(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルテリウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットであって、前記ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットは、以下の群から少なくとも１つ選択されるプライマーセット；
（１）前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーが、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４でそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、プライマーセット；
（２）前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーが、それぞれ配列番号１、配列番号５、配列番号３および配列番号６でそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、プライマーセット；
（３）前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーが、それぞれ配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０でそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、プライマーセット；
（４）前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーが、それぞれ配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４でそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、プライマーセット；
（５）前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーが、それぞれ配列番号１、配列番号１５、配列番号３および配列番号１６でそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、プライマーセット；
（６）前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーが、それぞれ配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０でそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、プライマーセット；
（７）前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーが、それぞれ配列番号２１、配列番号５、配列番号２２および配列番号６でそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、プライマーセット；
（８）前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーが、それぞれ配列番号２１、配列番号１８、配列番号２２および配列番号２０でそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、プライマーセット；
（９）前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーが、それぞれ配列番号２３、配列番号１５、配列番号２４および配列番号１６でそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、プライマーセット、またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、プライマーセット；
（１０）前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーが、それぞれ配列番号２５、配列番号８、配列番号２６および配列番号１０でそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、プライマーセット；
（１１）前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーが、それぞれ配列番号２５、配列番号２７、配列番号２６および配列番号２８でそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、プライマーセット；
（１２）前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーが、それぞれ配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１および配列番号３２でそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、プライマーセット、またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、プライマーセット；
（１３）前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーが、それぞれ配列番号３３、配列番号３０、配列番号３４および配列番号３２でそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、プライマーセット；
（１４）前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーが、それぞれ配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７および配列番号３８でそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、プライマーセット；
（１５）前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーが、それぞれ配列番号３９、配列番号２７、配列番号４０および配列番号２８でそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、プライマーセット；
（１６）前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーが、それぞれ配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１および配列番号１１２でそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、プライマーセット；
（１７）前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーが、それぞれ配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１１９および配列番号１２２でそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、プライマーセット；
（１８）前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーが、それぞれ配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２６および配列番号１２９でそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、プライマーセット；
（１９）前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーが、それぞれ配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３３および配列番号１３６でそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、を含むプライマーセット；
（２０）前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーが、それぞれ配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４０および配列番号１４３でそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる、プライマーセット。
【請求項２】
請求項１に記載のプライマーセットであって、更に、ループプライマーとしてＬＰｆおよび／またはＬＰｂを含み、前記ＬＰｆが、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号９４、配列番号１１３、配列番号１２３、配列番号１３０、配列番号１３７、配列番号１４４およびそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー群より少なくとも１つ選択されるプライマーであり、前記ＬＰｂが、配列番号１９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５および配列番号７６並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー群より少なくとも１つ選択されるプライマーである、プライマーセット。
【請求項３】
アルテリウイルスの検出するためのアッセイキットであって、
請求項１または２に記載のプライマーセットと、
前記プライマーセットを用いて得られた増幅産物からアルテリウイルスを特異的に検出するためのプローブであり、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８５、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４５および配列番号１４６並びにそれらの相補配列でそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプローブからなる群より少なくとも１つ選択されたプローブと、
を含むことを特徴とするアッセイキット。
【請求項４】
アルテリウイルスに由来する核酸を特異的に増幅する方法であって、試料に含まれる核酸を請求項１または２に記載のプライマーセットを用いて試料をＬＡＭＰ増幅することを具備する方法。
【請求項５】
試料に含まれる核酸を請求項１または２に記載のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ増幅すること、および
前記ＬＡＭＰ増幅により生じた増幅産物の有無に基づいて、前記試料中のアルテリウイルスの存在の有無を判定すること
を具備するアルテリウイルスを検出する方法。
【請求項６】
前記試料中のアルテリウイルスの存在の有無の判定が、前記ＬＡＭＰ増幅により生じた反応産物と、それぞれ配列番号８１、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８５、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４５および配列番号１４６並びにそれらの相補配列でそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプローブからなる群より少なくとも１選択されたプローブとを反応し、前記反応の結果を基に判定される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記プローブ群が基体に固定されている請求項６の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルテリウイルス（Arterivirus）由来の核酸を増幅および／または検出する手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルテリウイルスは、ニドウイルス目（Order Nidovirales）アルテリウイルス科（Family Arteriviridae）に属するウイルスグループである。またアルテリウイルス科に分類される属（genus）はアルテリウイルス属(genus Arterivirus)のみである。そのビリオンはエンベロープを有する球形粒子（45−60nm）であり、内部にあるヌクレオカプシドは径35nmの正二十面体である。約13、000ヌクレオチドの大きさの直鎖一本鎖（＋）RNAをゲノムとして持つ。なお、5’および3’末端には、それぞれ真核細胞メッセンジャーRNAと類似のキャップ構造とpolyAがある。本ウイルスの増殖は細胞質内で行われ、小胞体やゴルジ装置から出芽する。主に脊椎動物に感染し、さまざまな疾病を引き起こすことが知られている。
【０００３】
特に、経済動物等に対する重大な疾病を引き起こすアルテリウイルス属ウイルスとして、家畜伝染病予防法における届出伝染病に指定されている「馬ウイルス性動脈炎」を引き起こすウマ動脈炎ウイルス（Equine arteritis virus）、豚および猪の届出伝染病であるブタ繁殖・呼吸障害症候群を引き起こすブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus）、サルの病原ウイルスとして知られるサル出血熱ウイルス（Simian hemorrhagic fever virus）が知られており、注目を集めている。一方、マウスなどの動物実験は、今日の生命科学研究には必要不可欠であるが、再現性の高い動物実験を行うためには、病原微生物等を対象とした定期的な微生物モニタリングによる品質管理が必須である。実験動物並びにその組織／細胞等の微生物モニタリングにおいて、最も重要な病原微生物の１つである乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（Lactate dehydrogenase-elevating virus）も、Arterivirus属ウイルスの代表例として挙げられる。このウイルスの感受性動物はマウスであり、感染動物は持続的なウイルス血症と血清中の乳酸脱水素酵素量の上昇を特徴とする。また、通常は血液、唾液を介して伝播すると考えられるが、マウスで継代された腫瘍を介しての伝播や、マウス組織・細胞由来製品、例えば、様々な細胞のIn vitro分化および／または維持に有用な基底膜成分（Basement Membrane Extract、BME）など、を介した伝播が知られており、わが国の研究施設でも汚染が散見されている事から、本ウイルスを対象とした微生物モニタリングが定期的に実施されている。
【０００４】
これまでの検査手法は、主に「血清抗体の検査」が用いられてきたが、感染初期の動物では十分な抗体上昇がなく、早期検出が難しかった。また、実験動物分野では、免疫不全動物を使用するケースや、腫瘍組織・細胞などを使う事が多くなってきたが、感染の有無を血清学的に検査する事が出来ないため、汚染を見逃す危険がある。これら抗体検査が無効な動物や、動物実験に関連した組織・細胞及び配偶子などの汚染検査にはウイルス自体を検出する検査手法が求められている。
【０００５】
以上のようなことから、問題となるウイルスに特徴的な遺伝子配列の存在の検知と迅速な同定を行うことの出来る方法が臨床診断現場や微生物モニタリング、疫学研究、その他様々な分野において求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、アルテリウイルス由来の核酸を特異的に且つ迅速に増幅するためのプライマーセット、これを用いる前記ウイルスを増幅および／または検出する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するための手段は、
（１）アルテリウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのLAMP増幅用核酸プライマーセットであって、前記LAMP増幅用核酸プライマーセットは、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、F３プライマー、Ｂ３プライマーを含み、
当該ＦＩＰプライマーは配列番号１、配列番号７、配列番号１１、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３５および配列番号３９並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含み、
当該ＢＩＰプライマーは配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２７、配列番号３０および配列番号３６並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含み、
当該Ｆ３プライマーは配列番号３、配列番号９、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７および配列番号４０並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含み、および
当該Ｂ３プライマーは配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３２および配列番号３８並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む
プライマーセット；
（２）  アルテリウイルスの検出するためのアッセイキットであって、
請求項１〜３の何れか１項に記載のプライマーセットと、
前記プライマーセットを用いて得られた増幅産物からアルテリウイルスを特異的に検出するためのプローブであり、それぞれ配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４５および配列番号１４６並びにその相補配列で示されるポリヌクレオチドを含むプローブからなる群より少なくとも１選択されたプローブと、
を含むことを特徴とするアッセイキット；
（３）  アルテリウイルスに由来する核酸を特異的に増幅する方法であって、試料に含まれる核酸を前記（１）のプライマーセットを用いて試料をＬＡＭＰ増幅することを具備する方法；
（４）    試料に含まれる核酸を前記（１）のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ増幅すること、および
前記ＬＡＭＰ増幅により生じた増幅産物の有無に基づいて、前記試料中のアルテリウイルスの存在の有無を判定すること
を具備するアルテリウイルスを検出する方法；
である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、アルテリウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセット、前記微生物を検知および／または分類するための方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】従来のLAMP法による増幅方法を説明するための模式図。
【図２】従来のLAMP法を用いて得られる増幅産物を説明するための模式図。
【図３】本発明の測定用核酸の製造における増幅方法を説明するための模式図。
【図４】本発明の測定用核酸を説明するための模式図。
【図５】アルテリウイルス属に分類される微生物遺伝子型判定用核酸チップ。
【図６】アルテリウイルス属に分類される微生物遺伝子型判定用核酸チップ。
【図７】ＬＡＭＰ増幅の電気泳動写真の一例を示す図。
【図８】電流検知型核酸チップによる検知結果の一例を示す図。
【図９】電流検知型核酸チップによる検知結果の一例を示す図。
【図１０】電流検知型核酸チップによる検知結果の一例を示す図。
【図１１】電流検知型核酸チップによる検知結果の一例を示す図。
【図１２】電流検知型核酸チップによる検知結果の一例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．プライマー
本発明の１態様に従うと、アルテリウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットが提供される。
【００１１】
ここにおける「ＬＡＭＰ法」は、それ自身公知の何れのＬＡＭＰ法をも含むが、好ましくはＲＴ−ＬＡＭＰ法である。ＲＴ−ＬＡＭＰ法は、等温遺伝子増幅法であるＬＡＭＰ法の１種で、逆転写反応とＬＡＭＰ反応を同時に行うことによりＲＮＡを鋳型にＬＡＭＰ増幅できる方法である。「ＬＡＭＰ増幅」および「ＲＴ−ＬＡＭＰ増幅」とは、ＬＡＭＰ法またはＲＴ−ＬＡＭＰ法により行われる増幅または増幅工程を指す。
【００１２】
一般的にＬＡＭＰ法は２種若しくは4領域または４種若しくは６領域のプライマーを用いる点がＰＣＲ法とは異なる。ＬＡＭＰ法は、ＰＣＲを用いた方法に比べ増幅効率が優れていると共に、サンプル中の不純物の影響も受けにくい。そのため、簡便なサンプルの前処理で微量なアルテリウイルス属に分類される微生物を検知することが可能である。
【００１３】
ＬＡＭＰ法におけるプライマー設計および得られる増幅産物について、図１および図２を参照して説明する。
【００１４】
図１は、検知されるべき二本鎖ＤＮＡと、合計４種類のプライマー配列、即ち、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーを示す。ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーは、各々二つの領域を含む。即ち、ＦＩＰはＦ１ｃとＦ２を含み、ＢＩＰはＢ２とＢ１ｃを含む。Ｆ３プライマーはＦ３領域を含んでいる。Ｂ３プライマーはＢ３領域を含む。
【００１５】
ここで、Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃ領域は、前記二本鎖ＤＮＡのうちの一本鎖ＤＮＡの５'→３'方向にかけてこの順で設定された領域である。またＢ３、Ｂ２、Ｂ１、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃ領域は、その相補鎖の一本鎖ＤＮＡの５'→３'方向にかけてこの順で設定された領域である。このときＢ３とＢ３ｃ、Ｂ２とＢ２ｃ、Ｂ１とＢ１ｃ、Ｆ１ｃとＦ１、Ｆ２ｃとＦ２、Ｆ３ｃとＦ３は相補鎖である。
【００１６】
このようなＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマーおよびＢ３プライマーを用いてＬＡＭＰ増幅を行なうと、図１の二本鎖ＤＮＡの夫々の鎖から、図２に示すようなダンベル型のステム・アンド・ループ構造の増幅産物が得られる。その増幅機構については、例えば特開２００２−１８６７８１号公報を参照することが可能である。また、この４種のプライマーのほかにループプライマーを併せて用いてもよい。
【００１７】
ＲＴ−ＬＡＭＰ法が使用される場合、前記ＬＡＭＰ法反応液に逆転写活性を持つ酵素を添加して、逆転写反応を行いながらＬＡＭＰ増幅法を行えばよい。ＬＡＭＰ法であっても、ＲＴ−ＬＡＭＰ法であっても、同じ配列のプライマーを等しく使用することが可能である。
【００１８】
検出しようとする配列であるターゲット配列は、一本鎖のループ部分またはステム部分の何れに対しても設定することが可能である。好ましくはループ部分に設定される。ターゲット配列とは、所望の増幅が行われた後に得られる増幅産物を検出する際に使用される配列である。ターゲット配列の有無の検出は、例えば、ターゲット配列に相補的なプローブとのハイブリダイゼーションの有無を検出することにより行えばよい。
【００１９】
次に、一本鎖ループ部分にターゲット配列が位置するようにプライマーを設計する場合について説明する。図３を参照されたい。ターゲット配列（図３では、ＦＰｃ、ＦＰ、ＢＰおよびＢＰｃの何れかとして理解されたい）が、領域Ｆ１とＦ２との間(この領域はＦ２領域を含んでもよい)、領域Ｆ２ｃとＦ１ｃとの間(この領域はＦ２ｃ領域を含んでもよい)、領域Ｂ１とＢ２との間(この領域はＢ２領域を含んでもよい)、および／または領域Ｂ２ｃとＢ１ｃとの間(この領域はＢ２ｃ領域を含んでもよい)の何れかに対応する位置するように、６つのプライマー領域を設定する。ターゲット配列は、上記それぞれの領域間に形成される一本鎖のループ部分の何れの部位に位置するように設計されてよい。ここで、プライマー領域Ｆ１とＦ２との間のループ部分には、Ｆ２領域自体も含まれてよい。こうして設定された６つのプライマー領域に基づいて４種類のプライマーを作製し、これらプライマーを用いてＬＡＭＰ増幅を行なう。それにより、図４に示すようなＬＡＭＰ増幅産物の一部が得られる。このＬＡＭＰ増幅産物中においては、ターゲット配列ＦＰｃ、ＦＰ、ＢＰ、ＢＰｃが増幅産物のダンベル構造における一本鎖ループの中に位置する。
【００２０】
一方、プライマー領域Ｆ１ｃとＦ１、およびＢ１ｃとＢ１は、もともと相補的な配列を有しているので、相互に自己ハイブリダイゼーションを生じて二本鎖を形成する。
【００２１】
このように増幅産物中に含まれるターゲット配列は、図４に示すような一本鎖の状態のものが存在する。その部分を利用すれば、変性操作を行なうことなく、各ターゲット配列に対して相補的なプローブ核酸（即ち、ＦＰ、ＦＰｃ、ＢＰ、ＢＰｃ）との特異的ハイブリダイゼーションが行える。これを利用することにより、ハイブリダイゼーションの有無により増幅の鋳型となる検出対象の有無を判定することが可能である。
【００２２】
特異的ハイブリダイゼーションとは、一塩基多型(Single  Nucleotide  PolymorpHisms:SNPs)または変異が存在する場合、その僅かの違いも検知することが可能であることを意味している。
【００２３】
上述したとおり、本発明に従う好ましいプライマーセットの例において、当該ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットは、Ｆ１、Ｆ２、F３、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃおよびＢ３ｃ領域を元に設計される。
【００２４】
それぞれの領域の例を表１に示す。
【表１−１】
0005738551.tif 000002
【００２５】
以下で詳しく述べるが、表１−２には、表１−１の領域がプライマーにおいてどのように具体的に利用されているか、その例を示した。各プライマーには、Ｆ１、Ｆ２、F３、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃおよびＢ３ｃ領域として選択された表１−１に示した配列の相同配列および／または相補配列が含まれている。
【表１−２】
0005738551.tif 000003
【００２６】
表１の領域が、アルテリウイルスのゲノムにおいてどのような位置に対応する配列であるのかを表２−１および表２−２に複数の株についてのアライメントを示した。
【表２−１】
0005738551.tif 000004
【００２７】
【表２−２】
0005738551.tif 000005
【００２８】
表２−１および表２−２は、複数のアルテリウイルス株のゲノムについてのアラインメントである。最下段には塩基について全ての種が共通する塩基を有する位置には「＊」を示し、種により変異のある位置には「．」を記した。更に表２−１および表２−２には、アルテリウイルスプライマーとして選択した領域を示す。この領域は、アルテリウイルス属において高度に保存された領域である。また、当該プライマーにより増幅される領域は、アルテリウイルスを特定するために特徴的な領域である。
【００２９】
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｆ１領域は配列番号８６またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでいてもよい。また、当該Ｆ１領域は、配列番号８６またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドの何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入を有していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、表２−１および表２−２に示されたアラインメント上の同領域の他の配列を参照されたい。このような配列は何れもその何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが、混合ヌクレオチドとして調製されてもよく、また、その何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが、ユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００３０】
ここで、ユニバーサルなヌクレオチドの例は、これらに限定するものではないが、デオキシイノシン（deoxyinosine；dI)や、Ｇｒｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社の3−ニトロピロール（Nitropyrrole）、5-ニトロインドール（Nitroindole）、デオキシリボルラノシル（deoxyribofuranosyl ；dP)、デオキシ-5'-ジメトキシトリチル-D-リボフラノシル（deoxy-5'-dimethoxytrityl-D-ribofuranosyl ；dK)が含まれる。
【００３１】
またここで、プライマーの各配列間またはその末端側には、１〜１００ヌクレオチド、好ましくは２〜３０ヌクレオチド程度の配列（例えば、スペーサーとして使用される配列）が含まれていてもよい。当該プライマーの長さは３０〜２００ヌクレオチド程度であってよく、好ましくは３５〜１００ヌクレオチド、更に好ましくは４３〜６０ヌクレオチドであってよい。
【００３２】
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｆ２領域は、配列番号８７および配列番号８８並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでもよい。このようなＦ２領域に好ましい各配列は、その何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入を有していてもよい。表２−１および表２−２に示されたアラインメント上の同領域の他の配列を参照されたい。また、このような配列は何れも何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００３３】
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｆ３領域は配列番号８９またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでもよい。このようなＦ３領域に好ましい各配列は、その何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入を有していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、表２−１および表２−２に示されたアラインメント上の同領域の他の配列を参照されたい。また、これらの何れの配列もその何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００３４】
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｂ１ｃ領域は配列番号９０および９１並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでもよい。このようなＢ１ｃ領域に好ましい各配列はその何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入を有していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、表２−１および表２−２に示されたアラインメント上の同領域の他の配列を参照されたい。また、このような配列の何れもその何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００３５】
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｂ２ｃ領域は配列番号９２およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでもよい。このようなＢ２ｃ領域に好ましい各配列はその何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入を有していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、表２−１および表２−２に示されたアラインメント上の同領域の他の配列を参照されたい。また、このような配列の何れもその何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００３６】
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｂ３ｃ領域は配列番号９３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでもよい。このようなＢ３ｃ領域に好ましい各配列はその何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入を有していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、表２−１および表２−２に示されたアラインメント上の同領域の他の配列を参照されたい。また、このような配列の何れもその何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００３７】
上記のような領域を使用したプライマーを用いて、アルテリウイルス属に分類される微生物あるいはその遺伝子を含有する検体試料に対してＬＡＭＰ法による増幅を行うと、図４で説明したようにステム・アンド・ループ構造が形成され、一本鎖のループ構造内に含まれるアルテリウイルス属に分類される微生物由来のターゲット配列が得られる。
【００３８】
これらを基にアルテリウイルスを検出するための好ましいプライマーを表３に示す。
【表３−１】
0005738551.tif 000006
【００３９】
【表３−２】
0005738551.tif 000007
【００４０】
また、プライマーセットは、ＦＩＰプライマーとＦ３プライマーとＢＩＰプライマーとＢ３プライマーを含んでよく、そのようなプライマーセットの例は、以下の通りである：
当該ＦＩＰプライマーが、配列番号１、配列番号７、配列番号１１、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３９、配列番号１０９、配列番号１２０、配列番号１２７、配列番号１３４および配列番号１４１並びにその相補配列によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドまたはアルテリウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＦＩＰプライマーであり、
当該ＢＩＰプライマーが、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３６、配列番号１１０、配列番号１２１、配列番号１２８、配列番号１３５および配列番号１４２並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドまたはアルテリウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＢＩＰプライマーであり、
当該Ｆ３プライマーが、配列番号３、配列番号９、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号１１１、配列番号１１９、配列番号１２６、配列番号１３３および配列番号１４０並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドまたはアルテリウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＦ３プライマーであり、および
当該Ｂ３プライマーが、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３２、配列番号３８、配列番号１１２、配列番号１２２、配列番号１２９、配列番号１３６および配列番号１４３並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドまたはアルテリウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＢ３プライマーである。
【００４１】
これらのプライマーのいずれか、または全ての配列について、その何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入を有していてもよい。また、ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３およびＢ３のの少なくとも１の配列がその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含んでもよい。
【００４２】
プライマーセットにおいて使用されるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーの組み合わせの例は、以下の（１）〜（２０）よりなる群から少なくとも１選択された組み合わせであってよい。これらの組み合わせは、（１）〜（２０）に示される他のプライマーやそれ自身公知の何れのプライマーと同時に使用されてもよい。１つの組み合わせに含まれる配列の並びは、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーの順である：
（１）それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４で示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット、またはそれらの少なくとも１の配列がその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット；
（２）それぞれ配列番号１、配列番号５、配列番号３および配列番号６で示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット、またはそれらの少なくとも１の配列がその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット；
（３）それぞれ配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０で示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット、またはそれらの少なくとも１の配列がその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット；
（４）それぞれ配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４で示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット、またはそれらの少なくとも１の配列がその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット；
（５）それぞれ配列番号１、配列番号１５、配列番号３および配列番号１６で示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット、またはそれらの少なくとも１の配列がその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット；
（６）それぞれ配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０で示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット、またはそれらの少なくとも１の配列がその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット；
（７）それぞれ配列番号２１、配列番号５、配列番号２２および配列番号６で示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット、またはそれらの少なくとも１の配列がその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット；
（８）それぞれ配列番号２１、配列番号１８、配列番号２２および配列番号２０で示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット、またはそれらの少なくとも１の配列がその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット；
（９）それぞれ配列番号２３、配列番号１５、配列番号２４および配列番号１６で示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット、またはそれらの少なくとも１の配列がその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット；
（１０）それぞれ配列番号２５、配列番号８、配列番号２６および配列番号１０で示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット、またはそれらの少なくとも１の配列がその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット；
（１１）それぞれ配列番号２５、配列番号２７、配列番号２６および配列番号２８で示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット、またはそれらの少なくとも１の配列がその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット；
（１２）それぞれ配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１および配列番号３２で示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット、またはそれらの少なくとも１の配列がその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット；
（１３）それぞれ配列番号３３、配列番号３０、配列番号３４および配列番号３２で示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット、またはそれらの少なくとも１の配列がその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット；
（１４）それぞれ配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７および配列番号３８で示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット、またはそれらの少なくとも１の配列がその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット；
（１５）それぞれ配列番号３９、配列番号２７、配列番号４０および配列番号２８で示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット、またはそれらの少なくとも１の配列がその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット；
（１６）それぞれ配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１および配列番号１１２で示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット、またはそれらの少なくとも１の配列がその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット；
（１７）それぞれ配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１１９および配列番号１２２で示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット、またはそれらの少なくとも１の配列がその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット；
（１８）それぞれ配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２６および配列番号１２９で示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット、またはそれらの少なくとも１の配列がその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット；
（１９）それぞれ配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３３および配列番号１３６で示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット、またはそれらの少なくとも１の配列がその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット；
（２０）それぞれ配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４０および配列番号１４３で示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット、またはそれらの少なくとも１の配列がその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含むプライマーセット。
【００４３】
ここで、（１）〜（２０）にそれぞれ記載の組み合わせは、ユニバーサルにウイルスを増幅することも、種特異的に増幅することもが可能なプライマーセットであり、目的に応じて選択してよく、それのプライマーセットを更に組み合わせて使用してもよい。
【００４４】
より確実に包括的にウイルスを増幅するためには、少なくとも変異部位に関してユニバーサルヌクレオチドまたはミックス塩基となるようにプライマーを設計および使用することが好ましい。そのような組み合わせは、例えば、（１６）〜（２０）の組み合わせのプライマーセットであってもよく、それらのプライマーセットを更に組み合わせたものであってもよく、それらのプライマーの1以上の何れかの塩基をミックス塩基として含むものであってもよい。また、そのような組み合わせは、例えば、（１）〜（２０）の組み合わせのプライマーセットの少なくとも２以上を選択して含む組み合わせであってもよく、それらのプライマーセットを更に組み合わせたものであってもよく、それらのプライマーの1以上の何れかの塩基をミックス塩基として含むものであってもよい。上記のプライマーにおいて、配列中に複数の塩基を示す１塩基表示による記号を含むものもある。それらの記号の示す塩基の意味は通常当該技術分野において一般的に使用される意味である。即ち、「ｒ」はグアニンまたはアデニン、「ｙ」はチミンまたはシトシン、「ｍ」はアデニンまたはシトシン、「ｋ」はグアニンまたはチミン、「ｓ」はグアニンまたはシトシン、「ｗ」はアデニンまたはチミン、「ｂ」はグアニンまたはシトシンまたはチミン、「ｄ」はアデニンまたはグアニンまたはチミン、「ｈ」はアデニンまたはシトシンまたはチミン、「ｖ」はアデニンまたはグアニンまたはシトシン、「ｎ」はアデニンまたはグアニンまたはシトシンまたはチミンである。本明細書においてもこの通りに意味する。（８）の組み合わせのプライマーセットをミックス塩基で使用することは、ユニバーサルにウイルスを増幅するためにより効果的である。また、そこにおいて、少なくとも１つのプライマーの一部にアルテリウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含んでもよい。特異的に増幅可能な範囲とは、分類学的にアルテリウイルスと同定されるために必ずしも必要ではない範囲内で変異が存在する範囲である。
【００４５】
種特異的または特定の遺伝子型について増幅を行う場合には、目的とする種や遺伝子型に特異的なヌクレオチドを含むように設計すればよい。
【００４６】
プライマーセットは、上述のプライマーの組み合わせに加えて、更にループプライマーを使用してもよい。ループプライマーを使用することにより更に効率よく増幅を行なうことが可能である。例えば、ＬＰｆは、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号９４、配列番号１１３、配列番号１２３、配列番号１３０、配列番号１３７、配列番号１４４およびその相補配列並びにアルテリウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含むプライマーであればよい。例えば、ＬＰｂは、配列番号１９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５および配列番号７６並びにその相補配列並びにその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはアルテリウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含むプライマーであればよい。プライマーセットにおいて使用される場合、ＬＰｆとＬＰｂが同時に使用されてもよく、何れか一方が使用されてもよく、複数の種類のＬＰｆおよび／またはＬＰｂが同時に使用されてもよい。
【００４７】
上記のようなプライマーセットをアルテリウイルス属に分類される微生物に対して適用すれば、アルテリウイルス属に特徴的な遺伝子型を反映する核酸が増幅される。得られる増幅産物の存在を検知することにより、アルテリウイルスを検知することが可能である。従って、試料におけるアルテリウイルスの検知は、検出対象である試料について、当該プライマーセットを用いて増幅反応を行えばよい。
【００４８】
増幅反応の条件は、それ自身公知の何れかの条件を利用すればよい。また、当該増幅反応を行った結果を基に当該試料はアルテリウイルスが含まれている、または含まれていないと判定すればよい。そのような判定により試料中のアルテリウイルスを検知することが可能である。
【００４９】
例えば、上記増幅反応は、例えば、１チューブ当たり１プライマーセットで行ってもよく、あるいは１チューブに各種遺伝子型に対応した複数のプライマーセットを用いて行ってもよい。複数の遺伝子型を特定する必要がある場合は、後者の方法で行う方が効率的である。ここではチューブを例に挙げたが、増幅反応はそれ自身公知の何れの容器または反応場で行うことが可能である。
【００５０】
また、上記増幅反応は、これに限定するものではないが、例えば、以下に示すような組成のバッファー中で行ってよい：
ＲＴ−ＬＡＭＰ法の反応液組成
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．８）
１０ｍＭ  ＫＣＬ
８ｍＭ  ＭｇＳＯ４
１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４
０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０
０．８Ｍ  Ｂｅｔａｉｎｅ
１．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
16 U Bst DNA polymerase
0.625U AMV Reverse transcriptase。
【００５１】
このような組成の反応液で、総量２５μＬで反応を行う際には、下記の濃度でそれぞれのプライマーを持ち込んでもよい；
プライマー添加量
ＦＩＰプライマー  ４０ｐｍｏＬ
ＢＩＰプライマー  ４０ｐｍｏＬ
Ｆ３プライマー      ５ｐｍｏＬ
Ｂ３プライマー      ５ｐｍｏＬ。
【００５２】
ここで「試料」は「検体」または「検体試料」とも称してよく、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、フェレット、オナガザル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、アザラシ、ネズミイルカなどの哺乳類、鳥類などの体液、組織、細胞、並びに水、湖水、川水、海水および土壌などの環境に存在する何れかの物質であってもよい。例えば、血液、血清、白血球、尿、精液、唾液、組織、バイオプシー、口腔内粘膜、培養細胞、喀痰等であってもよい。また、当該試料は、コロナウイルス属に分類される微生物あるいはその遺伝子が含まれている可能性の疑われる物質であってよい。そのような物質をそれ自身公知の手段により、核酸の増幅に適した状態に前処理したものであってもよく、何れの前処理もなされなくてもよい。例えば、そのような前処理の例は、変性、濾過、核酸抽出、不純物除去などを含む。
【００５３】
以上のようなプライマーセットを用いて核酸の増幅を行うことにより、簡便、安価、高速に、特異的にアルテリウイルスを増幅することが可能である。これを利用して、試料に含まれる核酸を当該プライマーまたはプライマーセットを用いるＬＡＭＰ増幅反応に供し、増幅反応の結果生じた増幅産物の有無を判定することにより、当該試料にアルテリウイルスを特異的に検出することが可能である。
【００５４】
従来の方法では、特異性を配列検出の際の特異性は、一般的にＰＣＲ法で増幅した目的遺伝子産物をＤＮＡチップにより検出している。この場合、ＰＣＲにより生成される産物は２本鎖であるため、プローブとハイブリダイゼーション反応させると、相補鎖がプローブに対するコンペティターとなりハイブリ効率が低く検出感度が悪い。そのような方法において、また従来では、ターゲットを１本鎖にするために、相補鎖を分解する、または分離するといった方法も取られている。これらの場合、酵素の使用、磁気ビーズの使用などによる高価な価格となったり、操作が煩雑性になったりする。また、アルテリウイルス属に分類される微生物は、培養が難しく、適切な培養条件を整えたとしても、時間がかかる。このような問題も本発明を用いることにより解決される。
【００５５】
これまで、迅速診断法としては特異的な抗体を使って抗原−抗体反応を介して検出する方法や、ＤＮＡ配列中の特徴的な配列を含む領域をポリメラーゼチェインリアクション（PCR）で増幅し、電気泳動法により検出する方法などが知られていた。しかしながら、前者の方法では近縁株等との区別が難しいことや、感染初期には抗体が検出できないことが知られている。また、後者のＰＣＲを利用する方法は、サーマルサイクラーのような複雑な温度制御装置が必要なことや簡便性に課題があるなどの不利点がある。またＰＣＲ法では、万が一誤って相補鎖合成が行われてしまった場合にはその生成物が鋳型となり増幅してしまい、誤った判定をしてしまう可能性がある。実際に、プライマーの末端の１塩基相違のみでは特異的な増幅を制御することは困難である。このような問題も本発明を用いることにより解決される。
【００５６】
ここで、本明細書に記載される核酸に関する情報を表４−１〜表４−８に纏めて示す。
【表４−１】
0005738551.tif 000008
【００５７】
【表４−２】
0005738551.tif 000009
【００５８】
【表４−３】
0005738551.tif 000010
【００５９】
【表４−４】
0005738551.tif 000011
【００６０】
【表４−５】
0005738551.tif 000012
【００６１】
【表４−６】
0005738551.tif 000013
【００６２】
【表４−７】
0005738551.tif 000014
【００６３】
【表４−８】
0005738551.tif 000015
【００６４】
２．プローブ
本発明は更に、上述のプライマーセットにより増幅されたアルテリウイルスに由来する核酸を検知および／または分類するためのプローブおよびプローブセットを提供する。
【００６５】
プローブは、所望の種または特定の遺伝子型を特異的に検出するためのプローブであってもよく、また、幾つかの種または遺伝子型を特異的に検出するためのプローブであってもよい。このようなプローブは、例えば、上述のプライマーにより増幅されたステム・アンド・ループ構造を有するポリヌクレオチドの一本鎖のループ部分の領域に対して結合するように設定してもよく、ステム部分に対して結合するように設定してもよいが、好ましくはループ部分に設定される。また、当該プローブは好ましくは、約１０〜６０塩基長、約１２〜４０塩基長などであればよい。
【００６６】
当該増幅産物を検出するためのプローブは、検出する細ウイルス株の保持する遺伝的多型や変異などに応じて変化させてもよい。上述したプローブは、何れも各表に示した配列の任意の位置の塩基が1つまたは数個置換あるいは欠失あるいは塩基を挿入された配列からなってもよい。また、核酸プローブの構造も特に限定されるものではなく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、メチルホスホネート骨格の核酸、その他の人工核酸鎖を用いることが可能である。また、これらのキメラ核酸でもよい。また、プローブに含まれる1つまたは数個置換あるいは欠失あるいは塩基を挿入された配列は、アルテリウイルス由来の核酸を特異的に検出可能な範囲な範囲であればよい。
【００６７】
例えば、好ましいプローブは、図３に示すようなステム・アンド・ループ構造のプライマー領域Ｆ１とＦ２との間(この領域はＦ２領域を含んでもよい)、プライマー領域Ｆ２ｃとＦ１ｃとの間(この領域はＦ２ｃ領域を含んでもよい)、プライマー領域Ｂ１とＢ２との間(この領域はＢ２領域を含んでもよい)、および／またはプライマー領域Ｂ２ｃとＢ１ｃとの間(この領域はＢ２ｃ領域を含んでもよい)の何れかの位置に対応するように選択されてよい。この選択は検出しようとするウイルス種に特異的な配列が適宜選択されるように行えばよい。或いは複数種を同時且つ特異的に、または広い範囲のウイルス種に亘り包括的、即ち、ユニバーサルに検出を行ってもよい。
【００６８】
本発明に従うプローブの例は、それぞれ配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４５および配列番号１４６並びにその相補配列で示されるポリヌクレオチドを含むプローブからなる群より少なくとも１選択されればよい。これらのプローブは、アルテリウイルス由来の核酸を特異的に検出可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドによりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプローブ群から選択される少なくとも１であってもよい。
【００６９】
これらのプローブは２以上選択されて組み合わされて使用されてもよく、および／またはその塩基にミックス塩基および／またはユニバーサルヌクレオチドが含まれてもよい。ミックス塩基やユニバーサルヌクレオチドを含む場合、ユニバーサルプローブとして使用されてもよい。それらのミックス塩基を含むプローブを、他のミックス塩基を含むまたは含まないプローブと組み合わせて使用してもよく、単独でミックス塩基のみが異なる配列からなるプローブセットとして使用してもよい。ミックス塩基および／またはユニバーサル塩基を使用することは、包括的にアルテリウイルスを検出するために有利である。
【００７０】
このようなユニバーサルプローブの非限定的な例を表５に示した。
【表５−１】
0005738551.tif 000016
【００７１】
【表５−２】
0005738551.tif 000017
【００７２】
表５に示すように、アルテリウイルス属をユニバーサルに検出可能なプローブの例は、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１４５および配列番号１４６並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプローブ群より少なくとも１選択されてもよい。或いは、これらのプローブから選択された２種以上のプローブが組み合わされて選択されてもよく、それぞれの配列からなる全てのプローブが一緒に使用されてもよい。また、これらの配列を構成する何れか１以上の塩基として、ミックス塩基またはユニバーサルヌクレオチドが使用されてもよい。ここで、「ミックス塩基」とは、ミックス塩基としたい所望の箇所の塩基を「アデニン」、「チミン」、「シトシン」および「グアニン」からなる群より少なくとも２選択して設計したプローブを２以上または全て混合して使用するプローブセットをいう。また、複数種類の塩基に対して対合可能な修飾塩基で置換するように設計されてもよい。
【００７３】
また、当該プライマーは好ましくは、約１０〜約６０塩基長、約１２〜約４０塩基長などであってよい。
【００７４】
例えば、Equine arteritis virus、Lactate dehydrogenase-elevating virus、Porcine reproductive and respiratory syndrome virusおよびSimian hemorrhagic fever virusを、それぞれ種特異的に検出するためのプローブの例を表６−１〜表６−３に示す。
【表６−１】
0005738551.tif 000018
【００７５】
【表６−２】
0005738551.tif 000019
【００７６】
【表６−３】
0005738551.tif 000020
【００７７】
また、何れのプローブも、同一種内での配列変異が明らかになっているなどの場合には、同一種内の配列変異に対応するために異なる配列からなるプローブを複数使用してよい。
【００７８】
また、検知したいウイルス種のためのプローブを所望に応じて表６から選択し、それらを組み合わせて、プローブセットとして使用してもよい。
【００７９】
上述した何れのプローブも、２種以上で選択され組み合わされて使用されてもよく、それぞれの配列からなる全てのプローブが一緒に使用されてもよい。および／または、これらの配列を構成する何れかの１以上の塩基がミックス塩基に設計されてもよい。また、複数種類の塩基に対して対合可能な修飾塩基で置換するように設計されてもよい。
【００８０】
当該プローブは、所望の種を特異的に検出するためのプローブであってもよく、また、幾つかの種を特異的に検出するためのプローブであってもよい。このようなプローブは、例えば、上述のプライマーにより増幅されたステム・アンド・ループ構造を有するポリヌクレオチドの一本鎖のループ部分の領域に対して結合するように設定されればよい。また、当該プライマーは好ましくは、約１０〜６０塩基長、約１２〜４０塩基長などであればよい。
【００８１】
何れのプローブおよびプローブセットも、上述した増幅産物を所望に応じて検出するために使用されてよい。当該プローブは、固相基体表面に固定化されたものであってもよく、典型的にはＤＮＡチップとして構成されたものが用いられてよく、また他のマイクロアレイを構成するプローブとして用いられてもよい。当該増幅産物を検出するためのプローブは、検知する細ウイルス株の保持する遺伝的多型や変異などに応じて変化させてもよい。
【００８２】
上述したプローブは、何れも各表に示した配列の任意の位置の塩基が1つまたは数個置換あるいは欠失あるいは塩基を挿入された配列からなってもよい。
【００８３】
また、核酸プローブの構造も特に限定されるものではなく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、メチルホスホネート骨格の核酸、その他の人工核酸鎖を用いることが可能である。また、これらのキメラ核酸でもよい。
【００８４】
核酸プローブを固相に固定化する場合は、末端にアミノ基、チオール基、ビオチン、などの官能基を導入してもよく、更に、官能基とヌクレオチドの間にスペーサーを導入してもよい。ここで用いられるスペーサーの種類は特に限定されないが、例えばアルカン骨格、エチレングリコール骨格などを用いてよい。また、一部の塩基がユニバーサルなヌクレオチドに置換されてもよい。本発明使用可能なユニバーサルなヌクレオチドの例は、deoxyinosine(dI)や、Gren Research社の3-Nitropyrrole、5-Nitroindole、deoxyribofuranosyl (dP)、deoxy-5'-dimethoxytrityl-D-ribofuranosyl (dK)などを含む。
【００８５】
本発明で使用する検出法は、これらに特に限定されるものではないが、濁度、可視光、蛍光、化学発光、電気化学発光、化学蛍光、蛍光エネルギー転移法、ＥＳＲなどの光学的な手法や、電流、電圧、周波数、伝導度、抵抗などの電気的な性質を利用することも可能である。
【００８６】
基体に核酸プローブが固相されたＤＮＡチップの例を以下に説明する。図５のＤＮＡチップは、非限定的な１例である微生物遺伝子型判定用核酸チップである。ＤＮＡチップ１は、基体２に固定化領域３を具備する。核酸プローブ４は該固定化領域３に固定化される。このようなＤＮＡチップ１は、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体２に配置される固定化領域３の数及びその配置は、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。このようなＤＮＡチップは、蛍光を用いた検出方法のために好適に用いられてよい。1つの固定化領域には、独立した１つの信号として得ることが必要な情報を得るために必要な１種類または１種類以上の核酸プローブまたはプローブセットが固定化される。
【００８７】
図６のＤＮＡチップは、非限定的な１例である微生物遺伝子型判定用核酸チップである。図６のＤＮＡチップ１１は、基体１２に電極１３を具備する。核酸プローブ１４は電極１３に固定化される。電極１３は、パット１５に接続される。電極１３からの電気的情報はパット１５を介して取得される。このようなＤＮＡチップ１１は、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体１２に配置される電極１３の数及びその配置は、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。さらに、本例のＤＮＡチップは、必要に応じて、参照電極及び対極を具備してもよい。1つの固定化領域には、独立した１つの信号として得ることが必要な情報を得るために必要な１種類または１種類以上の核酸プローブまたはプローブセットが固定化される。
【００８８】
本発明で用いるプローブを固定化するための表面は、特に限定されるものではないが、樹脂ビーズ、磁気ビーズ、金属微粒子、マイクロタイタープート、ガラス基板、シリコン基板、樹脂製基板、電極基板などを用いることができる。
【００８９】
本発明で使用する基体の材料は、特に限定されるものではない。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素、等の無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。
【００９０】
例えば、電気的な性質を利用する場合、電極を基体に配置することが好ましい。電極は特に限定されるものではないが、例えば、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウム、タングステン等の金属単体及びそれらの合金、あるいはグラファイト、グラシーカーボン等の炭素等、またはこれらの酸化物、化合物であってよい。更に、酸化珪素等の半導体化合物や、CCD、FET、CMOSなど各種半導体デバイスを用いてもよい。
【００９１】
抽出方法は特に限定される物ではなく、フェノール−クロロホルム法等の液−液抽出法や担体を用いる固液抽出法を用いることができる。また、市販の核酸抽出方法ＱＩＡａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、（社製）等を利用することも可能である。次に、抽出した核酸成分を鋳型にＲＴ-ＬＡＭＰ増幅を行った後、遺伝子検出用電極とでハイブリダイゼーション反応を行う。反応溶液は、イオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液中で行う。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストランや、サケ精子DNA、牛胸腺DNA、EDTA、界面活性剤などを添加することが可能である。ここに抽出・増幅した核酸成分を添加の上、核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応に供与する。反応中は、撹拌、あるいは振とうなどの操作で反応速度を高めることもできる。反応温度は１０℃〜９０℃の範囲で、また反応時間は1分以上1晩程度行う。ハイブリダイゼーション反応後の洗浄には、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いる。
【００９２】
抽出・増幅したサンプル核酸は、あらかじめＦＩＴＣやＣｙ３、Ｃｙ５、ローダミンなどの蛍光色素やビオチン、ハプテン、オキシダーゼやポスファターゼ等の酵素や、フェロセンやキノン類等の電気化学的に活性な物質で標識するか、あるいは前述した物質で標識したセカンドプローブを用いることで検出が可能になる。
【００９３】
電気化学的に活性な核酸結合物質を用いた検出を行う場合は、以下のような手順で検出を行う。基体を洗浄後、電極表面に形成した二本鎖部分に選択的に結合する核酸結合物質を作用させ、電気化学的な測定を行ってよい。ここで用いられる核酸結合物質は特に限定される物ではないが、例えば、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター、ポリインターカレーター等を用いることが可能である。更に、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン、ビオロゲン等で修飾しておくことも可能である。核酸結合物質の濃度は、その種類によって異なるが、一般的には１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲で使用する。この際、イオン強度０．００１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いる。電極を核酸結合物質と反応させた後、電気化学的な測定を行う。電気化学的な測定は、3電極タイプ、すなわち参照電極、対極、作用極、あるいは2電極タイプ、すなわち対極、作用極で行う。測定では、核酸結合物質が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、核酸結合物質に由来する反応電流値を測定する。この際、電位は定速で掃引するか、あるいはパルスで印加するか、あるいは、定電位を印加することができる。測定には、ポテンショスタット、デジタルマルチメーター、ファンクションジェネレーター等の装置を用いて電流、電圧を制御する。得られた電流値を基に、検量線から標的遺伝子の濃度を算出する。遺伝子検出用電極を用いた遺伝子検出装置は、遺伝子抽出部、遺伝子反応部、核酸結合物質反応部、電気化学測定部、洗浄部等から構成される。
【００９４】
３．アッセイキット
本発明に従うと、アルテリウイルスの検出および／または分類するためのアッセイキットが提供されてもよい。そのようなアッセイキットは、上述のプライマーまたはプライマーセットとプローブまたはプローブセットとを含めばよい。当該アッセイキットは、当該プライマーまたはプライマーセットおよびプローブまたはプローブセットに加えて、ＬＡＭＰ増幅に必要なバッファーを含んでもよく、ハイブリダイゼーションに必要なバッファー、並びにそこにおいて当該増幅および／またはハイブリダイゼーションを行うための容器を具備してもよい。また、アッセイキットに含まれるプローブは基体に固定化されていてもよい。その場合の基体は上述した何れかの基体であればよい。
【００９５】
４．アルテリウイルス属の分類方法
本発明に従うと、更に、アルテリウイルスを検知する方法が提供される。当該検知方法は、上記したプライマー、プローブおよび増幅方法を利用することによって、更に、アルテリウイルス属に分類される微生物の検知および属レベルまたは種レベルで遺伝子型分類を行う方法である。
【００９６】
そのような方法は、試料に含まれる核酸を上述の何れかのプライマーセットを用いてＲＴ-ＬＡＭＰ増幅する工程と、前記ＬＡＭＰ増幅により生じた増幅産物と上述の何れかのプローブとを反応することと、前記反応の結果から試料に存在するアルテリウイルスを検知および／または分類することを具備すればよい。
【００９７】
また、上述の何れかのプライマーセットを用いて、試料についてＲＴ-ＬＡＭＰ増幅反応を行うことと、当該増幅反応により生じた増幅産物と、上述の何れかのプローブとを反応し、それにより生じるハイブリダイズの有無を検出することにより試料におけるアルテリウイルスの存在の有無を判定する、および／または試料におけるアルテリウイルスを分類することを具備する方法であってもよい。
【００９８】
また、例えば、そのようなアルテリウイルス属に分類される微生物の感染や存在を検知する方法は、
本発明に従うプライマーから任意に選択される少なくとも１つのプライマーを含む複数のプライマーを使用して、ＬＡＭＰ反応により試料について核酸鎖増幅反応を行う工程と、
前記増幅反応後に増幅産物の有無を検知する工程と、
を具備すればよい。当該試料は、予め核酸を抽出する工程に供されてもよい。
【００９９】
ここにおける「ＲＴ-ＬＡＭＰ増幅」とは、逆転写を行いながらＬＡＭＰ反応により増幅対象の核酸を増幅することをいう。当該ＲＴ-ＬＡＭＰ増幅は、上述の何れかのプライマーを用いて増幅対象の核酸を増幅可能なそれ自身公知の何れの条件で行ってよい。
【０１００】
当該増幅産物と当該プローブとの反応は、上述の何れかのプローブを用いてハイブリダイズが可能なそれ自身公知の何れかの条件で行ってよい。
【０１０１】
LAMP産物に特徴的な複雑な高次構造が、ハイブリダイゼーション反応時においてプローブが結合した基体と物理的な障害を起こす要因となり、その結果ハイブリダイゼーション効率に悪影響を及ぼすことが見出されている（たとえば、特開2005-95043を参照されたい）。そのような悪影響を受けないようにするために、本発明に従うプローブは、従来のターゲット配列の位置とは異なり、一本鎖のループ部分にアルテリウイルス属に分類される微生物由来のターゲット配列が位置するようにプライマーを設計している。
【０１０２】
本発明によれば、簡便、安価、高速にアルテリウイルス属に分類される微生物の検知および属レベルまたは種レベルで遺伝子型を分類する方法が提供される。
【０１０３】
また、上述したとおり、これまで、迅速診断法としてはウイルスＲＮＡから逆転写酵素によりＤＮＡを作成した上、前記DNA配列中の特徴的な配列を含む領域をポリメラーゼチェインリアクション（PCR）で増幅し、電気泳動法により検知する方法（ＲＴ-ＰＣＲ法）などが知られている。しかしながら、PCRを利用する方法は、サーマルサイクラーのような複雑な温度制御装置が必要なことや簡便性に課題があるなどの不利点がある。またPCR法では、万が一誤って相補鎖合成が行われてしまった場合にはその生成物が鋳型となり増幅してしまい、誤った判定をしてしまう可能性がある。実際に、プライマーの末端の1塩基相違のみでは特異的な増幅を制御することは困難である。特異性を配列検知の際の特異性を挙げる方法としては、一般的にPCR法で増幅した目的遺伝子産物をDNAチップにより検知する手法が挙げられるが、PCRにて生成される産物が2本鎖であるため、プローブとハイブリダイゼーション反応させる場合に、相補鎖がプローブに対するコンペティターとなりハイブリ効率が低く検知感度が悪いのが問題である。本発明に従うと、このようなＰＣＲ法による問題も解決することが可能である。
【０１０４】
また、ターゲットを1本鎖にするために、相補鎖を分解する、または分離するといった従来の方法もあるが、これらの方法は、いずれも、酵素の使用、磁気ビーズの使用などによる高価格化、操作における煩雑性が問題である。このような問題も本発明により解決することが可能である。
【０１０５】
［例］
以下に、本発明による核酸検知方法について例を用いて具体的に説明する。
【０１０６】
今回検知方法の対象としたアルテリウイルスを構成するウイルス種では、ウイルスゲノム解析の結果non-glycosylated envelope protein、（membrane protein M、non-glycosylated envelope protein、unglycosylated membrane protein M）をコードする遺伝子配列」と「nucleocapsid protein、（nucleocapsid protein N、capsid protein）をコードする遺伝子配列」に跨る遺伝子配列の一部領域が、ウイルス種毎にユニークな配列を保持しながら高度に保存されていることを見出した。そこで、先ず、アルテリウイルスの代表列としてＬＤＶを用い、前記遺伝子領域において検知に最適なプライマーおよび／またはプローブ設計遺伝子配列を検討（例１−例６）。選定されてきたPrimer/Probeを用いて様々な検体を検出した結果、望ましい検出特性（検出信号量および、検出特異性）が得られることを確認した。その後、他のアルテリウイルス（Equine arteritis virus、Porcine reproductive and respiratory syndrome virus、Simian hemorrhagic fever virus）についても、前記で「ＬＤＶを代表として選定した最適なPrimer/Probe設計」に対応する遺伝子配列領域にPrimer/Probeを設計。それぞれの核酸検知特性を確認し、望ましい検出特性が得られることを確認した。詳細を以下に記す。
【０１０７】
例１
＜プライマーセットの選択＞
LDV（Lactate dehydrogenase-elevating virus、アクセション番号 NC_001639, AB001875, AF092282, AF092283, U15146, L13298, L06811, M55296）配列からアライメントを作成し、変異のない、または変異頻度の少ない領域を選んでプライマーを設計した。ＬＤＶの一部をクローニングしたプラスミド（103copies/reaction）をテンプレートにして、以下の組成にて６３℃９０分Ｒｅａｌｏｏｐ−３０（モリテックス社製）を用いてＬＡＭＰ増幅を行った。プライマーの組み合わせと増幅結果（濁度立上がり時間）を合わせて表１に示す。濁度立上がり時間５０分未満が３種得られた。５０−９０分で立ち上がるものも１２種得られた。結果を表７に示す。
【表７】
0005738551.tif 000021
【０１０８】
LAMP反応液組成（１×）
FIP          40 pmol
BIP          40 pmol
F3            5 pmol
B3            5 pmol
(Lfc/Lb      20 pmol)
2×Reaction Mixture   12.5 μl
8 U/μl Bst DNA polymerase  1μl
Template                  1μl
Distilled Water        Up to 25μl。
【０１０９】
Reaction Mixture（反応時濃度）
Tris-HCl (pH8.8)        20 mM
KCL                  10 mM
MgSO4                 8 mM
(NH4)SO4                     10 mM
Tween-20               0.1 %
Betaine                 0.8 M
dNTPs                  1.4 mM each
＜ループプライマーの選択＞
50分以内で濁度が立上がった3種のプライマーセットに対し、定法に従ってループプライマーを設計して合成した。上述の反応組成に20pmolのループプライマーを追加して同様にLAMP増幅を行った。テンプレートは添加前に９５℃５分処理したものを使用した。プライマーの組合せと増幅結果を合わせて表８に示す。この実験から各プライマーセットに対する良好なループプライマーを選択することができた。Fループ、Bループいずれかにループプライマーを用いれば、濁度立上がり時間20分程度の速い増幅系となることが示された。
【表８】
0005738551.tif 000022
【０１１０】
例２
＜変異株用プライマーの設計＞
プライマーセット5-1について、プライマー領域にある変異箇所を調べたところ、F2領域およびB1領域に頻度の高い変異があることがわかった。そこで、これら変異株も良好に増幅できるよう、表６のプライマーを新たに追加して増幅を行った。対応するプライマーの混合量は等量とした。その結果、この混合プライマーは変異のない基準株、変異株のいずれも配列でも濁度立上がり時間30分未満で増幅可能であることが示された。
【０１１１】
例３
＜RT-LAMP＞
プライマーセット5-1および変異対応追加プライマーを混合したＬＡＭＰ増幅液（例１記載の組成）に、0.625UのAMV transcriptase を添加し、実際のLDVウイルス（譲渡された基準株）のRT-LAMP（６３℃６０分）を行った。その結果、抽出検体の段階希釈液において良好な増幅であった。
【表Ａ】
0005738551.tif 000023
【０１１２】
例４
＜プローブ配列設計＞
前記プライマーセットにて増幅されたＬＡＭＰ産物検出用プローブを選定するため、ＬＡＭＰ産物の１本鎖核酸領域にハイブリダイゼーションが可能な設計にて複数の候補配列を選定した。３’末端チオール修飾を持つ合成核酸として以下のような候補プローブを準備した。
【０１１３】
プローブ名                  配列
候補Probe1      AGGAGCGGTTAACCTTTTGAAATATGTCTCAAAAT
候補Probe2      GCGGTTAACCTTTTGAAATATGTCTCAAAATAAGAAGAA
候補Probe3      TATGTCTCAAAATAAGAAGAAGGGCGGCCAGA
候補Probe4      TGCCCGTTCACAAGGGTACTACCTGGCTTCC
候補Probe5      TGCCCGTTTACAAGGGTACTACCTGGCTTCC。
【０１１４】
例５
＜プローブ選定＞
図６に示すような核酸プローブ固定化電極を作製した。基板１２に配置された金電極１３に対して、プローブ候補となる配列の合成核酸（３’末端がチオール修飾されている）をスポットすることにより配列毎に固定化した。また、同様にネガティブコントロールプローブもスポットした。その後、超純水で洗浄し、風乾し、電流検知型の核酸チップを作製した。作製した核酸チップを２×ＳＳＣの塩を添加したＬＡＭＰ産物に浸漬し、３５℃で６０分間静置することによってハイブリダイゼーション反応を行った。ＬＡＭＰ産物は、標準株配列を持つプラスミドをテンプレートに増幅したものを用いた。更に、この電極を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含むリン酸緩衝液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。電流測定の結果を表９に示す。電極に固定化したプローブは、領域中に存在する変異をあらかじめ考慮したものを複数用意した。３０ｎＡ以上の増加量を示す最適なプローブ、２０−３０ｎＡの増加量を示す良好なプローブが得られ、ＬＤＶ検出用核酸チップに搭載するプローブ配列を選択することができた。
【表９】
0005738551.tif 000024
【０１１５】
例６
検出対象である、ＬＤＶはＲＮＡウイルスであることから、ゲノム配列には多様な変異（バリエーション）が存在する。そこで、公表されている全てのＬＤＶゲノム配列情報を元に、例１−例５にて選定されてきた最適なプライマーおよびプローブ領域の変異発生状況を確認した。それぞれの変異に対応する鋳型配列を合成遺伝子により作成したと伴に、全パターンについて変異対応プライマーおよびプローブを準備した（表６−１、表６−２）。配列変異を含むウイルス配列検知を試みた。その結果、何れの組み合わせにおいてもプライマーおよびプローブ配列と検体がフルマッチであれば、３０ｎＡ以上の電流増加量にて検出が可能であることを確認した（表６−３）。なお、近縁ウイルスであるEquine arteritis virus、Porcine reproductive and respiratory syndrome virus、Simian hemorrhagic fever virus等の配列を持つ鋳型核酸を検体として適用した場合では、何れのプライマー/プローブの組み合わせにおいても、優位な電流値増加（２０ｎＡ以上）は認められなかった。
【０１１６】
以上の事から、ＬＤＶにおいては、例１−例５にて選定されたプライマーおよびプローオブ領域を用いることで、望ましい検出特性（即ち、検出信号量および、検出特異性）が得られること、必要に応じてプライマーおよび／またはプローブの配列を一部改変することにより、ウイルス配列変異に対して検出特性を損なうことなく対応可能であることが確認できた（表６−１〜表６−３を参照されたい）。
【０１１７】
図７にＬＤＶのＬＡＭＰ増幅産物を電気泳動した。レーン２〜５は、ＬＤＶのＬＡＭＰ増幅産物である。レーン１および６はマーカー１００ｂｐラダーである（図７）。
【０１１８】
図８および９に電流検地型核酸チップによる検出例を示した。陰性の検体を使用した結果を図８に、ＬＤＶ陽性検体を使用した結果を図９に示した（図８および９）
例７
他のアルテリウイルス（Equine arteritis virus  DQ846750、Porcine reproductive and respiratory syndrome virus  AY150312、Simian hemorrhagic fever virus  NC_003092）についても、例１−例６で示された「ＬＤＶを代表として選定した最適なプライマーおよびプローブ設計」に対応する遺伝子領域を特定した。それぞれのウイルス種に対応したプライマーおよびプローブを構築した（表１０）。ＬＤＶを含めたアルテリウイルスに対する検出特性を確認した。
【表１０】
0005738551.tif 000025
【０１１９】
その結果、構築したプローブおよびプライマーにて、アルテリウイルスに分類されるウイルス種を特異的かつ十分な信号量にて検知できることが確認できた（表１１）。
【表１１】
0005738551.tif 000026
【０１２０】
例９
検出対象である、アルテリウイルスはＲＮＡウイルスである事から、ゲノム配列には多様な変異（バリエーション）が存在する。そこで、例６同様、公表されている全てのEquine arteritis virus  DQ846750、Porcine reproductive and respiratory syndrome virus  のゲノム配列情報を基に、前記実施例にて選定されてきた最適プライマーおよびプローブ領域の変異発生状況を確認。それぞれの変異に対応する鋳型配列を合成遺伝子により作成したと伴に、全パターンについて変異対応プライマーおよびプローブを準備した（表１２）。
【表１２−１】
0005738551.tif 000027
【０１２１】
【表１２−２】
0005738551.tif 000028
【０１２２】
配列変異を含むウイルス配列検知を試みた。その結果、何れの組み合わせにおいてもプライマーおよびプローブ配列と検体がフルマッチであれば、３０ｎＡ以上の電流増加量にて検出が可能であることを確認した。代表的な検出結果例を図１０〜１２に示す。図１０は陰性検体を用いた場合の結果であり、図１１はEquine arteritis virus陽性検体を当てた場合の結果である（図１０および図１１）。また、図１２は、Porcine reproductive and respiratory syndrome virus陽性検体を当てた場合の結果である（図１２）。
【０１２３】
なお、変異対応を行なったプライマーおよびプローブを使用した場合であっても、表１１に示したのと同様、近縁ウイルス間での交差反応による２０ｎＡ以上の優位な電流値増加は全く認められなかった。この事は、配列の更に異なる他のウイルス属・ウイルス種や、他の微生物との交差反応を生じないことを示唆する。
【０１２４】
以上の事から、本発明にて選定されたプライマーおよびプローブ領域を用いることで、アルテリウイルスの検知ならびに種判別およびタイピングを望ましい検出特性（検出信号量および、検出特異性）にて行な得ることが示された。また必要に応じてプライマーおよびプローブの配列を一部改変する事で、アルテリウイルスを構成するウイルス種及びウイルス配列変異に対して、検出特性を損なうことなく対応可能である事が確認できた。
【符号の説明】
【０１２５】
1・・・プローブ、2・・・プローブ、3・・・プローブ、4・・・プローブ、5・・・プローブ、6・・・スライドガラス、10・・・基板、11・・・金電極、12・・・接続部、13・・・プローブ、14・・・プローブ、15・・・プローブ、16・・・プローブ、17・・・プローブ、18・・・核酸プローブ固定化電極
【図１】
0005738551.tif 000029
【図２】
0005738551.tif 000030
【図３】
0005738551.tif 000031
【図４】
0005738551.tif 000032
【図５】
0005738551.tif 000033
【図６】
0005738551.tif 000034
【図７】
0005738551.tif 000035
【図８】
0005738551.tif 000036
【図９】
0005738551.tif 000037
【図１０】
0005738551.tif 000038
【図１１】
0005738551.tif 000039
【図１２】
0005738551.tif 000040
【配列表】
0005738551000001.app