(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト又は哺乳類の骨芽細胞をイン  ビトロ培養して、培養培地中に均一に分布した対応する細胞凝集物を形成する方法であって、該骨芽細胞を、（ａ）ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、及び（ｂ）必須元素を含む塩、モノ−及びジ−サッカリド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、及びホルモンから選ばれる細胞成長促進若しくは支持剤を含む培養培地と、１日から１若しくは２週間接触させることを含み、ここで該細胞凝集物は線維芽細胞形態を有する細胞を、該ヒドロキシプロピルメチルセルロースの不在下で得られる対応する含量に比べて減少した含量で有する方法。
【請求項２】
ヒト又は哺乳類の骨芽細胞をイン  ビトロ培養して、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）の不在下で得られる対応する含量に比べて線維芽細胞形態を有する細胞を減少した含量で有する対応する細胞凝集物を形成するための、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）を含む細胞培養培地の使用。
【請求項３】
上記培養培地が、必須元素を含む塩、モノ−及びジ−サッカリド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、及びホルモンから選ばれる細胞成長促進若しくは支持剤を含む、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
歯科用骨組織再生における請求項３に記載の使用。
【請求項５】
上記培養培地が歯周組織再生のためにタンパク性エナメルマトリックス誘導体を含む請求項４に記載の使用。
【請求項６】
整形外科骨組織再生における請求項２〜５のいずれか1項に記載の使用。
【請求項７】
上記培養培地がカルシウム源及びリン酸源を含む、請求項４又は６に記載の使用。
【請求項８】
上記カルシウム源が、一リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、ピロリン酸カルシウム及びクエン酸カルシウムから成る群から選ばれるカルシウム塩を含む、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
リンの源が、一リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム及びピロリン酸カルシウムから選ばれるリン酸塩である、請求項７又は８に記載の使用。
【請求項１０】
上記培地が、カルシウムヒドロキシアパタイト、水不溶性のリン酸カルシウム及び骨粉から成る群から選ばれる水不溶性の粒状材料を含む、請求項７〜９のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１１】
上記粒状材料の粒子の９５重量％又はそれ以上が２μｍ〜５０μｍの直径である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
上記粒状材料の粒子の９５重量％又はそれ以上が２μｍ〜１５μｍの直径である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
ヒト又は哺乳類の骨芽細胞をイン  ビトロ培養するための、（ａ）ヒドロキシプロピルメチルセルロース、（ｂ）必須元素の塩、モノ−及びジ−サッカリド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、及びホルモンから成る群から選ばれる細胞成長促進若しくは支持剤の１種又はそれ以上、及び（ｄ）カルシウム源及びリン酸源、を含む培養培地。
【請求項１４】
上記カルシウム源が、一リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、ピロリン酸カルシウム及びクエン酸カルシウムから成る群から選ばれるカルシウム塩を含む、請求項１３に記載の培養培地。
【請求項１５】
リンの源が、一リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム及びピロリン酸カルシウムから選ばれるリン酸塩を含む、請求項１３又は１４に記載の培養培地。
【請求項１６】
上記培養培地が、カルシウムヒドロキシアパタイト、水不溶性のリン酸カルシウム及び骨粉から成る群から選ばれる水不溶性の粒状材料を含む、請求項１３〜１５のいずれか1項に記載の培養培地。
【請求項１７】
上記粒状材料の粒子の９５重量％又はそれ以上の直径が２μｍ〜１５μｍである、請求項１６に記載の培養培地。
【請求項１８】
上記培養培地が歯周組織再生のためにタンパク性エナメルマトリックス誘導体を含む請求項１３〜１７のいずれか1項に記載の培養培地。
【請求項１９】
骨に固定するための薬学的組成物で覆った金属製固定表面領域を含む医学器具であって、該薬学的組成物は、ヒト又は哺乳類の骨芽細胞を（ａ）ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及び（ｂ）必須元素を含む塩、モノ−及びジ−サッカリド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、及びホルモンから成る群から選ばれる細胞成長促進若しくは支持剤の存在下で、１日から２週間培養して得られた、線維芽細胞形態を有する細胞をヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）の不在下で得られる対応する含量に比べて減少した含量で有するヒト又は哺乳類の骨芽細胞凝集物を含む、上記医学器具。
【請求項２０】
上記金属が、チタン、タンタル及びそれらの合金から選ばれる、請求項１９に記載の医学器具。
【請求項２１】
上記固定表面が、プレート、糸（ｔｈｒｅａｄ）、ねじ、又は他の骨固定要素の表面である、請求項２０に記載の医学器具。
【請求項２２】
ヒドロキシプロピルメチルセルロースの不在下で得られる対応する含量に比べて線維芽細胞形態を有する細胞を減少した含量で有する骨芽細胞凝集物であって、ヒト骨芽細胞を、（ａ）ヒドロキシプロピルメチルセルロース、（ｅ）生理的食塩水又はその他の浸透圧制御剤、及び（ｂ）必須元素を含む塩、モノ−及びジ−サッカリド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質及びホルモンから選ばれるゲルに溶解した細胞成長促進若しくは支持剤から成る群から選ばれる１種若しくはそれ以上を含む水性培地中で、１日から１週間若しくは２週間イン  ビトロ培養することにより得られる上記骨芽細胞凝集物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養培地中に均一に分布した細胞凝集物（クラスター）を形成するために、ヒト又は哺乳類の間葉幹細胞及び骨芽細胞を培養する方法に関する。本発明はまた、骨芽細胞用組成物を運ぶための、対応する手段及びその使用、並びに骨芽細胞の培養凝集物の他の側面、例えば破壊された生きた骨の修復、骨組織の再生及び医学器具の骨への埋め込み、に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、多くの研究が、無傷の組織に見られる細胞の構成に似た細胞の構成を真似た培養システムの開発の重要性を強調している（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。かかる培養システムは、研究及び臨床的方法により適切な動的システムを創造すると考えられている。他の操作又は連続培養なしで細胞の三次元（３Ｄ）構造（細胞凝集体）への成長を促す環境は、標準的培養プレートでは不可能である。かかる培地中で培養された細胞はまた、増殖反応を好むのに必要な細胞構成に変化を誘発する。培養物中の幹細胞の性質の維持及び多数の幹細胞の発生は、臨床的応用に不可欠な基準である。
【０００３】
アガロース、アルギネート、ゼラチン、フィブリン等のようなヒドロゲルは３Ｄ骨芽細胞培養及びかかる細胞の埋め込み部位へのイン  ビボ伝達に使用されている（非特許文献４）。これらの研究は、ヒドロゲル細胞培養物において良好な細胞の存続性及び細胞分化の誘導への機会を例証した。しかしながら、ゲル封入細胞をイン  ビボ伝達の応用に用いる場合は、細胞への機械的損傷、細胞移動の妨害の可能性、従って、埋め込み部位における低い一体化パーセントを考慮に入れなければならない。
【０００４】
いくつかの研究から、複合細胞と細胞、及び細胞と細胞外マトリックスの相互作用が生きた組織に起きることが明らかである（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。Ｅｎｇｌｅｒ（２００６）はマトリックスの堅さはヒト間葉幹細胞の分化の方向を変更し得ることを見出した。幹細胞の分化を支配するのにおいて、柔らかい基質は脳組織の弾性によく似ており、一方、堅い基質は骨のマトリックスによく似ていることを彼らは示した。主な問題は、所定の生きた組織において元の三次元細胞組織体を正確に反映して有効なイン  ビトロ３Ｄ細胞培養系の開発を可能にする基質を確定することである。
【０００５】
ヒドロキシプロピル−メチルセルロース（ＨＰＭＣ）を二相性リン酸カルシウム（ＢＣＰ）と組み合わせて使用して、骨の修復における空洞充填用の注入可能な骨代替物を製造していた（非特許文献８、非特許文献９）。Ｇｒｉｍａｎｄｉ外は、ＨＰＭＣとリン酸カルシウムの組み合わせはイン  ビトロで毒性でないことを示し、そして細胞成長を評価するためにＨＰＭＣ及びリン酸カルシウムに対して予備インキュベートした媒体抽出を使用した時に細胞成長を阻害したことを観察した。Ｌｅｒｏｕｘｅｌ（２００６）は、注入可能なリン酸カルシウム足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）（ＩＣＰＳ、ＢＣＰカルシウム粒状物とセルロース性ポリマー誘導体との混合物から成る）を骨髄移植のための担体として使用して、照射した骨欠損のために動物モデル内の欠損領域に充填した。彼らは、骨髄細胞とＩＣＰＳの混合物を骨欠損部に充填するために使用した場合、移植用ＩＣＰＳのみを使用した場合に比べて、骨修復に著しい増加を示した。
【０００６】
歯、形成／再構成及び整形外科用における骨組織再生は、骨組織を損なったいろいろな種類の損傷に即応することを目的とする。移植材料を移植部位に置き、次いで移植材料及び該部位をバリアーで覆う。新しい骨成長を該部位に、移植材料のホスト再吸収により誘発する。移植材料は該部位において骨形成を誘発することができなければならない。バリアー材料は生分解性でなければならない。チタン及びタンタルは、骨代替物及び／又は骨置換物として及び／又はインプラント内へ固定するために及び／又は補綴手術のために使用される生体適合性金属である。
【０００７】
あごに固定された歯インプラントはしばしば、歯周病（ｐａｒｏｄｏｎｔｉｔｉｓ）又は歯の損失の他の原因の後の歯置換えに使用される。歯インプラントがうまく固定されるために、あごは充分な量の骨材料を含まなければならない。アメロゲニン（Ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎ）（Ｅｍｄｏｇａｉｎ、登録商標）は、歯の失われた付属物の再生に使用されるマトリックスタンパク質混合物である。該薬剤は歯根表面上に沈殿し、そして幹細胞定着を誘発して歯根付属物となる。骨粗しょう症は、骨再吸収と骨形成との間の不均衡の結果であり、ここで骨組織が骨芽細胞により形成されるよりも速く、破骨細胞が骨組織を再吸収する。骨粗しょう症の骨はより崩壊し易い。典型的な骨粗しょう症崩壊は、脊髄、臀部及び手首で起こる。
【０００８】
シラン化ヒドロキシプロピルメチルセルロース（Ｓｉ−ＨＰＭＣ）は、ヒト軟骨細胞及びヒト骨形成細胞の３Ｄ細胞培養に使用されていた（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。しかしながら、該Ｓｉ−ＨＰＭＣ足場は水溶性でなく、従って培養された骨形成細胞を体液のような水性媒体で濯いでも除去できない。
【０００９】
特許文献１は、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース（ＨＰＭＣ）の水溶液を、培養された膵臓ベータ細胞の成長を刺激するための媒体として使用することを開示する。特許文献２は、ＤＮＡ／ＲＮＡ−埋め込み媒体としてＨＰＭＣの水溶液を開示する。
【００１０】
コラーゲン型Ｉは最も豊富な骨マトリックスタンパク質である。それは成熟骨細胞の全有機マトリックスの９０パーセントを構成し、組織の強度に関与する。オステオカルシンは骨形成の後期のマーカーであり、マトリックス鉱物化に関与し、そしてその発現は鉱化の過程を親密に写すだす。それは骨鉱化の均衡において調整的役割を有する（非特許文献１３）。ＣＤ４４は軟骨細胞のマーカーと考えられる。ＣＤ４４遺伝子の発現は骨芽細胞分化の全段階に検出されている。ＣＤ４４遺伝子発現は骨形成及び骨組織編成に役割を果たすであろうことが示唆された（非特許文献１４）。
【００１１】
特許文献３は、メチルセルロース又はカルボキシメチルセルロースのような水溶性ポリマーを含む細胞培養液を、制御された大きさのヒト線維芽細胞から細胞回転楕円体を産生するのに使用することを開示する。このようにして産生された回転楕円体は薬物の毒性のイン  ビトロ評価に意図されている。
【００１２】
特許文献４は、非接着性壁を有する容器内の軟骨細胞及び正常骨細胞の浮遊培養された細胞凝集物を開示する。
【００１３】
間葉幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｒｌｌ）（多機能間質細胞）は、種々の細胞型、例えば骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）及び軟骨細胞、に分化することができる多機能細胞である。間葉幹細胞及び骨芽細胞の培養における問題は、当業界で知られた細胞培養方法を用いて得られる低拡大（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）レベルである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＷＯ９８／０４１６１７
【特許文献２】ＥＰ１３０３５８６  Ａｌ
【特許文献３】ＪＰ７０７９７７２  Ａ
【特許文献４】ＪＰ２００３３０４８６６  Ａｌ
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｃｕｋｉｅｒｍａｎ  Ｅ  外，２００１
【非特許文献２】Ｇｒｉｆｆｉｔｈ及びＮａｕｇｈｔｏｎ，２００２
【非特許文献３】Ｓｃｈｍｅｉｃｈｅｌ及びＢｉｓｓｅｌｌ，２００３
【非特許文献４】Ｔｒｏｊａｎｉ  Ｃ  外、，２００５
【非特許文献５】Ｙａｍａｄａ及びＣｌａｒｋ，２００２
【非特許文献６】Ｇｕｍｂｉｎｅｒ  Ｂ  Ｍ，１９９６
【非特許文献７】Ｏｈｌｓｔｅｉｎ  Ｂ  外，２００４
【非特許文献８】Ｇｒｉｍａｎｄｉ  Ｇ  外，１９９８
【非特許文献９】Ｌｅｒｏｕｘｅｌ  Ｅ  外，２００６
【非特許文献１０】Ｖｉｎａｔｉｅｒ  Ｃ  外，２００５
【非特許文献１１】Ｖｉｎａｔｉｅｒ  Ｃ  外，２００７
【非特許文献１２】Ｔｒｏｊａｎｉ  Ｃ  外，２００５
【非特許文献１３】Ｔｅｒｍｉｎｅ  Ｊ  Ｄ  外，１９８１
【非特許文献１４】Ｊａｍａｌ及びＡｕｂｉｎ，１９９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、ヒト又は哺乳類の間葉幹細胞を骨芽細胞、特に均一に分布した３−Ｄ細胞凝集物の形態の骨芽細胞、に培養する方法を提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、ヒト又は哺乳類の間葉幹細胞を骨芽細胞に培養する方法、又は培養中に骨形成遺伝子発現の減少したレベルを示すヒト又は哺乳類の骨芽細胞を培養する方法を提供することである。
【００１８】
本発明の更に別の目的は、線維芽細胞形態を有する細胞の含量が減少した間葉幹細胞若しくは骨芽細胞の凝集物を提供することである。
【００１９】
本発明の更に別の目的は、ヒト又は哺乳類の間葉幹細胞又は骨芽細胞の細胞を細胞凝集物、特に線維芽細胞形態を有する細胞の含量が減少した細胞凝集物、に形成させる、ヒト又は哺乳類の間葉幹細胞又は骨芽細胞を培養するための培地を提供することである。
【００２０】
本発明の追加の目的は、治療においてかかる細胞のための培養培地の使用を提供することである。
【００２１】
本発明の他の目的は、下記の本発明の概要、好ましい態様、及び添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、哺乳類又はヒト（一次）間葉幹細胞及び骨芽（造骨）細胞を水溶性セルロース誘導体の存在下で培養すると、拡大が向上し、そして培養培地に均一に分布した間葉幹細胞若しくは骨芽細胞の凝集物若しくは塊（クラスター）の形成が向上するとの考察に基づく。これと対照的に、水溶性セルロース誘導体の不存在下で、その他は同じ条件下でかかる細胞を培養すると、培養設備の表面に細胞が、線維芽細胞様の形態を保持した単層として付着し、塊又は凝集物が形成されない結果となる。特に、本発明は、ヒト又は哺乳類の間葉幹細胞又は骨芽細胞を水溶性セルロース誘導体の存在下で制限した期間、例えば２週間又はそれ以下、特に１週間又はそれ以下、培養すると、線維芽細胞の含量が減少した骨芽細胞の凝集物又は塊が得られる、との考察に基づく。更に、水溶性セルロース誘導体の存在下で水溶性セルロース誘導体を含む培養培地中でかかる細胞の拡大は、セルロース誘導体の不存在での拡大速度と比べて、実質的に増加した拡大速度で進む。本発明の細胞凝集物又は塊が開始から２４時間以内に培養培地に観察される。本願で、骨芽細胞の凝集物又は塊中の”線維芽細胞形態を有する細胞の減少した含量”とは、水溶性セルロース誘導体の不在下で対応する培養で得られる含量に対して減少した含量を意味する。線維芽細胞形態を有する細胞の減少した含量は、例えば、２０％又はそれ以上、更に好ましくは５０％又はそれ以上、最も好ましくは７０％又はそれ以上減少した含量である。線維芽細胞を有する細胞の減少した含量は、例えば、骨芽細胞凝集物が骨細胞凝集物に変換するのを遅らせる、即ち、適当な種類の鉱物源の存在下で骨芽細胞凝集物のイン  ビトロ及びイン  ビボでの鉱化を遅らせるのに有利であると思われている。かかる減少した含量はまた、かかる細胞を公知の培養工程によるよりも速く且つ実質的に大量に得るのを可能にする。マウスＭＣ３Ｔ３−Ｌ１（プロト）骨芽細胞及び（一次）ヒト間葉幹細胞を用いた実験で、本発明の水溶性セルロース誘導体の存在下でのそれらの培養は２倍又はそれ以上、細胞増殖を向上させることが観察され、同時に、成熟骨芽細胞への分化を示す骨芽細胞マーカーの発現、及び細胞死を示すカルシウム含量が、それぞれの細胞培養培地中で減少したことが観察された。本発明の凝集物又は塊の物理的性質は、生きた骨中の骨欠損の部位に薬物伝達のための注入及びインプラント一体化のために、それらを適したものとする。
【００２３】
本発明によると、上記の種類の方法であって、間葉幹細胞又は骨芽細胞を水溶性セルロース誘導体とイン  ビトロ又はイン  ビボで接触させることを含む方法が提供される。該水溶性セルロース誘導体は、必須元素を含む塩、モノ−若しくはジ−サッカリド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、及びホルモンから選ばれる細胞成長促進若しくは支持剤（ｓｕｓｔａｉｎｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含むのが好ましい。本発明の方法は、特に間葉幹細胞又は骨芽細胞が容易に且つ短時間に拡大するのを可能にし、一方それらの固有の表現型性質を保持する。拡大した細胞は欠損部位の充填、薬物伝達、及びインプラントの骨組織への一体化に使用できる。
【００２４】
本発明のセルロース誘導体はアルキル化、ヒドロキシ−アルキル化、及びアルキル化／ヒドロキシ−アルキル化セルロースである。特に好ましいのは、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチル−メチルセルロース、ヒドロキシエチル−エチルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロースである。最も好ましいのは、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース（ＨＰＭＣ）である。シリル化（ｓｉｌａｔｅｄ）セルロース誘導体の使用は、本発明に含まれない。
【００２５】
本願で使用する用語のセルロース誘導体は、セルロース鎖の実質的分解により得られる平均分子量２，０００Ｄａ又はそれ以下を有するフラグメントになったセルロース誘導体を含まない。本願で、”水溶性”とは、水又は生理学的ｐＨ、特にｐＨ約７−８の水性媒体を云う。本発明のセルロース誘導体は、ダウ  ケミカル、ウェスト  ポイント  ＰＡ，米国、で製造されそして商品名ＭＥＴＨＯＣＥＬ  Ｅ４Ｍで市販されている薬学的等級ヒドロキシメチルプロピルセルロース（ＨＰＭＣ）に似たゲル形成能力を有するべきである。このポリマーの２％水溶液は３０００〜５４００ｍＰａ・ｓの粘度を有する。本発明で、セルロース誘導体の量は、間葉幹細胞又は骨芽細胞の培養の方法に適合させて、培養培地の粘度を許容レベルに保持する。しかしながら、培養培地の高い粘度は、細胞成長速度に負に影響するので、避けるべきである。本発明の水溶性セルロース誘導体の水溶液の粘度は、ＭＥＴＨＯＣＥＬ（商品名）Ｅ４Ｍの０．３重量％から１．０重量％の水溶液の粘度に対応する粘度が好ましい。本発明のすべての観点で、水溶性セルロース誘導体は細胞成長促進量で使用される。細胞成長促進量は、培養培地中の細胞成長の速度を、本発明の水溶性セルロース誘導体を欠く対応する培養培地中の細胞成長速度に比べて増加させる量である。
【００２６】
従って、本発明により、ヒト又は哺乳類の間葉幹細胞又は骨芽細胞をイン  ビトロ培養して、培養培地中に均一に分布した対応する細胞凝集物を形成する方法であって、該間葉幹細胞又は骨芽細胞を、アルキル化、ヒドロキシ−アルキル化、及びアルキル化／ヒドロキシ−アルキル化セルロース又はそれらの混合物から選ばれる水溶性セルロース誘導体、及び必須元素を含む塩、モノ−及びジ−サッカリド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、及びホルモンから選ばれる細胞成長促進若しくは支持剤を含む培養培地と、１日から３日又は１若しくは２週間、接触させることを含む方法が提供され、ここで該細胞凝集物は線維芽細胞形態を有する細胞を、水溶性セルロース誘導体の不在下で得られる対応する含量に対して（比べて）減少した含量、特に２０％又はそれ以上、更に好ましくは５０％又はそれ以上、最も好ましくは７０％又はそれ以上減少した含量で有する。
【００２７】
本発明の好ましい観点によると、ヒト又は哺乳類の間葉幹細胞又は骨芽細胞をイン  ビトロ又はイン  ビボ培養するための培養培地であって、（ａ）本発明の水溶性セルロース誘導体、（ｂ）必須元素の塩、モノ−及びジ−サッカリド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、及びホルモンから成る群から選ばれる細胞成長促進若しくは支持剤の１種又はそれ以上、（ｃ）任意に薬品、特に抗生物質、（ｄ）カルシウム源及びリン酸源を含む培養培地が提供される。本発明の細胞培養培地において、カルシウム源は好ましくはカルシウム塩、特に一リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、ピロリン酸カルシウム、クエン酸カルシウムから成る群から選ばれるカルシウム塩を含む。本発明の細胞培養培地において、リン源は好ましくはリン酸塩、特に一リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、ピロリン酸カルシウムから選ばれるリン酸塩を含む。本発明によると、細胞培養培地は追加して又は独立して、カルシウムヒドロキシアパタイト、実質的に水不溶性のリン酸カルシウム、及び骨粉から成る群から選ばれる実質的に水不溶性の粒状材料を含み得る。粒状材料の粒子の９５パーセントは２μｍ〜５０μｍの直径を有するのが有利である。本発明の培養培地は更に、歯周組織再生のためにタンパク性エナメルマトリックス誘導体、特にアメロゲニン（ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎ）、を含み得る。
【００２８】
ヒト又は哺乳類の間葉幹細胞又は骨芽細胞のイン  ビトロ培養用以外に、本発明の培養培地は多くの好ましい用途、例えば崩壊した生きた骨を接着するため及び生体適合性材料を生きた骨に接着固定するための接着剤（のり）としての用途、を有する。本発明の培養培地で湿らすことができるあらゆる生体適合性材料を使用できる。好ましい材料はチタン、ハフニウム及びセラミック材料、並びにポリマー材料、例えばポリウレタン、ポリ（ウレタン尿素）、ポリアセテート、ポリグリコレート、ポリ（ラクテート、グリコレート）、である。
【００２９】
本発明の第２の好ましい観点によると、骨粗しょう症治療のための薬学的組成物が開示され、該組成物は、アルキル化、ヒドロキシ−アルキル化、又はアルキル化／ヒドロキシ−アルキル化セルロース又はそれらの混合物、特にＨＰＭＣ、から選ばれる水溶性セルロース誘導体のゲルの存在下で１日から１週間若しくは２週間の期間培養した間葉幹細胞凝集物及び骨芽細胞凝集物を含み、該凝集物は線維芽細胞形態を有する細胞を減少した含量で有する。該組成物は、場合によっては、生理的食塩水又は他の浸透圧制御剤、必須元素を含む塩、モノ−及びジ−サッカリド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、及びホルモンから成る群から選ばれる該ゲルに溶解した細胞成長促進若しくは支持剤から成る群から選ばれる１種又は数種の薬剤を含む。線維芽細胞形態を有する細胞の減少した含量は、水溶性セルロース誘導体の不在下で得られる対応する含量に対して（比べて）、２０％又はそれ以上、更に好ましくは５０％又はそれ以上、最も好ましくは７０％又はそれ以上減少した含量である。本発明の薬学的組成物の好ましい用途は、形成外科及び再建外科である。
【００３０】
本発明の第３の好ましい観点によると、線維芽細胞形態を有する細胞を水溶性セルロース誘導体の不在下で得られる対応する含量に対して（比べて）減少した含量、特に２０％又はそれ以上、更に好ましくは５０％又はそれ以上、最も好ましくは７０％又はそれ以上減少した含量、で有するヒト又は哺乳類の間葉細胞又は骨芽細胞の凝集物であって、ヒト又は哺乳類の間葉幹細胞又は骨芽細胞を、本発明の水溶性セルロース誘導体、並びに生理的食塩水又はその他の浸透圧制御剤、及び必須元素を含む塩、モノ−及びジ−サッカリド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、及びホルモンから選ばれるゲルに溶解した細胞成長促進若しくは支持剤から成る群から選ばれる１種若しくはそれ以上を含む水性培養培地中で、１日から１週間、又は１日から２週間イン  ビトロ培養することにより得られる上記凝集物が開示される。本発明の骨芽細胞凝集物の好ましい用途は、骨再生である。
【００３１】
本発明の第４の好ましい観点によると、ヒト又は哺乳類の間葉幹細胞又は骨芽細胞をイン  ビトロ又はイン  ビボ培養して、水溶性セルロース誘導体の不在下で得られる対応する含量に対して（比べて）線維芽細胞形態を有する細胞を減少した含量、特に、２０％又はそれ以上、更に好ましくは５０％又はそれ以上、最も好ましくは７０％又はそれ以上減少した含量、で有する対応する細胞凝集物を形成するための、水溶性セルロース誘導体を含む細胞培養培地の使用が開示される。本発明のヒト又は哺乳類の間葉細胞凝集物又は骨芽細胞凝集物は、１日から１若しくは２週間にわたる培養期間中に形成される。該培養培地は更に、必須元素を含む塩、モノ−及びジ−サッカリド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、及びホルモンから選ばれる細胞成長促進若しくは支持剤を含むことができ、そして場合によっては薬品、特に抗生物質を含む。好ましい用途は、歯科骨組織再生であり、かかる場合、培養培地は歯周組織再生のためにタンパク性エナメルマトリックス誘導体、特にアメロゲニン（ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎ）、を含むことができる。別の好ましい用途は、整形外科骨組織再生である。有利には、培養培地はカルシウム源及びリン酸源を含むことができる。カルシウム源は、カルシウム塩、特に一リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、ピロリン酸カルシウム、クエン酸カルシウムから成る群から選ばれるカルシウム塩を含むのが好ましい。リンの好ましい源は、リン酸塩、特に一リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、ピロリン酸カルシウムから選ばれるリン酸塩である。培養培地は追加して、カルシウムヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、及び骨粉から成る群から選ばれる実質的に水不溶性の粒状材料を含み得、該粒状材料の粒子の９５重量％又はそれ以上は２μｍ〜５０μｍの直径を有する。
【００３２】
本発明の第５の観点によると、骨に固定するための医学器具であって、本発明の水溶性セルロース誘導体のゲル又は乾燥ゲル、又は本発明の培養培地、又は本発明の薬学的組成物で覆った金属製固定表面領域を含む該医学器具が開示される。該器具の金属は好ましくは、チタン、タンタル及びそれらの合金から選ばれる。該固定表面は、プレート、糸（ｔｈｒｅａｄ）、ねじ、とじ金（ステープル）又は他の骨固定要素の表面であることができる。
【００３３】
本発明の第６の観点によると、ヒト間葉幹細胞（ＭＳＣ）の患者への伝達における水溶性セルロース誘導体の使用が開示される。患者へ伝達するためのヒト間葉幹細胞（ＭＳＣ）の組成物は、薬学的に許容される水性担体、及び本発明の水溶性セルロース誘導体を該組成物の好ましくは０．２重量％〜５重量％の量、特に０．２重量％〜２重量％、で含む。該間葉幹細胞は好ましくは自系細胞である。骨欠損を有する患者の骨の再生方法は、該患者からヒト間葉幹細胞（ＭＳＣ）を入手し、該細胞を、本発明の水溶性セルロース誘導体を含む培養培地中で拡大し、拡大した細胞を採取し、該拡大した細胞を該患者の骨欠損に注入することを含む。該間葉幹細胞は、本発明の水溶性セルロース誘導体を含む水性注入媒体に懸濁して患者に注入する。
【００３４】
本発明を、多くの図面に例示された、好ましいがしかし制限するものでない態様を参照して、更に詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の細胞培養物及び対照培養物（ＨＰＭＣの存在下及びＨＰＭＣの不在下で０．５ｘ１０６細胞／ｍｌで培養したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）中のＬＤＨ放出を示すグラフである。データは４人の個々の実験からの平均±ＳＥＭである。
【図２】図２Ａ及び図２Ｂは培養３日後のＭＣ３Ｔ３−Ｌ１細胞の位相差顕微鏡写真である：（Ａ）ＨＰＭＣの存在下、（Ｂ）対照。
【図３Ａ】ＨＰＭＣの存在下及び対照におけるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の増殖を示すグラフである。データは４人の個々の実験からの平均±ＳＥＭである。
【図３Ｂ】ＨＰＭＣの存在下及び対照におけるＭＳＣ細胞の増殖を示すグラフである。データは４人の個々の実験からの平均±ＳＥＭである。
【図４】本発明のＨＰＭＣゲルを含む培地中のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞中のコラーゲン型ＩｍＲＮＡ、オステオカルシンｍＲＮＡ及びＣＤ４４ｍＲＮＡの発現、並びにＣａ＋濃度を、対照培地中の対応する発現又は濃度に対するパーセントとして示すグラフである。発現は、個々のサンプル中の２種のハウスキーピング遺伝子（ＲＰＩＩ及びＧＡＰＤＨ）の発現に相対的に計算した。結果を各時点における対照に対する％で計算し、そしてデータを５回の実験の平均±ＳＥＭとして表示する。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
細胞培養：マウス骨芽細胞系ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１（ＤＳＭＺ，ＡＣＣ２１０，ブラウンシュベーグ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ），ドイツ）を、２０％ウシ胎児血清（ＰＡＡ研究会社、オーストリア）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）を補充したアルファ−ＭＥＭ（ＰＡＡ研究会社、オーストリア）中で培養した。該細胞を３７℃の湿った雰囲気（空気９５％、ＣＯ２５％）のインキュベータ中に保持した。該細胞を、１ｍＭのＥＤＴＡを含む０．２５％のトリプシンを用いて８０％−９０％コンフリュエントで１週間に２回、二次培養した。ヒト間葉幹細胞（ＭＳＣ；カンブレックス  ビオ  サイエンス  ウォーカーズビレ社、ＭＤ，米国）を、２００ｍＭのＬ−グルタミン（ＭＳＣ；カンブレックス  ビオ  サイエンス  ウォーカーズビレ社、ＭＤ，米国）及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（カンブレックス  ビオ  サイエンス  ウォーカーズビレ社、ＭＤ，米国）を補充したＭＳＣ基礎培地（カンブレックス  ビオ  サイエンス  ウォーカーズビレ社、ＭＤ，米国）中で培養した。該細胞を、１ｍＭのＥＤＴＡを含む０．２５％のトリプシンを用いて８０％−９０％コンフリュエントで二次培養した。    
【００３７】
実験設計：該細胞を、それぞれアルファ−ＭＥＭ及びＭＳＣ基礎培地を補充したそれぞれの培養培地中で上記のようにして、２４穴細胞培養プレート中の培養インサート内で培養した。２つのタイプの培養インサート（ミリポア社、アイルランド）：孔サイズ０．４μｍのＰＣＦ（ポリカーボネート）及びＣＭ（親水性ポリ（テトラフルオロエチレン））、を平行にテストした。該細胞を本発明のゲル状（ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ）培地（ｇ／ｌ：１２．０、ＨＰＭＣ（ＭＥＴＨＯＣＥＬ（商品名）Ｅ４Ｍ、医薬等級；ダウ  ケミカル  カンパニー）；ＫＣｌ，０．４５；ＮａＣｌ，６．０；ＫＨ２ＰＯ４，０．４５；Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ，１５．２；ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ，２．２；水を加えて１Ｌ；η＝１２５（ｍＰａ・ｓ））の好ましい態様中に、又は通常の培地のみ中に、それぞれ細胞培養プレートの２つの区画内で懸濁して、最終濃度０．５ｘ１０６細胞／ｍＬとし、そして静かに混合して均一な懸濁液を作った。５００μｌの細胞懸濁液を含む培養インサートを、既に５００μｌの細胞培養培地を含む２４穴プレートの穴に置いた。該培地を１日置きに取り替えた。該プレートを３７℃の湿った雰囲気（空気９５％、ＣＯ２５％）のインキュベータ中に１４日間置いた。
【００３８】
形態：本発明のゲル状細胞培地内の細胞の形態を評価するために、全ての培養物を、オインパス逆光顕微鏡（オリンパス  ドイッチランド社、ハンブルグ、ドイツ）を用いて毎日調べた。
【００３９】
細胞増殖検定：細胞増殖速度を、細胞培養２４、４８及び７２時間後に［３Ｈ］−チミジン混入により決定した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、本発明のゲル状培地を用いて又は用いずに、両タイプの細胞培養インサート内で濃度０．５ｘ１０６細胞／ｍＬで培養した。細胞を、細胞収穫前に１２時間１μＣｉ／穴［３Ｈ］−チミジンに暴露した。各培養インサートの細胞を１．５ｍＬチューブに移した。チューブ内の細胞培養インサート及び細胞の両方を氷冷１ＸＰＢＳを用いて２回、そして氷冷５％トリクロロ酢酸を用いて２回洗って、混入されない［３Ｈ］−チミジンを除去した。洗浄段階中に細胞が確実に失われないようにするために、インサートから捨てた洗浄溶液をそれぞれのチューブ材料の中に集め、そして１３，０００ｘｇで３分、洗浄した細胞と共に遠心分離した。チューブ内の細胞及び培養インサート内に残っているかもしれない細胞を５００μＬの１Ｍ  ＮａＯＨに溶解した。溶解した細胞溶液４００μＬをインスタ（Ｉｎｓｔａ）−ゲルＩＩ液体シンチレーション流体８ｍＬに移し、そしてパーカードシンチレーションカウンター（パーカード、チューリッヒ、スイス）中で３分間測定した。ＨＰＭＣゲルの観察された影響が血清希釈又は血清濃度の変化によらないようにするために、ＨＰＭＣゲル培養物中の血清希釈が細胞増殖に及ぼす影響を、種々のＨＰＭＣゲル対血清の比で調査した。血清濃度の変化は、研究したあらゆるタイプの細胞における細胞増殖に著しい影響がないことが見出された。
【００４０】
細胞存続可能性（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）：本発明のゲル状培地における培養物の存続可能性状態を特徴づけるために、上澄みへのＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞培養物のラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出を１，２，４，７及び１４日後に測定した。ＬＤＨ放出を、ＨＰＭＣを有する細胞及びＨＰＭＣを有しない細胞（対照）について、及び両方の上記の培養インサートについて測定した。細胞培養を、インサート中及びプラスチックプレート上０．５ｘ１０６細胞／ｍＬの濃度で始まった。ＬＤＨ活性を、細胞毒検出キット（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（ＬＤＨ）（ボーリンガー、マンハイム、ドイツ）を用いて測定した。プロトコルによると、５０μＬの細胞サンプルを９６穴プレート内に、５０μＬのキット混合物（触媒及び着色溶液）と共に入れ、暗所で３０分間置き、その後吸収率をＥＬＩＳＡ読取器で４５０ｎｍで読み取った。全ての測定で低対照及び高対照を含めた。新しい培養培地中のＬＤＨ活性を低対照として（又は背景吸収率として）測定した。最高放出量のＬＤＨ（高対照）を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を有するプラスチックプレート上で溶解細胞により決定した。ＬＤＨ活性の百分率を、下記の式を用いて計算した：
ＬＤＨ活性（％）＝ｅｘｐ．値−低対照／高対照−低対照ｘ１００
【００４１】
ｍＲＮＡ単離：各穴からの全細胞培養培地を注意深く集め、そして−２０℃で保存した。細胞を溶解／結合バッファ（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＬｉＣｌ，１０ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０、０．５ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、及び１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））に溶解した。ｍＲＮＡを磁気ビーズＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５を用いて、製造者（ダイナル  エーエス（Ｄｙｎａｌ  ＡＳ）、オスロ、ノルウェー）が記載したようにして単離した。ｍＲＮＡを含むビーズを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、中に再懸濁し、そして使用するまで−７０℃で保存した。第１ストランド相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を得るために、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５及びランダムヘキサマープライマーの両方を含むｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（ビオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ヘルキュレス、カルフォルニア、米国）を用いてｍＲＮＡ含有溶液１μＬを直接塗布した。
【００４２】
リアルタイムＰＣＲ：反応を、ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ（ビオ−ラッド、ヘルキュレス、カルフォルニア、米国）を用いて行いそして監視した。２Ｘ  ｉＱ  ＳＹＢＲグリーン  スーパーミックスは、ｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ビオ−ラッド、ヘルキュレス、カルフォルニア、米国）に基づく。増幅プログラムは、鋳型（テンプレート）ｃＤＮＡの変性のための予備インキュベーションステップ（３分、９５℃）、次いで変性ステップ（１５秒、９５℃）、アニーリングステップ（１５秒、６０℃）、及び伸長ステップ（３０秒、７２℃）から成る５０サイクルから成る。各サイクルの後、フルオレッセンス（蛍光）を７２℃で測定した。ｃＤＮＡの無い負の対照を各検定で行った。サンプルは２重で行った。ＰＣＲ後の相対的定量を可能にするために、標準曲線を、各標的及びハウスキーピング遺伝子についての標準的反応から、Ｃｔ値（即ち、フルオレッセンスシグナルがバックグラウンドを越えるサイクル数）対ｌｏｇｃＤＮＡ希釈をプロットすることにより構築した。次に、未知のサンプルの各々についてのＣｔ読みを、標的又はハウスキーピングのいずれかの標準に対する量を計算するのに使用した。ｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピング遺伝子の平均の相対的濃度に対する標的遺伝子の相対的濃度の比として計算した。ｃＤＮＡを、Ｉ型コラーゲン、オステオカルシン、アルカリホスファターゼ、ＣＤ４４，骨サイアロタンパク質（ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ），オステリックス（Ｏｓｔｅｒｉｘ）の相対的転写発現について分析した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに使用したハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ及びオリゴヌクレオチドプライマー配列及び特定のパラメータを表に示す。リアルタイム効率は、全調査転写物の高リアルタイムＰＣＲ効率割合（ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｒａｔｅｓ）を示す、一連の希釈物を用いたｉＣｙｃｌｅｒ  ソフトウェア内の所定のスロープ、及びいろいろな濃度を使用した場合は高線形性（ｒ＞０．９９）から計算した。ＰＣＲ産生物をｉＣｙｃｌｅｒ上の融点曲線分析に付し、引き続き２％アガロース／トリス酢酸−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）ゲル電気泳動に付して、それぞれ増幅特異性、Ｔｍ及び産生物サイズを確認した（表）。
【００４３】
表：リアルタイムＰＣＲ定量に使用したプライマー
【表１】
0005714896.tif 000002
【００４４】
＊標的及びハウスキーピング遺伝子のリアルタイムＰＣＲに使用したセンス（Ｓ）及びアンチセンス（Ａ）プライマーのオリゴヌクレオチド配列
【００４５】
統計的分析：統計的分析を、繰り返し測定のために一元配置分散分析を用いて行った。相違の顕著性が学生のｔ−テスト或いはマン−ウィットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）Ｕテストのいずれかで評価された。顕著性はＰ＜０．０５に設定した。
【００４６】
細胞の細胞傷害性作用：類似の値が、ＰＣＦ及びＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞用のＣＭ培養インサート中のＬＤＨ活性について得られた（図１）。ＬＤＨ活性の増加は本発明のゲル状培地内の細胞培養物に観察された。しかし、本発明のゲル状培地を有する細胞培養物は対照と比べて７日目で著しく高いだけであった。本発明のゲル状培地を有する細胞培養物及び対照のＬＤＨ活性割合は４日目まで培養物中で増加し、そして５日以降は該割合は残る培養期間を通して一定になる。
【００４７】
細胞形態：ＣＭインサートは倒立顕微鏡を使用した細胞の可視化を可能にする。本発明のゲル状培地内で培養したＭＣＳ細胞及びＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の両方は、細胞成長２４時間内に多細胞凝集物形態を示した（図２Ａ）。該細胞は丸い形態を有し、そして該凝集物はゲル全体を通して均一に分布した。本発明のゲル状培地が不在の細胞培養物中の細胞は、線維芽細胞様の形態を維持し、そして培養インサート表面上に均一に分布しなかった（図２Ｂ）。それらは不規則な網構造を形成した。
【００４８】
細胞増殖：ＭＣ３Ｔ３−Ｌ１細胞（図３Ａ）及び一次ヒトＭＳＣ（図３Ｂ）の数は、ＨＰＭＣゲルで培養した場合、対照と比べて著しく多かった。ＭＣ３Ｔ３−Ｌ１細胞の、１日目で３倍の増加が観察され（Ｐ＝０．０２９）、２日及び３日目で５倍の増加が観察され（それぞれＰ＝０．０１１及びＰ＝０．０２９）、そして２日及び３日目でＭＳＣの２倍の増加が観察された（それぞれＰ＝０．００７及び０．０３９）。細胞増殖は、可能な血清希釈作用について検定した場合（データは示されていない）、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞及びＭＳＣの両方でＨＰＭＣゲル内で２倍を越えて増加した。
【００４９】
オステオカルシン及びコラーゲン１型マーカーの発現：オステオカルシン及びコラーゲン１型の両方のｍＲＮＡ発現は、本発明のＨＰＭＣゲルで培養したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞で著しく減少した。ＨＰＭＣの存在下で、図４から明らかなように、オステオカルシン及びコラーゲン１型のｍＲＮＡ発現は、１４日の培養期間にわたって、最も特定的には７日の培養期間にわたって、著しく減少したレベルにあった（それぞれＰ≦０．００１及びＰ≦０．０１４）。また、コラーゲン１型の発現は著しく減少したレベルにあったＰ≦０．０１４）。しかし、１日目を除いて、ＣＤ４４の発現は著しく影響はされなかった。カルシウム濃度はまた、両培養期間中に著しく減少した（Ｐ≦０．００２）。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）及びオステリックスのｍＲＮＡ発現は、本発明のＨＰＭＣゲルで培養された細胞内では検出限界に近く又はそれ以下であった（データは示されていない）。
【００５０】
細胞増殖：ＰＣＦ及びＣＭ培養インサートを有するＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞について、増殖は、両細胞培養インサートに匹敵するパターンを示した。本発明のゲル状培地を有する細胞培養物について、細胞増殖は対照よりも全ての期間で著しく高かった。対照に比べて、本発明のゲル状培地を有する細胞培養物を用いた細胞成長で５倍の増加が２日目（Ｐ＝０．０１１）及び４日目（Ｐ＝０．０２９）にあった。細胞成長は１日目に３倍増加し、そして著しく高かった（Ｐ＝０．０２９）。しかしながら、［３Ｈ］−チミジン混入速度は３日間の実験期間中に減少した。ヒト間葉幹細胞の細胞増殖は本発明のゲル状培地で著しく増加した。対照に比べて、本発明のゲル状培地内では２日目（Ｐ＝０．００７）及び３日目（Ｐ＝０．０３９）に２倍を越える増加があった。２４時間目に混入した放射性［３Ｈ］−チミジンの速度は同じであった。
【００５１】
骨芽細胞マーカーの遺伝子発現：ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の骨芽細胞表現型の性質を評価するために、コラーゲン型１、オステオカルシン及びＣＤ４４の一時的発現を研究した。遺伝子発現結果は両細胞培養インサート内で類似していた。一般に、コラーゲン型１、オステオカルシン及びＣＤ４４の発現レベルは、本発明のゲル状培地中の細胞培養物では対照と比べて低かった。コラーゲン型１の発現は、本発明のゲル状培地中の細胞培養物では５倍増加し、対照では２倍より多く増加した。コラーゲン型１発現は、本発明のゲル状培地中の細胞培養物では、１日目（ｎ＝４，Ｐ＝０．０３５）及び４日目（ｎ＝４，Ｐ＝０．０２９）では著しく低かった。培養中のいかなる時点でも、ＣＤ４４遺伝子発現レベルに著しい差異は観察されなかった。しかしながら、発現レベルは、培養１４日の間に、対照では５倍より多く増加し、そして本発明のゲル状培地中の細胞培養物では１．４倍増加した。オステオカルシン遺伝子発現は、７日目で本発明のゲル状培地中の細胞培養物では対照に比べて著しく低かった（ｎ＝４，Ｐ＝０．００１）。発現プロフィルは、培養時間と共に、対照では５倍の増加を示し、そして本発明のゲル状培地中の細胞培養物では３倍の増加を示した。アルカリホスファターゼ、骨シアロタンパク質及びオステリックス遺伝子の発現は、本発明のゲル状培地中の細胞培養インサートと、本発明のゲル状培地のないＣＭインサートの両方で、負又は無視できるレベルであった。しかしながら、それらは、本発明のゲル状培地のないＰＣＦ培養インサートにおいて、低レベルで検出され、培養時間と共に増加した。プラスチック培養プレート上のアルカリホスファターゼ、骨シアロタンパク質及びオステリックス遺伝子の発現は、培養時間の増加と共に増加レベルを示した。
【００５２】
［Ｃａ２＋］測定：サンプルの採取後、該サンプルを凍結乾燥し、３％ＨＣｌ中で均質化し、そして室温で２４時間振とうした。カルシウム含量を空気−アセチレン炎中で原子吸収分光法（ＡＡｎａｌｙｓｔ  ４００，パーキン  エルマー  インストルメンツ、シェルトン、米国）で測定した。リン酸塩の干渉を、測定前に標準及びサンプルに５％ランタンを添加して抑えた。
【００５３】
参考文献
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【図１】
0005714896.tif 000003
【図２】
0005714896.tif 000004
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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