(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤の肝臓毒性を予測する方法であって、
a)未処理細胞および薬剤処理細胞から代謝物プロファイルを得るステップと、
b)未処理細胞および薬剤処理細胞から得られた代謝物プロファイルを比較して、変化した代謝物1を決定するステップと、
c)共分散行列適用進化的戦略(CMA-ES)分析を実施し、変化した代謝物1の原因となるパラメータセットを推定するステップであり、前記共分散行列適用進化的戦略(CMA-ES)分析が、
i.恒常性肝臓モデルにパラメータセットを提供し、変化した代謝物2を得るステップ、および
ii.前記パラメータセットが予め決定された適合度基準に基づいて変化した代謝物1の原因となるかどうかを決定するステップを含むステップと、
d)恒常性肝臓モデルへの入力としてパラメータセットを提供し、前記薬剤の肝臓毒性を予測するステップとを含む方法。
【請求項２】
ステップ(c)のサブステップiが、
a)任意のパラメータセットまたは変化した代謝物1の原因となる可能性がある予め定義されたパラメータセットを選択し、前記パラメータセットの各パラメータに初期値を提供するステップと、
b)恒常性肝臓モデルに前記パラメータセットを提供し、恒常性肝臓モデルをシミュレートして変化した代謝物2を得るステップとを含む方法によって実施され、
ステップ(c)のサブステップiiが、
c)変化した代謝物1と変化した代謝物2との間の差を測定するステップと、
d)前記差が予め決定された適合度基準よりも小さいか、または大きいかを評価するステップと、
e)測定された差が予め決定された適合度基準よりも小さいことが見出された場合、前記パラメータセットを選択するステップ、または測定された差が予め決定された適合度基準よりも大きいことが見出された場合、前記パラメータセットを破棄し、請求項1のステップ(c)を反復するステップとを含む方法によって実施される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
代謝物プロファイルが、生化学アッセイ、質量分析法、NMRまたはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択された技術によって得られる、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
変化した代謝物1および2が、インビトロ、インビボおよびインシリコ法またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択された方法によって得られる、請求項1または2に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、肝毒性を引き起こす基礎となる機序を同定する方法に関する。この方法は、肝臓代謝のモデルと組み合わせて、療法/薬物治療の前後に実験的に得られた細胞代謝物プロファイルの変化を使用することによって実施される。その後、共分散行列を適用し、続いて進化的選択を使用することによって、実験的に得られた薬物誘導性の代謝物プロファイルとインシリコモデルを使用して生成されたプロファイルを比較し、その変化によって薬物治療による代謝物プロファイルを生じ得る潜在的なパラメータ候補を自動的に列挙する。これらのパラメータの値は、モデルによって生成した代謝物の値と実験的に観察されたデータとの間の差を最小限にする最適制御問題を定式化することによって推定される。推定されたパラメータは、恒常性肝臓モデルへの入力として提供され、シミュレーションが実施され、その結果によって毒性発現の機序が説明される。分析によって同定された変化パラメータの活性は、酵素測定法またはこのアプローチの成功を示す出版文献のデータによって確認(validate)される。
【背景技術】
【０００２】
本開示の分野では、候補化合物の潜在的毒性は、遺伝子発現、タンパク質量および/または代謝物プロファイルの変化をモニターすることによって推定される。しかし、化合物の潜在的毒性の決定は最終的に類似性またはクラスタリングに基づいて行われる。したがって、k-meansクラスタリング、PCAなどの標準的な統計学的技術によって測定したとき、既に公知の肝臓毒と有意なレベルの類似性が表れない場合、今までは未知で/新規の機序を有する毒物が見落とされる可能性があり得た。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】インド特許出願番号第3091/CHE/2008号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
したがって、本開示は、薬物の肝臓毒性を予測する方法に関し、前記方法は、a)未処理細胞および薬物処理細胞から代謝物プロファイルを得るステップと、b)未処理細胞および薬物処理細胞から得られた代謝物プロファイルを比較して変化した代謝物1を決定するステップと、c)共分散行列適用進化的戦略(CMA-ES)分析を実施し、変化した代謝物1の原因となるパラメータセットを推定するステップと、d)恒常性肝臓モデルへの入力として前記パラメータセットを提供し、薬物の毒性を予測するステップとを含む。
【０００５】
開示が容易に理解され、実際に実施することができるように、ここでは添付の図面を参照として用いて例示的実施形態を記載する。この図面は、以下の詳細な説明と一緒に明細書に組み込まれ、明細書の一部を形成し、本開示に従って実施形態をさらに例示し、様々な原則および利点を説明する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】本開示の様々なステップの流れ図を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本開示は、薬物の肝臓毒性を予測する方法に関し、前記方法は、a)未処理細胞および薬物処理細胞から代謝物プロファイルを得るステップと、b)未処理細胞および薬物処理細胞から得られた代謝物プロファイルを比較して変化した代謝物1を決定するステップと、c)共分散行列適用進化的戦略(CMA-ES)分析を実施し、変化した代謝物1の原因となるパラメータセットを推定するステップと、d)恒常性肝臓モデルへの入力としてパラメータセットを提供し、毒性を予測するステップとを含む。
【０００８】
本開示の一実施形態では、CMA-ES分析は、a)パラメータセットを決定し、前記セットのパラメータに初期値を提供するステップと、b)パラメータセットを提供し、恒常性肝臓モデルをシミュレートして変化した代謝物2を得るステップと、c)変化した代謝物1と変化した代謝物2との間の差を測定するステップと、d)測定された差が予め決定された適応度基準よりも小さいことが見出された場合、変化した代謝物1の原因となるパラメータセットを選択するステップ、または測定された差が予め決定された適応度基準よりも大きいことが見出された場合、変更された値を有する変更されたパラメータセットを生成し、前記のステップbおよびcを反復するステップとを含む。
【０００９】
本開示の別の実施形態では、代謝物プロファイルは、生化学アッセイ、質量分析法、NMRまたはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択された技術によって得られる。
【００１０】
本開示のさらに別の実施形態では、変化した代謝物1および2は、インビトロ、インビボおよびインシリコ法またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択された方法によって得られる。
【００１１】
本発明の方法は、実験に基づく代謝物プロファイルが与えられれば、共分散行列適用進化的戦略(CMA-ES)パラメータ推定技術を使用してインビボにおける毒性機序を明らかにし、新規化学物質の毒性学的評価における動物の使用をかなり減らすことができる。
【００１２】
薬物が肝臓と相互作用する生化学的機序の理解は、薬物誘導性肝障害(DILI)の予防において不可欠な要素である。本開示は、インド特許出願番号第3091/CHE/2008号に記載されたような「インシリコ肝臓代謝モデル」を使用する。前記モデルは、細胞基質、ミトコンドリアおよび血漿の70種を上回る代謝物ならびに100を上回る反応フラックス(reaction flux)および450を上回る動力学的パラメータから構成されている。モデルの重要な要素のいくつかは、酵素および炭水化物輸送体、エネルギー、グルタチオン、脂肪、胆汁酸塩およびビリルビン代謝である。簡単に説明すると、インシリコ肝臓モデルは、薬物誘導性臓器障害を列挙することによって構築される。次に、毒性の分子的機序を得、次いで前記薬物が臓器障害を引き起こす基礎的な生化学的経路をまとめ、最終的に生体分子を同定し、生化学的経路を推定し、これらの経路に関与する酵素の動力学をモデル化して、恒常性インシリコモデルを得る。モデルは、詳細な文献データおよび公知の肝毒物で実施された一連の酵素アッセイによって確認される。本開示では、このモデルを使用して計算およびシミュレーションの全てを実施する。
【００１３】
肝臓毒性を予測するための本開示による方法を図1に示し、以下のようにまとめて示す。
【００１４】
最初に、肝臓に特異的な細胞または細胞系を薬物または毒物で処理し、細胞抽出物中の代謝物プロファイルを得る。次のステップで、処理細胞および未処理細胞(対照)の代謝物プロファイルを使用して、変化した代謝物(変化した代謝物1と称する)を見出す。一連のパラメータ値および恒常性インシリコ肝臓モデルを使用して、薬物曝露によって生じると考えられる代謝物プロファイル(変化した代謝物2と称する)をシミュレーションによって算出する。次に、実験的に観察された代謝物プロファイル(変化した代謝物1)とモデルによって生成したプロファイル(変化した代謝物2)の間の差に基づいて目的関数を定義する。この関数は、共分散行列適用進化的戦略(CMA-ES)と称するパラメータ推定戦略を使用して極小化(minimize)される。これによって、処理によって得られた変更された代謝物プロファイルに対応する一連の変化パラメータを生成し、薬物または毒物によって影響を受ける酵素、プロセスまたは輸送体を表すことが可能となる。変更されたパラメータを、恒常性インシリコ肝臓モデルへの入力としてここで使用し、インビボにおける肝臓毒性を予測するためにシミュレーションを行う。前記のアプローチを、以下により詳細に述べる。
【００１５】
ステップ1および2:実験データの収集およびその後の変化した代謝物プロファイルの生成
肝臓特異的細胞または細胞系を公知の用量の薬物または毒物で処理する。処理後、細胞を収集し、細胞抽出物を調製する。これらの抽出物において、代謝物プロファイルの薬物誘導性変化は、生化学アッセイ、質量分析法、NMRまたは当業界で公知の代謝物プロファイルを得るための任意のその他の技術などの任意の技術によって得ることができる。次に、これらを薬物無しで得られた値と比較する。これらの未処理の値から著しい変化のある代謝物を同定する。これによって、変化した代謝物1と称するものが生成される。
【００１６】
ステップ3:パラメータ推定
代謝物は、いくつかの酵素、輸送体またはプロセスが変化し、恒常的な速度と比較して異なる速度で機能するので、肝細胞中で変化する。変化したプロセスを同定するために、酵素、輸送体およびプロセスがパラメータとしてモデル化されている恒常性インシリコ肝臓モデルと共にパラメータ推定技術を使用する。共分散行列適用進化的戦略(CMA-ES)は、目的の(適応度)関数を解くために使用される微分情報を用いない確率的数値最適化法である。探索操作としての変異および選択の解法に実際のパラメータ値を使用する。新規パラメータ値は、生物学的事象の微分情報に基づく最適化に関連した数値的困難性を克服するCMA-ESを使用することによって、最小値(global minimum)を得るために決定される。本発明では、最適化問題は、最小限に抑えるべき目的関数を定義することによって定式化される。これは、インシリコモデルで予測された変化した代謝物プロファイル(変化した代謝物2と称される)と実験的に得られた変化した代謝物プロファイル(変化した代謝物1)との間の誤差である。
【００１７】
CMA-ES法を開始するために、μパラメータセットの初期集団を選択して、ラムダ変異体を生成する。一実施形態では、μは任意の正の整数であり得る。インシリコモデルに全パラメータセットを与え、シミュレーションによって代謝物プロファイル(変化した代謝物2と称する)を生成する。この変化した代謝物2を変化した代謝物1と比較して、その差を推定する。差が、予め定義した適応度基準よりも大きい場合、パラメータセットを破棄する。適応度の順位に基づいた、最良の適応度パラメータセットは次の生成の元となる。前記の新規パラメータセットがESを使用して生成され、CMAを使用して新たに生成されたセットにおけるパラメータの値を計算する。変異および交差を実施して、このパラメータセット生成を正確に行う。次に、新規代謝物プロファイルを生成するために、変更されたパラメータセットをインシリコモデルに与える。前記CMA-ES法は、所望する最終基準が満たされるまで継続される。最終基準とは、差が予め定義された適応度基準よりも小さくなるときである。前記で説明した方法によって得られたパラメータセットは、以下のステップ4で記載するように、恒常性モデルの入力として与えられる。
【００１８】
本開示の例示的実施形態では、適応度基準10-8を有する40個の無作為に生成されたパラメータセットの初期集団を使用する。正規化された重み係数1/C2を適応度関数で使用する。
【００１９】
ステップ4:インビボにおける毒性機序の予測
前述したように推定されたパラメータは、酵素、輸送体およびプロセスの変化を表す。これがインビボにおいてどのように肝臓に影響を及ぼすかを理解するために、次に、これらのパラメータを肝臓モデルに与え、シミュレーションを実施する。このシミュレーションの結果によって、インビボにおける肝臓の状態が明らかになり、したがって、実験的薬物処理の代謝物プロファイルが与えられれば、利用者はインビボにおける新規薬物の効果の予測を効果的に得る。
【００２０】
前記は開示を実施する例示的モデルであり、限定的であることを意図するものではない。本開示の精神および範囲を逸脱することなく変更を行うことができることは当業者には明らかであろう。
【００２１】
本開示はさらに、以下の実施例および添付の図面を用いてさらに詳しく述べられる。しかし、これらの実施例は、本開示の範囲を限定するものち解釈するべきではない。
【００２２】
(実施例)
開示の適用性を試験し、アプローチが正しいことを確認する(validate)ために、一組の薬物を選択する。これらは、アセトアミノフェン、ジクロフェナク、シクロスポリン、バルプロ酸およびアミオダロンである。これらの薬物が毒性を引き起こす機序は、文献で詳細に報告されている。
【００２３】
薬物処理後の代謝物プロファイルは全て、ラット幹細胞初代培養から実験的に得られる。次に、薬物誘導性代謝物プロファイルを未処理細胞の代謝物プロファイルと比較して変化した代謝物1を得る。適応度基準10-8を有する40個の無作為に生成されたパラメータセットの初期集団を使用し、以下の薬物について変化した可能性のあるパラメータのセットを推定する前述のCMA-ES法を適用する。さらに、パラメータ変化のレベルを実験的に測定することが可能ならばいつでも、一連の生化学アッセイを実施する。パラメータの推定される変化(%)(% change)の集計値および実験によって観察されたデータ(または出版文献のデータ)による確認はよく一致しており、本開示は状況に応じて毒性についての見通しを与えることができることを示している。これらの結果を以下にまとめて示す。
【００２４】
(実施例1)
アセトアミノフェンを用いた研究
アセトアミノフェンは、広く使用されている鎮痛剤であり、過剰投与が肝毒性の発症に関わることが多い。既に記載された最終基準に到達するには、計19470のパラメータセットの評価が必要である。
【００２５】
推定および測定されたパラメータの変化(%)の結果をTable 1（表1）に示す。
【００２６】
【表１】
0005678215.tif 000002
【００２７】
(実施例2)
アミオダロンを用いた研究
アミオダロンは、不整脈の臨床管理で使用される薬物である。肝臓障害のよく知られた形態である脂肪肝または脂肪過多症の発症を引き起こすことが知られている。この場合、最終基準に到達するには、26070のパラメータセットの評価が必要である。推定および観察されたパラメータの変化(%)の結果をTable 2（表2）に示す。
【００２８】
【表２】
0005678215.tif 000003
【００２９】
(実施例3)
シクロスポリンを用いた研究
シクロスポリンは、免疫抑制剤である。移植の状況下で使用されることが多い。肝臓に胆汁うっ滞性の損傷を引き起こすことが知られている。シクロスポリンの場合、最終基準に到達するには、27880のパラメータセットの評価が必要である。推定および観察されたパラメータの変化(%)の結果をTable 3（表3）に示す。
【００３０】
【表３】
0005678215.tif 000004
【００３１】
(実施例4)
ジクロフェナクを用いた研究
ジクロフェナクは、酸化ストレスによって肝毒性を引き起こす、一般的に使用されるNSAID(非ステロイド性抗炎症剤)である。観察されたパラメータセットは、その肝毒性の機序の文献所見と一致する。この場合、最終基準を満たす前に、22860のパラメータセットの評価を実施する。推定および観察されたパラメータの変化(%)の結果をTable 4（表4）に示す。
【００３２】
【表４】
0005678215.tif 000005
【００３３】
(実施例5)
バルプロ酸を用いた研究
バルプロ酸は、てんかんの治療に使用される。ミトコンドリアでのベータ酸化の阻害を引き起こし、したがって脂肪肝の発症を引き起こすことも知られている。この分子の酸性の性質が、この現象の発現の原因となるという仮説が立てられている。我々の方法はまた、ベータ酸化の重要な酵素、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼの還元が、細胞がこの薬物に曝露したときに変化するパラメータの1つであることを示している。この場合、30050のパラメータセットの評価が実施される。結果をTable 5（表5）に示す。
【００３４】
【表５】
0005678215.tif 000006
【００３５】
この開示が正しいことを確認するために、生化学的酵素アッセイを使用する。しかし、NMR、質量分析法などの方法はまた、代謝物データ収集のために使用することができる。これらは、非侵襲性のハイスループットな方法で実施することができるので、本開示は、毒性研究における生きた動物の使用を減らす可能性を有する。
【図１】
0005678215.tif 000007