(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類において複数のインフルエンザウイルスサブタイプに対する保護免疫応答を誘発するための組成物であって、
前記哺乳類の細胞内にコンセンサスインフルエンザ抗原を発現して、前記哺乳類において免疫応答を誘発することが可能なＤＮＡプラスミドを含むＤＮＡプラスミドワクチンを含み、前記コンセンサスインフルエンザ抗原は、コンセンサスＨＡまたはコンセンサスＨＡとＮＡとＭ２ｅ−ＮＰとの組み合わせを含み、
前記組成物は、前記哺乳類の組織に送達され、そして前記組織の細胞は、前記細胞において前記ＤＮＡプラスミドの進入を可能にするのに有効な定電流でのエネルギーのパルスを使用して電気穿孔されることを特徴とし、
ここで、前記コンセンサスＨＡは、配列番号２または配列番号１４であるか、または前記コンセンサスＨＡをコードする核酸配列は、配列番号１または配列番号１３であり、
ここで、前記保護免疫応答は、前記コンセンサスＨＡとは異なるクレードにわたる保護であり、そして、前記コンセンサスＨＡと同一のクレード内での保護である、組成物。
【請求項２】
前記送達は、前記ＤＮＡプラスミドワクチンを皮内、皮下、または筋肉組織に注入するステップを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記電気穿孔は、
前記組織に送達されるのに所望の電流を予め設定するステップと、
前記予め設定された電流と同等の定電流でのエネルギーのパルスを使用して前記組織の細胞を電気穿孔するステップと、
を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記電気穿孔は、
前記電気穿孔された細胞内のインピーダンスを測定するステップと、
前記測定されたインピーダンスと比較して前記エネルギーのパルスのエネルギーレベルを調節し、前記電気穿孔された細胞内で定電流を維持するステップと、をさらに含み、
ここで、前記測定および調節は、前記エネルギーのパルスの寿命内に行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記電気穿孔は、
分散パターンで前記エネルギーのパルスを送達するパルスシーケンスのパターンに従って、前記エネルギーのパルスを複数の電極に送達するステップを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＤＮＡプラスミドが、前記コンセンサスインフルエンザ抗原の発現を調整し、コード配列に機能し得るように連結したプロモータを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＤＮＡプラスミドは、前記コード配列のＮ末端の端部に付着し、前記プロモータに機能し得るように連結したＩｇＧリーダー配列をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＤＮＡプラスミドは、前記コード配列のＣ末端の端部に付着したポリアデニル化配列をさらに含む、請求項６〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＤＮＡプラスミドは、コドン最適化されている、請求項６〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記コンセンサスＨＡは、配列番号２である、請求項６〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
コンセンサスＨＡをコード化する前記コード配列は、配列番号１である、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記コンセンサスＮＡは、配列番号４である、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
コンセンサスＮＡをコード化する前記コード配列は、配列番号３である、請求項６〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記コンセンサスＭ２ｅ−ＮＰは、配列番号８である、請求項６〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
コンセンサスＭ２ｅ−ＮＰをコード化する前記コード配列は、配列番号７である、請求項６〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＤＮＡプラスミドは、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７を含む、請求項６〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項６〜１６のいずれか１項に記載の組成物であって、前記ＤＮＡプラスミドワクチンは、複数の異なるＤＮＡプラスミドを含み、
前記複数のＤＮＡプラスミドのうちの１つは、コンセンサスＨＡをコードする配列を含み、
前記複数のＤＮＡプラスミドのうちの１つは、コンセンサスＮＡをコードする配列を含み、
前記複数のＤＮＡプラスミドのうちの１つは、コンセンサスＭ２ｅ−ＮＰをコードする配列を含む、
組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、１９９７年１１月１２日に出願された、米国特許仮出願第６０／９８７，２８４号の利益を主張し、その内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、免疫応答を誘発するため、ならびに個体をインフルエンザに対して予防的および／または治療的に免疫化するための、改善されたインフルエンザワクチン、改善された方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
動物およびヒトの疾患に対してワクチン接種するための核酸配列の使用が研究されている。研究は、所望の抗原の必要な発現を得るための有効かつ効果的な送達手段に焦点を当てており、免疫原性反応および最終的にこの技術の成功をもたらしている。プラスミドＤＮＡ等の核酸配列を送達する１つの方法は、電気穿孔（ＥＰ）技術である。この技術は、ブレオマイシン等の抗癌剤を送達するためのヒトの臨床試験、および多数の動物種の多くの前臨床研究に使用されている。
【０００４】
インフルエンザウイルスゲノムは、１１個のタンパク質（ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＥＰ、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ１−Ｆ２、ＰＢ２）をコード化する８つの単一（非対）のＲＮＡ鎖に含まれる。ゲノムのセグメント化特性によって、細胞共存中に異なるウイルス株間での全遺伝子を交換することが可能になる。８つのＲＮＡセグメントは、血球凝集素（約５００分子の血球凝集素が、１ビリオンを形成するために必要である）をコード化するＨＡ、ノイラミニダーゼ（約１００分子のノイラミニダーゼが、１ビリオンを形成するために必要である）をコード化するＮＡ、核タンパク質をコード化するＮＰ、同一のＲＮＡセグメントからの異なるリーディングフレームを使用して、２つのマトリクスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）（約３０００個のマトリクスタンパク質分子が、１ビリオンを形成するために必要である）をコード化するＭ、同一のＲＮＡセグメントからの異なるリーディングフレームを使用して、２つの異なる非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＥＰ）をコード化するＮＳ、ＲＮＡポリメラーゼをコード化するＰＡ、同一のＲＮＡセグメントからの異なるリーディングフレームを使用して、ＲＮＡポリメラーゼおよびＰＢ１−Ｆ２タンパク質（アポトーシスを誘発する）をコード化するＰＢ１、およびＲＮＡポリメラーゼをコード化するＰＢ２である。
【０００５】
インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）は、インフルエンザウイルス粒子の表面に発現し、ウイルスとその宿主細胞との間の初期接触に関与する。ＨＡは、周知の免疫原である。インフルエンザＡ株Ｈ５Ｎ１（トリインフルエンザ株）は、そのＨＡタンパク質（Ｈ５）が自然変異によって、わずかに遺伝子的に再集合された場合に、ウイルスの他の株と比較してヒト細胞の感染性を大幅に増加させるため、特に、ヒト集団に脅威を及ぼす。乳幼児および高齢者、または免疫不全の成人のウイルスＨ５Ｎ１株の感染は、しばしば、不良な臨床転帰に相関する。したがって、インフルエンザのＨ５Ｎ１株の予防は、公衆に大いに必要とされている。
【０００６】
入手可能な抗インフルエンザ剤には、インフルエンザＡの細胞の進入／脱外被の阻害剤（抗ウイルス性アマンタジンおよびリマンタジン等）、およびノイラミニダーゼ阻害剤（抗ウイルス性オセルタミビル、ザナミビル等）の２つの種類がある。これらの抗ウイルス剤は、インフルエンザＡおよびＢの両方の細胞放出を阻害する。これらの薬剤に耐性があるウイルス株の発見により、これらの薬剤の使用における懸念が報告されている。
【０００７】
インフルエンザワクチンは、一般の季節性ワクチンであり、多くの人は、そのようなワクチン接種の経験がある。しかしながら、ワクチン接種は、ワクチンが、ウイルスの特定のサブタイプに特異的であるため、保護効果に限定される。米国疾病対策予防センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）は、３つのインフルエンザウイルス（殺滅されたウイルス）（１つのＡ（Ｈ３Ｎ２）ウイルス、１つのＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルス、および１つのＢウイルス）を含むワクチンである「予防注射」でのワクチン接種を促進する。ワクチンのウイルスは、国際監視およびウイルスのどの型および株が所与の年に広がるかについての科学者らの予測に基づき毎年変化することも報告される。したがって、ワクチン接種は、サブタイプの予測に、そして特定のワクチンの有効性は、そのサブタイプに限定されることは、明らかである。
【０００８】
経済的で数々のサブタイプにわたって有効である、有効なインフルエンザワクチンの必要性が依然として残っている。さらに、予防的または治療的にインフルエンザに対する免疫化を提供するために、ＤＮＡワクチンを哺乳類に投与するための効果的な方法の必要性が残っている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様は、哺乳類において、ＤＮＡプラスミドおよび薬学的に許容可能な賦形剤を含む、複数のインフルエンザウイルスサブタイプに対する免疫応答を誘発することが可能なＤＮＡプラスミドワクチンに関する。ＤＮＡプラスミドは、哺乳類の細胞内に哺乳類において免疫応答を誘発するのに有効な量のコンセンサスインフルエンザ抗原を発現することが可能であり、コンセンサスインフルエンザ抗原は、コンセンサス血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリクスタンパク質、核タンパク質、Ｍ２外部ドメイン−核タンパク質（Ｍ２ｅ−ＮＰ）、またはそれらの組み合わせを含む。好適には、コンセンサスインフルエンザ抗原は、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ２ｅ−ＮＰ、またはそれらの組み合わせを含む。ＤＮＡプラスミドは、コンセンサスインフルエンザ抗原をコード化するコード配列に機能し得るように連結したプロモータを含む。好適には、ＤＮＡプラスミドワクチンは、１ｍｇ／ｍｌ以上の総ＤＮＡプラスミドの濃度を有するものである。
【００１０】
本発明の別の態様は、哺乳類の細胞内にコンセンサスインフルエンザ抗原を発現することが可能なＤＮＡプラスミドに関し、コンセンサスインフルエンザ抗原は、コンセンサス血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリクスタンパク質、核タンパク質、Ｍ２外部ドメイン−核タンパク質（Ｍ２ｅ−ＮＰ）、またはそれらの組み合わせを含む。好適には、コンセンサスインフルエンザ抗原は、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ２ｅ−ＮＰ、またはそれらの組み合わせを含む。ＤＮＡプラスミドは、コンセンサスインフルエンザ抗原をコード化するコード配列に機能し得るように連結したプロモータを含む。
【００１１】
本発明の別の態様は、哺乳類における複数のインフルエンザウイルスサブタイプに対する免疫応答を誘発するための方法に関する。該方法は、ＤＮＡプラスミドワクチンを哺乳類の組織に送達するステップ、および細胞においてＤＮＡプラスミドの進入を可能にするのに効果的な定電流でのエネルギーのパルスを使用して組織の細胞を電気穿孔するステップを含み、ＤＮＡプラスミドワクチンは、哺乳類の細胞内にコンセンサスインフルエンザ抗原を発現して、哺乳類において免疫応答を誘発することが可能なＤＮＡプラスミドを含み、コンセンサスインフルエンザ抗原は、コンセンサスＨＡ、ＮＡ、Ｍ２ｅ−ＮＰ、またはそれらの組み合わせを含む。
【００１２】
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
哺乳類において複数のインフルエンザウイルスサブタイプに対する免疫応答を引き起こすことが可能なＤＮＡプラスミドワクチンであって、
上記哺乳類の細胞内に上記哺乳類において免疫応答を誘発するのに有効な量のコンセンサスインフルエンザ抗原を発現することが可能なＤＮＡプラスミドであって、上記コンセンサスインフルエンザ抗原は、コンセンサス血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、Ｍ２外部ドメイン−核タンパク質（Ｍ２ｅ−ＮＰ）、またはそれらの組み合わせを含む、ＤＮＡプラスミドと、
薬学的に許容可能な賦形剤と、
を含み、
上記ＤＮＡプラスミドは、上記コンセンサスインフルエンザ抗原をコード化するコード配列に機能し得るように連結したプロモータを含み、上記ＤＮＡプラスミドワクチンは、１ｍｇ／ｍｌ以上の総ＤＮＡプラスミドの濃度を有する、ＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目２）
上記ＤＮＡプラスミドは、上記コード配列のＮ末端の端部に付着し、上記プロモータに機能し得るように連結したＩｇＧリーダー配列をさらに含む、項目１に記載のＤＮＡプラスミドワクチン
（項目３）
上記ＤＮＡプラスミドは、上記コード配列のＣ末端の端部に付着したポリアデニル化配列をさらに含む、項目１〜２のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目４）
上記ＤＮＡプラスミドは、コドン最適化されている、項目１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目５）
上記薬学的に許容可能な賦形剤は、アジュバントである、項目１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目６）
上記アジュバントは、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５から成る群から選択される、項目５に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目７）
上記薬学的に許容可能な賦形剤は、トランスフェクション促進剤である、項目１〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目８）
上記トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である、項目７に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目９）
上記トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸塩である、項目７に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目１０）
上記トランスフェクション促進剤は、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度のポリ−Ｌ−グルタミン酸塩である、項目１〜９のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目１１）
複数の異なるＤＮＡプラスミドを含み、
上記複数のＤＮＡプラスミドのうちの１つは、コンセンサスＨＡをコード化する配列を含み、
上記複数のＤＮＡプラスミドのうちの１つは、コンセンサスＮＡをコード化する配列を含み、
上記複数のＤＮＡプラスミドのうちの１つは、コンセンサスＭ２ｅ−ＮＰをコード化する配列を含む、
項目１〜１０のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目１２）
上記コンセンサスＨＡは、コンセンサスＨ１、コンセンサスＨ２、コンセンサスＨ３、またはコンセンサスＨ５である、項目１１に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目１３）
上記コンセンサスＨＡは、配列番号２、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４である、項目１１に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目１４）
上記コンセンサスＨＡは、配列番号２である、項目１１に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目１５）
コンセンサスＨＡをコード化する上記配列は、配列番号１、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１３である、項目１１に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目１６）
コンセンサスＨＡをコード化する上記配列は、配列番号１である、項目１１に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目１７）
上記コンセンサスＮＡは、配列番号４である、項目１１に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目１８）
コンセンサスＮＡをコード化する上記配列は、配列番号３である、項目１１に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目１９）
上記コンセンサスＭ２ｅ−ＮＰは、配列番号８である、項目１１に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目２０）
コンセンサスＭ２ｅ−ＮＰをコード化する上記配列は、配列番号７である、項目１１に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目２１）
コンセンサスＨ１をコード化する配列を含むＤＮＡプラスミドと、
コンセンサスＨ３をコード化する配列を含むＤＮＡプラスミドと、
コンセンサスＨ５をコード化する配列を含むＤＮＡプラスミドと、
コンセンサスＮＡをコード化する配列を含むＤＮＡプラスミドと、
コンセンサスＭ２ｅ−ＮＰをコード化する配列を含むＤＮＡプラスミドと、
を含む、項目１〜１０のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目２２）
上記コンセンサスＨ１は、配列番号２である、項目２１に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目２３）
コンセンサスＨ１をコード化する上記配列は、配列番号１である、項目２１に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目２４）
上記コンセンサスＨ３は、配列番号１２である、項目２１に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目２５）
コンセンサスＨ３をコード化する上記配列は、配列番号１１である、項目２１に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目２６）
上記コンセンサスＮＡは、配列番号４である、項目２１に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目２７）
コンセンサスＮＡをコード化する上記配列は、配列番号３である、項目２１に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目２８）
コンセンサスＭ２ｅ−ＮＰは、配列番号８である、項目２１に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目２９）
コンセンサスＭ２ｅ−ＮＰをコード化する上記配列は、配列番号７である、項目２１に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目３０）
上記哺乳類は、霊長類である、項目１〜２９のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目３１）
上記免疫応答は、体液性応答である、項目１〜３０のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目３２）
上記免疫応答は、細胞性応答である、項目１〜３０のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目３３）
上記免疫応答は、体液性応答および細胞性応答の組み合わせである、項目１〜３０のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
（項目３４）
哺乳類において複数のインフルエンザウイルスサブタイプに対する免疫応答を誘発する方法であって、
ＤＮＡプラスミドワクチンを上記哺乳類の組織に送達するステップであって、上記ＤＮＡプラスミドワクチンは、上記哺乳類の細胞内にコンセンサスインフルエンザ抗原を発現して、上記哺乳類において免疫応答を誘発することが可能なＤＮＡプラスミドを含み、上記コンセンサスインフルエンザ抗原は、コンセンサスＨＡ、ＮＡ、Ｍ２ｅ−ＮＰ、またはそれらの組み合わせを含む、ステップと、
上記細胞において上記ＤＮＡプラスミドの進入を可能にするのに有効な定電流でのエネルギーのパルスを使用して上記組織の細胞を電気穿孔するステップと、
を含む、方法。
（項目３５）
上記送達するステップは、上記ＤＮＡプラスミドワクチンを皮内、皮下、または筋肉組織に注入するステップを含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
上記組織に送達されるのに所望の電流を予め設定するステップと、
上記予め設定された電流と同等の定電流でのエネルギーのパルスを使用して上記組織の細胞を電気穿孔するステップと、
を含む、項目３４〜３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
上記電気穿孔するステップは、
上記電気穿孔された細胞内のインピーダンスを測定するステップと、
上記測定されたインピーダンスと比較して上記エネルギーのパルスのエネルギーレベルを調節し、上記電気穿孔された細胞内で定電流を維持するステップと、をさらに含み、
上記測定および調節するステップは、上記エネルギーのパルスの寿命内に行われる、項目３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
上記電気穿孔するステップは、
分散パターンで上記エネルギーのパルスを送達するパルスシーケンスのパターンに従って、上記エネルギーのパルスを複数の電極に送達するステップを含む、項目３４〜３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
哺乳類の細胞内にコンセンサスインフルエンザ抗原を発現することが可能なＤＮＡプラスミドであって、
コンセンサス血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、Ｍ２外部ドメイン−核タンパク質（Ｍ２ｅ−ＮＰ）、またはそれらの組み合わせを含むコード配列と、
上記コンセンサスインフルエンザ抗原の発現を調整する上記コード配列に機能し得るように連結したプロモータと、
を含む、ＤＮＡプラスミド。
（項目４０）
上記ＤＮＡプラスミドは、上記コード配列のＮ末端の端部に付着し、上記プロモータに機能し得るように連結したＩｇＧリーダー配列をさらに含む、項目３９に記載のＤＮＡプラスミド。
（項目４１）
上記ＤＮＡプラスミドは、上記コード配列のＣ末端の端部に付着したポリアデニル化配列をさらに含む、項目３９〜４０のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミド。
（項目４２）
上記ＤＮＡプラスミドは、コドン最適化されている、項目３９〜４１のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミド。
（項目４３）
上記コンセンサスＨＡは、コンセンサスＨ１、コンセンサスＨ２、コンセンサスＨ３、またはコンセンサスＨ５である、項目３９〜４２のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミド。
（項目４４）
上記コンセンサスＨＡは、配列番号２、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４である、項目３９〜４３のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミド。
（項目４５）
上記コンセンサスＨＡは、配列番号２である、項目３９〜４４のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミド。
（項目４６）
コンセンサスＨＡをコード化する上記コード配列は、配列番号１、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１３である、項目３９〜４５のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミド。
（項目４７）
コンセンサスＨＡをコード化する上記コード配列は、配列番号１である、項目３９〜４６のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミド。
（項目４８）
上記コンセンサスＮＡは、配列番号４である、項目３９〜４７のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミド。
（項目４９）
コンセンサスＮＡをコード化する上記コード配列は、配列番号３である、項目３９〜４８のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミド。
（項目５０）
上記コンセンサスＭ２ｅ−ＮＰは、配列番号８である、項目３９〜４９のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミド。
（項目５１）
コンセンサスＭ２ｅ−ＮＰをコード化する上記コード配列は、配列番号７である、項目３９〜５０のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミド。
（項目５２）
上記ＤＮＡプラスミドは、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７を含む、項目３９〜４２のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミド。
本発明の多くの目的および利点は、添付の図面を参照して当業者は、より良く理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本明細書に記載する研究に使用するＤＮＡプラスミド構築物の略図（プラスミドマップ）を示す。コンセンサスＨＡ、ＮＡ、およびＭ２ｅ−ＮＰ構築物は、近年ヒトに致命的であることが証明された、１６個のＨ５ウイルス、および４０個以上のヒトＮ１ウイルスからの一次ウイルス配列（Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ’ｓ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）を分析して得た。コンセンサス配列を生成した後、構築物は、Ｋｏｚａｋ配列の追加、コドン最適化、およびＲＮＡ最適化を含む、哺乳類における発現のために最適化した。次いで、これらの構築物を、ｐＶＡＸベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）にサブクローニングした。プラスミドｐＧＸ２００１（コンセンサスＨＡ）、ｐＧＸ２００２（コンセンサスＮＡ）、ｐＧＸ２００３（コンセンサスＭ２ｅ−ＮＰ）を示す。示したプラスミドｐＣＭＶＳＥＡＰは、レポータタンパク質分泌性胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコード化する。
【図２】注入後３５日目のブタの血清内のＨＩ力価の結果の棒グラフを示す。最大力価は、０．５Ａの電流設定で２ｍｇのＨＡ発現プラスミドが投与された群で見られた（１２０±４０、２ｍｇ／０．３Ａに対して＊Ｐ＝０．１１、そして２ｍｇ／０．１Ａに対して＊Ｐ＝０．０２）。減少した用量のプラスミドが投与され、０．５Ａで電気穿孔された３つの群は、ＨＩ力価の減少も示した。
【図３】ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ数の棒グラフを示す。数は、２ｍｇのＨＡおよび２ｍｇのＮＡプラスミドワクチン（合計４ｍｇのプラスミド）が投与され、０．３Ａの電流で電気穿孔されたブタ（２０００スポット）、および０．８ｍｇのＨＡおよび０．８ｍｇのＮＡプラスミドワクチン（合計１．６ｍｇのプラスミド）が投与され、０．５Ａの電流で電気穿孔された群（９３４スポット）で最大であった。比較目的で、免疫化されていない対照群の細胞免疫応答を示す。
【図４】１４日目および３５日目における治療されたブタの筋生検からの結果を示す棒グラフを示す。図４Ａは、すべての群の平均病理学スコアを示す棒グラフを示す。図４Ｂは、筋壊死および線維症スコアを示す棒グラフを示す。６ｍｇの総プラスミドが注入され、０．５Ａで電気穿孔された群は、最大の平均病理学スコア（対照と比較して、＊Ｐ＜０．０００２）を呈した。病理学スコアは、０．３ｍｇ／０．３Ａ群（Ｐ＝０．０５７）および２．４ｍｇ／０．１Ａ群（Ｐ＝１．０）を除く、すべての群（Ｐ＜０．０５）において、１４日目と比較して、３５日目に有意に減少した。
【図５】Ｈ５Ｎ１ウイルス（Ａ／Ｖｉｅｔ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）／ＰＲ８−ＩＢＣＤＣ−ＲＧ）で抗原投与した後のフェレットの体重変化の％を示す。ＨＡ、ＨＡ＋Ｍ２ｅ−ＮＰ、またはＨＡ＋Ｍ２ｅ−ＮＰ＋ＮＡでワクチン接種されたフェレットは、抗原投与後期間９日の内に対照動物よりも体重の減少が有意に少なかった（対照に対して＊Ｐ＜０．００５）。ＨＡワクチン群内の１つの動物は、抗原投与後に実際には体重が増加した。
【図６】抗原投与後の９日間のフェレットの体温を示すグラフを示す。対照動物は、ワクチン接種した動物よりも高い体温を示した。５日目の体温は、異なる時刻で測定されたために示されず、群に関わらず、すべての体温は、低かった。
【図７】ワクチン接種後のフェレットのＨＩ力価からの結果の棒グラフを示し、アッセイは、米国疾患対策センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）から得た再集合体ウイルス、Ａ／Ｖｉｅｔ／１２０３／０４、またはＩｎｄｏ／０５／２００５インフルエンザ株を使用して実施した。
【図８】２回目の免疫化の３週間後に測定されたＨＩ力価からの結果の棒グラフを示す。ＩＤの免疫化後にＥＰを受けたマカクは、すべての他の群よりも有意に高いＨＩ力価を示した（Ｐ＜０．０３）。未処置の対照は、いかなるＨＩ力価も呈さなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
好適な実施形態の詳細な説明
以下の省略または短縮された定義は、本発明の好適な実施形態の理解に役立つために提供する。本明細書に記載する省略された定義は、決して包括的でも、また当該分野で理解される定義、または辞書の意味での定義と矛盾するものでもない。省略された定義は、当該技術分野において周知の定義を補足する、またはより明確に定義するために本明細書に記載する。
【００１５】
定義
本明細書に使用するヌクレオチドおよびアミノ酸の配列相同性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、およびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（参照することにより、本明細書にその全体が組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９９７，  ２５，  ３３８９）、およびＰＡＵＰ＊４．０ｂ１０ソフトウエア（Ｄ．Ｌ．  Ｓｗｏｆｆｏｒｄ，  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して決定され得る。簡潔に述べると、基本的局所配列検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を表す、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、配列類似性を決定するのに適する（参照することにより、本明細書にその全体が組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，  １９９０、２１５、４０３−４１０）。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から公的に入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムで提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチド配列間での適合が偶然に生じる確率の指標を提供する最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、核酸は、試験する核酸の他の核酸との比較における最小合計確率が、約１未満、好適には、約０．１未満、さらに好適には、約０．０１未満、および最も好ましくは、約０．００１未満である場合に、別のものと類似すると考えられる。「類似性のパーセンテージ」は、ＰＡＵＰ＊４．０ｂ１０ソフトウエア（Ｄ．Ｌ．  Ｓｗｏｆｆｏｒｄ，  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して算出することができる。コンセンサス配列の平均類似性は、系統樹のすべての配列と比較して算出される。
【００１６】
本明細書に使用する、「遺伝的構築物」または「核酸構築物」という用語は、交換可能に使用され、タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード配列、または「コード核酸配列」は、核酸分子が投与される個体の細胞内での発現を誘導することが可能なプロモータとポリアデニル化シグナルとを含む、調節エレメントに機能し得るように連結された開始および終結シグナルを含む。
【００１７】
本明細書に使用する、「発現可能な形態」という用語は、個体の細胞内に存在するときに、コード配列が発現されるように、タンパク質をコード化するコード配列に機能し得るように連結した必要な調節エレメントを含む、核酸構築物を指す。
【００１８】
本明細書において、「定電流」という用語は、組織またはその組織を規定する細胞によって、同一の組織に送達される電気パルスの期間にわたって、受容または経験する電流を定義するために使用される。電気パルスは、本明細書に記載する電気穿孔デバイスから送達される。本明細書に提供する電気穿孔デバイスは、フィードバック要素、好適には瞬間フィードバックを有するため、この電流は、電気パルスの寿命にわたりその組織内に一定アンペア数で残存する。フィードバック要素は、パルスの期間中にわたって、組織（または細胞）の抵抗を測定することができ、同一組織内の電流が電気パルス（数マイクロ秒のオーダーで）にわたり、またパルス間で一定のままであるように、電気穿孔デバイスにその電気エネルギー出力を変更（例えば、電圧を増大）させることができる。いくつかの実施形態では、フィードバック要素は、コントローラを含む。
【００１９】
「フィードバック」または「電流フィードバック」という用語は、交換可能に使用され、電極間の組織内の電流を測定し、それにしたがって電流を一定レベルに維持するためにＥＰデバイスによって送達されたエネルギー出力を変更するステップを含む、提供された電気穿孔デバイスの能動的な応答を意味する。この一定レベルは、パルスシーケンスまたは電気治療の開始前にユーザによって予め設定される。電気穿孔デバイス内の電気回路が電極間の組織内の電流を継続的に監視し、監視した電流（または細胞内の電流）を予め設定された電流と比較し、監視した電流を予め設定したレベルに維持するために継続的にエネルギー出力調節を行うことが可能であるため、好適には、フィードバックは、電気穿孔デバイスの電気穿孔コンポーネント、例えば、コントローラによって達成される。いくつかの実施形態では、フィードバックループは、アナログ閉ループフィードバックであるため瞬時のものである。
【００２０】
本明細書で交換可能に使用される「電気穿孔」、「電気透過処理（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」または「電気動力学的促進（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｋｉｎｅｔｉｃ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」（「ＥＰ」）という用語は、生体膜内の微視的経路（細孔）を誘発するための、膜貫通電界パルスの使用を指す。それらの存在により、プラスミド等の生体分子、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオン、および水が細胞膜の一方の側から他方の側へ通過することが可能になる。
【００２１】
本明細書において、「分散電流」という用語は、本明細書に記載する電気穿孔デバイスのさまざまな針電極アレイから送達された電流のパターンを定義するために使用され、パターンは、電気穿孔される組織の任意の領域における電気穿孔関連の熱ストレスの発生を最小限にする、または好適には除去する。
【００２２】
本明細書に使用する「フィードバック機構」という用語は、ソフトウエアまたはハードウエア（またはファームウエア）のいずれかによって実行されるプロセスを指し、そのプロセスは、所望の組織（エネルギーのパルスの送達前、送達中、および／または送達後）のインピーダンスを受容し、現在値、好適には電流と比較し、予め設定された値を達成するために送達されたエネルギーのパルスを調節する。本明細書において、「インピーダンス」という用語は、フィードバック機構を考察するときに使用され、オームの法則に従い電流値に変換することができ、したがって、予め設定された電流との比較が可能になる。好適な実施形態では、「フィードバック機構」は、アナログ閉ループ回路によって実施する。
【００２３】
本明細書において、「免疫応答」という用語は、提供されるＤＮＡプラスミドワクチンを介するインフルエンザコンセンサス抗原の導入に対応する、宿主の免疫系、例えば、哺乳類における免疫系の活性化を意味するために使用される。免疫応答は、細胞応答もしくは体液性応答、またはその両方の形態であり得る。
【００２４】
本明細書において、「コンセンサス」または「コンセンサス配列」という用語は、特定のインフルエンザ抗原の複数のサブタイプまたは血清型に対する広域な免疫を誘発するために使用することができる、特定のインフルエンザ抗原の複数のサブタイプのアラインメントの分析に基づき構成された、合成核酸配列、または対応するポリペプチド配列を意味するために使用される。コンセンサスインフルエンザ抗原は、コンセンサスＨ１、Ｈ２、Ｈ３、またはＨ５を含むＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、マトリクスタンパク質、および非構造タンパク質を含む。また、融合タンパク質（例えば、Ｍ２ｅ−ＮＰ）等の合成抗原を、コンセンサス配列（またはコンセンサス抗原）に操作することができる。
【００２５】
本明細書において、「アジュバント」という用語は、ＤＮＡプラスミドおよび以下に記載するコード核酸配列によってコード化されたインフルエンザ抗原の抗原性を強化するために、本明細書に記載するＤＮＡプラスミドワクチンに追加されるいかなる分子も意味するために使用される。
【００２６】
「サブタイプ」または「血清型」という用語は、本明細書で交換可能に、およびインフルエンザウイルスに関して使用され、１つのサブタイプが免疫系によって異なるサブタイプとは別に認識される（または、言い換えると、それぞれのサブタイプが異なるサブタイプと抗原特性において異なる）ように、１つのインフルエンザウイルス抗原の遺伝的変異体を意味する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、哺乳類の細胞内にコンセンサスインフルエンザ抗原を発現することが可能なＤＮＡプラスミドがあり、コンセンサスインフルエンザ抗原は、コンセンサス血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリクスタンパク質、核タンパク質、Ｍ２外部ドメイン−核タンパク質（Ｍ２ｅ−ＮＰ）、またはそれらの組み合わせを含む。好適には、コンセンサスインフルエンザ抗原は、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ２ｅ−ＮＰ、またはそれらの組み合わせを含む。ＤＮＡプラスミドは、コンセンサスインフルエンザ抗原をコード化するコード配列に機能し得るように連結したプロモータを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本発明は、哺乳類において複数のインフルエンザウイルスサブタイプに対する免疫応答を誘発することが可能なＤＮＡプラスミドワクチンを提供し、ＤＮＡプラスミドワクチンは、ＤＮＡプラスミドおよび薬学的に許容可能な賦形剤を含む。ＤＮＡプラスミドは、哺乳類の細胞内に哺乳類において免疫応答を誘発するのに有効な量のコンセンサスインフルエンザ抗原を発現することが可能であり、コンセンサスインフルエンザ抗原は、コンセンサス血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリクスタンパク質、核タンパク質、Ｍ２外部ドメイン−核タンパク質（Ｍ２ｅ−ＮＰ）、またはそれらの組み合わせを含む。好適には、コンセンサスインフルエンザ抗原は、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ２ｅ−ＮＰ、またはそれらの組み合わせを含む。ＤＮＡプラスミドは、コンセンサスインフルエンザ抗原をコード化するコード配列に機能し得るように連結したプロモータを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンは、１ｍｇ／ｍｌ以上の総ＤＮＡプラスミドの濃度を有するものである。免疫応答は、細胞性または体液性応答、もしくはその両方であってもよく、好適には、免疫応答は、細胞性および体液性の両方である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、コード配列のＮ末端の端部に付着し、プロモータに機能し得るように結合したＩｇＧリーダー配列をさらに含むことができる。また、いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、コード配列のＣ末端の端部に付着したポリアデニル化配列をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、コドン最適化される。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンは、アジュバントをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、アジュバントは、αインターフェロン、γインターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ａｔｔｒａｃｔｉｎｇ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｈｙｍｕｓ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６（シグナル配列を欠失し、任意にＩｇＥからのシグナルペプチドを含むＩＬ−１５を含む）から成る群から選択される。有用なアジュバントであり得る他の遺伝子は、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌα、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮細胞成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能的フラグメントをコード化する遺伝子を含む。いくつかの好ましい実施形態では、アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、またはＭＥＣから選択される。
【００３１】
いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な賦形剤は、以下を含み得るトランスフェクション促進剤である：免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）等の表面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含むＬＰＳアナログ、ムラミルペプチド、キノンアナログ、スクアレンおよびスクアレン等のベシクル、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、もしくは他の公知のトランスフェクション促進剤。好適には、トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリ−Ｌ−グルタミン酸塩（ＬＧＳ）を含むポリカチオン、または脂質である。好適には、トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸塩であり、さらに好適には、ポリ−Ｌ−グルタミン酸塩は、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度でＤＮＡプラスミドワクチン内に存在する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチン内のポリ−Ｌ−グルタミン酸塩の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンは、複数の異なるＤＮＡプラスミドを含むことができる。いくつかの実施例では、異なるＤＮＡプラスミドは、コンセンサスＨＡをコード化する核酸配列を含むＤＮＡプラスミド、コンセンサスＮＡをコード化する配列を含むＤＮＡプラスミド、およびコンセンサスＭ２ｅ−ＮＰをコード化する配列を含むＤＮＡプラスミドを含む。いくつかの実施形態では、コンセンサスＨＡは、コンセンサスＨ１、コンセンサスＨ２、コンセンサスＨ３、またはコンセンサスＨ５である。好適には、コンセンサスＨＡは、配列番号１（Ｈ５Ｎ１ＨＡコンセンサスＤＮＡ）、配列番号９（コンセンサスＨ１ＤＮＡ）、配列番号１１（コンセンサスＨ３ＤＮＡ）、または配列番号１３（コンセンサスＨ５）であるヌクレオチド配列である。コンセンサスＨＡは、配列番号２、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４のポリペプチド配列をコード化するヌクレオチド配列であってもよい。いくつかの実施形態では、コンセンサスＮＡは、配列番号３であるヌクレオチド配列、または配列番号４のポリペプチド配列をコード化するヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、コンセンサスＭ２ｅ−ＮＰは、配列番号７であるヌクレオチド配列、または配列番号８のポリペプチド配列をコード化するヌクレオチド配列である。好適な一実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンは、コンセンサスＨ１をコード化する配列を含むＤＮＡプラスミド、コンセンサスＨ２をコード化する配列を含むＤＮＡプラスミド、コンセンサスＨ３をコード化する配列を含むＤＮＡプラスミド、コンセンサスＨ５をコード化する配列を含むＤＮＡプラスミド、コンセンサスＮＡをコード化する配列を含むＤＮＡプラスミド、および、コンセンサスＭ２ｅ−ＮＰをコード化する配列を含むＤＮＡプラスミドを含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンは、コンセンサスインフルエンザ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミド、および１つのインフルエンザサブタイプ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドを含む、複数の異なるＤＮＡプラスミドを含むことができる。いくつかの実施例では、コンセンサス抗原を発現する異なるＤＮＡプラスミドは、コンセンサスＨＡをコード化する核酸配列を含むＤＮＡプラスミド、コンセンサスＮＡをコード化する配列を含むＤＮＡプラスミド、およびコンセンサスＭ２ｅ−ＮＰをコード化する配列を含むＤＮＡプラスミドを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンは、コンセンサスＨＡ抗原、例えば、コンセンサスＨ１、Ｈ３、またはＨ５を発現することができるＤＮＡプラスミド、および以下のインフルエンザＡ抗原のうちのいずれか１つを発現することができるＤＮＡプラスミドを含む：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、もしくはＮＥＰ、またはそれらの組み合わせ。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンは、コンセンサスＮＡ抗原を発現することができるＤＮＡプラスミド、および以下のインフルエンザＡ抗原のうちのいずれか１つを発現することができるＤＮＡプラスミドを含む：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、もしくはＮＥＰ、またはそれらの組み合わせ。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンは、コンセンサスＭ２ｅ−ＮＰを発現することができるＤＮＡプラスミド、および以下のインフルエンザＡ抗原のうちのいずれか１つを発現することができるＤＮＡプラスミドを含む：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、もしくはＮＥＰ、またはそれらの組み合わせ。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンは、免疫応答を誘発するように哺乳類に送達することができ、好適には、哺乳類は、ヒトおよび非ヒト霊長類を含む霊長類、ウシ、ブタ、ニワトリ、イヌ、またはフェレットである。さらに好適には、哺乳類は、ヒト霊長類である。
【００３５】
本発明の一態様は、哺乳類における複数のインフルエンザウイルスサブタイプに対する免疫応答を誘発するための方法に関する。この方法は、ＤＮＡプラスミドワクチンを哺乳類の組織に送達するステップ、ならびに細胞においてＤＮＡプラスミドの進入を可能にするのに効果的な定電流でのエネルギーのパルスを使用して組織の細胞を電気穿孔するステップを含み、このＤＮＡプラスミドワクチンは、哺乳類の細胞内でコンセンサスインフルエンザ抗原を発現して哺乳類において免疫応答を誘発することが可能なＤＮＡプラスミドを含み、このコンセンサスインフルエンザ抗原は、コンセンサスＨＡ、ＮＡ、Ｍ２ｅ−ＮＰ、またはそれらの組み合わせを含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＤＮＡプラスミドワクチンを皮内、皮下、または筋組織内に注入するステップを含む、送達ステップを含む。好適には、これらの方法は、生体内電気穿孔デバイスを使用して、組織に送達するのに所望される電流を予め設定するステップと、予め設定された電流と同等の定電流でのエネルギーのパルスを使用して組織の細胞を電気穿孔するステップを含む。いくつかの実施形態では、電気穿孔するステップは、電気穿孔された細胞内のインピーダンスを測定するステップと、測定されたインピーダンスと比較してエネルギーのパルスのエネルギーレベルを調節し、電気穿孔された細胞内の定電流を維持するステップとをさらに含み、ここで測定および調節ステップは、エネルギーのパルスの寿命内に行われる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、電気穿孔するステップは、分散パターンでエネルギーのパルスを送達するパルスシーケンスのパターンに従い、エネルギーのパルスを複数の電極に送達するステップを含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡプラスミドインフルエンザワクチンは、コンセンサスＨＡ、またはコンセンサスＨＡをコード化するヌクレオチド配列、および配列番号４、６、および８から成る群から選択されるインフルエンザタンパク質をコード化する核酸配列を含む。配列番号１および１３は、それぞれ、インフルエンザウイルスのコンセンサスＨ５Ｎ１  ＨＡおよびＨ５をコード化する核酸配列を含む。配列番号２および１４は、それぞれ、インフルエンザウイルスのＨ５Ｎ１  ＨＡおよびＨ５のアミノ酸配列を含む。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のワクチンは、配列番号３または配列番号４を含む。配列番号３は、インフルエンザＨ１Ｎ１およびＨ５Ｎ１（Ｈ１Ｎ１／Ｈ５Ｎ１）ＮＡコンセンサス配列をコード化する核酸配列を含む。配列番号４は、インフルエンザＨ１Ｎ１／Ｈ５Ｎ１ＮＡコンセンサス配列のアミノ酸配列を含む。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のワクチンは、配列番号５または配列番号６を含む。配列番号５は、インフルエンザＨ１Ｎ１／Ｈ５Ｎ１  Ｍ１コンセンサス配列をコード化する核酸配列を含む。配列番号６は、インフルエンザＨ１Ｎ１／Ｈ５Ｎ１  Ｍ１コンセンサス配列のアミノ酸配列を含む。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のワクチンは、配列番号７または配列番号８を含む。配列番号７は、インフルエンザＨ５Ｎ１  Ｍ２Ｅ−ＮＰコンセンサス配列をコード化する核酸配列を含む。配列番号８は、インフルエンザＨ５Ｎ１  Ｍ２Ｅ−ＮＰコンセンサス配列のアミノ酸配列を含む。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のワクチンは、配列番号９または配列番号１０を含む。配列番号９は、インフルエンザＨ１Ｎ１  ＨＡコンセンサス配列をコード化する核酸配列を含む。配列番号４は、インフルエンザＨ１Ｎ１  ＨＡコンセンサス配列のアミノ酸配列を含む。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のワクチンは、配列番号１１または配列番号１２を含む。配列番号１１は、インフルエンザＨ３Ｎ１ＨＡコンセンサス配列をコード化する核酸配列を含む。配列番号１２は、インフルエンザＨ３Ｎ１ＨＡコンセンサス配列のアミノ酸配列を含む。インフルエンザウイルス株Ｈ５Ｎ１ＨＡのコンセンサス配列は、配列番号１または配列番号１３に示す免疫優勢エピトープを含む。配列番号１でコード化されるインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１  ＨＡアミノ酸配列は、配列番号２であり、配列番号１３でコード化されるそれは、配列番号１４である。インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１／Ｈ５Ｎ１  ＮＡのコンセンサス配列は、配列番号３に示す免疫優勢エピトープを含む。配列番号３でコード化されるインフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１／Ｈ５Ｎ１  ＮＡアミノ酸配列は、配列番号４である。インフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１／Ｈ５Ｎ１  Ｍ１のコンセンサス配列は、配列番号５に示す免疫優勢エピトープを含む。配列番号５でコード化されるインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１／Ｈ５Ｎ１  Ｍ１アミノ酸配列は、配列番号６である。インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１  Ｍ２Ｅ−ＮＰのコンセンサス配列は、配列番号７に示す免疫優勢エピトープを含む。配列番号７でコード化されるインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１  Ｍ２Ｅ−ＮＰアミノ酸配列は、配列番号８である。本発明のワクチンは、上述の核酸分子でコード化されるタンパク質産物またはタンパク質の任意のフラグメントを含んでもよい。
【００３９】
本発明は、少なくとも１つのインフルエンザサブタイプの非フラグメントの応答と実質的に同様な、哺乳類における免疫応答を誘発することが可能なポリペプチドをコード化するＤＮＡフラグメントをも含む。ＤＮＡフラグメントは、配列番号１、３、５、７、９、１１、および１３を含む、本発明のさまざまなコード化ヌクレオチド配列の少なくとも１つから選択されるフラグメントであり、それは本明細書に提供する特定のコード核酸配列に適用されるため、以下に記載するＤＮＡフラグメントのいずれかであってもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡフラグメントは、３０以上、４５以上、６０以上、７５以上、９０以上、１２０以上、１５０以上、１８０以上、２１０以上、２４０以上、２７０以上、３００以上、３６０以上、４２０以上、４８０以上、５４０以上、６００以上、６６０以上、７２０以上、７８０以上、８４０以上、９００以上、９６０以上、１０２０以上、１０８０以上、１１４０以上、１２００以上、１２６０以上、１３２０以上、１３８０以上、１４４０以上、１５００以上、１５６０以上、１６２０以上、１６８０以上、もしくは１７４０以上のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡフラグメントは、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）リーダー配列のためのコード配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡフラグメントは、６０未満、７５未満、９０未満、１２０未満、１５０未満、１８０未満、２１０未満、２４０未満、２７０未満、３００未満、３６０未満、４２０未満、４８０未満、５４０未満、６００未満、６６０未満、７２０未満、７８０未満、８４０未満、９００未満、９６０未満、１０２０未満、１０８０未満、１１４０未満、１２００未満、１２６０未満、１３２０未満、１３８０未満、１４４０未満、１５００未満、１５６０未満、１６２０未満、１６８０未満、または１７４０未満のヌクレオチドを含むことができる。好適には、ＤＮＡフラグメントは、配列番号１、３、７、９、１１、または１３のフラグメント、さらに好適には、配列番号１、５、９、１１、または１３のフラグメント、よりさらに好適には、配列番号１、９、または１３のフラグメントである。
【００４０】
本発明は、少なくとも１つのインフルエンザサブタイプの非フラグメントの応答と実質的に同様な、哺乳類における免疫応答を誘発することが可能なポリペプチドフラグメントをも含む、ポリペプチドフラグメントは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、および１４を含む、本発明のさまざまなポリペプチド配列の少なくとも１つから選択され、それは本明細書に提供する特定のポリペプチド配列に適用されるため、以下に記載するポリペプチドフラグメントのいずれかであってもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドフラグメントは、１５以上、３０以上、４５以上、６０以上、７５以上、９０以上、１０５以上、１２０以上、１５０以上、１８０以上、２１０以上、２４０以上、２７０以上、３００以上、３６０以上、４２０以上、４８０以上、５４０以上、もしくは５６５以上のアミノ酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドフラグメントは、３０未満、４５未満、６０未満、７５未満、９０未満、１２０未満、１５０未満、１８０未満、２１０未満、２４０未満、２７０未満、３００未満、３６０未満、４２０未満、４８０未満、５４０未満、５６５未満のアミノ酸を含むことができる。好適には、ポリペプチドフラグメントは、配列番号２、４、８、１０、１２、または１４のフラグメントであり、さらに好適には、配列番号２、６、１０、１２、または１４のフラグメントであり、よりさらに好適には、配列番号２、１０、または１４のフラグメントである。
【００４１】
少なくとも１つのインフルエンザサブタイプの非フラグメントの応答と実質的に同様な、哺乳類における免疫応答を誘発するフラグメントの決定は、当業者によって容易に決定することができる。フラグメントは、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙのインフルエンザ配列データベース等の公的に入手可能なデータベースで提供される、少なくとも１つ、好適には、それ以上の抗原エピトープを含むように分析することができる。また、免疫応答の研究は、以下の実施例に示すとおり、マウス、ならびにＨＩ力価およびＥＬＩＳｐｏｔｓを使用してルーチン的に評価することができる。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によると、複数のインフルエンザウイルスに対する哺乳類の免疫応答を誘導または誘発する方法は、ａ）インフルエンザ株Ｈ５Ｎ１コンセンサスＨＡタンパク質、その機能的フラグメント、またはその発現可能なコード配列、およびｂ）本明細書に提供する、１つ以上の単離されたコード核酸分子、そのような核酸分子によってコード化されるタンパク質、またはそのフラグメントを哺乳類に投与するステップを含む。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によると、複数のインフルエンザウイルスに対する哺乳類の免疫応答を誘導または誘発する方法は、ａ）インフルエンザ株Ｈ１Ｎ１およびインフルエンザ株Ｈ５Ｎ１コンセンサスＮＡタンパク質、その機能的フラグメント、またはその発現可能なコード配列、およびｂ）本明細書に提供する、１つ以上の単離されたコード核酸分子、そのような核酸分子によってコード化されるタンパク質、またはそのフラグメントを哺乳類に投与するステップを含む。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によると、複数のインフルエンザウイルスに対する哺乳類の免疫応答を誘導または誘発する方法は、ａ）インフルエンザ株Ｈ１Ｎ１およびインフルエンザ株Ｈ５Ｎ１コンセンサスＭ１タンパク質、その機能的フラグメント、またはその発現可能なコード配列、およびｂ）本明細書に提供する、１つ以上の単離されたコード核酸分子、そのような核酸分子によってコード化されるタンパク質、またはそのフラグメントを哺乳類に投与するステップを含む。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によると、複数のインフルエンザウイルスに対する哺乳類の免疫応答を誘導または誘発する方法は、ａ）インフルエンザ株Ｈ５Ｎ１  Ｍ２Ｅ−ＮＰコンセンサスタンパク質、その機能的フラグメント、またはその発現可能なコード配列、およびｂ）本明細書に提供する、１つ以上の単離されたコード核酸分子、そのような核酸分子によってコード化されるタンパク質、またはそのフラグメントを哺乳類に投与するステップを含む。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によると、複数のインフルエンザウイルスに対する哺乳類の免疫応答を誘導または誘発する方法は、ａ）インフルエンザ株Ｈ１Ｎ１  ＨＡコンセンサスタンパク質、その機能的フラグメント、またはその発現可能なコード配列、およびｂ）本明細書に提供する、１つ以上の単離されたコード核酸分子、そのような核酸分子によってコード化されるタンパク質、またはそのフラグメントを哺乳類に投与するステップを含む。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によると、複数のインフルエンザウイルスに対する哺乳類の免疫応答を誘導または誘発する方法は、ａ）インフルエンザ株Ｈ３Ｎ１  ＨＡコンセンサスタンパク質、その機能的フラグメント、またはその発現可能なコード配列、およびｂ）本明細書に提供する、１つ以上の単離されたコード核酸分子、そのような核酸分子によってコード化されるタンパク質、またはそのフラグメントを哺乳類に投与するステップを含む。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のワクチンは、以下の配列のうちの少なくとも２つを含む：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４、または前述のリストからの２つ以上の配列の任意の組み合わせ。
【００４９】
ワクチン
いくつかの実施形態では、本発明は、タンパク質、および免疫応答が誘導され得る免疫原としてタンパク質を特に有効にするエピトープを有するタンパク質をコード化する遺伝的構築物を提供することによって、改善されたワクチンを提供する。したがって、ワクチンは、治療的または予防的免疫応答を誘導するために提供することができる。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態によると、本発明に従うワクチンは、個体に送達され、個体の免疫系の活性を調節し、それによって、免疫応答を強化する。タンパク質をコード化する核酸分子が、個体の細胞によって取り込まれるとき、ヌクレオチド配列は、細胞内に発現し、それによって、タンパク質は、個体に送達される。本発明の態様は、プラスミド等の核酸分子上のタンパク質のコード配列を送達する方法を提供する。
【００５１】
本発明のいくつかの態様によると、個体を予防的および／または治療的に免疫化する組成物および方法が提供される。
【００５２】
細胞によって取り込まれるとき、ＤＮＡプラスミドは、別個の遺伝物質として、存在し続けることができる。あるいは、ＲＮＡは、細胞に投与されてもよい。動原体、テロメア、および複製起点を含む、線状ミニ染色体としての遺伝的構築物を提供することも意図する。遺伝的構築物は、核酸分子の遺伝子発現に必要な調節エレメントを含む。これらのエレメントとしては、プロモータ、開始コドン、終止コドン、およびポリアデニル化シグナルが挙げられる。さらに、エンハンサは、しばしば、標的タンパク質、または免疫調節タンパク質をコード化する配列の遺伝子発現に必要とされる。これらのエレメントは、所望のタンパク質をコード化する配列に機能し得るように連結され、調節エレメントは、それらが投与される個体内で機能し得るものであることが必要である。
【００５３】
一般的に、開始コドンおよび終止コドンは、所望のタンパク質をコード化するヌクレオチド配列の一部であると考えられる。しかしながら、これらのエレメントは、核酸構造が投与される哺乳類において機能的であることが必要である。開始および終止コドンは、コード配列とインフレームでなければならない。
【００５４】
使用するプロモータおよびポリアデニル化シグナルは、個体の細胞内で機能的でなければならない。
【００５５】
本発明の実施、特にヒトの遺伝子ワクチンの産生において有用なプロモータの例は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）からのプロモータ、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）等のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモータ、モロニーウイルス、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、ＣＭＶ最初期プロモータ等のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ならびに、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、およびヒトメタロチオネイン等のヒト遺伝子からのプロモータを含むが、これらに限定されず、他の実施形態では、プロモータは、天然型または合成の筋肉または皮膚に特異的なプロモータ等、組織に特異的なプロモータであってもよい。そのようなプロモータの例は、米国特許出願公開第ＵＳ２００４０１７５７２７号に記載され、参照することにより全体が組み込まれる。
【００５６】
本発明の実施、特に、ヒトの遺伝子ワクチンの産生において有用なポリアデニル化シグナルの例は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、およびヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルを含むが、これらに限定されない。特に、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと称される、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）内にあるＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを、使用することができる。
【００５７】
ＤＮＡ発現に必要な調節エレメントの他に、ＤＮＡ分子には、他のエレメントも含まれ得る。そのような付加的エレメントは、エンハンサを含む。エンハンサは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ならびにＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶからのウイルスエンハンサ等のウイルスエンハンサを含むが、これらに限定されない群から選択されてもよい。
【００５８】
遺伝的構築物は、染色体外にこの構築物を維持し、細胞内に複数コピーの構築物を産生するために、哺乳類の複製起点とともに提供され得る。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）のプラスミドｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４、およびｐＲＥＰ４は、エプスタイン・バー・ウイルス複製起点、および組み込みすることなく高コピーのエピソーム複製を産生する核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含む。
【００５９】
タンパク質産生を最大限にするために、構築物が投与される細胞における遺伝子発現のために好適である調節配列が選択されてもよい。また、該タンパク質をコード化するコドンは、宿主細胞内に最も効果的に転写されるように選択されてもよい。当業者は、細胞内で機能的であるＤＮＡ構築物を生成することができる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するタンパク質のコード配列が、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される核酸構築物が提供され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するタンパク質は、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される。
【００６１】
例えば、タンパク質が使用される、いくつかの実施形態では、当業者は、周知の技術を使用して、周知の技術を使用する本発明のタンパク質を産生および単離することができる。例えば、タンパク質が使用される、いくつかの実施形態では、当業者は、周知の技術を使用して、本発明のタンパク質をコード化するＤＮＡ分子を周知の発現系に使用する市販の発現ベクターに挿入することができる。例えば、市販のプラスミドｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．）は、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）におけるタンパク質の産生に使用されてもよい。例えば、市販のプラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．）は、酵母のサッカロマイセス・セレヴィシエ株における産生に使用されてもよい。例えば、市販のＭＡＸＢＡＣＴＭ完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．）は、昆虫細胞における産生に使用されてもよい。例えば、市販のプラスミドｐｃＤＮＡＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．）は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳類の細胞における産生に使用されてもよい。当業者は、慣用技術、および容易に入手可能な出発物質によって、これらの市販の発現ベクターおよび系、またはその他を使用して、タンパク質を産生することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）参照）。したがって、所望のタンパク質は、原核細胞および真核細胞系の両方で調製することができ、それによって、広範なプロセシングされた形態のタンパク質がもたらされる。
【００６２】
当業者は、他の市販の発現ベクターおよび系を使用してもよい、または周知の方法および容易に入手可能な出発物質を使用してベクターを産生してもよい。プロモータおよびポリアデニル化シグナル等の必要な制御配列を含む発現系、および好適にはエンハンサは、容易に入手可能であり、さまざまな宿主に関して当該技術分野において知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）を参照されたい。遺伝的構築物は、構築物が形質移入される細胞株、または標的組織の細胞内で機能的であるプロモータに機能し得るように連結されたタンパク質コード配列を含む。構成的プロモータの例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはＳＶ４０からのプロモータを含む。誘導可能なプロモータの例は、マウス乳房白血病ウイルス、またはメタロチオネインプロモータを含む。当業者は、容易に入手可能な出発物質から、本発明のタンパク質をコード化するＤＮＡで細胞を形質移入するのに有用な遺伝的構築物を容易に生成することができる。タンパク質をコード化するＤＮＡを含む発現ベクターを使用して、適合性のある宿主を形質転換し、次いで、これを外来ＤＮＡの発現が行われる条件下で培養し、維持する。
【００６３】
産生されたタンパク質は、当該技術分野において適切かつ周知のとおり、細胞を溶解することによるか、または培地からのいずれかで、培養物から回収される。当業者は、周知の技術を使用して、そのような発現系を使用して産生されるタンパク質を単離することができる。上述のとおり特定のタンパク質に特異的に結合する抗体を使用して天然源からタンパク質を精製する方法は、組み換えＤＮＡ方法によって産生されたタンパク質を精製するステップに同様に適用されてもよい。
【００６４】
組み換え技術によってタンパク質を産生する他に、単離された、本質的に純粋なタンパク質を産生するために、自動ペプチド合成器も使用してもよい。そのような技術は、当業者には周知であり、置換を有する誘導体がＤＮＡでコード化されたタンパク質産生に提供されない場合に有用である。
【００６５】
核酸分子は、生体内電気穿孔、リポソーム媒介、ナノ粒子促進、組み換えベクター（例えば、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス関連のウイルス、および組み換えワクシニア）を使用するおよび使用しない、ＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも称される）を含む、いくつかの周知の技術のいずれかを使用して送達されてもよい。好適には、本明細書に記載するＤＮＡプラスミド等の核酸分子は、ＤＮＡ注入を介し、生体内電気穿孔とともに送達される。
【００６６】
投与経路は、筋肉内、鼻内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼内、および経口ならびに局所的、経皮的、吸入または坐薬によるか、あるいは粘膜組織に対するもの（例えば、膣、直腸、尿道、口腔、および舌下組織に対する洗浄による等）を含むが、それらに限定されない。好適な投与経路は、筋肉内、腹腔内、皮内、および皮下注入を含む。遺伝的構築物は、従来の注射器、無針注入デバイス、「マイクロプロジェクタイルボンバードメント遺伝子銃」、もしくは電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、または超音波等の他の物理的方法を含むが、それらに限定されない方法で投与されてもよい。
【００６７】
本発明のＤＮＡワクチンの送達を促進するのに好適な電気穿孔デバイスおよび電気穿孔方法の例は、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらの米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらによって提出された米国特許広報第２００５／００５２６３０号に記載されるものを含み、その内容は、参照することによりその全体が組み込まれる。また、２００７年１０月１７日に出願され、３５ＵＳＣ１１９（ｅ）に基づき、２００６年１０月１７日に出願された米国特許仮出願第６０／８５２，１４９号および２００７年１０月１０日に出願された第６０／９７８，９８２号における利益を主張する、同時係属および共同所有の米国特許出願第１１／８７４０７２号に提供されるＤＮＡワクチンの送達を促進する電気穿孔デバイスおよび電気穿孔方法も好適であり、それらすべては参照することによりその全体が組み込まれる。好適には、電気穿孔デバイスは、筋肉内（ＩＭ）および皮内（ＩＤ）モデルを含む、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡＴＭデバイス（ＶＧＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｂｌｕｅ  Ｂｅｌｌ，  ＰＡ）である。
【００６８】
Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらの米国特許第７，２４５，９６３号は、体内または植物内の選択した組織の細胞への生体分子の導入を促進するためのシステムおよびそれらの使用を記載する。モジュラ電極システムは、複数の針電極、皮下注射針、プログラム可能な定電流パルスコントローラから複数の針電極への導電連結を提供する電気コネクタ、および電源を含む。操作者は、支持構造上に載置される複数の針電極を保持し、それらを体内または植物内の選択した組織内にしっかりと挿入することができる。次いで、生体分子は、皮下注射針を介して選択した組織に送達される。プログラム可能な定電流パルスコントローラは、活性化され、定電流電気パルスは、複数の針電極に印加される。印加した定電流電気パルスは、複数の電極の間の細胞内への生体分子の導入を促進する。米国特許第７，２４５，９６３号の全体の内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００６９】
Ｓｍｉｔｈらによって提出された、米国特許広報第２００５／００５２６３０号は、体内または植物内の選択した組織の細胞内への生体分子の導入を効果的に促進するために使用されてもよい電気穿孔デバイスを記載する。電気穿孔デバイスは、その動作がソフトウエアまたはファームウエアによって特定される、動電デバイス（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｋｉｎｅｔｉｃ  ｄｅｖｉｃｅ）（「ＥＫＤ」）を含む。ＥＫＤデバイスは、ユーザ制御およびパルスパラメータの入力に基づき、アレイ内の電極の間の一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生成し、電流波形データの保存および取得を可能にする。電気穿孔デバイスは、針電極のアレイを有する交換可能な電極ディスク、注射針のための中心注入チャネル、および取り外し可能なガイドディスクをも含む。米国特許広報第２００５／００５２６３０号の全体の内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００７０】
米国特許第７，２４５，９６３号、および米国特許広報第２００５／００５２６３０号に記載される電極アレイおよび方法は、筋肉等の組織だけでなく、他の組織または臓器内の深部への侵入にも適合される。電極アレイの構成により、（選択する生体分子を送達するための）注射針は、標的臓器内に完全に挿入され、注入は、電極によって予め区画された領域内の標的組織に垂直に投与される。好適には、米国特許第７，２４５，９６３号、および米国特許広報第２００５／００５２６３号に記載される電極は、２０ｍｍの長さで、２１ゲージである。  
【００７１】
以下は、本発明の方法の実施例であり、上述の特許参考文献でより詳細に記載される：電気穿孔デバイスは、ユーザによって予め設定された電流入力と同様の定電流を産生するエネルギーのパルスを哺乳類の所望の組織に送達するように構成することができる。電気穿孔デバイスは、電気穿孔コンポーネント、および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを含む。電気穿孔コンポーネントは、コントローラ、電流波形発生器、インピーダンス試験器、波形ロガー、入力要素、状況報告要素、通信ポート、メモリコンポーネント、電源、および電源スイッチを含む、電気穿孔デバイスのさまざまな要素の１つ以上を含み、組み込むことができる。電気穿孔コンポーネントは、電気穿孔デバイスの１つの要素として機能することができ、他の要素は、電気穿孔コンポーネントと通信する別個の要素（またはコンポーネント）である。いくつかの実施形態では、電気穿孔コンポーネントは、電気穿孔コンポーネントから分離した電気穿孔デバイスのなお他の要素と通信することができる、電気穿孔デバイスの１つより多い要素として機能することができる。本発明は、要素が１つのデバイスとしてか、または互いと通信する別個の要素として機能することができるため、電気機械または機械デバイスの一部として存在する電気穿孔デバイスの要素によって制限されない。電気穿孔コンポーネントは、所望の組織内に定電流を生成するエネルギーのパルスを送達することが可能であり、フィードバック機構を含む。電極アセンブリは、空間的に配置された複数の電極を有する電極アレイを含み、電極アセンブリは、電気穿孔コンポーネントからのエネルギーのパルスを受信し、それを電極を介して所望の組織に送達する。複数の電極の少なくとも１つは、エネルギーのパルスの送達中に中性であり、所望の組織内のインピーダンスを測定し、インピーダンスを電気穿孔コンポーネントに伝達する。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受信することができ、定電流を維持するために電気穿孔コンポーネントによって送達されたエネルギーのパルスを調節することができる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、複数の電極は、分散パターンのエネルギーのパルスを送達することができる。いくつかの実施形態では、複数の電極は、プログラムされたシーケンスの下で電極の制御を介して分散パターンのエネルギーのパルスを送達することができ、プログラムされたシーケンスは、ユーザによって電気穿孔コンポーネントに入力される。いくつかの実施形態では、プログラムされたシーケンスは、シーケンスで送達された複数のパルスを含み、複数のパルスのそれぞれのパルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を有する、少なくとも２つの活性電極によって送達され、複数のパルスの続くパルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を有する、少なくとも２つの活性電極のうちの異なる１つによって送達される。
【００７３】
いくつかの実施形態では、フィードバック機構は、ハードウエアまたはソフトウエアのいずれかによって実施される。好適には、フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路によって実施される。好適には、このフィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓ、または１μｓ毎に生じるが、好適には、リアルタイムフィードバックまたは瞬間（つまり、応答時間を決定するための使用可能な技術によって決定されるとおり、実質的に瞬間）である。いくつかの実施形態では、中性電極は、所望の組織内のインピーダンスを測定し、インピーダンスをフィードバック機構に伝達し、フィードバック機構は、インピーダンスに応答して、予め設定された電流と同様の値で定電流を維持するためにエネルギーのパルスを調節する。いくつかの実施形態では、フィードバック機構は、エネルギーのパルスの送達中に継続的かつ瞬間的に定電流を維持する。
【００７４】
薬学的に許容可能な賦形剤は、公知であり、公衆に容易に入手可能である、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤のような、機能的な分子を含むことができる。好適には、薬学的に許容可能な賦形剤は、アジュバントまたはトランスフェクション促進剤である。いくつかの実施形態では、核酸分子、またはＤＮＡプラスミドは、ポリヌクレオチド機能エンハンサまたは遺伝子ワクチン促進剤（またはトランスフェクション促進剤）の投与と組み合わせて細胞に送達される。ポリヌクレオチド機能エンハンサは、米国第５，５９３，９７２号、５，９６２，４２８号、および１９９４年１月２６日に出願された、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９号に記載され、それらは、参照することにより本明細書に組み込まれる。遺伝子ワクチン促進剤は、１９９４年４月１日に出願された、米国第０２１，５７９号に記載され、それは、参照することにより本明細書に組み込まれる。トランスフェクション促進剤は、核酸分子との混合物として、核酸分子と組み合わせて投与する、または核酸分子の投与と同時、投与前、または投与後に別個に投与することができる。トランスフェクション促進剤の例は、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）等の界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含むＬＰＳアナログ、ムラミルペプチド、キノンアナログ、およびスクアレンおよびスクアレン等のベシクルを含み、ヒアルロン酸は、遺伝的構築物と組み合わせて使用して、投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンは、脂質、ＤＮＡリポソーム混合物としての、レシチンリポソームまたは当該技術分野において周知の他のリポソームを含むリポソーム（例えば、国際公開第ＷＯ０９３２４６４０号参照）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子等のトランスフェクション促進剤、または他の周知のトランスフェクション促進剤をも含んでもよい。好適には、トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリ−Ｌ−グルタミン酸塩（ＬＧＳ）を含む、ポリカチオン、または脂質である。
【００７５】
いくつかの好適な実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、そのような標的タンパク質に対する免疫応答をさらに強化するタンパク質の遺伝子であるアジュバントとともに送達される。そのような遺伝子の例は、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＩＬ−１５（シグナル配列を欠失し、ＩｇＥ由来のシグナルペプチドを任意に含んだＩＬ−１５を含む）等の他のサイトカインおよびリンホカインをコード化する遺伝子である。有用であり得る他の遺伝子は、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌα、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、 神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼ、ＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、非活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能的フラグメントをコード化する遺伝子を含む。
【００７６】
本発明に従う医薬組成物は、約１ナノグラム〜１００ミリグラム、約１マイクログラム〜１０ミリグラム、または好適には、約０．１マイクログラム〜１０ミリグラム、またはさらに好適には、約１ミリグラム〜２ミリグラムのＤＮＡ量を含む。いくつかの好適な実施形態では、本発明に従う医薬組成物は、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好適な実施形態では、医薬組成物は、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好適な実施形態では、医薬組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好適な実施形態では、医薬組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好適な実施形態では、医薬組成物は、約２５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好適な実施形態では、医薬組成物は、約１００〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含む。
【００７７】
本発明に従う医薬組成物は、使用される投与様式に従い製剤される。医薬組成物が注入可能な医薬組成物である場合では、それらは、無菌、発熱物質を含まず、および微粒子を含まない。好適には、等張性製剤が使用される。一般的に、等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含むことができる。いくつかの場合では、リン酸緩衝生理食塩水等の等張性溶液が好適である。安定化剤は、ゼラチンおよびアルブミンを含む。いくつかの実施形態では、血管収縮剤が、製剤に添加される。いくつかの実施形態では、長期間の間、室温または周囲温度で製剤を安定化させることが可能なＬＧＳ、もしくは他のポリカチオンまたはポリアニオン等の安定化剤が、製剤に添加される。
【００７８】
いくつかの実施形態では、コンセンサスインフルエンザ抗原に対する哺乳類の免疫応答を誘発する方法は、粘膜免疫応答を誘導する方法を含む。そのような方法は、１つ以上のＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質、およびそれらの機能的フラグメント、または、それらの発現可能なコード配列を、上述のコンセンサスインフルエンザ抗原を含むＤＮＡプラスミドと組み合わせて、哺乳類に投与するステップを含む。１つ以上のＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質、およびそれらの機能的フラグメントを、本明細書に提供するＤＮＡプラスミドインフルエンザワクチンの投与前、その投与と同時、またはその投与後に投与してもよい。いくつかの実施形態では、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、およびそれらの機能的フラグメントから成る群から選択される、１つ以上のタンパク質をコード化する単離した核酸分子が、哺乳類に投与される。
【実施例】
【００７９】
本発明を、以下の実施例でさらに説明する。本発明の好適な実施形態を示しながら、これらの実施例は、説明目的のみで提供されることを理解されたい。上述の説明およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的特長を確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな使用および条件に適応するように本発明のさまざまな変更および修正を行うことができる。したがって、本明細書に示し、記載するものの他に、本発明のさまざまな修正は、前述の説明から当業者には明らかであろう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることも意図する。
【００８０】
好適には、本明細書に記載する筋肉または皮膚ＥＰデバイスとともに使用するＤＮＡ製剤は、高いＤＮＡ濃度、好適には、ミリグラム〜数十ミリグラムの量を含む濃度、好適には、皮膚への送達に最適である少容量、好適には、少注入量、理想的には、２５〜２００マイクロリットル（μＬ）中に数十ミリグラムの量のＤＮＡを有する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ製剤は、１ｍｇ／ｍｌ以上（ｍｇＤＮＡ／製剤容量）等の高いＤＮＡ濃度を有する。さらに好適には、ＤＮＡ製剤は、２００μＬの調製中のグラム量のＤＮＡ、さらに好適には、１００μＬの調製中のグラム量のＤＮＡを提供するＤＮＡ濃度を有する。
【００８１】
本発明のＥＰデバイスとともに使用するためのＤＮＡプラスミドは、公知のデバイスおよび技術を使用して製剤または製造することができるが、好適には、それらは、２００７年５月２３日に出願された、共同所有で同時係属の米国仮出願第６０／９３９，７９２号に記載される、最適化されたプラスミド製造技術を使用して製造される。いくつかの実施例では、これらの研究に使用されるＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上または同等の濃度で製剤することができる。製造技術は、２００７年７月３日に発行された、共同所有の米国特許第７，２３８，５２２号を含む、米国特許第６０／９３９７９２号に記載されるものの他に、当業者に一般的に公知のさまざまなデバイスおよびプロトコルも含むか、または援用する。本明細書に記載する皮膚ＥＰデバイスおよび送達技術とともに使用する高濃度のプラスミドにより、かなり小容量でＩＤ／ＳＣ空間内へのプラスミドの投与が可能になり、発現および免疫化効果の強化に役立つ。共同所有の出願および特許の米国第６０／９３９，７９２号、および米国特許第７，２３８，５２２号は、それぞれ、その全体が組み込まれる。
【００８２】
実施例１：プラスミド構築物
普遍的なサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータは、ｐＣＭＶ−ＳＥＡＰベクター内のヒト分泌性胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポータ導入遺伝子産物の発現を駆動する。プラスミドは、市販されるキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，  Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，  ＣＡ）を使用して得た。内毒素レベルは、Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｃｈｒｏｍａｇｅｎｉｃ  ＬＡＬ（Ｅｎｄｏｓａｆｅ，  Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ，  ＳＣ）で測定されるとおり、０．０１ＥＵ／μｇ未満であった。コンセンサスＨＡおよびＮＡ構築物は、ヒトに致命的であることが近年証明された１６個のＨ５ウイルス、および４０個以上のヒトＮ１ウイルスからの一次ウイルス配列を分析して生成した。これらの配列は、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙのインフルエンザ配列データベースからダウンロードした。コンセンサス配列を生成した後、構築物を、Ｋｏｚａｋ配列の追加、コドン最適化、およびＲＮＡ最適化を含む、哺乳類の発現のために最適化した。次いで、これらの構築物を、ｐＶＡＸベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）にサブクローニングした。特に記載がない限り、プラスミド調製物を、滅菌水内で希釈し、１％重量／重量のポリ−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム塩（ＬＧＳ）（ＭＷ＝１０．５ｋＤＡ平均）（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）とともに製剤し、さらにＶＧＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，  ＴＸ）でＨＰＬＣ精製した。
【００８３】
実施例２：ブタの治療
ブタは、合計４０匹のブタを１０個の群×１群当たり４匹のブタに分けた（表１）。ブタは、４日間順応させ、体重を計り、耳にタグをつけた。研究０日目に、ブタの体重を計り、採血し、ブタのための麻酔前組み合わせ（ケタミン−（２０ｍｇ／ｋｇ）、キシラジン−（２．２ｍｇ／ｋｇ）、およびアトロピン（０．０４ｍｇ／ｋｇ））を使用して麻酔をかけ、次いで、イソフルラン（５％で導入、２−３％で維持）を使用して麻酔をかけた。ブタ（ｎ＝４／群）は、０．６ｍＬのＣＭＶ−ＨＡ（コンセンサスＨ５抗原を発現するｐＶＡＸベースの構築物）、ＣＭＶ−ＮＡ（コンセンサスＮ１抗原を発現するｐＶＡＸベースの構築物）、およびＣＭＶ−ＳＥＡＰ（リポータ遺伝子である分泌性胚アルカリンホスファターゼ、ＳＥＡＰを発現する構築物）プラスミド（「筋損傷」評価のために、プラスミド濃度、および溶液の粘度を増加するために添加された最後のもの）ならびに１．０ｗｔ％／ｗｔＬＧＳで、変動するプラスミド濃度および電流強度において注入した。プラスミドは、実施例１に提供する物質および方法に従い、調製した。４秒後、動物は、５つの針電極を備え、以下のパルスパラメータ（５２ミリ秒パルス、パルス間の１秒、異なる電流（０．１、０．３および０．５Ａ）の３つのパルス）で動作する適応定電流ＣＥＬＬＥＣＴＲＡＴＭ筋肉内（ＩＭ）システム（ＶＧＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｂｌｕｅ  Ｂｅｌｌ，  ＰＡ）を使用して電気穿孔した。
【００８４】
【表１】
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それぞれの注入部位を囲繞する領域は、注入後１４日目および３５日目の生検の迅速な同定のために刺青をした。
【００８５】
ブタは、麻酔から回復させ、完全な回復を確実にするために２４時間密接に監視した。治療後２〜３時間以内に完全に回復しなかったあらゆるブタを、書きとめた。ブタは、体重を計り、１０日目、２１日目、および３５日目に採血した。ブタは、２１日目に２回目のワクチン接種を施した。血液は、２つの紫色の頂部のチューブ（ＣＢＣおよび鑑別のために１．０ｍＬ（Ａｎｔｅｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｉｒｖｉｎｅ，  ＣＡ）、ＨＡおよびＮＡ抗原に対するＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔｓのために１０ｍＬ）、および凝固させ、遠心分離して血清を単離する別個のファルコンチューブ内に収集し、次いで、氷上のチューブ内に等分した。３５日目に、すべてのブタは、麻酔の外科的平面下で放血させ、注入部位の針パンチ生検は、組織学に用いた。
【００８６】
血球凝集抑制（ＨＩ）アッセイ
ブタの血清を、３部のレセプター破壊酵素（ＲＤＥ）で１部の血清を希釈することによって、この酵素で処理し、３７℃の水浴で一晩インキュベートした。酵素は、５６℃で３０分間インキュベートすることによって不活化し、続いて、１／１０の最終希釈のために６部のＰＢＳを添加した。ＨＩアッセイは、以前に記載されるように、４ＨＡ単位のウイルスのおよび１％のウマの赤血球を使用して、Ｖ底９６ウェルマイクロタイタープレートで実施した（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，  Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，  １０３（１−２）：９１−５（Ｊｕｌｙ  ２００４））。
【００８７】
ＨＩアッセイで表された最大の力価（図２）は、０．５Ａの電流設定で２ｍｇのＨＡ発現プラスミドを投与された群由来の血清で見られ（１２０±４０、２ｍｇ／０．３Ａに対してＰ＝０．１１、そして２ｍｇ／０．１Ａに対してＰ＝０．０２）、力価は、２ｍｇのそれぞれのプラスミドを受容した群で電界の強度とともに減少し、電流のプラスミドの量のいずれかがその後減少する場合は、力価は、より変化しやすく、群間で差はなかった。
【００８８】
ＨＩ力価は、２ｍｇのＨＡ発現プラスミドが投与され、０．５Ａで電気穿孔された群で最大であった。さらに、力価は、０．５Ａで電気穿孔された群においてプラスミドの用量の減少、および電界の強度とともに減少する。低いプラスミド量、または低い電流強度は、群内の変動性を増加させるように見えた。
【００８９】
ＨＡおよびＮＡ  ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔｓ
以前に記載されるように、ＥＬＩＳｐｏｔを、ＩＦＮ−γ捕獲抗体および検出抗体（ＭａｂＴｅｃｈ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して実施した（Ｂｏｙｅｒ  ＪＤ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｐｒｉｍａｔｏｌ，  ３４（５−６）：２６２−７０（ＯＣＴ．２００５））。抗原特異的応答は、陰性対照ウェル内のスポット数をペプチドを含有するウェルから差し引いて決定した。結果は、三連のウェルから得られた平均値（スポット／百万の脾細胞）として示す。
【００９０】
０．３Ａの電流設定で、２ｍｇのそれぞれのプラスミド（総量４ｍｇ）を投与された群は、１００万個の細胞当たり５３７±３２２ＳＦＵのＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔｓで測定されるとおり、最大の細胞免疫応答を得た。その他のすべての群の平均の応答は、アッセイのバックグラウンドレベル内であった。最大の細胞免疫応答を得た２つの動物の個別のＥＬＩＳｐｏｔ反応を、図３に強調表示する。
【００９１】
ＣＢＣ結果
リンパ球は、研究の２１日目に電流設定にかかわらず、ワクチンの最大用量を投与された群において最大レベルに達したが、最大用量（４ｍｇの総プラスミド、それぞれ２ｍｇ）および最大電流設定（０．５Ａ）の群が、対照よりも４０％高い、最大のリンパ球応答を示す（それぞれ、１２６７０±１４１２対７６０７±１６０３リンパ球数／１００血液、Ｐ＜０．００２）。
【００９２】
筋肉組織病理学
ブタを放血させた後に、注入部位を同定し、治療後１４日目および３５日目にパンチ生検を行った。組織は、２４時間緩衝ホルマリン中で固定し、次いで、ＰＢＳ中で３回洗浄し、７０％のアルコール中で保管した。生検試料をＡｎｔｅｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓに提出し、そこで、それらを処理し、切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。すべてのスライドを、さまざまな組織層（表３）内の病理学的基準（表２）に関して０〜５にそれらを採点する単一の有資格病理学者によって評価した。平均得点は、それぞれの時点でそれぞれの群に対して算出した。
【００９３】
【表２】
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【００９４】
【表３】
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組織病理学は、プラスミド注入後１４および３５日目の筋生検（図４Ａ）および０〜５スケールの基準（表２）に基づくＥＰから採点した。電気穿孔に続く全体の病理学スコアは、１４日目から３５日目に組織層で減少した（表３）。０．３Ａ設定で６ｍｇの総プラスミドを受容した群は、最大平均リンパ球応答に相関して、１４日目で最大の総病理学スコアを呈した（１８．３±６．４、対照に対してＰ＜０．０００２）。３５日目のすべての病理学スコアは、治療されていない対照レベル（６．６７〜４．２５の範囲）のレベルに近づいた。それにもかかわらず、筋壊死および線維症（典型的にＥＰ手順と関連して）（Ｇｒｏｎｅｖｉｋ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ，  ７（２）：２１８−２７（２００５  Ｆｅｂ））が別個に分析されたとき（図４Ｂ）、スコアは、１および２の間の範囲であり、群間、または治療された群と対照との間で差異はない一方、より高いスコアは、免疫応答によるリンパ球性、形質細胞性、または好酸球性炎症に関連した。有意に、これらのスコアも、治療後１４日〜３５日に減少した。
【００９５】
データ分析
データを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓパッケージを使用して分析した。図に示す値は、平均±ＳＥＭである。具体的な値は、一方向ＡＮＯＶＡおよびその後のｔ検定を使用する比較で得た。ｐ＜０．０５の値は、統計的有意性のレベルとして設定した。
【００９６】
実施例３：フェレットの治療
生後４〜６ヶ月、または少なくとも１ｋｇの体重の２０匹のオスのフェレット（Ｔｒｉｐｌｅ  Ｆ  Ｆａｒｍｓ，  Ｓａｙｒｅ，  ＰＡ）を本研究に使用し、ＢＩＯＱＵＡＬ，  Ｉｎｃ．  （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）に収容した。フェレット研究設計は、表４である。動物は、研究前の２週間順応させた。動物は、０週目、４週目、および９週目に（麻酔下で）免疫化した。血液は、２週間毎に採血した。３回目の免疫化の後に、動物は、ＢＳＬ−３施設に移動し、トリインフルエンザ（Ｈ５Ｎ１）の非常に強力な株で１３週目に抗原投与し、次いで、抗原投与後さらに２週間追跡した。抗原投与後２週間、動物は、毎日監視され、体重、体温および臨床スコアを記録した。活動レベルを監視し、記録し、死亡を文書に記録した。
【００９７】
この研究では、フェレットのインフルエンザ抗原投与モデルにおいて、ＩＭに送達され、続いて、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡＴＭ適応定電流電気穿孔筋肉内（ＩＭ）システム（ＶＧＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｂｌｕｅ  Ｂｅｌｌ，  ＰＡ）を使用して電気穿孔することによるＨＡ、ＮＡ、およびＭ２ｅ−ＮＰＤＮＡワクチンの有効性を試験した。ＤＮＡプラスミドは、実施例１に提供する物質および方法に従い調製した。表４に概説されるとおり、群２、３、および４の動物は、０．２ｍｇのそれぞれのインフルエンザプラスミドワクチンを受けた。用量を訂正するために、１つのプラスミドワクチンを受けた群（群２および３）、またはワクチンを受けていない群（対照群１）で、あらゆる群のすべての動物が０．６ｍｇのプラスミドの総用量を受容するように、差異を、ｐＶＡＸ空ベクターによって補った。５つの針電極アレイを使用した、電気穿孔の条件は、０．５アンペア、５２ミリ秒パルス幅、パルス間で１秒、注入と電気穿孔との間で４秒の遅れであった。
【００９８】
【表４】
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血球凝集抑制（ＨＩ）アッセイ
血清を、３部のレセプター破壊酵素（ＲＤＥ）で１部の血清を希釈することによって、この酵素で処理し、３７℃の水浴で一晩インキュベートした。酵素を、５６℃で３０分間インキュベートすることによって不活化し、続いて、１／１０の最終希釈のために６部のＰＢＳを添加した。ＨＩアッセイは、以前に記載されるように、４ＨＡ単位のウイルスおよび１％のウマ赤血球を使用して、Ｖ底９６ウェルマイクロタイタープレートで実施した（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，  Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，  １０３（１−２）：９１−５（Ｊｕｌｙ  ２００４））。ＨＩアッセイに使用するウイルスは、疫病管理センターから入手した再集合体株、Ａ／Ｖｉｅｔ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）／ＰＲ８−ＩＢＣＤＣ−ＲＧ（クレード１ウイルス）およびＡ／Ｉｎｄｏ／０５／２００５（Ｈ５Ｎ１）／ＰＲ８−ＩＢＣＤＣ−ＲＧ２（クレード２ウイルス）である。インフルエンザ感染のフェレットモデルは、ヒト疾患をより反映するものであり、より厳密な抗原投与モデルであると考えられる。フェレットは、インフルエンザに感染したヒトと同様の症状、ならびにヒトおよびトリインフルエンザウイルスに関する同様の組織親和性を呈する。研究を通して、異なる時点で収集した血清は、Ｈ５Ｎ１ウイルスに対するＨＩ活性を検出するために使用した。図７に示すとおり、コンセンサスＨ５特異的ＨＡ構築物を含む群の両方は、２回の免疫化後に抗体の防御レベル（＞１：４０）に達し、クレード２  Ｈ５Ｎ１ウイルスを阻害することも可能であった。言い換えると、ＨＩアッセイは、コンセンサスＨＡ株がクレード１ウイルスに基づくにもかかわらず、ウイルス株の両方に対して陽性であった。
【００９９】
データ分析
データは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓパッケージを使用して分析した。図に示す値は、平均±ＳＥＭである。具体的な値は、一方向ＡＮＯＶＡおよびその後のｔ検定を使用する比較で得た。ｐ＜０．０５の値は、統計的有意性のレベルとして設定した。
【０１００】
フェレットインフルエンザ抗原投与
インフルエンザ抗原投与の結果を、図５および６に示す。対照動物は、抗原投与後に平均して体重の２５％を失った（図５）一方、ＨＡ（群１）またはＨＡ＋Ｍ２ｅ−ＮＰ＋ＮＡ（群４）でワクチン接種された動物は、９〜１０％減少した（＊対照に対してＰ＜０．００４）。対照動物において、体温は、８日目までにすべての対照動物の死亡が確認されるか、または安楽死させられるまで上昇した（図６）。どのワクチンのレジメンであるかにかかわらず、ワクチン接種を受けたすべての動物は、抗原投与を生き延び、臨床スコアから明らかなとおり、対照動物と比較して少ない感染の兆候を示した（表５）。対照動物は、臨床スコア（鼻汁、咳、嗜眠）まで悪化し、抗原投与後５日目から７日目の間に死亡した。表５に示すとおり、ワクチン接種を受けた動物の臨床スコアの重症度は、抗体力価に逆相関した（より高い抗体力価で、より低い臨床スコア、より優れた臨床転帰となる）。
【０１０１】
【表５】
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表５注記：臨床スコアは、抗原投与後の観察期間について示す。「＊」は、動物が安楽死させられたことを示し、ＦＤ＝死亡が確認された。それぞれの縦の欄の最初の臨床スコアは、鼻の症状についてである：０＝なし、１＝鼻汁、２＝口から呼吸。２番目のスコアは、活動についてである：０＝睡眠、１＝快活および機敏、２＝機敏だが、応答なし、３=嗜眠。抗原投与３週間前に測定したそれぞれの動物のＨＩ力価は、比較目的で示す。
【０１０２】
実施例４：霊長類における皮内送達の筋肉内送達との比較
アカゲザルをこれらの研究において免疫化をした。動物は、実験の開始２ヶ月前に順応させた。研究は、以下のとおりに進めた。０週目に１回目の免疫化（プラスミド用量投与）およびベースライン採血を実施、２週目に採血を実施、３週目、２回目の免疫化を実施（プラスミド用量投与）、５週目に採血を実施、６週目に３回目の免疫化（プラスミド用量投与）および採血を実施、８週目に採血を実施した。
【０１０３】
【表６】
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すべてのプラスミドは、上述の実施例に記載するとおり、注射用蒸留水＋１％ＬＧＳ中において１０ｍｇ／ｍＬで製剤し、研究群（上の表６の群Ｃ、Ｄ、Ｇ、およびＨ）当たり単一の溶液に混合した。ＩＭ  ＣＥＬＬＥＣＴＲＡＴＭ  ＥＰ（ＶＧＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＩＤ  ＣＥＬＬＥＣＴＲＡＴＭ  ＥＰ（ＶＧＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、およびＩＭシリンジと指定されるそれぞれの群について正確な注入容量を、算出した。ＩＤ投与では、必要な注入容量が部位当たり１００μＬを超過した場合に、製剤は、注入部位の数（総ｍｇのワクチンがどれぐらい投与されたかによって２、３、または６）に分割した。ＩＭ注射を受けた動物は、１つの単一部位ですべての製剤を与えた。
【０１０４】
ブタの実験、フェレットの実験、および非ヒトの実験に使用したＣＥＬＬＥＣＴＲＡＴＭ適応定電流デバイスを、実施例に記載した。電気穿孔条件は、以下のとおりであった。ＩＭ注射および電気穿孔群では、条件は、０．５アンペア、５２ミリ秒／パルス、３パルス、プラスミド注入と電気穿孔との間で４秒の遅れであった。ＩＤ注射および電気穿孔群では、条件は、０．２アンペア、５２ミリ秒／パルス、３パルス、プラスミド注入と電気穿孔との間で４秒の遅れであった。
【０１０５】
血球凝集抑制（ＨＩ）アッセイ−サルの血清を、３部のレセプター破壊酵素（ＲＤＥ）で１部の血清を希釈することによって、この酵素で処理し、３７℃の水浴で一晩インキュベートした。この酵素を、５６℃で３０分間インキュベートすることによって不活化し、その後、１／１０の最終希釈のために６部のＰＢＳを添加した。ＨＩアッセイは、４ＨＡ単位のウイルスおよび１％のウマの赤血球を使用して、Ｖ底９６ウェルマイクロタイタープレートで実施した。本明細書に提示するデータは、２回目の免疫化後の結果である（３回目の免疫化前に採血）。
【０１０６】
ＨＩ力価は、２回目の免疫化の３週間後に測定した。結果は、図８のグラフの表示で確認することができる。ＩＤ注入、続いて電気穿孔を介してＨＡプラスミドワクチンを受けたサルは、ＩＭ＋ＥＰ群の平均力価の２倍超、およびＩＭ群のみの平均力価の約３倍を呈した（＊Ｐ＜０．０３）。未処置の対照は、いかなるＨＩ力価も呈さなかった。
【０１０７】
実施例５：霊長類の交差保護
送達方法の使用−ＩＤ注射後の電気穿孔（ＥＰ）
インフルエンザワクチン（Ｈ５、ＮＡ、およびＭ２ｅ−ＮＰコンセンサス抗原を含む、上記参照）を使用する非ヒトの霊長類における研究は、ＩＤ注射後の電気穿孔がＩＭ注射よりも高いワクチン抗原への抗体応答を誘発したことを示した。本発明者らの非ヒト霊長類研究（ＮＨＰ）のうちの１つにおいて、動物を、表７のとおりワクチン接種した。
【０１０８】
【表７】
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それぞれの動物は３回のワクチン接種を受け、ＨＡＩ力価およびマイクロ中和（ｍｉｃｒｏｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、同一のクレードおよび交差クレード（ｃｒｏｓｓ−ｃｌａｄｅ）の両方で実施した。示すとおり、コンセンサスワクチンは、同一のクレード内だけでなく、交差クレードでも広域な保護を提供した。結果は、表８に含まれる。
【０１０９】
【表８】
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ＩＤ電気穿孔デバイスの針は、より短いゲージの、ずっと短い（約５ｍｍ）ものであり、今まで試験した動物で筋収縮も目に見える疼痛応答も誘発しない。さらに、有効なＩＤ  ＥＰのために必要な電界は、最適なＩＭ送達に必要とされる電界よりも低い。ＩＤ注射は、インフルエンザワクチン抗原へのより良い免疫応答を誘発することが明らかになっている（Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｄ，  ｅｔ  ａl．  （２００８）  Ｊ  Ｉｎｆ  Ｄｉｓ．  １９８：６５０−５８）。通常、ＩＭ送達と比較して、同様の体液性応答を達成するために、低用量しか、ＩＤで送達されるワクチンには必要とされない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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