(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体からの試料におけるバイオマーカーを検出することを含む、被験体における心血管の状態を検出またはモニタリングする方法であって、
バイオマーカーは、トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）およびインターロイキン１７ａ（ＩＬ−１７ａ）を含み、
少なくとも１つのバイオマーカーの検出限界は２０ｐｇ／ｍｌより小さい、方法。
【請求項２】
Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、ｐｒｏＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、インターロイキン６（ＩＬ−６）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）からなる群から選択される少なくとも１つの追加のバイオマーカーの検出を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
２０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界を有する少なくとも１つのバイオマーカーの検出が、試料をマーカーに対するラベルに接触させること、およびラベルの存在または不存在を検出することを含み、ラベルの存在の検出は対応するマーカーの存在を意味する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ラベルが蛍光部分を含み、２０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界を有する少なくとも１つのバイオマーカーが、バイオマーカーの単一分子に対応するラベルを含むインタロゲーション・スペースにおいて検出される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ラベルが蛍光部分を含み、検出が、単一分子検出器にラベルを通すことを含み、単一分子検出器が
（ａ）蛍光部分を刺激するための電磁放射線源；
（ｂ）電磁波源から放射される電磁放射線を受け取るためのインタロゲーション・スペース；および
（ｃ）刺激された蛍光部分の電磁気学的特性を決定するための、インタロゲーション・スペースに操作可能に接続された電磁放射線検出器
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのマーカーの検出限界が１０ｐｇ／ｍｌ〜０．０１ｐｇ／ｍｌの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記状態が鬱血性心不全を含み、バイオマーカーがｃＴｎＩ、ＢＮＰ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１７ａを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
被験体における心血管の状態を検出する方法であって、その方法は、心疾患の生理学的バイオマーカーを測定すること、および被験体からの血液試料中のバイオマーカーを検出することを含み、バイオマーカーは、トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）およびインターロイキン１７ａ（ＩＬ−１７ａ）を含み、
少なくとも１つのバイオマーカーの検出限界は２０ｐｇ／ｍｌより小さい、方法。
【請求項９】
Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、ｐｒｏＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、インターロイキン６（ＩＬ−６）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）からなる群から選択される少なくとも１つの追加のバイオマーカーの検出を更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
生理学的バイオマーカーの測定がストレス試験にて行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
生理学的バイオマーカーの測定が睡眠試験にて行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
バイオマーカーが１つまたはそれより多くのサイトカインを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
１つまたはそれより多くのサイトカインがＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６および／またはｈｓＣＲＰを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
生理学的バイオマーカーが頸動脈内膜中膜厚（ＣＩＭＴ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
バイオマーカーが１つまたはそれより多くの血管炎症マーカーを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
１つまたはそれより多くの血管炎症マーカーがｈｓＣＲＰ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
被験体における鬱血性心不全を検出する方法であって、その方法は、バイオマーカーのパネルの１つまたはそれより多くの要素が、正常集団における１つまたはそれより多くのバイオマーカーのレベルと比較して増加しているか否かを検出することを含み、バイオマーカーは、トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）およびインターロイキン１７ａ（ＩＬ−１７ａ）を含み、パネルの少なくとも１つの要素の検出限界は２０ｐｇ／ｍｌより小さい、方法。
【請求項１８】
パネルの要素が、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、ｐｒｏＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、インターロイキン６（ＩＬ−６）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）の少なくとも１つを更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
パネルの２０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界を有する少なくとも１つの要素がｃＴｎＩである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
２０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界を有する少なくとも１つのバイオマーカーの検出が、試料をマーカーに対するラベルに接触させること、およびラベルの存在または不存在を検出することを含み、ラベルの存在の検出は、対応するマーカーの存在を意味する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ラベルが蛍光部分を含み、２０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界を有する少なくとも１つのバイオマーカーが、バイオマーカーの単一分子に対応するラベルを含むインタロゲーション・スペースにおいて検出される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
ラベルが蛍光部分を含み、検出が、単一分子検出器にラベルを通すことを含み、単一分子検出器が
（ａ）蛍光部分を刺激するための電磁放射線源；
（ｂ）電磁波源から放射される電磁放射線を受け取るためのインタロゲーション・スペース；および
（ｃ）刺激された蛍光部分の電磁気学的特性を決定するための、インタロゲーション・スペースに操作可能に接続された電磁放射線検出器
を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１つのマーカーの検出限界が１０ｐｇ／ｍｌ〜０．０１ｐｇ／ｍｌの範囲である、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
循環器系疾患は、心臓および／または血管機能の異常である。冠状動脈疾患、鬱血性心不全、不整脈、アテローム性動脈硬化、高血圧症、卒中、脳血管疾患、末梢血管疾患および心筋梗塞のような様々な医学的状態がこの名称の下に含まれる。米国において、ＣＶＤは主な死因である。１９９７年において、全ての死の約４０％または約１００万人が循環器系疾患に起因した。この国において、６２００万人が循環器系疾患にかかっており、５０００万人が高血圧症にかかっていると推定される。
【０００２】
循環器系疾患は、心筋（心臓病理学）および血管炎症の両方に病因を有する進行性プロセスである。疾患のプロセスは、早期発症性の軽度の血管炎症から急性心筋梗塞等の深刻な急性事象または心不全等の慢性事象への連続的変化に従う。よく知られた健康状態、高血圧症、肥満、糖尿病、メタボリックシンドローム、高コレステロール血症等の患者は、様々な程度のＣＶＤを発症するリスクを有する。ＣＶＤリスク因子を示す患者を有する臨床医が直面する課題は、それらのリスクの程度を理解すること、適切な治療計画を開発すること、そして疾患リスクの改善について患者をモニタリングすることである。
【０００３】
豊富な研究により、ＣＶＤが概して予防可能であることの説得力のある証拠が提示されてきた。循環器系疾患の原因は、構造的欠陥から感染（症）、炎症、環境及び遺伝的性質へと多岐にわたる。変更（または修正）することができないリスク因子もあるが（遺伝的性質、年齢、性別）、生活様式の変化によって又は医学的に対処することができるリスク因子が多数存在する。これらの制御可能なリスク因子として、喫煙、高血圧症、肥満、糖尿病、運動不足および高血中コレステロール値が挙げられる。心臓に関する問題が検出される時点までに、根底にある原因（アテローム性動脈硬化）は通常かなり発達しており、数十年間進行している。従って、リスク因子を修正することによって、例えば健康な食事、運動および喫煙の回避等によってアテローム性動脈硬化を予防することが、ますます注目されている。
【０００４】
ＣＶＤ、例えば鬱血性心不全（ＣＨＦ）はしばしば、臨床症状の発症の後に最初に診断され、それにより、早期介入の可能性が排除される。ＣＶＤの高感度検出に対するニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００５】
一の態様において、本発明は、被験体における状態を検出またはモニタリングする方法を提供し、この方法は、被験体からの第１試料における第１マーカーを検出すること、および第２マーカーを検出することを含み、ここで第１マーカーには、心筋トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が含まれ、第１マーカーの検出限界は約２０ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、少なくとも１つのマーカーの検出は、マーカーに対するラベルに試料を接触させること、およびラベルの存在または不存在を検出することを含み、ラベルの存在の検出は、対応するマーカーの存在を意味する。いくつかの態様において、ラベルは蛍光部分を含み、検出は、ラベルが単一分子検出器を通過することを含み、単一分子検出器は以下のものを含んでなる：（ａ）蛍光部分を刺激するための電磁放射線源；（ｂ）電磁波源から放射される電磁放射線を受容するためのインタロゲーション・スペース；および（ｃ）刺激された蛍光部分の電磁気学的特性を決定するために、インタロゲーション・スペースに操作可能に接続される電磁放射線検出器。
【０００６】
いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は約１０ｐｇ／ｍｌ〜約０．０１ｐｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は約１０ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は約５ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は約１ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は約０．５ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は約０．１ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は約０．０５ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は約０．０１ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は約０．００５ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は約０．００１ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、検出限界の変動係数（ＣＶ）は約２０％〜約１％の範囲である。いくつかの態様において、検出限界の変動係数（ＣＶ）は約１００％〜約１％の範囲である。いくつかの態様において、検出限界の変動係数（ＣＶ）は約７５％〜約１％の範囲である。いくつかの態様において、検出限界の変動係数（ＣＶ）は約５０％〜約１％の範囲である。いくつかの態様において、検出限界の変動係数（ＣＶ）は約２５％〜約１％の範囲である。いくつかの態様において、検出限界の変動係数（ＣＶ）は約２０％〜約１％の範囲である。いくつかの態様において、検出限界の変動係数（ＣＶ）は約１５％〜約１％の範囲である。いくつかの態様において、検出限界の変動係数（ＣＶ）は約１０％〜約１％の範囲である。いくつかの態様において、検出限界の変動係数（ＣＶ）は約５％〜約１％の範囲である。いくつかの態様において、試料サイズは約１０μｌ〜約０．１μｌの範囲である。いくつかの態様において、試料サイズは約１００μｌ〜約０．１μｌの範囲である。いくつかの態様において、試料サイズは約７５μｌ〜約０．１μｌの範囲である。いくつかの態様において、試料サイズは約５０μｌ〜約０．１μｌの範囲である。いくつかの態様において、試料サイズは約２５μｌ〜約０．１μｌの範囲である。いくつかの態様において、試料サイズは約２０μｌ〜約０．１μｌの範囲である。いくつかの態様において、試料サイズは約５μｌ〜約０．１μｌの範囲である。いくつかの態様において、試料サイズは約１μｌ〜約０．１μｌの範囲である。いくつかの態様において、試料サイズは約１００μｌより小さい。いくつかの態様において、試料サイズは約７５μｌより小さい。いくつかの態様において、試料サイズは約５０μｌより小さい。いくつかの態様において、試料サイズは約２５μｌより小さい。いくつかの態様において、試料サイズは約２０μｌより小さい。いくつかの態様において、試料サイズは約１５μｌより小さい。いくつかの態様において、試料サイズは約１０μｌより小さい。いくつかの態様において、試料サイズは約５μｌより小さい。いくつかの態様において、試料サイズは約２μｌより小さい。いくつかの態様において、試料サイズは約１μｌより小さい。いくつかの態様において、試料サイズは約��．５μｌより小さい。いくつかの態様において、試料サイズは約０．１μｌより小さい。いくつかの態様において、試料サイズは約０．０５μｌより小さい。いくつかの態様において、試料サイズは約０．０１μｌより小さい。
【０００７】
いくつかの態様において、本方法は、第１試料を２つ又はそれより多くのアリコートに分割すること、およびその２つ又はそれより多くのアリコート中の少なくとも１つのマーカーを検出することを更に含む。いくつかの態様において、試料には血漿、血清、細胞溶解物または組織試料が含まれる。いくつかの態様において、試料には、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）、血液、血清、血漿、尿、鼻腔スワブ、脳脊髄液、胸膜液、滑液、腹水、羊水、胃液、リンパ液、間質液、組織ホモジネート、細胞抽出物、唾液、痰、便、生理学的分泌物、涙液、粘液、汗、母乳、精液、精漿、膣分泌物、潰瘍ならびに他の表面皮疹、水疱、および膿瘍からの液体、ならびに正常組織、悪性組織および疑わしい組織、または目標とする件の粒子を含有し得る他の何らかの身体構成要素の生検を含む組織抽出物が含まれる。細胞もしくは組織培養物または培養ブロス等の他の同様の検体も対象となる。
【０００８】
いくつかの態様において、第２マーカーにはバイオマーカー、生理学的マーカーまたは遺伝子マーカーが含まれる。いくつかの態様において、第２マーカーにはタンパク質が含まれる。いくつかの態様において、第１マーカーおよび第２マーカーの少なくとも１つが、正常者からの試料において、１０ｐｇ／ｍｌより低い濃度で発見される。いくつかの態様において、第１マーカーおよび第２マーカーの少なくとも１つが、正常者からの試料において、１００ｐｇ／ｍｌより低い濃度で発見される。いくつかの態様において、第１マーカーおよび第２マーカーの少なくとも１つが、正常者からの試料において、７５ｐｇ／ｍｌより低い濃度で発見される。いくつかの態様において、第１マーカーおよび第２マーカーの少なくとも１つが、正常者からの試料において、５０ｐｇ／ｍｌより低い濃度で発見される。いくつかの態様において、第１マーカーおよび第２マーカーの少なくとも１つが、正常者からの試料において、２５ｐｇ／ｍｌより低い濃度で発見される。いくつかの態様において、第１マーカーおよび第２マーカーの少なくとも１つが、正常者からの試料において、２０ｐｇ／ｍｌより低い濃度で発見される。いくつかの態様において、第１マーカーおよび第２マーカーの少なくとも１つが、正常者からの試料において、１５ｐｇ／ｍｌより低い濃度で発見される。いくつかの態様において、第１マーカーおよび第２マーカーの少なくとも１つが、正常者からの試料において、１０ｐｇ／ｍｌより低い濃度で発見される。いくつかの態様において、第１マーカーおよび第２マーカーの少なくとも１つが、正常者からの試料において、５ｐｇ／ｍｌより低い濃度で発見される。いくつかの態様において、第１マーカーおよび第２マーカーの少なくとも１つが、正常者からの試料において、２ｐｇ／ｍｌより低い濃度で発見される。いくつかの態様において、第１マーカーおよび第２マーカーの少なくとも１つが、正常者からの試料において、１ｐｇ／ｍｌより低い濃度で発見される。いくつかの態様において、第１マーカーおよび第２マーカーの少なくとも１つが、正常者からの試料において、０．５ｐｇ／ｍｌより低い濃度で発見される。いくつかの態様において、第１マーカーおよび第２マーカーの少なくとも１つが、正常者からの試料において、０．１ｐｇ／ｍｌより低い濃度で発見される。いくつかの態様において、第１マーカーおよび第２マーカーの少なくとも１つが、正常者からの試料において、０．０５ｐｇ／ｍｌより低い濃度で発見される。いくつかの態様において、第１マーカーおよび第２マーカーの少なくとも１つが、正常者からの試料において、０．０１ｐｇ／ｍｌより低い濃度で発見される。
【０００９】
いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約１０ｐｇ／ｍｌ〜約０．０１ｐｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約１０ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約５ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約１ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約０．５ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約０．１ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約０．０５ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約０．０１ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約０．００５ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約０．００１ｐｇ／ｍｌより小さい。
【００１０】
いくつかの態様において、第２マーカーにはＢ型ナトリウム利尿ペプチド、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ｃＴｎＩ、ＶＥＧＦ、インスリン、ＧＬＰ−１（活性型）、ＧＬＰ−１（ｔｏｔａｌ）、ＴＲＥＭ１、ロイコトリエンＥ４、Ａｋｔ１、Ａβ−４０、Ａβ−４２、ＦａｓリガンドまたはＰＳＡが含まれる。いくつかの態様において、第２マーカーはサイトカインである。いくつかの態様において、サイトカインはＧ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＩＬ−８、ＩＬ−５、ＩＬ−２１、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−１５、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１α、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７α、ＩＬ−１β、ＭＣＰ、ＩＬ−３２またはＲＡＮＴＥＳである。いくつかの態様において、サイトカインはＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−７、ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βである。いくつかの態様において、第２マーカーにはアポリポタンパク質、虚血修飾アルブミン（ＩＭＡ）、フィブロネクチン、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）が含まれる。
【００１１】
いくつかの態様において、本発明の方法は、第１マーカーの濃度を決定すること、および、第２マーカーがタンパク質を含む場合、第２マーカーの濃度を決定することを更に含む。いくつかの態様において、本発明の方法は、第２マーカーがタンパク質を含む場合、第２マーカーの濃度に対する第１マーカーの濃度の比を決定することを含む。
【００１２】
いくつかの態様において、第２マーカーには生理学的マーカーが含まれる。いくつかの態様において、生理学的マーカーには心電図（ＥＫＧ）、ストレス試験、放射性映像（ｎｕｃｌｅａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ）、超音波、インスリン耐性、ボディマス指数、血圧、年齢、性別または睡眠時無呼吸が含まれる。
【００１３】
いくつかの態様において、第２マーカーには分子マーカーが含まれる。いくつかの態様において、分子マーカーにはコレステロール、ＬＤＬ／ＨＤＬ／Ｑ−ＬＤＬ、トリグリセリド、尿酸、クレアチニン、血中ブドウ糖（または血糖）またはビタミン−Ｄが含まれる。いくつかの態様において、分子マーカーにはトリグリセリドまたはＬＤＬ／ＨＤＬ／Ｑ−ＬＤＬの亜分画が含まれる。
【００１４】
いくつかの態様において、第２マーカーには遺伝子マーカーが含まれる。いくつかの態様において、遺伝子マーカーには、ＡｐｏＥ等のアポリポタンパク質をエンコードする遺伝子の変異が含まれる。いくつかの態様において、遺伝子マーカーには一塩基多型（ＳＮＰ）が含まれる。いくつかの態様において、遺伝子マーカーには挿入、欠失、融合または他の変異が含まれる。いくつかの態様において、遺伝子マーカーにはＤＮＡメチル化またはインプリンティング等のエピジェネティックマーカーが含まれる。
【００１５】
本発明の方法のいくつかの態様において、病態には、心臓障害、炎症性疾患、増殖性疾患、代謝異常、血管形成、アテローム性動脈硬化または糖尿病が含まれる。いくつかの態様において、心臓障害には、心筋梗塞、壊死、心筋機能障害、不安定狭心症、斑、心不全、冠動脈疾患またはリウマチ性心疾患が含まれる。いくつかの態様において、増殖性疾患には癌が含まれる。いくつかの態様において、癌には乳癌、前立腺癌またはリンパ腫が含まれる。
【００１６】
いくつかの態様において、本発明の方法は、被験体からの第１試料と第２試料との間でマーカーの濃度変化を測定することを更に含み、それにより、その変化は、病態を検出またはモニタリングするのに用いられる。いくつかの態様において、本発明の方法は、被験体からの第１試料と第２試料との間で、第１マーカーおよび第２マーカーの濃度比における変化を測定することを更に含み、それにより、その変化は、病態を検出またはモニタリングするのに用いられる。いくつかの態様において、被験体からの第１試料の採取と第２試料の採取との間に医療処置を行う。いくつかの態様において、医療処置には、外科的処置、ストレス試験または治療的介入が含まれる。いくつかの態様において、被験体からの一連の試料が、病態を検出またはモニタリングするのに用いられる。いくつかの態様において、一連の試料を時間と共に収集し、一連の試料における濃度変化を評価する。
【００１７】
いくつかの態様において、本発明によるモニタリングは、病気の進行、病気の再発、リスク評価、治療効果または外科的効果のモニタリングを含む。
【００１８】
一の態様において、本発明は、試料中の単一粒子を検出する方法を提供し、その方法は、（ａ）粒子が存在する場合、その粒子をラベルでラベリングすること；および（ｂ）ラベルの存在または不存在を検出することを含み、ラベルの存在の検出は試料中に単一粒子が存在することを意味し、単一粒子の検出限界は２０ｐｇ／ｍｌより小さく、単一粒子には、心筋トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ、ｐｒｏＢＮＰまたはＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）、ＴＲＥＭ−１、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、ロイコトリエンＥ４（ＬＴＥ４）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）、Ａｋｔ１、Ａβ−４０、Ａβ−４２、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の単一分子、フラグメントまたは複合体が含まれる。いくつかの態様において、単一粒子の検出限界は約１０ｐｇ／ｍｌ〜約０．０１ｐｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの態様において、単一粒子の検出限界は約１０ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、単一粒子の検出限界は約５ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、単一粒子の検出限界は約１ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、単一粒子の検出限界は約０．５ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、単一粒子の検出限界は約０．１ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、単一粒子の検出限界は約０．０５ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、単一粒子の検出限界は約０．０１ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、単一粒子の検出限界は約０．００５ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、単一粒子の検出限界は約０．００１ｐｇ／ｍｌより小さい。
【００１９】
一の態様において、本発明は、２つ又はそれより多くのバイオマーカーに対する２つ又はそれより多くの抗体を含有する組成物を含むキットを提供し、ここで、２つ又はそれより多くの抗体は蛍光色素部分に結合し、２つ又はそれより多くのバイオマーカーは上述の粒子を含み、当該部分は、当該部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、少なくとも約２００個の光子を放出することができ、レーザーは、当該部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下であり、組成物は、適切なパッケージングの中に包まれている。
【００２０】
一の態様において、本発明は、被験体における心血管の状態を検出またはモニタリングする方法を提供し、その方法は、２つまたはそれより多くのバイオマーカーを検出することを含み、バイオマーカーは心臓病理学的バイオマーカーまたは血管炎症バイオマーカーであり、少なくとも１つのマーカーの検出限界は約２０ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、少なくとも１つのマーカーの検出は、試料をマーカーに対するラベルに接触させること、およびラベルの存在または不存在を検出することを含み、ラベルの存在の検出は、対応するマーカーの存在を意味する。いくつかの態様において、ラベルは蛍光部分を含み、検出は、単一分子検出器にラベルを通すことを含み、単一分子検出器は以下のものを含む：ａ）蛍光部分を刺激するための電磁放射線源；ｂ）電磁波源から放射される電磁放射線を受け取るためのインタロゲーション・スペース；およびｃ）刺激された蛍光部分の電磁気学的特性を決定するための、インタロゲーション・スペースに操作可能に接続された電磁放射線検出器。いくつかの態様において、少なくとも１つのマーカーの検出限界は、約１０ｐｇ／ｍｌ〜約０．０１ｐｇ／ｍｌの範囲である。
【００２１】
いくつかの態様において、心臓病理学的バイオマーカーは心筋トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）またはＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ、ｐｒｏＢＮＰまたはＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）である。いくつかの態様において、血管炎症バイオマーカーは、インターロイキン６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）またはインターロイキン１７ａ（ＩＬ−１７ａ）である。いくつかの態様において、状態（または病態）は鬱血性心不全を含み、バイオマーカーはｃＴｎＩ、ＢＮＰ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１７ａを含む。
【００２２】
一の態様において、本発明は、被験体における心血管の状態を検出する方法を提供し、その方法は、生理学的バイオマーカーを測定すること、および被験体からの血液試料中の１つまたはそれより多くのバイオマーカーを検出することを含む。いくつかの態様において、生理学的バイオマーカーはストレス試験であり、１つまたはそれより多くのバイオマーカーはｃＴｎＩを含む。いくつかの態様において、生理学的バイオマーカーは睡眠試験であり、１つまたはそれより多くのバイオマーカーは１つまたはそれより多くのサイトカインを含む。１つまたはそれより多くのサイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１７ａおよび／またはｈｓＣＲＰを含み得る。いくつかの態様において、生理学的バイオマーカーは頸動脈内中膜厚（ＣＩＭＴ）であり、１つまたはそれより多くのバイオマーカーは１つまたはそれより多くの血管炎症マーカーを含む。１つまたはそれより多くの血管炎症マーカーは、ｈｓＣＲＰ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１を含み得る。
【００２３】
［引用による組み込み］
本明細書において言及する全ての出版物、特許および特許出願は、各個別の出版物、特許または特許出願が引用により組み込まれたと具体的かつ個別に示されたのと同程度に、引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００２４】
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲において詳細に明記される。本発明の原理が用いられている例示的態様を明記する以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって、本発明の特徴および利点のより良い理解が得られるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、単一粒子分析器の構成要素の配置の概略図を示す。図１Ａは１つの電磁波源および１つの電磁波検出器を有する分析器を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、２つの電磁波源および１つの電磁波検出器を有する分析器を示す。
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、単一粒子分析器のためのキャピラリーフローセルの概略図を示す。図２Ａは、１つの電磁波源を有する分析器のフローセルを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、２つの電磁波源を有する分析器のフローセルを示す。
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、単一粒子分析器のレーザーおよび検出器の光学機器構成の、常套的（Ａ）および共焦点（Ｂ）配置を示す概略図を示す。図３Ａは、１つの電磁波源および１つの電磁波検出器を有する分析器の配置を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、２つの電磁波源および２つの電磁波検出器を有する分析器の配置を示す。
【図４】図４は、複数のマーカー検出または状態のモニタリングのフローチャートを示す。
【図５】図５は、顧客のワークステーションがリモート・コンピュータからの分析結果を受け取るコンピュータシステムを示す。
【図６】図６は、ｃＴｎＩの濃度範囲に対する線形化された検量線を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、０．１〜０．２ｐｇ／ｍｌのＬｏＤにおける、１００μｌ試料および５０μｌ試料のｃＴｎＩ分析感度を示すグラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、検量線信号の下端を示すグラフである。
【図８】図８は、対応する１０％の変動係数（ＣＶ）によって９９パーセンタイルにおいて設定される、７ｐｇ／ｍｌのｃＴｎＩ濃度におけるｃＴｎＩに対する生物学的閾値（カットオフ濃度）を示す。
【図９】図９は、  本発明の分析器システムを用いて規定されるｃＴｎＩの分析結果の、米国標準技術局（ＮＩＳＴ）によって提供される標準測定との相関関係を示す（Ｒ２＝０．９９９９）。
【図１０】図１０は、緊急治療室において胸の痛みを示す患者からの一連の血清試料中のｃＴｎＩの検出を示す。本発明の分析器システムを用いて行われる測定を、市販のアッセイを用いて行われる測定と比較した。
【図１１】図１１は、ｃＴｎＩの正常な生物学的濃度、および胸の痛みを示している患者からの血清試料中のｃＴｎＩ濃度の分布を示す。
【図１２】図１２はＬＴＥ４に関する競合曲線を示す。ＬＯＤは１．５ｐｇ（ＬＴＥ４）／ｍｌであると決定された。
【図１３】図１３は、Ａｋｔ１濃度に関する検量線を示すグラフを図示する。ＬＯＤは２５ｐｇ（Ａｋｔ１）／ｍｌであると計算された。
【図１４】図１４は、ＴＧＦβ濃度に関する検量線を示すグラフを図示する。ＬＯＤは、３５０ｐｇ（ＴＧＦβ）／ｍｌであると計算された。
【図１５】図１５は、試料中の単一タンパク質分子、ならびに蛍光部分およびタンパク質分子に対する結合パートナーを含む少なくとも１つのラベルを検出するための分析器システムを有するキットの配置図を示し、分析器は、蛍光部分を刺激するための電磁放射線源；ラベルを通すためのキャピラリーフローセル；キャピラリーフローセルにおいてラベルを移動させるための駆動力源；電磁波源から放射される電磁放射線を受け取るための、キャピラリーフローセル内に規定されたインタロゲーション・スペース；および刺激された蛍光部分の電磁気学的特性を測定するための、インタロゲーション・スペースに操作可能に接続された電磁放射線検出器を含んでなり、蛍光部分は、当該部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、少なくとも約２００個の光子を放出することができ、レーザーは、当該部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である。
【図１６】図１６は、単一粒子分析器システムに対して開発されたサンドウィッチ分子免疫測定において測定されたＴＲＥＭ−１の検量線を示す。分析の線形範囲は１００〜１５００ｆＭである。
【図１７Ａ】図１７Ａ〜ＦはＩＬ−６およびＩＬ−８の検出を図示する。Ａ）市場で入手可能なキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）によって希釈されたＩＬ−６標準物質は、０．１〜１０ｐｇ／ｍｌの間で線形応答をもたらした。
【図１７Ｂ】Ｂ）１ｐｇ／ｍｌより低濃度のＩＬ−６検量線。
【図１７Ｃ】Ｃ）血液バンクドナーのＥＤＴＡ標本において同定されたＩＬ−６の分布。
【図１７Ｄ】Ｄ）血液バンクドナーのＥＤＴＡ標本において同定されたＩＬ−８の分布。
【図１７Ｅ】Ｅ）任意の被分析物の低濃度における検出範囲は、分析器の検出を、分子のカウント（デジタル信号）から、より高濃度の被分析物において発生する光子の総数（アナログ信号）の検出に切り替えることによって、より高濃度に拡張し得る。単一粒子分析器は、６ｌｏｇの拡張された線形ダイナミックレンジを有する。６−ｌｏｇの検出レンジは、デジタル検出からアナログ検出への切り替えに基づいている。
【図１７Ｆ】Ｆ）個別の粒子によって放出される光子をカウントする（デジタル信号）ことによって決定される、ＩＬ−６の低濃度範囲（０．１ｆｇ／ｍｌ〜１０ｆｇ／ｍｌ）、およびＩＬ−６の高濃度範囲（１０ｆｇ／ｍｌ〜１ｐｇ／ｍｌ）を示す非線形検量線。
【図１８】図１８は、本発明の分析の、常套的分析との比較を示す。
【図１９Ａ】図１９Ａは、ヒトＶＥＧＦ分析の性能を示すグラフである。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、最も低い濃度における分析性能のグラフである。
【図２０Ａ】図２０Ａは、マウスＶＥＧＦ分析の性能を示すグラフである。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、最も低い濃度における分析性能のグラフである。
【図２１】図２１は、本発明のＶＥＧＦ分析と、ヒト血漿のＥＬＩＳＡ分析とを比較するグラフである。
【図２２Ａ】図２２Ａは、細胞溶解物において検出されるＶＥＧＦのレベルと、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１胸腺癌細胞を用いた培地とを比較するグラフである。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、細胞溶解物において検出されるＶＥＧＦのレベルと、ＨＴ−２９結腸腺癌細胞を用いた培地とを比較するグラフである。
【図２３】図２３は、本発明のＶＥＧＦ分析と、マウス血漿試料に対するＥＬＩＳＡ分析との比較である。
【図２４Ａ】図２４Ａは、細胞溶解物、およびＢ１６黒色腫マウス細胞株を用いた培地において検出されたマウスＶＥＧＦの濃度を示すグラフである。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、細胞溶解物、および４Ｔ１乳癌を用いた培地において検出されたマウスＶＥＧＦの濃度を示すグラフである。
【図２４Ｃ】図２４Ｃは、細胞溶解物、およびＣＴ２６結腸癌細胞株を用いた培地において検出されたマウスＶＥＧＦの濃度を示すグラフである。
【図２５Ａ】図２５Ａは、ＶＥＧＦの高感度検出を示すグラフを図示する。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、下端における検量線信号を示す。
【図２６】図２６は、３つの異なる免疫測定フォーマット：１）磁性微粒子をベースとする単一分子カウント（ＭＰ−ＳＭＣ）；２）３８４−ウェルプレートをベースとする単一分子カウント（Ｐｌａｔｅ−ＳＭＣ）；および３）西洋ワサビペルオキシダーゼをベースとする酵素免疫吸着法（ＨＲＰ−ＥＬＩＳＡ）を用いたヒトＶＥＧＦ検出の、予測されたレベルに対する測定されたレベルを示す。
【図２７Ａ】図２７Ａは、健康な患者および乳癌患者の血漿試料１０μｌにおいて検出されたヒトＶＥＧＦのレベルを示す。標準的なＥＬＩＳＡフォーマット（ＬＯＤ＝３１．２ｐｇ／ｍｌ）に対する、本発明の方法（Ｅｒｒｅｎａ；ＬＯＤ＝３．５ｐｇ／ｍｌ）を用いた検出限界（ＬＯＤ）を示す。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、１０μｌ溶解物試料における同様のデータを示す。
【図２８】図２８Ａ〜Ｃは、ＶＥＧＦのアナログおよびデジタル測定を組み合わせたものを示す。
【図２９Ａ】図２９Ａは、Ａβ−４０分析の選択性（または特異性）および線形性を示すグラフである。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、Ａβ−４２分析の選択性および線形性を示すグラフである。
【図３０Ａ】図３０Ａは、ＩＬ−１αに関する分析のカーブフィッティングを示すグラフである。
【図３０Ｂ】図３０Ｂは、ＩＬ−１α分析の検量線信号の下端を示すグラフである。
【図３１Ａ】図３１Ａは、ＩＬ−１β分析のカーブフィッティングを示すグラフである。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、ＩＬ−１βカーブ信号の下端検量線を示す。
【図３２Ａ】図３２Ａは、ＩＬ−４分析のカーブフィッティングを示すグラフである。
【図３２Ｂ】図３２Ｂは、下端におけるＩＬ−４分析の検量線信号である。
【図３３Ａ】図３３Ａは、ＩＬ−６分析のカーブフィッティングを示すグラフである。
【図３３Ｂ】図３３Ｂは、下端におけるＩＬ−６分析の検量線信号である。
【図３４】図３４は、年齢および性別が適合した健康な対照被験体と比較した、鬱血性心不全（ＣＨＦ）の被験体に対する循環器系疾患（ＣＶＤ）パネルの診断特異性を示す。
【図３５】図３５は、鬱血性心不全（ＣＨＦ）の被験体における循環器系疾患（ＣＶＤ）パネルに関するバイオマーカーの増加数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
［概要］
Ｉ．緒言
ＩＩ．本発明の方法および組成物による高感度検出に関する分子
Ａ．総則
Ｂ．マーカー
ＩＩＩ．ラベル
Ａ．結合パートナー
１．抗体
Ｂ．蛍光部分
１．色素
２．量子ドット
Ｃ．結合パートナー−蛍光部分組成物
ＩＶ．分子の高感度分析
Ａ．試料
Ｂ．試料調製
Ｃ．件の分子の検出および濃度の測定
Ｖ．分子の高感度分析に適した機器およびシステム
Ａ．装置／システム
Ｂ．単一粒子分析器
１．電磁放射線源
２．キャピラリーフローセル
３．駆動力
４．検出器
Ｃ．サンプリングシステム
Ｄ．試料調製システム
Ｅ．試料の回収
ＶＩ．分子の高感度分析を用いる方法
Ａ．方法
Ｂ．例示的マーカー
１．心臓障害
２．感染症
３．サイトカイン
ａ．インターロイキン１
ｂ．インターロイキン４
ｃ．インターロイキン６
４．炎症マーカー
ａ．ロイコトリエンＥ４
ｂ．ＴＧＦβ
５．Ａｋｔ１
６．Ｆａｓリガンド
７．ＶＥＧＦ
８．アミロイドベータタンパク質
Ｃ．多重マーカーパネル
１．多重バイオマーカーパネル
２．混合マーカーパネル
Ｄ．検出およびモニタリング
Ｅ．心血管バイオマーカーパネル
Ｆ．臨床的方法
ＶＩＩ．キット
ＶＩＩＩ．実施例
【００２７】
［Ｉ．緒言］
本発明は、単一分子の高感度検出のための、および試料中の分子濃度の測定のための機器、キット、組成物および方法を提供する。いくつかの態様において、本発明の機器、組成物、方法およびキットの感度および精度は、以下のものから選択される要素の組み合わせによって達成され得るが、これらの要素に限定されない。適切な波長および出力を有する電磁波源、適切なインタロゲーション・スペース寸法、高開口数のレンズ、単一光子を検出できる検出器、ならびに単一分子をカウントするためのデータ分析システム。本発明の機器は、「単一分子検出器」または「単一粒子検出器」と呼ばれ、用語「単一分子分析器」および「単一粒子分析器」によっても包含される。いくつかの態様において、本発明のキットおよび方法の感度および精度は、本発明の機器を、以下のものから選択される要素の組み合わせと一緒に用いることによって達成されるが、これらの要素に限定されない。単一分子のレベルでの分子の検出を可能にする特性を示す、分子に対するラベル、および本明細書に記載の機器においてラベルを分析する方法。
【００２８】
本発明の機器、キットおよび方法は、単一分子または少数の分子の高感度かつ高精度の検出において、および試料中の分子濃度の決定に関して特に有用である。
【００２９】
いくつかの態様において、本発明は、単一分子の検出による分子濃度の高感度検出および測定のための機器およびキット、そのような検出および測定のためのラベル、ならびにそのような機器およびラベルを試料分析において用いる方法を提供する。特に、本発明の機器、キットおよび方法の感度および精度により、極めて低い濃度、例えば、約１００、１０、１、０．１、０．０１または０．００１フェムトモル濃度より低い濃度における、分子（例えば生物学的状態に関するマーカー）の濃度の検出および測定が可能となる。更なる態様において、本発明の機器およびキットは、試料の希釈または他の処理を必要とすることなく広いダイナミックレンジの濃度にわたって、例えば１０５倍、１０６倍または１０７倍より大きい濃度範囲にわたって、試料中の種の濃度、例えば分子の濃度を測定することができる。
【００３０】
本発明の機器、キットおよび方法の高感度により、検出感度が不足しているので従来は有用でなかったマーカー、例えば生物学的マーカーの使用が可能となる。本発明の機器、キットおよび方法の高感度は、新規のマーカーの確立も容易にし得る。生物学的状態を決定するのに有用であり得るが、マーカーの低濃度範囲の測定における現在の限界により、現在のところ実用的でない、現在入手可能な多数のマーカーが存在する。いくつかの場合において、異常に高レベルのマーカーは現在の方法によって検出可能であるが、正常範囲は知られていない。いくつかの場合において、異常に高いレベルのマーカーは現在の方法によって検出可能であるが、正常範囲は確立されていなかった。いくつかの場合において、マーカーの上方正常範囲は検出可能であるが、下方正常範囲または正常範囲より下のレベルは検出不可能である。いくつかの場合、例えば癌または感染症のマーカーにおいて、いずれのレベルのマーカーも、生物学的状態の存在を示し得、増大した検出感度は早期診断に対する利点である。いくつかの場合において、複数の時点にわたるマーカー濃度における変化速度（または変化率）または変化の欠如は、最も有用な情報を提供するが、現在の分析方法は、通常は最も処置し易い病態の初期段階におけるタイムポイントサンプリングを許容しない。いくつかの場合において、複雑な試料処理および時間を要する分析を必要とする方法のように、臨床状況において実用的または有用でない煩雑な方法によってのみ、マーカーは臨床的に有用なレベルで検出され得る。更に、現在の方法によって存在を検出することが依然として極めて困難または不可能であるほど低濃度の、生物学的状態の潜在的マーカーが存在する。
【００３１】
本発明の分析方法および組成物は、生物学的状態に関するマーカーの、従来はマーカーを検出できなかった濃度での検出を可能にする、従って、確認マーカーまたは限られた研究状況でのみ有用なマーカーから、診断マーカー、予後診断マーカー、治療向けマーカー、または臨床状況および／もしくは臨床試験を含む大規模臨床状況において有用な他の種類のマーカーへと、そのようなマーカーの「再目的化」を可能にするレベルの感度、精度およびロバスト性を提供する。そのような方法により、そのようなマーカーに対する正常および異常範囲の決定が可能となる。
【００３２】
そのように再目的化されたマーカーは、例えば、正常状態（正常範囲）の検出、（例えば、薬の投与等の処置に対する）レスポンダー（または応答者）／ノンレスポンダー（または非応答者）の検出；早期疾患または病理学的発現の検出（例えば、癌の早期検出、心虚血の早期検出）；病期分類（例えば癌）；疾患のモニタリング（例えば、糖尿病のモニタリング、治療後の癌の再発に関するモニタリング）；疾患のメカニズムの研究；および薬物治療の毒性等の治療毒性の研究に用いられ得る。
【００３３】
従って、本発明は、マーカーの高感度検出のための方法および組成物、ならびにマーカーの正常および異常レベルに関する値を確立する更なる方法を提供する。更なる態様において、本発明は、マーカーに対して確立された値に基づく、診断、予後診断および／または治療の選択の方法を提供する。本発明は、そのような方法において用いるための組成物、例えば、マーカーの超高感度検出のための検出試薬も提供する。
【００３４】
［ＩＩ．本発明の方法および組成物による高感度検出に関する分子］
本発明の機器、キットおよび方法は、複数の異なる種類の単一分子の濃度の高感度検出および決定に使用可能である。特に、機器、キットおよび方法は、生物学的状態のマーカー濃度の高感度検出および決定において有用である。「単一分子の検出」は、本明細書においてその用語を用いる場合、直接的検出および間接的検出の両方を指す。例えば、単一分子を蛍光ラベルでラベリングしてよく、分子−ラベル複合体を本明細書に記載の機器において検出してよい。別法として、単一分子を蛍光ラベルでラベリングしてよく、その後、蛍光ラベルを単一分子から分離し、ラベルを本明細書に記載の機器において検出する。用語「単一分子の検出」は、両方の検出形態を包含する。
【００３５】
［Ａ．総則］
本発明の分析器および関連する方法を用いて検出され得る分子の例として以下のものが挙げられる：タンパク質、核酸、炭水化物等の生体高分子および有機および無機の小分子。本明細書に記載の機器、キットおよび方法は特に、生物学的試料中のタンパク質および小分子の単一分子の検出、ならびに試料中のそのような分子の濃度の決定において有用である。
【００３６】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、本明細書において互いに置き換え得るように用いられ、それらの用語には、ペプチド結合によって結合した２つ又はそれより多くのアミノ酸を含む任意の組成物が含まれる。ポリペプチドには、２０種の天然に存在するアミノ酸と一般に呼ばれる２０種のアミノ酸以外のアミノ酸が含まれ得ることが理解され得る。また、ポリペプチドには、末端アミノ酸を含む１つまたはそれより多くのアミノ酸が含まれ得、これらは、当該技術分野において公知の方法によって（自然に、あるいは人工的に）修飾される。ポリペプチド修飾の例として、例えばグリコシル化による修飾、または他の翻訳後修飾が挙げられる。本発明のポリペプチドにおいて存在してよい修飾には以下のものが含まれるがこれらに限定されない。アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、糖化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、水酸化、ヨウ素（またはヨード）化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化等のタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ仲介付加およびユビキチン化。
【００３７】
本発明の機器、キットおよび方法によって検出された分子は遊離していてよく、または複合体の一部、例えば抗体−抗原複合体、もしくはより一般的にはタンパク質−タンパク質複合体、例えばトロポニンもしくは前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の複合体の一部であってよい。タンパク質に言及する場合、本発明は断片（またはフラグメント）、ポリペプチド、突然変異体、変異型またはそれらの複合体を検出し得ることを、当業者は理解するであろう。
【００３８】
［Ｂ．生物学的状態のマーカー］
いくつかの態様において、本発明は、生物学的マーカーの高感度検出、ならびに診断、予後診断および／または治療方法の決定におけるそのようなマーカーの使用のための組成物および方法を提供する。
【００３９】
本発明のマーカーは、例えば、生物の生物学的状態（例えば、病気の状態または病気でない状態等の病態）に関連する組成物および／もしくは分子、または組成物および／もしくは分子の複合体のいずれかであってよい。マーカーは、例えば、小分子、ポリペプチド、ＤＮＡおよびＲＮＡ等の核酸、リン脂質またはミセル等の脂質、ミトコンドリアまたは葉緑体等の細胞成分等であり得る。本発明で意図されるマーカーは、既に公知であり得、または未知であり得る。例えば、いくつかの態様において、本発明の方法は、件の生物学的状態または件の状態に関するマーカーとして使用可能である新規のポリペプチドを同定してよく、一方、他の態様において、既知のポリペプチドが、件の生物学的状態または状態に関するマーカーとして同定される。本発明のシステムを用いると、それらのマーカー、例えば生物の生物学的状態の決定に用いられる高い可能性を有するが低濃度でのみ存在するポリペプチド（病変組織から「漏れた」ポリペプチド等）を観測し得ることが可能である。有用性に関して高い可能性を有する他のマーカーまたはポリペプチドは、疾患に関連するマーカーまたはポリペプチド、例えば、腫瘍−宿主環境において発生するマーカーまたはポリペプチドであってよい。生物学的状態に関する情報を提供するいずれの適切なマーカーも、本発明の方法および組成物において使用してよい。「マーカー」には、本明細書においてその用語を用いる場合、生物からの試料において検出してよい分子であって、それらの検出または定量が生物の生物学的状態に関する情報を提供するいずれの分子も含まれる。
【００４０】
生物学的状態には以下のものが含まれるが、それらに限定されない。表現型の状態；生物に影響を及ぼす状態；進行状態；年齢；健康状態；病理；疾患の検出、治療もしくは病期分類；感染；毒性；または化学的要因、環境因子もしくは薬物因子（薬物反応の表現型検査、薬物毒性の表現型検査、または薬物の有効性の表現型検査等）に対する応答。
【００４１】
用語「生物」は、本明細書において用いる場合、少なくとも１つの細胞からなる生物を指す。生物は、単細胞生物と同じくらい単純であり得、または哺乳類と同じくらい複雑であり得る。本発明の生物は、好ましくは哺乳類である。そのような哺乳類は、例えばヒト、または霊長類（例えば、サル、チンパンジー等）、飼い慣らされた動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ等）、家畜（例えば、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ等）もしくは実験動物（例えば、マウス、ラット等）等の動物であり得る。好ましくは、生物はヒトである。
【００４２】
いくつかの態様において、本発明の方法および組成物は、複数の種類のマーカー、例えばサイトカイン、成長因子、腫瘍マーカー、炎症マーカー、内分泌マーカー、自己免疫マーカー、甲状腺マーカー、心血管マーカー、糖尿病マーカー、感染症マーカー、神経マーカー、呼吸器マーカー、消化管マーカー、筋骨格マーカー、皮膚疾患および代謝マーカーを対象としている。
【００４３】
表１は、本発明の方法および組成物によって測定された、これらの種類のマーカーの例を提示し、本発明の方法および組成物によって検出されたマーカーの例示的濃度、および本発明の単一粒子分析器システムによって特定のマーカーに関してカウントされる粒子の数を提示する。
【００４４】
【表１】
0005678045.tif 000002
【００４５】
【表２】
0005678045.tif 000003
【００４６】
【表３】
0005678045.tif 000004
【００４７】
［１．サイトカイン］
研究および診断の両方に対して、サイトカインは、多数の状態、疾患、病理等のマーカーとして有用であり、本発明の組成物および方法は、サイトカインを検出および定量するためのラベル、ならびにサイトカインの正常レベルおよび異常レベルを決定するためにそのようなラベルを用いる方法、ならびにそのようなレベルに基づく診断、予後診断および／または治療の決定の方法を含む。
【００４８】
現在のところ、同調調節または非調和（ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ）調節が臨床的に興味深い１００種類を超えるサイトカイン／ケモカインが存在する。特定の疾患過程をサイトカインのレベルにおける変化と関連付けるために、理想的なアプローチは、試料を、所定の１つのサイトカインまたは複数のサイトカインに関して高い感度で分析することを必要とする。現在マーカーパネルにおいて使用されており、かつ本発明の方法および組成物において使用してよい例示的サイトカインには以下のものが含まれるが、これらに限定されない。ＢＤＮＦ、ＣＲＥＢ  ｐＳ１３３、ＣＲＥＢ  Ｔｏｔａｌ、ＤＲ−５、ＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、エオタキシン、脂肪酸結合タンパク質、塩基性ＦＧＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＧＣＰ−２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子ＧＭ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、成長関連癌遺伝子−ケラチノサイト（ＧＲＯ−ＫＣ）、ＨＧＦ、ＩＣＡＭ−１、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、インターロイキンＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２  ｐ４０、ＩＬ−１２  ｐ４０／ｐ７０、ＩＬ−１２  ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１Ｆ３、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、インターフェロン誘導タンパク質（１０  ＩＰ−１０）、ＪＥ／ＭＣＰ−１、ケラチノサイト（ＫＣ）、ＫＣ／ＧＲＯａ、ＬＩＦ、リンホタクチン、Ｍ−ＣＳＦ、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−５、ＭＤＣ、ＭＩＧ、炎症性マクロファージ（ＭＩＰ−１α）、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１γ、ＭＩＰ−２、ＭＩＰ−３β、ＯＳＭ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、Ｒｂ（ｐＴ８２１）、Ｒｂ（ｔｏｔａｌ）、Ｒｂ  ｐＳｐＴ２４９／２５２、Ｔａｕ（ｐＳ２１４）、Ｔａｕ（ｐＳ３９６）、Ｔａｕ（ｔｏｔａｌ）、組織因子、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＶＣＡＭ−１ならびにＶＥＧＦ。いくつかの態様において、サイトカインはＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１０、ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−１２  ｐ４０、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−１８、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、エオタキシン、ＩＬ−１６、ＭＩＧ、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１３、ＩＬ−２Ｒ（可溶性）、ＩＬ−２、ＬＩＦ／ＨＩＬＤＡ、ＩＬ−１β、Ｆａｓ／ＣＤ９５／Ａｐｏ−１またはＭＣＰ−１である。
【００４９】
［２．成長因子］
成長因子には以下のものが含まれる。アンフィレグリン、ＬＲＩＧ３、ベータセルリン、ニューレグリン−１／ＮＲＧ１、ＥＧＦ、ニューレグリン−３／ＮＲＧ３、エピゲン、ＴＧＦ−α、エピレグリン、ＴＭＥＦＦ１／トモレグリン−１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＭＥＦＦ２、ＬＲＩＧ１等のＥＧＦリガンド；ＥＧＦ  Ｒ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ４等のＥＧＦ  Ｒ／ＥｒｂＢ受容体ファミリー；ＦＧＦリガンドである酸性ＦＧＦ、ＦＧＦ−１２、塩基性ＦＧＦ、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−２２、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−２３、ＦＧＦ−１１、ＫＧＦ／ＦＧＦ−７、ＦＧＦ受容体であるＦＧＦ  Ｒ１−４、ＦＧＦ  Ｒ３、ＦＧＦ  Ｒ１、ＦＧＦ  Ｒ４、ＦＧＦ  Ｒ２、ＦＧＦ  Ｒ５、ＦＧＦ調節因子であるＦＧＦ−ＢＰ等のＦＧＦファミリー；ヘッジホッグファミリーであるデザートヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグ、インディアンヘッジホッグ；ヘッジホッグ関連分子および調節因子であるＢＯＣ、ＧＬＩ−３、ＣＤＯ、ＧＳＫ−３α／β、ＤＩＳＰ１、ＧＳＫ−３α、Ｇａｓ１、ＧＳＫ−３β、ＧＬＩ−１、Ｈｉｐ、ＧＬＩ−２；ＩＧＦファミリーであるＩＧＦリガンドのＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体（ＣＤ２２１）ＩＧＦ−Ｉ  Ｒ、およびＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）ファミリーであるＡＬＳ、ＩＧＦＢＰ−５、ＣＴＧＦ／ＣＣＮ２、ＩＧＦＢＰ−６、Ｃｙｒ６１／ＣＣＮ１、ＩＧＦＢＰ−Ｌ１、エンドカン、ＩＧＦＢＰ−ｒｐ１／ＩＧＦＢＰ−７、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−ｒＰ１０、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＯＶ／ＣＣＮ３、ＩＧＦＢＰ−３、ＷＩＳＰ−１／ＣＣＮ４、ＩＧＦＢＰ−４；受容体型チロシンキナーゼであるＡｘｌ、ＦＧＦ  Ｒ４、Ｃ１ｑ  Ｒ１／ＣＤ９３、ＦＧＦ  Ｒ５、ＤＤＲ１、Ｆｌｔ−３、ＤＤＲ２、ＨＧＦ  Ｒ、Ｄｔｋ、ＩＧＦ−Ｉ  Ｒ、ＥＧＦ、Ｒ  ＩＧＦ−ＩＩ  Ｒ、Ｅｐｈ、ＩＮＳＲＲ、ＥｐｈＡ１、インスリンＲ／ＣＤ２２０、ＥｐｈＡ２、Ｍ−ＣＳＦ  Ｒ、ＥｐｈＡ３、Ｍｅｒ、ＥｐｈＡ４、ＭＳＰ  Ｒ／Ｒｏｎ、ＥｐｈＡ５、ＭｕＳＫ、ＥｐｈＡ６、ＰＤＧＦ  Ｒα、ＥｐｈＡ７、ＰＤＧＦ  Ｒβ、ＥｐｈＡ８、Ｒｅｔ、ＥｐｈＢ１、ＲＴＫ様オーファン受容体１／ＲＯＲ１、ＥｐｈＢ２、ＲＴＫ様オーファン受容体２／ＲＯＲ２、ＥｐｈＢ３、ＳＣＦ  Ｒ／ｃ−ｋｉｔ、ＥｐｈＢ４、Ｔｉｅ−１、ＥｐｈＢ６、Ｔｉｅ−２、ＥｒｂＢ２、ＴｒｋＡ、ＥｒｂＢ３、ＴｒｋＢ、ＥｒｂＢ４、ＴｒｋＣ、ＦＧＦ、Ｒ１−４  ＶＥＧＦ  Ｒ、ＦＧＦ  Ｒ１、ＶＥＧＦ  Ｒ１／Ｆｌｔ−１、ＦＧＦ  Ｒ２、ＶＥＧＦ  Ｒ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、ＦＧＦ  Ｒ３、ＶＥＧＦ  Ｒ３／Ｆｌｔ−４；プロテオグリカンおよびプロテオグリカン調節因子であるアグリカン、ミメカン、アグリン、ＮＧ２／ＭＣＳＰ、バイグリカン、オステオアドヘリン（Ｏｓｔｅｏａｄｈｅｒｉｎ）、デコリン、ポドカン、ＤＳＰＧ３、δ−サルコグリカン、エンドカン、シンデカン−１／ＣＤ１３８、エンドグリカン、シンデカン−２、エンドレペリン／パールカン、シンデカン−３、グリピカン２、シンデカン−４、グリピカン３、テスチカン（Ｔｅ���ｔｉｃａｎ）１／ＳＰＯＣＫ１、グリピカン５、テスチカン２／ＳＰＯＣＫ２、グリピカン６、テスチカン３／ＳＰＯＣＫ３、ルミカン、バーシカン、プロテオグリカン調節因子、アリールスルファターゼＡ／ＡＲＳＡ、グルコサミン（Ｎ−アセチル）−６−スルファターゼ／ＧＮＳ、エキソストシン−ライク２／ＥＸＴＬ２、ＨＳ６ＳＴ２、エキソストシン−ライク３／ＥＸＴＬ３、イズロン酸２−スルファターゼ／ＩＤＳ、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ；ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３リガンドおよびＭ−ＣＳＦ  Ｆｌｔ−３、Ｍ−ＣＳＦ  Ｒ、Ｆｌｔ−３リガンド、ＳＣＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ  Ｒ／ｃ−ｋｉｔ；ＴＧＦ−βスーパーファミリー（炎症マーカーに関して列挙されるものと同様）；ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーであるニューロピリン−１、ＰｌＧＦ、ニューロピリン−２、ＰｌＧＦ−２、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ  Ｒα、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ  Ｒβ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＶＥＧＦ  Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ  Ｒ１／Ｆｌｔ−１、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ  Ｒ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ  Ｒ３／Ｆｌｔ−４；Ｗｎｔ関連分子、ディックコップ（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ）タンパク質およびＷｎｔ阻害因子であるＤｋｋ−１、Ｄｋｋ−４、Ｄｋｋ−２、Ｓｏｇｇｙ−１、Ｄｋｋ−３、ＷＩＦ−１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄおよび関連タンパク質であるＦｒｉｚｚｌｅｄ−１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−２、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−９、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−３、ｓＦＲＰ−１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−４、ｓＦＲＰ−２、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−５、ｓＦＲＰ−３、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−６、ｓＦＲＰ−４、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−７、ＭＦＲＰ；ＷｎｔリガンドであるＷｎｔ−１、Ｗｎｔ−８ａ、Ｗｎｔ−２ｂ、Ｗｎｔ−８ｂ、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−９ａ、Ｗｎｔ−４、Ｗｎｔ−９ｂ、Ｗｎｔ−５ａ、Ｗｎｔ−１０ａ、Ｗｎｔ−５ｂ、Ｗｎｔ−１０ｂ、Ｗｎｔ−７ａ、Ｗｎｔ−１１、Ｗｎｔ−７ｂ；他のＷｎｔ関連分子であるＡＰＣ、クレメン−２、アキシン−１、ＬＲＰ−１、β−カテニン、ＬＲＰ−６、ディシブルド（Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ）−１、ノリン（Ｎｏｒｒｉｎ）、ディシブルド−３、ＰＫＣβ１、グリピカン３、ピゴパス（Ｐｙｇｏｐｕｓ）−１、グリピカン５、ピゴパス−２、ＧＳＫ−３α／β、Ｒ−スポンジン（Ｓｐｏｎｄｉｎ）１、ＧＳＫ−３α、Ｒ−スポンジン２、ＧＳＫ−３β、Ｒ−スポンジン３、ＩＣＡＴ、ＲＴＫ様オーファン受容体１／ＲＯＲ１、クレメン−１、ＲＴＫ様オーファン受容体２／ＲＯＲ、および他の成長因子であるＣＴＧＦ／ＣＣＮ２、β−ＮＧＦ、Ｃｙｒ６１／ＣＣＮ１、ノリン、ＤＡＮＣＥ、ＮＯＶ／ＣＣＮ３、ＥＧ−ＶＥＧＦ／ＰＫ１、オステオクリン、ヘパソシン、ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＨＧＦ、プログラヌリン、ＬＥＣＴ２、トロンボポエチン、ＬＥＤＧＦ、ＷＩＳＰ−１／ＣＣＮ４。
【００５０】
［３．炎症マーカー］
炎症マーカーにはＩＣＡＭ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−２、ＭＩＰ−１−β、ＭＩＰ−１−αおよびＭＭＰ−３が含まれる。更なる炎症マーカーには、インテグリンであるα１β１、α２β１、α３β１、α４β１、α５β１、α６β１、α７β１、α８β１、α９β１、αＶβ１、α４β７、α６β４、αＤβ２、αＬβ２、αＭβ２、αＶβ３、αＶβ５、αＶβ６、αＶβ８、αＸβ２、αＩＩｂβ３、αＩＥＬｂβ７、β−２インテグリン、β−３インテグリン、β−２インテグリン、β−４インテグリン、β−５インテグリン、β−６インテグリン、β−７インテグリン、β−８インテグリン、α−１インテグリン、α−２インテグリン、α−３インテグリン、α−４インテグリン、α−５インテグリン、α−６インテグリン、α−７インテグリン、α−８インテグリン、α−９インテグリン、α−Ｄインテグリン、α−Ｌインテグリン、α−Ｍインテグリン、α−Ｖインテグリン、α−Ｘインテグリン、α−ＩＩｂインテグリン、αＩＥＬｂインテグリン等の接着分子；βＩＧ−Ｈ３、メルシン（Ｍｅｌｕｓｉｎ）、ＣＤ４７、ＭＥＰＥ、ＣＤ１５１、オステオポンチン、ＩＢＳＰ／シアロタンパク質ＩＩ、ＲＡＧＥ、ＩＧＳＦ８等のインテグリン関連分子；Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン等のセレクチン；ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＰＳＧＬ−１、ビトロネクチック、ビトロネクチン受容体、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３、ＢＬ−ＣＡＭ、ＬＦＡ−２、ＶＣＡＭ−１、ＮＣＡＭ、ＰＥＣＡＭ等のリガンドが含まれる。更なる炎症マーカーには、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、−κ、−τ、−ζ、ＩＦＮ−ω、ＩＦＮ−γ、ＩＬ２９、ＩＬ２８ＡおよびＩＬ２８Ｂ、ＩＬ−１、ＩＬ−１αおよびβ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＴＣＣＲ／ＷＳＸ−１等のサイトカインが含まれる。更なる炎症マーカーには、共通β鎖、ＩＬ−３Ｒα、ＩＬ−３Ｒβ、ＧＭ−ＣＳＦ  Ｒ、ＩＬ−５Ｒα、共通γ鎖／ＩＬ−２Ｒγ、ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−９Ｒ、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−２１Ｒ、ＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−７Ｒα／ＣＤ１２７、ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１Ｆ３、ＩＬ−１Ｒ８、ＩＬ−１ＲＩ、ＩＬ−１Ｒ９、ＩＬ−１ＲＩＩ、ＩＬ−１８Ｒα／ＩＬ−１Ｒ５、ＩＬ−１Ｒ３／ＩＬ−１Ｒ  ＡｃＰ、ＩＬ−１８Ｒβ／ＩＬ−１Ｒ７、ＩＬ−１Ｒ４／ＳＴ２  ＳＩＧＩＲＲ、ＩＬ−１Ｒ６／ＩＬ−１Ｒ  ｒｐ２、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−３１ＲＡ、ＣＮＴＦ  Ｒα、レプチンＲ、Ｇ−ＣＳＦ  Ｒ、ＬＩＦ  Ｒα、ＩＬ−６Ｒ、ＯＳＭ  Ｒβ、ＩＦＮ−α／βＲ１、ＩＦＮ−α／βＲ２、ＩＦＮ−γＲ１、ＩＦＮ−γＲ２、ＩＬ−１０Ｒα、ＩＬ−１０Ｒβ、ＩＬ−２０Ｒα、ＩＬ−２０Ｒβ、ＩＬ−２２Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１７ＲＤ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−１７Ｂ  Ｒ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−１２Ｒβ１、ＩＬ−１２Ｒβ２��ＴＣＣＲ／ＷＳＸ−１、ＩＬ−１３Ｒα１等のサイトカイン受容体が含まれる。更なる炎症マーカーには、ＣＣＬ−１、ＣＣＬ−２、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４、ＣＣＬ−５、ＣＣＬ−６、ＣＣＬ−７、ＣＣＬ−８、ＣＣＬ−９、ＣＣＬ−１０、ＣＣＬ−１１、ＣＣＬ−１２、ＣＣＬ−１３、ＣＣＬ−１４、ＣＣＬ−１５、ＣＣＬ−１６、ＣＣＬ−１７、ＣＣＬ−１８、ＣＣＬ−１９、ＣＣＬ−２０、ＣＣＬ−２１、ＣＣＬ−２２、ＣＣＬ−２３、ＣＣＬ−２４、ＣＣＬ−２５、ＣＣＬ−２６、ＣＣＬ−２７、ＣＣＬ−２８、ＭＣＫ−２、ＭＩＰ−２、ＣＩＮＣ−１、ＣＩＮＣ−２、ＫＣ、ＣＩＮＣ−３、ＬＩＸ、ＧＲＯ、胸腺ケモカイン−１、ＣＸＣＬ−１、ＣＸＣＬ−２、ＣＸＣＬ−３、ＣＸＣＬ−４、ＣＸＣＬ−５、ＣＸＣＬ−６、ＣＸＣＬ−７、ＣＸＣＬ−８、ＣＸＣＬ−９、ＣＸＣＬ−１０、ＣＸＣＬ−１１、ＣＸＣＬ−１２、ＣＸＣＬ−１３、ＣＸＣＬ−１４、ＣＸＣＬ−１５、ＣＸＣＬ−１６、ＣＸＣＬ−１７、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ケメリン（Ｃｈｅｍｅｒｉｎ）等のケモカインが含まれる。更なる炎症マーカーには、ＣＣＲ−１、ＣＣＲ−２、ＣＣＲ−３、ＣＣＲ−４、ＣＣＲ−５、ＣＣＲ−６、ＣＣＲ−７、ＣＣＲ−８、ＣＣＲ−９、ＣＣＲ−１０、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ２、Ｃｈｅｍ  Ｒ２３等のケモカイン受容体が含まれる。更なる炎症マーカーには、ＴＮＦ−α、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３、リンホトキシン、ＢＡＦＦ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、リンホトキシンβ／ＴＮＦＳＦ３、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ１Ａ、ＥＤＡ、ＴＮＦ−β／ＴＮＦＳＦ１Ｂ、ＥＤＡ−Ａ２、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦ１０、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２等の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が含まれる。更なる炎症マーカーには、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９、ＮＧＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１６、ＢＡＦＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、オステオプロテジェリン／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＤｃＲ３／ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦ  ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＤｃＴＲＡＩＬ  Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ２３、ＴＮＦ  ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＤｃＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ２２、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＤＲ６／ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＲＡＩＬ  Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＥＤＡＲ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６、ＴＲＯＹ／ＴＮＦＲＳＦ１９、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＷＥＡＫ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１２、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＸＥＤＡＲ等のＴＮＦスーパーファミリ���受容体が含まれる。更なる炎症マーカーには、ＦＡＤＤ、ＴＲＡＦ−２、ＲＩＰ１、ＴＲＡＦ−３、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ−４、ＴＲＡＦ−１、ＴＲＡＦ−６等のＴＮＦスーパーファミリー修飾因子が含まれる。更なる炎症マーカーには急性期反応物質および急性期タンパク質が含まれる。更なる炎症マーカーには、アクチビン、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−３ｂ／ＧＤＦ−１０、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−１５／ＧＤＦ−９Ｂ、ＢＭＰ−６、デカペンタプレジック、成長／分化因子（ＧＤＦ）、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−９  ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−１５、ＧＤＦ−７、ＧＤＮＦファミリーリガンド、アルテミン、ニュールツリン、ＧＤＮＦ、ペルセフィン（Ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β５、ＬＡＰ（ＴＧＦ−β１）、潜在型ＴＧＦ−β  ｂｐ１、潜在型ＴＧＦ−β１、潜在型ＴＧＦ−β  ｂｐ２、ＴＧＦ−β１．２、潜在型ＴＧＦ−β  ｂｐ４、ＴＧＦ−β２、レフティ（Ｌｅｆｔｙ）、ＭＩＳ／ＡＭＨ、レフティ−１、ノーダル（Ｎｏｄａｌ）、レフティ−Ａ、アクチビンＲＩＡ／ＡＬＫ−２、ＧＦＲα−１／ＧＤＮＦ  Ｒα−１、アクチビンＲＩＢ／ＡＬＫ−４、ＧＦＲα−２／ＧＤＮＦ  Ｒα−２、アクチビンＲＩＩＡ、ＧＦＲα−３／ＧＤＮＦ  Ｒα−３、アクチビンＲＩＩＢ、ＧＦＲα−４／ＧＤＮＦ  Ｒα−４、ＡＬＫ−１、ＭＩＳ  ＲＩＩ、ＡＬＫ−７、Ｒｅｔ、ＢＭＰＲ−ＩＡ／ＡＬＫ−３、ＴＧＦ−βＲＩ／ＡＬＫ−５、ＢＭＰＲ−ＩＢ／ＡＬＫ−６、ＴＧＦ−β  ＲＩＩ、ＢＭＰＲ−ＩＩ、ＴＧＦ−β  ＲＩＩｂ、エンドグリン／ＣＤ１０５、ＴＧＦ−β  ＲＩＩＩ等のＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドが含まれる。更なる炎症マーカーには、アムニオンレス（Ａｍｎｉｏｎｌｅｓｓ）、ＮＣＡＭ−１／ＣＤ５６、ＢＡＭＢＩ／ＮＭＡ、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、ＢＭＰ−１／ＰＣＰ、ＮＯＭＯ、カロンテ（Ｃａｒｏｎｔｅ）、ＰＲＤＣ、ケルベロス（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）１、ＳＫＩ、コーディン、Ｓｍａｄ１、コーディン−ライク１、Ｓｍａｄ２、コーディン−ライク２、Ｓｍａｄ３、ＣＯＣＯ、Ｓｍａｄ４、ＣＲＩＭ１、Ｓｍａｄ５、クリプト、Ｓｍａｄ７、クロスベインレス（Ｃｒｏｓｓｖｅｉｎｌｅｓｓ）−２、Ｓｍａｄ８、クリプティック（Ｃｒｙｐｔｉｃ）、ＳＯＳＴ、ＤＡＮ、潜在型ＴＧＦ−β  ｂｐ１、デコリン、潜在型ＴＧＦ−β  ｂｐ２、ＦＬＲＧ、潜在型ＴＧＦ−β  ｂｐ４、フォリスタチン、ＴＭＥＦＦ１／トモレグリン−１、フォリスタチン−ライク１、ＴＭＥＦＦ２、ＧＡＳＰ−１／ＷＦＩＫＫＮＲＰ、ＴＳＧ、ＧＡＳＰ−２／ＷＦＩＫＫＮ、ＴＳＫ、グレムリン、バソリン（Ｖａｓｏｒｉｎ）等のＴＧＦ−βスーパーファミリー調節因子が含まれる。更なる炎症マーカーには、アンフィレグリン、ＬＲＩＧ３、ベータセルリン、ニューレグリン−１／ＮＲＧ１、ＥＧＦ、ニューレグリン−３／ＮＲＧ３、エピゲン、ＴＧＦ−α、エピレグリン、ＴＭＥＦＦ１／トモレグリン−１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＭＥＦＦ２、ＬＲＩＧ���等のＥＧＦリガンドが含まれる。更なる炎症マーカーには、ＥＧＦ  Ｒ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ４等のＥＧＦ  Ｒ／ＥｒｂＢ受容体ファミリーが含まれる。更なる炎症マーカーにはフィブリノゲンが含まれる。更なる炎症マーカーにはＳＡＡが含まれる。更なる炎症マーカーには、α．１−抗トリプシン、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、α．２−マクログロブリン、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、Ｍａｃ−１、Ｆ４／８０等のグリアマーカーが含まれる。更なる炎症マーカーにはミエロペルオキシダーゼが含まれる。更なる炎症マーカーには、Ｃ３ｄ、Ｃ１ｑ、Ｃ５、Ｃ４ｄ、Ｃ４ｂｐおよびＣ５ａ−Ｃ９等の補体マーカーが含まれる。更なる炎症マーカーには、ＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−Ａ、Ｄ、Ｃ等の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）糖タンパク質が含まれる。更なる炎症マーカーには、ＣＲ３受容体、ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩ、ＣＤ３１、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ６８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＤ、ＣＤ１８、ＣＤ５９、ＣＲ４、ＣＤ４５、ＣＤ６４およびＣＤ４４等のミクログリアマーカーが含まれる。更なる炎症マーカーには、α．２マクログロブリン受容体、線維芽細胞成長因子、Ｆｃ  γ  ＲＩ、Ｆｃ  γ  ＲＩＩ、ＣＤ８、ＬＣＡ（ＣＤ４５）、ＣＤ１８、ＣＤ５９、Ａｐｏ  Ｊ、クラスタリン、２型プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、ＣＤ４４、マクロファージコロニー刺激因子受容体、ＭＲＰ１４、２７Ｅ１０、４−ヒドロキシノネナール−タンパク質共役（または複合体）、Ｉ．κ．Ｂ、ＮＦ．κ．Ｂ、ｃＰＬＡ．ｓｕｂ．２、ＣＯＸ−２、マトリクス・メタロプロテイナーゼ、膜脂質過酸化およびＡＴＰアーゼ活性が含まれる。ＨＳＰＣ２２８、ＥＭＰ１、ＣＤＣ４２、ＴＬＥ３、ＳＰＲＹ２、ｐ４０ＢＢＰ、ＨＳＰＣ０６０もしくはＮＡＢ２、またはＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＭＡＰＲＥ２およびＯＡＳ１発現のダウンレギュレーション、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７、α−１−酸性糖タンパク質、アンジオポエチン−１、ＭＩＦ、アンジオポエチン−２、ＣＤ１４、β−ディフェンシン２、ＭＭＰ−２、ＥＣＦ−Ｌ／ＣＨＩ３Ｌ３、ＭＭＰ−７、ＥＧＦ、ＭＭＰ−９、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＭＳＰ、ＥＮ−ＲＡＧＥ、酸化窒素、エンドセリン−１、オステオ
アクチビン／ＧＰＮＭＢ、ＦＰＲ１、ＰＤＧＦ、ＦＰＲＬ１、ペントラキシン３／ＴＳＧ−１４、ＦＰＲＬ２、Ｇａｓ６、ＰＬＵＮＣ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＧＥ、Ｓ１００Ａ１０、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＨＩＦ−１α、Ｐ物質、ＴＦＰＩ、ＴＧＦ−β１、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３、ＴＩＭＰ−４、ＴＬＲ４、ＬＢＰ、ＴＲＥＭ−１、ロイコトリエンＡ４、加水分解酵素ＴＳＧ−６、リポカリン−１、ｕＰＡ、Ｍ−ＣＳＦ、ならびにＶＥＧＦ。
【００５１】
［４．多岐にわたるマーカー］
腫瘍マーカーには、ＥＧＦ、ＴＮＦ−α、ＰＳＡ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β１、ＦＧＦｂ、ＴＲＡＩＬおよびＴＮＦ−ＲＩ（ｐ５５）が含まれる。
【００５２】
内分泌機能マーカーには、１７β−エストラジオール（Ｅ２）、ＤＨＥＡ、ＡＣＴＨ、ガストリンおよび成長ホルモン（ｈＧＨ）が含まれる。
【００５３】
自己免疫マーカーには、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｃ−反応性タンパク質およびＧ−ＣＳＦが含まれる。
【００５４】
甲状腺機能マーカーには、環状ＡＭＰ、カルシトニンおよび副甲状腺ホルモンが含まれる。
【００５５】
心血管マーカーには、心筋トロポニンＩ、心筋トロポニンＴ、Ｂ−ナトリウム利尿ペプチド、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、Ｃ−反応性タンパク質ＨＳおよびβ−トロンボグロブリンが含まれる。
【００５６】
糖尿病マーカーには、Ｃ−ペプチドおよびレプチンが含まれる。
【００５７】
感染症マーカーには、ＩＦＮ−γおよびＩＦＮ−αが含まれる。
【００５８】
代謝マーカーには、Ｂｉｏ−ｉｎｔａｃｔ  ＰＴＨ（１−８４）およびＰＴＨが含まれる。
【００５９】
［５．生物学的状態のマーカー］
マーカーは、件の特定の表現型の状態の存在を示し得る。表現型の状態の例として以下のものが挙げられる。環境の変化、薬物治療、遺伝子操作もしくは遺伝子変異、傷害、食物の変化、加齢、または１つの生物もしくは生物の網もしくは亜網の他の何らかの（１つまたは複数の）特性に起因する表現型。
【００６０】
いくつかの態様において、件の表現型の状態は、臨床的に診断された疾患の状態である。そのような疾患の状態には、例えば、癌、循環器疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、神経疾患、感染症、妊娠に関連する障害が含まれる。別法として、健康状態がマーカーを用いて検出可能である。
【００６１】
癌表現型は、本発明のいくつかの要旨に含まれる。癌の例として以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：乳癌、皮膚癌、骨肉腫、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、脳腫瘍、喉頭癌、胆嚢癌、膵臓癌、直腸癌、副甲状腺癌、甲状腺癌、副腎癌、神経組織癌、頭部および頸部癌、結腸癌、胃癌、気管支癌、腎臓癌、基底細胞癌、潰瘍性および乳頭型の扁平上皮癌、転移性皮膚癌、骨肉腫、ユーイング肉腫、細網肉腫（ｖｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｃｅｌｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、骨髄腫、巨細胞腫、小細胞肺腫瘍、非小細胞肺癌結石、島細胞腫、原発性脳腫瘍、急性および慢性のリンパ球性および顆粒球性腫瘍、有毛細胞腫瘍、腺腫、過形成、髄様癌、褐色細胞腫、粘膜神経腫、腸神経節細胞腫、過形成角膜神経腫、マルファン症候群様体質腫瘍、ウィルムス腫瘍、精上皮腫、卵巣腫瘍、平滑筋腫瘍、子宮頸部形成異常および上皮内癌、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、軟部組織肉腫、悪性カルチノイド、局所性皮膚病変、菌状息肉腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、骨肉腫および他の肉腫、悪性高カルシウム血症、腎細胞腫、真性多血症、腺癌、多形神経膠芽腫、白血病、リンパ腫、悪性黒色腫、扁平上皮癌、ならびに他の癌腫および肉腫。
【００６２】
本発明は癌を検出する方法を提供する。いくつかの態様において、がんには急性リンパ性白血病が含まれる。他の態様において、癌には急性骨髄性白血病が含まれる。他の態様において、癌には副腎皮質癌が含まれる。他の態様において、癌にはＡＩＤＳに関連する癌が含まれる。他の態様において、癌にはＡＩＤＳに関連するリンパ腫が含まれる。他の態様において、癌には肛門癌が含まれる。他の態様において、癌には虫垂癌が含まれる。他の態様において、癌には小児小脳星細胞腫が含まれる。他の態様において、癌には小児大脳星細胞腫が含まれる。他の態様において、癌には中枢神経系非定型奇形腫様／横紋筋肉腫様腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には、基底細胞癌または他の皮膚癌（非黒色腫）が含まれる。他の態様において、癌には肝外胆管癌が含まれる。他の態様において、癌には膀胱癌が含まれる。他の態様において、癌には、骨肉腫または悪性線維性組織球腫等の骨癌が含まれる。他の態様において、癌には脳幹部神経膠腫が含まれる。他の態様において、癌には成人脳腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には、中枢神経系非定型奇形腫様／横紋筋肉腫様腫瘍を含む脳腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫を含む脳腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には頭蓋咽頭腫脳腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には上衣芽細胞腫脳腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には上衣腫脳腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には髄芽腫脳腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には髄様上皮腫脳腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には、中間分化型松果体実質腫瘍を含む脳腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫を含む脳腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には、視経路および視床下部膠腫を含む脳腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には脳および脊髄腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には乳癌が含まれる。他の態様において、癌には気管支腫瘍が含まれる。他の態様において、癌にはバーキットリンパ腫が含まれる。他の態様において、癌にはカルチノイド腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には消化管カルチノイド腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には原発不明癌が含まれる。他の態様において、癌には中枢神経系非定型奇形腫様／横紋筋肉腫様腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には中枢神経系胚芽腫が含まれる。他の態様において、癌には中枢神経系原発リンパ腫が含まれる。他の態様において、癌には小脳星細胞腫が含まれる。他の態様において、癌には大脳星細胞腫／悪性神経膠腫が含まれる。他の態様において、癌には子宮頸癌が含まれる。他の態様において、癌には小児癌が含まれる。他の態様において、癌には脊索腫が含まれる。他の態様において、癌には慢性リンパ性白血病が含まれる。他の態様において、癌には慢性骨髄性白血病が含まれる。他の態様において、癌には慢性骨髄増殖性疾患が含まれる。他の態様において、癌には結腸癌が含まれる。他の態様において、癌には結腸直腸癌が含まれる。他の態様において、癌には頭蓋咽頭腫が含まれる。他の態様において、癌には、菌状息肉腫およびセザリー症候群を含む皮膚Ｔ細胞リンパ腫が含まれる。他の態様において、癌には中枢神経系胚芽腫が含まれる。他の態様において、癌には子宮内膜癌が含まれる。他の態様において、癌には上衣芽細胞腫が含まれる。他の態様において、癌には上衣腫が含まれる。他の態様において、癌には食道癌が含まれる。他の態様において、癌にはユーイング腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には頭蓋外胚細胞腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には性腺外胚細胞腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には肝外胆管癌が含まれる。他の態様において、癌には眼内黒色腫眼癌が含まれる。他の態様において、癌には網膜芽細胞腫眼癌が含まれる。他の態様において、癌には胆嚢癌が含まれる。他の態様において、癌には胃癌（Ｇａｓｔｒｉｃ（Ｓｔｏｍａｃｈ）Ｃａｎｃｅｒ）が含まれる。他の態様において、癌には消化管カルチノイド腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）が含まれる。他の態様において、癌には消化管間質細胞腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には頭蓋外胚細胞腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には性腺外胚細胞腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には卵巣胚細胞腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には妊娠性絨毛腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には神経膠腫が含まれる。他の態様において、癌には脳幹部神経膠腫が含まれる。他の態様において、癌には大脳星細胞腫神経膠腫が含まれる。他の態様において、癌には視経路または視床下部膠腫が含まれる。他の態様において、癌には有毛細胞白血病が含まれる。他の態様において、癌には頭部および頸部癌が含まれる。他の態様において、癌には肝細胞（肝臓）癌が含まれる。他の態様において、癌にはホジキンリンパ腫が含まれる。他の態様において、癌には下咽頭癌が含まれる。他の態様において、癌には眼内黒色腫が含まれる。他の態様において、癌には島細胞腫（内分泌膵臓（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｐａｎｃｒｅａｓ））が含まれる。他の態様において、癌にはカポジ肉腫が含まれる。他の態様において、癌には腎臓（腎細胞）癌が含まれる。他の態様において、癌には喉頭癌が含まれる。他の態様において、癌には急性リンパ性白血病が含まれる。他の態様において、癌には急性骨髄性白血病が含まれる。他の態様において、癌には慢性リンパ性白血病が含まれる。他の態様において、癌には慢性骨髄性白血病が含まれる。他の態様において、癌には有毛細胞白血病が含まれる。他の態様において、癌には口唇癌が含まれる。他の態様において、癌には口腔癌が含まれる。他の態様において、癌には原発性肝癌が含まれる。他の態様において、癌には非小細胞肺癌が含まれる。他の態様において、癌には小細胞肺癌が含まれる。他の態様において、癌にはＡＩＤＳ関連リンパ腫が含まれる。他の態様において、癌にはバーキットリンパ腫が含まれる。他の態様において、癌には皮膚Ｔ細胞リンパ腫が含まれる。他の態様において、癌には菌状息肉腫およびセザリー症候群が含まれる。他の態様において、癌にはホジキンリンパ腫が含まれる。他の態様において、癌には非ホジキンリンパ腫が含まれる。他の態様において、癌には中枢神経系原発リンパ腫が含まれる。他の態様において、癌にはワルデンシュトレーム・マクログロ���リン血症が含まれる。他の態様において、癌には、骨の悪性線維性組織球腫または骨肉腫が含まれる。他の態様において、癌には髄様上皮腫が含まれる。他の態様において、癌には黒色腫が含まれる。他の態様において、癌には眼内（眼球）黒色腫が含まれる。他の態様において、癌にはメルケル細胞癌が含まれる。他の態様において、癌には中皮腫が含まれる。他の態様において、癌には原発不明の転移性頸部扁平上皮癌が含まれる。他の態様において、癌には口腔（ｍｏｕｔｈ）癌が含まれる。他の態様において、癌には多発性内分泌腫瘍症候群が含まれる。他の態様において、癌には多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には菌状息肉腫が含まれる。他の態様において、癌には骨髄異形成症候群が含まれる。他の態様において、癌には骨髄異形成または骨髄増殖性疾患が含まれる。他の態様において、癌には慢性骨髄性白血病が含まれる。他の態様において、癌には急性骨髄性白血病が含まれる。他の態様において、癌には多発性骨髄腫が含まれる。他の態様において、癌には慢性骨髄増殖性疾患が含まれる。他の態様において、癌には鼻腔または副鼻腔癌が含まれる。他の態様において、癌には上咽頭癌が含まれる。他の態様において、癌には上咽頭癌が含まれる。他の態様において、癌には神経芽細胞腫が含まれる。他の態様において、癌には非ホジキンリンパ腫が含まれる。他の態様において、癌には非小細胞肺癌が含まれる。他の態様において、癌には口腔（ｏｒａｌ）癌が含まれる。他の態様において、癌には口腔（ｏｒａｌ  ｃａｖｉｔｙ）癌が含まれる。他の態様において、癌には口腔咽頭癌が含まれる。他の態様において、癌には骨肉腫が含まれる。他の態様において、癌には骨の悪性線維性組織球腫が含まれる。他の態様において、癌には卵巣癌が含まれる。他の態様において、癌には上皮性卵巣癌が含まれる。他の態様において、癌には卵巣胚細胞腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には卵巣低悪性度腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には膵臓癌が含まれる。他の態様において、癌には島細胞腫膵臓癌が含まれる。他の態様において、癌には乳頭腫症が含まれる。他の態様において、癌には副鼻腔癌が含まれる。他の態様において、癌には鼻腔癌が含まれる。他の態様において、癌には副甲状腺癌が含まれる。他の態様において、癌には陰茎癌が含まれる。他の態様において、癌には咽頭癌が含まれる。他の態様において、癌には褐色細胞腫が含まれる。他の態様において、癌には中間分化型松果体実質腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には松果体芽腫またはテント上原始神経外胚葉性腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には下垂体部腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫が含まれる。他の態様において、癌には胸膜肺芽腫が含まれる。他の態様において、癌には中枢神経系原発リンパ腫が含まれる。他の態様において、癌には前立腺癌が含まれる。他の態様において、癌には直腸癌が含まれる。他の態様において、癌には腎細胞（腎臓）癌が含まれる。他の態様において、癌には腎盂および尿管の移行上皮癌が含まれる。他の態様において、癌には、１５番染色体におけるＮＵＴ遺伝子に関連する呼吸器癌が含まれる��他の態様において、癌には網膜芽細胞腫が含まれる。他の態様において、癌には筋肉腫が含まれる。他の態様において、癌には唾液腺癌が含まれる。他の態様において、癌にはユーイング肉腫ファミリーの腫瘍が含まれる。他の態様において、癌にはカポジ肉腫が含まれる。他の態様において、癌には軟部組織肉腫が含まれる。他の態様において、癌には子宮肉腫が含まれる。他の態様において、癌にはセザリー症候群が含まれる。他の態様において、癌には非黒色腫皮膚癌が含まれる。他の態様において、癌には黒色腫皮膚癌が含まれる。他の態様において、癌にはメルケル細胞皮膚癌が含まれる。他の態様において、癌には小細胞肺癌が含まれる。他の態様において、癌には小腸癌が含まれる。他の態様において、癌には扁平上皮癌、例えば非黒色腫皮膚癌が含まれる。他の態様において、癌には原発不明の転移性頸部扁平上皮癌が含まれる。他の態様において、癌には胃癌（Ｓｔｏｍａｃｈ（Ｇａｓｔｒｉｃ）Ｃａｎｃｅｒ）が含まれる。他の態様において、癌にはテント上原始神経外胚葉性腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には皮膚Ｔ細胞リンパ腫、例えば菌状息肉腫およびセザリー症候群が含まれる。他の態様において、癌には精巣癌が含まれる。他の態様において、癌には咽頭癌が含まれる。他の態様において、癌には胸腺腫または胸腺癌が含まれる。他の態様において、癌には甲状腺癌が含まれる。他の態様において、癌には腎盂および尿管の移行上皮癌が含まれる。他の態様において、癌には妊娠性絨毛腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には原発不明癌が含まれる。他の態様において、癌には小児に特有の癌が含まれる。他の態様において、癌には尿管および腎盂の移行上皮癌が含まれる。他の態様において、癌には尿道癌が含まれる。他の態様において、癌には子宮内膜癌が含まれる。他の態様において、癌には子宮肉腫が含まれる。他の態様において、癌には膣癌が含まれる。他の態様において、癌には視経路および視床下部膠腫が含まれる。他の態様において、癌には外陰癌が含まれる。他の態様において、癌にはワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症が含まれる。他の態様において、癌にはウィルムス腫瘍が含まれる。他の態様において、癌には女性の癌が含まれる。
【００６３】
循環器疾患は本発明の他の用途に含まれてよい。循環器疾患の例として以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。鬱血性心不全、高血圧、不整脈、アテローム性動脈硬化、コレステロール、ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群、ＱＴ延長症候群、狭心症、頻脈、徐脈、心房細動、心室細動、鬱血性心不全、心筋虚血、心筋梗塞、心タンポナーデ、心筋炎、心膜炎、催不整脈性右心室異形成、肥大型心筋症、ウイリアムズ症候群、心臓弁膜症、心内膜炎、細菌性の肺動脈閉鎖、大動脈弁狭窄症、レイノー病、コレステロール塞栓症、ワレンベルグ症候群、ヒッペル・リンダウ病および毛細血管拡張症。
【００６４】
炎症性疾患および自己免疫疾患は本発明の他の態様に含まれてよい。炎症性疾患および自己免疫疾患の例としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。関節リウマチ、非特異的関節炎、喉頭の炎症性疾患、炎症性腸疾患、乾癬、甲状腺機能低下症（例えば橋本甲状腺機能低下症）、結腸炎（または大腸炎）、１型糖尿病、骨盤内炎症性疾患、中枢神経系の炎症性疾患、側頭動脈炎、リウマチ性多発筋痛、強直性脊椎炎、結節性多発動脈炎、ライター症候群、強皮症、全身紅斑症およびエリテマトーデス。
【００６５】
本発明の方法および組成物は、以下のもののマーカーを含む感染症マーカーに関する実験情報も提供し得る。アデノウイルス、百日咳菌、クラミジア肺炎、クラミジア・トラコマチス、コレラ毒素、コレラ毒素β、カンピロバクター・ジェジュニ、サイトメガロウイルス、ジフテリア毒素、エプスタイン・バーＮＡ、エプスタイン・バーＥＡ、エプスタイン・バーＶＣＡ、ヘリコバクター・ピロリ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コア、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）エンベロープ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）サーフェス（Ａｙ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コア、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ３、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ４、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ５、Ａ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）ｏｒｆ２  ３ＫＤ、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）ｏｒｆ２  ６ＫＤ、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）ｏｒｆ３  ３ＫＤ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１  ｐ２４、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１  ｇｐ４１、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１  ｇｐ１２０、ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）、単純ヘルペスウイルスＨＳＶ−１／２、単純ヘルペスウイルスＨＳＶ−１  ｇＤ、単純ヘルペスウイルスＨＳＶ−２  ｇＧ、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）−１／２、Ａ型インフルエンザ、Ａ（Ｈ３Ｎ２）型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、ドノバン・リーシュマニア、ライム病、おたふく風邪、肺炎マイコプラズマ、結核菌、１型パラインフルエンザ、２型パラインフルエンザ、３型パラインフルエンザ、ポリオウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、風疹、麻疹、ストレプトリジンＯ、破傷風毒素、梅毒トレポネーマ１５ｋｄ、梅毒トレポネーマｐ４７、クルーズトリパノソーマ、トキソプラズマおよび水疱帯状ヘルペス。
【００６６】
［ＩＩＩ．ラベル］
いくつかの態様において、本発明は、分子（例えばマーカー）の高感度検出および定量のためのラベルを含む方法および組成物を提供する。
【００６７】
粒子混合物中の目標とする分子の検出または識別を可能にするために、その目標とする分子をラベリングすることに関して、多数の戦略が使用可能であることを、当業者は理解するであろう。ラベルは、任意の公知手法によって取り付けてよく、その手法として、ラベルとターゲットとの非特異的または特異的相互作用を利用する方法が挙げられる。ラベルは検出可能な信号を提供してよく、または電場における粒子の移動度に影響を及ぼしてよい。更に、ラベリングは直接的に又は結合パートナーを通じて達成され得る。
【００６８】
いくつかの態様において、ラベルは件の分子に対する結合パートナーを含み、ラベルにおいて、結合パートナーは蛍光部分に結合されている。本発明の組成物および方法は、高度に蛍光を発する部分、例えば、当該部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると少なくとも約２００個の光子を放出することができる部分を使用してよく、レーザーは、当該部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である。本発明の組成物および方法に適した部分を、以下により詳細に記載する。
【００６９】
いくつかの態様において、本発明は、生物学的分子を検出するためのラベルであって、蛍光部分に結合された、生物学的分子に対する結合パートナーを含むラベルを提供し、蛍光部分は、当該部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、少なくとも約２００個の光子を放出することができ、レーザーは、当該部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、蛍光部分は複数の蛍光成分、例えば、約２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９、２〜１０、または約３〜５、３〜６、３〜７、３〜８、３〜９もしくは３〜１０の蛍光成分を含む。いくつかの態様において、蛍光部分は約２〜４の蛍光成分を含む。いくつかの態様において、生物学的分子はタンパク質または小分子である。いくつかの態様において、生物学的分子はタンパク質である。蛍光成分は蛍光色素分子であり得る。いくつかの態様において、蛍光色素分子は、少なくとも１つの置換インドリウム環系であって、インドリウム環の３位の炭素における置換基が化学反応性基または共役物質を含む置換インドリウム環系を有する。いくつかの態様において、色素分子は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００からなる群から選択されるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ分子である。いくつかの態様において、色素分子は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００からなる群から選択されるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ分子である。いくつかの態様において、色素分子はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７色素分子である。いくつかの態様において、色素分子は、第１の種類および第２の種類の色素分子、例えば２種類の異なるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ分子を含有し、例えば、第１の種類および第２の種類の色素分子は異なる放射スペクトルを有する。第２の種類の色素分子に対する第１の種類の色素分子の数の比は、例えば４対１、３対１、２対１、１対１、１対２、１対３または１対４であり得る。結合パートナーは、例えば抗体であり得る。
【００７０】
いくつかの態様において、本発明はマーカーを検出するためのラベルを提供し、そのラベルはマーカーに対する結合パートナーおよび蛍光部分を含有し、その蛍光部分は、当該部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、少なくとも約２００個の光子を放出することができ、レーザーは、当該部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、蛍光部分は蛍光分子を含む。いくつかの態様において、蛍光部分は、複数の蛍光分子、例えば約２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４、３〜１０、３〜８または３〜６の蛍光分子を含む。いくつかの態様において、ラベルは約２〜４の蛍光分子を含む。いくつかの態様において、蛍光色素分子は、少なくとも１つの置換インドリウム環系であって、インドリウム環の３位の炭素における置換基が化学反応性基または共役物質を含む置換インドリウム環系を有する。いくつかの態様において、蛍光分子は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００からなる群から選択される。いくつかの態様において、蛍光分子は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００からなる群から選択される。いくつかの態様において、蛍光分子はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子である。いくつかの態様において、結合パートナーには抗体が含まれる。いくつかの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。他の態様において、抗体はポリクローナル抗体である。
【００７１】
抗体は適切なマーカーに対して特異的であってよい。いくつかの態様において、抗体は、サイトカイン、成長因子、腫瘍マーカー、炎症マーカー、内分泌マーカー、自己免疫マーカー、甲状腺マーカー、心血管マーカー、糖尿病マーカー、感染症マーカー、神経学的マーカー、呼吸器マーカー、消化管マーカー、筋骨格マーカー、皮膚疾患および代謝マーカーからなる群から選択されるマーカーに対して特異的である。
【００７２】
いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるサイトカインに対して特異的である。いくつかの態様において、サイトカインは、以下のものからなる群から選択される。ＢＤＮＦ、ＣＲＥＢ  ｐＳ１３３、ＣＲＥＢ  Ｔｏｔａｌ、ＤＲ−５、ＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、エオタキシン、脂肪酸結合タンパク質、塩基性ＦＧＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＧＣＰ−２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子ＧＭ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、成長関連癌遺伝子−ケラチノサイト（ＧＲＯ−ＫＣ）、ＨＧＦ、ＩＣＡＭ−１、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、インターロイキン（ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２  ｐ４０、ＩＬ−１２  ｐ４０／ｐ７０、ＩＬ−１２  ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１Ｆ３、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９等）、インターフェロン誘導タンパク質（１０  ＩＰ−１０）、ＪＥ／ＭＣＰ−１、ケラチノサイト（ＫＣ）、ＫＣ／ＧＲＯａ、ＬＩＦ、リンホタクチン、Ｍ−ＣＳＦ、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−５、ＭＤＣ、ＭＩＧ、炎症性マクロファージ（ＭＩＰ−１α）、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１γ、ＭＩＰ−２、ＭＩＰ−３β、ＯＳＭ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、Ｒｂ（ｐＴ８２１）、Ｒｂ（ｔｏｔａｌ）、Ｒｂ  ｐＳｐＴ２４９／２５２、Ｔａｕ（ｐＳ２１４）、Ｔａｕ（ｐＳ３９６）、Ｔａｕ（ｔｏｔａｌ）、組織因子、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＶＣＡＭ−１、およびＶＥＧＦ。
【００７３】
いくつかの態様において、サイトカインは以下のものからなる群から選択される。ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１０、ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−１２  ｐ４０、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−１８、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、エオタキシン、ＩＬ−１６、ＭＩＧ、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１３、ＩＬ−２Ｒ（可溶性）、ＩＬ−２、ＬＩＦ／ＨＩＬＤＡ、ＩＬ−１β、Ｆａｓ／ＣＤ９５／Ａｐｏ−１およびＭＣＰ−１。
【００７４】
いくつかの態様において、抗体は、マーカーである成長因子に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーである成長因子、即ちＴＧＦ−βに対して特異的である。いくつかの態様において、成長因子は、アンフィレグリン、ＬＲＩＧ３、ベータセルリン、ニューレグリン−１／ＮＲＧ１、ＥＧＦ、ニューレグリン−３／ＮＲＧ３、エピゲン、ＴＧＦ−α、エピレグリン、ＴＭＥＦＦ１／トモレグリン−１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＭＥＦＦ２、ＬＲＩＧ１等のＧＦリガンド；ＥＧＦ  Ｒ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ４等のＥＧＦ  Ｒ／ＥｒｂＢ受容体ファミリー；ＦＧＦリガンド、酸性ＦＧＦ、ＦＧＦ−１２、塩基性ＦＧＦ、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−２２、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−２３、ＦＧＦ−１１、ＫＧＦ／ＦＧＦ−７、ＦＧＦ受容体であるＦＧＦ  Ｒ１−４、ＦＧＦ  Ｒ３、ＦＧＦ  Ｒ１、ＦＧＦ  Ｒ４、ＦＧＦ  Ｒ２、ＦＧＦ  Ｒ５、ＦＧＦ調節因子であるＦＧＦ−ＢＰ等のＦＧＦファミリー；ヘッジホッグファミリーであるデザートヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグ、インディアンヘッジホッグ；ヘッジホッグ関連分子および調節因子であるＢＯＣ、ＧＬＩ−３、ＣＤＯ、ＧＳＫ−３α／β、ＤＩＳＰ１、ＧＳＫ−３α、Ｇａｓ１、ＧＳＫ−３β、ＧＬＩ−１、Ｈｉｐ、ＧＬＩ−２；ＩＧＦファミリーＩＧＦリガンドであるＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体（ＣＤ２２１）ＩＧＦ−Ｉ  Ｒ、およびＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）ファミリーＡＬＳ、ＩＧＦＢＰ−５、ＣＴＧＦ／ＣＣＮ２、ＩＧＦＢＰ−６、Ｃｙｒ６１／ＣＣＮ１、ＩＧＦＢＰ−Ｌ１、エンドカン、ＩＧＦＢＰ−ｒｐ１／ＩＧＦＢＰ−７、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−ｒＰ１０、ＩＧＦＢＰ−２、ＮＯＶ／ＣＣＮ３、ＩＧＦＢＰ−３、ＷＩＳＰ−１／ＣＣＮ４、ＩＧＦＢＰ−４；受容体型チロシンキナーゼであるＡｘｌ、ＦＧＦ  Ｒ４、Ｃ１ｑ  Ｒ１／ＣＤ９３、ＦＧＦ  Ｒ５、ＤＤＲ１、Ｆｌｔ−３、ＤＤＲ２、ＨＧＦ  Ｒ、Ｄｔｋ、ＩＧＦ−Ｉ  Ｒ、ＥＧＦ、Ｒ  ＩＧＦ−ＩＩ  Ｒ、Ｅｐｈ、ＩＮＳＲＲ、ＥｐｈＡ１、インスリンＲ／ＣＤ２２０、ＥｐｈＡ２、Ｍ−ＣＳＦ  Ｒ、ＥｐｈＡ３、Ｍｅｒ、ＥｐｈＡ４、ＭＳＰ  Ｒ／Ｒｏｎ、ＥｐｈＡ５、ＭｕＳＫ、ＥｐｈＡ６、ＰＤＧＦ  Ｒα、ＥｐｈＡ７、ＰＤＧＦ  Ｒβ、ＥｐｈＡ８、Ｒｅｔ、ＥｐｈＢ１、ＲＴＫ様オーファン受容体１／ＲＯＲ１、ＥｐｈＢ２、ＲＴＫ様オーファン受容体２／ＲＯＲ２、ＥｐｈＢ３、ＳＣＦ  Ｒ／ｃ−ｋｉｔ、ＥｐｈＢ４、Ｔｉｅ−１、ＥｐｈＢ６、Ｔｉｅ−２、ＥｒｂＢ２、ＴｒｋＡ、ＥｒｂＢ３、ＴｒｋＢ、ＥｒｂＢ４、ＴｒｋＣ、ＦＧＦ、Ｒ１−４  ＶＥＧＦ  Ｒ、ＦＧＦ  Ｒ１、ＶＥＧＦ  Ｒ１／Ｆｌｔ−１、ＦＧＦ  Ｒ２、ＶＥＧＦ  Ｒ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、ＦＧＦ  Ｒ３、ＶＥＧＦ  Ｒ３／Ｆｌｔ−４；プロテオグリカンおよび調節因子プロテオグリカンであるアグリカン、ミメカン、アグリン、ＮＧ２／ＭＣＳＰ、バイグリカン、オステオアドヘリン、デコリン、ポドカン、ＤＳＰＧ３、δ−サルコグリカン、エンドカン、シンデカン−１／ＣＤ１３８、エンドグ��カン、シンデカン−２、エンドレペリン／パールカン、シンデカン−３、グリピカン２、シンデカン−４、グリピカン３、テスチカン１／ＳＰＯＣＫ１、グリピカン５、テスチカン２／ＳＰＯＣＫ２、グリピカン６、テスチカン３／ＳＰＯＣＫ３、ルミカン、バーシカン、プロテオグリカン調節因子、アリールスルファターゼＡ／ＡＲＳＡ、グルコサミン（Ｎ−アセチル）−６−スルファターゼ／ＧＮＳ、エキソストシン−ライク２／ＥＸＴＬ２、ＨＳ６ＳＴ２、エキソストシン−ライク３／ＥＸＴＬ３、イズロン酸２−スルファターゼ／ＩＤＳ、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ；ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３リガンドおよびＭ−ＣＳＦであるＦｌｔ−３、Ｍ−ＣＳＦ  Ｒ、Ｆｌｔ−３リガンド、ＳＣＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ  Ｒ／ｃ−ｋｉｔ；ＴＧＦ−βスーパーファミリー（炎症マーカーに関して列挙したものと同じ）；ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーであるニューロピリン−１、ＰｌＧＦ、ニューロピリン−２、ＰｌＧＦ−２、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ  Ｒα、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ  Ｒβ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＶＥＧＦ  Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ  Ｒ１／Ｆｌｔ−１、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ  Ｒ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ  Ｒ３／Ｆｌｔ−４；Ｗｎｔ関連分子、ディックコップ（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ）タンパク質およびＷｎｔ阻害因子であるＤｋｋ−１、Ｄｋｋ−４、Ｄｋｋ−２、Ｓｏｇｇｙ−１、Ｄｋｋ−３、ＷＩＦ−１  Ｆｒｉｚｚｌｅｄおよび関連タンパク質であるＦｒｉｚｚｌｅｄ−１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−２、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−９、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−３、ｓＦＲＰ−１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−４、ｓＦＲＰ−２、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−５、ｓＦＲＰ−３、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−６、ｓＦＲＰ−４、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−７、ＭＦＲＰ  ＷｎｔリガンドであるＷｎｔ−１、Ｗｎｔ−８ａ、Ｗｎｔ−２ｂ、Ｗｎｔ−８ｂ、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−９ａ、Ｗｎｔ−４、Ｗｎｔ−９ｂ、Ｗｎｔ−５ａ、Ｗｎｔ−１０ａ、Ｗｎｔ−５ｂ、Ｗｎｔ−１０ｂ、Ｗｎｔ−７ａ、Ｗｎｔ−１１、Ｗｎｔ−７ｂ；他のＷｎｔ関連分子であるＡＰＣ、クレメン−２、アキシン−１、ＬＲＰ−１、β−カテニン、ＬＲＰ−６、ディシブルド−１、ノリン、ディシブルド−３、ＰＫＣ  β１、グリピカン３、ピゴパス−１、グリピカン５、ピゴパス−２、ＧＳＫ−３α／β、Ｒ−スポンジン１、ＧＳＫ−３α、Ｒ−スポンジン２、ＧＳＫ−３β、Ｒ−スポンジン３、ＩＣＡＴ、ＲＴＫ様オーファン受容体１／ＲＯＲ１、クレメン−１、ＲＴＫ様オーファン受容体２／ＲＯＲ、および他の成長因子であるＣＴＧＦ／ＣＣＮ２、β−ＮＧＦ、Ｃｙｒ６１／ＣＣＮ１、ノリン、ＤＡＮＣＥ、ＮＯＶ／ＣＣＮ３、ＥＧ−ＶＥＧＦ／ＰＫ１、オステオクリン、ヘパソシン、ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＨＧＦ、プログラヌリン、ＬＥＣＴ２、トロンボポエチン、ＬＥＤＧＦ、またはＷＩＳＰ−１／ＣＣＮ４である。
【００７５】
いくつかの態様において、抗体はマーカーである癌マーカー（腫瘍マーカー）に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体はマーカーである癌マーカー、即ちＥＧＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーである癌マーカー、即ちＴＮＦ−αに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるマーカー、即ちＰＳＡに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるマーカー、即ちＶＥＧＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるマーカー、即ちＴＧＦ−βに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるマーカー、即ちＦＧＦｂに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるマーカー、即ちＴＲＡＩＬに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるマーカー、即ちＴＮＦ−ＲＩ（ｐ５５）に対して特異的である。
【００７６】
別の態様において、抗体は、癌マーカーであるα−フェトプロテインに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＥＲ  β／ＮＲ３Ａ２に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＥｒｂＢ２に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるカリクレイン３／ＰＳＡに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＥＲ  α／ＮＲ３Ａ１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるプロゲステロンＲ／ＮＲ３Ｃ３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＡ３３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＭＩＡに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるオーロラＡに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＭＭＰ−２に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＢｃｌ−２に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＭＭＰ−３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるカドヘリン−１３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＭＭＰ−９に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＥ−カドヘリンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＮＥＫ２に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーである炭酸脱水酵素ＩＸに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるネスチンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるβ−カテニンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＮＧ２／ＭＣＳＰに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるカテプシンＤに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるオステオポンチンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＣＤ４４に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるｐ２１／ＣＩＰ１／ＣＤＫＮ１Ａに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＣＥＡＣＡＭ−６に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるｐ２７／Ｋｉｐ１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるコルヌリン（Ｃｏｒｎｕｌｉｎ）に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるｐ５３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＤＰＰＡ４に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるプロラクチンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＥＣＭ−１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＰＳＰ９４に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＥＧＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＳ１００Ｂに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＥＧＦ  Ｒに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＳ１００Ｐに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＥＭＭＰＲＩＮ／ＣＤ１４７に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＳＣＦ  Ｒ／ｃ−ｋｉｔに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーである線維芽細胞活性化タンパク質α／ＦＡＰに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるセルピンＥ１／ＰＡＩ−１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーである酸性ＦＧＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーである血清アミロイドＡ４に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーである塩基性ＦＧＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるスルビビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるガレクチン−３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＴＥＭ８に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるグリピカン３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＴＩＭＰ−１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＨＩＮ−１／セクレトグロブリン（Ｓｅｃｒｅｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）３Ａ１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＴＩＭＰ−２に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＩＧＦ−Ｉに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＴＩＭＰ−３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＩＧＦＢＰ−３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＴＩＭＰ−４に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＩＬ−６に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ１Ａに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるカリクレイン６／ニューロシンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＴＲＡＦ−４に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＭ−ＣＳＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるｕＰＡに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるマトリプターゼ／ＳＴ１４に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるｕＰＡＲに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるメソテリンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＶＣＡＭ−１に対して特異的である。いくつかの���様において、抗体は、癌マーカーであるメチオニンアミノペプチダーゼに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるＶＥＧＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、癌マーカーであるメチオニンアミノペプチダーゼ２に対して特異的である。
【００７７】
いくつかの態様において、抗体は、炎症マーカーであるマーカーに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、炎症マーカーであるマーカー、即ちＩＣＡＭ−１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、炎症マーカーであるマーカー、即ちＲＡＮＴＥＳに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、炎症マーカーであるマーカー、即ちＭＩＰ−２に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、炎症マーカーであるマーカー、即ちＭＩＰ−１βに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、炎症マーカーであるマーカー、即ちＭＩＰ−１αに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、炎症マーカーであるマーカー、即ちＭＭＰ−３に対して特異的である。
【００７８】
いくつかの態様において、抗体は、内分泌機能マーカーであるマーカーに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、内分泌機能マーカーであるマーカー、即ち１７β−エストラジオール（Ｅ２）に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、内分泌機能マーカーであるマーカー、即ちＤＨＥＡに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、内分泌機能マーカーであるマーカー、即ちＡＣＴＨに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、内分泌機能マーカーであるマーカー、即ちガストリンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、内分泌機能マーカーであるマーカー、即ち成長ホルモンに対して特異的である。
【００７９】
いくつかの態様において、抗体は、自己免疫疾患マーカーであるマーカーに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、自己免疫疾患マーカーであるマーカー、即ちＧＭ−ＣＳＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、自己免疫疾患マーカーであるマーカー、即ちＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、自己免疫疾患マーカーであるマーカー、即ちＧ−ＣＳＦに対して特異的である。
【００８０】
いくつかの態様において、抗体は、甲状腺機能マーカーに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、甲状腺機能マーカーである環状ＡＭＰに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、甲状腺機能マーカーに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、甲状腺機能マーカーであるカルシトニンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、甲状腺機能マーカーに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、甲状腺機能マーカーである副甲状腺ホルモンに対して特異的である。
【００８１】
いくつかの態様において、抗体は心血管機能マーカーに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、心血管機能マーカーであるＢ−ナトリウム利尿ペプチドに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、心血管機能マーカーであるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、心血管機能マーカーであるＣ反応性タンパク質、ＨＳに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、心血管機能マーカーであるβ−トロンボグロブリンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、心血管機能マーカーである心筋トロポニンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、心血管機能マーカーである心筋トロポニンＩに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、心血管機能マーカーである心筋トロポニンＴに対して特異的である。
【００８２】
いくつかの態様において、抗体は糖尿病マーカーに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、糖尿病マーカーであるＣ−ペプチドに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、糖尿病マーカーであるレプチンに対して特異的である。
【００８３】
いくつかの態様において、抗体は感染症マーカーに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、感染症マーカーであるＩＦＮ  γに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、感染症マーカーであるＩＦＮ  αに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、感染症マーカーであるＴＲＥＭ−１に対して特異的である。
【００８４】
いくつかの態様において、抗体は代謝マーカーに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、代謝マーカーであるｂｉｏ−ｉｎｔａｃｔ  ＰＴＨ（１−８４）に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、代謝マーカーであるＰＴＨに対して特異的である。
【００８５】
いくつかの態様において、抗体はマーカーであるＩＬ−１βに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＴＮＦ−αに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−６に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＴｎＩ（心筋トロポニンＩ）に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−８に対して特異的である。
【００８６】
いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＡβ４０に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＡβ４２に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるｃＡＭＰに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＦＡＳリガンドに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーである塩基性ＦＧＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＧＭ−ＣＳＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＦＮ−αに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＦＮ−γに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−１ａに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−２に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−４に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−５に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−７に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−１２に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−１３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−１７に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＭＣＰ−１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＭＩＰ−１ａに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＲＡＮＴＥＳに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＶＥＧＦに対して特異的である。
【００８７】
いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＡＣＥに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるアクチビンＡに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるアディポネクチンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるアジプシンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＡｇＲＰに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＡＫＴ１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるアルブミンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるベータセルリンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるボンベシンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＣＤ１４に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＣＤ−２６に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＣＤ−３８に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＣＤ−４０Ｌに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＣＤ−４０ｓに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＣＤＫ５に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーである補体Ｃ３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーである補体Ｃ４に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＣ−ペプチドに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＣＲＰに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＥＧＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＥ−セレクチンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＦＡＳに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＦＡＳＬＧに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるフェチュインＡに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるフィブリノゲンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるグレリンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるグルカゴンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーである成長ホルモンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるハプトグロブリンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーである肝細胞成長因子に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＨＧＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＣＡＭ１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＦＮＧに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＧＦ１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−１ＲＡに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩｌ−６ｓｒに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−８に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−１０に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−１８に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬＧＦＢＰ１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬＧＦＢＰ３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるインスリン様成長因子１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＬＥＰに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＭ−ＣＳＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＭＭＰ２に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＭＭＰ９に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＮＧＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＰＡＩ−１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＲＡＧＥに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＲＳＰ４に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるレジスチンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーである性ホルモン結合グロブリンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＳＯＣＸ３に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＴＧＦ  βに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるトロンボプラスチンに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＴＮＦ  Ｒ１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＶＣＡＭ−１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＶＷＦに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＴＳＨに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＥＰＩＴＯＭＥに対して特異的である。
【００８８】
いくつかの態様において、抗体は、マーカーである心筋トロポニンＩに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＴＲＥＭ−１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−６に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＩＬ−８に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるロイコトリエンＴ４に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＡｋｔ１に対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＴＧＦ−βに対して特異的である。いくつかの態様において、抗体は、マーカーであるＦａｓリガンドに対して特異的である。
【００８９】
いくつかの態様において、蛍光部分は蛍光分子を含む。いくつかの態様において、蛍光部分は複数の蛍光分子、例えば約２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４、３〜１０、３〜８または３〜６の蛍光分子を含む。いくつかの態様において、ラベルは約２〜４の蛍光分子を含む。いくつかの態様において、蛍光分子には、少なくとも１つの置換インドリウム環系を有する分子であって、インドリウム環の３位の炭素における置換基が化学反応性基または共役物質基（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  ｇｒｏｕｐ）を含む分子が含まれる。いくつかの態様において、蛍光分子は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００からなる群から選択される。いくつかの態様において、蛍光分子は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００からなる群から選択される。いくつかの態様において、蛍光分子はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子である。
【００９０】
［Ａ．結合パートナー］
検出すべき分子、例えばマーカーの形態に対して必要な特異性（または選択性）を有する任意の適切な結合パートナーを用いてよい。分子、例えばマーカーがいくつかの異なる形態を有する場合、様々な特異性の結合パートナーが可能である。適切な結合パートナーは当該技術分野において公知であり、それには抗体、アプタマー、レクチンおよび受容体が含まれる。有用かつ多用途な結合パートナーの種類は抗体である。
【００９１】
［１．抗体］
いくつかの態様において、結合パートナーは、検出すべき分子に対して特異的な抗体である。用語「抗体」は、本明細書において用いられる場合、幅広い意味を有する用語であり、その通常の意味で用いられ、その用語は、天然抗体および非天然抗体を意味することが含まれるがこれらに限定されず、例えば、一本鎖抗体、キメラ抗体、二機能性抗体およびヒト化抗体、ならびにそれらの抗原結合性フラグメントが含まれる。エピトープまたは抗体が取り上げられる分子領域の選択が、例えば分子（存在する場合）または全体（例えば、全て又は実質的に全ての分子）の様々な形態に対するその特異性を決定するであろうことが理解されるであろう。
【００９２】
抗体を製造する方法は十分に確立されている。当業者は、例えば『Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ』（Ｅｄ  ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）に記載されているように、多数の手法が抗体の製造に利用可能であることを理解するであろう。抗体に類似した結合性フラグメントまたはＦａｂフラグメントもまた、様々な手法によって遺伝情報から製造され得ることも、当業者は理解するであろう（『Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ』Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．編、１９９５、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、オクスフォード；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１４９巻、第３９１４〜３９２０頁（１９９２））。分子（例えばタンパク質）およびマーカーに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体もまた、商業的に入手可能である（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス；ＨｙＴｅｓｔ，ＨｙＴｅｓｔ  Ｌｔｄ．、フィンランド、トゥルク；Ａｂｃａｍ  Ｉｎｃ．、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ；Ｌｉｆｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、米国ペンシルベニア州ウェストチェスター；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、米国マサチューセッツ州０１７４２−３０４９コンコード；ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ、カリフォルニア州エメリービル）。
【００９３】
いくつかの態様において、抗体はポリクローナル抗体である。他の態様において、抗体はモノクローナル抗体である。
【００９４】
捕捉結合パートナーと検出結合パートナーのペア、例えば捕捉および検出抗体のペアを、本発明の態様において用いてよい。従って、いくつかの態様において、通常は２つの結合パートナー、例えば２つの抗体を使用する不均一分析プロトコルを用いる。一方の結合パートナーは、通常は固体支持体に固定化された捕捉パートナーであり、他方の結合パートナーは、通常は検出可能なラベルが結合された検出結合パートナーである。そのような抗体ペアは、上述の供給源、例えばＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ（カリフォルニア州エメリービル）から入手可能である。抗体ペアは、当該技術分野において公知の方法によっても設計および製造可能である。本発明の組成物には抗体ペアが含まれ、抗体ペアの一方の要素は本明細書に記載のラベルであり、他方の要素は捕捉抗体である。
【００９５】
いくつかの態様において、様々な種と公差反応する抗体を、捕捉抗体、検出抗体、またはその両方として用いることが有用である。そのような態様として、例えば心臓障害のマーカーとしての心筋トロポニンの血液中への放出を測定することによる、薬物毒性の測定が挙げられる。交差反応抗体は、毒性の研究を一の種、例えばヒト以外の種において行い、その結果を、アッセイの試薬中の同じ抗体または抗体ペアを用いて、従ってアッセイ間の変動を減少させて、別の種、例えばヒトの研究または臨床的観察に直接受け渡すことを可能にする。従って、いくつかの態様において、マーカー、例えば心筋トロポニン（心筋トロポニンＩ等）に対する結合パートナーとして使用するための抗体の１つまたはそれより多くは、交差反応抗体であってよい。いくつかの態様において、抗体は、ヒト、サル、イヌおよびマウスからなる群から選択される少なくとも２つの種からのマーカー、例えば心筋トロポニンと交差反応する。いくつかの態様において、抗体は、ヒト、サル、イヌおよびマウスからなる群の全てからのマーカー、例えば心筋トロポニンと交差反応する。
【００９６】
［Ｂ．蛍光部分］
本発明において用いられるラベルのいくつかの態様において、結合パートナー、例えば抗体を、蛍光部分に結合させる。蛍光部分の蛍光は、本明細書に記載の単一分子検出器等の単一分子検出器における検出を可能にするのに十分であろう。
【００９７】
「蛍光部分」は、本明細書においてその用語を用いる場合、１つ又はそれより多くの蛍光成分であって、その全蛍光は、本明細書に記載の単一分子検出器において蛍光部分を検出し得るようなものである、蛍光成分を含む。従って、蛍光部分は、単一の成分（例えば量子ドットまたは蛍光分子）または複数の成分（例えば複数の蛍光分子）を含んでよい。「（蛍光）部分」が、本明細書においてその用語を用いる際に蛍光成分の群、例えば複数の蛍光色素分子を意味する場合、検出されるべき十分な蛍光を、それらの成分が１つの群として提供する限りにおいて、各個別の成分は別々に結合パートナーと結合してよく、または成分は一緒に結合してよいことが、理解されるであろう。
【００９８】
通常、蛍光部分の蛍光は、単一分子検出器においてバックグラウンドレベルを超えて蛍光部分を検出し得るのに十分な量子効率および光退色の欠如と、分析の所望の検出限界、確度および精度に対して必要な整合性との組み合わせを含む。例えば、いくつかの態様において、蛍光部分の蛍光は、本明細書に記載の機器において、約１０、５、４、３、２、１、０．１、０．０１、０．００１、０．００００１または０．０００００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界、および約２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％より小さい又はそれ未満の、例えば約１０％またはそれ未満の変動係数で、分子、例えばマーカーを検出および／または定量し得るようなものである。いくつかの態様において、蛍光部分の蛍光は、本明細書に記載の機器において、約５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界、および約１０％より小さい変動係数で、分子、例えばマーカーを検出および／または定量し得るようなものである。
【００９９】
「検出限界」またはＬｏＤは、これらの用語を本明細書において用いる場合、試料が件の物質の分子を含有すると同定し得る最も低い濃度、例えば最初の非ゼロ値を含む。それは、ゼロ値の変動および検量線の傾きによって規定可能である。例えば、分析の検出限界は、検量線を引くこと、検量線のゼロ値を決定すること、およびその値に２標準偏差を加えることによって決定してよい。この値と等しい信号を生じる件の物質の濃度は、「検出下限」濃度である。
【０１００】
更に、蛍光部分は、最適な分析におけるその使用に合致した特性を有する。いくつかの態様において、分析は免疫測定であり、その免疫測定において、蛍光部分は抗体に結合されている；当該部分は、他の抗体もしくはタンパク質と凝集しないような特性、または必要とされる分析確度および精度に合致するよりも多くの凝集を経験しないような特性を有しなければならない。いくつかの態様において、好ましい蛍光部分は、蛍光部分、例えば、１）高い吸収係数；２）高い量子収率；３）高い光安定性（低い光退色性）；および４）件の分子（例えばタンパク質）のラベリングとの適合性の組み合わせを有し、その結果、本発明の分析器およびシステムを用いて分析し得る（例えば、件のタンパク質の沈殿、または当該部分が結合しているタンパク質の沈殿を引き起こさない）色素分子である。
【０１０１】
本発明のいくつかの態様において有用な蛍光部分、例えば単一の蛍光色素分子または複数の蛍光色素分子を、ＥＭ放射によって刺激される際のそれらの光子放出特性によって規定してよい。例えば、いくつかの態様において、本発明は蛍光部分、例えば単一の蛍光色素分子または複数の蛍光色素分子を含む部分を使用し、蛍光部分は、当該部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、平均で少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００個の光子を放出することができ、レーザーは、当該部分を含む直径約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。レーザーの出力と色素部分の曝露時間の長さとの多数の異なる組み合わせによって全エネルギーを達成してよいことが、理解されるであろう。例えば、出力１ｍＷのレーザーは３ｍｓの間使用してよく、出力３ｍＷのレーザーは１ｍｓの間使用してよく、出力６ｍＷのレーザーは０．５ｍｓの間使用してよく、出力１２ｍＷのレーザーは０．２５ｍｓの間使用してよいといったことである。
【０１０２】
いくつかの態様において、本発明は、蛍光色素部分、例えば単一の蛍光色素分子または複数の蛍光色素分子を使用し、その蛍光色素部分は、当該部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、平均で少なくとも約５０個の光子を放出することができ、レーザーは、当該部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、本発明は、蛍光色素部分、例えば単一の蛍光色素分子または複数の蛍光色素分子を使用し、その蛍光色素部分は、当該部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、平均で少なくとも約１００個の光子を放出することができ、レーザーは、当該部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、本発明は、蛍光色素部分、例えば単一の蛍光色素分子または複数の蛍光色素分子を使用し、その蛍光色素部分は、当該部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、平均で少なくとも約１５０個の光子を放出することができ、レーザーは、当該部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、本発明は、蛍光色素部分、例えば単一の蛍光色素分子または複数の蛍光色素分子を使用し、その蛍光色素部分は、当該部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、平均で少なくとも約２００個の光子を放出することができ、レーザーは、当該部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、本発明は、蛍光色素部分、例えば単一の蛍光色素分子または複数の蛍光色素分子を使用し、その蛍光色素部分は、当該部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、平均で少なくとも約３００個の光子を放出することができ、レーザーは、当該部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、本発明は、蛍光色素部分、例えば単一の蛍光色素分子または複数の蛍光色素分子を使用し、その蛍光色素部分は、当該部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、平均で少なくとも約５００個の光子を放出することができ、レーザーは、当該部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。
【０１０３】
いくつかの態様において、蛍光部分は平均で少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の蛍光成分、例えば蛍光分子を含む。いくつかの態様において、蛍光部分は、平均で約２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１以下の蛍光成分、例えば蛍光分子を含む。いくつかの態様において、蛍光部分は、平均で約１〜１１、または約２〜１０、または約２〜８、または約２〜６、または約２〜５、または約２〜４、または約３〜１０、または約３〜８、または約３〜６、または約３〜５、または約４〜１０、または約４〜８、または約４〜６、または約２、３、４、５、６、または約６より多くの蛍光成分を含む。いくつかの態様において、蛍光部分は、平均で約２〜８の結合された蛍光部分を含む。いくつかの態様において、蛍光部分は平均で約２〜６の蛍光成分を含む。いくつかの態様において、蛍光部分は平均で約２〜４の蛍光成分を含む。いくつかの態様において、蛍光部分は平均で約３〜１０の蛍光成分を含む。いくつかの態様において、蛍光部分は平均で約３〜８の蛍光成分を含む。いくつかの態様において、蛍光部分は平均で約３〜６の蛍光成分を含む。「平均」は、本発明のラベル群を代表する所定の試料であって、試料が複数の結合パートナー−蛍光部分ユニットを含有する試料において、標準的な分析方法によって測定すると、結合パートナーに対する特定の蛍光成分のモル比が、規定された数または数の範囲に一致することを意味する。例えば、ラベルが、抗体である結合パートナーと、固有の吸光度を有する複数の蛍光色素分子を含む蛍光部分とを含む態様において、ラベル溶液を適切なレベルに希釈し、タンパク質（抗体）のモル濃度を決定するために２８０ｎｍにおける吸光度を取得し、蛍光色素分子のモル濃度を決定するために、例えば（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７に対して）６５０ｎｍにおける吸光度を取得する分光光度分析が使用可能である。前者に対する後者のモル濃度の比は、各抗体に結合された蛍光部分における蛍光成分（色素分子）の平均数を表している。
【０１０４】
［１．色素］
いくつかの態様において、本発明は蛍光色素分子を含む蛍光部分を使用する。いくつかの態様において、本発明は、蛍光色素分子であって、その分子の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、平均で少なくとも約５０個の光子を放出することができる蛍光色素分子を使用し、レーザーは、その分子を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、本発明は、蛍光色素分子であって、その分子の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、平均で少なくとも約７５個の光子を放出することができる蛍光色素分子を使用し、レーザーは、その分子を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、本発明は、蛍光色素分子であって、その分子の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、平均で少なくとも約１００個の光子を放出することができる蛍光色素分子を使用し、レーザーは、その分子を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、本発明は、蛍光色素分子であって、その分子の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、平均で少なくとも約１５０個の光子を放出することができる蛍光色素分子を使用し、レーザーは、その分子を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、本発明は、蛍光色素分子であって、その分子の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、平均で少なくとも約２００個の光子を放出することができる蛍光色素分子を使用し、レーザーは、その分子を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。
【０１０５】
いくつかの態様において、本発明は、蛍光色素部分（例えば単一の蛍光色素分子または複数の蛍光色素分子）であって、当該部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、平均で少なくとも約５０個の光子を放出することができる蛍光色素部分を使用し、レーザーは、当該部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、本発明は、蛍光色素部分（例えば単一の蛍光色素分子または複数の蛍光色素分子）であって、当該部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、平均で少なくとも約１００個の光子を放出することができる蛍光色素部分を使用し、レーザーは、当該部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、本発明は、蛍光色素部分（例えば単一の蛍光色素分子または複数の蛍光色素分子）であって、当該部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、平均で少なくとも約１５０個の光子を放出することができる蛍光色素部分を使用し、レーザーは、当該部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、本発明は、蛍光色素部分（例えば単一の蛍光色素分子または複数の蛍光色素分子）であって、当該部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、平均で少なくとも約２００個の光子を放出することができる蛍光色素部分を使用し、レーザーは、当該部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、本発明は、蛍光色素部分（例えば単一の蛍光色素分子または複数の蛍光色素分子）であって、当該部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、平均で少なくとも約３００個の光子を放出することができる蛍光色素部分を使用し、レーザーは、当該部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、本発明は、蛍光色素部分（例えば単一の蛍光色素分子または複数の蛍光色素分子）であって、当該部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、平均で少なくとも約５００個の光子を放出することができる蛍光色素部分を使用し、レーザーは、当該部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。
【０１０６】
本発明の蛍光部分において用いる有用な蛍光成分の包括的でない一覧表を下記の表２に示す。いくつかの態様において、蛍光色素は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、フルオレセイン、Ｂ−フィコエリトリン、アロフィコシアニン、ＰＢＸＬ−３およびＱｄｏｔ  ６０５からなる群から選択される。いくつかの態様において、蛍光色素は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、フルオレセイン、Ｂ−フィコエリトリン、アロフィコシアニン、ＰＢＸＬ−３およびＱｄｏｔ  ６０５からなる群から選択される。
【０１０７】
【表４】
0005678045.tif 000005
【０１０８】
【表５】
0005678045.tif 000006
【０１０９】
【表６】
0005678045.tif 000007
【０１１０】
本発明において用いるのに適した色素には修飾カルボシアニン色素が含まれる。そのような修飾には、カルボシアニン色素のインドリウム環の、３位の位置における反応性基または共役物質を許容する修飾が含まれる。インドリウム環の修飾は、タンパク質、核酸および他の生体高分子において、１位の位置における窒素原子を通じて結合される、構造的に類似したカルボシアニン色素でラベリングされた共役よりも、均一に、かなり多くの蛍光を発する色素共役（または複合体）を提供する。実質的に同一の波長において構造的に類似した色素より強度の大きい蛍光放射を有すること、および生体高分子と共役した際にそれらの吸収スペクトルにおいてアーチファクトが減少することに加えて、修飾カルボシアニン色素は、構造的に類似した色素よりも、優れた光安定性、およびピーク吸光度の波長における高い吸光度（減衰係数）を有する。従って、修飾カルボシアニン色素は、修飾色素およびそれらの共役を用いた分析において、より優れた感度をもたらす。好ましい修飾色素として、少なくとも１つの置換インドリウム環系を有する化合物であって、インドリウム環の３位の炭素における置換基が化学反応性基または共役物質を含む化合物が挙げられる。他の色素化合物として、アザベンズアゾリウム環部分および少なくとも１つのスルホネート部分を包含する化合物が挙げられる。本発明の種々の態様において個々の分子を検出するのに用いられ得る修飾カルボシアニン色素は、米国特許第６，９７７，３０５号に記載されており、これは、その全体を引用することによって本明細書に組み込まれる。従って、いくつかの態様において、本発明のラベルは、置換インドリウム環系を有する蛍光色素であって、インドリウム環の３位の炭素における置換基が化学反応性基または共役物質基を含む蛍光色素を利用する。
【０１１１】
いくつかの態様において、ラベルは、１つ又はそれより多くのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）を含む蛍光部分を有する。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素は、米国特許第６，９７７，３０５号；第６，９７４，８７４号；第６，１３０，１０１号；および第６，９７４，３０５号に開示されており、これらは、その全体を引用することによって本明細書に組み込まれる。本発明のいくつかの態様は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０からなる群から選択される色素を使用する。本発明のいくつかの態様は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０からなる群から選択される色素を使用する。本発明のいくつかの態様は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０からなる群から選択される色素を使用する。本発明のいくつかの態様は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子を使用し、これは、約６５０〜６６０ｎｍの間に吸収極大を有し、約６６０〜６７０ｎｍの間に放射極大を有する。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７色素は単独で使用し、または他のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素と組み合わせて使用する。
【０１１２】
現在入手可能な有機蛍光色素は、ポリエチレン等の親水性基を加えることによりそれらの疎水性を減じることによって、改良可能である。別法として、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７色素等の現時点でスルホン化されている有機ｆｌｕｏｒは、それらを両性イオンにすることによって酸性を減じることが可能である。修飾ｆｌｕｏｒでラベリングされた抗体等の粒子は、免疫測定において表面およびタンパク質に非特異的に結合する可能性が低く、従って、より高い感度およびより低いバックグラウンドを有する分析を可能にする。単一分子を検出するシステムの感度を高めるために、蛍光色素の特性を変更（または修飾）および改良する方法は、当該技術分野において公知である。好ましくは、修飾は、高い量子収率を保持しながらストークスシフトを改良する。
【０１１３】
［２．量子ドット］
いくつかの態様において、本発明の分析器システムを用いて試料中の分子を検出するのに用いられる蛍光ラベル部分は量子ドットである。量子ドット（ＱＤ）は、半導体ナノ結晶または人工原子としても知られており、いずれの場所においても１００〜１０００の電子および２〜１０ｎｍの範囲を有する半導体結晶である。ＱＤの中には、直径が１０〜２０ｎｍであり得るものもある。ＱＤは高い量子収率を有し、それにより、それらのＱＤは光学的用途に対して特に有用である。ＱＤは、励起子の形成によって蛍光を発するフルオロフォアであり、これは、従来のフルオロフォアの励起状態に類似しているが、最大で２００ナノ秒のより長い寿命を有する。この特性は、ＱＤに低い光退色性を与える。ＱＤのエネルギーレベルは、ＱＤの寸法および形状、ならびにＱＤのポテンシャルの深さを変化させることによって制御可能である。小さい励起子ＱＤの光学的特徴の１つは着色であり、これは、ドット寸法によって決定される。ドットが大きいほど、蛍光はより赤くなり、またはより一層スペクトルの赤色端に向かう。ドットが小さいほど、スペクトルはより青くなり、またはより一層青色端に向かう。エネルギー、従って蛍光の色を規定するバンドギャップエネルギーは、ＱＤ寸法の２乗に反比例する。ＱＤが大きいほど、より狭い間隔の、より高いエネルギーレベルを有し、従って、ＱＤが、より小さいエネルギーを有する光子、即ちスペクトルの赤色端により近い光子を吸収することが可能となる。ドットの放射振動数がバンドギャップに依存するので、ドットの出力波長を非常に高精度に制御することが可能である。いくつかの態様において、単一分子分析器システムで検出されるタンパク質は、ＱＤでラベリングされる。いくつかの態様において、単一分子分析器は、１つのＱＤでラベリングされたタンパク質を検出するのに用いられ、フィルターを用いることにより、異なる波長で異なるタンパク質を検出することが可能となる。
【０１１４】
ＱＤは、広い励起特性および狭い放射特性を有し、ＱＤは、カラーフィルタリングと共に用いられる場合、唯一つの電磁波源が、１つの試料における多数のターゲットの多重分析の間に、個々の信号を解像することを必要とする。従って、いくつかの態様において、分析器システムは、１つの連続波レーザー、および各々が１つのＱＤでラベリングされた粒子を含む。コロイド状に調製されたＱＤは浮遊しており、金属配位官能基を介して種々の分子に結合し得る。これらの群には、チオール、アミン、ニトリル、ホスフィン、ホスフィンオキシド、ホスホン酸、カルボン酸または他のリガンドが含まれるが、これらに限定されない。適切な分子を表面に結合させることによって、量子ドットはほとんど全ての溶媒中に分散もしくは溶解し得、または様々な無機および有機フィルムの中に組み込まれ得る。量子ドット（ＱＤ）は、マレイミドエステルカップリング反応によってストレプトアビジンと直接カップリングし得、またはマレイミド−チオールカップリング反応によって抗体とカップリングし得る。これにより、表面に共有結合した生体分子を有する材料がもたらされ、比活性度の高い共役を形成する。いくつかの態様において、単一分子分析器で検出されるタンパク質は、１つの量子ドットでラベリングされる。いくつかの態様において、量子ドットは直径が１０〜２０ｎｍである。他の態様において、量子ドットは直径が２〜１０ｎｍである。他の態様において、量子ドットは直径が約２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、１１ｎｍ、１２ｎｍ、１３ｎｍ、１４ｎｍ、１５ｎｍ、１６ｎｍ、１７ｎｍ、１８ｎｍ、１９ｎｍまたは２０ｎｍである。有用な量子ドットには、ＱＤ６０５、ＱＤ６１０、ＱＤ６５５およびＱＤ７０５が含まれる。好ましい量子ドットはＱＤ６０５である。
【０１１５】
［Ｃ．結合パートナー−蛍光部分組成物］
一般に、本発明のラベルは、蛍光部分に結合された結合パートナー、例えば抗体を含有し、それによって、本明細書に記載の機器における検出および定量に必要な蛍光を提供する。本明細書に記載の単一分子検出器における検出に適した、結合パートナーと蛍光部分とのいずれの組み合わせも、本発明におけるラベルとして用いてよい。いくつかの態様において、本発明は、生物学的状態のマーカーに対するラベルを提供し、ラベルは、マーカーに対する抗体および蛍光部分を有する。マーカーは、上述のマーカーのいずれであってもよい。抗体は、上述のいずれの抗体であってもよい。蛍光部分は、当該部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、ラベルが平均で少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００個の光子を放出し得るように結合されてよく、レーザーは、ラベルを含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、蛍光部分は、当該部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、平均で少なくとも約５０、１００、１５０または２００個の光子を放出し得る蛍光部分であってよく、レーザーは、当該部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。蛍光部分は、置換インドリウム環系を含む構造を有する１つ又はそれより多くの色素分子であって、インドリウム環の３位の炭素における置換基が化学反応性基または共役物質基を含む色素分子を有する蛍光部分であってよい。ラベル組成物は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０からなる群から選択される１つまたはそれより多くの色素分子を有する蛍光部分を含んでよい。ラベル組成物には、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０からなる群から選択される１つまたはそれより多くの色素分子を有する蛍光部分を含んでよい。ラベル組成物は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８である１つまたはそれより多くの色素分子を有する蛍光部分を含んでよい。ラベル組成物は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５である１つまたはそれより多くの色素分子を有する蛍光部分を含んでよい。ラベル組成物は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０である１つまたはそれより多くの色素分子を有する蛍光部分を含んでよい。ラベル組成物は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７である１つまたはそれより多くの色素分子を有する蛍光部分を含んでよい。ラベル組成物は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０である１つまたはそれより多くの色素分子を有する蛍光部分を含んでよい。ラベル組成物は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００である１つまたはそれより多くの色素分子を有する蛍光部分を含んでよい。ラベル組成物は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕ���ｒ  ７５０である１つまたはそれより多くの色素分子を有する蛍光部分を含んでよい。
【０１１６】
いくつかの態様において、本発明は、生物学的状態のマーカーを検出するための組成物を提供し、その組成物は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ分子、例えば、マーカーに対して特異的な抗体に結合されるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子等の記載された群から選択されるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ分子を含有する。いくつかの態様において、組成物は、平均で約１〜１１、または約２〜１０、または約２〜８、または約２〜６、または約２〜５、または約２〜４、または約３〜１０、または約３〜８、または約３〜６、または約３〜５、または約４〜１０、または約４〜８、または約４〜６、または約２、３、４、５、６、または約６より多くの、マーカーに対する抗体に結合されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子を含有する。いくつかの態様において、本発明は、生物学的状態のマーカーを検出するための組成物を提供し、その組成物は、平均で約１〜１１、または約２〜１０、または約２〜８、または約２〜６、または約２〜５、または約２〜４、または約３〜１０、または約３〜８、または約３〜６、または約３〜５、または約４〜１０、または約４〜８、または約４〜６、または約２、３、４、５、６、または約６より多くの、マーカーに対して特異的な抗体に結合されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子を含有する。いくつかの態様において、本発明は生物学的状態のマーカーを検出するための組成物を提供し、その組成物は、平均で約２〜１０の、マーカーに対して特異的な抗体に結合されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子を含有する。いくつかの態様において、本発明は生物学的状態のマーカーを検出するための組成物を提供し、その組成物は、平均で約２〜８の、マーカーに対して特異的な抗体に結合されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子を含有する。いくつかの態様において、本発明は生物学的状態のマーカーを検出するための組成物を提供し、その組成物は、平均で約２〜６の、マーカーに対して特異的な抗体に結合されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子を含有する。いくつかの態様において、本発明は生物学的状態のマーカーを検出するための組成物を提供し、その組成物は、平均で約２〜４の、マーカーに対して特異的な抗体に結合されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子を含有する。いくつかの態様において、本発明は生物学的状態のマーカーを検出するための組成物を提供し、その組成物は、平均で約３〜８の、マーカーに対して特異的な抗体に結合されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子を含有する。いくつかの態様において、本発明は生物学的状態のマーカーを検出するための組成物を提供し、その組成物は、平均で約３〜６の、マーカーに対して特異的な抗体に結合されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子を含有する。いくつかの態様において、本発明は生物学的状態のマーカーを検出するための組成物を提供し、その組成物は、平均で約４〜８の、マーカーに対して特異的な抗体に結合されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子を含有する。
【０１１７】
蛍光部分または蛍光部分を構成する蛍光成分の、結合パートナー（例えば抗体）との結合は、任意の適切な方法によるものであってよい；そのような方法は当該技術分野においてよく知られており、例示的方法は実施例において示される。いくつかの態様において、蛍光部分を結合パートナーに結合させて、本発明の方法において用いるラベルを形成した後に、かつ件のタンパク質をラベリングするのにそのラベルを使用する前に、濾過工程を行うことが有用である。例えば、抗体−色素ラベルを、使用前に、例えば０．２ミクロンのフィルターまたは凝集体を除去するための任意の適切なフィルターを用いて濾過してよい。本発明の分析において使用する他の試薬もまた、例えば０．２ミクロンのフィルターまたは任意の適切なフィルターを用いて濾過してよい。理論に拘束されることなく、そのような濾過によって、例えば抗体−色素ラベルの凝集体の一部が除去されると考えられる。そのような凝集体はユニットとして件のタンパク質に結合し得るが、溶出緩衝液に放出すると分散される（またはバラバラになる）可能性があるので、偽陽性が生じることがある；即ち、唯１つの件のタンパク質分子に結合した凝集体から、複数のラベルが検出されるだろう。理論にかかわらず、濾過によって、その後の分析における偽陽性が減少し、かつ確度および精度が改善されることがわかった。
【０１１８】
免疫測定はサンドウィッチ形式をしばしば採用し、そのサンドウィッチ形式において、同じ分子（例えばマーカー）に対する結合パートナーのペア（例えば抗体）が用いられることが理解されるであろう。本発明は、結合パートナーのペア（例えば抗体）も包含し、両方の抗体は同じ分子、例えば同じマーカーに対して特異的であり、ペアの少なくとも一方の要素は、本明細書に記載のラベルである。従って、結合パートナーおよび蛍光部分を有する任意のラベルに関して、本発明は、結合パートナーのペアであって、、第１の結合パートナー（例えば抗体）はラベルの一部であり、第２の結合パートナー（例えば抗体）は通常はラベリングされておらず、捕捉結合パートナーとしてはたらく結合パートナーのペアも包含する。更に、結合パートナーのペアは、ＦＲＥＴ分析において頻繁に用いられる。本発明において有用なＦＲＥＴ分析が米国特許出願第１１／０４８，６６０号に記載されており、その全体を引用することによって本明細書に組み込まれ、また、本発明は、各々がＦＲＥＴラベルを含む結合パートナーのペアも包含する。
【０１１９】
［ＩＶ．分子の高感度分析］
一の要旨において、本発明は、試料中の単一分子、例えば生物学的状態のマーカー分子の存在または不存在を、ｉ）分子が存在する場合、その分子をラベルでラベリングすること；およびｉｉ）ラベルの存在または不存在を検出することによって決定する方法を提供し、ラベルの存在の検出は、試料中に単一分子が存在していることを示す。いくつかの態様において、本方法は、約１００、８０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０５、０．０１、０．００５または０．００１フェムトモル濃度より小さい検出限界で分子を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１００フェムトモル濃度より小さい検出限界で分子を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１０フェムトモル濃度より小さい検出限界で分子を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１フェムトモル濃度より小さい検出限界で分子を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．１フェムトモル濃度より小さい検出限界で分子を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０１フェムトモル濃度より小さい検出限界で分子を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００１フェムトモル濃度より小さい検出限界で分子を検出することができる。検出限界は、適切な標準物質、例えば米国国立標準技術研究所の参照標準物質を用いることによって規定してよい。
【０１２０】
本方法は、試料中の分子の単一分子を検出することによって、試料中の分子、例えば生物学的状態を示すマーカーの濃度を決定する方法も提供する。単一分子を「検出すること」には、分子を直接的に又は間接的に検出することが含まれる。間接的検出の場合において、単一分子に対応するラベル、例えば単一分子に結合されるラベルを検出し得る。
【０１２１】
いくつかの態様において、本発明は、生物学的試料中のタンパク質の単一分子の存在または不存在を決定する方法を提供し、その方法は、前記分子をラベルでラベリングすること、および単一分子検出器において前記ラベルの存在または不存在を検出することを含み、ラベルは、蛍光部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、少なくとも約２００個の光子を放出し得る蛍光部分を含み、レーザーは、当該部分を含む直径約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、単一分子検出器は、１つ以下のインタロゲーション・スペースを含んでよい。試料中の単一分子の検出限界は、約１０、１、０．１、０．０１または０．００１フェムトモル濃度より小さくてよい。いくつかの態様において、検出限界は約１フェムトモル濃度より小さい。検出は、前記蛍光部分によって放射される電磁放射線の検出を含んでよい。本方法は、電磁放射線、例えばレーザー（約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ｍＷの出力を有するレーザー等）によって与えられる電磁放射線に、前記蛍光部分を曝すことを更に含む。いくつかの態様において、レーザーによる刺激は、約１０〜１０００マイクロ秒、または約１０００、２５０、１００、５０、２５または１０マイクロ秒の間、インタロゲーション・スペースに光を供給する。いくつかの態様において、ラベルは、前記分子を結合するのに特異的な結合パートナー、抗体等を更に含む。いくつかの態様において、蛍光部分は蛍光色素分子（少なくとも１つの置換インドリウム環系を有する色素分子であって、インドリウム環の３位の炭素における置換基が化学反応性基または共役物質を含む色素分子等）を有する。いくつかの態様において、色素分子は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００からなる群から選択されるＡｌｅｘＦｌｕｏｒ分子である。いくつかの態様において、色素分子はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７色素分子である。いくつかの態様において、蛍光部分は複数のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子を含む。いくつかの態様において、複数のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子は約２〜４のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子、または約３〜６のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子を含む。いくつかの態様において、蛍光部分は量子ドットである。本方法は、試料中の前記タンパク質の濃度測定を更に含んでよい。
【０１２２】
いくつかの態様において、前記ラベルの存在または不存在の検出は以下の工程を含む：（ｉ）インタロゲーション・スペースを通して前記試料の一部を移動させる工程；（ｉｉ）前記インタロゲーション・スペースを電磁放射線に曝露させる工程であって、前記ラベルが存在する場合、前記電磁放射線は、前記蛍光部分を刺激して光子を放出させるのに十分である工程；および（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の前記曝露の間に放出される光子を検出する工程。本方法は、前記インタロゲーション・スペースにおけるバックグラウンド光子レベルを決定する工程を更に含んでよく、前記バックグラウンドレベルは、インタロゲーション・スペースが工程（ｉｉ）と同じ方法で電磁放射線に付されるがインタロゲーション・スペースにラベルが存在しない場合の、インタロゲーション・スペースの平均光子放出を表している。本発明は、工程（ｉｉｉ）において検出される光子の量を閾値光子レベルと比較する工程を更に含んでよく、前記閾値光子レベルは、前記バックグラウンド光子レベルの関数であり、工程（ｉｉｉ）において検出される、閾値レベルの光子量より多い光子量は、前記ラベルの存在を意味し、工程（ｉｉｉ）において検出される、閾値レベルに等しい又はそれより少ない光子の量は、前記ラベルが存在しないことを意味する。
【０１２３】
［Ａ．試料］
試料は任意の適切な試料であってよい。通常、試料は生物学的試料、例えば生物学的液体（または流体）である。そのような液体には、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）、血液、血清、血漿、尿、鼻腔スワブ、脳脊髄液、胸膜液、滑液、腹水、羊水、胃液、リンパ液、間質液、組織ホモジネート、細胞抽出物、唾液、痰、便、生理学的分泌物、涙液、粘液、汗、母乳、精液、精漿、膣分泌物、潰瘍ならびに他の表面皮疹、水疱および膿瘍からの液体、ならびに生体の正常組織、悪性組織および疑わしい組織、または目標とする件の粒子を含み得る他の何らかの身体構成要素の生検を含む組織抽出物が含まれるが、これらに限定されない。細胞もしくは組織培養物または培養ブロス等の他の同様の検体も対象となる。
【０１２４】
いくつかの態様において、試料は血液試料である。いくつかの態様において、試料は血漿試料である。いくつかの態様において、試料は血清試料である。いくつかの態様において、試料は尿試料である。いくつかの態様において、試料は鼻腔スワブである。いくつかの態様において、試料は細胞溶解物である。いくつかの態様において、試料は組織試料である。
【０１２５】
［Ｂ．試料調製］
一般に、件の分子、例えば測定すべき生物学的状態のマーカーに対応するラベルを製造するいずれの試料調製方法を用いてもよく、この方法において、ラベルは、本明細書に記載の機器において検出可能である。当該技術分野において知られているように、１つ又はそれより多くの分子にラベルを加える試料調製は、均一または不均一形式で行ってよい。いくつかの態様において、試料調製は均一形式で構成される。均一形式を採用する分析器システムにおいて、結合していないラベルは試料から除去されない。例えば米国特許出願第１１／０４８，６６０号を参照のこと。いくつかの態様において、件の１つの粒子または複数の粒子は、件の１つの粒子または複数の粒子に結合する、ラベリングされた１つの抗体または複数の抗体を加えることによってラベリングされる。
【０１２６】
いくつかの態様において、不均一分析形式が用いられ、この形式において、結合していないラベルを除去するための工程が通常採用される。そのような分析形式は、当該技術分野においてよく知られている。一の特に有用な分析形式はサンドウィッチ・アッセイ、例えばサンドウィッチ免疫測定である。この形式において、件の分子、例えば生物学的状態のマーカーが、捕捉結合パートナーを用いて、例えば固体支持体上で捕捉される。その後、不要な分子および他の物質を場合により洗い落としてよく、次いで、検出結合パートナーおよび検出可能なラベル、例えば蛍光部分を有するラベルを結合する。更に洗浄して、結合していないラベルを除去し、その後、検出可能ラベルは通常、検出結合パートナーに必ずしも未だ結合されていないが、検出可能なラベルが放出される。別の態様において、試料およびラベルは、間に洗浄することなく、例えば同時に、捕捉結合パートナーに加えられる。他の変更は当業者に明らかだろう。
【０１２７】
いくつかの態様において、件の分子、例えば生物学的状態のマーカーを検出する方法は、抗体、例えばモノクローナル抗体を捕捉結合パートナーとして用いるサンドウィッチ・アッセイを用いる。この方法は、試料中の分子を、結合表面に固定化された捕捉抗体に結合すること、および検出抗体を含むラベルをその分子に結合して「サンドウィッチ」複合体を形成することを含む。本明細書に記載されているように、ラベルは検出抗体および蛍光部分を含有し、例えば本発明の単一分子分析器を用いて検出される。捕捉抗体および検出抗体の両方が分子に特異的に結合する。サンドウィッチ免疫測定の多数の例が公知であり、いくつかはＧｒｕｂｂらの米国特許第４，１６８，１４６号およびＴｏｍらの米国特許第４，３６６，２４１号に記載されており、この両方は引用することにより本明細書に組み込まれる。特定のマーカーに特有の更なる例は実施例に記載する。
【０１２８】
捕捉結合パートナーは、固体支持体、例えばマイクロタイタープレートまたは常磁性ビーズと結合してよい。いくつかの態様において、本発明は、常磁性ビーズに結合された、件の分子、例えば生物学的状態のマーカーに対する結合パートナーを提供する。捕捉することが望まれる分子に対して特異的な任意の適切な結合パートナーを用いてよい。結合パートナーは抗体、例えばモノクローナル抗体であってよい。抗体の製造および供給源は本明細書の他の箇所に記載されている。本明細書において捕捉抗体として有用であると同定された抗体は検出抗体としても有用であり得、逆もまた真であることが理解されるであろう。
【０１２９】
結合パートナー（例えば抗体）の、固体支持体への結合は、共有結合または非共有結合であってよい。いくつかの態様において、結合は非共有結合である。当該技術分野においてよく知られている非共有結合の一例は、ビオチン−アビジン／ストレプトアビジン相互作用である。従って、いくつかの態様において、固体支持体、例えばマイクロタイタープレートまたは常磁性ビーズは、非共有結合、例えばビオチン−アビジン／ストレプトアビジン相互作用によって、捕捉結合パートナー、例えば抗体に結合される。いくつかの態様において、結合は共有結合である。従って、いくつかの態様において、固体支持体、例えばマイクロタイタープレートまたは常磁性ビーズは、共有結合によって捕捉結合パートナー、例えば抗体に結合される。
【０１３０】
捕捉抗体は、件の分子の捕捉を最適化する方向で共有結合され得る。例えば、いくつかの態様において、結合パートナー、例えば抗体は、固体支持体、例えばマイクロタイタープレートまたは常磁性微粒子に対して配向した形式で結合される。
【０１３１】
固体支持体に対する抗体の配向性結合のための例示的プロトコルは以下の通りである：ＩｇＧをｐＨ５．５の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液に溶解させて、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度にする。等体積の氷冷した０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を加える。ＩｇＧを氷上で１／２時間酸化させる。過剰な過ヨウ素酸試薬を、０．１５体積の１Ｍグリセロールを加えることによって急冷する。酸化反応の低分子量副生成物を、限外濾過によって除去する。酸化されたＩｇＧフラクションを適切な濃度（通常は１ｍｌ当たり０．５マイクログラムのＩｇＧ）に希釈し、室温で少なくとも２時間、ヒドラジドで活性化されたマルチウェルプレートと反応させる。結合していないＩｇＧは、ホウ酸塩緩衝生理食塩水または別の適切な緩衝液でマルチウェルプレートを洗浄することによって除去される。必要に応じて、保管のためにプレートを乾燥させてよい。マイクロビーズの材料がそのような結合に適している場合、マイクロビーズに関して同様のプロトコルに従ってよい。
【０１３２】
いくつかの態様において、固体支持体はマイクロタイタープレートである。いくつかの態様において、固体支持体は常磁性ビーズである。一の例示的常磁性ビーズはストレプトアビジンＣ１（Ｄｙｎａｌ、６５０．０１−０３）である。他の適切なビーズは当業者に明らかであろう。抗体を常磁性ビーズに結合させる方法は、当該技術分野においてよく知られている。一例を実施例２に示す。
【０１３３】
件の分子は、捕捉結合パートナー、例えば固体支持体に固定化された捕捉抗体に接触する。いくつかの試料調製を用いてよい；例えば血液試料からの血清の調製、または試料が捕捉抗体に接触する前の濃縮工程。免疫測定においてタンパク質を結合するためのプロトコルは当該技術分野においてよく知られており、実施例に含まれる。
【０１３４】
結合が許容される時間は、条件に応じて変化するだろう；いくつかの状況、特に臨床状況において、より短い結合時間が望ましいことは明らかであろう。例えば常磁性ビーズの使用が、結合に要する時間を減少させ得る。いくつかの態様において、捕捉結合パートナー、例えば抗体に対する件の分子の結合が許容される時間は、約１２、１０、８、６、４、３、２もしくは１時間より短く、または約６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０もしくは５分より短い。いくつかの態様において、捕捉結合パートナー、例えば抗体に対する件の分子の結合が許容される時間は、約６０分より短い。いくつかの態様において、捕捉結合パートナー、例えば抗体に対する件の分子の結合が許容される時間は、約４０分より短い。いくつかの態様において、捕捉結合パートナー、例えば抗体に対する件の分子の結合が許容される時間は、約３０分より短い。いくつかの態様において、捕捉結合パートナー、例えば抗体に対する件の分子の結合が許容される時間は、約２０分より短い。いくつかの態様において、捕捉結合パートナー、例えば抗体に対する件の分子の結合が許容される時間は、約１５分より短い。いくつかの態様において、捕捉結合パートナー、例えば抗体に対する件の分子の結合が許容される時間は、約１０分より短い。いくつかの態様において、捕捉結合パートナー、例えば抗体に対する件の分子の結合が許容される時間は、約５分より短い。
【０１３５】
いくつかの態様において、捕捉結合パートナー、例えば捕捉抗体に対する件の分子の粒子の結合の後に、非特異的に結合された粒子および試料中の他の望ましくない物質を洗い流して、特異的に結合した件の分子の粒子のみを実質的に残す。他の態様において、試料の追加とラベルの追加との間に洗浄を行わず、このことは試料調製時間を短縮し得る。従って、いくつかの態様において、捕捉結合パートナー、例えば抗体に対する件の分子の結合と、件の分子に対するラベルの結合の両方が許容される時間は、約１２、１０、８、６、４、３、２もしくは１時間より短く、または約６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０もしくは５分より短い。いくつかの態様において、捕捉結合パートナー、例えば抗体に対する件の分子の結合と、件の分子に対するラベルの結合の両方が許容される時間は、約６０分より短い。いくつかの態様において、捕捉結合パートナー、例えば抗体に対する件の分子の結合と、件の分子に対するラベルの結合の両方が許容される時間は、約５０分より短い。いくつかの態様において、捕捉結合パートナー、例えば抗体に対する件の分子の結合と、件の分子に対するラベルの結合の両方が許容される時間は、約４０分より短い。いくつかの態様において、捕捉結合パートナー、例えば抗体に対する件の分子の結合と、件の分子に対するラベルの結合の両方が許容される時間は、約３０分より短い。いくつかの態様において、捕捉結合パートナー、例えば抗体に対する件の分子の結合と、件の分子に対するラベルの結合の両方が許容される時間は、約２０分より短い。いくつかの態様において、捕捉結合パートナー、例えば抗体に対する件の分子の結合と、件の分子に対するラベルの結合の両方が許容される時間は、約１５分より短い。いくつかの態様において、捕捉結合パートナー、例えば抗体に対する件の分子の結合と、件の分子に対するラベルの結合の両方が許容される時間は、約１０分より短い。いくつかの態様において、捕捉結合パートナー、例えば抗体に対する件の分子の結合と、件の分子に対するラベルの結合の両方が許容される時間は、約５分より短い。
【０１３６】
件の分子を測定するのに用いられる捕捉および信号抗体を含むいくつかの免疫測定診断試薬は、動物血清に由来し得る。他の種の免疫グロブリンに結合する能力を有する内因性ヒト異好性抗体またはヒト抗動物抗体は、１０％より多くの患者の血清または血漿中に存在する。これらの血中異好性抗体は、免疫測定法を妨げ得る。サンドウィッチ免疫測定において、これらの異好性抗体は、捕捉抗体と検出（診断）抗体とを架橋し得、それによって偽陽性信号が生じ、あるいは、これらの異好性抗体は、診断抗体の結合を阻害し得、それによって偽陰性信号が生じる。競合免疫測定において、異好性抗体は、分析抗体に結合し得、件の分子に対するその分析抗体の結合を阻害し得る。異好性抗体は、特に抗種（ａｎｔｉｓｐｅｃｉｅｓ）抗体が分離システムにおいて用いられる場合、遊離した件の分子からの抗体−件の分子複合体の分離を阻害し得、または増加させ得る。従って、これらの異好性抗体の妨害の影響は予測困難であり、異好性抗体の結合を阻害することが好都合であり得る。本発明のいくつかの態様において、免疫測定は、１つ又はそれより多くの異好性抗体阻害剤を用いて、試料から異好性抗体を激減させる工程を含む。免疫測定において試験すべき試料から異好性抗体を除去する方法は公知であり、以下の工程を含む：標本を、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中で９０℃にて１５分間加熱し、１２００ｇで１０分間遠心分離する；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて異好性免疫グロブリンを沈殿させる；タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇを用いて標本から妨害異好性免疫グロブリンを免疫抽出する；または非免疫マウスＩｇＧを加える。本発明の方法の態様は、単一分子検出器による分析の前の試料調製を検討する。前処理方法の妥当性を決定し得る。異好性抗体によって引き起こされる免疫測定の妨害を最小にするための生化学薬品が、市場で入手可能である。例えば、ＭＡＫ３３と呼ばれる製品は、ｈ−ＣＫ−ＭＭに対するＩｇＧ１モノクローナル抗体であり、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手可能である。ＭＡＫ３３  ｐｌｕｓ製品は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ１−Ｆａｂの組み合わせを含有する。ｐｏｌｙＭＡＫ３３はＩｇＧ１と共に重合されたＩｇＧ１−Ｆａｂを含有し、ｐｏｌｙＭＡＣ  ２ｂ／２ａはＩｇＧ２ｂと共に重合されたＩｇＧ２ａ−Ｆａｂを含有する。Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．（ニューヨーク州イーストメドウ）は、免疫グロブリン阻害試薬として知られている異好性抗体を無効化（または失活）させるための生化学薬品の第２の商業的供給源を商っている。この製品は、多数の種、主にＢａｌｂ／ｃマウスからのマウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３からの免疫グロブリン（ＩｇＧおよびＩｇＭ）の製剤である。いくつかの態様において、異好性抗体は、当該技術分野において公知の方法を用いて、例えば妨害抗体をタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇに結合させることにより試料中の異好性抗体試料を激減させることによって、試料から免疫抽出され得る。いくつかの態様において、異好性抗体は、１つ又はそれより多くの異好性抗体阻害剤を用いて無効化可能である。異好性阻害剤は、抗アイソタイプ異好性抗体阻害剤、抗イディオ���イプ異好性抗体阻害剤および抗−抗イディオタイプ異好性抗体阻害剤からなる群から選択され得る。いくつかの態様において、異好性抗体阻害剤の組み合わせが使用可能である。
【０１３７】
ラベルは、試料の添加および洗浄と共に、またはその後に加える。抗体および他の免疫ラベルをタンパク質および他の分子に結合するためのプロトコルは、当該技術分野においてよく知られている。ラベル結合工程が捕捉結合工程から独立している場合、ラベルの結合が許容される時間は、例えば臨床的用途または他の時間に敏感な設定において重要であり得る。いくつかの態様において、ラベル、例えば抗体−色素に対する件の分子の結合が許容される時間は、約１２、１０、８、６、４、３、２もしくは１時間より短く、または約６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０もしくは５分より短い。いくつかの態様において、ラベル、例えば抗体−色素に対する件の分子の結合が許容される時間は、約６０分より短い。いくつかの態様において、ラベル、例えば抗体−色素に対する件の分子の結合が許容される時間は、約５０分より短い。いくつかの態様において、ラベル、例えば抗体−色素に対する件の分子の結合が許容される時間は、約４０分より短い。いくつかの態様において、ラベル、例えば抗体−色素に対する件の分子の結合が許容される時間は、約３０分より短い。いくつかの態様において、ラベル、例えば抗体−色素に対する件の分子の結合が許容される時間は、約２０分より短い。いくつかの態様において、ラベル、例えば抗体−色素に対する件の分子の結合が許容される時間は、約１５分より短い。いくつかの態様において、ラベル、例えば抗体−色素に対する件の分子の結合が許容される時間は、約１０分より短い。いくつかの態様において、ラベル、例えば抗体−色素に対する件の分子の結合が許容される時間は、約５分より短い。過剰なラベルを洗浄によって除去する。
【０１３８】
いくつかの態様において、ラベルは件のタンパク質から溶出されない。他の態様において、ラベルは件のタンパク質から溶出される。好ましい溶出緩衝液は、有意なバックグラウンドが生じることなくラベルを放出するのに有効である。溶出緩衝液が静菌性である場合が有用である。本発明において用いられる溶出緩衝液は、カオトロープ、緩衝液、マイクロタイタープレートの表面を覆うためのアルブミンおよび比較的低いバックグラウンドを生じる様に選択される界面活性剤を含み得る。カオトロープには、尿素、グアニジン化合物、または他の有用なカオトロープが含まれ得る。緩衝液には、ホウ酸塩緩衝生理食塩水または他の有用な緩衝液が含まれ得る。タンパク質キャリアには、例えばアルブミン（ヒト、ウシまたは魚アルブミン等）、ＩｇＧ、または他の有用なキャリアが含まれ得る。界面活性剤には、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）その他を含むイオン性または非イオン性洗剤が含まれ得る。
【０１３９】
もう１つの態様において、固相結合分析は、競合的結合分析であり得る。そのような方法の１つは以下の通りである。第１に、結合表面において固定化された捕捉抗体が、ｉ）試料中の件の分子、例えば生物学的状態のマーカー、およびｉｉ）検出可能なラベルを含む分子（検出試薬）のラベリングされた類似物によって競合的に結合される。第２に、単一分子分析器を用いてラベルの量を測定する。もう１つのそのような方法は以下の通りである。第１に、検出可能なラベルを有する抗体（検出試薬）を、ｉ）試料中の件の分子、例えば生物学的状態のマーカー、およびｉｉ）結合表面に固定化された分子（捕捉試薬）の類似物と、競合的に結合させる。第２に、単一分子分析器を用いてラベルの量を測定する。本明細書において、「分子の類似物」は、捕捉抗体に結合させるための分子と競合する種を意味する。競合免疫測定の例は、Ｄｅｕｔｓｃｈらの米国特許第４，２３５，６０１号、Ｌｉｏｔｔａの米国特許第４，４４２，２０４号およびＢｕｅｃｈｌｅｒらの米国特許第５，２０８，５３５号に開示されており、それらの全ては引用することによって本明細書に組み込まれる。
【０１４０】
［Ｃ．件の分子の検出および濃度の測定］
溶出の後に、ラベルは、例えば溶出緩衝液中で、単一分子検出器を通って流れる。処理試料は、ラベルを含まなくてよく、単一のラベルを含んでよく、または複数のラベルを含んでよい。ラベルの数は、捕捉工程の間に捕捉された件の分子、例えば生物学的状態のマーカーの分子数に一致または比例（試料の希釈またはフラクションが用いられる場合）する。
【０１４１】
件の分子と共に用いられるラベルを検出し得るいずれの適切な単一分子検出器を用いてもよい。適切な単一分子検出器は本明細書に記載されている。通常、検出器は、調製された試料をサンプリングするための自動サンプラー、および場合により試料を回収するための回収システムを有するシステムの一部であろう。
【０１４２】
いくつかの態様において、処理試料は、キャピラリーフローシステムを利用する単一分子分析器において分析され、その単一分子分析器は、キャピラリーフローセル、処理試料が通過するキャピラリー内のインタロゲーション・スペースを照射するためのレーザー、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するための検出器、およびインタロゲーション・スペースを通って処理試料を移動させるための駆動力源を有する。いくつかの態様において、単一分子分析器は、処理試料がインタロゲーション・スペースを通って移動する際にその処理試料から放射される光を集光する顕微鏡対物レンズ、例えば高開口数の顕微鏡対物レンズを更に有する。いくつかの態様において、レーザーおよび検出器は共焦点配置にある。いくつかの態様において、レーザーは連続波レーザーである。いくつかの態様において、検出器はアバランシェフォトダイオード検出器である。いくつかの態様において、駆動力源は圧力を供給するためのポンプである。いくつかの態様において、本発明は、複数の試料を自動的にサンプリングし得るサンプリングシステムであって、試料容器とインタロゲーション・スペースとの間の流体連結を与えるサンプリングシステムを有する分析器システムを提供する。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは約０．００１〜５００ｐＬ、または約０．０１ｐＬ〜１００ｐＬ、または約０．０１ｐＬ〜１０ｐＬ、または約０．０１ｐＬ〜５ｐＬ、または約０．０１ｐＬ〜０．５ｐＬ、または約０．０２ｐＬ〜約３００ｐＬ、または約０．０２ｐＬ〜約５０ｐＬ、または約０．０２ｐＬ〜約５ｐＬ、または約０．０２ｐＬ〜約０．５ｐＬ、または約０．０２ｐＬ〜約２ｐＬ、または約０．０５ｐＬ〜約５０ｐＬ、または約０．０５ｐＬ〜約５ｐＬ、または約０．０５ｐＬ〜約０．５ｐＬ、または約０．０５ｐＬ〜約０．２ｐＬ、または約０．１ｐＬ〜約２５ｐＬの体積を有する。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは約０．００４ｐＬ〜１００ｐＬの体積を有する。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは、約０．０２ｐＬ〜５０ｐＬの体積を有する。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは約０．００１ｐＬ〜１０ｐＬの体積を有する。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは約０．００１ｐＬ〜１０ｐＬの体積を有する。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは約０．０１ｐＬ〜５ｐＬの体積を有する。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは約０．０２ｐＬ〜約５ｐＬの体積を有する。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは約０．０５ｐＬ〜５ｐＬの体積を有する。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは約０．０５ｐＬ〜１０ｐＬの体積を有する。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは約０．５ｐＬ〜約５ｐＬの体積を有する。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは約０．０２ｐＬ〜約０．５ｐＬの体積を有する。
【０１４３】
いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは約１μｍ３より大きい、約２μｍ３より大きい、約３μｍ３より大きい、約４μｍ３より大きい、約５μｍ３より大きい、約１０μｍ３より大きい、約１５μｍ３より大きい、約３０μｍ３より大きい、約５０μｍ３より大きい、約７５μｍ３より大きい、約１００μｍ３より大きい、約１５０μｍ３より大きい、約２００μｍ３より大きい、約２５０μｍ３より大きい、約３００μｍ３より大きい、約４００μｍ３より大きい、約５００μｍ３より大きい、約５５０μｍ３より大きい、約６００μｍ３より大きい、約７５０μｍ３より大きい、約１０００μｍ３より大きい、約２０００μｍ３より大きい、約４０００μｍ３より大きい、約６０００μｍ３より大きい、約８０００μｍ３より大きい、約１００００μｍ３より大きい、約１２０００μｍ３より大きい、約１３０００μｍ３より大きい、約１４０００μｍ３より大きい、約１５０００μｍ３より大きい、約２００００μｍ３より大きい、約３００００μｍ３より大きい、約４００００μｍ３より大きい、または約５００００μｍ３より大きい体積を有する。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは、体積が約５００００μｍ３より小さく、約４００００μｍ３より小さく、約３００００μｍ３より小さく、約２００００μｍ３より小さく、約１５０００μｍ３より小さく、約１４０００μｍ３より小さく、約１３０００μｍ３より小さく、約１２０００μｍ３より小さく、約１１０００μｍ３より小さく、約９５００μｍ３より小さく、約８０００μｍ３より小さく、約６５００μｍ３より小さく、約６０００μｍ３より小さく、約５０００μｍ３より小さく、約４０００μｍ３より小さく、約３０００μｍ３より小さく、約２５００μｍ３より小さく、約２０００μｍ３より小さく、約１５００μｍ３より小さく、約１０００μｍ３より小さく、約８００μｍ３より小さく、約６００μｍ３より小さく、約４００μｍ３より小さく、約２００μｍ３より小さく、約１００μｍ３より小さく、約７５μｍ３より小さく、約５０μｍ３より小さく、約２５μｍ３より小さく、約２０μｍ３より小さく、約１５μｍ３より小さく、約１４μｍ３より小さく、約１３μｍ３より小さく、約１２μｍ３より小さく、約１１μｍ３より小さく、約１０μｍ３より小さく、約５μｍ３より小さく、約４μｍ３より小さく、約３μｍ３より小さく、約２μｍ３より小さく、または約１μｍ３より小さい。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースの体積は、約１μｍ３〜約１００００μｍ３である。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは、約１μｍ３〜約１０００μｍ３である。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは、約１μｍ３〜約１００μｍ３である。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは、約１μｍ３〜約５０μｍ３である。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは、約１μｍ３〜約１０μｍ３である。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは、約２μｍ３〜約１０μｍ３である。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは、約３μｍ３〜約７μｍ３である。
【０１４４】
いくつかの態様において、本発明の方法において用いられる単一分子検出器はキャピラリーフローシステムを利用し、かつキャピラリーフローセルと、処理試料が通過するキャピラリーの中のインタロゲーション・スペースを照射するための連続波レーザーと、処理試料がインタロゲーション・スペースを通過する際にその処理試料から放射される光を集光する高開口数顕微鏡対物レンズと、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアバランシェフォトダイオード検出器と、インタロゲーション・スペースを通って処理試料を移動させるための圧力を提供するポンプとを有し、インタロゲーション・スペースは約０．０２ｐＬ〜約５０ｐＬである。いくつかの態様において、本発明の方法において用いられる単一分子検出器はキャピラリーフローシステムを利用し、かつキャピラリーフローセルと、処理試料が通過するキャピラリーの中のインタロゲーション・スペースを照射するための連続波レーザーと、処理試料がインタロゲーション・スペースを通過する際にその処理試料から放射される光を集光する高開口数顕微鏡対物レンズ（レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する）と、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアバランシェフォトダイオード検出器と、インタロゲーション・スペースを通って処理試料を移動させるための圧力を提供するポンプとを有し、インタロゲーション・スペースは約０．００４ｐＬ〜約１００ｐＬである。いくつかの態様において、本発明の方法において用いられる単一分子検出器はキャピラリーフローシステムを利用し、かつキャピラリーフローセルと、処理試料が通過するキャピラリーの中のインタロゲーション・スペースを照射するための連続波レーザーと、処理試料がインタロゲーション・スペースを通過する際にその処理試料から放射される光を集光する高開口数顕微鏡対物レンズ（レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する）と、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアバランシェフォトダイオード検出器と、インタロゲーション・スペースを通って処理試料を移動させるための圧力を提供するポンプとを有し、インタロゲーション・スペースは約０．０５ｐＬ〜約１０ｐＬである。いくつかの態様において、本発明の方法において用いられる単一分子検出器はキャピラリーフローシステムを利用し、かつキャピラリーフローセルと、処理試料が通過するキャピラリーの中のインタロゲーション・スペースを照射するための連続波レーザーと、処理試料がインタロゲーション・スペースを通過する際にその処理試料から放射される光を集光する高開口数顕微鏡対物レンズ（レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する）と、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアバランシェフォトダイオード検出器と、インタロゲーション・スペースを通って処理試料を移動させるための圧力を提供するポンプとを有し、インタロゲーション・スペースは約０．０５ｐＬ〜約５ｐＬである。いくつかの態様において、本発明の方法において用いられる単一分子検出器はキャピラリーフローシステムを利用し、かつキャピラリーフローセルと、処理試料が通過するキャピラリーの中のインタロゲーション・スペースを照射するための連続波レーザーと、処理試料がインタロゲーション・スペースを通過する際にその処理試料から放射される光を集光する高開口数顕微鏡対物レンズ（レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する）と、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアバランシェフォトダイオード検出器と、インタロゲーション・スペースを通って処理試料を移動させるための圧力を提供するポンプとを有し、インタロゲーション・スペースは約０．５ｐＬ〜約５ｐＬである。これらの態様のいずれにおいても、分析器は最大で１つのインタロゲーション・スペースを含んでよい。
【０１４５】
いくつかの態様において、２００８年１２月１８日に出願された米国特許出願第１２／３３８，９５５号（発明の名称「単一分子検出のための走査分析器および使用方法」）に開示されているように、単一分子検出器は走査分析器システムを有する。いくつかの態様において、本発明の方法において用いられる単一分子検出器は、試料プレート、試料が入っている試料プレートに向けられる連続波レーザー、インタロゲーション・スペースが試料を通って移動する際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ（レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する）、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアバランシェフォトダイオード検出器、および試料を通ってインタロゲーション・スペースを移動させるための、可動鏡を有する走査モーターを使用し、インタロゲーション・スペースは約１μｍ３〜約１００００μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法において用いられる単一分子検出器は、試料プレート、試料内に配置されるインタロゲーション・スペースに向けられる連続波レーザー、インタロゲーション・スペースが試料を通って移動する際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ（レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する）、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアバランシェフォトダイオード検出器、および試料を通ってインタロゲーション・スペースを移動させるための走査モーターを使用し、インタロゲーション・スペースは約１μｍ３〜約１０００μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法において用いられる単一分子検出器は、試料プレート、試料内に配置されるインタロゲーション・スペースに向けられる連続波レーザー、インタロゲーション・スペースが試料を通って移動する際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ（レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する）、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアバランシェフォトダイオード検出器、および試料を通ってインタロゲーション・スペースを移動させるための走査モーターを使用し、インタロゲーション・スペースは約１μｍ３〜約１００μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法において用いられる単一分子検出器は、試料プレート、試料内に配置されるインタロゲーション・スペースに向けられる連続波レーザー、インタロゲーション・スペースが試料を通って移動する際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ（レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する）、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアバランシェフォトダイオード検出器、および試料を通ってインタロゲーション・スペースを移動させるための走査モーターを使用し、インタロゲーション・スペースは約１μｍ３〜約１０μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法において用いられる単一分子検出器は、試料プレート、試料内に配置されるインタロゲーション・スペースに向けられる連続波レーザー、インタロゲーション・スペースが試料を通って移動する際に試料から放射される光を��光する高開口数の顕微鏡対物レンズ（レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する）、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアバランシェフォトダイオード検出器、および試料を通ってインタロゲーション・スペースを移動させるための走査モーターを使用し、インタロゲーション・スペースは約２μｍ３〜約１０μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法において用いられる単一分子検出器は、試料プレート、試料内に配置されるインタロゲーション・スペースに向けられる連続波レーザー、インタロゲーション・スペースが試料を通って移動する際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ（レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する）、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアバランシェフォトダイオード検出器、および試料を通ってインタロゲーション・スペースを移動させるための走査モーターを使用し、インタロゲーション・スペースは約２μｍ３〜約８μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法において用いられる単一分子検出器は、試料プレート、試料内に配置されるインタロゲーション・スペースに向けられる連続波レーザー、インタロゲーション・スペースが試料を通って移動する際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ（レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する）、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアバランシェフォトダイオード検出器、および試料を通ってインタロゲーション・スペースを移動させるための走査モーターを使用し、インタロゲーション・スペースは約３μｍ３〜約７μｍ３である。これらの態様のいずれにおいても、分析器は１つのインタロゲーション・スペースのみを有し得る。
【０１４６】
他の態様において、本発明の方法において用いられる単一分子検出器は、試料プレート、試料が入っている試料プレートに向けられる連続波レーザー、インタロゲーション・スペースが試料を通って移動する際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアバランシェフォトダイオード検出器、および試料を通ってインタロゲーション・スペースを移動させるための、可動鏡を有する走査モーターを使用し、インタロゲーション・スペースは約１μｍ３〜約１００００μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法において用いられる単一分子検出器は、試料プレート、試料内に配置されるインタロゲーション・スペースに向けられる連続波レーザー、インタロゲーション・スペースが試料を通って移動する際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアバランシェフォトダイオード検出器、および試料を通ってインタロゲーション・スペースを移動させるための走査モーターを使用し、インタロゲーション・スペースは約１μｍ３〜約１０００μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法において用いられる単一分子検出器は、試料プレート、試料内に配置されるインタロゲーション・スペースに向けられる連続波レーザー、インタロゲーション・スペースが試料を通って移動する際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアバランシェフォトダイオード検出器、および試料を通ってインタロゲーション・スペースを移動させるための走査モーターを使用し、インタロゲーション・スペースは約１μｍ３〜約１００μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法において用いられる単一分子検出器は、試料プレート、試料内に配置されるインタロゲーション・スペースに向けられる連続波レーザー、インタロゲーション・スペースが試料を通って移動する際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアバランシェフォトダイオード検出器、および試料を通ってインタロゲーション・スペースを移動させるための走査モーターを使用し、インタロゲーション・スペースは約１μｍ３〜約１０μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法において用いられる単一分子検出器は、試料プレート、試料内に配置されるインタロゲーション・スペースに向けられる連続波レーザー、インタロゲーション・スペースが試料を通って移動する際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアバランシェフォトダイオード検出器、および試料を通ってインタロゲーション・スペースを移動させるための走査モーターを使用し、インタロゲーション・スペースは約２μｍ３〜約１０μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法において用いられる単一分子検出器は、試料プレート、試料内に配置されるインタロゲーション・スペース���向けられる連続波レーザー、インタロゲーション・スペースが試料を通って移動する際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアバランシェフォトダイオード検出器、および試料を通ってインタロゲーション・スペースを移動させるための走査モーターを使用し、インタロゲーション・スペースは約２μｍ３〜約８μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法において用いられる単一分子検出器は、試料プレート、試料内に配置されるインタロゲーション・スペースに向けられる連続波レーザー、インタロゲーション・スペースが試料を通って移動する際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアバランシェフォトダイオード検出器、および試料を通ってインタロゲーション・スペースを移動させるための走査モーターを使用し、インタロゲーション・スペースは約３μｍ３〜約７μｍ３である。これらの態様のいずれにおいても、分析器は１つのインタロゲーション・スペースのみを有し得る。
【０１４７】
いくつかの態様において、単一分子検出器は、試料中の件の分子に対する濃度を決定することができ、試料は、少なくとも約１００倍、または１０００倍、または１０，０００倍、または１００，０００倍、または３００，０００倍、または１，０００，０００倍、または１０，０００，０００倍、または３０，０００，０００倍の範囲にわたる濃度に及び得る。
【０１４８】
いくつかの態様において、本発明の方法は、検出器に導入される第１の試料と第２の試料との間の、被分析物濃度における約５０％、４０％、３０％、２０％、１５％または１０％より小さい差を検出できる単一分子検出器を使用し、分析器に導入される第１の試料および第２の試料の体積は約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、５、４、３、２または１μｌより小さく、被分析物は、約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、５、４、３、２または１フェムトモル濃度より低い濃度で存在する。いくつかの態様において、本発明の方法は、検出器に導入される第１の試料と第２の試料との間の、被分析物濃度における約５０％より小さい差を検出できる単一分子検出器を使用し、分析器に導入される第１の試料および第２の試料の体積は約１００μｌより小さく、被分析物は、約１００フェムトモル濃度より低い濃度で存在する。いくつかの態様において、本発明の方法は、検出器に導入される第１の試料と第２の試料との間の、被分析物濃度における約４０％より小さい差を検出できる単一分子検出器を使用し、分析器に導入される第１の試料および第２の試料の体積は約５０μｌより小さく、被分析物は、約５０フェムトモル濃度より低い濃度で存在する。いくつかの態様において、本発明の方法は、検出器に導入される第１の試料と第２の試料との間の、被分析物濃度における約２０％より小さい差を検出できる単一分子検出器を使用し、分析器に導入される第１の試料および前記第２の試料の体積は約２０μｌより小さく、被分析物は、約２０フェムトモル濃度より低い濃度で存在する。いくつかの態様において、本発明の方法は、検出器に導入される第１の試料と第２の試料との間の、被分析物濃度における約２０％より小さい差を検出できる単一分子検出器を使用し、分析器に導入される第１の試料および前記第２の試料の体積は約１０μｌより小さく、被分析物は、約１０フェムトモル濃度より低い濃度で存在する。いくつかの態様において、本発明の方法は、検出器に導入される第１の試料と第２の試料との間の、被分析物濃度における約２０％より小さい差を検出できる単一分子検出器を使用し、分析器に導入される第１の試料および前記第２の試料の体積は約５μｌより小さく、被分析物は、約５フェムトモル濃度より低い濃度で存在する。いくつかの態様において、本発明の方法は、検出器に導入される第１の試料と第２の試料との間の、被分析物濃度における約２０％より小さい差を検出できる単一分子検出器を使用し、分析器に導入される第１の試料および前記第２の試料の体積は約５μｌより小さく、被分析物は、約５０フェムトモル濃度より低い濃度で存在する。
【０１４９】
単一分子検出器およびシステムを、以下により詳細に記載する。本発明の方法において有用な単一分子分析器の更なる態様、例えば、１つより多くのインタロゲーション窓を有する検出器、動電学または電気泳動の流れを利用する検出器等は、米国特許出願第１１／０４８，６６０号において見ることができ、その全体を引用することによって本明細書に組み込まれる。
【０１５０】
測定の間に機器を洗浄してよい。いくつかの態様において、キャピラリーのコンディショニングを保持するため；即ちキャピラリー表面を試料間で相対的に一定に保って変動を少なくするために、試料の塩濃度および界面活性剤濃度を保持する洗浄緩衝液を用いてよい。
【０１５１】
本発明の機器および方法の極めて高い感度に寄与する特徴は、ラベルを検出およびカウントする方法であり、いくつかの態様において、それらのラベルは、検出すべき単一分子に結合されており、または、より一般的には、検出すべき単一分子に一致する。簡潔に言うと、キャピラリーを通って流れる又は試料プレートに入っている処理試料は、キャピラリーの所定のインタロゲーション・スペースに、ラベルにおいて用いられる蛍光部分に適した励起波長で光を放射するレーザーからのＥＭ放射を既定の時間受けさせること、およびその時間の間に放出される光子を検出することによって、一連の検出イベントに有効に分割される。各々の既定の時間は「ビン」である。あるビンにおいて検出される光子の総数が所定の閾値レベルを上回る場合、検出イベントはそのビンに対して記録される（即ち、ラベルが検出された）。光子の総数が所定の閾値レベルにない場合、検出イベントは記録されない。いくつかの態様において、処理試料濃度は、大部分の検出イベントに関して検出イベントが唯１つのラベルが窓を通過することを意味する程度に十分希薄であり、このことは原試料における件の単一の分子に対応し、即ち、ほとんどの検出イベントは、１つのビンにおける１つより多くのラベルを意味しない。いくつかの態様において、処理試料中のより高いラベル濃度（即ち２つ又はそれより多くのラベルが単一の検出イベントとして検出される可能性がもはや取るに足らないものでない濃度）を正確に検出することを可能にするために、更なる改良が適用される。
【０１５２】
他のビン時間が本発明の範囲から逸脱することなく用いられ得るが、いくつかの態様において、ビン時間は約１マイクロ秒〜約５ｍｓの範囲で選択される。いくつかの態様において、ビン時間は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、７５０、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００または５０００マイクロ秒より長い。いくつかの態様において、ビン時間は約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、７５０、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００または５０００マイクロ秒より短い。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜１０００マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜７５０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜５００マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜２５０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜１００マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜５０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜４０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜３０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜２５マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜２０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜１０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜７．５マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１〜５マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約５〜５００マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約５〜２５０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約５〜１００マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約５〜５０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約５〜２０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約５〜１０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１０〜５００マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１０〜２５０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１０〜１００マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１０〜５０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１０〜３０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１０〜２０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約２マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約３マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約４マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約５マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約６マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約７マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約８マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約９マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１１マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１２マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１３マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１４マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約５マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１５マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１６マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１７マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１８マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１９マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約２０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約２５マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約３０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約４０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約５０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１００マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約２５０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約５００マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約７５０マイクロ秒である。いくつかの態様において、ビン時間は約１０００マイクロ秒である。
【０１５３】
いくつかの態様において、試料中の粒子−ラベル複合体の濃度の決定には、バックグラウンド・ノイズレベルの決定が含まれる。いくつかの態様において、バックグラウンド・ノイズレベルは、平均ノイズレベルまたは二乗平均平方根ノイズから決定される。他の場合において、通常のノイズ値または統計値が選択される。多くの場合、ノイズはポアソン分布に従うと予想される。
【０１５４】
従って、ラベルがインタロゲーション・スペースに直面すると、ラベルはレーザービームに照射されて光子のバーストを発生する。ラベルによって放出される光子は、試料中に存在するバックグラウンド・ノイズの量からなる所定の閾値エネルギーレベルより大きいエネルギーを有する光子のバーストのみを考慮することによって、バックグラウンド光またはバックグラウンド・ノイズ放射と区別される。バックグラウンド・ノイズは通常、例えば、試料中に存在するラベリングされていない粒子の固有の蛍光、分析のための試料調製において用いられる緩衝液または希釈剤の固有の蛍光、ラマン散乱および電子ノイズによって生じる低振動数放射を含む。いくつかの態様において、バックグラウンド・ノイズに割り当てられる値は、複数のビンにおいて検出される平均バックグラウンド信号ノイズとして計算され、それらのビンは、所定の長さの時間の間にインタロゲーション・スペースにおいて検出される光子信号の測定である。従って、いくつかの態様において、バックグラウンド・ノイズは、各試料に対してその試料に固有の数として計算される。
【０１５５】
バックグラウンド・ノイズの値を仮定すると、閾値エネルギーレベルを割り当てることができる。上で議論したように、閾値は、（ラベルの蛍光に起因する）真の信号をバックグラウンド・ノイズと区別するために決定される。ランダムなノイズからの偽陽性信号の数を最小にし、それと共に拒絶される真の信号の数も最小にするように、閾値の選択に注意を払わなければならない。
閾値を選択する方法には、ノイズレベルより大きい固定値を決定すること、およびノイズ信号の分布に基づいて閾値を計算することが含まれる。一の態様において、閾値は、バックグラウンドレベルよりも固定された数の標準偏差分大きい値に設定される。ノイズのポアソン分布を仮定すると、この方法を用いて、実験の時間経過と共に偽陽性信号の数を見積もることができる。いくつかの態様において、閾値レベルは、バックグラウンド・ノイズより４σ大きい値として計算される。例えば、平均バックグラウンド・ノイズレベルが２００個の光子であると仮定すると、分析器システムによって、２００個の光子である平均バックグラウンド・ノイズレベルより４√２００大きい閾値レベルは２５６個の光子であると定められる。従って、いくつかの態様において、試料中のラベルの濃度の決定には閾値レベルの規定が含まれ、その閾値レベルより大きい光子信号がラベルの存在を示す。反対に、閾値レベルのエネルギーより大きくないエネルギーレベルを有する光子信号は、ラベルが存在しないことを意味する。
【０１５６】
試料濃度を決定するために多数のビン測定が行われ、ラベルの存在または不存在が各ビン測定に対して確認される。通常、６０，０００回またはそれより多くの測定を１分で行うことができる（例えば、ビンサイズが１ｍｓである態様において、ビンサイズが小さいほど、測定数はそれに対応してより大きくなる（例えば、１０マイクロ秒のビンサイズに対して１分当たり６，０００，０００回の測定））。従って、単一の測定は重要でなく、本方法は、広い誤差範囲に備えている。ラベルを含有していないと測定されたビン（「ノー」ビン）は考慮されず、ラベルを含有していると測定されたビン（「イエス」ビン）において行われた測定のみが、処理試料中のラベル濃度の決定に考慮される。「ノー」ビンまたはラベルを有しないビンにおいて行われる測定を考慮に入れないことにより、ノイズに対する信号の割合および測定の確度が増加する。従って、いくつかの態様において、試料中のラベルの濃度の決定には、ラベルの存在を反映するビン測定の検出が含まれる。
【０１５７】
ノイズに対する信号の割合または分析器システムの感度は、粒子−ラベル複合体が検出されるビン測定の間にバックグラウンド・ノイズが検出される時間を最小にすることによって増大させることができる。例えば、１ミリ秒の間継続し、その間に１つの粒子−ラベル複合体が検出されるビン測定において、２５０マイクロ秒の内にインタロゲーション・スペースを通過する場合、１ミリ秒の内７５０マイクロ秒はバックグラウンド・ノイズ放射を検出するのに費やされる。ノイズに対する信号の割合は、ビン時間を短くすることによって改良可能である。いくつかの態様において、ビン時間は１ミリ秒である。他の態様において、ビン時間は７５０、５００、２５０マイクロ秒、１００マイクロ秒、５０マイクロ秒、２５マイクロ秒または１０マイクロ秒である。他のビン時間は本明細書に記載されているとおりである。
【０１５８】
測定に影響を及ぼす他の要因は、蛍光部分の輝度または薄暗さ（ｄｉｍｎｅｓｓ）、流速およびレーザー出力である。ラベルの検出を可能にする関連要因の種々の組み合わせは、当業者に明らかであろう。いくつかの態様において、ビン時間を、流速を変化させることなく調節する。ビン時間が減少するにつれて、ビン時間の間にインタロゲーション・スペースに供給される全エネルギーを一定に保持するために、インタロゲーション・スペースに向けられるレーザー出力を増加させなければならないことを、当業者は理解するであろう。例えば、ビン時間が１０００マイクロ秒から２５０マイクロ秒に減少する場合、第１の近似として、レーザー出力は約４倍増加しなければならない。これらの設定によって、従来の設定を仮定して１０００μｓの間にカウントされる光子の数と同じ数の光子を、２５０μｓの間に検出することが可能となり、かつ、より小さいバックグラウンド、即ちより高い感度で試料をより速く分析することが可能となる。更に、試料の処理を加速するために流速を調節してよい。これらの数は単に例示的なものであり、当業者は、所望の結果を達成するために必要に応じてパラメータを調節し得る。
【０１５９】
いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは、試料ストリームの全断面を包含する。インタロゲーション・スペースが試料ストリームの全断面を包含する場合、規定された長さの時間においてカウントされるラベルの数および試料ストリームの断面を通過する体積のみが、処理試料中のラベルの濃度を計算するのに必要とされる。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは試料ストリームの断面積より小さく規定され得、それは例えば、インタロゲーション・スペースがレーザービームによって照射されるスポットの寸法によって規定されることによる。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは、分析器の開口部３０６（図１Ａ）または３５８および３５９（図１Ｂ）を調節して、対物レンズによって検出器に結像される照射体積を小さくすることによって規定可能である。インタロゲーション・スペースが試料ストリームの断面積より小さく規定される態様において、ラベル濃度は、既知の標準物質濃度の１つ又はそれより多くの試料を用いて得られる検量線から、複合体によって放射される信号を内挿することによって決定され得る。更に他の態様において、ラベル濃度は、測定された粒子を内部ラベル標準と比較することによって決定され得る。希釈された試料を分析する態様において、出発試料中の件の分子の濃度計算において希釈係数が考慮される。
【０１６０】
上で議論したように、インタロゲーション・スペースが試料ストリームの全断面を包含する場合、規定の長さの時間（ビン）において試料ストリームの断面を通過するラベルのカウント数、およびビンにおいてインタロゲートされた試料の体積のみが、試料濃度を計算するのに必要とされる。「イエス」ビンに含まれるラベルの総数が決定され、処理試料中のラベルの濃度を決定するために、分析において用いられるビンの総数によって表される試料体積と関連付けられる。従って、一の態様において、処理試料中のラベル濃度の決定には、「イエス」ビンで検出されるラベルの総数を決定すること、および検出されたラベルの総数を分析された全試料体積と関連付けることが含まれる。分析される全試料体積は、特定の時間間隔においてキャピラリーフローセルを通過してインタロゲーション・スペースを横切る試料体積である。別法として、試料中のラベル複合体の濃度は、多数のビンにおいてラベルによって放射される信号を検量線から内挿することによって決定され、その検量線は、同じ数のビンにおけるラベルによって放射される信号を、既知の濃度のラベルを含有する標準試料により決定することによって得られる。
【０１６１】
いくつかの態様において、ビンにおいて検出される個々のラベルの数は、処理試料中の粒子の相対濃度に関連する。比較的低い濃度、例えば約１０−１６Ｍより低い濃度において、ラベルの数は、ビンにおいて検出される光子信号に比例する。従って、ラベル濃度が低い場合、光子信号はデジタル信号として与えられる。比較的高い濃度、例えば約１０−１６Ｍより高い濃度において、２つ又はそれより多くのラベルがほぼ同じ時間にインタロゲーション・スペースを横切って、１個としてカウントされる尤度（または可能性）が有意になるので、ラベルに対する光子信号の比例関係は失われる。従って、いくつかの態様において、約１０−１６Ｍより高濃度の試料中の個々の粒子は、ビン測定の時間の長さを短くすることによって分割される。
【０１６２】
別法として、他の態様において、任意の一のビンに存在する複数の粒子によって放出される全光子信号を検出する。これらの態様により、ダイナミックレンジが少なくとも３、３．５、４、４．５、５．５、６、６．５、７、７．５、８ｌｏｇである、または８ｌｏｇより大きい本発明の単一分子検出器が可能となる。
【０１６３】
「ダイナミックレンジ」は、本明細書においてその用語を用いる場合、濃度の異なる一連の試料の濃度を変化させるための希釈または他の処理を必要とすることなく機器によって定量化してよい試料濃度の範囲を意味し、ここで、濃度は、目的とする用途に適した確度で決定される。例えば、マイクロタイタープレートが、１つのウェルにおいて、件の被分析物に関して濃度が１フェムトモル濃度の試料を含有し、別のウェルにおいて、件の被分析物に関して濃度が１０，０００フェムトモル濃度の試料を含有し、かつ第３のウェルにおいて、被分析物に関して濃度が１００フェムトモル濃度の試料を含有する場合、ダイナミックレンジが少なくとも４ｌｏｇで定量下限が１フェムトモル濃度の機器は、濃度を調節するための更なる処理、例えば希釈を必要とすることなく、全ての試料の濃度を正確に定量することができる。確度は、標準的な方法によって、例えば、ダイナミックレンジにわたる濃度の一連の標準物質を用いて検量線を作図することによって決定してよい。得られる検量線をフィッティングする標準的な基準、例えば約０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８または０．９９より大きいｒ２を、確度の基準として用いてよい。
【０１６４】
検出器からのデータを分析する方法を変更することによって、および／または検出器とインタロゲーション・スペースとの間で減衰器を用いることによって、ダイナミックレンジの増大が達成される。処理試料が十分に低濃度で、その結果、ビンにおける各検出イベント、即ち閾値レベルを上回る各光子バースト（「イベント光子」）が唯１つのラベルを表す可能性が高い、範囲の下端において、データが分析されて検出イベントが単一分子としてカウントされる。それにより、上述のように、各ビンは、ラベルの存在に関して単純な「イエス」または「ノー」として分析される。２つ又はそれより多くのラベルが１つのビンに占める尤度（または可能性）が有意になる、より高濃度の処理試料に関して、かなりの数のビンにおけるイベント光子の数が、１つのラベルに対して予想される数より実質的に大きいことがわかり、例えば、かなりの数のビンにおけるイベント光子の数は、１つのラベルに対して予想されるイベント光子の数の２倍、３倍またはそれより多くに一致する。これらの試料に関して、機器は、そのデータ分析方法を、処理試料のビンに関してイベント光子の総数を積分する方法に変更する。この合計は、全てのビンに存在するラベルの総数に比例するだろう。大部分のビンにおいて多数のラベルが存在する、より一層高濃度の処理試料に関して、バックグラウンド・ノイズは各ビンからの全信号の有意でない部分になり、機器は、そのデータ分析方法を、ビン毎の全光子（バックグラウンドを含む）をカウントする方法に変更する。検出器に達する光の強度が、減衰器を用いなければ正確に光子をカウントするための検出器の能力を超えるような濃度、即ち検出器が飽和するような濃度である場合、フローセルと検出器との間で減衰器を使用することによって、ダイナミックレンジをより一層増大させることができる。
【０１６５】
機器は、検出器からの入力を受け、測定中の試料に適した分析方法を決定し、そしてそのような分析に基いて値を出力するデータ分析システムを有してよい。データ分析システムは、減衰器が機器に含まれる場合、減衰器を使用する又は使用しないという指示を更に出力してよい。
【０１６６】
そのような方法を用いることによって、機器のダイナミックレンジは飛躍的に増大し得る。従って、いくつかの態様において、機器は、約１０００（３ｌｏｇ）、１０，０００（４ｌｏｇ）、１００，０００（５ｌｏｇ）、３５０，０００（５．５ｌｏｇ）、１，０００，０００（６ｌｏｇ）、３，５００，０００（６．５ｌｏｇ）、１０，０００，０００（７ｌｏｇ）、３５，０００，０００（７．５ｌｏｇ）または１００，０００，０００（８ｌｏｇ）より大きいダイナミックレンジにわたって試料濃度を測定し得る。いくつかの態様において、機器は、約１００，０００（５ｌｏｇ）より大きいダイナミックレンジにわたって試料濃度を測定し得る。いくつかの態様において、機器は、約１，０００，０００（６ｌｏｇ）より大きいダイナミックレンジにわたって試料濃度を測定し得る。いくつかの態様において、機器は、約１０，０００，０００（７ｌｏｇ）より大きいダイナミックレンジにわたって試料濃度を測定し得る。いくつかの態様において、機器は、約１〜１０フェムトモル濃度から少なくとも約１０００；１０，０００；１００，０００；３５０，０００；１，０００，０００；３，５００，０００；１０，０００，０００；または３５，０００，０００フェムトモル濃度のダイナミックレンジにわたって試料濃度を測定し得る。いくつかの態様において、機器は、約１〜１０フェムトモル濃度から少なくとも約１０，０００フェムトモル濃度のダイナミックレンジにわたって試料濃度を測定し得る。いくつかの態様において、機器は、約１〜１０フェムトモル濃度から少なくとも約１００，０００フェムトモル濃度のダイナミックレンジにわたって試料濃度を測定し得る。いくつかの態様において、機器は、約１〜１０フェムトモル濃度から少なくとも約１，０００，０００フェムトモル濃度のダイナミックレンジにわたって試料濃度を測定し得る。いくつかの態様において、機器は、約１〜１０フェムトモル濃度から少なくとも約１０，０００，０００のダイナミックレンジにわたって試料濃度を測定し得る。
【０１６７】
いくつかの態様において、本発明の分析器または分析器システムは、１ナノモル濃度、または１ピコモル濃度、または１フェムトモル濃度、または１アトモル濃度、または１ゼプトモル濃度より小さい検出限界で被分析物、例えばバイオマーカーを検出し得る。いくつかの態様において、バイオマーカーが試料中で１ナノモル濃度、または１ピコモル濃度、または１フェムトモル濃度、または１アトモル濃度、または１ゼプトモル濃度より低い濃度で存在する場合、かつ各試料の寸法が約１００、５０、４０、３０、２０、１０、５、２、１、０．１、０．０１、０．００１または０．０００１μｌより小さい場合、分析器または分析器システムは、一の試料から別の試料への、１つの被分析物または複数の被分析物、例えば１つのバイオマーカー又は複数のバイオマーカーの約０．１％、１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％より小さい濃度変化を検出し得る。いくつかの態様において、被分析物が約１ピコモル濃度より低い濃度で存在する場合、かつ各試料の寸法が約５０μｌより小さい場合、分析器または分析器システムは、第１の試料から第２の試料への、被分析物の約２０％より小さい濃度変化を検出し得る。いくつかの態様において、被分析物が約１００フェムトモル濃度より低い濃度で存在する場合、かつ各試料の寸法が約５０μｌより小さい場合、分析器または分析器システムは、第１の試料から第２の試料への、被分析物の約２０％より小さい濃度変化を検出し得る。いくつかの態様において、被分析物が約５０フェムトモル濃度より低い濃度で存在する場合、かつ各試料の寸法が約５０μｌより小さい場合、分析器または分析器システムは、第１の試料から第２の試料への、被分析物の約２０％より小さい濃度変化を検出し得る。いくつかの態様において、被分析物が約５フェムトモル濃度より低い濃度で存在する場合、かつ各試料の寸法が約５０μｌより小さい場合、分析器または分析器システムは、第１の試料から第２の試料への、被分析物の約２０％より小さい濃度変化を検出し得る。いくつかの態様において、被分析物が約５フェムトモル濃度より低い濃度で存在する場合、かつ各試料の寸法が約５μｌより小さい場合、分析器または分析器システムは、第１の試料から第２の試料への、被分析物の約２０％より小さい濃度変化を検出し得る。いくつかの態様において、被分析物が約１フェムトモル濃度より低い濃度で存在する場合、かつ各試料の寸法が約５μｌより小さい場合、分析器または分析器システムは、第１の試料から第２の試料への、被分析物の約２０％より小さい濃度変化を検出し得る。
【０１６８】
本発明の単一分子検出器は、変動係数（ＣＶ）が非常に小さい高感度な方法で件の分子を検出し得る。いくつかの態様において、ＣＶは約５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％より小さく、または約１％より小さい。いくつかの態様において、ＣＶは約５０％より小さい。いくつかの態様において、ＣＶは約４０％より小さい。いくつかの態様において、ＣＶは約３０％より小さい。いくつかの態様において、ＣＶは約２５％より小さい。いくつかの態様において、ＣＶは約２０％より小さい。いくつかの態様において、ＣＶは約１５％より小さい。いくつかの態様において、ＣＶは約１０％より小さい。いくつかの態様において、ＣＶは約５％より小さい。いくつかの態様において、ＣＶは約１％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約１００ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約１０％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約５０ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約１０％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約４０ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約１０％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約３０ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約１０％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約２０ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約１０％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約１５ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約１０％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約１０ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約１０％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約５ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約１０％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約１ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約１０％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約０．０５ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約１０％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約０．０１ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約１０％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約１０ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約５０％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約１０ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約２５％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約１０ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約１０％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約１０ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約５％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約１０ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約１％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約５ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約１００％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約５ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約５０％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約５ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約２５％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約５ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約１０％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約５ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約５％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約５ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約１％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約１ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約１００％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約１ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約５０％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約１ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約２５％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約１ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約１０％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約１ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約５％より小さい。いくつかの態様において、検出限界（ＬＯＤ）は約１ｐｇ／ｍｌより小さく、かつＣＶは約１％より小さい。
【０１６９】
［Ｖ．分子の高感度分析に適した機器およびシステム］
本発明の方法は、高感度分析機器、例えば単一分子検出器を利用する。そのような単一分子検出器には以下に記載する態様が含まれる。
【０１７０】
いくつかの態様において、本発明は、試料中の単一タンパク質分子を検出するための分析器システムキットを提供し、前記システムには、試料中の単一タンパク質分子、ならびに蛍光部分およびタンパク質分子に対する結合パートナーを含む少なくとも１つのラベルを検出するための分析器システムが含まれ、そのシステムにおいて、分析器は、蛍光部分を刺激するための電磁放射線源；ラベルを通過させるためのキャピラリーフローセル；キャピラリーフローセルにおいてラベルを移動させるための駆動力源；電磁波源から放射される電磁放射線を受け取るための、キャピラリーフローセル内に規定されたインタロゲーション・スペース；および刺激された蛍光部分の電磁気学的特性を測定するための、インタロゲーション・スペースに操作可能に接続された電磁放射線検出器を有し、蛍光部分は、当該部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、少なくとも約２００個の光子を放出することができ、レーザーは、当該部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である。
【０１７１】
本発明の分析器キットの一の態様を図１５に表す。キットは、タンパク質分子に対する結合パートナーと蛍光部分とを有する、タンパク質分子に対するラベルを含む。キットは、単一タンパク質分子を検出するための分析器システム（３００）を更に含み、その分析器システムは、蛍光部分を刺激するための電磁放射線源３０１、ラベルを通過させるためのキャピラリーフローセル３１３；キャピラリーフローセルにおいてラベルを移動させるための駆動力源（図示せず）；電磁波源から放射される電磁放射線を受け取るための、キャピラリーフローセル内に規定されたインタロゲーション・スペース３１４（図２Ａ）；および刺激された蛍光部分の電磁気学的特性を測定するための、インタロゲーション・スペースに操作可能に接続された電磁放射線検出器３０９を有し、蛍光部分は、当該部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、少なくとも約２００個の光子を放出することができ、レーザーは、当該部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、電磁放射線源３０１からのビーム３１１は、顕微鏡対物レンズ３１５によって焦点が合わせられて、キャピラリーフローセル３１３内に１つのインタロゲーション・スペース３１４（図２Ａ）を形成する。いくつかの態様において、顕微鏡対物レンズは０．７、０．８、０．９または１．０に等しい又はそれより大きい開口数を有してよい。
【０１７２】
分析器システムキットのいくつかの態様において、分析器は、１つ以下のインタロゲーション・スペースを有する。いくつかの態様において、電磁放射線源は、少なくとも約３、５、１０または２０ｍＷの出力を有するレーザーである。いくつかの態様において、蛍光部分は蛍光分子を含有する。いくつかの態様において、蛍光分子は、少なくとも１つの置換インドリウム環系を有する色素分子であって、インドリウム環の３位の炭素における置換基が化学反応性基または共役物質を含む色素分子等の、色素分子である。いくつかの態様において、蛍光部分は量子ドットである。いくつかの態様において、電磁放射線源は、発光ダイオードまたは連続波レーザー等の連続波電磁放射線源である。いくつかの態様において、駆動力は圧力である。いくつかの態様において、検出器はアバランシェフォトダイオード検出器である。いくつかの態様において、分析器は、前記インタロゲーション・スペース上にレーザービームを偏向させるため、および前記刺激された色素分子を結像するための共焦点光学配置（図１、３に示す）を利用し、前記共焦点光学配置は、少なくとも約０．８の開口数の対物レンズを有する。いくつかの態様において、分析器は、複数の試料を自動的にサンプリングすることができ、かつ試料容器と前記インタロゲーション・スペースとの間の流体連結を与えることができるサンプリングシステムを更に有する。いくつかの態様において、分析器システムは、前記インタロゲーション・スペースに流体連結した試料回収システムを更に有し、前記回収システムは、実質的に全ての前記試料を回収し得る。いくつかの態様において、キットには、システムの使用に関する取扱説明書が更に含まれる。
【０１７３】
［Ａ．装置／システム］
一の要旨において、本明細書に記載の方法は、試料中の単一分子を検出し得る分析器システムを使用する。一の態様において、分析器システムは、蛍光ラベリングされた粒子の単一分子検出が可能であり、分析器システムは、分析器システムのサンプリングシステムに流体接続されるキャピラリーフローセルの内部に規定されたインタロゲーション・スペースに単一粒子が存在する場合に、電磁放射線源による曝露に応答して励起された蛍光ラベルによって放射されるエネルギーを検出する。分析器システムの更なる態様において、単一粒子は、駆動力によってキャピラリーフローセルのインタロゲーション・スペースを通って移動する。分析器システムのもう１つの態様において、自動サンプリングシステムは、試料を分析器システムに導入するために分析器システムに含まれてよい。分析器システムのもう１つの態様において、試料調製システムは、試料を調製するために分析器システムに含まれてよい。別の態様において、分析器システムは、分析が完了した後に試料の少なくとも一部を回収するための試料回収システムを有してよい。
【０１７４】
一の要旨において、分析器システムは、蛍光ラベルでラベリングされた単一粒子を励起させるための電磁放射線源を含んでなる。一の態様において、分析器システムの電磁放射線源はレーザーである。別の態様において、電磁放射線源は連続波レーザーである。
【０１７５】
通常の態様において、電磁放射線源は、ラベルがキャピラリーフローセルのインタロゲーション・スペースを通過する際に、ラベルに結合された蛍光部分を励起させる。いくつかの態様において、蛍光ラベル部分は、１つ又はそれより多くの蛍光色素分子を含む。いくつかの態様において、蛍光ラベル部分は量子ドットである。本明細書に記載のいずれの蛍光部分も、ラベルにおいて用いてよい。
【０１７６】
キャピラリーフローセルの内部に設けられたインタロゲーション・スペースをラベルが通過する際に、ラベルは電磁放射線に曝露される。インタロゲーション・スペースは通常、サンプリングシステムに流体接続される。いくつかの態様において、ラベルは、分析器システムを通ってラベルを前進させるための駆動力によって、キャピラリーフローセルのインタロゲーション・スペースを通過する。インタロゲーション・スペースは、放射源から放射される電磁放射線を受け取る様に配置される。いくつかの態様において、サンプリングシステムは、人間のオペレーターから介入されることなく複数の試料をサンプリングし得る自動サンプリングシステムである。
【０１７７】
ラベルはインタロゲーション・スペースを通過し、電磁放射線源によって励起されると、検出可能な量のエネルギーを放射する。一の態様において、電磁放射線検出器は、インタロゲーション・スペースに操作可能に接続される。電磁放射線検出器は、ラベル、例えばラベルの蛍光部分によって放射されるエネルギーを検出し得る。
【０１７８】
分析器システムの更なる態様において、システムは試料調製メカニズムを更に含み、そのメカニズムにおいて、分析器システムによる分析のために、試料を部分的に又は完全に調製してよい。分析器システムのいくつかの態様において、試料は、システムによって分析した後に廃棄する。他の態様において、分析器システムは、試料回収メカニズムを更に有し、それによって、試料の少なくとも一部、または別法として試料の全て若しくは実質上全てを、分析後に回収してよい。そのような態様において、試料は、試料の源（または起点）に戻すことができる。いくつかの態様において、試料は、試料マイクロタイタープレートにおけるマイクロタイターウェルに戻すことができる。分析器システムは通常、検出された信号を収集し、報告（または記録）するためのデータ取得システムを更に含んでなる。
【０１７９】
［Ｂ．単一粒子分析器］
図１Ａに示すように、分析器システム３００の一の態様をここで説明する。分析器システム３００は、電磁放射線源３０１、鏡３０２、レンズ３０３、キャピラリーフローセル３１３、顕微鏡対物レンズ３０５、開口部３０６、検出器レンズ３０７、検出器フィルター３０８、単一光子検出器３０９、および場合により検出器に接続されるプロセッサ３１０を有する。
【０１８０】
操作において、電磁放射線源３０１は、その出力３１１が鏡３０２の正面３１２で反射されるように配置される。レンズ３０３は、キャピラリーフローセル３１３における単一のインタロゲーション・スペース（インタロゲーション・スペース３１４の実例となる一例を図２Ａに示す）において、ビーム３１１の焦点を合わせる。顕微鏡対物レンズ３０５は、試料粒子からの光を集め、開口部３０６にビームの像を形成する。開口部３０６は、キャピラリーフローセル３１３のインタロゲーション・スペースにおける標本によって放射される、集光され得る光のフラクションに影響を及ぼす。検出器レンズ３０７は、開口部３０６を通過する光を集め、検出器フィルター３０８を通過した後に、検出器３０９のアクティブ領域上に光の焦点を合わせる。検出器フィルター３０８は、粒子に結合される励起された蛍光部分によって放射される信号を最大にしながら、光散乱または周辺光に起因する異常なノイズ信号を最小にする。プロセッサ３１０は、本明細書に記載の方法によって粒子からの光信号を処理する。
【０１８１】
一の態様において、顕微鏡対物レンズ３０５は高開口数の顕微鏡対物レンズである。本明細書において用いられる場合、「高開口数のレンズ」には、開口数が０．６に等しい又はそれより大きいレンズが含まれる。開口数は、高度に回折された像形成光線の、対物レンズによって捕捉される数の尺度である。開口数が大きいほど、より多くの斜光線が対物レンズに入ることが可能になり、それによって、より解像度の高い像が形成される。更に、像の輝度は、開口数が高くなるにつれて増加する。高い開口数のレンズは、種々の製造業者から商業的に入手可能であり、約０．６に等しい又はそれより大きい開口数を有する任意の１つのレンズを、分析器システムに使用してよい。いくつかの態様において、レンズは約０．６〜約１．３の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは約０．６〜約１．０の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは約０．７〜約１．２の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは約０．７〜約１．０の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは約０．７〜約０．９の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは約０．８〜約１．３の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは約０．８〜約１．２の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは約０．８〜約１．０の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは少なくとも約０．６の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは少なくとも約０．７の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは少なくとも約０．９の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは少なくとも約１．０の開口数を有する。いくつかの態様において、顕微鏡対物レンズ３０５の開口数は約１．２５である。０．８の顕微鏡対物レンズ３０５が用いられる態様において、Ｎｉｋｏｎ  ６０Ｘ／０．８ＮＡ  Ａｃｈｒｏｍａｔレンズ（Ｎｉｋｏｎ，Ｉｎｃ．、米国）を用いることができる。
【０１８２】
いくつかの態様において、電磁放射線源３０１は、可視スペクトルにおける光を放射するレーザーである。全ての態様において、電磁放射線源は、レーザー波長が、粒子に結合されている蛍光ラベルを励起するのに十分な波長であるように設定されるように設定される。いくつかの態様において、レーザーは、波長が６３９ｎｍの連続波レーザーである。他の態様において、レーザーは、波長が５３２ｎｍの連続波レーザーである。他の態様において、レーザーは、波長が４２２ｎｍの連続波レーザーである。他の態様において、レーザーは、波長が４０５ｎｍの連続波レーザーである。本発明の方法および組成物において使用する際に蛍光部分を励起するのに適した波長を有するいずれの連続波レーザーも、本発明の範囲から逸脱することなく用いてよい。
【０１８３】
単一粒子分析器システム３００において、各粒子が電磁放射線源のビーム３１１を通過すると、粒子は励起状態になる。粒子がその励起状態から緩和すると、検出可能な光のバーストが放射される。粒子がビームを通過するのにかかる長さの時間、各粒子によって励起−放射サイクルが何度も繰り返され、分析器システム３００が、粒子がインタロゲーション・スペース３１４を通過する際に各粒子に対して数十〜数千個の光子を検出することができる。蛍光粒子によって放出される光子を、検出器３０９（図１Ａ）によって、粒子−ラベル複合体がインタロゲーション・スペースを通過する時間を示す時間遅延と共に記録する。光子強度を検出器３０９によって記録し、サンプリング時間をビンに分割し、ビンは、均一で任意の、自由に選択可能な時間チャンネル幅を有する時間セグメントである。各ビンに含まれる信号の数を評価する。粒子が存在する場合を決定するためにいくつかの統計的分析方法の１つまたは組み合わせを採用する。そのような方法には、分析器システムのベースラインノイズを決定すること、および検出器からの偽陽性信号を排除するために、ベースラインノイズより大きい統計的レベルにおいて蛍光ラベルの信号強度を設定することが含まれる。
【０１８４】
電磁放射線源３０１は、分析器システム３００のキャピラリーフローセル３１３に焦点が合わせられ、キャピラリーフローセル３１３は、試料システムに流体接続される。インタロゲーション・スペース３１４を図２Ａに示す。図１Ａの連続波電磁放射線源３０１からのビーム３１１は、キャピラリーフローセル３１３の内部の特定の深さ（または深度）に光学的に焦点が合わせられる。ビーム３１１は、試料を満たしたキャピラリーフローセル３１３に、キャピラリーフローセル３１３に垂直な角度で向けられる。ビーム３１１は、件の粒子をラベリングするのに用いられる特定の蛍光ラベルを励起させるように選択された所定の波長で操作される。インタロゲーション・スペース３１４の寸法または体積は、ビーム３１１の直径、およびビーム３１１の焦点が合わせられる深度（または深さ）によって規定される。別法として、インタロゲーション・スペースは、既知の濃度の較正試料を分析器システムの中に流すことによって規定され得る。
【０１８５】
単一分子が試料濃度で検出される場合、単一分子検出に必要とされるビーム寸法および焦点深度が設定され、それによって、インタロゲーション・スペース３１４の寸法を規定する。インタロゲーション・スペース３１４は、時刻観察が行われる各時間間隔の間に、唯１つの粒子が適切な試料濃度でインタロゲーション・スペース３１４に存在するように設定される。
【０１８６】
検出インタロゲーション体積は、ビームによって規定される場合、完全な球形でなく、通常は「ボウタイ」形状であることが理解されるであろう。しかし、定義付けの目的のために、インタロゲーション・スペースの「体積」は、ここでは、ビームの集光されたスポットの直径に等しい直径の球によって囲まれる体積として定義される。ビーム３１１の集光されたスポットは、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の直径を有してよい。いくつかの態様において、ビームの集光されたスポットの直径は、約１〜約５、１０、１５もしくは２０ミクロン、または約５〜約１０、１５もしくは２０ミクロン、または約１０〜約２０ミクロン、または約１０〜約１５ミクロンである。いくつかの態様において、ビームの集光されたスポットの直径は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ミクロンである。いくつかの態様において、ビームの集光されたスポットの直径は、約５ミクロンである。いくつかの態様において、ビームの集光されたスポットの直径は、約１０ミクロンである。いくつかの態様において、ビームの集光されたスポットの直径は、約１２ミクロンである。いくつかの態様において、ビームの集光されたスポットの直径は、約１３ミクロンである。いくつかの態様において、ビームの集光されたスポットの直径は、約１４ミクロンである。いくつかの態様において、ビームの集光されたスポットの直径は、約１５ミクロンである。いくつかの態様において、ビームの集光されたスポットの直径は、約１６ミクロンである。いくつかの態様において、ビームの集光されたスポットの直径は、約１７ミクロンである。いくつかの態様において、ビームの集光されたスポットの直径は、約１８ミクロンである。いくつかの態様において、ビームの集光されたスポットの直径は、約１９ミクロンである。いくつかの態様において、ビームの集光されたスポットの直径は、約２０ミクロンである。
【０１８７】
単一粒子分析器システムの別の態様において、異なる波長の蛍光ラベルでラベリングされた粒子を励起するために、１つより多くの電磁放射線源を使用し得る。もう１つの別の態様において、キャピラリーフローセルにおける１つより多くのインタロゲーション・スペースを使用し得る。もう１つの別の態様において、蛍光ラベルからの異なる放射波長を検出するのに複数の検出器を利用可能である。分析器システムのこれらの別の態様の各々を包含する図を図１Ｂに示す。これらの態様は、先の米国特許出願第１１／０４８，６６０号から引用することによって包含される。
【０１８８】
分析器システム３００のいくつかの態様において、分析器システム３００のキャピラリーフローセル３１３を通って粒子を移動させるために、駆動力が必要とされる。一の態様において、駆動力は圧力の形態であり得る。キャピラリーフローセルを通って粒子を移動させるのに用いられる圧力は、ポンプによって発生可能である。いくつかの態様において、Ｓｃｉｖｅｘ，Ｉｎｃ．製のＨＰＬＣポンプを使用し得る。ポンプが駆動力として用いられるいくつかの態様において、試料は、１μｌ／分〜約２０μｌ／分または約５μｌ／分〜約２０μｌ／分の速度でキャピラリーフローセルを通過し得る。いくつかの態様において、試料は、約５μｌ／分の速度でキャピラリーフローセルを通過し得る。いくつかの態様において、試料は、約１０μｌ／分の速度でキャピラリーフローセルを通過し得る。いくつかの態様において、試料は、約１５μｌ／分の速度でキャピラリーフローセルを通過し得る。いくつかの態様において、試料は、約２０μｌ／分の速度でキャピラリーフローセルを通過し得る。いくつかの態様において、分析器システムを通って粒子を移動させるために導電学的力を使用し得る。そのような方法は、既に開示されており、先の米国特許出願第１１／０４８，６６０号から引用することによって組み込まれる。
【０１８９】
分析器システム３００の一の要旨において、分析器システムの検出器３０９は、蛍光ラベルによって放出される光子を検出する。一の態様において、光子検出器はフォトダイオードである。別の態様において、検出器はアバランシェフォトダイオード検出器である。いくつかの態様において、フォトダイオードは、１９０ｎｍおよび１１００ｎｍの波長検出を有するシリコンフォトダイオードであり得る。ゲルマニウムフォトダイオードが用いられる場合、検出される光の波長は４００ｎｍ〜１７００ｎｍの間である。他の態様において、インジウムガリウムヒ化物フォトダイオードが用いられる場合、フォトダイオードによって検出される光の波長は、８００ｎｍ〜２６００ｎｍの間である。硫化鉛フォトダイオードが検出器として用いられる場合、検出される光の波長は、１０００ｎｍ〜３５００ｎｍの間である。
【０１９０】
いくつかの態様において、電磁放射線源３０１の光学的構成および検出器３０９の光学的構成を、常套的な光学配置で配置する。そのような配置において、電磁放射線源および検出器を、異なる焦点面に配列する。図１Ａおよび１Ｂに示すように、分析器システムのレーザーおよび検出器光学の配置は、常套的な光学配置の配置である。
【０１９１】
いくつかの態様において、電磁放射線源の光学的構成および検出器の光学的構成を、共焦点光学配置で配置する。そのような配置において、電磁放射線源３０１および検出器３０９は、同一の焦点面に配列する。共焦点配置は、分析器システムを移動させる場合に電磁放射線源３０１および検出器光学３０９を再調整する必要がないので、分析器のロバスト性をより高める。この配置は、分析器システムの要素を再調整する必要がないので、分析器の使用をより簡単にする。分析器３００（図１Ａ）および分析器３５５（図１Ｂ）に対する共焦点配置を各々、図３Ａおよび３Ｂに示す。図３Ａは、電磁放射線源３０１からのビーム３１１が顕微鏡対物レンズ３１５によって焦点を合わせられて、キャピラリーフローセル３１３の中に１つのインタロゲーション・スペース３１４（図２Ａ）を形成することを示す。ダイクロイックミラー（または二色鏡）３１６は、レーザー光を反射するが蛍光を透過し、レーザー光から蛍光を分離するのに用いられる。検出器の正面に配置されるフィルター３１７は、検出器における非蛍光を排除する。いくつかの態様において、共焦点配置で構成される分析器システムは、２つ又はそれより多くのインタロゲーション・スペースを有し得る。そのような方法は既に開示されており、先の米国特許出願第１１／０４８，６６０号から引用することによって組み込まれる。
【０１９２】
レーザーは、ヘリウム−ネオンレーザー等の可変色素レーザーであり得る。レーザーは、６３２．８ｎｍの波長を放射するように設定され得る。別法として、レーザーの波長は、５４３．５ｎｍまたは１５２３ｎｍの波長を放射するように設定され得る。別法として、電磁レーザーはアルゴンイオンレーザーであり得る。そのような態様において、アルゴンイオンレーザーは、可視スペクトルにおける約２５の異なる波長にて、連続ガスレーザーとして操作され得、その波長は、４０８．９〜６８６．１ｎｍに設定されるがその最適性能においては４８８〜５１４．５ｎｍに設定される。
【０１９３】
［１．電磁放射線源］
分析器システムのいくつかの態様において、化学発光ラベルを使用してよい。そのような態様において、粒子を検出するためのＥＭ源を使用することが必要でないことがある。もう１つの態様において、外的なラベルまたは粒子に固有の特性は、蛍光ラベルまたは光散乱ラベル等の、光相互作用ラベルまたは特性である。そのような態様において、ＥＭ放射源は、ラベルおよび／または粒子を照射するのに用いられる。蛍光ラベルを励起するためのＥＭ放射源が好ましい。
【０１９４】
いくつかの態様において、分析器システムは、電磁放射線源３０１を含んでなる。本発明の範囲から逸脱することなく、任意の数の放射源を任意の１つの分析器システム３００において使用してよい。電磁放射線の多数の源が既に開示されており、先の米国特許出願第１１／０４８，６６０号から引用することによって組み込まれる。いくつかの態様において、全ての連続波電磁（ＥＭ）放射線源は、同じ波長の電磁放射線を放射する。他の態様において、異なる放射源は異なる波長のＥＭ放射を放出する。
【０１９５】
一の態様において、（１つまたは複数の）ＥＭ源３０１、３５１、３５２は、２００ｎｍ〜１０００ｎｍの波長を生じさせる連続波レーザーである。そのようなＥＭ源は、小型で、耐久性があり、比較的安価であるという利点を有する。更に、それらのＥＭ源は一般に、他の光源より大きい蛍光信号を発生させる能力を有する。適切な連続波ＥＭ源の具体例には以下のものが含まれるが、これらに限定されない：アルゴン、クリプトン、ヘリウム−ネオン、ヘリウム−カドミウム型のレーザー、および波長可変ダイオードレーザー（赤色〜赤外領域）、各々は振動数倍増の可能性を有する。レーザーは、それらの照射を遮断するための付属の電子装置または機械装置（シャッター等）の無い連続照射を提供する。連続波レーザーが用いられる態様において、３ｍＷの電磁放射線源は、蛍光ラベルを励起させるのに十分なエネルギーであり得る。そのようなエネルギー出力の連続波レーザーからのビームは、直径が２〜５μｍであってよい。３ｍＷに曝露させるために粒子をレーザービームに曝露する時間は、約１ミリ秒の時間であってよい。別の態様において、レーザービームに曝露する時間は、約５００マイクロ秒に等しくてよく又はそれより短くてよい。別の態様において、曝露時間は、約１００マイクロ秒に等しくてよく又はそれより短くてよい。別の態様において、曝露時間は、約５０マイクロ秒に等しくてよく又はそれより短くてよい。別の態様において、曝露時間は、約１０マイクロ秒に等しくてよく又はそれより短くてよい。
【０１９６】
ＬＥＤは、低コストで信頼性の高いもう１つの照射源である。超高輝度ＬＥＤならびに大きい吸収断面および量子効率を有する色素における最近の進歩は単一粒子検出に対するＬＥＤの適用可能性を支持している。そのようなレーザーは単独で、または水素アークランプ、元素アークランプ、ハロゲンランプ、アーク放電、プラズマ放電、発光ダイオードまたはそれらの組み合わせ等の他の光源と組み合わせて使用することができる。
【０１９７】
他の態様において、ＥＭ源はパルス波レーザーの形態であり得る。そのような態様において、レーザーのパルス寸法は重要な要因である。そのような態様において、寸法、焦点スポット、およびレーザーによって放射される全エネルギーが重要であり、蛍光ラベルを励起し得るように十分なエネルギーでなければならない。パルスレーザーを使用する場合、継続時間のより長いパルスを必要とすることがある。いくつかの態様において、２ナノ秒のレーザーパルスを使用してよい。いくつかの態様において、５ナノ秒のレーザーパルスを使用してよい。いくつかの態様において、２〜５ナノ秒のパルスを使用してよい。
【０１９８】
最適なレーザー強度は、単一色素の光退色特性、およびインタロゲーション・スペースを横切るのに必要とされる時間の長さ（粒子速度、１つより多くのインタロゲーション・スペースを使用する場合のインタロゲーション・スペース間の距離、および（１つまたは複数の）インタロゲーション・スペースの寸法が含まれる）に依存する。最大の信号を得るために、大部分の色素の光退色を引き起こさないであろう最大の強度で試料を照射することが望ましい。好ましい強度は、粒子がインタロゲーション・スペースを横切るまでの時間に、５％以下の色素が脱色されるようなものである。
【０１９９】
レーザー出力は、刺激されることを必要とする色素分子の種類、および色素分子が刺激される時間の長さ、ならびに／または色素分子がキャピラリーフローセルを通過する速度に応じて設定する。レーザー出力は、エネルギーがビームによって伝達される速度として定義され、ジュール／秒またはワットの単位で測定される。レーザーの出力が大きいほど、レーザーが粒子を照射する時間が短くてよく、一方、粒子がインタロゲーション・スペースを通過する間に、一定量のエネルギーがそのインタロゲーション・スペースに供給されることが理解されるであろう。従って、いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間の組み合わせは、照射時間の間にインタロゲーション・スペースによって受け取られる全エネルギーが約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００マイクロジュールより大きいような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間の組み合わせは、照射時間の間にインタロゲーション・スペースによって受け取られる全エネルギーが約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１１０マイクロジュールより小さいような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間の組み合わせは、照射時間の間にインタロゲーション・スペースによって受け取られる全エネルギーが約０．１〜１００マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間の組み合わせは、照射時間の間にインタロゲーション・スペースによって受け取られる全エネルギーが約１〜１００マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間の組み合わせは、照射時間の間にインタロゲーション・スペースによって受け取られる全エネルギーが約１〜５０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間の組み合わせは、照射時間の間にインタロゲーション・スペースによって受け取られる全エネルギーが約２〜５０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間の組み合わせは、照射時間の間にインタロゲーション・スペースによって受け取られる全エネルギーが約３〜６０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間の組み合わせは、照射時間の間にインタロゲーション・スペースによって受け取られる全エネルギーが約３〜５０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間の組み合わせは、照射時間の間にインタロゲーション・スペースによって受け取られる全エネルギーが約３〜４０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間の組み合わせは、照射時間の間にインタロゲーション・スペースによって受け取られる全エネルギーが約３〜３０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間の組み合わせは、照射時間の間にインタロゲーション・スペースによって受け取られる全エネルギーが約１マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間の組み合わせは、照射時間の間にインタロゲーション・スペースによって受け取られる全エネルギーが約３マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間の組み合わせは、照射時間の間にインタロゲーション・スペースによって受け取られる全エネルギーが約５マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間の組み合わせは、照射時間の間にインタロゲーション・スペースによって受け取られる全エネルギーが約１０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間の組み合わせは、照射時間の間にインタロゲーション・スペースによって受け取られる全エネルギーが約１５マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間の組み合わせは、照射時間の間にインタロゲーション・スペースによって受け取られる全エネルギーが約２０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間の組み合わせは、照射時間の間にインタロゲーション・スペースによって受け取られる全エネルギーが約３０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間の組み合わせは、照射時間の間にインタロゲーション・スペースによって受け取られる全エネルギーが約４０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間の組み合わせは、照射時間の間にインタロゲーション・スペースによって受け取られる全エネルギーが約５０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間の組み合わせは、照射時間の間にインタロゲーション・スペースによって受け取られる全エネルギーが約６０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間の組み合わせは、照射時間の間にインタロゲーション・スペースによって受け取られる全エネルギーが約７０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間の組み合わせは、照射時間の間にインタロゲーション・スペースによって受け取られる全エネルギーが約８０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間の組み合わせは、照射時間の間にインタロゲーション・スペースによって受け取られる全エネルギーが約９０マイクロジュールであるような組み合わせである。いくつかの態様において、レーザー出力と照射時間の組み合わせは、照射時間の間にインタロゲーション・スペースによって受け取られる全エネルギーが約１００マイクロジュールであるような組み合わせである。
【０２００】
いくつかの態様において、レーザー出力は、少なくとも約１ｍＷ、２ｍＷ、３ｍＷ、４ｍＷ、５ｍＷ、６ｍＷ、７ｍＷ、８ｍＷ、９ｍＷ、１０ｍＷ、１３ｍＷ、１５ｍＷ、２０ｍＷ、２５ｍＷ、３０ｍＷ、４０ｍＷ、５０ｍＷ、６０ｍＷ、７０ｍＷ、８０ｍＷ、９０ｍＷ、１００ｍＷに設定され、または１００ｍＷより大きく設定される。いくつかの態様において、レーザー出力は少なくとも約１ｍＷに設定される。いくつかの態様において、レーザー出力は少なくとも約３ｍＷに設定される。いくつかの態様において、レーザー出力は少なくとも約５ｍＷに設定される。いくつかの態様において、レーザー出力は少なくとも約１０ｍＷに設定される。いくつかの態様において、レーザー出力は少なくとも約１５ｍＷに設定される。いくつかの態様において、レーザー出力は少なくとも約２０ｍＷに設定される。いくつかの態様において、レーザー出力は少なくとも約３０ｍＷに設定される。いくつかの態様において、レーザー出力は少なくとも約４０ｍＷに設定される。いくつかの態様において、レーザー出力は少なくとも約５０ｍＷに設定される。いくつかの態様において、レーザー出力は少なくとも約６０ｍＷに設定される。いくつかの態様において、レーザー出力は少なくとも約９０ｍＷに設定される。
【０２０１】
レーザーがインタロゲーション・スペースを照射する時間は、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００または１０００マイクロ秒以上に設定され得る。レーザーがインタロゲーション・スペースを照射する時間は、約２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、１５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００または２０００マイクロ秒以下に設定され得る。レーザーがインタロゲーション・スペースを照射する時間は、約１〜１０００マイクロ秒の間に設定され得る。レーザーがインタロゲーション・スペースを照射する時間は、約５〜５００マイクロ秒の間に設定され得る。レーザーがインタロゲーション・スペースを照射する時間は、約５〜１００マイクロ秒の間に設定され得る。レーザーがインタロゲーション・スペースを照射する時間は、約１０〜１００マイクロ秒の間に設定され得る。レーザーがインタロゲーション・スペースを照射する時間は、約１０〜５０マイクロ秒の間に設定され得る。レーザーがインタロゲーション・スペースを照射する時間は、約１０〜２０マイクロ秒の間に設定され得る。レーザーがインタロゲーション・スペースを照射する時間は、約５〜５０マイクロ秒の間に設定され得る。レーザーがインタロゲーション・スペースを照射する時間は、約１〜１００マイクロ秒の間に設定され得る。いくつかの態様において、レーザーがインタロゲーション・スペースを照射する時間は約１マイクロ秒である。いくつかの態様において、レーザーがインタロゲーション・スペースを照射する時間は約５マイクロ秒である。いくつかの態様において、レーザーがインタロゲーション・スペースを照射する時間は約１０マイクロ秒である。いくつかの態様において、レーザーがインタロゲーション・スペースを照射する時間は約２５マイクロ秒である。いくつかの態様において、レーザーがインタロゲーション・スペースを照射する時間は約５０マイクロ秒である。いくつかの態様において、レーザーがインタロゲーション・スペースを照射する時間は約１００マイクロ秒である。いくつかの態様において、レーザーがインタロゲーション・スペースを照射する時間は約２５０マイクロ秒である。いくつかの態様において、レーザーがインタロゲーション・スペースを照射する時間は約５００マイクロ秒である。いくつかの態様において、レーザーがインタロゲーション・スペースを照射する時間は約１０００マイクロ秒である。
【０２０２】
例えば、レーザーがインタロゲーション・スペースを照射する時間は、３ｍＷ、４ｍｗ、５ｍＷの、または５ｍＷより大きい出力を提供するレーザーと共に、１ミリ秒、２５０マイクロ秒、１００マイクロ秒、５０マイクロ秒、２５マイクロ秒または１０マイクロ秒に設定され得る。いくつかの態様において、ラベルは、３ｍＷの出力を提供し、かつ約１０００マイクロ秒間ラベルを照射するレーザーによって照射される。他の態様において、ラベルは、１０００ミリ秒より短い間、約２０ｍＷ以下の出力を提供するレーザーによって照射される。他の態様において、ラベルは、約２５０マイクロ秒に等しい又はそれより短い間、２０ｍＷのレーザー出力によって照射される。いくつかの態様において、ラベルは、約１０００マイクロ秒に等しい又はそれより短い間、約５ｍＷのレーザー出力によって照射される。
【０２０３】
［２．キャピラリーフローセル］
キャピラリーフローセルは、試料システムに流体接続される。一の態様において、分析器システムのインタロゲーション・スペース３１４は、対応するビーム３１１の断面積によって、および検出器３０９の視野内のビームのセグメントによって規定される。分析器システムの一の態様において、インタロゲーション・スペース３１４は、ここで規定するように、約０．０１〜５００ｐＬ、または約０．０１ｐＬ〜１００ｐＬ、または約０．０１ｐＬ〜１０ｐＬ、または約０．０１ｐＬ〜１ｐＬ、または約０．０１ｐＬ〜０．５ｐＬ、または約０．０２ｐＬ〜約３００ｐＬ、または約０．０２ｐＬ〜約５０ｐＬ、または約０．０２ｐＬ〜約５ｐＬ、または約０．０２ｐＬ〜約０．５ｐＬ、または約０．０２ｐＬ〜約２ｐＬ、または約０．０５ｐＬ〜約５０ｐＬ、または約０．０５ｐＬ〜約５ｐＬ、または約０．０５ｐＬ〜約０．５ｐＬ、または約０．０５ｐＬ〜約０．２ｐＬ、または約０．１ｐＬ〜約２５ｐＬの体積を有する。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは約０．０１ｐＬ〜１０ｐＬの体積を有する。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペース３１４は約０．０１ｐＬ〜１ｐＬの体積を有する。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペース３１４は約０．０２ｐＬ〜約５ｐＬの体積を有する。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペース３１４は約０．０２ｐＬ〜約０．５ｐＬの体積を有する。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペース３１４は約０．０５ｐＬ〜約０．２ｐＬの体積を有する。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペース３１４は約０．１ｐＬの体積を有する。他の有用なインタロゲーション・スペース体積は、本明細書に記載されているようなものである。分析器の最大性能に対してインタロゲーション・スペース３１４を選択し得ることを、当業者は理解するべきである。非常に小さいインタロゲーション・スペースがバックグラウンド・ノイズを最小にすることが示されてきたが、大きいインタロゲーション・スペースは、低濃度試料を妥当な長さの時間で分析し得るという利点を有する。２つのインタロゲーション・スペース３７０および３７１を用いる態様において、１つのインタロゲーション・スペース３１４に関して本明細書に記載した体積等の体積を用いてよい。
【０２０４】
本発明の一の態様において、インタロゲーション・スペースは、約１０００フェムトモル濃度（ｆＭ）〜約１ゼプトモル濃度（ｚＭ）の範囲の濃度での粒子の検出を可能にするのに十分な大きさである。本発明の一の態様において、インタロゲーション・スペースは、約１０００ｆＭ〜約１アトモル濃度（ａＭ）の範囲の濃度での粒子の検出を可能にするほど十分に大きい。本発明の一の態様において、インタロゲーション・スペースは、約１０ｆＭ〜約１アトモル濃度（ａＭ）の範囲の濃度での粒子の検出を可能にするのに十分な大きさである。多くの場合、大きいインタロゲーション・スペースは、前濃縮装置または技術を追加することなく、約１ｆＭより低い濃度での粒子の検出を可能にする。最も適切なインタロゲーション・スペース寸法が、検出すべき粒子の輝度、バックグラウンド信号のレベル、および分析すべき試料の濃度に依存することを、当業者は理解するであろう。
【０２０５】
インタロゲーション・スペース３１４の寸法は、分析器の光学的構成を調節することによって限定することができる。一の態様において、ビーム３１１の直径を調節してインタロゲーション・スペース３１４の体積を変化させることができる。もう１つの態様において、検出器３０９の視野を変化させることができる。従って、源３０１および検出器３０９を調節して、インタロゲーション・スペース３１４の中で単一粒子を照射および検出することができる。もう１つの態様において、検出器３０９の視野を決定する開口部３０６（図１Ａ）の幅は変更可能である。この構成により、ほぼリアルタイムでインタロゲーション・スペースを変化させて、それによって、より高濃度または低濃度の試料を補償し、２つ又はそれより多くの粒子が同時にインタロゲーション・スペース内に存在する低い可能性を確保することが可能となる。２つ又はそれより多くのインタロゲーション・スペース３７０および３７１に関して同様の変更を行ってよい。
【０２０６】
もう１つの態様において、インタロゲーション・スペースは、実際の試料を試験する前に、キャピラリーフローセルを通過する既知の濃度の較正試料を用いることによって規定し得る。較正試料がキャピラリーフローセルを通過する際に、較正試料において１度にたった１つの単一粒子が検出される場合、焦点深度は、電磁放射線源のビームの直径と共に、キャピラリーフローセル内のインタロゲーション・スペースの寸法を決定する。
【０２０７】
インタロゲーション・スペースに対する物理的制限を固体壁によって提供することも可能である。一の態様において、試料流体がキャピラリー内に収容されている場合、壁はフローセル３１３（図２Ａ）の壁の１つまたはそれより多くである。一の態様において、セルはガラスから作製されるが、石英、溶融石英、および有機材料（テフロン（登録商標）、ナイロン、プラスチック（塩化ポリビニル、ポリスチレンおよびポリエチレン等）等）またはそれらのいずれかの組み合わせ等の、約２００〜約１，０００ｎｍの範囲またはそれより長い光に対して透明な他の物質を、本発明の範囲から逸脱することなく使用してよい。他の断面形状（例えば長方形、円筒形）を本発明の範囲から逸脱することなく用いてよいが、一の態様において、キャピラリーフローセル３１３は正方形断面を有する。もう１つの態様において、インタロゲーション・スペースは、チップ（図示せず）内にエッチングされたチャンネル（図示せず）によって少なくとも部分的に規定してよい。同様の考察が、２つのインタロゲーション・スペースを用いる態様に適用される（図２Ｂにおける３７０および３７１）。
【０２０８】
インタロゲーション・スペースは液体に浸かっている（ｂａｔｈｅｄ）。一の態様において、液体は水性である。他の態様において、液体は非水性、または水性流体および非水性流体の混合物である。更に、液体は、ｐＨを調節する試薬、イオン性組成物、または可溶性マクロ粒子もしくはポリマーもしくはゲル等のシービング剤（ｓｉｅｖｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含有してよい。流体接続を一時的に中断するために、バルブまたは他のデバイスがインタロゲーション・スペースの間に存在してよいことが考えられる。一時的に中断されたインタロゲーション・スペースは、流体によって接続されていると考えられる。
【０２０９】
本発明のもう１つの態様において、インタロゲーション・スペースは、フローセル３１３内に存在する単一のインタロゲーション・スペースであって、希釈体積（または希釈剤体積）内の試料材料の層流（鞘流（ｓｈｅａｔｈ  ｆｌｏｗ）とも呼ぶ）の寸法によって制限されるインタロゲーション・スペースである。これらの態様および他の態様において、インタロゲーション・スペースは、鞘流のみによって、または照射源の寸法もしくは検出器の視野との組み合わせによって規定し得る。鞘流は多数の方法で構成可能であり、それには以下のものが含まれる：試料材料が、同心の層流における内側（または内部）材料であり、希釈体積を外側に有する；希釈体積が試料体積の１つの側にある；希釈体積が試料材料の２つの側にある；希釈体積が試料材料の多数の側にあるが、試料材料を完全に取り囲んではいない；希釈体積が試料材料を完全に取り囲んでいる；希釈体積が試料材料を同心円状に完全に取り囲んでいる；試料材料が、不連続な一連の滴における内側材料であり、希釈体積が試料材料の各々の滴を完全に取り囲んでいる。
【０２１０】
いくつかの態様において、本発明の単一分子検出器は、１つ以下のインタロゲーション・スペースを有する。いくつかの態様において、多数のインタロゲーション・スペースが用いられる。多数のインタロゲーション・スペースは既に開示されており、米国特許出願第１１／０４８，６６０号から引用することによって組み込まれる。いくつかの場合において、分析器が複数の異なるインタロゲーション・スペースを有するであろうことを、当業者は理解するであろう。いくつかの態様において、分析器は、２、３、４、５、６またはそれより多くの異なるインタロゲーション・スペースを有する。
【０２１１】
［３．駆動力］
分析器システムの一の態様において、粒子は、駆動力によってインタロゲーション・スペースを通って移動する。いくつかの態様において、粒子を移動させるための駆動力は圧力である。いくつかの態様において、圧力は、ポンプ、および空気圧源、真空源、遠心分離器、またはそれらの組み合わせによって供給される。いくつかの態様において、粒子を移動させるための駆動力は導電学的力である。駆動力として導電学的力を使用することは先の出願において既に開示されており、米国特許出願第１１／０４８，６６０号から引用することによって組み込まれる。
【０２１２】
一の態様において、キャピラリーフローセルのインタロゲーション・スペースを通って粒子を移動させるための駆動力として、圧力が使用可能である。別の態様において、ポンプによって試料を移動させるために圧力が供給される。適切なポンプは、当該技術分野において公知である。一の態様において、ＨＰＬＣ用途で製造されたポンプ（Ｓｃｉｖａｘ，Ｉｎｃ．によって製造されたポンプ等）が、駆動力として使用可能である。他の態様において、より小さい体積の試料をポンプで送る場合、マイクロフルイディクス用途で製造されたポンプが使用可能である。そのようなポンプは米国特許第５，０９４，５９４号、第５，７３０，１８７号、第６，０３３，６２８号および第６，５３３，５５３号に記載されており、これらは、ナノリットルまたはピコリットル範囲の流体体積をポンプで送ることができる装置を開示している。好ましくは、試料に接触するポンプ内の全ての材料は、高度に不活性な材料、例えばポリエーテルエーテルトン（ＰＥＥＫ）、溶融石英またはサファイアから作製される。
【０２１３】
キャピラリーフローセルを通って試料を移動させて、分析のためのインタロゲーション・スペースを通って試料を押し出すために、駆動力が必要である。駆動力は、試料が通過した後に、キャピラリーフローセルを通って洗浄試料を押し出すためにも必要とされる。試料の回収を行う場合、駆動力は、試料回収容器の中に試料を押し戻すためにも必要とされる。標準的なポンプは様々な寸法のものがあり、予想される試料寸法および流れの必要条件に適するように、適切な寸法を選択してよい。いくつかの態様において、個別のポンプを試料分析、およびシステムの洗浄に使用する。分析ポンプは約０．０００００１ｍＬ〜約１０ｍＬ、または約０．００１ｍＬ〜約１ｍＬ、または約０．０１ｍＬ〜約０．２ｍＬ、または約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、または０．５ｍＬの容量を有してよい。洗浄ポンプは、分析ポンプより大きい容量であってよい。洗浄ポンプは約０．０１ｍＬ〜約２０ｍＬ、または約０．１ｍＬ〜約１０ｍＬ、または約０．１ｍＬ〜約２ｍＬ、または約０．０５、０．１、０．５、１、５、または１０ｍＬの体積を有してよい。これらのポンプ寸法は一例に過ぎず、用途、試料サイズ、ポンプで送る液体の粘度、管の寸法、流速、温度、および当該技術分野においてよく知られている他の要因に応じてポンプ寸法を選択してよいことを、当業者は理解するであろう。いくつかの態様において、システムのポンプはステッピングモーターによって駆動され、このステッピングモーターは、マイクロプロセッサによって非常に正確に制御することが容易である。
【０２１４】
好ましい態様において、洗浄および分析ポンプを、流れの方向を制御するために特別な逆止弁と共に連続して使用する。分析ポンプが最大量の試料を抜き出す場合に、試料がポンプ自体に達しないように、配管を設計する。このことは、分析ポンプの１回拍出量（ｓｔｒｏｋｅ  ｖｏｌｕｍｅ）より管体積が大きくなるように、分析ポンプと分析キャピラリーとの間の管のＩＤおよび長さを選択することによって達成される。
【０２１５】
［４．検出器］
一の態様において、電磁放射線に曝された後に蛍光ラベルによって放射される光（例えば、紫外、可視または赤外領域における光）が検出される。検出器３０９（図１Ａ）または検出器（３６４、３６５、図１Ｂ）は、蛍光部分からの光子バーストの振幅および継続時間を捕らえることができ、更に、光子バーストの振幅および継続時間を電気信号に変換することができる。ＣＣＤカメラ、ビデオ入力モジュールカメラおよびストリークカメラ等の検出装置を、連続信号で像を形成するために使用し得る。もう１つの態様において、逐次的な信号を形成する、ボロメータ、フォトダイオード、フォトダイオードアレイ、アバランシェフォトダイオードおよび光電子増倍管等の装置を使用してよい。上述の検出器のいずれの組み合わせを用いてもよい。一の態様において、アバランシェフォトダイオードが、光子を検出するために用いられる。
【０２１６】
インタロゲーション・スペース３１４（図２Ａ）と、それに対応する検出器３０９（図１Ａ）との間に特定の光学機器を用いると、放射される電磁放射線のいくつかの異なる特性を検出し得、その特性には以下のものが含まれる：放射波長、放射強度、バーストサイズ、バーストの継続時間および蛍光偏光。いくつかの態様において、検出器３０９は、逆バイアスで使用されるフォトダイオードである。逆バイアスに設定されたフォトダイオードは通常、極めて高い抵抗を有する。この抵抗は、適切な振動数の光がＰ／Ｎ接合において光を放つ場合に減少する。従って、逆バイアスダイオードは、その中を流れる電流をモニタリングすることによって、検出器として使用可能である。この効果に基づく回路は、ゼロバイアスに基づく回路よりも、光に対して高感度である。
【０２１７】
分析器システムの一の態様において、フォトダイオードは、常套的なフォトダイオードよりずっと大きい逆バイアスで操作可能なアバランシェフォトダイオードであり得、従って、各々の光発生キャリアをアバランシェ降伏によって増加させることが可能となり、そのことがフォトダイオード内に内部増幅をもたらし、それにより装置の有効反応性（または応答性）（感度）が増加する。フォトダイオードの選択は、蛍光ラベリングされた粒子によって放射されるエネルギーまたは放射波長によって決定される。いくつかの態様において、フォトダイオードは、１９０〜１１００ｎｍの範囲のエネルギーを検出するシリコンフォトダイオードである；もう１つの態様において、フォトダイオードは、８００〜１７００ｎｍの範囲のエネルギーを検出するゲルマニウムフォトダイオードである；もう１つの態様において、フォトダイオードは、８００〜２６００ｎｍの範囲のエネルギーを検出するインジウムガリウムヒ化物フォトダイオードである；また、更に他の態様において、フォトダイオードは、１０００ｎｍ未満〜３５００ｎｍの範囲のエネルギーを検出する硫化鉛フォトダイオードである。いくつかの態様において、アバランシェフォトダイオードは、４００ｎｍ〜１１００ｎｍの波長範囲のエネルギーを検出するように設計された単一光子検出器である。単一光子検出器は市販されている（例えばＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウェルズリー）。
【０２１８】
いくつかの態様において、検出器は、３００ｎｍ〜１７００ｎｍのエネルギーを検出するアバランシェフォトダイオード検出器である。一の態様において、シリコンアバランシェフォトダイオードは、３００ｎｍ〜１１００ｎｍの波長を検出するのに使用可能である。インジウムガリウムヒ化物フォトダイオードは、９００ｎｍ〜１７００ｎｍの波長を検出するのに使用可能である。いくつかの態様において、分析器システムは少なくとも１つの検出器を有し得る；他の態様において、分析器システムは少なくとも２つの検出器を有し得、各検出器は、特定の波長範囲で光エネルギーを検出するように選択および構成され得る。例えば、２つの個別の検出器が、異なるラベルで標識された粒子を検出するのに使用可能であり、それらの粒子は、ＥＭ源で励起されると、異なるスペクトルのエネルギーを有する光子を放出するであろう。一の態様において、分析器システムは、緑色色素（例えばＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６）によって放射されるような４５０〜７００ｎｍの範囲の蛍光エネルギーを検出し得る第１検出器；および遠赤色色素（例えばＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７）によって放射されるような６２０〜７８０ｎｍの範囲の蛍光エネルギーを検出し得る第２検出器を有し得る。青色色素（例えばＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２）によって放射されるような４００〜６００ｎｍの範囲の蛍光エネルギーを検出するため、および赤色色素（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６およびＣｙ３）によって放射されるような５６０〜７００ｎｍの範囲のエネルギーを検出するための検出器もまた、使用可能である。
【０２１９】
２つ又はそれより多くの検出器を有するシステムは、異なるスペクトルで光を放射する２つ又はそれより多くのラベルで各々標識された個別の粒子を検出するのに使用可能である。例えば、２つの異なる検出器が、２つの異なる色素ラベルで標識された抗体を検出し得る。別法として、２つの検出器を有する分析器システムは、異なる種類の粒子を検出するのに使用され得、各々の種類の粒子は、異なる色素分子または２つ若しくはそれより多くの色素分子の混合物で標識されている。例えば、２つの異なる検出器が、２つの異なるタンパク質を認識する２つの異なる種類の抗体を検出するのに使用され得、各々の種類の抗体は、異なる色素ラベルまたは２つ若しくはそれより多くの色素ラベル分子の混合物で標識される。２つ又はそれより多くの色素ラベル分子の割合を変化させることによって、２つ又はそれより多くの異なる種類の粒子を、２つの検出器を用いて個別に検出することができる。３つ又はそれより多くの検出器が、本発明の範囲から逸脱することなく使用可能であることが理解される。
【０２２０】
１つ又はそれより多くの検出器が各インタロゲーション・スペースに設定され得ること、１つ又はそれより多くのインタロゲーション・スペースがフローセル内で規定されること、および上で列挙した放射された電磁放射線の特性のいずれかを検出するために各検出器を設定してよいことを、当業者は理解するべきである。多数の検出器、例えば多数のインタロゲーション・スペースに対する多数の検出器の使用が、先の出願において既に開示されており、米国特許出願第１１／０４８，６６０号から引用することによって本明細書に組み込まれる。一旦粒子がラベリングされて検出可能になると（または、粒子がその粒子を検出可能にする固有の特性を有する場合）、当該技術分野において公知の任意の適切な検出メカニズムを本発明の範囲から逸脱することなく使用してよい（例えばＣＣＤカメラ、ビデオ入力モジュールカメラ、ストリークカメラ、ボロメータ、フォトダイオード、フォトダイオードアレイ、アバランシェフォトダイオード、および連続信号を生成する光電子増倍管、ならびにそれらの組み合わせ）。以下のものを含む電磁放射線の異なる特性を検出し得る：放射波長、放射強度、バーストサイズ、バーストの継続時間、蛍光偏光、およびそれらのいずれかの組み合わせ。
【０２２１】
［Ｃ．サンプリングシステム］
別の態様において、分析器システムは、分析器システムに導入する試料を調製するためのサンプリングシステムを含んでよい。含まれるサンプリングシステムは、複数の試料を自動的にサンプリングし、試料容器と第１のインタロゲーション・スペースとの間の流体連結を提供することができる。
【０２２２】
いくつかの態様において、本発明の分析器システムは、試料のアリコートを分析のために単一粒子分析器に導入するためのサンプリングシステムを有する。試料を導入し得るいずれのメカニズムを用いてもよい。試料は、ポンプによって形成される真空吸引を用いて、または液体をチューブの中へ押し進めるであろう、試料に加えられた圧力によって、または試料をサンプリング管に導入するように機能する他の何らかのメカニズムによって抜き出し得る。一般に、サンプリングシステムは、既知の試料体積の試料を単一粒子分析器の中に導入するが、必ずしもそうではない；１つの粒子または複数の粒子の存在または不存在が検出されるいくつかの態様において、試料サイズの正確な情報は重要でない。好ましい態様において、サンプリングシステムは、単一試料または複数の試料に対する自動サンプリングを提供する。既知の体積の試料がシステムの中に導入される態様において、サンプリングシステムは、約０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、１０００、１５００または２０００μｌより多くの分析試料を供給する。いくつかの態様において、サンプリングシステムは、約２０００、１０００、５００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、２、１、０．１、０．０１または０．００１μｌより少ない分析試料を供給する。いくつかの態様において、サンプリングシステムは、約０．０１〜１５００μｌ、または約０．１〜１０００μｌ、または約１〜５００μｌ、または約１〜１００μｌ、または約１〜５０μｌ、または約１〜２０μｌの分析試料を供給する。いくつかの態様において、サンプリングシステムは約５μｌ〜２００μｌ、または約５μｌ〜約１００μｌ、または約５μｌ〜５０μｌの分析試料を供給する。いくつかの態様において、サンプリングシステムは約１０μｌ〜２００μｌ、または約１０μｌ〜１００μｌ、または約１０μｌ〜５０μｌの分析試料を供給する。いくつかの態様において、サンプリングシステムは、約０．５μｌ〜約５０μｌの分析試料を供給する。
【０２２３】
本発明の方法の感度を理由として、非常に小さい試料体積を使用し得る。例えば、本発明の方法は、標準的な試料体積である１００μｌと比較して小さい試料体積、例えば１０μｌまたはそれより小さい試料体積でＶＥＧＦを測定するのに使用可能である。本発明は、他の方法と比較して、より多数の試料が小体積試料における定量的結果をもたらすことを可能にする。例えば、通常の１ｍｍ針生検から調製される溶解物は、１０μｌより小さい又はそれに等しい体積を有してよい。本発明を用いると、そのような試料を分析し得る。いくつかの態様において、本発明は１００μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は９０μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は８０μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は７０μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は６０μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は５０μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は４０μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は３０μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は２５μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は２０μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は１５μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は１０μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は５μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は１μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は０．０５μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は０．０１μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は０．００５μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は０．００１μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は０．０００５μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は０．０００１μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。
【０２２４】
いくつかの態様において、サンプリングシステムは、試料ごとに変化し得る試料サイズを提供する。これらの態様において、試料サイズは、本明細書に記載のいずれの試料サイズであってもよく、記載されているように、各試料で又は試料の各組で変化させてよい。
【０２２５】
試料体積の確度、およびサンプリングシステムの試料間の体積精度が、当面の分析に対して必要とされる。いくつかの態様において、サンプリング体積の精度は、用いられるポンプによって決まり、通常、試料体積の約５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１、０．５、０．１、０．０５または０．０１％より小さいＣＶによって示される。いくつかの態様において、サンプリングシステムの試料間の精度は、約５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１、０．５、０．１、０．０５または０．０１％より小さいＣＶによって示される。いくつかの態様において、サンプリングシステムのアッセイ内（ｉｎｔｒａ−ａｓｓａｙ）の精度は、約１０、５、１、０．５または０．１％より小さいＣＶによって示される。いくつかの態様において、サンプリングシステムのアッセイ内の精度は、約１０％より小さいＣＶを示す。いくつかの態様において、サンプリングシステムのアッセイ間（ｉｎｔｅｒａｓｓａｙ）の精度は、約５％より小さいＣＶによって示される。いくつかの態様において、サンプリングシステムのアッセイ間の精度は、約１％より小さいＣＶを示す。いくつかの態様において、サンプリングシステムのアッセイ間の精度は、約０．５％より小さいＣＶによって示される。いくつかの態様において、サンプリングシステムのアッセイ間の精度は、約０．１％より小さいＣＶを示す。
【０２２６】
いくつかの態様において、サンプリングシステムは、小さい試料キャリーオーバーを提供し、これは、試料間で追加の洗浄工程を必要としないという点で好都合である。従って、いくつかの態様において、試料のキャリーオーバーは約１、０．５、０．１、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００５または０．００１％より小さい。いくつかの態様において、試料のキャリーオーバーは約０．０２％より小さい。いくつかの態様において、試料のキャリーオーバーは約０．０１％より小さい。
【０２２７】
いくつかの態様において、サンプラーは試料ループを提供する。これらの態様において、多数の試料が管の中へと連続的に抜き出され、各々は、緩衝液の「栓」によって他から分離される。試料は通常、間に洗浄することなく、次々と読み取られる。洗浄はループの最後に１回行われる。緩衝液の「栓」を用いる態様において、栓を回収して、マイクロタイタープレートの独立したウェルの中に緩衝液の栓を排出してよい。
【０２２８】
サンプリングシステムは、標準的分析器具、例えば９６−ウェルマイクロタイタープレート、または好ましくは３８４−ウェルプレートと共に使用されるようになっていてよい。いくつかの態様において、システムは、９６−ウェルプレート・ポジショナー、ならびに試料管をウェルに浸すため及びウェルから取り出すためのメカニズム、例えばＸ、ＹおよびＺ軸に沿う動きを提供するメカニズムを有する。いくつかの態様において、サンプリングシステムは、多数のサンプリングチューブであって、試料を保存して試験を開始する際にそこから試料を抽出してよいサンプリングチューブを提供する。いくつかの態様において、多数のチューブからの全ての試料を１つの検出器において分析する。他の態様において、複数の単一分子検出器を試料管に接続してよい。試料は、サンプリングシステムによってサンプリングする前に、プレートのウェル中の試料において実施される操作を含む工程によって調製してよく、または分析器システム内で試料を調製してよく、または両方の何らかの組み合わせであってよい。
【０２２９】
［Ｄ．試料調製システム］
試料の調製には、分析のための原試料を調製するのに必要な工程が含まれる。これらの工程は、例として、以下の１つまたはそれより多くの工程を含み得る：遠心分離、濾過、蒸留、クロマトグラフィー等の分離工程；濃縮、細胞溶解、ｐＨの変化、緩衝液の追加、希釈剤の追加、試薬の追加、加熱または冷却、ラベルの追加、ラベルの結合、照射による架橋、結合していないラベルの分離、妨害化合物の不活性化および／または除去、ならびに単一粒子分析器による分析のために試料を調製するのに必要とされる他の何らかの工程。いくつかの態様において、血液を処理して血漿または血清に分離する。追加のラベリング、結合していないラベルの除去および／または希釈工程もまた、血清または血漿試料において実施してよい。
【０２３０】
いくつかの態様において、分析器システムは、単一粒子分析器による分析の準備がされた試料を提供するのに必要とされる工程のいくつか又は全てを行う試料調製システムを含む。このシステムは、上で列挙した試料調製のための工程のいずれか又は全てを行ってよい。いくつかの態様において、試料は、分析器システムの試料調製システムによって部分的に処理される。従って、いくつかの態様において、試料は、まず、分析器システムの外部で部分的に処理してよい。例えば、試料をまず遠心分離してよい。その後、試料調製システムによって分析器の内部で試料を部分的に処理してよい。分析器内部における処理は、試料のラベリング、試料と緩衝液との混合、および当業者に公知であろう他の処理工程を含む。いくつかの態様において、血清または血漿試料を提供するために、血液試料を分析器システムの外部で処理し、その試料を分析器システムの中に導入し、件の１つの粒子または複数の粒子をラベリングするため、および場合により結合していないラベルを除去するために、試料調製システムによって更に処理する。他の態様において、試料調製は、注目していない粒子を除去するため、および試料分析を阻害し得る粒子を除去するための試料の免疫除去を含み得る。更に他の態様において、試料は、試料分析を阻害し得る粒子が激減され得る。例えば、試料調製は、異好性抗体の激減を含み得、異好性抗体は、件の粒子を直接的または間接的に検出するために非ヒト抗体を使用する免疫測定を阻害することが知られている。同様に、件の粒子の測定を阻害する他のタンパク質が、阻害タンパク質を認識する抗体を用いて試料から除去可能である。
【０２３１】
いくつかの態様において、試料は、測定および分析の前に固相抽出に付すことができる。例えば、ｃＡＭＰに関して分析される血清試料は、まず、それと結合するｃ１８カラムを用いて固相抽出にかけることができる。プロテアーゼ、リパーゼおよびホスファターゼ等の他のタンパク質をカラムから洗い流し、ｃＡＭＰ測定を劣化させ得る又は阻害し得るタンパク質を実質的に含まないｃＡＭＰを溶出する。固相抽出は、分析感度を低下させ得る試料の塩基性マトリクス（ｂａｓｉｃ  ｍａｔｒｉｘ）を除去するのに使用可能である。更に他の態様において、試料中に存在する件の粒子は、試料を乾燥または凍結乾燥させ、元の試料の体積より小さい体積中で粒子を可溶化することによって濃縮してよい。
【０２３２】
いくつかの態様において、分析器システムは、システムにおいて分析すべき試料の完全な調製、例えば血液試料、唾液試料、尿試料、脳脊髄液試料、リンパ液試料、ＢＡＬ試料、生検標本、法医学試料、バイオテロ試料等の完全な調製を提供する試料調製システムを提供する。いくつかの態様において、分析器システムは、試料調製のいくつか又は全てを提供する試料調製システムを提供する。いくつかの態様において、初期試料は、分析器システムによって更に処理される血液試料である。いくつかの態様において、試料は、分析器システムによって更に処理される血清または血漿試料である。血清または血漿試料は、例えば、件の１つの粒子または複数の粒子に結合するラベルに接触させることによって更に処理してよい；試料は、その後、結合していないラベルの除去と共に、または結合していないラベルを除去することなく用いてよい。
【０２３３】
いくつかの態様において、試料の調製は、分析システムの外部で、または分析システムの試料調製要素において、９６−ウェルプレート等の１つ又はそれより多くのマイクロタイタープレートにおいて行われる。試薬、緩衝液等の貯蔵容器は、当該技術分野においてよく知られているように、管または他の適切な構造によって、プレートのウェルと断続的に流体連結され得る。試料は、９６−ウェルプレートまたはチューブにおいて個別に調製してよい。試料分離工程、ラベル結合工程、および必要であればラベル分離工程は、１つのプレートにおいて行ってよい。いくつかの態様において、調製された粒子をその後、プレートから放出し、試料分析システムの中へとサンプリングするためのチューブの中に試料を移動させる。いくつかの態様において、試料調製の全ての工程は１つのプレートにおいて行われ、分析システムは、試料をプレートから直接採取する。この態様は９６−ウェルプレートに関して記載されているが、１つ又はそれより多くの試料を入れるための容器であって、試料調製に適した任意の容器を使用してよいことが、理解されるであろう。例えば、標準的な３８４または１５３６ウェルのマイクロタイタープレートを使用してよい。より一般的には、いくつかの態様において、試料調製システムは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、５００、１０００、５０００または１０，０００より多くの試料を保持および調製することができる。いくつかの態様において、複数の分析器システムにおける分析のために、複数の試料を採取してよい。従って、いくつかの態様において、２つの試料、または約２、３、４、５、７、１０、１５、２０、５０もしくは１００より多くの試料を試料調製システムから採取し、複数の試料分析器システムにおいて並行して実行する。
【０２３４】
マイクロフルイディクスシステムもまた、試料調製のために、および、特により少量の試料が検出に必要とされるのに十分な高濃度の粒子を含有すると推測される試料のための、分析器システムの一部である試料調製システムとして使用してよい。マイクロ流体マニピュレーションの原理および技術は当該技術分野において公知である。例えば、米国特許第４，９７９，８２４号；第５，７７０，０２９号；第５，７５５，９４２号；第５，７４６，９０１号；第５，６８１，７５１号；第５，６５８，４１３号；第５，６５３，９３９号；第５，６５３，８５９号；第５，６４５，７０２号；第５，６０５，６６２号；第５，５７１，４１０号；第５，５４３，８３８号；第５，４８０，６１４号；第５，７１６，８２５号；第５，６０３，３５１号；第５，８５８，１９５号；第５，８６３，８０１号；第５，９５５，０２８号；第５，９８９，４０２号；第６，０４１，５１５号；第６，０７１，４７８号；第６，３５５，４２０号；第６，４９５，１０４号；第６，３８６，２１９号；第６，６０６，６０９号；第６，８０２，３４２号；第６，７４９，７３４号；第６，６２３，６１３号；第６，５５４，７４４号；第６，３６１，６７１号；第６，１４３，１５２号；第６，１３２，５８０号；第５，２７４，２４０号；第６，６８９，３２３号；第６，７８３，９９２号；第６，５３７，４３７号；第６，５９９，４３６号；第６，８１１，６６８号および公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ９９５５４６１（Ａ１）を参照のこと。試料は、単一または複数の分析器システムにおいて使用するために、連続して又は並行して調製してよい。
【０２３５】
いくつかの態様において、試料は緩衝液を含む。緩衝液は、分析器システムの外部で試料と混合してよく、または試料調製メカニズムによって提供してよい。任意の適切な緩衝液を使用し得るが、好ましい緩衝液は低い蛍光バックグラウンドを有し、検出可能にラベリングされた粒子に対して不活性であり、作動ｐＨを保持し得、駆動力が導電学的である態様において、電気泳動に適したイオン強度を有する。緩衝液濃度は、約１〜約２００ｍＭの範囲の濃度等の、任意の適切な濃度であり得る。溶解度、機能、および件の分子の検出可能性を備える限り、任意の緩衝液系を用いてよい。いくつかの態様において、例えば、ポンピングを用いる用途に関して、緩衝液は以下のものからなる群から選択される。ホスフェート、グリシン、アセテート、シトレート、アシデュレート（ａｃｉｄｕｌａｔｅ）、カーボネート／バイカーボネート、イミダゾール、トリエタノールアミン、グリシンアミド、ボレート、ＭＥＳ、ビス−トリス、ＡＤＡ、ａｃｅｓ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ビス−トリスプロパン、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＴＡＰＳＯ、トリズマ（Ｔｒｉｚｍａ）、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＴＥＡ、ＥＰＰＳ、トリシン、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、ＨＥＰＢＳ、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＤ、ＴＡＢＳ、ＡＭＰＳＯ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＡＭＰ、ＣＡＰＳおよびＣＡＢＳ。緩衝液は、以下のものからなる群からも選択され得る。Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、ビシン、トリシン、２−モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、４−モルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）および２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール塩酸塩（ＡＭＰ）。有用な緩衝液は、ｐＨ８．１の２ｍＭトリス／ボレートであるが、トリス／グリシンおよびトリス／ＨＣｌも許容できる。他の緩衝液は本明細書に記載される。
【０２３６】
電気泳動に有用な緩衝液は、先の出願において開示されており、米国特許出願第１１／０４８，６６０号から引用することによって本明細書に組み込まれる。
【０２３７】
［Ｅ．試料の回収］
本発明の分析器および分析システムの態様の一の非常に有用な特徴は、試料を消費することなくその試料を分析し得ることである。このことは、試料材料が制限される場合に特に重要であり得る。試料の回収は、試料の他の分析を行うこと、または試料を再分析することも可能にする。試料サイズが制限され、かつ／または試料を再分析する能力が望まれる用途、例えば法医学、薬物のスクリーニング、および臨床的診断用途に対するこの特徴の利点は、当業者に明らかだろう。
【０２３８】
従って、いくつかの態様において、本発明の分析器システムは、分析後に試料を回収するための試料回収システムを更に提供する。これらの態様において、システムは、試料を分析器の中へと抜き出し、分析し、その後、例えば同じ経路によって、試料ホルダー、例えば試験管に戻すメカニズムおよび方法を含む。試料が破壊されないので、また、試料がバルブまたは他の管ののいずれにも入らないので、試料は汚染されないままである。更に、試料経路における全ての材料が高度に不活性である（例えばＰＥＥＫ、溶融石英またはサファイア）ので、試料経路からの汚染がほとんど存在しない。ステッピングモーターで制御されたポンプ（特に分析ポンプ）を使用することにより、引き上げられる体積および外に押し返される体積の正確な制御が可能となる。これにより、洗浄緩衝液による僅かな希釈がたとえあったとしても、試料の完全な又はほとんど完全な回収が可能となる。従って、いくつかの態様において、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％より多くの試料が分析の後に回収される。いくつかの態様において、回収された試料は希釈されない。いくつかの態様において、回収された試料は約１．５倍、１．４倍、１．３倍、１．２倍、１．１倍、１．０５倍、１．０１倍、１．００５倍または１．００１倍より小さい割合で希釈される。
【０２３９】
サンプリングおよび／または試料の回収のために、試料容器から分析器へ液体試料を移すための何らかのメカニズムを使用してよい。いくつかの態様において、分析キャピラリーの入口端は、短い長さの管、例えば試料容器（例えば試験管またはサンプルウェル）の中に浸され得る、または廃容器の上で保持され得るＰＥＥＫ管に取り付けられる。洗浄する場合、装置から前の試料を取り除くために、このチューブを廃容器の上に配置して、洗浄廃液を捕らえる。試料を抜き取る場合、チューブをサンプルウェルまたは試験管の中に入れる。通常、試料は素早く抜き取られ、次に、試料内の粒子を観察しながらゆっくりと押し出される。別法として、いくつかの態様において、抜き取りサイクルの少なくとも一部の間に、試料をゆっくりと抜き取る；試料は、ゆっくりと抜き取りながら分析してよい。この後に、試料を急速に戻して急速に洗浄することができる。いくつかの態様において、試料は、内側（抜き取り）サイクルおよび外側（押し出し）サイクルの両方で分析してよく、このことによって、例えば少量かつ希薄な試料の計数統計および結果の裏付け等が改善される。試料を節約することが望ましい場合、試料を、その試料が来た同じサンプルウェルの中に、または別のサンプルウェルに押し戻すことが可能である。試料の節約が望まれていない場合、管を廃容器の上に設ける。
【０２４０】
［ＶＩ．分子の高感度分析を用いる方法］
本発明のシステム、システムキットおよび方法により、従来測定されていた濃度よりずっと低い濃度で試料中の分子を測定することが可能となる。本発明の機器、キットおよび方法の高感度によって、検出感度の欠如により従来は不可能であったマーカー、例えば生物学的マーカーの設定が可能となる。本発明は、新たなマーカーを発見するために、本明細書に記載の組成物および方法を使用することも含む。
【０２４１】
生物学的状態を決定するのに使用される可能性を有するが、それらの下方範囲が知られていないので現在のところ実用的な役に立たない、現在入手可能な多数のマーカーが存在する。いくつかの場合において、異常に高いレベルのマーカーは現在の方法論によって検出可能であるが、正常範囲は確立されていなかった。いくつかの場合において、マーカーの上方正常範囲は検出可能であるが、下方正常範囲、または正常より下のレベルは検出できない。いくつかの場合、例えば、腫瘍に対して特異的なマーカー、または感染症マーカーにおいて、マーカーのいずれのレベルも生物学的状態の潜在的な存在を示し、検出感度の増強は早期診断に対して好都合である。いくつかの場合において、複数の時点にわたるマーカー濃度の変化速度または変化の欠如は最も有用な情報を提供するが、現在の分析方法では、通常は最も治療し易い病態の早期段階でのタイムポイントサンプリングにおけるマーカーレベルの決定が不可能である。多くの場合、マーカーは、臨床状況において実用的でない又は有用でない面倒な方法（複雑な試料処理および時間を要する分析を必要とする方法等）を使用することによってのみ、臨床的に有用なレベルで検出されることがある。
【０２４２】
更に、現在の方法によってその存在を検出することが極めて困難または不可能なままであるのに十分な低濃度で存在する潜在的な生物学的状態のマーカーが存在する。
【０２４３】
本発明の分析方法および組成物は、従来はマーカーを検出できなかった濃度での、生物学的状態に関するマーカーの検出を可能にし、従って、確認マーカー、または診断、予後、治療の方向付けに対する限られた研究状況においてのみ有用なマーカー、または臨床状況および／もしくは臨床試験等の大規模臨床状況において有用な他の種類のマーカーからのそのようなマーカーの「再目的化」を可能にするレベルの感度および精度を提供する。そのような方法によって、例えば、そのようなマーカーに対する正常および異常範囲の決定が可能となる。
【０２４４】
そのように再目的化されたマーカーは、例えば正常状態（正常範囲）の検出、（例えば、薬の投与等の処置に対する）レスポンダー／ノンレスポンダーの検出；早期疾患または病理学的発現の検出（例えば、早期段階の癌の検出、心虚血の早期検出）；病期分類（例えば癌）；疾患のモニタリング（例えば、糖尿病のモニタリング、治療後の癌の再発のモニタリング）；疾患のメカニズムの研究；および治療毒性（薬物治療の毒性（例えば心毒性）等）の研究のために使用可能である。
【０２４５】
［Ａ．方法］
従って、本発明は、マーカーの高感度検出のための方法および組成物、ならびにマーカーの正常および異常レベルに対する値を確立する更なる方法を提供する。更なる態様において、本発明は、マーカーに対して確立された値に基づく診断、予後診断および／または治療の選択の方法を提供する。本発明は、そのような方法において用いるための組成物、例えばマーカーの超高感度検出のための検出試薬も提供する。
【０２４６】
いくつかの態様において、本発明は、例えばマーカーの単一分子に結合したラベルを検出することによって、マーカーの単一分子を検出し、それによって生物学的試料のマーカー濃度を測定し、それによって、第１集団から得られる生物学的試料中のマーカーに関する濃度範囲を設定することにより、生物学的状態に関するマーカーを確立する方法を提供する。いくつかの態様において、マーカーは、ポリペプチドまたは小分子である。試料は本明細書に記載のいずれのもの（例えば血液、血漿、血清または尿）であってもよい。
【０２４７】
本方法は第１集団からの試料を使用してよく、この方法において、その集団は生物学的状態を示さない集団である。生物学的状態が病態である場合において、第１集団は、疾患を示さない集団、例えば「正常」集団であってよい。いくつかの態様において、本方法は、マーカーの単一分子を検出することにより生物学的試料のマーカー濃度を測定することによって、第２集団から得られる生物学的試料中のマーカーに関するレベルの範囲を設定することを更に含んでよく、第２集団の要素は生物学的状態を示す。いくつかの態様、例えば横断的研究において、第１および第２集団は異なる。いくつかの態様において、第２集団の少なくとも１つの要素は第１集団の要素であり、または前記集団の少なくとも１つの要素は第２集団の要素である。いくつかの態様、例えば縦断的研究において、第２集団の実質的に全ての要素は、生物学的状態、例えば疾患または病的状態が進行した第１集団の要素である。
【０２４８】
マーカーの単一分子の検出は、本明細書に記載の方法、例えば前記マーカーに対して、約１０００、１００、５０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５または０．００１フェムトモル濃度より小さい試料中のマーカーの検出限界を有する方法を用いて、マーカーの単一分子を検出することによって行われる。いくつかの態様において、マーカーの単一分子を検出することによる前記マーカーの検出限界は、約１００、５０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５または０．００１ｐｇ／ｍｌより小さい試料中のマーカーである。
【０２４９】
生物学的状態は、表現型の状態；生体に影響を及ぼす状態；発達状況；年齢；健康；病理；疾患；疾患過程；病期分類；感染症；毒性；または化学的因子、環境因子もしくは薬物因子（薬物反応の表現型検査、薬物毒性の表現型検査または薬物有効性の表現型検査等）に対する反応であってよい。
【０２５０】
いくつかの態様において、生物学的状態は病的状態であり、それには炎症、異常な細胞増殖および異常な代謝状態が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの態様において、状態は病態である。病態には、癌、循環器疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、神経疾患、感染症および妊娠に関連する障害が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの態様において、状態は、病期状態、例えば癌の病期状態である。
【０２５１】
本方法は、治療反応状況を決定するのに用いてもよい。いくつかの態様において、治療は薬物治療である。反応は、治療効果または副作用（例えば有害な影響）であってよい。治療効果に対するマーカーは、薬物によって治療された疾患または病態に基づくであろう。有害な影響に対するマーカーは通常、薬物の分類、ならびに作用および代謝の特定の構造およびメカニズムに基づくであろう。一般的な有害な影響は薬物毒性である。一例は心毒性であり、これは、心筋トロポニンマーカーによってモニタリング可能である。いくつかの態様において、病態に対する１つ又はそれより多くのマーカー、および薬物の１つ又はそれより多くの有害な影響に対する１つ又はそれより多くのマーカーを、通常は薬物を投与されている集団において、モニタリングする。試料は、間隔をおいて採取してよく、試料中のマーカーの各々の値を、時間と共に評価してよい。
【０２５２】
マーカーの単一分子の検出は、蛍光部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、少なくとも約２００個の光子を放出し得る蛍光部分を含むラベルでマーカーをラベリングすることを含んでよく、レーザーは、当該部分を含む直径約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、蛍光部分は、少なくとも１つの置換インドリウム環系を有する分子であって、インドリウム環の３位の炭素における置換基が化学反応性基または共役物質を含む分子を有する。いくつかの態様において、蛍光部分は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００からなる群から選択される色素を含んでよい。いくつかの態様において、蛍光部分はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７を含む。いくつかの態様において、ラベルはマーカーに対する結合パートナー、例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体等の、前記マーカーに対して特異的な抗体を更に含む。種々のマーカーに対する結合パートナーは本明細書に記載される。
【０２５３】
本方法は、第１範囲に基づいて、または第１および第２範囲に基づいて、マーカーに関する閾値レベルを設定することを更に含んでよく、閾値レベルの上または下のレベルにおける、個体からの生物学的試料中のマーカーの存在は、前記個体における生物学的状態の存在の可能性の増加を示す。正常集団に対して決定された閾値の一例は、心筋トロポニンに関して提案された、正常集団における９９パーセンタイル値より大きい閾値である。実施例３を参照のこと。他の閾値レベルは、実験的に、即ち第１および第２集団からの、マーカーレベル、ならびにモニタリングされている生物学的状態の存在、非存在、重症度、発達速度、退縮速度等に関するデータに基づいて決定してよい。範囲のいずれかの端、例えば最小値（それより下では、試料中のマーカー濃度が生物学的状態の可能性の増加を示す）および／または最大値（それより上では、試料中のマーカー濃度が生物学的状態の可能性の増加を示す）において、閾値レベルを設定してよいことが、理解されるであろう。いくつかの態様において、リスク層化を形成してよく、そのリスク層化において、２つ又はそれより多くのマーカー濃度範囲が２つ又はそれより多くのリスクレベルに対応する。２つの集団からのデータ又はマーカーに対するデータを分析する他の方法、および例えば医師および他の健康管理専門家によって用いられる臨床的に意義のある値を生み出す他の方法は、当該技術分野においてよく知られている。
【０２５４】
いくつかの生物学的マーカーに関して、マーカーが少しでも存在することは、疾患または病的状態を示すものであり、閾値は実質的にゼロである。一例は、前立腺除去後の癌の再発をモニタリングするための、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の使用である。ＰＳＡは前立腺によってのみ製造されるので、また、前立腺および全ての腫瘍は除去されていると推測されるので、除去後のＰＳＡはゼロである。いずれのレベルにおけるＰＳＡの出現も、例えば転移部における、癌の再発の可能性を示す。従って、検出方法が高感度であるほど、そのような再発の発症に対してより早期の介入を行うことができる。
【０２５５】
一連の試料における評価方法等のマーカー濃度の他の評価方法も行ってよく、その評価方法において、値の変化、変化速度、混合量、減少等は全て、生物学的状態の決定に有用な情報を提供し得る。更に、１つより多くのマーカーが生物学的状態に関する情報を提供することが発見される場合、マーカーのパネルを用いてよい。マーカーのパネルを用いる場合、マーカーは、別々の試料（例えば、共通の試料のアリコート）において別々に測定してよく、または多重化によって同時に測定してよい。マーカーのパネルおよび多重化の例は、例えば米国特許出願第１１／０４８，６６０号に示されている。
【０２５６】
そのようなマーカー、ならびに例えば正常および／または異常状態に対する参照範囲の設定により、生物の生物学的状態の高感度かつ正確な決定が可能となる。従って、いくつかの態様において、本発明は、生物の生物学的状態の存在または不存在を検出する方法を提供し、その方法は以下のものを含む。ｉ）生体からの生物学的試料中のマーカー濃度の測定であって、前記マーカーが、第１集団から得られる生物学的試料中の前記マーカーに関する濃度範囲を、マーカーの単一分子の検出により生物学的試料のマーカー濃度を測定することにより設定することによって設定されるマーカーである、測定；およびｉｉ）前記生物中の前記マーカーの前記濃度に基づく、前記生物学的状態の存在または不存在の決定。
【０２５７】
いくつかの態様において、本発明は、生物における生物学的状態の存在または不存在を検出するための方法を提供し、その方法は以下のものを含む。ｉ）前記生物からの複数の生物学的試料中のマーカー濃度の測定であって、前記マーカーは、第１集団から得られる生物学的試料中の前記マーカーに関する濃度範囲を、マーカーの単一分子を検出することにより生物学的試料のマーカー濃度を測定することによって設定することによって設定されるマーカーである、測定；およびｉｉ）前記複数の試料中の前記マーカーの前記濃度に基づく、前記生物学的状態の存在または不存在の決定。いくつかの態様において、試料は異なる種類のものであり、例えば、異なる種類の組織からの試料である。この場合において、決定は、前記異なる種類の試料中の前記マーカーの濃度の比較に基づく。より一般的には、試料は同じ種類のものであり、試料は間隔をおいて採取される。試料は、本明細書に記載のいずれの種類の試料、例えば血液、血漿もしくは血清；または尿であってもよい。試料間の間隔は、数分、数時間、数日、数週間、数ヶ月または数年であってよい。緊急の臨床状況において、間隔は数分または数時間であってよい。個体のモニタリングを含む設定において、間隔は数日、数週間、数ヶ月または数年であってよい。
【０２５８】
多くの場合において、その存在または不存在を検出すべき生物学的状態は、疾病表現型である。従って、一の態様において、件の表現型の状態は臨床的に診断された疾患の状態である。そのような疾患の状態には、例えば、癌、循環器疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、神経疾患、呼吸器疾患、感染症および妊娠に関連する障害が含まれる。
【０２５９】
癌表現型が本発明のいくつかの要旨に含まれる。本明細書における癌の例として以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：乳癌、皮膚癌、骨肉腫、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、脳腫瘍、喉頭癌、胆嚢癌、膵臓癌、直腸癌、副甲状腺癌、甲状腺癌、副腎癌、神経組織癌、頭部および頸部癌、結腸癌、胃癌、気管支癌、腎臓癌、基底細胞癌、潰瘍性および乳頭型の両方の扁平上皮癌、転移性皮膚癌、骨肉腫、ユーイング肉腫、細網肉腫、骨髄腫、巨細胞腫、小細胞肺腫瘍、非小細胞肺癌結石、島細胞腫、原発性脳腫瘍、急性および慢性のリンパ球性および顆粒球性腫瘍、有毛細胞腫瘍、腺腫、過形成、髄様癌、褐色細胞腫、粘膜神経腫、腸神経節細胞腫、過形成角膜神経腫、マルファン症候群様体質腫瘍、ウィルムス腫瘍、精上皮腫、卵巣腫瘍、平滑筋腫瘍、子宮頸部形成異常および上皮内癌、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、軟部組織肉腫、悪性カルチノイド、局所性皮膚病変、菌状息肉腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、骨肉腫および他の肉腫、悪性高カルシウム血症、腎細胞腫、真性多血症、腺癌、多形神経膠芽腫、白血病、リンパ腫、悪性黒色腫、扁平上皮癌、ならびに他の癌腫および肉腫。
【０２６０】
循環器疾患は本発明の他の用途に含まれてよい。循環器疾患の例として以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。鬱血性心不全、高血圧、不整脈、アテローム性動脈硬化、コレステロール、ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群、ＱＴ延長症候群、狭心症、頻脈、徐脈、心房細動、心室細動、鬱血性心不全、心筋虚血、心筋梗塞、心タンポナーデ、心筋炎、心膜炎、催不整脈性右心室異形成、肥大型心筋症、ウイリアムズ症候群、心臓弁膜症、心内膜炎、細菌性肺動脈閉鎖、大動脈弁狭窄症、レイノー病、コレステロール塞栓症、ワレンベルグ症候群、ヒッペル・リンダウ病、および毛細血管拡張症。
【０２６１】
炎症性疾患および自己免疫疾患は本発明の他の態様に含まれてよい。炎症性疾患および自己免疫疾患の例として以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。関節リウマチ、非特異的関節炎、喉頭の炎症性疾患、炎症性腸疾患、乾癬、甲状腺機能低下症（例えば橋本甲状腺炎）、結腸炎（または大腸炎）、１型糖尿病、骨盤内炎症性疾患、中枢神経系の炎症性疾患、側頭動脈炎、リウマチ性多発筋痛、強直性脊椎炎、結節性多発動脈炎、ライター症候群、強皮症、全身性紅斑症およびエリテマトーデス。
【０２６２】
本発明の方法および組成物は、以下のもののマーカーを含む感染症マーカーに関する研究情報も提供する。アデノウイルス、百日咳菌、クラミジア肺炎、クラミジア・トラコマチス、コレラ毒素、コレラ毒素β、カンピロバクター・ジェジュニ、サイトメガロウイルス、ジフテリア毒素、エプスタイン・バーＮＡ、エプスタイン・バーＥＡ、エプスタイン・バーＶＣＡ、ヘリコバクター・ピロリ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コア、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）エンベロープ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）サーフェス（Ａｙ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コア、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ３、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ４、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ５、Ａ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）ｏｒｆ２  ３ＫＤ、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）ｏｒｆ２  ６ＫＤ、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）ｏｒｆ３  ３ＫＤ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１  ｐ２４、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１  ｇｐ４１、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１  ｇｐ１２０、ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）、単純ヘルペスウイルスＨＳＶ−１／２、単純ヘルペスウイルスＨＳＶ−１  ｇＤ、単純ヘルペスウイルスＨＳＶ−２  ｇＧ、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）−１／２、Ａ型インフルエンザ、Ａ（Ｈ３Ｎ２）型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、ドノバン・リーシュマニア、ライム病、おたふく風邪、肺炎マイコプラズマ、結核菌、１型パラインフルエンザ、２型パラインフルエンザ、３型パラインフルエンザ、ポリオウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、風疹、麻疹、ストレプトリジンＯ、破傷風毒素、梅毒トレポネーマ１５ｋｄ、梅毒トレポネーマｐ４７、クルーズトリパノソーマ、トキソプラズマおよび水痘帯状疱疹。
【０２６３】
癌の検出およびモニタリングはしばしば、腫瘍の成長の粗い測定（腫瘍自体の可視化等）の使用に依存し、その測定は不正確であり、または、例えば現在の方法による実際の臨床状況において検出可能になる前に、高いレベルに達してしまう。検出の時点において、腫瘍はしばしばかなりの大きさに成長し、転移の前に介入が行われる可能性は低い。例えば、Ｘ線による肺癌の検出は、腫瘍の直径が１ｃｍより大きいことを必要とし、ＣＴスキャンによる検出は、腫瘍の直径が２〜３ｍｍより大きいことを必要とする。別法として、腫瘍成長のバイオマーカーを使用してよいが、バイオマーカーが現在の臨床技術で利用可能なレベルで検出可能である時点までに、腫瘍は再びかなり発達していることが多い。更に、医療介入（例えば、１つの腫瘍もしくは複数の腫瘍を縮小もしくは除去するための外科手術、化学療法、または放射線療法）の後に、残存疾患が、更なる介入が成功しない可能性の高い時点に進行するまでに、癌の再発が存在するか否かを決定するのに十分な感度で腫瘍マーカーを測定することは不可能であることが多い。本発明の分析器、システムおよび方法を用いると、例えば転移可能性が低いことにより介入が成功する可能性の高い時点における、腫瘍成長の発現および腫瘍成長の再発の両方を検出することが可能である。今までは示されていないレベルで検出可能である癌のためのマーカーには、本明細書に記載のマーカーが含まれる。診断マーカーへと再目的化し得るマーカーを検出するための分析の例として、本明細書に記載されているように、ＴＧＦβ、Ａｋｔ１、ＦａｓリガンドおよびＩＬ−６が挙げられる。
［Ｂ．例示的マーカー］
【０２６４】
本発明の機器、ラベルおよび方法は、例えば血清および尿中のマーカーに対する範囲を、従来のレベルより１０〜１００倍低い、またはそれより低いレベルに設定するために使用した。マーカーは、幅広い種類の生物学的状態、例えば心疾患および心毒性（トロポニン）、感染症（ＴＲＥＭ−１）、炎症および他の状態（ＬＴＥ４、ＩＬ−６およびＩＬ−８）、喘息（ＬＴＥ４）、癌（Ａｋｔ１、ＴＧＦ−β、Ｆａｓリガンド）、ならびに同種移植片拒絶および変性疾患（Ｆａｓリガンド）を示す。
【０２６５】
マーカーにはタンパク質マーカーおよび非タンパク質マーカーが含まれる。マーカーはここで簡潔に記載され、手順および結果は実施例において示される。
【０２６６】
［１．心臓障害］
心筋トロポニンは、従来においては異常に多い量でのみ検出可能であるマーカーの一例である。心筋トロポニンは、多数の疾患および病態、例えば急性心筋梗塞（ＡＭＩ）における診断、予後診断および治療方法の決定において有用な心臓障害のマーカーである。更に、心筋トロポニンは、治療、例えば薬物治療による心毒性の有用なマーカーである。
【０２６７】
筋肉中のトロポニン複合体はトロポニンＩ、ＣおよびＴからなる。トロポニンＣは、２つのアイソフォームとして存在し、１つは心筋および遅筋からのものであり、もう１つは速筋からのものである；トロポニンＣは、実質上全ての横紋筋において発見されるので、特異的マーカーとしてのトロポニンＣの使用は限定される。対照的に、トロポニンＩおよびＴは、遅筋、速筋および心筋における異なるアイソフォームとして発現する。トロポニンＩおよびＴの特有の心臓アイソフォームは、それらを、骨格筋の他のトロポニンと免疫学的に区別することを可能にする。従って、心筋トロポニンＩおよびＴの血液中への放出は、心筋に対する障害を示し、診断マーカーもしくは予後マーカーとしてのそれらの使用、または処置の決定を補助するためのそれらの使用に関する基礎を提供する。
【０２６８】
現在使用されている心臓障害マーカーは、それらの臨床的有用性を制限する不都合な点がある。心筋酵素分析において、心筋に対するダメージが存在するか否かを決定するための基準が作成された。残念ながら、標準的なクレアチンキナーゼ−ＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）分析は、胸痛の発症後１０〜１２時間までの梗塞の排除において信頼できない。早期診断は、線溶療法およびトリアージに関して非常に特別な利点を有するだろう。
【０２６９】
健常者の血液循環において見られるトロポニンのレベルが非常に低いので、また、心筋に特異的なトロポニンは心臓外の源から生じないので、トロポニンは非常に感度が高く、特異的な心外傷マーカーである。心筋梗塞に加えて、多数の他の状態が心筋に対して障害を引き起こし得、そのような障害の早期検出が臨床医に対して有用であることが判明するであろう。しかし、心筋トロポニンの現在の検出および定量方法は、レベルが異常に高い濃度、例えば０．１ｎｇ／ｍｌまたはそれより高濃度に達するまでに、心筋トロポニンの血液中への放出を検出するのに十分な感度を有しない。
【０２７０】
従って、本発明の方法および組成物は、心筋トロポニンの高感度検出および定量のための方法および組成物、ならびにそのような高感度検出および定量に基づく診断、予後診断、および／または治療の決定のための組成物および方法を含む。心筋トロポニンＩに関する検量線を、約１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界で規定した（実施例１）。心筋トロポニンＩのレベルを、正常者において規定し、正常者の９９パーセンタイルにおける閾値を規定した（実施例３）。急性心筋梗塞に罹患した個体からの一連の試料を分析し、心筋トロポニンＩ濃度に関する時間経過（ベースラインからの偏差を含む）を決定した（実施例４）。従って、心筋トロポニンＩは、本発明のシステムおよび方法によって、臨床状況および研究状況における使用の診断情報および予後情報を提供するためのレベルで検出し得るマーカーの一例として機能する。２００８年３月５日に出願された米国特許出願第１１／７８４，２１３号（発明の名称『Ｈｉｇｈｌｙ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｒｏｐｏｎｉｎ』、これはその全体を引用することにより本明細書に組み込まれる）も参照のこと。
【０２７１】
心筋トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）は心筋細胞に対して特異的であり、心臓障害に従って血液中に放出される。広範囲な研究は、損傷した心筋細胞からｃＴｎＩがゆっくりと放出され、外傷後、検出可能になるのにしばしば４〜８時間を要することを示した。血漿／血清中のｃＴｎＩ濃度の測定は、非ＳＴＥＭＩ急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の診断に関する治療の基準である。更に、このバイオマーカーは、前臨床薬および臨床薬の開発状況において、心筋障害、従って心臓障害の指標として広く受け入れられている。ＴｎＩは、実験的治療の潜在的な心毒性を評価するためのバイオマーカーとして受け入れられる。ＴｎＩは前臨床状況において幅広く研究されており、前臨床データが心臓関連有害事象の可能性を示唆する場合、臨床的薬物開発プログラムに含まれる。
【０２７２】
ＡＭＩを診断するための治療標準として、ならびに前臨床および臨床開発において、ｃＴｎＩが使用されているにもかかわらず、最近まで、現在のところ健康な人および前臨床動物モデルの血漿中のｃＴｎＩ濃度は報告されていなかった。従って、所定の動物またはヒトの中の「正常」レベルを基準に従って評価すること、および僅かな心臓障害に関連し得るｃＴｎＩの僅かな増加（速度）を測定することは不可能であった。更に、多数のアッセイは、異なる種にわたるｃＴｎＩを等しく定量せず、大きい血漿試料体積を必要とし、前臨床状況、特に齧歯類モデルシステムにおけるこれらの使用が制限される。本発明の方法を用いると、内因性ｃＴｎＩの正常レベル、および血漿ｃＴｎＩにおける小変化が、ヒト、ラット、イヌおよびサルにおいて定量され得、以前は解決困難であった心筋細胞の病態生理学に関する解法が提供される。実施例１〜４を参照のこと。
【０２７３】
いくつかの態様において、本発明のｃＴｎＩ分析は：（１）健康なヒト、ラット、イヌおよびサルにおける血漿および血清ｃＴｎＩの濃度を規定するため；（２）ＡＭＩをより早期に同定するため；（３）物理的圧力もしくは既知の心臓毒性の下で、より早期に心臓障害を測定するため；ならびに／または（４）僅か１０μｌの血漿を用いて、１つのラットにおけるｃＴｎＩ濃度を試験するために用いられる。他の態様において、本発明のｃＴｎＩ分析は：（１）前臨床および臨床状況の両方における、治療法の心臓に関する潜在的な安全性および投与量を測定するため；（２）試料体積が問題となる場合に、個別の小動物もしくは貴重な試料を用いて試験を実施するため；（３）ベースライン正常レベルからのｃＴｎＩ濃度変化速度がエンドポイントとして用いられる場合、よりロバスト性の高い臨床試験および前臨床試験を設計するため；（４）種々の心臓関連疾患における、正常レベルからのｃＴｎＩレベルの変化の様子を理解するため；ならびに／または（５）臨床的事象に対するサロゲートエンドポイントとして機能するためのバイオマーカーとしてのｃＴｎＩの有用性を理解するために用いられる。
【０２７４】
いくつかの態様において、本方法は、約１００、８０、６０、５０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５または０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界、例えば約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でｃＴｎＩを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でｃＴｎＩを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約８０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でｃＴｎＩを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約６０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でｃＴｎＩを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でｃＴｎＩを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約３０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でｃＴｎＩを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約２５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でｃＴｎＩを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でｃＴｎＩを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でｃＴｎＩを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でｃＴｎＩを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でｃＴｎＩを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でｃＴｎＩを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でｃＴｎＩを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でｃＴｎＩを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でｃＴｎＩを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でｃＴｎＩを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でｃＴｎＩを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でｃＴｎＩを検出することができる。
【０２７５】
［２．感染症］
最近の報告によって、細菌性または真菌性感染症のバイオマーカーとしてＴＲＥＭ−１が確立された。例えば、Ｂｏｕｃｈｏｎら（２０００年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４９９１−９５；Ｃｏｌｏｎｎａ（２００３年）、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：４４５−５３；Ｇｉｂｏｔら（２００４年）、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：４５１−５８；Ｇｉｂｏｔら（２００４年）、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１４１：９−１５を参照のこと。本発明の分析は、１００ｆＭまたはそれより低い濃度でＴＲＥＭ−１を定期的に測定してよいことを示唆している。実施例９を参照のこと。
【０２７６】
いくつかの態様において、本方法は、約１００、８０、６０、５０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５または０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界、例えば約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＲＥＭ−１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＲＥＭ−１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約８０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＲＥＭ−１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約６０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＲＥＭ−１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＲＥＭ−１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約３０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＲＥＭ−１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約２５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＲＥＭ−１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＲＥＭ−１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＲＥＭ−１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＲＥＭ−１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＲＥＭ−１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＲＥＭ−１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＲＥＭ−１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＲＥＭ−１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＲＥＭ−１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＲＥＭ−１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＲＥＭ−１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＲＥＭ−１を検出することができる。
【０２７７】
［３．サイトカイン］
現行の技術が、病気の患者からの試料において発見されるレベルより下のレベルを検出できないので、多数のサイトカイン、ケモカインおよび成長因子の正常レベルは主として知られていない。例えば、他のサイトカイン（ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γ等）の基礎レベルが、臨床状況において実施されるルーチン分析によって検出することができないのに対し、本発明の分析器システムは、これらのサイトカインおよび他のサイトカインのレベルを直ちに決定することができる。サイトカインおよび成長因子のレベルを知ることは、癌ならびに呼吸器疾患、感染性疾患および循環器疾患を含む種々の疾患の診断、予後診断および処置を行う臨床医を助ける。臨床標本における正常状態および病態をモニタリングするための早期のサイトカイン検出は、血漿、血清および尿、ならびにより優れた展開医療（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ）を提供するための他の流体試料等の試料を分析するために本発明の分析器システムを用いることによって達成され得る。例えば、正常範囲の濃度が知られていないサイトカインのレベルを決定することは、以下の状態および疾患の診断および治療を行う臨床医を補助するであろう。骨形成タンパク質は、骨折、脊椎固定、整形外科および口腔外科に関する治療をモニタリングするのに有用であろう；インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫および卵巣癌を含む癌の存在に関する検出およびモニタリングに対して、ならびに抗炎症療法、臓器移植、免疫不全、および寄生虫感染症の影響の検出およびモニタリングに対して有用であろう；インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）は、乳癌等の癌の存在に関する検出およびモニタリングに対して有用である；インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は癌およびＨＩＶ感染症に関する検出およびモニタリングに対して有用である；ＴＮＦ−α、炎症性サイトカインは、単独で又はＩＬ−６と組み合わせて、敗血症、急性膵炎、結核、ならびに関節リウマチおよび狼瘡等の自己免疫疾患の良好な予測因子として使用可能である。
【０２７８】
別法として、正常および異常値に関してデータベースが既に存在していることがあるが、現在の方法は、定められた（またはルーチン）基準で個体をスクリーニングして、マーカーに対する個々の値が正常範囲内であるか否かを十分な感度で決定するのに実用的でないことがある。例えば、試料中のＩＬ−６濃度を決定するための現在の方法の大部分は、約５ｐｇ／ｍｌまでの濃度のＩＬ−６のみを検出することができる；ＩＬ−６の正常範囲値は約１〜約１０ｐｇ／ｍｌである；従って、現在の方法は、正常範囲の上部分においてのみ、ＩＬ−６を検出することができる。対照的に、本発明の分析器および分析器システムは、約０．０１ｐｇ／ｍｌより低い、または正常範囲値の１／１０〜１／１００より低い濃度までＩＬ−６を検出し得る。従って、本発明の分析器および分析器システムによって、更に広範囲でより詳細なデータベースをバイオマーカー、例えばＩＬ−６に対して作成することが可能となり、かつそのバイオマーカーに対する正常範囲の内側および外側の両方でのクリーニングも可能となり、早期検出が可能となる。従って、本発明の分析器および分析器システムによって、更に広範囲でより詳細なデータベースをバイオマーカー（例えばＩＬ−６）に対して作成することが可能となり、かつそのバイオマーカーに対する正常範囲の内側および外側の両方でのスクリーニングも可能となり、バイオマーカー、例えばＩＬ−６が関与する状態の早期発見が可能となる。
【０２７９】
［ａ．インターロイキン１］
ＩＬ−１αおよび−βは、感染症に対する免疫防御に関与する炎症促進性サイトカインであり、サイトカインのＩＬ−１スーパーファミリーの一部である。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの両方は、マクロファージ、単球および樹状細胞によって形成される。ＩＬ−１は、炎症において主要な役割を有する種々の免疫応答に関与し、それにより、ＩＬ−１は関節リウマチ（ＲＡ）に関するターゲットとなる。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは前駆体ペプチドとして形成され、これは、細胞傷害に応答してタンパク質分解的に処理されて放出され、従ってアポトーシスを誘発する。末梢組織におけるＩＬ−１β生成は、熱に関連する痛覚過敏（痛みに対する感度の増大）とも関連する。
【０２８０】
Ａｍｇｅｎは現在、ヒトインターロイキン−１受容体拮抗薬（ＩＬ−１Ｒａ）の合成型である、キネレット（アナキンラ）を市販している。ＩＬ−１Ｒａは、ＩＬ−１が、幅広い種類の組織および臓器において発現するインターロイキン−１Ｉ型受容体（ＩＬ１−ＲＩ）と結合するのを競合的に阻害することによって、ＩＬ−ｌαおよびβの生物活性を妨げる。ＩＬ−１Ｒａは、体外および体内の両方におけるＩＬ−１の生物学的活性を抑制し、敗血性ショック、関節リウマチ、移植片対宿主拒絶反応、脳卒中および心虚血の動物モデルにおいて有効であることが示されてきた。インターロイキン−１（ＩＬ−１）の作用を阻害することを目的とする十分なヒトモノクローナル抗体である、ＡＭＧ１０８が、アムジェン・パイプラインにおいても存在する。ＡＭＧ１０８で関節リウマチを治療することの長期安全性を評価するために、第２相臨床研究が進行中である。
【０２８１】
［ｉ．インターロイキン１α（ＩＬ−１α）］
ヒトの疾患において炎症が幅広く関与することにより、このタンパク質が興味深い診断対象であり続けるであろうことが確実となる。ＩＬ−１αレベルの増加は、関節リウマチ等の炎症性疾患に対する診断対象であり続ける。従って、疾患を示すＩＬ−１αの低いレベルと高いレベルとを区別するために、ＩＬ−１αの低い正常レベルを定量するための高感度分析を開発する必要がある。また、ＩＬ−１α関連疾患に対する治療としてＩＬ−１αレベル増加を減少させるために、治療薬物ターゲットとしてのＩＬ−１αの可能性を評価する必要がある。このことは、治療の有効性および投与量を評価するためにＩＬ−１αレベルの減少速度を検出する必要性を示すであろう。このことは、炎症性サイトカイン経路をターゲットとする薬物（キネレット（ＩＬ−１Ｒａ拮抗薬）およびエンテラセプト（ｅｎｔｅｒａｃｅｐｔ）（ＴＮＦ−α拮抗薬）等）の同時投与（または併用）の後に進行する、好中球減少症のような有害事象を防止し得る。これらの目標を達成するために、ヒト血漿において正常レベルより下でＩＬ−１αを検出し得る分析を有することが重要である。
【０２８２】
本発明は、健康で正常な人の被験体からの血漿中のＩＬ−１α濃度を、従来は達成不可能であったレベルの確度および精度で定量するのに十分な高感度のＩＬ−１α分析を提供する。実施例２３を参照のこと。それは、健康な状態と疾患状態との間のＩＬ−１α濃度の区別を可能にし、有効な前臨床および臨床研究設計を可能にする。ＩＬ−１α分析により、薬物の有効性または疾患の進行に関する識見を提供し得る非常に低いレベルにおける定量と、小さい濃度変化の間の区別とが可能となることによって、ＩＬ−１αの有用性が増大する。ＩＬ−１α分析は、幅広いダイナミックレンジにおけるヒト血漿中のＩＬ−１αの正確な定量を可能にする。種々の態様において、分析は、研究者が：（１）ＩＬ−１を介した炎症性反応を妨げるように設計された治療法（キネレット等）の有効性および投与量を測定すること；（２）ＡＭＧ１０８の臨床試験のように、ＩＬ−１α濃度を治療上のエンドポイントとして使用し得る場合に、よりロバスト性の高い臨床および前臨床研究を設計すること；ならびに／または（３）患者が健康な状態から病気の状態に移行する際に、患者におけるＩＬ−１αレベルの変化の様子を理解することを可能にする。
【０２８３】
いくつかの態様において、本方法は、約１００、８０、６０、５０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５または０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界、例えば約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１αを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１αを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約８０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１αを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約６０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１αを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１αを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約３０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１αを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約２５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１αを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１αを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１αを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１αを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１αを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１αを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１αを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１αを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１αを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１αを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１αを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１αを検出することができる。
【０２８４】
［ｉｉ．インターロイキン１β（ＩＬ−１β）］
ＩＬ−１αと同様に、ヒトの疾患において炎症が幅広く関与することにより、ＩＬ−１βが興味深い診断対象であり続けるであろうことが確実である。ＩＬ−１βレベルの増加は、関節リウマチ等の炎症性疾患に対する診断対象であり続ける。従って、疾患を示すＩＬ−１βの低いレベルと高いレベルとを区別するために、ＩＬ−１βの低い正常レベルを定量するための高感度分析を開発する必要がある。また、ＩＬ−１β関連疾患に対する治療としてＩＬ−１βレベル増加を減少させるために、治療薬物ターゲットとしてのＩＬ−１βの可能性を評価する必要がある。このことは、治療の有効性および投与量を評価するためにＩＬ−１βレベルが減少する速度を検出する必要性を示すであろう。このことは、炎症性サイトカイン経路をターゲットとする薬物（キネレット（ＩＬ−１Ｒａ拮抗薬）およびエンテラセプト（ＴＮＦ−α拮抗薬）等）の同時投与（または併用）の後に進行する、好中球減少症のような有害事象を防止し得る。これらの目標を達成するために、ヒト血漿において正常レベルより下でＩＬ−１βを検出し得る分析を有することが重要である。
【０２８５】
本発明は、薬物の有効性または疾患の進行に関する識見を提供し得る非常に低いレベルにおける定量、および小さい濃度変化の間の区別を可能にすることによって、ＩＬ−１βの有用性を増大させるＩＬ−１β分析を提供する。実施例２４を参照のこと。ＩＬ−１β分析は、健康で正常な人間の被験体からの血漿中のＩＬ−１β濃度を、以前は達成不可能であったレベルの確度および精度で定量するのに十分な高感度である。ＩＬ−１β分析は、幅広いダイナミックレンジでのヒト血漿中のＩＬ−１βの正確な定量を可能にする。種々の態様において、この分析は、研究者が：（１）ＩＬ−１を介した炎症性反応を妨ぐように設計された治療法（キネレット等）の有効性および投与量を測定すること、；（２）ＡＭＧ１０８の臨床試験のように、ＩＬ−１β濃度を治療上のエンドポイントとして使用し得る場合に、よりロバスト性の高い臨床試験および前臨床試験を設計すること；ならびに（３）患者が健康状態から疾病状態に移行する際に、患者におけるＩＬ−１βレベルの変化の様子を理解することを可能にするだろう。
【０２８６】
いくつかの態様において、本方法は、約１００、８０、６０、５０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５または０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界、例えば約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約２００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１５０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約８０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約６０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約３０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約２５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−１βを検出することができる。
【０２８７】
［ｂ．インターロイキン４（ＩＬ−４）］
インターロイキン−４（ＩＬ−４）は、液性免疫および適応免疫において重要な調節因子であるサイトカインである。ＩＬ−４は、ナイーブヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０細胞）のＴｈ２細胞への分化を引き起こす。それは多数の生物学的役割を有し、それには、活性化されたＢ細胞およびＴ細胞の増殖の刺激、ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ２細胞への分化が含まれる。ＩＬ−４は、アレルギー性炎症反応の進行において重要な役割を果たす。ＩＬ−４は、ＩｇＥの製造を制御し、ＩＬ−４によるＴ細胞サブセットの製造を拡大させ、エフェクター細胞の機能を安定化させる。
【０２８８】
ＩＬ−４は、アレルギー性炎症反応の進行におけるＩＬ−４の役割に起因する治療可能性を有する。ＩＬ−４は、癌をターゲットとする薬物において見込みを有することも示されてきた。例えば、ＰＲＸ３２１（Ｐｒｏｔｏｘ）は目標とされる治療毒であり、そこでは、ＩＬ−４が緑膿菌外毒素、癌細胞を破壊し得る強力な物質に結合される。脳腫瘍、腎臓癌および肺癌に加えて、ＰＲＸ３２１は、膵臓、卵巣、胸部、頭部および頸部、黒色腫、前立腺、ならびに慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）およびホジキンリンパ腫等の血液の癌を含む、ＩＬ−４受容体を過剰に発現する多数の癌において、有望な前臨床的結果を示した。
【０２８９】
健康な人の被験体における血漿ＩＬ−４濃度は、まだ規定されていない。従って、ＩＬ−４濃度における差異が疾患状態と健康な状態との間で果たす役割を理解することは困難である。更に、ＩＬ−４減少速度を測定することによる、ＩＬ−４の低下を目標とする実験的治療法の有効性の測定は、分析感度の欠如によって妨げられる。更に、最も高感度のＥＬＩＳＡの読取り範囲は２ｌｏｇより小さく制限され、そのことは、試料に再試験または消耗を強制する。従って、僅かな濃度変化の速度を検出し得、かつ正常な被験体におけるＩＬ−４のベースライン濃度を測定し得る高感度分析に対する必要性が存在する。
【０２９０】
本発明によって提供されるＩＬ−４分析は、健康で正常な人の被験体からの血漿中のＩＬ−４濃度を、現在のところ他の高感度分析を用いて得ることができないレベルの確度および精度で定量するのに十分な高感度である。実施例２５を参照のこと。この分析は、非常に低レベルの血漿ＩＬ−４の定量を可能にする。いくつかの態様において、分析は、治療効果に関する識見を提供し得るＩＬ−４レベルの僅かな変化の測定を可能にする。種々の態様において、この分析は、研究者が：（１）一般的な炎症性反応およびアレルギー反応を妨げるように設計された治療法の有効性および投与量を測定すること；（２）ＩＬ−４濃度を治療上のエンドポイントとして使用する場合に、よりロバスト性の高い臨床および前臨床研究を設計すること；ならびに（３）患者が健康状態から疾病状態に移行する際に、患者におけるＩＬ−４レベルの変化の様子を理解することを可能にする。
【０２９１】
いくつかの態様において、本発明の方法は、約１００、８０、６０、５０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５または０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界、例えば約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約８０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約６０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約３０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約２５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ４を検出することができる。
【０２９２】
［ｃ．インターロイキン６（ＩＬ−６）］
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、外傷（特に、火傷または炎症をもたらす他の組織損傷）に対する免疫応答を刺激するために、Ｔ細胞およびマクロファージによって分泌される炎症促進性サイトカインである。ＩＬ−６はまた、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）と呼ばれる特定の微生物分子に応答して、マクロファージによって分泌され、これは先天性免疫応答を誘発し、炎症性サイトカインの生成を開始させる。ＩＬ−６は、熱および急性相反応の最も重要なメディエーターの１つである。ＩＬ−６は「ミオカイン（ｍｙｏｋｉｎｅ）」とも呼ばれ、筋肉から生成するサイトカインであり、筋収縮に反応して増加する。更に、骨芽細胞はＩＬ−６を分泌して破骨細胞の形成を促進する。
【０２９３】
ＩＬ−６関連疾患は、敗血症、末梢動脈疾患および慢性閉塞性肺疾患を含むがこれらに限定されない。インターロイキン−６を介した炎症は、アテローム硬化性血管疾患ならびに骨粗鬆症および２型糖尿病を含む年齢関連疾患に対する共通の原因要素および治療対象でもある。更に、ＩＬ−６は、敗血性ショック等の更なる疾患を診断するために、他のサイトカイン、例えばＴＮＦ−αと組み合わせて測定可能である。ＩＬ−６は、抗炎症および急性相反応の抑制をもたらすであろう薬物ターゲットとしての治療可能性を有する。異質な病原体に対する宿主反応に関して、ＩＬ−６は、マウスにおいて、バクテリア、肺炎連鎖球菌に対する抵抗を必要とすることが示された。ＩＬ−６の阻害物質（エストロゲンを含む）が、閉経後骨粗鬆症を治療するのに用いられる。ＩＬ−６はハイブリドーマ成長に不可欠であり、ｂｒｉｃｌｏｎｅ等の多数の追加（または補助）クローニング媒体において発見されるので、癌に対する治療可能性も存在する。
【０２９４】
健康な被験体の血漿におけるＩＬ−６の血中レベルは、現在利用可能な多数の分析を用いて決定することが困難であり、従って、健康な状態から疾患を区別することは困難である。更に、治療対象として用いる場合、ＩＬ−６レベルが正常状態レベルより下に減少する際のＩＬ−６レベルを測定することによって治療効果を測定することが望ましい。これは、現在利用可能な分析によっては達成することができない。ＩＬ−６分析は、米国外においては診断用途のために現在のところ利用可能であり、米国および日本においては研究用途のみ（ＲＵＯ）である。
【０２９５】
本発明は、非常に低いレベルの血漿ＩＬ−６の定量を可能にし、かつ疾患過程または治療的介入に起因するＩＬ−６レベルにおける小さな変化の正確な測定を可能にするＩＬ−６分析を提供する。実施例２６を参照のこと。この高レベルの感度は、治療効果に関する識見を提供し得る。種々の態様において、この分析は、研究者が：（１）炎症性反応を妨げるように設計された治療法の有効性および投与量を測定すること；（２）ＩＬ−６濃度を治療上のエンドポイントとして使用する場合に、よりロバスト性の高い臨床および前臨床研究を設計すること；ならびに（３）患者が健康な状態から病気の状態へと推移する際に患者におけるＩＬ−６レベルの変化の様子を理解することを可能にするだろう。
【０２９６】
いくつかの態様において、本発明は、約１００、８０、６０、５０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５または０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界、例えば約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−６を検出することができる方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は、約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−６を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約８０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−６を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約６０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−６を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−６を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約３０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−６を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約２５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−６を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−６を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−６を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−６を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−６を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−６を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−６を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−６を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−６を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−６を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−６を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−６を検出することができる。
【０２９７】
［ｄ．インターロイキン８（ＩＬ−８）］
ＩＬ−６と同様に、本発明は、非常に低いレベルの血漿ＩＬ−８の定量を可能にし、かつ疾患過程または治療的介入に起因するＩＬ−８レベルの小さな変化の正確な測定を可能にするインターロイキン８（ＩＬ−８）分析を提供する。図１７を参照のこと。いくつかの態様において、本発明は、約１００、８０、６０、５０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５または０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界、例えば約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−８を検出することができる方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は、約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−８を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約８０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−８を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約６０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−８を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−８を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約３０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−８を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約２５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−８を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−８を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−８を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−８を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−８を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−８を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−８を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−８を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−８を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−８を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−８を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＩＬ−８を検出することができる。
【０２９８】
［４．炎症マーカー］
炎症性疾患の早期発症を検出するのに有用であり得る他のサイトカインには、本明細書に記載の炎症マーカー、および炎症マーカーのパネルが含まれる。炎症性疾患を検出するのに使用され得るサイトカインの例として、喘息の早期マーカーであり得るロイコトリエン４（ＬＴＥ４）、および線維症、硬化症を含む炎症性疾患の状態を検出およびモニタリングするのに使用され得るＴＧＦβが挙げられる。いくつかのマーカーは、１つより多くの疾患を検出するのに使用することができ、例えばＴＧＦβは癌の存在を検出するのにも使用可能である。
【０２９９】
［ａ．ロイコトリエンＥ４］
システイニルロイコトリエン（ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、ＬＴＥ４）は、喘息の発症において重要な役割を果たす。ロイコトリエンは、肥満細胞、好酸球および他の気道炎症性細胞によって製造され、血管透過性を増加させ、気管支平滑筋を収縮させ、気管支過敏性を仲介する。ＬＴＣ４およびＬＴＤ４の安定な代謝物である尿中ＬＴＥ４のレベルは、抗原の気管支投与の後、アスピリンに敏感な喘息患者におけるアスピリンの経口投与の後、および運動によって引き起こされた気管支けいれんの間に、健康な対照と比較して喘息の子供および大人において、ならびに喘息患者において増加する。喘息の病理におけるロイコトリエンの重要性は、ロイコトリエンの作用を阻害する試薬による大規模臨床試験において更に実証された。例えば、モンテルカスト（一日１回経口摂取される強力なロイコトリエン受容体拮抗薬）は、子供（２〜１４歳）および大人の両方において喘息のコントロールをかなり改善し、運動によって引き起こされる気管支収縮を弱める。
【０３００】
ロイコトリエン経路の活性化は尿中ＬＴＥ４レベルの増加を伴い、喘息の急性悪化は尿中ＬＴＥ４レベルが増加してその後、消散の間にかなり減少することを伴う。悪化および追跡期間の間、気流制限の程度は尿中ＬＴＥ４レベルと相関し、従って、ロイコトリエン経路が急性喘息の間に活性化されることを示す。更に、ＬＴＣ４またはＬＴＥ４の気管支収縮用量の吸入は、用量依存的な方法で尿中ＬＴＥ４の排出を変化させ、従って、喘息患者の肺におけるスルフィドペプチドロイコトリエン合成のマーカーとして尿中ＬＴＥ４を使用し得ることを示す。
【０３０１】
本発明の方法は、尿試料等の生物学的試料中のＬＴＥ４の変化を検出するのに使用され得る。実施例５を参照のこと。サブナノグラムレベルのＬＴＥ４の測定は、慢性または急性喘息患者の肺におけるスルフィドペプチドロイコトリエン合成の検出およびモニタリンクに関するレファレンスとして有用であり得る。
【０３０２】
いくつかの態様において、本発明の方法は、約１００、８０、６０、５０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５または０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界、例えば約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＬＴＥ４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＬＴＥ４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約８０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＬＴＥ４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約６０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＬＴＥ４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＬＴＥ４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約３０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＬＴＥ４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約２５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＬＴＥ４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＬＴＥ４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＬＴＥ４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＬＴＥ４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＬＴＥ４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＬＴＥ４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＬＴＥ４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＬＴＥ４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＬＴＥ４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＬＴＥ４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＬＴＥ４を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＬＴＥ４を検出することができる。
【０３０３】
［ｂ．ＴＧＦβ］
本発明の方法は、ＴＧＦβがマーカーである疾患の早期発症を検出するためにも実施可能である。ＴＧＦβ関連疾患の例として線維症が挙げられる。線維症は、瘢痕組織の過剰かつ持続的な形成を意味し、これは、肺、腎臓、眼、心臓、肝臓および皮膚に影響を及ぼす種々の慢性疾患における臓器不全に関係する罹患率および死亡者数に関与する。ＴＧＦβは、慢性線維化作用のメディエーターとしてのその役割でよく知られている。例えば、ＴＧＦβは、線維性肺疾患における線維芽細胞増殖およびマトリクスの蓄積の促進に関与する。ＴＧＦβの抑制は、肺線維症を扱うための潜在的な治療手段として提案されてきた。ＴＧＦβは、フィブロネクチンおよびＩ型コラーゲンならびにそれらの受容体を含む多数の細胞外マトリクス分子の合成を促進するだけでなく、プロテアーゼおよびそれらの阻害物質の発現における分化効果（ｄｉｆｆｅｒｅｃｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔ）によってマトリクス分解を減少させ、細胞外マトリクスの発生を強固に促進する。従って、本発明の分析器システムは、例えば線維症に関連するＴＧＦβの異常レベルを検出し得、線維症には、特発性肺線維症、糖尿病性腎症、糸球体硬化症およびＩｇＡ腎症を含む進行性腎症（腎臓障害の原因であり、透析および再移植の必要性）；糖尿病性網膜症および進行性黄斑変性症（眼の線維症であり、失明の主な原因）；肝硬変および胆道閉鎖症（肝線維症および障害の主な原因）；鬱血性心不全；シャーガス病における進行性線維症に関連する心筋症；肺線維症；ならびに強皮症が含まれるがこれらに限定されない。
【０３０４】
ＴＧＦβは、前立腺癌、子宮頸癌、肺癌およびホジキン病を含む癌のマーカーでもある。肺癌患者におけるＴＧＦβの血漿レベルはしばしば増加する。診断において血漿ＴＧＦ  β１レベルが増加している患者において、このレベルのモニタリングが、放射線治療後の病気の持続および再発の両方の検出に有用であり得ることが示された。
【０３０５】
形質転換増殖因子−β（ＴＧＦβ）もまた、進行、恒常性および組織修復に影響を及ぼす多能性成長因子である。ＴＧＦβ発現の増加が異なる悪性度で報告されており、腫瘍形成においてこの成長因子が果たす役割を示唆している。特に、骨肉腫の腫瘍間質における小血管の内皮層および血管周囲層におけるＴＧＦβの存在がこの成長因子の血管形成活性を示唆すること、ならびにＴＧＦ−βアイソフォームの発現の増加が骨肉腫の進行に関与することが示唆されたことが実証されてきた（Ｋｌｏｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ、８０：２２３０〜３９（１９９７））。ＴＧＦβは、細胞増殖を抑制し得るあまり知られていないタンパク質の１つである。しかし、概念に議論の余地があるにもかかわらず、研究者の中には、乳癌等のいくつかのヒト悪性腫瘍がそれら自体の目的のためにＴＧＦβを破壊すると信じている者もいる。理解されていないパラドクスにおいて、これらの癌はＴＧＦβを生成し、そして、そのＴＧＦβが転移の進行および生存率の低下のマーカーになるまで、徐々にその発現を増大させる。例えば、血漿ＴＧＦβのレベルは、局所リンパ節および骨への転移性前立腺癌の男性において著しく上昇する。転移の臨床的または病理学的証拠のない男性において、術前の血漿ＴＧＦ−βレベルは、前立腺全摘出術の際に存在する潜在性転移疾患との関連性により恐らく、手術後の生化学的経過の強力な予測因子である。
【０３０６】
いくつかの態様において、本方法は、約１００、８０、６０、５０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５または０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界、例えば約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＧＦ−βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＧＦ−βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約８０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＧＦ−βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約６０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＧＦ−βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＧＦ−βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約３０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＧＦ−βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約２５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＧＦ−βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＧＦ−βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＧＦ−βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＧＦ−βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＧＦ−βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＧＦ−βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＧＦ−βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＧＦ−βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＧＦ−βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＧＦ−βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＧＦ−βを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＴＧＦ−βを検出することができる。
【０３０７】
本明細書に記載されているように、本発明の方法によって検出される異常細胞増殖の他のマーカーには、Ａｋｔ１、Ｆａｓリガンド、ＶＥＧＦ、Ａβ−４０、Ａβ−４２、ｃＴｎＩ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−４およびＩＬ−６が含まれる。
【０３０８】
［５．Ａｋｔ１］
Ａｋｔ１はｖ−ａｋｔマウス胸腺腫ウイルス性癌遺伝子ホモログ１であり、ＡＫＴ１遺伝子によってエンコードされたセリン−トレオニンタンパク質キナーゼである。Ａｋｔキナーゼは、アポトーシスの抑制ならびに細胞増殖、血管形成および腫瘍細胞侵潤性の促進を含む異種細胞の反応に関与してきた。
【０３０９】
アポトーシスおよび非アポトーシス性細胞死を抑制するＡｋｔの能力に関してよく知られているので、Ａｋｔは、抗癌治療に対する腫瘍反応を予測するためにモニタリングされ得る。アポトーシスおよび非アポトーシス性細胞死の影響を評価することによる腫瘍反応の予測は、抗癌治療の治療効果を強化するためのより有用な戦略の開発を可能にするであろう。抗癌治療に起因するアポトーシスは、ミトコンドリアを介するアポトーシス促進性および非アポトーシス性タンパク質のバランスによって調節され、アポトーシスに対する耐性は、Ａｋｔ依存性経路およびＢｃｌ−２依存性経路によって仲介される。Ｂｃｌ−２は、アポトーシスおよび非アポトーシス性細胞死を部分的に抑制し、一方、Ａｋｔは、いくつかのターゲットタンパク質によって、アポトーシスおよび非アポトーシス性細胞死の両方を抑制する。薬物の感度がアポトーシスおよび非アポトーシス性細胞死の蓄積に関連する可能性があるので、薬物感度は、抗癌治療における腫瘍反応全体に影響を及ぼし得る。いくつかの重要な細胞死関連タンパク質の調節から腫瘍反応全体を予測する能力は、治療効果を向上させるためのより有効な戦略をもたらし得る。
【０３１０】
Ａｋｔ１は、上皮間葉移行（ＥＭＴ）にも関与し、ＥＭＴは、進行および腫瘍形成において重要なプロセスであり、それによって、上皮細胞が線維芽細胞様特性を獲得し、細胞間接着性の低下および運動性の増加を示す。ＡＫＴは、多数のヒト癌において活性化され、ＡＫＴ駆動ＥＭＴは、組織侵潤および転移に必要とされる運動性を与えることがある。従って、ＡＫＴ抑制に基づく将来の治療が、腫瘍細胞の浸潤および転移を制御することによる常套的治療を補ってよい。Ａｋｔは、大部分の黒色腫細胞株および異なる進行段階の腫瘍試料において構造的に活性化され、ＡＫＴの活性化は、浸潤／転移関連黒色腫細胞接着分子（ＭｅｌＣＡＭ）の発現に結び付き、次いで、このことがヒト黒色腫による悪性の獲得と強く関連する。Ａｋｔ１は膵臓癌においても活性化され、ＡＫＴの活性化は、より高い組織学的腫瘍悪性度に関連することが示された。従って、ＡＫＴの活性化は、重要な予後因子である腫瘍の悪性度に関連する。Ａｋｔ１は、前立腺癌においても上方制御され、その発現は腫瘍の発達に関連する。従って、Ａｋｔ１は、癌の最も早期の段階における、癌の治療的介入を対象とし得た。いくつかの態様において、本発明の分析器システムは、Ａｋｔ１レベルが約１００、５０または２５ｐｇ／ｍｌより低い場合に、患者からの試料中のＡｋｔ１の存在または濃度を決定することによる癌の早期診断を提供するための方法を提供する。実施例６を参照のこと。
【０３１１】
いくつかの態様において、本発明の方法は、約１００、８０、６０、５０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５または０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界、例えば約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡｋｔ１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡｋｔ１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約８０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡｋｔ１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約６０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡｋｔ１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡｋｔ１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約３０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡｋｔ１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約２５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡｋｔ１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡｋｔ１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡｋｔ１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡｋｔ１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡｋｔ１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡｋｔ１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡｋｔ１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡｋｔ１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡｋｔ１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡｋｔ１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡｋｔ１を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡｋｔ１を検出することができる。
【０３１２】
［６．Ｆａｓリガンド］
Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）は、ＣＤ９５Ｌとしても知られており、ＴＮＦファミリーの一員であり、Ｆａｓ（ＣＤ９５）との結合によってアポトーシスを引き起こす。タンパク質は２つの形態で存在する；膜ＦａｓＬまたは可溶性ＦａｓＬのいずれかであり、これらは各々、４５ｋＤａおよび２６ｋＤａの分子量で移動する。ＦａｓＬは、活性化リンパ球、ナチュラルキラー細胞および単球を含む種々の細胞において発現する。ＦａｓＬとＦａｓとの相互作用は、生理的アポトーシスプロセスにおいて重要な役割を果たす。Ｆａｓ−ＦａｓＬ系の機能不全は、末梢リンパ器官における過形成を引き起こし、自己免疫疾患の進行および腫瘍形成を促進する。一般に、可溶性アポトーシス因子のレベルに関して、より具体的には治療計画による可溶性アポトーシス因子の修飾に関して限られたデータしか存在しない。
【０３１３】
本発明のシステムおよび方法は、２．４ｐｇ／ｍｌにまで低下したＦａｓリガンド濃度を検出し得る。従って、いくつかの態様において、本発明の分析器システムおよび方法は、アポトーシスの異常レベル等の病態を同定するためのＦａｓリガンドの検出を提供する。患者試料中のＦａｓの測定は、多嚢胞性卵巣症候群、精巣生殖細胞腫瘍等の腫瘍、膀胱癌、肺癌および濾過樹状細胞腫瘍等の珍しい腫瘍等の状態を診断するのに使用可能である。更に、ＦａｓリガンドのＦａｓ測定は、同種移植片拒絶および変形性関節症等の変性疾患を診断するのに使用可能である。従って、いくつかの態様において、本発明の分析器システムおよび方法は、Ｆａｓリガンド関連疾患を診断するために、Ｆａｓリガンド関連疾患に罹っている疑いのある患者からの試料中のＦａｓリガンド濃度を決定するのに使用可能であり、あるいは、Ｆａｓリガンド濃度は、Ｆａｓリガンド関連疾患の治療を受けている患者におけるＦａｓリガンド関連疾患の経過および状態をモニタリングするのに使用可能である。いくつかの態様において、分析は、約１００、５０、２５、１０または５ｐｇ／ｍｌより小さい濃度で、試料中のＦａｓリガンドのレベルを決定することができる。実施例８を参照のこと。
【０３１４】
いくつかの態様において、本発明の方法は、約１００、８０、６０、５０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５または０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界、例えば約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＦａｓＬを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＦａｓＬを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約８０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＦａｓＬを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約６０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＦａｓＬを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＦａｓＬを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約３０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＦａｓＬを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約２５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＦａｓＬを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＦａｓＬを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＦａｓＬを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＦａｓＬを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＦａｓＬを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＦａｓＬを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＦａｓＬを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＦａｓＬを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＦａｓＬを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＦａｓＬを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＦａｓＬを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＦａｓＬを検出することができる。
【０３１５】
［７．ＶＥＧＦ］
ＶＥＧＦとして一般に知られている血管内皮成長因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）は、内皮細胞増殖、生存、移動および血管透過性を促進する分泌性糖タンパク質ファミリーの一員であり、それらの全ては血管形成に寄与する。ＶＥＧＦの、その受容体への結合は、既存の血管系からの血管の成長のために重要である細胞シグナル伝達経路の活性化を引き起こす。ＶＥＧＦは、癌、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症および関節リウマチを含む種々の疾患に関与する。このように、ＶＥＧＦは、これらの疾患、特に癌に対する治療の開発のための興味を引く候補である。
【０３１６】
第１の抗ＶＥＧＦ薬物、モノクローナル抗体アバスチンは、２００４年にＦＤＡによって認可され、転移性大腸癌および非小細胞肺癌を治療することが認可されている。薬物は、他の多数の癌の治療に関しても研究中である。ＶＥＧＦを介した細胞シグナル伝達をターゲットとする他の化合物として、加齢性黄斑変性症を治療することが認可されているモノクローナル抗体フラグメント・ルセンティス、ならびにＶＥＧＦ受容体を含む受容体型チロシンキナーゼをターゲットとする２つの小分子、スーテントおよびネクサバールが挙げられる。この経路をターゲットとする他の薬物候補が開発中である。
【０３１７】
ＶＥＧＦおよびその経路をターゲットとする薬物に見られる有効性により、ＶＥＧＦは、興味深い開発対象である。更に、ＶＥＧＦシグナル伝達が関与する種々の癌および他の疾患を研究者が調査する場合、ＶＥＧＦレベルにおける小変化の測定は、疾患が進行するに従って生じる生物学的変化を研究者が理解するのに役立つだろう。しかし、現在商業的に入手可能な免疫測定は、増加したＶＥＧＦ濃度のみを測定し得る。それらの免疫測定は、健康な人の被験体から得られる血漿中のＶＥＧＦを測定するのに十分な高感度でなく、または早期疾患状態を示すことのあるＶＥＧＦレベルにおける小さい変化を検出するのに十分な高感度でない。しかし、本発明による血漿ＶＥＧＦ分析は、疾患に対するバイオマーカーとしてＶＥＧＦを使用するのに必要とされる能力（またはパワー）、ならびに健常者の被験体および抗ＶＥＧＦ治療を受けている被験体におけるＶＥＧＦを定量するための感度を提供する。いくつかの態様において、ヒトＶＥＧＦ分析は、約０．１ｐｇ／ｍｌのＬＯＤおよび０．３ｐｇ／ｍｌの定量下限（ＬＬＯＱ）を有し、一般に用いられているＥＬＩＳＡ分析より９０倍高感度になる。実施例１１〜２１を参照のこと。
【０３１８】
本発明は、科学者が非常に低いレベルのＶＥＧＦを検出して、薬物の有効性または疾患の進行に関する識見を提供し得るＶＥＧＦレベルにおける小さい変化を測定することを可能にすることによって、ＶＥＧＦの臨床的有用性を増大させる。他の改良の中で、本分析は、研究者が：（１）特にＶＥＧＦレベルを正常状態においてみられるレベルより非常に小さくするべきである場合に、ＶＥＧＦレベルを低下させるために設計された治療法の有効性および投薬を測定すること；（２）ＶＥＧＦ濃度を治療上のエンドポイントとして使用する場合に、よりロバスト性の高い臨床および前臨床研究を設計すること；ならびに（３）患者が健康状態から、癌および血管形成を含む他の疾患を有する疾病状態に移行する際に、患者におけるＶＥＧＦレベルの変化の様子を理解することを可能にする。
【０３１９】
いくつかの態様において、本発明は、正常レベルのＶＥＧＦを定量する方法、および早期段階の癌／腫瘍の存在を示す、異常に増加したＶＥＧＦレベルを同定する方法を提供する。ヒトにおけるＶＥＧＦの通常の健常レベルは５０ｐｇ／ｍｌより小さく、癌の被験体においてはかなり増加する（＞１００ｐｇ／ｍｌ、しばしば２００〜５００ｐｇ／ｍｌ）。他の態様において、本明細書に記載の方法は、他の癌（前立腺およびリンパ腫等）の存在を示すのに使用可能である。本発明の方法は、増加したＶＥＧＦレベルを有するであろう血管新生中の固形（または充実性）腫瘍の存在を示すのに使用可能である。
【０３２０】
いくつかの態様において、本発明は、正常レベルのＶＥＧＦを定量する方法、および血管炎症の存在を示す異常に増加したＶＥＧＦレベルを同定する方法を提供する。この測定は、健常者において、増加したレベルが炎症を示す他の炎症性サイトカインの同時測定によって補強され得る。いくつかの態様において、血管形成およびアテローム性動脈硬化におけるＶＥＧＦの役割を理由として、本発明は、心筋梗塞を検出するのに最も信頼できる基準であるｃＴｎＩのレベルの増加と関連する心疾患の指標として、異常に増加したレベルのＶＥＧＦを定量するのにも使用可能である。この測定は、健常者において、他の心臓マーカー（即ちｐｒｏ−ＢＮＰ）または炎症マーカー（即ちｈｓＣＲＰ、サイトカイン）の同時測定によって補強され得、増加したレベルは心疾患を示す。いくつかの態様において、記載された方法は、正常レベルのＶＥＧＦを定量するのに使用され得、糖尿病の被験体におけるアテローム性動脈硬化の存在を示す、異常に増加したレベルのＶＥＧＦを同定し得る。この測定は、他の糖尿病マーカー（即ちインスリン）および代謝性疾患マーカー（即ちグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１））の同時測定によって補強され得る。
【０３２１】
本発明は、標準的な試料体積である１００μｌより小さい、非常に小さい試料体積におけるＶＥＧＦを測定する方法を提供する。本発明の方法は、分析の感度によって可能となり、他の方法と比較して、より多数の試料が小さい体積にて定量可能な結果を提供することが可能となる。一の態様において、本発明の方法は、１０μｌより少ない又はそれに等しいヒトまたはマウス血漿試料中のＶＥＧＦを測定する。もう１つの態様において、本発明の方法は、１０μｌより少ない又はそれに等しいヒトまたはマウス血漿試料からの組織溶解物中のＶＥＧＦを測定する。これらの方法は、ヒト乳癌組織生検からの溶解物において、およびいくつかのマウス株からのマウス組織溶解物において検査された。もう１つの態様において、本発明の方法は、健康な個体および病気の個体における組織生検から調製された溶解物中のＶＥＧＦを測定する。通常の１ｍｍの針生検、および１０μｌより小さい又はそれに等しい得られる溶解物体積に基づいて、この方法は、針生検からのＶＥＧＦの定量を可能にする。小体積の試料サイズは本発明の他のマーカーによっても提供される。
【０３２２】
一の要旨において、本発明は、試料中のＶＥＧＦの単一分子またはフラグメントまたはそれらの複合体の存在または不存在を、ｉ）分子、フラグメントまたは複合体が存在する場合、それらをラベルでラベリングすることによって；およびｉｉ）ラベルの存在または不存在を検出することによって決定する方法を提供し、ラベルの存在の検出は、試料中にＶＥＧＦの単一分子、フラグメントまたは複合体が存在することを意味する。いくつかの態様において、本発明の方法は、約１１５、１００、８０、６０、５０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５または０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界、例えば約１１５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＶＥＧＦを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１１５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＶＥＧＦを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＶＥＧＦを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約８０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＶＥＧＦを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約６０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＶＥＧＦを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＶＥＧＦを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約３０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＶＥＧＦを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約２５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＶＥＧＦを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＶＥＧＦを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＶＥＧＦを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＶＥＧＦを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＶＥＧＦを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＶＥＧＦを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＶＥＧＦを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＶＥＧＦを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＶＥＧＦを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＶＥＧＦを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＶＥＧＦを検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＶＥＧＦを検出することができる。
【０３２３】
［８．Ａβ−４０およびＡβ−４２］
アミロイドベータタンパク質（４０および４２アミノ酸）は、アルツハイマー病（ＡＤ）患者の脳におけるアミロイド斑の主な構成要素である。健康な状態および病気の状態において、脳脊髄液（ＣＳＦ）および血漿の両方において、２つの内Ａβ−４０がより一般的な形態である（Ａβ−４２より１０〜２０倍高い）。ＡＤの患者において、Ａβ−４２がまず凝集し、そして脳に堆積して斑を形成する。従って、多数のＡＤ患者のＣＳＦにおいてＡβ−４２濃度が減少する。最近の研究は、ＣＳＦおよび血漿におけるＡβ−４２濃度の低下（Ａβ−４０／Ａβ−４２比における並行する変化を伴う）がＡＤの発症の前兆となることを示唆している。
【０３２４】
アルツハイマー病に対する治療法は存在せず、現在利用可能な治療法は、ＡＤに関連する症状のいくらかを最小限にするが、疾患の進行を遅らせない。多数の実験的アプローチは、Ａβ−４２の生成を防ぐことによって又はＡβ−４２濃度を低下させることによって、Ａβ−４２レベルを最小限にすること、Ａβタンパク質を攻撃するために免疫系を刺激すること、およびＡβタンパク質が凝集して斑を形成するのを防ぐことに焦点を合わせている。治験の設計において重要な要素は、研究を費用対効果の高いタイムリーな方法で行い得るように、ＡＤが進行する危険性のある患者を同定することである。従って、バイオマーカーは、サロゲートエンドポイントとして及び有効な研究計画においてＡβレベルを理解するのに非常に重要であろう。
【０３２５】
予防的治療は、ＡＤを扱う最良の方法としての主要な焦点である。ガイドラインは、ＡＤの形成を予測および診断するのに使用可能な非侵襲性バイオマーカーの必要性を記載している。そのような情報は、臨床研究の設計および治療の有用性の評価に関して有用であろう。血漿中のＡβ−４０およびＡβ−４２濃度の測定は、そのような情報に関する展望を提供する。健康で正常なヒトにおいて、血漿濃度は、２００〜４００ｐｇ／ｍｌ（Ａβ−４０）および１５〜３０ｐｇ／ｍｌ（Ａβ−４２）の範囲である。しかし、ＡＤに罹っていると、Ａβ−４２レベルが減少し、現在利用可能なＥＩＡ技術によって検出できないことが多い。更に、Ａβ−４２の形成を激減させることに基づく介入戦略は、Ａβ−４２の減少を測定する方法を必要とする。従って、血漿中の低濃度のアミロイドタンパク質を正確かつ精密に定量する必要がある。
【０３２６】
本発明によるＡβ−４０およびＡβ−４２分析は、ヒト血漿からのアミロイドベータタンパク質を非常に優れた感度で定量することを可能にし、アルツハイマー病研究における速度バイオマーカーとして、および治療的介入を評価するために、Ａβ−４０／Ａβ−４２の使用を可能にする。実施例２２を参照のこと。他の利点の中で、この分析は、研究者が：（１）ＡＤの進行に対する潜在的なハイリスクを有する被験体を同定し、従って、疾患の進行に対するハイリスクを含む介入研究を設計すること；（２）Ａβタンパク質濃度を治療上のエンドポイントとして使用する場合に、よりロバスト性の高い臨床および前臨床研究を設計すること；ならびに（３）ヒトが健康状態から疾病状態に移行する際に、ヒトにおけるＡβタンパク質レベルの変化の様子を理解することを可能にする。
【０３２７】
いくつかの態様において、本発明の方法は、約１００、８０、６０、５０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５または０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界、例えば約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４０を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４０を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約８０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４０を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約６０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４０を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４０を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約３０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４０を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約２５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４０を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４０を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４０を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４０を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４０を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４０を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４０を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４０を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４０を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４０を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４０を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４０を検出することができる。
【０３２８】
いくつかの態様において、本方法は、約２５０、２００、１５０、１００、８０、６０、５０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５または０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界、例えば約２００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４２を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約２００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４２を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１５０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４２を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１００ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４２を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約８０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４２を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約６０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４２を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４２を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約３０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４２を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約２５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４２を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４２を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４２を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４２を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４２を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４２を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４２を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４２を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４２を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４２を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００５ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４２を検出することができる。いくつかの態様において、本方法は、約０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界でＡβ−４２を検出することができる。
【０３２９】
［Ｃ．多重マーカーパネル］
医療診断は、伝統的に単一の分子マーカー（例えば、遺伝子突然変異、ＰＳＡレベルの増加）の検出に依存していた。残念ながら、単一マーカーのアプローチは、多数の生物学的状態または疾患、例えば癌を検出または区別するのに次善のものである。従って、いくつかの場合において、ただ１つのマーカーを認識する分析は、限定された予測値を有する。本発明の方法によれば、複数のマーカーを用いたそのような生物学的状態、例えば疾患のスクリーニング、診断および治療のモニタリングが、単一マーカー分析を用いる方法に関するかなりの改良を提供し得る。癌は非常に複雑な疾患であるので、この多重アプローチは癌の診断に特に良く適しており、この多機能「パネル」アプローチは、癌の細胞学的および臨床的不均一性に整合する。
【０３３０】
医学的検査に対するパネルアプローチの実施の成功の鍵は、生物学的状態を特徴付けて識別することができる最適化されたマーカーパネル（またはマーカーのパネル）の設計および開発である。あらゆる医学的スクリーニングまたは診断検査の鍵となる２つの評価基準は、その感度および特異性であり、それらは、病気に冒された全ての個体を、例外なく、かつターゲットとする疾患を有しない個体が誤って含まれることなく正確に検出するために検査をどのように実施するかを評価する（予測値）。歴史的に、多数の診断検査が、乏しい感度および特異性を理由として批判されてきた。
【０３３１】
真陽性（ＴＰ）の結果は、検査が陽性であり、病態が存在するものである。偽陽性（ＦＰ）の結果は、検査は陽性であるが、病態は存在しないものである。真陰性（ＴＮ）の結果は、検査は陰性であり、病態は存在しないものである。偽陰性（ＦＮ）の結果は、検査は陰性であるが、病態は存在するものである。ここで、感度＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）であり、選択性（または特異性）＝ＴＮ／（ＦＰ＋ＴＮ）であり、予測値＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）である。
【０３３２】
感度は、検査される個体において目標とする疾患を正確に検出する検査能力の尺度である。乏しい感度を有する検査は、高い割合の偽陰性、即ち、疾患を有するが、その特定の疾患がないと誤って同定される個体を生む。偽陰性の潜在的な危険性は、病気の個体が、いくらかの期間診断されず治療されないままになり、その間、疾患が後の段階に進行し得、その後の段階においては、治療をたとえ行ったとしてもあまり有効でないことがあることである。低い感度を有する検査の一例は、ＨＩＶに関するタンパク質ベースの血液検査である。疾患が十分に成立してかなりの数のウイルスが血流に侵入するまで、ウイルスの存在を検出できないので、この種の検査は、低い感度を示す。対照的に、高感度を有する検査の一例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いたウイルス量検出である。この種の検査は非常に少量のウイルスを検出し得るので、高い感度が達成される。誤診断によって生じる結果が大きい場合、高い感度が特に重要である。
【０３３３】
一方、選択性（または特異性）は、病態のない患者を正確に同定するための検査能力の尺度である。選択性の乏しい検査は、高い割合の偽陽性、即ち疾患を有していると誤って同定される個体を生む。偽陽性の不都合な点は、付随するリスク、感情的および経済的ストレスを伴う不必要な医療処置を受けることを患者に強いることであり、このことは、患者の健康に有害な影響を有し得るだろう。選択性の高い診断検査の開発を困難にする疾患の特徴は、疾患のメカニズムが、特に癌において、しばしば複数の遺伝子およびタンパク質に作用することである。更に、特定のタンパク質が、病態とは無関係の理由で増加することがある。高い選択性を有する検査の一例は、ｐ５３突然変異を検出し得る遺伝子ベースの検査である。更なる診断法または更なる医療介入に関連するコストまたはリスクが非常に高い場合、選択性が重要である。
【０３３４】
多数のマーカーからのデータを組み合わせるために統計的手法が開発され、生物学的状態の存在、例えば癌等の疾患の存在の統計的尤度を提供することを、当業者は理解するであろう。そのような方法の例は、米国特許出願第１１／９３４，００８号；第１１／９３９，４８４号；および第１１／６４０，５１１号において開示されている。一の態様において、患者の試料中のパネル要素濃度はロジスティック回帰を用いて組み合わせることができ、被験体の疾患状態は受信者操作特性（ＲＯＣ）分析を用いて決定することができる。例えば米国特許出願第１１／９３４，００８号；第１１／９３９，４８４号；および第１１／６４０，５１１号を参照のこと。他の手法において、マーカーパネルの検出に基づいて試料を分類するために統計的方法を用いることができる。例えば、マーカー分析結果は、試料を病気である又は健康であると分類するのに用いることができる。そのような分類（パターン認識）方法として、例えば、ベイズ分類器、プロファイル相似（ｐｒｏｆｉｌｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）、人工ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、ロジスティックまたは論理回帰、線形または二次判別分析、決定木、クラスタリング、主成分分析、Ｆｉｓｃｈｅｒ判別分析または近傍分類分析が挙げられる。分類のための機械学習法として、例えば、加重投票、ｋ近傍法、決定木の誘導、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）およびフィードフォワードニューラルネットワークが挙げられる。そのような方法は当業者に公知である。
【０３３５】
他の態様において、より簡単なスキームを用いることができる。例えば、一の態様において、２つのマーカーの濃度増加が生物学的状態、例えば疾患の存在を示すことがある。もう１つの態様において、２つのマーカーの濃度低下が生物学的状態、例えば疾患の存在を示すことがある。もう１つの態様において、１つのマーカーの濃度増加および別のマーカーの濃度低下が生物学的状態、例えば疾患の存在を示すことがある。そのような方法を用いると、第２マーカーの結果は、診断、予後診断、または治療経過における信頼性の増加を医師にもたらす。多数のマーカーは確証的な検出、診断、予後診断等を提供し得る。上述のいずれの方法も、３つのマーカー、４つのマーカー等に対して使用し得ることが理解されるであろう。
【０３３６】
［１．多重バイオマーカーパネル］
バイオマーカー（例えばｃＴｎＩ、サイトカインまたはＶＥＧＦ）の定量的測定に関して記載された本発明の方法は、同じ技術を用いて定量された他のバイオマーカーの測定と組み合わせることができる。図４を参照のこと。これらの多重マーカー分析は、被験体における状態の検出およびモニタリングの感度および選択性を改良し得る。そのような分析は高感度のままであり、正常で健康な参照範囲にわたって各被分析物を正確に定量する能力を有する。本明細書において開示されているように、本発明のマーカーは、例えば、生物の生物学的状態（例えば、病態または非疾患状態等の病態）に関連する任意の組成物および／もしくは分子、または組成物および／もしくは分子の複合体を含む。
【０３３７】
一の態様において、本発明は、被験体における状態を検出またはモニタリングするための方法を提供し、この方法は、被験体からの第１試料中の第１マーカーの検出および第２マーカーの検出を含み、第１マーカーは、心筋トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含み、第１マーカーの検出限界は約１０ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は約１００ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は約５０ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は約５ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は約１ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は約０．５ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は約０．１ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は約０．０５ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は約０．０１ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は約０．００５ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は約０．００１ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は約０．０００５ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は約０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は約１０ｐｇ／ｍｌ〜約０．０１ｐｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は、約５ｐｇ／ｍｌ〜約０．０１ｐｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は、約１ｐｇ／ｍｌ〜約０．０１ｐｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は、約１０ｐｇ／ｍｌ〜約０．００１ｐｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は、約５ｐｇ／ｍｌ〜約０．００１ｐｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は、約１ｐｇ／ｍｌ〜約０．００１ｐｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は、約１０ｐｇ／ｍｌ〜約０．０００１ｐｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は、約５ｐｇ／ｍｌ〜約０．０００１ｐｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの態様において、第１マーカーの検出限界は、約１ｐｇ／ｍｌ〜約０．０００１ｐｇ／ｍｌの範囲である。
【０３３８】
いくつかの態様において、試料は血漿、血清、細胞溶解物または本明細書に記載の他の試料を含む。例えば、本発明は、本明細書に記載されているように、ヒトおよびマウスの血漿中のＶＥＧＦを測定するのに使用され得る。
【０３３９】
本発明の利点はそのロバスト性である。再現性のレベルにより、広範囲の検出にわたるより高感度な検出が可能となる。より高いレベルにおける変動を減少させることができるので、検出限界が所定のマーカーの通常レベルまたは予想されるレベルより小さい場合であっても、本発明は利点を提供する。いくつかの態様において、検出限界の変動係数（ＣＶ）は約１００％〜約１％の範囲である。いくつかの態様において、検出限界の変動係数（ＣＶ）は約９０％〜約１％の範囲である。いくつかの態様において、検出限界の変動係数（ＣＶ）は約８０％〜約１％の範囲である。いくつかの態様において、検出限界の変動係数（ＣＶ）は約７０％〜約１％の範囲である。いくつかの態様において、検出限界の変動係数（ＣＶ）は約６０％〜約１％の範囲である。いくつかの態様において、検出限界の変動係数（ＣＶ）は約５０％〜約１％の範囲である。いくつかの態様において、検出限界の変動係数（ＣＶ）は約４０％〜約１％の範囲である。いくつかの態様において、検出限界の変動係数（ＣＶ）は約３０％〜約１％の範囲である。いくつかの態様において、検出限界の変動係数（ＣＶ）は約２０％〜約１％の範囲である。いくつかの態様において、検出限界の変動係数（ＣＶ）は約１５％〜約１％の範囲である。いくつかの態様において、検出限界の変動係数（ＣＶ）は約１０％〜約１％の範囲である。いくつかの態様において、検出限界の変動係数（ＣＶ）は約５％〜約１％の範囲である。
【０３４０】
本発明の方法の感度を理由として、非常に少量の試料体積を用いることができる。例えば、本方法は、標準的な試料体積である１００μｌと比較して、少量の試料体積、例えば１０μｌまたはそれより少ない量でＶＥＧＦを測定するのに用いることができる。本発明は、多数の試料が、他の方法と比較して少量の試料において定量可能な結果を提供することを可能にする。例えば、通常の１ｍｍ針生検から調製された溶解物は、１０μｌより小さい又はそれに等しい体積を有してよい。本発明を用いると、そのような試料を分析することができる。いくつかの態様において、本発明は１００μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は９０μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は８０μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は７０μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は６０μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は５０μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は４０μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は３０μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は２５μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は２０μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は１５μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は１０μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は５μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は１μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は０．０５μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は０．０１μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は０．００５μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は０．００１μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は０．０００５μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、本発明は０．０００１μｌより小さい試料体積の使用を可能にする。いくつかの態様において、試料サイズの範囲は約１０μｌ〜約０．１μｌである。いくつかの態様において、試料サイズの範囲は約１０μｌ〜約１μｌである。いくつかの態様において、試料サイズの範囲は約５μｌ〜約１μｌである。いくつかの態様において、試料サイズの範囲は約５μｌ〜約０．１μｌである。
【０３４１】
いくつかの態様において、第２マーカーにはバイオマーカー、例えばタンパク質または核酸が含まれる。ここで開示されるように、第１マーカーまたは第２マーカーがタンパク質である場合、タンパク質のフラグメントもしくは複合体、またはポリペプチドを包含することが理解される。第２マーカーがそのようなタンパク質である態様において、第２マーカーの検出限界は約１０ｐｇ／ｍｌ〜約０．１ｐｇ／ｍｌの範囲であり得る。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約１００ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約１０ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約５ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約１ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約０．５ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約０．１ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約０．０５ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約０．０１ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約０．００５ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約０．００１ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約０．０００５ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約０．０００１ｐｇ／ｍｌより小さい。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約１０ｐｇ／ｍｌ〜約０．０１ｐｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約５ｐｇ／ｍｌ〜約０．０１ｐｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約１ｐｇ／ｍｌ〜約０．０１ｐｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約１０ｐｇ／ｍｌ〜約０．００１ｐｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約５ｐｇ／ｍｌ〜約０．００１ｐｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約１ｐｇ／ｍｌ〜約０．００１ｐｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約１０ｐｇ／ｍｌ〜約０．０００１ｐｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約５ｐｇ／ｍｌ〜約０．０００１ｐｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの態様において、第２マーカーの検出限界は約１ｐｇ／ｍｌ〜約０．０００１ｐｇ／ｍｌの範囲である。
【０３４２】
第２マーカーは、生物学的状態を示す任意のバイオマーカーであり得る。多数のそのようなバイオマーカーが本明細書に記載される。第２マーカーは本発明の方法によって測定してよく、または別の方法、例えば既存の方法を用いて測定してよい。いくつかの態様において、第２マーカーは本発明の方法を用いて検出される。いくつかの態様において、第２マーカーは、種々の供給者から商業的に入手可能なキットを用いて検出される。これらのキットには、アフィニティー精製された抗体および共役物質を含む第２マーカーを検出するために使用可能である商業的に入手可能なキット、ウエスタンブロット・キットおよび試薬、組み替え型タンパク質の検出および分析、ｅｌｉｓａキットおよび試薬、免疫組織学キットおよび試薬、試料調製およびタンパク質精製、ならびにタンパク質ラベリングキットおよび試薬が含まれる。そのようなキットを供給する会社には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｏｇｅｎｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂｕｅｈｌｍａｎｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＡＧ、ＱｕｉｄｅｌおよびＳｃｉｍｅｄｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが含まれる。実際には、本発明の方法は、別のバイオマーカーを検出する任意の方法と組み合わせることができる。
【０３４３】
いくつかの態様において、第２マーカーは、ｐｒｏＢＮＰ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ｃＴｎＩ、ＶＥＧＦ、インスリン、ＧＬＰ−１、ＴＲＥＭ１、ロイコトリエンＥ４、Ａｋｔ１、Ａβ−４０、Ａβ−４２またはＦａｓリガンドを含むバイオマーカーである。いくつかの態様において、第２マーカーはサイトカインである。ここで開示するように、現在のところ、その同調調節または非調和（ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ）調節が臨床的に注目されている１００を越えるサイトカイン／ケモカインが存在し、そのいずれも、本発明の方法を用いて検出可能である。いくつかの態様において、サイトカインはＧ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＩＬ−８、ＩＬ−５、ＩＬ−２１、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−１５、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１α、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７α、ＩＬ−１β、ＭＣＰ、ＩＬ−３２またはＲＡＮＴＥＳである。いくつかの態様において、サイトカインはＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−７、ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βである。他の態様において、第２マーカーは多量のタンパク質である。そのような態様において、第２マーカーはアポリポタンパク質、虚血修飾アルブミン（ＩＭＡ）、フィブロネクチン、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ、ｐｒｏＢＮＰおよびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを含む）またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）であり得る。
【０３４４】
いくつかの態様において、提供される方法は、第１マーカー、即ちｃＴｎＩまたはＶＥＧＦに関する濃度を決定すること、および第２マーカーがバイオマーカー、例えばタンパク質である場合、第２マーカーに関する濃度を決定することを含む。いくつかの態様において、提供される方法は、第２マーカーに関する濃度に対する第１マーカー濃度の比を決定することを含む。本発明の装置および方法を用いて濃度を決定する方法は、本明細書において開示される。市販のキット、例えば市販のＥＬＩＳＡキットもまた、例えば検出されたバイオマーカーのレベルを検量線と比較することによって、タンパク質濃度を決定するのに使用可能である。
【０３４５】
［２．混合マーカーパネル］
本発明の方法は、所望の生物学的状態、例えば疾患の状態の測定基準としてはたらく他の種類のマーカーと組み合わせることも可能である。図４を参照のこと。例として、生理学的マーカー（ストレス試験、インスリン耐性、ＢＭＩ、血圧、睡眠時無呼吸）、分子マーカー（コレステロール、ＬＤＬ／ＨＤＬ、ビタミン−Ｄ）、多量のタンパク質（アポリポタンパク質、ＩＭＡ、フィブロネクチン）、および疾患に関する遺伝子マーカーが挙げられる。いくつかの態様において、第２マーカーは生理学的マーカーである。いくつかの態様において、第２マーカーは分子マーカーである。いくつかの態様において、第２マーカーは遺伝子マーカーである。
【０３４６】
一の態様において、本発明は、被験体における状態を検出またはモニタリングする方法を提供し、この方法は、被験体からの第１試料中の第１マーカーの検出および第２マーカーの検出を含み、第１マーカーは、心筋トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含み、第２マーカーは生理学的マーカーを含む。生理学的マーカーの例として、心電図（ＥＫＧ）、ストレス試験、放射性映像、超音波、インスリン耐性、ボディー・マス・インデックス（または体格指数）、骨量、血圧、年齢、性別、睡眠時無呼吸、病歴、または他の生理的状態が挙げられる。一の態様において、第２マーカーは、被験体が冠動脈疾患を有するか、または被験体が冠動脈疾患の合併症を発症する危険性があるかを決定するための医療処置を含み、その医療処置には以下のものが含まれるがこれらに限定されない。冠動脈造影法、冠動脈血管内超音波法（ＩＶＵＳ）、ストレス試験（画像を伴う及び伴わない）、頸動脈内膜中膜厚の評価、仮想組織学（ｖｉｒｔｕａｌ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ）の技術の実施を伴う又は伴わない頸動脈超音波検査、冠動脈電子ビーム・コンピュータ断層撮影法（ＥＢＴＣ）、心臓コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、ＣＴ血管造影法、心臓核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）および磁気共鳴血管造影法（ＭＲＡ）。本発明の方法は、循環器疾患を有する危険性がある被験体をモニタリングするのにも有用であり、ここで、第２マーカーは危険因子である。心疾患の危険因子として、血中ＭＰＯレベルの上昇、高血圧、早期ＣＶＤの家族歴、喫煙、高い総コレステロール、低ＨＤＬコレステロール、肥満、糖尿病等が挙げられる。循環器疾患は通常、被験体の血管系の一部分に限定されないので、冠動脈疾患を有する又は有する危険性があると診断された被験体は、脳血管疾患、大動脈腸骨疾患および末梢動脈疾患等の他の形態のＣＶＤを進行させる又は有する危険性もあると考えられる。循環器疾患を有する危険性がある被験体は、ストレス検査の異常または心臓カテーテル検査の異常を有する危険性がある。ＣＶＤを有する危険性がある被験体は、頸動脈内膜中膜厚および冠動脈石灰化の増加を示す危険性もあり、これらは、非侵襲性造影技術を用いて評価可能な特性である。ＣＶＤを有する危険性がある被験体は、動脈硬化性プラーク負荷の増加を有する危険性もあり、これは、血管内超音波法を用いて検査可能な特性である。
【０３４７】
虚血性心疾患（ＩＨＤ）に対する危険因子を有する患者に関して、スクリーニング検査が特に重要である。ＩＨＤに関する一般的な初期スクリーニング検査は、ある期間にわたって電気的活性を測定するものであり、電気活性は繰り返し波形として再現され、それは一般に心電計（ＥＣＧまたはＥＫＧ）と呼ばれ、心筋の律動性脱分極および再分極を示す。様々な波、ならびに脱分極および再分極の法線ベクトルの分析により、重要な診断情報が得られる。しかし、ＥＣＧ測定は、特に高感度ではなく、心血管異常または機能不全の検出に非常に有用なデータでもない。従って、制御された条件の下で心臓にストレスを加えて、ＥＣＧデータにおける変化を測定することは通常、次の段階であるが、常にそうではない。ストレス試験は、時にトレッドミル試験または運動試験と呼ばれ、心臓に向かう動脈を通る血液供給の不足が存在しているか否かを示すことができる。ストレス検査において、患者は、脈拍、ＥＫＧ、血圧および疲労を含む種々のパラメータをモニタリングしながら、制御された条件のもとで運動する。運動の実施によって、または別法として運動に類似した生理学的効果を呈するドブタミン等の医薬品の投与によって、ストレスを加えてよい。ＩＥＤに関するスクリーニング検査において用いられるもう１つの種類のストレス検査には、放射性同位体（通常はタリウムまたはカーディオライト）を患者の血流に注入し、その後、血管系全体にわたる放射性ヌクレオチドの拡散、および心臓筋肉組織への放射性ヌクレオチドの吸収を可視化することを含む放射性ヌクレオチド（核）ストレス検査が含まれる。その後、患者は一定時間の運動を受け、その後、画像化を繰り返して血管系および心臓全体にわたる放射性ヌクレオチドの分布における変化を可視化する。負荷心エコー法には、運動前、運動中および運動後の心臓の超音波可視化が含まれる。放射性ヌクレオチド負荷試験および負荷心エコー法は、個人の心血管の健康状態に関するより明確な理解を得るために、ＥＣＧ測定と組み合わせて用いられることが多い。
【０３４８】
一の態様において、本発明の装置によって検出されるマーカー、例えばｃＴｎＩまたはＶＥＧＦのレベルの増加、および生理学的マーカーの存在は、生物学的状態、例えば疾患を意味する。例えば、被験体における状態を、第１マーカーのレベルの増加、および異常なＥＫＧまたは負荷試験の結果によって検出してよい。
【０３４９】
一の態様において、本発明は、被験体における状態を検出またはモニタリングするための方法を提供し、この方法は、被験体からの第１試料中の第１マーカーの検出および第２マーカーの検出を含み、第１マーカーは心筋トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含み、第２マーカーは分子マーカーを含む。分子マーカーには、その存在が生物学的状態を意味するいずれの物質も含まれる。生物由来の分子マーカーの例として、総コレステロール、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）ＬＤＬ／ＨＤＬ比、トリグリセリド、尿酸またはクレアチニンが挙げられる。いくつかの態様において、分子マーカーには、総コレステロール、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）ＬＤＬ／ＨＤＬ比、トリグリセリド、尿酸またはクレアチニンが含まれる。いくつかの態様において、分子マーカーには、トリグリセリド、ＬＤＬ／ＨＤＬ／Ｑ−ＬＤＬの亜分画が含まれる。米国心臓協会は、脂質プロファイル測定に関する以下の勧告を提示している。
ＨＤＬ：「正常」示数は、男性に関して４０〜５０ｍｇ／ｄＬの間で変化し、女性に関して５０〜６０ｍｇ／ｄＬの間で変化する；６０ｍｇ／ｄＬより大きい測定値が「保護的（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）」であると考えられる。
ＬＤＬ：１３０ｍｇ／ｄＬより小さいと良いと考えられる；１００より小さいと「最適」であると考えられる。
トリグリセリド：１５０ｍｇ／ｄＬより小さいと「正常」であると考えられる。
総コレステロール（トリグリセリド測定値の１／５にＬＤＬおよびＨＤＬの数を加える）：２００ｍｇ／ｄＬより小さいことが「望ましい」と考えられる。
一般に、０．３〜０．４またはそれより大きいＨＤＬ／ＬＤＬ比が望ましいものとして示される。
【０３５０】
分子マーカーを被験体中に導入することも可能であり、例えば塩化ルビジウムが、心筋の灌流を評価するための放射性同位体として用いられる。他の分子マーカーとして、血糖（例えば血中ブドウ糖）およびビタミン−Ｄが挙げられる。
【０３５１】
一の態様において、本発明の装置によって検出されるマーカー、例えばｃＴｎＩまたはＶＥＧＦのレベルの増加、および分子マーカーの存在は、生物学的状態、例えば疾患を示す。例えば、被験体における状態は、第１マーカーのレベルの増加および低ＨＤＬ／ＬＤＬ示数によって検出してよい。
【０３５２】
一の態様において、本発明は、被験体における状態を検出またはモニタリングする方法を含み、この方法は、被験体からの第１試料中の第１マーカーの検出および第２マーカーの検出を含み、第１マーカーは、心筋トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含み、第２マーカーは遺伝子マーカーを含む。遺伝子マーカーは、染色体において同定可能な物理的位置を有するＤＮＡセグメントであって、その遺伝形質が継承され得るＤＮＡセグメントを含む。遺伝子マーカーには、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、タンデム反復数（ＶＮＴＲ）、マイクロサテライト多型、ミニサテライト、一塩基多型（ＳＮＰｓ）、短いタンデム反復（ＳＴＲ）、およびシングルフィーチャー多型（ＳＦＰ）が含まれる。多数の遺伝子マーカー、例えばＳＮＰｓが、種々の疾患に対する危険因子として関連付けられた。例えば、アルツハイマー病に関連する遺伝子の１つである、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）は、この遺伝子に対する３つの可能な対立遺伝子Ｅ２、Ｅ３およびＥ４をもたらす２つのＳＮＰを含有する。各対立遺伝子は、１つのＤＮＡ塩基が異なり、各遺伝子のタンパク質生成物は、１つのアミノ酸が異なる。少なくとも１つのＥ４対立遺伝子を受け継いでいる人は、アルツハイマー病が進行するより高い可能性を有するが、一方、Ｅ２対立遺伝子を受け継いでいることは、アルツハイマー病が進行する尤度（または可能性）が少ないことを示していると考えられる。ＳＮＰｓのデータベースは、ハップマッププロジェクトによって維持されおり、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈａｐｍａｐ．ｏｒｇ／で利用可能である。心血管系疾患に関連するＳＮＰｓの例は、米国特許出願第１２／１０９，１３７号；第１２／１３９，１３９号；第１２／１５１，２７５号；第１２／０７７，９３５号；および第１２／０１９，６５１号に記載されている。遺伝子マーカーは、挿入、欠失または融合を含む突然変異を更に含む。遺伝子マーカーは、ＤＮＡメチル化等のエピジェネティックマーカー、例えばＣｐＧ配列の文脈におけるシトシンのメチル化を更に含む。ＤＮＡメチル化パターンは、特定の条件に応じて細胞において変化し得る。例えば、異常ＤＮＡメチル化は、癌の顕著な特徴である。例えば一の対立遺伝子のＤＮＡメチル化サイレンシングによる、遺伝子の発現に特異的な対立遺伝子を含むインプリンティングもまた、病態、例えば癌等の病態のリスクの増大を示し得る。その様なマーカーは、当業者によく理解されている。例えば、Ｌａｉｒｄ、「Ｃａｎｃｅｒ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ」、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．、２００５年４月１５日；１４  Ｓｐｅｃ  Ｎｏ  １、第Ｒ６５〜７６頁）、ＴａｎｇおよびＨｏ、「Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｉｎ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｒｅｖ  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｏｒｄ．、２００７年６月；８（２）、第１７３〜８２頁を参照のこと。
【０３５３】
一の態様において、本発明の装置によって検出されるマーカー、例えばｃＴｎＩまたはＶＥＧＦのレベルの増加、および遺伝子マーカーの存在は、生物学的状態、例えば疾患を意味する。例えば、被験体における状態は、第１マーカーおよび病態と相関関係にあるＳＮＰのレベルの増加によって検出してよい。例えば、被験体における状態は、第１マーカー、および病態と相関することがわかっているＤＮＡメチル化パターンのレベルの増加によって検出してよい。
【０３５４】
［Ｄ．検出およびモニタリング］
長期的な（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ）試料が定められた期間にわたって個体から収集される場合、本発明の方法は、バイオマーカー、例えばＶＥＧＦのレベルにおける微細な変化を時間と共に定量し得る。目立たない変化を定量する能力は、本明細書に記載の方法を用いる場合に行われる測定の感度と精度とを組み合わせることによって可能となる。
【０３５５】
本明細書に記載された方法は、健常者におけるバイオマーカー、例えばＶＥＧＦ、サイトカイン、ｃＴｎＩのレベルをモニタリングするのに用いることができ、疾患の危険性または早期疾患を示す被分析物のレベルにおける微細な増加を検出する能力を有する。一定の長期的な試料が個体から収集される場合、正常を上回るそのような増加を時間と共に定量することができる。目立たない変化をモニタリングする能力は、本明細書に記載の方法を用いる場合に行われる測定の感度と精度とを組み合わせることによって可能となる。
【０３５６】
本明細書に記載された方法は、バイオマーカー、例えばＶＥＧＦ、サイトカイン、ｃＴｎＩのレベルを、レベルの増加が観察された個体に関してモニタリングするのに用いることができ、被分析物のレベルにおける、健康な状態への回復を示す微細な減少を検出する能力を有する。一定の長期的な試料が個体から収集される場合、そのような減少を時間と共に定量することができ、健康な範囲と比較することができる。この情報は、治療的介入の成功または正常で健康な状態への回復を確定するのに用いることができる。目立たない変化をモニタリングする能力は、本発明の測定の感度と精度とを組み合わせることによって可能である。
【０３５７】
記載された方法は、長期的な試料が定められた期間にわたって個体から収集される場合に、被分析物、例えばＶＥＧＦ、サイトカイン、ｃＴｎＩのレベルにおける微細な変化を時間と共にモニタリングするのに用いることができる。目立たない変化をモニタリングする能力は、本発明による測定の感度と精度とを組み合わせることによって可能である。
【０３５８】
一の態様において、本発明は、被験体における状態を検出またはモニタリングする方法を提供し、この方法は、被験体からの第１試料中の第１マーカーの検出および第２マーカーの検出を含み、この方法において、第１マーカーの濃度が決定され、かつ第２マーカーの濃度が決定され、この方法は、被験体からの第１試料と第２試料との間のマーカー濃度の変化の測定を更に含む。いくつかの態様において、第１マーカーには心筋トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が含まれる。この方法によると、変化は、状態を検出またはモニタリングするのに用いられる。
【０３５９】
一の態様において、本発明は、被験体における状態を検出またはモニタリングする方法を提供し、この方法は、被験体からの第１試料中の第１マーカーの検出および第２マーカーの検出を含み、この方法において、第１マーカーの濃度が決定され、かつ第２マーカーの濃度が決定され、この方法は、被験体からの第１試料と第２試料との間の第１マーカーおよび第２マーカーの濃度比の変化を決定することを更に含み、それにより、この変化が状態の検出またはモニタリングに用いられる。いくつかの態様において、第１マーカーには心筋トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が含まれる。
【０３６０】
いくつかの態様において、被験体からの第１試料の取得と第２試料の取得との間に、医療処置が行われる。いくつかの態様において、医療処置には、外科的処置、ストレス試験、放射性ヌクレオチドストレス試験または治療的介入が含まれる。いくつかの態様において、本発明は、被験体における状態を検出またはモニタリングする方法を提供し、この方法は、被験体からの第１試料中の第１マーカーの検出および第２マーカーの検出、外科的処置の実施、ならびに処置後の第１および第２マーカーの検出を含み、処置の前後のマーカーにおける変化が、状態を検出およびモニタリングするのに用いられる。いくつかの態様において、第１マーカーには心筋トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が含まれる。いくつかの態様において、本発明は、被験体における状態を検出またはモニタリングするための方法を提供し、この方法は、被験体からの第１試料中の第１マーカーの検出および第２マーカーの検出、被験体におけるストレス試験の実施、ならびにストレス試験後の第１および第２マーカーの検出を含み、処置の前後のマーカーにおける変化が、状態を検出およびモニタリングするのに用いられる。いくつかの態様において、第１マーカーには心筋トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が含まれる。いくつかの態様において、本発明は、被験体における状態を検出またはモニタリングするための方法を提供し、この方法は、被験体の第１試料中の第１マーカーの検出および第２マーカーの検出（第１マーカーには心筋トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）が含まれる）、被験体におけるストレス試験の実施、ならびにストレス試験後の第１および第２マーカーの検出を含み、処置の前後のマーカーにおける変化が、状態を検出およびモニタリングするのに用いられる。いくつかの態様において、本発明は、被験体における状態を検出またはモニタリングするための方法を提供し、この方法は、被験体からの第１試料中の第１マーカーの検出および第２マーカーの検出（第１マーカーには血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が含まれる）、被験体におけるストレス試験の実施、ならびにストレス試験後の第１および第２マーカーの検出を含み、処置の前後のマーカーにおける変化が、状態を検出およびモニタリングするのに用いられる。いくつかの態様において、本発明は、被験体における状態を検出またはモニタリングするための方法を提供し、この方法は、被験体からの第１試料中の第１マーカーの検出および第２マーカーの検出、被験体における治療的介入の実施、ならびにストレス試験後の第１および第２マーカーの検出を含み、処置の前後のマーカーにおける変化が、状態を検出およびモニタリングするのに用いられる。いくつかの態様において、第１マーカーには心筋トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が含まれる。
【０３６１】
一の態様において、本発明は、被験体における状態をモニタリングする方法を提供し、この方法は、被験体からの第１試料中の第１マーカーの検出および第２マーカーの検出を含み、モニタリングには、疾患の進行、疾患の再発、リスク評価、治療効果または手術の有効性のモニタリングが含まれる。いくつかの態様において、第１マーカーには心筋トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が含まれる。いくつかの態様において、モニタリングには、被験体からの一連の試料、例えば２つ又はそれより多くの試料中のマーカーの検出が含まれる。いくつかの態様において、一連の試料が、本明細書に開示されているように種々の時間間隔で時間と共に収集される。いくつかの態様において、本発明は、一連の試料からの各試料からのマーカーのレベルを、第１試料から採取された試料中のマーカーのレベルと比較することを含む。いくつかの態様において、異なる体液、組織または他の生体起源から一連の試料が収集される。そのような試料は、同一もしくは同様の時点で、および／または上述のように時間と共に収集され得る。一連の試料におけるマーカーの変化または変化の欠如は、生物学的状態、例えば疾患の進行、治療効果、疾患の再発、リスク評価または手術の有効性をモニタリングするのに用いることができる。いくつかの態様において、本発明の方法は、以下のものからなる群から選択される分析を含む。１つのマーカーまたは複数のマーカーの濃度または一連の濃度を、その１つのマーカーまたは複数のマーカーの濃度に関する正常値と比較すること、濃度または一連の濃度を、ベースライン値と比較すること、および一連の濃度に関する濃度変化速度を決定すること。いくつかの態様において、本発明の方法は、試料中のマーカー濃度を所定の閾値濃度と比較すること、および試料濃度が閾値レベルより大きい場合に診断、予後診断または治療方法を決定することを含む。
【０３６２】
一の態様において、本発明は、被験体における状態をモニタリングする方法を提供し、この方法は、被験体からの第１試料中の第１マーカーの検出および第２マーカーの検出を含み、モニタリングには疾患の進行のモニタリングが含まれる。いくつかの態様において、第１マーカーには心筋トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が含まれる。一の態様において、マーカーの増加は疾患の進行を示す。一の態様において、マーカーの減少は疾患の進行を示す。一の態様において、マーカーにおける変化の欠如は疾患の進行を示す。例えば、マーカーの増加はマーカーを発現する細胞の増殖を示すことがあり、例えば、マーカーの増加は腫瘍細胞の増殖を示し得る。いくつかの態様において、医学的検査または治療は、１つのマーカーまたは複数のマーカーのモニタリングに応じて変化する。いくつかの態様において、被験体に対して追加検査が指示されることがある。例えば、本発明による分析の結果が循環器疾患の進行を示すことがあり、ストレス検査または同様の検査がそれに応じて命じられることがある。もう１つの例において、本発明による分析結果が癌の進行を示すことがあり、撮像技術または同様のものがそれに応じて命じられることがある。いくつかの態様において、分析が疾患の進行を示す場合、被験体に治療薬または外科手術を施してよい。そのような医学的検査または治療が、マーカー、病態、被験体の病歴等に依存するであろうことを、当業者は理解するであろう。
【０３６３】
一の態様において、本発明は、被験体における状態をモニタリングする方法を提供し、この方法は、被験体からの第１試料中の第１マーカーの検出および第２マーカーの検出を含み、モニタリングには疾患の再発のモニタリングが含まれる。いくつかの態様において、第１マーカーには心筋トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が含まれる。一の態様において、マーカーの増加は疾患の再発を示す。一の態様において、マーカーの減少は疾患の再発を示す。一の態様において、マーカーにおける変化の欠如は疾患の再発を示す。例えば、マーカーの増加は、マーカーを発現する細胞、例えば腫瘍細胞の存在を示すことがあり、それによって病態、例えば癌の再発を示す。いくつかの態様において、医学的検査または治療は、１つのマーカーまたは複数のマーカーのモニタリングに応答して禁止される。例えば、分析が疾患の再発を示す場合、治療薬を投与することができ、または外科的処置を行うことができる。そのような医学的検査または治療が、マーカー、病態、被験体の病歴等に依存するであろうことを、当業者は理解するであろう。
【０３６４】
一の態様において、本発明は、被験体における状態をモニタリングする方法を提供し、この方法は、被験体からの第１試料中の第１マーカーの検出および第２マーカーの検出を含み、モニタリングにはリスク評価のモニタリングが含まれる。いくつかの態様において、第１マーカーには心筋トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が含まれる。一の態様において、マーカーの増加は疾患の再発を示す。一の態様において、マーカーの減少は疾患の再発を示す。一の態様において、マーカーにおける変化の欠如は疾患の再発を示す。例えば、マーカーの増加は、心血管系の合併症、例えば心臓発作の危険性、危険性の増加、または危険性の減少を示すことがある。いくつかの態様において、医学的検査または治療は、１つのマーカーまたは複数のマーカーのモニタリングに応答して禁止される。例えば、分析が危険性または危険性の増加を示す場合、治療薬の投与または外科的処置の実施を行い得る。同様に、例えば患者の生活様式の変化または治療効果に応じて危険性が低下した場合、治療的処置を減じてよい。そのような医学的検査または治療が、マーカー、病態、被験体の病歴等に依存するであろうことを、当業者は理解するであろう。
【０３６５】
一の態様において、本発明は、被験体における状態をモニタリングする方法を提供し、この方法は、被験体からの第１試料中の第１マーカーの検出および第２マーカーの検出を含み、モニタリングには治療効果のモニタリングが含まれる。いくつかの態様において、第１マーカーには心筋トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が含まれる。一の態様において、マーカーの増加は準最適な治療効果を示す。一の態様において、マーカーの減少は準最適な治療効果を示す。一の態様において、マーカーにおける変化の欠如は準最適な治療効果を示す。例えば、マーカーにおける増加または変化の欠如は、治療が、例えば腫瘍の成長の停止に有効でないことにより、疾患の進行を遅らせるのに失敗したことを示し得る。いくつかの態様において、本発明は、個体における治療的処置の有効性をモニタリングする方法であって、個体からの第１試料中のマーカーの濃度を測定すること（第１試料は治療的処置の適用前に採取される）を含み、治療的処置の開始後の異なる時点において、個体から採取された一連の試料中のマーカー濃度を測定することを更に含み、更に、治療的処置の有効性を決定するために、治療的処置の前のマーカー濃度を、治療処置の後のマーカーのレベルと比較する、方法を提供する。本明細書において開示されているように、確証的または補足的結果を提供するために、追加のマーカーを評価することができる。いくつかの態様において、治療的処置は、１つのマーカーまたは複数のマーカーのモニタリングに応じて変化する。いくつかの態様において、治療薬（例えば薬物または生物剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ））の投与量は、結果に応じて変化することがある。いくつかの態様において、治療薬（例えば薬物または生物剤）による治療は、結果に応じて中断されることがある。いくつかの態様において、追加の治療薬、例えば薬物または生物剤を、結果に応じて、第１の薬剤に加えて又は第１の薬剤に替えて投与してよい。
【０３６６】
一の態様において、本発明は、被験体における状態をモニタリングする方法を提供し、この方法は、被験体からの第１試料中の第１マーカーの検出および第２マーカーの検出を含み、第１マーカーには心筋トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が含まれ、モニタリングには手術の有効性のモニタリングが含まれる。一の態様において、マーカーの増加は準最適な手術の有効性を示す。一の態様において、マーカーの減少は準最適な手術の有効性を示す。一の態様において、マーカーにおける変化の欠如は準最適な手術の有効性を示す。例えば、マーカーにおける増加または変化の欠如は、外科手術が病変組織、例えば組織腫瘍に由来する組織の全てを除去するのに失敗したことを意味し得る。いくつかの態様において、被験体の治療は検査結果の影響を受ける。例えば、分析結果が、外科的切除が被験体からの全ての癌の除去に失敗したことを示す場合、対象は化学療法によって治療されることがある。同様に、分析結果が、外科的切除が成功したことを示す場合、更なる治療を回避してよい。そのような医学的検査または治療が、マーカー、病態、被験体の病歴等に依存するであろうことを、当業者は理解するであろう。
【０３６７】
［Ｅ．心血管バイオマーカーパネル］
循環器系疾患に対する多数のリスク因子が同定されてきた。これらのリスク因子は２つの大きなカテゴリーに分類することができる：変更不可能な（ｕｎｍｏｄｉｆｉａｂｌｅ）因子（性別が男性であること、および若年性心臓疾患の家族歴等）および変更可能な因子。変更可能な因子は、生活様式因子および根底にある障害／疾患因子へと更に細かく分けることができる。多くの場合、生活様式および根底にある疾患は結び付いている（肥満および糖尿病等）。組み合わされたこれらの因子の全てを、一般集団における、循環器系疾患になる特に高いリスクを有する者を同定するのに使用することができる。
【０３６８】
循環器系疾患を予防する試みは、それらの試みが原因を取り除く又は防ぐ場合により効果的であり、それらの試みはしばしば、リスク因子の変更という形式をとる。生活様式の変更または治療のいずれかによって変更可能なリスク因子の包括的でないリストとして、以下のものが挙げられる。
【０３６９】
（生活様式のリスク因子）
喫煙、肥満および運動不足。
【０３７０】
（疾患のリスク因子）
高血圧症、高コレステロール値、メタボリックシンドローム、糖尿病、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および閉塞型睡眠時無呼吸。
【０３７１】
（高血圧症）
高血圧症は、脳血管疾患および冠動脈性心疾患に対して強力なリスク因子である。およそ５０００万人が高血圧症である。
【０３７２】
（血中コレステロール値）
血中コレステロール値とその後の冠動脈性心疾患との間の明確かつ肯定的な関係が繰り返し実証されている。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）フラクションと関連付けられるコレステロール値は、冠動脈性心疾患と正の相関があり、一方、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と関連付けられるコレステロールは負の相関がある（レベルが高くなるほどリスクが低くなる）。
【０３７３】
（メタボリックシンドローム）
メタボリックシンドロームの主な特徴として、インスリン抵抗性、高血圧症（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ（ｈｉｇｈ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ））、コレステロール異常および凝固の危険性の増加が挙げられる。患者はほとんどの場合、体重超過または肥満である。このクラスタリングによって、あるいはいくつかのリスク因子が同時に進行すると、ＣＶＤのリスクが非常に高くなる。
【０３７４】
（糖尿病）
糖尿病は循環器系疾患に対する強力かつ独立したリスク因子であり、糖尿病患者の主な死因である。血糖値に加えて他の要因によってリスクが高まる。
【０３７５】
（リウマチ性関節炎（ＲＡ））
リウマチ性関節炎の患者は早期死亡の高いリスクを有し、これは循環器系疾患に起因する可能性が高い。
【０３７６】
（全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ））
自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に罹っている女性は、その疾患にかかっていない女性と比較して２倍以上高い循環器系疾患のリスクを有する。
【０３７７】
（閉塞型睡眠時無呼吸（ＯＳＡ））
ＯＳＡは、咽頭の気道の虚脱（ｃｏｌｌａｐｓｅ）に起因して睡眠中に呼吸が繰り返し中断されることを特徴とする。ＯＳＡ患者の集団ベースの疫学的研究および観察は一貫して、ＯＳＡに罹っている人々において高血圧症、２型糖尿病、循環器系疾患および脳卒中の罹患率がより高いことを示してきた。
【０３７８】
心血管障害、例えば鬱血性心不全（ＣＨＦ）はしばしば、臨床症状の発症の後に最初に診断され、これにより早期介入の可能性が排除される。一の態様において、本発明は、血液試料、例えば血漿においてＣＨＦを早期検出するより高感度の分析のためのマルチマーカー免疫分析を提供する。超高感度単一分子計数法を用いてマーカーを定量する多重マーカーパネルの使用は、診断鋭敏度および特異性（または特異度）の改良を実証し、リスク因子の治療および変更（または修正）を改善するのに使用することができる。
【０３７９】
一の態様において、本発明は、バイオマーカーを用いて心筋機能の完全性を評価する方法を提供する。例えば、ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰおよびＮＴｐｒｏＢＮＰ）濃度は、左心室機能不全に罹患している無症候性および症候性の両方の患者において、鬱血性心不全を検査および診断するのに使用することができる。ペプチド濃度が高くなるほど、より悪いＣＶＤ転帰（または結果）と関連付けられ、従って強力な予後情報を提供する。心筋トロポニンは、心筋の病理を評価し得るもう１つの種のバイオマーカーである。トロポニンは心筋細胞によって製造される。可逆的または不可逆的方法のいずれかにおいてこれらの細胞が損傷されると、トロポニンの循環血液中への放出がもたらされる。無症候性の集団における血中トロポニン濃度の上昇は、その後の心臓事象の兆候であり、トロポニン濃度が高いほど高いリスク分類が規定される。これらの炎症性サイトカインの血中バイオマーカーおよび心筋に特異的な血中バイオマーカーは、患者におけるＣＶＤ事象に先立つＣＶＤリスクおよび再発リスクを評価する手段である。更に、これらのマーカーは、より悪い転帰（または結果）と関連するより高い濃度に対して動的である。いくつかの態様において、心臓病理学的バイオマーカーおよび血管炎症バイオマーカーのパネルが使用される。
【０３８０】
バイオマーカーであるｐｒｏＢＮＰ、ｃＴｎＩ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７ａおよびｈｓＣＲＰは、循環器系疾患の様々な病期の患者における様々な上昇段階（ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｅｌｅｖａｔｉｏｎ）を示す。いくつかの態様において、これらの血中バイオマーカーはマルチマーカーパネルにおいて組み合わされて、循環器系疾患のリスクおよび状態のより高感度かつ特異的な評価を提供する。いくつかの態様において、追加のバイオマーカーがパネルに加えられる。いくつかの態様において、２つまたはそれより多くのマーカーが、ＣＶＤを評価するのに使用される。更に、これらのマーカーは、より悪い転帰（または結果）と相関するより高い濃度に対して動的である。本明細書に記載の単一分子検出デバイスおよび方法を用いてマーカーが定量されるこれらの高感度マルチマーカーパネルは、心臓疾患に対する生理学的バイオマーカーに基づく従来の検査と組み合わせることができ、それにより、心血管リスクの程度を評価し、且つ疾患状態を改善するためにリスクを有する患者をモニタリングすることができる。従来の診断法による検査は以下のものを含むがこれらに限定されない。トレッドミル／ＥＫＧストレス試験、閉塞型睡眠障害（ＯＳＤ）評価および頸動脈内中膜複合体厚（ＣＩＭＴ）評価。これらの従来の試験は、以下に記載の補助的診断法（ＡＤＭ）を構築するために高感度の血中バイオマーカーを加えることによって改良される。
【０３８１】
（改良されたストレス試験）
いくつかの態様において、ＥＫＧによる標準的なトレッドミルストレス試験の性能は、血漿心筋トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）バイオマーカー測定を加えることによって改良される。本発明に従って測定されるｃＴｎＩは、心臓負荷（ストレス）の間の心筋生理学に関する洞察を提供する。血漿ｃＴｎＩ濃度は、ストレス試験により誘発される虚血を呈する個体において増加し、その血漿ｃＴｎＩ濃度は核潅流イメージング（ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ）および他の技術を用いて測定することができる。軽度の虚血でさえ、ｃＴｎＩ濃度の増加を誘発し得る。ｃＴｎＩの増加の大きさは、虚血の程度と正の相関を示す。高度の虚血は、心筋ミオサイトから血中へのｃＴｎＩの最大の放出を誘発する。ｃＴｎＩの増加を他の全てのストレスＥＫＧ出力変数と比較する多変数分析を用いると、ｃＴｎＩ増加のみが虚血と相関していた。ｃＴｎＩを検出する他の方法、例えばＳｉｅｍｅｎｓ超高感度ｃＴｎＩおよびＲｏｃｈｅ  ｃＴｎＴは、トロポニンの変化を虚血と関連付けるための感度および確度を提供しない。
【０３８２】
いくつかの態様において、心筋の病理をモニタリングするために血漿ｃＴｎＩ測定が使用される。血漿ｃＴｎＩは、健康なヒトにおいて１−８ｐｇ／ｍｌの範囲で特異的かつ正確に測定することができる。単一個体の内部において、ｃＴｎＩは安定なバイオマーカーであり、時間単位または週単位で最小限の変化を示す。ｃＴｎＩ濃度における２倍より大きい経時的増加は有意である。更に、単一心筋トロポニン測定の上昇は、測定から３月〜８年後の心臓有害事象と相関する。従って、本明細書において提示される血中ｃＴｎＩのモニタリングは、心筋細胞の完全性、従って心筋の病理をモニタリングする方法を提供し、将来の心血管事象の可能性に対する洞察を与える。
【０３８３】
（改良された睡眠試験）
閉塞型睡眠障害（ＯＳＤ）は高度に蔓延しているが、強力なＣＶＤリスク因子としては未だ正しく評価されていない。米国心臓協会は最近、エキスパート・コンセンサス・ドキュメント（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ）を発行し、それはＣＶＤに対するリスクを有する個体または既にＣＶＤに罹っている個体に対するＯＳＤの関連性を強調している。Ｓｏｍｅｒｓ  ＶＫらの『Ｓｌｅｅｐ  ａｐｎｅａ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：ａｎ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ／Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，Ｓｔｒｏｋｅ  Ｃｏｕｎｃｉｌ，ａｎｄ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｎｕｒｓｉｎｇ』（Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．５２：６８６−７１７．（２００８年））を参照のこと。ＯＳＤの特質として、低酸素症、血管収縮、かなり上昇した血圧が挙げられる。そのような攪乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−１７ａ等の血漿バイオマーカーサイトカイン並びにｈｓＣＲＰの増加を伴う血管炎症をもたらし得る。これらのバイオマーカーの上昇は治療的介入の成功によって減少し得る。
【０３８４】
ＯＳＤは、簡単な家庭用検査手順によって診断することができる。本発明は、１つまたはそれより多くのバイオマーカー、例えばＴＮＦ−αまたはＩＬ−１７ａ等の血漿サイトカインを加えることによる、家庭用睡眠試験を改良する方法を提供する。これらの測定は、睡眠障害の大きさ（または程度）および全身性炎症におけるその睡眠障害の影響に関するより幅広く且つより深いイメージを提供する。これらの炎症性バイオマーカーは動的であるので、それらはＯＳＤ患者において、睡眠時無呼吸および血管炎症の両方に対する治療的介入の成功に関するマーカーとしてモニタリング可能である。
【０３８５】
（改良されたＣＩＭＴ試験）
頸動脈内膜中膜厚（ＣＩＭＴ）は冠動脈を含む全ての動脈におけるアテローム性動脈硬化の評価基準である。ＣＩＭＴは動脈壁のイメージを提供し、それにより、潜在性（または無症状）アテローム性動脈硬化の場合であっても狭窄症の程度の評価が可能となる。本発明は、超音波診断に基づく改良されたＣＩＭＴ試験を提供する。アテローム性動脈硬化は、血管炎症の最終結果である。いくつかの態様において、血中のバイオマーカー、例えば、血漿中の炎症誘発性サイトカインの測定は、潜在性（または無症状）疾患を含む動脈疾患のリスクおよび状態の物理的および生化学的評価を提供することによって、ＣＩＭＴを改良することができる。血漿バイオマーカー、例えばｈｓＣＲＰ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１は、血管炎症とともに増加し得、ＣＩＭＴ試験によって測定される狭窄症と相関し得る。これらのバイオマーカーは、炎症性リスクの大きさに関する洞察を提供する。更に、それらは動的であるので、それらの血漿濃度の変化は、患者をモニタリングする間に治療の有効性を評価するのに使用可能である。
【０３８６】
［Ｆ．臨床的方法］
本発明は、生物学的状態または生物における状態を診断するために使用可能なマーカーを確立するため、そのようなマーカーに基づく診断を整備するため、ならびに診断およびそのような診断を用いたサービスを商業化／市販するためのシステムおよび方法（臨床的方法を含む）に関する。
【０３８７】
一の態様において、本発明の臨床的方法は：１つのマーカーまたは複数のマーカーの単一分子の検出により生物学的試料中の１つのマーカーまたは複数のマーカーの濃度を測定することによって、第１集団から得られた生物学的試料中の前記１つのマーカーまたは複数のマーカーに関する濃度範囲を確定すること；および例えば診断製品において、上述の工程において同定された１つ又はそれより多くのマーカーを商品化することを含む方法を用いて、１つ又はそれより多くのマーカーを確立することを含む。同定されたバイオマーカーは、好ましくはポリペプチドまたは小分子である。そのようなポリペプチドは、既に公知であり得、または未知であり得る。ここに示す診断製品薬には、マーカー（例えば、ポリペプチド）に特異的に結合する１つ又はそれより多くの抗体が含まれ得る。
【０３８８】
一の態様において、本発明の臨床的方法は：マーカーの単一分子の検出により生物学的試料のマーカー濃度を測定することによって、第１集団から得られる生物学的試料中の前記マーカーに関する濃度範囲を確立すること；および生物が生物学的状態または件の病態を有するか否かを決定するための診断サービスを提供することを含むシステムを用いて、１つ又はそれより多くのマーカーを確立することを含む。ここに示す診断サービスは、事業の下で認可された又は事業自体である、ＣＬＩＡに認可された研究施設によって提供されてよい。本明細書における診断サービスは、医療提供者、医療保険業者または患者に直接提供することができる。従って、本明細書における臨床的方法は、例えば診断サービスまたは診断製品の販売から収益を上げることができる。
【０３８９】
本明細書における臨床的方法は、例えば医療提供者、保険業者、患者等に診断サービスを提供することも意図している。ここに示す事業は、サービスラボに外注することによって、または（臨床検査室改善法（ＣＬＩＡ）または他の規制認可の下で）サービスラボを設立することによって、診断サービスを提供することができる。その後、そのようなサービスラボは、本明細書に記載の方法を実施して、試料内に特定のマーカーまたはマーカーパターンが存在するか否かを同定することができる。
【０３９０】
１つまたはそれより多くのマーカーは、ポリペプチドもしくは小分子、または新規化学成分である。
【０３９１】
他の態様において、本発明の方法を用いて収集されたデータが得られ、治療を管理するために医師に提出される。一の例示的態様において、被験体からの試料は研究所に送られ、そこで、本発明の方法を用いて試料を分析する。分析結果はその後、医療専門家、例えば医師に伝えられる。医療専門家はその後、分析結果に基づいて被験体に関する治療経過を管理するだろう。一の態様において、分析は、被験体からの試料において増加したレベルのｃＴｎＩまたはＶＥＧＦを提供する。分析結果は、例えば電子通信または標準的な紙の郵便物によって、医療専門家に提出される。医療専門家は、患者に対する治療方針、例えば心疾患を予防する薬を提案することができる。医療専門家は、行動の方針を決定する場合、分析結果を、他の医療マーカー、例えば病歴、喫煙、年齢、体重、人種、ストレス試験、血圧等と組み合わせてもよい。
【０３９２】
いくつかの態様において、本発明の種々の論理演算を実行するために、コンピュータシステムが用いられる。コンピュータシステムは、１つ又はそれより多くのコンピュータ、データベース、メモリシステムおよびシステム出力（例えばコンピュータスクリーンまたはプリンタ）を含み得る。いくつかの態様において、コンピュータが実行可能な論理回路またはプログラムコードは、記憶媒体に保存され、コンピュータにロードされ且つ／若しくはコンピュータによって実行され、または何らかの伝送媒体を介して、例えば電気配線もしくはケーブルを介して、光ファイバーを通じて、もしくは電磁放射線によって、例えばワイヤレスで、伝送される。汎用マイクロプロセッサにおいて実行する場合、コンピュータが実行可能な論理は、特定の論理回路を作成するためにマイクロプロセッサを設定することができる。いくつかの態様において、多数のコンピュータシステムが用いられる。一の態様において、患者または機関は、安全なサーバー（安全性に関する工業的要件を満たしている）にそのようなデータをアップロードすることによって、または高密度ポータブルフォーム（ＣＤＲＯＭ、ＤＶＤ等）で情報を送ることによって、分析データを提供することができる。その後、遠隔地でデータを分析することができる。
【０３９３】
いくつかの態様において、コンピュータシステムは、種々の論理演算を実行するための１つ又はそれより多くの命令の集合を含むプログラムコードを有するコンピュータ読取可能媒体、例えばフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ハードドライブ、フラッシュメモリ、テープまたは他のデジタル記憶媒体を含む。いくつかの態様において、コンピュータシステムは分析機器の操作を管理するために用いられる。いくつかの態様において、コンピュータシステムは分析データを分析するのに用いられる。いくつかの態様において、コンピュータシステムは、多数のマーカーからデータを組み合わせ、それによって、生物学的状態、例えば疾患の検出またはモニタリングに役立てるために用いられる。
【０３９４】
いくつかの態様において、関連情報、例えば実験的プロトコル、マーカー特性、または多数のマーカーを組み合わせるためのアルゴリズムのデータベースは、デジタル記憶媒体、例えばフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ハードドライブ、フラッシュメモリ、テープまたは他のデジタル記憶媒体に保存可能である。そのようなデータベースは、他のコンピュータシステム、例えば論理演算を実行するため、または医師にデータを提示するために用いられるコンピュータシステムに対してローカルまたはリモートで保存可能である。図５を参照のこと。
【０３９５】
［ＶＩＩ．キット］
本発明はキットを更に提供する。いくつかの態様において、キットは、上述のように、分析器システムおよびラベルを含む。本発明のキットは、適切なパッケージングにおいて、本明細書に記載の分子（マーカー等）の高感度検出に有用な１つ又はそれより多くの組成物を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載されているように、本発明のキットは、他の要素（取扱説明書、試薬または他の要素等）と一緒にラベルを提供する。いくつかの態様において、キットは、使用前に消費者によって結合させるために、個別の容器における、個別の要素（抗体および蛍光部分等）としてラベルを提供する。本明細書において記載されているように、いくつかの態様において、本発明のキットは、結合パートナーのペア、例えば抗体ペアを提供し、これらは分子、例えばマーカーに対して特異的であり、結合パートナーの少なくとも１つは、マーカーに対するラベルである。いくつかの態様において、結合パートナー、例えば抗体は、別々の容器で提供される。いくつかの態様において、結合パートナー、例えば抗体は、同じ容器で提供される。いくつかの態様において、結合パートナー、例えば抗体の内の１つは、固体支持体、例えばマイクロタイタープレートまたは常磁性ビーズに固定化される。これらの態様のいくつかにおいて、もう一方の結合パートナー、例えば抗体が、本明細書に記載されているように、蛍光部分でラベリングされる。
【０３９６】
結合パートナー（例えば抗体）、固体支持体、およびキットの要素に対する蛍光ラベルは、本明細書に記載のそのような適切な任意の要素であってよい。
【０３９７】
キットは、本発明の方法において有用な試薬、例えば緩衝液、および結合反応において用いられる他の試薬、洗浄剤、緩衝液、または分析を行う機器を前調節するための他の試薬、試薬を濾過するためのフィルター、ならびに溶出緩衝液または装置に試料を流すための他の試薬を更に含んでよい。
【０３９８】
キットは、１つ又はそれより多くの標準物質、例えば本発明の分析において使用する標準物質（高度に精製された標準物質、例えば組み替え型、タンパク質マーカー、またはそれらの種々のフラグメント、複合体等）を含んでよい。キットは、取扱説明書を更に含んでよい。
本願発明は以下の態様を含む。
（態様１）
被験体からの試料における２つまたはそれより多くのバイオマーカーを検出することを含む、被験体における心血管の状態を検出またはモニタリングする方法であって、
バイオマーカーは、トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、ｐｒｏＢＮＰおよびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰからなる群から選択される心臓病理学的バイオマーカー、並びにインターロイキン６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）またはインターロイキン１７ａ（ＩＬ−１７ａ）からなる群から選択される血管炎症バイオマーカーであり、
少なくとも１つのバイオマーカーの検出限界は約２０ｐｇ／ｍｌより小さい、方法。
（態様２）
約２０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界を有する少なくとも１つのバイオマーカーの検出が、試料をマーカーに対するラベルに接触させること、およびラベルの存在または不存在を検出することを含み、ラベルの存在の検出は対応するマーカーの存在を意味する、態様１に記載の方法。
（態様３）
ラベルが蛍光部分を含み、約２０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界を有する少なくとも１つのバイオマーカーが、バイオマーカーの単一分子に対応するラベルを含むインタロゲーション・スペースにおいて検出される、態様２に記載の方法。
（態様４）
ラベルが蛍光部分を含み、検出が、単一分子検出器にラベルを通すことを含み、単一分子検出器が
（ａ）蛍光部分を刺激するための電磁放射線源；
（ｂ）電磁波源から放射される電磁放射線を受け取るためのインタロゲーション・スペース；および
（ｃ）刺激された蛍光部分の電磁気学的特性を決定するための、インタロゲーション・スペースに操作可能に接続された電磁放射線検出器
を含む、態様２に記載の方法。
（態様５）
少なくとも１つのマーカーの検出限界が約１０ｐｇ／ｍｌ〜約０．０１ｐｇ／ｍｌの範囲である、態様１に記載の方法。
（態様６）
前記状態が鬱血性心不全を含み、２つまたはそれより多くのバイオマーカーがｃＴｎＩ、ＢＮＰ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１７ａを含む、態様１に記載の方法。
（態様７）
被験体における心血管の状態を検出する方法であって、その方法は、生理学的バイオマーカーを測定すること、および被験体からの血液試料中の１つまたはそれより多くのバイオマーカーを検出することを含み、バイオマーカーは、トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、ｐｒｏＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、インターロイキン６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）またはインターロイキン１７ａ（ＩＬ−１７ａ）からなる群から選択され、
少なくとも１つのバイオマーカーの検出限界は約２０ｐｇ／ｍｌより小さい、方法。
（態様８）
生理学的バイオマーカーがストレス試験である、態様７に記載の方法。
（態様９）
１つまたはそれより多くのバイオマーカーがｃＴｎＩを含む、態様８に記載の方法。
（態様１０）
生理学的バイオマーカーが睡眠試験である、態様７に記載の方法。
（態様１１）
１つまたはそれより多くのバイオマーカーが１つまたはそれより多くのサイトカインを含む、態様１０に記載の方法。
（態様１２）
１つまたはそれより多くのサイトカインがＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１７ａおよび／またはｈｓＣＲＰを含む、態様１１に記載の方法。
（態様１３）
生理学的バイオマーカーが頸動脈内膜中膜厚（ＣＩＭＴ）である、態様７に記載の方法。
（態様１４）
１つまたはそれより多くのバイオマーカーが１つまたはそれより多くの血管炎症マーカーを含む、態様１３に記載の方法。
（態様１５）
１つまたはそれより多くの血管炎症マーカーがｈｓＣＲＰ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１を含む、態様１４に記載の方法。
（態様１６）
被験体における鬱血性心不全を検出する方法であって、その方法は、２つまたはそれより多くのバイオマーカーを含むバイオマーカーパネルの１つまたはそれより多くの要素が、正常集団における１つまたはそれより多くのバイオマーカーのレベルと比較して増加しているか否かを検出することを含み、バイオマーカーは、トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、ｐｒｏＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、インターロイキン６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）またはインターロイキン１７ａ（ＩＬ−１７ａ）からなる群から選択され、パネルの少なくとも１つの要素の検出限界は約２０ｐｇ／ｍｌより小さい、方法。
（態様１７）
パネルの約２０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界を有する少なくとも１つの要素がｃＴｎＩである、態様１６に記載の方法。
（態様１８）
約２０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界を有する少なくとも１つのバイオマーカーの検出が、試料をマーカーに対するラベルに接触させること、およびラベルの存在または不存在を検出することを含み、ラベルの存在の検出は、対応するマーカーの存在を意味する、態様１６に記載の方法。
（態様１９）
ラベルが蛍光部分を含み、約２０ｐｇ／ｍｌより小さい検出限界を有する少なくとも１つのバイオマーカーが、バイオマーカーの単一分子に対応するラベルを含むインタロゲーション・スペースにおいて検出される、態様１６に記載の方法。
（態様２０）
ラベルが蛍光部分を含み、検出が、単一分子検出器にラベルを通すことを含み、単一分子検出器が
（ａ）蛍光部分を刺激するための電磁放射線源；
（ｂ）電磁波源から放射される電磁放射線を受け取るためのインタロゲーション・スペース；および
（ｃ）刺激された蛍光部分の電磁気学的特性を決定するための、インタロゲーション・スペースに操作可能に接続された電磁放射線検出器
を含む、態様１６に記載の方法。
（態様２１）
少なくとも１つのマーカーの検出限界が約１０ｐｇ／ｍｌ〜約０．０１ｐｇ／ｍｌの範囲である、態様２０に記載の方法。
【実施例】
【０３９９】
下記の実施例は例示を目的として提示されるものであり、残りの開示事項を限定することを目的とするものでない。
【０４００】
他に明記しない限り、実施例における処理試料は、本明細書に記載の単一分子検出器（ＳＭＤ）において、以下のパラメータを用いて分析した：レーザー：波長６３９ｎｍの連続波ガリウムヒ素ダイオードレーザー（Ｂｌｕｅ  Ｓｋｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カリフォルニア州ミルピタス）、約２ミクロンのスポット寸法に焦点を合わせる（ここで規定されるように０．００４ｐＬのインタロゲーション・スペース）；内径１００平方ミクロンおよび外径３００平方ミクロンの溶融石英キャピラリーを通る流速＝５マイクロリットル／分；レンズの非共焦点配置（例えば図１Ａを参照のこと）；開口数が０．８の集光レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）；シリコンアバランシェフォトダイオード検出器（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）。
【０４０１】
［実施例１  バイオマーカーに関するサンドウィッチ・アッセイ：心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）］
分析：この分析の目的は、ヒト血清中の心筋トロポニンＩ（ｃＴＮＩ）の存在を検出することであった。分析形式は、マウスモノクローナル捕捉抗体およびヤギポリクローナル検出抗体をベースとする２段階サンドウィッチ免疫測定であった。１０マイクロリットルの試料が必要であった。分析の動作範囲は、０〜９００ｐｇ／ｍｌであり、通常の分析検出限界は１〜３ｐｇ／ｍｌである。分析は、完了に約４時間のベンチタイムを必要とした。
【０４０２】
材料：以下の材料を、下記に記載の手順で使用した。：分析プレート：Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ、製品４６４７１８、３８４ウェル、透明、モノクローナル抗体で受動的に（ｐａｓｓｉｖｅｌｙ）コーティング、ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ  Ａ３４４４０２２８Ｐ、ロット番号Ａ０３１６（０．０５Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）における５μｇ／ｍｌ、室温で一晩）；ＰＢＳ中の５％スクロース、１％ＢＳＡで阻害（またはブロック）し、４℃で保存。検量線のために、ヒト心筋トロポニンＩ（ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ  カタログ番号Ｊ３４０００３５２）を用いた。標準濃度のための希釈剤は、アリコートされて−２０℃で保存された、内因性ｃＴＮＩ免疫枯渇ヒト血清であった。標準物質の希釈は、９６ウェル、円錐形、ポリプロピレン（Ｎｕｎｃ、製品番号２４９９４４）において行った。以下の緩衝液および溶液を用いた：（ａ）分析緩衝液：１％ＢＳＡおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＢＢＳ；（ｂ）２ｍｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ）を含有する分析緩衝液中の受動的阻害溶液（ｐａｓｓｉｖｅ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）；２ｍｇ／ｍｌのヤギＩｇＧ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ）；ならびに２ｍｇ／ｍｌ  ＭＡＫ３３  ｐｏｌｙ、Ｒｏｃｈｅ＃１１９３９６６１；（ｃ）検出抗体（Ａｂ）：ペプチド３へとアフィニティー精製されたヤギポリクローナル抗体（ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ  Ｇ１２９Ｃ）（蛍光色素Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７でラベリングし、４℃で保存した）；検出抗体希釈剤：５０％分析緩衝液、５０％受動的阻害溶液；洗浄緩衝液：ホウ酸緩衝生理食塩水Ｔｒｉｔｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＢＳＴ）（１．０Ｍホウ酸、１５．０Ｍ塩化ナトリウム、１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ８．３）；溶出緩衝液：４Ｍ尿素を含むＢＢＳ、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．００１％ＢＳＡ。
【０４０３】
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７でラベリングされた抗体の調製：最初に１００μｇのＧ−１２９−Ｃを４００μｌのカップリング緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３）に溶解することによって、検出抗体Ｇ−１２９−ＣをＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７に接合させた。次に、溶液をＹＭ−３０フィルターの中に移し、溶液およびフィルターを遠心分離にかけることによって、抗体溶液を５０μｌに濃縮した。次に、４００μｌのカップリング緩衝液を加えることによって、ＹＭ−３０フィルターおよび抗体を３回洗浄した。５０μｌをフィルターに加え、フィルターを反転させ、５，０００ｘｇで１分間遠心分離することによって、抗体を回収した。得られた抗体溶液は１〜２μｇ／μｌであった。２０μｌのＤＭＳＯを１バイアルのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７に加えることによって、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  ＮＨＳエステルを再構成し、この溶液を最大で１ヶ月間、−２０℃で保存した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７ストック溶液３μｌを抗体溶液に加え、次にそれを混合し、暗所で１時間培養した。１時間後、１Ｍトリス７．５μｌを抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７溶液に加えて混合した。溶液を、ＹＭ−３０で限外ろ過して低分子量成分を除去した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７に結合した抗体を含有する保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）の体積を、ＰＢＳを加えることによって２００〜４００μｌに調節した。３μｌの１０％ＮａＮ３を溶液に加え、得られる溶液をＵｌｔｒａｆｒｅｅ０．２２遠心分離ユニットに移し、１２，０００ｘｇで２分間回転させた。結合した抗体を含有する濾液を収集し、分析に用いた。
【０４０４】
手順：ｃＴｎＩ標準物質および試料の調製ならびに分析：
【０４０５】
検量線を以下のように作成した：ｃＴｎＩのストックを標準希釈剤中に連続希釈することによって、または１．２ｐｇ／ｍｌ〜４．３μｇ／ｍｌのｃＴｎＩ濃度を達成するために、実施（ｗｏｒｋｉｎｇ）標準物質を調製した（０〜９００ｐｇ／ｍｌ）。
【０４０６】
１０μｌの受動的阻害溶液および１０μｌの標準物質または試料を、各ウェルに加えた。標準物質は４回測定した。プレートをＡｘｙｓｅａｌ封止フィルムで封止し、３０００ＲＰＭで１分間遠心分離し、２５℃で２時間振動させながら培養した。プレートを５回洗浄し、ペーパータオルの上で反転させた状態で、ローターが３０００ＲＰＭに達するまで遠心分離した。１ｎＭの検出抗体の実施希釈液を調製し、２０μｌの検出抗体を各ウェルに加えた。プレートを封止して遠心分離し、アッセイを、２５℃で１時間振動させながら培養した。３０μｌの溶出緩衝液をウェル毎に加え、プレートを封止し、アッセイを２５℃で１／２時間培養した。プレートは、分析前に４℃にて最大で４８時間保存し、または試料は直ちに分析した。
【０４０７】
分析のために、ウェル毎に２０μｌを４０μｌ／分で入れ、５μｌを５μｌ／分で分析した。データは、４σの閾値に基づいて分析した。標準物質濃度に対する未加工信号をプロットした。低濃度範囲に対して線形フィッティングを行い、検量線全体に対して非線形フィッティングを行った。検出限界（ＬｏＤ）は、ＬＯＤ＝（３×ゼロ値の標準偏差）／（線形フィッティングの傾き）として計算した。試料濃度は、試料信号に適した方程式（線形または非線形）から決定した。
【０４０８】
アリコートを、ポンプで分析器の中に送った。唯１つの蛍光ラベルの放射が、レーザー励起後の規定されたスペースにおいて検出されるように、インタロゲーション体積を設定することによって、個別にラベリングされた抗体をキャピラリーフローの間に測定した。デジタルイベントを表す各信号によって、この構成は極めて高い分析感度を可能にする。全蛍光信号は、個々のデジタルイベントの合計として決定される。カウントされた各分子は、数百〜数千のＤＭＣイベント／試料を含む陽性データ点である。本発明のｃＴｎＩ分析の検出限界は、「平均＋３ＳＤ」法によって決定した。
【０４０９】
結果：分析プロトコルを用いて４回測定した通常のｃＴｎＩ検量線に関するデータを表３に示す。
【０４１０】
【表７】
0005678045.tif 000008
【０４１１】
分析器システムの感度を、１５回試験し、表４におけるデータによって示されるように、規定通りに、サブフェムトモル濃度（ｆＭ）レベルの較正試料が検出されることがわかった。精度は、４および１２ｐｇ／ｍｌ（ｃＴｎＩ）において１０％であった。
【０４１２】
【表８】
0005678045.tif 000009
【０４１３】
ｃＴｎＩの濃度範囲に関する線形化された検量線を図６に示す。分析的検出限界（ＬｏＤ）を、１５回の連続分析にわたって決定した。ＬｏＤは、アッセイ内の測定の０ｓｔｄ＋３ＳＤ（ｎ＝４）の平均である。平均ＬｏＤは１．７ｐｇ／ｍｌであった（範囲：０．４〜２．８ｐｇ／ｍｌ）。
【０４１４】
ｃＴｎＩを免疫除去して、既知の量のｃＴｎＩを混合した血清の試料を分析することによって、試料の回収を測定した。表５は、３日間にわたって分析されたシステムによる試料の回収に関するデータを示す。
【０４１５】
【表９】
0005678045.tif 000010
【０４１６】
ｃＴｎＩを混合し、標準的な希釈剤で希釈したヒトプール血清において、分析の線形性を決定した。表６の結果は、希釈、および対応する希釈に対して予想される信号の％を示す。
【０４１７】
【表１０】
0005678045.tif 000011
【０４１８】
更なる実験において、本発明は、正常レベルに対するｃＴｎＩ定量を提供する（例えば１０％およびそれより小さいＣＶにおいて０．８ｐｇ／ｍｌ）。ｃＴｎＩに対する分析システムの分析感度を図７Ａに図示する。ＬｏＤは０．１〜０．２ｐｇ／ｍｌであった。１００μｌの試料について、ＬｏＤは０．１１７ｐｇ／ｍｌであった。５０μｌの試料について、ＬｏＤは０．２３２ｐｇ／ｍｌであった。下端の検量線信号を図７Ｂに示す。
【０４１９】
これらのデータは、本発明の分析器システムが、サブフェムトモル濃度のｃＴｎＩに対する高感度レーザー誘起免疫測定の実施を可能にすることを示している。分析は、ヒト、ラット、イヌおよびサルの間でｃＴｎＩを等しく（ｅｑｕｉｌａｔｅｒａｌｌｙ）定量するのに使用可能である。
【０４２０】
［実施例２  ＴｎＩに対するサンドウィッチ・ビーズベース・アッセイ］
上述の分析は、目標とする分子を固定化するのにプラスチック面を使用する、同一のマイクロタイタープレート形式を用いる。単一粒子分析器システムは、結合していない成分からの結合された成分の分離を達成するために微粒子またはビーズを用いて溶液中で行われる分析にも適合する。
【０４２１】
材料：ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１微粒子（ＭＰ）はＤｙｎａｌから得られる（６５０．０１〜０３、１０ｍｇ／ｍｌストック）。以下のものを含む緩衝液を分析において使用する：１０Ｘホウ酸緩衝生理食塩水Ｔｒｉｔｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＢＳＴ）（１．０Ｍホウ酸、１５．０Ｍ塩化ナトリウム、１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ８．３）；分析緩衝液（０．１Ｍトリス（ｐＨ８．１）、０．０２５Ｍ  ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．１％  ＮａＮ３における、２ｍｇ／ｍｌの正常なヤギＩｇＧ、２ｍｇ／ｍｌの正常なマウスＩｇＧおよび０．２ｍｇ／ｍｌのＭＡＢ−３３−ＩｇＧ−ポリマー、４℃にて保存）；および溶出緩衝液（４Ｍ尿素、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．００１％ＢＳＡを含むＢＢＳ、２〜８℃にて保存）。サンドウィッチ・ビーズベース・アッセイにおいて用いられる抗体には以下のものが含まれる：Ｂｉｏ−Ａｂ（ＩｇＧ１つ当たり１〜２のビオチンを有するＡ３４６５０２２８Ｐ（ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ））およびＤｅｔ−Ａｂ（Ａ６４７に結合したＧ−１２９−Ｃ（ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ）、ＩｇＧ１つ当たり２〜４のｆｌｕｏｒｓ）。標準物質は、組み替え型ヒト心筋トロポニンＩ（ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ、カタログ＃Ｊ３４１２０３５２）である。較正希釈剤はＴＢＳ  ｗＥＤＴＡ中の３０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡである。
【０４２２】
微粒子コーティング：１００μｌのＭＰストックをエッペンドルフチューブに入れる。磁石を適用し、上澄みを除去し、磁石を除去し、洗浄緩衝液中で再懸濁させることによって、ＭＰを１００μｌのＢＢＳＴ洗浄緩衝液で３回洗浄する。洗浄後、ＭＰを１００μｌの分析緩衝液中に再懸濁させて、１５μｇのＢｉｏ−Ａｂを加える。次に、混合物を室温で１時間、常に撹拌しながら培養する。ＭＰを、上述のように１ｍｌの洗浄緩衝液で５回洗浄する。洗浄後、ＭＰを１５ｍｌの分析緩衝液中で再懸濁させる（または１００μｌの分析緩衝液中で再懸濁させて４℃で保存する）。
【０４２３】
標準物質および試料の調製：標準物質を較正希釈剤で希釈して適切な検量線を作成する（通常、２００ｐｇ／ｍｌから０．１ｐｇ／ｍｌに低下させる）。凍結血清および血漿試料は、室温にて１０分間、１３Ｋｒｐｍで遠心分離することが必要である。澄んだ血清／血漿を注意深く取り出して、ペレットまたは浮遊物をできるだけ採取しないようにして、新たなチューブに入れる。５０μｌの各標準物質または試料を、ピペットで適切なウェルに入れる。
【０４２４】
捕捉ターゲット：（分析緩衝液＋４００ｍＭ  ＮａＣｌにおいて１５ｍｌに再懸濁させた後の）１５０μｌのＭＰを各ウェルに加える。混合物を室温で１時間ＪｉｔｔｅｒＢｕｇ，５において培養する。
【０４２５】
洗浄および検出：プレートを磁石の上に置き、全てのＭＰが磁石によって確実に捕捉された後に、上澄みを除去する。プレートを磁石から取り外した後に、２５０μｌの洗浄緩衝液を加える。その後、プレートを磁石上に置き、全てのＭＰが磁石によって確実に捕捉された後に、上澄みを除去する。２０μｌのＤｅｔ−Ａｂをウェル毎に加える（５００ｎｇ／ｍｌまでのＤｅｔ−Ａｂを分析緩衝液＋４００ｍＭ  ＮａＣｌにおいて希釈する））。混合物を室温で３０分間、ＪｉｔｔｅｒＢｕｇ，５において培養する。
【０４２６】
洗浄および溶出：プレートを磁石の上に置き、洗浄緩衝液で３回洗浄する。全てのＭＰが磁石によって捕捉されたことを確認した後に上澄みを除去し、２５０μｌの洗浄緩衝液を加える。洗浄後、試料を新たな９６−ウェルプレートに移す。次いで、新たなプレートを磁石上に置き、全てのＭＰが磁石によって捕捉されたことを確認した後に上澄みを除去する。次に、磁石からプレートを取り外した後に、２５０μｌの洗浄緩衝液を加える。その後、プレートを磁石上に置き、全てのＭＰが磁石によって捕捉されたことを確認した後に上澄みを除去する。次いで、２０μｌの溶出緩衝液を加え、混合物を室温にて３０分間、ＪｉｔｔｅｒＢｕｇ，５において培養する。
【０４２７】
ＭＰの濾取および３８４−ウェルプレートへの移動：標準物質および試料を、３８４−ウェル分析プレートの上端に配置された３８４−ウェルフィルタープレートの中に移す。その後、プレートを、プレートローターを用いて室温にて３０００ｒｐｍで遠心分離にかける。フィルタープレートを取り出し、適切な較正試料を加える。プレートを覆い、ＳＭＤにおいて実行する準備を整える。
【０４２８】
ＳＭＤ：アリコートをポンプで分析器の中に送る。レーザー励起によって唯１つの蛍光分子の放射が規定されたスペースにおいて検出されるようにインタロゲーション体積を設定することによって、個別にラベリングされた抗体をキャピラリーフローの間に測定する。各信号がデジタルイベントを表すことにより、この構成は極めて高い分析感度を可能にする。全蛍光信号は、個々のデジタルイベントの合計として決定される。カウントされた各分子は、数百〜数千のＤＭＣイベント／試料を含む陽性データ点である。本発明のｃＴｎＩ分析の検出限界を「平均＋３ＳＤ」法によって決定する。
【０４２９】
［実施例３  正常な非疾病被検体の集団におけるｃＴｎＩの濃度範囲］
ヒト血清中のｃＴｎＩ濃度に関する参照範囲または正常範囲を、８８の現在のところ健康な（病気でない）被験体からの血清試料を用いて確定した。実施例１に記載のサンドウィッチ免疫測定を行い、本発明の単一粒子分析器システムを用いて上述の信号またはイベントの数をカウントした。血清トロポニンＩ濃度は、分析器によって検出される信号を上述の検量線と関連付けることによって決定した。全ての分析は４回行った。
【０４３０】
現在の欧州および米国心臓病学会（ＥＳＣ／ＡＣＣ）による推奨によると、トロポニン分析は、ＡＣＳ患者と虚血性心疾患に罹患していない患者とを確実に区別するために、および心臓有害事象に対するリスク層化のために、１０％より小さい分析の不正確性（ＣＶ）で、正常範囲の９９パーセンタイルを正確に定量すべきである。分析は、ＴｎＩに対する生物学的閾値（カットオフ濃度）が７ｐｇ／ｍｌのＴｎＩ濃度であり、これは、９９パーセンタイルにおいて、対応する１０％のＣＶで設定されることを示した（図８）。１０％のＣＶレベルにおいて、精度プロファイルは４〜１２ｐｇ／ｍｌのＴｎＩ濃度を示す。
【０４３１】
更に、分析は、米国標準技術局によって提供されるトロポニン−Ｉ標準測定とよく相関する（図９）。
【０４３２】
本発明の分析は、ＥＳＣ／ＡＣＣの要件を満たすのに十分に高感度かつ正確であり、これは、Ｋｏｅｒｂｉｎらによって記載された分析（Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、４２：１９〜２３（２００５））等の分析と比較した場合、心筋トロポニンＩに関する最も高感度な分析である。本発明の分析は、生物学的閾値範囲が１１１〜３３３ｐｇ／ｍｌ（ｃＴｎＩ）であると決定された、現在利用可能な分析より１０〜２０倍高い感度をする。
【０４３３】
［実施例４  急性心筋梗塞（ＡＭＩ）患者の血液循環へのＴｎＩの早期放出の検出］
調査１：救急科（ＥＤ）において胸痛を示した１８人の患者から４７の試料を連続的に得た。これらの患者の全ては非ＳＴのＥＣＧ増加を有し、ＡＭＩと診断された。１８人の患者全てからの初期試料中のｃＴｎＩ濃度は、緊急治療室に入る際に、市販の分析によって、３５０ｐｇ／ｍｌ（１０％カットポイント）より低いと測定され、１２人は１００ｐｇ／ｍｌ（９９パーセンタイル）より低かった。その後、同じ市販の分析を用いてこれらの試料を検査し、ｃＴｎＩに対して陽性反応を示すことが測定された。同じ血清試料を、ＴｎＩに対して実施例１および３に記載の本発明の分析によっても分析し、その結果を、市販の分析を用いて得られた結果と比較した。
【０４３４】
患者が胸痛を示した時に最初に採血を行い（試料１）、その後、４〜８時間の間隔で採血を行った（１２時間において試料２、１６時間において試料３、２４時間において試料４、３０時間において試料５、３６時間において試料６、４２時間において試料７、および４８時間において試料８）。本発明の方法および現在の市販の方法によって血清を分析し、得られた結果を図１０に示す。本発明の分析器は、患者が胸痛を示した時にＴｎＩを検出した（試料１）が、一方、市販の分析は、更に後の時点で最初にｃＴｎＩを検出した（３６時間における試料６）。試料３におけるＴｎＩ濃度は、本発明の分析器を用いて確定された生物学的閾値レベル（７ｐｇ／ｍｌ、図８を参照のこと）を上回り、試料３がＴｎＩに対して陽性であることを示し、それによって、心臓事象の発生を示唆した。市販の分析に対する生物学的閾値は、１１１〜３３３ｐｇ（ＴｎＩ）／ｍｌである。従って、試料３は、心臓事象の可能性を示していると考えられなかったであろう。
【０４３５】
更に、本発明の方法および組成物は、患者から採取した最初の試料に関する結果からわかるように、心筋トロポニンレベルに基づくより一層早期の診断および介入の可能性を可能にする。１００〜３５０ｎｇ／ｍｌの市販の分析の初期ｃＴｎＩ値を有した３つの場合において、本発明の分析方法によって、全てがｃＴｎＩに対して陽性であった（即ち７ｐｇ／ｍｌを超えるｃＴｎＩ）。１００ｐｇ／ｍｌより小さい市販の分析の初期ｃＴｎＩ値を有した１２の場合において、本発明の分析によって、５つの分析が心血管系イベントに対して陽性であると決定された（即ち７ｐｇ／ｍｌを超えるｃＴｎＩ）。本発明の分析の期待される用途は、緊急治療室に入る際の試料を検査した場合に現在の市販の分析より５３％多いＡＭＩ事例を検出しただろう。
【０４３６】
調査２：市販の分析によって陰性であると検査された５０の追加の血清試料を、本発明の分析器およびアッセイを用いて検査した。結果を図１１に示す。５０の試料の内、３６は、９９パーセンタイル内であり、本発明の分析によって設定される正常範囲内であると決定された。しかし、市販の「正常」または非疾患範囲内であると決定された残りの１４の試料は、本発明によって設定された生物学的閾値を上回ることが示された。
【０４３７】
従って、本発明の高感度ｃＴｎＩ分析は、ｃＴｎＩ血清レベルが商業的に入手可能な技術による閾値より下の場合における、患者の心筋障害の検出を可能にする。高感度かつ正確な本発明のｃＴｎＩ分析の使用は、現行のｃＴｎＩ分析より早期のＡＭＩ検出を可能にし、それにより、適切な診断および早期医療介入の機会を提供して結果を改善する。
【０４３８】
［実施例５  ロイコトリエンＴ４（ＬＴＥ４）の検出］
例えば尿標本を用いる分析に対する予備分析として、緩衝液中のロイコトリエンＥ４（ＬＴＥ４）を定量するために分析手法を開発した。分析形式は、１段階の単一抗体競合免疫測定であった。５０マイクロリットルの試料が必要であった。この分析手法の通常の実施範囲は０〜３００ｐｇ／ｍｌであり、通常の検出限界は２〜３ｐｇ／ｍｌ（０．１〜０．１５ｐｇ／試料）であった。分析は、完了に約４時間のベンチタイムを必要とした。
【０４３９】
以下の材料を調製し、下記に記載の手順で使用した：Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ  Ｅ４（ＥＩＡ  Ｋｉｔ、カタログ番号  ５２０４１１）において提供されるマウス抗ウサギＩｇＧで被覆されたプレート；ストックＬＴＥ４標準物質（エタノール中の１００ｎｇ／ｍｌの精製ＬＴＥ４（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ  Ｅ４  ＥＩＡ  Ｋｉｔ、カタログ番号５２０４１１））；９０ｍｌのＮａｎｏｐｕｒｅ水で１：１０に希釈した分析緩衝液（１０Ｘ  ＥＩＡ緩衝液濃縮物（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ  Ｅ４  ＥＩＡ  Ｋｉｔ、カタログ番号５２０４１１））；標準物質を希釈するための緩衝液（３％エタノール）；３０ｍｌのＥＩＡ緩衝液で希釈した抗ＬＴＥ４抗体（ロイコトリエンＥ４  ＥＩＡ抗血清（Ｃａｙｍａｎ  ＣｈｅｍｉｃａｌロイコトリエンＥ４  ＥＩＡ  Ｋｉｔ、カタログ番号５２０４１１）；３１μＭのストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ検出試薬ストック溶液（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７で標識されたストレプトアビジン）；トレーサー（ＬＴＥ４−ビオチン複合体）を、分析器による検出に適合させた；１：４０に希釈した洗浄緩衝液（４００Ｘ濃縮物（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ  Ｅ４  ＥＩＡ  Ｋｉｔ、カタログ番号５２０４１１））；溶出緩衝液（４Ｍ尿素、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．００１％ＢＳＡを含むホウ酸塩緩衝生理食塩水、ｐＨ８．３）。トレーサーのマトリクスおよび抗血清濃度を試験して最も高感度な分析条件を同定した。
【０４４０】
検量線を以下のように作成した：１００ｎｇ／ｍｌストックの分析緩衝液中への連続希釈を行うことによって実施標準物質を調製し、０．００５ｐｇ／ｍｌ〜３０００ｐｇ／ｍｌの濃度範囲を得た。５０μｌの標準物質（または試料）を分析プレートの各ウェルに加えた。全ての標準物質を２回測定した。トレーサーストックを分析緩衝液で１ｐｇ／ｍｌに希釈することによって実施トレーサーを調製した。５０μｌのトレーサー（または緩衝液）を分析プレートの各ウェルに加えた。１００％のストック（キットの取扱説明書に従って作製）を分析緩衝液で希釈することによって、１０％の実施抗血清溶液を調製した。５０μｌの抗血清（または緩衝液）を、分析プレートの各ウェルに加えた；プレートを封止し、２５℃で一晩振動させながら培養した。ストックを分析緩衝液で１４０ｐＭに希釈することによって実施ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ検出試薬を調製した。検出試薬１５μｌを各ウェルに加え、プレートを振動させながら２５℃で３０分間培養した。プレートを５回洗浄した。５０μｌの溶出緩衝液を各セルに加え、振動させながらプレートを２５℃で１／２時間培養した。プレートは直ちに使用し、または分析の前に４℃で最大で４８時間保存した。
【０４４１】
２０μｌを速度４０μｌ／分で分析器の中にポンプで送り、５μｌの試料を５μｌ／分で分析した。データファイルを、閾値＝４σおよび０〜８ミリ秒の相互相関を用いて分析した。標準物質に関して、未加工信号を濃度に対してプロットし、線形フィッティングを低濃度範囲の標準物質に対して用い、一方、非線形フィッティングを検量線全体に対して用いた。検出限界は、ＬＯＤ＝（最大信号の８０％（標的制御なし））（Ｂ／Ｂ０＝８０％における濃度）として計算した。試料濃度は、試料信号に適した方程式（線形または非線形）から算出した。
【０４４２】
ＬＴＥ４の競合曲線を図１２に示す。ＬｏＤは、８０％Ｂ／Ｂｏ＝１．５ｐｇ／ｍｌ（約５ｐＭ）であると計算された。商業的に入手可能なキットを用いて行われるＬＴＥ４分析は、少なくとも３０ｐｇ／ｍｌの濃度で存在する場合のみ、ＬＴＥ４を検出し得る。
【０４４３】
従って、分析器システムは、ＬＴＥ４のレベルを検出してＬＴＥ４関連疾患、例えば疾患の発症における喘息の存在を示すため、および臨床転帰を改善するための疾患の早期段階における治療的介入の必要性を臨床医に警告するために使用することができる。
【０４４４】
［実施例６  ヒトＡｋｔ１の検出］
血清試料中の低レベルのＡｋｔ１を定量するために、サンドウィッチ免疫測定を開発した。検量線は、高濃度標準物質を緩衝タンパク質溶液中で希釈することによって作成した。分析緩衝液１０マイクロリットル（μｌ）、および試料または標準物質１０μｌを、Ａｋｔ１に特異的な抗体で被覆された３８４−ウェルプレートの各ウェルに加え、２時間培養した。より具体的には、抗体８４１６６０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上に２．５マイクログラム／ｍｌで被覆させた。プレートを洗浄し、Ａｋｔ１に対して特異的な、ラベリングされた検出抗体ＡＦ１７７５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７でラベリング、２〜４のｆｌｕｏｒ／ＩｇＧ）を２０μｌ、各ウェルに加えた。１時間の培養の後、プレートを洗浄して結合していない検出抗体を除去した。結合した検出抗体を溶出させ、分析機器において測定した。
【０４４５】
以下の材料を後述の分析手順において使用した。被覆された３８４ウェルプレート；分析緩衝液；再懸濁緩衝液；希釈緩衝液；標準希釈剤；Ａｋｔ１標準物質；Ａｋｔ１に対する検出抗体試薬；洗浄緩衝液（１０ｍＭホウ酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐＨ８．３）；溶出緩衝液（０．０２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．００１％ＢＳＡを含む４Ｍ尿素）、「７」に設定されたマイクロプレート振盪機、マイクロプレート洗浄器、プレート遠心分離器、Ａｘｙｓｅａｌ封止フィルム（Ａｘｙｇｅｎ製品３２１−３１−０５１）、Ｎｕｎｃ穿孔可能封止テープ（Ｎｕｎｃ製品２３５３０６）。
【０４４６】
材料：
（提供された試薬）
捕捉抗体：Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上に、２．５マイクログラム／ｍｌで被覆された８４１６６０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（３８４ウェルプレート）
分析緩衝液
再懸濁緩衝液
希釈緩衝液
標準希釈剤
Ａｋｔ  １標準物質
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７でラベリングされた（２〜４のｆｌｕｏｒ／ＩｇＧ）、Ａｋｔ１に対する検出抗体試薬、ＡＦ１７７５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）
（必要とされる他の試薬）
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００洗浄緩衝液（１０ｍＭホウ酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐＨ８．３）
溶出緩衝液（０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．００１％ＢＳＡを含有する４Ｍ尿素）
「７」に設定されたマイクロプレート振盪機
マイクロプレート洗浄器
プレート遠心分離器
Ａｘｙｓｅａｌ封止フィルム、Ａｘｙｇｅｎ製品３２１−３１−０５１
Ｎｕｎｃ穿孔可能封止テープ、Ｎｕｎｃ製品２３５３０６
【０４４７】
手順：
Ａｋｔ１標準物質調製
標準物質を０．５ｍｌの再懸濁緩衝液において再懸濁させる。最終濃度＝１７０ｎｇ／ｍｌ
標準物質を希釈緩衝液において１：３に希釈する（＝５７ｎｇ／ｍｌ）。
標準物質を標準希釈剤において１：１９に希釈する（＝３ｎｇ／ｍｌ）。
標準希釈剤において３倍希釈を連続して行って４．１ｐｇ／ｍｌへと低下させる。
ウェルごとに１０μｌの分析緩衝液を加える。
ウェルごとに１０μｌの標準物質または試料を加える。
Ａｘｙｓｅａｌ封止フィルムでプレートを封止する。
３０００ＲＰＭで１分間回転させる。
振動させながら２５℃で２時間培養する。
プレートを５回洗浄する。
ペーパータオルの上で逆さにしたプレートを３０００ＲＰＭで１分間回転させる。
ウェルごとに２０μｌの検出抗体試薬を加える。
Ａｘｙｓｅａｌ封止フィルムでプレートを封止する。
ペーパータオルの上で逆さにしたプレートを３０００ＲＰＭで１分間回転させる。
振動させながら２５℃で１時間培養する。
プレートを５回洗浄する。
ペーパータオルの上で逆さにしたプレートを３０００ＲＰＭで１分間回転させる。
ウェルごとに３０μｌの溶出緩衝液を加える。
３０００ＲＰＭで１分間回転させる。
Ｎｕｎｃ穿孔可能封止テープで封止し、ローラーを用いて堅固な封止を確保する。
振動させながら、２５℃で１／２時間培養する。
プレートを、分析の前に、４℃にて最大で４８時間保存してよい。
ＺｅｐｔＸ機器において分析する。
【０４４８】
Ａｋｔ１検量線を以下のように作成した。Ａｋｔ１標準物質を調製して、４．１ｐｇ／ｍｌ〜１７０ｎｇ／ｍｌの範囲のＡｋｔ１を得た。１０μｌの各標準希釈物（または試料）を分析プレートウェルに加えた。プレートを封止し、振動させながら２５℃にて２時間培養した。プレートを洗浄し、遠心乾燥させた。ウェルごとに２０μｌの検出抗体試薬を加え、振動させながら２５℃にて１時間培養した。ウェルごとに３０μｌの溶出緩衝液を加え、振動させながら２５℃にて１／２時間培養することによって、抗体−Ａｋｔ１複合体を分離した。プレートは、直ちに使用するか、または分析の前に最大で４８時間４℃で保存した。溶出液を、ポンプによって分析器に送った。
【０４４９】
分析プロトコルを用いて４回測定した通常のＡｋｔ１検量線に関するデータを表７に示し、グラフ化したデータを図１３に示す。
【０４５０】
【表１１】
0005678045.tif 000012
【０４５１】
１つのプレートにおける試料を分析することによって、同一アッセイ内（Ｉｎｔｒａ−Ａｓｓａｙ）の精度を、標準物質１０００ｐｇ／ｍｌの３６回の反復実験試料を用いて検査した。平均信号は、１８２２±２４３（％ＣＶ＝１３）であった。分析の検出限界（ＬｏＤ）は、３６回のゼロ標準物質の反復実験の平均信号に２標準偏差を加え、検量線から対応するＡｋｔ１濃度を計算することによって決定した。ＬｏＤは、２５ｐｇ／ｍｌであると計算された。
【０４５２】
従って、分析器システムは、Ａｋｔ１関連疾患、例えば癌の存在または不存在を決定するためにＡｋｔ１のレベルを検出するのに使用可能である。
【０４５３】
［実施例７  ＴＧＦ−βの検出］
血清中の低レベルのＴＧＦβを定量するために、サンドウィッチ免疫測定を開発した。高濃度標準物質を緩衝タンパク質溶液中で希釈することによって検量線を作成した。１０マイクロリットル（μｌ）の分析緩衝液および１０μｌの試料または標準物質を、ＴＧＦβに対して特異的な抗体で被覆された３８４−ウェルプレートの各ウェルに加え、２時間培養した。プレートを洗浄し、ＴＧＦβに対して特異的な、ラベリングされた検出抗体２０μｌを各ウェルに加えた。１時間培養した後、プレートを洗浄して結合していない検出抗体を除去した。結合された検出抗体を溶出させ、分析機器において測定した。
【０４５４】
下記の分析手順において以下の材料を用いた。被覆された３８４ウェルプレート；分析緩衝液；標準希釈剤；ＴＧＦβ標準物質の１０μｇ／ｍｌストック溶液；ＴＧＦβに対する検出抗体試薬；ＴｒｉｔｏｎＸ−１００洗浄緩衝液（１００ｍＭホウ酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐＨ８．３）；溶出緩衝液（０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．００１％  ＢＳＡを含有する４Ｍ尿素）。
【０４５５】
ＴＧＦ−β検量線を以下のように作成した。ＴＧＦ−β標準物質を調製して、１００ｎｇ／ｍｌ〜４．１ｐｇ／ｍｌの範囲のＴＧＦβを達成した。１０μｌの分析緩衝液および１０μｌの標準物質または試料を各ウェルに加えた。プレートを封止し、２５℃で２時間振動させながら培養した。プレートを洗浄し、遠心乾燥した。ウェル毎に２０μｌの検出抗体試薬を加え、２５℃で１時間振動させながら培養した。３０μｌの溶出緩衝液をウェル毎に加え、２５℃で１／２時間振動させながら培養することによって、抗体−ＴＧＦ−β複合体を分離させた。プレートは直ちに使用し、または分析の前に最大で４８時間４℃にて保存した。溶出液を分析器の中にポンプで送った。
【０４５６】
分析プロトコルを用いて４回測定された通常のＴＧＦ−β検量線に関するデータを表８に示し、グラフ化したデータを図１４に示す。
【０４５７】
【表１２】
0005678045.tif 000013
【０４５８】
２０回のゼロ標準物質の反復試験の平均信号に２標準偏差を加え、検量線から対応するＴＧＦβ濃度を計算することによって、分析の検出限界（ＬｏＤ）を決定した。ＬｏＤ＝３５０ｐｇ／ｍｌ。
【０４５９】
従って、分析器システムは、ＴＧＦβ関連疾患、例えば癌の存在または不存在を決定するためにＴＧＦβのレベルを検出するのに使用可能である。
【０４６０】
［実施例８  Ｆａｓリガンドの検出］
［血清中の低レベルのＦａｓリガンドを定量するためのサンドウィッチ免疫測定］
高濃度標準物質を緩衝タンパク質溶液中で希釈することによって、検量線を作成した。１０マイクロリットル（μｌ）の分析緩衝液および１０μｌの試料または標準物質を、Ｆａｓリガンドに対して特異的な抗体で被覆した３８４−ウェルプレートの各ウェルに加え、２時間培養した。プレートを洗浄し、Ｆａｓリガンドに特異的な、ラベリングされた検出抗体２０μｌを各ウェルに加えた。１時間培養した後、プレートを洗浄して、結合していない検出抗体を除去した。結合された検出抗体を溶出し、ＺｅｐｔＸ（商標）装置において測定した。
【０４６１】
Ｆａｓリガンド検量線を以下のように作成した。Ｆａｓリガンド標準物質を調製して、１００ｎｇ／ｍｌ〜４．１ｐｇ／ｍｌの範囲のＦａｓリガンドを得た。１０μｌの分析緩衝液および１０μｌの標準物質または試料を各ウェルに加えた。プレートを封止し、２５℃で２時間振動させながら培養した。プレートを洗浄して遠心乾燥した。２０μｌの検出抗体試薬をウェル毎に加え、振動させながら２５℃で１時間培養した。３０μｌの溶出緩衝液を各ウェルに加えて、２５℃で１／２時間振動させながら培養することによって、抗体−Ｆａｓリガンド複合体を分離させた。プレートは、直ちに使用し、または分析前に４℃にて最大で４８時間保存した。
【０４６２】
分析プロトコルを用いて４回測定した通常のＦａｓリガンド検量線のデータを表９に示す。
【０４６３】
【表１３】
0005678045.tif 000014
【０４６４】
１つのプレートにおける試料を分析することによって、同一アッセイ内（Ｉｎｔｒａ−Ａｓｓａｙ）の精度を、３つの標準物質濃度の１２回の反復試験試料を用いて検査した。３つの点の各々に対する１２の値の平均、標準偏差およびＣＶを表１０に示す。
【０４６５】
【表１４】
0005678045.tif 000015
【０４６６】
２０のゼロ標準物質の反復試験の平均信号に２標準偏差を加え、対応するＦａｓリガンド濃度を検量線から計算することによって、分析の検出限界（ＬｏＤ）を決定した。ＬｏＤは２．４ｐｇ／ｍｌであると計算された。
【０４６７】
従って、本発明の分析器システムは、Ｆａｓリガンド関連疾患、例えば癌、同種移植片拒絶および変形性関節症等の変性疾患の存在を示すために、Ｆａｓリガンドのレベルを検出することができる。
【０４６８】
［実施例９  バイオマーカーＴＲＥＭ−１に関するサンドウィッチ・アッセイ］
ＴＲＥＭ−１に関する分析は、サンドウィッチ・アッセイフォーマットを用いて開発された（「Ｓａｎｄｗｉｃｈ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、米国特許仮出願第６０／６２４，７８５号）。ＴＲＥＭ−１検出のための分析試薬は商業的に入手可能である（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）。９６−ウェルプレートにおいて分析を行った。モノクローナル抗体を捕捉試薬として使用し、検出のために別のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いた。検出抗体を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（登録商標）でラベリングした。
【０４６９】
分析のプロトコルは以下の通りであった：
１．プレートを捕捉抗体で被覆し、５回洗浄する。
２．ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ、５％スクロースにおいて阻害（またはブロック）する。
３．血清で希釈されたターゲットを加え、培養し、５回洗浄する。
４．検出抗体を加え、培養し、５回洗浄する。
５．０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．８）を加えて、結合分析要素をプレートから放出する。
６．試料を処理プレートから検出プレートに移し、試料のｐＨを中性にし、単一粒子分析器システムにおいて測定する。
【０４７０】
図１６は、この分析を用いて作成されたＴＲＥＭ−１の検量線である。分析は、１００〜１５００フェムトモル濃度の測定範囲において線形であった。Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓのＥＬＩＳＡ分析は最近導入された。それらのＥＬＩＳＡ分析に対して報告した検量線は、６０〜４０００ｐｇ／ｍｌであった。この実施例は、１００ｆＭ（４．７ｐｇ／ｍｌ）を検量線において規定通りに測定し得、約１０倍高感度な測定を可能にし得ることを示唆している。更に、ケモカイン、Ｔ細胞活性化分子、細胞接着分子およびシグナル伝達分子に対する検量線を作成した。図１８を参照のこと。結果は、単一粒子分析器を用いた被分析物の検出による検出が、ＥＬＩＳＡ分析を用いた検出より一貫して１０〜１００倍高感度であることを示す。
【０４７１】
［実施例１０  バイオマーカーに関するサンドウィッチ・アッセイ：血清中のＩＬ−６およびＩＬ−８レベル］
分析：このプロトコルは、本発明の単一粒子分析器システムを用いて血清中の低レベルのＩＬ−６を定量するためのサンドウィッチ免疫測定を説明する。高濃度標準物質を緩衝タンパク質溶液で希釈することによって、検量線を作成した。１０マイクロリットル（μｌ）の分析緩衝液および１０μｌの試料または標準物質を、ＩＬ−６に対して特異的な抗体で被覆された３８４−ウェルプレートの各ウェルに加え、２時間培養した。プレートを洗浄し、ＩＬ−６に対して特異的な、ラベリングされた検出抗体２０μｌを各ウェルに加えた。１時間培養した後、プレートを洗浄して結合していない検出抗体を除去した。結合した検出抗体を溶出させ、単一粒子分析器において測定した。
【０４７２】
材料：以下の材料を、下記に記載の手順で使用した。：被覆された３８４ウェルプレート；分析緩衝液；標準希釈剤；ＩＬ−６標準物質の１００ｎｇ／ｍｌストック溶液；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７色素でラベリングされた、ＩＬ−６に対する検出抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ＴｒｉｔｏｎＸ−１００洗浄緩衝液（１０ｍＭホウ酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐＨ８．３）；溶出緩衝液（０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．００１％ＢＳＡを含む４Ｍ尿素）；「７」に設定されたマイクロプレート振盪機；マイクロプレート洗浄器；プレート遠心分離器；Ａｘｙｓｅａｌ封止フィルム、Ａｘｙｇｅｎ製品３２１−３１−０５１；およびＮｕｎｃ穿孔可能封止テープ、Ｎｕｎｃ製品２３５３０６。
【０４７３】
手順：ＩＬ−６に対する検量線を以下のように作成した：１００ｎｇ／ｍｌのストック溶液を解凍し、標準希釈剤において１：１０００希釈して１００ｐｇ／ｍｌにし、６回連続の３倍希釈を行うことによって、０．１４ｐｇ／ｍｌの最も低い標準物質濃度を有する濃度範囲を得る。ウェル当たり１０μｌの分析緩衝液および１０μｌの標準物質または試料を、被覆された３８４ウェルプレートの各ウェルに加えた。プレートをＡｘｙｓｅａｌ封止フィルムで封止し、３０００ＲＰＭで１分間遠心分離した。分析プレートを２５℃で２時間振動させながら培養した；５回洗浄した；ペーパータオルの上で反転させて３０００ＲＰＭで１分間遠心分離した。２０μｌの検出抗体試薬を各ウェルに加えた；プレートをＡｘｙｓｅａｌ封止フィルムで封止し、３０００ＲＰＭで１分間遠心分離した。分析プレートを２５℃で１時間、振動させながら培養し、５回洗浄し、ペーパータオルの上で反転させて３０００ＲＰＭで１分間遠心分離した。３０μｌの溶出緩衝液を各ウェルに加えた；プレートをＮｕｎｃ穿孔可能封止テープで封止し、ローラーと共に用いることで堅固な密封を確保した。分析プレートを３０００ＲＰＭで１分間遠心分離し、２５℃で１／２時間、振動させながら培養した。アッセイ分析を直ちに行った。別法として、分析前にプレートを４℃にて最大で４８時間保存した。
【０４７４】
ＥＤＴＡで処理された３２人の血液バンクドナーの全ての血液からの血清試料をＩＬ−６に関して分析した。
【０４７５】
結果：分析プロトコルを用いて４回測定した通常のＩＬ−６検量線に関するデータを表１１に示す。
【０４７６】
【表１５】
0005678045.tif 000016
【０４７７】
ＩＬ−６のより高濃度範囲および低濃度範囲に関する線形化された検量線を各々図１７Ａ〜Ｂに示す。分析は、０．５ｐｇ／ｍｌより低濃度のＩＬ−６の検出を可能にした（図１７Ａ〜Ｂ）。検出限界（ＬｏＤ）は、０．０６ｐｇ／ｍｌであると計算された。ゼロ標準物質の反復試験の平均信号に標準偏差を加え、対応するＩＬ−６濃度を検量線から計算することによって、分析の検出限界（ＬｏＤ）を決定した。この感度レベルは、０．５〜１０ｐｇ／ｍｌの範囲のＩＬ−６の正常レベルの検出に対してさえも優れている。
【０４７８】
血液バンクドナーからの血液試料の血清中のＩＬ−６およびＩＬ−８を検出するための分析を実施し、分析結果を図１７Ｃ〜Ｄに示す。１００％の試料（３２／３２）においてＩＬ−６を定量した。ＩＬ−６の平均濃度は２．３ｐｇ／ｍｌであり、濃度範囲は０．２ｐｇ／ｍｌから２６ｐｇ／ｍｌより高濃度であった（図１７Ｃ）。同じ試料を、ＩＬ−６に関して記載した手順を実質的に用いて、ＩＬ−８に関しても分析した。ＩＬ−８標準物質およびＩＬ−８に特異的な抗体を用いた。ＩＬ−８に対する検量線を設定し（図示せず）、試料中のＩＬ−８濃度を決定するのに用いた（図１７Ｄ）。ＩＬ−８は、１００％（３２／３２）の試料において定量した。ＩＬ−８の平均濃度は７．３ｐｇ／ｍｌであり、濃度範囲は１．２ｐｇ／ｍｌから２６ｐｇ／ｍｌより高濃度であった。
【０４７９】
ＩＬ−６または任意の件の粒子の測定は、より高濃度の被分析物において、分析器の検出を分子のカウント（デジタル信号）から生じる光子の総量（アナログ信号）の検出に切り替えることによって、低濃度およびより高い濃度において測定可能である（図１７ＡおよびＢ）。このことを、図１７Ｅにおいて一般的な方法で示す。単一粒子分析器は、６ｌｏｇの拡大された線形ダイナミックレンジを有する。試料中の粒子濃度を検出するための、ダイナミックレンジを増大させる能力は、正常レベル（低濃度範囲）および疾患レベル（高濃度範囲）に対する粒子濃度の決定を可能にする。ＩＬ−６の正常および疾患レベルに対する検出範囲を図１７Ｆに示す。
【０４８０】
［実施例１１  血管内皮成長因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）分析］
ヒトＶＥＧＦおよびマウスＶＥＧＦの両方に対して、ＶＥＧＦを検出するための分析を開発した。いくつかの態様において、ヒトＶＥＧＦ分析は、約０．１ｐｇ／ｍｌのＬＯＤおよび０．３ｐｇ／ｍｌのＬＬＯＱを有し、このことにより、このヒトＶＥＧＦ分析は一般に用いられるＥＬＩＳＡ分析より９０倍高い感度になる。マウスＶＥＧＦとの公差反応性は、検査した全ての試料種に関して最小限であった。分析は、検査した１００％の血漿、細胞溶解物および使用済み媒体試料中のＶＥＧＦ濃度を測定することができた。対照的に、ＥＬＩＳＡは通常、６％の健康な血漿試料および１０％の健康な細胞溶解物試料におけるヒトＶＥＧＦしか正確に検出することができなかった。両方の分析が試料中のＶＥＧＦ濃度を測定した場合、ＥＬＩＳＡがかなり多くのＶＥＧＦを検出した使用済み媒体を除いて、決定されたレベルを２つの分析に対して比較した。この不一致は、ＥＬＩＳＡが全ＶＥＧＦを測定するのに対し、本発明の分析は遊離ＶＥＧＦを測定するという事実に起因するものであろう。可溶性ＶＥＧＦ受容体が使用済み媒体中に放出されることにより、遊離ＶＥＧＦ濃度はかなり低下するだろう。同一アッセイ内（Ｉｎｔｒａ−Ａｓｓａｙ）の変動性は、大部分の血漿試料に対して１０％より小さく、高ＶＥＧＦ濃度の血漿試料に対して１５％より小さかった。血漿試料の分析に対するアッセイ間（Ｉｎｔｅｒ−ａｓｓａｙ）のＣＶは１０％より小さかった。
【０４８１】
［実施例１２  マウスおよびヒトＶＥＧＦの検出のためのサンドウィッチ免疫測定］
抗体および抗原試薬の調製：
マウスＶＥＧＦバイオアッセイの開発に要する必要な抗体および抗原試薬の生成。マウスＶＥＧＦ分析に最適な試薬を同定するために、組み替え型マウスＶＥＧＦタンパク質（Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓおよびＳｉｇｍａ）および抗マウスＶＥＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡｂｃａｍおよびＳｉｇｍａ）を、適合性に関して検査した。ヒトＶＥＧＦ分析のために、組み替え型ＶＥＧＦタンパク質（Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓおよびＡｂｃａｍ）、および抗ヒトＶＥＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓおよびＡｂｃａｍ）を入手して検査した。サンドウィッチ−免疫測定フォーマットの捕捉工程において使用するために、磁性粒子を抗ＶＥＧＦ抗体で被覆した。潜在的な検出抗体を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素と接合（または共役）させた。両方の分析に関する抗体ペアは、初期分析条件の基本的なセットを用いて、分析最適化プロセスの一部としてスクリーニングした。
【０４８２】
サンドウィッチＶＥＧＦ免疫測定の準備：
抗体および抗原試薬の調製において調製された最適な抗体ペアを用いて、分析を行って、捕捉抗体、検出抗体および磁性粒子の濃度を最適化した。更に、種々の分析成分を試験して、各分析に対する最適な分析緩衝液を設計した。これは、最良の阻害試薬および洗剤を同定し、次いで各成分の濃度を最適化することを含む。
【０４８３】
ヒトＶＥＧＦ分析を実施する方法：
濃度１ｎｇ／ｍｌの組み替え型ヒトＶＥＧＦタンパク質の標準物質溶液を連続希釈した。試料を３回調製した。ＶＥＧＦ分析を用いてこれらの試料の濃度を測定した。この分析を用いて測定された濃度を、予測されたＶＥＧＦ濃度に対してプロットした。
【０４８４】
結果：
分析の性能が実証され、投入される標準物質として用いられる組み替え型ＶＥＧＦ濃度との線形性の高い相関を提供することがわかった。ヒトＶＥＧＦ分析は、０．１ｐｇ／ｍｌのＬＯＤおよび０．３ｐｇ／ｍｌのＬＬＯＱを有する（表１２および図１９Ａ〜Ｂ）。表１２は、ヒトＶＥＧＦ分析の性能データを示し、分析は１０％より小さいＣＶおよび８４〜１０７％の回収率を示す。
【０４８５】
【表１６】
0005678045.tif 000017
【０４８６】
表１３はヒトＶＥＧＦ分析性能のデータを示し、分析は０．０７ｐｇ／ｍｌのＬＯＤを示す。
【０４８７】
【表１７】
0005678045.tif 000018
【０４８８】
表１２および１３に示すデータを、図１９Ａ〜Ｂに図示する。
【０４８９】
同様に、マウスＶＥＧＦ分析は２ｐｇ／ｍｌのＬＯＤおよび３ｐｇ／ｍｌのＬＬＯＱを有する（表１４および１５）。
【０４９０】
【表１８】
0005678045.tif 000019
【０４９１】
【表１９】
0005678045.tif 000020
【０４９２】
表１４および１５に示すデータを、図２０Ａ〜Ｂにおいて図示する。
【０４９３】
データは、基準となる各々のＲ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓのＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡ分析キット（９ｐｇ／ｍｌのｍＶＥＧＦ分析感度；３２ｐｇ／ｍｌのヒトＶＥＧＦ分析感度）の規定感度と比較すると、マウスＶＥＧＦ分析は３倍高感度であり、ヒトＶＥＧＦ分析は９０倍高感度であることを示している。［分析のＬＯＤを正確に規定するために、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓが提示したヒトＶＥＧＦ分析に対する６．８ｐｇ／ｍｌのＬＯＤに５を掛けなければならないことに留意すること。この調節は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓの分析において必要とされる試料の１：５希釈を計算に入れるのに必要とされる（この分析における標準物質は希釈せず、試料の１：５希釈は、その感度計算の一部として含まれない）］。実施例のヒトＶＥＧＦ分析のために、モノクローナル抗体で被覆された磁性粒子を捕捉工程に用い、Ａｌｅｘａラベリングされたポリクローナル抗体を検出工程に用いる。マウスＶＥＧＦ分析に関して、ポリクローナル抗体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＥＬＩＳＡキットと同様に、捕捉および検出工程の両方に用いられる。
【０４９４】
本発明とＥＬＩＳＡ分析との同等な比較を確保するために、値の割り当てに用いられる標準被分析物濃度の間で比較を行った。この情報の結果として、ＥＬＩＳＡ標準物質の分析からの結果に従って本発明の標準物質を再評価した。現在のデータをこの標準物質再評価で調節した場合、両方の分析を用いて決定されたＶＥＧＦ濃度は類似した。元のデータおよび再評価したデータを、下記の表１６に示す。
【０４９５】
［実施例１３  血漿中のヒトおよびマウスＶＥＧＦバイオマーカー分析の再現性、変動性および精度の決定］
ヒト血漿分析の比較：
２４の個別のマウスからの血漿試料を、本発明の分析を用いて分析した；１２のこれらの試料は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＥＬＩＳＡを用いた試験も行った（主張された感度のＬｏＤ＝３１．２ｐｇ／ｍｌ（血清／血漿））。本発明の分析は、１２の試料の全てのＶＥＧＦ濃度を決定し、一方、ＥＬＩＳＡ分析は、検査した試料の１／１２（８．３％）のみを定量した（表１６および図２１）。表１６は、血漿分析に関する、本発明の分析とＥＬＩＳＡヒトＶＥＧＦ分析との比較を示す。
【０４９６】
【表２０】
0005678045.tif 000021
【０４９７】
表１６に示す選択データを、ヒト血漿のＳｉｎｇｕｌｅｘとＥＬＩＳＡ分析との比較として図２１において図示する。ＥＬＩＳＡ分析は、１つの試料においてＶＥＧＦを検出した（検査された１６個の内の１つ）；他の血漿試料のＶＥＧＦ値は、ＥＬＩＳＡ検量線の最も下の点より小さく、従って確実に決定することができなかった。Ｓｉｎｇｕｌｅｘ分析のＣＶは平均して２０％より小さかった。
【０４９８】
異なる細胞株の細胞溶解物および培地におけるｈＶＥＧＦレベルの決定：
２種類の異なるヒト細胞株を培養して採取した。より低濃度のＳＤＳが用いられること、および試料が煮沸されないことを除いて、ＮＣＩ  ＳＯＰ＃３４０５０６に従って細胞を溶解させた。用いられる細胞株は、ヒト細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１胸腺癌およびＨＴ−２９結腸腺癌であった。
【０４９９】
試料は、本発明の分析およびＲ＆Ｄ  ＥＬＩＳＡ分析の両方において２回測定した。溶解物をまず１：８に希釈し、その後（３）連続１：２希釈を行った。媒体をそのまま分析し、また、１：４、１：１６および１：６４に希釈して分析した。各試料を２回ずつ検査した。２つの分析からの値の比較を図２１に示す。両方の分析が、細胞抽出物および使用済み媒体におけるＶＥＧＦを検出した（図２２Ａ〜Ｂ）。分析結果は、使用済み媒体より細胞抽出物において検出されるＶＥＧＦが少ないことで概ね一致した。全体的なＶＥＧＦレベルは、ＭＤＡ−ＭＤ２３１試料においてかなり低く、このことは、両方の分析によって裏付けられた。
【０５００】
マウス血漿試料の分析の比較：
各マウスからの８つのマウス血漿試料を、本発明の分析およびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＥＬＩＳＡを用いて分析した。同程度の値が両方の分析において観察された（図２３）。
【０５０１】
細胞溶解物および培地におけるｍＶＥＧＦレベルの決定：
異なる３つのマウス細胞株を培養し、採取した。細胞を上述のように溶解させた。用いられる細胞株は、マウス細胞株：Ｂ１６黒色腫、４Ｔ１乳癌およびＣＴ２６結腸癌であった。
【０５０２】
試料は、本発明の分析およびＲ＆Ｄ  ＥＬＩＳＡ分析の両方において２回測定した。溶解物は、最初は１：８に希釈し、その後（３）連続１：２希釈を行った。媒体をそのまま分析し、また、１：４、１：１６および１：６４に希釈して分析した。各試料を２回ずつ検査した。２つの分析からの値の比較を図２４に示す。両方の分析が、細胞抽出物および使用済み媒体におけるＶＥＧＦを検出した。分析結果は、細胞株の各々に対して同様の範囲にあり、図２４Ａ〜Ｃに示される。図の間でわかるように、４Ｔ１乳腺細胞株は、最も低いレベルを有した；Ｂ１６黒色腫試料は、４Ｔ１の約４倍のレベルを有し、ＣＴ２６結腸試料は、Ｂ１６の約２倍の高さのレベルであった。２つの分析間で一貫した差異が存在した。本発明の分析は、細胞溶解物においてより多くのＶＥＧＦを検出し、使用済み媒体においてより少ないＶＥＧＦを検出した。更に、放出されたＶＥＧＦに対する細胞内ＶＥＧＦの割合は、Ｓｉｎｇｕｌｅｘ分析に関しては一貫して約５：１であったが、ＥＬＩＳＡ分析結果に関しては、細胞外のＶＥＧＦに対する細胞内のＶＥＧＦの割合がかなり変化した。
【０５０３】
［実施例１４  ＶＥＧＦの同一アッセイ内（Ｉｎｔｒａ−Ａｓｓａｙ）およびアッセイ間（Ｉｎｔｅｒ−Ａｓｓａｙ）の性能］
ヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）の同一アッセイ内（Ｉｎｔｒａ−Ａｓｓａｙ）の再現性：
試料の調製：
２つの異なる正常なヒト血漿試料を、１つのマイクロアッセイプレートを用いて複数回分析した。Ｐ１血漿試料をそのまま分析し、かつ１：８希釈して分析した。希釈された血漿は、低ｈＶＥＧＦ濃度における同一アッセイ内（ｉｎｔｒａ−ａｓｓａｙ）を決定するために試料源を提供した。試料は、１８、２１および１８の反復試験において試験した。
【０５０４】
結果：
ヒト血漿試料に関する同一アッセイ内（Ｉｎｔｒａ−Ａｓｓａｙ）再現性の概略を表１７に示す。表１７におけるデータの概略は、試料の反復試験に対するＣＶが７、１２および９％であることを示している。表１７の最終列は、ＥＬＩＳＡ分析において用いられる標準物質と比較した分析標準物質濃度の評価に基づいて補正された測定ＶＥＧＦ濃度を示す。２ｐｇ／ｍｌより低いＶＥＧＦ濃度が１０％より小さいＣＶで測定された。
【０５０５】
【表２１】
0005678045.tif 000022
【０５０６】
ヒトＶＥＧＦのアッセイ間（ｉｎｔｅｒ−ａｓｓａｙ）再現性：
試料の調製：
ヒト血漿試料に対する検量線および値のアッセイ間（ｉｎｔｅｒ−ａｓｓａｙ）再現性を試験するために、３日間にわたって異なる人により試料当たり３回の反復試験と共に独立して７回分析を行った。
【０５０７】
結果：
ヒト血漿試料の間のアッセイ間（ｉｎｔｅｒ−ａｓｓａｙ）の変動性を表１８に示す。血漿アッセイに対する変動係数（ＣＶ）は１０％より小さかった（表１８）。血漿分析に対するＣＶは同様に、分析実施番号６に関する血漿Ｐ２の結果を除いて１０％より小さかった（表１８）。この分析において、３つの値の内２つはほぼ一致しており、値の１つは実質的に低かった。この１回の反復試験をシリーズから除いた場合、ＶＥＧＦ血漿試料分析に対する全体的なＣＶは１０％より小さくなるであろう。
【０５０８】
【表２２】
0005678045.tif 000023
【０５０９】
マウスＶＥＧＦの同一アッセイ内（Ｉｎｔｒａ−Ａｓｓａｙ）再現性：
試料の調製：
３つの異なるＥＤＴＡマウス血漿からの反復試験試料を、本発明の１つのマイクロタイタープレートにおいて分析した。
【０５１０】
結果：
マウス血漿試料に対する同一アッセイ内（Ｉｎｔｒａ−Ａｓｓａｙ）再現性を表１９に示す。各血漿試料からの１８〜２１の各反復試験に対するデータを表１９に示す。３つの血漿試料の反復試験に対するＣＶは、１４％〜１６％の範囲であった（表１９）。
【０５１１】
【表２３】
0005678045.tif 000024
【０５１２】
Ｓｉｎｇｕｌｅｘのアッセイ間（ｉｎｔｅｒ−ａｓｓａｙ）再現性  −  マウス血漿試料：
試料の調製：
４つの異なるマウスＥＤＴＡ血漿試料を、１０分間１３，０００Ｘｇで遠心分離することによって澄ませた。その後、異なる６日間において試料を３回ずつ検査した。
【０５１３】
結果：
マウス血漿ＶＥＧＦ分析のアッセイ間（ｉｎｔｅｒ−ａｓｓａｙ）再現性の概略を表２０および２１に示す。マウス血漿試料のＣＶは、６つのアッセイにわたって２５％より小さかった（表２０および２１）。
【０５１４】
【表２４】
0005678045.tif 000025
【０５１５】
【表２５】
0005678045.tif 000026
【０５１６】
［実施例１５  異種移植片マウスにおけるＶＥＧＦ］
マウス乳癌異種移植片からの試料は、ワシントン大学のＤｒ．Ｍａｔｔｈｅｗ  Ｅｌｌｉｓの研究室から入手した。血漿および乳癌組織は、５つの異なる異種移植片株から得た。対照として、ＳＣＩＤマウスからの血漿およびマウス胸部組織を使用した。全ての試料を、マウスＶＥＧＦおよびヒトＶＥＧＦの存在に関して試験した。マウスＶＥＧＦは、正常なマウス血漿において８６〜１０９ｐｇ／ｍｌの範囲であった。３つの異種移植片マウスは、正常なものの２倍の大きさのＶＥＧＦレベルを有し、他の２つの異種移植片試料は、現在の正常範囲の下方におけるＶＥＧＦレベルを有する（８０〜８６ｐｇ／ｍｌ）。データを表２２に示す。
【０５１７】
【表２６】
0005678045.tif 000027
【０５１８】
［実施例１６  血漿および細胞溶解物中のヒトＶＥＧＦの定量のための免疫測定キット］
Ｅｒｅｎｎａ（商標）ヒトＶＥＧＦ免疫測定は、ヒト血漿および細胞溶解物中の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を測定するために、定量的蛍光サンドウィッチ免疫測定技術を用いる。ヒトＶＥＧＦに対して特異的な捕捉抗体を常磁性微粒子（ＭＰ）の上にプレコートした。使用者は、ＭＰ、標準物質および試料を、被覆されていないマイクロプレートウェルにピペットで移す。培養の間、試料中に存在する遊離ＶＥＧＦは、被覆されたＭＰ上の捕捉抗体に結合する。結合していないＶＥＧＦ分子を、その後の緩衝液の交換および洗浄工程の間に洗い流す。ＶＥＧＦに特異的な、蛍光ラベルされた色素検出抗体を各ウェルに加え、培養する。この検出抗体は、ＭＰの上に捕捉されたＶＥＧＦを認識してそのＶＥＧＦと結合するだろう。その後の洗浄工程の間にＭＰを清潔なプレートに移す。その後、溶出緩衝液を加えて培養する。溶出緩衝液は、結合したタンパク質サンドウィッチをＭＰ表面から解離させる。蛍光抗体はこの時、ウェル内で浮遊している。最終のマイクロプレートに移す間にこれらの抗体は微粒子から分離され、プレートは、蛍光分子をカウントするＥｒｅｎｎａシステムの中に取り付けられる。蛍光ラベルされた検出抗体のカウントされた数は、捕捉された際に試料中に存在する遊離ＶＥＧＦの量に直接比例する。未知の試料中の遊離ＶＥＧＦの量は検量線から内挿する。
【０５１９】
（提供された試薬）
【表２７】
0005678045.tif 000028
【０５２０】
［１．保存の指示および安定性］
Ｅｒｅｎｎａ  ＶＥＧＦ試薬キットは２〜８℃で保存するべきである。標準物質は、別の容器においてドライアイス上で輸送し、−７０℃以下で保存するべきである。キット到着時に標準物質が凍ったままであることが重要である。キット要素の有効期限は、要素が適切に保存された場合および各要素が１回使用された場合にのみ保証される。成分を適切な有効期限によってラベリングする。
【０５２１】
［２．追加の／他の供給業者］
【表２８】
0005678045.tif 000029
【０５２２】
［３．微粒子関連部材および供給品］
【表２９】
0005678045.tif 000030
【０５２３】
［４．他の有用な備品（明示されていない）］
・脱イオン水または蒸留水
・２０μｌ、１００μｌおよび２５０μｌを移す又は加えることができるマルチチャンネルピペット
・マイクロ遠心分離器チューブ
・小型遠心分離器
・２５０ｍＬ容器
・２５０ｍＬメスシリンダー
【０５２４】
（安全上の注意事項）
・生物学的試料を扱う際には、防護服およびグローブを着用することによって、常に注意すること。
・この試薬キットの成分は、約０．１％のアジ化ナトリウムを保存料として含有する。アジ化ナトリウムは、酸または金属と混合した場合に有毒かつ危険な化合物である。アジ化ナトリウムを含有する溶液は適切に廃棄するべきである。
【０５２５】
（高感度分析に起因する技術的ヒント）
・実験台およびピペットを、使用前に７０％イソプロパノールでしっかりと拭く。
・バイアルをあける前に、高濃度標準物質および初期の標準希釈物を高速回転させる。
・交差汚染の回避を助けるために、滅菌ピペットチップおよび試薬トレイを用いる。
・高濃度の標準物質を移す際にフィルターチップを用いる。
・標準物質および試料を調製するために９６−ウェル１ｍＬポリプロピレン希釈プレートを用いることが推奨される。
・各標準点の３回の反復試験試料を希釈プレートから移し、その後９６−ウェルＶＥＧＦ分析プレートの中に移すことが推奨される。
・各移し替え（または移動）の前に、チップを２回予め湿らせる（ウェル内で吸引および排出する）。
【０５２６】
（試薬調製）
１．使用前に全ての試薬を室温に温める。
２．１Ｘ洗浄緩衝液を（１０Ｘ洗浄緩衝液から）以下のように調製する：
ａ．１０Ｘ洗浄緩衝液の２５ｍＬ瓶を２５０ｍＬ容器に注ぎ入れる。
ｂ．２２５ｍＬの脱イオン水を加える。
ｃ．ゆっくりと反転させることによって十分に混合する。
３．使用する直前に、回転器を用いて３０分間バイアルを反転させることによってＭＰを再懸濁させ、それによって、バイアルにおいてＭＰを確実に均等に分布させるのに役立てる。
【０５２７】
（アッセイ調製）
（標準物質  −  初期標準物質希釈の説明）
１．バイアルを開ける前に、小型遠心分離器において標準物質バイアルを渦動および高速回転させる。材料の減損、または標本もしくはプレートのエアロゾル汚染を防ぐために、この高濃度標準物質バイアルを開ける際に注意する。
２．ＶＥＧＦ標準物質濃度に関して標準物質分析の証明書を参照する。標準希釈剤でストックを１０ｎｇ／ｍＬに希釈する。
【０５２８】
［５．血漿試料検量線］
検量線を作成して、９６−ウェル１ｍｌディープ希釈プレートにおける列にする。１：２の連続希釈を行って、２００ｐｇ／ｍｌ〜０．０５ｐｇ／ｍｌの曲線を得る。標準物質を３回検査する。
【０５２９】
［Ｃ．細胞溶解物および媒体の検量線］
検量線を作成して、９６−ウェル１ｍｌディープ希釈プレートにおける列にする。１：２の連続希釈を行って、４０００ｐｇ／ｍｌ〜０．２４ｐｇ／ｍｌの曲線を得る。標準物質を３回検査する。
【０５３０】
［Ｄ．試料調製］
血漿試料を、使用する直前に１５，８００ｘｇより大きい遠心力で１０分間遠心分離することが重要である。微粒子を避けながら注意深くピペットで採取する；脂質層の下をゆっくりと吸引する。凍結−解凍サイクルの繰り返しを避ける。移動を容易にするために、試料を９６−ウェルプレートに加える。
【０５３１】
溶解物は、使用する直前に、４，６００ｘｇで５分間、４℃にて遠心分離するべきである。上澄みを注意深くピペットで吸い取る。凍結−融解サイクルを避ける。
【０５３２】
分析にかける前に、溶解物を標準物質希釈剤中で少なくとも１０倍希釈するべきである。
【０５３３】
［ヒトＶＥＧＦ分析手順］
（分析の設定）
キットに含まれる取扱説明書による試薬調製、およびバルク試薬パッケージの挿入を行う。上述のように検量線を作成し、試料を調製する。
【０５３４】
（ターゲットの捕捉）
微粒子（ＭＰ）を再懸濁させた後に、１００μｌのＶＥＧＦ捕捉試薬を９６−ウェルポリプロピレンプレート（ＰＰＰ）に加える。ウェル毎に、１００μｌの標準物質／試料を９６−ウェルＰＰＰにピペットで採取する。プレートを、仮のプレートシール（ＡｘｙＳｅａｌ、ＰＣＲＳＰプレート封止フィルム）または同等物で封止する。室温（ＲＴ）で２時間、培地環境で培養する／振動させる。仮のプレートシールを注意深く除去して跳ね返りを避ける。プレートを磁石（Ｄｙｎａｌ  ＭＰＣ（登録商標）−９６Ｓ）上に設置し、ＭＰを安定させる（全てのＭＰをペレットとして磁石に確実に寄せ集める）ために２分待ち、その後、上澄みを吸引する（ＭＰは目に見えるままである）。ＭＰを固定したままで、２５０μｌの洗浄緩衝液を各ウェルに加える。２分待ち（ＭＰは寄せ集められたままである）、緩衝液を吸引する。
【０５３５】
（検出）
プレートを磁石から取り外し、２０μｌのＶＥＧＦ検出試薬を各ウェルに加える。プレートを仮のシールで封止する。遠心分離器において最大１００Ｘｇで脈動（ｐｕｌｓｅ）させる。遠心分離器からプレートを取り出し、室温で１時間培養する／振動させる。プレートシールを除去し、プレートを磁石上に設置する。２分待ち、上澄みを吸引する。２５０μｌの洗浄緩衝液を３回（３Ｘ）加えて除去し、その間ＭＰを磁化する／寄せ集める。各緩衝液を加えた後に２分間脈動させる。ＭＰを磁石から浮遊させない又は取り除かない。プレートを磁石から取り外し、２５０μｌの洗浄緩衝液を各ウェルに加える。プレートを１０秒間振動させてＭＰを再懸濁させる。各ウェルの内容物を新しい９６−ウェルＰＰＰに移す。新たな９６−ウェルプレートを磁石上に設置し、ＭＰを寄せ集める／安定させるために２分間待つ。洗浄緩衝液を除去する。プレートを磁石から取り外し、２５０μｌの洗浄緩衝液を加えて１０秒間振動させる。プレートを磁石上に取り付け、２分待ち、その後緩衝液を吸引する。サイクルを繰り返すと、磁化されたＭＰは目に見えるはずである。
【０５３６】
（溶出）
プレートを磁石から取り外し、ウェル毎に２０μｌの溶出緩衝液を加える。プレートを仮のシールで封止し、遠心分離器において最大１００ｘｇで脈動させる。室温で３０分間培養する／振動させる。別々に、３８４−ウェルポリプロピレンプレートの上に３８４−ウェルフィルタープレートを設置し、遠心分離アダプターカラムを用いてフィルター−ボトムプレートを作製する。９６−ウェルプレートからシールを取り除き、標本を３８４−ウェルフィルター−ボトムプレートに移す前に、磁石上で２分間ＭＰを集合させる。フィルター−ボトムプレートの上部を仮のプレートシールで覆い、プレートを遠心分離器の中に設置する。室温にて１分間、８５０ｘｇでプレートを回転させる。フィルタープレートを取り外して廃棄し、穴開け可能な（耐久性のある）プレートシール（Ｎｕｎｃ、２３５３０６）を用いて分析プレートを覆う。良好な封止を確保するために、プレートシールローラー（ＶＷＲ  ＃  ６０９４１−１１８）を用いる。完成した分析プレートをＥｒｅｎｎａ免疫測定システムに取り付ける。
【０５３７】
（ヒトＶＥＧＦクイック分析ガイド）
１．  全ての試薬、検量線および試料を指示通りに準備する。
２．  ９６−ウェルポリプロピレンプレートの各ウェルに１００μｌの捕捉試薬を加え、次いで１００μｌの標準物質／試料を加える。
３．  覆いをし、室温で２時間培養する／振動させる。
４．  カバーを取り除き、プレートを磁石の上に設置し、ＭＰを２分間安定させ／寄せ集め、上澄みを取り除く。
５．  プレートを磁石上に置いた状態で、２５０μｌの洗浄緩衝液を加える。２分間待ち、緩衝液を取り除く。
６．  磁石から取り外し、２０μｌのＶＥＧＦ検出試薬を各ウェルに加える。１００ｘｇでパルス（ｐｕｌｓｅ）遠心分離する。
７．  覆いをし、室温で１時間培養する／振動させる。
８．  プレートを磁石の上に設置し、ＭＰを寄せ集めるために２分間待つ。上澄みを除去する。
９．  磁石の近くでＭＰを磁気的に寄せ集めながら、２５０μｌの洗浄緩衝液を３回加えて除去する。各サイクルの間に、緩衝液を吸引する前に２分間待つ。
１０．磁石から取り外し、２５０μｌの洗浄緩衝液を加え、１０秒間プレートを振動させて、ＭＰを再懸濁させる。全内容物を新しい９６−ウェルプレートに移す。
１１．プレートを磁石の上に設置し、２分間待つ。上澄みを除去する。
１２．磁石から取り外し、２５０μｌの洗浄緩衝液を加え、１０秒間プレートを振動させる。
１３．工程１１および１２を各々繰り返す。
１４．磁石から取り外し、各ウェルに２０μｌの溶出緩衝液を加える。１００ｘｇでパルス遠心分離する。
１５．覆いをし、室温で３０分間培養する／振動させる。
１６．フィルタープレートを３８４−ウェルプレート（分析プレート）の上に設置する。
１７．９６−ウェルプレートの内容物を、３８４−ウェルフィルタープレート／分析プレートの組み合わせに移す。
１８．フィルタープレートの組み合わせを覆い、１分間８５０ｘｇで遠心分離する。
１９．上部のフィルタープレートを取り外して廃棄する。３８４−ウェルプレートを穴開け可能なプレートシールカバーで覆う。
２０．プレートをＥｒｅｎｎａシステムに取り付ける。
【０５３８】
［追加の試料情報］
この分析は、様々な種類の血漿および血清を検査するのに用いてよい。
【０５３９】
（性能特性）
（通常の検量線）
図２６に示す検量線を、情報を提供する目的のために提供する。検量線は、分析する試料の各セットに対して作成するべきである。
【０５４０】
【表３０】
0005678045.tif 000031
【０５４１】
［実施例１７  血漿および細胞溶解物中のマウスＶＥＧＦの定量的決定のための免疫測定キット］
Ｅｒｅｎｎａ（商標）マウスＶＥＧＦ免疫測定は、マウス血漿および細胞溶解物中の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を測定するために、定量的蛍光サンドウィッチ免疫測定技術を使用する。マウスＶＥＧＦに対して特異的な捕捉抗体を常磁性微粒子（ＭＰ）の上にプレコートした。使用者は、ＭＰ、標準物質および試料を、被覆されていないマイクロプレートウェルにピペットで移す。培養の間、試料中に存在するＶＥＧＦは、被覆されたＭＰ上の捕捉抗体に結合する。結合していないＶＥＧＦ分子を、その後の緩衝液の交換および洗浄工程の間に洗い流す。蛍光ラベルされた色素検出抗体を各ウェルに加え、培養する。この検出抗体は、ＭＰの上に捕捉されたＶＥＧＦを認識してそのＶＥＧＦと結合するだろう。その後の洗浄工程の間にＭＰを清潔なプレートに移す。その後、溶出緩衝液を加えて培養する。溶出緩衝液は、結合したタンパク質サンドウィッチをＭＰ表面から解離させる。蛍光抗体はこの時、ウェル内で浮遊している。最終のマイクロプレートに移す間にこれらの抗体は分離され、プレートは、蛍光分子をカウントするＥｒｅｎｎａシステムの中に取り付けられる。蛍光ラベルされた検出抗体のカウントされた数は、捕捉された際に試料中に存在するＶＥＧＦの量に直接比例する。未知の試料中のＶＥＧＦの量は検量線から内挿する。
【０５４２】
（提供された試薬）
【表３１】
0005678045.tif 000032
【０５４３】
（保存の指示および安定性）
Ｅｒｅｎｎａ  ＶＥＧＦ試薬キットは２〜８℃で保存するべきである。標準物質は、別の容器においてドライアイス上で輸送し、−７０℃以下で保存するべきである。キット到着時に標準物質が凍ったままであることが重要である。キット成分の有効期限は、成分が適切に保存された場合、および各成分が１回使用された場合にのみ保証される。成分を適切な有効期限によってラベリングする。
【０５４４】
（追加の／他の供給物）
【表３２】
0005678045.tif 000033
【０５４５】
（微粒子の部材および供給物）
【表３３】
0005678045.tif 000034
【０５４６】
（他の有用な備品（明示されていない））
・脱イオン水または蒸留水
・２０μｌ、１００μｌおよび２５０μｌを移す又は加えることができるマルチチャンネルピペット
・マイクロ遠心分離器チューブ
・小型遠心分離器
・２５０ｍＬ容器
・２５０ｍＬメスシリンダー
【０５４７】
（安全上の注意事項）
生物学的試料を扱う際には、防護服およびグローブを着用することによって、常に注意すること。この試薬キットの成分は、約０．１％のアジ化ナトリウムを保存料として含有する。アジ化ナトリウムは、酸または金属と混合した場合に有毒かつ危険な化合物である。アジ化ナトリウムを含有する溶液は適切に廃棄するべきである。
【０５４８】
（高感度分析に起因する技術的ヒント）
・実験台およびピペットを、使用前に７０％イソプロパノールでしっかりと拭く。
・バイアルをあける前に、高濃度標準物質および初期の標準希釈物を高速回転させる。
・交差汚染の回避を助けるために、滅菌ピペットチップおよび試薬トレイを用いる。
・高濃度の標準物質を移す際にフィルターチップを用いる。
・標準物質および試料を調製するために９６−ウェル１ｍＬポリプロピレン希釈プレートを用いることが推奨される。
・各標準点の３回の反復試験試料を希釈プレートから移し、その後９６−ウェルＶＥＧＦ分析プレートの中に移すことが推奨される。
・各移し替え（または移動）の前に、チップを２回予め湿らせる（ウェル内で吸引および排出する）。
【０５４９】
（試薬調製）
使用前に全ての試薬を室温に温める。１Ｘ洗浄緩衝液を（１０Ｘ洗浄緩衝液から）下記のように調製する：１０Ｘ洗浄緩衝液の２５ｍＬ瓶を２５０ｍＬ容器に注ぎ入れる；２２５ｍＬの脱イオン水を加える；ゆっくりと反転させることによって十分に混合する。使用前に、回転器を用いて３０分間バイアルを反転させることによってＭＰを再懸濁させ、それによって、バイアルにおいてＭＰを確実に均等に分布させる。
【０５５０】
（分析の準備）
（標準物質−初期標準物質希釈の説明）
バイアルを開ける前に、小型遠心分離器において標準物質バイアルを渦動および高速回転させる。材料の減損、または標本もしくはプレートのエアロゾル汚染を防ぐために、この高濃度標準物質バイアルを開ける際に注意する。ＶＥＧＦ標準物質濃度に関して標準物質分析の証明書を参照する。標準希釈剤でストックを１０ｎｇ／ｍＬに希釈する。
【０５５１】
［検量線］
検量線を作成して、９６−ウェル１ｍｌディープ希釈プレートにおける列にする。１：２の連続希釈を行って、４０００ｐｇ／ｍｌ〜３．９ｐｇ／ｍｌの曲線を得る。標準物質を３回検査する。
【０５５２】
［試料の調製］
使用する直前に、血漿試料を１５，８００ｘｇより大きい遠心力で１０分間遠心分離する。（微）粒子を避けながら注意深くピペットで採取する；脂質層の下をゆっくり吸引する。凍結−解凍サイクルの繰り返しを避ける。移動を容易にするために、試料を９６−ウェルプレートに加える。使用する直前に、溶解物を４℃、４，６００ｘｇで５分間遠心分離するべきである。注意深く上澄みをピペットで取り除く。凍結−解凍サイクルを回避する。溶解物は、分析にかける前に、少なくとも１０倍希釈するべきである。
【０５５３】
［マウスＶＥＧＦ分析手順］
（分析の準備）
キットに含まれる指示毎の試薬調製、およびバルク試薬パッケージの挿入を行う。上述のように検量線を作成し、試料を調製する。
【０５５４】
（ターゲット捕捉）
微粒子（ＭＰ）を再懸濁させた後に、ウェルごとに５０μｌのＶＥＧＦ捕捉試薬を９６−ウェルポリプロピレンプレート（ＰＰＰ）に加える。ウェルごとに１０μｌの標準物質／試料を９６−ウェルＰＰＰにピペットで加える。プレートを最大１００ｘｇでパルス回転（Ｐｕｌｓｅ  ｓｐｉｎ）させて、全ての試料が確実にＭＰ混合物内にあるようにする。プレートを、仮のプレートシール（ＡｘｙＳｅａｌ、ＰＣＲＳＰプレート封止フィルム）または同等物で封止する。室温（ＲＴ）で２時間、培地環境で培養する／振動させる。仮のプレートシールを注意深く除去して跳ね返りを避ける。プレートを磁石（Ｄｙｎａｌ  ＭＰＣ（登録商標）−９６Ｓ）上に設置し、ＭＰを安定させる（全てのＭＰをペレットとして磁石に確実に寄せ集める）ために２分待ち、その後、上澄みを吸引する（ＭＰは目に見えるままである）。ＭＰを固定したままで、２５０μｌの洗浄緩衝液を加える。２分間待ち（ＭＰは寄せ集められたままである）、緩衝液を吸引する。
【０５５５】
（検出）
プレートを磁石から取り外し、２０μｌのＶＥＧＦ検出試薬を各ウェルに加える。プレートを仮のシールで封止する。遠心分離器において最大１００Ｘｇで脈動させる。遠心分離器からプレートを取り出し、室温で２時間培養する／振動させる。プレートシールを除去し、プレートを磁石上に設置する。２分待ち、上澄みを吸引する。２５０μｌの洗浄緩衝液を３回（３Ｘ）加えて除去し、その間ＭＰは磁化／収集される。各緩衝液を加えた後に２分間脈動させる。ＭＰを磁石から浮遊させない又は取り除かない。プレートを磁石から取り外し、２５０μｌの洗浄緩衝液を各ウェルに加える。プレートを１０秒間振動させてＭＰを再懸濁させる。各ウェルの内容物を新しい９６−ウェルＰＰＰに移す。新たな９６−ウェルプレートを磁石上に設置し、ＭＰを寄せ集める／安定させるために２分間待つ。洗浄緩衝液を除去する。プレートを磁石から取り外し、２５０μｌの洗浄緩衝液を加えて１０秒間振動させる。プレートを磁石上に取り付け、２分待ち、その後緩衝液を吸引する。サイクルを繰り返すと、磁化されたＭＰが目に見えるはずである。
【０５５６】
（溶出）
プレートを磁石から取り外し、ウェル毎に２０μｌの溶出緩衝液を加える。プレートを仮のシールで封止し、遠心分離器において最大１００ｘｇで脈動させる。室温で３０分間培養する／振動させる。別々に、３８４−ウェルＰＰＰ分析プレートの上に３８４−ウェルフィルター−プレートを設置し、フィルター−ボトムプレートを作製する。９６−ウェルプレートからシールを取り除き、標本を３８４−ウェルフィルター−ボトムプレートに移す。フィルター−ボトムプレートの上部を仮のプレートシールで覆い、プレートを遠心分離器の中に設置する。室温にて１分間、８５０ｘｇでプレートを回転させる。フィルタープレートを取り外して廃棄し、穴開け可能な（耐久性のある）プレートシール（Ｎｕｎｃ、２３５３０６）を用いて分析プレートを覆う。良好な封止を確保するために、プレートシールローラー（ＶＷＲ  ＃  ６０９４１−１１８）を用いる。完成した分析プレートをＥｒｅｎｎａ免疫測定システムに取り付ける。
【０５５７】
（マウスＶＥＧＦクイック分析ガイド）
１．  全ての試薬、検量線および試料を指示通りに準備する。
２．  ９６−ウェルポリプロピレンプレートの各セルに５０μｌの捕捉試薬を加え、次いで１０μｌの標準物質／試料を加える。
３．  最大１００ｘｇでプレートをパルス回転させて、試料が確実にＭＰ溶液中に存在するようにする。
４．  覆いをし、室温で２時間培養する／振動させる。
５．  覆いを取り除き、プレートを磁石の上に設置し、ＭＰを２分間安定させ／寄せ集め、上澄みを取り除く。
６．  プレートを磁石上に置いた状態で、２５０μｌの洗浄緩衝液を加える。２分間待ち、緩衝液を取り除く。
７．  磁石から取り外し、２０μｌのＶＥＧＦ検出試薬を各ウェルに加える。１０００ＲＰＭでパルス遠心分離する。
８．  覆いをし、室温で２時間培養する／振動させる。
９．  プレートを磁石の上に設置し、ＭＰを寄せ集めるために２分間待つ。上澄みを除去する。
１０．磁石の近くでＭＰを磁気的に寄せ集めながら、２５０μｌの洗浄緩衝液を３回加えて除去する。各サイクルの間に、緩衝液を吸引する前に２分間待つ。
１１．磁石から取り外し、２５０μｌの洗浄緩衝液を加え、１０秒間プレートを振動させて、ＭＰを再懸濁させる。全内容物を新しい９６−ウェルプレートに移す。
１２．プレートを磁石の上に設置し、２分間待つ。上澄みを除去する。
１３．磁石から取り外し、２５０μｌの洗浄緩衝液を加え、１０秒間プレートを振動させる。
１４．工程１１、１２および１３を各々繰り返す。
１５．磁石から取り外し、各ウェルに２０μｌの溶出緩衝液を加える。１００ｘｇでパルス遠心分離する。
１６．覆いをし、室温で３０分間培養する／振動させる。
１７．フィルタープレートを３８４−ウェルプレート（分析プレート）の上に設置する。
１８．９６−ウェルプレートの内容物を、３８４−ウェルフィルタープレート／分析プレートの組み合わせに移す。
１９．フィルタープレートの組み合わせを覆い、１分間８５０ｘｇで遠心分離する。
２０．上部のフィルタープレートを取り外して廃棄する。３８４−ウェルプレートを穴開け可能なプレートシールカバーで覆う。
２１．プレートをＥｒｅｎｎａシステムに取り付ける。
この分析は、様々な種類の血漿および細胞溶解物を検査するのに用いてよい。
【０５５８】
（性能特性）
（通常の検量線）
表３０に示す検量線は、情報を与える目的で提供する。検量線は、分析する試料の各セットに対して作成するべきである。
【０５５９】
【表３４】
0005678045.tif 000035
【０５６０】
［実施例１８  ＶＥＧＦの高感度検出］
血漿中の異なる濃度のＶＥＧＦに関するシステムの感度を表３１に示す。データを図２５Ａにおいて図示する。
【０５６１】
【表３５】
0005678045.tif 000036
【０５６２】
ＶＥＧＦ−Ａ検量線の下端における検出されたＶＥＧＦ−Ａ濃度を表３２に示す。
【０５６３】
【表３６】
0005678045.tif 000037
【０５６４】
このデータは、図２５Ｂに示すグラフに対応する。
【０５６５】
［実施例１９  ＶＥＧＦに関する予測値に対する測定値］
図２６は、ＶＥＧＦに関して予測値に対する測定値を３つの異なる分析形式で示す。異なる固相免疫測定形式を用いた３つのヒトＶＥＧＦ分析に対する標準的な検量線（または較正曲線）を、連続的に希釈した較正試料の共通の組において作成した。ｈＶＥＧＦ  ＭＰをベースとする分析は、固相捕捉形式としての検出抗体、および蛍光ラベリングされた検出抗体で被覆された常磁性微粒子を使用する。ｈＶＥＧＦプレートをベースとする分析は、３８４−ウェルプレートを使用し、ウェルは、固相捕捉形式としての検出抗体、および蛍光ラベリングされた検出抗体で被覆した。ｈＶＥＧＦ  ＨＲＰ−ＥＬＩＳＡ分析は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから商業的に利用可能なＥＬＩＳＡ分析（ＬｏＤ＝３１．２ｐｇ／ｍｌ）であり、これは、９６−ウェル固相捕捉フォーマットからなり、酵素的に共役した検出抗体を使用する。
【０５６６】
［実施例２０  血漿および細胞溶解物の小体積試料中のＶＥＧＦの検出］
健康な患者および乳癌患者からの１０μｌの試料において検出されたヒトＶＥＧＦのレベルを比較した。標準的なＥＬＩＳＡ形式（ＬＯＤ＝３１．２ｐｇ／ｍｌ）に対する、本発明の方法を用いた検出限界（ＬＯＤ）（Ｅｒｒｅｎａ；ＬＯＤ＝３．５ｐｇ／ｍｌ）を示す。ヒト血漿（図２７Ａ）および組織（図２７Ｂ）試料を、Ｅｒｅｎｎａ  ｈＶＥＧＦ−Ａ免疫測定で試験した。（図２７Ａ）ｈＶＥＧＦ−Ａの血中濃度を、健康な血液ドナー（ｎ＝２４）および乳癌の被験体（ｎ＝１５）からの血漿試料において測定した。血漿ＶＥＧＦレベルのメジアンおよび４分位範囲を計算し、健康な血液ドナーと乳癌の被験体との間で比較した。（図２７Ｂ）乳癌の被験体（ｎ＝１０）からの適合された悪性組織生検標本と非悪性（または良性）組織生検標本との、メジアンおよび４分位範囲の比較。組織試料を、手術後に正常または悪性のいずれかとして指定し、結果を、試料当たりの全タンパク質１ｍｇ当たりのＶＥＧＦタンパク質（ｐｇ）で示す。標準的なＥＬＩＳＡ分析を用いた定量は、健康な試料の質の悪い定量を示したが、本発明による血漿試料の定量には、健康な被験体および癌の被験体から試験された全ての試料が含まれた。標準的なＥＬＩＳＡ分析を用いた定量は、健康な試料の質の悪い定量を示すが、血漿における場合と同様に、本発明による組織試料の定量には健康な被験体および癌の被験体から試験された全ての試料が含まれる。
【０５６７】
［実施例２１  組み合わされたアナログおよびデジタルＶＥＧＦ測定］
図２８は、本発明に関する読み出し方法の相関を示す。ｈＶＥＧＦ被分析物に対して検量線を作成し、Ｅｒｅｎｎａシステムを用いて測定した。３つの異なる読み出し方法の各々に対して結果を示す：（ａ）全光子（ＴＰ）、これは標準的なＥＬＩＳＡプレート・リーダー技術に類似している；（ｂ）検出されたイベント（ＤＥ）、これはインタロゲーション・ゾーンを通過する単一分子を別々のイベントとしてカウントする；ならびに（ｃ）全光子および検出されたイベントを組み合わせる処理アルゴリズムの使用。（図２８Ａ）および（図２８Ｂ）平均の２標準偏差を傾きで除したものを用いた各方法（ＤＥおよびＴＰ）の結果を用いて、ＬｏＤを計算した。図２８Ａおよび図２８Ｂにおけるデータを、４つのパラメータの曲線を用いて分析した。線形回帰を用いて図２８Ｃにおけるデータを分析し、得られた方程式および相関統計を示す。
【０５６８】
［実施例２２  Ａβ−４０およびＡβ−４２（アミロイドベータタンパク質４０および４２）分析］
本発明は、Ａβ−４０およびＡβ−４２に関する分析を提供する。試料中のＡβ−４０およびＡβ−４２に関するシステムの詳細を表３３に示す。
【０５６９】
【表３７】
0005678045.tif 000038
【０５７０】
Ａβ−４０およびＡβ−４２の被分析物濃度に関連するシステムによって検出されるイベントを図２９Ａに示す。図２９ＢにＡβ−４２分析の選択性および線形性を示す。
【０５７１】
［実施例２３  インターロイキン１，α（ＩＬ−１α）分析］
ＩＬ−１α検出における、本発明によって提供される分析の感度を表３４に示す。ＬｏＤは通常、約０．１ｐｇ／ｍｌまたはそれより小さい。図３０Ａは、表３４で表されるデータに対応するグラフを示す。
【０５７２】
【表３８】
0005678045.tif 000039
【０５７３】
ＩＬ−１α曲線の下端を表３５に記載し、図３０Ｂにおいてグラフで表す。
【０５７４】
【表３９】
0005678045.tif 000040
【０５７５】
［実施例２４  インターロイキン１β（ＩＬ−１β）分析］
ＩＬ−１βの異なる濃度に関する一の態様の感度を、下記の表３６に示す。ＬｏＤは通常、０．０２ｐｇ／ｍｌまたはそれより少ない。測定された又は計算されたＩＬ−１β濃度に対する、予測された濃度を図３１Ａにおいて図示する。
【０５７６】
【表４０】
0005678045.tif 000041
【０５７７】
下端のＩＬ−１β検量線データを下記の表３７に示す。これらの値を図３１Ｂにおいてグラフで表す。
【０５７８】
【表４１】
0005678045.tif 000042
【０５７９】
［実施例２５  インターロイキン４（ＩＬ−４）分析］
本発明によって提供されるＩＬ−４分析の感度を表３８に示す。計算または測定されたＩＬ−４レベルに対する、予測されたＩＬ−４濃度レベルを図３２Ａに示す。
【０５８０】
【表４２】
0005678045.tif 000043
【０５８１】
ＩＬ−４分析は、２０％より小さいＣＶで、僅か０．０４ｐｇ／ｍｌの血漿ＩＬ−４を定量した。いくつかの態様において、ＬｏＤは０．０４ｐｇ／ｍｌである。表３９は、下端のＩＬ−４検量線データにおいて検出されたＩＬ−４濃度を列挙している。図３２Ｂは、表３９に示されたデータに対応している。
【０５８２】
【表４３】
0005678045.tif 000044
【０５８３】
［実施例２６  インターロイキン６（ＩＬ−６）分析］
本発明によって提供されるＩＬ−６分析の一の態様の感度および確度を表４０に示す。分析によって計算または測定された濃度に対する、予測されたＩＬ−６濃度を、図３３Ａにグラフで示す。
【０５８４】
【表４４】
0005678045.tif 000045
【０５８５】
下端のＩＬ−６検量線データを表４１に示し、図３３Ｂにおいて図示する。
【０５８６】
【表４５】
0005678045.tif 000046
【０５８７】
ＩＬ−６分析は、２０％より小さいＣＶで僅か０．０１ｐｇ／ｍｌの血漿ＩＬ−６を定量する。ＬｏＤは、０．０１ｐｇ／ｍｌまたはそれより小さい。これにより、健康な被験体から得られる０．３６〜１．１７ｐｇ／ｍｌまたはそれより小さい範囲のヒト血漿中のＩＬ−６の正確な定量が可能となる。
【０５８８】
［実施例２７  バイオマーカー分析］
ここで開示される種々のマーカーの検出限界（ＬＯＤ）を本発明によって分析した。分析の結果を表４２および４３に示す。種々のマーカーに対する用途を図４２、４３、４４に示す。
【０５８９】
【表４６】
0005678045.tif 000047
【０５９０】
【表４７】
0005678045.tif 000048
【０５９１】
【表４８】
0005678045.tif 000049
【０５９２】
［実施例２８  循環器系疾患の検出のためのバイオマーカーパネル］
材料および方法：ＣＨＦに罹患している被験体（Ｎ＝３２、４０％女性、７６±１１歳、５６％ＮＹＨＡ  Ｉ／ＩＩ、４４％ＮＹＨＡ  ＩＩＩ）ならびに現在のところ健康な被験体の年齢および性別が適合した対照群（Ｎ＝３２、４０％女性、平均年齢７５±１０歳）からＥＤＴＡ−血漿を収集した。収集したＥＤＴＡ血漿パネルはＰｒｏＭｅｄＤｘから購入した。
【０５９３】
試料は、単一分子計数に基づくＥｒｅｎｎａ（商標）免疫分析システムに関して開発されたタンパク質バイオマーカー免疫分析の幅広いパネルに関して試験した。初期のマルチパネルにおける分析は以下のものを含む：心臓病理学的マーカーであるｃＴｎＩおよびｐｒｏ−ＢＮＰ；血管炎症マーカーであるＶＥＧＦａ；並びに炎症性サイトカインであるＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−１７ｆ、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ。標準的Ｅｒｅｎｎａ免疫分析に対するＳＯＰを以下に説明する。
【０５９４】
試料はＥｒｅｎｎａ機器において読み取られ、検出されたイベント、イベント光子および全光子の値が決定され、試験した全ての試料について、ＳＭＤ  Ｃｕｒｖｅ  Ｆｉｔ，ｖ  ２．０を用いて被分析物濃度がｐｇ／ｍＬ単位で計算された。階層的クラスタリング法は、包含／除外に関するトレーニングセットを開発するために用いられ、得られたパネルを診断特異性に関して評価した。データをデータマトリクスへと配列し、Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｖ  ３．０を用いて階層的クラスタリングを行った。データを対数に変換し、平均に対して集中させ（ｃｅｎｔｅｒｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｍｅａｎ）、規格化した。平均距離を用いてタンパク質セットおよびＥＤＴＡ血漿試料の両方の階層的クラスタリングを行った。初期データセットをトレーニングセットとして使用し、診断特異性が最適化されるまで、連続データセットにおいてクラスタリングを繰り返した。
【０５９５】
得られたパネルは、ＣＨＦ被験者と対照被験体との間の群の比較における個々の有意性に関して、Ｓｔｕｄｅｎｔ  Ｔ検定を用いて更に検査した。群の間で有意な差を有するマーカーを、最終パネルに対して同定した。対照被験体の値の平均＋３標準偏差（９９％ＣＩ）を用いて、各個別のマーカーに対してカットポイントを決定した。カットポイントより上および下のＣＨＦパネルにおける個体の数を、各個別のマーカーに対して決定し、マーカーの診断鋭敏度およびパネルの累積診断鋭敏度を計算するのに使用した。
【０５９６】
Ｅｒｅｎｎａ免疫分析システムの標準的な操作手順は以下の通りである：
【０５９７】
・尿素分析緩衝液を用いて検量線希釈系列を構築し、標準被分析物を用いて実験目的に適した範囲を構築する。
【０５９８】
・微粒子（ＭＰ）を尿素分析緩衝液で希釈して、最適化された最終濃度にする。
【０５９９】
・９６ウェルポリプロピレンプレートにおいて、１００μｌの希釈したＭＰと１００μｌの標準物質または試料とを混合する。
【０６００】
・撹拌しながら２時間培養する。
【０６０１】
・洗浄して、結合していないタンパク質を除去する。
【０６０２】
・ヤギ／マウス／ウサギＩｇＧ＋ＮａＦを含むＴＢＳ／ＢＳＡベースの分析緩衝液で希釈した濾過検出抗体を２０μｌ加える。
【０６０３】
・撹拌しながら１時間培養する。
【０６０４】
・洗浄して、結合していない検出抗体を取り除く。
【０６０５】
・ウェル１つ当たり２０μｌの溶出試薬を加え、撹拌しながら１０分間培養する。
【０６０６】
・３８４ウェルフィルタープレートに移す。
【０６０７】
・  ４μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓが入っている３８４ウェルポリプロピレンプレート中に遠心濾過（ｓｐｉｎ  ｆｉｌｔｅｒ）する。
【０６０８】
・Ｅｒｅｎｎａシステムにおいて読み込む。
【０６０９】
結果：トレーニングセットの階層的クラスタリングにより、年齢および性別が適合した対照被験体と比較して９１％のＣＨＦに対する診断特異性を有する予備マルチマーカーパネルが得られた（図３４）。２つの群の間で著しい差異を示したマーカーのサブセットを更に同定した：ｃＴｎＩ（ｐ＝０．００２５）、ＢＮＰ（ｐ＜０．０００１）、ＩＬ−６（ｐ＜０．０００１）、ＴＮＦ−α（ｐ＜０．０００１）およびＩＬ−１７ａ（ｐ＝０．０１６６）。これらのマーカーを最終パネルに使用し、カットポイントおよび診断特異性を決定した（表４５）。確立されたカットポイントを基準として、個別のマーカーの診断鋭敏度は、パネルの累積鋭敏度（または感度）と比較して低かった。５つのタンパク質バイオマーカー全てをパネルに包含させることにより、９４％の総診断鋭敏度が得られた。更に、多重バイオマーカーは、ＣＨＦパネルにおいて７５％（２４／３２）の被験体に対して増加し（図３５）、このことは、相乗的なバイオマーカーの増加が要因であることを示唆している。
【０６１０】
【表４９】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４】
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【図３５】
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