(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
銀耳を乾燥するステップと、
選定割合に従って前記銀耳を水中に浸漬するステップと、
５５℃〜９５℃の熱水により銀耳抽出液を抽出し、そして前記銀耳抽出液を室温まで冷却させるステップと、
前記銀耳抽出液を第１段階の遠心を行わせるステップと、
前記銀耳抽出液を濾過することにより、銀耳濃縮液を得るステップと、
前記銀耳濃縮液を分離させて濃縮することにより、８００００より大きい分子量を有する銀耳多糖類を得るステップと、
前記銀耳多糖類及びアルコールを混合して１２時間〜４８時間作用させ、第２段階の遠心を行わせるステップと、
アルコールにより前記銀耳多糖類を洗浄するステップと、
前記銀耳多糖類を乾燥するステップと、
２８℃〜５５℃の環境条件において前記銀耳多糖類を１２時間〜４８時間静置することにより、前記銀耳多糖類中の蛋白質を除去するステップとを含み、
前記第１段階の遠心は、４℃の条件において４０００ｒｐｍ〜６０００ｒｐｍの速度で５分間〜１５分間行われ、
前記第２段階の遠心は、６０００ｒｐｍ〜１５０００ｒｐｍの速度で５分間〜１５分間行われることを特徴とする、網膜細胞保護用の銀耳多糖類の製造方法。
【請求項２】
前記銀耳と水の前記選定割合は、１：４０〜１：１００であることを特徴とする、請求項１に記載の網膜細胞保護用の銀耳多糖類の製造方法。
【請求項３】
前記銀耳を、前記熱水中に２時間〜６．５時間浸漬することを特徴とする、請求項１に記載の網膜細胞保護用の銀耳多糖類の製造方法。
【請求項４】
保留粒子径が４μｍ〜１０μｍの濾紙を用いて濾過を行うことを特徴とする、請求項１に記載の網膜細胞保護用の銀耳多糖類の製造方法。
【請求項５】
前記銀耳多糖類の乾燥時間は、０．５時間〜５時間であることを特徴とする、請求項１に記載の網膜細胞保護用の銀耳多糖類の製造方法。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れか１項に記載の網膜細胞保護用の銀耳多糖類の製造方法によって製造される網膜細胞保護用の銀耳多糖類であって、医薬品と食品の賦形剤または添加剤を含むことを特徴とする、網膜細胞保護用の銀耳多糖類。
【請求項７】
前記賦形剤または前記添加剤は、調味剤、甘味料、防腐剤、抗酸化剤、キレート剤、等浸透剤、潤滑剤、錠剤補助剤、着色剤、保湿剤、結合剤、医薬的に許容し得る担体及びこれらの組合わせからなる群より選択されることを特徴とする、請求項６に記載の網膜細胞保護用の銀耳多糖類。
【請求項８】
請求項１乃至５の何れか１項に記載の網膜細胞保護用の銀耳多糖類の製造方法によって製造される網膜細胞保護用の銀耳多糖類を含む目薬であって、分子量８０ｋＤａ以上の多糖類、全フェノールやフラボノイドを含むことを特徴とする、目薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、銀耳多糖類に係り、特に、製造過程において化学薬剤を添加することなく、かつ網膜細胞を酸化ダメージから保護する作用を奏することができる、銀耳多糖類及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
文献によれば、食用・薬用きのこ類は、抗酸化物のソースとして提供され、人体内の活性酸素から生じる超酸化物陰イオンや過酸化水素等の遊離基を減少させることができることが示されている。きのこ類の子実体または菌糸体抽出液から得られる有効成分としては、多糖体（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、トリテルペン類（ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ）、蛋白質（ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）やキトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）等が挙げられる。そのうち、重要な有効成分としては、グルカン（ｇｌｕｃａｎｓ）、フェノール類とフラボン類が挙げられ、かつβ−Ｄ−グルカン（β−Ｄ−ｇｌｕｃａｎｓ）、全フェノール類とフラボン類は、強力な抗酸化活性を持つ。
【０００３】
多糖体の最も知られている働きとしては、マクロファージの活性化、抗酸化、解毒や降コレステロール等が挙げられ、人体の免疫力を調節することによって各種の病原因子を軽減させて抗病性機能が達成される。近年、研究から分かるように、例えば霊芝、スエヒロタケ、冬虫夏草やヤマブシタケ等の有益な菌蕈類の菌糸から生成される多糖体のいずれも非常に強い抗癌性・抗病性機能を有する。
【０００４】
銀耳は、高等担子菌の１種で昔から菌の王様という美称が与えられた。銀耳（Ｔｒｅｍｅｌｌａ  ｆｕｃｉｆｏｒｍｉｓ  Ｂｅｒｋ）は、シロキクラゲ（ｗｈｉｔｅ  ｊｅｌｌｙ  ｆｕｎｇｉ）とも称され、生物の分類上では、真菌界、ディカリア亜界、担子菌門、菌蕈亜門、シロキクラゲ綱、シロキクラゲ目（Ｔｒｅｍｅｌｌａｌｅｓ）、シロキクラゲ科（Ｔｒｅｍｅｌｌａｃｅａｅ）、シロキクラゲ属（Ｔｒｅｍｅｌｌａ）に属するきのこである。統計によると、全世界のシロキクラゲ属は約４０種余りを含み、その形態としては２部分に分けられ、即ち、栄養器官である菌糸体と繁殖器官である子実体からなる。新鮮な銀耳子実体は、純白色で半透明状である。乾燥すると、角質になって質感が硬く、脆くなり、かつ白色またはベージュ色で、体積が本来の約１０分の１に大きく縮むことがある。
【０００５】
一般的に、銀耳の食用可能な部分が子実体で、それに食物繊維が豊富に含まれており、また蛋白質６．７％〜１０％、炭水化物６５％〜７１．２％、脂肪０．６％〜１２．８％、粗繊維２．４％〜２．７５％、無機塩４％〜５．４％、水分１５．２％〜１８．７％及び少量のビタミンＢ群が含まれている。銀耳の蛋白質中に複数のアミノ酸が含まれている。その主成分としては、抗腫瘍性多糖（β−ｇｌｕｃａｎ）も含まれているため、価値の高い農産品になりつつある。
【０００６】
銀耳多糖類の主な化学構造は、α−１，３−マンナン（ｍａｎｎａｎ）を主鎖とし、その側鎖にβ−Ｄ−キシロース（ｘｙｌｏｓｅ）とβ−Ｄ−グルクロン酸（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）が結合しており、Ｃ２の位置にβ−（１，２）Ｄ−キシロビオース（ｘｙｌｏｂｉｏｓｅ）が結合しており、またグルクロン酸が含まれているため、酸性を呈して酸性ヘテロ多糖体に属する。銀耳子実体に含まれている銀耳多糖類は、組成割合によって異なるので、主に５種の構造に分けられる。（１）酸性多糖：キシロース、マンノースとグルクロン酸からなる他に、少量のブドウ糖、フコースが含まれており、その分子内には典型的なアセチル基構造も含まれている。（２）中性雑多糖：その分子量は約８０００で、主にキシロース、マンノース、ガラクトースとブドウ糖から構成される。（３）酸性オリゴ糖：それぞれＯ−β−Ｄ−グルクロン酸−（１−２）−Ｏ−α−Ｄ−マンノース−（１−３）−Ｏ−α−Ｄ−マンノース−（１−３）−Ｄ−マンノースＯ−（β−Ｄ−グルクロン酸）−（１−２）−Ｏ−α−Ｄ−マンノース−（１−３）−Ｄ−マンノース２−Ｏ−（β−Ｄ−グルクロン酸）−Ｄ−マンノースである。（４）細胞壁多糖：それは２種の細胞壁多糖に分離し得る。即ち、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−マンノースとＤ−キシロースからなる酸性多糖、及びＤ−ブドウ糖、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−マンノースとＤ−キシロースからなるアルカリ不溶性多糖に分離し得る。（５）細胞外多糖：主にフコース、アラビノース、キシロース、マンノースとグルクロン酸からなる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
銀耳を取得するソースは２つに分けられ、その１つは、液体で培養された菌糸体から抽出して取得する。また１つは、栽培袋で培養された食用可能な子実体から生成する。しかし、抽出に関連する技術が未成熟であるために、商品化して量産することができなかった。しかして、銀耳子実体から多糖体を抽出する伝統的な方法は、アルカリ性化学薬剤を用いて銀耳子実体の処理を行い、水洗いまたはｐＨ値の調節により中性付近のｐＨ値に調整され、そして熱水またはエタノール（アルコール）により抽出して取得する。このような抽出方法によれば、銀耳多糖類の抽出率は２７〜３０％に達することができるが、化学薬剤を利用して抽出する手段なので、得られた銀耳多糖類に化学物質が残留してしまうおそれがある。従って、上記の問題点を改善するため、化学物質が含まれていない天然の銀耳多糖類が得られると共に、銀耳多糖類の抽出率を増加することができるように、銀耳多糖類を抽出する技術は、さらなる改善が求められている。
【０００８】
そこで、本発明は、上記のような従来技術の問題点に鑑みてなされたものであり、網膜細胞保護用の銀耳多糖類及びその製造方法を提供することを本発明の目的としている。これにより、従来技術のように、化学物質を利用して銀耳多糖類を抽出するという問題点を解決することができると共に、抽出される銀耳多糖類により網膜細胞を保護することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の目的に従って、本発明は、網膜細胞保護用の銀耳多糖類の製造方法を提供し、その製造方法は、銀耳を乾燥するステップと、選定割合に従って銀耳を水中に浸漬するステップと、５５℃〜９５℃の熱水により銀耳抽出液を抽出し、そして銀耳抽出液を室温まで冷却させるステップと、銀耳抽出液を第１段階の遠心を行わせるステップと、銀耳抽出液を濾過することにより、銀耳濃縮液を得るステップと、銀耳濃縮液を分離させて濃縮することにより、８００００より大きい分子量を有する銀耳多糖類を得るステップと、銀耳多糖類及びアルコールを混合して第２段階の遠心を行わせるステップと、アルコールにより前記銀耳多糖類を洗浄するステップと、銀耳多糖類を乾燥するステップと、２８℃〜５５℃の環境条件において銀耳多糖類を１２時間〜４８時間静置することにより、銀耳多糖類中の蛋白質を除去するステップとを含む。
【００１０】
より好ましいのは、銀耳と水の選定割合は、１：４０〜１：１００である。
【００１１】
より好ましいのは、銀耳を、熱水中に２時間〜６．５時間浸漬することである。
【００１２】
より好ましいのは、第１段階の遠心は、４℃の条件において４０００ｒｐｍ〜６０００ｒｐｍの速度で５分間〜１５分間行われることである。
【００１３】
より好ましいのは、銀耳抽出液を濾過する工程は、保留粒子径が４μｍ〜１０μｍの濾紙を用いて濾過を行うことである。
【００１４】
より好ましいのは、銀耳多糖類及びアルコールを混合して１２時間〜４８時間作用させることである。
【００１５】
より好ましいのは、第２段階の遠心は、６０００ｒｐｍ〜１５０００ｒｐｍの速度で５分間〜１５分間行われることである。
【００１６】
より好ましいのは、銀耳多糖類の乾燥時間は、０．５時間〜５時間である。
【００１７】
より好ましいのは、本発明の網膜細胞保護用の銀耳多糖類は、医薬品と食品の賦形剤または添加剤を含むことである。賦形剤または添加剤は、調味剤、甘味料、防腐剤、抗酸化剤、キレート剤、等浸透剤、潤滑剤、錠剤補助剤、着色剤、保湿剤、結合剤、医薬的に許容し得る担体及びこれらの組み合わせからなる群より選択される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、銀耳多糖体を測定したところ、その中には、全フェノールやフラボノイド等の成分が含まれていることにより、生理的な活性が現れ、酸化を効果的に防止できる活性を有することから、生理的な抗酸化機能を持つ食品としての開発潜在力が期待されている。生体の外網膜色素上皮細胞に酸化ストレスを与える過程において、多糖体と全フェノールが含まれている銀耳抽出物による網膜細胞に対して保護作用を奏することができ、網膜細胞を酸化のダメージから免れることができる。
【００１９】
上記のとおり、本発明に係る網膜細胞保護用の銀耳多糖類及びその製造方法は、化学薬剤に頼ることなく、純粋で無毒な天然の銀耳多糖類抽出物が得られ、人体に直接使用することができ、網膜細胞を保護する効果が達成される。
【００２０】
本発明をさらに完全に理解するために、本発明の技術特徴及びその達成できる作用効果については、好適な実施例の詳細な説明と併せて後述する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明に係る網膜細胞保護用の銀耳多糖類の製造方法を示すフローチャートである。
【図２】全フェノールの吸光度を示す検量線である。
【図３】本発明に係る網膜細胞保護用の銀耳多糖類の全フェノール含有量を示す図である。
【図４】フラボノイドの吸光度を示す検量線である。
【図５】本発明に係る網膜細胞保護用の銀耳多糖類のフラボノイド含有量を示す図である。
【図６】本発明に係る網膜細胞保護用の銀耳多糖類（ＬＴ１）による網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）に対する生存率を示す図である。
【図７】本発明に係る網膜細胞保護用の銀耳多糖類（ＬＴ１）によるＨ２Ｏ２酸化ダメージを受けた網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）への保護作用を示す図である。
【図８】本発明に係る網膜細胞保護用の銀耳多糖類（ＬＴ１）による網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）のＨ２Ｏ２酸化ダメージに対する修復作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
＜実施例１＞
実施例１：本発明の網膜細胞保護用の銀耳多糖類の製造方法
【００２３】
図１は、本発明に係る網膜細胞保護用の銀耳多糖類の製造方法を示すフローチャートである。図１に示すように、本発明の網膜細胞保護用の銀耳多糖類の製造方法は、ステップＳ２０〜ステップＳ２９を含む。まず、ステップＳ２０において、銀耳を乾燥する。次に、ステップＳ２１において、銀耳と水の割合が１：４０〜１：１００で銀耳を水中に浸漬する。ステップＳ２２において、５５℃〜９５℃の熱水により銀耳抽出液を抽出し、そして銀耳抽出液を室温まで冷却させる。ここで、銀耳を熱水中に浸漬する時間は、例えば２時間〜６．５時間であってもよい。続いて、４℃の条件下、ステップＳ２３において、銀耳抽出液を第１段階の遠心を行わせ、遠心の速度が４０００ｒｐｍ〜６０００ｒｐｍであってもよく、遠心の時間が５分間〜１５分間であってもよい。そして、保留粒子径が４μｍ〜１０μｍの濾紙を用いてステップＳ２４を行い、銀耳抽出液を濾過することにより、銀耳濃縮液を得る。その後、異なる効果を有する多糖体を得るために、ステップＳ２５において、きのこ類膜管分離型濃縮機で銀耳濃縮液を分離させて濃縮することにより、８００００より大きい分子量を有する銀耳多糖類を得る。次に、ステップＳ２６において、銀耳多糖類及びアルコールを混合して第２段階の遠心を行わせ、混合後の静置時間は、例えば１２時間〜４８時間であってもよく、かつ６０００ｒｐｍ〜１５０００ｒｐｍの速度で５分間〜１５分間遠心を行ってもよい。ステップＳ２７において、アルコールにより銀耳多糖類を洗浄する。それから、ステップＳ２８において、銀耳多糖類を０．５時間〜５時間乾燥する。最後に、Ｓ２９において、２８℃〜５５℃の条件において銀耳多糖類を１２時間〜４８時間静置することにより、銀耳多糖類中の蛋白質を除去する。
【００２４】
＜実施例２＞
実施例２：β−グルカン（β−Ｇｌｕｃａｎ）分析
【００２５】
（１）多糖類含有量の測定
本実施例は、実施例１に記載の製造方法を利用して、ＬＴ１銀耳株及びＬＴ６銀耳株のそれぞれに対して銀耳多糖類を抽出した後に、各株の銀耳多糖類０．１ｇを精秤し、１．５ｍｌ塩酸（３７％体積百分率）を加え、３０℃の条件の水浴中で１５分間毎に１回攪拌する頻度で４５分間行う。続いて、１０ｍｌの重水素減少水（Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ  Ｄｅｐｌｅｔｅｄ  Ｗａｔｅｒ，ＤＤＷ）を加えて攪拌した後に、重水素減少水を９５℃までに加熱し、２時間温度を維持した後に、室温まで冷却させる。それから、１０ｍｌ、２Ｎの水酸化カリウム（ＫＯＨ）を加え、各銀耳株の管内の内容物を１００ｍｌの容量フラスコに移し、２００ｍＭ、ｐＨ５．０の酢酸ナトリウム緩衝液で管内壁を流し洗い、１００ｍｌを定量して容量フラスコの瓶口を密封膜で封止すると共に、回転混合させてから、２５０ｃｃの遠心瓶中に移し、１５００ｒｐｍの速度で１０分間遠心を行う。その後、上清液０．１ｍｌを取り、そしてｅｘｏ−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ（ｅｘｏ−１，３−β−Ｄ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ）（２０Ｕ／ｍｌ）と、β−グルコシダーゼ（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）及び２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加えて１５ｍｌの試験管中に入れ、攪拌して４０℃の水浴器中で１時間作用させる。また、３ｍｌグルコース酸化酵素／過酸化酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｏｘｉｄａｓｅ／ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を加えて混合し、標準群及びブランク群として調製される。標準群及びブランク群を４０℃の水浴器中で２０分間作用させた後に、１０００μｌを取り、比色セルに置入し、波長５１０ｎｍの光照射下の吸光値を測定する。
【００２６】
１．ブランク群：３ｍｌのｅｘｏ−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ（ｅｘｏ−１，３−β−Ｄ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ）（２０Ｕ／ｍｌ）と、β−グルコシダーゼ（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）及び０．２ｍｌ、ｐＨ５．０の酢酸ナトリウム緩衝液。
２．標準群：３ｍｌのｅｘｏ−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ（ｅｘｏ−１，３−β−Ｄ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ）（２０Ｕ／ｍｌ）と、β−グルコシダーゼ（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）に０．１ｍｌ、ｐＨ５．０の酢酸ナトリウム緩衝液を加えて０．１ｍｌのＤ−ブドウ糖（Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ）標準溶液を加える。
【００２７】
（２）α−グルカン（α−Ｇｌｕｃａｎ）含有量の測定
ＬＴ１銀耳株及びＬＴ６銀耳株の各銀耳多糖類０．１ｇをそれぞれ精秤し、５０ｍｌの冷凍遠心管に置入し、２ｍｌ、２Ｍの水酸化カリウム（ＫＯＨ）を加え、磁石を入れて氷浴器中で２０分間攪拌する。そして、８ｍｌ、ｐＨ３．８の酢酸ナトリウム緩衝液１．２Ｍと、０．２ｍｌのアミログルコシダーゼ（ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）（１６３０Ｕ／ｍｌ）及び転化酵素（５００Ｕ／ｍｌ）を加え、４０℃の水浴中で３０分間作用させた後に、攪拌して、各管から同じ重量を秤量し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心を行った後に、上清液０．１μｌを取り、１５ｍｌの試験管中に置入し、３ｍｌのｅｘｏ−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ（ｅｘｏ−１，３−β−Ｄ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ）（２０Ｕ／ｍｌ）とβ−グルコシダーゼ（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を加え、標準群及びブランク群として調製される。標準群及びブランク群を４０℃の水浴器中で２０分間作用させた後に、１０００μｌを取り、比色皿に置入し、波長５１０ｎｍの吸光度を測定する。
【００２８】
１．ブランク群：３ｍｌのｅｘｏ−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ（ｅｘｏ−１，３−β−Ｄ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ）（２０Ｕ／ｍｌ）と、β−グルコシダーゼ（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）に０．２ｍｌ、ｐＨ５．０の酢酸ナトリウム緩衝液を加える。
２．標準群：３ｍｌのｅｘｏ−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ（ｅｘｏ−１，３−β−Ｄ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ）（２０Ｕ／ｍｌ）と、β−グルコシダーゼ（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）に０．１ｍｌ、ｐＨ５．０の酢酸ナトリウム緩衝液と、０．１ｍｌのＤ−ブドウ糖（Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ）標準溶液を加える。
【００２９】
（３）多糖類含有量からα−グルカン（α−Ｇｌｕｃａｎ）含有量を除いて得られる異なる株の銀耳におけるβ−グルカン（β−Ｇｌｕｃａｎ）含有量の結果を表１に示す。
【００３０】
【表１】
0005705264.tif 000002
【００３１】
＜実施例３＞
実施例３：全フェノール含有量の測定
【００３２】
本実施例は、実施例１に記載の製造方法を利用して、ＬＴ１銀耳株及びＬＴ６銀耳株のそれぞれに対して銀耳多糖類を抽出し、下記のステップを行うことにより、各銀耳株の全フェノール含有量を測定し得る。
【００３３】
（１）試剤の調製：
１．６０％メタノール水溶液。
２．試剤Ａ：０．３％塩酸＋６０％メタノール水溶液。
３．試剤Ｂ：２％炭酸ナトリウム水溶液（ＳｏｄｉｕｍＣａｒｂｏｎａｔｅ）。
４．試剤Ｃ：５０％フォリン−シオカルトフェノール試薬（Ｆｏｌｉｎ−ｃｉｏｃａｌｔｅｕ’ｓ  ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ）。
【００３４】
（２）標準群の調製：１００ｍｇ没食子酸（Ｇａｌｌｉｃ  ａｃｉｄ）を取り、２０ｍｌの試料瓶に移し、そして１０ｍｌの試剤Ａを加え、試剤Ａを用いて標準液の濃度が１０ｍｇ／ｍｌになるように希釈する。
【００３５】
（３）測定方法：５０μｌの各濃度の標準試料と測定待ち試料を取り、１．５ｍｌの微量遠心管に置入し、そして１ｍｌの試剤Ｂを加え、攪拌した後に２分間静置し、光を避けながら、５０μｌの試剤Ｃを加えて攪拌し、室温下３０分間静置してから、１ｍｌを比色管へ吸い取り、一方、ブランク群の試験管には１ｍｌの重水素減少水を使用し、波長７５０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【００３６】
図２は、全フェノールの吸光度を示す検量線であり、図３は、本発明に係る網膜細胞保護用の銀耳多糖類の全フェノール含有量を示す図である。図２と図３を併せて参照する。図２には、波長７５０ｎｍの光照射下の全フェノールの吸光度曲線図を示しており、吸光度と濃度が正比例関係になり、それを検量線として図３と対照すると、銀耳株ＬＴ１及び銀耳株ＬＴ６の銀耳多糖類中の全フェノール含有量が分かる。
【００３７】
＜実施例４＞
実施例４：フラボノイド含有量の測定
【００３８】
本実施例は、実施例１に記載の製造方法を利用して、ＬＴ１銀耳株及びＬＴ６銀耳株のそれぞれに対して銀耳多糖類を抽出し、下記のステップを行うことにより、各銀耳株のフラボノイド含有量を測定し得る。
【００３９】
（１）試剤の調製：
１．７０％エタノール水溶液。
２．試剤Ｈ：１０％塩化アルミニウム水溶液。
３．試剤Ｉ：１Ｍ酢酸カリウム水溶液。
【００４０】
（２）標準液の調製：１０ｍｇクエルセチン（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）を取り、２０ｍｌの試料瓶に移し、そして１０ｍｌの７０％エタノール水溶液を加える。また、７０％エタノール水溶液を用いて標準液の所要濃度が１ｍｇ／ｍｌになるように希釈する。
【００４１】
（３）測定方法：０．５ｍｌの各濃度の標準試料と測定待ち試料を取り、１５ｍｌの遠心管に置入し、一方、０．５ｍｌの重水素減少水をブランク群の試験管に置入する。２．８ｍｌの重水素減少水と１．５ｍｌ、９９．９％のメタノールを加え、そして０．１ｍｌの試剤Ｈと試剤Ｉを加えて攪拌し、室温下３０分間静置してから、１ｍｌを比色管へ吸い取り、波長４１５ｎｍの光照射下の吸光度を測定する。
【００４２】
図４は、フラボノイドの吸光度を示す検量線であり、図５は、本発明に係る網膜細胞保護用の銀耳多糖類のフラボノイド含有量を示す図である。図４と図５を併せて参照する。図４には、波長４１５ｎｍの光照射下のフラボノイドの吸光度曲線を示しており、それを検量線として図５と対照すると、銀耳株ＬＴ１及び銀耳株ＬＴ６の銀耳多糖類中のフラボノイド含有量が分かる。
【００４３】
＜実施例５＞
実施例５：細胞生存率の測定（ＭＴＴ  ａｓｓａｙ）
【００４４】
網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）を１００μｌの５×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ細胞量で９６ｗｅｌｌの微量培養皿（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ）に接種し、そして培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）に置いて２４時間培養した後に、旧培養液を除去する。続いて、１００μｌ／ｗｅｌｌの燐酸塩緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）で細胞表面を洗浄した後に除去する。それから、１００μｌ／ｗｅｌｌの細胞培養液と濃度測定待ち試料を加え、そしてそれぞれ２４、４８及び７２時間培養した後に溶液を除去し、それぞれ１００μｌ／ｗｅｌｌの０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ溶液を加え、３７℃の細胞培養器（５％のＣＯ２を含む）に４時間培養した後に溶液を除去し、１００μｌ／ｗｅｌｌのジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，ＤＭＳＯ）を加えてホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）結晶を溶解し、一方、ブランク群としてブランク井戸孔（ｗｅｌｌ）に同体積のＤＭＳＯを加えてなる。酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｅｒ）を使用して波長５４０ｎｍにおける吸光値を検出する。
【００４５】
図６は、本発明に係る網膜細胞保護用の銀耳多糖類（ＬＴ１）による網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）に対する生存率を示す図である。図６を参照し、図中には、異なる銀耳多糖類の濃度において、網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）をそれぞれ２４時間と４８時間培養した後の細胞生存率の計測結果を示している。図６に示すように、２４時間培養した後の網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）の生存率より、各濃度の銀耳多糖類中に４８時間培養した後の網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）の生存率が高いことが分かる。
【００４６】
＜実施例６＞
実施例６：Ｈ２Ｏ２酸化ダメージを受けたＡＲＰＥ−１９細胞への保護
【００４７】
銀耳抽出物（ＬＴ１）により、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）酸化ダメージを受けたＡＲＰＥ−１９細胞を保護する。ＡＲＰＥ−１９細胞を１０００μｌの６×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ細胞量で１２ｗｅｌｌの微量培養皿（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ）に接種し、そして培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）に置いて２４時間培養した後に、旧培養液を除去する。続いて、５００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳ緩衝液で細胞表面を洗浄した後に旧培養液を除去する。それから、１０００μｌ／ｗｅｌｌの細胞培養液と濃度測定待ち試料を加え、そして１２時間培養した後に溶液を除去する。続いて、５００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳ緩衝液で細胞表面を洗浄した後に除去する。それから、１０００μｌ／ｗｅｌｌの細胞培養液と１００μｌ／ｗｅｌｌ、５００μＭの過酸化水素Ｈ２Ｏ２を加えて２時間培養した後に溶液を除去する。その後、５００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳ緩衝液で細胞表面を洗浄した後に除去する。それから、１０００μｌ／ｗｅｌｌの細胞培養液を加えて４時間培養した後に溶液を除去する。続いて、５００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳ緩衝液で細胞表面を洗浄した後に除去する。それから、３％のホルマリンを加えて１５分後に除去し、５００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳ緩衝液で細胞表面を洗浄した後に除去する。１％のクリスタルバイオレットを加えて１５分後に除去し、５００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳ緩衝液で細胞表面を洗浄した後に除去する。３００μｌ／ｗｅｌｌの抽出物緩衝液を加えて２０分後に波長５９０ｎｍの分光光度を測定する。
【００４８】
図７は、本発明に係る網膜細胞保護用の銀耳多糖類（ＬＴ１）によるＨ２Ｏ２酸化ダメージを受けた網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）への保護作用を示す図である。図７を参照し、＊ｐは、実験数値には差があることを示しており、＊＊ｐは、実験数値には顕著な差があることを示している。図中には、各種の異なる濃度の銀耳多糖類を含む網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）が、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）酸化ダメージを受けた後に、波長５９０ｎｍの光照射下の分光光度をそれぞれ測定する。図に示すように、銀耳多糖類が添加されていない健康な網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）は、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）酸化ダメージを受けた網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）と比較して、酸化ダメージを受けた網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）の吸光率が大幅に低下することが分かる。しかし、網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）に銀耳多糖類が添加される場合は、銀耳多糖類が添加されていない網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）場合に比べて、吸光度の上昇が見られた。これによると、銀耳多糖類は、網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）を酸化ダメージから保護する効果があることが分かる。
【００４９】
＜実施例７＞
実施例７：Ｈ２Ｏ２酸化ダメージを受けたＡＲＰＥ−１９細胞への修復
【００５０】
ＡＲＰＥ−１９細胞を１０００μｌの６×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ細胞量で１２ｗｅｌｌの微量培養皿（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ）に接種し、そして培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）に置いて２４時間培養した後に、旧培養液を除去する。続いて、５００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳ緩衝液で細胞表面を洗浄した後に旧培養液を除去する。それから、１０００μｌ／ｗｅｌｌの細胞培養液と１００μｌ／ｗｅｌｌ、５００μＭの過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を加えて２時間培養した後に溶液を除去する。その後、５００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳ緩衝液で細胞表面を洗浄した後に除去する。それから、１０００μｌ／ｗｅｌｌの細胞培養液と濃度測定待ち試料を加え、そして２４時間培養した後に溶液を除去する。続いて、５００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳ緩衝液で細胞表面を洗浄した後に除去する。さらに続いて、５００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳ緩衝液で細胞表面を洗浄した後に除去する。それから、３％のホルマリンを加えて１５分後に除去し、５００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳ緩衝液で細胞表面を洗浄した後に除去する。１％のクリスタルバイオレットを加えて１５分後に除去し、５００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳ緩衝液で細胞表面を洗浄した後に除去する。３００μｌ／ｗｅｌｌの抽出物緩衝液を加えて２０分後に波長５９０ｎｍの分光値を測定する。
【００５１】
図８は、本発明に係る網膜細胞保護用の銀耳多糖類（ＬＴ１）による網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）のＨ２Ｏ２酸化ダメージに対する修復作用を示す図である。図８を参照し、＊ｐは、実験数値には差があることを示しており、＊＊ｐは、実験数値には顕著な差があることを示している。図に示すように、銀耳多糖類を有していない健康な網膜色素上皮細胞に比べて、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）酸化ダメージを受けたものの吸光率が大幅に低下することが分かる。しかし、異なる濃度の銀耳多糖類を有する網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）が、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）酸化ダメージを受けた後に、銀耳多糖類を有する網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）の吸光度は、銀耳多糖類を有していない網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）の吸光度に比べて、若干上昇させた。この結果から、銀耳多糖類は、ダメージを受けた網膜色素上皮細胞を修復する効果があることが証明された。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
上記を総合し、本発明の網膜細胞保護用の銀耳多糖類及びその製造方法は、製造過程において化学薬剤を用いることなく、天然で無毒な銀耳多糖類が得られる。また、上記実施例のように実施された場合、分子量８０ｋＤａの銀耳多糖類が得られる。実験的証明によって銀耳多糖類は、網膜色素上皮細胞を保護する、または修復する作用効果を有することが確認され、目薬に添加されて医療ケア用品として用いることが可能であり、あるいは賦形剤や他の化学物質を添加して生物学的医薬剤として用いることも可能である。
【符号の説明】
【００５３】
Ｓ２０〜Ｓ２９：ステップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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