(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物である化合物。
【請求項２】
５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、又は薬学的に許容可能なその塩である請求項１記載の化合物。
【請求項３】
５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルである請求項１記載の化合物。
【請求項４】
５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルギ酸塩又は５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル二塩化水素塩である請求項１記載の化合物。
【請求項５】
５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸塩である請求項１記載の化合物。
【請求項６】
【化１】
0005705743.tif 000027
である請求項１記載の化合物。
【請求項７】
２θ±０．０２＝１２．６４、２１．２５及び２６．１５にてピークを有するＸ線粉末回折パターンを特徴とする結晶形態における請求項６記載の化合物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項の化合物又は塩を、薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項の化合物又は塩を含む、癌を治療するための医薬組成物。
【請求項１０】
前記癌が、膀胱癌、結腸癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、中皮腫、腎臓癌及び子宮癌から成る群から選択される請求項９記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃｈｋ１を阻害し、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）複製、染色体分離又は細胞分裂における不具合を特徴とする癌を治療するのに有用であるアミノピラゾール化合物、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃｈｋ１は、ＤＮＡ損傷のチェックポイントシグナル伝達経路におけるＡｔｍ及び／又はＡｔｒの下流にあるタンパク質キナーゼである。哺乳類細胞では、イオン化放射線（ＩＲ）、紫外（ＵＶ）線及びヒドロキシウレアを含むＤＮＡに損傷を引き起こす因子に応答してＣｈｋ１がリン酸化される。哺乳類細胞にてＣｈｋ１を活性化するこのリン酸化はＡｔｒに左右される。Ｃｈｋ１は、Ｓ期及びＧ２Ｍでの停止を招くＡｔｒ依存性のＤＮＡ損傷チェックポイントにて役割を担う。Ｃｈｋ１は、Ｓ期を介して進行を止めるサイクリンＥ／Ｃｄｋ２を通常脱リン酸化する二重特異性のホスファターゼであるＣｄｃ２５Ａをリン酸化し、不活化する。Ｃｈｋ１はまた、Ｇ２と有糸分裂の境界での細胞周期の進行を停止するサイクリンＢ／Ｃｄｃ２（Ｃｄｋ１としても知られる）を脱リン酸化する二重特異性のホスファターゼであるＣｄｃ２５Ｃをリン酸化し、不活化する（非特許文献１）。双方の場合、Ｃｄｋ活性の調節が細胞周期の停止を誘導し、ＤＮＡ損傷又は複製されないＤＮＡの存在下で細胞が有糸分裂に入るのを妨げる。
【０００３】
Ｃｈｋ１の種々の阻害剤が報告されている。たとえば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４を参照のこと。さらに、一連のアミノピラゾールＣｈｋ１阻害剤は、特許文献５に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第０５／０６６１６３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０４／０６３１９８号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０３／０９３２９７号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０２／０７０４９４号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０５／００９４３５号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｆｅｒｎｅｒｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：１４９５−７，１９９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ＤＮＡ損傷因子の増強剤として効果的に作用することができる細胞周期のチェックポイントの強力な阻害剤であるＣｈｋ１阻害剤へのニーズは依然として存在する。本発明は、Ｃｈｋ１の強力な阻害剤である新規のアミノピラゾール化合物、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物を提供する。該化合物、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物は、組織培養及び生体内にてＤＮＡ損傷因子による処理によって誘導されるＣｈｋ１が介在する細胞周期の停止を強力に排除する。さらに、本発明の該化合物、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物はまた、Ｃｈｋ２の阻害も提供し、それは癌の治療に有益であり得る。加えて、たとえば、ＣＤＫ１のような特定のそのほかのタンパク質キナーゼの阻害の欠如は望ましくない効果を最少限に抑えることによって治療効果を提供することができる。さらに、本発明の該化合物、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物は、Ｃｈｋ１阻害に依存するメカニズムによって癌細胞の細胞増殖を阻害する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、Ｃｈｋ１の拮抗剤である、新しいアミノピラゾール化合物、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物を提供する。そのような新しい化合物は、癌の安全で有効な治療に対するニーズに対処し得る。
【０００８】
本発明は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルである化合物、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物を提供する。好ましい実施態様は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルギ酸塩、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル二塩化水素塩、及び５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸塩、及び２−ピラジンカルボニトリル、５−［［５−［２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル］−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］アミノ］モノメシレート一水和物である。
【０００９】
特定の実施態様として、本発明は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルである化合物を提供する。
【００１０】
本発明は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルのギ酸塩、二塩化水素塩及びメタンスルホン酸塩を提供する。
【００１１】
本発明はまた、２−ピラジンカルボニトリル、５−［［５−［２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル］−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］アミノ］モノメシレート一水和物である化合物を提供する。
【００１２】
本発明は、２θ±０．０２＝１２．６４、２１．２５及び２６．１５でピークを有するＸ線粉末回折パターンを特徴とする結晶形態での２−ピラジンカルボニトリル、５−［［５−［２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル］−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］アミノ］モノメシレート一水和物を提供する。
【００１３】
本発明は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせた、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物を含む医薬組成物を提供する。
【００１４】
本発明は、癌の治療を必要とする患者に、有効量の５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物を投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。さらに、本発明はまた、癌の治療を必要とする患者に、有効量の５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物と、イオン化放射線を投与することを含む、癌を治療する方法も提供する。さらに、本発明は、癌の治療を必要とする患者に、有効量の５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物と、化学療法剤を投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。
【００１５】
本発明は、癌を治療するための薬剤を製造するための、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物の使用を提供する。さらに、本発明はまた、治療がイオン化放射線の併用療法を含む、癌の前記治療のための薬剤を製造するための、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物の使用も提供する。さらに、本発明は、併用療法によって癌を治療するための薬剤を製造するための、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物の使用を提供し、その際、前記併用療法の治療は、同一患者への前記薬剤の投与と、１以上のそのほかの化学療法剤の投与とを含む。
【００１６】
本発明は、治療に使用するための５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物を提供する。本発明はまた、癌の治療において使用するための５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物を提供する。さらに、本発明はまた、治療に使用するための５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物と、イオン化放射線を提供する。さらに、本発明は、治療に使用するための５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物と、化学療法剤を提供する。
【００１７】
本発明は、癌の治療に使用するための５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物を提供する。さらに、本発明はまた、癌の治療に使用するための５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物と、イオン化放射線を提供する。さらに、本発明は、癌の治療に使用するための５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物と、化学療法剤を提供する。
【００１８】
本発明は、癌の治療のための薬剤を製造するために５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物の使用を提供し、その際、薬剤は、イオン化放射線と同時に、別々に又は順次投与されるべきである。
【００１９】
本発明は、癌の治療のための薬剤を製造するために５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物の使用を提供し、その際、薬剤は化学療法剤も含み、又は薬剤は、化学療法剤と同時に、別々に又は順次投与されるべきである。
【００２０】
本発明は、癌の治療においてイオン化放射線と同時の、別々の又は順次の併用にて使用するために５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物を提供する。
【００２１】
本発明は、癌の治療において化学療法剤と同時の、別々の又は順次の併用にて使用するために５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物を提供する。
【００２２】
本発明は、薬学的に許容可能な担体及び任意でそのほかの治療成分と一緒に、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物を含む医薬組成物を提供する。
【００２３】
さらに、本発明は、本明細書に記載されるように方法及び使用の好ましい実施態様を提供し、その際、化学療法剤は、５−フルオロウラシル、ヒドロキシウレア、ゲムシタビン、メソトレキセート、ペメトレキセド、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン及びタキソールから成る群から選択される。本明細書で記載される方法及び使用の好ましい実施態様は、膀胱癌、結腸癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、中皮腫、腎臓癌及び子宮癌から成る群から選択される癌である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の化合物、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物は、互変異性型として存在してもよい。互変異性型が存在する場合、各型及びその混合物が本発明で意図される。
【化１】
0005705743.tif 000002
【００２５】
特に定義されない限り、本発明は、実施例３の化合物の薬学的に許容可能な塩、並びに実施例３の化合物の遊離の塩基の溶媒和物又は薬学的に許容可能なその塩を含む。用語「薬学的に許容可能な塩」は本明細書で使用されるとき、実施例３の化合物の塩を指す。薬学的に許容可能な塩及びその調製のための方法の例は、従来技術で慣習として認められている。たとえば、Ｓｔａｈｌらの「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ」、ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，（２００２）；Ｇｏｕｌｄ，Ｐ．Ｌ．の「Ｓａｌｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｂａｓｉｃ  ｄｒｕｇｓ」、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３３：２０１−２１７（１９８６）；及びＢａｓｔｉｎらの「Ｓａｌｔ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｎｅｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｔｉｔｉｅｓ」、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４：４２７−４３５（２０００）を参照のこと。
【００２６】
薬学的に許容可能な塩に加えて、ほかの塩が本発明に含まれる。それらは、化合物の精製又はほかの薬学的に許容可能な塩の調製において中間体として役立ち、同定、性状分析又は精製に有用である。
【００２７】
本明細書で使用されるとき、用語「患者」は、ヒト又は非ヒト哺乳類を指す。さらに具体的には用語「患者」はヒトを指す。
【００２８】
用語「治療すること」（又は「治療する」又は「治療」）は、症状、障害、状態又は疾患の進行又は重症度を遅くする、妨害する、停止させる、制御する、抑制する又は逆転することに関与する過程を指す。
【００２９】
本明細書で使用されるとき、用語「有効量」は、患者に対して単回用量又は複数回用量を投与する際、診断又は治療のもとで患者にて所望の効果を提供する、単独で又はイオン化放射線若しくは化学療法剤との併用での、本明細書に記載される本発明の化合物、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物の量又は投与量を指す。哺乳類の種；その大きさ、年齢及び全身状態；必要であれば、ほかの剤の同時投与；関与する特定の疾患；その疾患の程度又は重症度；個々の患者の応答；投与される特定の化合物；投与方式；投与される製剤の生物利用効率の特徴；選択される投与計画；付随する薬物の使用、及びそのほかの関連する状況のような多数の因子を考慮することによって、当業者としての主治医である診断医により有効量を容易に決定することができる。本発明では決して限定として解釈されるべきではない一方で、２０〜１５０ｍｇ／ｍ２が、本明細書で記載される化合物、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物の有効量を表す。
【００３０】
本明細書で使用されるとき、用語「併用療法」は、本発明の化合物、又は薬学的に上許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物と、化学療法剤との別々の、同時の又は順次の投与を指す。さらに、用語「併用療法」は、本発明の化合物、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物と、イオン化放射線との別々の、同時の又は順次の投与を指す。
【００３１】
実施例３の化合物、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物は、医薬組成物の一部として投与のために製剤化されてもよい。従って、１以上の薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤との組み合わせで実施例３の化合物、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物を含む医薬組成物は本発明の重要な実施態様である。それらの調製のための医薬組成物及び方法の例は当該技術で周知である。たとえば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ、Ａ．Ｇｅｎｎａｒら編、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９５）を参照のこと。
【００３２】
本発明の化合物、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物は、経口及び非経口の経路を含む、それを生物学的に利用可能にする任意の経路によって投与することができる。たとえば、化合物、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物は、経口で、皮下に、筋肉内に、静脈内に、経皮で、局所に、鼻内に、直腸に、頬内になどで投与することができる。或いは、化合物、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物は、点滴によって投与することができる。ＩＶ点滴は投与の好ましい経路である。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、以下の用語は指示された意味を有する：「ＢＣＡ」はビシンコニン酸を指し；「ｂｏｃ又はｔ−ｂｏｃ」はｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルを指し；「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを指し；「ＣＰＭＳ」は１分当たりのカウントを指し；「ＤＩＡＤ」はジイソプロピルアゾジカルボキシレートを指し；「ＤＭＦＭ」はダルベッコの改変イーグル培地を指し；「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドを指し；「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指し；「ＤＰＢＳ」はダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水を指し；「ＤＴＴ」はジチオスレイトールを指し；「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を指し；「ＥｔＯＨ」はエタノールを指し；「ＦＢＳ」はウシ胎児血清を指し；「ＨＥＰＥＳ」はＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸を指し；「ＭＥＭ」は最小必須培地を指し；「ＭｅＯＨ」はメタノールを指し；「ＰＢＳ」はリン酸緩衝生理食塩水を指し；「ＰＢＳＴ」はリン酸緩衝生理食塩水ツイーン２０を指し；「ＰＩ」はヨウ化プロピジウムを指し；「ＲＮＡａｓｅ」はリボヌクレアーゼＡを指し；「ＳＤＳ」はドデシル硫酸ナトリウムを指し；「ＲＴ」は室温を指し；「ＴＢＳ」はトリス緩衝生理食塩水を指し；「ＴＢＳＴ」はトリス緩衝生理食塩水ツイーン２０を指し；「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを指し；「ＴＲ−ＦＲＥＴ」は時間分割蛍光エネルギー移動を指し；「Ｔｒｉｓ」はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを指し；「Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ」は４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコールｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールポリエチレングリコールｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテルを指し；「ツイーン２０」はポリソルベート２０を指す。
【００３４】
以下のアッセイの結果は、本発明の化合物、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物が、Ｃｈｋ１阻害剤、Ｃｈｋ２阻害剤及び抗癌剤として有用である証拠を明らかにする。本明細書で使用されるとき、「ＩＣ５０」はその剤について考えられる最大阻害反応の５０％を生じる剤の濃度を指し、「ＥＣ５０」はその剤について考えられる最大の応答の５０％を生じる剤の濃度を指す。
【００３５】
Ｃｈｋ１生化学アッセイ
ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイを用いて、Ｃｈｋ１の生化学的な活性に対する化合物の効果を測定することができる。このアッセイでは、テルビウムを標識した抗体を用いて、キナーゼと蛍光標識の基質とＡＴＰとの反応から形成されるリン酸化された生成物を検出する。抗体はリン酸化された基質に結合し、その結果、受容体シグナル（フルオレセイン）対供与体シグナル（テルビウム）の比として算出されるＴＲ−ＦＲＥＴ値が上昇する。
【００３６】
９６穴の面積の半分が黒色のポリスチレンプレート（Ｃｏｓｔａ、カタログ番号３６９４）にてキナーゼ反応（２５μＬの反応体積）を行う。ＡＴＰの添加によって反応が開始する。最終的な反応条件は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．００５％（ｖ／ｖ）のＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、２ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０４ｎＭのフルオレセイン−ＰＫＣ基質（インビトロゲン、カタログ番号ＰＶ３５０６）、３０μＭのＡＴＰ、１．５ｎＭの活性のあるＣｈｋ１酵素（ミリポア、カタログ番号１４−３４６）、４％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ及び連続希釈した実施例２の化合物（２０μＭで出発した１：３の連続希釈、１０ポイント）である。ＡＴＰの添加に続いて、反応を室温で７５分間インキュベートし、次いで１０ｍＭのＥＤＴＡと２．１ｎＭのＴｂ−ｐＳｅｒ抗体（インビトロゲン、カタログ番号ＰＶ３５７４）を含有する２５μＬのＴＲ−ＦＲＥＴ希釈緩衝液（インビトロゲン、カタログ番号ＰＶ３５７４）の添加によって終了する。反応を止めた反応物を室温で６０分間インキュベートし、次いでＥｘ３４０ｎｍ、Ｅｍ４９５ｎｍ及びＥｍ５２０ｎｍの波長のフィルターを持つパーキンエルマーのＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを用いてＴＲ−ＦＲＥＴを測定する。
【００３７】
ＩＣ５０の決定については、各プレートでの対照からのＴＲ−ＦＲＥＴの比を用いて各濃度についてパーセント阻害を算出する。その後、ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ４．０を用いて１０ポイントの化合物濃度のデータを４つのパラメータの対数方程式に当てはめる。得られた曲線からＩＣ５０の絶対値を算出する。実施例２の化合物は、このアッセイで０．００１μＭ未満のＩＣ５０を有することが測定される。このことは、本発明の化合物がＣｈｋ１の強力な阻害剤であることを明らかにしている。
【００３８】
Ｃｈｋ２の生化学アッセイ
ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイを用いてＣｈｋ２の生化学的活性に対する化合物の効果を測定することができる。このアッセイでは、テルビウムを標識した抗体を用いて、キナーゼと蛍光標識の基質とＡＴＰとの反応から形成されるリン酸化された生成物を検出する。抗体はリン酸化された基質に結合し、その結果、受容体シグナル（フルオレセイン）対供与体シグナル（テルビウム）の比として算出されるＴＲ−ＦＲＥＴ値が上昇する。
【００３９】
９６穴の面積の半分が黒色のポリスチレンプレート（Ｃｏｓｔａ、カタログ番号３６９４）にてキナーゼ反応（２５μＬの反応体積）を行う。ＡＴＰの添加によって反応が開始する。最終的な反応条件は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．００５％（ｖ／ｖ）のＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、２ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０４ｎＭのフルオレセイン−ＰＫＣ基質（インビトロゲン、カタログ番号ＰＶ３５０６）、３０μＭのＡＴＰ、２．５ｎＭの活性のあるＣｈｋ２酵素（ミリポア、カタログ番号１４−３４７）、４％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ及び連続希釈した実施例２の化合物（２０μＭで出発した１：３の連続希釈、１０ポイント）である。ＡＴＰの添加に続いて、反応を室温で７５分間インキュベートし、次いで１０ｍＭのＥＤＴＡと２．１ｎＭのＴｂ−ｐＳｅｒ抗体（インビトロゲン、カタログ番号ＰＶ３５７４）を含有する２５μＬのＴＲ−ＦＲＥＴ希釈緩衝液（インビトロゲン、カタログ番号ＰＶ３５７４）の添加によって終了する。反応を止めた反応物を室温で６０分間インキュベートし、次いでＥｘ３４０ｎｍ、Ｅｍ４９５ｎｍ及びＥｍ５２０ｎｍの波長のフィルターを持つパーキンエルマーのＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを用いてＴＲ−ＦＲＥＴを測定する。
【００４０】
ＩＣ５０の決定については、各プレートでの対照からのＴＲ−ＦＲＥＴの比を用いて各濃度についてパーセント阻害を算出する。その後、ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ４．０を用いて１０ポイントの化合物濃度のデータを４つのパラメータの対数方程式に当てはめる。得られた曲線からＩＣ５０の絶対値を算出する。実施例２の化合物は、このアッセイで０．００４７μＭのＩＣ５０を有することが測定される。このことは、本発明の化合物がＣｈｋ２の強力な阻害剤であることを明らかにしている。
【００４１】
Ｃｈｋ１自己リン酸化細胞に基づくアッセイ
Ｃｈｋ１の阻害剤は、ＤＮＡ損傷反応が活性化されている細胞にてタンパク質のキナーゼ活性が基質をリン酸化するのを妨げる。Ｃｈｋ１の容易に検出可能な基質は、Ｃｈｋ１自体の自己リン酸化部位、セリン２９６である。以下の免疫ブロットアッセイを用いてＣｈｋ１におけるセリン２９６のリン酸化の量を測定し、Ｃｈｋ１タンパク質キナーゼの活性レベルを間接的に測定することができる。１０％（ｖ／ｖ）熱非働化ＦＢＳ（ギブコ（商標））、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（ギブコ（商標））、１×ピルビン酸（ギブコ（商標））、及び２４穴培養プレートのウエル当たり６００μＬのＭＥＭ培養培地（上記）に入れた１×１０５個の細胞で補完された、Ｅａｒｌｅ’ｓ塩（インビトロゲン）とＬ−グルタミン（ギブコ（商標））を伴ったＭＥＭにてＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣから購入）を培養する。３７℃、５％ＣＯ２及び９５％〜１００％の湿度にて細胞を２４時間インキュベートする。培養培地中の４μＭのドキソルビシン（シグマ）のストック１６μＬを各適当なウエルに加え、１００ｎＭの最終濃度のドキソルビシンを作製する。Ｃｈｋ１阻害剤化合物を添加する前にさらに２４時間、プレートをインキュベータに戻す。化合物を１００％ＤＭＳＯにて１０ｍＭで可溶化し、次いで４０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯで２ｍＭに希釈し、次いで４％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯを加えた培養培地で１００μＭに希釈する。その後、１００μＭ〜０．００５μＭの範囲にわたって化合物の連続希釈（１：３）を調製する。６６μＬの化合物ストックをプレートの適当なウエルに加えて０．４％（ｖ／ｖ）の最終ＤＭＳＯ濃度と１μＭ〜０．０００５μＭの間の最終化合物濃度の範囲を生じる。さらに２時間プレートをインキュベータに戻し、次いで細胞の溶解と処理のために取り出す。次いでプレートから培地を取り除き、０．５ｍＬの氷冷ＤＰＢＳ（ギブコ（商標））で各ウエルを１回洗浄し、液体をすべて取り除き、残りの手順のためにプレートを氷上に置く。ホスファターゼ阻害剤（シグマ）とプロテアーゼ阻害剤（ロシュダイアグノスティクス）を含有する細胞抽出緩衝液（インビトロゲン）から成る氷冷溶解緩衝液７５μＬを各ウエルに加える。１０分後、各ウエルを擦り、溶解物を氷上の１．５ｍＬのポリプロピレン微量遠心管に移す。各溶解物をプレートカップホルンソニケータ（ミソニックス）によって４５秒間超音波処理するが、水／氷槽にて懸濁する。４×ラムリ試料緩衝液（２４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４０％のグリセロール、０．０５％のブロモフェノールブルー、８％ｗ／ｖのＳＤＳ及び２０％（ｖ／ｖ）のβ−メルカプトエタノール）２５μＬを含有する０．５ｍＬのポリプロピレン微量遠心管に５０μＬの各試料を移し、９５℃で５分間加熱し、−８０℃にて凍結保存する。残りの溶解物は、タンパク質濃度を決定する（ＢＣＡ（商標）プロテインアッセイキット、サーモサイエンティフィック）のに用いる。試料緩衝液中の各細胞溶解物５μｇをＥ−Ｐａｇｅウエルゲル（インビトロゲン）に適用し、製造元の指示書に従って電気泳動に供する。当該技術でよく理解されている手順に従ってタンパク質をゲルからイモビロン−Ｐ膜（ミリポア）に電気的に移す［Ｔｏｗｂｉｎら、１９７９］。１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．０５％（ｖ／ｖ）のツイーン２０（ＴＢＳＴ）で手短に膜をすすぎ、ＴＢＳＴ／５％（ｖ／ｖ）の再構成されたＣａｒｎａｔｉｏｎ（登録商標）即席ミルク中にて２５℃で１時間浸す。ＴＢＳＴにて５分間、膜を４回洗浄し、次いで適当な希釈のウサギ抗ホスフォＣｈｋ１（セリン２９６）（セルシグナリング）を伴ったＴＢＳＴ／５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡにて４℃で２４時間、膜を浸す。２５℃にてＴＢＳＴで５分間、膜を４回洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ；アマシャム）を結合したロバ抗ウサギＩｇＧの適当な希釈物を含有するＴＢＳＴ／５％ミルクにて２５℃で２時間、膜を浸し、自己リン酸化したＣｈｋ１タンパク質を検出する。２５℃にてＴＢＳＴで５分間、膜を４回、再び洗浄する。化学発光撮影装置（富士フィルム）を用いて、製造元によって推奨されるように、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｆｅｍｏｔｏ  ＨＲＰ−検出試薬（ピアース）によって膜に固定化された抗原−抗体−リポーター抱合体が検出される。「Ｔｏｔａｌ  Ｌａｂ」ソフトウエア（ノンリニアダイナミックス）を用いてホスフォ−Ｃｈｋ１（Ｓｅｒ２９６）バンドの強度を算出する。ドキソルビシン誘導のＣｈｋ１自己リン酸化のパーセント阻害は、以下の式：％阻害＝（試料のホスフォＣｈｋ１バンドの強度−ドキソルビシンなしの陰性対照のホスフォＣｈｋ１バンドの強度）／（ドキソルビシン陽性対照のホスフォＣｈｋ１バンドの強度−ドキソルビシンなしの陰性対照のホスフォＣｈｋ１バンドの強度）×１００を用いて算出する。実施例２の化合物はこのアッセイで０．０００５μＭ未満のＥＣ５０を有することが測定される。このことは、本発明の化合物がＣｈｋ１の強力な阻害剤であることを明らかにしている。
【００４２】
ドキソルビシン誘導のＧ２Ｍチェックポイント破棄のＨｅＬａ細胞に基づいた鋭敏アッセイ
Ｃｈｋ１の阻害剤は、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤であるドキソルビシンによって処理されたｐ５３マイナス腫瘍細胞におけるＧ２ＭのＤＮＡ損傷チェックポイントを無効にする。Ｇ２Ｍのチェックポイントの破棄の測定は、細胞がＧ２Ｍチェックポイントを越えて有糸分裂に入った後生じるセリン１０におけるヒストンＨ３のリン酸化である。以下の高含量の画像化アッセイを用いて細胞におけるヒストンＨ３のリン酸化を測定することができる。ポリＤ−リジンを被覆した透明な底の黒色プレート（ＢＤバイオコート、カタログ番号３５０４６４０）にて、ウエル当たり１００μＬ体積で、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを補完し、ウエル当たり２０００個の細胞を入れたＭＥＭ培地（ギブコ（商標））においてＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣから購入した）を培養する。次いで細胞培養インキュベータにて１８〜２４時間、プレートをインキュベートする（３７℃、５％ＣＯ２及び９５％相対湿度）。最初のインキュベートに続いて、６２５ｎＭのドキソルビシンを含有するギブコ（商標）ＭＥＭ培地１０％ＦＢＳ２０μＬをプレートの適当なウエルに加え、１２５ｎＭの最終濃度を生じる。細胞をＧ２Ｍチェックポイントで停止させるのに十分な２４時間、プレートをインキュベータに戻す。翌日、細胞を実施例２の化合物で処理する。実施例２の化合物は、１００％ＤＭＳＯに１０ｍＭにて可溶化し、次いで４％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ−ＭＥＭにて５０μＭから出発して１０×ストックに希釈する。その後、５０μＭ〜０．３９μＭにわたって化合物の連続希釈（１：２）を調製する。１３μＬの化合物ストックをプレートの適当なウエルに加え、０．４％のＤＭＳＯ最終濃度と５μＭ〜０．０３９μＭの間の範囲の化合物の最終濃度を生じる。プレートをさらに７時間インキュベータに戻し、次いで固定のために取り出す。各ウエルから液体を慎重に取り除き、１００μＬのＰＲＥＦＥＲ（商標）固定液（アナテック社、カタログ番号４１４）を加える。プレートを室温にて２０分間保持し、固定液を除き、次いで１００μＬ／ウエルのＤＰＢＳ（ギブコ（商標）、カタログ番号１４０４０）中の０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（ピアース、カタログ番号２８３１４）を１０分間添加することによって細胞を透過処理する。溶液を取り除き、ウエル当たり１００μＬのＤＰＢＳで２回プレートを洗浄し、次いで室温にて１時間、５０μｇ／ｍＬのＲＮＡａｓｅ（リボヌクレアーゼＡ、シグマ、カタログ番号Ｒ−６５１３）を含有する１００μＬのＤＰＢＳを加える。ＲＮＡａｓｅ溶液を取り除き、１：５００希釈のウサギ抗ｐＨＨ３（ｓｅｒ１０）（ＵＢＩ、カタログ番号０６−５７０）と１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ（ギブコ（商標）、カタログ番号１５２６０）を含有するＲＮＡａｓｅ溶液５０μＬを各ウエルに加えることによってセリン１０にてリン酸化されたヒストンＨ３（ｐＨＨ３）の存在について細胞を染色する。プレートを密封し、一晩４℃に保つ。ウエル当たり１００μＬのＤＰＢＳによって各プレートを２回洗浄することによって一次抗体を取り除き、ＤＰＢＳと１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中のＡｌｅｘａ染料４８８（インビトロゲン、カタログ番号Ａ１１００８）に結合したヤギ抗ウサギＩｇＧの１：７���０希釈５０μＬで置き換える。アルミニウムホイルで覆って光から保護して室温にてプレートを１時間保持する。ウエル当たり１００μＬのＤＰＢＳによって再び２回プレートを洗浄し、１５ｎＭのヨウ化プロピジウム１００μＬ（元々の溶液からのＰＢＳによる１：１００希釈、モレキュラープローブ、カタログ番号Ｐ３５６６）によって置き換える。黒色シールでプレートを密封し、光からプレートを保護する。プレートを３０分間インキュベートして核を染色する。４８８ｎｍの励起（ＴＴＰラボテック社）を用いたＡＣＵＭＥＮ  ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）レーザー走査蛍光マイクロプレートサイトメータによってプレートを走査し、ｐＨＨ３と２Ｎ及び４Ｎを含むＤＮＡ含量とを測定する。Ａｌｅｘａ４８８からの５１９ｎｍでの平均強度によってｐＨＨ３陽性細胞を特定する。ヨウ化プロピジウム／ＤＮＡからの６５５〜７０５ｎｍでの総強度を用いて細胞周期（２Ｎ細胞、４Ｎ細胞）における個々の細胞及び細胞の亜集団を特定する。％ｐＨＨ３、％２Ｎ及び％４Ｎの最終アッセイ出力を生じる総細胞の％を正規化することによって各集団についての最終的な読み取りを決定する。次いで、１００ｎＭでの阻害剤対照化合物の最大濃度で細胞を処理することによって１００％活性を決定して、各化合物の最終的な％活性を決定する。０％の活性は、化合物で処理しないことに基づく。相対的なＥＣ５０は、ＡＣＴＩＶＩＴＹ  ＢＡＳＥ（商標）、エクセルフィット、４つのパラメータの対数適合を用いた曲線の適合、方程式２０５を用いて１００％の最大対照に対する％ｐＨＨ３を決定することによって決定される。実施例２の化合物は、このアッセイで０．０１０５μＭのＥＣ５０を有することが測定される。このことは、本発明の化合物がＧ２ＭのＤＮＡ損傷チェックポイントを無効にすることを明らかにしている。
【００４３】
ＥＣｔｆｓ（２倍の感作）アッセイ
Ｃｈｋ１の阻害剤は、Ｓ期内のチェックポイントの破棄を介してゲムシタビン（又はそのほかの細胞毒性剤）の抗増殖活性を増強することができ、結果的に持続し、高められたＤＮＡ損傷を生じる。ＤＮＡ損傷後、継続して増殖する腫瘍細胞の能力は、そのＤＮＡを複製する細胞の能力を測定することによって分析することができる。このアッセイは、細胞がＤＮＡ損傷を修復する機会を有した後、そのＤＮＡを複製する細胞の能力を評価する。このアッセイでは、細胞をゲムシタビン、次いで実施例２の化合物で処理する。回復期に続いて、Ｓ期の間、ＤＮＡに放射性チミジンを取り込む能力について細胞をアッセイする。ＥＣｔｆｓパラメータは、ゲムシタビンのＧＩ９０濃度を半減するのに必要とされるＣｈｋ１阻害剤の濃度の測定値であり、Ｃｈｋ１阻害の非存在下でこのアッセイにて測定される。１０％（ｖ／ｖ）の熱非働化ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ１６４０（ギブコ（商標））にてＨＴ−２９細胞（ＡＴＣＣから入手した）を増殖させる。コーニングコースター９６穴組織培養プレートにウエル当たり１．３×１０３個にてこれらの細胞を入れる。細胞を入れた後、３７℃に戻す前に組織培養プレートを室温にて４５分間保持する。ゲムシタビンを加える前にプレートを２４時間インキュベートする。ゲムシタビン添加の前に、すべてのウエルから培地を取り除き、ウエル当たり１５０μＬの新鮮なＲＰＭＩ培地に置き換える。リン酸緩衝生理食塩水にて１０ｍＭでのゲムシタビンのストックを調製する。ＲＰＭＩ培地中で４×濃度でゲムシタビンの希釈を調製し、ウエル当たり５０μＬをウエルに加えた。使用したゲムシタビンの最高最終濃度は８０μＭであり、４倍段階で希釈を進める。２時間後、ゲムシタビン含有の培地をウエルから取り除き、ウエル当たり１５０μＬの新鮮なＲＰＭＩ培地で置き換える。実施例２の化合物（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を先ず、ＤＭＳＯにて２０００×の最終濃度に希釈し、次いでＲＰＭＩ培地で１：５００に希釈してウエルへの添加用に４×ストックを生成する。添加の体積は５０μＬである。化合物の希釈は、５０００ｎＭから出発して２倍希釈によって開始する。実施例２の化合物の添加後２４時間で、阻害剤を含有する培地を吸引によって取り除き、ウエル当たり２００μＬの新鮮なＲＰＭＩ培地で置き換える。実施例２の化合物を取り除いた７２時間後、トリチウム化したチミジン標識を開始する。３Ｈ−チミジン（ＮＥＴ０２７Ｘ００１、パーキンエルマー、比活性２０Ｃｉ／ミリモル）を完全ＲＰＭＩにて１：２０に希釈して０．０５ｍＣｉ／ｍＬの濃度を得る。この溶液２０μＬを各ウエルに添加して１μＣｉ／ウエルの３Ｈ−チミジンを得る。細胞を２２時間標識する。３Ｈ−チミジンを含有する培地をウエルから十分に取り除く。次いで−２０℃にてプレートを数時間凍結する。取り込まれた３Ｈ−チミジンを含有するＤＮＡを回収するために、プレートを数分で融解し、ウエル当たり１２０μＬの０．１ＮのＮａＯＨを各ウエルに添加する。次いで、回転装置にてゆっくり混合しながら、各プレートを１０分間３７℃にてインキュベートする。Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ１９６ハーベスタ（パーキンエルマー）によってＤＮＡを回収し、９６穴ＵｎｉｆｉｌｔｅｒＧＦ／Ｃ���レート（パーキンエルマー、Ｎｏ．６００５１７４）に集める。細胞が標識された組織培養プレートのウエルを水で５回洗浄する。ウエル当たり追加の４．５ｍＬ（３×１．０ｍＬ及び最終的に１．５ｍＬの洗浄）によってＵｎｉｆｉｌｔｅｒプレート膜を洗浄する。次いで３７℃にて少なくとも６時間、Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートを乾燥する。各フィルタープレートの底をＢａｃｋｓｅａｌ粘着シート（パーキンエルマー）で封止し、５０μＬ／ウエルのＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０（パーキンエルマー）を添加する。次いでＴｏｐｓｅａｌ透明粘着シート（パーキンエルマー）によって各プレートを封止する。Ｔｏｐｃｏｕｎｔシンチレーションカウンター（パーキンエルマー）にてウエル当たり１分、プレートを計数する。解析とプロットのために３Ｈ−チミジンの１分当たりのカウント（ｃｐｍ）をＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）に転送する。実施例２の化合物の各濃度についてゲムシタビンの用量反応を決定する。これを行うために、ゲムシタビンの非存在下での実施例２の化合物の濃度についての平均ｃｐｍとして１００％取り込みを設定し、取り込みなし（１００％阻害）をｃｐｍ＝０（１分当たりのカウントなし）として設定してｃｐｍを正規化する。Ｐｒｉｓｍにおけるデータのプロットについては、ゲムシタビンの濃度を対数値に変換し、非線形回帰によって用量反応曲線を適合させる。最上の適合も最下の適合も拘束されない。ＥＣｔｆｓ値は０．３ｎＭである。さらに、ＨＴ２９結腸癌細胞にて３ｎＭの実施例２の化合物は、ゲムシタビンのＥＣ５０を３７ｎＭから５ｎＭに７倍低下させる。実施例２の化合物の作用はまた、増殖阻害の比率をゲムシタビンの５２から併用の７３に上昇させる。単独では、３ｎＭの実施例２の化合物がＨＴ２９細胞の増殖にほとんど効果を有さない。
【００４４】
Ｃｈｋ１の生体内での標的阻害アッセイ
増殖培地（１０％（ｖ／ｖ）熱非働化ＦＢＳ（ギブコ（商標））、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（ギブコ（商標））、１×ピルビン酸（ギブコ（商標））によって補完した、Ｌ−グルタミン（ギブコ（商標））を伴い、Ｅａｒｌｅ’ｓ塩（インビトロゲン）を伴ったＭＥＭ）でＣａｌｕ−６細胞（ＡＴＣＣ）を培養し、増殖させる。細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、増殖培地（血清なし）中の１×１０６個の細胞を、等量のＢＤＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）マトリクス（ＢＤバイオサイエンス、ニュージャージー州、フランクリン）と混合し、次いで事前に放射線照射した（４．５Ｇｙ）ヌードマウス（インディアナ州、インディアナポリスのＨａｒｌａｎからの無胸腺ヌード）の横腹に皮下注射する。移植後１５日目に（腫瘍サイズ＝１５０〜２００ｍｍ３）、腹腔内経路にて１５０ｍｇ／ｋｇ用量にて生理食塩水で新鮮に調製したゲムシタビン（イリノイ州、レイクフォレストのＨｏｓｐｉｒａ）を動物に毎日投与する。６時間後、モル比にてメタンスルホン酸／２０％Ｃａｐｔｉｓｏｌ（カンザス州、オーバーランドパークのＣＹＤＥＸ）で調製された実施例２の化合物を静脈内経路にて用量を１５ｍｇ／ｋｇ以下で変化させて動物に投与する。Ｃｈｋ１阻害剤投与の２時間後、動物を屠殺し、腫瘍を回収し、直ちに、ホスファターゼ阻害剤（シグマ）とプロテアーゼ阻害剤（ロシュダイアグノスティクス）を含有する氷冷した細胞抽出緩衝液（インビトロゲン、カタログ番号ＦＮＮ００１１）にて処理する。１５秒間、高に設定されたモーター付きの組織ホモゲナイザー（Ｐｏｗｅｒｇｅｎ７００）を用いて、氷冷１５ｍＬポリプロピレン円錐管にて１．５〜２．０ｍＬの溶解緩衝液中で腫瘍を処理する。試料を氷上の保持しながら、２５ゲージの針を付けた１ｍＬの注射筒を介して溶解物を４回引き出す。次に、０．１５ｍＬの４×ラムリ試料緩衝液（２４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４０％のグリセロール、０．０５％のブロモフェノールブルー、８％ｗ／ｖのＳＤＳ及び２０％（ｖ／ｖ）のβ−メルカプトエタノール）を含有する１．５ｍＬのポリプロピレン微量遠心管に０．３５ｍＬの腫瘍溶解物を移す。次いで、試料を混合し、９５℃にて５分間加熱し、高出力Ｍｉｓｏｎｉｘ３０００プレートホルンソニケーターを用いて１分間超音波処理する。次いで、ウエスタンブロットによる標的阻害評価のために、試料を氷上で保存する、又は−８０℃で保存する。残りの溶解物は、タンパク質濃度を決定する（ＢＣＡ（商標）プロテインアッセイキット、サーモサイエンティフィック）のに用いる。試料緩衝液中の各腫瘍溶解物５μｇをＥ−Ｐａｇｅ９６ウエルゲル（インビトロゲン）に適用し、製造元の指示書に従って電気泳動に供する。当該技術でよく理解されている手順に従ってタンパク質をニトロセルロースＰｒｏｔｒａｎＢＡ８３膜（ワットマン）に移す［Ｔｏｗｂｉｎら，１９７９］。次いで膜を処理して、セリン２９６にて自己リン酸化されたＣｈｋ１タンパク質を測定する。水、次いで１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．０５％（ｖ／ｖ）のツイーン２０（ＴＢＳＴ）で手短に膜をすすぎ、ＴＢＳＴ／５％（ｖ／ｖ）の再構成されたＣａｒｎａｔｉｏｎ（登録商標）即席ミルク中にて２５℃で１時間浸す。次いでＴＢＳＴにて５分間、膜を４回洗浄する。次いで適当な希釈のウサギ抗ホスフォＣｈｋ１（セリン２９６）（セルシグナリング）を伴ったＴＢＳＴ／５％（ｖ／ｖ）ＢＳＡにて４℃で１６時間、膜を浸す。次に２５℃にてＴＢＳＴで５分間、膜を４回洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ；アマシャム）を結合したロバ抗ウサギＩｇＧの適当な希釈物を含有するＴＢＳＴ／５％ミルクにて２５℃で２時間、膜を浸し、ホスフォＣｈｋ１（ｓｅｒ２９６）を検出する。２５℃にてＴＢＳＴで５分間、膜を４回、再び洗浄する。製造元によって推奨されるように、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｆｅｍｏｔｏ  ＨＲＰ−検出試薬（ピアース）によって、膜に固定化された抗原−抗体−リポーター抱合体が検出される。
【００４５】
ＦＵＪＩ  ＬＡＳ−４０００画像化システムを用いてシグナルを検出し、捕捉する。「Ｔｏｔａｌ  Ｌａｂ」ソフトウエア（ノンリニアダイナミックス）を用いてホスフォ−Ｃｈｋ１（ｓｅｒ２９６）バンドの強度を算出する。ゲムシタビンが誘導したＣｈｋ１の自己リン酸化のパーセント阻害は、以下の式；％阻害＝（試料のホスフォＣｈｋ１バンドの強度−平均ゲムシタビン（Ｍａｘ）陽性対照のホスフォＣｈｋ１バンドの強度）／（平均陰性対照（Ｍｉｎ）のホスフォＣｈｋ１バンドの強度−平均ゲムシタビン（Ｍａｘ）陽性対照のホスフォＣｈｋ１バンドの強度）×１００を用いて算出する。
【００４６】
このアッセイでは、実施例２の化合物は、Ｃｈｋ１の自己リン酸化について０．０３ｍｇ／ｋｇの標的調節有効用量５０（ＴＭＥＤ５０）を有することが測定される。
【００４７】
ヒト腫瘍の異種移植モデル
Ｃａｌｕ−６肺腫瘍及びＨＴ２９結腸腫瘍の異種移植有効性モデルを用いて、腫瘍の殺傷を達成するＣｈｋ１阻害剤の能力を生体内で測定することができる。Ｃａｌｕ−６肺癌細胞（ＡＴＣＣ）は、増殖培地（１０％（ｖ／ｖ）熱非働化ＦＢＳ（ギブコ（商標））、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（ギブコ（商標））、１×ピルビン酸ナトリウム（ギブコ（商標））によって補完した、Ｌ−グルタミン（ギブコ（商標））を伴い、Ｅａｒｌｅ’ｓ塩（インビトロゲン）を伴ったＭＥＭ）で培養し、ＨＴ２９結腸癌細胞（ＡＴＣＣ）は、増殖培地（１０％ＦＢＳ（ギブコ（商標））を補完したＭｃＣｏｙの５Ａ培地（ギブコ（商標））で培養し、増殖させる。細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、増殖培地（血清なし）中の５×１０６個の細胞（ＨＴ−２９）又は１×１０６個の細胞（Ｃａｌｕ−６）を等量のＢＤＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）マトリクス（ＢＤバイオサイエンス、ニュージャージー州、フランクリン）と混合し、次いでヌードマウス（マサチューセッツ州、ウィルミントンのチャールズリバーラボからのＣＤ−１ｎｕ／ｎｕ）の横腹に皮下注射する。移植（１５０〜２００ｍｍ３）のおよそ１６日後、ゲムシタビンを生理食塩水中で新鮮に調製し、腹腔内の経路にて６０ｍｇ／ｋｇ用量で動物に毎日投与する。２４時間後、モル比にてメタンスルホン酸／２０％Ｃａｐｔｉｓｏｌ（カンザス州、オーバーランドパークのＣＹＤＥＸ）で調製された実施例２の化合物を静脈内経路にて動物に投与する。１日休んだ後、投与をさらに３サイクル（Ｃｈｋ１阻害剤の相殺によりＱ３Ｄ×４＋２４時間）繰り返す。各投与群は９匹の動物から成る。治療の経過中、週に２回行う腫瘍体積の測定によって腫瘍の応答を判定する。腫瘍増殖の阻害（ＴＧＩ）は、ビヒクル処理の対照群の平均腫瘍サイズからの化合物処理群の平均腫瘍サイズの％減少として算出される。単独で投与された及びゲムシタビンとの併用での実施例２の化合物は、ＨＴ−２９及びＣａｌｕ−６の腫瘍異種移植モデルの双方にて優れた用量依存性の抗腫瘍活性を示し、ゲムシタビン単独よりも６倍まで高い腫瘍増殖阻害を示す。
【００４８】
単一剤の有効性投与
Ｃａｌｕ−６肺異種移植有効性モデルを用いて、腫瘍の殺傷を達成するＣｈｋ１阻害剤の能力を生体内で判定することができる。Ｃａｌｕ−６肺癌細胞（ＡＴＣＣ）は上述のように培養する。細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、増殖培地（血清なし）中の１×１０６個の細胞（Ｃａｌｕ−６）を等量のＢＤＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）マトリクス（ＢＤバイオサイエンス、ニュージャージー州、フランクリン）と混合し、次いでヌードマウス（マサチューセッツ州、ウィルミントンのチャールズリバーラボからのＣＤ−１ｎｕ／ｎｕ）の横腹に皮下注射する。移植（１５０〜２００ｍｍ３）のおよそ１６日後、実施例２の化合物を１５ｍｇ／ｋｇ（皮下に（ＳＣ）１日２回（ＢＩＤ×５で２日休み）にて３サイクル投与する。治療の経過中、週に２回行う腫瘍体積の測定によって腫瘍の応答を判定する。５日間のＢＩＤスケジュール（１５ｍｇ／ｋｇ）で投与された実施例２の化合物は、前述のゲムシタビンに加えた実施例２の化合物の併用スケジュールよりも優れた増殖阻害を提供する。完全な腫瘍の退行は迅速であり、永続的である。
【００４９】
単層の増殖及び細胞傷害性のアッセイ
Ｃｈｋ１阻害剤の効能の手段の１つは、制御されない複製開始点の活性化による培養における癌細胞の増殖を阻害する能力である（Ｃｏｎｔｉら，Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ６：２７６０−２７６７，２００７）。幅広い範囲の腫瘍種に由来する細胞株におけるＣｈｋ１阻害剤の抗増殖活性の判定は、どの腫瘍種がＣｈｋ１阻害剤による化学療法に臨床的に反応性であってもよいかを示している。以下に記載される細胞増殖アッセイはドイツ、Ｏｎｃｏｔｅｓｔ社で行われている。３０の固形腫瘍細胞株は、１３の異なった腫瘍の組織種に由来し、それぞれ１〜６の異なった細胞株によって表される（Ｏｎｃｏｔｅｓｔ社）。それらは、膀胱癌、脳腫瘍、結腸癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、腎臓癌及び子宮体癌、並びに黒色腫及び胸膜中皮種から樹立されている。細胞株はすべて、患者に由来する腫瘍異種移植からＯｎｃｏｔｅｓｔにて樹立されている（Ｒｏｔｈら，１９９９）。供与者異種移植の起源はＦｉｅｂｉｇらによって記載されている（Ｆｉｅｂｅｒｇら，１９９２および１９９９）。細胞株は慣例的に週１回又は２回継代し、２０継代まで培養で維持される。細胞はすべて、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ドイツ、ＰＡＡ、Ｃｏｌｂｅ）と０．１ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシン（ドイツ、ＰＡＡ、Ｃｏｌｂｅ）で補完したＲＰＭＩ１６４０培地（ドイツ、ＰＡＡ、Ｃｏｌｂｅ）にて５％ＣＯ２を伴った湿った雰囲気中３７℃で増殖させる。改変されたヨウ化プロピジウムアッセイを用いてこれらの細胞株に対する化合物の細胞傷害性活性を評価する。手短には、トリプシン処理によって指数相培養から付着性細胞を回収し、計数し、細胞株に依存する細胞密度（４，０００〜２０，０００細胞／ウエル）にて９６穴平底マイクロタイタープレートに入れる。細胞が付着し、指数増殖を再開するのを可能にする２４時間の回復期間の後、１０μＬの培養培地（６つの対照ウエル／プレート）又は実施例２の化合物を含有する培養培地を加える。ＤＭＳＯにて１ｍＭの濃度で実施例２の化合物のストック溶液を調製する。以下のように完全ＲＰＭＩ１６４０培養培地によってその後の希釈を行う：ＤＭＳＯストック溶液を先ず１：２２に希釈する（４．５％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯを含有する）。この溶液を用いて、細胞培養培地における連続希釈（１／２対数又は２倍）を作製する。最終の希釈工程（１：１５）については、ウエル当たり１０μＬの各最終化合物溶液をウエル当たり１４０μＬの培養培地に直接加える。最終的なＤＭＳＯの濃度は≦０．３％（ｖ／ｖ）である。実施例２の化合物を１０ポイント濃度曲線での３つ組に適用し、処理を４日間継続する。４日間の処理の後、培養培地を取り除き、７μｇ／ｍＬのＰＩ水溶液２００μＬによって置き換える。生細胞の数を測定するには、凍結によって細胞に透過処理を行い、化合物による処理後、ウエルに付着したままだった細胞すべての死を生じる。最終的に、Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ４０００マイクロプレートリーダー（励起λ＝５３０ｎｍ、放射λ＝６２０ｎｍ）を用いてＰＩの蛍光を測定して全生細胞の数を決定する。増殖阻害は、試験／対照×１００（％Ｔ／Ｃ）の値として表現される。Ｔ／Ｃ値に基づいて、反応（％Ｔ／Ｃ）に対する非線形���帰（ｌｏｇ［阻害剤の濃度］）を用いて相対的ＩＣ５０値を決定する。実施例２の化合物は、２０ｎＭを下回るＥＣ５０にてこれら腫瘍細胞株の大半の増殖を阻害するということは、単剤として広い抗癌活性の可能性を示唆している。
【００５０】
以下の調製及び実施例を提供して本発明をさらに詳細に説明し、化合物、又は薬学的に許容可能なその塩若しくはその塩の溶媒和物の典型的な合成を表す。本発明の化合物の名称は、特に指示される場合を除いて一般に、ＣｈｅｍＤｒａｗ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）１０．０又は１１．０によって提供される。
【００５１】
経路Ａ
調製１
５−イソチオシアナトピラジン−２−カルボニトリル
【化２】
0005705743.tif 000003
チオホスゲン（１．８６ｇ、１５ミリモル）のＴＨＦ（４ｍＬ）溶液を室温にて、５−アミノピラジン−２−カルボニトリル（１．２０ｇ、１０ミリモル）とピリジン（２ｍＬ）のＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）とＴＨＦ（２５ｍＬ）の溶液に一滴ずつ加える。反応混合物を室温にて３時間撹拌する。混合物を濃縮し、粗生成物を酢酸エチルで希釈し、濾過し、濃縮して標題の化合物を得る。
【００５２】
調製２
（ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−アセチル−３−メトキシフェノキシ）プロピルカルバメート
【化３】
0005705743.tif 000004
室温にてｔｅｒｔ−ブチル３−ヒドロキシプロピルカルバメート（２．４５ｇ、１４．０ミリモル）と、１−（２−ヒドロキシ−６−メトキシフェニル）エタノン（１．９４ｇ、１１．７ミリモル）と、トリフェニルホスフィン（３．６６ｇ、１４．０ミリモル）の撹拌したＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液に、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（２．８２ｇ、１４．０ミリモル）を加える。１８時間撹拌した後、減圧下で溶媒を取り除き、粗生成物をクロマト分画し（ヘキサン−酢酸エチル：０〜６０％の勾配）、１．６０ｇの標題の化合物を得る。
【００５３】
実施例１
５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルギ酸塩
【化４】
0005705743.tif 000005
ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−アセチル−３−メトキシフェノキシ）プロピルカルバメート（１．０８ｇ、３．１７ミリモル）の撹拌された無水ＴＨＦ（２５ｍＬ）溶液に、室温にてＴＨＦ（７．６ｍＬ、７．６ミリモル）中のリチウムヘキサメチルジシラザン１Ｍ溶液をゆっくり加える。１０分間撹拌した後、ＴＨＦ（４ｍＬ）中の５−イソチオシアナトピラジン−２−カルボニトリル（０．５１０ｇ、３．１７ミリモル）を加え、撹拌を３０分間継続する。反応混合物を濃縮し、エタノール（５０ｍＬ）と酢酸（５ｍＬ）に再溶解し、その後、ヒドラジン水和物（２ｍＬ）を加える。次いで得られた反応混合物を１２０℃にて２分間加熱した。次いで反応混合物を室温に冷却し、水（１００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（１００ｍＬで２回）で抽出する。有機部分を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮する。粗生成物をジクロロメタン（５０ｍＬ）に再溶解し、トリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）で処理し、室温で１５分間撹拌する。溶媒を取り除き、分取ＨＰＬＣを用いて粗生成物（１．２０ｇ）を精製して０．０４６ｇの標題の化合物を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３６６．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００５４】
経路Ｂ
調製３
１−［２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル］エタノン
【化５】
0005705743.tif 000006
ＴＨＦ中の１−（２−ヒドロキシ−６−メトキシフェニル）エタノン（３０ｇ、１８０．５ミリモル）と、炭酸カリウム（４９．９ｇ、３６１ミリモル）と、ヨウ化ナトリウム（２．６８ｇ、１８．１ミリモル）と４−メトキシベンジルクロリド（２７．０ｍＬ、１９８．６ミリモル）をフラスコに充填し、混合物を一晩加熱還流する。混合物を室温に冷却し、水で希釈し、酢酸エチルで抽出する。合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮する。酢酸エチル／ヘキサンの溶離液によるシリカゲルクロマトグラフィによって粗生成物を精製し、白色固形物として３２．５１ｇ（５７％）の所望の生成物を得る。
【００５５】
調製４
１−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−３，３−ビス（メチルチオ）プロパ−２−エン−１−オン
【化６】
0005705743.tif 000007
５００ｍＬの丸底フラスコに９５％ＮａＨ（７．２８ｇ、２８８ミリモル）を充填し、無水ＤＭＳＯ（１７０ｍＬ）を加える。得られた不均質な混合物に、無水ＤＭＳＯ（６０ｍＬ）中の１−［２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル］エタノン（４１．２ｇ、１４４ミリモル）を一滴ずつ加える。混合物を室温で１０分間撹拌し、その時点で、二硫化炭素（８．６９ｍＬ、１４４ミリモル）を一滴ずつ加え、その後直ちにヨウ化メチル（１８．０ｍＬ、２．８８ミリモル）を加える。慎重な添加を促す双方の試薬の添加の間、熱と気体が発生する。均質な溶液を室温にて１８時間撹拌し、次いで３倍容量の水にゆっくり注ぐ。固形生成物を濾別し、高真空下で乾燥させ、橙色の固形物として標題の化合物を得る。
【００５６】
調製５
５−ブロモ−Ｎ−（５−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）ピラジン−２−アミン
【化７】
0005705743.tif 000008
５−ブロモピラジン−２−アミン（３．７３ｇ、２１．４ミリモル）をＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶解し、−７８℃に冷却する。ｎ−ブチルリチウムのヘキサン（１０．３２ｍＬ、２３．５ミリモル）溶液をゆっくり加える。低温にて反応混合物を１５分間撹拌し、次いで室温にゆっくり温め、さらに１時間撹拌する。混合物を０℃に再冷却し、１−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−３，３−ビス（メチルチオ）プロパ−２−エン−１−オン（８．３９ｇ、２１．４ミリモル）のＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液を、カニューレを介して加える。溶液は均質になり、室温にて溶液を１５分間撹拌したのち、１０時間加熱還流する。次いで溶液を室温に冷却し、減圧下で溶媒を取り除く。固形残留物をＥｔＯＨ（１５０ｍＬ）に溶解し、氷酢酸（１．３ｍＬ、２３．５ミリモル）を加える。ヒドラジン水和物（５．２５ｍＬ、１０７ミリモル）を加え、溶液をさらに８時間還流する。混合物を室温に冷却し、真空下で濃縮する。シリカゲルクロマトグラフィ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ）によって生成物を精製して５．７６ｇ（７４％）の茶色の固形物を得る。
【００５７】
調製６
２−（３−（５−ブロモピラジン−２−イルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−メトキシフェノール
【化８】
0005705743.tif 000009
５−ブロモ−Ｎ−（５−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）ピラジン−２−アミン（３．１ｇ、６．４３ミリモル）をＭｅＯＨ（１００ｍＬ）に溶解する。反応混合物を介してＨＣｌガスを２０分間混入する。混合物を２時間撹拌し、減圧下で溶媒を取り除く。残留物を３：１のクロロホルム／イソプロパノール（１００ｍＬ）に再溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１００ｍＬ）と混ぜ合わせる。層を分離し、酢酸エチルで水性層を抽出する（５０ｍＬで３回）。合わせた有機層を濃縮し、メタノールで粉砕して１．５ｇ（６４％）の茶色固形物を得る。
【００５８】
調製７
ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（３−（５−ブロモピラジン−２−イルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−メトキシフェノキシ）プロピルカルバメート
【化９】
0005705743.tif 000010
ｔｅｒｔ−ブチル３−ヒドロキシプロピルカルバメート（０．８３ｍＬ、４．８３ミリモル）と、２−（３−（５−ブロモピラジン−２−イルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−メトキシフェノール）（１．５９ｇ、４．３８ミリモル）と、ポリスチレントリフェニルホスフィン（５．９１ｇ、８．７６ミリモル）の撹拌されたＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液に、室温にてジイソプロピルアゾジカルボキシレート（１．７３ｍＬ、８．７６ミリモル）を加える。４５分間撹拌した後、反応物を濾過し、減圧下で溶媒を取り除く。得られた残留物をクロマト分画し（メタノール／ＣＨ２Ｃｌ２）、１．２７ｇ（５４％）の黄色固形物を得る。
【００５９】
調製８
ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（３−（５−シアノピラジン−２−イルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−メトキシフェノキシ）プロピルカルバメート
【化１０】
0005705743.tif 000011
ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（３−（５−ブロモピラジン−２−イルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−メトキシフェノキシ）プロピルカルバメート（０．３７８ｇ、０．７３０ミリモル）とシアン化亜鉛（０．１０ｇ、０．８７０ミリモル）のＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液を、窒素気流で１時間脱気し、次いで８０℃に加熱する。Ｐｄ（Ｐｈ３Ｐ）４（０．０８０ｇ、０．０７０ミリモル）を反応に加え、混合物を一晩加熱する。反応物を室温に冷却し、減圧下で濃縮する。シリカゲルクロマトグラフィ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ）によって残留物を精製して０．２５１ｇ（７３％）の標題の化合物を得る。
【００６０】
経路Ｃ
調製９
（Ｅ）−５−（３−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−１−（メチルチオ）−３−オキソプロパ−１−エニルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル
【化１１】
0005705743.tif 000012
空気撹拌器の棒及び羽根と、温度計と、水凝縮器と、窒素気泡器を備えた５リットルのフランジ付きフラスコに、水素化ナトリウム（２２．４ｇ、５６０．１ミリモル）と無水ＴＨＦ（３Ｌ）を充填する。よく撹拌した混合物に、２−アミノ−５−シアノピラジン（６７．０ｇ、５５７．８ミリモル）を１．５時間かけて少しずつ加えるが、泡立ちを可能にする。内部の温度は全体にわたって２２℃のままである。混合物を３５分間撹拌する。次いで、２２℃にて１時間かけて１−（２−メトキシ−６−（４−メトキシ−ベンジルオキシ）−フェニル）−３，３−ビス−メチルスルファニル−プロペノン（１４６．０ｇ、３７３．９ミリモル）を加える。室温にて黄色の懸濁液を４５分間撹拌し、次いで反応物が穏やかに還流されるまで加熱を適用する。６５℃にて１９時間後、反応混合物を１５℃に冷却する。次いで、混合物を半分ずつ２つに分け、各ロットを水（２Ｌ）に入れて反応を止め、酢酸エチルで抽出する（１Ｌで２回）。有機抽出物を合わせ、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、４０℃にて減圧下で濃縮して１９６ｇの黄色／橙色の固形物を得るが、さらに精製することなく次の工程でそれを使用する。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４６３．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００６１】
調製１０
５−（５−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル
【化１２】
0005705743.tif 000013
空気撹拌器の棒及び羽根と、温度計と、水凝縮器と、窒素気泡器を備えた１０リットルのフランジ付きフラスコに、（Ｅ）−５−（３−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−１−（メチルチオ）−３−オキソプロパ−１−エニルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル（１９６ｇ、４２３．８ミリモル）と無水エタノール（３Ｌ）を充填する。窒素のもとで撹拌した懸濁液に、ヒドラジン水和物（４１．０ｍＬ、８３８．７ミリモル）と氷酢酸（６６．０ｍＬ、１．１５モル）を加える。小さな発熱に留意する。黄色の懸濁液を６５℃まで温める。次いで加熱を止め、反応混合物を室温に冷却する。窒素雰囲気下で一晩混合物を放置する。濾過によって固形物を回収し、新鮮なエタノールで洗浄し、４５℃にて真空下で乾燥させ、１４０ｇ（２工程について８７％の収率）の鮮黄色の固形物を得る。さらに精製することなく生成物を次の工程で使用する。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４２９．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００６２】
調製１１
５−（５−（２−ヒドロキシ−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル
【化１３】
0005705743.tif 000014
空気撹拌器の棒及び羽根と、温度計と、水凝縮器と、苛性溶液ガスの洗浄器への出口を備えた１０Ｌのフランジ付きフラスコに、５−（５−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル（１４０ｇ、３２６．７６ミリモル）と、１，４−ジオキサン中の４Ｎの塩化水素（２５００ｍＬ、１０．０モル）溶液を充填する。混合物を６０〜６５℃にて１．５時間よく撹拌し、次いで混合物を５０℃に冷却する。合計４時間後、１，４−ジオキサン中の４Ｎの塩化水素をさらに加え（１０００ｍＬ）、６５℃への加熱を再開する。この温度にて１時間後、加熱を止め、一晩撹拌しながら、混合物を室温に冷却する。大きな焼結漏斗を介して混合物を濾過する。回収した固形物を新鮮な１，４−ジオキサンで洗浄し、次いで手短に吸引乾燥させる。嵩高な濾過ケーキを１０Ｌのフラスコに戻し、水（２Ｌ）と酢酸エチル（３．５Ｌ）と共に激しく撹拌する。次いで濃アンモニア（４４０ｍＬ）を加えることによって混合物をアルカリ性にする。溶液を濾過し、次いで５Ｌの分液漏斗に移す。水性層を分離し、酢酸エチルで再び抽出する（０．５Ｌ）。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮する。固形物を４５℃にて真空下乾燥させ、１０１．３ｇを得る。温めた無水テトラヒドロフラン（２．２Ｌ）に粗生成物を懸濁し、イソ−ヘキサンを用いて詰めたシリカ（１ｋｇ）湿潤物のパッドに負荷する。酢酸エチルによって生成物を溶出する。合わせた分画を部分的に濃縮し、得られた沈殿物を濾過によって回収し、４０℃にて一晩真空下で乾燥させて６０．９ｇを得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３０９．２［Ｍ＋１］＋。
【００６３】
調製１２
ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（３−（５−シアノピラジン−２−イルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−メトキシフェノキシ）プロピルカルバメート
【化１４】
0005705743.tif 000015
空気撹拌器の棒及び羽根と、温度計と、圧力均等化滴下漏斗と窒素気泡器を備えた５Ｌのフランジ付き丸底フラスコに、５−（５−（２−ヒドロキシ−６−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）−ピラジン−２−カルボニトリル（４７．０ｇ、１５２ミリモル）と無水ＴＨＦ（１．２Ｌ）を充填する。窒素のもとで撹拌した懸濁液を０℃に冷却する。大きな磁気撹拌器棒と、温度計と、窒素気泡器を備えた別の２Ｌの３つ口丸底フラスコに、トリフェニルホスフィン（４４．０ｇ、１６８ミリモル）と無水ＴＨＦ（６００ｍＬ）を充填する。窒素のもとで撹拌した溶液を０℃に冷却し、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（３４．２ｇ、１６９ミリモル）を加え、乳状の溶液が形成される。３〜４分後、ｔ−ブチル−Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）−カルバメート（３０．３ｇ、１７３ミリモル）の無水ＴＨＦ（１００ｍＬ）溶液を加え、混合物を３〜４分間撹拌する。次いでこの混合物を０℃にて出発物質の撹拌した懸濁液に５分間かけて加える。反応混合物は迅速に黒っぽい溶液になり、それをゆっくりと室温に温める。６．５時間後、無水ＴＨＦ（１５０ｍＬ）中のＰＰｈ３（８ｇ）と、ＤＩＡＤ（６．２ｇ）とカルバメート（５．４ｇ）を用いて上記のようにさらなる試薬を調製する。混合物を反応混合物に加え、−５℃に冷却し、一晩かけて室温に温める。真空下で溶媒を取り除く。得られた粘性の溶液をシリカのパッドに負荷し、酢酸エチルで生成物を溶出する。濃縮された分画をメタノールで別々に粉砕し、得られた固形物を濾過により回収する。合わせた固形物をメタノール（４００ｍＬ）で再び粉砕し、次いで濾過によって単離し、５０℃にて一晩真空下で乾燥させて３１．３ｇの所望の生成物を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４６６．２［Ｍ＋１］＋。
【００６４】
実施例２
５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル二塩化水素塩
【化１５】
0005705743.tif 000016
空気撹拌器の棒及び羽根と、温度計と、気泡器付きの空気冷却器を備えた５Ｌのフランジ付きの丸底フラスコに、ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（３−（５−シアノピラジン−２−イルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−メトキシフェノキシ）プロピルカルバメート（３０．９ｇ、６６．３ミリモル）と酢酸エチル（３Ｌ）を充填する。機械的に撹拌した黄色の懸濁液を１０℃直下に冷却する。次いで、そのまま定位置にある氷槽と一体化した気体流入管を介して、レクチャーボトルからの塩化水素を１５分間激しく泡立てる。５時間後、混合物は外見上顕著に濃厚化する。濾過によって固形物を回収し、酢酸エチルで洗浄し、次いで６０℃にて一晩、真空下で乾燥させて、３０．０ｇを得る。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ２．０５（ｍ，２Ｈ），２．９６（ｍ，２Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），４．１２（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），６．０８（ｂｒ  ｓ，３Ｈ），６．７７７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．７８２（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．８８（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．３４（ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．５５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．７１（ｓ，１Ｈ），１０．８３（ｓ，１Ｈ），１２．４３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３６６．２［Ｍ＋１］＋。
【００６５】
実施例３
５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル
【化１６】
0005705743.tif 000017
５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル二塩化水素塩（３．０ｇ、６．８４ミリモル）を２００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に懸濁する。１ＮのＮａＯＨを加える（２００ｍＬ、２００ミリモル）。室温にて５時間、窒素のもとで混合物を磁気的に撹拌する。濾過によって固形物を回収し、水で十分に洗浄する。５０℃にて一晩、真空下で濾過ケーキを乾燥させ、黄色の固形物として２．２６ｇ（９０％）の遊離の塩基を得る。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．８１（ｍ，２Ｈ），２．７３（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），４．０９（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），６．７６（ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），６．９３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．３１（ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．５２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．６７（ｓ，１Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ／ＥＳ  ｍ／ｚ  ３６６．２［Ｍ＋１］＋。
【００６６】
実施例４
５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸塩
【化１７】
0005705743.tif 000018
５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル（１．０ｇ、２．７４ミリモル）をＭｅＯＨ（１００ｍＬ）に懸濁する。撹拌しながら、メタンスルホン酸の１Ｍ、ＭｅＯＨ溶液（２．７４ｍＬ、２．７４ミリモル）を一滴ずつ混合物に加える。固形物をほぼ完全に溶解し、超音波処理し、１５分間撹拌し、濾過して５０ｍＬに濃縮する。溶液を一晩−１５℃に冷却し、形成される固形物を濾過によって回収する。固形物を一晩、真空オーブンで乾燥させ、０．９３８ｇ（７４％）の黄色固形物を得る。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．９７（ｍ，２Ｈ），２．２８（ｓ，３Ｈ），２．９５（ｍ，２Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），４．０９（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），６．７５３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７６６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．３３  （ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６７（ｂｒ  ｓ，３Ｈ），８．４９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．６４（ｓ，１Ｈ），１０．７０（ｓ，１Ｈ），１２．３１（ｓ，１Ｈ）。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３６６．２［Ｍ＋１］＋。
【００６７】
経路Ｄ
調製１３
１−［２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル］エタノン
【化１８】
0005705743.tif 000019
１−（２−ヒドロキシ−６−メトキシフェニル）エタノン（１３００ｇ、７．８２モル）とジメチルホルムアミド（１０．４Ｌ）を２２Ｌのフラスコに加え、撹拌して溶液を得る。炭酸カリウム（２７００ｇ、１９．５４モル）を少しずつ加え、次いで少なくとも３０分間撹拌する。添加漏斗を用いて、塩化４−メトキシベンジル（１４７００ｇ、９．３９モル）を２．５時間かけて一滴ずつ混合物に加える一方で温度を３０℃未満に維持する。反応混合物を３５℃に温め、その温度を１２時間保持する。反応の変換をＨＰＬＣによってモニターし、３５℃にて１３時間後、完全であると判断する。スラリーを濾過し、得られた固形物をジメチルホルムアミド（１Ｌ）で洗浄する。酢酸エチルと水による濾液の抽出後処理の後、濃縮によって蝋状の黄色固形物を得る。蝋状の黄色固形物に、メチルｔ−ブチルエーテル（２．６Ｌ）を加える。得られたスラリーを撹拌する。今や自由に流れるスラリーを濾過し、メチルｔ−ブチルエーテル（１Ｌ）で洗浄する。白色の固形物を真空乾燥させて１５３９グラム（６９％）の標題の化合物を得る。ｍｐ１０５〜１０７℃。
【００６８】
調製１４
１−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−３，３−ビス（メチルチオ）プロパ−２−エン−１−オン
【化１９】
0005705743.tif 000020
リチウムｔｅｒｔ−ブトキシド（６０２．４ｇ、７．５２モル）の無水ＤＭＳＯ（１１．０Ｌ）混合物に窒素雰囲気下で１−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）エタノン（１０００．０ｇ、３．４９モル）を加える。得られた混合物を３０分間撹拌し、１〜１．５時間かけてＣＳ２（２５９ｍＬ、４．２９６モル）をゆっくり加える一方で内部温度を３０℃より低く維持する。常温にて少なくとも１時間撹拌した後、ヨードメタン（１０００ｇ、７．０４５モル）をゆっくり加える一方で内部温度を３０℃より低く維持する。得られた混合物を常温にて３０分〜１時間撹拌する。反応の完了をＨＰＬＣによって確認する。得られた反応混合物を冷却し、その後、水と酢酸エチルによる抽出後処理を行う。得られた有機部分を濃縮してスラリーを提供し、それを濾過し、酢酸エチル（１Ｌ）、その後メチルｔ−ブチルエーテル（１Ｌで２回）で洗浄する。単離された固形物を真空オーブンで４０℃にて乾燥させて１０５７ｇ（７７％）の標題の化合物を得る。ｍｐ９３〜９４℃；ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３９１．２［Ｍ＋１］＋。
【００６９】
調製１５
（Ｅ）−５−（３−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−１−（メチルチオ）−３−オキソプロパ−１−エニルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル
【化２０】
0005705743.tif 000021
乾燥した不活性の２２Ｌフラスコに、水素化ナトリウム（１５９．２ｇ、３．９８モル）とテトラヒドロフラン（１０．４Ｌ）を加える。混合物を５〜１５℃に冷却する。５−イソシアノピラジン−２−アミン（３８２．２ｇ、３．１８モル）を３０分間かけて４回に分けて加え、水素の放出を制御し、添加と１０℃での温度の維持の間で発泡が弱まるようにする。混合物を１５〜９０分間撹拌する一方で温度を１５℃に上げる。反応混合物に、１−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−３，３−ビス（メチルチオ）プロパ−２−エン−１−オン（１０３６ｇ、２．６５モル）を少しずつ充填して発泡を制御する。得られたスラリーを１５分間撹拌する。混合物を６６℃での穏やかな還流に加熱する。反応の変換をＨＰＬＣでモニターする。反応混合物の反応を冷水（１４．２Ｌ）で止め、その後、酢酸エチルで抽出後処理を行う。有機部分を濃縮してスラリーを形成し、それを濾過して９５７ｇ（７８％）の標題の化合物を得る。ｍｐ１２８〜１３５℃；ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４６３．２［Ｍ＋１］＋。
【００７０】
調製１６
５−（５−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル
【化２１】
0005705743.tif 000022
２０Ｌの容器にて、エタノール（１１．２８Ｌ）と酢酸（３１８ｍＬ、５．５４５モル）を混ぜ合わせる。窒素のパージと共に反応物をブリーチスクラバーに放出する。２２Ｌの反応フラスコに、（Ｅ）−５−（３−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−１−（メチルチオ）−３−オキソプロパ−１−エニルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル（９４０ｇ、１．９３１モル）とエタノール／酢酸溶液を加える。得られた茶色のスラリーにヒドラジン一水和物（１９７ｇ、３．９３５モル）を加え、軽い発熱を生じる。得られた黄色のスラリーを６５〜７０℃にゆっくり加熱し、ＨＰＬＣによってモニターする。反応の持続時間は１時間未満である。濃厚なスラリーを１〜２時間かけて３０℃未満にゆっくり冷却する。スラリーを濾過し、冷エタノールで洗浄する。４０℃にて物質を真空乾燥して（８２０ｇ、９９．１％）の標題の化合物を得る。ｍｐ２１５〜１１７℃；ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４２９．２［Ｍ＋１］＋。
【００７１】
調製１７
５−（５−（２−ヒドロキシ−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル二塩化水素塩
【化２２】
0005705743.tif 000023
以下の操作はすべて苛性スクラバーシステムに排出させてＨＣｌの気体発生を制御する。６０Ｌのガラス製反応器に、５−（５−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル（１．２４ｋｇ、２．８９モル）とジオキサン（２６．０６ｋｇ、９９．２８モル）中４ＮのＨＣｌを充填する。スラリーをゆっくり６０〜７０℃に加熱する。ＨＰＬＣによって反応をモニターする。９時間後、反応が完全であると判定する。茶色のスラリーを２０℃に冷却し、一晩保持する。酸性の反応混合物を濾過し、ケーキを酢酸エチル（７Ｌ）で洗浄する。湿ったケーキを一定の重量に真空乾燥し、（１０１０ｇ、補正収率９１．８４％）の標題の化合物を得る。ｍｐ２２５〜２２８℃（遊離の塩基）；ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３０９．２［Ｍ＋１］＋。
【００７２】
調製１８
ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（３−（５−シアノピラジン−２−イルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−メトキシフェノキシ）プロピルカルバメート
【化２３】
0005705743.tif 000024
５−（５−（２−ヒドロキシ−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル（６１８ｇ、１．６２モル）をテトラヒドロフラン（６．１８Ｌ、１０容量）にてスラリーにし、アセトン／氷槽で−５〜０℃に冷やす。−５〜５℃にて３０〜４０分間かけて添加漏斗を介してトリエチルアミン（３３０ｇ、３．２５モル）を加える。得られたスラリーを−５〜５℃にて６０〜９０分間撹拌する。不溶性の塩酸トリエチルアミンを濾過し、適当な反応容器にフェノール（（５−（２−ヒドロキシ−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル）の溶液を回収する。ケーキをＴＨＦ（１．２４Ｌ）ですすぐ。必要とされるまで、１５〜２０℃にてフェノールのＴＨＦ溶液を保持する。
【００７３】
室温にてトリフェニルホスフィン（１０７４ｇ、４．０５モル）をＴＨＦ（４．３３Ｌ）に溶解する。透明な無色の溶液をアセトン／氷槽で−５〜５℃に冷却する。温度を１０℃未満に保持して、４０〜６０分間かけて添加漏斗を介してジイソプロピルアゾジカルボキシレート（７９５ｇ、３．８９モル）を一滴ずつ加える。得られた濃厚な白色スラリーを−５〜０℃に冷やし戻す。ｔｅｒｔ−ブチル３−ヒドロキシプロピルカルバメート（７１７ｇ、４．０５モル）を最小量のＴＨＦ（８００ｍＬ）に溶解する。ｔｅｒｔ−ブチル３−ヒドロキシプロピルカルバメート／ＴＨＦ溶液を−５〜５℃にて２０〜３０分間かけて添加漏斗を介して試薬スラリーに添加する。調製した試薬を使える状態になるまで−５〜０℃にて氷槽で撹拌する。
【００７４】
調製した試薬スラリー（２０％）を１５〜２０℃にて基質溶液に加える。残りの試薬は氷槽に戻す。常温にて基質溶液を３０分間撹拌し、次いでＨＰＬＣ用に試料採取する。試薬の第２のおよそ２０％部分を基質に加え、常温で撹拌し、前のように試料採取する。ＨＰＬＣによって反応の完了をモニターしながら、試薬の添加を継続する。完了した反応物を濃縮し、温めたメタノール（４．３３Ｌ、５０〜６０℃）によって粉砕し、その後氷槽で冷却する。得られた黄色の沈殿物を濾過し、冷ＭｅＯＨ（２Ｌ）ですすぎ、一定の重量まで乾燥させて５４４ｇ（７２％）の標題の化合物を得る。ｍｐ２１４〜２１６℃；ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４６６．２［Ｍ＋１］＋。
【００７５】
実施例５
２−ピラジンカルボニトリル、５−［［５−［２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル］−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］アミノ］モノメシレート一水和物（化学物質情報命名法）
【化２４】
0005705743.tif 000025
３０Ｌの反応器でのアセトン（２１．５Ｌ）と共に、ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（３−（５−シアノピラジン−２−イルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−メトキシフェノキシ）プロピルカルバメート（１４３０ｇ、３．０７モル）をスラリーにする。中程度の流れで添加漏斗を介してメタンスルホン酸（１４８４ｇ、１５．３６モル）を加える。約５２℃の還流に１〜３時間スラリーを温め、ＨＰＬＣ解析によって反応の完了についてモニターする。完了した反応物を４．５時間かけて還流から１５〜２０℃に冷却する。２−ピラジンカルボニトリル、５−［［５−［２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル］−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］アミノ］ジメシレート塩の黄色スラリーを濾過し、アセトン（７Ｌ）ですすぎ、真空オーブンで乾燥させる。
【００７６】
ジメシレート塩（１６０８ｇ、２．８８モル）を水（１６Ｌ）でスラリーにする。水酸化ナトリウム（５０％水溶液、２２８ｇ、２．８５モル）をゆっくりスラリーに注ぐ。スラリーを６０℃に加熱し、１時間撹拌する。次いでそれを４時間かけて１６℃に冷却し、濾過する。湿った濾過ケーキをアセトン（４Ｌ）ですすぎ、４０℃での真空オーブンにて一定重量まで乾燥させ、８３３ｇ（９４％）の２−ピラジンカルボニトリル、５−［［５−［２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル］−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］アミノ］モノメシレート一水和物を得る。ｍｐ２２２．６℃；ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３６６．２［Ｍ＋１］＋。
【００７７】
実施例５ａ
２−ピラジンカルボニトリル、５−［［５−［２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル］−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］アミノ］モノメシレート一水和物（化学物質情報命名法）
以下の手順を用いて、粗精製の２−ピラジンカルボニトリル、５−［［５−［２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル］−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］アミノ］モノメシレート一水和物を精製する。１：１のアセトン／水の溶媒混合物（１４．７Ｌ）にて技術等級の２−ピラジンカルボニトリル、５−［［５−［２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル］−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］アミノ］モノメシレート一水和物（１２２１ｇ、２．５５モル）をスラリーにする。混合物を５０〜５５℃に温めることによって固形物を溶解する。溶液を５０〜５５℃にて０．２２μのカートリッジフィルターを介して艶出濾過する。溶液をゆっくりと約４２〜４５℃の播種温度に冷却し、播種する。緩慢な冷却をさらに３０〜６０分間継続し、核生成を確認する。薄いスラリーを３時間かけて３８℃から１５℃に冷却する。真空蒸留を設定し、１１０〜９０ｍｍで２０〜３０℃にてアセトンを取り除く。混合物を３０℃から１５℃に１４時間かけて冷却し、１５℃で２時間保持し、次いで濾過する。再結晶化した物質を１９：１の水／アセトン（２Ｌ）、次いで水（６Ｌ）ですすぎ、４０℃の真空オーブンにて一定の重量まで乾燥させて１０２４ｇ（８３．９％）の標題の化合物を得る。ｍｐ２２２．６℃；ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３６６．２［Ｍ＋１］＋。
【００７８】
位置感受性検出器を伴った、４０ｋＶと４０ｍＡで操作するＣｕＫα源（λ＝１．５４０５６オングストローム）を備えたＢｒｕｋｅｒＤ８アドバンス粉末回折計にてＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンを得ることができる。２θ±０．０２における０．０２６°の刻み幅と、０．３秒の刻み時間を０．６ｍｍの分岐スリットと１０．３９ｍｍの検出スリットと共に用いて、°２θ±０．０２における４°と３５°の間で各試料を走査する。一次及び二次のソーラースリットはそれぞれ２°であり、分散防止スリットは６．１７ｍｍであり、分散シンクは定位置である。
特徴的なピーク位置と相対的な強度：
【表１】
0005705743.tif 000026
【００７９】
Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ  ＤＳＣ単位（Ｍｏｄｅｌ  ＤＳＣ８２２ｅ）にて示差走査熱量（ＤＳＣ）解析を行うことができる。小さい穴を伴った密閉アルミニウム製皿で試料を、５０ｍＬ／分の窒素パージと共に１０℃／分にて２５〜３５０℃に加熱する。Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＴＧＡ単位（Ｍｏｄｅｌ  ＴＧＡ／ＳＤＴＡ  ８５１ｅ）にて熱重量分析（ＴＧＡ）を行うことができる。小さい穴を伴った密閉アルミニウム製皿で試料を、５０ｍＬ／分の窒素パージと共に１０℃／分にて２５〜３５０℃に加熱する。
【００８０】
ＤＳＣの熱特性は、８０〜１４０℃からの弱く、広い吸熱、その後２２２℃で開始する（２２５℃でピーク）の鋭い融解吸熱を示す。ＴＧＡによって２５〜１４０℃で４％の質量損失が見られる。