポリペプチドだけでなく、野生型サイトゾルキナーゼ（ＮＲＴＫ）が内因的に利用可能でなく且つリン酸化のために必要である場合は、ＮＲＴＫの過発現をもたらす強力なプロモータにより野生型ＮＲＴＫを外因的に導入し発現させる。過発現は経験的に決定することができるが、通常はこの過発現により、存在するＮＲＴＫのレベルを実質的に２倍以上上回るレベルのＮＲＴＫがもたらされる。
【００３２】
一般に、個々のプラスミドはそれぞれの抗生物質耐性遺伝子によって利用されるが、構成成分のうちの１つがマルチユニットである場合、それらのユニットは同じベクター、例えばプラスミド上に存在する可能性がある。これらのベクターを順次または同時に細胞内に導入し、形質転換細胞をそれらの抗生抵抗を利用して選択する。処理を容易にするために内部リボソーム進入部位を含む２シストロンベクターを使用し、それによって両方の受容体サブユニットが同じベクターから発現できるようにすることができる。
【００３３】
この検出システムはβ‐ガラクトシダーゼ酵素断片コンプリメンテーションの使用に依存する。このシステムでは、互いに親和性が低いβ‐ガラクトシダーゼの小断片と、より大きい大断片とを利用する。β‐ガラクトシダーゼの小断片（「ＥＤ」）は天然配列または突然変異配列を有し得る。ここで特に注目するのは、約３６〜６０、より一般的には５０以下のアミノ酸の小断片である。ＲＴＫペプチドとＰＴＢペプチドの結合がないときは大断片と小断片の間の複合体形成が殆ど生じないようにするために、ＥＤはβ‐ガラクトシダーゼの大断片（「ＥＡ」）と親和性が低いことが望ましい。これらの小断片の詳しい説明については米国特許第７，１３５，３２５号を参照されたい。突然変異ＥＤの詳しい説明については米国特許出願公開第２００７／０２７５３９７号を参照されたい。これらの特許文献の内容はいずれも参照により本明細書に援用する。当該アッセイまたは類似のアッセイにおける小ＥＤおよび突然変異ＥＤは、一般に野生型配列の活性のうち約０．５未満、少なくとも約０．１を有し、他のタンパク質との融合がないときは、従来使用される約９０のアミノ酸の商用配列のうち約６０％未満を有する。ＥＤとＥＡ間の親和性を高めるためにより長いＥＤを使用し、野生型配列からの突然変異が生じないようにする。ＲＴＫのＰＴＢペプチドの親和性が低いほど互いの親和性が高くなる２つの断片間の望ましい親和性レベルは、特定のアッセイに関して経験的に決定することができる。
【００３４】
２つまたは随意選択で３つの発現コンストラクト、すなわち、一方のβ‐ガラクトシダーゼ断片とＲＴＫ（通常は小断片）との融合体と、他方のβ‐ガラクトシダーゼ断片とＰＴＢペプチド（通常は大断片）との融合体と、随意選択で、特に強力なプロモータを有する適切なサイトゾルキナーゼのための発現コンストラクトとを利用する。都合の良いことに、各タンパク質は異なるプラスミドから発現し、各プラスミドはそれぞれの抗生物質耐性遺伝子を有する。受容体が複数のサブユニット（それぞれ別々の遺伝子によってコード化される）で構成される場合は、複数のプロモータまたは２シストロンベクターまたはＩＲＥＳを使用して１つのプラスミドに対して２つ以上のタンパク質を発現させることができる。
【００３５】
発現コンストラクトおよび他の従来の操作方法の説明については、例えば下記の文献を参照されたい。Sambrook, Fritsch & Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (以下「Sambrook et al., 1989」)、"DNA Cloning: A Practical Approach," Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985)、"Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait ed. 1984)、"Nucleic Acid Hybridization" [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)]、"Transcription And Translation" [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]、"Animal Cell Culture" [R. I. Freshney, ed. (1986)]、"Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]、B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984)。
【００３６】
融合タンパク質をコード化する遺伝子は発現コンストラクトの一部となる。この遺伝子を細胞ホスト内で機能する転写および翻訳調節領域の下方にくるように配置する。調節領域はエンハンサーを含むことができる。エンハンサーは、融合タンパク質の発現細胞のタイプを制限すること、特定の発現条件を必要とすること、タンパク質による自然発現をもたらすこと等、いくつかの利点をもたらすことができる。多くの場合、調節領域はタンパク質をコード化する遺伝子の天然の調節領域であってよく、その場合は融合タンパク質が天然の遺伝子に取って代わってもよく、天然のタンパク質に加えて存在してもよく、ホスト細胞のゲノムに組み込むことも組み込まずに例えば染色体外因子上に存在させることもできる。
【００３７】
上述のとおり、ＲＴＫと結合したβ‐ガラクトシダーゼ断片は、ＲＴＫのＣ末端で融合し、一般に好都合にはＧＧＧＳを１〜２回繰り返すリンカーで結合される。ＰＴＢペプチドと融合する大断片は、ペプチド末端、すなわちＮまたはＣ末端と直接融合させること、または小断片のリンカーと同じもしくは異なるリンカーを有することができる。
【００３８】
以下の実施例は限定ではなく例示のために提示するものである。
【実施例】
【００３９】
［実験］
使用した細胞株はすべてＤｉｓｃｏｖｅＲｘ社のものであり、ＳＨ２‐ＥＡ（β‐ガラクトシダーゼの大断片、全長β‐ガラクトシダーゼ。アミノ酸３１〜４１において削除。）を安定に発現する細胞内のＰＫ（42aa、DSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAARPPFASWRNSEEARTDR）で標識した様々なＲＴＫを発現した。
【００４０】
[実施例]
アミノ酸１〜５８３＝ＳＨＣ１
アミノ酸５８４〜５９７＝リンカー
アミノ酸５９８〜１５９２＝β‐ガラクトシダーゼの大断片（ＥＡ）
【００４１】
[化１]
MDLLPPKPKYNPLRNESLSSLEEGASGSTPPEELPSPSASSLGPILPPLPGDDSPTTLCSFFPRMSNLRLANPAGGRPGSKGEPGRAADDGEGIVGAAMPDSGPLPLLQDMNKLSGGGGRRTRVEGGQLGGEEWTRHGSFVNKPTRGWLHPNDKVMGPGVSYLVRYMGCVEVLQSMRALDFNTRTQVTREAISLVCEAVPGAKGATRRRKPCSRPLSSILGRSNLKFAGMPITLTVSTSSLNLMAADCKQIIANHHMQSISFASGGDPDTAEYVAYVAKDPVNQRACHILECPEGLAQDVISTIGQAFELRFKQYLRNPPKLVTPHDRMAGFDGSAWDEEEEEPPDHQYYNDFPGKEPPLGGVVDMRLREGAAPGAARPTAPNAQTPSHLGATLPVGQPVGGDPEVRKQMPPPPPCPGRELFDDPSYVNVQNLDKARQAVGGAGPPNPAINGSAPRDLFDMKPFEDALRVPPPPQSVSMAEQLRGEPWFHGKLSRREAEALLQLNGDFLVRESTTTPGQYVLTGLQSGQPKHLLLVDPEGVVRTKDHRFESVSHLISYHMDNHLPIISAGSELCLQQPVERKLGGGGSGGGGSLESMGVITDSLAVVARTDRPSQQLRSLNGEWRFAWFPAPEAVPESWLECDLPEADTVVVPSNWQMHGYDAPIYTNVTYPITVNPPFVPTENPTGCYSLTFNVDESWLQEGQTRIIFDGVNSAFHLWCNGRWVGYGQDSRLPSEFDLSAFLRAGENRLAVMVLRWSDGSYLEDQDMWRMSGIFRDVSLLHKPTTQISDFHVATRFNDDFSRAVLEAEVQMCGELRDYLRVTVSLWQGETQVASGTAPFGGEIIDERGGYADRVTLRLNVENPKLWSAEIPNLYRAVVELHTADGTLIEAEACDVGFREVRIENGLLLLNGKPLLIRGVNRHEHHPLHGQVMDEQTMVQDILLMKQNNFNAVRCSHYPNHPLWYTLCDRYGLYVVDEANIETHGMVPMNRLTDDPRWLPAMSERVTRMVQRDRNHPSVIIWSLGNESGHGANHDALYRWIKSVDPSRPVQYEGGGADTTATDIICPMYARVDEDQPFPAVPKWSIKKWLSLPGETRPLILCEYAHAMGNSLGGFAKYWQAFRQYPRLQGGFVWDWVDQSLIKYDENGNPWSAYGGDFGDTPNDRQFCMNGLVFADRTPHPALTEAKHQQQFFQFRLSGQTIEVTSEYLFRHSDNELLHWMVALDGKPLASGEVPLDVAPQGKQLIELPELPQPESAGQLWLTVRVVQPNATAWSEAGHISAWQQWRLAENLSVTLPAASHAIPHLTTSEMDFCIELGNKRWQFNRQSGFLSQMWIGDKKQLLTPLRDQFTRAPLDNDIGVSEATRIDPNAWVERWKAAGHYQAEAALLQCTADTLADAVLITTAHAWQHQGKTLFISRKTYRIDGSGQMAITVDVEVASDTPHPARIGLNCQLAQVAERVNWLGLGPQENYPDRLTAACFDRWDLPLSDMYTPYVFPSENGLRCGTRELNYGPHQWRGDFQFNISRYSQQQLMETSHRHLLHAEEGTWLNIDGFHMGIGGDDSWSPSVSAEFQLSAGRYHYQLVWCQK
（配列番号：１）
【００４２】
ＲＴＫ融合体は以下を含む：ＥｒｂＢ‐１（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ‐２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＲＲ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＣＳＦ‐１Ｒ、Ｃ‐Ｋｉｔ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、Ｆｌｔ３、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ‐１）、ＶＥＧＦＲ‐２（Ｆｌｔ‐１／ＫＤＲ）、ＶＥＧＦＲ‐３（Ｆｌｔ‐４）、Ｃ‐Ｍｅｔ、ＲＯＮ、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＳＫＹ（ＴＹＲＯ３）（Ｄｔｋ）、ＬＴＫ（ＴＹＫ１）、ＡＬＫ、Ｔｉｅ‐１、Ｔｉｅ‐２、（ＴＥＫ）、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＭｕＳＫ、ＲＥＴ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＣＣＫ４（ＰＴＫ７）、ＲＯＳ、ＡＡＴＹＫ１、ＡＡＴＹＫ２、ＡＡＴＹＫ３、ＲＯＲ１およびＲＯＲ２。
【００４３】
細胞株は以下を含む：ＴｒｋＡ‐ＰＫ融合体およびＳＨＣ１‐ＥＡを含有するＵ２ＯＳ、ＩＮＳＲ（インスリン受容体）‐ＰＫ融合体およびＰＬＣＧ２（ホスホリパーゼＣγ２（ホスファチジルイノシトール特異的））‐ＥＡを含有するＵ２ＯＳ、ＩＧＦ１Ｒ‐ＰＫ（インスリン様成長因子１受容体）およびＳＨＣ１‐ＥＡを含有するＵ２ＯＳ、ＴｒｋＢ‐ＰＫ融合体およびＳＨＣ１‐ＥＡ、ＴｒｋＣ‐ＰＫ融合体およびＳＨＣ１‐ＥＡを含有するＵ２ＯＳ、ＰＬＣＧ１（ホスホリパーゼＣγ１）‐ＥＡを含むＰＤＧＦＲＢ‐ＰＫ融合体を含有するＵ２ＯＳ、Ｇｒｂ２（成長因子受容体結合タンパク質２）‐ＥＡを含むＰＤＧＦＲＢ‐ＰＫ融合体を含有するＵ２ＯＳ、ＰＬＣＧ２‐ＥＡを含むＰＤＧＦＲＢ‐ＰＫ融合体を含有するＵ２ＯＳ、ＰＴＰＮ  １１（プロテイン  チロシンホスファターゼ、非受容体１１型）を含むＰＤＧＦＲＢ‐ＰＫ融合体を含有するＵ２ＯＳ‐ＥＡ、ＳＹＫ（脾臓チロシンキナーゼ）‐ＥＡ、ＥｒｂＢ４（ｖ‐ｅｒｂ‐ａ赤芽球白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４）‐ＰＫ融合体およびＧｒｂ２（成長因子受容体結合タンパク質２）‐ＥＡを含むＰＤＧＦＲＢ‐ＰＫ融合体を含有するＵ２ＯＳ。
【００４４】
一般に、融合タンパク質のための発現コンストラクトは、少なくともプロモータ（５’から３’の順）と、その後に続く受容体またはＳＨ２ドメインと、その後に続くリンカーと、その後に続くＥＡまたはＰＫを含む。すべてのアッセイで１ウェル当たり１０，０００セルを２０μＬの培地に播種し、０．１％ＢＳＡおよび適切な基本培地（Ｆ‐１２またはＤＭＥＭ）中で一晩培養した。アゴニストアッセイでは５μＬの化合物を細胞に加え室温で培養した。アンタゴニストアッセイでは５倍で５μＬの化合物を細胞に加え３７℃／５％ＣＯ２で１０分間培養し、その後６倍で５μＬのアゴニストを加え室温で６０分間培養した。５０％（ｖ／ｖ）のＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｄｘ ９３‐０００１、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ試薬はＤｉｓｃｏｖｅＲｘ社（カリフォルニア州フリーモント）から入手可能）を用いてＳＨ２‐ＥＡのＲＴＫとの複合体形成を検出した（溶解緩衝液活性成分１％ＣＨＡＰＳ、Ｅｍｅｒａｌｄ ＩＩ（商標）およびＧａｌａｃｔｏｎ Ｓｔａｒ（商標）はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から入手可能）。Ｐａｃｋａｒｄ Ｖｉｃｔｏｒ ２（登録商標）またはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＶｉｅｗＬｕｘ（登録商標）リーダまたは同等の計器上でデータを読み取り、このデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４（登録商標）分析ソフトウェアを使用して分析した。
【００４５】
ＴｒｋＡ‐ＰＫおよびＳＨＣ１‐ＥＡ融合タンパク質を発現するＵ２ＯＳ細胞を３８４ウェルプレートの各ウェル内の０．１％ＦＢＳを含む無血清培地に入れて１０Ｋ細胞／ウェルで平板培養した。翌日、これらの細胞を１％ＢＳＡを添加したＰＢＳ中の１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ、または０．１％ＢＳＡを添加したＰＢＳにより室温で異なる期間にわたって処理し、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ社）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ試薬を使用して検定した。結果を図１に示す。
【００４６】
５Ｋ細胞／ウェルのＵ２ＯＳ  ＴｒｋＡ‐ＰＫ  ＳＨＣ１‐ＥＡ二重安定細胞を３８４ウェルプレートの各ウェル内の０．１％ＦＢＳを含む無血清培地に入れて平板培養した。翌日、これらの細胞を異なる濃度のＮＧＦにより室温で１時間処理した（上記の説明参照）。次いでＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ化学発光基質を加え、１時間後にシグナルを読み取った。９．３ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０および７．８のアッセイウィンドウが得られた。結果は図２のとおりである。
【００４７】
５Ｋ細胞／ウェルのＵ２ＯＳ  ＴｒｋＡ‐ＰＫ  ＳＨＣ１‐ＥＡ二重安定細胞を３８４ウェルプレートの各ウェル内の０．１％ＦＢＳを含む無血清培地に入れて平板培養した。翌日、これらの細胞を異なる濃度のアンタゴニスト、例えば市販のＴｒｋＡ阻害剤またはＴｒｋ阻害剤であるＫ２５２ａ［（８Ｒ＊，９Ｓ＊，１１Ｓ＊）‐（−）‐９‐ヒドロキシ‐９‐メトキシカルボニル‐８‐メチル‐２，３，９，１０‐テトラヒドロ‐８，１１‐エポキシ‐１Ｈ，８Ｈ，１１Ｈ‐２，７ｂ，１１ａ‐トリアザジベンゾ（ａ，ｇ）シクロオクタ（ｃｄｅ）‐トリンデン‐１‐オン］等により室温で１０分間処理し、その後２０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦにより室温で１時間刺激した（上記の説明参照）。次いでＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ化学発光基質を加え、１時間後にシグナルを読み取った。ＴｒｋＡ阻害剤からは１８ｎＭのＩＣ５０および６．７のアッセイウィンドウが与えられた。Ｋ‐２５２ａからは３７ｎＭのＩＣ５０および７．６のアッセイウィンドウが与えられた。結果は図３のとおりである。
【００４８】
５Ｋ細胞／ウェルのＰＤＧＦＲＢ‐ＰＫ  ＳＨ２含有タンパク質‐ＥＡの二重安定細胞を３８４ウェルプレートの各ウェル内の０．１％ＦＢＳを含む無血清培地に入れて平板培養した。下記の６つのＳＨ２含有タンパク質‐ＥＡを使用した：ＳＨＣ１‐ＥＡ、Ｇｒｂ２‐ＥＡ、ＰＬＣＧ‐１‐ＥＡ、ＰＬＣＧ２‐ＥＡ、ＰＴＰＮ１１‐ＥＡおよびＳＹＫ‐ＥＡ。翌日、これらの細胞を０．１％ＦＢＳを含む無血清培地内に１００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ‐ＡＢを加えてまたは加えずに室温で１時間処理した。次いでＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ化学発光基質を加え、２時間後にシグナルを読み取った。結果は図４のとおりである。
【００４９】
１０Ｋ細胞／ウェルのＩＧＦ１Ｒ‐ＰＫ  ＳＨ２含有タンパク質‐ＥＡの二重安定細胞を３８４ウェルプレートにおいて平板培養し、指定のアッセイ手順に従ってＩＦＧ１Ｒの既知のリガンドであるＩＧＦ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社（カタログ番号：ＡＦ‐１００‐１１））により室温で３時間刺激した。刺激後に検出試薬を加え、１時間後にＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（９３‐０００１）を使用してシグナルを検出した。４．４倍のアッセイウィンドウが観察され、リガンドＩＧＦ１のＥＣ５０は１７ｎｇ／ｍｌであった。結果は図５のとおりである。
【００５０】
１０ｋ細胞／ウェルのＩＮＳＲ‐ＰＫ  ＳＨ２含有タンパク質‐ＥＡの二重安定細胞を３８４ウェルプレートにおいて平板培養し、指定のアッセイ手順に従ってＩＮＳＲの既知のリガンドであるインスリンより室温で３時間刺激した。刺激後に検出試薬を加え、１時間後にＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（９３‐０００１）を使用してシグナルを検出した。７．６倍のアッセイウィンドウが観察され、リガンドＩＧＦ１のＥＣ５０は２．０ｎｇ／ｍｌであった。
【００５１】
１０Ｋ細胞／ウェルのＴｒｋＢ‐ＰＫ  ＳＨ２含有タンパク質‐ＥＡの二重安定細胞を３８４ウェルプレートにおいて平板培養し、指定のアッセイ手順に従ってＴｒｋＢの既知のリガンドであるＢＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、カタログ番号：４５０‐０２）により室温で３時間刺激した。刺激後に検出試薬は加え、１時間後にＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（９３‐０００１）を使用してシグナルを検出した。４．０倍のアッセイウィンドウが観察され、リガンドＢＤＮＦのＥＣ５０は４．２１ｎｇ／ｍｌであった。結果は図７のとおりである。
【００５２】
１０Ｋ細胞／ウェルのＴｒｋＣ‐ＰＫ  ＳＨ２含有タンパク質‐ＥＡの二重安定細胞を３８４ウェルプレートにおいて平板培養し、指定のアッセイ手順に従ってＴｒｋＣの既知のリガンドであるＮＴ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、カタログ番号：４５０‐０３））により室温で３時間刺激した。刺激後に検出試薬は加え、１時間後にＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（９３‐０００１）を使用してシグナルを検出した。８．１倍のアッセイウィンドウが観察され、リガンドＮＴ３のＥＣ５０は７ｎｇ／ｍｌであった。結果は図８のとおりである。
【００５３】
リン酸化のためのサイトゾルチロシンキナーゼに依存する有意な数のＴＫＲが存在する。このようなＴＫＲ受容体を活性化するためのアッセイは、細胞がサイトゾルチロシンキナーゼを過発現する発現コンストラクトを有し三倍安定となる点を除いて、上述のアッセイとほぼ同じである。下記の実施例では、以下のコンストラクトを含むＵ２ＯＳ細胞を使用した：ｎｅｏ（ネオマイシン）セレクションを有するＧ‐ＣＳＦＲ（顆粒白血球‐コロニー刺激因子受容体）‐ＰＫ、ｈｙｇｒｏ（ハイグロマイシン）セレクションを有するＳＨＣ１‐ＥＡ、およびピューロマイシンセレクションを有するＪａｋ２。結果は図９のとおりである。
【００５４】
ＲＴＫ、ＳＨ２およびＮＲＴＫドメインの遺伝子は、民間供給業者等任意の便利なソースから得ることができ、ＲＴ  ＰＣＲは、従来の手順に従い既知の配列をプローブとして使用して分離されたＲＮＡから得ることができ、ＰＣＲは、既知の配列に由来するプライマーを使用してゲノムＤＮＡから得ることができる。これらの遺伝子は、３’端の終始コドンを除去するために増幅され、その後制限部位がプライマー配列と共に含まれる制限酵素によって消化されるＰＣＲである。次いで、これらの産物を従来の手法で精製し、その後ＰＫまたはＥＡでフレームを読み取る際はＰＫまたはＥＡが挿入された市販ベクターに結合する。ＰＫおよびＥＡを遺伝子から分離するのはｇｌｙ‐ｓｅｒリンカーであるが、このリンカーは融合タンパク質に柔軟性をもたらし、それによりコンプリメンテーションを強化する。このリンカーは活性に必要なものではない。転写調節領域は、一般にベクター用に使用されるウイルスの５’ＬＴＲのような市販ベクター内に存在する。代案としてＣＭＶプロモータを使用することもできる。次いで、結果として得られたベクターを、モロニーマウス白血病ウイルスベクターおよびパッケージング細胞株によるリポソーム媒介トランスフェクションまたは回収性感染（retrival infection）によって宿主細胞中に導入する。その後、結果として得られたウイルスをウイルス感染に使用する。これらのベクターもハイグロマイシン、ピューロマイシンおよびネオマイシン耐性のような選択遺伝子を含み、またコンストラクトが統合される細胞を従来の選択培地で選択する。その後、アゴニスト用量反応アッセイにおいて、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ試薬を使用して生存細胞を白壁マイクロプレート内でスクリーニングした。
【００５５】
上記の結果から、本方法がＲＴＫのアゴニストおよびアンタゴニストを測定する頑健且つ正確なアッセイを提供することが理解されるだろう。候補化合物の哺乳類環境における効果を厳密に定義するために、細胞環境内のハイスループットスクリーニングで効果的に使用可能な細胞を提供する。これらのプロトコルは平易であり、標準的な機器を使用するため容易に自動化することができる。
【００５６】
［結論］
上記の実施例を参照しながら本発明の説明を行ってきたが、本発明の精神および範囲には様々な修正形態および変更形態が含まれることが理解されるだろう。従って、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。本明細書中で言及したすべての参考文献は、それらの内容全体を参照により本明細書に援用する。
【図１】
0005739807.tif 000002
【図２】
0005739807.tif 000003
【図３】
0005739807.tif 000004
【図４】
0005739807.tif 000005
【図５】
0005739807.tif 000006
【図６】
0005739807.tif 000007
【図７】
0005739807.tif 000008
【図８】
0005739807.tif 000009
【図９】
0005739807.tif 000010
【配列表】
0005739807000001.xml