(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）の領域に存在する、配列番号２の塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて、
配列番号２の塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基がＴである場合、前立腺癌の可能性または発症リスクが高いと判定されることを特徴とする、前立腺癌の発症および／または罹患リスクの判定方法。
（１）第５染色体短腕１５領域またはＩＲＸ４遺伝子
【請求項２】
配列番号２の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１５塩基以上の配列、又はその相補配列を有する、請求項１に記載された方法に使用されるための前立腺癌検査用プローブ。
【請求項３】
配列番号２の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる、請求項１に記載された方法に使用されるための前立腺癌検査用プライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は前立腺癌の発症および／または罹患リスクを判定するための検査方法及び該検査方法に用いられる試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺は、男性の骨盤内にあるクルミほどの大きさの精液を作る臓器である。前立腺癌は前立腺に発生する腫瘍であり、世界で最も発生頻度の高い癌の１つである。以前は日本人の前立腺癌の罹患率は低かったものの、食生活を含む生活の欧米化や人口の超高齢化に伴い、近年、その罹患者数は急激に増加しつつある。日本では、2020年には前立腺癌の罹患者数は8万人近くになり、肺癌に次いで、男性の癌で2番目に罹患者数が多くなると予想されている。また、前立腺癌による死亡者数は、2008年には約1万人であったが、2020年には2倍の2万人を超えるものと推測されている。同様に他のアジア諸国においても、その罹患者数は急激に増えつつある。
【０００３】
前立腺癌は、男性ホルモンを抑制するホルモン療法、放射線療法、手術療法が奏功し、予後が比較的良い癌の１つとして知られている。前立腺癌の検診は、今日、前立腺で特異的に作られるタンパク質であるＰＳＡ（prostate-specific antigen）を検出することにより行われ、ＰＳＡの血清値が４ｎｇ／ｍｌ以上で異常値とされている。しかしながら、ＰＳＡの血清値は前立腺炎や前立腺肥大でも異常値を示し、また、血清値が低くても前立腺癌が認められることもあり、前立腺癌の発症リスク評価や診断には未だ問題が残っている。
【０００４】
前立腺癌の危険因子としては、人種（アフリカ人＞欧米人＞アジア人の順に多い）、食生活、ホルモン環境、加齢などが重要視されているが、特定の危険因子は判明していない。しかしながら、前立腺癌の発症には遺伝的素因が深く関与していることが明らかとなりつつある。
【０００５】
近年、ゲノムワイド相関解析（ＧＷＡＳ）によって前立腺癌の発症に関連する遺伝子や一塩基多型（ＳＮＰｓ）を同定する試みがなされている。結果として、染色体上の３０以上の箇所において、前立腺癌の発症リスクに影響を与えるバリアントが同定されている（非特許文献１〜１１）。しかしながら、ＧＷＡＳによる前立腺癌の解析は、欧米人に限られており、日本人等のアジア人やそれ以外の人種については行われていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Gudmundsson, J. et al. Nat. Genet. 39, 631.637 (2007).
【非特許文献２】Yeager, M. et al. Nat. Genet. 39, 645.649 (2007).
【非特許文献３】Gudmundsson, J. et al. Nat. Genet. 39, 977.983 (2007).
【非特許文献４】Gudmundsson, J. et al. Nat. Genet. 40, 281.283 (2008).
【非特許文献５】Eeles, R.A. et al. Nat. Genet. 40, 316.321 (2008).
【非特許文献６】Thomas, G. et al. Nat. Genet. 40, 310.315 (2008).
【非特許文献７】Gudmundsson, J. et al. Nat. Genet. 41, 1022.1026 (2009).
【非特許文献８】Eeles, R.A. et al. Nat. Genet. 41, 1116.1121 (2009).
【非特許文献９】Yeager, M. et al. Nat. Genet. 41, 1055.1057 (2009).
【非特許文献１０】Al Olama, A.A. et al. Nat. Genet. 41, 1058.1060 (2009).
【非特許文献１１】Witte, J.S. Nat. Rev. Genet. 10, 77.82 (2009).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前立腺癌の発症リスクや発症を正確に検査する方法、及び該方法に用いられる検査試薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題の解決のために鋭意検討した結果、第５染色体短腕１５領域もしくはＩＲＸ４遺伝子、ＧＰＲＣ６Ａ／ＲＦＸ６遺伝子、第１３染色体長腕２２領域、Ｃ２ｏｒｆ４３遺伝子、またはＦＯＸＰ４遺伝子に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）が前立腺癌と相関することを同定した。そして、これらの多型を調べることにより前立腺癌の発症リスクや発症の推定を正確に実施できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]
以下の（１）〜（５）のいずれかの領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて前立腺癌を検査することを特徴とする、前立腺癌の発症および／または罹患リスクの判定方法。
（１）第５染色体短腕１５領域またはＩＲＸ４遺伝子
（２）ＧＰＲＣ６Ａ／ＲＦＸ６遺伝子
（３）第１３染色体長腕２２領域
（４）Ｃ２ｏｒｆ４３遺伝子
（５）ＦＯＸＰ４遺伝子
[２]
前記一塩基多型が、配列番号１、２、３、４、または５の塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、[１]に記載の方法。
[３]
配列番号１、２、３、４、または５の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する前立腺癌検査用プローブ。
[４]
配列番号１、２、３、４、または５の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる前立腺癌検査用プライマー。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、これまで予測が困難であった前立腺癌の発症リスク（罹患リスク）を正確かつ簡便に予測することができる。また、前立腺癌の発症を正確かつ簡便に判定することができる。したがって、本発明は前立腺癌の予防や早期治療に貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ヒト第２染色体短腕２４領域（２ｐ２４領域）のケース−コントロール相関解析結果および連鎖不平衡（ＬＤ）マップを示す図。下向きの短い矢印は、ＧＷＡＳで同定されたマーカーＳＮＰの位置を示す（以下、同じ）。
【図２】ヒト第５染色体短腕１５領域（５ｐ１５領域）のケース−コントロール相関解析結果および連鎖不平衡（ＬＤ）マップを示す図。
【図３】ヒト第６染色体短腕２１領域（６ｐ２１領域）のケース−コントロール相関解析結果および連鎖不平衡（ＬＤ）マップを示す図。
【図４】ヒト第６染色体長腕２２領域（６ｑ２２領域）のケース−コントロール相関解析結果および連鎖不平衡（ＬＤ）マップを示す図。
【図５】ヒト第１３染色体長腕２２領域（１３ｑ２２領域）のケース−コントロール相関解析結果および連鎖不平衡（ＬＤ）マップを示す図。
【図６】Ａは、前立腺癌の被検者３００１名と対照被検者５４１５名からなる集団のロジスティック回帰分析の結果を示す図。Ｂは、Ａで用いた集団とは独立した、前立腺癌の被検者７３２名と対照被検者９５７名からなる集団のロジスティック回帰分析の結果を示す図。Ｃは、血清PSA値が10 ng/mL未満の症例のロジスティック回帰分析の結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜１＞本発明の方法
本発明の方法は、ヒトの第５染色体短腕１５領域もしくはＩＲＸ４遺伝子、ＧＰＲＣ６Ａ／ＲＦＸ６遺伝子、第１３染色体長腕２２領域、Ｃ２ｏｒｆ４３遺伝子、またはＦＯＸＰ４遺伝子に含まれるＳＮＰを分析し、該分析結果に基づいて前立腺癌を検査することを特徴とする、前立腺癌の発症および／または罹患リスクの判定方法である。なお、本発明において、「検査」とは前立腺癌の発症リスクの検査及び前立腺癌の発症の有無の検査を含む。本発明の方法においては、ＳＮＰの分析結果を、前立腺癌の発症リスクおよび／または発症の有無と関連付ける。
【００１３】
Ｃ２ｏｒｆ４３遺伝子は、第２染色体のオープンリーディングフレーム４３を意味する機能未知の遺伝子であり、ヒト第２染色体短腕２４領域（２ｐ２４領域）に存在する。Ｃ２ｏｒｆ４３遺伝子としては、具体的には、GenBank Accession No. NC_000002.11の20884818〜21022827の領域が挙げられる。
【００１４】
Ｃ２ｏｒｆ４３遺伝子に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs13385191を挙げることができる。ここで、rs番号はNational Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）の登録番号を示す。rs13385191はGenBank Accession No. NT_015926.14の20751746番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）／アデニン（Ａ）の多型を意味し、この塩基がＧである場合は前立腺癌の可能性または発症リスクが高い。また、アレルを考慮して解析した場合は、rs13385191がＧＧ＞ＧＡ＞ＡＡの順で前立腺癌の可能性または発症リスクが高い。
【００１５】
ヒト第５染色体短腕１５領域（５ｐ１５領域）とは、より具体的には、第５染色体の1.90〜1.99 Mbの領域を意味する。この領域に関わる遺伝子多型は、近傍のＩＲＸ４遺伝子の発現に関わるものである。したがって、ＩＲＸ４遺伝子に存在するＳＮＰを解析することによっても前立腺癌を検査することができる。ＩＲＸ４遺伝子としては、具体的には、GenBank Accession No. NC_000005.9の1877541〜1882880の領域が挙げられる。
【００１６】
５ｐ１５領域に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs12653946を挙げることができる。rs12653946はGenBank Accession No. NT_006576.15の1948829番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）／チミン（Ｔ）の多型を意味し、この塩基がＴである場合は前立腺癌の可能性または発症リスクが高い。また、アレルを考慮して解析した場合は、rs12653946がＴＴ＞ＴＣ＞ＣＣの順で前立腺癌の可能性または発症リスクが高い。
【００１７】
ＦＯＸＰ４遺伝子は、ＦＯＸファミリーのサブファミリーＰに属する転写因子をコードし、ヒト第６染色体短腕２１領域（６ｐ２１領域）に存在する。ＦＯＸＰ４遺伝子としては、具体的には、GenBank Accession No. NC_000006.11の41514164〜41570122の領域が挙げられる。
【００１８】
ＦＯＸＰ４遺伝子に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs1983891を挙げることができる。rs1983891はGenBank Accession No. NT_007592.14の41644405番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）／チミン（Ｔ）の多型を意味し、この塩基がＴである場合は前立腺癌の可能性または発症リスクが高い。また、アレルを考慮して解析した場合は、rs1983891がＴＴ＞ＴＣ＞ＣＣの順で前立腺癌の可能性または発症リスクが高い。
【００１９】
ＧＰＲＣ６Ａ／ＲＦＸ６遺伝子は、ヒト第６染色体長腕２２領域（６ｑ２２領域）に存在する。ＧＰＲＣ６Ａ遺伝子は、Ｇタンパク質共役受容体（G protein-coupled receptor（GPCR））をコードし、性ホルモンの産生やメタボリック症候群に関連する。ＲＦＸ６遺伝子は、ＲＦＸファミリーに属する転写因子をコードする。ＧＰＲＣ６Ａ／ＲＦＸ６遺伝子としては、具体的には、GenBank Accession No. NC_000006.11の117113248〜117253314の領域が挙げられる。より具体的には、ＧＰＲＣ６Ａ遺伝子としては117113248〜117150198の領域が挙げられ、ＲＦＸ６遺伝子としては117198376〜117253314の領域が挙げられる。
【００２０】
ＧＰＲＣ６Ａ／ＲＦＸ６遺伝子に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs339331を挙げることができる。rs339331はGenBank Accession No. NT_025741.14の117316745番目の塩基におけるチミン（Ｔ）／シトシン（Ｃ）の多型を意味し、この塩基がＴである場合は前立腺癌の可能性または発症リスクが高い。また、アレルを考慮して解析した場合は、rs339331がＴＴ＞ＴＣ＞ＣＣの順で前立腺癌の可能性または発症リスクが高い。
【００２１】
ヒト第１３染色体長腕２２領域（１３ｑ２２領域）とは、より具体的には、第１３染色体の72.57〜72.68 Mbの領域を意味する。
【００２２】
１３ｑ２２領域に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs9600079を挙げることができる。rs9600079はGenBank Accession No. NT_024524.13の72626140番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）／チミン（Ｔ）の多型を意味し、この塩基がＴである場合は前立腺癌の可能性または発症リスクが高い。また、アレルを考慮して解析した場合は、rs9600079がＴＴ＞ＴＧ＞ＧＧの順で前立腺癌の可能性または発症リスクが高い。
【００２３】
なお、rs13385191、rs12653946、rs1983891、rs339331、およびrs9600079について、ＳＮＰ塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、それぞれ配列番号１、２、３、４、および５に示した。６１番目の塩基が多型を有する。
【００２４】
本発明においては、上記塩基に相当する塩基を解析する。「上記塩基に相当する塩基」とは、上記領域における該当塩基を意味する。すなわち、「上記塩基に相当する塩基を解析する」ことには、仮に人種の違いなどによって上記配列がＳＮＰ以外の位置で若干変化したとしても、上記領域における該当塩基を解析することが含まれる。
【００２５】
また、本発明において解析する塩基は上記のものに限定されず、上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基の多型を分析してもよい。ここで「上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基」とは、上記の塩基とｒ2＞０．５、好ましくはｒ2＞０．８、さらに好ましくはｒ2＞０．９の関係を満たす塩基をいう。いずれも、リスクアレルのホモ接合体  ＞  リスクアレルと非リスクアレルのへテロ接合体  ＞  非リスクアレルのホモ接合体の順で前立腺癌の可能性または発症リスクが高い。
【００２６】
上記ＳＮＰの塩基の種類を調べ、得られた結果を上記のような基準に基づいて前立腺癌と関連付けることにより、前立腺癌を検査することができる。上記ＳＮＰは単独で解析されてもよいし、上記ＳＮＰの少なくとも１つを含む複数のＳＮＰｓをまとめて解析（ハプロタイプ解析）してもよい。例えば、上記ＳＮＰの複数をまとめて解析してもよいし、上記ＳＮＰの少なくとも１つと、前立腺癌と相関する既知のＳＮＰとを組み合わせて解析してもよい。前立腺癌と相関する既知のＳＮＰとしては、欧米人被検者で見出された３１個のＳＮＰｓが挙げられる（表３（後述））。日本人の前立腺癌を検査する場合には、前立腺癌と相関する既知のＳＮＰとして、日本人の前立腺癌と相関する１９個のＳＮＰｓを用いることができる（表３（後述））。これらのＳＮＰｓの多型の種類や、前後の領域を含む塩基配列は、上記dbSNPデータベースで参照できる。また、前立腺癌と相関する既知のＳＮＰとしては、これら既知のＳＮＰｓと連鎖不平衡にある塩基を解析してもよい。前立腺癌と相関する複数のＳＮＰｓをまとめて解析すれば、前立腺癌の検査の精度が向上する。なお、いずれのＳＮＰも、二本鎖ＤＮＡのどちらの鎖を解析してもよい。例えば、ＩＲＸ４遺伝子、Ｃ２ｏｒｆ４３遺伝子、ＧＰＲＣ６Ａ／ＲＦＸ６遺伝子、またはＦＯＸＰ４遺伝子の配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。
【００２７】
ＳＮＰの解析に用いる試料としては、染色体ＤＮＡを含む試料であれば特に制限されないが、例えば、血液、尿等の体液サンプル、口腔粘膜などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。ＳＮＰの解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。
【００２８】
ＳＮＰの解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、インベーダー法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
シークエンス解析は通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の５’側  数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンス反応の前に、あらかじめＳＮＰ部位を含む断片をＰＣＲなどによって増幅しておくことが好ましい。
【００３０】
また、ＳＮＰの解析は、ＰＣＲによる増幅の有無を調べることによって行うことができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、３’末端が各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してＰＣＲを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。また、ＬＡＭＰ法（特許第３３１３３５８号明細書）、ＮＡＳＢＡ法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許２８４３５８６号明細書）、ＩＣＡＮ法（特開２００２−２３３３７９号公報）などによって増幅の有無を調べることもできる。その他、単鎖増幅法を用いてもよい。
【００３１】
また、ＳＮＰ部位を含むＤＮＡ断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism）法（Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.）が挙げられる。具体的には、まず、目的のＳＮＰを含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００３２】
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００３３】
また、ハイブリダイゼーションの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってＳＮＰがいずれの塩基であるかを調べることもできる。
【００３４】
このようにしてＳＮＰがいずれの塩基であるかを決定することで、前立腺癌を検査するためのデータを得ることができる。
【００３５】
＜２＞本発明の検査用試薬
本発明はまた、前立腺癌を検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、上記ＳＮＰ部位を含み、ハイブリダイズの有無によってＳＮＰ部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１、２、３、４、または５において塩基配列の６１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１０塩基以上の長さのプローブが挙げられる。プローブの長さは好ましくは、１５〜３５塩基であり、より好ましくは２０〜３５塩基である。
【００３６】
また、プライマーとしては、上記ＳＮＰ部位を増幅するためのＰＣＲに用いることのできるプライマー、又は上記ＳＮＰ部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１、２、３、４、または５の塩基配列の６１番目の塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１０〜５０塩基が好ましく、１５〜３５塩基がより好ましく、２０〜３５塩基がさらに好ましい。
【００３７】
上記ＳＮＰ部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の５’側領域、好ましくは３０〜１００塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは３０〜１００塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。ＰＣＲによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。
【００３８】
なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、ＰＣＲ用のポリメラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００４０】
（１）前立腺癌と相関するＳＮＰｓの同定
前立腺癌感受性を決定する遺伝的変異を同定するために、日本人被検者を用いてゲノムワイド相関解析（ＧＷＡＳ）および追試（replication study）を行った。ＧＷＡＳとは、疾患等の表現型に関わる遺伝的変異を探索する遺伝統計学的手法である。例えば、ヒトゲノム全体を網羅するような数十万〜１００万箇所のＳＮＰｓを用いて、ある疾患の患者（ケース）とその疾患にかかっていない被験者（コントロール）との間で、多型の頻度に差があるかどうかを統計的に検定することで、疾患と関連する遺伝的変異を見出すことができる。
【００４１】
＜被検者＞
ＧＷＡＳおよび追試に用いた被検者の特徴を表１に示す。
【００４２】
【表１】
0005807894.tif 000002
【００４３】
ＧＷＡＳおよび追試に用いる前立腺癌の被検者（ケース（Case））としては、東京大学医科学研究所のBioBank Japan (BBJ) (Nakamura, Y. The BioBank Japan Project. Clin Adv Hematol Oncol 5, 696-7 (2007)) に登録された前立腺癌患者群から、前立腺生検による病理学的評価に基づき、前立腺癌に罹患していると臨床的に診断された患者を選択して用いた。なお、ＧＷＡＳに用いた前立腺癌の被検者１５８３名の内、２５０名は前立腺癌の家族歴を有し、７４４名はグリーソンスコア（Gleason score）が８以上である。
【００４４】
ＧＷＡＳに用いる対照被検者（コントロール（control））としては、BBJに登録された２４８０名の前立腺癌以外の疾患の患者、および大阪御堂筋ロータリークラブで募集した９０６名の健康なボランティアを用いた。追試に用いる対照被検者としては、これまでに前立腺癌以外の疾患のＧＷＡＳに患者として用いた男性被検者を用いた。
【００４５】
いずれの被検者も、アジア人集団に分類され、かつ、分集団が存在しないことは、主成分分析（ＰＣＡ）により確認された。
【００４６】
本研究は東京大学医科学研究所および理化学研究所横浜研究所の倫理委員会によって承認され、全ての参加者からインフォームドコンセントを得た。
【００４７】
＜統計解析＞
ＧＷＡＳおよび追試において、常染色体上の各ＳＮＰと前立腺癌との相関は、遺伝モデルとしてadditive modelを用いて解析し、dominant modelおよびrecessive modelも参照した。Ｘ染色体上の各ＳＮＰと前立腺癌との相関は、２×２のカイ２乗検定により解析した。ＧＷＡＳと追試を組み合わせた統計解析は、同じ遺伝モデルに基づきＭａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ法により行った。
【００４８】
＜ＧＷＡＳ＞
前立腺癌の被検者１５９４名の遺伝型は、Human610-Quad BeadChip（Illumina社）を用いて解析した。対照被検者３３８６名の遺伝型は、HumanHap550v3 Genotyping BeadChip（Illumina社）を用いて解析した。両チップで共通に利用できる５１０６８７個のＳＮＰｓについて相関解析を行った。
【００４９】
ＧＷＡＳにより、染色体上の独立した８つの領域に、Ｐ＜１．０×１０-7で前立腺癌と有意に相関する３７個のＳＮＰｓを同定した。この内、６つの領域にはすでに前立腺癌に関連するＳＮＰｓが報告されていたが、それに加えて、第５染色体短腕１５領域（５ｐ１５領域）にrs12653946（Ｐ＝８．３×１０-10）が、第６染色体長腕２２領域（６ｑ２２領域）にrs339331（Ｐ＝６．０×１０-8）が、前立腺癌に感受性のＳＮＰｓとして新たに見出された（表２）。
【００５０】
【表２】
0005807894.tif 000003
Ｐ値は、いずれも、genomic inflation factor（λ）に基づき補正したＰGC値を意味する。
ａ：NCBIのヒトゲノムBuild 36の座標情報（NCBI Human Genome Build 36 coordinates）に基づく染色体上の位置。
ｂ：ＳＮＰが位置する領域。なお、任意の遺伝子の転写開始点から２０ｋｂ以内、あるいは最後のエクソンから１０ｋｂ以内にＳＮＰｓが位置する場合には、ＳＮＰｓは当該遺伝子に含まれるものとした。
ｃ：ＧＷＡＳで用いた対照被検者での頻度に基づくメジャーアレル／マイナーアレル。
ｄ：前立腺癌感受性をもたらすＳＮＰアレル。
ｅ：信頼区間（Confidence Interval；CI）９５％でのアレルのオッズ比（Odds Ratio；OR）。
【００５１】
＜追試＞
前立腺癌に感受性の箇所をさらに探索するため、前立腺癌の被検者３００１名と対照被検者５４１５名を用いて追試を行った。前立腺癌の被検者の遺伝型は、multiplex-PCR invader assay（Third Wave Technologies）（Ohnishi, Y. et al. J Hum Genet 46, 471-7 (2001)）により解析した。対照被検者の遺伝型は、Human610-Quad BeadChip（Illumina社）を用いて解析した。なお、被検者はいずれもＧＷＡＳに用いた被検者とは独立である。
【００５２】
追試に用いるＳＮＰｓとしては、ＧＷＡＳにおいて、３つの遺伝モデル（additive model、dominant model、およびrecessive model）の少なくとも１つで最小Ｐ＜１．０×１０-4となった２６３個のＳＮＰｓを選択した。これらＰ＜１．０×１０-4で前立腺癌と有意に相関する２６３個のＳＮＰｓの内、既知の８０個を除いた１８３個のＳＮＰｓについて、これらＳＮＰｓ間での連鎖不平衡係数（linkage disequilibium（LD）coefficient）（ｒ2）を算出した。それぞれｒ2≧０．８の範囲で、Ｐ値の低い上位９１個のＳＮＰｓを選択し、追試に供した。
【００５３】
９１個の内、３個のＳＮＰｓが、ボンフェローニ補正後のＰ＜５．５×１０-4を満たし、前立腺癌との有意な相関が再度確認された。当該３個のＳＮＰｓは、前記rs12653946およびrs339331、並びに第１３染色体長腕２２領域（１３ｑ２２領域）のrs9600079であった。また、これら３個のＳＮＰｓは、ＧＷＡＳと追試を組み合わせると、ＰGC＝３．９×１０-18〜２．８×１０-9で前立腺癌と有意に相関することが再度確認された。
【００５４】
さらに、第２染色体短腕２４領域（２ｐ２４領域）のrs13385191、および第６染色体短腕２１領域（６ｐ２１領域）のrs1983891は、Ｐ＜５．５×１０-4を満たさなかったものの、Ｐ＜０．０５を満たした。ＧＷＡＳと追試を組み合わせると、rs13385191はＰGC＝７．５×１０-8、rs1983891はＰGC＝７．６×１０-8で、いずれもゲノムワイドな有意性（genome-wide significance）の閾値として設定されたＰ＜１．０×１０-7を満たしており前立腺癌と有意に相関することが確認された。
【００５５】
以上より、前立腺癌に感受性の５個のＳＮＰｓが新規に見出された（表２）。また、これら５個のＳＮＰｓは、前立腺癌の家族歴を有さない被験者と比較して、前立腺癌の家族歴を有する被験者においてオッズ比（Ｏｄｄｓ  Ｒａｔｉｏ；  ＯＲ）が高くなる傾向が見られた。
【００５６】
（２）前立腺癌感受性遺伝子の同定
前立腺癌の感受性遺伝子を探索するため、これら５個のＳＮＰｓが位置する領域のマッピング解析（連鎖不平衡（ＬＤ）パターンの解析）を行った。ＨａｐＭａｐプロジェクトのフェーズ２の日本人のデータベース（ＪＰＴ）に基づき、Haploview（Barrett, J. et al. Bioinformatics 21, 263.265 (2005)）を用いて、これらＳＮＰｓの周辺領域に存在するマイナーアレル頻度（ＭＡＦｓ）≧０．０５である全ＳＮＰｓがｒ2＞０．９で含まれるようタグＳＮＰｓを選択した。結果を図１〜５に示す。
【００５７】
最も前立腺癌との相関が強いrs12653946（ＰGC＝３．９×１０-18）は、染色体の５ｐ１５領域に位置していた。３６個のタグＳＮＰｓを用いて候補領域（第５染色体の1.90〜1.99 Mb）のマッピング解析を行ったところ、rs12653946の位置する２０ｋｂにわたる相関領域（associated region）が前立腺癌感受性領域として同定された（図２）。当該領域には既知の遺伝子は存在しないが、当該領域は近傍に存在するＩＲＸ４遺伝子の発現に関わっている。
【００５８】
２番目に前立腺癌との相関が強いrs339331（ＰGC＝１．６×１０-12）は、染色体の６ｑ２２領域に位置し、具体的には、ＲＦＸ６遺伝子のイントロン４に位置していた。５９個のタグＳＮＰｓを用いて５８０ｋｂの候補領域（第６染色体の117.0〜117.6 Mb）のマッピング解析を行ったところ、rs339331は、ＲＦＸ６遺伝子とＧＰＲＣ６Ａ遺伝子の２遺伝子を含む２００ｋｂにわたる相関領域に位置することが明らかとなった（図４）。ＲＦＸ６遺伝子は、ＲＦＸファミリーに属する転写因子をコードし、ほぼ膵臓のランゲルハンス島でのみ発現する（Aftab, S. et al. BMC Evol. Biol. 8, 226 (2008)）。ＧＰＲＣ６Ａ遺伝子は、Ｇタンパク質共役受容体（G protein-coupled receptor（GPCR））をコードし、精巣のライディッヒ細胞で強く発現する。ＧＰＲＣ６Ａ遺伝子の雄ノックアウトマウスは、雌化が認められ、また、エストラジオールの血中濃度上昇とテストステロンの血中濃度低下を含むメタボリック症候群の症状を呈することが知られている（Pi, M. et al. PLoS One 3, e3858 (2008)）。これらの性ホルモンは前立腺癌の発生（initiation）過程や進行（progression）過程と密接に関わっており、ＧＰＲＣ６Ａ／ＲＦＸ６遺伝子領域の遺伝的変異は、ＧＰＲＣ６Ａを介した性ホルモン産生を変化させることにより前立腺癌感受性に影響している可能性がある。なお、ＧＰＲＣ６Ａ遺伝子とＲＦＸ６遺伝子では、ＧＰＲＣ６Ａ遺伝子の方が、前立腺癌感受性に影響している可能性が高いと考えられる。
【００５９】
３番目に前立腺癌との相関が強いrs9600079（ＰGC＝２．８×１０-9）は、染色体の１３ｑ２２領域に位置していた。３６個のタグＳＮＰｓを用いて候補領域（第１３染色体の72.57〜72.68 Mb）のマッピング解析を行ったところ、rs9600079は、３５ｋｂにわたる相関領域に位置することが明らかとなった（図５）。当該領域には、既知の遺伝子は存在しない。
【００６０】
４番目に前立腺癌との相関が強いrs13385191（ＰGC＝７．５×１０-8）は、染色体の２ｐ２４領域に位置し、具体的には、Ｃ２ｏｒｆ４３遺伝子のイントロン６に位置していた。Ｃ２ｏｒｆ４３遺伝子とは、第２染色体のオープンリーディングフレーム４３を意味し、機能未知の遺伝子である。４５個のタグＳＮＰｓを用いて候補領域（第２染色体の20.72〜20.93 Mb）のマッピング解析を行ったところ、rs13385191の位置するＣ２ｏｒｆ４３遺伝子の３’側の１２．３ｋｂにわたる相関領域が前立腺癌感受性領域として同定された（図１）。
【００６１】
５番目に前立腺癌との相関が強いrs1983891（ＰGC＝７．６×１０-8）は、染色体の６ｐ２１領域に位置し、具体的には、ＦＯＸＰ４遺伝子のイントロン２に位置していた。候補領域（第６染色体の41.58〜41.74 Mb）のマッピング解析を行ったところ、rs1983891の位置する７２ｋｂにわたる相関領域が前立腺癌感受性領域として同定された（図３）。当該領域に含まれる遺伝子はＦＯＸＰ４遺伝子のみであった。ＦＯＸＰ４遺伝子は、ＦＯＸファミリーのサブファミリーＰに属する転写因子をコードし、胚発生、細胞周期制御、および腫瘍形成において重大な役割を担っている（Teufel, A. et al. Biochim. Biophys. Acta 1627, 147.152 (2003)）。
【００６２】
なお、欧米人被検者を用いた研究により前立腺癌と相関することが報告されている３１個のＳＮＰｓ（非特許文献１〜１１）の内、１９個のＳＮＰｓは日本人被検者を用いたＧＷＡＳでも前立腺癌との相関が確認された（表３）。一方、残りの１２個のＳＮＰｓは、日本人では前立腺癌との相関は確認されなかった。また、本実施例で見出された５個のＳＮＰｓは、欧米人被検者を用いた大規模な相関解析では見出されていなかったものであるが、それらのマイナーアレル頻度（ＭＡＦｓ）は日本人と欧米人とで顕著な差は認められなかった。これらのことから、日本人と欧米人とでは、前立腺癌感受性を決定する遺伝的変異と、マーカーとなるＳＮＰｓとの連鎖不平衡（ＬＤ）のパターンが異なっている可能性がある。よって、本実施例で見出された５個のＳＮＰｓおよびそれらと連鎖不平衡の関係にあるＳＮＰｓは、これらＳＮＰｓが前立腺癌と相関するいずれの人種においても有用であるが、特に、日本人の前立腺癌の検査に有用であると期待される。
【００６３】
【表３】
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「GWAS in Japanese population」は、日本人被検者を用いた本実施例のＧＷＡＳおよび追試の結果を示す。濃く色付けしたＳＮＰｓは日本人においてＰ＜１．６×１０‐3で前立腺癌と有意な相関を示すもの、薄く色付けしたＳＮＰｓは日本人において１．６×１０‐3＜Ｐ＜０．０５で前立腺癌と有意な相関を示すものである。
ａ：データは既報（非特許文献１〜１１）のものである。
ｂ：各試験でのリスクアレル頻度。
ｃ：ＨａｐＭａｐデータベースから取得したリスクアレル頻度。
ｄ：統計的検出力（statistical power）は、ＨａｐＭａｐプロジェクトのＪＰＴデータベースのマイナーアレル頻度に基づき、CaTS‐power calculatorにより算出した。
ｅ：リスクアレル頻度およびオッズ比は、ステージ１とステージ２の試験結果を組み合わせたものである。
ｆ：各ＳＮＰは、あらかじめ選択されたＨａｐＭａｐプロジェクトのフェーズ２のＣＥＵデータベースのＳＮＰｓと強い連鎖不平衡（ｒ2≧０．８）を示した。
（３）前立腺癌と相関するＳＮＰｓを用いた前立腺癌の罹患リスク予測
本願により新たに見出された上記５個と、既報の前立腺癌と相関する１１個の計１６個のＳＮＰｓ（表４）を用いて、前立腺癌の罹患リスクの予測を行った。
【００６４】
【表４】
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【００６５】
＜方法＞
前立腺癌と相関する１６個のＳＮＰｓ（表４）について、ロジスティック回帰モデル（Logistic regression model）によって、前立腺癌の罹患リスク診断モデルとして下記のような式を導きだした。式中で用いるパラメータについては表５に示す。
【００６６】
【数１】
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【００６７】
【表５】
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【００６８】
このリスク診断モデルの精度を、モデルを構築した集団（追試で用いた前立腺癌の被検者３００１名と対照被検者５４１５名からなる集団）の遺伝子多型情報と、該集団とは別の独立した集団の遺伝子多型情報を用いて評価をおこなった。
【００６９】
＜結果と考察＞
上記の式を用いて、追試で用いた前立腺癌の被検者３００１名と対照被検者５４１５名でのROCカーブを描くと、図６Ａのようになり、AUC（Area Under the Curve）で0.665であった。つぎに、別の独立した７３２例の前立腺癌被検者および９５７例の男性対照被検者からなる集団について、１６個の遺伝子多型の型判定を行い、上記の式を用いてロジスティック回帰分析を行い、各個人での前立腺癌リスクを検討した。ROCカーブを描くと図６Ｂのようになり、AUCで0.672であり、前立腺癌のリスク評価の再現性が得られた。また、前立腺癌の確定診断が比較的難しい（約80％が前立腺癌の診断が得られない）PSA値10ng/mL未満の症例について、同様の解析を行うと、AUCは0.659であり、同様の精度で前立腺癌のリスク評価が行えた（図６Ｃ)。
【００７０】
血清ＰＳＡ値の測定は、現在広く前立腺癌の検診に使われており、癌の診断マーカーとしては唯一信頼性が高いマーカーとされる。しかし、最近、ＰＳＡ検診が最も普及し、前立腺癌の罹患者数が最も多いアメリカを中心にＰＳＡの評価の見直しが唱えられている。まず、一般的に増殖が遅くて予後がよく、また、高齢での発生が多い前立腺癌においては、ＰＳＡスクリーニング導入による前立腺癌の生存率の延長が必ずしも確認されていない。また、一般的にＰＳＡのカットオフ値は4.0 ng/mLであるが、4.0 ng/mL以下でも約20％に前立腺癌が発見されるとの報告があり、2 ng/ml以下でも10数％が前立腺癌を罹患しているとの報告もあり、ＰＳＡのカットオフ値がゆらいでいる。なお、10 ng/mL以上だと40％に前立腺癌が発見されるが、4〜10 ng/mLだと20％となる。このような特異性が低い診断方法で陽性になった人には、前立腺生検という侵襲的で入院を要するような精密検査が行われるのが現状である。
【００７１】
前立腺癌と相関するＳＮＰｓを用いた前立腺癌のリスク診断モデルは、前立腺癌の検査に特に制限されず利用することができるが、特に、以下のような目的において有用である。
（１）PSA 4〜10 ng/mLのいわゆるグレーゾーンの症例に対して、遺伝子多型によるリスク診断を行い、侵襲的な前立腺生検を行うか否かの判断に用いる。また、前立腺生検陰性であった症例においても、遺伝子多型によるリスク診断を行い、以後のサーベイランスの頻度の決定の材料に用いる。
（２）Dutasterideなどの前立腺癌の予防プログラムがいくつか行われているが、遺伝子多型によるリスク診断によって、高リスク群を絞り込んで前立腺癌の予防プログラムを行い、効率的な前立腺癌予防を試みる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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