(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸を分析する方法であって、
ａ）合成プローブ及び熱安定性ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼの存在下にて、前記合成プローブが増幅反応中に切断されて切断断片を生成する条件下で、標的核酸をポリメラーゼ連鎖反応により増幅する工程であって、
前記合成プローブが分析物特異的部分及び非標的部分を含むフットプリントプローブであり、前記非標的部分が前記標的核酸に対して非相補的であり、前記分析物特異的部分の長さが１２ヌクレオチド以下であり、前記分析物特異的部分が前記標的核酸に対して相補的である最高１２ヌクレオチドを含み、
前記増幅が等温反応で行われる場合、前記フットプリントプローブの前記分析物特異的部分が、前記等温反応を実施する温度より少なくとも５℃低い前記標的に対する計算Ｔｍ値を有し、又は前記増幅反応が熱サイクル反応である場合、前記フットプリントプローブの前記分析物特異的部分が、前記熱サイクルで用いられる最低温度より少なくとも５℃低い前記標的に対する計算Ｔｍ値を有する、
上記工程と、
ｂ）前記増幅反応中に前記切断断片を検出する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
前記増幅が等温反応で行われる場合、前記フットプリントプローブの前記分析物特異的部分が、前記等温反応を実施する温度より少なくとも８℃低い前記標的に対する計算Ｔｍ値を有し、又は前記増幅反応が熱サイクル反応である場合、前記フットプリントプローブの前記分析物特異的部分が、前記熱サイクルで用いられる最低温度より少なくとも８℃低い前記標的に対する計算Ｔｍ値を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅が等温反応で行われる場合、前記フットプリントプローブの前記分析物特異的部分が、前記等温反応を実施する温度より少なくとも１０℃低い前記標的に対する計算Ｔｍ値を有し、又は前記増幅反応が熱サイクル反応である場合、前記フットプリントプローブの前記分析物特異的部分が、前記熱サイクルで用いられる最低温度より少なくとも１０℃低い前記標的に対する計算Ｔｍ値を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記合成プローブが標識されていない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記合成プローブが非天然ヌクレオチドを含まない、及び／又は副溝バインダー部分を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記合成プローブの前記非標的部分の長さが少なくとも１０ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記標的核酸がＲＮＡであり、前記方法が前記増幅前に又は前記増幅と同時に前記ＲＮＡを逆転写する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記増幅がプライマーオリゴヌクレオチドを使用するものであり、前記合成プローブの前記分析物特異的部分が、前記標的核酸に対する少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチドの計算Ｔｍ値より少なくとも５℃低い前記標的核酸に対する計算Ｔｍ値を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記合成プローブの前記分析物特異的部分が、前記標的核酸に対する少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチドの計算Ｔｍ値より少なくとも８℃低い前記標的核酸に対する計算Ｔｍ値を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記合成プローブの前記分析物特異的部分が、前記標的核酸に対する少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチドの計算Ｔｍ値より少なくとも１０℃低い前記標的核酸に対する計算Ｔｍ値を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記プローブの前記分析物特異的部分が、１１以下のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記プローブの前記分析物特異的部分が、１０以下のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記プローブの前記分析物特異的部分が、９以下のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記プローブの前記分析物特異的部分が、８以下のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記プローブの前記分析物特異的部分が、７以下のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記プローブの前記分析物特異的部分が、６以下のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記プローブが切断される前に切断構造が形成され、前記切断構造が、ａ）前記標的核酸の第１の領域における前記合成プローブ、及びｂ）前記標的核酸の第１の領域の下流に存在する前記標的核酸の第２の領域における第２のオリゴヌクレオチドと、前記標的核酸との会合により形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的核酸の第２の領域が第１の領域に隣接している、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記切断構造において、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端において少なくとも１個のヌクレオチドが、前記プローブと前記標的核酸とのハイブリダイゼーション領域と重複する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記切断構造において、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドが、前記標的核酸に対して非相補的である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第２のオリゴヌクレオチドが前記増幅で用いられるプライマーオリゴヌクレオチドでもある、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記切断断片の検出が、１つ以上の前記切断断片を合成検出オリゴヌクレオチドと会合させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記合成検出オリゴヌクレオチドが標識を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記標識が蛍光標識である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記合成検出オリゴヌクレオチドが蛍光クエンチャー部分を更に含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記切断断片が、前記合成検出オリゴヌクレオチドと会合したとき、前記熱安定性ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼにより切断可能な切断構造を形成する、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年３月１５日出願の米国特許仮出願第６１／０３６，９５３号の優先権を主張し、該出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、検出アッセイ（例えば切断アッセイ）と組み合わせて増幅反応を実施するためのシステム、方法及びキットであって、該検出アッセイが比較的短い（例えば６〜１２塩基）分析物特異的領域（「ＡＳＲ」）を有するプローブを使用して、核酸修飾酵素（例えばＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ）が認識可能な最小量の二本鎖を提供するシステム、方法及びキットを提供する。いくつかの実施形態では、かかるアッセイは標的を定量するために用いられ、他の実施形態では、かかるアッセイは遺伝子型同定のために用いられる。特定の実施形態では、かかる短いプローブの使用によりダイナミックレンジの広いアッセイが可能になる。
【背景技術】
【０００３】
核酸の定量は、生物学及び医学分野で重要な役割を果たしている。例えば核酸の定量は、癌の診断及び予後診断、ウイルス診断、並びに治療効果の判断（例えばＨＣＶ及びＨＩＶに対する）において重要である。ＨＣＶのＲＮＡの定量は、ＩＦＮを服用している患者にとって重要である。ＩＦＮ療法の効果は、ＩＦＮ療法中にウイルスの量をモニタすることにより直接見出すことができる。これによって各患者の臨床症状に合わせたより有効なＩＦＮ療法を行うことが可能になる。標的核酸の定量は、将来の疾患診断にとって重要である。例えば、外因性刺激に起因する疾患の場合、外因性刺激に応答するｍＲＮＡの発現レベルを調べることによって、より早期の診断が可能となる。
【０００４】
ポリメラーゼ連鎖反応を核酸の定量に用いることができる。しかしＰＣＲを用いる場合、増幅された核酸の絶対量は、増幅開始時点で存在していた標的核酸の量を正確に反映している訳ではない。第１に、ＰＣＲによる増幅産物の量は一般的に各サイクル毎に指数関数的に増加するが、増幅産物の量が一定レベルを超えると増加速度が低下し、ついには停止する。したがって、増幅産物の最終量は、反応開始時の標的核酸の量に関係なく一定である。この現象はプラトー効果と呼ばれ、ＰＣＲによる増幅産物を定量するときには考慮すべきものである。
【０００５】
「リアルタイムＰＣＲ」として知られている技術が、標的配列の定量に広く用いられている（例えばＢｕｓｔｉｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２０００）２５，１６９−１９３；Ｂｕｓｔｉｎ  ａｎｄ  Ｎｏｌａｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：１５５−１６６；ＡＢＩ“Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ”Ｐａｒｔ  Ｎｕｍｂｅｒ４３７１０８９  Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ａ；ＡＢＩ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｏｆｔａｒｅ  ３．０“Ｇｅｔｔｉｎｇ  Ｓｔａｒｔｅｄ  Ｇｕｉｄｅ”Ｐａｒｔ  Ｎｕｍｂｅｒ４３６２４６０  Ｒｅｖ．Ｂ，Ｊａｎｕａｒｙ  ２００５参照）。この技術では、各増幅標的の検量線を最初に作成する。段階希釈した標的核酸を準備し、各サンプルをＰＣＲに供し、一般的に増幅された物質の量に比例して蓄積するシグナル（例えば蛍光）を検出することにより、産物の蓄積をリアルタイムで、すなわち増幅過程中に検出する。バックグラウンド蛍光又は「基準」を上回る増幅産物に特異的なシグナルが最初に検出されるサイクルである、閾値サイクル（Ｃｔサイクル）を決定する。異なる段階希釈物のＣｔ値を縦軸上にプロットし、各希釈物中の標的核酸の初期コピー数を横軸にプロットして、その標的物質の検量線を作成する。対象となる未知のサンプル（例えば未知の量の同じ標的物質を含有していると思われるサンプル）を同条件下でＰＣＲに供し、未知の物質のＣｔ値を決定する。次いでその標的の検量線を用いて、未知のサンプルの初期コピー数を決定する。
【０００６】
一般的に用いられている均質な蛍光レポーティング法が２種存在する。「非特異的」検出は、増幅産物の蓄積を示すが正しい又は対象とするアンプリコンに対して特異的ではなく、一方「特異的」検出は特定の対象とする産物の蓄積を立証する。非特異的検出は、臭化エチジウム又はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ等のインターカレーション色素を用いてもよく、該色素はＰＣＲ反応中に生成される任意の二本鎖ＤＮＡに結合し、強い蛍光を発する。かかる色素は熱サイクル前にＰＣＲ試薬に添加される。本質的に非特異的であるが、ＤＮＡ融解曲線を用いて増幅産物の種類（identity）を調べることができる。色素インターカレーション法を用いることの利点としては、１）色素を用いて任意の二本鎖ＤＮＡ配列の増幅をモニタすることができ、２）プローブが必要なく、アッセイのセットアップコスト及びランニングコストを低減できることが挙げられる。
【０００７】
反応レポーティング法としてインターカレーション色素を用いることの主な問題点は、該色素が擬陽性シグナルを生じさせる可能性があること、すなわち色素は配列選択性無しに任意の二本鎖ＤＮＡに結合するため、非特異的な二本鎖ＤＮＡの存在下でシグナルが生じることである。非特異的ＤＮＡとしては、混入ＤＮＡ、「プライマーダイマー」アーチファクトＤＮＡ、又は反応に加えられるプライマーを用いて増幅することができる対象とする標的以外の任意のＤＮＡを挙げることができる。
【０００８】
非特異性に加えて、インターカレーション色素は正しい標的でさえも定量をより複雑にする場合がある。なぜならばシグナルの量は産物のコピー数ではなく増幅反応中に生成される二本鎖ＤＮＡの質量に依存するためである。より長い増幅産物はより大きな質量を有し、より多くの色素分子に結合することができるため、同じコピー数のより短い産物よりも強いシグナルが生じることがある。対照的に、蛍光性プローブを用いるときには、アンプリコンの長さにかかわらず増幅分子の各コピーにつき１つの蛍光物質が消光状態から解き放たれる。
【０００９】
テンプレート又は標的特異的分析は一般的に、各ＰＣＲアッセイにつき１つ以上の特注蛍光プローブを設計及び合成する必要がある。プライマー配列は正しい増幅産物にも誤った増幅産物にも同様に組み込まれるため、プローブは一般的にプライマー間に存在する標的配列の領域にハイブリダイズするよう設計され、その結果プローブのハイブリダイゼーションの成功は対象とする標的配列が増幅されたことを裏付ける。大部分のレポーティング系は、検出の基礎として蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、又はドナー分子及びクエンチャー分子の間の類似の相互作用を利用している。一般的に蛍光シグナルは、アンプリコン特異的プローブがその相補的標的にハイブリダイズした場合にのみ生じる。ＴＡＱＭＡＮ及び他の５’ヌクレアーゼ検出アッセイ等の一般的な実施形態では、５’ヌクレアーゼはハイブリダイズしているプローブを切断して蛍光物質をクエンチャー分子から分離する。しかし一部の反応設計では、プローブは切断されず正しい標的の存在下では立体構造が変化する。かかるプローブの立体構造の変化により蛍光物質がクエンチャー分子から分離されて、特異的標的の増幅の成功の指標である蛍光増加が生じる。
【００１０】
特異的化学反応は、例えばミスプライミング又はプライマーダイマーアーチファクトに起因する非特異的増幅によるシグナルが生じず、蛍光検出器に検出されないという点で有利である。これを用いればアンプリコンの種類（identity）を確かめるためのＰＣＲ後のサザンブロッティング、配列解析、又は融解曲線の必要がない。インターカレーション色素の別の利点は、異なる識別可能なレポーター色素でプローブを標識することができる点であり、これにより１回のＰＣＲ反応においていくつかの異なる配列から生じる増幅産物を検出することが可能になる（マルチプレックス）。プローブに基づく特異的検出化学反応の１つの主な問題点は、検出される異なる配列毎に異なるプローブの合成が必要なことである。（ＡＢＩ“Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ”  Ｐａｒｔ  Ｎｕｍｂｅｒ４３７１０８９  Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ａ）。その上高価な色素で標識された様々な特注プローブ、クエンチャー分子、及び任意的に副溝バインダーを使用する必要があるため、プローブに基づくアンプリコン特異的リアルタイムＰＣＲ分析に加えて著しい追加費用がかかる。別の問題点は、密接に関連する配列を識別することが困難である点である。ＰＣＲ及び加水分解プローブを用いる対立遺伝子の判別は、一般的に、「間違った」標的にハイブリダイズしたとき３’末端がミスマッチであり、その結果対立遺伝子の増幅を妨げるプライマー（例えば増幅することを意図していない対立遺伝子にハイブリダイズしたとき、一方の対立遺伝子を増幅することを意図するプライマー）、又は対象としない対立遺伝子にはそれほどアニールしないよう設計された加水分解プローブのいずれかを用いることが必要である。かかるミスマッチが存在する場合でさえもプライマー伸長及びプローブ切断の両方が生じる場合があるため、上記両方のアプローチからは不完全な判別しか得られない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記点を考慮して、リアルタイムで、標的特異的に核酸を定量するための比較的単純で安価で均質な方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
いくつかの実施形態では、本発明は対象となる標的核酸を分析するための検出技術を提供する。本明細書に記載するように、検出技術は必要に応じて定量的又は半定量的であり得る、リアルタイム検出能を有する。システム、組成物（例えば、キット、反応混合物等）、及び方法が提供される。システム、組成物及び方法は、他の既知の技術又は将来開発されるであろう技術と併用してもよい。いくつかの実施形態では、本発明は、例えば検出酵素を用いて検出するのに必要な最小構造（例えば二本鎖）を提供するフットプリントプローブの使用を含む検出システムを提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本発明は標的核酸の分析方法であって、核酸二本鎖を含む構造を認識する５’ヌクレアーゼを選択する工程と、５’ヌクレアーゼのためのフットプリント二本鎖長を決定する工程と、合成フットプリントプローブ及び５’ヌクレアーゼの存在下で、前記合成フットプリントプローブが標的増幅反応中に切断されて切断断片を生成する条件下で標的核酸を増幅する工程であって、前記合成フットプリントプローブが分析物特異的部分及び非標的部分を含み、前記非標的部分が前記標的核酸に対して実質的に非特異的であり、前記分析物特異的部分が前記５’ヌクレアーゼのためのフットプリント二本鎖長より長くない前記標的核酸とのプローブ−標的二本鎖を形成する、上記工程とを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、本方法は増幅反応中に切断断片を検出することを更に含む。特に好ましい実施形態では、標的増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応である。好ましい実施形態では、５’ヌクレアーゼは、天然ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ、改変型ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ、及び少なくとも１種のエンドヌクレアーゼの少なくとも一部を含むキメラタンパク質から成る群から選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本発明は標的核酸を分析する方法であって、ａ）合成プローブ及びＦＥＮ−１ヌクレアーゼの存在下で、前記合成プローブが増幅反応中に切断されて切断断片を生成する条件下で標的核酸を増幅する工程であって、前記合成プローブがＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼのためのフットプリントプローブであり、前記フットプリントプローブが分析物特異的部分及び非標的部分を含み、前記非標的部分が前記標的核酸に対して実質的に非特異的であり、前記増幅反応が等温反応である場合、前記フットプリントプローブの分析物特異的部分が、前記等温反応が実施される温度より少なくとも５℃、より好ましくは８℃、更により好ましくは１０℃低い標的に対する計算Ｔｍ値を有し、又は増幅反応が熱サイクル反応である実施形態では、前記フットプリントプローブの分析物特異的部分が前記熱サイクルで用いられる最低温度より少なくとも５℃、より好ましくは８℃、更により好ましくは１０℃低い前記標的に対する計算Ｔｍ値を有し、前記フットプリントプローブは副溝バインダー部分を含まない、上記工程を含む方法を提供する。好ましい実施形態では、本方法は前記増幅反応中に切断産物を検出することを更に含む。
【００１５】
特に好ましい実施形態では、本発明は核酸増幅アッセイ及び検出アッセイの使用を含む方法であって、前記増幅アッセイ又は検出アッセイの少なくとも１つが１２ヌクレオチド以下の分析物特異的領域を有するフットプリントプローブの使用を含み、５’ヌクレアーゼ（例えば古細菌若しくは真核生物のＦＥＮ−１ヌクレアーゼ、又はウイルス若しくは真正細菌ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ）の使用を更に含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、フットプリントプローブのＡＳＲは標的核酸に対して完全に相補的である１２ヌクレオチドを含み、いくつかの実施形態では、プローブのＡＳＲはその１つ以上が標的核酸鎖中の対応するヌクレオチドに対して相補的ではない１２ヌクレオチドを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明は標的核酸を分析する方法であって、ａ）プローブ及びエンドヌクレアーゼの存在下で、前記プローブが増幅反応中に切断されて切断断片を生成する条件下にて標的核酸を増幅する工程であって、前記プローブが分析物特異的部分（すなわち標的結合領域）及び非標的部分を含み、前記非標的部分が前記標的核酸に対して実質的に非相補的であり、前記標的結合部分が前記標的核酸に対して相補的である１２以下のヌクレオチドを含む、上記工程と、ｂ）前記増幅反応中に切断断片を検出する工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、プローブは合成プローブである。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼはＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ（例えば、熱安定性ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ、例として古細菌種由来のＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼが挙げられるがこれに限定されない）である。
【００１７】
本方法は、実施される分析の性質により制限されない。いくつかの実施形態では、分析は、増幅反応中に切断断片を検出することにより標的核酸の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、分析は標的核酸の多型（例えば一塩基多型、欠失、挿入、反復配列等）の存在を同定することを含む。いくつかの実施形態では、分析は、標的核酸が由来する生物の種類を判定することを含む。例えばいくつかの実施形態では、生物は界、門、綱、目、科、属、種、亜種、又は個体レベルで同定される。いくつかの実施形態では、分析は標的核酸の量を検出することを含む。いくつかの実施形態では、検出される量はサンプル中に最初に存在する標的核酸の量である。
【００１８】
本発明は、標的核酸の源又は性質により制限されない。いくつかの実施形態では、標的核酸はサンプルから単離されている。本発明はサンプルの性質により制限されない。サンプルとしては、細胞サンプル（例えば生物、培養細胞、幹細胞、腫瘍細胞、病原体、単細胞生物由来）、組織サンプル、流体サンプル（例えば血液、血清、血漿、尿、唾液等）、培養サンプル、及び環境サンプルが挙げられるが、これらに限定されない。標的核酸は、生物、例えば動物（例えばヒト等の哺乳類）、植物、細菌、ウイルス、及び真菌が挙げられるがこれらに限定されない生物由来であってもよい。標的核酸は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はこれらの組み合わせを含んでいてもよい。標的核酸は、天然核酸分子若しくは合成核酸分子又はこれらの組み合わせを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、標的核酸がＲＮＡである又はＲＮＡを含む場合、例えば逆転写酵素で逆転写されることにより、ＲＮＡをＤＮＡに変換する。標的核酸は、その構造の１つ以上のヌクレオチド又は他の部分に対する共有又は非共有修飾を含んでいてもよい。例えばいくつかの実施形態では、核酸は１つ以上のヌクレオチドがメチル化されており、分析は標的核酸中のメチル化ヌクレオチドの存在、頻度（degree）、又は位置を決定することを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本方法により使用される増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応であるが、他の温度サイクル又は等温増幅技術を使用してもよい。増幅技術の多くがポリメラーゼを使用する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは熱安定性ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠く。増幅技術の多くが１つ以上のプライマーを使用する。したがっていくつかの実施形態では、本方法は第１及び第２のプライマーオリゴヌクレオチドを利用する。また必要な場合又は望ましい場合、更なるプライマーオリゴヌクレオチドを使用してもよい。
【００２０】
いくつかの実施形態では、プローブ切断は切断構造の形成及び前記切断構造の切断により達成される。いくつかの実施形態では、切断構造はプローブが切断される前に形成され、前記切断構造は、ａ）標的核酸の第１の領域におけるプローブ、及びｂ）標的核酸の第２の領域に会合する第２のオリゴヌクレオチドであって、第２の領域が標的核酸の長さに沿って第１の領域の３’に存在する第２のオリゴヌクレオチドと、標的核酸との会合により形成される。いくつかの実施形態では、標的核酸の第１及び第２の領域は互いに隣接している。いくつかの実施形態では、切断構造中の第２のオリゴヌクレオチドの３’末端における少なくとも１個のヌクレオチドが、プローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーション領域と重複している。いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドは、切断構造中で標的核酸に対して相補的ではない。いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドはまた増幅工程で用いられるプライマーでもある。
【００２１】
いくつかの実施形態では、切断構造は、米国特許第７，３１２，０３３号、同第７，３０６，９１７号、同第７，２９７，７８０号、同第７，２７３，６９６号、同第７，２５６，０２０号、同第７，１９５，８７１号、同第７，１５０，９８２号、同第７，１０１，６７２号、同第７，０８７，３８１号、同第７，０６７，６４３号、同第７，０６０，４３６号、同第７，０４５，２８９号、同第７，０１１，９４４号、同第６，９３２，９４３号、同第６，９１３，８８１号、同第６，８７５，５７２号、同第６，８７２，８１６号、同第６，７８０，９８２号、同第６，７８０，５８５号、同第６，７５９，２２６号、同第６，７０９，８１９号、同第６，７０９，８１５号、同第６，７０６，４７１号、同第６，６９２，９１７号、同第６，６７３，６１６号、同第６，６３５，４６３号、同第６，５６２，６１１号、同第６，５５５，３５７号、同第６，４５８，５３５号、同第６，３７２，４２４号、同第６，３５８，６９１号、同第６，３５５，４３７号、同第６，３４８，３１４号、同第６，２１４，５４５号、同第６，１９４，１４９号、同第６，０９０，６０６号、同第６，０９０，５４３号、同第６，００１，５６７号、同第５，９９４，０６９号、同第５，９８５，５５７号、同第５，８８８，７８０号、同第５，８４６，７１７号、同第５，８４３，６６９号、同第５，８４３，６５４号、同第５，８３７，４５０号、同第５，７１９，０２８号、同第５，６１４，４０２号、及び同第５，５４１，３１１号、並びに米国特許出願公開第２００８００１５３４９号、同第２００８００１４１２４号、同第２００７０２９２８５６号、同第２００７０２０７４５５号、同第２００７０２０２５１７号、同第２００７０１１１２００号、同第２００７００８７３４５号、同第２００７００４９７４５号、同第２００６０２５２０３２号、同第２００６０２４６４７５号、同第２００６０２４０４５２号、同第２００６０１９９２０２号、同第２００６０１８３２０７号、同第２００６０１６００７４号、同第２００６０１４７９５５号、同第２００６０１４７９３８号、同第２００５０２７７１３８号、同第２００５０１９６７５０号、同第２００５０１８６５８８号、同第２００５０１８１４３５号、同第２００５０１６４１７７号、同第２００５０１５８７１６号、同第２００５０１３０１７９号、同第２００５０１０６５９６号、同第２００５００７４７８８号、同第２００５００４８５２７号、同第２００４０２１９５７６号、同第２００４０２０３０３５号、同第２００４００９６８７４号、同第２００４００１４０６７号、同第２００３０２１９７８４号、同第２００３０１４３５３５号、同第２００３０１３４３４９号、同第２００３０１２４５２６号、同第２００３０１１３２３７号、同第２００３０１１３２３６号、同第２００３０１０４４７０号、同第２００３０１０４３７８号、同第２００３００９２０３９号、同第２００３００８２５４４号、同第２００３００７２６８９号、同第２００２０１５６２５５号、同第２００２０１４２４５４号、及び同第２００２０１２８４６５号（これらは各々その全文が、参照として本明細書に組み込まれる）の１つ以上に記載されている構造である、又はこれらの１つ以上に記載されている試薬若しくはアプローチを使用する。これらの特許及び公開出願はまた、酵素、設計、製造、及び検出システム、並びに本発明の方法、組成物及びシステムで有用である他の成分についても記載している。
【００２２】
いくつかの実施形態では、プローブの標的結合部分は、前記標的核酸に対して相補的である１１以下（例えば１０、９、８、７、６等）のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プローブは標識されている。他の実施形態では、プローブは標識されていない。いくつかの実施形態では、プローブは非天然ヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、プローブは天然に存在するヌクレオチドから成る。いくつかの実施形態では、プローブは３’末端にポリメラーゼによるプローブの伸長を防ぐ部分を有する。プローブの非標的部分は任意の所望の長さであってもよい。いくつかの実施形態では、プローブの非標的部分は単一ヌクレオチドである。他の実施形態では、プローブの非標的部分は２以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、．．．、４０、．．．５０、．．．等）のヌクレオチド長である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、検出工程は検出オリゴヌクレオチドを利用する。例えばいくつかの実施形態では、切断断片の検出は、１つ以上の前記切断断片と合成検出オリゴヌクレオチドとを会合させることを含む。いくつかの実施形態では、合成検出オリゴヌクレオチドはヘアピン構造を形成する自己相補性領域を有する。いくつかの実施形態では、合成検出オリゴヌクレオチドは標識（例えば蛍光標識）を含む。いくつかの実施形態では、合成検出オリゴヌクレオチドは蛍光クエンチャー部分を更に含む。いくつかの実施形態では、切断フラップは、テンプレートとして検出オリゴヌクレオチドを用いる切断フラップの伸長により検出される。いくつかの実施形態では、切断フラップは、テンプレートとして検出オリゴヌクレオチドを用いる切断フラップの別の分子へのライゲーションにより検出される。いくつかの実施形態では、切断断片は、合成検出オリゴヌクレオチドと会合したとき、ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼにより切断可能な切断構造を形成する。いくつかの実施形態では、検出は切断構造（合成検出オリゴヌクレオチドを含む）を切断して検出可能なシグナルを生じさせることを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、未知の標的核酸を既知の合成対照標的核酸と組み合わせて分析して、例えば未知の標的核酸の量を決定する。
【００２５】
本発明はまた、本明細書に記載される方法のいずれかを実施するのに有用な、必要な、又は十分な１つ以上の成分を含む組成物及びシステムを提供する。例えばいくつかの実施形態では、組成物は、ａ）標的核酸と、ｂ）増幅プライマーと、ｃ）ポリメラーゼと、ｄ）ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼと、ｅ）分析物特異的部分及び非標的部分を含む非標識合成プローブであって、前記非標的部分が標的核酸に対して実質的に相補的ではなく、前記標的結合部分が標的核酸に対して相補的である１２以下のヌクレオチドを含む、上記非標識合成プローブとを含む。いくつかの実施形態では、組成物は反応混合物である。いくつかの実施形態では、組成物はキットである（例えば、各々が１つ以上の成分を収容している１つ以上の容器を備える）。いくつかの実施形態では、本発明のシステムは、前記組成物と、サンプル精製若しくは加工試薬若しくは設備、検出設備、コントロールソフトウェア、及びデータ解析システム等の１つ以上の追加成分とを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本組成物は、ａ）標的核酸と、ｂ）増幅プライマーと、ｃ）ポリメラーゼと、ｄ）ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼと、ｅ）分析物特異的部分及び非標的部分を含む非標識合成プローブであって、前記非標的部分が標的核酸に対して実質的に相補的ではない、上記非標識合成プローブとを含む。本発明はまた標的核酸を分析する方法であって、かかる組成物を準備する工程と、増幅反応中にプローブと標的核酸との間に切断構造を形成する工程と、プローブをＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼで切断して、プローブの非標的部分を含む切断構造を生成する工程と、切断産物を検出する工程とを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ＰＣＲと、侵入的切断用フットプリントプローブを用いる侵入的切断反応との組合せを含む本発明の実施形態の概略図を提供する。
【図２Ａ】図２Ａは、図１に係るアッセイにおいて１０及び１１ヌクレオチドのＡＳＲ（それぞれ計算Ｔｍ値３４．２℃及び３６．２℃、最近接モデル及びＤＮＡ二本鎖形成のための公開されているパラメータを用いて計算、Ａｌｌａｗｉ  ａｎｄ  ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：１０５８１（１９９７）、及びＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，９５（４）：１４６０（１９９８））を有するフットプリントプローブの図１に係るアッセイにおける使用を示す図を提供する。図２Ａ及び２Ｂに示すアッセイでは、標的核酸は別個の反応でＰＣＲにより増幅させた。ポリメラーゼ酵素を熱で失活させ、ＰＣＲのアリコートをＦＲＥＴカセットを有さず、図示した侵入的切断構造を用いるＩＮＶＡＤＥＲアッセイ反応で用いた。指示した温度でＰｆｕ  ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼを用いて反応を実行した（勾配サーマルサイクラー内にて）。次いで適切なＦＲＥＴカセットを反応に添加し、最初のＩＮＶＡＤＥＲアッセイ反応で切断されたプローブの量をＦＲＥＴカセットの切断を測定することにより決定した。これらのデータは、１０又は１１ヌクレオチドのＡＳＲを含むプローブが反応温度の範囲全体にわたって類似する広い性能曲線及び反応温度とは独立した性能を有することを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図１に係るアッセイにおいて９ヌクレオチドのＡＳＲ（図２Ａの説明に記載されている方法に従って計算したＴｍ値４５．６℃）を有するフットプリントプローブの性能を示す。これらのデータは、９ヌクレオチドのＡＳＲを含むプローブも反応温度の範囲全体にわたって機能し、反応温度が上昇するにつれて性能は穏やかに低下することを示す。本発明を特定の作用機序に限定するものではないが、このプローブが１０及び１１  ＡＳＲプローブより高いＴｍを有するが、温度が上昇するにつれて性能の低下を示すという所見は、性能低下がプローブのＡＳＲのようなプローブを安定化させる酵素の能力低下と関連していることを示唆する。
【図３】図３は、分析物特異的領域の計算Ｔｍ値の変動を示すフットプリントプローブの表を示す。これらのプローブはＭＧＢ等の二本鎖安定化部分を含んでいなかった。示したＴｍは図２Ａの説明に記載されている方法に従って計算された。図３に示した各プローブは５０℃で侵入的切断反応において機能し（５２℃における試験も同じ結果を示した）、これは約１２以下のヌクレオチドのＡＳＲを含むフットプリントプローブを設計し、Ｔｍを反応温度（１又は複数）に一致させる必要なく使用することができることを示す。
【図４】図４は、ｍｉＲ  １５５マイクロＲＮＡを検出するためにフットプリントプローブを用いてリアルタイムＰＣＲ＋侵入的切断を用いた結果（パネルＡ）と、ＴＡＱＭＡＮアッセイ（パネルＢ）の結果とを比較する。これらのデータは、ＰＣＲ＋侵入的切断アッセイではシグナル蓄積が速く、ＴＡＱＭＡＮアッセイでは標的なし対照でバックグラウンドが現れ始めるが、フットプリントプローブを用いる反応ではバックグラウンドが現れないことを示す。反応は実施例３に記載するように実施した。
【図５】図５は、フットプリントプローブを用いるＰＣＲ＋侵入的切断を用いて第５因子標的配列におけるＳＮＰを増幅し遺伝子型を同定するためのオリゴヌクレオチド配列を示す。
【図６−１】図６は、図８に示すアッセイ設計を用いるＰＣＲ＋侵入的切断アッセイの結果と、ＴＡＱＭＡＮアッセイを用いる同対立遺伝子の遺伝子型同定結果とを比較する。図６Ａ〜ＣはＰＣＲ＋侵入的切断結果（実施例３に記載されているように実施した）を示すものであり、図６Ａは突然変異体第５因子標的配列の検出プロットを示し、図６Ｂは野性型第５因子標的配列の検出プロットを示し、図６Ｃは不均一な第５因子標的配列の検出プロットを示す。
【図６−２】図６Ｄ〜ＦはＴＡＱＭＡＮアッセイ結果を示すものであり、図６Ｄは突然変異体第５因子標的配列の増幅プロットを示し、図６Ｅは野性型第５因子標的配列の増幅プロットを示し、図６Ｆは不均一な第５因子標的配列の増幅プロットを示す。
【図７】図７は、フットプリントプローブを用いるＰＣＲ＋侵入的切断（実施例３に記載されているような）による（７Ｂ）、及びＴＡＱＭＡＮアッセイ（７Ａ）による、第５因子遺伝子におけるＳＮＰを検出するためのスキャッタープロットを比較する。
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、ＰＣＲ増幅をＩＮＶＡＤＥＲアッセイを用いる増幅後検出と組み合わせた「ＩＮＶＡＤＥＲプラス」アッセイを用いた単一塩基変異の検出結果（パネル８Ａ）と、フットプリントプローブを用いるリアルタイムＰＣＲ＋侵入的切断を用いたＶＺＶの野性型又はＯｋａ変異体の検出（パネルＢ、Ｃ、標的なし対照を用いたＤ）とを比較する。
【図９】図９Ａ〜９Ｂは、１ヌクレオチドが標的とミスマッチであり、フットプリントプローブはＡＳＲ中に１１ヌクレオチドしか有しない１２ヌクレオチドを含むフットプリントプローブと比較した、ＡＳＲ中に１２の相補的ヌクレオチドを含むフットプリントプローブを用いるヒトｍｉＲ−２１マイクロＲＮＡの検出において得られた結果（実施例３に記載されているような条件を用いて）を示す。１１の相補的ヌクレオチドに加えて２つのミスマッチヌクレオチドを有するプローブ（合計でＡＳＲ中に１３ヌクレオチド）についても試験した。パネルＡは試験分子の概略図を示し、パネルＢは６００又は６０００コピーのｍｉＲ−２１  ＲＮＡを有するサンプルから得られたデータを示す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂは、１ヌクレオチドが標的とミスマッチであり、フットプリントプローブはＡＳＲ中に１０ヌクレオチドしか有しない１１ヌクレオチドを含むフットプリントプローブと比較した、ＡＳＲに１１の相補的ヌクレオチドを含むフットプリントプローブを用いるｈｓａ−ｍｉＲ−１７−３ｐマイクロＲＮＡの検出において得られた結果を示す（実施例３に記載されているような条件を用いて）。パネルＡは試験分子の概略図を示し、パネルＢは６×１０６コピーのｈｓａ−ｍｉＲ−１７−３ｐマイクロＲＮＡを有するサンプルから得られたデータを示す。これらの例は、ＦＥＮ−１酵素にとって最適な長さ付近のＡＳＲを有する（例えば１１又は１２ヌクレオチド）と最も強い検出シグナルがもたらされ、一方適切な長さのＡＳＲを有するがミスマッチを含むプローブを用いると最適な長さ未満のＡＳＲを有するプローブを用いて得られるよりも強いシグナルがもたらされることを示す。
【図１１−１】図１１ＡはヒトｍｉＲ−２１標的を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチド配列を示し、図１１ＢはヒトｍｉＲ−１５５標的を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチド配列を示し、図１１ＣはヒトｍｉＲ−１２６標的を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチド配列を示す。
【図１１−２】図１１ＤはヒトＵ６  ｓｎＲＮＡ標的を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチド配列を示し、図１１ＥはヒトＵ２４  ｓｎＲＮＡ標的を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチド配列を示す。
【図１２Ａ】図１２は、図１１に示すアッセイ設計を用いるＰＣＲ−侵入的切断組合せアッセイの結果を示し、これはフットプリントプローブの使用を含む。各標的について得られたデータを、蛍光対サイクル数としてプロットした。各標的について、コピー数対標的レベルの最線形回帰（ｍｏｓｔ  ｌｉｎｅａｒ  ｆｉｔ）を与える閾値を割り当てた（各図の下方パネル参照）。各標的についての結果を以下の図に示す：ｍｉＲ−１５５（図１２Ａ）；
【図１２Ｂ】ｍｉＲ−２１（図１１２Ｂ）；
【図１２Ｃ】ｍｉＲ−１２６（図１２Ｃ）；
【図１２Ｄ】Ｕ６（図１２Ｄ）；及び
【図１２Ｅ】Ｕ２４（図１２Ｅ）。
【図１３−１】図１３ＡはＵ６  ＤＮＡ標的を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチド配列を示し、図１３Ｂは第５因子ＤＮＡ標的を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチド配列を示し、図１３Ｃは第２因子ＤＮＡ標的を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチド配列を示す。
【図１３−２】図１３ＤはＧＡ−２１−Ｒ  ＤＮＡ標的を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチド配列を示し、図１３ＥはヒトＵ６  ＲＮＡ標的を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチド配列を示す。
【図１４−１】図１４は、実施例２のＰＣＲ及び侵入的切断アッセイの組み合わせとフットプリントプローブを用いて第２因子を検出した結果を示す。図１４Ａ〜Ｂは、侵入的オリゴヌクレオチド及びＡｆｕ  ＦＥＮ−１酵素の両方が存在する実施例２の結果を示す。
【図１４−２】図１４Ｃ〜Ｄは侵入的オリゴヌクレオチド及びＡｆｕ  ＦＥＮ−１酵素が存在しない結果を示す。
【図１５Ａ】図１５は、実施例２のフットプリントプローブを用いるＰＣＲ及び侵入的切断アッセイの組み合わせを用いて第５因子を検出した結果を示す。図１５Ａ〜Ｂは、全ての反応成分が存在する実施例２の結果を示す。
【図１５Ｂ】全ての反応成分が存在する実施例２の結果を示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃ〜Ｄは侵入的オリゴヌクレオチド及びＡｆｕ  ＦＥＮ−１酵素が存在しない結果を示す。
【図１５Ｄ】侵入的オリゴヌクレオチド及びＡｆｕ  ＦＥＮ−１酵素が存在しない結果を示す。
【図１５Ｅ】図１５Ｅ〜Ｆは、ｙ軸の最大が６０，０００ではなく１０，０００であることを除いて図１５Ｃ〜Ｄと同じ結果を示す。
【図１５Ｆ】ｙ軸の最大が６０，０００ではなく１０，０００であることを除いて図１５Ｃ〜Ｄと同じ結果を示す。
【図１６−１】図１６は、実施例２のフットプリントプローブを用いるＰＣＲ及び侵入的切断アッセイの組み合わせを用いてＧＡ−２１−Ｒを検出した結果を示す。図１６Ａ〜Ｂは、侵入的オリゴヌクレオチド及びＡｆｕ  ＦＥＮ−１酵素の両方が存在する実施例２の結果を示す。
【図１６−２】図１６Ｃ〜Ｄは侵入的オリゴヌクレオチド及びＡｆｕ  ＦＥＮ−１酵素が存在しない結果を示す。
【図１７−１】図１７は、実施例２のフットプリントプローブを用いるＰＣＲ及び侵入的切断アッセイの組み合わせを用いてＵ６  ＲＮＡを検出した結果を示す。図１７Ａ〜Ｂは、侵入的オリゴヌクレオチド及びＡｆｕ  ＦＥＮ−１酵素の両方が存在する実施例２の結果を示す。
【図１７−２】図１７Ｃ〜Ｄは侵入的オリゴヌクレオチド及びＡｆｕ  ＦＥＮ−１酵素が存在しない結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
定義
本発明の理解を助けるために、いくつかの用語及び語句を以下に定義する。
【００２９】
例えば標的核酸と、ある構造、例えば二本鎖を形成するよう構成されている核酸プローブに関して本明細書で使用する「酵素フットプリントプローブ」又は「フットプリントプローブ」という用語は、構造に対して選択したレベルの酵素反応を必要とする最小構造を形成するよう選択されたプローブを指す。いくつかの実施形態では、フットプリントプローブは最適な性能（例えば認識、結合、切断等）に必要な最小構造を提供するよう選択され、いくつかの実施形態では、フットプリントプローブは、性能が例えば制限される、低下する、又はそうでなければその用途においてよりストリンジェントになるように、最適な性能に必要な最小構造より小さな構造を提供するよう選択される。
【００３０】
一例であり、本発明を任意の特定の核酸修飾酵素に限定するものではないが、特定の５’ヌクレアーゼ、例えばＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼは、標的核酸にアニールしたプローブを最適に認識及び切断するために、プローブと標的鎖との間の二本鎖が少なくとも約１２塩基対であることを好むことが決定できた。一般的に、より長いプローブ−標的二本鎖は、必ずしも酵素活性を低下させるものではないが、活性を更に増加させることもない（例えばＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼの結合又は切断活性）。酵素の対象活性（例えばＦＥＮ−１酵素によるプローブ切断）を上昇させることなく追加の二本鎖長を提供するプローブは、一般にこの酵素に対するフットプリントプローブの定義外である。例えばプローブ−標的二本鎖が少なくとも１２塩基対長であるときに最大活性を有するＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼでは、より長い塩基対、例えば１５若しくは１６、又はそれ以上の塩基対のプローブ／標的二本鎖を提供するプローブは、一般にこの特定の酵素に対するフットプリントプローブとはみなされない。仮にプローブ−標的二本鎖が少なくとも１５塩基対長であるときにのみ、異なるＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼが最大活性を有するとすれば（例えば異なる供与源由来のＦＥＮ、又は大きなフットプリントを有するよう改変されている、又はフットプリントがより小さなフットプリントから拡大されるよう決定された条件で用いられる）、第２のＦＥＮ−１に対するフットプリントプローブは１５ヌクレオチド以下のＡＳＲを有するプローブであろう。
【００３１】
本明細書で使用する「フットプリント二本鎖長」という用語は、二本鎖を認識する核酸修飾酵素、例えばＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼが反応条件で十分な活性を示す最小長の二本鎖を指す。例えば上述のようにプローブ−標的二本鎖が少なくとも１２塩基対長であるとき最大活性を有するＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼでは、ＦＥＮ−１酵素のフットプリント二本鎖長は１２塩基対である。フットプリントプローブは一般に、プローブが用いられる酵素の最大のフットプリント二本鎖長であるが、それを超えない長さを有するＡＳＲを提供する。
【００３２】
本明細書で使用する「ダイナミックレンジ」という用語は、検出アッセイ（例えば核酸検出アッセイ）において有用な定量範囲を指す。例えば、ウイルス検出アッセイのダイナミックレンジは、ウイルス粒子の最小数（例えばコピー数）とウイルス粒子の最大数との間の範囲であって、アッセイがそれらを判別することができる範囲である。
【００３３】
本明細書で使用する「被験体」及び「患者」という用語は、植物、微生物、及び動物（例えばイヌ、ネコ、家畜、及びヒト等の哺乳類）を含む任意の生物を指す。
【００３４】
「プライマー」という用語は、プライマー伸長が開始される条件下に置かれたとき、合成開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチド「プライマー」は、精製された制限酵素消化物として天然に存在してもよく、又は合成で生成してもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーはテンプレート核酸とともに用いられ、プライマー伸長はテンプレート依存性であり、その結果テンプレートの相補体が形成される。
【００３５】
本明細書で使用する「切断構造」という用語は、二本鎖を含む構造を形成する、少なくとも１つのプローブオリゴヌクレオチドと標的核酸との相互作用により形成される構造を指し、得られた構造は切断手段（酵素が挙げられるがこれに限定されない）により切断可能である。切断構造は、切断試薬による特異的切断の基質であり、二次構造を問わず核酸分子を切断する（すなわち二本鎖構造の形成を必要としない）ホスホジエステラーゼ等の試薬による非特異的切断の基質である核酸分子とは対照的である。
【００３６】
本明細書で使用する「侵入的切断構造」という用語は、ｉ）標的核酸、ｉｉ）上流核酸（例えばＩＮＶＡＤＥＲオリゴヌクレオチド）、及びｉｉｉ）下流核酸（例えばプローブ）を含む切断構造を指し、前記上流及び下流核酸は標的核酸の隣接領域にアニールし、上流核酸の３’部分と、下流核酸と標的核酸との間に形成される二本鎖との間に重複部が形成される。重複部は、上流核酸の重複塩基（１又は複数）が標的核酸と相補的又は非相補的であっても、またそれらの塩基が天然塩基又は非天然塩基であっても、上流核酸と下流核酸の１つ以上の塩基が標的核酸の塩基に対して同位置を占有している場合に生じる。いくつかの実施形態では、下流二本鎖と重複する上流核酸の３’部分は、例えば米国特許第６，０９０，５４３号（全文が本明細書に参照することにより援用される）に開示されているような、芳香環構造等の非塩基化学部分である。いくつかの実施形態では、例えば核酸ステムループ等の共有結合によって、又は非核酸化学結合（例えば多炭素鎖）によって、１つ以上の核酸が互いに結合していてもよい。
【００３７】
本明細書で使用する「切断手段」又は「切断試薬」という用語は、切断構造を切断できる任意の手段を指し、例えば酵素が挙げられるがこれに限定されない。「構造特異的ヌクレアーゼ」又は「構造特異的酵素」は、核酸分子中の特定の二次構造を認識し、これらの構造を切断する酵素である。本発明の切断試薬は、切断構造の存在に応答して核酸分子を切断し、必ずしも切断試薬が切断構造内の任意の特定の位置で切断構造を切断する必要はない。
【００３８】
切断試薬としては、Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）製のＣＬＥＡＶＡＳＥ酵素、ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ（ＲＡＤ２及びＸＰＧタンパク質、天然若しくは改変型ＦＥＮ−１酵素、又は１つ以上のＦＥＮ−１酵素の少なくとも一部を含むキメラ酵素を含む）、並びに５’ヌクレアーゼ活性を含む酵素、例えば真正細菌ＰｏｌＡポリメラーゼ等、限定されるものではないが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、及び大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ等を含む種々の供給元から提供されるヌクレアーゼ活性を挙げることができる。切断試薬はまた、５’ヌクレアーゼ活性を有するが合成活性を欠く改変型ＤＮＡポリメラーゼも含む。本発明の方法及びキットで用いるのに好適な切断試薬の例は、米国特許第５，６１４，４０２号；同第５，７９５，７６３号；同第５，８４３，６６９号；同第７，１２２，３６４号；同第７，１５０，９８２号、並びにＰＣＴ出願ＷＯ９８／２３７７４号；ＷＯ０２／０７０７５５Ａ２号；及びＷＯ０１９０３３７Ａ２号（全文を本明細書に参照することにより援用する）に提供されている。
【００３９】
５’ヌクレアーゼ等の酵素に関して使用される「熱安定性」という用語は、高温、すなわち約５５℃以上で酵素が機能する又は活性を有する（すなわち触媒作用を行い得る）ことを示す。いくつかの実施形態では、酵素は６５℃以上の高温（例えば７５℃、８５℃、９５℃等）で機能する又は活性を有する。
【００４０】
本明細書で使用する「切断産物」という用語は、切断試薬と切断構造との反応（すなわち切断試薬による切断構造の処理）により生じる産物を指す。
【００４１】
本明細書で使用する「特異的にハイブリダイズする」という用語は、所与のハイブリダイゼーション条件下で、プローブ又はプライマーが実質的に、標的配列を含むサンプル中の標的配列にのみ検出可能にハイブリダイズする（すなわち非標的配列にはほとんどハイブリダイゼーションしない、又は検出不可能である）ことを意味する。核酸（例えば標的）及びプライマー又はプローブの変性とアニーリングサイクルを含む増幅方法では、所与のハイブリダイゼーション条件としては、増幅方法におけるアニーリング工程の条件、すなわち予測Ｔｍ値に基づいて選択されたアニーリング温度、及び選択したポリメラーゼ酵素に好適な塩条件が挙げられる。
【００４２】
本明細書で使用する「増幅（された）」という用語は、分子、部分又は効果の存在量の増加を指す。標的核酸は、例えばＰＣＲ等のインビトロ複製により増幅し得る。シグナル、例えば検出可能な事象又は産物は、標的核酸の存在を示す。
【００４３】
本明細書で使用するとき、核酸増幅手段に関して用いられる「増幅方法」という用語は、対象核酸の存在量を特異的に増幅させるプロセスを意味する。いくつかの増幅方法（例えばポリメラーゼ連鎖反応、すなわちＰＣＲ）は、熱変性、オリゴヌクレオチドプライマーのテンプレート分子へのアニーリング、及びアニーリングしたプライマーの核酸ポリメラーゼによる伸長の反復サイクルを含む。これらの各工程に必要な条件及び時間は当該技術分野において周知である。いくつかの増幅方法は単一温度で実施され、「等温」であると見なされる。増幅産物の蓄積は指数関数的であっても直線的であってもよい。いくつかの増幅方法（「標的増幅」方法）は、例えばそれを多数回コピーすることにより、標的配列の存在量を増幅させるが（例えば、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、鎖置換増幅、リガーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ、ＩＣＡＮ、ＲＰＡ、ＳＰＩＡ、ＨＡＤ等）、いくつかの増幅方法は、標的配列を含んでいてもいなくてもよいが、その増幅が反応における特定の標的配列の存在を示す、核酸種の存在量を増幅させる（例えば、ローリングサークル増幅、ＲＡＭ増幅）。後者の方法は時に「シグナル増幅」方法と称される。いくつかのシグナル増幅方法は、出発核酸を変換することにより、例えば出発核酸を切断して切断産物を形成する、又は例えば重合若しくはライゲーションにより出発核酸を伸長させることにより、核酸種の存在量を増加させることができる。標的増幅方法をシグナル分子に適用することもでき（例えばＰＣＲを用いて多コピーのライゲーション、切断、又は非標的コピー反応産物を生成することができる）、逆も同様である。
【００４４】
本明細書で使用する「ポリメラーゼ連鎖反応」及び「ＰＣＲ」という用語は、ＤＮＡのセグメントがインビトロで標的核酸から複製される酵素反応を指す。この反応は一般にテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼにより標的核酸の各鎖上でプライマーを伸長させて、その鎖の一部の相補的コピーを生成することを含む。連鎖反応は、例えば加熱によりＤＮＡ鎖を変性させ、続いて冷却してプライマーをアニーリング及び伸長させるという反復サイクルを含み、結果としてプライマー結合部位に隣接し、該部位を含む標的核酸の領域のコピーが指数関数的に蓄積する。ＲＮＡ標的核酸がＰＣＲにより増幅される場合、一般にそれを最初に逆転写してＤＮＡコピー鎖を生成する。
【００４５】
本明細書で使用する「プライマーのアニーリング」という用語は、オリゴヌクレオチドプライマーがテンプレート核酸鎖にハイブリダイズするのを可能にする条件を指す。プライマーのアニーリング条件は、プライマーの長さ及び配列によって変化し、一般にプライマーの実測又は計算Ｔｍ値に基づく。例えば熱サイクルを含む増幅方法におけるアニーリング工程は、かかるアニーリングを可能にするのに十分な時間にわたり、熱変性工程後の温度をプライマー配列のＴｍに基づく温度に低下させることを含む。
【００４６】
本明細書で使用する「増幅可能な核酸」という用語は任意の増幅方法により増幅することができる核酸に関して用いられる。「増幅可能な核酸」は通常「サンプルテンプレート」を含むことが意図される。
【００４７】
核酸増幅又はシグナル増幅の検出に関して本明細書で使用する「リアルタイム」という用語は、反応が進行している間、例えばインキュベーション又は熱サイクル中に、反応における産物又はシグナルの蓄積を検出又は測定することを指す。かかる検出又は測定は連続的に行ってもよく、あるいは増幅反応が進行している間の別個の複数の時点で行ってもよく、あるいはこれらの組み合わせであってもよい。例えばポリメラーゼ連鎖反応では、検出（例えば蛍光の検出）を熱サイクルの全て又は一部の間に連続的に行ってもよく、あるいは１回以上のサイクル中の１つ以上の時点で一過的に行ってもよい。いくつかの実施形態では、ＰＣＲのリアルタイム検出は、複数のサイクルの各々における又は全サイクルにおける同時点（例えばサイクル中のある時点、又はサイクル中の温度工程）の蛍光レベルを測定することにより達成される。増幅のリアルタイム検出はまた、増幅反応「中」の検出と称してもよい。
【００４８】
本明細書で使用する「逆転写」及び「逆転写する」という用語は、テンプレート依存性ポリメラーゼを使用してＲＮＡテンプレートに対して相補的なＤＮＡ鎖を生成することを指す。
【００４９】
本明細書で使用する「核酸の存在量」という用語は、サンプル又はアリコート中に存在する特定の標的核酸配列の量を指す。この量は一般に質量（例えばμｇ）、単位体積当たりの質量（例えばμｇ／μＬ）；コピー数（例えば、１０００コピー、１アトモル）、又は単位体積当たりのコピー数（例えば１０００コピー／ｍＬ、１アトモル／μＬ）で表される。核酸の存在量はまた、既知の濃度又はコピー数の標準量に対する量としても表すことができる。核酸の存在量の測定は、サンプルの物理的密度、光学密度、屈折特性、染色特性を含む核酸の存在量の好適な定量的表現として当業者に理解される任意の基準でもよいし、又は検出可能な標識、例えば蛍光標識の強度に基づいていてもよい。
【００５０】
「アンプリコン」又は「増幅産物」という用語は、ＰＣＲプロセス等の増幅プロセスにより生成された核酸（一般にＤＮＡ）のセグメントを指す。この用語はまた、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ等のＲＮＡポリメラーゼを使用する増幅方法により生成されるＲＮＡセグメントに関しても用いられる。
【００５１】
熱サイクル増幅反応に関して用いられる「増幅プロット」という用語は、増幅の指標であるシグナルのプロット、例えば蛍光シグナル対サイクル数のプロットを指す。非熱サイクル増幅反応に関して用いられる場合には、増幅プロットは一般に時間の関数としてのシグナルの蓄積のプロットを指す。
【００５２】
増幅プロットに関して用いられる「基準」という用語は、インキュベーション前、又はＰＣＲの場合最初のサイクル中に、組み立てられた増幅反応から検出されるシグナルを指し、そこではシグナルはほとんど変化しない。
【００５３】
熱サイクルである増幅反応中のリアルタイム検出に関して本明細書で使用する「Ｃｔ」又は「閾値サイクル」という用語は、検出されたシグナル（例えば蛍光）が一定の閾値を超える部分（fractional）サイクル数を指す。
【００５４】
対照反応に関して本明細書で使用する「テンプレートなし対照」及び「標的なし対照」（又は「ＮＴＣ」）という用語は、テンプレート若しくは標的核酸を含まない反応又はサンプルを指す。それを用いて増幅品質を検証する。
【００５５】
検出反応に関して使用する「受動参照」という用語は、データ解析中にそれに対してレポーターシグナル（例えば別の色素）を正規化し得る内部参照を提供する、色素等の参照物質を指す。正規化は一般に濃度又は体積の変化によりもたらされる変動を補正するために必要である。
【００５６】
「Ｒｎ」又は「正規化されたレポーター」は、受動参照色素の蛍光発光強度で除したレポーター色素の蛍光発光強度を指す。
【００５７】
「Ｒｎ＋」は、テンプレート又は標的を含む全ての成分を含有する反応のＲｎ値を指す。
【００５８】
Ｒｎ−は未反応サンプルのＲｎ値を指す。Ｒｎ−値は、リアルタイム反応、例えばリアルタイムＰＣＲ実行の初期サイクル（蛍光の検出可能な増加前のサイクルから）、又は任意のテンプレートを含まない反応から得ることができる。
【００５９】
「ΔＲｎ」又は「デルタＲｎ」は、所与の増幅条件、例えばＰＣＲ条件のセットにより生じるシグナルの大きさを指す。ΔＲｎ値は、以下の式により決定される：（Ｒｎ＋）−（Ｒｎ−）。既知の濃度の標準Ａサンプルを用いて標準曲線を構築する。様々な濃度の標準で実行することにより、それから未知のサンプルの量を推定することができる標準曲線が作成される。
【００６０】
増幅反応のリアルタイム検出に関して用いられる「閾値」という用語は、調節可能な因子を乗じた初期ＰＣＲサイクルのＲｎの平均標準偏差を指す。閾値はＰＣＲ産物の指数関数的増加に関連する領域に設定すべきである。
【００６１】
定量アッセイに関して用いられる「未知」という用語は、未知の量のテンプレートを含有するサンプルを指し、一般に例えばリアルタイムＰＣＲ及び／又はＩＮＶＡＤＥＲアッセイ反応等の定量アッセイの性能により、その量を決定することが望まれるサンプルを指す。
【００６２】
本明細書で使用する「サンプルテンプレート」という用語は、「標的」の存在について分析されるサンプルに由来する核酸を指す。対照的に、「バックグラウンドテンプレート」は、サンプル中に存在してもしなくてもよいサンプルテンプレート以外の核酸に関して用いられる。バックグラウンドテンプレートの存在はほとんどの場合故意によるものではない。それはキャリーオーバーの結果である場合もあり、又はサンプルから分離して精製しようとする核酸混入物の存在によるものである場合もある。例えば検出対象以外の生物由来の核酸が試験サンプル中にバックグラウンドとして存在する場合がある。
【００６３】
プライマー、プローブオリゴヌクレオチド、又はＩＮＶＡＤＥＲオリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドに関して用いられる「分析物特異的領域」又は「ＡＳＲ」及び「分析物特異的部分」という用語は互換的に用いられ、標的核酸又は標的核酸のセット中の特定の核酸配列に特異的にハイブリダイズするよう選択されるオリゴヌクレオチドの領域／部分を指す。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの分析物特異的領域は、それがハイブリダイズする標的核酸のセグメントと完全に相補的であってもよく、他の実施形態では、分析物特異的領域はそれがハイブリダイズする標的核酸のセグメントに対して１つ以上のミスマッチを含んでいてもよい。更に他の実施形態では、分析物特異的領域は１つ以上の塩基類似体、例えば標的鎖中の塩基との間に改変された水素結合を有する、又は水素結合を有しない化合物を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの配列全体が分析物特異的領域であり、他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは分析物特異的領域、及び標的核酸と相補的ではない１つ以上の領域（例えば非相補的フラップ領域）を含む。
【００６４】
核酸基質に関して用いられる「実質的に一本鎖」という用語は、鎖内塩基対合相互作用により結合された２本の核酸鎖として存在する二本鎖基質と対照的に、基質分子が主に一本鎖核酸として存在することを意味する。
【００６５】
本明細書で使用する「解放（ｌｉｂｅｒａｔｉｎｇ）」という用語は、放出された断片がもはや残りのオリゴヌクレオチドに共有結合しないように、例えば５’ヌクレアーゼの作用により、オリゴヌクレオチド等のより大きな核酸断片から核酸断片を遊離させることを指す。
【００６６】
本明細書で使用する「微生物」という用語は、小さ過ぎて肉眼で観察することができない生物を意味し、細菌、ウイルス、原生生物、真菌、及び繊毛虫が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６７】
「微生物遺伝子配列」という用語は、微生物に由来する遺伝子配列を指す。
【００６８】
「細菌」という用語は任意の細菌種を指す。
【００６９】
互換的に用いられる「古細菌」、「古細菌種」、「古細菌の」、及び「始原菌」という用語は、生物の古細菌ドメイン又は界のメンバーとして分類される任意の生物を指す。
【００７０】
「ウイルス」という用語は、自律複製できない（すなわち複製に宿主細胞の機構の使用を必要とする）偏性、極微の細胞内寄生生物を指す。
【００７１】
「多剤耐性」又は「複数剤耐性」という用語は、前記微生物の処理で用いられる１種超の抗生物質又は抗微生物剤に対して耐性である微生物を指す。
【００７２】
「標的核酸の供与源」という用語は、核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）を含有する任意のサンプルを指す。標的核酸の特に好ましい供与源は、血液、唾液、脳脊髄液、胸水、乳、リンパ、痰、及び精液が挙げられるがこれらに限定されない生体サンプルである。
【００７３】
第１及び第２の標的核酸を「含有すると思われる」サンプルは、標的核酸分子のいずれかを含有していてもよく、両方を含有していてもよく、どちらも含有していなくてもよい。
【００７４】
「反応物質」という用語は、本明細書では最も広義で用いられる。反応物質は、例えば酵素反応物質、化学反応物質、又は光（例えば紫外線、特に短い波長の紫外線はオリゴヌクレオチド鎖を破壊することが知られている）を含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドと反応してオリゴヌクレオチドをより短くする（すなわち切断）又はより長くすることができる任意の試薬が、「反応物質」という用語に包含される。
【００７５】
本明細書で使用するとき、タンパク質に関して用いられる「一部」という用語は（「所与のタンパク質の一部」のように）、ポリペプチドのアミノ酸の完全鎖より短いタンパク質断片又はアミノ酸配列を指す。同様に、核酸に関して用いられるとき（「所与の核酸又はオリゴヌクレオチドの一部」のように）、この用語は核酸の断片、又は核酸若しくはオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの完全鎖より短いヌクレオチド配列を指す。一部は、１アミノ酸又はヌクレオチド残基からアミノ酸又はヌクレオチド配列全体のサイズ範囲であってもよい。
【００７６】
「二本鎖」という用語は、一方の鎖上のヌクレオチドの塩基部分が第２の鎖上に配置された相補的塩基に水素結合によって結合している核酸の状態を指す。二本鎖形態である条件は、核酸の塩基の状態が反映される。塩基対合により、核酸鎖はまた一般に主溝及び副溝を有する二重らせんの三次構造であると見なされる。二本鎖になっている最中にらせん形態であると仮定するのは暗黙の理解である。
【００７７】
「テンプレート」という用語は、その相補的コピーがテンプレート依存性核酸ポリメラーゼの活性によってヌクレオシド三リン酸から構築される核酸鎖を指す。二本鎖内で、テンプレート鎖は、慣例により、「下」鎖として表され、記載される。同様に、非テンプレート鎖は「上」鎖として表され、記載されることが多い。
【００７８】
本明細書で使用する「サンプル」という用語は最も広義で用いられる。例えば、いくつかの実施形態では、検体又は培養物（例えば微生物培養物）を含むことを意味するが、他の実施形態では、生体及び環境サンプル（例えば標的核酸、遺伝子、又はテンプレートを含むと思われる）の両方を含むことを意味する。いくつかの実施形態では、サンプルは合成源の検体を含んでいてもよい。サンプルは未精製であってもよく、部分的に若しくは完全に精製されているか、さもなくば加工されていてもよい。
【００７９】
本発明は、用いられる又は分析される生体サンプルの種類に限定されない。本発明は、ヒト（例えば成人、乳幼児、若しくは胚）、又は動物（例えばウシ、家禽、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ネコ、ウマ等）から得られる組織（例えば器官（例えば心臓、肝臓、脳、肺、胃、腸、脾臓、腎臓、膵臓、及び生殖器官（例えば卵巣）、腺、皮膚、及び筋肉組織）、細胞（例えば血液細胞（例えばリンパ球若しくは赤血球）、筋肉細胞、腫瘍細胞、及び皮膚細胞）、気体、体液（例えば血液若しくはその一部、血清、血漿、尿、精液、唾液等）、又は固体（例えば糞便）サンプルが挙げられるがこれらに限定されない種々の生体サンプルに有用である。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、乳製品、野菜、肉及び屠殺獣の肉以外の有用物、並びに廃棄物等の固形食及び／又は飼料製品及び／又は成分であってもよい。生体サンプルは、有蹄動物、クマ、魚類、ウサギ目、げっ歯類等が挙げられるがこれらに限定されない家畜、未馴化又は野生動物の種々の科の全てから得ることができる。
【００８０】
生体サンプルはまた、生検及び組織切片（例えば腫瘍、新生物、発疹、感染部の生検若しくは切片、又はパラフィン包埋切片）、医学的又は病院サンプル（例えば限定されるものではないが、血液サンプル、唾液、口腔スワブ検体、脳脊髄液、胸水、乳汁、初乳、リンパ、痰、嘔吐物、胆汁、精液、卵母細胞、子宮頸部細胞、羊水、尿、糞便、毛髪、及び汗）、研究室サンプル（例えば細胞成分分画）、並びに法医学的サンプル（例えば血液又は組織（例えば飛沫又は残留物）、核酸を含む毛髪及び皮膚細胞）、並びに考古学的サンプル（例えば化石化した生物、組織、又は細胞）も挙げられる。
【００８１】
環境サンプルとしては、表面物質、土壌、水（例えば淡水又は海水）、藻類、地衣類、地質サンプル、核酸を含む物質を含む空気、結晶、及び工業サンプル、並びに食品及び乳加工用具、装置、設備、器具、使い捨て製品及び使い捨てではない商品から得られるサンプル等の環境物質が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８２】
他の種類の生体サンプルとしては、細菌（例えば放線細菌（例えば、アクチノミセス属、アルスロバクター属、コリネバクテリウム属（例えばジフテリア菌）、マイコバクテリウム属（例えば結核菌及びハンセン菌）、プロピオン酸菌属（例えばアクネ菌）、ストレプトミセス属、クラミジア属（例えばトラコーマ病原体及びクラミジア肺炎病原体）、シアノバクテリア、ディノコッカス属（例えばサームス属（例えばサーマス・アクアチクス））、ファーミキューテス門（例えばバチルス属（例えば炭疽菌、セレウス菌、バチルス・チューリンゲンシス、及び枯草菌）、リステリア属（例えばリステリア菌）、スタフィロコッカス属（例えば黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、及び溶血性連鎖球菌）、フソバクテリウム門、プロテオバクテリア（例えばリケッチア目、スフィンゴモナス目、ボルデテラ（例えば百日咳菌）、ナイセリア目（例えば淋菌及び髄膜炎菌）、エンテロバクター目（例えばエシェリキア属（例えば大腸菌）、クレブシエラ属、プレシオモナス属、プロテウス属、サルモネラ属、シゲラ属、及びエルニシア属）、レジオネラ目、パスツレラ目（例えばインフルエンザ菌）、シュードモナス属、ビブリオ属（例えばコレラ菌及びビブリオ・バルニフィカス）、カンピロバクター目（例えばカンピロバクター属（例えばジェジュニ菌）、及びヘリコバクター属（例えばピロリ菌））、及びスピロヘータ鋼（例えばレプトスピラ属、ボレリア・ベルグドルフェリ、及び梅毒トレポネーマ）；古細菌（例えば好塩菌及びメタン細菌）；真核生物（例えば動物界（例えば環形動物門、節足動物門（例えば鋏角類、多足類、昆虫類、及び甲殻類）、軟体動物門、線形動物門（例えば線虫及び旋毛虫）、及び脊索動物（例えば条鰭亜綱、両生綱、鳥綱、軟骨魚綱、は虫綱、及び哺乳綱（例えば霊長目、げっ歯目、ウサギ目、及び食肉目））））；真菌類（例えば皮膚生菌類、フサリウム属、アオカビ属、及びサッカロミセス属）；植物界（例えば被子植物及びユリ綱））、及び原生生物界（例えばアピコンプレックス門（例えばクリプトスポリジウム属、プラスモジウム属（例えば熱帯熱マラリア原虫、及びトキソプラズマ）、及びメタモナーダ門（例えばランブル鞭毛虫）））；並びにウイルス（例えばｄｓＤＮＡウイルス（例えばバクテリオファージ、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、パピローマウイルス科、ポリオーマウイルス科、及びポックスウイルス科）、ｓｓＤＮＡウイルス（例えばパルボウイルス科）、ｄｓＲＮＡウイルス（レオウイルス科など）、（＋）ｓｓＲＮＡウイルス（例えばコロナウイルス科、アストロウイルス科、ブロモウイルス科、コモウイルス科、フラビウイルス科、ピコルナウイルス科、及びトガウイルス科）、（−）ｓｓＲＮＡウイルス（例えばボルナウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、ブニヤウイルス科、及びオルトミクソウイルス科）、ｓｓＲＮＡ逆転写ウイルス（例えばレトロウイルス科）、及びｄｓＤＮＡ逆転写ウイルス（例えばヘパドナウイルス科及びカリモウイルス科）が挙げられる。
【００８３】
サンプルは、任意の所望の方法又は好適な方法により調製できる。いくつかの実施形態では、米国特許出願公開第２００５０１８６５８８号（その全文を参照することにより本願に援用する）に記載されている方法を用いて体液又は他のサンプルから直接核酸を分析する。
【００８４】
しかしながら上記例は、本発明に適用可能なサンプルの種類（例えば標的配列、遺伝子、又はテンプレートを含むと思われるサンプル（例えばその存在又は非存在を本発明の組成物及び方法を用いて決定できる））を限定すると解釈されるものではない。
【００８５】
本明細書で使用する用語「ヌクレオチド類似体」、「非天然」、又は「天然に存在しない」という用語は、天然ヌクレオチド及び塩基以外のヌクレオチドを指す。かかる類似体並びに非天然塩基及びヌクレオチドとしては、修飾天然ヌクレオチド及び天然に存在しないヌクレオチドが挙げられ、例えば７−デアザプリン（すなわち７−デアザ−ｄＡＴＰ及び７−デアザ−ｄＧＴＰ）等のスタッキング相互作用の変化している類似体；代替水素結合構造を有する塩基類似体（例えばイソ−Ｃ及びイソ−Ｇ、並びに米国特許第６，００１，９８３号（Ｓ．Ｂｅｎｎｅｒ）に記載されている他の非標準的塩基対、並びに米国特許第５，９１２，３４０号（Ｉｇｏｒ  Ｖ．Ｋｕｔｙａｖｉｎら）に記載されている選択的に結合している塩基類似体）；非水素結合類似体（例えば、Ｂ．Ａ．Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  ａｎｄ  Ｅ．Ｔ．Ｋｏｏｌ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，５９，７２３８−７２４２，Ｂ．Ａ．Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  ａｎｄ  Ｅ．Ｔ．Ｋｏｏｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９５，１１７，１８６３−１８７２に記載されている２，４−ジフルオロトルエン等の無極性芳香族ヌクレオシド類似体）；５−ニトロインドール及び３−ニトロピロール等の「ユニバーサル」塩基；並びにユニバーサルプリン及びピリミジン（それぞれ「Ｋ」及び「Ｐ」ヌクレオチド；Ｐ．Ｋｏｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８９，１７，１０３７３−１０３８３，Ｐ．Ｋｏｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５１４９−５１５２）が挙げられるがこれらに限定されない。ヌクレオチド類似体としては、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの修飾型が挙げられる。「非天然」及び「天然に存在しない」塩基及びヌクレオチドは、自然界で絶対に見られない塩基に特に限定される訳ではない。核酸損傷等の天然プロセスは、本明細書で定義される「天然」ヌクレオチドのセットの一部であるとは一般に見なされない塩基を「天然に」発生させ得る。例えばイソ−Ｇは酸化的に損傷を受けたＤＮＡで見出され得る。かかる非天然塩基とその複製及び他の核酸合成中の挙動は、ＤＮＡ損傷研究等の状況で広く研究されているが、化合物は時に異なる用語を用いて記載される。例えば、イソグアノシン塩基を含むリボヌクレオチドは文献中ではｉＧ；イソＧ；イソ−Ｇ；イソグアノシン；２−ヒドロキシアデニン；２−オキソアデニン；２−ヒドロキシＡ；及び２−ＯＨ−Ａのように様々に称されている。イソグアノシン塩基を含むデオキシリボヌクレオシドは、ｉＧ；イソＧ；イソｄＧ；デオキシイソ−Ｇ；デオキシイソグアノシン；２−ヒドロキシデオキシアデノシン；２−ヒドロキシｄＡ；及び２−ＯＨ−Ａｄｅのように様々に称されている。
【００８６】
更に他のヌクレオチド類似体としては、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの修飾型が挙げられる。本発明の種々のオリゴヌクレオチド（例えば一次プローブ又はＩＮＶＡＤＥＲオリゴ）はヌクレオチド類似体を含有していてもよい。
【００８７】
本明細書で使用する「核酸配列」及び「核酸分子」という用語は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、又はポリヌクレオチド、及びその断片又は一部を指す。この用語は、上に列挙したものを含み、また４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシル−メチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュード−ウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル−グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチル−シトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシ−アミノ−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、２，６−ジアミノプリン、並びにピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、例えばグアニン類似体６アミノ１Ｈ−ピラゾロ［３，４ｄ］ピリミジン４（５Ｈ）オン（ｐｐＧ又はＰＰＧ、またＳｕｐｅｒＧ）及びアデニン類似体４アミノ１Ｈ−ピラゾロ［３，４ｄ］ピリミジン（ｐｐＡ又はＰＰＡ）が挙げられるがこれらに限定されないＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチドの類似体を含む配列を包含する。キサンチン類似体１Ｈ−ピラゾロ［５，４ｄ］ピリミジン４（５Ｈ）−６（７Ｈ）−ジオン（ｐｐＸ）を用いてもよい。これらの塩基類似体は、オリゴヌクレオチド中に存在するとき、ハイブリダイゼーションを強化し、ミスマッチの識別を改善する。天然に存在する塩基、修飾塩基、及び塩基類似体の全ての互変異性体型を本発明のオリゴヌクレオチド複合体に含んでいてもよい。本発明で有用な他の修飾塩基としては、６−アミノ−３−プロパ−１−イニル−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、ＰＰＰＧ；６−アミノ−３−（３−ヒドロキシプロパ−１−イニル）ｌ−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、ＨＯＰＰＰＧ；６−アミノ−３−（３−アミノプロパ−１−イニル）−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−  −オン、ＮＨ２ＰＰＰＧ；４−アミノ−３−（プロパ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、ＰＰＰＡ；４−アミノ−３−（３−ヒドロキシプロパ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、ＨＯＰＰＰＡ；４−アミノ−３−（３−アミノプロパ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、ＮＨ２ＰＰＰＡ；３−プロパ−１−イニルピラゾロ［３，��−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミノ、（ＮＨ２）２ＰＰＰＡ；２−（４，６−ジアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）エチン−１−オール、（ＮＨ２）２  ＰＰＰＡＯＨ；３−（２−アミノエチニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン、（ＮＨ２）２ＰＰＰＡＮＨ２；５−プロパ−１−イニル−１，３−ジヒドロピリミジン−２，４−ジオン、ＰＵ；５−（３−ヒドロキシプロパ−１−イニル）−１，３−ジヒドロピリミジン−２，４−ジオン、ＨＯＰＵ；６−アミノ−５−プロパ−１−イニル−３−ジヒドロピリミジン−２−オン、ＰＣ；６−アミノ−５−（３−ヒドロキシプロパ−１−イニ）−１，３−ジヒドロピリミジン−２−オン、ＨＯＰＣ；及び６−アミノ−５−（３−アミノプロパ−１−イニ）−１，３−ジヒドロピリミジン−２−オン、ＮＨ２ＰＣ；５−［４−アミノ−３−（３−メトキシプロパ−１−イニル）ピラゾール［３，４−ｄ］ピリミジニル］−２−（ヒドロキシメチル）オキソラン−３−オール、ＣＨ３ＯＰＰＰＡ；６−アミノ−１−［４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）オキソラン−２−イル］−３−（３−メトキシプロパ−１−イニル−１）−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、ＣＨ３ＯＰＰＰＧ；４，（４，６−ジアミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−ブタ−３−イン−１−オール、ＳｕｐｅｒＡ；６−アミノ−３−（４−ヒドロキシ−ブタ−１−イニル）−１，５−ジヒドロ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン；５−（４−ヒドロキシ−ブタ−１−イニル）−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオン、ＳｕｐｅｒＴ；３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（（ＮＨ２）２ＰＰＡＩ）；３−ブロモ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（（ＮＨ２）２ＰＰＡＢｒ）；３−クロロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（（ＮＨ２）２ＰＰＡＣｌ）；３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イルアミン（ＰＰＡＩ）；３−ブロモ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イルアミン（ＰＰＡＢｒ）；及び３−クロロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イルアミン（ＰＰＡＣｌ）が挙げられる。
【００８８】
上述の修飾塩基に加えて、本発明のオリゴヌクレオチドは糖又はグリコシド部分の骨格、好ましくは全てのヌクレオチド間結合が天然に存在するホスホジエステル結合である２−デオキシリボフラノシドを有していてもよい。しかしながら別の実施形態では、２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノース基が、他の糖、例えばβ−Ｄ−リボフラノースで置換されている。更にリボース部分の２−ＯＨがＣ１〜６アルキル基（（２−（Ｏ−Ｃ１〜６アルキル）リボース）又はＣ２〜６アルケニル基（２−（Ｏ−Ｃ２〜６アルケニル）リボース）でアルキル化されている、あるいはフルオロ基により置換されている（２−フルオロリボース）、β−Ｄ−リボフラノースが存在してもよい。本発明で有用な関連するオリゴマー形成糖は「ロック」されている、すなわちＣ−４’とＣ−２’の酸素原子との間にメチレン架橋を含むものである。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに適合する他の糖部分を用いてもよく、それは当業者に既知であり、例えばα−Ｄ−アラビノフラノシド、α−２’−デオキシリボフラノシド、又は２’，３’−ジデオキシ−３’−アミノリボフラノシドが挙げられるがこれらに限定されない。α−Ｄ−アラビノフラノシドを含むオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，１７７，１９６号に記載されているように調製することができる。２’，３’−ジデオキシ−３’−アミノリボフラノシドを含むオリゴヌクレオチドは、Ｃｈｅｎら  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３：２６６１−２６６８（１９９５）に記載されている。ロック核酸の合成手順（Ｓｉｎｇｈら，  Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，４５５−４５６（１９９８）；Ｗｅｎｇｅｌ  Ｊ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，３２：３０１−３１０（１９９８））及び２’−ハロゲン−２’−デオキシリボフラノシドを含むオリゴヌクレオチド（Ｐａｌｉｓｓａら，Ｚ．Ｃｈｅｍ．，２７：２１６（１９８７））もまた記載されている。本明細書に記載されている修飾オリゴヌクレオチドのリン酸骨格はまた、オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート結合及び／又はメチルホスホネート及び／又はホスホロアミデートを含むように修飾され得る（Ｃｈｅｎら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３：２６６２−２６６８（１９９５））。オリゴヌクレオチド結合の組み合わせはまた本発明の範囲内である。更に他の骨格修飾が当業者に既知である。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている修飾塩基はＰＮＡ及びＤＮＡ／ＰＮＡキメラに組み込まれてＴｍの平衡を保ち、ミスマッチの識別が改善された修飾オリゴヌクレオチドを提供する。ＤＮＡ及びＤＮＡ類似体の種々の修飾形態は、プローブ及びプライマーとしてのＤＮＡ分子の使用の不利点のいくつかを克服する試みで用いられている。特にペプチド核酸（ＰＮＡ、ポリアミド核酸としても知られている）である。Ｎｉｅｌｓｅｎら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００（１９９１）。ＰＮＡは、ＤＮＡ及びＲＮＡの糖−リン酸骨格特徴の代わりに、ポリアミド骨格により結合されている、ＤＮＡ及びＲＮＡで見られるような複素環式塩基単位を含む。ＰＮＡは、相補的ＤＮＡ及びＲＮＡ標的配列にハイブリダイズすることができ、実際対応する核酸プローブより強くハイブリダイズする。ＰＮＡオリゴマーの合成、及びＰＮＡオリゴマーの合成で用いる反応性モノマーの合成は、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；同第５，７７３，５７１号；同第５，７３６，３３６号、及び同第５，７６６，８５５号に記載されている。ＰＮＡ及びＤＮＡ／ＲＮＡキメラ合成とＰＮＡ合成用モノマーへの別のアプローチが要約されている。Ｕｈｌｍａｎｎら  Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３７：２７９６−２８２３（１９９８）。したがって、ＤＮＡ、ＰＮＡ、又はＤＮＡ／ＰＮＡキメラのＴｍの平衡を保つための、通常の塩基、非置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン塩基（例えばＰＰＧ及びＰＰＡ）、３−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、修飾プリン、修飾ピリミジン、５−置換ピリミジン、ユニバーサル塩基、糖修飾、骨格修飾、又は副溝バインダーの任意の組み合わせの使用は本発明の範囲内である。核酸、ＰＮＡ、及びＰＮＡ／ＤＮＡキメラ合成に必要な修飾塩基モノマー単位の合成に必要な合成方法は当該技術分野において利用可能であり、本出願及びＵｈｌｍａｎｎら  Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３７：２７９６−２８２３（１９９８）の方法を参照のこと。
【００９０】
核酸配列又は分子は、ゲノム又は合成供与源のＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく、それは一本鎖又は二本鎖であってもよく、センス鎖又はアンチセンス鎖を表す。したがって、核酸配列はｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、混合ｓｓＤＮＡ、混合ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡにされたｄｓＤＮＡ（例えば融解、変性、ヘリカーゼ等により）、Ａ−、Ｂ−、又はＺ−ＤＮＡ、三本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡの混合物、ｓｓＲＮＡにされたｄｓＲＮＡ（例えば融解、変性、ヘリカーゼ等により）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、触媒ＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はタンパク質核酸（ＰＮＡ）であってもよい。
【００９１】
本発明は、利用される核酸の種類又は供与源（例えば配列又は分子（例えば標的配列及び／又はオリゴヌクレオチド））により制限されるものではない。例えば核酸配列は、増幅された配列又は創製された配列（例えば合成による核酸配列の増幅又は創製（例えば重合（例えばプライマー伸長（例えばＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマー技術））及び逆転写（例えばＲＮＡをＤＮＡに）及び／又は増幅（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、サイクリングプローブ技術、Ｑ−ベータレプリカーゼ、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、分岐ＤＮＡシグナル増幅（ｂＤＮＡ）、ハイブリッドキャプチャー、及びヘリカーゼ依存性増幅）であってもよい。
【００９２】
「ヌクレオチド」及び「塩基」という用語は、本明細書で特に指示しない限り、核酸配列に関して用いるときは互換的に用いられる。
【００９３】
本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、２以上のヌクレオチド（例えばデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）、好ましくは少なくとも５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０〜１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１５〜３０ヌクレオチド、又はそれ以上（例えばオリゴヌクレオチドは典型的には２００残基長未満（例えば１５〜１００ヌクレオチド））を含む分子として定義されるが、本明細書で使用するとき、この用語はまたより長いポリヌクレオチド鎖を包含することも意図される。正確な大きさは多くの要因に依存し、その要因は最終的なオリゴヌクレオチドの機能又は用途に依存する。オリゴヌクレオチドはその長さにより呼ばれることが多い。例えば２４残基のオリゴヌクレオチドは「２４ｍｅｒ」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリダイズにより、又は他のポリヌクレオチドへのハイブリダイズにより二次構造及び三次構造を形成することができる。かかる構造としては、二本鎖、ヘアピン、十字型、屈曲、及び三本鎖が挙げられるがこれらに限定されない。オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、ＰＣＲ、又はこれらの組み合わせを含む任意の方法で作製することができる。いくつかの実施形態では、侵入的切断構造を形成するオリゴヌクレオチドは反応により作製される（例えば酵素伸長反応におけるプライマーの伸長）。
【００９４】
あるモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸がホスホジエステル結合を介して一方向にその近傍の３’酸素に結合する方法で、モノヌクレオチドが反応してオリゴヌクレオチドになるため、オリゴヌクレオチドの末端は、５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に結合しない場合「５’末端」と呼ばれ、その３’酸素が次のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に結合しない場合「３’末端」と呼ばれる。本明細書で使用するとき、核酸配列は、より大きなオリゴヌクレオチド内部である場合でさえも５’及び３’末端を有すると言うことができる。核酸鎖に沿った第１の領域は、５’から３’への方向に核酸鎖に沿って移動するとき、第１の領域の３’末端が第２の領域の５’末端の前にある場合、別の領域の上流にあると言われる。
【００９５】
２種の異なる重複しないオリゴヌクレオチドが同じ線状相補的核酸配列の異なる領域にアニールし、あるオリゴヌクレオチドの３’末端が他の５’末端の方向を指すとき、前者を「上流」オリゴヌクレオチド、後者を「下流」オリゴヌクレオチドと呼ぶことがある。同様に、２つの重複するオリゴヌクレオチドが同じ線状相補的核酸配列にハイブリダイズし、第１のオリゴヌクレオチドの５’末端が第２のオリゴヌクレオチドの５’末端の上流に存在し、第１のオリゴヌクレオチドの３’末端が第２のオリゴヌクレオチドの３’末端の上流に存在するように第１のオリゴヌクレオチドが位置付けられているとき、第１のオリゴヌクレオチドを「上流」オリゴヌクレオチドと呼ぶことができ、第２のオリゴヌクレオチドを「下流」オリゴヌクレオチドと呼ぶことができる。
【００９６】
本明細書で使用する「相補的」又は「相補性」という用語は、塩基対合ルールにより関連づけられているポリヌクレオチド（例えば２以上のヌクレオチド配列（例えばオリゴヌクレオチド又は標的配列））に関して用いられる。例えば配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」と相補的である。相補性は「部分的」であってもよく、この場合一部の核酸塩基のみが塩基対合ルールに従ってマッチする。あるいは、核酸塩基間に「完全」又は「全」相補性が存在してもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーション効率及び強度に大きな影響を与える。これは２以上の核酸鎖の会合に依存する増幅反応、及び検出法において特に重要である。個々のヌクレオチドに関して、特にポリヌクレオチドに関して、いずれの用語を使用してもよい。例えばオリゴヌクレオチド内の特定のヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド及び核酸配列の残りとの間の相補性と対比させて又は比べて、別の核酸配列（例えば標的配列）に対する相補性又は相補性の欠如について言及してもよい。
【００９７】
本明細書で使用する核酸配列の相補体は、ある配列の５’末端が他の配列の３’末端と対になるように核酸配列を整列させたとき、「逆平行会合」の状態であるオリゴヌクレオチドを指す。上述のようにヌクレオチド類似体は、本発明の核酸に含まれてもよく、本発明の核酸を含んでもよい。相補性は完全である必要はなく、安定な二本鎖はミスマッチ塩基対又は非マッチ塩基を含んでいてもよい。核酸技術の当業者は、例えばオリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成及び配列、ミスマッチ塩基対のイオン強度及び発生率を含む多数の変数を考慮して経験的に二本鎖の安定性を決定することができる。
【００９８】
「相同性」という用語は相補性の程度を指す。部分的相同性又は完全相同性（すなわち同一性）が存在する場合がある。部分的に相同な配列は、別の配列と１００％未満同一である配列である。「実質的に相同性」である部分的に相補的な配列は、完全に相補的な核酸分子が標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する核酸分子である。標的配列に対して完全に相補的な配列のハイブリダイゼーション阻害は、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションアッセイ（例えばサザンブロット、ノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて調べることができる。実質的に相同な配列又はプローブは、低ストリンジェンシー条件下で完全に相同な核酸分子の標的への結合（例えばハイブリダイゼーション）と競合し、阻害する。これは低ストリンジェンシー条件が、非特異的な結合を許容するという訳ではない（例えば低ストリンジェンシー条件が２つの配列の互いの結合が特異的（例えば選択的）相互作用であるような条件である場合もある）。非特異的結合の非存在は、実質的に非相補的である（例えば同一性約３０％未満）第２の標的を用いることにより試験できる。非特異的結合の非存在下ではプローブは第２の非相補的標的にハイブリダイズしない。
【００９９】
ｃＤＮＡ又はゲノムクローン等の二本鎖核酸配列に関して用いるとき、「実質的に相同」という用語は、上記のように低ストリンジェンシー条件下で二本鎖核酸配列のいずれかの鎖又は両方の鎖にハイブリダイズすることができる任意のプローブを指す。
【０１００】
一本鎖核酸配列に関して用いられるとき、「実質的に相同」という用語は、上記のように低ストリンジェンシー条件下で一本鎖核酸配列にハイブリダイズすることができる（例えば相補的な）任意のプローブを指す。
【０１０１】
「標的核酸」及び「標的配列」という用語は、検出又は分析される核酸を指す。したがって「標的」は、他の核酸又は核酸配列と区別される。例えば増幅反応に関して用いられるとき、これらの用語は反応により増幅される核酸又は核酸の一部を指してもよく、一方、多型に関して用いられるとき、これらの用語は疑わしい多型を含む部分を指してもよい。侵入的切断反応に関して使用するとき、これらの用語は少なくとも第１の核酸分子（例えばプローブオリゴヌクレオチド）と少なくとも部分的に相補的であり、また第２の核酸分子（例えばＩＮＶＡＤＥＲオリゴヌクレオチド）と少なくとも部分的に相補的であってもよい配列を含む核酸分子を指す。一般に標的核酸（例えばサンプル（例えば生体サンプル又は環境サンプル）内に存在する、サンプルから単離される、サンプルから濃縮した、サンプルから増幅された、又はサンプル内の）は、標的領域内に位置し、切断試薬により切断可能な第１及び第２の核酸分子（例えばプローブオリゴヌクレオチド及びＩＮＶＡＤＥＲオリゴヌクレオチド）と組み合わせて侵入的切断構造の形成の成功によって同定可能である。生物由来の標的核酸は、ゲノムＤＮＡ及びＲＮＡに限定されない。生物由来の標的核酸は、任意の核酸種を含んでいてもよく、例えばゲノムＤＮＡ及びＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、構造ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、及びｔＲＮＡ、並びにｓｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等の小ＲＮＡが挙げられるがこれらに限定されない。例えばその全文を参照することにより本願に援用する、２００３年１２月１８日に出願された同時係属米国特許出願第１０／７４０，２５６号参照。「セグメント」は標的配列内の核酸領域として定義される。
【０１０２】
本明細書で使用する「プローブオリゴヌクレオチド」という用語は、標的核酸と相互作用して検出可能な複合体を形成するオリゴヌクレオチドを指す。ＴＡＱＭＡＮアッセイ及びＩＮＶＡＤＥＲアッセイ等の５’ヌクレアーゼ切断アッセイでは、プローブオリゴヌクレオチドは標的核酸にハイブリダイズし、プローブオリゴヌクレオチド内で切断が生じる。いくつかの実施形態では、プローブと標的との複合体はそれが存在してる間検出されるが、いくつかの実施形態では、複合体の形成は、例えばプローブ／標的複合体の形成の結果として生じる事象（例えば切断事象）の検出により、それがもはや存在していなくても検出することができる。
【０１０３】
「ＩＮＶＡＤＥＲオリゴヌクレオチド」という用語は、プローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーション領域付近の位置で標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、プローブと標的との間のハイブリダイゼーション領域に重複する部分（例えば化学部分、又はヌクレオチド、標的に相補的又は非相補的のいずれでも）を含むオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、ＩＮＶＡＤＥＲオリゴヌクレオチドは、プローブオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する配列と実質的に同じ配列を３’末端に含む。
【０１０４】
本明細書で使用する「カセット」という用語は、プローブオリゴヌクレオチドの切断に応答して検出可能なシグナルが生じるよう構成されているオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの組み合わせを指す。好ましい実施形態では、カセットはプローブオリゴヌクレオチドの切断により生じた切断産物にハイブリダイズして、第２の侵入的切断構造を形成し、その結果カセットは次いで切断され得る。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、カセットはヘアピン部分（すなわちカセットオリゴヌクレオチドのある部分が反応条件下で同じオリゴヌクレオチドの第２の部分にハイブリダイズして二本鎖を形成する領域）を含む単一オリゴヌクレオチドである。他の実施形態では、カセットは反応条件下で二本鎖を形成できる相補的部分を含む少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、カセットは標識を含む。特に好ましい実施形態では、カセットは、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）効果を生じさせる標識部分を含む。
【０１０６】
オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドが他のオリゴヌクレオチド（又は標的核酸配列）より高いモル濃度で存在する場合、別のオリゴヌクレオチド（又は標的核酸配列）に対して「過剰」に存在すると言われる。プローブオリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドが相補的標的核酸配列の濃度に対して過剰に切断反応中に存在するとき、反応を用いて存在する標的核酸配列の量を示すことができる。典型的には、過剰に存在するとき、プローブオリゴヌクレオチドは少なくとも１００倍モル濃度過剰に存在し、標的核酸配列が約１０ｆｍｏｌ以下で存在するとき典型的には少なくとも１ピコモルの各プローブオリゴヌクレオチドが用いられる。
【０１０７】
本明細書で使用する「遺伝子」という用語は、ポリペプチド、前駆体、又はＲＮＡ（例えばｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えばＤＮＡ）配列を指す。ポリペプチドは、完全長ポリペプチド又はポリペプチド断片の所望の活性又は機能特性（例えば酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達、免疫原性等）が保持される限り、完全長コード配列又はコード配列の任意の部分によりコードされ得る。この用語はまた、遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さに一致するよう、構造遺伝子のコード領域、並びにいずれかの末端から約１ｋｂ以上の距離で５’及び３’末端の両方においてコード領域に隣接して位置する配列も包含する。コード領域の５’に位置しｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の３’又は下流に位置しｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と呼ばれる。「遺伝子」という用語は、遺伝子のｃＤＮＡ及びゲノム形態の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態又はクローンは、「イントロン」又は「介在領域」又は「介在配列」と命名された非コード配列で中断されているコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（例えばｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントであり、イントロンは調節エレメント（例えばエンハンサ）を含んでいてもよい。イントロンは核又は一次転写産物から除去される、又は「切り出される」。したがってイントロンはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物中には存在しない。ｍＲＮＡは翻訳中に新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列又は順序を特定するために機能する。
【０１０８】
本明細書で使用する「異種遺伝子」という用語は、その天然環境には存在しない遺伝子を指す。例えば、異種遺伝子はある種から別の種へ導入された遺伝子を含む（例えばヒト宿主内に存在するウイルス又は細菌遺伝子（例えば染色体外又は宿主ＤＮＡに組み込まれる））。異種遺伝子はまた、いくつかの方法で改変されている生物由来の遺伝子を含む（例えば、突然変異している、複数のコピーに付加されている、非天然制調節配列に結合している等）。いくつかの実施形態では、異種遺伝子は、異種遺伝子配列が典型的には染色体内の遺伝子配列と天然では会合することが見出されていないＤＮＡ配列に結合する、又は自然界には見られない染色体の部分と会合する（例えば遺伝子が通常発現しない遺伝子座で発現している遺伝子）という点で内因性遺伝子と区別できる。
【０１０９】
本明細書で使用する「遺伝子発現」という用語は、遺伝子の「転写」によってＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はｓｎＲＮＡ）に、タンパク質をコードしている遺伝子の場合はｍＲＮＡの「翻訳」によってタンパク質になる、遺伝子にコードされている遺伝情報を変換するプロセスを指す。遺伝子発現はこのプロセスの多くの段階で制御され得る。「アップレギュレーション」又は「活性化」は、遺伝子発現産物（例えばＲＮＡ又はタンパク質）の産生を増加させる制御を指し、一方「ダウンレギュレーション」又は「抑制」はその産生を減少させる制御を指す。アップレギュレーション又はダウンレギュレーションに関与する分子（例えば転写因子）は、それぞれ「活性化因子（アクチベーター)」及び「リプレッサー」と呼ばれることが多い。
【０１１０】
イントロンを含むことに加えて、遺伝子のゲノム形態はまたＲＮＡ転写産物上に存在する配列の５’及び３’末端の両方に位置する配列を含んでいてもよい。これらの配列は「フランキング」配列又は領域と称される（例えば、これらのフランキング配列はｍＲＮＡ転写産物上に存在する非翻訳配列の５’又は３’に位置し得る）。５’フランキング領域は、遺伝子の転写をコントロールする又は影響を与えるプロモータ及びエンハンサ等の調節配列を含んでいてもよい。３’フランキング領域は、転写の終結、転写後切断、及びポリアデニル化を指示する配列を含んでいてもよい。
【０１１１】
「野性型」という用語は、天然に存在する供与源から単離された遺伝子又は遺伝子産物を指す。野性型は、集団中で最も頻繁に見られ、したがって任意に設計された遺伝子の「正常」又は「野性型」形態である。対照的に、「改変」又は「突然変異」という用語は、野性型遺伝子又は遺伝子産物と比べて、配列又は機能特性が改変されている（例えば特徴が変化している）遺伝子又は遺伝子産物を指す。天然に存在する突然変異体を単離できることに留意すべきである（例えば野性型遺伝子又は遺伝子産物と比べて特徴が変化している（例えば核酸配列が変化している）という事実により同定される）。
【０１１２】
核酸に関して用いられる「単離」という用語は（例えば「単離オリゴヌクレオチド」又は「単離ポリヌクレオチド」又は「単離核酸配列」）は、天然源では通常会合している少なくとも１成分又は混入物質から分離された核酸配列を指す。したがって、単離核酸は自然界で見られるものとは異なる形態又は状態で存在する。対照的に、非単離核酸は、自然界で存在する状態で見られるＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸である。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば遺伝子）は周辺の遺伝子と近接して宿主細胞の染色体上に見られ、特定のタンパク質をコードしている特定のｍＲＮＡ配列等のＲＮＡ配列は多くのタンパク質をコードしている多数の他のｍＲＮＡとの混合物として細胞内に見られる。しかしながら、所与のタンパク質をコードしている単離核酸としては、一例として、核酸が天然細胞とは異なる染色体上の位置に存在する、又はさもなければ自然界で見られるものとは異なる核酸配列に隣接する場合、所与のタンパク質を通常発現する細胞内のかかる核酸が挙げられる。単離核酸、オリゴヌクレオチド、又はポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖形態で存在してもよい。単離核酸、オリゴヌクレオチド、又はポリヌクレオチドを利用してタンパク質を発現させるとき、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは最低限センス鎖又はコード鎖を含む（例えばオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは一本鎖であってもよい）が、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含んでいてもよい（例えばオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは二本鎖であってもよい）。
【０１１３】
本明細書で使用する「精製された」又は「精製する」という用語は、サンプル（例えば分子（例えば核酸又はアミノ酸配列））に関して用いられるとき、その天然環境からサンプルを取り出す（例えば単離及び／又は分離する）ことを指す。用語「実質的に精製された」とは、その天然環境から取り出されており（例えば単離及び／又は精製）、天然に会合している他の成分の少なくとも６０％を含まない、好ましくは７５％を含まない、又は最も好ましくは９０％を含まない、又はそれ以上を含まないサンプル（例えば分子（例えば核酸又はアミノ酸配列）を指す。「単離ポリヌクレオチド」又は「単離オリゴヌクレオチド」はしたがって、天然で会合している他の成分を含まない（例えば６０％、７５％、又はより好ましくは９０％以上）ようにされている場合、実質的に精製されていることになる。
【０１１４】
本発明は、（例えば精製された又は実質的に精製された分子（例えば核酸配列）を生成するための）精製の任意の特定の手段に限定されない。実際、遠心分離（例えば等密度、沈降速度、勾配、及び分画遠心）、電気泳動（例えばゲル及びキャピラリー電気泳動）、ゲル濾過、マトリックス捕捉、電荷捕捉、質量捕捉、抗体捕捉、磁気分離、フローサイトメトリー、及び配列特異的ハイブリダイゼーションアレイ捕捉が挙げられるがこれらに限定されない種々の精製技術を利用することができる。
【０１１５】
本明細書で使用する「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的核酸の対合に関して用いられる。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション強度（例えば核酸間の会合強度）は、核酸間の相補性の程度、必要とされる条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴｍ、及び核酸中のＧ：Ｃ比等の要因に影響を受ける。その構造内に相補的核酸の対合を含む単一分子を「自己ハイブリダイズしている」と言う。
【０１１６】
本明細書で使用する「Ｔｍ」という用語は「融解温度」に関して用いられる。融解温度は、二本鎖核酸分子の集団の半分が一本鎖に解離した状態になる温度である。「計算Ｔｍ値」は、反応条件（例えば混合物中の塩濃度、相補鎖の濃度）の要因に加えて、相補的核酸の物理的配列から計算することにより決定される融解温度を指す。核酸のＴｍを計算するためのいくつかの式が当該技術分野において周知である。標準的な参考文献により指示されているように、核酸が１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液中に存在するとき、Ｔｍ値の単純な推定は以下の等式により計算できる：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）（例えばＹｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，（１９８５）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｈａｍｅｓ＆Ｈｉｇｇｉｎｓ編）ｐｐ４７−７１，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）参照）。Ｔｍを計算するための他の計算法も当該技術分野において既知であり、構造及び環境、並びに配列特徴を考慮したものである（例えばＡｌｌａｗｉ，Ｈ．Ｔ．ａｎｄ  ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｊ．，Ｊｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，１０５８１−９４（１９９７））及びＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，９５（４）：１４６０（１９９８）参照）。
【０１１７】
本明細書で使用する「ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬」という用語は、標的配列を検出するための１つ以上の試薬を指し、前記試薬は標的配列の存在下で侵入的切断構造の形成に関与し得る核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬は予め形成された構造の侵入的切断構造を形成するために必要な核酸分子の全てを含み、いくつかの実施形態では、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬は、侵入的切断構造の形成において用いられる核酸分子の形成を可能にする１つ以上の追加試薬（例えばプライマー、重合化酵素、リガーゼ、ヌクレアーゼ）を提供する、又はこれらと併用される。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬は侵入的切断構造（例えば切断試薬）の存在を検出するための試薬を更に含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は第１及び第２のオリゴヌクレオチドを含み、第１オリゴヌクレオチドは標的核酸の第１の領域に対して相補的な５’部分を含み、第２のオリゴヌクレオチドは３’部分と５’部分とを含み、前記５’部分は第１の領域の下流であり第１の領域に隣接している標的核酸の第２の領域に対して相補的である。いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドの３’部分は標的核酸に対して相補的ではない３’末端ヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドの３’部分は、標的核酸に対して相補的ではない単一ヌクレオチドから成る。ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬は、例えば米国特許第５，８４６，７１７号、同第５，９８５，５５７号、同第５，９９４，０６９号、同第６，００１，５６７号、同第６，９１３，８８１号、同第６，０９０，５４３号、ＷＯ９７／２７２１４号、ＷＯ９８／４２８７３号、米国特許出願公開第２００５００１４１６３号、同第２００５００７４７８８号、同第２００５０１６５９６号、同第２００５０１８６５８８号、同第２００４０２０３０３５号、同第２００４００１８４８９号、同第２００５０１６４１７７号、米国特許出願第１１／２６６，７２３号、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２９２（１９９９）、及びＨａｌｌら，ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，９７：８２７２（２０００）に見出すことができ、これらは全ての目的のためにその全文を参照することにより本願に援用する。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬は、二本鎖領域を含む介在領域により分離されている第１及び第２の非連続一本鎖領域を含む標的核酸配列を検出するよう構成されている。特定の実施形態では、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬は、標的核酸配列の第１及び第２の非連続一本鎖領域に結合できる架橋オリゴヌクレオチドを含む。特に好ましい実施形態では、前記ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬の前記第１及び／又は前記第２のオリゴヌクレオチドのいずれか又は両方が架橋オリゴヌクレオチドである。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬は固体支持体を更に含む。例えばいくつかの実施形態では、アッセイ試薬の１つ以上のオリゴヌクレオチド（例えば架橋又は未架橋の、第１及び／又は第２のオリゴヌクレオチド）が前記固体支持体に結合している。アッセイ試薬の１つ以上のオリゴヌクレオチドは、固体支持体に直接的又は間接的に（例えばスペーサ分子（例えばオリゴヌクレオチド）を介して）結合していてもよい。代表的な固相侵入的切断反応は、米国特許出願公開第２００５０１６４１７７号及び同第２００３０１４３５８５号に記載されており、その全文を参照することにより本願に援用する。
【０１２１】
本明細書で使用する「固体支持体」は、アッセイ条件下でその形状を維持し、液相から分離することができる任意の物質である。その形状を維持する支持体は剛性である必要はない。実際、液相から分離することができる限り炭水化物鎖等の可撓性ポリマーを固体支持体として用い得ることも想定されている。本発明は利用される固体支持体の種類に限定されない。実際、種々の固体支持体が本発明で有用であると想定されており、例えばビーズ、平面、制御化多孔性ガラス（ＣＰＧ）、ウェハー、ガラス、シリコン、ダイヤモンド、グラファイト、プラスチック、常磁性ビーズ、磁気ビーズ、ラテックスビーズ、超常磁性ビーズ、複数のビーズ、マイクロ流体チップ、シリコンチップ、顕微鏡用スライド、マイクロプレートウェル、シリカゲル、高分子膜、粒子、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲル、多糖類、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ナイロン、セファロース、ポリ（アクリレート）、ポリスチレン、ポリ（アクリルアミド）、ポリオール、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、デンプン、フィコール、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、ニトロセルロース、ジアゾセルロース又はデンプン、高分子微粒子、高分子膜、高分子ゲル、ガラススライド、スチレン、マルチウェルプレート、カラム、マイクロアレイ、ラテックス、ヒドロゲル、多孔質３Ｄ親水性ポリマーマトリックス（例えば、ＨＹＤＲＯＧＥＬ，  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，Ｃｏｎｎ．）、光ファイバー束及びビーズ（例えばＢＥＡＤＡＲＲＡＹ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）、米国特許出願公開第２００５０１６４１７７号に記載）、小粒子、膜、フリット、スライド、微小チップ、アルカンチオール−金層、非多孔質表面、アドレス指定可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）アレイ、及びポリヌクレオチド固定化媒体（例えば米国特許出願公開第２００５０１９１６６０号に記載）が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、固体支持体は結合層又は物質（例えば金、ダイヤモンド、又はストレプトアビジン）でコーティングされている。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬は緩衝溶液を更に含み、いくつかの好ましい実施形態では、緩衝溶液は二価カチオン（例えばＭｎ２＋及び／又はＭｇ２＋イオン）源を含む。集合的にＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬を構成する個々の成分（例えばオリゴヌクレオチド、酵素、緩衝剤、標的核酸）を「ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬成分」と称する。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬は第１の標的核酸（例えばスタッカーオリゴヌクレオチド）の第１の部分の上流の標的核酸の第３の部分に対して相補的な第３のオリゴヌクレオチドを更に含む。更に他の実施形態では、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬は標的核酸を更に含む。いくつかの実施形態では、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬は第２の標的核酸を更に含む。更に他の実施形態では、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬は第２の標的核酸の第１の領域に対して相補的な５’部分を含む第３のオリゴヌクレオチドを更に含む。いくつかの特定の実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドの３’部分は第２の標的核酸に共有結合している。他の特定の実施形態では、第２の標的核酸は５’部分を更に含み、ここで第２の標的核酸の５’部分は第３のオリゴヌクレオチドである。更に他の実施形態では、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬はＡＲＲＥＳＴＯＲ分子（例えばＡＲＲＥＳＴＯＲオリゴヌクレオチド）を更に含む。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、１つ以上のＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬又はＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬成分は、予め分配された形式で提供されてもよい（例えば再測定又は再分配すること無しに手順の工程で使用するために予め測定されている）。いくつかの実施形態では、選択されたＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬成分は混合され、共に予め分配される。好ましい実施形態では、事前分配アッセイ試薬成分は予め分配されており、反応容器（例えば反応チューブ又はウェル（例えばマイクロタイタープレート）が挙げられるがこれらに限定されない）内に提供される。特定の好ましい実施形態では、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬は、米国特許第６，６２７，１５９号、同第６，７２０，１８７号、同第６，７３４，４０１号、同第６，８１４，９３５号、及び米国特許出願公開第２００２／００６４８８５号（それぞれその全文を参照することにより本願に援用する）に記載されているもの等のマイクロ流体デバイス内に提供される。特に好ましい実施形態では、事前分配ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬成分は反応容器内で乾燥している（例えば乾燥又は凍結乾燥）。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬又はＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬成分はキットとして提供される。本明細書で使用する「キット」という用語は、物質を供給するための任意の供給システムを指す。反応アッセイについて、かかる供給システムとしては、ある位置から別の位置へ反応試薬（例えばオリゴヌクレオチド、酵素等、適切な容器内のもの）及び／又は補助物質（例えば緩衝剤、アッセイを実施するための説明書に記載されているなど）を保管する、輸送する、又は供給することを可能にするシステムが挙げられる。例えばキットは、関連反応試薬及び／又は補助物質を収容している１つ以上の筐体（例えば箱）を含む。本明細書で使用する「細分化キット」という用語は、それぞれキット成分全体の一部を収容している２以上の別個の容器を備える供給システムを指す。容器は、一緒に又は別々に対象レシピエントに供給することができる。例えば第１の容器はアッセイで用いられる酵素を収容してもよく、第２の容器はオリゴヌクレオチドを収容する。「細分化キット」という用語は、連邦食品医薬品化粧品法（Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｆｏｏｄ，Ｄｒｕｇ，ａｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ａｃｔ）の第５２０条（ｅ）項に規定されている分析物特異的試薬を含むキットを包含することを意図するが、これに限定されない。実際、それぞれキット成分全体の一部を収容している２以上の別個の容器を備える任意の供給システムが「細分化キット」という用語に含まれる。対照的に、「組合せキット」は単一容器（例えば所望の成分のそれぞれを収容している単一箱）内に反応アッセイの成分の全てが収容されている供給システムを指す。「キット」という用語は、細分化キット及び組合せキットの両方を含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明を実施するために必要な１つ以上の成分を備えるＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬キットを提供する。例えば、本発明はＩＮＶＡＤＥＲアッセイを実施するために必要な酵素及び／若しくは反応成分を保管又は供給するためのキットを提供する。キットは、例えば試薬自体、緩衝剤、対照試薬（組織サンプル、陽性及び陰性対照標的オリゴヌクレオチド等）、固体支持体、標識、文章及び／又は絵による説明書、並びに製品情報、阻害剤、標識試薬及び／又は検出試薬、包装用環境制御物質（例えば氷、乾燥剤等）等が挙げられるがこれらに限定されないアッセイに必要な又は望ましい任意の及び全ての成分を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、キットは必要な成分の部分集合であって、ユーザが残りの成分を補充することが予想されるキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは各容器が供給される成分の部分集合を収容している２以上の別個の容器を備える。例えば第１の容器（例えば箱）は酵素（例えば好適な保管緩衝剤及び容器内の構造特異的切断酵素）を収容していてもよく、第２の箱はオリゴヌクレオチド（例えばＩＮＶＡＤＥＲオリゴヌクレオチド、プローブオリゴヌクレオチド、対照標的オリゴヌクレオチド等）を含有していてもよい。
【０１２７】
いくつかの好ましい実施形態では、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬は核酸切断産物を検出するための試薬を更に含む。いくつかの実施形態では、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬中の１つ以上のオリゴヌクレオチドが標識を含む。いくつかの好ましい実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドは標識を含む。他の好ましい実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドは標識を含む。特に好ましい実施形態では、試薬は蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）効果を生じさせる部分で標識された第１及び／又は第３のオリゴヌクレオチドを含む。
【０１２８】
本明細書で使用する「標識」という用語は、検出され得る又は検出可能な反応を導くことができる任意の部分（例えば化学種）を指す。いくつかの好ましい実施形態では、標識の検出は定量可能な情報を提供する。標識は、例えば放射性標識（例えば放射性核種）、リガンド（例えばビオチン又はアビジン）、発色団（例えば検出可能な色を付与する色素又は粒子）、ハプテン（例えばジゴキシゲニン）、質量標識（ｍａｓｓ  ｌａｂｅｌ）、ラテックスビーズ、金属粒子、常磁性標識、発光化合物（例えば生物発光、リン光、又は化学発光標識）、あるいは蛍光化合物等の任意の既知の検出可能な部分であってよい。
【０１２９】
標識は、オリゴヌクレオチド又は他の生物分子に直接又は間接的に結合することができる。直接標識は、共有結合、又は水素結合、疎水性及びイオン性相互作用等の非共有結合性相互作用を含む、標識をオリゴヌクレオチドに結合させる結合又は相互作用によって、あるいはキレート錯体又は配位錯体の形成によって行い得る。間接標識は、直接又は間接的に標識されている抗体又は追加のオリゴヌクレオチド（１又は複数）等の架橋部分又は「リンカー」の使用によって生じ得る。
【０１３０】
標識は単独で、又は標識（例えば発光標識）の発光スペクトルを抑制（例えば消光）、励起、又は転移（例えばシフト）（例えば蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ））することができる部分と組み合わせて用いてもよい。
【０１３１】
本明細書で使用する「ＦＲＥＴ」という用語は、蛍光共鳴エネルギー転移を指し、これは部分（例えばフルオロフォア）がエネルギーを、例えば自身の中で、又はフルオロフォアから非フルオロフォア（例えばクエンチャー分子）へ転移させるプロセスである。いくつかの状況では、ＦＲＥＴは、短距離（例えば約１０ｎｍ以下）の双極子−双極子相互作用を介して低エネルギーアクセプタフルオロフォアへエネルギーを転移するドナーフルオロフォアを励起することを含む。他の状況では、ＦＲＥＴはドナーからの蛍光エネルギーの喪失、及びアクセプタフルオロフォアにおける蛍光の増加を含む。ＦＲＥＴの更に他の形態では、エネルギーは励起されたドナーフルオロフォアから非蛍光分子（例えば消光分子）へ交換され得る。ＦＲＥＴは当業者に既知であり、既に報告されている（例えばＳｔｒｙｅｒら，１９７８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：８１９；Ｓｅｌｖｉｎ，１９９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２４６：３００；Ｏｒｐａｎａ，２００４  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇ  ２１，４５−５０；Ｏｌｉｖｉｅｒ，２００５  Ｍｕｔａｎｔ  Ｒｅｓ  ５７３，１０３−１１０（その全文を参照することにより本願に援用する）参照）。
【０１３２】
本明細書で使用する「非標識」という用語は、プローブオリゴヌクレオチドに関して用いられるとき、検出を促進するための任意の非核酸部分、例えば発光団又はフルオロフォアを含まないプローブオリゴヌクレオチドを指す。非標識プローブは、ポリメラーゼによる伸長を防ぐために３’ブロッキング基等の修飾を含んでいてもよい。
【０１３３】
本明細書で使用する「ドナー」という用語は、第１の波長で吸収し、第２のより長い波長で放射する部分（例えばフルオロフォア）を指す。「アクセプタ」という用語は、フルオロフォア、発光団、又はクエンチャー等の部分であって、ドナー基に近接するとき（典型的には１〜１００ｎｍ）ドナーから放射されたエネルギーの一部又は大部分を吸収することができる部分を指す。アクセプタは、ドナーの発光スペクトルに重なる吸収スペクトルを有していてもよい。一般にアクセプタがフルオロフォアである場合、第３の更に長い波長で再放射し、発光団又はクエンチャーである場合、光子を放射すること無しにドナーから吸収されたエネルギーを放出する。いくつかの好ましい実施形態では、ドナー及び／又はアクセプタ部分のエネルギーレベルの変化が検出される（例えばドナー及び／若しくはアクセプタ部分の間のエネルギー転移、又はドナー及び／若しくはアクセプタ部分からのエネルギー転移を測定することによる（例えば発光を検出することにより））。いくつかの好ましい実施形態では、アクセプタ部分の発光スペクトルは、部分からの放射（例えば光及び／又はエネルギーの放射）が互いに区別できる（例えばスペクトルとして分解される）ように、ドナー部分の発光スペクトルと異なる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、ドナー部分は複数のアクセプタ部分と組み合わせて用いられる。好ましい実施形態では、ドナー部分がクエンチャーに近接するとき（例えば１〜１００ｎｍ、又はより好ましくは１〜２５ｎｍ、又は更に好ましくは約１０ｎｍ以下）、その励起がアクセプタ部分ではなくクエンチャー部分に転移し、クエンチャー部分が除去されたとき（例えばプローブの切断により）、ドナー部分の励起がアクセプタ部分に転移するように、ドナー部分は非蛍光クエンチャー部分及びアクセプタ部分と組み合わせて用いられる。いくつかの好ましい実施形態では、アクセプタ部分からの発光が検出される（例えば波長シフト分子ビーコンを用いて）（例えばＴｙａｇｉら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：１１９１（２０００）；Ｍｈｌａｎｇａ  ａｎｄ  Ｍａｌｍｂｅｒｇ，２００１  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５，４６３−４７１；Ｏｌｉｖｉｅｒ，２００５  Ｍｕｔａｎｔ  Ｒｅｓ  ５７３，１０３−１１０、及び米国特許出願公開第２００３０２２８７０３号参照（それぞれその全文を参照することにより本願に援用する））。
【０１３５】
好適なフルオロフォアとしては、フルオレセイン、ローダミン、ＲＥＤＭＯＮＤ  ＲＥＤ色素、ＹＡＫＩＭＡ  ＹＥＬＬＯＷ色素、ヘキサクロロフルオレセイン、ＴＡＭＲＡ色素、ＲＯＸ色素、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、及びＣｙ７、４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボーラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸、４，４−ジフルオロ−５，ｐ−メトキシフェニル−４−ボーラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸、４，４−ジフルオロ−５−スチリル−４−ボーラ−３ａ，４−ジアザ−Ｓ−インダセン−プロピオン酸、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、テキサスレッド、エオシン、フルオレセイン、４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボーラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸、４，４−ジフルオロ−５，ｐ−エトキシフェニル−４−ボーラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン３−プロピオン酸及び４，４−ジフルオロ−５−スチリル−４−ボーラ−３ａ，４ａ−ジアザ−Ｓ−インダセン−プロピオン酸、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２，４’，５，７’，４−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシローダミン（ＪＯＥ）、２’−クロロ−５’−フルオロ−７’，８’−縮合フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＮＥＤ）、２’−クロロ−７’−フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、塩化ダンシル，アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）、エリトロシン、ＢＯＤＩＰＹ色素、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ色素、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ色素、ピレン、リサミン、キサンテン、アクリジン、オキサジン、フィコエリトリン、ＱＵＡＮＴＵＭ色素、チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロダイマー等が挙げられるがこれらに限定されない。好適なクエンチャーとしては、シアニン色素、例えばＣｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、及びＣｙ７、ローダミン色素、例えばテトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、及びテトラプロパノ−６−カルボキシローダミン（ＲＯＸ）、ＤＡＢＳＹＬ色素、ＤＡＢＣＹＬ色素，シアニン色素、ニトロチアゾールブルー（ＮＴＢ），アントラキノン、マラカイトグリーン、ニトロチアゾール、又はニトロイミダゾール化合物、ＱＳＹ７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ＥＣＬＩＰＳＥクエンチャー（Ｎａｎｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）等が挙げられるがこれらに限定されない。ＦＲＥＴ構成に使用するための部分の対又は群の選択における種々の分子の吸収及び放射スペクトル等の因子の分析は、当業者に周知である。
【０１３６】
標識又は検出可能な反応（例えば標識により提供される）の検出は、当該技術分野において周知である多数の技術、システム、及び方法を用いて測定し得る。例えば、標識は検出可能な蛍光（例えば単純蛍光、ＦＲＥＴ、時間分解蛍光、蛍光消光、蛍光偏光等）、放射活性、化学発光、電気化学発光、ＲＡＭＡＮ、比色分析、重力測定、ハイブリダイゼーション（例えばハイブリダイゼーション保護アッセイにおける配列に対する）、Ｘ線回折又は吸収、磁性、酵素活性、質量又は質量により影響を受ける挙動の特徴（例えばＭＡＬＤＩ飛行時間型質量分析）等を提供するため、標識を検出することができる。
【０１３７】
本明細書で使用する「相互作用標識」という用語は、検出可能な効果を生じさせるように相互作用する２以上の成分を有する標識を指す。相互作用は、相互作用の任意の特定の性質に限定されない。標識成分の相互作用は、例えば２成分間の共有結合性接触又は非共有結合性接触（例えばタンパク質−タンパク質接触、又は近接部分間の衝突エネルギー転移）等の直接接触を介していてもよく、共鳴エネルギー転移（例えば１つ以上の色素間、又は色素とクエンチャー部分との）を含んでいてもよく、例えばある標識の部位で生じる反応の産物が別の標識の部位に拡散して検出可能な効果を生じさせる、拡散効果を含んでいてもよい。相互作用性標識の成分は同じであってもよく（例えば２以上の同分子又は原子）、異なっていてもよい。
【０１３８】
標識は荷電部分（正電荷又は負電荷）であってもよく、或いは電荷的中性であってもよい。標識は、標識を含む配列が検出可能である限り核酸又はタンパク質配列を含んでいてもよく、又はそれから成ってもよい。いくつかの実施形態では、標識は核酸又はタンパク質ではない。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、標識は検出用粒子を含む。例えばいくつかの実施形態では、粒子はリン光体粒子である。リン光体粒子の例としては、アップコンバートリン光体粒子（例えばＯｓｔｅｒｍａｙｅｒ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｉｎｆｒａｒｅｄ−ｔｏ−ｖｉｓｉｂｌｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｓ．Ｍｅｔａｌｌ．Ｔｒａｎｓ．７５２，７４７−７５５（１９７１）参照）が挙げられるがこれに限定されない。いくつかの実施形態では、希土類でドープされたセラミック粒子をリン光体粒子として用いる。リン光体粒子は、アップコンバートリン光体技術（ＵＰＴ）が挙げられるがこれらに限定されない任意の好適な方法により検出することができ、該技術ではアップコンバートリン光体が低エネルギー赤外線（ＩＲ）を高エネルギー可視光に転移させる。機序の理解は本発明を実施するために必須ではないが、本発明は任意の特定の作用機序に限定される訳ではなく、いくつかの実施形態では多光子吸収及びその後のドーパント依存性リン光の放射によりＵＰＴが赤外光を可視光にアップコンバートする（例えば米国特許第６，３９９，３９７号；ｖａｎ  Ｄｅ  Ｒｉｊｋｅら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９（３）：２７３−６（２００１）；Ｃｏｒｓｔｊｅｎｓら，ＩＥＥ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５２（２）：６４（２００５）参照、それぞれその全文を参照することにより本願に援用する）。
【０１４０】
本明細書で使用するシグナル（例えば１つ以上の標識のシグナル）に関して「区別できる」という用語は、例えば蛍光放射波長、色、吸収、質量、大きさ、蛍光偏光特性、電荷等のスペクトル特性により、又は化学試薬、酵素、抗体等の別の部分と相互作用する能力により、互いに識別され得るシグナルを指す。
【０１４１】
本明細書で使用する「合成」という用語は、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド（例えばプローブ）に関して用いられるとき、例えば酵素又は化学合成反応等の無細胞インビトロ反応において作製された核酸を指す。合成核酸の酵素的形成の例としては、制限酵素消化、重合（テンプレート又は非テンプレート）、ライゲーション等による形成が挙げられる。核酸の化学合成の例としては、例えばホスホジエステル及びホスホトリエステル法、ホスホロアミダイト及びＨ−ホスホネート化学法等が挙げられるがこれらに限定されない。例えばＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ２０：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ  ｐｐ．１６５−１８９（Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｐｐ．８７−１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編，１９９１）；Ｕｈｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ，前掲．Ａｇｒａｗａｌ  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．６：１２（１９９５）；Ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｃｒｏｏｋｅ  ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ；編，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３），Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２（１９８１），及びＡｇｒａｗａｌ  ａｎｄ  Ｚａｍｅｃｎｉｋ，米国特許第５，１４９，７９８号（１９９２）参照。いくつかの実施形態では、合成オリゴヌクレオチドは予め形成されている反応に導入されるが、いくつかの実施形態では、合成オリゴヌクレオチドは、例えばポリメラーゼ、リガーゼ、切断酵素等の作用により、反応中に形成される又は修飾される。
【０１４２】
本明細書で使用する酵素に関する「ＦＥＮ−１」という用語は、真核生物又は古細菌生物由来の非ポリメラーゼフラップエンドヌクレアーゼを指す。
【０１４３】
本明細書で使用するＦＥＮ−１活性という用語は、フラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）、ニックエキソヌクレアーゼ（ＥＸＯ）、及びギャップエンドヌクレアーゼ（ＧＥＮ）活性が挙げられるがこれらに限定されないＦＥＮ−１酵素の任意の酵素活性を指す（例えばＳｈｅｎら，ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２７，Ｉｓｓｕｅ７，Ｐａｇｅｓ７１７−７２９参照、参照することにより本願に援用する）。
【０１４４】
本明細書で使用するとき「多型の存在を同定する」という用語は、遺伝的変異があると疑われる点の位置でヌクレオチドの同一性を推定する任意の方法を指す。いくつかの実施形態では、特定の多型又は突然変異の存在は間接的に検出される、例えば多型の存在は検出可能な事象を生じさせる（例えばプローブハイブリダイゼーション、プローブ切断、核酸標的又はシグナル増幅等）が、他の実施形態では、多型又は突然変異の存在は特定のヌクレオチド又はヌクレオチド配列の非存在から推定され得る（例えばその位置における突然変異又は多型ヌクレオチドの存在の指標としての核酸配列のある位置における野性型ヌクレオチドの非存在）。
【０１４５】
本明細書で使用する「生物の種類を判定する（同定する）」とは、例えば関連生物の集団の中の変異体として、特有の個々の生物を同定すること、及び／又は種、属、科、目等により生物を分類することが挙げられるがこれらに限定されない、対象生物に身元（種類）を割り当てる任意の方法を包含する。生物の種類は、表現型又は遺伝子型によるものであってもよい。
【０１４６】
発明の説明
本発明は、増幅された核酸、例えばＰＣＲで増幅されたＤＮＡを検出するための均質なリアルタイムアッセイに関する。いくつかの実施形態では、用いられるプローブはフルオロフォア等の検出可能な部分を含むが、いくつかの実施形態では、プローブはフルオロフォア及びクエンチャー部分等の相互作用検出系を含む。更に他の実施形態では、本発明の方法及びシステムは、分析物特異的プローブの切断産物を検出するよう構成されている検出系と共役した、非標識の分析物特異的プローブを使用する。
【０１４７】
本発明は、短い分析物特異的領域を有する酵素フットプリントプローブを用いるリアルタイム検出方法を提供する。本発明のフットプリントプローブは、標準的な方法、例えば最近接モデル及びＤＮＡ二本鎖形成のための公開されているパラメータ（Ａｌｌａｗｉ  ａｎｄ  ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：１０５８１（１９９７），及びＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，９５（４）：１４６０（１９９８））を用いて計算されるプローブの融解温度を遥かに上回る温度であるアッセイ条件下で一般に用いられる。
【０１４８】
検出及び特性決定におけるフットプリントプローブの使用は、より選択的アッセイをもたらす。本発明を任意の特定の作用機序に限定するものではないが、データは、選択性が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（例えば高反応温度）の使用だけではなく、形成される任意の二本鎖が酵素認識及び切断に都合のよいフットプリントを供給しなければならないという事実からも生じることを示唆している。
【０１４９】
本発明の１つの驚くべき結果は、フットプリントプローブが正しい長さのＡＳＲを含んでプローブ−標的二本鎖を形成する限り、フットプリントプローブの機能はプローブの正確な配列にそれ程依存しない、又は全く依存しないことである。この配列に対する依存性を有しないことの重要な局面は、分析物特異的領域のＴｍ（例えばＡＳＲの配列含量により決定される）が、検出反応がプローブ−標的二本鎖の計算Ｔｍ値を実質的に上回る温度で実施される場合でさえも、本発明の検出反応におけるプローブの性能に影響を与えないことである。したがって、好ましい実施形態では、ほぼ長さのみに基づいてプローブを選ぶことができ（例えば検出アッセイで用いられる酵素の既知のフットプリントであるよう選択された長さ、例えばＡｆｕ  ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼでは１２以下のヌクレオチド）、検出アッセイを進行させる前に分析物特異的領域のＴｍを計算することさえ必要ではない。
【０１５０】
本発明のこの態様は、複雑なソフトウェア及びプローブ修飾を用いて特定の反応温度で使用可能なプローブを選択及び構築するという従来のプローブに基づくアッセイとは劇的に逸脱している。例えば多くの先行技術のアッセイ、例えばＴＡＱＭＡＮ  ５’ヌクレアーゼアッセイでは、又はＩＮＶＡＤＥＲ及びＩＮＶＡＤＥＲ  ＰＬＵＳアッセイのいくつかの実施形態では、新規標的用にアッセイを設計する第１段階としてアッセイのための特定の操作温度が選択される。反応温度は第１段階として選択されることが多く、その結果多くの異なる実験を例えば同じサーマルサイクラー又はインキュベータ内で一緒に実施できるよう設計することができる。一旦操作温度が選択されると、アッセイのプローブ、プライマー、及び／又は他の核酸成分を、選択した温度条件における性能について設計する。異なる標的配列では、プローブ及びプライマーを、例えば長さ、Ｇ−Ｃ塩基対含量、及び／又はＭＧＢ若しくはペプチド核酸等の安定化部分の結合により調整する。同じ温度で操作するために選択されたプローブの長さは、標的核酸の配列に応じて非常に異なることがある（例えばＧ−Ｃリッチである場合、又はＡ−Ｔリッチである場合）。
【０１５１】
同じ温度で（又は同じ熱サイクルセットの温度で）操作されるよう構成された多数のアッセイを成功するよう設計するために、複雑なソフトウェアを設計プロセスで用いることが多い。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓは、予め選択した熱サイクル温度プロファイルで実行するためのＴＡＱＭＡＮ及び類似の５’ヌクレアーゼＰＣＲアッセイ（例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡによる、プローブに基づくＦＵＬＬＶＥＬＯＣＩＴＹアッセイ）で使用するためのプライマー、及びプライマー／プローブの組み合わせを設計するための「ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ」ソフトウェアパッケージを供給している。Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓは、選択用ＩＮＶＡＤＥＲＣｒｅａｔｏｒソフトウェア、又は予め選択した温度（例えば６３℃）で実行するための検出アッセイ用ＩＮＶＡＤＥＲオリゴヌクレオチド／プローブの組み合わせを供給している。
【０１５２】
本発明の組成物、方法、システム、及びキットは、かかる複雑なアッセイ設計工程及びソフトウェアの必要性がない。
【０１５３】
フットプリントの大きさの同定
上述のように、本発明は酵素フットプリントプローブを使用する。二本鎖を認識する核酸修飾酵素用の認識フットプリントの同定は、ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ等の５’ヌクレアーゼについて本明細書に記載されている。しかしながら、本発明はこれらの酵素と共に使用するために設計されたフットプリントプローブに限定されない。当業者は、他の核酸修飾酵素の活性要件の分析に同じ原理を適用することができる。
【０１５４】
ＤＮＡとの複合体でのパイロコッカス・フリオサス由来の構造特異的５’フラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ−１）の３次元モデルが提唱されている（例えば米国特許出願第１０／７８３，５５７号、及びＡｌｌａｗｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖ．３２８（３）：５３７−５５４（２００３）参照）。モデルは酵素の既知のＸ線構造、並びに酵素とＤＮＡとの間の距離制限の形で利用されている種々の生化学的及び分子動態データに基づく。５’フラップエンドヌクレアーゼと重複フラップ基質の糖−リン酸骨格との間の接触は、メチルホスホネート又は２’−Ｏ−メチル置換基を有する基質に対する酵素活性アッセイを用いて同定した。酵素フットプリントは切断部位の２〜４塩基対上流及び８〜９塩基対下流に伸長し、したがって二本鎖ＤＮＡの１０〜１３塩基対を包含する。フットプリントデータは、下流二本鎖が酵素のへリックス−ヘアピン−へリックスモチーフと相互作用するようにＤＮＡ結合溝内で基質が結合しているモデルと一致する。
【０１５５】
しかし、上流二本鎖を提供するプローブ又はヘアピンと併用されるとき、６〜１２ヌクレオチドの範囲の下流二本鎖を提供するプローブ（すなわち、６〜１２ヌクレオチドの標的特異的配列を有するプローブ）は、ＦＥＮ−１及びポリメラーゼ由来の５’ヌクレアーゼを用いて試験するとき、分析物特異的配列の長さが約１２ヌクレオチドに近づくにつれて酵素認識及び／又は切断速度の増加を示すが、その長さを超える二本鎖では切断の改善は見られないことが見出されている（例えばＫａｉｓｅｒら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，Ｖｏｌ．２７４，Ｉｓｓｕｅ３０，２１３８７−２１３９４，Ｊｕｌｙ  ２３，１９９９参照）。したがって、本発明の好ましい実施形態では、ＦＥＮ−１及びポリメラーゼ由来の５’ヌクレアーゼと共に使用するためのフットプリントプローブは、最高約１２ヌクレオチド長の分析物特異的領域を提供する。上述のように、特定の実施形態では、最高１２ヌクレオチドのうち１つ以上は標的鎖に対して非相補的であってもよい。好ましい実施形態では、フットプリントプローブは上流二本鎖を提供するオリゴヌクレオチド（例えばプライマー又はＩＮＶＡＤＥＲオリゴヌクレオチド）と併用される。
【０１５６】
増幅アッセイにおけるフットプリントプローブの使用
ここでは、高融解温度を有するプライマーの存在下でさえ、また熱サイクルで用いられる「アニーリング温度」がフットプリントプローブのＡＳＲの計算Ｔｍ値（例えば最近接モデル及びＤＮＡ二本鎖形成のための公開されているパラメータ等の当該技術分野において標準的である方法を用いて計算される、Ａｌｌａｗｉ  ａｎｄ  ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：１０５８１（１９９７）、及びＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，９５（４）：１４６０（１９９８））を優に上回る反応でさえも、短いフットプリントプローブを増幅アッセイで用い得ることを示す。本発明を任意の特定の作用機序に限定するものではないが、ＦＥＮ−１酵素は計算Ｔｍ値を優に上回る温度で短いプローブのアニーリング及び切断を促進する因子であり得ると思われる。事実、本明細書に提供される実験データは、本発明の方法を実施できる温度が、用いられるプローブのＡＳＲの計算Ｔｍ値にほとんど依存しない、又は全く依存しないことを示す。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、検出反応の過程において切断され、６〜１２ヌクレオチドの短い分析物特異的領域を有するプローブを、プローブのすぐ下流（標的鎖に沿って下流、及びプローブのＡＳＲの５’末端の上流）にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと併用する。切断構造を形成するために、上流核酸（例えばＩＮＶＡＤＥＲオリゴヌクレオチド）を提供して短いプローブの切断を促進する。
【０１５８】
本発明の方法、組成物、及びシステムは、特定の実施形態に関連して、例えば標的増幅のポリメラーゼ連鎖反応法に関して、発明の説明及び発明の概要（参照することにより本明細書に援用する）に記載されるが、本発明はこれらの実施形態に限定されないことが理解される。以下で論じる実施形態は一例として提供され、本発明を限定するものではない。
【０１５９】
いくつかの実施形態及び本発明の態様について以下で論じる。
【０１６０】
特異性の改善されたアッセイ
本発明の態様は、リアルタイムでＰＣＲアッセイ等の標的増幅アッセイを検出するためのシステム及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は検出アッセイ（例えば切断アッセイ）と組み合わせた標的増幅アッセイを実施するためのシステム、方法及びキットを提供し、前記検出アッセイは比較的短い（例えば６〜１２塩基）の分析物特異的領域を有するプローブを用いる。好ましい実施形態では、これらのプローブは、検出試薬、例えばＦＥＮ−１ヌクレアーゼ等の切断試薬により有効に認識可能な二本鎖の最小長又はおよそ最小長であるプローブ／分析物二本鎖を提供するよう構成されており、その結果プローブの分析物特異的部分に対して配列中にミスマッチを有する標的にアニールしたプローブは、十分な効率で切断されない又は全く切断されない。かかる実施形態では、ミスマッチの標的核酸にハイブリダイズしたプローブからの検出可能な切断が、プローブの分析物特異的部分に完全に相補的である標的核酸にハイブリダイズしているプローブからの検出可能な切断に比べて減少しており、それによりこのアッセイがより高い特異性及び／又はより低いバックグラウンドを有する。
【０１６１】
本発明は、本発明のフットプリントプローブの使用によって特異性の改善された及び／又はバックグラウンドの低下した任意の特定の作用機序に限定されるものではない。改善された特異性の他の態様は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で（例えばプローブの分析物特異的部分の計算Ｔｍ値より高い温度で）使用される短いプローブにより提供されるより選択的なハイブリダイゼーションであり、その結果完全にマッチするプローブのみが標的鎖にアニーリングする傾向がある。一方いくつかの実施形態では、改善された結果は完全にマッチしているプローブ／標的二本鎖と不完全にマッチしているプローブ／標的二本鎖との切断酵素による判別に起因する場合がある。改善された特異性の別の態様は、例えばＦＥＮ−１酵素等の５’ヌクレアーゼによるプローブの効率的切断にとって最小の二本鎖長又はおよそ最小の二本鎖長である対象標的との二本鎖を提供するよう構成されているプローブの使用を通じたものである。かかる実施形態では、プローブの分析物特異的部分が１つ以上のヌクレオチド位置において標的とミスマッチである場合、二本鎖の５’ヌクレアーゼ切断は実質的に減少する、又は切断されない。特に好ましい実施形態では、ＦＥＮ−１は古細菌種由来の熱安定性ＦＥＮ−１である。
【０１６２】
切断構造（例えば侵入的切断構造）の切断効率に対するプローブ／標的二本鎖長（例えばＩＮＶＡＤＥＲオリゴヌクレオチド又はプライマーオリゴヌクレオチドにより提供されるような「上流二本鎖」に対して「下流二本鎖長」とも呼ばれる）の効果は、種々の５’ヌクレアーゼ酵素について研究されている。例えばＫａｉｓｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｊｕｌ  ２３；２７４（３０）：２１３８７−９４（１９９９）（参照することにより本明細書に援用する）参照。Ｋａｉｓｅｒは、上流二本鎖（例えばＩＮＶＡＤＥＲオリゴヌクレオチド／標的二本鎖）が６塩基対の長さである重複フラップ基質について、６〜１６塩基対の下流二本鎖長を有する基質を用いてプローブ／標的二本鎖の効果を調べた。実験では、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ（ＡｆｕＦＥＮ）、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ（ＰｆｕＦＥＮ）、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（ＭｊａＦＥＮ）、及びＭ．ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（ＭｔｈＦＥＮ）由来の４種の古細菌ＦＥＮ−１酵素、Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ（ＴａｑＰｏｌ）及びＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＴｔｈＰｏｌ）由来の２種の真正細菌ポリメラーゼＩ酵素、並びにＴａｑＰｏｌの５’ヌクレアーゼドメイン（ＴａｑＥｘｏと称される）について調べた。ＴａｑＰｏｌを除く全ての酵素が、１０〜１６塩基対の範囲の長さの下流二本鎖長に依存しない速度で重複フラップ基質を切断し、ＴａｑＰｏｌは１２塩基対の基質より約５倍遅く１０塩基対の基質を切断した。大部分の酵素では、切断活性は８塩基対の下流二本鎖基質で減少し、二本鎖長が６ｂｐに減少すると著しく低下したが、ＭｊａＦＥＮ及びＭｔｈＦＥＮのＦＥＮ−１酵素は６塩基対の下流二本鎖を有する基質を切断することができた。したがって、ミスマッチ標的核酸に短いプローブがアニールした場合でさえ、マッチ標的配列にハイブリダイズしている同じプローブと比べて５’ヌクレアーゼによる切断が低下するという点で、短い分析物特異的領域を有するプローブの使用は、ハイブリダイゼーションの機構を超える更に高水準の判別を提供する。したがって、これらの酵素では、プローブの分析物特異的部分において標的核酸に相補的な１２以下の塩基を有するプローブの使用は、これらの酵素のうち１種を切断反応に用いるとき、より慣用的な設計のプローブの使用に対して著しい利点を提供する。
【０１６３】
短い分析物特異的領域を含むプローブは、例えばＩＮＶＡＤＥＲアッセイ等の侵入的切断アッセイの特定の実施形態で用いられている。例えば米国特許第５，９８５，５５７号（Ｐｒｕｄｅｎｔら）参照。しかしながら、ＰＣＲ等の増幅反応におけるリアルタイム検出法用のプローブ設計のために長年にわたって確立されたルールの観点では、このような短いＡＳＲを有するプローブ、特にＭＧＢ等の二本鎖安定化部分を欠くプローブが、プローブの融解温度を優に上回る温度で実施されるアッセイにおけるリアルタイム検出で機能するようになり得ることは驚くべきである。これらのプローブの性能は、ＰＣＲ増幅等の反応に関して特に驚くべきことであり、ここで高Ｔｍ値を有するプライマーの伸長はプローブ結合部位を完全に塞ぐと予想される。本発明を任意の特定の作用機序に限定するものではないが、いくつかの実施形態では、本発明の反応における酵素、例えばＦＥＮ−１酵素は、プライマー伸長が結合部位を塞ぐ前に短いプローブがアニールすることができ、融解温度より数度以上高い温度で用いることができるように、フットプリントプローブ−標的二本鎖を安定化することができる。
【０１６４】
背景技術のセクションで論じたように、ＰＣＲにおけるリアルタイム検出で一般に用いられている方法は、反応において蛍光標識分析物特異的加水分解プローブを用いることである。最も一般的に用いられている方法では、５’ヌクレアーゼ「ニック翻訳」活性（例えばＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）などのポリメラーゼが用いられ、ポリメラーゼがＰＣＲプライマーを伸長し、ハイブリダイズしたプローブに遭遇したときにプローブの切断が生じる（例えば米国特許第５，２１０，０１５号、及びＨｏｌｌａｎｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７２７６（１９９１）参照）。いくつかの種類の５’ヌクレアーゼＰＣＲ反応では、ポリメラーゼ及び５’ヌクレアーゼは別々のタンパク質（例えばＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＰｆｕ  ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ）として提供される。後者の構成では、ポリメラーゼは、ＦＥＮ−１酵素により認識される構造を生成するように、プローブが部分的に置換される点までプライマーを伸長し、次いでＦＥＮ−１がプローブ分子を切断する（例えば米国特許第６，５２８，２５４号、及び同第６，５４８，２５０号、ＦＵＬＬＶＥＬＯＣＩＴＹ  Ｑ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ＃１１４００５，  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ．，  ＦＵＬＬＶＥＬＯＣＩＴＹ  ＱＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ＃  Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ＃１１４００５，  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ．）。
【０１６５】
上記方法の両方において、加水分解プローブがプライマー伸長前に標的鎖にアニーリングすることがアッセイ設計において必須であると考えられる。この理由のために、これらのリアルタイムＰＣＲ法（ＦＵＬＬＶＥＬＯＣＩＴＹ法を含む）で用いるための加水分解プローブは、増幅反応で用いられるプライマーより安定に（すなわちより高い融解温度、すなわちＴｍで）標的核酸に結合するよう選択される。例えば米国特許第５，２１０，０１５号、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）オリゴ設計ソフトウエア、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ’ｓ“Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ”Ｍｅｔｈｏｄｓ及びＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｇｕｉｄｅ，ＩＮ  ＃７０２００−００／Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ＃０８４００１  Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  ２００４年，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ参照。
【０１６６】
いくつかのリアルタイムＰＣＲアッセイ設計では、プローブの安定性は、プライマーを上回るＴｍ値を有するよう選択された長さ及び配列組成を有する分析物特異的プローブ配列を選択することにより保証される。他のアッセイ設計では、より短いプローブが用いられるが、プローブの融解温度はプローブに二本鎖安定化部分を付着させることにより上昇する。具体的には、副溝バインダー（「ＭＧＢ」）等の二本鎖ＤＮＡに結合する部分（例えば米国特許第６，３１２，８９４号、Ｋｕｔｙａｖｉｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．２  ６５５−６６１、及びＡＢＩ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｍａｎｕａｌ，前掲）が、リアルタイムＰＣＲで用いるための加水分解プローブに一般的に用いられている。ＭＧＢのオリゴヌクレオチドへの複合体化は、オリゴヌクレオチドとその標的との間に形成されるハイブリッドの安定性を劇的に増加させる（例えば米国特許第６，３１２，８９４号、Ｋｕｔｙａｖｉｎら，前掲参照）。安定性の増加（すなわちハイブリダイゼーションの程度の増加）は、同一の長さ及び配列の非複合体化オリゴヌクレオチドにより形成されるものに比べて、かかるＭＧＢ−オリゴヌクレオチド複合体により形成されるハイブリッド二本鎖の融解温度が高いことに現れる。この効果は、短いオリゴヌクレオチド（例えば長さ約２１ヌクレオチド未満）で特に顕著であり、かかる複合体化した短いオリゴヌクレオチドプローブ（約１２ヌクレオチド以上）が均質な５’ヌクレアーゼＰＣＲアッセイの設計要件を満たす、すなわちプライマーより安定な標的核酸に結合することを可能にする。
【０１６７】
ＴＡＱＭＡＮ  ５’ヌクレアーゼプローブ切断アッセイに基づくリアルタイムＰＣＲ検出用プローブ及びプライマーの設計を指導するＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアバージョン３．０「Ｇｅｔｔｉｎｇ  Ｓｔａｒｔｅｄ」は、プローブは常にプライマーより高いＴｍ値を有するべきであると指示している。例えば、標準的な（非ＭＧＢ）プローブは６８℃〜７０℃のＴｍ値を有することが最適であると教示されるが、プライマーは５８℃〜６０℃のＴｍ値を有することが最適であると教示される。ＭＧＢをプローブとして用いるとき（例えば対立遺伝子判別）、マニュアルは、Ｔｍ値が６５℃〜６７℃であるプローブを５８℃〜６０℃のＴｍ値を有するプライマーと共に使用すべきであると指示している。ＭＧＢを安定化しようとしまいと、マニュアルは、リアルタイム５’ヌクレアーゼアッセイ検出で用いられるプローブが、共に使用されるプライマーのＴｍ値より少なくとも５〜１０℃高いＴｍ値を有するべきであると指示している。ポリメラーゼ及び５’ヌクレアーゼ切断活性が別々の酵素として提供されるアッセイでも、同じことが推奨されている（例えばＦＵＬＬＶＥＬＯＣＩＴＹ  Ｑ−ＰＣＲ  ａｎｄ  ＱＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌｓ，前掲参照）。
【０１６８】
上で述べたように、本発明は、例えばＦＥＮ−１酵素用に最小のフットプリント二本鎖を提供するよう選択された短い分析物特異的領域を有する加水分解プローブを含む改善されたリアルタイム検出アッセイを提供する。典型的にＴＡＱＭＡＮアッセイ及びＦＵＬＬＶＥＬＯＣＩＴＹ法で用いられる加水分解プローブと対照的に、本発明のフットプリントプローブは反応におけるＦＥＮ−１酵素を好適に機能させる最小長のプローブ／標的二本鎖を提供するよう選択される。本発明のフットプリントプローブは、共に用いられるＰＣＲプライマーより実質的に低い融解温度を有する。いくつかの好ましい実施形態では、プローブは１２ヌクレオチド以下の分析物特異的部分を有する。標識及び他のかかる成分はプローブ／標識二本鎖の安定性に影響を与える場合があるが、特に好ましい実施形態では、本発明のプローブは二本鎖の安定性を高める目的のために提供される非核酸部分（例えば副溝バインダー）を含まない。
【０１６９】
本明細書に提供される例は、本発明の短いフットプリントプローブが、ほとんどバックグラウンド無しにリアルタイムＰＣＲ検出において明らかなシグナルを提供することを示す（例えば標的なし対照におけるシグナルの蓄積がほとんど無い、例えば図４参照）。
【０１７０】
より迅速な検出を提供するアッセイ
本発明の別の態様は、標準的な加水分解プローブに基づく方法と比べたとき、より迅速な増幅反応のリアルタイム検出を提供する。上で論じたように、ＴＡＱＭＡＮ型アッセイでは、プライマーがＰＣＲのサイクルにおいて標的に沿って伸長したとき加水分解プローブを切断する。したがって、シグナル蓄積速度は、ＰＣＲの温度サイクリングに関連し、それにより制限される。
【０１７１】
ＰＣＲ中の加水分解プローブの切断により可能になる二次的な切断事象を提供するアッセイが記載されている。例えば米国特許第６，８９３，８１９号を参照。ここでは加水分解プローブからの５’フラップは、一旦切断されると、検出反応でプライマーとして用いられる。例えばフラップ−プライマーは伸長して別のプローブを含む第２の切断構造を形成し、別のフラップを遊離させる。しかしながら、かかるアッセイでは、元の加水分解事象の切断産物である５’フラップは、第２の反応で消費され、追加反応には寄与しない。
【０１７２】
本発明の態様は、検出可能なシグナルの蓄積が同時ＰＣＲアッセイの熱サイクリングに依存しない又は制限されない、検出アッセイを提供することである。例えば、本発明の好ましい実施形態では、切断産物は標的鎖にアニールしたとき分析物特異的プローブから遊離し、次いで切断産物は、例えば図１に記載するＦＲＥＴカセットとの、多くの次の切断構造の形成に関与する。いくつかの実施形態では、最初の切断産物は第２の及び次の切断構造の切断の際に更に変化しないが、他の実施形態では、最初の切断産物の任意の変化（例えば更なる切断、プライマー伸長）は、変化した最初の切断産物が第２の及び次の切断構造の形成に関与することを妨げない。
【０１７３】
特に好ましい実施形態では、第２の及び次の切断構造は、それらがＰＣＲ温度サイクリングに依存すること無しに形成及び解離できるように構成され、その結果多くの切断構造が、少なくとも一部の検出切断構造が形成され得る範囲内である反応温度の全ての時点で形成及び切断され得る。このように構成されるとき、検出切断構造の多くのコピーが、反応温度が同時ＰＣＲの熱サイクルで変化（move）しているときでさえ、最初の切断産物の各コピーについて切断され得る。この方法では、検出アッセイによるシグナル増幅は、アンプリコンの蓄積よりも急速に、そして標準的な加水分解プローブ切断で可能であるよりも又は最初の切断産物が再利用されず消費される二次検出アッセイで可能であるよりも急速に蓄積する。急速なシグナル蓄積により、より感受性の強い検出が可能になり、結果が出るまでの時間がより早くなる。
【０１７４】
コストの低いアッセイ
上述のように、リアルタイムＰＣＲのためのプローブに基づく特異的検出化学の主な問題点の１つは、異なる分析物配列の各々について、高価な色素、クエンチャー、及び任意的にＭＧＢを含む種々の特注プローブを使用する必要があることである。いくつかの実施形態では、本発明は、標識されたオリゴヌクレオチドを用いる二次検出反応に加えて、非標識の分析物特異的プローブを使用することを含むリアルタイム検出法を提供し、その結果高価な部分で標識された分析物特異的プローブを作製する必要がなくなる。
【０１７５】
ダイナミックレンジの改善されたアッセイ
本発明の方法は、標的核酸の種類に限定されない。例えば、標的核酸としては、例えばＲＮＡゲノムを有するウイルスから調製された核酸物質を挙げることができる。典型的には、ＲＮＡ標的配列は逆転写酵素の作用によりｃＤＮＡ分子に変換され、次いで核酸検出アッセイにより検出される。本発明の方法の組み込みにより、ＲＮＡ標的配列の検出のダイナミックレンジは未だ実現不可能な幅に増加する。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、標的配列は合成配列である。例えば酵素的反応で生じた断片（例えば制限酵素断片、侵入的切断反応から切断されたフラップ等）を標的配列と見なすことができる。いくつかのかかる実施形態では、かかる分子の検出は、それから合成配列が生成される別個の標的核酸を間接的に検出する。例えば、侵入的切断反応では、一次反応から切断されたフラップは、ＦＲＥＴカセットである第１及び第２のプローブを用いて検出される。ＦＲＥＴカセットは、切断されたフラップが第１及び第２のプローブに示差的にハイブリダイズするようにいくつかの特徴（例えば長さ等）が異なる。両方のＦＲＥＴカセット（又は第３、第４等）を用いることにより、反応のダイナミックレンジが改善される。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、検出のダイナミックレンジを更に増加させる方法と併用される。例えば米国特許出願第１１／３３８，２４４号（参照することにより本明細書に援用する）参照。例えばいくつかの実施形態では、本発明は、標的核酸の領域の増幅の示差的レベル（例えば増幅無し、１つ以上の効率における直線的増幅、及び／又は１つ以上の効率における指数関数的増幅）を利用して検出のダイナミックレンジを広げる方法と併用される。いくつかの実施形態では、本発明は、標的核酸（１又は複数）の１つ以上の分析物特異的領域に対して異なるハイブリダイゼーション特性を有するプローブの使用によって検出のダイナミックレンジを広げる方法と併用される。いくつかの好ましい実施形態では、異なるプローブは異なるＡＳＲを有し、例えば検出試薬による切断のために、最適及び／又は準最適のフットプリントの範囲を提供する。好ましい実施形態では、２以上の方法の組み合わせを使用する。例えばいくつかの好ましい実施形態では、２以上のプローブ（例えば３、４等）を、異なるレベルの増幅によって得られた第１及び第２のアンプリコンと接触させる。いくつかのかかる実施形態では、各プローブは同種のシグナルを生じ、その結果反応により生じる全シグナルが簡単に検出される。集合的シグナルにより、広いダイナミックレンジにわたって標的核酸を検出することが可能になる。例えば、本発明の開発中に実施された実験は、サンプル中に元々存在する標的核酸のコピー数が８ｌｏｇ超異なるサンプルに由来する標的核酸を検出する能力を示していた。
【０１７８】
本発明の組成物、方法、システム、及びキットは、広範な核酸標的の検出及び定量に有用である。本発明の組成物及び方法は、ウイルス標的核酸（例えばウイルス病原体）の定量に特に有用である。広い範囲のウイルス濃度（例えばウイルス量）の検出について臨床又は研究の必要がある代表的なウイルス核酸としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及び他のレトロウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、バクテリオファージ（例えばファージラムダ）、アデノウイルス、及びレンチウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。他の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、細菌（例えば商業的及び研究的用途で重要な病原体又は細菌）の検出における用途が見出されている。例としては、クラミジア種（Chlamydia sp.）、淋菌（N. gonorrhea）、及びＢ群連鎖球菌（group B streptococcus）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７９】
本発明の方法及び組成物を用いる標的核酸の定量は、種々の臨床及び研究用途で利用されている。例えばいくつかの実施形態では、本発明のダイナミックレンジの増加した検出アッセイは、ヒトサンプル中のウイルス病原体の検出及び定量に利用されている。本発明の検出アッセイは、尿、糞便、リンパ液、全血、及び血清が挙げられるがこれらに限定されない種々の精製及び未精製サンプルと共に用いるのに好適である。好ましい実施形態では、本発明の検出アッセイは宿主細胞の存在下で使用するのに好適である。
【０１８０】
他の実施形態では、本発明の検出アッセイは、薬物スクリーニング（例えばウイルス病原体に対する薬物のスクリーニング）、疾患の動物モデル、及び標的核酸のインビトロ定量（例えば細菌、ウイルス、又はゲノム核酸）が挙げられるがこれらに限定されない研究用途における用途が見出されている。
【０１８１】
本発明のプローブオリゴヌクレオチドは、以下に記載のものが挙げられるがこれらに限定されない種々の核酸検出アッセイにおける用途が見出されている。ハイブリダイゼーションを使用する任意の核酸検出法が本発明のシステム及び方法から利益を受け得ることを理解すべきである。
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）標的核酸を分析する方法であって、ａ）合成プローブ及びＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼの存在下にて、前記合成プローブが増幅反応中に切断されて切断断片を生成する条件下で、標的核酸を増幅する工程であって、前記合成プローブが分析物特異的部分及び非標的部分を含むフットプリントプローブであり、前記非標的部分が前記標的核酸に対して実質的に非相補的であり、前記分析物特異的部分の長さが１２ヌクレオチド以下であり、前記分析物特異的部分が前記標的核酸に対して相補的である最高１２ヌクレオチドを含む、上記工程と；ｂ）前記増幅反応中に前記切断断片を検出する工程と、を含む方法。
（２）前記分析が、前記増幅反応中に前記切断断片を検出することにより前記標的核酸の存在を検出することを含む、（１）に記載の方法。
（３）前記分析が、前記標的核酸における多型の存在を同定することを含む、（１）に記載の方法。
（４）前記分析が、標的核酸が由来する生物を同定することを含む、（１）に記載の方法。
（５）前記分析が、前記標的核酸の量を検出することを含む、（１）に記載の方法。
（６）前記標的核酸がサンプルから単離されている、（１）に記載の方法。
（７）前記サンプルが、細胞サンプル、組織サンプル、流体サンプル、培養サンプル、及び環境サンプルから成る群から選択される、（６）に記載の方法。
（８）前記標的核酸が、動物、植物、細菌、ウイルス、及び真菌から成る群から選択される生物に由来する、（１）に記載の方法。
（９）前記標的核酸がＤＮＡである、（１）に記載の方法。
（１０）前記標的核酸がＲＮＡである、（１）に記載の方法。
（１１）前記増幅前に又は前記増幅と同時に前記ＲＮＡをＤＮＡに逆転写する工程を更に含む、（１０）に記載の方法。
（１２）前記増幅がポリメラーゼ連鎖反応を含む、（１）に記載の方法。
（１３）前記増幅がポリメラーゼを使用する、（１）に記載の方法。
（１４）前記ポリメラーゼが熱安定性ポリメラーゼである、（１３）に記載の方法。
（１５）前記ポリメラーゼが５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠いている、（１３）に記載の方法。
（１６）前記ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼが熱安定性ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼである、（１）に記載の方法。
（１７）前記ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼが古細菌種由来である、（１）に記載の方法。
（１８）前記増幅が第１及び第２のプライマーオリゴヌクレオチドを使用する、（１）に記載の方法。
（１９）前記プローブが切断される前に切断構造が形成され、前記切断構造がａ）前記標的核酸の第１の領域における前記プローブ、及びｂ）第１の領域の下流に存在する前記標的核酸の第２の領域と会合する第２のオリゴヌクレオチドと、前記標的核酸との会合により形成される、（１）に記載の方法。
（２０）第２の領域が第１の領域に隣接している、（１９）に記載の方法。
（２１）前記切断構造における第２のオリゴヌクレオチドの３’末端において少なくとも１個のヌクレオチドが、前記プローブと前記標的核酸とのハイブリダイゼーション領域と重複する、（１９）に記載の方法。
（２２）第２のオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドが、前記切断構造における前記標的核酸に対して非相補的である、（２１）に記載の方法。
（２３）第２のオリゴヌクレオチドが前記増幅で用いられるプライマーでもある、（１９）に記載の方法。
（２４）前記プローブの前記標的結合部分が、前記標的核酸に対して相補的である１１以下のヌクレオチドを含む、（１）に記載の方法。
（２５）前記プローブの前記標的結合部分が、前記標的核酸に対して相補的である１０以下のヌクレオチドを含む、（１）に記載の方法。
（２６）前記プローブの前記標的結合部分が、前記標的核酸に対して相補的である９以下のヌクレオチドを含む、（１）に記載の方法。
（２７）前記プローブの前記標的結合部分が、前記標的核酸に対して相補的である８以下のヌクレオチドを含む、（１）に記載の方法。
（２８）前記プローブの前記標的結合部分が、前記標的核酸に対して相補的である７以下のヌクレオチドを含む、（１）に記載の方法。
（２９）前記プローブの前記標的結合部分が、前記標的核酸に対して相補的である６以下のヌクレオチドを含む、（１）に記載の方法。
（３０）前記プローブが標識されていない、（１）に記載の方法。
（３１）前記プローブが非天然ヌクレオチドを含まない、（１）に記載の方法。
（３２）前記プローブの前記非標的部分の長さが少なくとも１０ヌクレオチドである、（１）に記載の方法。
（３３）前記切断断片の検出が、１つ以上の前記切断断片を合成検出オリゴヌクレオチドと会合させることを含む、（１）に記載の方法。
（３４）前記合成検出オリゴヌクレオチドがヘアピン構造を形成する自己相補性領域を有する、（３３）に記載の方法。
（３５）前記合成検出オリゴヌクレオチドが標識を含む、（３３）に記載の方法。
（３６）前記標識が蛍光標識である、（３５）に記載の方法。
（３７）前記合成検出オリゴヌクレオチドが蛍光クエンチャー部分を更に含む、（３６）に記載の方法。
（３８）前記切断断片が、前記合成検出オリゴヌクレオチドと会合したとき、前記ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼにより切断可能な切断構造を形成する、（３３）に記載の方法。
（３９）前記検出が、前記合成検出オリゴヌクレオチドを含む前記切断構造を切断して、検出可能なシグナルを生成することを含む、（３８）に記載の方法。
（４０）合成対照標的核酸の既知の量も分析する、（１）に記載の方法。
（４１）分析された合成対照標的核酸を用いて前記標的核酸の量を決定する、（４０）に記載の方法。
（４２）ａ）標的核酸と、ｂ）増幅プライマーと、ｃ）ポリメラーゼと、ｄ）ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼと、ｅ）分析物特異的部分及び非標的部分を含む非標識合成プローブであって、前記非標的部分が前記標的核酸に対して実質的に非相補的であり、前記分析物特異的部分の長さが１２ヌクレオチド以下であり、前記分析物特異的部分が前記標的核酸に対して相補的である最高１２ヌクレオチドを含む非標識合成プローブとを含む組成物。
（４３）前記組成物が反応混合物である、（４２）に記載の組成物。
（４４）前記組成物がキットである、（４２）に記載の組成物。
（４５）前記キットが、標的核酸、増幅プライマー、ポリメラーゼ、ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ、及び非標識合成プローブの１以上を収容している複数の容器を備える、（４４）に記載の組成物。
（４６）前記標的核酸が、動物、植物、細菌、ウイルス、及び真菌から成る群から選択される生物に由来する、（４２）に記載の組成物。
（４７）前記標的核酸がＤＮＡである、（４２）に記載の組成物。
（４８）前記標的核酸がＲＮＡである、（４２）に記載の組成物。
（４９）逆転写酵素を更に含む、（４２）に記載の組成物。
（５０）前記ポリメラーゼが熱安定性ポリメラーゼである、（４２）に記載の組成物。
（５１）前記ポリメラーゼが５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠いている、（５０）に記載の組成物。
（５２）前記ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼが熱安定性ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼである、（４２）に記載の組成物。
（５３）前記ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼが古細菌種由来である、（４２）に記載の組成物。
（５４）前記標的核酸の存在下にて前記プローブと共に切断構造を形成するよう構成されている第２のオリゴヌクレオチドを更に含み、前記切断構造が、ａ）前記標的核酸の第１の領域における前記プローブ、及びｂ）第１の領域の下流にある前記標的核酸の第２の領域と会合する第２のオリゴヌクレオチドと、前記標的核酸との会合により形成される、（４２）に記載の組成物。
（５５）第２の領域が第１の領域に隣接している、（５４）に記載の組成物。
（５６）前記切断構造における第２のオリゴヌクレオチドの３’末端において少なくとも１個のヌクレオチドが、前記プローブと前記標的核酸とのハイブリダイゼーション領域と重複している、（５４）に記載の組成物。
（５７）第２のオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドが、前記切断構造における前記標的核酸に対して非相補的である、（５４）に記載の組成物。
（５８）前記プローブの前記分析物特異的部分が、前記標的核酸に対して相補的である１１以下のヌクレオチドを含む、（４２）に記載の組成物。
（５９）前記プローブの前記分析物特異的部分が、前記標的核酸に対して相補的である１０以下のヌクレオチドを含む、（４２）に記載の組成物。
（６０）前記プローブの前記分析物特異的部分が、前記標的核酸に対して相補的である９以下のヌクレオチドを含む、（４２）に記載の組成物。
（６１）前記プローブの前記分析物特異的部分が、前記標的核酸に対して相補的である８以下のヌクレオチドを含む、（４２）に記載の組成物。
（６２）前記プローブの前記分析物特異的部分が、前記標的核酸に対して相補的である７以下のヌクレオチドを含む、（４２）に記載の組成物。
（６３）前記プローブの前記分析物特異的部分が、前記標的核酸に対して相補的である６以下のヌクレオチドを含む、（４２）に記載の組成物。
（６４）前記プローブが標識されていない、（４２）に記載の組成物。
（６５）前記プローブが非天然ヌクレオチドを含まない、（４２）に記載の組成物。
（６６）前記プローブの前記非標的部分の長さが少なくとも１０ヌクレオチドである、（４２）に記載の組成物。
（６７）前記プローブの前記非標的部分に対して相補的である領域を有する合成検出オリゴヌクレオチドを更に含む、（４２）に記載の組成物。
（６８）前記合成検出オリゴヌクレオチドがヘアピン構造を形成する自己相補性領域を有する、（６７）に記載の組成物。
（６９）前記合成検出オリゴヌクレオチドが標識を含む、（６７）に記載の組成物。
（７０）前記標識が蛍光標識である、（６９）に記載の組成物。
（７１）前記合成検出オリゴヌクレオチドが蛍光クエンチャー部分を更に含む、（７０）に記載の組成物。
（７２）（４２）に記載の組成物を含むシステム。
（７３）検出器を更に含む、（７２）に記載のシステム。
（７４）前記検出器が蛍光シグナルを検出する、（７３）に記載のシステム。
（７５）ａ）標的核酸と、ｂ）増幅プライマーと、ｃ）ポリメラーゼと、ｄ）ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼと、ｅ）分析物特異的部分及び非標的部分を含む非標識合成プローブであって、前記非標的部分が前記標的核酸に対して実質的に非相補的である非標識合成プローブと、を含む組成物。
（７６）標的核酸を分析する方法であって、（７５）に記載の組成物を準備する工程と、増幅反応中に前記プローブと前記標的核酸との間に切断構造を形成する工程と、前記プローブを前記ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼで切断して、前記プローブの前記非標的部分を含む切断産物を生成する工程と、前記切断産物を検出する工程とを含む方法。
（７７）標的核酸を分析する方法であって、ａ）合成プローブ及びＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼの存在下にて、前記合成プローブが増幅反応中に切断されて切断断片を生成する条件下で、標的核酸を増幅する工程であって、前記合成プローブが前記ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼのためのフットプリントプローブであり、前記フットプリントプローブが分析物特異的部分及び非標的部分を含み、前記非標的部分が前記標的核酸に対して実質的に非相補的であり、前記増幅反応が等温反応である場合、前記フットプリントプローブの前記分析物特異的部分が、前記等温反応を実施する温度より少なくとも５℃低い前記標的に対する計算Ｔｍ値を有し、又は前記増幅反応が熱サイクル反応である場合、前記フットプリントプローブの前記分析物特異的部分が、前記熱サイクルで用いられる最低温度より少なくとも５℃低い前記標的に対する計算Ｔｍ値を有し、前記フットプリントプローブが副溝バインダー部分を含まない、上記工程と、ｂ）前記増幅反応中に前記切断断片を検出する工程と、を含む方法。
（７８）前記フットプリントプローブの前記分析物特異的部分が、前記等温反応を実施する温度より少なくとも８℃低い前記標的核酸に対する計算Ｔｍ値を有し、又は前記増幅反応が熱サイクル反応である場合、前記フットプリントプローブの前記分析物特異的部分が、前記熱サイクルで用いられる最低温度より少なくとも８℃低い前記標的核酸に対する計算Ｔｍ値を有する、（７７）に記載の方法。
（７９）前記フットプリントプローブの前記分析物特異的部分が、前記等温反応を実施する温度より少なくとも１０℃低い前記標的に対する計算Ｔｍ値を有し、又は前記増幅反応が熱サイクル反応である場合、前記フットプリントプローブの前記分析物特異的部分が、前記熱サイクルで用いられる最低温度より少なくとも１０℃低い前記標的に対する計算Ｔｍ値を有する、（７７）に記載の方法。
（８０）標的核酸を分析する方法であって、
ａ）核酸二本鎖を含む構造を認識する５’ヌクレアーゼを選択する工程と、
ｂ）前記５’ヌクレアーゼのためのフットプリント二本鎖長を決定する工程と、
ｃ）合成フットプリントプローブ及び前記５’ヌクレアーゼの存在下にて、前記合成プローブが標的増幅反応中に切断されて切断断片を生成する条件下で、標的核酸を増幅する工程であって、前記合成プローブが分析物特異的部分及び非標的部分を含み、前記非標的部分が前記標的核酸に対して実質的に非相補的であり、前記分析物特異的部分が前記５’ヌクレアーゼ酵素のための前記フットプリント二本鎖長より長くない前記標的核酸とのプローブ−標的二本鎖を形成する工程と、
ｄ）前記増幅反応中に前記切断断片を検出する工程と、
を含む方法。
（８１）前記標的増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、（８０）に記載の方法。
（８２）前記５’ヌクレアーゼが、天然ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ、改変型ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ、及び少なくとも１種のＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼの少なくとも一部を含むキメラタンパク質から成る群から選択される、（８０）に記載の方法。
【実施例】
【０１８２】
以下の開示では、以下の略称を使用する：Ｅｘ．（実施例）；Ｆｉｇ．（図）；℃（摂氏温度）；ｇ（重力場）；ｈｒ（時間）；ｍｉｎ（分）；ｏｌｉｏ（オリゴヌクレオチド）；ｒｘｎ（反応）；ｖｏｌ（体積）；ｗ／ｖ（重量／体積）；ｖ／ｖ（体積／体積）；ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）；ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）；ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ｐ（プラスミド）；μｌ（マイクロリットル）；ｍｌ（ミリリットル）；ｎｇ（ナノグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｍｇ（ミリグラム）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；ｐｍｏｌ（ピコモル）；ａｍｏｌ（アトモル）；ｚｍｏｌ（ゼプトモル）；ｎｍ（ナノメートル）；ｋｄａｌ（キロダルトン）；ＯＤ（光学密度）；ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）；ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）ＦＡＭ（フルオレセイン）；ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）；ＮａＰＯ４（リン酸ナトリウム）；ＮＰ−４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）；Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）；ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）；ＴＢＥ（トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ、すなわちＨＣｌではなくホウ酸で滴定され、ＥＤＴＡを含有しているトリス緩衝液）；ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）；ＰＰＢＳ（１ｍＭ  ＰＭＳＦを含有しているリン酸緩衝生理食塩水）；ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）；Ｔｗｅｅｎ（ポリオキシエチレン−ソルビタン）；Ｒｅｄ又はＲＥＤ（ＲＥＤＭＯＮＤ  ＲＥＤ色素、Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ  ＷＡ）Ｚ２８（ＥＣＬＩＰＳＥクエンチャー、Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）；Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）；Ｃｏｒｉｅｌｌ（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ）；Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）；Ｑｉａｇｅｎ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）。
【０１８３】
以下の実施例は本発明の特定の好ましい実施形態及び態様を示し、更に例証するために提供され、その範囲を限定するものとしては解釈されない。
【０１８４】
［実施例１］ＰＣＲ中のＩＮＶＡＤＥＲアッセイにおけるフットプリントプローブの使用
この実施例は、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ及びＰＣＲの組み合わせから構成される定量アッセイについて記載する。ＩＮＶＡＤＥＲアッセイは、短い分析物特異的領域（例えば１１又は１２塩基）を有するフットプリントプローブを用いて実施される。本発明のかかる短い酵素フットプリントプローブの使用により、ＩＮＶＡＤＥＲ−ＰＣＲ組合せアッセイのダイナミックレンジが増加する。任意の特定の機序に限定されるものではなく、また本発明の実施に必須ではないが、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ等の侵入的切断アッセイにおいて短い分析物特異的領域を有するプローブを使用することにより、標的検出のダイナミックレンジを増加させることができると考えられている。なぜなら切断されたプローブはＰＣＲ反応に干渉しないためである。例えば、切断されたプローブは、短いため、１）安定にハイブリダイズせず、それ故ＰＣＲプライマー伸長を阻害しない、そして２）ＰＣＲ反応の一部として不適切に伸長されないと考えられている。
【０１８５】
この実施例では、以下の６種の標的を用いた：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−１２６；ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−１５５；Ｕ６  ＲＮＡ；及びＵ２４  ＲＮＡ。以下の１０×オリゴミックスを各標的に用いた：４μＭのリバースプライマー；４μＭのフォワードプライマー；４μＭのプライマー−スタッカー；５μＭのプローブオリゴ；及び２．５μＭのＦＲＥＴオリゴ。以下の１０×反応緩衝液を各反応に用いた：１００ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．５；７５ｍＭのＭｇＣｌ２；及び２５０μＭのｄＮＴＰ。２００ｎｇ／μＬのＡｆｕＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ；１．３３ユニット／μＬのＧｏ  Ｔａｑポリメラーゼ；８０ユニット／μＬのＭＭＬＶ逆転写酵素；及び７ｍＭのＤＴＴから構成されている４０×酵素ミックスも各反応に用いた。
【０１８６】
各標的に対する特異的プローブ、プライマー、侵入的オリゴヌクレオチド、及びＦＲＥＴカセット配列を図１１に示す。具体的には、図１１ＡはヒトｍｉＲ−２１標的を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチド配列を示し；図１１ＢはヒトｍｉＲ−１５５標的を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチド配列を示し；図１１ＣはヒトｍｉＲ−１２６標的を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチド配列を示し；図１１ＤはヒトＵ６  ｓｎＲＮＡ標的を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチド配列を示し；図１１ＥはヒトＵ２４  ｓｎＲＮＡ標的を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチド配列を示す。図１１Ａに関しては、一例として、配列の同一性は以下の通りである：プローブ（配列番号１）；ｍｉＲ−２１標的配列（配列番号２）；フォワードプライマー（配列番号３）；リバースプライマー／侵入的オリゴヌクレオチド（配列番号４）；プライマー−スタッカー（配列番号５）；及びＦＲＥＴカセット配列（配列番号６）。プライマー−スタッカーに関しては（図１１Ａ〜Ｃに示す配列番号５）、この配列はＲＴ−プライマー／マイクロＲＮＡハイブリッドを安定化させるために機能する。一般に、この配列がないと、検出レベルは著しく低下する場合がある（約１００倍）。プライマー−スタッカーではなく、ループ状に折り畳まれて５’末端にヘアピンを形成するリバースプライマーを使用することができる。
【０１８７】
反応は以下のように設定した。各ｍｉＲＮＡ標的のプレミックスを１ｐＭで調製し、Ｕ６及びＵ２４  ＲＮＡ標的のプレミックスを５ｐＭで調製した。次に１×濃度及び５×希釈の１０μＬの標的のアリコートを２つずつ９６ウェルプレート中に調製した。次に１０μＬのｔＲＮＡ標的なし対照（２０ｎｇ／μＬ  ｔＲＮＡ）を試験する各オリゴミックスに添加した。次いで、反応ミックスを各ウェルに添加し、その反応ミックスは以下の成分から構成されていた：２μＬの１０×オリゴミックス、２μＬの１０×反応緩衝液；０．５μＬの４０×酵素ミックス；及び５．５μＬの水。最後にプレートを１２００ｒｐｍで３０秒間回転させ、次いで以下のようにプログラムされたリアルタイムＰＣＲサーモサイクラーに入れた：４２℃−３０分；９５℃−２分；及び４０サイクルの（９５℃−２０秒→５０℃−４５秒→６０℃−３０秒）。データ収集は各５０℃−４５秒工程の終わりに設定した。
【０１８８】
データを図１２Ａ〜Ｅに示すように蛍光対サイクル数としてプロットした。コピー数対サイクル閾値の最線形回帰（ｍｏｓｔ  ｌｉｎｅａｒ  ｆｉｔ）を与える閾値を割り当てた（各図の下方パネル参照）。各標的の結果を以下の図に示す；ｍｉＲ−１５５（図１２Ａ）；ｍｉＲ−２１（図１２Ｂ）；ｍｉＲ−１２６（図１２Ｃ）；Ｕ６（図１２Ｄ）；及びＵ２４（図１２Ｅ）。これらのデータは、本発明の方法を用いて広範な初期標的数にわたって標的ＲＮＡの容易且つ迅速な検出を示す。
【０１８９】
［実施例２］ＰＣＲ−侵入的切断反応の種々の成分の効果
この実施例は、アッセイの種々の成分を試験するために、特定の成分を除く又は含むことを除いて、実施例１と同種のＰＣＲ−侵入的切断反応について記載する。この実施例では、以下の標的を使用した：Ｕ６  ＲＮＡ；ＧＡ−２１−ＤＮＡ；第５因子ＤＮＡ；及び第２因子ＤＮＡ。以下の１０×オリゴミックスを各標的のために調製した：４μＭのリバースプライマー；４μＭのフォワードプライマー；０．４μＭの侵入的オリゴ（指示したように特定の条件では省略）；６．７μＭのプローブオリゴ；及び２．５μＭのＦＲＥＴオリゴ。以下の構成を有する１０×反応緩衝液を各反応に用いた：１００ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．５；７５ｍＭのＭｇＣｌ２；及び２５０μＭのｄＮＴＰ（指示したように特定の条件では省略）。２００ｎｇ／μＬのＡｆｕＦＥＮ−１（指示したように特定の条件では省略）；１．３３ユニット／μＬのＧｏ  Ｔａｑポリメラーゼ（天然Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）；８０ユニット／μＬのＭＭＬＶ逆転写酵素（ＤＮＡ標的では省略）；及び７ｍＭ  ＤＴＴから構成されていた４０×酵素ミックスも各反応に用いた。
【０１９０】
各標的に対する特異的プローブ、プライマー、侵入的オリゴヌクレオチド、及びＦＲＥＴカセット配列を図１３に示す。具体的には、図１３ＡはＵ６  ＤＮＡ標的を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチド配列を示し；図１３Ｂは第５因子ＤＮＡ標的を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチド配列を示し；図１３Ｃは第２因子ＤＮＡ標的を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチド配列を示し；図１３ＤはＧＡ−２１−Ｒ  ＤＮＡ標的を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチド配列を示し；図１３ＥはヒトＵ６  ＲＮＡ標的を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチド配列を示す。
【０１９１】
反応は以下のように設定した。１ｎＭの合成標的又は１００ｎｇのゲノム標的でプレミックスを調製した。次に１×濃度及び５×希釈の１０μＬの標的のアリコートを２つずつ９６ウェルプレート中に調製した。次に１０μＬのｔＲＮＡ標的なし対照ミックス（２０ｎｇ／μＬ  ｔＲＮＡ）も試験する各オリゴミックスに対して調製した。１０μＬの反応ミックスを各ウェルに添加し、その反応ミックスは以下の成分から構成されていた：２μＬの１０×オリゴミックス、２μＬの１０反応緩衝液；０．５μＬの４０×酵素ミックス；及び５．５μＬの水。次にプレートを１２００ｒｐｍで３０秒間回転させ、次いで以下のようにプログラムされたリアルタイムＰＣＲサーモサイクラーに入れた：９５℃−２分；及び４０サイクルの（９５℃−２０秒→５０℃−４５秒→６０℃−３０秒）。データ収集は各５０℃−４５秒工程の終わりに設定した。
【０１９２】
データを図１４〜１７に示すように蛍光対サイクル数としてプロットした。第２因子標的の結果を図１４Ａ〜Ｄに示す。図１４Ａ〜Ｂは、侵入的オリゴヌクレオチド及びＦＥＮ−１酵素の両方が存在するこの実施例の結果を示し、図１４Ｃ〜Ｄは侵入的オリゴヌクレオチド及びＦＥＮ−１酵素が存在しない結果を示す。第２因子の各ウェルの標的レベルを以下の表１に示す。ここで用いられる「Ｃｌｅａｖａｓｅ」とは、Ａｆｕ  ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼを指す。
【表１】
0005651022.tif 000002
【０１９３】
第５因子標的の結果を図１５Ａ〜Ｆに示す。図１５Ａ〜Ｂは、全ての反応成分が存在する実施例の結果を示す。図１５Ｃ〜Ｄは、侵入的オリゴヌクレオチド及びＦＥＮ−１酵素が存在しない結果を示す。図１５Ｅ〜Ｆは、ｙ軸の最大が６０，０００ではなく１０，０００であることを除いて図１５Ｃ〜Ｄと同じ結果を示す。
【０１９４】
トウモロコシの導入遺伝子ＧＡ−２１−Ｒ標的の結果を図１６Ａ〜Ｄに示す。図１６Ａ〜Ｂは、侵入的オリゴヌクレオチド及びＦＥＮ−１酵素の両方が存在する実施例の結果を示し、図１６Ｃ〜Ｄは侵入的オリゴヌクレオチド及びＦＥＮ−１酵素が存在しない結果を示す。ＧＡ−２１−Ｒの各ウェルの標的レベルを以下の表２に示す。
【表２】
0005651022.tif 000003
【０１９５】
Ｕ６標的の結果を図１７Ａ〜Ｄに示す。図１７Ａ〜Ｂは、侵入的オリゴヌクレオチド及びＦＥＮ−１酵素が両方存在するこの実施例の結果を示し、図１７Ｃ〜Ｄは侵入的オリゴヌクレオチド及びＦＥＮ−１酵素が存在しない結果を示す。Ｕ６の各ウェルの標的レベルを以下の表３に示す。ここで用いられる「Ｃｌｅａｖａｓｅ」とは、ＡｆｕＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼを指す。
【表３】
0005651022.tif 000004
【０１９６】
上記結果を鑑みて、ポリメラーゼ酵素が５’ヌクレアーゼ活性を含む場合でさえも、ＦＥＮ−１酵素及び侵入的オリゴが存在しないときには実質的にシグナルが生じないことが明らかである。
【０１９７】
［実施例３］ＰＣＲ中にＳＮＰを検出するために構成されたＩＮＶＡＤＥＲアッセイにおける短いプローブの使用
この実施例は、遺伝子型同定のためにＰＣＲ中に実施される侵入的切断アッセイにおける短い分析物特異的領域（この実施例では１２塩基）を有するプローブの使用について記載する。この実施例における標的は第５因子である。第５因子のＳＮＰを検出するための特異的プローブ、プライマー、侵入的オリゴヌクレオチド、及びＦＲＥＴカセット配列を図５に示す。
【０１９８】
野性型及び突然変異体反応を以下のように設定した。ゲノムＤＮＡ（１ｎｇ／μＬ）又はｔＲＮＡ標的なし対照（２０ｎｇ／μＬ  ｔＲＮＡ）の１０μＬのアリコートを９６ウェルプレートに入れた。１０μＬの反応混合物を各ウェルに添加し、ここで前記反応混合物（並びに４０×酵素ミックス）は実施例１に記載の通りである。１０×オリゴ混合物（反応混合物の一部）は、表４に示す以下の配列で構成されている。
【表４】
0005651022.tif 000005
【０１９９】
プレートを１２００ｒｐｍで３０秒間回転させ、以下のようにプログラムされたリアルタイムＰＣＲサーモサイクラーに入れた：９５℃−２分；及び５０サイクルの（９５℃−２０秒→５２℃−６０秒）。データを各５2℃−４５秒工程の終わりに収集した。
【０２００】
図６に示すように、データを蛍光データ対サイクルとしてプロットする。突然変異体標的検出の結果を図６Ａに示し、野性型標的検出の結果を図６Ｂに示し、不均一な標的検出の結果を図６Ｃに示す。各標的について、各遺伝子型に対する最小交差反応性を与えるサイクル閾値（Ｃｔ）を割り当てる。Ｌｕｄｅｒｅｒら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５０，Ｎｏ．４（２００４）：７８７−７８８に記載されているＴＡＱＭＡＮアッセイを用いた同じ対立遺伝子の検出のデータを図６Ｄ〜Ｆに示す。
【０２０１】
図７は、ここに記載のように、フットプリントプローブを用いるＰＣＲ＋侵入的切断におけるＦＡＭ  Ｃｔ対Ｙｅｌｌｏｗ  Ｃｔのスキャッタープロット（パネルＢ）と比べた、Ｌｕｄｅｒｅｒらのデータのスキャッタープロット（パネルＡ）を示す。遺伝子型はＣｔ色素割当に基づいて決定される。パネルＡ及びＢの両方において、突然変異体はプロットの上方左角に示され、野性型はプロットの下方右角に示される。パネルＡでは、不均一な標的の結果を上方右側に示し、一方パネルＢでは、不均一な標的の結果をプロットの下方左角に示し、標的なし対照は同様に逆側である（パネルＡの下方左側、及びパネルＢの上方右角）。
【０２０２】
上記明細書で言及された全ての刊行物及び特許を参照することにより本明細書に援用する。本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく記載されている本発明の組成物及び方法の種々の修正及び変形は当業者に明らかである。本発明は特に好ましい実施形態に関連して記載しているが、本発明はかかる特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際、関連分野の当業者に明らかである本発明を実施するために記載されている方法の種々の修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【図１】
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【図２Ａ】
0005651022.tif 000007
【図２Ｂ】
0005651022.tif 000008
【図３】
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【図４】
0005651022.tif 000010
【図５】
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【図６−１】
0005651022.tif 000012
【図６−２】
0005651022.tif 000013
【図７】
0005651022.tif 000014
【図８】
0005651022.tif 000015
【図９】
0005651022.tif 000016
【図１０】
0005651022.tif 000017
【図１１−１】
0005651022.tif 000018
【図１１−２】
0005651022.tif 000019
【図１２Ａ】
0005651022.tif 000020
【図１２Ｂ】
0005651022.tif 000021
【図１２Ｃ】
0005651022.tif 000022
【図１２Ｄ】
0005651022.tif 000023
【図１２Ｅ】
0005651022.tif 000024
【図１３−１】
0005651022.tif 000025
【図１３−２】
0005651022.tif 000026
【図１４−１】
0005651022.tif 000027
【図１４−２】
0005651022.tif 000028
【図１５Ａ】
0005651022.tif 000029
【図１５Ｂ】
0005651022.tif 000030
【図１５Ｃ】
0005651022.tif 000031
【図１５Ｄ】
0005651022.tif 000032
【図１５Ｅ】
0005651022.tif 000033
【図１５Ｆ】
0005651022.tif 000034
【図１６−１】
0005651022.tif 000035
【図１６−２】
0005651022.tif 000036
【図１７−１】
0005651022.tif 000037
【図１７−２】
0005651022.tif 000038
【配列表】
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