(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つの胞子形成遺伝子における機能的破壊、
（ｂ）少なくとも１つのフェロモン応答遺伝子における機能的破壊、および
（ｃ）目的のタンパク質をコードする、染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列
を含む遺伝子改変二倍体酵母細胞であって、該遺伝子改変二倍体酵母細胞は、胞子形成が損なわれ、および、内因性接合が損なわれている、遺伝子改変二倍体酵母細胞。
【請求項２】
ヘテロタリック（ｈｏ）である、請求項１に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項３】
接合型対立遺伝子について以外はホモ接合型である、請求項２に記載の遺伝子改変二倍体酵母細胞。
【請求項４】
（ａ）少なくとも１つの胞子形成遺伝子における機能的破壊、
（ｂ）少なくとも１つのフェロモン応答遺伝子における機能的破壊、および
（ｃ）目的のタンパク質をコードする、染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列
を含む遺伝子改変ヘテロタリック（ｈｏ）一倍体酵母細胞であって、該遺伝子改変ヘテロタリック（ｈｏ）一倍体酵母細胞は、胞子形成が損なわれ、および、内因性接合が損なわれている、遺伝子改変ヘテロタリック（ｈｏ）一倍体酵母細胞。
【請求項５】
機能性ホモタリズム（ＨＯ）タンパク質をコードする組換えプラスミドをさらに含む、請求項４に記載の遺伝子改変一倍体酵母細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の遺伝子改変一倍体酵母細胞であって、該遺伝子改変一倍体酵母細胞において機能的に破壊されている前記少なくとも１つのフェロモン応答遺伝子の機能性コピーをコードする少なくとも１つの組換えプラスミドをさらに含む、遺伝子改変一倍体酵母細胞。
【請求項７】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項８】
前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞はパン酵母株、Ｍａｕｒｉ株、Ｓａｎｔａ  Ｆｅ株、ＩＺ−１９０４株、ＴＡ株、ＢＧ−１株、ＣＲ−１株、ＳＡ−１株、Ｍ−２６株、Ｙ−９０４株、ＰＥ−２株、ＰＥ−５株、ＶＲ−１株、ＢＲ−１株、ＢＲ−２株、ＭＥ−２株、ＶＲ−２株、ＭＡ−３株、ＭＡ−４株、ＣＡＴ−１株、ＣＢ−１株、ＮＲ−１株、ＢＴ−１株、またはＡＬ−１株である、請求項７に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項９】
前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞はＰＥ−２株である、請求項７に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項１０】
前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞はＣＡＴ−１株である、請求項７に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの胞子形成遺伝子は、ＩＭＥ１、ＩＭＥ２、ＮＤＴ８０、ＳＰＯ１１、ＳＰＯ２０、ＡＭＡ１、ＨＯＰ２、およびＳＰＯ２１からなる群より選択される、請求項１または４に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのフェロモン応答遺伝子は、ＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７、およびＳＴＥ１１からなる群より選択される、請求項１または４に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項１３】
ＩＭＥ１遺伝子の機能的破壊を含む、請求項１１に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項１４】
ＳＴＥ５遺伝子の機能的破壊を含む、請求項１２に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項１５】
ＩＭＥ１遺伝子およびＳＴＥ５遺伝子の機能的破壊を含む、請求項１または４に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項１６】
ＳＴＥ５遺伝子の機能的破壊、および機能性ＳＴＥ５タンパク質をコードする組換えプラスミドを含む、請求項６に記載の遺伝子改変一倍体酵母細胞。
【請求項１７】
胞子形成および内因性接合が損なわれている遺伝子改変二倍体酵母細胞を作製する方法であって、以下の工程
（ａ）第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞および第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞のそれぞれを、該第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞および該第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞の内因性接合欠陥を相補することができるタンパク質をコードする少なくとも１つのプラスミドで形質転換する工程であって、該第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、胞子形成および内因性接合が損なわれており、および、目的のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列を含み、該第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、胞子形成および内因性接合が損なわれており、該第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞と反対の接合型であり、および、該目的のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列を含む、工程、
（ｂ）該第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞を該第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞と接合させ、それにより、遺伝子改変二倍体酵母細胞を形成する工程、ならびに
（ｃ）１つまたは複数の該プラスミドを該遺伝子改変二倍体酵母細胞から除去する工程であって、その結果生じた該遺伝子改変二倍体酵母細胞は、胞子形成および内因性接合が損なわれており、および、該目的のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列を２コピー含む、工程
を含み、該第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞および該第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、少なくとも１つのフェロモン応答遺伝子の機能的破壊によって内因性接合が損なわれている、方法。
【請求項１８】
工程（ａ）が、前記第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞および前記第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞のそれぞれを、該第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞および該第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞において機能的に破壊されている前記少なくとも１つのフェロモン応答遺伝子の機能性コピーをコードする少なくとも１つのプラスミドで形質転換する工程を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記フェロモン応答遺伝子は、ＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７、およびＳＴＥ１１からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記フェロモン応答遺伝子は、ＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７、およびＳＴＥ１１からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記フェロモン応答遺伝子はＳＴＥ５である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記フェロモン応答遺伝子はＳＴＥ５である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞および前記第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、少なくとも１つの胞子形成遺伝子の機能的破壊によって胞子形成が損なわれている、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記胞子形成遺伝子は、ＩＭＥ１、ＩＭＥ２、ＮＤＴ８０、ＳＰＯ１１、ＳＰＯ２０、ＡＭＡ１、ＨＯＰ２、およびＳＰＯ２１からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記胞子形成遺伝子はＩＭＥ１である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞および前記第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、ＳＴＥ５遺伝子の機能的破壊によって内因性接合が損なわれており、および、ＩＭＥ１遺伝子の機能的破壊によって胞子形成が損なわれている、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
前記第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、前記第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞の集団において接合型切り換えを誘導することによって得られる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞の集団はヘテロタリック（ｈｏ）であり、かつ、該第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞を機能性ホモタリズム（ＨＯ）タンパク質をコードする組換えプラスミドで形質転換することによって接合型を切り換えるように誘導され、該ＨＯタンパク質の発現は該第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞の接合型切り換えを誘導することができる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記遺伝子改変二倍体酵母細胞はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞はパン酵母株、ＩＺ−１９０４株、ＴＡ株、ＢＧ−１株、ＣＲ−１株、ＳＡ−１株、Ｍ−２６株、Ｙ−９０４株、ＰＥ−２株、ＰＥ−５株、ＶＲ−１株、ＢＲ−１株、ＢＲ−２株、ＭＥ−２株、ＶＲ−２株、ＭＡ−３株、ＭＡ−４株、ＣＡＴ−１株、ＣＢ−１株、ＮＲ−１株、ＢＴ−１株、またはＡＬ−１株である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞はＰＥ−２株である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞はＣＡＴ−１株である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１７〜３２のいずれか一項に記載の方法によって作製された、胞子形成および内因性接合が損なわれた二倍体酵母細胞。
【請求項３４】
胞子形成および内因性接合が損なわれた遺伝子改変ヘテロタリック（ｈｏ）二倍体酵母細胞を作製するための方法であって、以下の工程
（ａ）第１の遺伝子改変ヘテロタリック一倍体酵母細胞の集団を機能性ホモタリズム（ＨＯ）タンパク質をコードするプラスミドで形質転換して、第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞を生じる工程であって、該ＨＯタンパク質の発現は該第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞の接合型切り換えを誘導することができ、それにより、該第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞と反対の接合型の第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞が得られ、該第１の遺伝子改変ヘテロタリック一倍体酵母細胞は、目的のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列ならびにＳＴＥ５遺伝子およびＩＭＥ１遺伝子における機能的破壊を含む、工程、
（ｂ）該第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞および該第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞のそれぞれを、ＳＴＥ５タンパク質をコードするプラスミドで形質転換する工程であって、結果として、該形質転換工程は、該第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞と該第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞との接合を生じ、それにより遺伝子改変二倍体酵母細胞を形成する、工程、ならびに
（ｃ）該遺伝子改変二倍体酵母細胞から任意のプラスミドを除去して、遺伝子改変ヘテロタリック二倍体酵母細胞を生じる工程であって、生じた該遺伝子改変ヘテロタリック二倍体酵母細胞は胞子形成および内因性接合が損なわれており、および、該目的のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列を２コピー含む、工程
を含む、方法。
【請求項３５】
前記胞子形成および内因性接合が損なわれたヘテロタリック（ｈｏ）二倍体酵母細胞はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞はパン酵母株、Ｍａｕｒｉ株、Ｓａｎｔａ  Ｆｅ株、ＩＺ−１９０４株、ＴＡ株、ＢＧ−１株、ＣＲ−１株、ＳＡ−１株、Ｍ−２６株、Ｙ−９０４株、ＰＥ−２株、ＰＥ−５株、ＶＲ−１株、ＢＲ−１株、ＢＲ−２株、ＭＥ−２株、ＶＲ−２株、ＭＡ−３株、ＭＡ−４株、ＣＡＴ−１株、ＣＢ−１株、ＮＲ−１株、ＢＴ−１株、またはＡＬ−１株である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞はＰＥ−２株である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞はＣＡＴ−１株である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の方法によって作製された、胞子形成および内因性接合が損なわれたヘテロタリック（ｈｏ）二倍体酵母細胞。
【請求項４０】
ＭＡＴα／ａ  ｓｔｅ５／ｓｔｅ５  ｉｍｅ１／ｉｍｅ１酵母細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年６月１日に出願された米国仮出願番号６１／１８３，０３１の利益を主張し、上記米国仮出願は、その全容が参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
本明細書に提供される方法および組成物は、一般的に、酵母などの微生物の産業的使用に関する。天然における散在、特に、組換えＤＮＡ配列の天然における散在のリスクを著しく低下させるように改変されている遺伝子改変微生物が本明細書に提供される。そのような遺伝子改変微生物を作製する方法および使用する方法も提供される。
【背景技術】
【０００３】
組換えＤＮＡテクノロジーの進歩により、原核生物または真核生物の利用を通しての産業的に有用な物質の大量製造が可能になっている。真核生物の中で、酵母（特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する酵母）は、発酵産物の製造に広く用いられている。一般的に、酵母は、迅速に増殖することができ、細菌と比較してより高密度で培養することができ、産業的設定において無菌的環境を必要としない。さらに、酵母細胞は、細菌と比較して培地から容易に分離することができ、産物の抽出および精製のための工程を大いに単純化することができる。これらの特徴のため、酵母（特に、組換えＤＮＡ配列を内部に有する遺伝子改変酵母）は、有用な産物の製造のための宿主として用いられており、そのような酵母の利用は確立されている。しかしながら、産業における遺伝子改変酵母の使用は、そのような酵母および／またはそのような酵母に含まれる組換えＤＮＡ配列の分散が生態系に予想不可能な結果を生じる可能性があるという理由により、潜在的環境リスクを有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、産業的適用に適しているが、天然において散在し、繁殖するというリスクの低下をもたらし、特に、天然においてそれらの組換えＤＮＡ配列を散在するというリスクの低下をもたらす酵母の必要性が存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
胞子形成および／または内因性接合が損なわれている遺伝子改変微生物、例えば、遺伝子改変酵母株を作製する方法が本明細書に提供される。本明細書に提供される方法は、遺伝子改変の一倍体微生物細胞、例えば、酵母細胞において１つもしくは複数の胞子形成遺伝子および／または１つもしくは複数のフェロモン応答遺伝子を機能的に破壊する工程、ならびに前記遺伝子改変一倍体微生物細胞が、それらの胞子形成および／または接合能力の欠損により、効果的に性的に生殖不能であり、および、それらの生活環の二倍体状態に制約される安定な二倍体を形成するように誘導する工程を含む。本明細書に提供される方法に従って遺伝子改変された微生物、例えば、酵母株は、産業的適用、例えば、産業的発酵適用に用途を見出し、野生型微生物との接合を通して天然において散在し、繁殖するというリスクの著しい低下をもたらす利点を提供することができる。
【０００６】
一態様において、以下を含む遺伝子改変酵母細胞が本明細書に提供される：１つまたは複数の胞子形成遺伝子における機能的破壊であって、前記酵母細胞が、前記の１つまたは複数の胞子形成遺伝子の破壊の結果として胞子形成能力を欠く、機能的破壊；１つまたは複数のフェロモン応答遺伝子における機能的破壊であって、前記酵母細胞が、前記の１つまたは複数のフェロモン応答遺伝子の破壊の結果として内因性接合能力を欠く、機能的破壊。いくつかの実施形態において、遺伝子改変酵母細胞はヘテロタリック（ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃ（ｈｏ））である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変酵母細胞は、１つもしくは複数の胞子形成遺伝子の両方のコピーおよび／または１つもしくは複数のフェロモン応答遺伝子の両方のコピーが機能的に破壊されている二倍体細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変二倍体細胞は、その接合型対立遺伝子について以外はホモ接合型である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変酵母細胞は一倍体細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変一倍体細胞は、ホモタリズム（ｈｏｍｏｔｈａｌｌｉｓｍ（ＨＯ））タンパク質をコードする組換えプラスミドをさらに含む。いくつかの実施形態において、遺伝子改変一倍体細胞は、前記酵母細胞において機能的に破壊されている１つまたは複数のフェロモン応答遺伝子をコードする１つまたは複数の組換えプラスミドを含む。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供された方法の実施に有用な遺伝子改変酵母細胞はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞は、パン酵母、Ｍａｕｒｉ、Ｓａｎｔａ  Ｆｅ、ＣＢＳ  ７９５９、ＣＢＳ  ７９６０、ＣＢＳ  ７９６１、ＣＢＳ  ７９６２、ＣＢＳ  ７９６３、ＣＢＳ  ７９６４、ＩＺ−１９０４、ＴＡ、ＢＧ−１、ＣＲ−１、ＳＡ−１、Ｍ−２６、Ｙ−９０４、ＰＥ−２、ＰＥ−５、ＶＲ−１、ＢＲ−１、ＢＲ−２、ＭＥ−２、ＶＲ−２、ＭＡ−３、ＭＡ−４、ＣＡＴ−１、ＣＢ−１、ＮＲ−１、ＢＴ−１、またはＡＬ−１の株である。特定の実施形態において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞はＰＥ−２株である。他の特定の実施形態において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞はＣＡＴ−１株である。
【０００８】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変酵母細胞における破壊された１つまたは複数の胞子形成遺伝子は、ＩＭＥ１、ＩＭＥ２、ＮＤＴ８０、ＳＰＯ１１、ＳＰＯ２０、ＡＭＡ１、ＨＯＰ２、およびＳＰＯ２１からなる群より選択される。特定の実施形態において、ＩＭＥ１遺伝子が破壊されている。いくつかの実施形態において、遺伝子改変酵母細胞における破壊された１つまたは複数のフェロモン応答遺伝子は、ＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７、およびＳＴＥ１１からなる群より選択される。特定の実施形態において、ＳＴＥ５遺伝子が破壊されている。特定の実施形態において、遺伝子改変酵母細胞は、ＳＴＥ５およびＩＭＥ１遺伝子の両方の機能的破壊を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子改変酵母細胞の一倍体細胞は、ＳＴＥ５遺伝子の機能的破壊およびＳＴＥ５タンパク質をコードする組換えプラスミドを含む。
【０００９】
別の態様において、胞子形成および接合能力が損なわれている二倍体酵母株を作製する方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、該方法は以下の工程：（ａ）第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞を得る工程であって、第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞が胞子形成および内因性接合が損なわれており、および、目的のタンパク質をコードする、染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列を含む、工程；（ｂ）第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞を得る工程であって、第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞が、胞子形成および内因性接合が損なわれており、および、第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞と反対の接合型であり、および、目的の前記のタンパク質をコードする、染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列を含む、工程；（ｃ）第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞および第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞のそれぞれを、前記の第１および第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞の内因性接合欠陥を相補することができるタンパク質をコードする１つまたは複数のプラスミドで形質転換する工程；（ｄ）第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞を第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞と接合させ、それにより、遺伝子改変二倍体酵母細胞を形成する工程；ならびに（ｅ）遺伝子改変二倍体酵母細胞から前記の１つまたは複数のプラスミドを除去する工程であって、その結果生じた遺伝子改変二倍体酵母細胞が胞子形成および内因性接合が損なわれている、工程、を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞および第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞が、１つまたは複数のフェロモン応答遺伝子の機能的破壊によって内因性接合が損なわれている。いくつかのそのような実施形態において、工程（ｃ）は、第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞および第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞のそれぞれを、前記の第１および第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞において機能的に破壊されているフェロモン応答遺伝子の機能性コピーをコードする１つまたは複数のプラスミドで形質転換する工程を含む。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のフェロモン応答遺伝子は、ＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７、およびＳＴＥ１１からなる群より選択される。ある特定の実施形態において、第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞および第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、ＳＴＥ５遺伝子の機能的破壊によって内因性接合が損なわれている。
【００１１】
いくつかの実施形態において、第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞および第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、１つまたは複数の胞子形成遺伝子の機能的破壊によって胞子形成が損なわれている。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の胞子形成遺伝子は、ＩＭＥ１、ＩＭＥ２、ＮＤＴ８０、ＳＰＯ１１、ＳＰＯ２０、ＡＭＡ１、ＨＯＰ２、およびＳＰＯ２１からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞および第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、ＩＭＥ１遺伝子の機能的破壊によって胞子形成が損なわれている。特定の実施形態において、第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞および第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、ＳＴＥ５遺伝子の機能的破壊によって接合が損なわれており、および、ＩＭＥ１遺伝子の機能的破壊によって胞子形成が損なわれている。
【００１２】
いくつかの実施形態において、第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞の集団において接合型切り換えを誘導することによって得られる。いくつかのそのような実施形態において、第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞はヘテロタリック（ｈｏ）であり、前記集団は、遺伝子改変一倍体酵母細胞をホモタリズム（ＨＯ）タンパク質をコードする組換えプラスミドで形質転換することによって接合型を切り換えるように誘導され、ＨＯタンパク質の発現が、遺伝子改変一倍体酵母細胞の接合型切り換えを誘導する。
【００１３】
他の実施形態において、第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、組換えＤＮＡテクノロジーを用いて第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞において接合型の座を変化させることによって得られる。いくつかの実施形態において、第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞において接合型の座に隣接するヌクレオチド配列と相同である相同配列に隣接した、第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞の接合型以外の接合型をコードするヌクレオチド配列を組込み配列として含む組込み構築物で形質転換される。相同組換えによる組込み配列の組込みで、第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞の接合型の座は、挿入配列によってコードされる接合型の座と置換され、その結果として、第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞の産生を生じる。いくつかの実施形態において、組込み構築物は、α接合型（ＭＡＴ  α）をコードする組込み構築物を用いてａからαへ第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞の接合型を切り換えるために用いられる。いくつかの実施形態において、組込み構築物は、配列番号１５５を含む。他の実施形態において、組込み構築物は、ａ接合型（ＭＡＴ  Ａ）をコードする組込み構築物を用いてαからａへ第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞の接合型を切り換えるために用いられる。いくつかの実施形態において、組込み構築物は配列番号１５６を含む。
【００１４】
別の態様において、胞子形成および内因性接合が損なわれたヘテロタリック（ｈｏ）二倍体酵母細胞を作製する方法が本明細書に提供され、該方法は以下の工程：（ａ）第１の遺伝子改変ヘテロタリック一倍体酵母細胞を得る工程であって、第１の遺伝子改変ヘテロタリック一倍体酵母細胞が（ｉ）目的のタンパク質をコードする、染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列；および（ｉｉ）ＳＴＥ５遺伝子およびＩＭＥ１遺伝子における機能的破壊を含む、工程；（ｂ）第１の遺伝子改変ヘテロタリック一倍体酵母細胞の集団を、ホモタリズム（ＨＯ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換する工程であって、ＨＯタンパク質の発現が第１の遺伝子改変ヘテロタリック一倍体酵母細胞の接合型切り換えを誘導し、それにより第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞が得られ、第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞が第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞と反対の接合型であり、（ｉ）目的の前記のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列；および（ｉｉ）ＳＴＥ５遺伝子およびＩＭＥ１遺伝子における機能的破壊を含む、工程；（ｃ）第１の遺伝子改変ヘテロタリック一倍体酵母細胞および第２の遺伝子改変ヘテロタリック一倍体酵母細胞のそれぞれを、ＳＴＥ５遺伝子をコードするプラスミドで形質転換する工程；（ｄ）第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞を第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞と接合させ、それにより、遺伝子改変二倍体酵母細胞を形成する工程；ならびに（ｅ）遺伝子改変二倍体酵母細胞からいかなるプラスミドも除去する工程であって、その結果生じた遺伝子改変ヘテロタリック二倍体酵母細胞が胞子形成および内因性接合が損なわれている、工程、を含む。
【００１５】
本発明により作製された、胞子形成および内因性接合能力を欠く遺伝子改変ヘテロタリック（ｈｏ）酵母細胞もまた本明細書に提供される。
【００１６】
ＭＡＴα／ａ  ｓｔｅ５／ｓｔｅ５ｉｍｅ１／ｉｍｅ１酵母細胞もまた本明細書に提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、相Ｉ破壊構築物の構造、および相同組換えによるその破壊配列の組込み後の標的座の構造を提供する。
【図２】図２は、相ＩＩ破壊構築物の構造、および相同組換えによるその破壊配列の組込み後の標的座の構造を提供する。
【図３】図３は、相ＩＩＩ破壊構築物の構造、および相同組換えによるその破壊配列の組込み後の標的座の構造を提供する。
【図４】図４は、相Ｉマーカーリサイクリング構築物の構造、および相同組換えによるその構築物の組込み後の標的座の構造を提供する。
【図５】図５は、相ＩＩマーカーリサイクリング構築物の構造、および相同組換えによるその構築物の組込み後の標的座の構造を提供する。
【図６】図６は、相ＩＩＩマーカーリサイクリング構築物の構造、および相同組換えによるその構築物の組込み後の標的座の構造を提供する。
【図７】図７は、ＳＴＥ５破壊構築物の構造、および相同組換えによるその破壊配列の組込み後の標的座の構造を提供する。
【図８】図８は、ＩＭＥ１破壊構築物の構造、および相同組換えによるその破壊配列の組込み後の標的座の構造を提供する。
【図９】図９は、遺伝子改変の内因性接合の損なわれた一倍体Ｙ１９１５細胞と遺伝子改変の内因性接合能力のあるＹ１９１２細胞との接合能力の比較を提供する。
【図１０】図１０は、遺伝子改変の胞子形成および内因性接合の損なわれた二倍体Ｙ１９７９細胞と遺伝子非改変の胞子形成および内因性接合の能力のあるＹ１１９８細胞との胞子形成能力の比較を提供する。
【図１１】図１１は、遺伝子改変の胞子形成および内因性接合の損なわれた二倍体Ｙ１９７９細胞と遺伝子非改変の胞子形成および内因性接合の能力のあるＹ１１９８細胞との土壌中の生存の比較を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（専門用語）
本明細書に用いられる場合、用語「異種性」とは、通常には天然で見出されないものを指す。用語「異種性ヌクレオチド配列」は、天然で所定の細胞において通常には見出されないヌクレオチド配列を指す。それとして、異種性ヌクレオチド配列は、（ａ）その宿主細胞にとって外来であり得る（すなわち、その細胞にとって「外因性」であり得る）；（ｂ）宿主細胞において天然で見出されるが（すなわち、「内因性」）、細胞において不自然な量（すなわち、宿主細胞において天然で見出されるより多い量、または少ない量）で存在し得る；または（ｃ）宿主細胞において天然で見出されるが、その天然の座の外側に位置し得る。
【００１９】
本明細書に用いられる場合、標的遺伝子、例えば、フェロモン応答遺伝子または胞子形成遺伝子を「機能的に破壊する」こと、またはそれの「機能的破壊」とは、標的遺伝子が、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を宿主細胞において減少させるような様式で変化していることを意味する。いくつかの実施形態において、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性は、宿主細胞において除去されている。他の実施形態において、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性は宿主細胞において減少している。標的遺伝子の機能的破壊は、遺伝子発現が除去され、もしくは低下するように、または遺伝子産物の活性が除去され、もしくは低下するように、遺伝子の全部または一部を欠失させることによって達成されてもよい。標的遺伝子の機能的破壊はまた、遺伝子の制御エレメント、例えば、遺伝子のプロモーターを、発現が除去され、もしくは低下するように突然変異することによって、または遺伝子のコード配列を、遺伝子産物の活性が除去され、もしくは低下するように突然変異することによって、達成されてもよい。いくつかの実施形態において、標的遺伝子の機能的破壊は、結果として、標的遺伝子の完全なオープンリーディングフレームの除去を生じる。
【００２０】
本明細書に用いられる場合、「内因性接合」および「内因性接合能力」は、反対の接合型、すなわち、接合型ａおよびαの一倍体微生物細胞が、異種性遺伝子発現、例えば、フェロモン応答遺伝子またはそのような一倍体の間で接合を誘導する能力がある任意の遺伝子の異種性コピーの発現の非存在下において、二倍体細胞を形成する能力を指す。
【００２１】
本明細書に用いられる場合、「内因性接合が損なわれた」とは、野生型一倍体微生物細胞の集団に対して、そのような微生物細胞の一倍体の集団内での接合を阻害するのに十分な、微生物細胞の内因性接合能力の低下を指す。いくつかの実施形態において、阻害は、野生型一倍体微生物細胞の集団の接合率に対して一倍体微生物細胞の集団の接合率の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の低下を含む。
【００２２】
本明細書に用いられる場合、「胞子形成が損なわれた」とは、野生型二倍体微生物細胞の集団に対して、そのような微生物細胞の二倍体の集団内で胞子形成を阻害するのに十分な二倍体微生物細胞の胞子形成活性の低下を指す。いくつかの実施形態において、阻害は、野生型二倍体微生物細胞の集団の胞子形成率に対して二倍体微生物細胞の集団の胞子形成率の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の低下を含む。
【００２３】
本明細書に用いられる場合、遺伝子との関連における用語「相補すること」とは、機能的に破壊された遺伝子、例えば、機能的に破壊された胞子形成遺伝子またはフェロモン応答遺伝子の機能を置換する機能を有する遺伝子を指す。いくつかの実施形態において、相補遺伝子と破壊された遺伝子の間で機能の機構は同一である必要はない。いくつかの実施形態において、機能的に破壊されている標的遺伝子、例えば、胞子形成遺伝子またはフェロモン応答遺伝子は、破壊された遺伝子によってコードされるタンパク質と相同なタンパク質を産生するか、または例えば、別の機構によって胞子形成もしくは接合を可能にする表現型を提供するかのいずれかである異種性遺伝子によって相補することができる。
【００２４】
（遺伝子改変微生物およびそれを作製する方法）
胞子形成および／または内因性接合能力において機能的に損なわれている遺伝子改変微生物、例えば、遺伝子改変酵母細胞（例えば、遺伝子改変Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞）を含む組成物、ならびにそのような組成物を作製するための方法および材料が本明細書に提供される。本明細書に提供される方法は、微生物の有性生殖サイクルを中断させて、天然におけるその微生物の散在を最小限にし、遺伝子改変微生物と、天然において散在する能力が損なわれていない野生型微生物との間での遺伝物質の交換の可能性を最小限にする。
【００２５】
多くの真菌細胞、例えば、酵母細胞は、有性的および無性的の両方で生殖することができる。無性生殖は、１つの親細胞のみが関係し、迅速な集団増殖を可能にする。対照的に、有性生殖は、配偶子の形成および融合を伴い、細胞間の水平遺伝子伝達による遺伝的多様性のより迅速な発生を可能にする。有性生殖する真菌細胞は、それらの生活環を通じて２つの細胞状態を想定し、１つが二倍体細胞状態であり、もう１つが一倍体細胞状態である。二倍体真菌細胞は、一般的に非常に安定であり、一般的に、それらが、いくつかの特定の環境的刺激（例えば、栄養枯渇）のうちの１つまたは複数に遭遇しない限り、二倍体相のままであるだろう。１つまたは複数のそのような刺激に遭遇した場合、二倍体細胞は胞子形成して、（四分子と呼ばれる）４つの一倍体胞子を形成する。都合良い条件が戻った場合、これらの一倍体胞子は出芽して４つの一倍体細胞（２つの接合型ａ、および２つの接合型α）を生成し、それは、その後、反対の接合型の他の一倍体細胞と接合して、再び二倍体細胞を形成することができる。
【００２６】
二倍体真菌細胞の胞子形成する能力、および一倍体真菌細胞の接合する能力は、特定の遺伝子産物の機能に依存している。酵母細胞におけるこれらの中では、ＩＭＥ１、ＩＭＥ２、ＮＤＴ８０、ＳＰＯ１１、ＳＰＯ２０、ＡＭＡ１、ＨＯＰ２、およびＳＰＯ２１遺伝子の産物などの胞子形成遺伝子の産物、ならびにＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７、およびＳＴＥ１１の産物などのフェロモン応答遺伝子の産物である。
【００２７】
一態様において、胞子形成および／または内因性接合が損なわれており、および、目的のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列を含む遺伝子改変一倍体真菌細胞が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、少なくとも１つの胞子形成遺伝子および／または少なくとも１つのフェロモン応答遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、以下の胞子形成遺伝子の１つまたは複数が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である：ＩＭＥ１、ＩＭＥ２、ＮＤＴ８０、ＳＰＯ１１、ＳＰＯ２０、ＡＭＡ１、ＨＯＰ２、およびＳＰＯ２１。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＩＭＥ１遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＩＭＥ２遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＮＤＴ８０遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＰＯ１１遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＰＯ２０遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＡＭＡ１遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＨＯＰ２遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＰＯ２１遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＩＭＥ１、ＩＭＥ２、ＮＤＴ８０、ＳＰＯ１１、ＳＰＯ２０、ＡＭＡ１、ＨＯＰ２、およびＳＰＯ２１からなる群より選択される１つより多い胞子形成遺伝子が破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＩＭＥ１、ＩＭＥ２、ＮＤＴ８０、ＳＰＯ１１、ＳＰＯ２０、ＡＭＡ１、ＨＯＰ２、およびＳＰＯ２１からなる群より選択される２つより多い胞子形成遺伝子が破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＩＭＥ１、ＩＭＥ２、ＮＤＴ８０、ＳＰＯ１１、ＳＰＯ２０、ＡＭＡ１、ＨＯＰ２、およびＳＰＯ２１からなる群より選択される３つより多い胞子形成遺伝子が破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＩＭＥ１、ＩＭＥ２、ＮＤＴ８０、ＳＰＯ１１、ＳＰＯ２０、ＡＭＡ１、ＨＯＰ２、およびＳＰＯ２１からなる群より選択される４つより多い胞子形成遺伝子が破壊されている一倍体酵母細胞である。
【００２９】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、以下のフェロモン応答遺伝子の１つまたは複数が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である：ＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７、およびＳＴＥ１１。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＴＥ５遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＴＥ４遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＴＥ１８遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＴＥ１２遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＴＥ７遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＴＥ１１遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７、およびＳＴＥ１１からなる群より選択される１つより多いフェロモン応答遺伝子が破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７、およびＳＴＥ１１からなる群より選択される２つより多いフェロモン応答遺伝子が破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７、およびＳＴＥ１１からなる群より選択される３つより多いフェロモン応答遺伝子が破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７、およびＳＴＥ１１からなる群より選択される４つより多いフェロモン応答遺伝子が破壊されている一倍体酵母細胞である。
【００３０】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、少なくとも１つの胞子形成遺伝子および少なくとも１つのフェロモン応答遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。
【００３１】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＩＭＥ１遺伝子およびＳＴＥ５遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＩＭＥ２遺伝子およびＳＴＥ５遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＮＤＴ８０遺伝子およびＳＴＥ５遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＰＯ１１遺伝子およびＳＴＥ５遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＰＯ２０遺伝子およびＳＴＥ５遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＡＭＡ１遺伝子およびＳＴＥ５遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＨＯＰ２遺伝子およびＳＴＥ５遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＰＯ２１遺伝子およびＳＴＥ５遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。
【００３２】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＩＭＥ１遺伝子およびＳＴＥ４遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＩＭＥ２遺伝子およびＳＴＥ４遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＮＤＴ８０遺伝子およびＳＴＥ４遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＰＯ１１遺伝子およびＳＴＥ４遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＰＯ２０遺伝子およびＳＴＥ４遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＡＭＡ１遺伝子およびＳＴＥ４遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＨＯＰ２遺伝子およびＳＴＥ４遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＰＯ２１遺伝子およびＳＴＥ４遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。
【００３３】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＩＭＥ１遺伝子およびＳＴＥ１８遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＩＭＥ２遺伝子およびＳＴＥ１８遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＮＤＴ８０遺伝子およびＳＴＥ１８遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＰＯ１１遺伝子およびＳＴＥ１８遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＰＯ２０遺伝子およびＳＴＥ１８遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＡＭＡ１遺伝子およびＳＴＥ１８遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＨＯＰ２遺伝子およびＳＴＥ１８遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＰＯ２１遺伝子およびＳＴＥ１８遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。
【００３４】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＩＭＥ１遺伝子およびＳＴＥ１２遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＩＭＥ２遺伝子およびＳＴＥ１２遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＮＤＴ８０遺伝子およびＳＴＥ１２遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＰＯ１１遺伝子およびＳＴＥ１２遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＰＯ２０遺伝子およびＳＴＥ１２遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＡＭＡ１遺伝子およびＳＴＥ１２遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＨＯＰ２遺伝子およびＳＴＥ１２遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＰＯ２１遺伝子およびＳＴＥ１２遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。
【００３５】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＩＭＥ１遺伝子およびＳＴＥ７遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＩＭＥ２遺伝子およびＳＴＥ７遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＮＤＴ８０遺伝子およびＳＴＥ７遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＰＯ１１遺伝子およびＳＴＥ７遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＰＯ２０遺伝子およびＳＴＥ７遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＡＭＡ１遺伝子およびＳＴＥ７遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＨＯＰ２遺伝子およびＳＴＥ７遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＰＯ２１遺伝子およびＳＴＥ７遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。
【００３６】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＩＭＥ１遺伝子およびＳＴＥ１１遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＩＭＥ２遺伝子およびＳＴＥ１１遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＮＤＴ８０遺伝子およびＳＴＥ１１遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＰＯ１１遺伝子およびＳＴＥ１１遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＰＯ２０遺伝子およびＳＴＥ１１遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＡＭＡ１遺伝子およびＳＴＥ１１遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＨＯＰ２遺伝子およびＳＴＥ１１遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＰＯ２１遺伝子およびＳＴＥ１１遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。
【００３７】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、１つまたは複数のフェロモン応答遺伝子の機能的に破壊された染色体コピー、および前記の１つまたは複数のフェロモン応答遺伝子のコード配列の機能性染色体外コピーを含む１つまたは複数の組換えプラスミドを含む一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、機能的に破壊されたＳＴＥ５遺伝子、およびＳＴＥ５遺伝子のコード配列の機能性染色体外コピーを含む組換えプラスミドを含む一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、機能的に破壊されたＳＴＥ４遺伝子、およびＳＴＥ４遺伝子のコード配列の機能性染色体外コピーを含む組換えプラスミドを含む一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、機能的に破壊されたＳＴＥ１８遺伝子、およびＳＴＥ１８遺伝子のコード配列の機能性染色体外コピーを含む組換えプラスミドを含む一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、機能的に破壊されたＳＴＥ１２遺伝子、およびＳＴＥ１２遺伝子のコード配列の機能性染色体外コピーを含む組換えプラスミドを含む一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、機能的に破壊されたＳＴＥ７遺伝子、およびＳＴＥ７遺伝子のコード配列の機能性染色体外コピーを含む組換えプラスミドを含む一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、機能的に破壊されたＳＴＥ１１遺伝子、およびＳＴＥ１１遺伝子のコード配列の機能性染色体外コピーを含む組換えプラスミドを含む一倍体酵母細胞である。
【００３８】
別の態様において、胞子形成および／または内因性接合が損なわれており、および、目的のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列を２コピー含む遺伝子改変二倍体真菌細胞が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、少なくとも１つの胞子形成遺伝子の両方のコピーおよび／または少なくとも１つのフェロモン応答遺伝子の両方のコピーが機能的に破壊された二倍体酵母細胞である。
【００３９】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、以下の胞子形成遺伝子の１つまたは複数の両方のコピーが機能的に破壊されている二倍体酵母細胞である：ＩＭＥ１、ＩＭＥ２、ＮＤＴ８０、ＳＰＯ１１、ＳＰＯ２０、ＡＭＡ１、ＨＯＰ２、およびＳＰＯ２１。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＩＭＥ１遺伝子の両方のコピーが機能的に破壊されている二倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、以下のフェロモン応答遺伝子の１つまたは複数の両方のコピーが機能的に破壊されている二倍体酵母細胞である：ＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７、およびＳＴＥ１１。いくつかの実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、ＳＴＥ５遺伝子の両方のコピーが機能的に破壊されている二倍体酵母細胞である。さらに他の実施形態において、遺伝子改変真菌細胞は、少なくとも１つの胞子形成遺伝子の両方のコピーおよび少なくとも１つのフェロモン応答遺伝子の両方のコピーが機能的に破壊されている二倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、ＩＭＥ１遺伝子の両方のコピーおよびＳＴＥ５遺伝子の両方のコピーが機能的に破壊されている二倍体酵母細胞である。
【００４０】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変二倍体真菌細胞は、それの接合型対立遺伝子について以外はホモ接合である。例えば、遺伝子改変二倍体真菌細胞が胞子形成するべきである場合には、生じた４つの一倍体真菌細胞は、それらの接合型対立遺伝子を除いて遺伝的に同一であるだろう。そのような事象において、一倍体細胞のうちの２つは、接合型ａであり、残りの２つの一倍体細胞は接合型αであろう。いくつかの実施形態において、遺伝子改変二倍体真菌細胞は、抗生化合物に対する耐性を与える異種性遺伝子を含まない。
【００４１】
本明細書に提供される遺伝子改変二倍体真菌細胞は、それに含まれる異種性ヌクレオチド配列の望まれない繁殖に対するいくつかの保護手段を有する。第一に、二倍体真菌細胞は、一般的に、非常に安定であり、それらの二倍体状態において、他の真菌細胞と接合できない。第二に、本明細書に提供される二倍体真菌細胞は、胞子形成する能力が損なわれており、したがって、適切な環境的刺激の存在下でさえも、胞子を形成する能力をほとんどもたない。第三に、胞子が形成される可能性が低い事象において、生じた一倍体真菌細胞は、接合する能力が損なわれている。総合すれば、本明細書に提供される遺伝子改変真菌細胞の胞子形成および接合の欠損した性質は、異種性ヌクレオチド配列の野生型真菌細胞への移動の可能性を著しく低下させる。
【００４２】
別の態様において、本明細書に記載された遺伝子改変二倍体真菌細胞を作製する方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、該方法は以下の工程：（ａ）第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞を得る工程であって、第１の遺伝子改変一倍体真菌細胞が胞子形成および／または内因性接合が損なわれており、および、目的のタンパク質をコードする、染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列を含む、工程；（ｂ）第２の遺伝子改変一倍体真菌細胞を得る工程であって、第２の遺伝子改変一倍体真菌細胞が、胞子形成および内因性接合が損なわれており、および、第１の遺伝子改変一倍体真菌細胞と反対の接合型であり、および、目的の前記のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列を含む、工程；（ｃ）第１の遺伝子改変一倍体真菌細胞および第２の遺伝子改変一倍体真菌細胞のそれぞれを、前記の第１および第２の遺伝子改変一倍体真菌細胞の内因性接合欠陥を相補することができるタンパク質をコードする１つまたは複数のプラスミドで形質転換する工程；（ｄ）第１の遺伝子改変一倍体真菌細胞を第２の遺伝子改変一倍体真菌細胞と接合させ、それにより、遺伝子改変二倍体真菌細胞を形成する工程；ならびに（ｅ）遺伝子改変二倍体真菌細胞から１つまたは複数のプラスミドを除去する工程であって、その結果生じた遺伝子改変二倍体真菌細胞が胞子形成および内因性接合が損なわれており、および、目的の前記のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列を２コピー含む、工程、を含む。
【００４３】
いくつかの実施形態において、第１の遺伝子改変一倍体真菌細胞および第２の遺伝子改変一倍体真菌細胞が、１つまたは複数のフェロモン応答遺伝子の機能的破壊によって内因性接合が損なわれている。いくつかの実施形態において、本発明の方法の工程（ｃ）は、第１の遺伝子改変一倍体真菌細胞および第２の遺伝子改変一倍体真菌細胞のそれぞれを、前記の第１および第２の遺伝子改変一倍体真菌細胞において機能的に破壊されている１つまたは複数のフェロモン応答遺伝子の機能性コピーをコードする１つまたは複数のプラスミドで形質転換する工程を含む。いくつかの実施形態において、第１および第２の遺伝子改変一倍体真菌細胞は、一倍体酵母細胞であり、１つまたは複数のフェロモン応答遺伝子は、ＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７、およびＳＴＥ１１からなる群より選択される。ある特定の実施形態において、第１および第２の遺伝子改変一倍体真菌細胞は、ＳＴＥ５遺伝子の機能的破壊によって内因性接合が損なわれている一倍体酵母細胞である。
【００４４】
いくつかの実施形態において、第１の遺伝子改変一倍体真菌細胞および第２の遺伝子改変一倍体真菌細胞は、１つまたは複数の胞子形成遺伝子の機能的破壊によって胞子形成が損なわれている。いくつかの実施形態において、第１および第２の遺伝子改変一倍体真菌細胞は一倍体酵母細胞であり、１つまたは複数の胞子形成遺伝子は、ＩＭＥ１、ＩＭＥ２、ＮＤＴ８０、ＳＰＯ１１、ＳＰＯ２０、ＡＭＡ１、ＨＯＰ２、およびＳＰＯ２１からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、第１および第２の遺伝子改変一倍体真菌細胞は、ＩＭＥ１遺伝子の機能的破壊によって胞子形成が損なわれている一倍体酵母細胞である。特定の実施形態において、第１および第２の遺伝子改変一倍体真菌細胞は、ＳＴＥ５遺伝子の機能的破壊によって接合が損なわれており、および、ＩＭＥ１遺伝子の機能的破壊によって胞子形成が損なわれている一倍体酵母細胞である。
【００４５】
いくつかの実施形態において、第２の遺伝子改変一倍体真菌細胞は、第１の遺伝子改変一倍体真菌細胞の集団において接合型切り換えを誘導することによって得られる。いくつかの実施形態において、第１の遺伝子改変一倍体真菌細胞はヘテロタリック（ｈｏ）一倍体Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞であり、前記ヘテロタリック（ｈｏ）一倍体Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞集団は、前記ヘテロタリック（ｈｏ）一倍体Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を、ホモタリズム（ＨＯ）タンパク質をコードするプラスミドで形質転換することによって接合型を切り換えるように誘導され、ＨＯタンパク質の発現は、一倍体Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞において接合型切り換えを誘導し、第２の遺伝子改変一倍体Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を生じる。ヘテロタリック（ｈｏ）一倍体Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞は、自発的接合型切り換えが事実上、発生しない（たった１０−６の頻度）ことを特徴とする。ＨＯタンパク質を一過性に発現することによって、一倍体Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞における自発的接合型切り換えの頻度は、多くも細胞分裂ごとに１回にまで増加することができ、お互いに接合して二倍体Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を生じることができる反対の接合型の一倍体細胞集団を提供する。
【００４６】
別の態様において、胞子形成および内因性接合能力を欠く遺伝子改変ヘテロタリック（ｈｏ）二倍体酵母細胞を作製する方法が本明細書に提供され、該方法は以下の工程：（ａ）第１の遺伝子改変ヘテロタリック一倍体酵母細胞を得る工程であって、第１の遺伝子改変ヘテロタリック一倍体酵母細胞が（ｉ）目的のタンパク質をコードする、染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列；および（ｉｉ）１つまたは複数の胞子形成遺伝子および１つまたは複数のフェロモン応答遺伝子における機能的破壊を含む、工程；（ｂ）第１の遺伝子改変ヘテロタリック一倍体酵母細胞の集団を、ホモタリズム（ＨＯ）タンパク質をコードするプラスミドで形質転換して、第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞を生じる工程であって、ＨＯタンパク質の発現が第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞において接合型切り換えを誘導し、それにより第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞が得られ、第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞が第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞と反対の接合型であり、および、（ｉ）目的の前記のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列；および（ｉｉ）１つまたは複数の胞子形成遺伝子および１つまたは複数のフェロモン応答遺伝子における機能的破壊を含む、工程；（ｃ）第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞および第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞のそれぞれを、前記の第１および第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞において機能的に破壊されている１つまたは複数のフェロモン応答タンパク質をコードするプラスミドで形質転換する工程；（ｄ）第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞を第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞と接合させ、それにより、それの接合型対立遺伝子について以外はホモ接合である遺伝子改変二倍体酵母細胞を形成する工程；ならびに（ｅ）遺伝子改変二倍体酵母細胞からいかなるプラスミドも除去して、遺伝子改変ヘテロタリック二倍体酵母細胞を生じる工程であって、その結果生じた遺伝子改変ヘテロタリック二倍体酵母細胞が胞子形成および内因性接合が損なわれており、および、目的の前記のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列を２コピー含む、工程、を含む。
【００４７】
本明細書に提供され、下記でより詳細に記載される方法の工程は、経時的順序で提示されているが、当業者は、いくつかの工程の順序を、本発明の範囲を超えることなく、交換し、組み合わせ、または繰り返すことができることは認識しているであろう。したがって、いくつかの実施形態において、胞子形成および内因性接合能力を欠く遺伝子改変ヘテロタリック（ｈｏ）二倍体酵母細胞は、遺伝子改変ヘテロタリック一倍体酵母細胞を、前記の遺伝子改変ヘテロタリック一倍体酵母細胞において機能的に破壊されている１つまたは複数のフェロモン応答遺伝子をコードするプラスミドで形質転換し、その後、その細胞をホモタリズム（ＨＯ）タンパク質をコードするプラスミドで形質転換することによって作製される。他の実施形態において、胞子形成および内因性接合能力を欠く遺伝子改変ヘテロタリック（ｈｏ）二倍体酵母細胞は、遺伝子改変ヘテロタリック一倍体酵母細胞を、前記の遺伝子改変ヘテロタリック一倍体酵母細胞において機能的に破壊されている１つまたは複数のフェロモン応答タンパク質をコードするプラスミド、およびホモタリズム（ＨＯ）タンパク質をコードするプラスミドで同時に形質転換することによって作製される。
【００４８】
（微生物選択）
本明細書に提供された方法の実施において有用な微生物には、真核単細胞生物、具体的には真菌、より具体的には酵母が挙げられる。
【００４９】
いくつかの実施形態において、本発明に有用な酵母には、微生物受託機関（例えば、ＩＦＯ、ＡＴＣＣなど）に寄託されており、とりわけ、Ａｃｉｃｕｌｏｃｏｎｉｄｉｕｍ、Ａｍｂｒｏｓｉｏｚｙｍａ、Ａｒｔｈｒｏａｓｃｕｓ、Ａｒｘｉｏｚｙｍａ、Ａｓｈｂｙａ、Ｂａｂｊｅｖｉａ、Ｂｅｎｓｉｎｇｔｏｎｉａ、Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ、Ｂｏｔｒｙｏｚｙｍａ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｂｕｌｌｅｒａ、Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｄｅｋｋａｒａ、Ｄｉｐｏｄａｓｃｏｐｓｉｓ、Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ、Ｅｅｎｉｅｌｌａ、Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｅｌｌａ、Ｅｒｅｍａｓｃｕｓ、Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｈａｓｅｇａｗａｅａ、Ｈｏｌｔｅｒｍａｎｎｉａ、Ｈｏｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｈｙｐｈｏｐｉｃｈｉａ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａｓｐｏｒａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｏｎｄｏａ、Ｋｕｒａｉｓｈｉａ、Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ、Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ、Ｍｒａｋｉａ、Ｍｙｘｏｚｙｍａ、Ｎａｄｓｏｎｉａ、Ｎａｋａｚａｗａｅａ、Ｎｅｍａｔｏｓｐｏｒａ、Ｏｇａｔａｅａ、Ｏｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ、Ｐｈａｃｈｙｔｉｃｈｏｓｐｏｒａ、Ｐｈａｆｆｉａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｓａｉｔｏｅｌｌａ、Ｓａｋａｇｕｃｈｉａ、Ｓａｔｕｒｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｃｈｉｚｏｂｌａｓｔｏｓｐｏｒｉｏｎ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｒｏｐａｃｈｙｄｅｒｍｉａ、Ｓｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ、Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ、Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｅｓ、Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｅｌｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ、Ｔｓｕｃｈｉｙａｅａ、Ｕｄｅｎｉｏｍｙｃｅｓ、Ｗａｌｔｏｍｙｃｅｓ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ、Ｙａｍａｄａｚｙｍａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｚｙｇｏａｓｃｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｚｙｇｏｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ、およびＺｙｇｏｚｙｍａの属に属する酵母が挙げられる。
【００５０】
いくつかの実施形態において、微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｄｅｋｋｅｒａ  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ（以前、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓと呼ばれた）、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、またはＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（現在、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａとして知られている）である。いくつかの実施形態において、微生物は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、またはＣａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓなどのＣａｎｄｉｄａ属の株である。
【００５１】
特定の実施形態において、微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。いくつかの実施形態において、微生物は、パン酵母、ＣＢＳ  ７９５９、ＣＢＳ  ７９６０、ＣＢＳ  ７９６１、ＣＢＳ  ７９６２、ＣＢＳ  ７９６３、ＣＢＳ  ７９６４、ＩＺ−１９０４、ＴＡ、ＢＧ−１、ＣＲ−１、ＳＡ−１、Ｍ−２６、Ｙ−９０４、ＰＥ−２、ＰＥ−５、ＶＲ−１、ＢＲ−１、ＢＲ−２、ＭＥ−２、ＶＲ−２、ＭＡ−３、ＭＡ−４、ＣＡＴ−１、ＣＢ−１、ＮＲ−１、ＢＴ−１、およびＡＬ−１からなる群より選択されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株である。いくつかの実施形態において、微生物は、ＰＥ−２、ＣＡＴ−１、ＶＲ−１、ＢＧ−１、ＣＲ−１、およびＳＡ−１からなる群より選択されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株である。特定の実施形態において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株はＰＥ−２である。別の特定の実施形態において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株はＣＡＴ−１である。別の特定の実施形態において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株はＢＧ−１である。
【００５２】
いくつかの実施形態において、微生物は、産業的発酵、例えば、バイオエタノール発酵に適している微生物である。特定の実施形態において、微生物は、認識されている産業的発酵環境のストレス条件である、高溶媒濃度、高温、広範な基質利用、栄養制限、糖および塩による浸透圧ストレス、酸過剰、亜硫酸塩および細菌の汚染、またはそれらの組み合わせの下で存在するように条件付けされる。
【００５３】
（微生物の遺伝子改変）
組換えプラスミドまたは染色体組込みベクターを用いて微生物を遺伝的に改変する方法は、当技術分野においてよく知られている。例えば、Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．（１９７８）；Ｇｕｔｈｒｉｅ，Ｃ．ら（編）Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９４巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌら編、現行版、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを参照；それらの開示は参照により本明細書に組み入れられている。
【００５４】
いくつかの実施形態において、微生物は、新しい代謝経路、すなわち、微生物によって内因的に産生されない代謝産物を産生する代謝経路の酵素をコードする１つまたは複数の異種性ヌクレオチド配列を含むように遺伝子改変される。他の実施形態において、微生物は、微生物にとって内因性である代謝経路、すなわち、微生物によって内因的に産生される代謝産物を産生する代謝経路の酵素をコードする１つまたは複数の異種性ヌクレオチド配列を含むように遺伝子改変される。
【００５５】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、フェロモン応答遺伝子の１つまたはＨＯによってコードされるものなどの特定のタンパク質を微生物において一過性に発現させるために組換えプラスミドの使用を必要とする。酵母細胞に用いるのに適した組換えプラスミドの例証的な例として、ＣＥＮ／ＡＲＳおよび２μのプラスミドが挙げられる。
【００５６】
いくつかの実施形態において、本発明の微生物は、抗生物質耐性をコードする異種性ヌクレオチド配列を含まない。抗生物質耐性マーカーは、遺伝子改変細胞の構築に一般的に用いられる。抗生物質耐性マーカーが、微生物に導入された遺伝子改変をマークするために用いられる本発明のそのような実施形態において、これらのマーカーは、所望の遺伝子改変の全部が微生物になされた後で、続いて欠失させられる。または、栄養要求性相補（例えば、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ１、ＭＥＴ１５、ＴＲＰ１、ＡＤＥ２、ＵＲＡ３、およびＬＹＳ２））などの他の選択ツールを遺伝子改変微生物の構築に用いることができる。
【００５７】
（胞子形成および／またはフェロモン応答遺伝子の破壊）
本明細書に提供された方法は、遺伝子改変微生物細胞において１つもしくは複数の胞子形成遺伝子および／または１つもしくは複数のフェロモン応答遺伝子を機能的に破壊する工程を含む。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の胞子形成遺伝子の破壊は、胞子形成能力を欠く遺伝子改変微生物細胞を生じる。特に、遺伝子改変二倍体微生物細胞は胞子形成能力を欠く。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のフェロモン応答遺伝子の破壊は、内因性接合が損なわれている微生物細胞を生じる。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の胞子形成遺伝子の破壊および１つまたは複数のフェロモン応答遺伝子の破壊は、胞子形成および内因性接合が損なわれている微生物細胞を生じる。
【００５８】
いくつかの実施形態において、胞子形成遺伝子またはフェロモン応答遺伝子の破壊は、微生物細胞への構築物の導入で胞子形成標的遺伝子またはフェロモン応答標的遺伝子を特異的に破壊する能力がある「破壊構築物」を用いて、破壊される遺伝子を非機能性にすることによって達成される。いくつかの実施形態において、標的遺伝子の破壊は、機能性タンパク質の発現を阻止する。いくつかの実施形態において、標的遺伝子の破壊は、破壊される遺伝子からの非機能性タンパク質の発現を生じる。いくつかの実施形態において、胞子形成標的遺伝子またはフェロモン応答標的遺伝子の破壊は、相同組換えにより標的遺伝子座内の「破壊配列」の組込みによって達成される。そのような実施形態において、破壊構築物は、標的遺伝子座の１対のヌクレオチド配列に相同である１対のヌクレオチド配列（相同配列）に隣接した破壊配列を含む。破壊構築物による標的遺伝子の標的部分の置換で、破壊配列は、機能性タンパク質の発現を阻止し、または標的遺伝子からの非機能性タンパク質の発現を引き起こす。
【００５９】
１つまたは複数の胞子形成遺伝子またはフェロモン応答遺伝子を破壊する能力がある破壊構築物は、当技術分野において周知の標準の分子生物学技術を用いて構築することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹおよびＡｕｓｕｂｅｌら編、現行版、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを参照。本方法の実施において変わり得る破壊構築物のパラメータには、相同配列の長さ、相同配列のヌクレオチド配列、破壊配列の長さ、破壊配列のヌクレオチド配列、および標的遺伝子のヌクレオチド配列が挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、各相同配列の長さについての有効な範囲は５０〜５，０００塩基対である。特定の実施形態において、各相同配列の長さは約５００塩基対である。遺伝子を標的にするのに必要とされる相同性の長さの議論については、Ｈａｓｔｙら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１：５５８６−９１（１９９１）を参照されたい。いくつかの実施形態において、相同配列は、標的遺伝子のコード配列を含む。他の実施形態において、相同配列は、標的遺伝子の上流配列または下流配列を含む。いくつかの実施形態において、一方の相同配列は、標的遺伝子のコード配列の５’に位置するヌクレオチド配列と相同であるヌクレオチド配列を含み、他方の相同配列は、標的遺伝子のコード配列の３’に位置するヌクレオチド配列と相同であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、破壊配列は、破壊配列を含む微生物細胞の選択を可能にする選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む。したがって、そのような実施形態において、破壊構築物は、二重機能、すなわち、標的遺伝子を機能的に破壊すること、および標的遺伝子が機能的に破壊されている細胞の同定のための選択マーカーを提供することを有する。いくつかの実施形態において、終止コドンは、標的遺伝子によってコードされる野生型タンパク質のある程度の活性を有する融合タンパク質を生じる可能性がある翻訳の読み過ごしを防ぐために選択マーカーをコードするヌクレオチド配列とインフレームで、および、それの下流に位置する。いくつかの実施形態において、破壊配列の長さは、１塩基対である。単一塩基対の挿入は、コード配列における単一塩基対の挿入が、機能性タンパク質の発現を阻止することができるフレームシフト突然変異を構成することができるため、標的遺伝子を破壊するのに十分であり得る。いくつかの実施形態において、破壊配列の配列は、相同配列の間に位置する標的遺伝子のヌクレオチド配列と単一塩基対だけ、異なる。標的遺伝子内のヌクレオチド配列の破壊配列との置換で、導入される単一塩基対置換は、タンパク質における重要部位での単一アミノ酸置換、および非機能性タンパク質の発現を生じ得る。しかしながら、非常に短い破壊配列を用いてもたらされる破壊は、自然��然変異によって野生型配列への復帰変異を起こしやすく、したがって、接合および胞子形成能力の回復を宿主株にもたらすことは認識されるべきである。したがって、特定の実施形態において、破壊配列は、１〜２、３塩基対より長い。それとは正反対に、過剰な長さの破壊配列は、中程度の長さの破壊配列に優る少しの利点でも与える可能性は低く、トランスフェクションまたはターゲティングの効率を減少させる可能性がある。この関連における過剰な長さは、標的遺伝子における選択された相同配列間の距離より何倍も長い。このように、ある特定の実施形態において、破壊配列についての長さは、２塩基対から２，０００塩基対までであり得る。他の実施形態において、破壊配列についての長さは、破壊構築物における相同配列とマッチする標的遺伝子座の領域間の距離とおよそ等しい長さである。
【００６０】
いくつかの実施形態において、破壊構築物は、直鎖ＤＮＡ分子である。他の実施形態において、破壊構築物は、環状ＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、環状破壊構築物は、上記のような破壊配列によって分離した１対の相同配列を含む。いくつかの実施形態において、環状破壊構築物は、単一の相同配列を含む。そのような環状破壊構築物は、標的遺伝子座での組込みで、直鎖状になり、相同配列の部分は各末端に位置し、破壊構築物の残りのセグメントは、標的遺伝子ヌクレオチド配列のいずれとも置換することなく、標的遺伝子に挿入され、それを破壊するであろう。特定の実施形態において、環状破壊構築物の単一の相同配列は、標的遺伝子のコード配列内に位置する配列と相同である。
【００６１】
破壊構築物は、非限定的に、当業者に公知の任意の方法によって微生物細胞へ導入することができる。そのような方法には、溶液からの細胞による分子の直接的取り込み、または例えば、リポソームもしくは免疫リポソームを用いるリポフェクションによる促進性取り込み；粒子媒介性トランスフェクションなどが挙げられるが、それらに限定されない。例えば、米国特許第５，２７２，０６５号；Ｇｏｅｄｄｅｌら編、１９９０、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、ＣＡ；Ｋｒｉｅｇｅｒ、１９９０、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌら編、現行版、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを参照。酵母細胞を形質転換する特定の方法は当技術分野において周知である。Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１２９２−３（１９７８）；Ｃｒｅｇｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６−３３８５（１９８５）参照。例示的な技術として、スフェロプラスト化、エレクトロポレーション、ＰＥＧ  １０００媒介性形質転換、および酢酸リチウムまたは塩化リチウム媒介性形質転換が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６２】
（フェロモン応答遺伝子）
いくつかの実施形態において、本明細書に提供された方法に従って破壊される酵母細胞におけるフェロモン応答遺伝子は、ＳＴＥ５である。ＳＴＥ５は、酵母接合経路を通してのマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）への直接的シグナル伝達に必要とされるスキャフォールドタンパク質をコードする。例えば、Ｇｏｏｄら、Ｃｅｌｌ  Ｍａｒ  ２０；１３６（６）：１０８５−９７（２００９）参照。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＳＴＥ５ヌクレオチド配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｌ２３８５６、ならびに本明細書に提供されているような配列番号１７、４５、７３、１０１、および１２９が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＳｔｅ５タンパク質配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ３５１１５、ならびに本明細書に提供されているような配列番号１８、４６、７４、１０２、および１３０が挙げられる。
【００６３】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供された方法に従って破壊される酵母細胞におけるフェロモン応答遺伝子は、ＳＴＥ４である。ＳＴＥ４遺伝子は、Ｓｔｅ１８ｐと二量体を形成して接合シグナル伝達経路を活性化するＧタンパク質βサブユニットをコードする。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＴＥ４遺伝子の配列は以前に記載されている。Ｄｕｊｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８７（６６３２  Ｓｕｐｐｌ）：９８−１０２（１９９７）。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＳＴＥ４ヌクレオチド配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１１４７．５、ならびに本明細書に提供されているような配列番号１９、４７、７５、１０３、および１３１が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＳｔｅ４タンパク質配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０１４８５５、ならびに本明細書に提供されているような配列番号２０、４８、７６、１０４、および１３２が挙げられる。
【００６４】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供された方法に従って破壊される酵母細胞におけるフェロモン応答遺伝子は、ＳＴＥ１８である。ＳＴＥ１８遺伝子は、Ｓｔｅ４ｐと二量体を形成して接合シグナル伝達経路を活性化するＧタンパク質γサブユニットをコードする。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＴＥ１８遺伝子の配列は以前に記載されている。例えば、Ｇｏｆｆｅａｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４（５２８７）：５４６−５４７（１９９６）参照。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＳＴＥ１８ヌクレオチド配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１１４７．５、ならびに本明細書に提供されているような配列番号２１、４９、７７、１０５、および１３３が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＳｔｅ１８タンパク質配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０１２６１９、ならびに本明細書に提供されているような配列番号２２、５０、７８、１０６、および１３４が挙げられる。
【００６５】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供された方法に従って破壊される酵母細胞におけるフェロモン応答遺伝子は、ＳＴＥ１２である。ＳＴＥ１２遺伝子は、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達カスケードによって活性化され、および、接合経路または仮性菌糸／浸潤性増殖経路に関与する遺伝子を活性化する転写因子をコードする。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＴＥ１２遺伝子の配列は以前に記載されている。例えば、Ｇｏｆｆｅａｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４（５２８７）：５４６−５４７（１９９６）参照。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＳＴＥ１２ヌクレオチド配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１１４０．５、ならびに本明細書に提供されているような配列番号２３、５１、７９、１０７、および１３５が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＳｔｅ１２タンパク質配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０１１９５２、ならびに本明細書に提供されているような配列番号２４、５２、８０、１０８、および１３６が挙げられる。
【００６６】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供された方法に従って破壊される酵母細胞におけるフェロモン応答遺伝子は、ＳＴＥ７である。ＳＴＥ７遺伝子は、Ｆｕｓ３ｐをリン酸化する、フェロモン応答に関与するシグナル伝達ＭＡＰキナーゼをコードする。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＴＥ７遺伝子の配列は以前に記載されている。例えば、Ｔｅａｇｕｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８３（１９）：７３７１−５（１９８６）参照。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＳＴＥ７ヌクレオチド配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｚ７４２０７、ならびに本明細書に提供されているような配列番号２５、５３、８１、１０９、および１３７が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＳｔｅ７タンパク質配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ９８７３２、ならびに本明細書に提供されているような配列番号２６、５４、８２、１１０、および１３８が挙げられる。
【００６７】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供された方法に従って破壊される酵母細胞におけるフェロモン応答遺伝子は、ＳＴＥ１１である。ＳＴＥ１１遺伝子は、Ｓｔｅ７ｐをリン酸化する、フェロモン応答および仮性菌糸／浸潤性増殖経路に関与するシグナル伝達ＭＥＫキナーゼをコードする。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＴＥ１１遺伝子の配列は以前に記載されている。例えば、Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８７（６６３２  Ｓｕｐｐｌ）、８７−９０（１９９７）参照。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＳＴＥ１１ヌクレオチド配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１１４４．４、ならびに本明細書に提供されているような配列番号２７、５５、８３、１１１、および１３９が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＳｔｅ１１タンパク質配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０１３４６６、ならびに本明細書に提供されているような配列番号２８、５６、８４、１１２、および１４０が挙げられる。
【００６８】
（胞子形成遺伝子）
いくつかの実施形態において、本明細書に提供された方法に従って破壊される酵母細胞における胞子形成遺伝子はＩＭＥ１である。ＩＭＥ１遺伝子は、減数分裂の開始に必要とされる、初期減数分裂遺伝子転写を活性化する転写因子をコードする。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＩＭＥ１遺伝子の配列は以前に記載されている。例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｈ．Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０（１２）：６１０３−６１１３（１９９０）参照。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＩＭＥ１ヌクレオチド配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ３７１８８、ならびに本明細書に提供されているような配列番号１、２９、５７、８５、および１１３が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＩｍｅ１タンパク質配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ８６７９０、ならびに本明細書に提供されているような配列番号２、３０、５８、８６、および１１４が挙げられる。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供された方法に従って破壊される酵母細胞における胞子形成遺伝子はＩＭＥ２である。ＩＭＥ２遺伝子は、減数分裂の活性化に関与するセリン／スレオニンプロテインキナーゼをコードする。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＩＭＥ２遺伝子の配列は以前に記載されている。例えば、ＥＭＢＯ  Ｊ．１５（９）、２０３１−２０４９（１９９６）参照。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＩＭＥ２ヌクレオチド配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１１４２、ならびに本明細書に提供されているような配列番号３、３１、５９、８７、および１１５が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＩｍｅ２タンパク質配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０１２４２９、ならびに本明細書に提供されているような配列番号４、３２、６０、８８、および１１６が挙げられる。
【００７０】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供された方法に従って破壊される酵母細胞における胞子形成遺伝子はＮＤＴ８０である。ＮＤＴ８０遺伝子は、太糸期からの脱出および完全減数分裂組換えに必要とされる減数分裂特異的転写因子をコードする。Ｎｄｔ８０タンパク質はまた、中間胞子形成遺伝子を活性化する。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＮＤＴ８０遺伝子の配列は以前に記載されている。例えば、Ｇｏｆｆｅａｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４（５２８７）：５４６−５４７（１９９６）参照。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＮＤＴ８０ヌクレオチド配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１１４０、ならびに本明細書に提供されているような配列番号５、３３、６１、８９、および１１７が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＮｄｔ８０タンパク質配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０１１９９２、ならびに本明細書に提供されているような配列番号６、３４、６２、９０、および１１８が挙げられる。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供された方法に従って破壊される酵母細胞における胞子形成遺伝子はＳＰＯ１１である。ＳＰＯ１１遺伝子は、減数分裂組換えに必要とされる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＰＯ１１遺伝子の配列は以前に記載されている。例えば、Ａｔｃｈｅｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８４（２２）、８０３５−８０３９（１９８７）参照。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＳＰＯ１１ヌクレオチド配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｊ０２９８７、ならびに本明細書に提供されているような配列番号７、３５、６３、９１、および１１９が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＳｐｏ１１タンパク質配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ６５５３２、ならびに本明細書に提供されているような配列番号８、３６、６４、９２、および１２０が挙げられる。
【００７２】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供された方法に従って破壊される酵母細胞における胞子形成遺伝子はＳＰＯ２０である。ＳＰＯ２０遺伝子は、胞子形成中の前胞子膜形成に必要とされる、ｔ−ＳＮＡＲＥ複合体の減数分裂特異的サブユニットをコードする。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＰＯ２０遺伝子の配列は以前に記載されている。例えば、Ｂｏｗｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８７（６６３２  Ｓｕｐｐｌ）、９０−９３（１９９７）参照。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＳＰＯ２０ヌクレオチド配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０７８７４０、ならびに本明細書に提供されているような配列番号９、３７、６５、９３、および１２１が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＳｐｏ２０タンパク質配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０１３７３０、ならびに本明細書に提供されているような配列番号１０、３８、６６、９４、および１２２が挙げられる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供された方法に従って破壊される酵母細胞における胞子形成遺伝子はＡＭＡ１である。ＡＭＡ１遺伝子は、減数分裂後期促進複合体のアクチベーターをコードする。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＭＡ１遺伝子の配列は以前に記載されている。例えば、Ｔｅｔｔｅｌｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８７（６６３２  Ｓｕｐｐｌ）：８１−８４（１９９７）参照。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＡＭＡ１ヌクレオチド配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１１３９．８、ならびに本明細書に提供されているような配列番号１１、３９、６７、９５、および１２３が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＡｍａ１タンパク質配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０１１７４１、ならびに本明細書に提供されているような配列番号１２、４０、６８、９６、および１２４が挙げられる。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供された方法に従って破壊される酵母細胞における胞子形成遺伝子はＨＯＰ２である。ＨＯＰ２遺伝子は、相同染色体間のシナプシスを確実にする減数分裂特異的タンパク質をコードする。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨＯＰ２遺伝子の配列は以前に記載されている。例えば、Ｌｅｕら、Ｃｅｌｌ  ９４（３）：３７５−３８６（１９９８）参照。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＨＯＰ２ヌクレオチド配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ＿０７８７４０．１、ならびに本明細書に提供されているような配列番号１３、４１、６９、９７、および１２５が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＨｏｐ２タンパク質配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ３１８２３、ならびに本明細書に提供されているような配列番号１４、４２、７０、９８、および１２６が挙げられる。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供された方法に従って破壊される酵母細胞における胞子形成遺伝子はＳＰＯ２１である。ＳＰＯ２１遺伝子は、前胞子膜形成の前に必要とされる減数分裂外側プラーク（ｍｅｉｏｔｉｃ  ｏｕｔｅｒ  ｐｌａｑｕｅ）を修飾することに関与する、紡錘極体の減数分裂外側プラークの成分をコードする。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＰＯ２１遺伝子の配列は以前に記載されている。例えば、Ｄｕｊｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８７（６６３２  Ｓｕｐｐｌ）：９８−１０２（１９９７）参照。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＳＰＯ２１ヌクレオチド配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１１４７．５、ならびに本明細書に提供されているような配列番号１５、４３、７１、９９、および１２７が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＳｐｏ２１タンパク質配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０１４５５０、ならびに本明細書に提供されているような配列番号１６、４４、７２、１００、および１２８が挙げられる。
【００７６】
（二倍体の調製）
本明細書に提供された方法は、１つもしくは複数の胞子形成遺伝子における機能的破壊および／または１つまたは複数のフェロモン応答遺伝子における機能的破壊を含む一倍体細胞の間で接合を誘導する工程を含む。前記接合の結果として形成される二倍体細胞は、細胞の１つまたは複数の胞子形成遺伝子の機能的破壊による二倍体相に制約される安定な二倍体細胞である。
【００７７】
接合能力を欠く一倍体細胞から二倍体細胞を形成するために、接合欠陥性一倍体細胞は、「接合相補プラスミド」、すなわち、１つまたは複数のフェロモン応答遺伝子における機能的破壊によって引き起こされた接合欠損を相補することができる異種性遺伝子を含む組換えプラスミドで形質転換される。一倍体細胞内の異種性フェロモン応答遺伝子の一過性発現は、一時的に、細胞に接合機能を回復させ、反対接合型の一倍体細胞が安定な二倍体細胞を形成することを可能にする。特に、それによって形成された安定な二倍体細胞は、それらの接合型対立遺伝子について以外はホモ接合であり、同じ遺伝子改変集団の一倍体から生成される。
【００７８】
したがって、一倍体細胞がＳＴＥ５遺伝子の機能的破壊を含むいくつかの実施形態において、一倍体細胞は、ＳＴＥ５コード配列を含む接合相補プラスミドで形質転換される。一倍体細胞がＳＴＥ４遺伝子の機能的破壊を含むいくつかの実施形態において、一倍体細胞は、ＳＴＥ４コード配列を含む接合相補プラスミドで形質転換される。一倍体細胞がＳＴＥ１８遺伝子の機能的破壊を含むいくつかの実施形態において、一倍体細胞は、ＳＴＥ１８コード配列を含む接合相補プラスミドで形質転換される。一倍体細胞がＳＴＥ１２遺伝子の機能的破壊を含むいくつかの実施形態において、一倍体細胞は、ＳＴＥ１２コード配列を含む接合相補プラスミドで形質転換される。一倍体細胞がＳＴＥ７遺伝子の機能的破壊を含むいくつかの実施形態において、一倍体細胞は、ＳＴＥ７コード配列を含む接合相補プラスミドで形質転換される。一倍体細胞がＳＴＥ１１遺伝子の機能的破壊を含むいくつかの実施形態において、一倍体細胞は、ＳＴＥ１１コード配列を含む接合相補プラスミドで形質転換される。
【００７９】
発現ベクターの構築、および発現ベクターを含む細胞における遺伝子の発現についての技術は、当技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、およびＡｕｓｕｂｅｌら編、現行版、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを参照。接合相補遺伝子をコードするプラスミドは、当業者に公知の任意の方法によって宿主細胞へ導入することができる。
【００８０】
プラスミドに基づいた系は、一般的に、細胞において外来ＤＮＡを維持するようにプラスミドに選択圧を必要とする。酵母細胞は典型的には、有糸分裂後ごとに、細胞に含まれる１０％のプラスミドを喪失するため、酵母におけるたいていのプラスミドは相対的に不安定である。したがって、いくつかの実施形態において、接合相補遺伝子をコードするプラスミドを含む一倍体細胞の接合によって形成されたが、それ自体、そのプラスミドを含まない二倍体細胞の選択は、プラスミドが集団から効果的に希釈されるように十分な有糸分裂を二倍体細胞に起こさせることによって達成される。あるいは、二倍体細胞は、プラスミドの非存在について選択することによって、例えば、対抗選択マーカー（例えば、ＵＲＡ３など）に対して選択することによって、または選択培地および非選択培地の両方に同一のコロニーを蒔き、その後、選択培地で増殖しないが、非選択培地で増殖するコロニーを選択することによって、選択することができる。
【００８１】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法は、一倍体ヘテロタリック（ｈｏ）酵母細胞を、ホモタリズム（ＨＯ）タンパク質をコードする組換えプラスミドで形質転換する工程であって、ＨＯタンパク質の発現が一倍体細胞の接合型切り換えを誘導する、工程を含む。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨＯ遺伝子の配列は以前に記載されている。例えば、Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  ６（１２）：４２８１−４２９４（１９８６）参照。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＨＯヌクレオチド配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１１３６および本明細書に提供されているような配列番号１５１が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的なＨＯタンパク質配列には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０１００５４および本明細書に提供されているような配列番号１５２が挙げられる。
【実施例】
【００８２】
実施例１：遺伝子改変二倍体細胞の作製
この実施例は、遺伝子改変一倍体Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を作製する例示的な方法を記載する。
【００８３】
相Ｉ破壊構築物（図１；配列番号１４１）は、破壊配列として、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＡＬ８０座の上流ヌクレオチド配列および下流ヌクレオチド配列からなる相同配列に隣接した、選択マーカー（ハイグロマイシンＢ耐性を与えるｈｙｇＡ）；ガラクトース誘導性プロモーター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０のプロモーター）の制御下の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＥＶ経路の２つの酵素（切断型ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼをコードする切断型ＨＭＧ１コード配列およびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードするＥＲＧ１３コード配列）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの別の酵素（アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＥＲＧ１０コード配列）をコードするヌクレオチド配列を含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞への導入で、相Ｉ破壊構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞ゲノムのＧＡＬ８０座へ相同組換えによって組み込まれ、ＧＡＬ８０コード配列をその破壊配列と置換することによってＧＡＬ８０座を機能的に破壊することができる。相Ｉ破壊構築物を、ＴＯＰＯ  Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）へクローニングし、プラスミドＴＯＰＯ−相Ｉ破壊構築物を生じた。その構築物を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天上で増殖するＴＯＰ１０細胞中に繁殖させた。
【００８４】
相ＩＩ破壊構築物（図２；配列番号１４２）は、破壊配列として、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＬＥＵ２座の上流ヌクレオチド配列および下流ヌクレオチド配列からなる相同配列に隣接した、選択マーカー（ノールセオスリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）耐性を与えるｎａｔＡ）、およびガラクトース誘導性プロモーター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０のプロモーター）の制御下のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＥＶ経路の数個の酵素（メバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ１２コード配列およびホスホメバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ８コード配列）をコードするヌクレオチド配列；加えて、ＧＡＬ４ｏｃプロモーター（ＭＩＧ１結合部位を除去する突然変異を含むＧＡＬ４プロモーターであって、それにしたがって、プロモーターをグルコースの抑圧に対してより低感受性にさせている）の制御下のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＡＬ４遺伝子のコード配列を含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞への導入で、相ＩＩ破壊構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞ゲノムのＬＥＵ２座へ相同組換えによって組み込まれ、ＬＥＵ２コード配列をその破壊配列と置換することによってＬＥＵ２座を機能的に破壊することができる。相ＩＩ破壊構築物を、ＴＯＰＯ  Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩクローニングベクターへクローニングし、プラスミドＴＯＰＯ−相ＩＩ破壊構築物を生じた。その構築物を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天上で増殖するＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に繁殖させた。
【００８５】
相ＩＩＩ破壊構築物（図３；配列番号１４３）は、破壊配列として、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＲＧ９座の上流ヌクレオチド配列およびコードヌクレオチド配列に隣接した、選択マーカー（Ｇ４１８耐性を与えるｋａｎＡ）；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＥＶ経路の酵素（ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするＥＲＧ１９コード配列）、およびガラクトース誘導性プロモーター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、およびＧＡＬ７のプロモーター）の制御下の、ＭＥＶ経路の産物のＩＰＰをＦＰＰへ変換することに関与するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２つの酵素（ＥＲＧ２０コード配列はファルネシルピロリン酸シンターゼをコードし、ＩＤＩ１コード配列はイソペンテニルピロリン酸デカルボキシラーゼをコードする）をコードするヌクレオチド配列；加えて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＴＲ３遺伝子のプロモーターを含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞への導入で、相ＩＩ破壊構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞ゲノムのＥＲＧ９座の上流に相同組換えによって組み込まれ、ＥＲＧ９（スクワレンシンターゼ）の発現が銅によって調節され得るように天然ＥＲＧ９プロモーターをＣＴＲ３プロモーターで置換することができる。相ＩＩＩ破壊構築物を、ＴＯＰＯ  Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩクローニングベクターへクローニングし、プラスミドＴＯＰＯ−相ＩＩＩ破壊構築物を生じた。その構築物を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天上で増殖するＴＯＰ１０細胞中に繁殖させた。
【００８６】
相Ｉマーカーリサイクリング構築物（図４；配列番号１４４）は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＡＬ８０座の上流ヌクレオチド配列およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＭＧ１遺伝子のコード配列に隣接した、選択マーカー（ウラシル欠損培地で増殖する能力を与えるＵＲＡ３）；およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＡＬ７遺伝子のプロモーターの制御調節下のＡ．ａｎｎｕａの酵素（ファルネセンシンターゼをコードするＦＳコード配列）をコードするヌクレオチド配列を含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞への導入で、相Ｉマーカーリサイクリング構築物は、選択マーカーｈｐｈＡがＵＲＡ３と置換されるように、すでに組み込まれた相Ｉ破壊配列へ相同組換えによって組み込むことができる。
【００８７】
相ＩＩマーカーリサイクリング構築物（図５；配列番号１４５）は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＬＥＵ２座の上流ヌクレオチド配列およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＲＧ１２遺伝子のコード配列に隣接した、選択マーカー（ウラシル欠損培地で増殖する能力を与えるＵＲＡ３）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＡＬ７遺伝子のプロモーターの制御調節下のＡ  ａｎｎｕａの酵素（ファルネセンシンターゼをコードするＦＳコード配列）をコードするヌクレオチド配列を含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞への導入で、相ＩＩマーカーリサイクリング構築物は、選択マーカーｎａｔＡがＵＲＡ３と置換されるように、すでに組み込まれた相ＩＩ破壊配列へ相同組換えによって組み込むことができる。
【００８８】
相ＩＩＩマーカーリサイクリング構築物（図６；配列番号１４６）は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＲＧ９座の上流ヌクレオチド配列およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＲＧ１９遺伝子のコード配列に隣接した、選択マーカー（ウラシル欠損培地で増殖する能力を与えるＵＲＡ３）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＡＬ７遺伝子のプロモーターの制御調節下のＡ  ａｎｎｕａの酵素（ファルネセンシンターゼをコードするＦＳコード配列）をコードするヌクレオチド配列を含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞への導入で、相ＩＩマーカーリサイクリング構築物は、選択マーカーｋａｎＡがＵＲＡ３と置換されるように、すでに組み込まれた相ＩＩＩ破壊配列へ相同組換えによって組み込むことができる。
【００８９】
発現プラスミドｐＡＭ４０４（配列番号１５３）は、β−ファルネセンシンターゼをコードする。ヌクレオチド配列挿入断片を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためにコドン最適化されたＡｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ８３５３９８）のβ−ファルネセンシンターゼ遺伝子のコード配列を鋳型として用いて、合成的に作製した。
【００９０】
スターターの宿主株Ｙ１１９８については、１００ｕｇ／ｍＬのカルバミシリンおよび５０ｕｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５ｍＬのＹＰＤ培地中に活性乾燥ＰＥ−２酵母（１９９４年に単離された；Ｓａｎｔｅｌｉｓａ  Ｖａｌｅ、Ｓｅｒｔａｏｚｉｎｈｏ、Ｂｒａｚｉｌからの贈与）を再懸濁することによって作製した。培養物を、２００ｒｐｍでの回転式振盪機で、３０℃、一晩、インキュベートした。その後、１０ｕＬの培養物のアリコートをＹＰＤプレートに蒔き、乾燥させた。単一のコロニーのために細胞を連続的に画線し、３０℃で２日間、インキュベートした。１２個の単一コロニーを採取し、新しいＹＰＤプレート上にパッチ状に置き、３０℃で一晩、増殖させた。コロニーの株アイデンティティを、製造会社の仕様書に従い、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＨＥＦ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｌｕｇ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いてＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣＨＥＦ  ＤＲ  ＩＩシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）でそれらの染色体サイズを分析することによって検証した。１個のコロニーを採取し、Ｙ１１９８株として保存した。
【００９１】
Ｙ１１９８株から、遺伝子操作を可能にするためにその株の一倍体にすることによって、Ｙ１６６１株、Ｙ１６６２株、Ｙ１６６３株、およびＹ１６６４株を作製した。Ｙ１１９８株を、回転式ドラム内のガラスチューブにおいて、５ｍＬのＹＰＤ培地中、３０℃で一晩、増殖させた。ＯＤ６００を測定し、細胞を、２％の酢酸カリウムを含む５ｍＬのＹＰ培地中、０．２のＯＤ６００に希釈した。培養物を、回転式ドラム内のガラスチューブにおいて３０℃で一晩、増殖させた。ＯＤ６００を再び、測定し、４ＯＤ６００＊ｍＬの細胞を、５，０００  ｘ  ｇで２分間の遠心分離によって収集した。細胞ペレットを滅菌水で一度、洗浄し、その後、０．０２％のラフィノースを含む３ｍＬの２％酢酸カリウム中に再懸濁した。細胞を、回転式ドラム内のガラスチューブにおいて３０℃で３日間、増殖させた。胞子形成を顕微鏡で確認した。３３μＬの培養物のアリコートを１．５ｍＬの微量遠心管に移し、１４，０００ｒｐｍで２分間、遠心分離した。細胞ペレットを、２μＬの１０ｍｇ／ｍＬ  Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ  １００Ｔ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）を含む５０μＬの滅菌水中に再懸濁し、細胞を３０℃の水浴中で１０分間、インキュベートした。チューブを氷に移し、１５０μＬの氷水を加えた。１０μＬのこの混合物のアリコートを１２ｍＬのＹＰＤプレートに加え、Ｓｉｎｇｅｒ  ＭＳＭ  ３００ダイセクション顕微鏡（Ｓｉｎｇｅｒ、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、ＵＫ）において四分子を切り離した。ＹＰＤプレートを３０℃で３日間、インキュベートし、その後、胞子を新鮮なＹＰＤプレート上にパッチ状に置き、３０℃で一晩、増殖させた。８個の４胞子四分子からの各胞子の接合型をコロニーＰＣＲによって分析した。２個のＭＡＴａ胞子および２個のＭＡＴα胞子を有する単一の４胞子四分子を採取し、Ｙ１６６１株（ＭＡＴａ）、Ｙ１６６２株（ＭＡＴａ）、Ｙ１６６３株（ＭＡＴα）、およびＹ１６６４株（ＭＡＴα）として保存した。
【００９２】
酵母細胞形質転換について、２５ｍｌの酵母エキスペプトンデキストロース（ＹＰＤ）培地に、出発宿主株の単一コロニーを接種した。培養物を、２００ｒｍｐでの回転式振盪機上で３０℃、一晩、増殖させた。培養物のＯＤ６００を測定し、その後、培養物を用いて、５０ｍｌのＹＰＤ培地に０．１５のＯＤ６００まで接種した。その新しく接種された培養物を２００ｒｐｍでの回転式振盪機において３０℃で、０．７〜０．９のＯＤ６００まで増殖させ、その時点で、細胞を１μｇのＤＮＡで形質転換した。宿主細胞形質転換体を同定するために選択剤を含む寒天上に細胞を蒔く前に、細胞をＹＰＤ培地中で４時間、回復させた。
【００９３】
ＰｍｅＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて完了まで消化されたプラスミドＴＯＰＯ相Ｉ破壊構築物でＹ１６６４株を形質転換することによって宿主株Ｙ１５１５を作製した。宿主細胞形質転換体を、３００ｕｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを含むＹＰＤ培地上で選択し、ＧＡＬ８０座に組み込まれた相Ｉ破壊配列を含む陽性形質転換体を、ＰＣＲ増幅によって検証した。
【００９４】
ＰｍｅＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて完了まで消化されたプラスミドＴＯＰＯ相ＩＩ破壊構築物でＹ１５１５株を形質転換することによって宿主株Ｙ１７６２を作製した。宿主細胞形質転換体を、１００ｕｇ／ｍＬのノールセオスリシンを含むＹＰＤ培地上で選択し、ＬＥＵ２座に組み込まれた相ＩＩ破壊配列を含む陽性形質転換体を、ＰＣＲ増幅によって検証した。
【００９５】
ＰｍｅＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて完了まで消化された、発現プラスミドｐＡＭ４０４およびプラスミドＴＯＰＯ相ＩＩＩ破壊構築物での２段階でＹ１７６２株を形質転換することによって宿主株Ｙ１７７０を作製した。ｐＡＭ４０４を有する宿主細胞形質転換体を、メチオニンおよびロイシンを欠損する完全合成培地（ＣＳＭ）上で選択した。ｐＡＭ４０４および相ＩＩＩ破壊構築物を有する宿主細胞形質転換体を、メチオニンおよびロイシンを欠損し、および、２００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標））を含むＣＳＭ上で選択し、ＥＲＧ９座に組み込まれた相ＩＩＩ破壊配列を含む陽性形質転換体を、ＰＣＲ増幅によって検証した。
【００９６】
Ｙ１７７０株をＵＲＡ３ノックアウト構築物（配列番号１５４）で形質転換することによって宿主株Ｙ１７９３を作製した。ＵＲＡ３ノックアウト構築物は、（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＣＥＮ．ＰＫ２ゲノムＤＮＡから生じた）ＵＲＡ３座の上流配列および下流配列を含む。宿主細胞形質転換体を、５−ＦＯＡを含むＹＰＤ培地上で宿主細胞形質転換体を選択した。
【００９７】
Ｙ１７９３株を相Ｉマーカーリサイクリング構築物で形質転換することによって宿主株ＹＡＡＡを作製した。宿主細胞形質転換体を、メチオニンおよびウラシルを欠損するＣＳＭ上で選択した。２００ｒｐｍでの回転式振盪機上、ＹＰＤ培地中、３０℃で一晩、細胞を増殖させ、その後、５−ＦＯＡを含む寒天上に細胞を蒔くことによってＵＲＡ３マーカーを切除した。マーカー切除をコロニーＰＣＲによって確認した。
【００９８】
ＹＡＡＡ株を相ＩＩマーカーリサイクリング構築物で形質転換することによって宿主株ＹＢＢＢを作製した。宿主細胞形質転換体を、メチオニンおよびウラシルを欠損するＣＳＭ上で選択した。２００ｒｐｍでの回転式振盪機上、ＹＰＤ培地中、３０℃で一晩、細胞を増殖させ、その後、５−ＦＯＡを含む寒天上に細胞を蒔くことによってＵＲＡ３マーカーを切除した。マーカー切除をコロニーＰＣＲによって確認した。
【００９９】
ＹＢＢＢ株を相ＩＩＩマーカーリサイクリング構築物で形質転換することによって宿主株Ｙ１９１２を作製した。宿主細胞形質転換体を、メチオニンおよびウラシルを欠損するＣＳＭ上で選択した。２００ｒｐｍでの回転式振盪機上、ＹＰＤ培地中、３０℃で一晩、細胞を増殖させ、その後、５−ＦＯＡを含む寒天上に細胞を蒔くことによってＵＲＡ３マーカーを切除した。マーカー切除をコロニーＰＣＲによって確認した。
【０１００】
実施例２：遺伝子改変された胞子形成欠陥性および内因性接合欠陥性の一倍体細胞の作製
この実施例は、遺伝子改変一倍体Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞において胞子形成遺伝子およびフェロモン応答遺伝子を破壊して、胞子形成および内因性接合が損なわれている遺伝子改変一倍体Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を生じるための例示的な方法を記載する。
【０１０１】
ＳＴＥ５破壊構築物（図７；配列番号１４７）は、破壊配列として、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＴＥ５座の上流ヌクレオチド配列および下流ヌクレオチド配列からなる相同配列に隣接した、選択マーカー（ウラシル欠損培地上で増殖する能力を与えるＵＲＡ３）；およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＤＨ３遺伝子のプロモーターの制御調節下のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＥＶ経路の酵素（切断型ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼをコードする切断型ＨＭＧ１コード配列）をコードするヌクレオチド配列を含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞への導入で、ＳＴＥ５破壊構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞ゲノムのＳＴＥ５座へ相同組換えによって組み込まれ、ＳＴＥ５コード配列をその破壊配列と置換することによってＳＴＥ５座を機能的に破壊することができる。
【０１０２】
ＩＭＥ１破壊構築物（図８；配列番号１４８）は、破壊配列として、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩＭＥ５座の上流ヌクレオチド配列および下流ヌクレオチド配列からなる相同配列に隣接した、選択マーカー（ロイシンを欠損する培地上で増殖する能力を与えるＬＥＵ２）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＤＨ３遺伝子のプロモーターの制御調節下のＡ．ａｎｎｕａの酵素（ファルネセンシンターゼをコードするＦＳコード配列）をコードするヌクレオチド配列を含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞への導入で、ＩＭＥ１破壊構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞ゲノムのＩＭＥ１座へ相同組換えによって組み込まれ、ＩＭＥ１コード配列をその破壊配列と置換することによってＩＭＥ１座を機能的に破壊することができる。
【０１０３】
Ｙ１９１２株をＳＴＥ５破壊構築物で形質転換することによって宿主株Ｙ１９１３を作製した。宿主細胞形質転換体を、メチオニンおよびウラシルを欠損するＣＳＭにおいて選択し、陽性形質転換体をＰＣＲ増幅によって検証した。
【０１０４】
Ｙ１９１３株からｐＡＭ４０４を排除（ｃｕｒｉｎｇ）し、生じた株をＩＭＥ１破壊構築物で形質転換することによって宿主株Ｙ１９１５を作製した。Ｙ１９１３株を、２００ｒｐｍでの回転式振盪機上、３０℃で３日間、非選択ＹＰＤ培地中で繁殖させた。約１００細胞をＹＰＤ固形培地上に蒔き、３０℃で３日間、増殖させ、その後、メチオニンおよびロイシンを欠損するＣＳＭプレート上でレプリカプレーティングを行い、そこで、それらを３０℃でさらに３日間、増殖させた。ロイシンを含む最少培地上で増殖するできること、およびロイシンを欠損する培地上で増殖できないことによって治癒細胞（ｃｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ）を同定した。単一のそのようなコロニーを採取し、ＩＭＥ１破壊構築物で形質転換した。宿主細胞形質転換体を、メチオニンおよびロイシンを欠損するＣＳＭ上で選択した。
【０１０５】
実施例３：遺伝子改変された胞子形成欠陥性および内因性接合欠陥性の二倍体細胞の作製
この実施例は、胞子形成および内因性接合が損なわれている遺伝子改変一倍体Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を二倍体にするための例示的な方法を記載する。
【０１０６】
Ｙ１９１５株の自己接合によって二倍体宿主株Ｙ１９７９を作製した。反対の接合型の細胞を作製するため、およびＹ１９１５株を一過性に接合可能にするために、ＨＯタンパク質をコードするプラスミドｐＡＭ１１２４（配列番号１４９）ならびにＳＴＥ５およびＧ４１８耐性マーカーをコードするプラスミドｐＡＭ１７５８（配列番号１５０）でその株を同時形質転換した。宿主細胞形質転換体を、Ｇ４１８およびノールセオスリシンを含むＣＳＭ上で選択した。陽性形質転換体を、非選択培地上に単一コロニーについて再び蒔き、Ｇ４１８感受性、ノールセオスリシン感受性の二倍体を、コロニーＰＣＲを用いるスクリーニングを通して同定した。
【０１０７】
実施例４：胞子形成欠陥および内因性接合欠陥の確認
遺伝子改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞の胞子形成欠陥および内因性接合欠陥を確認するための例示的な方法を記載する。
【０１０８】
Ｙ１９１５株が接合できないことを確認するために、一倍体Ｙ１９１５細胞（ＭＡＴα  ＫａｎＳ  ＵＲＡ３＾ｓｔｅ５）または一倍体Ｙ１９１２細胞（ＭＡＴα  ＫａｎＳ  ＵＲＡ３  ＳＴＥ５）をＹＥＰＤ固形培地上で一倍体Ｙ１７９２細胞（ＭＡＴａ  ＫａｎＲ  ｕｒａ３  ＳＴＥ５）と組み合わせた。接合培養物を、３０℃で１６時間、インキュベートした。その後、各接合培養物の同一のアリコートを、ウラシルを欠損し、さらにＧ４１８を含むＣＳＭ固形培地に蒔き、その培養物を３０℃で１週間、インキュベートした。図９に示されているように、Ｙ１７９２×Ｙ１９１２接合培養物のアリコートを含むプレート上のみコロニー増殖が観察されたが、Ｙ１７９２×Ｙ１９１５接合培養物のアリコートを含むプレート上には観察されなかった。
【０１０９】
Ｙ１９７９株が胞子形成できないことを確認するために、Ｙ１９７９株細胞およびＹ１１９８株細胞を、胞子形成誘導培地（非発酵性炭素源、例えば、酢酸カリウムを欠損する培地であり、それは、天然Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞が細胞有糸分裂周期を放棄し、減数分裂へ入って胞子形成するように誘導する）中に７日間、培養した。その後、培養物を分割し、水またはジエチルエーテルで１５分間、処理した。懸濁液を、反転によってホモジナイズし、滅菌水中に再懸濁し、希釈し、ＹＥＰＤ固形培地上に蒔き、３日間、増殖させた。図１０に示されているように、９５％のＹ１１９８株細胞が、これらの条件下で四分子胞子を形成したが、Ｙ１９７９株細胞は形成しなかった。
【０１１０】
実施例５：胞子形成欠陥性および内因性接合欠陥性の細胞が天然に散在することができないことの確認
この実施例は、胞子形成欠陥性および内因性接合欠陥性の遺伝子改変二倍体Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞が天然に散在することができないことを確認するための例示的な方法を記載する。
【０１１１】
土壌中のＹ１９７９およびそれの非トランスジェニック同種系のＹ１１９８（ＰＥ−２）の生存を評価した。この目的を達成するために、４５Ｌのフラスコを約２５％のバーミキュライトおよびサトウキビ栽培地からの７５％の土壌で満たし（合計４０Ｌ）、栽培品種ＲＢ  ８６−７５１５サトウキビ植物である１つのＳａｃｃｈａｒｕｍ種（およそ月齢６ヶ月）を植えた。各ポットを、５−２５−３０の乾燥の窒素／リン／カリウムの混合物を施肥し、植物を閉鎖系温室内で１４日間、成長させた。各ポットへ、Ｙ１９７９株またはＹ１１９８株の６００ｍＬの細胞懸濁液を加えた。酵母細胞の添加は、土壌の表面５ｃｍ中に１０７細胞／ｇの濃度に達することと等価である。１．５×５土壌コアの５つの試料を以下の時点で収集した：ｔ＝０日目（暴露前）、０日目（曝露後）、３日目、７日目、１４日目、２８日目、４０日目、６０日目、および９０日目（試料採取された土壌の総体積は４４ｍＬであり、試料採取された土壌の総重量は約５０ｇであった）。複合試料から、１０グラムを分離し、１００ｍＬの蒸留水中に再懸濁した。酵母生存を定量化するために、１００μＬの水抽出物を、０．０５ｇ／Ｌのコウシンバラ（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｒ３８７７）を添加され、かつ０．２ｇ／Ｌのアンピシリン（Ｓｉｇｍａ  Ａ０１６６）を含む、硫酸６ＮでｐＨ５．５に調整されたＹＰＥＤ培地上に直接、蒔いた（２５ｍＬ／プレート）。試料を二連で、１〜１０７の希釈系列で蒔き、または蒔かれるべき希釈回数は、各処理について前の試料採取において得られた生存の数に基づいた。プレーティング後すぐに、その液体をＤｒｉｇａｌｓｋｉスパチュラで広げた。プレートを、その液体を全て蒸発させるために、最高３０分間、流れに対して開いたままにしておき、その後、閉じて、反転させ、３０℃で４８時間、インキュベートした。プレートあたりのコロニー数を、コロニー計数機（ＣＰ６００  Ｐｌｕｓ、Ｐｈｏｅｎｉｘ）を用いて、計数可能な希釈度において読み取り、その結果をＣＦＵ／プレートで表した。コロニーの総数が３０〜３００コロニーの間である場合のみ、計数が認められた。図１１に示されているように（各データ点は５つの繰り返しの平均である）、Ｙ１９７９細胞は、遺伝子改変されていない、胞子形成および接合の熟達したＹ１１９８株の親細胞より、明らかに土壌中における生存能力が低かった。
【０１１２】
本明細書に引用された全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個々に示されて参照により組み入れられているかのうように、参照により本明細書に組み入れられている。前述の本発明は、例証および理解を明確にするための例として、かなり詳細に記載されているが、ある特定の変化および改変が、添付された特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、それらになされ得ることは、本発明の教示を鑑みれば、当業者にとって容易に明らかであろう。
したがって、本発明は以下の項目を提供する：
（項目１）
（ａ）少なくとも１つの胞子形成遺伝子における機能的破壊、
（ｂ）少なくとも１つのフェロモン応答遺伝子における機能的破壊、および
（ｃ）目的のタンパク質をコードする、染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列
を含む遺伝子改変酵母細胞であって、該遺伝子改変酵母細胞は、胞子形成が損なわれ、および、内因性接合が損なわれている、遺伝子改変酵母細胞。
（項目２）  ヘテロタリック（ｈｏ）である、項目１に記載の遺伝子改変酵母細胞。
（項目３）  二倍体である、項目１に記載の遺伝子改変酵母細胞。
（項目４）  二倍体である、項目２に記載の遺伝子改変酵母細胞。
（項目５）  接合型対立遺伝子について以外はホモ接合型である、項目４に記載の遺伝子改変二倍体酵母細胞。
（項目６）  一倍体である、項目１に記載の遺伝子改変酵母細胞。
（項目７）  一倍体である、項目２に記載の遺伝子改変酵母細胞。
（項目８）  機能性ホモタリズム（ＨＯ）タンパク質をコードする組換えプラスミドをさらに含む、項目７に記載の遺伝子改変一倍体酵母細胞。
（項目９）  項目８に記載の遺伝子改変一倍体酵母細胞であって、該遺伝子改変一倍体酵母細胞において機能的に破壊されている上記少なくとも１つのフェロモン応答遺伝子の機能性コピーをコードする少なくとも１つの組換えプラスミドをさらに含む、遺伝子改変一倍体酵母細胞。
（項目１０）  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である、項目１〜９のいずれか一つに記載の遺伝子改変酵母細胞。
（項目１１）  上記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞はパン酵母株、Ｍａｕｒｉ株、Ｓａｎｔａ  Ｆｅ株、ＩＺ−１９０４株、ＴＡ株、ＢＧ−１株、ＣＲ−１株、ＳＡ−１株、Ｍ−２６株、Ｙ−９０４株、ＰＥ−２株、ＰＥ−５株、ＶＲ−１株、ＢＲ−１株、ＢＲ−２株、ＭＥ−２株、ＶＲ−２株、ＭＡ−３株、ＭＡ−４株、ＣＡＴ−１株、ＣＢ−１株、ＮＲ−１株、ＢＴ−１株、またはＡＬ−１株である、項目１０に記載の遺伝子改変酵母細胞。
（項目１２）  上記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞はＰＥ−２株である、項目１０に記載の遺伝子改変酵母細胞。
（項目１３）  上記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞はＣＡＴ−１株である、項目１０に記載の遺伝子改変酵母細胞。
（項目１４）  上記少なくとも１つの胞子形成遺伝子は、ＩＭＥ１、ＩＭＥ２、ＮＤＴ８０、ＳＰＯ１１、ＳＰＯ２０、ＡＭＡ１、ＨＯＰ２、およびＳＰＯ２１からなる群より選択される、項目１に記載の遺伝子改変酵母細胞。
（項目１５）  上記少なくとも１つのフェロモン応答遺伝子は、ＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７、およびＳＴＥ１１からなる群より選択される、項目１に記載の遺伝子改変酵母細胞。
（項目１６）  ＩＭＥ１遺伝子の機能的破壊を含む、項目１４に記載の遺伝子改変酵母細胞。
（項目１７）  ＳＴＥ５遺伝子の機能的破壊を含む、項目１５に記載の遺伝子改変酵母細胞。
（項目１８）  ＩＭＥ１遺伝子およびＳＴＥ５遺伝子の機能的破壊を含む、項目１に記載の遺伝子改変酵母細胞。
（項目１９）  ＳＴＥ５遺伝子の機能的破壊、および機能性ＳＴＥ５タンパク質をコードする組換えプラスミドを含む、項目９に記載の遺伝子改変一倍体酵母細胞。
（項目２０）  胞子形成および内因性接合が損なわれている遺伝子改変二倍体酵母細胞を作製する方法であって、以下の工程
（ａ）第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞および第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞のそれぞれを、該第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞および該第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞の内因性接合欠陥を相補することができるタンパク質をコードする少なくとも１つのプラスミドで形質転換する工程であって、該第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、胞子形成および内因性接合が損なわれており、および、目的のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列を含み、該第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、胞子形成および内因性接合が損なわれており、該第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞と反対の接合型であり、および、該目的のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列を含む、工程、
（ｂ）該第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞を該第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞と接合させ、それにより、遺伝子改変二倍体酵母細胞を形成する工程、ならびに
（ｃ）１つまたは複数の該プラスミドを該遺伝子改変二倍体酵母細胞から除去する工程であって、その結果生じた該遺伝子改変二倍体酵母細胞は、胞子形成および内因性接合が損なわれており、および、該目的のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列を２コピー含む、工程
を含む、方法。
（項目２１）  上記第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞および上記第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、少なくとも１つのフェロモン応答遺伝子の機能的破壊によって内因性接合が損なわれている、項目２０に記載の方法。
（項目２２）  工程（ａ）が、上記第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞および上記第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞のそれぞれを、該第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞および該第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞において機能的に破壊されている上記少なくとも１つのフェロモン応答遺伝子の機能性コピーをコードする少なくとも１つのプラスミドで形質転換する工程を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）  上記フェロモン応答遺伝子は、ＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７、およびＳＴＥ１１からなる群より選択される、項目２１に記載の方法。
（項目２４）  上記フェロモン応答遺伝子は、ＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７、およびＳＴＥ１１からなる群より選択される、項目２２に記載の方法。
（項目２５）  上記フェロモン応答遺伝子はＳＴＥ５である、項目２１に記載の方法。
（項目２６）  上記フェロモン応答遺伝子はＳＴＥ５である、項目２２に記載の方法。
（項目２７）  上記第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞および上記第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、少なくとも１つの胞子形成遺伝子の機能的破壊によって胞子形成が損なわれている、項目２０に記載の方法。
（項目２８）  上記胞子形成遺伝子は、ＩＭＥ１、ＩＭＥ２、ＮＤＴ８０、ＳＰＯ１１、ＳＰＯ２０、ＡＭＡ１、ＨＯＰ２、およびＳＰＯ２１からなる群より選択される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）  上記胞子形成遺伝子はＩＭＥ１である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）  上記第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞および上記第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、ＳＴＥ５遺伝子の機能的破壊によって内因性接合が損なわれており、および、ＩＭＥ１遺伝子の機能的破壊によって胞子形成が損なわれている、項目２０に記載の方法。
（項目３１）  上記第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、上記第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞の集団において接合型切り換えを誘導することによって得られる、項目２０に記載の方法。
（項目３２）  上記第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞の集団はヘテロタリック（ｈｏ）であり、かつ、該第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞を機能性ホモタリズム（ＨＯ）タンパク質をコードする組換えプラスミドで形質転換することによって接合型を切り換えるように誘導され、該ＨＯタンパク質の発現は該第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞の接合型切り換えを誘導することができる、項目３１に記載の方法。
（項目３３）  上記遺伝子改変二倍体酵母細胞はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である、項目２０に記載の方法。
（項目３４）  上記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞はパン酵母株、ＩＺ−１９０４株、ＴＡ株、ＢＧ−１株、ＣＲ−１株、ＳＡ−１株、Ｍ−２６株、Ｙ−９０４株、ＰＥ−２株、ＰＥ−５株、ＶＲ−１株、ＢＲ−１株、ＢＲ−２株、ＭＥ−２株、ＶＲ−２株、ＭＡ−３株、ＭＡ−４株、ＣＡＴ−１株、ＣＢ−１株、ＮＲ−１株、ＢＴ−１株、またはＡＬ−１株である、項目３３に記載の方法。
（項目３５）  上記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞はＰＥ−２株である、項目３３に記載の方法。
（項目３６）  上記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞はＣＡＴ−１株である、項目３３に記載の方法。
（項目３７）  項目２０〜３６のいずれか一つに記載の方法によって作製された、胞子形成および内因性接合が損なわれた二倍体酵母細胞。
（項目３８）  胞子形成および内因性接合が損なわれた遺伝子改変ヘテロタリック（ｈｏ）二倍体酵母細胞を作製するための方法であって、以下の工程
（ａ）第１の遺伝子改変ヘテロタリック一倍体酵母細胞の集団を機能性ホモタリズム（ＨＯ）タンパク質をコードするプラスミドで形質転換して、第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞を生じる工程であって、該ＨＯタンパク質の発現は該第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞の接合型切り換えを誘導することができ、それにより、該第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞と反対の接合型の第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞が得られ、該第１の遺伝子改変ヘテロタリック一倍体酵母細胞は、目的のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列ならびにＳＴＥ５遺伝子およびＩＭＥ１遺伝子における機能的破壊を含む、工程、
（ｂ）該第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞および該第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞のそれぞれを、ＳＴＥ５タンパク質をコードするプラスミドで形質転換する工程であって、結果として、該形質転換工程は、該第１の遺伝子改変一倍体酵母細胞と該第２の遺伝子改変一倍体酵母細胞との接合を生じ、それにより遺伝子改変二倍体酵母細胞を形成する、工程、ならびに
（ｃ）該遺伝子改変二倍体酵母細胞から任意のプラスミドを除去して、遺伝子改変ヘテロタリック二倍体酵母細胞を生じる工程であって、生じた該遺伝子改変ヘテロタリック二倍体酵母細胞は胞子形成および内因性接合が損なわれており、および、該目的のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列を２コピー含む、工程
を含む、方法。
（項目３９）  上記胞子形成および内因性接合が損なわれたヘテロタリック（ｈｏ）二倍体酵母細胞はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である、項目３９に記載の方法。
（項目４０）  上記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞はパン酵母株、Ｍａｕｒｉ株、Ｓａｎｔａ  Ｆｅ株、ＩＺ−１９０４株、ＴＡ、ＢＧ−１株、ＣＲ−１株、ＳＡ−１株、Ｍ−２６株、Ｙ−９０４株、ＰＥ−２株、ＰＥ−５株、ＶＲ−１株、ＢＲ−１株、ＢＲ−２株、ＭＥ−２株、ＶＲ−２株、ＭＡ−３株、ＭＡ−４株、ＣＡＴ−１株、ＣＢ−１株、ＮＲ−１株、ＢＴ−１株、またはＡＬ−１株である、項目３９に記載の方法。
（項目４１）  上記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞はＰＥ−２株である、項目３９に記載の方法。
（項目４２）  上記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞はＣＡＴ−１株である、項目３９に記載の方法。
（項目４３）  項目３８〜４２のいずれか一つに記載の方法によって作製された、胞子形成および内因性接合が損なわれたヘテロタリック（ｈｏ）二倍体酵母細胞。
（項目４４）  ＭＡＴα／ａ  ｓｔｅ５／ｓｔｅ５  ｉｍｅ１／ｉｍｅ１酵母細胞。
【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【配列表】
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