(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血球凝集素を抗原として認識し、複数のＨ１サブタイプＡ型インフルエンザウイルス分離株に対する中和活性を有し、前記複数のＨ１サブタイプＡ型インフルエンザウイルス分離株が少なくとも以下の分離株：A/Puerto Rico/8/34、A/Wilson-Smith/33、A/Malaya/302/54およびA/California/04/2009を含むことを特徴とする、Ａ型インフルエンザウイルスに対するヒトモノクローナル抗体であって、配列番号：１のアミノ酸配列を有する少なくとも１つの重鎖可変ドメインおよび配列番号：２のアミノ酸配列を有する少なくとも１つの軽鎖可変ドメインを含む、前記ヒトモノクローナル抗体。
【請求項２】
配列番号：３のヌクレオチド配列によりコードされる少なくとも１つの重鎖可変ドメインおよび配列番号：４のヌクレオチド配列によりコードされる少なくとも１つの軽鎖可変ドメインを含む、請求項１記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項３】
少なくとも１つの重鎖可変ドメインおよび少なくとも１つの軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン全体および免疫グロブリンのフラグメントからなる群から選択されるものである、請求項１または２に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項４】
前記免疫グロブリンのフラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む群から選択されるものである、請求項３記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項５】
配列番号：１および配列番号：２から選択される単離されたポリペプチド。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか記載のモノクローナル抗体のイディオタイプに対して特異的である、抗イディオタイプ抗体。
【請求項７】
配列番号：３および配列番号：４から選択されるヌクレオチド配列からなる単離された核酸。
【請求項８】
配列番号：３のヌクレオチド配列、または配列番号：４のヌクレオチド配列、あるいは配列番号：３のヌクレオチド配列および配列番号：４のヌクレオチド配列の両方を含む、発現ベクター。
【請求項９】
請求項８記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
有効量の請求項１から４または６のいずれか記載の少なくとも１つの抗体、ならびに医薬上許容される担体および／または希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
Ｈ１サブタイプ血球凝集素を発現するＡ型インフルエンザウイルスによる感染により直接または間接的に引き起こされる症状を処置するための予防用または治療用の医薬として使用するための、請求項１から４または６のいずれか記載の抗体。
【請求項１２】
Ｈ１サブタイプ血球凝集素を発現するＡ型インフルエンザウイルスによる感染により引き起こされる症状を処置するための予防用または治療用の医薬を製造するための、請求項１から４または６のいずれか記載の抗体の使用。
【請求項１３】
Ｈ１サブタイプ血球凝集素を発現するＡ型インフルエンザウイルスによる感染により引き起こされる症状が、インフルエンザ症候群である、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
前記症状が、ブタインフルエンザウイルスまたは新型インフルエンザウイルスとも称されるＨ１Ｎ１ Ａ型インフルエンザウイルスによる感染により引き起こされるものである、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
患者に由来する生物学的試料において、Ｈ１サブタイプ血球凝集素を発現するＡ型インフルエンザウイルスに対するホモサブタイプ交差中和特性を有する抗インフルエンザウイルス抗体の存在を検出するためのアッセイ方法であって、前記生物学的試料と、特異的なアッセイ試薬としての請求項１から４のいずれか記載のモノクローナル抗体とを接触させることを含む方法。
【請求項１６】
免疫原性またはワクチン組成物において、Ｈ１サブタイプ血球凝集素を発現するＡ型インフルエンザウイルスに対するホモサブタイプ交差中和特性を有する抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体を誘導することができるＨ１サブタイプ血球凝集素を発現するＡ型インフルエンザウイルスに由来するエピトープの存在を検出するためのインビトロアッセイ方法であって、該組成物が投与される対象において、前記組成物と、特異的なアッセイ試薬としての請求項１から４のいずれか記載のモノクローナル抗体とを接触させることを含む方法。
【請求項１７】
患者から得られた生物学的試料または免疫原性もしくはワクチン組成物において、Ｈ１サブタイプ血球凝集素を発現するＡ型インフルエンザウイルスに対するホモサブタイプ交差中和特性を有する抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体を検出または定量するためのキットであって、特異的な試薬として請求項１から４のいずれか記載のモノクローナル抗体を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、免疫学の分野に関する。
【０００２】
より詳細には、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１サブタイプＨＡ（血球凝集素）抗原に対するモノクローナル抗体であって、ヒトから単離された株および動物から単離された株の両方を認識し、中和することができる抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
インフルエンザウイルスは、特に、数種類のトリ、ブタおよび同等の種間で、異なる動物種に感染することができる。これらのウイルスのうちのごくわずかが、ヒトに適応すること、すなわち、ヒトに感染し、特に、ヒトからヒトに自分自身を広めることに成功した。この適応を可能とする主な要因は、ウイルスの最も重要な表面タンパク質、血球凝集素に関するものである。特に、１６種類のサブタイプ（Ｈ１〜Ｈ１６）がこのタンパク質の抗原の特徴に基づいて区別され、これらのうちわずか３種類（Ｈ１、Ｈ２およびＨ３）がヒトに完全に適応することに成功し、過去１００年のうちの３回の大規模なインフルエンザのパンデミックに関連している。現在、季節のインフルエンザ流行を引き起こすヒトを循環する２種類のサブタイプ、サブタイプＨ１およびサブタイプＨ３が存在する。Ｈ１サブタイプは、本発明の目的である抗体により認識され、１９１８年にヒトにおいて出現し、最初に報告されたヨーロッパの国にちなんで「スペイン風邪」と呼ばれる悲惨なパンデミックを引き起こした。近年の研究では、「スペイン風邪」に関与したウイルスが、数個の変異の結果として、ヒトに感染し、それ自身ヒトからヒトに広がる能力を生じた、トリに感染したトリウイルスであることが示された。１９１８年の分離株は、ヒトおよびブタなどの他の動物で見出される全てのＨ１サブタイプウイルスの共通の祖先である。Ｈ１サブタイプウイルスは、１９５７年まで毎年ヒトインフルエンザ流行に関連し、それらは、その年の間に、いわゆる「アジア」パンデミックに関与したＨ２サブタイプ血球凝集素を有するウイルスにより取って代わられた。Ｈ１サブタイプにより引き起こされたケースは、いくつかのＨ１分離株がいまだ完全に理解されていない理由により増大した年の１９７７年まで報告されなかった。それゆえ、今日において、Ｈ１サブタイプウイルスは、１９６７年からヒトに出現したＨ３サブタイプウイルスを伴って、いまだ循環している。例えば、２００７年から２００８年のインフルエンザ時期の間、２００７年の４０週目および２００８年の１６週目までの間に含まれる期間内のヨーロッパにおける告知は、分離株の３０％近くがＨ１サブタイプ血球凝集素に関連したことを証明している（European Influenza Surveillance Scheme- Weekly Electronic Bulletin- April 28, 2008）。
【０００４】
毎年のインフルエンザウイルス流行は、公共医療サービスおよびそれに付随するコストに大きな影響を与える。アメリカ合衆国のみにおいて、２０００００人より多くの人々がインフルエンザウイルスに関連する症状のために毎年入院し、それに多かれ少なかれ直接関連して約４００００人が死亡していると見積もられている（Thompson et al., JAMA, 2003, 289:179-186）。これらのデータに対して、我々は、程度の差はあれ長い期間働かない感染患者の著しく大きな数値において就業日の損失により必然として経済的に影響を与える全ケースを加えなければならない。最近の報告では（Molinari et al., Vaccine, 2007, 25: 5086-5096）、１年あたり１０４億ＵＳドルの毎年のインフルエンザ流行に関する医療コストが見積もられており、さらに就業できないことによる所得の損失に関して１６３億ＵＳドルが追加されなければならない。計算上、感染した対象の死亡に関する経済的損失の収益化などのその他の項目を考慮すると、その総額は、１年あたり８７１億ＵＳドルの信じ難い数字まで上昇する。
【０００５】
現在、毎年のインフルエンザ流行に立ち向かうための利用可能なツールは、恐らく次のインフルエンザ時期の流行に関連するであろう（Ｂ型分離株に加えて）Ｈ１−およびＨ３−サブタイプウイルス分離株の抗原を含む不活性化された三価ワクチンのみである。この種の予測は、いくかの先行する地理上の区域における初期の分離株に関する疫学データに基づいており、必ずしも正確であるとは限らない。それゆえ、あるインフルエンザ時期に開発した三価ワクチンが実質的に無効であるという少しも無視できないリスクが毎年存在する。
【０００６】
この場合、新しいパンデミックの場合と同様に、わずかな利用可能な予防／治療補助は、抗ウイルス剤の２つの利用可能なクラス：Ｍ２タンパク質阻害剤（アマンタジンおよびリマンタジン）およびノイラミニダーゼ阻害剤（オセルタミビルおよびザナミビル）を用いることのみであろう。しかしながら、この場合においても、感染の非常に早い時期に抗ウイルスを投与する必要性、および耐性ウイルス分離株のすでに起きてしまった急な出現の両方に関連する一連の問題が予想されうる。
【０００７】
代替的な有効な戦略は、重要なウイルスタンパク質に対する中和抗体調製物であって、インフルエンザウイルスの異なる分離株間で共有されるごときタンパク質の部分を認識できるものに基づくものでありうる。
【０００８】
抗体の受動投与に基づくアプローチの可能性をより理解するために、インフルエンザの主要な構造特徴に言及することが有用である。インフルエンザウイルスは、オルトミクソ科ファミリーに属し、約５００個のスパイクが存在する感染した細胞膜に由来し、突起（projection）とも呼ばれる外被の存在により特徴付けられる。かかる突起は、２つの重要なウイルス表面タンパク質に由来する三量体および四量体、すなわち、前記血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）からなり、Ａ型ウイルスの細分類にも用いられる。内在性膜タンパク質（Ｍ２）はまた、外被表面上で見出され、血球凝集素およびノイラミニダーゼと比較して非常に少ない数で存在し、四量体で組織されている。
【０００９】
インフルエンザウイルスは、さらに、８個の一本鎖ＲＮＡフラグメントからなるセグメント化されたゲノムのコア内における存在により特徴付けられる。３つの公知のインフルエンザウイルス型は、ビリオン内のいくつかのタンパク質（ＮＰおよびＭ１）：Ａ型、Ｂ型、およびＣ型の特徴に基づいて認識することができる。毎年の流行に関連するものは、Ａ型およびＢ型ウイルスである。あるいは、Ｃ型ウイルスは、ほとんど重篤でない症状に関するものである。
【００１０】
表面タンパク質の役割は、ウイルス複製サイクルに必須である。特に、血球凝集素は、ウイルスをいずれかの細胞の表面に存在するシアル酸を認識し、それらに感染することを可能にするタンパク質である。あるいは、ノイラミニダーゼは、ウイルス複製サイクルの終結時、すなわち、感染した細胞から新しいウイルス粒子の遊離時に作用する。その機能は、それらを産生した細胞の表面上に存在するシアル酸から新たに形成されたビリオンの血球凝集素の遊離を促進することである。これらの２つのタンパク質により果たされた重要な役割、ならびにウイルス表面上のそれらの提示は、それらが免疫応答の主な標的を示す理由、およびそれらが変異の高速度に感受性である理由を説明する。実際に、毎年の流行は、前年のものと多かれ少なかれ異なり、それによりそれらが刺激された免疫応答を多かれ少なかれ効率的に逃れることができるウイルスによって引き起こされる。言い換えれば、血球凝集素（大部分）およびノイラミニダーゼ（副次的）における点変異の進行性蓄積は、全体的には非効率的な進行で以前の流行の過程において産生された防御抗体を作り出す。
【００１１】
抗インフルエンザ免疫反応内の主な防御の役割は、液性成分により果たされる。抗体は、主に血球凝集素のシアル酸への結合を妨げ、それにより細胞の感染を防ぐというそれらの防御の役割を発揮する。かかる選択圧は、血球凝集素における高い頻度の変異を決定する。しかしながら、かかる高い変異率において、タンパク質の機能における必要な役割の指標としていくつかの不変なアミノ酸残基が見出された。これらの血球凝集素の部分は、交差中和反応に対する可能性のある標的であることを示す。しかしながら、かかる領域は、イムノサイレント（immunosilent）領域におけるかかる標的の潜伏が、ウイルスにとってまさに好ましい進化段階を確実に示すという点で、大半の患者において有効な抗体反応を生じることができないと予想できる。
【００１２】
予防および治療の態様を考慮しても、あるサブタイプ内のかかる共通の領域を認識することができる抗体分子を提供することは極めて有用である。かかる抗体は、同じサブタイプであるが、進化的に互いに異なる広い範囲のウイルスを認識することができ、それゆえ、動物からヒトに広がる能力を獲得する可能性のある新しいウイルスを含む、かかるサブタイプに属するほとんどのウイルスから保護できる可能性があることから、実際に、リスクのある対象に投与される場合に有用な予防ツールを示す。この免疫タイプは、循環する分離株が前年より高い頻度の変異を示す場合に失われ、ホモサブタイプ抗インフルエンザ免疫（HOMOSUBTYPE ANTI-INFLUENZA IMMUNITY）として知られている。
【発明の概要】
【００１３】
本発明者らは、今回、前記の所望される特徴を有するモノクローナル抗体を取得することに成功した。
【００１４】
それゆえ、本発明の第１の態様は、Ａ型インフルエンザウイルスに対するモノクローナル抗体であって、Ｈ１サブタイプ血球凝集素を発現するＡ型インフルエンザウイルスのヒトおよび動物の両方の複数の分離株に結合することができる抗体である。
【００１５】
本発明の第２の態様は、Ｈ１サブタイプＡ型インフルエンザウイルスのヒトおよび動物の分離株に対して中和活性を有することを特徴とするＡ型インフルエンザウイルスに対するモノクローナル抗体である。好ましくは、かかる中和モノクローナル抗体は、抗原としてＨ１サブタイプＡ型インフルエンザウイルスの血球凝集素（ＨＡ）を認識する。
【００１６】
本発明のモノクローナル抗体は、好ましくは、ヒトまたはヒト化である。
【００１７】
かかる抗体は、リスクのある患者に投与される場合に有益な予防ツールを表す。
【００１８】
さらに、ヒト患者に対するヒトまたはヒト化モノクローナル抗体の使用は、ヒトまたはヒト化抗体が十分に許容される点でさらに有利な点を有する。
【００１９】
加えて、このウイルスに対するヒト抗体反応の一部を表すことにより、本発明のモノクローナル抗体は、現在用いられるワクチンによって誘導されるよりもＨ１サブタイプウイルスに対して極めてより有効で、防御的で、広範囲である免疫を誘導することができる革新的なワクチンの設計に関する重要な因子を構成する。
【００２０】
本発明のモノクローナル抗体を獲得するステップは、下記の実験セクションに詳細に記載されており、それはまた、その結合および中和特性についても示す。この実験セクションに詳細に記載される方法により得られるモノクローナル抗体は、ヒト抗体である。
【００２１】
ヒト化抗体の調製は、それ自体公知な方法、例えば、Baca et al, 1997 J. Biol. Chem 272:10678-84またはCarter et al, 1992, Proc.Natl. Acad. Sci 89:4285に記載のごとく行われうる。かかる参考文献は、例示のために排他的に提供されるものであって、限定するためのものではない。実際に、ヒト化抗体の調製のためのその他の方法は当該技術分野で知られており、本発明の範囲内で用いることができる。
【００２２】
Ｈ１サブタイプＡ型インフルエンザウイルスに由来する複数のヒトおよび動物分離株に結合するインビトロにおける能力を有するＦａｂフラグメントの形態でモノクローナル抗体を産生することができる（ＩＮＦ４９と称される）１つのクローンの獲得は、実験セクションに詳細に記載される。
【００２３】
（Ｆａｂ４９と称される）クローンＩＮＦ４９により産生されるモノクローナル抗体は、これらの抗体がＨ１サブタイプＡ型インフルエンザウイルスに由来するヒトおよび動物分離株に対する中和活性を示すことを本発明者が実験的に証明したため、本発明の１の好ましい態様を表す。簡便のために、Ｈ１サブタイプＡ型インフルエンザウイルスに由来するヒトおよび動物分離株を中和する能力に関するかかる免疫学的特性は、以下の本明細書において「サブタイプＨ１に対するホモサブタイプ交差中和活性」とも称される。
【００２４】
配列表は、本発明のＦａｂ４９の重鎖可変ドメイン（配列番号：１）および軽鎖可変ドメイン（配列番号：２）のアミノ酸配列を示す。さらに、それは、それらの各コーディングヌクレオチド配列を示し、それぞれ配列番号：３および配列番号：４と称される。
【００２５】
特に、実験セクションは、ＦａｂフラグメントとしてのＦａｂ４９モノクローナル抗体の製造を記載する。しかしながら、モノクローナル抗体は、例えば、免疫グロブリン全体のごときその他の形態において、あるいは、例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントまたはＦａｂより小さい抗体フラグメント（例えば、単鎖抗体、単一ドメイン抗体）などの抗体フラグメントのその他のタイプの形態において、ならびにＦａｂと同一の免疫学的特性を有する少なくとも８アミノ酸の長さのペプチドの形態においても製造し、用いることができると理解される。
【００２６】
単鎖抗体は、出典明示により本明細書に含まれるＬａｄｎｅｒらによる米国特許第4946778号に記載の方法により構築することができる。単鎖抗体は、可擣性（flexible）リンカーにより連結された軽鎖および重鎖可変領域を含む。単一ドメイン抗体と呼ばれる抗体フラグメントは、１つの単離されたＶＨドメインのみを含むことから、単鎖抗体よりも小さい。抗体全体と同一の結合能を少なくとも部分的に有する単一ドメイン抗体を取得するための技術は、過去の技術文献に記載されている。Ward, et al., in "Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted from Escheria coli," Nature 341:644-646は、単離された形態で標的エピトープに結合するのに十分な親和性を有する抗体の重鎖の可変領域（ＶＨ単一ドメイン抗体）を取得するためのスクリーニング方法を開示する。
【００２７】
図１から３は、本研究で用いたＨ１Ｎ１サブタイプインフルエンザウイルス分離株上で行われた異なる中和セッションにおいて、クローンＩＮＦ４９により産生されたＦａｂ４９を用いて得られた結果の概要である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】特に、図１は、異なるＦａｂ濃度によるウイルスA/Puerto Rico/8/34の中和パーセンテージを示す図である。ヒトｅ５０９抗ＨＣＶＦａｂを用いて得られた結果を陰性コントロールとして示す。
【図２】図２は、異なるＦａｂ４９濃度によるA/Wilson-Smith/33分離株の中和パーセンテージを示す図である。ヒトｅ５０９抗ＨＣＶＦａｂを用いて得られた結果を陰性コントロールとして示す。
【図３】図３は、異なるＦａｂ４９濃度による本明細書で用いられるフィールドブタ分離株SW1の中和パーセンテージを示す。ヒトｅ５０９抗ＨＣＶ  Ｆａｂを用いて得られた結果を陰性コントロールとして示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
下記の明細書において、用語「抗体」は、免疫グロブリン全体、Ｆａｂフラグメントまたはその他の抗体フラグメントタイプ、単鎖抗体、単一ドメイン抗体などを含む、上記の全ての態様を意味するのに用いられる。
【００３０】
本発明のモノクローナル抗体は、遊離形態または担体が抱合された形態で作成され、用いられてもよい。担体は、抗体と抱合し、それを免疫原性とし、あるいはその免疫原性を増加させることができるいずれの分子または化学的もしくは生物学的物質である。担体の非限定的な例は、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、エデスチン、サイログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などのアルブミン、ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）などの赤血球、テタナスアナトキシン、コレラアナトキシンのごときタンパク質、例えば、ポリ（Ｄ−リジン：Ｄ−グルタミン酸）のごときポリアミノ酸などである。抗体の担体への結合を容易にするために、抗体Ｃ末端またはＮ末端は、例えば、さらなるアミノ酸残基、例えば、ジスルフィド架橋を形成することができる１つまたはそれ以上のシステイン残基の挿入により修飾されてもよい。
【００３１】
Ｆａｂ４９に関する以下の実験セクションに詳細が示されるその特性により、本発明のモノクローナル抗体は、医薬上の適用、特に、Ｈ１サブタイプＡ型インフルエンザウイルス感染の広い範囲の予防用または治療用の処置のための医薬の製造における使用に特に適する。
【００３２】
それゆえ、例えば、インフルエンザ症候群のごときＨ１サブタイプＡ型インフルエンザウイルスにより引き起こされる症状の予防用または治療用の処置のための医薬を製造するための本発明のモノクローナル抗体の使用は、本発明の範囲内である。
【００３３】
さらに、これに関して、用語「Ｆａｂ４９抗体」は、Ｆａｂフラグメントのみではなく、抗体が調製されうるいずれか他の形態、例えば、免疫グロブリン全体、その他の種類の抗体フラグメント、単鎖抗体などを含む。
【００３４】
実験セクションに詳細に記載されるように、本発明のモノクローナル抗体は、ヒト交差反応性モノクローナル抗体を産生することができるＥＢＶ形質転換ヒトリンパ球から開始する分子生物学的技術により取得されており、それゆえ、Ｈ１サブタイプ血球凝集素を発現する以下の明細書に記載されるごときＡ型インフルエンザウイルスの数種類のヒト対照分離株：A/Puerto Rico/8/34（ATCC (登録商標) no.VR-1469TM）；A/Wilson-Smith/33（ATCC (登録商標) no.VR-1520）；A/Malaya/302/54（ATCC (登録商標) no.VR-98）で感染されたＭＤＣＫ（メイディン・ダービー・イヌ腎臓）（ATCC (登録商標) no.CCL-34TM）細胞溶解物を認識することができる。本発明の抗体はまた、発現されるＨ１サブタイプ血球凝集素のＨＡ２フラグメントの配列（配列番号：５）により示されるごとく、動物由来、特に、ブタ由来（ＳＷ１）の「フィールド（field）」分離株で感染されたＮＳＫ（新生ブタ腎臓）（ブレシア動物予防試験所（Istituto Zooprofilattico di Brescia））細胞溶解物を認識できることとなった。
【００３５】
本発明のモノクローナル抗体のさらなる特に有益な特性は、最近、ＷＨＯにより「新型インフルエンザ」と正式に称され、いわゆる「ブタインフルエンザ」に関する分離株の１つとして同定されたA/California/04/2009インフルエンザウイルス分離株に由来する組み換えＨＡタンパク質に結合する能力である。
【００３６】
A/California/04/2009分離株に由来する組み換えＨＡタンパク質、および陽性コントロールとして用いたA/PR/08/1934分離株に由来する組み換えＨＡタンパク質により実施した結合アッセイは、以下の実験セクションに記載される。このアッセイは、本発明のモノクローナル抗体Ｆａｂ４９が組み換えＨＡタンパク質の両方に結合することができることを証明する。
【００３７】
実施したアッセイは、さらに、モノクローナル抗体Ｆａｂ４９が上記インフルエンザウイルス分離株の両方に由来するＨＡタンパク質シュード粒子（pseudo-particle）を中和できることを示す。
【００３８】
形質転換されたＢ細胞株を患者の末梢血から作成するのに用いられる特定の方法は、下記の実験セクションに記載される。
【００３９】
本発明のＦａｂ４９抗体の重鎖および軽鎖のＦｄ部分をコードする遺伝子をクローン化するのに用いられる方法、ならびに単一ペプチドおよびＦａｂフラグメントの両方として組み換え的にそれらを産生するための方法もまた記載される。
【００４０】
Ｈ１サブタイプＡ型インフルエンザウイルスに由来する異なるヒトおよび動物分離株で感染された細胞と反応する本発明のモノクローナル抗体の能力は、ＥＬＩＳＡおよび免疫蛍光染色法で確認される。さらに、中和アッセイは、本抗体のインビトロ生物学的活性を確認するために行われた。このアッセイにおいて、Ｆａｂ４９抗体は、上記に示されるごときヒトおよび動物Ａ型ならびにサブタイプＨ１ウイルス分離株に対するホモサブタイプ交差中和活性を示した。
【００４１】
得られたデータは、本発明の抗体が、記載される形態の１つで投与される対象に、Ｈ１サブタイプＡ型インフルエンザウイルスに対する受動免疫を付与するのに潜在的に有効であること、ならびに例えば、インフルエンザ症候群のごときＨ１サブタイプＡ型インフルエンザウイルスによる感染により引き起こされる症状の広い範囲の予防および治療におけるその有効性を示す。
【００４２】
それゆえ、本発明のさらなる態様は、活性成分として本発明のモノクローナル抗体の有効な量ならびに医薬上許容される担体および／または希釈剤を含む医薬組成物である。有効な量は、前記組成物が投与される対象において所望される効果を誘導する、例えば、Ｈ１サブタイプＡ型インフルエンザウイルスを中和することができる量である。
【００４３】
これに関して、用語「対象」は、ヒトを含む、組成物が投与され得る動物宿主のいずれかを称する。
【００４４】
本発明の医薬組成物で用いることができる医薬上許容される担体または希釈剤の非限定的な例は、ＳＰＧＡなどの安定化剤、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、グルコース、デキストラン）、アルブミンもしくはカゼインなどのタンパク質、ウシ血清もしくは脱脂粉乳などのタンパク質含有薬剤、ならびに緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）を含む。
【００４５】
本発明のモノクローナル抗体はまた、（例えば、血清、血漿、血液試料またはいずれか他の適当な生物学的材料などの）患者から過去に得られた生物学的試料において、同一または同様の中和特性を有する抗Ｈ１サブタイプＡ型インフルエンザウイルス抗体検出のためのインビトロ方法において診断試薬として有利に用いることができる。
【００４６】
「同一または同様の中和特性を有する抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体」は、ヒトもしくは動物Ｈ１サブタイプＡ型インフルエンザウイルスに対してホモサブタイプ交差中和活性を示す抗体である。これらの抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスに対する以前の曝露の結果として、あるいは患者が、治療用もしくは予防用または研究目的のために本発明のモノクローナル抗体で以前に投与されたことから、患者（もしくは動物）に由来する生物学的試料において見出されうる。
【００４７】
それゆえ、患者もしくは動物宿主から以前に得られた生物学的試料において、Ｈ１サブタイプに対するホモサブタイプ交差中和活性を有する抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体の存在を検出するためのアッセイ方法であって、前記生物学的試料と、特異的なアッセイ試薬として本発明のモノクローナル抗体とを接触させることを含む方法は、本発明の範囲に含まれる。
【００４８】
前記アッセイは、定性的もしくは定量的でありうる。ホモサブタイプ交差中和活性を有する抗Ｈ１サブタイプＡ型インフルエンザウイルス抗体の検出もしくは定量は、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイにより行われてもよい。それゆえ、特異的な試薬として本発明によるモノクローナル抗体を含む診断キットはまた、本発明の範囲内であり、前記キットは、特に、患者もしくは動物宿主から以前に得られた生物学的試料においてＨ１サブタイプ型インフルエンザウイルスに対するホモサブタイプ交差中和活性を有する抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体の検出もしくは定量のために設計される。
【００４９】
同様に、本発明のモノクローナル抗体は、以前製造された免疫原性もしくはワクチン組成物において、かかる組成物が投与された患者にて、本発明のモノクローナル抗体と同一または同様の中和特性、すなわち、Ｈ１サブタイプＡ型インフルエンザウイルスに対するホモサブタイプ交差中和活性を有する抗Ｈ１サブタイプＡ型インフルエンザウイルス抗体を誘導することができるエピトープを検出もしくは定量するためのアッセイ方法において特異的な試薬として用いることができる。
【００５０】
かかる方法は、本発明のモノクローナル抗体による認識が、免疫原性調製物および／またはワクチンにおいて、例えば、Ｈ１サブタイプＡ型インフルエンザウイルスに対するホモサブタイプ免疫を誘導できるエピトープなどの有益なエピトープを認識できる抗体クローンの産生を活性化できる１つまたはそれ以上のエピトープの存在の指標であり得るため、ワクチンもしくは免疫原性調製物として用いられるいずれかの調製の評価に有用であることが予想される。
【００５１】
最終的に、本発明のモノクローナル抗体は、それ自体公知な方法により抗イディオタイプ抗体を調製するために用いられてもよい。抗イディオタイプ抗体は、それらを調製するのに用いられる広範囲の中和抗体のイディオタイプに対する特異的な抗体であり、それらが認識する重要なエピトープを模倣することができる。
【００５２】
それゆえ、本発明のモノクローナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体は、本発明の範囲に含まれる。
【００５３】
以下の実験セクションは、単に例示のために提供されるものであって、限定のためのものではない。
【００５４】
実験セクション
患者の選択
研究に参加した患者を、異なるインフルエンザ分離株を認識し、潜在的に中和することができる抗体である交差反応性抗インフルエンザ抗体をそこからクローニングする機会を増やすために選んだ。特に、何人かの個人は、インフルエンザウイルスへの継続的な曝露にもかかわらず（時々、医者、小児科医、幼稚園および学校で働いている人々などの職業上の理由のため）、病気にかからないことを注記する。このため、かれらを、ヒトモノクローナル抗体を作成するのに最も適する候補者であると考えた。特に、以下の選定基準に従った：
−年齢２５から５５歳の間；
−臨床的インフルエンザ症候群に対して陰性である研究より前の最近１０年間の病理学的な病歴；
−研究前５年間の毎年の流行に関するＨ１Ｎ１サブタイプウイルス分離株に対する１：１０００より高い抗体力価；
−２種類のヒト対照Ｈ１Ｎ１サブタイプＡ型ウイルス分離株（A/Puerto Rico/8/34；A/Malaya/302/54）に対して検出できる中和力価（ＩＣ５０＞＝１：２０）
−過去に抗インフルエンザワクチン接種経験がないこと
−抗インフルエンザワクチン接種を受容するための適合性
【００５５】
ワクチン接種時、およびワクチン接種後約３週間後に、約２０ｍｌの血液を各患者からヘパリン添加試験管に採取した。
【００５６】
対照ウイルス分離株の培養
ＭＤＣＫ（メイディン・ダービー・イヌ腎臓）（ATCC (登録商標) no.CCL-34TM）を、１０％不活性化（５６℃で３０分間処理）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（EuroClone）、５０μｇ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（GIBCO）および２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（EuroClone）を補充した改変イーグル培地（ＭＥＭ）（GIBCO）中で増殖させ、細胞株として用いた。（本願に関連するＨＡ２領域配列により明確に特徴付けられる）フィールド（field）ブタ分離株ＳＷ１に関して、ＮＳＫ（新生ブタ腎臓）細胞（Is-tituto Zooprofilattico di Brescia）を代わりに用いて、同様に処理した。前記細胞を５％  ＣＯ２雰囲気にて３７℃でインキュベートし、１週間に２回、１：３の割合で継代した。本願に記載される実験において、下記のＨ１Ｎ１サブタイプインフルエンザウイルス分離株を用いた：A/Puerto Rico/8/34株（ATCC (登録商標) no. VR-1469TM)；A/Wilson-Smith/33株(ATCC (登録商標) no. VR-1520)、およびA/Malaya/302/54株(ATCC (登録商標) no. VR-98)。Ｈ１Ｎ１サブタイプに関して、血球凝集素ＨＡ２部分の配列（配列番号：５）に基づいて特徴付けられたブタ由来の分離株（ＳＷ１）も用いた。２種類はＡ型サブタイプＨ３Ｎ２（A/Port Chalmers/1/73-ATCC (登録商標) no. VR-810およびA/Aichi/2/68-ATCC (登録商標) no. VR-547）に属し、１種類はＢ型（B/Lee/40-ATCC (登録商標) no. VR-101）に属する３種類の他の対照分離株もまた用いた。ウイルスを増殖させるための培養用培地として、１μｇ／ｍｌ  血清を含まないトリプシン（SIGMA）で補充したＭＥＭを用いた。ウイルスストックを、細胞外ウイルスとして培養上澄み液から得た。簡単に説明すると、細胞を感染させた後、単層を毎日観察して細胞変性効果の出現をモニターした。一般に、感染４日後、上澄み液を収集し、１０００ＲＣＦ（相対遠心力）で１０分間遠心分離して細胞残屑を取り除き、次いで０．２２μｍフィルター（MILLIPORE）でろ過した。次に、上澄み液を、細胞を含まないウイルスとして一定分量にし、−８０℃で保存した。
【００５７】
末梢血Ｂリンパ球由来のモノクローナル抗インフルエンザウイルス抗体の選択
患者に由来するモノクローナル抗体の産生を、Cole et al, 1984 Cancer Research 22:2750-2753により記載される、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）による感染を介する形質転換法を用いることにより行った。取得した異なるクローンに由来する上澄み液を、ＥＬＩＳＡにより抗体の存在について測定した。次いで、上記３種類のヒト分離株およびＨ１Ｎ１サブタイプブタ分離株ＳＷ１で感染させた細胞株に対してＥＬＩＳＡにおいて反応できるが、２種類のＨ３Ｎ２サブタイプ分離株およびＢ分離株で感染させたものに対しては反応できない上澄み液でＩｇＧ抗体を産生できるクローンを、後の特徴付けについて選択した。特に、ＭＤＣＫ細胞を前記分離株にて高い感染多重度において感染させた。感染の約４８時間後に、細胞をフラスコから剥離し、ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、細胞沈殿物を、３００μｌの溶解水溶液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８および０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）で懸濁させ、氷上で２０分間保存した。細胞残屑を、１００００ｇにて５分間遠心分離して取り除き、上澄み液を、タンパク質抽出物として２０℃で保存した。コントロール抗原の調製物に関しては、非感染細胞を同じ方法で処理した。上澄みタンパク質濃縮物を、ＢＣＡ（登録商標）タンパク質アッセイキット（Pierce）を用いて２回調べた。簡単に説明すると、試料タンパク質用量を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の一連の公知の濃度希釈物により得られた検量線を参照することにより決定した。全ての試料の吸光度を、分光光度計にて５４０ｎｍの波長で測定した。そうして得られた溶解物を、ＥＬＩＳＡプレート（COSTAR）上に載せ（１ウェルあたり３００ｎｇ）、４℃で一晩インキュベートした。次の日、プレートを蒸留水で洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ（Sigma）で３７℃にて４５分間ブロックした。次いで、各クローンからの上澄み液の４０μｌを、各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（Sigma）による５回より多い洗浄（WASHER ETI-SYSTEM, DiaSorin）後、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（Pierce）の４０μｌを各ウェルに添加した。約１５分後、酵素活性を４０μｌのＨ２ＳＯ４を添加することにより阻害し、分光光度計セットで４５０ｎｍにてシグナルを測定した。特に、（ｃＩＮＦ４９と名付けた）１つのクローンは、動物分離株を含む、異なるＨ１Ｎ１サブタイプ分離株で感染させた細胞から得られる全ての溶解物を特定の方法で認識できる抗体を産生することができることが証明された。一方、２種類のＨ３Ｎ２サブタイプウイルスおよびＢ分離株で感染させた培養物においてシグナルを検出できなかった。
【００５８】
クローンｃＩＮＦ４９に由来するＦａｂフラグメントの調製
Ｆａｂ４９鎖をコードする遺伝子を原核生物の発現ベクターにクローン化した。これにより、モノクローナル抗体である分子、ならびに抗体自体の量の増加を有するために、抗体産生細胞クローンの不安定性の問題を回避し、分子的観点からコードする遺伝子をより特徴付けることが可能となる。
【００５９】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を培養したｃＩＮＦ４９クローンから抽出し、それ自身公知な方法によりオリゴ−ｄＴを用いて逆転写させた。軽鎖およびＦｄフラグメント（すなわち、Ｆａｂフラグメント内に存在する重鎖可変部分および定常部分の一部）をコードするｃＤＮＡを、記載された方法（CSH press, Phage display manual, ed. D.R.Burton, p. A1.6）により増幅させた。次に、得られたｃＤＮＡを、それ自体公知である発現ベクターにクローン化し、ＲＢＣａｆと名付けた（Burioni et al, J. Imm. Meth, 1988）。簡潔には、重鎖Ｆｄ部分をコードする遺伝子（増幅させたＤＮＡ）を制限酵素ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ（Roche）を用いて３７℃で１．５時間消化させ、次いで重鎖をベクターのクローニング部位に挿入し、同じ酵素で消化させた。一方、軽鎖（増幅させたＤＮＡ）を酵素ＳａｃＩおよびＸｂａＩ（Roche）で消化させ、同様に消化させたベクターにクローン化した。
【００６０】
そうして得られた組み換え構築物を用いて、（グリセロールで氷冷洗浄することによりコンピテントにした）大腸菌株ＸＬ１Ｂｌｕｅを、０．２ｃｍキュベットを使用する一般的なプロトコル（電圧：２５００Ｖ；電気容量（Capacitance）：２５μＦ；抵抗：２００Ω）に従って電気的に形質転換させた（electro-transform）。平行して、軽鎖可変部分および重鎖可変部分のＤＮＡ配列を解析した。配列を配列表に記載されるものである。変異パターンの分子解析は、抗原で誘導される体細胞プロセスに起因する図を示した。
【００６１】
Ｆａｂ４９構築物で形質転換させた４０個の組み換え細菌クローンを、培養して熱ショックを施したことにより得た粗溶解物を用いてＥＬＩＳＡにより解析した。特に、構築物で形質転換した細菌のクローンを、アンピシリンおよびテトラサイクリンをそれぞれ５０μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌの濃度で含むＳＢ培地の１０ｍｌに植菌し、Ｏ．Ｄ．６００＝１に達するまで３７℃で振蘯しながら増殖させた。その後、特定の誘導剤（ＩＰＴＧ−イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を１ｍＭの最終濃度で添加し、３０℃で一晩振蘯しながら培養した。細胞を熱ショックにより溶解し（−８０℃と３７℃でそれぞれ凍結／融解を３回繰り返した）、次いで遠心分離して細胞残屑をＦａｂ含有上澄み液から分離した。得られた可溶性ＦａｂをＥＬＩＳＡによりアッセイした。９６ウェルマイクロタイタープレート（Nunc）を、上記ウイルス分離株で感染させた細胞からの溶解物でコートした。感染していない細胞から得られた溶解物を、陰性コントロールとして用いた。次いで、記載のとおり得られた溶解物の３００ｎｇでコートしたＥＬＩＳＡプレートを、４℃で一晩置いた。次の日、結合しなかった抗原を取り除いた後、プレートをＰＢＳで５回洗浄し、非特異的な結合部位を、ＰＢＳ中の３％アルブミンにて３７℃で１時間ブロックした。ブロッキング溶液の除去後、上記のとおりに処理し、可溶性Ｆａｂを含む細胞培養物の上澄み液を、それに添加した。この後、３７℃で２時間インキュベーションした。ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０による１０回の洗浄サイクル後、ＰＢＳ／１％  ＢＳＡ中のダイコンペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗ヒトＦａｂ免疫グロブリン（Sigma）のポリクローナル調製物の１：７００希釈の４０μｌを、そこに添加した。３７℃で１時間のインキュベーション、さらに１０回の一連の洗浄後、基質（ＯＰＤ−ｏ−フェニレンジアミン）をウェルに添加した。次いで、プレートを暗中にて室温で３０分間インキュベートした。反応を１Ｎ  硫酸で止め、吸光度を、分光光度計で４５０ｎｍを読み取ることにより測定した。全てのアッセイしたクローンは、Ｈ１Ｎ１サブタイプウイルスで感染させた細胞から得られた全ての溶解物に対する特異的な反応性を示した。それゆえ、Ｆａｂ４９の軽鎖および重鎖Ｆｄフラグメントの遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した１つの細菌クローンを選択した。選択した細菌クローンをＩＮＦ４９と名付けた。
【００６２】
Ｆａｂ４９の精製および感染させた細胞溶解物におけるＥＬＩＳＡによる同じものの評価
クローンＩＮＦ４９から産生されたＦａｂ（以下、「クローン」と「Ｆａｂ」を区別せずに記載する）を、ヒトＦａｂに結合することができるヤギ抗体のポリクローナル調製物（PIERCE, Illinois）が共有結合したプロテインＧ（〜２ｍｇ／ｍｌ）を含むセファロース樹脂からなるカラムを用いて免疫アフィニティーにより精製した。簡潔には、クローンＩＮＦ４９の１つのコロニーを、アンピシリンとテトラサイクリンをそれぞれ５０μｇ／ｍｌと１０μｇ／ｍｌの濃度で含むＳＢ培地の１０ｍｌに植菌した。３７℃で一晩増殖させた培養物を、先ほどと同じ濃度の抗生物質を添加したＳＢの５００ｍｌのフラスコにサブ植菌（sub-inoculated）した。細胞を１ｍＭ  ＩＰＴＧにより誘導し、３０℃で一晩振蘯した。培養物を５０００ｒｐｍで２５分間遠心分離し、ＰＢＳで再懸濁したペレットを超音波で分解した。１８０００ｒｐｍで２５分間のさらなる遠心分離は、細胞残屑を取り除くために必要である。上澄み液をろ過し、次いで上記のセファロースカラムをゆっくり通した。その後、この樹脂を１０ＰＢＳ体積で洗浄し、結合したＦａｂを酸性溶液（溶出緩衝液−Ｈ２Ｏ／ＨＣｌ  ｐＨ２．２）で溶出した。採取した様々なフラクションを適当な溶液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９）で中和し、限外ろ過（Centricon, Millipore）により濃縮した。精製したＦａｂの純度を、１２％ポリアクリルアミド／ドデシル硫酸ナトリウムゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において１のアリコートを流すことにより評価した。最終的に、精製したＦａｂの連続希釈を、記載されるごときＥＬＩＳＡによりアッセイした。ＨＣＶ  Ｅ２糖タンパク質に対するモノクローナルＦａｂの調製物を陰性コントロールとして含めた。この実験結果は、細菌溶解物で得られたものを確認し、Ｈ１Ｎ１サブタイプウイルスで感染させた細胞に対するクローンの特異的な反応性を立証した。
【００６３】
ＲＢＣａｆにクローニングすることにより得られたＦａｂ４９の免疫蛍光測定
ＥＬＩＳＡにより行われたデータを確認するために、Ｆａｂ４９を免疫蛍光測定によっても解析した。簡単に説明すると、全ての記載される対照ウイルスで感染させた培養物に由来する細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄した後、血球計数器を搭載する顕微鏡にてカウントした。それゆえ、細胞懸濁物を、細胞収集装置（Cytospin 4, Shandon Southern Products）における９０ｇで３分間の遠心分離によるスライドの調製に用いた。調製したスライドは、それぞれ合計２ｘ１０５個の細胞を含有した。コントロールのスライドを、感染していない細胞を用いて同様に調製した。次いで、細胞を、（−２０℃の温度で使用した）メタノール−アセトン溶液を用いて室温で１０分間固定し、透過処理した。ＰＢＳで３回洗浄後、細胞をＦａｂ４９（１００μｇ／ｍｌ）と一緒に湿度チャンバーにて３７℃で３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳで３回洗浄した。
【００６４】
次いで、細胞を、エバンスブルーにて１：２００に希釈した蛍光イソチオシアン酸抱合ヤギＦａｂ（Sigma）とともに、暗中の湿度チャンバーにて３７℃で３０分間インキュベートした。スライドを蛍光顕微鏡（Olympus）にて検視した。市販されているＭ１インフルエンザウイルスタンパク質に特異的なマウスモノクローナル（Argene）を陽性コントロールとして用いた。Ｃ型肝炎ウイルスのＥ２糖タンパク質に対する抗体（e509；Burioni et al., Hepatology, 1998）を陰性コントロールとして使用した。Ｆａｂ４９は、免疫蛍光により、ヒトＨ１Ｎ１サブタイプ分離株、すなわち、A/Puerto Rico/8/34分離株、A/Wilson-Smith/33分離株およびA/Malaya/302/54分離株で感染させた全ての細胞に対して特異的な反応性を示した。同様の結果を、本研究で用いたブタ分離株SW1により感染させた細胞を用いて得た。示された蛍光パターンは、明らかな細胞質型パターンであった。あるいは、蛍光は、感染させなかった細胞、Ｈ３Ｎ２サブタイプウイルスで感染させた細胞、およびＢ型分離株または陰性コントロール抗体で感染させた細胞において観察されなかった。
【００６５】
中和アッセイ
選択したクローンのインビトロにおける生物学的活性を特徴付けるために、中和アッセイを、本研究で用いられるいくつかの対照ウイルス分離株について設計した。簡潔には、ＭＤＣＫ細胞（ブタ分離株SW1の場合にはＮＳＫ）を、９６ウェルプレートにてＭＥＭ−１０％ＦＢＳに撒いた（２ｘ１０４細胞／ウェル）。上記のとおりに得られたウイルスストックの連続希釈物（１０−１から１０−８まで）を維持培地（２％ＦＢＳを含むＭＥＭ）で調製した。各希釈を６回繰り返した。培養した細胞がコンフルエントとなった時、増殖培地を取り除き、ウイルス希釈物の各々１００μｌを各ウェルに添加した。３７℃で１時間後、接種菌物を取り除き、１μｇ／ｍｌ  トリプシンを添加したＭＥＭ培地の２００μｌを各ウェルに置いた。ウイルス力価を、ＴＣＩＤ５０（細胞培養物の５０％を感染させるための用量）で表し、リード−ミュンヒの（Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ’）式：
【表１】
0005792060.tif 000002
を適用することにより算出した。
【００６６】
得られたデータを考慮して、ウイルスストックを、中和実験で約０．０１の感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ）（１００個の細胞あたり１ウイルス粒子）を用いるために希釈した。実際の中和アッセイにおいて、細胞を、各ウェルに滅菌スライドを含む２４ウェルプレートに播いた。中和実験を８０％〜９０％コンフルエントな細胞、すなわち、それを撒いて約４８時間後に行った。次いで、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌの最終濃度になるように、精製されたＦａｂ４９の希釈物を調製した。ｅ５０９抗ＨＣＶ抗体の対応する希釈を、陰性コントールとして調製した。次いで、様々なＦａｂ濃度を、希釈したウイルスストック（Ｍ．Ｏ．Ｉ：０．０１）の同一体積にて３７℃で１時間インキュベートした。次に、ウイルス−Ｆａｂ混合物の２５０μｌを、細胞を含むウェルに添加した。感染に対する陽性コントロールを、ウイルスストックに培地のみを添加することにより調製した。プレートを、中和されなかったウイルスを吸着させるために、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、接種菌物を取り除き、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。１μｇ／ｍｌ  トリプシンを含有する血清を含まない培地の１．５ｍｌを各ウェルに添加した。３７℃で６時間のインキュベーション後、細胞の単層をＰＢＳで洗浄し、氷冷メタノール−アセトン溶液（１：２比率にて−２０℃で保存した）で室温にて１０分間固定した。固定された細胞を洗浄し、市販されているモノクローナル抗Ｍ１抗体（Argene）の２５０μと一緒に、湿度チャンバーにて３７℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、最終的に、エバンスブルーで希釈したフルオレセイン抱合ヤギ抗マウス抗体と一緒に、暗室の湿度チャンバーにて３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、スライドを蛍光顕微鏡で検視した。Ｆａｂ４９の中和活性を、単一の陽性細胞をカウントし、ウイルスのみで感染させた陽性コントロールと比較して感染細胞数のパーセンテージ減少を算出することにより調べた。中和アッセイを、中和アッセイに用いられる分離株の各々に対する別々のセッションにて実施した（図１〜３参照）。各実験において、異なるＦａｂ４９希釈物を、同様に、感染の陰性（Ｆａｂ  ｅ５０９抗Ｅ２／ＨＣＶ）および陽性（ウイルスおよびＦａｂを含まない培地）コントロールに対して３回繰り返した。
【００６７】
クローンＩＮＦ４９により産生されたＦａｂは、ヒトおよび動物Ｈ１Ｎ１サブタイプウイルスＡ分離株に対するホモタイプ交差中和活性を示した。一方、本研究で使用した２種類のＨ３Ｎ２サブタイプウイルスおよびＢ型ウイルスの感染能力の減少を検出できず、このことは、サブタイプＨ１Ｎ１において観察されるホモサブタイプ中和活性の特異性を立証する。特に、クローンＩＮＦ４９により産生されるＦａｂ（Ｆａｂ４９と呼ぶ）は、アッセイされたＨ１Ｎ１サブタイプ分離株の各々に対して５μｇ／ｍｌより低いＩＣ５０（アッセイされたウイルス分離株による感染の５０％を阻害するＦａｂ濃度）、すなわち、Ｆａｂが免疫グロブリン形態全体に変換される時に観察される中和する生物学的活性における通常の大きな増加を考慮さえすることなく、問題となっている分子のインビボ投与により得られる濃度を示し、本発明の範囲内に含まれる可能性のある医薬製剤の１つである。
【００６８】
Ｆａｂ４９により認識される抗原の特徴付け：感染細胞由来の溶解物におけるウェスタンブロット
上述のごとく調製したA/Puerto Rico/8/34で感染させた細胞溶解物の１０μｇを、１０％  ポリアクリルアミドゲルにおいて元々の条件下で流した。このため、試料を、適当な冷蔵タンク（BIORAD）にて１００Ｖで１時間流した。その後、ゲルを電気泳動装置から回収し、試薬残渣を取り除くために、トランスファー緩衝液（トリスベース（Tris base）３ｇ；グリシン１４．４１ｇ、ｄＨ２Ｏ  ８００ｍｌ、メタノール  ２００ｍｌ）中で１０分間インキュベートした。次いで、ニトロセルロース膜（Hybond-ECL; Amersham Biosciences）上でトランスファーを、３０Ｖと９０ｍＡで一晩行った。次いで、膜を、１ＸＰＢＳに溶解させた５％  乾燥ミルクで１時間ブロックし、その後、１ＸＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。各洗浄中、膜をスイングプラットフォームにて１０分間振蘯させた。その後、５％乾燥ミルクを含有するＰＢＳで希釈した異なるＦａｂを５μｇ／ｍｌの濃度で添加した。Ｆａｂ４９以外に、下記のコントロールを添加した：陰性コントロールとしてｅ５０９；市販されているマウス抗ＨＡ全ＩｇＧ１（COVANCE）；市販されているマウス抗Ｍ１全ＩｇＧ１（ARGENE）；マウス抗Ｍ２全ＩｇＧ１（ABCAM）；１：２００で希釈したヒト血清。各抗体を室温にて１時間振蘯させた。その後、膜を上述のごとくＰＢＳで再度洗浄した。次いで、ＥＬＩＳＡアッセイにて記載したものと同一の二次マウス（１：１０００）またはヒト（１：２０００）抗体を、検出される抗体の供給源に応じて添加した。シグナルを検出するために、ワーキング（working）溶液を、２つの基質（SuperSignal （登録商標） West Pico Chemiluminescent Substrate Pierce）を１：１の割合で混合させることにより、特に光源に曝露しないように注意しながら調製した。ニトロセルロース膜をワーキング溶液で５分間インキュベートし、次いで取り除き、HyperCassette（AMERSHAM）にマウントした。これを、必要な露出時間後に暗室にてKodakフィルム上に現像した。記載のアッセイを２つの異なるセッションにて行い、それらの各々において、Ｆａｂ４９でインキュベートした膜の一部は、ウイルス血球凝集素の未成熟形態（ＨＡ０）の重さと一致する８０ｋＤよりわずかに低い重さを示すバンドの存在を示した。このことを、抗血球凝集素コントロール抗体とインキュベートした条片（strip）上に示された同一のバンドによっても確認した。他よりもより強い類似バンドを、ヒト血清でインキュベートした膜の一部においても検出した。この実験の結果より、この抗体は、血球凝集素がヒト中和反応の主な標的であることが知られていることから、中和データと完全に一致してインフルエンザウイルス血球凝集素に対して指向性を有することを示す。
【００６９】
サブタイプＡ型インフルエンザ（Ｈ１Ｎ１）（ブタインフルエンザ）由来のＨＡに対する結合および中和アッセイ
インフルエンザウイルスA/PR/08/1934およびA/California/04/2009のＨＡ部分を、それぞれ感染させたＭＤＣＫ細胞の上澄み液から増幅するか、またはインビトロで合成し（ドイツ、レーゼンバーグのGenART）、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（Invitrogen）にクローン化し、それにより１つの構築物Ｈ１  ＨＡ（A/RP/08/1934）および１つの構築物Ｈ１  ＨＡ（A/California/04/2009）を得た。
【００７０】
２つの上記分離株のＨＡタンパク質のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：６（A/PR/08/1934に由来するＨＡタンパク質のｃＤＮＡ配列）、配列番号：７（A/PR/08/1934に由来するＨＡタンパク質のアミノ酸配列）、配列番号：８（A/California/04/2009に由来するＨＡタンパク質のｃＤＮＡ配列）および配列番号：９（A/California/04/2009に由来するＨＡタンパク質のアミノ酸配列）として配列表にて示す。
【００７１】
ヒト上皮腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞を、構築物Ｈ１  ＨＡ（A/RP/08/1934）または構築物Ｈ１  ＨＡ（A/California/04/2009）を含む組み換えベクターｐｃＤＮＡ３．１の３μｇでトランスフェクトした。遠心分離および固定の後、トランスフェクトされた細胞を、Ｆａｂ４９（１０μｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベートした。さらなる洗浄後、細胞を、ＦＩＴＣ抱合ヒト抗Ｆａｂモノクローナル抗体と一緒にインキュベートし、ＦＡＣＳによりアッセイした。データを、Perotti et al., J Virology, 2008 Jan;82(2):1047-52により記載されるごとく解析した。実験は、Ｆａｂ４９が組み換えベクターのいずれかでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を認識することを示した。
【００７２】
中和アッセイにおいては、レポーター遺伝子Ｌｕｃを含むペリキャプシド（pericapside）（シュードタイピング）におけるインフルエンザＨＡタンパク質を発現させるように改変したレトロウイルスベクターを、ＦｕＧｅｎｅ６（Roche）および下記のプラスミド：Ｌｕｃシステム（５μｇ pCMVΔR8.2および５．５μｇ pHR’CMV-Luc）と構築物Ｈ１  ＨＡ（A/PR/08/1934）またはＨ１  ＨＡ（A/California/04/2009）の３μｇで共トランスフェクトした２９３Ｔ細胞から産生した。上澄み液をトランスフェクションの４８時間後に採取し、０．４５μｍ  低タンパク質結合フィルターを通してろ過し、すぐに使用するか、または−８０℃で凍結させた。ＨＡシュードタイプの力価を２９３ＴおよびＭＤＣＫ細胞において測定した。簡単に説明すると、異なる希釈においてレンチウイルスＬｕｃ  ＨＡ-シュードタイプベクター（ＨＡ−Ｌｕｃ）の１００μｌによる細胞の感染４８時間後に、９６ウェルプレート中の細胞を、製造業者の説明書に従ってＬｕｃ細胞溶解緩衝液（ルシフェラーゼアッセイ試薬、Promega）中で溶解させた。シュードタイプの力価を相対蛍光単位（ＲＬＵ／ｍｌ）として表した。
【００７３】
Ｆａｂ４９の中和活性を、インフルエンザシュード粒子に基づく中和アッセイを用いることにより試験した。この方法は、Ｆａｂ４９が、約２μｇ／ｍｌの［ＩＣ５０］をもって、２種類のＨ１Ｎ１サブタイプ分離株（A/PR/08/1934およびH1 HA (A/California/04/2009）で作成した全てのインフルエンザウイルスシュード粒子に対して強力な中和活性を有することを示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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