(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から単離した生体試料において、ＦＯＸＬ−２及び／又はそのプロモータにおけるＣｐＧメチル化の有無を検出し、ＣｐＧの高メチル化を肺癌の存在の指標とする、肺癌の検出の判断材料を提供する方法。
【請求項２】
被験者から得られた生体試料から単離したゲノムＤＮＡを、該ゲノムＤＮＡの少なくとも１つの標的領域内でメチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを識別する、少なくとも１つの試薬又は試薬群に接触させる工程であって、該標的領域が、配列番号５の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドの配列を含み、該連続したヌクレオチドがＣｐＧジヌクレオチド配列を少なくとも１つ含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ）処理ゲノムＤＮＡ又はその処理断片を、増幅酵素及び配列番号１６、１７、３０及び３１から成る群から選択される配列に相補的である、少なくとも１６ヌクレオチドの連続した配列及びその相補鎖を含む少なくとも１つのプライマーに接触させる工程であって、該処理ゲノムＤＮＡ又はその断片のいずれかを増幅し、少なくとも１つの増幅産物を産出するか又は増幅しない、接触させる工程、並びに
ｂ）前記増幅産物の有無又は特性に基づき、配列番号５の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベル、又はその平均、又は配列番号５の複数のＣｐＧジヌクレオチドの平均メチル化状態若しくはレベルを反映する値を決定し、当該決定により肺癌の検出又は診断の少なくとも一方の判断材料の提供を可能にする、決定する工程、
をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ゲノムＤＮＡ又はその断片の処理において、重亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩、硫酸アンモニウム又は硫酸グアニジン、及びこれらの組合せから成る群から選択される試薬の使用を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
被験者から得られた生体試料が、細胞株、組織断片、生検、パラフィン包埋組織、体液、尿、血漿、血清、全血、単離血球、血液から単離される細胞及びこれらの組合せを含む群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
配列番号１６、１７、３０及び３１から成る群から選択される配列に相補的である、少なくとも１６ヌクレオチドの連続した配列及びその相補鎖を含む少なくとも１つの核酸分子又はペプチド核酸分子をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
核酸分子又はペプチド核酸分子がハイブリダイズされる核酸の増幅を抑制する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｂ）の決定する工程において、増幅産物のシークエンシングを行うことを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
ａ）の増幅又は接触させる工程において、メチル化特異的なプライマーの使用を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
ａ）ゲノムＤＮＡを被験者から得られた生体試料から抽出、又は単離する工程、
ｂ）ａ）のゲノムＤＮＡ又はその断片を、１つ又は複数のメチル化感受性制限酵素で消化する工程、
ｃ）ｂ）のＤＮＡ制限酵素消化物を、増幅酵素及び配列番号５のＣｐＧジヌクレオチドを少なくとも１つ含む配列の増幅に適した少なくとも２つのプライマーに接触させる工程、及び
ｄ）増幅産物の有無に基づき、配列番号５の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベルを決定する工程であって、当該決定により肺癌の検出の判断材料の提供が可能になる、決定する工程、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号５の少なくとも１６塩基長のセグメントと、同一であるか又はこれに相補的である少なくとも１つの核酸若しくはペプチド核酸とのハイブリダイゼーションによって増幅産物の有無が決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
配列番号１６、１７、３０及び３１から成る群から選択されるＤＮＡ配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチド、又はそれらに相補的な配列を含む核酸からなる肺癌検出用プライマー又はプローブ。
【請求項１３】
配列番号１６、１７、３０及び３１から成る群から選択されるＤＮＡ配列の少なくとも１６ヌクレオチド長のセグメントと、同一であるか又はこれに相補的であるオリゴヌクレオチドからなる肺癌検出用プライマー又はプローブ。
【請求項１４】
（ａ）重亜硫酸試薬と、（ｂ）配列番号１６、１７、３０及び３１から成る群から選択されるＤＮＡ配列の少なくとも１６塩基長のＤＮＡセグメントと同一であるか又はこれに相補的である、少なくとも一組のオリゴヌクレオチドとを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法を行うのに適した肺癌検出用キット。
【請求項１５】
肺癌の診断、肺癌の進行の状態の検出、肺癌に関する情報の取得及び／又は肺癌の特徴付けの判断材料の提供における、
・請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法、
・請求項１２若しくは１３に記載のプライマー又はプローブ、及び／又は
・請求項１４に記載のキット、
の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、正常な状態に比べて疾患状態において発現パターンの変化を示すゲノムＤＮＡ配列に関する。特定の実施の形態が、細胞増殖性障害を検出又は診断するのに有用な方法、核酸、核酸アレイ及びキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＣｐＧアイランドメチル化。  突然変異は別にして、ＣｐＧアイランドの異常なメチル化によって、これまでに癌を含む様々な細胞増殖性障害の発症に関係するとされる或る特定の遺伝子の転写サイレンシングがもたらされることが示されている。ＣｐＧアイランドは、ＣｐＧジヌクレオチドに豊富にある短い配列であり、通常全てのヒト遺伝子のおよそ５０％の５'領域で見出すことができる。これらのアイランドにおけるシトシンのメチル化は、遺伝子発現の欠失をもたらし、Ｘ染色体の不活性化及びゲノムインプリンティングで報告されている。
【０００３】
医学的検査の発展。  任意の医学的スクリーニング又は診断検査の２つの鍵となる評価基準は、感度及び特異度であり、これらによって、どのくらい良好に試験を行い、例外なく、また誤って標的疾患ではない（予測値を有しない）個体を包含することなく、全ての罹患個体を正確に検出することができるかが評価される。歴史的に、感度及び特異度が低いため、多くの診断検査が批判されている。
【０００４】
真陽性（ＴＰ）結果は、検査が陽性であり、且つ症状がある場合である。偽陽性（ＦＰ）結果は、検査が陽性であるが、症状がない場合である。真陰性（ＴＮ）結果は、検査が陰性であり、且つ症状がない場合である。偽陰性（ＦＮ）結果は、検査が陰性であるが、症状がない場合である。これに関して、感度＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）、特異度＝ＴＮ／（ＦＰ＋ＴＮ）、及び予測値＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）である。
【０００５】
感度は、検査する個体において標的疾患を正確に検出する検査能の評価基準である。感度が低い検査では、偽陰性、即ち疾患であるのに、この特定の疾患ではないと誤って同定される個体の割合が高くなる。偽陰性の潜在的な危険性は、罹患個体が一定期間、診断及び治療されず、その間に疾患が後期に進行し、そのような場合に治療の効果が低くなる可能性があることである。感度が低い検査の例は、ＨＩＶに関するタンパク質ベースの血液検査である。この種の検査は、疾患が確定され、相当数のウイルスが血流に侵入するまでウイルスの存在を検出することができないため、低感度を示す。これに対して、感度が高い検査の例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用したウイルス量（viral-load）検出である。この種の検査は、ごく少量のウイルスを検出することができるために、高感度が達成される。結果として診断を誤る可能性が高い場合に、高感度は特に重要である。
【０００６】
他方で特異度は、疾患状態にない患者を正確に同定する検査能の評価基準である。特異度が低い検査では、偽陽性、即ち疾患であるとして誤って同定される個体の割合が高くなる。偽陽性の難点は、付帯リスク、感情及び金銭的なストレスを伴い、且つ患者の健康に対して悪影響を与える可能性がある、不必要な医療処置、治療を受けることを患者に強いることである。特異度が高い診断検査を開発することを難しくしている疾患の特徴は、特に細胞増殖性障害における疾患機構に複数の遺伝子及びタンパク質が関与することが多いことである。さらに、疾患状態に関係のない理由から或る特定のタンパク質が上昇する可能性がある。さらなる診断法又はさらなる医学的介入に関連するコスト又はリスクが非常に高い場合に、特異度は重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、被験者において細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害、最も好ましくは肺癌を検出又は識別する方法であって、発現レベルを決定することを含み、発現レベルを決定することは、上記被験者から単離した生体試料において、ＦＯＸＬ−２、ＯＮＥＣＵＴ１、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列のメチル化のレベル及びパターンを決定することも含み、高メチル化及び／又は低発現が、上記障害の存在の指標となる、被験者において細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害、最も好ましくは肺癌を検出又は識別する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の様々な態様は、有効且つ特有の遺伝子マーカーを提供し、これにより上記マーカーの発現解析によって、特に高い感度、特異度及び／又は予測値での細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害の検出を可能にする。肺腺癌、大細胞肺癌、肺扁平上皮癌、小細胞肺癌から成る群から選択される肺癌が好ましい。
【０００９】
一実施の形態では、本発明は、被験者において細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）を検出する方法であって、上記被験者から単離した生体試料において、ＦＯＸＬ−２、ＯＮＥＣＵＴ１、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列の発現レベルを決定することを含み、低発現及び／又はＣｐＧメチル化が、上記障害の存在の指標となる、被験者において細胞増殖性障害好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）を検出する方法を提供する。一実施の形態では、上記遺伝子から転写されるｍＲＮＡの有無又はレベルを検出することによって、上記発現レベルを決定する。さらなる実施の形態では、上記遺伝子によってコードされるポリペプチド又はその配列の有無又はレベルを検出することによって、上記発現レベルを決定する。
【００１０】
さらに好ましい実施の形態では、上記遺伝子内のＣｐＧメチル化の有無又はレベルを検出することによって、上記発現を決定し、低発現（ＣｐＧメチル化の存在又は或る特定レベルのメチル化の存在により示されると理解される）が細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）の存在を示す。
【００１１】
上記方法は、ｉ）好ましくはヒト被験者である被験者から得られた生体試料（好ましくは、細胞若しくは細胞株、組織断片、生検、パラフィン包埋組織、体液、射精液、尿、血漿、血清、全血、単離血球、唾液及び気管支鏡検査（気管支洗浄、気管支肺胞洗浄、気管支擦過及び気管支掻爬を含むが、これらに限定されない）で得られる生体物質から成る群から選択される）から単離したゲノムＤＮＡを、ゲノムＤＮＡの少なくとも１つの標的領域内でメチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを識別する、少なくとも１つの試薬又は試薬群に接触させる工程であって、標的領域が研究対象領域であり、上記標的領域のヌクレオチド配列が、ＦＯＸＬ−２、ＯＮＥＣＵＴ１、ＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列のＣｐＧジヌクレオチド配列を少なくとも１つ含む、接触させる工程と、ｉｉ）細胞増殖性障害、好ましくは少なくとも部分的に表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）を検出する工程とを含む。好ましくは標的領域は、上述の群から選択されるゲノム配列内に位置する。標的領域は、配列番号１〜配列番号７の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドの配列を含むか、又はストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズするのが好ましい。
【００１２】
好ましくは、上記検出の感度は、約７５％〜約９６％、又は約８０％〜約９０％、又は約８０％〜約８５％である。好ましくは、特異度は、約７５％〜約９６％、又は約８０％〜約９０％、又は約８０％〜約８５％である。
【００１３】
上記の遺伝子の使用は、任意の遺伝子発現の解析、ｍＲＮＡ発現解析又はタンパク質発現解析によって可能になる。しかしながら、本発明の最も好ましい実施の形態では、細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）の検出は、ＦＯＸＬ−２、ＯＮＥＣＵＴ１、ＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくと１つの遺伝子又はゲノム配列のメチル化状況の解析によって可能になる。
【００１４】
本発明は、細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）の発症に関連する特徴に関して生体試料を解析する方法であって、配列番号１〜配列番号７の核酸又はその断片を、ゲノム配列内でメチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを識別することができる試薬又は試薬群に接触させることを特徴とする、方法を提供する。 
【００１５】
本発明は、細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）の発症に関連するゲノムＤＮＡのエピジェネティックパラメータを確認する方法を提供する。この方法は、上記疾患の検出及び診断の改善に有用である。
【００１６】
好ましくは、検査試料の供給源は、細胞若しくは細胞株、組織断片、生検、パラフィン包埋組織、体液、射精液、尿、血漿、血清、全血、単離血球、唾液及び気管支鏡検査（気管支洗浄、気管支肺胞洗浄、気管支擦過、気管支掻爬を含むが、これらに限定されない）で得られる生体物質並びにこれらの組合せから成る群から選択される。より好ましくは、試料型は、血漿、唾液及び気管支鏡検査（気管支洗浄、気管支肺胞洗浄、気管支擦過及び気管支掻爬を含むが、これらに限定されない）で得られる生体物質並びにこれらの可能な全ての組合せから成る群から選択される。
【００１７】
具体的に本発明は、診断ツールにおける使用に適した、細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）を検出する方法であって、ゲノム核酸（複数可）を含む生体試料を得ること、核酸（複数可）又はその断片を、対象となる核酸の標的配列内でメチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列と非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列とを識別するのに十分な１つの試薬又は複数の試薬に接触させることであって、標的配列が、配列番号１〜配列番号７の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含む配列を含むか、若しくはストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズし、上記連続したヌクレオチドがＣｐＧジヌクレオチド配列を少なくとも１つ含む、接触させること、並びに少なくとも一部上記識別に基づき、上記標的配列内の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはその平均、又は対象となる核酸の上記標的配列内の複数の標的ＣｐＧジヌクレオチドの平均メチル化状態を反映する値を決定することであって、標的配列が、配列番号１〜配列番号７の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含む配列を含むか、若しくはストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズし、上記連続したヌクレオチドがＣｐＧジヌクレオチド配列を少なくとも１つ含む、決定することを含む、診断ツールにおける使用に適した、細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）を検出する方法を提供する。
【００１８】
好ましくは、標的配列内のメチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列と非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列との識別は、少なくとも１つのこのようなＣｐＧジヌクレオチド配列を、配列番号８〜配列番号３５から成る群から選択される配列内の対応する変換ジヌクレオチド配列又は非変換ジヌクレオチド配列、及び標的配列に対応するその連続した領域へメチル化状態依存的に変換又は非変換することを含む。
【００１９】
さらなる実施の形態によって、細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）を検出する方法であって、対象となるゲノムＤＮＡを有する生体試料を得ること、ゲノムＤＮＡを抽出すること、ゲノムＤＮＡ又はその断片を１つ又は複数の試薬で処理することであって、５位の非メチル化シトシン塩基を、ウラシル塩基又はハイブリダイゼーション特性に関してシトシンと異なることが検出可能な別の塩基に変換する、処理すること、処理ゲノムＤＮＡ又はその処理断片を、増幅酵素及びそれぞれの場合、配列番号８〜配列番号３５から成る群から選択される配列に相補的であるか、又は適度にストリンジェントな条件若しくはストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチド長の連続した配列及びその相補体を含む少なくとも２つのプライマーに接触させることであって、処理ＤＮＡ又はその断片のいずれかを増幅して増幅産物を産生するか、又は増幅しない、接触させること、並びに上記増幅産物の有無又は特性に基づき、メチル化状態若しくは平均、又は配列番号１〜配列番号７の少なくとも１つ、しかしより好ましくは複数のＣｐＧジヌクレオチドの平均メチル化レベルを反映する値を決定することを含む、細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）を検出する検出方法が与えられる。
【００２０】
好ましくは、決定には、ｉ）配列番号８〜配列番号３５から成る群から選択される配列に相補的であるか、又は適度にストリンジェントな条件若しくはストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチド長の連続した配列及びその相補体を含む少なくとも１つの核酸分子をハイブリダイズすること、ｉｉ）固相と結合し、配列番号８〜配列番号３５から成る群から選択される配列に相補的であるか、又は適度にストリンジェントな条件若しくはストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチド長の連続した配列及びその相補体を含む少なくとも１つの核酸分子をハイブリダイズすること、ｉｉｉ）配列番号８〜配列番号３５から成る群から選択される配列に相補的であるか、又は適度にストリンジェントな条件若しくはストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチド長の連続した配列及びその相補体を含む少なくとも１つの核酸分子をハイブリダイズすると共に、少なくとも１つのこのようなハイブリダイズした核酸分子を、少なくとも１ヌクレオチド塩基伸長させること、並びにｉｖ）増幅産物をシークエンシングすることから成る群から選択される少なくとも１つの方法の使用が含まれる。
【００２１】
さらなる実施の形態によって、細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）の解析（即ち検出又は診断）方法であって、対象となるゲノムＤＮＡを有する生体試料を得ること、ゲノムＤＮＡを抽出すること、配列番号１〜配列番号７から成る群から選択される１つ若しくは複数の配列、又はストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする配列を含むゲノムＤＮＡ若しくはその断片を、１つ若しくは複数のメチル化感受性制限酵素と接触させることであって、ゲノムＤＮＡを消化し消化断片を産生するか、又はそれによっては消化しない、接触させること、並びに少なくとも１つのこのような断片の有無又は特性に基づき、配列番号１〜配列番号７の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態若しくはその平均、又は複数のＣｐＧジヌクレオチド配列の平均メチル化状態を反映する値を決定することを含む、細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）の解析（即ち検出又は診断）方法が与えられる。好ましくは、上記決定前に、消化ゲノムＤＮＡ又は非消化ゲノムＤＮＡを増幅する。
【００２２】
さらなる実施の形態によって、配列番号１〜配列番号７内のシトシンのメチル化パターンの解析のために、新規のゲノム的且つ化学的に修飾した核酸配列、及びオリゴヌクレオチド、及び／又はＰＮＡ−オリゴマーが与えられる。
【００２３】
さらなる実施の形態によって、新規の解析アッセイ、並びにプライマー及びブロッカー（blocker）の特定の有益な組合せ又はプライマー及びプローブが与えられ、これにより診断検査又は解析検査が特に良好に行われる。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
用語「実測値／期待値の比（Expected Ratio）」（「Ｏ／Ｅ比」）は、特定のＤＮＡ配列内のＣｐＧジヌクレオチドの頻度を表し、それぞれの断片に関して［ＣｐＧ部位の数／（Ｃ塩基の数×Ｇ塩基の数）］／バンド長に対応する。
【００２５】
用語「ＣｐＧアイランド」は、（１）０．６を超えた「実測値／期待値の比」に対応するＣｐＧジヌクレオチド頻度を有し、且つ（２）「ＧＣ含量」が０．５を超える基準を満たすゲノムＤＮＡの連続した領域を表す。ＣｐＧアイランドの長さは、いつもというわけではないが、典型的に、約０．２ｋｂ〜約１ｋｂ又は約２ｋｂである。
【００２６】
用語「メチル化状態」又は「メチル化状況」は、ＤＮＡ配列内の１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドでの５−メチルシトシン（「５−ｍＣｙｔ」）の有無を表す。ＤＮＡ配列内の１つ又は複数の特定のＣｐＧメチル化部位（それぞれが２つのＣｐＧジヌクレオチド配列を有する）でのメチル化状態としては、「非メチル化」、「完全メチル化」及び「ヘミ−メチル化」が挙げられる。
【００２７】
用語「ヘミ−メチル化」又は「ヘミメチル化」は、１つだけの鎖がメチル化している二本鎖ＤＮＡのメチル化状態を表す。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「ＡＵＣ」は、曲線下面積の略語である。特に、ＡＵＣは、受信者動作特性（Receiver Operating Characteristic）（ＲＯＣ）曲線下面積を表す。ＲＯＣ曲線は、診断検査の異なり得る切点に関する、偽陽性率に対する真陽性率のプロットである。このプロットは、選択された切点に応じた感度と特異度との間のトレードオフを示す（任意の感度増大は、特異度の減少を伴う）。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、診断検査の正確性の評価基準である（面積が大きければ大きいほど良好であり、最適値は１であり、無作為検査は、面積が０．５の傾きに基づくＲＯＣ曲線を有し、J.P. Egan. Signal Detection Theory and ROC Analysis, Academic Press, New York, 1975を参照されたい）。
【００２９】
用語「マイクロアレイ」は、当該技術分野で認識されるように、広く「ＤＮＡマイクロアレイ」と「ＤＮＡチップ（複数可）」の両方を表し、当該技術分野で認識される固体支持体を全て包含し、またその固体支持体に核酸分子を付加する方法、又はその固体支持体上で核酸を合成する方法を全て包含する。
【００３０】
「遺伝的パラメータ」は、その調節にさらに必要となる遺伝子及び配列の突然変異及び多型である。突然変異と規定されるものは、特に挿入、欠失、点突然変異、反転及び多型、特に好ましくは一塩基変異多型（ＳＮＰ）である。
【００３１】
「エピジェネティックパラメータ」は特に、シトシンのメチル化である。しかし、さらなるエピジェネティックパラメータには、例えば記載の方法を使用して直接解析することはできないが、同様にＤＮＡメチル化と相関するヒストンのアセチル化が含まれる。
【００３２】
用語「重亜硫酸試薬」は、本明細書に開示されるようにメチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列と非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列とを識別するのに有用である、重亜硫酸塩、二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、又はこれらの組合せを含む試薬を表す。
【００３３】
用語「メチル化アッセイ」は、ＤＮＡの配列内の１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態又はメチル化レベルを決定する任意のアッセイを表す。
【００３４】
用語「ＭＳ．ＡＰ−ＰＣＲ」（メチル化感受性任意プライムポリメラーゼ連鎖反応（Methylation-Sensitive Arbitrarily-Primed Polymerase Chain Reaction））は、ＣｐＧジヌクレオチドを含有する可能性が最も高い領域に焦点を当てるのに高ＣＧプライマーを使用して、ゲノムの広域精査を可能にする当該技術分野で認識される技術を表し、Gonzalgo et al., Cancer Research 57:594-599, 1997に記載される。
【００３５】
用語「ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」は、Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999に記載の当該技術分野で認識される蛍光ベースのリアルタイムＰＣＲ法を表す。
【００３６】
本明細書で実施される、その実施形態における用語「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）」アッセイは、増幅プライマー間のＣｐＧ位置をカバーする、又は増幅プライマーによってカバーされる、メチル化特異的な遮断プローブ（本明細書でブロッカーとも称される）によって、核酸試料のメチル化特異的な選択増幅が可能になるアッセイを表す。
【００３７】
本明細書で実施される、その実施形態における用語「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」アッセイは、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイを、増幅プライマー間のＣｐＧ位置をカバーするメチル化特異的な遮断プローブと組合せたＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイの変法である、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイを表す。
【００３８】
用語「Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ」（メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長）は、Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997で記載された当該技術分野で認識されるアッセイを表す。
【００３９】
用語「ＭＳＰ」（メチル化特異的ＰＣＲ）は、Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996及び米国特許第５,７８６,１４６号明細書で記載された当該技術分野で認識されるメチル化アッセイを表す。
【００４０】
用語「ＣＯＢＲＡ」（複合重亜硫酸制限解析）は、Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997で記載された当該技術分野で認識されるメチル化アッセイを表す。
【００４１】
用語「ＭＣＡ」（メチル化ＣｐＧアイランド増幅）は、Toyota et al., Cancer Res. 59:2307-12, 1999、及び国際公開第００／２６４０１号パンフレットで記載されたメチル化アッセイを表す。
【００４２】
用語「ハイブリダイゼーション（hybridisation）」は、オリゴヌクレオチドと、二本鎖構造を形成する試料ＤＮＡにおいて一連のワトソン−クリック塩基対合に沿った相補的な配列との結合と理解される。
【００４３】
本明細書で規定される場合、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、５×ＳＳＣ／５×デンハート溶液／１．０％ＳＤＳ中、６８℃でハイブリダイズすること、及び０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、室温で洗浄することを伴うか、又は当該技術分野で認識されるその等価物（例えば、２．５×ＳＳＣバッファー中、６０℃でハイブリダイゼーションを行った後に、低いバッファー濃度における３７℃での幾つかの洗浄工程を行い、安定状態を保つ条件）を伴う。本明細書で規定される場合、適度にストリンジェントな条件は、３×ＳＳＣ中、４２℃での洗浄、又は当該技術分野で認識されるその等価物を含むことを伴う。塩濃度及び温度のパラメータを変更し、プローブと標的核酸との間に最適な同一性レベルを達成することができる。このような条件に関するガイダンスが、例えばSambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.、及びAusubel et al.（eds.）, 1995, Current Protocols in Molecular Biology,（John Wiley & Sons, N.Y.）at Unit 2.10によって当該技術分野で利用可能である。
【００４４】
用語「メチル化特異的制限酵素」又は「メチル化感受性制限酵素」は、その認識部位のメチル化状態によって選択的に核酸を消化する酵素を意味するものとする。認識部位がメチル化又はヘミメチル化されないと特異的に切断するこのような制限酵素の場合、切断が起こらないか、又は認識部位がメチル化されると効率は大幅に低減する。認識部位がメチル化されると特異的に切断するこのような制限酵素の場合、切断が起こらないか、又は認識部位がメチル化されないと効率が大幅に低減する。メチル化特異的制限酵素が好ましく、その認識配列は、ＣＧジヌクレオチド（例えばｃｇｃｇ又はｃｃｃｇｇｇ）を含有する。シトシンがこのジヌクレオチドにおいて炭素原子Ｃ５でメチル化されても切断しない制限酵素が幾つかの実施形態でさらに好ましい。
【００４５】
「非メチル化特異的制限酵素」又は「非メチル化感受性制限酵素」は、効率がほぼ同一であるメチル化状態に関係なく核酸配列を切断する制限酵素である。これらは、「メチル化非特異的制限酵素」とも呼ばれる。
【００４６】
用語「ＯＮＥＣＵＴ１、ＦＯＸＬ−２及びＴＦＡＰ２Ｅ、ＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列」は、その任意の転写変異型を含むものとする。さらに、複数のＳＮＰが上記遺伝子内で知られているので、この用語は、その全ての配列変異型を含むものとする。
【００４７】
本明細書内でゲノム領域ＥＮ２−２、ＥＮ２−３及びＳＨＯＸ２−２が言及される場合、これらの用語は、（表１に挙げられる）配列プロトコルに提示されるようなゲノム配列を表す。これらの領域は、ＥＮ２遺伝子又はＳＨＯＸ２遺伝子に関連したＣｐＧアイランドを表す。
【００４８】
本発明による方法のいずれかで解析され得る試料型は、細胞又は細胞株、組織断片、生検、パラフィン包埋組織、体液、射精液、尿、血漿、血清、全血、単離血球、唾液及び気管支鏡検査（気管支洗浄、気管支肺胞洗浄、気管支擦過、気管支掻爬を含むが、これらに限定されない）で得られる生体物質を含む群からのいずれか、並びにそれらの組合せであり得る。より好ましくは、試料型は、血漿、唾液及び気管支鏡検査（気管支洗浄、気管支肺胞洗浄、気管支擦過及び気管支掻爬を含むが、これらに限定されない）で得られる生体物質並びにこれらの全ての可能な組合せから成る群から選択される。
【００４９】
本発明による方法のいずれかで解析され得る試料型は血流で得られる流体群に属するのが好ましい。
【００５０】
また本発明による方法のいずれかで解析され得る試料型は肺で得られる生体試料群に属するのが好ましい。そのため用語「肺で得られる生体試料」は肺の気管支系から得られる流体及び／又は細胞を含むものとする。肺で得られるこのような生体試料は、外部流体を添加することなく被験者（例えば患者）から採取してもよく、この場合の典型的な試料型は唾液、気管若しくは気管支流体、呼気流体、擦過液（brushings）又は生検である。しかしながら、気管支系由来のこのような流体は、外部流体を添加した後、又は外部流体で洗い流した後に採取してもよく、この場合の典型的な試料は例えば、誘発唾液、気管支洗浄液又は気管支肺胞洗浄液である。肺で得られるこのような生体試料は、機器（吸引カテーテル、気管支鏡、ブラシ、鉗子、吸水トラップ）の使用により又は機器を使用せずに採取してもよい。この方法は、既に任意のこのような材料から得られたＤＮＡを解析するのに利用してもよい。
【００５１】
気管支系（「気道」とも呼ばれる）は、生物と環境（例えば気管、気管支、細気管支、肺胞管、肺胞）との間の空気（特に酸素及び二酸化炭素）の取り込み及び交換に関与する器官系であると理解される。
【００５２】
用語「気管支洗浄液（ＢＬ）」又は「気管支肺胞液（ＢＡＬ）」は、医療処置に従って、ＢＬ及びＢＡＬを行って回収される流体の種類であると理解される。ＢＬ及びＢＡＬは、気管支鏡を、口又は鼻を介して肺へと通し、流体を肺の小部分に噴き付け、それから検査のために再び回収する、医療処置である。典型的にはＢＬ／ＢＡＬは肺疾患を診断するのに行う。特に、ＢＡＬは、免疫系に問題がある人々の感染、人工呼吸器を装着した人々の肺炎、幾つかの種類の肺癌及び肺の瘢痕（間質性肺疾患）を診断するのに一般的に使用される。ＢＡＬは、上皮内層液（ＥＬＦ）の構成要素をサンプリングするのに、及び肺気道のタンパク質組成を決定するのに最も一般的な方法であり、肺におけるサンプリング細胞又は病原菌レベルによる免疫学研究に使用されることが多い。これらの例としてはＴ細胞集団及びインフルエンザウイルスレベルが挙げられる。
【００５３】
ＢＬ及びＢＡＬは、洗い出される気管支系の領域（区域）と使用される流体量とが異なり、
ＢＬはおよそ１０ｍｌの流体を使用して気管支に焦点を当て、
ＢＡＬはより多量（約１００ｍｌ）の流体を使用してさらに細気管支及び肺胞管へと到達する。
【００５４】
用語「気管支鏡検査」は、気道を観察し、肺疾患を診断する医学的検査を含むように理解される。また気管支鏡検査は幾つかの肺状態の治療中に使用され得る。
【００５５】
また肺で得られる生体試料は、気管及び気管支系用の吸入カテーテルを用いて得ることができ、例えば肺から流体を吸引するための少なくとも１つの連続管腔を備える管状の可撓性吸入カテーテルを気管及び気管支系に挿入するのに使用することができる。
【００５６】
用語「肺癌」は、本明細書で肺癌の検出又は肺癌の診断に言及するときはいつでも、肺に位置する腫瘍で同定され得る肺腺癌；大細胞肺癌；肺扁平上非癌及び小細胞肺癌、並びに他の形態の珍しい癌型を含むものとする。
【００５７】
用語「メチル化」はシトシンメチル化又はＣｐＧメチル化と理解されるような意味である。これらの用語は、ＣｐＧの文脈内のシトシンのＣ５原子でのメチル化を説明するのに使用される。
【００５８】
本発明は、被験者において細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）を検出する方法であって、上記被験者から単離した生体試料においてＦＯＸＬ−２、ＯＮＥＣＵＴ１、ＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列の発現又はメチル化レベルを決定することを含み、高メチル化及び／又は低発現が上記障害の存在の指標となる、被験者において細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）を検出する方法を提供する。上記マーカーは、細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）の診断に使用し得る。
【００５９】
ＤＮＡの重亜硫酸修飾は、ＣｐＧメチル化状況を評価するのに使用される当該技術分野で認識されるツールである。５−メチルシトシンは、真核細胞のＤＮＡにおける最も高頻度な共有結合的な塩基修飾である。５−メチルシトシンは、例えば転写調節、遺伝子インプリンティング、及び腫瘍形成に関与する。したがって、遺伝子情報の構成要素としての５−メチルシトシンの同定は非常に興味深い。しかし、５−メチルシトシンがシトシンと同じ塩基対合挙動をするので、シークエンシングでは５−メチルシトシンの位置を同定することはできない。さらに、５−メチルシトシンが保持するエピジェネティック情報は、例えばＰＣＲ増幅中に完全に失われる。
【００６０】
５−メチルシトシンの存在に関してＤＮＡを解析する最も頻繁に使用される方法は、重亜硫酸塩とシトシンとの特異的反応に基づき、その後のアルカリ加水分解の際に、シトシンは、塩基対合挙動においてチミンに対応するウラシルに変換される。しかし重要なことに、５−メチルシトシンは、これらの条件下で非修飾のままである。結果として、ここでは標準的な当該技術分野で認識される分子生物学的技法を使用して（例えば増幅及びハイブリダイゼーション、又はシークエンシングによって）、そのままではハイブリダイゼーション挙動ではシトシンと区別することができないメチルシトシンを、残存シトシンとしてのみ検出することができるように、元のＤＮＡを変換する。全てのこれらの技法は、異なる塩基対合性に基づいており、ここで十分に利用することができる。
【００６１】
感度に関して、従来技術は、アガロースマトリクスで解析するＤＮＡを内包すること、それによりＤＮＡの拡散及び再生を防ぐこと（重亜硫酸塩のみが一本鎖ＤＮＡと反応する）、及び全ての析出工程と精製工程とを迅速透析に置き換えることを含む方法によって規定される（Olek A, et al., A modified and improved method for bisulfite based cytosine methylation analysis, Nucleic Acids Res. 24:5064-6, 1996）。このようにして、メチル化状況に関して個々の細胞を解析することが可能になり、方法の有用性及び感度が示される。当該技術分野で認識される５−メチルシトシンを検出する方法の概略は、Rein, T., et al., Nucleic Acids Res., 26:2255, 1998で与えられる。
【００６２】
幾つかの例外を除いて（例えばZeschnigk M, et al., Eur J Hum Genet. 5:94-98, 1997）、重亜硫酸技法は、現在研究においてのみ使用されている。全ての場合で、重亜硫酸処理後に、既知の遺伝子の短く特異的な断片を増幅し、完全にシークエンシングして（Olek & Walter, Nat Genet. 1997 17:275-6, 1997）、１つ又は複数のプライマー伸長反応を行い（Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res., 25:2529-31, 1997、国際公開第９５／００６６９号パンフレット、米国特許第６，２５１，５９４号明細書）、個々のシトシン位置を解析するか、又は酵素消化によって処理する（Xiong & Laird, Nucleic Acids Res., 25:2532-4, 1997）。ハイブリダイゼーションによる検出も、当該技術分野で記載されている（Olek et al.,国際公開第９９／２８４９８号パンフレット）。さらに、個々の遺伝子に対するメチル化検出のための重亜硫酸技法の使用が記載されている（Grigg & Clark, Bioessays, 16:431-6, 1994、Zeschnigk M, et al., Hum Mol Genet., 6:387-95, 1997、Feil R, et al., Nucleic Acids Res., 22:695-, 1994、Martin V, et al., Gene, 157:261-4, 1995、国際公開第９７／４６７０５号パンフレット及び国際公開第９５／１５３７３号パンフレット）。
【００６３】
本発明は、配列番号１〜配列番号７内のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状況を決定するための１つ又は複数のメチル化アッセイと組合せた重亜硫酸技法の使用を提供する。ゲノムＣｐＧジヌクレオチドをメチル化又は非メチル化（代替的には、それぞれ上方メチル化及び下方メチル化として知られている）することができる。しかし、本発明の方法は、不均一性を有する生体試料（例えば体液検体、例えば肺で得られる生体試料、例えば唾液又は気管支洗浄液又は気管支肺胞洗浄液のバックグラウンド内の低濃度の腫瘍細胞）の解析に好適である。したがって、このような試料内のＣｐＧ位置のメチル化状況を解析する際、当業者は、メチル化状態に対して特定のＣｐＧ位置のメチル化のレベル（例えばパーセント、分数、比、割合又は程度）を決定するのに定量的アッセイを使用してもよい。したがって、用語「メチル化状況」又は「メチル化状態」は、ＣｐＧ位置のメチル化度を反映する値、即ちメチル化レベルも意味するものとする。特に記述がない限り、用語「高メチル化」又は「上方メチル化」は、特定のカットオフ点のメチル化レベルを超えるメチル化レベルを意味するものとし、上記カットオフは、所定の集団に対する平均若しくは中央値のメチル化レベルを表す値であり得るか、又は最適化されたカットオフレベルであるのが好ましい。「カットオフ」は、本明細書で「閾値」とも称される。本発明との関連で、用語「メチル化」、「高メチル化」又は「上方メチル化」は、ＦＯＸＬ−２、ＯＮＥＣＵＴ１、ＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列内、及び（例えばプロモータ又は調節領域において）これらと関連する全てのＣｐＧ位置に対して、カットオフを超えるメチル化レベルが、０％（又はそれと同等の）メチル化であることを含むものとする。
【００６４】
本発明によれば、配列番号１〜配列番号７内のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状況の決定は、細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）の診断及び検出に有用である。
【００６５】
メチル化アッセイ法。  様々なメチル化アッセイ法が当該技術分野で既知であり、本発明と併せて使用することができる。これらのアッセイによって、ＤＮＡ配列内の１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチド（例えばＣｐＧアイランド）のメチル化状態の決定が可能になる。このようなアッセイは、数ある技法の中でも重亜硫酸処理ＤＮＡのＤＮＡシークエンシング、（配列特異的な増幅のための）ＰＣＲ、サザンブロット解析、及びメチル化感受性制限酵素の使用を伴う。
【００６６】
例えば、重亜硫酸処理を利用することによって、ＤＮＡメチル化パターンの解析及び５−メチルシトシン分布のためのゲノムシークエンシングを単純化している（Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992）。さらに、重亜硫酸変換されたＤＮＡから増幅したＰＣＲ産物の制限酵素消化、例えばSadri & Hornsby（Nucl. Acids Res. 24:5058-5059, 1996）に記載されている方法、又は複合重亜硫酸制限解析（ＣＯＢＲＡ）（Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997）を利用する。
【００６７】
ＣＯＢＲＡ。  ＣＯＢＲＡ（商標）解析は、少量のゲノムＤＮＡで特定遺伝子座のＤＮＡメチル化レベルを決定するのに有用である定量的メチル化アッセイである（Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997）。要するに、制限酵素消化を利用して、重亜硫酸ナトリウム処理したＤＮＡのＰＣＲ産物においてメチル化依存的配列差異を明らかにする。初めに、Frommer et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992）で記載された手法に従った標準的な重亜硫酸処理によって、ゲノムＤＮＡにメチル化依存的配列差異を導入する。それから、対象となるＣｐＧアイランドに特異的なプライマーを使用して、重亜硫酸変換したＤＮＡのＰＣＲ増幅を行った後、制限エンドヌクレアーゼ消化、ゲル電気泳動、及び特異的な標識ハイブリダイゼーションプローブを使用した検出を行う。元のＤＮＡ試料のメチル化レベルは、広範なＤＮＡメチル化レベルにわたって一次定量的に、消化及び非消化ＰＣＲ産物の相対量で表す。また、この技法は確実に、顕微解剖したパラフィン包埋組織試料から得られたＤＮＡに適用することができる。
【００６８】
ＣＯＢＲＡ（商標）解析に典型的な試薬（例えば典型的なＣＯＢＲＡ（商標）ベースキットで見出され得るような）には、これらに限定されないが、特定遺伝子（又は重亜硫酸処理ＤＮＡ配列若しくはＣｐＧアイランド）に関するＰＣＲプライマー、制限酵素及び適切なバッファー、遺伝子ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド、対照ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプローブのためのキナーゼ標識キット、及び標識ヌクレオチドが含まれ得る。また、重亜硫酸変換試薬には、ＤＮＡ変性バッファー、スルホン化バッファー、ＤＮＡ回収試薬又はキット（例えば析出カラム、限外濾過カラム、アフィニティカラム）、脱スルホン化バッファー、及びＤＮＡ回収成分が含まれ得る。
【００６９】
好ましくは、「ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」等のアッセイ（蛍光ベースのリアルタイムＰＣＲ法）(Eads et al., cell proliferative disorders, preferably those according to Cancer Res. 59:2302-2306, 1999に記載の）、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ（商標）（メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長）反応（Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997）、メチル化特異的ＰＣＲ（「ＭＳＰ」、Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996）、米国特許第５，７８６，１４６号明細書）、及びメチル化ＣｐＧアイランド増幅（「ＭＣＡ」、Toyota et al., cell proliferative disorders, preferably those accroding to Cancer Res. 59:2307-12, 1999）を、単独で又は他のこれらの方法と組合せて使用する。
【００７０】
「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）」アッセイ法は、重亜硫酸処理ＤＮＡのメチル化特異的増幅に基づき、メチル化の差異を評価する定量的方法である。増幅プライマー間のＣｐＧ位置をカバーする、又は増幅プライマーによってカバーされる、メチル化特異的な遮断プローブ（本明細書でブロッカーとも称される）によって、核酸試料のメチル化特異的な選択増幅が可能になる。
【００７１】
本明細書で実施される、その実施形態における用語「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」アッセイは、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイを、増幅プライマー間のＣｐＧ位置をカバーするメチル化特異的な遮断プローブと組合せたＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイの変法である、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイを表す。ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）アッセイは、メチル化特異的な増幅プライマーと組合せて使用することもできる。
【００７２】
ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）解析に典型的な試薬（例えば典型的なＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）ベースキットで見出され得るような）には、これらに限定されないが、特定遺伝子（又は重亜硫酸処理ＤＮＡ配列若しくはＣｐＧアイランド）に関するＰＣＲプライマー、遮断オリゴヌクレオチド、最適化したＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド、並びにＴａｑポリメラーゼが含まれ得る。
【００７３】
ＭＳＰ。  ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）によって、メチル化感受性制限酵素の使用と関係なく、ＣｐＧアイランド内の実質的に任意の群のＣｐＧ部位のメチル化状況の評価が可能になる（Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996、米国特許第５，７８６，１４６号明細書）。要するに、メチル化シトシンではなく、全ての非メチル化シトシンをウラシルに変換する重亜硫酸ナトリウムによってＤＮＡを修飾し、その後非メチル化ＤＮＡに対してメチル化ＤＮＡに特異的なプライマーで増幅する。ごく少量のＤＮＡしか必要としないＭＳＰは、所定のＣｐＧアイランド座の０．１％メチル化対立遺伝子に感受性であり、パラフィン包埋試料から抽出したＤＮＡで行うことができる。ＭＳＰ解析に典型的な試薬（例えば典型的なＭＳＰベースキットで見出され得るような）には、これらに限定されないが、特定遺伝子（複数可）（又は重亜硫酸処理ＤＮＡ配列若しくはＣｐＧアイランド）に関するメチル化特異的ＰＣＲプライマー及び非メチル化特異的ＰＣＲプライマー、最適化したＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド、並びに特異的プローブが含まれ得る。
【００７４】
ＴＳＰ法。  この方法を、欧州特許出願公開第０８１５９２２７．１号明細書（実施例の項の２９頁〜２８頁を参照されたい）に記載のように行った。要するに、ＤＮＡ制限酵素Ｔｓｐ５０９Ｉをブロッカーオリゴヌクレオチドの代わりに使用する。この酵素は、重亜硫酸処理後の増幅中に非メチル化ＤＮＡを特異的に切断する。結果として、非メチル化ＤＮＡは増幅することができない。
【００７５】
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）。  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイは、ＰＣＲ工程後にさらに操作を必要としない蛍光ベースのリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（商標））法を利用するハイスループット定量的メチル化アッセイである（Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999）。要するに、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）プロセスはゲノムＤＮＡの混合試料から始め、これは、標準的な手法に従って、重亜硫酸ナトリウム反応中にメチル化依存的な配列差異がある混合プールに変換される（重亜硫酸プロセスによって、非メチル化シトシン残基がウラシルに変換される）。それから、蛍光ベースのＰＣＲを「偏向（biased：バイアス）」（既知のＣｐＧジヌクレオチドと重複するＰＣＲプライマーによる）反応中に行う。配列識別（discrimination）は、増幅プロセスのレベルと蛍光検出プロセスのレベルとの両方で行うことができる。
【００７６】
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイは、ゲノムＤＮＡ試料におけるメチル化パターンに関する定量的検査として使用してもよく、配列識別はプローブハイブリダイゼーションのレベルで起こる。この定量的なバージョンでは、ＰＣＲ反応によって、特定の推定メチル化部位と重複する蛍光プローブの存在下でメチル化特異的な増幅が与えられる。プライマーもプローブも全くＣｐＧジヌクレオチドに重ならない反応によって、ＤＮＡの導入量に対する不偏制御が与えられる。代替的に、既知のメチル化部位を「カバー」しない対照オリゴヌクレオチド（ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）法及びＭＳＰ法の蛍光ベースのバージョン）、又は潜在的なメチル化部位をカバーするオリゴヌクレオチドのいずれかで偏向ＰＣＲプールをプローブ化することによって、ゲノムメチル化に関する定性的検査を行う。
【００７７】
例えば「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）等の任意の好適なプローブを使用することによって、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）プロセスを行うことができる。例えば、二本鎖ゲノムＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムで処理し、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを使用して、例えばＭＳＰプライマー及び／又はＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌブロッカーオリゴヌクレオチド及びＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブで、２組のＰＣＲ反応の１つを行う。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、蛍光「レポータ」及び「クエンサー（quencher：消光）」分子で二重標識し、このプローブは、フォワードプライマー又はリバースプライマーよりも約１０℃高い温度でＰＣＲサイクル中に溶融するように、比較的ＧＣ含量が高い領域に特異的になるように設計する。これによって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブをＰＣＲアニーリング／伸長工程中、十分なハイブリダイズ状態に維持することが可能になる。Ｔａｑポリメラーゼが、ＰＣＲ中に新規の鎖を酵素的に合成するので、最終的には、アニーリングしたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに達する。それから、Ｔａｑポリメラーゼ５'→３'エンドヌクレアーゼ活性によって、リアルタイム蛍光検出システムを使用して、現時点で消光していないシグナルを定量的に検出するために、蛍光レポータ分子を放出するように消化することによって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが置き換わる。
【００７８】
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）解析に典型的な試薬（例えば典型的なＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）ベースキットで見出され得るような）には、これらに限定されないが、特定遺伝子（又は重亜硫酸処理ＤＮＡ配列若しくはＣｐＧアイランド）に関するＰＣＲプライマー、ＴａｑＭａｎ（登録商標）又はＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）プローブ、最適化したＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド、並びにＴａｑポリメラーゼが含まれ得る。
【００７９】
ＱＭ（商標）（定量的メチル化）アッセイは、ゲノムＤＮＡ試料におけるメチル化パターンに関する代替的な定量的検査であり、配列識別はプローブハイブリダイゼーションのレベルで起こる。この定量的なバージョンでは、ＰＣＲ反応によって、特定の推定メチル化部位と重複する蛍光プローブの存在下で不偏増幅が与えられる。プライマーもプローブも全くＣｐＧジヌクレオチドに重ならない反応によって、ＤＮＡの導入量に対する不偏制御が与えられる。代替的に、既知のメチル化部位を「カバー」しない対照オリゴヌクレオチド（ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）法及びＭＳＰ法の蛍光ベースのバージョン）、又は潜在的なメチル化部位をカバーするオリゴヌクレオチドのいずれかで偏向ＰＣＲプールをプローブ化することによって、ゲノムメチル化に関する定性的検査を行う。
【００８０】
増幅プロセスにおいて例えば「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）等の任意の好適なプローブを使用することによって、ＱＭ（商標）プロセスを行うことができる。例えば、二本鎖ゲノムＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムで処理し、不偏プライマー及びＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに曝す。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、蛍光「レポータ」及び「クエンサー」分子で二重標識し、このプローブは、フォワードプライマー又はリバースプライマーよりも約１０℃高い温度でＰＣＲサイクル中に溶融するように、比較的ＧＣ含量が高い領域に特異的になるように設計する。これによって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブをＰＣＲアニーリング／伸長工程中、十分なハイブリダイズ状態に維持することが可能になる。Ｔａｑポリメラーゼが、ＰＣＲ中に新規の鎖を酵素的に合成するので、最終的には、アニーリングしたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに達する。それから、Ｔａｑポリメラーゼ５'→３'エンドヌクレアーゼ活性によって、リアルタイム蛍光検出システムを使用して、現時点で消光していないシグナルを定量的に検出するために、蛍光レポータ分子を放出するように消化することによって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが置き換わる。
【００８１】
ＱＭ（商標）解析に典型的な試薬（例えば典型的なＱＭ（商標）ベースキットで見出され得るような）には、これらに限定されないが、特定遺伝子（又は重亜硫酸処理ＤＮＡ配列若しくはＣｐＧアイランド）に関するＰＣＲプライマー、ＴａｑＭａｎ（登録商標）又はＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）プローブ、最適化したＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド、並びにＴａｑポリメラーゼが含まれ得る。
【００８２】
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ。  Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ（商標）法は、ＤＮＡの重亜硫酸処理に基づき、特定のＣｐＧ部位でのメチル化差異を評価した後に、単一ヌクレオチドプライマー伸長を行う、定量的方法である（Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997）。要するに、ゲノムＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムと反応させ、非メチル化シトシンをウラシルに変換させるが、５−メチルシトシンは変わらない。それから、重亜硫酸変換したＤＮＡに特異的なＰＣＲプライマーを使用して、所望の標的配列の増幅を行い、得られた産物を、対象となるＣｐＧ部位（複数可）のメチル化解析のための鋳型として単離及び使用する。少量のＤＮＡ（例えば顕微解剖した病理切片）を解析することができ、ＣｐＧ部位のメチル化状況を決定するのに、制限酵素の利用を回避する。
【００８３】
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ（商標）解析に典型的な試薬（例えば典型的なＭｓ−ＳＮｕＰＥ（商標）ベースキットで見出され得るような）には、これらに限定されないが、特定遺伝子（又は重亜硫酸処理ＤＮＡ配列若しくはＣｐＧアイランド）に関するＰＣＲプライマー、最適化したＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド、ゲル抽出キット、陽性対照プライマー、特定遺伝子に対するＭｓ−ＳＮｕＰＥ（商標）プライマー、（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ反応のための）反応バッファー並びに標識ヌクレオチドが含まれ得る。さらに、重亜硫酸変換試薬には、ＤＮＡ変性バッファー、スルホン化バッファー、ＤＮＡ回収試薬又はキット（例えば析出カラム、限外濾過カラム、アフィニティカラム）、脱スルホン化バッファー、及びＤＮＡ回収成分が含まれ得る。
【００８４】
配列番号１〜配列番号７に記載のゲノム配列（複数可）及び配列番号８〜配列番号３５に記載のその非天然処理変異型には、細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）の検出に新規の有用性があることを求めた。この有用性は、本明細書内、特に実施例で記載の特定のアッセイで例示されている。
【００８５】
Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）法（概して欧州特許出願公開９８１２７６８．１号明細書に記載される）を、欧州特許公開第１６５４３８８号明細書内で詳細に記載されるように、ＣｐＧメチル化解析に適合させた。
【００８６】
一実施形態において、本発明の方法は、ｉ）ＯＮＥＣＵＴ１、ＦＯＸＬ−２及びＴＦＡＰ２Ｅから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列の発現を決定する工程と、ｉｉ）被験者が細胞増殖性障害を患う危険性若しくは危険性の増大の有無を決定する工程、又は細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）を検出する工程とを含む。肺腺癌、大細胞肺癌、肺扁平上皮癌及び小細胞肺癌から成る群から選択される肺癌の検出が好ましい。
【００８７】
本発明の方法は、それから転写したＲＮＡ又は上記ＲＮＡから翻訳したポリペプチド若しくはタンパク質の発現解析のいずれか、好ましくはｍＲＮＡ発現解析又はポリペプチド発現解析によって可能になり得る。しかしながら、本発明の最も好ましい実施形態では、細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）の検出は、ＦＯＸＬ−２、ＯＮＥＣＵＴ１、ＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列のメチル化状況又はメチル化レベルの解析によって可能になる。
【００８８】
したがって、本発明は、被験者においてＯＮＥＣＵＴ１、ＦＯＸＬ−２及びＴＦＡＰ２Ｅから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列の発現の検出、及び該検出から被験者が細胞増殖性障害を患う危険性若しくは危険性の増大の有無を決定すること、又は上記被験者における細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）の検出に関する定量的且つ定性的な診断アッセイ及び方法も提供する。細胞増殖性障害が肺癌であるのが特に好ましく、肺腺癌、大細胞肺癌、肺扁平上皮癌及び小細胞肺癌から成る群から選択されるのが特に好ましい。
【００８９】
ＯＮＥＣＵＴ１、ＦＯＸＬ−２及びＴＦＡＰ２Ｅから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列から転写したｍＲＮＡの異常な発現は、被験者において細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）の存在に関連する。細胞増殖性障害が肺癌、好ましくは肺腺癌、大細胞肺癌、肺扁平上皮癌及び小細胞肺癌から成る群から選択される肺癌であるのが特に好ましい。
【００９０】
本発明によれば、高メチル化及び／又は低発現は、細胞増殖性障害、特に表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）の存在に関連する。
【００９１】
遺伝子又はゲノム配列をコードするｍＲＮＡの存在を検出するために、患者から試料を得る。試料は、腫瘍の細胞性物質を含む任意の好適な試料であり得る。好適な試料型としては、細胞若しくは細胞株、組織断片、生検、パラフィン包埋組織、体液、射精液、尿、血漿、血清、全血、単離血球、唾液及び気管支鏡検査（気管支洗浄、気管支肺胞洗浄、気管支擦過、気管支掻爬を含むが、これらに限定されない）で得られる生体物質並びにこれらの全ての可能な組合せが挙げられる。より好ましくは、試料型は、血漿、唾液及び気管支鏡検査（気管支洗浄、気管支肺胞洗浄、気管支擦過及び気管支掻爬を含むが、これらに限定されない）で得られる生体物質並びにこれらの全ての可能な組合せから成る群から選択される。
【００９２】
試料を処理して、そこに含有されるＲＮＡを抽出することができる。それから、試料から得られる核酸を解析する。遺伝子発現の絶対レベル及び相対レベルを決定する多くの技法が最先端技術で知られており、本発明に使用するのに適した一般的に使用される技法としては、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えばＦＩＳＨ）、ノーザン解析、ＲＮａｓｅ保護アッセイ（ＲＰＡ）、マイクロアレイ及びＰＣＲベースの技法（定量的ＰＣＲ及び示差表示ＰＣＲ又は任意の他の核酸検出法等）が挙げられる。
【００９３】
逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）の使用が特に好ましい。ＲＴ−ＰＣＲの方法は当該技術分野で既知である（例えば、Watson and Fleming（上記）を参照されたい）。
【００９４】
ＲＴ−ＰＣＲ法は、以下のように行うことができる。例えば標準的なイソチオシアネートグアニジウム法によって総細胞ＲＮＡを単離し、総ＲＮＡを逆転写する。逆転写法は、逆転写酵素及び３'末端オリゴヌクレオチドｄＴプライマー及び／又はランダム六量体プライマーを使用したＲＮＡ鋳型上でのＤＮＡ合成を伴う。それから、このようにして産生したｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅する（Belyavsky et al, Nucl Acid Res 17:2919-2932, 1989、Krug and Berger, Methods in Enzymology, Academic Press, N.Y., Vol.152, pp. 316-325, 1987、参照により援用される）。ＰＣＲ産物をハイブリダイゼーションプローブ（例えばＴａｑＭａｎ、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ及びＳｃｏｒｐｉｏｎ）又はＳＹＢＲグリーンで検出する、ＲＴ−ＰＣＲの「リアルタイム」変法がさらに好ましい。それから、検量線を参照するか、又はＣｔ値と較正基準の値とを比較することによって、プローブ又はＳＹＢＲグリーンから検出されるシグナルを定量化する。結果を正規化するのには、ハウスキーピング遺伝子解析が使用されることが多い。
【００９５】
ノーザンブロット解析において、総ｍＲＮＡ又はポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを変性アガロースゲル上に泳動し、乾燥ゲル自体における又は膜上の標識プローブに対するハイブリダイゼーションによって検出する。得られたシグナルは、ＲＮＡ集団において標的ＲＮＡの量に比例する。
【００９６】
２つ以上の細胞集団又は組織からのシグナルを比較することによって、遺伝子発現レベルの相対的差異が明らかになる。シグナルと、標的ＲＮＡに対応する既知の量のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写産物を使用して作成した検量線とを比較することによって、絶対的定量化を行うことができる。発現レベルが条件に関係なく相対的に一定のままであると予測される遺伝子である、ハウスキーピング遺伝子の解析は、結果を正規化し、ＲＮＡの膜への不均衡な移動、又はゲル上のＲＮＡの不均衡な充填によって引き起こされるいかなる見掛けの差異も取り除くのに使用されることが多い。
【００９７】
ノーザン解析の第１工程は、対象となる細胞又は組織から純粋で無傷のＲＮＡを単離することである。ノーザンブロットは、サイズによってＲＮＡを識別するので、試料の完全性は、シグナルが単一バンドに局在化する程度に影響を与える。部分的に分解したＲＮＡ試料によって、シグナルが塗抹されるか、又は幾つかのバンドにわたって分散され、全体的に感度が失われ、データが誤って解釈される可能性がある。ノーザンブロット解析では、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びオリゴヌクレオチドプローブを使用することができ、これらのプローブは標識するのが好ましい（例えば放射線標識、質量標識又は蛍光標識）。プローブではない標的ＲＮＡのサイズによって、検出バンドのサイズが決定されるため、可変長のプローブを作製するランダムプライム化標識のような方法がプローブ合成に好適である。プローブの比活性によって、感度レベルが決定されるため、比活性が高いプローブを使用するのが好ましい。
【００９８】
ＲＮａｓｅ保護アッセイにおいて、ＲＮＡ標的及び規定長のＲＮＡプローブを溶液中でハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、一本鎖核酸に特異的なＲＮａｓｅでＲＮＡを消化し、任意のハイブリダイズしていない一本鎖の標的ＲＮＡ及びプローブを除去する。ＲＮａｓｅを不活性化し、例えば、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、ＲＮＡを分離する。無傷のＲＮＡプローブの量は、ＲＮＡ集団における標的ＲＮＡの量に比例する。ＲＰＡは、遺伝子発現の相対的及び絶対的定量化、並びにまたＲＮＡ構造（イントロン／エキソン境界及び転写開始部位等）のマッピングに使用することができる。ＲＮａｓｅ保護アッセイは、一般的に検出限界がより低いのでノーザンブロット解析よりも好ましい。
【００９９】
ＲＰＡに使用するアンチセンスＲＮＡプローブは、規定の終点を有するＤＮＡ鋳型のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって作製し、典型的に５０ヌクレオチド〜６００ヌクレオチドの範囲内である。標的ＲＮＡと相同ではない付加的配列を含むＲＮＡプローブの使用によって、保護断片を完全長プローブと識別することが可能になる。一本鎖ＲＮＡプローブを作製するのが容易であり、且つＲＮａｓｅによるＲＮＡ：ＲＮＡ二本鎖消化に再現性及び信頼性があるので（Ausubel et al. 2003）、典型的にＤＮＡプローブの代わりにＲＮＡプローブを使用し、比活性が高いプローブが特に好ましい。
【０１００】
マイクロアレイの使用が特に好ましい。マイクロアレイ解析プロセスは、２つの主要部に分けることができる。初めに、スライドガラス（又は他の固体支持体）上に既知の遺伝子配列を固定した後、スライドガラス（又は他の固相）上に固定した既知の遺伝子に対して、蛍光標識したｃＤＮＡ（検索する配列を含む）をハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーション後、蛍光マイクロアレイスキャナを使用して、アレイを精査する。異なる遺伝子の相対的蛍光強度を解析することは、遺伝子発現の差異の評価基準を与える。
【０１０１】
調製スライドガラス又は他の固体表面上に前合成したオリゴヌクレオチドを固定化することによって、ＤＮＡアレイを作製することができる。この場合、標準的なオリゴヌクレオチド合成法及び精製法を使用して、代表的な遺伝子配列を製造及び調製する。これらの合成遺伝子配列は、ＯＮＥＣＵＴ１、ＦＯＸＬ−２及びＴＦＡＰ２Ｅから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列のＲＮＡ転写産物（複数可）に相補的であり、２５ヌクレオチド〜７０ヌクレオチドの範囲内でより短い配列である傾向がある。代替的に固定化オリゴは、スライド表面上にｉｎ  ｓｉｔｕで化学合成することができる。ｉｎ  ｓｉｔｕオリゴヌクレオチド合成は、適切なヌクレオチドをマイクロアレイ上のスポットに逐次付加することを伴い、ヌクレオチドを受けていないスポットは、物理的マスク又は仮想マスクを使用して、各プロセス段階中で保護される。好ましくは、上記合成核酸は、ロックド（locked）核酸である。
【０１０２】
発現プロファイリングマイクロアレイの実験において、使用するＲＮＡ鋳型は、研究中の細胞又は組織の転写プロファイルの代表的なものである。初めに、比較する細胞集団又は組織からＲＮＡを単離する。それから逆転写反応を介して蛍光標識ｃＤＮＡを作製するために、各ＲＮＡ試料を鋳型として使用する。ｃＤＮＡの蛍光標識は、直接標識法又は間接標識法のいずれかで達成することができる。直接標識中、蛍光修飾ヌクレオチド（例えばＣｙ（登録商標）３−ｄＣＴＰ又はＣｙ（登録商標）５−ｄＣＴＰ）は、逆転写中にｃＤＮＡに直接組み込む。代替的に、間接標識は、ｃＤＮＡ合成中、アミノアリル修飾ヌクレオチドを組み込み、それから逆転写反応が完了した後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル色素と、アミノアリル修飾ｃＤＮＡとを結合することによって達成することができる。代替的に、プローブは、標識しなくてもよく、直接又は間接的に標識したリガンドとの特異的結合によって検出することもできる。リガンド（及びプローブ）を標識するのに適した標識及び方法は当該技術分野で既知であり、例えば既知の方法（例えばニックトランスレーション又はキナーゼ処理（kinasing））によって組み込まれ得る放射性標識が含まれる。他の好適な標識としては、ビオチン、蛍光基、化学発光基（例えばジオキセタン、特に誘発ジオキセタン）、酵素、抗体等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
様々な遺伝子の発現解析を行うために、様々なＲＮＡ試料から作製したｃＤＮＡをＣｙ（登録商標）３で標識する。得られた標識ｃＤＮＡを精製し、組み込まれなかったヌクレオチド、遊離色素及び残留ＲＮＡを除去する。精製後、標識ｃＤＮＡ試料をマイクロアレイとハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション中、及び洗浄手順中、多くの因子（温度、イオン強度、時間の長さ、ホルムアミド濃度を含む）によって、ハイブリダイゼーションの緊縮性を決定する。これらの因子は、例えばSambrook et al.（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., 1989）で概説される。ハイブリダイゼーション後、蛍光マイクロアレイスキャナを使用して、マイクロアレイを精査する。各スポットの蛍光強度は解析遺伝子の発現レベルを示し、明るいスポットは強く発現する遺伝子に対応し、暗いスポットは弱い発現を示す。
【０１０４】
画像を得たら、生データを解析する必要がある。初めに、各スポットの蛍光からバックグラウンド蛍光を差し引く必要がある。それから、データを制御配列（外から加えられた核酸（好ましくはＲＮＡ又はＤＮＡ）、又は任意の非特異的ハイブリダイゼーション、アレイセットアップにおけるアレイ不完全性又は変動性、ｃＤＮＡ標識、ハイブリダイゼーション又は洗浄の原因となるハウスキーピング遺伝子パネル等）に正規化する。データの正規化によって、複数のアレイ結果の比較が可能になる。
【０１０５】
本発明の別の態様は、本発明の方法に従って、被験者において細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌及びさらに好ましくは、肺腺癌、大細胞肺癌、肺扁平上皮癌、小細胞肺癌から成る群から選択される肺癌である）を診断するのに使用するキットであって、ＯＮＥＣＵＴ１、ＦＯＸＬ−２及びＴＦＡＰ２Ｅから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列の転写レベルを測定する手段を含む、キットに関する。好ましい実施形態では、転写レベルを測定する手段は、ストリンジェントな条件又は適度にストリンジェントな条件下で、ＦＯＸＬ−２、ＯＮＥＣＵＴ１、ＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列の転写産物とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む。最も好ましい実施形態では、ノーザンブロット解析、逆転写酵素ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、及びマイクロアレイの群から選択される技法によって転写レベルを決定する。本発明の別の実施形態ではキットは、患者の生体試料を得る手段をさらに含む。転写レベルを測定する手段及び患者の生体試料を収容するのに好適であるのが最も好ましいコンテナをさらに含み、最も好ましくはキット結果を利用及び解釈するための取扱説明書をさらに含むキットが好ましい。
【０１０６】
好ましい実施形態において、キットは、（ａ）ストリンジェントな条件又は適度にストリンジェントな条件下で、ＦＯＸＬ−２、ＯＮＥＣＵＴ１、ＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列の転写産物とハイブリダイズすることができる複数のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと、（ｂ）好ましくは、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド及び転写産物を含む患者の生体試料を収容するのが好適であるコンテナであって、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件又は適度にストリンジェントな条件下で転写産物とハイブリダイズすることができる、コンテナと、（ｃ）（ｂ）のハイブリダイゼーションを検出する手段と、任意で（ｄ）キット結果を利用及び解釈するための取扱説明書とを含む。
【０１０７】
キットは、別々のコンテナに入った状態で、ハイブリダイゼーションバッファー等の他の成分（オリゴヌクレオチドはプローブとして使用する）を含有してもよい。代替的に、標的領域を増幅するのにオリゴヌクレオチドを使用する場合、キットは、ポリメラーゼによって媒介されるプライマー伸長（ＰＣＲ等）のために最適化したポリメラーゼと反応バッファーとを別々のコンテナに入った状態で含有してもよい。上記ポリメラーゼは逆転写酵素であるのが好ましい。上記キットはＲＮａｓｅ試薬を含有するのがさらに好ましい。
【０１０８】
本発明は、患者から得られた試料において上記遺伝子配列によってコードされるポリペプチドの存在を検出する方法をさらに提供する。
【０１０９】
ＯＮＥＣＵＴ１、ＦＯＸＬ−２及びＴＦＡＰ２Ｅから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列によってコードされるポリペプチドの異常なレベルのポリペプチド発現は、細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）の存在に関連する。肺腺癌、大細胞肺癌、肺扁平上皮癌、小細胞肺癌から成る群から選択される肺癌が特に好ましい。
【０１１０】
本発明によれば、上記ポリペプチドの低発現は、細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）の存在に関連する。細胞増殖性障害が肺癌であること、並びに肺腺癌、大細胞肺癌、肺扁平上皮癌、及び小細胞肺癌から成る群から選択されることが特に好ましい。
【０１１１】
ポリペプチドを検出する当該技術分野で既知の任意の方法を使用することができる。このような方法としては、質量分析法（mass-spectrometry）、免疫拡散法、免疫電気泳動法、免疫化学法、バインダ−リガンドアッセイ、免疫組織化学技法、凝集及び補体アッセイ（例えばBasic and Clinical Immunology, Sites and Terr, eds., Appleton & Lange, Norwalk, Conn. pp 217-262, 1991（参照により援用される）を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。抗体をエピトープ（単数又は複数）と反応させること、及び標識ポリペプチド又はその誘導体を競争的に置き換えることを含むバインダ−リガンドイムノアッセイ法が好ましい。
【０１１２】
本発明の或る特定の実施形態は、ＯＮＥＣＵＴ１、ＦＯＸＬ−２及びＴＦＡＰ２Ｅから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列によってコードされるポリペプチド（複数可）に特異的な抗体の使用を含む。
【０１１３】
このような抗体は、細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害に、及び最も好ましくは肺癌の診断に有用である。肺腺癌、大細胞肺癌、肺扁平上皮癌、小細胞肺癌から成る群から選択される肺癌が特に好ましい。或る特定の実施形態では、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の産生は、抗原としてＯＮＥＣＵＴ１、ＦＯＸＬ−２及びＴＦＡＰ２Ｅから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列のポリペプチドによってコードされるエピトープの使用によって誘導することができる。そのような抗体はさらに、細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害に関するマーカー、及び最も好ましくは肺癌の診断用のマーカーとして発現ポリペプチドを検出するのに使用してもよい。肺腺癌、大細胞肺癌、肺扁平上皮癌、小細胞肺癌から成る群から選択される肺癌が特に好ましい。存在するこのようなポリペプチドレベルは従来方法によって定量化し得る。抗体−ポリペプチド結合は、当該技術分野で既知の様々な手段（蛍光リガンド又は放射性リガンドによる標識等）によって検出及び定量化し得る。本発明は、上述の手順を行うためのキットをさらに含み、このようなキットは、研究するポリペプチドに特異的な抗体を含有する。
【０１１４】
多くの競合ポリペプチド結合イムノアッセイ及び非競合ポリペプチド結合イムノアッセイが、当該技術分野で既知である。このようなアッセイで利用する抗体は、例えば凝集検査で使用される場合、標識されず、又は多種多様なアッセイ法を使用する場合は標識され得る。使用することができる標識としては、放射性核種、酵素、蛍光因子（fluorescers）、化学発光因子（chemiluminescers）、酵素基質又は補因子、酵素阻害剤、粒子、色素等が挙げられる。好ましいアッセイとしては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ、例えば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光イムノアッセイ等が挙げられるが、これらに限定されない。イムノアッセイに使用するために、当該技術分野で既知の多くの方法のいずれかによってポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体又はそのエピトープを作製することができる。
【０１１５】
この方法の代替的な実施形態において、タンパク質をウェスタンブロット解析で検出してもよい。上記解析は、当該技術分野で標準的なものであり、簡潔に電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によってタンパク質を分離する。それから、分離タンパク質を好適な膜（又は紙）、例えばニトロセルロースに移し、電気泳動によって得られる空間的分離を維持する。その後、膜上で粘性の残る場所と結合させるために、膜を遮断剤とインキュベートし、一般的に使用される遮断剤にはジェネリックタンパク質（例えば乳タンパク質）が含まれる。それから、対象となるタンパク質に特異的な抗体を添加し、上記抗体は、例えば色素又は酵素的手段（例えばアルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼ）によって検出可能に標識する。その後、膜上の抗体位置を検出する。
【０１１６】
この方法の代替的な実施形態において、タンパク質を免疫組織化学法（試料におけるプローブ特異的な抗原に対する抗体を使用すること）によって検出してもよい。上記解析は、当該技術分野で標準的なものであり、組織における抗原の検出が免疫組織化学法として知られている一方で、培養細胞における検出は一般的に、免疫細胞化学法と呼ばれている。簡潔に一次抗体は、その特異的な抗原と結合することで検出する。それから、抗体−抗原複合体は、酵素結合した二次抗体によって結合する。必要となる基質及び色原体の存在下では、抗体−抗原結合部位での発色沈殿物によって、結合酵素を検出する。様々な試料型、抗原−抗体親和性、抗体型、及び検出増大法が存在する。したがって、免疫組織化学的検出又は免疫細胞化学的検出に最適な条件は、各々の場合で当業者が決定しなければいけない。
【０１１７】
ポリペプチドに対する抗体を調製するアプローチの１つは、アミノ酸配列を化学的に合成し、それを適切な動物（通常ウサギ又はネズミ）に注射する、ポリペプチドの全て又は一部のアミノ酸配列の選択及び調製である（Milstein and Kohler Nature 256:495-497, 1975、Gulfre and Milstein, Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques 73:1-46, Langone and Banatis eds., Academic Press, 1981、その全体が参照により援用される）。ポリペプチド又はそのエピトープを調製する方法としては、化学合成、組み換えＤＮＡ技法、又は生体試料からの単離が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
この方法の最終工程では、患者の診断を決定し、（ｍＲＮＡ又はポリペプチドの）低発現は、細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）の存在の指標となる。好ましくは肺腺癌、大細胞肺癌、肺扁平上皮癌及び小細胞肺癌から成る群から選択される肺癌が特に好ましい。用語「低発現」は、平均、中央値又は最適化した閾値から成る群から選択され得る所定のカットオフ値よりも低い検出レベルでの発現を意味するものとする。用語「過剰発現」は、平均、中央値又は最適化した閾値から成る群から選択され得る所定のカットオフ値よりも高い検出レベルでの発現を意味するものとする。
【０１１９】
本発明の別の態様は、本発明の方法に従って、被験者において細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）を診断するのに使用するキットであって、ＯＮＥＣＵＴ１、ＦＯＸＬ−２及びＴＦＡＰ２Ｅから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列のポリペプチドを検出する手段を含む、キットを提供する。ポリペプチドを検出する手段は、抗体、抗体誘導体、又は抗体断片を含むのが好ましい。標識抗体を利用するウェスタンブロッティングによって、ポリペプチドを検出するのが最も好ましい。本発明の別の実施形態ではキットは、患者の生体試料を得る手段をさらに含む。患者の生体試料においてポリペプチドを検出する手段を収容するのに適したコンテナをさらに含み、最も好ましくはキット結果を利用及び解釈するための取扱説明書をさらに含むキットが好ましい。好ましい実施形態ではキットは、（ａ）ＯＮＥＣＵＴ１、ＦＯＸＬ−２及びＴＦＡＰ２Ｅから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列のポリペプチドを検出する手段と、（ｂ）上記手段及びポリペプチドを含む患者の生体試料を収容するのに適したコンテナであって、この手段は、ポリペプチドと複合体を形成することができる、コンテナと、（ｃ）（ｂ）の複合体を検出する手段と、任意で（ｄ）キット結果を利用及び解釈するための取扱説明書とを含む。
【０１２０】
キットは、別々のコンテナに入った状態で、遮断、洗浄又はコーティングに適したバッファー又は溶液等の他の成分を含有してもよい。
【０１２１】
本発明の特定の実施形態は、細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）を患う危険性の正確な検出、特徴付け、評価を可能にする、ＦＯＸＬ−２、ＯＮＥＣＵＴ１、ＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列内のメチル化状況、メチル化のレベル及び／又はパターンの解析の新規の用途を提供する。この肺癌は、肺腺癌、大細胞肺癌、肺扁平上皮癌及び小細胞肺癌から成る群から選択されるのが特に好ましい。細胞増殖性障害、特に肺癌の早期検出は、疾患進行に直接関係し、これによって開示の方法により、医師及び患者がより良好且つ多くの情報を得た上で治療法を決定することが可能となる。したがって、早期の疾患の検出を可能にする本発明の方法をスクリーニングツールとして又は最初の診断がはっきりしないときはいつでもさらなる診断検査として行うのが好ましい。
【０１２２】
本発明の方法内で使用される好ましい試料型は、唾液又は肺で得られる生体試料、好ましくは気管流体、気管支洗浄液及び気管支肺胞洗浄液である。この試料型は、慣行で現在使用され、また標準的なケアの一部として肺疾患の確立された従来の診断法（例えば組織学的手法及び／又は細胞学的手法）により得ることができる試料であるという利点がある。利用可能な試料を使用することの利点は、同じ試料からさらに情報を得ることができることである。第２の利点は、これらの試料を非侵襲的に得ることができ（例えば唾液）、又は被験者若しくは患者に対する危険性が低いことである。
【０１２３】
気管支系から回収される試料を使用することの別の重要な利点は、肺癌の特異的診断又は肺癌のリスク評価に使用することができるマーカーが、癌型に関して余り特異的ではない可能性があるということである。同じマーカーで他の癌型を検出しても（他の試料型、例えば血液で検査しても）問題はない。
【０１２４】
この方法の最も好ましい実施形態において、被験者が細胞増殖性障害を患う危険性若しくは危険性の増大の有無、又は細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌、特に肺腺癌、大細胞肺癌、肺扁平上皮癌及び小細胞肺癌から成る群から選択される肺癌）の検出を、ＦＯＸＬ−２、ＯＮＥＣＵＴ１、ＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列の１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状況又はレベルの解析によって決定する。
【０１２５】
一実施形態において、上記本発明の方法は、ｉ）被験者から得られた（好ましくは体液から単離した）ゲノムＤＮＡを、ＦＯＸＬ−２、ＯＮＥＣＵＴ１、ＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列内でメチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを識別する、少なくとも１つの試薬又は試薬群に接触させる工程と、ｉｉ）細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）を検出する工程とを含む。肺腺癌、大細胞肺癌、肺扁平上皮癌及び小細胞肺癌から成る群から選択される肺癌が特に好ましい。
【０１２６】
ＦＯＸＬ−２、ＯＮＥＣＵＴ１、ＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列の上記１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドが、配列番号１〜配列番号７に規定されるその各ゲノム標的配列及びそれらの相補体内に含まれることが好ましい。本発明は、シトシンのメチル化を解析することによって、被験者内でＦＯＸＬ−２、ＯＮＥＣＵＴ１、ＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列、及び／又は配列番号１〜配列番号７に記載のゲノム配列の遺伝的パラメータ及び／又はエピジェネティックパラメータを確かめる方法をさらに提供する。上記方法は、上記被験者から得られた生体試料において配列番号１〜配列番号７を含む核酸を、標的核酸内でメチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを識別する、少なくとも１つの試薬又は試薬群に接触させることを含む。
【０１２７】
好ましい実施形態において、上記方法は以下の工程を含む：第１の工程では、解析する組織試料を得る。供給源は、細胞若しくは細胞株、組織断片、生検、パラフィン包埋組織、体液、射精液、尿、血漿、血清、全血、単離血球、唾液、肺で得られる生体物質、好ましくは気管支鏡検査（気管支洗浄、気管支肺胞洗浄、気管支擦過、気管支掻爬を含むが、これらに限定されない）で得られる生体物質及びこれらのすべての可能な組合せ等の任意の好適な供給源であり得る。より好ましくは、試料型は、血漿、唾液、肺で得られる生体物質、好ましくは気管支鏡検査（気管支洗浄、気管支肺胞洗浄、気管支擦過及び気管支掻爬を含むが、これらに限定されない）で得られる生体物質並びにこれらの全ての可能な組合せから成る群から選択される。試料型が唾液及び（これまでに記載されるような）肺で得られる生体試料から成る群から選択され、最も好ましくはこの生体物質が、気管支鏡検査（気管支洗浄、気管支肺胞洗浄、気管支擦過及び気管支掻爬を含むが、これらに限定されない）で得られることが本発明の方法の好ましい実施形態である。
【０１２８】
その後、試料からゲノムＤＮＡを単離する。ゲノムＤＮＡは、市販のキットの使用を含む、当該技術分野で標準的な任意の手段によって単離してもよい。要するに、対象となるＤＮＡが、細胞膜によってその中に封入され、生体試料は、酵素的手段、化学的手段又は機械的手段によって破壊及び溶解する必要がある。それから、例えばプロテイナーゼＫによる消化で、ＤＮＡ溶液からタンパク質及び他の汚染物質を除去してもよい。その後、溶液からゲノムＤＮＡを回収する。塩析、有機抽出、又はＤＮＡと固相支持体との結合を含む様々な方法によって、これを行ってもよい。方法の選択は、時間、費用及び要求されるＤＮＡ量を含む幾つかの因子の影響を受ける。
【０１２９】
試料ＤＮＡは膜中に封入されず（例えば血液試料由来の循環ＤＮＡ）、ＤＮＡの単離及び／又は精製のために当該技術分野で標準的な方法を利用してもよい。このような方法としては、タンパク質変性剤（例えばカオトロピック塩、例えば塩酸グアニジン又は尿素）、又は界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、臭化シアン）の使用が挙げられる。代替的な方法としては、エタノール析出又はプロパノール析出、特に遠心分離による減圧濃縮が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、濾過装置（例えば限外濾過、シリカ表面又はシリカ膜、磁性粒子、ポリスチロール粒子、ポリスチロール表面、正に荷電した表面、及び正に荷電した膜、荷電膜、荷電表面、荷電スイッチ膜（charged switch membranes）、荷電切り替え表面（charged switched surfaces））等の装置を使用してもよい。
【０１３０】
核酸を抽出したら、ゲノム二本鎖ＤＮＡを解析に使用する。
【０１３１】
この方法の第２の工程において、５'位で非メチル化したシトシン塩基を、ウラシル、チミン、又はハイブリダイゼーション挙動に関してシトシンと異なる別の塩基に変換するように、ゲノムＤＮＡ試料を処理する。これは、本明細書中では「前処理」又は「処理」と理解される。
【０１３２】
この工程の明確な順番は、重亜硫酸処理の前のＤＮＡ単離工程を省略することが可能であり、場合によっては有益でもあるため、本発明の方法の唯一の実施形態である。この場合、例えば試料ＤＮＡが膜中に封入されない場合、ＤＮＡを単離及び／又は精製する前に重亜硫酸処理（以下の詳細を参照されたい）を行う。そのため重亜硫酸処理は、粗試料、即ち生体物質自体で行い得る。場合によっては、界面活性剤、例えばＳＤＳの存在が必要となり得る。
【０１３３】
重亜硫酸試薬による処理によってこれを達成するのが好ましい。用語「重亜硫酸試薬」は、本明細書に開示されるようにメチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列と非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列とを識別するのに有用である、重亜硫酸塩、二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、又はこれらの組合せを含む試薬を表す。上記治療方法は、当該技術分野で既知である（例えば国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５号明細書、その全体が参照により援用される）。これらに限定されないが、ｎ−アルキレングリコール、特にジエチレングリコールジメチルエーテル（ＤＭＥ）等の変性溶媒の存在下、又はジオキサン若しくはジオキサン誘導体の存在下で重亜硫酸処理を行うのが好ましい。好ましい実施形態では、変性溶媒は、１％〜３５％（ｖ／ｖ）の濃度で使用する。これらに限定されないが、クロマン誘導体（例えば、６−ヒドロキシ−２，５，７，８，−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、又はトリヒドロキシ安息香酸（trihydroxybenzoe acid）及びその誘導体（例えば没食子酸）等のスカベンジャの存在下で重亜硫酸反応を行うのも好ましい（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５号明細書（その全体が参照により援用される）を参照されたい）。重亜硫酸変換は、３０℃〜７０℃の反応温度で行うのが好ましく、反応中、短時間で８５℃を超えるまで温度が増大する（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５号明細書（その全体が参照により援用される）を参照されたい）。定量化の前に重亜硫酸処理ＤＮＡを精製するのが好ましい。これに限定されないが、限外濾過等、当該技術分野で既知の任意の手段によって、これを行ってもよく、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（商標）カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）製）によって行うのが好ましい。改良した製造業者のプロトコルに従って精製を行う（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５号明細書（その全体が参照により援用される）を参照されたい）。
【０１３４】
この方法の第３の工程において、本発明によるプライマーオリゴヌクレオチド組と、増幅酵素とを使用して、処理ＤＮＡ断片を増幅する。１つの同じ反応容器で、幾つかのＤＮＡセグメントの増幅を同時に行うことができる。典型的に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、増幅を行う。好ましくは、上記増幅産物は、１００塩基対長〜２０００塩基対長である。プライマーオリゴヌクレオチド組は、それぞれの配列が、配列番号８〜配列番号３５の内の１つの塩基配列及びこれに相補的な配列の少なくとも１６塩基対長のセグメントと逆相補的、同一又はストリンジェントな条件又は高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む。
【０１３５】
この方法の代替的な実施形態において、ＦＯＸＬ−２、ＯＮＥＣＵＴ１、ＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列内、及び好ましくは配列番号１〜配列番号７の核酸配列内の予め選択されたＣｐＧ位置のメチル化の状況又はレベルは、メチル化特異的なプライマーオリゴヌクレオチドの使用によって検出し得る。この技法（ＭＳＰ）は、Hermanへの米国特許第６，２６５，１７１号明細書に記載されている。重亜硫酸処理ＤＮＡの増幅のためのメチル化状況に特異的なプライマーの使用によって、メチル化核酸と非メチル化核酸との識別が可能になる。ＭＳＰプライマー対は、重亜硫酸処理ＣｐＧジヌクレオチドとハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを含有する。したがって、上記プライマー配列は、ＣｐＧジヌクレオチドを少なくとも１つ含む。非メチル化ＤＮＡに特異的なＭＳＰプライマーは、ＣｐＧにおけるＣ位の位置で「Ｔ」を含有する。好ましくはしたがって、上記プライマーの塩基配列は、配列番号８〜配列番号３５の内の１つによる処理核酸配列及びこれに相補的な配列とハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチド長の配列を含むことが要求され、上記オリゴマーの塩基配列は、ＣｐＧジヌクレオチドを少なくとも１つ含む。この方法のさらなる好ましい実施形態は、ブロッカーオリゴヌクレオチド（ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）アッセイ）の使用を含む。このようなブロッカーオリゴヌクレオチドの使用は、Yu et al., BioTechniques 23:714-720, 1997に記載されている。遮断プローブオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲプライマーと同時に重亜硫酸処理核酸とハイブリダイズする。遮断プローブに相補的な配列が存在する場合に核酸の増幅が抑制されるように、核酸のＰＣＲ増幅は遮断プローブの５'位で終結する。プローブは、メチル化状況に特異的に重亜硫酸処理核酸とハイブリダイズするように設計し得る。例えば非メチル化核酸集団内のメチル化核酸の検出のために、メチル化核酸の増幅抑制が望まれる場合、「ＣｐＧ」に対して対象となる位置で「ＣｐＡ」又は「ＴｐＡ」を含む遮断プローブを使用することによって、対象となる位置で非メチル化する核酸の増幅抑制を起こす。
【０１３６】
ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲ法のために、ポリメラーゼ媒介性増幅の効果的な破壊には、ブロッカーオリゴヌクレオチドがポリメラーゼでは伸長しないことが要求される。好ましくは、３'−デオキシオリゴヌクレオチド、又は「遊離」ヒドロキシル基以外で３'位で誘導体化したオリゴヌクレオチドであるブロッカーを使用することによって、これを達成する。例えば、３'−Ｏ−アセチルオリゴヌクレオチドは、好ましいブロッカー分子群の代表的なものである。
【０１３７】
さらに、ブロッカーオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ媒介性分解を防ぐ必要がある。好ましくは、このような防止には、５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を失ったポリメラーゼの使用、又は例えばブロッカー分子をヌクレアーゼ耐性にする、その５'末端（terminii）にチオエート架橋を有する修飾ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用のいずれかが含まれる。特定の適用には、このようなブロッカーの５'修飾は要求され得ない。例えば、ブロッカー結合部位及びプライマー結合部位が重複し、それによりプライマーが（例えば過剰なブロッカーと）結合するのを防ぐ場合、ブロッカーオリゴヌクレオチドの分解が実質的に防がれる。これは、ポリメラーゼがプライマーをブロッカーに向かって（５'−３'方向に）伸長させないため、通常ハイブリダイズするブロッカーオリゴヌクレオチドの分解をもたらすプロセスである。
【０１３８】
本発明のために、及び本明細書中で行われるように、特に好ましいブロッカー／ＰＣＲの実施形態には、ブロッカーオリゴヌクレオチドとしてのペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーの使用が含まれる。このようなＰＮＡブロッカーオリゴマーは、ポリメラーゼでは分解も伸長もしないので理想的に適している。
【０１３９】
好ましくはしたがって、上記ブロッカーオリゴヌクレオチドの塩基配列には、配列番号８〜配列番号３５の内の１つの処理核酸配列及びこれに相補的な配列とハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチド長の配列を含むことが要求され、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列が、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド、ＴｐＧジヌクレオチド又はＣｐＡジヌクレオチドを含む。
【０１４０】
増幅によって得られる断片は、直接又は間接的に検出可能な標識を保有し得る。蛍光標識、放射性核種、又は質量分析計で検出することができる典型的な質量を有する分離型分子断片の形態での標識が好ましい。上記標識が質量標識である場合、標識された増幅産物が、質量分析計でのより良好なディレクタビリディ（delectability：検出能）を可能にする、単一の正の正味電荷又は負の正味電荷を有することが好ましい。例えばマトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）によって、又は電子噴霧（electron spray）質量分析（ＥＳＩ）を使用して、検出を行い可視化し得る。
【０１４１】
マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は、生体分子の解析に非常に効果的な進歩である（Karas & Hillenkamp, Anal Chem., 60:2299-301, 1988）。検体は吸光マトリクスに包埋される。マトリクスは、短レーザーパルスで蒸発し、これにより検体分子を非断片化して気相に移す。マトリクス分子による衝突によって、検体をイオン化する。印加電圧が、フィールドフリー飛行管へとイオンを加速させる。これらの異なる質量により、イオンが異なる速度で加速する。小さいイオンは、大きいイオンよりも早く検出器に到達する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計は、ペプチド及びタンパク質の解析に十分適している。核酸の解析は幾らか難しくなる（Gut & Beck, Current Innovations and Future Trends, 1:147-57, 1995）。核酸解析に対する感度は、ペプチドに対する感度のおよそ１００分の１であり、断片の大きさが増大するにつれ不均衡に減少する。さらに、複合的に負に荷電した骨格を有する核酸に対しては、マトリクスを介したイオン化プロセスはほとんど有効ではない。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析では、マトリクスの選択は、極めて重要な役割を果たす。ペプチドの脱離に対して、非常に精細な結晶体を作製する非常に効果的なマトリクスが幾つか見出されている。現在、ＤＮＡに対して幾つかの反応性マトリクスが存在するが、ペプチドと核酸との感度の差異は低減されていない。しかし、ペプチドと類似になるようにＤＮＡを化学修飾することによって、この感度の差異を低減することができる。例えば、骨格の通常のリン酸塩をチオリン酸塩に置換したホスホロチオエート核酸は、単純なアルキル化化学反応を用いて電荷が中性のＤＮＡに変換させることができる（Gut & Beck, Nucleic Acids Res. 23: 1367-73, 1995）。荷電タグとこの修飾ＤＮＡとのカップリングによって、ペプチドで見出されるのと同じレベルまでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ感度が増大する。荷電タグ化のさらなる利点は、非修飾基質の検出を非常に困難なものにする不純物に対する解析の安定性の増大である。
【０１４２】
この方法の第４の工程において、処理前にＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状況を確かめるために、この方法の第３の工程中に得られた増幅産物を解析する。
【０１４３】
ＭＳＰ増幅によって増幅産物が得られた実施形態において、増幅産物の有無自体が、上記プライマーの塩基配列に従って、プライマーがカバーするＣｐＧ位置のメチル化状態の指標となる。
【０１４４】
標準的なＰＣＲ及びメチル化特異的ＰＣＲの両方によって得られた増幅産物は、これらに限定されないが、アレイ技法及びプローブベースの技法等の客観的（based-based）方法によって、並びにシークエンシング及び鋳型指向性伸長等の技法によってさらに解析してもよい。
【０１４５】
この方法の一実施形態において、工程３で合成された増幅産物を次に、アレイ又はオリゴヌクレオチド組、及び／又はＰＮＡプローブ組とハイブリダイズする。これに関して、ハイブリダイゼーションは以下のように行う：ハイブリダイゼーション中に使用されるプローブ組は、少なくとも２つのオリゴヌクレオチド又はＰＮＡ−オリゴマーから構成されるのが好ましく；プロセス中、増幅産物は、予め固相と結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするプローブとして有用であり；続いて、ハイブリダイズしなかった断片を除去し；上記オリゴヌクレオチドは、本発明の配列表で指定される塩基配列のセグメントと逆相補的又は同一である少なくとも９ヌクレオチド長の少なくとも１つの塩基配列を含有し；このセグメントは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド、ＴｐＧジヌクレオチド又はＣｐＡジヌクレオチドを含む。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズ部分は典型的に、少なくとも９ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長又は３５ヌクレオチド長である。しかし、より長い分子が本発明に有用であり、このため本発明の範囲内である。
【０１４６】
好ましい実施形態において、上記ジヌクレオチドがオリゴマーの中央部３分の１内にある。例えば、オリゴマーは、１つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、上記ジヌクレオチドは、１３−ｍｅｒの５'末端から５番目〜９番目のヌクレオチドであるのが好ましい。配列番号１〜配列番号７から成る群から選択される配列、及び配列番号８〜配列番号３５内の等価位置内の各ＣｐＧジヌクレオチドの解析に対して、１つのオリゴヌクレオチドが存在する。上記オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸形態でも存在し得る。その後、ハイブリダイズしなかった増幅産物を除去する。次いで、ハイブリダイズした増幅産物を検出する。これに関して、増幅産物に付着する標識は、オリゴヌクレオチド配列が位置する各固相位置で同定可能であるのが好ましい。
【０１４７】
この方法のまたさらなる実施形態において、ＣｐＧ位置のゲノムメチル化状況は、ＰＣＲ増幅プライマー（上記プライマーは、メチル化に特異的、又は標準的なものであり得る）と同時に重亜硫酸処理ＤＮＡとハイブリダイズする（上記で詳述された）オリゴヌクレオチドプローブで確かめることができる。
【０１４８】
この方法の特に好ましい実施形態は、二重標識蛍光オリゴヌクレオチドプローブ（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００配列検出システム（Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, California）を使用するＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲ）を利用した蛍光ベースのリアルタイム定量ＰＣＲの使用である（Heid et al., Genome Res. 6:986-994, 1996、米国特許第６，３３１，３９３号明細書も参照されたい）。ＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲ反応は、好ましい実施形態でフォワード増幅プライマーとリバース増幅プライマーとの間に位置する高ＣｐＧ配列とハイブリダイズするように設計した、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブと呼ばれる非伸長性検索オリゴヌクレオチドの使用を利用する。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、ＴａｑＭａｎ（商標）オリゴヌクレオチドのヌクレオチドに付着したリンカー部分（例えばホスホルアミダイト（phosphoramidites））と共有結合する蛍光「レポータ部分」と「クエンサー部分」とをさらに含む。重亜硫酸処理後の核酸内のメチル化解析のために、プローブが、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイとしても知られる米国特許第６，３３１，３９３号明細書（その全体が参照により援用される）で記載されるように、メチル化特異的であることが要求される。また、記載の本発明と共に使用するのに適したＴａｑＭａｎ（商標）検出法の変法には、二重プローブ技法（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（商標））又は蛍光増幅プライマー（Ｓｕｎｒｉｓｅ（商標）法）の使用が含まれる。これらの技法の両方は、重亜硫酸処理ＤＮＡとの使用、さらにＣｐＧジヌクレオチド内のメチル化解析に好適になるように適合し得る。
【０１４９】
この方法のさらに好ましい実施形態において、この方法の第４の工程には、鋳型指向性のオリゴヌクレオチド伸長（Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997に記載されるＭＳ−ＳＮｕＰＥ等）の使用が含まれる。この方法のまたさらなる実施形態において、この方法の第４の工程には、この方法の第３の工程で生成した増幅産物のシークエンシング及びその後の配列解析が含まれる（Sanger F., et al., Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467, 1977）。
【０１５０】
この方法の最も好ましい実施形態において、上記で概説された方法の最初の３つの工程に従ってゲノム核酸を単離及び処理する、即ち：
ａ）対象となるゲノムＤＮＡを有する生体試料を被験者から得ること、
ｂ）ゲノムＤＮＡを抽出、又はそうでなければ単離すること、
ｃ）ｂ）のゲノムＤＮＡ又はその断片を１つ又は複数の試薬で処理することであって、５位の非メチル化シトシン塩基を、ウラシル残基又はハイブリダイゼーション特性に関してシトシンと異なることが検出可能な別の塩基に変換する、処理すること、また
ｄ）ｃ）での処理後に、メチル化特異的に、即ちメチル化特異的プライマー又はメチル化特異的ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用することによって増幅を行い、さらに
ｅ）上記のように、リアルタイム検出プローブによって、増幅産物の検出を行う。
【０１５１】
好ましくは、上記のように、メチル化特異的プライマーによって、ｄ）のその後の増幅が行われ、上記メチル化特異的プライマーは、配列番号８〜配列番号３５の内の１つの処理核酸配列及びこれに相補的な配列とハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチド長の配列を含み、上記オリゴマーの塩基配列は、少なくとも１つ、しかし好ましくは２つ又は３つのＣｐＧジヌクレチドを含む。
【０１５２】
この方法の工程ｅ）、即ち配列番号１〜配列番号７の１つ又は複数のＣｐＧ位置のメチル化状況の指標となる特定の増幅産物の検出は、上記のようなリアルタイム検出法によって行われる。
【０１５３】
本発明のさらなる実施形態は、重亜硫酸変換を必要とせずに、ＦＯＸＬ−２、ＯＮＥＣＵＴ１、ＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２（好ましくは配列番号１〜配列番号７、及びその相補体）から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列のメチル化状況を解析する方法を提供する。メチル化感受性制限酵素試薬、又は標的領域内でメチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを識別するメチル化感受性制限酵素試薬を含む制限酵素試薬群をメチル化を決定するのに利用する方法、例えばこれに限定されないが、ＤＭＨ等が当該技術分野で既知である。
【０１５４】
このようなさらなる実施形態の第１の工程において、組織源又は細胞源からゲノムＤＮＡ試料を単離する。ゲノムＤＮＡは、市販のキットの使用を含む、当該技術分野で標準的な任意の手段によって単離してもよい。要するに、対象となるＤＮＡが、細胞膜によってその中に封入され、生体試料は、酵素的手段、化学的手段又は機械的手段によって破壊及び溶解する必要がある。次いで、例えばプロテイナーゼＫによる消化で、ＤＮＡ溶液からタンパク質及び他の汚染物質を除去してもよい。その後、溶液からゲノムＤＮＡを回収する。塩析、有機抽出、又はＤＮＡと固相支持体との結合を含む様々な方法によって、これを行ってもよい。方法の選択は、時間、費用及び要求されるＤＮＡ量を含む幾つかの因子の影響を受ける。新生物性物質又は潜在的に新生物性の物質を含む全ての臨床試料型は、本発明の方法に使用するのに適しており、好ましくは、細胞若しくは細胞株、組織断片、生検、パラフィン包埋組織、体液、射精液、尿、血漿、血清、全血、単離血球並びに唾液及び気管支鏡検査（気管支洗浄、気管支肺胞洗浄、気管支擦過、気管支掻爬を含むが、これらに限定されない）で得られる生体物質等の肺で得られる生体試料並びにこれらの組合せである。より好ましくは、試料型は、血漿、唾液及び気管支鏡検査（気管支洗浄、気管支肺胞洗浄、気管支擦過、気管支掻爬を含むが、これらに限定されない）で得られる生体物質並びにこれらの全ての可能な組合せから成る群から選択される。
【０１５５】
核酸を抽出したら、ゲノム二本鎖ＤＮＡを解析に使用する。
【０１５６】
好ましい実施形態において、ＤＮＡは、メチル化感受性制限酵素による処理の前に切断し得る。このような方法は、当該技術分野で既知であり、物理的手段及び酵素的手段の両方を含み得る。メチル化感受性ではない１つ又は複数の制限酵素の使用が特に好ましく、その認識部位は高ＡＴであり、ＣＧジヌクレオチドを含まない。このような酵素の使用によって、断片化ＤＮＡにおけるＣｐＧアイランド及び高ＣｐＧ領域の変換が可能になる。非メチル化特異的制限酵素は、ＭｓｅＩ、ＢｆａＩ、Ｃｓｐ６Ｉ、Ｔｒｕ１Ｉ、Ｔｖｕ１Ｉ、Ｔｒｕ９Ｉ、Ｔｖｕ９Ｉ、ＭａｅＩ及びＸｓｐＩから成る群から選択されるのが好ましい。２つ又は３つのこのような酵素の使用が特に好ましい。ＭｓｅＩ、ＢｆａＩ及びＣｓｐ６Ｉの組合せの使用が特に好ましい。
【０１５７】
それから、その後の酵素増幅を容易にするために、断片化ＤＮＡをアダプタオリゴヌクレオチドにライゲートしてもよい。平滑末端ＤＮＡ断片及び付着末端ＤＮＡ断片へのオリゴヌクレオチドのライゲーションは、当該技術分野で既知であり、（例えば仔ウシ又はエビのアルカリホスファターゼを使用した）末端の脱リン酸化手段、及びその後のｄＡＴＰの存在下でリガーゼ酵素（例えばＴ４  ＤＮＡリガーゼ）を使用したライゲーションによって行われる。アダプタオリゴヌクレオチドは典型的に、少なくとも１８塩基対長である。
【０１５８】
次いで、第３の工程において、１つ又は複数のメチル化感受性制限酵素で、ＤＮＡ（又はその断片）を消化する。制限部位でのＤＮＡの加水分解が、ＦＯＸＬ−２、ＯＮＥＣＵＴ１、ＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列の特定のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状況の情報を与えるように、消化が行われる。
【０１５９】
好ましくは、メチル化特異的制限酵素は、Ｂｓｉ  Ｅ１、Ｈｇａ  Ｉ  ＨｉｎＰ１、Ｈｐｙ９９Ｉ、Ａｖａ  Ｉ、Ｂｃｅ  ＡＩ、Ｂｓａ  ＨＩ、ＢｉｓＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｈＩ２３６Ｉ、ＡｃｃＩＩ、ＢｓｔＦＮＩ、ＭｃｒＢＣ、ＧｌａＩ、ＭｖｎＩ、ＨｐａＩＩ（ＨａｐＩＩ）、ＨｈａＩ、ＡｃｉＩ、ＳｍａＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＥａｇＩ及び２つ以上の上記酵素の組合せから成る群から選択される。制限酵素ＢｓｔＵＩ、ＨｐａＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ及びＨｉｎＰ１Ｉを含有する混合物が好ましい。
【０１６０】
任意ではあるが、好ましい実施形態である第４の工程において、制限断片を増幅する。ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、これを行うのが好ましく、上記増幅産物は、上述のように好適な検出可能な標識、即ちフルオロフォア標識、放射性核種及び質量標識を保有し得る。増幅酵素と、それぞれの場合で配列番号１〜配列番号７から成る群から選択される配列及びその相補体に相補的であるか、又は適度にストリンジェントな条件又はストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする少なくとも１６ヌクレオチド長の連続した配列を含む少なくとも２つのプライマーとによる増幅が特に好ましい。好ましくは、上記の連続した配列は、少なくとも１６ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長又は２５ヌクレオチド長である。代替的な実施形態では、上記プライマーは、断片と連結した任意のアダプタに相補的であり得る。
【０１６１】
第５の工程において、増幅産物を検出する。これらに限定されないが、例えばゲル電気泳動解析、ハイブリダイゼーション解析、ＰＣＲ産物内の検出可能なタグの組み込み、ＤＮＡアレイ解析、ＭＡＬＤＩ又はＥＳＩ解析等の当該技術分野で標準的な任意の手段によって検出が行われ得る。好ましくは、それぞれの場合で配列番号１〜配列番号７から成る群から選択される配列及びその相補体に相補的であるか、又は適度にストリンジェントな条件又はストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする少なくとも１６ヌクレオチド長の連続した配列を含む少なくとも１つの核酸又はペプチド核酸とのハイブリダイゼーションによって、上記検出が行われる。好ましくは、上記連続した配列は、少なくとも１６ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長又は２５ヌクレオチド長である。
【０１６２】
被験者試料から得られるゲノム核酸のメチル化状態又はメチル化レベルの決定の後に、配列番号１〜配列番号７の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態若しくはレベル、又はその平均、又は配列番号１〜配列番号７の複数のＣｐＧジヌクレオチド配列の平均メチル化状態を反映する値に基づき、被験者が細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）を患う危険性若しくは危険性の増大又はこのような細胞増殖性障害の存在を推測し、ここでメチル化は、細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）の存在に関連する。定量的手段によって上記メチル化を決定し、上記メチル化の存在を決定するためのカットオフ値は０であるのが好ましい（即ち、試料は任意のメチル化度を示し、解析されるＣｐＧ位置でメチル化状況を有すると決定される）。それにもかかわらず、当業者は、特に好ましい感度又は特異度のアッセイを与えるために、上記カットオフ値を調整することを望み得ると予測される。したがって、上記カットオフ値は増大してもよく（このようにして特異度を増大させる）、上記カットオフ値は、０％〜５％、５％〜１０％、１０％〜１５％、１５％〜２０％、２０％〜３０％及び３０％〜５０％から成る群から選択される範囲内にあり得る。カットオフ値は、１０％、１５％、２５％及び３０％が特に好ましい。
【０１６３】
ＦＯＸＬ−２、ＯＮＥＣＵＴ１、ＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列のメチル化及び／又は発現の決定の際に、細胞増殖性障害の有無、又は被験者が細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）を患う危険性の増大を決定し、ここで高メチル化及び／又は低発現が、細胞増殖性障害の存在、及び／又は被験者がこのような障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）を患う危険性の増大の存在を示し、低メチル化及び／又は過剰発現が、被験者内での細胞増殖性障害の非存在、及び／又は被験者がこのような障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）を患う危険性の増大の非存在を示す。上記増殖性障害が肺腺癌、大細胞肺癌、肺扁平上皮癌及び小細胞肺癌から成る群から選択される肺癌であるのが特に好ましい。
【０１６４】
危険性の増大は、同じ年齢群における同じ性別の集団の平均危険性よりも危険性が少なくとも２倍高いと理解される（ここで被験者は、解析する被験者よりも最大で年齢が５歳上又は５歳下でなければ同じ年齢群に属する）。
【０１６５】
さらなる改善点
開示された本発明は、ゲノムの配列番号１〜配列番号７に由来する処理核酸であって、この処理が、ゲノムＤＮＡ配列の少なくとも１つの非メチル化シトシン塩基を、ウラシル、又はハイブリダイゼーションに関してシトシンと検出可能に異なる検出可能な別の塩基に変換するのに適した、配列番号１〜配列番号７に由来する処理核酸を提供する。対象となるゲノム配列は、１つ又は複数の連続したメチル化ＣｐＧ位置を含み得る。上記処理は、重亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩及びその組合せから成る群から選択される試薬の使用を含むのが好ましい。しかし、上記処理は、（重亜硫酸処理の代わりに）適切な酵素処理を含んでもよく、これにより異なる塩基対合挙動の塩基対への非メチル化シトシンの変換がもたらされる。本発明の好ましい実施形態では本発明は、配列番号８〜配列番号３５から成る群から選択される配列の少なくとも１６ヌクレオチド塩基長の連続した配列を含む非天然修飾核酸を提供する。本発明のさらに好ましい実施形態では、上記核酸は、配列番号８〜配列番号３５で開示された核酸配列のセグメントの少なくとも５０塩基対長、１００塩基対長、１５０塩基対長、２００塩基対長、２５０塩基対長又は５００塩基対長である。配列番号１〜配列番号７ではなく、配列番号８〜配列番号３５の配列の全て若しくは一部と同一若しくは相補的な核酸分子、又は他の天然ＤＮＡが特に好ましい。
【０１６６】
上記配列は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド、ＴｐＡジヌクレオチド又はＣｐＡジヌクレオチド及びこれに相補的な配列を含むことが好ましい。配列番号８〜配列番号３５の配列によって、配列番号１〜配列番号７の核酸の非天然修飾型が与えられ、各ゲノム配列の修飾によって、以下のように上記ゲノム配列に特有で、且つこれとは異なる配列を有する核酸が合成される。各センス鎖のゲノムＤＮＡ（例えば配列番号１〜配列番号７）に対して、４つの変換型が開示される。「Ｃ」が「Ｔ」に変換するが、「ＣｐＧ」は「ＣｐＧ」のままである（即ち、ゲノム配列に関して、ＣｐＧジヌクレオチド配列の全ての「Ｃ」残基がメチル化し、したがって変換しない場合に対応する）第１の型が与えられ、第２の型は、開示されたゲノムＤＮＡ配列の相補体（即ちアンチセンス鎖）を開示し、「Ｃ」が「Ｔ」に変換するが、「ＣｐＧ」は「ＣｐＧ」のままである（即ち、ＣｐＧジヌクレオチド配列の全ての「Ｃ」残基がメチル化し、したがって変換しない場合に対応する）。配列番号１〜配列番号７の「上方メチル化」変換配列は、配列番号８〜配列番号２１に対応する。「ＣｐＧ」ジヌクレオチド配列のものを含む全ての「Ｃ」残基に関して「Ｃ」が「Ｔ」に変換される（即ちゲノム配列に関して、ＣｐＧジヌクレオチド配列の全ての「Ｃ」残基が非メチル化している場合に対応する）各ゲノム配列の化学変換した第３の型が与えられ、各配列の化学変換した最後の型は、開示されたゲノムＤＮＡ配列の相補体（即ちアンチセンス鎖）を開示し、「ＣｐＧ」ジヌクレオチド配列のものを含む全ての「Ｃ」残基に関して「Ｃ」が「Ｔ」に変換される（即ち各ゲノム配列の相補体（アンチセンス鎖）に関して、ＣｐＧジヌクレオチド配列の全ての「Ｃ」残基が非メチル化している場合に対応する）。配列番号１〜配列番号７の「下方メチル化」変換配列は、配列番号１９〜配列番号３０に対応する。
【０１６７】
重要なことは、これまで配列番号８〜配列番号３５に記載の核酸配列及び分子は、細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）の検出又は診断に関与又は相関していなかった。細胞増殖性障害は、肺腺癌、大細胞肺癌、肺扁平上皮癌及び小細胞肺癌から成る群から選択される肺癌が特に好ましい。
【０１６８】
代替的な好ましい実施形態において、本発明は、配列番号１〜配列番号３５に従って、ゲノムＤＮＡ又は処理（化学修飾）ＤＮＡ内のシトシンのメチル化状態を検出するために、本発明の方法で使用するのに適したオリゴヌクレオチド又はオリゴマーをさらに提供する。上記オリゴヌクレオチド又はオリゴマー核酸は、新規の診断手段を提供する。上記オリゴヌクレオチド又はオリゴマーは、配列番号８〜配列番号３５の処理核酸配列及び／又はこれに相補的な配列、若しくは配列番号１〜配列番号７のゲノム配列及び／又はこれに相補的な配列と同一であり、（本明細書で上記で規定のように）適度にストリンジェントな条件又はストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチド長の核酸配列を含む。
【０１６９】
したがって本発明は、適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件及び／又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１〜配列番号３５の配列の全て若しくは一部、又はその相補体とハイブリダイズする核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド及びペプチド核酸（ＰＮＡ）分子（ＰＮＡ−オリゴマー））を含む。適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件及び／又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１〜配列番号７ではなく、配列番号８〜配列番号３５の配列の全て若しくは一部、又は他のヒトゲノムＤＮＡとハイブリダイズする核酸分子が特に好ましい。
【０１７０】
ハイブリダイズする核酸の同一部分又はハイブリダイズ部分は典型的に、少なくとも９ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長又は３５ヌクレオチド長である。しかし、より長い分子が本発明に有用であり、このため本発明の範囲内である。
【０１７１】
好ましくは、本発明のハイブリダイズする核酸のハイブリダイズ部分は、配列番号８〜配列番号３５の配列若しくはその一部、又はその相補体に対して少なくとも９５％、又は少なくとも９８％、又は１００％同一である。
【０１７２】
本明細書に記載の種類のハイブリダイズする核酸は、例えばプライマー（例えばＰＣＲプライマー）、又は診断プローブ若しくはプライマーとして使用することができる。好ましくは、ストリンジェントな条件下で、オリゴヌクレオチドプローブと核酸試料とのハイブリダイゼーションを行い、プローブは、標的配列と１００％同一である。核酸二本鎖又はハイブリッド安定性は、溶融温度即ちＴｍで表し、これはプローブが標的ＤＮＡから解離する温度である。この溶融温度は、要求されるストリンジェントな条件を規定するのに使用する。
【０１７３】
同一ではなく、配列番号１〜配列番号７の対応配列に関連し、実質的にこれと同一である標的配列（対立遺伝子変異型及びＳＮＰ等）に関して、初めに相同ハイブリダイゼーションだけが特定濃度の塩（例えばＳＳＣ又はＳＳＰＥ）で起こる最小温度を確立することが有用である。それから、ミスマッチが１％であると仮定すると、Ｔｍが１℃減少し、そのためハイブリダイゼーション反応の最終洗浄の温度が減少する（例えば、プローブとの同一性が９５％を超える配列が求められる場合、最終洗浄温度は５℃減少する）。実際、Ｔｍの変化は、１％のミスマッチ当たり０．５℃〜１．５℃であり得る。
【０１７４】
例えば配列番号１を参照してポリヌクレオチド位置によって示されるように、Ｘ（ヌクレオチド）長の本発明のオリゴヌクレオチドの例には、長さがＸの連続した重複オリゴヌクレオチドの組（センス組及びアンチセンス組）に対応するものが含まれ、ここで、連続して重複した各組内のオリゴヌクレオチド（所定のＸ値に対応する）が、ヌクレオチド位置からＺ個のオリゴヌクレオチドの有限組と規定される：
ｎ〜（ｎ＋（Ｘ−１））
（式中、ｎ＝１、２、３、・・・（Ｙ−（Ｘ−１））、
Ｙは配列番号１の（ヌクレオチド又は塩基対）長に等しく（３９０５）、
Ｘは、この組における各オリゴヌクレオチドの一般的な（ヌクレオチド）長に等しく（例えば、連続して重複した２０−ｍｅｒの組ではＸ＝２０）、且つ
長さがＹの所定の配列番号１に対する、長さがＸの連続して重複したオリゴマーの数（Ｚ）は、Ｙ−（Ｘ−１）に等しい）。例えばＸ＝２０の場合、配列番号１のセンス組又はアンチセンス組のいずれかに関して、Ｚ＝３９０５−１９＝３８８６である。
【０１７５】
好ましくはこの組は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド、ＴｐＧジヌクレオチド又はＣｐＡジヌクレオチドを含み、このため何れの場合でも変換されずに少なくとも１つの（メチル化又は非メチル化）ＣｐＧを含む変換された標的ＤＮＡ領域とハイブリダイズするこれらのオリゴマーに限定される。
【０１７６】
本発明の２０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの例としては、配列番号１を参照してポリヌクレオチド位置で示される以下の組の３９０５個のオリゴマー（及びこれに相補的なアンチセンス組）が挙げられる：
１〜２０、２〜２１、３〜２２、４〜２３、５〜２４、・・・及び３８８６〜３９０５。
【０１７７】
好ましくはこの組は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド、ＴｐＧジヌクレオチド又はＣｐＡジヌクレオチドを含み、このため何れの場合でも変換されずに少なくとも１つの（メチル化又は非メチル化）ＣｐＧを含む変換された標的ＤＮＡ領域とハイブリダイズするこれらのオリゴマーに限定される。
【０１７８】
同様に、本発明の２５−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの例としては、配列番号１を参照してポリヌクレオチド位置で示される以下の組の３８８１個のオリゴマー（及びこれに相補的なアンチセンス組）が挙げられる：
１〜２５、２〜２６、３〜２７、４〜２８、５〜２９、・・・及び３８８１〜３９０５。
【０１７９】
好ましくはこの組は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド、ＴｐＧジヌクレオチド又はＣｐＡジヌクレオチドを含み、このため何れの場合でも変換されずに少なくとも１つの（メチル化又は非メチル化）ＣｐＧを含む変換された標的ＤＮＡ領域とハイブリダイズするこれらのオリゴマーに限定される。
【０１８０】
本発明は、配列番号１〜配列番号３５（センス及びアンチセンス）のそれぞれに対して、複数の連続して重複したオリゴヌクレオチド組又は長さがＸ（例えばＸ＝９、１０、１７、２０、２２、２３、２５、２７、３０又は３５ヌクレオチド）の修飾オリゴヌクレオチド組を包含する。
【０１８１】
本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴマーは、配列番号１〜配列番号７に対応するゲノム配列の遺伝的パラメータ及びエピジェネティックパラメータを確かめるのに有用な効果的ツールを構成する。このような好ましいオリゴヌクレオチド組又は長さがＸの修飾オリゴヌクレオチド組は、配列番号１〜配列番号３５（及びその相補体）に対応する、連続して重複したオリゴマー組である。好ましくは、上記オリゴマーは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド、ＴｐＧジヌクレオチド又はＣｐＡジヌクレオチドを含み、このため何れの場合でも変換されずに少なくとも１つの（メチル化又は非メチル化）ＣｐＧを含む変換された標的ＤＮＡ領域とハイブリダイズする。
【０１８２】
特に好ましい本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴマーは、ＣｐＧジヌクレオチド（又は対応する変換ＴｐＧ若しくはＣｐＡジヌクレオチド）配列のシトシンが、オリゴヌクレオチドの中央部３分の１内にある、即ちオリゴヌクレオチドが、例えば１３塩基長であり、ＣｐＧジヌクレオチド、ＴｐＧジヌクレオチド又はＣｐＡジヌクレオチドが、５'末端から５番目〜９番目のヌクレオチド内に位置しているものである。
【０１８３】
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、オリゴヌクレオチドと１つ又は複数の部分又は複合体とを化学結合させることによって修飾して、オリゴヌクレオチドの活性、安定性又は検出を高めることができる。このような部分又は複合体としては、クロモフォア、フルオロフォア、コレステロール等の脂質、胆汁酸、チオエーテル、脂肪族鎖、リン脂質、ポリアミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、パルミチル部分、及び例えば米国特許第５，５１４，７５８号明細書、同第５，５６５，５５２号明細書、同第５，５６７，８１０号明細書、同第５，５７４，１４２号明細書、同第５，５８５，４８１号明細書、同第５，５８７，３７１号明細書、同第５，５９７，６９６号明細書、及び同第５，９５８，７７３号明細書で開示されるような他のものが挙げられる。プローブはまた、特に好ましい対合性があるペプチド核酸（ＰＮＡ）形態で存在し得る。このように、オリゴヌクレオチドは、ペプチド等の他の添付群を含んでもよく、ハイブリダイゼーション誘起切断剤（Krol et al., BioTechniques 6:958-976, 1988）又は挿入剤（Zon, Pharm. Res. 5:539-549, 1988）を含んでもよい。このために、オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えばクロモフォア、フルオロフォア、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘起架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘起切断剤等と複合体を形成してもよい。
【０１８４】
オリゴヌクレオチドはまた、少なくとも１つの当該技術分野で認識される修飾糖及び／又は塩基部分を含み得るか、又は修飾骨格若しくは非天然ヌクレオシド間連結を含み得る。
【０１８５】
本発明の特定の実施形態のオリゴヌクレオチド又はオリゴマーは典型的に、「組」で使用し、配列番号１〜配列番号７から成る群から選択されるゲノム配列又はその一部及びこれに相補的な配列の各ＣｐＧジヌクレオチドの解析のために、又は配列番号８〜配列番号３５の処理核酸の配列及びこれに相補的な配列内の対応するＣｐＧジヌクレオチド、ＴｐＧジヌクレオチド若しくはＣｐＡジヌクレオチドの解析のために少なくとも１つのオリゴマーを含有する。しかし、経済的要因又は他の要因のために、好ましくは、上記配列内のＣｐＧジヌクレオチドの制限選択を解析してもよく、それに応じてオリゴヌクレオチド組の含有量が変わることが予測される。
【０１８６】
したがって、特定の実施形態では本発明は、処理ゲノムＤＮＡ（配列番号８〜配列番号３５）、又はゲノムＤＮＡ（配列番号１〜配列番号７及びこれに相補的な配列）においてシトシンのメチル化状態を検出するのに有用な、少なくとも２つの（オリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡ−オリゴマー）組を提供する。これらのプローブによって、細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）の診断及び検出が可能になる。肺腺癌、大細胞肺癌、肺扁平上皮癌及び小細胞肺癌から成る群から選択される肺癌が特に好ましい。オリゴマー組はまた、処理ゲノムＤＮＡ（配列番号８〜配列番号３５）、又はゲノムＤＮＡ（配列番号１〜配列番号７及びこれに相補的な配列）において一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するのに使用してもよい。
【０１８７】
好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチド組の少なくとも１つ、及びより好ましくは全ての成員が固相に結合する。
【０１８８】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号１〜配列番号３５の内の１つのＤＮＡ配列及びこれに相補的な配列、又はそのセグメントを増幅するための「プライマー」オリゴヌクレオチドとして使用する、少なくとも２つのオリゴヌクレオチド組を提供する。
【０１８９】
オリゴヌクレオチドは、「アレイ」又は「ＤＮＡチップ」（即ち固相に結合した様々なオリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡ−オリゴマーの配置）の全て又は一部を構成し得ることが予測される。様々なオリゴヌクレオチド−オリゴマー配列及び／又はＰＮＡ−オリゴマー配列のこのようなアレイは、例えば長方形又は六方格子の形態で固相上に配置されることを特徴とし得る。 固相表面は、ケイ素、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、又は金で構成され得る。また、ニトロセルロース、並びにペレット状で存在し得るナイロン、又は樹脂マトリクス等のプラスチックを使用してもよい。オリゴマーアレイの製造における従来技術の概説は、Nature Genetics（Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999及びそこで言及される文献から）の特別版から収集することができる。固定化ＤＮＡアレイの精査に、蛍光標識プローブを使用することが多い。Ｃｙ３色素及びＣｙ５色素と、特異的なプローブの５'−ＯＨとの単純な連結は、蛍光標識に特に好適である。例えば、共焦点顕微鏡によって、ハイブリダイズするプローブの蛍光の検出を行ってもよい。他の多くのものに加えて、Ｃｙ３色素及びＣｙ５色素も市販されている。
【０１９０】
オリゴヌクレオチド又はその特定の配列は、「仮想アレイ」（オリゴヌクレオチド又はその特定の配列は、例えば「指定子」として検体の複合混合物を解析するために、多様な特別に標識したプローブ集団の一部として、又はこれと組合せて使用する）の全て又は一部を構成し得ることも予測される。例えば、このような方法は、米国特許出願公開第２００３／００１３０９１号明細書（２００３年１月１６日に公開された米国特許出願第０９／８９８，７４３号明細書）（参照により本明細書に援用される）に記載されている。このような方法において、複合混合物における各核酸（即ち各検体）が、特有の標識と独自に結合し、それにより検出することができるように、十分な標識が生成される（各標識を直接計測し、それにより混合物中の各分子種をデジタルで読み取る）。
【０１９１】
本発明のオリゴマーは、細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）を検出若しくは診断するのに、又は被験者が細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）を患う危険性の増大の有無を検出するのに利用するのが特に好ましい。障害が肺癌であること、並びに肺腺癌、大細胞肺癌、肺扁平上皮癌、及び小細胞肺癌から成る群から選択されることが特に好ましい。
【０１９２】
キット
さらに、本発明のさらなる態様は、ＦＯＸＬ−２、ＯＮＥＣＵＴ１、ＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列の発現又はメチル化の状況若しくはレベルを決定する手段を備えるキットである。ＦＯＸＬ−２、ＯＮＥＣＵＴ１、ＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列の発現又はメチル化の状況若しくはレベルを決定する手段は、重亜硫酸含有試薬と、配列が配列番号８〜配列番号３５から選択される配列の９塩基長又はより好ましくは１８塩基長のセグメントと同一であるか、又はこれに相補的であるか、又はストリンジェントな条件若しくは高ストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする、１つ又は複数のオリゴヌクレオチドと、任意で記載のメチル化解析方法を実行及び評価するための取扱説明書とを含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド、ＣｐＡジヌクレオチド又はＴｐＧジヌクレオチドを含む。
【０１９３】
さらなる実施形態において、上記キットは、ＣｐＧ位置特異的なメチル化解析を行うのに標準的な試薬をさらに含んでもよく、上記解析は、１つ又は複数の以下の技法を含む：ＭＳ−ＳＮｕＰＥ、ＭＳＰ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ、ＣＯＢＲＡ、及び核酸シークエンシング。しかし、本発明に沿ったキットは、上述の構成要素の一部分だけを含有することもできる。
【０１９４】
好ましい実施形態において、キットは、ＤＮＡ変性バッファー、スルホン化バッファー、ＤＮＡ回収試薬又はキット（例えば析出カラム、限外濾過カラム、アフィニティカラム）、脱スルホン化バッファー、及びＤＮＡ回収成分から成る群から選択される、さらなる重亜硫酸変換試薬を含み得る。
【０１９５】
さらなる代替的な実施形態において、キットは、ポリメラーゼと、ポリメラーゼによって媒介されるプライマー伸長（ＰＣＲ等）のために最適化した反応バッファーとを別々のコンテナに入った状態で含有し得る。本発明の別の実施形態では、キットは、患者の生体試料を得る手段をさらに含む。患者の生体試料において、ＦＯＸＬ−２、ＯＮＥＣＵＴ１、ＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列のメチル化を決定する手段を収容するのに適したコンテナをさらに含み、最も好ましくはキット結果を利用及び解釈するための取扱説明書をさらに含むキットが好ましい。好ましい実施形態では、キットは、（ａ）重亜硫酸試薬と、（ｂ）上記重亜硫酸試薬及び患者の生体試料を収容するのに適したコンテナと、（ｃ）それぞれの場合で配列が、配列番号８〜配列番号３５から選択される配列の９塩基長、又はより好ましくは１８塩基長のセグメントと同一であるか、又はこれに相補的であるか、又はストリンジェントな条件若しくは高ストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする、２つのオリゴヌクレオチドを含有する少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチド組と、任意で（ｄ）キット結果を利用及び解釈するための取扱説明書とを含む。代替的な好ましい実施形態では、キットは、（ａ）重亜硫酸試薬と、（ｂ）上記重亜硫酸試薬及び患者の生体試料を収容するのに適したコンテナと、（ｃ）少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、及び／又は配列番号８〜配列番号３５の内の１つの前処理核酸配列及びこれに相補的な配列と同一であるか、又はこれとハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチド長又は１６ヌクレオチド長のＰＮＡ−オリゴマーと、任意で（ｄ）キット結果を利用及び解釈するための取扱説明書とを含む。
【０１９６】
代替的な実施形態では、キットは、（ａ）重亜硫酸試薬と、（ｂ）上記重亜硫酸試薬及び患者の生体試料を収容するのに適したコンテナと、（ｃ）それぞれの場合で配列が、配列番号８〜配列番号３５から選択される配列の９塩基長、又はより好ましくは１８塩基長のセグメントと同一であるか、又はこれに相補的であるか、又はストリンジェントな条件若しくは高ストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする、２つのオリゴヌクレオチドを含有する少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチド組と、（ｄ）少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、及び／又は配列番号８〜配列番号３５の内の１つの前処理核酸配列及びこれに相補的な配列と同一であるか、又はこれとハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチド長又は１６ヌクレオチド長のＰＮＡ−オリゴマーと、任意で（ｅ）キット結果を利用及び解釈するための取扱説明書とを含む。
【０１９７】
またキットは、別々のコンテナに入った状態で、遮断、洗浄又はコーティングに適したバッファー又は溶液等の他の成分を含有してもよい。
【０１９８】
本発明の別の態様は、細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）の存在を決定する、及び／又は細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）を診断するのに使用するキットに関する。肺腺癌、大細胞肺癌、肺扁平上皮癌、小細胞肺癌から成る群から選択される肺癌が特に好ましい。
【０１９９】
上記キットは、ＯＮＥＣＵＴ１、ＦＯＸＬ−２及びＴＦＡＰ２Ｅから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列の転写レベルを測定する手段と、ＦＯＸＬ−２、ＯＮＥＣＵＴ１、ＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列のメチル化の状況又はレベルを決定する手段とを含むのが好ましい。
【０２００】
ＣＯＢＲＡ（商標）解析に典型的な試薬（例えば典型的なＣＯＢＲＡ（商標）ベースキットで見出され得るような）には、これらに限定されないが、ＦＯＸＬ−２、ＯＮＥＣＵＴ１、ＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列及び／又はその重亜硫酸変換配列に関するＰＣＲプライマー、制限酵素及び適切なバッファー、遺伝子ハイブリダイゼーションオリゴ、対照ハイブリダイゼーションオリゴ、オリゴプローブのためのキナーゼ標識キット、及び標識ヌクレオチドが含まれ得る。ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）解析に典型的な試薬（例えば典型的なＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）ベースキットで見出され得るような）には、これらに限定されないが、ＯＮＥＣＵＴ１、ＦＯＸＬ−２及びＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列の重亜硫酸変換配列に関するＰＣＲプライマー、重亜硫酸特異的プローブ（例えばＴａｑＭａｎ（商標）又はＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（商標））、最適化したＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド、並びにＴａｑポリメラーゼが含まれ得る。
【０２０１】
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ（商標）解析に典型的な試薬（例えば典型的なＭｓ−ＳＮｕＰＥ（商標）ベースキットで見出され得るような）には、これらに限定されないが、特定遺伝子（又は重亜硫酸処理ＤＮＡ配列若しくはＣｐＧアイランド）に関するＰＣＲプライマー、最適化したＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド、ゲル抽出キット、陽性対照プライマー、ＯＮＥＣＵＴ１、ＦＯＸＬ−２及びＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列の重亜硫酸変換配列に対するＭｓ−ＳＮｕＰＥ（商標）プライマー、（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ反応のための）反応バッファー並びに標識ヌクレオチドが含まれ得る。
【０２０２】
ＭＳＰ解析に典型的な試薬（例えば典型的なＭＳＰベースキットで見出され得るような）には、これらに限定されないが、ＯＮＥＣＵＴ１、ＦＯＸＬ−２及びＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列の重亜硫酸変換配列に対するメチル化特異的及び非メチル化特異的ＰＣＲプライマー、最適化したＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド、並びに特異的プローブが含まれ得る。
【０２０３】
さらに、本発明のさらなる態様は、ＯＮＥＣＵＴ１、ＦＯＸＬ−２及びＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列のメチル化（状況又はレベル）を決定する手段を含む代替的キットであり、上記手段は、少なくとも１つのメチル化特異的制限酵素と、配列番号１〜配列番号７から選択される配列のＣｐＧジヌクレオチドを少なくとも１つ含む配列の増幅に適した、１つ又は複数のプライマーオリゴヌクレオチド（好ましくは１つ又は複数のプライマー対）と、任意で記載のメチル化解析方法を実施及び評価するための取扱説明書とを含むのが好ましい。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１〜配列番号７から選択される配列の少なくとも１８塩基長のセグメントと同一であるか、又はこれに相補的であるか、又はストリンジェントな条件若しくは高ストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする。
【０２０４】
さらなる実施形態において、上記キットは、消化断片の解析のための１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブを含んでもよく、好ましくは上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜配列番号７から選択される配列の少なくとも１６塩基長のセグメントと同一であるか、又はこれに相補的であるか、又はストリンジェントな条件若しくは高ストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする。
【０２０５】
好ましい実施形態において、キットは、バッファー（例えば制限酵素、ＰＣＲ、保存バッファー又は洗浄バッファー）、ＤＮＡ回収試薬又はキット（例えば析出カラム、限外濾過カラム、アフィニティカラム）及びＤＮＡ回収成分から成る群から選択されるさらなる試薬を含み得る。
【０２０６】
さらなる代替的な実施形態において、キットは、ポリメラーゼと、ポリメラーゼによって媒介されるプライマー伸長（ＰＣＲ等）のために最適化した反応バッファーとを別々のコンテナに入った状態で含有し得る。本発明の別の実施形態では、キットは、患者の生体試料を得る手段をさらに含む。好ましい実施形態では、キットは、（ａ）メチル化感受性制限酵素試薬と、（ｂ）上記試薬及び患者の生体試料を収容するのに適したコンテナと、（ｃ）配列番号１〜配列番号７から選択される配列の少なくとも９塩基長のセグメントと同一であるか、又はこれに相補的であるか、又はストリンジェントな条件若しくは高ストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする、１つ又は複数の核酸又はペプチド核酸を含有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド組と、任意で（ｄ）キット結果を利用及び解釈するための取扱説明書とを含む。
【０２０７】
代替的な好ましい実施形態において、キットは、（ａ）メチル化感受性制限酵素試薬と、（ｂ）上記試薬及び患者の生体試料を収容するのに適したコンテナと、（ｃ）配列番号１〜配列番号７から選択される配列のＣｐＧジヌクレオチドを少なくとも１つ含む配列の増幅に適した少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチド組と、任意で（ｄ）キット結果を利用及び解釈するための取扱説明書とを含む。
【０２０８】
代替的な実施形態では、キットは、（ａ）メチル化感受性制限酵素試薬と、（ｂ）上記試薬及び患者の生体試料を収容するのに適したコンテナと、（ｃ）配列番号１〜配列番号７から選択される配列のＣｐＧジヌクレオチドを少なくとも１つ含む配列の増幅に適した少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチド組と、（ｄ）配列番号１〜配列番号７から選択される配列の少なくとも９塩基長のセグメントと同一であるか、又はこれに相補的であるか、又はストリンジェントな条件若しくは高ストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする、１つ又は複数の核酸又はペプチド核酸を含有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド組と、任意で（ｅ）キット結果を利用及び解釈するための取扱説明書とを含む。
【０２０９】
またキットは、別々のコンテナに入った状態で、遮断、洗浄又はコーティングに適したバッファー又は溶液等の他の成分を含有してもよい。
【０２１０】
本発明はさらに、メチル化感受性制限酵素解析によって被験者において細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）の有無の診断を与えるのに使用するキットに関する。上記キットは、コンテナとＤＮＡマイクロアレイ構成要素とを含む。上記ＤＮＡマイクロアレイ構成要素は、複数のオリゴヌクレオチドが設計位置で固定化される表面であり、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのＣｐＧメチル化部位を含む。上記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、ＯＮＥＣＵＴ１、ＦＯＸＬ−２及びＴＦＡＰ２Ｅ（プロモータ又はその調節因子を含む）、及びＥＮ２−２、ＥＮ２−３、ＳＨＯＸ２−２及びＢＡＲＨＬ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はゲノム配列に特異的であり、少なくとも１５塩基対長の配列を含むが、配列番号１〜配列番号７の１つの配列を２００ｂｐ以下しか含まない。好ましくは上記配列は、少なくとも１５塩基対長であるが、配列番号１〜配列番号７の１つの配列を８０ｂｐ以下しか含まない。上記配列が、少なくとも２０塩基対長であるが、配列番号１〜配列番号７の１つの配列を３０ｂｐ以下しか含まないのがさらに好ましい。
【０２１１】
上記検査キットは、１つ又は複数のメチル化感受性制限酵素を含む制限酵素構成要素をさらに含むのが好ましい。
【０２１２】
さらなる実施形態において、上記検査キットはさらに、少なくとも１つのメチル化特異的制限酵素を含むことを特徴とし、オリゴヌクレオチドは、上記少なくとも１つのメチル化特異的制限酵素の制限部位を含むことを特徴とする。
【０２１３】
キットは、ＤＮＡ濃縮に関して当該技術分野で知られている以下の構成要素の１つ又は幾つかをさらに含み得る：タンパク質構成要素（上記タンパク質は、メチル化ＤＮＡと選択的に結合する）、任意で好適な溶液中の三重鎖形成核酸成分である１つ又は複数のリンカー、ライゲーションを行うための物質又は溶液（例えばリガーゼ、バッファー）、カラムクロマトグラフィを行うための物質又は溶液、免疫学に基づく濃縮（例えば免疫沈降）を行うための物質又は溶液、核酸増幅（例えばＰＣＲ）を行うための物質又は溶液、カップリング試薬に適用される場合、溶液中で適用される場合の色素又は幾つかの色素、ハイブリダイゼーションを行うための物質又は溶液、及び／又は洗浄工程を行うための物質又は溶液。
【０２１４】
記載の本発明は、細胞増殖性障害、好ましくは表２に記載の障害（最も好ましくは肺癌）を検出又は診断するのに有用な物質の組成物をさらに提供する。肺腺癌、大細胞肺癌、肺扁平上皮癌、小細胞肺癌から成る群から選択される肺癌が特に好ましい。
【０２１５】
上記組成物は、少なくとも１つの核酸と、配列番号８〜配列番号３５に開示の核酸配列の１８塩基対長のセグメントと、１ｍＭ〜５ｍＭの塩化マグネシウム、１００μＭ〜５００μＭのｄＮＴＰ、０．５単位〜５単位のｔａｑポリメラーゼ、ウシ血清アルブミン、オリゴマー、特にオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸（ＰＮＡ）−オリゴマー（上記オリゴマーはそれぞれの場合、配列番号８〜配列番号３５の１つの前処理ゲノムＤＮＡに相補的であるか、又は適度にストリンジェントな条件若しくはストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチド長の少なくとも１つの塩基配列及びそれに相補的な配列を含む）を含む群から選択される１つ又は複数の物質とを含むのが好ましい。上記物質の組成物は、水溶液中で上記核酸の安定化に適切なバッファー溶液を含み、上記溶液中でポリメラーゼに基づく反応が可能であることが好ましい。好適なバッファーは当該技術分野で既知であり、市販されている。
【０２１６】
本発明のさらに好ましい実施形態において、上記少なくとも１つの核酸は、少なくとも５０塩基対長、１００塩基対長、１５０塩基対長、２００塩基対長、２５０塩基対長又は５００塩基対長の配列番号８〜配列番号３５に開示の核酸配列のセグメントである。
【０２１７】
【表１】
0005694776.tif 000002
【０２１８】
【表２】
0005694776.tif 000003
【０２１９】
【表３Ａ】
0005694776.tif 000004
【０２２０】
【表３Ｂ】
0005694776.tif 000005
【０２２１】
【表３Ｃ】
0005694776.tif 000006
【０２２２】
【表４】
0005694776.tif 000007
【実施例】
【０２２３】
以下の解析を、ＦＯＸＬ２及びＢＡＲＨＬ２遺伝子マーカーのメチル化状況を調べるために行った。初めにＤＮＡを気管支洗浄試料から抽出し、重亜硫酸処理した。処理ＤＮＡを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴプラットフォームでＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌベースのリアルタイムＰＣＲを使用して解析した。
【０２２４】
事前解析
ＤＮＡ抽出
固定されていない気管支洗浄生検由来のゲノムＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Qiagen, Hilden, Germany）を使用して単離した。ＤＮＡ抽出前に、１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ、Carl Roth, Germany）を最終濃度が０．２２５％になるまで添加し、少なくとも３０分間、又は所望の流動性が得られるまで、試料を室温でインキュベートすることで、気管支洗浄試料の粘性を低減した。３２００×ｇで１２分間の遠心分離後、ペレットを、製造業者のプロトコルに従ってＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔを使用して処理した。
【０２２５】
重亜硫酸処理
抽出した試料ＤＮＡの重亜硫酸処理を、以下の変更をして、製造業者のプロトコルに従ってＥｐｉＴｅｃｔ  Ｋｉｔ（Qiagen, Hilden, Germany）を使用して行った。固定量の１５μｌの試料抽出液由来のＤＮＡを、５μｌの水、８５μｌの重亜硫酸ミックス及び３５μｌの保護バッファーと共に混合した。２つの溶出工程を、それぞれ２５μｌの溶出バッファーを使用して行った。
【０２２６】
解析
原理
特定の遺伝子座のメチル化の定量化を、２つのＰＣＲにより達成する。第１のＰＣＲは、２つの遺伝子特異的プライマーと、メチル化状態に関係なくＤＮＡを検出する遺伝子特異的プローブとから構成される（総ＤＮＡの定量）。第２のＰＣＲは、メチル化ＤＮＡに特異的なプローブを含有する以外は同じプライマーと、非メチル化ＤＮＡの増幅を抑制する２つのブロッカーとから構成される。
【０２２７】
ＦＯＸＬ２（配列番号１２３）では、
配列番号４４  フォワードプライマー  ｃｃａａａａｃｃｔａａａｃｔｔａｃａａｃ
配列番号４５  リバースプライマー  ｇａｇａｇｇｇｇｔｔａｇｔａｇｔ
配列番号４６  フォワードブロッカー  ｔａｃａａｃａｃｃａｃｃａａｃａａａｃｃｃａａａａａｃａｃａａ
配列番号４７  リバースブロッカー  ｔｔｇｇｇａａｇａｔｔｔｔｇｇｔｔｔｇｇａｇｔ
【０２２８】
一アッセイ（ＢＡＲＨＬ２に関する）において、ＤＮＡ制限酵素Ｔｓｐ５０９Ｉを、ブロッカーオリゴヌクレオチドの代わりに使用する。この酵素が、メチル化特異的増幅をもたらす重亜硫酸処理後に非メチル化ＤＮＡを特異的に切断する。
【０２２９】
ＢＡＲＨＬ２（配列番号１２５）では、
配列番号５９  プライマー  ｇｔｔｔｔｇａａａｔｔｔａｔｔａｇａａｔａａｃｇａｃｇｔｔ
配列番号６０  プライマー  ａｃａｔａｔａａｃａａａｔａｔａｔｔｔｔａｔｃｃａａｃ
【０２３０】
バイオマーカー／アッセイ
以下のアッセイを、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブを用いて行った：ＦＯＸＬ２、
配列番号４８  プローブ  ｃｃｇｃｃｇａａａａｃａｃｇａａａｃｇｇｃｇｇｇａｇａｇｇｇｇｔｔａｇｔａｇｔ
配列番号４９  プローブ  ｃｃｃｇｇｇａａｇａｔｔｔｔｇｇｔｔｔｇｇａｇｃｃｃｇｇｇｃｃａａａａｃｃｔａａａｃｔｔａｃａａｃ
【０２３１】
以下のアッセイを、ＴａｑＭａｎプローブを用いて行った：ＢＡＲＨＬ２、
配列番号６１  プローブ  ｔｔｇｇａｔｔａｔｔｔｔａａａｔｇｔｇｇｔｔａａａａ
【０２３２】
ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌベースのリアルタイムＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲ実験を、Applied BiosystemsのＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ機器を使用して行った。１つのバイオマーカーに対する各リアルタイムアッセイは２つの独立反応から構成されていた：総導入ＤＮＡの定量のための参照反応、及びメチル化標的鋳型の定量のためのＨＭ反応。参照アッセイは、２つのメチル化非特異的オリゴヌクレオチドとメチル化非特異的プローブとから構成され、ＨＭアッセイは、同じ２つのメチル化非特異的プライマーと、さらにそれ以外に２つのメチル化特異的ブロッカー（それぞれのプライマーに対して１つ）と、メチル化特異的プローブとから構成されていた。バイオマーカーＢＡＲＨＬ２では、ＤＮＡ制限酵素Ｔｓｐ５０９Ｉを、ブロッカーオリゴヌクレオチドの代わりに使用する。この酵素は、重亜硫酸処理後の増幅中に非メチル化ＤＮＡを特異的に切断する。結果として、非メチル化ＤＮＡが増幅するのを防ぐ。
【０２３３】
２つの異なるプローブ系を、バイオマーカー／アッセイに応じてＲＴ−ＰＣＲ解析に使用した。ＦＯＸＬ２では、メチル化非特異的プライマー部分とメチル化特異的プローブ部分とから成るＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブを使用した。Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブは、クエンサーとしてＢＨＱ１と、蛍光レポーターとして６−ＦＡＭとを含有していた。マーカーＢＡＲＨＬ２では、ＢＨＱ１及び６−ＦＡＭを有するＴａｑＭａｎプローブを検出システムとして使用した。各アッセイを８６個のＢＬ試料（４０個の癌、４６個の良性肺疾患）で試験した。各ＰＣＲプレートは幾つかのＰＣＲ対照を含有していた。これらは、５０ｎｇの重亜硫酸処理精子ＤＮＡ（０％ＢｉｓＳｔｄ）（これは通常メチル化されていない）と、５０ｎｇの精子ＤＮＡ（１％ＢｉｓＳｔｄ）中に０．５ｎｇのメチル化Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＤＮＡと、非鋳型対照（ＮＴＣ）とを含んでいた。これらの対照は、一般的なＲＴ−ＰＣＲ動作をモニタリングするのに、及び試料を排除する濃度限界を規定するのに使用した（データ及び統計解析を参照されたい）。
【０２３４】
２０μｌのＰＣＲ反応液は、０．２５μｌの重亜硫酸処理試料ＤＮＡ（事前の濃度決定なし）と、１０μｌのＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ＮｏＲＯＸ混合物（Qiagen, Hilden）と、０．３μＭの非特異的なフォワード及びリバースプライマーと、０．３μＭのＴａｑＭａｎプローブ又は０．１５μＭのＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブのいずれかとを含有していた。Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブをこの実験に使用した場合、それぞれの非プローブプライマーの濃度が０．１５μＭに減少した。ＴａｑＭａｎプローブ濃度が０．３０μＭであった。ＨＭ反応では、ブロッカーを、それぞれ最終濃度が１μＭになるまで添加した。Ｔｓｐ５０９Ｉベースアッセイでは、１Ｕの制限酵素をメチル化特異的増幅に使用した。
【０２３５】
熱サイクル条件は以下の通りであった：９５℃で１５分間の最初の変性、その後の９５℃で１５秒と５６℃で３０秒のアニーリング／変性工程とが５０サイクル。単一の蛍光検出をアニーリング／伸長工程中に行った。
【０２３６】
臨床試料
臨床試料数：８６
癌試料数：４０
良性試料数：４６
【配列表】
0005694776000001.app