(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１７のアミノ酸配列からなるＭＳＴ１Ｒの部分ペプチドに特異的な抗原結合領域を含むヒトもしくはヒト化抗体またはその機能性断片であって、該抗原結合領域が（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＨ−ＣＤＲ３領域、配列番号２のアミノ酸配列からなるＨ−ＣＤＲ２領域、配列番号３のアミノ酸配列からなるＨ−ＣＤＲ１領域、配列番号７のアミノ酸配列からなるＬ−ＣＤＲ３領域、配列番号１３のアミノ酸配列からなるＬ−ＣＤＲ１領域、および配列番号１４のアミノ酸配列からなるＬ−ＣＤＲ２領域、（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列からなるＨ−ＣＤＲ３領域、配列番号５のアミノ酸配列からなるＨ−ＣＤＲ２領域、配列番号６のアミノ酸配列からなるＨ−ＣＤＲ１領域、配列番号８のアミノ酸配列からなるＬ−ＣＤＲ３領域、配列番号１５のアミノ酸配列からなるＬ−ＣＤＲ１領域、および配列番号１６のアミノ酸配列からなるＬ−ＣＤＲ２領域、（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＨ−ＣＤＲ３領域、配列番号２のアミノ酸配列からなるＨ−ＣＤＲ２領域、配列番号３のアミノ酸配列からなるＨ−ＣＤＲ１領域、配列番号９のアミノ酸配列からなるＬ−ＣＤＲ３領域、配列番号１３のアミノ酸配列からなるＬ−ＣＤＲ１領域、および配列番号１４のアミノ酸配列からなるＬ−ＣＤＲ２領域、（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＨ−ＣＤＲ３領域、配列番号２のアミノ酸配列からなるＨ−ＣＤＲ２領域、配列番号３のアミノ酸配列からなるＨ−ＣＤＲ１領域、配列番号１０のアミノ酸配列からなるＬ−ＣＤＲ３領域、配列番号１３のアミノ酸配列からなるＬ−ＣＤＲ１領域、および配列番号１４のアミノ酸配列からなるＬ−ＣＤＲ２領域、（ｖ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＨ−ＣＤＲ３領域、配列番号２のアミノ酸配列からなるＨ−ＣＤＲ２領域、配列番号３のアミノ酸配列からなるＨ−ＣＤＲ１領域、配列番号１１のアミノ酸配列からなるＬ−ＣＤＲ３領域、配列番号１３のアミノ酸配列からなるＬ−ＣＤＲ１領域、および配列番号１４のアミノ酸配列からなるＬ−ＣＤＲ２領域、または（ｖｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＨ−ＣＤＲ３領域、配列番号２のアミノ酸配列からなるＨ−ＣＤＲ２領域、配列番号３のアミノ酸配列からなるＨ−ＣＤＲ１領域、配列番号１２のアミノ酸配列からなるＬ−ＣＤＲ３領域、配列番号１３のアミノ酸配列からなるＬ−ＣＤＲ１領域、および配列番号１４のアミノ酸配列からなるＬ−ＣＤＲ２領域を含み、
１）ＭＳＴ１Ｒのリガンド依存的および／または非依存的リン酸化を阻害する、
２）ＭＳＴ１Ｒの前記部分ペプチドに対して、表面プラズモン共鳴による決定または溶解平衡滴定による決定で１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満または０．１ｎＭ未満のＫＤの親和性を有する、
３）ＭＳＴ１Ｒを発現する腫瘍細胞のＭＳＰ促進細胞増殖または移動を抑制する、
４）ＭＳＴ１Ｒを内在化させる、または
５）ヒトおよび少なくとも１つの他の種と交差反応性である、
抗体またはその機能性断片。
【請求項２】
ＭＳＴ１Ｒのリガンド依存的および非依存的リン酸化を阻害する請求項１に記載の抗体またはその機能性断片。
【請求項３】
ＥＲＫおよび／またはＡｋｔのリン酸化を阻害するのに加えて、ＭＳＴ１Ｒのリガンド依存的および／または非依存的リン酸化を阻害する請求項１に記載の抗体またはその機能性断片。
【請求項４】
ＥＲＫおよび／またはＡｋｔのリン酸化を阻害するのに加えて、ＭＳＴ１Ｒのリガンド依存的および非依存的リン酸化を阻害する請求項１に記載の抗体またはその機能性断片。
【請求項５】
前記他の種がマウスまたはサルである請求項１に記載の抗体またはその機能性断片。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体またはその機能性断片の抗原結合領域。
【請求項７】
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列からなる可変重鎖および配列番号２３、２７、２９、３１もしくは３３のアミノ酸配列からなる可変軽鎖または（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列からなる可変重鎖および配列番号２５のアミノ酸配列からなる可変軽鎖を含む請求項６に記載の抗原結合領域。
【請求項８】
（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号５３のアミノ酸配列からなる軽鎖または（ｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号５５、５７、５９、６１もしくは６３のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む請求項６に記載の抗原結合領域。
【請求項９】
ＩｇＧである請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
ＩｇＧ１である請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列からなる可変重鎖および配列番号２３、２７、２９、３１もしくは３３のアミノ酸配列からなる可変軽鎖または（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列からなる可変重鎖および配列番号２５のアミノ酸配列からなる可変軽鎖を含む請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体またはその機能性断片。
【請求項１２】
（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号５３のアミノ酸配列からなる軽鎖を有する抗体ならびに（ｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号５５、５７、５９、６１または６３のアミノ酸配列からなる軽鎖を有する抗体からなる群から選択される抗体。
【請求項１３】
ＦａｂまたはｓｃＦｖ抗体断片である請求項１から５、１１または１２のいずれか一項に記載の機能性断片。
【請求項１４】
（ｉ）配列番号１８の配列および配列番号２２、２６、２８、３０もしくは３２の配列または（ｉｉ）配列番号２０の配列および配列番号２４の配列を含む、配列番号１７のアミノ酸配列からなるＭＳＴ１Ｒの部分ペプチドに特異的な抗体またはその機能性断片をコードする核酸分子。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１７】
細菌細胞である請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
哺乳類細胞である請求項１６に記載の細胞。
【請求項１９】
請求項１５に記載のベクターを用いることによって抗体またはその機能性断片を産生する方法。
【請求項２０】
請求項１６から１８のいずれか一項に記載の細胞を培養することによって抗体またはその機能性断片を産生する方法。
【請求項２１】
請求項１９または２０の産生方法により得られる抗体またはその機能性断片。
【請求項２２】
合成ヒト抗体である請求項１から５、９から１２または２１のいずれか一項に記載のヒト抗体。
【請求項２３】
請求項１から５、９から１３、２１または２２のいずれか一項に記載の抗体またはその機能性断片とその薬学的に許容される担体または添加剤とを含む医薬組成物。
【請求項２４】
ＭＳＴ１Ｒの望ましくない存在に関連する疾患または状態を処置するための請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記疾患または状態がＭＳＴ１Ｒリン酸化によって引き起こされる疾患または状態である請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記疾患または状態が悪性腫瘍および／または新生物である請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記疾患または状態が乳がん、肺がん、結腸がん、膀胱がん、皮膚がん、膵臓がん、神経膠腫、リンパ腫、前立腺がん、甲状腺がん、卵巣がん、胃がん、肝臓がんまたは胃がんである請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
細胞試料中のＭＳＴ１Ｒ陽性細胞をターゲッティングする方法であって、前記ＭＳＴ１Ｒ陽性細胞を、請求項１から５、９から１３、２１または２２のいずれか一項に記載の抗体またはその機能性断片と接触させる工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ＲＯＮまたはＣＤｗ１３６とも記載される、ＭＳＴ１Ｒ（マクロファージ刺激１受容体；ヒトＭＳＴ１ＲはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２４４７．２に示されている）は、上皮由来の細胞上に見出されるｃ−Ｍｅｔ関連チロシンキナーゼである。１４００アミノ酸の単一鎖前駆体が、細胞外の４０ｋＤａのα鎖と、細胞内チロシンキナーゼドメインを含む１５０ｋＤａのβ鎖に切断されて、ジスルフィド結合したヘテロ二量体を形成する。ｃ−Ｍｅｔと同様に、ＭＳＴ１Ｒは、浸潤性細胞増殖、移動、細胞解離、およびマトリックス浸潤を誘導する［Ｗａｎｇら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２４、１２９１〜１３００、２００３；Ｌｅｅら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１、２２２２〜２２２８、２００５］。両チロシンキナーゼとも、乳がん、肺がんまたは前立腺がんなどの様々な悪性腫瘍で過剰発現される［Ｏ’Ｔｏｏｌｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６、９１６２〜９１７０、２００６］。ＭＳＰ、すなわちマクロファージ刺激タンパク質は、今のところ知られている唯一のＭＳＴ１Ｒリガンドである。ＭＳＰ結合は、ＭＳＴ１Ｒチロシンキナーゼドメインの自己リン酸化を引き起こし、それによって活性化されたＭＳＴ１Ｒは、様々な異なった経路のカスケードの伝達を行う［Ｗａｎｇら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２４、１２９１〜１３００、２００３；Ｏ’Ｔｏｏｌｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６、９１６２〜９１７０、２００６］。ｍＲＮＡスプライシングを介した、生物学的に活性な末端欠失型ＭＳＴ１Ｒバリアントの生成も報告されている［Ｗａｎｇら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２４、１２９１〜１３００、２００３］。例えば、ＭＳＴ１ＲΔ１６０バリアントは、結腸直腸癌試料のいくつかで見出されており、リガンドなしのその過剰発現は、ヌードマウスで腫瘍形成を惹起した［Ｚｈｏｕら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２、１８６〜１９７、２００３］。ＩＭＣ−４１Ａ１０のような抗ＭＳＴ１Ｒ抗体は、リガンド−受容体相互作用を遮断し、受容体および下流シグナル伝達、細胞移動ならびに腫瘍形成の強力な阻害剤である［Ｏ’Ｔｏｏｌｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６、９１６２〜９１７０、２００６］。
【０００２】
結論として、ＭＳＴ１Ｒ活性を遮断する抗体は、ヒトがんにおける潜在的な治療関連性を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＭＳＴ１Ｒに対するヒト抗体およびヒト化抗体を提供することが目的である。
【０００４】
ヒト投与に安全な抗体を提供することが別の目的である。
【０００５】
本発明の１つまたは複数の抗体を用いることによって、ＭＳＴ１Ｒの上方制御に関連した疾患および／または状態を治療する方法を提供することも目的である。これらの目的および他の目的は、本明細書においてさらに完全に記載されている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一実施形態では、抗原結合領域を含有する単離された抗体または機能性断片はＭＳＴ１Ｒに特異的である。
【０００７】
そのような抗体またはその機能性断片は、配列番号１または４のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ３（重鎖ＣＤＲ３）領域を含有する抗原結合領域を含有でき；該抗原結合領域は、配列番号２または５のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ２（重鎖ＣＤＲ２）領域をさらに含有でき；該抗原結合領域は、配列番号３または６のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ１（重鎖ＣＤＲ１）領域も含有できる。そのような抗体またはその機能性断片は、配列番号７、８、９、１０、１１または１２のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ３（軽鎖ＣＤＲ３）領域を含有する抗原結合領域を含有でき；該抗原結合領域は、配列番号１３または１５のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ１（軽鎖ＣＤＲ１）領域をさらに含有でき；該抗原結合領域は、配列番号１４または１６のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ２（軽鎖ＣＤＲ２）領域も含有できる。
【０００８】
本明細書に記載の抗体（およびその機能性断片）は、ＭＳＴ１Ｒのエピトープに特異的な抗原結合領域を含有でき、このエピトープは、配列番号１７のアミノ酸配列を有するアミノ酸の１つまたは複数のアミノ酸残基を含有する。特定の抗体において、エピトープは線形であり得、一方、他のものでは、エピトープは、コンフォメーショナル（すなわち、不連続）であり得る。これらの特性の１つまたは複数を有する抗体またはその機能性断片は、配列番号１または４のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ３領域を含有する抗原結合領域を含有でき；該抗原結合領域は、配列番号２または５のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ２領域をさらに含有でき；該抗原結合領域は、配列番号３または６のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ１領域も含有できる。本発明のそのようなＭＳＴ１Ｒ特異抗体は、配列番号７、８、９、１０、１１または１２のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ３領域を含有する抗原結合領域を含有でき；該抗原結合領域は、配列番号１３または１５に示すＬ−ＣＤＲ１領域をさらに含有でき；該抗原結合領域は、配列番号１４または１６のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ２領域も含有できる。
【０００９】
本明細書に開示の配列のペプチドバリアントは、本開示の様々な実施形態にも包含される。したがって、実施形態には、ＣＤＲ領域における、配列番号１、２、３、４、５もしくは６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ領域と少なくとも６０パーセントの配列同一性；および／またはＣＤＲ領域における、配列番号１、２、３、４、５もしくは６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ領域と少なくとも８０パーセントの配列相同性を有する重鎖アミノ酸配列を有する抗ＭＳＴ１Ｒ抗体が含まれる。更に、ＣＤＲ領域における、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ領域と少なくとも６０パーセントの配列同一性；および／またはＣＤＲ領域における、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ領域と少なくとも８０パーセントの配列相同性を有する軽鎖アミノ酸配列を有する抗ＭＳＴ１Ｒ抗体も含まれる。
【００１０】
本明細書に開示の抗体は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１）であり得、一方、抗体断片は、例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖであり得る。したがって、本発明の抗体断片は、本明細書に記載の１つまたは複数の様式で挙動する抗原結合領域であり得る、または該抗原結合領域を含有し得る。
【００１１】
別の実施形態は、それぞれが、ＭＳＴ１Ｒのエピトープに特異的なヒト抗体またはその機能性断片の抗原結合領域をコードできる単離された核酸配列にも関する。そのような核酸配列は、抗体の可変重鎖をコードでき、配列番号１８、２０、または配列番号１８もしくは２０の相補鎖と高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成する核酸配列からなる群から選択される配列を含有する。核酸は、単離された抗体またはその機能性断片の可変軽鎖をコードし得、配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、または配列番号２２、２４、２６、２８、３０もしくは３２の相補鎖と高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成する核酸配列からなる群から選択される配列を含有し得る。
【００１２】
本明細書に記載の核酸は、遺伝子組換え体生産に適している。したがって、本明細書に開示の核酸配列を含有するベクターおよび宿主細胞もさらに別の実施形態である。
【００１３】
本明細書に記載の組成物は、治療用または予防用の適用に使用できる。したがって、これらの実施形態は、本発明の抗体（または機能性抗体断片）と、その薬学的に許容される担体または添加剤とを含有する医薬組成物を含む。関連した態様では、別の実施形態は、ＭＳＴ１ＲまたはＭＳＴ１Ｒ発現細胞の望ましくない存在に関連した疾患または状態を処置する方法を含む。そのような方法は、本明細書で記載または企図されているように、本発明の抗体を含有する医薬組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与するステップを含む。
【００１４】
さらに他の実施形態は、線形形態またはコンフォメーショナル形態のいずれかである、ＭＳＴ１Ｒの単離されたエピトープと、当該エピトープに特異的な抗原結合領域を含む抗体またはその機能性断片の単離のためのそれらの使用とに関する。この点で、コンフォメーショナルエピトープは、配列番号１７中の１つまたは複数のアミノ酸残基を含有できる。ＭＳＴ１Ｒのエピトープは、例えば、抗体またはそれらの機能性断片（抗体または抗体断片のそれぞれは、そのようなエピトープに特異的な抗原結合領域を含む）の単離に用いることができ、この単離は、ＭＳＴ１Ｒの前記エピトープを抗体ライブラリーと接触させるステップと、抗体（複数可）またはその機能性断片（複数可）を単離するステップとを含む。
【００１５】
別の実施形態では、本開示は、基本的に配列番号１７のアミノ酸配列からなるＭＳＴ１Ｒの単離されたエピトープを提供する。本明細書で使用される場合、そのようなエピトープは、付加的な特質を加えた、すぐ前に先行するアミノ酸配列のうちの１つ「から基本的になる」。ただし、付加的な特質は、エピトープの基本的特徴および新規な特徴に実質的な影響を与えない。
【００１６】
本開示は、（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基を含むＭＳＴ１Ｒの単離されたエピトープ；（ｉｉ）抗体ライブラリー；および（ｉｉｉ）抗体ライブラリーを使用して、そのようなエピトープに特異的に結合する、そのようなライブラリーの１つまたは複数のクローンを単離するための説明を有するキットも対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】様々な新規抗体可変重鎖領域のアミノ酸配列を提示し、ＣＤＲおよびフレームワーク（ＦＲ）領域を示す図である。ＶＨ３配列（配列番号８０）は、ＭＯＲ０７６９２、ＭＯＲ０７９２３、ＭＯＲ０７９２４、ＭＯＲ０７９２５、ＭＯＲ０７９２６の可変重鎖領域配列（配列番号１９）とアライメントされており、ＶＨ５配列（配列番号８１）は、ＭＯＲ０７９１９の可変重鎖領域配列（配列番号２１）とアライメントされている。
【図２Ａ】様々な新規抗体可変軽鎖領域のアミノ酸配列を提示し、ＣＤＲおよびフレームワーク（ＦＲ）領域を示す図である。ＶＬκ３配列（ＶＬｋ３；配列番号８２）は、ＭＯＲ０７６９２（配列番号２３）、ＭＯＲ０７９２３（配列番号２７）、ＭＯＲ０７９２４（配列番号２９）、ＭＯＲ０７９２５（配列番号３１）、ＭＯＲ０７９２６（配列番号３３）の可変軽鎖領域配列とアライメントされており、ＶＬλ３配列（ＶＬｌ３；配列番号８３）は、ＭＯＲ０７９１９の可変軽鎖領域配列（配列番号２５）とアライメントされている。
【図２Ｂ】様々な新規抗体可変軽鎖領域のアミノ酸配列を提示し、ＣＤＲおよびフレームワーク（ＦＲ）領域を示す図である。ＶＬκ３配列（ＶＬｋ３；配列番号８２）は、ＭＯＲ０７６９２（配列番号２３）、ＭＯＲ０７９２３（配列番号２７）、ＭＯＲ０７９２４（配列番号２９）、ＭＯＲ０７９２５（配列番号３１）、ＭＯＲ０７９２６（配列番号３３）の可変軽鎖領域配列とアライメントされており、ＶＬλ３配列（ＶＬｌ３；配列番号８３）は、ＭＯＲ０７９１９の可変軽鎖領域配列（配列番号２５）とアライメントされている。
【図３Ａ】図３Ａ（ＭＯＲ０７６９２、ＭＯＲ０７９２３、ＭＯＲ０７９２４、ＭＯＲ０７９２５、ＭＯＲ０７９２６；配列番号１８）は、様々な新規抗体可変重鎖領域の核酸配列を提示する図である。
【図３Ｂ】図３Ｂ（ＭＯＲ０７９１９；配列番号２０）は、様々な新規抗体可変重鎖領域の核酸配列を提示する図である。
【図３Ｃ】図３Ｃ（ＭＯＲ０７６９２、ＭＯＲ０７９２３、ＭＯＲ０７９２４、ＭＯＲ０７９２５、ＭＯＲ０７９２６；配列番号１９）は、様々な新規抗体可変重鎖領域のアミノ酸配列を提示する図である。ＣＤＲ領域Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、およびＨ−ＣＤＲ３は、Ｎ末端からＣ末端に向けて指定され、太字体と下線で表されている。
【図３Ｄ】図３Ｄ（ＭＯＲ０７９１９；配列番号２１）は、様々な新規抗体可変重鎖領域のアミノ酸配列を提示する図である。ＣＤＲ領域Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、およびＨ−ＣＤＲ３は、Ｎ末端からＣ末端に向けて指定され、太字体と下線で表されている。
【図４Ａ】図４Ａ（ＭＯＲ０７６９２；配列番号２２）は、様々な新規な抗体可変軽鎖領域の核酸配列を提示する図である。
【図４Ｂ】図４Ｂ（ＭＯＲ０７９１９；配列番号２４）は、様々な新規な抗体可変軽鎖領域の核酸配列を提示する図である。
【図４Ｃ】図４Ｃ（ＭＯＲ０７９２３；配列番号２６）は、様々な新規な抗体可変軽鎖領域の核酸配列を提示する図である。
【図４Ｄ】図４Ｄ（ＭＯＲ０７９２４；配列番号２８）は、様々な新規な抗体可変軽鎖領域の核酸配列を提示する図である。
【図４Ｅ】図４Ｅ（ＭＯＲ０７９２５；配列番号３０）は、様々な新規な抗体可変軽鎖領域の核酸配列を提示する図である。
【図４Ｆ】図４Ｆ（ＭＯＲ０７９２６；配列番号３２）は、様々な新規な抗体可変軽鎖領域の核酸配列を提示する図である。
【図４Ｇ】図４Ｇ（ＭＯＲ０７６９２；配列番号２３）は、様々な新規な抗体可変軽鎖領域のアミノ酸配列を提示する図である。ＣＤＲ領域Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３は、Ｎ末端からＣ末端に向けて指定され、太字体と下線で表されている。
【図４Ｈ】図４Ｈ（ＭＯＲ０７９１９；配列番号２５）は、様々な新規な抗体可変軽鎖領域のアミノ酸配列を提示する図である。ＣＤＲ領域Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３は、Ｎ末端からＣ末端に向けて指定され、太字体と下線で表されている。
【図４Ｉ】図４Ｉ（ＭＯＲ０７９２３；配列番号２７）は、様々な新規な抗体可変軽鎖領域のアミノ酸配列を提示する図である。ＣＤＲ領域Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３は、Ｎ末端からＣ末端に向けて指定され、太字体と下線で表されている。
【図４Ｊ】図４Ｊ（ＭＯＲ０７９２４；配列番号２９）は、様々な新規な抗体可変軽鎖領域のアミノ酸配列を提示する図である。ＣＤＲ領域Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３は、Ｎ末端からＣ末端に向けて指定され、太字体と下線で表されている。
【図４Ｋ】図４Ｋ（ＭＯＲ０７９２５；配列番号３１）は、様々な新規な抗体可変軽鎖領域のアミノ酸配列を提示する図である。ＣＤＲ領域Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３は、Ｎ末端からＣ末端に向けて指定され、太字体と下線で表されている。
【図４Ｌ】図４Ｌ（ＭＯＲ０７９２６；配列番号３３）は、様々な新規な抗体可変軽鎖領域のアミノ酸配列を提示する図である。ＣＤＲ領域Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３は、Ｎ末端からＣ末端に向けて指定され、太字体と下線で表されている。
【図５】様々なコンセンサスベースのヒトコンビナトリアル抗体ライブラリー（ＨｕＣＡＬ（登録商標））の抗体マスター遺伝子配列の可変重鎖領域のアミノ酸配列を提示する図である。ＣＤＲ領域Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、およびＨ−ＣＤＲ３は、Ｎ末端からＣ末端に向けて指定され、下線で表されている。上側の行は、ＭＯＲ０７９１９（配列番号２１）であり、下側の行は、ＭＯＲ０７６９２／７９２３／７９２４／７９２５／７９２６（配列番号１９）である。
【図６】様々なコンセンサスベースＨｕＣＡＬの抗体マスター遺伝子配列の可変軽鎖領域のアミノ酸配列を提示する図である。ＣＤＲ領域Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３は、Ｎ末端からＣ末端に向けて指定され、下線で表されている。２セットの行は、上から下に向けて以下の通りである：それぞれＭＯＲ０７９１９（配列番号２５）、ＭＯＲ０７６９２（配列番号２３）、ＭＯＲ０７９２３（配列番号２７）、ＭＯＲ０７９２４（配列番号２９）、ＭＯＲ０７９２５（配列番号３１）、ＭＯＲ０７９２６（配列番号３３）。
【図７Ａ】ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿ＩｇＧ１ｆから発現される、様々な新規抗体重鎖の核酸配列およびアミノ酸配列（図７Ａ：ＭＯＲ０７９１９）を提示する図である。ＣＤＲ領域は、太字体および下線で表されている。ＶＨリーダーおよび重鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれ斜字体または斜字体および太字体で示されている。配列決定プライマーの制限部位およびプライミング部位が配列の上または配列の下に指定されている。図７Ａの核酸配列は配列番号６４によって表され、アミノ酸配列は配列番号６５である。
【図７Ｂ】ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿ＩｇＧ１ｆから発現される、様々な新規抗体重鎖の核酸配列およびアミノ酸配列（図７Ｂ：ＭＯＲ０７６９２、ＭＯＲ０７９２３、ＭＯＲ０７９２４、ＭＯＲ０７９２５、およびＭＯＲ０７９２６）を提示する図である。ＣＤＲ領域は、太字体および下線で表されている。ＶＨリーダーおよび重鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれ斜字体または斜字体および太字体で示されている。配列決定プライマーの制限部位およびプライミング部位が配列の上または配列の下に指定されている。図７Ｂの核酸配列は配列番号６６によって表され、アミノ酸配列は配列番号６７である。
【図８】ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿Ｉｇ＿ｌａｍｂｄａ２から発現される、新規抗体ラムダ軽鎖（ＭＯＲ０７９１９）の核酸配列（配列番号６８）およびアミノ酸配列（配列番号６９）を提示する図である。ＣＤＲ領域は、太字体および下線で表されている。ＶＬリーダーおよびラムダ軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれ斜字体または斜字体および太字体で示されている。配列決定プライマーの制限部位およびプライミング部位が配列の上または配列の下に指定されている。
【図９Ａ】ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿Ｉｇ＿カッパから発現される、様々な新規抗体カッパ軽鎖の核酸配列およびアミノ酸配列を提示する図である。ＣＤＲ領域は、太字体および下線で表されている。ＶＬリーダーおよびカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれ斜字体または斜字体および太字体で示されている。配列決定プライマーの制限部位およびプライミング部位が配列の上または配列の下に指定されている。図９Ａの核酸配列は配列番号７０によって表され、アミノ酸配列は配列番号７１（ＭＯＲ０７６９２）である。
【図９Ｂ】ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿Ｉｇ＿カッパから発現される、様々な新規抗体カッパ軽鎖の核酸配列およびアミノ酸配列を提示する図である。ＣＤＲ領域は、太字体および下線で表されている。ＶＬリーダーおよびカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれ斜字体または斜字体および太字体で示されている。配列決定プライマーの制限部位およびプライミング部位が配列の上または配列の下に指定されている。図９Ｂの核酸配列は配列番号７２によって表され、アミノ酸配列は配列番号７３（ＭＯＲ０７９２３）である。
【図９Ｃ】ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿Ｉｇ＿カッパから発現される、様々な新規抗体カッパ軽鎖の核酸配列およびアミノ酸配列を提示する図である。ＣＤＲ領域は、太字体および下線で表されている。ＶＬリーダーおよびカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれ斜字体または斜字体および太字体で示されている。配列決定プライマーの制限部位およびプライミング部位が配列の上または配列の下に指定されている。図９Ｃの核酸配列は配列番号７４によって表され、アミノ酸配列は配列番号７５（ＭＯＲ０７９２４）である。
【図９Ｄ】ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿Ｉｇ＿カッパから発現される、様々な新規抗体カッパ軽鎖の核酸配列およびアミノ酸配列を提示する図である。ＣＤＲ領域は、太字体および下線で表されている。ＶＬリーダーおよびカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれ斜字体または斜字体および太字体で示されている。配列決定プライマーの制限部位およびプライミング部位が配列の上または配列の下に指定されている。図９Ｄの核酸配列は配列番号７６によって表され、アミノ酸配列は配列番号７７（ＭＯＲ０７９２５）である。
【図９Ｅ】ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿Ｉｇ＿カッパから発現される、様々な新規抗体カッパ軽鎖の核酸配列およびアミノ酸配列を提示する図である。ＣＤＲ領域は、太字体および下線で表されている。ＶＬリーダーおよびカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれ斜字体または斜字体および太字体で示されている。配列決定プライマーの制限部位およびプライミング部位が配列の上または配列の下に指定されている。図９Ｅの核酸配列は配列番号７８によって表され、アミノ酸配列は配列番号７９（ＭＯＲ０７９２６）である。
【図１０】ＭＳＴＩＲオーソログに対する単離された抗体（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＩｇＧ１、２μｇ／ｍｌ）の交差反応性を実証するＦＡＣＳ分析を提示する図である。
【図１１】ＰＢＳ対照と比較した、ヒトＭＳＴ１Ｒの２５〜５７１部分に対するＭＯＲ０７６９２、ＭＯＲ０７９１９、ＭＯＲ０７９２３、ＭＯＲ０７９２４、ＭＯＲ０７９２５、およびＭＯＲ０７９２６の結合活性を示す図である。ｎ＝３のｔ検定分析を用いると、ｐ値は以下の通りである：ＭＯＲ０７６９２：４．５６Ｅ−０７；ＭＯＲ０７９１９：１．４３Ｅ−０５；ＭＯＲ０７９２３：２．１０Ｅ−０５；ＭＯＲ０７９２４：１．４２Ｅ−０６；ＭＯＲ０７９２５：９．７４Ｅ−０７；およびＭＯＲ０７９２６：１．５３Ｅ−０６。
【図１２】リガンドの非存在下におけるＥｌｋ１トランスレポーター抑制活性を示す図である。ｔ検定分析、および５μｇ／ｍｌの抗体濃度を用いると、ｐ値は以下の通りである：ＭＯＲ０７６９２：５．３９Ｅ−０６；ＭＯＲ０７９１９：３．１９Ｅ−０４；およびＭＯＲ０７９２５：３．７８Ｅ−０５。
【図１３】５７０ｎｍを参照にして４５０ｎｍの吸光度を様々な時点（分）でｈＩｇＧ対照と比較した、ＭＯＲ０７６９２による、２００ｎｇ／ｍｌのＭＳＰによって誘導されたリン酸化の阻害を示す図である。５分の時点では、ｐ値は５．４３Ｅ−０５であり、１５分の時点では、ｐ値は４．７６Ｅ−０６である。
【図１４】架橋された抗体１μｇ／ｍｌの存在下または非存在下において抗体無しおよびｈＩｇＧ対照と比較した、１μｇ／ｍｌのＭＯＲ０７６９２による、１００ｎｇ／ｍｌのＭＳＰによって誘導された、ＥＲＫのリン酸化の阻害を例証するウェスタンブロットを示す図である。
【図１５】１００ｎｇ／ｍｌのＭＳＰの存在下または非存在下における、ＭＳＰ誘導の細胞増殖（％）に対する、特定の抗体または無抗体対照の阻害活性を示す図である。様々な抗体について、ｐ値は以下の通りである：ＭＯＲ０７６９２：０．０００１；ＭＯＲ０７９１９：０．２０３７；ＭＯＲ０７９２３：０．０１０６；ＭＯＲ０７９２４：０．０２０３；ＭＯＲ０７９２５：０．００４２；およびＭＯＲ０７９２６：０．００４４。
【図１６】示されている抗ＭＳＴ１Ｒ抗体による、ＭＳＰ誘導の移動の阻害を示す図である。
【図１７】示されている抗ＭＳＴ１Ｒ抗体の細胞内在化誘導能力を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本開示は、ＭＳＴ１Ｒに特異的であるか、または高親和性を有し、かつ個体に治療的有用性をもたらすことができる新規な抗体の発見に基づいている。本明細書に開示の抗体は、ヒトまたはヒト化抗体であり得、多くのコンテクストで用いることができる。これらについては、本明細書において、さらに完全に記載されている。
【００１９】
「ヒト」抗体または機能性ヒト抗体断片は、ここで、キメラではなく（例えば、「ヒト化」ではない）、かつ（全体的または部分的に）非ヒト種由来でないものと定義される。ヒト抗体または機能性抗体断片は、ヒトから得られるものであり得、あるいは合成ヒト抗体であり得る。「合成ヒト抗体」は、本明細書では、既知のヒト抗体配列の分析に基づいた合成配列から全体的または部分的にｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで得られる配列を有する抗体と定義される。ヒト抗体配列またはその断片のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ設計は、例えば、ヒト抗体配列または抗体断片配列のデータベースを分析し、そこから得られたデータを利用したポリペプチド配列を創出することによって実現できる。ヒト抗体または機能性抗体断片の別の例は、ヒト起源の抗体配列のライブラリー（すなわち、そのようなライブラリーはヒト天然源から得られた抗体に基づいている）から単離される核酸によってコードされるものである。
【００２０】
「ヒト化抗体」または機能性ヒト化抗体断片は、本明細書では、（ｉ）非ヒト供給源（例えば、異種免疫系を有するトランスジェニックマウス）から得られるものであり、ヒト生殖系列配列に基づく抗体；または（ｉｉ）可変ドメインが非ヒト起源から得られ、定常ドメインがヒト起源から得られるキメラであるもの；または（ｉｉｉ）可変ドメインのＣＤＲが非ヒト起源から得られ、一方、可変ドメインの１つまたは複数のフレームワークがヒト起源のものであり、かつ（もしあるならば）定常ドメインがヒト起源のものである、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植されたもの、と定義される。
【００２１】
本明細書で使用される場合、抗体が抗原（ここでは、ＭＳＴ１Ｒ）「に特異的に結合する」とは、そのような抗原と１つまたは複数の参照抗原とをそのような抗体が識別できる場合に、抗原「に対して／に特異的である」、または抗原を「特異的に認識する」ことである。これは、結合特異性が絶対的なものではなく、相対的特性であるためである。その最も一般的な形態において（かつ特定された参照が言及されていない場合）、「特異的な結合」は、例えば下記の方法の１つに従って決定される、対象とする抗原と、無関係の抗原とを識別する抗体の能力を指している。そのような方法は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ試験、ＲＩＡ試験、ＥＣＬ試験、ＩＲＭＡ試験、およびペプチドスキャンを含むが、これらに限定されない。例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを実行することができる。スコアリングは、標準的な発色（例えば、ホースラディッシュペルオキシド付きの二次抗体とテトラメチルベンジジンおよび過酸化水素）によって行うことができる。特定のウェル内の反応が、例えば４５０ｎｍの光学濃度によってスコアリングされる。典型的なバックグランド（＝陰性反応）は、０．１ＯＤであり得、典型的な陽性反応は、１ＯＤであり得る。これは、陽性／陰性差が１０倍超であり得ることを意味する。典型的には、結合特異性の決定は、粉ミルク、ＢＳＡ、トランスフェリンまたは同様のものなど、単一の参照抗原ではなく、およそ３種から５種の無関係な抗原のセットを用いることによって行われる。
【００２２】
しかし、「特異的な結合」は、標的抗原と、基準点として使用される１つまたは複数の密接に関連した抗原との識別、例えば標的ＭＳＴ１Ｒと標的セマホリンとの識別を行う抗体の能力も指し得る。加えて、「特異的な結合」は、その標的抗原の異なった部分、例えば、標的ＭＳＴ１ＲのＮ末端領域もしくはＣ末端領域中のエピトープなど、ＭＳＴ１Ｒの異なったドメインもしくは領域相互の識別、または標的ＭＳＴ１Ｒの１つもしくは複数の主要なアミノ酸残基もしくはアミノ酸残基のストレッチ相互の識別を行う抗体の能力に関係し得る。
【００２３】
また、本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、ここで、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＤクラス（またはその任意のサブクラス）に属するタンパク質と定義され、従来知られている抗体およびそれらの機能性断片すべてを含む。抗体／免疫グロブリンの「機能性断片」は、ここで、抗原結合領域を保持する抗体／免疫グロブリンの断片（例えば、ＩｇＧの可変領域）と定義される。抗体の「抗原結合領域」は、典型的には、抗体の１つまたは複数の超可変領域、すなわち、ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２および／またはＣＤＲ−３領域にある。しかし、可変「フレームワーク」領域も、ＣＤＲに足場を提供することなどによって、抗原結合に重要な役割を果たすことができる。様々な実施形態で、「抗原結合領域」は、少なくとも可変軽（ＶＬ）鎖のアミノ酸残基４から１０３および可変重（ＶＨ）鎖のアミノ酸残基５から１０９、ＶＬのアミノ酸残基３から１０７およびＶＨのアミノ酸残基４から１１１を含み、完全なＶＬ鎖およびＶＨ鎖である（ＶＬのアミノ酸位置１から１０９およびＶＨのアミノ酸位置１から１１３；ＷＯ９７／０８３２０による付番）。本明細書に記載の実施形態で使用するための免疫グロブリンの例示的クラスはＩｇＧである。本発明の「機能性断片」には、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、およびｓｃＦｖのドメインが含まれる。Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂは、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間に生じる分子間ジスルフィド相互作用を最小にするか、または完全に除去するように構築できる。
【００２４】
本明細書に記載の抗体は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ設計され、合成により生成された核酸によってコードされたアミノ酸配列に基づいた組換え体抗体ライブラリーから得ることができる。抗体配列のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ設計は、例えば、ヒト配列のデータベースを分析し、そこから得られたデータを利用してポリペプチド配列を創出することによって実現される。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ生成配列を設計および取得する方法は、例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれている、Ｋｎａｐｐｉｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７〜８６、２０００；Ｋｒｅｂｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５４：６７〜８４、２００１；およびＫｎａｐｐｉｋらに発行された米国特許第６，３００，０６４号に記載されている。
（本明細書に記載の抗体）
この開示を通して、次の代表的抗体、すなわち「抗体ｎｏｓ．」または「ＬＡＣＳ」または「ＭＯＲ」Ｘに言及する。ＭＯＲ  Ｘは、配列番号１８または２０（ＤＮＡ）／配列番号１９または２１（タンパク質）に対応する可変重鎖領域ならびに配列番号２２、２４、２６、２８、３０および３２（ＤＮＡ）／配列番号２３、２５、２７、２９、３１および３３（タンパク質）からなる群から選択される可変軽鎖領域を有する抗体を表す。
【００２５】
一例では、本開示は、配列番号１８（ＤＮＡ）／配列番号１９（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号２２（ＤＮＡ）／配列番号２３（タンパク質）に対応する可変軽鎖を有する抗体を提供する。
【００２６】
一例では、本開示は、配列番号２０（ＤＮＡ）／配列番号２１（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号２４（ＤＮＡ）／配列番号２５（タンパク質）に対応する可変軽鎖を有する抗体を提供する。
【００２７】
一例では、本開示は、配列番号１８（ＤＮＡ）／配列番号１９（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号２６（ＤＮＡ）／配列番号２７（タンパク質）に対応する可変軽鎖を有する抗体を提供する。
【００２８】
一例では、本開示は、配列番号１８（ＤＮＡ）／配列番号１９（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号２８（ＤＮＡ）／配列番号２９（タンパク質）に対応する可変軽鎖を有する抗体を提供する。
【００２９】
一例では、本開示は、配列番号１８（ＤＮＡ）／配列番号１９（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号３０（ＤＮＡ）／配列番号３１（タンパク質）に対応する可変軽鎖を有する抗体を提供する。
【００３０】
一例では、本開示は、配列番号１８（ＤＮＡ）／配列番号１９（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号３２（ＤＮＡ）／配列番号３３（タンパク質）に対応する可変軽鎖を有する抗体を提供する。
【００３１】
別の態様では、本開示は、下記の抗体を提供する。
【００３２】
一例では、本開示は、配列番号１または４のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ３（重鎖ＣＤＲ３）領域を含有する抗原結合領域を含有する抗体を提供し；該抗原結合領域は、配列番号２または５のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ２（重鎖ＣＤＲ２）領域をさらに含有でき；該抗原結合領域は、配列番号３または６のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ１（重鎖ＣＤＲ１）領域も含有できる。そのような抗体は、配列番号７、８、９、１０、１１または１２のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ３（軽鎖ＣＤＲ３）領域を含有する抗原結合領域を含有でき；該抗原結合領域は、配列番号１３か１５のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ１（軽鎖ＣＤＲ１）領域をさらに含有でき；該抗原結合領域は、配列番号１４または１６のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ２（軽鎖ＣＤＲ２）領域も含有できる。
【００３３】
本開示は、（ｉ）Ｈ−ＣＤＲ３領域が配列番号１のアミノ酸配列を有し、Ｈ−ＣＤＲ２領域が配列番号２のアミノ酸配列を有し、Ｈ−ＣＤＲ１領域が配列番号３のアミノ酸配列を有する、（ｉｉ）Ｈ−ＣＤＲ３領域が配列番号４のアミノ酸配列を有し、Ｈ−ＣＤＲ２領域が配列番号５のアミノ酸配列を有し、Ｈ−ＣＤＲ１領域が配列番号６のアミノ酸配列を有する、抗原結合領域を含有する抗体も提供する。
【００３４】
一実施形態は、（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ３領域、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ１領域、および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ２領域、（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ３領域、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ１領域、および配列番号１６のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ２領域、（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ３領域、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ１領域、および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ２領域、（ｉｖ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ３領域、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ１領域、および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ２領域、（ｖ）配列番号１１のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ３領域、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ１領域、および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ２領域、または（ｖｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ３領域、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ１領域、および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ２領域からなる群から選択される抗原結合領域を含有する抗体も提供する。
【００３５】
別の実施形態は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ３領域、配列番号２のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ２領域、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ１領域、配列番号７のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ３領域、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ１領域、および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ２領域、（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ３領域、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ２領域、配列番号６のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ１領域、配列番号８のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ３領域、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ１領域、および配列番号１６のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ２領域、（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ３領域、配列番号２のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ２領域、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ１領域、配列番号９のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ３領域、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ１領域、および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ２領域、（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ３領域、配列番号２のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ２領域、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ１領域、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ３領域、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ１領域、および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ２領域、（ｖ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ３領域、配列番号２のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ２領域、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ１領域、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ３領域、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ１領域、および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ２領域、ならびに（ｖｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ３領域、配列番号２のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ２領域、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ１領域、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ３領域、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ１領域、および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ２領域からなる群から選択される抗原結合領域を含有する抗体を提供する。
【００３６】
別の態様では、本開示は、下記の抗体を提供する。
【００３７】
一実施形態は、（ｉ）配列番号４９または５１のアミノ酸配列を有する重鎖；ならびに（ｉｉ）配列番号５３、５５、５７、５９、６１、および６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体も提供する。
【００３８】
さらに別の実施形態は、（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号５３のアミノ酸配列を有する軽鎖（「ＭＯＲ０７９１９」と命名されている）、（ｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号５５のアミノ酸配列を有する軽鎖（「ＭＯＲ０７６９２」と命名されている）、（ｉｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号５７のアミノ酸配列を有する軽鎖（「ＭＯＲ０７９２３」と命名されている）、（ｉｖ）配列番号５１のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖（「ＭＯＲ０７９２４」と命名されている）、（ｖ）配列番号５１のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号６１のアミノ酸配列を有する軽鎖（「ＭＯＲ０７９２５」と命名されている）、（ｖｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号６３のアミノ酸配列を有する軽鎖（「ＭＯＲ０７９２６」と命名されている）からなる群から選択される抗体を提供する。
【００３９】
一態様では、本開示は、配列番号１７のアミノ酸配列を有する、標的ＭＳＴ１Ｒの１つまたは複数の領域に特異的に結合することができる、または高親和性を有する抗原結合領域を有する抗体を提供する。抗体は、親和性測定値が、ＫＤで少なくとも１００ｎＭ（Ｆａｂ断片の一価親和性）である場合に、抗原に「高親和性」を有すると言われる。例えば、本明細書に記載の抗体または抗原結合領域は、約１００ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、または約３０ｎＭ未満の親和性でＭＳＴ１Ｒに結合することができる。別の実施形態は、約１０ｎＭ未満または約３ｎＭ未満の親和性でＭＳＴ１Ｒに結合する抗体を含む。特に、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＭＳＴ１Ｒの部分ペプチドに特異的な抗原結合領域を含む単離されたヒトもしくはヒト化抗体またはその機能性断片であって、ＭＳＴ１Ｒの部分ペプチドに対して、表面プラズモン共鳴による決定で、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．５ｎＭ未満または約０．１ｎＭ未満のＫＤの親和性を有する、抗体またはその機能性断片。一方、ＭＳＴ１Ｒの部分ペプチドに対して、溶解平衡滴定による決定で、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．５ｎＭ未満または０．１ｎＭ未満のＫＤの親和性。例えば、ＭＳＴ１Ｒに対する、本明細書に記載の抗体の親和性は、約０．９８ｎＭまたは０．０２ｎＭ（Ｆａｂ断片の一価親和性）であり得る。
【００４０】
表１は、表面プラズモン共鳴法（Ｂｉａｃｏｒｅ）および溶解平衡滴定（ＳＥＴ）によって決定された、本明細書に開示の代表的抗体の親和性の概要を示す。
【００４１】
【表１】
0005714511.tif 000002
表１に関して、固定化した組換え体ヒトＭＳＴ１Ｒに関する表面プラズモン共鳴法（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって、ＭＯＲ  Ｘ抗体の親和性を測定した。直接固定化された抗原について、Ｂｉａｃｏｒｅ研究を行った。ＭＯＲｓ  ＸのＦａｂフォーマットは、固定化されたＭＳＴ１Ｒタンパク質について、約０．０２から０．９８ｎＭの間の範囲の一価親和性を示し、Ｆａｂ  ＭＯＲ０７９２５が最も高い親和性を示し、Ｆａｂ  ＭＯＲ０７９２３およびＭＯＲ０７９２６がそれに続く。加えて、ＳＥＴ研究では、ＭＯＲｓ  ＸのＦａｂフォーマットは、約０．０１から０．２７ｎＭの間の範囲の親和性を示し、Ｆａｂ  ＭＯＲ０７９２５が最も高い親和性を示し、Ｆａｂ  ＭＯＲ０７９２３およびＭＯＲ０７９２４がそれに続く。
【００４２】
本明細書に記載の抗体の別の特質は、ＭＳＴ１ＲのＮ末端領域内の区域へのそれらの特異性である。例えば、本明細書に開示のＭＯＲ  Ｘは、ＭＳＴ１ＲのＮ末端領域に特異的に結合することができる。
【００４３】
本明細書に記載の抗体が結合するエピトープのタイプは、線形（すなわち、１つの連続したアミノ酸ストレッチ）でも、コンフォメーショナル（すなわち、複数のアミノ酸ストレッチ）でもよい。特定の抗体のエピトープが線形であるか、コンフォメーショナルであるか決定するために、当業者は、ＭＳＴ１Ｒの異なったドメインをカバーする、オーバーラップしているペプチド（例えば、１１アミノ酸のオーバーラップを有する１３ｍｅｒアミノ酸長ペプチド）への抗体の結合を分析することができる。配列番号１７のアミノ酸配列を有する組換え体ＭＳＴ１Ｒ部分ペプチドを用いてＥＬＩＳＡ分析を行った。ＭＯＲ  Ｘは、同じ組換え体ＭＳＴ１Ｒタンパク質の変性型を検出するためのイムノブロット分析に適用可能でなかったので、ＭＯＲ  Ｘは、配列番号１７のアミノ酸残基内にコンフォメーショナルエピトープを有するにちがいない。
【００４４】
本明細書に開示の抗体は、ヒト、および例えばサルまたはマウスであり得る少なくとも１つの他の種と交差反応性を有する。例えば、少なくともカニクイザルと交差反応性を有する抗体は、同じ抗体を用いて複数の動物種でｉｎ  ｖｉｖｏ研究を行う目的において、既知の抗標的ＭＳＴ１Ｒ抗体を上回る、より大きな柔軟性と利益とを提供できる。
【００４５】
一実施形態では、記載の抗体は、ＭＳＴ１Ｒに結合できるだけでなく、ＭＳＴ１Ｒの活性化も阻害できる。受容体の阻害は、受容体の内因性キナーゼ活性の抑制をもたらし、シグナル伝達を下方制御する。そのような下方制御は、例えば、ＭＳＴ１Ｒへのリガンド結合を制限することによって、ＭＳＴ１Ｒのコンフォメーションを変えることによって、またはＭＳＴ１Ｒの内在化によって起こり得る。より詳細には、本明細書に開示の抗体は、抗体エフェクター機能を介してＭＳＴ１Ｒによりその治療効果を媒介することができる。
【００４６】
さらに別の実施形態は、本明細書に記載の抗体による、ＭＳＴ１Ｒのリガンド依存的ＭＳＴ１Ｒリン酸化活性の阻害に関する。開示の抗体は、「Ｅｌｋ１ルシフェラーゼアッセイ」などのＭＳＰ依存的ＭＳＴ１Ｒシグナル伝達アッセイシステムにおいて、少なくとも１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｎｇ／ｍｌ、または少なくとも５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０値を有する。
【００４７】
本明細書に記載の別の抗体は、リガンド非依存的ＭＳＴ１Ｒ活性化も阻害する。
【００４８】
本明細書に開示のさらに別の抗体は、ＭＳＴ１ＲリガンドＭＳＰに反応するＥＲＫリン酸化も阻害する。
【００４９】
本明細書に記載のさらに別の抗体は、ＭＳＴ１Ｒを発現する腫瘍細胞の、ＭＳＰ促進増殖も抑制する。
（ペプチドバリアント）
本開示を通して記載される抗体は、本明細書に示す特定のペプチド配列に限定されない。むしろ、これらのポリペプチドのバリアントも具現化される。本開示ならびに従来から利用可能な技術および参考文献を参照して、当業者であれば、本明細書に開示の抗体の機能性バリアントを調製、試験、利用することができ、同時に、ＭＳＴ１Ｒのリガンド依存的および／または非依存的活性化の両方／いずれかを抑制する能力を有するこれらのバリアントが本発明の範囲に包含されることが理解されよう。
【００５０】
バリアントは、例えば、少なくとも１つの改変された相補性決定領域（ＣＤＲ）（超可変）、および／またはフレームワーク（ＦＲ）（可変）ドメイン／位置、を有する抗体を、本明細書に開示のペプチド配列と突き合わせて、含むことができる。この概念を、さらによく説明するため、以下に抗体構造を簡単に記載する。
【００５１】
抗体は、２本のペプチド鎖で構成され、それらのそれぞれが、１つ（軽鎖）または３つ（重鎖）の定常ドメインと、１つの可変領域（ＶＬ、ＶＨ）とを含有し、それらのうち後者は、いずれの場合も、４つのＦＲ領域と、間を置いた３つのＣＤＲとでできている。抗原結合部位は、１つまたは複数のＣＤＲによって形成されるが、ＦＲ領域は、ＣＤＲの構造フレームワークを提供し、したがって、抗原結合において重要な役割を果たす。ＣＤＲまたはＦＲ領域における１つまたは複数のアミノ酸残基を改変することによって、当業者は、変異導入されている、または多様化されている抗体配列を慣行的に生成することができ、例えば、新規または改善された特性を求めて、それらを抗原に対してスクリーニングすることができる。
【００５２】
図１（ＶＨ）および図２（ＶＬ）は、本明細書に開示の特定の抗体のＣＤＲおよびＦＲ領域（Ｋａｂａｔの定義による）を図示し、所与の位置のアミノ酸を相互、および対応するＨｕＣＡＬ「マスター遺伝子」配列（米国特許第６，３００，０６４号に記載されている）と比較する。
【００５３】
当業者は、図１および図２のデータを用いて、本明細書に開示の実施形態の範囲に包含されるペプチドバリアントを設計することができる。一実施形態では、バリアントは、１つまたは複数のＣＤＲ領域内のアミノ酸を改変することによって構築され、バリアントは、１つまたは複数の改変されたフレームワーク領域も有し得る。新規な抗体の相互比較に関して、改変できる候補残基には、ＭＯＲ  Ｘの可変軽鎖の残基および可変重鎖の残基が含まれる。フレームワーク領域でも改変できる。例えば、ペプチドＦＲドメインを改変でき、その場合、生殖系列配列と比較して、残基のずれが生じる。
【００５４】
対応するコンセンサスまたは「マスター遺伝子」配列との新規抗体の比較に関して、改変できる候補残基には、ＶＬλ３の残基など、ＭＯＲ  Ｘの可変軽鎖の残基が含まれ、ＶＨ３の残基など、ＭＯＲ  Ｘの可変重鎖の残基が含まれる。代替として、当業者は、例えばＫｎａｐｐｉｋら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６、５７〜８６，２０００）によって、およびＫｎａｐｐｉｋらに発行された米国特許第６，３００，０６４号に記載された手順を用いて、本明細書に開示のアミノ酸配列を、同じクラスのそのような抗体の既知配列と比較することによって、同じ分析を行うことができる。
【００５５】
さらに、ＭＯＲ  Ｘ配列中の１つまたは複数のアミノ酸残基、好ましくは１つまたは複数のＣＤＲ内のアミノ酸残基を多様化させることによって、およびその結果得られた抗体バリアントのコレクションを、改善された特性を有するバリアントを求めてスクリーニングすることによって、最適化の出発点として１つのＭＯＲ  Ｘを用いることによってバリアントを得てもよい。トリヌクレオチド変異誘発（ＴＲＩＭ）技術（Ｖｉｒｎｅｋａｓ，Ｂ．、Ｇｅ，Ｌ．、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｋ．Ｃ．、Ｗｅｌｌｎｈｏｆｅｒ，Ｇ．およびＭｏｒｏｎｅｙ  Ｓ．Ｅ．（１９９４）「Ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ：ｉｄｅａｌ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍｉｘｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２、５６００）を用いてＤＮＡ分子のコレクションを合成することによって、ＶＬのＣＤＲ−３、ＶＨのＣＤＲ−３、ＶＬのＣＤＲ−１および／またはＶＨのＣＤＲ−２内の１つまたは複数のアミノ酸残基の多様化を行うことができる。
（保存アミノ酸バリアント）
本明細書に記載の抗体ペプチド配列の全体的分子構造を保存するポリペプチドバリアントを作製することができる。個々のアミノ酸の特性を所与として、いくつかの合理的な置換が当業者によって認識されよう。アミノ酸置換、すなわち「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて導入することができる。
【００５６】
例えば、（ａ）非極性（疎水性）のアミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ；（ｂ）極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ；（ｃ）正電荷（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ；（ｄ）負電荷（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。置換は、典型的には、群（ａ）〜（ｄ）の中で導入され得る。加えて、グリシンおよびプロリンは、αヘリックスを中断させるそれらの能力に基づいて、相互に置換され得る。同様に、アラニン、システイン、ロイシン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンおよびリジンなど、特定のアミノ酸はαヘリックスで、より一般的に見出され、一方、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびトレオニンはβプリーツシートで、より一般的に見出される。グリシン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、およびプロリンはターンで一般的に見出される。いくつかの好ましい置換は、下記の群、すなわち、（ｉ）ＳおよびＴ；（ｉｉ）ＰおよびＧ；ならびに（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、ＬおよびＩの中で行われ得る。既知の遺伝コード、ならびに組換えおよび合成ＤＮＡ技法を所与として、当業者は、保存アミノ酸バリアントをコードするＤＮＡを容易に構築できる。
【００５７】
本明細書で使用される場合、２つのポリペプチド配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。「配列相同性」は、同一であるまたは保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸のパーセンテージを示す。本発明のポリペプチド配列は、ＣＤＲ領域における、少なくとも６０％、少なくとも７０％もしくは８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有する。具現化される抗体は、ＣＤＲ領域における、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列相同性も有する。
（ＤＮＡ分子）
本開示は、本明細書に記載の抗体をコードするＤＮＡ分子にも関する。これらの配列は、図３Ａ、３Ｂ、および４Ａから４Ｆに記載のＤＮＡ分子が含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
本開示のＤＮＡ分子は、本明細書に開示の配列に限定されず、それらのバリアントも含む。様々な実施形態内のＤＮＡバリアントは、ハイブリダイゼーションにおけるそれらの物理特性を参照することにより記載され得る。核酸ハイブリダイゼーション技術を使用し、ＤＮＡを用いて、その相補体と、ＤＮＡは二本鎖であるのでその等価物または相同体とを同定できることが当業者には認識されよう。ハイブリダイゼーションが１００％未満の相補性で起こり得ることも認識されよう。しかし、条件の適切な選択を所与として、ＤＮＡ配列を、特定のプローブへのそれらの構造的な関連性に基づいて相互に区別するのに、ハイブリダイゼーション技術を用いることができる。そのような条件に関する指針として、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＵＳＡ）およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９９５（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．、Ｒ．Ｂｒｅｎｔ、Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ、Ｊ．Ｇ．Ｓｅｄｍａｎ、Ｊ．Ａ．ＳｍｉｔｈおよびＫ．Ｓｔｒｕｈｌ編集（１９９５）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）を参照されたい。
【００５９】
２つのポリヌクレオチド配列間の構造類似性は、２つの配列が相互にハイブリッド形成する条件の「ストリンジェンシー」の関数として表すことができる。本明細書で使用される場合、用語「ストリンジェンシー」は、その条件がハイブリダイゼーションに否定的である程度を指す。ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーションに強く否定的であり、構造的に最も関連した分子のみがそのような条件下で相互にハイブリッド形成する。逆に、非ストリンジェントな条件は、より低度の構造的関連性を示す分子のハイブリダイゼーションに肯定的である。したがって、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、２つの核酸配列の構造関係と直接的に相関する。ハイブリダイゼーションと関連性とを相関させるのに、下記の関係（ここで、Ｔｍは核酸二本鎖の融解温度）が有用である。
ａ．  Ｔｍ＝６９．３＋０．４１（Ｇ＋Ｃ）％
ｂ．  ミスマッチ塩基対の数が１％の増加するごとに、二本鎖ＤＮＡのＴｍが１℃低下する。
ｃ．  （Ｔｍ）μ２−（Ｔｍ）μ１＝１８．５ｌｏｇ１０μ２／μ１
式中、μ１およびμ２は２つの溶液のイオン強度である。
【００６０】
ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、全体的なＤＮＡ濃度、イオン強度、温度、プローブサイズ、および水素結合を壊す作用物質の存在を含めた、多くの因子の関数である。ハイブリダイゼーションを促進する因子には、高ＤＮＡ濃度、高イオン強度、低温、より長いプローブサイズ、および水素結合を壊す作用物質の不在が含まれる。ハイブリダイゼーションは、通常、「結合」段階および「洗浄」段階の２段階で行われる。
【００６１】
第１に、結合段階では、ハイブリダイゼーションに肯定的である条件下で、プローブを標的に結合させる。この段階では、ストリンジェンシーは、通常、温度を変えることによって制御される。短い（＜２０ｎｔ）オリゴヌクレオチドプローブが使用される場合でなければ、高ストリンジェンシー用には、通常、温度は６５℃から７０℃の間である。代表的なハイブリダイゼーション溶液は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液、および１００μｇの非特異的担体ＤＮＡを含む。Ａｕｓｕｂｅｌら、セクション２．９、増補２７（１９９４）を参照されたい。当然ながら、多くの異なった、しかし機能的に同等なバッファー条件が知られている。関連性の程度がさらに低ければ、より低い温度が選ばれ得る。低ストリンジェンシーの結合温度は約２５℃から４０℃の間である。中程度ストリンジェンシーは、少なくとも約４０℃から約６５℃未満の間である。高ストリンジェンシーは、少なくとも約６５℃である。
【００６２】
第２に、余分なプローブを洗浄で除去する。この段階では、通常、よりストリンジェントな条件が適用される。したがって、ハイブリダイゼーションを介して関連性を決定するのに最も重要なのは、この「洗浄」ステージである。洗浄溶液は、通常、低塩濃度を有する。１つの例示的な中程度ストリンジェンシー溶液は、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有する。高ストリンジェンシー洗浄溶液は、約０．２×ＳＳＣ未満と同等なもの（イオン強度について）を含有し、好ましいストリンジェント溶液は約０．１×ＳＳＣを含有する。様々なストリンジェンシーに関連する温度は、「結合」について上記で論じたものと同じである。また、洗浄溶液は通常、洗浄中に何回か交換される。例えば、典型的な高ストリンジェンシー洗浄条件は、５５℃で３０分間の洗浄２回および６０℃で１５分間の洗浄３回を含む。
【００６３】
したがって、本開示は、図３Ａ、３Ｂ、および４Ａ〜４Ｆに記載の分子と、高ストリンジェンシーの結合および洗浄条件下でハイブリッド形成する核酸分子であって、本明細書に記載の特性を有する抗体またはその機能性断片をコードする核酸分子を含む。具現化される分子（ｍＲＮＡの観点からのもの）は、本明細書に記載のＤＮＡ分子の１つと少なくとも７５％または８０％（好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％）の相同性または配列同一性を有するものである。本開示のバリアントの特定の一例では、配列番号１８または２０における核酸位置７をＣからＧに置換し、それによってコドンをＣＡＡからＧＡＡに変えることができる。
（機能的に同等なバリアント）
本発明の範囲内にあるさらに別のクラスのＤＮＡバリアントは、それらがコードする産物（図３Ｃ、３Ｄ、および４Ｇから４Ｌに示されるペプチドを参照されたい）を参照して記載できる。これらの機能的に同等な遺伝子は、それらが、図３Ｃ、３Ｄ、および４Ｇから４Ｌに示すものと同じペプチド配列を遺伝コードの縮重によりコードするという事実によって特徴付けられる。図３Ｃ中のアミノ酸配列は配列番号１９としても示される。図３Ｄ中のアミノ酸配列は配列番号２１としても示される。図４Ｇ中のアミノ酸配列は配列番号２３としても示される。図４Ｈ中のアミノ酸配列は配列番号２５としても示される。図４Ｉ中のアミノ酸配列は配列番号２７としても示される。図４Ｊ中のアミノ酸配列は配列番号２９としても示される。図４Ｋ中のアミノ酸配列は配列番号３１としても示される。図４Ｌ中のアミノ酸配列は配列番号３３としても示される。
【００６４】
本明細書に提示するＤＮＡ分子のバリアントは、いくつかの異なった方法で構築できると認識される。例えば、それらは、完全に合成のＤＮＡとして構築できる。２０ヌクレオチドから約１５０ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドを効率的に合成する方法は広く利用可能である。Ａｕｓｕｂｅｌら、セクション２．１１、増補２１（１９９３）を参照のこと。Ｋｈｏｒａｎａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７２：２０９〜２１７（１９７１）（Ａｕｓｕｂｅｌら、同上、セクション８．２も参照されたい）によって最初に報告された方法で、オーバーラップを有するオリゴヌクレオチドを合成して、アセンブルさせてもよい。合成ＤＮＡは、適したベクター中へのクローニングを容易にするために、遺伝子の５’および３’末端に工作された好都合な制限部位を有するように設計することが好ましい。
【００６５】
上述のように、バリアントを生成する方法は、本明細書に開示のＤＮＡの１つから始め、次いで部位特異的変異誘発を行うものである。Ａｕｓｕｂｅｌら、同上、第８章、増補３７（１９９７）を参照のこと。典型的な方法では、標的ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡバクテリオファージ媒体にクローニングする。一本鎖ＤＮＡを単離し、所望のヌクレオチド改変（複数可）を含有するオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させる。相補鎖を合成し、宿主に二本鎖ファージを導入する。結果として得られる後代の一部は、所望の変異体を含有していることになり、これはＤＮＡ配列決定を用いて確認できる。加えて、後代ファージが所望の変異体となる確率を増大させる様々な方法が利用可能である。これら方法は当業者にはよく知られており、そのような変異体を生成させるためのキットが市販されている。
（組換え体ＤＮＡコンストラクトおよび発現）
本開示は、本明細書に記載のヌクレオチド配列の１つまたは複数を含む組換え体ＤＮＡコンストラクトをさらに提供する。これらの組換え体コンストラクトは、任意の開示の抗体をコードするＤＮＡ分子が挿入される、プラスミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターなどのベクターと共に使用される。
【００６６】
コードされた遺伝子は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９に記載の技法で生産できる。代替として、ＤＮＡ配列は、例えば合成機を用いて化学的に合成することもできる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９８４、Ｇａｉｔ編集、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ）に記載の技法を参照されたい。本開示の組換え体コンストラクトは、コードされたＤＮＡ（複数可）のＲＮＡおよび／またはタンパク質産物を発現できる発現ベクターで構成される。ベクターは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作用可能に連結したプロモーターを含めた、調節配列をさらに含み得る。ベクターは、選択マーカー配列をさらに含み得る。特定の開始シグナルおよび細菌分泌シグナルも挿入される標的遺伝子コード配列の効率的な翻訳に必要であり得る。
【００６７】
本開示は、本明細書に記載のＤＮＡの少なくとも１つを含有する宿主細胞をさらに提供する。宿主細胞は、発現ベクターが利用可能である事実上いかなる細胞でもあり得る。それは、例えば、哺乳動物細胞などの高等真核細胞宿主細胞でも、酵母細胞などの下等真核細胞宿主細胞でもよく、細菌細胞などの原核細胞でもよい。宿主細胞内への組換え体コンストラクトの導入は、リン酸カルシウム形質移入、リポフェクション、ＤＥＡＥ、デキストラン媒介形質移入、エレクトロポレーションまたはファージ感染で行うことができる。
（細菌発現）
細菌での使用に有用な発現ベクターは、機能的プロモーターと作用可能なリーディングフェーズにある適した翻訳開始シグナルおよび終止シグナルと一緒に所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を挿入することによって構築される。ベクターは、ベクターの維持を確実にするため、および望ましい場合には宿主内での増幅を提供するため、１つまたは複数の表現型選択マーカーおよび複製開始点を含むことになる。形質転換に適した原核細胞宿主には、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の多様な種が含まれる。
【００６８】
細菌ベクターは、例えば、バクテリオファージベース、プラスミドベース、またはファージミドベースのものであり得る。これらのベクターは、よく知られているクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣアクセッション番号３７０１７）のエレメントを通常含有している市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌複製開始点を含有することができる。適した宿主株を形質転換し、宿主株を適切な細胞密度まで増殖させた後、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）によって、選択されたプロモーターを抑制解除または誘導し、さらなる期間、細胞を培養する。通常、細胞を遠心分離によって採取し、物理的または化学的手段によって破壊し、この結果得られた粗抽出物をさらなる精製用に保持する。
【００６９】
細菌系では、発現されるタンパク質に意図されている使用に応じて、多数の発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体の生成のため、またはペプチドライブラリーをスクリーニングするために、多量のそのようなタンパク質が産生されることになっている場合には、例えば、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指示するベクターが望ましい。
（治療方法）
治療方法は、本開示によって企図されている抗体の治療有効量を、処置を必要とする個体に投与することを含む。ここで、「治療有効」量は、単独で、または他の薬剤と組み合わせて、単回用量として、または反復投与処方計画によって、個体の処置領域におけるＭＳＴ１Ｒ陽性細胞を枯渇させるのに十分な量である抗体量であって、有害な状態の緩和をもたらし、かつ毒物学的に許容される量と定義される。個体は、ヒトでも、非ヒト動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス、サルまたは他の下等霊長類）でもよい。
【００７０】
本開示の抗体は、既知の医薬と共に同時投与しても、場合によっては、抗体それ自体を改変してもよい。例えば、潜在的にさらに効力を増強するために、抗体をイムノトキシンまたは放射標識抗体に結合させることができる。
【００７１】
本明細書に記載の抗体は、ＭＳＴ１Ｒの発現または存在が望ましくない様々な状態における治療ツールまたは診断ツールとして使用できる。本開示の抗体を用いた処置に特に適した疾患および状態は、例えば、乳腺、肺、結腸、膀胱、皮膚、膵臓、神経膠腫、リンパ腫、前立腺、甲状腺、卵巣、胃、肝臓および胃部などにおける、ＭＳＴ１Ｒを発現している悪性腫瘍および新生物である。
【００７２】
上記の疾患のいずれかを処置するために、本開示に従って使用するための医薬組成物を、１つまたは複数の生理的に許容される担体または添加剤を用いて、従来の方法で製剤化することができる。本明細書に記載のいずれの抗体も、任意の適した手段で投与でき、その手段は、処置される疾患のタイプに応じて異なり得る。可能な投与経路には、非経口（例えば、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下）、肺内、鼻腔内、および病巣内投与（局所的免疫抑制療法に望ましい場合）が含まれる。加えて、開示の任意の抗体を、例えば、漸減用量の抗体のパルス注入によって投与してもよい。投薬は、投与が短いものか、慢性的なものかに一部応じて、例えば、静脈内または皮下注射などの注射によって行うことができる。投与されるべき量は、臨床的症状、個体の体重、他の薬物が投与されるかどうかなどの様々な因子に依存する。当業者ならば、処置されるべき疾患または状態に応じて投与経路が異なることを認識し、各個体の特定の因子に基づいて、いずれの経路が個体に最も適切であるか理解されよう。
【００７３】
本発明による、新規なポリペプチドの治療有効量の決定は、主として、特定の患者特性、投与経路、および処置される疾患の性質に依存する。一般的指針は、例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｓａｔｉｏｎの刊行物およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２７章および２８章、４８４〜５２８頁（第１８版、Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、１９９０）に見出すことができる。より詳細には、治療有効量の決定は、医薬の毒性および効力などの因子に依存する。毒性は、当技術分野でよく知られており、上記の参考文献で見出される方法を用いて決定できる。効力は、下記、実施例に記載の方法に関連する同じ指針を用いて決定できる。
（診断方法）
ＭＳＴ１Ｒは、特定の悪性腫瘍におけるがん細胞表面に強く発現され；したがって、本開示の抗ＭＳＴ１Ｒ抗体は、患者におけるＭＳＴ１Ｒの発現部位または位置を画像化または可視化するのに利用できる。この点で、放射性同位元素、親和性標識（ビオチン、アビジンなど）、蛍光標識、常磁性原子などの使用を介して、抗体を検出可能に標識することができる。そのような標識化を実現するための手順は、当技術分野でよく知られている。画像診断における抗体の臨床適用については、Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｈ．Ｂ．、Ｕｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒ．１３：４６５〜４７４（１９８６））、Ｕｎｇｅｒ，Ｅ．Ｃ．ら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｒａｄｉｏｌ．２０：６９３〜７００（１９８５））、およびＫｈａｗ，Ｂ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：２９５〜２９７（１９８０））で総説されている。
【００７４】
そのような検出可能に標識された抗体の集束（ｆｏｃｉ）の検出は、例えば、ＭＳＴ１Ｒの存在を示すものであり得る。一実施形態では、この検査は、組織または血液の試料を取り出して、検出可能に標識された抗体の存在下でそのような試料をインキュベートすることによって行われる。一実施形態では、この技法は、磁気イメージング、フルオログラフィーなどの使用を通して非侵襲的方法で行われる。そのような診断検査は、疾患の処置の成果をモニターする際に利用でき、その際、ＭＳＴ１Ｒ陽性細胞の存在または不在が適切な指標となる。
（治療用および診断用組成物）
本開示の抗体は、薬学的に有用な組成物を調製する既知の方法によって製剤化でき、その際、薬学的に許容される担体媒体との混合物中に、本明細書に記載の抗体（いかなるその機能性断片も含まれる）が混合される。適した媒体およびそれらの処方は、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（第１８版、Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、１９９０）に記載されている。効果的な投与に適した薬学的に許容される組成物を生成するためには、そのような組成物は、適量の担体媒体と共に本開示の抗体の１つまたは複数を有効量含有する。
【００７５】
活性化合物の放出制御が得られるように、調製物を適切に製剤化することができる。放出制御調製物は、ポリマーを使用して、抗ＭＳＴ１Ｒ抗体と複合体を形成させるか、抗ＭＳＴ１Ｒ抗体を吸収させることを介して実現できる。制御送達は、放出を制御するために適切な巨大分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレン酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはプロタミン、スルフェート）および巨大分子の濃度、ならびに組入れ方法を選択することによって遂行できる。放出制御調製物によって作用時間を制御する別の可能な方法は、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレン酢酸ビニルコポリマーなどのポリマー物質の粒子内に抗ＭＳＴ１Ｒ抗体を組み入れることである。代替として、これらの薬剤をポリマー粒子に組み入れる代わりに、例えば、コアセルベーション技法によって、もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルの中に、またはコロイド薬物送達システム、例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセルの中に、またはマクロエマルションの中に、これらの物質を捕捉することが可能である。そのような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）に開示されている。
【００７６】
化合物は、注射による非経口投与、例えば、ボーラス注入または持続注入用に製剤化することができる。注射用製剤は、添加された保存剤を伴う単位剤形で、例えば、アンプルまたは多用量容器中に提供することができる。組成物は、油性もしくは水性媒体中の懸濁液、溶液、またはエマルションなどの形態を取ることができ、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤を含有できる。代替として、活性成分は、使用する前に適した媒体、例えば発熱因子を含まない滅菌水で構成させるのに用いる粉末形態であってもよい。
【００７７】
組成物は、望ましい場合、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイスで提供できる。パックは、例えば、ブリスターパックなど、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサーデバイスは、投与のための説明を伴い得る。さらに、パックまたはディスペンサーデバイスおよび組成物を、商品流通用のキットで提供してもよい。
【００７８】
例示を目的とし、したがって本発明の開示の範囲を限定しない以下の実施例を参照して、本発明の様々な実施形態をさらに理解することができる。
【実施例】
【００７９】
（細胞培養および一過性形質移入）
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）細胞をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。２９３αは、インテグリンαｖおよびインテグリンβ３発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞内に形質移入することによって得られた安定した形質移入体であった。ＨＥＫ２９３および２９３α細胞は、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で増殖させた。ＰＣ３およびＴ４７Ｄは、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ中で培養した。パニング、スクリーニング、および機能アッセイには、２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、プラスミドＤＮＡでＨＥＫ  ２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）細胞に形質移入した。２９３Ｔおよび２９３α細胞には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、供給業者の指示に従って、プラスミドＤＮＡで形質移入した。
（フローサイトメトリー（「ＦＡＣＳ」））
丸底の９６ウェル培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内において、４℃で６０分間、５０μｌのＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、５％ＦＣＳ）中で、示した濃度のＦａｂまたはＩｇＧ抗体と共に細胞（５×１０５細胞／ウェル）をインキュベートした。細胞を２回洗浄し、次いで４℃で３０分間、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合検出抗体と共にインキュベートした。細胞を再び洗浄し、０．３ｍｌのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、次いで、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）におけるフローサイトメトリーによって分析した。データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｏｍｙ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を介して分析した。陽性対照として、ポリクローナルヤギ抗ｈＭＳＰ  Ｒ  ＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）または抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ）を用い、陰性対照として、ＭＯＲ０３２０７（抗リゾチーム）抗体を用いた。
（表面プラズモン共鳴法）
ＢＩＡｃｏｒｅ３０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用し、共有結合によって固定化されたＭＳＴ１Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）に結合するそれぞれのＦａｂの系列希釈を用いて、動態定数ｋｏｎおよびｋｏｆｆを決定した。共有結合性の抗原固定化には、標準的なＥＤＣ−ＮＨＳアミンカップリング化学を用いた。ＭＳＴ１Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質の直接カップリングには、１０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．５中における約６００〜７００ＲＵでＣＭ５センサーチップス（Ｂｉａｃｏｒｅ）をコーティングした。参照フローセルには、それぞれの量のＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）を用いた。動態測定は、１５．６〜５００ｎＭの範囲のＦａｂ濃度を用いて、流速２０μｌ／分のＰＢＳ（１３６ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）中で行った。各濃度の注入時間は１分であった。これに、３分間の解離段階が続いた。再生には、５μｌの１０ｍＭ  ＨＣｌを用いた。すべてのセンソグラムは、ＢＩＡ評価ソフトウェア３．２（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて全体的にフィッティングさせた。
（溶解平衡滴定（ＳＥＴ））
溶液中の親和性決定は、基本的に文献（Ｆｒｉｇｕｅｔ，Ｂ．、Ｃｈａｆｆｏｔｔｅ，Ａ．Ｆ．、Ｄｊａｖａｄｉ−Ｏｈａｎｉａｎｃｅ，Ｌ．、およびＧｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．Ｅ．（１９８５）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７７、３０５〜３１９）に記載の通り行った。ＳＥＴ法の感度および精度を改善するために、この方法を古典的なＥＬＩＳＡからＥＣＬベースの技法に修正した（Ｈａｅｎｅｌ，Ｃ．、Ｓａｔｚｇｅｒ，Ｍ．、Ｄｕｃａｔａ，Ｄ．Ｄ．、Ｏｓｔｅｎｄｏｒｐ，Ｒ．、およびＢｒｏｃｋｓ，Ｂ．（２００５）  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３３９，１８２〜１８４）。
【実施例１】
【００８０】
（ＨｕＣＡＬライブラリーからの抗体生成）
ＭＳＴ１Ｒに対する治療用抗体の生成には、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤファージディスプレーライブラリーを用いた選択を行った。ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）は、ＨｕＣＡＬ（登録商標）コンセプト（Ｋｎａｐｐｉｋら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９６、５７〜８６、２０００）；Ｋｒｅｂｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２５４、６７〜８４、２００１；Ｒｏｔｈｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３７６（４）：１１８２〜２００、２００８）に基づくＦａｂライブラリーである。ＨｕＣＡＬでは、６つのＣＤＲすべてが多様化されており、ＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（商標）技術を利用して、Ｆａｂ断片がファージ表面に連結される（ＷＯ０１／０５９５０）。
（Ａ．ファージミドレスキュー、ファージ増幅、および精製）
３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび１％グルコースを含有する２×ＹＴ培地（２×ＹＴ−ＣＧ）中で、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージミドライブラリーを増幅させた。０．５のＯＤ６００ｎｍにおけるヘルパーファージ感染（ＶＣＳＭ１３）（振盪させずに３７℃で３０分間；２５０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で３０分間）の後に、細胞を遠心分離し（４１２０ｇ、５分間、４℃）、２×ＹＴ／３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール／５０μｇ／ｍｌカナマイシン／０．２５ｍＭ  ＩＰＴＧ中に再懸濁し、２２℃で終夜培養した。上清からファージをＰＥＧ沈殿させ、ＰＢＳ／２０％グリセロール中に再懸濁し、−８０℃で保存した。２ラウンドのパニングの間のファージ増幅は以下の通りに行った。溶出されたファージに、対数期の中間部にあるＴＧ１細胞を感染させ、１％グルコースおよび３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補ったＬＢ（ＬＢ−ＣＧ）アガーにプレーティングした。３０℃における終夜インキュベーションの後に、コロニーを擦り取り、２×ＹＴ−ＣＧに接種するのに用い、０．５のＯＤ６００ｎｍに達した後、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを、感染用に上述の通り添加した。
（Ｂ．ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）を用いたパニング）
選択用に、ＶＨマスター遺伝子の異なった組合せを含む６つのプール（プール１：ＶＨ１／３／５κ、プール２：ＶＨ１／３／５λ、プール３：ＶＨ２／４／６κ、プール４：ＶＨ２／４／６λ、プール５：ＶＨ１〜６κ、プール６：ＶＨ１〜６λ）に、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）抗体ファージを分割した。これらのプールに対して個別に、ＭＳＴ１Ｒ発現ベクターで形質移入されたＨＥＫ  ２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）細胞における全細胞パニングおよびそれに続くｐＨ溶出を３ラウンド、ならびにＭＳＴ１Ｒ陰性ＨＥＫ  ２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）細胞における、無関係な抗体ファージを除去するための吸着後ステップを行った。最後に、残っている抗体ファージを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞を感染させるのに用いた。次いで、これをアガープレート上にプレーティングし、３０℃で終夜インキュベートした。翌日、細菌コロニーをプレートから擦り落とし、ファージを上述の通りにレスキューし、増幅させた。選択の第２のラウンドおよび第３のラウンドは、最初のラウンドと同様に行った。標準的なパニングに加えて、潜在的に、より高い親和性を有するクローンを同定するためにＬＣＤＲ３−ＲａｐＭＡＴ（登録商標）技術を適用した。ＲａｐＭＡＴ（登録商標）は、高親和性抗体を迅速に選択するための親和性成熟過程を表す。この技術は、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）Ｆａｂライブラリーのモジュール設計に基づいている。ＲａｐＭＡＴ（登録商標）法のため、ラムダおよびカッパライブラリーの別々のプールを用いて、２ラウンドの標準的なパニングを行った。ＬＣＤＲ３をＬＣＤＲ３ライブラリーカセットと交換することによって、選択された第２のラウンドのＦａｂプールを多様化させた。この結果得られたＦａｂライブラリーに対して、ストリンジェントな条件下でのパニングをさらに２ラウンド行った。
（Ｃ．可溶性Ｆａｂ断片のサブクローニングおよび発現）
可溶性Ｆａｂの迅速な発現を促進するために、選択されたＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージミドのＦａｂコードインサートを発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＳにサブクローニングした（Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（４０）：３８１９４〜２０５、２００３）。このために、選択されたクローンのＦａｂコードインサート（ｏｍｐＡ−ＶＬＣＬおよびｐｈｏＡ−Ｆｄ）をＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩでプラスミドＤＮＡから切り出し、ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ切断ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）ｘ９＿ＦＳにクローニングした。このベクターで発現されたＦａｂは、検出および精製用の２つのＣ末端タグ（ＦＬＡＧ（商標）およびＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）ＩＩ）を保持する。
（Ｄ．Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）Ｆａｂ抗体の発現および精製）
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ−１細胞における、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＳによってコードされたＦａｂ断片の発現は、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補った２×ＹＴ培地７５０ｍｌを用いたシェーカーフラスコ培養で行った。ＯＤ６００ｎｍが０．５に達するまで、培養物を３０℃で振盪させた。発現は、０．７５ｍＭのＩＰＴＧの添加によって、３０℃で２０時間誘導した。細菌を遠心分離によって採取し、３０〜３５ｍｌのＢＢＳを用いてペリプラズム画分を調製した。Ｆａｂは、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）ＩＩを介して、Ｓｔｅｐ−Ｔａｃｔｉｎセファロースカラムを用いて精製した。試料の純度は、変性、還元状態でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、および未変性状態でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、較正標準と共に分析した。タンパク質濃度は、ＵＶ分光光度法によって決定した（Ｋｒｅｂｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５４、６７〜８４、２００１）。
【実施例２】
【００８１】
（ＨｕＣＡＬ（登録商標）ＩｇＧ１のクローニング、発現、および精製）
完全長のＩｇＧ１を発現するために、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン断片を、Ｆａｂ発現ベクターからｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈＩｇベクターにサブクローニングした。ＶＨ断片のサブクローニングには、制限酵素ＭｆｅＩおよびＢｌｐＩを用いた。ＶＬカッパまたはＶＬラムダ断片のサブクローニングには、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＢｓｉＷＩまたはＨｐａＩを用いた。消化の後、ＶＨ断片およびＶＬ断片を調製用アガロースゲルから単離し、それぞれのＩｇＧ発現ベクターに（ＶＨ断片はｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿ＩｇＧ１ｆに；Ｖカッパ断片はｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿Ｉｇκに；Ｖラムダ断片はｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿Ｉｇλ２に）連結した。この結果得られたＩｇＧ発現プラスミドを制限分析および配列決定によって特徴付けた。完全長ヒトＩｇＧの一過性発現をＨＫＢ１１細胞で行った。ＨＫＢ１１細胞にＩｇＧ重鎖および軽鎖発現ベクターで形質移入した。プロテインＡセファロースカラムを介した親和性クロマトグラフィーによって、ＩｇＧを細胞培養上清から精製した。さらに次の精製工程では、ゲル濾過によるバッファー交換および精製されたＩｇＧの無菌濾過が含まれた。得られた抗体の品質は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる＞９０％の純度と、分析サイズ排除クロマトグラフィーによって決定された＞９０％の単量体ＩｇＧであることを明らかにした。
【実施例３】
【００８２】
（ＨｕＣＡＬ（登録商標）ＦａｂのクローンおよびＨｕＣＡＬ（登録商標）ＩｇＧ１のＥＬＩＳＡスクリーニング）
３８４ウェルＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）マイクロタイタープレートのウェルを、ＰＢＳ中に希釈された０．５μｇ／ｍｌの組換え体ＭＳＴ１Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質でコーティングした。このプレートを４℃で終夜インキュベートした。翌日に、ウェルを、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、次いで、マイクロタイタープレートシェーカー上、室温で３０分間、ＭＰＢＳＴ（ＰＢＳＴ中に５％粉ミルク）でブロックした。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、その後、一次抗体、すなわち、ＨｕＣＡＬ（登録商標）ＦａｂクローンのプレブロックされたＢＥＬ抽出物または精製ＨｕＣＡＬ（登録商標）抗体および対照抗体を添加した。プレートをマイクロタイタープレートシェーカー上、室温で２時間インキュベートし、次いでＰＢＳＴで３回洗浄した。ＨｕＣＡＬ（登録商標）抗体の検出には、ヤギ抗ヒトＩｇＧアルカリ性ホスファターゼ（Ｄｉａｎｏｖａ、０．５％粉ミルク含有ＰＢＳＴ中に１：５，０００希釈されたもの）を添加し、プレートをマイクロタイタープレートシェーカー上、室温で１時間インキュベートした。続いて、プレートをＴＢＳＴ（ＴＢＳ中に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄した。Ａｔｔｏｐｈｏｓ（ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質セット、Ｒｏｃｈｅ）を添加し（ＴＢＳ中に１：１０希釈）、ＴＥＣＡＮマイクロタイタープレートリーダーで蛍光を測定した（発光：５３５ｎｍ、励起：４３０ｎｍ）。
【実施例４】
【００８３】
（ＦＡＣＳによる交差反応性分析）
ＭＳＴ１Ｒオーソログ発現細胞のＦＡＣＳ分析：Ｎ末端Ｆｌａｇタグ（ｐＦＬＡＧ−ｍｙｃ−ＣＭＶ−１９、Ｓｉｇｍａ）を含有するヒトＭＳＴ１Ｒ（ｃＤＮＡヌクレオチド配列はＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００２４４７．２として示されている）、カニクイザルＭＳＴ１ＲおよびマウスＭＳＴ１Ｒ（ｃＤＮＡヌクレオチド配列はＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００９０７４．１として示されている）発現ベクターを構築した。それぞれ配列番号３４および３５のヌクレオチド配列を有する順方向プライマーおよび逆方向プライマーと共に、カニクイザルの胃のｃＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲによって、カニクイザルＭＳＴ１ＲをコードするｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ産物の配列決定分析によって、配列番号３６に示すカニクイザルＭＳＴ１Ｒ  ＯＲＦヌクレオチド配列を同定した。対応するアミノ酸配列を配列番号３７に示した。次いで、適切なクローニング部位を備えた、それぞれ配列番号３８および３９（ヒト）、４０および４１（カニクイザル）、４２および４３（マウス）のヌクレオチド配列を有する順方向プライマーおよび逆方向プライマーを用いて、シグナルペプチド領域を除いた、ヒト、カニクイザルおよびマウスのＭＳＴ１Ｒ  ＯＲＦ  ｃＤＮＡを増幅し、次いで、ｐＦＬＡＧ−ｍｙｃ−ＣＭＶ−１９にクローニングした。増幅されたヒトＭＳＴ１Ｒ断片は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００２４３８．２（配列番号４５）に対応するアミノ酸をコードする。マウスＭＳＴ１Ｒ断片は、以下の位置におけるアミノ酸の相違、すなわち６８８（ＬｅｕからＰｒｏ）、７１３（ＩｌｅからＶａｌ）、７１４（ＡｌａからＧｌｙ）および７１９（ＡｌａからＶａｌ）を除いて、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０３３１００．１（配列番号４７）に対応するアミノ酸をコードする。これらの発現ベクターでＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入した。ＦＡＣＳ分析には、細胞を、２μｇ／ｍｌの一次抗体と共にインキュベートし、続いて、上述の通り、ＦＩＴＣ標識された二次抗体と共にインキュベートした。図１０において、抗Ｆｌａｇ抗体によりそれぞれのタンパク質（ヒト、カニクイザル、およびマウスＭＳＴ１Ｒ）の発現を確認した。ＭＯＲ０７６９２、ＭＯＲ０７９２３、ＭＯＲ０７９２４、ＭＯＲ０７９２５、およびＭＯＲ０７９２６は、ヒトおよびサルＭＳＴ１Ｒの両方に結合することを示した。一方、ＭＯＲ０７９１９は、ヒトおよびサルＭＳＴ１Ｒに加えて、マウスＭＳＴ１Ｒにも結合することを示した。
【００８４】
これらの抗体のヌクレオチド配列をＤＮＡシーケンサによって決定した。ＭＯＲ０７６９２、ＭＯＲ０７９２３、ＭＯＲ０７９２４、ＭＯＲ０７９２５、およびＭＯＲ０７９２６の可変重鎖のヌクレオチド配列は、図３Ａおよび配列番号１８に示す通りに決定された。ＭＯＲ０７９１９の可変重鎖のヌクレオチド配列を図３Ｂおよび配列番号２０に示す。ＭＯＲ０７６９２、ＭＯＲ０７９２３、ＭＯＲ０７９２４、ＭＯＲ０７９２５、およびＭＯＲ０７９２６の可変重鎖のアミノ酸配列は、図３Ｃおよび配列番号１９に示す通りに決定された。ＭＯＲ０７９１９の可変重鎖のアミノ酸配列を図３Ｄおよび配列番号２１に示す。
【００８５】
ＭＯＲ０７６９２の可変軽鎖のヌクレオチド配列を図４Ａおよび配列番号２２に示す。ＭＯＲ０７６９２の可変軽鎖のアミノ酸配列を図４Ｇおよび配列番号２３に示す。ＭＯＲ０７９１９の可変軽鎖のヌクレオチド配列を図４Ｂおよび配列番号２４に示す。ＭＯＲ０７９１９の可変軽鎖のアミノ酸配列を図４Ｈおよび配列番号２５に示す。ＭＯＲ０７９２３の可変軽鎖のヌクレオチド配列を図４Ｃおよび配列番号２６に示す。ＭＯＲ０７９２３の可変軽鎖のアミノ酸配列を図４Ｉおよび配列番号２７に示す。ＭＯＲ０７９２４の可変軽鎖のヌクレオチド配列を図４Ｄおよび配列番号２８に示す。ＭＯＲ０７９２４の可変軽鎖のアミノ酸配列を図４Ｊおよび配列番号２９に示す。ＭＯＲ０７９２５の可変軽鎖のヌクレオチド配列を図４Ｅおよび配列番号３０に示す。ＭＯＲ０７９２５の可変軽鎖のアミノ酸配列を図４Ｋおよび配列番号３１に示す。ＭＯＲ０７９２６の可変軽鎖のヌクレオチド配列を図４Ｆおよび配列番号３２に示す。ＭＯＲ０７９２６の可変軽鎖のアミノ酸配列を図４Ｌおよび配列番号３３に示す。
【００８６】
ＭＯＲ０７６９２、ＭＯＲ０７９２３、ＭＯＲ０７９２４、ＭＯＲ０７９２５、およびＭＯＲ０７９２６の可変重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を配列番号１に示す。ＭＯＲ０７９１９の可変重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００８７】
ＭＯＲ０７６９２、ＭＯＲ０７９２３、ＭＯＲ０７９２４、ＭＯＲ０７９２５、およびＭＯＲ０７９２６の可変重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）のアミノ酸配列を配列番号２に示す。ＭＯＲ０７９１９の可変重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）のアミノ酸配列を配列番号５に示す。
【００８８】
ＭＯＲ０７６９２、ＭＯＲ０７９２３、ＭＯＲ０７９２４、ＭＯＲ０７９２５、およびＭＯＲ０７９２６の可変重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）のアミノ酸配列を配列番号３に示す。ＭＯＲ０７９１９の可変重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）のアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００８９】
ＭＯＲ０７６９２の可変軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を配列番号７に示す。ＭＯＲ０７９１９の可変軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を配列番号８に示す。ＭＯＲ０７９２３の可変軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を配列番号９に示す。ＭＯＲ０７９２４の可変軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を配列番号１０に示す。ＭＯＲ０７９２５の可変軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を配列番号１１に示す。ＭＯＲ０７９２６の可変軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を配列番号１２に示す。
【００９０】
ＭＯＲ０７６９２、ＭＯＲ０７９２３、ＭＯＲ０７９２４、ＭＯＲ０７９２５、およびＭＯＲ０７９２６の可変軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）のアミノ酸配列を配列番号１４に示す。ＭＯＲ０７９１９の可変軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）のアミノ酸配列を配列番号１６に示す。
【００９１】
ＭＯＲ０７６９２、ＭＯＲ０７９２３、ＭＯＲ０７９２４、ＭＯＲ０７９２５、およびＭＯＲ０７９２６の可変軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）のアミノ酸配列を配列番号１３に示す。ＭＯＲ０７９１９の可変軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）のアミノ酸配列を配列番号１５に示す。
【００９２】
ＭＯＲ０７６９２の重鎖のヌクレオチド配列を配列番号５０に示す。ＭＯＲ０７６９２の重鎖のアミノ酸配列を配列番号５１に示す。ＭＯＲ０７６９２の軽鎖のヌクレオチド配列を配列番号５４に示す。ＭＯＲ０７６９２の軽鎖のアミノ酸配列を配列番号５５に示す。
【００９３】
ＭＯＲ０７９２３の重鎖のヌクレオチド配列を配列番号５０に示す。ＭＯＲ０７９２３の重鎖のアミノ酸配列を配列番号５１に示す。ＭＯＲ０７９２３の軽鎖のヌクレオチド配列を配列番号５６に示す。ＭＯＲ０７９２３の軽鎖のアミノ酸配列を配列番号５７に示す。
【００９４】
ＭＯＲ０７９２４の重鎖のヌクレオチド配列を配列番号５０に示す。ＭＯＲ０７９２４の重鎖のアミノ酸配列を配列番号５１に示す。ＭＯＲ０７９２４の軽鎖のヌクレオチド配列を配列番号５８に示す。ＭＯＲ０７９２４の軽鎖のアミノ酸配列を配列番号５９に示す。
【００９５】
ＭＯＲ０７９２５の重鎖のヌクレオチド配列を配列番号５０に示す。ＭＯＲ０７９２５の重鎖のアミノ酸配列を配列番号５１に示す。ＭＯＲ０７９２５の軽鎖のヌクレオチド配列を配列番号６０に示す。ＭＯＲ０７９２５の軽鎖のアミノ酸配列を配列番号６１に示す。
【００９６】
ＭＯＲ０７９２６の重鎖のヌクレオチド配列を配列番号５０に示す。ＭＯＲ０７９２６の重鎖のアミノ酸配列を配列番号５１に示す。ＭＯＲ０７９２６の軽鎖のヌクレオチド配列を配列番号６２に示す。ＭＯＲ０７９２６の軽鎖のアミノ酸配列を配列番号６３に示す。
【００９７】
ＭＯＲ０７９１９の重鎖のヌクレオチド配列を配列番号４８に示す。ＭＯＲ０７９１９の重鎖のアミノ酸配列を配列番号４９に示す。ＭＯＲ０７９１９の軽鎖のヌクレオチド配列を配列番号５２に示す。ＭＯＲ０７９１９の軽鎖のアミノ酸配列を配列番号５３に示す。
【実施例５】
【００９８】
（ＥＬＩＳＡによる結合活性分析）
９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）マイクロタイタープレートのウェルを、ＰＢＳ中に希釈された１μｇ／ｍｌの組換え体ＭＳＴ１Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質（ヒトＭＳＴ１Ｒの２５〜５７１アミノ酸配列を含有する、Ｒ＆Ｄ）でコーティングした。このプレートを４℃で終夜インキュベートした。翌日、ウェルを、ＰＢＳ−ＦＣＳバッファー（ＰＢＳ中に５％ＦＣＳ）で１回洗浄し、次いで、室温で１時間、ＰＢＳ−ＦＣＳバッファーでブロックした。ＰＢＳ−ＦＣＳバッファーを除去した後、ＭＳＴ１Ｒ−Ｆｃコーティングされたウェルに４μｇ／ｍｌの一次抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ＦＣＳバッファーで１回洗浄した後、二次抗体を添加し、室温で１時間インキュベートさせた。ＰＢＳ−ＦＣＳバッファーで３回洗浄した後、ＨＲＰの基質（基質バッファー（５０ｍＭ無水クエン酸三ナトリウム、１００ｍＭリン酸水素二ナトリウム、ｐＨ４．５）中の０．４ｍｇ／ｍｌ  ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリドおよび０．００６％過酸化水素）を添加した。黄色に発色した後に、１Ｍ  ＨＣｌをさらに添加して、反応を停止させた。４９０ｎｍの吸光度をＥｎＶｉｓｉｏｎマイクロタイタープレートリーダーで測定した。図１１において、得られた抗体（ＭＯＲ０７６９２、ＭＯＲ０７９１９、ＭＯＲ０７９２３、ＭＯＲ０７９２４、ＭＯＲ０７９２５、およびＭＯＲ０７９２６）のすべてがヒトＭＳＴ１Ｒの２５〜５７１部分に結合することを示した。各抗体は、非還元、非変性ＭＳＴ１Ｒの免疫沈降には適用可能であったが、還元、変性ＭＳＴ１Ｒを検出するウェスタンブロッティングには適用可能でなかった（データは示されていない）。それは、これらの抗体が配列番号１７中のアミノ酸残基内の非変性コンフォメーションを認識することを示す。
【実施例６】
【００９９】
（生物学的アッセイ）
（Ａ．Ｅｌｋ１ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ）
抗体の機能性をＥｌｋ１ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイで試験した。アッセイの原理は、いくつかのベクターを用いた２９３α細胞の同時形質移入に基づいている。ＭＳＴ１Ｒは、細胞膜中に組み込まれており、それが過剰発現されるか、またはＭＳＰで刺激された場合、活性型（リン酸化型）となって、ＥＲＫ（細胞外シグナル制御キナーゼ）へとシグナル伝達する。抗体の機能性を試験するために、Ｅｌｋ１ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを以下の通りに確立した。最初に、本発明者らはｐＦＲ−Ｌｕｃ２ＣＰベクターを構築した。ｐＦＲ−Ｌｕｃ２ＣＰを構築するために、ｐＦＲ−Ｌｕｃベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、平滑末端化するためにＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、５×ＧＡＬ４結合エレメントおよびＴＡＴＡボックスを含有する約１４０ｂｐの断片を得るためにＢａｍＨＩで消化した。ｐＧＬ４．１２［ｌｕｃ２ＣＰ］（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、ＥｃｏＩＣＲＩ／ＢｇｌＩＩで消化し、脱リン酸し、上記断片と連結して、ｐＦＲ−Ｌｕｃ２ＣＰを生成させた。次に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）形質移入手順を用いて、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０  ＭＳＴ１Ｒ、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０、ｐＦＡ２−Ｅｌｋ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＦＲ−Ｌｕｃ２ＣＰ、およびｐＧＬ４．７４［ｈＲｌｕｃ／ＴＫ］（Ｐｒｏｍｅｇａ）で一過性に２９３α細胞に同時形質移入し、白色９６ウェル細胞培養プレートに播種した。形質移入の翌日、細胞を抗体と共に１時間プレインキュベートし、次いで、リガンド（ヒトＭＳＰ）をウェルに添加した。６時間のインキュベーションの後、細胞溶解物を調製し、Ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ホタルルシフェラーゼ活性（特異的シグナル）およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性（正規化のためのシグナル）を測定した。各ウェルのデータを正規化するために、ホタル／Ｒｅｎｉｌｌａ比を計算した。表２は、１００ｎｇ／ｍｌのＭＳＰリガンドの存在下におけるＩＣ５０値を示す。ＭＯＲ０７６９２、ＭＯＲ０７９１９、ＭＯＲ０７９２３、ＭＯＲ０７９２４、ＭＯＲ０７９２５、およびＭＯＲ０７９２６は、４から１００ｎｇ／ｍｌの間の範囲の低ＩＣ５０値を示した。図１２に示す通り、ＭＳＴ１Ｒの過剰発現は、それ自体でＭＳＴ１Ｒのリガンド非依存的活性化を誘導した。ＭＯＲ０７９２５、ＭＯＲ０７９１９、およびＭＯＲ０７６９２も、ＭＳＴ１Ｒの活性化のこのタイプを抑制した。
【０１００】
【表２】
0005714511.tif 000003
（Ｂ．ＭＳＴ１Ｒのリン酸化を検出するためのＥＬＩＳＡ）
リガンドおよび／または抗体で処置した後のＭＳＴ１Ｒのリン酸化状態の変化をＥＬＩＳＡ系によって決定した。ＰＣ３細胞（１×１０６）を直径６ｃｍのディッシュ上で終夜インキュベートした後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．１％のＢＳＡ−ＲＰＭＩ培地と共にインキュベートした。終夜インキュベーションの後に、細胞を３７℃にて１時間、１μｇ／ｍｌのＭＯＲ０７６９２抗体で処置し、次いで、０分から１５分まで、２００ｎｇ／ｍｌの組換え体ＭＳＰ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）で刺激した。次いで、細胞溶解物を調製し、リン酸化型のＭＳＴ１Ｒをヒトホスホ−ＭＳＰ  Ｒ／Ｒｏｎ  ＥＬＩＳＡ系（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）によって供給業者指示に従って測定した。図１３に示す通り、ＭＯＲ０７６９２は、ＭＳＰリガンドの添加によって促進されたＭＳＴ１Ｒリン酸化の完全阻害を示した。
（Ｃ．活性化されたＥＲＫのウェスタンブロッティング）
リガンドおよび／または抗体で処置した後のＥＲＫのリン酸化状態の変化をウェスタンブロッティングで決定した。１２ウェルプレート上でＰＣ３細胞（２×１０５）を終夜培養した後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．１％のＢＳＡ−ＲＰＭＩ培地でインキュベートした。終夜インキュベーションの後に、ヒトＩｇＧ−Ｆｃに対する親和性精製されたヤギ抗体（Ｃａｐｐｅｌ）１μｇ／ｍｌの存在下または非存在下において、３７℃で１時間、１μｇ／ｍｌのＭＯＲ０７６９２抗体で細胞を処置した。インキュベーションの後に、１００ｎｇ／ｍｌの組換え体ＭＳＰ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加し、さらに、３０分間インキュベートした。次いで、ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｉｎｉ（Ｒｏｃｈｅ）およびホスファターゼ阻害剤（Ｎａｋａｒａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）を含有するＲＩＰＡバッファーで細胞を溶解させた。細胞片から溶解物を遠心分離して清澄化し、ＢＣＡタンパク質アッセイ（ＰＩＥＲＣＥ）を用いてタンパク質濃度を決定した。溶解物をβ−メルカプトエタノールを含有するバッファー中に再懸濁し、９９℃で５分間変性させた。５〜２０％のゲルにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、タンパク質（１０μｇ／レーン）は分離した。ＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ）上にタンパク質をブロッティングした。膜を室温で１時間、Ｂｌｏｃｋａｃｅ（Ｙｕｋｉｊｉｒｕｓｈｉ）でブロックし、ＥＲＫに対するポリクロナール抗体またはホスホ−ＥＲＫ抗体と共に４℃で終夜インキュベートした。洗浄の後、膜をホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ウサギ二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共にインキュベートした。ＥＣＬ  ｐｌｕｓ基質（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、Ｘ線フィルムで免疫反応性バンドを可視化した。図１４は、リガンドＭＳＰに反応したＥＲＫリン酸化を表した。増大は、ヒトＩｇＧ−Ｆｃに対する架橋結合抗体の存在下および非存在下におけるＭＯＲ０７６９２の添加によってほぼ完全に阻害された。
（Ｄ．細胞増殖アッセイ）
２％チャーコール／デキストラン処置されたＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含有するＲＰＭＩ培地に懸濁されたＴ−４７Ｄ細胞（５０００細胞／ウェル）を９６ウェルプレート上に播種した。細胞を、３７℃で１時間、１μｇ／ｍｌの抗体と共にインキュベートし、次いで、１００ｎｇ／ｍｌの組換え体ＭＳＰで刺激した。５日間のインキュベーションの後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって、供給業者の指示に従って細胞ＡＴＰを測定した。図１５に示す通り、ＭＯＲ０７６９２、ＭＯＲ０７９２３、ＭＯＲ０７９２４、ＭＯＲ０７９２５、およびＭＯＲ０７９２６は、ＭＳＰによって促進されたＴ−４７Ｄ細胞の増殖を明確に抑制した。ＭＯＲ０７９１９は、他の抗体より弱い阻害活性を有した。
（Ｅ．移動アッセイ）
１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ培地中に懸濁されたＢｘＰＣ−３細胞（５×１０４細胞／ウェル）を９６ウェルＯｒｉｓ（商標）細胞移動アッセイプレート（Ｐｌａｔｙｐｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣ．）に播種した。終夜培養の後に、試験ウェルからストッパーを取り除き、培地を、２％チャーコール／デキストランで処置されたＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で置き換えた。細胞を、３７℃で１時間、１０μｇ／ｍｌの抗体と共にインキュベートし、次いで、３００ｎｇ／ｍｌの組換え体ＭＳＰで刺激した。２４時間のインキュベーションの後に、移動した細胞を明視野顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を用いて観察し、次いで、それらのイメージをＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアによって分析して、無細胞領域を計算した。図１６に示す通り、ＭＯＲ０７９１９、ＭＯＲ０７６９２、およびＭＯＲ０７９２５は、ＭＳＰによって促進されたＢｘＰＣ−３細胞の細胞移動を明確に抑制した。ＭＯＲ０７６９２およびＭＯＲ０７９２５は、ＭＯＲ０７９１９と比較して、より強い阻害活性を有した。
（Ｆ．内部移行アッセイ）
抗体が内部移行する能力を評価するために、Ｈｕｍ−ＺＡＰ二次結合体（ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＳＹＳＴＥＭＳ提供の親和性精製されたヤギ抗ヒトＩｇＧサポリン）を二次抗体として用いて、細胞内への内部移行の後に、タンパク質合成阻害、最終的には細胞死を引き起こした。１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ培地中に懸濁されたＰＣ３細胞（２０００細胞／ウェル）を９６ウェル透明平底白色培養プレートに播種した。翌日、細胞を抗体と共に４℃で１時間プレインキュベートした。抗体を含有する培地を除去した後、０．５μｇ／ｍｌのＨｕｍ−ＺＡＰ二次結合体をウェルに添加した。プレートを４℃で１時間、次いで３７℃で３日間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって、供給業者の指示に従って、細胞生存率の読み取り値として細胞ＡＴＰを測定した。図１７に示す通り、ＰＣ３細胞の生存率は、ＭＯＲ０７６９２、ＭＯＲ０７９１９、ＭＯＲ０７９２３、ＭＯＲ０７９２４、ＭＯＲ０７９２５、およびＭＯＲ０７９２６での処置によって大きく低減した。これは、これらの抗体の細胞内在化能力を示唆する。
【０１０１】
本発明が属する分野の技術水準をより完全に記載するために、本明細書に引用したすべての特許、特許出願、公開ＰＣＴ出願、ならびに論文、書籍、参考文献、参照マニュアル、および抄録の内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれている。
【０１０２】
本発明の範囲および精神から逸脱することなく、上述の主題に様々な変更を加えることができるので、上記の説明に包含される、または添付の特許請求の範囲に記載されるすべての主題は、本発明の説明および例示であると解釈されるものとする。本発明の多くの修正形態および変形形態が上記教示に照らして可能である。
【図１】
0005714511.tif 000004
【図２Ａ】
0005714511.tif 000005
【図２Ｂ】
0005714511.tif 000006
【図３Ａ】
0005714511.tif 000007
【図３Ｂ】
0005714511.tif 000008
【図３Ｃ】
0005714511.tif 000009
【図３Ｄ】
0005714511.tif 000010
【図４Ａ】
0005714511.tif 000011
【図４Ｂ】
0005714511.tif 000012
【図４Ｃ】
0005714511.tif 000013
【図４Ｄ】
0005714511.tif 000014
【図４Ｅ】
0005714511.tif 000015
【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
0005714511.tif 000017
【図４Ｈ】
0005714511.tif 000018
【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
0005714511.tif 000020
【図４Ｋ】
0005714511.tif 000021
【図４Ｌ】
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【図５】
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【図６】
0005714511.tif 000024
【図７Ａ】
0005714511.tif 000025
【図７Ｂ】
0005714511.tif 000026
【図８】
0005714511.tif 000027
【図９Ａ】
0005714511.tif 000028
【図９Ｂ】
0005714511.tif 000029
【図９Ｃ】
0005714511.tif 000030
【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
0005714511.tif 000035
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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