(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
触媒ドメインにおいて、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が自己タンパク質分解する傾向にある位置Ｐの内部アミノ酸の少なくとも１つが、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が、自己タンパク質分解しにくいアミノ酸へ突然変異していることを特徴とする、単離されたプラスミノーゲン変異体もしくはそれから得られたプラスミン、または単離されたプラスミン変異体であって、前記位置Ｐの内部アミノ酸の少なくとも１つが、前記ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１４７のリジン、または非ヒトプラスミンの触媒ドメインにおいて対応するリジンまたはアルギニンであり、位置１４７のアミノ酸はＡｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、またはＰｈｅから選ばれたアミノ酸に突然変異されており、前記ヒトプラスミンの触媒ドメインは位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸であり、プラスミン変異体の自己分解定数が、野生型プラスミンの自己分解定数の最大で９５％であることをさらに特徴とする、単離されたプラスミノーゲン変異体もしくはそれから得られたプラスミン、または単離されたプラスミン変異体。
【請求項２】
触媒ドメインにおいて、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が自己タンパク質分解する傾向にある位置Ｐの内部アミノ酸の少なくとも１つが、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が、自己タンパク質分解しにくいアミノ酸へ突然変異していることを特徴とする、単離されたプラスミノーゲン変異体もしくはそれから得られたプラスミン、または単離されたプラスミン変異体であって、前記位置Ｐの内部アミノ酸の少なくとも１つが、前記ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１３７のリジン、または非ヒトプラスミンの触媒ドメインにおいて対応するリジンまたはアルギニン、または前記ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１５８のアルギニンであり、位置１３７のアミノ酸はＡｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、ＧｌｎまたはＡｒｇから選ばれたアミノ酸に突然変異されており、位置１５８のアミノ酸はＡｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＨｉｓから選ばれたアミノ酸に突然変異されており、そして、
（ｉ）位置Ｐの前記少なくとも１つの内部アミノ酸の突然変異が、前記ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１３７（これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンを基準としたアミノ酸位置６９８である）のリジンまたは非ヒトプラスミンの触媒ドメインにおいて対応するリジンまたはアルギニンの、Ａｌａ、ＭｅｔまたはＧｌｎへの突然変異である場合、前記プラスミノーゲン変異体またはプラスミン変異体は、（ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンを基準とした）アミノ酸位置５６１および５６２でインタクトな活性化部位を含み、および触媒ドメインの外の（ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンを基準とした）位置５３６および５４１のアミノ酸が存在する場合は、前記アミノ酸は野生型のシステインであるか、または、
（ｉｉ）位置Ｐの前記少なくとも１つの内部アミノ酸の突然変異が、ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１５８（これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンを基準としたアミノ酸位置７１９である）のアルギニンの、アラニンまたはグルタミン酸への突然変異である場合、少なくとも位置１３７または位置１４７が突然変異しており、位置１３７のアミノ酸はＡｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、ＧｌｎまたはＡｒｇから選ばれたアミノ酸に突然変異されており、位置１４７のアミノ酸はＡｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、またはＰｈｅから選ばれたアミノ酸に突然変異されており、
前記ヒトプラスミンの触媒ドメインは位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸であり、プラスミン変異体の自己分解定数が、野生型プラスミンの自己分解定数の最大で９５％であることをさらに特徴とする、単離されたプラスミノーゲン変異体もしくはそれから得られたプラスミン、または単離されたプラスミン変異体。
【請求項３】
触媒ドメインにおいて、位置Ｐ＋１およびＰ’＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が自己タンパク質分解する傾向にある位置ＰおよびＰ’の内部アミノ酸の少なくとも２つが、位置Ｐ＋１およびＰ’＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が、自己タンパク質分解しにくいアミノ酸へ突然変異していることを特徴とする、単離されたプラスミノーゲン変異体もしくはそれから得られたプラスミン、または単離されたプラスミン変異体であって、前記位置Ｐまたは位置ＰおよびＰ’の内部アミノ酸の少なくとも２つは、
（ｉ）Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、ＧｌｎまたはＡｒｇに突然変異される、ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１３７のリジン、または非ヒトプラスミンの触媒ドメインにおいて対応するリジンもしくはアルギニン；
（ｉｉ）Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、またはＰｈｅに突然変異される、前記ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１４７のリジン、または非ヒトプラスミンの触媒ドメインにおいて対応するリジンもしくはアルギニン；または、
（ｉｉｉ）Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＨｉｓに突然変異される、前記ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１５８のアルギニン、または非ヒトプラスミンの触媒ドメインにおいて対応するアルギニンもしくはリジン；
の２つであり、前記ヒトプラスミンの触媒ドメインは位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸であり、プラスミン変異体の自己分解定数が、野生型プラスミンの自己分解定数の最大で９５％であることをさらに特徴とする、単離されたプラスミノーゲン変異体もしくはそれから得られたプラスミン、または単離されたプラスミン変異体。
【請求項４】
ヒト触媒ドメインの位置１３７および／または１５８の内部アミノ酸、または非ヒトプラスミンの触媒ドメインにおいて対応するリジンおよび／またはアルギニンの突然変異をさらに含み、前記ヒトプラスミンの触媒ドメインは位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸である、請求項１に記載のプラスミノーゲン変異体、またはプラスミン変異体。
【請求項５】
ヒト触媒ドメインの位置１４７の内部アミノ酸、または非ヒトプラスミンの触媒ドメインにおいて対応するリジンまたはアルギニンの突然変異をさらに含み、前記ヒトプラスミンの触媒ドメインは位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸である、請求項２に記載のプラスミノーゲン変異体、またはプラスミン変異体。
【請求項６】
触媒定数ｋｃａｔが、野生型プラスミンのｋｃａｔの１０％〜２００％の範囲にあることをさらに特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載のプラスミン変異体。
【請求項７】
自己分解定数が、野生型プラスミンの自己分解定数の最大で９５％であり、触媒定数ｋｃａｔが、野生型プラスミンのｋｃａｔの１０％〜２００％の範囲にあることをさらに特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載のプラスミン変異体。
【請求項８】
該プラスミンが１つ又は複数のクリングルドメインを欠く、および／または、１つ又は複数のクリングルドメインの一部を欠く、請求項１から７のいずれか一項に記載のプラスミンのタンパク質分解活性誘導体であって、該プラスミン誘導体の触媒ドメインは機能を保持する、プラスミンのタンパク質分解活性誘導体。
【請求項９】
該プラスミンが標識されているか、またはペグ化されている、請求項１から８のいずれか一項に記載のプラスミンのタンパク質分解活性誘導体、または、ハイブリッドまたはキメラ分子に含まれる該プラスミンのタンパク質分解活性誘導体。
【請求項１０】
可逆的な不活性化がアシル化または非最適ｐＨ条件により引き起こされる、請求項１から９のいずれか一項に記載のプラスミンの可逆的に不活性な誘導体。
【請求項１１】
前記プラスミノーゲンまたはプラスミンが、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンまたはＧｌｕ−プラスミン、Ｌｙｓ−プラスミノーゲンまたはＬｙｓ−プラスミン、ミジプラスミノーゲンまたはミジプラスミン、ミニプラスミノーゲンまたはミニプラスミン、マイクロプラスミノーゲンまたはマイクロプラスミン、デルタプラスミノーゲンまたはデルタプラスミンである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
【請求項１２】
医薬として使用するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、もしくはプラスミン誘導体、またはこれらのいずれかの組合せ。
【請求項１３】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、もしくはプラスミン誘導体、またはこれらのいずれかの組合せ、および薬学的に許容される希釈剤、担体または補助剤の少なくとも１つを含む組成物。
【請求項１４】
抗凝血剤、血栓溶解剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、血管新生阻害剤、抗有糸分裂剤、抗ヒスタミン剤または麻酔剤の少なくとも１つをさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
対象における病的なフィブリン沈着の溶解を誘発する、または促進するための請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
【請求項１６】
対象における眼における後部硝子体剥離の誘発のための、および／または眼における硝子体の液化の誘発のための、または眼における硝子体切除手術を容易にするための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
【請求項１７】
対象の損傷した組織の酵素的壊死組織除去のための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
【請求項１８】
対象において、循環フィブリノーゲンを減少させるための、またはα２−抗プラスミンレベルを減少させるための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
【請求項１９】
病的なフィブリン沈着のリスクを減少させるための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
【請求項２０】
安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体をスクリーニングするための方法であって、前記方法が、
（ｉ）ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１３７、１４７および１５８のアルギニンまたはリジンアミノ酸、または非ヒトプラスミンにおいて対応するアルギニンまたはリジンの、１つ又は複数を、天然のアミノ酸とは異なるアミノ酸へ突然変異させること、
（ｉｉ）（ｉ）で得られた突然変異体の自己タンパク質分解安定性を測定すること、および
（ｉｉｉ）自己分解定数が、野生型プラスミンの自己分解定数の最大で９５％である突然変異体を、安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体として、（ｉｉ）から選択することを含み、
前記ヒトプラスミンの触媒ドメインは位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸である、方法。
【請求項２１】
前記安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体のタンパク質分解活性を測定するステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体をインビトロで産生するための方法であって、前記方法が、
（ｉ）請求項１から１１のいずれか一項に記載のプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現できる適切な宿主細胞に導入するステップと；
（ｉｉ）（ｉ）で得られた宿主細胞で前記プラスミノーゲンが発現するのに十分な条件下、十分な時間をかけて前記宿主細胞を生育させるステップと；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で発現した前記プラスミノーゲンを回収するステップと；
を含む方法。
【請求項２３】
（ｉｉｉ）において回収された前記プラスミノーゲンを精製するステップ（ｉｖ）をさらに含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のプラスミン変異体をインビトロで産生するための方法であって、前記方法が、
（ｉ）請求項１から１１のいずれか一項に記載のプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現できる適切な宿主細胞に導入するステップと；
（ｉｉ）（ｉ）で得られた前記宿主細胞を、前記宿主細胞内で前記プラスミノーゲンが発現するのに十分な条件下、十分な時間をかけて生育させるステップと；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で発現した前記プラスミノーゲンを回収するステップと；
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の前記プラスミノーゲンをプラスミンへ活性化させるステップと；
を含む方法。
【請求項２５】
（ｉｉｉ）において回収された前記プラスミノーゲンを（ｉｖ）における活性化に先立って精製する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
（ｉｖ）において得られた前記活性プラスミンを精製する、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記活性プラスミンが誘導体化される、および／または可逆的に不活化される、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体またはプラスミン変異体をコードする単離された核酸。
【請求項２９】
請求項２８に記載の核酸を含む組換えベクター。
【請求項３０】
請求項２８に記載の核酸、または請求項２９に記載のベクターで形質転換されたエキソビボ宿主細胞。
【請求項３１】
プラスミノーゲン変異体がヒトプラスミノーゲンの変異体である、請求項１から５、１１、１２および１５から１９のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体。
【請求項３２】
プラスミノーゲン変異体が配列番号１により定義されるヒトプラスミノーゲンの変異体である、請求項１から５、１１、１２および１５から１９のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体。
【請求項３３】
プラスミノーゲン変異体がヒトプラスミノーゲンの変異体である、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項３４】
プラスミノーゲン変異体が配列番号１により定義されるヒトプラスミノーゲンの変異体である、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項３５】
プラスミノーゲン変異体がヒトプラスミノーゲンの変異体である、請求項２０から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
プラスミノーゲン変異体が配列番号１により定義されるヒトプラスミノーゲンの変異体である、請求項２０から２７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、プラスミンのプロテアーゼ活性の自己触媒による崩壊を減少させる、または防ぐ、触媒ドメインにおける１つ又は複数の点突然変異を含むプラスミノーゲンおよびプラスミンの変異体に関する。プラスミノーゲンおよびプラスミンの前記変異体の組成物、用途、および使用方法も開示される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
酵素前駆体であるプラスミノーゲンの活性化により、線維素溶解活性／血栓溶解活性を有するセリンプロテアーゼであるプラスミンが形成される。内因性のプラスミノーゲンの活性化は、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼもしくはｔＰＡ、またはこれらの任意の変異体等のプラスミノーゲン活性化因子の投与によって引き起こされ、また強化される。活性化において、プラスミノーゲンタンパク質は、タンパク質分解酵素で、５つのクリングルドメインを含む重鎖、および触媒ドメインを含む軽鎖に切断される。両鎖は２つのジスルフィド結合によってつながっている。活性化後、自己分解による切断により、重鎖からＮ末端のセグメント（ヒトプラスミンでは７８個のアミノ酸、ウシプラスミンでは７７個のアミノ酸）が除去される。ウシプラスミンの重鎖はさらに、クリングル３と４の間で自己触媒により切断され得、それゆえウシのミジプラスミンが生じる（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３０５、９７−１０２）。プラスミノーゲンのプラスミンへの活性化は、ヒトプラスミノーゲンにおけるＲ５６１−Ｖ５６２のペプチド結合の切断により引き起こされ、軽鎖での大規模なコンホメーション変化を伴い、前記軽鎖内の触媒三残基内のプライミング、または活性化がもたらされる。ストレプトキナーゼおよびスタフィロキナーゼ等の細菌のプラスミノーゲン活性化因子は、プラスミノーゲンと複合体を形成し、プラスミノーゲンのＲ５６１−Ｖ５６２のペプチド結合を切断せずに、活性化因子とプラスミノーゲンの複合体形成におけるコンホメーション変化により、プラスミノーゲンの触媒部位を活性化する（プラスミノーゲンの活性化メカニズムは、例えば、Ｔｅｒｚｙａｎら、２００４；Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ５６：２７７−２８４の序論で概説されている）。
【０００３】
プラスミノーゲン活性化因子は間接的な血栓溶解剤として作用するが、プラスミンそれ自体を線維素溶解／血栓溶解剤として直接使用することも提案されている。しかしながら、プラスミンが多くのプロテアーゼと同様、自己触媒によるタンパク質分解を受けやすいという事実がそのような直接利用の妨げとなっており、この分解は産物阻害を受ける二次カイネティクスに続いて起こる（Ｊｅｓｐｅｒｓｅｎら、１９８６、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４１、３９５−４０４）。
【０００４】
１９６０年代の前半に、プラスミンの酸性ｐＨでの安定化、または、リジン等のアミノ酸が存在する条件で、中性ｐＨでの安定化が確立された。にもかかわらず、プラスミンがｐＨ３．８で貯蔵されていてもＬｙｓ１０４、Ａｒｇ１８９およびＬｙｓ６２２（リジンプラスミンに対する番号付け）の後で自己分解により切断されることが報告されている（国際公開第０１／３６６０８号パンフレット）。プラスミンがｐＨ２．２よりも低いｐＨで貯蔵されている場合、位置Ａｓｐ６２、Ａｓｐ１５４およびＡｓｐ３４６のＡｓｐ−Ｐｒｏ（Ｄ−Ｐ）の間で、自己分解ではなく酸による切断が生じる（国際公開第０１／３６６０８号パンフレット）。これは、あきらかな自己触媒による分解がこれ以上生じないところまでｐＨを低減できるが、そこでは酸加水分解が不安定化の１つの要因となることを示している。国際公開第０１／３６６０８号パンフレットには、プラスミンのペプチド結合が中性ｐＨで（自己触媒的）加水分解を受けやすいことについての情報は記載されていない。プラスミンの既知の安定剤には、グリセロール、十分に高いイオン強度、フィブリノーゲンおよびε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）があり、Ｊｅｓｐｅｒｓｅｎらにより開示されている（１９８６、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ  ４１、３９５−４０４）。リジンおよびリジン誘導体（ＥＡＣＡおよびトラネキサム酸等）、およびｐ−アミノメチル安息香酸（ＰＡＭＢＡ）も、さらなる既知の安定剤として挙げられる（Ｕｅｈｓｉｍａら、１９９６、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ２４５、７−１８；Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ  １９８５、Ｄｒｕｇｓ  ２９、２３６−２６１）。米国特許第４，４６２，９８０号明細書には、酸性条件での貯蔵にもかかわらず、プラスミン分解の一因となるプラスミン凝集体が形成されることが報告されている。この問題を、ポリヒドロキシ化合物の付加により解決する方法が米国特許第４，４６２，９８０号明細書に記載されている。プラスミンの安定化方法には他に、オリゴペプチド化合物の付加もある（例えば米国特許第５，８７９，９２３号明細書）。あるいは、プラスミンの触媒部位を、誘導体化、例えばアシル化によって可逆的にブロックできる（欧州特許第０００９８７９号明細書）。酵素を安定化する手段として、プラスミンのペグ化も提案されている（国際公開第９３／１５１８９号パンフレット）。
【０００５】
プラスミンの切断型以外のプラスミン変異体が多数記載されており、キメラ的なマイクロプラスミン（国際公開第２００４／０４５５５８号パンフレット）、および２つの鎖の切断部位に点突然変異を有する変異体（米国特許第５，０８７，５７２号明細書）、または触媒三残基アミノ酸に点突然変異を有する変異体（Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒら  １９９３、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０、５３７４−５３７７；Ｗａｎｇら、２００１、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９５、９０３−９１４）がある。Ｗａｎｇら（１９９５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４、１７５８−１７６７および１７６８−１７７９）は、位置５４５、５４８、５５０、５５５、５５６、５５８、５６０−５６４、５８５、７４０および７８８のアミノ酸が変異している、多数の一連のマイクロプラスミノーゲン突然変異体を報告した。アミノ酸位置５５８および５６６のシステインがセリンに置換されている二重突然変異体はＬｉｎｄｅらにより報告された（１９９８、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２５１、４７２−４７９）。Ｔａｋｅｄａ−Ｓｈｉｔａｋａら（１９９９、Ｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ  ４７、３２２−３２８）は、活性が減少したプラスミン変異体、位置６０１のアミノ酸のアラニンがスレオニンへ置換した変異に言及している。上記で言及したアミノ酸位置はすべて、位置１のアミノ酸Ｇｌｕから始まるＧｌｕ−‐プラスミノーゲンに対する位置である。非切断性プラスミノーゲン変異体（重鎖および軽鎖の間が切断されない）が国際公開第９１／０８２９７号パンフレットに記載されている。Ｄａｗｓｏｎら（１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３、１２０４２−１２０４７）は、位置７１９のＡｒｇ（Ｒ７１９Ｅ）の代わりにＧｌｕを有するＧｌｕ−プラスミノーゲン変異体がストレプトキナーゼへの親和性を減少させていることを記載している。Ｊｅｓｐｅｒｓら（１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７、６３８０−６３８６）はＡｌａスキャンにおいて、一連のファージ提示マイクロプラスミノーゲンの単一サイト突然変異体Ｈ５６９Ａ、Ｒ６１０Ａ、Ｋ６１５Ａ、Ｄ６６０Ａ、Ｙ６７２Ａ、Ｒ７１２Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｔ７８２Ａ、Ｒ７８９Ａを産生し、位置７１９でのアルギニンがスタフィロキナーゼとの相互作用のカギであることを発見した。Ｄ６６０Ａ突然変異体は、発現が非常に低いため、詳細な特徴は不明である。Ｒ７１９Ａ突然変異体のみをさらに可溶型で産生した。どの突然変異体でも、タンパク質分解活性は著しい変化を示さなかった（基質Ｓ−２４０３）。Ｊｅｓｐｅｒｓら（１９９８）は、彼らの分析に活性サイト突然変異体Ｓ７４１Ａも含め、この突然変異体の結晶構造は、Ｗａｎｇら（２０００、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９５、９０３−９１４）に開示されている。ストレプトキナーゼ／プラスミノーゲン相互作用部位を解明するさらなる試みで、Ｔｅｒｚｙａｎら（２００４、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ５６、２７７−２８４）は、既に突然変異している（Ｒ５６１Ａ）変異体のマイクロプラスミノーゲン突然変異体を複数（Ｋ６９８Ｍ、Ｄ７４０Ｎ、Ｓ７４１Ａ）報告した。Ｒ５６１Ａ突然変異体はプラスミノーゲンのタンパク質分解活性を妨げ、したがって活性マイク��プラスミンの形成を妨げる（これはストレプトキナーゼ−マイクロプラスミノーゲン複合体の接触−活性化メカニズムの研究を複雑化するだろう）。Ｔｅｒｚｙａｎら（２００４）はさらに、二重突然変異体Ｒ５６１Ａ／Ｋ６９８Ｍとは明らかに機能的には無関係な、「偶然得られた」三重突然変異体Ｒ５６１Ａ／Ｈ５６９Ｙ／Ｋ６９８Ｍに言及している。Ｗａｎｇら（２０００、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６７、３９９４−４００１）は、ストレプトキナーゼ／プラスミン（プラスミノーゲン）相互作用の研究において、Ｃｙｓ５３６ＡｌａおよびＣｙｓ５４１Ｓｅｒが既に突然変異している一連のマイクロプラスミノーゲン（Ｇｌｕ−プラスミノーゲンのアミノ酸５３０−７９１）変異体セットを産生した。これらの突然変異体は、Ｒ５６１Ａ／Ｋ６９８Ｇ、Ｒ５６１Ａ／Ｋ６９８ＡおよびＲ５６１ａ／Ｋ６９８Ｑ二重突然変異体と同様、上述のＲ５６１Ａ突然変異（Ｔｅｒｚｙａｎら（２００４））を含む。同じＣ５３６Ａ／Ｃ５４１Ｓ突然変異において、Ｋ６９８ＧおよびＫ６９８Ａ単一突然変異も導入した。Ｋ６９８Ｇは精製が困難だったため、詳細な特徴は不明である。上記の研究では、プラスミノーゲン／プラスミン分子の特徴をよりよく理解することが狙いであったが、プラスミノーゲン／プラスミン突然変異体の臨床上の有益性もしくは利点、または、推定される臨床上の優位性についてはなんら報告されていない。Ｐｅｉｓａｃｈら（１９９９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８、１１１８０−１１１８８）は、Ｍ５８５Ｑ、Ｖ６７３ＭおよびＭ７８８Ｌ突然変異を含むマイクロプラスミノーゲンの結晶構造の決定に成功した。
【０００６】
ＮｇｕｙｅｎおよびＣｈｒａｍｂａｃｈ（１９８１、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １１、１５９−１７２）は、１０．０ｋＤａの「微量で未確認のタンパク質構成成分」の存在を報告した。ウロキナーゼに活性化されたプラスミンの未精製の市販製剤（Ｈｏｍｏｌｙｓｉｎ）の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいて、ヒトプラスミンのｐＨによる自己分解の差異はＳｈｉおよびＷｕ（１９８８、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５１、３５５−３６４）によって詳細に記載されている。Ｏｈｙａｍａら（２００４、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２７１、８０９−８２０）は、がんの治療における非リジンアナログプラスミノーゲン修飾物質の使用を提案している。このような化合物は、（プラスミノーゲン活性化因子ウロキナーゼの存在下）プラスミンの自己タンパク質分解を増強させ、アンギオスタチンの形成を強化するからである。Ｏｈｙａｍａら（２００４）の表３は、自己タンパク質分解を増強する化合物に接触させたプラスミン内の１５箇所もの切断部位を記載している。先行研究の観点から彼らの観察を考察すると、自己タンパク質分解を増強する化合物は、多かれ少なかれ選択的にＢ／軽鎖のタンパク質分解を増強するが、自己タンパク質分解を増強する化合物の非存在下では、Ａ／重鎖、およびＢ鎖の両方の分解はわずかであったように思われる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の方法／変異体のいずれもが、分子レベルで安定したプラスミンを提供するという問題を解決しないことは明らかである。自己触媒による分解に内因的に耐性のある触媒ドメインを有するプラスミン変異体（またはプラスミンが由来する、同様のプラスミノーゲン変異体）の提供は、効果的で安全な長期貯蔵に向けた、また、血栓溶解療法、または眼の後部硝子体剥離もしくは硝子体の液化の誘導等におけるプラスミンの効果的で安全な治療用途に向けた、大きな前進となるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明は、触媒ドメインにおいて、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が自己タンパク質分解する傾向にある位置Ｐの内部アミノ酸の少なくとも１つが、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が、自己タンパク質分解しにくいまたは全く自己タンパク質分解する傾向がないアミノ酸へ突然変異していることを特徴とする、単離されたプラスミノーゲン変異体、もしくはそれから得られたプラスミン、または単離されたプラスミン変異体、または前記プラスミンのいずれかのタンパク質分解性が活性な、または可逆的に不活性な誘導体に関する。
【０００９】
あるいは、本発明のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体は、自身の触媒ドメインにおいて、位置Ｐ＋１と位置Ｐ’＋１との内部アミノ酸とのペプチド結合が自己タンパク質分解する傾向にある位置ＰおよびＰ’の内部アミノ酸の少なくとも２つが、位置Ｐ＋１と位置Ｐ’＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が、自己タンパク質分解しにくいまたは全く自己タンパク質分解する傾向がないアミノ酸へ突然変異している。
【００１０】
特に、前記位置Ｐまたは位置ＰおよびＰ’の内部アミノ酸は、リジンまたはアルギニンである。
【００１１】
さらに詳細には、前記位置Ｐまたは位置ＰおよびＰ’の少なくとも１つまたは２つの内部のアミノ酸は、
（ｉ）ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１３７のリジン、もしくは非ヒトプラスミンの触媒ドメインにおいて対応するリジンまたはアルギニン；
（ｉｉ）ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１４７のリジン、もしくは非ヒトプラスミンの触媒ドメインにおいて対応するリジンまたはアルギニン；または、
（ｉｉｉ）ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１５８のアルギニン、もしくは非ヒトプラスミンの触媒ドメインにおいて対応するアルギニンまたはリジン；の少なくとも１つ、または少なくとも２つであり、前記ヒトプラスミンの触媒ドメインは位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸である。
【００１２】
さらにあるいは、前記少なくとも１つの位置Ｐの内部アミノ酸は、ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１４７のリジンであるか、または非ヒトプラスミン触媒ドメインにおいて対応するリジンまたはアルギニンであり、前記ヒトプラスミンの触媒ドメインは位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸である。必要に応じて、ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１４７のリジン（または非ヒトプラスミンの触媒ドメインにおいて対応するリジンまたはアルギニン）の突然変異を有するプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体はさらに、ヒト触媒ドメインの位置１３７および／または１５８の内部アミノ酸の突然変異または、非ヒトプラスミンの触媒ドメインにおいて対応するリジンおよび／またはアルギニンの突然変異を含んでいてもよく、前記ヒトプラスミンの触媒ドメインは位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸である。
【００１３】
あるいは、本発明のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体は以下のようなものである：
（ｉ）前記位置Ｐの内部アミノ酸の少なくとも１つの突然変異が、ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１３７（これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンを基準としたアミノ酸位置６９８である）のリジンの、自己タンパク質分解により耐性のある、アミノ酸１３７と１３８の間のペプチド結合を与えるアミノ酸への突然変異である場合、前記プラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体またはプラスミン誘導体は、（ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンを基準とした）アミノ酸位置５６１および５６２で無傷の活性化部位を含み、および触媒ドメインの外の（ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンを基準とした）位置５３６および５４１のアミノ酸が存在する場合は、前記アミノ酸は野生型のシステインであり、または、
（ｉｉ）前記位置Ｐの内部アミノ酸の少なくとも１つの突然変異が、ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１５８（これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンを基準としたアミノ酸位置７１９である）のアルギニンの、アラニンまたはグルタミンへの突然変異である場合、したがって、位置Ｐ’＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が自己タンパク質分解する傾向にある位置Ｐ’の、ヒトプラスミンの触媒ドメインの他の内部アミノ酸の少なくとも１つが、位置Ｐ’＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が、自己タンパク分解しにくいまたは全く自己タンパク質分解する傾向がないアミノ酸へ突然変異している。
【００１４】
上記の（ｉ）または（ｉｉ）に記載のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体はさらに、ヒト触媒ドメインの位置１４７の内部アミノ酸の突然変異、または、非ヒトプラスミンの触媒領域において対応するリジンまたはアルギニンの突然変異を含み、前記ヒトプラスミンの触媒領域は位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸である。
【００１５】
本発明のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体のいずれかは、さらに、その自己分解定数が野生型プラスミンの自己分解定数の最大で９５％であるという特徴を有してもよい。
【００１６】
本発明のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体のいずれかは、さらに、触媒定数ｋｃａｔが野生型プラスミンのｋｃａｔの１０％〜２００％の範囲にあるという特徴を有してもよい。
【００１７】
本発明のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体のいずれかは、さらに、その自己分解定数が野生型プラスミンの自己分解定数の最大で９５％であり、その触媒定数ｋｃａｔが野生型プラスミンのｋｃａｔの１０％〜２００％の範囲にあるという特徴を有してもよい。
【００１８】
いかなる制限も課すことなく、本発明の上記のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体のいずれかは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンまたはＧｌｕ−プラスミン、Ｌｙｓ−プラスミノーゲンまたはＬｙｓ−プラスミン、ミジプラスミノーゲンまたはミジプラスミン、ミニプラスミノーゲンまたはミニプラスミン、マイクロプラスミノーゲンまたはマイクロプラスミン、デルタプラスミノーゲンまたはデルタプラスミンの１つであってもよい。
【００１９】
本発明はさらに、医薬として使用する本発明の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体、またはこれらのいずれかの組合せに関する。
【００２０】
本発明はまた、本発明の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体、またはこれらのいずれかの組合せ、および薬学的に許容される希釈剤、担体または補助剤の少なくとも１つを含む組成物に関する。そのような組成物は、抗凝血剤、血栓溶解剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、血管新生阻害剤、抗有糸分裂剤、抗ヒスタミン剤または麻酔剤のうちの少なくとも１つを任意でさらに含んでもよい。
【００２１】
本発明はまた、本発明の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体のあらゆる有益な適用をも含む。いかなる制限も課すことなく、このような適用には、患者における病的なフィブリン沈着の溶解の誘導または促進、眼の後部硝子体剥離の誘導、および／または眼の硝子体液化の誘導、患者の眼の硝子体切除手術の容易化、患者の損傷した組織の酵素的壊死組織除去、患者における循環フィブリノーゲンの減少、患者におけるα２−抗プラスミンレベルの減少、または病的なフィブリン沈着のリスクの減少等がある。
【００２２】
本発明はさらに、安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体をスクリーニングするための方法に関し、前記方法は、
（ｉ）野生型プラスミンの触媒ドメインで、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が自己タンパク質分解する傾向にある位置Ｐの内部アミノ酸を少なくとも１つ同定するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）において同定された位置Ｐのアミノ酸を、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が、自己タンパク質分解しにくいまたは全く自己タンパク質分解する傾向がないアミノ酸に突然変異させるステップと、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた突然変異体の自己タンパク質分解安定性を測定するステップと、
（ｉｖ）安定した自己タンパク質分解性を有する変異体として、自己タンパク質分解性が安定している突然変異体を（ｉｉｉ）から選択するステップと
を含む。
【００２３】
あるいは、安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体をスクリーニングするための方法は、
（ｉ）ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１３７、１４７および１５８のアルギニンまたはリジンアミノ酸の、または、非ヒトプラスミンにおいて対応するアルギニンまたはリジンの、１つ又は複数を、天然のアミノ酸とは異なるアミノ酸へ突然変異させるステップと、
（ｉｉ）（ｉ）から得られた突然変異体の自己タンパク質分解安定性を測定するステップと、
（ｉｉｉ）安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体として、自己タンパク質分解性が安定している突然変異体を（ｉｉ）から選択するステップとを含んでよく、
前記ヒトプラスミンの触媒ドメインは位置のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸である。
【００２４】
上記のスクリーニング法のいずれかは、任意でさらに、安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体のタンパク質分解活性を測定するステップを含んでもよい。
【００２５】
本発明はさらに、プラスミン含有組成物の長期貯蔵安定性を強化するための方法を含み、前記方法は、タンパク質分解活性の著しい損失がなく長期にわたり貯蔵できる、安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体を同定するステップを含む。
【００２６】
本発明はさらに、本発明のプラスミノーゲン変異体を産生するための方法を含み、
（ｉ）本発明のプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現できる適切な宿主細胞に導入するステップと；
（ｉｉ）前記宿主細胞において前記プラスミノーゲンが発現するのに十分な条件下、十分な時間をかけて（ｉ）で得られた宿主細胞を生育するステップと；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）において発現したプラスミノーゲンを回収するステップとを含む。
そのような方法は任意でさらに、（ｉｉｉ）において回収されたプラスミノーゲンを精製するステップ（ｉｖ）を含んでもよい。
【００２７】
同様に本発明は、本発明のプラスミン変異体を産生するための方法を含み、前記方法は、
（ｉ）本発明のプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現できる適切な宿主細胞に導入するステップと；
（ｉｉ）前記宿主細胞において前記プラスミノーゲンが発現するのに十分な条件下、十分な時間をかけて（ｉ）で得られた宿主細胞を生育するステップと；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）において発現したプラスミノーゲンを回収するステップと；
（ｉｖ）（ｉｉｉ）のプラスミノーゲンをプラスミンへ活性化するステップとを含む。
そのような方法はさらに任意で、（ｉｖ）における活性化に先立って（ｉｉｉ）において回収されたプラスミノーゲンを精製するステップを含んでもよい。さらに、本発明のプラスミン変異体を産生するためのいかなる方法においても、（ｉｖ）において得られた活性プラスミンを任意で精製してもよい。また、さらには、本発明の方法によって産生された活性プラスミン変異体は、任意で、誘導および／または可逆的に不活化されてもよい。
【００２８】
本発明はさらに、本発明のプラスミノーゲン変異体またはプラスミン変異体をコードする単離された核酸配列に関する。また、このような核酸を含む組換えベクターも、このような核酸または組換えベクターで形質転換された宿主細胞も本発明の一部である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】野生型ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲン（１〜７９１）およびプラスミン触媒ドメイン（１〜２３０、アミノ酸配列と番号は太字で示す）のアミノ酸位置に二重に番号を付けたアミノ酸配列。本発明を実証するために使用するマイクロプラスミノーゲンはアミノ酸位置５４３（Ｇｌｕ−プラスミノーゲンに対する番号）から始まる。アミノ酸位置１３７、１４７および１５８（プラスミン触媒ドメインに対する番号）にある強調されたアミノ酸は、位置１３８、１４８および１５９のアミノ酸とのそれぞれのペプチド結合が自己触媒的切断に感受性が高いと判断されたアミノ酸である。クリングルドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ３６４５１に含まれる情報に由来）は、四角で囲み、そのアミノ酸配列は、標準およびイタリック体で交互に示す。触媒三残基アミノ酸を丸囲みで示す。
【図２】大量に産生されたマイクロプラスミンの分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロフィール。分画番号５（プレピーク１）、分画番号７と８（プレピーク２）、分画番号１０〜１２（マイクロプラスミンのピーク）、および分画番号１５と１６（ポストピーク）に対応する溶出液を収集し、その中の物質のＮ末端アミノ酸配列を決定した（エドマン分解）。分画番号１７と１８前後のピークの溶出は緩衝液ピークに相当する。ＡＵ：吸光度単位。
【図３】大量に産生されたマイクロプラスミンの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーン１：分子量マーカー、左に分子量を示す。レーン２：マイクロプラスミノーゲン。レーン３：ｐＨ３．１のマイクロプラスミン。レーン４：ｐＨ４．０のマイクロプラスミン。レーン５：ｐＨ５．０のマイクロプラスミン。レーン６：ｐＨ６．０のマイクロプラスミン。レーン７：ｐＨ７．０のマイクロプラスミン。全試料（最終タンパク質濃度０．６ｍｇ／ｍＬ）を示したｐＨで２０℃で４時間置き、次に、−７０℃で凍結させた。クーマシーブリリアントブルーでゲルを染色した。μＰｌｇ＝マイクロプラスミノーゲン、μＰｌ＝プラスミン、前端＝泳導ゲル前端。
【図４】マイクロプラスミンを中性ｐＨ緩衝液でインキュベートし、試料を示された時間経過後に収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）またはウェスタンブロット（Ｂ）によって分析した。矢印「ａ」は無傷のマイクロプラスミンを示し、一方矢印「ｂ」および「ｃ」は約１５ｋＤａおよび約１０ｋＤａのフラグメントをそれぞれ示し、これは自己触媒により産生されたものである。
【図５】ウェスタンブロット（円）によって評価されたマイクロプラスミンの自己分解のカイネティクスは、マイクロプラスミン活性（四角）の減少に対応している。
【図６】（Ａ）マイクロプラスミンを、ＰＢＳ（四角）、またはブタの眼の硝子体液（円）において、１．５３μＭの最終濃度まで希釈し、活性のあるマイクロプラスミンの残渣の濃度を様々な時点で測定した。（Ｂ）ブタの眼の硝子体液の試料を、図に示した時点で収集し、ウェスタンブロットによって解析した。矢印は約１５ｋＤａのフラグメントを示す。
【図７】（Ａ）固定した抗マイクロプラスミン抗体上のマイクロプラスミン変異体Ｌｙｓ１３７Ｍｅｔ（Ｋ１３７Ｍ）の免疫アフィニティクロマトグラム。収集された溶出液分画をＸ軸（溶出量）上に１から１１まで番号をつける。（Ｂ）（Ａ）で実施された免疫アフィニティクロマトグラムの溶出液分画の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン１：分子量マーカー。レーン２：溶出液分画２。レーン３：溶出液分画３；レーン４：溶出液分画４；レーン５：溶出液分画５；レーン６：溶出液分画６；レーン７：未精製の上清。ゲルをクーマシー染色した。
【図８】（Ａ）組み換えスタフィロキナーゼでのＫ１３７Ｍ変異体の活性化。活性は１０分後に最大値に到達し（矢印で示す）、次いで、自己分解による不活性化が生じるとともに、減少した。（Ｂ）約１７および約８ｋＤａの２つのフラグメントの蓄積により証明されるように、スタフィロキナーゼによる活性化は１０分以内でほぼ完了し、自己分解が活性の減少を招くことを示す、Ｋ１３７Ｍ変異体の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーン１〜７は、スタフィロキナーゼ付加後０分、１０分、１時間、２時間、３時間、６時間、および２４時間に収集した試料を示す。（上向き黒三角）マイクロプラスミノーゲン、（下向き黒三角）マイクロプラスミン、（▽）自己分解の分解フラグメント。（Ｃ）スタフィロキナーゼ付加後、０分、１０分および６時間で収集された試料のＨＰＬＣ解析。スタフィロキナーゼ付加後、１０分で得たＨＰＬＣプロフィールは、不活性なマイクロプラスミノーゲンの約８５％が活性のあるマイクロプラスミン種に変換され、ｔ＝６時間のＨＰＬＣプロフィールは、自己分解の分解フラグメント（▽）の存在を示し、（Ｂ）で示されたＳＤＳゲルに合致している。ｔ＝１０分（矢印）のマイクロプラスミンピーク面積を、高度に精製されたマイクロプラスミンで確立した標準曲線（データを示さず）との比較により、活性種の濃度を算出するために使用した。Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣツール（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して、ＨＰＬＣデータをすべて得た。典型的には、マイクロプラスミン試料を０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５％のアセトニトリルで５倍に希釈し、０．１％のＴＦＡ、３４％のアセトニトリル中であらかじめ平衡にした、ＢＥＨ３００  Ｃ１８  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ）に注入した。次いで、溶出を０．１％のＴＦＡにおいて３４〜４４％のアセトニトリルの１．５ｍＬの直線勾配で行い、タンパク質を２１４ｎｍの吸光度によって追跡して検出した。カラムの温度を７５℃に維持し、実験をすべて１００μＬ／分の流量で行った。（Ｄ）ｔ＝１０分のＫ１３７Ｍマイクロプラスミン種のＨＰＬＣによる定量化と続いて残存活性の減少とを、各時点で試料中にある無傷、活性マイクロプラスミンのモル濃度を算出するために組み合わせた。等式１（実施例３を参照）にデータをあてはめ、自己分解の第２次速度定数（ｋ）を算出した。白丸（○）は、Ｋ１３７Ｍ変異体のデータを示す。比較のため、別の変異体（Ｋ１４７Ａ−Ｒ１５８Ａ）で得られた同様のデータセットもまた（●）で示した。
【図９】Ｋ１３７Ｍマイクロプラスミン変異体のカイネティックパラメーターの測定。異なる基質（Ｓ−２４０３）濃度での加水分解の初速度（ｖｉ）の測定値からのｋｃａｔおよびＫｍの測定。データを等式２にあてはめた（実施例４を参照）。
【図１０】ＧｅｎＢａｎｋから得た哺乳類プラスミノーゲンタンパク質のアミノ酸配列アラインメント。配列アラインメントを、デフォルト設定で国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）ウェブサイトを通して利用可能なＣＯＢＡＬＴソフトウエア（Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ−ｂａｓｅｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ；ＰａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓおよびＡｇａｒｗａｌａ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３：１０７３−７９、２００７）で行った。下向き黒三角：Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの開始の表示。アミノ酸の番号付けはヒトプラスミノーゲンを基準として行われる。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明は中性ｐＨにおけるプラスミンのタンパク質分解活性の自発的な自動不活性化の根底にあるメカニズムの研究の結果に基づいており、この研究で発明者は、大部分がプラスミンの触媒ドメインからなるマイクロプラスミンに焦点を当てた。プラスミンによる切断を受けやすいペプチド結合はリジンまたはアルギニンのＣ末端側に位置する（ＷｅｉｎｓｔｅｉｎおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９７２、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２５８、５７７−５９０）。プラスミン触媒ドメイン（ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンのアミノ酸位置５６２のバリンから開始）のアミノ酸のほぼ１０％（２３０個のうち２２個）は、リジンまたはアルギニンである。理論上、１つのプラスミン分子にある、このリジンおよびアルギニンのＣ末端側のすべてのペプチド結合は、別のプラスミン分子のタンパク質分解により切断可能である。
【００３１】
したがって、本発明の１つの態様は、プラスミン分子およびプラスミノーゲン分子、特に活性化可能な／潜在的にプラスミンに活性化可能なプラスミノーゲン分子に関し、この分子は触媒ドメインに１つ又は複数のアミノ酸の突然変異を含むため、野生型プラスミンまたはプラスミノーゲンにおいては自己タンパク質分解により分解する傾向にあるペプチド結合が、本発明のプラスミンおよびプラスミノーゲン分子対象においては、自己タンパク質分解しにくいかまたは全く自己タンパク質分解する傾向がなくなっている。
【００３２】
本発明は、言い換えれば、触媒ドメインにおいて、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が自己タンパク質分解する傾向にある（すなわち分解に対する感受性、敏感さ、または脆弱の度合いが高い）位置Ｐの内部アミノ酸の少なくとも１つが、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が、自己タンパク質分解しにくいかまたは全く自己タンパク質分解する傾向がない（すなわち分解に対する感受性、敏感さ、または脆弱の度合いが低いか、無い）アミノ酸へ突然変異していることを特徴とする、単離されたプラスミノーゲン変異体、もしくはそれから得られたプラスミン、または単離されたプラスミン変異体、または前記プラスミンのいずれかのタンパク質分解性が活性な、または可逆的に不活性な誘導体に関する。特に、前記位置Ｐの内部アミノ酸はリジンまたはアルギニンである。本明細書で使用される場合（別段に記述しない限り）、プラスミンの触媒ドメインは、ヒトプラスミンを基準として番号が付けられ、位置Ｐ＝１のバリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２のバリンと同じである（図１を参照）。本明細書では、プラスミン触媒ドメインにおける２つの異なるアミノ酸位置も参照し、それぞれＰおよびＰ’と名付ける。
【００３３】
あるいは、本発明のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体では、自身の触媒ドメインにおいて、位置Ｐ＋１およびＰ’＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が自己タンパク質分解する傾向にある位置ＰおよびＰ’の内部アミノ酸の少なくとも２つが、位置Ｐ＋１およびＰ’＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が、自己タンパク質分解しにくいかまたは全く自己タンパク質分解する傾向がないアミノ酸へ突然変異していてもよい。
【００３４】
位置Ｐのアミノ酸を同定した後、当業者は、野生型の位置Ｐのアミノ酸を、別のどのアミノ酸へ突然変異させられるか、容易に決定できるであろう。そのような決定は、アミノ酸の大きさ、アミノ酸電荷、アミノ酸極性、および／またはアミノ酸疎水性親水性指標等の基準（表１を参照）を用いてもよいが、必ずしも必要ではない。特に、プラスミンおよびプラスミノーゲンでは、前記位置Ｐの内部アミノ酸はリジンまたはアルギニンである可能性が高く、それぞれアルギニンまたはリジンとは異なるアミノ酸に突然変異させるべきであることが示唆される。さらに、プラスミノーゲンの結晶構造およびプラスミン触媒ドメイン（ＭＭＤＢ  ＩＤ：１２７１７；ＰＤＢ  ＩＤ：１ＤＤＪ；Ｗａｎｇら、２００１、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９５、９０３−９１４）の入手しやすさは、得られた突然変異プラスミンまたはプラスミノーゲン分子がタンパク質分解活性を保持するよう突然変異させるアミノ酸を同定するのに大いに価値がある。さらに、前記位置Ｐの野生型アミノ酸が、所与の群のいずれか１つのアミノ酸へ突然変異することにより、類似の結果がもたらされることが予想できる。表１に基づき、前記所与の群を以下のように定義できる：
−  疎水性の脂肪族アミノ酸：Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌ
−  疎水性の芳香族アミノ酸：Ｐｈｅ
−  親水性の酸性アミノ酸：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｓｎおよびＧｌｎ
−  親水性の塩基性アミノ酸：Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＨｉｓ
−  中程度に疎水性の脂肪族アミノ酸：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ
−中程度に疎水性の芳香族アミノ酸：ＴｙｒおよびＴｒｐ
この中で、突然変異の目的では、ＣｙｓおよびＰｒｏは、Ｃｙｓが遊離できるチオール基を生成すること、または、Ｐｒｏがタンパク質構造を大きく乱すため、野生型プラスミンまたはプラスミノーゲンアミノ酸の置換アミノ酸としては好ましくない可能性がある。他のアミノ酸置換には、プラスミン（プラスミノーゲン）触媒ドメインの前記位置Ｐの野生型のアミノ酸の、非天然もしくは非標準アミノ酸へのノルロイシン、ノルバリン、オルニチンまたはシトルリン等のアミノ酸類似体への突然変異がある（より詳細な一覧については、例えば、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎら、２００４、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７３、１４７−１７６を参照）。
【００３５】
【表１】
0005819293.tif 000002
【００３６】
発明者は、試験条件下で、自己タンパク質分解切断が、プラスミン触媒ドメイン内で限られた数しか生じないことを観察した。実施例に記載したように、本発明では自己タンパク質分解の３つのホットスポットを同定した。しかしながら、これは、自己タンパク質分解により切断されやすいペプチド結合が他にも存在する可能性を排除するものではない。
【００３７】
したがって、上記において、前記位置Ｐの内部アミノ酸の少なくとも１つ、または前記位置ＰおよびＰ’の内部アミノ酸の少なくとも２つは、より具体的には、
（ｉ）ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１３７のリジン、もしくは非ヒトプラスミンにおいて対応するリジンもしくはアルギニン；
（ｉｉ）ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１４７のリジン、もしくは非ヒトプラスミンにおいて対応するリジンもしくはアルギニン；または、
（ｉｉｉ）ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１５８のアルギニン、もしくは非ヒトプラスミンにおいて対応するリジンもしくはアルギニン；から選択される少なくとも１つまたは少なくとも２つであり、
前記ヒトプラスミンの触媒領域は位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸である。ヒトプラスミノーゲンおよびヒトプラスミンの触媒ドメインでのアミノ酸の番号付けを明確にするために、本明細書では図１を参照する。
【００３８】
ヒトプラスミン（プラスミノーゲン）のアミノ酸に「対応する」非ヒトプラスミン（プラスミノーゲン）配列のアミノ酸の同定（つまり「対応する」アミノ酸の同定）はまず、両方のアミノ酸配列のアラインメントを実施することを意味する。このようなアラインメントでは、高い同一性および相同性を得るために、アラインメントした配列の片方または両方に、ギャップをわずかに導入するなどの最適化が必要な場合がある。次に、ヒトプラスミン（プラスミノーゲン）のアミノ酸とアラインする非ヒトプラスミン（プラスミノーゲン）のアミノ酸が同定されるが、本明細書ではこれを「対応する」アミノ酸と称する。本明細書の図１０には、公に利用可能な哺乳類のプラスミノーゲンタンパク質配列の、上記のようなアラインメントを示し、ヒトプラスミノーゲン配列（ライン１）に存在する本発明にとって特に興味のあるアミノ酸を、非ヒトプラスミノーゲン配列（ライン２〜１８）の対応するアミノ酸と一緒に強調して示す。特に興味のあるアミノ酸は、位置６９８（触媒ドメインの位置１３７、図１を参照）のＬｙｓ、位置７０８（触媒ドメインの位置１４７、図１を参照）のＬｙｓ、および位置７１９（触媒ドメインの位置１５８、図１を参照）のＡｒｇである。
【００３９】
本発明の前記プラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体では、前記位置Ｐの内部アミノ酸の少なくとも１つは、ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１４７のリジンであるか、または非ヒトプラスミン触媒ドメインにおいて対応するリジンもしくはアルギニンである。これは、さらにヒト触媒ドメインの位置１３７および／または１５８の内部アミノ酸、または非ヒトプラスミンの触媒ドメインにおいて対応するリジンおよび／またはアルギニンの突然変異を、任意で含んでもよい。本明細書では、前記ヒトプラスミンの触媒ドメインは位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸である。
【００４０】
またさらに、本発明の前記プラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体では、
（ｉ）前記位置Ｐの内部アミノ酸の少なくとも１つの突然変異が、ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１３７（これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンを基準としたアミノ酸位置６９８である）のリジンの、自己タンパク質分解に耐性のある、またはより耐性のあるアミノ酸１３７と１３８の間のペプチド結合を与えるアミノ酸への突然変異である場合、前記プラスミノーゲン変異体、前記プラスミン変異体または前記プラスミン誘導体は、（ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンを基準とした）アミノ酸位置５６１および５６２で無傷の活性化部位を含み、および触媒ドメインの外の（ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンを基準とした）位置５３６および５４１のアミノ酸が存在する場合は、前記アミノ酸は野生型のシステインであり、または、
（ｉｉ）前記位置Ｐの内部アミノ酸の少なくとも１つの突然変異が、ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１５８（これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンを基準としたアミノ酸位置７１９である）のアルギニンの、アラニンまたはグルタミンへの突然変異である場合、したがって、位置Ｐ’＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が自己タンパク質分解する傾向にある位置Ｐ’の、ヒトプラスミンの触媒ドメインの他の内部アミノ酸の少なくとも１つが、位置Ｐ’＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が、自己タンパク質分解しにくいかまたは全く自己タンパク質分解する傾向がないアミノ酸へ突然変異している。
上記（ｉ）および（ｉｉ）に記載の変異体は任意でさらに、ヒト触媒ドメインの位置１４７の内部アミノ酸、または非ヒトプラスミンの触媒ドメインにおいて対応するリジンまたはアルギニンの突然変異をさらに含み、前記ヒトプラスミンの触媒ドメインは位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸である。
【００４１】
上述のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体のいずれかにおいて、前記ヒト触媒ドメインの位置１３７のリジン、または非ヒトプラスミンの触媒ドメインにおいて対応するリジンまたはアルギニンは、疎水性脂肪族アミノ酸、疎水性芳香族アミノ酸、親水性の酸性アミノ酸、リジン以外の親水性の塩基性アミノ酸、中程度に疎水性の芳香族アミノ酸、および中程度に疎水性の脂肪族アミノ酸の群内のアミノ酸に突然変異させてもよい。特に、前記リジンは、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、ＧｌｎまたはＡｒｇから選ばれたアミノ酸に突然変異させてもよい。
【００４２】
上述のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体のいずれかにおいて、前記ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１４７のリジン、または非ヒトプラスミンの触媒ドメインにおいて対応するリジンまたはアルギニンは、疎水性脂肪族アミノ酸、疎水性芳香族アミノ酸、親水性の酸性アミノ酸、リジン以外の親水性の塩基性アミノ酸、中程度に疎水性の芳香族アミノ酸、および中程度に疎水性の脂肪族アミノ酸の群内のアミノ酸に突然変異させてもよい。特に、前記リジンは、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、またはＰｈｅから選ばれたアミノ酸に突然変異させてもよい。
【００４３】
上述のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体のいずれかにおいて、前記ヒト触媒ドメインの位置１５８のアルギニン、または非ヒトプラスミンの触媒ドメインにおいて対応するリジンまたはアルギニンは、疎水性脂肪族アミノ酸、疎水性芳香族アミノ酸、親水性の酸性アミノ酸、親水性の塩基性アミノ酸、中程度に疎水性の芳香族アミノ酸、および中程度に疎水性の脂肪族アミノ酸の群内のアミノ酸に突然変異させてもよい。特に、前記アルギニンは、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＨｉｓから選ばれたアミノ酸に突然変異させてもよい。
【００４４】
「プラスミン」は、フィブリノリジンまたはｌｙｓｏｆｉｂｒｉｎとしても知られ、セリン型のプロテアーゼであり、酵素前駆体であるプラスミノーゲンの活性化によりもたらされる。活性化は、アミノ酸５６１および５６２（ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンを基準とした番号付け）の間のタンパク質分解切断により起こる。プラスミンは、５つのクリングルドメインを含む重鎖、および触媒ドメインを含む軽鎖を保有する。プラスミノーゲンは、例えば、リジンアフィニティークロマトグラフィー（ＤｅｕｔｓｃｈおよびＭｅｒｔｚ、１９７０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １７０、１０９５−１０９６）によって血漿から濃縮できる。触媒ドメインが機能を有する限り、プラスミン分子を切断（プラスミン触媒ドメインの外部および／または内部で）ができ、したがってこのような切断によりプラスミンの「タンパク質分解活性誘導体」が形成される。そのため、５つのクリングルドメインの１つ又は複数を、全体的にまたは部分的に欠失させることができる。１つ又は複数のクリングルドメインを欠く、および／または、１つ又は複数のクリングルドメインの一部を欠く切断プラスミンは、したがって、本発明においてプラスミンのタンパク質分解活性誘導体の例として想定される。プラスミンの切断変異体の例には、「ミジプラスミン」、「ミニプラスミン」、「マイクロプラスミン」、「デルタプラスミン」があるが、これらに限定されない。ミジプラスミンは基本的にクリングルドメイン１〜３を欠いている（例えばＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３０５、９７−１０２）。ミニプラスミンは、元は、エラスターゼでプラスミンを限定的に分解して得られたもので、基本的にクリングルドメイン１〜４を欠いている（例えばＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、１９７９、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ５６７、４７２−４８１；ＰｏｗｅｌｌおよびＣａｓｔｅｌｌｉｎｏ、１９８０、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５５、５３２９）。ミニプラスミンはその後、組換えで産生されている（国際公開第２００２／０５０２９０号パンフレット）。マイクロプラスミンは、元は、高ｐＨでプラスミンをインキュベートすることで得られたもので、基本的にクリングルドメインをすべて欠いている（例えば国際公開第８９／０１３３６号パンフレット）。高ｐＨでプラスミンをインキュベートすることで得られたマイクロプラスミンは、重鎖のカルボキシ末端の３０〜３１個のアミノ酸を含むが、組換えで産生されたマイクロプラスミン変異体は、重鎖のカルボキシ末端の１９個のアミノ酸を含む（国際公開第２００２／０５０２９０号パンフレット）。デルタプラスミンは、クリングルドメイン１が触媒ドメインに直接に結合されているプラスミンの組み換え型である（国際公開第２００５／１０５９９０号パンフレット）。上記のプラスミンの切断変異体は、「ミジプラスミノーゲン」、「ミニプラスミノーゲン」、「マイクロプラスミノーゲン」および「デルタプラスミノーゲン」のそれぞれの活性化により得られる。活性化が可能であるためには、切断プラスミノーゲンは、クリングル５ドメインと触媒ドメインの間にリンカーとなる最小数のアミノ酸を含む必要がある（例えば、Ｗａｎｇら、１９９５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４、１７５８−１７６７を参照）。本発明の文脈においてプラスミノーゲンは「無傷の活性化部位」を含むことが望ましく、「無傷の活性化部位」とは、少なくともアミノ酸５６１および５６２（ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンに対する；または非ヒトプラスミノーゲンにおいて対応するアミノ酸）が、プラスミノーゲンのプラスミンへの活性化／転化を、異なったカイネティクスを有する可能性があるにもかかわらず、野生型プラスミンと同様生じることができるようになっていることを意味する。プラスミンまたはその活性切断変異体の代わりに、活性化可能なプラスミノーゲンまたはその切断変異体を本発明の文脈において使用できる（例えば欧州特許第０４８０９０６号明細書；米国特許第５，３０４，３８３号明細書；欧州特許第０６３１７８６号明細書；米国特許第５，５２０，９１２号明細書；米国特許第５，５９７，８００号明細書；米国特許第５，７７６，４５２号明細書を参照）。「プラスミノーゲン」は、例えばＧｌｕ−プラスミノーゲンまたはＬｙｓ−プラスミノーゲン（位置６８でのＡｒｇ、もしくは位置７７または７８のＬｙｓから開始）などのプラスミノーゲンの任意の形態を指す。活性化可能なプラスミノーゲンまたはその活性化可能な切断変異体を使用する場合、プラスミンへの活性化は遅れ、器官、組織または体液との接触後に、つまり対象への投与後に生じるのが一般的であろう。また別の形態では、本発明の文脈において、プラスミンまたはその活性切断変異体の代わりに、活性化可能なプラスミノーゲンまたはその活性化可能な切断変異体を、プラスミノーゲン活性化因子（組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼまたはスタフィロキナーゼ、またはその任意の変異体等）と併用して使用してもよい。（例えば米国特許第６，７３３，７５０号明細書；米国特許第６，５８５，９７２号明細書；米国特許第６，８９９，８７７号明細書；国際公開第０３／３３０１９号パンフレットを参照）。さらにまた別の形態では、（ｉ）プラスミンまたはその誘導体、（ｉｉ）活性化可能なプラスミノーゲン、またはその活性化可能な誘導体、および、任意で、（ｉｉｉ）プラスミノーゲン活性化因子のいずれかの混合物を、本発明の文脈において、使用できる（例えば米国特許出願公開第２００４／００８１６４３号明細書を参照）。プラスミン（またはプラスミノーゲン）の安定性を確実なものとするために、プラスミン（またはプラスミノーゲン）は、一般的に低温で貯蔵される（例えば摂氏＋４度または摂氏−２０度）。貯蔵組成物は安定化組成物、例えば低ｐＨ組成物（ｐＨ４以下のｐＨ、例えば、酸１ｍＭ〜２５０ｍＭのクエン酸等の酸で得られる、例えば、ＣａｓｔｅｌｌｉｎｏおよびＳｏｄｅｔｚ、１９７６、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ４５、２７３−２８６；国際公開第０１／３６６０８号パンフレット；国際公開第０１／３６６０９号パンフレット；国際公開第０１／３６６１１号パンフレットを参照）、もしくは高グリセロール含有組成物（３０〜５０％ｖ／ｖ、例えば、ＣａｓｔｅｌｌｉｎｏおよびＳｏｄｅｔｚ、１９７６、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ４５、２７３−２８６）であってもよく、または、例えばアミノ酸（例えば、リジンまたはＥＡＣＡまたはトラネキサム酸等のリジン類似体）、糖（例えばマンニトール）、または当技術分野において知られている任意の安定剤（例えばジペプチド、国際公開第９７／０１６３１号パンフレット）などを含む１つ又は複数のさらなる安定剤組成物内に、もしくはその安定剤組成物と一緒に貯蔵してもよい。「プラスミン」種にはさらに、その任意の活性誘導体（もしくはその活性切断プラスミン変異体）、または活性化可能なプラスミノーゲンの同様の誘導体（もしくはその活性可能な切断変異体）が含まれる。そのような誘導体には、例えば、Ｔｃ９９−標識プラスミン（Ｄｅａｃｏｎら、１９８０、Ｂｒ  Ｊ  Ｒａｄｉｏｌ  ５３、６７３−６７７）等の標識プラスミンまたはプラスミノーゲン（もしくはその切断変異体）、またはペグ化された、もしくはアシル化されたプラスミンまたはプラスミノーゲン（もしくはその切断変異体；欧州特許第９８７９号明細書、国際公開第９３／１５１８９号パンフレット）が含まれる。他の任意の標識（放射性、蛍光性等）も、プラスミンまたはプラスミノーゲンの誘導体を産生するために使用してよい。前記誘導体にはさらに、ハイブリッドまたはキメラのプラスミンまたはプラスミノーゲン分子があり、この分子は例えば、フィブリン結合分子（ｔＰＡのクリングル２、アポリポタンパク質のクリングル、ｔＰＡもしくはフィブロネクチンのフィンガードメイン、またはフィブリン結合抗体のＦａｂドメイン等）に融合された、例えば、本発明の切断されたプラスミンまたはプラスミノーゲンを含む。
【００４５】
野生型プラスミン、および本発明のプラスミン変異体またはプラスミン誘導体の自己タンパク質分解に対する耐性（つまり安定性）は、タンパク質分解活性を比較するための方法と類似の方法で比較でき、例えば、発色性の活性分析、または例えばフィブリン、フィブリノーゲンまたはフィブロネクチンに基づく生物学的基質分析等がある。
【００４６】
自己タンパク質分解に対する耐性の測定のために、自己分解速度定数が測定し得る。本発明のプラスミノーゲン変異体から得られたプラスミン、または本発明の任意のプラスミン誘導体のいずれかを含む、本発明のプラスミン変異体の自己分解速度定数は、野生型プラスミンの自己分解速度定数より少なくとも５％、もしくは少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９９％もしくは９９．５％低く、または、自己分解速度定数は、野生型プラスミンの自己分解速度定数の最大で９５％、または最大で０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、もしくは９０％であるという特徴を有してもよい。示された百分率を測定するため、算出は絶対自己分解速度定数の価に基づいて行われ得る。例えば、野生型マイクロプラスミンの自己分解速度定数は２３０Ｍ−１ｓ−１であり、一方、マイクロプラスミン変異体Ｋ１３７Ｍの自己分解速度定数は１Ｍ−１ｓ−１である（実施例３／表３を参照）。したがってＫ１３７Ｍ変異体の自己分解速度定数は、野生型マイクロプラスミンの自己分解速度定数の０．４３％である。
【００４７】
さらに、本発明のプラスミノーゲン変異体から得られたプラスミン、または前記プラスミンのいずれかの誘導体を含む、本発明のプラスミン変異体のいずれかは、野生型プラスミンのタンパク質分解活性とは異なるタンパク質分解活性（高いまたは低い）を有してもよく、この活性は、例えば発色性の活性分析、または、フィブリン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、ラミニンまたはコラーゲン等に基づいた生物学的基質分析等で測定される。
【００４８】
本発明のプラスミノーゲン変異体から得られたプラスミン、または本発明の任意のプラスミン誘導体のいずれかを含む、本発明のプラスミン変異体のタンパク質分解活性を、野生型プラスミンのタンパク質分解活性と、触媒定数ｋｃａｔにより、比較してもよい。触媒定数ｋｃａｔは単位時間当たりに各酵素部位が生成物に変換する基質分子の数の尺度である。したがって、本発明のプラスミノーゲン変異体から得られたプラスミン、または本発明のプラスミン誘導体のいずれかを含む、本発明のプラスミン変異体のいずれかは、野生型プラスミンのｋｃａｔ値の＋１００％〜−９０％、または＋５０％〜−５０％の範囲にあるｋｃａｔ値、つまり、野生型プラスミンのｋｃａｔ値の１０％〜２００％、または５０％〜１５０％の範囲のｋｃａｔ値を有することを特徴としてもよい。示された百分率を測定するため、算出は絶対ｋｃａｔ値に基づいて行われる。例えば、野生型マイクロプラスミンのｋｃａｔは４６ｓ−１であるが、マイクロプラスミン変異体Ｋ１３７Ｍのｋｃａｔは３６ｓ−１である（実施例４／表３を参照）。したがってＫ１３７Ｍ変異体のｋｃａｔは野生型マイクロプラスミンのｋｃａｔの７８．３％である。
【００４９】
本発明のプラスミノーゲン変異体から得られたプラスミン、または本発明のプラスミン誘導体のいずれかを含む、本発明のプラスミン変異体のタンパク質分解活性を、野生型プラスミンのタンパク質分解活性と比較する別の方法には、ｋｃａｔ／Ｋｍ（表３）の比較が含まれる。本発明のプラスミノーゲン変異体から得られたプラスミン、または本発明のプラスミン誘導体のいずれかを含む、本発明のプラスミン変異体のｋｃａｔ／Ｋｍは、野生型プラスミンのｋｃａｔ／Ｋｍと比較して１／１０００まで、または１／５００まで低くても許容できる（後を参照）。
【００５０】
さらに、本発明のプラスミノーゲン変異体から得られたプラスミン、または本発明のプラスミン誘導体のいずれかを含む、本発明のプラスミン変異体のいずれかは、上で定義された自己分解速度定数および触媒定数ｋｃａｔを組合せた特徴を有してもよい。
【００５１】
あるいは、本発明のプラスミノーゲン変異体から得られたプラスミン、または本発明のプラスミン誘導体のいずれかを含む、本発明のプラスミン変異体のいずれかを、自己分解速度定数データとｋｃａｔ／Ｋｍデータとを組み合わせることにより、野生型プラスミンと比較してもよい。例えば、自己分解速度定数が野生型プラスミンと比較して１／２０でありｋｃａｔ／Ｋｍが野生型プラスミンと比較して１／１０であるプラスミン変異体は、野生型プラスミンより２倍優れているであろう。明らかに最終的な使用方法次第ではあるが、タンパク質分解活性が低い非常に安定したプラスミン（すなわち自己タンパク質分解により分解されない、またはほとんど分解されない）は、例えば、プラスミン活性が低レベルであるが持続することが望ましい場合、または目的とする臨床的効果を達成するために必要とされる場合に、強く求められる可能性が高い。したがって、このようなタンパク質分解活性が低い高度に安定したプラスミン変異体は、除放性の担体または補助剤を実際に使用する必要のない、除放性の製剤と事実上等しいものとなるであろう。
【００５２】
本発明のプラスミノーゲン変異体から得られたプラスミン、または本発明のプラスミン誘導体のいずれかを含む、本発明のプラスミン変異体のいずれかを比較するためのまた別の方法では、自己分解速度定数データとｋｃａｔデータを組み合わせることにより、野生型プラスミンと比較してもよい。
【００５３】
上述のような任意の比較測定では、明らかにプラスミン変異体をその最も近い野生型プラスミンと比較することが望ましい。例えば、マイクロプラスミン変異体を野生型マイクロプラスミンと、またはミニプラスミン変異体を野生型ミニプラスミンと比較することが望ましい。さらに、任意の活性測定では明らかに、本発明のプラスミン変異体の可逆的に不活化された誘導体を、まず可逆的な不活性化の原因（例えばアシル化または非最適ｐＨ）を除くことにより活性化するべきである。
【００５４】
本発明のプラスミノーゲン変異体またはそれから得られたプラスミン、本発明のプラスミン変異体のいずれかは、Ｇｌｕ−プラスミンまたはＧｌｕ−プラスミノーゲン、Ｌｙｓ−プラスミノーゲンまたはＬｙｓ−プラスミン、ミジプラスミノーゲン、またはミジプラスミン、ミニプラスミノーゲンまたは、ミニプラスミン、マイクロプラスミノーゲンまたはマイクロプラスミン、デルタプラスミノーゲンまたはデルタプラスミンであってもよい。
【００５５】
プラスミン種がタンパク質分解活性を有するかどうかを判断するための分析が多数ある。簡易で直接的な分析は、試料中のプラスミンによる発色基質の分解に基づいており；発色基質には、タンパク質分解切断でｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）を放出するＳ−２４０３（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ）およびＳ−２２５１（Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ）がある。形成されたｐＮＡの量は吸光度４０５ｎｍで測定できる。プラスミン活性を測定するための他の分析には電位差測定分析がある。比色分析（発色基質を使用する）および電位差測定の分析は、例えば、ＣａｓｔｅｌｌｉｎｏおよびＳｏｄｅｔｚ（１９７６、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ４５、２７３−２８６）に記載されている。プラスミン活性を測定するためのさらに他の分析には、カゼイン分解法がある（例えば、ＲｏｂｂｉｎｓおよびＳｕｍｍａｒｉａ、１９７０、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９、１８４−１９９；ＲｕｙｓｓｅｎおよびＬａｕｗｅｒｓ、１９７８、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」のＩＸ章−Ｐｌａｓｍｉｎ、Ｓｔｏｒｙ−Ｓｃｉｅｎｔｉａ，Ｇｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ、１２３−１３１ページ）。プラスミン活性を測定するための、さらなる他の分析には線溶検査がある（例えば、ＡｓｔｒｕｐおよびＭｕｌｌｅｒｔｚ、１９５２、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ４０、３４６−３５１）。他のタンパク質基質を使用して、他の活性分析を容易に設計できる。このような分析を、酵素の自己タンパク質分解による分解に起因する、長期にわたるプラスミンのタンパク質分解活性の消失を追跡するためにも使用してもよいことは明らかである。本発明のプラスミン変異体、またはその任意の活性切断変異体もしくは誘導体の安定性を分析するための別の方法として、前記プラスミン変異体を野生型プラスミンの存在下でインキュベートしてもよく、野生型プラスミンによる分解に対するプラスミン変異体の耐性をモニターできる。
【００５６】
病変、創傷、潰瘍化した傷等（縫合創の潰瘍形成等）からの壊死要素または壊死組織片の除去におけるプラスミンの使用は、例えば米国特許第３，２０８，９０８号明細書に記載されている。同様に、熱傷の治療にプラスミンを含む治療用製剤の局所使用が、例えば米国特許第４，１２２，１５８号明細書に開示されている。壊死組織切除は、壊死した、損傷した、および／または感染した組織を除去し、残存している健康な組織の治癒を改善、または強化する。このような除去は、外科的、機械的、化学的な手段により、または選択的に壊死組織を食べる、生きている特定の種の蛆虫（蛆療法）により行ってもよい。壊死組織切除を酵素を使用して、または酵素を併用して行ってもよく、この方法は酵素的壊死組織除去と呼ばれる。壊死組織切除は、熱傷および重度の創傷等の治癒過程の重要な一側面であり、ある種のヘビ咬傷の治療においても同様に使用される。酵素的壊死組織除去（単独で、または他のタイプの壊死組織切除との併用で）におけるプラスミン（または上述の任意のプラスミンの変異体もしくは誘導体、またはその代替物）の適用は、創傷治癒を促進または容易にするために、および皮膚移植等の外科的処置の補助として特に有益である。
【００５７】
プラスミン（または上述の任意のプラスミンの変異体もしくは誘導体、またはその代替物）のより広く知られた使用方法は、大まかに言えば、病的なフィブリンの沈着の治療に関する。フィブリンの沈着は身体の種々様々な病的状態に起因する。例えばフィブリンを含む血塊が組織内の血管で形成されると、深部静脈、冠状動脈、脳動脈または網膜静脈の閉鎖症、または血栓症を引き起こす。フィブリンのわずかな蓄積は、切迫した重篤な血栓症に先行し、またはその警告となる可能性がある。例として、不安定狭心症が挙げられるが、これは切迫した冠状動脈血栓症および一過性脳虚血発作の警告と考えられ、脳卒中に先行する場合がある。フィブリンはさらに、感染、自己免疫疾患および癌などの多くの疾病プロセスに付随する炎症に関連して、組織内に蓄積することが多い。フィブリンは他にも、微生物による感染によって引き起こされた化膿巣の周囲に沈着する。さらにフィブリン沈着は、特定の固形腫瘍に関連して見られることが多い。フィブリン沈着はまた、あらゆるタイプの創傷の治癒中に生じる恐れがある。また、フィブリン沈着は、網膜静脈におけるフィブリンの蓄積としても現れ、網膜変性症、視力障害または視力喪失にさえもつながる可能性がある。病的なフィブリン沈着という用語はさらに、カテーテル、カテーテルデバイス内やその先端、または、人工血管、および合成の、ヒトまたは動物由来の移植組織等の、フィブリンを含む閉塞により実質的に閉塞されるインプラント内で形成または存在する沈着を包含する。用語「カテーテルデバイス」は、身体に挿入できる任意のカテーテルまたはチューブ状のデバイスを指し、動脈カテーテル、心臓カテーテル、中心静脈カテーテル、静脈内カテーテル、末梢挿入中心静脈カテーテル、肺動脈カテーテル、トンネル状中心静脈カテーテル、および動静脈シャント等がある。
【００５８】
血栓症、つまり、血栓または止血血栓の形成、の進行を助長する様々な要因には、（１）罹患血管の血管内皮細胞表層の損傷（２）血中凝固特性の増加、および（３）罹患血管の血液の停滞、がある。血栓症は、血管表層の破損箇所に付着された非常に小さな塊から発症する。小さな塊は、血栓症の発症を助長し、血管の内径を減少させ血流を減速させる作用がある。さらに、最初の小さな血栓が成長すると、罹患血管の完全な、またはほぼ完全な閉鎖に発展する可能性が高い。血栓症が動脈の１つで起こると、その動脈により供給される組織では、酸素および栄養が欠乏し、その結果組織の損傷または死（壊疽）を引き起こす可能性がある。損傷の度合いは、血栓症の位置および大きさ、増殖速度、患部が動脈１本としかつながっていないか、または側副血管により供給を受けるかどうかに依存する。例えば心臓または脳のような重要臓器へつながる血管が影響を受ける場合、人間は重度に障害を負うか、または死亡する可能性がある。時に、血栓は細菌等の伝染性の生物体を含む場合があり敗血症性血栓症が、膿形成および周囲の組織の感染を伴い発症する可能性がある。
【００５９】
さらに、プラスミン（または上述のそのあらゆる変異体もしくはその誘導体、またはその代替物）の使用法には、循環フィブリノーゲンレベルの減少（例えば国際公開第９３／０７８９３号パンフレット）、およびα２−抗プラスミン阻害因子としての使用（虚血性脳卒中後に脳梗塞の大きさを減少させるという報告がされている；国際公開第００／１８４３６号パンフレット）がある。
【００６０】
プラスミン（または上述のそのあらゆる変異体もしくはその誘導体、またはその代替物）のさらなる別の使用法は、眼における後部硝子体剥離（ＰＶＤ）の誘導、および／または硝子体液化に関し、機械的な硝子体切除術の補助手段として、またはその代替法としての使用がある（国際公開第２００４／０５２２２８号パンフレット；米国特許第６，７３３，７５０号明細書；米国特許第６，５８５，９７２号明細書；米国特許第６，８９９，８７７号明細書；国際公開第０３／３３０１９号パンフレット；国際公開第２００６／１２２２４９号パンフレット；国際公開第２００７／０４７８７４号パンフレット；米国特許第５，３０４，１１８号明細書；米国特許出願公開第第２００６／００２４３４９号明細書；米国特許出願公開第第２００３／０１４７８７７号明細書）。硝子体切除および／または硝子体液化は、多くの眼の疾患にとって利点があり、そのような疾患には、硝子体浮遊物（通常透明な硝子体液内の硝子体液の自動性細片／蓄積で視力を損なう）、網膜剥離（硝子体の牽引により発症する可能性のある盲検化の症状）、黄斑パッカー（網膜黄斑上の瘢痕組織；黄斑は鮮明な中心視覚に必要である；黄斑パッカーはまた、網膜上膜症、または網膜前膜症、セロファン黄斑症、網膜しわ、表面しわ網膜症、黄斑前線維症、または内境界膜疾病としても知られる）、硝子体出血および／または網膜上の線維性瘢痕組織の形成（網膜剥離の原因となる可能性がある）を招く糖尿病網膜症（増殖性または非増殖性）、黄斑円孔（盲点の原因となり、硝子体の牽引、受傷または外傷事故により発症する網膜黄斑の孔）、硝子体出血（糖尿病網膜症、受傷、網膜剥離もしくは網膜裂孔、クモ膜下出血（テルソン症候群）、または閉鎖された血管が原因）、硝子体下出血（硝子体を覆う硝子体膜下の出血）、黄斑浮腫（流動性タンパク質の、眼の網膜黄斑上またはその下での沈着）、および黄斑変性（ドルーゼンの形成で発症；乾燥型および湿潤型；年齢に関連する場合加齢黄斑変性症）がある。プラスミンの他の眼への適用には、トラベクレクトミー手術（眼圧減少のために実施）後のろ過胞の維持または再建がある。例えば、国際公開第２００９／０７３４５７号パンフレットを参照。
【００６１】
プラスミン（またはそのあらゆる変異体もしくはその誘導体、またはその代替物）のさらに別の使用法は、診断にあり、より具体的には、適正に標識された（例えば、Ｔｃ９９標識された、上記を参照）プラスミン（または上述のそのあらゆる変異体もしくはその誘導体、またはその代替物）を、病的なフィブリン沈着の検出に適用してもよい。本発明の切断プラスミンまたはプラスミノーゲン変異体をこのような診断法に適用する場合、前記変異体がフィブリン結合部位を含むことに注意するべきである（プラスミンそれ自体のものであろうが、例えばハイブリッド分子を作ることによりプラスミン触媒ドメインとなって付加されたものであろうが）。
【００６２】
本発明のプラスミン、またはそのあらゆる変異体もしくはその誘導体、またはその代替物は、薬学的に許容される担体、希釈剤または補助剤において貯蔵してもよい。そのような担体、希釈剤または補助剤は、１〜１００ｍＭの酢酸またはクエン酸等の酸性の低緩衝液から構成されるか、または含んでもよい。酸性の場合、薬学的に許容される担体、希釈剤または補助剤のｐＨは、２．５〜４．０であり、例えば３．０〜３．５、または３．１である。有益な酸性化合物には、酢酸、クエン酸、塩酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸または安息香酸がある。ギ酸を使用してもよいが、この化合物はＡｓｐ残基のＣ末端でタンパク質分解切断を誘導しないため、注意が必要である。酸性か中性の薬学的に許容される担体、希釈剤または補助剤は、セリン、スレオニン、メチオニン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、バリン、アラニン、アスパラギン酸、リジン、ヒスチジンまたはその任意の誘導体または類似体等の１つ又は複数のアミノ酸を含んでもよい。薬学的に許容される担体、希釈剤または補助剤は、単糖、二糖、多糖または多価アルコール等の糖を含んでもよい。例えば、スクロース、グルコース、フルクトース、ラクトース、トレハロース、マルトースおよびマンノース等の糖、ソルビトールおよびマンニトール等の糖アルコール、デキストリン、デキストラン、グリコゲン、デンプンおよびセルロース等の多糖がある。薬学的に許容される担体、希釈剤または補助剤は、グリセロール、ナイアシンアミド、グルコサミン、チアミン、シトルリン、無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム等）、ベンジルアルコールまたは安息香酸等の化合物を含んでもよい。薬学的に許容される担体、希釈剤または補助剤には、ε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）および／またはトラネキサム酸等の化合物を含んでもよい（上記、および背景技術節を参照）。この化合物のいくつかを、上記のプラスミン、またはそのあらゆる変異体もしくは誘導体、またはその代替物の安定剤として使用してもよい。
【００６３】
上記を考慮すると、本発明の別の態様は、薬剤として使用する、本発明の単離されたプラスミノーゲン、プラスミン、またはそのあらゆる変異体もしくは誘導体、またはその代替物、またはこれらのいずれかの組合せに関する。
【００６４】
本発明のまた別の態様は、本発明の単離されたプラスミノーゲン、プラスミン、またはそのあらゆる変異体もしくは誘導体、またはその代替物、またはこれらのいずれかの組合せ、および薬学的に許容される希釈剤、担体または補助剤の少なくとも１つを含む組成物に関する。さらなる実施形態において、前記組成物は、抗凝血剤、さらに血栓溶解剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、血管新生阻害剤、抗有糸分裂剤、抗ヒスタミン剤または麻酔剤のうちの少なくとも１つを追加でさらに含んでもよい。
【００６５】
本発明の上述の２つの態様に対する一実施形態において、本発明の単離されたプラスミノーゲン、プラスミン、またはそのあらゆる変異体もしくは誘導体、またはその代替物、またはこれらのいずれかの組合せ、または、本発明の組成物は、臨床的に意義のあるあらゆる状況で使用されてもよく、例えばこのような状況には、病的なフィブリン沈着の治療、眼の後部硝子体剥離の誘導、眼の硝子体液化の誘導、眼の硝子体切除の補助および容易化、後部硝子体剥離の誘導、硝子体黄斑癒着の分離、黄斑円孔の閉鎖、酵素的壊死組織除去、循環フィブリノーゲンの減少、α２−抗プラスミンレベルの減少、またはトラベクレクトミーとの併用がある。
【００６６】
本発明の上述の２つの態様に対する別の実施形態において、本発明の単離されたプラスミノーゲン、プラスミン、またはそのあらゆる変異体もしくは誘導体、またはその代替物、またはこれらのいずれかの組合せ、または、本発明の組成物は、予防の目的で、または予防療法のための方法で使用されてもよい。予防的な使用法には、病的なフィブリン沈着の発症リスクが高い哺乳動物（肥満の、運動不足の、または大きな外科的イベントまたは手術を受ける予定のある哺乳動物等）における発症リスクの減少がある。予防的な使用法には、他にも、片眼が後部硝子体剥離および／または硝子体液化の誘導が必要であると診断される／された哺乳動物の、健康な方の眼における後部硝子体剥離および／または硝子体液化の誘導がある。
【００６７】
あるいは、本発明は、患者における病的なフィブリン沈着を治療する、分解する、軟化する、浸解する、溶解するための、フィブリン沈着の溶解を誘導するまたは促進するための方法に関し、前記方法は、本発明の単離されたプラスミノーゲン、プラスミン、またはそのあらゆる変異体もしくは誘導体、またはその代替物、またはこれらのいずれかの組合せの有効量を接触させることを含み、前記接触により、前記病的なフィブリン沈着の治療、分解、軟化、浸解、溶解、または前記病的なフィブリン沈着の溶解の誘導もしくは促進が得られる。
【００６８】
本発明はまたさらに、眼における後部硝子体剥離を誘導する、および／または眼における硝子体の液化を誘導する、または眼における外科的な硝子体切除の容易化のための方法に関し、前記方法は、このような治療が必要な前記患者の眼に、本発明の単離されたプラスミノーゲン、プラスミン、またはそのあらゆる変異体もしくは誘導体、またはその代替物、またはこれらのいずれかの組合せの有効量を接触させることを含み、前記接触により、前記後部硝子体剥離および／または硝子体の前記液化の誘導、または前記外科的な硝子体切除の容易化が得られる。
【００６９】
本発明はまた、患者の損傷した組織の酵素的壊死組織除去のための方法に関し、前記方法は、本発明の単離されたプラスミノーゲン、プラスミン、またはその任意の変異体もしくは誘導体、またはその代替物、またはこれらのいずれかの組合せの有効量を前記損傷した組織に接触させることを含み、前記接触により、前記損傷した組織の前記酵素的壊死組織除去が得られる。
【００７０】
本発明の他の方法は、臨床的に関連のある、他のあらゆる適応症を治療するか予防し、患者の循環フィブリノーゲンを減少させるための、またはα２−抗プラスミンレベルを減少させるための方法を含み、前記方法は、本発明の単離されたプラスミノーゲン、プラスミン、またはその任意の変異体もしくは誘導体、またはその代替物、またはこれらのいずれかの組合せの有効量をそのような治療を必要とする患者に接触させることを含み、前記接触により、前記循環フィブリノーゲン、または前記α２−抗プラスミンレベルを減少させる。
【００７１】
一般的に、本発明のプラスミン（またはそのあらゆる変異体もしくはその誘導体、またはその代替物）を含む本発明の薬剤または組成物は、最終的な使用方法および投与法によるが、抗凝血剤、さらなる血栓溶解剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、血管新生阻害剤、抗有糸分裂剤、抗ヒスタミン剤、または麻酔剤等の１つ又は複数のさらなる活性成分を含んでもよい。
【００７２】
「抗凝血剤」には、ヒルジン、ヘパリン、クマリン、低分子ヘパリン、トロンビン阻害物質、血小板抑制剤、血小板凝集阻害剤、凝固因子抑制因子、抗フィブリン抗体、および第ＶＩＩＩ因子阻害物質（国際公開第０１／０４２６９号パンフレットおよび国際公開第２００５／０１６４５５号パンフレットに記載されたもの等）がある。
【００７３】
「血栓溶解剤」には、野生型プラスミン、野生型プラスミノーゲン、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡまたはアルテプラーゼ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）およびスタフィロキナーゼ、またはこれらのあらゆる変異体もしくは誘導体、例えばＡＰＳＡＣ（アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化因子複合体）、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、ｓｃｕＰＡ（単鎖ｕＰＡ）、またはこれらのいずれかの組合せがある。
【００７４】
「抗炎症剤」には、ステロイド剤（例えばプレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、コルチゾン、ハイドロコルチゾン、プレドニゾン、トリアムシノロン、デキサメサゾン）および非ステロイド系の抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ；例えばアセトアミノフェン、イブプロフェン、アスピリン）がある。
【００７５】
「抗ウイルス剤」には、トリフルリジン、ビダラビン、アシクロビル、バラシクロビル、ファムシクロビル、およびイドクスウリジンがある。
【００７６】
「抗菌剤」または抗生剤には、アンピシリン、ペニシリン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、フラミセチン、ガチフロキサシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、バシトラシン、ネオマイシンおよびポリミキシンがある。
【００７７】
「抗糸状菌／静真菌／抗真菌剤」には、フルコナゾール、アムホテリシン、クロトリマゾール、エコナゾール、イトラコナゾール、ミコナゾール、５−フルオロシトシン、ケトコナゾールおよびナタマイシンがある。
【００７８】
「血管新生阻害剤」には、抗−ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）、または抗−ＰｌＧＦ（胎盤成長因子）抗体等の抗体（またはそのフラグメント）、およびマクゲン（ペガプタニブナトリウム）、トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｒｐＲＳ）、酢酸アネコルタブ、コンブレタスタチンＡ４プロドラッグ、ＡｄＰＥＤＦ（色素上皮由来因子を発現できるアデノベクター）、ＶＥＧＦトラップ、ＶＥＧＦレセプター２の阻害剤、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦまたはＴＧＦ−βの阻害剤、シロリムス（ラパマイシン）およびエンドスタチン等の剤がある。
【００７９】
「抗有糸分裂剤」には、マイトマイシンＣおよび５−フルオロウラシルがある。
【００８０】
「抗ヒスタミン剤」には、フマル酸ケトチフェンおよびマレイン酸フェニラミンがある。
【００８１】
「麻酔剤」には、ベンゾカイン、ブタムベン、ジブカイン、リドカイン、オキシブプロカイン、プラモキシン、プロパラカイン、プロキシメタカイン、テトラカインおよびアメトカインがある。
【００８２】
「接触する」は、本明細書で使用される場合、薬剤等の組成物と、前記組成物が接触する組織、体液、器官、生物体等との間の相互作用をもたらす、あらゆる投与の方法を指す。組成物と、組織、体液、器官、生物体等との間の相互作用は、組成物を投与して直ちに、またはほぼ直ちに生じさせることができ、長期間（期間は組成物を投与して直ちに、またはほぼ直ちに開始する）生じさせることができ、または、組成物を投与した時間に対して遅らせることができる。
【００８３】
病的なフィブリン沈着に接触するあらゆる方法が利用できるが、その方法は、フィブリン沈着にプラスミン（またはそのあらゆる変異体もしくは誘導体、またはその代替物）の有効量を（直ちに、遅延して、または長期間にわたって）提供する。そのようなフィブリン沈着が血塊を伴う場合、注射および／または点滴および／またはカテーテルによって、プラスミン（またはそのあらゆる変異体もしくは誘導体、またはその代替物）を動脈内、静脈内または局所的に（血塊の近くに、または血塊中にさえも）送達できる。
【００８４】
酵素的壊死組織除去においてプラスミン（またはそのあらゆる変異体もしくはその誘導体、またはその代替物）を使用する場合、局所に塗布できるゲル様の組成物、または液状の形態での適用も含んでよい。
【００８５】
眼の硝子体液および／または房水に接触するあらゆる方法が利用できるが、その方法では、硝子体液および／または房水にプラスミン（またはそのあらゆる変異体もしくは誘導体、またはその代替物）の有効量を（直ちに、遅延して、または長期間にわたって）提供する。硝子体液および／または房水に接触する方法の１つには、硝子体液および／または房水に直接注射する、１つ又は複数の眼球内注射がある。あるいは、前記接触方法には、結膜下、筋肉内、または静脈注射がある。さらに別の接触方法には、ＯＣＵＳＥＲＴ（登録商標）（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）または、ＶＩＴＲＡＳＥＲＴ（登録商標）（Ｂａｕｓｃｈ  ＆  Ｌｏｍｂ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）等の硝子体へ埋め込み型のデバイスを設置する方法がある。硝子体液および／または房水にプラスミン（またはそのあらゆる変異体もしくは誘導体、またはその代替物）の有効量を接触させる方法は、持効性製剤、徐放性製剤、または任意の適切な埋め込み型のデバイスを使用した、持続的な方法でもよい。
【００８６】
用語「有効量」は、本発明の薬剤、特に本発明の薬剤の活性成分、すなわち、プラスミンまたは活性切断変異体（または上述のそのあらゆる代替物）の投与措置を指す。有効量は、一般に、接触または投与の方法および治療される症状に対する調節により異なり、またそのような調節を必要とする。薬剤、特にその活性成分の有効量は、深刻なまたは不必要な毒性作用を引き起こさず、望ましい臨床結果または治療的効果もしくは予防的効果を得るために必要とされる量である。有効量を得るまたは維持するために、薬剤を単回投与または複数回投与してもよい。有効量はさらに、治療が必要な症状の重症度、または予防が必要な症状の予想される重症度により異なる場合があり、また有効量は、患者の全体的な健康状態および身体状況に依存し、通常、有効量を決定するには、治療を行う医師または内科医の判断が必要となるであろう。有効量はさらに、異なったタイプの投与の組合せによって決定してもよい。薬剤は、溶液（液体、またはゲル状等の半液体、または分散液もしくは懸濁液内、コロイド、エマルジョン内、ナノ粒子懸濁液）として、または固形物（例えば錠剤、小型錠剤、ハードまたはソフトカプセル）として投与してもよい。
【００８７】
血栓溶解の目的では、プラスミン治療におけるプラスミンの用量および治療期間は、典型的には血塊の大きさと場所、また患者の身体の大きさ、体重および年齢に依存する。血塊が静脈性の場合、プラスミンでの治療は数日継続する可能性があるが、血塊が動脈性の場合、プラスミン治療は数時間しか必要とされない可能性がある。心筋梗塞症では、短い単回投与で治療してもよいが、血栓静脈炎および肺塞栓症等の症状には、長期間の複数回投与の治療を必要とする可能性がある。長期間の持続的および／または間欠的な血栓溶解剤プラスミンでの治療を、冠状動脈閉塞症の治療に、または血栓形成を発症するリスクが高いとされる患者において、血栓形成のリスクを減らすための予防的治療に適用してもよい。プラスミンの用量に影響するさらなる因子には、α２−抗プラスミンおよび／またはα２−マクログロブリン等のプラスミン阻害因子の循環レベルがあり、その初期レベルは患者に依存する。全循環α２−抗プラスミンの多くとも１５％が残存し、効果的な血栓溶解療法を達成するように、プラスミン用量を調節することが望ましいであろう。血栓溶解を誘導する目的で、血栓の近位部のそばにプラスミン、またはそのあらゆる変異体または誘導体、またはその代替物を送達する接触方法は、血清抑制因子への曝露が減少するため有利となる可能性がある。そのような接触方法には、一般的にカテーテルデバイスによる運搬がある。血栓溶解に対する使用でのプラスミン用量は、一般的に５００マイクログラム／体重約１０ミリグラム／ｋｇ体重の範囲にあり、単回ボーラス投与、または１回の初回ボーラス投与とその後の１回または反復ボーラス投与に分けて投与する。プラスミンを、あるいは点滴、またはドラッグデリバリー用のマイクロポンプによって長期間にわたり投与してもよい。持続的投与のためのプラスミン用量は１〜１０ｍｇ／ｋｇ／時間までの範囲にあってもよい。
【００８８】
後部硝子体剥離、硝子体液化、硝子体の血液または出血のクリアランス、または硝子体腔からの有毒物質もしくは異物のクリアランスを誘導するためのプラスミン用量は一般的に、片眼１用量あたり、約０．１マイクログラム〜約２５０マイクログラムまでの範囲にあってもよく、片眼１用量あたり約５０マイクロリットル〜約３００マイクロリットルまでの希釈剤または担体容積内で送達できる。希釈剤または担体は、例えば、無菌の平衡塩類溶液（ＢＳＳまたはＢＳＳ  Ｐｌｕｓ）、生理的食塩溶液、または１〜１０ｍＭのクエン酸を含む溶液であってもよい。一実施形態においては、プラスミンを、０．１ｍＬ希釈剤または担体に含まれる１２５マイクログラムの用量で、眼に送達する。硝子体切除の場合には、前記プラスミンを硝子体切除の１５〜３００分前、または１５〜１２０分前に眼に送達してもよい。プラスミンの代替源としてプラスミノーゲンを使用する場合（「プラスミン」の定義を参照）、片眼当たり２５０マイクログラムまでのプラスミノーゲンを使用でき、前記プラスミノーゲンは、プラスミノーゲン活性化因子としてウロキナーゼまたはストレプトキナーゼを２０００ＩＵまで、またはｔＰＡを２５マイクログラムまで併用してもよい。眼に使用される場合、プラスミンまたはプラスミノーゲンの投与ではさらに、空気、膨張気体または液化可能な気体、またはそれらの混合物等の気体状の補助剤を、眼に無毒である限り、併用して投与してもよい。他の適切な気体には、ＳＦ６（六フッ化硫黄）およびＣ２Ｆ６（ヘキサフルオロエタン）、Ｃ３Ｆｓ（オクタフルオロプロパン）、Ｃ４Ｆｓ（オクタフルオロシクロブタン）等のパーフルオロカーボン、酸素、窒素、二酸化炭素、アルゴン、および他の不活性ガスがある。眼に使用される気体材料の容積は、気体材料、患者、および望ましい結果に依存する。例えば、後眼房に注入される空気の容積は約０．５ｍＬ〜約０．９ｍＬの範囲にあり得る。ＳＦ６およびパーフルオロカーボンの気体等の他の気体材料では、約０．３ｍＬ〜０．５ｍＬの範囲にあり得る。気体材料は、後部硝子体膜に硝子体液を圧迫し、眼を損傷させずに硝子体液内に空間を形成するのに十分な量で、眼の後眼房へ注入することが好ましい。好ましい実施形態では、気体状補助剤を硝子体液に注入し、眼球内腔の内部体積の約４０％〜約６０％を占める空間を形成する。
【００８９】
上に詳述された用量は、いかなる場合にも制限を意味する数値ではない。前記用量はさらに、野生型プラスミンまたはプラスミノーゲン、またはその任意の活性または活性可能な切断変異体を指す。本発明の安定性が増加したプラスミン（またはそのあらゆる変異体もしくはその誘導体、またはその代替物）を使用する場合の用量は、本発明のプラスミンの最終的な安定度および残存活性に依るが、野生型プラスミンで得られるのと同じ、または全体的により優れた臨床的効果を得るため、同程度の用量、より高い用量、またはより低い用量であってもよい。本発明のプラスミンの用量は、α２−抗プラスミン等の内因性阻害因子による阻害速度にも依存する。
【００９０】
本明細書で開示された研究に沿って、本発明はさらに、安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体をスクリーニングするための方法に関し、前記方法は、
（ｉ）野生型プラスミンの触媒ドメインにおいて、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が自己タンパク質分解する傾向にある位置Ｐの内部アミノ酸を少なくとも１つ同定するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）において同定された位置Ｐのアミノ酸を、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が、自己タンパク質分解しにくいかまたは全く自己タンパク質分解する傾向がないアミノ酸に突然変異させるステップと、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた突然変異体の自己タンパク質分解安定性を測定するステップと、
（ｉｖ）自己タンパク質分解性が安定している突然変異体を、安定した自己タンパク質分解性を有する変異体として（ｉｉｉ）から選択するステップとを含む。
【００９１】
本発明は同様に、安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体をスクリーニングするための方法に関し、前記方法は、
（ｉ）ヒトプラスミンの触媒領域の位置１３７、１４７および１５８のアルギニンまたはリジンアミノ酸の、または、非ヒトプラスミンにおいて対応するアルギニンまたはリジンの１つ又は複数を、天然のアミノ酸とは異なるアミノ酸へ突然変異させるステップと、
（ｉｉ）（ｉ）で得られた突然変異体の自己タンパク質分解安定性を測定するステップと、
（ｉｉｉ）自己タンパク質分解性が安定している突然変異体を、安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体として（ｉｉ）から選択するステップとを含み、
前記ヒトプラスミンの触媒領域は位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸である。
【００９２】
上記のスクリーニング法は、安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体のタンパク質分解活性を測定するステップをさらに含んでもよい。
【００９３】
薬物を含む多数の製品（ここでは特に、使用者が利用できる状態にある活性成分、すなわち、患者に投与できる最終的な製剤として理解される）、およびバルク貯蔵された薬物の活性成分は、通常利用に先立ってかなりの時間貯蔵される。可能な限り製品の有効期限を延ばすことが目的である。有効期限とは、製品が安全に使用され得、その有用性が効力を維持する、つまり薬剤の場合はその活性が、および／またはその活性成分が効力を維持する期間を意味する。典型的には、有効期限は製品またはその包装に表示される。一旦有効期限が切れると、製品の安全性と有用性の効力は保証されない。製品の貯蔵においてさらに重要な側面は、望ましい有効期限を達成できる貯蔵温度である。例えば、＋４℃または平均的な冷蔵庫の温度で貯蔵された製品の有効期限は、１２ヶ月になる可能性があるが、−２０℃または平均的な冷凍庫の温度で貯蔵された同じ製品の有効期限は、３６ヶ月になる可能性がある。しかしながら、物流的に、例えば−２０℃の凍結温度でコールドチェーンを維持するのは、＋４℃でコールドチェーンを維持するより、著しく複雑で困難で費用がかかる。したがって、製品が＋４℃で貯蔵されながら、短くはあるが十分な長さの有効期限を有することは、依然として大変魅力的である可能性がある。本発明は、プラスミン、もしくはその任意の活性断片もしくは誘導体、またはプラスミンもしくはその任意の活性誘導体を含む組成物の有効期限または長期貯蔵安定性を延長、強化、増加させるための解決策を提供する。解決策では、本明細書に記載した、安定性を増強したプラスミン変異体を提供し、これにより、内因的に有効期限を増加、強化、延長する。
【００９４】
本発明は、同様にプラスミンを含む組成物の長期貯蔵安定性を強化する方法に関し、前記方法は、タンパク質分解活性の著しい損失がなく長期にわたり貯蔵できる、安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体を同定するステップを含む。長期安定性の測定には、本発明のプラスミン製剤を等分し、活性測定を想定した貯蔵期間中に反復して行う。想定した貯蔵期間が、例えば２４か月である場合、活性測定を例えば毎月行い得る。想定した貯蔵期間終了時点でのタンパク質分解活性の許容可能な減少量は、大部分は想定した臨床適用によるが、例えば１０％〜１５％を上回らないのが一般的であり得る。
【００９５】
本発明はさらに、本発明のプラスミノーゲン変異体を産生するための方法、
つまりプラスミノーゲンを産生するための方法に関し、この方法は、触媒ドメインにおいて、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が自己タンパク質分解する傾向にある位置Ｐの内部アミノ酸の少なくとも１つが、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が、自己タンパク質分解しにくいかまたは全く自己タンパク質分解する傾向がないアミノ酸へ突然変異していることを含む。このような方法は、
（ｉ）本発明のプラスミノーゲン変異体をコードする核酸を前記プラスミノーゲンを発現できる適切な宿主細胞に導入するステップと；
（ｉｉ）前記宿主細胞において前記プラスミノーゲンが発現するのに十分な条件下、十分な時間をかけて（ｉ）で得られた宿主細胞を生育するステップと；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で発現したプラスミノーゲンを回収するステップとを含む。
この方法には、最後に（ｉｉｉ）で回収されたプラスミノーゲンの精製を含むステップ（ｉｖ）を付加できる。
発現および産生に適した宿主細胞および方法は、例えば国際公開第９０／１３６４０号パンフレット（昆虫細胞）、国際公開第２００２／０５０２９０号パンフレットおよび国際公開第０３／０６６８４２号パンフレット（酵母細胞）、国際公開第２００８／０５４５９２号パンフレット（細菌細胞／リフォールディングプロセス）および国際公開第２００５／０７８１０９号パンフレット（ウキクサ科形質転換植物または形質転換植物細胞）に開示されている。
【００９６】
本発明はさらに、本発明のプラスミン変異体を産生するための方法、つまりプラスミンを産生するための方法を包含し、この方法は、触媒ドメインにおいて、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が自己タンパク質分解する傾向にある位置Ｐの内部アミノ酸の少なくとも１つが、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が、自己タンパク質分解しにくいかまたは全く自己タンパク質分解する傾向がないアミノ酸へ突然変異していることを含む。そのような方法は一般的に、上述のように本発明のプラスミノーゲンを産生するステップを含み、さらに、適切なプラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ、ｕＰＡ、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、またはその任意の変異体等）を使用して、本発明のプラスミノーゲンを本発明のプラスミンへ活性化するステップを含む。最終的には、活性化に先立ってプラスミノーゲンを精製する、活性化したプラスミンを精製する、ならびに／または活性プラスミンを上述のように誘導する、および／もしくは可逆的に不活化する、および／もしくは、任意で適切な貯蔵条件（溶液の安定化、凍結乾燥および／または低温）下に置く、１つ又は複数のステップを付加できる。
【００９７】
本発明はまた、本発明のプラスミノーゲン変異体またはプラスミン変異体をコードする、単数または複数の単離された核酸配列に関する。本発明は、またそのような核酸を含む単数または複数の組換えベクターに関する。本発明はまた、そのような核酸、またはそのような組換えベクターで形質転換された単数または複数の宿主細胞に関する。
【実施例】
【００９８】
実施例１  プラスミン触媒ドメインの自己分解、および自己タンパク質分解に感受性のプラスミン触媒ドメインにおけるペプチド結合の測定。
プラスミンのタンパク質分解活性の自動不活性化の根底にあるメカニズムを調査するため、発明者は、主にプラスミンの触媒ドメインからなるマイクロプラスミンに焦点を当てることとした。
【００９９】
大量に産生されたマイクロプラスミンの典型的な分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロフィールを図２に示す。分画番号５（プレピーク１）、分画番号７と８（プレピーク２）、分画番号１０〜１２（マイクロプラスミンのピーク）、および分画番号１５と１６（ポストピーク）に対応する溶出液を収集し、その中の物質をＮ末端アミノ酸配列を決定した（エドマン分解）。分画番号１７と１８前後のピークの溶出は緩衝液ピークに相当する。ＳＥＣは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラムをＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣシステムに接続して行った。カラムを、８ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭのＫＣｌ、０．５Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含むｐＨ７．４の緩衝液で平衡にし溶出した。１ｍｇ／ｍＬのマイクロプラスミン溶液の５０μＬ（つまり、５０μｇのマイクロプラスミン）を注入した。溶出液のタンパク質をＵＶ吸光度検出器で２２０ｎｍでモニターした。
【０１００】
得られたアミノ酸配列を、表２に記載する。マイクロプラスミンの「重鎖」（アミノ酸ＡＰＳから開始、すなわち、重鎖の１９個のＣ末端のアミノ酸）および軽鎖（アミノ酸ＶＶＧから開始）に対応したアミノ酸配列、および２つの自己分解生成物（アミノ酸ＥＡＱおよびアミノ酸ＶＣＮから開始）に対応するアミノ酸配列がある。プラスミン（プラスミノーゲン）の全配列、および重鎖と軽鎖の指標、および自己切断部位については、図１を参照のこと。自己分解生成物は、Ｌｙｓ１３７およびＬｙｓ１４７のＣ末端アミド結合の切断にそれぞれ対応する（番号付けはプラスミンの軽鎖の位置１のバリンから開始、図１を参照）。
【０１０１】
【表２】
0005819293.tif 000003
【０１０２】
大量に産生されたマイクロプラスミンを自己触媒により分解させた。０．６ｍｇ／ｍＬの最終濃度のマイクロプラスミンを＋２０℃で４時間、ｐＨ３．１、ｐＨ４．０、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、およびｐＨ７．０でインキュベートし、−７０℃で直ちに凍結した。試料を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、その結果を図３に示す（クーマシーブリリアントブルー染色ゲル）。図３には、約１５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、および１０ｋＤａよりやや小さい、自己触媒による主な分解生成物を示す。観察されたバンドはＮ末端のアミノ酸配列決定により決定された切断部位に一致している（表１を参照）。
【０１０３】
実験の別のセットにおいては、大量に産生したマイクロプラスミン（５ｍＭのクエン酸、６ｍｇ／ｍＬのマンニトール、ｐＨ３、１中４ｍｇ／ｍＬ）を中性ｐＨ緩衝液により希釈し、時間を変えて収集されたアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはウェスタンブロットのどちらかで分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、マイクロプラスミンを、ＢＳＳ＋（Ａｌｃｏｎ；ｍＬ当たり、７．１４ｍｇのＮａＣｌ、０．３８ｍｇのＫＣｌ、０．１５４ｍｇのＣａＣｌ２、０．２ｍｇのＭｇＣｌ２、０．４２ｍｇのナトリウムリン酸、２．１ｍｇのＮａＨＣＯ３、０．９２ｍｇのグルコース、および０．１８４ｍｇのグルタチオンジスルフィドを含む；ｐＨ７．４）で１．２５ｍｇ／ｍＬの最終濃度に希釈して、室温で維持しデータを得た（図４Ａ）。ウエスタンブロット解析では、マイクロプラスミン（最終濃度１．５３μＭ）をＰＢＳで希釈し、３７℃でインキュベートし、マウスの抗マイクロプラスミン抗体でウェスタンブロットを反応させた（図４Ｂ）。図４Ａおよび４Ｂは、無傷のマイクロプラスミンの経時分解および自己触媒による分解生成物の蓄積を示す。別の試料を、大量に産生したマイクロプラスミンを１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２で２倍希釈して調製し３７℃で３０分インキュベートした。次いで、４〜１２％のポリアクリルアミドゲル上で２５マイクログラムのタンパク質を分離した。クーマシー染色に引き続き、２つの分解フラグメントに対応するバンドを切り取り、ペプチドをゲルから単離し、Ｎ末端配列に供した（Ｅｕｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂ．Ｖ．，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓにより実施）。１５ｋＤａのバンドからは、無傷の触媒ドメイン（に対して期待された配列Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）が得られた。より低分子の、１０ｋＤａのフラグメントからは、Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕの配列が得られ、Ａｒｇ１５８とＶａｌ１５９の間の主要な切断部位が同定された。また、１０ｋＤａフラグメントからは、量が少なく（＜１０％）、分解能の低い配列（Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ）が得られ、小さな切断部位が、リジン１４７のＣ末端側に位置することが示唆される。すべての番号付けは、プラスミンの軽鎖の位置１のＶａｌから開始する（図１を参照）。したがって、マイクロプラスミンを２ｍｇ／ｍＬで自己分解させた場合、Ａｒｇ１５８とＶａｌ１５９との間の新たな自己触媒的な切断部位が同定された。
【０１０４】
図５に示すように、ウェスタンブロット（円）によって評価されたマイクロプラスミンの自己分解のカイネティクスは、発色基質分析によって評価されたようにマイクロプラスミン活性の減少（四角）と同様であった（実施例３を参照）。自己分解データは、図４Ｂにおける無傷のマイクロプラスミンに対応するバンドの定量化、および活性データ（二次反応方程式を使用して最も一致した；データを示さず）から得た。上述の実験から、マイクロプラスミンの自己分解は、活性を減少させる原因であり、自己触媒により切断しやすい主要な部位は、Ａｒｇ１５８とＶａｌ１５９、Ｌｙｓ１４７とＶａｌ１４８、Ｌｙｓ１３７とＧｌｕ１３８の間にあることが結論づけられた。
【０１０５】
興味深いことに、眼の硝子体液におけるマイクロプラスミンの不活性化のカイネティクスは、ＰＢＳにおいて観察されたカイネティクスと非常に類似しており（図６Ａ）、ウエスタンブロット解析では、眼の硝子体液におけるマイクロプラスミンの不活性化も自己分解によって生じることが示された（図６Ｂ）。ＰＢＳ（図６Ａで四角）で、またはブタの眼の硝子体液（図６Ａで円）で、マイクロプラスミンを１．５３μＭの最終濃度に希釈し、活性のあるマイクロプラスミンの残渣の濃度を、発色基質Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ｐＮＡを使用して、様々な時点で測定した。ブタの眼の硝子体液の試料を、図に示した時間で収集し、ウェスタンブロット（図６Ｂ）によって上述のように解析した。矢印は１５ｋＤａのフラグメントを示す。
【０１０６】
実施例２  プラスミノーゲン変異体の作成、発現、および精製、ならびにプラスミンへの活性化。
発現ベクター
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入したｐＰＩＣＺαＡ分泌ベクターを、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における組み換えヒトマイクロプラスミノーゲンの発現および分泌のために使用した。
【０１０７】
このベクターは、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子プレプロペプチドの分泌シグナルを含む。ＸｈｏＩ認識配列は、Ｌｙｓ−Ａｒｇ部位のすぐ上流の、α−因子分泌シグナルのカルボキシ末端に存在し、Ｌｙｓ−Ａｒｇ部位は、成熟タンパク質から分泌シグナルを除去するためにＫｅｘ２により切断される。このＸｈｏＩ制限酵素部位を、５’末端でＸｈｏＩおよびＫｅｘ２認識部位を有する遺伝子を合成して、目的の遺伝子をＫｅｘ２切断部位に隣接させてクローニングするために使用してもよい。次いで、目的の組み換えの遺伝子は、天然のＮＨ２終端を有して発現する。異種遺伝子のクローンニングを容易にするために、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳｆｉＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩＩおよびＸｂａＩのための認識部位を有するマルチプルクローニングサイトが、ｐＰＩＣＺαＡベクターのα−因子分泌シグナルからすぐ下流に作られている。
【０１０８】
遺伝子合成
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるヒトマイクロプラスミノーゲンの発現を改善するために、ヒトマイクロプラスミノーゲンおよびその変異体をコードする遺伝子を、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）にとって好ましいコドン利用を考慮に入れて、新しく合成した。
【０１０９】
コドン最適化遺伝子配列を設計するため、ヒトマイクロプラスミノーゲンアミノ酸配列（配列番号２）を、プログラムＧｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒにインポートした。Ｇｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒは、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により開発され、インターネットで自由に利用できる。この配列を、プログラムで提供されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）コドン利用表を使用して、ＤＮＡ塩基配列へ逆翻訳した。次いで、核酸配列を手動でチェックし、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のコドン利用により適するように調整した。さらに、可能な場合、６塩基対パリンドローム配列および核酸反復を除去した。５’末端に、ＸｈｏＩ制限酵素部位およびＫｅｘ２切断部位を、３’末端にＸｂａＩ制限酵素部位を付加した。
【０１１０】
この野生型のマイクロプラスミノーゲン配列に、実施例１に記載のように、同定されたアミノ酸残基を変化させるため、突然変異を導入した。隣接した核酸を、ユニークな制限酵素部位を導入するために変化させたが、この場合、コードされたアミノ酸配列を保存するために注意を要した。
【０１１１】
第１の変異体において、位置１３７のリジンはグルタミンに置換される。Ｌｙｓ１３７は、位置４７８〜４８０のコドンＡＡＡによりコードされている。核酸ＴＴＧＡＡＡ（位置４７５〜４８０）をＣＴＧＣＡＧに変化させ、ＰｓｔＩ部位を導入し、マイクロプラスミノーゲンタンパク質のＬｙｓ１３７をＧｌｎに変化させたが、位置１３６のロイシンは変化させなかった。（核酸配列は、配列番号４にあり、推定されるアミノ酸配列は配列番号５にある）。
【０１１２】
第２の変異体において、位置１４７のリジンはヒスチジンに置換される。Ｌｙｓ１４７は位置５０８〜５１０のコドンＡＡＧにコードされている。核酸ＡＡＧＧＴＴ（位置５０８〜５１３）をＣＡＣＧＴＧに変化させ、ＰｍｌＩ部位を導入し、マイクロプラスミノーゲンタンパク質のＬｙｓ１４７をＨｉｓに変化させたが、位置１４８のバリンは変化させなかった。（核酸配列は配列番号６にあり、推定されるアミノ酸配列は配列番号７にある。）
【０１１３】
第３の変異体において、位置１５８のアルギニンはヒスチジンに置換される。Ａｒｇ１５８は位置５４０〜５４２のコドンＣＧＴにコードされている。核酸ＴＣＧＴＧＴＴ（位置５３９〜５４５）をＡＣＡＣＧＴＧに変化させ、ＰｍｌＩ部位を導入し、マイクロプラスミノーゲンタンパク質のＡｒｇ１５８をＨｉｓに変化させたが、位置１５７のグリシンおよび位置１５９のバリンは変化させなかった。（核酸配列は配列番号８に示し、推定されるアミノ酸配列は配列番号９に示す。）
【０１１４】
第４の変異体において、上記の変化を全て組み合わせ、位置１３７のリジンをグルタミンに、位置１４７のリジンをヒスチジンに、位置１５８のアルギニンをヒスチジンに置換する。（核酸配列は配列番号１０に示し、推定されたアミノ酸配列を配列番号１１に示す。）
【０１１５】
マイクロプラスミノーゲン変異体の配列を新たに合成し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）のベクターｐＵＣ５７へクローニングした。他の場合には、マイクロプラスミノーゲンの配列を合成し、同じクローニング方法を使用してＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｋｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のベクターｐＰＩＣＺαＡへクローニングした。
【０１１６】
さらに別の場合には、マイクロプラスミノーゲン変異体を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用して上述のように作成した発現ベクターでの部位特異的突然変異誘発後に得た。下記のプライマーを使用した：
Ｌｙｓ１３７Ｇｌｎ突然変異：
ＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＡＡＴＴＡＣＣＴＧＴＧ（センス；配列番号１２）および
ＣＡＣＡＧＧＴＡＡＴＴＧＴＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＡＡＣＧ（アンチセンス；配列番号１３）
Ｌｙｓ１３７Ａｒｇ突然変異：
ＧＧＴＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＴＣＴＧＴＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＡＣＡＡＴＴＡＣＣＴＧＴＧＡＴＴＧ（センス；配列番号１４）および
ＣＡＡＴＣＡＣＡＧＧＴＡＡＴＴＧＴＧＣＴＴＣＡＣＧＣＡＡＣＡＧＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＡＡＣＧＴＡＣＣ（アンチセンス；配列番号１５）
Ｌｙｓ１４７Ａｌａ突然変異：
ＣＡＡＴＴＡＣＣＴＧＴＧＡＴＴＧＡＧＡＡＣＧＣＣＧＴＧＴＧＴＡＡＣＡＧＡＴＡＣＧＡＧＴＴＣ（センス；配列番号１６）および
ＧＡＡＣＴＣＧＴＡＴＣＴＧＴＴＡＣＡＣＡＣＧＧＣＧＴＴＣＴＣＡＡＴＣＡＣＡＧＧＴＡＡＴＴＧ（アンチセンス；配列番号１７）
Ｌｙｓ１４７Ｇｌｕ突然変異：
ＣＡＡＴＴＡＣＣＴＧＴＧＡＴＴＧＡＧＡＡＣＧＡＡＧＴＧＴＧＴＡＡＣＡＧＡＴＡＣＧＡＧＴＴＣ（センス；配列番号１８）および
ＧＡＡＣＴＣＧＴＡＴＣＴＧＴＴＡＣＡＣＡＣＴＴＣＧＴＴＣＴＣＡＡＴＣＡＣＡＧＧＴＡＡＴＴＧ（アンチセンス；配列番号１９）
Ｌｙｓ１４７Ｇｌｎ突然変異：
ＣＡＡＴＴＡＣＣＴＧＴＧＡＴＴＧＡＧＡＡＣＣＡＡＧＴＧＴＧＴＡＡＣＡＧＡＴＡＣＧＡＧＴＴＣ（センス；配列番号２０）および
ＧＡＡＣＴＣＧＴＡＴＣＴＧＴＴＡＣＡＣＡＣＴＴＧＧＴＴＣＴＣＡＡＴＣＡＣＡＧＧＴＡＡＴＴＧ（アンチセンス；配列番号２１）
Ａｒｇ１５８Ａｌａ突然変異：
ＣＡＧＡＴＡＣＧＡＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＡＧＴＣＣＡＣＴＧＡＧＴＴＧＴＧＴＧＣＡＧＧ（センス；配列番号２２）および
ＣＣＴＧＣＡＣＡＣＡＡＣＴＣＡＧＴＧＧＡＣＴＧＣＡＣＧＧＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＡＡＣＴＣＧＴＡＴＣＴＧ（アンチセンス；配列番号２３）
Ａｒｇ１５８Ｇｌｎ突然変異：
ＧＡＴＡＣＧＡＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＧＧＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＣＣＡＣＴＧＡＧＴＴＧＴＧＴＧ（センス；配列番号２４）および
ＣＡＣＡＣＡＡＣＴＣＡＧＴＧＧＡＣＴＧＡＡＣＣＴＧＡＣＣＡＴＴＣＡＧＧＡＡＣＴＣＧＴＡＴＣ（アンチセンス；配列番号２５）
単一、二重および三重突然変異体の全リストは、表３に記載する（後を参照）。
【０１１７】
マイクロプラスミノーゲン変異体のための発現ベクターの作成
野生型および変異のマイクロプラスミノーゲン配列を、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩでベクターｐＵＣ５７を分解して得、ベクターｐＰＩＣＺαＡへ直接クローニングした。宿主ベクターフラグメントをＸｈｏＩおよびＸｂａＩ制限酵素で調製し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、アガロースゲルから精製した。大腸菌株ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をライゲーションミックスを使用し形質転換し、アンピシリン抵抗性のクローンを選択した。制限分析に基づいて、期待された大きさの挿入物を含むプラスミドクローンを、後の特性評価のために保持した。得られたプラスミドクローンの配列決定により、マイクロプラスミノーゲンのコード領域へ正確に挿入されα−因子接合信号に融合されたこと、およびコード領域に不要な突然変異がないことが確認された。
【０１１８】
マイクロプラスミノーゲン変異体の発現とプラスミンへの活性化
マイクロプラスミノーゲン変異体および活性マイクロプラスミン変異体を、国際公開第０２／５０２９０号パンフレットの実施例２に概説される手順に実質的に従って得る。   
【０１１９】
活性化に先立って、マイクロプラスミノーゲン突然変異体を免疫アフィニティによって直接ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）上清から精製した。マウスの抗ヒトマイクロプラスミン抗体（抗原としてマイクロプラスミンを使用して、Ｂａｌｂ／ｃマウスで産生；ハイブリドーマセルライン７Ｈ１１Ａ１１により産生、ＴｈｒｏｍｂｏＧｅｎｉｃｓ  Ｎ．Ｖ．で入手可能）をＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのプロトコル番号７１５０００１５ＡＤに記載のセファロースビーズに結合した。このプロトコルに従い、７．５ｍＬの免疫アフィニティ樹脂を４５ｍｇの抗体から調製し、ＸＫ１６／２０カラムに詰めた。未精製の上清２００〜４００ｍＬ（ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）培養物を０．２μでろ過／ｐＨ６．０）を直接７Ｈ１１Ａ１１アフィニティーカラムに添加した。洗浄ステップ（１００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．２、カラム容量の１０倍量）後、マイクロプラスミノーゲン変異体を０．２Ｍのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３．０の緩衝剤で溶出した。
溶出液（分画４〜６）を中和し、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２に透析した。Ｌｙｓ１５７Ｍｅｔ（Ｋ１５７Ｍ）突然変異体の精製物を、免疫アフィニティークロマトグラフィーで得られたクロマトグラムを（Ａ）により、図７に示し異なった溶出液分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後のクーマシー染色で分析した（Ｂ）。
【０１２０】
上述の野生型および変異マイクロプラスミノーゲン種のアミノ酸配列および核酸配列を以下に記載する。
配列番号２−野生型ヒトマイクロプラスミノーゲンアミノ酸配列
【化１】
0005819293.tif 000004
配列番号３−ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）での発現に最適化されたコドン利用を有する人工の核酸配列。核酸配列は、配列番号２の野生型ヒトマイクロプラスミノーゲンアミノ酸配列をコードする。
【化２−１】
0005819293.tif 000005
【化２−２】
0005819293.tif 000006
配列番号４−Ｌｙｓ１３７Ｇｌｎ置換を有するマイクロプラスミノーゲン変異体（突然変異させたコドンは太字イタリック体、ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位に下線）
【化３】
0005819293.tif 000007
配列番号５−配列番号４の推定アミノ酸配列（下線を引いたＮ末端アミノ酸「ＬＥＫＲ」は導入されたＸｈｏＩ＋Ｋｅｘ２切断部位によりコードされる；導入されたアミノ酸突然変異は太字／イタリック体で示し下線を引く。）
【化４】
0005819293.tif 000008
配列番号６−Ｌｙｓ１４７Ｈｉｓ置換を有するマイクロプラスミノーゲン変異体（突然変異させたコドンは太字イタリック体、ＸｈｏＩ、ＰｍｌＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位に下線）
【化５】
0005819293.tif 000009
配列番号７−配列番号６の推定アミノ酸配列（下線を引いたＮ末端アミノ酸「ＬＥＫＲ」は導入されたＸｈｏＩ＋Ｋｅｘ２切断部位によりコードされる；導入されたアミノ酸突然変異は太字／イタリック体で示し下線を引く。）
【化６】
0005819293.tif 000010
配列番号８−Ａｒｇ１５８Ｈｉｓ置換を有するマイクロプラスミノーゲン変異体（突然変異させたコドンは太字イタリック体、ＸｈｏＩ、ＰｍｌＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位に下線）
【化７】
0005819293.tif 000011
配列番号９−配列番号８の推定アミノ酸配列（下線を引いたＮ末端アミノ酸「ＬＥＫＲ」は導入されたＸｈｏＩ＋Ｋｅｘ２切断部位によりコードされる；導入されたアミノ酸突然変異は太字／イタリック体で示し下線を引く。）
【化８】
0005819293.tif 000012
配列番号１０−Ｌｙｓ１３７Ｇｌｎ、Ｌｙｓ１４７ＨｉｓおよびＡｒｇ１５８Ｈｉｓ置換を有するマイクロプラスミノーゲン変異体（突然変異させたコドンは太字イタリック体、ＸｈｏＩ、Ｐｓｔｌ、ＰｍｌＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位に下線）
【化９−１】
0005819293.tif 000013
【化９−２】
0005819293.tif 000014
配列番号１１−配列番号１０の推定アミノ酸配列（下線を引いたＮ末端アミノ酸「ＬＥＫＲ」は導入されたＸｈｏＩ＋Ｋｅｘ２切断部位によりコードされる；導入されたアミノ酸突然変異は太字／イタリック体で示し下線を引く。）
【化１０】
0005819293.tif 000015
【０１２１】
実施例３  野生型プラスミンと比較して減少したプラスミン変異体の自己タンパク質分解
最初に、精製されたマイクロプラスミノーゲン突然変異体を、組み換えスタフィロキナーゼ（ＳＡＫ−ＳＹ１６２）またはウロキナーゼ（Ｓｉｇｍａ）を使用して、活性のあるマイクロプラスミン種に変換した。簡単に述べると、マイクロプラスミノーゲン突然変異体（典型的には２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．２中５〜２０μＭ）を、スタフィロキナーゼ（典型的にはマイクロプラスミノーゲン／スタフィロキナーゼ比＝５０／１）またはウロキナーゼ（典型的にはマイクロプラスミノーゲン／ウロキナーゼ比＝２００）の存在下、３７℃でインキュベートし、他で記述したように、活性マイクロプラスミン種の出現を、発色基質Ｓ−２４０３（濃度０．３ｍＭで使用）に対する加水分解性の活性をモニターして追跡した。一旦最大活性に到達すると、マイクロプラスミノーゲン変換の程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣで評価した。活性化に続いて、自己分解反応を、３７℃で維持した試料の活性の減少量を測定することでモニターした。自己分解による分解をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣで可視化した。そのような実験の代表例を図８Ａ〜Ｃに示す。自己分解の二次の反応速度定数（ｋ）の測定を以下のように決定した：（１）ＨＰＬＣでのマイクロプラスミンピーク面積を、活性マイクロプラスミン種のモル濃度を算出するために（精製された、野生型マイクロプラスミンで確立された標準曲線との比較によって）活性化フェーズの終わりに／自己分解フェーズの最初に使用した；（２）自己分解フェーズ中に測定された活性の減少を、各時点の活性マイクロプラスミンの残渣のモル濃度を算出するため使用した；（３）残渣のマイクロプラスミン濃度（ｍｏｌ／ｌの単位で）を時間の関数（秒の単位で）としてプロットし、データを非線形回帰分析により等式１にあてはめ、自己分解定数ｋ（Ｍ−１ｓ−１の単位で）を得た。
等式１：
【数１】
0005819293.tif 000016
等式１では、［μＰＬ］は任意の所与の時間のマイクロプラスミン濃度であり、［μＰＬ］０はｔ＝０のときの濃度である。そのような曲線の一例を図８Ｄに示し、様々なマイクロプラスミン突然変異体に対して測定されたｋ値を表３に記載する（後を参照）。
【０１２２】
ＳＡＫ−ＳＹ１６２は、スタフィロキナーゼＳａｋ−ＳＴＡＲ（Ｃｏｌｌｅｎら、１９９２；Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ６、２０３−２１３）の変異体であり、次のアミノ酸置換を有する：Ｋ３５Ａ、Ｅ６５Ｑ、Ｋ７４Ｒ、Ｅ８０Ａ、Ｄ８２Ａ、Ｔ９０Ａ、Ｅ９９Ｄ、Ｔ１０１Ｓ、Ｅ１０８Ａ、Ｋ１０９Ａ、Ｋ１３０ＴおよびＫ１３５Ｒ。
【０１２３】
実施例４  野生型プラスミンと比較したプラスミン変異体のタンパク質分解活性。
マイクロプラスミンの加水分解活性は発色基質Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ（Ｓ−２４０３、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ）を使用して、追跡できる。基質の加水分解において、ｐＮＡ（ｐ−ニトロアニリン）群が放出され、４０５ｎｍで吸光度が増加する。野生型マイクロプラスミンおよびマイクロプラスミン変異体の活性を、Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ  Ｘ（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ）プレート読み取り装置を用いて測定した。５０ｍＭトリス、３８ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．４中、３７℃で分析を行った。
【０１２４】
マイクロプラスミン変異体に対して、最初に、調製物をスタフィロキナーゼまたはウロキナーゼで活性化し、活性マイクロプラスミン種の濃度を活性化フェーズの終わりに、別記したように決定した。しかしながら、後の不活性化を防ぐために、活性化された試料を、２倍量の５ｍＭのクエン酸を付加してｐＨを約３まで低下させることにより、安定化させた。
【０１２５】
発色基質Ｓ−２４０３に対するマイクロプラスミン変異体のカイネティクスパラメーター（ｋｃａｔとＫｍ）を、様々な基質濃度で加水分解の初速度を測定すること、および等式２でのデータの解析によって得た。等式２では［μＰＬ］がＨＰＬＣによって測定された活性マイクロプラスミンの濃度であり、［Ｓ］はＳ−２４０３の濃度である。加水分解の初速度の測定値から得たｋｃａｔおよびＫｍ測定の一例を図９に示す。
等式２：
【数２】
0005819293.tif 000017
様々なマイクロプラスミン突然変異体に対して得られたｋｃａｔおよびＫｍ値を表３に記載する。
【０１２６】
【表３】
0005819293.tif 000018
【０１２７】
実施例５  インビトロまたはインビボモデルにおけるプラスミン変異体の治療効果。
５．１脳梗塞サイズに対するプラスミン変異体の影響。
国際公開第００／１８４３６号パンフレットの実施例２の記載のように、またはＷｅｌｓｈら（１９８７、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ４９、８４６−８５１）によれば、脳梗塞サイズを減少させる本発明のプラスミン変異体の効果を、マウスの脳梗塞モデルにおいて見ることができる。野生型プラスミンの脳梗塞サイズへの有益な効果が、国際公開第００／１８４３６号パンフレットの実施例５で実証されている。類似の実験を本発明のいずれかのプラスミン変異体で行い、これらのプラスミン変異体の有益な効果を測定し、野生型プラスミンの有益な効果と比較する。
【０１２８】
５．２  プラスミン変異体のインビボの血栓溶解活性
ウサギの体外ループ血栓溶解モデル（国際公開第０２／５０２９０号パンフレットの実施例６；Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓら、１９８７、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ５８、１０７  要約書３７７）、イヌの冠動脈回旋枝の銅コイル誘導血栓症モデル（国際公開第０２／５０２９０号パンフレットの実施例８；Ｂｅｒｇｍａｎｎら、１９８３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０、１１８１−１１８３）、またはウサギの頚静脈血栓症モデル（Ｃｏｌｌｅｎら、１９８３、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ７１、３６８−３７６）を本発明のプラスミン変異体のインビボの血栓溶解活性を実証するために使用できる。国際公開第００／１８４３６号パンフレットの実施例７および９、およびＣｏｌｌｅｎら（１９８３）による記載にあるように、血栓溶解への野生型プラスミンの有益な効果をこれらのモデルで実証した。類似の実験を本発明のプラスミン変異体のいずれかで行い、これらのプラスミン変異体の有益な効果を測定し、野生型プラスミンの有益な効果と比較する。
【０１２９】
５．３プラスミン変異体のインビトロの血栓溶解活性
末梢動脈閉鎖（ＰＡＯ）のインビトロモデルは国際公開第０１／３６６０９号パンフレットの実施例６に記載されており、野生型プラスミンの血栓溶解の効果をこのモデルにおいて実証した。類似の実験を本発明のプラスミン変異体のいずれかで行い、これらのプラスミン変異体の末梢動脈閉鎖の血栓溶解への有益な効果を測定し、野生型プラスミンの有益な効果と比較する。
【０１３０】
５．４  プラスミン変異体によって誘導された眼の硝子体の液化および後部硝子体剥離
国際公開第２００４／０５２２２８号パンフレットの実施例５は、死後のブタの眼における硝子体の液化におけるマイクロプラスミンの効果と、効果を測定するための分析を開示している。国際公開第２００４／０５２２２８号パンフレットの実施例６は、死後のヒトの眼における後部硝子体剥離（ＰＶＤ）の誘導におけるマイクロプラスミンの効果の他に、効果を測定するための分析を開示する。本発明のプラスミン変異体による硝子体液化およびＰＶＤの誘導を、類似の死後モデルにおいて実証する。
【０１３１】
５．５  プラスミン変異体によって誘導されたインビボのＰＶＤ
国際公開第２００４／０５２２２８号パンフレットの実施例７は、インビボのネコのモデルにおけるＰＶＤの誘導に対するマイクロプラスミンの効果の他に、その効果を測定するための分析を開示している。本発明のプラスミン変異体によるＰＶＤの誘導を、インビボのモデルにおいて実証する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１０−７】
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【図１０−８】
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【図１０−９】
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【図１０−１０】
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【図１０−１１】
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【図１０−１２】
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【配列表】
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