(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料を血球溶解物又は昆虫の体液由来成分に接触させて液体試料中の微生物夾雑物と血球溶解物又は昆虫の体液由来成分とを反応させ、液体試料中における微生物夾雑物の存在又は量を決定するためのマイクロ流体デバイスであって、
前記マイクロ流体デバイスは基板であり、
前記基板に形成された、試料導入口と、光学セルと、前記試料導入口と前記光学セルを連通するマイクロ流路とを備え、
前記マイクロ流路の断面形状は、縦横比１：４から４：１の略四角形であり、断面積が１ｍｍ2以下であり、
試料導入口から導入された液体試料は、マイクロ流路を通って光学セルへ到達可能であり、
マイクロ流路内には、血球溶解物又は昆虫の体液由来成分を少なくとも含有する血球溶解物等含有試薬が配置され、
マイクロ流路内又は光学セル内には、所定の基質と反応して生物発光又は化学発光を発生させる発光用試薬が配置され、
試料導入口から導入された液体試料がマイクロ流路を通って光学セルに到達する際に、液体試料が前記血球溶解物等含有試薬と前記発光用試薬に接触してこれらを溶解し、当該溶解物が発する生物発光又は化学発光を前記光学セルにて検出可能であることを特徴とするマイクロ流体デバイス。
【請求項２】
血球溶解物等含有試薬の下流側に発光用試薬が配置されていることを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３】
発光用試薬は、光学セル内に配置されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項４】
マイクロ流路内の第一領域に、血球溶解物等含有試薬が配置され、
マイクロ流路内であって第一領域の下流側にある第二領域に、発光基質を遊離する発光合成基質が配置され、
マイクロ流路内であって第二領域の下流側にある第三領域又は光学セル内に、発光用試薬が配置され、
発光用試薬には前記発光基質と反応する発光酵素が含まれていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項５】
血球溶解物等含有試薬には発光基質を遊離する発光合成基質が混合されており、発光用試薬には前記発光基質と反応する発光酵素が含まれていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項６】
発光合成基質はルシフェリン又はその誘導体を遊離可能なものであり、発光酵素はルシフェラーゼであることを特徴とする請求項４又は５に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項７】
微生物夾雑物は、エンドトキシン、βグルカン、又はペプチドグリカンであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項８】
血球溶解物は、カブトガニの血球抽出成分であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項９】
昆虫の体液由来成分は、カイコの体液抽出成分であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１０】
マイクロ流路には、導入された液体試料の攪拌を補助する攪拌補助手段が設けられていることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１１】
攪拌補助手段は、流路の屈折、流路の分岐及び合流、流路断面積の変化、流路内面の粗面化、及び障害物の設置からなる群より選ばれた少なくとも１つであることを特徴とする請求項１０に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１２】
平板状であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１３】
マイクロ流路には、マイクロ流路内を液体試料が移動するための駆動源が接続される駆動源接続口が設けられていることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１４】
気体供給手段をさらに備え、駆動源接続口からマイクロ流路に気体を供給可能であることを特徴とする請求項１３に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１５】
駆動源接続口を複数備え、複数の箇所からマイクロ流路に気体を供給可能であることを特徴とする請求項１４に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１６】
気体供給手段は、光応答性ガス発生材からなることを特徴とする請求項１４又は１５に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１７】
光応答性ガス発生材はフィルム状又はテープ状であり、駆動源接続口に貼付されていることを特徴とする請求項１６に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかに記載のマイクロ流体デバイスと、発光検出器を備えたことを特徴とする微生物夾雑物検出システム。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれかに記載のマイクロ流体デバイスを用いて液体試料中の微生物夾雑物の存在又は量を決定することを特徴とする微生物夾雑物の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体デバイス、微生物夾雑物検出システム、並びに、微生物夾雑物の検出方法に関し、さらに詳細には、生物発光又は化学発光を利用して液体試料中の微生物夾雑物の存在又は量を決定するためのマイクロ流体デバイス、当該マイクロ流体デバイスを備えた微生物夾雑物検出システム、並びに、当該マイクロ流体デバイスを用いた微生物夾雑物の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物汚染（例えば、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、酵母、真菌、および糸状菌）は、重篤な疾患の原因となり得るものであり、場合によっては人を死に至らしめることもある。そのため、製薬産業、医療デバイス産業、および食品産業における製造業者は、厳しい基準を満たすために、各製品が基準を超える微生物夾雑物を含まないことを確認しなければならない。これらの産業では、特定の基準、例えば、日本では日本薬局方によって課される基準、米国では米国食品医薬品局（ＵＳＦＤＡ）又は環境保護局によって課される基準を満たす必要があり、微生物夾雑物の存在に関して、高感度かつ高精度な試験が求められる。例えば、ＵＳＦＤＡは、医薬品および侵襲性医療デバイスの特定の製造業者に、自社製品が、検出可能なレベルのグラム陰性細菌のエンドトキシン（リポ多糖）を含まないことを確証するように求めている。
【０００３】
エンドトキシンの測定方法として、カブトガニの血球細胞抽出物（ＬＡＬ）を用いたリムルス試験が広く行われている。リムルス試験には、ゲル化反応（凝固反応）を利用したゲル化法と比濁法、および合成発色基質を用いる発色法（比色法）が知られている。
【０００４】
リムルス試験におけるゲル化は、以下のカスケード反応により起こる。まず、エンドトキシンとＬＡＬとが接触すると、ＬＡＬ中のファクターＣが活性化される。活性化されたファクターＣはＬＡＬ中のファクターＢを活性化し、さらに活性化されたファクターＢはＬＡＬ中の凝固酵素（Clotting enzyme）を活性化する。そして、活性化された凝固酵素によってコアグローゲン（Coagulogen）がコアグリン（Coagulin）に変換され、コアグリンが重合してゲルを形成する。前記したゲル化法と比濁法は、本カスケード反応によるゲル形成がエンドトキシン濃度に依存することに基づいている。
一方、発色法では、凝固酵素の基質として発色合成基質を用いる。例えば、発色合成ペプチド基質を用い、遊離した発色物質の量を吸光度により測定する。
【０００５】
特許文献１には、ＬＡＬ試薬と合成発色基質を組み合わせた発色法を構成する試薬を内蔵したカートリッジが開示されている。このカートリッジを用いることで、その場でエンドトキシン測定結果を得る「ポイント・オブ・ケア検査」を実現することが可能とされている。しかしながら、この技術は発色法に基づくため、高感度測定には不向きである。
【０００６】
一方、合成発色基質の代わりに、ルシフェリンが結合した合成基質及びルシフェラーゼによる生物発光を組み合わせて高感度化を図る技術が提案されている（特許文献２）。しかしながら、この技術では、高感度測定は可能になるものの、試料とＬＡＬ試薬の混合工程、合成基質の添加工程、発光試薬の添加工程の各工程が求められ、少なくとも２〜３回のピペット操作が必要である。そのため、反応液への外部のエンドトキシンの混入が起こるおそれがあり、高感度測定には不向きであると共に、操作も煩雑である。
【０００７】
なお、ＬＡＬ中の凝固酵素の活性化は、βグルカンとＬＡＬとが接触することによっても起こる。これは、ＬＡＬ中のファクターＧがβグルカンによって活性化されることによるものである。すなわち、活性化されたファクターＧが凝固酵素を活性化する。
【０００８】
またβグルカンとペプチドグリカンの検出技術として、ＳＬＰ法が知られている。ＳＬＰ法は、カイコの体液抽出成分に含まれるフェノール酸化酵素がβグルカンあるいはペプチドグリカンにより活性化される現象を利用したものである。
【０００９】
また一方、微量の液体試料を取り扱うためのマイクロ流体デバイスが開発されている。例えば、手で容易に取り扱い得る大きさの基板内に、液体試料等を搬送するためのマイクロ流路が形成され、必要に応じて、試料の導入部、試薬類の保持部、反応室等が設けられたマイクロ流体デバイスが知られている（特許文献３）。さらに、マイクロ流体デバイスのマイクロ流路（微細流路）等に微量の流体を送るための駆動源となるマイクロポンプが知られている。例えば、光照射により気体を発生する光応答性ガス発生材料を利用したマイクロポンプが知られている（特許文献４）。ここでマイクロポンプとは、マイクロ流路等に微量の流体を送るための駆動源であり、マイクロ流体デバイスに実装できる小さなポンプを指す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２００７−５０１０２０号公報
【特許文献２】国際公開第２００９／０６３８４０号
【特許文献３】特許第４１７７８８４号公報
【特許文献４】国際公開第２００９／１１３５６６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
以上のように、エンドトキシン、βグルカン、ペプチドグリカン等の微生物夾雑物の検出において、高感度でかつ簡便・迅速な測定技術が求められている。このような現状に鑑み、本発明は、エンドトキシン測定等の微生物夾雑物の検出をより高感度でかつ簡便・迅速に行うことができる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、液体試料を血球溶解物又は昆虫の体液由来成分に接触させて液体試料中の微生物夾雑物と血球溶解物又は昆虫の体液由来成分とを反応させ、液体試料中における微生物夾雑物の存在又は量を決定するためのマイクロ流体デバイスであって、前記マイクロ流体デバイスは基板であり、前記基板に形成された、試料導入口と、光学セルと、前記試料導入口と前記光学セルを連通するマイクロ流路とを備え、前記マイクロ流路の断面形状は、縦横比１：４から４：１の略四角形であり、断面積が１ｍｍ2以下であり、試料導入口から導入された液体試料は、マイクロ流路を通って光学セルへ到達可能であり、マイクロ流路内には、血球溶解物又は昆虫の体液由来成分を少なくとも含有する血球溶解物等含有試薬が配置され、マイクロ流路内又は光学セル内には、所定の基質と反応して生物発光又は化学発光を発生させる発光用試薬が配置され、試料導入口から導入された液体試料がマイクロ流路を通って光学セルに到達する際に、液体試料が前記血球溶解物等含有試薬と前記発光用試薬に接触してこれらを溶解し、当該溶解物が発する生物発光又は化学発光を前記光学セルにて検出可能であることを特徴とするマイクロ流体デバイスである。
【００１３】
本発明は液体試料中における微生物夾雑物の存在又は量を決定するためのマイクロ流体デバイスに関するものである。本発明のマイクロ流体デバイスは、試料導入口と、光学セルと、試料導入口と光学セルを連通するマイクロ流路とを備えている。また、マイクロ流路内には、血球溶解物又は昆虫の体液由来成分（以下、「血球溶解物等」と称することがある。）を少なくとも含有する「血球溶解物等含有試薬」が配置され、マイクロ流路内又は光学セル内には、所定の基質と反応して生物発光又は化学発光を発生させる「発光用試薬」が配置されている。試料導入口から導入された液体試料がマイクロ流路を通って光学セルに到達する際に、液体試料が血球溶解物等含有試薬と発光用試薬に接触してこれらの試薬を溶解し、当該溶解物が発する生物発光又は化学発光を光学セルにて検出可能である。本発明のマイクロ流体デバイスによれば、エンドトキシン等の微生物夾雑物の検出を簡便かつ迅速に行うことができる。さらに、本発明のマイクロ流体デバイスによれば、生物発光又は化学発光を利用することができるので、微生物夾雑物の検出を高感度で行える。
【００１４】
血球溶解物等含有試薬と発光用試薬は、マイクロ流路内の同一の場所に配置されてもよく、異なる場所に配置されてもよい。同一の場所に配置する場合には、両試薬を混合した状態で配置することもできる。
【００１５】
「マイクロ流路」とは、流路を流れる液体に所謂マイクロ効果が発現する形状寸法に形成されている微細な流路をいう。具体的には、流路を流れる液体が、表面張力と毛細管現象との影響を強く受け、通常の寸法の流路を流れる液体とは異なる挙動を示す形状寸法に形成されている微細な流路である。マイクロ流路の内径は、一般に０．０２μｍ〜２ｍｍ程度である。
「マイクロ流体デバイス」とは、マイクロ流路を有するデバイスをいう。デバイスの例としては、基板が挙げられる。
【００１６】
「血球溶解物」と「昆虫の体液由来成分」には、本来の生物由来のものの他に、化学合成や遺伝子組換え技術により作製された、血球溶解物あるいは昆虫の体液由来成分の「同等物」も含まれる。
【００１７】
血球溶解物等含有試薬の下流側に発光用試薬が配置されている構成が好ましい（請求項２）。
【００１８】
請求項３に記載の発明は、発光用試薬は、光学セル内に配置されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のマイクロ流体デバイスである。
【００１９】
かかる構成により、発光寿命が短い場合であっても、高感度かつ正確に生物発光を検出できる。
【００２０】
マイクロ流路内の第一領域に、血球溶解物等含有試薬が配置され、マイクロ流路内であって第一領域の下流側にある第二領域に、発光基質を遊離する発光合成基質が配置され、マイクロ流路内であって第二領域の下流側にある第三領域又は光学セル内に、発光用試薬が配置され、発光用試薬には前記発光基質と反応する発光酵素が含まれていてもよい（請求項４）。
【００２１】
血球溶解物等含有試薬には発光基質を遊離する発光合成基質が混合されており、発光用試薬には前記発光基質と反応する発光酵素が含まれていてもよい（請求項５）。
【００２２】
発光合成基質はルシフェリン又はその誘導体を遊離可能なものであり、発光酵素はルシフェラーゼである構成が好ましい（請求項６）。ここで「ルシフェリンの誘導体」とは、ルシフェリンと同様に、ルシフェラーゼと反応することにより生物発光を発するルシフェリンと構造類似の化合物をいう。
【００２３】
微生物夾雑物は、エンドトキシン、βグルカン、又はペプチドグリカンである構成が好ましい（請求項７）。
【００２４】
血球溶解物は、カブトガニの血球抽出成分である構成が好ましい（請求項８）。
【００２５】
昆虫の体液由来成分は、カイコの体液抽出成分である構成が好ましい（請求項９）。
【００２６】
請求項１０に記載の発明は、マイクロ流路には、導入された液体試料の攪拌を補助する攪拌補助手段が設けられていることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のマイクロ流体デバイスである。
【００２７】
かかる構成により、血球溶解物等含有試薬と発光用試薬を、液体試料に対して効率的に溶解させることができる。
【００２８】
攪拌補助手段は、流路の折り曲げ、流路の分岐及び合流、流路断面積の変化、流路内面の粗面化、及び障害物の設置からなる群より選ばれた少なくとも１つであることが好ましい（請求項１１）。
【００２９】
本発明のマイクロ流体デバイスは、平板状であってもよい（請求項１２）。
【００３０】
請求項１３に記載の発明は、マイクロ流路には、マイクロ流路内を液体試料が移動するための駆動源が接続される駆動源接続口が設けられていることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載のマイクロ流体デバイスである。
【００３１】
本発明のマイクロ流体デバイスは、マイクロ流路内を液体試料が移動するための駆動源が接続される駆動源接続口を有している。例えば、駆動源接続口にポンプ等を接続して加圧あるいは吸引することにより、液体試料をマイクロ流路内で自由に移動させることができる。なお、駆動源接続口の設置位置は特に限定はなく、マイクロ流路の上流側末端、下流側末端、途中位置のいずれでもよい。駆動源接続口の数は、１個でもよいし、複数個でもよい。
【００３２】
請求項１４に記載の発明は、気体供給手段をさらに備え、駆動源接続口からマイクロ流路に気体を供給可能であることを特徴とする請求項１３に記載のマイクロ流体デバイスである。
【００３３】
本発明のマイクロ流体デバイスは、気体供給手段をさらに備えている。そのため、気体供給手段から供給される気体による圧力を、液体試料がマイクロ流路を移動する際の推進力として利用することができる。気体の発生・供給方法については特に限定はなく、例えば、ポンプ、シリンジ、ピペット、光応答性ガス発生材等を用いて行うことができる。
【００３４】
請求項１５に記載の発明は、駆動源接続口を複数備え、複数の箇所からマイクロ流路に気体を供給可能であることを特徴とする請求項１４に記載のマイクロ流体デバイスである。
【００３５】
かかる構成により、マイクロ流路内における液体試料の移動をより細かく制御できる。例えば、移動方向（上流側から下流側、下流側から上流側）を変えることも容易となる。
【００３６】
請求項１６に記載の発明は、気体供給手段は、光応答性ガス発生材からなることを特徴とする請求項１４又は１５に記載のマイクロ流体デバイスである。
【００３７】
本発明のマイクロ流体デバイスでは、気体供給手段が光応答性ガス発生材からなるので、光を照射するだけで気体を発生させることができる。そのため、操作がさらに簡単である。
【００３８】
光応答性ガス発生材はフィルム状又はテープ状であり、駆動源接続口に貼付されている構成が好ましい（請求項１７）。
【００３９】
請求項１８に記載の発明は、請求項１〜１７のいずれかに記載のマイクロ流体デバイスと、発光検出器を備えたことを特徴とする微生物夾雑物検出システムである。
【００４０】
本発明は微生物夾雑物検出システムに係るものであり、本発明のマイクロ流体デバイスと、発光検出器を備えている。本発明は微生物夾雑物検出システムによれば、液体試料中の微生物夾雑物を、より簡便かつ迅速に検出することができる。
【００４１】
請求項１９に記載の発明は、請求項１〜１７のいずれかに記載のマイクロ流体デバイスを用いて液体試料中の微生物夾雑物の存在又は量を決定することを特徴とする微生物夾雑物の検出方法である。
【００４２】
本発明は微生物夾雑物の検出方法に係るものであり、上記した本発明のマイクロ流体デバイスを用いるものである。本発明によれば、液体試料中の微生物夾雑物を、正確かつ簡便・迅速に検出することができる。
【発明の効果】
【００４３】
本発明のマイクロ流体デバイスによれば、エンドトキシン、βグルカン、ペプチドグリカン等の微生物夾雑物を高精度かつ簡便・迅速に検出することができる。
【００４４】
本発明の微生物夾雑物検出システムについても同様であり、エンドトキシン、βグルカン、ペプチドグリカン等の微生物夾雑物を高精度かつ簡便・迅速に検出することができる。
【００４５】
本発明の微生物夾雑物の検出方法についても同様であり、エンドトキシン、βグルカン、ペプチドグリカン等の微生物夾雑物を高精度かつ簡便・迅速に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の第一実施形態に係るマイクロ流体デバイスを表す正面図である。
【図２】図１のマイクロ流体デバイスの分解斜視図である。
【図３】基板本体の正面図である。
【図４】図１のＡ−Ａ断面図である。
【図５】（ａ）は全体流路の内部構造を表す断面斜視図、（ｂ）は（ａ）の流路部分のみを模式的に表す斜視図である。
【図６】光応答性ガス発生フィルムの積層構造を表す断面図である。
【図７】試料移動流路の断面形状を表す説明図である。
【図８】（ａ）〜（ｄ）はマイクロ流体デバイスの使用方法を説明する説明図である。
【図９】（ｅ）〜（ｈ）はマイクロ流体デバイスの使用方法を説明する説明図である。
【図１０】マイクロ流体デバイスと光照射装置を表す斜視図である。
【図１１】マイクロ流体デバイスと発光検出器を表す斜視図である。
【図１２】本発明の第二実施形態に係るマイクロ流体デバイスを表し、（ａ）はマイクロ流体デバイスの正面図、（ｂ）は基板本体の正面図、（ｃ）は（ａ）のＢ−Ｂ断面図である。
【図１３】本発明の第三実施形態に係るマイクロ流体デバイスの全体流路を表す正面図である。
【図１４】複数の気体導入口を設けた実施形態を表す模式図である。
【図１５】液溜部の構成を表す概略図である。
【図１６】試料移動流路に屈折路を設けた例を表す模式図である。
【図１７】試料移動流路に分岐点と合流点を設けた例を表す模式図である。
【図１８】（ａ）〜（ｃ）は試料移動流路に流路断面積の変化を付与した例を表す模式図である。
【図１９】（ａ）、（ｂ）は試料移動流路の流路内面を粗面化した例を表す模式図である。
【図２０】試料移動流路に障害物を設けた例を模式的に表す図であり、（ａ）は正面図、（ｂ）は斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
以下、本発明の実施形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明するマイクロ流体デバイス１は、通常、正面（図１）が鉛直方向における上向きとなる姿勢（基本姿勢）で用いられる。以下の記載において、上下方向は基本姿勢における方向を基準とする。すなわち、基本姿勢において、保護層５が上側、光応答性ガス発生フィルム３が下側となる。また左右方向については図１の姿勢を基準とする。例えば、液体試料の移動方向については左側が上流、右側が下流となり、液体試料は左から右に向かって移動する。
また、発明の理解を容易にするために、各図面において、各部材の大きさや厚みについては一部誇張して描かれており、実際の大きさや比率等とは必ずしも一致しないことがある。
【００４８】
本発明の第一実施形態に係るマイクロ流体デバイス１は、液体試料中のエンドトキシン（微生物夾雑物）を検出するためのものである。マイクロ流体デバイス１は、図１，図２に示すように、全体形状が平板状の基板であり、基本的に、光応答性ガス発生フィルム（気体供給手段）３と、基板本体２と、保護層５がこの順に積層された構造を有している。詳細には、基板本体２の一方の面（下面）に光応答性ガス発生フィルム３、他方の面（上面）に保護層５がそれぞれ設けられている。
【００４９】
基板本体２は、図３に示すように、長方形状の板体であり、合成樹脂やガラスで構成されている。基板本体２のサイズは、例えば、縦１０〜５０ｍｍ程度、横５０〜２００ｍｍ程度、厚み３〜８ｍｍ程度であるが、これに限定されるものではない。基板本体２には、全体流路６が形成されている。全体流路６は直線状の微細な流路であり、気体導入部７、気体導入流路８、試料導入部１０、試料移動流路１１、光学セル１２、および開放流路１５を有する。全体流路６の詳細な構成については後述する。
基板本体２には気体導入口（駆動源接続口）２０が設けられており、全体流路６の気体導入部７に連通している（図４，図５）。
【００５０】
光応答性ガス発生フィルム（気体供給手段）３は、基板本体２の一方の面（下面）に設けられている。光応答性ガス発生フィルム３は、基板本体２と略同じ長方形状のフィルムであり、図６に示すように、ガス発生層１７と基材層１８とが積層された２層構造を有する。そして、ガス発生層１７が基板本体２に接触するように基板本体２に貼付されている。
ガス発生層１７は、光応答性ガス発生材を含むものであり、その厚みは２０〜２００μｍ程度である。光応答性ガス発生材は、「ガスを発生する材料」と、粘接着性を有するバインダー樹脂とで構成されている。すなわち、ガス発生層１７は粘着剤を含んでおり、基板本体２に簡単に貼付できる。基材層１８はポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）からなる支持体であり、その厚みは２０〜１００μｍ程度である。基材層１８は光透過性であり、外部から照射された光は基材層１８を通過してガス発生層１７に届く。
なお図６以外の図では、光応答性ガス発生フィルム３の積層構造は省略している。
【００５１】
ガス発生層１７における光応答性ガス発生材を構成する「ガスを発生する材料」の例としては、アゾ化合物、アジド化合物、ポリオキシアルキレン樹脂、などが挙げられる。さらに、特許文献４に記載されているような、光酸発生剤（スルホン酸オニウム塩、ベンジルスルホン酸エステル、ハロゲン化イソシアヌレート、ビスアリールスルホニルジアゾメタン等）と酸刺激ガス発生剤（炭酸塩及び／又は重炭酸塩等）の組み合わせ、光塩基発生剤（コバルトアミン系錯体、カルバミン酸ｏ−ニトロベンジル、オキシムエステル、カルバモイルオキシイミノ基含有化合物等）と塩基増殖剤（Ｆｌｕ３、Ｆｌｕ４等）の組み合わせ、などが挙げられる。
光応答性ガス発生材には、さらに光増感剤を含ませてもよい。
【００５２】
なお、本実施形態では光応答性ガス発生フィルム３は基板本体２の裏面全体に貼付されているが、気体導入口２０を覆う部分のみに貼付する構成としてもよい。
【００５３】
保護層５は、基板本体２の光応答性ガス発生フィルム３が設けられた面とは逆の面（上面）に設けられている。保護層５の形状は基板本体２と略同じ長方形状であり、その厚みは０．１ｍｍ程度である。保護層５はＰＥＴ樹脂に粘着材を塗工して作製されたものであり、無色透明かつ透光性である。保護層５は全体流路６を保護するとともに上から覆い、気体による加圧で液体試料が試料移動流路１１内を移動可能な状態にする。
保護層５には試料導入口２１が設けられており、全体流路６の試料導入部１０に連通している（図４，図５）。
【００５４】
前述のように、マイクロ流体デバイス１には全体流路６が形成されている。図２〜図５に示すように、全体流路６は、基板本体２の保護層５側の面に形成された直線状の溝と保護層５の裏面（下面）とで構成された、断面形状が略長方形状の筒状流路である。全体流路６は、気体導入部７、気体導入流路８、試料導入部１０、試料移動流路１１、光学セル１２、および開放流路１５を有している。気体導入部７、気体導入流路８、試料導入部１０、試料移動流路１１、光学セル１２、および開放流路１５は、上流から下流に向かってこの順番に並び、互いに連通して全体流路６を構成している。
【００５５】
全体流路６は、マイクロ流体デバイス１の正面視において、マイクロ流体デバイス１の長辺に対して平行に１個配されている。全体流路６の上流側（図１，図３，図４における左側）の端部は基板１の上流側（左側）短辺までは至っておらず、一方、下流側（図１，図３，図４における右側）の端部はマイクロ流体デバイス１の下流側（右側）短辺まで至っており、外部に開放している（開放端１６）。すなわち、全体流路６の長さはマイクロ流体デバイス１の長辺の長さよりも少し短い。
【００５６】
気体導入部７は、全体流路６の上流側最端部又はその近傍に位置している。気体導入部７は、液体試料に圧力を付与する気体が導入される部位である。気体導入部７は、基板本体２に設けられた気体導入口（駆動源接続口）２０と連通している。
【００５７】
気体導入流路８は、気体導入部７の下流側に位置する流路である。気体導入部７と試料導入部１０は、気体導入流路８を介して繋がっている。
【００５８】
試料導入部１０は、気体導入流路８の下流側に位置している。試料導入部１０は、液体試料が導入される部位である。試料導入部１０は保護層５に設けられた試料導入口２１と連通している。試料導入口２１を通じて導入された液体試料は、試料導入部１０に導入される。
【００５９】
試料移動流路１１は、試料導入部１０の下流側に位置している。試料移動流路１１は、試料導入部１０に導入された液体試料が移動する流路である。試料移動流路１１の断面形状は、図７に示すような略長方形状である。断面の縦横比（流路の深さＨと幅Ｗの比）については特に限定はないが、好ましくは、Ｈ：Ｗが１：４〜４：１、より好ましくは１：３〜３：１、さらに好ましくは１：２〜２：１、最も好ましくは１：１（Ｈ＝Ｗ，正方形）である。断面積については、マイクロ流路としての機能を発揮できる面積であれば特に限定はないが、好ましくは１ｍｍ2以下、より好ましくは０．８ｍｍ2以下、さらに好ましくは０．６ｍｍ2以下である。縦（深さＨ）と横（幅Ｗ）の長さは、一般的には０．５μｍ〜２０００μｍ（２ｍｍ）程度であり、好ましくは１００μｍ〜６００μｍ程度、より好ましくは２００μｍ〜４００μｍ程度である。
【００６０】
なお、本発明において試料移動流路の断面積と形状は一定である必要はなく、後述する図１６に示す実施形態のように、断面積と形状が変化している場合もある。この場合には、試料移動流路の全長の８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上において、前記した断面の縦横比、断面積、および縦と横の長さの範囲を満たすことが好ましい。
【００６１】
試料移動流路１１の断面形状（溝の形状）については長方形状以外でもよく、半円状、Ｖ字状、などでもよい。
【００６２】
試料移動流路１１の中央からやや上流の位置（第一領域２２）に、血球溶解物等含有試薬２６が配置されている（図４）。血球溶解物等含有試薬２６は凍結乾燥品等の固形物であり、第一領域２２の底面及び／又は側面を層状に覆っている。本実施形態においては、血球溶解物等含有試薬２６として、カブトガニの血球抽出物（ＬＡＬ）が採用されている。
【００６３】
また試料移動流路１１の中央からやや下流の位置（第二領域２３）に、発光合成基質２８が配置されている（図４）。発光合成基質２８は凍結乾燥品等の固形物であり、第二領域２３の底面及び／又は側面を層状に覆っている。発光合成基質２８としては、ＬＡＬ中の活性化凝固酵素の作用によってルシフェリン（又はその誘導体）を遊離することができる合成基質、例えば、ベンゾイル−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−アミノルシフェリンである。ベンゾイル−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−アミノルシフェリンによれば、活性化凝固酵素によってアミノルシフェリンが遊離される。
【００６４】
なお、発光合成基質２８の他の例としては、Ｌｅｕ−Ｇｒｙ−Ａｒｇ−アミノルシフェリン、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−アミノルシフェリンが挙げられる。さらに、これらのＮ末端は保護基で保護されていてもよい。当該保護基としては、Ｎ−スクシニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンゾイル基、ｐ−トルエンスルホニル基、などが挙げられる。
【００６５】
光学セル１２は、試料移動流路１１の下流側に位置している。光学セル１２は試料移動流路１１と連通しており、試料移動流路１１を移動してきた液体試料は、そのまま光学セル１２に導入される。光学セル１２は、液体試料の光学的変化を検出するための「窓」である。
【００６６】
試料導入口２１と光学セル１２とは、試料導入部１０と試料移動流路１１を介して連通している。換言すれば、試料導入部１０と試料移動流路１１とが１つのマイクロ流路を形成しており、当該マイクロ流路が試料導入口２１と光学セル１２とを連通している。
【００６７】
光学セル１２内には発光用試薬２７が配置されている（図４）。発光用試薬２７は凍結乾燥品等の固形物であり、光学セル１２の底面及び／又は側面を層状に覆っている。本実施形態においては、発光用試薬２７として、ルシフェラーゼ（発光酵素）とＡＴＰとの混合物が採用されている。
なお、図２，図３，図５では、血球溶解物等含有試薬２６と発光用試薬２７の図示を省略している。
【００６８】
光学セル１２の下流側は、開放流路１５と開放端１６を通じて外部に開放している。
【００６９】
全体流路６を基板本体２に形成する方法としては、切削加工、レーザー加工、光造形、射出成形、インプリント等の公知の方法を採用することができる。
なお、全体流路６は直線状でなくてもよい。
【００７０】
続いて、マイクロ流体デバイス１を用いて、液体試料中のエンドトキシン検出を行う手順について、図８と図９を参照しながら説明する。
【００７１】
まず、エンドトキシン検出の対象となる液体試料２９を、試料導入口２１からマイクロピペット等を用いて導入する。これにより、液体試料２９が試料導入部１０に配置される（図８（ａ））。液体試料２９の導入量は、試料移動流路１１の内壁と隙間なく接触して流路面（断面）を塞ぎ、気体による圧力を受けて試料移動流路１１を移動できる液滴を形成可能な量であればよい。例えば、試料移動流路１１の断面形状が１ｍｍ四方の正方形であれば、１ｍｍ3（１μＬ）程度（一辺１ｍｍの立方体の液滴を形成）あれば十分である。
また試料導入口２１については、保持層５に予め設けておいてもよいし、液体試料２９の導入前に針等を用いて孔を形成させて設けてもよい。液体試料２９が試料導入部１０に配置されたことを確認した後、試料導入口２１をカバーテープ３３で塞ぐ。
【００７２】
次に、光応答性ガス発生フィルム３の気体導入口２０に対応する位置に、光（紫外線）を照射する。前述のとおり、光応答性ガス発生フィルム３の基材層１８は光透過性であり、下から照射された光は基材層１８を通過してガス発生層１７に届く。このとき、気体導入口２０の近傍で気体が発生し、気体導入口２０に導入される。これにより、試料導入部１０に配置された液体試料２９に対して気体による圧力が付与され、液体試料２９が試料移動流路１１に入り、下流側に向かって移動する（図８（ｂ））。液体試料２９の移動の開始と停止は、例えば、光照射をオンオフすることにより制御することができる。照射時間の長短で制御してもよい。光照射をパルス的に繰り返して微調整することもできる。
【００７３】
液体試料２９が試料移動流路１１の第一領域２２（血球溶解物等含有試薬２６が設置されている）に到達したら、気体の供給を停止して液体試料２９の移動を停止させる（図８（ｃ））。これにより、液体試料２９が血球溶解物等含有試薬２６を覆う形となり、血球溶解物等含有試薬２６が液体試料２９に溶解する。この状態で、一定時間保持する。この際、液体試料２９を第一領域２２上で前後に動かして、溶解と混合を促進させてもよい。液体試料２９の前後移動は、例えば、光照射と開放端１６からの加圧とを繰り返すことにより、行うことができる。
血球溶解物等含有試薬２６が液体試料２９に溶解すると、液体試料２９中に存在するエンドトキシンが血球溶解物等含有試薬２６中のＬＡＬとカスケード反応を起こして凝固酵素を活性化する。
凝固酵素を確実に活性化するために、必要に応じて、第一領域２２を所定温度（例えば３７±１℃）にインキュベートする。インキュベートは、例えば、第一領域２２を含む部分を上下から面状ヒーターやペルチェ素子で挟んだり、マイクロ流体デバイス１全体を恒温器内に入れて行うことができる。
【００７４】
液体試料２９を一定時間保持して凝固酵素の活性化を完了させた後、再び光応答性ガス発生フィルム３に対する光照射を行い、気体を発生させる。これにより、液体試料２９（活性化された凝固酵素を含んでいる）が下流側に向かって再び移動する（図８（ｄ））。この工程でも、液体試料２９の移動の開始と停止は、光照射のオンオフや照射時間の長短で制御することができ、光照射をパルス的に繰り返して微調整することもできる。
【００７５】
液体試料２９が試料移動流路１１の第二領域２３（発光合成基質２８が設置されている）に到達したら、気体の供給を停止して液体試料２９の移動を停止させる（図９（ｅ））。これにより、液体試料２９が発光合成基質２８を覆う形となり、発光合成基質２８が液体試料２９に溶解する。この状態で、一定時間保持する。この際、液体試料２９を第二領域２３上で前後に動かして、溶解と混合を促進させてもよい。液体試料２９の前後移動は、例えば、光照射と開放端１６からの加圧とを繰り返すことにより、行うことができる。
発光合成基質２８が液体試料２９に溶解すると、活性化された凝固酵素が発光合成基質たるベンゾイル−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−アミノルシフェリンに作用し、アミノルシフェリンが遊離される（ルシフェリン遊離反応）。
ルシフェリン遊離反応を確実に行うために、必要に応じて、第二領域２３を所定温度（例えば３７±１℃）にインキュベートする。インキュベートは、例えば、第二領域２３を含む部分を上下から面状ヒーターやペルチェ素子で挟んだり、マイクロ流体デバイス１全体を恒温器内に入れて行うことができる。
【００７６】
液体試料２９を一定時間保持してルシフェリン遊離反応を完了させた後、再び光応答性ガス発生フィルム３に対する光照射を行い、気体を発生させる。これにより、液体試料２９（遊離アミノルシフェリンを含んでいる）が移動を再開し、光学セル１２に向かう（図９（ｆ））。
【００７７】
液体試料２９が光学セル１２（発光用試薬２７が設置されている）に到達したら、気体の供給を停止して液体試料２９の移動を停止させる（図９（ｇ））。これにより、液体試料２９が発光用試薬２７を覆う形となり、光学セル１２内で発光用試薬２７が液体試料２９に溶解する。
発光用試薬２７が液体試料２９に溶解すると、液体試料２９中に存在する遊離アミノルシフェリンが、発光用試薬２７中のルシフェラーゼ（発光酵素）及びＡＴＰと反応して生物発光を発する。
【００７８】
最後に、光学セル１２内で生じた生物発光を、発光検出器３６によって検出する（図９（ｈ））。得られた発光強度の値から、液体試料２９中のエンドトキシン量を算出する。
【００７９】
なお生物発光や化学発光は一般に発光寿命が短いため、本実施形態のように発光用試薬２７を発光セル１２内に設置し、発光後すみやかに発光測定ができる構成とすることが好ましい。ただし、本発明はこの構成に限定されるものではなく、発光用試薬２７を試料移動流路１１内に設置してもよい。例えば、発光セル１２の少し上流の位置（第三領域）に発光用試薬２７を設置し、発光反応開始後、速やかに光学セル１２に液体試料２９を移動させる構成としてもよい。
【００８０】
マイクロ流体デバイス１に光照射する工程（図８（ｂ）、図８（ｄ）、図９（ｆ））において、図１０に示すようなカートリッジ式の光照射装置３０を用いることで、光照射を容易に行うことができる。光照射装置３０は、マイクロ流体デバイス１が挿入及び保持されるデバイス挿入部３１と、マイクロ流体デバイス１に光（紫外線）を照射する発光部３２とを有している。デバイス挿入部３１のサイズはマイクロ流体デバイス１がちょうど収まるサイズであり、基本姿勢のマイクロ流体デバイス１を上流側（図１の左側）からスライドさせながら挿入する。
発光部３２には複数の発光ダイオード３５が配されており、図示しないスイッチによってオンオフ可能である。発光ダイオード３５は紫外線ＬＥＤ（ＵＶ−ＬＥＤ）であり、紫外線を発することができる。マイクロ流体デバイス１をデバイス挿入部３１にセットした状態において、発光部３２の発光ダイオード３５の位置は、気体導入口２０の真下となる。そのため、光応答性ガス発生フィルム３の気体導入口２０に対応する位置に対して確実に光（紫外線）を照射することができる。
【００８１】
また、光学セル１２からの生物発光を検出する工程（図９（ｈ））において、図１１に示すようなカートリッジ式の発光検出器３６を用いることで、発光測定を容易に行うことができる。発光検出器３６はいわゆるルミノメーターであり、その側面にデバイス挿入口３７を備えている。デバイス挿入口３７にマイクロ流体デバイス１を開放端１６側（図１の右側）から挿入し、光学セル１２部分を発光検出器３６内に入れる。光学セル１２から発せられる生物発光は、発光検出器３６が備える発光検出系により検出・解析され、結果が表示部３８に表示される。
【００８２】
上記した実施形態において、第一領域２２（血球溶解物等含有試薬２６が設置されている）と第二領域２３（発光合成基質２８が設置されている）の位置は、第一領域２２が上流、第二領域２３が下流となる限りにおいて自由である。例えば、第一領域２２を試料導入部１０に設定してもよい。すなわち、試料導入部１０に血球溶解物等含有試薬２６を設置してもよい。この構成によれば、液体試料２９の導入と同時に血球溶解物等含有試薬２６が溶解し、凝固酵素の活性化が始まる。
【００８３】
上記した実施形態において、光応答性フィルム３の基板本体２への貼付は、液体試料２９の導入直前に行ってもよいし（用時調製）、予め行っておいてもよい。
【００８４】
上記した実施形態では、光応答性ガス発生フィルム３を利用したマイクロポンプによって、液体試料２９を移動させた。しかし、本発明はこの構成に限定されるものではなく、光応答性ガス発生フィルム３を用いない実施形態も可能である。例えば、第一実施形態における気体導入口２０に、光応答性ガス発生フィルム３以外の駆動源を接続してもよい。例えば、光応答性ガス発生フィルム３に代えて、シリンジポンプ、ダイヤフラム式等の１〜１０００μＬ／分程度の送液能力を有するポンプを気体導入口２０に接続してもよい。
【００８５】
光応答性ガス発生フィルム３を用いず、さらに気体導入口２０と気体導入部７を設けない実施形態も可能である。例えば、図１２に示す第二実施形態に係るマイクロ流体デバイス５１は、全体流路５６が試料導入部１０、試料移動流路１１、光学セル１２、及び開放流路１５からなり、気体の導入に関係する構成（気体導入部７、気体移動流路８、気体導入口２０）を有しない。マイクロ流体デバイス５１では、開放端１６にマイクロポンプ等の駆動源を接続して加圧又は吸引することにより、液体試料２９を移動させることができる。
【００８６】
上記した実施形態では、第一領域２２に血球溶解物等含有試薬２６、第二領域２３に発色合成基質２８、光学セル１２に発光用試薬２７が設置されていたが、本発明はこの構成に限定されるものではない。図１３に示す第三実施形態に係るマイクロ流体デバイスの全体流路６６では、試料移動流路１１の略中央に第一領域２２が設定されており、第二領域は設定されていない。そして本実施形態では、第一領域２２に血球溶解物等含有試薬２６が配置されているが、この血球溶解物等含有試薬２６には発光合成基質２８が混合されている。換言すれば、本実施形態では、血球溶解物等含有試薬２６がＬＡＬとベンゾイル−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−アミノルシフェリンとの混合物である。
第三実施形態のその他の構成は、第一実施形態と同じである。例えば、発光セル１２には、発光用試薬２７（ルシフェラーゼとＡＴＰの混合物）が設置されている。
第三実施形態によれば、凝固酵素の活性化とルシフェリン遊離反応とを１つの系で同時に行うことができ、操作を簡略化できる。
第三実施形態に係るマイクロ流体デバイスは、図８，９と同様の手順で使用することができる。
【００８７】
さらに、血球溶解物等含有試薬２６、発光合成基質２８、及び発光用試薬２７の混合物（すなわち、全ての試薬の混合物）を一箇所に設置してもよい。
【００８８】
上記した第一実施形態では、気体導入口２０とそれに対応する気体導入部７が各１個のみ設けられているが、気体を複数個所から導入できる構成としてもよい。図１４に示す実施形態では、試料移動流路１１に第一領域２２、第二領域２３、第三領域２５がそれぞれ設定されている。そして、第一領域２２に血球溶解物等含有試薬２６（ＬＡＬ）、第二領域に発光合成基質２８（ベンゾイル−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−アミノルシフェリン）、第三領域２５に発光用試薬２７（ルシフェラーゼとＡＴＰの混合物）が、それぞれ設置されている。本実施形態では、一番上流にある気体導入口２０に加えて、領域ごとに個別の気体導入口が設けられている。すなわち、第一領域２２に連通する第一気体導入口５２、第二領域２３に連通する第二気体導入口５３、第三領域２５に連通する第三気体導入口５５が、それぞれ設けられている。
本実施形態では、各領域にある液体試料を下流に移動させる際には、その領域に連通する個別の気体導入口から気体を導入することができる。すなわち、第一領域２２にて凝固酵素の活性化反応が終了した後、第一気体導入口５２から気体を導入して液体試料を下流に移動させることができる。同様に、第二領域２３にてルシフェリン遊離反応が終了した後、第二気体導入口５３から気体を導入して液体試料を下流に移動させることができる。同様に、第三領域２５にて発光反応が終了した後、第三気体導入口５５から気体を導入して液体試料を下流に（光学セル１２に向けて）移動させることができる。本実施形態によれば、光応答性ガス発生フィルムによる圧力付与を領域ごとに個別に行うことができ、液体試料の移動がより確実である。
【００８９】
また、液体試料２９の導入量を正確にするための構成として、図１５に示す構成が挙げられる。図１５に示す実施形態では、試料導入部が一定容量の液溜部４１で構成されている。液溜部４１には試料導入ライン（試料導入口）４２と試料排出ライン４３が接続されている。本実施形態では、試料導入ライン４２から液体試料２９を液溜部４１に導入していき、液溜部４１が満たされた後、余剰の液体試料２９は試料排出ライン４３へ溢れ出る。これにより、液溜部４１に一定体積の液体試料２９を量り取ることができる。その後、気体移動流路８側から気体を供給することにより、一定体積の液体試料２９は試料移動流路１１を移動し始める。
【００９０】
上記した実施形態では、液体試料２９が血球溶解物等含有試薬２６、発光合成基質２８、発光用試薬２７を順次溶解し、各種の反応が行われる。したがって、これらの試薬を溶解した液体試料２９が試料移動流路１１内でできるだけ効率的に攪拌・混合されることが好ましい。以下に、液体試料２９の攪拌・混合を促進させるための構成（攪拌補助手段）について、図１６〜図２０を参照しながら順次説明する。これらの構成は、いずれも液体試料２９が試料移動流路１１内を移動する際に効果を発揮するものである。図１６〜図２０において、液体試料２９は左から右に移動する。
【００９１】
図１６に示す例は、試料移動流路１１に屈折路を設けたものである。本実施形態では、流路の屈折部分４５（曲がり角）で液体試料２９が壁面に衝突することにより、攪拌・混合が促進される。
【００９２】
図１７に示す例は、試料移動流路１１に分岐点４６と合流点４７を設けたものである。本実施形態では、分岐点４６においては液体試料２９が流路の壁面に衝突することにより、攪拌・混合が促進される。また合流点４７においては、液体試料２９同士が衝突することにより、攪拌・混合が促進される。
【００９３】
図１８に示す例は、流路断面積の変化である。本実施形態では、流路断面積が途中で変化することにより、流路内で流速の差が生じ、液体試料２９に剪断力が働く。これにより、液体試料２９の攪拌・混合が促進される。図１８（ａ）は流路の片側の幅を広げた例である。図１８（ｂ）は、図１８（ａ）の構成を複数備えた例である。図１８（ｃ）は流路の両側の幅を広げた例である。流路の幅に代えて、流路の深さを変化させてもよい。
【００９４】
図１９は、流路内面を粗面化した例である。本実施形態では、流路内面を鮫肌状などに加工することにより、液体試料２９自身がよく転がり、攪拌・混合が促進される。図１９（ａ）は規則的な鮫肌状に加工した例である。図１９（ｂ）は流路内をうねるような鮫肌状に加工した例であり、壁面への衝突効果が加味される。
【００９５】
図２０は、流路内に障害物を形成した例である。すなわち、流路内の底面と天面を繋ぐ柱状物４８を複数備えており、液体試料２９が柱状物４８にぶつかることにより、攪拌・混合が促進される。
【００９６】
図１６〜図２０に示した各構成（攪拌補助手段）については、１つのみを採用してもよいし、複数を組み合わせて採用してもよい。
【００９７】
上記した実施形態では、マイクロ流体デバイス１個に対して１個の全体流路６が設けられているが、全体流路６の数については特に限定はなく、２個以上でもよい。
【００９８】
また上記したマイクロ流体デバイス１，５１、全体流路６、気体導入部７、気体移動流路８、試料導入部１０、試料移動流路（マイクロ流路）１１、光学セル１２等のサイズについては、これらに限定されるものではなく、全体流路６の数、試料移動流路（マイクロ流路）１１のサイズ、液体試料２９の量、血球溶解物等含有試薬２６の量、発光用試薬２７の量、光学セル１２のサイズ等によって適宜設定することができる。
【００９９】
マイクロ流体デバイス１と発光検出器３６とを組み合わせることにより、エンドトキシン検出システム（微生物夾雑物検出システム）４０を構築することができる（図１１）。エンドトキシン検出システム４０を用いることにより、エンドトキシンの検出をより簡便・迅速に行うことができる。
【０１００】
上記した実施形態では、ルシフェリンとルシフェラーゼの組み合わせによる生物発光を利用しているが、他の生物発光・化学発光の系を利用してもよい。例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとルミノール、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとイソルミノール、ペルオキシダーゼとルミノール、ペルオキシダーゼとイソルミノール、などの各組み合わせによる生物発光・化学発光を利用することができる。
【０１０１】
上記した実施形態では、微生物夾雑物としてエンドトキシンを検出する例を示したが、βグルカンやペプチドグリカンの検出も同様の実施形態をもって検出することができる。
【０１０２】
上記した実施形態では、血球溶解物等含有試薬２６に含まれる血球溶解物としてカブトガニの血球抽出成分（ＬＡＬ）を用いたが、本発明はこれに限定されるものではない。例えば、生体由来成分から単離精製されたファクターＣ等（ファクターＣ、ファクターＧ、凝固酵素等）や遺伝子組換え技術によって作製された組換えファクターＣ等を適宜使用して作製した「ＬＡＬの同等物」を用いることができる。また、βグルカンあるいはペプチドグリカン測定用として、血球溶解物に代えてカイコの体液抽出成分を使用することができる。カイコの体液抽出成分についても、生体由来成分から単離精製されたフェノール酸化酵素や組換え型のフェノール酸化酵素を用いて作製した「カイコの体液抽出成分の同等物」を用いることができる。
【０１０３】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【０１０４】
図１に示すマイクロ流体デバイス１を用い、図８、図９に示す手順で液体試料中のエンドトキシン検出を行った。マイクロ流体デバイス１の基板本体２として、縦２０ｍｍ×横１５０ｍｍ×厚み５ｍｍのアクリル基板を用い、切削加工により全体流路６を形成して作製した。試料移動流路（マイクロ流路）１１の断面形状は、縦横比１：１の正方形とした。縦（深さ）と横（幅）の長さについては、１ｍｍ四方、３ｍｍ四方、４．７ｍｍ四方の３種類とした。
【０１０５】
リムルス試薬（ＬＡＬ）、エンドトキシン標準液（大腸菌0111:B4由来エンドトキシン)、およびパイロジェンフリー水は、エンドトキシン測定試薬ＱＣＬ−１０００（ロンザ社）に付属のものを使用した。べンゾイル−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−アミノルシフェリン（発光合成基質）とルシフェラーゼ（発光酵素）は、Proteasome-GloTM Assay（プロメガ社）に付属のものを使用した。
【０１０６】
液体試料として、０．０５ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン溶液を調製して用いた。液体試料の導入量（体積）は、液体試料の液滴が略立方体となる量、すなわち、１ｍｍ四方の流路に対して１μＬ、３ｍｍ四方の流路に対して２７μＬ、４．７ｍｍ四方の流路に対して１００μＬとした。
【０１０７】
光応答性ガス発生フィルム３は、アクリル系のバインダー樹脂にアゾ化合物を加え、これをＰＥＴフィルムに塗工することにより作製した。
保護層５は、ＰＥＴフィルムに粘着材を塗工することにより作製した。
【０１０８】
血球溶解物等含有試薬２６として、２μＬのリムルス試薬を用いた。発光合成基質２３として、２μＬの１５０μＭ べンゾイル−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−アミノルシフェリン溶液（１ｍＭ ＭｇＣｌを含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）に溶解）を用いた。発光用試薬２７として、１０μＭ ＡＴＰを含むルシフェラーゼ（０．１ｍＭ ＭｇＣｌと２０ｍＭＣaＣｌ2を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）に溶解）混合溶液２μＬを用いた。血球溶解物等含有試薬２６を第一領域２２に、発光合成基質２３を第二領域２３に、発光用試薬２７を光学セル１２にそれぞれ置き、凍結乾燥させた。
【０１０９】
試料導入口２１から液体試料を導入し、試料導入口２１をカバーテープ３３で塞いだ。光応答性ガス発生フィルム３に紫外線を照射して気体を発生させ、気体導入口２０から気体を導入し、液体試料の移動を開始した。液体試料を第一領域２２に到達させて血球溶解物等含有試薬２６を溶解し、３７℃で５分間保持した（凝固酵素の活性化反応）。
再び気体導入口２０から気体を導入し、液体試料を移動させた。液体試料を第二領域２３に到達させて発光合成基質２３を溶解し、３７℃で２分間保持した（ルシフェリン遊離反応）。
再び気体導入口２０から気体を導入し、液体試料を移動させた。液体試料を光学セル１２に到達させて発光用試薬２７を溶解した（発光反応）。速やかに、その発光強度を顕微鏡下（Ｍ１６５  ライカ社）でＣＣＤカメラ（AxioCam HRm、カールザイス社）を用いて観察し、各流路によるにおける反応物の発光強度を定性的に比較した。
【０１１０】
〔比較例〕
比較例として試験管を用いてエンドトキシン測定を行った。試験管に設置された乾燥ＬＡＬ試薬（リムルスHS-Jシングルテストワコー、和光純薬社）に液体試料（０．０５ＥＵ／ｍＬ）１０００μＬ加えた。３７℃で５分間反応させた後、１．６５ｍＭの発光合成基質を１００μＬ添加し、２分間反応させた。その後、１００μＬの発光試薬（ルシフェーラーゼ及びＡＴＰを含む）を添加し、顕微鏡下で発光強度を観察した。
【０１１１】
その結果、流路断面が１ｍｍ四方の場合に最も強い発光が観察された（評価Ａ）。流路断面が３ｍｍ四方の場合には、発光強度が少し低下した（評価Ｂ）。流路断面が４．７ｍｍ四方の場合と比較例の場合には、発光強度がかなり低くなった（評価Ｃ）。
【符号の説明】
【０１１２】
１  マイクロ流体デバイス
３  光応答性ガス発生フィルム（気体供給手段）
１０  試料導入部（マイクロ流路）
１１  試料移動流路（マイクロ流路）
１２  光学セル
１６  開放端（駆動源接続口）
２０  気体導入口（駆動源接続口）
２１  試料導入口
２２  第一領域
２３  第二領域
２５  第三領域
２６  血球溶解物等含有試薬
２７  発光用試薬
２８  発光合成基質
２９  液体試料
３６  発光検出器
４０  エンドトキシン検出システム（微生物夾雑物検出システム）
４２  試料導入ライン（試料導入口）
４５  屈折部分
４６  分岐点
４７  合流点
４８  柱状物（障害物）
５１  マイクロ流体デバイス
５２  第一気体導入口（駆動源接続口）
５３  第二気体導入口（駆動源接続口）
５５  第三気体導入口（駆動源接続口）
【図１】
0005727218.tif 000002
【図２】
0005727218.tif 000003
【図３】
0005727218.tif 000004
【図４】
0005727218.tif 000005
【図５】
0005727218.tif 000006
【図６】
0005727218.tif 000007
【図７】
0005727218.tif 000008
【図８】
0005727218.tif 000009
【図９】
0005727218.tif 000010
【図１０】
0005727218.tif 000011
【図１１】
0005727218.tif 000012
【図１２】
0005727218.tif 000013
【図１３】
0005727218.tif 000014
【図１４】
0005727218.tif 000015
【図１５】
0005727218.tif 000016
【図１６】
0005727218.tif 000017
【図１７】
0005727218.tif 000018
【図１８】
0005727218.tif 000019
【図１９】
0005727218.tif 000020
【図２０】
0005727218.tif 000021