(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
子癇前症の発症前の妊婦が子癇前症を発症するリスクが高いかどうかを試験する方法であって、
ａ）子癇前症の発症前の前記妊婦から得られた生体試料中のＨ２レラキシン濃度を測定するステップと、
ｂ）前記Ｈ２レラキシン濃度が、妊婦の下位四分位濃度のカットオフ値である５００ｐｇ／ｍｌ未満である場合、前記妊婦は子癇前症を発症するリスクを有することを示すと判定するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記生体試料が血漿または血清を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｈ２レラキシン濃度が、前記Ｈ２レラキシンに対する抗体を用いて測定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｈ２レラキシン濃度が、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記子癇前症の発症前が、妊娠５週から１５週にわたる前記妊婦の妊娠第１期中である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記妊婦が子癇前症になりやすい群の一部であり、前記群が初回妊娠、３５歳超、１８歳未満、多胎妊娠および既存状態のうちの１つまたは複数を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記既存状態が、高血圧症、糖尿病、ループス、栓友病、腎疾患および肥満から成る群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生体試料中のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）濃度を測定するステップと、前記Ｈ２レラキシン濃度が５００ｐｇ／ｍｌより高い場合であっても、前記ＣＲＰ濃度が１３．５マイクログラム／ｍｌより高い場合、前記妊婦は子癇前症を発症するリスクを有することを示すと判定するステップとをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記生体試料中のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）濃度を測定するステップと、前記Ｈ２レラキシン濃度が５００ｐｇ／ｍｌより高い場合であっても、前記ＣＲＰ濃度が１．５マイクログラム／ｍｌ未満の場合、前記妊婦は子癇前症を発症するリスクを有することを示すと判定するステップとをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年１１月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／２００，１５０号の米国特許法第１１９（ｅ）条の下の利益を主張するものであり、本出願は全目的のため全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、妊婦における子癇前症（preeclampsia）のリスク増加を評価する方法に関する。本明細書に記載の方法は、妊婦の生体試料中のレラキシンレベルの測定、および場合によりＣ反応性タンパク質レベルの測定を用いる。開示はさらに、妊婦へのレラキシン医薬製剤の投与を介して、子癇前症のリスクを低下させる方法を含む。
【背景技術】
【０００３】
子癇前症（妊娠中毒症としても知られる）は、通常は第２期後期または第３期の妊婦、および出産後最初の６週間の産後女性に影響する致死的な状態である。子癇前症は、新規発症の尿中タンパク質（タンパク尿）および高血圧により診断される。該状態は、妊婦の腎臓、肝臓、脳、心臓および胎盤に影響する。子癇前症は、妊娠の約８から１０パーセントに発生し、陣痛誘発または帝王切開のいずれかによる妊娠の終了により緩和されるのみである。原因は依然としてほとんど不明である。子癇前症は初回妊娠中に最も多く発生する。子癇前症のリスクは、３５歳超または１８歳未満の女性、この状態に遺伝的になりやすい女性、既存の高血圧症、糖尿病、ループスのような自己免疫疾患、第Ｖ因子ライデンのようなさまざまな遺伝性栓友病、または腎疾患に罹患している女性、肥満女性を含む特定の妊婦群、および多胎妊娠女性（双子、三つ子以上）で中程度に増加することも知られている。子癇前症を発症する単独の最も重大なリスクは、以前の妊娠で子癇前症になったことである。
【０００４】
子癇前症は通常、妊娠２０週後に発症するが、胞状奇胎（hydatiform mole）がある場合、より早期に始まることもあり得る。子癇前症は、徐々にまたは突然発症し得、妊娠期間中軽度のままであるまたは重度になる可能性がある。高血圧およびタンパク尿に加えて一般的な症状は、尿酸の上昇、点滅光または視界不良などの視覚問題、持続性頭痛、手足の極度の腫脹、体液貯留、右上腹部の疼痛である。未治療の場合、子癇前症は、母体の肝臓または腎臓を損傷する、胎児から酸素を奪う、および子癇（発作）の原因となる可能性がある。子癇前症の徴候を有する妊婦は、医師により注意深くモニターされなければならない。中程度から重度の子癇前症は多くの場合、安静、硫酸マグネシウム、および高血圧のための薬剤により病院で治療される。不幸なことに、分娩は依然として子癇前症に対する唯一の真の「治癒」である。事実、女性が重度の子癇前症を有する、または軽度から中程度の子癇前症で予定日が近い場合、分娩は依然としてこれまでで最善の治療である。陣痛は次いで、帝王切開が必要と思われない限り、投薬により開始される。出産後最初の数日以内に、母親の血圧は通常は正常に戻るが、重度の子癇前症では、血圧が正常に戻るのに数週間を要する場合がある。
【０００５】
具体的には、子癇前症は、妊婦が高血圧（少なくとも４時間をおいて取られた２つの別々の測定値が１４０／９０ｍｍ  Ｈｇ以上）および２４時間尿サンプル中のタンパク質３００ｍｇ（すなわち、タンパク尿）を発症する場合に診断される。腫脹または浮腫、（特に手および顔の）は、子癇前症診断の重要な徴候と長い間考えられたが、正常妊娠女性の最大４０％もまた浮腫を有し得ることから、今日の医療では高血圧症およびタンパク尿のみが診断に必要である。しかし、押した場合に凹みを残すことで顕著となる圧痕浮腫、すなわち、異常な腫脹（特に手、足、または顔の）は、重大である可能性があり、医師に報告しなければならない。子癇は死に至る可能性があるが、子癇前症は明らかに無症候性である場合、または典型的な妊娠関連疾患の症状を示す場合がある。例えば、肝臓障害を反映し、およびヘルプ症候群（すなわち、溶血、肝酵素の上昇および血小板減少）と呼ばれる重症型の子癇前症の典型である上腹部痛は、妊娠のきわめて一般的な問題である胸焼けと容易に混同され得る。したがって、子癇前症の推定診断は、一致する子癇前症の特徴に頼っており、確定診断は出産が認められた後、症状が退行するまで一般に不可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
子癇前症スクリーニングの領域では進歩があったが、臨床医は、子癇前症のリスクがある妊婦をモニターする最適な戦略に取り組み続けている。母親および子どもの両方を子癇前症の悪影響から守るアプローチが望まれる。本開示は、妊婦が子癇前症を有するまたは子癇前症になりやすいかどうかを判定する方法を提供してこのニーズに応える。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、妊婦において子癇前症を発症するリスクを評価する方法、および可能性を低下させる方法を提供する。本開示の１つの大きな利点は、療法をタイミング良く開始できるように、子癇前症の発症リスクを妊娠中の早期に評価することができる点である。本開示の別の利点は、子癇前症を予防または軽減するために、子癇前症のリスクが高いと判定された妊婦を、比較的低レベルのレラキシンまたはこのアゴニストで治療することができる点である。レラキシンの早期投与は、妊娠第１期中にＨ２レラキシンが比較的欠乏している妊婦における妊娠合併症数を劇的に減少させることができる。レラキシンは妊婦に自然発生するため、外因性レラキシンによる治療が有害な副作用を伴うはずはない。本開示のさらに別の利点は、子癇前症、および子癇前症になりやすい妊娠被験者のサブセットにおける疾患進行をよりよく理解するための研究および／または臨床試験に、豊富な患者集団を選択することができる点である。
【０００８】
１つの態様では、本開示は、妊娠第１期の妊娠ヒト女性を選択するステップと、ヒト女性における子癇前症の発症リスクを評価するため、妊娠ヒト女性でのレラキシンタンパク質レベルを検出するステップとを含む、妊娠ヒト女性における子癇前症の発症リスクを評価する方法を提供する。別の態様では、本開示は、妊娠第２期の妊娠ヒト女性を選択するステップと、ヒト女性における子癇前症の発症リスクを評価するため、妊娠ヒト女性でのレラキシンタンパク質レベルを検出するステップとを含む、妊娠ヒト女性における子癇前症の発症リスクを評価する方法を提供する。別の態様では、本開示は、子癇前症の発症前の妊娠ヒト女性を選択するステップと、ヒト女性における子癇前症の発症リスクを評価するため、妊娠ヒト女性でのレラキシンタンパク質レベルを検出するステップとを含む、妊娠ヒト女性における子癇前症の発症リスクを評価する方法を提供する。レラキシンは血中で検出することができる。好ましくは、レラキシンは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などのレラキシンに対する抗体を用いて検出される。本開示の１つの実施形態では、ヒト女性は妊娠５から１４週である。本開示の別の実施形態では、ヒト女性は妊娠５から２８週である。本開示の別の実施形態では、ヒト女性は１人を超える子どもを妊娠している。本開示の別の実施形態では、妊娠ヒト女性は３５歳超である。さらに別の実施形態では、妊娠ヒト女性は１８歳以下である。さらに別の実施形態では、妊娠ヒト女性は遺伝的に子癇前症になりやすい。本開示の別の態様では、方法は、妊娠ヒト女性におけるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベルを検出するステップとをさらに含む。ＣＲＰは血中で検出される。好ましくは、ＣＲＰは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などのＣＲＰに対する抗体を用いて検出される。
【０００９】
別の態様では、本開示は、妊娠ヒト女性が血流中約５００ｐｇ／ｍｌ未満のレラキシンレベルを有する、妊娠第１期の該妊娠ヒト女性を選択するステップとを含む、妊娠ヒト女性における子癇前症の発症可能性を低下させる方法を提供する。別の態様では、本開示は、妊娠ヒト女性が血流中約５００ｐｇ／ｍｌ未満のレラキシンレベルを有する、妊娠第２期の該妊娠ヒト女性を選択するステップとを含む、妊娠ヒト女性における子癇前症の発症可能性を低下させる方法を提供する。別の態様では、本開示は、妊娠ヒト女性が血流中約５００ｐｇ／ｍｌ未満のレラキシンレベルを有する、子癇前症の発症前の該妊娠ヒト女性を選択するステップとを含む、妊娠ヒト女性における子癇前症の発症可能性を低下させる方法を提供する。方法は、妊娠ヒト女性における子癇前症の発症可能性を低下させるため、妊娠ヒト女性に医薬製剤でのレラキシンを投与するステップとをさらに含む。レラキシンは、１日あたり約１０μｇ／ｋｇから約１００μｇ／ｋｇ被験者体重の量で妊娠ヒト女性に投与することができる。１つの好ましい実施形態では、レラキシンは、１日あたり約３０μｇ／ｋｇ被験者体重の量で妊娠ヒト女性に投与される。レラキシン投与は、欠乏が顕著になり次第開始することができ、妊娠期間中継続することができる。このように、レラキシンは、例えば、妊娠中を通じて約１０ｎｇ／ｍｌのレラキシン血清濃度を維持するように被験者に投与される。レラキシン医薬製剤は、皮下（ＳＱ）または他の経路により投与することができる。例えば、レラキシンは、注入ポンプによる持続注入により送達することができる。
【００１０】
本開示の医薬製剤に使用されるレラキシンは、例えば、合成もしくは組換えレラキシン、または薬学的に有効なレラキシンアゴニストもしくは模倣剤であってもよい。本開示の１つの実施形態では、レラキシンはＨ１ヒトレラキシンである。別の実施形態では、レラキシンはＨ２ヒトレラキシンである。さらに別の実施形態では、レラキシンはＨ３ヒトレラキシンである。さらなる実施形態では、レラキシンは合成もしくは組換えヒトレラキシン、または薬学的に有効なレラキシンアゴニストもしくはレラキシン模倣剤である。故に、子癇前症のリスクがある妊娠ヒト女性は、合成もしくは組換えヒトレラキシンまたはレラキシンアゴニストもしくは模倣剤の医薬製剤で治療することができる。本開示の１つの実施形態では、妊娠ヒト女性は合成ヒトレラキシンで治療される。別の実施形態では、妊娠ヒト女性は組換えヒトレラキシンで治療される。さらに別の実施形態では、妊娠ヒト女性は薬学的に有効なレラキシンアゴニストまたは模倣剤で治療される。レラキシンは、皮下、筋肉内、静脈内、舌下および吸入を含むがこれらに限定されない幾つかの異なる経路により、妊娠ヒト女性に投与することができる。１つの好ましい投与経路は、皮下（ＳＱ）投与である。
【００１１】
本開示はさらに、妊娠第１期の妊娠ヒト女性を選択するステップと、ヒト女性における子癇前症の発症リスクを評価するため、妊娠ヒト女性でのレラキシンタンパク質レベルを検出するステップとを含む、妊娠ヒト女性における子癇前症の発症リスクを評価するのに使用するレラキシンを提供する。本開示はさらに、妊娠第２期の妊娠ヒト女性を選択するステップと、ヒト女性における子癇前症の発症リスクを評価するため、妊娠ヒト女性でのレラキシンタンパク質レベルを検出するステップとを含む、妊娠ヒト女性における子癇前症の発症リスクを評価するのに使用するレラキシンを提供する。本開示はさらに、子癇前症の発症前の妊娠ヒト女性を選択するステップと、ヒト女性における子癇前症の発症リスクを評価するため、妊娠ヒト女性でのレラキシンタンパク質レベルを検出するステップとを含む、妊娠ヒト女性における子癇前症の発症リスクを評価するのに使用するレラキシンを提供する。本開示はさらに、妊娠ヒト女性が血流中約５００ｐｇ／ｍｌ未満のレラキシンレベルを有する、妊娠第１期の該妊娠ヒト女性を選択するステップを含む、妊娠ヒト女性における子癇前症の発症可能性を低下させるのに使用するレラキシンを提供する。本開示はさらに、妊娠ヒト女性が血流中約５００ｐｇ／ｍｌ未満のレラキシンレベルを有する、妊娠第２期の該妊娠ヒト女性を選択するステップを含む、妊娠ヒト女性における子癇前症の発症可能性を低下させるのに使用するレラキシンを提供する。本開示はさらに、妊娠ヒト女性が血流中約５００ｐｇ／ｍｌ未満のレラキシンレベルを有する、子癇前症の発症前の該妊娠ヒト女性を選択するステップを含む、妊娠ヒト女性における子癇前症の発症可能性を低下させるのに使用するレラキシンを含む。
【００１２】
さらに、本開示は、ａ）子癇前症の発症前の妊婦から得られた生体試料中のＨ２レラキシン濃度を測定するステップと、ｂ）Ｈ２レラキシン濃度が妊婦の下位４分の１の濃度（下位四分位濃度）のカットオフ値未満である場合、前記妊婦は子癇前症を発症するリスクが高いと判定するステップとを含む、妊婦が子癇前症を発症するリスクが高いかどうかを評価する方法を提供する。幾つかの実施形態では、下位四分位濃度は、同様の在胎期間および同様の地域の妊婦群で測定されたＨ２レラキシン濃度の上位７５％から下位２５％を区切るＨ２レラキシン濃度である。幾つかの実施形態では、本開示の目的のための同様の在胎期間の同様の妊婦集団は、テスト被験者（例えば、ステップａおよびｂの妊婦）と同じ期間、好ましくはプラスマイナス１カ月の在胎期間、またはより好ましくはプラスマイナス２週間の在胎期間の妊婦集団である。幾つかの実施形態では、本開示の目的のための同様の地域の同様の妊婦集団は、テスト被験者（例えば、ステップａおよびｂの妊婦）の好ましくは１０００マイル以内、またはより好ましくは５００マイル以内の、同じ大陸、同じ国に居住する妊婦集団である。幾つかの好ましい実施形態では、生体試料は血漿または血清を含む。幾つかの好ましい実施形態では、Ｈ２レラキシンはＨ２レラキシンに対する抗体を用いて測定されるのに対し、これらの実施形態のサブセットでは、Ｈ２レラキシンは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で測定される。幾つかの実施形態では、子癇前症の発症前は、妊娠５週から１５週にわたる妊婦の第１期中である。本開示はまた、妊婦が、子癇前症になりやすい群であって、初回妊娠、３５歳超、１８歳未満、多胎妊娠および既存状態のうちの１つまたは複数を含む群の一部である方法も提供する。幾つかの実施形態では、既存状態は、高血圧症、糖尿病、ループス、栓友病、腎疾患、および肥満から成る群から選択される。幾つかの好ましい実施形態では、下位四分位濃度のカットオフ値は約５００ｐｇ／ｍｌである。さらに本開示は、生体試料中のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）濃度を測定するステップと、Ｈ２レラキシン濃度が約５００ｐｇ／ｍｌより高い場合でも、ＣＲＰ濃度が約１３．５ｍｃｇ／ｍｌより高い場合、該妊婦は子癇前症を発症するリスクが高いと判定するステップとをさらに含む方法を提供する。あるいは本開示は、生体試料中のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）濃度を測定するステップと、Ｈ２レラキシン濃度が約５００ｐｇ／ｍｌより高い場合でも、ＣＲＰ濃度が約１．５ｍｃｇ／ｍｌ未満の場合、該妊婦は子癇前症を発症するリスクが高いと判定するステップとをさらに含む方法を提供する。本開示はまた、ａ）妊婦から得られた生体試料中のＨ２レラキシン濃度を測定するステップと、ｂ）Ｈ２レラキシン濃度が妊婦の下位四分位濃度のカットオフ値未満である場合、該妊婦は子癇前症を有する（子癇前症に罹患している）と判定するステップとを含む、妊婦が子癇前症を有するかどうかを評価する方法も提供する。幾つかの好ましい実施形態では、生体試料は、妊婦が子癇前症の少なくとも１つの症状を示している場合に該妊婦から得られ、方法は、該妊婦が子癇前症を有すると診断するための一部に使用される。これらの実施形態のサブセットでは、子癇前症の少なくとも１つの症状は、浮腫、重度の頭痛、視覚変化、上部腹痛、悪心、嘔吐、目眩、尿排出量の減少、および１週間あたり２ポンドを超える突然の体重増加から成る群の１つまたは複数を含む。
【００１３】
また、本開示は、ａ）妊娠第１期中に得られた生体試料中、約５００ｐｇ／ｍｌ未満の血清Ｈ２レラキシン濃度を有する妊婦を選択するステップと、ｂ）該妊婦が子癇前症を発症する可能性を低下させるために医薬製剤でのＨ２レラキシンを該妊婦に投与するステップとを含む、妊婦が子癇前症を発症する可能性を低下させる方法も提供する。幾つかの実施形態では、Ｈ２レラキシンは、妊娠の最終部（例えば、Ｈ２レラキシン濃度の判定後）の間中１日あたり約３０μｇ／ｋｇ体重の量で妊婦に投与される。幾つかの実施形態では、Ｈ２レラキシンは、妊娠中を通じて約１０ｎｇ／ｍｌのレラキシンの血清濃度を維持するために妊婦に投与される。好ましい方法では、血清Ｈ２レラキシン濃度は免疫アッセイにより判定される。幾つかの実施形態では、妊娠第１期は妊娠５週から１５週にわたる。幾つかの実施形態では、妊婦は子癇前症になりやすい群であって、初回妊娠、３５歳超、１８歳未満、多胎妊娠および既存状態のうちの１つまたは複数を含む群の一部である。これらの実施形態のサブセットでは、既存状態は高血圧症、糖尿病、ループス、栓友病、腎疾患、および肥満から成る群から選択される。幾つかの特に好ましい実施形態では、妊婦は北米出身である。より好ましくは、妊婦は、北米の工業北東地域（例えば、ピッツバーグから２５０マイル以内）出身である。
【００１４】
さらに、本開示は、Ｈ２レラキシンと反応するモノクローナル抗体であって、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）  ＰＴＡ−８４２３として示されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体を提供する。さらなる実施形態では、ＰＴＡ−８４２３のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体、マイクロプレート、および試料のＨ２レラキシン濃度を測定するための説明書を含む免疫アッセイキットが提供される。幾つかの好ましい実施形態では、免疫アッセイは、ポリクローナル抗レラキシン抗体をさらに含むＨ２レラキシン捕捉アッセイである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】在胎期間に関して子癇前症（ＰＥ）女性（ＨＰＵおよびＨＰ群）における血清レラキシン濃度を示す図である。線は同じ被験者由来の試料を結んでいる。菱形は、後に子癇前症を発症し、および内因性レラキシンレベルが最初の１５週に５００ｐｇ／ｍｌより低かった妊婦由来の試料を示す。四角形は、後に子癇前症を発症したが、内因性レラキシンレベルが５００ｐｇ／ｍｌを上回った妊婦由来の試料を示す。菱形は、子癇前症を発症しなかった妊婦由来の試料を示す。正常な妊娠結果を有する女性で、最初の１５週に５００ｐｇ／ｍｌより低いレラキシン濃度であった者はほとんどいなかったことに注意すべきである。
【図２】試験被験者から採取された第１試料のレラキシン濃度の二変量ヒストグラム（すなわち、子癇前症クラスター）の図解である。被験者が異なる時点で試験に採用されたため、第１試料は在胎期間５から１１週から得られた。
【図３】分岐数が１および終端ノード数が２である、ＨＰＵおよびＨＰ妊娠（すなわち、子癇前症女性）に関する分類および回帰木（ＣＡＲＴ）の図解である。レラキシン（Ｒｌｘ）による特異度が９６％であるのに対し、感度は３７％である。この分類木に使用されたデータは図１に示されている。これは、妊娠の後期に子癇前症を発症するリスクが高い女性集団を特定するのに、血清レラキシンを使用できることを図示している。この予測は、子癇前症の臨床症状が出現する数カ月前に行うことができる。
【図４】分岐数が３および終端ノード数が４である、ＨＰＵおよびＨＰ妊娠（すなわち、子癇前症女性）に関するＣＡＲＴ分析を示す図である。レラキシン（Ｒｌｘ）およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）による特異度が９３％であるのに対し、感度はレラキシン（Ｒｌｘ）単独と比べて８３％に改善した（図３参照）。ＣＲＰ測定の追加は、レラキシン（Ｒｌｘ）濃度単独の判定では特定されなかった子癇前症になりやすい女性の特定を可能にする。
【図５】分岐数が３および終端ノード数が４である、ＨＰＵ、ＨＵまたはＨＰ妊娠（すなわち、子癇前症女性を含む高血圧女性）に関する分類木を示す図である。レラキシン（Ｒｌｘ）およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）測定による特異度は６３％、感度は９６％である。
【図６】分岐数が５および終端ノード数が６である、ＨＰＵ、ＨＵまたはＨＰ妊娠（すなわち、子癇前症女性を含む高血圧女性）に関する分類木を示す図である。レラキシン（Ｒｌｘ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、およびクレアチニン（ＣＲＥＡＴ）測定による特異度は９２％、感度は８７％である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
概説
１つの態様では、本開示は、妊娠ヒト被験者における子癇前症の発症リスクを評価する方法に関する。本明細書に記載の方法は、妊娠第１期中の妊婦から得られた生体試料中のレラキシン、および場合によりＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のレベルの測定を用いる。子癇前症は、女性が妊娠中に入院する主な理由の１つであることから、医療制度に対する高コストと関連している。子癇前症は、特に母親の血圧が１４０／９０ｍｍＨｇを超えた場合に、母体または胎児の健康上の懸念のため帝王切開による妊娠の早期終結をもたらすことが多いため、子癇前症またはこの症状で入院する妊婦の予後はこれまで深刻であった。今日現在、妊娠の終結以外に子癇前症の治癒はない。この問題を軽減するため、本開示は、子癇前症の発症可能性またはリスクを評価するのに使用できるテストを提供する。好ましい実施形態では、テストは、女性をモニターでき、子癇前症が完全に進展するのを防ぐための適切な介入を行えるように妊娠早期（例えば、第１期）で行われる。子癇前症のリスク増大を早期に認識することは、担当医師が妊娠患者の状態を発症から安定化できるようにする。高血圧を予防または低下させるための療法形態での介入は、同様に、母親および子どもの死亡リスクを低下させ、妊娠の早期終結のリスクをさらに低下させる。
【００１７】
本明細書に記載の通り、妊婦におけるレラキシンレベルの測定によって、女性が子癇前症を発症するかどうかを予測することができる。このように、低レベルのレラキシンは状態の高度に特異的な指標になる。ヒト被験者に関して本明細書では用語レラキシン（天然レラキシンおよび内因性レラキシン）は、特に規定のない限り、Ｈ２レラキシンを指す。図１および３は、妊婦におけるレラキシンレベルが５００ｐｇ／ｍｌより低い場合、女性が子癇前症を発症する可能性は９６％にもなることを示している（ＣＡＲＴ分析に関する図３参照）。事実、図１のデータを用いて特定された子癇前症女性の３分の１が、レラキシンレベルが５００ｐｇ／ｍｌより低い。さらなる実施形態では、レラキシンレベルに加えて天然Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベルを測定することにより、テストはさらにより感受性になる。例えば図４は、ＣＲＰが約１．５μｇ／ｍｌ未満または約１３．５μｇ／ｍｌを超える場合、テストの感度は８３パーセントまで上昇することを示している。
【００１８】
別の態様では、本開示は、薬学的に活性なＨ２レラキシンまたはＨ２レラキシンアゴニストの投与により、子癇前症の発症可能性を予防または低下させる方法を提供する。より具体的には、妊娠中の女性を安定させ、および子癇前症が発症するのを予防するため、内因性レラキシンレベルが５００ｐｇ／ｍｌより低い場合に外因性Ｈ２レラキシンを妊婦に投与することができる。このように、妊婦は、妊娠の最終期間中（例えば、Ｈ２測定後）、合成もしくは組換えヒトレラキシンの医薬製剤またはレラキシンアゴニストにより治療され、レラキシンは主に予防薬として機能する。
【００１９】
定義
用語「内因性レラキシン」または「天然レラキシン」は、本明細書では互換的に使用され、当技術分野でよく知られている自然発生のペプチドホルモンレラキシンを指す。女性では、レラキシンは卵巣の黄体、胸部ならびに、妊娠中は、胎盤、絨毛膜、および脱落膜によっても産生される。内因性レラキシンレベルは、黄体による産生の結果、排卵後に上昇し、黄体期中期および後期にピークに達する。受胎できない月経周期では、レラキシン濃度は検出不能なレベルまで減少する。しかし、受胎できる月経周期では、レラキシン濃度は急増し、第１期にピークに達する。レラキシン濃度は次いで緩やかに減少し始めるが、妊娠期間中上昇したままである。ヒト被験者に関して本明細書では用語レラキシン（天然レラキシンおよび内因性レラキシン）は、特に規定のない限り、Ｈ２レラキシンを指す。
【００２０】
用語「外因性レラキシン」は、本明細書では、インタクトな完全長ヒトレラキシンまたは生物活性を保持するレラキシン分子の一部を含む、非内因性ヒトレラキシンを意味する。用語「外因性レラキシン」は、ヒトＨ１プレプロレラキシン、プロレラキシン、およびレラキシン；Ｈ２プレプロレラキシン、プロレラキシン、およびレラキシン；ならびにＨ３プレプロレラキシン、プロレラキシン、およびレラキシンを含む。用語「レラキシン」は、さらに、生物学的に活性な（「薬学的に活性な」とも本明細書で呼ばれる）、組換え、合成または天然源由来のレラキシン、およびアミノ酸配列変異体などのレラキシン変異体を含む。このように、該用語は、合成Ｈ１、Ｈ２およびＨ３ヒトレラキシンならびに組換えＨ１、Ｈ２およびＨ３ヒトレラキシンを含む、合成ヒトレラキシンおよび組換えヒトレラキシンを含む。該用語は、さらに、レラキシン受容体（例えば、ＬＧＲ７受容体、ＬＧＲ８受容体、ＧＰＣＲ１３５、ＧＰＣＲ１４２等）から結合レラキシンを競合的に置換する全ての薬剤を含む、レラキシンアゴニスト、レラキシン模倣剤および／またはレラキシン類似体ならびに生物活性を保持するこれらの部分など、レラキシン様活性を有する活性薬剤を含む。故に、薬学的に有効なレラキシンアゴニストまたは模倣剤は、レラキシン受容体に結合してレレラキシン様反応を誘発することができる、レラキシン様活性を有するいずれかの薬剤である。さらに、本明細書ではヒトレラキシンの核酸配列は、ヒトレラキシン（例えば、Ｈ１、Ｈ２および／またはＨ３）の核酸配列と必ずしも１００％同一でなくてもよいが、ヒトレラキシンの核酸配列と少なくとも約４０％、５０％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であることができる。レラキシンは、本明細書では、当業者に既知の任意の方法により作製することができる。このような方法の例は、例えば、米国特許第５，７５９，８０７号、およびBullesbachら（１９９１年）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６６（１７）：１０７５４〜１０７６１頁に示されている。レラキシン分子および類似体の例は、例えば、米国特許第５，１６６，１９１号に示されている。
【００２１】
自然発生の生物学的に活性なレラキシンは、ヒト、ネズミ（すなわち、ラットまたはマウス）、ブタ、または他の哺乳動物源由来であってもよい。また、インビボでの半減期を増大するために修飾されたレラキシン、例えば、ペグ化レラキシン（すなわち、ポリエチレングリコールに結合されたレラキシン）、分解酵素による切断に供される、レラキシンにおけるアミノ酸の修飾等も含まれる。該用語はまた、Ｎおよび／またはＣ末端トランケーションを有するＡおよびＢ鎖を含むレラキシンも含む。一般に、Ｈ２レラキシンでは、Ａ鎖はＡ（１〜２４）からＡ（１０〜２４）まで異なり得、Ｂ鎖はＢ（１〜３３）からＢ（１０〜２２）まで異なり得；およびＨ１レラキシンでは、Ａ鎖はＡ（１〜２４）からＡ（１０〜２４）およびＢ鎖はＢ（１〜３２）からＢ（１０〜２２）まで異なり得る。また、用語「レラキシン」の範囲内には、１つまたは複数のアミノ酸残基の他の挿入、置換、または欠失、グリコシル化変異体、非グリコシル化レラキシン、有機および無機塩、レラキシンの共有結合修飾された誘導体、プレプロレラキシン、およびプロレラキシンも含まれる。また、該用語には、米国特許第５，８１１，３９５号に開示されたレラキシン類似体を含むがこれに限定されない、野生型（例えば、自然発生）配列とは異なるアミノ酸配列を有するレラキシン類似体も含まれる。レラキシンアミノ酸残基に対する可能な修飾には、Ｎ末端を含む遊離アミノ基のアセチル化、ホルミル化もしくは類似の保護、Ｃ末端基のアミド化、またはヒドロキシルもしくはカルボン酸基のエステルの形成（例えば、ホルミル基の付加によるＢ２でのトリプトファン（Ｔｒｐ）残基の修飾）が含まれる。ホルミル基は、容易に除去可能な保護基の典型例である。他の可能な修飾には、異なるアミノ酸（天然アミノ酸のＤ型を含む）との、Ｂおよび／またはＡ鎖内の１つまたは複数の天然アミノ酸の置換（ノルロイシン（Ｎｌｅ）、バリン（Ｖａｌ）、アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）またはホモセリン（ＨｏｍｏＳｅｒ）との、Ｂ２４におけるＭｅｔ部分の置換を含むが、これらに限定されない）が含まれる。他の可能な修飾には、該鎖からの天然アミノ酸の欠失、または該鎖への１つまたは複数の余分なアミノ酸の付加が含まれる。さらなる修飾には、プロレラキシンのＢ／ＣおよびＣ／Ａ接合部におけるアミノ酸置換（この修飾はプロレラキシンからのＣ鎖の切断を促進する）、および例えば、米国特許第５，７５９，８０７号に記載されているような非自然発生Ｃペプチドを含む変異体レラキシンが含まれる。
【００２２】
また、用語「レラキシン」により、レラキシンおよび異種ポリペプチドを含む融合ポリペプチドも含まれる。異種ポリペプチド（例えば、非レラキシンポリペプチド）融合パートナーは、融合タンパク質のレラキシン部分に対しＣ末端またはＮ末端であってもよい。異種ポリペプチドには、免疫学的に検出可能なポリペプチド（例えば、「エピトープタグ」）；検出可能なシグナルを生成することができるポリペプチド（例えば、緑色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼなどの酵素、および当技術分野で既知の他のもの）；サイトカイン、ケモカイン、および成長因子を含むがこれらに限定されない、治療ポリペプチドが含まれる。変異体をもたらすレラキシン分子構造におけるこのような変異または変化は全て、レラキシンの機能（生物）活性が維持される限り、本開示の範囲内に含まれる。好ましくは、レラキシンアミノ酸配列または構造のいずれかの修飾は、レラキシン変異体で治療される個体において免疫原性を増加させないものである。記載された機能活性を有するようなレラキシン変異体は、当技術分野で既知のインビトロおよびインビボアッセイを用いて容易に同定することができる。
【００２３】
幾つかの実施形態では、本開示は、レラキシンアゴニストの投与を含む方法を提供する。幾つかの方法では、レラキシンアゴニストは、ＲＸＦＰｌ、ＲＸＦＰ２、ＲＸＦＰ３、ＲＸＦＰ４、ＦＳＨＲ（ＬＧＲｌ）、ＬＨＣＧＲ（ＬＧＲ２）、ＴＳＨＲ（ＬＧＲ３）、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＬＧＲ６  ＬＧＲ７（ＲＸＦＰｌ）およびＬＧＲ８（ＲＸＦＰ２）から選択されるがこれらに限定されない、１つまたは複数のレラキシン関連Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を活性化する。幾つかの実施形態では、レラキシンアゴニストは、Ｃｏｍｐｕｇｅｎ社のＷＯ  ２００９／００７８４８の式Ｉのアミノ酸配列（レラキシンアゴニスト配列の教示のため参照により本明細書に組み込まれる）を含む。例示的なレラキシンアゴニストは、Ｃｏｒｔｈｅｒａ社の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４４２５１（配列番号：４〜８のレラキシンアゴニスト配列の教示のため参照により本明細書に組み込まれる）にも開示されている。
【００２４】
本開示はまた、式Ｉポリペプチドの相同体も含み、このような相同体は、例示的なレラキシンアゴニストのアミノ酸配列（例えば、Ｃｏｒｔｈｅｒａ社のＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４４２５１の配列番号５または配列番号６）と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上、例えば１００％同一であってもよく、デフォルトパラメータ（場合によりおよび好ましくは以下を含む：フィルタリング（このオプションはＳｅｇ（タンパク質）プログラムを用いてクエリから反復配列または低複雑度配列をフィルタリングする）、タンパク質のスコア行列がＢＬＯＳＵＭ６２、ワードサイズが３、Ｅ値が１０、ギャップコストが１１、１（初期化および（初期化および伸長））を用いる米国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを用いて決定することができる。場合によりおよび好ましくは、核酸配列同一性／相同性は、デフォルトパラメータ（好ましくはＤＵＳＴフィルタプログラムを用いることを含み、また好ましくはＥ値１０を有すること、低複雑度配列をフィルタリングすることおよびワードサイズ１１も含む）を用いる米国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＮソフトウェアにより決定される。最後に本開示は、上記のポリペプチド、および自然発生のまたは人工的に導入された（ランダムにまたは標的化方法で）、１つまたは複数のアミノ酸の欠失、挿入または置換などの突然変異を有するポリペプチドのフラグメントも含む。
【００２５】
用語「妊娠」は、妊娠９カ月（最終月経期から４０週）を指し、伝統的に３つの期間、すなわち、異なる段階の胎児発達が起こるおよそ３カ月の明確に区別できる期間に分けられる。第１期は、基本的な細胞分化の期間である。第１期は、胎児の動きを母親が初めて感じる（胎動初感）ことで終わると考えられ、これは通常は第３カ月（すなわち在胎期間約１２から１４週）の終わり頃に起きる。第２期は、体組織の急速な成長および成熟の期間である（在胎期間約１５から約２８週）。未熟児で生まれる第２期の胎児は、入院治療次第で生存できる可能性がある。第３期は、胎児の成長の最終段階を示す。組織が完成し、脂肪が胎児の皮膚下に蓄積し、および胎児が出生のための位置に移動する（在胎期間約２９から４２週）。この期間は、出生自体により終了する。
【００２６】
記載された値との関連で使用される場合の用語「約」は、記載された値のプラスマイナス最大１０％の範囲（例えば、記載された値の９０〜１１０％）を含む。例えば、約３０ｍｃｇ／ｋｇ／日の静脈内（ＩＶ）注入速度は、２７ｍｃｇ／ｋｇ／日から３３ｍｃｇ／ｋｇ／日のＩＶ注入速度を含む。
【００２７】
「治療的に有効な」は、患者のベースライン状態または未治療もしくはプラセボ治療（例えば、レラキシンで治療されない）被験者の状態と比べて、測定可能な所望の医学的または臨床的ベネフィットをもたらすであろう薬学的に活性なレラキシンの量を指す。
【００２８】
子癇前症
子癇前症（preeclampsia）（またはpre−eclampsia）は、低酸素状態になる浅く着床した胎盤が原因となり得、胎盤からのアップレギュレート炎症性メディエーター（血管内皮で作用する）の分泌を特徴とする免疫反応をもたらす。浅い着床は、胎盤に対する母体免疫系の反応から生じる。この理論は、胎児およびこの胎盤由来の父親抗原に対する確立した免疫寛容の欠如を示唆する証拠に関連している。子癇前症の幾つかのケースでは、母親は、母体の免疫反応をダウンレギュレートするための、胎盤が分泌するタンパク質に対する受容体が欠けていると考えられる（Ｍｏｆｆｅｔｔら、Ｐｌａｃｅｎｔａ  Ｓｕｐｐｌ．  Ａ：Ｓ５１〜６頁、２００７年）。しかし、子癇前症の多くのケースでは、胎盤に対する母体の反応は、正常な着床が起こるのを可能にしているように思われる。慢性高血圧症または自己免疫疾患などの基礎疾患から生じる炎症のベースラインレベルが高い女性は、妊娠の炎症影響に対する寛容が低くなり得る可能性がある。
【００２９】
多くの理論が、なぜ子癇前症が起きるのか説明しようと試み、該症候群を以下の状態（内皮細胞損傷、胎盤の免疫拒絶、胎盤灌流障害、血管反応性の変化、プロスタサイクリンとトロンボキサンの間の不均衡、塩分および水分の貯留を有する糸球体濾過率の低下、血管内容積の減少、中枢神経系興奮性の増加、播種性血管内凝固、子宮筋伸長（虚血）、ビタミン不足を含む食事要因、および遺伝要因を含む）の存在と関連づけてきた。
【００３０】
子癇前症の理解は、胎盤を低酸素症になりやすくする極めて変わりやすい第１段階、これに続く例えば、内皮細胞損傷、血管反応性の変化、糸球体内皮症の典型的病変、血管内容積の減少、炎症等をもたらす可溶性因子が放出する、２段階のプロセスとしてである。幾つかの試験は、該状態になりやすい母親においては、内皮（血管の内層）への損傷、代謝の変化、炎症、および他の病的反応の原因となるホルモンまたは化学物質の放出をもたらす、胎盤への不十分な血液供給の概念を裏付ける（ＤｒｉｆｅおよびＭａｇｏｗａｎ（編）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｙ、第３９章、３６７〜３７０頁）。
【００３１】
幾つかの試験は、不十分な灌流から生じる低酸素症が、ＶＥＧＦおよびＰＬＧＦアンタゴニストであるｓＦｌｔ−１をアップレギュレートし、母体内皮の損傷および胎盤の成長の制限をもたらすことを示唆する（Ｍａｙｎａｒｄら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１１１（５）：６４９〜５８頁、２００３年）。さらに、ＴＧＦ−ベータアンタゴニストであるエンドグリンは、子癇前症を発症する妊婦で上昇する（Ｖｅｎｋａｔｅｓｈａら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、１２（６）：６４２〜６４９頁、２００６年）。可溶性エンドグリンは恐らく、母体免疫系により産生される細胞表面エンドグリンのアップレギュレーションに反応して胎盤によりアップレギュレートされるが、ｓＥｎｇが母体内皮により産生される可能性もある。ｓＦｌｔ−１およびｓＥｎｇどちらのレベルも、疾患の重症度が増すに伴い増加し、ヘルプ症候群ケースではｓＥｎｇレベルがｓＦｌｔ−１レベルを上回る。ヘルプ症候群は、溶血、肝酵素の上昇、および 血小板減少を特徴とする、子癇前症の重度の変異型である。ｓＦｌｔ−１およびｓＥｎｇは両方とも、全ての妊婦である程度アップレギュレートされる。これは、妊娠における高血圧疾患が、正常な妊娠適応の失敗したものであるという考えを裏付ける。胎盤細胞栄養芽層の初期母体拒絶は、浅い着床に関連した子癇前症のようなケースでは、不適切にリモデルされたらせん動脈の原因になり得、下流の低酸素症およびアップレギュレートされたｓＦｌｔ−１およびｓＥｎｇに反応した母体症状の出現をもたらす。
【００３２】
胎児赤芽球などの胎児の細胞、および無細胞胎児ＤＮＡは、子癇前症を発症する女性における母体循環で増加することも実証されている。これらの知見は、子癇前症とは、低酸素病変などの胎盤病変が増加した胎児物質の母体循環への侵入を可能にし、免疫反応および内皮損傷をもたらし、最終的には子癇前症および子癇をもたらす疾患プロセスである、という仮説を生んだ。
【００３３】
統計は、子癇前症および関連の妊娠障害（子癇および妊娠高血圧障害など）は、世界中の母体死亡、ならびに乳児の死亡および病気の大部分に関与していることを示す。年間約７６，０００人の女性がこれらの障害のため死亡している。女性の中には症状を全く経験しない者もいるため、子癇前症は特に危険である。これが、スクリーニングおよび予測の改善がこの状態の診断に不可欠な理由である。女性は子癇前症または高血圧妊娠と診断された後、いずれかの１つまたは複数の以下の薬物療法（メチルドパ、ヒドララジン、ラベタロール、ニフェジピン、硫酸マグネシウム、ベタメタゾンおよびデキサメタゾンを含む）を受ける可能性がある。
【００３４】
カルシウム、アスピリンおよび抗酸化剤（例えば、ビタミンＣおよびＥ）などの予防戦略は、十分に成功してはない。幾つかのケースでは、メタ分析に基づくアスピリンによる子癇前症リスクのわずかな減少があり得る（ＰＡＲＩＳコラボレーション）が、これは治癒ではない。厳格な血圧管理は、脳卒中などの深刻な母体の罹患を予防することができるが、疾患を十分に治療することもない。
【００３５】
レラキシン
内因性または天然レラキシンは、インスリンにサイズおよび形が類似したペプチドホルモンである。より具体的には、レラキシンは、インスリン遺伝子スーパーファミリーに属するエンドクリンおよびオートクリン／パラクリンホルモンである。コードされたタンパク質の活性型は、ジスルフィド結合（２つの鎖間および１つの鎖内）により結合された、Ａ鎖およびＢ鎖から成る。故に、構造は、ジスルフィド結合の配置がインスリンに酷似している。ヒトでは、３つの既知の非対立レラキシン遺伝子、レラキシン−１（ＲＬＮ−１またはＨ１）、レラキシン−２（ＲＬＮ−２またはＨ２）およびレラキシン−３（ＲＬＮ−３またはＨ３）がある。Ｈ１およびＨ２は、高い配列相同性を共有する。この遺伝子に関して記載された異なるアイソフォームをコードする２つの選択的スプライス転写変異体がある。Ｈ１およびＨ２は、生殖器官で異なって発現される（米国特許第５，０２３，３２１号；およびＧａｒｉｂａｙ−Ｔｕｐａｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２１９：１１５〜１２５頁、２００４年参照）のに対し、Ｈ３は主に脳内で見出される。レラキシンペプチドファミリーおよびこの受容体の進化が、当技術分野で記載されている（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、ＢＭＣ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５（１４）：１〜１７頁、２００５年；およびＷｉｌｋｉｎｓｏｎおよびＢａｔｈｇａｔｅ、第１章、Ｒｅｌａｘｉｎ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｌａｎｄｅｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ、２００７年参照）。
【００３６】
レラキシンは、特異的レラキシン受容体、すなわち、ＬＧＲ７（ＲＸＦＰ１）およびＬＧＲ８（ＲＸＦＰ２）ならびにＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２を活性化すると考えられる。ＬＧＲ７およびＬＧＲ８は、Ｇタンパク質共役受容体の固有のサブグループを代表する、ロイシンリッチリピート含有、Ｇタンパク質共役受容体（ＬＧＲ）である。これらは、ヘプタヘリカル膜貫通ドメインおよび大きなグリコシル化細胞外ドメインを含有し、ＬＨ受容体またはＦＳＨ受容体などグリコプロテオホルモン（glycoproteohormone）に対する受容体と遠縁に当たる。これらのレラキシン受容体は心臓、平滑筋、結合組織、ならびに中枢および自律神経系で見出される。Ｈ１、Ｈ２、ブタおよびクジラレラキシンなどの強力なレラキシンは、共通の特定の配列を保有する。ラット、サメ、イヌおよびウマレラキシンなど、保存Ｈ１およびＨ２配列から逸脱するレラキシンは、ＬＧＲ７およびＬＧＲ８受容体を介した生物活性の低下を示す（Ｂａｔｈｇａｔｅら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、１０４１：６１〜７６頁、２００５年；  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｌａｘｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）。しかし、Ｈ２レラキシンに類似して、Ｈ３レラキシンはＬＧＲ７受容体を活性化する（Ｓａｔｏｋｏら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７８（１０）：７８５５〜７８６２頁、２００３年）。さらに、Ｈ３はＧＰＣＲ１３５受容体（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｅｓｔｈｕｉｚｅｎ、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、１０４１：３３２〜３３７頁、２００５年）およびＧＰＣＲ１４２受容体を活性化することが示されている。ＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２は、２つの構造的に関連したＧタンパク質共役受容体である。マウスおよびラットＧＰＣＲ１３５は、ヒトＧＰＣＲ１３５に高い相同性（すなわち、８５％超）を示し、ヒトＧＰＣＲ１３５にきわめて類似した薬理学的特性を有する。ヒトおよびマウスおよびラットレラキシン−３は、マウス、ラット、およびヒトＧＰＣＲ１３５に高親和性で結合および活性化する。対照的に、マウスＧＰＣＲ１４２は、ヒトＧＰＣＲ１４２ではあまりよく保存されない（すなわち、７４％相同性）。サル、ウシ、およびブタ由来のＧＰＣＲ１４２遺伝子がクローン化され、ヒトＧＰＣＲ１４２に高い相同性を示すことが示された（すなわち、８４％超）。異なる種由来のＧＰＣＲ１４２の薬理学的特性評価は、レラキシン−３が異なる種由来のＧＰＣＲ１４２に高親和性で結合することを示した（Ｃｈｅｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、３１２（１）：８３〜９５頁、２００５年）。
【００３７】
レラキシンおよび妊娠
レラキシンの特徴的な機能は、妊娠中の子宮頸部および膣の細胞外マトリックスのリモデリングならびに満期時の胎膜の破裂に関与する生化学的プロセスの制御を含む、女性生殖器官生理機能と関連がある。これらの修飾は、子が産道を通過できるようにし、難産（すなわち、分娩中の胎児下降もしくは子宮頸部拡張の著しい遅れもしくは停止またはこの両方）を予防する。さらに、レラキシンは、子宮および胎盤の成長を促進し、血管発生および子宮内膜の増殖に影響する（Ｐａｒｒｙら、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ、６１２：３４〜４８頁、２００７年）。
【００３８】
ヒトでは、循環で見出されるレラキシンは、妊娠および非妊娠女性の両方において主に卵巣の黄体により産生される。レラキシンは、排卵約１４日以内にピークに達し、次いで妊娠がない場合は減少し、月経をもたらす。妊娠第１期中には血清レベルが上昇する。さらに、レラキシンは、脱落膜および栄養膜により産生されるが、このレラキシンが循環に侵入するとは考えられていない。レラキシンのピークは第１期の１４週間に到達される。レラキシンは、妊娠中の生殖組織および幾つかの他の組織の成長およびリモデリングで注目されている。上述の通り、レラキシンの作用はレラキシン受容体により媒介される。
【００３９】
子癇前症の母親のもとに生まれた子どもは、しばしば、出生体重が低く、これに続く後年の心臓血管状態のリスクがより高い。低出生体重の乳児を出産する母親は、虚血性心臓疾患および死亡のリスクがより高い。具体的には、早期に小さな新生児を出産する子癇前症女性は、対照女性より１０倍高い虚血性心臓疾患の入院率または死亡率を有する。心臓血管リスクは、この状態に罹患していない女性に比べて子癇前症を有する女性で増加するという極めて強力な証拠がある。事実、いずれかの妊娠高血圧障害は、高血圧症および脳卒中のリスクが後に増加する。出産２から４カ月後、子癇前症女性の３分の２が、微量アルブミン尿（すなわち、少量のタンパク質（例えば、アルブミン）の尿中への漏出）を依然として有し得る。閉経後女性では、微量アルブミン尿は重大な心臓血管リスク因子である。さらに、子癇前症は、女性における長期リスクを意味する、インスリン抵抗性およびホモシステインレベルの上昇と関連がある（Ｄａｖｉｓｏｎら、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ、１５：２４４０〜２４４８頁、２００４年）。
【００４０】
正常妊娠中は、糸球体濾過率（ＧＦＲ）および腎血漿流量は、それぞれ４０から６５および５０から８５パーセント増加する。特に、レラキシンは、妊娠中の腎血管拡張を媒介する。レラキシンは、血管ゼラチナーゼ活性を増加させ、これによりビッグＥＴからＥＴ１−３２へ変換し、腎血管拡張、過剰濾過ならびに内皮ＥＴＢ受容体および一酸化窒素を介した腎小動脈の筋原性反応性の低下をもたらすことが知られている（Ｊｅｙａｂａｌａｎら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  １２：２４２５〜２４３７頁、２００７年）。
【００４１】
尿酸は、プリン代謝の最終産物である。プリンは、身体により自然に産生され、食事からも得られる。ヒトでは、ほとんどの循環尿酸は肝臓により産生され、約６６パーセントが腎臓により排出されるのに対し、約３３パーセントは胃腸管により排出される。尿酸の血清濃度は通常、ＧＦＲの増加、近位尿細管再吸収の低下、および糸球体フィルター帯電変化の可能性の結果、正常妊娠中に低下する。子癇前症における胎盤由来の抗血管新生因子は、該疾患中の糸球体内皮症（すなわち、子癇前症に特徴的な組織学的病変）、タンパク尿、および高血圧症に寄与し得ると考えられる。子癇前症を有するほとんどの女性では、腎血漿流量および糸球体濾過率は、輸入細動脈抵抗の増加および／または限外濾過係数の低下の結果、わずかに低下する。腎クリアランス低下のため、この血清尿酸濃度は主に増加する。ＧＦＲの低下は、尿酸濾過負荷量の減少をもたらす。さらに、血漿量の減少は、ナトリウムに結合した近位尿細管再吸収の増加に寄与する。子癇前症における尿中タンパク質排泄の増加は、糸球体フィルターのサイズおよび／または電荷選択性の変化、糸球体毛細管圧増加の可能性、および近位尿細管再吸収障害に続発する（Ｊｅｙａｂａｌａｎら、上記参照）。
【００４２】
正常ヒト妊娠中に、総タンパク質、アルブミン、低分子量タンパク質、および尿細管酵素の尿中排泄量は増加する。子癇前症妊娠では、腎機能は低下する。幾つかの試験によれば、ＧＦＲおよび有効腎血漿流量（ＥＲＰＦ）は、それぞれ３２パーセントおよび２４パーセント減少する（Ｊｅｙａｂａｌａｎら、上記参照）。子癇前症における腎循環の障害に関与する正確な機序は、依然として不明である。ＥＲＰＦの減少は、高い腎血管抵抗が原因であると考えられる。腎輸入（前糸球体細動脈（pre-glomerular aerteriolar））抵抗の上昇は、総腎血管抵抗の増加に対する主要な寄与因子であり得る。この点で、子癇前症における輸入細動脈緊張の増加が、高い全身動脈圧に因る損傷から糸球体を保護する可能性がある。ＥＲＰＦの減少、限外濾過係数の低下、またはこの両方は、子癇前症におけるＧＦＲ低下の可能性のある機序であり得る（Ｊｅｙａｂａｌａｎら、上記参照）。
【００４３】
理論に拘束されることを望むものではないが、レラキシン作用の基底にある機序は、血管拡張および血管新生を刺激することに基づくと広く考えられている。第一に、レラキシンは、子宮での血管新生を刺激して胎児および母体の血管のより良い結合を提供する（すなわち、母体のらせん動脈数を増加させる、母体のらせん動脈を修飾するおよび／または母体らせん動脈の栄養膜浸潤を促進する）と考えられる。血管新生および血管拡張を増加させることは、子癇前症の病因、すなわち母親から子どもへの不十分な血液供給ならびに胎盤および母体の器官灌流の低下を標的にする。レラキシンが妊婦に投与されると、レラキシンは子宮および胎盤で受容体に結合し、ＶＥＧＦ産生を刺激する。ＶＥＧＦは、同様に、内皮細胞に結合して血管新生を刺激する。これは、母親と子どもの間のより良い血液供給を提供する。第二に、レラキシンは強力な血管拡張剤であり、故にいずれも子癇前症を有する女性で低下する子宮胎盤および母体の全身性器官灌流（systemic organ perfusion）を改善できる。レラキシンは、一酸化窒素シンターゼ経路を介して働き、これにより一酸化窒素ＮＯを刺激してヒトにおける血管拡張を増加させる。故に、妊娠中のレラキシンの投与は、子癇前症の最も有害な症状の１つ（すなわち、１４０／９０ｍｍＨｇレベル以上での高血圧）の発症を予防する可能性がある。第三に、糸球体濾過率（ＧＦＲ）および腎血漿流量（ＲＰＦ）は、深刻な妊娠高血圧合併症である子癇前症では減少することが知られている。故にレラキシンの投与は、妊婦における腎血流も増加させる可能性があり、これにより子癇前症リスクをさらに低下させる可能性がある。さらに、レラキシンは潜在的抗炎症効果を有する。
【００４４】
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および妊娠
ＣＲＰは、身体での炎症に反応して肝臓により産生される血漿タンパク質を指す。炎症は、損傷、感染または高血圧などの状態に起因し得る。ＣＲＰは、先天性免疫系の一部および慢性全身性炎症マーカーと見なされている。ＣＲＰはまた、心臓血管イベントの独立した予測因子でもある。ＣＲＰは、アルブミン合成がＩＬ−６および循環において増加する他のサイトカインに因り減少するのと同時に、急性期反応物質として正常妊娠で増加すると考えられる。特に、ＩＬ−１およびＩＬ−６レベルは子癇前症でより高く、これはＣＲＰレベルも子癇前症でより高い理由を説明し得る。この知見は、子癇前症中に悪化する、正常妊娠の炎症反応と一致する。故に、血清レラキシンレベルに加えて血清ＣＲＰレベルについて妊婦をテストすることは、これらの女性が子癇前症をどれ程発症する可能性があるかのさらなる洞察を提供することができる。もう１つの因子としてＣＲＰを用いることにより、本明細書に記載のＨ２レラキシンテストの感度が増大する。
【００４５】
血清ＣＲＰは、子癇の既往（例えば、高血圧腎症妊娠中の発作）を有する女性で上昇することが見出されている。事実、子癇前症または子癇の既往を有する女性は、依然として不明のままである理由のため妊娠後の心臓血管疾患。炎症、脂質異常症およびインスリン抵抗性は、高い子癇前症リスクと関連がある、およびＣＲＰは、上昇した場合、炎症および心臓血管リスクの指標となると考えられる（Ｈｕｂｅｌら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ５１：１４９９〜１５０５頁、２００８年）。
【００４６】
低レラキシンレベルは子癇前症を予測する
ＣＡＲＴ（分類および回帰木）は、実験例に開示された試験中に妊婦から得られたデータを分析するのに使用された。子癇前症予測に使用されるパラメータは、レラキシンおよび、場合により、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）である。図１に見ることができるように、妊娠中の在胎期間は３つの期間、すなわち、０〜１５週（第１期）、１５〜２５週（第２期）、および２５〜３５週（第３期）に分けられる。疾患が十分に進展するのを防ぐ治療を開始するため、子癇前症マーカーについてできる限り早期に妊婦をテストすることが有益である。故に、第１期に女性をテストすることは、妊娠第２または第３期中に女性をテストするより好ましい。テストがより早期にできない場合、妊娠第２および／または第３期に女性をテストできる場合もある。
【００４７】
ＣＡＲＴは、従属変数がそれぞれカテゴリー的か数値的かによって、分類または回帰木のいずれかを作成する非パラメトリック法である。木は、モデリングデータセット中の特定の変数の値に基づきルールを収集して形成される。このように、ルールは、変数の値に基づく分岐が従属変数に基づく観測をいかによく区別できるかに基づき選択される。ひとたびルールが選択されノードを２つに分岐すると、同じ論理が各子ノードに適用される（すなわち、これは再帰的手続きである）。分岐停止は、ＣＡＲＴがさらなるゲインを検出しない、または幾つかの事前に設定された停止ルールが満足される場合に行うことができる。木の各枝は終端ノードで終了する。各観測は、１つのノードおよび正確には１つの終端ノードに分類され、各終端ノードは、一連のルールにより一意的に定義される。
【００４８】
子癇前症は一般に、高血圧症およびタンパク尿などの症状により定義される。妊婦の中には尿酸上昇も患う者もいる。故に、子癇前症女性は、高血圧症およびタンパク尿（ＨＰ）を示す者、および高血圧症、タンパク尿および尿酸（ＨＰＵ）を示す者の２群に分類される。特に、妊婦が高血圧症および尿酸上昇（ＨＵ）を示す場合など、妊婦がタンパク尿の症状を示さない場合、妊婦は通常、子癇前症よりむしろ高血圧妊娠を有すると考えられる。本明細書で論じられるＣＡＲＴ分析の目的のため、以下の群が表１に定義される。
【００４９】
【表１】
0005727938.tif 000002
【００５０】
図３の分類木を参照すると、分岐数は１であり、終端ノード数は２である。より具体的には、最上部のボックスは、子癇前症と分類された３５人の被験者（点線）、および正常と分類された２４人の被験者（実線）がいることを示す。５９人の合計試験被験者のうち、１４人の被験者は４７６．７ｐｇ／ｍｌより低いＨ２レラキシンレベルを有し、４５人の被験者は４７６．７ｐｇ／ｍｌを超えるレラキシンレベルを有した。レラキシンテストがどれ程特異的かをさらに判定するため、子癇前症被験者および正常被験者が２群に分岐され、左の１つのボックスは４７６．７ｐｇ／ｍｌレラキシンより低い者を示し、右の１つのボックスは４７６．７ｐｇ／ｍｌレラキシンを超える者を示す。左に見ることができるように、４７６．７ｐｇ／ｍｌレラキシンより低いレラキシンレベルを有する者のうち、１３人が子癇前症を発症したのに対し、１人のみが正常妊娠であり、このテストを高度に特異的にするものである（より詳細な分析については実施例２参照）。
【００５１】
別の小さな試験は、オーストラリア出身のあまりよく明らかにされていない妊婦集団から得られた試料を用いて行われた。第２の試験では、２つの試料のみが５００ｐｇ／ｍｌ未満のレラキシンを含有し、これらの２つの試料のうち１試料のみが子癇前症被験者から得られた。これは、北米（例えば、ピッツバーグ、ＰＡ）出身の妊婦から、特定の在胎期間で採取された試料を用いて行われた第１のより大きな試験とは異なる。２つの試験間の起こり得る試料採取の違いに加えて、オーストラリアの試験集団が均質な白人集団であると推定されるのに対し、北米試験集団の被験者の３０％超がアフリカ系アメリカ人であった。したがって、好ましい実施形態では血液試料は、妊娠第１期中の妊婦から得られる。幾つかの実施形態では、妊婦は北米人である。これらの実施形態のサブセットでは、北米の被験者は合衆国および／またはカナダ出身である。さらなる実施形態では、試験被験者はアフリカ系である。
【００５２】
レラキシンの投与は子癇前症の発症を予防する
子癇前症は危険な状態であり、妊娠中、分娩中および分娩後最大６週の間のいつでも出現し得るが、子癇前症は最終期（第３期）に最も頻繁に生じ、ほとんどの場合妊娠２０〜３５週までは生じない。子癇前症は、徐々に発症、または極めて突然発症し得る（数時間で再燃することすらある）が、徴候および症状は数カ月間気づかれない場合がある。子癇前症が無症候性で、日常的な血圧チェックおよび／または尿検査中に突然出現し、赤ん坊は予定日が近い（３６週後）ならば、陣痛が誘発され、赤ん坊が出産され、および母親は注意深くモニターされる。子癇前症が妊娠早期に生じる場合、この影響はさらにより深刻である。管理下で母親の血圧を維持するため、例えば、安静、薬物療法およびさらには入院が指示される場合がある。可能な限り子宮で維持されるのが赤ん坊の一番の利益になる。不幸にも、子癇前症の唯一の治癒は赤ん坊の出産であり、予定日前に赤ん坊を出産するのが母親の一番の利益になり得る。医師は、ベータ遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、ヒドララジン、アルファメチルドーパ、クロニジン、および稀なケースでは、ラシックスまたは利尿剤（ウォーターピル）などの降圧剤を処方することができるが、後者は一般に勧められない。血圧が薬物療法および治療で管理することができない、ならびに母親および／または乳児の健康が危険な状態にあるならば、生存可能な赤ん坊が早産され得るように乳児の肺の成熟を助けるため、母親はステロイドを与えられる場合がある。
【００５３】
本開示は、子癇前症を発症する可能性を低下させる措置を講じることができるように、子癇前症になりやすい妊婦を特定する方法を提供する。本開示はさらに、約５００ｐｇ／ｍｌ未満のＨ２レラキシンレベルが、妊娠第１期中に得られた血液試料由来の血漿または血清で測定される場合、妊娠第１および／または第２期に妊婦にＨ２レラキシンを投与して子癇前症のリスクを低下または子癇前症を予防する方法を提供する。Ｈ２レラキシンは、低レラキシンレベル（例えば、５００ｐｇ／ｍｌより下）が検出され次第、妊婦に好ましくは予防的に投与される。しかし、子癇前症は、妊娠２０〜３５週まで発症しないことが多い。故に、レラキシンが症状の発症前の妊娠中後期に投与されるならば、これは、本格的な子癇前症の可能性の低下に依然として有益であり得る。
【００５４】
本開示の１つの実施形態では、レラキシンは合成ヒトレラキシンである。本開示の別の実施形態では、レラキシンは組換えヒトレラキシンである。本開示のさらなる別の実施形態では、レラキシンはレラキシンアゴニストまたはレラキシン模倣剤である。レラキシンが投与される場合、これは好ましくはＨ２レラキシンである。さらなる実施形態では、レラキシンは、Ｈ２レラキシンのＡもしくはＢ鎖およびＨ１またはＨ２レラキシンのＡもしくはＢ鎖を含むキメラレラキシンである。合成ヒトレラキシンおよびキメラは、ＣＢＬ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社（ボールダー、ＣＯ）から入手可能である。幾つかの実施形態では、レラキシンは、Ｃｏｍｐｕｇｅｎ社（テルアビブ、イスラエル）により製造されたものなどのＨ２レラキシンアゴニストである。他のあまり好ましくはない実施形態では、レラキシンはＨ１ヒトレラキシン、またはＨ３ヒトレラキシンである。レラキシンは、ひとたび欠乏が判定されると、１日あたり約１０μｇ／ｋｇから約１００μｇ／ｋｇ被験者体重の量で被験者に投与することができる。１つの好ましい実施形態では、レラキシンは、妊娠期間中または妊娠の一部の間中、１日あたり約３０μｇ／ｋｇ被験者体重の量で被験者に投与される。このように、レラキシンは、例えば、妊娠中を通じて約１０ｎｇ／ｍｌのレラキシン血清濃度を維持するように被験者に投与される。レラキシン医薬製剤は、皮下（ＳＱ）または他の経路により投与することができる。
【００５５】
妊娠ヒト女性にレラキシンを投与することの有益な効果は、血管新生および血管拡張の両方を刺激する受容体特異的薬剤として作用するレラキシンの直接的結果であると考えられる。血管新生を増加させることは、子癇前症の原因、すなわち最終的には母親における危険なほど高い血圧をもたらす母親から子どもへの不十分な血液供給を標的にする。血管拡張を増加させることはさらに、降圧および腎臓での腎血流の増加を助け、子癇前症の症状をさらに減少させる。故に、妊娠ヒト女性が、特定のレラキシン受容体（例えば、ＬＲＧ７、ＬＧＲ８、ＧＰＣＲ１３５、ＧＰＣＲ１４２受容体）を標的にする薬学的に活性なレラキシンまたは薬学的に有効なレラキシンアゴニストを有する医薬組成物を投与される場合、その結果は子癇前症の改善または予防である。
【００５６】
濃縮ヒト集団
早期検出の１つの利点は、該疾患によりなりやすい女性群を研究試験および／または臨床試験のため濃縮すること、および予防対策のテストを容易にすることである。本開示は、子癇前症および疾患進行および疾患との闘い方をより良く理解するための臨床および／または研究試験のため患者の濃縮集団を選択することを含む、新規のスクリーニングプロセスを可能にする。女性の濃縮集団は、低レラキシンレベルのテストにより定義することができ、科学的および／または臨床的に意義のある結果を得るためにはるかに少ない患者が必要とされる。妊娠第１または第２期中または子癇前症症状の出現前の妊婦が、血流中のレラキシンレベルを検査されてもよく、約５００ｐｇ／ｍｌ未満のレラキシンレベルを有する者が、濃縮患者集団に選択される。この有益な選択プロセスがなければ、新規の薬剤または作用物質が子癇前症に効果を有するかどうかを判定するのに、数百人の女性のスクリーニングを必要とするであろう。故に、本開示は、子癇前症を発症するより高い可能性を有する妊婦を濃縮集団から選択すること、および新規作用物質の有効性についてこれらの女性をテストすることを含む、臨床および／または研究試験中に子癇前症を治療または予防する新規作用物質のスクリーニング方法を提供する。濃縮集団には、約５００ｐｇ／ｍｌ未満である血流中レラキシンレベルを有する、妊娠第１および第２期中または子癇前症症状の出現前の女性が含まれる。
【００５７】
レラキシン組成物および製剤
レラキシン、レラキシンアゴニスト、レラキシン模倣剤および／またはレラキシン類似体は、本開示の方法で使用される医薬品として調製される。生物学的もしくは薬学的に活性なレラキシン（例えば、合成レラキシン、組換えレラキシン）またはレラキシンアゴニスト（例えば、レラキシン類似体またはレラキシン様モジュレーターまたはレラキシン模倣剤）のレラキシン受容体への結合に関連した生物学的反応を刺激することができる任意の組成物または化合物が、本開示で医薬品として使用され得る。調製および投与法に関する一般的詳細は、科学的文献に十分に記載されている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ、イーストン  Ｐａ．参照）。薬学的に活性なレラキシンを含有する医薬製剤は、医薬品の製造のための当技術分野で既知の任意の方法により調製することができる。本開示の方法で使用される薬学的に活性なレラキシンまたはレラキシンアゴニストを含有する製剤は、皮下（ＳＱ）、筋肉内、静脈内、舌下、局所、経口および吸入を含むがこれらに限定されない、任意の従来許容可能な方法で投与するために調製されてもよい。説明例が以下に記載される。１つの好ましい実施形態では、レラキシンは皮下（ＳＱ）投与される。
【００５８】
薬剤が皮下（ＳＱ）送達される場合、薬学的に活性なレラキシンまたは薬学的に有効なレラキシンアゴニストを含有する製剤は、滅菌注射水性または油性懸濁液などの滅菌注射製剤の形態であってもよい。例えば、レラキシンは、これが極めて溶けやすくおよび安定するｐＨ５．０、酢酸ナトリウムで希釈されてもよい。患者は、必要な限り持続注入によりレラキシン組成物で治療することができる。例えば、レラキシン注入ポンプは、皮下投与される針までカニューレを介してレラキシンを送達し、ポンプは患者の衣服の下のベルトに装着されてもよい。レラキシンは、患者が子癇前症の症状をモニターされている間、適時レラキシン注射により投与することもできる。用量は、患者ごとに調整することができる。
【００５９】
レラキシン懸濁液は、上述されたような適切な分散または湿潤剤および懸濁化剤を用いて既知の技術により調製することができる。滅菌注射製剤はまた、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液であってもよい。使用することができる許容可能なビヒクルおよび溶媒は、水、および等張食塩水のリンゲル液である。さらに、滅菌固定油は、溶媒または懸濁化媒質として従来通りに使用することができる。この目的のため、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の無菌固定油が使用され得る。さらに、オレイン酸などの脂肪酸も同様に、注射剤の調製において使用することができる。
【００６０】
本開示の水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適切な賦形剤との混合でレラキシンを含有する。このような賦形剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアカシアゴムなどの懸濁化剤、ならびに自然発生のホスファチド（例えば、レシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルとの縮合物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノ−オレエート）、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）などの分散剤または湿潤剤が含まれる。水性懸濁液はまた、ｐ−ヒドロキシ安息香酸塩エチルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸塩ｎ−プロピルなどの１つまたは複数の保存剤、１つまたは複数の着色剤、１つまたは複数の香味剤、およびスクロース、アスパルテームまたはサッカリンなどの１つまたは複数の甘味剤も含有してもよい。製剤は、オスモル濃度を調整することができる。
【００６１】
油性懸濁液は、植物油（ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはココナッツ油など）、または鉱油（流動パラフィンなど）にレラキシンを懸濁して調製することができる。油性懸濁剤は、増粘剤（ミツロウ、固形パラフィンまたはセチルアルコールなど）を含有することができる。甘味剤は、口当たりのよい経口製剤を提供するのに添加することができる。これらの製剤は、アスコルビン酸などの抗酸化剤の添加により保存することができる。
【００６２】
水の添加による水性懸濁液の調製に適切な本開示の分散性粉末および顆粒は、分散、懸濁化および／または湿潤剤、ならびに１つまたは複数の保存剤と混合してレラキシンから調製することができる。適切な分散または湿潤剤および懸濁化剤は、上に開示されたものにより例示されている。さらなる賦形剤、例えば甘味剤、香味剤および着色剤も存在していてもよい。
【００６３】
本開示の医薬製剤は、水中油型エマルションの形態であってもよい。油性相は、オリーブ油もしくはラッカセイ油などの植物油、流動パラフィンなどの鉱油、またはこれらの混合物であってもよい。適切な乳化剤には、自然発生のゴム（アカシアゴムおよびトラガカントゴムなど）、自然発生のホスファチド（ダイズ、レシチンなど）、脂肪酸およびヘキシトール無水物由来のエステルまたは部分エステル（ソルビタンモノ−オレエートなど）、ならびにこれらの部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物（ポリオキシエチレンソルビタンモノ−オレエートなど）が含まれる。エマルションはまた、甘味剤および香味剤も含有することができる。シロップ剤およびエリキシル剤は、グリセロール、ソルビトールまたはスクロースなどの甘味剤により調製することができる。このような製剤は、粘滑剤、保存剤、香味剤または着色剤も含有してもよい。
【００６４】
レラキシン製剤の投与および投与計画
本開示の方法で使用される薬学的に活性なＨ２レラキシンまたは薬学的に有効なＨ２レラキシンキメラ、アゴニスト、または模倣剤を含有する製剤は、皮下、筋肉内、静脈内、舌下、局所、経口および吸入を含むがこれらに限定されない、任意の従来許容可能な方法で投与することができる。投与は、薬剤の薬物動態および他の特性ならびに患者の健康状態により変わるであろう。一般的ガイドラインが以下に示されている。
【００６５】
本開示の方法は、妊婦における子癇前症の発症可能性を低下させる。これを達成するのに適切な、レラキシン単独または別の作用物質もしくは薬剤との併用での量は、治療的に有効な用量と考えられる。この使用に有効な投与スケジュールおよび量、すなわち、「投与計画」は、患者の健康の全身状態、患者の身体状態、妊娠の種類（例えば、単胎ｖｓ多胎妊娠）、年齢等を含む様々な要因により決まるであろう。患者の投与計画の計算では、投与方法も考慮される。投与計画は、薬物動態、すなわち、吸収速度、生物学的利用速度、代謝速度、クリアランス速度等も考慮しなければならない。これらの原則に基づき、レラキシンは、妊婦における子癇前症の発症を低下または予防するのに使用することができる。本開示はまた、レラキシンまたはレラキシンアゴニストもしくは模倣剤および、場合により、同時、単独または連続投与用の別の薬剤も提供する。例えば、本開示は、レラキシンおよび、場合により、必要に応じて療法で併用するための高血圧剤を提供する。別の例では、本開示はさらに、レラキシンおよび、場合により、併用療法での発作予防のためのＭｇＳＯ４を提供する。
【００６６】
本開示は、妊婦における子癇前症の発症を低下または予防する医薬品の製造におけるレラキシンの使用も提供する。このように、医薬品は妊娠中に投与するため調製される。本開示はさらに、レラキシンが妊婦に投与するため調製される、子癇前症の発症可能性を低下させる方法で使用するためのレラキシンまたはレラキシン類似体もしくは模倣剤を提供する。
【００６７】
技術水準は、臨床医が個々の妊婦ごとにレラキシンの投与計画を決定するのを可能にする。説明例として、レラキシンについて以下に提供されるガイドラインは、本開示の方法を実践する場合に投与される薬学的に活性なレラキシンを含有する製剤の投与計画、すなわち、投与スケジュールおよび投与レベルを決定するための指針として使用することができる。一般的ガイドラインとして、薬学的に活性なＨ１、Ｈ２および／またはＨ３ヒトレラキシン（例えば、合成、組換え、類似体、アゴニスト、模倣剤等）の日用量は、典型的には１日あたり約１０から約１００μｇ／ｋｇ被験者体重の範囲での量であることが予期される。妊娠ヒト女性に投与することができる。１つの好ましい実施形態では、レラキシンの用量は、妊娠期間中約３０μｇ／ｋｇ／日である。別の実施形態では、これらの用量は、例えば、約１０ｎｇ／ｍｌのレラキシン血清濃度をもたらす。１つの好ましい実施形態では、薬学的に有効なレラキシンまたはこのアゴニストは、妊娠期間中または妊娠の一部の間中、約３０μｇ／ｋｇ／日で投与される。別の実施形態では、レラキシンの投与は、約０．５から約３００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．５から約１００ｎｇ／ｍｌ、および最も好ましくは約０．５から約１０ｎｇ／ｍｌのレラキシンの血清濃度を維持するように継続される。最も好ましくは、レラキシンの投与は、妊娠期間中１０ｎｇ／ｍｌ以上のレラキシンの血清濃度を維持するように継続される。これらのレラキシン濃度は、子癇前症の発症可能性を低下させることができ、これにより、高血圧症（hypertension）、高血圧（high blood pressure）、タンパク尿、腎不全および死亡などの母親における症状を減少させることができる。さらに、これらのレラキシン濃度は、乳児における低出生体重の可能性および関連リスクおよび乳児の死亡を低下または予防することができる。被験者に応じて、レラキシン投与は、妊娠している母親および子どもでの安定性を達成するのに特定の期間または必要とされる限り維持される。例えば、レラキシンは、妊娠の終了まで連続注入により投与することができる。これは、注入ポンプまたは他の手段により達成することができる。あるいは、レラキシンは、必要に応じて第１および／または第２期中のみ投与されてもよい。
【００６８】
レラキシン特異的およびＣＲＰ特異的抗体
レラキシンおよび／またはＣＲＰのエピトープを特異的に認識できる抗体の産生方法が、本明細書に記載されている。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより生成されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および上記いずれかのエピトープ結合フラグメントが含まれ得るが、これらに限定されない。レラキシンおよび／またはＣＲＰに対する抗体の産生のため、様々な宿主動物を、レラキシンタンパク質もしくはＣＲＰタンパク質、またどちらか一方の部分を注射して免疫化することができる。このような宿主動物には、ウサギ、マウス、およびラットが含まれ得るが、これらに限定されない。フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール（pluronic polyol）、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメットゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）などの潜在的に有用なヒトアジュバントを含むがこれらに限定されない、様々なアジュバントを、宿主種に応じて、免疫学的反応を増加するのに使用することができる。
【００６９】
ポリクローナル抗体は、レラキシンもしくはＣＲＰ、またはレラキシンもしくはＣＲＰの抗原性機能誘導体などの抗原で免疫化された動物の血清由来抗体分子の異種集団である。ポリクローナル抗体の産生のため、上述されたもののような宿主動物を、レラキシンまたはＣＲＰを注射して免疫化することができる。免疫化された動物における抗体価は、固定化ポリペプチドを用いた酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるなど、標準的手法により経時的にモニターすることができる。所望であれば、抗体分子は、動物から（例えば、血液から）単離され得、さらにタンパク質Ａクロマトグラフィーなどのよく知られた手法により精製されてＩｇＧ画分を得られ得る。レラキシンまたはＣＲＰなど特定の抗原に対する抗体の均質集団であるモノクローナル抗体は、培養における連続細胞系（当技術分野でよく知られている）による抗体分子の産生を提供する任意の手法により得ることができる。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびこれらのいずれかのサブクラスを含む、いずれかのイムノグロブリンクラスであってもよい。本開示のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養することができる。
【００７０】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製する代わりに、レラキシンおよび／またはＣＲＰに対するモノクローナル抗体を、レラキシン、ＣＲＰまたはこれらの誘導体で組換えコンビナトリアルイムノグロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングして同定および単離することができる。ファージディスプレイライブラリーを生成およびスクリーニングするためのキットが市販されている。さらに、標準的組換えＤＮＡ法を用いて作製することができる、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗体は、本開示の範囲内である。キメラ抗体は、ネズミｍＡｂ由来の可変領域およびヒトイムノグロブリン定常領域を有するもの（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号および４，８１６，３９７号）など、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つまたは複数の相補的決定領域（ＣＤＲ）およびヒトイムノグロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する非ヒト種由来の抗体分子である（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号）。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野で既知の組換えＤＮＡ法により生成することができる。
【００７１】
本明細書に記載の抗体は、妊婦が、対応する健康な妊婦よりも子癇前症を発症するリスクが高いかどうかを判定するため、妊婦の血液がレラキシンレベルについてテストされる任意のアッセイにおいて使用することができる。血液中のレラキシンレベルが約５００ｐｇ／ｍｌを下回るならば、女性は子癇前症を発症するリスクがより高く、妊娠の全期間または一部の期間に注意深くモニターされ、かつ／またはレラキシンで治療される必要がある。場合により、妊婦の血液は、より感度の高いアッセイを達成するためＣＲＰレベルをさらにテストされてもよい。血液中のＣＲＰレベルが１．５ｍｃｇ／ｍｌより低いまたは１３．５ｍｃｇ／ｍｌを超えるならば、女性はさらにより子癇前症を発症する可能性がある。ＥＬＩＳＡ、バイオアッセイ、免疫アッセイ等を含む、血液中のレラキシンおよび／またはＣＲＰレベルの正確な判定を可能にする任意のアッセイが、本明細書で使用され得る。市販のキットも使用され得る。
【００７２】
実験
以下の略語が本明細書で使用される：ｍｃｇまたはμｇ（マイクログラム）、ｍｌ（ミリリットル）、ｐｇ（ピコグラム）、ＢＭＩ（体格指数）、ＣＡＲＴ（分類および回帰木）、ＣＩ（信頼区間）、ＣＲＥＡＴ（クレアチニン）、ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＨＰ（高血圧症、タンパク尿）、ＨＰＵ（高血圧症、タンパク尿、尿酸）、ＨＵ（高血圧症、尿酸）、ＲｌｘまたはＲＬＸ（レラキシン）。
【００７３】
以下の特定の例は、本開示を例示することを意図するものであり、特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００７４】
子癇前症妊婦の試験
卵巣の黄体から放出されるペプチドホルモンであるレラキシンは、妊娠中の強力な血管拡張剤である。血清Ｈ２濃度は第１期中に上昇し、第２期早期にピークに達し、著しい母体腎臓および全身血管拡張と一致する。対照的に、不十分な血管拡張の適応および全身性血管抵抗性の増加が、子癇前症の顕著な特徴である。この例は、妊娠中の血清レラキシンの測定、および第１期中の血清レラキシンの低下と子癇前症の発症リスクの増加との関連の判定を示す。
【００７５】
１３週間未満の妊娠女性６２人のコホート内症例対照試験を行った。６２人の試験被験者のうち、３７人の女性が、２０週間の妊娠後の高血圧症およびタンパク尿の新規発症により定義されているような子癇前症を発症した。残りの被験者は正常血圧であり、および合併症のない妊娠であった。Ｈ２レラキシンはＥＬＩＳＡにより測定した（ただし、バイオアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ等などの他のアッセイもこの目的に適切である）。ロジスティック回帰を含む記述統計をデータ分析に使用した。
【００７６】
具体的には、血清中のヒトレラキシン２の濃度は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ミネアポリス、ＭＮ）を用いて免疫アッセイにより測定した。この免疫アッセイで使用したＨ２レラキシン特異的モノクローナル抗体は、３Ｆ２．Ｆ２ハイブリドーマにより産生されたマウスＩｇＧ１であった。３Ｆ２．Ｆ２ハイブリドーマは、ＢＡＳ  Ｍｅｄｉｃａｌ社、現Ｃｏｒｔｈｅｒａ  Ｉｎｃ．社（サンマテオ、ＣＡ）により開発され、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、マナサス、ＶＡ）特許寄託指定（Patent Deposit Designation）ＰＴＡ−８４２３としてブタペスト条約下で寄託された。３Ｆ２．Ｆ２抗体を使用するＨ２レラキシンＥＬＩＳＡは、十分に妥当性を確認した。有意な交差反応性または干渉は、組換えヒトＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インスリン（アミノ酸２５〜１００）、インスリン様３、レラキシン１（Ｈ１）およびレラキシン３（Ｈ３）とは観察されなかった。さらに、有意な交差反応性または干渉は、組換えイヌ、ブタまたはげっ歯類（マウスおよびラット）レラキシン−２とは観察されなかった。
【００７７】
血清レラキシン濃度は、子癇前症女性と対照間の有意差はなかった（中央値および四分位範囲、６７０．４［４５６．９〜１１１７．２］ｖｓ．８０２．３［５７０．８〜９６６．４］ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝０．４７）。しかし、下位四分位に近いカットオフである４７７ｐｇ／ｍｌ未満のレラキシン濃度を有する女性は、子癇前症を発症するオッズ比が６．２であった（９５％ＣＩ  １．３〜３０．７、ｐ＝０．０２５）。試料採取時点での妊娠期間、体格指数（ＢＭＩ）、人種、および喫煙状態を調整後、これらの女性が子癇前症を発症する可能性は７．４倍高く（９５％ＣＩ  １．４〜３８．９、ｐ＝０．０２）、驚くほど高かった。この強い関連は、新規発症の高血圧症、タンパク尿、および高尿酸血症を有する女性サブグループ（有害転帰率がより高いより均質な子癇前症サブセット）で持続した（調整ＯＲ  ６．９、９５％  ＣＩ  １．２〜４０、ｐ＝０．０３）。
【００７８】
この試験は、低血清レラキシン濃度が子癇前症の独立したリスク因子であることを示している。妊娠早期のレラキシンの欠乏に続発する不十分な血管拡張の適応が、子癇前症の病因にさらに寄与する可能性がある。
【実施例２】
【００７９】
子癇前症予測の統計分析
ＣＡＲＴ（分類および回帰木）を用いて、表２に示した特徴を有する６９人の妊婦から得られたデータを分析した。この拡大分析は、実施例１の最初の試験被験者、および数人の追加被験者から得られたデータに基づく。子癇前症予測に使用したパラメータは、最初はＨ２レラキシンレベルであり、次いでＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベルも使用した。図１に見ることができるように、妊娠中の在胎期間は、３つの期間、すなわち、０〜１５週（第１期）、１５〜２５週（第２期）、および２５〜３５週（第３期）に分けられた。図１は、子癇前症女性（ＨＰＵおよびＨＰ群）における血清レラキシン濃度を在胎年齢に関して示す。線は同じ被験者由来の試料を結ぶ。三角形は、子癇前症を後期に発症し、最初の１５週に内因性Ｈ２レラキシンレベルが５００ｐｇ／ｍｌより低かった妊婦由来の試料を表す。四角形は、子癇前症を後期に発症し、および内因性Ｈ２レラキシンレベルが約５００ｐｇ／ｍｌであった妊婦由来の試料を表す。菱形は、子癇前症を発症しなかった妊婦由来の試料を表す。これらの女性で、最初の１５週に５００ｐｇ／ｍｌより低いＨ２レラキシン濃度であった者はほとんどいなかったことに注意すべきである。
【００８０】
【表２】
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【００８１】
ＣＡＲＴ分析では、最初の１５週の被験者由来の全試料を平均化した。これは、被験者ごとに妊娠中の異なる時点で採取した試料数が異なったためである。図３の分類木を参照すると、分岐数は１であり、終端ノード数は２であった。より具体的には、最上部のボックスは、４７６．７ｐｇ／ｍｌより低い天然Ｈ２レラキシンレベルを有する３５人の子癇前症被験者（点線参照）、および４７６．７ｐｇ／ｍｌを超える天然レラキシンレベルを有する２４人の正常被験者（実線参照）がいたことを示す。レラキシンテストの特異度をさらに判定するため、子癇前症被験者および正常被験者を２群に分岐させ、左のボックス２は４７６．７ｐｇ／ｍｌ以下の血清Ｈ２レラキシンを有するような被験者示し、右のボックス３は４７６．７ｐｇ／ｍｌを超える血清Ｈ２レラキシンを有するような被験者を示す。左のボックス２に見ることができるように、４７６．７ｐｇ／ｍｌレラキシン以下のＨ２レラキシンレベルを有する者のうち、１３人が子癇前症を発症したのに対し、１人のみが正常妊娠であり、このテストを高度に特異的にするものである。右のボックス３に見ることができるように、４７６．７ｐｇ／ｍｌを超えるＨ２レラキシンレベルを有する者のうち、２３人が正常妊娠であり、２２人が子癇前症を発症した。右のボックス２に示された結果は、テストの感度を増加させるための第２パラメータの組み入れを促した。
【００８２】
図４は、図３と同じ分類木、その上Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベルに基づくさらなる分岐を示す。４７６．７を超えるＨ２レラキシンレベルを有する被験者を、１３．４８１ｍｃｇ／ｍｌ以下のＣＲＰレベルを有する者、および１３．４８１ｍｃｇ／ｍｌを超えるＣＲＰレベルを有する者に分岐させた。著しいことに、１３．８１ｍｃｇ／ｍｌを超えるＣＲＰレベルを有するような女性は、子癇前症を発症する可能性が極めて高く、これは、子癇前症を発症した９人の妊婦および正常妊娠をした１人の妊婦を表すボックス５に示されている。ボックス４を、１．４６８１ｍｃｇ／ｍｌ以下のＣＲＰレベルを有する者、および１．４６８１ｍｃｇ／ｍｌを超えるＣＲＰレベルを有する者にさらに分岐させた。ボックス６に見ることができるように、７人が子癇前症を発症したのに対し、１人のみが正常妊娠であり、このテストをより高感度にするものである。ＣＲＰ測定を使用することにより、テストの感度は８３％まで増加した。
【００８３】
図５は、高血圧妊娠（ＨＰ、ＨＰＵおよびＨＵ被験者、表１および２も参照）の分類木を示す。被験者を、妊娠早期の血清Ｈ２レラキシンおよびＣＲＰ濃度に基づき４群に分岐させた。これらの２つの測定の使用により、極めて良好な感度レベルが得られた。事実、レラキシンおよびＣＲＰ測定の両方を使用すると、特異度は６３％、感度は９６％であった。
【００８４】
図６は、高血圧妊娠の別の分類木を示す（すなわち、ＨＰ、ＨＰＵおよびＨＵを含む４８人の高血圧女性および２５人の正常女性）。被験者を、図５のように血清Ｈ２レラキシンおよびＣＲＰレベル、ならびに予測をさらに洗練させるためのクレアチニンレベルに基づき分岐させた。これらの３つの分析物により、高血圧症を後に発症する妊娠を予測するための極めて高感度および特異的なアルゴリズムを開発した。レラキシン、ＣＲＰ、およびクレアチニン（ＣＲＥＡＴ）により、特異度は９２％、感度は８７％であった。これらの女性は子癇前症ではなく高血圧妊娠の候補にすぎないため、Ｈ２レラキシンおよびＣＲＰに加えてＣＲＥＡＴを用いて高血圧症の可能性を判定した。
【実施例３】
【００８５】
妊婦における子癇前症の予測
妊婦由来の血清試料は妊娠早期に採取する。血清Ｈ２レラキシン濃度およびＣＲＰ濃度はＥＬＩＳＡにより判定する。図３に示されたようなアルゴリズムを用いて、子癇前症を発症する可能性を判定する。例えば血清Ｈ２レラキシンレベルが３００ｐｇ／ｍｌならば、患者は子癇前症のほぼ確実な発症を予防するための治療を受ける。血清レラキシンレベルが６００ｐｇ／ｍｌならば、ＣＲＰレベルも検査される。ＣＲＰレベルが１．５ｍｃｇ／ｍｌより高くおよび１３．５ｍｃｇ／ｍｌ未満ならば、妊娠は正常妊娠と見なされる。しかし、妊娠被験者のＣＲＰレベルがこの範囲外であるならば、妊娠被験者は子癇前症を発症するリスクが高い。
【００８６】
本開示の様々な修正および変形形態は、本開示の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者に明らかであろう。本開示は特定の好ましい実施形態との関係で記載されているが、請求されたような本開示がこのような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないことが理解されるべきである。実際、当業者により理解される、本開示を実施するための記載された方法の様々な修正は、特許請求の範囲内であることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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