(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝的に改変したヒトアルギナーゼに共有結合的に結合したＰＥＧ部分を有するＰＥＧ−アルギナーゼコンジュゲートを含む、アルギニン依存性疾患を治療するための医薬組成物であって、
該ヒトアルギナーゼの遺伝的改変は該ＰＥＧ部分を共有結合的に結合させるための単一のアミノ酸位置を有するアミノ酸配列を形成するものであり、
該遺伝的に改変したヒトアルギナーゼのアミノ酸位置は、該ＰＥＧ−アルギナーゼコンジュゲートの血清循環半減期を純粋の非改変ヒトアルギナーゼの血清循環半減期を越えて増加させ、該ＰＥＧ−アルギナーゼコンジュゲートの免疫原性を純粋の非改変ヒトアルギナーゼの免疫原性を下回るように減少させるように配置させるものであり、
該ＰＥＧ部分の結合位置は、結果として生じた折りたたまった遺伝的に改変したＰＥＧ−コンジュゲート化したヒトアルギナーゼタンパク質内の活性部位から該ＰＥＧ結合が活性部位に干渉しない程度に十分に遠いものであり、
該遺伝的に改変したヒトアルギナーゼが配列番号６で示されるアミノ酸配列からなり、該ＰＥＧ部分の結合位置がＣｙｓ４５である、上記医薬組成物。
【請求項２】
遺伝的に改変したバチルス・カルドベロックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ）アルギナーゼに共有結合的に結合したＰＥＧ部分を有するＰＥＧ−アルギナーゼコンジュゲートを含む、アルギニン依存性疾患を治療するための医薬組成物であって、
該バチルス・カルドベロックスアルギナーゼの遺伝的改変は該ＰＥＧ部分を共有結合的に結合させるための単一のアミノ酸位置を有するアミノ酸配列を形成するものであり、
該遺伝的に改変したバチルス・カルドベロックスアルギナーゼのアミノ酸位置は、該ＰＥＧ−アルギナーゼコンジュゲートの血清循環半減期を純粋の非改変バチルス・カルドベロックスアルギナーゼの血清循環半減期を越えて増加させ、該ＰＥＧ−アルギナーゼコンジュゲートの免疫原性を純粋の非改変バチルス・カルドベロックスアルギナーゼの免疫原性を下回るように減少させるように配置させるものであり、
該ＰＥＧ部分の結合位置は、結果として生じた折りたたまった遺伝的に改変したＰＥＧ−コンジュゲート化したバチルス・カルドベロックスアルギナーゼタンパク質内の活性部位から該ＰＥＧ結合が活性部位に干渉しない程度に十分に遠いものであり、
該遺伝的に改変したバチルス・カルドベロックスアルギナーゼが配列番号８で示されるアミノ酸配列からなり、該ＰＥＧ部分の結合位置がＣｙｓ１６１である、上記医薬組成物。
【請求項３】
前記ＰＥＧ部分と前記遺伝的に改変したヒトアルギナーゼ又は遺伝的に改変したバチルス・カルドベロックスアルギナーゼの比が１である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＰＥＧ部分が一本鎖又は分岐鎖ポリエチレングリコールである、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
薬学的に許容される担体、賦形剤又は補助剤をさらに含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記アルギニン依存性疾患が、アルギニン依存性の癌又はＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウイルス及びＢ型肝炎ウイルスからなる群より選択されるウイルスによる感染症である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００９年３月２６日に出願された米国特許仮出願番号第６１／１６３，８６３号からの利益を主張するものであり、その内容は全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明はアルギナーゼの修飾に関し、酵素の血清又は循環時の半減期を増加させて、その薬物動態学的特性、生体内での生物学的活性、安定性を改善し、生体内での酵素に対する免疫反応（免疫原性）を低減することを目的とする。より具体的には、本発明は酵素をコードする遺伝子を遺伝子改変することを通じたモノポリエチレングリコールのアルギナーゼへの部位特異的な共有結合的コンジュゲーションにより、モノの、部位特異的なペグ化アルギナーゼを生産することに関し、これは例えば、様々ながん及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症などの数種のアルギニン依存性疾患についての有効な手段となるものである。
【背景技術】
【０００３】
アルギナーゼ
アルギナーゼは金属活性化型の水酸化物イオンを含有するマンガン金属酵素であり、この水酸化物イオンは加水分解又は水和反応を触媒する金属酵素での重要な求核体である。アルギナーゼは自然に存在するアルギニンをオルニチン及び尿素へと変換する。この酵素は細菌及びヒトを包含する多くの生きている生物中に存在する（Ｊｅｎｋｉｎｓｏｎ他、１９９６年、Ｃｏｍｐ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１１４：１０７〜３２頁）。
【０００４】
アルギナーゼのペグ化
アルギナーゼは治療薬として用いられ、様々な適応症のために非経口的に投与され得る。しかしながら非経口的に投与されたアルギナーゼはタンパク質であり、免疫原性があって薬理学的半減期は短いものであり得る。その結果として、患者の中でタンパク質を治療的に有用な血中レベルに達させるのは難しいことがある。これらの問題はタンパク質をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマーにコンジュゲートすることにより克服し得る。
【０００５】
不活性な、非毒性の、生分解性ポリマーであるＰＥＧの分子への共有結合的付加はバイオテクノロジー及び医学の中で重要な用途を有する。生物学的及び薬学的に活性のあるタンパク質のペグ化は薬物動態を改善して持続時間の維持をもたらし、安全性を改善し（毒性、免疫原性及び抗原性を低下させる等）、有効性を増加させ、投薬頻度を減少させ、薬剤の溶解性及び安定性を改善し、タンパク質分解を低減し、及び調節された薬剤放出を促進することが報告されている（Ｒｏｂｅｒｔｓ他、２００２年、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、５４：４５９〜７６頁；Ｈａｒｒｉｓ＆Ｃｈｅｓｓ、２００３年、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ、２：２１４〜２２１頁）。
【０００６】
当該技術分野の従来法により生産されたＰＥＧ−タンパク質コンジュゲートは不均一な種を含有するが、これらの各々に可変数のＰＥＧ分子が付加されており、その数は０からタンパク質が有するアミノ基数までの範囲にわたる。同数のＰＥＧ分子が付加された種であったとしても、タンパク質上の付加部位は種ごとに変わり得る。かかる非特異的なペグ化はしかしながら、部分的に又は実質的に不活性なコンジュゲートをもたらすことがある。活性の低減は、ＰＥＧが不適当な部位に付加されたときにタンパク質の活性受容体結合ドメインが遮蔽されることによるものであり得る。したがって、元のタンパク質の活性を保持する、均一にペグ化されたタンパク質分子を生産し、臨床での使用に必要な正確で一致した用量の投与を可能にする、より良い方法への明確な需要がある。
【０００７】
アミノ酸欠如を通じたがん治療
アミノ酸欠如治療はいくらかのがんの治療に有効な手段である。正常細胞はアルギニンを要求しないが、多くのがん細胞系はこのアミノ酸に対して栄養要求性がある。多種の証拠は、アルギニン分解酵素による又はアルギニン欠乏培地を用いる試験管内でのアルギニン枯渇が広い範囲のがん細胞の迅速な破壊を導くことを示している（Ｓｃｏｔｔ他、２０００年、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、８３：８００〜１０頁）。しかしタンパク質である酵素の直接的な使用は免疫原性、抗原性及び短い循環半減期の問題がある。
【０００８】
アルギニン欠如によるウイルス阻害
ウイルス感染症は毎年数百万人にも上る死亡の主たる原因の１つで、肝炎ウイルス及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を包含するいくつかのウイルスに直接的に起因し得るものである。しかしながら、現在の抗ウイルス治療にはいくつかの問題がある。第一に、有効な抗ウイルス薬は比較的少ない。現存する抗ウイルス薬の多くは有害な又は望ましくない副作用を引き起こす。最も有効な治療（ワクチン接種など）は単一のウイルス株のみに対して高度に特異的である。しばしばウイルスは薬剤又はワクチンのいずれかに対して耐性となるように変異を起こす。従来技術に関連した問題を持たないウイルス複製を阻害する方法への需要がある。
【０００９】
過去３０年間にわたる多くの研究は、細胞外のアルギニンが試験管内でのウイルス複製に必要とされることを実証した。歴史的にこれはアルギニンを欠乏した組織培養培地を作製して、アルギニンを含まない培地を達成するための添加物として用いられる血清を透析することにより成し遂げられた。アルギニン欠如を達成するこの方法論を用いることは、アデノウイルス（Ｒｏｕｓｅ他、１９６３年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２０：３５７〜３６５頁）、ヘルペスウイルス（Ｔａｎｋｅｒｓｌｅｙ、１９６４年、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、８７：６０９〜１３頁）を包含する多様なウイルスファミリーの多くについて複製阻害をもたらした。
【００１０】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は致命的な疾病であり、その報告症例は過去数年の間で劇的に増加した。ＡＩＤＳウイルスは１９８３年に初めて同定された。ＡＩＤＳウイルスはいくつかの名称及び頭字語により知られている。ＡＩＤＳウイルスは三番目に公知になったＴ−リンパ指向性のウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）で、免疫系の細胞内で複製する能力を有し、重度の細胞破壊を引き起こす。ＡＩＤＳウイルスはレトロウイルスで、複製の際に逆転写酵素を用いるウイルスである。２つの別個のＨＩＶファミリー、即ちＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２が今までに記述されている。本明細書の中で頭字語“ＨＩＶ”はヒト免疫不全ウイルスを一般的に呼ぶのに用いられる。ＨＩＶ複製はアルギニン依存的と思われており、したがってアルギニンの枯渇はＨＩＶ複製を阻害する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の１つの目的は、実質的に均一な、アルギナーゼ分子の特異的部位に共有結合したＰＥＧ部分を有する、新規のＰＥＧ−アルギナーゼコンジュゲートを提供することである。本発明の好ましい実施形態の２つは、Ｃｙｓ４５−ヒトアルギナーゼＩ（ＨＡＩ）及びＣｙｓ１６１−バチルス・カルドベロックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ）アルギナーゼ（ＢＣＡ）である。
【００１２】
本発明の別の目的は、部位指定的な、モノペグ化アルギナーゼコンジュゲートを生産する方法を提供することであり、このコンジュゲートは強力な抗がん及び抗ウイルス効果を有する。本発明の特定の実施形態の１つは、３つの一般的なステップを含む。第一のステップは、アルギナーゼをコードする遺伝子を遺伝子改変することで、結果として得られるアルギナーゼが所定の位置において単一の遊離システイン残基を有するようにすることである。第二のステップは、改変された遺伝子を選択された系の中で発現させて所望のアルギナーゼを生産することである。発現系はヒト細胞若しくは組織、又は例えば細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞若しくはトランスジェニック動物を包含する他の生物であり得る。第三のステップはアルギナーゼの遊離システイン残基とＰＥＧ化合物のマレイミド基（ＭＡＬ）との間のコンジュゲーションであり、ＰＥＧ化合物とアルギナーゼの遊離システインとの間の共有結合をもたらす。
【００１３】
本発明の別の目的は、アルギニン枯渇を通じてウイルス感染症を治療する方法を提供することである。この治療方法は均一なモノペグ化アルギナーゼをウイルスの複製阻害に利用する。
【００１４】
本発明の別の目的は、抗ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の方法を提供することである。この方法は均一なモノペグ化アルギナーゼをＨＩＶの複製阻害に利用する。
【００１５】
本発明の別の目的は、バチルス・カルドベロックスアルギナーゼの２０位におけるバリン（又はＨＡＩ及び他のアルギナーゼ中の相当位置）を別のアミノ酸残基、例えばプロリンで置換することにより、アルギナーゼの酵素活性を増強する方法を提供することである。
【００１６】
本発明のなお別の目的は、アルギナーゼの酵素活性を増強する方法を提供することであり、これは野生型の金属補因子であるマンガンをコバルトで置換することにより達成される。
【００１７】
本発明を特徴付ける様々な新しい特徴は、本明細書に添付され、その一部を形成する特許請求の範囲の中で詳細に説明されている。本発明、その操作上の利点及びその使用により達成される特定の目的をより良く理解するため、本発明の好ましい実施形態が図示され記述される図面及び以下の記載を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１ａ】ヒトアルギナーゼＩのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す図である。
【図１ｂ】本発明による部位指定的なペグ化のためにデザインされたヒトアルギナーゼＩの変異ヌクレオチド配列（配列番号２）を示す図である。
【図１ｃ】本発明によるバチルス・カルドベロックスアルギナーゼのヌクレオチド配列（配列番号３）を示す図である。
【図１ｄ】本発明による部位指定的なペグ化のためにデザインされたバチルス・カルドベロックスアルギナーゼの変異ヌクレオチド配列（配列番号４）を示す図である。
【００１９】
【図２ａ】ヒトアルギナーゼＩのアミノ酸配列（配列番号５）を示す図である。
【図２ｂ】本発明によるＣｙｓ４５部位指定的なペグ化のためにデザインされたヒトアルギナーゼＩの改変アミノ酸配列（配列番号６）を示す図である。
【図２ｃ】バチルス・カルドベロックスアルギナーゼのアミノ酸配列（配列番号７）を示す図である。
【図２ｄ】本発明によるＣｙｓ１６１部位指定的なペグ化のためにデザインされたバチルス・カルドベロックスアルギナーゼの改変アミノ酸配列（配列番号８）を示す図である。
【００２０】
【図３ａ】Ｃｙｓ４５部位指定的なペグ化のためにデザインされたヒトアルギナーゼＩ変異体（Ｃ１６８Ｓ／Ｃ３０３Ｓ）のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（配列番号９及び１０）を示す図である。
【図３ｂ】Ｃｙｓ４５部位指定的なペグ化のためにデザインされた６×Ｈｉｓタグ付加ヒトアルギナーゼＩ変異体（Ｃ１６８Ｓ／Ｃ３０３Ｓ）のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（配列番号１１及び１２）の配列比較を示す図である。
【図３ｃ】Ｃｙｓ１６１部位指定的なペグ化のためにデザインされたバチルス・カルドベロックスアルギナーゼ変異体（Ｓ１６１Ｃ）のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（配列番号１３及び１４）を示す図である。
【図３ｄ】Ｃｙｓ１６１部位指定的なペグ化のためにデザインされた６×Ｈｉｓタグ付加バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ変異体（Ｓ１６１Ｃ）のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（配列番号１５及び１６）の配列比較を示す図である。
【００２１】
【図４ａ】野生型ヒトアルギナーゼＩの結晶構造（ＮＣＢＩウェブサイトからＣｎ３Ｄ  ４．１ソフトウェアを用いてダウンロードされた）を示す図であり、Ｃｙｓ４５は活性部位から離れていることを示している。
【図４ｂ】野生型バチルス・カルドベロックスアルギナーゼの結晶構造を示す図であり、Ｓｅｒ１６１は活性部位から離れていることを示す。
【００２２】
【図５ａ】６×Ｈｉｓタグ付加ヒトアルギナーゼＩ変異体の単一鎖ｍＰＥＧ−マレイミド（２０ｋＤａ）でのＣｙｓ４５特異的なモノペグ化についてのコンジュゲーション手順を示す図であり、マレイミドの二重結合がスルフヒドリル基とアルキル化反応を起こして、安定なチオエーテル結合を形成することを示している。
【図５ｂ】６×Ｈｉｓタグ付加バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ変異体のＣｙｓ１６１特異的なモノペグ化についての対応する手順を示す。
【００２３】
【図６ａ１】アルギナーゼ遺伝子を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１−ＤＥ３による２リットル発酵槽中での発酵の時間経過を表す、回分発酵から得られた結果を示す図である。
【図６ａ２】アルギナーゼ遺伝子を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１−ＤＥ３による２リットル発酵槽中での発酵の時間経過を表す、流加回分発酵から得られた結果を示す図である。
【図６ｂ１】回分発酵の履歴プロットを示す図であり、温度、撹拌速度、ｐＨ、溶存酸素値などのパラメーターの変化を示す。
【図６ｂ２】流加回分発酵の履歴プロットを示す図であり、温度、撹拌速度、ｐＨ、溶存酸素値などのパラメーターの変化を示す。
【図６ｃ】６×Ｈｉｓタグ付加ヒトアルギナーゼＩ変異体のキレート化ＦＦセファロースカラムからの溶出プロファイルを示す図であり、最初のピークはタンパク質の不純物、２番目のピークは精製されたヒトアルギナーゼＩである。
【図６ｄ】６×Ｈｉｓタグ付加バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ変異体のキレート化ＦＦセファロースカラムからの溶出プロファイルを示す図であり、最初のピークはタンパク質の不純物、２番目のピークは精製されたバチルス・カルドベロックスアルギナーゼである。
【００２４】
【図７ａ】６×Ｈｉｓタグ付加ヒトアルギナーゼＩ変異体に関係した異なる画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図７ｂ】６×Ｈｉｓタグ付加バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ変異体に関係した異なる画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【００２５】
【図８ａ】ペグ化されていないヒトアルギナーゼＩ変異体及びＣｙｓ４５ペグ化ヒトアルギナーゼＩ変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である（レーン１：タンパク質分子量マーカー、レーン２：ペグ化されていないヒトアルギナーゼＩ変異体、レーン３：Ｃｙｓ４５ペグ化ヒトアルギナーゼＩ（ＨＡＩ−ＰＥＧ２０））。
【図８ｂ】ペグ化されていないバチルス・カルドベロックスアルギナーゼ変異体及びＣｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である（レーン１：タンパク質分子量マーカー、レーン２：ペグ化されていないバチルス・カルドベロックスアルギナーゼ変異体、レーン３：Ｃｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ（ＢＣＡ−ＰＥＧ２０））。
【００２６】
【図９ａ】ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注入された単一用量のペグ化されていない及びＣｙｓ４５ペグ化ヒトアルギナーゼＩ（ＨＡＩ−ＰＥＧ２０）の薬物動態学的プロファイルを示す図である。
【図９ｂ】ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注入された単一用量のペグ化されていない及びＣｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ（ＢＣＡ−ＰＥＧ２０）の薬物動態学的プロファイルを示す図である。
【００２７】
【図１０ａ】ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注入された単一用量のＣｙｓ４５ペグ化ヒトアルギナーゼＩ（ＨＡＩ−ＰＥＧ２０）の１４日目までの薬力学的プロファイルを示す図である。
【図１０ｂ】ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注入された単一用量のＣｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ（ＢＣＡ−ＰＥＧ２０）の１４日目までの薬力学的プロファイルを示す図である。
【００２８】
【図１１ａ】異なる薬剤を注入された、Ｈｅｐ３Ｂヒト肝臓がん細胞を異種移植されたＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの試験期間中の平均体重（±ｓ．ｅ．ｍ．）を示す図である。
【図１１ｂ】Ｃｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼを注入された、ＭＣＦ−７ヒト乳がん細胞を異種移植されたＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの試験期間中の平均体重（±ｓ．ｅ．ｍ．）を示す図である。
【００２９】
【図１２ａ】Ｈｅｐ３Ｂヒト肝臓腫瘍細胞を皮下に移植されたＢＡＬＢ／ｃヌードマウスでのペグ化されていない及びＣｙｓ４５ペグ化ヒトアルギナーゼＩ（ＨＡＩ−ＰＥＧ２０）の生体内での活性（効力）を示す図である。
【図１２ｂ】ＭＣＦ−７ヒト乳がん細胞を皮下に異種移植されたＢＡＬＢ／ｃヌードマウスでのＣｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ（ＢＣＡ−ＰＥＧ２０）の生体内での活性を示す図である。
【００３０】
【図１３】Ｃｙｓ４５ペグ化ヒトアルギナーゼＩ（ＨＡＩ−ＰＥＧ２０）についてのＨＩＶ阻害アッセイを示す図である。
【００３１】
【図１４】アジドチミジン（ＡＺＴ）についてのＨＩＶ阻害アッセイを示す図である。
【００３２】
【図１５】Ｃｙｓ４５ペグ化ヒトアルギナーゼＩ（ＨＡＩ−ＰＥＧ２０）の細胞毒性を示す図である。
【００３３】
【図１６】異なる金属補因子、即ちＭｎ２＋及びＣｏ２＋を伴うヒトアルギナーゼＩの定常状態反応速度の比較を示す図である。
【００３４】
【図１７】バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ（ＢＣＡ）のＶ２０Ｐ変異体及びＭｎ２＋（ＢＣＡＷＴＭｎ２＋）又はＣｏ２＋で置き換えた野生型ＢＣＡの定常状態反応速度の比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
ヒトアルギナーゼＩ遺伝子（ＨＡＩ）のクローニング
ヒトアルギナーゼＩの遺伝子配列は図１ａ（配列番号１）に示される。６×Ｈｉｓタグ付加ヒトアルギナーゼＩ（ＨＡＩ）の遺伝子はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりｐＡＥＤ４／ＨＡＩプラスミドから生成され、以下のオリゴヌクレオチドを用いることで５’末端においてＮｄｅＩ認識部位、３’末端においてＢａｍＨＩ認識部位が生成された。
【化１】
0005746137.tif 000002
ＰＣＲ産物はＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断され、ｐＥＴ３ａ発現プラスミドベクター（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）中にサブクローニングされた。
【００３６】
ｐＥＴ３ａ大腸菌発現プラスミドベクターはＴ７プロモーターを含有する。Ｔ７プロモーターは遺伝子１０のリーダー断片の上流に位置する。正確な配列はヒトアルギナーゼＩの全コード領域（図１ａ）をＤＮＡ塩基配列決定することで確認された。このプラスミドはｐＥＴ３ａ／ＨＡＩと呼ばれる。
【００３７】
バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ遺伝子（ＢＣＡ）のクローニング
バチルス・カルドベロックスアルギナーゼの遺伝子配列は図１ｃ（配列番号３）に示される。６×Ｈｉｓタグ付加バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ（ＢＣＡ）の遺伝子はｐＵＣ５７／ＢＣＡプラスミドからＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素を用いて切り出された。挿入断片はｐＥＴ３ａ発現プラスミドベクター（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）中にサブクローニングされた。
【００３８】
正確な配列はバチルス・カルドベロックスアルギナーゼの全コード領域（図１ｃ）を塩基配列決定することで確認された。このプラスミドはｐＥＴ３ａ／ＢＣＡと呼ばれる。
【００３９】
ＨＡＩの変異誘発
プラスミドｐＥＴ３ａ／ＨＡＩはＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）に従って部位指定的な変異誘発のための鋳型として用いられた。Ｃｙｓ１６８及びＣｙｓ３０３残基に対するコドンは、以下の変異誘発プライマー（それぞれ配列番号１９、２０、２１及び２２）を用いることでそれぞれＳｅｒ１６８及びＳｅｒ３０３に対するコドンに変異した。
Ｓｅｒ１６８に対するコドンに変異するＣｙｓ１６８に対するコドン
【化２】
0005746137.tif 000003
Ｓｅｒ３０３に対するコドンに変異するＣｙｓ３０３に対するコドン
【化３】
0005746137.tif 000004
【００４０】
変異プラスミドは最初にコンピテント大腸菌のＴｏｐ１０細胞中に形質転換された。変異プラスミドの配列はＤＮＡ塩基配列決定により確認された。部位指定的なペグ化のためにデザインされたＨＡＩ変異体の遺伝子配列は図１ｂ（配列番号２）に示される。変異プラスミドは次いでタンパク質発現のため、大腸菌ＢＬ２１−ＤＥ３細胞中に形質転換された。野生型ＨＡＩのアミノ酸配列は図２ａ（配列番号５）に示される。Ｃ１６８Ｓ／Ｃ３０３Ｓ変異体のアミノ酸配列は図２ｂ（配列番号６）、図３ａ（配列番号１０）及び図３ｂ（配列番号１２）に示される。図２ｂに示されるように、ヒトアルギナーゼＩの中の２つのシステイン残基はセリン残基により置換された。これら２つのセリン残基は下線を引かれている。唯一存在するＣｙｓはＣｙｓ４５である。この変異体はＣ１６８Ｓ／Ｃ３０３Ｓと称され、ただ１つの単一のＣｙｓ残基（これも下線を引かれている）のみを含有する。野生型ＨＡＩの結晶構造は図４ａに示される。この構造に基づいて、Ｃ１６８Ｓ／Ｃ３０３Ｓ変異体を構築するための合理的なタンパク質薬剤デザインが作製された。図２ｄでは、バチルス・カルドベロックスアルギナーゼの中の１つのセリン残基がシステイン残基に置き換えられたことを示す。このシステイン残基は下線を引かれている。６×Ｈｉｓタグ領域もまた下線を引かれており、Ｃ末端に配置されている。この変異体はＳ１６１Ｃと称される。
【００４１】
６×Ｈｉｓタグ付加アルギナーゼの発現及び精製
６×Ｈｉｓタグ付加ヒトアルギナーゼＩをコードする変異アルギナーゼ遺伝子を含有するプラスミドを内部に有する大腸菌ＢＬ２１−ＤＥ３は３７℃で一晩、８０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ培地中で培養された。接種菌液は１：２５に希釈されてＯＤ６００が約０．８になるまで振とうフラスコ中で培養されるか、又は接種菌液は１：１０に希釈されてＯＤ６００が約１５になるまで発酵槽中で培養された。細胞は次いで０．４ｍＭのＩＰＴＧで４時間誘導された。細菌細胞は遠心分離により回収され、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、ｐＨ７．４中に再懸濁され、高圧ホモゲナイゼーションにより破砕された。
【００４２】
６×Ｈｉｓタグ付加ヒトアルギナーゼＩはバッファーＡ（０．０２Ｍリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化されたキレート化ＦＦセファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム（５．０ｃｍ×９ｃｍ、総容積１７６ｍＬ）により精製された。６×Ｈｉｓタグ付加アルギナーゼは０．１５から０．２５Ｍ勾配のイミダゾールで溶出された（図６ａ及び図６ｂ）。流速は２０ｍＬ／分であった。精製されたアルギナーゼを含有する画分（図７ａ及び図７ｂ）が回収された。精製されたアルギナーゼの収率はおよそ２８０ｍｇ／Ｌ細胞培養であった。
【００４３】
上述の６×Ｈｉｓタグ付加ヒトアルギナーゼＩの場合の手法と全く同じ手法が、精製された６×Ｈｉｓタグ付加バチルス・カルドベロックスアルギナーゼを得るために繰り返された。
【００４４】
６×Ｈｉｓタグ付加アルギナーゼの部位指定的なペグ化
図５ａは６×Ｈｉｓタグ付加ヒトアルギナーゼＩ変異体の単一鎖ｍＰＥＧ−マレイミド（２０ｋＤａ）でのＣｙｓ４５特異的なモノペグ化についてのコンジュゲーション手順を示し、これは“ＨＡＩ−ＰＥＧ２０”と呼ばれる。マレイミドの二重結合はスルフヒドリル基とアルキル化反応を起こして、安定なチオエーテル結合を形成する。図５ｂは６×Ｈｉｓタグ付加バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ変異体の単一鎖ｍＰＥＧ−マレイミド（２０ｋＤａ）でのＣｙｓ１６１特異的なモノペグ化についてのコンジュゲーション手順を示し、これは“ＢＣＡ−ＰＥＧ２０”と呼ばれる。６×Ｈｉｓタグ付加アルギナーゼ１ｇは０．０２Ｍリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中で、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎシステム（５００ｍＬ）を用いて１０Ｋ（カットオフ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により透析濾過された。アルギナーゼ濃度は最終的に約２ｍｇ／ｍＬに希釈された。還元剤のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、ＴＣＥＰが１モルのアルギナーゼに対してモル量で１０モル超、還元のために添加され、溶液は室温で４時間、穏やかに撹拌された。１モルのアルギナーゼに対してモル量で２０モル超のｍＰＥＧ−マレイミド又はｍＰＥＧ−ＭＡＬ（２０ｋＤａ）（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ）が還元されたアルギナーゼに対して添加され、４℃で一晩撹拌された。
【００４５】
部位指定的なペグ化の進捗はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図８ａ及び図８ｂ）によりモニターされた。上述の条件下で、ヒトアルギナーゼＩ上の４５位におけるシステインの遊離スルフヒドリル基は安定なチオエーテル結合を通じてｍＰＥＧ−ＭＡＬ（２０ｋＤａ）の活性化されたマレイミド基に特異的に連結された。コンジュゲーションの最終産物は主にＣｙｓ４５ペグ化ヒトアルギナーゼＩ、コンジュゲートされていないヒトアルギナーゼＩ及びｍＰＥＧ−ＭＡＬ（２０ｋＤａ）を含む。同様にバチルス・カルドベロックスアルギナーゼについて、１６１位のシステイン残基が安定なチオエーテル結合を通じてｍＰＥＧ−ＭＡＬ（２０ｋＤａ）の活性化されたマレイミド基に特異的に連結された。
【００４６】
ｍＰＥＧ−ＭＡＬ（２０ｋＤａ）ペグ化アルギナーゼはｍＰＥＧ−ＭＡＬ（５ｋＤａ）ペグ化アルギナーゼに対して半減期が長い点で有利であり、ｍＰＥＧ−ＭＡＬ（４０ｋＤａ）ペグ化アルギナーゼに対して溶解性が良い点で有利である。
【００４７】
２リットル発酵槽中での回分発酵
アルギナーゼ遺伝子を含有する大腸菌ＢＬ２１−ＤＥ３株は−８０℃で保存された。回分発酵及び流加回分発酵のための種菌液を調製するため、前述の株の凍結ストック１００μＬが８０ｍＬの発酵培地を含有する２５０ｍＬフラスコ中に移された。細菌培養液は３７℃、ｐＨ７．０でオービタルシェーカーの中で回転数２５０ｒｐｍで培養された。培養はＯＤ６００ｎｍが５．５〜６．０に達したおよそ８〜１０時間時で停止された。種菌液１２ｍＬ（１％）は１２００ｍＬのオートクレーブされた強化発酵培地を含有する２Ｌ発酵槽中に導入された。回分発酵は温度３７℃で行われた。ｐＨは水酸化ナトリウム及び塩酸を添加することにより７．０に維持された。溶存酸素レベルは空気を１〜４Ｌ／分で導入すること及び発酵槽の撹拌速度を３００〜１２００ｒｐｍに調整することにより、３０％より高い空気飽和度に調節された。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト−Ｐ（ＩＰＴＧ）１００ｍＭは、バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ（ＢＣＡ）タンパク質発現の誘導物質であるが、ＯＤ６００ｎｍがおよそ１１．０であった５時間時に発酵ブロス中に終濃度０．５ｍＭで導入された。ＩＰＴＧ誘導の後、発酵はＯＤ６００ｎｍがおよそ１６．４であった９時間時まで続けられた。発酵細胞はＢＣＡの分離及び精製のため、ＩＰＴＧ誘導後４時間時に収集された。前述の株はおよそ１０５ｍｇ／Ｌ発酵培地の量の活性型ＢＣＡを生産した。発酵の時間経過は図６ａ１にプロットされる。温度、撹拌速度、ｐＨ及び溶存酸素値などのパラメーターの変化を示す、この回分発酵の履歴プロットは図６ｂ１に表される。
【００４８】
２Ｌ発酵槽中での流加回分発酵
高細胞密度培養での流加回分発酵は３７℃、ｐＨ７．０で行われ、溶存酸素は全発酵プロセスの間、３０％より高い空気飽和度に維持された。種菌液を調製するための手順は上記の回分発酵のそれと同様であった。発酵は初期には回分培養戦略で、５ｍＬ（１％）の種菌液を５００ｍＬのオートクレーブされた強化発酵培地を含有する２Ｌ発酵槽中に導入することにより開始された。溶存酸素は回分培養期間中の増殖相の間、３０％前後の空気飽和度に徐々に減少した。いったん溶存酸素レベルが８０％より高く上昇したら、これは炭素源の枯渇を表しており、ＰＯ２  ｓｔａｔ流加回分戦略が強化培地供給を追加して開始された。この戦略の中で、供給速度は６０％を下回る溶存酸素レベルを維持するように調製され、これは最小限ではあるが適切な量の炭素源を発酵プロセスの間、提供した。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト−Ｐ（ＩＰＴＧ）１００ｍＭはＯＤ６００ｎｍがおよそ１００であった１８時間時に発酵ブロス中に終濃度０．５ｍＭで導入された。ＩＰＴＧ誘導の後、発酵はＯＤ６００ｎｍがおよそ１８６．８であった２８時間時まで続けられた。発酵細胞はＢＣＡの分離及び精製のため、ＩＰＴＧ誘導後１０時間時に収集された。前述の株は発酵培地１リットルあたりおよそ１４８９．６ｍｇ量の活性型ＢＣＡを生産し、これは異なる型のアルギナーゼについての他の全ての報告された収率より高い。発酵の時間経過は図６ａ２にプロットされる。温度、撹拌速度、ｐＨ及び溶存酸素値などのパラメーターの変化を示す、この回分発酵の履歴プロットは図６ｂ２に表される。
【００４９】
回分発酵と流加回分発酵との比較
下の表１は回分発酵と流加回分発酵との結果を比較している。比較は、培養液のＯＤ６００、細胞乾燥重量及び培養液１リットルあたりのＢＣＡ収率の点で流加回分発酵が回分操作より大きく優れていることを実証している。
【表１】
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【００５０】
部位指定的ペグ化アルギナーゼの精製
アフィニティーニッケルイオンカラムクロマトグラフィーは６×Ｈｉｓタグ付加部位指定的ペグ化アルギナーゼをｍＰＥＧ−ＭＡＬ（２０ｋＤａ）から分離するのに以下に述べられるように用いられた。コンジュゲーションの最終産物はバッファーＡ（０．０２Ｍリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化されたキレート化ＦＦセファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム（５．０ｃｍ×９ｃｍ、総体積１７６ｍＬ）上にロードされた。カラムはカラム体積の５倍のバッファーＡで洗浄され、遊離ｍＰＥＧ−ＭＡＬ（２０ｋＤａ）が除去された。ペグ化アルギナーゼは３０％から１００％までの塩勾配の、カラム体積の５倍のバッファーＢ（０．０２Ｍリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍイミダゾール、ｐＨ７．４）を用いて溶出された。溶出液のタンパク質含量は２８０ｎｍの波長でモニターされた。カラムは流速２０ｍＬ／分で溶出され、ペグ化アルギナーゼ画分が回収された。プールされた画分はＰＢＳバッファー（Ｇｉｂｃｏ）中で透析濾過され、４〜６ｍｇ／ｍＬに濃縮された。動物試験の前に、タンパク質薬剤の中のエンドトキシンはＱ−ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｓ）を用いて除去された。
【００５１】
部位指定的ペグ化アルギナーゼの試験管内での細胞毒性
Ｃｙｓ４５ペグ化ヒトアルギナーゼＩ及びＣｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼの試験管内での細胞毒性は、異なるヒトがん細胞（黒色腫、肝細胞癌、胃腺癌、結腸直腸腺癌、膵臓癌、膵臓腺癌及びＴ細胞白血病）中での標準ＭＴＴアッセイにより試験された。
【００５２】
既知数の細胞（５０００）は９６ウェルプレートの各ウェル内で、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で、異なる濃度のＣｙｓ４５ペグ化ヒトアルギナーゼＩ及びＣｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼの存在下で６８時間インキュベートされた。６８時間の薬剤インキュベーション後、５０μｇのＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド、テトラゾール）溶液が各ウェル内に添加され、さらに４時間インキュベートされた。上清が捨てられ、１００μＬの１０％ＳＤＳ／０．０１Ｍ  ＨＣｌが各ウェル内に添加され、次いで一晩インキュベートされた。吸光度は５４０ｎｍにおいてマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により記録された。５０％の細胞増殖を阻害するのに必要な各薬剤の濃度（ＩＣ５０）が異なるがん細胞系について決定された。実験は３連で実施された。
【００５３】
Ｃｙｓ４５ペグ化ヒトアルギナーゼＩ及びＣｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼの異なる細胞系についてのＩＣ５０値が計算され、結果が表２に記載されている。バチルス・カルドベロックスアルギナーゼは抗がん応答について全く知られておらず、したがってその抗がん特性及び効力を実証した最初の機会である。様々な黒色腫細胞系（ＳＫ−ＭＥＬ−２、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、Ａ３７５）で、Ｃｙｓ４５ペグ化ヒトアルギナーゼＩのＩＣ５０値はＣｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼのそれと比較して低かった。異なる肝細胞癌細胞系（ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５）の中で、ＨｅｐＧ２細胞はＣｙｓ４５ペグ化ヒトアルギナーゼＩ及びＣｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼのいずれに対しても最も感受性であった。まとめると、検査された全ての肝臓がん（ＨＣＣ）及び黒色腫細胞系はＢＣＡ−ＰＥＧ２０及びＨＡＩ−ＰＥＧ２０により効率的に阻害された。
【００５４】
Ｃｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼはまた、胃腺癌、結腸直腸腺癌、膵臓癌、膵臓腺癌及びＴ細胞白血病を包含する他の５つのがん細胞系について検査された。胃腺癌細胞系の場合、Ｃｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼのＭＫＮ−４５細胞に対するＩＣ５０（０．７９８Ｕ／ｍＬ）はＡＧＳ細胞（０．６６２Ｕ／ｍＬ）と同様であった。異なる結腸直腸腺癌細胞系（ＷｉＤｒ、ＨＴ−２９、ＳＷ１１１６）の中で、ＷｉＤｒ細胞及びＨＴ−２９細胞はＣｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼに感受性であった。膵臓癌細胞系（ＰＡＮＣ−１）と膵臓腺癌細胞系（ＢｘＰＣ−３）とを比較すると、Ｃｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼのＩＣ５０はＰＡＮＣ−１細胞では４倍低かった。Ｔ細胞白血病細胞系（Ｊｕｒｋａｔ、Ｃｌｏｎｅ  Ｅ６−１）の場合は、Ｃｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼのＩＣ５０（０．４１Ｕ／ｍＬ）はまた他のがん細胞系と比較すると低かった。まとめると、検査された全てのがん細胞系はＨＡＩ−ＰＥＧ２０及びＢＣＡ−ＰＥＧ２０処理に感受性であった（及びこれらにより阻害された）。
【表２】
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【００５５】
部位指定的ペグ化アルギナーゼによるアルギニン枯渇
Ｃｙｓ４５ペグ化ヒトアルギナーゼＩ及びＣｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼの薬力はＢＡＬＢ／ｃ正常マウスを用いて試験された。試験は薬物動態試験（後述）と一緒に行われた。それ故、プロトコールは同じままである。再度、回収された血液サンプルは速やかに１３，２００ｒｐｍで５分間遠心分離され、血漿層が回収されてＡｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ３０、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｌｔｄ．、Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いたさらなる解析が行われた。
【００５６】
図１０ａに示されるように、オルニチンレベルはＣｙｓ４５ペグ化ヒトアルギナーゼＩ注入後に上昇し始め、３日目まで高いレベル（＞１５０μＭ）に留まった。アルギニンは６時間時（０日目）を始めに完全に枯渇され、アルギナーゼ投与後６．８±２．３日で現れ始めた。これはＨＡＩ−ＰＥＧ２０が血中のアルギニンを効率的に枯渇させたことを指し示す。
【００５７】
Ｃｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ（ＢＣＡ−ＰＥＧ２０）の場合、オルニチンレベルはまた上昇し始め、３日目まで高いレベル（＞１７０μＭ）に留まった（図１０ｂ）。アルギニンは６時間時（０日目）を始めに完全に枯渇され、アルギナーゼ投与後６．７±２．１日で現れ始めた。これはＢＣＡ−ＰＥＧ２０が血中のアルギニンを効率的に枯渇させたことを指し示す。
【００５８】
両ペグ化アルギナーゼ（Ｃｙｓ４５ペグ化ヒトアルギナーゼＩ及びＣｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ）は同様の薬力学的プロファイルを示した。
【００５９】
肝臓がんに対する生体内での抗腫瘍有効性
ペグ化されていないヒトアルギナーゼＩ（ＨＡＩ）及びＣｙｓ４５ペグ化ヒトアルギナーゼＩ（ＨＡＩ−ＰＥＧ２０）の肝臓がんに対する生体内での抗腫瘍有効性が次いで試験された。
【００６０】
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス数匹は肝細胞癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞を腹腔内に注入（ｉ．ｐ．）され、生体内で維持された。次いで３０匹のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスは各々、生体内で維持されたがん細胞約１×１０６個を右の腋窩に皮下注入された。触知可能な直径５ｍｍの腫瘍が増殖したら、マウスは３つの異なる群に分けられた（表３参照）。薬剤又はＰＢＳバッファーは０日目に始まって８週間、週に１回、腹腔内に投与された。体重及び腫瘍寸法（Ｌ：腫瘍の長径の長さ、Ｗ：腫瘍の短径の長さ）は週に２回測定された。腫瘍体積（１／２×Ｌ×Ｗ２）が計算されて、時間に対してプロットされた。６０日後又は腫瘍直径が２．５ｃｍに達した時、マウスは安楽死させられた。マウスの生存率は試験終了時に記録された。
【表３】
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【００６１】
図１１ａに示されるように、ＰＢＳ対照群、Ｃｙｓ４５ペグ化ヒトアルギナーゼＩ群及びペグ化されていないヒトアルギナーゼＩ群の平均体重はそれぞれ２５．９±０．２ｇ、２５．０±０．２ｇ及び２５．５±０．２ｇであり、各群について実験期間全体を通じて有意な変化はなかった。
【００６２】
腫瘍体積の点では、Ｃｙｓ４５ペグ化ヒトアルギナーゼＩ（ＨＡＩ−ＰＥＧ２０）は４７日目から腫瘍増殖率をＰＢＳ対照群と比較して有意に低減させたが（ｐ＜０．０１）、ペグ化されていないヒトアルギナーゼＩ（ＨＡＩ）は有意な効果を何ら示さなかった（ｐ＞０．０５）（図１２ａ）。
【００６３】
乳がんに対する生体内での抗腫瘍有効性
乳がんに対するＣｙｓ１６１ペグ化バチルスアルギナーゼ（ＢＣＡ−ＰＥＧ２０）の生体内での抗腫瘍有効性が次に決定された。
【００６４】
胸腺欠損のヌードＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）は滅菌条件下、１２時間の明暗周期で、オートクレーブされた飼料を自由摂取で供給されて飼育された。マウスは実験開始前に少なくとも１週間馴化された。各ヌードマウスはＭＣＦ−７ヒト乳がん細胞１×１０６個を右の腋窩に皮下注入された。触知可能な直径５ｍｍの腫瘍が増殖したら、マウスは２つの異なる群にランダムに分けられた（表４）。薬剤又は対照溶媒（ＰＢＳ）は０日目から始まって週１回、腹腔内に注入された。腫瘍寸法（Ｌ：長径、Ｗ：それに直交する直径）及び体重は毎月曜日、水曜日及び金曜日にノギスで測定された。腫瘍体積は式（１／２×Ｌ×Ｗ２）で計算され、腫瘍体積の増加倍率が０日目を参照して計算された。結果は時間に対してプロットされた。１８日目又は腫瘍直径が２．５ｃｍに達した時、マウスは安楽死させられ、最終的な腫瘍及び体重が記録された。
【表４】
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【００６５】
図１１ｂに示されるように、対照群（１８．７６±０．５０）及びＣｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ（１９．７６±０．６６）の平均体重には実験期間全体を通じて有意な差は認められなかった（図１１ｂ）。Ｃｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼはＰＢＳ対照群と比較して有意に腫瘍増殖を抑制し、腫瘍体積の増加倍率を低減させた（２元配置ＡＮＯＶＡ：ｐ＜０．０００１、図１２ｂ）。ボンフェローニ法での事後検定を用いると、低減は低減率が２．８倍を超えた１５日目（ｐ＜０．０１）から始まって統計的に有意である。
【００６６】
肺がんに対する生体内での抗腫瘍有効性
胸腺欠損のヌードＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）は滅菌条件下、１２時間の明暗周期で、オートクレーブされた飼料を自由摂取で供給されて飼育された。マウスは実験開始前に少なくとも１週間馴化された。各ヌードマウスはＡ５４９ヒト肺がん細胞５×１０６個をマトリゲル増殖補助剤と共に右の腋窩に皮下注入された。触知可能な直径約５ｍｍの腫瘍が増殖したら、マウスは３つの異なる群にランダムに分けられた（表５）。薬剤又は対照溶媒（ＰＢＳ）は０日目から始まって週１回、腹腔内に注入された。腫瘍寸法（Ｌ：長径、Ｗ：それに直交する直径）及び体重は毎月曜日、水曜日及び金曜日にノギスで測定された。腫瘍体積は式（１／２×Ｌ×Ｗ２）で計算され、腫瘍体積の増加倍率（相対的腫瘍体積）が０日目を参照して計算された。
【表５】
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【００６７】
異なる群間の平均体重には実験期間全体を通じて有意な差は認められず、最後の記録は実験終了時において対照群では２３．９８±２．６８ｇ、ペグ化されていないバチルス・カルドベロックスアルギナーゼでは２３．６８±１．５０ｇ及びＣｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼでは２３．１６±２．０８ｇであった。
【００６８】
Ｃｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ（ＢＣＡ−ＰＥＧ２０）はしかしながら、溶媒対照群と比較して、腫瘍体積の進行性変化及び腫瘍体積倍率の点で腫瘍増殖を統計的に有意に抑制した。２元配置ＡＮＯＶＡは両パラメーターについてｐ値＜０．０００１を示したが、ボンフェローニ法での事後検定は腫瘍体積については２８日目（ｐ＜０．０５）から始まって３５日目（ｐ＜０．００１）まで、相対的腫瘍体積については３０日目から始まって３５日目まで（全ての時点についてｐ＜０．０１）までの差を指し示した。ペグ化されていないバチルス・カルドベロックスアルギナーゼ（ＢＣＡ）は同用量の処方においても両パラメーターについて統計的な有意差のある同程度の抗肺がん効果を示した（２元配置ＡＮＯＶＡ、両者ともｐ＜０．０００１）。
【００６９】
結腸直腸がんに対する生体内での抗腫瘍有効性
結腸直腸がんに対するペグ化されていない（ＢＣＡ）及びＣｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ（ＢＣＡ−ＰＥＧ２０）の生体内での抗腫瘍有効性は次のように決定された。
【００７０】
胸腺欠損のヌードＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）は滅菌条件下、１２時間の明暗周期で、オートクレーブされた飼料を自由摂取で供給されて飼育された。マウスは実験開始前に少なくとも１週間馴化された。各ヌードマウスは生体内で維持されたＨＣＴ−１５ヒト結腸直腸がん細胞約３ｍｍ３を右の腋窩に皮下移植された。安定に触知可能な腫瘍が直径約５ｍｍに増殖したら、マウスは５つの異なる群にランダムに分けられた（表６）。アルギナーゼ薬剤又は対照溶媒（ＰＢＳ）の腹腔内投与は週に２回、５−フルオロウラシルの腹腔内投与は週に１回、０日目から行われた。腫瘍寸法（Ｌ：長径、Ｗ：それに直交する直径）及び体重は毎月曜日、水曜日及び金曜日にノギスで測定された。腫瘍体積は式（１／２×Ｌ×Ｗ２）で計算され、腫瘍体積の増加倍率（相対的腫瘍体積）が０日目を参照して計算された。結果は時間に対してプロットされた。マウスは実験終了時又は腫瘍直径が２．５ｃｍに達した時に安楽死させられた。
【表６】
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【００７１】
異なる群間の平均体重には実験期間全体を通じて有意な差は認められず、最後の記録は実験終了時において対照群では２４．３±０．９ｇ、ペグ化されていないバチルス・カルドベロックスアルギナーゼ群では２２．１±１．０ｇ、Ｃｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ群では２４．２±０．７ｇ、Ｃｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ＋５−フルオロウラシル群では２３．５±１．２ｇ及び５−フルオロウラシル群では２４．５±１．４ｇであった。
【００７２】
Ｃｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ（ＢＣＡ−ＰＥＧ２０）及びペグ化されていないバチルス・カルドベロックスアルギナーゼ（ＢＣＡ）はいずれも３つ全てのアルギナーゼ薬剤処理群で腫瘍増殖を統計的に有意に抑制した。薬剤組み合わせ群（Ｃｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ＋５−フルオロウラシル）について、２元配置ＡＮＯＶＡは腫瘍体積倍率及び腫瘍体積についていずれの場合もｐ＜０．０００１で有意差を示した。ボンフェローニ法での事後検定はさらに腫瘍体積倍率について３６日目から４０日目まで有意差を正確に示した。Ｃｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ単独群については、２元配置ＡＮＯＶＡは腫瘍体積倍率及び腫瘍体積について、それぞれｐ＝０．０００５及びｐ＝０．００１１で有意性を示した。ボンフェローニ法での事後検定は腫瘍体積倍率については３８日目から始まって４０日目まで、腫瘍体積については４０日目に差を指し示した。ペグ化されていないバチルス・カルドベロックスアルギナーゼ群について、腫瘍体積倍率及び腫瘍体積についてのｐ値はそれぞれ０．０２０２及び＜０．０００１であった。５−フルオロウラシル群は腫瘍体積倍率の点で有意な腫瘍抑制を示さなかった。薬剤組み合わせ群は腫瘍体積及び腫瘍体積倍率についてＣｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ単独群（それぞれｐ＜０．０００１及びｐ＝０．０１２０）及び５−フルオロウラシル単独群（それぞれｐ＝０．０１５８及びｐ＝０．０４３４）の両群よりも統計的に有意に低い結果になった。結果はＣｙｓ１６１ペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ及び５−フルオロウラシルの相乗的な治療的効果を指し示した。
【００７３】
乳がん転移に対する生体内での阻害的有効性
マウス転移乳がん細胞系（４Ｔ１）の細胞１×１０５個は６〜８週齢の野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスの４番鼠径部乳房脂肪パッド内に同所性に注入された。腫瘍が平均５ｍｍに達した時、マウスは２つの異なる処理群に分割された（表７）。ＢＣＡ−ＰＥＧ２０（２５０Ｕ／マウス）又は対照溶媒（ＰＢＳ）は０日目から始まって週に２回、腹腔内に注入された。体重は毎週測定された。３週間後、マウスは屠殺されて肺転移について分析された。肺転移の数はＰＢＳで洗浄した後に解剖顕微鏡下で数えられた。
【００７４】
異なる群間の平均体重には実験期間全体を通じて有意な差は認められず、最後の記録は実験終了時において対照群では２１．８ｇ、ＢＣＡ−ＰＥＧ２０群では２１．５ｇであった。
【００７５】
結果はＢＣＡ−ＰＥＧ２０がＰＢＳ溶媒群と比較して自発性の肺腫瘍小結節形成を低減させたことを表す。自発性の肺転移はＰＢＳ群では数えるには多すぎる数だったが、ＢＣＡ−ＰＥＧ２０処理群では平均でわずか４小結節のみが見出された（表８）。結果はＢＣＡ−ＰＥＧ２０によるアルギニン枯渇は乳房腫瘍転移を阻害することを示す。
【表７】
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【表８】
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【００７６】
ＨＩＶに対する効果（ＨＡＩ−ＰＥＧ２０）
Ｃｙｓ４５ペグ化ヒトアルギナーゼＩ（ＨＡＩ−ＰＥＧ２０）のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、ＨＩＶに対するその効果の尺度として決定された。
【００７７】
抗ウイルス薬の効率はウイルス複製についての細胞培養モデルを用いることで推定され得る。ＨＩＶ複製アッセイはＨ９細胞及びＨＩＶ−１のＲＦ株を利用する。Ｈ９細胞はヒトＴリンパ球由来で、ＣＸＣＲ４を用いるＨＩＶ−Ｉ単離株による感染に高度に感受性であり、感染後数日で明確な細胞変性効果の兆候を示す。ＨＩＶ−１のＲＦ株はＣＸＣＲ４を用いるクラスＢの単離株で、Ｈ９細胞中で高レベルに複製する。
【００７８】
Ｈ９細胞は４枚の９６ウェルプレートに生存細胞５×１０４個／ｍＬで播種され、培養液は３７℃でインキュベートされた。翌日、２枚の９６ウェルプレートにＨＩＶ−１が感染多重度０．００５（１ウェルあたり５０μＬ）で接種された。
【００７９】
感染から２４時間後、感染された９６ウェルプレート１枚の細胞は組織培養培地（１０％ＲＰＭＩ）中で終濃度１Ｕ／ｍＬ、１０Ｕ／ｍＬ及び５０Ｕ／ｍＬに希釈されたＣｙｓ４５ペグ化ヒトアルギナーゼＩ（ＨＡＩ−ＰＥＧ２０）で処理された。各薬剤濃度について８反復が検査され、１ウェルあたり１００μＬが添加された。
【００８０】
アジドチミジン（ＡＺＴ）はこのアッセイについての基準薬として、用量応答が得られることを保証するために用いられた。これは１０％ＲＰＭＩ中で適切に希釈され（０．０１、０．１及び１μｇ／ｍＬ）、２枚目の感染プレートに添加された。各薬剤濃度について８反復が検査され、１ウェルあたり１００μＬが添加された。
【００８１】
細胞毒性対照は並行して設定された。これは３つの薬剤濃度（１Ｕ／ｍＬ、１０Ｕ／ｍＬ及び５０Ｕ／ｍＬ、薬剤濃度あたり８反復）で処理された非感染細胞の９６ウェルプレート１枚からなる。これにより細胞毒性濃度（ＣＣ５０）決定が可能になる。
【００８２】
残りの９６ウェルプレートは組織培養培地のみが接種されて陰性対照として働いた。
【００８３】
感染から５日後、プレートは細胞変性効果について実験され、薬剤のＩＣ５０は薬剤処理及び非処理細胞中の合胞体細胞数を比較することで決定された。
【００８４】
結果はＨＩＶのＲＦ株を接種したＨ９細胞はウイルス感染を起こしたが、組織培養培地のみが接種されたＨ９細胞は試験全体を通じて健常なままであったことを示す。細胞変性効果は、ＨＩＶを感染されて全濃度のＣｙｓ４５ペグ化ヒトアルギナーゼＩ（ＨＡＩ−ＰＥＧ２０）で処理されたＨ９培養物において認められた。ペグ化酵素が終濃度１Ｕ／ｍＬで処理された感染ウェルの８個中８個（８／８）が細胞変性効果を示した。酵素が終濃度１０Ｕ／ｍＬで処理された感染ウェルについては、６／８のウェルが細胞変性効果を示した。薬剤が最も高い終濃度５０Ｕ／ｍＬで検査された場合、３／８のウェルが細胞変性効果を示した。これらの結果は表９及び図１３に示される。薬剤のＩＣ５０はおよそ３７Ｕ／ｍＬであることが見出された。
【００８５】
基準薬のＡＺＴが感染ウェルに０．０１μｇ／ｍＬで添加された場合、７／８のウェルが細胞変性効果を示した。ＡＺＴが０．１μｇ／ｍＬで処理された感染ウェルについては６／８のウェルが細胞変性効果を示し、１μｇ／ｍＬで検査された場合は２／８のウェルが細胞変性効果を示した。これらの結果は図１４に図示される。ＡＺＴのＩＣ５０は０．５８μｇ／ｍＬであることが見出された。
【表９】
0005746137.tif 000013
【００８６】
表１０は細胞毒性対照についての生存率カウントを提示する。細胞毒性検査の中で全ウェルが細胞毒性の兆候を示し、それ故、生存率カウントはＣｙｓ４５ペグ化ヒトアルギナーゼＩの各濃度について１ウェルに対して実施された。最も高い濃度は５０Ｕ／ｍＬ及び１０Ｕ／ｍＬの各々について細胞生存率３０％及び３９％という結果になった。１Ｕ／ｍＬについては、細胞生存率は５８％であった。これに基づいて８ウェル全てについて細胞生存率が評価され、平均値は４８．９％と決定された。細胞が９６ウェルプレート上に播種された場合の細胞の細胞生存率（９６．８％）に基づくと、これは細胞生存率の５０％低減に近い。これらの結果は表１０及び図１５に示され、ＨＡＩ−ＰＥＧ２０がＨＩＶ複製に対する阻害効果を有することを明確に実証している。
【００８７】
【表１０】
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【００８８】
試験管内での抗がん効果
異なるアルギニン枯渇酵素の抗がん効力に対する試験管内でのがん細胞培養試験は様々ながんのタイプについて行われた。
【００８９】
細胞増殖アッセイ：各がん細胞系について、１００μＬ培養培地中の細胞（５×１０３個）が９６ウェルプレートのウェルに播種され、２４時間標準の方法によりインキュベートされた。培養培地はアルギナーゼ又はアルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）のうちの１つを異なる濃度で含有する培地で置換された。プレートはさらに３日間、３７℃、９５％空気／５％ＣＯ２の雰囲気中でインキュベートされた。代謝的に生存している細胞画分はＭＴＴアッセイにより決定され、このＭＴＴアッセイを行うことで培養液中の生存細胞数が推定された。Ｐｒｉｓｍ４．０（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）での非線形回帰がシグモイド用量応答曲線をあてはめるのに用いられ、細胞増殖の５０％阻害を達成するのに必要な各アルギニン分解酵素の量（Ｕ／ｍＬ、ｕｎｉｔ／ｍｌ又はμｇ／ｍＬの点からの）がＩＣ５０として定義された。
【００９０】
ＲＴ−ＰＣＲ試験：全ＲＮＡは培養液中で培養されたがん細胞系からＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキットを用いて抽出された。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）について、ＲＮＡは最初にｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣＡ）により製造業者の説明書に従ってｃＤＮＡに逆転写された。簡潔には、５□ｇの全ＲＮＡは４２℃で３０分間ＲＴに供された。ｃＤＮＡの２μＬ分は次いで０．５ユニットのｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣＡ）を含有する反応混合液５０μＬを用いて増幅された。ＰＣＲはＤＮＡ  ｔｈｅｒｍａｌ  ＭｙＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣＡ）中で実施された。以下の隣接プライマーが用いられた。
【００９１】
（ａ）ヒトＡＳＳ（４４８ｂｐの産物）：
【化４】
0005746137.tif 000015
【００９２】
（ｂ）ヒトＡＳＬ（２１８ｂｐの産物）：
【化５】
0005746137.tif 000016
【００９３】
（ｃ）ヒトＯＴＣ（２２１ｂｐの産物）：
【化６】
0005746137.tif 000017
【００９４】
（ｄ）ヒトＧＡＰＤＨ（３０６ｂｐの産物）：
【化７】
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【００９５】
反応産物は１％アガロースゲル電気泳動に供された。電気泳動及びエチジウムブロマイドでの染色後、全てのＰＣＲ産物のバンド強度はＬｕｍｉ−Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ＩＮ）により分析され、相対的ｍＲＮＡ発現レベルがハウスキーピング遺伝子であるＧＡＤＰＨでの正規化により推定された。
【００９６】
結果が指し示すように、アルギナーゼ及びＡＤＩは全て効果のあるアルギニン分解酵素である。意外なことに我々は、ここで検査された全てのがん細胞系はアルギナーゼ感受性であるが、多くのがん細胞系は実際にはＡＤＩ処理に耐性であることを見出した。アルギナーゼはアルギニンをオルニチン及び尿素に変換するのに対し、ＡＤＩはアルギニンをシトルリン及びアンモニアに変換するという事実がこの差の原因であることが本発明の中で発見された。がん細胞がＡＳＳ陽性及びＡＳＬ陽性である場合、シトルリンはアルギニンに再循環されることができ、これが薬剤耐性につながる。最も著しいことに、がん細胞がＯＴＣ陰性の場合、それらはＡＳＳ陽性及びＡＳＬ陽性であったとしても細胞の中でオルニチンをアルギニンに再循環できない。本発明により提供されるこのガイドラインは全ての我々のデータと一致しており、他の研究グループからのデータも同様であることが見出されている。このガイドラインの下では、例えばがん細胞がＡＳＳ陰性若しくはＡＳＬ陰性又はその両方のいずれかである場合、それらはアルギナーゼ感受性及びＡＤＩ感受性であろう。他方、がん細胞がＡＳＳ陽性及びＡＳＬ陽性の両方であるがＯＴＣ陰性の場合、それらはアルギナーゼ感受性及びＡＤＩ耐性であろう。それ故、アルギナーゼはＡＤＩより広範な抗がん適用を有すると思われる。その上、アンモニア（ＡＤＩ反応からの産物）は尿素（アルギナーゼ反応からの産物）より毒性である。したがって、本発明のアルギナーゼ抗がん剤はＡＤＩより安全と思われる。
【００９７】
試験管内での抗がん有効性の結果は表１１ａ〜１１ｇに要約される。表１１ａに指し示されるように、検査された全ての黒色腫細胞系はアルギナーゼ処理に感受性であった。アルギナーゼが培養培地に添加された場合、アルギニンはオルニチン及び尿素に変換された。これらの細胞は全てＯＴＣ陰性であって、上で議論されたガイドラインに従うとこれらの細胞は細胞の中でアルギナーゼ反応産物であるオルニチンをアルギニンに再循環できす、それ故に細胞はアルギニン欠如のために阻害される。ＩＣ５０値によると、検査された全てのアルギナーゼはがん細胞の増殖阻害に対して非常に有効であった。
【００９８】
検査された全ての黒色腫細胞系はＡＳＳ陽性及びＡＳＬ陽性であったにも関わらずＡＳＳ発現レベルは低かったが、これはＡＳＳ活性アッセイを実施することで確認され得る。低いＡＳＳ発現レベルは、何故これらの細胞系が全てＡＤＩ処理に感受性であったかを説明する。Ｂ１６はマウス黒色腫細胞系で、またアルギナーゼ及びＡＤＩの両方に感受性である。したがって、ＡＤＩが黒色腫細胞を死滅させるのは低レベルのＡＳＳ発現が原因であった一方、アルギナーゼが黒色腫細胞を死滅させるのはそれらがＯＴＣ陰性なのが理由であると思われる。
【００９９】
表１１ｂの中で、検査された全ての白血病細胞系はアルギナーゼ処理に感受性であったことが示される。検査されたこれらのがん細胞のうちいくらかはＯＴＣ陰性であって、上で議論されたガイドラインに従うとこれらの細胞は細胞の中でアルギナーゼ反応産物であるオルニチンをアルギニンに再循環できす、それ故に細胞はアルギニン欠如のために阻害される。ＩＣ５０値によると、検査された全てのアルギナーゼは白血病がん細胞の増殖阻害に対して非常に有効であった。ＡＤＩ処理については検査された全４つの白血病細胞系はＲＰＭＩ８２２６細胞系を除いて感受性であったが、ＲＰＭＩ８２２６細胞系がＡＤＩ処理に耐性であったのは多分ＡＳＳ陽性及びＡＳＬ陽性の両方であるという事実が原因である。それ故、白血病細胞を阻害するにはアルギナーゼはＡＤＩよりも有利である。
【０１００】
表１１ｃは検査された全ての結腸直腸がん細胞系はアルギナーゼ処理に感受性であったことを示す。検査されたこれら全てのがん細胞はＯＴＣ陰性であった。上で議論されたガイドラインに従えばこれらの細胞は細胞の中でアルギナーゼ反応産物であるオルニチンをアルギニンに再循環できす、それ故に細胞はアルギニン欠如のために阻害される。ＩＣ５０値によると、検査された全てのアルギナーゼは結腸直腸がん細胞の増殖阻害に対して非常に有効であった。ＡＤＩ処理については検査された結腸直腸がん細胞系のうち２つ（ＷｉＤｒ及びＨＴ２９）だけが感受性であって、その他の２つ（ＳＷ１１１６及びＨＣＴ１５）はＡＤＩ処理に耐性であったが、これらが耐性であったのは多分ＡＳＳ陽性及びＡＳＬ陽性の両方であるという事実が原因である。ＨＴ２９については、ＲＴ−ＰＣＲのデータによるとＡＳＳ陽性及びＡＳＬ陽性であったにも関わらずＡＳＳ活性アッセイを実施することで確認されるようにＡＳＳ発現レベルは低かったが、これは何故この細胞系がＡＤＩ処理に感受性であるかを説明する。
【０１０１】
表１１ｃにまた示されるように、最も著しいことに検査された全ての膵臓がん細胞系はアルギナーゼ処理に感受性であった。検査されたこれら全てのがん細胞はＯＴＣ陰性であった。上で議論されたように、これらの細胞は細胞の中でアルギナーゼ反応産物であるオルニチンをアルギニンに再循環できす、それ故に細胞はアルギニン欠如のために阻害される。ＩＣ５０値によると、検査された全てのアルギナーゼは膵臓がん細胞の増殖阻害に対して非常に有効であった。ＡＤＩ処理については検査された膵臓がん細胞系のうち１つ（Ｐａｎｃ１）だけが感受性であり、その他の２つ（ＢｘＰＣ３及びＨＰＡＦＩＩ）はＡＤＩ処理に耐性であった。明らかに、膵臓がん細胞を阻害するにはアルギナーゼはＡＤＩより良好である。
【０１０２】
表１１ｄは検査された全ての胃がん細胞系はアルギナーゼ処理に感受性であったことを示す。検査されたこれら全てのがん細胞はＯＴＣ陰性であって、したがって上で議論されたように、これらの細胞は細胞の中でアルギナーゼ反応産物であるオルニチンをアルギニンに再循環できす、それ故に細胞はアルギニン欠如のために阻害される。ＩＣ５０値が指し示すように、検査された全てのアルギナーゼは胃がん細胞の増殖阻害に対して非常に有効であった。はっきりと対照的に、検査された全ての胃がん細胞系はＡＤＩ処理に耐性であったが、多分それらがＡＳＳ陽性及びＡＳＬ陽性の両方であるという事実が原因である。これと同様の結果が検査された肝臓がん（即ちＨＣＣ）細胞系について表１１ｅに示されるように得られた。
【０１０３】
表１１ｅはまた、検査された網膜芽細胞腫がん細胞系Ｙ７９はアルギナーゼ処理に感受性であったがＡＤＩ処理に耐性であったことを示しており、これは多分それらがＡＳＳ陽性及びＡＳＬ陽性の両方であるという事実が原因である。
【０１０４】
表１１ｆは検査された肺がん細胞系Ａ５４９はアルギナーゼ処理に感受性であったことを示す。検査されたこれらのがん細胞はＯＴＣ陰性であった。この細胞はまたＡＤＩ処理に感受性であり、これは多分それらがＡＳＳ陰性又はＡＳＬ陰性のいずれかであるという事実が原因である。対照的に表１１ｆにまた示されるように、検査された全ての子宮頸がん細胞系はアルギナーゼ処理に感受性であって（それらは全てＯＴＣ陰性であった）、しかし検査された子宮頸がん細胞系の２つ（ＳｉＨａ及びＣ−３３Ａ）だけがＡＤＩ処理に感受性でその他の３つ（ＨｅＬａ、ＭＥ１８０、ＣＣ３）は耐性であったが、これは多分それらがＡＳＳ陽性及びＡＳＬ陽性の両方であるという事実が原因である。
【０１０５】
乳がん細胞についての結果が表１１ｇに示される。表が示すように、検査された全ての乳がん細胞系はアルギナーゼ処理に感受性であった（それらは全てＯＴＣ陰性であった）。著しいことに、検査された乳がん細胞系の１つ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）だけがＡＤＩ処理に感受性でその他の３つ（ＭＣＦ−７、ＺＲ−７５−１、Ｈｓ５７８Ｔ）は耐性であった。
【０１０６】
表１１ｇにまた示されるのは前立腺がん細胞系についての結果であり、アルギナーゼ処理及びＡＤＩ処理の両方に感受性であることが見出された。上で議論されたように、かかる結果はこの細胞系がＯＴＣ陰性及びＡＳＳ陰性の両方であるという事実により説明され得る。
【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【０１０７】
表１１について、“＋”＝ｍＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲにより検出されたことであり、相当する遺伝子が発現していることを指し示す。“−”＝ｍＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲにより検出されなかったことであり、相当する遺伝子が発現していないことを指し示す。“Ｒ”は細胞系がＡＤＩ耐性でＩＣ５０値が推定され得なかったことを指し示す。“Ｌ”は細胞系が比較的低いレベルのＡＳＳ発現を有し、それ故に細胞系がＡＤＩ感受性のままであることを指し示す。
【０１０８】
以下の仮説及び作業モデルにより束縛されることは望まないが、出願人は以下の仮説及び作業モデルは本発明の実験データと一致するものであり、したがって本明細書に開示される本発明のさらなる利用についての有用なガイドであると考えている（図１８も参照）。
【０１０９】
何故ＯＴＣ陰性がん細胞はアルギナーゼ感受性であるがＡＤＩ耐性であり得るかを説明する仮説及び作業モデル。アルギナーゼが培養培地中に添加又はペグ化アルギナーゼが血液中（体内）に注入されると、アルギニンはアルギナーゼ酵素反応によりオルニチン及び尿素に変換される。形成されたオルニチンは次いでがん細胞の中へ進む。正常な細胞と異なりがん細胞は増殖が速く、正常な細胞よりも一層多くのアルギニンをタンパク質合成及び他の細胞プロセスのために必要とする。がん細胞がＯＴＣ陽性、ＡＳＳ陽性及びＡＳＬ陽性であるなら、オルニチンはアルギニンへと再循環され得る。それ故、がん細胞は未だアルギニンを有していてアルギニン欠乏ではなく、がんの増殖は阻害されない。他方、ＯＴＣ陰性、ＡＳＳ陰性若しくはＡＳＬ陰性又はこれらの欠乏の任意の組み合わせであるか、又はこれら遺伝子のうち任意のものの発現レベルが低いがん細胞では、オルニチンからアルギニンへの合成（又は再循環）経路は遮断され、それ故にがん細胞はアルギニンを欠如し、したがってがん細胞の増殖は阻害されてがん細胞の死が起こり得る。
【０１１０】
ＯＴＣ陰性である肝臓がん細胞についての仮説及び作業モデル。尿素回路の遺伝子発現及びペグ化アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ−ＰＥＧ）及びペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ（ＢＣＡ−ＰＥＧ２０）に対する耐性に関するモデル。肝臓がん細胞は尿素回路酵素であるアルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）及びアルギナーゼ（ＡＲＧ）を発現するが、オルニチントランスカルバモイラーゼ（ＯＴＣ）を欠如している。血流中のＢＣＡ−ＰＥＧ２０はアルギニンを枯渇させてオルニチンを生成するが、オルニチンは細胞に入るもののＯＴＣが存在しないため尿素回路を通じて再循環されない。ＡＤＩ−ＰＥＧはアルギニンをシトルリンに変換し、シトルリンは肝臓がん細胞内への取り込み後にＡＳＳ及びＡＳＬにより容易にアルギニンに再び変換され得る。それ故、このモデルにおいて肝臓がん細胞はＢＣＡ−ＰＥＧ２０処理に感受性である（ＢＣＡ−ＰＥＧ２０により阻害される）が、ＡＤＩ−ＰＥＧ処理に耐性である。
【０１１１】
ＯＴＣ陰性であるがん細胞についての仮説及び作業モデル。がん細胞中の遺伝子発現及びペグ化アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ−ＰＥＧ）及びペグ化バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ（ＢＣＡ−ＰＥＧ２０）に対する耐性に関するモデル。アルギナーゼ（ＡＲＧ）を発現しないがん細胞の場合、がん細胞は酵素であるアルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）を発現するが、オルニチントランスカルバモイラーゼ（ＯＴＣ）を欠如している。血流中のＢＣＡ−ＰＥＧ２０はアルギニンを枯渇させてオルニチンを生成するが、オルニチンは細胞に入るもののＯＴＣが存在しないため再循環されない。ＡＤＩ−ＰＥＧはアルギニンをシトルリンに変換し、シトルリンはがん細胞内への取り込み後にＡＳＳ及びＡＳＬにより容易にアルギニンに再び変換され得る。それ故、このモデルにおいてがん細胞はＢＣＡ−ＰＥＧ２０処理に感受性である（ＢＣＡ−ＰＥＧ２０により阻害される）が、ＡＤＩ−ＰＥＧ処理に耐性である。このモデルは一般的にがん細胞に適用され得る。
【０１１２】
コバルトを金属補因子として用いることによるアルギナーゼ活性のさらなる亢進方法
野生型アルギナーゼの金属補因子はマンガン（Ｍｎ２＋）である。驚くべきことに、マンガンをコバルトで置き換えることで酵素の活性は劇的に亢進されることが本発明により発見された。バチルス・カルドベロックスアルギナーゼ（ＢＣＡ）又はヒトアルギナーゼＩ（ＨＡＩ）のいずれかが先に述べられたように発現された。精製方法は、１０ｍＭの金属イオン（ＣｏＳＯ４又はＭｎＳＯ４）がニッケルアフィニティークロマトグラフィー前の添加の代わりにニッケルアフィニティークロマトグラフィーからの精製タンパク質溶出液に添加されたこと以外は前述と同じであった。アルギナーゼ酵素を含有する溶出された画分は１０ｍＭの金属と５０〜５５℃で１５分間インキュベートされた後、０．４５μｍのシリンジフィルターを通して濾過が行われた。次いで溶液は限外濾過により保存バッファーと交換された。
【０１１３】
ジアセチルモノオキシン（ＤＡＭＯ）アッセイは異なる金属補因子を伴うヒトアルギナーゼの反応速度パラメーターを決定するのに用いられた。全ての酵素反応はｐＨ７．４で行われた。結果は図１６に示される。Ｍｎ２＋又はＣｏ２＋で置き換えられた組換えヒトアルギナーゼＩ（ＨＡＩ）即ちｈｕＡｒｇの定常状態反応速度はリン酸ナトリウムバッファー中でｐＨ７．４、２５℃で測定された。Ｍｎ２＋を伴うＨＡＩ（ＨＡＩ  Ｍｎ２＋）即ちｈｕＡｒｇ  Ｍｎ２＋及びＣｏ２＋を伴うＨＡＩ（ＨＡＩ  Ｃｏ２＋）即ちｈｕＡｒｇ  Ｃｏ２＋のＫｍはそれぞれ１．８３ｍＭ及び０．１９ｍＭである。Ｋｍ値がＨＡＩ  Ｃｏ２＋即ちｈｕＡｒｇ  Ｃｏ２＋においておよそ１０倍改善されることから、その特異的活性は１０倍改善されており、アルギニンを枯渇させるのにＨＡＩ  Ｍｎ２＋即ちｈｕＡｒｇ  Ｍｎ２＋よりも一層効率的な薬剤である。
【０１１４】
遺伝子改変のさらなる改変によるアルギナーゼ活性の亢進
驚くべきことに、ＢＣＡの２０位は酵素活性を改善するために他のアミノ酸で置き換えられ得ることが本発明により発見された。野生型配列中の２０番目のアミノ酸残基であるバリンはプロリン（又は例えばセリン若しくはグリシンといった他の任意のアミノ酸で、ＢＣＡの特異的活性を改善するもの）で部位指定的な変異誘発（例えばコドンＧＴＴ［バリン］をＣＣＧ［プロリン］に）により置き換えられた。変異体遺伝子は詳細な試験のためにクローニングされ、発現されて精製された。代表的なかかる変異体酵素はバリンをプロリンで置換することで作られたが、これは“ＢＣＡ変異体Ｖ２０Ｐ”又は“ｂｃＡｒｇ  Ｖ２０Ｐ変異体”と呼ばれる。ＢＣＡ変異体Ｖ２０Ｐ及びＭｎ２＋又はＣｏ２＋を伴うＢＣＡの定常状態反応速度はリン酸ナトリウムバッファー中でｐＨ７．４、２５℃で測定され、図１７に示された。Ｍｎ２＋を伴うＢＣＡ変異体Ｖ２０Ｐ（ＢＣＡ変異体Ｖ２０Ｐ  Ｍｎ２＋）及びＣｏ２＋を伴うＢＣＡ変異体Ｖ２０Ｐ（ＢＣＡ変異体Ｖ２０Ｐ  Ｃｏ２＋）のＫｍ値はそれぞれおよそ１．２９ｍＭ及び０．１８ｍＭである。Ｍｎ２＋を伴うＢＣＡ（ＢＣＡＷＴＭｎ２＋）のＫｍはおよそ３．２ｍＭである。それ故、補因子としてＣｏ２＋を伴うＢＣＡ変異体Ｖ２０Ｐ［Ｋｍ＝０．１８ｍＭ］は、アルギニンを枯渇させるのにＢＣＡ（ＢＣＡＷＴＭｎ２＋）［Ｋｍ＝３．２ｍＭ］よりも一層効率的な薬剤である。
【０１１５】
ＢＣＡ変異体Ｖ２０Ｐを用いた試験管内でのがん細胞系試験
細胞増殖アッセイは次のように行われた。
【０１１６】
２．５×１０３個のＳｋ−ｍｅｌ−２８（ＥＭＥＭ）、５×１０３個のＨＥＫ２９３（ＥＭＥＭ）、ＭＣＦ−７（ＥＭＥＭ）、ＨＣＴ−１５（ＲＰＭＩ）、Ｈｅｐ３Ｂ（ＤＭＥＭ）、ＰＡＮＣ−１（ＤＭＥＭ）、Ｈｅｌａ（ＤＭＥＭ）及びＡ５４９（ＤＭＥＭ）細胞は９６ウェルプレートの各ウェルの培養培地１００μＬ中に播種され、一晩プレートに付着させられた。翌日、培養培地は異なる濃度のＢＣＡ及びＢＣＡ変異体Ｖ２０Ｐタンパク質薬剤を含有する培地で置換された。２×１０４個のＪｕｒｋａｔ（ＲＰＭＩ）浮遊細胞はタンパク質薬剤を添加する日に９６ウェルプレートの各ウェルの培養培地５０μＬ中に播種され、異なる濃度の５０μＬのタンパク質薬剤が直接的に各ウェルに添加された。細胞はさらに３日間、３７℃で９５％空気／５％ＣＯ２の雰囲気中でインキュベートさせられた。ＭＴＴ細胞増殖アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は次いで培養液中の生存細胞数を推定するために実施された。簡潔には、５ｍｇ／ｍＬの水可溶性のＭＴＴ試薬１０μＬが１００μＬの培養培地に添加され、３７℃で４時間インキュベートされた。ＭＴＴは細胞により紫色のホルマザンへと化学的に還元され、次いで酸性化ＳＤＳ（１０％ＳＤＳ中の０．０１Ｎ  ＨＣｌ）により組織培養培地中に溶解される。開裂産物ホルマザンの濃度は次いでその吸光度を分光光度計で５７０ｎｍフィルターにより読み取ることで測定された。細胞増殖のデータは対照のパーセンテージとして表された。Ｐｒｉｓｍ４．０（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）での非線形回帰がシグモイド用量応答曲線をあてはめるのに用いられ、５０％の細胞増殖阻害を達成するのに必要なタンパク質薬剤の量がＩＣ５０として定義された。結果は表１２に示される。相当する酵素活性は表１３に示される。
【表１８】
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【表１９】
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【０１１７】
結果はＢＣＡ変異体のＶ２０Ｐは試験管内での薬剤有効性試験において様々なタイプのがん細胞を死滅させるのにより一層効率的であることを示す。
【０１１８】
本発明の基本的な新規の特徴はその好ましい実施形態に適用されるように記述され、詳細に説明されたが、形式及び図示された実施形態の詳細における様々な省略、置き換え及び変更は、当業者により本発明の趣旨から逸脱しないでなされ得ることが理解されるであろう。本発明は上述の例として提示されただけの実施形態により限定されず、様々な方法で、添付の特許請求の範囲により定義される保護の範囲内で改変され得る。
【図１Ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
0005746137.tif 000038
【図４ｂ】
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【図１６】
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【図３ｄ】
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【図４ａ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
0005746137.tif 000044
【図６ａ１】
0005746137.tif 000045
【図６ａ２】
0005746137.tif 000046
【図６ｂ１】
0005746137.tif 000047
【図６ｂ２】
0005746137.tif 000048
【図６ｃ】
0005746137.tif 000049
【図６ｄ】
0005746137.tif 000050
【図７ａ】
0005746137.tif 000051
【図７ｂ】
0005746137.tif 000052
【図８ａ】
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【図８ｂ】
0005746137.tif 000054
【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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