(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐ−セレクチンに結合し、補体因子Ｃ１ｑに結合せず、ＮＫ細胞上のＦｃγ受容体に結合せず、ヒト起源由来のＦｃ部分を含む抗体であって、配列番号２１のアミノ酸配列によって定義されるＬ鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３部、および、配列番号２２によって定義されるＨ鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３部を含み、精製Ｐ−セレクチンへの白血球様ＨＬ６０細胞の結合を０．０８〜０．５μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で阻害することを特徴とする抗体。
【請求項２】
ａ）ヒト抗体またはヒト化抗体であり、かつ
ｂ）Ｐ−セレクチンとＥ−および／またはＬ−セレクチンとをマイクロタイタープレートに被覆する細胞性ＥＬＩＳＡでのＥＣ５０値によって測定されるように、Ｅ−またはＬ−セレクチンよりもＰ−セレクチンに対して少なくとも１０００倍高く特異的に結合することを特徴とする、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
配列番号２１のアミノ酸配列によって定義されるＬ鎖可変ドメインおよび配列番号２２によって定義されるＨ鎖可変ドメインを含む、請求項１または２記載の抗体。
【請求項４】
Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、および／もしくはＰ３２９に少なくとも一つの突然変異を含むヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体であるか、またはＳ２２８がＰに置換され、Ｌ２３５がＥに置換されたヒトサブクラスＩｇＧ４の抗体であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の抗体。
【請求項５】
Ｓ２２８がＰに置換され、Ｌ２３５がＥに置換されたヒトサブクラスＩｇＧ４の抗体であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の抗体。
【請求項６】
ヒトＨ鎖定常部が、配列番号２８のアミノ酸配列を含み、および、κＬ鎖定常部が配列番号２３に定義されたとおりである、請求項１〜５のいずれか１項記載の抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の抗体分子をコードする、核酸分子。
【請求項８】
請求項７記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項９】
請求項８記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体分子を調製するための方法であって、該抗体分子の合成を可能にする条件下で請求項９記載の宿主細胞を培養することと、該培養物から該抗体分子を回収することとを含む、方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体分子または請求項１０記載の方法によって生成される抗体分子を含む、組成物。
【請求項１２】
薬学的組成物または診断用組成物である、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体と、少なくとも一つの薬学的に許容されうる賦形剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
炎症障害および血栓障害の予防および処置において使用するための、請求項１〜６のいずれか１項記載のまたは請求項１０に記載の方法によって生成された抗体。
【請求項１５】
障害が、末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）または重症肢虚血（ＣＬＩ）である、請求項１４記載の抗体。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１項記載の抗体分子、請求項７記載の核酸分子、請求項８記載のベクター、または請求項９記載の宿主細胞を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に抗Ｐ−セレクチン抗体、特に補体因子Ｃ１ｑと結合しない抗Ｐ−セレクチン抗体に関するものである。 好ましくは、これらの抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。
【０００２】
Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ、ＧＭＰ−１４０、ＰＡＤＧＥＭ、ＬＥＣＡＭ−３）は、トロンビンおよび他のアゴニストに応答して活性化血小板および内皮の表面に発現する１４０kDaのカルシウム依存性糖質結合タンパク質である（McEver et al, J Biol Chem 270:11025 (1995); Varki, Proc Natl Acad Sci USA 91:7390 (1994); Springer TA, Annu Rev Physiol 57:827 (1995)）。両方の種類の細胞では、Ｐ−セレクチンは分泌顆粒、すなわち血小板のα顆粒および内皮細胞のＷｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ小体に貯蔵される（McEver et al., J Clin Invest 84:92 (1984)）。Ｐ−セレクチンは、ＮＨ２末端レクチンドメインの後にＥＧＦ様ドメイン、補体調節タンパク質に相同性を有する９個のショートコンセンサスリピート（short consensus repeat）、膜貫通ドメイン、および短鎖の細胞質側末端が続いたものから構成されるＩ型膜貫通糖タンパク質である（Johnston et al., Cell 56:1033 (1989)）。Ｐ−セレクチンの構造は、セレクチンファミリーの他の二つのメンバーであるＥ−セレクチンおよびＬ−セレクチンと類似しており、これらのセレクチンは、サイトカインによって活性化した内皮細胞に発現している（Ｅ−セレクチン）か、または大部分のクラスの白血球上に構成的に発現している（Ｌ−セレクチン）かのいずれかである。
【０００３】
全てのセレクチンは、シアリルルイスｘ（ｓＬｅｘ; Foxall et al., J Cell Biol 117:895 (1992); Varki, Curr Opin Cell Biol 257:257 (1992)）のような低分子シアリル化フコシル化オリゴ糖に低親和性で結合することが公知である。Ｅ−セレクチンではなくＰ−セレクチンおよびＬ−セレクチンは、ヘパリン硫酸のような特定の硫酸化糖質にも結合する（総説については、McEver and Cummings, J Clin Invest 100:S97 (1997)を参照されたい）。Ｐ−セレクチンに対する高親和性リガンドは、ムチン様糖タンパク質（McEver et al., J Biol Chem 270:11025 (1995)）であり、その糖タンパク質は、シアリル化Ｏ−グリカンのクラスターを有するポリペプチド主鎖からなる。Ｐ−セレクチンが優先的に結合するあるシアロムチンリガンドは、循環している白血球によって、約１２０kDaの相対分子量を有する二つのジスルフィド結合サブユニットを有するホモ二量体として通常は発現されるＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド１（ＰＳＧＬ−１、ＣＤ１６２）である。Ｐ−セレクチンの結合部位は、ＰＳＧＬ−１のＮＨ２末端の最末端部分に局在する。そのリガンドに結合することによって、Ｐ−セレクチンは活性化血小板および内皮細胞上での白血球のローリングを仲介する。このローリング過程は、白血球の移動速度を効果的に低下させ、強固な接着および内皮下への白血球のその後の移行に、また血栓への白血球の蓄積にも欠かせない。
【０００４】
Ｐ−セレクチン欠損マウスおよびＰ−セレクチン特異的遮断抗体を用いた研究から、虚血／再潅流傷害を含めた多数の急性および慢性炎症疾患の病態生理にＰ−セレクチンが関係することが示された（Winn et al., J Clin Invest 92:2042 (1993); Massberg et al., Blood 92:507 (1998)）。さらに、アテローム性動脈硬化症（Collins et al., J Exp Med 191: 189 (2000); Johnson et al., J Clin Invest 99:1037 (1997)）、再狭窄（Manka et al., Circulation 103:1000 (2001); Bienvenu et al., Circulation 103:1128 (2001)）および血栓症（Kumar et al., Circulation 99:1363 (1999); Andre et al., Proc Natl Acad Sci USA 97:13835 (2000); Blann et al., Br. J. Haematol 108:191 (2000); Myers et al., Thromb Haemostasis 85: 423 (2001)のような炎症性構成要素を有する心血管疾患にＰ−セレクチンは明らかに寄与している。どうやら、Ｐ−セレクチン機能の阻害は、血管内皮または血小板に対する白血球の接着を伴う種々の疾患での治療として有効であろう（例えばＷＯ９３／０６８６３を参照されたい）。
【０００５】
Ｐ−セレクチンに対する抗体は、当技術分野の現状に記載され、それらの抗体の抗炎症効果および抗血栓効果に関して研究されてきた。米国特許第４，７８３，３９９号およびＷＯ９３／０６８６３は、活性化血小板と反応性のＰ−セレクチンに対するマウスモノクローナル抗体を記載している。Geng J. G.ら（J. Biol. Chem., 266 (1991) 22313-22318）は、Ｐ−セレクチンのアミノ酸（ａａ）フラグメントａａ６０〜７５（シグナル配列を含むスイスプロット配列Ｐ１６１０９により計数してＣｙｓからＧｌｕ。ＷＯ９３／２１９５６はＰ−セレクチンに対するマウスモノクローナル抗体と、規定の抗体と競合してＰ−セレクチンフラグメントａａ６０〜７５の存在下で結合するＩｇＧ１サブクラスのヒト化抗体とを参照している）にカルシウムイオンの不在下で結合するマウスモノクローナル抗体を記載している。挙げられた、ヒトＰ−セレクチンに対するマウスモノクローナル抗体のどれも、ヒト患者の処置に有用ではない。ＷＯ９３／２１９５６に挙げられたＰ−セレクチンに対するヒトＩｇＧ１サブクラスのヒト化抗体は、開発の前臨床段階にある（www.mrctechnology.org）。
【０００６】
発明の開示
本発明は、Ｐ−セレクチンと結合して、ヒト補体因子Ｃ１ｑと結合しないことを特徴とする抗体に関するものである。好ましくは、この抗体はＮＫ細胞上のヒトＦｃγ受容体にも結合しない。本発明による抗体は、ヒト起源由来のＦｃ部分を含む。好ましくは、これらの抗体はヒト化抗体またはヒト抗体である。これらの抗体は、特に末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）および重症肢虚血（ＣＬＩ）による炎症障害および血栓障害を患う患者に利益をもたらす新しい発明的な性質を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明の抗体がマイクロタイタープレートに被覆した精製Ｐ−セレクチンに対する白血球様ＨＬ６０細胞の接着を阻害することを示す図である。突然変異抗体は非突然変異親抗体よりも強力である。
【図２】ＨＬ６０細胞に対するトロンビン活性化血小板の接着を測定するロゼット形成アッセイでの本発明の抗体の阻害活性を示す図である。
【図３ａ】本発明の抗体とラットおよびカニクイザルＰ−セレクチンとの交差反応性を示す図である。抗Ｐ−セレクチン抗体はＨＬ６０細胞に対するトロンビン活性化ラット血小板の接着に影響しないが、一方で商業的に入手できるポリクローナル抗Ｐ−セレクチン抗体（Pharmingen 09361A）はこの相互作用を阻害する。
【図３ｂ】本発明の抗体とラットおよびカニクイザルＰ−セレクチンとの交差反応性を示す図である。本発明の抗体はＨＬ６０細胞に対するカニクイザル活性化血小板の接着を阻害する。
【図４ａ】Ｐ−、Ｅ−、およびＬ−セレクチントランスフェクタントに関する代表的な結合曲線によりＥ−およびＬ−セレクチンに比べてＰ−セレクチンに対する抗体の選択性を実証する図である。本発明による抗体は、０．０１から０．０７μg/mlの範囲のＥＣ５０値でＰ−セレクチンＣＨＯ細胞に結合する。Ｅ−セレクチンＣＨＯ細胞およびＬ−セレクチン３００．１９細胞に関するＥＣ５０値は好ましくは１００μg/mlよりも大きい。
【図４ｂ】Ｐ−、Ｅ−、およびＬ−セレクチントランスフェクタントに関する代表的な結合曲線によりＥ−およびＬ−セレクチンに比べてＰ−セレクチンに対する抗体の選択性を実証する図である。本発明による抗体は、０．０１から０．０７μg/mlの範囲のＥＣ５０値でＰ−セレクチンＣＨＯ細胞に結合する。Ｅ−セレクチンＣＨＯ細胞およびＬ−セレクチン３００．１９細胞に関するＥＣ５０値は好ましくは１００μg/mlよりも大きい。
【図４ｃ】Ｐ−、Ｅ−、およびＬ−セレクチントランスフェクタントに関する代表的な結合曲線によりＥ−およびＬ−セレクチンに比べてＰ−セレクチンに対する抗体の選択性を実証する図である。本発明による抗体は、０．０１から０．０７μg/mlの範囲のＥＣ５０値でＰ−セレクチンＣＨＯ細胞に結合する。Ｅ−セレクチンＣＨＯ細胞およびＬ−セレクチン３００．１９細胞に関するＥＣ５０値は好ましくは１００μg/mlよりも大きい。
【図５】完全ヒト流動系での本発明の抗体の阻害活性を示す図である。これらの抗体は剪断速度６５/sで濃度依存的に血小板単層へのヒト白血球の接着を阻害する。
【図６ａ】Ｐ−セレクチンを発現しているヒト内皮細胞に対する白血球の接着に及ぼす本発明の抗体の阻害効果を示す図である。対照に対する％で表した白血球の接着の合計阻害を明らかにする。
【図６ｂ】Ｐ−セレクチンを発現しているヒト内皮細胞に対する白血球の接着に及ぼす本発明の抗体の阻害効果を示す図である。種々の白血球サブセットの絶対数に及ぼす抗体の一つの阻害効果を代表的に示す。
【０００８】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
用語「Ｐ−セレクチン」はHsu-Lin et al., J Biol Chem 259: 9121 (1984)およびMc Ever et al., J Clin Invest 84:92 (1989)に記載されたような、ヒト血小板および内皮細胞によって発現される１４０kDaのタンパク質を指す。このＩ型膜貫通糖タンパク質は、ＮＨ２末端レクチンドメインの後に上皮増殖因子（ＥＧＦ）様ドメインおよび９個のコンセンサスリピートドメインが続いたものから構成される。Ｐ−セレクチンは、単一の膜貫通ドメインによって膜に固定され、短鎖の細胞質側末端を含む。本発明は、Ｐ−セレクチンによって仲介される一つまたは複数の生物学的活性、例えば、炎症活性または血栓活性を阻害できる抗体を提供する。この抗体はＰ−セレクチンに結合し、Ｐ−セレクチンとそのリガンドとの結合を妨害することによって作用する。
【０００９】
用語「Ｐ−セレクチンリガンド」は、Moore et al., J Cell Biol 118:2445 (1992)、Sako et al., Cell 75:1179 (1993)によって記載されたようなムチン様糖タンパク質であるＰ−セレクチンリガンド糖タンパク質１（ＰＳＧＬ−１）のような高親和性生物関連Ｐ−セレクチンリガンドに好ましくは関するものである。ＰＳＧＬ−１は、シアリル化Ｏ−グリカンのクラスターと連結した一連の１０個のリピートを含む、セリン、トレオニン、およびプロリンに富む細胞外ドメインを有するＩ型膜タンパク質である。ＰＳＧＬ−１は、循環している白血球によって約１２０kDaの相対分子量を有する二つのジスルフィド結合サブユニットを有するホモ二量体として通常は発現される。Ｐ−セレクチンの結合部位は、ＰＳＧＬ−１のＮＨ２末端の最末端部に局在する。血小板によって発現され、ＰＳＧＬ−１と構造類似性を有するシアロムチンＧＰＩｂαは、Ｐ−セレクチンに対する血小板のリガンドであると最近実証された（Romo et al, J Exp Med 190:803 (1999)。Ｐ−セレクチンに結合するＧＰＩｂαの生理学的重要性はまだ研究中であるが、その相互作用がローリングおよび活性化内皮細胞に対する血小板の接着に貢献しているようである（Berndt et al., Thromb Haemost 86:178 (2001)。Ｐ−セレクチンは、シアリルルイスｘのような低分子シアル酸化フコシル化オリゴ糖（Foxall et al., J Cell Biol 117:895 (1992), Varki, Curr Opin Cell Biol 257 (1992)にも、特にヘパリン硫酸のような硫酸化糖質（McEver et al., J Biol Chem 270:11025 (1995)にも低親和性で結合する。
【００１０】
用語「抗体」は、本発明による性質が保たれる限りは全抗体、抗体フラグメント、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、および遺伝子操作抗体（変異抗体または突然変異抗体）を含むがそれに限定されるわけではない多様な形態の抗体、好ましくはモノクローナル抗体を包含する。特に組換えヒト抗体としてのヒトまたはヒト化モノクローナル抗体が特に好ましい。
【００１１】
本明細書に使用するような用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、単一のアミノ酸組成の抗体分子の調製物を指す。
【００１２】
用語「キメラ抗体」は、ある起源または種からの可変部、すなわち結合部と、異なる起源または種由来の定常部の少なくとも部分とを含む、組換えＤＮＡ法によって通常は調製されたモノクローナル抗体を指す。マウス可変部とヒト定常部とを含むキメラ抗体が特に好ましい。そのようなマウス／ヒトキメラ抗体は、マウス免疫グロブリン可変部をコードするＤＮＡセグメントと、ヒト免疫グロブリン定常部をコードするＤＮＡセグメントとを含む発現された免疫グロブリン遺伝子の生成物である。本発明に包含される他の形態の「キメラ抗体」は、定常部が本来の抗体の定常部から修飾または変更されて、特にＣ１ｑの結合および／またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）の結合に関して本発明による性質を発生する抗体である。そのような「キメラ」抗体は、「クラススイッチ抗体」とも称される。キメラ抗体を生成させる方法は、従来の組換えＤＮＡ法および当技術分野で現在周知である遺伝子トランスフェクション法を含む。例えばMorrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855;米国特許第５，２０２，２３８号および第５，２０４，２４４号を参照されたい。
【００１３】
用語「ヒト化抗体」は、フレームワーク部または「相補性決定部」（ＣＤＲ）が修飾されて親免疫グロブリンとは特異性が異なる免疫グロブリンＣＤＲを含む抗体を指す。好ましい態様では、マウスＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク部にグラフトして、「ヒト化抗体」を調製する。例えばRiechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327;およびNeuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270を参照されたい。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体および二機能抗体に関して上に述べたように、抗原を認識する配列を表すＣＤＲに対応する。本発明に包含される他の形態の「ヒト化抗体」は、定常部が本来の抗体から修飾または変更されて、特にＣ１ｑの結合および／またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）の結合に関して本発明による性質を発生する抗体である。
【００１４】
本明細書に使用するような用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の可変部および定常部を有する抗体を含むことを意図する。ヒト抗体は、当技術分野の現状で周知である (van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5:368 (2001)。内因性免疫グロブリンの生成の不在下で免疫処置に応じてヒト抗体の全レパートリーを生成できるトランスジェニック動物（例えばマウス）でヒト抗体を生成させることもできる。そのような生殖細胞系突然変異マウスへのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの導入は、抗原による攻撃誘発に応答してヒト抗体の生成を招くであろう（例えばJakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551-2555 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)を参照されたい）。ファージディスプレイライブラリーでもヒト抗体を生成させることができる（Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992); Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581 (19991)）。ColeらおよびBoernerらの技法もヒトモノクローナル抗体の調製に利用できる（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985)およびBoerner et al., J. Immunol., 147(l):86-95 (1991)）。本発明によるキメラ抗体およびヒト化抗体に関してすでに触れたように、本明細書に使用するような用語「ヒト抗体」は、定常部で修飾されて、特にＣ１ｑの結合および／またはＦｃＲの結合に関して本発明による性質を発生する抗体も含む。さらに、本発明はＣ１ｑおよび／またはＦｃＲに結合するヒト抗体を含む。そのようなヒト抗体は、Ｅ−およびＬ−セレクチンよりもＰ−セレクチンに対する高い選択性を特徴とする。本発明によるそのような抗体は、０．０１から０．０７μg/mlの範囲のＥＣ５０値で、Ｐ−セレクチン発現細胞に結合する。Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチン発現細胞に関するＥＣ５０値は、好ましくは１００μg/mlよりも大きい。そのような抗体は、本発明による性質を有するヒト抗体を製造するための中間体として好ましくは有用である。
【００１５】
本明細書に使用するような用語「組換えヒト抗体」は、ＮＳ０もしくはＣＨＯ細胞のような宿主細胞から、またはヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックな動物（例えばマウス）から単離された抗体、あるいは宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体のような、組換え手段によって調製、発現、作出、または単離された全てのヒト抗体を含むことを意図する。本発明による組換えヒト抗体は、再編成された形態の可変部および定常部を有する。本発明による組換えヒト抗体は、インビボ体細胞高頻度突然変異に供されている。よって、これらの組換え抗体のＶＨおよびＶＬ部のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨおよびＶＬ配列に由来して、それらの配列に関係する一方で、自然にはインビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリーに存在しないおそれがある配列である。
【００１６】
「可変部」（本明細書に使用するようなＬ鎖可変部（ＶＬ）、Ｈ鎖可変部（ＶＨ））は、抗原に対する抗体の結合に直接関与するＬ鎖およびＨ鎖のペアのそれぞれを示す。ヒト可変部Ｌ鎖およびＨ鎖のドメインは同じ一般構造を有し、各ドメインは四つのフレームワーク（ＦＲ）部を含み、その配列は広く保存され、三つの「超可変部」（または相補性決定部ＣＤＲ）によって連結している。フレームワーク部はβシートコンホメーションを採り、ＣＤＲはβシート構造を連結しているループを形成する場合がある。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク部によって三次元構造に保持され、もう一方の鎖からのＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。抗体Ｈ鎖およびＬ鎖のＣＤＲ３部は、本発明による抗体の結合特異性／親和性に特に重要な役割を演じ、よって本発明のさらなる目的を提供する。
【００１７】
用語「超可変部」または「抗体の抗原結合部分」は、本明細書に使用する場合に、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変部は、「相補性決定部」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」部または「ＦＲ」部は、本明細書に定義するような超可変部の残基以外の可変ドメイン部である。よって、抗体のＬ鎖およびＨ鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４ドメインを含む。特に、Ｈ鎖ＣＤＲ３は抗原結合に最も寄与する領域である。ＣＤＲおよびＦＲ部は、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）の標準的な定義および／または「超可変ループ」の残基によって決定される。
【００１８】
本明細書に使用するような用語「核酸または核酸分子」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖または二本鎖の場合があるが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００１９】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合に「作動可能に連結」される。例えば、プレ配列または分泌リーダーがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質としてポリペプチドが発現するならば、そのプレ配列または分泌リーダー配列に関するＤＮＡはそのポリペプチドに関するＤＮＡと作動可能に連結され、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列の転写に影響するならば、そのプロモーターまたはエンハンサーはその配列に作動可能に連結され、また、リボソーム結合部位が翻訳を促進するように位置するならば、そのリボソーム結合部位はコード配列に作動可能に連結される。一般に「作動可能に連結した」は、連結されたＤＮＡ配列が隣接し、分泌リーダーの場合は隣接して読出し期であることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要がない。連結は、都合のよい制限部位での連結反応によって実現される。そのような制限部位が存在しないならば、従来の常法により合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
【００２０】
本明細書に使用するような表現「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養物」は相互交換可能に使用され、そのような呼称の全ては子孫を含む。このように、語「形質転換体」および「形質転換細胞」は、初代対象細胞および継代数とは無関係にそれ由来の培養物を含む。全ての子孫は、故意または偶然の突然変異が原因でＤＮＡ含量が厳密には同一ではない場合があることも了解されている。本来形質転換された細胞でスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫も含まれる。別個の呼称が意図される場合は、情況から明らかであろう。
【００２１】
「定常ドメイン」は、抗原に対する抗体の結合に直接関与せず、様々なエフェクター機能を示す。Ｈ鎖定常部のアミノ酸配列に応じて、抗体または免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭのクラスに分かれ、これらのいくつかをサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４と、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２とにさらに分けることができる。種々のクラスの免疫グロブリンに対応するＨ鎖定常部は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。本発明による抗体は、好ましくはＩｇＧ型である。
【００２２】
抗体のＦｃ部分は補体活性化、すなわちＣ１ｑの結合およびＦｃ受容体の結合に直接関与する。補体系に及ぼす抗体の影響はある状態に依存するが、Ｃ１ｑに対する結合は、Ｆｃ部分での所定の結合部位によって起こる。そのような結合部位は、当技術分野の現状で公知であり、例えばBoakle et al., Nature 282 (1975) 742-743; Lukas et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560, Brunhouse and Cebra, Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie et al., J. Immunol.164 (2000) 4178-4184; Hezareh et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168; Morgan et al., Immunology 86 (1995) 319-324、ＥＰ０３０７４３４に記載されている。そのような結合部位は、例えばＬ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、およびＰ３２９（Kabat、下記参照のＥＵインデックスにより付番）である。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３の抗体は、通常は補体活性化とＣ１ｑおよびＣ３の結合を示すが、一方ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、Ｃ１ｑおよびＣ３を結合しない。本明細書に使用するような、用語「ヒト起源由来のＦｃ部分」は、サブクラスＩｇＧ４のヒト抗体のＦｃ部分、または下記に定義するようなＣ１ｑの結合および／もしくはＦｃＲの結合を検出できないように修飾されたサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ３のヒト抗体のＦｃ部分のいずれかであるＦｃ部分を示す。「抗体のＦｃ部分」は、当業者に周知の用語であり、パパインによる抗体の切断に基づき定義される。本発明による抗体は、Ｆｃ部分としてヒト起源由来のＦｃ部分と、好ましくはヒト定常部の他の全ての部分とを含む。好ましくは、Ｆｃ部分はヒトＦｃ部分であり、特に好ましくはヒトＩｇＧ４サブクラス、またはヒトＩｇＧ１サブクラスからの突然変異Ｆｃ部分のいずれか由来である。Ｆｃ部分と、配列番号２５〜２８に示すか、またはＰＶＡ２３６突然変異を有さない配列番号２５のＨ鎖定常部とが最も好ましい。
【００２３】
ＩＩ．本発明の好ましい態様
本発明は、Ｐ−セレクチンに結合する抗体であって、該抗体の可変Ｈ鎖アミノ酸配列ＣＤＲ３がＨ鎖ＣＤＲ３配列である配列番号３８、３９、４０、４１または４２からなる群より選択されることを特徴とする、抗体を含む。
【００２４】
本発明は、可変Ｈ鎖および可変Ｌ鎖を含む、Ｐ−セレクチンに結合する抗体を好ましくは提供し、その抗体は、可変Ｈ鎖がＣＤＲ配列であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１が、配列番号２９、３０、３１、および３２からなる群より選択され、ＣＤＲ２が配列番号３３、３４、３５、３６、および３７からなる群より選択され、ＣＤＲ３が配列番号３８、３９、４０、４１、および４２からなる群より選択されることを特徴とし、ここで、該ＣＤＲは相互に独立して選択される。
【００２５】
本発明による抗体は、可変部Ｌ鎖がＣＤＲ配列であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１が配列番号４３および４４より選択され、ＣＤＲ２が配列番号４５および４６より選択され、ＣＤＲ３が配列番号４７、４８、４９、５０、５１、および５２より選択されることを好ましくは特徴とし、ここで、該ＣＤＲは相互に独立して選択される。
【００２６】
その抗体は、Ｈ鎖ＣＤＲとして配列番号２のＣＤＲおよびＬ鎖ＣＤＲとして配列番号１のＣＤＲ、Ｈ鎖ＣＤＲとして配列番号４のＣＤＲおよびＬ鎖ＣＤＲとして配列番号３のＣＤＲ、Ｈ鎖ＣＤＲとして配列番号６のＣＤＲおよびＬ鎖ＣＤＲとして配列番号５のＣＤＲ、Ｈ鎖ＣＤＲとして配列番号８のＣＤＲおよびＬ鎖ＣＤＲとして配列番号７のＣＤＲ、Ｈ鎖ＣＤＲとして配列番号１０のＣＤＲおよびＬ鎖ＣＤＲとして配列番号９のＣＤＲ、Ｈ鎖ＣＤＲとして配列番号１２のＣＤＲおよびＬ鎖ＣＤＲとして配列番号１１のＣＤＲ、Ｈ鎖ＣＤＲとして配列番号１４のＣＤＲおよびＬ鎖ＣＤＲとして配列番号１３のＣＤＲ、Ｈ鎖ＣＤＲとして配列番号１６のＣＤＲおよびＬ鎖ＣＤＲとして配列番号１５のＣＤＲ、Ｈ鎖ＣＤＲとして配列番号１８のＣＤＲおよびＬ鎖ＣＤＲとして配列番号１７のＣＤＲ、Ｈ鎖ＣＤＲとして配列番号２０のＣＤＲおよびＬ鎖ＣＤＲとして配列番号１９のＣＤＲ、またはＨ鎖ＣＤＲとして配列番号２２のＣＤＲおよびＬ鎖ＣＤＲとして配列番号２１のＣＤＲを含むことを好ましくは特徴とする。
【００２７】
Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義によりＣＤＲ配列を決定できる。各鎖のＣＤＲは、フレームワークアミノ酸によって引き離されている。配列番号１〜２２のＣＤＲを配列番号２９〜５２に示す。
【００２８】
本発明による抗体は、該抗体がＰ−セレクチンと結合し、以下からなる群より独立して選択されるＨ鎖可変部およびＬ鎖可変部を含むことを好ましくは特徴とする：
ａ）配列番号２のアミノ酸配列によって定義されるＨ鎖可変ドメインおよび配列番号１によって定義されるＬ鎖可変ドメイン；
ｂ）配列番号４のアミノ酸配列によって定義されるＨ鎖可変ドメインおよび配列番号３によって定義されるＬ鎖可変ドメイン；
ｃ）配列番号６のアミノ酸配列によって定義されるＨ鎖可変ドメインおよび配列番号５によって定義されるＬ鎖可変ドメイン；
ｄ）配列番号８のアミノ酸配列によって定義されるＨ鎖可変ドメインおよび配列番号７によって定義されるＬ鎖可変ドメイン；
ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列によって定義されるＨ鎖可変ドメインおよび配列番号９によって定義されるＬ鎖可変ドメイン；
ｆ）配列番号１２のアミノ酸配列によって定義されるＨ鎖可変ドメインおよび配列番号１１によって定義されるＬ鎖可変ドメイン；
ｇ）配列番号１４のアミノ酸配列によって定義されるＨ鎖可変ドメインおよび配列番号１３によって定義されるＬ鎖可変ドメイン；
ｈ）配列番号１６のアミノ酸配列によって定義されるＨ鎖可変ドメインおよび配列番号１５によって定義されるＬ鎖可変ドメイン；
ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列によって定義されるＨ鎖可変ドメインおよび配列番号１７によって定義されるＬ鎖可変ドメイン；
ｊ）配列番号２０のアミノ酸配列によって定義されるＨ鎖可変ドメインおよび配列番号１９によって定義されるＬ鎖可変ドメイン；
ｋ）配列番号２２のアミノ酸配列によって定義されるＨ鎖可変ドメインおよび配列番号２１によって定義されるＬ鎖可変ドメイン。
【００２９】
本発明による抗体は、Ｈ鎖可変部が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、および２２からなる群より独立して選択されるアミノ酸配列を含むことを好ましくは特徴とする。
【００３０】
本発明による抗体は、Ｌ鎖可変部が配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、および２１からなる群より独立して選択されるアミノ酸配列を含むことを好ましくは特徴とする。
【００３１】
本発明は、Ｐ−セレクチンと結合し、補体因子Ｃ１ｑおよび／またはＦｃ受容体と結合しない抗体を述べる。これらの抗体は、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を誘発しない。好ましくは、この抗体は、Ｐ−セレクチンと結合し、ヒト起源由来のＦｃ部分を含み、かつ補体因子Ｃ１ｑと結合しないことを特徴とする。さらに好ましくは、この抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。
【００３２】
本発明による抗体は、定常鎖がヒト起源であることを好ましくは特徴とする。そのような定常鎖は当技術分野の現状において周知であり、例えばKabatに記載されている（例えばJohnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照されたい）。例えば有用なヒトＨ鎖定常部は、配列番号２４、２５、２６、２７、および２８からなる群より独立して選択されるアミノ酸配列を含む。例えば有用なヒトＬ鎖定常部は、配列番号２３のカッパＬ鎖定常部のアミノ酸配列を含む。
【００３３】
抗体Ｆｃ部のＦｃ部分によって仲介されるエフェクター機能は、抗原に対する抗体の結合後に作動するエフェクター機能を指す（これらの機能は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）による補体カスケードの活性化および／または細胞活性化を含む）。
【００３４】
補体カスケードの機能をＣＨ５０アッセイによって評価できる。抗赤血球抗体（ＥＡ）で感作されたヒツジ赤血球を被験血清に加えて古典的経路を活性化する結果として、溶血が生じる。５０％の赤血球を溶解させるのに必要な血清の容積がＣＨ５０ユニットを決定する。ＡＰ−ＣＨ５０は代替経路および最終経路の尺度となる。その手順は、ウサギ赤血球を使用する以外は同様である。代替経路は被験血清の添加に応じて活性化する。
【００３５】
Ｃ１ｑと、二つのセリンプロテアーゼであるＣ１ｒおよびＣ１ｓとは、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）経路の第一成分である複合体Ｃ１を形成する。補体カスケードを活性化するために、抗原性標的に付着したＣ１ｑは少なくとも２分子のＩｇＧ１または１分子のＩｇＭと結合する（Ward and Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77-94 (1995)）。Burton（Molec. Immunol., 22(3): 161-206 (1985)）は、アミノ酸残基３１８から３３７を含むＨ鎖部が補体の固定に関与していると記載した。DuncanおよびWinter（Nature 332:738-40 (1988)）は部位特異的突然変異誘発を使用して、Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、およびＬｙｓ３２２がＣ１ｑに対する結合部位を形成すると報告した。Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、およびＬｙｓ３２２残基がＣ１ｑの結合に果たす役割は、これらの残基を含む短鎖合成ペプチドが補体介在性溶解を阻害できることによって確認された。
【００３６】
用語「補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）」は、本発明による抗体による、補体の存在下でのＰ−セレクチンを発現しているヒト内皮細胞および血小板の溶解を指す。ＣＤＣは、Ｐ−セレクチンを発現しているヒト内皮細胞および血小板を補体の存在下で本発明による抗体で処理することによって好ましくは測定される。細胞をカルセインで好ましくは標識する。抗体が３０μg/mlの濃度で標的細胞の２０％以上に溶解を誘導するならば、ＣＤＣが認められる。しかし、本発明者らは、本発明による抗体の性質にはＥＬＩＳＡアッセイで補体因子Ｃ１ｑに対する減少した結合が不可欠であると見出した。そのようなアッセイでは、原則としてＥＬＩＳＡプレートに様々な濃度範囲の抗体を被覆し、そのプレートに精製ヒトＣ１ｑまたはヒト血清を加える。Ｃ１ｑの結合をＣ１ｑに対する抗体に続いてペルオキシダーゼ標識コンジュゲートによって検出する。結合（最大結合Ｂｍａｘ）の検出をペルオキシダーゼの基質であるＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホナート（６）］）に関する４０５nmでの吸光度（ＯＤ４０５）として測定する。したがって、本発明は抗体を説明し、その抗体は、補体因子Ｃ１ｑに対するその抗体の非結合がそのようなＥＬＩＳＡアッセイ測定を参照することを特徴とし、ここで、抗体濃度１０μg/mlでその抗体に対するＣ１ｑの最大結合（Ｂｍａｘ）が、細胞系ｈｕ−Ｍａｂ＜Ｐ−セレクチン＞ＬＣ１００４−００２（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６４１）の抗体ＬＣ１００４−００２のＢｍａｘの３０％以下、好ましくは２０％以下である。
【００３７】
本発明による抗体がＥＬＩＳＡアッセイにおいて補体因子Ｃ３に対して減少した結合を示すこともさらに好ましい。Ｃ１ｑアッセイと同様にしてアッセイを行う。そのようなアッセイでは原則としてＥＬＩＳＡプレートを様々な濃度範囲の抗体で被覆し、そのプレートに精製ヒトＣ３またはヒト血清を加える。Ｃ３に対する抗体に続いてペルオキシダーゼ標識コンジュゲートによってＣ３の結合を検出する。結合（最大結合Ｂｍａｘ）の検出をペルオキシダーゼの基質であるＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホナート（６）］）に関する４０５nmでの吸光度（ＯＤ４０５）として測定する。したがって、本発明は抗体を説明し、その抗体は、補体因子Ｃ３に対する抗体の非結合がそのようなＥＬＩＳＡアッセイ測定を参照することを特徴とし、ここで、抗体濃度１０μg/mlでその抗体に対するＣ３の最大結合（Ｂｍａｘ）が、細胞系ｈｕ−Ｍａｂ＜Ｐ−セレクチン＞ＬＣ１００４−００２（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６４１）の抗体ＬＣ１００４−００２のＢｍａｘの１０％、好ましくは５％以下である。
【００３８】
用語「抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）」は、Ｆｃ受容体の結合によって仲介される機能であり、本発明による抗体による、エフェクター細胞の存在下でのＰ−セレクチンを発現している標的細胞の溶解を指す。ＡＤＣＣは、新鮮単離されたＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）のようなエフェクター細胞、または単球もしくはＮＫ（ナチュラルキラー）細胞のようなバフィコート由来精製エフェクター細胞の存在下で、Ｐ−セレクチンを発現している内皮細胞調製物を本発明による抗体で処理することによって好ましくは測定される。標的細胞を５１Ｃｒで標識してから、抗体と共にインキュベートする。標識された細胞をエフェクター細胞と共にインキュベートして、放出された５１Ｃｒに関して上清を分析する。対照はエフェクター細胞存在下であるが抗体不在下で標的内皮細胞をインキュベートすることを含む。（ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現している）顆粒球、（ＦｃγＲＩＩＩを発現している）ＮＫ細胞、および（ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩを発現している）単球のようなＦｃγ受容体発現細胞に対するこれらの抗体の結合を測定することによって、これらの抗体がＡＤＣＣを仲介する初段階を誘導する能力が決定された。
【００３９】
抗体のＦｃ部とＦｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用によって、Ｆｃ受容体と結合するエフェクター機能を仲介できる。ＦｃＲは造血細胞上の専門化した細胞表面受容体である。Ｆｃ受容体は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、抗体で被覆された病原体を免疫複合体の食作用によって除去すること、ならびに対応する抗体で被覆された赤血球および他の様々な細胞標的（例えば腫瘍細胞）の抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を経由した溶解の両方を仲介することが示された。Van de Winkel and Anderson, J. Leuk. Biol. 49:511-24 (1991)。ＦｃＲは、免疫グロブリンアイソタイプに対する特異性によって定義され、ＩｇＧ抗体に対するＦｃ受容体はＦｃγＲ、ＩｇＥに対してはＦｃεＲ、ＩｇＡに対してはＦｃαＲなどと呼ばれる。Ｆｃ受容体の結合は、例えばRavetch and Kinet, Ann. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel et al., Immunomethods 4 (1994) 32-34; de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341およびGessner et al., Ann. Hematol. 76 1998) 231-248に記載されている。本発明による抗体は、Ｆｃγ受容体、好ましくはＦγｃＲＩ、ＦγｃＲＩＩＡ、ＦγｃＲＩＩＢ、および／またはＦγｃＲＩＩＩＡに対して減少した結合を示す。
【００４０】
本発明の抗体による抗体は、好ましくはエフェクター機能を全く誘発せず、ＮＫ細胞上に提示されたＦｃγＲに結合しない。よって、用語「ＦｃγＲと結合しない」は、抗体濃度１０μg/mlでのＮＫ細胞に対する本発明による抗体の結合が、細胞系ｈｕ−Ｍａｂ＜Ｐ−セレクチン＞ＬＣ１００４−００２（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６４１）の抗体ＬＣ１００４−００２に対して見いだされた結合の１％以下であることを意味する。
【００４１】
ＩｇＧ４はＦｃＲとの減少した結合を示すが、他のＩｇＧサブクラスの抗体は強い結合を示す。しかし、Ｐｒｏ２３８、Ａｓｐ２６５、Ａｓｐ２７０、Ａｓｎ２９７（Ｆｃ糖質を欠如）、Ｐｒｏ３２９と、２３４、２３５、２３６および２３７と、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４、およびＨｉｓ４３５とは、改変されたならばＦｃＲの減少した結合を提供する残基である（Shields et al. J. Biol. Chem. 276 (2001), 6591-6604; Lund et al. FASEB J. 9 (1995), 115-119; Morgan et al. Immunology 86 (1995) 319-324、ＥＰ０３０７４３４）。好ましくは本発明による抗体は、ＦｃＲと、Ｓ２２８、Ｌ２３４、Ｌ２３５および／もしくはＤ２６５に突然変異を有し、かつ／またはＰＶＡ２３６もしくはＧＬＰＳＳ３３１突然変異を含むＩｇＧ４サブクラスの、あるいはＩｇＧ１またはＩｇＧ２サブクラスの結合に関するものである。突然変異Ｓ２２８Ｐ（ＩｇＧ４）、Ｌ２３４Ａ（ＩｇＧ１）、Ｌ２３５Ａ（ＩｇＧ１）、Ｌ２３５Ｅ（ＩｇＧ４）、ＧＬＰＳＳ３３１（ＩｇＧ１）および／またはＰＶＡ２３６（ＩｇＧ１）が特に好ましい。突然変異の好ましい組み合わせを表１にも示す。追加的な好ましい組み合わせはＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａである。
【００４２】
本明細書に使用するような用語「Ｐ−セレクチンに対する結合」は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden）、またはマイクロタイタープレートに精製Ｐ−セレクチンもしくはＰ−セレクチンＣＨＯトランスフェクタントのいずれかを被覆したＥＬＩＳＡのいずれかにおけるＰ−セレクチンに対する抗体の結合を意味する。
【００４３】
ＢＩＡｃｏｒｅアッセイでは、抗体を表面に結合させ、Ｐ−セレクチンの結合を表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によって測定する。結合の親和性を、用語ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体の会合速度定数）、ｋｄ（解離定数）、およびＫＤ（ｋｄ／ｋａ）によって定義する。本発明による抗体は、１０−８以下、好ましくは約１０−１１から１０−９MのＫＤを示す（実施例を参照されたい）。したがって、本発明は、上記のような抗体を指し、ここで、その抗体はＢＩＡｃｏｒｅアッセイで１０−８M未満のＫＤ値でＰ−セレクチンに結合し、好ましくはＫＤの範囲は１０−１１から１０−９Mである。
【００４４】
好ましくは、その抗体はヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４サブタイプである。
【００４５】
さらに好ましくは、その抗体はＬ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、および／もしくはＰ３２９に少なくとも一つの突然変異を含むヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体、またはＬ２３５およびＳ２２８（ＥＵインデックスにより付番）に少なくとも一つの突然変異を含むヒトサブクラスＩｇＧ４の抗体であることを特徴とする。
【００４６】
Ｐ−セレクチン特異的ＥＬＩＳＡでは、精製Ｐ−セレクチンをマイクロタイタープレートに被覆し、ビオチン化抗ヒトＩｇＧおよびＥＬＩＳＡの通常の段階を用いて、Ｐ−セレクチンに対する抗体の結合を検出する。このアッセイにおけるＥＣ５０値は、Ｐ−セレクチンＣＨＯ細胞では０．００２から０．０３μg/mlの間の範囲に好ましくはあり、すなわち、本発明はＥＬＩＳＡアッセイでＰ−セレクチンの結合に関するＥＣ５０値がＰ−セレクチンを提示しているＣＨＯ細胞に対して０．００２から０．０３μg/mlの間の範囲にある抗体を指す。Ｐ−セレクチン発現ＣＨＯトランスフェクタントをマイクロタイタープレートに被覆するアッセイでは、ＥＣ５０値は０．０１から０．０８μg/mlの間、好ましくは０．０１から０．０４μg/mlの間の範囲にある。
【００４７】
Ｅ−およびＬ−セレクチントランスフェクタントに対するＥＣ５０値は、好ましくは１００μg/mlよりも大きい。本発明の抗体は、Ｐ−セレクチンと、Ｅ−および／またはＬ−セレクチンとをマイクロタイタープレートに被覆するＥＬＩＳＡアッセイでのＥＣ５０値によって測定されるように、Ｅ−および／またはＬ−セレクチンよりもＰ−セレクチンに対して少なくとも１０００倍大きく特異的に結合することを特徴とする。
【００４８】
本明細書に使用するような用語「Ｐ−セレクチンに対するＰ−セレクチンリガンド結合の阻害」は、ＨＬ６０細胞上に提示されたＰ−セレクチンリガンドに対する精製Ｐ−セレクチンまたは細胞発現Ｐ−セレクチンの結合を指す。リガンドに対するＰ−セレクチンの結合は本発明による抗体によって阻害される。抗体がリガンドに対するＰ−セレクチンの結合を阻害する能力を分析するインビトロアッセイでのＩＣ５０としてその阻害を測定する。そのようなアッセイについて実施例に記載する。これらのアッセイはＰ−セレクチンの適切な供給源として親和性精製されたＰ−セレクチンおよび活性化血小板を、リガンドの適切な供給源としてＨＬ６０細胞のような白血球様細胞を使用する。そのようなアッセイでは、Ｐ−セレクチンまたは活性化血小板に対するＰ−セレクチンの生理関連リガンドとしてのＰＳＧＬ−１を発現しているＨＬ６０細胞の接着を、漸増する濃度の抗体の不在下および存在下で測定する。ＩＣ５０値を少なくとも３回の独立した測定の平均値として測定する。阻害は、１μg/mlよりも大きくない、好ましくは０．５から０．０８μg/mlのＩＣ５０値を意味する。
【００４９】
本発明の抗体は、０．０８から０．５μg/mlの範囲、好ましくは０．０８から０．１１μg/mlのＩＣ５０値で精製Ｐ−セレクチンに対する白血球様ＨＬ６０細胞の接着を阻害する。活性化血小板に対する白血球様ＨＬ６０細胞の接着は、０．０５から０．３μg/mlの範囲のＩＣ５０値で阻害される。
【００５０】
したがって、本発明のさらなる態様は、Ｐ−セレクチンの結合に関するＥＣ５０値がＥＬＩＳＡアッセイでは０．０１から０．０８μg/mlの範囲であることを特徴とする抗体を述べ、ここで、Ｐ−セレクチンを発現するＣＨＯトランスフェクタントをマイクロタイタープレートに被覆する。好ましい範囲は０．０１から０．０４μg/mlである。Ｅ−およびＬ−セレクチントランスフェクタントに関するＥＣ５０値は１００μg/mlよりも大きい。さらなる態様では、本発明の抗体は、精製Ｐ−セレクチンに対する白血球様ＨＬ６０細胞の接着を０．０８から０．５μg/mlの間のＩＣ５０値で阻害する。好ましい範囲は、０．０８から０．１１μg/mlである。
【００５１】
本発明の抗体は、完全にヒトの流動系で好ましくは７０％よりも大きく白血球と血小板の単層との相互作用を（１０μg/mlの濃度で）阻害する。さらに、これらの抗体は、３μg/mlの濃度で６０〜９０％の範囲でヒト流動系での活性化内皮細胞に対する白血球の接着を（白血球サブタイプに対する異なる効果を有して）阻害する。
【００５２】
本発明の抗体は、Ｐ−セレクチンフラグメントａａ６０〜７５（Swiss-Prot配列P16109）の存在下でＰ−セレクチンと好ましくは結合でき、かつ／またはＡＴＣＣアクセッション番号ＨＢ１１０４１と称する細胞系によって分泌される、抗体のＰ−セレクチンに対する結合を競合的に阻害しない。
【００５３】
本発明の抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイ形式でＰ−セレクチンと血小板膜糖タンパク質ＧＰＩｂαとの相互作用を好ましくは阻害しない。ＥＬＩＳＡではＧＰＩｂαの可溶性細胞外部分であるグリコカリシンを、記載されたようにマイクロタイタープレートのウェルに固定化し（Romo et al., J Exp Med 190:803 (1999)、ポリクローナル抗Ｐ−セレクチン抗体を用いて、Ｐ−セレクチンＨｕＭａｂと共に予備インキュベート後の精製Ｐ−セレクチンの結合を検出した。
【００５４】
本発明のさらなる好ましい態様では、その抗体はＣ３タンパク質と結合しないことを特徴とし、さらに好ましくは補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を誘発しないことを特徴とする。さらに、その抗体はＮＫエフェクター細胞上のＦｃγ受容体に結合しないことを特徴とする場合がある。好ましくは、その抗体はＬ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、および／もしくはＰ３２９に少なくとも一つの突然変異を含むヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体、またはＬ２３５およびＳ２２８（ＥＵインデックスにより付番）に少なくとも一つの突然変異を含むヒトサブクラスＩｇＧ４の抗体であることを特徴とする。さらなる好ましい態様では、その抗体は抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を誘発しないことを特徴とする。
【００５５】
なおさらに好ましい態様では、本発明の抗体は、Ｐ−セレクチンと結合し、以下からなる群より独立して選択される可変部を含むことを特徴とする：
ａ）配列番号１のアミノ酸配列によって定義されるＬ鎖可変ドメインおよび配列番号２によって定義されるＨ鎖可変ドメイン、
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列によって定義されるＬ鎖可変ドメインおよび配列番号４によって定義されるＨ鎖可変ドメイン、
ｃ）配列番号５のアミノ酸配列によって定義されるＬ鎖可変ドメインおよび配列番号６によって定義されるＨ鎖可変ドメイン、
ｄ）配列番号７のアミノ酸配列によって定義されるＬ鎖可変ドメインおよび配列番号８によって定義されるＨ鎖可変ドメイン、
ｅ）配列番号９のアミノ酸配列によって定義されるＬ鎖可変ドメインおよび配列番号１０によって定義されるＨ鎖可変ドメイン、
ｆ）配列番号１１のアミノ酸配列によって定義されるＬ鎖可変ドメインおよび配列番号１２によって定義されるＨ鎖可変ドメイン、
ｇ）配列番号１３のアミノ酸配列によって定義されるＬ鎖可変ドメインおよび配列番号１４によって定義されるＨ鎖可変ドメイン、
ｈ）配列番号１５のアミノ酸配列によって定義されるＬ鎖可変ドメインおよび配列番号１６によって定義されるＨ鎖可変ドメイン、
ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列によって定義されるＬ鎖可変ドメインおよび配列番号１８によって定義されるＨ鎖可変ドメイン、
ｊ）配列番号１９のアミノ酸配列によって定義されるＬ鎖可変ドメインおよび配列番号２０によって定義されるＨ鎖可変ドメイン、
ｋ）配列番号２１のアミノ酸配列によって定義されるＬ鎖可変ドメインおよび配列番号２２によって定義されるＨ鎖可変ドメイン。
【００５６】
好ましくは、その抗体はアミノ酸配列である配列番号３によって定義されるＬ鎖可変ドメインおよび配列番号４によって定義されるＨ鎖可変ドメインを含む。
【００５７】
好ましい抗体は、ヒトＩｇＧ４サブクラスであるか、補体因子Ｃ１ｑに対する非結合を引き起こす少なくとも一つのアミノ酸突然変異を含むことを特徴とする。これらの変異抗体は、例えば配列番号２５または配列番号２６と、配列番号２８とからなる群より独立して選択されるアミノ酸配列を含む。
【００５８】
「変異」抗Ｐ−セレクチン抗体は、本明細書において親抗体配列での一つまたは複数のアミノ酸残基における付加、欠失および／または置換によって「親」抗Ｐ−セレクチン抗体のアミノ酸配列とアミノ酸配列が異なる分子を指す。好ましい態様では、その変異体は、親抗体の一つまたは複数の定常部または可変部に、好ましくは定常部に、一つまたは複数のアミノ酸置換を含む。例えば、その変異体は親抗体の一つまたは複数の可変部に少なくとも１個、例えば約１から約１０個、好ましくは約２から約５個の置換を含む場合がある。通常は、その変異体は親抗体の定常ドメインおよび／または可変ドメイン配列と少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するであろう。
【００５９】
この配列に関係して同一性または相同性は、配列を整列させて必要ならばギャップを導入して最大率の配列同一性を実現した後で、候補配列において親抗体残基と同一であるアミノ酸残基の率として本明細書に定義される。Ｎ末端、Ｃ末端、または抗体配列への内部伸長、欠失、もしくは挿入のどれも配列同一性または相同性に影響するとして解釈してはならない。その変異体はヒトＰ−セレクチンと結合する能力を保有し、好ましくは親抗体よりも優れた性質を有する。例えば、その変異体は、さらに強い結合親和性、重症肢虚血または末梢動脈閉塞性疾患（ＣＬＩ／ＰＡＯＤ）に関連する疾患を処置する能力の増強を有する場合がある。
【００６０】
本明細書において特に関心対象である変異抗体は、Ｆｃγ受容体との結合の排除が原因で、親抗体に比較したときに接着アッセイで阻害活性の少なくとも約４倍の増強を示す抗体である。
【００６１】
本明細書における「親」抗体は、変異体の調製に使用されたアミノ酸配列にコードされる抗体である。好ましくは、親抗体はヒトフレームワーク部を有し、もしも存在するならばヒト抗体定常部を有する。例えば、親抗体はヒト化抗体またはヒト抗体でありうる。
【００６２】
本発明による抗体は、本発明による抗体の上記性質に影響せず、それを改変もしない「保存的配列修飾」であるヌクレオチドおよびアミノ酸配列修飾を有するような抗体をさらに含む。部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ介在性突然変異誘発のような当技術分野で公知の標準的な技法によって修飾を導入できる。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に交換された置換がある。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖(例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸がある。このように、ヒト抗Ｐ−セレクチン抗体における予測される非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基に好ましくは交換できる。
【００６３】
Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327およびQueen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033によって記載されたような分子モデリングに基づいた突然変異誘発によってアミノ酸置換を行うことができる。
【００６４】
さらなる好ましい態様では、抗体は配列番号２３に定義されるようなκＬ鎖定常部を含む。
【００６５】
本発明による好ましい抗体は、ＩｇＧ１ｖ１（Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、デルタＧ２３６、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓによって規定されるＰＶＡ−２３６；ＧＬＰＳＳ３３１）、ＩｇＧ１ｖ２（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）およびＩｇＧ４ｖ１（Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ）として定義される抗体である。
【００６６】
さらに好ましい態様では、これらの抗体はＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２および一本鎖フラグメントからなる群より選択される抗体フラグメントも含む。
【００６７】
本発明は、本発明による抗体の製造方法をさらに含み、その方法は、ａ）本発明による親ヒト抗体のＬ鎖をコードする第一核酸配列と、Ｆｃ部分が補体因子Ｃ１ｑおよび／またはＦｃ受容体と結合しないために修飾されている該親ヒト抗体のＨ鎖をコードする第二ＤＮＡ配列とを用いて宿主細胞を形質転換する段階、ｂ）該抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が生成するように該第一および第二ＤＮＡ配列を発現させる段階、ならびにｃ）該抗体を宿主細胞または宿主細胞培養物から回収する段階とを含む。
【００６８】
本発明は、中間体である抗体、すなわち抗Ｐ−セレクチン抗体についても述べ、それらの抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体であって、Ｐ−セレクチンとＥ−および／またはＬ−セレクチンとをマイクロタイタープレートに被覆するＥＬＩＳＡアッセイで測定したときに、Ｅ−またはＬ−セレクチンよりもＰ−セレクチンに対して少なくとも１０００倍大きく特異的に結合することを特徴とする。好ましくはこれらの抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である。これらの抗体は、配列番号２４のγ１Ｈ鎖定常部または配列番号２７のγ４Ｈ鎖定常部によって定義されるようなアミノ酸配列も含む場合がある。特に、これらの抗体は、ｈｕ−Ｍａｂ＜Ｐ−セレクチン＞ＬＣ１００４−００１（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６４０）、ｈｕ−Ｍａｂ＜Ｐ−セレクチン＞ＬＣ１００４−００２（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６４１）、およびｈｕ−Ｍａｂ＜Ｐ−セレクチン＞ＬＣ１００４−０１７（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６４２）からなる群より選択される細胞系によって生成される抗体を指す。
【００６９】
本発明による抗体は、本発明による抗体の上記性質に影響せず、それを改変もしない「保存的配列修飾」であるヌクレオチドおよびアミノ酸配列修飾を有するような抗体をさらに含む。部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ介在性突然変異誘発のような当技術分野で公知の標準的な技法によって修飾を導入できる。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に交換された置換がある。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖(例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ−分岐側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸がある。このように、ヒト抗Ｐ−セレクチン抗体における予測される非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基に好ましくは交換できる。
【００７０】
Riechmann, L.ら、Nature 332 (1988) 323-327およびQueen, C.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033によって記載された分子モデリングに基づいた突然変異誘発によってアミノ酸置換を行うことができる。
【００７１】
本発明は、上に挙げた抗体をコードする核酸分子、これらの核酸を含む対応するベクター、およびこれらのベクターに関する対応する宿主細胞も含む。本発明は、該抗体分子の合成を可能にする条件で対応する宿主細胞を培養する段階と、該培養物から該抗体を回収する段階とを含む、例えばＨ鎖をコードする核酸およびＬ鎖をコードする核酸を原核または真核宿主細胞に発現させる段階と、該細胞から該ポリペプチドを回収する段階とによる、抗体の調製方法を包含する。
【００７２】
診断および治療へのこの抗体の使用が考えられている。一つの診断応用では、本発明はＰ−セレクチンを含むと疑われる試料を抗Ｐ−セレクチン抗体に曝露する段階と、その試料に対する抗体の結合を決定する段階とを含む、Ｐ−セレクチンタンパク質の存在を決定する方法を提供する。この使用に関して、本発明は抗体と、その抗体を使用するための指示とを含む、Ｐ−セレクチンタンパク質を検出するためのキットを提供する。
【００７３】
本発明の抗体は、炎症疾患および血栓疾患の処置に有用である。そのような疾患には,アテローム性動脈硬化症、動脈および深部静脈血栓症、血管形成術またはステント留置術後の再狭窄のような血管障害がある。好ましい適用は、末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）および重症肢虚血（ＣＬＩ）である。他の適用は、心筋梗塞、脳虚血イベント（例えば卒中）、腎梗塞などによって起こる虚血後白血球介在性組織損傷の処置である。これらの抗体は、敗血症、急性白血球介在性肺傷害、および喘息のようなアレルギー反応の処置にも適している。他の適用は、臓器移植の拒絶反応および慢性関節リウマチを含む自己免疫疾患の予防である。さらに、循環している癌細胞の接着を阻害することによって腫瘍転移を予防できる。
【００７４】
本発明は、上記の炎症障害および血栓障害、特にＰＡＯＤおよびＣＬＩ（末梢動脈閉塞性疾患または重症肢虚血）を患う哺乳動物を処置するための方法をさらに提供する。
【００７５】
本発明は、治療、例えばこれらの疾患の処置のための薬を製造するための上記抗体の使用をさらに提供する。
【００７６】
本発明は、薬学的組成物を製造するための上に定義したような抗体の使用にも関し、薬学的有効量で本発明による抗体を、場合によっては薬学的目的の抗体製剤に有用な緩衝剤および／または補助剤と共に含む薬学的組成物を含む。
【００７７】
本発明は、薬学的に許容される担体中にそのような抗体を含む薬学的組成物をさらに提供する。一態様では、その薬学的組成物は製品またはキットに含まれる場合がある。
【００７８】
本発明は、本発明によるそのようなアンタゴニストモノクローナル抗体、例えば親抗体を生成するハイブリドーマ細胞系をさらに提供する。
【００７９】
本発明による好ましいハイブリドーマ細胞系であるｈｕ−Ｍａｂ＜Ｐ−セレクチン＞ＬＣ１００４−００１（抗体ＨｕＭａｂ００１）、ｈｕ−Ｍａｂ＜Ｐ−セレクチン＞ＬＣ１００４−００２（抗体ＨｕＭａｂ００２）、およびｈｕ−Ｍａｂ＜Ｐ−セレクチン＞ＬＣ１００４−０１７（抗体ＨｕＭａｂ０１７）は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（DSMZ）、ドイツに寄託された。
【００８０】
【表１】
0005714554.tif 000002
【００８１】
該細胞系から得ることができる抗体は、本発明の好ましい態様である。
【００８２】
本発明による抗体は、組換え手段によって好ましくは生成される。そのような方法は当技術分野の現状で広く公知であり、原核および真核細胞でのタンパク質の発現と、それに続く抗体ポリペプチドの単離と、通常は薬学的に許容される純度までの精製とを含む。タンパク質の発現のために、Ｌ鎖およびＨ鎖、またはそれらのフラグメントをコードする核酸を標準的な方法によって発現ベクターに挿入する。ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、または大腸菌（E.coli）細胞のような適切な原核または真核宿主細胞で発現を行い、それらの細胞（上清または溶解後の細胞）から抗体を回収する。
【００８３】
抗体の組換え生成は、当技術分野の現状で周知であり、例えばMakrides, S. C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R. J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R. G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の総説に記載されている。
【００８４】
抗体は、全細胞中、細胞溶解液中、または部分精製された形もしくは実質的に純粋な形で存在しうる。他の細胞構成要素または他の混入物、例えば他の細胞性核酸またはタンパク質を除去するために、アルカリ／ＳＤＳ処理、カラムクロマトグラフィー、および当技術分野で周知の他の技法を含めた標準的な技法によって精製を行う。Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照されたい。
【００８５】
ＮＳ０細胞での発現は、例えばBarnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123およびBarnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270に記載されている。一過性発現は、例えばDurocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9に記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；およびNorderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87に記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Schlaeger, E.-J.およびChristensen, K.（Cytotechnology 30 (1999) 71-83）ならびにSchlaeger, E.-J.（J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199）によって記載されている。
【００８６】
原核生物に適した制御配列には、例えばプロモーターと、場合によってはオペレーター配列と、リボソーム結合部位とがある。真核細胞はプロモーターと、エンハンサーと、ポリアデニル化シグナルとを利用することが公知である。
【００８７】
別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合に、核酸は「作動可能に連結」している。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現するならば、そのプレ配列もしくは分泌リーダーに関するＤＮＡはそのポリペプチドに関するＤＮＡと作動可能に連結しており；プロモーターもしくはエンハンサーが配列の転写に影響するならば、そのプロモーターもしくはエンハンサーはコード配列に作動可能に連結し；またはリボソーム結合部位が翻訳を可能にするように位置するならば、そのリボソーム結合部位はコード配列に作動可能に連結する。一般的に「作動可能に連結」は、連結しているＤＮＡ配列が隣接し、分泌リーダーの場合は隣接してリーディングフレームに存在することを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、好都合な制限部位での連結反応によって実現される。そのような部位が存在しないならば、常法により合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
【００８８】
モノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製法によって培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡおよびＲＮＡは、従来法を使用して容易に単離および配列決定される。ハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡおよびＲＮＡの供給源として作用できる。いったん単離されたならば、そのＤＮＡを発現ベクターに挿入でき、それを次にＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、または骨髄腫細胞のような宿主細胞にトランスフェクトして、宿主細胞での組換えモノクローナル抗体の合成を得る。それらの宿主細胞は、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を生成しない。
【００８９】
抗体ＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入することによって、またはヌクレオチド合成によって、ヒトＰ−セレクチン抗体のアミノ酸配列変異体（または突然変異体）を調製する。しかし、そのような修飾を例えば上記のように非常に限定した範囲内でのみ行うことができる。例えば、これらの修飾はＩｇＧアイソタイプおよびエピトープの結合のような先に述べた抗体特性を改変しないが、組換え生成の収率もしくはタンパク質の安定性を改善するか、または精製を容易にする場合がある。
【００９０】
抗Ｐ−セレクチン抗体の固有のコンホメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基を一般的にセリンに置換して、その分子の酸化安定性を高めて異所性の架橋を防止することもできる。逆に、システイン結合を抗体に加えて（特にその抗体がＦｖフラグメントのような抗体フラグメントである場合に）その安定性を高めることができる。
【００９１】
その抗体の別の種類のアミノ酸変異体は、その抗体の本来のグリコシル化パターンを改変する。改変によって、その抗体にみられる一つもしくは複数の糖質部分を欠失させること、および／またはその抗体に存在しない一つもしくは複数のグリコシル化部位を付加することを意味する。抗体のグリコシル化は、概してＮ−結合である。Ｎ−結合は、アスパラギン残基の側鎖に対する糖質部分の付着を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸）は、アスパラギン側鎖に糖質部分が酵素的に付着するための認識配列である。このように、ポリペプチドにこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在することによって、潜在的グリコシル化部位が生み出される。（Ｎ−結合グリコシル化部位に関して）先に述べた一つまたは複数のトリペプチド配列を含むようにアミノ酸配列を改変することによって、抗体へのグリコシル化部位の付加を好都合に実現する。
【００９２】
抗Ｐ−セレクチン抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野で公知の様々な方法によって調製される。これらの方法には、（天然アミノ酸配列変異体の場合）天然供給源からの単離、または初期に調製した変異体もしくは非変異体版のヒト化抗Ｐ−セレクチン抗体のオリゴヌクレオチド介在性（または部位特異的）突然変異誘発と、ＰＣＲ突然変異誘発と、カセット突然変異誘発とによる調製があるが、それに限定されるわけではない。
【００９３】
本発明は、化学療法剤、毒素（例えば細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらのフラグメント）、放射性同位体（すなわち放射性コンジュゲート）、または炎症障害および血栓障害、特にＰＡＯＤおよびＣＬＩによる障害の予防もしくは処置のための薬剤のプロドラッグのような細胞傷害剤に結合した、本発明による抗体を含む免疫コンジュゲートにも関する。抗体と細胞傷害剤とのコンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、（ジメチルアジピミダートＨＣＬのような）イミドエステルの二官能性誘導体、（スベリン酸ジスクシンイミジルのような）活性エステル、（グルタルアルデヒドのような）アルデヒド、（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンのような）ビス−アジド化合物、（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン（bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylenediatnine）のような）ビス−ジアゾニウム誘導体、（トリエン（tolyene）２，６−ジイソシアナートのような）ジイソシアナート、および（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンのような）ビス−活性フッ素化合物のような様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素をVitetta, E. S., et al., Science 238 (1987) 1098-1104）に記載されているように調製できる。炭素１４標識１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は抗体に放射性ヌクレオチドを結合させるための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。
【００９４】
別の種類の共有結合性修飾は、その抗体にグリコシドを化学的または酵素的にカップリングすることを含む。これらの手順は、Ｎ−またはＯ−結合グリコシル化に関するグリコシル化能力を有する宿主細胞で抗体を生成させる必要がない点で有利である。使用したカップリング様式に応じて、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのもののような遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのもののような遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンのもののような芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に糖（類）を付着させることができる。これらの方法は、ＷＯ８７／０５３３０、およびAplin, J.D., and Wriston, J.C. Jr., CRC Crit. Rev. Biochem. (1981) 259-306に記載されている。
【００９５】
抗体上に存在する任意の糖質部分の除去を化学的または酵素的に実現できる。化学的脱グリコシル化は、化合物であるトリフルオロメタンスルホン酸または同等の化合物にその抗体を曝露することを必要とする。この処理の結果として、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外の大部分または全ての糖の開裂が生じる一方で、抗体はインタクトのまま残る。化学的脱グリコシル化は、Sojahr, H. T., and Bahl, O. P., Arch. Biochem. Biophys. 259 (1987) 52-57およびEdge, A. S., et al. Anal. Biochem. 118 (1981) 131-137に記載されている。Thotakura, N.R., and Bahl, O. P., Meth. Enzymol. 138 (1987) 350-359に記載されたように様々なエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって、抗体上の糖質部分の酵素的開裂を実現できる。
【００９６】
別の種類の抗体の共有結合性修飾は、米国特許第４，６４０，８３５号、第４，４９６，６８９号、第４，３０１，１４４号、第４，６７０，４１７号、第４，７９１，１９２号、または第４，１７９，３３７号に記述されているように、様々な非タンパク質ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンに抗体を連結する段階を含む。
【００９７】
なお別の局面では、本発明は、ヒト抗Ｐ−セレクチン抗体（例えば本発明によるｈｕ−Ｍａｂ＜Ｐ−セレクチン＞ＬＣ１００４−００１（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６４０）、ｈｕ−Ｍａｂ＜Ｐ−セレクチン＞ＬＣ１００４−００２（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６４１）、およびｈｕ−Ｍａｂ＜Ｐ−セレクチン＞ＬＣ１００４−０１７（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６４２）からなる群より選択される細胞系によって生成される親抗体）を発現する非ヒトトランスジェニック動物、例えばトランスジェニックマウスから単離されたＢ細胞を提供する。ＫＭマウスは、適切な染色体導入マウスである。ＫＭマウスは、ヒトＨ鎖導入染色体およびヒトカッパＬ鎖導入遺伝子を含む。ＫＭマウスでは、内因性マウスＨ鎖およびＬ鎖遺伝子も破壊されている結果、マウスの免疫処置によってマウス免疫グロブリンよりもヒト免疫グロブリンの生成がもたらされる。ＫＭマウスの構築およびヒト免疫グロブリンを発生させるためのそれらのマウスの使用はＷＯ０２／４３４７８に詳細に記載されている。
【００９８】
好ましくは、 単離されたＢ細胞は、精製型、もしくは組換え型のＰ−セレクチン抗原および／またはＰ−セレクチンを発現している細胞を用いて免疫処置された非ヒトトランスジェニック動物、例えばトランスジェニックマウスから得られる。好ましくは、非ヒトトランスジェニック動物、例えばトランスジェニックマウスは、本発明の抗体の全てまたは部分をコードする、ヒトＨ鎖導入遺伝子とヒトＬ鎖導入遺伝子とを含むゲノムを有する。次に、単離されたＢ細胞は不死化されてヒト抗Ｐ−セレクチン抗体の供給源（例えばハイブリドーマ）を提供する。したがって、本発明は本発明によるヒトモノクローナル抗体を生成できるハイブリドーマも提供する。一態様では、ハイブリドーマは、本発明の抗体の全てまたは部分をコードするヒトＨ鎖導入遺伝子とヒトＬ鎖導入遺伝子とを含むゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物、例えばトランスジェニックマウスから得られるＢ細胞が不死化細胞と融合したものを含む。
【００９９】
特定の態様では、非ヒトトランスジェニック動物は、本発明の抗体の全てまたは部分をコードする、ヒトＨ鎖導入遺伝子とヒトＬ鎖導入遺伝子とを含むゲノムを有するトランスジェニックマウスである。精製もしくは濃縮されたＰ−セレクチン抗原調製物および／またはＰ−セレクチンを発現している細胞を用いて非ヒトトランスジェニック動物を免疫処置できる。好ましくは、非ヒトトランスジェニック動物、例えばトランスジェニックマウスは、Ｐ−セレクチンに対するヒトモノクローナル抗体のＰ−セレクチンアイソタイプを生成できる。
【０１００】
精製もしくは濃縮されたＰ−セレクチン抗原調製物および／またはＰ−セレクチンを発現している細胞を用いて、本発明の抗体の全てまたは部分をコードする、ヒトＨ鎖導入遺伝子とヒトＬ鎖導入遺伝子とを含むゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物、例えばトランスジェニックマウスを免疫処置することによって、本発明によるヒトモノクローナル抗体を生成させることができる。次に、その動物のＢ細胞（例えば脾臓Ｂ細胞）を得て、骨髄腫細胞と融合させて、Ｐ−セレクチンに対するヒトモノクローナル抗体を分泌する不死化ハイブリドーマ細胞を形成させる。
【０１０１】
好ましい態様では、Ｐ−セレクチンに対するヒトモノクローナル抗体を、マウス免疫系よりもヒト免疫系の部分を保有するトランスジェニックマウスを使用して発生させることができる。本明細書において「ＨｕＭａｂ」マウスと称されるこれらのトランスジェニックマウスは、Ｈ鎖（μおよびγ）およびκＬ鎖（定常部遺伝子）と、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的突然変異とを含む再編成されていないヒト免疫グロブリン遺伝子をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含む（Lonberg, N., et al., Nature 368 (1994) 856-859）。したがって、そのマウスはマウスＩｇＭまたはＩｇＫの減少した発現を示し、導入されたヒトＨ鎖およびＬ鎖導入遺伝子は、免疫処置に応答してクラススイッチおよび体細胞突然変異を受けて、高親和性のヒトＩｇＧモノクローナル抗体を発生する（Lonberg, N., et al., Nature 368 (1994) 856-859。Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113 (1994) 49-101; Lonberg, N., and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. 25 (1995) 65-93;およびHarding, F., and Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sci 764 (1995) 536-546に総説されている）。ＨｕＭａｂマウスの調製は、Taylor, L., et al., Nucleic Acids Research 20 (1992) 6287-6295; Chen, J., et al., International Immunology 5 (1993) 647-656; Tuaillon, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 90 (1993) 3720-3724; Choi, T.K., et al., Nature Genetics 4 (1993) 117-123; Chen, J., et al., EMBO J. 12 (1993) 821-830; Tuaillon, N., et al., Immunol. 152 (1994) 2912-2920; Lonberg, N., et al., Nature 368 (1994) 856-859; Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113 (1994) 49-101; Taylor, L., et al., Int. Immunol. 6 (1994) 579-591; Lonberg, N., and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. 25 (1995) 65-93; Harding, F., and Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sci 764 (1995) 536-546; Fishwild, D.M., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851に記載されており、これら全ての内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。米国特許第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，７８９，６５０号、第５，８７７，３９７号、第５，６６１，０１６号、第５，８１４，３１８号、第５，８７４，２９９号、第５，５４５，８０７号、第５，７７０，４２９号、ＷＯ９８／２４８８４、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９３／１２２７、ＷＯ９２／２２６４５、およびＷＯ９２／０３９１８をさらに参照されたい。
【０１０２】
Ｐ−セレクチンに対する完全ヒトモノクローナル抗体を発生させるために、Lonberg, N. et al., Nature 368 (1994) 856-859; Fishwild, D. M. et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851、およびＷＯ９８／２４８８４に記載されたような一般的な方法により、Ｐ−セレクチン抗原の精製もしくは濃縮された調製物および／またはＰ−セレクチンを発現している細胞を用いてＨｕＭａｂマウスを免疫処置することができる。好ましくは、最初の免疫処置の際にマウスは６〜１６週齢であろう。例えば、可溶性Ｐ−セレクチン抗原の精製または濃縮された（例えばＰ−セレクチン発現細胞から精製された）調製物を使用して、ＨｕＭａｂマウスを腹腔内免疫処置することができる。Ｐ−セレクチン抗原の精製または濃縮された調製物を使用した免疫処置の結果として抗体が生じない場合には、Ｐ−セレクチンを発現している細胞、例えば腫瘍細胞系を用いてマウスを免疫処置して免疫応答を促進することもできる。様々な抗原での累積的な経験は、最初フロイントの完全アジュバントに入れた抗原を用いて腹腔内（ｉ．ｐ．）免疫処置してから、フロイントの不完全アジュバントに入れた抗原を用いて２週間毎に（例えば合計６週間まで）ｉ．ｐ．免疫処置を行う場合に、ＨｕＭａｂトランスジェニックマウスが最もよく応答することを示した。眼窩採血によって得られた血漿試料を用いた、免疫処置プロトコールの過程にわたり免疫応答を監視できる。ＥＬＩＳＡによって血漿をスクリーニングでき、十分な力価の抗Ｐ−セレクチンヒト免疫グロブリンを有するマウスを対応するＢ細胞の不死化に使用できる。屠殺して脾臓およびリンパ節を取り出す３から４日前に、マウスの静脈内に抗原を追加免疫できる。各抗原について２〜３回の融合を行う必要がありうると予想される。各抗原について数匹のマウスに免疫処置を行う。例えば、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２系統のＨｕＭａｂマウス合計１２匹に免疫処置を行うことができる。
【０１０３】
ＨＣｏ７マウスは、（Chen, J. et al., EMBO J. 12 (1993) 821-830に記載されているように）内因性Ｌ鎖（カッパ）遺伝子にＪＫＤ破壊、（ＷＯ０１／１４４２４の実施例１に記載されているように）内因性Ｈ鎖遺伝子にＣＭＤ破壊、（Fishwild, D.M., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851に記載されているように）ＫＣｏ５ヒトカッパＬ鎖導入遺伝子、および（米国特許第５，７７０，４２９号に記載されているように）ＨＣｏ７ヒトＨ鎖導入遺伝子を有する。
【０１０４】
ＨＣｏ１２マウスは、（Chen, J. et al., EMBO J. 12 (1993) 821-830に記載されているように）内因性Ｌ鎖（カッパ）遺伝子にＪＫＤ破壊、（ＷＯ０１／１４４２４の実施例１に記載されているように）内因性Ｈ鎖遺伝子にＣＭＤ破壊、（Fishwild, D.M., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851に記載されているように）ＫＣｏ５ヒトカッパＬ鎖導入遺伝子、および（ＷＯ０１／１４４２４の実施例２に記載されているように）ＨＣｏ１２ヒトＨ鎖導入遺伝子を有する。マウスリンパ球を単離して、標準的なプロトコールに基づいてＰＥＧを使用してマウス骨髄腫細胞系と融合させてハイブリドーマを発生させることができる。結果として生じたハイブリドーマから、次に抗原特異的抗体の生成をスクリーニングする。例えば、免疫処置したマウスからの脾臓およびリンパ節由来リンパ球の単細胞懸濁物を、５０％ＰＥＧを用いて６分の１の数のＳＰ２／０非分泌型マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８１）と融合させる。平底マイクロタイタープレートで約２×１０５個の細胞を平板培養してから、選択培地で約２週間インキュベートする。
【０１０５】
次に、個別のウェルからＥＬＩＳＡによってヒト抗Ｐ−セレクチンモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体をスクリーニングする。いったんハイブリドーマの大規模な成長が起こったならば、通常は１０〜１４日後に培地を分析する。抗体を分泌しているハイブリドーマをもう一度平板培養し、再度スクリーニングして、ヒトＩｇＧ抗Ｐ−セレクチンモノクローナル抗体がまだ陽性であれば、そのハイブリドーマを限界希釈によって少なくとも２回サブクローニングできる。次に、安定なサブクローンをインビトロで培養してキャラクタリゼーション用の組織培養培地で抗体を生成させる。
【０１０６】
ＣＤＲ配列が抗体−抗原相互作用を担うことから、種々のヒト抗体からのフレームワーク配列上に本発明によるＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、本発明による組換え抗体を発現させることが可能である（例えばRiechmann, L., et al., Nature 332 (1998) 323-327; Jones, P., et al., Nature 321 (1986) 522-525;およびQueen, C, et al., Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86 (1989)10029-10033を参照されたい）。そのようなフレームワーク配列を、生殖細胞系ヒト抗体遺伝子配列を含む公共のＤＮＡデータベースから得ることができる。これらの生殖細胞系配列は、Ｂ細胞が成熟する間にＶ（Ｄ）Ｊ組換えによって形成する完全に集合した可変部遺伝子を含まないと思われることから、成熟抗体遺伝子配列とは異なるであろう。生殖細胞系遺伝子配列は、個別の高親和性二次レパートリー抗体の配列とも可変部に均等にわたって異なるであろう。
【０１０７】
本発明は、好ましくは試料のＰ−セレクチンと本発明による抗体との間の結合を決定する免疫アッセイによる、Ｐ−セレクチンのインビトロ診断のための本発明による抗体の使用をさらに含む。
【０１０８】
別の局面では、本発明は、本発明のヒトモノクローナル抗体の一つもしくは組み合わせ、またはその抗原結合部分が薬学的に許容される担体と共に製剤されたものを含む組成物、例えば薬学的組成物を提供する。さらに具体的には、その組成物は薬学的または診断用組成物であり、なおさらに具体的には、その薬学的組成物は上に定義されたような抗体と、少なくとも一つの薬学的に許容される賦形剤とを含む。
【０１０９】
本発明の薬学的組成物を、併用療法で、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。例えば、併用療法は、本発明の組成物を、重症肢虚血（ＣＬＩ／ＰＡＯＤ）に関連した疾患の予防もしくは処置、または他の従来の治療法に有用な少なくとも一つの薬剤と共に含む場合がある。
【０１１０】
本明細書に使用するような「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合性の任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などがある。好ましくは、担体は（例えば注射または注入による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与に適する。
【０１１１】
「薬学的に許容される塩」は、抗体の所望の生物学的活性を保持し、任意の望まれない毒性作用を与えない塩を指す（例えばBerge, S.M., et al., J. Pharm. Sci. 66 (1977) 1-19を参照されたい）。そのような塩は本発明に含まれる。そのような塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩がある。酸付加塩には、塩酸塩のような無毒性無機酸由来の塩がある。
【０１１２】
本発明の組成物を、当技術分野で公知の様々な方法によって投与できる。当業者に認識されているであろうが、投与経路および／または投与様式は、所望の結果に応じて変動するであろう。
【０１１３】
ある投与経路で本発明の化合物を投与するために、その化合物をある物質で被覆するか、またはある物質と同時投与してその化合物の不活性化を防止することが必要な場合がある。例えば、適切な担体、例えばリポソーム、または希釈剤に入れてその化合物を被験体に投与できる。薬学的に許容される希釈剤には、生理食塩水および水性緩衝溶液がある。
【０１１４】
薬学的に許容される賦形剤または担体には、注射可能な滅菌溶液または分散物を即時調製するための滅菌水溶液または分散物と滅菌粉末とがある。薬学的に活性な物質のためのそのような媒質および薬剤の使用は、当技術分野で公知である。
【０１１５】
本明細書に使用する句「非経口投与」および「非経口的に投与する」は、経腸および局所投与以外の、通常は注射による投与様式を意味し、非限定的に静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、上皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、髄腔内、硬膜外、および胸骨内への注射および注入を含む。
【０１１６】
これらの組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤、および分散剤のような賦形剤または佐剤も含む場合もある。上記滅菌法と、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの様々な抗細菌剤および抗真菌剤の包含との両方によって、微生物の存在防止を確実にすることができる。組成物に糖類、塩化ナトリウムなどのような等張化剤を含ませることも理想的でありうる。さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような、吸収を遅延させる薬剤の包含によって、注射可能な薬学的形態の持続性吸収をなし遂げることができる。
【０１１７】
選択した投与経路とは無関係に、適切な水和形態で使用できる本発明の化合物および／または本発明の薬学的組成物を、当業者に公知の通常の方法によって薬学的に許容される投薬剤形に製剤する。
【０１１８】
本発明の薬学的組成物中の有効成分の実際の投薬レベルは、特定の患者に有毒とならずにその患者、組成物、および投与様式に関して所望の治療応答を実現するために有効である有効成分の量を得るように変動しうる。選択された投薬レベルは、採用された本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩、もしくはアミドの活性と、投与経路と、投与時間と、採用される特定の化合物の排泄速度と、処置の持続時間と、採用された特定の組成物と併用される他の薬物、化合物、および／または物質と、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態、および以前の病歴と、医学の分野で周知の同様の因子を含めた様々な薬物動態因子とに依存するであろう。典型的な１週用量は、上に挙げた因子に応じて約０．１mg/kgから約２０mg/kg以上まで変動しうるであろう。
【０１１９】
その組成物は無菌であって、シリンジによって送達できる程度に流動性でなければならない。水以外に、担体は等張緩衝生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物でありうる。
【０１２０】
例えばレシチンのようなコーティング剤の使用によって、分散物の場合は必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤の使用によって、妥当な流動性を維持できる。多くの場合で等張化剤、例えば糖類、マンニトールまたはソルビトールのようなポリアルコール、および塩化ナトリウムをその組成物に含ませることが好ましい。吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンをその組成物に含ませることによって、注射可能な組成物の長時間吸収をもたらすことができる。
【０１２１】
本発明は治療を必要とする患者を処置するための方法を含み、その方法は、Ｐ−セレクチンと結合し、ヒト起源由来のＦｃ部分を含み、かつ補体因子Ｃ１ｑと結合しない、治療有効量の抗体をその患者に投与することを特徴とする。
【０１２２】
本発明は、Ｐ−セレクチンと結合し、ヒト起源由来のＦｃ部分を含み、かつ補体因子Ｃ１ｑと結合しない抗体を治療に使用することを含む。
【０１２３】
本発明は、Ｐ−セレクチンと結合し、ヒト起源由来のＦｃ部分を含み、かつ補体因子Ｃ１ｑと結合しない抗体を、炎症障害および血栓障害の予防および処置のための薬の調製に使用することを含む。
【０１２４】
本発明は、Ｐ−セレクチンと結合し、ヒト起源由来のＦｃ部分を含み、かつ補体因子Ｃ１ｑと結合しない抗体を、ＰＡＯＤおよびＣＬＩの処置のために使用することを含む。
【０１２５】
このように、本発明は、Ｐ−セレクチンに結合し、補体因子Ｃ１ｑに結合せず、ヒト起源由来のＦｃ部分を含む抗体を提供し、該抗体は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、および／もしくはＰ３２９に少なくとも一つの突然変異を含むヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体であるか、またはＳ２２８がＰに交換され、Ｌ２３５がＥに交換されたヒトサブクラスＩｇＧ４の抗体であることを特徴とする。一態様では、その抗体はヒト抗体である。別の態様では、その抗体はヒト化抗体である。
【０１２６】
一態様では、本発明は、Ｐ−セレクチンに結合し、補体因子Ｃ１ｑに結合せず、ヒト起源由来のＦｃ部分を含む抗体を提供し、該抗体は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、および／もしくはＰ３２９に少なくとも一つの突然変異を含むヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体であるか、またはＳ２２８がＰに交換され、Ｌ２３５がＥに交換されたヒトサブクラスＩｇＧ４の抗体であることを特徴とする。ここで、補体因子Ｃ１ｑにその抗体が結合しないことは、その抗体の濃度１０μg/mlでその抗体に対するＣ１ｑの最大結合（Ｂｍａｘ）が、細胞系ｈｕ−Ｍａｂ＜Ｐ−セレクチン＞ＬＣ１００４−００２（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６４１）の抗体ＬＣ１００４−００２のＢｍａｘの３０％以下であるＥＬＩＳＡアッセイの測定値を指す。別の態様では、最大結合は細胞系ｈｕ−Ｍａｂ＜Ｐ−セレクチン＞ＬＣ１００４−００２（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６４１）の抗体ＬＣ１００４−００２のＢｍａｘの２０％以下である。
【０１２７】
一態様では、本発明は、Ｐ−セレクチンに結合し、補体因子Ｃ１ｑに結合せず、ヒト起源由来のＦｃ部分を含む抗体を提供し、該抗体は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、および／もしくはＰ３２９に少なくとも一つの突然変異を含むヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体であるか、またはＳ２２８がＰに交換され、Ｌ２３５がＥに交換されたヒトサブクラスＩｇＧ４の抗体であることを特徴とする。ここで、その抗体はＢＩＡｃｏｒｅアッセイで１０−８M未満のＫＤ値でＰ−セレクチンに結合する。別の態様では、ＫＤの範囲は１０−１１から１０−９Mである。
【０１２８】
一態様では、本発明は、Ｐ−セレクチンに結合し、補体因子Ｃ１ｑに結合せず、ヒト起源由来のＦｃ部分を含む抗体を提供し、該抗体は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、および／もしくはＰ３２９に少なくとも一つの突然変異を含むヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体であるか、またはＳ２２８がＰに交換され、Ｌ２３５がＥに交換されたヒトサブクラスＩｇＧ４の抗体であることを特徴とする。ここで、その抗体は、Ｐ−セレクチンとＥ−および／またはＬ−セレクチンとがマクロタイタープレートに被覆されたＥＬＩＳＡアッセイにおいてＥＣ５０値によって測定されたように、Ｅ−および／またはＬ−セレクチンよりもＰ−セレクチンに対して少なくとも１０００倍大きく特異的に結合する。別の態様では、Ｅ−およびＬ−セレクチントランスフェクタントに対するＥＣ５０値は１００μg/mlよりも大きい。
【０１２９】
一態様では、本発明は、Ｐ−セレクチンに結合し、補体因子Ｃ１ｑに結合せず、ヒト起源由来のＦｃ部分を含む抗体を提供し、該抗体は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、および／もしくはＰ３２９に少なくとも一つの突然変異を含むヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体であるか、またはＳ２２８がＰに交換され、Ｌ２３５がＥに交換されたヒトサブクラスＩｇＧ４の抗体であることを特徴とする。ここで、その抗体は１μg/mlよりも大きくないＩＣ５０値で精製Ｐ−セレクチンに対する白血球様ＨＬ６０細胞の接着を阻害する。別の態様では、ＩＣ５０値は０．０８から０．５μg/mlの範囲である。なお別の態様では、ＩＣ５０値は０．０８から０．１１μg/mlの範囲である。
【０１３０】
一態様では、本発明は、Ｐ−セレクチンに結合し、補体因子Ｃ１ｑに結合せず、ヒト起源由来のＦｃ部分を含む抗体を提供し、該抗体は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、および／もしくはＰ３２９に少なくとも一つの突然変異を含むヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体であるか、またはＳ２２８がＰに交換され、Ｌ２３５がＥに交換されたヒトサブクラスＩｇＧ４の抗体であることを特徴とする。ここで、
（ａ）活性化血小板に対する白血球様ＨＬ６０細胞の接着は０．０５から０．３μg/mlのＩＣ５０値で阻害されるか、
（ｂ）その抗体は白血球と血小板単層との相互作用を７０％よりも大きく阻害するか、
（ｃ）その抗体は３μg/mlの濃度でヒト流動系中の活性化内皮細胞に対する白血球の接着を６０から９０％の範囲で阻害するか、
（ｄ）その抗体はＣ３タンパク質と結合しないか、
（ｅ）その抗体は補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を誘発しないか、
（ｆ）その抗体はＮＫエフェクター細胞上のＦｃγ受容体に結合しないか、または
（ｇ）その抗体は抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を誘発しない。
【０１３１】
一態様では、本発明はＰ−セレクチンに結合する抗体を提供し、該抗体は、可変部Ｈ鎖アミノ酸配列ＣＤＲ３がＨ鎖ＣＤＲ３配列である配列番号３８、３９、４０、４１、または４２からなる群より選択されることを特徴とする。
【０１３２】
一態様では、本発明は、Ｐ−セレクチンに結合し、可変部Ｈ鎖および可変部Ｌ鎖を含む抗体を提供し、その抗体は、可変部Ｈ鎖がＣＤＲ配列であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１が配列番号２９、３０、３１、３２からなる群より選択され、ＣＤＲ２が配列番号３３、３４、３５、３６、３７からなる群より独立して選択され、ＣＤＲ３が配列番号３８、３９、４０、４１、４２からなる群より選択されることを特徴とし、ここで、該ＣＤＲは相互に独立して選択される。
【０１３３】
一態様では、本発明は、可変部Ｌ鎖がＣＤＲ配列であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１が配列番号４３、４４より選択され、ＣＤＲ２が配列番号４５、４６より選択され、ＣＤＲ３が配列番号４７、４８、４９、５０、５１、５２より選択されることを特徴とする抗体を提供し、ここで、該ＣＤＲは相互に独立して選択される。
【０１３４】
一態様では、本発明は、Ｐ−セレクチンと結合すること、および以下からなる群より独立して選択される可変部を含むことを特徴とする抗体を提供する：
ａ）配列番号１のアミノ酸配列によって定義されるＬ鎖可変ドメインおよび配列番号２によって定義されるＨ鎖可変ドメイン、
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列によって定義されるＬ鎖可変ドメインおよび配列番号４によって定義されるＨ鎖可変ドメイン、
ｃ）配列番号５のアミノ酸配列によって定義されるＬ鎖可変ドメインおよび配列番号６によって定義されるＨ鎖可変ドメイン、
ｄ）配列番号７のアミノ酸配列によって定義されるＬ鎖可変ドメインおよび配列番号８によって定義されるＨ鎖可変ドメイン、
ｅ）配列番号９のアミノ酸配列によって定義されるＬ鎖可変ドメインおよび配列番号１０によって定義されるＨ鎖可変ドメイン、
ｆ）配列番号１１のアミノ酸配列によって定義されるＬ鎖可変ドメインおよび配列番号１２によって定義されるＨ鎖可変ドメイン、
ｇ）配列番号１３のアミノ酸配列によって定義されるＬ鎖可変ドメインおよび配列番号１４によって定義されるＨ鎖可変ドメイン、
ｈ）配列番号１５のアミノ酸配列によって定義されるＬ鎖可変ドメインおよび配列番号１６によって定義されるＨ鎖可変ドメイン、
ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列によって定義されるＬ鎖可変ドメインおよび配列番号１８によって定義されるＨ鎖可変ドメイン、
ｊ）配列番号１９のアミノ酸配列によって定義されるＬ鎖可変ドメインおよび配列番号２０によって定義されるＨ鎖可変ドメイン、
ｋ）配列番号２１のアミノ酸配列によって定義されるＬ鎖可変ドメインおよび配列番号２２によって定義されるＨ鎖可変ドメイン。
【０１３５】
一態様では、本発明は、Ｐ−セレクチンに結合し、補体因子Ｃ１ｑに結合せず、ヒト起源由来のＦｃ部分を含む抗体を提供し、該抗体は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、および／もしくはＰ３２９に少なくとも一つの突然変異を含むヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体であるか、またはＳ２２８がＰに交換され、Ｌ２３５がＥに交換されたヒトサブクラスＩｇＧ４の抗体であることを特徴とする。ここで、その抗体は、アミノ酸配列である配列番号３によって定義されるＬ鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３部と、配列番号４によって定義されるＨ鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３部とを含む。別の態様では、その抗体は、アミノ酸配列である配列番号３によって定義されるＬ鎖可変ドメインと、配列番号４によって定義されるＨ鎖可変ドメインとを含む。
【０１３６】
一態様では、本発明は、Ｐ−セレクチンに結合し、補体因子Ｃ１ｑに結合せず、ヒト起源由来のＦｃ部分を含む抗体を提供し、該抗体は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、および／もしくはＰ３２９に少なくとも一つの突然変異を含むヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体であるか、またはＳ２２８がＰに交換され、Ｌ２３５がＥに交換されたヒトサブクラスＩｇＧ４の抗体であることを特徴とする。ここで、
（ａ）その抗体は補体因子Ｃ１ｑに結合しないようにさせる少なくとも一つのアミノ酸突然変異をＦｃ部分に含むか、
（ｂ）そのヒトＨ鎖定常部は配列番号２５、配列番号２６、および２８からなる群より独立して選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｃ）その抗体は配列番号２３によって定義されるようなκＬ鎖定常部を含むか、
（ｄ）その抗体は補体Ｃ１ｑに結合しないようにさせる少なくとも一つのアミノ酸突然変異を含むか、
（ｅ）その抗体はＩｇＧ１ｖ１、ＩｇＧ１ｖ２、およびＩｇＧ４ｖ１からなる群より選択されるＨ鎖定常部を含むか、または
（ｆ）その抗体はＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、もしくは一本鎖フラグメントである。
【０１３７】
一態様では、本発明は、ａ）ヒト抗体またはヒト化抗体であり、ｂ）Ｐ−セレクチンとＥ−および／またはＬ−セレクチンとをマイクロタイタープレートに被覆するＥＬＩＳＡアッセイにおいてＥＣ５０値によって測定されるようにＥ−またはＬ−セレクチンよりもＰ−セレクチンに対して少なくとも１０００倍大きく特異的に結合することを特徴とする抗Ｐ−セレクチン抗体を提供する。別の態様では、その抗体は、配列番号２４、２５、もしくは２６のγ１Ｈ鎖定常部、または配列番号２７もしくは２８のγ４Ｈ鎖定常部によって定義されるようなアミノ酸配列を含む。なお別の態様では、その抗体は、ｈｕ−Ｍａｂ＜Ｐ−セレクチン＞ＬＣ１００４−００１（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６４０）、ｈｕ−Ｍａｂ＜Ｐ−セレクチン＞ＬＣ１００４−００２（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６４１）、およびｈｕ−＋Ｍａｂ＜Ｐ−セレクチン＞ＬＣ１００４−０１７（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６４２）からなる群より選択される細胞系によって生成される。
【０１３８】
本発明は、段落［００１２９］から［００１４１］に記載されたような定義を有する態様およびそれらの組み合わせも提供するものとする。
【０１３９】
本発明の理解を助けるために以下の実施例、参照、配列リスト、および図面を提供し、その真の範囲を添付の特許請求の範囲に示す。本発明の精神から逸脱せずに、示された手順に変更を加えることができると了解されている。
【０１４０】
配列リストの説明
配列番号１      ＨｕＭａｂ１００４−００１のＬＣ１００４−００１Ｌ鎖可変ドメイン
配列番号２      ＨｕＭａｂ１００４−００１のＬＣ１００４−００１Ｈ鎖可変ドメイン
配列番号３      ＨｕＭａｂ００２のＬＣ１００４−００２Ｌ鎖可変ドメイン
配列番号４      ＨｕＭａｂ００２のＬＣ１００４−００２Ｈ鎖可変ドメイン
配列番号５      ＨｕＭａｂ００３のＬＣ１００４−００３Ｌ鎖可変ドメイン
配列番号６      ＨｕＭａｂ００３のＬＣ１００４−００３Ｈ鎖可変ドメイン
配列番号７      ＨｕＭａｂ００４（Ｉ）のＬＣ１００４−００４Ｌ鎖（Ｉ）可変ドメイン
配列番号８      ＨｕＭａｂ００４（Ｉ）のＬＣ１００４−００４Ｈ鎖（Ｉ）可変ドメイン
配列番号９      ＨｕＭａｂ００４（ＩＩ）のＬＣ１００４−００４Ｌ鎖（ＩＩ）可変ドメイン
配列番号１０    ＨｕＭａｂ００４（ＩＩ）のＬＣ１００４−００４Ｈ鎖（ＩＩ）可変ドメイン
配列番号１１    ＨｕＭａｂ００５のＬ鎖可変ドメイン
配列番号１２    ＨｕＭａｂ００５のＨ鎖可変ドメイン
配列番号１３    ＨｕＭａｂ０１０（Ｉ）のＬ鎖可変ドメイン
配列番号１４    ＨｕＭａｂ０１０（Ｉ）のＨ鎖可変ドメイン
配列番号１５    ＨｕＭａｂ０１０（ＩＩ）のＬ鎖可変ドメイン
配列番号１６    ＨｕＭａｂ０１０（ＩＩ）のＨ鎖可変ドメイン
配列番号１７    ＨｕＭａｂ０１０（ＩＩＩ）のＬ鎖可変ドメイン
配列番号１８    ＨｕＭａｂ０１０（ＩＩＩ）のＨ鎖可変ドメイン
配列番号１９    ＨｕＭａｂ０１１のＬ鎖可変ドメイン
配列番号２０    ＨｕＭａｂ０１１のＨ鎖可変ドメイン
配列番号２１    ＨｕＭａｂ０１７のＬ鎖可変ドメイン
配列番号２２    ＨｕＭａｂ０１７のＨ鎖可変ドメイン
配列番号２３    κＬ鎖定常部
配列番号２４    γ１Ｈ鎖定常部
配列番号２５    γ１Ｈ鎖定常部ＰＶＡ２３６／ＧＬＰＳＳ３３１（ＩｇＧ１ｖ１）
配列番号２６    γ１Ｈ鎖定常部Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＩｇＧ１ｖ２）
配列番号２７    γ４Ｈ鎖定常部
配列番号２８    γ４Ｈ鎖定常部Ｓ２２８／Ｌ２３５Ｅ（ＩｇＧ４ｖ１）
配列番号２９〜３２    Ｈ鎖ＣＤＲ１
配列番号３３〜３７    Ｈ鎖ＣＤＲ２
配列番号３８〜４２    Ｈ鎖ＣＤＲ３
配列番号４３〜４４    Ｌ鎖ＣＤＲ１
配列番号４５〜４６    Ｌ鎖ＣＤＲ２
配列番号４７〜５２    Ｌ鎖ＣＤＲ３
【０１４１】
省語：
アミノ酸を３文字（Ｌｅｕ）または１文字の略号（Ｌ）のいずれかに省略する
抗体ＨｕＭａｂ００Ｘを抗体００Ｘとも呼ぶ
Ｌ２３４は、ＥＵ番号（Kabat）により位置２３４のアミノ酸ロイシンを意味する
Ｌ２３４Ａは、位置２３４のアミノ酸ロイシンがアラニンに交換されたことを意味する
ＰＶＡ２３６は、２３６領域においてＩｇＧ１のＥＬＬＧまたはＩｇＧ４のＥＦＬＧがＰＶＡに修正されたことを意味する
ＧＬＰＳＳ３３１は、３３１領域におけるＩｇＧ１のＡＬＰＡＰまたはＩｇＧ２のＧＬＰＡＰがＧＬＰＳＳに交換されたことを意味する
他のＩｇＧサブクラスも同様に修正する
【０１４２】
実施例
抗Ｐ−セレクチン抗体を生成するハイブリドーマ細胞系の発生
ハイブリドーマの培養
ＨｕＭａｂハイブリドーマをＩＭＤＭ（Cambrex）、ウシ胎仔クローン１血清（Perbio Science）、ハイブリドーマクローニング因子原液(Igen)、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシン、２−メルカプトエタノール、ＨＡＴ（Sigma-Aldrich）、およびカナマイシン（Invitrogen）中で３７℃および５％ＣＯ２で培養した。
【０１４３】
抗Ｐ−セレクチン抗体を生成するハイブリドーマ細胞系の発生
トランスジェニックマウスの免疫処置法
プロトコールＡ：
Ｐ−セレクチンの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠如した組換え短縮型Ｐ−セレクチンをR&D Systemsから購入し、それを用いてＨＣｏ７トランスジェニックマウス１０匹（雄５匹、雌５匹）ＧＧ２２０１系統（Medarex, San Jose, CA, USA）に免疫処置を行った。初回免疫処置には、ＰＢＳ１００μlに溶かした組換えＰ−セレクチン５０μgをフロイントの完全アジュバント１００μlと混合した。残りの免疫処置には、ＫＬＨとカップリングした組換えＰ−セレクチンを使用した。２回目の免疫処置には、ＫＬＨとカップリングした組換えＰ−セレクチン５０μgをＰＢＳ１００μlに溶かし、フロイントの不完全アジュバント１００μlと混合した。残りの免疫処置には、ＫＬＨとカップリングした組換えＰ−セレクチン２０μgをＰＢＳ１００μlに溶かし、フロイントの不完全アジュバント１００μlと混合した。腹腔内免疫処置から開始して、腹腔内投与と皮下投与とを交互にして免疫処置を行った。
【０１４４】
プロトコールＢ：
ＨＣｏ７トランスジェニックマウス（全て雌）３匹およびＫＭトランスジェニックマウス（全て雄）３匹ＧＧ２４８９系統（Medarex, San Jose, CA, USA）に、イムノアフィニティークロマトグラフィー（下記参照）によって無効のヒト血小板から精製した完全長Ｐ−セレクチンを用いて免疫処置を行った。初回免疫処置には、ＰＢＳ１００μlに溶かした精製Ｐ−セレクチン５０μgをフロイントの完全アジュバント（CFA; Difco Laboratories, Detroit, USA）１００μlと混合した。２回目の免疫処置にはＰＢＳ１００μlに溶かした精製Ｐ−セレクチン５０μgをフロイントの不完全アジュバント１００μl（ICFA; Difco）と混合した。
【０１４５】
他の全ての免疫処置については、精製Ｐ−セレクチン２０μgを使用して、フロイントの不完全アジュバント１００μlと混合した。
【０１４６】
抗原特異的ＥＬＩＳＡ
免疫処置されたマウスの血清中抗Ｐ−セレクチン力価を抗原特異的ＥＬＩＳＡによって決定した。平板（９６平底ＥＬＩＳＡプレート、Greiner）に、ＰＢＳに溶かした０．１μg/ml精製Ｐ−セレクチンを被覆し、室温で一晩被覆した。その後、ウェルをＰＢＳＴＣ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Sigma-Aldrich Chemie BV）および２％ニワトリ血清（Gibco）を含むＰＢＳ）を用いて室温で１時間ブロッキングした。
【０１４７】
被験血清タップをＰＢＳＴＣで１：１００に希釈してウェルに加えた。免疫処置前にマウスから得た血清をＰＢＳＴＣで１：１００の割合で溶かし、陰性対照として使用した。ヒトＰ−セレクチンに対するマウス抗体（１／７、Roche Baselが社内で製造）をＰＢＳＴＣに１：１００の割合で溶かし、陽性対照として使用した。プレートを室温で１時間インキュベートした。次に、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）を使用してプレートを２回洗浄した。Ｇｔ−α−ｈｕＩｇＧ−ＨＲＰ（Jackson）をＰＢＳＴＣに１：５０００に希釈して被験タップおよび陰性対照を含むウェルに加えた。Ｒｂ−α−ｍＩｇＧ（Jackson）をＰＢＳＴＣに１：３０００に希釈し、陽性対照を含むウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートした。最後にＰＢＳＴを使用してプレートを２回洗浄し、新鮮調製したＡＢＴＳ（登録商標）溶液（１mg/ml）（ＡＢＴＳ：２，２’−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）を用いて暗条件で室温（ＲＴ）で３０分間発色させた。４０５nmの吸光度を測定した。
【０１４８】
マウスの追加免疫
血清中の抗Ｐ−セレクチン力価が十分な場合、ＰＢＳ１００μlに入れた組換えヒトＰ−セレクチン２０μgを用いて、融合の４日および３日前にマウス静脈内に追加的に追加免疫処置を２回行った。
【０１４９】
ハイブリドーマの発生
マウスを屠殺し、腹大動脈および大静脈に隣接する脾臓およびリンパ節を集めた。脾臓細胞およびリンパ節細胞と、融合パートナーであるＳＰ２．０細胞との融合を標準的な操作法により行った。
【０１５０】
配列番号１〜２２の可変部Ｈ鎖およびＬ鎖配列を有するヒトモノクローナル抗体を免疫処置法によって得た。
【０１５１】
κ−ＥＬＩＳＡ
融合の結果生じたハイブリドーマがヒト抗体を発生するかどうかを決定するために、κ−ＥＬＩＳＡを行った。４℃で一晩インキュベートすることによってＰＢＳで１／１００００に希釈したラット抗ヒトＩｇＧκＬ鎖抗体（ＤＡＫＯ）をＥＬＩＳＡプレートに被覆した。ウェルの中身を捨てた後で、室温で１時間ＰＢＳＴＣと共にインキュベートすることによってプレートをブロッキングした。その後、ＰＢＳＴＣで１／２に希釈したハイブリドーマ培養上清と共にウェルをインキュベートした。ＰＢＳＴＣで１／２に希釈した培地を陰性対照として使用し、ＰＢＳＴＣで１／１００に希釈したκＬ鎖陽性マウス血清を陽性対照として役立てた。続いて、ウェルを３回洗浄して、ＰＢＳＴＣで１／２０００に希釈したＨＲＰ結合ラット抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２（DAKO）と共に３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを３回洗浄して、新鮮調製したＡＢＴＳ（登録商標）溶液（１mg/ml）を用いて暗条件で室温（ＲＴ）で３０分間アッセイ液を発色させた。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４０５nmで吸光度を測定した。
【０１５２】
抗Ｐ−セレクチンＨｕＭａｂ可変ドメインのクローニングおよび配列分析（κＬ鎖およびγ１Ｈ鎖）
Ｐ−セレクチンＨｕＭａｂのＬ鎖可変部ＶＬおよびＨ鎖可変部ＶＨをコードするヌクレオチド配列を標準的なｃＤＮＡ合成／ＰＣＲ法によって単離した。
【０１５３】
ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキット（Qiagen）を使用して１×１０６〜１×１０７個のハイブリドーマ細胞から総ＲＮＡを調製した。ハイブリドーマ由来ＲＮＡを第一鎖のｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして使用し、その合成をオリゴｄＴプライマーを使用した従来法により行った。第二鎖ｃＤＮＡ合成と、ＶＬおよびＶＨをコードするｃＤＮＡフラグメントのさらなるＰＣＲ増幅とを、κＬ鎖およびγ１Ｈ鎖定常部のヌクレオチド配列に相補的な逆方向Ｌ鎖およびＨ鎖プライマーと、５’特異的Ｌ鎖およびＨ鎖プライマーとをそれぞれ用いて行った。Invitrogen（商標）life technologiesからのＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキットと、クローニングベクターとしてｐＣＲ４−ＴＯＰＯとを使用してＰＣＲ生成物をクローニングした。クローニングしたＰＣＲ生成物を、消化にＥｃｏＲＩを使用して適切なプラスミドの制限地図を作成することによって同定し、ＶＬおよびＶＨに対してそれぞれ約７４０および７９０bpのＤＮＡフラグメントサイズであると予測／計算した。
【０１５４】
クローニングされたＰＣＲフラグメントのＤＮＡ配列を二本鎖の配列決定により決定した。
【０１５５】
ＧＣＧ（Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin）ソフトウェアパッケージバージョン１０．２をデータ処理全般に使用した。ＤＮＡおよびタンパク質の配列をＧＣＧモジュールＣＬＵＳＴＡＬＷを使用してアライメントを作成した。プログラムＧＥＮＥＤＯＣ（バージョン２．１）を使用して配列アライメントを一覧にして、編集して、色分けした。
【０１５６】
抗Ｐ−セレクチンＩｇＧ１  ＨｕＭａｂに関する発現プラスミドの構築
抗Ｐ−セレクチンＨｕＭａｂＬ鎖をコードしている遺伝子およびＨ鎖をコードしている遺伝子を哺乳動物細胞発現ベクターに別々に集めた。
【０１５７】
それによって、抗Ｐ−セレクチンＨｕＭａｂＬ鎖可変部（ＶＬ）をコードする遺伝子セグメントおよびヒトκＬ鎖定常部（ＣＬ）をコードする遺伝子セグメントを、抗Ｐ−セレクチンＨｕＭａｂＨ鎖可変部（ＶＨ）およびヒトγ１Ｈ鎖定常部（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）に関する遺伝子セグメントと同様に連結した。
【０１５８】
コドン利用頻度を推定できるヒトＬ鎖およびＨ鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman, K. S., and Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242に示されている。
【０１５９】
抗Ｐ−セレクチンＨｕＭａｂ  κＬ鎖の転写ユニットは、以下のエレメントから構成される：
・  ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）由来前初期エンハンサーおよびプロモーター、
・  Ｋｏｚａｋ配列を含む合成５’−ＵＴ、
・  シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリンＨ鎖シグナル配列、
・  ５’末端に独特のＢｓｍＩ制限部位と、スプライスドナー部位と、３’末端に独特のＮｏｔＩ制限部位とを有して配列した、クローニングされた抗Ｐ−セレクチンＨｕＭａｂ可変部Ｌ鎖ｃＤＮＡ、
・  イントロン２マウスＩｇ−κエンハンサーを含むヒトゲノムκ遺伝子定常部（Picard, D., and Schaffner, W. (1984) Nature 307, 80-82）、ならびに
・  ヒト免疫グロブリンκ−ポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列。
【０１６０】
抗Ｐ−セレクチンＨｕＭａｂ  γ１Ｈ鎖の転写ユニットは、以下のエレメントから構成される：
・  ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）由来前初期エンハンサーおよびプロモーター、
・  Ｋｏｚａｋ配列を含む合成５’−ＵＴ、
・  シグナル配列イントロンを含む修飾されたマウス免疫グロブリンＨ鎖シグナル配列、
・  ５’末端に独特のＢｓｍＩ制限部位と、スプライスドナー部位と、３’末端に独特のＮｏｔＩ制限部位とを有して配列した、クローニングされた抗Ｐ−セレクチンＨｕＭａｂ可変部Ｈ鎖ｃＤＮＡ、
・  マウスＩｇμ−エンハンサーを含むヒトゲノムγ１Ｈ鎖遺伝子定常部（Neuberger, M. S. (1983) Embo J2, 1373-1378）、
・  ヒトγ１−免疫グロブリンポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列。
【０１６１】
抗Ｐ−セレクチンＨｕＭａｂ  κＬ鎖発現プラスミドおよびγ１Ｈ鎖発現プラスミドの機能的エレメント：抗Ｐ−セレクチンＨｕＭａｂ  κＬ鎖またはγ１Ｈ鎖発現カセットの他に、これらのプラスミドは、以下を含む：
・  ヒグロマイシン耐性遺伝子
・  エプスタン・バールウイルス（ＥＢＶ）の複製起点ｏｒｉＰ
・  E.coliでのベクターｐＵＣ１８の複製を可能にする、このプラスミド由来の複製起点、および
・  E.coliにアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子。
【０１６２】
抗Ｐ−セレクチンＩｇＧ４  ＨｕＭａｂに関する発現プラスミドの構築
ヒトゲノムγ１定常部およびγ１免疫グロブリンポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列を、ヒトゲノムγ４定常部およびγ４−免疫グロブリンポリアデニル化シグナル配列に交換することによって、抗Ｐ−セレクチンγ１Ｈ鎖発現プラスミドから抗Ｐ−セレクチンγ４Ｈ鎖プロトタイプの発現プラスミドを得た。
【０１６３】
抗Ｐ−セレクチンＨｕＭａｂ  κＬ鎖を発現させるために、ＩｇＧ１について記載したのと同様の発現プラスミドを使用した（上記参照）。
【０１６４】
突然変異（変異）抗Ｐ−セレクチンＩｇＧ１およびＩｇＧ４に関する発現プラスミドの構築
突然変異抗Ｐ−セレクチンγ１およびγ４Ｈ鎖をコードする発現プラスミドを、QuickChange（商標）部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene）を使用した野生型発現プラスミドの部位特異的突然変異誘発によって生み出した。
【０１６５】
ＬＣ１００４−００２に対して以下の突然変異体が発生した。ＥＵ付番によりアミノ酸に番号を付けた（Edelman, G. M., Cunningham, B. A., Gall, W. E., Gottlieb, P. D., Rutishauser, U., and Waxdal, M. J. (1969) Proc Natl Acad Sci USA 63, 78-85; Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman, K. S., and Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242）。
【０１６６】
【表２】
0005714554.tif 000003
【０１６７】
組換え抗Ｐ−セレクチンＨｕＭａｂの生成
１０％超低濃度ＩｇＧ  ＦＣＳ（Gibco）、２mMグルタミン（Gibco）、１％v/v 非必須アミノ酸（Gibco）、および２５０μg/mlＧ４１８（Roche）を補充したＤＭＥＭ（Gibco）中で培養した接着ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＴＣ＃ＣＲＬ−１０８５２）の一過性トランスフェクションによって組換えＨｕＭａｂを発生させた。トランスフェクションにＦｕｇｅｎｅ（商標）６（Roche）トランスフェクション試薬を、試薬（μl）対ＤＮＡ（μg）の比が３：１から６：１の範囲で使用した。Ｌ鎖をコードするプラスミド対Ｈ鎖をコードするプラスミドのモル比を１：２から２：１で用いて、二つの異なるプラスミドから免疫グロブリンＬ鎖およびＨ鎖を、発現させた。ＨｕＭａｂを含む細胞培養上清をトランスフェクションの４日後および１１日後に採集した。精製まで上清を−２０℃で保存した。
【０１６８】
例えばＨＥＫ２９３でのヒト抗体の組換え発現に関する一般的な情報は、Meissner, P., Pick, H., Kulangara, A., Chatellard, P., Friedrich, K., and Wurm, F. M. (2001) Biotechnol Bioeng 75, 197-203に示されている。
【０１６９】
抗Ｐ−セレクチンＨｕＭａｂの親和性の決定
装置：
機器：BIACORE（登録商標）２０００
チップ：ＣＭ５
カップリング法：アミンカップリング
緩衝液：ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ）、ｐＨ７．４、２５℃
【０１７０】
親和性の測定のために、ウサギ抗ヒトＦｃγ抗体（Dianova）をアミンカップリング法によってチップ表面にカップリングし、Ｐ−セレクチンに対する抗体に提示させた。約４００RUの抗Ｐ−セレクチン抗体が結合した。組換えＰ−セレクチン（R&D Systems）を０〜５０nMの間の様々な濃度で加えた。Ｐ−セレクチンを１２０秒間インジェクトすることによって会合を測定し、チップ表面を緩衝液で１８０秒間洗浄することによって解離を測定した。種々のＰ−セレクチン抗体に関する親和性のデータを表２に示す。Biaevaluationソフトウェアを使用して、提示されたモノクローナル抗体に対するＰ−セレクチンの１：１ラングミュア型結合モデルに動態データをあてはめた。
【０１７１】
【表３】
0005714554.tif 000004
【０１７２】
細胞性接着およびロゼット形成アッセイでのＰ−セレクチン抗体の阻害活性
材料および方法：
細胞接着アッセイ：接着アッセイではマイクロタイタープレートに被覆したＰ−セレクチンに対する白血球様ＨＬ６０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２４０）の接着に及ぼすＨｕＭａｂの効果を評価した。ＨＬ６０細胞をＢＣＥＣＦ−ＡＭ（２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（および−６−）カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエステル、カタログ番号２１６２５４、Calbiochem）で標識した。１５０mM ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１mM ＭｇＣｌ２、２０mM Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、および０．０００５％Ｔｘ１００を含む緩衝液中の濃度１μg/mlの完全長精製Ｐ−セレクチン（精製法については上記参照）を９６ウェルプレート（Nunc Immunoplate Maxisorp F96）に４℃で一晩被覆した。その後、３．５％ウシ血清アルブミン（BSA, Fluka）を含む上記緩衝液で室温（ＲＴ）で２時間ウェルをブロッキングした。１％ＢＳＡを含む上記緩衝液にＰ−セレクチンＨｕＭａｂまたは参照マウスＰ−セレクチン抗体（ＷＡＰＳ１２．２、各ハイブリドーマ細胞系はＡＴＣＣが提供）を様々に希釈した液５０μlと共に、これらのウェルをＲＴで２０分間予備インキュベートした。標識ＨＬ６０細胞（５０μl、細胞７００００個/ウェル）を加えて、ＲＴで４５分間結合させた。一部の実験では、Ｆｃ受容体をブロッキングするために２０μg/mlのヒトＩｇＧ１と共にＨＬ６０細胞を３０分間予備インキュベートしてから、それらの細胞をウェルに加えた。未結合のＨＬ６０細胞を静かに洗浄する（上記緩衝液で４回）ことによって除去してから、接着した細胞をＮＰ−４０（Fluka、Ｈ２Ｏに溶かした１％溶液）１２０μlで溶解させた。上清１００μlをプレートに移して、発光分光分析装置ＬＳ５０Ｂ（Perkin Elmer）を使用して励起波長４８５nmおよび発光５３８nmで各蛍光を測定した。
【０１７３】
ロゼット形成アッセイ：活性化血小板とＨＬ６０細胞との相互作用に及ぼす抗体の効果を評価するために、ロゼット形成アッセイ（Jungi et al, Blood 67:629 (1986)）を二色細胞蛍光分析（Evangelista et al., Blood 88:4183 (1996)）と組み合わせて適用した。記載されたように（Fox et al, Methods Enzymol 215:45 (1992)）洗浄ヒト血小板を調製した。トロンビン（終濃度１U/ml）を用いて５分間それらの血小板を活性化させ、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＧＰＩＩｂ抗体ｐｌ−３６で標識した（Kouns et al., J Biol Chem 267:18844 (1992)）。次に、タイロード溶液７０μl中の血小板１．４〜２×１０６個を、種々に希釈したＨｕＭａｂ（１００μl）と共に暗条件でＲＴで３０分間インキュベートした。２０×１０６個/mlに調整した（タイロード溶液中の）ＨＬ６０細胞懸濁液５０μlを加えた。ＰＥ（フィコエリトリン）結合抗ヒトＣＤ４５Ａｂ（コード番号５５５４８３、Pharmingen）２０μlと共にインキュベートすることによってＨＬ６０細胞を標識した。標識したＨＬ６０細胞を血小板およびＨｕＭａｂと共に室温で３０分間ＦＡＣＳ管（Becton Dickinson）中でインキュベートした後で、ＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson）を使用して血小板とＨＬ６０細胞との両方のマーカー蛍光を測定することによって、混合凝集体またはロゼットの形成を分析した。前方および側方散乱、ならびに緑色（ＦＩＴＣ）および赤色（ＰＥ）シグナルを、励起波長４８８nmならびにそれぞれ発光波長５３０nm（ＦＩＴＣ）および５７０nm（ＰＥ）での対数増幅によって取得した。電子補正を使用して、スペクトルの重複を除いた。前方散乱および側方散乱に基づいてＨＬ６０細胞を同定した。ＨＬ６０細胞と同定されたイベントに関してゲーティングを行って、単一の血小板を除外した。ＨＬ６０細胞のゲートに入った５０００イベントを各試料について測定した。非活性化またはトロンビン活性化血小板をＥＤＴＡ（１０mmol/l）の存在下でＨＬ６０細胞と混合した試料を使用して、緑色蛍光スケールでの閾値を設定した。閾値よりも大きいＨＬ６０細胞の率は、血小板と結合しているＨＬ６０細胞の率を表す。血小板マーカーの蛍光が低蛍光値に移動することは、多数の接着血小板を有する混合凝集体の数が減少して、少数の接着血小板を有する混合凝集体の数が増加するのに有利になっていることを反映する。
【０１７４】
結果：
ＨＬ６０細胞接着アッセイでは、Ｐ−セレクチン抗体はＨＬ６０細胞が０．０８〜０．５μg/mlの範囲のＩＣ５０値で精製Ｐ−セレクチンに接着するのを阻害した。抗体のＦｃ部分に突然変異が導入されたが、ＨｕＭａｂのＩｇＧ４およびＩｇＧ１変異体の両方は、図１に示すように０．０８〜０．１１μg/mlのＩＣ５０値を有して、親抗体よりも強力であった。ＨＬ６０細胞をヒトＩｇＧ１と予備インキュベートした場合、図１のＨｕＭａｂ００２について実証されたようにＩＣ５０値の約３から４倍の低下となって非突然変異親抗体の効力も増加した。この結果は、接着アッセイでの突然変異体の有効性が増加したことの主な原因が、その抗体のＦｃ部分がＦｃγ受容体に対することを介して、Ｐ−セレクチンに対するＨＬ６０細胞の接着が除去されることであると示唆している。
【０１７５】
ＨＬ６０細胞に対する、Ｐ−セレクチンを発現しているヒト活性化血小板の接着を評価するロゼット形成アッセイでは、ＨｕＭａｂのＩＣ５０値は、このアッセイでのＰ−セレクチン受容体の数が少ないことが原因で接着アッセイでの値よりもなお低かった（ＩＣ５０：０．０５〜０．３μg/ml、好ましくは０．０５〜０．２μg/ml）。各ＨｕＭａｂのＦｃ変異体の有効性は、非突然変異親抗体に比べて増加する傾向にある（図２）。活性化血小板と共にインキュベートする前にＨＬ６０細胞をＩｇＧ１およびＩｇＧ４と予備インキュベーションしても、突然変異体と親抗体との両方の阻害活性に有意に影響しなかった。これは、接着アッセイに比べてロゼット形成アッセイではＦｃγ受容体介在性結合の役割があまり顕著でないことを示している。
【０１７６】
Ｐ−セレクチン抗体と動物種由来Ｐ−セレクチンとの交差反応性
材料および方法：Ｐ−セレクチンＨｕＭａｂの交差反応性を、（ｉ）ＦＡＣＳ分析を用いてラットおよびカニクイザル由来活性化血小板に対するＨｕＭａｂの結合、ならびに（ｉｉ）ＨＬ６０細胞に対するラットおよびカニクイザル血小板の接着を評価するロゼット形成アッセイでのそれらの抗体の阻害活性を測定することによって評価した。
【０１７７】
ラットおよびカニクイザルの活性化血小板に対するＨｕＭａｂの結合を測定するために、ラットおよびカニクイザルの洗浄した血小板を、ヒトの洗浄血小板（上記参照）の調製と同様に調製した。それらの血小板をトロンビンで５分間活性化させた（終濃度１U/ml）。活性化血小板を種々に希釈したＨｕＭａｂ（２０μl）と共にＲＴで３０分間インキュベートした。ＨｕＭａｂと結合させた後で、血小板を２％ＰＦＡを用いてＲＴで１５分間固定した。試料をタイロード緩衝液で洗浄してタイロード３００mlに再懸濁した。ＨｕＭａｂの結合を、ウサギ抗ヒトＩｇＧのＦＩＴＣ結合Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（コード番号Ｆ００５６、Dako）を用いて検出した。ラットＰ−セレクチンを阻害する対照抗体としてウサギ抗ヒトポリクローナル抗Ｐ−セレクチン抗体（コード番号０９３６１Ａ、Pharmingen）を使用した。
【０１７８】
ロゼット形成アッセイでのＰ−セレクチンＨｕＭａｂの阻害効果を測定するために、ヒト血小板について上に記載したのと同様に、ラットおよびカニクイザルの洗浄血小板を調製した。本質的にヒト血小板について記載したようにロゼット形成アッセイを行った。カニクイザル血小板を標識するためにＦＩＴＣ結合抗ヒトＧＰＩＩｂ抗体ｐｌ−３６を使用し、一方でラット血小板をＦＩＴＣ結合マウス抗ラットＣＤ６１抗体（コード番号５５４９５２、Pharmingen）で標識した。
【０１７９】
結果：図３ａのいくつかの例に示すように、ヒトＰ−セレクチン介在性機能を阻害する本発明のＰ−セレクチン特異的抗体のどれも、ラットＰ−セレクチンに結合せず、ラット血小板およびＨＬ６０細胞からなる混合凝集体の形成も阻害しないことが示された。しかし、Ｐ−セレクチンＨｕＭａｂはカニクイザルＰ−セレクチンに結合し、それを阻害する（図３ｂ）。
【０１８０】
Ｅ−およびＬ−セレクチンと比べたＰ−セレクチン抗体の選択性
材料および方法：Ｅ−およびＬ−セレクチンと比べたＰ−セレクチンＨｕＭａｂの選択性を、組換えＥ−およびＬ−セレクチンに対する抗体（ＡＤＰ１およびＡＤＰ２、R&D Systems）の結合を測定する無細胞ＥＬＩＳＡと、Ｅ−セレクチンＣＨＯトランスフェクタントおよびＬ−セレクチン３００．１９トランスフェクタントに対する抗体の結合を測定する細胞性ＥＬＩＳＡとで決定した（Goetz et al., J Cell Biol 137:509 (1997); Ley et al., Blood 82:1632 (1993)に記載されているようにトランスフェクタントを発生させた）。
【０１８１】
無細胞ＥＬＩＳＡでは、１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＣａＣｌ２、１mM ＭｇＣｌ２、２０mMトリス（ｐＨ７．４）、および０．０００５％Ｔｘ１００を含む緩衝液中濃度１μg/mlの組換えＰ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、またはＬ−セレクチンを９６ウェルプレート（Nunc Immunoplate Maxisorp F96）に４℃で一晩被覆した。その後、ウェルを３．５％ウシ血清アルブミン（BSA, Fluka）を含む上記緩衝液でＲＴで２時間ブロッキングした。１％ＢＳＡを含む上記緩衝液に種々に希釈したＰ−セレクチンＨｕＭａｂまたは参照マウスＰ−、Ｅ−セレクチン抗体（ＢＢＡ２６；R&D Systems）およびヤギＬ−セレクチン抗体（ＡＦ７２８；R&D Systems）５０μlと共にウェルをＲＴで一晩予備インキュベートした。ビオチン化抗ヒトＩｇＧ（Amersham、ＲＰＮ１００３、終濃度１：１０００）または対照抗体については対応するビオチン化抗マウスもしくは抗ヤギＩｇＧを使用することによって、ＨｕＭａｂの結合を検出した。１時間インキュベートした後で、ウェルを上記の緩衝液で（３回）洗浄し、０．１％ＢＳＡを含む上記緩衝液に１：７５０に希釈したストレプトアビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体（Amersham、ＲＰＮ１０５１）０．１mlを３０分間加えた。次に、ウェルを洗浄して、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ジ−（３−エチルベンズチアゾリンスルホナート、Boehringer, Mannheim）を含むペルオキシダーゼ基質溶液０．２mlを加えた（ＡＢＴＳ原液；４０mM ＡＢＴＳ １ml、３０％Ｈ２Ｏ２５μl、および０．１M酢酸Ｎａ２０ml、０．０５  ＮａＨ２ＰＯ４）。約１０分後に０．１Mクエン酸塩および０．０１％ＮａＮ３の液５０μlを使用して反応を停止させた。呈色反応を４０５nmで読み取った。
【０１８２】
細胞性ＥＬＩＳＡでは、細胞解離溶液（Sigma C5914）で細胞をはがした後に、Ｐ−およびＥ−セレクチンＣＨＯ−トランスフェクタントを９６ウェルプレート（TC Microwell F96 Nunc 167008）の各ウェルに細胞１０００００個/ウェルに調整して蒔き、各培地中で３７℃で一晩培養した（Ｐ−ＣＨＯ−トランスフェクタント用培地：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋２mMグルタミン＋ペニシリン１００U/ml/ストレプトマイシン１００μg/ml；Ｅ−セレクチントランスフェクタント用培地：ＨＡＭ Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ＋２mMグルタミン＋ペニシリン１００U/ml/ストレプトマイシン１００μg/ml＋０．１％フンギゾン＋１００μg/mlネオマイシン）。培地を除き、３％ＴｏｐＢｌｏｃｋ（コード番号TB232010; Juro）を含むＡ−Ｔ緩衝液（１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＣａＣｌ２、１mM ＭｇＣｌ２、２０mM トリス（ｐＨ７．４））で１時間ウェルをブロッキングした後で、１％ＴｏｐＢｌｏｃｋおよび０．１％アジドを含む上記緩衝液に種々に希釈したＰ−セレクチンＨｕＭａｂまたは参照マウスＰ−およびＥ−セレクチン抗体（上記参照）５０μlを加えて、ＲＴで６０分間インキュベートした。ウェルを（４回）洗浄後に、無細胞ＥＬＩＳＡについて上に挙げたのと同じ段階を使用して、結合した抗体を検出した。
【０１８３】
Ｌ−セレクチン３００．１９細胞は懸濁細胞であることから、９６ウェルポリスチレンフィルタープレート（Corning 3510）のウェルにＬ−セレクチン３００．１９トランスフェクタントを平板培養することによって細胞性ＥＬＩＳＡの形式を変更しなければならなかった。フィルタープレートのブロッキングを使用して、インキュベーション溶液をプレートの底を通して濾過することによって除去したが、それ以外ではプロトコールはＰ−およびＥ−セレクチンＣＨＯ細胞を使用した場合と同様であった。対照としてトランスフェクトしていないＣＨＯおよび３００．１９を使用した。
【０１８４】
結果：
本発明の抗体は、Ｅ−およびＬ−セレクチンに比べて高度に選択性であった。これらの抗体は０．０１から０．０８μg/ml、好ましくは０．０１から０．０４μg/mlの範囲のＥＣ５０値でＰ−セレクチンＣＨＯ細胞に結合したが、Ｅ−セレクチンＣＨＯ細胞およびＬ−セレクチン３００．１９に対するＥＣ５０値は５０μg/mlよりも明らかに大きく、好ましくは１００μg/mlよりも大きかった。ＨｕＭａｂ００２は細胞性ＥＬＩＳＡでＥ−およびＬ−セレクチンに比べて４０００倍よりも大きい選択係数を伴う最高の選択性を有した。さらに、ＨｕＭａｂ００２は、濃度１００μg/mlまでのベースラインレベルを超えてＥ−およびＬ−セレクチントランスフェクタントに結合しない。ＨｕＭａｂ００２のＦｃ変異体ＩｇＧ４ｖ１およびＩｇＧ１ｖ１の選択性は、親ＨｕＭａｂ００２の選択性と類似している（図４ａ〜ｃ）。
【０１８５】
完全ヒト血流系でのＰ−セレクチン抗体のex vivo阻害活性
血小板単層への白血球接着に及ぼすＰ−セレクチンＨｕＭａｂの効果
材料および方法：
血管壁損傷部および血小板血栓の部位への白血球の動員に及ぼすＰ−セレクチン抗体の効果について取り組みために、異なる剪断速度でヒト白血球とヒト血小板との相互作用を測定できるヒト血流系を、本質的に記載されたように使用した（Kirchhofer et al., Blood 89:1270 (1997)）。平行平板型潅流装置に健康ドナーの前肘静脈から採取したヒト全血で、損傷して露出した血管壁を模倣するコラーゲン表面に潅流した。以前に記載されたようにコラーゲンを被覆したカバースリップを調製した（Kirchhofer et al., Blood 89:1270 (1997)）。それらのカバースリップを３個の平行平板型潅流チャンバーに配置した。異なる剪断速度（６５/sおよび２８０/s）の測定を可能にするために、異なる寸法の潅流チャンバーを使用して、一定の血流１ml/minでコラーゲン被覆カバースリップ上に血液を潅流させた。潅流装置と離れて位置する個別のローラーポンプで血流を制御した。静脈から採血して３本の管にその血液を分注した直後に、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤（０．５μmol/ラミフィバン）を加えて血小板の凝集を防止して血小板単層を発生させた。同時に、Ｐ−セレクチン抗体（ＨｕＭａｂ、突然変異体、各参照抗体、または対照としてヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４）を種々の濃度で投与して、次に、コラーゲン被覆カバースリップを含む潅流チャンバーに血液−阻害剤混合物を導入した。５．５分間の潅流時間の後で、流動を中断せずにＰＢＳで潅流チャンバーを３分間潅流した。流動を短時間中断した後で、チャンバーをＰＢＳに溶かした３％パラホルムアルデヒドで１ml/minで２分間固定した。次に、カバースリップをチャンバーからはずし、ＰＢＳに溶かした３％パラホルムアルデヒドで４℃で１時間再び固定し、ＰＢＳ−０．０３％ナトリウムアジド中で保存した。血小板単層に接着している白血球数を評価するために、風乾した後でカバースリップをDiff-Quick溶液（Dade Behring AG）で染色してMerckoglas（Merck, Germany）に包埋した。画像解析システム（MCID, Imaging Research Inc.）を使用して、カバースリップの先端から１mm離れた、血流に垂直方向の標準領域に接着している白血球数を決定した。剪断速度６５/sおよび２８０/sで白血球数を計数した面積は、それぞれ３．１mm2および２．１mm2を有した。
【０１８６】
結果：
Ｐ−セレクチンＨｕＭａｂは血小板単層に対する白血球の接着を濃度依存的に阻害した。剪断速度６５/sおよび濃度１０μg/mlでＨｕＭａｂは白血球の接着を６０〜９９％、好ましくは７０〜９９％阻害した。ＨｕＭａｂの阻害効果は、静脈の剪断速度６５/sよりも高い剪断速度２８０/s（動脈の状況に近い）の方が顕著であった。全体的に、剪断速度２８０/sで接着している白血球数は、６５/sの場合よりも小さかった。Ｆｃ変異体を各親抗体と比べると、ＨｕＭａｂ００２とその変異体ＩｇＧ４ｖ１およびＩｇＧ１ｖ１とについて実証されたように、それらの抗体はex vivo潅流チャンバーで類似した阻害活性を有した（図５）。インビトロアッセイでみられた親抗体に比べて突然変異体で増加した阻害活性は、ex vivo潅流チャンバーでは観察されなかった。これは、ヒト全血で白血球のＦｃγ受容体が飽和していることが原因であろう。
【０１８７】
内皮細胞への白血球の接着に及ぼすＰ−セレクチンＨｕＭａｂの効果
材料および方法：
剪断条件でのＰ−セレクチンＨｕＭａｂの抗炎症能について取り組むために、内皮細胞をカバースリップ上に被覆した設定で、上に挙げたヒト血流系を使用した。Jaffeら、1993の方法（完全な引用を添えられたい）によりＩＩ型コラゲナーゼ（Roche Switzerland）で消化することによって臍帯からヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を単離した。それらの細胞を２０％ウシ胎仔血清（Gibco, Auckland）、１００IU/mlペニシリン（Gibco, Auckland）、０．１mg/mlストレプトマイシン（Gibco, Auckland）、２mmol/l Ｌ−グルタミン（Gibco, Auckland）、１０U/mlヘパリン（Sigma）、および５０μg/ml ＥＣ成長補助剤（Sigma, Germany）を補充した１９９培地（M199, Sigma, Germany）中で１％ゼラチンを被覆した組織培養フラスコに入れて培養した。ＨＵＶＥＣを集密まで（約４日）成長させ、トリプシン／エチレンジアミン四酢酸（Gibco, Auckland）と共に継代して、１％ゼラチン（Fluka, Germany）で予め被覆したThermanoxプラスチックカバースリップ上に蒔いた（ＥＣ約２０００００個/カバースリップ）。ＨＵＶＥＣを沈降させ、ＨＵＶＥＣは１〜２日で集密となった。潅流開始の２４時間前に２０ng/ml ＩＬ−４（R&D Systems）で、潅流の５〜１０分前に１０−４Mヒスタミン（Fluka, Germany）でこれらの細胞を刺激した。各実験を第１回継代のＨＵＶＥＣで行った。刺激されたＨＵＶＥＣの集密単層を有するカバースリップを上記のような平行平板型潅流チャンバーに配置した。上記の潅流実験と同様に、健康ドナーから全血を採取した。しかし、これらの実験ではトロンビン阻害剤Ｒｏ−４６−６２４０（１０μM）で血液の凝固を阻止して、種々の濃度のＰ−セレクチン抗体（ＨｕＭａｂ、突然変異体、各参照抗体）または対照としてヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４と共に、活性化内皮細胞上を潅流する直前に５分間予備インキュベートした。血流を１ml/minに、剪断速度を６５/sに、かつ潅流時間を５．５分間に調整した。ＰＢＳを用いた３分間の洗浄時間の後で、接着している白血球を有するＨＵＶＥＣを上記と同じ流動条件で３％パラホルムアルデヒドで２分間固定した。次に、チャンバーからカバースリップを取り出し、新鮮固定液に１時間浸し、ＰＢＳ−０．０２％アジ化ナトリウム中で保存した。形態分析のために、修飾ビオチン化抗マウス免疫グロブリン（Animal Research Kit, Dako, USA）を使用して予め標識した、白血球共通抗原ＣＤ４５に対するマウス抗体で白血球を染色した。核をヘマトキシリン（J.T Baker, Holland）で対比染色した。
【０１８８】
結果：
ＩＬ−４およびヒスタミンの組み合わせを用いたＨＵＶＥＣの刺激は、Ｐ−セレクチンの発現と、種々の種類の白血球の接着とを招き、（ＰＭＮおよび好酸球を含めた）顆粒球が接着している白血球の主要な部分を構成した。本発明のＨｕＭａｂは、３μg/mlで総白血球数の６０〜９０％の接着を阻害した。全体的に、Ｆｃ変異体の阻害活性は非突然変異ＨｕＭａｂの阻害活性と有意には異ならなかった。
【０１８９】
Ｐ−セレクチンＨｕＭａｂは、種々の白血球サブタイプに異なる効果を及ぼすことを実証した。顆粒球に及ぼす効果は、単核性白血球に比べて顕著である。本発明による抗体は、（ＰＭＮおよび好酸球を含めた）顆粒球の接着を９０〜９９％、単球を５０〜８８％、リンパ球を５〜４０％阻害した。種々の白血球サブタイプの絶対数の各減少を、図６にＩｇＧ４ｖ１について代表的に示す。
【０１９０】
Ｐ−セレクチンＨｕＭａｂが補体系を活性化する能力
Ｃ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡ：
本発明の抗体がＣ１ｑの結合およびＣ３の活性化を誘導する能力を決定するために、ＥＬＩＳＡ法を使用した。Ｃ１ｑは適応免疫系の一部であり、免疫複合体と結合するといくつかの酵素前駆体の連続活性化を誘発する。それらの酵素は順番にＣ３分子の開裂を引き起こし、これは炎症反応の開始、外来または異常粒子のオプソニン化、および細胞膜の溶解を招く場合がある。
【０１９１】
原則として、ＥＬＩＳＡプレートに種々の濃度範囲の抗体を被覆し、そこにヒトＣ１ｑか、またはＣ３の供給源としてヒトプール血清を加える。ヒトＣ１ｑまたはＣ３εに対する抗体によって、続いてペルオキシダーゼ標識コンジュゲートによってＣ１ｑまたはＣ３εの結合を検出する。
【０１９２】
ＨｕＭａｂ００２（ハイブリドーマおよび一過性トランスフェクトーマ由来材料、その突然変異体、ならびに対照抗体）を０．１６〜２０μg/mlの濃度で試験した。陰性対照として、Ｃ１ｑと非常に弱く結合するヒトＩｇＧ４（CLB, the Netherlands,０．５μg/ml原液）を使用した。ヒトＩｇＧ１（Sigma, ２ug/ml原液）を陽性対照として組み入れた。Ｃ１ｑを検出するために、Ｃ１ｑに対するウサギ抗体（Dako）と、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Sigma）と結合したブタ抗ウサギＩｇＧ抗体とを使用した。Ｃ３εを検出するために、マウス抗ヒトＣ３抗体と、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Sigma）と結合したウサギ抗マウスＩｇＧ抗体とを適用した。
【０１９３】
試験したＨｕＭａｂのＥＣ５０値または１０μg/mlでの最大結合（Ｂｍａｘ）に関する計算を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用した非線形回帰曲線あてはめ（１部位結合）を使用して決定した。
【０１９４】
結果：
本発明によるＨｕＭａｂ００２は、ハイブリドーマおよびトランスフェクトーマ由来材料に関してそれぞれ０．９４６μg/mlおよび１．１５９μg/mlのＥＣ５０値と、０．９８７および０．７１１のＢｍａｘ（ＯＤ４０５）値とから示されるように、効率的にＣ１ｑと結合できた。予想通り、ＯＤ４０５でのＢｍａｘ値０．２２２により示されるように、陰性対照であるヒトＩｇＧ４はＣ１ｑと結合しなかった。しかし、試験した三つのＦｃ変異体全て（ＩｇＧ４ｖ１、ＩｇＧ１ｖ１、ＩｇＧ１ｖ２）は、それぞれ０．１３２、０．１１９、および０．１３２のＯＤ４０５ Ｂｍａｘ値によって示されるようにＣ１ｑと結合する能力を欠如した（表３）。Ｃ１ｑとの結合能と一致して、（ハイブリドーマおよびトランスフェクトーマ由来）ＨｕＭａｂ００２に対するＣ３の沈着は抗体濃度依存的に起こり、ＥＣ５０値は２．７μg/mlから８．３μg/mlの範囲であった。しかし、三つのＦｃ変異体全ては、それぞれ０．１０４、０．１５６、および０．１３３のＯＤ４０５ Ｂｍａｘ値によって示されるように、Ｃ３の沈着を開始できなかった（表３）。
【０１９５】
ＨｕＭａｂ００２が補体成分と相互作用することから、この抗体はインビボでＣＤＣを誘導する内因性能力を有する。したがって、この抗体のＦｃ部分は本発明により修飾されている。
【０１９６】
【表４】
0005714554.tif 000005
【０１９７】
Ｐ−セレクチンＨｕＭａｂがＦｃγ受容体に結合する能力
ＩｇＧ抗体依存性細胞傷害効果は、エフェクター細胞上のＦｃγ受容体によって仲介される。ヒト血液由来ＦｃγＲ発現エフェクター細胞に対する、ハイブリドーマおよびトランスフェクトーマ由来ＨｕＭａｂ００２と、突然変異抗体と、対照抗体との結合をＦＡＣＳ分析によって検討した。
【０１９８】
材料および方法：
ＦｃγＲＩ ＩＩＡ１．６トランスフェクタントまたは新鮮単離したエフェクター細胞を抗体と共にインキュベートして、抗体の結合をＦＩＴＣ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２（DAKO）、またはＦＩＴＣ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２（BD/Pharmingen）を用いて検出した。ＨｕＭａｂ００２（一過性トランスフェクトーマおよび／またはハイブリドーマ由来材料、ならびに突然変異体）を濃度１μg/ml（ＩＩＡ１．６トランスフェクタント）または１０μg/ml（エフェクター細胞）で試験した。一次抗体またはヒトＩｇＧ４（１０μg/ml）の不在を陰性対照として使用した。ＩＩＡ１．６細胞上のＦｃγＲＩの発現を検出するために、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ６４（BD/Pharmingen）を使用した。ＮＫ細胞に富む末梢血単核細胞を使用した実験では、ＰＥ標識マウス抗ヒトＣＤ５６（BD/Pharmingen）を使用した二重染色によってＮＫ細胞を同定した。ＦＳＣ／ＳＳＣプロフィールに基づいて顆粒球および単球を同定した。
【０１９９】
ＩＩＡ１．６細胞、ＩＩＡ１．６−ＦｃγＲＩトランスフェクタント、および新鮮単離したエフェクター細胞を抗体と共にインキュベートした。抗体の結合をＦＩＴＣ標識Ｒｂ−α−ｈｕＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２（DAKO）またはＦＩＴＣ標識Ｒｂ−α−ｈｕＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２（BD/Pharmingen）を用いて検出した。
【０２００】
ＩＩＡ１．６−ＦｃγＲＩトランスフェクタント結合アッセイでは、ＨｕＭａｂ００２（一過性トランスフェクトーマ由来、ハイブリドーマ由来および突然変異体材料）を１μg/mlの濃度で試験した。ＩＩＡ１．６野生型細胞を陰性対照として使用した。ＦｃγＲＩ発現の対照としてｍ−α−ｈｕＣＤ６４−ＦＩＴＣ（BD/Pharmingen）を使用した。
【０２０１】
エフェクター細胞結合アッセイでは、ＨｕＭａｂ００２（一過性トランスフェクトーマ由来、ハイブリドーマ由来および突然変異体材料）を１０μg/mlの濃度で試験した。顆粒球結合アッセイでは一過性トランスフェクトーマ材料を試験しなかった。顆粒球結合アッセイを除く全てのエフェクター細胞結合アッセイでＩｇＧ４（１０μg/ml）を陰性対照として使用した。
【０２０２】
ＮＫ単離キット（Dynal Biotech ASA, Oslo, Norway）を使用して全血のＮＫ細胞を濃縮した。ｍ−α−ｈｕＣＤ５６−ＦＩＴＣ染色によってＮＫ細胞を同定した。
【０２０３】
ＮＫ単離キット（Dynal Biotech ASA, Oslo, Norway）に同封されているプロトコールに記載されているフィコール法を使用して、全血からＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を得た。ＦＳＣ／ＳＳＣプロフィールに基づいて単球を同定した。ＦＡＣＳ溶解緩衝液を使用して全血から顆粒球を単離して、ＦＳＣ／ＳＳＣプロフィールに基づいて同定した。
【０２０４】
新鮮単離したエフェクター細胞を抗体と共にインキュベートして、抗体の結合をＦＩＴＣ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２（DAKO）またはＦＩＴＣ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２（BD/Pharmingen）を用いて検出した。ＨｕＭａｂ００２（一過性トランスフェクトーマおよび／またはハイブリドーマ由来材料、ならびに突然変異体）を濃度１０μg/mlで試験した。一次抗体またはヒトＩｇＧ４（１０μg/ml）の不在を陰性対照として使用した。ＮＫ単離キット（Miltenyi Biotec, USA）によってＭＮＣ試料からＮＫ細胞を単離した。ＮＫ細胞に富む末梢血単核細胞を使用した実験では、ＰＥ標識マウス抗ヒトＣＤ５６（BD/Pharmingen）を使用した二重染色によってＮＫ細胞を同定した。当技術分野の現状により、ＰＢＭＣから顆粒球および単球を単離した（例えば単球単離キット（Miltenyi、上記参照）。顆粒球および単球をＦＳＣ／ＳＳＣプロフィールに基づいて同定した。
【０２０５】
結果：
本発明によるＨｕＭａｂ００２は、顆粒球、単球、およびＮＫ細胞に対する結合によって示されるようにＦｃＲに結合できた。試験した三つのＦｃ変異体全て（ＩｇＧ４ｖ１、ＩｇＧ１ｖ１、およびＩｇＧ１ｖ２）はＮＫ細胞に結合する能力を完全に欠如していた（表４）。さらに、ＨｕＭａｂ００２は顆粒球および単球に効率的に結合したが、表５および６に抗体に結合している細胞の率によって示されるように、突然変異体はヒトＩｇＧ４に対する一次抗体の不在に匹敵する結合レベルを示した。これは、突然変異体がエフェクター細胞上のＦｃＲと相互作用する能力を欠如したことを示している。
【０２０６】
ＨｕＭａｂ００２はＦｃＲと効率的に相互作用できるので、この抗体はインビボで抗体依存性細胞性細胞傷害作用を誘導する内因性能力を有する。本発明によるＦｃ変異体に関して行われたようなＦｃＲとの相互作用の不活性化は、効果的にＡＤＣＣを阻止する。
【０２０７】
【表５】
0005714554.tif 000006
【０２０８】
【表６】
0005714554.tif 000007
【０２０９】
【表７】
0005714554.tif 000008
【図１】
0005714554.tif 000009
【図２】
0005714554.tif 000010
【図３ａ】
0005714554.tif 000011
【図３ｂ】
0005714554.tif 000012
【図４ａ】
0005714554.tif 000013
【図４ｂ】
0005714554.tif 000014
【図４ｃ】
0005714554.tif 000015
【図５】
0005714554.tif 000016
【図６ａ】
0005714554.tif 000017
【図６ｂ】
0005714554.tif 000018
【配列表】
0005714554000001.app