(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
共通のスカフォールドに基づくポリペプチド変異体の集団であって、該集団中の各ポリペプチドは、スカフォールドアミノ酸配列
【化１】
0005651476.tif 000014
（ここで、各Ｘは、それぞれ該集団内で変化するアミノ酸残基に対応する）を含む、上記集団。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチド変異体の集団であって、該スカフォールドアミノ酸配列が
【化２】
0005651476.tif 000015
（ここで、各Ｘは、それぞれ該集団内で変化するアミノ酸残基に対応する）
である、上記集団。
【請求項３】
少なくとも１×１０4のユニークなポリペプチド分子を含む、請求項１または２に記載の集団。
【請求項４】
ポリヌクレオチド集団であって、それらの各メンバーが請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド集団のメンバーをコード化することを特徴とする、上記ポリヌクレオチド集団。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド集団と請求項４に記載のポリヌクレオチド集団との組み合わせであって、ここで、該ポリペプチド集団の各メンバーは、遺伝
子型−表現型カップリング手段を介してそのメンバーをコード化するポリヌクレオチドと物理的または空間的に関連する、上記組み合わせ。
【請求項６】
ポリペプチド集団から所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択する方法であって、
（ａ）請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド集団を備える工程；
（ｂ）ポリペプチド集団を、標的と標的に対する親和性を有する少なくとも１つの所望のポリペプチドとの間で特異性相互作用を可能にする条件下、所定の標的と接触させる工程；および
（ｃ）該特異性相互作用に基づいて、残りのポリペプチド集団から少なくとも１つの所望のポリペプチドを選択する工程を含む、上記方法。
【請求項７】
工程（ａ）が、請求項４に記載のポリヌクレオチド集団を備え、そして該ポリヌクレオチド集団を発現させて、該ポリペプチド集団を得る予備工程を含み、ここでポリペプチド集団の各メンバーが、遺伝子型−表現型カップリング手段を介してそのメンバーをコード化するポリヌクレオチドと物理的または空間的に関連する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを単離する方法であって、
−該所望のポリペプチドおよびそれをコード化するポリヌクレオチドを、ポリペプチド集団から請求項７に記載の方法を使用して選択する工程；および
−このように分離した、所望のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを単離する工程を含む、上記方法。
【請求項９】
所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを同定する方法であって、
−該所望のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを、請求項８に記載の方法を使用して単離する工程；および
−ポリヌクレオチドを配列決定して、該所望のポリペプチドのアミノ酸配列を推論することにより確立する工程を含む、上記方法。
【請求項１０】
ポリペプチド集団から所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択し、そして同定する方法であって、（ａ）分離担体またはビーズ上の請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド集団の各メンバーを合成し；（ｂ）担体またはビーズを、ポリペプチドと所定の標的との相互作用に基づいて選択または濃縮し；そして（ｃ）タンパク質キャラクタリゼーション方法により、該ポリペプチドを同定する工程
を含む、上記方法。
【請求項１１】
所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを生産する方法であって、
−請求項９に記載の方法を使用して、所望のポリペプチドを単離し、そして同定するか；または、請求項１０に記載の方法を使用して、所望のポリペプチドを選択し、そして同定する工程；および
−該所望のポリペプチドを生産する工程
を含む、上記方法。
【請求項１２】
所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ１）請求項８に記載の方法を使用して、該所望のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを単離する工程；または
（ａ２）請求項１０に記載の方法を使用することにより同定されたポリペプチドを逆翻訳する工程；および
（ｂ）（ａ１）または（ａ２）のいずれかに続いて、このように単離されたポリヌクレ
オチドを発現させ、該所望のポリペプチドを生産する工程
を含む、上記方法。
【請求項１３】
スカフォールドに基づいて第一のポリペプチドを生産する方法であって、
所定の標的に対する親和性を有する第二のポリペプチドを備える工程（ここで、該第二のポリペプチドは、以下に示すＳｐＡ由来の元のスカフォールドに基づく：
EXXXAXXEIX XLPNLNXXQX XAFIXSLXDD PSQSANLLAE AKKLNDAQ）、および、
元のスカフォールドアミノ酸を突然変異させ、スカフォールドアミノ酸配列
【化３】
0005651476.tif 000016
（ここで、各Ｘは、それぞれ第二のポリペプチドから保存されるアミノ酸残基に対応する）を含む第一のポリペプチドを生成させる工程
を含む、上記方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、
ここで、該第二のポリペプチドは、以下に示すＳｐＡ由来の元のスカフォールドに基づき：
NKFNK EXXXAXXEIX XLPNLNXXQX XAFIXSLXDD PSQSANLLAE AKKLNDAQ、また、
該第一のポリペプチドは、スカフォールドアミノ酸配列
【化４】
0005651476.tif 000017
（ここで、各Ｘは、それぞれ第二のポリペプチドから保存されるアミノ酸残基に対応する）を含む、
上記方法。
【請求項１５】
第一のスカフォールドアミノ酸配列
【化５】
0005651476.tif 000018
（ここで、各Ｘは、以下に示す元のスカフォールドアミノ酸配列に基づく、所定の標的に対する親和性を有する第二のポリペプチド中の各Ｘに対応する：
EXXXAXXEIX XLPNLNXXQX XAFIXSLXDD PSQSANLLAE AKKLNDAQ）を含む、
該所定の標的に対する親和性を有するポリペプチド。
【請求項１６】
第一のスカフォールドアミノ酸配列
【化６】
0005651476.tif 000019
（ここで、各Ｘは、以下に示す元のスカフォールドアミノ酸配列に基づく、所定の標的に対する親和性を有する第二のポリペプチド中の各Ｘに対応する：
NKFNK EXXXAXXEIX XLPNLNXXQX XAFIXSLXDD PSQSANLLAE AKKLNDAQ）を含む、
請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
検出試薬、捕捉試薬または分離試薬としての、請求項１５または１６に記載のポリペプ
チドの使用。
【請求項１８】
治療に使用するための、請求項１５または１６に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
診断剤として使用するための、請求項１５または１６に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
標的がＴＮＦ−α、インスリンおよびｔａｑ−ポリメラーゼから選択される、請求項１５または１６に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共通のスカフォールドに基づく新規なポリペプチド変異体の集団に関する。これらの集団は、とりわけ、新規な結合タンパク質およびポリペプチドを提供するのに使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
新規な結合タンパク質を構築するための様々な方法が記載されている（非特許文献１）。１つのストラテジーは、ライブラリー生成と所望の特性のスクリーニングまたは選択を組み合わせている。
【０００３】
元のＡｆｆｉｂｏｄｙ(R)分子、このような分子の集団およびこのような分子のスカフォールドは、とりわけ、特許文献１に記載されており、この教示は参照により本明細書に加入される。
【０００４】
いくつかの適用のための、改善された特性（例えば、アルカリ安定性、低い抗原性、構造的安定性、化学合成のし易さおよび親水性）を有するタンパク質、ポリペプチドまたはＡｆｆｉｂｏｄｙ(R)分子、このような分子の集団およびスカフォールドが記載されている。
【０００５】
アルカリ安定性
タンパク質製剤および生物工学試薬の生産は、所望でない汚染物質を除去しながら、特定の生成物に濃縮（ｅｎｒｉｃｈ）するために、数回の生成工程を必要とする。タンパク性アフィニティーマトリクス（例えば、モノクローナル抗体およびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）プロテインＡ（ＳｐＡ））により媒介されるアフィニティー精製は、１工程での効率的精製を可能にする。しかし、費用効率を高めるために、アフィニティーマトリクスを適切に再生可能とすることが所望される。これは、通常、定置洗浄（ＣＩＰ）として公知の手段に関し、ここで、試薬−しばしばアルカリ溶液−が、汚染物質を溶出するのに使用される。
【０００６】
アルカリ安定性はまた、最も一般的なＳＰＥＣＴ  核種テクネチウム−９９ｍで標識され、そして実施されるいくつかの他の種類の化学修飾を可能にする分子像トレーサーを必要とする。
【０００７】
低い抗原性
タンパク質ベースの製剤（例えば、治療的モノクローナル抗体およびＡｆｆｉｂｏｄｙ(R)分子）は、ヒトにおいて所望でない免疫応答を引き起こす可能性を有する。免疫原性の一因となる主な因子は、不純物、タンパク質凝集体、外来エピトープ、例えば、新しいイディオトープ、異なるＩｇアロタイプまたは非自己配列の存在である。さらに、交差反応免疫グロブリン（Ｉｇ）相互作用は、タンパク質製剤に対する特定のＴ細胞媒介性記憶免疫応答を生成する可能性が最も高い。免疫系との所望でない相互作用の危険性を最小化するために、製剤のタンパク質工学により既存の免疫エピトープを除去することが所望される。
【０００８】
Ａｆｆｉｂｏｄｙ(R)分子は、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）プロテインＡ（ＳｐＡ）由来であり、これは、グラム陽性菌黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ａｕｒｅｕｓ）の表面上の細胞壁関連レセプターである。もっと正確に言えば、ＳｐＡは、５つの高度相同ドメインからなり、この全ては、多くの哺乳動物種（ヒトを含む）の免疫グロブリンに結合する。各ＳｐＡドメインは、２つの異なる方法；ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４を含むＦｃγに直接結合することにより（非特許文献２）、またはＶＨ３ファミリーのメンバーに結合することにより（非特許文献３）ヒトＩｇと相互作用する。元のＡｆｆｉｂｏｄｙ(R)分子の共通のスカフォールドは、Ｇ２９Ａ突然変異（この突然変異は、タンパク質安定性を増大し、そしてヒドロキシルアミン切断部位を除去するために含まれた）、およびドメイン間のスペーサー領域中に導入されるＡ１Ｖ突然変異を除外してＳｐＡのドメインＢと同一である（非特許文献４）。ＦｃγとＶＨ３との相互作用に関連するＳｐＡ中のアミノ酸残基は周知であり、そして文献に記載されている（非特許文献５）。異なるＡｆｆｉｂｏｄｙ(R)分子の分子ライブラリーは、分子の１つの表面で表面残基（Ｆｃγとの相互作用に関連することが公知である残基を含む）をランダム化し、それにより、Ｆｃγに対する親和性を除去することにより構築された。
【０００９】
構造的安定性
ペプチドおよびタンパク質製剤を成功させるための鍵となる因子の１つは、タンパク質の安定性である。高い構造的安定性を示すタンパク質は、生産の間さらにヒト体内の両方で、化学修飾およびタンパク質分解に最も機能的に耐えるようである。さらに安定性は、ペプチドまたはタンパク質製剤の活性化貯蔵期間（ａｃｔｉｖｅ  ｓｈｅｌｆ−ｌｉｆｅ）さらにヒト体内でのペプチドまたはタンパク質製剤の活性化期間（ａｃｔｉｖｅ  ｌｉｆｅ）に影響を与える。
【００１０】
化学合成のし易さ
研究者は、伝統的に、生物学的方法によりタンパク質を得ているが、ペプチドおよび低分子タンパク質の化学合成は、有力な相補的ストラテジーであり、そして一般に、構造生物学、タンパク質工学および生物医学研究に使用される。タンパク質の化学合成は、生物学的汚染物質（例えば、ＤＮＡ不純物および宿主細胞タンパク質）を含まない均一タンパク質を迅速かつ効率的に生産する方法を提供する。さらに、化学合成は、非天然アミノ酸の取り込み、化学修飾および生化学的および生物物理的プローブの導入を可能にするので、柔軟性が増す。ペプチドおよびタンパク質の化学合成の成功は、問題になっている分子のアミノ酸配列に依存する。特定のアミノ酸残基は、低効率なカップリングを示し、これは保証された成功を伴わない時間のかかるプロセスである、合成の間のいくつかの工程が最適化される必要があることを意味する。さらに、化学合成の間に効率的に導入しにくいアミノ酸は、タンパク質配列が長いほどタンパク質収率により悪い影響を与える。
【００１１】
増大した親和性
多くの適用について、ペプチドおよびタンパク質が低い凝集傾向を示す高溶解性であることが所望される。タンパク質製剤に関していえば、このようなタンパク質特性は、特に重要である。タンパク質表面疎水性と低い安定性および凝集傾向の増加との間に強い正相関が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＷＯ  ９５／１９３７４
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｎｙｇｒｅｎ  ＰＡ  ａｎｄ  Ｕｈｌeｎ  Ｍ（１９９７）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ７：４６３−４６９
【非特許文献２】Ｌａｎｇｏｎｅ  ＪＪ（１９８２）Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：１５７−２５２
【非特許文献３】Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ＧＪ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：５７−７８
【非特許文献４】Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ（１９８７），Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  １：１０７−１１３
【非特許文献５】Ｇｒａｉｌｌｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９７：５３９９−５４０４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の説明
新規なスカフォールドに基づくポリペプチド変異体の集団を提供することが本発明の目的である。
【００１５】
これらの新規なスカフォールドは、既知の類似のスカフォールド（いわゆる、元のスカフォールド）と比較していくつかの利点を有する。利点はまた、これらの新規なスカフォールドを使用することで得られるポリペプチドにも適用される。これらの利点は、以下により詳細に議論されるが、いくつかの例はここに示される。例えば、アルカリ性環境において、高い安定性を示す新規なポリペプチドスカフォールドを開発するために、広範囲の研究が実施されている。アルカリ安定性の１つの局面は、アスパラギンの脱アミドに対する安定性である。構造的硬直性を増大させることにより、またはこの残基を置換することにより、この反応を回避することはまた、アスパラギンの脱アミドが分離しにくい不均一混合物の強い一因となる、例えば、発酵プロセスにおける生産または貯蔵の後に均一生成物を得ることに寄与する化学安定性を提供する。
【００１６】
さらに、新規なスカフォールド配列において、免疫グロブリン（主にＶＨ３媒介性）に対する残存アフィニティーを除去することにより、低い抗原性に関する改善されたプロファイル（ほとんどないＩｇＧ結合性）を得た。
【００１７】
さらに、新規なスカフォールドは、容易に折り畳まれるαらせん構造、高い融解温度およびタンパク質分解を標的することが公知である部位の除去（ａｂｏｌｉｓｈｍｅｎｔ）に関して、高い構造的安定性を示すように操作されている。
【００１８】
元のＡｆｆｉｂｏｄｙ(R)分子スカフォールドは、化学合成の速度および成功を減少させることを示しているいくつかのアミノ酸を含む。効率的な、すなわちハイスループットおよび高収率のＡｆｆｉｂｏｄｙ(R)タンパク質生産方法にするために、多数のアミノ酸が化学合成により適合する特性を有する残基に交換された。
【００１９】
親水性および安定性を改善するために、Ａｆｆｉｂｏｄｙ(R)分子スカフォールドの表面上の疎水性残基はより親水性なアミノ酸に交換されている。
【００２０】
本発明の別の目的は、ポリヌクレオチド集団を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、ポリペプチド集団とポリヌクレオチド集団との組み合わせを提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、ポリペプチド集団から所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択するための方法を提供することである。
【００２３】
別の目的は、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを単離する方法を提供することである。
【００２４】
別の目的は、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを同定する方法を提供することである。
【００２５】
さらなる目的は、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択し、そして同定する方法を提供することである。
【００２６】
関連する目的は、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを生産する方法を提供することである。
【００２７】
本発明に従う集団および方法は、所定の標的に特異的に結合することにより特徴付けられるポリペプチドの提供を通じて、所定の標的に対する親和性を有する薬剤の提供（生産および評価を含む）を可能にする。
【００２８】
ほとんど非特異的結合を示さない所定の標的に結合するポリペプチドを提供することもまた可能である。
【００２９】
融合ポリペプチド中の一部として容易に使用され得る所定の標的に結合するポリペプチドを提供することもまた可能である。
【００３０】
さらに、既存の抗体試薬で経験される１つまたはそれ以上の公知の問題を解決する所定の標的に結合するポリペプチドを提供することが可能である。
【００３１】
さらに、治療的および／または診断的適用に使用され易い所定の標的に結合するポリペプチドを提供することが可能である。
【００３２】
化学ペプチド合成により容易に作製される所定の標的に結合するポリペプチドを提供することもまた可能である。
【００３３】
さらに、本発明は、同じ標的に結合する公知の薬剤に対して改善された安定性を示す所定の標的に結合するポリペプチドの同定を可能にする。
【００３４】
哺乳動物において、インビボで使用される場合に低い抗原性を示し、そして／または哺乳動物に投与される際、改善された生体内分布を示す所定の標的に結合するポリペプチドを提供することもまた可能である。
【００３５】
これらおよび他の目的は、添付の特許請求の範囲において主張されるように、本発明の異なる局面により対処される。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
第一の局面において、本発明は、共通のスカフォールドに基づくポリペプチド変異体の集団を提供し、該集団中の各ポリペプチドは、スカフォールドアミノ酸配列
【化１】
0005651476.tif 000002
またはいくつかの場合において、より好ましくは
【化２】
0005651476.tif 000003
を含む。
【００３７】
上記の配列において、各Ｘは、独立して、集団内で変化するアミノ酸残基に対応する。
【００３８】
集団は、このようなポリペプチド分子の多数の変異体からなる。これに関連して、多数とは、少なくとも１×１０4のユニークなポリペプチド分子、または少なくとも１×１０6または少なくとも１×１０8または少なくとも１×１０10、または少なくとも１×１０12、または少なくともの１×１０14のユニークなポリペプチド分子を含む集団を意味する。しかし、所望の大きさの集団を提供するのに十分な大きさである群を使用することが必要である。本明細書中に記載される「集団」はまた、「ライブラリー」を示し得る。
【００３９】
各Ｘが、独立して、変更されるアミノ酸残基に対応することが上記されている。これは、各Ｘが配列中のＸで示される任意の他の残基の同一性から独立して、任意のアミノ酸残基であり得ることを意味する。スカフォールドアミノ酸配列において、任意のこれらの２０の天然のアミノ酸残基が、任意の所定の変異体において、対応するＸ位置に存在し得るように、異なる変更されたアミノ酸Ｘは、２０の天然のアミノ酸残基全てから選択され得る。各位置におけるアミノ酸の選択は、ほぼランダム化される。異なる変更されたアミノ酸残基が１９、１８、１７、１６または２０未満の天然のアミノ酸残基から選択される群に限定することもまた可能である。異なる位置における変動性は、１（ランダム化がないことを意味する）から２０までのアミノ酸全ての間で個別に調節され得る。導入されるデオキシリボヌクレオチド塩基の厳選により、アミノ酸のより小さいサブセットのランダム導入を得ることができ、例えば、ポリペプチド鎖中の所定の位置でセリンまたはチロシンのいずれかのランダム導入を得るために、コドンＴ（Ａ／Ｃ）Ｃを導入し得る。同様に、ポリペプチド鎖中の所定の位置でフェニルアラニン、ロイシン、アラニンおよびバリンのランダム導入を得るために、コドン（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）ＣＣを導入し得る。当業者は、ポリペプチド鎖中の所定の位置でアミノ酸の異なる組み合わせを得るために使用され得る多くの代替のデオキシリボムクレオチド塩基の組み合わせを承知している。ポリペプチド鎖中の所定の位置に現れ得る一連のアミノ酸はまた、オリゴヌクレオチド合成の間に、同時に１つのデオキシリボヌクレオチド塩基の代わりにトリヌクレオチドを導入することにより決定され得る。
【００４０】
上記のスカフォールドアミノ酸配列を含むポリペプチドは、新規なＡｆｆｉｂｏｄｙ(R)分子である。それ自体、これらは、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）プロテインＡ（ＳｐＡ）由来である。これに関連して、「由来する」とは、ポリペプチドそれら自体が何らか必ず直接的にＳｐＡが起源であることを意味しない。代わりに、スカフォールドが１つのＳｐＡドメイン（３ヘリックスバンドルタンパク質の疎水性コア中にアミノ酸が保存されている）に類似する配列および構造を有することを意味する。
【００４１】
本発明に従う集団を構成するポリペプチドの異なる修飾、および／またはこれらへの付加が、本発明の範囲から逸脱することなく、意図される特定の使用にポリペプチドを適合させるために実施され得る。このような修飾および付加が以下により詳細に記載され、そして同じポリペプチド鎖に含まれる追加のアミノ酸、または集団を構成するポリペプチドに化学的に抱合されるか、または別の方法で結合される標識および／もしくは治療薬を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｃ末端上の追加のアミノ酸残基が好ましくあり得る。これらの追加のアミノ酸残基は、ポリペプチドの結合において役割を果たし得るが、例えばポリペプチドの生産、精製、安定化、カップリングまたは検出の１つまたはそれ以上に関連する他の目的にも同様に十分役立ち得る。このような追加のアミノ酸残基は、化学的カップリングの目的で付加される１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を含み得る。この一例は、ポリペプチド鎖の最初および最後の位置、すなわちＮ−またはＣ−末端でのシステイン残基の付加である。化学的カップリングに使用されるシステイン残基はまた、タンパク質ドメインの表面上、好ましくは、標的結合に関連しない表面の一部上の別のアミノ酸の置換により導入され得る。このような追加のアミノ酸残基はまた、ポリペプチドの精製または検出のための「タグ」、例えば、ヘキサヒスチジル（Ｈｉｓ6）タグ、またはタグに対して特異的な抗体との相互作用のための「ｍｙｃ」タグもしくは「ＦＬＡＧ」タグを含み得る。当業者は、他の代替法を承知している。
【００４２】
上述の「追加のアミノ酸残基」はまた、任意の所望の機能、例えば、別の結合機能、もしくは酵素機能、もしくは金属イオンキレート化機能、もしくは蛍光機能、またはそれらの組み合わせ（ｍｉｘｔｕｒｅ）を有する１つまたはそれ以上のポリペプチドドメインを構成し得る。
【００４３】
第二の局面において、本発明は、ポリヌクレオチド集団を提供する。この集団中の各ポリヌクレオチドは、上記のポリペプチド集団のメンバーをコード化する。
【００４４】
第三の局面において、本発明は、本発明に従うポリペプチド集団と本発明に従うポリヌクレオチド集団の組み合わせを提供し、ここで、ポリペプチド集団の各メンバーは、遺伝子型−表現型カップリング手段を介するメンバーをコード化するポリヌクレオチドと物理的または空間的に関連する。この物理的または空間的な関連は、使用されるシステムに依存してほぼ厳密である。
【００４５】
遺伝子型−表現型カップリング手段としては、ファージディスプレイシステムが挙げられ得る。ファージディスプレイシステムは当業者に周知であり、そして例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＧＰ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７およびＢａｒｂａｓ  ＣＦ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８８：７９７８−７９８２に記載される。
【００４６】
さらに、遺伝子型−表現型カップリング手段としては、細胞表面ディスプレイシステムが挙げられ得る。細胞表面ディスプレイシステムは、原核細胞、例えば、グラム陽性細胞、または真核細胞、例えば、酵母細胞を含み得る。細胞表面ディスプレイシステムは当業者に周知である。原核細胞系は、例えば、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９０：１０４４４−１０４４８およびＬｅｅ  ＳＹ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１：４５−５２に記載される。真核細胞系は、例えば、Ｂｏｄｅｒ  ＥＴ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５：５５３−５５７およびＧａｉ  ＳＡ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １７：４６７−４７３に記載される。
【００４７】
さらに、遺伝子型−表現型カップリング手段としては、無細胞ディスプレイシステムが挙げられ得る。無細胞ディスプレイシステムとしては、リボソームディスプレイシステム、またはインビトロコンパートメント化（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）ディスプレイシステム、またはシスディスプレイのためのシステム、または微粒子ディスプレイシステムが挙げられ得る。リボソームディスプレイシステムは当業者に周知であり、そして例えば、Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ  ＬＣ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９１：９０２２−９０２６およびＺａｈｎｄ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２６９−２７９に記載される。インビトロコンパートメント化システムは当業者に周知であり、そして例えば、Ｓｅｐｐ  Ａ  ｅｔ  ａｌ（２００２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５３２：４５５−４５８に記載される。シスディスプレイシステムは当業者に周知であり、そして例えば、Ｏｄｅｇｒｉｐ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０１：２８０６−２８１０に記載される。微粒子ディスプレイシステムは当業者に周知であり、そして例えば、Ｎｏｒｄ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０６：１−１３に記載される。
【００４８】
さらに、遺伝子型−表現型カップリング手段としては、非−ディスプレイシステム、例えば、タンパク質−フラグメント相補性試験（ＰＣＡ）が挙げられ得る。ＰＣＡシステムは当業者に周知であり、そして例えば、Ｋｏｃｈ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３５７：４２７−４４１に記載される。
【００４９】
第四の局面において、本発明は、ポリペプチド集団から所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択する方法を提供し、該方法は、以下：
（ａ）上記のポリペプチド集団を備える工程；
（ｂ）ポリペプチド集団を、標的と標的に対する親和性を有する少なくとも１つの所望のポリペプチドとの間で特異性相互作用を可能にする条件下、所定の標的と接触させる工程；および
（ｃ）該特異性相互作用に基づいて、残りのポリペプチド集団から少なくとも１つの所望のポリペプチドを選択する工程を含む。
【００５０】
この方法は、以下で本発明に従う選択方法と称される。
【００５１】
工程（ａ）は、ポリヌクレオチド集団を提供し、そして前記ポリヌクレオチド集団を発現させ、該ポリペプチド集団を得る予備工程を包含し得る。ポリペプチド集団を得る手段は、使用されるディスプレイシステムによって変わり、そしてこのような手段の例としては、上記の遺伝子型−表現型参考文献に見出され得る。本発明に従う選択方法において使用される前記ポリペプチド集団の各メンバーは、遺伝子型−表現型カップリング手段を介するメンバーをコード化するポリヌクレオチドと物理的に関連し得る。遺伝子型−表現型カップリング手段は、上記されるものの１つであり得る。
【００５２】
工程（ｂ）は、標的と標的に対する親和性を有する少なくとも１つの所望のポリペプチドとの間で特異性相互作用を可能にする条件下、ポリペプチド集団を所定の標的と接触させる工程を含む。適用可能な条件の範囲は、標的のロバスト性、ディスプレイシステムのロバスト性により、および標的との相互作用の所望の特性により決定される。例えば、所定のｐＨまで酸性化することのような、相互作用を分離する特定の方法が望ましくあり得る。当業者は、適切な条件を決定するためにどのような実験が必要であるか理解している。
【００５３】
工程（ｃ）は、少なくとも１つのポリペプチドの選択を包含する。所定の標的と標的に対する親和性を有する少なくとも１つの所望のポリペプチドとの間の特異性相互作用に基づいて、残りの集団から所望のポリペプチドを選択する手段は、使用されるディスプレイシステムによって変わり、そして上記の遺伝子型−表現型参考文献に見出され得る。例えば、システム、例えば、ファージディスプレイおよびタンパク質フラグメントコンパートメント化アッセイと対照的に、インビボディスプレイ選択システムは無細胞である。
【００５４】
第五の局面において、本発明は、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを単離する方法を提供し、該方法は、以下：
−所望のポリペプチドおよびそれをコード化するポリヌクレオチドを、ポリペプチド集団から本発明に従う選択方法を使用して選択する工程；および
−このように分離した、所望のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを単離する工程を含む。
【００５５】
この方法は、以下で本発明に従う単離方法と称される。
【００５６】
ポリペプチドからのポリヌクレオチドの分離は、選択のために使用されるディスプレイシステムに依存して別々になされ得る。例えば、無細胞ディスプレイシステム、例えば、シスディスプレイおよびリボソームディスプレイにおいて、ポリヌクレオチドまたは対応するｍＲＮＡは、上記の遺伝子型−表現型参考文献に記載される手段を使用してポリペプチドから有効な溶出により回収される。
【００５７】
ポリヌクレオチドの単離は、選択のために使用されるディスプレイシステムに依存して別の方法でなされ得る。上記の選択システム（例えばタンパク質フラグメント相補性試験）のほとんどにおいて、ポリヌクレオチドは、適切なオリゴヌクレオチドを使用する特定のＰＣＲ増幅により直接単離され得る。例外的に、リボソームディスプレイにおいて見られるように、逆翻訳を使用して、ポリヌクレオチドを対応するｍＲＮＡから単離し得る。ポリヌクレオチドを単離するための種々の手段は、上記の遺伝子型−表現型参考文献において見出され得る。
【００５８】
第六の局面において、本発明は、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを同定する方法を提供し、該方法は、以下：
−所望のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを、本発明に従う単離方法を使用して単離する工程；および
−該ポリヌクレオチドを配列決定して、該所望のポリペプチドのアミノ酸配列を推論することにより確立する工程を含む。
【００５９】
ポリヌクレオチドの配列決定は、当業者に周知の標準的な手順に従ってなされ得る。
【００６０】
第七の局面において、本発明は、ポリペプチド集団から所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択し、そして同定する方法を提供し、該方法は、以下：
（ａ）分離担体またはビーズ上の該ポリペプチド集団の各メンバーを合成する工程；
（ｂ）担体またはビーズを、ポリペプチドと所定の標的との相互作用に基づいて選択または濃縮する工程；および
（ｃ）タンパク質キャラクタリゼーション方法により、該ポリペプチドを同定する工程を含む。
【００６１】
工程（ｃ）において、例えば、質量分析法が使用可能である。
この方法は、以下で本発明に従う選択および同定方法と称される。
【００６２】
第八の局面において、本発明は、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを生産する方法を提供し、該方法は、以下：
−本発明に従う選択方法または本発明に従う選択および同定方法を使用して、所望のポリペプチドを単離し、そして同定する工程；および
−該所望のポリペプチドを生産する工程を含む。
【００６３】
この方法は、以下で本発明に従う生産方法と称される。
【００６４】
本発明に従う生産方法において、所望のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの組換え発現を使用して、生産が実行され得る。生産はまた、所望のポリペプチドのデノボ化学合成を使用して実行され得る。
【００６５】
第九の局面において、本発明は、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを生産する方法を提供し、該方法は、以下：
（ａ１）本発明に従う単離方法を使用して、該所望のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを単離する工程；または
（ａ２）本発明に従う選択および同定方法を使用して同定されたポリペプチドを逆翻訳する工程；および
（ｂ）このように単離されたポリヌクレオチドを発現させ、該所望のポリペプチドを生産する工程を含み、ここで工程（ｂ）は工程（ａ１）または工程（ａ２）のいずれかの後に実施される。
【００６６】
ポリヌクレオチドの発現は、当業者に公知の任意の適切な発現宿主（例えば、これらに限定されないが、細菌性細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞）においてなされ得る。
【００６７】
「所定の標的に対する結合親和性」、「所定の標的に結合する」などのような表現は、親和性定数、すなわち、所定の抗原濃度で結合および解離するポリペプチドの量の決定により直接測定され得るポリペプチドの特性をいう。異なる方法を使用して、分子間相互作用をキャラクタリゼーションすることができ、これらの方法としては、例えば、競合分析、均衡分析および微小熱量分析、ならびに表面プラズモン共鳴相互作用に基づくリアルタイム相互作用分析（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ(R)機器を使用する）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法は当業者に周知であり、そして例えば、Ｎｅｒｉ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １４：４６５−４７０およびＪａｎｓｓｏｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：８１８９−８１９７に記載される。
【００６８】
本発明者らは、所定の標的に結合し、任意の上記の方法により得られるポリペプチドが、同じ標的に結合する既知のポリペプチドと比較して、これらのすでに既知であるポリペプチドが標的に結合する能力を残したまま、１つまたはそれ以上の驚くべき利点を示し得ることを見出している。このような利点の非限定的な例は、次の通りである：
・所定の標的に結合し、そして任意の上記の方法により得られるポリペプチドは、ポリペプチド配列の化学合成において、低収率および低い成功率のような問題となり得るいくつかのアミノ酸残基、例えば、アスパラギン、アルギニン、アスパラギン酸およびメチオニンを含む。
・所定の標的に結合し、そして任意の上記の方法により得られるポリペプチドは、表面疎水性を与えるいくつかのアミノ酸残基を含む。これは低い安定性および凝集に関連するいくつかの問題を暗示する。理論に拘束されることなく、より親水性である特性は、宿主に投与される際、肝胆経路（肝臓による排出）からより所望される腎臓経路（腎臓による排出）へ、ポリペプチドの生体内分布をシフトするように作用すると現在考えられている。
・所定の標的に結合し、そして任意の上記の方法により得られるポリペプチドは、ポリペプチド安定性問題に関連するいくつかのアミノ酸残基、例えば、メチオニン、アスパラギンおよびジペプチドアスパラギン−プロリンを含む。メチオニンは、酸化され易く、アスパラギンは脱アミドされ易く、そしてアスパラギン−プロリン結合は酸開裂し易く、従って、これらは最終生成物の非均一性の一因となる。
・所定の標的に結合し、そして任意の上記の方法により得られるポリペプチドは、類似の配列において、ＶＨ３由来の重鎖可変ドメインを含む免疫グロブリンとの相互作用を増大させることが見出されているアミノ酸残基を欠損する（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ＧＪ（１９９２）前出）。理論に拘束されることなく、所定の標的に結合し、そして任意の上記の方法により得られるポリペプチド中のこのようなアミノ酸残基の置換は、宿主に同じものを投与する際、ポリペプチドの抗原性を低下させると現在考えられている。
【００６９】
本発明のスカフォールドの利点のうち、アルカリ安定性、低い抗原性、構造的安定性、化学合成の改善された特性および／または増大した親水性が特に重要である。
【００７０】
所定の標的に結合し、そして任意の上記の方法により得られるポリペプチドは、検出試薬、捕捉試薬、分離試薬、インビボまたはインビトロでの診断のための診断用薬として、それ自体での治療薬としてまたは所定の標的に対する他の治療薬および／または診断用薬を標的化するための手段として使用され得る。インビトロで本発明に従うポリペプチドを利用する方法は、異なる形式、例えば、マイクロタイタープレート中、タンパク質アレイ中、バイオセンサー表面上、組織切片上などで実施され得る。
【００７１】
本発明に従う集団を構成するポリペプチドに対する上記の修飾はまた、任意の上記の方法により得られるポリペプチドに適用可能である。
【００７２】
本発明に従うポリペプチドは、任意の公知の手段により生産され得、この手段としては、化学合成または異なる原核生物または真核生物宿主（植物およびトランスジェニック動物を含む）での発現が挙げられる。
【００７３】
本発明は、これから、本発明に従って実施される実施例の記述により詳細に説明される。以下の実施例は、限定として解釈されない。この実施例において、添付の図について申し述べる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】Ｊａｓｃｏ  Ｊ−８１０分光偏光計を使用するＣＤ測定から得られた結果を示す。Ｈｉｓ6−ＺTNF-α:3230の温度可変測定をＰＢＳ緩衝液中０．５ｍｇ／ｍｌで行なった。吸光度を２２１ｎｍで２０〜８０℃、５℃／分の温度傾斜を用いて測定した。１ｍｍの光路長を有するセルを使用した。Ｈｉｓ6−ＺTNF-α:3230の融解温度（Ｔｍ）を温度可変測定から決定した。
【図２】実施例４に記載される選択の概観を示す。選択を２つの異なるトラック、高い標的濃度を有するもの（トラック１）および低い標的濃度を有するもの（トラック２）で行なった。標的濃度が各トラックおよびサイクルについて示され、さらに洗浄の回数（丸括弧内）が示される。
【図３】Ｈｉｓ6−Ｚ０４６７４の９６℃での加熱前（実線）および加熱後（点線）の２つのＣＤスペクトルのオーバーレイプロットである。
【図４】ポリペプチド変異体のバイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）分析の結果を示す；固定化ダイナザイム（Ｄｙｎａｚｙｍｅ）に対するＨｉｓ6−Ｚ０４７７７（黒矩形）、Ｈｉｓ6−Ｚ０４６８７（黒三角）、Ｈｉｓ6−Ｚ０４６６５（白三角）、Ｈｉｓ6−Ｚ０４６７４（黒線）、Ｈｉｓ6−Ｚ０４７８１（灰色線）およびランニングバッファー（白矩形）の連続注入後に得られるセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）。反応（ＲＵにおける）を時間（ｓ）に対してプロットした。
【図５Ａ】アミノ酸残基１８〜５８の合成段階で、配列ｍａＥＳＥＫＹＡＫＥＭＲ  ＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰ  ＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦ  ＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱ  ＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫ  ＬＮＤＳＱＡＰＫを有するポリペプチドの分析的ＨＰＬＣ溶出プロファイルを示す。位置２２〜２３、４１〜４２、４５〜４６および５３〜５４にシュードプロリンを使用して、ポリスチレン樹脂上で行なった合成。
【図５Ｂ】アミノ酸残基１８〜５８の合成段階で、配列ｍａＥＳＥＫＹＡＫＥＭＲ  ＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰ  ＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦ  ＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱ  ＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫ  ＬＮＤＳＱＡＰＫを有するポリペプチドの分析的ＨＰＬＣ溶出プロファイルを示す。シュードプロリンを使用しないポリスチレン樹脂上での標準的ペプチド合成。
【図６Ａ】アミノ酸残基１〜５８（Ａ）および１０〜５８（Ｂ）の合成段階で、配列ｍａＥＳＥＫＹＡＫＥＭＲ  ＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰ  ＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦ  ＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱ  ＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫ  ＬＮＤＳＱＡＰＫを有するポリペプチドの分析的ＨＰＬＣ溶出プロファイルを示す。位置２２〜２３、４１〜４２、４５〜４６および５３〜５４にシュードプロリンを使用して、ポリスチレン樹脂上で行なった合成。
【図６Ｂ】アミノ酸残基１〜５８（Ａ）および１０〜５８（Ｂ）の合成段階で、配列ｍａＥＳＥＫＹＡＫＥＭＲ  ＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰ  ＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦ  ＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱ  ＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫ  ＬＮＤＳＱＡＰＫを有するポリペプチドの分析的ＨＰＬＣ溶出プロファイルを示す。シュードプロリンを使用しないポリスチレン樹脂上での標準的ペプチド合成。
【図７Ａ】配列Ａ）ＡＥＡＫＹＡＫＥＭＷ  ＩＡＷＥＥＩＲＮＬＰ  ＮＬＮＧＷＱＭＴＡＦ  ＩＡＫＬＬＤＤＰＳＱ  ＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫ  ＬＮＤＳＱＡＰＫＣ（本発明に従う）およびＢ）ＡＥＮＫＦＮＫＥＭＷ  ＩＡＷＥＥＩＲＮＬＰ  ＮＬＴＧＷＱＭＴＡＦ  ＩＡＳＬＬＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ（比較用）を有するポリペプチドの分析的ＨＰＬＣ溶出プロファイルを示す。
【図７Ｂ】配列Ａ）ＡＥＡＫＹＡＫＥＭＷ  ＩＡＷＥＥＩＲＮＬＰ  ＮＬＮＧＷＱＭＴＡＦ  ＩＡＫＬＬＤＤＰＳＱ  ＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫ  ＬＮＤＳＱＡＰＫＣ（本発明に従う）およびＢ）ＡＥＮＫＦＮＫＥＭＷ  ＩＡＷＥＥＩＲＮＬＰ  ＮＬＴＧＷＱＭＴＡＦ  ＩＡＳＬＬＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ（比較用）を有するポリペプチドの分析的ＨＰＬＣ溶出プロファイルを示す。
【実施例】
【００７５】
実施例１−コンビナトリアルポリペプチドライブラリーの構築
基本的にＧｒｏｅｎｗａｌｌ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
１２８：１６２−１８３に記載されるように、黄色ブドウ球菌タンパク質Ａ−誘導性タンパク質Ｚ（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８７、前出）のヘリックス１および２をコード化し、点突然変異Ｎ３Ａ、Ｆ５Ｙ、Ｎ６Ａ、Ｎ２３ＴおよびＳ３３Ｋを有する特定の縮重コドンを有する１２３−ヌクレオチドの鋳型オリゴヌクレオチド（５’−ＧＴＡ  ＧＡＴ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＴＡＣ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＣＧ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＴＴＡ  ＣＣＴ  ＡＡＣ  ＴＴＡ  ＡＣＣ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＣＡＡ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＮＮＮ  ＡＡＡ  ＴＴＡ  ＮＮＮ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＡＧＣ−３’）のＰＣＲ増幅により、ポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーを構築した。それぞれ、Ｘｈｏ  Ｉ部位およびＳａｃ  Ｉ部位（表１で下線を引く）を有するプライマーＡＦＦＩ−１３６４およびＡＦＦＩ−１３６５を使用して、ＰＣＲ増幅を行なった。
【００７６】
得られたライブラリーコード化遺伝子フラグメントを、Ｘｈｏ  ＩおよびＳａｃ  Ｉで制限した。続いて、ライブラリーコード化遺伝子フラグメントを、点突然変異Ａ４２Ｓ、Ｎ４３Ｅ、Ａ４６ＳおよびＡ５４Ｓを有するヘリックス３をコード化するタンパク質Ｚのアミノ酸残基４１〜５８を備えたフレーム内で、ファージミドベクターｐＡｆｆｉ１（Ｇｒｏｅｎｗａｌｌ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ（２００７）、前出）に基本的に基づいて、ファージディスプレイ用に採用されたＸｈｏ  Ｉ−  およびＳａｃ  Ｉ−制限ファージミドベクター（ｐＡＹ２０１６で示される）中にライゲーションした。２つの相補的オリゴヌクレオチドＡＦＦＩ−１３３３およびＡＦＦＩ−１３３４（表１）のアニーリングにより、ヘリックス３を構築した。
【００７７】
得られたライブラリーベクターを、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＲＲ１ΔＭ１５（Ｒｕｔｈｅｒ  Ｕ（１９８２）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １０：５７６５−５７７２）にエレクトロポレーションし、２．４×１０10メンバーのライブラリーを得た。
【００７８】
Ｍ１３Ｋ０７  ヘルパーファージ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）を含む標準的な手順を使用して、ライブラリーからのファージストックの調製を実施し、培養液（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）１ｍｌあたり約１０11  ｃｆｕのファージ力価を型どおりに得た。
【００７９】
【表１】
0005651476.tif 000004
【００８０】
実施例２−ヒトＨＥＲ２結合ポリペプチド変異体のファージディスプレイ選択およびキャラクタリゼーション
要約
実施例１で構築したライブラリーを使用するファージディスプレイ選択における標的として、ビオチン化ＨＥＲ２タンパク質を使用する。ＨＥＲ２に対して高い親和性を有する分子を得る見込みを最大化するために、種々の条件を使用して選択を実行する。選択されたファージの溶出後、ＥＬＩＳＡセットアップにおいて、対応する発現タンパク質のＨＥＲ２に対する親和性について試験する。陽性クローンを同定し、そして配列決定し、そして対応するポリペプチドの予測されるアミノ酸配列およびそれらのＨＥＲ２結合モチーフを推論し、これにより多数のＨＥＲ２結合分子の配列を得る。
【００８１】
ＨＥＲ２のビオチン化
凍結乾燥したヒトＨＥＲ２タンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃１１２９−ＥＲ）を１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度でＰＢＳ（２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ  ７．４）に溶解する。ＥＺ−連結スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、＃２１３３５）を１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で水に溶解し、そして５および３０倍のモル過剰を０．５ｍｌの全体積中ＨＥＲ２（５００μｇ）に添加する。混合物を室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートする。透析カセット（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｓｅｒ、１０  ｋＤａ；Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してＰＢＳ対して透析することにより、未結合のビオチンを除去する。
【００８２】
ファージディスプレイ選択
次第にストリンジェントになる条件（例えばＨＥＲ２濃度の減少および洗浄回数の増加）を使用して、全体で、５ラウンドの選択を実行する。主に適切な選択プロトコルを確立する目的で最初の３ラウンドを行なう。次いで、表２に掲記される選択緩衝液、標的濃度および固体支持体の組み合わせを使用して、さらに２サイクルの選択を実行する。
【００８３】
【表２】
0005651476.tif 000005
【００８４】
選択手順において使用される全てのチューブおよびビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ(R)  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、＃１１２．０６；Ｄｙｎａｌ）をＴＰＢＳＢ（５％）（ＰＢＳ中０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０２％アジ化Ｎａ）またはゼラチン（０．５％）中、ＲＴで少なくとも３０分間プレブロック（ｐｒｅ−ｂｌｏｃｋ）する。
【００８５】
表２に従うビオチン化ヒトＨＥＲ２、ファージ、アジ化Ｎａ（０．０２％）、Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％）、およびＢＳＡ（３％）またはゼラチン（０．１％）のいずれかを含む選択溶液（１ｍｌ）をＰＢＳ中で調製する。ファージをビオチン化ヒトＨＥＲ２標的と共に４℃でサイクル４について３日間およびサイクル５について１日間インキュベートし、次いで、ＲＴで撹拌下１時間インキュベートする。選択サンプルをブロックしたストレプトアビジンビーズにＲＴで撹拌下１５分間で移す。ビーズを選択緩衝液（すなわち、ＴＰＢＳＢ（３％）（ＰＢＳ中０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０２％  アジ化Ｎａ）またはＧＴ  ０．１（ＰＢＳ  中０．１％  ゼラチン、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０および０．０２％  アジ化Ｎａ））（１ｍｌ）で１０回洗浄し、次いでＰＢＳで１０回洗浄し、２回目の最後の洗浄は５分間行なう。ファージを、ＲＴの５０ｍＭ  グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ  ２．２（１０００μｌ）で１０分間溶出し次いで１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１００μｌ）を補充したＰＢＳ（ｐＨ  ８．０）（９００μｌ）ですぐに中和するか、またはＲＴのトリプシン（２ｍｇ／ｍｌ）（１０００μｌ）で３０分間溶出し、次いでアプロチニン（０．４ｍｇ／ｍｌ）（１０００μｌ）を添加する。選択の各サイクルの後、溶出したファージ（３／４の体積）を使用して、対数期の大腸菌ＲＲ１ΔＭ１５細胞（Ｒｕｅｔｈｅｒ、１９８２、前出）（５０ｍｌ）に感染させる。３７℃で３０分間穏やかに撹拌しながらインキュベートし、そして３０分間激しく撹拌した後、細胞を遠心分離し、そしてペレットをより少ない体積に溶解し、そしてＴＹＥプレート（１５ｇ／ｌ  寒天、１０ｇ／ｌ  トリプトン水（Ｍｅｒｃｋ）、５ｇ／ｌ  酵母エキス、３ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、２％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを補充している）上に塗り、そして最後に３７℃で一晩インキュベートする。
【００８６】
ファージストック調製
プレートからの細胞をＴＳＢ培地（３０ｇ／ｌ  トリプティックソイブロス）に再懸濁し、そしてＯＤ600＝１が５×１０8細胞／ｍｌに対応すると仮定して、６００ｎｍでの光学密度を測定することにより細胞濃度を決定する。細胞を２％  グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充したＴＳＢ＋ＹＥ培地（１００ｍｌ）に植菌し（溶出ファージと比較して、細胞の約１００倍過剰）、３７℃で約ＯＤ600＝０．５〜０．７まで増殖させる。その後、１０ｍｌを新しいフラスコに移し、そして１０倍モル過剰のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、＃ＮＯ３１５Ｓ）を感染させ、そして静かに撹拌しながら３０分間インキュベートする。細胞を１０分間  ２０００ｇでペレット化し、そして１００μＭ  イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンおよび１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを補充したＴＳＢ＋ＹＥ培地（１００ｍｌ）に再懸濁し、そして１００  ｒｐｍおよび２５℃で一晩増殖させる。再懸濁した細胞の一部をグリセリンストックとして−８０℃で保存する。
【００８７】
一晩培養物を２５００ｇで１０分間遠心分離し、そしてシの体積の沈殿緩衝液（２０％  ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌ）を添加することにより上清中のファージを沈殿させ、そして１時間氷上でインキュベートする。１００００ｇ、４℃で３０分間遠心分離することにより、沈殿したファージをペレット化し、ＰＢＳ（２０ｍｌ）に再懸濁し、その後、沈殿手順を繰り返す。最後にファージをＰＢＳ（１ｍｌ）に再懸濁し、そして０．４５μｍフィルターに通して濾過する。
【００８８】
選択の各ラウンド後に、選択溶液、洗浄溶液および溶出溶液を滴定する。ファージ溶液をマイクロタイタープレート中の滅菌水に希釈し、そして対数期の大腸菌ＲＲ１ΔＭ１５細胞（１００μｌ）を各ファージ希釈液に添加する。ＲＴで２０分間インキュベートした後、各滴定から５μｌをＴＹＥプレートに移し、そして３７℃で一晩インキュベートする。得られたコロニーを計数し、そして力価（ｃｆｕ／ｍｌ）を計算する。
【００８９】
ＨＥＲ２結合のＥＬＩＳＡ分析
以下の実施例４に記載されるように（しかし、標的タンパク質としてＨＥＲ２を使用する）、または以下に記載されるように、最終選択サイクルからのクローンを発現させ、そしてＥＬＩＳＡ  セットアップを使用して、ＨＥＲ２結合活性についてスクリーニングする。１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンおよび１ｍＭ  ＩＰＴＧを補充したＴＳＢ＋ＹＥ培地（１ｍｌ）中に各コロニーを植菌することにより、ランダムに採取したコロニーを９６ディープウェルプレート中で発現させ、そして３７℃で１８〜２４時間増殖させる。インキュベート後、−２０℃で保存するために、１５％  グリセリンを含む９６ウェルプレートに各培養物の少量の画分を移すことにより、複製プレートを作製する。
【００９０】
残りの細胞を３０００ｇで１０分間の遠心分離によりペレット化し、ＰＢＳ−Ｔ  ０．０５（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を補充したＰＢＳ）（４００μｌ）に再懸濁し、そして−８０℃で凍結する。凍結したサンプルを水浴中で解かし、そして細胞を３７００ｇで少なくとも２０分間ペレット化する。発現した分子を含む上清を集め、そしてＥＬＩＳＡに使用する。
【００９１】
ハーフエリアマイクロタイターウェル（Ｃｏｓｔａｒ、＃３６９０）を、ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液（Ｓｉｇｍａ、＃３０４１）中６μｇ／ｍｌの濃度のＨＳＡ（５０μｌ）で４℃で一晩コーティングする。ウェルをブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中２％  脱脂粉乳）（１００μｌ）を用いてＲＴで２時間ブロックする。ブロッキング緩衝液を除去した後、調製したタンパク質（５０μｌ）をウェルに添加し、そしてプレートをＲＴで１．５時間インキュベートする。上清を廃棄し、そしてＰＢＳ−Ｔ  ０．０５中０．５〜１０μｇ／ｍｌの濃度のビオチン化ＨＥＲ２をウェルに添加し、そして１．５時間インキュベートする。結合複合体をＰＢＳ−Ｔ  ０．０５に１：５０００で希釈し、ＲＴで１時間インキュベートした西洋ワサビペルオキシダーゼ複合ストレプトアビジン（ＨＲＰ、Ｄａｋｏ、＃Ｐ０３９７）を用いて検出する。ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ(R)  ＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ、＃３４０２１）（５０μｌ）をウェルに添加し、そしてプレートを製造業者の推奨に従って処理する。ウェルの吸光度をＴｅｃａｎ  Ｕｌｔｒａ  ３８４  ＥＬＩＳＡリーダー（Ｔｅｃａｎ）中４５０ｎｍで読み取り、そしてＭａｇｅｌｌａｎ  ｖ．５．０ソフトウェア（Ｔｅｃａｎ）を使用して評価する。各新しい試薬を添加する前に、ＰＢＳ−Ｔ  ０．０５で洗浄を４回行う。
【００９２】
この実験結果に基づいて、配列決定するために、次に記載されるようにクローンを採取する。
【００９３】
ＥＬＩＳＡ陽性クローンの配列決定
適切なオリゴヌクレオチドを使用して、選択したコロニー由来のＰＣＲフラグメントを増幅させる。製造業者の推奨に従って、ＢｉｇＤｙｅ(R)Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、そして適切なビオチン化オリゴヌクレオチドを用いて、増幅したフラグメントの配列決定を行なう。Ｍａｇｎａｔｒｉｘ  ８０００  機器（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を使用して、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ(R)  ＲＥＧＥＮTMストレプトアビジンコート化常磁性ビーズに結合させることにより、配列決定反応物を精製し、そして最後にＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ(R)  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析する。
【００９４】
プラスミドｐＡＹ１４４８へのサブクローニング
選択したＤＮＡコード化物（ＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ）およびＨＥＲ２−特異的分子を発現ベクター発現ベクターｐＡＹ１４４８中にサブクローニングし、ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤ（Ｈｉｓ6−Ｚ＃＃＃＃＃）として発現されるＨｉｓ6−タグ化単量体分子を作出し、ここで、Ｚ＃＃＃＃＃は、変異体分子の出発集団の同定されたメンバーを表す。製造業者の推奨に従って、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、挿入物を含むプラスミドを１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを補充したＴＳＢ中の大腸菌ＲＲ１ΔＭ１５細胞の一晩培養物（２ｍｌ）から精製する。
【００９５】
適切なＰＣＲプライマー対を使用するＡｃｃＩ−ＮｏｔＩ  ＰＣＲ付着末端クローニングにより、選択された分子のＤＮＡを発現ベクターｐＡＹ１４４８中にサブクローニングする。
【００９６】
発現ベクターｐＡＹ１４４８をそれぞれ、ＮＥＢ４およびＮＥＢ３緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）中ＡｃｃＩ  およびＮｏｔＩを使用して、３７℃で４時間２工程で消化し、そしてコウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ；Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて３７℃で１時間脱リン酸化する。切断したプラスミドおよびフラグメントを、製造業者の推奨に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製する。
【００９７】
ＰＣＲ産物をハイブリダイズし、そしてＴ４  ＤＮＡリガーゼ（５  単位／μｌ；Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用して、ＲＴで１時間ＡｃｃＩ−ＮｏｔＩ消化および脱リン酸化ｐＡＹ１４４８にライゲーションする。ライゲーションのアリコートを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞にエレクトロポレーションする。５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを補充したトリプトース血液寒天基礎培地（ＴＢＡＢ）プレート上に細胞をプレーティングし、そして３７℃で一晩インキュベートする。陽性クローンを始めにＰＣＲスクリーニングで挿入について検証し、次いで上記のように正しい配列（ｃｏｒｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）について分析する。
【００９８】
Ｈｉｓ6−タグ化ポリペプチドの発現および精製
上記のように全てをｐＡＹ１４４８にサブクローニングした選択分子を、Ｎ−末端Ｈｉｓ6−タグへの融合として大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中で発現させ、そしてＩＭＡＣにより精製する。各分子のコロニーを使用して、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを補充したＴＳＢ培地（５ｍｌ）に植菌する。培養物を３７℃で一晩増殖させる。翌日、各培養物（５０μｌ）を、１リットルフラスコ中の５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを補充したＴＳＢ＋ＹＥ培地（１００ｍｌ）に別々に植菌する。培養物を１００ｒｐｍ、３７℃で０．７〜１のＯＤ600まで増殖させ、その後、ＩＰＴＧを０．５ｍＭの最終濃度で添加し、そして細胞を１００ｒｐｍ、ＲＴで一晩インキュベートする。８０００ｇで５分間の遠心分離により培養物を採取し、そしてペレットをタンパク質調製まで冷凍庫中で保存する。
【００９９】
１．５ｍｌ  Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、変性条件下、Ｈｉｓ6−タグ化タンパク質をＩＭＡＣ精製する。ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、緩衝液をＰＢＳに交換する。
【０１００】
製造業者に推奨されるように、Ａ280およびＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、タンパク質濃度を決定する。クマシーブルーＲで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質の純度を分析する。
【０１０１】
ヒトＨＥＲ２に対する選択分子の親和性のバイオセンサー分析
製造業者の推奨に従って、ＣＭ−５チップ（研究グレード（ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｇｒａｄｅ）；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の表面上のカルボキシル化されたデキストラン層上へのアミンカップリングにより固定化されたヒトＨＥＲ２を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのバイオセンサー分析を行なう。チップ上の表面１を活性化し、そして失活させ、そして注入の間、参照細胞として使用する。上記のように発現させ、そして精製した選択分子を２５ｎＭでＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に希釈し、そして２５μｌ／分の一定流速で１０分間注入し、次いでＨＢＳ−ＥＰ中で３０分間解離させる。表面を２５ｍＭ  ＨＣｌの２回の注入で再生させる。
【０１０２】
実施例３−元のおよび本発明のスカフォールド変異体のクローニング、生産ならびに融解温度およびインビトロ抗原性の評価
要約
この実施例は、元のおよび本発明のスカフォールド変異体のクローニング、生産および評価を記載する。導入されたスカフォールド突然変異は、ポリペプチド分子のいくつかの特性、例えば抗原性、親水性ならびにアルカリ安定性および構造的安定性を改善すると考えられている。従って、種々の分子を、融解温度およびインビトロ抗原性について評価し、そして結果は、元の分子と比較して、本発明の分子が融解温度を上昇させ、そしてより低下したインビトロ抗原性（より低いＩｇＧ結合性）を有することを示した。
【０１０３】
ポリペプチドのクローニング
元の構築物について、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、ＨＥＲ２、インスリン、Ｔａｑポリメラーゼおよび血小板由来増殖因子受容体β（ＰＤＧＦ−Ｒβ）に特異的なＤＮＡ配列コード化分子（表３）を各２つの別個の反応（ＰＣＲ１およびＰＣＲ２）において、ＰＣＲにより増幅させた。５’−末端にＡｃｃＩ制限酵素認識部位の一部をコード化するプライマー対ＡＦＦＩ−２６７／ＡＦＦＩ−１０１４およびＡＦＦＩ−１０１５／ＡＦＦＩ−２７０（表４）を、それぞれ、ＰＣＲ１およびＰＣＲ２に適用した。プラスミド鋳型を調製するために、プラスミドＤＮＡを含む細菌を５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを補充したＴＳＢ培地中で一晩増殖させた。遠心分離により細胞をペレット化し、そしてＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してプラスミドを調製した。
【０１０４】
本発明の構築物について、鋳型として部分的重複オリゴヌクレオチド（ＡＦＦＩ−１３２０−ＡＦＦＩ−１３２３、ＡＦＦＩ−１３２６およびＡＦＦＩ−１３２７）を使用するか、または元の構築物および関連する突然変異を含むオリゴヌクレオチドを有するベクター（ＡＦＦＩ−６９、ＡＦＦＩ−７０、ＡＦＦＩ−１１５１およびＡＦＦＩ−１１５２）（表４）を使用して、修飾された本発明の分子をコード化するヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅（ＰＣＲ１およびＰＣＲ２）を行なった。５’−末端にＡｃｃＩ制限酵素認識部位の一部をコード化するプライマー対ＡＦＦＩ−１３２８／ＡＦＦＩ−１３３１およびＡＦＦＩ−１３２９／ＡＦＦＩ−１３３０が、ＰＣＲ反応物中に含まれた。
【０１０５】
標準ＰＣＲプロトコルに従って、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、＃６００８５４−５２）を使用して、ＰＣＲ反応物を増幅させ、そしてＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動により分析した。
【０１０６】
多様なコドンを有するオリゴヌクレオチドおよびＰＣＲベースの突然変異誘発技術を使用して、ＰＤＧＦ−Ｒβ結合Ｚ変異体を生成させた。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ技術（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、＃６３９６０７）を使用して、得られたＰＣＲフラグメントを切断発現ベクター中にライゲーションした。
【０１０７】
全ての構築物について、上流および下流のＡｃｃＩ付着末端を含むＤＮＡフラグメントを生成させるために、電磁ストレプトアビジンビーズを使用して、ＰＣＲ１およびＰＣＲ２産物の順方向および逆方向のヌクレオチド鎖を分離した。持続回転の下、ＲＴで３０分間インキュベートした後、ビーズを洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＤＴＴ）で洗浄し、そして９５℃で５分間加熱した。非−ビオチン化フラグメントを含む上清を集め、そして９５℃で加熱し、次いで、ＤＮＡ鎖をハイブリダイズさせるために、２５℃で３０分間段階的に冷却した。
【０１０８】
その後、結合分子をコード化するＤＮＡフラグメントを、ＣＩＰ−処理し（コウシ腸アルカリホスファターゼ）、そして精製した発現ベクター（予めＡｃｃＩ制限酵素で消化している）中にＲＴで、２時間または一晩のいずれかでライゲーションした。得られた構築物は、ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤ、ＭＧＳＳＬＱ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤＣ（ＺPDGF-Rβ:2465について）またはＭ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−Ｃ（ＺPDGF-Rβ:3358について）であった。
【０１０９】
ライゲーション物（ｌｉｇａｔｉｏｎ）をエレクトロコンピテントな大腸菌ＴＯＰ１０細胞に形質転換し、そして実施例２に記載されるようにプレート上で培養した。新しく構築されたプラスミドを含む細菌コロニーを  ＰＣＲスクリーニングし、そして挿入ＤＮＡ配列を実施例２に記載されるように検証した。
【０１１０】
検証したプラスミドを、前述のように調製した。
【０１１１】
ポリペプチドの発現
関連するプラスミドを用いて形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）培養物を、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンおよび０．３ｍｌ／ｌ  消泡剤（Ｂｒｅｏｘ  ＦＭＴ  ３０）を補充したＴＳＢ−ＹＥ培地（８００ｍｌ）中に植菌し、そして約２のＯＤ６００まで３７℃で増殖させた。次いで、０．５ｍＭの最終濃度で１  Ｍ  ＩＰＴＧを添加することにより、タンパク質発現を誘導した。マルチ発酵槽（ｍｕｌｔｉｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）システムＧｒｅｔａ（Ｂｅｌａｃｈ）を使用して、培養を行なった。誘導の５時間後、１５  ９００×ｇで２０分間の遠心分離により培養物を採取した。上清を廃棄し、そして細胞ペレットを回収し、そして−２０℃で保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび染色ゲルの目視検査（ｏｃｕｌａｒ  ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）を使用して、タンパク質発現レベルを決定した。
【０１１２】
発現したポリペプチドの精製
Ｈｉｓ6タグを含むタンパク質を以下のように精製した：可溶性Ｈｉｓ6タグ化ポリペプチドを含むペレット化した細菌細胞をＨｉｓ  ＧｒａｖｉＴｒａｐ結合緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  イミダゾールおよび４０Ｕ／ｍｌ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ(R)）に懸濁し、そして超音波処理により破砕した。清澄化した後、上清を予めＨｉｓ  ＧｒａｖｉＴｒａｐ  結合緩衝液で平衡化したＨｉｓ  ＧｒａｖｉＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。１０カラム体積（ＣＶ）のＨｉｓ  ＧｒａｖｉＴｒａｐ洗浄緩衝液（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、６０ｍＭ  イミダゾール）でカラムを洗浄した後、ポリペプチドを３ＣＶ  Ｈｉｓ  ＧｒａｖｉＴｒａｐ溶出緩衝液（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾール）で溶出した。
【０１１３】
Ｈｉｓ6タグを含まないタンパク質を以下のように精製した：可溶性ＺPDGF-Rβ:2465−ＣｙｓまたはＺPDGF-Rβ:3358−Ｃｙｓを含むペレット化した細菌細胞を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．１）に懸濁した。細胞を破砕し、そして細胞内内容物を放出させるために、細胞懸濁液を８５℃で３分間加熱した。遠心分離により溶解物を清澄化し、続いて濾過し、そして予め２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．１）で平衡化したＸＫ２６カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中にパックされた２５ｍｌ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。５ＣＶ  ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．１）でカラムを洗浄した後、結合タンパク質を１０  ＣＶの間、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．１）中０〜０．５  Ｍ  ＮａＣｌの直線グラジエントで溶出した。流速は５ｍｌ／分であり、そして２８０ｎｍシグナルをモニターした。ＺPDGF-Rβ:2465−ＣｙｓまたはＺPDGF-Rβ:3358−Ｃｙｓを含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により同定した。関連する画分をプールし、そして５０ｍＭの最終濃度で１Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）を添加することにより、ｐＨを８．０に調整した。２０ｍＭまでのＤＴＴを添加し、次いで４０℃で３分間インキュベートし、構築物上のＣ−末端システインを還元した。還元後、５％の最終濃度でアセトニトリル（ＡＣＮ）を添加し、そして還元ＺPDGF-Rβ:2465−ＣｙｓまたはＺPDGF-Rβ:3358−Ｃｙｓを予めＲＰＣ
Ａ緩衝液（０．１％  ＴＦＡ、５％  ＡＣＮ、９５％  水）で平衡化した１ｍｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  １５ＲＰＣ  カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。１０ＣＶ  ＲＰＣ  Ａ緩衝液でカラムを洗浄した後、結合タンパク質を０〜４０％  ＲＰＣ  Ｂ緩衝液（０．１％  ＴＦＡ、８０％  ＡＣＮ、２０％  水）の直線グラジエントで溶出した。流速は１ｍｌ／分であり、そして２８０ｎｍシグナルをモニターした。純粋なＺPDGF-Rβ:2465−ＣｙｓまたはＺPDGF-Rβ:3358−Ｃｙｓを含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により同定し、そしてプールした。
【０１１４】
タンパク質の凍結乾燥を可能にするために、使い捨てＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、緩衝液を１０ｍＭ  炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ  ８．０）、または１０ｍＭ  酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ  ６．０）のいずれかに交換した。関連するタンパク質の等電点に対して凍結乾燥緩衝液を選択した。最後に、Ｃｈｒｉｓｔ  Ａｌｐｈａ  ２−４  ＬＳＣ機器を使用して、結合ポリペプチドＨｉｓ6−ＺTNF-α:185、Ｈｉｓ6−ＺHER2:342、Ｈｉｓ6−Ｚインスリン:810、Ｈｉｓ6−ＺTaq:1154、ＺPDGF-Rβ:2465−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ6−ＺHER2:2628、Ｈｉｓ6−ＺTaq:3229、Ｈｉｓ6−ＺTNF-α:3230、Ｈｉｓ6−Ｚインスリン:3232 およびＺPDGF-Rβ:3358−Ｃｙｓを凍結乾燥させ、使用するまで４℃で保存した（表５）。製造業者（Ｐｉｅｒｃｅ）の推奨に従って、Ｎ−エチルマレイミド（ｅｔｈｙｌｍａｌｅｍｉｄｅ）（ＮＥＭ）を使用して、遊離のＣ−末端システインをブロックした。
【０１１５】
精製したポリペプチドの分析
ＮａｎｏＤｒｏｐ(R)  ＮＤ−１０００分光光度計を使用して、２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより、ポリペプチド溶液の濃度の決定を行なった。タンパク質をさらにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣ−ＭＳで分析した。
【０１１６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析について、ポリペプチド（約１０μｇ）をＬＤＳサンプル緩衝液およびＤＴＴ（４５ｍＭ  最終濃度）と混合し、７０℃で１５分間インキュベートし、そしてＮｕＰＡＧＥ(R)  ４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上にロードした。分子量マーカーとしてＳｅｅＢｌｕｅ(R)  Ｐｌｕｓ２  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄおよび染色のためにＰａｇｅＢｌｕｅTMＰｔｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを利用して、Ｎｏｖｅｘ  Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ中ＭＥＳ  ＳＤＳランニング緩衝液を用いてゲルを走らせた（ｒｕｎ）。
【０１１７】
ポリペプチドの同定を検証するために、ＡＰＩ−ＥＳＩを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＬＣ／ＭＳＤシステムおよびシングル四重極質量分析器（ｓｉｎｇｌｅ  ｑｕａｄｒｕｐｌｅ  ｍａｓｓ  ａｎａｌｙｚｅｒ）を使用して、ＬＣ／ＭＳ分析を行なった。緩衝液交換の後、タンパク質サンプルを０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度で凍結乾燥緩衝液に希釈し、そして１０μｌを０．５ｍｌ／分の流速で、Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ−Ｃ８  Ｎａｒｒｏｗ−Ｂｏｒｅカラム（２．１×１５０ｍｍ、３．５μｍ）にロードした。０．５ｍｌ／分で３０分間、１０〜７０％  溶液Ｂの直線グラジエントを使用して、タンパク質を溶出した。３０℃で分離を行なった。イオンシグナルならびに２８０および２２０ｎｍでの吸光度をモニターした。イオンシグナルの分析により、精製タンパク質の分子量を決定した。
【０１１８】
融解温度（Ｔｍ）の決定
凍結乾燥ポリペプチドを約０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度でＰＢＳに溶解し、そして氷上で保存した。１ｍｍの光路長を有するセルにおいて、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−８１０分光偏光計でＣＤ分析を行なった。温度可変測定において、５℃／分の温度傾斜を用いて、吸光度を２２１ｎｍ、２０〜８０℃で測定した。ＣＤ対温度プロットにおける転移（transition）の中間点を決定することにより、試験ポリペプチドについての融解温度（Ｔｍ）を計算した。
【０１１９】
本発明に従って修飾されたポリペプチド分子は、元の分子と比較して融解温度を上昇させた（表６）。図１において、Ｈｉｓ6−ＺTNF-α:3230（本発明のＴＮＦ−α特異的ポリペプチド）について得られた融解曲線を示す。
【０１２０】
インビトロ抗原性ＥＬＩＳＡ（血清中のＩｇＧ結合性の分析）
ＥＬＩＳＡについての一般条件は以下の通りであった：ハーフエリア、９６−ウェルプレート中でＥＬＩＳＡアッセイを行なった。１００μｌを使用するブロッキングを除いて、全てのインキュベートについて使用した体積は１ウェルあたり５０μｌであった。コーティング緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ2ＣＯ3および３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ3）中、４℃で一晩コーティングを行い、そして全ての他のインキュベートを室温で行なった。霊長類の血清および検出抗体の希釈をＰＢＳ＋０．５％  カゼインで作製した。全ての洗浄を自動ＥＬＩＳＡ  Ｓｃａｎ  Ｗａｓｈｅｒ  ３００を使用して行い、各ウェルを１回の洗浄あたり洗浄緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ；１×ＰＢＳ中０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）（１７５μｌ）で４回洗浄した。
【０１２１】
ＥＬＩＳＡプレートのウェルを２μｇ／ｍｌの結合ポリペプチドＨｉｓ6−ＺTNF-α:185、Ｈｉｓ6−ＺHER2:342、Ｈｉｓ6−Ｚインスリン:810、Ｈｉｓ6−ＺTaq:1154、ＺPDGF-Rβ:2465−Ｃｙｓ−ＮＥＭ、Ｈｉｓ6−ＺHER2:2628、Ｈｉｓ6−ＺTaq:3229、Ｈｉｓ6−ＺTNF-α:3230、Ｈｉｓ6−Ｚインスリン:3232およびＺPDGF-Rβ:3358−Ｃｙｓ−ＮＥＭでコーティングした。ＺHER2:342を標準として使用した。コーティング後、ウェルを水道水で２回洗浄し、そしてＰＢＳ＋０．５％  カゼインでブロックした。プレートを空にし、そして２−倍希釈系列のカニクイザル由来の霊長類血清プール（ＭＡｃｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ；Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌから入手）をウェルに添加した。滴定系列（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｓｅｒｉｅｓ）を１／１００希釈で開始し、そして１／１０２４００で終了した。９６−ウェルプレート中で希釈を直接行った。霊長類血清プールと共に１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、そして検出のために１／５０００希釈でヤギ抗−ヒトＩｇ−ＨＲＰ抗体を添加した。検出抗体と共に５０分間インキュベートした後、プレートを洗浄し、そして基質を添加した。ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ(R)ＴＭＢキット中の等体積の２つの成分を混合し、そして１ウェルあたり５０μｌを添加した。続いて、プレートを暗所で１２分間インキュベートし、そして停止溶液（２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4）（５０μｌ）を添加することにより反応を停止させた。ＥＬＩＳＡリーダーを使用して、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。陰性対照として、霊長類血清プールの代わりに、ＰＢＳ＋０．５％
カゼインを使用した。
【０１２２】
結果を評価するため、およびポリペプチドに対する霊長類Ｉｇ−分子結合性のレベルを示すＩＶＡ値を得るために、プログラムＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を使用した。バックグラウンドＯＤ値を差引いたサンプル値を、ＸＹ−非線形回帰（Ｓ字型用量反応（ｓｉｇｍｏｉｄａｌ  ｄｏｓｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ））式に基づくテンプレートに入れた。ＯＤ  ０．３についての希釈値を式から得、そして標準希釈値を１００に設定し、そして全てのサンプルを１００に関連付けることにより、ＩＶＡ値を計算する。１００以下の値は、陽性対照として使用されるＺHER2:342分子と比較して、試験ポリペプチドが免疫グロブリンに結合する能力の低下を指示する。
【０１２３】
本発明の分子は、元の分子と比較して、免疫グロブリンに結合する可能性が少ないことを示した（表７）。結果をインビトロ抗原性（ＩＶＡ）値として示し、そして低下したインビトロ抗原性（ＩｇＧ結合性）をＩＶＡ値の減少として読み取る。
【０１２４】
【表３】
0005651476.tif 000006
【０１２５】
【表４】
0005651476.tif 000007
【０１２６】
【表５】
0005651476.tif 000008
【０１２７】
【表６】
0005651476.tif 000009
【０１２８】
【表７】
0005651476.tif 000010
【０１２９】
実施例４−Ｄｙｎａｚｙｍｅ結合ポリペプチド変異体のファージディスプレイ選択およびキャラクタリゼーション
Ｄｙｎａｚｙｍｅのビオチン化
製造業者のプロトコルに従って、１０×モル過剰のＮｏ−ｗｅｉｇｈｔTMスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、＃２１３２７）を使用して、種サームスブロッキアヌス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、＃Ｆ−５０１Ｌ）由来の標的タンパク質Ｄｙｎａｚｙｍｅ  ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｙｎａｚｙｍｅ）をビオチン化した。Ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ、１０Ｋ、０．５〜３ｍｌ）を使用する透析により、緩衝液をビオチン化前にＰＢＳに交換し、そしてビオチン化後にＴＫＭＴ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ  ８．８）に交換し、未結合のビオチンを除去した。
【０１３０】
ファージディスプレイ選択
本発明のポリペプチド集団（実施例１）を使用して、ビオチン化Ｄｙｎａｚｙｍｅに対する選択を行なった。選択のために２つのアプローチを利用した；高い標的濃度を有するもの（トラック１）および低い標的濃度を有するもの（トラック２）。４回の選択サイクルを行なった。各サイクルの間に新しいファージストックを調製した。選択の要旨および詳細について、図２を参照のこと。
【０１３１】
ファージライブラリーストックを実施例２に記載されるように２回ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿させ、そして０．１％  ゼラチンを補充したＴＫＭＴ（ＴＫＭＴｇ）に溶解した。ファージをストレプトアビジン−コート化ビーズ（ＳＡビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ(R)  Ｍ−２８０）と共にＲＴで３０分間プレインキュベートした。選択手順に使用したビーズおよび全てのチューブをＴＫＭＴｇ中でプレブロックした（ｐｒｅ−ｂｌｏｃｋｅｄ）。
【０１３２】
各サイクルにおける標的濃度および洗浄回数を図２に示す。選択および洗浄に使用した緩衝液はＴＫＭＴｇであった。予め選択したファージをビオチン化標的と共に４℃で１７時間インキュベートし、次いで第一サイクルの間ＲＴで３時間、そして次のサイクルの間にそれぞれ、３時間または１時間インキュベートした。続いて、ファージ粒子をプレブロックＳＡビーズ、５ｍｇ（第一サイクルトラック１）、３．５ｍｇ（第一サイクルトラック２）または０．５ｍｇ（全ての他のサイクル）に移し、そして撹拌しながら１０分間インキュベートした。その後、ビーズを洗浄し、そしてファージ粒子を実施例２に記載されるように低ｐＨ緩衝液で溶出した。選択の各ラウンドの後、溶出したファージを使用して、対数期大腸菌ＲＲ１ΔＭ１５細胞に感染させた。３７℃で２０分間インキュベートした後、細胞を遠心分離により採取した。ペレットを少量のＴＳＢ−ＹＥに溶解し、ＴＹＥプレートに塗り、そして３７℃で一晩インキュベートした。基本的に実施例２に記載されるように、各サイクルの間にファージストックを調製した。各選択サイクルの後にファージ粒子力価および収率を計算した。ファージ粒子収率（ファージ粒子アウト／ファージ粒子イン）は各サイクル（第二のものを除く）で増加し、この増加は標的結合クローンにおける濃縮を指示した。
【０１３３】
Ｄｙｎａｚｙｍｅ結合ポリペプチドのＥＬＩＳＡ分析
実施例２に記載されるように、選択の最終ラウンドの後に得られたクローンをランダムに採取し、そして９６−ウェルプレート形式におけるペリプラズムタンパク質発現に使用した。ＡＢＤに融合した可溶性ポリペプチド変異体を含む上清を、以下の通りにＥＬＩＳＡにおいて標的結合性についてアッセイした。推定結合ポリペプチドをＡＱＬＥ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤＹＶ−［ＡＢＤ］−ＳＱＫＡ（ＡＢＤ＝連鎖球菌属の種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）Ｇ１４８由来のアルブミン結合ドメインＧＡ３、Ｋｒａｕｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３７８（２）：１９０−１９４）（ここで、Ｚ＃＃＃＃＃は本発明のポリペプチド集団の個々の変異体を表す）として発現させた。
【０１３４】
ハーフエリアマイクロタイターウェル（Ｃｏｓｔａｒ、＃３６９０）を、ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液中２〜３μｇ／ｍｌ  Ｄｙｎａｚｙｍｅ（５０μｌ）でコーティングした。ウェルを０．５％  カゼイン（Ｓｉｇｍａ）を補ったＴＫＭＴ（ＴＫＭＴ−カゼイン）（１００μｌ）を用いてＲＴで１時間ブロックした。ブロッキング溶液を除去した後、上清（５０μｌ）をウェルに添加し、そしてプレートをＲＴで１．５時間インキュベートした。一次、次いで二次抗体を添加することにより、捕捉したポリペプチド変異体を検出した。一次抗体、Ｚ変異体に対するアフィニティー精製したポリクローナルウサギＩｇを、ＴＫＭＴ−カゼインに１：５０００で希釈し、そしてＲＴで１．５時間インキュベートした。二次抗体、ヤギα−ウサギ−ＨＲＰ  Ｉｇ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、＃Ｐ０４４８）をＴＫＭＴ−カゼインに１：５０００で希釈し、そしてＲＴで１時間インキュベートした。抗体および発色溶液（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）と共にインキュベートする前に、プレートをＴＫＭＴで４回洗浄した。
【０１３５】
プレートを実施例２に記載されるように発色させ（ｄｅｖｅｌｏｐ）、そしてＥＬＩＳＡ分光光度計において４５０ｎｍで読み取った。全てのプレートを関連する陰性および陽性対照、さらにブランクを用いて調製し、ここではペリプラスム上清の代わりＴＫＭＴを用いた。全体で、１０８０のランダムに採取されたクローンをＤｙｎａｚｙｍｅに対するそれらの結合性についてＥＬＩＳＡでスクリーニングした。陽性クローンおよび低い吸光度値を有するいくつかのクローンが、配列決定のために選択された。
【０１３６】
ＥＬＩＳＡ陽性ポリペプチドの配列決定
実施例２に従って、個々のクローンを配列決定に供した。ＥＬＩＳＡスクリーニングにおいて陽性とされる１１のユニークな結合ポリペプチドが見出された。いくつかのクローンは、数個のコピーを生じた。さらに、より低いＥＬＩＳＡ値を有するクローン由来の数個の配列が同定された。
【０１３７】
ポリペプチドのプラスミドｐＡＹ１４４８へのサブクローニング
付着末端ＰＣＲのための鋳型として調製されたプラスミドを使用して、単量体として１５のユニークなポリペプチドを、Ｎ−末端Ｈｉｓ6−タグを与える発現ベクターｐＡＹ１４４８（実施例２に記載されるような）へのサブクローニングに供した。実施例３に記載されるように、サブクローニングを行なった。
【０１３８】
ポリペプチドの精製
以下のテキストは、１５の単量体のＨｉｓ6−タグ化ポリペプチド、すなわち、Ｈｉｓ6−Ｚ０４６６５、Ｈｉｓ6−Ｚ０４６７２、Ｈｉｓ6−Ｚ０４６７４、Ｈｉｓ6−Ｚ０４６７８、Ｈｉｓ6−Ｚ０４６８７、Ｈｉｓ6−Ｚ０４７６７、Ｈｉｓ6−Ｚ０４７７０、Ｈｉｓ6−Ｚ０４７７５、Ｈｉｓ6−Ｚ０４７７６、Ｈｉｓ6−Ｚ０４７７７、Ｈｉｓ6−Ｚ０４７７８、Ｈｉｓ6−Ｚ０４７７９、Ｈｉｓ6−Ｚ０４７８０、Ｈｉｓ6−Ｚ０４７８１およびＨｉｓ6−Ｚ０４８９９の精製を記載する。可溶性Ｈｉｓ6−タグ化分子を含むペレット化細菌細胞を、Ｈｉｓ  ＧｒａｖｉＴｒａｐTM結合緩衝液（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  イミダゾールおよび２５Ｕ／ｍｌ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ(R)）に懸濁し、そして超音波処理により破砕した。上清の温度が９０℃付近で安定するまでの５分間、熱水（９５℃）を使用して、超音波処理した細胞の上清を加熱した。遠心分離により清澄化した後、上清を予めＨｉｓ  ＧｒａｖｉＴｒａｐ  結合緩衝液で平衡化したＨｉｓ  ＧｒａｖｉＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。５ＣＶ  Ｈｉｓ  ＧｒａｖｉＴｒａｐ結合緩衝液および５ＣＶ  Ｈｉｓ  ＧｒａｖｉＴｒａｐ洗浄緩衝液（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、６０ｍＭ  イミダゾール）でカラムを洗浄した後、ポリペプチドを３  ＣＶ  Ｈｉｓ  ＧｒａｖｉＴｒａｐ溶出緩衝液（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．５  Ｍ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾール）で溶出した。
【０１３９】
ポリペプチド変異体をさらに、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）により精製した。Ｈｉｓ  ＧｒａｖｉＴｒａｐからの溶出画分中に２％の最終濃度でアセトニトリル（ＡＣＮ）を添加した。サンプルを予めＲＰＣ  Ａ緩衝液（０．１％  トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２％  ＡＣＮ、９８％  水）で平衡化したＲＥＳＯＵＲＣＥTMＲＰＣ  ３ｍｌカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。５  ＣＶ  ＲＰＣ  Ａ緩衝液でカラムを洗浄した後、結合タンパク質を２０  ＣＶ  ０〜５０％  ＲＰＣ  Ｂ緩衝液（０．１％  ＴＦＡ、８０％  ＡＣＮ、２０％  水）の直線グラジエントで溶出した。流速は５ｍｌ／分であり、そして２８０ｎｍシグナルをモニターした。純粋なポリペプチドを含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により同定し、そしてプールした。
【０１４０】
使い捨てＰＤ−１０  脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のサイズ排除クロマトグラフィーにより、精製したポリペプチドの緩衝液を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．８）に置き換えた。
【０１４１】
１５のポリペプチド変異体のうちの１２が、首尾よく精製された：Ｈｉｓ6−Ｚ０４６６５、Ｈｉｓ6−Ｚ０４６７２、Ｈｉｓ6−Ｚ０４６７４、Ｈｉｓ6−Ｚ０４６８７、Ｈｉｓ6−Ｚ０４７７０、Ｈｉｓ6−Ｚ０４７７５、Ｈｉｓ6−Ｚ０４７７６、Ｈｉｓ6−Ｚ０４７７７、Ｈｉｓ6−Ｚ０４７７８、Ｈｉｓ6−Ｚ０４７８０、Ｈｉｓ6−Ｚ０４７８１およびＨｉｓ6−Ｚ０４８９９。
【０１４２】
精製したポリペプチドの分析
ＮａｎｏＤｒｏｐTMＮＤ−１０００分光光度計を使用して、２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより、ポリペプチド溶液の濃度の決定を行なった。タンパク質をさらにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣ−ＭＳで分析した。
【０１４３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のため、ポリペプチド溶液をＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、７４℃で１０分間インキュベートした。各ポリペプチド変異体（１０μｇ）をＮｕＰＡＧＥ(R)４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にロードした。分子量マーカーとしてＮｏｖｅｘ(R)Ｓｈａｒｐ  Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および染色のためにＰｈａｓｔＧｅｌＴＭ  Ｂｌｕｅ  Ｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）タンパク質染色溶液を利用して、ＸＣｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋTMＭｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中ＭＥＳ  ＳＤＳランニング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてゲルを走らせた。
【０１４４】
ポリペプチド変異体の同定を検証するために、ＡＰＩ−ＥＳＩを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＬＣ／ＭＳＤシステムおよびシングル四重極質量分析器を使用して、ＬＣ／ＭＳ分析を行なった。タンパク質サンプルを０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度で５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．８）に希釈し、そして１０μｌを１ｍｌ／分の流速で、Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ−Ｃ１８カラム（４．６×１５０、３．５μｍ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）にロードした。溶液Ａは水中０．１％  ＴＦＡを含み、そして溶液ＢはＡＣＮ中０．１％  ＴＦＡを含んだ。１ｍｌ／分で、１５〜６５％  溶液Ｂの２２分間直線グラジエントを使用して、タンパク質を溶出した。３０℃で分離を行なった。イオンシグナルならびに２８０および２２０ｎｍでの吸光度をモニターした。イオンシグナルの分析により、精製タンパク質の分子量を確認した。
【０１４５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣ／ＭＳ−分析により、ポリペプチド変異体の純度は、９５％以上であることを決定した。
【０１４６】
融解温度（Ｔｍ）の決定
精製ポリペプチド変異体を０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度で５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．８）に希釈した。１ｍｍの光路長を有するセルにおいて、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−８１０分光偏光計で円偏光二色性（ＣＤ）分析を行なった。温度可変測定において、５℃／分の温度傾斜を用いて、吸光度を２２１ｎｍ、２０〜９０℃で測定した。ＣＤ対温度プロットにおける転移の中間点を決定することにより、ポリペプチド融解温度（Ｔｍ）を計算した。結果について、表８を参照のこと。
【０１４７】
【表８】
0005651476.tif 000011
【０１４８】
熱安定性の分析
加熱に供された後、元のαヘリカル構造がリフォールディングする能力は、上記のポリペプチド変異体に要求される特性であった。構造の可逆性を詳細に調べるために、１サンプルあたり２つのＣＤスペクトルを２０℃で得た。２つの測定の間に、サンプルを９６℃に加熱した。サンプルを９６℃で２分間維持し、次いで２０℃に冷却した。加熱前および加熱後の類似のＣＤスペクトルは、サンプルが構造可逆性であることを証明する。１２の分析したポリペプチド変異体のうち３つが、熱処理により悪影響を受けたが、９つのポリペプチド変異体は、それらのαヘリックス構造を完全に取り戻すことを示した。加熱前および加熱後の２つのＣＤスペクトルの典型的なオーバーレイを図３に示す。
【０１４９】
Ｂｉａｃｏｒｅ結合分析
本発明に従って選択された１２のＨｉｓ6−タグ化単量体Ｚ変異体とＤｙｎａｚｙｍｅとの間の相互作用を、Ｂｉａｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で分析した。標的タンパク質をＣＭ５チップ表面のカルボキシル化デキストラン層上のフローセル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化した。製造業者のプロトコルに従うアミンカップリング化学を使用し、そしてアセテート（ｐＨ  ５．５）を使用して、固定化を行なった。被検体注入の間、ブランクとして使用するために、チップ上の１つのフローセル表面を活性化し、そして失活させた。被検体、すなわち、１０μＭの最終濃度でＨＢＳ−ＥＰランニング緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に希釈したポリペプチド変異体を、ランダムな順に二連（duplicate）で１０μｌ／分の流速で５分間注入した。１０分間の解離の後、０．０５％  ＳＤＳの１回の注入を用いて表面を再生した。ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で結果を分析した。ブランク表面の曲線をリガンド表面の曲線から引いた。図４に概説されるように、固定化Ｄｙｎａｚｙｍｅに対する５つのポリペプチド変異体の相互作用が分析により示された。
【０１５０】
実施例５−本発明に従うポリペプチド集団の化学合成の比較研究
要約
この実施例を構成する実験において、本発明に従うポリペプチド集団の固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）が記載され、そして元のスカフォールドに基づくポリペプチドの合成と比較した。４つの位置、すなわち、［Ｎ２３Ｔ］、［Ａ４２Ｓ］、［Ａ４６Ｓ］および［Ａ５４Ｓ］に導入された突然変異が、シュードプロリン前躯体（簡略化された省略形Ｆｍｏｃ−Ｘｘｘ−Ｙｙｙ−ＯＨを有する）を用いる代替合成ストラテジーを使用することを可能にした。上記の３または４つの位置でシュードプロリンを使用して、以下：
ＳＥＱ  Ａ：ｍａＥＳＥＫＹＡＫＥＭＲ  ＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰ  ＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦ
ＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱ  ＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫ  ＬＮＤＳＱＡＰＫ
（ここで、ｍａはポリペプチドのＮ−末端にカップリングしたメルカプトアセチル示す）；および
ＳＥＱ  Ｂ：ＡＥＡＫＹＡＫＥＭＷ  ＩＡＷＥＥＩＲＮＬＰ  ＮＬＮＧＷＱＭＴＡＦ  ＩＡＫＬＬＤＤＰＳＱ  ＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫ  ＬＮＤＳＱＡＰＫＣの配列を有する完全長分子を合成することを可能にし；
その一方で、標準合成はＳＥＱ  Ａを有するペプチドを生産できなかった。
【０１５１】
ＳＥＱ  Ｃ：ＡＥＮＫＦＮＫＥＭＷ  ＩＡＷＥＥＩＲＮＬＰ  ＮＬＴＧＷＱＭＴＡＦ  ＩＡＳＬＬＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫの標準合成（これは、ＳＥＱ  Ｂに類似するが、非常に不純な調製物およびペプチドの低収率をもたらす元のスカフォールドアミノ酸を含む）。
【０１５２】
新規なセリンまたはスレオニン残基の導入はまた、イソアシルジペプチドの使用を可能にし、このイソアシルジペプチドはペプチド合成中、凝集を抑制することにより合成効率を高めるためのシュードプロリンの代替物である（Ｓｏｈｍａ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４７：３０１３，２００６）。いくつかのこのような構成要素は、Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＧのＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから入手可能である。
【０１５３】
原理
ＨＥＲ２結合分子ＺHER2:342（ＺHER2:107としてＷＯ  ２００５／００３１５６に開示され、そして時折Ｚ００３４２とも称される）のペプチド合成、さらにこの分子のＮ−末端へのＤＯＴＡのカップリングが可能であり、そして文献に記載されている（Ｏｒｌｏｖａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６７：２１７８−２１８６）。しかし、合成後、ペプチド収率において膨大なばらつきが観察された。再現性良くペプチドを合成することの困難さは、ペプチドの長さ、さらに一次アミノ酸配列の両方に関連し得る。さらに、依然として保護されているアミノ酸側鎖の反応基を有する長いペプチドは、都合の悪い二次構造、例えばβシートを生成し得、これは固相ペプチド合成を妨げ得る（Ｑｕｉｂｅｌｌ  Ｍ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｔ  ｉｎ  Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ，Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ  Ｅｄｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２０００：１１５−１３５）。ペプチド合成中の二次構造形成を妨げる１つに方法は、シュードプロリンの使用である。アミノ酸Ｙｙｙがセリン、スレオニンまたはシステインである場合、シュードプロリン（簡略された省略形Ｆｍｏｃ−Ｘｘｘ−Ｙｙｙ−ＯＨを有する）を使用し得る。これらのシュードプロリンは、バックボーンに連結した側鎖を有する閉プロリン様構造（ｃｌｏｓｅｄ  ｐｒｏｌｉｎｅ−ｌｉｋｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を示し、そして酸処理により通常のアミノ酸構造に変換され得る（Ｈａａｃｋ  Ｔ  ａｎｄ  Ｍｕｔｔｅｒ  Ｍ（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ３３：１５８９−１５９２）。位置Ｙｙｙにおけるセリンまたはスレオニンと一緒に位置Ｘｘｘにおける１４のアミノ酸（Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒを除く全ての天然アミノ酸）についてのシュードプロリンが市販されている。
【０１５４】
親分子ＺHER2:342は、一次配列中にスレオニンおよびシステインを有さない。セリンは位置３３、３９  および４１においてのみ見出される。シュードプロリン前駆体は、セリン４１（Ｑ40−Ｓ41）についてのみ利用可能である。２つの他のセリンについて、利用可能な前駆体（Ｒ32−Ｓ33およびＰ38−Ｓ39）が存在しないので、位置Ｘｘｘにおけるアミノ酸は、シュードプロリンの使用を避ける。
【０１５５】
本発明に従う集団中に含まれるポリペプチドに導入される突然変異は、ペプチド合成を促進することを目標にするが、これに限定されない。特に、位置２３、４２、４６および５４、すなわち［Ｎ２３Ｔ］、［Ａ４２Ｓ］、［Ａ４６Ｓ］および［Ａ５４Ｓ］における突然変異は、ＳＰＰＳにおいて認識される２つの問題を解決する能力を有し得る：これらは、シュードプロリンの使用を可能にし、そしてアスパラギンをスレオニンに置き換えることにより、アミノ酸位置２１〜２６周辺の臨界（critical）領域を位置２３で変更する。
【０１５６】
合成ストラテジー１
アミノ酸配列ＳＥＱ  Ａを、完全自動化ペプチドシンセサイザー中Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｗａｎｇポリスチレン樹脂上でアセンブルした。この樹脂は、Ｆｍｏｃ−ストラテジーを用いるペプチドの形成に非常にふさわしい。５７アミノ酸を樹脂上に（適切な側鎖保護を用いて）カップリングした。最後の工程において、Ｓ−トリチル−保護化メルカプト酢酸のカップリングを手動で行なった。
【０１５７】
工程１：固相ペプチド合成
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｗａｎｇポリスチレン樹脂を、撹拌棒を備えたＳＰＰＳ反応器中に移した。次いで、樹脂のＦｍｏｃ脱保護で合成を開始し、以下に示される一般的記載に従ってＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨを用いるカップリング手順を続けた。この工程の後再び、Ｆｍｏｃ  脱保護、次いで配列に従うアミノ酸誘導体のカップリングを行った。最後にイソプロピルエーテル（ＩＰＥ）で樹脂を洗浄した後、ペプチド樹脂をデシケーター中で減圧下乾燥させた。
【０１５８】
標準Ｆｍｏｃペプチド合成、および４つの位置にシュードプロリンを使用する合成の両方を行なった。標準ペプチド合成のため、Ｆｍｏｃ−アミノ酸のみを使用した。代替のペプチド合成のため、Ｆｍｏｃ−アミノ酸とは別に、以下のシュードプロリンを使用した：位置２２〜２３においてＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨ、位置４１〜４２においてＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−ＯＨ、位置４５〜４６においてＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−ＯＨおよび位置５３〜５４においてＦｍｏｃ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−ＯＨ。
【０１５９】
Ｆｍｏｃ脱保護手順
Ｎ−α−Ｆｍｏｃ保護基の切断を達成するために、樹脂をまた、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）中２０％ピペリジンで処理した。次いで、樹脂の洗浄をＮＭＰで行なった。
【０１６０】
カップリング手順
アミノ酸誘導体Ｐｒｏ５７〜Ｇｌｕ１の自動化カップリング。最大３当量のＦｍｏｃ−ＡＡ誘導体をＮＭＰに溶解した。カップリングのため、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＢＴＵ）およびＮＭＰ中ｓｙｍ−コリジン（２，４，６−トリメチルピリジン）を添加した。樹脂上に注ぐ前に、得られた溶液を室温で混合した。溶媒としてＮＭＰを使用した。６０℃で少なくとも１５分のカップリング時間後、樹脂をＮＭＰで洗浄した。
【０１６１】
各カップリング手順の後、カップリング試薬としてＤＭＦ中２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＡＴＵ）を用いて、そして溶媒としてジクロロエタンを用いるカップリングの繰り返しを自動的に行ない、無水酢酸カップリングを続ける。
【０１６２】
工程２：メルカプト酢酸のカップリング
５モル当量のアミノ酸、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ｈｅｘａｆｌｕｏｒｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＨＢＴＵ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）および１０当量のＮ−エチルジイソプロピルアミン（ＤＩＥＡ、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｒｅｃａｍｂｅ，Ｅｎｇｌａｎｄから入手）を用いて、アシル化を行なった。Ｓ−トリチル−メルカプト酢酸をＡｎａＳｐｅｃ  Ｉｎｃ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手した。
【０１６３】
工程３：残りの保護基の切断を含む樹脂からの切断
精製水、エタンジチオール（ＥＤＴ）、およびトリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）の存在下、ペプチド樹脂をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理した。室温で約２時間の切断時間後、反応混合物を約０℃に冷却し、そしてヨウ化アンモニウムおよび硫化ジメチルを添加し、酸化メチオニンを還元した。約０℃でさらに６０分間の切断時間後、形成されたヨウ素をアスコルビン酸で還元した。生成物を濾過して取り出した後、これを低温中、ＩＰＥ中で沈殿させ、再び濾過して取り出し、ＩＰＥで洗浄し、そして減圧下乾燥させた。
【０１６４】
ＨＰＬＣによる純度分析
Ｖｙｄａｃ  ２１８  ＴＰ５４（５μｍ、２５０×４．６ｍｍ）カラムおよびそれぞれ溶媒ＡおよびＢとして、Ｈ2Ｏ中０．１％  ＴＦＡ、１％  アセトニトリルおよびアセトニトリル中０．１％  ＴＦＡを使用して、５８アミノ酸長ペプチドおよびいくつかの中間体の純度を逆相ＨＰＬＣにより決定した。カラムオーブンの温度を３５℃に設定した。カラムを３０分で１５〜４５％  溶媒Ｂのグラジエント、または３０分で２０〜５０％  Ｂのグラジエントのいずれかを用いて溶出した。ＵＶ検出は２２０ｎｍであった。面積正規化により、純度を計算した。
【０１６５】
結果
シュードプロリンを用いてまたは用いずに合成した配列ＳＥＱ  Ａを有する分子の収率および純度を、分析用逆相クロマトグラフィーにより分析した。合成の経過を追跡するために、合成樹脂のごく一部をいくつかのカップリング工程後に取り、そして所望のペプチドの中間体の存在、純度および収率について分析した。図５は、４１アミノ酸長ペプチド中間体（アミノ酸１８〜５８）のＨＰＬＣ分析を示す。シュードプロリンを使用して合成を行なった場合、ペプチド合成のこの段階で、正しい配列を有する１つの明確かつ重要なペプチドピーク（ＲＴ＝１５．３３分、収率  ４９％）を同定した（図５Ａ）。しかし、標準Ｆｍｏｃ合成は、大量の小さいペプチドピークおよび同じ大きさの２つの主なピークをもたらしたが、収率は低かった。正しい配列（ａａ  １８〜５８）を有するペプチド中間体としてこの２つのピークの一方（ＲＴ＝２０．８２分）を同定した（図５Ｂ）。シュードプロリンを使用して合成を行なった場合、完全長ペプチド（アミノ酸１〜５８）のみを得た。図６Ａは、２６％の最終ペプチドの収率を有する単一生成物ピークを示す。しかし、標準Ｆｍｏｃ−合成は、最終ペプチド生成物を生産できなかった。標準合成からの４９アミノ酸長中間体（アミノ酸１０〜５８）の分析は、所望の中間体が検出され得ず、そして合成が停止されたことを明らかにした（図６Ｂ）。
【０１６６】
合成ストラテジー２
集積マイクロ波オーブン（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｗａｖｅ  ｏｖｅｎ）を用いる完全自動化ペプチドシンセサイザー上でＦｍｏｃ−ストラテジーを使用して、２つの分子をアセンブルした。
本発明のスカフォールド配列に基づくＳＥＱ  Ｂの５９アミノ酸残基をＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｗａｎｇ  ＬＬポリスチレン樹脂上で（適切な側鎖保護を用いて）アセンブルした。
元のＡｆｆｉｂｏｄｙ(R)分子スカフォールドに基づくＳＥＱ  Ｃの５８アミノ酸残基を、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｗａｎｇ  ＬＬポリスチレン樹脂上で（適切な側鎖保護を用いて）アセンブルした。
Ｗａｎｇ樹脂ＬＬは、Ｆｍｏｃストラテジーを用いるペプチドの形成に非常にふさわしい。
【０１６７】
工程１：固相ペプチド合成
ポリスチレン樹脂をシンセサイザー（Ｌｉｂｅｒｔｙ，ＣＥＭ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＮＣ  ＵＳＡ）により、ＳＰＰＳ反応容器中に自動的に移した。次いで、樹脂のＦｍｏｃ脱保護で合成を開始し、以下に示される要約に従って、次のＦｍｏｃ−保護化アミノ酸（Ｆｍｏｃ−ＡＡ）を用いるカップリング手順を続けた。この工程の後再び、Ｆｍｏｃ  脱保護、次いで配列に従うアミノ酸誘導体のカップリングを行った。最後にジクロロメタン（ＤＣＭ）で樹脂を洗浄した後、ペプチド樹脂を減圧下乾燥させた。標準Ｆｍｏｃペプチド合成により、完全なペプチドＳＥＱ  Ｃが作製されたが、一方、シュードプロリンはスカフォールドになされた改善により可能となったＳＥＱ  Ｂ中の位置で使用した。以下のシュードプロリンを使用した：位置４１〜４２にＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−ＯＨ、位置４５〜４６にＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−ＯＨおよび位置５３〜５４にＦｍｏｃ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−ＯＨ。
【０１６８】
Ｆｍｏｃ脱保護手順
Ｎ−α−Ｆｍｏｃ保護基の切断を達成するために、マイクロ波照射を用いて、樹脂をＮＭＰ中５％ピペラジンで処理した。次いで、樹脂の洗浄をＮＭＰで行なった。
【０１６９】
カップリング手順
アミノ酸誘導体Ｃｙｓ５９〜Ａｌａ１（ＳＥＱ  Ｂについて）およびＬｙｓ５８〜Ａｌａ１（ＳＥＱ  Ｃについて）の自動化カップリング。最大５当量のＦｍｏｃ−ＡＡをＮＭＰに溶解した。カップリングのため、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ＮＭＰ中Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を１：１：１：２（ＡＡ／ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＰＥＡ）のモル比で樹脂に添加した。反応容器の底から窒素ガスを泡立てることにより、混合物を撹拌した。マイクロ波照射を使用してエネルギーを加えながら７５〜８０℃で少なくとも５分のカップリング時間後、樹脂をＮＭＰで洗浄した。
【０１７０】
各カップリング手順の後、自動化無水酢酸カップリングを行なった。
【０１７１】
工程２：残りの保護基の切断を含む樹脂からの切断
精製水、エタンジチオール（ＥＤＴ）、およびトリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）の存在下、ペプチド樹脂をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理した。室温で約２時間の切断後、切断混合物を濾過し、そして樹脂をストレートの９５％  ＴＦＡ／水でリンスした。濾液を冷却したメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）にゆっくりと添加した。沈殿物を遠心分離し、そしてＭＴＢＥを除去した。固体をエーテルに再懸濁し、そして全体で３回の操作を繰り返した。エーテルの最後の除去後、固体を０．１％  ＴＦＡ／水に再懸濁し、残りのエーテルをエバポレートのためにそのままにし、そして凍結乾燥前に溶液を凍結した。
【０１７２】
ＨＰＬＣ−ＭＳによる純度分析および質量分析
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）および単一四重極（ｓｉｎｇｌｅ  ｑｕａｄｒｏｐｏｌ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣ／ＭＳＤを使用する、高速液体クロマトグラフィーおよびオンライン質量分析（ＨＰＬＣ−ＭＳ）によりペプチドの純度を決定した。Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ  Ｃ１８（３．５μｍ、１５０×４．６ｍｍ）カラムおよびそれぞれ溶媒ＡおよびＢとして、０．１％  ＴＦＡ／水および０．１％  ＴＦＡ／アセトニトリル（ＡＣＮ）を使用して、ＨＰＬＣを実行した。カラムオーブンの温度を３０℃に設定した。カラムを４０分で１５〜５５％溶媒Ｂのグラジエントを用いて溶出した。ＵＶ検出は２２０ｎｍであった。面積正規化により、純度を計算した。質量分析および評価に使用したソフトウェアは、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｖ．Ｂ．０２．０１．（Ａｇｉｌｅｎｔ）であった。
【０１７３】
結果
分子ＳＥＱ  ＢおよびＳＥＱ  Ｃの収率および純度を、分析用逆相クロマトグラフィーにより分析した。完全長ペプチドが両方の合成において得られたが、しかしＳＥＱ  Ｂについてより大きな収率が得られた。図７Ａは、ＳＥＱ  Ｂについての予測される質量を有する主な生成物ピーク（ＲＴ＝４１．４８分）および１５％の最終ペプチドの収率を示す。８％の収率のさらなるピーク（ＲＴ＝４１．２１分）は、完全長生成物の予測される質量よりも７２Ｄａ高い質量を有することが見出された。これは、Ｃｙｓ５９アミノ酸残基上の副反応が原因であると考えられる。副反応の種類によって、これは合成の間または樹脂からペプチドを切断する間に生じ得る。合成および／または切断プロトコルを最適化することにより、この副反応は最小化され、それによりこの場合において、最高で全収率の２３％まで収率が増加し得る。
【０１７４】
しかし、ＳＥＱ  Ｃの標準Ｆｍｏｃ−合成は、多数の小さなペプチドピークをもたらした（図７Ｂ）。主なピークの１つ（ＲＴ＝４３．６０分）は、予測される質量を有する完全長ペプチドとして同定された。この生成物の収率は４％であった。
【０１７５】
実施例６−元のおよび本発明のポリペプチド変異体の免疫原性
要約
この実施例において、１つの元のおよび１つの本発明のポリペプチド変異体の免疫原性をインビボで比較した。二量体分子をラットに投与し、そして特異的抗体反応を抗−薬物抗体（ＡＤＡ）アッセイで決定した。本発明に従って導入されたスカフォールド突然変異を有する分子は、元のＺ変異体と比較して、より低い抗体反応および遅延した抗体反応を示す。
【０１７６】
ポリペプチドのクローニングおよび生産
アルブミン結合ドメインＡＢＤ０３５（Ｊｏｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ８：５１５−２７）に融合した２つのＴａｑ−ポリメラーゼ特異的結合ポリペプチドをこの研究に使用した：
１．（Ｚ０１１５４）2−ＡＢＤ０３５：元のスカフォールド
２．（Ｚ０３２２９）2−ＡＢＤ０３５：本発明のスカフォールド
ＡｃｃＩ−オーバーハングを有するＺ０１１５４およびＺ０３２２９のＰＣＲ増幅し、そしてハイブリダイズしたフラグメントを、それぞれ、ＡｃｃＩ消化ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）誘導発現ベクターｐＡＹ４９２およびｐＡＹ１４５０において、二量体としてクローンニングした。得られたベクターをＡｃｃＩ−ＮｏｔＩで消化し、そしてＡｃｃＩおよびＮｏｔＩオーバーハングを有するＰＣＲ  増幅したＡＢＤ０３５フラグメントでライゲーションし、構築物ｐＡＹ１８２７（ＭＧＳＳＬＱ−［Ｚ０１１５４］−［Ｚ０１１５４］−ＶＤ−［ＡＢＤ０３５］をコード化する）およびｐＡＹ２２９２（ＭＧＳＳＬＱ−［Ｚ０３２２９］−［Ｚ０３２２９］−ＶＤ−［ＡＢＤ０３５］をコード化する）を生成した。基本的に実施例３に記載されるように、プラスミドをコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換し、そして発酵によりタンパク質を生産した。ペレット化した細胞を［２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５  Ｕ／ｍｌ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ(R)（Ｍｅｒｃｋ、＃１．０１６５４．０００１）、ｐＨ  ８．０］に懸濁し、そして氷上で超音波処理により破砕した。清澄化した上清を、ヒト血清アルブミンを用いて組織内でカップリングしたＣＮＢｒ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃１７−０９８１−０３）をパックしたカラムにロードした。カラムを予め１×ＴＳＴ［２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ  ８．０］中で平衡化した。サンプル適用後、Ａｂｓ280シグナルの還元が観察されなくなるまで、１×ＴＳＴ、次いで５ｍＭ  ＮＨ4Ａｃ（ｐＨ  ５．５）での洗浄を行なった。結合したタンパク質を０．５  Ｍ  ＨＡｃ（ｐＨ  ２．８）で溶出した。溶出したサンプルに２％の最終濃度でアセトニトリルを補充し、そしてＲｅｓｏｕｒｃｅ  ＲＰＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃１７−１１８２−０１）の逆相クロマトグラフィーによりさらに精製した。［２％  アセトニトリル、水中０．１％  ＴＦＡ］をランニング緩衝液として使用し、そして２５  カラム体積にわたって０〜５０％の［８０％  アセトニトリル、水中０．１％  ＴＦＡ］の直線グラジエントを使用してサンプルを溶出した。ＨｉＰｒｅｐ  ２６／１０脱塩カラム（ＧＨ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃１７−５０８７−０１）を使用して、［５ｍＭ  リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．２］への緩衝液の交換を行なった。実施例３に記載されるように、サンプル純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣ／ＭＳ分析により確認した。製造業者の使用説明書に従って、ＡｆｆｉｎｉｔｙＰａｋ  Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌエンドトキシン除去ゲル（Ｔｈｅｒｍｏ、＃２０３４４）で微量のエンドトキシンを除去した。ＡＰＬ（Ａｐｏｔｅｋｅｔ  Ｐｒｏｄｕｋｔｉｏｎ  ＆  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｒ  ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）により実施されたゲルクロットＬＡＬ試験で、エンドトキシンは検出されなかった。ランニング緩衝液として１×ＰＢＳ、０．５ｍｌ／分の流速および１ｍｇ／ｍｌの濃度での１００μｌのサンプル体積を使用して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  カラム（ＧＥ  Ｈ���ａｌｔｈｃａｒｅ、＃１７−５１７４−０１）で実行されるサイズ排除クロマトグラフィーにより検証されるように、サンプルは可溶性凝集体を含まなかった。
【０１７７】
投与およびサンプリングスキーム
動物実験倫理委員会（ｌｏｃａｌ  ａｎｉｍａｌ  ｅｔｈｉｃｓ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）から認証されたＡｇｒｉｓｅｒａ  ＡＢ（Ｖaｎｎaｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）で、動物実験を行なった。３群に分けた雌のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを、表９に概説されるように、（Ｚ０１１５４）2−ＡＢＤ０３５、（Ｚ０３２２９）2−ＡＢＤ０３５または緩衝液コントロールを皮下注射した。日０、４、７、１４、２１および２８に注射した。血液サンプル（２５０μｌ）を日１（前血清（ｐｒｅ−ｓｅｒｕｍ））ならびに日６、１３、２０および３５に各動物から採取した。全ての動物を３５日目に犠牲にした。採取した血液サンプルを４℃で一晩放置して凝固させ、そして得られた血清を分析まで−２０℃で保存した。
【０１７８】
【表９】
0005651476.tif 000012
【０１７９】
抗−薬物抗体（ＡＤＡ）アッセイ
抗−（Ｚ０１１５４）2−ＡＢＤ０３５および抗−（Ｚ０３２２９）2−ＡＢＤ０３５抗体の存在を分析するために、３種類のＥＬＩＳＡ分析を行なった。全てのサンプルを、始めに反応抗体の存在についてスクリーニングし、次いで特異性を検証するために確認分析した。その後、Ｚ変異体に対する特異的抗体を有する血清サンプルを滴定し、抗−（Ｚ０１１５４）2−ＡＢＤ０３５および抗−（Ｚ０３２２９）2−ＡＢＤ０３５抗体の力価を定量した。
【０１８０】
血清サンプルをスクリーニングするために、２μｇ／ｍｌの最終濃度でコーティング緩衝液（Ｓｉｇｍａ、＃Ｃ３０４１）に希釈した（Ｚ０１１５４）2−ＡＢＤ０３５または（Ｚ０３２２９）2−ＡＢＤ０３５でＥＬＩＳＡプレート（９６−ウェル、ハーフエリアプレート、Ｃｏｓｔａｒ、＃３６９０）で一晩コーティングした。コーティング溶液（５０μｌ）をウェル毎に添加し、そしてプレートを４℃で一晩インキュベートした。プレートを手動で、脱イオン水で２回洗浄し、その後、１００μｌ／ウェルのＰＢＳ−カゼイン（０．５％  カゼイン（Ｓｉｇｍａ、＃８６５４）を含むＰＢＳ）で２時間ブロックした。ブロッキング溶液を除去し、そしてブロッキング緩衝液に１：５０で希釈した血清サンプル（５０μｌ／ウェル）を添加した。ＲＴで１．５時間インキュベートした後、プレートを自動ＥＬＩＳＡ洗浄器（Ｓｃａｎｗａｓｈｅｒ  ３００，Ｓｃａｔｒｏｎ）中ＰＢＳＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、＃２３３３６２５００）を含むＰＢＳ）で洗浄した。Ｚ変異体に対するラット抗体を検出するために、ＰＢＳ−カゼインに１：６０００で希釈したＨＲＰ−複合抗−ラットＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、＃３０５０−０５）（５０μｌ／１ウェル）を添加した。インキュベートの１時間後、プレートを上記のように洗浄し、そして５０μｌ／ウェルの基質溶液（Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ(R)  ＴＭＢ、Ｐｉｅｒｃｅ、＃３４０２１）を添加した。プレートを暗所中ＲＴでインキュベートし、そして１５分後、５０μｌ／ウェルの２  Ｍ  Ｈ2ＳＯ4（ＶＷＲ、＃１４３７４−１）を用いて発色（ｃｏｌｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）を停止させた。プレートをＥＬＩＳＡリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ3，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で４５０ｎｍで読み取った。
【０１８１】
上記のＥＬＩＳＡ法をまた、確認および滴定ＥＬＩＳＡアッセイに使用したが、いくらか変更した。確認分析のため、血清サンプルをＰＢＳ−カゼインまたはそれぞれの１μｇ／ｍｌのポリペプチド変異体を含むＰＢＳ−カゼインに１：５０で希釈した。４５％またはそれ以上のＯＤシグナルが減少した血清サンプルは、Ｚ変異体に対する特異的抗体を含むと考えられた。滴定分析のため、血清サンプルをＰＢＳ−カゼインに１：５０で希釈し、次いでそれらが力価の値がサンプルについて計算可能となるプレート−特異的カットポイントと交差するまで、２倍または５倍で連続希釈した。
【０１８２】
アッセイの進行の間、以下の主要パラメータを決定した：
・最小希釈：１：５０
・非特異的バックグラウンド（ＮＳＢ）：希釈マトリクスとして使用され、そして分析の間、各プレートに含まれる正常なラット血清プール（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ  ラット、Ｓｃａｎｂｕｒ）のＯＤ450
・アッセイカットポイント：３０の個体からの正常なラット血清の平均ＯＤ450＋平均値の標準偏差の１．６４５倍。（Ｚ０１１５４）2−ＡＢＤ０３５および（Ｚ０３２２９）2−ＡＢＤ０３５の両方で０．１１の値を得た。
・正規格化因子：ＮＳＢの平均ＯＤ450で割ったアッセイカットポイント：それぞれ、（Ｚ０１１５４）2−ＡＢＤ０３５および（Ｚ０３２２９）2−ＡＢＤ０３５について１．８７および１．８６
サンプル分析の間、次いでプレート特異的カットポイントを以下のように決定した：
プレート特異的ＮＳＢの平均ＯＤ450×正規化因子。
【０１８３】
２つのポリペプチド変異体に対する抗体を含むことが確認されたラット血清（過免疫（ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｉｓｅｄ）Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット、Ａｇｒｉｓｅｒａ）を、分析の間、各プレート上に含まれる陽性対照（ＰＣ）サンプルを調製するために使用した：ＨｉｇｈＰＣ：陽性対照血清はＰＢＳ−カゼイン中に最小限希釈する前に、マトリクスに１：４で希釈した。このＰＣは、アッセイ／プレートカットポイントのすぐ上のＯＤ値を有する。ＬｏｗＰＣ：陽性対照血清はＰＢＳ−カゼイン中に最小限希釈する前に、マトリクスに１：３００で希釈した。このＰＣは、アッセイ／プレートカットポイントすぐ上にはわずかに足らないＯＤ値を有する。
【０１８４】
ＬｏｗＰＣおよびＨｉｇｈＰＣ値を使用して、力価品質管理（Ｔｉｔｅｒ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ）（ＬｏＱＣ１−５およびＨｉＱＣ１−５）を調製した。ＬｏｗＰＣおよびＨｉｇｈＰＣをＰＢＳ−カゼインに１：５０で希釈し、それぞれ、ＬｏＱＣ１およびＨｉＱＣ１を得た。次いで、これらをＰＢＳ−カゼインにさらに希釈し、それぞれ、ＬｏＱＣ２（１：１００）、ＬｏＱＣ３（１：２００）、ＬｏＱＣ４（１：４００）およびＬｏＱＣ５（１：８００）、ならびにＨｉＱＣ２（１：２５０）、ＨｉＱＣ３（１：１２５０）、ＨｉＱＣ４（１：６２５０）およびＨｉＱＣ５（１：３１２５０）を得た。
【０１８５】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ）を使用して、力価の値を計算した。簡潔に、ＯＤ450値を対数希釈（ｌｏｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ）に対してプロットし、そしてサンプルの力価を、プレート特異的カットポイントで対数希釈として定義した。
【０１８６】
結果
元の（（Ｚ０１１５４）2−ＡＢＤ０３５）と本発明の（（Ｚ０３２２９）2−ＡＢＤ０３５）分子との間のインビボ比較は、本発明の分子がより低い免疫原性であったことを示した。反応は、各個体間で大幅に変動し、そして経時的と共に増加した。力価は、本発明の分子を投与した２つの個体と比較して、元の分子を投与した３つの個体で決定することができた。実際の力価はまた、本発明の分子を投与したグループでより低かった（表１０）。数匹の動物が抗体反応を発生させると見られる理由は、融合ＡＢＤ分子が原因であり得、これは融合ポリペプチドの免疫原性を減少させることが以前に示されている（例えば、ＷＯ  ２００５／０９７２０２を参照のこと）。
【０１８７】
【表１０】
0005651476.tif 000013
【図１】
0005651476.tif 000020
【図２】
0005651476.tif 000021
【図３】
0005651476.tif 000022
【図４】
0005651476.tif 000023
【図５Ａ】
0005651476.tif 000024
【図５Ｂ】
0005651476.tif 000025
【図６Ａ】
0005651476.tif 000026
【図６Ｂ】
0005651476.tif 000027
【図７Ａ】
0005651476.tif 000028
【図７Ｂ】
0005651476.tif 000029
【配列表】
0005651476000001.app