(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉのインスリンアナログ
【化１】
0005695909.tif 000021
（式中、
A−1は、Lys、Arg又はアミノ基に対応し；
A0は、Lys、Arg又は化学結合に対応し；
A1は、Arg又はGlyに対応し；
A5は、Asp、Glu又はGlnに対応し；
A15は、Asp、Glu又はGlnに対応し；
A18は、Asp、Glu又はAsnに対応し；
A21は、Ala、Ser、Thr又はGlyに対応し；
B−1は、Asp、Glu又はアミノ基に対応し；
B0は、Asp、Glu又は化学結合に対応し；
B1は、Asp、Glu、Phe又は化学結合に対応し；
B3は、Asp、Glu又はAsnに対応し；
B4は、Asp、Glu又はGlnに対応し；
B29は、Arg、Lys又はアミノ酸Phe、Ala、Thr、Ser、Val、Leu、Glu及びAspからなる群より選択されるアミノ酸、又は化学結合に対応し；
B30は、Thr又は化学結合に対応し；
B31は、Arg、Lys又は化学結合に対応し；
B32は、Arg−アミド又はLys−アミドに対応し、
ここで、A5、A15、A18、B−1、B0、B1、B2、B3及びB4からなる群より選択される１つかそれ以下のアミノ酸残基がAsp又はGluに対応する）。
【請求項２】
A−1がArgに対応する、請求項１に記載のインスリンアナログ。
【請求項３】
A0がArgに対応する、請求項１または２に記載のインスリンアナログ。
【請求項４】
A5がGluに対応する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のインスリンアナログ。
【請求項５】
A15がGluに対応する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のインスリンアナログ。
【請求項６】
A18がAspに対応する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のインスリンアナログ。
【請求項７】
A8がHisに対応する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のインスリンアナログ。
【請求項８】
A21がGlyに対応する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のインスリンアナログ。
【請求項９】
B0がGluに対応する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のインスリンアナログ。
【請求項１０】
B3がAspに対応する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のインスリンアナログ。
【請求項１１】
B4がGluに対応する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のインスリンアナログ。
【請求項１２】
B30がArgに対応する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のインスリンアナログ。
【請求項１３】
B30がLysに対応する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のインスリンアナログ。
【請求項１４】
以下からなる群より選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のインスリンアナログ：
Arg (A−1), Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)−NH2 ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)−NH2 ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)−NH2 ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)−NH2 ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)−NH2 ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)−NH2 ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B30)−NH2 ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Lys (B30)−NH2 ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B30)−NH2 ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Lys (B30)−NH2 ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B30)−NH2 ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Lys (B30)−NH2 ヒトインスリン、
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), Arg (A1), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), Arg (A1), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)−NH2−ヒトインスリン、及び
His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−ヒトインスリン。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のインスリンアナログの調製方法であって、インスリンアナログの前駆体を組換えによって調製し、前駆体を二本鎖インスリンに酵素的に処理し、そしてアルギニンアミドとのカップリングを、トリプシン活性を有する酵素の存在下で行ない、そしてインスリンアナログを単離する方法。
【請求項１６】
糖尿病を処置する医薬を製造するための請求項１〜１４のいずれか１項に記載のインス
リンアナログの使用。
【請求項１７】
Ｉ型若しくはII型糖尿病を処置する、軟骨を再生する、又はベータ細胞再生を補助する、医薬を調製するための方法における、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のインスリンアナログ及び／又はその生理学的に許容される塩を含む医薬。
【請求項１９】
製剤が、溶解したインスリンアナログを含む水性形態である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のインスリンアナログの製剤。
【請求項２０】
製剤が散剤の形態である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のインスリンアナログの製剤。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のインスリンアナログが、結晶形及び／又はアモルファス形で存在する、請求項２０に記載の製剤。
【請求項２２】
製剤が懸濁剤の形態である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のインスリンアナログの製剤。
【請求項２３】
製剤が化学シャペロンをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のインスリンアナログの製剤。
【請求項２４】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のインスリンアナログの前駆体をコードするＤＮＡ。
【請求項２５】
ＣペプチドがそのＮ末端にアミノ酸残基アルギニンを担持し、そのＣ末端が、形態Arg Arg、Arg Lys又はLys Arg Argを特徴とし、インスリン部分が請求項１記載の式Ｉのインスリンアナログからなるプレプロインスリンアナログ。
【請求項２６】
グルカゴン様ペプチド−１（GLP1）、若しくはそのアナログ若しくは誘導体、又はエキセンジン−３若しくは−４、若しくはそのアナログ若しくは誘導体をさらに含む、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項２７】
エキセンジン−４をさらに含む、請求項２６に記載の製剤。
【請求項２８】
エキセンジン−4のアナログが、
H−desPro36−エキセンジン−4−Lys6−NH2、
H−des(Pro36,37)−エキセンジン−4−Lys4−NH2及び
H−des(Pro36,37)−エキセンジン−4−Lys5−NH2、
並びにその薬理学的に許容される塩からなる群より選択される、請求項２６に記載の製剤。
【請求項２９】
エキセンジン−4のアナログが、
desPro36 [Asp28]エキセンジン−4 (1−39)、
desPro36 [IsoAsp28]エキセンジン−4 (1−39)、
desPro36 [Met(O)14, Asp28]エキセンジン−4 (1−39)、
desPro36 [Met(O)14, IsoAsp28]エキセンジン−4 (1−39)、
desPro36 [Trp(O2)25, Asp28]エキセンジン−2 (1−39)、
desPro36 [Trp(O2)25, IsoAsp28]エキセンジン−2 (1−39)、
desPro36 [Met(O)14Trp(O2)25, Asp28]エキセンジン−4 (1−39)及び
desPro36 [Met(O)14Trp(O2)25, IsoAsp28]エキセンジン−4 (1−39)、
並びにその薬理学的に許容される塩からなる群より選択される、請求項２６に記載の製剤。
【請求項３０】
ペプチド−Lys6−NH2が、エキセンジン−４のアナログのＣ末端に結合されている、請求項２６に記載の製剤。
【請求項３１】
エキセンジン−4のアナログが、
H−(Lys)6−des Pro36 [Asp28]エキセンジン−4(1−39)−Lys6−NH2、
des Asp28Pro36, Pro37, Pro38 エキセンジン−4(1−39) −NH2、
H−(Lys)6−des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]エキセンジン−4(1−39) −NH2、
H−Asn−(Glu)5 des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]エキセンジン−4(1−39) −NH2、
des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]エキセンジン−4(1−39)−(Lys)6−NH2、
H−(Lys)6−des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]エキセンジン−4(1−39)−(Lys)6−NH2、
H−Asn−(Glu)5−des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]エキセンジン−4(1−39)−(Lys)6−NH2、
H−(Lys)6−des Pro36 [Trp(O2)25, Asp28]エキセンジン−4(1−39)−Lys6−NH2、
H−des Asp28 Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25]エキセンジン−4(1−39) −NH2、
H−(Lys)6−des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25, Asp28]エキセンジン−4(1−39) −NH2、
H−Asn−(Glu)5−des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25, Asp28]エキセンジン−4(1−39)−NH2、
des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25, Asp28]エキセンジン−4(1−39)−(Lys)6−NH2、
H−(Lys)6−des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25, Asp28]エキセンジン−4(1−39)−(Lys)6−NH2、
H−Asn−(Glu)5−des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25, Asp28]エキセンジン−4(1−39)−(Lys)6−NH2、
H−(Lys)6−des Pro36 [Met(O)14, Asp28]エキセンジン−4(1−39)−Lys6−NH2、
des Met(O)14 Asp28 Pro 36, Pro37, Pro38 エキセンジン−4(1−39) −NH2、
H−(Lys)6−des Pro36, Pro 37, Pro38 [Met(O)14, Asp28]エキセンジン−4(1−39) −NH2、
H−Asn−(Glu)5−des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Asp28] エキセンジン−4(1−39) −NH2、
des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Asp28]エキセンジン−4(1−39)−(Lys)6−NH2、
H−(Lys)6−des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Asp28]エキセンジン−4(1−39)−Lys6−NH2、
H−Asn−(Glu)5 des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Asp28] エキセンジン−4(1−39)−(Lys)6−NH2、
H−(Lys)6−des Pro36 [Met(O)14, Trp(O2)25, Asp28]エキセンジン−4(1−39)−Lys6−NH2、
des Asp28 Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Trp(O2)25]エキセンジン−4(1−39) −NH2、
H−(Lys)6−des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Trp(O2)25, Asp28]エキセンジン−4(1−39) −NH2、
H−Asn−(Glu)5−des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Asp28] エキセンジン−4(1−39)−NH2、
des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Trp(O2)25, Asp28]エキセンジン−4(1−39)−(L
ys)6−NH2、
H−(Lys)6−des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Trp(O2)25, Asp28]エキセンジン−4(1−39)−(Lys)6−NH2、
H−Asn−(Glu)5−des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Trp(O2)25, Asp28] エキセンジン−4(1−39)−(Lys)6−NH2、
及びその薬理学的に許容される塩からなる群より選択される、請求項２６に記載の製剤。
【請求項３２】
Arg34, Lys26 (Nε(γ−グルタミル(Nα−ヘキサデカノイル))) GLP−1 (7−37)［リラグルチド］をさらに含む、請求項２６に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基礎時間／作用プロファイルを有する新規なインスリンアナログ、それらの調製及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病の発生率は、近年、ほぼ流行性の程度へ増加した。前記障害は、平均寿命の大幅な短縮を生じさせ得る。糖尿病を有する人は、外部からインスリンを身体に頻繁に供給しなければならない。インスリンでの治療を最適化することが、賢明である。特定の薬理学的性質を有する異なるインスリンが、現在、利用可能である。実際には、異なるインスリンは、それらの作用持続時間に従って、短時間作用型インスリン、速効型インスリン、長時間作用型インスリン及び混合型インスリンに区別される。長時間作用型インスリンについて同義的に使用される名称は、スローインスリン、デポーインスリン、又は基礎インスリンである。これらのインスリン製品の多くの中の有効成分は、１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加によってヒトインスリンから誘導された、いわゆるインスリンアナログである。用語「インスリンアナログ」及び「インスリン類」は、本明細書において同義的に使用される。
【０００３】
強化されたインスリン療法の方針は、基礎インスリンの早期投与により血糖値の安定的な制御を目指すことによって、健康リスクを減らそうと試みる。現在の基礎インスリンの一例は、medicament Lantus（登録商標）（有効成分：インスリングラルギン＝Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)ヒトインスリン）である。新規の改善された基礎インスリンを開発する一般的な目標は、低血糖事象の数を最小限にすることである。これに関連して理想的な基礎インスリンは、各患者において少なくとも24時間確実に作用するものである。インスリン効果は、理想的には、遅延開始及びできる限り浅い時間／作用プロファイルを有し、その結果、短時間の低血糖のリスクが明確に最小限にされ、食料品の事前摂取なしに、投与さえ可能となる。インスリン効果ができる限り長く同一のレベルで持続する場合、即ち、身体に一定量のインスリンが提供される場合、基礎インスリンの十分な供給が存在する。従って、低血糖事象のリスクは低く、患者及び日に特異的な変動性が最小限にされる。従って、理想的な基礎インスリンの薬物動態プロファイルは、遅延された作用開始、及び、延ばされた、即ち、長時間持続しかつ均一である作用を特徴とするべきである。
【０００４】
しかし、既に達成された治療的利益にもかかわらず、現在まで記載されたスローインスリンのいずれも、理想的な基礎インスリンの薬物動態特性を示していない。望ましいインスリンは、浅く、長時間持続する時間／作用プロファイルを有し、その結果、患者における日依存性の変動及び低血糖事象のリクスがさらに最小限にされ、作用持続時間がさらに延ばされ、その結果、インスリンを毎日投与することが、ある状況においては、もはや必要ではなくなる。これは、糖尿病患者の、特に、自分自身でインスリンを注射することがもはやできない高齢の糖尿病患者及び介護の必要がある糖尿病患者の簡易化された治療を可能にし、従って、非常に経済的に有利でもある。このような基礎インスリンは、さらに、２型糖尿病の初期において有利である。臨床医は、多くの人々に存在する注射恐怖症が、よい時期にインスリン療法を開始することを人々に思いとどまらせると報告している。結果として、血糖の制御が不十分となり、糖尿病の後遺症へ至る。注射によって与えられるインスリン用量の数を減らす基礎インスリンは、インスリン療法を患者により許容されるようにする効果を有し得る。
【０００５】
非特許文献１は、Ｂ鎖末端又はＡ及びＢ鎖のＮ末端でのリジン又はアルギニンの付加によって、ヒトインスリンの等電点（pI＝5.6）と比較してアルカリ性の範囲の方向にそれ
らの等電点（pI）がシフトしたインスリンアナログを調製することによって、インスリンの薬力学を最適化することが可能であり、その結果、生理学的条件下での溶解性が低下し、遅延した時間／作用プロファイルが生じるということを記載している。非特許文献１の化合物18（Arg (A0), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) ヒトインスリン（実験による測定値pI＝7.3；計算値pI＝7.58））は、これに関連して、その考えの文脈において最善の化合物と記載されている。従って、非特許文献１は、新規のインスリンアナログを設計することにおける主要な目的を、pI＝5.6から中性の範囲へと等電点を増加させるための、ヒトインスリンのアミノ酸配列への正に荷電したアミノ酸の付加であると考えている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kohn et al. (Peptides 28 (2007) 935−948)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
しかし、今回、驚くべきことに、記載される望ましい基礎の時間／作用プロファイルが、以下の特徴を特徴とするインスリンアナログで得られることがわかった：
・Ｂ鎖末端が、アミド化塩基性アミノ酸残基、例えば、リジン又はアルギニンアミドからなること、即ち、Ｂ鎖末端でのアミド化塩基性アミノ酸残基において、末端アミノ酸のカルボキシル基が、そのアミド化形態で存在すること、並びに
・アミノ酸位置A8が、ヒスチジン残基によって占められていること、並びに
・アミノ酸位置A21が、グリシン残基、アラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基によって占められていること、並びに
・A5、A15、A18、B−1、B0、B1、B2、B3及びB4を含む群の１つかそれ以下のアミノ酸残基が、Asp又はGluに対応すること。
【０００８】
驚くべきことに、まさに記載のインスリンアナログは、所望の有利な時間／作用プロファイルを有し、理想の、即ち、遅延した浅い作用開始及びより長い作用持続時間に近づく。従って、低血糖事象のリスクは、明確に最小限にされる。遅延は、非常に著しく、驚くべきことに、ラットについてのモデル実験においてさえ効果を検出することが可能である。対照的に、インスリングラルギンの遅延した作用は、図２に示されるように、ラットにおいて明白には観察され得ない。図１は、本発明の化合物YKL202及びYKL203の血糖降下作用を示す。ラットについての実験において得られた結果は、イヌについての実験において確認される。再度、作用持続時間が、インスリングラルギンのそれよりも明確により長いことが観察される。従って、明確により少ない頻度で投与される必要がある新規な基礎インスリンを提供した。記載のこれらの薬物動態的利益に加えて、本発明のアナログは、薬理学的な点でインスリングラルギンと比較してよりよい特性を示す。さらに、特許請求されるインスリンはまた、物理化学的な点で利益を示す。
【０００９】
今回、驚くべきことに、式Ｉのインスリンアナログ：
【化１】
0005695909.tif 000002
式中、
A−1は、Lys、Arg又はアミノ基に対応し；
A0は、Lys、Arg又は化学結合に対応し；
A1は、Arg又はGlyに対応し；
A5は、Asp、Glu又はGlnに対応し；
A15は、Asp、Glu又はGlnに対応し；
A18は、Asp、Glu又はAsnに対応し；
A21は、Ala、Ser、Thr又はGlyに対応し；
B−1は、Asp、Glu又はアミノ基に対応し；
B0は、Asp、Glu又は化学結合に対応し；
B1は、Asp、Glu、Phe又は化学結合に対応し；
B3は、Asp、Glu又はAsnに対応し；
B4は、Asp、Glu又はGlnに対応し；
B29は、Arg、Lys又はアミノ酸Phe、Ala、Thr、Ser、Val、Leu、Glu若しくはAspを含む群より選択されるアミノ酸、又は化学結合に対応し；
B30は、Thr又は化学結合に対応し；
B31は、Arg、Lys又は化学結合に対応し；
B32は、Arg−アミド又はLys−アミドに対応し、
ここで、A5、A15、A18、B−1、B0、B1、B2、B3及びB4を含む群の１つかそれ以下のアミノ酸残基が、Asp又はGluに対応する、
が、所望の薬理学的プロファイル、即ち、遅延した作用開始及びより長時間持続する一様な効果を有することがわかった。従って、本発明は、これらのインスリンアナログに関する。
【００１０】
本発明は、さらに、A5、A15、A18、B−1、B0、B1、B2、B3及びB4を含む群の１つのアミノ酸残基が、Asp又はGluに対応する、上述のインスリンアナログに関する。
【００１１】
本発明は、さらに、好ましくは、A−1がArgに対応し、A0がArgに対応し、A5がGluに対応し、A15がGluに対応し、A18がAspに対応し、A8がHisに対応し、A21がGlyに対応し、B0がGluに対応し、B3がAspに対応し、B4がGluに対応し、B30がArgに対応し、又はB30がLysに対応する、上述のインスリンアナログに関する。
【００１２】
本発明は、さらに、上述のインスリンアナログに関し、ここで、これは、以下を含む群より選択される：
Arg (A−1), Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)−NH2 ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)−NH2 ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)−NH2 ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)−NH2 ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)−NH2 ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)−NH2 ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B30)−NH2 ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Lys (B30)−NH2 ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B30)−NH2 ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Lys (B30)−NH2 ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B30)−NH2 ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Lys (B30)−NH2 ヒトインスリン、
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A−1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), Arg (A1), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)−NH2−ヒトインスリン、
Arg (A0), Arg (A1), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)−NH2−ヒトインスリン、
His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−ヒトインスリン。
【００１３】
記載されるインスリンアナログの名称における用語「ヒトインスリン」の明記は、ヒトインスリンのＡ鎖及びＢ鎖のアミノ酸配列に言及し、それらからの全ての逸脱（付加、置換、欠失）は、インスリンアナログの与えられる名称において示される。
【００１４】
本発明は、さらに、上述のインスリンアナログの調製方法に関し、ここで、インスリンアナログの前駆体を組換えによって調製し、前駆体を二本鎖インスリンに酵素的に処理し、そしてアルギニンアミドとのカップリングを、トリプシン活性を有する酵素の存在下で行ない、そしてインスリンアナログを単離する。
【００１５】
本発明は、さらに、糖尿病、特に、Ｉ型若しくはII型糖尿病を処置する医薬を製造するための上述のインスリンアナログの使用に関する。
【００１６】
本発明は、さらに、上述のインスリンアナログ及び／又はその生理学的に許容される塩を含む医薬に関する。
【００１７】
本発明は、さらに、軟骨再生について治療的に用いられる上述のインスリンアナログを含む医薬に関する。
【００１８】
本発明は、さらに、ベータ細胞再生の促進について治療的に用いられる上述のインスリンアナログを含む医薬に関する。
【００１９】
本発明は、さらに、製剤が、溶解したインスリンアナログを含む水性形態である、上述のインスリンアナログの製剤に関する。
【００２０】
本発明は、さらに、製剤が散剤の形態、特に、結晶形及び／又はアモルファス形である、上述のインスリンアナログの製剤に関する。
【００２１】
本発明は、さらに、製剤が懸濁剤の形態である、上述のインスリンアナログの製剤に関する。
【００２２】
本発明は、さらに、製剤が化学シャペロンをさらに含む、上述のインスリンアナログの製剤に関する。
【００２３】
本発明は、さらに、上述のインスリンアナログの前駆体をコードするDNAに関する。
【００２４】
本発明は、さらに、上述のインスリンアナログのＡ鎖をコードするDNAに関する。
【００２５】
本発明は、さらに、上述のインスリンアナログのＢ鎖をコードするDNAに関する。
【００２６】
本発明は、さらに、上述のDNAを含むベクターに関する。
【００２７】
本発明は、さらに、上述のDNA又は上述のベクターを含む宿主生物に関する。
【００２８】
本発明は、さらに、ＣペプチドがそのＮ末端にアミノ酸残基アルギニンを担持し、そのＣ末端が、形態Arg Arg、Arg Lys又はLys Arg Argを特徴とする、プレプロインスリンアナログに関する。
【００２９】
本発明は、さらに、グルカゴン様ペプチド−1（GLP1）、若しくはそのアナログ若しくは誘導体、又はエキセンジン−3若しくは−4、若しくはそのアナログ若しくは誘導体、好ましくは、エキセンジン−4をさらに含む、上述の製剤に関する。
【００３０】
本発明は、さらに、エキセンジン−4のアナログが、
H−desPro36−エキセンジン−4−Lys6−NH2、
H−des(Pro36,37)−エキセンジン−4−Lys4−NH2及び
H−des(Pro36,37)−エキセンジン−4−Lys5−NH2、
又はその薬理学的に許容される塩を含む群より選択される、上述の製剤に関する。
【００３１】
本発明は、さらに、エキセンジン−4のアナログが、
desPro36 [Asp28]エキセンジン−4 (1−39)、
desPro36 [IsoAsp28]エキセンジン−4 (1−39)、
desPro36 [Met(O)14, Asp28]エキセンジン−4 (1−39)、
desPro36 [Met(O)14, IsoAsp28]エキセンジン−4 (1−39)、
desPro36 [Trp(O2)25, Asp28]エキセンジン−2 (1−39)、
desPro36 [Trp(O2)25, IsoAsp28]エキセンジン−2 (1−39)、
desPro36 [Met(O)14Trp(O2)25, Asp28]エキセンジン−4 (1−39)及び
desPro36 [Met(O)14Trp(O2)25, IsoAsp28]エキセンジン−4 (1−39)、
又はその薬理学的に許容される塩を含む群より選択される、上述の製剤に関する。
【００３２】
本発明は、さらに、ペプチド−Lys6−NH2が、エキセンジン−4のアナログのＣ末端に結合されている、前記段落に記載の製剤に関する。
【００３３】
本発明は、さらに、エキセンジン−4のアナログが、
H−(Lys)6−des Pro36 [Asp28]エキセンジン−4(1−39)−Lys6−NH2、
des Asp28Pro36, Pro37, Pro38 エキセンジン−4(1−39)−NH2、
H−(Lys)6−des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]エキセンジン−4(1−39)−NH2、
H−Asn−(Glu)5 des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]エキセンジン−4(1−39)−NH2、
des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]エキセンジン−4(1−39)−(Lys)6−NH2、
H−(Lys)6−des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]エキセンジン−4(1−39)−(Lys)6−NH2、
H−Asn−(Glu)5−des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]エキセンジン−4(1−39)−(Lys)6−NH2、
H−(Lys)6−des Pro36 [Trp(O2)25, Asp28]エキセンジン−4(1−39)−Lys6−NH2、
H−des Asp28 Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25]エキセンジン−4(1−39)−NH2、
H−(Lys)6−des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25, Asp28]エキセンジン−4(1−39)−NH2、
H−Asn−(Glu)5−des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25, Asp28]エキセンジン−4(1−39)−NH2、
des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25, Asp28]エキセンジン−4(1−39)−(Lys)6−NH2、
H−(Lys)6−des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25, Asp28]エキセンジン−4(1−39)−(Lys)6−NH2、
H−Asn−(Glu)5−des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25, Asp28]エキセンジン−4(1−39)−(Lys)6−NH2、
H−(Lys)6−des Pro36 [Met(O)14, Asp28]エキセンジン−4(1−39)−Lys6−NH2、
des Met(O)14 Asp28 Pro 36, Pro37, Pro38 エキセンジン−4(1−39)−NH2、
H−(Lys)6−des Pro36, Pro 37, Pro38 [Met(O)14, Asp28]エキセンジン−4(1−39)−NH2、
H−Asn−(Glu)5−des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Asp28] エキセンジン−4(1−39)−NH2、
des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Asp28]エキセンジン−4(1−39)−(Lys)6−NH2、
H−(Lys)6−des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Asp28]エキセンジン−4(1−39)−Lys6−NH2、
H−Asn−(Glu)5 des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Asp28] エキセンジン−4(1−39)−(Lys)6−NH2、
H−(Lys)6−des Pro36 [Met(O)14, Trp(O2)25, Asp28]エキセンジン−4(1−39)−Lys6−NH2、
des Asp28 Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Trp(O2)25]エキセンジン−4(1−39)−NH2、
H−(Lys)6−des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Trp(O2)25, Asp28]エキセンジン−4(1−39)−NH2、
H−Asn−(Glu)5−des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Asp28] エキセンジン−4(1−39)−NH2、
des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Trp(O2)25, Asp28]エキセンジン−4(1−39)−(Lys)6−NH2、
H−(Lys)6−des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Trp(O2)25, Asp28]エキセンジン−4(1−39)−(Lys)6−NH2、
H−Asn−(Glu)5−des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Trp(O2)25, Asp28] エキセンジン−4(1−39)−(Lys)6−NH2、
又はその薬理学的に許容される塩を含む群より選択される、上述の製剤に関する。
【００３４】
本発明は、さらに、Arg34, Lys26 (Nε(γ−グルタミル(Nα−ヘキサデカノイル))) GLP−1 (7−37) ［リラグルチド］又はその薬理学的に許容される塩をさらに含む、上述の製剤に関する。
【００３５】
本発明のインスリンは、投与後に有利な効果を有する医薬製剤のアイテムであり得ることは、これに関連する当業者に明らかである。水溶液は、これに関連する出発点である。さらなる成分は、従って、混和性でなければならない。ウイルス動物汚染のリスクは、製剤が動物源由来のいかなる成分も含むべきではない点で、最小限にされる。防腐剤を添加することによって微生物汚染を予防することは、さらに有利である。等張剤を添加することによって、投与部位での組織細胞の生理機能に対する製剤の可能性のある負の効果を補うことが可能である。プロタミンの添加は、安定化効果を有し得、その結果、実質的に塩を含まないインスリン製剤が、製剤へプロタミンを添加することによって得ることができる。フェノール成分の添加は、使用されるインスリンアナログの構造の安定化をもたらし得、従って、特に、作用開始に対する遅延効果をさらにもたらし得る。本発明のスローインスリンの空間的構造を安定化し、よりよい熱的安定性をもたらす物質を、製剤へ添加することも可能である。このような化学シャペロンは、例えば、短い合成ペプチドであり得、これはまた、アミノ酸アナログを含み得、又は、例えば、インスリンのＣペプチド由来のペプチド配列を含み得る。
【００３６】
本発明のインスリンは、デポー形態を開発するために、ナノ粒子中へ組み入れられ得る。本発明のスローインスリンがポリマー担体へ可逆的に結合された状態で存在する、いわゆる徐放製剤も考えられる。
【００３７】
本発明のインスリンは、速効型インスリン、例えば、Apidra（登録商標）、NovoRapid（登録商標）、Humalog（登録商標）又は開発中のインスリン誘導体、又は、好適な時間／作用プロファイルを有する製剤、又は、開発中である吸入可能なインスリン又は経鼻若しくは経口投与されるインスリンと並行して投与され得る。速効型及び本発明のスローインスリンの適切に製剤化された混合物もまた、この目的のために使用され得ることが、これに関連する当業者に明らかである。本発明のインスリンアナログは、GLP−1（グルカゴン様ペプチド−1）又はエキセンジン−4若しくはエキセンジン−3と同等の活性によって記載されるペプチドを含む医薬製剤中においてさらに使用され得る。GLP−1 (7−37)、エクセナチド（Byetta（登録商標））、又は調製が特許出願WO 2006/058620、WO 2001/04156、WO 2004/005342及びWO 98/08871に記載されているペプチドは、このようなペプチドの例を示す。これに関連して特に有利な製剤は、これらのペプチドのデポー製剤を含むものである。特にII型糖尿病の初期段階において有利な治療のタイプは、本発明の医薬の投与と並行して与え、インスリンの効果を高めるもの、例えば、メトホルミンである。インクレチンのレベルを増加させるジペプチジルペプチダーゼ−4阻害剤を用いての併用療法が、膵臓中におけるインスリン分泌を増加させるスルホニル尿素との併用のように、同様に可能である。好適な幹細胞からのベータ細胞の再生が分化因子の投与によって開始される場合、本発明のスローインスリンが、特に有利に使用され得る。これらの適用の全ては、糖尿病の療法についての例として記載され、本発明は、同様にそれに関する。従って、本発明は、さらに、糖尿病、特に、Ｉ型糖尿病又はII型糖尿病の治療についての他の有効成分と併用しての本発明のインスリンの使用に関する。
【００３８】
本発明はまた、さらに、骨格に関する再生プロセス、例えば、軟骨再生における本発明のインスリンの使用に関する。この使用において、強い代謝反応を同時に誘発することなく、インスリンの分裂促進ポテンシャルを制御して使用することが、重要である。
【００３９】
本発明は、さらに、特に水性製剤又は散剤を示す、本発明のアナログを含む医薬に関する。
【００４０】
医薬は、好ましくは、注射用の液剤又は懸濁剤である医薬製剤であり；それは、溶解、アモルファス、及び／又は結晶形態、好ましくは溶解形態の、本発明のインスリンアナログの少なくとも１つ、及び／又は、それらの生理学的に許容される塩の少なくとも１つの、内容物を特徴とする。
【００４１】
製剤は、好ましくは、約2.5〜8.5、特に、4.0〜8.5のpHを有し、好適な等張化剤（tonicity agent）、好適な防腐剤、及び、必要に応じて、好適な緩衝剤、及び好ましくはさらに特定の亜鉛イオン濃度を、無菌水溶液中に含む。有効成分を除いた製剤成分の総計は、製剤担体を形成する。好適な等張化剤は、例えば、グリセロール、グルコース、マンニトール、NaCl、カルシウム又はマグネシウム化合物、例えば、CaCl2などである。弱酸性pH値での本発明のインスリン又はそれらの生理学的に許容される塩の溶解性は、等張化剤及び／又は防腐剤の選択によって影響される。
【００４２】
好適な防腐剤の例は、フェノール、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール及び／又はｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルである。
【００４３】
pHを約4.0〜8.5に調節するために特に使用され得る、緩衝物質は、例えば、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどである。そうでなければ、生理学的に許容される希酸（典型的に、HCl）又はアルカリ（典型的に、NaOH）もまた、pHを調節するために好適である。
【００４４】
製剤が亜鉛含有量を有する場合、好ましいのは、１μg／ml〜２mg／ml、特に、１μg／ml〜200μg亜鉛／mlのものである。本発明のインスリンアナログの作用プロファイルは、驚くべきことに、亜鉛の添加によって十分に影響され得る。これは、作用の全持続時間、作用開始の速度、及び効果曲線のプロファイルに関して異なる製剤の製造を可能にし、従って、患者の個々の安定化を可能にする。
【００４５】
本発明の製剤の有効成分プロファイルを変化させるために、未修飾インスリン、好ましくは、ウシ、ブタ又はヒトインスリン、特に、ヒトインスリン、又はそれらのインスリンアナログ及び誘導体を混合することも可能である。GLP−1（グルカゴン様ペプチド−1）と同等の活性を特徴とするペプチド又はエキセンジン−4誘導体を１つ又はそれ以上混合することが、同様に可能である。本発明は、同様に、このような医薬（製剤）に関する。
【００４６】
好ましい有効成分濃度は、約１〜1500、より好ましくは、約５〜1000、特に、約40〜400国際単位／mlに対応するものである。
【００４７】
本発明のインスリンアナログは、アミドをまだ含まない前駆体として、バイオテクノロジーによって最初は作製される。当業者は、インスリンを作製するための多数の可能性に精通している。これに関連して使用される宿主細胞系は、発酵による培養についての細菌、酵母及び高等植物又は植物細胞である。費用検討が許すならば、宿主系として動物細胞を使用する発現系も考えられる。しかし、そのための前提条件は、動物ウイルスを確実に含まないことである。従って、例として記載された発現系は、タンパク質の組換え作製のために開発された宿主／ベクター系のほんの一部を示すことが、明らかである。例えば、酵母、又は植物系、例えば、コケ、藻類、又は高等植物、例えば、タバコ、エンドウ、ベニバナ、大麦、トウモロコシ若しくはアブラナに基づくバイオテクノロジー方法は、本願に記載されていない。それにもかかわらず、本発明は、標的ペプチドが好適なバイオテクノロジー発現系において作製されることを可能にする、宿主／ベクター系及びコーディングDNA配列を同様に含む。従って、宿主生物は、特に、以下からの植物界より選択され得る：分裂菌綱（Schizomycetes）、細菌類又はラン藻類を含む第１門分裂植物門（Schizophyta）の生物、第２門藻類門（Phycophyta）第Ｖ綱緑藻綱（Chlorophyceae）の生物、第２門藻類門第VII綱紅藻綱（Rhodophyceae）の生物、第３門菌類門（Mycophyta）の生物、第５門コケ植物門（Bryophyta）の生物、及び第7門種子植物門（Spermatophyta）の生物。
【００４８】
欧州特許出願公開EP−A 1 222 207は、修飾Ｃペプチドを含むプレプロインスリンをコードするプラスミドpINT358dを記載している。本発明のインスリンの前駆体として役立ち得るプレプロインスリンを発現することが可能となるように、プロインスリンコード配列を特異的に修飾することが、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の助けを借りて、現在、可能である。対応の融合タンパク質は、細胞内に作製される必要は必ずしもない。このようなタンパク質はまた、細菌発現、ペリプラズム中への及び／又は培養上清中への続いての分泌によっても作製され得ることが、当業者に明らかである。欧州特許出願公開EP−A 1 364 029は、例としてこれを記載している。本発明は、同様に、本発明のアナログをもたらすプロインスリン前駆体に関する。
【００４９】
この方法で作製されたプロインスリンは、位置A0にリジン又はアルギニンを含みかつＢ鎖のＣ末端にリジン又はアルギニンを有するインスリンアナログ前駆体へ原則として変換され得る。あるいは、リジン又はアルギニンが既に存在しない場合、正に荷電したアミノ酸をＡ鎖のＮ末端へ半合成的に付加することが可能である。
【００５０】
本発明のプロインスリンが細菌中での細胞内発現の後に封入体の形態又は可溶形態である場合、これらの前駆体は、プロセッシング及び生化学的修飾が着手され得る前に、正しい構造へインビトロ折り畳みによって折り畳まれなければならない。これに関連して、記載の融合タンパク質は、尿素又はグアニジニウム塩酸塩による変性後に直接折り畳みを可能にし、本発明は、同様に、折り畳み中間体に関する。
【００５１】
個々の中間体を濃縮するために、生化学的方法、特に、それらの基本原理が公表され、実際にテキストブックの主題である分離プロセスが使用される。このような原理は、結果的に合わされ得、従って、それらの順序では以前は公表されていないプロセスとなり得ることが、当業者に明らかである。従って、本発明は、同様に、本発明のアナログの精製をもたらすプロセスに関する。
【００５２】
本発明は、さらに、本発明のインスリンアナログを製造するための方法に関し、ここで、インスリンアナログの前駆体が、組換えによって作製され、二本鎖インスリン前駆体へ酵素的に変換され、これは、Ａ鎖のアミノ酸１に関してＮ末端にアルギニン又はリジンを有し、Ｂ鎖のＣ末端にリジン又はアルギニン残基を有し、これが、トリプシン活性を有する酵素の存在下で、アルギニンアミド又はリジンアミドを用いて、アミドへ、従って、本発明のスローインスリンへ変換され、生化学的精製プロセスによって高純度で作製される。
【００５３】
他のアミノ酸残基による少なくとも１つの天然のアミノ酸残基の置換及び／又は少なくとも１つのアミノ酸残基の付加及び／又は欠失によって、対応の、その他の点では同一の天然のタンパク質とは相違するタンパク質は、タンパク質の「アナログ」と呼ばれる。これに関連して、付加された及び／又は置換されたアミノ酸残基が、天然には生じないものであることも、可能である。
【００５４】
最初のタンパク質の特定のアミノ酸残基の化学的修飾によって得られるタンパク質は、タンパク質の「誘導体」と呼ばれる。化学的修飾は、例えば、１つ又はそれ以上のアミノ酸への１つ又はそれ以上の特定の化学基の付加からなり得る。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ラットにおける本発明のインスリンアナログの血糖降下作用を示すグラフである。
【図２】ラットにおけるインスリングラルギンの血糖降下作用を示すグラフである。
【００５６】
以下の実施例は、これに関連して限定的な影響を与えることなしに本発明の概念を例証することを目的とする。
【実施例】
【００５７】
実施例１：Ｃ／Ａ鎖境界でArg Argを担持する修飾Ｃペプチド及びGly (A21)−インスリンをコードするベクター誘導体pINT3580の調製
欧州特許出願公開EP−A 1 222 207には、プラスミド類、pINT358d、pINT91d、及びプライマー配列Tirが記載されている。これらの産物のDNAを、プラスミドpINT3580を構築するために使用した。プラスミドpINT358dは、特定の性質を有する修飾Ｃペプチドをコードする遺伝子配列をさらに特徴とする。３つのプライマー配列を合成した：
【００５８】
【化２】
0005695909.tif 000003
【００５９】
このプライマーは、後処理後、pINT358dによってコードされるプロインスリン配列のＡ鎖の位置21にアスパラギンの代わりにグリシン（下線が引かれた、太字）を導入するのに用いた。
【００６０】
【化３】
0005695909.tif 000004
【００６１】
このプライマーは、プライマーarg_cjunc_revと同様、インスリンＡ／Ｂ鎖境界でリジンの代わりにアルギニンを導入するために役立った。
【００６２】
【化４】
0005695909.tif 000005
【００６３】
導入すべきアルギニンについてのコドンは、両方のプライマーにおいて太字になっている。プライマー対Tir／arg_cjunc_rev及びarg_cjuncf／pint3580_glya21revの各々並びにテンプレートとしてのプラスミドプラスミドpINT358dのDNAを用いて、欧州特許出願公開EP−A 1 222 207に従って、PCRを行った。２つの反応の産物のアリコートを合わせ、第3PCRにおいてプライマー対Tir／pint3580_glya21revと共に使用した。この反応の産物を、ゲル電気泳動による反応混合物の分画後精製し、そして一つの同じ反応で製造業者の説明書に従って制限酵素Sal1／Nco1で消化し、反応混合物をゲル電気泳動よって分画し、そしてプロインスリン配列をコードするDNAフラグメントを単離した。次いで、フラグメントを、DNAリガーゼ反応によって、Nco1／Sal1−オープンドpINT91dベクターDNA中に挿入した。
【００６４】
連結反応混合物を、コンピテント大腸菌細菌細胞を形質転換するために使用した。形質転換混合物を、25mg／ｌアンピシリンを含有する選択プレート上に取り出した。プラスミドDNAをコロニーから単離し、DNA配列分析によってキャラクタライズした。コレクトプラスミドをpINT3580と命名した。
【００６５】
実施例２：His (A8), Gly (A21)−プレプロインスリンをコードするプラスミドpINT3581の構築
実施例１に記載したように３つのポリメラーゼ連鎖反応によって、構築を行った。第３反応の産物を、Nco1／Sal1切断後に、Nco1／Sal1−オープンドpINT91dベクターDNA中に挿入した。プライマーTir及びpint3580_glya21revを使用した。２つのさらなるプライマーを合成した：
【化５】
0005695909.tif 000006
【００６６】
Ａ鎖の位置８でヒスチジンをコードするコドンを、各ケースにおいて太字表示することによって強調している。実施例１に記載したと同様に、構築を行った。PCR1及び2についてのテンプレートは、プラスミドpINT3580のDNAであった。PCR1をプライマー対Tir／pint3580_Ha8revを用いて行い、PCR2をプライマー対pint3580_Ha8f／pint3580_glya21revを用いて行った。プライマー対Tir／pint3580_glya21revを、PCR 3において使用した。この場合におけるテンプレートは、PCR1及びPCR2の反応産物の混合物であった。コレクトプラスミドをpINT3581と命名した。
【００６７】
前記プラスミドによってコードされたプレプロインスリンは、Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−ヒトインスリンとキャラクタライズされ、そしてアルギニンアミドでのアミド化の後に得られた、化合物YKL202についての前駆体である。
【００６８】
前記プラスミドによってコードされたプレプロインスリンは、Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)−NH2−ヒトインスリンとキャラクタライズされ、そしてリジンアミドでのアミド化の後に得られた、化合物YKL202bについての前駆体である。
【００６９】
実施例３：His (A8), Glu (A5), Gly (A21)−プレプロインスリンをコードするプラスミドpINT3582の構築
実施例１及び２に記載したと同様に、３つのポリメラーゼ連鎖反応によって、構築を行った。第３反応の産物を、Nco1／Sal1切断後に、Nco1／Sal1−オープンドpINT91dベクターDNA中に挿入した。プライマーTir及びpint3580_glya21revを使用した。２つのさらなるプライマーを合成した。
【化６】
0005695909.tif 000007
【００７０】
Ａ鎖の位置５にグルタミン酸をコードするコドンを、各ケースにおいて太字表示することによって強調している。構築を、実施例１に記載したと同様に行った。テンプレートは、プラスミドpINT3581のDNAであった。コレクトプラスミドをpINT3582と命名した。
【００７１】
前記プラスミドによってコードされたプレプロインスリンは、Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−ヒトインスリンとキャラクタライズされ、そしてアルギニンアミドでのアミド化の後に得られた、化合物YKL202−1についての前駆体である。
【００７２】
前記プラスミドによってコードされたプレプロインスリンは、Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)−NH2−ヒトインスリンとキャラクタライズされ、そしてリジンアミドでのアミド化の後に得られた、化合物YKL202−1bについての前駆体である。
【００７３】
実施例４：His (A8), Asp (A18), Gly(A21)−プレプロインスリンをコードするプラスミドpINT3583の構築
１つのみのポリメラーゼ連鎖反応によって行ったことにより、構築は実施例１とは相違した。この反応の産物を、Nco1／Sal1切断後に、Nco1／Sal1−オープンドpINT91dベクターDNA中に挿入した。プライマーTirを使用した。１つのさらなるプライマーを合成した：
【化７】
0005695909.tif 000008
【００７４】
Ａ鎖の位置18にアスパラギン酸をコードするコドンを、太字表示することによって強調している。テンプレートは、プラスミドpINT3581のDNAであった。コレクトプラスミドをpINT3583と命名した。
【００７５】
前記プラスミドによってコードされたプレプロインスリンは、Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−ヒトインスリンとキャラクタライズされ、そしてアルギニンアミドでのアミド化の後に得られた、化合物YKL202についての前駆体である。
【００７６】
前記プラスミドによってコードされたプレプロインスリンは、Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)−NH2−ヒトインスリンとキャラクタライズされ、そしてリジンアミドでのアミド化の後に得られた、化合物YKL202−2bについての前駆体である。
【００７７】
実施例５：His (A8), Glu (A15), Gly (A21)−プレプロインスリンをコードするプラスミドpINT3585の構築
１つのみのポリメラーゼ連鎖反応によって行うことにより、構築は実施例１とは相違した。この反応の産物を、Nco1／Sal1切断後に、Nco1／Sal1−オープンドpINT91dベクターDNA中に挿入した。プライマーTirを使用した。１つのさらなるプライマーを合成した：
【化８】
0005695909.tif 000009
【００７８】
Ａ鎖の位置15にグルタミン酸をコードするコドンを、太字表示することによって強調している。テンプレートは、プラスミドpINT3581のDNAであった。コレクトプラスミドをpINT3585と命名した。
【００７９】
前記プラスミドによってコードされたプレプロインスリンは、Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−ヒトインスリンとキャラクタライズされ、そしてアルギニンアミドでのアミド化の後に得られた、化合物YKL202−3についての前駆体である。
【００８０】
前記プラスミドによってコードされたプレプロインスリンは、Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)−NH2−ヒトインスリンとキャラクタライズされ、そしてリジンアミドでのアミド化の後に得られた化合物YKL202−3bについての前駆体である。
【００８１】
実施例６：His (A8), Gly (A21), Asp (B3)−プレプロインスリンをコードするプラスミドpINT3588の構築
実施例１及び２に記載したと同様に、３つのポリメラーゼ連鎖反応によって、構築を行った。第３反応の産物を、Nco1／Sal1切断後に、Nco1／Sal1−オープンドpINT91dベクターDNA中に挿入した。プライマーTir及びpint3580_glya21revを使用した。２つのさらなるプライマーを合成した：
【化９】
0005695909.tif 000010
【００８２】
インスリンＢ鎖の位置３にアスパラギンをコードするコドンを、各ケースにおいて太字表示することによって強調している。実施例１に記載したと同様に、構築を行った。テンプレートは、プラスミドpINT3581のDNAであった。コレクトプラスミドをpINT3588と命名した。
【００８３】
前記プラスミドによってコードされたプレプロインスリンは、Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−ヒトインスリンとキャラクタライズされ、そしてアルギニンアミドでのアミド化の後に得られた、化合物YKL202−4についての前駆体である。
【００８４】
前記プラスミドによってコードされたプレプロインスリンは、Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32)−NH2−ヒトインスリンとキャラクタライズされ、そしてリジンアミドでのアミド化の後に得られた、化合物YKL202−4bについての前駆体である。
【００８５】
実施例７：His (A8), Gly (A21), Glu (B4) プレプロインスリンをコードするプラスミドpINT3593の構築
実施例１及び２に記載したと同様に、３つのポリメラーゼ連鎖反応によって、構築を行った。第３反応の産物を、Nco1／Sal1切断後に、Nco1／Sal1−オープンドpINT91dベクターDNA中に挿入した。プライマーTir及びpint3580_glya21revを使用した。２つのさらなるプライマーを合成した：
【化１０】
0005695909.tif 000011
【００８６】
インスリンＢ鎖の位置４にグルタミンをコードするコドンを、太字表示することによって強調している。構築を、実施例１に記載したと同様に行った。テンプレートは、プラスミドpINT3581のDNAであった。コレクトプラスミドをpINT3593と命名した。
【００８７】
前記プラスミドによってコードされたプレプロインスリンは、Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−ヒトインスリンとキャラクタライズされ、そしてアルギニンアミドでのアミド化の後に得られた、化合物YKL202−5についての前駆体である。
【００８８】
前記プラスミドによってコードされたプレプロインスリンは、Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32)−NH2−ヒトインスリンとキャラクタライズされ、そしてリジンアミドでのアミド化の後に得られた、化合物YKL202−5bについての前駆体である。
【００８９】
実施例８：His (A8), Gly (A21), Glu (B0)−プレプロインスリンをコードするプラスミドpINT3597の構築
２つのポリメラーゼ連鎖反応によって、構築を行った。プライマーpint3580_glya21revを使用した。２つのさらなるプライマーを合成した：
【化１１】
0005695909.tif 000012
【００９０】
この場合において、２つのプライマーの部分的な重複が存在する。Pint3581_Eb0f2は、NcoI認識配列を含有する。これを下線で示す。Ｂ鎖の開始での位置０にグルタミン酸をコードするコドンを、各ケースにおいて太字表示することによって強調している。PCR1についてのテンプレートは、プラスミドpINT3581のDNAであった。
【００９１】
プライマー対pint3581_Eb−1f2／pint3580_glya21revを用いて、PCR1を行った。PCR2についてのテンプレートは、PCR1由来の産物であった。プライマー対pint3581_Eb−1f2／pint3580_glya21revを用いて、PCR2を行った。PCR2由来の産物は、完全なプレプロインスリン配列をカバーした。第２反応の産物を、Nco1／Sal1切断後に、Nco1／Sal1−オープンドpINT91dベクターDNA中に挿入した。コレクトプラスミドをpINT3597と命名した。
【００９２】
前記プラスミドによってコードされたプレプロインスリンは、Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−ヒトインスリンとキャラクタライズされ、そしてアルギニンアミドでのアミド化の後に得られた、化合物YKL202−6についての前駆体である。
【００９３】
前記プラスミドによってコードされたプレプロインスリンは、Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32)−NH2−ヒトインスリンとキャラクタライズされ、そしてリジンアミドでのアミド化の後に得られた、化合物YKL202−6bについての前駆体である。
【００９４】
位置B0のグルタミン酸についてのコドンを、アスパラギン酸のコドンによって置き換え、前記実施例に従うと、位置B0にグルタミン酸の代わりにアスパラギン酸を有するプラスミドを生じさせた。
【００９５】
実施例９：His (A8), Gly (A21), Lys (B0)−プレプロインスリンをコードするプラスミドpINT3700の構築
前記構築を、プレ配列とＢ鎖の開始との間の境界でアルギニンについてのコドンの代わりにリジンについてのコドンを導入するのに用いた。２つのポリメラーゼ連鎖反応によって、構築を行った。プライマーpint3580_glya21revを使用した。２つのさらなるプライマーを合成した：
【化１２】
0005695909.tif 000013
【００９６】
この場合において、２つのプライマーの部分的な重複が存在し、pint3581_Eb0f2はNcoI認識配列を含有する。これを下線で示す。Ｂ鎖の開始での位置０にグルタミン酸をコードするコドンを、各ケースにおいて太字表示することによって強調している。PCR1についてのテンプレートは、プラスミドpINT3581のDNAであった。プライマー対pint3581_Eb−1f2／pint3580_glya21revを用いて、PCR1を行った。PCR2についてのテンプレートは、PCR1由来の産物であった。プライマー対pint3581_Eb−1f2／pint3580_glya21revを用いて、PCR2を行った。PCR2由来の産物は、完全なプレプロインスリン配列をカバーした。第２反応の産物を、Nco1／Sal1切断後に、Nco1／Sal1−オープンドpINT91dベクターDNA中に挿入した。コレクトプラスミドをpINT3700と命名した。
【００９７】
前記プラスミドによってコードされたプレプロインスリンは、化合物Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)−NH2−ヒトインスリンについての前駆体であった。該化合物は、トリプシン及びリシルエンドペプチダーゼＣとの反応によって中間体Arg (A0), His (A8), Gly (A21), des Thr (B30)−ヒトインスリンを最初に調製し、続いてこの中間体を、アルギニンアミドでのアミド化によって所望の化合物YKL202−7に変換することによって得られ、これは、Arg (A0), His(A8), Gly(A21), Arg (B30)−NH2−ヒトインスリンとキャラクタライズされた。
【００９８】
前記プラスミドによってコードされたプレプロインスリンは、Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)−NH2−ヒトインスリンとキャラクタライズされ、そしてリジンアミドでのアミド化の後に得られた、化合物YKL202−7bについての前駆体である。
【００９９】
実施例10：Gly (A21) Lys (B0)−プレプロインスリンをコードするプラスミドpINT3701の構築
前記構築を、プレ配列とＢ鎖の開始との間の境界でアルギニンについてのコドンの代わりにリジンについてのコドンを導入するのに用いた。実施例９からの構築ストラテジーに従い、しかしPCR1についてのテンプレートとしてプラスミドpINT358dのDNAを使用して、プラスミドpINT3701が得られ、これは、元のプラスミドpINT358dと同様に、ＣペプチドとＡ鎖との境界がアミノ酸配列Lys−Argによって形成されることを特徴とした。
【０１００】
実施例11：実施例10に従うＣペプチドと共にHis (A8), Gly (A21), Lys (B0)−プレプロインスリンをコードするプラスミドpINT3702の構築
実施例２に記載の構築プランに従い、しかしテンプレートとしてプラスミドpINT3701のDNAを使用して、プラスミドpINT3702が得られた。
【０１０１】
前記プラスミドによってコードされたプレプロインスリンは、化合物Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)−NH2−ヒトインスリンについての前駆体であった。該化合物は、リシルエンドペプチダーゼＣのみとの反応によって中間体Arg (A0), His (A8), Gly (A21), des（of the）Thr (B30)−ヒトインスリンを最初に調製し、続いてこの中間体を、アルギニンアミドでのアミド化によって所望の化合物YKL202−8に変換することによって得られ、これは、Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)−NH2−ヒトインスリンとキャラクタライズされた。
【０１０２】
前記プラスミドによってコードされたプレプロインスリンは、Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)−NH2−ヒトインスリンとキャラクタライズされ、そしてリジンアミドでのアミド化の後に得られた、化合物YKL202−8bについての前駆体である。
【０１０３】
実施例12：His (A8), Gly (A21), Lys (B0)−プレプロインスリン及びＣ／Ａ鎖境界でトリペプチドLys−Arg−Argを担持する修飾Ｃペプチドをコードするベクター誘導体pINT3703の調製
プラスミドpINT3702のDNAをテンプレートとして使用し、プライマーpint3580_glya21rev及びTirを使用した。２つのプライマー配列を合成した。
【０１０４】
【化１３】
0005695909.tif 000014
【０１０５】
このプライマーは、プライマーarg_cjunc_revと同様、インスリンＡ／Ｂ鎖境界でアルギニンを導入するのに用いた。
【０１０６】
【化１４】
0005695909.tif 000015
【０１０７】
導入すべきアルギニンについてのコドンは、両方のプライマーにおいて太字になっている。プライマー対Tir／3702_cjunc_rev及び3702_arg_cjuncf／pint3580_glya21revの各々を用いて、そしてテンプレートとしてプラスミドpINT3702のDNAを用いて、欧州特許出願公開EP−A 1 222 207に従って、PCRを行った。２つの反応の産物のアリコートを合わせ、第3PCRにおいてプライマー対Tir／pint3580_glya21revと共に使用した。この反応の産物を、ゲル電気泳動による反応混合物の分画後精製し、そして一つの同じ反応で製造業者の説明書に従って制限酵素Sal1／Nco1で消化し、反応混合物をゲル電気泳動よって分画し、そしてプロインスリン配列をコードするDNAフラグメントを単離した。次いで、フラグメントを、DNAリガーゼ反応によって、Nco1／Sal1−オープンドpINT91dベクターDNA中に挿入した。
【０１０８】
連結反応混合物を、コンピテント大腸菌細菌細胞を形質転換するために使用した。形質転換混合物を、25mg／ｌアンピシリンを含有する選択プレート上において平板培養した。プラスミドDNAをコロニーから単離し、DNA配列分析によってキャラクタライズした。コレクトプラスミドをpINT3702と命名した。
【０１０９】
前記プラスミドによってコードされたプレプロインスリンは、化合物Arg (A−1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)−NH2−ヒトインスリンについての前駆体であった。該化合物は、リシルエンドペプチダーゼＣとの反応によって中間体Arg (A−1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), des（of the）Thr (B30)−ヒトインスリンを最初に調製することによって得られ、続いてこの中間体をアルギニンアミドでのアミド化によって所望の化合物に変換した。
【０１１０】
前記プラスミドによってコードされたプレプロインスリンは、リジンアミドでのアミド化の後に得られた、化合物Arg (A−1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)−NH2−ヒトインスリンについての前駆体である。
【０１１１】
実施例３〜８に従ってＡ又はＢ鎖の適切な位置にアスパラギン酸又はグルタミン酸を導入し得ることは、当業者に明らかである。これらのプロインスリンは、それら化合物についての前駆体である。
【０１１２】
【表１】
0005695909.tif 000016
【０１１３】
実施例13：His (A8), Gly (A21), Lys (B0)−プレプロインスリンをコードするベクター誘導体pINT3704の調製
この実施例は、His (A8), Gly (A21), Lys (B0)−プレプロインスリン、及びＣ／Ａ鎖境界でトリペプチドLys−Arg−Argを担持する修飾Ｃペプチドをコードする、ベクター誘導体pINT3704の調製を開示し、ここでヒトインスリンでは位置A21に存在するアミノ酸グリシンは欠失している。
実施例12に開示の合成スキームに従い、プライマー3702_arg_cjuncf及び3702_arg_cjuncfrevをプライマー3703_Δ Ga1f及び3703_Δ Ga1revで置き換え、テンプレートとしてプラスミドpINT3703のDNAを使用することによって、プラスミドpINT3704が得られ、ここで、Ａ鎖の位置１のアミノ酸グリシンは、コードされたプレプロインスリンでは欠失してお
り、該配列の残りのコースは、pINT3703によってコードされた配列のそれに対応した。
【０１１４】
【化１５】
0005695909.tif 000017
【０１１５】
前記プラスミドによってコードされたプレプロインスリンは、化合物Arg(A0), Arg (A1), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)−NH2−ヒトインスリンについての前駆体であった。該化合物は、リシルエンドペプチダーゼＣとの反応によって中間体Arg (A0), Arg (A1), His (A8), Gly (A21), des Thr (B30)−ヒトインスリンを最初に調製することによって得られ、次いでこの中間体をアルギニンアミドでのアミド化によって所望の化合物に変換した。
【０１１６】
前記プラスミドによってコードされたプレプロインスリンは、リジンアミドでのアミド化の後に得られた、化合物Arg (A0), Arg (A1), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)−NH2−ヒトインスリンについての前駆体である。
【０１１７】
負に荷電したアミノ酸を、実施例12に従ってプレプロインスリン配列中に導入し得ることは、当業者に明らかである。また、実施例13と同様にして、Ａ鎖の位置１にＮ末端アミノ酸としてアルギニンを担持するインスリン誘導体の調製を可能にするプロインスリン配列をコードするプラスミドを、プラスミドpINT3702から調製することも、可能である。
【０１１８】
実施例14：プロインスリン誘導体の発現
欧州特許出願公開EP−A 1 222 207の実施例１に従って、発現を行った。
【０１１９】
実施例15：プロインスリン誘導体の折り畳み
原則としてEP−A 0 668 282に記載の方法によって、折り畳みを行った。
【０１２０】
実施例16：実施例２〜８由来のプロインスリンのトリプシンでの処理
折り畳まれたプレプロインスリンを酵素的に処理して、Ｃ末端Ｂ鎖末端がリジン又はアルギニンを特徴とする二本鎖Arg (A0)−インスリン前駆体が得られた。折り畳まれたプレプロインスリン前駆体の酵素処理を、例えばWO91/03550の実施例４に記載される通りに行った。この場合において、WO 2007/031187 A1に記載のトリプシン変異体を使用することが、特に有利であるとわかった。
【０１２１】
実施例17：実施例９〜13由来のプロインスリンのエンドプロテイナーゼLys−Cでの処理
アクロモバクター・リティカス（Achromobacter lyticus）由来のエンドプロテアーゼLys−Cは、市販されている（Merck/Calbiochem）。少し変更して、Jekel, P.A. et al. [Anal. Biochem. 134, 347−354, (1983)]によって記載される通りに、反応を行った。pHを9.5に設定し、反応温度は30℃であった。
ワンポット反応で、プレ配列を除去し、そしてThr (B30)で開始するＣペプチドを切断して、Ｂ鎖のＣ末端を酵素触媒カップリング反応の反応部位として存在するリジンによって形成した。
【０１２２】
実施例18：アルギニン−又はリジンアミドとのカップリングによる二本鎖前駆体からのArg−NH2又はLys−NH2インスリン化合物の調製
追加の酸性アミノ酸のポジショニングに関係なく、標準反応を下記の通りに行った：Arg (A0), Gly (A21), Arg (B31)−インスリンアナログ100mgを、アルギニンアミド溶液（446ｇ／Ｌ）0.95mlに溶解し、M 酢酸Na緩衝液（pH 5.8）0.13mL、及びDMF ２mlを添加した。反応混合物を12℃に冷却し、トリプシン0.094ml（0.075mg, Roche Diagnostics）を添加することによって開始した。８時間後にTFAをpH 2.5まで添加することによって反応を停止させ、HPLCによって分析した。＞60％ Arg (A0), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−インスリンアナログが形成された。US 5,656,722と同様に、トリプシン阻害剤溶液を添加し、続いて、アミド化アナログを精製した。
対応のリジンアミド化合物の調製を同様にして行った。しかし、溶液中に366ｇ／Ｌのリジンアミドを含有するリジンアミドストック水溶液が、出発材料を形成した。
【０１２３】
実施例19：Lys (A−1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)−インスリンアミドの半合成的調製
構造Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)−インスリンアミドのインスリン誘導体に対応する、実施例11に記載の化合物YKL202−8を、化合物YKL202−11、Lys (A−1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)−インスリンアミドを調製するための出発材料として用いた。該化合物200mgを100mM Na2HP04／CH3CN（50：50）混合物40mlに溶解し、pHを7.7〜8.2に設定した。さらなる材料として、Boc−Lys (Boc)−NHSエステルを、0.3mM Boc−Lys(Boc)−OH、0.4mM N−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）及び0.4mMジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）をジクロロメタン中40分間混合することによって調製した。反応混合物をロータリー真空エバポレーターで濃縮乾固した。次いで、混合物をメタノール５mlに溶解し、溶解した最初のインスリンに添加した。反応液を、少なくとも60分間、しかし多くとも120分間、室温で撹拌した。TFA 200μlを添加することによって、反応を停止させた。３成分からなるモノアシル化生成物が存在することを実証するために、反応生成物の質量をLC−MS質量分析によってキャラクタライズした。成分をHPLCによって分離した。この間、ジアシル化及びトリアシル化副生成物もまた除去した。HPLC分離由来のフラクションを、質量分析によって分析した。モノアシル化生成物を各々が有する３つのフラクションをアミノ酸配列分析にかけ、これを解釈（interpretion）して、所望の化合物を含有するHPLCフラクションの同定が可能となり、続いてこれから、Boc保護基を加水分解によって除去した。新たなHPLC精製後、所望の生産物をその生物学的特性について試験した。
【０１２４】
実施例20：His (A8), Gly (A21) プロインスリンをコードするプラスミドpINT358_ha8の調製
実施例２からの調製スキームに従い、PCR1及びPCR2についてのテンプレートとしてプラスミドpINT358dのDNAを使用することによって、His (A8), Gly (A21)プロインスリンをコードするプラスミドpINT358_ha8が得られた。該プラスミドによってコードされたプロインスリンは、形態His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−ヒトインスリンの化合物についての前駆体として機能した。アミド化前に中間体としてHis (A8), Gly (A21), Arg (B31)を得るためのプレプロインスリンの処理を、この場合において、WO91/03550に記載される通りに行った。従来のトリプシンをこの場合において使用した。
【０１２５】
実施例21：アミド化インスリン誘導体の製剤
本発明のインスリン誘導体をそれらの生物薬理学的及び物理化学的特性について試験するために、化合物の溶液を下記の通りに調製した：本発明のインスリン誘導体を、80μg／mL亜鉛（塩化亜鉛として）を含む１mM塩酸に240±５μMの標的濃度で溶解した。この目的のために、最初に、分子量及び所望の濃度に基づいて必要とされるよりも約30％高い量の凍結乾燥材料を、量り分けた。次いで、存在する濃度を分析的HPLCによって測定し、続いて、溶液を、80μg／mL亜鉛を含む５mM塩酸を用いて、標的濃度を達成するに必要な体積まで補った。必要に応じて、pHを3.5±0.1に再調節した。240±５μMの標的濃度を確認するためのHPLCによる最終分析後、完成した溶液を、0.2μmフィルターアタッチメントを備えた注射器によって無菌バイアル中へ移し、これを、隔壁及びクリンプキャップで閉じた。本発明のインスリン誘導体の短期単回テストのため、例えば等張剤、防腐剤又は緩衝物質の添加に関して、製剤の最適化は行わなかった。
【０１２６】
実施例22：酵母発現によるHis (A8), Gly (A21), Arg(B31)ヒトインスリンの調製
EP−A 1 364 032には、酵母によるヒルジン及びミニプロインスリンの融合タンパク質の発現及び分泌を記載されている。これに関連して特に有利と記載されている酵母宿主生物は、S．セレビシエ（S. cerevisiae）、K．ラクティス（K. lactis）、H．ポリモルファ（H. polymorpha）及びP．パストリス（P. pastoris）である。前記特許出願公開の実施例４は、プラスミドの構築を記載しており、これは、P．パストリスにおける融合タンパク質の調製を可能にし、このDNAは、Ａ鎖中の位置A8、A15、A18及びA21のそのアミノ酸配列がアミノ酸ヒスチジン（A8）、グルタミン酸（A15）、アスパラギン酸（A18）及びグリシン（A21）によって特徴付けられるミニプロインスリンを調製するためのテンプレートとして機能した。プライマーpichia_H_if1を使用した。下記のプライマーを新たに合成し、合成後精製した：
【０１２７】
【化１６】
0005695909.tif 000018
太字表示によって強調されているコドンは、位置A21を示す。
【０１２８】
【化１７】
0005695909.tif 000019
太字表示によって強調されているコドンは、位置A8を示す。
【０１２９】
【化１８】
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太字表示によって強調されているコドンは、位置A8を示す。
【０１３０】
部分的に重複する、プライマーpichia_G21_rev及びプライマーpichia_H8f等モル量（１μg）を、好熱性ポリメラーゼ並びに４つのデオキシヌクレオチドdATP、dCTP、dGTP及びdTTP 5′を含有するポリメラーゼ緩衝液の存在下にて95℃で変性させ、次いで56℃で10〜15分間インキュベートした。この反応１の反応体積は25μlであった。標準ポリメラーゼ連鎖反応（反応２）において、プライマーpichia_H_if1及びpichia−a1−12revを、記載のテンプレートDNAと並行して反応させた。さらなるポリメラーゼ連鎖反応において、反応１及び２の反応生産物を、テンプレートとして、プライマーpichia_H_if1／pichia_G21revと反応させた。この反応の反応生産物をゲル電気泳動によって精製した。制限酵素XhoI及びSacIIとの反応後、融合生成物をカバーするDNAフラグメントを、実施例４と同様に、記載のベクターpPICZαA中に挿入した。結果はプラスミドpPIC_ins202であった。該プラスミドによってコードされた融合タンパク質を、記載の市販の発現キットを使用して発現させた。His (A8), Gly (A21), Arg (B31)−ヒトインスリン前駆体の調製に続けて、アルギニン(B31)に関する説明に従って、アルギニンアミドのカップリングを行った。結果は、化合物 His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−インスリン（YKL203）であり、これはそれ自体、実施例20に対応する新規なスローインスリン（slow insuline）を示し、ラット実験において試験した。同様に、リジンアミドとのカップリングによって、His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)−NH2−インスリンとしてキャラクタライズされた化合物YKL203bに導かれた。
【０１３１】
しかし、前記化合物はまた、化合物Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B31) Arg(B32)−NH2−インスリンを調製するための中間体として用いることができ、その調製は、Kohn et al. [Peptides 28 (2007) 935−948]に基づいた。この目的のために、化合物 His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)−NH2−ヒトインスリン200mgを、100mM Na2HP04／CH3CN（50：50）の混合物40mlに溶解し、pHを7.7〜8.2に設定した。
【０１３２】
さらなる材料として、Boc−Arg−NHSエステルを、0.3mM Boc−Arg−OH、0.4mM Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）及び0.4mMジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）をジクロロメタン中に40分間混合することによって調製した。反応混合物をロータリー真空エバポレーターにおいて濃縮乾固した。次いで、混合物をメタノール５mlに溶解し、溶解した最初のインスリンに添加した。反応液を、少なくとも60分間、しかし多くとも120分間、室温で撹拌した。TFA 200μlを添加することによって、反応を停止させた。３成分からなるモノアシル化生成物が存在することを実証するために、反応生成物の質量をLC−MS質量分析によってキャラクタライズした。成分をHPLCによって分離した。この間、ジアシル化及びトリアシル化副生成物もまた除去した。HPLC分離由来のフラクションを、質量分析によって分析した。モノアシル化生成物を各々が有する３つのフラクションをアミノ酸配列分析にかけ、これを解釈（interpretion）して、所望の化合物を含有するHPLCフラクションの同定が可能となり、続いてこれから、Boc保護基を緩やかな加水分解によって除去した。新たなHPLC精製後、所望の生成物をその生物学的特性について試験した。
【０１３３】
実施例23：ラットにおける新規なインスリンアナログの血中グルコース低下作用の評価
選択した新規なインスリンアナログの血中グルコース低下作用を、健常雄性正常血糖Wistarラットにおいて試験した。雄性ラットに、９nmol／kgの用量のインスリンアナログを皮下注射で投与した。インスリンアナログの注射の直前、及び注射後８時間までの一定の間隔で、動物から血液サンプルを採取し、その血中グルコース含量を測定した。本発明のインスリンアナログが、明確に遅延した作用開始、及びより長く、一様な作用持続時間をもたらすことが、実験によって明らかに示された（図１参照）。
【０１３４】
実施例24：イヌにおける新規なインスリンアナログの血中グルコース低下作用の評価
選択した新規なインスリンアナログの血中グルコース低下作用を、健常雄性正常血糖ビーグル犬において試験した。雄性動物に、６nmol／kgの用量のインスリンアナログを皮下注射で投与した。インスリンアナログの注射の直前、及び注射後48時間までの一定の間隔で、動物から血液サンプルを採取し、その血中グルコース含量を測定した。本発明のインスリンアナログが、明確に遅延した浅い作用開始、及びより長く、一様な作用持続時間をもたらすことが、実験によって明らかに示された。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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