(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における腫瘍または細胞の亜集団の悪性形質を示す方法であって、
ｉ）対象からの生物学的試料中のＮＡＶ３コピー数変化を決定し；次いで
ｉｉ）対象からの生物学的試料またはもう一つの生物学的試料中のＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲおよびβ−カテニンよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現を決定し；
ｉｉｉ）ＮＡＶ３コピー数変化、ならびにＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲおよびβ−カテニンよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現の双方が、該対象からの試料に存在する場合に、対象の腫瘍または細胞の亜集団の悪性形質を示す
ことを含み、ＮＡＶ３コピー数変化が、ＮＡＶ３遺伝子またはその主要部分の欠失または転座によって引き起こされ、またはＮＡＶ３が不活性化または低発現されることを特徴とする該方法。
【請求項２】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
対象におけるＮＡＶ３コピー数変化を含み、かつＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲおよびβ−カテニンよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および／または遺伝子産物の過剰発現を含み、ＮＡＶ３コピー数変化が、ＮＡＶ３遺伝子またはその主要部分の欠失または転座によって引き起こされ、またはＮＡＶ３が不活性化または低発現される、腫瘍または細胞の亜集団の悪性形質を示すための、ＮＡＶ３遺伝子または遺伝子産物、ならびにＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲおよびβ−カテニンよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および／または遺伝子産物の使用。
【請求項４】
ＮＡＶ３欠失がＮＡＶ３の全体的または部分的な欠失であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１記載の方法または使用。
【請求項５】
ＮＡＶ３コピー数変化が、ＦＩＳＨ、ＬＯＨ、ＣＧＨ、配列解析、免疫組織化学、ＰＣＲ、ｑＰＣＲまたは組織マイクロアレイによって確認されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１記載の方法または使用。
【請求項６】
腫瘍が、直腸結腸腫瘍、脳腫瘍または表皮角化細胞腫瘍であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１記載の方法または使用。
【請求項７】
腫瘍が、良性腫瘍または悪性腫瘍であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１記載の方法または使用。
【請求項８】
腫瘍が癌であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１記載の方法または使用。
【請求項９】
遺伝子および／または遺伝子産物が、活性化、不活性化、過剰発現または低発現するか、または遺伝子産物の量が増加または減少することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１記載の方法または使用。
【請求項１０】
ＮＡＶ３コピー数変化を含み、かつＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲおよびβ−カテニンよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現を含む腫瘍の存在が、リンパ節転移、高度の悪性および／または貧弱な生存に関係することを特徴とする請求項１〜９のいずれか１記載の方法または使用。
【請求項１１】
ＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲおよびβ−カテニンよりなる群から選択される遺伝子が、膜タンパク質、細胞プロセス調節タンパク質またはプリンヌクレオチド結合蛋白質であるタンパク質をコードすることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１記載の方法または使用。
【請求項１２】
遺伝子または遺伝子産物が、ＩＬ２３Ｒおよび／またはＧｎＲＨＲであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１記載の方法または使用。
【請求項１３】
遺伝子産物がタンパク質であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１記載の方法または使用。
【請求項１４】
生物学的試料中のＮＡＶ３コピー数変化を検出するための手段、ならびにＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲおよびβ−カテニンよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現を検出するための手段を含む、診断用キット。
【請求項１５】
腫瘍または細胞の亜集団の悪性形質を示すための請求項１４記載の診断用キット。
【請求項１６】
脳腫瘍が神経膠腫であることを特徴とする請求項６記載の方法または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝学および腫瘍学の分野に関し、腫瘍の検出方法、ならびに患者の処置方法および患者に対する予後の予測方法を提供する。  
【０００２】
詳細には、本発明は、対象における腫瘍または細胞の亜集団の悪性形質を示す方法、予後の予測方法、ＮＡＶ３コピー数変化および特定のリストから選択される少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現を含む腫瘍を有する対象の処置方法、ならびに対象に対する処置の選択方法に関する。また、本発明は、腫瘍または細胞の亜集団の悪性形質を示すための、対象に対する予後を予測するための、対象に対する処置を選択するための、およびＮＡＶ３コピー数変化を含む腫瘍を有する対象における癌治療のための、ＮＡＶ３遺伝子または遺伝子産物および特定のリストから選択される少なくとも１つの遺伝子および／または遺伝子産物の使用に関する。さらにまた、本発明は、対象における癌治療のために特定のリストから選択される少なくとも１つの遺伝子および／または遺伝子産物のアンタゴニスト、抗体または抑制分子の使用に関する。
【０００３】
なお、本発明は、生物学的試料中のＮＡＶ３コピー数変化を検出するための手段、および生物学的試料中の特定のリストから選択される少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発明を検出するための手段を含む診断用キットに関する。また、本発明は、腫瘍または細胞の亜集団の悪性形質を示すための、直腸結腸腫瘍、脳腫瘍または表皮角化細胞腫瘍を持つ患者にに対する予後を予測するための、および直腸結腸腫瘍、脳腫瘍または表皮角化細胞腫瘍を持つ対象に対する処置を選択するための本発明の診断キットの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
癌進行は、染色体不安定性、異数性、ならびに細胞増殖および生存に重要な遺伝子に影響する一連の後天性遺伝子異常の発生により特徴付けられる。単一の遺伝子は、いくつかの決定経路に影響し、正常細胞の癌細胞への転換に導き、癌遺伝子の活性化および腫瘍抑制遺伝子の不活性化を必要とする段階的なプロセスに関与し得る。最近の技術は、癌の発生に導くまれでさえある突然変異の同定を可能とする。
【０００５】
良性前駆体病変の腺腫性ポリープによる結腸直腸癌（ＣＲＣ）発生は、遺伝および後成的な変化の蓄積と共に、多段階の発癌の最もよく知られている例の１つである。また、最近の証拠は、組織微小環境が腫瘍細胞の増殖能および拡散に重要であり(Kim B.G.ら2006, Nature 441: 1015-9; Reuter J.A.ら 2009, Cancer Cell 15: 477-88)、かかる効果は、慢性炎症により駆動され得ることを示唆する。ＣＲＣは炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に関連付けられることが知られている。
【０００６】
結腸直腸癌の圧倒的多数は、２つの主要なゲノム不安定性表現型のうちの１つのマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）または、マイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）とも呼ばれる染色体不安定性（ＣＩＮ）を示す。ＣＲＣの約８５％は、ＭＳＳに関連し、異数性およびヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）を示し、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）またはβ−カテニン突然変異は、この表現型において最も一般的な早期の分子異常である。これらの突然変異は異常なＷｎｔ経路活性化に導き、これは結腸腺腫形成を始めると考えられる。いくつかのシグナル経路は、散発性結腸癌の発生に関与する。かくして、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子の突然変異が存在したとしても、結腸癌を発症するのに数年または数十年間かかる。第２の段階としての癌への腺腫の進行についても、ＫＲＡＳの活性化が必要である(Phelps R.A.ら 2009, Cell 37: 623-34)。また、機能的なＡＰＣの損失が一過性の四倍体性を介してｉｎ ｖｉｖｏにて異数性を誘導することが示され(Caldwell C.M.ら 2007, J Cell Biol 178: 1109-20)、これは、損傷または再配列した染色体を含む細胞の適応度を増強し得る。
【０００７】
発明者らは、染色体１２ｑ２１異常、特に、ニューロンナビゲーター３（ＮＡＶ３）遺伝子の対立形質の損失が、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）(Karenko L.ら 2005, Cancer Res 65: 8101-10; Hahtola Sら 2008, J Invest Dermatology 128: 2304-9; WO2008059112 A1)およびＣＴＣＬ関連肺癌(Hahtola Sら 2008, Genes Chromosomes Cancer 47: 107-17) のいくつかのサブタイプと関連することを従前に示した。より最近では、ＮＡＶ３突然変異またはコピー数変化は、各々、黒色腫(Bleeker F.ら 2008, Human Mutation 29: E451-59)、膵臓癌(Bleeker F.ら 2009, Hum Mutat 30(2): E451-9)、およびヒトグリア芽腫(Nord H.ら 2009, Neuro Oncol Mar20)において報告されている。加えて、ＮＡＶ３は、副腎皮質腺腫(Soon P.H.ら 2009, ERC)と比較して、副腎癌においてかなり差動的に発現（下方制御）した唯一の遺伝子であることが判明した。癌遺伝子景観内では、ＮＡＶ３は、ヒト乳癌および結腸癌において一般的に変化した「ヒル型」候補癌（ＣＡＮ）遺伝子に属する(Wood L.ら 2007, Science 318: 1108-13)。
【０００８】
遺伝子異常によって影響された経路の同定に研究努力を集中し、それにより、疾患を診断するためのおよび個別化された医療に特異的な医薬を設計するためのさらなる手段を提供することは、ますます重要であると考えられる。今や、発明者らは、ＮＡＶ３異常と特定の経路およびそれに関連する遺伝子との驚くべきかつ従前に知られていない相関を見出した。かくして、発明者らは、癌治療のための新規な標的、ならびに癌を診断または追跡するための新規な手段および方法を提供する。
【０００９】
潜在的に高悪性度の腫瘍のより有効でかつ早期の診断を提供するための、ならびに標的化した治療に感受性の腫瘍を同定するための新規なバイオマーカーまたはバイオマーカーの組合せが保証される。本発明は、腫瘍および癌腫進行を予測または同定するための特定の解決方法を提供する。また、本発明は、腫瘍の臨床的攻撃性および患者の生存を評価するための手段を開示する。さらに、本発明は、癌治療の新しい治療標的を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、遺伝学および腫瘍学の分野に関し、腫瘍の検出方法、ならびに患者の処置方法、および患者に対する予後の予測方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
かくして、本発明の目的は、腫瘍の悪性形質を示し、癌を病期分類およびモニタリングする新規な方法および手段を提供することにあり、かかる方法および手段は、その疾患の正確な診断を可能とする。
【００１２】
本発明の他の目的は、患者について腫瘍惹起または腫瘍進行を予測するならびに予後を予測し、癌を有する患者の処置を選択し、癌を有する患者を処置する新規な方法および手段を提供することにある。本発明の方法および手段は、特異的でかつ信頼性があり、それらは、個別化した医療を利用する。この方法および手段は、救命的であり得る良好に標的化された治療介在を可能とする。
【００１３】
本発明のさらにもう一つの目的は、癌の検出ならびに予後評価に有用である新規なバイオマーカーおよびバイオマーカーの組合せを提供することにある。
【００１４】
リンパ節転移および関連する炎症ならびに細胞増殖経路に連結したＮＡＶ３異常の証明は、癌、特に、結腸直腸、脳または表皮角化細胞をモニタリングするため比較的簡単でかつ入手可能な手段を提供するであろう。ＮＡＶ３は、悪性形質転換および／または悪性腫瘍の生物学的挙動に効果を有する他の遺伝子およびシグナル経路の発現を調節する。従って、ＮＡＶ３に影響される経路ならびにその異なる組合せも、抗癌治療設計の目標である。
【００１５】
ＮＡＶ３コピー数変化、特に、ＮＡＶ３欠失は、直接的に初期の発癌に関係し、より正確な診断法や合理的な治療アプローチのための新規な可能性を開く。
【００１６】
本発明は、対象における、腫瘍または細胞の亜集団の悪性形質を示す方法に関し、この方法は、
ｉ）対象からの生物学的試料中のＮＡＶ３コピー数変化を決定し；次いで
ｉｉ）対象からの生物学的試料またはもう一つの生物学的試料中のＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲ、β−カテニン、および表８〜１２に記載のものから選択される少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現を決定し；
ｉｉｉ）ＮＡＶ３コピー数変化、ならびにＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲ、β−カテニン、および表８〜１２に記載のものから選択される少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現の双方が対象からの試料中に存在する場合に、対象における腫瘍または細胞の亜集団の悪性形質を示す
ことを含む。
【００１７】
さらに、本発明は、ＮＡＶ３コピー数変化、ならびにＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲ、β−カテニン、および表８〜１２に記載のものから選択される少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現を含む腫瘍を有する対象の処置方法に関し、該方法は、少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物が過剰発現で影響される工程を含む。
【００１８】
さらに、本発明は、
ｉ）対象からの生物学的試料中のＮＡＶ３コピー数変化を決定し；
ｉｉ）対象からの生物学的試料またはもう一つの生物学的試料中のＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲ、β−カテニン、および表８〜１２に記載のものから選択される少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現を決定し；次いで
ｉｉｉ）その試料中のＮＡＶ３コピー数変化、ならびにＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲ、β−カテニン、および表８〜１２に記載のものから選択される少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現の双方を有する対象に対する予後を予測する
ことを含むことを特徴とする予後の予測方法に関する。
【００１９】
さらに、本発明は、
ｉ）対象からの生物学的試料中のＮＡＶ３コピー数変化を決定し；
ｉｉ）対象からの生物学的試料またはもう一つの生物学的試料中のＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲ、β−カテニン、および表８〜１２に記載されたものから選択される少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現を決定し；次いで
ｉｉｉ）試料中のＮＡＶ３コピー数変化、ならびにＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲ、β−カテニン、および表８〜１２に記載のものから選択される少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現の双方を有する対象に対する処置を選択する
ことを含むことを特徴とする対象に対する処置の選択方法に関する。
【００２０】
さらに、本発明は、対象におけるＮＡＶ３コピー数変化、ならびにＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲ、β−カテニンおよび表８〜１２に記載のものから選択される少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現を含む腫瘍または細胞の亜集団の悪性形質を示すための、ＮＡＶ３遺伝子または遺伝子産物、ならびにＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲ、β−カテニン、および表８〜１２に記載のものから選択される少なくとも１つの遺伝子および／または遺伝子産物の使用に関する。
【００２１】
さらに、本発明は、対象に対する予後を予測するためのＮＡＶ３遺伝子または遺伝子産物、ならびにＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲ、β−カテニンおよび表８〜１２に記載のものから選択される少なくとも１つの遺伝子および／または遺伝子産物の使用に関する。
【００２２】
さらに、本発明は、対象に対する処置を選択するためのＮＡＶ３遺伝子または遺伝子産物、ならびにＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲ、β−カテニンおよび表８〜１２に記載のものから選択される少なくとも１つの遺伝子および／または遺伝子産物の使用に関する。
【００２３】
さらに、本発明は、ＮＡＶ３コピー数変化を含む腫瘍を有する対象における癌治療のためのＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲ、β−カテニンおよび表８〜１２に記載のものから選択される少なくとも１つの遺伝子および／または遺伝子産物の使用に関する。
【００２４】
さらに、本発明は、ＮＡＶ３コピー数変化、ならびにＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲ、β−カテニンおよび表８〜１２に記載のものから選択される少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現を含む腫瘍を有する対象における癌治療のためのＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲ、β−カテニンおよび表８〜１２に記載のものから選択される少なくとも１つの遺伝子および／または遺伝子産物のアンタゴニスト、抗体または抑制分子の使用に関する。
【００２５】
さらに、本発明は、生物学的試料中のＮＡＶ３コピー数変化を検出するための手段、ならびに生物学的試料中のＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲ、β−カテニンおよび表８〜１２に記載のものから選択される少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現を検出するための手段を含む診断用キットに関する。
【００２６】
さらに、本発明は、腫瘍または細胞の亜集団の悪性形質を示すための本発明の診断用キットの使用に関する。
【００２７】
さらに、本発明は、直腸結腸腫瘍、脳腫瘍または表皮角化細胞腫瘍を持つ対象に対する予後を予測するための本発明の診断用キットの使用に関する。
【００２８】
なお、さらに、本発明は、直腸結腸腫瘍、脳腫瘍または表皮角化細胞腫瘍を持つ対象に対する処置を選択するための本発明の診断用キットの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、同一患者からの腺腫および癌腫試料中の第１２染色体の多染色体性およびＮＡＶ３欠失細胞の量を示す。
【図２】図２は、正常な結腸、ＭＳＳおよびＭＳＩ結腸癌、ならびに結腸腺腫試料中のＡ）第１２染色体の多染色体性、Ｂ）ＮＡＶ３増幅およびＣ）ＮＡＶ３欠失を示す。
【図３】図３は、染色体アーム特異的ＭＦＩＳＨによる第１２染色体の転座、またはＹＡＣ−プローブにより観察された欠失に関連するＮＡＶ３の欠失に関連するＢＡＣプローブにより観察された結腸癌細胞系におけるＮＡＶ３異常を示す。
【図４】図４は、アレイＣＧＨによって検出された患者試料中のＮＡＶ３の損失を示す。
【図５】図５は、ＧＯクラスタ系統樹および発現ヒートマップを示す。
【図６】図６は、ＮＡＶ３発現の比較を示す。
【図７】図７は、ＮＡＶ３発現抑制Ａ１７２膠芽腫細胞のＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーションを示す。
【図８】図８は、１０のうち８つのノックダウン実験において上方制御された遺伝子のＧＯクラスタ系統樹および発現ヒートマップを示す。
【図９】図９は、ヒト結腸および結腸直腸癌中のＩＬ２３Ｒおよびβ−カテニンの発現および細胞の局在を示す。
【図１０】図１０は、ＩＬ２３Ｒ免疫反応性についての生存分布のカプラン−マイヤープロットを示す。
【図１１】図１１は、ＮＡＶ３発現抑制０２０５細胞ならびに結腸直腸および神経膠腫組織のＧｎＲＨＲ免疫染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
（図面の簡単な記載）
以下において、本発明は、添付図面を参照して、好ましい具体例によってより詳細に記載される。
【００３１】
図１は、同一患者からの腺腫および癌腫試料中の第１２染色体の多染色体性およびＮＡＶ３欠失細胞の量を示す。
【００３２】
図２は、正常な結腸、ＭＳＳおよびＭＳＩ結腸癌、ならびに結腸腺腫試料中のＡ）第１２染色体の多染色体性、Ｂ）ＮＡＶ３増幅およびＣ）ＮＡＶ３欠失を示す。各黒点は１つの試料を表し、２００の細胞を全試料からカウントした。
【００３３】
図３は、染色体アーム特異的ＭＦＩＳＨによる第１２染色体の転座、またはＹＡＣ−プローブにより観察された欠失についてのＮＡＶ３の欠失に関連するＢＡＣプローブにより観察された結腸癌細胞系におけるＮＡＶ３異常を示す。ａ）一つにおける３コピーの第１２染色体動原体（緑色、Ａｌｅｘａ ４８８）および損失ＮＡＶ３遺伝子（赤色；  ＢＡＣ  ＲＰ１１−３６Ｐ３）を示す細胞系ＳＷ４０３（ＣＬＬ−２３０）の中期。この欠失は、染色体１５ｑ（ｂ；アーム−ＭＦＩＳＨ）から転座した物質を受け取り、２つの全サイズの出現している染色体１５コピー（ｃ、不平衡転座）を伴った染色体において観察された。対応する各ＤＡＰＩ染色は、パネルｄ〜ｆに示される。アーム特異的なＦＩＳＨ（ｇ）によって、染色体１５（赤色および紫色）からの転座は、第１２染色体（緑色およびカルモシン赤色）のｐ−アーム（オレンジ色）に位置し、欠失はｑ−アームに確認された。細胞系ＲＫＯ（ｈ〜ｊ）において、３つの第１２染色体（緑色中の動原体）の２つだけが、ＮＡＶ３遺伝子特異的ＢＡＣ  ＲＰ１１−１３６Ｆ１６プローブシグナル（赤色；ｈ）を示した。第１２染色体（ｉ、ＭＦＩＳＨ）および第２染色体（ｊ、ＭＦＩＳＨ）間の不平衡転座は、ＮＡＶ３遺伝子を消滅させた。Ｔ８４（ＣＬＬ−２４８）細胞は、一つ（オレンジ色、ＢＡＣ  ＲＰ１１−３６Ｐ３）におけるＮＡＶ３シグナルの損失を含むいくつかのコピーの第１２染色体（青色中のｃｅｎ；ｋ）を示した。正常および異常な第１２染色体間のサイズ差は小さかった（ｌ、アーム−ＭＦＩＳＨ）、しかし、ＮＡＶ３遺伝子の近位および遠位に伸びるＹＡＣプローブの８２５Ｆ９（１２Ｓ３２６およびＷＩ−７７７６、パネルｍ中の赤色）および８８５Ｇ４（ＷＩ−６４２９、ＷＩ−９７６０、パネルｎ中の赤色）によって示された欠失が観察された。ＮＡＶ３  特異的シグナル（ＲＰ１１−３６Ｐ３、赤色）は、ｄｅｒ（２）ｔ（２；１２）（ｏ）および正常な第１２染色体（ｑ）において見られたが、それは２つの他の第１２染色体（ｐ〜ｑ；  動原体、緑色）も、ｃｅｎ １２物質（ｑ）を含む微小染色体においても見られなかった。対応する異常な染色体は、正常な染色体、１２,ｔ）と並んだ、アーム−ＭＦＩＳＨ（２；１２）、ｒ）ｄｅｒ（１０）ｔ（１０；１２；３）、ｓ）およびｉ（１２）（ｐ）右、ｔ）によって一般的に観察される。
【００３４】
図４は、アレイＣＧＨによって検出された患者試料中のＮＡＶ３の損失を示す。底部からの視野：ゲノム概観、第１２染色体、遺伝子レベル、ＮＡＶ３プローブは四角形ボックスによってマークされた。
【００３５】
図５は、ＧＯクラスタ系統樹および発現ヒートマップを示す。分析は１６の遺伝子産物に基づく。遺伝子産物当たりのＧＯ注釈付けの中央の数は８である。加えて、２３の遺伝子産物がＧＯ注釈付けを有さず、分析から除外された。色は、遺伝子産物の発現値を表わす。より低い発現値は赤色で、より高い発現は白色で示されている。左の系統樹はＧＯに基づいたクラスタリングに対応するが、頂部の系統樹は、クラスタリングに対する発現値を用いている。
【００３６】
図６は、ＮＡＶ３発現の比較を示す。ＮＡＶ３ ｓｉＲＮＡでのトランスフェクション後のＮＡＶ３ ｍＲＮＡレベルは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ｑ ＲＴＰＣＲおよびＡｇｉｌｅｎｔ４×４４Ｋマイクロアレイによってアッセイした。
【００３７】
図７は、ＮＡＶ３発現抑制Ａ１７２膠芽腫細胞のＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーションを示す。ＮＡＶ３−ＲＮＡは、ＮＡＶ３ ＲＮＡ（紫色）のエクソン３７〜３９を認識するプローブで検出された。発現抑制細胞（ｅ）、非トランスフェクト細胞（ａ）、および対照ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞（ｃ）におけるＮＡＶ３発現。ａ、ｃおよびｅについての５×を超えるプローブを含むセンス対照は、各々、ｂ、ｄおよびｆに示されている。
【００３８】
図８は、１０のうち８つのノックダウン実験において上方制御された遺伝子のＧＯクラスタ系統樹および発現ヒートマップを示す。より低い発現値は赤色で、より高い発現は白色で示されている。ＧＯベースのクラスタ系統樹（左）および発現プロフィール（右）に基づいた系統樹クラスター試料が示される。遺伝子名は右側にあり、各カラムは単一の実験を表わす。１を超える遺伝子を含むＧＯ群は底部〜頂部にある：膜（黒色、９つの遺伝子）、イオン輸送（茶色、２つの遺伝子）、核（緑色、４つの遺伝子）およびリボヌクレオチド結合（青色、２つの遺伝子）。
【００３９】
図９は、ヒト結腸および結腸直腸癌中のＩＬ２３Ｒおよびβ−カテニンの発現および細胞の局在を示す。正常な結腸組織中のＩＬ２３Ｒ（ａ）およびβ−カテニン（ｄ）についての免疫染色の代表的な顕微鏡写真。上方制御されたＩＬ２３Ｒ免疫反応性は、ＮＡＶ３欠失（ｃ、グレード３染色、８％のＮＡＶ３欠失細胞）を含む結腸直腸癌試料中で観察され、一方、ＮＡＶ異常のない癌はＩＬ２３Ｒ染色（ｂ）を示さなかった。双方の試料（ｂおよびｃ）は第１２染色体の多染色体性を含む２０％の腫瘍細胞を有した。ＮＡＶ３欠失を含まないＣＲＣ試料は、正常な膜パターンのβ−カテニン染色（ｅ）を示し、一方、９％の細胞にＮＡＶ３欠失を含むＣＲＣ試料は、β−カテニン（ｆ）の主に強力な核局在を示した。
【００４０】
図１０は、ＩＬ２３Ｒ免疫反応性についての生存分布のカプラン−マイヤープロットを示す。
【００４１】
図１１は、ＮＡＶ３発現抑制０２０５細胞ならびに結腸直腸および神経膠腫組織のＧｎＲＨＲ免疫染色を示す。野生型細胞、（ａ）および対照構築体（ｂ）でトランスフェクトされた細胞に比較したＮＡＶ３発現抑制０２０５細胞中のＧｎＲＨＲの膜染色。ＮＡＶ３欠失を含む２つの結腸直腸癌試料中のＧｎＲＨＲ発現：ＭＳＳタイプＣＲＣを持つ患者（ｅ）、ＭＳＩタイプＣＲＣを持つ患者（ｆ）、正常な結腸直腸の組織対照（ｄ）。５５％のＮＡＶ３欠失細胞（ｈ）および９３％のＮＡＶ３欠失細胞（ｉ）を含む２つの神経膠腫（星状細胞腫）試料ならびに正常なＮＡＶ３コピー数（ｇ）のＧｎＲＨＲ染色。
【００４２】
（本発明の詳細な記載）
発明者らは、ＮＡＶ３コピー数変化がＭＳＳタイプＣＲＣ、結腸腺腫、脳腫瘍、表皮角化細胞、およびいくつかの樹立細胞株に頻繁に見出されることを今や報告する。ＮＡＶ３異常は第１２染色体の多染色体性およびリンパ節関与と関連した。さらに、ＮＡＶ３の特異的なｓｉＲＮＡ遺伝子発現抑制および発現アレイ分析は、ＮＡＶ３につき少なくとも２つの重要な標的分子を明らかにした。
【００４３】
診断法および処置方法、および予後予測方法
本願において列記された、上方制御された遺伝子またはそれらの遺伝子産物の全ては、新規な診断原理の開発に利用できる。ＮＡＶ３コピー数の決定に加えて、少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の発現が本発明の方法において検討される。本明細書に用いた、「遺伝子産物」なる表現は、ｍＲＮＡ、タンパク質、または遺伝子から達成されたいずれかの生成物をいう。本発明の特定の実施例において、遺伝子産物はタンパク質である。
【００４４】
分泌性であるタンパク質について、患者血液中のそれらのレベルの増加をテストする方法を診断法として用いることができる。非分泌性タンパク質について、免疫組織化学は用いるべき最も適当な方法であろう。
【００４５】
診断法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにて行うことができる。本発明の特定の具体例において、方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ方法である。
【００４６】
本発明の特定の具体例において、本発明の診断用キットは、腫瘍または細胞の亜集団の悪性形質を示すためのものである。ＮＡＶ３コピー数変化および／またはいずれかの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現を検出するための手段は、適当なプローブ、プライマーまたは抗体を含み得る。
【００４７】
本発明の特定の具体例において、腫瘍は、直腸結腸腫瘍、脳腫瘍、または表皮角化細胞腫瘍である。
【００４８】
大部分の主要な脳腫瘍は、星状細胞（星状細胞腫）、乏突起膠細胞（乏突起膠腫）または上衣細胞（上衣腫）のごとき膠細胞（神経膠腫）が起源である。また、星状細胞および乏突起膠細胞成分の双方を含む混合形態も存在する。これらは混合神経膠腫またはオリゴ星状細胞腫と呼ばれる。また、混合グリオ−ニューロン腫瘍（ニューロン成分、ならびにグリア成分を示す腫瘍、例えば、神経節膠腫、胚芽異形成性（disembryoplastic）神経上皮腫瘍）、ニューロン細胞が起源である腫瘍（神経節細胞腫、中枢神経節細胞腫）で遭遇し得る。
【００４９】
他の種類の主要な脳腫瘍は、原始神経上皮腫瘍（ＰＮＥＴ、例えば、髄芽腫、髄様上皮腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、上衣芽腫（ependymo-blastoma））、松果体実質の腫瘍（例えば、ピネオサイトーマ、松果体芽腫）、上衣細胞腫瘍、脈絡叢腫瘍、不確定の起源の神経上皮腫瘍（例えば、神経膠腫症、星状芽細胞腫）等を含む。本発明の特定の具体例において、脳腫瘍は神経膠腫（すなわち、膠芽腫）である。
【００５０】
本明細書に用いるとき「腫瘍」なる表現は、異常に過剰な細胞分裂のまたは正常細胞死の欠如による組織の異常な集団をいう。
【００５１】
本発明の特定の具体例において、腫瘍は良性腫瘍または悪性腫瘍、すなわち、癌性腫瘍でないかまたは癌性腫瘍である。「腺腫」なる表現は、非癌性腫瘍をいう。本発明の特定の具体例において、腫瘍は癌である。癌は上皮細胞に由来した悪性腫瘍である。
【００５２】
本発明の方法は、腫瘍の悪性形質を示す。悪性形質とは、悪性腫瘍、すなわち、癌性腫瘍をいう。悪性腫瘍は高悪性であり得、すなわち、急増殖でかつ恐らく転移し得る。いずれの「細胞亜集団」も、限定された細胞集団をいい、悪性形質につき検討できる。細胞亜集団は、組織浸潤性炎症細胞内に位置し得る。
【００５３】
本発明において、生物学的試料は、組織またはリンパ節、またはいずれかの体器官または全血中の転移性腫瘍病変からの生検のごときいずれの適当な組織試料でもあり得る。また、生物学的試料は尿、便または他の身体排泄物であり得る。生物学的試料は、必要ならば、当業者に知られた適当な方法で前処理できる。
【００５４】
また、本発明は、予後の予測に関する。本発明の特定の具体例において、ＮＡＶ３コピー数変化およびＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲ、β−カテニンおよび表８〜１２に記載のものから選択される少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現を含む腫瘍の存在は、リンパ節転移、高グレードの悪性および／または貧弱な生存に関係している。本発明の特定の具体例において、予後は不良である。「予後不良」とは、転移または腫瘍の広がり、最先端技術の治療法に対する無応答性および／または貧弱な生存の高い予期をいう。予測された貧弱な生存の患者において、平均余命は、対応する比較患者群よりも少ない。
【００５５】
臨床的設定において、腫瘍のタイプだけでなく、その腫瘍中に存在する遺伝的、機能的および免疫学的な変化を正確に診断する能力は増強されるにちがいない。次いで、より詳しい治療について、治療分子または抗体の選択は、その特定の腫瘍に適合できる。換言すれば、個別化医薬は、異なる分子を標的とする少なくとも２種の薬物を組み合せて必要とされる。
【００５６】
全体として、本発明は、有効な新規な治療原理および診断法の開発においてさらに用いることができるいくつかの利用できる結果を明らかにする。ＮＡＶ３欠失において上方制御され、悪性形質転換に関与する遺伝子の上方制御の発見は、所与の癌についての合理的な療法を選択するのに用いることができる。
【００５７】
治療の代替物を用いるべきであるという決定、すなわち、処置の選択は、ＮＡＶ３コピー数変化（ＮＡＶ３の発現減少に導くＮＡＶ３遺伝子の欠失）およびＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲ、β−カテニン、表８〜１２に記載のものおよびＩＬ２３／ＩＬ２３ＲならびＧｎＲＨＲ経路から選択された遺伝子または遺伝子産物のいずれか１つの上方制御についての悪性腫瘍のテストに基づいている。
【００５８】
さらに、本発明の特定の具体例において、処置方法は、ＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲ、β−カテニン、および表８〜１２に記載のものから選択された遺伝子または遺伝子産物が、遺伝子または遺伝子産物を低発現または不活性化するか、または遺伝子産物の量を減少させることにより影響される工程を含む。
【００５９】
さらに、本発明の特定の具体例において、処置方法は、ＮＡＶ３の遺伝子または遺伝子産物が影響される工程を含む。
【００６０】
本発明の特定の具体例において、ＮＡＶ３の遺伝子または遺伝子産物は、遺伝子または遺伝子産物を過剰発現または活性化すること、または遺伝子産物の量を増加させることにより影響される。本発明の特定の具体例において、遺伝子または遺伝子産物、すなわち、ＮＡＶ３、ＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲ、β−カテニンおよび表８〜１２に記載のものから選択されたものを活性化、不活性化、過剰発現または低発現させるか、あるいはその遺伝子産物の量を増加または減少させる。本発明の特定の具体例において、少なくともＧｎＲＨおよび／またはＪＡＫ／ＳＴＡＴのシグナル経路が影響される。
【００６１】
いずれの治療分子または分子群も標的遺伝子産物に影響させるために用いることができる。本発明の特定の具体例において、アンタゴニスト、抗体または抑制分子は、少なくとも１つの遺伝子産物に影響させるために用いる。「抑制分子」とは、標的作用を阻害または低下させるいずれかの分子（例えば、抑制性ＲＮＡ小分子または抗体）をいう。本発明の特定の具体例において、抑制分子はｓｉＲＮＡである。膜関連タンパク質の上方制御は、特に注目され、抗体媒介治療は現在広範囲に用いられ、標的分子に対するヒト化標的特異的な治療抗体を一般的に生成させる方法は容易に利用可能である。
【００６２】
処置方法は、従来の薬物の形態であり得、または遺伝子治療として所与され得る。本発明の特定の具体例において、処置方法は遺伝子治療である。
【００６３】
治療において、遺伝子の正常機能の回復を用いることができる。これは、機能的に相同性遺伝子の発現の増強により、無傷の遺伝子の導入により、または増殖性疾患の進行を防止するために遺伝子治療に現在利用可能であるいずれかの技術において遺伝子の改変された形態または遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて達成し得る。特に、腫瘍細胞増殖をかかる治療により減速するか、または停止さえし得る。かかる技術は、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｓｉｔｕ治療方法を含み、前者は、組換えまたはペプチド形態またはアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、またはベクターにおいて無傷または改変された遺伝子（またはその機能的ドメイン）を患者に形質導入またはトランスフェクトすることを含み、後者は、改変された遺伝子またはオリゴヌクレオチドを担体に挿入し、次いで、患者に導入することを含む。処置される疾患に依存して、一過性の治療または永続的な治療を達成し得る。あるいは、標的タンパク質に結合するモノクローナルまたはヒト化抗体またはペプチドを用いて、タンパク質の機能を抑制し、かくして、腫瘍細胞の増殖を減速または停止さえできる。また、標的タンパク質に対する抗体を用いて、細胞毒性物質のごとき他の剤をその遺伝子を過剰発現している癌細胞に運ぶことができる。次いで、かかる剤を用いて、癌細胞を特異的に死滅できる。
【００６４】
処置は、ＮＡＶ３の遺伝子または遺伝子産物および／または本願で列記されたいずれかの遺伝子または遺伝子産物を標的とし得る。しかしながら、また、ＧｎＲＨおよびＪａｋ／スタット経路に沿った、他の遺伝子または遺伝子産物も、治療の標的として用い得る。
【００６５】
アンタゴニスト、抗体または抑制分子のごとき治療分子は、単独または他の剤もしくは組成物と組み合わせて投与し得る。また、いずれかの治療分子に加えて、患者に投与される医薬組成物は、他の治療上有効な剤、医薬上許容される担体、緩衝剤、添加剤、補助剤、防腐剤、充填剤または安定化剤または増粘剤および／または対応する生成物に通常見出されるいずれの成分も含み得る。
【００６６】
医薬組成物は、投与に適した固体、半固体または液体形態のごとき、いずれの形態ともなり得る。薬物の投与は、例えば、経口または吸入投与を介して、または腫瘍内、筋肉内、動脈内または静脈内注射を介して行なうこともできる。
【００６７】
本発明の診断、処置またはいずれかの他の方法または使用のための対象は、ヒトまたは動物である。本発明の特定の具体例において、対象はヒトである。本発明の特定の具体例において、対象は結腸直腸腺腫または結腸直腸癌を有する。本発明のもう一つの特定の具体例において、対象は、直腸結腸腫瘍、脳腫瘍または表皮角化細胞腫瘍を有する。
【００６８】
ＮＡＶ３
ＮＡＶ３（ニューロンナビゲーター３、ＰＯＭＦＩＬ１とも呼ばれる）は、ｃ１２ｑ２１．１に位置したスプライスされた遺伝子（４０エクソン）であり、脳組織、活性化Ｔ細胞、胎盤、結腸、およびある種の癌細胞系において発現される。ＮＡＶ３のアミノ酸配列は、異なる種の中でよく保存され、これは、ＮＡＶ３が細胞プロセスに基本的な役割を演じることを示している。アミノ酸配列相同性は、ＮＡＶ３が細胞シグナリングおよび腫瘍抑制に関与することを示唆する。ＮＡＶ３は、細胞遊走の非常に重要な媒介物質のＣ．Ｅｌｅｇａｎｓのｕｎｃ−５３タンパク質のヒト相同体である。また、ＮＡＶ３相同体のＮＡＶ１およびＮＡＶ２は、細胞内フィラメントに結合し、細胞の伸長および遊走を調節する。
【００６９】
証拠の蓄積は、ＮＡＶ３遺伝子の混乱が癌進行の原因となることを示唆する。ＮＡＶ３転写物発現は、４０％の一次神経芽細胞腫において下方制御される(Coy JFら 2002, Gene 290(1-2):73-94)。また、ＮＡＶ３は、いくつかのサブタイプの皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）において欠失または転座される(Karenko L.ら 2005, Cancer Res 65(18):8101-10; Hahtola S.ら 2008, J Invest Dermatol 128(9):2304-9, Vermeer M.H.ら 2008, Cancer Res 68(8):2689-98)。また、発明者らは、上皮起源の癌におけるＮＡＶ３遺伝子コピー数変化（欠失／増幅）(Hahtola Sら 2008, J Invest Dermatol 128(9):2304-9; Hahtola Sら 2008, Genes Chromosomes Cancer 47(2):107-17; WO 2008059112 (A1))、および結腸直腸癌における対立形質ＮＡＶ３欠失を同定した(Sipila Lら 2008, EJC supplements 6(12) 118)。
【００７０】
本発明の特定の具体例において、ＮＡＶ３コピー数変化は、ＮＡＶ３遺伝子またはその主要部分の欠失、増幅または転座によって引き起こされる。ＮＡＶ３遺伝子のコピー数変化は、一倍体、二倍体および／または倍数体細胞において決定できる。
【００７１】
「欠失」とは、遺伝子のいずれかの断片の不存在をいい、この不存在は、遺伝子の機能に悪影響する。また、「欠失」とは、全体の遺伝子の不存在またはその遺伝子を含む染色体断片の不存在をいう。本発明の特定の具体例において、ＮＡＶ３欠失は、ＮＡＶ３の全体または部分的な欠失である。
【００７２】
「増幅」とは、少なくとも１コピーの遺伝子の存在下でのその遺伝子のいずれかの断片の挿入をいう。また、「増幅」とは、遺伝子を含む全体の遺伝子または染色体断片の増幅をいうこともできる。本発明の特定の具体例において、ＮＡＶ３増幅は、ＮＡＶ３の全体または部分的な増幅である。例えば、遺伝子の増幅は、遺伝子のコピー数変化によって検出される。
【００７３】
「転座」とは、非相同性染色体間の染色体領域の移行をいう。ＮＡＶ３は、部分的に、全体的に、またはＮＡＶ３を含むより大きな染色体の断片の一部として転座し得る。
【００７４】
本発明の方法によれば、遺伝子コピー数変化の存在または不存在は、欠失または増幅を検出するのに適当ないずれかの公知の検出方法によって生物学的試料から検出できる。かかる方法は、当業者によって容易に認識され、多重色蛍光インサイツハイブリダイゼーション、多重蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＭＦＩＳＨ）のごとき蛍光インサイツハイブリダイゼーション、スペクトル核型決定（ＳＫＹ）、総合二値比標識 (ＣＯＢＲＡ)、色変化核型決定（colour changing karyotyping）（ＣＣＫ）を含む。比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）において、遺伝子変化は、ＤＮＡ獲得および損失として分類される。ＣＧＨは、染色体およびサブ染色体のレベルの異常を含む特徴パターンを明らかにする。また、獲得または損失の粗い検出が十分とみなされる場合において、通常のＧ−バンディング技術を用いることができる。望ましい方法は、臨床検査室における使用に適するものである。
【００７５】
いずれかの遺伝子またはＮＡＶ３のコピー数の遺伝子発現を検出するのに適当ないずれかの公知の検出方法、すなわち、遺伝子（またはＤＮＡ）のコピー数の検出に基づいた方法、および／または遺伝子発現生成物（ｍＲＮＡまたはタンパク質）の検出に基づいたものは、本発明の方法に用いることができる。かかる方法は、当業者によって容易に認識され、通常のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ＲＴ−ＰＣＲ、ＦＩＳＨ、ｍＲＮＡインサイツハイブリダイゼーションのごときインサイツハイブリダイゼーション、ｍＲＮＡインサイツハイブリダイゼーション、ノーザン解析、サザンおよびウェスタン解析、免疫組織化学、およびＥＬＩＳＡのごとき他の免疫学的検定を含む。好ましい方法は、ルーチンの臨床検査室に用いるのに適したものである。
【００７６】
また、ＬＯＨ分析は、遺伝子コピー数変化の検出のために利用し得る。本明細書に用いた「ヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）」なる表現は、一部の細胞のゲノムに対する単一の親の寄与の損失をいう。ＬＯＨは腫瘍形成の抑制において役割を演じ得る遺伝子の変異遺伝子を曝露する事象と考えることができる。かくして、ＬＯＨは、腫瘍開始または増悪についての重要なマーカーである。癌におけるＬＯＨは、生殖系ＤＮＡにおける遺伝子座のヘテロ接合性の存在および腫瘍細胞の同一の座のヘテロ接合性の不存在によって同定できる。
【００７７】
本発明の特定の具体例において、ＮＡＶ３コピー数変化は、ＦＩＳＨ、ＬＯＨ、ＣＧＨ、配列解析、免疫組織化学、ＰＣＲ、ｑＰＣＲまたは組織マイクロアレイによって確認される。
【００７８】
遺伝子発現または遺伝子コピー数変化を検出するのに適したマーカーは、標的遺伝子に関連したマイクロサテライトマーカー、ＳＮＰマーカー、いずれかのプローブ、プライマーまたは抗体のごときいずれかの生物学的マーカーを含む。
【００７９】
ＮＡＶ３異常の効果
また、本検討の結果が、ＮＡＶ３の異常が種々の腫瘍および癌において一般的であることを確認する。発明者らは、ＮＡＶ３コピー数変化を探索する３種の異なる方法：ＬＯＨ、アレイ−ＣＧＨおよびＦＩＳＨを用いた。ＦＩＳＨ法を用いて、発明者らは、結腸直腸癌（ＣＲＣ）を持った実質的な数の症例における第１２染色体およびＮＡＶ３遺伝子のコピー数変化で細胞を観察した。また、重要なことには、ＮＡＶ３欠失は、２３％の腺腫試料で検出した。しかしながら、すべての症例での知見は、主として正常な二倍体形質を含む細胞、および可変数の第１２染色体および／またはＮＡＶ３標識を含む異常細胞よりなる腫瘍細胞の異種集団を示した。この設定において、遺伝子の対立形質の欠失または増幅は、例えば、同種腫瘍中の腫瘍抑制遺伝子における変異を含む状況とは異なる。このタイプのコピー数異常が、個々の細胞を分析するＦＩＳＨ法でのみ観察できるが、同じタイプの異常を示すために試料中に細胞の４０％以上を必要とする２種の方法のアレイ−ＣＧＨ、またはＬＯＨではほとんどの場合観察できないことに注目することは重要である。未選択の臨床系の組織試料からの発明者らの知見は、同様の第１２染色体の多染色体性およびＮＡＶ３コピー数変化がＭＳＳタイプの３種のＣＲＣ樹立細胞系、およびＭＳＩタイプの１種の細胞系においても観察されたという事実によって強調される。
【００８０】
明白な癌腫の症例において、ＮＡＶ３異常を持つ症例は、明らかにより多くのリンパ節転移を示した。
【００８１】
本検討では、腺腫性ポリープにおいて、ＮＡＶ３損失は、古典的基準（サイズ、分化）により、引き続いての悪性形質転換のより高いリスクを示した場合に、よりしばしば見られた。
【００８２】
遺伝子発現プロフィールに対するＮＡＶ３下方制御の効果を理解し、かつｉｎ ｖｉｔｒｏでのＮＡＶ３欠失の効果を特徴付けるために、発明者らは、正常な結腸上皮細胞、膠芽腫樹立細胞系、新しく誘導した膠芽腫細胞系およびヒト乳頭腫ウィルス感染を欠いている一次ヒト角化細胞におけるＲＮＡ干渉でＮＡＶ３発現を抑制させた。トランスフェクション後のいくつかの時点の遺伝子発現プロフィールは、アジレント２重色４×４４Ｋマイクロアレイを用いて分析された。このアプローチでは、ＮＡＶ３遺伝子抑制は結腸細胞において３９の遺伝子の一貫した上方制御に導いたが、２８の遺伝子は、膠細胞において上方制御された。これらのうち、ＩＬ２３およびＧｎＲＨの受容体は、ＰａｔｈｗａｙＥｘｐｒｅｓｓ解析が、ＧｎＲＨおよびＪａｋ−Ｓｔａｔシグナル経路がＮＡＶ３により標的とされることを示唆した。すべての細胞系からの結果を組み合わせた場合、ＧｎＲＨＲおよびＩＬ２３Ｒを含めた、４９の遺伝子は、１０の試料のうちの７において、各細胞型中で少なくとも１回上方制御された。結局、性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体（ＧｎＲＨＲ）およびインターロイキン２３受容体（ＩＬ２３Ｒ）を含めた１７の遺伝子が、結腸および膠細胞の８つの実験すべてにおいて上方制御された。
【００８３】
ＮＡＶ３のｓｉＲＮＡ発現抑制は、ｉｎ ｖｉｖｏにて見出された対立形質の欠失を模倣し、かくして、腫瘍形成性ならびに炎症／免疫反応の双方に関与することが知られた２種の受容体分子のＧｎＲＨＲおよびＩＬ２３Ｒの上方制御は、悪性プロセスの開始ならびに悪性細胞の生物学的挙動の決定の双方に潜在的な重要性を有する。
【００８４】
重要なことには、ＭＳＳ腫瘍において、ＩＬ２３Ｒ免疫反応性の上方制御はデューク病期分類（ｐ＜０．００１）およびリンパ節転移（ｐ＜０．００１）と相関したが、核β−カテニンは、リンパ節転移にだけ相関した（ｐ＝０．０４５）。ログランク検定は、上方制御されたＩＬ２３Ｒ免疫反応性を好ましくないマーカーと同定した（ｐ＝０．００９）。
【００８５】
さらに、ＮＡＶ３欠乏は、炎症伝達物質ＩＬ２３Ｒ、バニン３およびＣＹＳＬＴＲ２の上方制御により、組織炎症を腫瘍成長に連結した。かくして、発明者らの知見は、炎症の微小環境において、上方制御されたＩＬ２３Ｒが悪性細胞に増殖の有利さを与えるので、ＮＡＶ３コピー数変化が初期の発癌に直接的に関与することを示唆する。
【００８６】
ＧｎＲＨＲ
ＧｎＲＨＲは、脳下垂体の性腺刺激ホルモン分泌細胞により、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の分泌を刺激するオートクリン性腺刺激ホルモン受容体である(Yeung CMら 2005, Mol Hum Reprod 11(11):837-42）。脳下垂体の性腺刺激ホルモン分泌細胞に加えて、ＧｎＲＨＲは、リンパ球、乳房、卵巣および前立腺細胞の表面上で発現されることが知られている。多数の最近の報告は、ＧｎＲＨ−ＧｎＲＨＲ軸も下垂体細胞外において活性であり、ＧｎＲＨＲの上方制御が、多数の癌、特に、癌腫に観察されたことを示している(Harrison GSら 2004, Endocr Relat Cancer 11(4):725-48)。ＧｎＲＨＲ活性化は、β−カテニンおよびＴ細胞因子（ＴＣＦ）経路に影響する前初期遺伝子（ＩＥ）の活性化に最初に導くと考えられる(Salisbury TBら 2008, Mol Endocrinol 22(6):1295-303)。また、基準Ｗｎｔシグナル経路のメンバーのβ−カテニンは、β−カテニン分解を調節するグリコーゲン合成酵素キナーゼ３の不活性化(Gardner Sら 2009, Neuroendocrinology 89(3):241-51)を介してＧｎＲＨシグナルの変換(Salisbury TBら 2008, Mol Endocrinol 22(6):1295-303)に必須の役割を演じる。他方、いくつかの報告は、β−カテニンの発現レベルの増加が腫瘍のリンパ節転移に影響することを示している(Buhmeida Aら 2008, APMIS 116(1):1-9)。
【００８７】
発明者らの患者の材料において、核β−カテニン発現が、ＮＡＶ３異常と関連し、リンパ節転移と相関することを驚くべきことに見出した。また、ＮＡＶ３で調節された標的分子としてのＧｎＲＨの発明者らの同定は、癌腫予防および治療用の候補経路を表わす。
【００８８】
ＩＬ２３Ｒ
ＩＬ−２３Ｒの同定は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナリングに連結され、炎症促進性の組織微小環境が腫瘍細胞の増殖能および拡散に影響するという発明者らの仮説を支持する。ＩＬ−２３ＲリガンドＩＬ−２３はマクロファージおよび樹状細胞のごとき活性化された炎症細胞によって分泌される。ＩＬ−２３Ｒヘテロ二量体は、ＩＬ−１２受容体・ベータ１（ＩＬ−１２Ｒベータ１）およびＩＬ−２３Ｒ（ＩＬ−１２Ｒベータ２に関連）鎖からなり(Beyer BMら 2008, J Mol Biol 382(4):942-55)；その後者は、ＮＡＶ３発現抑制細胞中で上方制御された。ＪＡＫ２およびＳＴＡＴ３の双方は、ＩＬ−２３Ｒと関連する。ＪＡＫ２はＩＬ−２３に応じて受容体を燐酸化し、活性化ＳＴＡＴ３二量体は、核に移動させ、リガンド依存性にＩＬ−２３Ｒに結合する。また、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路は、上流の遺伝子における突然変異によって活性化され、多数のヒト悪性腫瘍において構成的に活性化されることが示されている(Constantinescu SNら 2008, Trends Biochem Sci 33(3):122-31; Li WX. 2008, Trends Cell Biol 18(11):545-51)。
【００８９】
最近の蓄積する証拠は、ＩＬ−２３が腫瘍細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞反応を炎症促進性エフェクター経路に変え得ることを示唆し、これはそれと戦う代わりに腫瘍を育てる(Langowski JLら 2006, Nature 442(7101):461-5)。結果的に、ＩＬ−２３Ｒを発現する腫瘍細胞は、増殖優位を得、腫瘍特異的Ｔ細胞の存在下でさえ持続するようである。また、ＩＬ−２３Ｒは炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に関連付けられている。初期のクローン病の小児において、ＩＬ１２ｐ４０およびＩＬ２３Ｒ ｍＲＮＡの粘膜レベルは、後期疾病においてよりもかなり高いことが示されている(Kugathasan Sら2007, Gut 56(12):1696-705)。注目すべきことには、ＩＢＤは、ＣＲＣおよび他の癌のリスク増加に関係している(Lakatos PLら 2008, World J Gastroenterol 14(25):3937-47; Hemminki Kら 2008, Int J Cancer 123(6):1417-21)。
【００９０】
癌が始まっている間の組織炎症細胞と上皮細胞との間の情報伝達は、マウスの胃腸管における自発的な上皮癌に導くＴ細胞におけるＳｍａｄ ４依存性シグナリングの損失を介して示された(Kim BGら 2006, Nature 441(7096):1015-9)。Ｓｍａｄ４−／−Ｔ細胞は、ＩＬ２３／ＩＬ−２３Ｒ複合体のようなＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル経路を活性化するＩＬ−６を生成した。また最近、Ｌ−６／ＳＴＡＴ３シグナリングは、大腸炎関連癌のマウスモデルの腫瘍形成に極めて重要な役割を有することが示された(Grivennikov Sら 2009, Cancer Cell 15(2):103-13)。
【００９１】
他の標的遺伝子
ＧＮＲＨＲおよびＩＬ２３Ｒに加えて、発癌に関連付けられる５つの遺伝子（ＡＲＬ１１、ＳＭＲ３Ｂ、ＦＡＭ１０７Ａ、ＭＦＳＤ２およびＢＣＬＢ６）および炎症に関連付けられる２種の遺伝子（ＣＹＳＬＴＲ２およびＶＮＮ３）が、本検討におけるＮＡＶ３発現抑制により上方制御されることが示された。最近、ＭＦＳＤ２を含めたＭＹＣＬ１ ＬＤ領域における多形性は、ＭＦＳＤ２遺伝子は対立遺伝子頻度における人種差を示すが、肺癌生存率に影響することが示された(Spinola Mら 2007, Lung Cancer 55(3):271-7)。最近、大腸炎関連結腸癌マウスモデルにおいて上皮バニン−１が炎症駆動の発癌を制御し(Poyet et al, 2009)、バニン−１およびバニン−３発現レベルの双方が、乾癬皮膚細胞の炎症促進性サイトカインによって増強される(Jansen PAら 2009, J Invest Dermatol Mar 26)ことが示された。この文脈において、乾癬および腹腔の患者群の双方が癌のリスク増加を有することに注目することは興味深い(Grulich AE および Vajdic CM. 2005, Pathology 37(6):409-19)。膜関連タンパク質クラスターおよびそれらの下流標的の上方制御は、特に注目される。
【００９２】
本発明において、少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物は、方法、手段または使用につき選択される。本発明の特定の具体例において、ＩＬ２３Ｒ、ＧｎＲＨＲ、β−カテニンおよび表８〜１２に記載のものから選択される遺伝子は、タンパク質をコードし、このタンパク質は、膜タンパク質、細胞プロセス調節タンパク質またはプリンヌクレオチド結合タンパク質である。本発明の１つの特定の具体例において、遺伝子または遺伝子産物は、ＡＲＬ１１、ＳＭＲ３Ｂ、ＦＡＭ１０７Ａ、ＭＦＳＤ２、ＢＣＬＢ６、ＣＹＳＬＴＲ２、ＶＮＮ３、ＧＮＧＴ１、ＤＮＥＲ、ＧｎＲＨＲ、ＩＬ２３Ｒ、β−カテニン、ＪＡＫ１およびＪＡＫ３よりなる群から選択される。本発明のもう一つの特定の具体例において、遺伝子または遺伝子産物はＩＬ２３Ｒまたは／およびＧｎＲＨＲである。
【００９３】
本発明の１つの特定の具体例において、遺伝子または遺伝子産物の組合せは、少なくともＩＬ２３Ｒ、ＧＮＲＨＲおよびβ−カテニンである。本発明の特定の具体例において、遺伝子または遺伝子産物の組合せはＩＬ２３Ｒ、ＧＮＲＨＲおよびβ−カテニンである。
【００９４】
本発明の１つの特定の具体例において、遺伝子または遺伝子産物の組合せは、表９に記載されたすべての４９の遺伝子または遺伝子産物である。本発明のもう一つの特定の具体例において、遺伝子または遺伝子産物の組合せは、表８に記載されたすべての１７の遺伝子または遺伝子産物である。本発明の１つの特定の具体例において、遺伝子または遺伝子産物の組合せは、表１０に記載されたすべての１４の遺伝子または遺伝子産物である。本発明の１つの特定の具体例において、遺伝子または遺伝子産物の組合せは表１１に記載されたすべての遺伝子または遺伝子産物である。本発明の１つの特定の具体例において、遺伝子または遺伝子産物の組合せは、表１２に記載されたすべての遺伝子または遺伝子産物である。
【００９５】
以下の実施例は本発明のさらなる例示のために与えられる。技術進歩につれて、種々の方法で本発明の概念を実施できることは当業者には明らかであろう。本発明およびその具体例は、下記の実施例に限定されず、特許請求の範囲の範囲内で変更し得る。
【実施例】
【００９６】
実施例１．組織試料、細胞および細胞系
組織試料
直腸結腸腫瘍試料
ミッケリ中央病院にてＣＲＣで手術した５９名の患者から外科的生検試料（６１のＣＲＣおよび１０の腺腫試料）をＦＩＳＨ、ＬＯＨおよび免疫組織化学によって検討した。この検討は、ミッケリ・セントラル病院の倫理審査委員会、および法医学的業務のための国内当局によって承認された。ホルマリン固定のパラフィン包埋組織試料の組織学を経験のある病理学者（ＭＨ）によって確認し、腫瘍、腺腫または正常な粘膜を顕微解剖して、純粋に正常または少なくとも５０％比の癌腫または腺腫組織を得た。標準的なプロトコールに従い、パラフィン包埋切片を５０μｍの厚みに切り、核をＦＩＳＨ分析のために単離し、ＤＮＡをＬＯＨ分析のために精製した(Hyytinen Eら 1994, Cytometry 16: 93-96; Isola J.ら 1994, Am. J. Pathol 145: 1301-1308)。すべての腺腫はＭＳＳであったが、５６の癌のうちの１４は高度のＭＳＩを有した。
【００９７】
５つのジヌクレオチド反復マーカー（Ｄ１２Ｓ１６８４、Ｄ１２Ｓ３２６、Ｄ１２Ｓ１７０８、Ｄ１８Ｓ４７４およびＤ９Ｓ１６７）を補足した、ベセスダの委員会からのモノヌクレオチド反復マーカーＢＡＴ２５およびＢＡＴ２６を用いて、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）ステータスを決定した。少なくとも２つの不安定なマーカーを含む試料は、ＭＳＩを有すると考え、一方、１つの不安定なマーカーを含むかまたは全く含まないものをマイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）とみなした。
【００９８】
以下のパラメーターを統計解析に含めた：腫瘍グレード、デュークによる腫瘍病期分類、および米国癌学会（ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ）によって定義されたＴＮＭ分類による腫瘍病期、リンパ節転移の存在、追跡時間（月）、および臨床結果（生存、他の理由で死亡、または疾患で死亡）。
【００９９】
脳腫瘍試料
ＦＩＳＨアッセイ用試料を１１９例の脳腫瘍症例から調製した。症例は、５５例の星状細胞腫、２０例の乏突起膠腫、１３例の上衣腫、１８例の髄芽腫、および１３例の神経芽細胞腫よりなった。すべての組織試料をルーチンのホルマリン固定によって処理し、パラフィン中に包埋した。
【０１００】
標準的プロトコールに従い、パラフィン包埋切片を５０μｍ厚みに切り、核をＦＩＳＨ分析のために単離した(Hyytinen Eら 1994, Cytometry 16: 93-96; Isola J.ら 1994, Am. J. Pathol 145: 1301-1308)。
【０１０１】
細胞、細胞系、および細胞培養
ＣＲＬ−１５４１およびＣＲＬ−１５３９の正常結腸細胞（ATCC, Manassas, VA, USA)、グレード４膠芽腫に由来した膠芽腫細胞系Ａ１７２、および一次表皮角化細胞（すべてATCC, Manassas, VA, USAから）を３０を超える継代のためにＡＴＣＣにより指示されたように増殖させた。また、結腸直腸癌の細胞系ＣＣＬ−２２８（ＳＷ４８０）、ＣＣＬ−２３０（ＳＷ４０３）、ＣＣＬ−２４８（Ｔ８４）、ＲＫＯ、ＬＩＭ１２１５およびＨＣＡ７(ATCC, Manassas, VA, USA)をＡＴＣＣにより指示されたように増殖させた。ＣＲＣ細胞系の中で、ＲＫＯ、ＬＩＭ１２１５およびＨＣＡ７は、ミスマッチ修復欠損性であり、ＭＳＩを有することが知られている。
【０１０２】
周術期に摘出したグレード４多形態の膠芽腫からの新鮮な細胞を用いて、細胞系０２０５を誘導した。腫瘍組織を機械的に分離し、細胞を血清の添加なくして、栄養素混合物Ｆ１２(Sigma-Aldrich, ST Louis, MO, USA)、ファンギゾン２.５μｇ／μｌ(Apothecon, NJ, USA)、Ｂ２７(Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)、上皮成長因子（ＥＧＦ）２０ｎｇ／ｍｌ(Sigma-Aldrich, ST Louis, VA, USA) 、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）４０ｎｇ／ｍｌ(Sigma-Aldrich, ST Louis, VA, USA)、ペニシリン−ストレプトマイシン１００Ｕ／ｍｌ(Biowhittaker, Verviers, Belgium)およびＧｌｕｔａｍａｘ（１ｘ）(Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を補足したＤＭＥＭ中で培養した。５継代後、クローン細胞集団がバルク調製物から出現し、アリコートを冷凍した。すべての引き続いての実験について、新鮮なアリコートを解凍し、２０継代未満の細胞培養物だけを用いた。神経細胞マーカー（神経膠線維酸性タンパク質および神経細胞クラスベータ−チューブリン）発現を免疫染色により評価した。細胞の回収は、ヘルシンキおよびウーシマー病院地区倫理委員会によって承認され、書面のインフォームドコンセントを患者から得た。
【０１０３】
実施例２．ＦＩＳＨおよびＬＯＨ分析
ＦＩＳＨ（蛍光インサイチューハイブリダイゼーション）
細胞系ＣＲＬ−１５４１、ＣＲＬ−１５３９およびＡ１７２を、従前に記載されたマルチカラーＦＩＳＨを用いてＮＡＶ３コピー数変化につき検討した(Karenko Lら 2005, Cancer Res 65:8101-10)。また、ＦＩＳＨ分析は、０２０５細胞系を確立した腫瘍組織につき行った。
【０１０４】
さらに、ＮＡＶ３特異的ＦＩＳＨアッセイを、患者試料（６１のＣＲＣおよび１０の腺腫）から単離した核、および結腸癌細胞系（ＣＣＬ−２２８、ＣＣＬ−２３０、ＣＣＬ−２４８、ＲＫＯ、ＬＩＭ１２１５およびＨＣＡ７）の中期染色体に行った。ＮＡＶ３  ＤＮＡ（ＲＰ１１−３６Ｐ３およびＲＰ１１−１３６Ｆ１６；Research Genetics Inc., Huntsville, AL, USA）および第１２染色体動原体プローブ（ｐＡ１２Ｈ８；American Type Cell Culture）に特異的なバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）クローンを用い、各々（患者試料）、またはジゴキシゲニンもしくはビオチン（細胞系から分裂中期）と共に、Ａｌｅｘａ５９４−５−ｄＵＴＰおよびＡｌｅｘａ ４８８−５−ｄＵＴＰ(Invitrogen)のいずれかで標識した。プローブ標識のための詳細な方法、ＦＩＳＨアッセイのスライドの調製およびアーム特異的ＭＦＩＳＨの使用を以下に示す。
【０１０５】
また、ＮＡＶ３特異的ＦＩＳＨアッセイを１１９の脳腫瘍症例の試料から単離した核に行った。プローブ標識のための詳細な方法、ＦＩＳＨアッセイのスライドの調製およびアーム特異的ＭＦＩＳＨの使用を以下に示す。
【０１０６】
プローブ標識．患者試料の分析のために、ＮＡＶ３ ＤＮＡに特異的な２種のバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）クローン（ＲＰ１１−３６Ｐ３およびＲＰ１１−１３６Ｆ１６；Research Genetics Inc., Huntsville, AL, USA）および第１２染色体動原体プローブ（ｐＡ１２Ｈ８；American Type Cell Culture）を、ニックトランスレーション法を用いて、各々、Ａｌｅｘａ ５９４−５−ｄＵＴＰおよびＡｌｅｘａ ４８８−５−ｄＵＴＰ（Invitrogen）で標識した。ＢＡＣおよび動原体プローブをヒトＣＯＴ−１ ＤＮＡ（Invitrogen）と一緒に混合し、沈殿させ、ハイブリダイゼーション緩衝液（１５％ｗ／ｖ硫酸デキストラン、２×ＳＳＣ、ｐＨ７．０中の７０％ホルムアミド）で希釈した。
【０１０７】
細胞系の分析のために、ＮＡＶ３特異的ＢＡＣプローブを調製し（前記参照）、ジゴキシゲニンで標識し、動原体１２特異的プローブを調製し、従前に記載されたニックトランスレーション (Karenkoら 2005)により、ビオチンまたはイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）をコンジュゲートしたｄＵＴＰで、あるいは同様にジエチルアミノクマリン−５−ｄＵＴＰ(DEAC, Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Boston, MA, USA)で標識した。
【０１０８】
ＦＩＳＨ法．  核スライドを１Ｍチオシアン酸ナトリウムで＋８０℃で５分間前処理し、２×ＳＳＣで３回洗浄し、５０％グリセロールで処理し、０．１×ＳＳＣで＋９０℃で６分間、２×ＳＳＣで３分間洗浄し、次いで蒸留水で２分間３回洗浄した。スライドをプロテイナーゼＫ(Sigma;２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，２ｍＭ ＣａＣｌ２中の８μｇ／ｍｌ)で＋３７℃で８分間消化した。脱水および風乾後に、プローブ混合物を添加し、スライドを＋８５℃で６分間変性させ、＋３７℃で４８時間ハイブリダイズした。スライドを１．５Ｍ尿素で３回、０．１×ＳＳＣで＋４７℃で１０分間、０．１×ＳＳＣで＋４７℃で１０分間、ＰＢＳで３回、室温にて０．１％ＮＰ−４０で洗浄し、蒸留水で濯ぎ、風乾し、４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ；Vector）を用いてＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ中で開始した。
【０１０９】
患者試料のＦＩＳＨスライドは、６０倍油浸レンズおよび、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５９４およびＤＡＰＩ(Chroma Technology Corp., Brattleboro, VT, USA)の同時検出用のトリプルバンドパスフィルターを備えたオリンパスＢＸ５１顕微鏡(Tokyo, Japan)を用いて評価した。
【０１１０】
通常の中期スライドを、従前に記載されたごとくＦＩＳＨのために調製した(Abdel-Rahman W. M.ら 2001, Proc Natl Acad Sci USA 98: 2538-43)。プローブのハイブリダイゼーション、ならびにジゴキシゲニン標識ＮＡＶ３プローブおよびビオチン標識動原体１２特異的プローブの検出は、従前に記載される(Karenkoら 2005)ごとく、アビジン−ＦＩＴＣ(Vector laboratories, Burlingame, CA, USA)、およびローダミンでコンジュゲートしたヒツジ抗ジゴキシゲニン(Roche, Mannheim, Germany)を用いて行った。アーム特異的なＭＦＩＳＨは、製造者により推奨されるようなＸａＣｙｔｅキット(Metasystems GmbH, Altlusheim, Germany)で行った。ハイブリダイズした中期は、マニュアルまたは、自動捕捉機能(Metafer, Metasystems, Altlussheim, Germany)のいずれかを用いて、落射蛍光顕微鏡(Axioplan Imaging 2, Zeiss, GmbH, Jena, Germany equipped with a CCD-camera)およびＭＦＩＳＨプログラムモジュール(Isis, Metasystems, Altlussheim, Germany)で分析した。
【０１１１】
ＦＩＳＨ結果の評価
患者由来の結腸直腸および脳腫瘍試料からのＦＩＳＨスライドは、２種の独立した分析機器によって、同一性をサンプリングするようにブラインドして分析した。結果は、２００の計数された細胞核の総数中の異常細胞の百分率として示す。２つの第１２染色体シグナルおよび１つだけのＮＡＶ３シグナルを含む細胞、および２を超える第１２染色体シグナルを含むが、より少数のＮＡＶ３シグナル（例えば、３つの第１２染色体動原体シグナルおよび１つのＮＡＶ３シグナル）を含む細胞をＮＡＶ３欠失を含む細胞と解釈した。動原体１２−シグナルより頻繁なＮＡＶ３シグナルを示す細胞は、ＮＡＶ３増幅を含む細胞と解釈した。増幅を示す間期細胞の百分率が７％を超えるか、または欠失を示す間期細胞の百分率が４％を超える（平均＋３標準偏差として通常のサンプル結果の正規分布から計算）ならば、試料は異常なＮＡＶ３であると考えた。細胞系ＣＣＬ−２２８、ＣＣＬ−２３０、ＣＣＬ−２４８、ＲＫＯ、ＬＩＭ１２１５およびＨＣＡ７について、１０〜４７の中期をＮＡＶ３および動原体１２につき分析し、６〜１１の中期をアーム−ＭＦＩＳＨにつき分析した。
【０１１２】
マイクロサテライトマーカーを用いるＮＡＶ３ ＬＯＨ分析および単一ヌクレオチドプライマー伸張ＳｎｕＰＥ
ＮＡＶ３ ＬＯＨアッセイは、従前に記載される (Hahtola Sら 2008, J Invest Dermatology 128: 2304-9)ごとく直腸結腸腫瘍試料で行った。加えて、白人／欧州人において０．４９３までのヘテロ接合性を示すＮＡＶ３遺伝子のエクソン１９内のＡ／Ｇ多形性（ｒｓ１８５２４６４）を、ＳＮｕＰＥ反応に用いた。
【０１１３】
まず、ＤＮＡ試料は、プライマーｒｓ１８５２４６４Ｆ ５’−ＣＣＴＧＣＴＡＴＴＴＴＣＡＴＣＴＴＴＣＡＡＧＣ  ３’（配列番号：１）およびｒｓ１８５２４６４Ｒ  ５’ＧＧＣＴＧＧＧＡＴＧＣＴＧＴＴＴＧＡＧ ３’（配列番号：２）用いてＰＣＲ 増幅して、Ａ／Ｇ多形性を含む１３０の１３０ｂｐ ＰＣＲ断片を得た。引き続いて、ＰＣＲ生成物をエキソヌクレアーゼＩ（１０Ｕ／μｌ）およびＳＡＰ（エビアルカリホスファターゼ、２Ｕ／μｌ） (ExoSAP-IT, Amersham Biosciences)により精製し、ＰＣＲ伸長を蛍光標識伸長プライマーの５’ＧＡＴＧＣＴＧＴＴＴＧＡＧＣＧＣＡＴＣＡＴＧＣＴＧＧＧＣＣＣ ３’（配列番号：３）およびｄｄＣＴＰを含むヌクレオチド混合物を用いて行った。伸長生成物は、ＧまたはＡがテンプレート中に存在するかに依存して、４３ｂｐまたは４９ｂｐであり、それらを分離し、従前に記載される(Hahtolaら 2008, J Invest Dermatology 128: 2304-9)ごとく、結果を分析した。
【０１１４】
試料は、その通常の適合に比較したフランキングマイクロサテライトマーカーにて、ｒｓ１８５２４６４で、またはこのマーカーにつき構成的ホモ接合性の事象において、腫瘍試料中の対立遺伝子のうちの１つが４０％以上のシグナルの現象を有したならば、ＬＯＨを示すとして得点した(Cleton-Jansen A. M.ら 2001, Cancer Res 61: 1171-7)。
【０１１５】
対応するＮＡＶ３異常は、ＦＩＳＨまたはＬＯＨ方法を用いた場合、同一患者に生起された結腸直腸の腺腫および癌に見出される
２症例以外の全てに同一の外科手術にて得られた所与の患者の腺腫および癌の試料間のＮＡＶ３コピー数の比較は、ＮＡＶ３欠失が腺腫段階におけるＦＩＳＨ技術によって頻繁に検出できることも明らかにした（図１）。しかしながら、ＮＡＶ３異常細胞の量は、組織学的悪性病変において常により高かった。同様に、ＬＯＨでの３つの腺腫のうちの２つにおいて、適合する癌は、大抵同様のパターンのＬＯＨを示した。これは、ＮＡＶ３異常を含む細胞を有する組織学的に良性の腺腫は、既に悪性腫瘍の特性を有し得ることを示唆する。
【０１１６】
ＮＡＶ３コピー数変化はＦＩＳＨまたはＬＯＨ方法を用いることによりＣＲＣおよび結腸直腸腺腫に見出される
ＮＡＶ３コピー数変化を含む細胞は、ＭＳＳタイプの結腸直腸の癌腫試料の４０％に検出し；ＮＡＶ３欠失または増幅のいずれかを含む細胞は試料の１５％に検出したが、１５％の試料はＮＡＶ３欠失だけを示し、１０％は単独で低レベルのＮＡＶ３増幅（３〜５コピー）を有した。また、ＮＡＶ３欠失を含む細胞は、ＭＳＩ標本試料の１２．５％および腺腫試料の２３％に検出した。加えて、第１２染色体の多染色体性を含む、最もしばしば、３または５コピーの細胞を、ＭＳＳタイプの結腸直腸の癌腫試料の７０％、ＭＳＩ標本試料の５０％および腺腫試料の３１％に検出した。ＦＩＳＨ結果を図２に示す。
【０１１７】
結腸癌細胞におけるＮＡＶ３コピー数変化をＬＯＨアッセイによって確認した。ＬＯＨは、ＭＳＳ癌の２１％および腺腫試料の１８％に検出した。各マーカーの結果を表１に示す。
【０１１８】
【表１】
0005819728.tif 000002
＊  ＬＯＨ頻度を有益な症例のみにつき計算した。検査した第１２染色体マイクロサテライトによりＬＯＨを示した５つの癌およびすべての腺腫における構成的なホモ接合性により、ＳＮｕＰＥテストは情報価値がなかった。
【０１１９】
ＦＩＳＨで示されたＮＡＶ３コピー数変化または転座は、ＣＲＣ樹立細胞系に見出される
６種の異なるＣＲＣ樹立細胞系（ＣＣＬ−２２８、ＣＣＬ−２３０、ＣＣＬ−２４８、ＲＫＯ、ＬＩＭ１２１５およびＨＣＡ７）および２種の正常な結腸細胞系（ＣＲＬ−１５４１およびＣＲＬ−１５３９）を、ＮＡＶ３特異的ＦＩＳＨで分析した（表２）。正常な結腸細胞ＣＲＬ−１５４１およびＣＲＬ−１５３９は、第１２染色体動原体シグナルに関してＮＡＶ３につき異常シグナルを示さなかったが、ＣＲＬ−１５３９においては、８％の細胞はこれらのシグナル双方に四染色体であった。３種の細胞系（ＳＷ４０３、ＲＫＯ、Ｔ８４）は、ＮＡＶ３の損失を含む中期の注目すべき部分を示した（ＳＷ−４０３およびＴ８４は中期の９０％以上およびＲＫＯは中期の４０％を超える；表２および図３）。近二倍体系ＣＣＬ−２２８は、典型的には、１つの正常な第１２染色体、ＮＡＶ３シグナルの損失を含む２つの染色体異常、およびＮＡＶ３シグナルを含むが第１２染色体動原体シグナルを含まない１つの染色体異常を示した。アームＭＦＩＳＨによってｔ（２；１２）と解釈されたＮＡＶ３のもう一つの染色体への転座は、１つを除いてすべての中期に観察した（表２、図３）。
【０１２０】
【表２】
0005819728.tif 000003
従前に観察したＨＣＡ７中のクローン１２ｑ＋染色体(Abdel-Rahman W.M.ら 2001. Proc Natl Acad Sci USA 98: 2538-43)さえ、本検討におけるＮＡＶ３シグナルを示したので、細胞系ＬＩＭ１２１５（ＭＩＮ）およびＨＣＡ７（ＭＩＮ）は、ＮＡＶ３シグナルと同数の動原体１２を示した（それぞれ、検討した２７／２７および２７／２９の中期）。
【０１２１】
結腸直腸試料のＮＡＶ３異常は、第１２染色体の多染色体性およびリンパ節転移と関連する
結腸直腸試料のＮＡＶ３異常は、統計的有意差を持って、第１２染色体の多染色体性およびおよびリンパ節転移と関連した（表３）。さらに、第１２染色体の多染色体性は、高度の悪性を持った腫瘍において、よりしばしば生じた（表３）。
表３。
【０１２２】
【表３】
0005819728.tif 000004
１）ｎｓ＝統計的に有意でない
２）ＭＳＳ患者群に対して分析した相関性。
２）カイ二乗検定、直接、両側。
３）対数ランクテスト
【０１２３】
ＮＡＶ３遺伝子コピー数変化は脳腫瘍で見出される
５５の星状細胞腫、２０の乏突起膠腫、１３の上衣腫、１８の髄芽腫および１３の神経芽腫の全体で１１９の脳腫瘍ケースを、ＦＩＳＨを用いてＮＡＶ３遺伝子コピー数変化および第１２染色体の多染色体性につき分析した（表４参照）。ＮＡＶ３欠失、ＮＡＶ３増幅および第１２染色体の多染色体性についてのカットオフレベルは、各々、４％、７％および１０％であった。
【０１２４】
ＮＡＶ３の欠失および増幅の双方は、星状細胞腫に検出し；検討症例の２０％（５５のうち１１）はＮＡＶ３欠失および１１％（５５のうち６）は増幅を示した。第１２染色体の多染色体性を、その症例の４５％（５５のうち２５）で観察した。カプラン−マイヤーテストを用いる統計分析はＮＡＶ３増幅の傾向を示し、ＮＡＶ３の欠失または正常なコピー数より疾患のより良好な結果を予測する。
【０１２５】
検討した乏突起膠腫の症例は、３０％（２０のうち６）にＮＡＶ３欠失および１５％（２０のうち３）に増幅を示した。第１２染色体の多染色体性をその症例の４３％（２３のうち１０）に検出した。第１２染色体の多染色体性は、カプラン−マイヤーテストで解析した場合にその疾患のより貧弱な結果を予測するようであった。
【０１２６】
上衣腫は、検討した症例の３１％（１３のうち４）でＮＡＶ３の欠失、５４％（１３のうち７）でＮＡＶ３増幅、および６９％（１３のうち９）で第１２染色体の多染色体性を示した。統計解析は、ＮＡＶ３増幅および第１２染色体の多染色体性がより貧弱な生存を予測することを示した。ＮＡＶ３の欠失は、髄芽腫症例の１１％（１８のうち２）、ＮＡＶ３の増幅は３９％（１８のうち７）、および第１２染色体の多染色体性は６１％（１８のうち１１）で観察された。カプラン−マイヤーテストを用いる統計解析は、ＮＡＶ３欠失がより貧弱な生存を予測することを示し、ＮＡＶ３増幅は、対照的に、ＮＡＶ３の正常なコピー数よりよい良好な見通しを予測した。
【０１２７】
ＮＡＶ３欠失は試験した神経芽細胞腫症例に検出されなかったが、６９％（１３のうち９）はＮＡＶ３増幅を示し、７７％（１３のうち１０）は、第１２染色体の多染色体性を示した。カプラン−マイヤーテストにおいて、ＮＡＶ３増幅および第１２染色体の多染色体性は、より貧弱な生存を予測するようであった。
【０１２８】
【表４】
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【０１２９】
神経膠腫瘍グレード１、２および３を１つのクラスに分類し、ＮＡＶ３異常（表５）に関するグレード４神経膠腫瘍と比較した（表５）。分析は、より良好に区別された、より低いグレード１、２および３が、グレード４の神経膠腫瘍よりも多数のＮＡＶ３増幅を含むことを示した。ＮＡＶ３増幅は、グレード４神経膠腫瘍における５％（３８のうち２）に対して、グレード１、２および３の神経膠腫瘍において２７％（４８のうち１３）で観察した。対照的に、グレード４神経膠腫瘍はグレード１、２および３より多数のＮＡＶ３欠失を含んだ。ＮＡＶ３欠失は、グレード１、２および３腫瘍における１５％（４８のうち７）に対して、グレード４神経膠腫瘍の１８％（３８のうち７）で観察した。
【０１３０】
【表５】
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【０１３１】
実施例３．ＣＧＨ
アレイＣＧＨ
ＤＮＡを標準プロトコールによって５０マイクロメートルのパラフィン包埋組織切片から抽出した。参照ＤＮＡは、４名の健康な男性および女性からフィンランド赤十字にてプールされた血液から抽出した。次いで、製造者(Agilent Technologies, Santa Clara, USA)のプロトコールに従い、消化、標識し、２４４Ｋのオリゴヌクレオチドアレイにハイブリダイズした。試料は、ＤＮＡマイクロアレイスキャナで走査し、Ｆｅａｔｕｒｅ  ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎおよびＣＧＨ解析ソフトウェア(Agilent Technologies, Santa Clara, USA)を用いて解析した。解析は、ｚ−スコアおよび１Ｍｂ遊走平均ウィンドウを用いて行った。＋／−０．４下のＬｏｇ２−値は、異常であると考えられなかった。３種の結腸癌細胞系および２種の結腸癌腫瘍試料をこの方法を用いて用いて解析した。
【０１３２】
選択した症例の患者材料およびＣＧＨ細胞系のアレイ−ＣＧＨ解析
患者材料からの２つの試料および、３種のＣＲＣ樹立細胞系ＣＬＬ−２３０、ＣＬＬ−２４８およびＣＬＬ−２２８に対してアレイ−ＣＧＨ試験を行った。アレイ−ＣＧＨデータは、患者試料のうちの１つにＮＡＶ３座にわたる１２ｑ２１における欠失を示し、それにより、ＦＩＳＨ結果を確認した（この患者試料は、ＦＩＳＨ法によって４１％のＮＡＶ３の欠失細胞を有した）（図４）。しかしながら、他の患者試料は、恐らくその試料中のＮＡＶ３異常細胞の不十分な比例数により、この解析において正常の結果を示した（２８％の細胞は、ＦＩＳＨ分析でＮＡＶ３シグナルの増幅を示す）。培養された癌細胞の中で期待されるように、結腸癌細胞系のアレイ−ＣＧＨ分析は、第１２染色体ならびに他の染色体のＦＩＳＨで明らかにされた主要な改変におけるＮＡＶ３損失を示す。ＣＬＬ−２３０系において、ＮＡＶ３座にわたる広範囲の欠失を１２ｑに検出した。この欠失は他の（２種の）細胞系（ＣＬＬ−２４８およびＣＬＬ−２２８）に検出されず、今度は、その染色体の他の部分の増幅を示した。
【０１３３】
実施例４。
ＲＮＡｉおよび遺伝子発現マイクロアレイ
方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＮＡＶ３−遺伝子発現抑制
ＮＡＶ３遺伝子をプールしたｓｉＲＮＡオリゴ (On-Target SMART pool, Dharmacon, Chicago, IL, USA)で抑制させた。そのオリゴのその具体的な配列は、以下の通りである：５’−ＧＧＡＣＵＵＡＡＣＣＵＡＵＡＵＡＣＵＡ−３’（配列番号：４）（エクソン１２）、５’−ＧＡＧＡＧＧＧＵＣＵＵＣＡＧＡＵＧＵＡ−３’（配列番号：５）（エクソン３８−３９）、５’−ＣＡＧＧＧＡＧＣＣＵＣＵＡＡＵＵＵＡＡ−３’（配列番号：６）（エクソン７）および５’−ＧＣＵＧＵＵＡＧＣＵＣＡＧＡＵＡＵＵＵ−３’（配列番号：７）（エクソン３０−３１）。
【０１３４】
膠芽腫細胞Ａ１７２、一次表皮角化細胞、ならびに正常な結腸細胞系ＣＲＬ−１５４１およびＣＲＬ−１５３９を７０％の密集まで６−ウェルプレートで培養し、その後、Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ１トランスフェクション試薬(Dharmacon)を用いて、２００ｐｍｏｌのＮＡＶ３ ｓｉＲＮＡプールまたは組換え対照ｓｉＲＮＡ(Dharmacon, IL, USA)でトランスフェクトした。膠芽腫細胞０２０５を誘導して、以下の通り前記培養条件を改変することにより接着性単層として増殖させた：ｂＦＧＦおよびＥＧＦを回収し、その培地をトランスフェクション前の４日間に１０％のＦＣＳを補足した。１つの６プレートウェルのトランスフェクションについて、ｓｉＲＮＡを、１００μｌの１×ｓｉＲＮＡ緩衝液（製造者から受け取った）中で１μＭまで希釈し、等量の通常の増殖培地と混合させた。４マイクロリットルのトランスフェクション試薬を１９６μｌの増殖培地と室温にて５分間培養した。ｓｉＲＮＡ希釈を加え、室温で２０分間インキュベートした後、１６００μｌの増殖培地中の細胞に添加した。トランスフェクションの６時間後、トランスフェクション培地を通常の増殖培養液と交換した。細胞の生存率はトリパンブルー染色でトランスフェクションの４８時間後にモニターした。すべての細胞タイプが、７０％以上の生存率を示し、付着細胞だけをＲＮＡ調製に用いた。
【０１３５】
遺伝子発現マイクロアレイ
ＮＡＶ３によって調節された遺伝子を同定するために、ＮＡＶ３標的ＲＮＡｉによって誘導された遺伝子発現プロフィールの変化を、Ａｇｉｌｅｎｔ４×４４Ｋ２重色マイクロアレイおよびオリゴヌクレオチドプローブ(Biochip center, Biomedicum Helsinki, http://www.helsinki.fi/biochipcenter/)で測定した。この分析については、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞からの合計のＲＮＡ試料をトランスフェクションの６、２４および４８時間後に得た（ＣＲＬ１５４１：６および４８時間、ＣＲＬ１５３９：６および２４時間、Ａ１７２：６および４８時間、０２０５：６および４８時間、一次表皮角化細胞（ＰＥＫ）：２４および４８時間）。
【０１３６】
細胞を３５０μｌのＲＬＴ緩衝液(Qiagen)に溶解し、ＲＮＡを（細胞量に依存して）ＲＮｅａｓｙ ＭｉｃｒｏまたはＭｉｎｉキット(Qiagen, Hilden, Germany)で精製し、−７０℃で貯蔵した。ＮＡＶ３発現抑制細胞から得た合計ＲＮＡを組換えオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした同一細胞からの対応する時点の試料とハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション前に、ＲＮＡ試料の品質を２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ(Agilent Technologies)で評価した。
【０１３７】
マイクロアレイ分析
その２種の正常な結腸細胞系ＣＲＬ−１５４１およびＣＲＬ−１５３９からのマイクロアレイデータ、およびＮＡＶ３発現抑制オリゴまたは対照オリゴでトランスフェクトした膠芽腫細胞および一次表皮角化細胞からのデータを分析した。プローブ強度は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ ９．１．３．１を用いるＬＯＷＥＳＳで背景補正し標準化した。各試料について、各試料内の倍変化を計算し、最高発現を含む２００のプローブおよび最低発現を含む２００のプローブが差動的な発現と考えられた。すべての正常な結腸細胞系および腫瘍試料中で一貫して差動的に発現した遺伝子は、ＰａｔｈｗａｙＥｘｐｒｅｓｓ(Draghici S.ら 2007, Genome Res 17(10): 1537-45)を用いて、計算上の経路分析に用いた。この方法において、差動的に発現した遺伝子の発現値を用いて、ＫＥＧＧデータベース[REFE: PMID: 18477636]中の経路を示すためのインパクト・ファクターおよび関連ｐ値を計算し、経路のトポロジーを考慮した。
【０１３８】
この方法では、経路の上流に位置したタンパク質をコードする遺伝子は下流のタンパク質より多数のインパクトを有する。
【０１３９】
加えて、新規なＧｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）ベースのクラスタリング法を用いて、細胞中の共通の生物学的機能または位置を共有する遺伝子集団を明らかにした(Ovaska Kら 2008, BioData Min 1(1):11)。遺伝子間の距離は、ＧＯ注釈付けに基づいたＬｉｎ意味的な類似性尺度 (Lin. Proceedings of the 15th International Conference on Machine Learning 1998: 296-304)を用いて計算する。同様のＧＯ注釈付けを有する遺伝子を相互からのより短い距離を有し、緊密にクラスター化する。これらのクラスターは、発現値と一緒に、ヒートマップおよび系統樹を用いて視覚化する。
【０１４０】
ｑＲＴ−ＰＣＲ
ＩＬ２３ＲおよびＧｎＲＨＲの効率的なＮＡＶ３発現抑制および上方制御をＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ ｑＲＴ−ＰＣＲおよびＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーションによって確認した。
【０１４１】
定量的ＲＴ−ＰＣＲについて、合計ＲＮＡを製造者の指示に従い、Ｒｅｖｅｒｔ Ａｉｄ（商標）Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔで逆転写した。標準曲線を調製するために、Ａ１７２細胞からのｃＤＮＡの系列希釈を調製した。反応は、ＬＣ ４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ１マスターキット(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)を用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（商標）装置で行った。略言すれば、製造者のガイドラインにより、ＤＮＡを９５℃で５分間変性させ、次いで、９５℃、５８℃および７２℃の４５サイクルを各々１０、１５および１０秒間試行させた後、融解曲線分析を行った。バックグラウンドの調整後、従前に記載される (Linja MJら 2004, Clin Cancer Res 10(3):1032-40)ように、フィット点法を用いて、交差点値を決定した。発現レベルの標準化のために、記載される(Linja MJら 2004, Clin Cancer Res 10(3):1032-40)ように、ＴＡＴＡ結合蛋白質（ＴＢＰ）の発現を測定した。相対的発現レベルはＮＡＶ３に対する値をＴＢＰ値で除することにより得た。融解曲線分析に加えて、ＰＣＲ生成物を１．５％アガロースゲル電気泳動によって分離して、正しい生成物サイズを保証した。また、ＩＬ２３ＲおよびＧｎＲＨＲの上方制御をアニーリング温度を６０℃まで増加させるｑＲＴ ＰＣＲにより確認した。反応に用いたすべてのプライマーを表６に列記する。
【０１４２】
【表６】
0005819728.tif 000007
【０１４３】
ＮＡＶ３発現抑制細胞のＮＡＶ３ ＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーション
ＮＡＶ３遺伝子のノックダウン効率を評価するために、発明者らは、細胞系Ａ１７２および０２０５のｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞のＮＡＶ３標的ＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーションを行った。ＮＡＶ３の発現を非トランスフェクト細胞および組換えオリゴでトランスフェクトした細胞と比較した。略言すると、ＮＡＶ３ ｍＲＮＡ転写体をエクソン３７−３９を認識するプローブで検出し、４５℃で一晩ハイブリダイゼーションした。
【０１４４】
ＮＡＶ３ ｍＲＮＡ用のｍＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーション
ＲＮＡプローブの調製
ＲＮＡプローブを以下のオリゴヌクレオチド（エクソン３７−３９：アンチセンス  ５’−ＴＴＧＧＣＴＧＣＴＴＣＴＴＧＧＡＧＴＴＴ−３’（配列番号：１４）、センス  ５’−ＣＡＣＣＡＡＡＴＣＴＡＧＡＧＣＴＧＣＡＴＣＡ−３’（配列番号：１５）を働かせるＮＡＶ３遺伝子の特定のエクソン位置に基づいて生成した。得られたＰＣＲ生成物をｐＣＲ（登録商標）ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Invitrogen）中でクローン化した。ＲＮＡプローブは、製造者の指示に従い、ＤＩＧ ＲＮＡ標識付けキット(SP6/T7, Roche)を用いて標識した。
【０１４５】
固定細胞用インサイチューハイブリダイゼーション
細胞系Ａ１７２および０２０５を無菌スライドガラス(LAB-TEK II chamber Slide w/Cover RS Glass Slide, Nalge Nunc International)上で培養し、４％パラホルムアルデヒド(MERCK)−ＰＢＳで室温にて１５分間固定した。スライドをＰＢＳで濯ぎ、１％のＰＦＡ−ＰＢＳ（７分間および＋４〜８℃）で再固定した後、ＰＢＳで再洗浄した。スライドは、０．１Ｍトリエタノールアミン(TEA, Riedel-de Haan)ｐＨ８．０−０．２５％無水酢酸(MERCK)中でアセチル化し、４×ＳＳＣ−５０％脱イオン化ホルムアミドで予めハイブリダイズした。インサイチューハイブリダイゼーションは、変性ＤＩＧ−ＲＮＡアンチセンスプローブ（４ｎｇ／μｌ）またはセンスプローブ（１９ｎｇ／μｌ）を含有するハイブリダイゼーション溶液を用いて、４５℃にて一晩加湿チャンバーで行った。ハイブリダイゼーション後のスライドを３７℃水浴（１×１０分間、１×５分間の２×ＳＳＣおよび２×５分間の１×ＳＳＣ）で予め暖めた緩衝液で洗浄し、ＲＮＡの過剰を３７℃で３０分間リボヌクレアーゼ（２０μｇ／ｍｌリボヌクレアーゼＡ、Sigma；５００ｍＭ ＮａＣｌ；１０ｍＭトリスｐＨ８．０；１ｍＭ ＥＤＴＡ）で除去した。洗浄後、ハイブリダイズしたプローブをブロッキング溶液中で１：１０００に希釈した抗−ＤＩＧアルカリホスファターゼＦａｂによって免疫学的に検出した。スライドを洗浄し、色基質溶液（０．００２ｍＭ新鮮なレバミソール(Vector Laboratories)を含有する検出緩衝液中の１：５０  ＮＢＴ／ＢＣＩＰ Ｓｔｏｃｋ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ(Roche))と加湿チャンバーで一晩インキュベートした。反応を終了するために、スライドを洗浄し、簡潔に水で濯ぎ、０．１％のＫｅｒｎｃｈｒｏｔ(１×５分間, Gurr, BDH Chemicals)で対比染色した。すべての試薬および機具をピロ炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ）で処理したか、またはＲＮアーゼを含まなかった。
【０１４６】
結果
ＧｎＲＨＲおよびＩＬ２３Ｒの発現の上方制御で生じたＮＡＶ３遺伝子発現抑制
正常な結腸細胞系
ＮＡＶ３のｉｎ ｖｉｖｏ関連標的遺伝子を同定するために、発明者らは、ＮＡＶ３を発現抑制した正常結腸細胞ＣＲＬ−１５４１およびＣＲＬ−１５３９（正常なＮＡＶ遺伝子コピー数を持つ）の遺伝子発現プロフィールを検討した。これらの実験において、発明者らは、ＮＡＶ３を発現抑制した正常結腸細胞中で常に上方制御された３９の遺伝子のうち、発癌に関与する２つのキーとなる受容体の上方制御を同定した。第１に、ＰａｔｈｗａｙＥｘｐｒｅｓｓを用いて、性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体（ＧｎＲＨＲ）経路を統計学的にかなり富化されることを同定し（複合仮説はｐ値＜０．００１で修正した）、この結果は転写変異体１のＧＮＲＨＲの上方制御によって駆動され、４．７〜３２．４の倍変化であった。第２に、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路は、わずかに統計的に有意であることを同定し（修正されたｐ値＜０．０５８）、インターロイキン２３受容体（ＩＬ２３Ｒ）の上方制御によって影響され、３．４〜１４．０１の倍変化であった。これらの受容体の上方制御は、選択された試料中でｑＲＴ−ＰＣＲによって確認された。図５を参照されたし。
【０１４７】
細胞系および組織試料
マルチカラーＦＩＳＨを用いて、ＮＡＶ３シグナル数を動原体１２シグナル数と比較し、その後、細胞を通常、増幅または欠失したＮＡＶ３シグナルのいずれを有するかを規定した。検討した細胞系ＣＲＬ−１５４１、ＣＲＬ−１５３９、０２０５およびＡ１７２は、ＮＡＶ３異常のない細胞より主になることを示し（表７）、従って、ＮＡＶ３発現抑制検討のために適当であった。ＮＡＶ３の効率的な発現抑制は、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーションによって確認した（図６および７）。また、Ａｇｉｌｅｎｔ４×４４ｋマイクロアレイ上に存在するＮＡＶ３用の双方のプローブを０．２６の中央倍変化で過小発現し、これは、ＮＡＶ３発現抑制が有効であることを示す。全方法は、すべての検討時点で、すべての細胞タイプにおけるＮＡＶ３の一貫した下方制御を示した。
【０１４８】
【表７】
0005819728.tif 000008
【０１４９】
すべてのＮＡＶ３発現抑制ＣＲＬ−１５４１およびＣＲＬ−１５３９の正常な結腸細胞、グレード４膠芽腫に由来した膠芽腫細胞系Ａ１７２、および一次表皮角化細胞(すべてはATCC, Manassas, VA, USAからのもの) の遺伝子発現プロフィールを評価した場合、発明者らはすべての実験において上方制御された１７の遺伝子を同定した（表８）。これらのうち、発癌に関与する２つのキーとなる受容体の上方制御が注目された。第１には、ＰａｔｈｗａｙＥｘｐｒｅｓｓを用いて、性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体（ＧｎＲＨＲ）経路を統計的にかなり富化されることを同定した（複合仮説はｐ値＜０．００１に修正した）。この結果は、１３．７の中央倍変化を有したＧＮＲＨＲ転写変異体１の上方制御によって駆動した。第２には、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路は、インターロイキン２３受容体（ＩＬ２３Ｒ）の上方制御によってわずかに統計的に有意に改変されることを同定し（修正されたｐ値＜０．０５８）、これは、７．２の中央倍変化を有した。これらの受容体の上方制御は、選択された試料中でｑＲＴ−ＰＣＲによって確認した。また、発明者らは、分析おいて、ＮＡＶ３発現抑制した一次ヒト角化細胞（ＰＥＫ）の遺伝子発現プロフィールを含むことを決定した。次いで、発明者らは、３種の細胞タイプのすべてで行った１０の実験のうちの７つに上方制御されたＧｎＲＨＲおよびＩＬ２３Ｒを含む５２の遺伝子を同定した（表９）。
【０１５０】
【表８】
0005819728.tif 000009
【０１５１】
【表９−１】
0005819728.tif 000010
【表９−２】
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【０１５２】
ＮＡＶ３調節遺伝子の遺伝子オントロジー分析
遺伝子オントロジーベースのクラスタリングをＮＡＶ３欠乏により影響された生物学的プロセスを同定するために行った。ＧＯ分析用遺伝子数を増加させるために、発明者らは、１０の実験のうちの７つに上方制御された５２の遺伝子に対してクラスタリングを行った。この群から、発明者らは４つのＧＯクラスター（図８）：膜（９の遺伝子）、イオン輸送（２つの遺伝子）、核（４つの遺伝子）およびリボヌクレオチド結合（２つの遺伝子）を同定した。リボヌクレオチド結合クラスターは、２つの遺伝子：グリセロールキナーゼおよびＡＲＬ１１を含んだ。グリセロールキナーゼは、グリセロールの摂取および代謝の調節におけるキー酵素であるが、ＡＲＬ１１（またはＡＲＬＴＳ１）は、ヒト発癌における改変された多数の調節経路に関与することが知られた小さなＧＴＰアーゼのＲａｓーのスーパーファミリーのＡＲＦファミリーに属する。
【０１５３】
遺伝子産物は、それらの遺伝子オントロジー（ＧＯ）注釈付けに基づいて、クラスター化（グループ化）する。同様の注釈付けを有する遺伝子は同一クラスターに属する。遺伝子産物間の距離は、情報理論的な意味的類似性尺度を用いて定義する。
【０１５４】
以下の表１０において、各クラスターの最も有益な（最も具体的な）共通のＧＯ用語を示す。クラスター中のすべての遺伝子産物を記載したＧＯ用語で注釈付けする。ＧＯ用語は、それがまれにしか全ゲノムのＧＯ注釈付けにおいて生じないならば、より有益である。演繹的カラムは、ランダム遺伝子産物が所与のＧＯ用語で注釈付けされる演繹的確率ｐを含む。情報はｌｏｇ２ｐと定義される。一般的には、（１）多数の遺伝子産物および（２）高い情報量を含む共通のＧＯ用語が最も注目される。
【０１５５】
【表１０】
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クラスターメンバー
G1 GAL3ST1 GK RDHE2 CECR1
G2 AQP10 ENST00000327625 CLCA3
G3 GNRHR OPRK1 DNER IL23R FLJ33641
G4 BCL6B FAM107A
【０１５６】
従前に言及した膜クラスター遺伝子ＩＬ２３ＲおよびＧｎＲＨＲに加えて、膜クラスター中の他の遺伝子（図８）は、ＧＮＧＴ１、ＣＹＳＬＴＲ２およびＳＭＲ３Ｂを含んだ。ＧＮＧＴ１は、主として桿状体外節で見出されたトランスデューシンのガンマサブユニットをコードする。ＣＹＳＬＴＲ２は、炎症プロセスの病原論に関与する細胞輸送および自然免疫反応の重要な媒介物質であるシステイニルロイコトリエンに属する。ＩＦＮガンマは、ＣｙｓＬＴＲ２発現を誘導し、ＣｙｓＬＴ誘導炎症反応を増強する。ＳＭＲ３Ｂ（顎下腺アンドロゲン調節タンパク質３Ｂ）は、候補腫瘍関連遺伝子である。
【０１５７】
核クラスターは、ＴＵ３Ａとも呼ばれるＦＡＭ１０７Ａ遺伝子を含み、それを種々の癌において後成的に発現抑制させることが報告されている。加えて、発明者らは、膠細胞系誘導の神経栄養因子によって上方制御される転写因子−コーディング遺伝子のＢＣＬＢ６遺伝子を同定した。各クラスターにおける遺伝子の完全なリストを図８に与える。また、炎症にリンクした注目すべき他の遺伝子は、分泌または膜関連エクト酵素のバニンファミリーのメンバーのバニン３を含めて、上方制御された遺伝子中で見出された。最近、バニン１およびバニン３は、炎症促進性活性を有することが示された。
【０１５８】
結腸および神経膠腫の細胞が特定の群として処理される場合、発明者らはＮＡＶ３発現抑制の正常結腸細胞における一貫して上方制御された３９の遺伝子、および膠細胞中で上方制御された２８の遺伝子を同定した（表１１および１２）。ＤＮＥＲは、細胞外ＥＧＦ様の繰り返しおよび異型Ｎｏｔｃｈリガンドを運ぶ膜貫通型タンパク質であり、それはＮＡＶ３発現抑制結腸細胞のみにおいて上方制御された（表１１）。
【０１５９】
【表１１−１】
0005819728.tif 000013
【表１１−２】
0005819728.tif 000014
【０１６０】
【表１２−１】
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【表１２−２】
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【０１６１】
実施例５．免疫組織化学
組織試料におけるＩＬ２３Ｒおよびβ−カテニン免疫組織化学
ＩＬ２３Ｒおよびβ−カテニン発現は、パラフィン包埋大腸生検法から調製した組織マイクロアレイ中の免疫組織化学により検討した。各患者から、組織学的に正常な結腸からの対での試料およびその結腸腫瘍からの２つの試料を、そのアレイに含めた。また、１０名の患者からの腺腫様の病変の対での試料および正常結腸からのもう一つの試料を含んだ。全体で５７名の患者の４３のＭＳＳ腫瘍試料、１４のＭＳＩ腫瘍試料、１４の腺腫試料および５７の対応する正常結腸試料を組織マイクロアレイに含めた。
【０１６２】
免疫組織化学は、色素形成基質としてのＤＡＢおよびアメリカおよび対比染色としてのマイヤーのヘマトキシリンと一緒に、アビジン・ビオチン・ペルオキシダーゼの複合体技術(Vectastain Elite ABC kit [mouse IgG], Vector laboratories, Burlingame, CA, USA)を用いて実行した。標準的脱パラフィン後、内因性ペルオキシダーゼ活性をＰＢＳ中の３％ Ｈ２Ｏ２において１０分間ブロックし、切片をクエン酸塩緩衝液(DakoCytomation, Glostrup, Denmark)中で＋９５℃水浴中で２０分間前処理した。次いで、スライドをＩＬ２３Ｒ（R&D MAB14001；１：３０で希釈、１％トリプシンで３７℃にて３０分間前処理したスライド）に対する、またはβ−カテニン(Zymed CAT-5H10, Invitrogen, Carlsbad, CA 92008 U.S.A;１：２５０で希釈、DAKO Target Retrieval Solution S1699, ｐＨ６〜６．２中で＋９５℃にて３０分間のスライド前処理)に対するマウスモノクローナル抗体と＋４℃にて一晩インキュベートした。ＤＡＢをＩＬ２３Ｒのための発色基質として用い、一方、ＶＥＣＴＯＲ ＮｏｖａＲＥＤ基質キットＳＫ−４８００をβ−カテニンに用いた。
【０１６３】
統計解析については、免疫標識結果を以下のようにスコアした：ＩＬ２３Ｒ免疫反応性について、染色なし（スコア０）、弱陽性染色（スコア１）、明確な陽性染色（スコア２）、強陽性染色（スコア３；実施例については、図９も参照）、β−カテニンについて、染色なし（スコア１）、細胞膜染色（スコア１）、細胞質染色（スコア２）、大多数の腫瘍細胞における核染色（スコア３；図９も参照）。
【０１６４】
統計解析
カテゴリー変数間の相関をカイ二乗検定または、有効でない場合には、フィッシャーの直接確率法を用いて解析した。生存率分析は、主要終点として結腸癌によって引き起こされた死亡を用いて行った。追跡調査時間は、政府系機関のフィンランド統計局から得た。ＳＰＳＳバージョン１５．０ソフトウェア(SPSS, IL, USA)を用いた。
【０１６５】
ＮＡＶ３異常ＭＳＳ腫瘍中のＩＬ２３Ｒまたは核β−カテニンの発現は、デューク病期分類およびリンパ節転移と関連し、ＩＬ２３Ｒの発現は予後不良と関連する
次いで、β−カテニン（ＧｎＲＨ経路に連結した）およびＩＬ２３Ｒ発現の免疫組織化学的検出は、４３のＭＳＳ（同一患者の８の腺腫試料を含む）および１４のＭＳＩ患者試料（腫瘍および対応する正常結腸上皮）を含む組織マイクロアレイで行った。これらのケースのすべての正常結腸試料において、β−カテニン染色は常に膜性であり、３つのケース（図９）を除いて、全くＩＬ２３Ｒ発現が見出されないか、または弱いＩＬ２３Ｒ発現（グレード１）だけが見出された。
【０１６６】
正常な上皮細胞において、β−カテニンは細胞膜に位置するが、癌腫試料中の核および細胞質へのその分布を変更することが知られている。代表的なＭＳＳ腫瘍試料（各二連試料）において、核β−カテニンは１０／４３のケースに、およびＩＬ２３Ｒ免疫反応性（スコア２〜３）の上方制御は２７／４３のケースで見出された。核β−カテニン発現はリンパ節転移と相関した。組織アレイ試料中の上方制御されたＩＬ２３Ｒ免疫反応性は、デューク病期分類（実施例２の表３参照、ＮＡＶ３異常は第１２染色体の多染色体性、そしてリンパ節転移と関連する）、およびさらにリンパ節転移（実施例２の表３参照）と強く相関した。対立形質のＮＡＶ３欠失を持つ腫瘍試料は、最も頻繁に明らかに上方制御されたＩＬ２３Ｒ反応性を示した（図９）。
【０１６７】
カプラン−マイヤー生存率分析（図１０）において、上方制御されたＩＬ−２３Ｒ免疫反応性（スコア２および３）を持つ患者は、通常または低発現レベルの患者より悪い予後を有することが判明した（すなわち、各々、０または１とスコアされた免疫組織学的染色強度、および正常な結腸試料のそれに匹敵する）（実施例２の表３参照）。低ＩＬ２３Ｒ発現を有する患者についての平均生存時間は４４か月（９５％ＣＩ ３８〜５０か月）であり、一方、上方制御された高発現を持った患者については、平均生存はわずか２３か月（９５％ＣＩ １３〜３３か月）であった。
【０１６８】
１１名のＭＳＳタイプＣＲＣ患者について、その腺腫および腫瘍の試料中のＩＬ２３Ｒ、β−カテニンおよびＮＡＶ３ ＦＩＳＨ結果を比較することは可能であった。高いＩＬ２３Ｒ発現（中程度または強い免疫染色）および／または核β−カテニンと一緒のＮＡＶ３コピー数変化は腺腫試料のうちの３つに存在し、ＩＬ２３Ｒ発現の上昇単独が、２つのさらなる腺腫に存在した（データを示さず）。対応する腫瘍試料において、ＮＡＶ３異常が上方制御されたＩＬ２３Ｒ発現にも拘らず見出されなかった２つの試料を除いてその知見は類似した。これらの後者の双方において、しかしながら、対応する腺腫病変は第１２染色体の多染色体性を示した。
【０１６９】
組織試料におけるＩＬ２３ＲおよびＧｎＲＨＲの免疫組織化学
ＧｎＲＨＲ免疫染色は、９００ワットにて２４分間の電子レンジ中で、室温にて２０分間の冷却し、ｐＨ９．０のトリス−ＥＤＴＡ緩衝液を用いて抗原検索後にＬａｂＶｉｓｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｅｒ(Labvision, CA, USA)を行った。ＧｎＲＨＲは、クロモゲン（図１１）としてジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を含む、マウスモノクローナル抗体（１：１０希釈, Abcam, Cambridge, UK）およびポリマーベースの検出システム(Envision, K5007, DakoCytomation)を用いて検出した（図１１）。
【０１７０】
結腸直腸癌または星状細胞腫の患者のパラフィン包埋大腸生検法から調製された、結腸直腸の組織切片の代表的な２つのケース（組織学的に正常な結腸および結腸腫瘍の対での試料）および星状細胞腫（膠芽腫）の２つのケースを含めた。これらの試料については、抗ＧｎＲＨＲ抗体およびＩＬ２３Ｒに対するマウスモノクローナル抗体（R&D MAB14001；  １：３０希釈、３７℃での３０分間の１％トリプシンで前処理されたスライド）、ならびに色素形成基質としてのＤＡＢでのアビジン・ビオチン・ペルオキシダーゼの複合体検出(Vectastain Elite ABC kit [mouse IgG], Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)を用いて、従前に記載されたように、免疫組織化学を実行した。
【０１７１】
ＮＡＶ３発現抑制０２０５細胞、ＣＲＣおよび膠芽腫組織試料におけるＩＬ２３およびＧｎＲＨＲタンパク質上方制御の確認
ＮＡＶ３発現抑制０２０５細胞中のＧｎＲＨＲタンパク質レベルの上方制御を免疫染色により示した。ＧｎＲＨＲ染色は野性型細胞およびｓｉＲＮＡ組み換え対照トランスフェクト細胞よりＮＡＶ３発現抑制細胞においてより高かった（図１１、ａ〜ｃ）。また、ＣＲＣ組織試料中のＧｎＲＨＲタンパク質免疫染色は正常な結腸上皮（図１１ｄ）においてよりも高かった。結果は、２つの典型的なＣＲＣ患者試料、ＭＳＳタイプＣＲＣを持つ１つの症例、および腫瘍（ＮＡＶ３欠失についてのカットオフは、早期に報告したごとく正常な参照試料において３％である、図１１ｅ）におけるＮＡＶ３欠失細胞の４１％、ＭＳＩタイプＣＲＣの１つの症例、および腫瘍（図１１ｆ）中のＮＡＶ３欠失細胞の８％（図１１ｆ）において再現可能であった。同様に、ＧＮＲＨＲおよびＩＬ２３Ｒの上方制御は、欠失のない神経膠腫瘍と比較して、ＮＡＶ３欠失を示す予備的な一連の膠芽腫（星状細胞腫）試料中で観察した（図１１ｇおよびｈ）。
【図１】
0005819728.tif 000017
【図２】
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【図３ａ）】
0005819728.tif 000019
【図３ｂ）】
0005819728.tif 000020
【図３ｃ）】
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【図３ｄ）】
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【図３ｅ）】
0005819728.tif 000023
【図３ｆ）】
0005819728.tif 000024
【図３ｇ）】
0005819728.tif 000025
【図３ｈ）】
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【図３ｉ）】
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【図３ｊ）】
0005819728.tif 000028
【図３ｋ）】
0005819728.tif 000029
【図３ｌ）】
0005819728.tif 000030
【図３ｍ）】
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【図３ｎ）】
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【図３ｏ）】
0005819728.tif 000033
【図３ｐ）】
0005819728.tif 000034
【図３ｑ）】
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【図３ｒ）】
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【図３ｓ）】
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【図３ｔ）】
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【図４】
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【図５】
0005819728.tif 000040
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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