(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３７に示される核酸分子、または配列番号３７に示される核酸分子と少なくとも９０％の相同性を有する、ＭＣＰ−１に結合する核酸分子を含む肺高血圧の治療および／または予防用の医薬組成物であって、前記核酸分子が注射によって投与される医薬組成物。
【請求項２】
前記肺高血圧が、左心疾患と関連する肺高血圧、肺病および／または低酸素血と関連する肺高血圧、慢性血栓疾患および／または慢性塞栓疾患による肺高血圧、ならびに肺動脈高血圧の群から選択される請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記肺高血圧が、肺動脈高血圧である請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記肺動脈高血圧が、特発性肺動脈高血圧、コラゲノース関連肺動脈高血圧、家族性肺動脈高血圧、他の疾患と関連する肺動脈高血圧、または静脈疾患もしくは毛細血管疾患と関連する肺動脈高血圧である請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記核酸分子が修飾を含む請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記修飾が、前記核酸分子に付加される高分子量成分である請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記修飾が、動物もしくはヒトの体内の滞留時間の点から、請求項１に記載の核酸の特徴を修飾することを可能にする請求項５または６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記修飾が、ＨＥＳ成分、ＰＥＧ成分、生分解性修飾、およびそれらの組み合わせを含む群から選択される請求項５〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＣＰ−１に結合する核酸ならびに薬剤および診断用薬の製造のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質−１。別名、ＭＣＡＦ［単球化学誘引因子および単球活性化因子］、ＣＣＬ２、ＳＭＣ−ＣＦ［平滑筋細胞コロニー刺激因子］、ＨＣ−１１、ＬＤＣＦ、ＧＤＣＦ、ＴＳＧ−８、ＳＣＹＡ２、Ａ２、スイスプロット（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）アクセッションコード、Ｐ１３５００）は、３つのグループにより独立して特徴付けられた（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ  １９８８、Ｒｏｌｌｉｎｓ  １９８９、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  １９８９）。ヒトＭＣＰ−１は７６アミノ酸から成り、全てのケモカインと同様にヘパリン結合部位を特色とする。２つの分子内ジスルフィド結合は、安定した、強固な構造を分子に与える。さらに、ＭＣＰ−１は、そのアミノ末端にピログルタミン酸を持つ。Ｔｈｒ７１に、潜在的なＯ結合型グリコシル化部位が位置する。さらなるＭＣＰファミリーメンバーは、ヒト（ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４）およびマウス（ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−５）の両方において存在する。これらのヒトタンパク質は、ヒトＭＣＰ−１に約７０％相同である。
【０００３】
ＭＣＰ−１の構造は、ＮＭＲ（Ｈａｎｄｅｌ  １９９６）およびＸ線（Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ  １９９７）によって解明されている。ＭＣＰ−１単量体は、アミノ末端システインの後に、ギリシャキーモチーフにおける３つの逆平行β−プリーツシートになる長いループが続く、典型的なケモカイン折り畳み構造を有する。このタンパク質は、３つのβシートを覆うαヘリックスで終結する（ＰＤＢデータアクセッションコード１ＤＯＫ）。
【０００４】
異なる哺乳動物種に由来するＭＣＰ−１形態の３次元構造は、概して保存されてきたが、アミノ酸配列は、進化の間に、特に十分に保存されてきたというわけではない。配列アライメント結果は、最初の７６アミノ酸内の、ヒトおよびマウスのＭＣＰ−１（ＪＥとも呼ばれる）の間の５５％の全体的な配列類似性を示す。アミノ酸配列以外に、マウスＭＣＰ−１は、分子サイズ（１２５アミノ酸）およびグリコシル化の程度においてヒトＭＣＰ−１と異なる。マウスＭＣＰ−１は、ヒトＭＣＰ−１において存在せず、インビトロ生物活性に必要とされない４９アミノ酸のカルボキシ末端ドメインを含む。ヒトＭＣＰ−１は、次のものに由来するＭＣＰ−１と以下の割合の同一アミノ酸を共有する。
・  Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ（アカゲザル）ＭＣＰ−１  ９７％
・  Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ（ブタ）ＭＣＰ−１  ７９％
・  Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ（ウマ）  ７８％
・  Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ）ＭＣＰ−１  ７６％
・  Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ（ウサギ）ＭＣＰ−１  ７５％
・  Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ（ウシ）  ７２％
・  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＭＣＰ−３  ７１％
・  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  エオタキシン  ６４％
・  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＭＣＰ−２  ６２％
・  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）  ＭＣＰ−１  ５５％
・  Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット）ＭＣＰ−１  ５５％
【０００５】
この高度の相違を考慮すれば、げっ歯動物モデルにおける薬理学的研究の作業を成功させるために、げっ歯動物ＭＣＰ−１のアンタゴニストを生成することは必要であるかもしれない。
【０００６】
ＭＣＰ−１は、単球／マクロファージ、好塩基球、活性化Ｔ細胞、およびＮＫ細胞の強力な誘引物質である。内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、滑膜細胞、メサンギウム細胞、骨芽細胞、平滑筋細胞などの幅広い種類の細胞型および多くの腫瘍細胞が、ＭＣＰ−１を発現する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  １９９４）。その発現は、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＬＰＳ（リポ多糖）、およびＧＭ−ＣＳＦなどのいくつかのタイプの炎症誘発性物質によって刺激される。
【０００７】
乱雑なケモカインネットワークにおいてかなり珍しいことに、ＭＣＰ−１は、その受容体利用が高度に特異的であり、高親和性でケモカイン受容体ＣＣＲ２にのみ結合する。全てのケモカイン受容体と同様に、ＣＣＲ２は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である（Ｄａｗｓｏｎ  ２００３）。ＣＣＲ２は、カルボキシ末端領域をコードするｍＲＮＡの選択的スプライシングにより２つのわずかに異なる形態、ＣＣＲ２ａおよびＣＣＲ２ｂで発現されるようである（Ｃｈａｒｏ  １９９４）。これらの受容体は、単球、骨髄前駆細胞、および活性化Ｔ細胞において発現される（Ｍｙｅｒｓ  １９９５、Ｑｉｎ  １９９６）。ＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクトされた受容体に対するＭＣＰ−１の解離定数は、単球で測定された値と一致する２６０ｐＭである（Ｍｙｅｒｓ  １９９５、Ｖａｎ  Ｒｉｐｅｒ  １９９３）。ＭＣＰ−１による、トランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞上のＣＣＲ２ｂの活性化は、９０ｐＭの濃度でアデニリルシクラーゼを阻害し、わずかに、より高い濃度で細胞内カルシウムを動員し、表面上はホスファチジルイノシトールの加水分解に依存していない。アデニリルシクラーゼおよび細胞内カルシウム放出に対する効果は百日咳毒素によって強く阻害され、このことはシグナル伝達におけるＧｉ型ヘテロ三量体Ｇタンパク質の関与を暗示する（Ｍｙｅｒｓ  １９９５）。
【０００８】
ＭＣＰ−１は、炎症組織への単球動員に関与する。そこでは、在住マクロファージは、ＭＣＰ−１などのようなケモカインならびにＴＮＦ、ＩＬ−１βなどのようなサイトカインを放出し、これらは、一連の接着分子を発現するように内皮細胞を活性化する。結果として生じる「粘着性の」内皮は血管中の単球をその表面に沿って進ませる。ここで、単球は、内皮表面上に提示されるＭＣＰ−１に出会い、ＭＣＰ−１は、単球上のＣＣＲ２に結合し、それらを活性化する。このことは、内皮に沿った単球の強固な捕捉、拡散、および周囲の組織への遊出を最終的にもたらし、ここで、単球は、マクロファージに分化し、最大のＭＣＰ−１濃度の部位に向かって移動する。
【０００９】
ＭＣＰ−１は、小さな（約８〜１４ｋＤａ）ヘパリン結合性の、大部分は塩基性の、構造上関連する分子のファミリーであるケモカインファミリーのメンバーである。それらは、炎症組織において主に形成され、白血球細胞（白血球）の動員、活性化、および増殖を調節する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  １９９４、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  １９９５、Ｓｃｈａｌｌ  １９９４）。ケモカインは、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、肥満細胞、Ｔ細胞、およびＢ細胞の走化性を選択的に誘発する。それらの走化性効果に加えて、それらは、細胞形状における変化、遊離細胞内カルシウムイオンの濃度の一時的な増加、脱顆粒、インテグリンのアップレギュレーション、ロイコトリエン、プロスタグランジン、トロンボキサンなどのような生物活性脂質の形成、または呼吸バースト（病原性生物もしくは腫瘍細胞の破壊のための活性酸素種の放出）のような、応答性の細胞における他の効果を選択的に及ぼすことができる。したがって、さらなる炎症誘発性媒介物質の放出、感染または炎症の部位に向けての白血球の走化性、および血管外遊出を誘発することによって、ケモカインは、炎症応答の段階的増大を引き起こす。
【００１０】
４つの保存されたシステイン残基のうちの最初の２つの配置に基づいて、ケモカインは、４つのクラスに分類される。システインが縦に並んでいるＣＣまたはβ−ケモカイン、システイン残基が１つのさらなるアミノ酸残基によって隔てられているＣＸＣまたはα−ケモカイン、ジスルフィド架橋を１つだけ持ち、現在のところ、リンホタクチンが唯一の代表であるＸＣまたはγケモカイン、および、システインの間の３つのアミノ酸残基を特色とし、膜結合型フラクタルカインが、現在のところ知られている唯一のクラスメンバーであるＣＸ３Ｃ−ケモカイン（Ｂａｚａｎ  １９９７）。
【００１１】
ＣＸＣケモカイン、特にそれらのアミノ末端上にアミノ酸配列ＥＬＲを持つそれらのＣＸＣケモカインは、主として好中球に作用する。好中球上で活性のＣＸＣケモカインの例は、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、およびＧＲＯγ、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ならびにＧＣＰ−２である。ＣＣケモカインは、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、ならびにＴリンパ球およびＢリンパ球などの幅広い種類の白血球に作用する（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ  １９９１、Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  １９９４；Ｍｉｌｌｅｒ  １９９２、Ｊｏｓｅ  １９９４、Ｐｏｎａｔｈ  １９９６ａ）。これらの例は、Ｉ−３０９、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−β、ＲＡＮＴＥＳ、ならびにエオタキシンである。
【００１２】
ケモカインは、７回膜貫通Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ、Ｍｕｒｐｈｙ  ２０００）のスーパーファミリーに属する受容体を通して作用する。概して言えば、ケモカインおよびケモカイン受容体の相互作用は、１つのケモカインが、多くのケモカイン受容体に結合することができ、逆に、１つのケモカイン受容体が、いくつかのケモカインと相互作用することができるという点で、乱雑となる傾向がある。ＣＣケモカインについていくつかの知られている受容体は、ＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳに結合するＣＣＲ１（Ｎｅｏｔｅ  １９９３；Ｇａｏ  １９９３）、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、およびＭＣＰ−４を含むケモカインに結合するＣＣＲ２（Ｃｈａｒｏ  １９９４、Ｍｙｅｒｓ  １９９５、Ｇｏｎｇ  １９９７、Ｇａｒｃｉａ−Ｚｅｐｅｄａ  １９９６）、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ、およびＭＣＰ−３を含むケモカインに結合するＣＣＲ３（Ｐｏｎａｔｈ  １９９６ｂ）、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、およびＲＡＮＴＥＳに応答してシグナル伝達することが分かったＣＣＲ４（Ｐｏｗｅｒ  １９９５）、ならびにＭＩＰ−１αおよび−βならびにＲＡＮＴＥＳに応答してシグナル伝達することが示されたＣＣＲ５（Ｂｏｒｉｎｇ  １９９６、Ｒａｐｏｒｔ  １９９６、Ｓａｍｓｏｎ  １９９６）を含む。
【００１３】
上記に言及されるように、ＭＣＰファミリーの４つ全てのメンバー（１〜４）は、ＣＣＲ２に結合するのに対して、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、およびＭＣＰ−４はまた、ＣＣＲ１およびＣＣＲ３と相互作用することもでき（Ｇｏｎｇ  １９９７；Ｈｅａｔｈ  １９９７、Ｕｇｕｃｃｉｏｎｉ  １９９７）、ＭＣＰ−２の場合には、ＣＣＲ５と相互作用することができる（Ｒｕｆｆｉｎｇ  １９９８）。ＭＣＰファミリーとの高度な相同性を示す他のＣＣケモカインは、エオタキシンであり、これは、元々、抗原で刺激された感作モルモットから採取された気管支肺胞洗浄液から単離された（Ｊｏｓｅ  １９９４）。エオタキシンもまた、ＣＣＲ２を活性化することができることが示された（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ  ２００１）。
【発明の概要】
【００１４】
本発明の根底にある問題は、ＭＣＰ−１と特異的に相互作用する手段を提供することであり、この手段は、慢性疾患および慢性障害の予防および／または治療にそれぞれ適している。より具体的には、本発明の根底にある問題は、ＭＣＰ−１と特異的に相互作用する核酸ベースの手段を提供することであり、この核酸は、慢性疾患および慢性障害の予防および／または治療にそれぞれ適している。
【００１５】
本発明の根底にあるさらなる問題は、疾患の治療のための診断用薬の製造のための手段を提供することであり、疾患は、それぞれ慢性疾患および慢性障害である。
【００１６】
上記の明示された問題に関して、慢性疾患および慢性障害は、それぞれ、好ましくは、慢性呼吸器疾患、慢性腎臓疾患、および全身性エリテマトーデスである。
【００１７】
本発明の根底にあるこれらおよび他の問題は、添付の独立請求項に記載の事項によって解決される。好ましい実施形態は、従属請求項から導かれてもよい。
【００１８】
本発明の根底にある問題は、独立請求項に記載の事項によって解決される。好ましい実施形態は、従属請求項に従う。
【００１９】
より具体的には、第１の態様として、なお、これは、この第１の態様の第１の実施形態でもあるが、本発明の根底にある問題は、ＭＣＰ−１に結合可能な核酸分子であって、慢性呼吸器疾患、慢性腎臓疾患、および全身性エリテマトーデスからなる群から好ましくは選択される慢性疾患または慢性障害の治療および／または予防のための薬剤として使用される核酸分子によって解決される。
【００２０】
第２の態様として、なお、これは、この第２の態様の第１の実施形態でもあるが、本発明の根底にある問題は、ＭＣＰ−１に結合可能な核酸分子であって、慢性呼吸器疾患、慢性腎臓疾患、および全身性エリテマトーデスからなる群から好ましくは選択される慢性疾患または慢性障害の診断のための診断用薬として使用される核酸分子によって解決される。
【００２１】
第１および第２の態様の第２の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第１の実施形態の一実施形態でもあるが、慢性呼吸器疾患は、肺炎、肺および胸膜の炎症、胸膜炎、胸水、ループス肺炎、慢性びまん性間質性肺病、肺塞栓、肺出血、縮小肺症候群（ｓｈｒｉｎｋｉｎｇ  ｌｕｎｇ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、肺高血圧、ならびに慢性閉塞性肺疾患ならびにそれらの組み合わせの群から選択される。
【００２２】
第１および第２の態様の第３の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもあるが、肺高血圧は、左心疾患と関連する肺高血圧、肺病および／または低酸素血と関連する肺高血圧、慢性血栓疾患および／または慢性塞栓疾患による肺高血圧、肺動脈高血圧、好ましくは特発性肺動脈高血圧、コラゲノース（ｃｏｌｌａｇｅｎｏｓｅ）関連肺動脈高血圧、家族性肺動脈高血圧、他の疾患と関連する肺動脈高血圧、ならびに静脈疾患または毛細血管疾患と関連する肺動脈高血圧の群から選択される。
【００２３】
第１および第２の態様の第４の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第１、第２、および第３の実施形態の一実施形態でもあるが、慢性閉塞性肺疾患は、肺血管病変を伴う慢性閉塞性肺疾患または肺血管病変を伴わない慢性閉塞性肺疾患である。
【００２４】
第１および第２の態様の第５の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第１、第２、第３、および第４の実施形態の一実施形態でもあるが、慢性閉塞性肺疾患は、慢性気管支炎および肺気腫の群から選択される。
【００２５】
第１および第２の態様の第６の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第１の実施形態の一実施形態でもあるが、慢性腎臓疾患は、ループス腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、ＩｇＡネフロパシー、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、腎炎症候群、巣状分節性糸球体硬化症、糖尿病性ネフロパシー、ネフローゼ症候群、およびネフローゼ症候群の群から選択され、好ましくはループス腎炎である。
【００２６】
第１および第２の態様の第７の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、および第６の実施形態の一実施形態でもあるが、核酸は、１Ａ型核酸、１Ｂ型核酸、２型核酸、３型核酸、４型核酸、および配列番号８７〜１１５のうちのいずれかに記載の核酸配列を有する核酸を含む群から選択される。
【００２７】
第１および第２の態様の第８の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第７の実施形態の一実施形態でもあるが、２型核酸は、第１のストレッチボックスＢ１Ａ、第２のストレッチボックスＢ２、および第３のストレッチボックスＢ１Ｂを５’→３’方向に含み、
第１のストレッチボックスＢ１Ａおよび第３のストレッチボックスＢ１Ｂは、任意選択的に互いにハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションに際して、二本鎖構造が形成され、
第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＡＣＧＣＡ、ＣＧＣＡ、およびＧＣＡを含む群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
第２のストレッチボックスＢ２は、ＣＳＵＣＣＣＵＣＡＣＣＧＧＵＧＣＡＡＧＵＧＡＡＧＣＣＧＹＧＧＣＵＣのヌクレオチド配列を含み、
第３のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＵＧＣＧＵ、ＵＧＣＧ、およびＵＧＣを含む群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００２８】
第１および第２の態様の第９の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第８の実施形態の一実施形態でもあるが、第２のストレッチボックスＢ２は、ＣＧＵＣＣＣＵＣＡＣＣＧＧＵＧＣＡＡＧＵＧＡＡＧＣＣＧＵＧＧＣＵＣのヌクレオチド配列を含む。
【００２９】
第１および第２の態様の第１０の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第８および第９の実施形態の一実施形態でもあるが、
ａ）第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＡＣＧＣＡのヌクレオチド配列を含み、第３のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＵＧＣＧＵのヌクレオチド配列を含むか、または
ｂ）第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＣＧＣＡのヌクレオチド配列を含み、第３のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＵＧＣＧのヌクレオチド配列を含むか、または
ｃ）第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＧＣＡのヌクレオチド配列を含み、第３のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＵＧＣまたはＵＧＣＧのヌクレオチド配列を含む。
【００３０】
第１および第２の態様の第１１の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第８、第９、および第１０の実施形態の一実施形態でもあるが、第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＧＣＡのヌクレオチド配列を含む。
【００３１】
第１および第２の態様の第１２の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第８、第９、第１０、および第１１の実施形態、好ましくは、第１および第２の態様の第１１の実施形態の一実施形態でもあるが、第３のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＵＧＣＧのヌクレオチド配列を含む。
【００３２】
第１および第２の態様の第１３の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第８、第９、第１０、第１１、および第１２の実施形態の一実施形態でもあるが、核酸は、配列番号３７、配列番号１１６、配列番号１１７、および配列番号２７８に記載の核酸配列を含む。
【００３３】
第１および第２の態様の第１４の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、および第７の実施形態の一実施形態でもあるが、３型核酸は、第１のストレッチボックスＢ１Ａ、第２のストレッチボックスＢ２Ａ、第３のストレッチボックスＢ３、第４のストレッチボックスＢ２Ｂ、第５のストレッチボックスＢ４、第６のストレッチボックスＢ５Ａ、第７のストレッチボックスＢ６、第８のストレッチボックスＢ５Ｂ、および第９のストレッチボックスＢ１Ｂを５’→３’方向に含み、
第１のストレッチボックスＢ１Ａおよび第９のストレッチボックスＢ１Ｂは、任意選択的に互いにハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションに際して、二本鎖構造が形成され、
第２のストレッチボックスＢ２Ａおよび第４のボックスＢ２Ｂは、任意選択的に互いにハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションに際して、二本鎖構造が形成され、
第６のストレッチボックスＢ５Ａおよび第８のボックスＢ５Ｂは、任意選択的に互いにハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションに際して、二本鎖構造が形成され、
第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＧＵＲＣＵＧＣ、ＧＫＳＹＧＣ、ＫＢＢＳＣ、およびＢＮＧＣを含む群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
第２のストレッチボックスＢ２Ａは、ＧＫＭＧＵのヌクレオチド配列を含み、
第３のストレッチボックスＢ３は、ＫＲＲＡＲのヌクレオチド配列を含み、
第４のストレッチボックスＢ２Ｂは、ＡＣＫＭＣのヌクレオチド配列を含み、
第５のストレッチボックスＢ４は、ＣＵＲＹＧＡ、ＣＵＷＡＵＧＡ、ＣＷＲＭＧＡＣＷ、およびＵＧＣＣＡＧＵＧを含む群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
第６のストレッチボックスＢ５Ａは、ＧＧＹおよびＣＷＧＣを含む群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
第７のストレッチボックスＢ６は、ＹＡＧＡ、ＣＫＡＡＵ、およびＣＣＵＵＵＡＵを含む群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
第８のストレッチボックスＢ５Ｂは、ＧＣＹＲおよびＧＣＷＧを含む群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
第９のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＧＣＡＧＣＡＣ、ＧＣＲＳＭＣ、ＧＳＶＶＭ、およびＧＣＮＶを含む群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００３４】
第１および第２の態様の第１５の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第１４の実施形態の一実施形態でもあるが、第３のストレッチボックスＢ３は、ＧＡＧＡＡまたはＵＡＡＡＡのヌクレオチド配列を含む。
【００３５】
第１および第２の態様の第１６の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第１４および第１５の実施形態の一実施形態でもあるが、第５のストレッチボックスＢ４は、ＣＡＧＣＧＡＣＵまたはＣＡＡＣＧＡＣＵのヌクレオチド配列を含む。
【００３６】
第１および第２の態様の第１７の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第１４、第１５、および第１６の実施形態の一実施形態でもあるが、第５のストレッチボックスＢ４は、ＣＡＧＣＧＡＣＵのヌクレオチド配列を含み、ボックスＢ３は、ＵＡＡＡＡのヌクレオチド配列を含む。
【００３７】
第１および第２の態様の第１８の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第１４、第１５、および第１６の実施形態の一実施形態でもあるが、第５のストレッチボックスＢ４は、ＣＡＡＣＧＡＣＵのヌクレオチド配列を含み、第３のストレッチボックスＢ３は、ＧＡＧＡＡのヌクレオチド配列を含む。
【００３８】
第１および第２の態様の第１９の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第１４、第１５、第１６、第１７、および第１８の実施形態の一実施形態でもあるが、第７のストレッチボックスＢ６は、ＵＡＧＡのヌクレオチド配列を含む。
【００３９】
第１および第２の態様の第２０の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、および第１９の実施形態の一実施形態でもあるが、
ａ）第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＧＵＲＣＵＧＣのヌクレオチド配列を含み、第９のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＧＣＡＧＣＡＣのヌクレオチド配列を含むか、または
ｂ）第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＧＫＳＹＧＣのヌクレオチド配列を含み、第９のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＧＣＲＳＭＣのヌクレオチド配列を含むか、または
ｃ）第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＫＢＢＳＣのヌクレオチド配列を含み、第９のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＧＳＶＶＭのヌクレオチド配列を含むか、または
ｄ）第１のストレッチボックス  Ｂ１Ａは、ＢＮＧＣのヌクレオチド配列を含み、第９のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＧＣＮＶのヌクレオチド配列を含む。
【００４０】
第１および第２の態様の第２１の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第２０の実施形態の一実施形態でもあるが、
ａ）第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＧＵＧＣＵＧＣのヌクレオチド配列を含み、第９のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＧＣＡＧＣＡＣのヌクレオチド配列を含むか、または
ｂ）第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＧＵＧＣＧＣのヌクレオチド配列を含み、第９のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＧＣＧＣＡＣのヌクレオチド配列を含むか、または
ｃ）第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＫＫＳＳＣのヌクレオチド配列を含み、第９のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＧＳＳＭＭのヌクレオチド配列を含むか、または
ｄ）第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＳＮＧＣのヌクレオチド配列を含み、第９のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＧＣＮＳのヌクレオチド配列を含む。
【００４１】
第１および第２の態様の第２２の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第２１の実施形態の一実施形態でもあるが、第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＧＧＧＣのヌクレオチド配列を含み、第９のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＧＣＣＣのヌクレオチド配列を含む。
【００４２】
第１および第２の態様の第２３の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、および第２２の実施形態の一実施形態でもあるが、第２のストレッチボックスＢ２Ａは、ＧＫＭＧＵのヌクレオチド配列を含み、第４のストレッチボックスＢ２Ｂは、ＡＣＫＭＣのヌクレオチド配列を含む。
【００４３】
第１および第２の態様の第２４の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第２３の実施形態の一実施形態でもあるが、第２のストレッチボックスＢ２Ａは、ＧＵＡＧＵのヌクレオチド配列を含み、第４のストレッチボックスＢ２Ｂは、ＡＣＵＡＣのヌクレオチド配列を含む。
【００４４】
第１および第２の態様の第２５の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、および第２４の実施形態の一実施形態でもあるが、
ａ）第６のストレッチボックスＢ５Ａは、ＧＧＹのヌクレオチド配列を含み、第８のストレッチボックスＢ５Ｂは、ＧＣＹＲのヌクレオチド配列を含むか、または
ｂ）第６のストレッチボックスＢ５Ａは、ＣＷＧＣのヌクレオチド配列を含み、第８のストレッチボックスＢ５Ｂは、ＧＣＷＧのヌクレオチド配列を含む。
【００４５】
第１および第２の態様の第２６の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第２５の実施形態の一実施形態でもあるが、第６のストレッチボックスＢ５Ａは、ＧＧＣのヌクレオチド配列を含み、第８のストレッチボックスＢ５Ｂは、ＧＣＣＧのヌクレオチド配列を含む。
【００４６】
第１および第２の態様の第２７の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、および第２６の実施形態の一実施形態、好ましくは、第１および第２の態様の第２５および第２６の実施形態の一実施形態でもあるが、第６のストレッチボックスＢ５Ａは、第８のストレッチボックスＢ５ＢのヌクレオチドＧＣＹとハイブリダイズする。
【００４７】
第１および第２の態様の第２８の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第１４、第１５、第１６、第１７および第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、ならびに第２７の実施形態の一実施形態でもあるが、核酸は、配列番号５６に記載の核酸配列を含む。
【００４８】
第１および第２の態様の第２９の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第１４、第１５、第１６および第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、ならびに第２７の実施形態の一実施形態でもあるが、核酸は、配列番号５７〜６１、配列番号６７〜７１、および配列番号７３に記載の核酸配列を含む群から選択される核酸配列を含む。
【００４９】
第１および第２の態様の第３０の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、および第７の実施形態の一実施形態でもあるが、４型核酸は、第１のストレッチボックスＢ１Ａ、第２のストレッチボックスＢ２、第３のストレッチボックスＢ１Ｂを５’→３’方向に含み、
第１のストレッチボックスＢ１Ａおよび第３のストレッチボックスＢ１Ｂは、任意選択的に互いにハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションに際して、二本鎖構造が形成され、
第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＡＧＣＧＵＧＤＵ、ＧＣＧＣＧＡＧ、ＣＳＫＳＵＵ、ＧＵＧＵＵ、およびＵＧＵＵを含む群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
第２のストレッチボックスＢ２は、ＡＧＮＤＲＤＧＢＫＧＧＵＲＧＹＡＲＧＵＡＡＡＧ、ＡＧＧＵＧＧＧＵＧＧＵＡＧＵＡＡＧＵＡＡＡＧ、およびＣＡＧＧＵＧＧＧＵＧＧＵＡＧＡＡＵＧＵＡＡＡＧＡを含む群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
第３のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＧＮＣＡＳＧＣＵ、ＣＵＣＧＣＧＵＣ、ＧＲＳＭＳＧ、ＧＲＣＡＣ、およびＧＧＣＡを含む群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００５０】
第１および第２の態様の第３１の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第３０の実施形態の一実施形態でもあるが、
ａ）第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＧＵＧＵＵのヌクレオチド配列を含み、第３のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＧＲＣＡＣのヌクレオチド配列を含むか、
ｂ）第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＧＣＧＣＧＡＧのヌクレオチド配列を含み、第３のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＣＵＣＧＣＧＵＣのヌクレオチド配列を含むか、または
ｃ）第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＣＳＫＳＵＵのヌクレオチド配列を含み、第３のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＧＲＳＭＳＧのヌクレオチド配列を含むか、または
ｄ）第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＵＧＵＵのヌクレオチド配列を含み、
第３のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＧＧＣＡのヌクレオチド配列を含むか、または
ｅ）第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＡＧＣＧＵＧＤＵのヌクレオチド配列を含み、第３のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＧＮＣＡＳＧＣＵのヌクレオチド配列を含む。
【００５１】
第１および第２の態様の第３２の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第３１の実施形態の一実施形態でもあるが、第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＣＳＫＳＵＵのヌクレオチド配列を含み、第３のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＧＲＳＭＳＧのヌクレオチド配列を含む。
【００５２】
第１および第２の態様の第３３の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第３２の実施形態の一実施形態でもあるが、第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＣＣＧＣＵＵのヌクレオチド配列を含み、第３のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＧＧＧＣＧＧのヌクレオチド配列を含む。
【００５３】
第１および第２の態様の第３４の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第３０、第３１、第３２、および第３３の実施形態の一実施形態でもあるが、第２のストレッチボックスＢ２は、ＡＧＧＵＧＧＧＵＧＧＵＡＧＵＡＡＧＵＡＡＡＧのヌクレオチド配列を含む。
【００５４】
第１および第２の態様の第３５の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第３０、第３１、第３２、第３３、および第３４の実施形態の一実施形態でもあるが、核酸は、配列番号８０および配列番号８１に記載の核酸配列を含む。
【００５５】
第１および第２の態様の第３６の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、および第７の実施形態の一実施形態でもあるが、１Ａ型核酸は、第１のストレッチボックスＢ１Ａ、第２のストレッチボックスＢ２、第３のストレッチボックスＢ３、第４のストレッチボックスＢ４、第５のストレッチボックスＢ５、第６のストレッチボックスＢ６、および第７のストレッチボックスＢ１Ｂを５’→３’方向に含み、
第１のストレッチボックスＢ１Ａおよび第７のストレッチボックスＢ１Ｂは、任意選択で互いにハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションに際して、二本鎖構造が形成され、
第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＡＧＣＲＵＧのヌクレオチド配列を含み、
第２のストレッチボックスＢ２は、ＣＣＣＧＧＷのヌクレオチド配列を含み、
第３のストレッチボックスＢ３は、ＧＵＲのヌクレオチド配列を含み、
第４のストレッチボックスＢ４は、ＲＹＡのヌクレオチド配列を含み、
第５のストレッチボックスＢ５は、ＧＧＧＧＧＲＣＧＣＧＡＹＣのヌクレオチド配列を含み、
第６のストレッチボックスＢ６は、ＵＧＣＡＡＵＡＡＵＧまたはＵＲＹＡＷＵＵＧのヌクレオチド配列を含み、
第７のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＣＲＹＧＣＵのヌクレオチド配列を含む。
【００５６】
第１および第２の態様の第３７の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第３６の実施形態の一実施形態でもあるが、第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＡＧＣＧＵＧのヌクレオチド配列を含む。
【００５７】
第１および第２の態様の第３８の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第３６および第３７の実施形態の一実施形態でもあるが、第２のストレッチボックスＢ２は、ＣＣＣＧＧＵのヌクレオチド配列を含む。
【００５８】
第１および第２の態様の第３９の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第３６、第３７、および第３８の実施形態の一実施形態でもあるが、第３のストレッチボックスＢ３は、ＧＵＧのヌクレオチド配列を含む。
【００５９】
第１および第２の態様の第４０の実施形態として、なお、これは、第１および第２の態様の第３６、第３７、第３８、および第３９の実施形態の一実施形態でもあるが、第４のストレッチボックスＢ４は、ＧＵＡのヌクレオチド配列を含む。
【００６０】
第１および第２の態様の第４１の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第３６、第３７、第３８、第３９、および第４０の実施形態の一実施形態でもあるが、第５のストレッチボックスＢ５は、ＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＡＣＣのヌクレオチド配列を含む。
【００６１】
第１および第２の態様の第４２の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第３６、第３７、第３８、第３９、第４０、および第４１の実施形態の一実施形態でもあるが、第６のストレッチボックスＢ６は、ＵＡＣＡＵＵＵＧのヌクレオチド配列を含む。
【００６２】
第１および第２の態様の第４３の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第３６、第３７、第３８、第３９、第４０、第４１、および第４２の実施形態の一実施形態でもあるが、第７のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＣＡＣＧＣＵのヌクレオチド配列を含む。
【００６３】
第１および第２の態様の第４４の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第３６、第３７、第３８、第３９、第４０、第４１、第４２、および第４３の実施形態の一実施形態でもあるが、核酸は、配列番号２１に記載の核酸配列を含む。
【００６４】
第１および第２の態様の第４５の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、および第７の実施形態の一実施形態でもあるが、１Ｂ型核酸は、第１のストレッチボックスＢ１Ａ、第２のストレッチボックスＢ２、第３のストレッチボックスＢ３、第４のストレッチボックスＢ４、第５のストレッチボックスＢ５、第６のストレッチボックスＢ６、および第７のストレッチボックスＢ１Ｂを５’→３’方向に含み、
第１のストレッチボックスＢ１Ａおよび第７のストレッチボックスＢ１Ｂは、任意選択的に互いにハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションに際して、二本鎖構造が形成され、
第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＡＧＹＲＵＧのヌクレオチド配列を含み、
第２のストレッチボックスＢ２は、ＣＣＡＧＣＵまたはＣＣＡＧＹのヌクレオチド配列を含み、
第３のストレッチボックスＢ３は、ＧＵＧのヌクレオチド配列を含み、
第４のストレッチボックスＢ４は、ＡＵＧのヌクレオチド配列を含み、
第５のストレッチボックスＢ５は、ＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＡＣＣのヌクレオチド配列を含み、
第６のストレッチボックスＢ６は、ＣＡＵＵＵＵＡまたはＣＡＵＵＵＡのヌクレオチド配列を含み、
第７のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＣＡＹＲＣＵのヌクレオチド配列を含む。
【００６５】
第１および第２の態様の第４６の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第４５の実施形態の一実施形態でもあるが、第１のストレッチボックスＢ１Ａは、ＡＧＣＧＵＧのヌクレオチド配列を含む。
【００６６】
第１および第２の態様の第４７の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第４５および第４６の実施形態の一実施形態でもあるが、第２のストレッチボックスＢ２は、ＣＣＡＧＵのヌクレオチド配列を含む。
【００６７】
第１および第２の態様の第４８の実施形態として、なお、これは、第１の態様および第２の態様の第４５、第４６、および第４７の実施形態の一実施形態でもあるが、第６のストレッチボックスＢ６は、ＣＡＵＵＵＵＡのヌクレオチド配列を含む。
【００６８】
第１および第２の態様の第４９の実施形態として、なお、これは、第１および第２の態様の第４５、第４６、第４７、および第４８の実施形態の一実施形態でもあるが、第７のストレッチボックスＢ１Ｂは、ＣＡＣＧＣＵのヌクレオチド配列を含む。
【００６９】
第１および第２の態様の第５０の実施形態として、なお、これは、第１および第２の態様の第４５、第４６、第４７、第４８、および第４９の実施形態の一実施形態でもあるが、核酸は、配列番号２８および配列番号２７に記載の核酸配列を含む。
【００７０】
第１および第２の態様の第５１の実施形態として、なお、これは、第１および第２の態様の第１〜第５０の実施形態のうちのいずれかの実施形態でもあるが、ＭＣＰ−１は、サルＭＣＰ−１、ウマＭＣＰ−１、ウサギＭＣＰ−１、ウシＭＣＰ−１、イヌＭＣＰ−１、ブタＭＣＰ−１、およびヒトＭＣＰ−１を含む群から選択される。
【００７１】
第１および第２の態様の第５２の実施形態として、なお、これは、第１および第２の態様の第１〜第５１の実施形態のうちのいずれかの実施形態でもあるが、核酸は、ヒトＭＣＰ−１に結合可能である。
【００７２】
第１および第２の態様の第５３の実施形態として、なお、これは、第１および第２の態様の第１〜第５２の実施形態のうちのいずれかの一実施形態、好ましくは、第１および第２の態様の第５２の実施形態の一実施形態でもあるが、ＭＣＰ−１は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。
【００７３】
第１および第２の態様の第５４の実施形態として、なお、これは、第１および第２の態様の第１〜第５３の実施形態のうちのいずれかの実施形態でもあるが、核酸は修飾を含み、修飾は、好ましくは高分子量部分であり、および／または修飾は、動物もしくはヒトの体内、好ましくはヒトの体内の滞留時間の点から、請求項１〜５４のいずれかに記載の核酸の特徴を修飾することを好ましくは可能にする。
【００７４】
第１および第２の態様の第５５の実施形態として、なお、これは、第１および第２の態様の第５４の実施形態の一実施形態でもあるが、修飾は、ＨＥＳ部分、ＰＥＧ部分、生分解性修飾、およびそれらの組み合わせを含む群から選択される。
【００７５】
第１および第２の態様の第５６の実施形態として、なお、これは、第１および第２の態様の第５５の実施形態の一実施形態でもあるが、修飾は、直鎖ＰＥＧまたは分枝ＰＥＧからなるＰＥＧ部分であり、ＰＥＧ部分の分子量は、好ましくは約２０，０００〜１２０，０００Ｄａ、より好ましくは約３０，０００〜８０，０００Ｄａ、最も好ましくは約４０，０００Ｄａである。
【００７６】
第１および第２の態様の第５７の実施形態として、なお、これは、第１および第２の態様の第５５の実施形態の一実施形態でもあるが、修飾は、ＨＥＳ部分であり、好ましくは、ＨＥＳ部分の分子量は、約１０，０００〜２００，０００Ｄａ、より好ましくは約３０，０００〜１７０．０００Ｄａ、最も好ましくは約１５０，０００Ｄａである。
【００７７】
第１および第２の態様の第５８の実施形態として、なお、これは、第１および第２の態様の第５４、第５５、第５６、および第５７の実施形態の一実施形態でもあるが、修飾は、リンカーを介して核酸につながれ、リンカーは、リンカーまたは生分解性リンカーである。
【００７８】
第１および第２の態様の第５９の実施形態として、なお、これは、第１および第２の態様の第５４、第５５、第５６、第５７、および第５８の実施形態の一実施形態でもあるが、修飾は、核酸に、その５’末端ヌクレオチドおよび／もしくはその３’末端ヌクレオチドでつながれ、ならびに／または５’末端ヌクレオチドおよび３’末端ヌクレオチドの間の核酸のヌクレオチドにつながれる。
【００７９】
第１および第２の態様の第６０の実施形態として、なお、これは、第１および第２の態様の第１〜第５９の実施形態のうちのいずれかの実施形態でもあるが、核酸のヌクレオチドまたは核酸を形成するヌクレオチドは、Ｌ−ヌクレオチドである。
【００８０】
第１および第２の態様の第６１の実施形態として、なお、これは、第１および第２の態様の第１〜第６０の実施形態のうちのいずれかの実施形態でもあるが、核酸は、Ｌ−核酸である。
【００８１】
第１および第２の態様の第６２の実施形態として、なお、これは、第１および第２の態様の第１〜第６０の実施形態のうちのいずれかの実施形態でもあるが、ＭＣＰ−１に結合可能な核酸の部分は、Ｌ−ヌクレオチドからなる。
【００８２】
第３の態様として、なお、これは、この第３の態様の第１の実施形態でもあるが、本発明の根底にある問題は、第１および第２の態様の任意の実施形態において規定される核酸分子および任意選択的にさらなる成分を含む医薬組成物であって、さらなる成分は、製薬学的に許容可能な賦形剤、製薬学的に許容可能な担体、および製薬学的に活性な作用物質を含む群から選択され、医薬組成物は、慢性疾患または慢性障害の治療および／または予防用のものである医薬組成物によって解決される。
【００８３】
第３の態様の第２の実施形態として、なお、これは、第３の態様の第１の実施形態の一実施形態でもあるが、医薬組成物は、第１および第２の態様の任意の実施形態において規定される核酸分子および製薬学的に許容可能な担体を含む。
【００８４】
第３の態様の第３の実施形態として、なお、これは、第３の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもあるが、慢性疾患または慢性障害は、先の請求項のいずれかにおいて規定される通りである。
【００８５】
第３の態様の第４の実施形態として、なお、これは、第３の態様の第１、第２、および第３の実施形態の一実施形態でもあるが、医薬組成物は、第２の製薬学的に活性な作用物質を含み、そのような第２の製薬学的に活性な作用物質は、免疫抑制薬である。
【００８６】
第３の態様の第５の実施形態として、なお、これは、第３の態様の第４の実施形態の一実施形態でもあるが、免疫抑制薬は、個別の投薬単位として上述の医薬組成物中に含有される。
【００８７】
第３の態様の第６の実施形態として、なお、これは、第３の態様の第４および第５の実施形態の一実施形態でもあるが、医薬組成物は、単独療法として免疫抑制薬を含有する医薬組成物よりも少ない量の免疫抑制薬を含有する。
【００８８】
第３の態様の第７の実施形態として、なお、これは、第３の態様の第４、第５、および第６の実施形態の一実施形態でもあるが、免疫抑制薬の投薬単位は、単独療法として使用される場合の免疫抑制薬の投薬単位よりも少ない量を含有する。
【００８９】
第３の態様の第８の実施形態として、なお、これは、第３の態様の第６および第７の実施形態の一実施形態でもあるが、第３の態様の第６および第７の実施形態に従う免疫抑制薬の減少は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、好ましくは少なくとも７５％である。
【００９０】
第３の態様の第９の実施形態として、なお、これは、第３の態様の第４、第５、第６、第７、および第８の実施形態の一実施形態でもあるが、免疫抑制薬は、シクロホスファミドおよびミコフェノール酸モフェチルを含む群から選択される。
【００９１】
第３の態様の第１０の実施形態として、なお、これは、第３の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、および第９の実施形態の一実施形態、より好ましくは、第３の態様の第８および第９の実施形態の一実施形態でもあるが、慢性疾患は、ループス腎炎および／または肺炎である。
【００９２】
第３の態様の第１１の実施形態として、なお、これは、第３の態様の第１、第２、および第３の実施形態の一実施形態でもあるが、医薬組成物は、第２の製薬学的に活性な作用物質を含み、そのような第２の製薬学的に活性な作用物質は、抗炎症薬である。
【００９３】
第３の態様の第１２の実施形態として、なお、これは、第３の態様の第１１の実施形態の一実施形態でもあるが、抗炎症薬は、個別の投薬単位として上述の医薬組成物中に含有される。
【００９４】
第３の態様の第１３の実施形態として、なお、これは、第３の態様の第１１および第１２の実施形態の一実施形態でもあるが、医薬組成物は、単独療法として抗炎症薬を含有する医薬組成物よりも少ない量の抗炎症薬を含有する。
【００９５】
第３の態様の第１４の実施形態として、なお、これは、第３の態様の第１１、第１２、および第１３の実施形態の一実施形態でもあるが、抗炎症薬の投薬単位は、単独療法として使用される場合の免疫抑制薬の投薬単位よりも少ない量を含有する。
【００９６】
第３の態様の第１５の実施形態として、なお、これは、第３の態様の第１３および第１４の実施形態の一実施形態でもあるが、第３の態様の第１３および第１４の実施形態に従う免疫抑制薬の減少は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、好ましくは少なくとも７５％である。
【００９７】
第３の態様の第１６の実施形態として、なお、これは、第３の態様の第１１、第１２、第１３、第１４、および第１５の実施形態の一実施形態でもあるが、抗炎症薬は、デキサメタゾンおよびロフルミラストを含む群から選択され、好ましくは、抗炎症薬は、デキサメタゾンである。
【００９８】
第３の態様の第１７の実施形態として、なお、これは、第３の態様の第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、および第１６の実施形態の一実施形態、好ましくは、第３の態様の第１５および第１６の実施形態の一実施形態でもあるが、慢性疾患は、慢性呼吸器疾患、より好ましくはＣＯＰＤである。
【００９９】
第４の態様として、なお、これは、この第４の態様の第１の実施形態でもあるが、本発明の根底にある問題は、慢性疾患または慢性障害に罹患している対象、またはそれを発症する危険性がある対象の治療のための方法における使用のための、第１および第２の態様の実施形態１〜６２のうちのいずれかにおいて規定される核酸分子であって、方法は、
対象に製薬学的に活性な量の核酸分子を投与するステップ
を含む核酸分子によって解決される。
【０１００】
第４の態様の第２の実施形態において、慢性疾患または慢性障害は、先の請求項のいずれかに規定される通りである。
【０１０１】
第４の態様の第３の実施形態として、なお、これは、第４の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもあるが、方法は、
対象に免疫抑制薬を投与するステップ
をさらに含む。
【０１０２】
第４の態様の第４の実施形態として、なお、これは、第４の態様の第３の実施形態の一実施形態でもあるが、治療の過程において投与される免疫抑制薬の量は、単独療法として対象に投与されたであろう、免疫抑制薬の量よりも少ない。
【０１０３】
第４の態様の第５の実施形態として、なお、これは、第４の態様の第４の実施形態の一実施形態でもあるが、免疫抑制薬の量は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％、好ましくは少なくとも７５％減少する。
【０１０４】
第４の態様の第６の実施形態として、なお、これは、第４の態様の第１、第２、第３、第４、および第５の実施形態の一実施形態でもあるが、免疫抑制薬は、シクロホスファミドおよびミコフェノール酸モフェチルを含む群から選択される。
【０１０５】
第４の態様の第７の実施形態として、なお、これは、第４の態様の第１、第２、第３、第４、第５、および第６の実施形態の一実施形態、より具体的には、第４の態様の第５および第６の実施形態の一実施形態でもあるが、慢性疾患は、慢性腎臓疾患、好ましくはループス腎炎、および／または肺炎である。
【０１０６】
第４の態様の第８の実施形態として、なお、これは、第４の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもあるが、方法は、
対象に抗炎症薬を投与するステップ
をさらに含む。
【０１０７】
第４の態様の第９の実施形態として、なお、これは、第４の態様の第８の実施形態の一実施形態でもあるが、治療の過程において投与される抗炎症薬の量は、単独療法として対象に投与されたであろう、免疫抑制薬の量よりも少ない。
【０１０８】
第４の態様の第１０の実施形態として、なお、これは、第４の態様の第９の実施形態の一実施形態でもあるが、免疫抑制薬の量は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、好ましくは少なくとも７５％減少する。
【０１０９】
第４の態様の第１１の実施形態として、なお、これは、第４の態様の第８、第９、および第１０の実施形態の一実施形態でもあるが、抗炎症薬は、デキサメタゾンおよびロフルミラストを含む群から選択され、好ましくは、抗炎症薬は、デキサメタゾンである。
【０１１０】
第４の態様の第１２の実施形態として、なお、これは、第４の態様の第８、第９、第１０、および第１１の実施形態の一実施形態、さらに特定すると、第４の態様の第１０および第１１の実施形態の一実施形態でもあるが、慢性疾患は、慢性呼吸器疾患、好ましくはＣＯＰＤである。
【０１１１】
第５の態様として、なお、これは、この第５の態様の第１の実施形態でもあるが、本発明の根底にある問題は、慢性疾患または慢性障害の治療および／または予防のための薬剤の製造のための、第１および第２の態様の実施形態１〜６２のいずれかに規定される核酸分子の使用によって解決される。
【０１１２】
第５の態様の第２の実施形態として、疾患または障害は、第１および第２の態様の実施形態１〜６２のいずれかに関連して規定されるものである。
【０１１３】
第５の態様の第３の実施形態として、なお、これは、第５の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもあるが、薬剤は、ヒト医学における使用、または獣医学のための使用のためのものである。
【０１１４】
第６の態様として、なお、これは、上述の第６の態様の第１の実施形態でもあるが、本発明の根底にある問題は、慢性疾患または慢性障害の診断のための方法であって、
慢性疾患または慢性障害に罹患しているか、またはそれを発症する危険性があるかどうかを試験される対象からの試料を、第１および第２の態様の実施形態１〜６２のうちのいずれかにおいて規定される核酸分子と接触させるステップ、および
ＭＣＰ−１および核酸分子を含む複合体が形成されるかどうかを直接的にまたは間接的に検出するステップ
を含む方法によって解決される。
【０１１５】
第６の態様の第２の実施形態として、慢性疾患または慢性障害は、第１および第２の態様の実施形態１〜６２のいずれかに関連して規定される慢性障害または慢性疾患である。
【０１１６】
第７の態様として、なお、これは、この第７の態様の第１の実施形態でもあるが、本発明の根底にある問題は、第１および第２の態様の実施形態１〜６２のいずれかに関連して規定される慢性疾患または慢性障害の診断のための診断用薬の製造のための、第１および第２の態様の実施形態１〜６２のいずれかに関連して規定される核酸分子の使用によって解決される。
【０１１７】
以下の実施形態および特徴はまた、本明細書において記載される特徴および実施形態に関連して、特に、本明細書に添付される請求項に従った態様および実施形態に関連して達成されてもよいことが当業者によって理解されるであろう。
【０１１８】
本明細書において使用されるように、慢性疾患および慢性障害という用語は、慢性呼吸器疾患、慢性腎臓疾患、および全身性エリテマトーデスを好ましくは指す。好ましくは、本明細書において使用される慢性呼吸器疾患という用語は、肺炎、肺および胸膜の炎症、胸膜炎、胸水、ループス肺炎、慢性びまん性間質性肺病、肺塞栓、肺出血、縮小肺症候群、肺高血圧、ならびに慢性閉塞性肺疾患ならびにそれらの組み合わせを含む。より好ましくは、肺高血圧という用語は、左心疾患と関連する肺高血圧、肺病および／または低酸素血と関連する肺高血圧、慢性血栓疾患および／または慢性塞栓疾患による肺高血圧、肺動脈高血圧、好ましくは特発性肺動脈高血圧、コラゲノース関連肺動脈高血圧、家族性肺動脈高血圧、他の疾患と関連する肺動脈高血圧、ならびに静脈疾患または毛細血管疾患と関連する肺動脈高血圧を含む。さらに、慢性閉塞性肺疾患という用語は、肺血管病変を伴うまたは伴わない慢性閉塞性肺疾患を好ましくは含む。最後に、慢性閉塞性肺疾患という用語は、慢性気管支炎および肺気腫の群から好ましくは選択され、それらを含む。さらに、慢性腎臓疾患という用語は、ループス腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、ＩｇＡネフロパシー、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、腎炎症候群、巣状分節性糸球体硬化症、糖尿病性ネフロパシー、ネフローゼ症候群、およびネフローゼ症候群、好ましくはループス腎炎を好ましくは含む。
【０１１９】
本明細書において記載される、本発明による核酸の特徴は、核酸が、単独でまたは任意の組み合わせにおいて使用される、本発明の任意の態様において達成することができる。
【０１２０】
ヒトＭＣＰ−１およびマウスＭＣＰ−１は、それぞれ配列番号１および２に記載のアミノ酸配列を有する塩基性タンパク質である。
【０１２１】
ＭＣＰ−１に対する短い高親和性核酸を同定することができたという発見は、この種の標的が、高いが非特異的なシグナル対ノイズ比を発生するので、塩基性タンパク質に対するアプタマー、すなわち標的分子に結合するＤ−核酸の生成が、通常、非常に困難であるということをＥａｔｏｎら（１９９７）が観察した限りにおいて、驚くべきことである。この高いシグナル対ノイズ比は、ＭＣＰ−１などのような塩基性の標的に対する核酸によって示される高い非特異的な親和性に起因する。
【０１２２】
特許請求の範囲および実施例１においてより詳細に概説されるように、本発明者らは、より一層驚くべきことに、多くの異なるＭＣＰ−１結合核酸分子を同定することができ、大半の核酸は、本明細書においてボックスとも呼ばれるヌクレオチドのストレッチの観点から特徴付けることができた。様々なＭＣＰ−１結合核酸分子は、それぞれ、上述のボックスならびにいくつかの構造上の特徴およびエレメントに基づいて分類することができる。このように規定される様々な分類は、型、より具体的には１Ａ型、１Ｂ型、２型、３型、および４型とも本明細書において呼ばれる。
【０１２３】
本発明による核酸またはそのストレッチまたはその任意の（１つもしくは複数の）部分が、原理的に、互いにハイブリダイズすることができることは、本発明の範囲内である。そのようなハイブリダイゼーションに際して、二本鎖構造が形成される。そのようなハイブリダイゼーションが、とりわけインビトロおよび／またはインビボ条件下で起こってもよいことまたは起こらなくてもよいことは、当業者らによって認められるであろう。さらに、そのようなハイブリダイゼーションの場合には、必ずしも、ハイブリダイゼーションが２つのストレッチの全長にわたって起こるとは限らず、少なくとも塩基対形成の規則に基づいて、そのようなハイブリダイゼーション、したがって、二本鎖構造の形成が、原理的に起こってもよい。好ましくは本明細書において使用されるように、二本鎖構造は、２つもしくはそれ以上の個別の鎖または一本鎖の空間的に離れた２つのストレッチによって形成される分子または構造の部分であり、好ましくはＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型塩基対の規則に従って塩基対形成している、少なくとも１つ、好ましくは、２つ以上の塩基対が存在する。Ｈｏｏｇｓｔｅｎ塩基対形成などの他の塩基対形成が、そのような二本鎖構造中に存在していてもよく、またはそれを形成してもよいこともまた、当業者によって認められるであろう。
【０１２４】
好ましい実施形態において、本明細書において使用される配置という用語は、本明細書において開示される核酸に関連して本明細書において記載される構造上のまたは機能的な特徴またはエレメントの順序または配列を意味する。
【０１２５】
本発明による核酸が、核酸分子であるということは、本発明の範囲内でである。その限りにおいて、核酸および核酸分子という用語は、それと反対の趣旨で示されない場合、同じことを表すように本明細書において使用される。本出願の一実施形態において、核酸、したがって核酸分子は、核酸分子を形成する連続したヌクレオチドの全てが、１つまたは１つを超える共有結合によって互いに連結されている、または結びつけられているという点で特徴付けられる核酸分子を含む。より具体的には、それぞれのそのようなヌクレオチドは、好ましくはホスホジエステル結合または他の結合を通して、２つの他のヌクレオチドに連結されており、または結びつけられており、連続したヌクレオチドのストレッチを形成する。しかしながら、そのような配置が、直鎖状の配置であり、環状の配置ではない、したがって、環状の分子ではなく直鎖状の分子であるという条件下でのみ、そのような配置において、２つの末端ヌクレオチド、つまり好ましくは５’末端および３’末端のヌクレオチドは、それぞれ、単一のヌクレオチドに連結される。
【０１２６】
本出願の他の実施形態において、核酸、したがって、核酸分子は、連続したヌクレオチドの少なくとも２つの群を含み、連続したヌクレオチドの各群内に、各ヌクレオチドは、好ましくはホスホジエステル結合または他の結合を通して、２つの他のヌクレオチドに連結されており、または結びつけられており、連続したヌクレオチドのストレッチを形成する。しかしながら、そのような配置において、２つの末端ヌクレオチド、つまり好ましくは５’末端および３’末端のヌクレオチドは、それぞれ、単一のヌクレオチドのみに連結される。そのような実施形態において、しかしながら、連続したヌクレオチドの２つの群は、一方の群の１つのヌクレオチドおよび他の群または他方の群の１つのヌクレオチドを共有結合、好ましくは、上述の２つのヌクレオチドのうちの一方の糖部分と上述の２つのヌクレオチドまたはヌクレオシドのうちの他方のリン部分との間で形成される共有結合を通して連結する共有結合を通して互いに連結されていないまたは結びつけられていない。代替の実施形態において、しかしながら、連続したヌクレオチドの２つの群は、一方の群の１つのヌクレオチドおよび他の群または他方の群の１つのヌクレオチドを共有結合、好ましくは、上述の２つのヌクレオチドのうちの一方の糖部分と上述の２つのヌクレオチドまたはヌクレオシドのうちの他方のリン部分との間で形成される共有結合を通して連結する共有結合を通して互いに連結されている、または結びつけられている。好ましくは、連続したヌクレオチドの少なくとも２つの群は、いかなる共有結合を通しても連結されない。他の好ましい実施形態において、少なくとも２つの群は、ホスホジエステル結合とは異なる共有結合を通して連結される。他の実施形態において、少なくとも２つの群は、ホスホジエステル結合である共有結合を通して連結される。
【０１２７】
本発明による核酸はまた、本明細書において開示される特定の配列に本質的に相同な核酸を含むものとする。実質的に相同なという用語は、相同性が、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％であり、最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超えると理解されるものとする。
【０１２８】
本発明による核酸中に存在する相同なヌクレオチドの実際の割合は、核酸中に存在するヌクレオチドの総数に依存するであろう。修飾パーセントは、核酸中に存在するヌクレオチドの総数に基づくものとすることができる。
【０１２９】
相同性は、当業者に知られているように決定することができる。より具体的には、配列比較アルゴリズムは、次いで、指定のプログラムパラメータに基づいて、参照配列と比較した、（１つまたは複数の）試験配列についての配列同一性パーセントを計算する。試験配列は、好ましくは、それが、他の核酸分子に対して相同であるかどうか、そうであれば、どの程度までかを断定される、または試験される配列または核酸分子であり、そのような他の核酸分子はまた、参照配列とも呼ばれる。一実施形態において、参照配列は、本明細書において記載される核酸分子、より好ましくは、配列番号１０〜１２９、１３２〜２５６、および２７８〜２８２のうちのいずれかに記載の配列を有する核酸分子である。比較のための配列の最適なアライメントは、たとえばＳｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ、１９８１）によって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ、１９７０）によって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ、１９８８）の類似性検索のための方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された手段（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）によって、または目視検査によって行うことができる。
【０１３０】
配列同一性パーセントを決定するのに適しているアルゴリズムの一例は、基本的な局所的アライメント検索ツールにおいて使用されるアルゴリズム（以後「ＢＬＡＳＴ」）であり、たとえば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）を参照されたい。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（以後「ＮＣＢＩ」）を通して公的に入手可能である。ＮＣＢＩから入手可能なソフトウェア、たとえばＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列用）およびＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸配列用）を使用して配列同一性を決定するのに使用されるデフォルトパラメータは、ＭｃＧｉｎｎｉｓら（ＭｃＧｉｎｎｉｓら、２００４）において記載される。
【０１３１】
発明に関する核酸または本発明による核酸という用語は、好ましくは核酸または上述の部分がＭＣＰ−１への結合に関与する限り、本明細書において開示される核酸配列またはその部分を含む、それらの核酸を含むものとする。好ましくは本明細書において使用される発明に関する核酸という用語はまた、一実施形態において、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、およびエオタキシンを含む群から選択される任意の分子に結合するのに適している核酸を含むものとする。本発明による個々の核酸が、そのような分子のうちの１つまたはいくつかのものに結合するであろうということは当業者らによって認められるであろう。そのような核酸は、一実施形態において、本明細書において記載される核酸分子またはその誘導体および／もしくは代謝物質のうちの１つであり、そのような誘導体および／または代謝物質は、好ましくは、本明細書において記載される核酸分子と比較して、トランケートされた核酸である。トランケーションは、本明細書において開示される核酸の末端のいずれかまたは両方に関するものであってもよい。さらに、トランケーションは、核酸のヌクレオチドの内側の配列に関するものであってもよい、つまり、それは、５’末端および３’末端ヌクレオチドの間の（１つまたは複数の）ヌクレオチドにそれぞれ関するものであってもよい。さらに、トランケーションは、本明細書において開示される核酸の配列からの、単一のヌクレオチドほどの少しの欠失を含むものとする。トランケーションはまた、（１つまたは複数の）発明に関する核酸の１つを超えるストレッチに関するものであってもよく、ストレッチは、１ヌクレオチド長ほどのものとすることができる。好ましくはＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、およびエオタキシンを含む群から選択される分子に対する本発明による核酸の結合は、ルーチン実験を使用してまたは本明細書において記載される方法、好ましくは、本明細書において実施例の部分に記載される方法を使用もしくは採用することによって、当業者らによって決定されることができる。反対の趣旨に明示的に示されない限り、それが、ＭＣＰ−１へのまたはＭＣＰ−１との、本発明による核酸の結合について本明細書において言及されるかどうかにかかわらず、これはまた、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、およびエオタキシンを含む群から選択される任意の分子へのまたはそれとの本発明による核酸の結合にも当てはまることは、本発明の実施形態の範囲内である。
【０１３２】
本発明による核酸は、Ｄ−核酸またはＬ−核酸のいずれかであってもよい。好ましくは、発明に関する核酸は、Ｌ−核酸である。さらに、核酸の１つまたはいくつかの部分は、Ｄ−核酸として存在し、核酸の少なくとも１つまたはいくつかの部分は、Ｌ−核酸であることが可能である。核酸の「部分」という用語は、１つほどのヌクレオチドを意味するものとする。そのような核酸は、概して、Ｄ−核酸およびＬ−核酸と本明細書においてそれぞれ呼ばれる。したがって、とりわけ好ましい実施形態において、本発明による核酸は、Ｌ−ヌクレオチドから成り、少なくとも１つのＤ−ヌクレオチドを含む。そのようなＤ−ヌクレオチドは、好ましくは、本発明による核酸を規定するストレッチと異なる部分、好ましくはそのそれらの部分に付加され、ここでは核酸の他の部分との相互作用が関与している。好ましくは、そのようなＤ−ヌクレオチドは、本発明によるストレッチのうちのいずれかおよび任意の核酸の末端にそれぞれ付加される。さらなる好ましい実施形態において、そのようなＤ−ヌクレオチドは、スペーサーまたはリンカーとして作用してもよく、好ましくは、ＰＥＧおよびＨＥＳなどのような修飾を本発明による核酸に付加する。
【０１３３】
それらの核酸配列に関して本明細書に全体として記載される核酸分子のそれぞれおよびいずれかが、特定のヌクレオチド配列に限定されることもまた本発明の実施形態の範囲内である。言いかえれば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」は、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）またはからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）の意味で、そのような実施形態において解釈されるものとする。
【０１３４】
本発明による核酸は、より長い核酸の一部であり、このより長い核酸は、いくつかの部分を含み、少なくとも１つのそのような部分は、本発明による核酸またはその部分であることもまた本発明の範囲内である。これらのより長い核酸の（１つまたは複数の）他の部分は、１つもしくはいくつかのＤ−核酸または１つもしくはいくつかのＬ−核酸とすることができる。任意の組み合わせは、本発明に関連して使用されてもよい。より長い核酸のこれらの他の部分は、単独でまたは一緒に、全体としてまたは特定の組み合わせにおいて、結合、好ましくはＭＣＰ−１への結合とは異なる機能を示すことができる。１つの可能な機能は、他の分子との相互作用を可能にすることであり、他のそのような分子は、好ましくは、ＭＣＰ−１とは異なり、たとえば固定、架橋、検出、または増幅のための分子などである。本発明のさらなる実施形態において、本発明による核酸は、個々の部分または組み合わせた部分として、本発明のいくつかの核酸を含む。本発明のいくつかの核酸を含むそのような核酸はまた、より長い核酸という用語によって包含される。
【０１３５】
本明細書において使用されるＬ−核酸は、Ｌ−ヌクレオチドからなる、好ましくは完全にＬ−ヌクレオチドからなる核酸である。
【０１３６】
本明細書において使用されるＤ−核酸は、Ｄ−ヌクレオチドからなる、好ましくは完全にＤ−ヌクレオチドからなる核酸である。
【０１３７】
核酸および核酸分子という用語は、反対の趣旨に明示的に示されない限り、本明細書において区別なく使用される。
【０１３８】
さらに、反対の趣旨に示されない限り、あらゆるヌクレオチド配列は、５’→３’方向に本明細書において記載される。
【０１３９】
発明に関する核酸が、Ｄ−ヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、または両方の組み合わせであって、たとえば無作為の組み合わせまたは少なくとも１つのＬ−ヌクレオチドおよび少なくとも１つのＤ−核酸からなるストレッチの規定された配列である組合せからなるかどうかに関係なく、核酸は、（１つまたは複数の）デオキシリボヌクレオチド、（１つまたは複数の）リボヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから成ってもよい。
【０１４０】
Ｌ−核酸として発明に関する核酸を設計することは、いくつかの理由で有利である。Ｌ−核酸は、天然に存在する核酸の鏡像異性体である。しかしながら、Ｄ−核酸は、ヌクレアーゼの広範囲の存在により、水溶液中およびとりわけ生物系または生物学的試料においてあまり安定していない。天然に存在するヌクレアーゼ、とりわけ、動物細胞からのヌクレアーゼは、Ｌ−核酸を分解することができない。このために、Ｌ−核酸の生物学的半減期は、動物およびヒトの体を含むそのような系において著しく増加する。Ｌ−核酸の分解性の欠如によりヌクレアーゼ分解産物は生成されず、したがって、そこから発生する副作用は観察されない。この態様は、ＭＣＰ−１の存在を伴う疾患および／または障害の療法において使用される事実上全ての他の化合物のＬ−核酸の範囲を定める。Ｗａｔｓｏｎ  Ｃｒｉｃｋ型塩基対と異なるメカニズムを通して標的分子に特異的に結合するＬ−核酸、または部分的にもしくは完全にＬ−ヌクレオチドからなるアプタマーもまた、とりわけ標的分子へのアプタマーの結合に関与するアプタマーのそれらの部分は、共にスピーゲルマー（Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒｓ）と呼ばれる。
【０１４１】
本明細書において本発明による核酸とも呼ばれる本発明の核酸は、それらがＤ−核酸、Ｌ−核酸、もしくはＤ，Ｌ−核酸として存在するどうか、またはそれらがＤＮＡもしくはＲＮＡであるかどうかに関係なく、一本鎖または二本鎖の核酸として存在してもよいことも本発明の範囲内である。典型的には、発明に関する核酸は、一次配列により規定される第２の構造を示す一本鎖核酸であり、したがって、三次構造を形成してもよい。しかしながら、発明に関する核酸はまた、互いに相補的なまたは部分的に相補的な２つの鎖が互いにハイブリダイズするという意味において、二本鎖であってもよい。これは、核酸に安定性を与え、これは、核酸が、Ｌ型ではなく天然に存在するＤ型として存在する場合、特に有利であろう。
【０１４２】
発明に関する核酸は、修飾されてもよい。そのような修飾は、核酸の単一のヌクレオチドに関するものであってもよく、当技術分野においてよく知られている。そのような修飾のための例は、とりわけＶｅｎｋａｔｅｓａｎ（Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ  ２００３）、Ｋｕｓｓｅｒ（Ｋｕｓｓｅｒ  ２０００）、Ａｕｒｕｐ（Ａｕｒｕｐ  １９９４）、Ｃｕｍｍｉｎｓ（Ｃｕｍｍｉｎｓ  １９９５）、Ｅａｔｏｎら（Ｅａｔｏｎ  １９９５）、Ｇｒｅｅｎら（Ｇｒｅｅｎ  １９９５）、Ｋａｗａｓａｋｉら（Ｋａｗａｓａｋｉ  １９９３）、Ｌｅｓｎｉｋら（Ｌｅｓｎｉｋ  １９９３）、およびＭｉｌｌｅｒ  ＆  Ｋｒａｇｅｌ（Ｍｉｌｌｅｒ  １９９３）において記載される。そのような修飾は、核酸がそれからなる個々のヌクレオチドの２’位のＨ原子、Ｆ原子、またはＯ−ＣＨ３基もしくＮＨ２基とすることができる。さらに、本発明による核酸は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオチドを含むことができる。一実施形態において、本発明による核酸は、ＬＮＡヌクレオチドからなる。
【０１４３】
一実施形態において、本発明による核酸は、多数の部分に分かれた核酸であってもよい。本明細書において使用される、多数の部分に分かれた核酸は、少なくとも２つの核酸鎖からなる核酸である。これらの少なくとも２つの核酸鎖は、機能単位を形成し、機能単位は、標的分子に対するリガンドとなる。少なくとも２つの核酸鎖は、２つの鎖を生成するために核酸を分割することによって、または発明の、つまり全体的な核酸の第１の部分に対応する一方の核酸および全体的な核酸の第２の部分に対応するもう一方の核酸を合成することによって、発明に関する核酸のいずれかから誘導されてもよい。分割および合成の両方は、上記に例示されるように２つを超える鎖がある、多数の部分に分かれた核酸を生成するために適用されてもよいことが認められるであろう。言いかえれば、ある程度の相補性が様々な核酸部分の間に存在してもよいが、この少なくとも２つの核酸鎖は、相補的で、互いにハイブリダイズする２つの鎖とは典型的に異なる。
【０１４４】
最後に、本発明による核酸の完全に閉じた、つまり環状の構造が達成される、つまり、本発明による核酸が、好ましくは共有結合によって閉じており、より好ましくは、そのような共有結合が、本明細書において開示される核酸配列の５’末端および３’末端の間で成されることもまた本発明の範囲内である。
【０１４５】
本発明者らは、本発明による核酸が、非常に好都合なＫＤ値の範囲を示すことを発見した。
【０１４６】
結合定数を決めるために可能性として考えられるのはいわゆるｂｉａｃｏｒｅデバイスの使用であり、これもまた、当業者に知られている。本明細書において使用される親和性もまた、実施例において記載される「プルダウンアッセイ」の使用によって測定された。本願ではＭＣＰ−１である標的と核酸との間の結合の強度を表現するための適切な手段はいわゆるＫＤ値であり、それ自体、その決定のための方法と同様に、当業者に知られている。
【０１４７】
本発明による核酸は、特定のＫＤ値によって特徴付けられる。好ましくは、本発明による核酸によって示されるＫＤ値は、１μＭ未満である。約１μＭのＫＤ値は、標的への核酸の非特異的な結合に特徴的であるといわれている。当業者らによって認められるように、本発明による核酸などの化合物のグループのＫＤ値は、特定の範囲内である。前述の約１μＭのＫＤは、ＫＤ値の好ましい上限値である。標的結合核酸のＫＤの好ましい下限値は、約１０ピコモル以上とすることができる。ＭＣＰ−１に結合する個々の核酸のＫＤ値が、好ましくはこの範囲内であることは、本発明の範囲内である。好ましい範囲は、この範囲内の任意の第１の数およびこの範囲内の任意の第２の数を選ぶことによって規定することができる。好ましい上の値は、２５０ｎＭおよび１００ｎＭであり、好ましい下の値は、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、および１０ｐＭである。
【０１４８】
本発明による核酸分子は、任意の長さを有していてもよい、但し、それらが、標的分子になお結合することができることを条件とする。本発明による核酸の好ましい長さがあるということが、当技術分野において認められるであろう。典型的には、長さは、１５〜１２０のヌクレオチドである。１５〜１２０の間の任意の整数が、本発明による核酸にとって可能な長さとなることが当業者らによって認められるであろう。本発明による核酸の長さのより好ましい範囲は、約２０〜１００のヌクレオチド、約２０〜８０のヌクレオチド、約２０〜６０のヌクレオチド、約２０〜５０のヌクレオチド、および約３０〜５０のヌクレオチドの長さである。
【０１４９】
本明細書において開示される核酸は、好ましくは高分子量部分である部分、および／またはとりわけ動物の体内、好ましくはヒトの体内の滞留時間の点から核酸の特徴を修飾することを好ましくは可能にする部分を含むことは、本発明の範囲内である。そのような修飾のとりわけ好ましい実施形態は、本発明による核酸のＰＥＧ化およびＨＥＳ化である。本明細書において使用されるように、ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）を意味し、ＨＥＳは、ヒドロキシエチルスターチを意味する。好ましくは本明細書において使用されるＰＥＧ化は、本発明による核酸の修飾であり、そのような修飾は、本発明による核酸に付加されるＰＥＧ部分からなる。好ましくは本明細書において使用されるＨＥＳ化は、本発明による核酸の修飾であり、そのような修飾は、本発明による核酸に付加されるＨＥＳ部分からなる。これらの修飾およびそのような修飾を使用して核酸を修飾するためのプロセスは、ＥＰ１３０６３８２ＡにおいておよびＷＯ２００５／０７４９９３において記載され、これらの開示は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０１５０】
好ましくは、高分子量部分からなる、またはそれを含む修飾の分子量は、約２，０００〜２５０，０００Ｄａ、好ましくは２０，０００〜２００，０００Ｄａである。ＰＥＧがそのような高分子量部分である場合には、分子量は、好ましくは２０，０００〜１２０，０００Ｄａ、より好ましくは４０，０００〜８０，０００Ｄａである。ＨＥＳがそのような高分子量部分である場合には、分子量は、好ましくは２０，０００〜２００，０００Ｄａ、より好ましくは４０，０００〜１５０，０００Ｄａである。ＨＥＳ修飾のプロセスは、たとえば、ドイツ特許出願ＤＥ１２００４００６２４９．８およびＷＯ２００２０８０９７９において記載され、これらの開示は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０１５１】
特許出願ＷＯ２００５／０７４９９３、ＷＯ２００２／０８０９７９、およびＰＣＴ／ＥＰ０２／１１９５０においてさらに記載されるように、ＰＥＧおよびＨＥＳのいずれかが、直鎖状形態または分枝状形態として使用されてもよいことは、本発明の範囲内である。そのような修飾は、原理的に、その任意の位置で、本発明の核酸分子に対して成すことができる。好ましくは、そのような修飾は、核酸分子の５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、ならびに／または５’ヌクレオチドおよび３’ヌクレオチドの間の任意のヌクレオチドに対して成される。
【０１５２】
修飾ならびに好ましくはＰＥＧおよび／またはＨＥＳ部分は、本発明の核酸分子に直接的にまたはリンカーを通して付加することができる。本発明による核酸分子が、１つまたは複数の修飾、好ましくは、１つまたは複数のＰＥＧおよび／またはＨＥＳ部分を含むこともまた、本発明の範囲内である。一実施形態において、個々のリンカー分子は、本発明による核酸分子に１つを超えるＰＥＧ部分またはＨＥＳ部分を付加する。本発明に関連して使用されるリンカーは、それ自体、直鎖状または分枝状とすることができる。この種のリンカーは、当業者らに知られており、特許出願ＷＯ２００５／０７４９９３およびＰＣＴ／ＥＰ０２／１１９５０においてさらに記載される。
【０１５３】
好ましい実施形態において、リンカーは、生分解性リンカーである。生分解性リンカーは、本発明による核酸からの修飾の放出により、とりわけ動物の体内、好ましくはヒトの体内における滞留時間に関して、本発明による核酸の特徴を修飾することを可能にする。生分解性リンカーの使用は、本発明による核酸の滞留時間のより良好なコントロールを可能にしてもよい。そのような生分解性リンカーの好ましい実施形態は、ＷＯ２００６／０５２７９０、ＷＯ２００８／０３４１２２、ＷＯ２００４／０９２１９１、およびＷＯ２００５／０９９７６８において記載されるが、これらに限定されない生分解性リンカーであり、ＷＯ２００４／０９２１９１およびＷＯ２００５／０９９７６８において、リンカーは、本明細書において記載される１つまたは２つの修飾、核酸分子、および介在する生分解性リンカーからなる重合体オリゴヌクレオチドプロドラッグの一部である。
【０１５４】
修飾が、生分解性修飾であり、生分解性修飾が、本発明の核酸分子に直接的にまたはリンカーを通して付加することができることは本発明の範囲内である。生分解性修飾は、本発明による核酸からの修飾の放出により、とりわけ動物の体内、好ましくはヒトの体内における滞留時間に関して、本発明による核酸の特徴を修飾することを可能にする。生分解性修飾の使用は、本発明による核酸の滞留時間のより良好なコントロールを可能にしてもよい。そのような生分解性修飾の好ましい実施形態は、ＷＯ２００２／０６５９６３、ＷＯ２００３／０７０８２３、ＷＯ２００４／１１３３９４、およびＷＯ２０００／４１６４７において、ＷＯ２０００／４１６４７、好ましくは１８頁４〜２４行目において記載されるが、これらに限定されない生分解性ポリマーである。より好ましくは、生分解性ポリマーは、ＷＯ２００４／１１３３９４およびＷＯ２０００／４１６４７においてそれぞれ記載される生分解性ＰＥＧまたは生分解性ポリグリコール酸（略称ＰＬＧＡ）である。
【０１５５】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ポリマー、とりわけ、本明細書において開示されるポリマーなどの、好ましくは生理学的に許容可能である高分子量部分を用いて本発明による核酸を修飾することによって、排泄反応速度が変化するように思われる。とりわけ、そのような修飾された発明に関する核酸の分子量の増加によりおよび代謝を受けやすくない核酸により、とりわけＬ型である場合、動物の体内から、好ましくは哺乳動物の体内、より好ましくはヒトの体内からの排泄は、減少するように思われる。排泄が、典型的には、腎臓を介して生じるので、本発明者らは、このように修飾された核酸の糸球体濾過率が、体内における滞留時間の増加をもたらすこの種の高分子量修飾を有していない核酸と比較して、著しく低下すると推測している。それと関連して、そのような高分子量修飾にもかかわらず、本発明による核酸の特異性が不利に影響を受けないことは、とりわけ注目すべきである。その限りにおいて、本発明による核酸は、製薬学的に活性な化合物から通常期待することができない驚くべき特徴を有するため、徐放を提供する医薬製剤が、徐放を提供するために必ずしも必要とされないという。むしろ、高分子量部分を含む修飾された形態の本発明による核酸は、すでにそれ自体として、徐放製剤として使用することができる。その限りにおいて、本明細書において開示される核酸分子の（１つまたは複数の）修飾およびこのように修飾された核酸分子およびこれらを含む任意の組成物は、その別個の、好ましくはコントロールされた薬理動態および体内分布を提供してもよい。これはまた、血液循環における滞留時間および組織への分布をも含む。そのような修飾は、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０２／１１９５０においてさらに記載される。
【０１５６】
しかしながら、本明細書において開示される核酸が、あらゆる修飾、とりわけＰＥＧ化またはＨＥＳ化などのような高分子量修飾を含まないこともまた本発明の範囲内である。そのような実施形態は、核酸が、体内における任意の標的器官もしくは標的組織に選択的な分布を示す場合、または投与後の、体内からの核酸の速いクリアランスが望まれる場合にとりわけ好ましい。体内における任意の標的器官または標的組織への選択的な分布プロファイルを有する、本明細書において開示される核酸は、核酸の全身の濃度を低く保ちながら、標的組織において有効な局所的な濃度の確立を可能にするであろう。これは、低用量の使用を可能にし、経済的な視点から有益であるばかりではなく、核酸作用物質に対する他の組織の不必要な暴露もまた低下させ、そのため、副作用の潜在的な危険性を低下させるであろう。本明細書において開示される核酸の、投与後の、体内からの速いクリアランスは、それぞれ本発明による核酸またはこれを含む薬剤を使用するインビボ画像診断または特異的な治療上の投薬の必要性がある場合には、望ましいかもしれない。
【０１５７】
本発明による核酸とも本明細書において呼ばれる発明に関する核酸および／または本発明によるアンタゴニストは、薬剤の生成または製造に使用されてもよい。本発明によるそのような薬剤または医薬組成物は、任意選択的にさらなる製薬学的に活性な化合物に加えて、少なくとも１つの発明に関する核酸を含有し、発明に関する核酸は、それ自体、製薬学的に活性な化合物として好ましくは作用する。そのような薬剤は、好ましい実施形態において、少なくとも１つの製薬学的に許容可能な担体を含む。そのような担体は、たとえば水、バッファー、ＰＢＳ、グルコース溶液、好ましくは５％グルコース平衡塩類溶液、デンプン、糖、ゼラチン、または任意の他の許容可能な担体物質であってもよい。そのような担体は、概して、当業者に知られている。本発明の薬剤のまたはそれに関する任意の実施形態、使用、および態様もまた、本発明の医薬組成物に適用可能であり、逆もまた同様であることは、当業者によって認められるであろう。
【０１５８】
本発明に従うまたは本発明に従って調製される核酸、医薬組成物、および薬剤の治療および／または予防のための徴候、疾患、および障害は、それぞれの病原性のメカニズムにおけるＭＣＰ−１の直接的なまたは間接的な関与に起因する。しかしながら、それらの徴候、疾患、および障害はまた、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、およびＭＣＰ−４、および／またはエオタキシンが直接的にまたは間接的に関与する病原性のメカニズムにおいても治療し、予防することができる。とりわけ、本発明によるそれらの核酸は、その限りにおいて、つまり、より広い意味において、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、およびエオタキシンに関係する疾患のために、使用することができ、これらは、それぞれＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、およびエオタキシンに対してまたはそれらとそれぞれ相互作用し、結合することは、当業者らにとって明白である。
【０１５９】
より具体的には、そのような使用は、ＭＣＰ−１の発現パターンからとりわけ起因し、これは、それが、単核細胞浸潤によって特徴付けられるヒト疾患において重要な役割を果たすことを示唆する。そのような細胞浸潤は、多くの炎症疾患および自己免疫疾患において存在する。
【０１６０】
動物モデルにおいて、ＭＣＰ−１は、局所虚血の後の脳において（Ｋｉｍ  １９９５、Ｗａｎｇ  １９９５）および実験的な自己免疫脳脊髄炎（Ｈｕｌｋｏｗｅｒ  １９９３、Ｒａｎｓｏｈｏｆｆ  １９９３、Ｂａｎｉｓｏｒ  ２００５）の間に発現されることが示された。ＭＣＰ−１は、発作および多発性硬化症などのような、これらの動物モデルによって例証される疾患プロセスにおいて単核細胞を標的とする重要なケモカインであるかもしれない。
【０１６１】
大部分の証拠は、単球化学誘引、したがって慢性炎症におけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２軸の特有の役割への支持を示す。（ｉ）ＭＣＰ−１またはＣＣＲ２が欠損したマウスは、著しく低下したマクロファージ走化性応答を示すが、欠損していなければ正常に見えた（Ｋｕｚｉｅｌ  １９９７、Ｋｕｒｉｈａｒａ  １９９７、Ｂｏｒｉｎｇ  １９９７、Ｌｕ  １９９８）。（ｉｉ）インビトロにおいて他のケモカインを用いて機能的に冗長にしたにもかかわらず、ＭＣＰ−１エフェクター機能のみの損失は、いくつかの炎症モデルにおける単球の輸送を損なうのに十分である（Ｌｌｏｙｄ  １９９７、Ｆｕｒｕｉｃｈｉ  ２００３、Ｅｇａｓｈｉｒａ  ２００２、Ｇａｌａｓｓｏ  ２０００、Ｏｇａｔａ  １９９７、Ｋｅｎｎｅｄｙ  １９９８、Ｇｏｎｚａｌｏ  １９９８、Ｋｉｔａｍｏｔｏ  ２００３）。（ｉｉｉ）ＭＣＰ−１レベルは、多くの炎症疾患において上昇する。実際に、ＭＣＰ−１は、関節リウマチ（Ｋｏｃｈ  １９９２、Ｈｏｓａｋａ  １９９４、Ａｋａｈｏｓｈｉ  １９９３、Ｈａｒｉｇａｉ  １９９３、Ｒｏｌｌｉｎｓ  １９９６）、腎疾患（Ｗａｄａ  １９９６、Ｖｉｅｄｔ  ２００２）、血管形成術の後の再狭窄（Ｅｃｏｎｏｍｏｕ  ２００１）、アレルギーおよび喘息（Ａｌａｍ  １９９６、Ｈｏｌｇａｔｅ  １９９７、Ｇｏｎｚａｌｏ  １９９８）、癌（Ｓａｌｃｅｄｏ  ２０００、Ｇｏｒｄｉｌｌｏ  ２００４）、アテローム性動脈硬化症（Ｎｅｌｋｅｎ  １９９１、Ｙｌａ−Ｈｅｒｔｔｕａｌａ  １９９１、Ｓｃｈｗａｒｔｚ  １９９３、Ｔａｋｅｙａ  １９９３、Ｂｏｒｉｎｇ  １９９８）、乾癬（Ｖｅｓｔｅｒｇａａｒｄ  ２００４）、神経系の炎症（Ｈｕａｎｇ  ２００１）、アトピー性皮膚炎（Ｋａｂｕｒａｇｉ  ２００１）、大腸炎（Ｏｋｕｎｏ  ２００２）、子宮内膜症（Ｊｏｌｉｃｏｅｕｒ  ２００１）、ぶどう膜炎（Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ２００２）、網膜障害（Ｎａｋａｚａｗａ２００７）、特発性肺線維症およびサルコイドーシス（Ｉｙｏｎａｇａ  １９９４）、ならびに多発性筋炎／皮膚筋炎（Ｄｅ  Ｂｌｅｅｃｋｅｒ  ２００２）などのような、明白な炎症性成分を伴うならびに伴わない多くの疾患において役割を果たすと考えられる。
【０１６２】
抗ＭＣＰ−１作用物質、またはＣＣＲ２アンタゴニストを用いる治療的介入は、過剰な炎症性の単球輸送に影響を与えるであろうが、食細胞の基本的な輸送を抑え、それによって、通常の免疫抑制を防ぎ、感染の危険性を増加させてしまうかもしれない（Ｄａｗｓｏｎ  ２００３）。
【０１６３】
さらに、炎症プロセスの分子メカニズム、および局所的に分泌される、炎症の媒介物質の相互作用に関して知識の増加に基づいて、腎臓疾患の療法のための新しい標的が同定された（Ｈｏｌｄｓｗｏｒｔｈ  ２０００、Ｓｅｇｅｒｅｒ  ２０００）。適切な動物モデルにおける発現および特異的なアンタゴニストを用いる介入研究に関する確かなデータが存在する、それらの標的のうちの１つは、ＭＣＰ−１である。このタンパク質は、腎臓の炎症の部位への免疫細胞動員のための幅広い非重複性の役割を有する。腎臓への免疫細胞の浸潤は、腎臓疾患の様々な形態の発症における構造上の腎臓の損傷および腎機能の減退の主なメカニズムであると考えられる。
【０１６４】
全てのタイプの腎臓細胞は、インビトロにおける刺激に際して、ＭＣＰ−１を含むケモカインを発現することができる（Ｓｅｇｅｒｅｒ  ２０００）。インビトロにおいてＭＣＰ−１発現を引き起こす刺激は、サイトカイン、酸素ラジカル、免疫複合体、および脂質媒介物質を含み、多数ある。
【０１６５】
ＭＣＰ−１は、ラットおよびマウスの健常な腎臓において発現されないが、免疫複合体糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎、糖尿病性ネフロパシー、閉塞性ネフロパシー、または急性尿細管壊死を含む腎臓の炎症の急性および慢性げっ歯動物モデルでの過程の間に急速にアップレギュレートされる（Ｓｅｇｅｒｅｒ  ２０００、Ａｎｄｅｒｓ  ２００３）。げっ歯動物におけるＭＣＰ−１の発現データは、ヒト腎生検材料において発見されたそれぞれの発現と十分に関連する（Ｒｏｖｉｎ  １９９４；Ｃｏｃｋｗｅｌｌ  １９９８、Ｗａｄａ  １９９９）。さらに、ヒト腎臓における腎臓での発現は、適切な療法が、疾患の寛解を促進した場合、疾患の活性および減退と関連する（Ａｍａｎｎ  ２００３）。
【０１６６】
糸球体単核細胞浸潤は、糖尿病性ネフロパシーを有する患者におけるびまん性糸球体硬化症の発症と関連する。ＭＣＰ−１は、糸球体内の単球およびリンパ球の動員および蓄積において重要な役割を果たす（Ｂａｎｂａ  ２０００、Ｍｏｒｉｉ  ２００３）。
【０１６７】
局所的に生産されるＭＣＰ−１は、腎毒性血清誘発腎炎（ＮＳＮ）を有するトランスジェニックマウスを使用する実験において立証されるように、尿細管間質性の損傷の開始および進行にとりわけ関与するように思われる。ＭＣＰ−１は、間質性の病変における血管内皮細胞、尿細管上皮細胞、および浸潤単核細胞において主として検出された。尿細管上皮細胞のＭＣＰ−１媒介性の活性化は、ＭＣＰ−１が、尿細管間質性の炎症、進行性の腎疾患の特徴の一因となるという見解と一致している（Ｗａｄａ  ２００１、Ｖｉｅｄｔ  ２００２）。
【０１６８】
一方のＭＣＰ−１ならびに他方のＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、およびエオタキシンの間の相同性により、本発明による核酸、少なくともそれらのうちの、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、およびエオタキシンとそれぞれ相互作用し、またはそれらに結合するものは、典型的に、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、およびエオタキシンが、それぞれ直接的または間接的に関与する任意の疾患の治療、予防、および／または診断に使用することができる。本明細書において好ましく使用される、関与するとは、疾患に関与するそれぞれの分子が、疾患の根底にある病原性メカニズムに関連して、その機能の１つ、いくつか、または全てを発揮することを妨げられる場合、疾患は治癒され、またはその程度は減少し、または発病は予防され、そのような疾患の少なくとも症状または任意の指標はそれぞれ軽減および改善され、症状および指標は、それぞれ、疾患に罹患していない対象またはそのような疾患を発症する危険性のない対象において観察される（１つまたは複数の）症状および指標と同一となるか、近いものとなることを意味する。
【０１６９】
もちろん、本発明によるＭＣＰ−１結合核酸が、ヒトＭＣＰ−１またはマウスＭＣＰ−１と相互作用し、またはそれに結合するので、当業者は、概して、本発明によるＭＣＰ−１結合核酸は、ヒトおよび動物の本明細書において記載される任意の疾患の治療、予防、および／または診断に容易に使用することができることを理解するであろう。
【０１７０】
単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）ファミリーのこれらのメンバー、つまりＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、およびエオタキシンは、したがって、ＭＣＰ−１と高い配列類似性を共有する。しかし、排他的ではないが、エオタキシン、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、およびＭＣＰ−４は、ヒト好酸球上の特徴的なケモカイン受容体であるＣＣＲ３を介して相互作用する（Ｈｅａｔｈ  １９９７）。ＣＣＲ３受容体は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（Ｋｌｅｉｎｈａｎｓ  ２００３）、神経膠芽腫（Ｋｏｕｎｏ  ２００４）、または腎細胞癌（Ｊｏｈｒｅｒ  ２００５）などのような腫瘍性の状態においてアップレギュレートされる。
【０１７１】
より具体的には、エオタキシンのレベルの増加は、喘息の診断および易感染性の肺機能（Ｎａｋａｍｕｒａ  １９９９）と直接的に関連する。アレルギー性炎症の部位でのエオタキシンの発現の上昇は、アトピー性および非アトピー性の喘息患者において観察された（Ｙｉｎｇ  １９９７、Ｙｉｎｇ  １９９９）。さらに、ＭＣＰ−２およびＭＣＰ−４をコードするｍＲＮＡは、様々な組織において恒常的に発現されるが、これらの環境におけるそれらの生理学的機能は知られていない。血漿ＭＣＰ−２レベルは、ＭＣＰ−１に加えて敗血症において上昇しており（Ｂｏｓｓｉｎｋ  １９９５）、ＭＣＰ−３発現は、喘息患者において生じる（Ｈｕｍｂｅｒｔ  １９９７）。最後に、ＭＣＰ−４は、アテローム性動脈硬化症の血管の管腔表面で発見することができる（Ｂｅｒｋｈｏｕｔ  １９９７）。
【０１７２】
したがって、本発明による薬剤が使用されてもよい治療および／または予防のための疾患および／または障害および／または疾患状態は、炎症疾患、自己免疫疾患、自己免疫脳脊髄炎、発作、急性および慢性多発性硬化症、慢性炎症、関節リウマチ、腎疾患、再狭窄、血管形成術の後の再狭窄、急性および慢性アレルギー反応、一次および二次免疫またはアレルギー反応、喘息、結膜炎、気管支炎、癌、アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化心血管心不全または発作、乾癬、乾癬性関節炎、神経系の炎症、アトピー性皮膚炎、大腸炎、子宮内膜症、ぶどう膜炎、黄斑変性症、網膜剥離、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜色素変性症、増殖性硝子体網膜症、および中心性漿液性網脈絡膜症を含む網膜障害；特発性肺線維症、特発性および／またはコラゲノース関連肺動脈高血圧、サルコイドーシス、多発性筋炎、皮膚筋炎、免疫抑制の回避、感染の危険性の低下、敗血症、腎臓の炎症、糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎、糖尿病性ネフロパシー、閉塞性ネフロパシー、急性尿細管壊死、およびびまん性糸球体硬化症、全身性エリテマトーデス、慢性気管支炎、ベーチェット病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、川崎病の後の早発性アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、肥満、慢性肝疾患、ペーロニー病、急性脊髄外傷、肺または腎臓移植、心筋炎、アルツハイマー病、およびニューロパチー、乳癌、胃癌、膀胱癌、卵巣癌、過誤腫、結腸直腸癌、大腸腺腫、膵臓炎、肺血管病変を伴うおよび伴わない慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ならびにクローン病または潰瘍性大腸炎などのような炎症性腸疾患を含むが、これらに限定されない。
【０１７３】
とりわけ好ましい慢性腎臓疾患は、好ましくは併用療法のためのループス腎炎である。
【０１７４】
ループス腎炎は、全身性エリテマトーデス（略称ＳＬＥ）によって引き起こされる腎臓の炎症であり、糸球体腎炎の一種または一形態であるループス糸球体腎炎としても知られている。糸球体の腎炎としても知られている糸球体腎炎は、腎臓における糸球体または微小血管の炎症によって特徴付けられる腎疾患である。
【０１７５】
ループスとしても知られているＳＬＥは、慢性自己免疫疾患であり、炎症および組織損傷をもたらす。腎臓以外に、ＳＬＥは、体のあらゆる部分に影響を与え得るが、ほとんどの場合、心臓、関節、皮膚、肺、血管、肝臓、および神経系を傷つける。肺の損傷は、肺炎などのような慢性呼吸器疾患において明らかになり、肺性の症状発現は、胸膜炎、胸水、ループス肺炎、慢性びまん性間質性肺病、肺高血圧、肺塞栓、肺出血、および縮小肺症候群を引き起こし得る肺および胸膜の炎症を含んでいてもよい。
【０１７６】
ループス腎炎の診断は、典型的には、血液試験、尿分析、Ｘ線、腎臓の超音波スキャン、および／または腎生検に依存する。
【０１７７】
世界保健機構は、ループス腎炎を生検に基づいて５つのクラスに分類し、それらのクラスの全てが本明細書において使用されるループス腎炎という用語によって包含されるものとする。
【０１７８】
この分類は、１９８２年に規定され、１９９５年に改訂された。
クラスＩは、光学顕微鏡上で組織学的に正常であるが、電子顕微鏡上でメサンギウム沈着物が見られる微小メサンギウム糸球体腎炎である。
クラスＩＩは、メサンギウム増殖性ループス腎炎の発見に基づく。この形態は、典型的には、コルチコステロイドを用いる治療に完全に応答する。
クラスＩＩＩは、巣状増殖性腎炎であり、高用量のコルチコステロイドを用いる治療にうまく応答することが多い。
クラスＩＶは、びまん性増殖性腎炎である。この形態は、コルチコステロイドおよび免疫抑制剤を用いて主として治療される。
クラスＶは、膜性腎炎であり、極度の浮腫およびタンパク質損失によって特徴付けられる。
クラスＶＩ  糸球体硬化症。
【０１７９】
腎臓疾患糸球体腎炎の他のタイプまたは形態は、以下の通りである。
膜性増殖性糸球体腎炎（略称ＭＰＧＮ）は、腎臓糸球体メサンギウムにおける沈着物ならびに基底膜（略称ＧＢＭ）肥厚、補体の活性化、および糸球体の損傷によって引き起こされる糸球体腎炎の一種である。
膜性糸球体腎炎（略称ＭＧＮ）は、腎臓の緩徐進行性疾患である膜性ネフロパシーとしても知られている。
ＩｇＡネフロパシーは、世界の至る所で最も共通の糸球体腎炎である。この疾患は、糸球体の中心であるメサンギウムにおける腫物パターンにおける免疫グロブリンＡ（略称ＩｇＡ）の沈着物にその名称が由来する。
連鎖球菌感染後糸球体腎炎は、連鎖球菌感染の後の、腎臓における糸球体（糸球体腎炎）または微小血管の障害である。
急速進行性糸球体腎炎（略称ＲＰＧＮ）は、治療されないままであると、急性腎不全および数か月以内に死に急速に進行する腎臓の症候群である。症例の５０％において、ＲＰＧＮは、グッドパスチャー症候群、全身性エリテマトーデス、またはウェゲナー肉芽腫症などのような基礎疾患と関連する。残りの症例は、特発性である。
腎炎症候群（または急性腎炎症候群）は、腎臓に影響を与える障害、より具体的には糸球体障害と関連するサインの集合をむしろ意味する。
巣状分節性糸球体硬化症は、子供および青年におけるネフローゼ症候群の原因ならびに大人における腎不全の重要な原因である。
糖尿病性ネフロパシーは、キンメルスティール−ウィルソン症候群および毛細血管間糸球体腎炎としても知られており、腎臓糸球体における毛細血管の血管障害によって引き起こされる進行性の腎臓疾患である。それは、ネフローゼ症候群および結節性糸球体硬化症によって特徴付けられる。それは、長年の真性糖尿病によるものであり、多くの西洋諸国における透析の第一原因である。
ネフローゼ症候群は、腎臓が損傷し、尿の中に大量のタンパク質（１．７３ｍ２体表面積当たり、１日当たり３．５グラム超）を腎臓に漏出させる非特異的障害である。
間質性腎炎（または尿細管性間質性腎炎）は、尿細管を囲む腎臓の間質に影響を与える腎炎の形態である。この疾患は、急性または慢性のものとなり得る。
【０１８０】
ＭＣＰ−１およびそのそれぞれのケモカイン受容体ＣＣＲ２が、ＳＬＥの臨床病態など自己免疫組織傷害において重大な役割を果たすという非常に強い証拠がある（Ｇｅｒａｒｄ  ＆  Ｒｏｌｌｉｎｓ  ２００１）。たとえば、ＭＣＰ−１遺伝子またはＣＣＲ２遺伝子のいずれかが欠損したＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスは、ループス様の自己免疫から防御される（Ｐｅｒｅｚ  ｄｅ  Ｌｅｍａ  ２００５、Ｔｅｓｃｈ  １９９９）。したがって、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２軸は、たとえばループス腎炎のための、有望な治療上の標的に相当するかもしれない。
【０１８１】
慢性肺疾患または慢性肺病としても知られている慢性呼吸器疾患は、気道、およびたとえば肺血管のような肺の他の構造の慢性疾患である。いくつかの最も共通した慢性呼吸器疾患は、喘息、慢性閉塞性肺疾患（略称ＣＯＰＤ）、呼吸器アレルギー、職業性肺病、および肺高血圧である。
【０１８２】
慢性閉塞性肺疾患（略称ＣＯＰＤ）は、肺からの気流の持続的な閉塞によって特徴付けられる肺の病気である。正常な呼吸を妨げ、完全に可逆性でない、診断が不十分で、生命を脅かす肺病である。ＣＯＰＤは、少数の肺病を含み、最も共通のものは、慢性気管支炎および肺気腫である。ＣＯＰＤを有する多くの人々は、これらの疾患の両方を有する。肺気腫は、気道の先端の肺胞に対する損傷であり、これは体が必要とする酸素を取り込むことを困難にする。慢性気管支炎の間に、気道は、刺激され、赤くなり、粘着性の粘液を過剰に作る。気道の壁は腫大し、空気が通過するのを部分的に遮断する。
【０１８３】
ＣＯＰＤおよび／またはＣＯＰＤ発症におけるＭＣＰ−１の関与は、これまで明らかではなかった。Ｄｅ  Ｂｏｅｒおよび同僚は、ＣＯＰＤを有する現在喫煙者または元喫煙者の周辺肺組織の半定量的分析において、ＭＣＰ−１のｍＲＮＡのレベルが１．５倍高いことを見出した（Ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ２０００）。それらの結果に基づいて、著者らは、ＭＣＰ−１が、ＣＯＰＤにおいて、気道上皮へのマクロファージおよび肥満細胞の動員に関与するかもしれないと推測した。Ｔｒａｖｅｓら（Ｔｒａｖｅｓ  ２００２）は、気管支肺胞洗浄（略称ＢＡＬ）液においてではなく、痰におけるＭＣＰ−１のレベルの増加を見つけ、ＭＣＰ−１が、気道への単球および好中球の移動に関与し、ＣＯＰＤと関連する炎症性の負荷の増加の一因となることを仮定した（Ｔｒａｖｅｓ  ２００２）。しかしながら、２００６年に、Ｋｏら（Ｋｏ  ２００６）は、ＣＯＰＤを有する患者の呼吸凝縮液を測定した。彼らは、ＣＯＰＤ患者における、ＭＣＰ−１レベルの上昇を見つけることができなかった（Ｋｏ  ２００６）。
【０１８４】
ＭＣＰ−１は、炎症プロセスならびに炎症を引き起こす単球および／または好中球の動員に関与するが、ＭＣＰ−１が、ＣＯＰＤおよび／またはＣＯＰＤの発症に関与するかどうかは全く明らかではなかった。驚いくべきことに、本発明の実施例１１において示されるように、ＣＯＰＤの治療における有用性について物質をスクリーニングするために広く使用される、認められている動物モデルにおいて、ＭＣＰ−１結合スピーゲルマーの投与が、肺への細胞浸潤の低下を導く。本出願において示されるデータに基づいて、ＭＣＰ−１結合スピーゲルマーは、単独で、または好ましくは、ステロイド剤、好ましくはデキサメタゾンとの併用療法における併用療法のエレメントとして、慢性呼吸器疾患、好ましくはＣＯＰＤの療法における使用に適しており、デキサメタゾンまたは他のステロイド剤とのＭＣＰ−１結合スピーゲルマーの併用療法は、ＣＯＰＤなどのような慢性呼吸器疾患を治療するために、２つの独立した作用機序を利用する。
【０１８５】
肺血管の構造および機能における変化は、肺血管病変を伴うＣＯＰＤとして本明細書において明示される、ＣＯＰＤを有する患者において高度に蔓延している（Ｐｅｉｎａｄｏ  ２００８）。血管異常は、ガス交換を損ない、ＣＯＰＤ患者における生存の低下と関連する主要な要因の１つである肺高血圧をもたらす場合がある（Ｐｅｉｎａｄｏ  ２００８）。肺循環における変化は、最初の疾患段階で同定され、それらの発病に対する新しい見識を提供した。タバコの煙による産物または炎症性エレメントの影響によってもたらされる内皮細胞損傷および機能障害は、現在、肺高血圧をもたらす一連のイベントを起こす一次変化であると考えられる（Ｐｅｉｎａｄｏ  ２００８）。
【０１８６】
肺高血圧（略称ＰＨ）は、肺血管系として共に知られている肺動脈、肺静脈、または肺毛細管における血圧の増加であり、息切れ、めまい、失神、および他の症状を導き、これらの全ては、激しい活動によって悪化する。ＰＨは、著しく減少した運動耐容能および心不全を有する重篤な疾患になり得る。１９７３年以来、一次ＰＨおよび二次ＰＨは区別されている（Ｈａｔａｎｏ  ＆  Ｓｔｒａｓｓｅｒ  １９７５）。
【０１８７】
一次ＰＨは、知られている原因がない状態で、慢性的に増加した肺血管抵抗によって特徴付けられる症候群であり、これは、治療されない場合、通常、４年以内に死を導く（Ｒｕｂｉｎ  １９９７）。
【０１８８】
二次ＰＨは、持続性の血管収縮および肺血管床に対する構造上の変化に起因する（Ｈｏｐｋｉｎｓ  ２００２）。これらの変化の原因となる主な刺激は、慢性肺胞性低酸素、慢性炎症、および過度のずり応力である（Ｖｏｅｌｋｅｒ  １９９５）。
【０１８９】
２００３年に、肺動脈高血圧についての第３回世界シンポジウムが、疾患メカニズムについての新しい理解に基づいて分類を修正するために、ベニスにおいて召集された。このグループによって進展した改訂システムは、肺高血圧を理解するための現在のフレームワークを提供する（Ｓｉｍｏｎｎｅａｕ  ２００４）。
ＷＨＯグループＩ−肺動脈高血圧（略称ＰＡＨ）
・  特発性肺動脈高血圧（略称ＩＰＡＨ）
・  家族性肺動脈高血圧（略称ＦＰＡＨ）
・  他の疾患と関連する肺動脈高血圧（略称ＡＰＡＨ）、他の疾患は、コラーゲン血管疾患（たとえば強皮症）、全身および肺循環の間の先天的な短絡、門脈圧亢進症、ＨＩＶ感染症、薬剤、毒素、または他の疾患もしくは障害である。
・  静脈疾患または毛細血管疾患と関連する肺動脈高血圧
ＷＨＯグループＩＩ−左心疾患と関連する肺高血圧
・  心房または心室の疾患
・  弁の疾患（たとえば僧帽弁狭窄）
ＷＨＯグループＩＩＩ−肺病および／または低酸素血と関連する肺高血圧
・  慢性閉塞性肺疾患（略称ＣＯＰＤ）、間質性肺病（略称ＩＬＤ）
・  睡眠呼吸障害、肺胞低換気
・  高地への慢性的な曝露
・  発達性肺異常
ＷＨＯグループＩＶ−慢性血栓および／または塞栓疾患による肺高血圧
・  肺動脈の近位部または遠位部における肺塞栓症
・  腫瘍細胞または寄生体などのような他の原因の塞栓症
ＷＨＯグループＶ−種々雑多
【０１９０】
多くの作用物質、すなわちエポプロステノールなどのプロスタサイクリン誘導体、ボセンタンなどのエンドセリン受容体アンタゴニスト、およびシルデナフィルなどのホスホジエステラーゼ５型阻害剤が、最近、一次ＰＡＨおよび二次ＰＡＨのために開発されている（Ｔｏｒｒｅｓ  ２００７）。
【０１９１】
ＭＣＰ−１レベルは、健常なコントロールと比較して、特発性肺動脈高血圧または原発性肺高血圧を有する患者において上昇している。これらの結果は、肺高血圧の発症に対するＭＣＰ−１の一因を暗示する（Ｉｔｏｈ  ２００６）。実施例１２において示されるように、ＭＣＰ−１結合スピーゲルマーは、肺高血圧の治療における有用性について物質をスクリーニングするために広く使用される動物モデルにおいてＰＨに対する陽性の効果を示す。したがって、ＭＣＰ−１結合スピーゲルマーは、ＰＨの治療の作用物質として使用可能である。
【０１９２】
さらなる実施形態において、薬剤は、さらなる製薬学的に活性な作用物質を含む。そのようなさらなる製薬学的に活性な化合物は、とりわけ、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤およびアンジオテンシン受容体遮断薬などのような、血圧および糖尿病をコントロールすることで知られているものであるが、これらに限定されない。さらなる製薬学的に活性な化合物はまた、さらなる実施形態において、慢性炎症の部位への免疫細胞の浸潤を低下させるか、慢性炎症性の環境において存在し、組織損傷を導く過度の免疫応答を概して抑制する化合物の１つとすることができる。そのような化合物は、ステロイドまたは免疫抑制剤とすることができるが、これらに限定されず、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾンのようなコルチコステロイドおよびシクロホスファミド、シクロスポリン、クロラムブシル、アザチオプリン、タクロリムス、またはミコフェノール酸モフェチルなどの通常の免疫抑制剤を含む群から好ましくは選択される。さらに、Ｔ細胞副刺激の、より特異的な遮断薬、たとえばＣＤ１５４もしくはＣＤ４０もしくはＣＤ２８もしくはＣＤ８６もしくはＣＤ８０の遮断薬、または抗ＣＤ２０薬のようなＴ細胞および／もしくはＢ細胞除去薬は、さらなる実施形態において有用である。最後に、さらなる製薬学的に活性な作用物質は、ケモカインのアゴニストもしくはアンタゴニスト、またはケモカイン受容体のアゴニストもしくはアンタゴニストとすることができる、任意の他のケモカインの活性の調節因子であってもよい。あるいはまたはさらに、そのようなさらなる製薬学的に活性な作用物質は、本発明によるさらなる核酸である。あるいは、薬剤は、ＭＣＰ−１とは異なる標的分子に結合するか、本発明による核酸のうちの１つとは異なる機能を示す、少なくとももう１つの核酸を含む。
【０１９３】
薬剤が、上述の疾患の治療のための薬剤の使用に関連して開示される疾患のいずれかの予防のために、原理的に、代わりにまたはさらに使用されることは、本発明の範囲内である。それぞれのマーカー、したがって、すなわちそれぞれの疾患のためのマーカーは、当業者らに知られている。好ましくは、それぞれのマーカーは、ＭＣＰ−１である。あるいはおよび／またはさらに、それぞれのマーカーは、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、およびエオタキシンを含む群から選択される。マーカーのさらなる群は、たとえば抗ｄｓＤＮＡ抗体またはリウマチ因子などの血漿中の自己反応性抗体を含む群から選択される。
【０１９４】
本発明の薬剤の一実施形態において、そのような薬剤は、本明細書において開示される疾患のいずれか、とりわけ、本発明の薬剤が使用される疾患のための他の治療と組み合わせて使用される。
【０１９５】
「併用療法（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）」（または「共療法（ｃｏ−ｔｈｅｒａｐｙ）」）は、これらの治療薬の共同作用から有益な効果を提供するように意図される特異的な治療レジメンの一部としての本発明の薬剤および少なくとも１つの第２の作用物質、つまり本発明の薬剤および上述の第２の作用物質の投与を含む。組み合わせの有益な効果は、治療薬の組み合わせから結果として生じる薬物動態学的または薬力学的な共同作用を含むが、これらに限定されない。これらの治療薬を組み合わて投与することは、規定された期間（通常、選択された組み合わせに依存して、数分間、数時間、数日間、または数週間）にわたって典型的には実行される。
【０１９６】
「併用療法」は、偶発的にまた恣意的に本発明の組み合わせをもたらす、個別の単独療法レジメンの一部としてこれらの治療薬の２回以上の投与を包含するように意図されてもよいが、概して意図されない。「併用療法」は、連続したこれらの治療薬の投与、すなわち、各治療薬が異なる時間に投与される投与、および、これらの治療薬または治療薬のうちの少なくとも２つの実質的に同時の投与を包含するように意図される。実質的に同時の投与は、たとえば、一定の比率の各治療薬を有する単一のカプセルまたは治療薬のそれぞれについての単一のカプセルを並行して対象に投与することによって達成することができる。
【０１９７】
好ましい実施形態において、慢性疾患は、併用療法を使用して治療される慢性腎臓疾患、より好ましくはループス腎炎または慢性肺病、より好ましくは肺炎である。そのような併用療法は、本明細書において開示される核酸分子および免疫抑制薬の組み合わせを使用する。好ましくは、免疫抑制薬は、シクロホスファミドおよびミコフェノール酸モフェチルを含む群から選択される。
【０１９８】
サイトホスファン（ｃｙｔｏｐｈｏｓｐｈａｎｅ）としても知られているシクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ、Ｎｅｏｓａｒ、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅの一般名称）は、オキサゾホリン（ｏｘａｚｏｐｈｏｒｉｎｅ）群からのナイトロジェンマスタードアルキル化薬である。シクロホスファミドの静脈内投与および経口投与は、ループス糸球体腎炎を治療するための標準的治療であった（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ  １９９１）。シクロホスファミドは、化学療法活性を有する活性形態に肝臓において変換される「プロドラッグ」である。実際には、シクロホスファミドの使用は、骨髄抑制、出血性膀胱炎、日和見感染、悪性疾患、および早発性性腺機能不全を含む、重症化する可能性のある毒性作用によって制限されている（Ｂｏｕｍｐａｓ  １９９５）。コルチコステロイドと組み合わせた断続的な静脈内シクロホスファミドを用いる治療の臨床試験は、コルチコステロイドのみを用いる治療と比較して、より長期的な腎臓の生存を示すが、全生存は示さない（Ａｕｓｔｉｎ  １９８６、Ｖａｌｅｒｉ  １９９４、Ｌｅｈｍａｎ  １９８９、Ｂｏｕｍｐａｓ  １９９２）。さらに、寛解の達成の失敗は、腎不全に対する進行の速度の増加と関連しており、シクロホスファミドを受けた患者の１８〜５７パーセントにおいて報告されている（Ｋｏｒｂｅｒｔ  ２０００、Ｇｏｕｒｌｅｙ  １９９６、Ｉｏｎｎｉｄｉｓ  ２０００、Ｍｏｋ  ２００４）。
【０１９９】
ミコフェノール酸モフェチルは、免疫抑制薬であり、それは、活性部分ミコフェノール酸に肝臓において代謝される。それは、Ｂリンパ球およびＴリンパ球の増殖において使用されるプリン合成のデノボ経路においてグアニン一リン酸の合成の速度をコントロールする酵素であるイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼを阻害する。ミコフェノール酸モフェチルは、移植拒絶の予防のために承認されており、シクロホスファミドに不応性の、ループス腎炎を有する患者において、およびシクロホスファミドに不耐性の患者において使用されてきた（Ｄｏｏｌｅｙ  １９９０、Ｇａｕｂｉｔｚ  １９９９、Ｋｉｎｇｄｏｎ  ２００１、Ｋａｒｉｍ  ２００２）。４週間の治験において、ミコフェノール酸モフェチルは、ループス腎炎の寛解の誘発において静脈内シクロホスファミドよりも有効であった（Ｇｉｎｚｌｅｒ  ２００５）。
【０２００】
しかしながら、それぞれの２つの薬剤は、重要な罹患率および死亡率と関連する。たとえば、Ａｓｐｒｅｖａ  Ｌｕｐｕｓ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｔｕｄｙ  （ＡＬＭＳ）治験において、ミコフェノール酸モフェチルは、２７．７％において重大な有害作用および４．９％において治療関連の死を引き起こし、シクロホスファミドは、それぞれ、治療患者の２２．８％および２．８％において引き起こした（Ａｐｐｅｌ  ２００７）。最も重大な有害作用および死は、シクロホスファミドおよびミコフェノール酸モフェチルの非特異的な免疫抑制作用による感染と関連した（Ａｐｐｅｌ  ２００７）。自己免疫性の炎症を特異的に遮断する新規な薬剤は、シクロホスファミドおよびミコフェノール酸モフェチルに取って代わることによって、または組み合わせて使用した場合に著しい用量の低下を可能にすることによって、現在の治療プロトコールの毒性を低下させることを可能にするかもしれない。
【０２０１】
そのような併用療法に関連して免疫抑制薬の総量の著しい減少は、なお治療効果を達成しながら可能である。免疫抑制薬の総量の減少は、各投与で免疫抑制薬の量を減少させることによって、または疾患の治療において免疫抑制薬の投与の頻度を減少させることによって達成されてもよい。上述の２つの選択肢のどちらを実行するかにかかわらず、いずれの場合においても、治療の過程において患者に投与される免疫抑制薬の総量は、本発明による免疫抑制薬および核酸分子の組み合わせではなく免疫抑制薬のみが投与される場合の、患者の治療において投与される免疫抑制薬の総量と比較して減少する。唯一の製薬学的に活性な作用物質としての、上述の疾患の治療に関連する免疫抑制薬のそのような投与は、本明細書において単独療法とも呼ばれる。そのような減少の程度は、特異的な免疫抑制薬および特異的疾患ならびに治療される患者の個々の特徴に依存する。いずれの場合も、本発明による併用療法は、単独療法としてのそれぞれの免疫抑制薬の使用と比較して、より少ない副作用と関係する。
【０２０２】
本発明による核酸分子を１つの製薬学的に活性な作用物質として使用する併用療法のさらなる好ましい実施形態は、慢性呼吸器疾患の治療に関連する併用療法であり、慢性呼吸器疾患は、好ましくはＣＯＰＤである。本発明による核酸分子に加えて上述の併用療法において使用される作用物質は、抗炎症薬である。好ましくは、抗炎症薬は、デキサメタゾンおよびロフルミラストを含む群から選択され、より好ましくは、上述の抗炎症薬は、デキサメタゾンである。
【０２０３】
各治療薬の連続のまたは実質的に同時の投与は、局所経路、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、および粘膜組織を通しての直接的な吸収を含むが、これらに限定されない任意の適切な経路によって達成することができる。治療薬は、同じ経路または異なる経路によって投与することができる。たとえば、選択される組み合わせの第１の治療薬は、注射によって投与されてもよいが、組み合わせの他の治療薬は、局所に投与されていてもよい。
【０２０４】
あるいは、たとえば、全ての治療薬は局所に投与されてもよく、または全ての治療薬は注射によって投与されてもよい。治療薬が投与される順序は、特に断りのない限り、厳密に決定的なものではない。「併用療法」はまた、他の生物学的に活性な成分とさらに組み合わせた上記に記載される治療薬の投与を包含することができる。併用療法が、さらに、非薬剤治療を含む場合、非薬剤治療は、治療薬と非薬剤治療との組み合わせの共同作用からの有益な効果が達成される限り、任意の適した時間に行われてもよい。たとえば、適切な症例において、有益な効果は、非薬剤治療が、おそらく数日間またはさらに数週間、治療薬の投与から一時的に取り除かれる場合、なお達成される。
【０２０５】
上記の一般用語において概説されるように、本発明による薬剤は、当業者らに知られている任意の形態で原理的に投与することができる。投与の好ましい経路は、全身投与、より好ましくは非経口投与によるもの、好ましくは注射によるものである。あるいは、薬剤は、局所的に投与されてもよい。投与の他の経路は、筋肉内、腹腔内、および皮下、経口、鼻腔内、気管内、または肺を含むが、効率を保証すると同時に、最も侵襲性ではない投与の経路が優先される。
【０２０６】
非経口投与は、概して、皮下、筋肉内、または静脈内の注射および注入に使用される。さらに、非経口投与のための１つのアプローチは、一定のレベルの投薬が維持されることを保証する緩効性系または徐放性系の移植を利用し、これらは当業者によく知られている。
【０２０７】
さらに、本発明の好ましい薬剤は、適している鼻腔内ビヒクル、吸入剤の局所の使用を介して鼻腔内形態においてまたは当業者らに十分に知られている経皮的皮膚パッチのそれらの形態を使用する経皮的経路を介して、投与することができる。経皮的送達系の形態において投与されるために、投薬投与は、もちろん、投薬レジメンの全体にわたって、断続的であるというよりむしろ継続的であろう。好ましい他の局所調製物は、クリーム、軟膏、ローション、エアロゾルスプレー、およびゲルを含み、活性成分の濃度は、典型的には、０．０１％〜１５％ｗ／ｗまたはｗ／ｖで変動するであろう。
【０２０８】
本発明の薬剤は、概して、製薬学的に許容可能な媒体中に溶解または分散された本発明の核酸分子を含むが、これに限定されない、療法の（１つまたは複数の）有効な量の活性成分を含むであろう。製薬学的に許容可能な媒体または担体は、任意のおよび全ての溶剤、分散媒体、コーティング剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤、ならびにその他同種のものを含む。医薬活性物質のためのそのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野においてよく知られている。補充的な活性の成分もまた、本発明の薬剤に組み込むことができる。
【０２０９】
さらなる態様において、本発明は、医薬組成物に関する。そのような医薬組成物は、本発明による少なくとも１つの核酸および好ましくは製薬学的に許容可能なビヒクルを含む。そのようなビヒクルは、当技術分野において使用され、および／または知られている任意のビヒクルまたは任意のバインダーとすることができる。とりわけ、そのようなバインダーまたはビヒクルは、本明細書において開示される薬剤の製造に関連して議論される任意のバインダーまたはビヒクルである。さらなる実施形態において、医薬組成物は、さらなる製薬学的に活性な作用物質を含む。
【０２１０】
薬剤および医薬組成物の調製は、本開示に照らして当業者らに知られているであろう。典型的には、そのような組成物は、液体溶液もしくは懸濁剤としての注射剤として、注射前の液体の溶液もしくは懸濁剤に適している固体形態として、経口投与のための錠剤もしくは他の固体として、持続放出カプセルとして、または点眼剤、クリーム、ローション、軟膏剤、吸入剤、およびその他同種のものを含む、現在使用されている任意の他の形態において調製されていてもよい。活動分野において特定のエリアを治療するための外科医、内科医、またはヘルスケアワーカーによる、生理食塩水ベースの洗浄などのような滅菌製剤の使用もまた、とりわけ有用であってもよい。組成物はまた、マイクロデバイス、微粒子、またはスポンジを介して送達されてもよい。
【０２１１】
製剤に際して、薬剤は、投薬製剤と適合する方法で、薬理学的に有効な量で投与されるであろう。製剤は、上記に記載される注射可能な溶液のタイプなどのような、様々な投薬形態において容易に投与されるが、薬剤放出カプセルおよびその他同種のものもまた利用することができる。
【０２１２】
これに関連して、投与される活性成分の量および組成物の容量は、治療される個人または対象に依存する。投与に必要とされる活性化合物の特定の量は、実行者の判断に依存し、各個人に特有である。
【０２１３】
活性化合物を分散させるのに必要とされる薬剤の最小容量が、典型的には用いられる。投与に適している投与計画は、変更可能であるが、最初に化合物を投与し、結果をモニターし、次いで、さらなる間隔で制御された用量をさらに与えることによって、特徴が示されるであろう。
【０２１４】
たとえば、錠剤またはカプセル（たとえばゼラチンカプセル）の形態における経口投与については、活性薬剤成分、つまり本発明の核酸分子および／または（１つもしくは複数の）治療薬または（１つもしくは複数の）活性化合物とも本明細書において呼ばれる、任意のさらなる製薬学的に活性な作用物質は、エタノール、グリセロール、水、およびその他同種のものなどのような、経口の、無毒性の、製薬学的に許容可能な不活性担体と組み合わせることができる。さらに、望まれる場合または必要とされる場合、適切なバインダー、潤滑剤、崩壊剤、および着色剤もまた混合物に組み込むことができる。適切なバインダーは、デンプン、ケイ酸アルミウニムマグネシウム、デンプンのり、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン、グルコースもしくはベータ−ラクトースなどのような天然糖、トウモロコシ甘味料、アラビアゴム、トラガントなどのような天然および合成ゴム、またはアルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ろう、およびその他同種のものを含む。これらの投薬形態において使用される潤滑剤は、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、シリカ、滑石、ステアリン酸、そのマグネシウム塩もしくはカルシウム塩、および／またはポリエチレングリコールならびにその他同種のものを含む。崩壊薬は、限定を伴うことなく、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、ザンサンガムデンプン、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、または沸騰性混合物、およびその他同種のものを含む。希釈剤は、たとえばラクトース、ブドウ糖、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、および／またはグリシンを含む。
【０２１５】
本発明の薬剤はまた、持続放出および徐放の錠剤またはカプセル、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、懸濁剤、シロップ剤、および乳剤などの経口投薬形態において投与することができる。坐剤は、脂肪性乳剤または懸濁剤から有利に調製される。
【０２１６】
医薬組成物または薬剤は、滅菌されてもよく、ならびに／または保存剤、安定化剤、湿潤剤、もしくは乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調節するための塩、ならびに／またはバッファーなどの補助薬を含有していてもよい。さらに、それらはまた、他の治療上価値のある物質を含有していてもよい。組成物は、従来の混合方法、造粒方法、またはコーティング方法に従って調製され、典型的には、約０．１％〜７５％、好ましくは約１％〜５０％の活性成分を含有する。
【０２１７】
液体の、とりわけ注射可能な組成物は、たとえば、溶解し、分散させることなどによって調製することができる。活性化合物は、たとえば水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノール、およびその他同種のものなどの、製薬学的に純粋な溶剤中に溶解され、またはそれらと混合され、それによって、注射可能な溶液または懸濁剤を形成する。さらに、注射前に液体中に溶解するのに適切な固体形態を、製剤することができる。
【０２１８】
固体組成物については、賦形剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム、およびその他同種のものを含む。上記に規定される活性化合物はまた、たとえばポリアルキレングリコール、たとえばプロピレングリコールを担体として使用して、坐剤として製剤されてもよい。いくつかの実施形態において、坐剤は、脂肪性乳剤または懸濁剤から有利に調製される。
【０２１９】
本発明の薬剤および核酸分子はまた、それぞれ、小さな単層小胞、大きな単層小胞、および多層小胞などのようなリポソーム送達系の形態において投与することもできる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリンを含有する様々なリン脂質から形成することができる。いくつかの実施形態において、脂質成分の膜は、薬剤の水溶液を用いて水和され、薬剤を被包する脂質層を形成するが、このことは当業者によく知られている。たとえば、本明細書において記載される核酸分子は、当技術分野において知られている方法を使用して構築される、親油性化合物または非免疫原性高分子化合物との複合体として提供することができる。さらに、リポソームは、細胞毒性薬をターゲティングおよび内部に収容して細胞死滅を媒介するために、それらの表面上にそのような核酸分子を運んでいてもよい。核酸関連複合体の例は、米国特許第６，０１１，０２０号において提供される。
【０２２０】
本発明の薬剤および核酸分子はまた、それぞれ、標的化可能な薬剤担体としての可溶性ポリマーとつながれてもよい。そのようなポリマーは、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパラミドフェノール、またはパルミトイル残基を用いて置換されたポリエチレンオキシドポリリシンを含むことができる。さらに、本発明の薬剤および核酸分子は、それぞれ、薬剤の制御放出を達成するのに有用な生分解性ポリマーのクラス、たとえばポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリル酸、およびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマーにつながれてもよい。
【０２２１】
望ましい場合、投与される医薬組成物および薬剤は、それぞれ、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ならびにたとえば酢酸ナトリウムおよびオレイン酸トリエタノールアミンなどのような他の物質などの、少量の無毒性補助物質を含有していてもよい。
【０２２２】
本発明の核酸分子および薬剤を用いる投薬レジメンは、それぞれ、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別、および状態、治療される状態の重症度、投与の経路、患者の腎臓および肝臓の機能、ならびに用いられる特定のアプタマーまたはその塩を含む様々な因子に従って選択される。熟練の内科医または獣医は、状態の進行を予防、対抗または阻止するために必要とされる有効量の薬剤を容易に決定し、処方することができる。
【０２２３】
本発明による核酸の有効な血漿レベルは、好ましくは、本明細書において開示される疾患のいずれかの治療において５００ｆＭ〜５００μＭに及ぶ。
【０２２４】
本発明の核酸分子および薬剤は、それぞれ、毎日１回の用量、２日もしくは３日ごと、毎週、２週間ごと、毎月１回の用量、または３カ月ごとに好ましくは投与されてもよい。
【０２２５】
本明細書において記載される薬剤が、本明細書において開示される医薬組成物を構成することは、本発明の範囲内である。
【０２２６】
さらなる態様において、本発明は、そのような治療を必要としている対象の治療のための方法に関し、方法は、製薬学的に活性な量の少なくとも１つの本発明による核酸の投与を含む。一実施形態において、対象は、疾患に罹患しており、またはそのような疾患を発症する危険性があり、疾患は、本明細書において開示されるもののうちのいずれか、とりわけ、薬剤の製造のための、本発明による核酸のうちのいずれかの使用に関連して開示される疾患のうちのいずれかである。
【０２２７】
本発明による核酸およびアンタゴニストは、薬剤として、または薬剤の製造のためだけではなく、とりわけ炎症を起こした領域の皮膚病変におけるＭＣＰ−１の関与に関した化粧品目的のためにも使用することができることが理解されるであろう。したがって、本発明による核酸、薬剤、および／または医薬組成物を使用することができる、治療または予防のためのさらなる状態または疾患は、炎症を起こした領域の皮膚病変である。
【０２２８】
好ましくは本明細書において使用されるように、診断薬または診断用薬または診断の手段は、ＭＣＰ−１、好ましくは本明細書において記載されるＭＣＰ−１、より好ましくは、本明細書において記載される様々な障害および疾患に関連して本明細書に記載されるＭＣＰ−１を直接的にまたは間接的に検出するのに適している。しかしながら、本発明による核酸分子がまた、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、およびエオタキシンのいずれか、いくつか、または全てと結合する限り、そのような核酸分子もまた、疾患および障害の診断にそれぞれ使用することができ、病原性メカニズムは、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、および／またはエオタキシンの過剰発現または過剰活性と直接的にまたは間接的に関連付けられ、または関連する。診断薬は、本明細書において記載される、障害および疾患のいずれかの検出および／または追跡調査にそれぞれ適している。そのような検出は、ＭＣＰ−１への本発明による核酸の結合を通して可能である。そのような結合は、直接的にまたは間接的に検出することができる。それぞれの方法および手段は、当業者らに知られている。とりわけ、本発明による核酸は、本発明による核酸、好ましくは、ＭＣＰ−１に結合した核酸の検出を可能にする標識を含んでいてもよい。そのような標識は、放射性標識、酵素標識、および蛍光標識を含む群から好ましくは選択される。原理的に、抗体のために開発された全ての既知の分析は、本発明による核酸に採用することができるが、標的結合抗体は、標的結合核酸に置き換えられる。非標識標的結合抗体を使用する抗体分析において、検出は、放射性、酵素、および蛍光標識を用いて修飾され、標的結合抗体にそのＦｃ断片で結合する二次抗体によって好ましくは行われる。核酸、好ましくは本発明による核酸の場合には、核酸は、そのような標識を用いて修飾され、好ましくは、そのような標識は、ビオチン、Ｃｙ−３、およびＣｙ−５を含む群から選択され、そのような標識は、そのような標識に対する抗体、たとえば抗ビオチン抗体、抗Ｃｙ３抗体、もしくは抗Ｃｙ５抗体によって検出されるか、標識がビオチンである場合には、標識はビオチンに天然に結合するストレプトアビジンまたはアビジンによって検出される。そのような抗体、ストレプトアビジン、またはアビジンは、同様に、それぞれの標識、たとえば放射性、酵素、または蛍光標識を用いて好ましくは（二次抗体のように）修飾される。
【０２２９】
さらなる実施形態において、本発明による核酸分子は、第２の検出手段によって検出または分析され、上述の検出手段は、分子ビーコンである。分子ビーコンの方法論は、当業者らに知られている。手短に言えば、分子ビーコンとも呼ばれる核酸プローブは、検出される核酸試料に対する逆方向の相補体であり、このために、検出される核酸試料の部分にハイブリダイズする。核酸試料への結合に際して、分子ビーコンの蛍光群が分離し、これは、蛍光シグナルの変化、好ましくは強度の変化をもたらす。この変化は、存在する核酸試料の量と関連する。
【０２３０】
本発明による核酸を使用するＭＣＰ−１の検出は、とりわけ、本明細書において規定されるＭＣＰ−１の検出を可能にするであろうということが認められるであろう。
【０２３１】
ＭＣＰ−１の検出に関連して、好ましい方法は、
（ａ）ＭＣＰ−１の存在について試験される試料を提供するステップ、
（ｂ）本発明による核酸を提供するステップ、
（ｃ）好ましくは反応容器において、核酸と試料を反応させるステップ
を含み、ステップ（ａ）はステップ（ｂ）の前に実行することができ、またはステップ（ｂ）はステップ（ａ）の前に実行することができる。
【０２３２】
好ましい実施形態において、核酸との試料の反応の検出であるさらなるステップｄ）が提供される。好ましくは、ステップｂ）の核酸は、表面に固定される。表面は、反応チューブ、プレートのウェルなどの反応容器の表面、またはたとえばビーズなどの、そのような反応容器中に含有されるデバイスの表面である。表面への核酸の固定は、非共有結合または共有結合を含むが、これに限定されなず、当業者らに知られている任意の手段によって成すことができる。好ましくは、結合は、表面および核酸の間の共有化学結合を介して確立される。しかしながら、核酸が、表面に間接的に固定され、そのような間接的な固定が、さらなる成分または１対の相互作用パートナーの使用を伴うこともまた本発明の範囲内である。そのようなさらなる成分は、好ましくは、相互作用パートナーとも呼ばれ、したがって、表面への核酸の結合を媒介する、固定される核酸と特異的に相互作用する化合物である。相互作用パートナーは、核酸、ポリペプチド、タンパク質、および抗体を含む群から好ましくは選択される。好ましくは、相互作用パートナーは、抗体、より好ましくはモノクローナル抗体である。あるいは、相互作用パートナーは、核酸、好ましくは機能的な核酸である。より好ましくは、そのような機能的な核酸は、核酸に少なくとも部分的に相補的なアプタマー、スピーゲルマー、および核酸を含む群から選択される。さらなる代替の実施形態において、表面への核酸の結合は、多数の部分に分かれた相互作用パートナーによって媒介される。そのような多数の部分に分かれた相互作用パートナーは、好ましくは１対の相互作用パートナーまたは第１のメンバーおよび第２のメンバーからなる相互作用パートナーであり、第１のメンバーは、核酸によって構成されまたはそれに付加され、第２のメンバーは、表面に付加され、または表面によって構成される。多数の部分に分かれた相互作用パートナーは、ビオチンおよびアビジン、ビオチンおよびストレプトアビジン、ならびにビオチンおよびニュートラアビジンを含む、相互作用パートナー対の群から好ましくは選択される。好ましくは、相互作用パートナー対の第１のメンバーは、ビオチンである。
【０２３３】
そのような方法の好ましい結果は、ＭＣＰ−１と核酸との固定された複合体の形成であり、より好ましくは、上述の複合体は検出される。複合体から、ＭＣＰ−１が検出されるのは一実施形態の範囲内である。
【０２３４】
この必要性に従うそれぞれの検出手段は、たとえば、ＭＣＰ−１の（１つまたは複数の）部分に特異的である、任意の検出手段である。とりわけ好ましい検出手段は、核酸、ポリペプチド、タンパク質、および抗体を含む群から選択される検出手段であり、これらの生成は当業者らに知られている。
【０２３５】
ＭＣＰ−１の検出のための方法はまた、試料が、ステップｃ）を実行するために好ましくは使用された反応容器から取り出されることをも含む。
【０２３６】
方法はまた、さらなる実施形態において、表面上、好ましくは上記に規定される表面上にＭＣＰ−１の相互作用パートナーを固定するステップをも含み、相互作用パートナーは、本明細書において、好ましくは、それぞれの方法に関連して上記のように規定され、より好ましくは、それらの様々な実施形態において核酸、ポリペプチド、タンパク質、および抗体を含む。この実施形態において、とりわけ好ましい検出手段は、本発明による核酸であり、そのような核酸は、好ましくは標識されていてもよいまたは非標識であってもよい。そのような核酸が標識されている場合には、それは、直接的にまたは間接的に検出することができる。そのような検出はまた、好ましくは、同様に、核酸、ポリペプチド、タンパク質、および本明細書において記載される様々な実施形態における実施形態を含む群から選択される第２の検出手段の使用を伴っていてもよい。そのような検出手段は、好ましくは、本発明による核酸に対して特異的である。より好ましい実施形態において、第２の検出手段は、分子ビーコンである。核酸または第２の検出手段またはその両方は、好ましい実施形態において検出標識を含んでいてもよい。検出標識は、ビオチン、ブロモデオキシウリジン標識、ジゴキシゲニン標識、蛍光標識、ＵＶ標識、放射性標識、およびキレーター分子を含む群から好ましくは選択される。あるいは、第２の検出手段は、核酸によって好ましくは含有され、構成され、またはそれに付加される検出標識と相互作用する。とりわけ好ましい組み合わせは、以下の通りである。
検出標識はビオチンであり、第２の検出手段はビオチンに対する抗体であり、または
検出標識はビオチンであり、第２の検出手段はアビジンもしくはアビジン運搬分子であり、または
検出標識はビオチンであり、第２の検出手段はストレプトアビジンもしくはストレプトアビジン運搬分子であり、または
検出標識はビオチンであり、第２の検出手段はニュートラアビジンもしくはニュートラアビジン運搬分子であり、または
検出標識はブロモ−デオキシウリジンであり、第２の検出手段はブロモデオキシウリジンに対する抗体であり、または
検出標識はジゴキシゲニンであり、第２の検出手段はジゴキシゲニンに対する抗体であり、または
検出標識はキレーターであり、第２の検出手段は放射性核種であり、上述の検出標識は核酸に付加されることが好ましい。この種の組み合わせは、核酸が表面に付加されている実施形態に適用可能であることも認められるであろう。そのような実施形態において、検出標識が相互作用パートナーに付加されていることは好ましい。
【０２３７】
最後に、第２の検出手段が第３の検出手段を使用して検出され、好ましくは、第３の検出手段は酵素である、より好ましくは、第２の検出手段の検出に際して酵素反応を示し、または第３の検出手段は、放射線、より好ましくは、放射性核種によって放射される放射線を検出するための手段であることもまた本発明の範囲内である。好ましくは、第３の検出手段は、特異的に、第２の検出手段を検出し、および／またはそれと相互作用する。
【０２３８】
さらに、この実施形態において、表面上に固定されているＭＣＰ−１の相互作用パートナー、および本発明による核酸は、相互作用パートナーとＭＣＰ−１との間で形成される複合体に好ましくは追加され、試料は、反応から、より好ましくはステップｃ）および／またはｄ）が実行される反応容器から取り出すことができる。
【０２３９】
一実施形態において、本発明による核酸は、蛍光部分を含み、蛍光部分の蛍光は、核酸と、ＭＣＰ−１および遊離ＭＣＰ−１との間の複合体形成に際して異なるものとなる。
【０２４０】
さらなる実施形態において、核酸は、本発明による核酸の誘導体であり、核酸の誘導体は、アデノシンに取って代わる、アデノシンの少なくとも１つの蛍光誘導体を含む。好ましい実施形態において、アデノシンの蛍光誘導体は、エテノアデノシンである。
【０２４１】
さらなる実施形態において、本発明による核酸の誘導体とＭＣＰ−１とからなる複合体は、蛍光を使用して検出される。
【０２４２】
方法の一実施形態において、シグナルはステップ（ｃ）またはステップ（ｄ）において生成され、好ましくは、シグナルは試料中のＭＣＰ−１の濃度と関連する。
【０２４３】
好ましい態様において、分析は９６ウェルプレートにおいて実行されてもよく、成分は上記に記載されるように反応容器において固定され、ウェルは反応容器として働く。
【０２４４】
少なくとも、本発明による核酸がまた、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、および／またはエオタキシンに対して結合、またはそれらと結合する限り、上記に述べたことがまた、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、および／またはエオタキシンにも適用されることは、当業者らによって認められるであろう。
【０２４５】
本明細書において開示される、試料中のＭＣＰ−１の検出のための方法はまた、本明細書においてより詳細に記載される慢性疾患および慢性障害などのような疾患の診断のための方法として適用されてもよいことは、本発明の範囲内である。
【０２４６】
本発明の核酸は、さらに、薬剤設計のための出発物質として使用されてもよい。基本的に、２つの可能なアプローチがある。１つのアプローチは、化合物ライブラリーのスクリーニングであるが、そのような化合物ライブラリーは、好ましくは、低分子量化合物ライブラリーである。一実施形態において、スクリーニングは、ハイスループットスクリーニングである。好ましくは、ハイスループットスクリーニングは、標的ベースのアッセイにおける化合物の速く、効率的で、試験的な評価である。最も好都合な場合において、分析は、比色定量測定によって実行される。それと関連して使用されるライブラリーは、当業者に知られている。
【０２４７】
あるいは、本発明による核酸は、合理的薬剤設計に使用されてもよい。好ましくは、合理的薬剤設計は、医薬のリード構造の設計である。典型的には、Ｘ線結晶学または核磁気共鳴分光法などのような方法によって同定される標的の３次元構造から始めて、コンピュータープログラムは、多くの異なる化学物質の構造を含有するデータベースを検索するために使用される。選択は、コンピューターによって行われ、同定された化合物は、続いて、実験室において試験することができる。
【０２４８】
合理的薬剤設計は、本発明による核酸のいずれかから始めてもよく、構造、好ましくは３次元構造を伴い、これは、本発明の核酸の構造に類似しているか、本発明の核酸の構造の結合媒介部分と同一である。いずれの場合においても、そのような構造はなお、本発明の核酸と同じまたは類似している結合性の特徴を示す。合理的薬剤設計におけるさらなるステップにおいてまたは代替のステップとして、好ましくは、神経伝達物質に結合する核酸の部分の３次元構造は、ヌクレオチドおよび核酸とは異なる化学基によって模倣される。この模倣によって、核酸とは異なる化合物を設計することができる。そのような化合物は、好ましくは、小さな分子またはペプチドである。
【０２４９】
当業者に知られている競合アッセイを使用することによるなどの、化合物ライブラリーのスクリーニングの場合には、適切なＭＣＰ−１アナログ、ＭＣＰ−１アゴニスト、またはＭＣＰ−１アンタゴニストを見出すこともできる。そのような競合アッセイは、以下のように設定されてもよい。本発明の核酸、好ましくは標的結合Ｌ−核酸であるスピーゲルマーは、固相につながれる。ＭＣＰ−１アナログを同定するために、標識ＭＣＰ−１は、アッセイに追加されてもよい。潜在的なアナログは、スピーゲルマーと結合するＭＣＰ−１分子と競合し、またこれは、それぞれの標識によって得られるシグナルにおける減少に付随するであろう。アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングは、当業者らに知られている細胞培養アッセイの使用を伴っていてもよい。
【０２５０】
本発明によるキットは、少なくとも１つまたはいくつかの発明に関する核酸を含んでいてもよい。さらに、キットは、少なくとも１つまたはいくつかのポジティブコントロールまたはネガティブコントロールを含んでいてもよい。ポジティブコントロールは、たとえばＭＣＰ−１であってもよく、とりわけ、本発明の核酸が選択され、または好ましくは液体の形態において本発明の核酸が結合するものであってもよい。ネガティブコントロールは、たとえば、ＭＣＰ−１に類似している生物物理的な特性に関して規定されるが、本発明の核酸によって認識されないペプチドであってもよい。さらに、上述のキットは、１つまたはいくつかのバッファーを含んでいてもよい。様々な成分は、乾燥形態もしくは凍結乾燥形態または液体中に溶解された形態でキット中に含有されていてもよい。キットは、キットの１つまたはいくつかの成分を同様に含有していてもよい１つまたはいくつかの容器を含んでいてもよい。さらなる実施形態において、キットは、キットおよびその様々な成分を使用する方法について使用者に情報を提供する説明書または説明書のパンフレットを含む。この種のキットがまた、特に、本明細書において記載される慢性疾患および慢性障害の診断および検出に適していることは理解されるであろう。
【０２５１】
本発明による核酸の医薬および生物分析測定は、基本的に、ヒトおよび非ヒトの体内のいくつかの体液、組織、および器官におけるその薬物動態学的および生体力学的プロファイルの評価用のものである。そのような目的のために、本明細書において開示され、当業者に知られている検出方法のいずれも使用されてもよい。本発明のさらなる態様において、本発明による核酸の検出のためのサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイが、提供される。検出アッセイ内で、捕捉プローブおよび検出プローブが使用される。捕捉プローブは本発明による核酸の第１の部分に相補的であり、検出プローブは、第２の部分に相補的である。捕捉プローブおよび検出プローブは共に、ＤＮＡヌクレオチド、修飾ＤＮＡヌクレオチド、修飾ＲＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチド、および／またはＰＮＡヌクレオチドによって形成することができる。
【０２５２】
したがって、捕捉プローブは、本発明による核酸の５’末端に相補的な配列ストレッチを含み、検出プローブは、本発明による核酸の３’末端に相補的な配列ストレッチを含む。この場合には、捕捉プローブは、その５’末端を介して表面またはマトリックスに固定され、捕捉プローブは、その５’末端で直接的に、またはその５’末端と表面もしくはマトリックスとの間のリンカーを介して固定することができる。しかしながら、原理的に、リンカーは、捕捉プローブの各ヌクレオチドに連結することができる。リンカーは、当技術分野における親水性リンカーによってまたはＤ−ＤＮＡヌクレオチド、修飾Ｄ−ＤＮＡヌクレオチド、Ｄ−ＲＮＡヌクレオチド、修飾Ｄ−ＲＮＡヌクレオチド、Ｄ−ＬＮＡヌクレオチド、ＰＮＡヌクレオチド、Ｌ−ＲＮＡヌクレオチド、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチド、修飾Ｌ−ＲＮＡヌクレオチド、修飾Ｌ−ＤＮＡヌクレオチド、および／またはＬ−ＬＮＡヌクレオチドによって形成することができる。
【０２５３】
あるいは、捕捉プローブは、本発明による核酸の３’末端に相補的な配列ストレッチを含み、検出プローブは、本発明による核酸の５’末端に相補的な配列ストレッチを含む。この場合には、捕捉プローブは、その３’末端を介して表面またはマトリックスに固定され、捕捉プローブは、その３’末端で直接的にまたはその３’末端および表面もしくはマトリックスの間のリンカーを介して固定することができる。しかしながら、原理的に、リンカーは、本発明による核酸に相補的である配列ストレッチの各ヌクレオチドに連結することができる。リンカーは、当技術分野における親水性リンカーによってまたはＤ−ＤＮＡヌクレオチド、修飾Ｄ−ＤＮＡヌクレオチド、Ｄ−ＲＮＡヌクレオチド、修飾Ｄ−ＲＮＡヌクレオチド、Ｄ−ＬＮＡヌクレオチド、ＰＮＡヌクレオチド、Ｌ−ＲＮＡヌクレオチド、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチド、修飾Ｌ−ＲＮＡヌクレオチド、修飾Ｌ−ＤＮＡヌクレオチド、および／またはＬ−ＬＮＡヌクレオチドによって形成することができる。
【０２５４】
本発明による核酸にハイブリダイズしてもよい捕捉プローブおよび検出プローブのヌクレオチドの数は変更可能であり、捕捉プローブおよび／もしくは検出プローブならびに／または本発明による核酸自体のヌクレオチドの数に依存し得る。本発明による核酸にハイブリダイズしてもよい捕捉プローブおよび検出プローブのヌクレオチドの総数は、本発明による核酸によって含まれるヌクレオチドの数が最大となるはずである。最小の数（２〜１０ヌクレオチド）の検出プローブおよび捕捉プローブのヌクレオチドは、本発明による核酸の５’末端または３’末端へのハイブリダイゼーションをそれぞれ可能にするはずである。本発明による核酸と、分析される試料中に生じる他の核酸との間で高度な特異性および選択性を達成するためには、捕捉プローブおよび検出プローブのヌクレオチドの総数は、本発明による核酸によって含まれるヌクレオチドの数とするべきであり、またはその数が最大となるべきである。
【０２５５】
さらに、検出プローブは、先に本明細書において記載されるように検出することができるマーカー分子または標識を好ましくは持つ。標識またはマーカー分子は、原理的に、検出プローブの各ヌクレオチドに連結することができる。好ましくは、標識またはマーカーは、検出プローブの５’末端または３’末端に位置し、本発明による核酸に相補的な検出プローブ内のヌクレオチドと、標識との間に、リンカーを挿入することができる。リンカーは、当技術分野における親水性リンカーによって、またはＤ−ＤＮＡヌクレオチド、修飾Ｄ−ＤＮＡヌクレオチド、Ｄ−ＲＮＡヌクレオチド、修飾Ｄ−ＲＮＡヌクレオチド、Ｄ−ＬＮＡヌクレオチド、ＰＮＡヌクレオチド、Ｌ−ＲＮＡヌクレオチド、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチド、修飾Ｌ−ＲＮＡヌクレオチド、修飾Ｌ−ＤＮＡヌクレオチド、および／またはＬ−ＬＮＡヌクレオチドによって形成することができる。
【０２５６】
本発明による核酸の検出は、以下のように実行することができる。
本発明による核酸は、捕捉プローブにその一端で、検出プローブに他端でハイブリダイズする。その後、非結合検出プローブは、たとえば１回または数回の洗浄ステップによって除去される。好ましくは標識またはマーカー分子を有する結合した検出プローブの量は、続いて、たとえば、引用することにより本明細書の一部をなすものとするＷＯ／２００８／０５２７７４においてより詳細に概説されるように測定することができる。
【０２５７】
好ましくは本明細書において使用されるように、治療という用語は、好ましい実施形態において、さらにまたはあるいは、予防および／または追跡調査を含む。
【０２５８】
好ましくは本明細書において使用されるように、疾患および障害という用語は、それと反対の趣旨に示されない限り、区別なく使用されるものとする。
【０２５９】
本明細書において使用されるように、含むという用語は、好ましくは、そのような用語によって理解または説明される事項を限定するように意図されない。しかしながら、代替の実施形態において、含むという用語は、含有するという意味で、したがって、そのような用語によって理解または説明される事項を限定するものとして理解されるものとする。
【０２６０】
様々な配列番号、本発明による核酸分子および本明細書において使用される標的分子ＭＣＰ−１の化学的性質、その実際の配列、ならびに内部参照番号は、以下の表に要約される。
【０２６１】
【表１Ａ】
0005777341.tif 000002
【表１Ｂ】
0005777341.tif 000003
【表１Ｃ】
0005777341.tif 000004
【表１Ｄ】
0005777341.tif 000005
【表１Ｅ】
0005777341.tif 000006
【表１Ｆ】
0005777341.tif 000007
【表１Ｇ】
0005777341.tif 000008
【表１Ｈ】
0005777341.tif 000009
【表１Ｉ】
0005777341.tif 000010
【表１Ｊ】
0005777341.tif 000011
【表１Ｋ】
0005777341.tif 000012
【表１Ｌ】
0005777341.tif 000013
【表１Ｍ】
0005777341.tif 000014
【表１Ｎ】
0005777341.tif 000015
【表１Ｏ】
0005777341.tif 000016
【表１Ｐ】
0005777341.tif 000017
【表１Ｑ】
0005777341.tif 000018
【表１Ｒ】
0005777341.tif 000019
【表１Ｓ】
0005777341.tif 000020
【表１Ｔ】
0005777341.tif 000021
【０２６２】
本発明を、図面、実施例および配列表によってさらに説明し、これらによりさらなる特徴、実施形態および利点が理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２６３】
【図１】好ましい実施形態においてヒトＭＣＰ−１への結合にその全体が不可欠である配列モチーフ（「１Ａ型」）を示すヒトＭＣＰ−１に結合する関連ＲＮＡリガンドの配列のアラインメントを示す図である。
【図２】好ましい実施形態においてヒトＭＣＰ−１およびＲＮＡリガンド１８０−Ｄ１−００２誘導体への結合にその全体が不可欠である配列モチーフ（「１Ｂ型」）を示すヒトＭＣＰ−１に結合する関連ＲＮＡリガンドの配列のアラインメントを示す図である。
【図３】好ましい実施形態においてヒトＭＣＰ−１への結合にその全体が不可欠である配列モチーフ（「２型」）を示すヒトＭＣＰ−１に結合する関連ＲＮＡリガンドの配列のアラインメントを示す図である。
【図４】好ましい実施形態においてヒトＭＣＰ−１への結合にその全体が不可欠である配列モチーフ（「３型」）を示すヒトＭＣＰ−１に結合する関連ＲＮＡリガンドの配列のアラインメントを示す図である。
【図５】ＲＮＡリガンド１７８−Ｄ５および１８１−Ａ２（配列モチーフ「３型」のヒトＭＣＰ−１ＲＮＡリガンド）の誘導体を示す図である。
【図６】好ましい実施形態においてヒトＭＣＰ−１（他の配列）への結合にその全体が不可欠である配列モチーフ（「４型」）を示すヒトＭＣＰ−１に結合する関連ＲＮＡリガンドの配列のアラインメントを示す図である。
【図７】ＭＣＰ−１結合配列モチーフ「１Ａ型」、「１Ｂ型」、「２型」、「３型」または「４型」に関連し得ないヒトＭＣＰ−１に結合するいくつかの異なるＲＮＡリガンドの配列表を示す図である。
【図８】マウスＭＣＰ−１に結合するＲＮＡリガンド１８８−Ａ３−００１および１８９−Ｇ７−００１の誘導体のアラインメントを示す図である。
【図９】ビオチニル化ヒトＤ−ＭＣＰ−１の濃度に対するアプタマーの結合として表される、室温および３７℃でのビオチニル化ヒトＤ−ＭＣＰ−１へのアプタマーＤ−ＮＯＸ−Ｅ３６の結合分析の結果を示す図である。
【図１０】ビオチニル化マウスＤ−ＭＣＰ−１の濃度に対するアプタマーの結合として表される、３７℃でのビオチニル化マウスＤ−ＭＣＰ−１へのアプタマーＤ−ｍＮＯＸ−Ｅ３６の結合分析の結果を示す図である。
【図１１】ＴＨＰ−１細胞におけるＭＣＰ−１誘発性のＣａ＋＋放出を示す図であり、ヒトＭＣＰ−１の濃度に対するブランクとの蛍光の差として表され、およそ３ｎＭの半有効濃度（ＥＣ５０）を示すヒトＭＣＰ−１の用量反応曲線が得られた。
【図１２】様々な量のスピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６と３７℃でプレインキュベートした３ｎＭのヒトＭＣＰ−１で細胞を刺激したカルシウム放出アッセイでの、ＮＯＸ−Ｅ３６の濃度に対する対照の割合として表される、スピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６の有効性を示す図である。
【図１３】様々な量のスピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６と３７℃でプレインキュベートした５ｎＭマウスＭＣＰ−１で細胞を刺激したカルシウム放出アッセイでの、ｍＮＯＸ−Ｅ３６の濃度に対する対照の割合として表される、スピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６の有効性を示す図である。
【図１４】ヒトＭＣＰ−１の濃度に対する対照と比較してＸ倍の増加として表される、ＴＨＰ−１細胞のヒトＭＣＰ−１誘発性の走化性を示す図であり、様々なＭＣＰ−１濃度に対するＴＨＰ−１細胞の３時間の移動後にＭＣＰ−１の用量反応曲線が得られた。
【図１５】様々な量のスピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６と３７℃でプレインキュベートした０．５ｎＭヒトＭＣＰ−１に対して細胞を移動させた走化性アッセイにおける、スピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６の濃度に対する対照の割合として表される、スピーゲルマー  ＮＯＸ−Ｅ３６の有効性を示す図である。
【図１６】様々な量のスピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６と３７℃でプレインキュベートした０．５ｎＭマウスＭＣＰ−１に対して細胞を移動させた走化性アッセイにおける、スピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６の濃度に対する対照の割合として表される、スピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６の有効性を示す図である。
【図１７】アミンカップリング手順によってＰｉｏｎｅｅｒＦ１センサーチップ上に固定されたヒトＭＣＰ−１へのスピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６の結合のＫＤ値を示す、時間に対する応答（ＲＵ）として表される、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００センサーグラムを示す図である。
【図１８】アミンカップリング手順によってそれぞれＰｉｏｎｅｅｒＦ１およびＣＭ４センサーチップ上に固定されたヒトＭＣＰファミリータンパク質（ｈｕＭＣＰ−１、ｈｕＭＣＰ−２、ｈｕＭＣＰ−３）およびヒトエオタキシンへのスピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６の結合を示す、時間に対する応答（ＲＵ）として表される、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００センサーグラムを示す図である。
【図１９】異なる形態のＭＣＰ−１はアミンカップリング手順によってＰｉｏｎｅｅｒＦ１およびＣＭ４センサーチップ上に固定された、異なる種由来のＭＣＰ−１（イヌＭＣＰ−１、サルＭＣＰ−１、ヒトＭＣＰ−１、ブタＭＣＰ−１、ウサギＭＣＰ−１、マウスＭＣＰ−１、ラットＭＣＰ−１）へのスピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６の結合を示す、時間に対する応答（ＲＵ）として表される、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００センサーグラムを示す図である。
【図２０】アミンカップリング手順によってＣＭ４センサーチップ上に固定されたヒトＭＣＰ−１へのスピーゲルマー１８１−Ａ２−０１８の結合のＫＤ値を示す、時間に対する応答（ＲＵ）として表される、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００センサーグラムを示す図である。
【図２１】アミンカップリング手順によってそれぞれＰｉｏｎｅｅｒＦ１およびＣＭ４センサーチップ上に固定されたヒトＭＣＰファミリータンパク質（ｈｕＭＣＰ−１、ｈｕＭＣＰ−２、ｈｕＭＣＰ−３）およびヒトエオタキシンへのスピーゲルマー１８１−Ａ２−０１８の結合を示す、時間に対する応答（ＲＵ）として表される、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００センサーグラムを示す図である。
【図２２】異なる形態のＭＣＰ−１はアミンカップリング手順によってそれぞれＰｉｏｎｅｅｒＦ１およびＣＭ４センサーチップ上に固定された、異なる種由来のＭＣＰ−１（イヌＭＣＰ−１、サルＭＣＰ−１、ヒトＭＣＰ−１、ブタＭＣＰ−１、ウサギＭＣＰ−１、マウスＭＣＰ−１、ラットＭＣＰ−１）へのスピーゲルマー１８１−Ａ２−０１８の結合を示す、時間に対する応答（ＲＵ）として表される、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００センサーグラムを示す図である。
【図２３】異なる哺乳動物種由来のＭＣＰ−１ならびにヒトＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３およびエオタキシン（１〜７６位のみ）のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメントを示す図である。
【図２４Ａ】異なる哺乳動物種由来のＭＣＰ−１ならびにヒトＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３およびエオタキシンに関するＮＯＸ−Ｅ３６および１８１−Ａ２−０１８の結合特異性の要約を示す表である。
【図２４Ｂ】ビオチン化ＮＯＸ−Ｅ３６をセンサーチップ表面上に固定し、様々なＣＣおよびＣＸＣケモカインのパネルのＮＯＸ−Ｅ３６への結合を分析したＢｉａｃｏｒｅ分析により決定された、ＮＯＸ−Ｅ３６の選択性をまとめた表である。
【図２４Ｃ】ケモカインをＣＭ５センサーチップ表面上に共有結合によって固定し、様々な濃度のＮＯＸ−Ｅ３６を注入して、ＮＯＸ−Ｅ３６の結合挙動をＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して解析したＢｉａｃｏｒｅ分析により決定されたケモカインと相互作用するＮＯＸ−Ｅ３６の動態解析を示す表である。
【図２４Ｄ】約０．２ｎＭの半有効濃度を有するＭＩＰ−１αによるＴＨＰ−１細胞刺激の走化性用量反応曲線を示す図である。
【図２４Ｅ】ＮＯＸ−Ｅ３６によるＭＩＰ−１α誘発性走化性の阻害を示す図である。ＮＯＸ−Ｅ３６は、ＴＨＰ−１細胞のＭＩＰ１ａ誘発性走化性に対して影響を及ぼさなかった。
【図２５】様々な量のスピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧと３７℃でプレインキュベートした３ｎＭヒトＭＣＰ−１で細胞を刺激したカルシウム放出アッセイでの、スピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧの濃度に対する対照の割合として表される、スピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧの有効性を示す図である。
【図２６】様々な量のスピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧと３７℃でプレインキュベートした０．５ｎＭヒトＭＣＰ−１に対して細胞を移動させた走化性アッセイでの、ＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧの濃度に対する対照の割合として表される、スピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧの有効性を示す図である。
【図２７Ａ】様々な量のスピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６−５’−ＰＥＧと３７℃でプレインキュベートした３ｎＭヒトＭＣＰ−１で細胞を刺激したカルシウム放出アッセイでの、スピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６−５’−ＰＥＧの濃度に対する対照の割合として表される、スピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６−５’−ＰＥＧの有効性を示す図である。
【図２７Ｂ】様々な量のスピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６−５’−ＰＥＧと３７℃でプレインキュベートした０．５ｎＭヒトＭＣＰ−１に対して細胞を移動させた走化性アッセイでの、スピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６−５’−ＰＥＧの濃度に対する対照の割合として表される、スピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６−５’−ＰＥＧの有効性を示す図である。
【図２８】マウスＭＣＰ−１の濃度に対する、ブランクとの蛍光の差として表される、ＴＨＰ−１細胞におけるマウスＭＣＰ−１誘発性のＣａ＋＋放出を示す図であり、およそ５ｎＭの半有効濃度（ＥＣ５０）を示すマウスＭＣＰ−１の用量反応曲線が得られた。
【図２９】様々な量のスピーゲルマー  ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧと３７℃でプレインキュベートした３ｎＭマウスＭＣＰ−１で細胞を刺激したカルシウム放出アッセイにおける、スピーゲルマー  ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧの濃度に対する対照の割合として表される、抗マウスＭＣＰ−１スピーゲルマー  ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧの有効性を示す図である。
【図３０】マウスＭＣＰ−１の濃度に対する対照と比較したＸ倍の増加として表される、ＴＨＰ−１細胞のマウスＭＣＰ−１誘発性の走化性を示す図であり、様々なｍＭＣＰ−１濃度に対するＴＨＰ−１細胞の３時間の移動後にｍＭＣＰ−１の用量反応曲線が得られた。
【図３１】様々な量のスピーゲルマー  ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧと３７℃でプレインキュベートした０．５ｎＭマウスＭＣＰ−１に対して細胞を移動させた走化性アッセイにおける、抗マウススピーゲルマー  ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧの濃度に対する対照の割合として表される、抗マウスＭＣＰ−１スピーゲルマー  ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧの有効性を示す図である。
【図３２】時間に対する応答（ＲＵ）として表される、アミンカップリング手順によってＰｉｏｎｅｅｒＦ１センサーチップ上に固定されたマウスＤ−ＭＣＰ−１へのアプタマーＤ−ｍＮＯＸ−Ｅ３６の結合のＫＤ値を示すＢｉａｃｏｒｅ  ２０００センサーグラムを示す図である。
【図３３】２つの異なる形態のＤ−ＭＣＰ−１がアミンカップリング手順によってそれぞれＰｉｏｎｅｅｒＦ１およびＣＭ４センサーチップ上に固定されたヒトＤ−ＭＣＰ−１およびマウスＤ−ＭＣＰ−１へのアプタマーＤ−ｍＮＯＸ−Ｅ３６の結合を示す、時間に対する応答（ＲＵ）として表される、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００センサーグラムを示す図である。
【図３４】示される通り過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）、Ｍａｃ−２（マクロファージ）およびＣＤ３（Ｔ細胞）に対する抗体で染色した、２４週齢ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスの腎切片を示す写真であり、画像は各群の７〜１２匹のマウスの代表である（原倍率  ＰＡＳ：×１００、ＰＡＳ挿入図：×４００、Ｍａｃ２：×４００、ＣＤ３：×１００。
【図３５】２４週齢ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスの異なる群における腎機能パラメータおよび組織学的所見を示す表である。
【図３６】全ての群のマウスの銀染色切片で実施した形態計測による組織学的変化の定量を示す図である。Ａ、間質容積指標、Ｂ、尿細管拡張指標、およびＣ、尿細管細胞損傷指標は高倍率視野の割合として計算し、平均±ＳＥＭとして表す。
【図３７】Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析により計算される、様々な処理群のＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスの生存率を示す図である。
【図３８】各群のマウスのＲＮＡレベルがそれぞれの１８Ｓ  ｒＲＮＡ発現によって表わされる、各群５匹のマウスからプールした全腎ＲＮＡを使用するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定される、ＣＣケモカインＣＣＬ２およびＣＣＬ５の腎臓ｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図３９】ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧを用いた処理による肺病変の減少を示す図である。肺組織は２４週齢の全ての群から調製し、半定量的に評価した。ｍＮＯＸ−Ｅ３６およびｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧを用いた処理は、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおいて細気管支周囲の炎症を抑制した。画像は各群の７〜１１匹のマウスの代表である。原倍率×１００。
【図４０】抗ｍＣＣＬ２スピーゲルマー処理したマウス（右のマウス）ではあまり見られなかった、顔もしくは頸部領域で典型的に発生する、２４週齢ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスの皮膚ループスの徴候（左のマウス）を示す写真である。
【図４１】２４週齢のＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおける血清および組織学的所見を示す表である。
【図４２】時間の関数としてのスピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６の血漿濃度として示される、試験中の血漿におけるＰＥＧ化および非ＰＥＧ化抗ｍＣＣＬ２スピーゲルマーの薬物動態を示す図である。
【図４３】２４週齢のビヒクルまたはｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ処理したＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおける骨髄および末梢血のＣＣＲ２についてのフローサイトメトリーを示す図である。データは、各群５匹のマウスの骨髄または末梢血いずれかにおけるＣＣＲ２陽性細胞の平均割合±ＳＥＭとして示す。
【図４４】図示した異なる時点でＥＬＩＳＡにより測定したＰｏＣ−ＰＥＧ（白色のバー）およびｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ（ｍＮＯＸ−Ｅ３６−Ｐ）（黒色のバー）で処理した１Ｋ  ｄｂ／ｄｂマウスにおける血清ＣＣＬ２濃度を示す図である。データは、平均±ＳＥＭである。＊、ＰｏＣ−ＰＥＧに対するｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ（ｍＮＯＸ−Ｅ３６−Ｐ）についてｐ＜０．０５。
【図４５】未処理またはＰＯＣ−ＰＥＧもしくはｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ処理したｄｂ／ｄｂマウスの糸球体および間質におけるＭａｃ−２およびＫｉ−６７陽性細胞の浸潤した数を示す表である。
【図４６】６カ月齢のｄｂ／ｄｂマウスにおける糖尿病性糸球体硬化を示す図である。異なる群のマウスの腎切片を過ヨウ素酸シッフで染色し、各腎切片の１５個の糸球体に、糸球体硬化の程度に関してスコアリングした。画像は、図示したそれぞれのスコアに等級付けされた代表的な糸球体を示す。原倍率４００×。グラフは、各群における全てのマウス（ｎ＝７〜１０）の各スコアの平均割合±ＳＥＭを示す。＊、ＰｏＣ−ＰＥＧ（ＰｏＣ−Ｐ）処理した１Ｋ  ｄｂ／ｄｂマウスに対するｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ（ｍＮＯＸ−Ｅ３６−Ｐ）についてｐ＜０．０５。
【図４７】６カ月齢のｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ（ｍＮＯＸ−Ｅ３６−Ｐ）およびＰｏＣ−ＰＥＧ（ＰｏＣ−Ｐ）で処理した１Ｋ  ｄｂ／ｄｂマウスにおける糸球体濾過速度（ＧＦＲ）を示す図である。ＧＦＲは、試験終了時に、ＰｏＣ−ＰＥＧおよびｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧで処理した１Ｋ  ｄｂ／ｄｂマウスの群におけるＦＩＴＣ−イヌリンのクリアランス動態により決定した。
【図４８】６カ月齢のｄｂ／ｄｂマウスの尿細管萎縮および間質容積を示す図である。銀染色した腎切片の画像は、それぞれの群の代表的な腎を示す（原倍率１００×）。値は、各群の７〜１０匹のマウスのそれぞれの形態計測分析指標の平均±ＳＥＭを表す。＊、ＢＫＳ野生型マウスに対する２Ｋ  ｄｂ／ｄｂについてｐ＜０．０５、＃、２Ｋ  ｄｂ／ｄｂマウスに対する１Ｋについてｐ＜０．０５、†、ＰｏＣ−ＰＥＧ処理した１Ｋ  ｄｂ／ｄｂマウスに対するｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ（ｍＮＯＸ−Ｅ３６−ＰＥＧ）についてｐ＜０．０５。
【図４９】各群の６〜１０匹のマウスからプールした全腎ＲＮＡを使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定された腎ＣＣＬ２のｍＲＮＡ発現ｄｂ／ｄｂマウスを示す図である。マウスの各群のｍＲＮＡレベルは、それぞれの１８Ｓ  ｒＲＮＡ発現ごとに表わされる。
【図５０】免疫染色により測定された、ｄｂ／ｄｂマウスの腎における空間的ＣＣＬ２発現を示す写真である。画像は、図示されるそれぞれの群の６カ月齢マウスの腎の代表的な切片を示す（原倍率、２００×）。
【図５１Ａ−Ｅ】ビヒクル、ｒｅｖｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧ、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧ、ＣＹＣ低、ＣＹＣ高、ＣＹＣ低＋ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧまたはＭＭＦによるＭＲＬ  ｌｐｒ／ｌｐｒマウス処理後の、ＭＲＬ  ｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおけるループス腎炎のマーカーを示す図である。これにより、ＤＰＬＮの活動性指標（図５１Ａ）および慢性指標（図５１Ｂ）を、Ａｕｓｔｉｎら（Ａｕｓｔｉｎら１９８４）により記述されている通り、ＰＡＳ染色した腎切片に関して決定し、２４週齢のＭＲＬ  ｌｐｒ／ｌｐｒマウスの腎切片における平均糸球体マクロファージ数（切片当たり１５個の糸球体におけるＭａｃ２＋細胞）（図５１Ｃ）、それぞれ２４週齢のＭＲＬ  ｌｐｒ／ｌｐｒマウスの腎切片における間質マクロファージ数（図５１Ｄ、またはＴ細胞数（図５１Ｅ）（切片当たり１５の高倍率視野におけるＭａｃ２＋細胞またはＣＤ３＋細胞）を測定した。
【図５２】過ヨウ素酸シッフで染色した２４週齢のＭＲＬ  ｌｐｒ／ｌｐｒマウス肺切片の肺損傷の半定量的スコアリングを示す図である。
【図５３Ａ】ＬＰＳチャレンジ前にビヒクル（陽性対照）、デキサメタゾン、ロフルミラストまたはＭＣＰ−１結合スピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧで、または清浄空気チャレンジ前にビヒクルで（陰性対照）、動物を処理したＬＰＳチャレンジ（×１０６／動物、平均±ＳＥＭ、陽性対照群に対する＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）の２４時間後のＢＡＬ液中の全細胞数を示す図である。
【図５３Ｂ】ＬＰＳチャレンジ前にビヒクル（陽性対照）、デキサメタゾン、ロフルミラストまたはＭＣＰ−１結合スピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧで、または清浄空気チャレンジ前にビヒクルで（陰性対照）、動物を処理したＬＰＳチャレンジ（平均±ＳＥＭ、＊＊陽性対照群に対するｐ＜０．０１）の２４時間後のＢＡＬ液中の好中球の絶対数を示す図である。
【図５４Ａ】健常動物またはＭＣＴ／ビヒクルもしくはＭＣＴ／ＭＣＰ−１結合スピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧによる処理後の動物の右心肥大を示す図である。読み出しは、左室に中隔を加えた重量に対する右室重量ＲＶ／（ＬＶ＋Ｓ）であった。
【図５４Ｂ】健常動物またはＭＣＴ／ビヒクルもしくはＭＣＴ／ＭＣＰ−１結合スピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧによる処理後の動物の右室収縮期圧（ＲＳＶＰ［ｍｍＨｇ］）を示す図である。
【実施例】
【０２６４】
［実施例１：  ヒトＭＣＰ−１に結合する核酸］
ビオチニル化ヒトＤ−ＭＣＰ−１を標的として使用して、ヒトＭＣＰ−１に結合するいくつかの核酸を作製することができ、そのヌクレオチド配列が図１〜７に示されている。この核酸を、ビオチニル化ヒトＤ−ＭＣＰ−１による競合的または直接プルダウンアッセイ（実施例４）を使用して、アプタマー、すなわちＤ−核酸レベルに関して特徴づけ、または、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００装置を使用した表面プラズモン共鳴測定（実施例７）、インビトロ細胞培養Ｃａ＋＋放出アッセイ（実施例５）、もしくはインビトロ走化性アッセイ（実施例６）によりスピーゲルマーレベル、すなわち、ＭＣＰ−１の天然の立体配置（Ｌ−ＭＣＰ）を有するＬ−核酸に関して特徴付けた。
【０２６５】
このように作製した核酸分子は種々の配列モチーフを示し、４つの主な型を図１および２（１Ａ／１Ｂ型）、図３（２型）、図４および図５（３型）ならびに図６（４型）に定義する。互いにおよび本明細書に記載の種々の配列モチーフと関連し得ないさらなるＭＣＰ−１結合核酸を、図７に列挙する。ヌクレオチド配列モチーフの定義のために、曖昧なヌクレオチドに関してＩＵＰＡＣ略称を使用する。
Ｓ    強          ＧまたはＣ、
Ｗ    弱          ＡまたはＵ、
Ｒ    プリン      ＧまたはＡ、
Ｙ    ピリミジン  ＣまたはＵ、
Ｋ    ケト        ＧまたはＵ、
Ｍ    イミノ      ＡまたはＣ、
Ｂ    Ａでない    ＣまたはＵまたはＧ、
Ｄ    Ｃでない    ＡまたはＧまたはＵ、
Ｈ    Ｇでない    ＡまたはＣまたはＵ、
Ｖ    Ｕでない    ＡまたはＣまたはＧ、；
Ｎ    全て        ＡまたはＧまたはＣまたはＵ
【０２６６】
反対に示されない場合、任意の核酸配列またはストレッチおよびボックスの配列は、それぞれ５’→３’の方向で示す。
【０２６７】
［１Ａ型ＭＣＰ−１結合核酸（図１）］
図１に示すように、１Ａ型ＭＣＰ−１結合核酸の全ての配列は、いくつかの配列ストレッチまたはボックスを含み、
【化１】
0005777341.tif 000022
は、互いにハイブリダイズすることができる５’末端および３’末端ストレッチである。しかしながら、このようなハイブリダイゼーションは、生理的条件下で実際に存在する分子において必ずしも与えられるわけではない。
【化２】
0005777341.tif 000023
は、
【化３】
0005777341.tif 000024
に挟まれている。
【０２６８】
結合挙動に関して順位付けするために、核酸を、ビオチニル化ヒトＤ−ＭＣＰ−１による直接および競合的プルダウンアッセイを使用してアプタマーレベルに関して特徴付けた（実施例４）。選択された配列を、スピーゲルマーとして合成し（実施例３）、インビトロ細胞培養Ｃａ＋＋放出アッセイにおいてＭＣＰ−１の天然立体配置（Ｌ−ＭＣＰ）を使用して試験した（実施例５）。
【０２６９】
決められたボックスの配列は、ＭＣＰ−１への結合親和性に影響を及ぼす１Ａ型ＭＣＰ−１結合核酸の間で異なっていてもよい。１Ａ型ＭＣＰ−１結合核酸としてまとめた種々のＭＣＰ−１結合核酸の結合分析に基づいて、以下に記載の
【化４】
0005777341.tif 000025
ならびにこれらのヌクレオチド配列は、個々に、より好ましくはその全体が、ＭＣＰ−１への結合に不可欠である。
【化５】
0005777341.tif 000026
【０２７０】
図１に示すように、１７６−Ｅ１０ｔｒｃと称される核酸分子は、ＭＣＰ−１への最高の結合親和性を有し（アプタマーとしてプルアッセイにおいて５ｎＭのＫＤを有し、スピーゲルマーとしてインビトロ細胞培養Ｃａ＋＋放出アッセイにおいて４〜５ｎＭのＩＣ５０を有する）、したがって、最適配列ならびに配列要素
【化６】
0005777341.tif 000027
の最適な組み合わせを構成し得る。
【０２７１】
［１Ｂ型ＭＣＰ−１結合核酸（図２）］
図２に示すように、１Ｂ型の全ての配列は、いくつかの配列ストレッチまたはボックスを含み、
【化７】
0005777341.tif 000028
は、互いにハイブリダイズすることができる５’末端および３’末端ストレッチであり、
【化８】
0005777341.tif 000029
は、
【化９】
0005777341.tif 000030
に挟まれている。しかしながら、このようなハイブリダイゼーションは、生理的条件下で実際に存在する分子において必ずしも与えられるわけではない。
【０２７２】
結合挙動に関して順位付けするために、核酸を、ビオチニル化ヒトＤ−ＭＣＰ−１による直接および競合的プルダウンアッセイを使用してアプタマーレベルに関して特徴付けた（実施例４）。選択された配列を、スピーゲルマーとして合成し（実施例３）、インビトロ細胞培養Ｃａ＋＋放出アッセイにおいてＭＣＰ−１の天然立体配置（Ｌ−ＭＣＰ）を使用して試験した（実施例５）。
【０２７３】
決められたボックスの配列は、ＭＣＰ−１への結合親和性に影響を及ぼす１Ｂ型ＭＣＰ−１結合核酸の間で異なっていてもよい。１Ｂ型ＭＣＰ−１結合核酸としてまとめた種々のＭＣＰ−１結合核酸の結合分析に基づいて、以下に記載した
【化１０】
0005777341.tif 000031
ならびにこれらのヌクレオチド配列は、個々に、より好ましくはその全体が、ＭＣＰ−１への結合に不可欠である。
【化１１】
0005777341.tif 000032
【０２７４】
図２に示すように、１７６−Ｃ９ｔｒｃと称される核酸は、ＭＣＰ−１への最高の結合親和性を有し（アプタマーとしてプルダウンアッセイにおいて５ｎＭのＫＤを有し、ならびにスピーゲルマーとしてインビトロ細胞培養Ｃａ＋＋放出アッセイにおいて４〜５ｎＭのＩＣ５０を有する）、したがって、最適配列ならびに配列要素
【化１２】
0005777341.tif 000033
の最適な組み合わせを構成し得る。
【０２７５】
［２型ＭＣＰ−１結合核酸（図３）］
図３に示すように、２型の全ての配列は、いくつかの配列のストレッチまたはボックスを含み、
【化１３】
0005777341.tif 000034
は、互いにハイブリダイズすることができる５’末端および３’末端ストレッチであり、ボックスＢ２は、主要な配列要素である。しかしながら、このようなハイブリダイゼーションは、生理的条件下で実際に存在する分子において必ずしも与えられるわけではない。
【０２７６】
結合挙動に関して順位付けするために、核酸を、ビオチニル化ヒトＤ−ＭＣＰ−１による直接および競合的プルダウンアッセイを使用してアプタマーレベルに関して特徴付けた（実施例４）。選択された配列を、スピーゲルマーとして合成し（実施例３）、インビトロ細胞培養Ｃａ＋＋放出アッセイ（実施例５）またはインビトロ走化性アッセイ（実施例６）においてＭＣＰ−１の天然立体配置（Ｌ−ＭＣＰ）を使用して試験した。
【０２７７】
決められたボックスの配列は、ＭＣＰ−１への結合親和性に影響を及ぼす３型ＭＣＰ−１結合核酸の間で異なっていてもよい。２型ＭＣＰ−１結合核酸としてまとめた種々のＭＣＰ−１結合核酸の結合分析に基づいて、以下に記載した
【化１４】
0005777341.tif 000035
ならびにこれらのヌクレオチド配列は、個々に、より好ましくはその全体が、ＭＣＰ−１への結合に不可欠である。
【化１５】
0005777341.tif 000036
【０２７８】
図３に示すように、１８０−Ｄ１−００２と称される核酸ならびに１８０−Ｄ１−０１１、１８０−Ｄ１−０１２、１８０−Ｄ１−０３５、および１８０−Ｄ１−０３６（＝ＮＯＸ−Ｅ３６）のような１８０−Ｄ１−００２誘導体は、アプタマーとしてプルダウンアッセイまたは競合的プルダウンアッセイにおいてＫＤ＜１ｎＭの、ＭＣＰ−１への最高の結合親和性を有し、したがって最適配列および配列要素
【化１６】
0005777341.tif 000037
の最適の組み合わせを構成し得る。
【０２７９】
核酸分子Ｄ−ＮＯＸ−Ｅ３６（Ｄ−１８０−Ｄ１−０３６、配列番号１５９）について、室温（ＲＴ）で８９０±６５ｐＭ、および３７℃で１４６±１３ｐＭの解離定数（ＫＤ）を測定した（実施例４、図９）。それぞれのスピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６（１８０−Ｄ１−０３６、配列番号３７）は、インビトロＣａ＋＋放出アッセイ（実施例５、図１２）において３〜４ｎＭ、およびインビトロ走化性アッセイ（実施例６、図１５）において約０．５ｎＭの阻害濃度（ＩＣ５０）を示した。ＮＯＸ−Ｅ３６のＰＥＧ化誘導体、ＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧおよびＮＯＸ−Ｅ３６−５’ＰＥＧについて、Ｃａ＋＋放出アッセイ（実施例５、図２５および図２７Ａ）において約３ｎＭ、および走化性アッセイ（実施例６、図２６および図２７Ｂ）において１ｎＭ未満のＩＣ５０を測定した。
【０２８０】
［３型ＭＣＰ−１結合核酸（図４および５）］
図４および図５に示すように、３型の全ての配列は、３組のボックスが３型ＭＣＰ−１結合核酸に特徴的であるいくつかの配列のストレッチまたはボックスを含む。
【化１７】
0005777341.tif 000038
は共に、互いにハイブリダイズする能力を有する。しかしながら、このようなハイブリダイゼーションは、生理的条件下で実際に存在する分子において必ずしも与えられるわけではない。これらの潜在的にハイブリダイズした配列要素間に、
【化１８】
0005777341.tif 000039
と定義されるハイブリダイズしてないヌクレオチドが位置する。
【０２８１】
結合挙動に関して順位付けするために、核酸を、ビオチニル化ヒトＤ−ＭＣＰ−１による直接および競合的プルダウンアッセイを使用してアプタマーレベルに関して特徴付けた（実施例４）。選択された配列を、スピーゲルマーとして合成し（実施例３）、インビトロ走化性アッセイにおいて（実施例６）またはＢｉａｃｏｒｅ測定によって（実施例７）ＭＣＰ−１の天然立体配置（Ｌ−ＭＣＰ）を使用して試験した。
【０２８２】
決められたボックスの配列は、ＭＣＰ−１への結合親和性に影響を及ぼす３型ＭＣＰ−１結合核酸の間で異なっていてもよい。３型ＭＣＰ−１結合核酸としてまとめた種々のＭＣＰ−１結合核酸の結合分析に基づいて、以下に記載した
【化１９】
0005777341.tif 000040
およびこれらのヌクレオチド配列は、個々に、より好ましくはその全体が、ＭＣＰ−１への結合に不可欠である。
【化２０】
0005777341.tif 000041
【０２８３】
図４および５に示すように、１７８−Ｄ５と称される核酸およびその誘導体１７８−Ｄ５−０３０ならびに１８１−Ａ２と共にその誘導体１８１−Ａ２−００２、１８１−Ａ２−００４、１８１−Ａ２−００５、１８１−Ａ２−００６、１８１−Ａ２−００７、１８１−Ａ２−０１７、１８１−Ａ２−０１８、１８１−Ａ２−０１９、１８１−Ａ２−０２０、１８１−Ａ２−０２１、および１８１−Ａ２−０２３は、ＭＣＰ−１への最高の結合親和性を有する。１７８−Ｄ５および１７８−Ｄ５−０３０は、アプタマーとして直接または競合的プルダウンアッセイ（実施例４）において約５００ｐＭのＫＤを有すると評価された。同じ実験設定において、１８１−Ａ２は、約１００ｐＭのＫＤと測定された。Ｂｉａｃｏｒｅ分析（実施例７）によって、ＭＣＰ−１に対する１８１−Ａ２およびその誘導体のＫＤは、２００〜３００ｐＭであると測定された。培養細胞によるＣａ＋＋放出アッセイおよび走化性アッセイ（それぞれ、実施例５および６）において、１７８−Ｄ５および１８１−Ａ２の両方について、約５００ｐＭのＩＣ５０が測定された。したがって、１７８−Ｄ５ならびに１８１−Ａ２およびそれらの誘導体は、最適配列および配列要素
【化２１】
0005777341.tif 000042
の最適の組み合わせを構成し得る。
【０２８４】
［４型ＭＣＰ−１結合核酸（図６）］
図６に示すように、４型の全ての配列は、いくつかの配列、ストレッチまたはボックスを含み、
【化２２】
0005777341.tif 000043
は、互いにハイブリダイズすることができる５’末端および３’末端ストレッチであり、ボックスＢ２は、主要な配列要素である。
【０２８５】
結合挙動に関して順位付けするために、核酸を、ビオチニル化ヒトＤ−ＭＣＰ−１による直接プルダウンアッセイを使用してアプタマーレベルに関して特徴付けた（実施例４）。選択された配列を、スピーゲルマーとして合成し（実施例３）、インビトロ細胞培養Ｃａ＋＋放出アッセイ（実施例５）および／または走化性アッセイ（実施例６）においてＭＣＰ−１の天然立体配置（Ｌ−ＭＣＰ）を使用して試験した。
【０２８６】
決められたボックスの配列は、ＭＣＰ−１への結合親和性に影響を及ぼす４型ＭＣＰ−１結合核酸の間で異なっていてもよい。４型ＭＣＰ−１結合核酸としてまとめた種々のＭＣＰ−１結合核酸の結合分析に基づいて、以下に記載した
【化２３】
0005777341.tif 000044
ならびにこれらのヌクレオチド配列は、個々に、より好ましくはその全体が、ＭＣＰ−１への結合に不可欠である。
【化２４】
0005777341.tif 000045
【０２８７】
図６に示すように、１７４−Ｄ４−００４および１６６−Ａ４−００２と称される核酸は、ＭＣＰ−１への最高の結合親和性を有し（スピーゲルマーとしてインビトロ細胞培養Ｃａ＋＋放出アッセイにおいて２〜５ｎＭのＩＣ５０を有する）、したがって、最適配列ならびに配列要素
【化２５】
0005777341.tif 000046
の最適な組み合わせを構成し得る。
【０２８８】
さらに、１型〜４型ＭＣＰ−１結合核酸について示してきたヌクレオチド配列要素の組み合わせでは記述することができない２９個の別のＭＣＰ−１結合核酸が同定された。これらの配列を、図７に列挙する。
【０２８９】
図１〜７に示す任意の配列が、それらのトランケート型を含むだけでなく、それらの伸長型も含めて、しかしこのようにトランケートおよび伸長された核酸分子がそれぞれ依然として標的に結合することができるという条件のもとで、本発明による核酸であることが理解されるべきである。
【０２９０】
［実施例２：  マウスＭＣＰ−１に結合する核酸］
ビオチン化マウスＤ−ＭＣＰ−１を標的として使用して、それらに結合するいくつかの核酸分子を作製することができた。これらの核酸分子の配列分析の結果は、図８から得ることができる。
【０２９１】
結合挙動に関して順位付けするために、核酸を、ビオチニル化マウスＤ−ＭＣＰ−１を使用したプルダウンアッセイを使用してアプタマーレベルに関して特徴付けた（実施例４）。選択された配列を、スピーゲルマーとして合成し（実施例３）、インビトロ細胞培養Ｃａ＋＋放出アッセイ（実施例５）および走化性アッセイ（実施例６）においてＭＣＰ−１の天然立体配置（Ｌ−ＭＣＰ）を使用して試験した。
【０２９２】
図８に示すように、Ｄ−１８８−Ａ３−００１およびＤ−１８９−Ｇ７−００１ならびにそれらの誘導体は、プルダウンアッセイにおいてナノモル未満のＫＤでＤ−ＭＣＰ−１に結合する（図８）。
【０２９３】
Ｄ−ｍＮＯＸ−Ｅ３６（＝Ｄ−１８８−Ａ３−００７、配列番号２４４）について、３７℃で０．１〜０．２ｎＭの解離定数（ＫＤ）を決定した（実施例４、図１０）。それぞれのスピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６（１８８−Ａ３−００７、配列番号１２２）は、インビトロＣａ＋＋放出アッセイ（実施例５、図１３）において約１２ｎＭ、およびインビトロ走化性アッセイ（実施例６、図１６）において約７ｎＭの阻害濃度（ＩＣ５０）を示した。ｍＮＯＸ−Ｅ３６のＰＥＧ化誘導体、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ（配列番号２５４）について、Ｃａ＋＋放出アッセイ（実施例５、図２９）において約８ｎＭ、および走化性アッセイ（実施例６、図３１）において約３ｎＭのＩＣ５０を測定した。
【０２９４】
図１〜７に示す任意の配列が、それらのトランケート型を含むだけでなく、それらの伸長型も含めて、しかしこのようにトランケートおよび伸長された核酸分子がそれぞれ依然として標的に結合することができるという条件のもとで、本発明による核酸であることが理解されるべきである。
【０２９５】
［実施例３：  アプタマーおよびスピーゲルマーの合成および誘導体化］
［小規模合成］
２’ＴＢＤＭＳ  ＲＮＡホスホラミダイト化学（Ｍ．Ｊ．Ｄａｍｈａ、Ｋ．Ｋ．Ｏｇｉｌｖｉｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０巻、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓおよびａｎａｌｏｇｓ、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編、８１〜１１４頁、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．１９９３）を使用して、ＡＢＩ３９４合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いた固相合成によって、アプタマーおよびスピーゲルマーを生成した。Ｄ−立体配置およびＬ−立体配置のｒＡ（Ｎ−Ｂｚ）−ホスホラミダイト、ｒＣ（Ａｃ）−ホスホラミダイト、ｒＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−ホスホラミダイト、およびｒＵ−ホスホラミダイトは、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡから購入した。アプタマーおよびスピーゲルマーは、ゲル電気泳動によって精製した。
【０２９６】
［大規模合成および修飾］
２’ＴＢＤＭＳ  ＲＮＡホスホラミダイト化学（Ｍ．Ｊ．Ｄａｍｈａ、Ｋ．Ｋ．Ｏｇｉｌｖｉｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０巻、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓおよびａｎａｌｏｇｓ、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編、８１〜１１４頁、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．１９９３）を使用して、ＡｋｔａＰｉｌｏｔ１００合成装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）を用いた固相合成によって、スピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６を生成した。Ｌ−ｒＡ（Ｎ−Ｂｚ）−ホスホラミダイト、Ｌ−ｒＣ（Ａｃ）−ホスホラミダイト、Ｌ−ｒＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−ホスホラミダイト、およびＬ−ｒＵ−ホスホラミダイトは、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡから購入した。５’−アミノ−修飾剤は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。非修飾スピーゲルマーの合成を、Ｌ−リボＧ修飾ＣＰＧ孔径１０００Å（Ｌｉｎｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｌａｓｇｏｗ、ＵＫ）において開始し、３’−ＮＨ２−修飾スピーゲルマーに関しては３’−アミノ修飾剤−ＣＰＧ、１０００Å（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を使用した。カップリング（１サイクル当たり１５分）については、アセトニトリル中の０．３Ｍベンジルチオテトラゾール（ＣＭＳ−Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、ＵＫ）およびアセトニトリル中のそれぞれの０．１Ｍホスホラミド溶液３．５当量を使用した。酸化−キャッピングサイクルを使用した。オリゴヌクレオチド合成のためのさらなる標準的な溶媒および試薬は、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ（Ｖａｌｋｅｎｓｗａａｒｄ、ＮＬ）から購入した。スピーゲルマーをＤＭＴ−ＯＮ合成し、脱保護後、Ｓｏｕｒｃｅ１５ＲＰＣ媒体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｗｉｎｃｏｔｔ  Ｆ．ら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３：２６７７）によって精製した。５’ＤＭＴ−基を、８０％酢酸（室温で３０分）で除去した。続いて、水性２ＭのＮａＯＡｃ溶液を加え、５Ｋ再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用した接線流濾過によってスピーゲルマーを脱塩した。
【０２９７】
［ＮＯＸ−Ｅ３６のＰＥＧ化］
インビボでのスピーゲルマーの血漿滞留時間を延長するために、スピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６を、４０ｋＤａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の３’末端または５’末端に共有結合によってつないだ。
【０２９８】
（ＮＯＸ−Ｅ３６の３’−ＰＥＧ化）
ＰＥＧ化（ＰＥＧ化のための方法の技術的詳細については、ＥＰ１３０６３８２Ａを参照されたい）のために、精製３’−アミノ修飾スピーゲルマーを、Ｈ２Ｏ（２．５ｍｌ）、ＤＭＦ（５ｍｌ）、および緩衝液Ａ（５ｍｌ。クエン酸・Ｈ２Ｏ［７ｇ］、ホウ酸［３．５４ｇ］、リン酸［２．２６ｍｌ］、および１ＭのＮａＯＨ［３４３ｍｌ］を混合し、１ｌの最終容量までＨ２Ｏを加えることにより調製した。ｐＨ＝８．４は１ＭのＨＣｌで調整した）の混合物に溶解させた。
【０２９９】
スピーゲルマー溶液のｐＨを、１ＭのＮａＯＨで８．４にした。次いで、４０ｋＤａのＰＥＧ−ＮＨＳエステル（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）を、３７℃で３０分ごとに０．６当量を４回に分けて、７５〜８５％の最大収率に達するまで加えた。反応混合物のｐＨは、ＰＥＧ−ＮＨＳエステルを加える間、１ＭのＮａＯＨで８〜８．５に保った。
【０３００】
反応混合物を４ｍｌの尿素溶液（８Ｍ）、４ｍｌの緩衝液Ａ、および４ｍｌの緩衝液Ｂ（Ｈ２Ｏ中０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート）と混ぜ、９５℃まで１５分間加熱した。次いでＰＥＧ化スピーゲルマーを、アセトニトリル勾配（緩衝液Ｂ、緩衝液Ｃ（アセトニトリル中０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート））を使用して、Ｓｏｕｒｃｅ１５ＲＰＣ媒体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。過剰なＰＥＧは５％緩衝液Ｃで、ＰＥＧ化スピーゲルマーは１０〜１５％緩衝液Ｃで溶出した。９５％超の純度（ＨＰＬＣにより評価した場合）を有する生成物画分を合わせ、３ＭのＮａＯＡＣ４０ｍｌと混合した。接線流濾過（５Ｋ再生セルロース膜、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ  ＭＡ）によってＰＥＧ化スピーゲルマーを脱塩した。
【０３０１】
（ＮＯＸ−Ｅ３６の５’−ＰＥＧ化）
ＰＥＧ化（ＰＥＧ化のための方法の技術的詳細については、ＥＰ１３０６３８２Ａを参照されたい）のために、精製５’−アミノ修飾スピーゲルマーを、Ｈ２Ｏ（２．５ｍｌ）、ＤＭＦ（５ｍｌ）、および緩衝液Ａ（５ｍｌ。クエン酸・Ｈ２Ｏ［７ｇ］、ホウ酸［３．５４ｇ］、リン酸［２．２６ｍｌ］、および１ＭのＮａＯＨ［３４３ｍｌ］を混合し、１ｌの最終容量まで水を加えることにより調製した。ｐＨ＝８．４は１ＭのＨＣｌで調整した）の混合物に溶解させた。
【０３０２】
スピーゲルマー溶液のｐＨを、１ＭのＮａＯＨで８．４にした。次いで、４０ｋＤａのＰＥＧ−ＮＨＳエステル（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）を、３７℃で３０分ごとに０．２５当量を６回に分けて、７５〜８５％の最大収率に達するまで加えた。反応混合物のｐＨは、ＰＥＧ−ＮＨＳエステルを加える間、１ＭのＮａＯＨで８〜８．５に保った。
【０３０３】
反応混合物を４ｍｌの尿素溶液（８Ｍ）、および４ｍｌの緩衝液Ｂ（Ｈ２Ｏ中０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート）と混ぜ、９５℃まで１５分間加熱した。次いでＰＥＧ化スピーゲルマーを、アセトニトリル勾配（緩衝液Ｂ、緩衝液Ｃ（アセトニトリル中０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート））を使用して、Ｓｏｕｒｃｅ１５ＲＰＣ媒体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。過剰なＰＥＧは５％緩衝液Ｃで、ＰＥＧ化スピーゲルマーは１０〜１５％緩衝液Ｃで溶出した。９５％超の純度（ＨＰＬＣにより評価した場合）を有する生成物画分を合わせ、３ＭのＮａＯＡＣ４０ｍｌと混合した。接線流濾過（５Ｋ再生セルロース膜、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ  ＭＡ）によってＰＥＧ化スピーゲルマーを脱塩した。
【０３０４】
［実施例４：  結合定数の決定（プルダウンアッセイ）］
［直接プルダウンアッセイ］
Ｄ−ＭＣＰ−１へのアプタマーの親和性を、２０℃または３７℃で、それぞれプルダウンアッセイ形式で測定した。アプタマーを、［γ−３２Ｐ］−標識ＡＴＰ（Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって５’−リン酸標識した。標識アプタマーの比放射能は、２００，０００〜８００，０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌであった。アプタマーを、変性および復元後、低濃度で平衡に達するために、２０ｐＭの濃度、３７℃で選択緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％［ｗ／ｖｏｌ］Ｔｗｅｅｎ−２０）中で、様々な量のビオチン化Ｄ−ＭＣＰ−１と一緒に４〜１２時間インキュベートした。結合相手の使用されたプラスチック容器または固定化マトリックスの表面との吸着を避けるために、選択緩衝液に１０μｇ／ｍｌヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および１０μｇ／ｍｌ酵母ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＵＳＡ）を添加した。ビオチン化Ｄ−ＭＣＰ−１の濃度範囲は８ｐＭ〜１００ｎＭに設定し、全反応容量は１ｍｌであった。ペプチドおよびペプチド−アプタマー複合体を、選択緩衝液で予め平衡化された１．５μｌのストレプトアビジンＵｌｔｒａｌｉｎｋ  Ｐｌｕｓ粒子（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＵＳＡ）上に固定し、全量６μｌ中に再懸濁した。粒子を、それぞれの温度で３０分間、サーモミキサー中で懸濁し続けた。上清の分離および適切な洗浄後、固定された放射能をシンチレーションカウンターで定量した。結合の割合をビオチン化Ｄ−ＭＣＰ−１の濃度に対してプロッティングし、１：１の化学量論比を仮定して、ソフトウェアアルゴリズム（ＧＲＡＦＩＴ；Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ  ソフトウェア；Ｓｕｒｒｅｙ  Ｕ．Ｋ．）を使用することによって解離定数を得た。
【０３０５】
［競合的プルダウンアッセイ］
異なるＤ−ＭＣＰ−１結合アプタマーを比較するために、競合的順位付けアッセイを行った。この目的のために、利用可能な大部分のアフィンアプタマーを放射性標識（上記参照）し、参照とした。変性および復元の後、これをビオチン化Ｄ−ＭＣＰ−１と一緒に３７℃で１ｍｌ選択緩衝液において、競合なしでニュートラアビジンアガロースまたはストレプトアビジンＵｌｔｒａｌｉｎｋ  Ｐｌｕｓ（共にＰｉｅｒｃｅ製）における固定化および洗浄後にペプチドへの約５〜１０％の結合をもたらす条件でインキュベートした。過剰の変性および復元された標識されていないＤ−ＲＮＡアプタマー変異体を、結合反応を並行させるために標識された参照アプタマーと一緒に、種々の濃度（たとえば、２、１０、および５０ｎＭ）に添加した。試験されるアプタマーは、標的結合に関して参照アプタマーと競合したため、その結合特性に依存して結合シグナルを減少させた。このアッセイにおいて最も活性であると判明したアプタマーは、したがってさらなるアプタマー変異体の競合分析のための新しい参照として機能することができた。
【０３０６】
［実施例５：  Ｃａ＋＋放出アッセイにおける阻害濃度の決定］
ＴＨＰ−１−細胞（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）を、０．３×１０６／ｍｌの細胞密度で３７℃および５％ＣＯ２で、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒に、加えて１０％ウシ胎児血清、５０ユニット／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび５０μＭβ−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ１６４０培地において一晩培養した。
【０３０７】
スピーゲルマーを、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、５ｍＭのプロベネシドおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＨＢＳＳ＋）を含有するハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で、１５〜６０分間３７℃で、組換えヒトＭＣＰ−１（Ｂａｃｈｅｍ）と一緒に、０．２ｍｌの薄型９６−チューブプレートにおいてインキュベートした（刺激溶液）。
【０３０８】
カルシウム指示染料（ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｄｙｅ）を導入するために、細胞を３００×ｇで５分間遠心分離し、４ｍｌの指示染料溶液（ＨＢＳＳ＋中１０μＭのフルオ−４［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ］、０．０８％のプルロニック１２７［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ］）に再懸濁し、３７℃で６０分間インキュベートした。その後、１１ｍｌのＨＢＳＳ＋を加え、細胞を上記の通り遠心分離し、１５ｍｌのＨＢＳＳ＋で１回洗浄し、次いでＨＢＳＳ＋中に再懸濁して１．１×１０６／ｍｌの細胞密度にした。９０μｌのこの細胞懸濁液を、黒色９６−ウェルプレートの各ウェルに加えた。
【０３０９】
蛍光シグナルの測定を、４８５ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの発光波長でＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ多重検出プレートリーダー（ＢＭＧ）において行った。いくつかの試料の並列測定のため、９６−ウェルプレートの１つの（垂直の）列のウェルを一緒に記録した。４秒の時間差の最初の３つの読み取りは、ベースラインの決定のために行った。次いで読み取りを中断し、プレートを装置から移動させた。マルチチャンネルピペットを使用して１０μｌの刺激溶液をウェルに加え、次いでプレートを再度装置の中に移動させ、測定を続けた。合計で、４秒の時間間隔で２０回の読み取りを行った。
【０３１０】
各ウェルについて最大蛍光およびベースライン値の間の差を測定し、ＭＣＰ−１濃度に対してプロッティングし、または、スピーゲルマーによるカルシウム放出阻害に関する実験においては、スピーゲルマー濃度に対してプロッティングした。
【０３１１】
［ヒトＭＣＰ−１の最大半有効濃度（ＥＣ５０）の決定］
様々なｈＭＣＰ−１濃度によるＴＨＰ−１細胞の刺激、ならびに最大およびベースラインシグナル間の差のプロッティング後、約２〜４ｎＭの半有効濃度（ＥＣ５０）を示すヒトＭＣＰ−１についての用量反応曲線を得た（図１１）。スピーゲルマーによるＣａ＋＋放出の阻害に関するさらなる実験のために、この濃度を使用した。
【０３１２】
［マウスＭＣＰ−１の最大半有効濃度（ＥＣ５０）の決定］
様々なｍＭＣＰ−１濃度によるＴＨＰ−１細胞の刺激、ならびに最大およびベースラインシグナル間の差のプロッティング後、約５ｎＭの半有効濃度（ＥＣ５０）を示すマウスＭＣＰ−１についての用量反応曲線を得た（図２８）。スピーゲルマーによるＣａ＋＋放出の阻害に関するさらなる実験のために、この濃度を使用した。
【０３１３】
［実施例６：  走化性アッセイにおける阻害濃度の決定］
上記の通り増殖させたＴＨＰ−１細胞を遠心分離し、ＨＢＨ（ＨＢＳＳ、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンおよび２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ含有）中で１回洗浄し、３×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。１００μｌのこの懸濁液を、５μＭの孔を有するＴｒａｎｓｗｅｌｌインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３４２１）に加えた。下部区画において、細胞を加える前に、ＭＣＰ−１を、様々な濃度のスピーゲルマーと一緒に６００μｌのＨＢＨにおいて３７℃で２０〜３０分間プレインキュベートした。細胞を３７℃で３時間移動させた。その後インサートを除去し、リン酸緩衝生理食塩水中６０μｌの４４０μＭレサズリン（Ｓｉｇｍａ）を下部区画に加えた。３７℃で２．５時間のインキュベーション後、５４４ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長でＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ多重検出プレートリーダー（ＢＭＧ）において蛍光を測定した。
【０３１４】
［ヒトＭＣＰ−１の最大半有効濃度（ＥＣ５０）の決定］
様々なヒトＭＣＰ−１濃度に対するＴＨＰ−１細胞の３時間の移動後、約１ｎＭの最大有効濃度および高濃度での活性化の減少を示す、ヒトＭＣＰ−１の用量反応曲線を得た（図１４）。スピーゲルマーによる走化性阻害に関するさらなる実験のために、０．５ｎＭのＭＣＰ−１濃度を使用した。
【０３１５】
［マウスＭＣＰ−１の最大半有効濃度（ＥＣ５０）の決定］
様々なマウスＭＣＰ−１濃度に対するＴＨＰ−１細胞の３時間の移動後、約１〜３ｎＭの最大有効濃度および高濃度での活性化の減少を示す、マウスＭＣＰ−１の用量反応曲線を得た（図３０）。スピーゲルマーによる走化性阻害に関するさらなる実験のために、０．５ｎＭのマウスＭＣＰ−１  濃度を使用した。
【０３１６】
［実施例７：  表面プラズモン共鳴測定による結合分析］
７．１  ＮＯＸ−Ｅ３６、１８１−Ａ２−０１８およびｍＮＯＸ−Ｅ３６の特異性評価
Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、ヒトＭＣＰ−１および関連タンパク質への核酸の結合を分析した。アミン基を介してカップリングを達成する場合、タンパク質を水に対して１〜２時間透析（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＶＳＷＰ混合セルロースエステル；孔径、０．０２５μＭ）して干渉するアミンを除去した。ＰｉｏｎｅｅｒＦ１またはＣＭ４センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）を、タンパク質カップリングの前に、５μｌ／分の流量で０．４ＭのＮＨＳおよび０．１ＭのＥＤＣの１：１希釈の３５μｌ注入によって活性化した。次いでケモカインを、０．１〜１．５μｇ／ｍｌの濃度で２μｌ／分の流量で、装置の応答が１０００〜２０００ＲＵ（相対単位）の範囲になるまで注入した。未反応ＮＨＳエステルを、５μｌ／分の流量で３５μｌのエタノールアミン塩酸塩溶液（ｐＨ８．５）の注入によって不活性化した。センサーチップを、結合緩衝液を用いて２回プライミングし、ベースラインが安定して見えるまで１０μｌ／分で１〜２時間平衡化した。全てのタンパク質について、選択緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ；ＮａＣｌ、１３７ｍＭ；ＫＣｌ、５ｍＭ；ＣａＣｌ２、１ｍＭ；ＭｇＣｌ２、１ｍＭ；Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％［ｗ／ｖ］；ｐＨ７．４）中１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、および０ｎＭの濃度の一連のスピーゲルマー注入によって、動態パラメータおよび解離定数を評価した。全ての実験において、１０μｌ／分の流量で１８０秒の結合時間および３６０秒の解離時間を定義するＫｉｎｊｅｃｔコマンドを使用して、３７℃で分析を行った。データ分析および解離定数（ＫＤ）の計算は、１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ化学量論的適合アルゴリズムを使用して、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．０ソフトウェア（ＢＩＡＣＯＲＥ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）により行った。
【０３１７】
（７．１．１  ＮＯＸ−Ｅ３６および１８１−Ａ２−０１８（ヒト−ＭＣＰ−１特異的核酸））
ヒトＭＣＰ−１についてのみ、全てのセンサーグラムを示し（それぞれ図１７および２０）、他のタンパク質については、明確にするために１２５ｎＭのスピーゲルマー濃度で得られたセンサーグラムのみ示す（図１８／１９および２１／２２）。
【０３１８】
ＮＯＸ−Ｅ３６・ｈＭＣＰ−１相互作用の分析。組換えヒトＭＣＰ−１を、１３８１ＲＵ（相対単位）の装置応答が確立されるまで、製造業者の推奨（アミンカップリング手順）に従ってＰｉｏｎｅｅｒＦ１センサーチップ上に固定した。ヒトＭＣＰ−１へのＮＯＸ−Ｅ３６結合について決定した解離定数（ＫＤ）は、約８９０ｐＭ（図１７）であった。
【０３１９】
１８１−Ａ２−０１８・ｈＭＣＰ−１相互作用の分析。組換えヒトＭＣＰ−１を、３１１１ＲＵ（相対単位）の装置応答が確立されるまで、製造業者の推奨（アミンカップリング手順）に従ってＣＭ４センサーチップ上に固定した。ヒトＭＣＰ−１への１８１−Ａ２−０１８結合について決定した解離定数（ＫＤ）は、約３７０ｐＭ（図２０）であった。
【０３２０】
ＮＯＸ−Ｅ３６および１８１−Ａ２−０１８の特異性を決定するために、様々なヒトＭＣＰ−１ファミリータンパク質ならびにヒトエオタキシンを、ＰｉｏｎｅｅｒＦ１およびＣＭ４センサーチップ上に固定した（ｈＭＣＰ−１、１７５４ＲＵ；ｈＭＣＰ−２、１５５８ＲＵ；ｈＭＣＰ−３、１２９０ＲＵ；エオタキシン、１５２３ＲＵ）。動態分析によって、ＮＯＸ−Ｅ３６は５〜１０ｎＭの解離定数（ＫＤ）でエオタキシンおよびｈＭＣＰ−２に結合し、ｈＭＣＰ−３は認識されないことが明らかになった（図１８および２４Ａ）。対照的に１８１−Ａ２−０１８は、やや低い親和性（１０〜２０ｎＭ；図２１および２４Ａ）であるが、エオタキシン、ｈＭＣＰ−２およびｈＭＣＰ−３に結合する。
【０３２１】
ＮＯＸ−Ｅ３６および１８１−Ａ２−０１８の種間交差反応性を、ヒト（１４６０ＲＵ）、サル（１２１８ＲＵ）、ブタ（１４２８ＲＵ）、イヌ（１２２４ＲＵ）、ウサギ（１２４４ＲＵ）、ラット（１２６７ＲＵ）、およびマウス（１３６１ＲＵ）由来のアミノ−カップリング固定化ＭＣＰ−１を使用した、ＰｉｏｎｅｅｒＦ１およびＣＭ４センサーチップにおいて評価した。動態分析によって、ＮＯＸ−Ｅ３６は０．８９〜１．２ｎＭの解離定数（ＫＤ）でヒト、サル、ブタ、およびイヌＭＣＰ−１に結合するが、マウス、ラットおよびウサギ由来のＭＣＰ−１は認識されないことが明らかになった（図１９および２４Ａ）。１８１−Ａ２−０１８は、０．５〜０．６ｎＭの比較解離定数（ＫＤ）でヒトおよびサルＭＣＰ−１に結合するが、ブタ、ウサギおよびイヌＭＣＰ−１には、はるかに低い親和性で結合する。ラットおよびマウスＭＣＰ−１は、ＮＯＸ−Ａ２−０１８により認識されなかった（図２２および２４Ａ）。
【０３２２】
異なる種由来のＭＣＰ−１タンパク質と密接に関連するヒトタンパク質との間での配列ならびに同一のアミノ酸の相同性パーセントの程度を図２３に示し、ＮＯＸ−Ｅ３６および１８１−Ａ２−０１８について計算したＫＤ値を図２４Ａに表形式で示す。
【０３２３】
（７．１．２  ｍＮＯＸ−Ｅ３６（マウスＭＣＰ−１特異的核酸））
ｍＮＯＸ−Ｅ３６の結合挙動を分析するために、３７５９ＲＵの合成ビオチン化マウスＤ−ＭＣＰ−１（フローセル３）および３３２６ＲＵのビオチニル化ヒトＤ−ＭＣＰ−１（フローセル４）を、ストレプトアビジンコンジュゲートセンサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上にそれぞれ固定した。５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、および０ｎＭのｍＮＯＸ−Ｅ３６アプタマー（Ｄ−ＲＮＡ）溶液を、１８０秒の結合時間および３６０秒の解離時間を定義するＫｉｎｊｅｃｔコマンドを使用して注入した。フローセル１を緩衝液およびデキストランマトリックス対照（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＡ−チップ表面）として使用し、フローセル２において、非特異的Ｄ−ペプチドを固定してアプタマーの非特異的結合を測定した。図３２は、２００〜３００ｐＭの推定解離定数（ＫＤ）を有するマウスＤ−ＭＣＰ−１への結合についてＤ−ＮＯＸ−Ｅ３６動態のセンサーグラムを示す。ｍＮＯＸ−Ｅ３６はヒトＤ−ＭＣＰ−１に結合しなかった（図３３）。明確にするために、１２５ｎＭのスピーゲルマーで得られたセンサーグラムのみを示す。
【０３２４】
（７．２  ＮＯＸ−Ｅ３６の選択性評価）
ＮＯＸ−Ｅ３６の選択性を、表面プラズモン共鳴分析によって、ストレプトアビジン（ＳＡ−チップ）上に５’ビオチン化ＮＯＸ−Ｅ３６を固定することによって評価した。フローセル（ＦＣ）１において３５２ＲＵのＮＯＸ−Ｅ３６およびＦＣ２において等量の５’末端ビオチン化された機能しない対照スピーゲルマー（ＰＯＣ）を、ストレプトアビジン／ビオチン結合によって固定した。ＦＣ３を表面対照として使用して、デキストラン−ＳＡセンサー表面への非特異的結合を測定した。
【０３２５】
４つの亜群（ＣＣ、ＣＸＣ、ＣＸ３Ｃ、およびＸＣ）全てのヒトケモカインの１００ｎＭのパネルを３６０秒間注入し、１０μｌ／分の流量および３７℃で複合体を３６０秒間解離させた。結合後（Ｒｅｓｐ．１、相互作用の程度）および解離後（Ｒｅｓｐ．２、相互作用の親和性）の応答単位をプロッティングした。各注入の後、チップ表面を２４０秒の０．１％Ｔｗｅｅｎ含有１Ｍ塩化ナトリウムで再生し、その後固定化スピーゲルマーを生理学的条件（ランニング緩衝液）で２分間リフォールディングさせた。各ケモカインの注入を３回繰り返した。ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ６およびＣＸＣＬ９は、リボ核酸およびチップデキストラン表面への非特異的結合を示した。固定化ＮＯＸ−Ｅ３６への特異的な高親和性結合は、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ８／ＭＣＰ−２、ＣＣＬ１１／エオタキシン、ＣＣＬ３／ＭＩＰ１α、およびＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２についてのみ検出することができた（図２４Ｂ）。ＭＣＰ−２およびエオタキシンにＮＯＸ−Ｅ３６が結合するという発見は、６２％および７０％というこれらのケモカインとＭＣＰ−１との間の比較的高い相同性から驚くべきことではなく、予想外の陽性反応ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αおよびＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２のために、それぞれ機能的阻害のためのインビトロ試験が行われたか、現在確立中である。
【０３２６】
最後に、ＮＯＸ−Ｅ３６とＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ８／ＭＣＰ−２、ＣＣＬ１１／エオタキシン、ＣＣＬ３／ＭＩＰ１α、ＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３およびＣＣＬ１３／ＭＣＰ−４との間の相互作用の動態パラメータを、「逆転した」系において決定した。この場合、ケモカインを固定し、遊離ＮＯＸ−Ｅ３６を注入した（詳細なプロトコールについては、７．１を参照されたい）。動態データを、図２４Ｃにまとめている。
【０３２７】
（７．３  インビトロでの抗ＭＩＰ−１α機能性の評価）
Ｂｉａｃｏｒｅ測定は、ＮＯＸ−Ｅ３６のＭＩＰ−１αとの交差反応性を示した。機能的な、細胞培養に基づくインビトロアッセイを採用することによって、ＭＩＰ−１αへのＮＯＸ−Ｅ３６のＢｉａｃｏｒｅ結合だけでも、機能性、たとえば、拮抗作用を生じるかどうかを確認するべきである。
【０３２８】
これを達成するために、ＭＩＰ−１αによって刺激することができるＴＨＰ−１細胞を用いて走化性実験を行った。上記の通り増殖させたＴＨＰ−１細胞を遠心分離し、ＨＢＨ（ＨＢＳＳ、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳ含有）中で１回洗浄し、３×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。１００μｌのこの懸濁液を、５μｍの孔を有するＴｒａｎｓｗｅｌｌインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３４２１）に加えた。下部区画において、細胞を加える前に、ＭＩＰ−１αを、様々な濃度のスピーゲルマーと一緒に６００μｌのＨＢＨにおいて３７℃で２０〜３０分間プレインキュベートした。細胞を３７℃で３時間移動させた。その後インサートを除去し、リン酸緩衝生理食塩水中６０μｌの４４０μＭレサズリン（Ｓｉｇｍａ）を下部区画に加えた。３７℃で２．５時間のインキュベーション後、５４４ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長でＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ多重検出プレートリーダー（ＢＭＧ）において蛍光を測定した。
【０３２９】
様々なヒトＭＩＰ−１α濃度に対するＴＨＰ−１細胞の３時間の移動後、約１ｎＭの最大半有効濃度および高濃度での活性化の減少を示す、ヒトＭＩＰ−１αの用量反応曲線を得た（図２４Ｄ）。スピーゲルマーによる走化性阻害に関するさらなる実験のために、０．５ｎＭのＭＩＰ−１α濃度を使用した。
【０３３０】
ＮＯＸ−Ｅ３６による走化性阻害の測定のための実験を、０．５ｎＭのＭＩＰ−１αの刺激で行った。ＮＯＸ−Ｅ３６は、ＭＩＰ−１αの試験した最高濃度の１μＭまでＭＩＰ−１α誘発性の走化性を阻害しないことを明らかに示すことができた。陽性対照として、刺激としてＭＣＰ−１を用いたそれぞれの実験を並行して行った（図２４Ｅ）。
【０３３１】
［実施例８：  抗ｍＭＣＰ−１スピーゲルマーを用いたＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおけるループス様疾患の療法］
前炎症性メディエーターの遮断は、慢性炎症の治療のための良好なアプローチとなっている（Ｓｔｅｉｎｍａｎ  ２００４）。ＣＣ−ケモカインは血管内腔から炎症部位への白血球動員を媒介する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  １９９８、Ｌｕｓｔｅｒ  ２００５）ため、ＴＮＦおよびインターロイキンに加えてＣＣ−ケモカインは特異的拮抗作用のための重要な候補である。ＭＣＰ−１（＝ＣＣＬ２）およびそのそれぞれのケモカイン受容体ＣＣＲ２は、全身性エリテマトーデスの臨床症状などの自己免疫性組織損傷において極めて重要な役割を果たす（Ｇｅｒａｒｄ  ＆  Ｒｏｌｌｉｎｓ  ２００１）という強力な証拠がある。たとえば、Ｃｃｌ２またはＣｃｒ２遺伝子のいずれかを欠損するＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスは、ループス様自己免疫から保護される（Ｐｅｒｅｚ  ｄｅ  Ｌｅｍａ  ２００５、Ｔｅｓｃｈ  １９９９）。したがって、ＣＣＬ２／ＣＣＲ２軸は、たとえば、ループス腎炎のための有望な治療標的を提示し得る。実際に、両方ともＮＨ２−切断型ＭＣＰ−１のｉｎ  ｓｉｔｕ生成をもたらす遅延遺伝子療法またはトランスフェクト細胞の移入は、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおいて顕著に自己免疫性組織損傷を減少させた。しかしながら、このような実験的アプローチは、アンタゴニスト産生および腫瘍形成を抑制できないために（Ｈａｓｅｇａｗａ  ２００３、Ｓｈｉｍｉｚｕ  ２００４）、ヒトにおいて使用することができない。したがって、インビボで有利な薬物動態プロファイルを有する新規なＣＣＬ２アンタゴニストを開発することが依然として必要である。この実施例において、抗ｍＣＣＬ２スピーゲルマー  ｍＮＯＸ−Ｅ３６またはｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧによるマウスＣＣＬ２の遮断が、ループス腎炎および全身性エリテマトーデスの別の疾患症状の治療に好適であることが示される。遅発性のｍＣＣＬ２スピーゲルマー療法は、ＣＣＬ２／ＣＣＲ２遮断治療に付随するこれまでの問題のいずれとも無関係に、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスのループス腎炎、自己免疫気管支周囲炎、およびループス様皮膚疾患を効果的に改善する。
【０３３２】
（動物および実験プロトコール）
１０週齢のメスＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスを、Ｈａｒｌａｎ  Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ（Ｂｏｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、１２時間の明暗サイクルで通常の飼育条件下に保った。水および標準食（Ｓｓｎｉｆｆ、Ｓｏｅｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）は、自由に摂取させた。１４週齢で、１２匹のマウスの群に、５％グルコース中のスピーゲルマー（注入量、４ｍｌ／ｋｇ）を週に３回、以下の通り皮下注入した。ｍＮＯＸ−Ｅ３６を１．５μｍｏｌ／ｋｇ、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧを０．９μｍｏｌ／ｋｇ、機能しない対照スピーゲルマーＰｏＣ（５’−ＵＡＡＧＧＡＡＡＣＵＣＧＧＵＣＵＧＡＵＧＣＧＧＵ  ＡＧＣＧＣＵＧＵＧＣＡＧＡＧＣＵ−３’）を１．９μｍｏｌ／ｋｇ、ＰｏＣ−ＰＥＧを０．９μｍｏｌ／ｋｇ、ビヒクル（５％グルコース）。ｍＮＯＸ−Ｅ３６およびｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧの血漿濃度は、注入のそれぞれ３時間または２４時間後に、眼窩後洞から毎週採取される血液試料から決定した。血漿試料中のスピーゲルマー濃度は、実施例８に記載の通りサンドイッチハイブリダイゼーション法の修正によって決定した。マウスは、２４週齢の最後に頸椎脱臼によって屠殺した。
【０３３３】
（全身性ループスの評価）
半定量的スコア（Ｓｃｈｗａｒｔｉｎｇ  ２００５）によって皮膚病変を記録した。脾臓および腸間膜リンパ節の大部分の全体重に対する重量比を、ループス関連リンパ球増殖性症候群のマーカーとして計算した。試験期間の終了時に、エーテル吸入による全身麻酔下で眼窩後静脈叢からの出血によって各動物から血液および尿試料を採取した。試験終了時に各動物から血液および尿試料を採取し、尿アルブミン／クレアチニン比ならびに血清ｄｓＤＮＡ自己抗体ＩｇＧアイソタイプ力価を、以前に記載されている通り（Ｐａｗａｒ  ２００６）決定した。糸球体濾過量（ＧＦＲ）を、単回ボーラス注入の５、１０、１５、２０、３５、６０、および９０分後の血漿ＦＩＴＣ−イヌリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のクリアランス動態によって、２４週で決定した（Ｑｉ  ２００４）。蛍光を４８５ｎｍ励起で測定し、５３５ｎｍでの発光を読み取った。２コンパートメントモデルに基づいて、非線形曲線適合ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してＧＦＲを推定した。市販のＥＬＩＳＡキットを使用して、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０（ＯｐｔＥｉＡ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、およびＩＦＮ−α（ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｓ、ＵＳＡ）について血清サイトカイン濃度を測定した。全てのマウスについて、腎臓および肺を１０％緩衝ホルマリン中で固定して、処理し、パラフィン中に包埋した。銀および過ヨウ素酸−シッフ染色のための５μｍの切片を、慣用のプロトコール（Ａｎｄｅｒｓ  ２００２）に従って調製した。腎臓病変の重症度を、ヒトループス腎炎について記載されている通り（Ａｕｓｔｉｎ  １９８４）活性および慢性化に関する指標を使用して等級付けし、腎間質損傷の形態計測を以前に記載されている通り（Ａｎｄｅｒｓ  ２００２）実施した。気管支周囲の炎症の重症度を、半定量的に０〜４に等級付けした。免疫染色のために、ホルマリン固定およびパラフィン包埋した組織の切片を脱パラフィンし、再水和した。内因性ペルオキシダーゼを３％過酸化水素によって遮断し、オートクレーブオーブンにおいてＡｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｖｅｃｔｏｒ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）中で抗原回復を行った。Ａｖｉｄｉｎ／Ｂｉｏｔｉｎ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ）を使用してビオチンを遮断した。スライドを、一次抗体と一緒に１時間、その後ビオチン化二次抗体（抗ラットＩｇＧ、Ｖｅｃｔｏｒ）、およびＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ）とインキュベートした。スライドを、インキュベーション段階の間にリン酸緩衝生理食塩水中で洗浄した。金属増感３’３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、Ｓｉｇｍａ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を検出系として使用して、黒色生成物をもたらした。メチルグリーンを対比染色として使用して、スライドを脱水し、Ｈｉｓｔｏｍｏｕｎｔ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）にマウントした。以下の一次抗体を使用した。ラット抗Ｍａｃ２（マクロファージ、Ｃｅｄｅｒｌａｎｅ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ、１：５０）、抗マウスＣＤ３（１：１００、クローン５００Ａ２、ＢＤ）、抗マウスＩｇＧ１（１：１００、Ｍ３２０１５、Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）、抗マウスＩｇＧ２ａ（１：１００、Ｍ３２２１５、Ｃａｌｔａｇ）、抗マウスＣ３（１：２００、ＧＡＭ／Ｃ３ｃ／ＦＩＴＣ、Ｎｏｒｄｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｔｉｌｂｕｒｇ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。陰性対照は、それぞれのアイソタイプ抗体とのインキュベーションを含んでいた。定量分析のために、１切片当たり１５個の皮質糸球体において糸球体細胞を計数した。糸球体ＩｇおよびＣ３ｃ沈着物は、１５個の皮質糸球体切片において０〜３のスコアをつけた。
【０３３４】
（ＲＮＡ調製およびリアルタイム定量（ＴａｑＭａｎ）ＲＴ−ＰＣＲ）
各マウスの腎臓組織を液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保存した。各動物から、全腎臓ＲＮＡ調製および逆転写を記載通り（Ａｎｄｅｒｓ  ２００２）行った。プライマーおよびプローブは、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ製であった。使用したプライマー（３００ｎＭ）は、Ｃｃｌ２、Ｃｃｌ５および１８Ｓ  ｒＲＮＡの検出のために、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のｐｒｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ＴａｑＭａｎアッセイ試薬を使用した。
【０３３５】
（フローサイトメトリー）
全血液および骨髄試料は、試験終了時に全ての群のマウスから得た。ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ装置および以前に特徴付けられたＭＣ２１抗ｍＣＣＲ２抗体（Ｍａｃｋ  ２００１）を使用して、フローサイトメトリーを行った。ビオチン化抗ラットＩｇＧ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、検出のために使用した。ラットＩｇＧ２ｂ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、アイソタイプ対照として使用した。
【０３３６】
（統計分析）
データは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。単変量ＡＮＯＶＡを使用して、群間の比較を行った。多重比較のために事後Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を使用した。ｐ＜０．０５の値を、統計的有意性を示すとみなした。
【０３３７】
［サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ］
試料中のスピーゲルマーの量を、Ｄｒｏｌｅｔら  ２０００（Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  １７：１５０３）により記載されているアッセイに基づいてサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイによって定量した。ＮＯＸ−Ｅ３６の血漿クリアランスを追跡するために、血液試料を並行して採取した。スピーゲルマー濃度を測定するために、選択した組織を調製した。
【０３３８】
（ハイブリダイゼーションプレート調製）
スピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６を、検証されていないサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイを使用することによって定量した。簡潔に述べると、ｍＮＯＸ−Ｅ３６捕捉プローブ（配列番号２８１）を、白色ＤＮＡ−ＢＩＮＤ９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に、０．７５ｍＭで、０．５Ｍのリン酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．５において、４℃で一晩固定した。ウェルを２回洗浄し、０．２５Ｍのリン酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．５において０．５％ｗ／ｖのＢＳＡを用いて３７℃で３時間ブロックし、再度洗浄し、使用するまで４℃で保存した。ハイブリダイゼーションの前に、ウェルを３７℃まで予熱し、予熱した洗浄緩衝液（３×ＳＳＣ、０．５％［ｗ／ｖ］ドデシルサルコシン酸ナトリウム、ｐＨ７．０；予め、２０×ストック［３Ｍ  ＮａＣｌ、０，３Ｍ  クエン酸Ｎａ３）をラウロイルサルコシンナトリウムなしで調製し、適宜希釈する）で２回洗浄した。
【０３３９】
（試料調製）
全ての試料を、２連でアッセイした。血漿試料を氷上で融解し、ボルテックスにかけ、卓上冷却遠心機中で軽くスピンダウンした。組織ホモジネートを室温で融解し、最大速度およびＲＴで５分遠心分離した。各試料５μｌだけをアッセイのために取り出し、その後保管のため冷凍庫に戻した。ハイブリダイゼーション緩衝液（洗浄緩衝液中８ｎＭのｍＮＯＸ−Ｅ３６検出プローブ［配列番号２８２］）を用いて、以下のスキームに従って室温で試料を希釈した：
１：３０  ５μｌ  試料＋１４５μｌ  ハイブリダイゼーション緩衝液
１：３００  ２０μｌ  １：３０＋１８０μｌ  ハイブリダイゼーション緩衝液
１：３０００  ２０μｌ  １：３００＋１８０μｌ  ハイブリダイゼーション緩衝液
１：３００００  ２０μｌ  １：３０００＋１８０μｌ  ハイブリダイゼーション緩衝液
【０３４０】
全ての試料希釈物をアッセイした。ｍＮＯＸ−Ｅ３６標準を段階希釈して、０〜４ｎＭの範囲にわたる８点検量線にした。ＱＣなしの試料を調製し、アッセイした。較正標準は、試験中試料のものと同一であった。
【０３４１】
（ハイブリダイゼーションおよび検出）
試料を９５℃で１０分間加熱し、３７℃まで冷却した。スピーゲルマー／検出プローブ複合体を、固定化捕捉プローブに３７℃で３０分間アニールさせた。結合していないスピーゲルマーを、それぞれ洗浄緩衝液および１×ＴＢＳＴ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．５）で２回洗浄することによって除去した。ハイブリダイズした複合体を、１×ＴＢＳＴにおいて１：５０００希釈されたストレプトアビジンアルカリホスファターゼによって室温で１時間検出した。結合していないコンジュゲートを除去するために、１×ＴＢＳＴおよび２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．８（各２回）でウェルを再度洗浄した。最後にウェルを、１００ｍｌのＣＳＤＰ基質（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で満たし、室温で４５分間インキュベートした。ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で化学発光を測定した。
【０３４２】
（データ分析）
以下のアッセイした試料希釈物を、定量的データ分析のために使用した。
ラットＥＤＴＡ血漿  １：２０００
【０３４３】
ビヒクル群（スピーゲルマーが投与されなかった）から得られたデータを、バックグラウンドシグナルとして差し引いた。
【０３４４】
本明細書に記載のサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイはまた、それぞれのＮＯＸ−Ｅ３６捕捉プローブ（配列番号２５５）およびそれぞれのＮＯＸ−Ｅ３６検出プローブ（配列番号２５６）が使用されなければならないスピーゲルマーＮＯＸ−３６、ＮＯＸ−Ｅ３６−５’−ＰＥＧおよびＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧに対して同様に作用する（データは示さず）。
【０３４５】
［結果］
（ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスの生存および腎臓疾患を改善する）
メスＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスは、ヒトのびまん性増殖性ループス腎炎と顕著な類似性を有する増殖性免疫複合体型糸球体腎炎を発症し、その後死亡する。この治療試験設計では、処理されたＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスを、ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化抗ｍＣＣＬ２スピーゲルマー、ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化対照（「ＰｏＣ」）−スピーゲルマーまたはビヒクルで１４〜２４週齢まで処理した。この時点で、ビヒクル、ＰｏＣまたはＰｏＣ−ＰＥＧ処理ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスは、糸球体マクロファージ浸潤ならびに糸球体および間質Ｍａｃ２陽性マクロファージおよび間質ＣＤ３陽性リンパ球からなる混合性の糸球体周辺および間質炎症細胞浸潤により特徴付けられる、びまん性増殖性糸球体腎炎を示した（図３４および３５）。ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは、ループス腎炎の活性および慢性化指標ならびに前述の腎臓炎症マーカーを改善した（図３５）。非ＰＥＧ化分子ｍＮＯＸ−Ｅ３６は、慢性指標および間質マクロファージおよびＴ細胞計数に対して有効性が低かった（図３５）。進行性慢性腎臓疾患を、ビヒクル、ＰｏＣ、およびＰｏＣ−ＰＥＧ処理マウスにおいて尿細管萎縮および間質性線維症の集密面積によってさらに示した（図３４）。これらの変化を定量するために形態計測を適用して、ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化ｍＮＯＸ−Ｅ３６は、全て慢性腎臓疾患の重症度および予後のマーカーである間質容積、尿細管細胞損傷、および尿細管萎縮を減少させることを見出した（図３６）。ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは５０％死亡率を改善したが、非ＰＥＧ化ｍＮＯＸ−Ｅ３６は改善しなかった（図３７）。したがって、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは、腎臓マクロファージおよびＴ細胞浸潤の数を減少させ、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスのループス腎炎および（腎臓の）生存を改善することができる。ｍＮＯＸ−Ｅ３６およびｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧによる処理が、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスの腎臓炎症に影響を及ぼすかどうかを試験するために、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行い、腎疾患の進行中にＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスの腎臓において徐々に上方制御されることが以前に示されている炎症誘発性ケモカインＣＣＬ２およびＣＣＬ５（Ｐｅｒｅｚ  ｄｅ  Ｌｅｍａ  ２００１）の発現レベルを評価した。１４〜２４週齢のｍＮＯＸ−Ｅ３６およびｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧによる処理は、ビヒクル処理対照と比較して、腎臓のＣＣＬ２およびＣＣＬ５ｍＲＮＡ発現を減少させた（図３８）。
【０３４６】
（抗ＣＣＬ２スピーゲルマーは、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおいて腎外性自己免疫性組織損傷を減少させる）
ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおいて皮膚および肺もまた、一般に自己免疫性組織損傷から影響を受ける。ビヒクル処理されたマウスにおいて自己免疫肺病は、中等度細気管支周囲および血管周囲の炎症細胞浸潤によって特徴付けられ、マウスの６０％において皮膚病変が観察された（図３９、４０および３５）。ｍＮＯＸ−Ｅ３６およびｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは両方とも、それぞれビヒクル、ＰｏＣ、およびＰｏＣ−ＰＥＧ処理したＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスと比較して、気管支周囲の炎症および皮膚疾患を減少させた（図３９、４０および３５）。したがって、ＣＣＬ２−特異的スピーゲルマーの作用はループス腎炎に限定されず、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおける自己免疫性組織損傷の他の症状にまで及ぶ。
【０３４７】
（ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおけるｍＮＯＸ−Ｅ３６およびリンパ増殖性症候群、ｄｓＤＮＡ自己抗体および血清サイトカイン濃度）
メスＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスは、巨大脾腫ならびに頸部、腋窩、鼠径、および腸間膜リンパ節の腫脹によって特徴付けられるリンパ増殖性症候群を発症する。ｍＮＯＸ−Ｅ３６およびｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは両方とも、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおいて脾臓およびリンパ節の重量に影響を及ぼさなかった（図４１）。ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおいて自己免疫は、ｄｓＤＮＡを含む複数の核抗原に対する自己抗体の産生によって特徴付けられる。２４週齢ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおいて、血清ｄｓＤＮＡ  ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ自己抗体が高レベルで存在した。ｍＮＯＸ−Ｅ３６およびｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは両方とも、これらのＤＮＡ自己抗体のいずれにも影響を及ぼさなかった（図４１）。ビヒクル処理されたＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおいてループス様疾患は、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、およびＩＬ−６の血清濃度の上昇によって特徴付けられた。ｍＮＯＸ−Ｅ３６およびｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは両方とも、これらの炎症性メディエーターのいずれにも影響を及ぼさなかった（図４１）。したがって、両方のｍＮＯＸ−Ｅ３６変異体は、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおいてリンパ増殖、抗ｄｓＤＮＡ  ＩｇＧ産生、および血清サイトカイン濃度に影響を及ぼさない。
【０３４８】
（ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおけるｍＮＯＸ−Ｅ３６およびｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧの血漿濃度）
ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスの進行性腎臓疾患中の薬物暴露をモニターするために、ｍＮＯＸ−Ｅ３６およびｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ血漿濃度を１週間間隔で測定した。注入３時間後のｍＮＯＸ−Ｅ３６および注入２４時間後のｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧの血漿濃度中央値は、試験の間中、それぞれ約３００ｎＭおよび１μＭであった（図４２）。したがって、ＰＥＧ化はｍＮＯＸ−Ｅ３６の血漿濃度を増加させ、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスの進行性腎臓疾患は、両スピーゲルマーの薬物動態を調節しなかった。
【０３４９】
（ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは骨髄からの単球の遊出を遮断する）
ケモカイン受容体ＣＣＲ２（Ｓｅｒｂｉｎａ  ２００６）を関連させるために、細菌感染中の骨髄からの単球遊出を示したが、自己免疫の関連におけるＣＣＬ２の役割は仮説のままである。したがって、２４週齢ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスのｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧおよびビヒクル−処理群のマウスにおける末梢血および骨髄中のＣＣＲ２陽性単球集団を試験した。ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧによる処理は、骨髄中のＣＣＲ２陽性細胞の割合を１３％から２６％まで増加させた一方で、末梢血中のこの集団を２６％から１１％まで減少させた（図４３）。これらのデータは、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスの自己免疫疾患中の、ＣＣＲ２陽性細胞の骨髄からの回避に関するＣＣＬ２の役割を支持する。
【０３５０】
［まとめ］
スピーゲルマー技術を適用することによって、インビトロおよびインビボでｍＣＣＬ２を強力に遮断する、新しい特異的ｍＣＣＬ２アンタゴニストを作り出した。実際に、遅発性のＣＣＬ２スピーゲルマーによる処理は、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおいて進行性ループス様自己免疫性組織損傷を顕著に改善した。これらのデータは、慢性炎症性組織損傷におけるＣＣＬ２の中心的役割を支持し、ＣＣＬ２スピーゲルマーを自己免疫性組織損傷のための新規な治療法として特定する。
【０３５１】
［実施例９：  片腎摘出糖尿病マウスにおける抗ｍＭＣＰ−１スピーゲルマーを用いた糖尿病性ネフロパシーの療法］
糖尿病性ネフロパシーは、アンジオテンシン依存的な病理学的機序を標的とすることが必ずしも疾患進行を阻止するとは限らないため（Ｚｉｍｍｅｔ  ２００１、Ｒｉｔｚ  １９９９、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｒｅｎａｌ  Ｄａｔａ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００４、Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ２００３）、依然として末期腎臓疾患の主な原因である。したがって、糖尿病性ネフロパシーのための治療装備に別の治療戦略を追加することが必要とされている。最近の実験的研究のデータは、糖尿病性ネフロパシーの進行を腎内炎症に関連付けている（Ｇａｌｋｉｎａ  ２００６、Ｍｏｒａ  ２００５、Ｍｅｙｅｒ  ２００３、Ｔｕｔｔｌｅ  ２００５）。たとえば、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキセートまたは放射線治療は、ストレプトゾトシン誘発性糖尿病性ネフロパシーを有するラットにおいて尿アルブミン排泄、および糸球体硬化症を減少させる（Ｙｏｚａｉ  ２００５、Ｕｔｉｍｕｒａ  ２００３）。それにもかかわらず、糖尿病性ネフロパシーにおける腎内炎症の分子および細胞機序は、依然としてあまり特徴付けられていない。糖尿病性ネフロパシー患者は、炎症の急性期マーカーの血清濃度が増加するが、これは腎内炎症を表さないことがある（Ｄａｌｌａ  Ｖｅｓｔｒａ  ２００５、Ｎａｖａｒｒｏ  ２００３）。糖尿病性ネフロパシー患者は、尿中に、腎内炎症により特異的であり得る高濃度のＣＣ−ケモカイン単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２）を排泄する（Ｍｏｒｉｉ  ２００３、Ｔａｓｈｉｒｏ  ２００２、Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ  ２００６）。実際に、ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２は、高グルコース濃度または後期糖化最終産物に暴露されたヒトメサンギウム細胞によって発現される。（Ｉｈｍ  １９９８、Ｙａｍａｇｉｓｈｉ  ２００２）。ＣＣＬ２は、血管内から血管外区画、すなわち糸球体および腎間質への白血球動員の複雑な多段階プロセスに含まれる（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  １９９８）。実際に、マクロファージ浸潤は、ヒトおよび実験用の糖尿病性糸球体硬化症および尿細管間質損傷に共通する所見である（Ｂｏｈｌｅ  １９９１、Ｆｕｒｕｔａ  １９９３、Ｃｈｏｗ  ２００７）。ＣＣＬ２−欠損１型または２型糖尿病マウスは、糸球体マクロファージ数が少なく、これは少ない糸球体損傷と関連している（Ｃｈｏｗ  ２００４、Ｃｈｏｗ  ２００６）。これらの研究において、１型および２型糖尿病性ネフロパシーの糸球体病理に関するＣＣＬ２の機能的役割もまた示された。したがって、ＣＣＬ２は糖尿病性ネフロパシーのための潜在的な治療標的を提示することができ、有利な薬物動態プロファイルを有する好適なＣＣＬ２アンタゴニストを、この疾患の関連において検証するべきである。この実施例において本発明者らは、進行性糖尿病性ネフロパシーを有する２型糖尿病性ｄｂ／ｄｂマウスにおいて、ＰＥＧ化抗ＣＣＬ２スピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧの作用を報告する。本発明者らは、抗ＣＣＬ２−スピーゲルマーが糖尿病性ネフロパシーの治療に好適であるだろうことを示した。
【０３５２】
（動物および実験プロトコール）
オスの５週齢Ｃ５７ＢＬＫＳ  ｄｂ／ｄｂまたはＣ５７ＢＬＫＳ野生型マウスを、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｒｙ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手し、フィルタートップケージにおいて１２時間明／暗サイクルで飼育し、食物および水は試験期間中無制限に摂取させた。ケージ、床敷、巣材、食物、および水は、使用前にオートクレーブにかけることによって滅菌した。ｄｂ／ｄｂおよび野生型マウスにおいて６週齢で一側腎摘出術（「１Ｋ」マウス）または偽手術（「２Ｋ」マウス）を、１ｃｍの側腹切開によって以前に記載されている通り行った（Ｂｏｗｅｒ  １９８０）。偽手術群のマウスにおいて腎臓は元の位置に置いたままにした。１０週間後、４カ月齢で、１Ｋ  ｄｂ／ｄｂマウスを、５％グルコース中のｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧまたはＰｏＣ−ＰＥＧ（用量、０．９μｍｏｌ／ｋｇ。注入量、１ｍｌ／ｋｇ）を週に３回皮下注入される２つの群に分けた。治療を８週間継続し（６カ月齢まで）、動物を屠殺し、組織病理学的評価のための組織を得た。全ての実験手順は、地方当局より承認を得た。
【０３５３】
（糖尿病性ネフロパシーの評価）
全ての免疫組織学的試験を、パラフィン包埋した切片において記載の通り（Ａｎｄｅｒｓ  ２００２）行った。以下の抗体を、一次抗体として使用した。ラット抗Ｍａｃ２（糸球体マクロファージ、Ｃｅｄｅｒｌａｎｅ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ、１：５０）、抗Ｋｉ−６７（細胞増殖、Ｄｉａｎｏｖａ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１：２５）。組織病理学的評価のために、各マウスから腎臓部分をリン酸緩衝生理食塩水中で１０％ホルマリンにおいて固定し、パラフィン中に包埋した。製造業者（Ｂｉｏ−Ｏｐｔｉｃａ、Ｍｉｌａｎｏ、Ｉｔａｌｙ）の使用説明書に従って、３μｍ切片を過ヨウ素酸−シッフ試薬または銀で染色した。糸球体硬化症の病変を、盲検観察者によって以下の通り半定量的スコアを使用して評価した。それぞれ、０は病変なし、１は２５％未満の硬化、２は２５〜４９％硬化、３は５０〜７４％硬化、４は７５〜１００％硬化。１切片当たり１５個の糸球体を分析した。間質容積および尿細管拡張の指標を、以前に記載されている通り（Ａｎｄｅｒｓ  ２００２）、１０個の重複していない皮質野において１００個の格子点を重ね合わせることによって決定した。１５個の高倍率視野（ｈｐｆ、４００×）において、盲検観察者によって間質細胞数を測定した。脱パラフィンした糸球体から、ＲＮＡ調製およびリアルタイム定量（ＴａｑＭａｎ）ＲＴ−ＰＣＲを行った。溶解緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２％ＳＤＳおよび２０μｇ／ｍｌのプロティナーゼＫ）中で６０℃で１６時間インキュベーション後、フェノール−クロロホルムによるＲＮＡ抽出を行った。糸球体ＲＮＡを、１０μｌのＲＮａｓｅフリー水中に溶解させた。全器官および糸球体ＲＮＡの逆転写およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、記載の通り（Ａｎｄｅｒｓ  ２００２、Ｃｏｈｅｎ  ２００２）行った。ｄｄＨ２Ｏからなる対照は、標的およびハウスキーパー遺伝子に関して陰性であった。ｍＣＣＬ２、Ｇａｐｄｈ、および１８ＳｒＲＮＡのためのオリゴヌクレオチドプライマー（３００ｎＭ）およびプローブ（１００ｎＭ）は、ＰＥ製ｐｒｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ＴａｑＭａｎアッセイ試薬であった。プライマーおよびプローブは、ＡＢＩ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ製であった。糸球体濾過量（ＧＦＲ）を、単回ボーラス注入の５、１０、１５、２０、３５、６０、および９０分後の血漿ＦＩＴＣ−イヌリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のクリアランス動態によって決定した（Ｑｉ  ２００４）。蛍光を４８５ｎｍ励起で測定し、５３５ｎｍでの発光を読み取った。２コンパートメントモデルに基づいて、非線形曲線適合ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してＧＦＲを推定した。全てのデータは、平均±ＳＥＭとして表す。ＡＮＯＶＡを使用して群の比較を行い、多重比較のためにｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を使用した。ｐ＜０．０５の値を、統計的有意性を示すとみなした。
【０３５４】
［結果］
（ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは、片腎摘出ｄｂ／ｄｂマウスにおいて糸球体マクロファージ数および球状糸球体硬化症を減少させる）
ｄｂ／ｄｂマウスにおいて機能的ＣＣＬ２の欠如が糸球体マクロファージ動員の減少と関連する（Ｃｈｏｗ  ２００７）、ならびにインビトロおよびインビボでｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧがＣＣＬ２を介するマクロファージ動員を遮断できる場合、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは、進行性２型糖尿病性ネフロパシーｄｂ／ｄｂマウスにおいて腎臓マクロファージ動員を減少させるはずである。この仮説を試験するために、本発明者らは、片腎摘出（「１Ｋ」）ｄｂ／ｄｂマウスにおいて４カ月齢でｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧまたはＰｏＣ−ＰＥＧの皮下注入を開始した。糖尿病性ネフロパシーの評価のための組織を採取した８週間、治療を継続した。その期間中、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ治療は、非糖尿病性ＢＬＫＳマウスと比較してｄｂ／ｄｂマウスの全ての群において共に著しく上昇した白血球数もしくは血小板数、血中グルコース濃度または体重に顕著な影響を及ぼさなかった（データは示さず）。興味深いことに、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは１Ｋ  ｄｂ／ｄｂマウスにおいてＣＣＬ２の血清濃度を増加させ、ＣＣＬ２アンタゴニストが循環血中にＣＣＬ２を保持していることを示した（図４４）。本発明者らの仮説と一致して、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ処理ｄｂ／ｄｂマウスにおいて糸球体内のＫｉ−６７陽性増殖細胞数の減少を伴って、ＰｏＣ−ＰＥＧまたはビヒクル処理されたｄｂ／ｄｂマウスと比較して糸球体マクロファージの数を大幅に４０％減少させた（図４５）。これらの所見は、１Ｋ  ｄｂ／ｄｂマウスにおける球状糖尿病性糸球体硬化症の顕著な改善と関連していた（図４６）。実際に、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ治療は、齢を適合させた腎摘出していない（「２Ｋ」）ｄｂ／ｄｂマウスにおいて存在する糸球体硬化症の程度まで、１Ｋ  ｄｂ／ｄｂマウスにおいて糖尿病性糸球体硬化症を減少させた（図４６）。これらの所見は、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧによるＣＣＬ２依存性の糸球体マクロファージ動員の遮断の遅延が、２型糖尿病性ｄｂ／ｄｂマウスにおいて球状糖尿病性糸球体硬化症を予防することを示す。
【０３５５】
（ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは、１Ｋ  ｄｂ／ｄｂマウスにおいてＧＦＲを改善する）
１Ｋ  ｄｂ／ｄｂマウスにおける糖尿病性糸球体硬化症に対するｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ治療の有益な効果は、より良好なＧＦＲを伴うべきである。本発明者らはｄｂ／ｄｂマウスにおけるＧＦＲのマーカーとしてＦＩＴＣ−イヌリンクリアランス動態を分析した（Ｑｉ  ２００４）。ｄｂ／ｄｂマウスにおける約２５０ｍｌ／分の正常なＧＦＲ（Ｑｉ  ２００４）と比較して、本発明者らは、ＰｏＣ−ＰＥＧを注入された６カ月齢の１Ｋ  ｄｂ／ｄｂマウスにおいて１１２±２３ｍｌ／分の減少したＧＦＲを見出した（図４７）。ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ処理は、１Ｋ  ｄｂ／ｄｂマウスにおいてＧＦＲを２３１±３０ｍｌ／分までを大幅に改善し（ｐ＜０．００１）、ＣＣＬ２依存性の糸球体マクロファージ動員を遮断することによって２型糖尿病マウスの腎臓機能もまた改善することができることを示唆した。
【０３５６】
（ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは、１Ｋ  ｄｂ／ｄｂマウスにおいて間質マクロファージ数および尿細管間質損傷を減少させる）
ヒトの進行性糖尿病性ネフロパシーは、大多数の間質マクロファージおよび尿細管間質損傷に関連している（Ｂｏｈｌｅ  １９９１）。２Ｋ  ｄｂ／ｄｂマウスにおいて間質マクロファージ浸潤および重大な尿細管間質損傷は、８カ月齢前には起こらない（Ｃｈｏｗ  ２００７）。早期の一側腎摘出術は、ｄｂ／ｄｂマウスにおいて尿細管間質病理の進行を促進する（Ｎｉｎｉｃｈｕｋ  ２００５）ので、本発明者らは間質マクロファージ、尿細管間質損傷のマーカーとして尿細管拡張および間質容積を、６カ月齢の全ての群のマウスにおいて定量した。この時点で１Ｋ  ｄｂ／ｄｂマウスは、２Ｋ  ｄｂ／ｄｂマウスと比較して間質マクロファージ数の増加および尿細管拡張および間質容積の顕著な上昇を示した（図４５、図４８）。ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ治療は、１Ｋ  ｄｂ／ｄｂマウスにおいて間質マクロファージ数を５３％、ならびに尿細管拡張および間質容積を減少させた（図４５、図４８）。したがって、ＣＣＬ２依存性の腎臓マクロファージ動員の遮断は、２型糖尿病性ｄｂ／ｄｂマウスにおいて尿細管間質損傷も予防する。
【０３５７】
（ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは、１Ｋ  ｄｂ／ｄｂマウスにおいてＣＣＬ２の腎臓の発現を減少させる）
マクロファージ浸潤は、組織損傷における炎症性応答、たとえば、局所的ＣＣＬ２発現を増幅する。本発明者らはしたがって、腎臓マクロファージにおけるｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧに関連する減少は、腎臓ＣＣＬ２発現の減少を伴うであろうという仮説を立てた。本発明者らは、ｄｂ／ｄｂマウスにおけるＣＣＬ２のｍＲＮＡ発現を定量するために、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用した。ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは、６カ月齢の１Ｋ  ｄｂ／ｄｂマウスの腎臓において、齢を適合させたＰｏＣ−ＰＥＧ処理マウスと比較してＣＣＬ２のｍＲＮＡレベルを減少させた（図４９）。ＣＣＬ２の空間的発現をさらに評価するために、本発明者らは、腎切片に対してＣＣＬ２タンパク質の免疫染色を行った。１Ｋ  ｄｂ／ｄｂマウスにおいて、ＣＣＬ２の発現は、２Ｋ  ｄｂ／ｄｂまたは２Ｋ野生型マウスと比較して、糸球体、細管、および間質細胞において著しく増強された（図５０）。ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは、ビヒクルまたはＰｏＣ−ＰＥＧ処理１Ｋ  ｄｂ／ｄｂマウスと比較して、これら全ての区画においてＣＣＬ２の染色を著しく減少させた。これらのデータは、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧによるＣＣＬ２依存性の腎臓マクロファージ動員の遮断が、１Ｋ  ｄｂ／ｄｂマウスにおいてＣＣＬ２局所的発現を減少させることを示す。
【０３５８】
［まとめ］
炎症がヒト糖尿病性ネフロパシーの進行に寄与する（Ｔｕｔｔｌｅ  ２００５）という考えは次第に受け入れられ、ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２はこの疾患を治療するための潜在的な標的として焦点になっている。この実施例において本発明者らは、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧによる片腎摘出糖尿病マウスの治療が、増殖糸球体細胞の減少を伴って、６カ月齢での糸球体（および間質）マクロファージ数を減少させたことを示している。加えて、ＣＣＬ２ｍＲＮＡの腎臓／糸球体発現は、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ治療により著しく減少した。さらに、治療群における糸球体マクロファージおよび糸球体増殖細胞数の減少は、球状糸球体硬化症からの保護および糸球体濾過率の顕著な改善に関連していた。糖尿病マウスにおける糸球体病理および腎臓機能に対するｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧの有益な効果は、別の糸球体損傷モデルにおいて別のＣＣＬ２アンタゴニストを使用する試験と一致している（Ｌｌｏｙｄ  １９９７、Ｈａｓｅｇａｗａ  ２００３、Ｔａｎｇ  １９９６、Ｗｅｎｚｅｌ  １９９７、Ｆｕｊｉｎａｋａ  １９９７、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  １９９９）。注目すべきことに、ＣＣＬ２遮断開始の遅延は、１Ｋ  ｄｂ／ｄｂマウスにおいて尿細管間質病理の減少と関連している間質マクロファージ数もまた減少させた。総合して、これらのデータは、ＣＣＬ２の糖尿病性ネフロパシーのための有望な治療標的としての正当性を立証し、疾患の進行した段階であってもスピーゲルマーによるＣＣＬ２遮断を開始することが保護になり得ることを示唆する。
【０３５９】
［実施例１０：  ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧは、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおいてびまん性増殖性ループス腎炎および肺炎を管理するためのシクロフホスファミドの用量減少を可能にする］
ヒトびまん性増殖性ループス腎炎（省略形ＤＰＬＮ）の管理は、シクロフホスファミド（省略形ＣＹＣ）またはミコフェノール酸モフェチル（省略形ＭＭＦ）による強力な免疫抑制を必要とする。２つの薬物はそれぞれ、高い罹病率および死亡率と関連している（Ａｐｐｅｌ  ２００７）。最も重篤な有害事象および死亡は、ＣＹＣおよびＭＭＦの非特異的免疫抑制作用のための感染症に関連していた（Ａｐｐｅｌ  ２００７）。自己免疫炎症を特異的に遮断する新規な薬物は、ＣＹＣおよびＭＭＦを置き換えることによって、または組み合わせて使用する場合に大幅な用量減少を可能にすることによって、現在の治療プロトコールの毒性を減少させ得る。
【０３６０】
実験的研究により、ＭＣＰ−１およびその受容体ＣＣＲ２が、全身性エリテマトーデス（省略形ＳＬＥ）の症状などの自己免疫性組織損傷において極めて重大な役割を有することが明らかとなり（Ｇｅｒａｒｄ  ２００１）、たとえば、実験用ＳＬＥを有するＭＣＰ−１またはＣＣＲ２−欠損ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスは、ＤＰＬＮから保護されることが実証されている（Ｐｅｒｅｚ  ２００５、Ｔｅｓｃｈ  １９９９）。単独療法としての抗ｍＭＣＰ−１スピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧによるＭＣＰ−１遮断の有益な効果は、すでにメスＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスによってインビボで実証されており、実施例９において示すように、１４週齢で開始したｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧによる１０週間の処理は、ＤＰＬＮを顕著に改善した。治療効果は明らかであるが、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧの有効性がどのようにＣＹＣまたはＭＭＦに匹敵するのかは不明なままである。免疫系を効果的に抑制する最大用量のＣＹＣと同等の治療効果は、ａｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧを加えた低用量ＣＹＣの組み合わせによっても達成できるという仮説を評価するするために、第２のインビボ試験を行った。
【０３６１】
（動物および実験プロトコール）
７週齢のメスＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスを、Ｈａｒｌａｎ  Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ（Ｂｏｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、１２時間の明暗サイクルで通常の飼育条件下に保った。水および標準食（Ｓｓｎｉｆｆ、Ｓｏｅｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）は、自由に摂取させた。１４週齢から、マウスに以下の通り１０週間注入した。（Ａ）、５％グルコース皮下投与（ビヒクル群）、（Ｂ）は０．８９μｍｏｌ／ｋｇのＰＥＧ化対照スピーゲルマーｒｅｖｍＮＯＸ−Ｅ３６皮下投与、（Ｃ）は０．８９μｍｏｌ／ｋｇのｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧ皮下投与、（Ｄ）は３０ｍｇ／ｋｇ／４週のＣＹＣ腹腔内投与（ＣＹＣ低）、（Ｅ）は３０ｍｇ／ｋｇ／週のＣＹＣ腹腔内投与（ＣＹＣ高）、（Ｆ）は０．８９μｍｏｌ／ｋｇのｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧ＋３０ｍｇ／ｋｇ／４週のＣＹＣ（組み合わせ）、および（Ｇ）は１００ｍｇ／ｋｇ／日のＭＭＦ経口（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。全てのビヒクルおよびスピーゲルマー注入は、３×／週で行った。マウスは、１０週間の治療の最後に頸椎脱臼によって屠殺した。全ての実験手順は、ドイツの実験動物取り扱い倫理規定に従って行い、地方当局より承認を得た。
【０３６２】
（全身性ループスの評価）
脾臓および腸間膜リンパ節の大部分の全体重に対する重量比を、ループス関連リンパ球増殖性症候群のマーカーとして計算した。尿アルブミン／クレアチニン比は、以前に記載されている通り（Ｐａｗａｒ  ２００６）決定した。全てのマウスについて、腎臓および肺を１０％緩衝ホルマリン中で固定して、処理し、パラフィン中に包埋した。過ヨウ素酸−シッフ染色のための５μｍの切片を、慣用のプロトコール（Ａｎｄｅｒｓ  ２００２）に従って調製した。腎臓病変の重症度を、ヒトループス腎炎について記載されている通り（Ａｕｓｔｉｎ  １９８４）活性および慢性化に関する指標を使用して等級付けした。気管支周囲の炎症の重症度を、盲検観察者によって半定量的に０〜４に等級付けした。免疫染色を以前に記載されている通り（Ａｎｄｅｒｓ  ２００２）行った。以下の一次抗体を使用した：ラット抗Ｍａｃ２（マクロファージ、Ｃｅｄｅｒｌａｎｅ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ、１：５０）、抗マウスＣＤ３（１：１００、クローン５００Ａ２、ＢＤ）。陰性対照は、それぞれのアイソタイプ抗体とのインキュベーションを含んでいた。１切片当たり１５個の皮質糸球体において陽性糸球体細胞を計数した。間質細胞を、高倍率視野（省略形ｈｐｆ）によって計数した。
【０３６３】
（統計分析）
データは、平均±平均の標準誤差（省略形ＳＥＭ）として表す。単変量ＡＮＯＶＡを使用して、群間の比較を行った。多重比較のためにＰｏｓｔｈｏｃ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を使用した。ｐ＜０．０５の値を、統計的有意性を示すとみなした。
【０３６４】
（ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧによる追加療法は、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスの腎臓疾患に対する月１回のＣＹＣの効果を向上させる）
メスＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスは、ヒトのＤＰＬＮと類似の増殖性免疫複合体型糸球体腎炎を発症する。ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスを、１４週齢から２４週齢までＣＹＣ、ＭＭＦ、スピーゲルマーまたはビヒクルで処理した。これは、１４週齢でＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスが４．１±１．１の活性スコア指標でＤＰＬＮを示したため、治療のための処理プロトコールを表す。この週齢で、尿細管間質区画の主な異常は存在しなかった（示さず）。１０週間の治療後、ビヒクル処理および対照スピーゲルマー処理したＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスは、糸球体過形成、糸球体マトリックスの膨張、多巣性壊死、および混合性の糸球体周辺および間質炎症細胞浸潤を伴うＤＰＬＮを示した。週１回のＣＹＣおよび月１回のＣＹＣ＋ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧは、ループス腎炎の活性および慢性指標の改善において同等に強力であった（図５１Ａおよび５１Ｂ）。ｍＮＯＸ−Ｅ３６および低用量ＣＹＣ単独ならびにＭＭＦは、あまり強力ではなかったが、やはりループス腎炎の活性および慢性指標を顕著に改善した。したがって、月１回のＣＹＣによるレジメンにｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧを加えることは、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスのＤＰＬＮのための週１回のＣＹＣ療法と同程度に強力である。
【０３６５】
（ｍＮＯＸ−Ｅ３６および月１回のＣＹＣは、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウス腎臓における免疫細胞浸潤の減少に対して相加効果を有する）
免疫細胞浸潤は、ループス腎炎における腎臓損傷に寄与する（Ｖｉｅｌｈａｕｅｒ  ２００６）。ＭＣＰ−１は、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスに対するＴ細胞およびマクロファージの動員を仲介する（Ｔｅｓｃｈ  １９９９）。したがって、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧ／月１回のＣＹＣ組み合わせ相加効果は、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおけるマクロファージおよびＴ細胞動員の減少に関連し得るという仮説を立てた。免疫染色による糸球体および間質マクロファージならびに間質Ｔ細胞（Ｍａｃ２＋マクロファージおよびＣＤ３＋Ｔ細胞）数の評価によって、週１回のＣＹＣおよび月１回のＣＹＣ＋ｍＮＯＸ−Ｅ３６は、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスの腎臓における糸球体ならびに間質Ｍａｃ２＋マクロファージ数を減少させることにおいて同等に強力であることが明らかとなった（図５１Ｃおよび５１Ｄ）。ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧおよび月１回のＣＹＣ単独ならびにＭＭＦは、あまり強力ではなかったが、やはり両区画におけるマクロファージを顕著に減少させた（図５１Ｃおよび５１Ｄ）。同様のことが、間質ＣＤ３陽性Ｔ細胞数について見出された（図３Ｅ）。したがって、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスの腎臓病理に対するｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧおよび月１回のＣＹＣの相加効果は、間質マクロファージおよびＴ細胞の、ならびに週１回のＣＹＣの作用と同様な糸球体マクロファージの大幅な減少に関連している。
【０３６６】
（ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧおよび月１回のＣＹＣは、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおける肺損傷の減少に対して相加効果を有する）
自己免疫気管支周囲炎は、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおけるループス様全身性自己免疫のもう１つの症状である。週１回のＣＹＣは、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおける肺損傷の管理において月１回のＣＹＣよりも有効であった。しかしながら、月１回のＣＹＣ＋ｍＮＯＸ−Ｅ３６は、週１回のＣＹＣと同程度に有効であった（図５２）。驚くべきことに、ＭＭＦは、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおける肺損傷に作用を及ぼさなかった。
【０３６７】
［まとめ］
データは、自己免疫性組織損傷がすでに確立されている（Ｔｅｓｃｈ  １９９９；Ｐｅｒｅｚ  ２００１）時点の１４週齢で開始したｍＮＯＸ−Ｅ３６および低用量ＣＹＣ治療の組み合わせが、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおけるＤＰＬＮおよび肺損傷の抑制において高用量ＣＹＣと同程度に有効であることを示す。結論として、ＣＹＣと組み合わせたＭＣＰ−１の阻害は、自己免疫組織損傷のようなＤＰＬＮの同等に強力な管理にもかかわらずＣＹＣの重篤な免疫毒性作用を回避する、大幅なＣＹＣ用量減少を可能にする。この新しい考えは、ＤＰＬＮ、およびＭＣＰ−１依存性の免疫細胞浸潤を含む自己免疫疾患の潜在的な他の重篤な症状の患者における、深刻で生命にかかわる恐れのあるＣＹＣ  毒性を減少させるために役立ち得る。
【０３６８】
［実施例１１：  ＣＯＰＤスクリーニング試験、ＭＣＰ−１結合スピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧを用いた治療による、肺への細胞浸潤の減少］
異なるグループの慢性呼吸器疾患は、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（省略形ＣＯＰＤ）、および喘息を含む。ＣＯＰＤおよび喘息に罹患した患者の肺組織構造は、ＣＯＰＤにおいてマクロファージおよび顆粒球、主に好中球、喘息において好酸球の顕著な気道浸潤を示す。臨床試験において、これらの炎症性パラメータは、肺機能の減少および非特異的刺激に対する過度の気管支収縮（気道過敏症［省略形ＡＨＲ］）と相関することが示されている。ＣＯＰＤの慢性炎症を模倣し、数日間にわたって肺機能を試験することができ、好中球増加およびＡＨＲを伴う粘液過分泌を刺激するインビボモデルはほとんどない。リポ多糖（省略形ＬＰＳ）へのラット／ヒトの単回暴露は、急性の肺好中球増加およびＡＨＲを引き起こすことが示されている。ＬＰＳの吸入は、ＣＯＰＤに類似したさらなる特徴、すなわち、進行性の肺機能低下、持続性ＡＨＲ、および酸化窒素の過剰生産と共に気管支肺胞洗浄液中に好中球炎症細胞集団を引き起こす。炎症細胞活性化、動員、およびＬＰＳに由来するメディエーターは、上皮増殖、透過性、および粘液過剰分泌性の表現型を誘発すると考えられる。
【０３６９】
この報告で記載されている試験において、細菌ＬＰＳを使用したチャレンジモデルを使用して、ラットのＬＰＳ誘発性肺炎症モデルにおいてＭＣＰ−１結合スピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧの治療効果を評価した。全ての動物を、急性呼吸器炎症の誘発についてＬＰＳでチャレンジした。ＭＣＰ−１結合スピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧ、デキサメタゾン（薬理学的基準物質１）、およびロフルミラスト（薬理学的基準物質２）による治療介入を、異なる用量で行った。
【０３７０】
デキサメタゾンは、ステロイドホルモンのグルココルチコイドクラスの強力な合成メンバーである。デキサメタゾンは、以下の免疫抑制剤と同様に、抗炎症薬としてとして機能する。
（Ｉ）、抗炎症薬：グルココルチコイドはリポコルチン−１（アネキシン−１）合成を誘発し、これは次いで細胞膜に結合して、ホスホリパーゼＡ２がその基質アラキドン酸と接触するするのを阻止する。このことは、エイコサノイド産生の減少をもたらす。シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の両方）発現もまた抑制され、効果を高める。換言すると、炎症における２つの主産物、プロスタグランジンおよびロイコトリエンは、グルココルチコイドの作用によって阻害される。グルココルチコイドはまた、リポコルチン−１を刺激して細胞外空間に脱出し、そこで白血球膜受容体に結合して様々な炎症性事象：上皮接着、遊出、走化性、貪食、呼吸器バースト、ならびに好中球、マクロファージ、および単球からの様々な炎症性メディエーターの放出（リソソーム酵素、サイトカイン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ケモカインなど）を阻害する。
（ＩＩ）、免疫抑制剤：グルココルチコイドは、細胞性免疫を抑制する。グルココルチコイドは、最も重要なものはＩＬ−２遺伝子であるが、多くのサイトカイン遺伝子を阻害し、結果としてＴ細胞増殖を減少させることによって機能する。Ｔ細胞増殖を阻止することに加えて、別のよく知られている作用は、グルココルチコイド誘発性のアポトーシスである。この作用は、胸腺に依然存在する未成熟Ｔ細胞においてより顕著であるだけでなく、末梢Ｔ細胞にも影響を及ぼす。最終的に、グルココルチコイドは液性免疫を抑制して、より少量のＩＬ−２およびＩＬ−２受容体をＢ細胞に発現させる。これにより、Ｂ細胞クローンの増大および抗体合成の両方が減少する。ＩＬ−２量の減少は、活性化されるＴリンパ球細胞も減少させる。
【０３７１】
ロフルミラストは、ホスホジエステラーゼ酵素ＰＤＥ−４の選択的な長時間作用型の阻害剤として作用する薬物である。ロフルミラストは炎症性作用を有し、喘息、慢性閉塞性肺疾患および肺気腫などの肺の炎症状態を治療するための経口投与薬物として開発中である。ロフルミラストは、臨床試験において有効であることが見出されたが、悪心、下痢および頭痛を含むいくつかの用量を制限する副作用をもたらし、臨床的有効性を保持したまま副作用を最小に抑えるために、開発を継続中である。
【０３７２】
（動物および管理）
ＬＰＳ誘発性炎症の十分に確立されているモデルとして、この試験においてオスのスプラギードーレーラットを使用した。ラットは、５週齢（約８０〜１１０ｇ）でＨａｒｌａｎ  Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ、Ｂｏｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙにより供給され、試験の開始時に７週齢であった。動物は、Ｍａｋｒｏｌｏｎ（登録商標）（ポリカーボネート）ケージにおいて飼育し（ケージ当たり２匹のラット）、慣用的な実験室条件下に維持した。ケージおよび針葉樹材の床敷材（Ｓｓｎｉｆｆ  ３／４、Ｓｏｅｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）は週に２回交換した。動物飼育室の温度および相対湿度は、電子的にモニターし、連続的に記録した。範囲は、温度については２２±２℃および相対湿度については５５±１５％に設定した。自動タイミング装置によって管理される照明については、１２時間の明／暗サイクルを使用した。食餌として、ペレット状の市販の飼料を使用した（Ｓｓｎｉｆｆ  Ｒ／Ｍ−Ｈ  Ｖ１５３４、Ｓｓｎｉｆｆ−Ｓｐｅｚｉａｌｄｉａｔｅｎ、Ｓｏｅｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。食餌および飲用水（Ｓｔａｄｔｗｅｒｋｅ  Ｈａｎｎｏｖｅｒ）は、自由に摂取させた。
【０３７３】
無作為化および１回目の感作の前に２週間、動物が施設の環境に順応および順化できるようにした。試験において使用した動物は、健康状態の低下の徴候を全く示さなかった。全ての動物を、ケージにおいて毎日観察した。
【０３７４】
（材料）
ＭＣＰ−１結合スピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ
ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧのビヒクル：注入用に５％グルコース溶液
ＬＰＳ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ０１１１：Ｂ４（Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ、バッチ番号７６Ｋ４０８５）由来のリポ多糖。希釈溶液は使用する日に新たに調製した。
薬理学的基準物質（１）：デキサメタゾンリン酸二水素ナトリウム、Ｒａｔｉｏｐｈａｒｍバッチ番号Ｈ２２４１６  ４ｍｇ／ｍｌ溶液。ストック溶液は、開封後冷蔵庫に７日間保存した。希釈溶液は使用する日ごとに新たに調製した。
薬理学的基準物質（２）：ロフルミラスト（選択的ＰＤＥ４阻害剤、バッチ番号Ｋ４２９９２７）。希釈溶液は使用する日に新たに調製した。
デキサメタゾンのビヒクル：Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まないダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（省略形ＤＰＢＳ）−０．００９５Ｍ（ＰＯ４）
【０３７５】
（試験の実施）
全ての動物の重量を測定し、１回目の感作の前に無作為化した：重量を考慮して動物をそれぞれ１０匹の動物の群に均等に分割した。群に分割後、平均体重（±ＳＤ）の平均値および標準偏差を確認し、群間と同様に各群内で２０％未満であった。動物の体重は測定して個別に記録した。
【０３７６】
試験の１日目に、吸入によってＬＰＳチャレンジを行い、約２．９３μｇのＬＰＳ用量を蓄積させた。陽性および陰性対照群の動物は、ＬＰＳチャレンジ（陽性対照）または清浄空気偽チャレンジ（陰性対照）前にビヒクル（５％グルコース）で１時間静脈内処理した。薬理学的対照（１）の動物に、腹腔内ＬＰＳチャレンジの１８時間および１時間前に２ｍｇ／ｋｇデキサメタゾンを投与し、薬理学的対照（２）の動物に、動物当たり６００μｇのロフルミラストを胃内投与した。ＬＰＳチャレンジ（０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ）１時間前に、ＭＣＰ−１結合スピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧを使用した治療を、４つの異なる用量で静脈内注入によって行った。
【０３７７】
チャレンジの２４時間後、ペントバルビタールナトリウム過剰投与により痛みを伴わずに動物を屠殺し、気管支肺胞洗浄液（省略形ＢＡＬ）を回収した。動物の肺を５回、毎回５．０ｍｌの氷冷０．９％ＮａＣｌで洗浄した。ＢＡＬの評価のために、遠心分離による細胞の沈降後、１回目の洗浄液の上清をアリコートにした。その後、全ての洗浄液の細胞を、回収後ただちにプールして遠心分離した（１２００Ｕ／分で１０分）。細胞を１ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁し、ＣａｓｙＯ細胞計数器で自動で計数した。ｃｙｔｏｓｐｏｔを調製し、Ｐａｐｐｅｎｈｅｉｍに従って染色して、異なる細胞数を評価した。ｃｙｔｏｓｐｏｔ当たり全４００個の細胞数を計数することによって、マクロファージ／単球、好中球、エオシン好性白血球およびリンパ球の数を含めて肺の炎症性状態を分析した。
【０３７８】
（統計方法）
群間の顕著な差異について試験するために、ノンパラメトリック検定を使用した。多重比較（２群超）のために、Ａｎｏｖａ検定およびノンパラメトリックＤｕｎｎｅｔｔ検定を行った。ｐ＜０．０５を有する差異を有意とみなした。
【０３７９】
［結果］
ＢＡＬにおける全細胞数は、予想通り、陽性対照群と比較して陰性対照群において顕著に減少した。２０ｍｇ／ｋｇＭＣＰ−１結合スピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧによる処理は、ＢＡＬにおける陽性対照群の４１％によって顕著に減少する全細胞数をもたらす。デキサメタゾンを使用した治療は、７１％の細胞数減少を誘発したが、ロフルミラストは顕著な作用を全く示さなかった（図５３Ａを参照されたい）。
【０３８０】
吸入ＬＰＳチャレンジは、ＢＡＬにおいて７１．８％好中性顆粒球の好中球増加で表される肺の炎症を誘発した。陰性対照群の未処理動物の肺洗浄液は、好中性顆粒球を含有していなかった。デキサメタゾンおよび２ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇのＭＣＰ−１結合スピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧを使用した処理は、好中球数の顕著な減少をもたらした。すでに２ｍｇ／ｋｇのｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧは好中球数を約４２％減少させ、２０ｍｇ／ｋｇのｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧは約４８％の好中球減少をもたらした。ロフルミラスト治療は、陽性対照群と比較して気管支肺胞洗浄液中の好中球の絶対量および相対量に影響を及ぼさなかった（図５３Ｂを参照）。
【０３８１】
（結論）
ＢＡＬ中の異なる細胞数についての結果は、肺の急性ＬＰＳ誘発性炎症応答を誘発することを明確に立証した。デキサメタゾンによるＬＰＳチャレンジラットの治療的処理は、ＬＰＳへの暴露後炎症応答を顕著に阻止することを示した。顕著な治療効果は、ＭＣＰ−１結合スピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧで処理した動物についても得られた。ここに示したデータに基づいて、ＭＣＰ−１結合スピーゲルマーは、慢性呼吸器疾患、好ましくはＣＯＰＤの療法において、単独または併用療法で、好ましくはデキサメタゾンと併用療法で使用される可能性を有する。デキサメタゾンとのＭＣＰ−１結合スピーゲルマーの併用療法は、ＣＯＰＤなどの慢性呼吸器疾患を治療するために２つの独立した作用機序を利用する。
【０３８２】
［実施例１２：  実験的肺高血圧におけるＭＣＰ−１結合スピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６の作用］
ここに記載の試験は、ラットのモノクロタリン誘発性肺高血圧の確立されたモデルにおいて血行動態およびリモデリングに対するＭＣＰ−１結合スピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧの作用を測定するために行った。肺動脈高血圧（省略形ＰＡＨ）は、安静時の平均肺動脈圧≧２０ｍｍＨｇの上昇、血管リモデリングおよび右室肥大によって定義される。原発性肺高血圧（省略形ＰＰＨ）としても知られる特発性ＰＡＨは若年女性に現れることが多く、治療をしなければ３年以内に右心不全による死亡を引き起こす。疾患の重症度についての重要点は、肺動脈平滑筋細胞（省略形ＰＡＳＭＣ）の増殖および遊走により特徴付けられる、肺血管リモデリングである。内皮細胞増殖の結果として、新生内膜病変はまた、進行した段階のＰＡＨにおいても観察することができる。観察された病理は潜在的に自己永続的であり、成長因子および炎症性メディエーターの同時の調節異常が疾患進行において役割を果たしている。
【０３８３】
（肺高血圧のげっ歯類動物モデルとしてのモノクロタリン）
このモデルは、臨床的肺高血圧のための、プラスタノイズ、ホスホジエステラーゼ阻害剤およびエンドセリン受容体アンタゴニストを含む全ての現代の治療の臨床的有効性をよく予測した。加えて、これはＰＡＨのための予防および反転試験の両方の機会を提供する。モノクロタリンモデルにおいてラットは、毒性ピロリジンアルカロイドモノクロタリンの単回皮下注入を受ける。毒は、３〜４週間後に著しい肺高血圧をもたらす炎症性肺血管障害を生じさせる。このモデルについての読み出しは、右室圧、全身性圧、右室／左室＋中隔重量比（ＲＶ／［ＬＶ＋Ｓ］）および肺血管リモデリングを含む。
【０３８４】
（動物）
成年のオスのスプラギードーレーラット（体重３００〜３５０ｇ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。実験動物に関する米国国立衛生研究所のガイドラインに従って実験を行った。
【０３８５】
（実験プロトコール）
生存中の手順：モノクロタリン（省略形ＭＣＴ、Ｓｉｇｍａ、Ｄｅｉｓｈｏｆｅｎ）を、１ＭのＮａＯＨでｐＨ７．４に調整した１ＭのＨＣｌに溶解し、６０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で単回皮下注入として記載の通り投与した。対照ラットには、等量の等張生理食塩水を投与した。
【０３８６】
慢性介入試験では、ＭＣＴ注入ラットを無作為化して、プラセボとして５％グルコース（ｎ＝１０）またはＭＣＰ−１結合スピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧ（両方ともそれぞれ２ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇの用量、ｎ＝１０）を、皮下注入によって週３回投与した。ＭＣＴ注入の３週間後、肺高血圧が完全に確立されたと予想される時点に治療を開始した。さらに２週間、すなわち、合計６回の注入で動物を処理した。３５日目に、血行動態パラメータを測定し、組織を調製した。
【０３８７】
血行動態：血行動態パラメータの決定のために、ラットに麻酔をかけた。その後、調製中の血管迷走神経性の副作用を最小に抑えるために、ラットにアトロピン（２５０μｇ／ｋｇ体重）の筋肉内注入を行った。ラットを気管切開し、６０回／分の頻度で肺換気した。呼吸終末陽圧を１ｃｍ  Ｈ２Ｏに設定した。動脈圧モニタリングのために左頸動脈にカニューレ挿入し、右室圧の測定のために、体液で満たされたフォーストランスデューサーを用いて右心カテーテルを右頸静脈を通して挿入した。
【０３８８】
組織調製：脱血後、肺動脈を介して２２ｃｍＨ２Ｏの一定圧で、肺を等張生理食塩水でフラッシュした。右肺を門で結紮し、液体窒素中で凍結してショックを与え、−８０℃で保存した；左葉を２２ｃｍＨ２Ｏの圧で肺動脈を介してＺａｍｂｏｎｉの固定剤で５分間灌流した。組織をホルマリン（４％）中で１２時間４℃で固定し、次いで０．１Ｍのリン酸緩衝液中に移した。右心肥大評価：右室肥大を評価するするために、心臓を取り出し切開した。中隔重量ＲＶ／（ＬＶ＋Ｓ）を加えた、左室に対する右室重量の比を計算した。
【０３８９】
（統計分析）
全てのデータは、平均±ＳＥＭとして示す。多重比較のためにＡＮＯＶＡおよびＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ事後検定によって群間の差異を評価した。
【０３９０】
［結果］
予想通り、健常動物との比較においてＭＣＴ／プラセボ処理した動物は、劇的な統計的に有意な右心肥大の増加を示した。ＭＣＴ／プラセボ処理した動物は、約０．６１のＲＶ／（ＬＶ＋Ｓ）を示した一方、健常ラットはわずか約０．２３であった。プラセボの代わりのＭＣＰ−１結合スピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧの投与は、ＭＣＴ処理した動物において、ｍＮＯＸ−Ｅ３６を２ｍｇ／ｋｇで約０．３９ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇで約０．４５の顕著に減少した右心肥大をもたらした（図５４Ａ参照）。
【０３９１】
右心肥大と一致して、ＭＣＴ／プラセボ処理したラットにおいて測定した右室収縮期圧は、６９ｍｍＨｇ（健常動物、２９ｍｍＨｇ）まで増加した。プラセボの代わりのＭＣＰ−１結合スピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧによる処理は、ＭＣＴ処理した動物において、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧを２ｍｇ／ｋｇで約４６ｍｍＨｇおよび２０ｍｇ／ｋｇで約４９ｍｍＨｇの顕著に減少した右室収縮期圧をもたらした（図５４Ｂ参照）。
【０３９２】
［結論］
ＭＣＴ／プラセボ処理した動物における右心肥大および右室収縮期圧に関する結果は、ＭＣＴによる肺動脈高血圧の誘発を明確に立証した。ＭＣＴ処理したラットへのＭＣＰ−１結合スピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧの投与は、右心肥大および右室収縮期圧の両方を顕著に阻止した。したがって、ＭＣＰ−１結合スピーゲルマーは、肺高血圧治療のための有望な作用物質である。
【０３９３】
［参照文献］
その開示が引用により本明細書の一部をなすものである文献の完全な書誌データは、特に言及がない場合は、以下の通りである。
【０３９４】
【表２Ａ】
0005777341.tif 000047
【表２Ｂ】
0005777341.tif 000048
【表２Ｃ】
0005777341.tif 000049
【表２Ｄ】
0005777341.tif 000050
【表２Ｅ】
0005777341.tif 000051
【表２Ｆ】
0005777341.tif 000052
【表２Ｇ】
0005777341.tif 000053
【表２Ｈ】
0005777341.tif 000054
【表２Ｉ】
0005777341.tif 000055
【表２Ｊ】
0005777341.tif 000056
【表２Ｋ】
0005777341.tif 000057
【表２Ｌ】
0005777341.tif 000058
【０３９５】
明細書、特許請求の範囲および／または図面において開示されている本発明の特徴は、その様々な形態において、別個で、および任意の組み合わせで、本発明を実現化するための材料とすることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５１Ｃ】
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【図５１Ｄ】
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【図５１Ｅ】
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【図５２】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５４Ａ】
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【図５４Ｂ】
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【配列表】
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