(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠している女性における子癇前症の検出を補助する方法またはそのリスクの推定を補助する方法であって、
ａ）該女性由来の血液中のＣｌｅｖｅｒ−１タンパク質のレベルを検出または定量すること、
ｂ）その結果を対照と比較すること、および
ｃ）Ｃｌｅｖｅｒ−１タンパク質の欠如またはレベルの減少を子癇前症またはそのリスクに結び付けること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃｌｅｖｅｒ−１受容体を含むヒト由来の新規な細胞；個体の免疫系に影響を与えるためおよび免疫系の機能に関連する疾患または状態を治療するための方法；ならびに抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１治療に反応し得るがん患者をスクリーニングするための方法または妊娠している女性において妊娠合併症を診断するための方法、または妊娠している女性において該合併症のリスクを推定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景技術を説明するために本明細書において使用される刊行物および他の文献、および特に実施に関してさらなる詳細を提供するようなものは参考文献として組み込まれる。
【０００３】
ＣＬＥＶＥＲ−１は、国際公開第０３／０５７１３０号に開示されたタンパク質、共通リンパ内皮および血管内皮受容体−１（Common Lymphatic Endothelial and Vascular Endothelial Receptor-1）である。それは、全身血管系およびリンパ管系の両方において、リンパ球（および悪性腫瘍細胞）の内皮への接着を媒介する結合タンパク質である。Ｃｌｅｖｅｒ−１とそのリンパ球基質との相互作用をブロックすることにより、リンパ球の再循環およびリンパ球の遊走、ならびに炎症などの関連疾患を組織へのリンパ球の流入および組織からのリンパ球の流出部位で同時に制御することが可能である。国際公開第０３／０５７１３０号はまた、Ｃｌｅｖｅｒ−１が、単球や顆粒球といったほかの種類の白血球のＨＥＶ−様管への結合を媒介するということも開示している。したがって、Ｃｌｅｖｅｒ−１と悪性腫瘍細胞との相互作用をブロックすることにより、Ｃｌｅｖｅｒ−１に結合する腫瘍細胞がリンパ管に取り込まれるのを妨げ、結果、リンパ節への悪性腫瘍の広がりを防止することにより転移を制御することが可能となる。
【０００４】
Ｃｌｅｖｅｒ−１は、リンパ内皮細胞、特定の血管内皮細胞において発現されるが、同時にマクロファージの亜集団においても発現される。マクロファージ上で、Ｃｌｅｖｅｒ−１は、スカベンジャー受容体として機能することが知られており、酸化−ＬＤＬなどの種々の分子のエンドサイトーシスによる取り込みを媒介することができる。
【０００５】
マクロファージは、伝統的に１型細胞と２型細胞に分類される。１型マクロファージは、古典的な炎症性マクロファージであり、大量の炎症性サイトカインおよび共刺激分子を産生し、そして皮序に効率的にＴ細胞応答を活性化する。対照的に、２型マクロファージは、免疫抑制細胞であり、抗−炎症性サイトカインを合成し、制御性Ｔ細胞を誘導し、したがって抗原駆動（antigen-driven）Ｔ細胞活性化を大いに抑制する。腫瘍関連マクロファージは、それらが腫瘍環境内で２型マクロファージに成熟し、抗−腫瘍免疫応答を抑制し（Martinez, F.O. et al. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. 13:453-461）、血管新生スイッチ、すなわちがん増殖における決定的な段階を媒介する（Lin, E.Y., and Pollard, J.W. 2007. Tumor-associated macrophages press the angiogenic switch in breast cancer. Cancer Res. 67:5064-5066）ので有害であるとみなされている。
【０００６】
妊娠は、胎児の抗原の半分は母親にとって異質である父方起源から来るので、免疫系への挑戦をもたらす。いくつかの免疫抑制機序が胎盤において作用して、母方の免疫系に対して半同種移植片として見なされ得る胎児の拒絶を防ぐ。その中でも最もよく知られた例は、非古典的ＭＨＣ分子の発現、ＮＫ−細胞活性の阻害、制御性Ｔ細胞（T regulatory cells）活性の誘導、Ｔ細胞アポトーシスの誘導および補体活性化の阻害である。抗原提示細胞活性の抑制は、寛容の誘導にも寄与することができる。抗原提示細胞のうち、マクロファージは胎盤に顕著に存在する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは今回、腫瘍、胎盤および妊娠している女性の血中においてもマクロファージの新しい亜型を同定した。この新しい細胞は、Ｃｌｅｖｅｒ−１受容体を発現もする２型マクロファージ細胞として定義することができる。本発明者らは、この細胞を「３型マクロファージ」と名付けた。この新しい「３型マクロファージ」は、２型マクロファージ同様、免疫抑制細胞である。この新しい細胞上のＣｌｅｖｅｒ−１受容体をモジュレート（中和または刺激それぞれ）することにより、本発明者らは驚くべきことに、これが個体における免疫系に影響を与える方法であることを見出した。この受容体の中和またはダウンレギュレーションは、悪性腫瘍の大きさおよび／または悪性腫瘍の増殖を減少させる。受容体の刺激またはアップレギュレーションは、胎児母体寛容の発生および妊娠合併症の予防に有用である。
【０００８】
したがって、１つの側面によれば、本発明はＣｌｅｖｅｒ−１受容体を含む２型マクロファージ細胞である単離細胞（３型マクロファージ）に関し、該細胞は、個体の腫瘍または胎盤由来、または妊娠している女性の血液由来である。
【０００９】
もう１つの側面によれば、本発明は、個体の免疫系に影響を与えるため、および免疫系の機能に関連した疾患または状態の治療のための方法に関し、該方法は、該個体における新規細胞（すなわち、「３型マクロファージ」）上のＣｌｅｖｅｒ−１受容体をモジュレートすることを含む。
【００１０】
第３の側面によれば、本発明は、抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１治療に反応し得るがん患者のスクリーニング方法に関し、該方法は、
ａ）該患者由来の腫瘍サンプル中のＣｌｅｖｅｒ−１タンパク質のレベルを検出または定量すること、
ｂ）その結果を対照と比較すること、および
ｃ）サンプル中のＣｌｅｖｅｒ−１タンパク質のレベルの増加を該治療への反応性に結び付けること
を含む。
【００１１】
第４の側面によれば、本発明は、妊娠している女性における妊娠合併症の診断方法、または妊娠している女性における該合併症のリスクを推定する方法に関し、該方法は、
ａ）該女性由来の組織または体液中のＣｌｅｖｅｒ−１タンパク質のレベルを検出または定量すること、
ｂ）その結果を対照と比較すること、および
ｃ）Ｃｌｅｖｅｒ−１タンパク質の欠如またはレベルの減少を妊娠合併症またはそのリスクに結び付けること
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１治療はメラノーマに有効である。Ｂ１６−Ｌｕｃメラノーマ細胞を耳の皮下に注射した。原発腫瘍の増殖および転移の進行をＩＶＩＳ化学発光検出システムにより追跡した。（Ａ）２つの治療群における１０および１４日後の原発腫瘍の相対的な大きさ（平均±ＳＥＭ）。（Ｂ）実験の最後（１４日目）における転移の相対的な大きさ（平均±ＳＥＭ）。対照治療群における原発腫瘍と転移の大きさを１．０と定義した。（Ｃ）抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１または対照抗体で治療した動物の例。白い矢印は注射部位（原発腫瘍）を指し、黄色い矢印は頸部転移を指す。１匹の抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１抗体治療マウスは、注射部位に検出可能な腫瘍をもたず、他のマウスは頸部転移が無いことに注目。両群においてＮ＝１２。
【図１Ｂ】抗体治療をＢ１６メラノーマ細胞の注射後３日に開始した（１４日目、両群においてｎ＝１２、および２０日目、両群においてｎ＝６）場合の原発腫瘍（Ａ）および転移（Ｂ）の発展を示す。
【図２】抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１治療は、腫瘍における２型マクロファージおよび制御性Ｔ細胞の数を減少させるが、血管系には影響を与えない。（Ａ）制御性Ｔ細胞の数。（Ｂ）２型マクロファージの数。（Ｃ）ＣＤ３陽性Ｔ細胞の数。（Ｄ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞の数。（Ｅ）ＣＤ３１陽性血管の数、および抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１治療マウスと対照抗体治療マウスでの、原発腫瘍および転移の抗−ＣＤ−３１抗体による免疫蛍光染色の例。（Ｆ）抗−ＭＥＣＡ−３２抗体で検出されたＰＶ−１陽性血管の数、および抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１治療マウスと対照抗体治療マウスでの、原発腫瘍および転移の抗−ＭＥＣＡ−３２抗体による免疫蛍光染色の例。ＨＰＦ（高倍率視野）。バーは１００μｍ。
【図３】腫瘍関連２型マクロファージは、Ｃｌｅｖｅｒ−１を発現するが、それらは免疫後リンパ節には見られない。（Ａ）抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１治療マウスおよび対照治療マウスのメラノーマ転移の免疫蛍光染色。抗−ＭＲ（緑）および抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１（赤）による二重染色。（Ｂ）ＯＶＡで免疫後の膝窩リンパ節におけるマクロファージの免疫組織化学染色。ＭＲ染色は緑、Ｃｌｅｖｅｒ−１染色は赤。（Ｃ）ＯＶＡ免疫後の同じ膝窩リンパ節のリンパ内皮の染色。ＭＲ染色は緑、Ｃｌｅｖｅｒ−１染色は赤。バーは（Ａ）および（Ｂ）は５０μｍ、（Ｃ）は１００μｍ。
【図４】抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１治療は、抗体応答を目立って損なうことはない。ウサギは、ＢＳＡ、加熱死菌腸炎菌（Salmonella enteritidis）および大腸菌（E. coli）ＬＰＳで免疫され、抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１または対照抗体のいずれかで治療された。抗体力価は最初の免疫後７および１１日目にＥＬＩＳＡを用いて測定した。破線は、非免疫動物（抗体は投与されている）における力価を示す。
【図５】抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１治療マウスは、通常ＯＶＡ免疫に応答する。（Ａ）記載された器官におけるリンパ球の数。（Ｂ）Ｂ細胞、ＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合。（Ｃ）制御性Ｔ細胞の割合。（Ｄ）ＯＶＡに対する増殖応答および抗体力価。
【図６】胎盤におけるＣｌｅｖｅｒ−１の発現。凍結切片胎盤を抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１抗体（３−３７２）、抗−ＣＤ１４（マクロファージマーカーとして）および陰性対照抗体、続いて適切な第二段階の試薬で染色した。
【図７】正常な妊娠期の血管単球におけるＣｌｅｖｅｒ−１の細胞表面発現。末梢血単核細胞を正常で妊娠していないボランティア、正常な妊娠している女性および中程度の子癇前症（pre-eclampsia）を患う妊娠している女性から単離した。単核細胞は、Ｆｉｃｏｌｌグラジエント遠心分離を用いて分離し、抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１および対照抗体（両方１０μｇ／ｍｌ）ならびにＦＩＴＣ−共役抗−マウスＩｇで染色した。細胞は、ＦＡＣＳを用いて分析した。分析された細胞集団（Ｒ２）は、前方および側方散乱を有する左パネルに示されている。ヒストグラムにおいて、蛍光強度は対数目盛でｘ軸であり、細胞の相対数がｙ軸である。右パネルに示される割合は、陰性対照抗体で染色された陽性細胞の割合（＝バックグラウンド）を差し引いて得ている。
【図８】インターロイキン−４およびデキサメタゾンは、胎盤マクロファージにおけるＣｌｅｖｅｒ−１発現を誘導する。分析された細胞（Ｒ２）の前方および側方散乱が、ＩＬ−４およびデキサメタゾン誘導なしとありで示される（２日間のインキュベーション）。ヒストグラムにおいて、蛍光強度は対数目盛でｘ軸であり、細胞の相対数がｙ軸である。右パネルに示される割合は、陰性対照抗体で染色された陽性細胞の割合（＝バックグラウンド）を差し引いて得ている。
【図９】Ｃｌｅｖｅｒ−１発現は、ｓｉＲＮＡ治療によりダウンレギュレーションさせることができる。Ｃｌｅｖｅｒ−１を標的化する、単一ｓｉＲＮＡ種およびプールしたｓｉＲＮＡでの治療が使用された。未治療および対照ｓｉＲＮＡによる治療は、比較として示される。分析された細胞（Ｒ２）の前方および側方散乱が、記載された治療の後、示される。ヒストグラムにおいて、蛍光強度は対数目盛でｘ軸であり、細胞の相対数がｙ軸である。右パネルに示される割合は、陰性対照抗体で染色された陽性細胞の割合（＝バックグラウンド）を差し引いて得ている。
【図１０】Ｃｌｅｖｅｒ−１／Ｓｔａｂｉｌｉｎ−１の発現は、メラノーマにおいて腫瘍血管上に誘導され、腫瘍浸潤性白血球および末梢血ＣＤ４陽性細胞に結合する。（Ａ）ビオチン化１．２６抗体によるＣｌｅｖｅｒ−１／Ｓｔａｂｉｌｉｎ−１（赤、左）および腫瘍血管を同定するＭＥＣＡ−３２抗体によるＰＶ−１（緑、中央）の二色染色。１．２６およびＭｅｃａ−３２による染色の重ね合わせは、右に示される。血管は、細い矢印で示され、２型マクロファージ（Ｃｌｅｖｅｒ−１／Ｓｔａｂｉｌｉｎ−１に陽性、赤）は太い矢印で示される。バーは１００μｍ。（Ｂ）血管陽性は、Ｃｌｅｖｅｒ−１／Ｓｔａｂｉｌｉｎ−１（Ｎ−末端３ｋｂ断片）に対する他のモノクローナル抗体（９−１１）でも確認された。陰性対照抗体による染色は、挿入図に示す。（Ｃ）血管上のＣｌｅｖｅｒ−１／Ｓｔａｂｉｌｉｎ−１は、腫瘍浸潤性白血球の結合を媒介する。インビボで抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１／Ｓｔａｂｉｌｉｎ−１（ｎ＝３）または対照抗体（ｎ＝３）で治療したマウスから得られたメラノーマにおいて、大きなおよび小さな腫瘍浸潤性白血球（ＴＩＬ）ならびにＣＤ４陽性細胞の血液から血管への結合は、エクソビボ凍結切片アッセイを用いて分析された。結果は、対照抗体で治療したマウスのメラノーマから得られた結合（１００％と定義）に対する平均％±ＳＥＭとして示される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義および好ましい態様：
用語「ＣＬＥＶＥＲ−１」は、国際公開第０３／０５７１３０号に開示されたタンパク質、共通リンパ内皮および血管内皮受容体−１（Common Lymphatic Endothelial and Vascular Endothelial Receptor-1）、すなわち全身血管系およびリンパ管の両方において、リンパ球（および悪性腫瘍細胞）の内皮への接着を媒介する結合タンパク質を示すために使用される。Ｃｌｅｖｅｒ−１のヌクレオチド配列（７８７９ｎｔ）およびアミノ酸配列は、配列番号：１に示す。Ｃｌｅｖｅｒ−１のヌクレオチド配列において、ジーンバンクエントリーＡＪ２７５２２１３（stabilin-1）と比較して、４つのヌクレオチド、すなわちヌクレオチド１１３１、２７６７、６６２９および６９６９が異なる。
【００１４】
用語「２型マクロファージ」は、マンノース受容体を発現する免疫抑制マクロファージとして理解されるものとする。
【００１５】
用語「３型マクロファージ」は、マンノース受容体に加えてＣｌｅｖｅｒ−１受容体も発現する２型マクロファージの亜集団として理解されるものとする。３型マクロファージ細胞上のＣｌｅｖｅｒ−１受容体は、全配列（配列番号：１）、そのわずかに改変された配列（Ｓｔａｂｉｌｉｎ−１など）またはそれらの断片のいずれかであることができる。
【００１６】
用語「治療」または「治療する」は、疾患または障害の完全な治癒ならびに該疾患または障害の改善または軽減を含むと理解されるものとする。
【００１７】
用語「予防」は、完全な予防（prevention）、防御（prophylaxis）、ならびに該疾患または障害で病に倒れる個体のリスクを低下させることを含むと理解されるものとする。
【００１８】
用語「個体」は、ヒトまたは動物対象を意味する。
【００１９】
用語「有効量」は、特に、動物またはヒト対象に投与した際に、所望の治療結果をもたらすのに充分な、本発明による薬剤の任意の量を含むことを意味する。
【００２０】
用語「阻害する」または「阻害」は、完全な阻害のみならず、任意の程度の抑制も含むと理解されるものとする。
【００２１】
１つの実施態様において、３型マクロファージ細胞上のＣｌｅｖｅｒ−１受容体のモジュレーティングにより個体の免疫系に影響を与える方法は、個体における悪性腫瘍のサイズおよび／または悪性腫瘍の増殖を減少させるために使用することができる。この実施態様において、Ｃｌｅｖｅｒ−１タンパク質の影響を中和することができるかまたは発現をダウンレギュレートすることができる薬剤の有効量が個体に投与される。
【００２２】
別の実施態様において、３型マクロファージ細胞上のＣｌｅｖｅｒ−１受容体のモジュレーティングにより個体の免疫系に影響を与える方法は、妊娠している女性における母体胎児寛容を維持するため、および／または妊娠している女性における妊娠合併症を予防するために使用することができる。この態様において、妊娠している女性へは、
ｉ）Ｃｌｅｖｅｒ−１タンパク質の発現をアップレギュレートするかまたは該タンパク質を刺激する薬剤の有効量、または
ii）インビトロ培養３型マクロファージ細胞
のいずれかで投与される。
【００２３】
好ましい薬剤
用語「Ｃｌｅｖｅｒ−１の影響を中和することができる薬剤」は、Ｃｌｅｖｅｒ−１タンパク質をブロックすることができるペプチドまたはタンパク質（可溶性Ｃｌｅｖｅｒ−１またはＣｌｅｖｅｒ−１アンタゴニスト抗体）、ならびにタンパク質活性を阻害するために有用な任意の阻害剤、特に低分子阻害剤を含むと理解されるものとする。好ましくは、有用な薬剤は抗体である。
【００２４】
用語「Ｃｌｅｖｅｒ−１の発現をダウンレギュレートすることができる薬剤」は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ならびにリボザイム、またはインビボにおいてそれらもしくはそれらの必須部分を発現することができるベクターを含むと理解されるものとする。
【００２５】
用語「抗体」は、それらが所望の生物学的活性を発揮する限りにおいて広義で使用され、具体的には単一モノクローナル抗体（アゴニスト抗体およびアンタゴニスト抗体を含む）、ポリクローナル抗体、ならびに抗体断片および一本鎖抗体（たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）2、Ｆｖ）を包含する。抗体のパパイン分解は、それぞれ単一抗原結合部位を有するＦａｂ断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、および残りの「Ｆｃ」断片（この名前は、容易に結晶化するその能力を反映している）を産生する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、なお抗原を架橋できるＦ（ａｂ'）2断片を生じる。一本鎖「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインとの堅い非共有結合性結合による二量体からなる。この構造において、各可変ドメインの３つのＣＤＲｓは、ＶH−ＶL二量体の表面上の抗原結合部位を定義するために相互作用する。まとめると、６つのＣＤＲｓが抗体に特異的に結合する抗原を与える。しかしながら、単一可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲｓのみを含むＦｖの半分）でさえ、完全な結合部位よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識し結合する能力を有する（Ladner et al., 米国特許第４，９４６，７７８号明細書およびBird, R.E. et al., Science, 242:423-426 (1988)参照）。
【００２６】
用語「抗体」は、異なる種由来の部分を含む、キメラ、ヒト化または霊長類化（primatized）（ＣＤＲ−移植）抗体、ならびにキメラまたはＣＤＲ−移植一本鎖抗体などを含むと理解されるものとする。「キメラ」抗体（イムノグロブリン）は、それらが、所望の生物学的な活性を発揮する限り、特定の種由来の抗体または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同な、重鎖および／または軽鎖の部分を含み、一方、鎖の残りは、もう１つの種由来の抗体またはもう１つの抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、ならびにそれらの抗体の断片における対応する配列と同一または相同である（Cabilly et al.,米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)）。これらの抗体の様々な部分は、従来の技術により化学的に一緒に結合することができ、また遺伝子工学技術を用いて連続したタンパク質として製造することができる。たとえば、キメラまたはヒト化した鎖をコードする核酸は、連続したタンパク質として産生させるために発現させることができる（たとえば、Cabilly et al.,米国特許第４，８１６，５６７号明細書参照；霊長類化抗体についてはNewman, R. et al., BioTechnology 10: 1455-1460(1992)も参照）。
【００２７】
特に好ましいＣｌｅｖｅｒ−１アンタゴニスト抗体は、モノクローナル抗体３−２６６（ＤＳＭ  ＡＣＣ２５１９）および３−３７２（ＤＳＭ  ＡＣＣ２５９０）であり、両方とも、２００１年８月２１日に特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブタペスト条約のもとＤＳＭＺ−ドイチェ・ザンルング・フォン・ミクロオルガニズメン・ウント・ツェルクルツレン・ゲーエムベーハー、デー−３８１２４  ブラウンシュヴァイク  マシェロデル  ヴェク  １ベー（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig）に寄託されている（国際公開第０３／０５７１３０号）。
【００２８】
ヒト個体の治療については、前記モノクローナル抗体のヒト化またはキメラまたは霊長類化変異体が好ましい。
【００２９】
好ましい阻害剤は低分子阻害剤である。
【００３０】
好ましくは、Ｃｌｅｖｅｒ−１の発現をダウンレギュレーションすることができる薬剤は、低分子干渉ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡ）、または該ｓｉＲＮＡ二本鎖または該二本鎖のアンチセンス鎖を、哺乳類細胞内でそのｓｉＲＮＡ二本鎖またはアンチセンス鎖の発現を可能とするような方法でコードする核酸を含む発現ベクターである。他のタンパク質、ＶＡＰ−１に対するそのようなｓｉＲＮＡ二本鎖が国際公開第２００６／１３４２０３号に記載されている。
【００３１】
ｓｉＲＮＡの原理は、文献に広く示されている。例としては、米国特許出願公開第２００３／０１４３７３２、２００３／０１４８５０７、２００３／０１７５９５０、２００３／０１９０６３５、２００４／００１９００１、２００５／０００８６１７および２００５／００４３２６６号明細書が挙げられる。ｓｉＲＮＡ二本鎖分子は、アンチセンス鎖とセンス鎖とを含み、該アンチセンス鎖は、あるタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列における標的領域に相補的な配列を含み、センス鎖は、該アンチセンス鎖に相補的な配列を含む。したがって、ｓｉＲＮＡ二本鎖分子は、２つの核酸断片から組み立てられており、１つの断片がアンチセンス鎖を含み、第２の断片が該ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖を含む。センス鎖とアンチセンス鎖は、リンカー分子を介して共通結合で結合することができ、該リンカー分子は、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーであり得る。アンチセンスおよびセンス鎖の長さは、典型的にはそれぞれ約１９から２１ヌクレオチドである。典型的には、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、両方とも数個の、典型的には２ヌクレオチドの３'−末端突出部を含む。アンチセンスの５'−末端は、典型的にはリン酸基（Ｐ）である。末端リン酸基（Ｐ）を有するｓｉＲＮＡ二本鎖は、一本鎖アンチセンスよりも細胞中に投与することが容易である。細胞において、活性なｓｉＲＮＡアンチセンス鎖が形成され、それが標的ｍＲＮＡの標的領域を認識する。これは、順に、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体（ＲＩＳＣ＝ＲＮＡ−誘導サイレンシング複合体）による標的ＲＮＡの切断を誘導し、そしてＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）によるさらなるＲＮＡの合成においては、ＤＩＣＥＲを活性化でき、結果としてさらなるｓｉＲＮＡ二本鎖分子を生じ、それにより応答が増幅される。
【００３２】
用語「相補的」は、ワトソン−クリック相互作用または他の塩基対相互作用によりヌクレオチド配列が標的ＲＮＡ配列と水素結合を形成できるということを意味する。この用語は、１００％相補的でない配列をも包含すると理解されるものとする。また、低い相補性も機能し得ると確信する。しかしながら、１００％相補性が好ましい。
【００３３】
ｓｉＲＮＡは、医薬品として使用される場合、標的細胞に導入されるものとする。送達は、２つの原理的に異なる方法：１）オリゴヌクレオチドの外因的な送達、または２）オリゴヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列の内因性転写により達成することができ、この場合ＤＮＡ配列はベクター内に位置する。
【００３４】
正常な未修飾ＲＮＡは、生細胞に存在するリボヌクレアーゼ酵素によるその分解により生理的条件下で安定性が低い。仮にオリゴヌクレオチドが外因的に投与されるとすると、化学的および酵素的分解に対するその安定性を増強するために既知の方法により分子を修飾することが非常に望ましい。
【００３５】
インビボで外因的に投与される予定のヌクレオチドの修飾は、広く本技術分野において説明されている。主に、ヌクレオチドの任意の部分、すなわちリボース糖、塩基および／またはヌクレオチド間リン酸ジエステル鎖を修飾することができる。前記修飾は、非限定的な例であることを強調しておく。
【００３６】
有用な標的領域は、科学者を支援して利用可能なｓｉＲＮＡ配列を探すために開発された数多くの学術的または商業的に提供されているアルゴリズムのいずれかを用いて容易に同定することができる。そのようなソフトウェアシステムの例として、ｓｉＤｉｒｅｃｔ（http://design.RNAi.jp/）（Nucleic Acids Res. 2004 Jul 1;32: W124-9）；ＴＲＯＤ（T7 RNAi Oligo Designer）（http://www.cellbio.unige.ch/RNAi.html; Nucleic Acids Res. 2004 Jul 1;32: W121-3）；ＤＥＱＯＲ（http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html; Nucleic Acids Res. 2004 Jul 1;32: W113-20）またはhttp://www.genscript.com; http://www.genscript.com/rnai.html#designまたはhttp://www.genscript.com/sirna_ca.html#design; Bioinformatics 2004 Jul 22;20(11)1818-20で利用可能なプログラムが挙げられる。ツールの欠くことのできない基準は、的外れの遺伝子サイレンシングが回避され、哺乳類ＲＮＡ干渉に関して最大の標的特異性を有するｓｉＲＮＡ：ｓに到達することである。そのようなアルゴリズムにより同定された任意の配列の有用性は、その後実験により検証されるものとする。
【００３７】
Ｃｌｅｖｅｒ−１タンパク質を刺激するための好ましい薬剤は、たとえば、アゴニスト抗体および低分子アゴニストである。「アゴニスト抗体」とは、Ｃｌｅｖｅｒ−１に結合し、他の組織の接着を促すことができる抗体を意味する。
【００３８】
好ましい低分子アゴニストは、抗炎症剤、特にインターロイキン−４、インターロイキン−１３などのインターロイキン、デキサメタゾンなどのステロイド系ホルモン、またはそれらの組合せなどの免疫抑制剤である。
【００３９】
妊娠している女性における母体胎児寛容を維持するおよび／または妊娠合併症を予防するためには、インビトロにて培養された３型マクロファージの投与も可能である。
【００４０】
治療に反応する疾患
本発明による悪性腫瘍のサイズおよび／または悪性腫瘍の増殖を減少させることによりがんを治療または予防する方法は、全ての形態のがんに適用できる。したがって、皮膚がんおよび結腸がんなどの、任意の良性もしくは悪性腫瘍または悪性腫瘍の転移が治療できる。また、白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫も治療できる。特に、メラノーマおよびリンパ腫がこの治療に良く応答する。
【００４１】
本発明者らは、本発明による方法が、全ての種類の肉腫、例えば線維肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫、中皮腫、髄膜腫、白血病、リンパ腫、ならびに扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、乳頭癌、嚢胞腺癌、気管支癌、メラノーマ、腎細胞癌、肝細胞癌、移行細胞癌、絨毛癌、セミノーマおよび胎児性癌などの全ての種類の癌腫の治療または予防に有用であると確信している。
【００４２】
Ｃｌｅｖｅｒ−１の刺激により、妊娠している女性における母体胎児寛容を維持することおよび／または妊娠合併症を予防することが可能である。治療できる妊娠合併症は、特に、自然流産のリスクおよび子癇前症である。
【００４３】
投与経路、製剤化および必要用量
本発明において使用される医薬組成物は、その意図する目的を達成する任意の手段により投与することができる。たとえば、投与は、非経口、皮下、静脈内、関節内、髄腔内、筋肉内、腹腔内もしくは皮内注射、または経皮、口腔内、経眼経路または吸入によってなされ得る。あるいは、経口投与も可能である。低分子阻害剤について特に好ましいのは経口投与である。薬学的に活性な化合物に加えて、その化合物の医薬製剤は、好ましくは、薬学的に使用することができる製剤への活性化合物の処理を容易にする賦形剤および助剤を含む適切で薬学的に許容され得る担体を含有する。
【００４４】
悪性腫瘍の大きさを減少させるおよび／または悪性腫瘍の増殖を減少させるためには、腫瘍内投与が有用であろう。
【００４５】
母体胎児寛容の維持および／または妊娠している女性における妊娠合併症の予防のためには、有効な薬剤の胎盤内投与も有用であろう。
【００４６】
本発明において使用するためのｓｉＲＮＡ二本鎖は、様々な方法により個体に投与することができる。ある方法によれば、ｓｉＲＮＡはそのまま、またはリポソーム、コレステロール、リトコール酸、ラウリン酸、陽イオン性脂質、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体とのそのコンジュゲートなどである適切な担体と混合した医薬組成物の形態で外因的に投与してもよい。しかしながら、他の担体も使用できる。ｓｉＲＮＡは全身的にまたは局所的に投与することができる。好適な投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮下注射、吸入、経口、局所、眼、舌下、鼻腔内、直腸、腹腔内デリバリーおよび経皮デリバリーシステムが挙げられる。ｓｉＲＮＡを含む組成物は、直接注射を用いる代わりに、たとえばカテーテル、注入ポンプまたはステントの使用により投与することもできる。
【００４７】
細胞におけるｓｉＲＮＡの高濃度を達成するための他の方法は、ｓｉＲＮＡ−コード配列を発現ベクターに組み込み、そのようなベクターを個体に投与することである。この適用において、発現ベクターは、ｓｉＲＮＡ二本鎖またはそのアンチセンス鎖のみのいずれかが、たとえば短ヘアピンＲＮＡの形態で発現されるように構築することができる。発現ベクターは、真核細胞で発現可能なＤＮＡプラスミドなどのＤＮＡ配列、またはウイルスベクターであってよい。そのようなウイルスベクターは、好ましくはアデノウイルス、アルファウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはレトロウイルスにもとづく。好ましくは、ベクターは、前述したｓｉＲＮＡと同様の方法で患者に送達される。発現ベクターの送達は、静脈内、筋肉内、腹腔内投与などの全身性送達、または患者から外植された標的組織または細胞への局所送達とそれに続く患者への再導入によりなされる。ｓｉＲＮＡの静脈内投与は、優先的に肝臓血管を標的とするので（Lewis DL and Wolff JA, Methods Enzymol. 2005;392:336-50; Soutschek J et al., Nature. 2004 Nov. 11;432(7014):173-8;およびSong E et al., Nat Med. 2003 Mar;9(3):347-51）、肝臓疾患は本発明の特に適切な標的である。特に、リポソームに埋め込まれたｓｉＲＮＡ：ｓは、肝臓組織を標的とするために非常に有用であると報告されている。毒性の副作用は報告されていない。
【００４８】
したがって、典型的な用量は、体重に対し、約０．１μｇ／ｋｇから約３００ｍｇ／ｋｇの投与量範囲、好ましくは１．０μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇのあいだである。本発明に使用される化合物は、１日１回で投与されてもよく、または１日の総投与量が１日に２回、３回または４回の分割用量で投与されても良い。ｓｉＲＮＡが使用される場合、典型的な日用量は、体重に対し、約１ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇの投与量範囲、好ましくは約５ｍｇ／ｋｇである。適切な投与頻度は、１日１回〜２回であると考える。ＲＮＡｉが発現ベクターにより送達される場合、単回投与（または特定の間隔での単回投与の繰り返し、たとえば１週間に１回）で充分であると考える。
【００４９】
診断方法
Ｃｌｅｖｅｒ−１の検出または定量方法は、組織または体液におけるＣｌｅｖｅｒ−１タンパク質のレベルを、
ｉ）ＲＴ−ＰＣＲまたはハイブリダイゼーション技術により該組織または体液からＣｌｅｖｅｒ−１ｍＲＮＡ発現を測定すること、または
ii）Ｃｌｅｖｅｒ−１タンパク質を含むことが予測される該組織または体液を、Ｃｌｅｖｅｒ−１を認識する結合剤（抗体、アフィボディ（affibody）またはアプタマー）に付し、そして該結合剤を検出および／または定量するか、または組織または体液をプロテオミクス技術による分析に付すこと
により検出または定量することにもとづくことができる。
【００５０】
ハイブリダイゼーション技術は、たとえば、ＤＮＡハイブリダイゼーションおよびノーザンブロットを含む。抗体または他の結合剤の検出または定量は、標準的な免疫アッセイプロトコール、たとえば標識−結合免疫吸着剤アッセイ、ウエスタンブロットおよび免疫組織化学法などにしたがって行なうことができる。本発明は、以下の非限定的な実施例の項目により説明されるであろう。
【実施例】
【００５１】
材料および方法
動物
Ｂａｌｂ／ＣおよびＣ５７Ｂ１６マウス（６〜９週齢）およびニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）ウサギをインビボ実験に使用した。地方倫理委員会は本研究に使用される実験手法を承認した。
【００５２】
腫瘍細胞株
ＫＣＡ、ヒトリンパ芽球様細胞株はE. Engleman（スタンフォード大学、ＣＡ）から提供された。ルシフェラーゼ構築物を含むＢ１６−Ｆ１０−ｌｕｃ−Ｇ５メラノーマ細胞株は、キセノゲン（Xenogen）社（アラメダ、ＣＡ）から購入した。腫瘍細胞は、ＲＰＭＩ  １６４０（ＫＣＡ）、および１０％ＦＢＳ（インビトロジェン、ギブコ）、非必須アミノ酸（バイオロジカル・インダストリー、Haemek、イスラエル）、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｂ１０  ホイッテカー（whittaker）、ウォーカーズビル（Walkersville）、ＭＤ）、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン、ギブコ）およびＭＥＭビタミン溶液（インビトロジェン、ギブコ、ペイズリー（Paisley）、英国）を補足したＭＥＭ／ＨＢＳＳ（Ｂ１６メラノーマ）（ハイクローン（HyClone）、ローガン（Logan）、ユタ）で培養した。
【００５３】
ウサギにおけるリンパ管を介した腫瘍細胞遊走
ウサギに３−３７２（抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１、ｎ＝８）または対照抗体（ｎ＝９）を２ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．でリンパ腫細胞移植の前日および当日に投与した。加えて、抗体０．５ｍｇを、足蹠に皮下投与するＣＦＳＥ−標識ＫＣＡリンパ腫細胞懸濁液に添加した。細胞移植から２４時間後、膝窩リンパ節を採取し、細胞懸濁液をフローサイトメトリーにより分析した。
【００５４】
リンパ管転移モデル
ＲＰＭＩ  １６４０（ギブコ）３０μｌ中の４００，０００細胞の投与量でＢ１６−Ｆ１０−ｌｕｃ−Ｇ５メラノーマ細胞を、マウスの左耳に皮下注射した。接種された腫瘍は、皮膚を貫いた黒い小塊として観察できる。腫瘍の増殖はルシフェラーゼ生物発光（Marttila-Ichihara, F. et al., Blood 112:64-72）により１週間に２回測定した。簡単に説明すると、２．５％イソフルラン（ベクトン・デッキンソン社）で麻酔した。基質のＤ−ルシフェリンナトリウム塩（シンケム（Synchem）社、カッセル、ドイツ）１５０ｍｇ／ｋｇをイメージングの１０分前にマウスの腹腔内に注射した。白黒画像を黒色チャンバーにおいて冷却（−７０℃）ＣＣＤカメラ（ＩＶＩＳ；キセノゲン、アラメダ、ＣＡ）で撮影した。信号の強度はリビングイメージ（Living Image）ソフトウェア（キセノゲン社）を使用して光子カウントとして定量した。腫瘍の注射前日、１２匹のＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスを抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１（Schledzewski, K. et al., J. Pathol. 209:67-77）抗体で、同じ数のマウスをＮＳ−１対照抗体で、耳に５０μｇの用量で抗体の皮下注射により治療した。腹腔内抗体投与は、１００μｇの用量で、腫瘍注射の翌日開始し、３日毎に繰り返した。マウスは１４日目に犠牲死させた。
【００５５】
免疫組織化学
マウスの耳および末梢リンパ節転移のアセトン固定凍結切片を、マクロファージマンノース受容体に対するラットｍＡｂ（ＭＲ、ＭＲ５Ｄ３、２型マクロファージのマーカー、L.Martinez-Pomaresから提供）、ＰＶ−１抗原に対するラットｍＡｂ（血管抗原、ＭＥＣＡ−３２、カリフォルニア州、スタンフォード大学のE. Butcherから提供）、ＣＤ３１に対するラットｍＡｂ（血管およびリンパ管のマーカー；ＢＤ社、ファーミンゲン）、ＣＤ３（ＢＤ社、ファーミンゲン）、ＣＤ８に対するラットｍＡｂ（カルタグ（Caltag）社）、または陰性対照ｍＡｂ（ヒトＣＤ４４に対するＨｅｒｍｅｓ−１）で染色した。５％正常マウス血清を含むＰＢＳに希釈されたＦＩＴＣ−共役抗−ラットＩｇ（シグマ社）を第２段階抗体として使用した。腫瘍組織、転移およびリンパ節切片はまた、ビオチン化抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１を用いて、続いてストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６を用いて染色した。Ｆｏｘｐ３発現について、凍結切片を２％パラホルムアルデヒドで固定し、抗−Ｆｏｘｐ３（イーバイオサイエンス（eBioscience）社）で、続いてペルオキシダーゼ−共役ウサギ抗−ラットＩｇ（ダコ社、デンマーク）で染色した。０．０３％過酸化水素含有ＰＢＳ中の３，３'−デアミノベンジジン塩酸塩を発色原として使用し、切片をヘマトキシリンで対比染色した。切片をオリンパスＢＸ６０顕微鏡およびcell＾Ｄバージョン２．６ソフトウェア（ソフト・イメージング・ソリューションズ社（Soft Imaging Solutions GmbH）を用いて分析した。ＳＰＡＲＣ染色は、イメージＪソフトウェア（Image J software）を用いて分析した。
【００５６】
免疫
ウサギは、加熱死菌腸炎菌（Salmonella enteritidis）、大腸菌（E. coli）ＬＰＳ（１０ｍｇ）およびウシ血清アルブミン（１ｍｇ）を含むカクテル（容量：２００μｌ）で足蹠に免疫した。同時にウサギは、抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１抗体（３−３７２、ｎ＝５）またはクラス適合陰性対照抗体（ＮＳ−１、ｎ＝５）２ｍｇ／ｋｇのいずれかで治療された。非免疫ウサギを対照として用いた。抗体治療は、２、４、７および９日目に繰り返した。免疫は７日目に繰り返した。血清試料は７および１１日目に採取し、抗体力価をＥＬＩＳＡにより分析した。簡単に説明すると、ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ、ロスキレ（Roskilde）、デンマーク）を事前検査された濃度の大腸菌ＬＰＳ（ディフコ  ラボラトリーズ社、デトロイト、ＵＳＡ）、加熱死菌腸炎菌およびＢＳＡのＳＤＳ抽出物（Ｖ画分、ＩＣＮ  バイオメディカル社、オハイオ、ＵＳＡ）で被覆した。血清でインキュベーションした後、ウェル中のＩｇＭおよびＩｇＧ抗体を、アルカリホスファターゼ−共役抗−ウサギＩｇＭ（サザン・バイオテクノロジー・アソシエイト（Southern Biotechnology Associates）、バーミングハム、ＡＬ、ＵＳＡ）および抗−ウサギＩｇＧ（ダコ・パット（Dako Patts）Ａ／Ｓ、コペンハーゲン、デンマーク）で検出した。吸光度は、ビクター多重標識計測器（Victor multilabel counter）（ワラック、ツルク、フィンランド）を用いて波長４０５ｎｍで検出した。
【００５７】
マウスは、不完全フロイントアジュバント中の５０μｇオボアルブミン（ＯＶＡ、等級Ｖ；シグマ、セントルイス、ＭＯ）の皮下注射で足蹠に免疫した。免疫は、３回繰り返した（０、７および１４日目）。マウスは最初の免疫の１時間前に、抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１または対照抗体（ＮＳ−１）（５０μｇ／マウス、ｎ＝６＋６）の皮下注射で治療し、そして１週間に３回腹腔内（１００μｇ／マウス）で治療した。マウスは１７日目に犠牲死させ、膝窩リンパ節、鼠径リンパ節および脾臓を採取し、細胞をフローサイトメトリー分析および増殖アッセイのために単離した。脾臓をホモジナイズし、赤色細胞は低張食塩水を用いて溶解した。Ｔ細胞（０．２×１０6）を、丸底９６ウェルプレートにおいてＯＶＡの濃度を増加させながら（０〜２ｍｇ／ｍｌ）共培養した。共培養物をＨＥＣ−培地において３日間インキュベートし、最後の６時間に3Ｈ−チミジン（１μＣｉ［０．０３７ＭＢｑ］／ウェル）を与えた。細胞は、半−自動プレートハーベスター（Tomtech MACH III；フィッシャー・サイエンティフィック（Fisher Scientific）社、ハンプトン、ＮＨ）を用いて収穫し、１４５０Micobeta計測器（ワラック社）を用いて計測された。ＯＶＡに対する抗体力価を記載されたように（Stolen, C.M. et al., Immunity 22:105-115）ＥＬＩＳＡにより測定した。表現型分析は、上に説明したように行なった。さらに、ＦｏｘＰ３陽性制御性Ｔ細胞は、製造業者の取扱説明書にしたがって、eBioscienceから入手したキットを用いて検出した。
【００５８】
結果
Ｃｌｅｖｅｒ−１治療では、原発腫瘍およびメラノーマの転移のいずれも小さく留まる。
Ｃｌｅｖｅｒ−１標的化が腫瘍の進行に有益な効果を有するかどうか研究するために、本発明者らはマウスにおけるＢ１６メラノーマモデルを使用した。耳の原発腫瘍と首の流入領域リンパ節における転移は共に、抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１抗体で治療した場合、対照治療動物と比較して、わずか約３０％のサイズであった（図１Ａ、Ａ−Ｃ）。臨床応用では、治療は悪性増殖が診断された後に開始されるので、本発明者らは、臨床状況をより良く模倣する実験も行なった。これらの実験において、本発明者らは、抗体治療を開始する前に３日間腫瘍を増殖させ、腫瘍細胞注射後、１４または２０日目のいずれかに実験を完了した。これらの実験の設計においても、抗体治療は２０日目で原発腫瘍および転移において統計学的に有意な減少を有効に導いた（図１Ｂ、ＡおよびＢ）。
【００５９】
抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１治療は、２型マクロファージおよび制御性Ｔ細胞の数を減少させるが、抗血管形成性ではない。
輸入リンパ管を介した流入領域リンパ節へのメラノーマ細胞遊走の阻害は、抗体治療に続く転移の大きさの減少を説明できた。しかしながら、原発腫瘍のサイズが小さいことについては説明できない。したがって、本発明者らは腫瘍の浸潤白血球の種々の亜集団や脈管の数を分析した。腫瘍浸潤白血球の数は、抗−腫瘍免疫応答の効果を反映し、脈管の数は、腫瘍の増殖を制御する血管形成活性を反映する（Dirkx, A.E. et al., J. Leukoc. Biol. 80:1183-1196）。後者の態様は、Ｃｌｅｖｅｒ−１がインビトロで血管形成に寄与することが報告されているので、Ｃｌｅｖｅｒ−１自身に関しても関わりがあるものである（Adachi, H.およびTsujimoto, M. 2002. J. Biol. Chem. 277:34264-34270）。２型マクロファージおよび制御性Ｔ細胞の数は、原発腫瘍および転移の両方で非常に減少した（図２Ａおよび２Ｂ）。この減少は、ＣＤ３およびＣＤ８陽性細胞の数として選択した場合、両治療群において匹敵していた（図２Ｃおよび２Ｄ）。血管およびリンパ管（ＣＤ３１および／またはＰＶ−１陽性）の数およびそれらの密度は、抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１治療および対照抗体治療の後で同じであった（図２Ｅおよび２Ｆ）。したがって、制御性免疫型細胞の数は、Ｃｌｅｖｅｒ−１治療後減少するが、血管およびリンパ管は両方インタクトなままのようである。
【００６０】
メラノーマにおける２型マクロファージは、Ｃｌｅｖｅｒ−１陽性であり、かつ抗体治療は完全にそれらを取り除くことができない。
抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１治療に続く２型マクロファージの数の減少に対する可能性のある説明は、その治療が、補体介在の致死によりＣｌｅｖｅｒ−１陽性マクロファージを殺すということである。しかしながら、抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１治療腫瘍では２型マクロファージの５０．３±１６．９％が、そして対照抗体治療腫瘍では６５．９±１６．７％が原発腫瘍においてＣｌｅｖｅｒ−１陽性であるため（図３Ａ）これは当てはまらないが、それらの絶対数は抗体治療により非常に減少する（図２Ｂ）。この状況において、しかしＣｌｅｖｅｒ−１陽性マクロファージは抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１治療後は対照治療後よりも小さくかつ弱いということに留意すべきである。
【００６１】
抗体治療は正常な免疫応答を有意には害するものではない。
Ｃｌｅｖｅｒ−１の封鎖は、リンパ球および腫瘍細胞の流入領域リンパ節への遊走を阻止するので、正常な免疫応答にも影響を与える可能性がある。本発明者らは、この可能性をウサギおよびマウスモデルの両方で検討した。ウサギは、抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１または対照抗体のいずれかで治療し、ＢＳＡ、加熱死菌腸炎菌および大腸菌ＬＰＳで足蹠に免疫した（図４）。統計学的有意差は、ＩｇＭおよびＩｇＧクラスの抗体応答において検出されなかった。ただ１つの例外は、抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１抗体で治療したウサギにおける、ＢＳＡの７日目および加熱死菌腸炎菌の１１日目でのＩｇＭ応答のわずかな減少であった。マウスはＯＶＡで足蹠に免疫した。両治療群のリンパ節および脾臓におけるリンパ球の絶対数と種々の亜集団の割合（パーセント）とは、ＯＶＡ−特異的ＴおよびＢ細胞応答（図５Ｄ）と匹敵する（図５Ａ−Ｃ）。メラノーマ内のＭＲ陽性２型マクロファージと対照的に、ＭＲ陽性マクロファージは、正常および免疫したマウスの膝窩リンパ節において、Ｃｌｅｖｅｒ−１陰性であったが、一方リンパ内皮はＣｌｅｖｅｒ−１陽性であった（図３Ｂおよび３Ｃ）。リンパ節内のＭＲ陽性マクロファージも、腫瘍においてよりも顕著に小さく、腫瘍内のＭＲ+／Ｃｌｅｖｅｒ−１+マクロファージが特有の亜型であることを示唆している。
【００６２】
腫瘍における２型マクロファージの数の減少の背後の機序を見出すために、本発明者らは、それらの入り口またはそれらの前駆体が抗体治療の間阻害されるかどうか調べた。まず、本発明者らは、腫瘍血管上のＣｌｅｖｅｒ−１／Ｓｔａｂｌｉｎ−１発現を分析した。腫瘍内の主な血管は、広く開口した内腔を有して拡大しており、Ｃｌｅｖｅｒ−１／Ｓｔａｂｉｌｉｎ−１を発現する正常な平らな壁面の血管とは異なる。この発現は、Ｃｌｅｖｅｒ−１／Ｓｔａｂｉｌｉｎ−１に対する２つの異なる抗体を用いて確認した（図１０、ＡおよびＢ）。つぎに、本発明者らは、抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１／Ｓｔａｂｉｌｉｎ−１および対照抗体治療動物の両方から腫瘍を採取し、腫瘍浸潤白血球と末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞のエクソビボでのそれらの腫瘍中の血管に対する結合を調べた。マクロファージと骨髄性細胞からなる腫瘍浸潤大白血球および腫瘍浸潤小リンパ球は共にＣｌｅｖｅｒ−１／Ｓｔａｂｉｌｉｎ−１治療動物の腫瘍血管にはほとんど結合しなかった。ＣＤ４陽性血管リンパ球の接着も減少した（図１０Ｃ）。これらの知見は、Ｃｌｅｖｅｒ−１ブロック治療は、単球／マクロファージおよびリンパ球が腫瘍の血管系へ結合するのを妨げるということを示す。結果として、３型マクロファージの発達（development）は減少される。Ｃｌｅｖｅｒ−１ブロックなしで、血流から流入する単球起源の３型マクロファージは、発達し、腫瘍組織において区別されるであろう。
【００６３】
母体胎児寛容：
胎盤中のＣｌｅｖｅｒ−１の発現
正常な胎盤（満期）がＣｌｅｖｅｒ−１について免疫組織化学的に染色される場合、多くの明るい陽性白血球が見られる（図６）。多色性ＦＡＣＳ分析は、さらに胎盤のＮＫ細胞がＣｌｅｖｅｒ−１陰性であり、一方ほとんどのＣＤ１４陽性マクロファージは、Ｃｌｅｖｅｒ−１を発現したということを示している（データは示さず）。
【００６４】
血中でのＣｌｅｖｅｒ−１の発現
試験した健常な個体における血中単核白血球の表面上にはＣｌｅｖｅｒ−１はほとんど存在しないか、または発現が非常に低い（図７）。対照的に、妊娠している女性では明らかに検出可能なレベルのＣｌｅｖｅｒ−１を血中単球の表面に有する。Ｃｌｅｖｅｒ−１は、妊娠の全試験時点で見出された（１２〜３８週）。興味深いことに、中程度の子癇前症を患う個体は、単球表面にＣｌｅｖｅｒ−１を検出できなかった（図７）。
【００６５】
Ｃｌｅｖｅｒ−１の発現は、インターロイキン−４およびデキサメタゾンによりアップレギュレートでき、ｓｉＲＮＡにより阻害できる
胎盤単球をインターロイキン−４およびデキサメタゾンと２日間インキュベーションすると、Ｃｌｅｖｅｒ−１陽性マクロファージの割合が増加する（図８）。対照的に、その発現は、Ｃｌｅｖｅｒ−１特異的ｓｉＲＮＡで阻害することができるが、対照ｓｉＲＮＡでは阻害することはできない（図９）。
【００６６】
抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１抗体はマウスにおける正常妊娠を干渉する
マウスを機能ブロック抗−マウスＣｌｅｖｅｒ−１抗体またはアイソタイプ適合対照抗体で妊娠の１日目から開始して治療した。治療は出産まで３日毎に静脈内に（１００μｇ  ｍＡｂ／注射）投与した。マウスが誕生すると、同腹子の数（litter-size）は、抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１抗体で治療したマウスにおいて対照と比較して少なかった（対照において１９匹（pups）、抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１治療マウスにおいて１０匹（pups）、両群ｎ＝３母体）。
【００６７】
議論
抗腫瘍効果：
本発明者らの研究により、抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１抗体治療が、腫瘍に存在する抑制性マクロファージの固有のサブセットを標的とし、制御性Ｔ細胞の数を減少させるということが示される。重要なことには、この抗体治療は、試験した種々の抗原に対する免疫応答を著しく弱めることはない。この研究は、腫瘍モデルとしてメラノーマを用いて行なわれているが、ＥＬ−４リンパ腫モデルでの本発明者らの予備的な実験では、この研究において報告される知見はメラノーマに限定されるものではないことを示している。
【００６８】
マクロファージマンノース受容体、スフィンゴシン−１−リン酸受容体およびＣＣＬ２１などの輸入リンパ管上に存在するほんの数種の分子が、輸入リンパ管を介したリンパ球輸送を媒介することが示されている（Marttila-Ichihara, F. et al., Blood 112:64-72）。そのなかでＣｌｅｖｅｒ−１が、抗がん免疫応答の抑制性の影響力に関与し、また薬となり得るということが今回示された最初の１つである。
【００６９】
腫瘍関連マクロファージは、流入血中単球から腫瘍環境内の２型マクロファージに分化する（２４）。本発明者らの実験では、腹膜マクロファージ（腫瘍外部）は、腹腔内においてメラノーマの存在下でＭＲ陽性とはならない（データは示さず）ので、直接的な細胞間接触が分化のために必要とされ得る。ＭＲ陽性２型腫瘍マクロファージの約６５％はＣｌｅｖｅｒ−１を発現する。興味深いことに、抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１抗体治療は、ＭＲ＋／Ｃｌｅｖｅｒ−１＋マクロファージおよびＭＲ＋／Ｃｌｅｖｅｒ−１−マクロファージ両方の数を減少させる。抗体治療後の腫瘍内のＭＲ＋／Ｃｌｅｖｅｒ−１＋マクロファージの存在は、抗体がこれらの細胞の殺傷の完全な介在には結び付かないということを示している。一方でＭＲ＋／Ｃｌｅｖｅｒ−１−マクロファージの数の減少は、これらの細胞もＣｌｅｖｅｒ−１を低いレベルで発現し、Ｃｌｅｖｅｒ−１の標的化がこれらの細胞の分化を抑えているということを示し得る。あるいは、Ｃｌｅｖｅｒ−１の阻害が、それらのＣｌｅｖｅｒ−１発現状態にかかわらず、抑制性マクロファージの数を制限する腫瘍内において潜在的にＳＰＡＲＣ含有量の変化を引き起こすことができる。Ｃｌｅｖｅｒ−１により取り込まれたＳＰＡＲＣは、いくつかの種類のがんにおいて、腫瘍の増殖および浸透（dissemination）をコントロールする重要な成分であり（Said, N. et al., Mol. Cancer Res. 5:1015-1030; Chlenski, A. et al., Cancer Res. 62:7357-7363; Chlenski, A. et al., Int. J. Cancer 118:310-316およびBrekken, R.A. et al., J. Clin. Invest. 111:487-495）、そして本発明者らの場合には腫瘍増殖を制御することもできた。
【００７０】
血液感染性単球のメラノーマへの進入における脈管のＣｌｅｖｅｒ−１の役割は、Ｂ１６メラノーマの血管がＣｌｅｖｅｒ−１を発現しないため除外され得る。理論上は、単球／マクロファージ上のＣｌｅｖｅｒ−１は、血液から原発腫瘍へのそれらの進入に関係し、抗体治療がその機能を阻害する可能性が高い。
【００７１】
２型マクロファージは、免疫抑制性であるＩＬ−１０および様々なケモカイン、特にＣＣＲ４陽性制御性Ｔ細胞を引き付けるＣＣＬ１７およびＣＣＬ２２を分泌する（Sica, A. et al., Cancer Lett. 267:204-215）。本発明者らの研究において観察された制御性Ｔ細胞の減少は、したがって２型マクロファージ、特にＣｌｅｖｅｒ−１を発現する２型マクロファージ、すなわち３型マクロファージの減少という結果として見なすことができる。それらの数および機能的能力の減少はまた、抗原特異的腫瘍細胞抑制を低下させ、全体にわたる免疫バランスが腫瘍促進から抗腫瘍へと移り変わる。
【００７２】
重要なことには、抗体治療が腫瘍治療において有効であったにもかかわらず、多様な種類の抗原に対する免疫応答が目立っては減少しなかった。この背後にある理由は、抗原が免疫応答を生み出すのに充分な量でリンパ節に入るからであり得る。さらに、その治療はおそらく免疫応答しているリンパ節へのおよびリンパ節からのリンパ球輸送を減少させるので、ＨＥＶを介したリンパ球の進入とリンパ節からのそれらの退出とのバランスが有意には変わらない。一旦生み出された抗体は、体内においてＣｌｅｖｅｒ−１とは無関係に循環するようである。際立って、免疫応答の間リンパ節内のマクロファージはＣｌｅｖｅｒ−１陰性のままであるが、しかしそれらの多くがＭＲを明らかに発現する。これは、免疫応答している腫瘍およびリンパ節内のＭＲ陽性マクロファージが異なる亜型に属しているということを示している。これはまた、なぜ免疫のあいだＣｌｅｖｅｒ−１を標的とする抗体治療が多くのＭＲ陽性マクロファージおよび制御性Ｔ細胞にいかなる効果も示さないかについても説明している。
【００７３】
まとめとして、本発明者らの結果は、Ｃｌｅｖｅｒ−１が、がんの増殖および伝達を決定する様々な制御ポイントに関与することを示している。がん患者の成功した治療は、薬物の異なる組合せを必要とし、抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１抗体または他のＣｌｅｖｅｒ−１アンタゴニストは、がんに対する戦いに使用される装備に加えて有益なものであり得る。
【００７４】
母体胎児寛容
本発明者らは、本明細書において、Ｃｌｅｖｅｒ−１陽性マクロファージの非常に卓越した集団がヒト胎盤に存在することを報告する。さらに、Ｃｌｅｖｅｒ−１は、正常な妊娠している女性の循環血単球の表面上に見出されているが、年齢−および性別−適合対照ヒトにおいては見出されていない（か、または非常に乏しい）。しかしながら、子癇前症の患者においては、Ｃｌｅｖｅｒ−１の誘導は血液単球上に見られなかった。最終的には、妊娠経過中の抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１抗体治療は、マウスの同腹子数を減少させた。これらのデータをあわせると、Ｃｌｅｖｅｒ−１陽性細胞集団は、免疫抑制性であり、それは妊娠中の正常な寛容の誘導に寄与していると示唆される。
【００７５】
Ｃｌｅｖｅｒ−１は、ヒトおよびマウスにおいて２型マクロファージの亜集団上に発現される。２型マクロファージは、マウスにおいて設計された多数の実験において免疫抑制性であることが示されている。しかしながら、Ｃｌｅｖｅｒ−１はすべての２型マクロファージ（通常、マクロファージマンノース受容体陽性細胞として定義される）で発現されるわけではないので、本発明者らは、これらの細胞の亜集団（３型マクロファージ）は、Ｃｌｅｖｅｒ−１発現にもとづいてさらに同定できることを提案する。
【００７６】
本発明者らは、３型マクロファージは通常、胎盤および妊娠期間中の血液循環において誘導されるということを示している。Ｃｌｅｖｅｒ−１の誘導が、インターロイキン−４、インターロイキン−１３またはデキサメタゾンなどの免疫抑制分子による刺激を通じて、正常な（妊娠していない）血液単球に見られるということは知られている。おそらく、これらのまたは他の抗−炎症性分子およびステロイドホルモンは、妊娠の期間中Ｃｌｅｖｅｒ−１誘導を担っている。本発明者らは、３型マクロファージが実際免疫抑制性であり、インビボにおける母体胎児寛容を維持するようにはたらくということを提案する。
【００７７】
妊娠期間中にＣｌｅｖｅｒ−１を誘導できないと、結果として寛容の喪失および母体胎児不適合の兆候を生じる。妊娠初期では、これは自然流産として現われ、後期においては子癇前症のような状態として顕在化する。したがって、血液単球上のＣｌｅｖｅｒ−１の誘導は、母親における免疫寛容のレベルを反映し、子癇前症の早期の検出に有用である。さらに、インターロイキンまたはステロイドなどの薬剤によるＣｌｅｖｅｒ−１発現３型マクロファージの治療的な誘導が、妊娠期間中の寛容の促進に有益であり得る。
【００７８】
本発明の方法は多様な態様の形態で組み込まれ、ほんの数例が本明細書に開示されているのみであることは理解されるであろう。当業者にとって、他の態様が存在し、本発明の精神に逸脱しないことは明らかである。したがって、記載された態様は、説明的なものであり、制限的なものとして解釈されるべきではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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