(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
システアミンからなる抗バイオフィルム剤。
【請求項２】
請求項１に記載の抗バイオフィルム剤を含有する、微生物感染および微生物バイオフィルム感染の治療のための組成物。
【請求項３】
さらに、抗微生物ペプチドを含み、
前記抗微生物ペプチドが、式Ｉ：
（（Ｘ）ｌ（Ｙ）ｍ）ｎ    （Ｉ）
（式中、ｌおよびｍは、１から１０、例えば１から５の整数であり、ｎは、１から１０の整数であり、ＸおよびＹは、同一であっても異なっていてもよく、独立して、疎水性アミノ酸または陽イオン性アミノ酸である）で表されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
抗微生物ペプチドが、抗菌ペプチドである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
抗微生物ペプチドが、２から２００のアミノ酸を含む、請求項３または４に記載の組成物。
【請求項６】
Ｘおよび／またはＹが陽イオン性アミノ酸である、請求項３から５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
抗微生物ペプチドが、式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を含み、ＸおよびＹが陽イオン性アミノ酸である、請求項３から６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
Ｘおよび／またはＹが、ヒスチジン、アルギニン、およびリシンからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
Ｘおよび／またはＹが、アルギニンおよびリシンからなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
消毒剤または殺生物剤としての能力を有する、請求項３から９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
医薬品として用いるための、請求項３から９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項３から１１のいずれか１項に記載の組成物が塗布または接着されている基質。
【請求項１３】
さらに、１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を含む、請求項３から９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
微生物感染またはそれに関連する疾患もしくは状態を治療するための、請求項３から９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記感染またはそれに関連する疾患もしくは状態が、皮膚および創傷感染、中耳感染、胃腸管感染、腹膜感染、尿生殖路感染、口腔軟組織感染、歯垢の形成、眼の感染、心内膜炎、嚢胞性線維症における感染、ならびに留置型医療用デバイスの感染からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記感染またはそれに関連する疾患もしくは状態が、細菌、真菌、酵母、ウイルス、および原生動物から選択されるバイオフィルム形成微生物に関連する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記感染またはそれに関連する疾患もしくは状態が口腔内である、請求項１５又は１６に記載の組成物。
【請求項１８】
治療上有効な量の
第１の抗バイオフィルム剤、および
第１の抗バイオフィルム剤とは異なる第２の抗バイオフィルム剤
を含有する、微生物感染を予防または治療するための医薬であって、
前記抗バイオフィルム剤の少なくとも１つが抗微生物ペプチドであり、前記抗バイオフィルム剤の少なくとももう１つがシステアミンであり、前記抗微生物ペプチドが、式Ｉ：
（（Ｘ）ｌ（Ｙ）ｍ）ｎ    （Ｉ）
（式中、ｌおよびｍは、１から１０、例えば１から５の整数であり、ｎは、１から１０の整数であり、ＸおよびＹは、同一であっても異なっていてもよく、独立して、疎水性アミノ酸または陽イオン性アミノ酸である）で表されるアミノ酸配列を含む、医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオフィルムの予防および治療に関して有用な製品、組成物、方法、および使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物のバイオフィルムは、ポリマー物質の細胞外マトリクス内に根付いた、生物学的な、または非生物的な表面に対して付着性の、微生物細胞の群集である。様々な微生物（関連するバクテリオファージおよび他のウイルスを含む、細菌、真菌、および／または原生動物）を、これらのバイオフィルムにおいて見ることができる。バイオフィルムは、自然界で遍在しており、広範な環境においてよく見られる。バイオフィルムが多くの感染に関与していること、特にそれらが感染の治療を困難にしていることが、科学界および医学界において次第に認められてきている。
【０００３】
バイオフィルムは、哺乳動物における多くの病態の病原因子であり、ヒトにおける感染の８０％に関与する。例には、皮膚および創傷感染、中耳感染、胃腸管感染、腹膜感染、尿生殖路感染、口腔軟組織感染、歯垢の形成、眼の感染（コンタクトレンズの汚染を含む）、心内膜炎、嚢胞性線維症における感染、ならびに人工関節、歯科インプラント、カテーテル、および心臓インプラントなどの留置型医療用デバイスの感染が含まれる。
【０００４】
浮遊性微生物（すなわち、液体媒質中で懸濁または増殖している微生物）は、典型的に、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）およびＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ（ＥＵＣＡＳＴ）によって記載されているように、抗微生物剤に対する感受性の調査のためのモデルとして用いられる。バイオフィルムにおける微生物は、それらの浮遊性の同等物よりも抗微生物治療に対して著しく耐性が高い。しかし、バイオフィルム微生物の抗生物質に対する感受性を研究するための、標準化された方法はない。
【０００５】
バイオフィルムの形成は、微生物が表面に接着する能力のみに限定されるわけではない。バイオフィルム中で増殖している微生物は、バイオフィルムが最初に発生する実際の物理的基底と相互作用するよりも、互いの間で、より相互作用することができる。例えば、この現象は、接合による遺伝子伝播を促し、これは、浮遊性細胞間よりもバイオフィルム中の細胞間で、大きい割合で生じる。このことは、細菌間での水平遺伝子伝播の機会が増大することを意味し、かつ、これは、耐性微生物から感受性微生物への、抗生物質に対する耐性または病原性を決定する遺伝子の伝播を容易にし得るため、重要である。細菌は、クオラムセンシングとして知られているシステムによって互いに連絡することができ、このシステムを介してシグナル伝達分子が環境内に放出され、それらの濃度が周辺の微生物によって検出され得る。クオラムセンシングによって、細菌がそれらの挙動を連係させることが可能となり、その結果、細菌の生存能力が増強される。クオラムセンシングに対する応答には、栄養の利用可能性に対する適合、同一の栄養について競合し得る他の微生物に対する防御、および細菌にとって危険である可能性がある毒性化合物の回避が含まれる。宿主（例えば、ヒト、他の動物、または植物）に感染している間の病原性細菌にとって、感染をうまく達成することができるように宿主細胞の免疫応答を免れるために、それらの病原性を連携させることは非常に重要である。
【０００６】
バイオフィルムの形成は、嚢胞性線維症および歯周炎などの多くの感染性疾患において、および留置型医療用デバイスの存在の結果としての血流感染および尿路感染において重要な役割を果たす。バイオフィルムに関連する微生物がそれらの宿主において疾患を引き起こすための示唆されるメカニズムには、（ｉ）バイオフィルムのマトリクスによる抗微生物剤の浸透の遅延、（ｉｉ）留置型医療用デバイスのバイオフィルムからの細胞または細胞集合体の脱離、（ｉｉｉ）エンドトキシンの生産、（ｉｖ）宿主免疫系に対する耐性、（ｖ）抗微生物剤に対する耐性および／または病原性を決定する遺伝子の水平遺伝子伝播による耐性生物の発生のためのニッチの提供、ならびに（ｖｉ）増殖速度の改変（すなわち、代謝的休眠）が含まれる（ＤｏｎｌａｎおよびＣｏｓｔｅｒｔｏｎ、Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  １５：１６７〜１９３頁、２００２年；ＰａｒｓｅｋおよびＳｉｎｇｈ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５７：６７７〜７０１頁、２００３年；Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ  Ｊ  Ｗ、Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｂｉｏｆｉｌｍｓ  ｔｏ  ｓｔｒｅｓｓ．「Ｔｈｅ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｐｒｉｍｅｒ」（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）．５６〜６４頁．２００７年）。
【０００７】
最近の実験的証拠によって、バイオフィルム内に、特殊な、代謝していない存続細胞（休眠細胞）の小さな亜集団が存在することが示されている。これらの細胞が、抗微生物剤に対するバイオフィルムの高い耐性／抵抗性に関与し得ると考えられている。多剤抵抗性の存続細胞は、浮遊性の集団およびバイオフィルムの集団の両方において存在し、酵母および細菌は、この亜集団に生存機能を付与する類似の戦略を発達させたと考えられる。ポリマー性のマトリクスによってもたらされた防御によって、存続細胞が排除を回避すること、および再増殖のための増殖源となることが可能になる。存続細胞が微生物バイオフィルムの多剤抵抗性に多大に関与し得ることが証明されている（ＬａＦｌｅｕｒら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５０：３８３９〜４６頁，２００６年；Ｌｅｗｉｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５、４８〜５６頁、２００７年）。
【発明の概要】
【０００８】
依然として、バイオフィルムの形成を予防するため、および微生物バイオフィルムに関連する症状を治療するための、より良い治療法が必要とされている。
【０００９】
本発明の第１の態様によると、少なくとも２つの抗バイオフィルム剤を含む製品が提供され、この製品において、抗バイオフィルム剤の少なくとも１つは、抗微生物ペプチドである。他方の抗バイオフィルム剤は、分散剤または抗付着剤とすることができる。
【００１０】
「抗バイオフィルム剤」という用語は、本明細書において、微生物バイオフィルムを消滅させることができるかまたはその増殖を阻害することができる作用物質を説明するために用いられる。抗バイオフィルム剤は、バイオフィルムの構造、例えば細胞外粘液マトリクスを崩壊させることができてもよく、または、バイオフィルム内の微生物細胞を消滅させることができるかもしくはその増殖を阻害することができてもよい。
【００１１】
本発明はさらに、抗微生物ペプチドを環境に投与するステップを含む、前記環境におけるバイオフィルムの形成を予防する方法を提供する。有利には、本方法は、本発明に従った製品を環境に投与するステップを含む。
【００１２】
本発明はさらに、治療上有効な量の抗微生物ペプチド、例えば陽イオン性ペプチドの投与を含む予防法または治療法によって、微生物の感染、特に微生物バイオフィルムを治療するための方法を提供する。典型的には、本方法は、治療上有効な量の
−  第１の抗バイオフィルム剤、および
−  第１の抗バイオフィルム剤とは異なる第２の抗バイオフィルム剤
の逐次投与または併用投与を伴い、第１および第２の抗バイオフィルム剤の少なくとも１つは、抗微生物ペプチド、例えば陽イオン性ペプチドである。
【００１３】
上述の活性作用物質は、自由なまたは固定された組み合わせで投与することができる。自由な組み合わせは、全ての活性作用物質を自由な組み合わせで含有する、組み合わせパッケージとして提供され得る。固定された組み合わせは、錠剤またはカプセルであることが多い。
【００１４】
本発明には、予防法もしくは治療法によって、微生物の感染、特に微生物バイオフィルムの感染を治療するための医薬品の製造における、抗微生物ペプチド、または上記に概説した活性作用物質の組み合わせの使用が含まれる。
【００１５】
製品は、バイオフィルム内に存在する、とりわけ存続細胞に対する抗菌活性を示すという利点を有し、これはバイオフィルムを根絶するための必須のステップである。
【００１６】
本発明の作用物質は、薬学的に許容される塩の形態で投与することができる。本発明の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって、塩基性または酸性の部分を含有する親化合物から合成することができる。通常、このような塩は、これらの化合物の遊離酸または遊離塩基の形態を、水もしくは有機溶媒またはこの２つの混合物内で、化学量論量の適切な塩基または酸と反応させることによって調製することができ、通常、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水媒質が好ましい。適切な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、ＵＳ、１９８５年、１４１８頁において見られ、この開示は、参照することによって本明細書に組み込まれる。また、Ｓｔａｈｌら編、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ」、Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００２年も参照されたい。「薬学的に許容される」という表現は、本明細書において、妥当な効果／リスク比に見合いながら、正しい医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、人間または場合によっては動物の組織と接触させる使用に適した、化合物、材料、組成物、および／または投薬形態を指すために用いられる。
【００１７】
したがって、本発明は、開示された化合物の薬学的に許容される塩を含み、親化合物は、その酸性または塩基性の塩、例えば、例えば無機または有機の酸または塩基から形成される従来の非毒性の塩または第４級アンモニウム塩を生じさせることにより、修飾される。このような酸付加塩の例には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンフルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、およびウンデカン酸塩が含まれる。塩基性の塩には、アンモニウム塩、ナトリウム塩およびカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩などのアルカリ土塁金属塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンなどの有機塩基との塩、ならびにアルギニン、リシンなどのアミノ酸との塩が含まれる。また、塩基性の窒素含有基を、塩化メチル、塩化エチル、塩化プロピル、塩化ブチル、臭化メチル、臭化エチル、臭化プロピル、臭化ブチル、ヨウ化メチル、ヨウ化エチル、ヨウ化プロピル、およびヨウ化ブチルなどの低級ハロゲン化アルキル、硫酸ジメチル、硫酸ジエチル、硫酸ジブチルなどの硫酸ジアルキル、ならびに硫酸ジアミル、そして、塩化デシル、塩化ラウリル、塩化ミリスチル、塩化ステアリル、臭化デシル、臭化ラウリル、臭化ミリスチル、臭化ステアリル、ヨウ化デシル、ヨウ化ラウリル、ヨウ化ミリスチル、およびヨウ化ステアリルなどの長鎖ハロゲン化合物、臭化ベンジルおよび臭化フェネチルなどのハロゲン化アラルキルなどの作用物質で、４級化することができる。
【００１８】
したがって、本発明は、少なくとも
−  第１の抗バイオフィルム剤、および
−  第１の抗バイオフィルム剤とは異なる第２の抗バイオフィルム剤
を通常含む薬学的製品を含み、第１および第２の抗バイオフィルム剤の少なくとも１つは、抗微生物ペプチド、例えば陽イオン性ペプチドである。
【００１９】
第１の抗バイオフィルム剤
第１の抗バイオフィルム剤は、抗微生物ペプチド、例えば抗菌ペプチドであってよい。好ましくは、第１の抗バイオフィルム剤は、以下「第１の抗微生物剤」と呼ばれる、抗微生物ペプチドである。第１の抗微生物剤は、式Ｉ：
（（Ｘ）ｌ（Ｙ）ｍ）ｎ    （Ｉ）
（式中、ｌおよびｍは、１から１０の整数、例えば１から５であり、ｎは、１から１０の整数であり、ＸおよびＹは、同一であっても異なっていてもよく、独立して、疎水性アミノ酸または陽イオン性アミノ酸である）に従ったアミノ酸を含むことができる。
【００２０】
好ましくは、第１の抗微生物剤は、ＸおよびＹが陽イオン性アミノ酸である式（Ｉ）に従ったアミノ酸を含む。
【００２１】
抗微生物ペプチドは、２から２００個のアミノ酸、例えば、３個、４個、５個、６個、または７個から１００個までのアミノ酸を含むことができ、これには、３個、４個、５個、６個、または７個から１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、または５０個までのアミノ酸が含まれる。一実施形態によると、抗微生物ペプチドは、３または４から５０個のアミノ酸を含む。あるいは、ペプチドは、２７個を超えるアミノ酸、典型的には２７から３００個のアミノ酸、適切には２７個から２００個のアミノ酸を含み得る。
【００２２】
ペプチドは、１００から２００個のアミノ酸、２０から１００個のアミノ酸、２０および４５個のアミノ酸、例えば、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４２個、または４５個のアミノ酸を含むことができる。ペプチドは、３から１５個の間のアミノ酸、例えば５から１５個のアミノ酸を含むことができる。
【００２３】
本明細書において用いられる場合、「疎水性」という用語は、無極性であり、通常は水性溶液によって反発される、生理的なｐＨで荷電していない側鎖を有するアミノ酸を言う。
【００２４】
本明細書において用いられる場合、「陽イオン性」という用語は、０以上の正味電荷を有するアミノ酸を言う。通常、「陽イオン性」という用語は、０よりも大きい正味電荷を有するアミノ酸を言う。
【００２５】
通常、疎水性アミノ残基は、−１．１０以上の疎水性、および０以上の電荷を有する。
【００２６】
疎水性アミノ酸には、ロイシン、フェニルアラニン、プロリン、アラニン、トリプトファン、バリン、イソロイシン、およびメチオニンが含まれ得る。
【００２７】
好ましくは、Ｘおよび／またはＹは、例えば、ヒスチジン、アルギニン、およびリシンからなる群から選択される、陽イオン性アミノ酸である。さらに好ましくは、Ｘおよび／またはＹは、アルギニンまたはリシンである。Ｘおよび／またはＹは、非天然のアミノ酸から選択され得、例えば陽イオン性アミノ酸であるオルニチンであり得る。
【００２８】
Ｘおよび／またはＹは、本明細書において定義される陽イオン性アミノ酸の光学異性体、例えば、Ｄ−またはＬ−アミノ酸であり得る。さらに、Ｘおよび／またはＹは、交互アミノ酸であり得る。
【００２９】
アミノ酸は、天然のものまたは合成のものであり得る。本発明はまた、上記のアミノ酸の既知の異性体（構造異性体、立体異性体、配座異性体、および立体配置異性体）および構造類似体、ならびに、天然の修飾（例えば、翻訳後修飾）、または限定はしないがリン酸化、グリコシル化、スルホニル化、および／もしくは水酸化を含む化学的修飾を受けたものを含む。
【００３０】
一実施形態によると、ペプチドは、陽イオン性アミノ酸または疎水性アミノ酸であるＸおよびＹの１つまたは複数の置換基を含み得る。しかし、ペプチドは、陽イオン性アミノ酸または疎水性アミノ酸であるＸおよびＹを主に含む。典型的には、ペプチドは、１から５個の置換基、適切には１から３個の置換基、通常は１個の置換基を含み得る。置換基は、末端であっても末端でなくてもよい。
【００３１】
置換基は、アミノ酸または非アミノ酸からなり得る。置換基は、荷電していてもいなくてもよい。典型的には、置換基の１つまたは複数は、荷電していないアミノ酸である。あるいは、またはさらに、置換基の１つまたは複数は、システアミンなどの非アミノ酸であり得る。
【００３２】
好ましくは、ＸおよびＹは同一であり、リシンまたはアルギニンである。
【００３３】
一実施形態によると、ペプチドは、アルギニンではない１つまたは複数のアミノ酸で置換されていてよいアルギニンアミノ酸を主に含む。
【００３４】
通常、ペプチドは、７から２０個のアルギニンアミノ酸を含み、これは、場合によっては１から５個のアルギニン以外のアミノ酸で置換されており、典型的には３から５個のアルギニン以外の置換基で置換されている。
【００３５】
あるいは、ペプチドは、７から２０個のリシンアミノ酸を含み得、これは、場合によっては１から５個のリシン以外のアミノ酸で置換されており、典型的には３から５個のリシン以外の置換基で置換されている。
【００３６】
さらなる実施形態によると、ペプチドは、２７から３００個のリシンアミノ酸、通常は２７から２００個のリシンアミノ酸を含み得る。典型的には、ペプチドは、リシン以外のアミノ酸での、末端以外での置換基を含まない。
【００３７】
式（Ｉ）のペプチドにおいて、ｌおよびｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０とすることができ、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０とすることができる。
【００３８】
式（Ｉ）のペプチドにおいて、ｌは１とすることができ、ｎは１とすることができ、ｍは４から９の間とすることができ、例えば、ｍは、３、４、５、６、７、８、または９とすることができる。
【００３９】
式（Ｉ）のペプチドにおいて、ｌ、ｎ、および／またはｍは、１から５の間、例えば、１、２、３、４、または５とすることができる。
【００４０】
式（Ｉ）のペプチドにおいて、ｌおよびｍは、０から７の間の整数とすることができ、ｎは、１から１０の間の整数とすることができる。
【００４１】
式（Ｉ）のペプチドにおいて、ｌおよびｍは、０、１、または２とすることができ、ｎは、１から１０の間の整数とすることができる。
【００４２】
式（Ｉ）のペプチドにおいて、ＸおよびＹは同一であってもよく、ｌは０とすることができ、ｍは１とすることができ、ｎは３、４、５、６、７、８、９、または１０とすることができる。
【００４３】
式（Ｉ）のペプチドにおいて、ＸおよびＹは同一であってもよく、ｌおよびｍは１とすることができ、ｎは２、３、４、または５とすることができる。
【００４４】
式（Ｉ）のペプチドにおいて、ＸおよびＹは同一であってもよく、ｌは１とすることができ、ｍは２とすることができ、ｎは１、２、３、または４とすることができる。
【００４５】
式（Ｉ）のペプチドにおいて、ＸおよびＹは同一であってもよく、ｌおよびｍは２とすることができ、ｎは１、２、３、または４とすることができる。
【００４６】
好ましくは、第１の抗微生物剤は、ポリリシンおよびポリアルギニンからなる群から選択されるペプチド配列を含む。
【００４７】
一実施形態において、第１の抗微生物剤は、ポリリシンを含む。
【００４８】
別の実施形態において、第１の抗微生物剤は、ポリアルギニンを含む。
【００４９】
本発明のさらなる態様によると、バイオフィルムの治療または予防における第１の抗微生物剤の使用が提供される。
【００５０】
典型的には、第１の抗微生物剤は、以下に記載される本発明の製品の形態である。
【００５１】
第２の抗バイオフィルム剤
第２の抗バイオフィルム剤は、バイオフィルムの形成を阻害する任意の作用物質とすることができる。例えば、第２の抗バイオフィルム剤は、細菌の付着、疎水性、またはスライムの生産を阻害し得る。第２の抗バイオフィルム剤は、分散剤および抗付着剤から選択され得る。
【００５２】
本発明の一実施形態によると、第２の抗バイオフィルム剤はペプチドではない。
【００５３】
「分散剤」という用語は、バイオフィルムの粒子を分散させることができる任意の作用物質を含むことを意図したものである。特に、分散剤は、細菌などの微生物によって生産されたスライム、バイオフィルムの一部を形成する粘液、例えばバイオフィルムの微生物が付着する細胞によって生産された粘液、および細菌などのバイオフィルムの微生物の分散を促進し得る。
【００５４】
分散剤は、粘液溶解剤であり得る。粘液溶解剤は、例えばＤＮａｓｅ、アルギナーゼ、プロテアーゼ、またはカルボヒドラーゼなどの酵素であり得る。あるいは、粘液溶解剤は、小分子、例えばアミノチオールなどのアミンまたはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの酸であり得る。アミンは、アセチルシステインおよびシステアミンから選択され得る。
【００５５】
「抗付着剤」という用語は、細胞間、タンパク質間、および生物間、例えば微生物間の付着を阻害して、それによってバイオフィルムの形成を予防するかまたはバイオフィルムの自己破壊を促進することができる、任意の作用物質を含むことを意図したものである。特に、抗付着剤は、微生物バイオフィルムに直面した全ての細胞型、特に遊離している生存微生物、すなわち浮遊性細胞の、表面または基質への付着を予防し得る。抗付着剤には、限定はしないが、ヒアルロナン、ヘパリン、またはカーボポール９３４が含まれ得る。
【００５６】
第２の抗バイオフィルム剤は、抗菌剤とすることができる。抗菌剤は、粘液溶解剤、例えば、粘液溶解活性および抗菌活性の両方を有する粘液溶解剤であり得る。好ましくは、抗菌剤はシステアミンである。
【００５７】
本発明の製品
本発明の製品は、抗微生物ペプチドを含み得る。
【００５８】
好ましい製品は、抗微生物ペプチドおよび粘液溶解剤を含む。
【００５９】
本発明の製品における第１の抗バイオフィルム剤と第２の抗バイオフィルム剤との比は、１：１０から１０：１であり得、通常は少なくとも２：１、例えば少なくとも３：１または４：１であり得る。一実施形態によると、第１の抗バイオフィルム剤と第２の抗バイオフィルム剤との比は、およそ１：１である。好ましくは、第１の抗バイオフィルム剤は陽イオン性ペプチドであり、第２の抗バイオフィルム剤は粘液溶解剤であり、陽イオン性ペプチド：粘液溶解剤の比は２：１から４：１までの範囲である。さらなる実施形態によると、比はおよそ１：１であり得る。
【００６０】
活性作用物質は、同時に、逐次的に、または個別に投与することができる。活性作用物質は、組み合わせパッケージとして提供され得る。組み合わせパッケージは、本発明の製品と、活性作用物質のそれぞれを同時に、個別に、または逐次的に投与するための指示とを含有し得る。逐次的な投与では、活性作用物質は、任意の順序で投与することができる。
【００６１】
本発明の製品の活性作用物質は、１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体をさらに含有する医薬組成物として提供されてもよい。これは、固定された組み合わせおよび自由な組み合わせの両方に適用される。
【００６２】
本発明の活性作用物質は、当業者に知られている任意の適切な経路によって、好ましくはこのような経路に適した医薬組成物の形態で、かつ意図した治療に有効な用量で投与することができる。活性化合物および活性組成物は、例えば、非経口的に、経口的に、鼻腔内に、気管支内に、経腸的に、経皮的に、舌下に、直腸に、膣に、眼に、または局所的に投与することができる。局部投与および全身投与の両方が考慮される。
【００６３】
非経口投与（本明細書において用いられる「非経口」は、静脈内、筋肉内、経腸、腹腔内、胸骨内、皮下、および関節内への注射および点滴を含む投与態様を言い、そのうち静脈内（連続的な静脈内投与を含む）が最も好ましい）を目的として、水性プロピレングリコール内の溶液、および対応する水溶性塩の無菌水性溶液を用いることができる。このような水性溶液は、必要に応じて適切に緩衝化することができ、液体希釈剤はまず、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。これらの水性溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内への注射という目的に特に適している。これに関して、用いられる無菌水性媒質は、全て、当業者に周知の標準的な技術によって容易に得ることができる。
【００６４】
本発明の製品はまた、鼻腔内に、または吸入によって投与することができ、適切な推進剤を使用して、または使用せずに加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー、噴霧器から発せられる、乾燥粉末吸入剤またはエアロゾルスプレーの形態で都合良く送達される。
【００６５】
あるいは、本発明の製品は、坐剤もしくはペッサリーの形態で投与することができるか、または、ゲル、ヒドロゲル、ローション、溶液、クリーム、軟膏、もしくは粉末の形態で局所的に塗布することができる。本発明の製品は、例えば皮膚パッチ、デポー、または皮下注射を用いて、皮膚に、または経皮的に投与することができる。これらはまた、肺経路または直腸経路によって投与することができる。
【００６６】
経口投与では、医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル、懸濁液、または液体の形態であり得る。医薬組成物は、好ましくは、特定の量の活性成分を含有する投薬単位の形態で作製される。このような投薬単位の例は、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、またはジャガイモデンプンなどの従来の添加剤、結晶セルロース、セルロール誘導体、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチンなどの結合剤、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤、およびタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤を伴う、カプセル、錠剤、粉末、顆粒、または懸濁液である。活性成分はまた、組成物として注射することによって投与することができ、この組成物において、例えば生理食塩水、デキストロース、または水を適切な担体として用いることができる。
【００６７】
本発明の製品にはまた、経口製剤としての／経口製剤における適用があり、製品は、例えば、フィルム、テープ、ゲル、ミクロスフェア、トローチ、チューインガム、歯磨き剤、およびマウスウォッシュから選択される担体内に製剤される。
【００６８】
投与される、治療的に活性な化合物の量、および、本発明の化合物および／または組成物を用いて病状を治療するための投薬レジメンは、対象の年齢、体重、性別、および医学的状態、疾患の重症度、投与の経路および頻度、ならびに用いられる特定の化合物、ならびに治療される個体の薬物動態特性を含む様々な因子に依存し、したがって、広く変化し得る。投薬は通常、化合物が全身に投与される場合よりも局部に投与される場合に、また治療のためよりも予防のための場合に、より少なくなる。このような治療は、必要な度に、かつ医師によって必要であると判断された時間にわたり、投与することができる。当業者には、投薬レジメまたは投与される阻害剤の治療上有効な量が各個人に最適化される必要があり得ることが理解されよう。医薬組成物は、約０．１から２０００ｍｇの範囲、好ましくは約０．５から５００ｍｇの範囲、最も好ましくは約１から２００ｍｇの間の活性成分を含有し得る。体重１ｋｇ当たり約０．０１から１００ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇ当たり約０．１から約５０ｍｇの間、最も好ましくは体重１ｋｇ当たり約１から２０ｍｇの１日用量が適切であり得る。１日用量は、１日当たり１から４回に分けて投与することができる。
【００６９】
本発明の製品は、好ましくは、気道に投与される。したがって、本発明はまた、本発明の製品を含むエアロゾル状の薬学的製剤を提供する。また、本発明の製品を含有する噴霧器または吸入剤も提供される。
【００７０】
さらに、本発明の製品は、持続放出投薬形態などとしての製剤に適している場合がある。製剤は、場合によって一定期間にわたり例えば腸管または気道の特定の部分で活性作用物質を放出するように構成され得る。コーティング、外皮、および保護マトリクスを、例えば、乳酸・グリコール酸共重合体、リポソーム、マイクロエマルジョン、微粒子、ナノ粒子、またはワックスなどのポリマー物質から作製することができる。これらのコーティング、外皮、および保護マトリクスは、例えばステント、カテーテル、腹膜透析管、排出デバイスなどの留置型デバイスを被覆するために有用である。
【００７１】
本発明の製品には、相乗的に有効な量の、本明細書において定義された各活性作用物質が含まれ得る。したがって、本発明には、相乗的に有効な量の（ｉ）第１の抗バイオフィルム剤、（ｉｉ）第１の抗バイオフィルムとは異なり典型的には抗微生物ペプチドである第２の抗バイオフィルム剤を含む製品が含まれる。製品は、微生物の感染、例えばバイオフィルム感染の治療において前記作用物質を同時に、個別に、または逐次的に投与するための医薬品の製造において用いることができる。本明細書において用いられる「相乗的に」は、共に作用して、個別に用いられた作用物質の予想される組み合わせ効果よりも大きい効果をもたらす、本発明の製品の２つ以上の作用物質の作用を説明し得る。
【００７２】
本発明のさらなる態様において、本発明の製品を塗布するかまたは接着させるための基質が提供される。好ましくは、基質は、創傷への塗布または創傷部位への送達に適している。好ましくは、基質によって、基質から創傷床への本発明の製品の活性作用物質の運搬が可能になり、それらの抗バイオフィルム効果が達成される。基質は、包帯、例えば創傷用の包帯であり得る。包帯は、布材料を含み得るか、または、コラーゲン様の材料であり得る。基質は、創傷への塗布に適した任意の形態であり得、典型的には、基質は、ヒドロゲル、コロイド、軟膏、クリーム、ゲル、フォーム、またはスプレーの形態であり得る。
【００７３】
本発明の製品にはまた、消毒剤または殺生物剤として／において、適用することができる。これに関連して、本発明のペプチドまたは医薬組成物は、単独で、または他の殺菌作用物質と組み合わせて、治療される表面に塗布することができる。本明細書において用いられる場合、「治療される表面」は、本明細書において定義される基質であってよく、医療用デバイスおよび留置型デバイス、例えば、ステント、カテーテル、腹膜透析管、排出デバイス、人工関節、歯科インプラントなどを含み得る。
【００７４】
方法および使用
本発明は、本発明に従った製品を環境に投与するステップを含む、前記環境におけるバイオフィルムの形成を予防する方法を提供する。本方法は、インビボであってもエクスビボであってもよい。
【００７５】
一実施形態によると、本方法は、抗微生物ペプチドを投与するステップを含む。
【００７６】
有利には、本方法は、
−  第１の抗バイオフィルム剤、および
−  第１の抗バイオフィルム剤とは異なる第２の抗バイオフィルム剤
を投与するステップを含み、第１および第２の抗バイオフィルム剤の少なくとも１つは、抗微生物ペプチド、例えば陽イオン性ペプチドである。
【００７７】
環境は、細菌、真菌、酵母、ウイルス、および原生動物から選択される任意のバイオフィルム形成微生物を含み得る。
【００７８】
典型的には、微生物は、細菌、例えばグラム陽性細菌またはグラム陰性細菌である。細菌病原体は、例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓなどのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属種、例えばＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓなどのＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属種、例えばＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなどのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属種、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属種、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属種、例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ群ＡまたはＢ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属種、例えばＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉなどのＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属種、例えばＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓなどのＮｅｉｓｓｅｒｉａ属種、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、例えばＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉなどのＳｈｉｇｅｌｌａ属種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、例えばＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅなどのＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属種、例えばＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉなどのＣｈｌａｍｙｄｉａ属種、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｆｕｌａｒｅｎｓｉｓ、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ属種、例えばＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍなどのＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ属種、例えばＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓなどのＹｅｒｓｉｎｉａ属種、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属種、例えばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉおよびＢ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉなどのＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属種からなる群から選択される細菌種に由来し得る。
【００７９】
特に、細菌には、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属種、例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓなどのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属種、例えばＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａなどのＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ、例えばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａなどのＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属種、例えばＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓなどのＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属種が含まれ得る。好ましくは、細菌は、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属種、ならびに例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓなどのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属種から選択される。
【００８０】
ウイルス病原体は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＴＶ１および２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ１および２）、エボラウイルス、ヒトパピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ−２、ＨＰＶ−５、ＨＰＶ−８、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−５２、ＨＰＶ−５４、およびＨＰＶ−５６）、パポバウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、エプスタインバーウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎ウイルス、天然痘ウイルス、ロタウイルス、またはＳＡＲＳコロナウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来し得る。
【００８１】
寄生病原体は、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ属種（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ、Ｔｒｙｐａｎｓｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属種、Ｇｉａｒｄｉａ属種、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ属種、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ属種、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ属種、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ属種、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ属種、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属種、Ｃｒｙｔｏｓｐｏｒｉｄｉｗｎ属種、Ｉｓｏｓｐｏｒａ属種、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ属種、Ｌｏａ  Ｌｏａ、Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｉｍｍｉｔｉｓ、例えばＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉなどのＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｓｓｐ．からなる群から選択される寄生病原体に由来し得る。真菌病原体は、Ｃａｎｄｉｄａ属種（例えば、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ属種、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ属種、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｉｍ属種、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属種（例えば、Ｔ．ｒｕｂｒｕｍおよびＴ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ）、Ｔｉｎｅａ属種、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属種、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ属種、Ｂｌａｓｔｏｓｃｈｉｚｏｍｙｃｅｓ属種、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ属種、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属種、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ属種、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｍｙｃｅｓ属種、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｘ属種、Ａｂｓｉｄｉａ属種、Ｃｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ属種、Ｆｏｎｓｅｃａｅａ属種、Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ属種、Ｌａｃａｚｉａ属種、Ａｒｔｈｒｏｇｒａｐｈｉｓ属種、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属種、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ属種、Ａｐｏｐｈｙｓｏｍｙｃｅｓ属種、Ｅｍｍｏｎｓｉａ属種、Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ属種、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ属種、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ属種、Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ属種、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ属種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属種、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ属種、Ｇｒａｐｈｉｕｍ属種、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ属種、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ属種、Ｍｕｃｏｒ属種、Ｎｅｏｔｅｓｔｕｄｉｎａ属種、Ｎｏｃａｒｄｉａ属種、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ属種、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ属種、Ｐｈｏｍａ属種、Ｐｉｅｄｒａｉａ属種、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ属種、Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ属種、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ属種、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属種、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属種、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属種、Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ属種、Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ属種、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ属種、Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ属種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属種、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属種、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ属種、Ｕｓｔｉｌａｇｏ属種、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ属種、Ｗａｎｇｉｅｌｌａ属種の属の真菌病原体に由来し得る。 
【００８２】
さらなる実施形態によると、微生物は、真菌、特にカンジダであり得る。
【００８３】
本発明の方法は、限定はしないが家庭、職場、実験室、産業環境、水域環境（例えば、パイプラインシステム）、本明細書において定義されるような留置型デバイスを含む医療用デバイス、歯科機器または歯科インプラント、動物の身体、例えばヒトの身体を含む、様々な環境におけるバイオフィルムの形成を最小化するため、好ましくは予防するために用いることができる。
【００８４】
したがって、本発明の方法は、ヒトの歯または歯科インプラント、例えば義歯における、プラークまたはう蝕の形成を予防するために、口内で用いることができる。
【００８５】
本発明の方法は、特に微生物の感染の治療において、ヒトの身体におけるバイオフィルムの形成を予防または制限するために用いることができる。バイオフィルムの感染に関連する症状には、局所的感染、口腔感染、および全身感染が含まれ得る。局所的感染には、創傷、潰瘍、および病変、例えば切り傷または火傷などの皮膚創傷、ならびにそれに関連する症状が含まれ得る。
【００８６】
口腔感染には、歯肉炎、歯周炎、および粘膜炎が含まれ得る。
【００８７】
全身感染には、嚢胞性線維症、および粘膜感染に関連する他の症状、例えば胃腸、尿生殖器、または呼吸器への感染が含まれ得る。
【００８８】
本発明の別の態様は、治療上有効な量の本発明の製品を哺乳動物に投与することによって、哺乳動物、特にヒトにおける微生物バイオフィルムの感染の存在に関連する疾患または状態の進行を治療するか、予防するか、または遅らせる方法にある。
【００８９】
「効果的な」量または「治療上有効な量」は、妥当な効果／リスク比に見合いながら、正しい医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく所望の効果をもたらすために十分な、１つまたは複数の活性物質の量を意味する。
【００９０】
本発明の一態様によると、本方法は、抗微生物ペプチドを投与するステップを含む。
【００９１】
有利には、本方法は、
−  第１の抗バイオフィルム剤、および
−  第１の抗バイオフィルム剤とは異なる第２の抗バイオフィルム剤
を投与するステップを含み、第１および第２の抗バイオフィルム剤の少なくとも１つは、抗微生物ペプチド、例えば陽イオン性ペプチドである。
【００９２】
本発明はさらに、上記に概説した活性作用物質の組み合わせの予防法または治療法によって微生物の感染、特に微生物バイオフィルムの感染を治療するための医薬品の製造における、本発明の製品の使用を提供する。
【００９３】
さらに、本発明は、予防法または治療法によって微生物の感染、特に微生物バイオフィルムの感染を治療するための医薬品の製造における、上記の抗微生物ペプチドの使用を提供する。
【００９４】
したがって、本発明の製品は、皮膚および創傷感染、中耳感染、胃腸管感染、腹膜感染、尿生殖路感染、口腔軟組織感染、歯垢の形成、眼の感染（コンタクトレンズの汚染を含む）、心内膜炎、嚢胞性線維症における感染、ならびに本明細書において記載されるような留置型医療用デバイスの感染からなる群から選択される疾患または状態の予防、進行の予防、または治療において有用であり得る。
【００９５】
本発明にはまた、本発明の製品を１つまたは複数の他の抗菌剤、例えば抗生物質と共に哺乳動物に投与する治療方法が含まれる。
【００９６】
本発明は、驚くべきことに、ある分散剤、特に粘液溶解剤がバイオフィルムの存続細胞の増殖を阻害することを見出した。したがって、本発明にはまた、粘液溶解剤、例えばシステアミンを環境に投与することを含む、前記環境におけるバイオフィルムの形成を治療／予防する方法が含まれる。粘液溶解剤は、単独で、または別の抗微生物剤、例えば抗微生物ペプチドと組み合わせて投与することができる。
【００９７】
本発明はまた、治療上有効な量の分散剤、特に粘液溶解剤、例えばシステアミンを投与することを含む予防法または治療法によって、微生物の感染、特に微生物バイオフィルムを治療するための方法を提供する。
【００９８】
本発明はさらに、微生物の感染、特に微生物バイオフィルムの感染を治療するための医薬品の製造における、分散剤、特に粘液溶解剤、例えばシステアミンの使用を提供する。
【００９９】
本明細書において言及される活性作用物質は、例えば、遊離酸、遊離塩基、エステル、ならびに他のプロドラッグ、塩、および互変異性体などの異なる形態で存在してもよく、本発明は、作用物質の全ての異型を含む。
【０１００】
本明細書の記載および特許請求の範囲の全体にわたり、文脈上別段の必要性がない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が用いられる場合、明細書は、文脈上別段の必要性がない限り、複数形および単数形を考慮しているものと理解される。
【０１０１】
本発明の特定の態様、実施形態、または実施例に関連して記載される特性、整数、特徴、化合物、化学的部分、または基は、本明細書において記載されている任意の他の態様、実施形態、または実施例と矛盾しない限り、それらに適用可能であると理解される。
【０１０２】
本明細書の記載および特許請求の範囲の全体にわたり、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含有する」という語、ならびにこれらの語の変型、例えば「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「限定はしないが包含する」ことを意味し、他の部分、付加物、構成要素、整数、またはステップを排除することを意図したものではない（かつ、排除しない）。
【０１０３】
通常、「およそ」という用語は、この用語が適用される任意の数値の１０％以下の範囲を包含することを意図したものである。
【０１０４】
本発明のさらなる態様および実施形態は、以下の記載および特許請求の範囲において説明される。
【０１０５】
以下、本発明を、以下の図面を参照して、例示としてのみ記載する。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−４７浮遊性細胞に対するＮＰ１０８およびＮＭ００１（システアミン）の抗菌活性を示す図である。
【図２】Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−４７浮遊性細胞に対するＮＰ１０８およびＮＭ００１（システアミン）の組み合わせの抗菌活性を示す図である。
【図３】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＤＳＭ  １１７２９浮遊性細胞に対するＮＰ１０８およびＮＭ００１（システアミン）の抗菌活性を示す図である。
【図４】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＤＳＭ  １１７２９浮遊性細胞に対するＮＰ１０８およびＮＭ００１（システアミン）の組み合わせの抗菌活性を示す図である。
【図５】グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌のバイオフィルム細胞に対するＮＰ３３９の活性を示す図である。
【図６】グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の存続細胞に対するＮＰ３３９の活性を示す図である。
【図７】グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌のバイオフィルム細胞に対するＮＰ３４１の活性を示す図である。
【図８】グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の存続細胞に対するＮＰ３４１の活性を示す図である。
【図９】グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌のバイオフィルム細胞に対するＮＭ００１（システアミン）の活性を示す図である。
【図１０】グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の存続細胞に対するＮＭ００１（システアミン）の活性を示す図である。
【図１１】Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−４７バイオフィルム細胞に対するＮＰ１０８およびＮＭ００１（システアミン）の組み合わせの抗菌活性を示す図である。
【図１２】Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−４７存続細胞に対するＮＰ１０８およびＮＭ００１（システアミン）の抗菌活性を示す図である。
【図１３】Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−４７存続細胞に対するＮＰ１０８およびＮＭ００１（システアミン）の組み合わせの抗菌活性を示す図である。
【図１４ａ】Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＤＳＭ  １１２８バイオフィルム細胞に対するＮＰ３３９およびＮＭ００１（システアミン）の組み合わせの抗菌活性を示す図である。
【図１４ｂ】Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−４７バイオフィルム細胞に対するＮＰ３３９およびＮＭ００１（システアミン）の組み合わせの抗菌活性を示す図である。
【図１４ｃ】Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＤＳＭ  １２９９バイオフィルム細胞に対するＮＰ３３９およびＮＭ００１（システアミン）の組み合わせの抗菌活性を示す図である。
【図１４ｄ】Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ２７８５３バイオフィルム細胞に対するＮＰ３３９およびＮＭ００１（システアミン）の組み合わせの抗菌活性を示す図である。
【図１５ａ】Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＤＳＭ  １１２８存続細胞に対するＮＰ３３９およびＮＭ００１（システアミン）の組み合わせの抗菌活性を示す図である。
【図１５ｂ】Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−４７存続細胞に対するＮＰ３３９およびＮＭ００１（システアミン）の組み合わせの抗菌活性を示す図である。
【図１６】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＤＳＭ  １１７２９バイオフィルム細胞に対するＮＰ１０８およびＮＭ００１（システアミン）の抗菌活性を示す図である。
【図１７】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＤＳＭ  １１７２９バイオフィルム細胞に対するＮＰ１０８およびＮＭ００１（システアミン）の組み合わせの抗菌活性を示す図である。
【図１８】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＤＳＭ  １１７２９存続細胞に対するＮＰ１０８およびＮＭ００１（システアミン）の抗菌活性を示す図である。
【図１９】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＤＳＭ  １１７２９存続細胞に対するＮＰ１０８およびＮＭ００１（システアミン）の組み合わせの抗菌活性を示す図である。
【図２０ａ】Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ２７８５３浮遊性細胞に対する、単独の、およびＮＰ３４１と組み合わされた、粘液溶解剤Ｎ−アセチルシステインの活性を示す図である。
【図２０ｂ】Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ２７８５３浮遊性細胞に対する、単独の、およびＮＰ３４１と組み合わされた、粘液溶解剤Ｎ−アセチルシステインの活性を示す図である。
【図２１ａ】Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ２７８５３浮遊性細胞に対する、単独の、およびＮＰ３４１と組み合わせた、ＮＭ００１（システアミン）の活性を示す図である。
【図２１ｂ】Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ２７８５３浮遊性細胞に対する、単独の、およびＮＰ３４１と組み合わせた、ＮＭ００１（システアミン）の活性を示す図である。
【図２２】（ａ）２４時間後の、未処理対照であるＳ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムを示す図である。（ｂ）２ｍｇ／ｍｌのＮＭ００１（システアミン）で処理した２４時間後のＳ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムを示す図である。（ｃ）０．２ｍｇ／ｍｌのコリスチンで処理した２４時間後のＳ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムを示す図である。（ｄ）２ｍｇ／ｍｌのペプチドＮＰ１０８で処理した２４時間後のＳ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムを示す図である。
【図２３】（ａ）２４時間後の、未処理対照であるＳ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムを示す図である。（ｂ）２ｍｇ／ｍｌのＮＭ００１（システアミン）で処理した２４時間後のＳ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムを示す図である。（ｃ）０．２ｍｇ／ｍｌのコリスチンで処理した２４時間後のＳ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムを示す図である。（ｄ）２ｍｇ／ｍｌのペプチドＮＰ１０８で処理した２４時間後のＳ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムを示す図である。
【図２４】（ａ）２４時間後の、未処理対照であるＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルムを示す図である。（ｂ）２ｍｇ／ｍｌのＮＭ００１（システアミン）で処理した２４時間後のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルムを示す図である。（ｃ）０．２ｍｇ／ｍｌのコリスチンで処理した２４時間後のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルムを示す図である。（ｄ）２ｍｇ／ｍｌのペプチドＮＰ１０８で処理した２４時間後のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルムを示す図である。
【図２５】（ａ）２４時間後の、未処理対照であるＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルムを示す図である。（ｂ）２ｍｇ／ｍｌのＮＭ００１（システアミン）で処理した２４時間後のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルムを示す図である。（ｃ）０．２ｍｇ／ｍｌのコリスチンで処理した２４時間後のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルムを示す図である。（ｄ）２ｍｇ／ｍｌのペプチドＮＰ１０８で処理した２４時間後のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルムを示す図である。
【図２６】Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１バイオフィルムに対する、単独の、およびＮＭ００１（システアミン）と組み合わされた、またはＮＰ１０８と組み合わされたＮＰ４３２の活性を示す図である。
【図２７】Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１バイオフィルムに対する、単独の、およびＮＭ００１（システアミン）と組み合わされた、またはＮＰ１０８と組み合わされたＮＰ４４５の活性を示す図である。
【図２８】Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１バイオフィルムに対する、単独の、およびＮＭ００１（システアミン）と組み合わされた、またはＮＰ１０８と組み合わされたＮＰ４５８の活性を示す図である。
【図２９】Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１バイオフィルムに対する、単独の、およびＮＭ００１（システアミン）と組み合わされた、またはＮＰ１０８と組み合わされたＮＰ４６２の活性を示す図である。
【図３０】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３バイオフィルムに対する、単独の、およびＮＭ００１（システアミン）と組み合わされた、またはＮＰ１０８と組み合わされたＮＰ４３２の活性を示す図である。
【図３１】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３バイオフィルムに対する、単独の、およびＮＭ００１（システアミン）と組み合わされた、またはＮＰ１０８と組み合わされたＮＰ４４５の活性を示す図である。
【図３２】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３バイオフィルムに対する、単独の、およびＮＭ００１（システアミン）と組み合わされた、またはＮＰ１０８と組み合わされたＮＰ４５８の活性を示す図である。
【図３３】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ２５９２３バイオフィルムに対する、単独の、およびＮＭ００１（システアミン）と組み合わされた、またはＮＰ１０８と組み合わされたＮＰ４６２の活性を示す図である。
【０１０７】
表１：グラム陰性のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株およびグラム陽性のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属種に対する、試験対象の抗微生物剤の活性の概要。
表２：Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対する、試験対象の抗微生物剤の活性の概要。
【０１０８】
0005727994.tif 000002
【０１０９】
0005727994.tif 000003
【０１１０】
0005727994.tif 000004
【実施例】
【０１１１】
細菌バイオフィルムに対する抗微生物剤の活性
材料および方法
１．１  細菌株
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ２７８５３、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＢＡＡ−４７（ＰＡＯ１）、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＤＳＭ１１２８、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＤＳＭ１２９９、およびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ３５９８４、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ１２２２８、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ２５９２３、およびメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＤＳＭ  １１７２９（ＭＲＳＡ）（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をこの研究において用いた。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの４つの臨床単離物（ＮＨ５７３８８Ａ〜Ｄ、Ｈｏｆｆｍａｎｎら、２００５頁、２００７年）を得、抗微生物剤に対する感受性の試験に用いた。
【０１１２】
１．２  抗微生物化合物の調製
この研究において試験された抗微生物剤は、１０〜２０ｋＤａのポリ−Ｌ−リシンに対応する陽イオン性ペプチドＮＰ１０８、臭化水素酸塩、およびシステアミン（ＮＭ００１）であった。両作用物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）から入手し、ストック溶液を、１４〜１８ＭΩｃｍの純水中に２０ｍｇ／ｍｌで調製した（Ｐｕｒｉｔｅ  ＨＰ４０水精製システム、Ｏｘｏｎ、ＵＫ）。溶解した後、調製物を０．２２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｗａｔｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて濾過滅菌し、−２０℃で保存した。
【０１１３】
以下のＮｏｖａＢｉｏｔｉｃｓ抗微生物ペプチドもまた調べた。
ＮＰ３３９  ｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲ
ＮＰ３４０  Ａｃ−ｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲ−ＣＯＮＨ
ＮＰ３４１  ｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲｄＲ−ＣＯＮＨ
ＮＰ３５２  ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ
ＮＰ４３２  ＲＲＲＦＲＦＦＦＲＦＲＲＲ
ＮＰ４３８  ＨＨＨＦＲＦＦＦＲＦＲＲＲ
ＮＰ４４１  ＨＨＰＲＲＫＰＲＲＰＫＲＲＨＨ
ＮＰ４４５  ＫＫＦＰＷＲＬＲＬＲＹＧＲＲ
ＮＰ４４９  ＫＫＰＲＲＫＰＲＲＰＫＲＫＫ−システアミン
ＮＰ４５１  ＨＨＰＲＲＫＰＲＲＰＫＲＨＨ−システアミン
ＮＰ４５７  ＲＲＲＲＲ−システアミン
ＮＰ４５８  ＲＲＲＲＲＨＨ−システアミン
【０１１４】
ＮｏｖａＢｉｏｔｉｃｓ抗微生物ペプチドは、Ｆｍｏｃ合成を用いて、ＮｅｏＭＰＳ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ）によって合成され、少なくとも９５％の純度であった。
【０１１５】
１．３  細菌接種材料の調製
細菌接種材料は、ＣＬＳＩ  Ｍ２６−Ａ法において記載されている０．５マクファーランド濁度標準で標準化された、ミューラーヒントン培養液において活性に増殖している培養物の希釈法によって得た。
【０１１６】
１．４  最小阻害濃度（ＭＩＣ）の決定
バイオフィルム形成の予防を決定するために、細菌接種材料および抗微生物剤の両方をプレートに同時に添加した。プレートを３７℃で２４時間にわたりインキュベートし、光学密度をマイクロタイタープレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ  Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ  ＸＳ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＵＳＡ）で、６２５ｎｍで読み取った。細菌の増殖の完全な阻害を示す抗微生物の最低濃度として、ＭＩＣを得た。
【０１１７】
１．５  部分阻害濃度（ＦＩＣ）の決定
ＦＩＣは、抗微生物剤の組み合わせが相乗的、付加的、拮抗的、または中立的であるかどうかを示す相互作用係数に対応する。ＦＩＣは、以下のように、組み合わされた作用物質の活性（作用物質Ａ＋作用物質ＢのＭＩＣ）を、単独の作用物質の活性（作用物質Ａまたは作用物質ＢのＭＩＣ）と比較することによって決定される（Ｓｉｎｇｈら、２０００年）。
ＦＩＣ＝ＭＩＣＡ［ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ］／ＭＩＣＡ［ａｌｏｎｅ］＋ＭＩＣＢ［ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ］／ＭＩＣＢ［ａｌｏｎｅ］
【０１１８】
２つの抗微生物剤の付加的な組み合わせは、１というＦＩＣインデックスによって示され、一方、１未満のＦＩＣインデックスは、相乗的な組み合わせを示す。中立的な組み合わせでは１から４の間のＦＩＣとなり、４を超えるＦＩＣインデックスは、２つの抗微生物剤の間での拮抗的な効果を示す。
【０１１９】
ＦＩＣはまた、細菌バイオフィルムに対する、組み合わされた２つの抗微生物剤の相互作用を評価するためにも計算された。ＭＩＣの代わりにＭＢＥＣを用いて、同一の式が適用される。
【０１２０】
１．６  最小バイオフィルム根絶濃度（ＭＢＥＣ）の決定
ミューラーヒントン内の全容積が１００μｌの細菌接種材料を、９６ウェルプレート（チャレンジプレート）の各ウェルに添加し、プレートを、回転振とうプラットフォーム（Ｇｒａｎｔ−ｂｉｏ  ＰＳ−３Ｄ、Ｓｈｅｐｒｅｔｈ、Ｅｎｇｌａｎｄ）上で、２４ｒｐｍで、３７℃で２４時間にわたりインキュベートして、バイオフィルムを形成させた。
【０１２１】
次に、チャレンジプレートを無菌ＰＢＳ（１×）で１回すすぎ、ミューラーヒントン内の抗微生物剤の２倍連続希釈物をチャレンジプレートに添加した。チャレンジプレートを、回転振とうプラットフォーム（Ｇｒａｎｔ−ｂｉｏ  ＰＳ−３Ｄ、Ｓｈｅｐｒｅｔｈ、Ｅｎｇｌａｎｄ）上で、２４ｒｐｍで、３７℃で２４時間にわたりインキュベートした。
【０１２２】
各チャレンジプレートの上清を新たなプレート内に移し、光学密度を、マイクロタイタープレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ  Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ  ＸＳ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＵＳＡ）で、６２５ｎｍで測定した。ＭＢＥＣを、細菌の増殖を示さない抗微生物の最低濃度によって得た。
【０１２３】
１．７  バイオフィルム内の存続細胞の推定
チャレンジプレートから上清を移した後、バイオフィルムを無菌ＰＢＳ（１×）で１回すすぎ、４μＭのＳＹＴＯ９を含有する１００μｌのＢａｃＬｉｇｈｔ生存／死滅蛍光染色溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）および無菌ＰＢＳ（１×）内の２０μＭのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を、チャレンジプレートのウェルに添加した。プレートを暗所で１５分間にわたり室温でインキュベートし、蛍光を、感度を５０に設定し、最下位の光学的位置を選択した、蛍光マイクロタイタープレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＵＳＡ）で、ＳＹＴＯ９およびＰＩ蛍光についてそれぞれ４８５（ｅｘ）／５２８（ｅｍ）および４８５（ｅｘ）／６４５（ｅｍ）で読み取った。Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ４０蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でバイオフィルムを直接観察することにより、生存している、および死滅した細菌の存在を同定することが可能となり、バイオフィルムの画像を１００から４００倍の倍率で得た。
【０１２４】
存続細胞の相対的な生存能力を、生存／死滅の蛍光測定値比によって決定し、顕微鏡での観察を用いて、生存細胞の存否の確認を行った。
【０１２５】
２．  結果
２．１  バイオフィルム形成の予防
グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方によるバイオフィルム形成の予防について評価するために、細菌接種材料および抗微生物剤をプレートに同時に添加した。抗微生物剤の濃度範囲は、グラム陰性細菌Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−４７に対しては０〜５００μｇ／ｍｌのＮＰ１０８および０〜３２０μｇ／ｍｌのシステアミンであり、グラム陽性のＭＲＳＡに対しては０〜１０００μｇ／ｍｌのＮＰ１０８および０〜３２０μｇ／ｍｌのシステアミンであった。
【０１２６】
２．１．１  Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−４７に対する活性
ＮＰ１０８のＭＩＣは６２．５μｇ／ｍｌであり、システアミンでは３２０μｇ／ｍｌであった。ＮＰ１０８は２５０μｇ／ｍｌで殺菌性であり、一方、システアミンは、３２０μｇ／ｍｌまで殺菌性ではなかった（データは示していない）。
【０１２７】
１６０μｇ／ｍｌのシステアミンの存在下では、ＮＰ１０８のＭＩＣは３１．２５μｇ／ｍｌまで低減した。システアミンの濃度を２倍にすると（すなわち３２０μｇ／ｍｌ）、ＮＰ１０８の濃度にかかわらず、増殖は観察されなかった。
【０１２８】
この組み合わせについてのＦＩＣの決定は、抗微生物剤が付加的な効果（ＦＩＣ＝１）を有することを示す。さらに、１２５μｇ／ｍｌのＮＰ１０８および３２０μｇ／ｍｌのシステアミンの存在下で殺菌活性が得られ（データは示していない）、このことは、これらの作用物質の付加的な効果を裏付けるものである。
【０１２９】
２．１．２  Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＤＳＭ  １１７２９に対する活性
ＮＰ１０８のＭＩＣは１２５μｇ／ｍｌであり、システアミンでは３２０μｇ／ｍｌ超であった。ＮＰ１０８は１２５μｇ／ｍｌで殺菌性であり、一方、システアミンは、３２０μｇ／ｍｌまで殺菌性ではなかった（データは示していない）。
【０１３０】
システアミンの濃度が増大すると、任意の所与の濃度のＮＰ１０８で、増殖の阻害が高まった。４０μｇ／ｍｌのシステアミンの存在下では、ＮＰ１０８のＭＩＣは３１．２５μｇ／ｍｌまで低減し、３２０μｇ／ｍｌのシステアミンを添加すると１５．６２５μｇ／ｍｌまで低下した。
【０１３１】
この組み合わせについてのＦＩＣの決定は、抗微生物剤が少なくとも付加的な効果（ＦＩＣ＜１）を有することを示す。さらに、３１．２５μｇ／ｍｌのＮＰ１０８および１６０μｇ／ｍｌ以上のシステアミンの存在下、ならびに６２．５μｇ／ｍｌのＮＰ１０８および８０μｇ／ｍｌ以上のシステアミンの存在下で殺菌活性が得られ（データは示していない）、このことは、これらの作用物質の付加的な効果を裏付けるものである。
【０１３２】
補足１は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＤＳＭ  １１７２９浮遊性細胞に対する、短い直鎖状アルギニンペプチド（ＮＰ３３９、ＮＰ３４０、ＮＰ３４１、およびＮＰ３５２）の経時的な活性を示す。
【０１３３】
補足２は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＤＳＭ１１７２９およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＢＡＡ−４７浮遊性細胞に対する、ＮＰ１０８、システアミン、組み合わされた両化合物の活性、ならびにＮＰ３３９およびＮＰ３４１の活性の概要である。
【０１３４】
２．２  形成されたバイオフィルムの破壊
細菌バイオフィルムに対するＮＰ１０８およびシステアミンの活性の評価を、２４時間齢のバイオフィルムで実施し、組み合わされた両化合物の活性もまた決定した。細菌バイオフィルムに対する抗微生物剤の活性を、バイオフィルム細胞および存続細胞に対するそれらの活性によって決定した。
【０１３５】
２．２．１  細菌バイオフィルムに対するＮＰ３３９の活性
図５は、１５６から６２５μｇ／ｍｌのＭＢＥＣをもたらす、３つのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種のバイオフィルムに対するＮＰ３３９の高い活性を示す。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ２５９２３に対する最高用量のＮＰ３３９での光学密度の増大は、微生物バイオフィルムの複合的で不均一な性質によるアーチファクトであると考えられる。対照的に、ＮＰ３３９はＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＢＡＡ−４７（ＰＡＯ１）の増殖を低減させたが、試験した最高用量（すなわち、５ｍｇ／ｍｌ）でも、バイオフィルム細胞の１００％を阻害するには不十分であった。
【０１３６】
図６は、ＮＰ３３９が存続細胞に対して活性であることを証明するものである。試験対象の４つの株のバイオフィルム細胞に対するＮＰ３３９の活性とは対照的に、ＮＰ３３９は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＢＡＡ−４７（ＰＡＯ１）の存続細胞よりもＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の存続細胞に対して活性が弱かった。ＮＰ３３９は、６２５μｇ／ｍｌで、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＢＡＡ−４７（ＰＡＯ１）存続細胞の生存能力を阻害することができた。
【０１３７】
２．２．２  細菌バイオフィルムに対するＮＰ３４１の活性
ＮＰ３３９（図５）と同様に、ＮＰ３４１は、バイオフィルム細胞の生存能力の有意な低減を示した。ＭＲＳＡ  １１７２９およびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  １２２２８でのＭＢＥＣは６２５μｇ／ｍｌであった。ＮＰ３４１は、ＭＲＳＡ  １１７２９およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＢＡＡ−４７（ＰＡＯ１）のバイオフィルム細胞の生存能力を、２から３倍、低減させた。
【０１３８】
ＮＰ３３９で見られるように、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ存続細胞の生存能力は、６２５μｇ／ｍｌのＮＰ３４１で完全に阻害された。３つのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の存続細胞の生存能力は、２５から５０％減少した。
【０１３９】
２．２．３  細菌バイオフィルムに対するシステアミンの活性
図９は、システアミンが、試験対象のグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌のバイオフィルム細胞に対する抗微生物活性を有することを証明するものである。
【０１４０】
図１０は、試験対象のグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の存続細胞に対するシステアミンの活性を示す。
【０１４１】
ここで示される結果は、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌のバイオフィルムに対する、直鎖状の短い陽イオン性ペプチドＮＰ３３９およびＮＰ３４１の抗微生物活性を示す。これらの化合物は、グラム陰性細菌よりもグラム陽性細菌のバイオフィルム細胞に対して効果的であると考えられ、一方、これは存続細胞に対しては逆である。システアミンは、高い濃度でバイオフィルム細胞に対して活性を示したが、試験した最低濃度（すなわち、６．２５ｍｇ／ｍｌ）で、グラム陽性およびグラム陰性の存続細胞の両方の生存能力を抑制した。
【０１４２】
２．２．４  Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−４７に対する、組み合わされたＮＰ１０８およびシステアミンの活性
これらの２つの抗微生物剤の組み合わせは、２５０μｇ／ｍｌのＮＰ１０８および６２．５から５００μｇ／ｍｌのシステアミンの存在下で、細菌の増殖を完全に阻害した。３１．２５μｇ／ｍｌのシステアミンを５００μｇ／ｍｌのＮＰ１０８に添加すると同様の効果が得られたが、３１．２５μｇ／ｍｌのシステアミンと２５０μｇ／ｍｌのＮＰ１０８とを合わせると、細菌の増殖は部分的にしか阻害されなかった。
【０１４３】
これらのＭＢＥＣ値（ＭＢＥＣＮＰ１０８［ａｌｏｎｅ］＞５００μｇ／ｍｌ、ＭＢＥＣＮＰ１０８［ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ］＝２５０μｇ／ｍｌ、ＭＢＥＣｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ［ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ］＝６２．５μｇ／ｍｌ、ＭＢＥＣｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ［ａｌｏｎｅ］≧１００．００μｇ／ｍｌ）で得られたＦＩＣは、およそ０．５であり、これは、これらの２つの抗微生物剤間の相乗効果を示す。これは、浮遊性細胞に対するＮＰ１０８／システアミンの組み合わせの活性からの観察（図２）と一致する。
【０１４４】
存続細胞に対するＮＰ１０８およびシステアミンの活性を、蛍光染色法を用いて評価して、細胞の相対的な生存能力を決定した。用いた核酸結合蛍光分子はＳＹＴＯ９およびＰＩであり、これは、それぞれ、全ての細菌細胞（緑色の蛍光）および膜が崩壊した細胞（赤い蛍光）を通過する。したがって、放射された緑（生存）／赤（死滅）蛍光の比は、細菌集団の相対的な生存能力の指標であり、バイオフィルム内の存続細胞に対応する、残った生存細胞の存在を推定するために用いられる。
【０１４５】
図１２は、ＮＰ１０８またはシステアミンで治療したバイオフィルムの相対的な生存能力が依然として顕著であったことを示し、このことは、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−４７の存続細胞に対するこれらの化合物の活性の欠如を示す。
【０１４６】
図１３は、ＮＰ１０８およびシステアミンの組み合わせが、単独のいずれかの化合物（図１２）よりも、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−４７の存続細胞に対して高い活性を示したことを証明するものである。これらの細胞に対する最も有効な組み合わせは、２５０〜５００μｇ／ｍｌのＮＰ１０８および６２．５〜５００μｇ／ｍｌのシステアミンであった。これらの組み合わせは、バイオフィルム内の最低の相対的な生存能力を示した。同様の結果が、３１．２５μｇ／ｍｌのＮＰ１０８および５００μｇ／ｍｌのシステアミンで得られ、２５０μｇ／ｍｌのシステアミンでは部分的な阻害のみが観察された。
【０１４７】
存続細胞に対するこれらの化合物の活性は、バイオフィルム細胞に対して得られた最適な組み合わせのプロファイル（図１１）に類似していた。さらに、蛍光染色されたバイオフィルムを顕微鏡によって直接的に観察すると、２５０〜５００μｇ／ｍｌのＮＰ１０８および６２．５〜５００μｇ／ｍｌのシステアミンの存在下では生存細胞が観察され得なかったため（データは示していない）、存続細胞に対するこれらの組み合わせの活性が裏付けられた。
【０１４８】
２．２．５  Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対する組み合わされたＮＰ３３９およびシステアミンの活性
図１４（ａ）〜（ｄ）は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの４つの株に対する、最大１０ｍｇ／ｍｌまで増大する濃度のシステアミンと組み合わされた、ＮＰ３３９の３つの濃度、すなわち１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、および１００μｇ／ｍｌの活性を示す。
【０１４９】
これらのデータは、システアミンと組み合わされたＮＰ３３９の、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルム細胞に対する増大した抗微生物活性を明らかに実証するものである。以下の図面は、これらの株のうち２つの株の持続細胞に対するこれらの組み合わせの活性の例を示す。
【０１５０】
図１６は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＤＳＭ  １１７２９バイオフィルム細胞に対するＮＰ１０８およびシステアミンの活性を示す。システアミンでのＭＢＥＣは２５０μｇ／ｍｌであり、一方、ＮＰ１０８は１２５μｇ／ｍｌでこれらの細胞の増殖を阻害した。
【０１５１】
ＮＰ１０８およびシステアミンの組み合わせは、３１．２５μｇ／ｍｌのＮＰ１０８および６２．５μｇ／ｍｌのシステアミンの存在下で、細菌の増殖の完全な阻害を示し、いずれかの化合物の濃度が低くなると、部分的な阻害を示した（図１７）。したがって、これらのＭＢＥＣ（ＭＢＥＣＮＰ１０８［ａｌｏｎｅ］  １２５μｇ／ｍｌ、ＭＢＥＣＮＰ１０８［ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ］＝３１．２５μｇ／ｍｌ、ＭＢＥＣｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ［ａｌｏｎｅ］＝２５０μｇ／ｍｌ、ＭＢＥＣｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ［ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ］＝６２．５μｇ／ｍｌ）で得られたＦＩＣは０．５であり、このことは、これらのグラム陽性細菌のバイオフィルムに対するこれらの２つの抗微生物剤間の相乗効果を示す。同様の結果が、グラム陰性細菌のバイオフィルムで観察された（図１１）。これはまた、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＤＳＭ  １１７２９の浮遊性細胞に対するＮＰ１０８／システアミンの組み合わせの活性の観察結果（図４）と一致する。
【０１５２】
Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−４７存続細胞に対して観察された活性の欠如と同様に（図１２）、ＮＰ１０８またはシステアミンで治療したＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＤＳＭ  １１７２９バイオフィルムの相対的な生存能力は依然として顕著であり、このことは、これらのグラム陽性細菌の存続細胞に対する、低濃度でのこれらの化合物の活性の欠如を示す（図１８）。
【０１５３】
ＮＰ１０８およびシステアミンの組み合わせは、単独のいずれかの化合物よりも、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＤＳＭ  １１７２９の存続細胞に対して高い活性を示した（図１９）。これらの細胞に対する最も有効な組み合わせは、２５０〜５００μｇ／ｍｌのＮＰ１０８および１２５〜２５０μｇ／ｍｌのシステアミンであった。これらの組み合わせは、バイオフィルム内の最低の相対的な生存能力を示した。同様の結果が、６２．５μｇ／ｍｌのＮＰ１０８および５００μｇ／ｍｌのシステアミンで得られた。いずれかの化合物の濃度が低くなった組み合わせは、バイオフィルム内の高い相対的な生存能力を示した。
【０１５４】
グラム陰性の存続細胞とは異なり、蛍光染色したＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＤＳＭ  １１７２９バイオフィルムを顕微鏡で直接観察すると、ＮＰ１０８およびシステアミンの組み合わされた最も高い濃度で、残った生存細胞の存在が示された（データは示していない）。
【０１５５】
表１は、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌に対する、短いアルギニンペプチドＮＰ３３９、ＮＰ３４１、ポリ−Ｌ−リシンＮＰ１０８、システアミン、およびＮＰ１０８とシステアミンとの組み合わせの活性の概要を示す。
【０１５６】
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【０１５７】
注記：
１−  補足１は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＤＳＭ  １１７２９に対する、試験対象の短いアルギニン抗微生物剤のＭＩＣを示す。
２−  補足２は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ２７８５３に対する、ＮＰ３４１と組み合わされた粘液溶解剤システアミンおよびＮ−アセチルシステインの活性を示す。
【０１５８】
補足１：データ（示されていない）は、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）ＤＳＭ  １１７２９の浮遊性細胞に対する、４８時間の短い直鎖状アルギニンペプチドの活性を示す。凡例で示される試験対象の濃度範囲はｍｇ／ｍｌで示される。データ（示されていない）は、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）ＤＳＭ  １１７２９の浮遊性細胞に対する、４８時間の短い直鎖状アルギニンペプチドの活性を示す。経時的な活性は、細菌の増殖の阻害が、抗微生物剤の用量および細胞への曝露時間に関連することを示す。完全な殺菌活性は、４８時間で、０．５ｍｇ／ｍｌを超える濃度のＮＰ３３９、ＮＰ３４０、およびＮＰ３５２で観察され、０．１２５および０．２５ｍｇ／ｍｌは、少なくとも２４時間で完全な阻害を示し、０．０６および０．０３ｍｇ／ｍｌなどの、より低い濃度は、それぞれ少なくとも２０時間および１５時間で完全な阻害を示した。０．２５ｍｇ／ｍｌが４８時間で完全な阻害を示したことを除いて、同様の結果がＮＰ３４１で得られた。
【０１５９】
補足２：しかし、３〜６ｍｇ／ｍｌのＮ−アセチルシステインと組み合わされると、ＭＢＥＣに達するために必要なＮＰ３４１はわずか２０５μｇ／ｍｌである（図２０ａ）。存続細胞に対して、これらの２つの化合物の組み合わせで活性の同様の増大が観察され、１０２４μｇ／ｍｌのＮＰ３４１＋３１２８μｇ／ｍｌのＮ−アセチルシステインは、存続細胞のおよそ７５％を阻害し、これは、２つの化合物のいずれかを単独で用いた際に得られたものよりもはるかに高い阻害である（図２０ｂ）。
【０１６０】
ＮＰ３４１とシステアミンまたはＮ−アセチルシステインとの組み合わせは、単独のいずれかの化合物の活性と比較して増大した抗細菌活性を示す。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ２７８５３に対するＮＰ３４１単独のＭＢＥＣは、２ｍｇ／ｍｌを超え、システアミンでは１００ｍｇ／ｍｌ超であった（図２１ａ）。これは、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ２７８５３のバイオフィルム細胞に対して、２つの化合物間で協調的な効果がないことを示す。しかし、このような協調は、存続細胞に対しては観察され、２０５μｇ／ｍｌのＮＰ３４１＋３ｍｇ／ｍｌのシステアミンは、存続細胞のおよそ７５％を阻害し、これは、単独の２つの化合物のいずれかよりもはるかに高いものである（図２１ｂ）。
【０１６１】
ＮＰ３３９と組み合わせて用いる場合、システアミンを少量でも添加すると、ＮＰ３３９のＭＢＥＣ値が低減されることが観察された（図１４ａ〜ｄ）。より興味深いことには、ＮＰ３３９とシステアミンとの組み合わせもまた、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＤＳＭ１１２８およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＢＡＡ−４７の存続細胞に対して増大した活性を示した（図１５ａ〜ｂ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１４ｄ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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