(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の体液中におけるＣＡ１２５に結合しているシアリルＴｎ抗原の量を測定し、その測定値を基準値と比較して、前記被験者における卵巣癌を検出することを特徴とする卵巣癌の検出方法。
【請求項２】
前記体液は、血液又は腹水であることを特徴とする請求項１に記載の卵巣癌の検出方法。
【請求項３】
前記体液をＣＡ１２５に対する抗体又はシアリルＴｎ抗原に対する抗体に接触させる工程を包含することを特徴とする請求項１又は２に記載の卵巣癌の検出方法。
【請求項４】
前記ＣＡ１２５に対する抗体又は前記シアリルＴｎ抗原に対する抗体は、支持体に固定化されていることを特徴とする請求項３に記載の卵巣癌の検出方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の卵巣癌の検出方法に用いるためのキットであって、ＣＡ１２５に対する抗体と、シアリルＴｎ抗原に対する抗体とを含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵巣癌の検出方法、並びに、キットに関し、さらに詳細には、体液中におけるＣＡ１２５に結合しているシアリルＴｎ抗原を指標とする卵巣癌の検出方法、並びに、当該方法に用いるためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
体液中の腫瘍マーカーを指標とした癌の臨床診断が広く行われている。そして、卵巣癌を検出できる腫瘍マーカーとして、癌関連糖鎖抗原の一種であるＣＡ１２５（carbohydrate antigen 125）がよく用いられている。すなわち、卵巣癌患者の血液においてＣＡ１２５濃度が上昇する。
ＣＡ１２５は分子量約１１万の糖タンパク質であり、ムチンの一種（ＭＵＣ１６）としても知られている。
【０００３】
一方、ＣＡ１２５は子宮内膜症患者と卵巣癌患者で共通に産生される抗原であり、血中ＣＡ１２５は子宮内膜症でも上昇することが知られている（非特許文献１）。そのため、ＣＡ１２５を指標とした卵巣癌診断においては、子宮内膜症患者が卵巣癌と誤判定されてしまう可能性を含んでいる。つまり、ＣＡ１２５の量的な差異のみをもって卵巣癌と子宮内膜症とを正確に区別することは難しいのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１１−０１４６２６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】杉村隆  監修、「図説臨床癌シリーズ（１９）」、第２版、メジカルビュー社、１９９３年８月、ｐ３１−３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
卵巣癌と子宮内膜症とを鑑別するための手法として、例えば、両者を鑑別できる臨床マーカーがあれば、卵巣癌の検出を正確かつ迅速に行うことが可能となる。そこで本発明は、卵巣癌と子宮内膜症とを鑑別できる臨床マーカーを特定し、卵巣癌を正確に検出できる一連の技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＣＡ１２５の量的な変化だけではなく「質的な変化」を捉えることによって、卵巣癌と子宮内膜症とを鑑別できないかを鋭意検討した。そして、卵巣癌患者の体液中のＣＡ１２５上に発現する糖鎖抗原の変化を詳細に調べた。その結果、ＣＡ１２５上のシアリルＴｎ抗原が、卵巣癌患者においては検出されるが、子宮内膜症患者ではほとんど検出されないことを見出した。そして、ＣＡ１２５上のシアリルＴｎ抗原を指標とすることで、卵巣癌と子宮内膜症とを高精度で鑑別できることを見出し、本発明を完成するに至った。上記した課題を解決するために提供される本発明は、以下のとおりである。
【０００８】
関連の発明は、被験者の体液中におけるＣＡ１２５に結合しているシアリルＴｎ抗原を指標として、前記被験者における卵巣癌を検出することを特徴とする卵巣癌の検出方法である。
請求項１に記載の発明は、被験者の体液中におけるＣＡ１２５に結合しているシアリルＴｎ抗原の量を測定し、その測定値を基準値と比較して、前記被験者における卵巣癌を検出することを特徴とする卵巣癌の検出方法である。
【０００９】
本発明は卵巣癌の検出方法に係るものであり、被験者の体液中におけるＣＡ１２５に結合しているシアリルＴｎ抗原（ＣＡ１２５上で発現しているシアリルＴｎ抗原）を指標として、前記被験者における卵巣癌を検出する。すなわち、従来技術におけるＣＡ１２５を指標とした卵巣癌の検出方法では、ＣＡ１２５上の糖鎖抗原の有無や構造の違いを考慮することなく、コアタンパク質を有する全てのＣＡ１２５を測定対象としていたが、本発明ではシアリルＴｎ抗原を有する特定のＣＡ１２５を指標とする。本発明によれば、卵巣癌と子宮内膜症とを高精度で鑑別することができ、卵巣癌を正確に検出することができる。
【００１０】
ここで「ＣＡ１２５に結合しているシアリルＴｎ抗原を指標とする」とは、ＣＡ１２５に結合しているシアリルＴｎ抗原、換言すれば、シアリルＴｎ抗原を有するＣＡ１２５を定量的または定性的に解析し、その解析結果を基に判断をすることを指す。例えば、シアリルＴｎ抗原を有するＣＡ１２５の体液中濃度を測定し、当該測定値を、予め設定した基準値と比較して卵巣癌の有無等を判断することが挙げられる。
また「卵巣癌の検出」には、被験者における卵巣癌の有無を検出することのほか、卵巣癌の進行度の把握や再発のモニタリングを行うことも含まれる。
本発明において、体液中のＣＡ１２５に結合しているシアリルＴｎ抗原の量は、卵巣癌患者の体液でより高値を示す。
【００１１】
請求項１に記載の卵巣癌の検出方法において、前記体液は、血液又は腹水であることが好ましい（請求項２）。
【００１２】
請求項３に記載の発明は、前記体液をＣＡ１２５に対する抗体又はシアリルＴｎ抗原に対する抗体に接触させる工程を包含することを特徴とする請求項１又は２に記載の卵巣癌の検出方法である。
【００１３】
本発明の卵巣癌の検出方法は、被験者の体液を「ＣＡ１２５に対する抗体」又は「シアリルＴｎ抗原に対する抗体」に接触させる工程を包含する。かかる構成により、ＣＡ１２５に結合しているシアリルＴｎ抗原（シアリルＴｎ抗原を有するＣＡ１２５）を簡便かつ正確に測定することができる。例えば、サンドイッチ法によるイムノアッセイが可能である。
なお、ここでいう「ＣＡ１２５に対する抗体」には、ＣＡ１２５上のシアリルＴｎ抗原のみを認識する抗体は含まれない。
【００１４】
請求項３に記載の卵巣癌の検出方法において、前記ＣＡ１２５に対する抗体又は前記シアリルＴｎ抗原に対する抗体は、支持体に固定化されていることが好ましい（請求項４）。
【００１５】
関連の発明は、請求項１〜４のいずれかに記載の卵巣癌の検出方法を用いて、前記被験者における卵巣癌と子宮内膜症とを鑑別することを特徴とする卵巣癌と子宮内膜症との鑑別方法である。
【００１６】
この発明は卵巣癌と子宮内膜症との鑑別方法に係るものであり、上記した本発明の卵巣癌の検出方法を用いる。換言すれば、被験者の体液中におけるＣＡ１２５に結合しているシアリルＴｎ抗原を指標として、前記被験者における卵巣癌と子宮内膜症とを鑑別する。この発明によれば、卵巣癌と子宮内膜症とを高精度で鑑別することができる。
【００１７】
請求項５に記載の発明は、請求項１〜４のいずれかに記載の卵巣癌の検出方法に用いるためのキットであって、ＣＡ１２５に対する抗体と、シアリルＴｎ抗原に対する抗体とを含むことを特徴とするキットである。
【００１８】
本発明は、上記した本発明の卵巣癌の検出方法に用いるためのキットに係るものであり、ＣＡ１２５に対する抗体と、シアリルＴｎ抗原に対する抗体とを含む。本発明のキットによれば、イムノアッセイを用いたシアリルＴｎ抗原を有するＣＡ１２５の測定を簡便かつ迅速に行うことができ、その結果、卵巣癌の検出や卵巣癌と子宮内膜症との鑑別を簡便かつ迅速に行うことができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の卵巣癌の検出方法によれば、卵巣癌と子宮内膜症とを高精度で鑑別することができ、卵巣癌を正確に検出することができる。
【００２０】
上記の卵巣癌と子宮内膜症との鑑別方法によれば、卵巣癌と子宮内膜症とを高精度で鑑別することができる。
【００２１】
本発明のキットによれば、卵巣癌の検出や卵巣癌と子宮内膜症との鑑別を簡便かつ迅速に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】子宮内膜症患者および卵巣癌患者の腹腔洗浄液について、ＣＡ１２５上のシアリルＴｎ抗原量を測定した結果を示すドットプロット図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の卵巣癌の検出方法は、被験者の体液中におけるＣＡ１２５に結合しているシアリルＴｎ抗原を指標として、前記被験者における卵巣癌を検出するものである。また本発明を利用した卵巣癌と子宮内膜症との鑑別方法は、被験者の体液中におけるＣＡ１２５に結合しているシアリルＴｎ抗原を指標として、前記被験者における卵巣癌と子宮内膜症とを鑑別するものである。
【００２４】
本発明で用いる体液としては特に限定はないが、血液又は腹水が好ましく採用される。特に、血液から調製した血清が、測定試料として好ましく採用される。
【００２５】
本発明では、「ＣＡ１２５に結合しているシアリルＴｎ抗原」を指標とする。「指標」の代表例は、基準値との比較である。すなわち、被験者の体液における「ＣＡ１２５に結合しているシアリルＴｎ抗原」量を測定し、その測定値を、予め設定した基準値（例えば、カットオフ値）と比較し、卵巣癌の検出あるいは卵巣癌と子宮内膜症との鑑別を行う。当該基準値は、例えば、卵巣癌に罹患していない人の体液における「ＣＡ１２５に結合しているシアリルＴｎ抗原」量のデータを収集し、統計処理を行って設定することができる。
例えば、予め設定したカットオフ値と測定値とを比較し、当該カットオフ値よりも測定値が大きい場合に、当該被験者を卵巣癌患者と判定することができる。
【００２６】
なお、従来のＣＡ１２５による卵巣癌の検出技術と本発明の方法とを組み合わせることにより、より効率的かつ正確に卵巣癌の検出や卵巣癌と子宮内膜症との鑑別を行うことができる。例えば、まず従来技術の方法により、卵巣癌（及び子宮内膜症）を広くスクリーニングする（一次判定、一次スクリーニング）。次に、従来技術で陽性と判定された被験者について、本発明の方法を適用する（二次判定、二次スクリーニング）。これにより、卵巣癌の検出並びに卵巣癌と子宮内膜症との鑑別を、高効率かつ正確に行うことが可能となる。
【００２７】
ＣＡ１２５に結合しているシアリルＴｎ抗原（シアリルＴｎ抗原を有するＣＡ１２５）を測定する方法としては特に限定はないが、好ましい実施形態では、被験者の体液を「ＣＡ１２５に対する抗体」又は「シアリルＴｎ抗原に対する抗体」に接触させる工程を包含する。これらの抗体は、モノクローナル抗体でもよいし、ポリクローナル抗体でもよい。
【００２８】
この好ましい実施形態の代表例として、「ＣＡ１２５に対する抗体」と「シアリルＴｎ抗原に対する抗体」を用いたサンドイッチ法によるイムノアッセイが挙げられる。例えば、「ＣＡ１２５に対する抗体」と「シアリルＴｎ抗原に対する抗体」のいずれか一方を支持体に固定化し（固相抗体）、他方を標識抗体として用いるサンドイッチ法により、ＣＡ１２５に結合しているシアリルＴｎ抗原を測定することができる。
サンドイッチ法に用いる固相（支持体）の例としては、マイクロタイタープレート、ビーズ、ラテックス粒子、基板などが挙げられる。
標識の例としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、ラジオアイソトープ（Ｉ125等）、蛍光物質（フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン等）、生物又は化学発光物質（ルシフェリン／ルシフェラーゼ等）などが挙げられる。これらの標識は、抗体に直接的に結合されたものでもよいし、アビジン−ビオチン複合体、プロテインＡ、金コロイドなどを介して間接的に結合されたものでもよい。
【００２９】
ここで、サンドイッチ法によるイムノアッセイの具体例を挙げる。この例は、酵素標識を利用したサンドイッチ法（サンドイッチＥＩＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）である。
まず、固相抗体として抗ＣＡ１２５モノクローナル抗体を、標識抗体として酵素標識した抗シアリルＴｎ抗原モノクローナル抗体をそれぞれ採用する。これらのモノクローナル抗体は、例えば、市販のものを用いることができる。なお、ここで用いる抗ＣＡ１２５モノクローナル抗体には、ＣＡ１２５上のシアリルＴｎ抗原のみを認識するものは含まれない。抗ＣＡ１２５モノクローナル抗体としては、例えば、ＣＡ１２５のコアタンパク質を認識するものを使用することができる。また、固相（支持体）として、市販の９６穴マイクロタイタープレートを採用する。
まず、マイクロタイタープレートの各穴に、抗ＣＡ１２５モノクローナル抗体（固相抗体）を固定化する。各穴をＰＢＳで洗浄後、ＢＳＡ等でブロッキングする。続いて、各穴をＰＢＳで洗浄後、血清等の体液試料を適宜希釈して各穴に添加する。これにより、体液試料中の「シアリルＴｎ抗原を有するＣＡ１２５」が、抗ＣＡ１２５モノクローナル抗体を介して固相上に捕捉される。各穴をＰＢＳで洗浄後、酵素標識した抗シアリルＴｎ抗原モノクローナル抗体を添加する。これにより、固相上に捕捉されたシアリルＴｎ抗原を有するＣＡ１２５に、酵素標識した抗シアリルＴｎ抗原モノクローナル抗体が結合する。各穴をＰＢＳで洗浄後、発色基質を添加し、発色反応を行う。最後に、吸光度を測定し、当該吸光度から「シアリルＴｎ抗原を有するＣＡ１２５」の濃度を算出する。
なお、検出感度を高めるために、抗シアリルＴｎ抗原モノクローナル抗体に対する標識２次抗体や、アビジン−ビオチン複合体による増幅検出系を用いてもよい。
【００３０】
得られた数値データについては、「シアリルＴｎ抗原を有するＣＡ１２５量」（絶対量）をもって評価してもよいし、「単位ＣＡ１２５あたりのシアリルＴｎ抗原量」をもって評価することもできる。後者の場合には、別途、従来の方法で体液中の全ＣＡ１２５量を測定し、「（シアリルＴｎ抗原を有するＣＡ１２５の量）／（全ＣＡ１２５量）」の値を算出することになる。
【００３１】
また上記サンドイッチ法において、「シアリルＴｎ抗原を有するＣＡ１２５量」は、ＣＡ１２５に結合した抗シアリルＴｎ抗原モノクローナル抗体量をもって表現することもできる。
【００３２】
上記した例では、「ＣＡ１２５に対する抗体」を固相抗体、「シアリルＴｎ抗原に対する抗体」を標識抗体としたが、「シアリルＴｎ抗原に対する抗体」を固相抗体、「ＣＡ１２５に対する抗体」を標識抗体としてもよい。
【００３３】
サンドイッチ法以外の例としては、競合法によるイムノアッセイが挙げられる。さらに、免疫沈降法、ラテックス凝集法、ウエスタンブロット法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析（ＭＳ）などの手法を用いてもよい。
【００３４】
本発明のキットは、本発明の卵巣癌の検出方法に用いるためのものであり、ＣＡ１２５に対する抗体と、シアリルＴｎ抗原に対する抗体とを含む。これらの抗体の形状は、凍結乾燥物でもよいし、溶液状でもよい。また本発明のキットには、さらに他の試薬類、例えば、標準物質、各種の緩衝液、標識２次抗体、発色基質、プレート等の支持体、などを含めてもよい。
【００３５】
以下に本発明のキットの構成例を挙げる。以下の構成例は、いずれもサンドイッチＥＬＩＳＡ用のものであり、固相抗体として抗ＣＡ１２５モノクローナル抗体を含んでいる。
【００３６】
〔キットの構成例１〕
・抗ＣＡ１２５モノクローナル抗体（固相抗体）：適量
・酵素標識抗シアリルＴｎ抗原モノクローナル抗体（標識抗体）：適量
・シアリルＴｎ抗原結合ＣＡ１２５標準物質：適量
・希釈用緩衝液：適量
【００３７】
〔キットの構成例２〕
・抗ＣＡ１２５モノクローナル抗体（固相抗体）：適量
・抗シアリルＴｎ抗原モノクローナル抗体（１次抗体）：適量
・酵素標識２次抗体（１次抗体に対する抗体）：適量
・シアリルＴｎ抗原結合ＣＡ１２５標準物質：適量
・希釈用緩衝液：適量
【００３８】
〔キットの構成例３〕
・抗ＣＡ１２５モノクローナル抗体（固相抗体）：適量
・ビオチン標識抗シアリルＴｎ抗原モノクローナル抗体：適量
・酵素標識ストレプトアビジン：適量
・シアリルＴｎ抗原結合ＣＡ１２５標準物質：適量
・希釈用緩衝液：適量
【００３９】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
（１）検体
卵巣癌又は子宮内膜症と確定診断された患者（卵巣癌：３６症例、子宮内膜症：２１症例）から採取した腹腔洗浄液を検体とした。
【００４１】
（２）サンドイッチＥＬＩＳＡ
抗ＣＡ１２５抗体を固相抗体、抗シアリルＴｎ抗原（ｓＴｎ）抗体を標識抗体としたサンドイッチＥＬＩＳＡの系を構築し、以下の手順にて各検体試料におけるＣＡ１２５上のｓＴｎ量を測定した。
【００４２】
抗ＣＡ１２５モノクローナル抗体（Hytest社）を５０ｍＭ 炭酸水素ナトリウム溶液で０．５μｇ／ｍＬに希釈し、固相抗体液を調製した。また、ビオチン標識抗ｓＴｎモノクローナル抗体ＭＬＳ１３２（自家調製品。Tanaka N, Nakada H, Inoue M, Yamashina I. Binding characteristics of an anti-Siaalpha2-6GalNAcalpha-Ser/Thr (sialyl Tn) monoclonal antibody (MLS 132). Eur J Biochem 1999; 263:27-32.に記載）を１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ（以下、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳと略記する）で１μｇ／ｍＬに希釈し、標識抗体液を作製した。また、５％ＢＳＡを含むＰＢＳを調製し、ブロッキング液とした。
【００４３】
９６穴マイクロタイタープレートの各穴に固相抗体液を５０μＬ添加し、４℃で１８時間静置した。ＰＢＳにて各穴を２回洗浄した後、ブロッキング液を各穴に４００μＬずつ添加し、室温で２時間静置した。
【００４４】
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ-２０を含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴと略記する）にて各穴を４回洗浄した後、検体試料を各穴に５０μＬずつ添加し、４℃で１８時間静置した。ＰＢＳＴにて各穴を４回洗浄した後、標識抗体液を各穴に５０μＬずつ添加し、室温で２時間静置した。ＰＢＳＴにて各穴を４回洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン溶液（Sigma社）を各穴に５０μＬずつ添加し、室温で１時間静置した。
【００４５】
ＰＢＳＴにて各穴を４回洗浄した後、ＴＭＢ基質液（Thermo Scientific社）を各穴に５０μＬずつ添加し、室温で５分間静置した。１Ｍ硫酸５０μＬを加えて発色を停止させ、プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。さらに、得られた測定値を、ＣＡ１２５に結合したビオチン標識抗ｓＴｎモノクローナル抗体量（ｐｇ）に換算し、この値を「Ａ」とした。すなわち、予め、ビオチン標識抗ｓＴｎモノクローナル抗体のタンパク質量と発色値の標準曲線を作成し、これを用いて、各検体における測定値を標識抗ｓＴｎモノクローナル抗体量に換算した。
Ａ値はＣＡ１２５に結合したｓＴｎ量を反映している。
【００４６】
別途、市販のＣＡ１２５測定キット（ＤＲＧ社）を用いて、各試料の全ＣＡ１２５濃度を測定した。この値を「Ｂ」とした。
各検体試料について、ＡをＢで除して（Ａ／Ｂ）、単位ＣＡ１２５あたりのｓＴｎ量（ｐｇ／Ｕ）を算出した。子宮内膜症検体と卵巣癌検体について、それぞれ平均値と標準偏差（ＳＤ）を算出した。さらに、疾患ごとのドットプロット図を作成した（図１）。
【００４７】
（３）結果
図１に示すように、卵巣癌患者と子宮内膜症患者とを比較すると、卵巣癌患者において、単位ＣＡ１２５あたりのｓＴｎ量が明確に高い値を示す例が多く確認された。
単位ＣＡ１２５あたりのｓＴｎ量について、子宮内膜症検体（２１症例）では、平均値２３．１ｐｇ／Ｕ、標準偏差２０．５ｐｇ／Ｕであった。卵巣癌の検体（３６症例）では、平均値８５６．３ｐｇ／Ｕ、標準偏差１４９０．３ｐｇ／Ｕであった。
子宮内膜症患者における平均値＋３ＳＤ値、すなわち８４．６ｐｇ／Ｕをカットオフ値とした場合（図１において点線にて表示）、卵巣癌検体３６症例のうち１６症例（４４％）において、子宮内膜症検体よりも明確に高いｓＴｎ値が検出された。
以上より、体液中におけるＣＡ１２５上のシアリルＴｎ抗原量を基準値と比較することにより、卵巣癌と子宮内膜症とを高精度で鑑別できることが示された。
【図１】
0005686431.tif 000002