(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる方法であって：
ａ．前記多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞をＢ２７（登録商標）で補充された培地を含む合成培地中で培養し、前記多能性幹細胞をアクチビンＡで処理することによって、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｃ．前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子、又はレチノイン酸及び少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子で処理することによって、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｄ．前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤で処理することによって、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記Ｂ２７（登録商標）が濃度０．５％〜１％で使用される、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記Ｂ２７（登録商標）が濃度１％で使用される、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が：
ａ．前記多能性幹細胞を、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上に播く工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞を、Ｂ２７（登録商標）で補充された培地を含む合成培地中で培養し、アクチビンＡで前記多能性幹細胞を処理する工程と、を含む方法により達成される、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、前記Ｂ２７（登録商標）が濃度０．５％〜１％で使用される、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、前記Ｂ２７（登録商標）が濃度１％で使用される、方法。
【請求項７】
請求項４に記載の方法において、前記Ｂ２７（登録商標）が濃度０．５％〜１％で使用される、方法。
【請求項８】
請求項４に記載の方法において、前記Ｂ２７（登録商標）が濃度１％で使用される、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法において、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が：
ａ．前記多能性幹細胞を、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上に播く工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞を、Ｂ２７（登録商標）で補充された培地を含む第一の合成培地中でアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと共に培養する工程と、
ｃ．前記多能性幹細胞を、Ｂ２７（登録商標）で補充された培地を含む第二の合成培地中でアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと共に培養する工程と、を含む方法により達成される、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法において、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記多能性幹細胞を線維芽細胞フィーダー層上に播く工程を更に含む方法により達成される、方法。
【請求項１１】
請求項４に記載の方法において、前記多能性幹細胞が、Ｂ２７（登録商標）、Ｗｎｔリガンド及びアクチビンＡで補充された培地を含む合成培地中で培養される、方法。
【請求項１２】
多能性幹細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる方法であって：
ａ．前記多能性幹細胞を、Ｂ２７（登録商標）で補充された培地を含む合成培地中で培養する工程と、
ｂ．前記多能性細胞をアクチビンＡで処理することによって、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｃ．前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子、又はレチノイン酸及び少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子で処理することによって、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、前記Ｂ２７（登録商標）が濃度０．５％〜１％で使用される、方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法において、前記Ｂ２７（登録商標）が濃度１％で使用される、方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の方法において、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記多能性幹細胞を線維芽細胞フィーダー層上に播く工程を更に含む方法により達成される、方法。
【請求項１６】
多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる方法であって：
ａ．前記多能性幹細胞を、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上に播く工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞を、Ｂ２７（登録商標）で補充された培地を含む合成培地中で培養し、アクチビンＡで前記多能性幹細胞を処理する工程と、を含む、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法において、前記Ｂ２７（登録商標）が濃度０．５％〜１％で使用される、方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法において、前記Ｂ２７（登録商標）が濃度１％で使用される、方法。
【請求項１９】
請求項１６に記載の方法において、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記多能性幹細胞を線維芽細胞フィーダー層上に播く工程を更に含む方法により達成される、方法。
【請求項２０】
請求項１６に記載の方法において、前記多能性幹細胞が、Ｂ２７（登録商標）、Ｗｎｔリガンド及びアクチビンＡで補充された培地を含む合成培地中で培養される、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法において、前記Ｂ２７（登録商標）が濃度０．５％〜１％である、方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法において、前記Ｂ２７（登録商標）が濃度１％である、方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法において、前記多能性幹細胞が、Ｂ２７（登録商標）及びアクチビンＡで補充された培地を含む合成培地中で培養される、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法において、前記Ｂ２７（登録商標）が濃度０．５％〜１％である、方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載の方法において、前記Ｂ２７（登録商標）が濃度１％である、方法。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔技術分野〕
本願は、２００７年４月１８日出願の米国特許出願第１１／７３６，９０８号の一部継続出願である。本願は２００６年４月２８日出願の米国仮特許出願第６０／７４５，８９９号、２００６年９月３０日出願の米国仮特許出願第６０／８２７，６９５号，及び２００６年１２月２９日出願の米国仮特許出願第６０／８８２，６７０号の優先権を主張し、これらの全容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、多能性幹細胞の分化を促進する方法を提供する。より詳細には、本発明は、膵臓内胚葉、膵臓ホルモン発現細胞、及び膵臓ホルモン分泌細胞の形成のための改良された方法を提供する。本発明は、フィーダー細胞層を使用することなく、多能性幹細胞の分化を促進する方法も提供する。
【０００３】
〔背景技術〕
Ｉ型糖尿病のための細胞代替療法における進歩と、移植可能なランゲルハウス島の不足により、インスリン産生細胞、又は移植に適した細胞の源を開発することに、興味の焦点が当てられている。一つの手法は、例えば、胚幹細胞等の多能性幹細胞から機能的β細胞を生成することである。
【０００４】
脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として公知のプロセスにて、３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓等の組織は、内胚葉から中間段階を経て発達する。このプロセスにおける中間段階は、胚体内胚葉の形成である。胚体内胚葉細胞は、ＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ４、Ｍｉｘｌ１、ＣＸＣＲ４及びＳｏｘ−１７等の多数のマーカーを発現する。
【０００５】
膵臓の形成は、胚体内胚葉の膵臓内胚葉への分化により起こる。膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子、Ｐｄｘ１を発現する。Ｐｄｘ１が存在しない場合、膵臓は、腹側芽及び背側芽の形成を越えて発達しない。したがって、Ｐｄｘ１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程を印している。成熟した膵臓は、他の細胞型の中でも、外分泌組織及び内分泌組織を含む。外分泌組織及び内分泌組織は、膵臓内胚葉の分化によって生じる。
【０００６】
島細胞の特徴を保持する細胞がマウスの胚細胞から誘導されたことが報告されている。例えば、ルメルスキー（Lumelsky）ら（サイエンス（Science）２９２：１３８９、２００１年）は、マウスの胚幹細胞の、膵島と同様のインスリン分泌構造への分化を報告している。ソリア（Soria）ら（糖尿病（Diabetes）４９：１５７、２０００年）は、ストレプトゾトシン糖尿病のマウスにおいて、マウスの胚幹細胞から誘導されたインスリン分泌細胞が糖血症を正常化することを報告している。
【０００７】
一例において、ホリ（Hori）ら（ＰＮＡＳ９９：１６１０５、２００２年）は、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＬＹ２９４００２）の阻害剤を用いたマウス胚幹細胞の処理により、β細胞に類似した細胞が生成されたことを開示している。
【０００８】
他の例では、Ｂｌｙｓｚｃｚｕｋら（ＰＮＡＳ１００：９９０、２００３年）が、Ｐａｘ４を構成的に発現しているマウス胚幹細胞からのインスリン産生細胞の生成を報告している。
【０００９】
ミカレフ（Micallef）らは、レチノイン酸が、胚幹細胞のＰｄｘ１陽性膵臓内胚葉の形成に対する関与を調整することができることを報告している。レチノイン酸は、胚における原腸形成の終了時に対応する期間中の、胚幹細胞分化の４日目に培養液に添加された場合、Ｐｄｘ１発現の誘発に最も効果的である（糖尿病（Diabetes）５４：３０１、２００５年）。
【００１０】
ミヤザキ（Miyazaki）らは、Ｐｄｘ１を過剰発現しているマウス胚幹細胞株を報告している。ミヤザキらの結果は、外因性のＰｄｘ１発現が、得られた分化細胞内でインスリン、ソマトスタチン、グルコキナーゼ、ニューロゲニン３、Ｐ４８、Ｐａｘ６、及びＨＮＦ６遺伝子の発現を明らかに高めたことを示している（糖尿病（Diabetes）５３：１０３０、２００４年）。
【００１１】
スカウディ（Skoudy）らは、マウス胚幹細胞内で、アクチビンＡ（ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバー）が、膵臓外分泌遺伝子（ｐ４８及びアミラーゼ）、並びに内分泌遺伝子（Ｐｄｘ１、インスリン、グルカゴン）の発現を上方調節することを報告している。最大の効果は、１ｎＭアクチビンＡを使用して観察された。スカウディ（Skoudy）らはまた、インスリン及びＰｄｘ１  ｍＲＮＡの発現レベルはレチノイン酸により影響を受けなかった；しかしながら、３ｎＭ  ＦＧＦ７処理によりＰｄｘ１に関する転写産物のレベルが増大したことも観察した（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７９：７４９、２００４年）。
【００１２】
シラキ（Shiraki）らは、胚幹細胞のＰｄｘ１陽性細胞への分化を特異的に高める増殖因子の効果を研究した。シラキらは、ＴＧＦβが、Ｐｄｘ１陽性細胞のより高い割合を再現性よく生み出すことを観察した（Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ．２００５年６月；１０（６）：５０３〜１６）。
【００１３】
ゴードン（Gordon）らは、血清の不在下、及びアクチビンとＷｎｔシグナル伝達阻害剤の存在下での、マウス胚幹細胞からの短尾奇形＋／ＨＮＦ−３β＋内胚葉細胞の誘発を示した（米国特許第２００６／０００３４４６Ａ１号）。
【００１４】
ゴードン（Gordon）ら（ＰＮＡＳ、１０３巻、１６８０６頁、２００６年）は、「Ｗｎｔ及びＴＧＦ−β／ｎｏｄａｌ／アクチビンシグナル伝達は、前側の原始線条の生成のために同時に必要である」と述べている。
【００１５】
しかしながら、胚幹細胞発達のマウスモデルは、例えば、ヒト等のより高等な哺乳動物内の発達プログラムを正確に模倣しない恐れがある。
【００１６】
トムソン（Thomson）らは、ヒト胚盤胞から胚幹細胞を単離した（サイエンス（Science）２８２：１１４、１９９８年）。同時に、ギアハルト（Gearhart）及び共同研究者は、胎児生殖腺組織から、ヒト胚生殖（ｈＥＧ）細胞株を誘導した（シャンブロット（Shamblott）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６、１９９８年）。白血病阻害因子（ＬＩＦ）と共に培養するのみで分化を阻止し得るマウス胚幹細胞とは異なり、ヒト胚幹細胞は、非常に特殊な条件下で維持する必要がある（米国特許第６，２００，８０６号；ＷＯ  ９９／２０７４１；ＷＯ  ０１／５１６１６）。
【００１７】
ダムール（D'Amour）らは、高濃度のアクチビン及び低血清の存在下でのヒト胚幹細胞誘導による胚体内胚葉に富んだ培養液の生成を記載している（ダムール（D'Amour）ＫＡら、２００５年）。これらの細胞を、マウスの腎臓皮膜下で移植することにより、いくつかの内胚葉性器官の特徴を有する、より成熟した細胞への分化が見られた。ヒト胚幹細胞誘導による胚体内胚葉細胞は、ＦＧＦ−１０の添加後、Ｐｄｘ１陽性細胞に更に分化することができる（米国特許出願公開第２００５／０２６６５５４Ａ１号）。
【００１８】
ダムール（D'Amour）ら（ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）−２４、１３９２〜１４０１（２００６年））は、「私達は、ヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞を、膵臓ホルモンインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド及びグレリンを合成できる内分泌細胞に変換する分化プロセスを開発した。このプロセスは、胚体内胚葉、腸管内胚葉、膵臓内胚葉及び内分泌前駆体が、内分泌ホルモンを発現する細胞へと向かう段階に類似した段階を通して細胞を指向させることにより、インビボでの膵臓器官形成を模倣する。」と述べている。
【００１９】
別の例において、フィスク（Fisk）らは、ヒト胚幹細胞から膵島細胞を産生するシステムを報告している（米国特許出願公開第２００６／００４０３８７Ａ１号）。この場合、分化経路は３つの段階に分割された。ヒト胚幹細胞は、最初に、ｎ−ブチレートとアクチビンＡとの組み合わせを使用して、内胚葉に分化された。次に、細胞をノギン等のＴＧＦβ拮抗薬と共に、ＥＧＦ又はベータセルリンと組み合わせて培養して、Ｐｄｘ１陽性細胞を生成した。最終分化は、ニコチンアミドにより誘発された。
【００２０】
一例において、ベンベニストリー（Benvenistry）らは：「私達は、Ｐｄｘ１の過剰発現が膵臓に富んだ遺伝子の発現を高め、インスリン発現の誘発には、インビボでのみ存在する追加のシグナルが必要であり得ると結論付ける」と述べている（ベンベニストリー（Benvenistry）ら、幹細胞（Stem Cells）２００６年；２４：１９２３〜１９３０）。
【００２１】
〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
したがって、膵臓内分泌細胞、ホルモン発現細胞、又は膵臓ホルモン分泌細胞に分化する可能性を維持する一方で、現在の臨床上の必要性に対処するよう拡張できる、多能性幹細胞株を樹立するための条件を開発する有意な必要性が今尚存在する。本発明者らは、膵臓内分泌細胞に向かうヒト胚幹細胞の分化の効率を改善する代替的な手法を採用した。
【００２２】
〔課題を解決するための手段〕
一実施形態において、本発明は、多能性幹細胞を分化させるための方法を提供し、この方法は：
ａ．多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｃ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｄ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、を含む。
【００２３】
一実施形態において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、多能性幹細胞を以下の方法のうちのいずれか１つにより処理することにより、多能性幹細胞から分化される：
ａ．血清の不在下で、アクチビンＡを含有する培地中で多能性幹細胞を培養した後、細胞をアクチビンＡ及び血清と共に培養し、次に細胞を異なる濃度のアクチビンＡ及び血清と共に培養し、又は
ｂ．血清の不在下で、アクチビンＡを含有する培地中で多能性幹細胞を培養した後、細胞を他の濃度の、血清を有するアクチビンＡと共に培養し、又は
ｃ．血清の不在下で、アクチビンＡ及びＷｎｔリガンドを含有する培地中で多能性幹細胞を培養した後、Ｗｎｔリガンドを除去し、血清を有するアクチビンＡと共に細胞を培養し、又は
ｄ．多能性幹細胞を、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上で培養し、また、多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと共に培養し、又は
ｅ．多能性幹細胞を、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上で培養した後、血清を含有する第一の培地中で、多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと共に培養し、次に多能性幹細胞を、血清を含有する第二の培地中で、アクチビンＡと共に培養し、又は
ｆ．多能性幹細胞を、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上で培養した後、血清を含有する第一の培地中で、多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと共に培養し、次に多能性幹細胞を、異なる濃度の血清を含有する第二の培地中で、アクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと共に培養し、又は
ｇ．Ｂ２７（登録商標）で補充された、Ｗｎｔリガンド及びアクチビンＡを含有する培地中で多能性幹細胞を培養し、又は
ｈ．Ｂ２７で補充された、アクチビンＡを含有する培地中で、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上で多能性幹細胞を培養する。
【００２４】
一実施形態において、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を以下の方法のうちのいずれか１つで処理することにより、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞から分化される：
ａ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、繊維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤で処理した後、繊維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤を含有する培地を除去し、続いて細胞をレチノイン酸、繊維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤を含有する培地中で培養し、又は
ｂ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、レチノイン酸及び少なくとも１つの繊維芽細胞増殖因子で処理し、又は
ｃ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、レチノイン酸で処理した後、レチノイン酸を除去し、続いて細胞を繊維芽細胞増殖因子の少なくとも１つで処理する。
【００２５】
一実施形態において、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、以下の方法のうちのいずれか１つで処理することにより、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞から分化される：
ａ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＤＡＰＴ及びエキセンディン４を含有する培地中で培養した後、ＤＡＰＴ及びエキセンディン４を含有する培地を除去し、続いて細胞をエキセンディン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含有する培地中で培養し、又は
ｂ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、エキセンディン４を含有する培地中で培養した後、エキセンディン４を含有する培地を除去し、続いて細胞をエキセンディン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含有する培地中で培養し、又は
ｃ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＤＡＰＴ及びエキセンディン４を含有する培地中で培養し、又は
ｄ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、エキセンディン４を含有する培地中で培養し、又は
ｅ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を阻害する因子で処理する。
【００２６】
一実施形態において、本発明は、糖尿病に苦しむ患者を処置するための方法を提供し、同方法は：
ａ．多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｃ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｄ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、β細胞系統の細胞に分化させる工程と、
ｅ．β細胞系統の細胞を患者に移植する工程と、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】パネルａは、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで２、５及び８日間処理した後の、ヒト胚幹細胞株Ｈ９内の胚体内胚葉マーカーＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ−３β、Ｍｉｘｌ１、Ｓｏｘ−１７の発現。胚体内胚葉マーカーの発現は、ｍＲＮＡレベルでアッセイされ、未処理のヒト胚幹細胞内の発現レベルに正規化された。パネルｂは、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで３及び５日間処理した後のヒト胚幹細胞株Ｈ９内の前側内胚葉マーカーＣｅｒｂｅｒｕｓ、Ｏｔｘ−１及びＨｅｘ遺伝子の発現。
【図２】１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで５日間処理した後のヒト胚幹細胞株Ｈ９内の胚体内胚葉マーカーの発現。胚体内胚葉マーカーの発現は、免疫組織化学的検査により検出された。パネル（ａ）は、Ｓｏｘ−１７発現。パネル（ｂ）は、ＨＮＦ−３β発現を示す。パネル（ｃ）は、Ｏｃｔ３／４発現。
【図３】段階的な分化プロトコル後のヒト胚幹細胞株Ｈ９における胚体内胚葉マーカーの発現。胚体内胚葉マーカーの発現は、ｍＲＮＡレベルでアッセイされ、未処理のヒト胚幹細胞内の発現レベルに正規化された。パネル（ａ）は、ＧＡＴＡ４発現。パネル（ｂ）は、Ｓｏｘ−１７発現。パネル（ｃ）は、ＨＮＦ−３β発現。パネル（ｄ）は、Ｍｉｘｌ１発現。「ＡＡ」の印を示したデータポイントは、１（１ｄ）、３（３ｄ）、５（５ｄ）、又は７（７ｄ）日間のアクチビンＡ処理。「ＵＴ」の印を示したデータポイントは、１（１ｄ）、３（３ｄ）、５（５ｄ）、又は７（７ｄ）日間培養した未処理の対照。
【図４】段階的な分化プロトコル後のヒト胚幹細胞株Ｈ９内の胚体外内胚葉マーカーの発現。胚体外内胚葉マーカーの発現は、ｍＲＮＡレベルでアッセイされ、未処理のヒト胚幹細胞内の発現レベルに正規化された。パネル（ａ）は、ＡＦＰ発現上の１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡの効果。パネル（ｂ）は、Ｓｏｘ７発現上の１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡの効果。「ＡＡ」の印を示したデータポイントは、１（１ｄ）、３（３ｄ）、５（５ｄ）、又は７（７ｄ）日間のアクチビンＡ処理。「ＵＴ」の印を示したデータポイントは、１（１ｄ）、３（３ｄ）、５（５ｄ）、又は（７ｄ）７日間培養した未処理の対照。
【図５】段階的な分化プロトコル後のヒト胚幹細胞株Ｈ９内の中胚葉及び外胚葉マーカーの発現。中胚葉及び外胚葉マーカーの発現は、ｍＲＮＡレベルでアッセイされ、未処理のヒト胚幹細胞内の発現レベルに正規化された。パネル（ａ）は、短尾奇形発現上の１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡの効果。パネル（ｂ）は、Ｚｉｃ１発現発現上の１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡの効果。「ＡＡ」の印を示したデータポイントは、１（１ｄ）、３（３ｄ）、５（５ｄ）、又は７（７ｄ）日間のアクチビンＡ処理。「ＵＴ」の印を示したデータポイントは、１（１ｄ）、３（３ｄ）、５（５ｄ）、又は７（７ｄ）日間培養した未処理の対照。
【図６】１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡによる１、３、５及び７日間の処理後の、ヒト胚幹細胞株Ｈ７内の胚体内胚葉マーカー短尾奇形（パネルａ）、ＣＸＣＲ４（パネルｂ）、Ｍｉｘｌ１（パネルｃ）、Ｓｏｘ１７（パネルｄ）、ＨＮＦ−３β（パネルｅ）、Ｏｃｔ４（パネルｆ）の発現。胚体内胚葉マーカーの発現は、ｍＲＮＡレベルでアッセイされ、未処理のヒト胚幹細胞内の発現レベルに正規化された。
【図７】分化プロトコルの適用後のヒト胚幹細胞株Ｈ９内の胚体内胚葉マーカーの発現。胚体内胚葉マーカーの発現は、免疫組織化学的検査により検出した。パネル（ａ）及び（ｂ）は、Ｓｏｘ−１７発現。パネル（ｃ）及び（ｄ）は、ＨＮＦ−３β発現。パネル（ｅ）及び（ｆ）は、ＧＡＴＡ４発現。パネル（ｂ）、（ｄ）及び（ｆ）は、ＤＡＰＩによる核の対比染色。「処理済み」の印を示したカラムは、５日間のアクチビンＡ処理（１００ｎｇ／ｍＬ）。「未処理」の印を示したカラムは、未処理の対照。
【図８】第二の分化プロトコルの適用後のヒト胚幹細胞株Ｈ９内の膵臓内胚葉マーカーの発現。膵臓内胚葉マーカーの発現は、ＰＣＲによりアッセイされ、アクチビンＡ処理したヒト胚幹細胞内の発現レベルに正規化された。パネル（ａ）は、Ｐｄｘ１発現。パネル（ｂ）は、ＧＬＵＴ−２発現。パネル（ｃ）は、ＰＴＦ１ａ発現。
【図９】第二の分化プロトコルの適用後のヒト胚幹細胞株Ｈ９内の膵臓内胚葉マーカーの発現。膵臓内胚葉マーカーの発現は、免疫組織化学的検査により検出された。パネル（ａ）は、未処理の対照内のＰｄｘ１発現を示し、パネル（ｂ）は、段階的な分化プロトコルにより処理した培養物内のＰｄｘ１発現を示す。
【図１０】第三の分化プロトコルの適用後のヒト胚幹細胞株Ｈ９内の膵臓内胚葉マーカーの発現。膵臓内胚葉マーカーの発現は、ＰＣＲによりアッセイされ、アクチビンＡ処理したヒト胚幹細胞内の発現レベルに正規化された。パネル（ａ）は、ＮｅｕｒｏＤ１発現。パネル（ｂ）は、Ｎｇｎ３発現。パネル（ｃ）は、インスリン発現。パネル（ｄ）は、Ｈｅｓ−１発現を示し、発現レベルは、膵臓内胚葉細胞に正規化されている。
【図１１】分化プロトコルの適用後のヒト胚幹細胞株Ｈ９内の膵臓内胚葉マーカーの発現。膵臓内胚葉マーカーの発現は、ＰＣＲによりアッセイされ、アクチビンＡ処理したヒト胚幹細胞内の発現レベルに正規化された。パネル（ａ）は、Ｎｋｘ２．２発現。パネル（ｂ）は、Ｐｄｘ１発現。
【図１２】培養物中の各継代（Ｐ０、Ｐ１及びＰ２）を伴う、細胞内のＰＤＸ−１の発現。ＰＤＸ−１の発現は、ＰＣＲによりアッセイされ、アクチビンＡ処理したヒト胚幹細胞内の発現レベルに正規化された。
【図１３】第三の分化プロトコルの適用後のヒト胚幹細胞株Ｈ９内の肝細胞マーカーの発現。肝細胞マーカーの発現は、ＰＣＲによりアッセイされ、アクチビンＡ処理したヒト胚幹細胞内の発現レベルに正規化された。パネル（ａ）は、ＡＦＰ発現。パネル（ｂ）は、アルブミン発現。
【図１４】ヒト胚幹細胞株Ｈ９内の多能性マーカーの発現。多能性マーカーの発現は、免疫組織化学的検査によりアッセイされた。パネル（ａ）は、Ｏｃｔ−４発現。パネル（ｂ）は、アルカリホスファターゼ発現。
【図１５】ヒト胚細胞株Ｈ９の核型。核型は、マウス胚線維芽細胞フィーダー細胞上で培養した、継代数Ｐ３６における細胞上で決定した。
【図１６】ヒト胚幹細胞が無フィーダーシステム中で胚体内胚葉に分化される、本発明の分化プロトコルの概略。
【図１７】様々な濃度のＭＡＴＲＩＧＥＬ上で培養され、（０．５〜２％）低血清及び高アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）に５日間暴露された、継代数４４におけるヒト胚幹細胞株Ｈ９のＦＡＣＳプロファイル。胚体（definite）内胚葉マーカーＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）の発現はＹ−軸上に示され、ＥＳマーカーＣＤ９の発現はＸ−軸上に示される。
【図１８】１：１０希釈のＭＡＴＲＩＧＥＬ（■）、１：２０希釈のＭＡＴＲＩＧＥＬ（■）、又は１：３０希釈のＭＡＴＲＩＧＥＬ（□）上で培養され、実施例１４に開示した分化プロトコルに暴露された、継代４４におけるヒト胚幹細胞株Ｈ９の培養物からの胚体内胚葉のマーカーに関するリアルタイムＰＣＲ結果。誘導率（fold induction）は、マウス胚線維芽細胞を使用して馴化（condition）した培地中で培養した、継代数４４におけるヒト胚幹細胞株Ｈ９の未分化細胞に対するもの。
【図１９】未分化多能性幹細胞内及び多能性幹細胞の分化から得られた胚体内胚葉細胞内の全体的な遺伝子発現に関する散布図。示したデータは、マウス胚線維芽細胞上で培養された継代４４（右パネル）及びＭＡＴＲＩＧＥＬ上で培養された継代８３（左パネル）におけるヒト胚幹細胞株Ｈ９細胞株の培養物からのもの。
【図２０】実施例４に開示した胚体内胚葉分化プロトコルに暴露した、マウス胚線維芽細胞フィーダー細胞上で培養されたヒト胚幹細胞株Ｈ１（パネルａ）ヒト胚幹細胞株Ｈ７（パネルｂ）、及びヒト胚幹細胞株Ｈ９（パネルｃ）に関する、ＦＡＣＳによる５日目のＣＸＣＲ４発現。
【図２１】マウス胚線維芽細胞フィーダー細胞上で培養した、ヒト胚幹細胞株Ｈ７（パネルａ）及びヒト胚幹細胞株Ｈ９（パネルｂ）の培養物における、指定した胚体内胚葉マーカーの発現のリアルタイムＰＣＲ結果。結果は、未分化細胞に関する倍増値（fold increase）として表される。
【図２２】ＭＡＴＲＩＧＥＬ（１：３０希釈）上で培養され、実施例４に開示した分化プロトコルに暴露されたヒト胚幹細胞株Ｈ１（パネルａ）、ヒト胚幹細胞株Ｈ７（パネルｂ）、及びヒト胚幹細胞株Ｈ９（パネルｃ）に関する、ＦＡＣＳによる５日目のＣＸＣＲ４の発現。
【図２３】ヒト胚幹細胞株Ｈ７（パネルａ）及びヒト胚幹細胞株Ｈ９（パネルｂ）及びヒト胚幹細胞株Ｈ１（パネルｃ）の培養物における指定した胚体内胚葉マーカーの発現のリアルタイムＰＣＲ結果。結果は、未分化細胞に関する倍増値として表される。細胞は、実施例４に開示した方法に従って処理された。
【図２４】１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（パネルａ）又は１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ＋２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３ａ（パネルｂ）の存在下での、継代４６のヒト胚幹細胞株Ｈ９の培養物の位相コントラスト画像。細胞は、５日間処理された。
【図２５】実施例４に開示した方法による処理後の、継代４４のヒト胚幹細胞株Ｈ７（パネルａ及びｂ）及び継代４６のＨ９（パネルｃ及びｄ）の培養物におけるＦＡＣＳによるＣＸＣＲ４の発現。パネルｂ及びパネルｄは、ＣＸＣＲ４発現上の２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａの効果。パネルａ及びパネルｃは、Ｗｎｔ−３ａ不在下でのＣＸＣＲ４発現。結果は、処理から５日後に得られた。
【図２６】ヒト胚幹細胞株Ｈ７（パネルａ）及びＨ９（パネルｂ）の培養物における指定した遺伝子の発現に関するリアルタイムＰＣＲデータ。培養物は、実施例４に開示した分化プロトコルにより処理した。Ｗｎｔ作動薬Ｗｎｔ−３ａ（２０ｎｇ／ｍＬ）、Ｗｎｔ−５ａ（２０ｎｇ／ｍＬ）及びＷｎｔ−７ａ（２０ｎｇ／ｍＬ）の効果も、パネル内に指定したように試験した。細胞は、５日間処理した。結果は、未分化細胞に関する倍増値として表される。
【図２７】処理の５日後の継代４６のヒト胚幹細胞株Ｈ９の培養物におけるＦＡＣＳによるＣＸＣＲ４の発現。パネル（ａ）は、Ｗｎｔ−３ａ不在下でのＣＸＣＲ４発現。パネル（ｂ）は、１０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３ａによる処理後のＣＸＣＲ４発現。パネル（ｃ）は、２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３ａによる処理後のＣＸＣＲ４発現を示し、パネル（ｄ）は、５０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３ａによる処理後のＣＸＣＲ４発現を示す。
【図２８】処理５日後のヒト胚幹細胞株Ｈ９の培養物における指定された最終的なマーカーの発現。結果は、リアルタイムＰＣＲにより測定された、発現における未処理細胞に関する倍増値として示される。パネル（ａ）は、１０、２０及び５０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３ａの、指定した胚体内胚葉マーカー遺伝子の発現上の効果。パネル（ｂ）は、１、５又は１０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３ａ（ｘ−軸ラベル：１０、５、１）の、処理の２日後（２ｄ）及び５日後（５ｄ）のグースコイド（■）発現及びＣＸＣＲ４（□）発現上の効果。パネル（ｃ）は、１、５又は１０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３ａの、２日目（□）又は５日目（■）における細胞数上の効果。
【図２９】実施例４に開示した分化プロトコルによる５日間の処理後の、ＦＡＣＳによるヒト胚幹細胞株Ｈ９の培養物におけるＣＸＣＲ４の発現。細胞は、Ｗｎｔ−３ａ又はＧＳＫ−３Ｂ阻害剤の不在下（パネルａ）、２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３Ａで全５日間（パネルｂ）、１０００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸで全５日間（パネルｃ）、５００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸで全５日間（パネルｄ）、１００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸで全５日間（パネルｅ）、１０ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸで全５日間（パネルｆ）、１００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸで１〜２日目（パネルｇ）、１０ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸで１〜２日目（パネルｈ）培養された。
【図３０】リアルタイムＰＣＲによる胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現。結果は、未処理の細胞に関する倍増値として表される。パネル（ａ）は、Ｗｎｔ−３ａ又はＧＳＫ−３Ｂ阻害剤を指定した濃度及び時間にて含む、実施例４に開示した胚体内胚葉プロトコルで処理した、継代数４８におけるヒト胚細胞株Ｈ９から得られたデータ。パネル（ｂ）は、Ｗｎｔ−３ａ又はＧＳＫ−３Ｂ阻害剤を指定された濃度及び時間にて含む、実施例４に開示した胚体内胚葉プロトコルで処理した、継代数４６におけるヒト胚細胞株Ｈ９から得られたデータ。
【図３１】本発明で使用される胚幹細胞株に関するＦＡＣＳによるＣＸＣＲ４の発現。パネル（ａ）〜（ｄ）は、継代数４９におけるヒト胚幹細胞株Ｈ９から得られたデータ。パネル（ｅ）〜（ｆ）は、継代数４６におけるヒト胚幹細胞株Ｈ１から得られたデータ。データは、処理の５日後に得られた。細胞は以下の条件で処理した：パネル（ａ）：１０ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで全５日間＋２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａで最初の２日間；パネル（ｂ）：１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで全５日間＋２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａで最初の２日間；パネル（ｃ）：１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで全５日間＋１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸで最初の２日間；パネル（ｄ）：１０ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで全５日間＋１００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ  ＩＸ阻害剤で最初の２日間、パネル（ｅ）：１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで全５日間＋２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａで最初の２日間、パネル（ｆ）：１０ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで全５日間＋２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａで最初の２日間。
【図３２】１０、５０、又は１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ＋２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａで処理した、継代４９におけるヒト胚幹細胞株Ｈ９の培養物に関するリアルタイムＰＣＲで測定した胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現。パネル（ａ）はＡＦＰ、Ｂｒｙ、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、ＨＮＦ−３Ｂ、及びＰＯＵ５Ｆ（Ｏｃｔ−４）、パネル（ｂ）ＳＯＸ−１７及びＧＡＴＡ４の発現。結果は、未処理の細胞に関する倍増値として表される。
【図３３】継代５３における胚幹細胞Ｈ９に関するＦＡＣＳによるＣＸＣＲ４の発現。データは、処置の５日後に得られた。細胞は、以下の条件で処理した：パネル（ａ）：１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで全５日間＋２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａで最初の２日間及び２５ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ−４で３〜５日間；パネル（ｂ）：１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで全５日間＋２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａで最初の２日間；パネル（ｃ）：１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで全５日間＋１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸで最初の２日間；パネル（ｄ）：２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３ａ＋２５ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ−４で全５日間；パネル（ｅ）：１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで全５日間＋２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａ＋１００ｎｍ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸで最初の２日間、パネル（ｆ）：１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ＋２５ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ−４で全５日間。全パネルに関して、Ｘ−軸はＣＤ９の発現を表し、Ｙ−軸はＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）の発現を表す。
【図３４】１０又は１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ＋２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａ又は１００ＮＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤で処理した、継代４６におけるヒト胚幹細胞株Ｈ１の培養物に開する、リアルタイムＰＣＲにより測定した胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現。パネル（ａ）：ＡＦＰ、Ｂｒｙ、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、及びＰＯＵ５Ｆ（Ｏｃｔ−４）、パネル（ｂ）：ＳＯＸ−１７、ＨＮＦ−３Ｂ、及びＧＡＴＡ４の発現。結果は、未処理の細胞に関する倍増値として表される。
【図３５】５０又は１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ＋１０又は１００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤で処理した、継代４９におけるヒト胚幹細胞株Ｈ９の培養物に開する、リアルタイムＰＣＲにより測定した胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現。パネル（ａ）：ＡＦＰ、Ｂｒｙ、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、ＨＮＦ−３Ｂ、及びＰＯＵ５Ｆ（Ｏｃｔ−４）、パネル（ｂ）：ＳＯＸ−１７及びＧＡＴＡ４の発現。結果は、未処理の細胞に関する倍増値として表される。
【図３６】アクチビンＡ、Ｗｎｔ−３ａ、ＧＳＫ−３阻害剤、及びＢＭＰ−４の組み合わせで５日間処理した、継代５３におけるヒト胚幹細胞株Ｈ９の培養物に関するリアルタイムＰＣＲにより測定した胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現。パネル（ａ）：ＡＦＰ、Ｂｒｙ、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、ＨＮＦ−３Ｂ、及びＳＯＸ７、パネル（ｂ）：ＳＯＸ−１７、ＨＮＦ−３Ｂ及びＧＡＴＡ４の発現。
【図３７】実施例２２に列挙した条件で処理したヒト胚幹細胞株Ｈ９の培養物における、ＦＡＣＳにより測定したＣＸＣＲ４発現の百分率。
【図３８】フィブロネクチン（パネルａ）又はＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（パネルｂ）上で培養したヒト胚幹細胞株Ｈ９の培養物における、ＦＡＣＳにより測定した胚体内胚葉マーカーの発現。
【図３９】フィブロネクチン（□）又は１：１０希釈の増殖因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬ（■）上で培養されたヒト胚幹細胞株Ｈ９の培養物における、リアルタイムＰＣＲにより測定した胚体内胚葉マーカーの発現。
【図４０】ヒト胚幹細胞の胚体内胚葉への分化に対する、低血清、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ及び２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａの存在下での様々な濃度のＭＡＴＲＩＧＥＬの効果。細胞は、実施例４に開示した方法に従って処理された。示した結果は、リアルタイムＰＣＲにより測定した、指定した遺伝子の発現レベル。
【図４１−１】ＭＡＴＲＩＧＥＬ上に維持されたが、マウス胚線維芽細胞上で分化されたヒト胚幹細胞による胚体内胚葉形成におけるＷｎｔ−３ａの役割。パネル（ａ）〜（ｄ）は、指定した遺伝子に関するリアルタイムＰＣＲデータ。パネル（ｅ）〜（ｇ）は、指定した条件に関するＦＡＣＳデータ。
【図４１−２】ＭＡＴＲＩＧＥＬ上に維持されたが、マウス胚線維芽細胞上で分化されたヒト胚幹細胞による胚体内胚葉形成におけるＷｎｔ−３ａの役割。パネル（ａ）〜（ｄ）は、指定した遺伝子に関するリアルタイムＰＣＲデータ。パネル（ｅ）〜（ｇ）は、指定した条件に関するＦＡＣＳデータ。
【図４１−３】ＭＡＴＲＩＧＥＬ上に維持されたが、マウス胚線維芽細胞上で分化されたヒト胚幹細胞による胚体内胚葉形成におけるＷｎｔ−３ａの役割。パネル（ａ）〜（ｄ）は、指定した遺伝子に関するリアルタイムＰＣＲデータ。パネル（ｅ）〜（ｇ）は、指定した条件に関するＦＡＣＳデータ。
【図４１−４】ＭＡＴＲＩＧＥＬ上に維持されたが、マウス胚線維芽細胞上で分化されたヒト胚幹細胞による胚体内胚葉形成におけるＷｎｔ−３ａの役割。パネル（ａ）〜（ｄ）は、指定した遺伝子に関するリアルタイムＰＣＲデータ。パネル（ｅ）〜（ｇ）は、指定した条件に関するＦＡＣＳデータ。
【図４２】Ｗｎｔ阻害剤ＤＫＫ−１による処理後、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）で被覆された組織培養基質上で培養された、ヒト胚幹細胞の胚体内胚葉への分化。示した結果は、リアルタイムＰＣＲで測定した、２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３Ａ＋１００ｎｇ／ｍＬのＤＫＫ１（ＤＥ＋ＤＫＫ１）の存在下、又はＤＫＫ１（ＤＥ）の不在下で、実施例４に開示した方法に従って処理されたＨ９細胞内の指定した遺伝子の発現。
【図４３】ＭＡＴＲＩＧＥＬで被覆された組織培養基質上で培養され、２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａを含まない（パネルａ）、又は２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａを含む（パネルｂ）、低血清＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ中で分化された、ヒト胚幹細胞株Ｈ９の培養液物における胚体内胚葉マーカーの蛍光免疫染色。Ｅｃａｄ＝Ｅ−カドヘリン、ＮＣＡＭ＝Ｎ−カドヘリン。
【図４４】継代３８におけるヒト胚幹細胞株ＳＡ００２の胚体内胚葉への分化。細胞は、指定した条件で５日間処理され、遺伝子発現は、パネル内に示した遺伝子に関して、リアルタイムＰＣＲにより測定された。
【図４５】１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（パネルａ）、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ＋２０ｎｇ／ｍＬＷｎｔ−３ａ（パネルｂ）、又は１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ＋１００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ（パネルｃ）で処理した後の、継代３８におけるヒト胚幹細胞株ＳＡ００２におけるＦＡＣＳによるＣＸＣＲ４の発現。細胞は、５日間処理された。
【図４６】継代５５における、ヒト血清で被覆した組織培養基質上でのヒト胚幹細胞株Ｈ１の胚体内胚葉への分化。細胞は指定した条件で処理され、遺伝子発現は、パネル内に示した遺伝子に関してリアルタイムＰＣＲにより測定された。
【図４７】Ｐ５４における、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）で被覆された組織培養基質上の、ヒト胚幹細胞株Ｈ１の培養物の胚体内胚葉への分化。５日間のＤＥプロトコル後に、様々なＧＳＫ−Ｂ阻害剤の効果を試験した。次のＧＳＫ−３Ｂ阻害剤が、処理の最初の２日間、１００ｎＭにて評価された：ＧＳＫ−３Ｂ  ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ、及びＸＩＩ。
【図４８】実施例４に開示した方法に従って、処理の最初の２日間、２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａの存在下で培養及び処理した、継代４９におけるヒト胚幹細胞株Ｈ９の培養物におけるＡＦＰ（パネルａ）、Ｐｄｘ−１（パネルｂ）、Ｃｄｘ−２及びＧｌｕｔ−２（パネルｃ）、並びにＨＮＦ−３β、ＨＮＦ−６及びソマトスタチン（パネルｄ）の発現。処理後、２％ＦＢＳ＋１μＭレチノイン酸、０．１〜１μＭ  ＴＴＮＰＢ（４−［（Ｅ）−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−プロペニル］安息香酸アロチノイド酸（Arotinoid acid））、又は０．１〜１０μＭ  ＡＭ−５８０（４−［（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸）により、細胞を更に３日間処理した。次に、２％ＦＢＳ＋２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ中で、細胞を更に３日間処理した。
【図４９】アクチビンＡ及びＷｎｔ−１で指定した時間及び濃度にて処理した、ヒト胚幹細胞株Ｈ１の培養物における、パネルａ及びパネルｂに示した胚体内胚葉マーカーの発現のリアルタイムＰＣＲ結果。
【図５０】分化培地又は低血清ベースの分化培地に暴露された、ＥＸＰＲＥＳ０１、ＢＧＯ１Ｖ、及びＨ１  Ｐ５０細胞株に関する、ＦＡＣＳによる４〜５日目のＣＸＣＲ４及びＣＤ９の発現。
【図５１】低血清又は合成培地＋アクチビンＡ＋ＷＮＴ３Ａで処理された、４〜５日目のＥＸＰＲＥＳ０１、ＢＧＯ１Ｖ、及びＨ１培養物に関するリアルタイムＰＣＲデータ。
【図５２】１％ｂ２７＋ＤＭ−Ｆ１２＋アクチビンＡ＋ＷＮＴ３Ａ＋ＧＳＫ０３Ｂ阻害剤を使用して５日間ＤＥに分化させたＥＸＰＲＥＳ  ０１  Ｐ４９細胞の免疫蛍光画像。
【図５３−１】低血清＋アクチビンＡ又は合成培地＋アクチビンＡのいずれかに暴露された、１〜５日目のＨ１細胞に関するリアルタイムＰＣＲデータ。
【図５３−２】低血清＋アクチビンＡ又は合成培地＋アクチビンＡのいずれかに暴露された、１〜５日目のＨ１細胞に関するリアルタイムＰＣＲデータ。
【図５３−３】低血清＋アクチビンＡ又は合成培地＋アクチビンＡのいずれかに暴露された、１〜５日目のＨ１細胞に関するリアルタイムＰＣＲデータ。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
開示の明確さのため、また限定を目的とすることなく、本発明の詳細な説明は、本発明の所定の特徴、実施形態、又は適用を記載し又は説明するサブセクションに分割される。
【００２９】
定義
幹細胞は、単一の細胞レベルにて自己複製し、分化して後代細胞を生成する、それら両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系統の機能的細胞に分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞への注入後、全部ではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。
【００３０】
幹細胞は、それらの発達能力により：（１）全胚及び胚体外細胞型を生じる能力を意味する全能性；（２）全胚細胞型を生じる能力を意味する多能性；（３）細胞系統の小集合を生じるが、全て特定の組織、器官又は生理的システム内で生じる能力を有することを意味する多能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己複製）、血液細胞に限定された寡能性前駆細胞、並びに血液の通常の構成要素である全細胞型及び要素（例えば、血小板）を含む子孫を産生できる）；（４）多能性幹細胞と比較して限定された細胞系統の小集合を生じる能力を有することを意味する寡能性；並びに（５）１つの細胞系統を生じる能力を有することを意味する単能性（例えば、精子形成幹細胞）に分類される。
【００３１】
分化は、非特殊化の（「中立の」）又は比較的特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞等の特殊化した細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した、又は分化を誘発された細胞は、細胞系統内でより特殊化した（「傾倒した」）状況を呈している細胞である。分化プロセスに適用した際の用語「傾倒した」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化し、又はより分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系統内で比較的特殊化されて（又は傾倒して）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用される場合、細胞系統は、細胞の遺伝、即ちその細胞がどの細胞から来たか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。細胞系統は、細胞を発達及び分化の遺伝的スキーム内に配置する。系統特異的なマーカーは、関心対象の細胞の表現型に特異的に関連した特徴を指し、中立細胞の関心対象系統への分化を評価する際に使用することができる。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「ＡＦＰ」又は「α−フェトプロテインタンパク質」は、肝臓発達の開始時に産生される抗原を指す。ＡＦＰは、胚体外細胞内にも発現され得る。
【００３３】
「アルブミン」は、成人の全血清タンパク質の約半分を占める可溶性の単量体タンパク質である。
【００３４】
「β−細胞系統」は、転写因子ＰＤＸ−１と、以下の転写因子：ＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４、及びＰａｘ６の少なくとも１つとに関する遺伝子発現が陽性の細胞を指す。β細胞系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、β細胞を含む。
【００３５】
本明細書で使用される場合「短尾奇形」は、Ｔボックス遺伝子ファミリーのメンバーである。これは、原始線条及び中胚葉細胞に関するマーカーである。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞」は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現している細胞を指す：ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ−４、ＨＮＦ−３β、ＧＳＣ、Ｃｅｒ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ−様ホメオボックスタンパク質（Mix-like homeobox protein）、ＦＧＦ４  ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、又はＯＴＸ２。内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞を含む。
【００３７】
「ｃ−Ｋｉ」及び「ＣＤ１１７」は、両方とも、ジェンバンク受入番号Ｘ０６１８２に開示されている配列、又はその天然に存在する変異体配列（例えば、対立遺伝子変異体）を有する細胞表面受容体チロシンキナーゼを指す。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ９９」は、受入番号ＮＭ＿００２４１４を有する遺伝子によりコードされるタンパク質を指す。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞」は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現している細胞を指す：ＰＤＸ−１、ＨＮＦ−１β、ＰＴＦ−１α、ＨＮＦ−６、又はＨＢ９。膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉細胞を含む。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞」は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現している細胞を指す：ＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌｅｔ−１、ＰＤＸ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、又はＰＴＦ−１α。膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞、及び膵臓ホルモン分泌細胞、並びにβ−細胞系統の細胞を含む。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「Ｃｅｒ１」又は「Ｃｅｒｅｂｒｕｓ」は、タンパク質のシステインノットスーパーファミリーのメンバーである。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「ＣＸＣＲ４」は、間質細胞誘導による因子１（ＳＤＦ−１）受容体を指し、「ＬＥＳＴＲ」又は「フーシン」としても公知である。原腸を形成するマウス胚において、ＣＸＣＲ４は胚体内胚葉及び中胚葉内に発現されるが、胚体外内胚葉内には発現されない。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカーを発現する：ＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ−４、ＳＯＸ−１７、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＯＴＸ２、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭｉｘｌ１。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「胚体外内胚葉」は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現している細胞の集団を指す：ＳＯＸ−７、ＡＦＰ、及びＳＰＡＲＣ。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「ＦＧＦ−２」「ＦＧＦ−４」「ＦＧＦ−８」「ＦＧＦ−１０」及び「ＦＧＦ−１７」は、繊維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーである。
【００４６】
「ＧＡＴＡ−４」及び「ＧＡＴＡ−６」は、ＧＡＴＡ転写因子ファミリーのメンバーである。この転写因子のファミリーは、ＴＧＦ−βシグナル伝達により誘発され、早期の内胚葉マーカーの維持に寄与する。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「ＧＬＵＴ−２」は、膵臓、肝臓、腸、脳、及び腎臓を含む、胎児及び成人の多数の組織内にて発現されるブドウ糖輸送体分子を指す。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「グースコイド」又は「ＧＳＣ」は、原口背唇内に発現されたホメオドメイン転写因子を指す。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「ＨＢ９」は、ホメオボックス遺伝子９を指す。
【００５０】
「ＨＮＦ−１α」「ＨＮＦ−１β」「ＨＮＦ−３β」及び「ＨＮＦ−６」は、転写因子の肝臓核因子ファミリーに属し、高度に保護されたＤＮＡ結合ドメインと２つの短いカルボキシ−末端ドメインにより特徴付けられる。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「Ｉｓｌｅｔ−１」又は「Ｉｓｌ−１」は、転写因子のＬＩＭ／ホメオドメインファミリーのメンバーであり、発達中の膵臓内に発現される。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「ＭａｆＡ」は、膵臓内に発現された転写因子であり、インスリンの生合成及び分泌に関与する遺伝子の発現を制御する。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「マーカー」は、関心対象の細胞内で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。本文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーのレベルの増大及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。検出可能なレベルのマーカー核酸又はポリペプチドは、他の細胞と比較して関心対象の細胞内で十分高く又は低く、そのため当技術分野で公知の多様な方法のいずれかを使用して、関心対象の細胞を他の細胞から識別及び区別することができる。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「中内胚葉細胞」は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現している細胞を指す：ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＳＯＸ−１７、ＤＫＫ４、ＨＮＦ−３β、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「Ｍｉｘｌ１」は、原始線条、中胚葉、及び内胚葉内の細胞のマーカーであるホメオボックス遺伝子を指す。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「ＮｅｕｒｏＤ」は、ニューロン新生に関わる塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス（ｂＨＬＨ）転写因子である。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「ＮＧＮ−３」は、塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス転写因子のニューロゲニンファミリーのメンバーである。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「Ｎｋｘ−２．２」及び「Ｎｋｘ−６．１」は、Ｎｋｘ転写因子ファミリーのメンバーである。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「Ｎｏｄａｌ」は、タンパク質のＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーである。
【００６０】
「Ｏｃｔ−４」は、ＰＯＵ−ドメイン転写因子のメンバーであり、多能性幹細胞の証明（hallmark）であると広く見なされている。Ｏｃｔ−４と多能性幹細胞との関係は、その発現が未分化多能性幹細胞に固く制限されていることによって示される。体細胞系統に分化した後、Ｏｃｔ−４の発現は急速に消失する。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「膵臓内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」は、以下のホルモンの少なくとも１つを発現することができる細胞を指す：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「膵臓ホルモン分泌細胞」は、以下のホルモンの少なくとも１つを分泌できる細胞を指す：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「Ｐａｘ−４」及び「Ｐａｘ−６」は、膵島発達に関与する、膵臓β細胞に特異的な転写因子である。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「ＰＤＸ−１」は、膵臓発達に関与するホメオドメイン転写因子を指す。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「前原始線条細胞」は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現している細胞を指す：Ｎｏｄａｌ、又はＦＧＦ８。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「原始線条細胞」は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現している細胞を指す：短尾奇形、Ｍｉｘ−様ホメオボックスタンパク質、又はＦＧＦ４。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「ＰＴＦ−１α」は、三量体の膵臓転写因子−１（ＰＴＦ１）の配列特異的なＤＮＡ結合サブユニットである、４８ｋＤの塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックスタンパク質を指す。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「ＳＯＸ−１」「ＳＯＸ−２」「ＳＯＸ−７」及び「ＳＯＸ−１７」は、ＳＯＸ転写因子ファミリーのメンバーであり、胚発生に関与している。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「ＳＰＡＲＣ」は、「酸性の、システインに富んだ分泌タンパク質」としても公知である。
【００７０】
「ＳＳＥＡ−１」（段階特異的な胚抗原−１）は、ハツカネズミ奇形癌幹細胞（ＥＣ）、ハツカネズミ及びヒト胚生殖細胞（ＥＧ）、並びにハツカネズミ胚幹細胞（ＥＳ）の表面上に存在する糖脂質表面抗原である。
【００７１】
「ＳＳＥＡ−３」（段階特異的な胚抗原−３）は、ヒト奇形癌幹細胞（ＥＣ）、ヒト胚生殖細胞（ＥＧ）、及びヒト胚幹細胞（ＥＳ）の表面上に存在する糖脂質表面抗原である。
【００７２】
「ＳＳＥＡ−４」（段階特異的な胚抗原−４）は、ヒト奇形癌幹細胞（ＥＣ）、ヒト胚生殖細胞（ＥＧ）、及びヒト胚幹細胞（ＥＳ）の表面上に存在する糖脂質表面抗原である。
【００７３】
「ＴＲＡ１−６０」は、ヒト奇形癌幹細胞（ＥＣ）、ヒト胚生殖細胞（ＥＧ）、及びヒト胚幹細胞（ＥＳ）の表面上に発現するケラチン硫酸塩関連の抗原である。
【００７４】
「ＴＲＡ１−８１」は、ヒト奇形癌幹細胞（ＥＣ）、ヒト胚生殖細胞（ＥＧ）、及びヒト胚幹細胞（ＥＳ）の表面上に発現するケラチン硫酸塩関連の抗原である。
【００７５】
「ＴＲＡ２−４９」は、ヒト奇形癌幹細胞（ＥＣ）及びヒト胚幹細胞（ＥＳ）の表面に発現されるアルカリホスファターゼアイソザイムである。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「ＵＴＦ−１」は、多能性胚幹細胞及び胚体外細胞内に発現される転写共役因子を指す。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「Ｚｉｃ１」は、Ｚｉｃ転写因子ファミリーのメンバーである。Ｚｉｃ１は、神経及び神経堤に特異的な遺伝子の発現を調節し、背側神経管及び遊走前（premigratory）神経堤の細胞内に発現される。
【００７８】
多能性幹細胞の単離、拡張及び培養
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、段階特異的な胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４の１つ以上と、Ｔｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と指定された抗体を使用して検出可能なマーカーとを発現し得る（トムソン（Thomson）ら、サイエンス（Science）２８２：１１４５、１９９８）。インビトロでの多能性幹細胞の分化は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１の発現（存在する場合）を消失させ、ＳＳＥＡ−１の発現を増大させる。未分化多能性幹細胞は、一般にアルカリホスファターゼ活性を有し、これは、製造業者（ベクター・ラボラトリーズ（Vector Laboratories）、バーリンゲーム（Burlingame）、カリフォルニア州）により説明されるように、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、基質としてＶｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄを使用して展開することにより検出することができる。未分化多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲで検出されるように、一般にＯｃｔ−４及びＴＥＲＴも発現する。
【００７９】
増殖した多能性幹細胞の他の望ましい表現型は、３つの全胚葉：内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の細胞に分化する可能性である。多能性幹細胞の多能性は、例えば細胞を重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに注入し、４％パラホルムアルデヒドを使用して、形成された奇形腫を固定した後、それらを３つの胚葉からの細胞型の痕跡に関して組織学的に検査することにより確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成し、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。
【００８０】
増殖した多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用して核型を決定することができ、確立された対応する霊長類種の核型と比較される。「正常な核型」を有する細胞を獲得することが望ましく、これは細胞が正倍数体であることを意味し、全ヒト染色体が存在しかつ著しく変更されてはいない。
【００８１】
多能性幹細胞の源
使用できる多能性幹細胞の種類は、妊娠後に形成された組織由来の多能性幹細胞の樹立された株を含み、この組織には、前胚組織（例えば胚盤胞）、胚組織、又は妊娠中の任意の時、一般には非限定的に妊娠約１０〜１２週の前である時に取った胎児組織が含まれる。非限定的な例は、例えばヒト胚幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９（ワイセル（WiCell））等のヒト胚幹細胞又はヒト胚生殖細胞の樹立株である。それらの細胞の最初の樹立又は安定化中に本開示の組成物を使用することも想定され、その場合、源となる細胞は、源となる組織から直接採取した一次多能性細胞であろう。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例えば、ＢＧ０１ｖ（ブレサゲン（BresaGen）、ジョージア州アセンズ）等の変異ヒト胚幹細胞株も好適である。
【００８２】
一実施形態において、ヒト胚幹細胞は、トムソン（Thomson）ら（米国特許第５，８４３，７８０号；サイエンス（Science）２８２：１１４５、１９９８年；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３ｆｆ．、１９９８年；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７８４４、１９９５年）に記載されているように調製される。
【００８３】
多能性幹細胞の培養
一実施形態において、多能性幹細胞は、一般にフィーダー細胞の層上で培養され、このフィーダー細胞は、多能性幹細胞を様々な方法で支持する。代替的に、多能性幹細胞は、基本的にフィーダー細胞が存在しないにも関わらず、ほぼ分化を受けないで多能性幹細胞の増殖を支持する培養液システム中で培養される。無フィーダー培養液中での分化なしでの多能性幹細胞の増殖は、以前に他の一細胞型で培養することによって馴化された培地を使用して支持される。代替的に、無フィーダー培養液中での分化なしでの多能性幹細胞の増殖は、合成培地を使用して支持される。一実施形態において、無フィーダー培養液中での分化なしでの多能性幹細胞の増殖は、Ｂ２７で補充された培地からなる合成培地を使用して支持される。
【００８４】
例えば、リュービノフ（Reubinoff）ら（ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）１８：３９９〜４０４（２０００年））及びトムソン（Thompson）ら（サイエンス（Science）６、１９９８年１１月：Ｖｏｌ．２８２．ｎｏ．５３９１、ｐｐ．１１４５〜１１４７）は、マウス胚線維芽細胞フィーダー細胞層を使用した、ヒト胚盤胞からの多能性幹細胞株の培養を開示している。
【００８５】
リチャード（Richards）ら（幹細胞（Stem Cells）２１：５４６〜５５６、２００３年）は、１１人の異なるヒト成人、胎児及び新生児のフィーダー細胞層のパネルを、それらのヒト多能性幹細胞培養を支持する能力に関して評価した。リチャードらは：「成人皮膚繊維芽細胞フィーダー上で培養したヒト胚幹細胞株は、ヒト胚幹細胞の形態を保持し、多能性を残していた」と述べている。
【００８６】
米国特許出願公開第２００２００７２１１７号は、無フィーダー培養液中で霊長類多能性幹細胞の増殖を支持する培地を生成する細胞株を開示している。使用される細胞株は、胚組織から得た又は胚幹細胞から分化した間葉系細胞株、及び繊維芽細胞様細胞株である。米国特許出願公開第２００２００７２１１７号はまた、一次フィーダー細胞層としての細胞株の使用も開示している。
【００８７】
別の例において、ワン（Wang）ら（幹細胞（Stem Cells）２３：１２２１〜１２２７、２００５年）は、ヒト胚幹細胞由来のフィーダー細胞層上でのヒト多能性幹細胞の長期間増殖のための方法を開示している。
【００８８】
別の例において、ストイコビッチ（Stojkovic）ら（幹細胞（Stem Cells）２００５  ２３：３０６〜３１４、２００５年）は、ヒト胚幹細胞の自発的分化に由来するフィーダー細胞システムを開示している。
【００８９】
更なる例において、ミヤモト（Miyamoto）ら（幹細胞（Stem Cells）２２：４３３〜４４０、２００４年）は、ヒト胎盤から得られるフィーダー細胞源を開示している。
【００９０】
アミット（Amit）ら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ  ６８：２１５０〜２１５６、２００３年）は、ヒト包皮に由来するフィーダー細胞層を開示している。
【００９１】
別の例において、インズンザ（Inzunza）ら（幹細胞２３：５４４〜５４９、２００５年）は、ヒト出生後包皮繊維芽細胞からのフィーダー細胞層を開示している。
【００９２】
米国特許第６６４２０４８号は、無フィーダー培養液中で、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞の増殖を支持する培地を開示し、そのような培地の生成に有用な細胞も開示している。米国特許第６６４２０４８号は：「本発明は、胚組織から得られた、又は胚幹細胞から分化した間葉系及び繊維芽細胞様の細胞株を含む。そのような細胞株を誘導し、培地を処理し、条件培地を使用して幹細胞を増殖させる方法は、本開示に記載及び説明されている。」と述べている。
【００９３】
別の例において、ＷＯ２００５０１４７９９は、哺乳動物細胞の維持、増殖及び分化のための条件培地を開示している。ＷＯ２００５０１４７９９は：「本発明に従って作製される培地は、ハツカネズミ細胞、特にＭＭＨ（Ｍｅｔハツカネズミ肝細胞）と命名された分化した不死化トランスジェニック肝細胞の細胞分泌活性により馴化される。」と述べている。
【００９４】
別の例において、Ｘｕら（幹細胞２２：９７２−９８０、２００４年）は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を過剰発現するよう遺伝子改変されたヒト胚幹細胞誘導体から得られる条件培地を開示している。
【００９５】
別の例において、米国特許出願公開第２００７００１００１１号は、多能性幹細胞を維持するための合成培地を開示している。
【００９６】
代替的な培養システムは、胚幹細胞の増殖を促進することができる増殖因子で補充された無血清培地を使用する。例えば、Ｃｈｅｏｎら（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ  ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０、２００５年１０月１９日）は、無フィーダー、無血清培養システムを開示し、ここで胚幹細胞は、胚幹細胞の自己複製を誘発することができる異なる増殖因子で補充された非血清代替（ＳＲ）培地中で維持される。
【００９７】
別の例において、レベンシュタイン（Levenstein）ら（幹細胞（Stem Cells）２４：５６８〜５７４、２００６年）は、繊維芽細胞又は条件培地の不在下で、ｂＦＧＦで補充された培地を使用して、胚幹細胞を長期間培養する方法を開示している。
【００９８】
別の例において、米国特許出願公開第２００５０１４８０７０号は、血清及び繊維芽細胞フィーダー細胞方法を含まない合成培地中でのヒト胚幹細胞の培養方法を開示し、同方法は：アルブミン、アミノ酸、ビタミン、無機物、少なくとも１つのトランスフェリン又はトランスフェリン代用物、少なくとも１つのインスリン又はインスリン代用物を含有する培地中で細胞を培養し、この培地は、基本的に哺乳動物胎児血清を含有せず、繊維芽細胞増殖因子シグナル伝達受容体を活性化できる少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬの繊維芽細胞増殖因子を含有し、ここで増殖因子は、繊維芽細胞フィーダー層のみでなく他の源からも供給され、培地はフィーダー細胞又は条件培地なしで、未分化状態の幹細胞の増殖を支持した。
【００９９】
別の例において、米国特許出願公開第２００５０２３３４４６号は、未分化の霊長類始原幹細胞を含む幹細胞の培養に有用な合成培地を開示している。溶液において、培地は、培養されている幹細胞と比較して実質的に等張等浸透圧である。所定の培養おいて、特定の培地は、基本培地と、実質的に未分化の始原幹細胞の増殖の支持に必要な、ある量のｂＦＧＦ、インスリン、及びアスコルビン酸の各々とを含有する。
【０１００】
別の例において、米国特許第６８００４８０号は、「一実施形態において、実質的に未分化状態の霊長類由来の始原幹細胞の増殖のための細胞培地が提供され、この培地は、霊長類由来の始原幹細胞の増殖の支持に有効な低浸透圧、低内毒素の培地を含む。基本培地は、霊長類由来の始原幹細胞とフィーダー細胞の増殖を支持するに有効な栄養血清、及びフィーダー細胞由来の細胞外マトリクス成分からなる群より選択される基質と組み合わされる。培地は、更に、非必須アミノ酸、抗酸化剤、並びにヌクレオシド及びピルビン酸塩からなる群より選択される第一の増殖因子を含有する。」と述べている。
【０１０１】
別の例において、米国特許出願公開第２００５０２４４９６２号は：「一態様において、本発明は、霊長類胚幹細胞の培養方法を提供する。繊維芽細胞フィーダー層のみからでなく他の源から供給された繊維芽細胞増殖因子の存在下、基本的に哺乳動物胎児血清を含まない（また好ましくは、基本的にいかなる動物血清をも含まない）培養液中で幹細胞を培養する。好ましい形態において、以前に幹細胞培養液の支持に必要であった繊維芽細胞フィーダー層は、十分な繊維芽細胞増殖因子を加えることにより不必要となっている。」と述べている。
【０１０２】
更なる例において、ＷＯ２００５０６５３５４は、基本的に無フィーダー無血清である既定された等張培地を開示し、この培地は：ａ．基本培地；ｂ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するに十分な量のｂＦＧＦ；ｃ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞を支持するに十分な量のインスリン；及びｄ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するに十分な量のアスコルビン酸を含有する。
【０１０３】
別の例において、ＷＯ２００５０８６８４５は、未分化の幹細胞を維持するための方法を開示し、同方法は、幹細胞を、細胞を未分化の状態に維持するに十分な量のタンパク質のトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）ファミリーのメンバー、タンパク質の繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバー、又はニコチンアミド（ＮＩＣ）に、所望の結果を達成するに十分な時間、暴露することを含む。
【０１０４】
多能性幹細胞は、好適な培養基質上に播くことができる。一実施形態において、好適な培養基質は、例えば基底膜から誘導されたもの、又は接着分子受容体−リガンド結合の一部を形成し得るもの等の細胞外マトリクス成分である。一実施形態において、好適な培養基質は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickenson））である。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞からの可溶性製剤であり、室温でゲル化して再構成された基底膜を形成する。
【０１０５】
他の細胞外マトリクス成分及び成分混合物は代替物として好適である。増殖させる細胞型に応じて、これは、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫塩、及び同様物を、単独で又は様々な組み合わせで含み得る。
【０１０６】
多能性幹細胞は、細胞の生存、増殖、及び所望の特徴の維持を促進する培地の存在下、基質上に好適な分布にて播かれてもよい。この特徴の全部は、播種分布に細心の注意を払うことから利益を得、当業者は容易に決定することができる。
【０１０７】
好適な培地は以下の構成要素、例えば、ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ修正イーグル培地（ＫＯ  ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃１０８２９−０１８；Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２／５０％  ＤＭＥＭ基本培地；２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ＃１５０３９−０２７；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ  １１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、シグマ（Sigma ）＃Ｍ７５２２；ヒト組み換え塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ＃１３２５６−０２９から作製されてもよい。
【０１０８】
膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞への多能性幹細胞の分化
本発明における使用に好適な多能性幹細胞は、例えばヒト胚幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨ  ｃｏｄｅ：ＷＡ０９）、ヒト胚幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨ  ｃｏｄｅ：ＷＡ０１）、ヒト胚幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨ  ｃｏｄｅ：ＷＡ０７）、及びヒト胚幹細胞株ＳＡ００２（セラーティス（Cellartis）、スェーデン）を含む。また本発明における使用に好適な細胞は、多能性細胞の特徴を示す以下のマーカーの少なくとも１つを発現している細胞である：ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ９、ＦｏｘＤ３、コネキシン４３、コネキシン４５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、Ｔｒａ１−８１。
【０１０９】
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ４、Ｈｎｆ−３β、ＧＳＣ、Ｃｅｒ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ−様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４  ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群より選択される。本発明における使用に好適なものは、胚体内胚葉系統の特徴を示す少なくとも１つのマーカーを発現している細胞である。本発明の一態様において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆体細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。
【０１１０】
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーは、Ｐｄｘ１、ＨＮＦ−１β、ＰＴＦ１ａ、ＨＮＦ−６、ＨＢ９及びＰＲＯＸ１からなる群より選択される。本発明における使用に好適なものは、膵臓内胚葉系統の特徴を示す少なくとも１つのマーカーを発現している細胞である。本発明の一態様において、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉細胞である。
【０１１１】
膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌｅｔ−１、Ｐｄｘ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、及びＰＴＦ−１αからなる群より選択される。一実施形態において、膵臓内分泌細胞は、以下のホルモンの少なくとも１つを発現することができる：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド。本発明で使用するに好適なものは、膵臓内分泌系統の特徴を示すマーカーを少なくとも１つ発現する細胞である。本発明の一態様において、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内分泌細胞である。膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってもよい。代替的に、膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。
【０１１２】
本発明の一態様において、膵臓内分泌細胞は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現している細胞である。β細胞系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、Ｐｄｘ１と、以下の転写因子の少なくとも１つを発現する：ＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４、及びＰａｘ６。本発明の一態様において、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、β細胞である。
【０１１３】
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
多能性幹細胞は、当技術分野における任意の方法、又は本発明で提案される任意の方法により、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。
【０１１４】
例えば、多能性幹細胞は、ダムール（D'Amour）ら、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）２３、１５３４〜１５４１（２００５年）に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。
【０１１５】
例えば、多能性幹細胞は、シノザキ（Shinozaki）らＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１、１６５１〜１６６２（２００４年）に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。
【０１１６】
例えば、多能性幹細胞は、マクリーン（McLean）ら、幹細胞（stem cells）２５、２９〜３８（２００７年）に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。
【０１１７】
例えば、多能性幹細胞は、ダムール（D'Amour）らネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。
【０１１８】
例えば、多能性幹細胞は、多能性幹細胞を、血清の不在下、アクチビンＡを含有する培地中で培養し、次に細胞をアクチビンＡ及び血清と共に培養し、次に細胞を異なる濃度のアクチビンＡ及び血清と共に培養することにより、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。この方法の例は、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）２３、１５３４〜１５４１（２００５年）に開示されている。
【０１１９】
例えば、多能性幹細胞は、多能性幹細胞を、血清の不在下、アクチビンＡを含有する培地中で培養し、次に細胞を、別の濃度の、血清を含むアクチビンＡと共に培養することにより、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。この方法の例は、ダムール（D' Amour）らによるネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）、２００５年に開示されている。
【０１２０】
例えば、多能性幹細胞は、多能性幹細胞を、血清の不在下、アクチビンＡ及びＷｎｔリガンドを含有する培地中で培養し、次にＷｎｔリガンドを除去し、細胞を血清を含むアクチビンＡと共に培養することにより、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。この方法の例は、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている。
【０１２１】
本発明の一態様において、多能性幹細胞は、多能性幹細胞を、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上に播種し、次に多能性幹細胞を、血清を含有する第一の培地中でアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと共にある期間培養し、次に多能性幹細胞を、より高い濃度の血清を含有する第二の培地中で、アクチビンＡと共に更にある期間培養することにより、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。
【０１２２】
上記に開示した第一の培地中の血清の濃度は、約０〜約０．５％であってもよく、培養時間は、約１〜約３日間であってもよい。上記に開示した第二の培地中の血清の濃度は、約０．５％〜約２％あってもよく、培養時間は、約１〜約４日間であってもよい。
【０１２３】
本発明の代替的な実施形態において、多能性幹細胞は、多能性幹細胞を、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上に播き、次に多能性幹細胞を血清を含有する第一の培地中でアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと共にある期間培養し、次に多能性幹細胞より高い濃度の血清を含有する第二の培地中で、アクチビンＡと共に更にある期間培養することにより、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。
【０１２４】
上記に開示した第一の培地中の血清の濃度は、約０〜約０．５％であってもよく、培養時間は、約１〜約３日間であってもよい。上記に開示した第二の培地中の血清の濃度は、約０．５％〜約２％あってもよく、培養時間は、約１〜約４日間であってもよい。
【０１２５】
一実施形態において、本発明は、多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる方法を提供し、同方法は：
ａ．細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上に、多能性幹細胞を播く工程と、
ｂ．多能性幹細胞を、アクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと共に培養する工程と、を含む。
【０１２６】
多能性幹細胞のアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドとの培養は、単一の培地中で実行されてもよい。単一の培地は、血清で補充された培地であってもよい。代替的に、単一の培地は、Ｂ２７で補充された培地を含む合成培地であってもよい。代替的に、多能性幹細胞のアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドとの培養は、２つ以上の培地中で別々に、又は一緒に実行されてもよい。一実施形態において、多能性幹細胞のアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドとの培養は、２つの培地中で実行される。この２つ以上の培地は、血清で補充された培地であってもよい。代替的に、この２つ以上の培地は、Ｂ２７で補充された培地を含む合成培地あってもよい。
【０１２７】
細胞外マトリクス
本発明の一態様において、多能性幹細胞は、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上で培養及び分化される。細胞外マトリクスは、マウス肉腫細胞から抽出された可溶化基底膜製剤（商品名ＭＡＴＲＩＧＥＬの下でＢＤバイオサイエンス（BD Biosciences）から販売されている）であってもよい。代替的に、細胞外マトリクスは、増殖因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬであってもよい。代替的に、細胞外マトリクスは、フィブロネクチンであってもよい。代替的な実施形態において、多能性幹細胞は、ヒト血清で被覆された組織培養基質上で培養及び分化されてもよい。
【０１２８】
細胞外マトリクスは、組織培養基質で被覆される前に希釈されてもよい。細胞外マトリクスの希釈と、組織培養基質の被覆に関する好適な方法の例は、クラインマン（Kleinman），Ｈ．Ｋ．らバイオケミストリー（Biochemistry）２５：３１２（１９８６年）、及びハドレー（Hadley），Ｍ．Ａ．らＪ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：１５１１（１９８５年）に見出すことができる。
【０１２９】
一実施形態において、細胞外マトリクスは、ＭＡＴＲＩＧＥＬである。一実施形態において、組織培養基質は、１：１０希釈のＭＡＴＲＩＧＥＬにより被覆される。代替的な実施形態において、組織培養基質は、１：１５希釈のＭＡＴＲＩＧＥＬにより被覆される。代替的な実施形態において、組織培養基質は、１：３０希釈のＭＡＴＲＩＧＥＬにより被覆される。代替的な実施形態において、組織培養基質は、１：６０希釈のＭＡＴＲＩＧＥＬにより被覆される。
【０１３０】
一実施形態において、細胞外マトリクスは、増殖因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬである。一実施形態において、組織培養基質は、１：１０希釈の増殖因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬにより被覆される。代替的な実施形態において、組織培養基質は、１：１５希釈の増殖因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬにより被覆される。代替的な実施形態において、組織培養基質は、１：３０希釈の増殖因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬにより被覆される。代替的な実施形態において、組織培養基質は、１：６０希釈の増殖因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬにより被覆される。
【０１３１】
単一の培地を使用した、細胞外マトリクス上での胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞への多能性幹細胞の分化
単一の培地が使用される際、培地は、十分低い濃度の、例えばインスリン及びＩＧＦ等の所定の因子を含有して、多能性幹細胞を胚体内胚葉へ分化させる必要がある（ＷＯ２００６０２０９１９に開示されているように）。このことは、血清濃度を低下させ、又は代替的に、インスリン及びＩＧＦが欠乏した合成培地を使用することにより達成され得る。合成培地の例は、ウイルス（Wiles）ら（Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９９９年２月２５日；２４７（１）：２４１〜８．）に開示されている。
【０１３２】
培地は、約０％〜約１０％の範囲内の血清濃度を有してもよい。代替的な実施形態において、濃度は、約０％〜約５％の範囲内であってもよい。代替的な実施形態において、濃度は、約０％〜約２％の範囲内であってもよい。代替的な実施形態において、濃度は、約２％であってもよい。
【０１３３】
代替的に、培地は、約０．５％〜約１％の範囲内のＢ２７で補充されてもよい。
【０１３４】
アクチビンＡ及びＷｎｔリガンドとの培養時間は、約１日間〜約７日間に亘っていてもよい。代替的な実施形態において、培養時間は、約１日間〜約３日間に亘っていてもよい。代替的な実施形態において、培養時間は約３日間であってもよい。
【０１３５】
アクチビンＡは、多能性幹細胞の分化を起こすに好適な、任意の濃度で使用されてよい。濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬであってもよい。代替的な実施形態において、濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１μｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。
【０１３６】
Ｗｎｔリガンドの選択は最適化されて、分化プロセスの効率を改善することができる。Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−５ａ及びＷｎｔ−７ａからなる群より選択されてもよい。一実施形態において、Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−１である。代替的な実施形態において、Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−３ａである。
【０１３７】
Ｗｎｔリガンドは、濃度約１ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬであってもよい。代替的な実施形態において、濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。
【０１３８】
単一の培地は、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤も含み得る。ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤は、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ及びＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＸＩからなる群より選択されてもよい。一実施形態において、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤は、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸである。本発明者は、ＩＸ及びＸＩ阻害剤の定義を見なかった。本発明者は、これらを元のＷＮＴ特許出願にて有した。
【０１３９】
多能性幹細胞がＧＳＫ−３Ｂ阻害剤と共に培養される際、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤の濃度は、約１ｎＭ〜約１０００ｎＭであってもよい。代替的な実施形態において、多能性幹細胞は、濃度約１０ｎＭ〜約１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤と共に培養される。
【０１４０】
単一の培地は、多能性幹細胞からの胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成を向上させ得る少なくとも１つの他の追加の因子を含有してもよい。代替的に、少なくとも１つの他の追加の因子は、本発明の方法により形成された、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞の増殖を高めてもよい。更に、少なくとも１つの他の追加の因子は、本発明の方法により形成された、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞の、他の細胞型を形成する能力、又は任意の他の追加の分化工程の効率を改善する能力を向上させてもよい。
【０１４１】
少なくとも１つの追加の因子は、例えば、ニコチンアミド、ＴＧＦ−β１、２、及び３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、血清アルブミン，繊維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバー、血小板由来増殖因子−ＡＡ、及び−ＢＢ、血小板に富んだ血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、１１）、グルカゴン様ペプチド−Ｉ及びＩＩ（ＧＬＰ−Ｉ及びＩＩ）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２疑似体、エキセンディン４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、インスリン、プロゲステロン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、βメルカプトエタノール、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ガストリンＩ及びＩＩ、例えばトリエチレンペンタミン等の銅キレーター、フォルスコリン、酪酸Ｎａ、アクチビン、ベータセルリン、ＩＴＳ、ノギン、神経突起増殖因子、ｎｏｄａｌ、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、スフィンゴシン１、ＶＥＧＦ、ＭＧ１３２（ＥＭＤ、カリフォルニア州）、Ｎ２及びＢ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州）、例えばシクロパミン（ＥＭＤ、カリフォルニア州）等のステロイドアルカロイド、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質ファミリー、ウシ下垂体抽出物、膵島新生に関連したタンパク質（ＩＮＧＡＰ）、インディアンヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグ、プロテアソーム阻害剤、ノッチ経路阻害剤、ソニックヘッジホッグ阻害剤、又はそれらの組み合わせであってもよい。
【０１４２】
少なくとも１つの他の追加の因子は、例えば、ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１４６９）、ＣＡＰＡＮ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＨＴＢ−７９）、ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１６８７）、ＨＰＡＦ−ＩＩ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１９９７）等の膵臓細胞株、例えば、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＨＴＢ−８０６５）等の肝臓細胞株、例えば、ＦＨｓ７４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＣＬ−２４１）等の腸細胞株、及び一次又は形質転換内皮細胞から得られた条件培地により供給されてもよい。
【０１４３】
２つの培地を使用した、細胞外マトリクス上での胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞への多能性幹細胞の分化
胚体内胚葉系統の細胞への多能性幹細胞の分化は、多能性幹細胞を、２つの培地を使用して、アクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと共に培養することにより達成することができる。したがって、多能性幹細胞の分化は、以下のように達成され得る：
ａ．多能性幹細胞を、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上に播き、
ｂ．多能性幹細胞を、アクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと共に第一の培地中で培養し、
ｃ．多能性幹細胞を、第二の培地中でアクチビンＡと共に培養する。
【０１４４】
第一の培地は、低濃度の血清を含有してもよく、第二の培地は、第一の培地よりも高い濃度の血清を含有してもよい。
【０１４５】
第二の培地は、Ｗｎｔリガンドを含有してもよい。
【０１４６】
第一の培地：第一の培地は、十分低い濃度の例えばインスリン及びＩＧＦ（ＷＯ２００６０２０９１９に開示されているような）等の所定の因子を含有して、多能性幹細胞を胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞へ分化させる必要がある。このことは、より低い血清濃度、又は代替的に、インスリン及びＩＧＦが不足する合成培地を使用することにより達成され得る。合成培地の例は、ウイルス（Wiles）ら（Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９９９年２月２５日；２４７（１）：２４１〜８．）に開示されている。
【０１４７】
第一の培地中に、第二の培地と比較して低い濃度の血清が存在してもよい。第二の培地の血清濃度を増大させることは、細胞の生存を増大させ、又は代替的に細胞の増殖を向上させ得る。第一の培地の血清濃度は、約０％〜約１０％の範囲内であってもよい。代替的に、第一の培地の血清濃度は、約０％〜約２％の範囲内であってもよい。代替的に、第一の培地の血清濃度は、約０％〜約１％の範囲内であってもよい。代替的に、第一の培地の血清濃度は、約０．５％であってもよい。
【０１４８】
多能性幹細胞を、少なくとも２つの培地を用いてアクチビン及びＷｎｔリガンドと共に培養する際、第一の培地中での培養時間は、約１日間〜約３日間に亘ってもよい。
【０１４９】
アクチビンＡは、好適な任意の濃度で使用されて、多能性幹細胞を分化させ得る。濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬであってもよい。代替的な実施形態において、濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１μｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。
【０１５０】
Ｗｎｔリガンドの選択は、分化プロセスの効率を改善するために最適化されてもよい。Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−５ａ及びＷｎｔ−７ａからなる群より選択され得る。一実施形態において、Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−１である。代替的な実施形態において、Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−３ａである。
【０１５１】
Ｗｎｔリガンドは、濃度約１ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬであってもよい。代替的な実施形態において、濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。
【０１５２】
第一の培地は、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤も含有し得る。ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤は、第一の培地に、第二の培地に、又は第一の培地と第二の培地の両方に添加されてもよい。
【０１５３】
ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤は、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ及びＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＸＩからなる群より選択され得る。一実施形態において、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤は、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸである。
【０１５４】
多能性幹細胞がＧＳＫ−３Ｂ阻害剤と共に培養される際、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤の濃度は、約１ｎＭ〜約１０００ｎＭであってもよい。代替的な実施形態において、多能性幹細胞は、濃度約１０ｎＭ〜約１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤と共に培養される。
【０１５５】
第一の培地は、多能性幹細胞からの、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成を向上させ得る少なくとも１つの他の追加の因子も含有し得る。代替的に、少なくとも１つの他の追加の因子は、本発明の方法により形成された、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞の増殖を高め得る。更に、少なくとも１つの他の追加の因子は、本発明の方法により形成された、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞の、他の細胞型の形成の能力を向上させ、又は任意の他の追加の分化工程の効率を改善し得る。
【０１５６】
少なくとも１つの追加の因子は、例えば、ニコチンアミド、ＴＧＦ−β１、２、及び３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、血清アルブミン、繊維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバー、血小板由来増殖因子−ＡＡ、及び−ＢＢ、血小板に富んだ血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、１１）、グルカゴン様ペプチド−Ｉ及びＩＩ（ＧＬＰ−Ｉ及びＩＩ）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２疑似体、エキセンディン４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、インスリン、プロゲステロン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、βメルカプトエタノール、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ガストリンＩ及びＩＩ、例えばトリエチレンペンタミン等の銅キレーター、フォルスコリン、酪酸Ｎａ、アクチビン、ベータセルリン、ＩＴＳ、ノギン、神経突起増殖因子、ｎｏｄａｌ、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、スフィンゴシン−１、ＶＥＧＦ、ＭＧ１３２（ＥＭＤ、カリフォルニア州）、Ｎ２及びＢ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州）、例えばシクロパミン（ＥＭＤ、カリフォルニア州）等のステロイドアルカロイド、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質ファミリー、ウシ下垂体抽出物、膵島新生に関連したタンパク質（ＩＮＧＡＰ）、インディアンヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグ、プロテアソーム阻害剤、ノッチ経路阻害剤、ソニックヘッジホッグ阻害剤、又はそれらの組み合わせであってもよい。
【０１５７】
少なくとも１つの他の追加の因子は、例えば、ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１４６９）、ＣＡＰＡＮ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＨＴＢ−７９）、ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１６８７）、ＨＰＡＦ−ＩＩ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１９９７）等の膵臓細胞株、例えば、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＨＴＢ−８０６５）等の肝臓細胞株、及び例えば、ＦＨｓ  ７４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＣＬ−２４１）等の腸細胞株から得られた条件培地により供給されてもよい。
【０１５８】
第二の培地：第二の培地は、例えば、インスリン及びＩＧＦ（ＷＯ２００６０２０９１９に開示されているような）等の所定の因子を、培養された細胞の生存を促進するに十分な濃度で含有する必要がある。このことは、血清濃度を増大させることにより、又は代替的に、インスリン及びＩＧＦの濃度が、第一の培地と比較して増大されている合成培地を使用することにより達成し得る。合成培地の例は、ウイルス（Wiles）ら（Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９９９年２月２５日；２４７（１）：２４１〜８．）に開示されている。
【０１５９】
より高い血清濃度を有する第二の培地において、第二の培地の血清濃度は、約０．５％〜約１０％の範囲内であってもよい。代替的に、第二の培地の血清濃度は、約０．５％〜約５％の範囲内であってもよい。代替的に、第二の培地の血清濃度は、約０．５％〜約２％の範囲内であってもよい。代替的に、第二の培地の血清濃度は、約２％であってもよい。第二の培地を用いて多能性幹細胞を培養する際、培養時間は、約１日間〜約４日間の範囲であってもよい。
【０１６０】
第一の培地と同様、アクチビンＡは、多能性幹細胞を分化させる好適な任意の濃度で使用されてもよい。濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬであってもよい。代替的な実施形態において、濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１μｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。
【０１６１】
Ｗｎｔリガンドは、濃度約１ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬであってもよい。代替的な実施形態において、濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。
【０１６２】
Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−５ａ及びＷｎｔ−７ａからなる群より選択されてもよい。一実施形態において、Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−１である。代替的な実施形態において、Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−３ａである。
【０１６３】
第二の培地は、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤も含有し得る。ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤は、第一の培地に、第二の培地に、又は第一の培地と第二の培地の両方に添加されてもよい。
【０１６４】
ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤は、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ及びＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＸＩからなる群より選択されてもよい。一実施形態において、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤は、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸである。
【０１６５】
多能性幹細胞がＧＳＫ−３Ｂ阻害剤と共に培養される際、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤の濃度は、約１ｎＭ〜約１０００ｎＭであってもよい。代替的な実施形態において、多能性幹細胞は、濃度約１０ｎＭ〜約１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤と共に培養される。
【０１６６】
第一の培地と同様、第二の培地は、多能性幹細胞からの胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成を向上させ得る少なくとも１つの他の追加の因子を含有してもよい。代替的に、少なくとも１つの他の追加の因子は、本発明の方法により形成された胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞の増殖を高めてもよい。更に、少なくとも１つの他の追加の因子は、本発明の方法により形成された、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞の、他の細胞型を形成する能力、又は任意の他の追加の分化工程の効率を改善する能力を向上させてもよい。
【０１６７】
少なくとも１つの追加の因子は、例えば、ニコチンアミド、ＴＧＦ−β１、２、及び３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、血清アルブミン、繊維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバー、血小板由来増殖因子−ＡＡ、及び−ＢＢ、血小板に富んだ血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、１１）、グルカゴン様ペプチド−Ｉ及びＩＩ（ＧＬＰ−Ｉ及びＩＩ）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２疑似体、エキセンディン４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、インスリン、プロゲステロン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、βメルカプトエタノール、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ガストリンＩ及びＩＩ、例えばトリエチレンペンタミン等の銅キレーター、フォルスコリン、酪酸Ｎａ、アクチビン、ベータセルリン、ＩＴＳ、ノギン、神経突起増殖因子、ｎｏｄａｌ、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、スフィンゴシン−１、ＶＥＧＦ、ＭＧ１３２（ＥＭＤ、カリフォルニア州）、Ｎ２及びＢ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州）、例えばシクロパミン（ＥＭＤ、カリフォルニア州）等のステロイドアルカロイド、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質ファミリー、ウシ下垂体抽出物、膵島新生に関連したタンパク質（ＩＮＧＡＰ）、インディアンヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグ、プロテアソーム阻害剤、ノッチ経路阻害剤、ソニックヘッジホッグ阻害剤、又はそれらの組み合わせであってもよい。
【０１６８】
少なくとも１つの他の追加の因子は、例えば、ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１４６９）、ＣＡＰＡＮ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＨＴＢ−７９）、ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１６８７）、ＨＰＡＦ−ＩＩ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１９９７）等の膵臓細胞株、例えば、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＨＴＢ−８０６５）等の肝臓細胞株、及び例えば、ＦＨｓ  ７４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＣＬ−２４１）等の腸細胞株から得られた条件培地により供給されてもよい。
【０１６９】
胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現している細胞系統（linage）の検出
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成は、以下の特定のプロトコルの前後に、マーカーの存在に関して試験することにより決定することができる。多能性幹細胞は、一般にそのようなマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化は、細胞がそれらの発現を開始した際に検出される。
【０１７０】
分化の効率は、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（例えば、抗体等）に、処理した細胞集団を暴露することにより測定することができる。
【０１７１】
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当技術分野にて標準的である。これらには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、分子生物学最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）（オースベル（Ausubel）ら、ｅｄｓ．２００１年付録）参照））、及び切片材料の免疫組織学的解析等の免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞内に到達出来るマーカーに関して、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、ハーロー（Harlow）及びレーン（Lane）、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８年）参照）が含まれる。
【０１７２】
所定のタンパク質マーカーの検出に有用な抗体の例は、表ＩＡに列挙されている。表ＩＡに列挙した抗体により認識されるものと同一のマーカーに指向される代替的な抗体が利用可能であり、又は容易に開発し得ることに留意するべきである。それらの代替的な抗体を、本発明に従って単離された細胞内のマーカーの発現を評価するために、使用してもよい。
【０１７３】
例えば、多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の追加の特徴は、継続して同定されている。多能性幹細胞マーカーは、例えば以下の１つ以上の発現を含む：ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦｏｘＤ３、コネキシン４３、コネキシン４５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、Ｔｒａ１−８１。
【０１７４】
多能性幹細胞を本発明の方法で処理した後、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現される、例えばＣＸＣＲ４等のタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（例えば、抗体等）に暴露することにより、分化した細胞を精製することができる。
【０１７５】
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、当技術分野の任意の方法、又は本発明で提案する任意の方法により、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。
【０１７６】
例えば、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、ダムール（D'Amour）らネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている方法に従って、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。
【０１７７】
例えば、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、繊維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤ＫＡＡＤ−シクロパミンで処理した後、繊維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含有する培地を除去し、続いて細胞をレチノイン酸、繊維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含有する培地中で培養することにより、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に更に分化される。この方法の例は、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている。
【０１７８】
本発明の一態様において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、レチノイン酸及び少なくとも１つの繊維芽細胞増殖因子で、ある期間処理することにより、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に更に分化される。その期間は、約１〜約６日間であってもよい。
【０１７９】
本発明の代替的な別の態様において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、細胞をレチノイン酸である期間処理することにより、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に更に分化される。その期間は、約１〜約３日間であってもよい。続いてレチノイン酸が除去され、細胞は少なくとも１つの繊維芽細胞増殖因子で、更にある期間処理される。その期間は、約１〜約３日間であってもよい。
【０１８０】
一実施形態において、本発明は、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させるための方法を提供し、同方法は：
ａ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を培養する工程と、
ｂ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、レチノイン酸及び少なくとも１つの繊維芽細胞増殖因子で処理する工程と、を含む。
【０１８１】
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞はいずれも、この方法を使用して膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させるに好適である。細胞は、Ｂ２７で補充された培地を含む合成培地中で処理されてもよい。代替的に、細胞は、無血清培地中で処理されてもよい。代替的に、細胞は、血清で補充された培地中で処理されてもよい。
【０１８２】
一実施形態において、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現している細胞は、レチノイン酸及び少なくとも１つの繊維芽細胞増殖因子で約１〜約６日間処理される。一実施形態において、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現している細胞は、レチノイン酸及び少なくとも１つの繊維芽細胞増殖因子で約６日間処理される。
【０１８３】
少なくとも１つの繊維芽細胞増殖因子は、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４及びＦＧＦ−１０からなる群より選択される。
【０１８４】
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞はいずれも、この方法を使用して膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させるに好適である。細胞は、Ｂ２７で補充された培地を含む合成培地中で処理されてもよい。代替的に、細胞は、無血清培地中で処理されてもよい。代替的に、細胞は、血清で補充された培地中で処理されてもよい。
【０１８５】
代替的な実施形態において、本発明は、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させるための方法を提供し、同方法は：
ａ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を培養し、
ｂ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、レチノイン酸及び少なくとも１つの繊維芽細胞増殖因子で処理し、
ｃ．レチノイン酸を除去した後、細胞を少なくとも１つの繊維芽細胞増殖因子で処理する、ことを含む。
【０１８６】
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞はいずれも、この方法を使用して膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させるに好適である。細胞は、Ｂ２７で補充された培地を含む合成培地中で処理されてもよい。代替的に、細胞は、無血清培地中で処理されてもよい。代替的に、細胞は、血清で補充された培地中で処理されてもよい。
【０１８７】
一実施形態において、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現している細胞は、レチノイン酸及び少なくとも１つの繊維芽細胞増殖因子で約１〜約３日間処理される。一実施形態において、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現している細胞は、レチノイン酸及び少なくとも１つの繊維芽細胞増殖因子で約３日間処理される。一実施形態において、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現している細胞は、少なくとも１つの繊維芽細胞増殖因子で約１〜約３日間処理される。一実施形態において、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現している細胞は、少なくとも１つの繊維芽細胞増殖因子で約３日間処理される。
【０１８８】
少なくとも１つの繊維芽細胞増殖因子は、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４及びＦＧＦ−１０からなる群より選択される。
【０１８９】
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞はいずれも、この方法を使用して膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させるに好適である。細胞は、Ｂ２７で補充された培地を含む合成培地中で処理されてもよい。代替的に、細胞は、無血清培地中で処理されてもよい。代替的に、細胞は、血清で補充された培地中で処理されてもよい。
【０１９０】
一実施形態において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、レチノイン酸で処理される。代替的に、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、ＦＧＦ−２、又は代替的にＦＧＦ−４、又は代替的にＦＧＦ−１０で処理される。代替的な実施形態において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、以下の因子の少なくとも１つで処理される：レチノイン酸、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４又はＦＧＦ−１０。代替的な実施形態において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、レチノイン酸と、少なくとも１つの以下の繊維芽細胞増殖因子で処理される：ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４又はＦＧＦ−１０。一実施形態において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、レチノイン酸及びＦＧＦ−２で処理される。別の実施形態において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、レチノイン酸及びＦＧＦ−４で処理される。更なる実施形態において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、レチノイン酸及びＦＧＦ−１０で処理される。
【０１９１】
レチノイン酸は、濃度約１ｎＭ〜約１ｍＭで使用されてもよい。一実施形態において、レチノイン酸は、濃度１μＭで使用される。
【０１９２】
ＦＧＦ−２は、濃度約５０ｐｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬで使用されてもよい。一実施形態において、ＦＧＦ−２は、濃度５０ｎｇ／ｍＬで使用される。
【０１９３】
ＦＧＦ−４は、濃度約５０ｐｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬで使用されてもよい。一実施形態において、ＦＧＦ−４は、濃度５０ｎｇ／ｍＬで使用される。
【０１９４】
ＦＧＦ−１０は、濃度約５０ｐｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬで使用されてもよい。一実施形態において、ＦＧＦ−１０は、濃度５０ｎｇ／ｍＬで使用される。
【０１９５】
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成を向上させ得る少なくとも１つの他の追加の因子で処理されてもよい。代替的に、少なくとも１つの他の追加の因子は、本発明の方法により形成された、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞の増殖を高めてもよい。更に、少なくとも１つの他の追加の因子は、本発明の方法により形成された膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞の、他の細胞型を形成する能力、又は任意の他の追加の分化工程の効率を改善する能力を改善してもよい。
【０１９６】
少なくとも１つの追加の因子は、例えば、ニコチンアミド、ＴＧＦ−β１、２、及び３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、血清アルブミン、繊維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバー、血小板由来増殖因子−ＡＡ、及び−ＢＢ、血小板に富んだ血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、１１）、グルカゴン様ペプチド−Ｉ及びＩＩ（ＧＬＰ−Ｉ及びＩＩ）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２疑似体、エキセンディン４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、インスリン、プロゲステロン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、βメルカプトエタノール、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ガストリンＩ及びＩＩ、例えばトリエチレンペンタミン等の銅キレーター、フォルスコリン、酪酸Ｎａ、アクチビン、ベータセルリン、ＩＴＳ、ノギン、神経突起増殖因子、ｎｏｄａｌ、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、スフィンゴシン−１、ＶＥＧＦ、ＭＧ１３２（ＥＭＤ、カリフォルニア州）、Ｎ２及びＢ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州）、例えばシクロパミン（ＥＭＤ、カリフォルニア州）等のステロイドアルカロイド、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質ファミリー、ウシ下垂体抽出物、膵島新生に関連したタンパク質（ＩＮＧＡＰ）、インディアンヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグ、プロテアソーム阻害剤、ノッチ経路阻害剤、ソニックヘッジホッグ阻害剤、又はそれらの組み合わせであってもよい。
【０１９７】
少なくとも１つの他の追加の因子は、例えば、ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１４６９）、ＣＡＰＡＮ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＨＴＢ−７９）、ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１６８７）、ＨＰＡＦ−ＩＩ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１９９７）等の膵臓細胞株、例えば、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＨＴＢ−８０６５）等の肝臓細胞株、及び例えば、ＦＨｓ  ７４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＣＬ−２４１）等の腸細胞株から得られた条件培地により供給されてもよい。
【０１９８】
膵臓内胚葉系統（linage）に特徴的なマーカーを発現している細胞の検出
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーは、当業者に周知であり、膵臓内胚葉系統の特徴を示す追加のマーカーが、継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して膵臓内胚葉系統の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用され得る。膵臓内胚葉系統に特異的なマーカーは、例えば、Ｈｌｘｂ９、ＰＴＦ−１ａ、ＰＤＸ−１、ＨＮＦ−６、ＨＮＦ−１β等の１つ以上の転写因子の発現を含む。
【０１９９】
分化の効率は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（例えば、抗体等）に、処理した細胞集団を暴露することにより測定することができる。
【０２００】
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当技術分野にて標準的である。これらには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、分子生物学最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）（オースベル（Ausubel）ら、ｅｄｓ．２００１年付録）参照）、及び切片材料の免疫組織学的解析等の免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞内に到達出来るマーカーに関して、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、ハーロー（Harlow）及びレーン（Lane）、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８年）参照）が含まれる。
【０２０１】
所定のタンパク質マーカーの検出に有用な抗体の例は、表ＩＡに列挙されている。表ＩＡに列挙した抗体により認識されるものと同一のマーカーに指向される代替的な抗体が利用可能であり、又は容易に開発し得ることに留意するべきである。それらの代替的な抗体を、本発明に従って単離された細胞内のマーカーの発現を評価するために、使用してもよい。
【０２０２】
膵臓内分泌系統のマーカーを発現している細胞の形成：
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、当技術分野の任意の方法、又は本発明で提案する任意の方法により、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。
【０２０３】
例えば、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、ダムール（D'Amour）らネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている方法に従って、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。
【０２０４】
例えば、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＤＡＰＴ及びエキセンディン４を含有する培地中で培養し、次にＤＡＰＴ及びエキセンディン４を含有する培地を除去し、続いて細胞をエキセンディン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含有する培地中で培養することにより、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に更に分化される。この方法の例は、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている。
【０２０５】
例えば、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、エキセンディン４を含有する培地中で培養し、次にエキセンディン４を含有する培地を除去し、続いて細胞をエキセンディン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含有する培地中で培養することにより、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に更に分化される。この方法の例は、ダムール（D'Amour）らネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）、２００６年に開示されている。
【０２０６】
例えば、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＤＡＰＴ及びエキセンディン４を含有する培地中で培養することにより、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に更に分化される。この方法の例は、ダムール（D'Amour）らネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）、２００６年に開示されている。
【０２０７】
例えば、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、エキセンディン４を含有する培地中で培養することにより、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に更に分化される。この方法の例は、ダムール（D'Amour）らネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）、２００６年に開示されている。
【０２０８】
本発明の一態様において、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することにより、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に更に分化される。ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子は、ノッチ細胞外受容体（Notch extracellular receptor）の拮抗薬であってもよい。代替的に、因子は、ノッチ受容体の生物活性を阻害してもよい。代替的に、因子は、細胞内のノッチシグナル伝達経路内の要素を阻害するか、又は同要素の拮抗薬であってもよい。細胞は、Ｂ２７で補充された培地を含む合成培地中で処理されてもよい。代替的に、細胞は、無血清培地中で処理されてもよい。代替的に、細胞は、血清で補充された培地中で処理されてもよい。
【０２０９】
一実施形態において、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子は、γ−セクレターゼ阻害剤である。一実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤は、Ｌ−６８５，４５８としても公知の１Ｓベンジル−４Ｒ−［１−（１Ｓ−カルバモイル−２−フェネチルカルバモイル）−１Ｓ−３−メチルブチルカルバモイル］−５  ２Ｒヒドロジ（hydrozy）−５フェニルペンチル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルである。
【０２１０】
Ｌ−６８５，４５８は、濃度約０．１μＭ〜約１００μＭで使用されてもよい。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、濃度約９０μＭで使用される。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、濃度約８０μＭで使用される。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、濃度約７０μＭで使用される。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、濃度約６０μＭで使用される。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、濃度約５０μＭで使用される。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、濃度約４０μＭで使用される。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、濃度約３０μＭで使用される。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、濃度約２０μＭで使用される。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、濃度約１０μＭで使用される。
【０２１１】
一実施形態において、本発明は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させるための方法を提供し、同方法は：
ａ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を培養する工程と、
ｂ．細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理する工程と、を含む。
【０２１２】
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞はいずれも、この方法を使用して膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させるに好適である。細胞は、Ｂ２７で補充された培地を含む合成培地中で処理されてもよい。代替的に、細胞は、無血清培地中で処理されてもよい。代替的に、細胞は、血清で補充された培地中で処理されてもよい。
【０２１３】
一実施形態において、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子は、γ−セクレターゼ阻害剤である。一実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤は、Ｌ−６８５，４５８としても公知の１Ｓ−ベンジル−４Ｒ−［１−（１Ｓ−カルバモイル−２−フェネチルカルバモイル）−１Ｓ−３−メチルブチルカルバモイル］−２Ｒ−ヒドロジ（hydrozy）−５−フェニルペンチル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルである。
【０２１４】
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で約１〜約５日間処理される。代替的に、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で約３〜約５日間処理される。代替的に、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で約５日間処理される。
【０２１５】
一実施形態において、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子は、γ−セクレターゼ阻害剤である。一実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤は、Ｌ−６８５，４５８としても公知の１Ｓ−ベンジル−４Ｒ−［１−（１Ｓ−カルバモイル−２−フェネチルカルバモイル）−１Ｓ−３−メチルブチルカルバモイル］−２Ｒ−ヒドロジ（hydrozy）−５−フェニルペンチル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルである。
【０２１６】
Ｌ−６８５，４５８は、濃度約０．１μＭ〜約１００μＭで使用されてもよい。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、濃度約９０μＭで使用される。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、濃度約８０μＭで使用される。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、濃度約７０μＭで使用される。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、濃度約６０μＭで使用される。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、濃度約５０μＭで使用される。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、濃度約４０μＭで使用される。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、濃度約３０μＭで使用される。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、濃度約２０μＭで使用される。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、濃度約１０μＭで使用される。
【０２１７】
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成を向上させ得る少なくとも１つの他の追加の因子で処理されてもよい。代替的に、少なくとも１つの他の追加の因子は、本発明の方法により形成された、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞の増殖を高めてもよい。更に、少なくとも１つの他の追加の因子は、本発明の方法により形成された膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞の、他の細胞型を形成する能力、又は任意の他の追加の分化工程の効率を改善する能力を改善してもよい。
【０２１８】
少なくとも１つの追加の因子は、例えば、ニコチンアミド、ＴＧＦ−β１、２、及び３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、血清アルブミン、繊維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバー、血小板由来増殖因子−ＡＡ、及び−ＢＢ、血小板に富んだ血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、１１）、グルカゴン様ペプチド−Ｉ及びＩＩ（ＧＬＰ−Ｉ及びＩＩ）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２疑似体、エキセンディン４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、インスリン、プロゲステロン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、βメルカプトエタノール、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ガストリンＩ及びＩＩ、例えばトリエチレンペンタミン等の銅キレーター、フォルスコリン、酪酸Ｎａ、アクチビン、ベータセルリン、ＩＴＳ、ノギン、神経突起増殖因子、ｎｏｄａｌ、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、スフィンゴシン−１、ＶＥＧＦ、ＭＧ１３２（ＥＭＤ、カリフォルニア州）、Ｎ２及びＢ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州）、例えばシクロパミン（ＥＭＤ、カリフォルニア州）等のステロイドアルカロイド、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質ファミリー、ウシ下垂体抽出物、膵島新生に関連したタンパク質（ＩＮＧＡＰ）、インディアンヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグ、プロテアソーム阻害剤、ノッチ経路阻害剤、ソニックヘッジホッグ阻害剤、又はそれらの組み合わせであってもよい。
【０２１９】
少なくとも１つの他の追加の因子は、例えば、ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１４６９）、ＣＡＰＡＮ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＨＴＢ−７９）、ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１６８７）、ＨＰＡＦ−ＩＩ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１９９７）等の膵臓細胞株、例えば、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＨＴＢ−８０６５）等の肝臓細胞株、及び例えば、ＦＨｓ  ７４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＣＬ−２４１）等の腸細胞株から得られた条件培地により供給されてもよい。
【０２２０】
膵臓内分泌系統（linage）に特徴的なマーカーを発現している細胞の検出
膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーは、当業者に周知であり、膵臓内分泌系統の特徴を示す追加のマーカーが、継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して膵臓内分泌系統の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用され得る。膵臓内分泌系統に特異的なマーカーは、１つ以上の、例えばＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌｅｔ−１等の転写因子の発現を含む。
【０２２１】
β細胞系統の細胞に特徴的なマーカーは、当業者に周知であり、β細胞系統の細胞の特徴を示す追加のマーカーが、継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して、β−細胞系統の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用し得る。β細胞系統に特異的な特徴は、１つ以上の、中でも例えば、Ｐｄｘ１（膵臓及び十二指腸ホメオボックス遺伝子−１）、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、Ｉｓｌ１、Ｐａｘ６、Ｐａｘ４、ＮｅｕｒｏＤ、Ｈｎｆ１ｂ、Ｈｎｆ−６、Ｈｎｆ−３β、及びＭａｆＡ等の転写因子の発現を含む。これらの転写因子は、内分泌細胞の確認に関して当技術分野にて定着している。例えば、エドランド（Edlund）（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：５２４〜６３２（２００２年））を参照されたい。
【０２２２】
分化の効率は、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（例えば、抗体等）に、処理した細胞集団を暴露することにより測定することができる。代替的に、分化の効率は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（例えば、抗体等）に、処理した細胞集団を暴露することにより測定することができる。
【０２２３】
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当技術分野にて標準的である。これらには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、分子生物学最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）（オースベル（Ausubel）ら、ｅｄｓ．２００１年付録）参照）、及び切片材料の免疫組織学的解析等の免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞内に到達出来るマーカーに関して、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、ハーロー（Harlow）及びレーン（Lane）、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８年）参照）が含まれる。
【０２２４】
所定のタンパク質マーカーの検出に有用な抗体の例は、表ＩＡに列挙されている。表ＩＡに列挙した抗体により認識されるものと同一のマーカーに指向される代替的な抗体が利用可能であり、又は容易に開発し得ることに留意するべきである。それらの代替的な抗体を、本発明に従って単離された細胞内のマーカーの発現を評価するために、使用してもよい。
【０２２５】
治療
本発明の一態様において、１型糖尿病に苦しむ、又は１型糖尿病の発症の危険を有する患者を処置する方法を提供する。本方法は、多能性幹細胞を培養し、この多能性幹細胞をインビトロでβ細胞系統に分化させ、このβ細胞系統の細胞を患者に埋め込むことを含む。
【０２２６】
尚別の態様において、本発明は、２型糖尿病に苦しむ、又は２型糖尿病の発症の危険を有する患者を処置する方法を提供する。本方法は、多能性幹細胞を培養し、この培養した多能性幹細胞をインビトロでβ細胞系統に分化させ、このβ細胞系統の細胞を患者に埋め込むことを含む。
【０２２７】
適切な場合、移植した細胞の生存及び機能を促進する医薬又は生物活性物質（bioactives）で患者を更に処置してもよい。それらの薬剤は、中でも例えば、インスリン、ＴＧＦ−β１、２、及び３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２、及び−１３）、繊維芽細胞増殖因子−１及び−２、血小板由来増殖因子−ＡＡ、及び−ＢＢ、血小板に富んだ血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−７、−８、−１０、−１５）、血管内皮由来増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリンを含んでもよい。他の医薬化合物は、例えば、ニコチンアミド、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−１）及びＩＩ、ＧＬＰ−１及び２疑似体、エキセンディン４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、ＭＡＰＫ阻害剤、例えば、米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号及び米国特許出願公開第２００４／０１３２７２９号に開示されている化合物等の化合物を含んでもよい。
【０２２８】
多能性幹細胞は、レシピエントに移植する前に、インスリン産生細胞に分化されてもよい。特定の実施形態において、多能性幹細胞は、レシピエントに移植する前に、β細胞に完全に分化される。代替的に、多能性幹細胞は、未分化又は一部が分化された状態でレシピエントに移植されてもよい。更なる分化は、レシピエント内で起こり得る。
【０２２９】
胚体内胚葉細胞、又は代替的に膵臓内胚葉細胞、又は代替的にβ細胞は、分散した細胞として埋め込まれてもよいし、又は肝臓門脈内に注入され得る塊に形成されてもよい。代替的に、細胞は、生体適合性・分解性ポリマー支持体、多孔性・非分解性デバイス内に提供されてもよく、又は宿主免疫応答から保護されるよう封入されてもよい。細胞は、レシピエント内の適切な部位内に埋め込まれてもよい。埋め込み部位は、例えば肝臓、天然の膵臓、腎被膜下空間、網、腹膜、漿膜下空間、腸、胃、又は皮下ポケットを含む。
【０２３０】
埋め込まれた細胞の更なる分化、生存又は活性を高めるために、増殖因子、抗酸化剤又は抗炎症剤等の追加の因子を、細胞の投与前に、投与と同時に、又は投与後に投与してもよい。所定の実施形態において、増殖因子は、インビボで、投与された細胞を分化させるよう使用される。これらの因子は、内在性細胞により分泌され、投与された細胞にその場で（in situ）で暴露されてもよい。埋め込まれた細胞は、内生の及び体外から投与された当技術分野にて公知の増殖因子の任意の組み合わせにより、分化を誘発されてもよい。
【０２３１】
埋め込みに使用される細胞の量は、患者の状態及び治療に対する応答を含む多数の様々な要因に依存し、当業者により決定され得る。
【０２３２】
本発明の一態様において、糖尿病に苦しむ、又は糖尿病の発症の危険を有する患者を処置する方法を提供する。本方法は、多能性幹細胞を培養し、この培養した多能性幹細胞をインビトロでβ細胞系統に分化させ、このβ細胞系統を３次元支持体に埋め込むことを含む。細胞は、患者へ埋め込まれる前、インビトロでこの支持体上に維持されていてもよい。代替的に、細胞を含む支持体は、インビトロでの追加の培養なしで直接患者に埋め込まれてもよい。支持体は、場合により、埋め込まれた細胞の生存及び機能を促進する少なくとも１つの医薬を組み込まれてもよい。
【０２３３】
本発明の目的に好適な支持体材料は、組織修復に有用な組織鋳型、導管、バリア及び貯蔵所を含む。より詳細には、発泡体、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物、及び不織構造の形態を有する合成及び天然材料であって、インビトロ及びインビボで使用されて、生物組織を再構築又は再生し、また走化性薬剤を送達して組織増殖を誘発する材料が、本発明の方法の実施における使用に適切である。例えば、米国特許第５，７７０，４１７号、米国特許第６，０２２，７４３号、米国特許第５，５６７，６１２号、米国特許第５，７５９，８３０号、米国特許第６，６２６，９５０号、米国特許第６，５３４，０８４号、米国特許第６，３０６，４２４号、米国特許第６，３６５，１４９号、米国特許第６，５９９，３２３号、米国特許第６，６５６，４８８号、米国特許出願公開第２００４／００６２７５３Ａ１号、米国特許第４，５５７，２６４号及び米国特許第６，３３３，０２９号に開示されている材料を参照されたい。
【０２３４】
医薬が組み込まれた支持体を形成するには、支持体形成するに先だって薬剤をポリマー溶液と混合し得る。代替的に、好ましくは医薬担体の存在下、医薬品を加工された支持体上に被覆してもよい。医薬品は、液体、超微粒子状固体、又は任意の他の適切な物理的形態として存在し得る。代替的に、医薬品の放出速度を変更するために、支持体に賦形剤を加えてもよい。代替的な実施形態において、支持体には、抗炎症化合物である少なくとも１つの医薬化合物、例えば米国特許第６，５０９，３６９号に開示されている化合物が組み込まれる。
【０２３５】
代替的な実施形態において、支持体には、抗アポトーシス化合物である少なくとも１つの薬剤、例えば米国特許第６，７９３，９４５号に開示されている化合物が組み込まれてもよい。
【０２３６】
代替的な実施形態において、支持体には、線維症阻害剤である少なくとも１つの医薬化合物、例えば米国特許第６，３３１，２９８号に開示されている化合物も組み込まれ得る。
【０２３７】
支持体には、血管新生を高めることができる少なくとも１つの医薬化合物、例えば米国特許出願公開第２００４／０２２０３９３号及び米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号に開示されている化合物も組み込まれ得る。
【０２３８】
支持体には、免疫抑制化合物である少なくとも１つの医薬化合物、例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１６２３号に開示されている化合物も組み込まれ得る。
【０２３９】
支持体には、中でも例えばＴＧＦ−β１、２、及び３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２、及び−１３）、繊維芽細胞増殖因子−１及び−２、血小板由来増殖因子−ＡＡ、及び−ＢＢ、血小板に富んだ血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−７、−８、−１０、−１５）、血管内皮由来増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリン等の増殖因子である少なくとも１つの医薬化合物も組み込まれ得る。他の医薬化合物は、例えばニコチンアミド、低酸素誘導因子１−α、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−Ｉ）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２疑似体、並びにＩＩ、エキセンディン４、ｎｏｄａｌ、ノギン、ＮＧＦ、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、テネイシン−Ｃ、トロポエラスチン、トロンビン由来ペプチド、カテリシジン、デフェンシン、ラミニン、フィブロネクチン及びビトロネクチン等の接着性細胞外マトリクスタンパク質の細胞−及びヘパリン−結合ドメインを含む生物ペプチド、例えば米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号及び米国特許出願公開第２００４／０１３２７２９号に開示されている化合物等のＭＡＰＫ阻害剤を含んでもよい。
【０２４０】
スカフォールド内への本発明の細胞の組み込みは、細胞をスカフォールド上に単に沈着させることにより達成できる。細胞は、単純な拡散（Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．２３（１  Ｐｔ  ２）：３〜９（１９８８年））によりスカフォールド内に入れることができる。細胞供給の効率を向上されるために、いくつかの他の手法が開発されている。例えば、軟骨細胞をポリグリコール酸スカフォールド上に播種する際に、スピナーフラスコが使用されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１４（２）：１９３〜２０２頁（１９９８年））。細胞播種のための他の手法は、遠心分離の使用であり、これは播種される細胞に最小の応力を与え、播種効率を向上させる。例えば、ヤン（Yang）らは、遠心分離細胞固定法（Centrifugational Cell Immobilization）（ＣＣＩ）と称される細胞播種方法（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．５５（３）：３７９〜８６頁（２００１年））を開発した。
【０２４１】
本発明を以下の実施例により更に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【０２４２】
（実施例１）
ヒト胚幹細胞の培養
ヒト胚幹細胞株Ｈ１、Ｈ７及びＨ９をウィセル・リサーチ・インスティテュート（WiCell Research Institute, Inc.）（ウィスコンシン州マディソン）から獲得し、供給元の研究所から提供された取扱説明書に従って培養した。手短には、細胞を、２０％ノックアウト血清代替、１００ｎＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、０．５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、４ｎｇ／ｍＬヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を有する２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（全てインビトロジェン（Invitrogen）／ＧＩＢＣＯより）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン／ＧＩＢＣＯ）からなるＥＳ細胞培地中にてマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー細胞上で培養した。Ｅ１３〜１３．５マウス胚由来のＭＥＦ細胞をチャールズ・リバー（Charles River）から購入した。ＭＥＦ細胞を、１０％ＦＢＳ（ハイクローン（Hyclone））、２ｍＭグルタミン、及び１００ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸で補充したＤＭＥＭ培地中で増殖させた。サブコンフルエントなＭＥＦ細胞培養物を１０μｇ／ｍＬマイトマイシンＣ（シグマ（Sigma）、ミズーリ州セントルイス）により３時間処理して、細胞分割を停止させた後、トリプシン処理し、２×１０4／ｃｍ2で０．１％ウシゼラチン−被覆皿上に播いた。継代２〜４からのＭＥＦ細胞をフィーダー層として使用した。ＭＥＦ細胞フィーダー層上に播いたヒト胚幹細胞を、加湿した組織培養インキュベーター内の５％ＣＯ2雰囲気中で３７℃で培養した。コンフルエントとなった際（播いてから約５〜７日後）、ヒト胚幹細胞を１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼタイプＩＶ（インビトロジェン／ＧＩＢＣＯ）により５〜１０分間処理し、次に５ｍＬピペットを使用して表面を穏やかに擦り落とした。細胞を９００ｒｐｍで５分間回転させ、ペレットを再懸濁し、１：３〜１：４の細胞の比で新鮮培地に再び播いた。
【０２４３】
（実施例２）
胚体内胚葉の形成
胚体内胚葉のマーカーの発現に関するアクチビンＡの効果を調べた。アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）を、マウス胚線維芽細胞上で培養したヒト胚幹細胞の集団に加えた。細胞をアクチビンＡの存在下、連続的に培養し、指定された時間に回収した。胚体内胚葉マーカーの発現のレベルは、ＰＣＲ（図１）、ＦＡＣＳ（結果を表ＩＩにまとめる）、及び免疫組織化学的検査（図２）により検査した。
【０２４４】
アクチビンＡは、Ｈ９株においてＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ−３β、Ｍｉｘｌ１及びＳｏｘ−１７  ｍＲＮＡの発現の時間依存的な増加を引き起こした（図１、パネルａ）。前側の内胚葉マーカー、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｏｔｘ−１及びＨｅｘ遺伝子の有意な上方調節も観察された（図１、パネルｂ）。アクチビンＡ処理後のＦＡＣＳ分析により、ＣＸＣＲ４タンパク質の増加が観察された。Ｅ−カドヘリン及びＮ−カドヘリンの発現は、アクチビンＡ処理後に変化しなかった（表ＩＩＡ）。ＣＸＣＲ４陽性細胞はまたＣ−ｋｉｔ、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ９９に関して高い陽性を示し、ＣＤ９に関して陰性であった。これらのマーカーの発現パターンは、検査した３つの全ｈＥＳ細胞株間で一致していた（Ｈ７に関して表ＩＩＢ、Ｈ１に関して表ＩＩＣ）。アクチビンＡで５日間処理した細胞上で行った免疫細胞化学により、処理した培養物中、３０〜４０％の細胞が、Ｓｏｘ１７及びＨＮＦ−３βに関して陽性であることが明らかとなった。並行して、ほぼ１００％の分化した細胞が、尚Ｏｃｔ４陽性であった（図２）。胚体内胚葉マーカーの発現の増大と組み合わせた多能性の表面マーカーの発現の低下により、これらのデータは、アクチビンＡがヒト胚幹細胞の胚体内胚葉への分化を促進することを示唆する。
【０２４５】
（実施例３）
膵臓内胚葉の形成
ヒト胚幹細胞の膵臓内胚葉への分化を誘発するとして公知の増殖因子を、細胞培養液に加えた。詳細には、膵臓内胚葉の形成を誘発するとして公知のアクチビンＡ、ｂＦＧＦ、及びレチノイン酸を、細胞培養液に加えた。
【０２４６】
第一の一連の実験において、アクチビンＡを、０％〜２％の血清及びアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）で補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２中にてマウス胚線維芽細胞上で７日間培養したヒト胚幹細胞の集団に加えた。細胞を、図３に示す時間点にて回収し、示した遺伝子の発現に関してＰＣＲによりアッセイした（図３、図４及び図５）。図３にて、ＰＣＲ分析は、アクチビン処理細胞が、ＧＡＴＡ４（図３、パネルａ）、Ｓｏｘ−１７（図３、パネルｂ）、ＨＮＦ−３β（図３、パネルｃ）、及びＭｉｘｌ−１（図３、パネルｄ）を含む、内胚葉発達に関連した広範囲の遺伝子を発現したことを示した。しかしながら、Ｐｄｘ１遺伝子発現は全く観察されなかった。アクチビンＡ処理Ｈ７細胞にて、内胚葉系統マーカーの同一の発現パターンが観察された（図６、パネルａ〜ｆ）。この段階では、Ｏｃｔ４発現の有意な発現は全く存在しなかった。
【０２４７】
アクチビンＡは、胚体外内胚葉マーカーＳｏｘ７（図４、パネルａ）及びＡＦＰ（図４、パネルｂ）の発現において時間依存的な低下を引き起こした。アクチビンＡは、短尾奇形（図５、パネルａ）の発現を低下させたが、ニューロンマーカーＺｉｃ１（図５、パネルｂ）の発現には全く効果を有さなかった。
【０２４８】
総合すれば、これらのデータは、Ｓｏｘ−１７、Ｍｉｘｌ１、Ｇａｔａ４、及びＨＮＦ−３βの発現の増大と、前側の内胚葉マーカーＯｔｘ１、Ｃｅｒ１及びＨｅｘ遺伝子の上方調節とが共に、アクチビンＡ処理に応答した胚体内胚葉の形成に一致することを示唆している。免疫細胞化学による胚体内胚葉マーカーの分析は、これらの遺伝子に関するタンパク質発現が、ｍＲＮＡ発現に観察された傾向も反映することを明らかにした。ＨＮＦ−３β、Ｓｏｘ−１７、及びＧＡＴＡ４に関する発現のレベルは、未処理の細胞で低く、全細胞の約１０〜２０％であった。５日間のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）処理は、ＨＮＦ−３β、Ｓｏｘ−１７、及びＧＡＴＡ４の発現を、全細胞の約５０％〜９０％に増大させた（図７）。
【０２４９】
第二の一連の実験において、ヒト胚幹細胞の培養物を、実施例１に記載した方法に従って、未分化培養物状態にて２〜３日間維持した。細胞が７０〜８０％コンフルエントとなった後、培地を、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを加えた０〜２％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ／Ｆ１２に変更し、アクチビンＡの存在下で３、５、又は７日間のいずれかの間培養した。この期間後、細胞を次に、図８に示すように、レチノイン酸とｂＦＧＦとの組み合わせで５〜６日間更に処理した。培養物を回収し、ｍＲＮＡのサンプルを収集して分析した。アクチビンＡ単独で５日間処理した細胞からなる対照培養物も含んでいた。
【０２５０】
遺伝子発現分析により、アクチビンＡ又はレチノイン酸は単独ではＰｄｘ１の発現を誘発しないことが明らかとなった。同様の結果が、アクチビンＡの存在下、レチノイン酸とＦＧＦとの組み合わせで処理した細胞の培養物で観察された（図８、パネルａ）。しかしながら、アクチビンＡの不在下でのレチノイン酸及びＦＧＦによる細胞の処理は、Ｐｄｘ１の発現をまた更に増大させた（図８、パネルａ）。アクチビンＡで３日間処理された後、アクチビンＡの不在下で１μＭレチノイン酸及び５０ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ（ＦＧＦ−２としても公知）で５日間処理された細胞は、アクチビンＡ単独で５日間処理されたサンプルにて観察されたものと比較して約３５００倍高いＰｄｘ１発現のレベルを示した（図８、パネルａ）。免疫細胞化学は、全細胞の５〜２０％がＰｄｘ１を発現したことを示した（図９）。
【０２５１】
アクチビンＡの不在下での１μＭレチノイン酸及びＦＧＦによる細胞の処理はまた、アクチビンＡ単独の存在下で処理された細胞に観察されなかったＧＬＵＴ−２及びＰＴＦ１ａの発現も増大させた（図８、パネルｃ）。ＧＬＵＴ−２及びＰＴＦ１ａ発現における最大の増大は、１μＭレチノイン酸及び５０ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦで処理された細胞にて観察された。総合すれば、これらのデータは、胚体内胚葉が形成された後に細胞培養液からアクチビンＡを除去することにより、膵臓内胚葉の形成が更に高められることを示唆している。
【０２５２】
（実施例４）
膵臓内分泌細胞の形成
ヒト胚幹細胞の培養物を、実施例１に記載した方法に従って、未分化培養物状態で３〜４日間維持した。細胞が５０〜６０％コンフルエントとなった後、培地を、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含有する、ＦＢＳを有さないＤＭＥＭ／Ｆ１２に変更し、この培地中で細胞を１日間培養した。１日培養の後、培地を除去し、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを有する０．５％ＦＢＳを含有する培地と交換し、細胞を１日間培養した。第二の１日培養の後、培地を除去し、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを有する２％ＦＢＳを含有する培地と交換し、細胞を１日間培養した。この期間後、細胞を次に、実施例２に概略したように、レチノイン酸とＦＧＦとの組み合わせで６日間処理し、次に培地を除去し、培地を１０μＭのγ−セクレターゼ阻害剤Ｌ−６８５，４５８を含有する２％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む培地で３日間置き換えた。培養物を回収し、ｍＲＮＡのサンプルを収集して分析した。アクチビンＡ単独で５日間処理した細胞からなる対照培養物も含んでいた。
【０２５３】
遺伝子発現分析により、アクチビンＡは、単独で、又はレチノイン酸及びＦＧＦとの組み合わせで、Ｎｇｎ３又はインスリンの発現を誘発しないことが明らかとなった（図１０、パネルａ、ｃ）。Ｌ−６８５，４５８による処理後に、Ｈｅｓ−１の発現の低下も観察された。処理３日後に、最大阻害が観察された（図１０、パネルｄ）。しかしながら、Ｌ−６８５，４５８による細胞の処理は、Ｎｇｎ３の発現を、アクチビンＡ単独、又はレチノイン酸及びＦＧＦとの組み合わせにより処理したサンプルに観察されたものの約５０倍のレベルで誘発した。γ−セクレターゼ阻害剤により処理したサンプルに、インスリン発現の７０倍の増大が観察された。Ｌ−６８５，４５８処理により、ＮｅｕｒｏＤ１発現も更に増大した（図１０、パネルａ）。総合すれば、これらのデータは、内分泌細胞の形成が、膵臓内胚葉が形成された後の、細胞培養液からのレチノイン酸及びＦＧＦの除去と、γ−セクレターゼ阻害剤の添加により、更に向上されることを示唆している。
【０２５４】
（実施例５）
Ｎｋｘ２．２を発現している膵臓内分泌細胞の形成
実施例２に概略した方法に従って得た胚体内胚葉細胞を、以下のように処理した：細胞を、２％ＦＢＳ＋５０ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを有するＤＭＥＭ／Ｆ１２、５０ｎｇ／ｍＬ基本ＦＧＦ及び１μＭのレチノイン酸を含有する基本培地中で３〜５日間培養した。細胞を、１μＭのレチノイン酸を単独で又はｂＦＧＦと共に含む基本培地中で、更に３〜５日間連続して培養した。このプロセスに沿った様々な時間点で、ＲＮＡサンプルを細胞から回収して、細胞の指向された分化の評価を補助した。更に、分化プロトコル全体において培地及び因子を定期的に除去し、補充した。アクチビンＡの添加は、アクチビンＡなしでのサンプルと比較して、Ｎｋｘ２．２発現の約３５倍の増大を示した。培養の最初の３日間アクチビンＡで処理されたサンプルは、そのＰｄｘ１発現がアクチビンＡを全く含まないサンプルと同様のレベルに維持された（図１１）。総合すれば、これらのデータは、膵臓内分泌マーカーＮｋｘ２．２の発現が、レチノイン酸及びｂＦＧＦ処理の最初の３日間にアクチビンＡを添加することにより更に向上されることを示唆している。
【０２５５】
（実施例６）
培養液中の膵臓内胚葉細胞の継代及び増殖
この実施例は、本明細書のヒト胚幹細胞から誘導した膵臓内胚葉細胞が細胞培養液中で維持され、更に分化することなく継代され得ることを示す。膵臓内胚葉細胞を、低血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２中、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡの存在下で分化させた。低血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２は、１日目に０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、２日目に０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、及びその後の各日に２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有していた。分化の４日後、細胞を、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１μＭレチノイン酸及び５０ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦを含有する低血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で、全体で更に６日間培養した。分化の６日後、細胞を、５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ１０の存在下、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有する低血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２の培養液中に、全体で６日間維持した。６日間の培養期間中、膵臓内胚葉細胞を２回継代し、細胞集団が２倍になる時間は、この６日間の培養中、約３６〜４８時間であった。培養の０、３、及び６日目に、Ｑ−ＰＣＲを用いて、膵臓内胚葉を示すマーカー遺伝子の発現を測定した。図１２に、５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ１０の存在下で増殖した細胞が、膵臓内胚葉マーカーＰｄｘ１の発現を、その誘導後の６日間の培養期間中に維持したことを示す。
【０２５６】
（実施例７）
ヒト胚幹細胞からの肝細胞の誘導
ヒト胚幹細胞の培養物を、実施例１に記載した方法に従って、２〜３日間未分化培養物状態に維持した。細胞が７０〜８０％コンフルエントとなった後、培地を、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含有する２％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ／Ｆ１２に変え、細胞をアクチビンＡの存在下で７日間培養した。アクチビンＡによる７日間の処理後、細胞を次に図１３に示す条件で５日間処理した。この時間の後、細胞を回収し、ｍＲＮＡのサンプルを収集して分析した。
【０２５７】
アクチビンＡの不在下で培養された細胞に関して、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びアルブミンの発現における増大が観察された（図１３、パネルａ）。これは、レチノイン酸及びＦＧＦ−４により更に増大した（図１３、パネルｂ）。総合すれば、これらのデータは、ヒト胚幹細の培養物が、上述した処理後に、肝細胞マーカーを発現可能であることを示唆している。更に、ヒト胚幹細胞は、肝細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化することが可能である。
【０２５８】
（実施例８）
Ｈ９ヒト胚幹細胞株の特徴付け
未分化ＥＳ細胞により発現される数個のマーカーの発現を評価することにより、Ｈ９細胞の品質をある時間に亘って監視した（カーペンター（Carpenter）ら、２００１；リュービノフ（Reubinoff）ら、２０００；トムソン（Thomson）ら、１９９８ａ）。Ｈ９細胞は、段階特異的な胚抗原の相反的な発現を示した（表ＩＩＩ）。Ｈ９細胞は、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＡＰ及びＣＤ９抗原に対して強力な免疫反応性を示し、これらは全て未分化ヒト胚幹細胞の特徴である。
【０２５９】
例えばＯＣＴ３／４、ＳＯＸ−２、ＵＴＦ−１、ＲＥＸ−１、Ｃｘ４３、Ｃｘ４５、ＡＢＣＧ−２及びＴＥＲＴ等の胚幹細胞に特徴的な遺伝子の発現を評価するためにＲＴ−ＰＣＲを行い、この実施例で増殖された細胞が、以前記載した未分化胚幹細胞と同様に現れることを確認した（表ＩＩＩ）。ＯＣＴ３／４タンパク質発現及びアルカリホスファターゼ活性（ケミコン（Chemicon））を、免疫染色により確認した。大部分のＨ９細胞は、ＯＣＴ３／４及びＡＰに関して陽性であった（図１４）。全体として、これらの結果は、この実施例で使用したＨ９細胞が、他の研究所からの報告と比較した場合に、形態、抗原免疫染色又は多能性マーカー発現において有意に異ならないことを示している。
【０２６０】
（実施例９）
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析
接着した細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ溶液（インビトロジェン、カリフォルニア州）との５分間のインキュベーションにより培養液プレートから除去した。解放された細胞をヒト胚幹細胞培地中に再懸濁し、遠心分離により回収した後、洗浄して、細胞を、ＰＢＳ中の２％  ＢＳＡ、０．０５％アジ化ナトリウムからなる染色緩衝液（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）中に再懸濁した。適切な場合、細胞は、０．１％γ−グロブリン（シグマ社）溶液を使用して、Ｆｃ−受容体を１５分間ブロックされた。アリコート（約１０5細胞）を、表Ｉに示すようにフィコエリトリン（phycoerythirin）（ＰＥ）又はアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合モノクローナル抗体（５μＬ抗体／１０6細胞）のいずれかと共に、又は非結合一次抗体と共にインキュベートした。対照は、適切なアイソタイプ一致抗体、非染色細胞、及び二次結合抗体のみで染色した細胞を含んでいた。抗体を用いた全インキュベーションは、４℃で３０分間行い、その後細胞を洗浄緩衝液で洗浄した。非結合一次抗体で染色したサンプルを、二次結合ＰＥ又は−ＡＰＣラベル抗体と共に、更に４℃で３０分間インキュベートした。使用した二次抗体のリストに関して表Ｉを参照されたい。洗浄した細胞をペレット化し、染色緩衝液中に再懸濁し、少なくとも１０，０００事象を収集することにより、細胞表面分子をＦＡＣＳアレイ（ＢＤバイオサイエンス）機器を使用して同定した。
【０２６１】
（実施例１０）
免疫細胞化学
０．１％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ）被覆皿上に播種した細胞を、４％パラホルムアルデヒドにより室温で２０分間固定した。固定した細胞を、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／１０％正常ヒヨコ血清／０．５％トリトンＸ−１００により室温で１時間ブロックした後、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／１０％正常ヒヨコ血清中の一次抗体と共に４℃で一夜インキュベートした。一次抗体及びそれらの作用希釈物のリストを、表ＩＢに示す。ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中で３回洗浄した後、ＰＢＳ中で１：１００希釈した蛍光二次抗体を、細胞と共に室温で１時間インキュベートして結合させた。対照サンプルは、一次抗体が省略され、又は一次抗体が、その一次抗体と同一濃度の対応する負の対応対照免疫グロブリンで代替された反応物を含んでいた。染色サンプルを濯ぎ；ジアミジノ−２−フェニルインドール，二塩酸塩（ＤＡＰＩ）を含有するＰＲＯＬＯＮＧ（登録商標）（インビトロジェン、カリフォルニア州）の一滴を各サンプルに加えて、核を対比染色し、また抗退色試薬として機能させた。ニコン・コンフォーカル・エクリプス（Nikon Confocal Eclipse）Ｃ−１倒立顕微鏡（ニコン、日本）及び１０−６０Ｘ対物レンズを使用して画像を得た。
【０２６２】
（実施例１１）
未分化細胞のＰＣＲ分析
ＲＮＡ抽出、精製、及びｃＤＮＡ合成。ＲＮＡサンプルを、エタノール−含有、高塩濃度緩衝液の存在下、シリカゲル膜（ＲＮｅａｓｙミニキット、（キアゲン（Qiagen））、カリフォルニア州）に結合させた後、混入物を洗浄することにより精製した。ＲＮＡをＴＵＲＢＯ  ＤＮＡ−フリーキット（アンビオン社（Ambion）、ＩＮＣ））を使用して更に精製し、次いで高品質ＲＮＡを水中に溶出した。分光光度計のＡ２６０及びＡ２８０読み取りにより収率及び純度を評価した。ＡＢＩ（ＡＢＩ、カリフォルニア州）ハイ・キャパシティｃＤＮＡアーカイブ・キット（high capacity cDNA archive kit）を使用して、精製したＲＮＡからｃＤＮＡコピーを作製した。
【０２６３】
リアルタイムＰＣＲ増幅及び定量分析。特に述べない限り、全試薬はアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）から購入した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００配列検出システムを使用して、リアルタイムＰＣＲ反応を行った。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ  ＰＣＲ  ＭＡＳＴＥＲ  ＭＩＸ（登録商標）（ＡＢＩ、カリフォルニア州）を、２０ｎｇの逆転写ＲＮＡと共に、２０μＬの全反応容積にて使用した。各ｃＤＮＡサンプルを２回使用（run）して、ピペッティング誤差に関して補正した。プライマー及びＦＡＭ−ラベルＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブを、濃度２００ｎＭにて使用した。各標的遺伝子に関する発現レベルを、以前にアプライド・バイオシステムズにより開発されたヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）内在性対照を使用して正規化した。プライマーとプローブのセットを以下に列挙する：Ｏｃｔ３／４（Ｈｓ００７４２８９６）、ＳＯＸ−２（Ｈｓ００６０２７３６）、ＵＴＦ−１（Ｈｓ００７４７４９７）、Ｒｅｘ−１（Ｈｓ００３９９２７９）、コネキシン４３（Ｈｓ００７４８４４５）、コネキシン４５（Ｈｓ００２７１４１６）、ＡＢＣＧ２（Ｈｓ００１８４９７９）、Ｔｅｒｔ（Ｈｓ００１６２６６９）、ＨＮＦ３β（Ｈｓ００２３２７６４）、ＧＡＴＡ−４（Ｈｓ００１７１４０３）、Ｍｉｘｌ１（Ｈｓ００４３０８２４）、Ｓｏｘ７（Ｈｓ００８４６７３１）、ＡＦＰ（Ｈｓ００１７３４９０）、短尾奇形（Ｈｓ００６１００８０）、ＧＳＣ（Ｈｓ００４１８２７９＿ｍ１）、Ｐｄｘ−１（Ｈｓ００４２６２１６）、ＰＴＦ１ａ（Ｈｓ００６０３５８６）、Ｎｇｎ３（Ｈｓ００３６０７００）、ＮｅｕｒｏＤ１（Ｈｓ００１５９５９８）、インスリン（Ｈｓ００３５５７７３）及びＧｌｕ２（Ｈｓ００１６５７７５）。ＰＲＩＭＥＲＳプログラム（ＡＢＩ、カリフォルニア州）を使用してＳｏｘ１７プライマーを指定し、以下の配列であった：Ｓｏｘ１７：
ＴＧＧＣＧＣＡＧＣＡＧＡＴＡＣＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ＡＧＣＧＣＣＴＴＣＣＡＣＧＡＣＴＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）及びＣＣＡＧＣＡＴＣＴＴＧＣＴＣＡＡＣＴＣＧＧＣＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）。最初５０℃で２分間、次いで９５℃で１０分間のインキュベーション後、サンプルを２段階にて４０回サイクルした−９５℃で１５秒間の変性工程と、その後の６０℃で１分間のアニーリング／伸長工程。ＧＥＮＥＡＭＰ（登録商標）７０００配列検出システムソフトウエアを使用して、データ解析を行った。各プライマー／プローブセットに関して、増幅の指数関数領域の中央において蛍光強度が特定の値に到達したサイクル数としてのＣt値を決定した。比較Ｃt法を使用して、相対的な遺伝子発現レベルを計算した。手短には、各ｃＤＮＡサンプルに関して、内在性対照Ｃt値を関心対象遺伝子のＣtから減算して、Ｃt値（ΔＣt）を得た。標的の正規化した量を２-ΔCtとして計算し、増幅を１００％効率と仮定した。最終的なデータを、標準物質サンプルに関して表した。
【０２６４】
（実施例１２）
核型分析
標準的なＧバンド核型分析により、Ｈ９細胞の核型を決定した。合計１００の分裂中期スプレッド（metaphase spread）を評価した（アプライド・ジェネティックス・ラボラトリーズ社（Applied Genetics Laboratories, Inc.））。分析した１００細胞において染色体異常は見出されなかった。細胞遺伝学的分析は、細胞が正常数の常染色体と、形式染色体数（modal chromosome number）４６を有することを示した。図１５に、ヒト胚幹細胞株Ｈ９から得られた典型的な核型を示す。
【０２６５】
（実施例１３）
細胞外マトリクスで被覆した組織培養基質上でのヒト胚幹細胞の培養
ヒト胚幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９をウィセル・リサーチ・インスティテュート（Wicell Research Institute、Inc.）、（ウィスコンシン州マディソン）から獲得し、供給元の研究所により提供された取扱説明書に従って培養した。手短には、細胞を、２０％ノックアウト血清代替、１００ｎＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、０．５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、４ｎｇ／ｍＬヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を有する２ｍＬ−グルタミンで補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（インビトロジェン／ＧＩＢＣＯ）からなるＥＳ細胞培地中のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー細胞上で培養した。Ｅ１３〜１３．５マウス胚由来のＭＥＦ細胞を、チャールズ・リバー（Charles River）から購入した。ＭＥＦ細胞を、１０％ＦＢＳ（ハイクローン（Hyclone））、２ｍＭグルタミン、及び１００ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸で補充したＤＭＥＭ培地中で増殖させた。サブコンフルエントなＭＥＦ細胞培養物を１０μｇ／ｍＬマイトマイシンＣ（シグマ（Sigma）、ミズーリ州セントルイス）で３時間処理して、細胞分割を停止させた後、トリプシン処理して、２×１０４／ｃｍ２にて０．１％ウシゼラチン−被覆皿上に播いた。継代２〜４からのＭＥＦ細胞をフィーダー層として使用した。ＭＥＦ細胞フィーダー層上に播いたヒト胚幹細胞を、加湿した組織培養インキュベーター内にて５％ＣＯ2の雰囲気中で３７℃で培養した。コンフルエントとなった際（播いた後、約５〜７日）、ヒト胚幹細胞を１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼタイプＩＶ（インビトロジェン／ＧＩＢＣＯ）で５〜１０分間処理し、次いで５ｍＬガラスピペットを使用して表面から穏やかに擦り落とした。細胞を９００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ペレットを再懸濁し、１：３０希釈の増殖因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤバイオサイエンス）で被覆したプレート上に細胞を１：３〜１：４の比で再び播いた。続いて、細胞を８ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ及びコラゲナーゼで補充したＭＥＦ−条件培地中で培養し、ＭＡＴＲＩＧＥＬ被覆プレート上で少なくとも５代継代した。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上で培養した細胞を、コラゲナーゼＩＶ（インビトロジェン／ＧＩＢＣＯ）、ディスパーゼ（ＢＤバイオサイエンス）又はリベラーゼ酵素（ロシュ（Roche）、インディアナ州）と共にルーチン的に継代させた。
【０２６６】
（実施例１４）
細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上で培養されたヒト胚幹細胞の胚体内胚葉への分化
胚幹細胞の胚体内胚葉への分化は、以前にネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）２３巻、１５３４〜１５４１頁（２００５年１２月）に記載されたように行った。手短には、約６０〜７０％コンフルエンシーのＨ９培養物を、０．５％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間暴露した後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＡＡ）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。Ｈ９細胞を、１：３０〜１：１０希釈の増殖因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬ、又は１：３０〜１：１０希釈の通常のＭＡＴＲＩＧＥＬで被覆したプレート上で培養した。プレートをＭＡＴＲＩＧＥＬで室温にて１時間被覆した。
【０２６７】
５日目に、培養物をＦＡＣＳによりＣＸＣＲ４、Ｅ−カドヘリン、ＣＤ９、及びＮ−カドヘリン発現に関して分析し、リアルタイムＰＣＲによりＳＯＸ−１７、ＳＯＸ−７、α−胎児タンパク質（ＡＦＰ）、ＣＸＣＲ４、短尾奇形（Brychyury）（Ｂｒｙ）、グースコイド（ＧＳＣ）、ＨＮＦ−３β、及びＧＡＴＡ４に関して分析した。ＡＦＰ及びＳＯＸ−７は内蔵内胚葉マーカーとみなされるされる一方、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ−３β及びＳＯＸ−１７は、明確な内胚葉マーカーを表し、ＧＳＣ、Ｂｒｙ、及びＣＸＣＲ４は原始線条のマーカーを表す。図１７に、ＦＡＣＳによるＣＸＣＲ４の発現を示す。１：１０希釈のＭＡＴＲＩＧＥＬで被覆されたプレート上で培養された細胞によるＣＸＣＲ４の発現において、より低い濃度のＭＡＴＲＩＧＥＬと比較して有意な増大が存在した。更に、増殖因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬは、胚体内胚葉細胞の形成において、通常のＭＡＴＲＩＧＥＬと比較して同等に有効ではなかった。
【０２６８】
図１８に、１：１０希釈のＭＡＴＲＩＧＥＬで被覆されたプレート上で培養された細胞は、１：３０希釈のＭＡＴＲＩＧＥＬ上で培養された細胞と比較して、胚体内胚葉マーカーの有意な上方調節を示すことを確証するリアルタイムＰＣＲの結果を示す。
【０２６９】
（実施例１５）
胚体内胚葉形成後の胚幹細胞内の遺伝子発現における変化のマイクロアレイ分析
ＲＮｅａｓｙミニキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して、以下のヒト胚幹細胞培養物から、全ＲＮＡを単離した：ＭＡＴＲＩＧＥＬ−被覆プレート上で培養され、０．５％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間暴露した後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＡＡ）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理したＨ９Ｐ８３細胞；ＭＥＦ上で培養され、０．５％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間暴露した後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理したＨ９Ｐ４４細胞。各グループの対照は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ−被覆皿上に播かれ、ＭＥＦ−条件培地中で培養された細胞、又はＭＥＦ上に播かれ、ＥＳ培地中で培養された細胞を含んでいた。
【０２７０】
サンプル製剤、ハイブリダイゼーション及び画像分析は、アフィメトリクス・ヒトゲノムＵ１３３プラス２．０アレイ（Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array）に従って行った。正規化及び対数変換の後、ＯｍｎｉＶｉｚ（登録商標）ソフトウエア（ＭＡ）及びＧＥＮＥＳＩＦＴＥＲ（ＶｉｚＸＬａｂｓ、ワシントン州）を使用してデータ解析を行った。各処理内及び異なる処理間のばらつきは、ピアソン相関係数を使用して比較した。異なる処理間の遺伝子発現プロファイルと、株間の相関係数とにおける分散を、図１９に示す。分散の分析と、調整したＰ値（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ及びＨｏｃｈｂｅｒｇ補正）≦０．０５を用いたＦ検定とを使用して、サンプル間の遺伝子発現における有意な差異を評価した。プレゼントコール（present call）を伴う遺伝子のみを分析に含めた。表ＩＶに、様々なサンプル間で少なくとも５倍の差異で特異に発現した遺伝子を列挙する。有意に発現した遺伝子の正規化した強度値を、各遺伝子に関する標準誤差（ＳＥＭ）と共に列挙する。
【０２７１】
（実施例１６）
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）で被覆された組織培養基質上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉への分化
胚幹細胞の胚体内胚葉への分化は、以前にネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）２３巻、１５３４〜１５４１頁（２００５年１２月）に記載されたように行った。手短には、増殖因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）培養液上に播種された約６０〜７０％コンフルエンシーのＨ９、Ｈ７、又はＨ１細胞を、０．５％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D Systems）、ミネソタ州））で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間暴露した後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＡＡ）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。続く全ての実施例において、特に断らない限り、この処理レジメンは、胚胎（definite）内胚葉（ＤＥ）プロトコルと称される。並行して、ＭＥＦフィーダー上で培養したＨ９、Ｈ７、又はＨ１細胞も、上記に概略したものと同一のＤＥプロトコルに暴露した。
【０２７２】
５日目に、培養物をＦＡＣＳによりＣＸＣＲ４、Ｅ−カドヘリン、ＣＤ９、ＣＤ９９、及びＮ−カドヘリン（ＣＤ５６）発現に関して、リアルタイムＰＣＲによりＳＯＸ−１７、ＳＯＸ−７、α−胎児タンパク質（ＡＦＰ）、ＣＸＣＲ４、短尾奇形（Brychyury）（Ｂｒｙ）、グースコイド（ＧＳＣ）、ＨＮＦ−３β、及びＧＡＴＡ４に関して分析した。ＡＦＰ及びＳＯＸ−７は内蔵内胚葉マーカーとみなされる一方、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ−３β及びＳＯＸ−１７は、明確な内胚葉マーカーを表し、ＧＳＣ、Ｂｒｙ、及びＣＸＣＲ４は、原始線条のマーカーを表す。
【０２７３】
マウスフィーダー上で培養し、ＤＥプロトコルに暴露したＨ−株は、ＦＡＣＳにより、ＤＥマーカーの強固な発現と、ＣＸＣＲ４の発現とを生じた（図２０）。ＤＥプロトコルで処理した後、Ｅ−カドヘリンの発現の有意な低下も存在した。最後に、ＣＸＣＲ４＋集団は、ＣＤ１１７に関しても陽性に染色された。図２１に、未処理のＨ７（図２１、パネルａ）及びＨ９細胞（図２１、パネルｂ）と比較した胚体内胚葉マーカーの有意な上方調節を示す。
【０２７４】
ＭＥＦフィーダー上で培養したＨ−株とは異なり、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）上で培養し、胚体内胚葉プロトコルで処理したＨ−株は、胚体内胚葉マーカーの強固な発現を示さなかった。特に、ＦＡＣＳによる、及びリアルタイムＰＣＲによるＣＸＣＲ４の発現は、マウス胚線維芽細胞上で培養した細胞と比較して、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上で培養した細胞で有意に低かった。胚体内胚葉マーカーの発現は、Ｈ１がＨ９より大きく、Ｈ９はＨ７より大きい一般的な応答パターンに従っていた（図２２及び図２３）。図２２から、Ｈ１細胞は、Ｈ７及びＨ９株と比較して、ＣＸＣＲ４発現において有意な増大を示した。全ての場合において、ＣＸＣＲ４の発現は、マウス胚線維芽細胞上で培養した細胞と比較して、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）上で培養した細胞において低かったことに注目されたい。図２３（パネルａ〜ｃ）に、Ｈ７（図２３、パネルａ）及びＨ９（図２３、パネルｂ）株において胚体内胚葉マーカーの上方調節が少々増大したことを示すリアルタイムＰＣＲ結果を示す。しかしながら、Ｈ１（図２３、パネルｃ）株は、Ｈ７及びＨ９株と比較して胚体内胚葉マーカーのより強固な上方調節を示した。
【０２７５】
（実施例１７）
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）で被覆された組織培養基質上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉（ＤＥ）への分化−Ｗｎｔリガンドの役割
Ｈ７Ｐ４４及びＨ９Ｐ４６胚幹細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：１０希釈）被覆皿上で培養し、０．５％ＦＢＳ、及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間暴露した後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＡＡ）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。いくつかの培養液に、２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３ａ（カタログ＃１３２４−ＷＮ−００２、Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州）、２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−５ａ（カタログ＃６５４−ＷＮ−０１０、Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州）、２５ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−７ａ（カタログ＃３００８−ＷＮ−０２５、Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州）、又は２５ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−５ｂ（カタログ＃３００６−ＷＮ−０２５、Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州）を、５日間の処理を通して加えた。図２４に、高濃度の（ａ）ＡＡ又は（ｂ）ＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３ａの存在下でのＨ９Ｐ４６胚体内胚葉培養物の位相差画像を示す。図２５に、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）上で培養し、ＤＥプロトコル＋Ｗｎｔ−３ａ（図２５、パネルｂ及びｄ）及び−Ｗｎｔ−３ａ（図２５、パネルａ及びｃ）に暴露したＨ７Ｐ４４、及びＨ９Ｐ４６株における、ＦＡＣＳによる５日目のＣＸＣＲ４の発現を示す。ＤＥ培養液中のＷｎｔ−３ａの存在は、低血清＋高濃度のＡＡで処理したＤＥ培養液と比較して、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）の強固な発現をもたらした。図２６に、低血清＋ＡＡ＋／−Ｗｎｔリガンドで処理したａ）Ｈ７及びｂ）Ｈ９培養物のリアルタイムＰＣＲデータを示す。両方のＨ−株に関して、ＷＮＴ−３ａの添加は、胚体内胚葉マーカーの有意な上方調節をもたらした。対照的に、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ−５ｂ及びＷｎｔ−７ａは、胚体内胚葉マーカーの発現に最小の影響を有した。
【０２７６】
（実施例１８）
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）で被覆された組織培養基質上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉への分化：Ｗｎｔ−３ａの有効用量
Ｈ９Ｐ４６胚幹細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）−被覆皿（１：１０希釈）上で培養し、０．５％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＡＡ）、及び１０〜５０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮｔ−３ａ（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間暴露した後、２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＡＡ）、及び１０〜５０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３ａで補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。対照培養物は、Ｗｎｔ−３ａで処理しなかった。図２７にて、パネルａはＷｎｔ−３ａの不在下、ｂ）１０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３ａ、ｃ）２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３ａ及びｄ）５０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３ａの５日目のＦＡＣＳによるＣＸＣＲ４の発現を示す。Ｗｎｔ−３ａの不在下において、ＣＸＣＲ４の発現は非常に低かった。対照的に、１０〜５０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａの添加は、ＣＸＣＲ４陽性細胞の数を有意に増大させた。更に、１０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａの添加は、５０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａの添加と同様に有効であった。リアルタイムＰＣＲ結果（図２８、パネルａ）も、この発見を確かなものとした。
【０２７７】
別個の研究において、Ｈ９ｐ５２細胞を１：３０低増殖因子ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上に播いた。ＤＥプロトコルの最初の２日間、１０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ及び１ｎｇ／ｍＬの範囲のＷｎｔ３Ａ用量を使用した。図２８にて、パネルｂは、５日間の処理後のＤＥマーカーのＰＣＲ分析を示す。実験の終わりの細胞の数を、図２８、パネルｃに示す。これは、より高い用量のＷｎｔ−３ａが使用されると細胞が増殖することを示す。Ｗｎｔ３ａ処理の５日間（５Ｄ）への延長は、ＰＣＲによるＤＥマーカー上に殆ど効果がなく、細胞数を有意に増大させなかった（図２８、パネルｃ）。これらのデータは、１０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３ａで２日間が、最適な細胞増殖と胚体内胚葉分化に達するに十分であることを示している。
【０２７８】
（実施例１９）
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）で被覆された組織培養基質上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉（ＤＥ）への分化−ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤の効果
Ｗｎｔ−３ａの効果が、Ｗｎｔ経路を介したものであったことを確認するために、ＧＳＫ−３阻害剤を使用して、例えばβカテニン等のＷｎｔの下流標的を活性化させた。Ｈ９Ｐ４６−Ｐ４８胚幹細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）被覆皿（１：１０希釈）上で培養し、０．５％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＡＡ）、及び１０−１０００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ（カタログ＃３６１５５０、カルビオケム（Calbiochem）、カリフォルニア州）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間暴露した後、２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＡＡ）、及び０〜１０００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ（カタログ＃３６１５５０、カルビオケム、カリフォルニア州）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。対照培養液は、低血清＋高用量のアクチビンＡ＋／−Ｗｎｔ−３ａで処理した。図２９にて、パネルａは、Ｗｎｔ−３ａ又はＧＳＫ−３Ｂ阻害剤の不在下、ｂ）＋２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３ａ、ｃ）＋１０００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ、ｄ）＋５００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ、ｅ）＋１００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ、ｆ）＋１０ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ、ｇ）１〜２日目に＋１００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ、及びＨ）１〜２日目に＋１０ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸの、５日目におけるＦＡＣＳによるＣＸＣＲ４の発現を示す。
【０２７９】
Ｗｎｔ−３ａの不在下、又は１０ｎｍ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤において、ＣＸＣＲ４の発現は非常に低かった。対照的に、２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａ又は１００〜１０００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤の添加は、ＣＸＣＲ４陽性細胞の数を有意に増大させた。更に、１００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤の１〜２日目の添加は、１００ｎＭＧＳＫ−３Ｂ阻害剤の全５日間の添加と同様に有効であった。図３０に、（パネルａ）Ｈ９Ｐ４８細胞及び（パネルｂ）Ｈ９Ｐ４６細胞に関する胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現を示す。
【０２８０】
図１６に、胚幹細胞が無フィーダー系内で胚体内胚葉に分化される、本発明の分化プロトコルの概略を示す。
【０２８１】
（実施例２０）
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）で被覆された組織培養基質上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉（ＤＥ）への分化−ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤又はＷｎｔ−３Ａの存在下でのアクチビンＡの有効用量
Ｈ９Ｐ４９及びＨ１Ｐ４６胚幹細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）被覆皿（１：１０希釈）上で培養し、０．５％ＦＢＳ、１０〜１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＡＡ）、及び１００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ（カタログ＃３６１５５０、カルビオケム、カリフォルニア州）又は２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３ａで補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間暴露した後、２％ＦＢＳ、１０〜１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＡＡ）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。対照培養液を、低血清＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで処理した。図３１に、Ｈ９Ｐ４９及びＨ１Ｐ４６に関する５日目におけるＦＡＣＳによるＣＸＣＲ４の発現を示し、ここでａ）１０ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで全５日間＋２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａで最初の２日間、ｂ）１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで全５日間＋２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａで最初の２日間ｃ）１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで全５日間＋１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸで最初の２日間ｄ）１０ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで全５日間＋１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸで最初の２日間、ｅ）１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで全５日間＋２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａで最初の２日間、及びｆ）１０ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで全５日間＋２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａで最初の２日間である。図３１にて、パネルａ〜ｄは、Ｈ９Ｐ４９細胞に関し、パネルｅ〜ｆは、Ｈ１Ｐ４６細胞に関する。図３２に、１０、５０、又は１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ＋２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａで処理したＨ９Ｐ４９培養物に関する胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現を示す：パネルａ：ＡＦＰ、Ｂｒｙ、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、ＨＮＦ−３Ｂ、及びＰＯＵ５Ｆ（Ｏｃｔ−４）、パネルｂ：ＳＯＸ−１７及びＧＡＴＡ４の発現。これはつじつまが合わない−図番による問題、又はカットアンドペーストの問題であると思われる。胚体内胚葉マーカーの強固な発現は、５０ｎｇ／ｍＬのＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３Ａ又は１００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸを使用して得ることができると思われる。より低い用量のアクチビンＡは、胚体外内胚葉の形成を導く。
【０２８２】
（実施例２１）
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）で被覆された組織培養基質上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉（ＤＥ）への分化−Ｗｎｔ−３ａとＧＳＫ−３Ｂ阻害剤との組み合わせ
Ｈ９Ｐ５３胚幹細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）被覆皿（１：３０希釈）上で培養し、０．５％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＡＡ）、及び１００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ（カタログ＃３６１５５０、カルビオケム、カリフォルニア州）＋／−２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３ａで補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間暴露した後、２％ＦＢＳ、１０〜１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＡＡ）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。並行して、Ｈ９Ｐ５３培養物を、２５ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ−４（カタログ＃３１４−ＢＰ−０１０、Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州）＋／−２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３Ａ＋／−１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで処理した。対照培養液を、低血清＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで処理した。図３３に、５日目のＦＡＣＳによるＣＸＣＲ４の発現を示し、ここでａ）１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで全５日間＋２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａで最初の２日間及び２５ｎｇ／ｍＬＢＭＰ−４で３〜５日目、ｂ）１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで全５日間＋２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａで最初の２日間ｃ）１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで全５日間＋１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸで最初の２日間ｄ）２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３ａ＋２５ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ−４で全５日間、ｅ）１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで全５日間＋２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３Ａ＋１００ｎｍ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸで最初の２日間、及びｆ）１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ＋２５ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ−４で全５日間である。図３４に、１０又は１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ＋２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａ又は１００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤で処理した、継代４６におけるヒト胚幹細胞株Ｈ１の培養物に関して、リアルタイムＰＣＲで測定した胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現を示す：パネル（ａ）：ＡＦＰ、Ｂｒｙ、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、及びＰＯＵ５Ｆ（Ｏｃｔ−４）、パネル（ｂ）：ＳＯＸ−１７、ＨＮＦ−３Ｂ、及びＧＡＴＡ４の発現。結果は、未処理の細胞に対する倍増値（fold increase）として表される。図３５に、５０又は１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ＋１０又は１００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤で処理した、継代４９におけるヒト胚幹細胞株Ｈ９の培養物に関して、リアルタイムＰＣＲで測定した胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現を示す：パネル（ａ）：ＡＦＰ、Ｂｒｙ、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、ＨＮＦ−３Ｂ、及びＰＯＵ５Ｆ（Ｏｃｔ−４）、パネル（ｂ）：ＳＯＸ−１７及びＧＡＴＡ４の発現。結果は、未処理の細胞に対する倍増として表される。図３６に、アクチビンＡ、Ｗｎｔ−３ａ、ＧＳＫ−３阻害剤、及びＢＭＰ−４の組み合わせで処理したＨ９Ｐ５３培養物に関する、胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現を示す：ａ）ＡＦＰ、Ｂｒｙ、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、ＨＮＦ−３Ｂ、及びＳＯＸ７、ｂ）ＳＯＸ−１７、ＨＮＦ−３Ｂ及びＧＡＴＡ４の発現。ＢＭＰ−４のＤＥプロトコルへの添加は、中胚葉マーカーＢＲＹの形成を誘発し、Ｗｎｔ−３ＡとＧＳＫ−４Ｂ阻害剤の組み合わせは、アクチビンＡの存在下での各薬剤のみの添加と比較して、胚体内胚葉マーカーの有意な上方調節を導かないと思われる。
【０２８３】
（実施例２２）
ＭＥＦ上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉（ＤＥ）への分化−低血清中のＷｎｔ−３ａ、アクチビンＡ、Ｗｎｔ−５ａ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＩＬ−４、及びＳＤＦ−１の組み合わせ
Ｈ９Ｐ４４細胞を、以前にマイトマイシン処理マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）で被覆した６ウェルプレート上に播いた。細胞を、２０％ノックアウト血清代替、１００ｎＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、０．５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（全てインビトロジェン／ＧＩＢＣＯより）及び８ｎｇ／ｍＬヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（Ｒ＆Ｄシステムズ）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン／ＧＩＢＣＯ）培地からなるＥＳ細胞培地中で、７０〜８０％コンフルエンシーまで増殖させた。
【０２８４】
ＤＥ形成のために、以下に詳細する他の増殖因子を加えたアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下、又は不在下で細胞を処理した。以下のレジメンに示すように、増殖因子を増大する濃度のＦＢＳに段階的に加えた：
０日目：ＤＭＥＭ／Ｆ１２中０％ＦＢＳ
１日目：ＤＭＥＭ／Ｆ１２中０．５％ＦＢＳ。
２日目：ＤＭＥＭ／Ｆ１２中２％ＦＢＳ。
３日目：細胞をＦＡＣＳ分析及びＲＴ−ＰＣＲのために回収した。
【０２８５】
全増殖因子をＲ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州から購入した。各処理グループに関する増殖因子の詳細な説明及び濃度を、以下に示す。
１．対照−増殖因子を全く添加しない
２．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）
３．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋Ｗｎｔ−３ａ（１０ｎｇ／ｍＬ）＋Ｗｎｔ５ａ（１０ｎｇ／ｍＬ）
４．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋Ｗｎｔ−３ａ（１０ｎｇ／ｍＬ）＋Ｗｎｔ５ａ（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＢＭＰ２（１００ｎｇ／ｍＬ）
５．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＢＭＰ−４（１００ｎｇ／ｍＬ）
６．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＢＭＰ−６（１００ｎｇ／ｍＬ）
７．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＢＭＰ−７（１００ｎｇ／ｍＬ）
８．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＢＭＰ−４（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＢＭＰ−６（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＢＭＰ−７（１００ｎｇ／ｍＬ）
９．ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍＬ）
１０．ＳＤＦ１ａ（２０ｎｇ／ｍＬ）
１１．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＳＤＦ１ａ（２０ｎｇ／ｍＬ）
１２．ＢＭＰ２（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＢＭＰ−４（１００ｎｇ．ｍＬ）＋ＢＭＰ−６（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＢＭＰ−７（１００ｎｇ／ｍＬ）
１３．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＢＭＰ−４（１００ｎｇ．ｍＬ）＋ＢＭＰ−６（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＢＭＰ−７（１００ｎｇ／ｍＬ）
１４．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍＬ）
１５．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＳＤＦ１ａ（２０ｎｇ／ｍＬ）
１６．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋Ｗｎｔ−３ａ（１０ｎｇ／ｍＬ）＋Ｗｎｔ−５ａ（１０ｎｇ／ｍＬ）＋Ｗｎｔ−７ａ（１０ｎｇ／ｍＬ）
１７．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＳＤＦ１ａ（２０ｎｇ／ｍＬ）＋ＢＭＰ−４（１００ｎｇ／ｍＬ）
【０２８６】
結果：
細胞をＤＥプロトコル処理の３日目に回収した。分析のために、処理した細胞のアリコートをＲＴ−ＰＣＲ用のＲＮＡ製剤に使用し、残りの細胞をＦＡＣＳ分析用に使用した。ＣＸＣＲ４の頻度（％）を図３７に示す。増殖因子（１つ又は複数）の添加は、低血清中の１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡでの処理を越えてＣＸＣＲ４の発現を向上させなかった。
【０２８７】
ＲＴ−ＰＣＲ分析のために、胚体内胚葉マーカーの選択されたパネルの発現に関して、細胞を分析した。示した結果は、基本培地中で増殖したが、アクチビンＡ又は任意の他の増殖因子で処理されなかった細胞に対して較正された。ＦＡＣＳデータと一致して、表Ｖは、Ｗｎｔ−３ａ等の増殖因子の添加により、低血清中の高用量のアクチビンＡで処理された培養物に対して、胚体内胚葉マーカーの有意な上方調節は存在しなかったことを示す。これは、アクチビンＡ、ＷＮＴ３Ａ、及び低血清の存在下、無フィーダー条件で培養されたＥＳ細胞に関するＤＥマーカーの有意な増大を示す、以前の実施例とは対照的である。
【０２８８】
（実施例２３）
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）又はヒトフィブロネクチンで被覆された組織培養基質上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉（ＤＥ）への分化
Ｈ９Ｐ５５細胞を、ヒトフィブロネクチン又は通常の増殖因子ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤバイオサイエンス（BD Biosciences））上で増殖及び分化させた。１ｕｇ／ｍＬのヒトフィブロネクチン（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州）を含有する１ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン／ＧＩＢＣＯ）を、６ウェルの組織培養液処理皿の各ウェルに加えた。代替的に、通常の増殖因子ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）をＤＭＥＭ／Ｆ１２中で１：１０に希釈し、１ｍＬの希釈ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）を、６ウェルの組織培養処理皿の各ウェルに加えた。細胞をコラゲナーゼと共に通過させた。細胞が８０％コンフルエンシーに到達した後、それらを以下のように処理した：１０ｎｇ／ｍＬマウス組み換えＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ）及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ）を含有する０．５％ＦＢＳで２日間。その後、２％ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで３日間。図３８にて、パネルａ〜ｂは、各々、フィブロネクチン及びＭＡＴＲＩＧＥＬ上で培養した胚幹細胞によるＣＸＣＲ４の発現を示す。リアルタイムＰＣＲ結果（図３９）は、胚体内胚葉の形成が、フィブロネクチン被覆プレートとＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）被覆プレートにおいて等価であったことを確認する。
【０２８９】
（実施例２４）
様々な濃度のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）で被覆された組織培養基質上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉への分化
約６０〜７０％コンフルエンシーのＨ９培養物を、０．５％ＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３ａ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間暴露した後、２％ＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３ａ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＡＡ）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。Ｈ９細胞を、１：６０〜１：１０希釈の通常のＭＡＴＲＩＧＥＬで被覆したプレート上で培養した。プレートをＭＡＴＲＩＧＥＬで室温にて１時間被覆した。
【０２９０】
リアルタイムＰＣＲ結果を、図４０に示す。ヒト胚幹細胞を低血清、アクチビンＡ及びＷｎｔ３ａで処理することにより、ＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ４、グースコイド、ＨＮＦ−３β、及びＳＯＸ−１７遺伝子の発現がもたらされ、これは、細胞が胚体内胚葉段階に分化していたことを示唆する。しかしながら、Ｗｎｔ−３Ａの存在下、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）コーティングの濃度は、分化に重要な役割を果たすと思われない。
【０２９１】
（実施例２５）
細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上で培養され、続いてＭＥＦＳ上で培養され、胚体内胚葉に分化されたヒト胚幹細胞の分化−Ｗｎｔ−３ａの役割
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上で少なくとも５継代培養したヒト胚幹細胞株Ｈ９からの細胞を、ＥＳ培地中のＭＥＦフィーダー上に播種した。細胞が６０〜７０％コンフルエンシーに到達した時、それらを０．５％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間暴露し、その後２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＡＡ）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。追加の処理グループは、２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａで全５日間＋１０〜１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む。
【０２９２】
３日目及び５日目に、培養物をリアルタイムＰＣＲによりＳＯＸ−１７、ＳＯＸ−７、α−胎児タンパク質（ＡＦＰ）、ＣＸＣＲ４、短尾奇形（Brychyury）（Ｂｒｙ）、グースコイド（ＧＳＣ）、ＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ４、ｈＴＥＲＴ及びＯｃｔ４に関して分析した。ＡＦＰ及びＳＯＸ−７は内蔵内胚葉マーカーとみなされる一方、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ−３β及びＳＯＸ−１７は明確な内胚葉マーカーを表し、ＧＳＣ、Ｂｒｙ、及びＣＸＣＲ４は原始線条のマーカーを表す。ｈＴＥＲＴ及びＯｃｔ−４は、各々、自己再生及び多能性に関するマーカーである。リアルタイム−ＰＣＲ結果を、図４１、パネルａ〜ｄに示す。３日目及び５日目にＦＡＣＳ分析も行った。ＣＸＣＲ−４、及びＣＤ９の発現レベルを分析し、図４１、パネルｅに報告した。
【０２９３】
Ｗｎｔ３ａの不在下で、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ中で培養された細胞のＡＦＰ発現レベルは、未処理の対照で見られたものと同様である。しかしながら、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ中で培養された細胞にＷｎｔ３ａを添加すると、ある時間に亘り増大するＡＦＰの発現の増大が存在する。より低い濃度のアクチビンＡが使用される場合、Ｗｎｔ３ａの存在に関わらずＡＦＰ発現は非常に高い（図４１、パネルａ）。このことは、細胞の胚体外組織への分化を避けるために、高い濃度のアクチビンＡが必要であることを示唆している。
【０２９４】
ＦＡＣＳ分析により、ＣＸＣＲ４陽性細胞は、３日目において、高い濃度のアクチビンＡ及びＷｎｔ３ａで処理されたサンプルにおける集団の２３〜３３％と比較して、高い濃度のアクチビンＡで処理されたがＷｎｔ３ａで処理されなかったサンプルにおける集団の３２〜４２％の範囲にあった（図４１、パネルｅ）。処理の５日目までに、高い濃度のアクチビンＡ及びＷｎｔ３ａで処理された細胞の４３〜５１％と比較して、高い濃度のアクチビンＡで処理されたがＷｎｔ−３ａで処理されなかった細胞の２８〜３２％が、ＣＸＣＲ４を発現した（図４１、パネルｆ）。低い濃度のアクチビンＡで処理された細胞では、Ｗｎｔ−３ａ処理グループ（３〜４％）と比較して、Ｗｎｔ３ａなしの処理グループ（１１〜２０％）において、より多数のＣＸＣＲ４陽性細胞が存在した（図４１、パネルｇ）。全体として、Ｗｎｔ−３ａは、ＭＥＦ上で培養されたヒト胚幹細胞の胚体内胚葉への分化において、有意な役割を果たさないと思われる。このことは、フィーダー層がおそらく十分なＷｎｔ−３ａ又は類似したリガンドを分泌して、アクチビンＡにより誘発される胚体内胚葉形成を向上させることを示唆している。
【０２９５】
（実施例２６）
阻害剤−ＤＫＫ−１で処理した後の、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉への分化
Ｗｎｔ−３ａの添加が分化を増大させるか否かを測定するために、培養液にＷｎｔ−３シグナル伝達の阻害剤を加えた。約６０〜７０％コンフルエンシーのＨ９培養物を、０．５％ＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３ａ、１００ｎｇ／ｍＬ  Ｄｉｋｋｏｐｆ−１（ＤＫＫ−１）及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間暴露した後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＡＡ）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。Ｈ９細胞を、１：３０希釈の増殖因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬで被覆されたプレート上で培養した。プレートは、ＭＡＴＲＩＧＥＬで室温にて１時間被覆された。
【０２９６】
５日目に、培養物をリアルタイムＰＣＲによりＳＯＸ−１７、ＳＯＸ−７、α−胎児タンパク質（ＡＦＰ）、ＣＸＣＲ４、短尾奇形（Brychyury）（Ｂｒｙ）、グースコイド（ＧＳＣ）、ＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ４、ｈＴＥＲＴ及びＯｃｔ４に関して分析した。ＡＦＰ及びＳＯＸ−７は内蔵内胚葉マーカーとみなされる一方、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ−３β及びＳＯＸ−１７は明確な内胚葉マーカーを表し、ＧＳＣ、Ｂｒｙ、及びＣＸＣＲ４は原始線条のマーカーを表す。ｈＴＥＲＴ及びＯｃｔ−４は、各々、自己再生及び多能性に関するマーカーである。結果を図４２に示す。
【０２９７】
Ｗｎｔ３ａの存在下、細胞は、全て胚体内胚葉のマーカーであるＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ−３β及びＳＯＸ１７を発現する。グースコイド等の原始線条形成のマーカーも、未処理対照にて検出されたものと比較して高いレベルで検出された。ＤＫＫ１の添加により、上述の分化マーカーの発現レベルは、未処理細胞と同様のレベルに劇的に低下した。
【０２９８】
（実施例２７）
組織培養基質被覆ＭＡＴＲＩＧＥＬ上で培養され、低血清＋アクチビンＡ及び＋／−Ｗｎｔ−３ａ中で分化されたＨ９胚幹細胞に関するＤＥマーカーの免疫蛍光染色
５日目に、Ｈ９細胞のＤＥ培養物を、実施例１０に従ってＳＯＸ−１７、ＨＮＦ−３Ｂ、ＧＡＴＡ−４、Ｎ−カドヘリン及びＥ−カドヘリンに関して染色した。全ての核をＤＡＰＩで対比染色した。２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３ａは、Ｗｎｔ−３ａの不在下で分化された培養物と比較して、ＳＯＸ−１７、ＨＮＦ−３β及びＧＡＴＡ−４に関して陽性に染色された有意に多数の核を生じた。更に、Ｗｎｔ−３ａの添加はｅ−カドヘリンの発現を有意に消失させ、Ｎ−カドヘリンの発現を高めた（図４３、パネルａ及び図４３、パネルｂ）。
【０２９９】
（実施例２８）
ＭＥＦ及びＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上での胚体内胚葉の形成後の胚幹細胞内の遺伝子発現における変化のマイクロアレイ分析
ＲＮｅａｓｙミニキット（キアゲン（Qiagen））を使用して、以下の胚幹細胞培養物から全ＲＮＡを単離した：Ａ）ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）−被覆プレート（１：３０希釈）上で培養し、０．５％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間暴露した後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＡＡ）で更に３日間処理したＨ９Ｐ３３細胞；Ｂ）ＭＥＦ上で培養し、０．５％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間暴露した後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで更に３日間処理したＨ９Ｐ４４細胞、並びにＣ）ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）−被覆プレート（１：３０希釈）上で培養し、０．５％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ＋２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３Ａで補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間暴露した後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＡＡ）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理したＨ９Ｐ４８細胞。各グループの対照は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ−被覆皿上に播かれ、ＭＥＦ−条件培地中で培養された細胞、又はＭＥＦ上に播かれＥＳ培地中で培養された細胞を含んでいた。全グループは３つの生物学的複製物を含み、各生物学的複製物は２つの別個の遺伝子チップ上で反復された。
【０３００】
サンプル調製、ハイブリダイゼーション、及び画像分析を、アフィメトリクス・ヒトゲノムＵ１３３プラス２．０アレイに従って行った。正規化及び対数変換の後、ＯｍｎｉＶｉｚ（登録商標）ソフトウエア（ＭＡ）及び遺伝子ＳＩＦＴＥＲ（ＶｉｚＸＬａｂｓ、ワシントン州）を使用して、データ解析を行った。サンプル間の遺伝子発現における有意な差異を、分散の分析と、調整したＰ値（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ及びＨｏｃｈｂｅｒｇ補正）の≦０．０５を用いたＦ検定を使用して評価した。少なくとも１つのグループ内のプレゼントコールを伴う遺伝子のみを分析に含めた。表ＶＩに、グループＡ、グループＢ及びグループＣの間で少なくとも５倍の差異を示す、遺伝子の平均正規化した対数変換シグナル強度を、各遺伝子に関する調整Ｐ値と共に列挙する。
【０３０１】
（実施例２９）
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）で被覆した組織培養基質上で培養したＳＡ００２ＥＳ株の胚体内胚葉（ＤＥ）への分化
以前にＭＡＴＲＩＧＥＬ−被覆プレート（１：３０希釈）上で８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦで補充したＭＥＦ−ＣＭ中で少なくとも３継代培養したＳＡ００２Ｐ３８細胞（セラーティス（Cellartis）、スウェーデン）を、０．５％ＦＢＳ、及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州）＋／−２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３ａ又は１００ｎｍＧＳＫ−３ＢＩＸ阻害剤で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間暴露した後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＡＡ）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。リアルタイムＰＣＲ結果を、図４４、パネルａ及びｂに示す。Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９株と同様、ＳＡ００２株も、ＤＥマーカーの強固な発現のために、Ｗｎｔ−３Ａの添加を必要とした。ＣＸＣＲ４の発現を、図４５に示す：ａ）ＡＡ処理  ｂ）ＡＡ＋Ｗｎｔ−３ａ  ｃ）ＡＡ＋ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤。
【０３０２】
（実施例３０）
ヒト血清で被覆した組織培養基質上で培養した、ヒト胚幹細胞の胚体内胚葉（ＤＥ）への分化
継代５５におけるヒト胚幹細胞株Ｈ１の培養物を、ヒト血清（シグマ、＃Ｈ１３８８、ミズーリ州）被覆プレート上で増殖及び分化させた。０．５ｍＬのヒト血清を６ウェル組織培養液処理プレートの各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートし、ヒト胚幹細胞を加える前に吸引した。細胞が８０％コンフルエンシーに到達した後、それらを以下のように処理した：１０ｎｇ／ｍＬマウス組み換えＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ）又は１００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ（カタログ＃３６１５５０、カルビオケム、カリフォルニア州）及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ）を含有する０．５％ＦＢＳで２日間。その後、２％ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで３日間。次に、培養物をリアルタイムＰＣＲで分析した（図４６、パネルａ及びｂ）。アクチビンＡのみで処理した細胞と比較して、アクチビンＡ＋ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤又はＷｎｔ−３Ａで処理した細胞において胚体内胚葉マーカーの強固な発現が注目された。これらの発見は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）又はヒトフィブロネクチン被覆プレート上で培養したヒト胚幹細胞における本発明者らの発見と同様である。
【０３０３】
（実施例３１）
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）で被覆した組織培養基質上で培養した、ヒト胚幹細胞の胚体内胚葉（ＤＥ）への分化−様々なＧＳＫ−３Ｂ阻害剤の評価
商業的に入手可能な多数のＧＳＫ−３Ｂ阻害剤の効果を、ヒト胚幹細胞からのＤＥの形成において評価した。以下のＧＳＫ−３Ｂ阻害剤を１００ｎＭにて評価した：ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＶＩＩＩ（カタログ＃３６１５４９、カルビオケム、カリフォルニア州）、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ（カタログ＃３６１５５０、カルビオケム、カリフォルニア州）、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＸＩ（カタログ＃３６１５５３、カルビオケム、カリフォルニア州）、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＸＩＩ（カタログ＃３６１５５４、カルビオケム、カリフォルニア州）。Ｈ１Ｐ５４  ＥＳ細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）被覆皿（１：３０希釈）上で培養し、０．５％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＡＡ）＋／−様々なＧＳＫ−３Ｂ阻害剤で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間暴露した後、２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＡＡ）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。対照培養物を、低血清＋高用量のＡＡで処理した。図４７にて、パネルａ及びパネルｂは、５日目の胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現を示す。ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ及びＸＩは、両方とも、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＶＩＩＩ及びＸＩＩと比較して、ＤＥ形成の誘発に効果的であった。
【０３０４】
（実施例３２）
無フィーダー条件下で培養したヒト胚幹細胞による膵臓内胚葉の形成：−レチノイン酸類似体の評価
Ｈ９Ｐ４９胚幹細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）被覆皿上で培養し、０．５％ＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３ａ（カタログ＃１３２４−ＷＮ−００２、Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州）、及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間暴露した後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＡＡ）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。５日目、細胞を収集してＦＡＣＳ及びリアルタイムＰＣＲにより評価した。以前の実施例で指摘したように、このプロトコルはＣＸＣＲ４及びＳＯＸ−１７等の胚体内胚葉マーカーの強固な上方調節をもたらした。得られた５日目の胚体内胚葉細胞を以下の培地条件に暴露して、膵臓内胚葉形成を誘発した：２％ＦＢＳ及び１μＭ全トランス型レチノイン酸（ＲＡ）（カタログ＃Ｒ２６２５、シグマ、ミズーリ州）、又は０．１〜１０μＭ  ＡＭ−５８０（４−［（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸、カタログ＃Ａ８８４３、シグマ、ミズーリ州）、又は０．１〜１μＭ  ＴＴＮＰＢ（４−［（Ｅ）−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−プロペニル］安息香酸アロチノイド酸、カタログ＃Ｔ３７５７、シグマ、ミズーリ州）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で３日間培養する。ＡＭ−５８０及びＴＴＮＰＢはレチノイン酸類似体であり、レチノイン酸受容体に対する親和性を有する。ＲＡ処理の後、２％ＦＢＳ及び２０〜５０ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ（カタログ＃Ｆ０２９１、シグマ、ミズーリ州）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で更に３日間処理した。培養物を回収し、ｍＲＮＡのサンプルを収集して分析した。
【０３０５】
遺伝子発現分析により、１μＭ  ＲＡの添加と、続くｂＦＧＦへの暴露は、ＰＤＸ−１等の膵臓内胚葉マーカーを有意に上方調節することが明らかとなった（図４８、パネルａ〜ｄ）。更に、このプロトコルはＣＤＸ−２及びＡＦＰ等の前腸内胚葉マーカーの強固な発現をもたらした。１μＭ濃度において、ＲＡ類似体の添加は等価な膵臓内胚葉と前腸マーカーとを生じた。しかしながら、１μＭ  ＲＡ類似体の添加は、全トランス型レチノイン酸と比較してより強固なＡＦＰの発現をもたらした。しかしながら、１０μＭ  ＡＭ−５８０の添加はＰＤＸ−１の高い発現を維持する一方で、ＡＦＰ及びＣＤＸ−２発現を抑制した。
【０３０６】
（実施例３４）
ヒト胚幹細胞におけるサイトカイン発現上のＷｎｔ−３ａ処理の効果
Ｗｎｔ−３ａ処理がサイトカイン発現上に有する効果を、タンパク質アレイを使用して分析した。ヒト胚幹細胞株Ｈ９の細胞を、実施例１５に記載した方法に従って培養した。継代５４において、細胞を、０．５％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ＋／−１０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３ａの存在下で２日間分化させた。続いて細胞を、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ及び２％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で更に３日間培養した。５日目の終わりに、各処理グループに関してＣＸＣＲ４発現をＦＡＣＳにより測定した。アクチビンＡのみで処理した細胞は、ＣＸＣＲ４を発現している細胞１％を有した。アクチビンＡ及びＷｎｔ３ａで処理した細胞は、ＣＸＣＲ４発現が陽性の細胞７３％を有した。
【０３０７】
各処理グループの細胞から細胞溶解物を、哺乳動物細胞溶解キット（シグマアルドリッチ（Sigma-Aldrich）、ミズーリ州）を用いて調製した。各処理グループからの条件培地を収集し、濃縮した。レイバイオテック（RayBiotech）、ジョージア州（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／）により提供されたサイトカインアレイパネルを使用して、サイトカインアレイ分析を完了した。表ＶＩＩに、データの正規化及びバックグラウンド減算後のサイトカイン、増殖因子、及び受容体発現を列挙する。各パネルに関して、正及び負の対照も含めた。示したデータは、細胞処理グループ毎の２つの独立したサンプルである（１、２）。
【０３０８】
アンギオジェニン、ＩＧＦＢＰ−１及びＥＧＦの顕著な上方調節が、Ｗｎｔ３処理細胞条件培地中に見られる。ＩＧＦＢＰ−１、ＴＧＦβ−１及びＴＧＦβ−３を含む多数のタンパク質が、Ｗｎｔ３ａ処理細胞溶解物において上方調節された。これら上方調節されたタンパク質を分化培地中に戻し加えて、胚体内胚葉形成上のＷｎｔ３ａの効果を代替又は高めることができる。
【０３０９】
（実施例３５）
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）で被覆された組織培養基質上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉への分化：Ｗｎｔ１の役割
Ｈ１Ｐ５５ＥＳ細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）被覆皿上で培養し、０．５％ＦＢＳ、及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ＋／−１０〜２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−１（レプロテック（PeproTech）、ニュージャージー州、カタログ＃１２０−１７）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間暴露した後、２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＡＡ）及び＋／−１０又は２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−１で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。ＷＮＴ１＋ＡＡの以下の組み合わせを試験した：
ａ）１〜２日目に０．５％ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２中２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ１＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ、次いで３日目に２％ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ、ｂ）１〜２日目に０．５％ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２中２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ１＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ、次いで３〜５日目に２％ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ、ｃ）１〜２日目に０．５％ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２中１０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ１＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ、次いで３日目に２％ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ、ｄ）１〜２日目に０．５％ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２中１０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ１＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ、次いで３〜５日目に２％ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ、ｅ）１〜２日目に０．５％ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２中２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ１＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ、次いで３日目に２％ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍＬＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ１、ｆ）１〜２日目に０．５％ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２中２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ１＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ、次いで３〜５日目に２％ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ１。図４９にて、パネルａ及びパネルｂは、Ｈ１細胞を低血清、ＡＡ及びＷｎｔ−１で処理した後の胚体内胚葉マーカーに関するリアルタイムＰＣＲデータを示す。１００ｎｇ／ｍＬのＡＡの存在下での２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ１の添加は、胚体内胚葉マーカー（Ｂｒｙ、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ−３Ｂ、及びＧＡＴＡ−４）の有意な上方調節をもたらした。
【０３１０】
（実施例３６）
合成培地中にて組織培養基質上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉への分化
低酸素条件（約３％Ｏ2）下で培養され、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）被覆皿上に播かれたＨ１胚幹細胞を、ＭＥＦ−条件培地中で約６０〜７０％コンフルエンシーまで培養した後、０．５％ＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ−３ａ（カタログ＃１３２４−ＷＮ−００２、Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州）、及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間暴露し、その後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＡＡ）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３〜４日間処理した。並行して、ＭＡＴＲＩＧＥＬ上で培養したＨ１細胞を、０．５〜１％Ｂ２７（インビトロジェン、カリフォルニア州）＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ−３ａ＋１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ＋／−ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ（カタログ＃３６１５５０、カルビオケム、カリフォルニア州）で補充したＤＭＥＭ−Ｆ１２又はＤＭＥＭ−ＬＧに４〜５日間暴露した。いくつかの培養液では、１％Ｂ２７の代わりに１％Ｎ２補充物（インビトロジェン、カリフォルニア州）を使用した。
【０３１１】
更に、「ＥＸＰＲＥＳ」細胞（増殖可能な前原始線条細胞（EXpandable Pre-Primitive Streak cells））と称される親Ｈ９ＥＳ株から単離した細胞株も、上述したものと同一の培地配合物に暴露して、胚体内胚葉（ＤＥ）の形成を誘発した。ＥＸＰＲＥＳ細胞の性質は、以前に米国特許出願第６０／９１３，４７５号に開示されている。最後に、インビトロジェンから獲得し、ＭＡＴＲＩＧＥＬ皮膜プレート上でＭＥＦ−条件培地＋８ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ内で培養したＢＧＯ１Ｖ株の細胞を上述した分化培地に暴露して、ＤＥ形成を誘発した。図５０に、合成分化培地又は低血清ベースの分化培地に暴露したＥＸＰＲＥＳ０１、ＢＧＯ１Ｖ、及びＨ１Ｐ５０細胞株に関する４〜５日目のＦＡＣＳによるＣＸＣＲ４及びＣＤ９の発現を示す。全試験株において、ＣＸＣＲ４の発現は、１％Ｂ２７補充物ベースの合成培地とＦＢＳベースの培地とを使用した場合にて等価であった。更に、１％Ｎ２補充物は、ＤＥ形成を誘発できず、これはおそらくＮ２補充物中の高濃度のインスリン（８．６μＭ）に起因する。図５１に、低血清又は合成培地＋ＡＡ＋ＷＮＴ３Ａで処理したＥＸＰＲＥＳ０１、ＢＧＯ１Ｖ、及びＨ１培養物の４〜５日目のリアルタイムＰＣＲデータを示す。このプロトコルは、ＤＥマーカーの有意な上方調節をもたらした。図５２に、１％ｂ２７＋ＤＭ−Ｆ１２＋アクチビンＡ＋ＷＮＴ３Ａ＋ＧＳＫ０３Ｂ阻害剤を５日間使用してＤＥに分化されたＥＸＰＲＥＳ  ０１  Ｐ４９細胞の免疫蛍光画像を示す。大部分の細胞はＧＡＴＡ−４、ＳＯＸ−１７、及びＨＮＦ−３Ｂに関して陽性に染色され、少数の細胞がＯＣＴ−４、ＳＯＸ−２、及びＮａｎｏｇに関して陽性に染色された。
【０３１２】
（実施例３７）
合成培地中にてＭＥＦＳ上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉への分化
Ｈ１細胞を、以前にマイトマイシン処理マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を播種した６ウェルプレート上に播いた。細胞を、２０％ノックアウト血清代替、１００ｎＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、０．５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（全てインビトロジェン／ＧＩＢＣＯより）及び８ｎｇ／ｍＬヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（Ｒ＆Ｄシステムズ）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（インビトロジェン／ＧＩＢＣＯ）からなるＥＳ細胞培地中で、７０〜８０％まで増殖させた。
【０３１３】
ＤＥ形成のために、以下に詳細する他の増殖因子を加えて、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は不在下で細胞を処理した。以下のレジメンに示すように、増殖因子を増大する濃度のＦＢＳに段階的に加えた：
０日目：ＤＭＥＭ−ＬＧ又はＲＰＭＩ中の０％ＦＢＳ又は１％Ｂ２７
１日目：ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＲＰＭＩ中の０．５％ＦＢＳ又は１％Ｂ２７
２〜５日目：ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＲＰＭＩ中の２％ＦＢＳ又は１％Ｂ２７
代替的に、細胞を、ＨＥＳＧｒｏ培地（ケミコン、カリフォルニア州）＋１００ｎＭ  ＬＹ−化合物（ＥＭＤ、カリフォルニア州）＋１００ｎｇ／ｍＬのＡＡで１〜５日間処理した。
【０３１４】
細胞を１〜５日目にＦＡＣＳ分析及びＲＴ−ＰＣＲのために回収した。全ての増殖因子は、Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州から購入した。図５３に、低血清＋アクチビンＡ又は合成培地＋アクチビンＡのいずれかに１〜５日間暴露したＨ１細胞に関するリアルタイムＰＣＲデータを示す。倍増の発現レベルを１日目の値に正規化した。
【０３１５】
本明細書を通して引用された刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明の様々な態様を、実施例及び好ましい実施形態を参照して説明してきたが、本発明の範囲は、以上の明細書の記述ではなく、特許法の原則の下で解釈される以下の特許請求の範囲により定義されることが理解されるであろう。
【０３１６】
【表１】
0005738591.tif 000002
【０３１７】
【表２】
0005738591.tif 000003
【０３１８】
【表３】
0005738591.tif 000004
【０３１９】
【表４】
0005738591.tif 000005
【０３２０】
【表５】
0005738591.tif 000006
【０３２１】
【表６】
0005738591.tif 000007
【０３２２】
【表７−１】
0005738591.tif 000008
【０３２３】
【表７−２】
0005738591.tif 000009
【０３２４】
【表７−３】
0005738591.tif 000010
【０３２５】
【表７−４】
0005738591.tif 000011
【０３２６】
【表７−５】
0005738591.tif 000012
【０３２７】
【表７−６】
0005738591.tif 000013
【０３２８】
【表７−７】
0005738591.tif 000014
【０３２９】
【表７−８】
0005738591.tif 000015
【０３３０】
【表７−９】
0005738591.tif 000016
【０３３１】
【表７−１０】
0005738591.tif 000017
【０３３２】
【表７−１１】
0005738591.tif 000018
【０３３３】
【表７−１２】
0005738591.tif 000019
【０３３４】
【表７−１３】
0005738591.tif 000020
【０３３５】
【表７−１４】
0005738591.tif 000021
【０３３６】
【表７−１５】
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【０３３７】
【表７−１６】
0005738591.tif 000023
【０３３８】
【表７−１７】
0005738591.tif 000024
【０３３９】
【表７−１８】
0005738591.tif 000025
【０３４０】
【表７−１９】
0005738591.tif 000026
【０３４１】
【表７−２０】
0005738591.tif 000027
【０３４２】
【表７−２１】
0005738591.tif 000028
【０３４３】
【表７−２２】
0005738591.tif 000029
【０３４４】
【表７−２３】
0005738591.tif 000030
【０３４５】
【表７−２４】
0005738591.tif 000031
【０３４６】
【表７−２５】
0005738591.tif 000032
【０３４７】
【表７−２６】
0005738591.tif 000033
【０３４８】
【表７−２７】
0005738591.tif 000034
【０３４９】
【表７−２８】
0005738591.tif 000035
【０３５０】
【表７−２９】
0005738591.tif 000036
【０３５１】
【表７−３０】
0005738591.tif 000037
【０３５２】
【表７−３１】
0005738591.tif 000038
【０３５３】
【表７−３２】
0005738591.tif 000039
【０３５４】
【表７−３３】
0005738591.tif 000040
【０３５５】
【表７−３４】
0005738591.tif 000041
【０３５６】
【表７−３５】
0005738591.tif 000042
【０３５７】
【表７−３６】
0005738591.tif 000043
【０３５８】
【表７−３７】
0005738591.tif 000044
【０３５９】
【表７−３８】
0005738591.tif 000045
【０３６０】
【表７−３９】
0005738591.tif 000046
【０３６１】
【表７−４０】
0005738591.tif 000047
【０３６２】
【表７−４１】
0005738591.tif 000048
【０３６３】
【表７−４２】
0005738591.tif 000049
【０３６４】
【表７−４３】
0005738591.tif 000050
【０３６５】
【表７−４４】
0005738591.tif 000051
【０３６６】
【表７−４５】
0005738591.tif 000052
【０３６７】
【表７−４６】
0005738591.tif 000053
【０３６８】
【表７−４７】
0005738591.tif 000054
【０３６９】
【表７−４８】
0005738591.tif 000055
【０３７０】
【表７−４９】
0005738591.tif 000056
【０３７１】
【表７−５０】
0005738591.tif 000057
【０３７２】
【表７−５１】
0005738591.tif 000058
【０３７３】
【表７−５２】
0005738591.tif 000059
【０３７４】
【表８】
0005738591.tif 000060
【０３７５】
【表９−１】
0005738591.tif 000061
【０３７６】
【表９−２】
0005738591.tif 000062
【０３７７】
【表９−３】
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【０３７８】
【表９−４】
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【０３７９】
【表９−５】
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【０３８０】
【表９−６】
0005738591.tif 000066
【０３８１】
【表９−７】
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【０３８２】
【表９−８】
0005738591.tif 000068
【０３８３】
【表９−９】
0005738591.tif 000069
【０３８４】
【表９−１０】
0005738591.tif 000070
【０３８５】
【表９−１１】
0005738591.tif 000071
【０３８６】
【表９−１２】
0005738591.tif 000072
【０３８７】
【表９−１３】
0005738591.tif 000073
【０３８８】
【表９−１４】
0005738591.tif 000074
【０３８９】
【表９−１５】
0005738591.tif 000075
【０３９０】
【表９−１６】
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【０３９１】
【表９−１７】
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【０３９２】
【表９−１８】
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【０３９３】
【表９−１９】
0005738591.tif 000079
【０３９４】
【表９−２０】
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【０３９５】
【表９−２１】
0005738591.tif 000081
【０３９６】
【表９−２２】
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【０３９７】
【表９−２３】
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【０３９８】
【表９−２４】
0005738591.tif 000084
【０３９９】
【表９−２５】
0005738591.tif 000085
【０４００】
【表９−２６】
0005738591.tif 000086
【０４０１】
【表９−２７】
0005738591.tif 000087
【０４０２】
【表９−２８】
0005738591.tif 000088
【０４０３】
【表９−２９】
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【０４０４】
【表９−３０】
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【０４０５】
【表９−３１】
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【０４０６】
【表９−３２】
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【０４０７】
【表９−３３】
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【０４０８】
【表９−３４】
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【０４０９】
【表９−３５】
0005738591.tif 000095
【０４１０】
【表９−３６】
0005738591.tif 000096
【０４１１】
【表９−３７】
0005738591.tif 000097
【０４１２】
【表９−３８】
0005738591.tif 000098
【０４１３】
【表１０−１】
0005738591.tif 000099
【０４１４】
【表１０−２】
0005738591.tif 000100
【０４１５】
〔実施態様〕
（１）  多能性幹細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる方法であって：
ａ．前記多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞をＢ２７で補充された培地を含む合成培地中で培養し、前記多能性幹細胞をアクチビンＡで処理することによって、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｃ．前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子、又はレチノイン酸及び少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子で処理することによって、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｄ．前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、γセクレターゼ阻害剤で処理することによって、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、を含む、方法。
（２）  前記Ｂ２７が濃度約０．５％〜約１％で使用される、実施態様１に記載の方法。
（３）  前記Ｂ２７が濃度約１％で使用される、実施態様１に記載の方法。
（４）  前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる前記工程が：
ａ．前記多能性幹細胞を、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上に播く工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞を、Ｂ２７で補充された培地を含む合成培地中で培養する工程と、を含む方法により達成される、実施態様１に記載の方法。
（５）  前記Ｂ２７が濃度約０．５％〜約１％で使用される、実施態様１に記載の方法。
（６）  前記Ｂ２７が濃度約１％で使用される、実施態様１に記載の方法。
（７）  前記Ｂ２７が濃度約０．５％〜約１％で使用される、実施態様４に記載の方法。
（８）  前記Ｂ２７が濃度約１％で使用される、実施態様４に記載の方法。
（９）  前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる前記工程が：
ａ．前記多能性幹細胞を、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上に播く工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞を、アクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと共に第一の培地中で培養する工程と、
ｃ．前記多能性幹細胞を、第二の培地中でアクチビンＡと共に培養する工程と、を含む方法により達成される、実施態様１に記載の方法。
（１０）  前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる前記工程が、前記多能性幹細胞を線維芽細胞フィーダー層上に播く工程を更に含む方法により達成される、実施態様１に記載の方法。
（１１）  前記多能性幹細胞が、Ｂ２７、Ｗｎｔリガンド及びアクチビンＡで補充されたＤＭＥＭ−Ｆ１２を含む合成培地中で培養される、実施態様４に記載の方法。
（１２）  前記多能性幹細胞が、Ｂ２７、Ｗｎｔリガンド及びアクチビンＡで補充されたＤＭＥＭ−ＬＧを含む合成培地中で培養される、実施態様４に記載の方法。
（１３）  多能性幹細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる方法であって：
ａ．前記多能性幹細胞を、Ｂ２７で補充された培地を含む合成培地中で培養する工程と、
ｂ．前記多能性細胞をアクチビンＡで処理することによって、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｃ．前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子、又はレチノイン酸及び少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子で処理することによって、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、を含む、方法。
（１４）  前記Ｂ２７が濃度約０．５％〜約１％で使用される、実施態様１３に記載の方法。
（１５）  前記Ｂ２７が濃度約１％で使用される、実施態様１３に記載の方法。
（１６）  前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる前記工程が、前記多能性幹細胞を線維芽細胞フィーダー層上に播く工程を更に含む方法により達成される、実施態様１３に記載の方法。
（１７）  多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる方法であって：
ａ．前記多能性幹細胞を、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上に播く工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞を、Ｂ２７で補充された培地を含む合成培地中で培養する工程と、を含む、方法。
（１８）  前記Ｂ２７が濃度約０．５％〜約１％で使用される、実施態様１７に記載の方法。
（１９）  前記Ｂ２７が濃度約１％で使用される、実施態様１７に記載の方法。
（２０）  前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる前記工程が、前記多能性幹細胞を線維芽細胞フィーダー層上に播く工程を更に含む方法により達成される、実施態様１７に記載の方法。
（２１）  前記多能性幹細胞が、Ｂ２７、Ｗｎｔリガンド及びアクチビンＡで補充されたＤＭＥＭ−Ｆ１２を含む合成培地中で培養される、実施態様１７に記載の方法。
（２２）  前記Ｂ２７が濃度約０．５％〜約１％である、実施態様２１に記載の方法。
（２３）  前記Ｂ２７が濃度約１％である、実施態様２１に記載の方法。
（２４）  前記多能性幹細胞が、Ｂ２７、Ｗｎｔリガンド及びアクチビンＡで補充されたＤＭＥＭ−ＬＧを含む合成培地中で培養される、実施態様１７に記載の方法。
（２５）  前記Ｂ２７が濃度約０．５％〜約１％である、実施態様２４に記載の方法。
（２６）  前記Ｂ２７が濃度約１％である、実施態様２４に記載の方法。
（２７）  前記多能性幹細胞が、Ｂ２７及びアクチビンＡで補充されたＤＭＥＭ−Ｆ１２を含む合成培地中で培養される、実施態様１に記載の方法。
（２８）  前記Ｂ２７が濃度約０．５％〜約１％である、実施態様２７に記載の方法。
（２９）  前記Ｂ２７が濃度約１％である、実施態様２７に記載の方法。
（３０）  前記多能性幹細胞が、Ｂ２７及びアクチビンＡで補充されたＤＭＥＭ−Ｆ１２を含む合成培地中で培養される、実施態様１に記載の方法。
（３１）  前記Ｂ２７が濃度約０．５％〜約１％である、実施態様３０に記載の方法。
（３２）  前記Ｂ２７が濃度約１％である、実施態様３０に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４１−３】
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【図４１−４】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３−１】
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【図５３−２】
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【図５３−３】
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