(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロース系バイオマスを、セルラーゼ及びヘミセルラーゼの混合物を含む酵素で糖化する糖化工程と、糖化工程終了後に酵素を回収する酵素回収工程を含むリグノセルロース系バイオマスの糖化方法であって、
糖化工程の前に、リグノセルロース系バイオマスの酵素糖化効率を高める処理を行う前処理工程を有し、
酵素回収工程が、以下の（Ａ）および（Ｂ）の工程のうち少なくとも１つを含むことを特徴する糖化方法。
（Ａ）糖化反応スラリーにアルカリを添加して、糖化反応残渣に吸着した酵素を脱着させた後、糖化反応スラリーの固液分離を行って酵素を含有する酵素回収液を回収する工程
（Ｂ）糖化反応スラリーの固液分離により得られた糖化反応残渣にアルカリを添加して、糖化反応残渣に吸着した酵素を脱着させて酵素を含有する酵素回収液を回収することを少なくとも２回以上繰り返し、その際、後の回の酵素回収液のｐＨを前の回の酵素回収液のｐＨより高くすることにより酵素回収液のｐＨが漸増するように糖化反応残渣にアルカリを添加する工程
【請求項２】
セルラーゼが少なくともセロビオヒドロラーゼ、β−グルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼを含み、ヘミセルラーゼが少なくともキシラナーゼおよびβ−キシロシダーゼを含むことを特徴とする請求項１に記載の糖化方法。
【請求項３】
（Ｂ）の工程において、ｐＨ漸増の終点における酵素回収液のｐＨが７〜１３の範囲内であることを特徴とする請求項１又は２に記載の糖化方法。
【請求項４】
酵素回収工程において、酵素回収液を回収後速やかに、酵素回収液のｐＨを弱酸性〜中性に調整することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の糖化方法。
【請求項５】
前処理工程が、リグノセルロース系バイオマスをアルカリ処理、酸処理、水熱処理から選ばれる少なくとも１つの方法で処理することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の糖化方法。
【請求項６】
前処理工程が、リグノセルロース系バイオマスをアルカリ処理するものであり、その際に生じたアルカリ廃液を、酵素回収工程のアルカリとして用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の糖化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマスの糖化方法に関するものであり、より詳細には、リグノセルロース系バイオマスを酵素で糖化する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
リグノセルロース系バイオマスを糖化し、発酵原料となる単糖類を得る技術は、食料と競合しない非可食性のバイオマスの資源・エネルギー利用という観点から、極めて重要な技術である。リグノセルロース系バイオマスを糖化する方法は、硫酸等の酸を用いて加水分解する酸糖化法と、酵素を用いて加水分解する酵素糖化法に大別される。酸糖化法はバイオマスとの反応性が高いという利点があるが、耐酸性の反応器を必要とし、使用後の酸を中和・回収する工程が必要となる点で課題を有する。一方、酵素糖化法は、比較的マイルドな反応条件で分解反応が進行するので、酸糖化法と比較して設備コストが低い、あるいは反応時における安全性が高いという利点を有する。しかしながら、酵素は非常に高価であり、酵素コストが実用上の大きな課題となっている。
【０００３】
酵素コストを低減する方策として酵素リサイクルが試みられているが、問題となるのは糖化反応残渣（糖化反応後の残渣）への酵素の吸着である。すなわち、リグノセルロース系バイオマスを糖化するために使用される酵素は、未分解の糖質およびリグニンに対して高い吸着性を示すため、糖化反応残渣に吸着する。この吸着現象が、酵素をリサイクルする上で大きな課題となっている（非特許文献１参照）。一方、酵素処理後の糖化反応液からの酵素の回収は、一般に膜分離法（限外ろ過）、またはリグノセルロース系バイオマスへの再吸着により行えることが知られており、比較的高い回収率が見込める。
【０００４】
糖化反応残渣に吸着した酵素の回収・リサイクル方法としては、例えば、以下の（ａ）〜（ｄ）などが知られている。
（ａ）酵素が吸着した糖化反応残渣をそのまま次回の酵素糖化反応に再利用する方法（特許文献１、非特許文献２参照）
（ｂ）界面活性剤を使用して糖化反応残渣から酵素を脱着・回収する方法（非特許文献３参照）
（ｃ）アルカリで糖化反応残渣から酵素を脱着・回収する方法（非特許文献３、４、５参照）
（ｄ）酸性〜中性の高濃度のバッファーで糖化反応残渣から酵素を脱着・回収する方法（非特許文献６、７参照）
【０００５】
上記（ａ）の方法は、リグニンを多く含むリグノセルロース系バイオマスを原料とする場合は、リグニンが蓄積するため適用することができない。一般に、リグニンを除去するには多大のコスト（多量のアルカリや酸等）を必要とするため、リグニン含量の高いリグノセルロース系バイオマスに適用可能な低コストのリサイクル方法が望まれる。
上記（ｂ）の方法は、酵素脱着効果が十分でなく酵素回収率が低いこと、界面活性剤を使用するためコスト高になることなどの課題を有している。
上記（ｃ）の方法は、アルカリによる酵素の失活が課題であり、また、高い回収率で酵素を回収した例は知られていない。
上記（ｄ）の方法は、高濃度のバッファー（例えば、０．５Ｍリン酸バッファー）を大量に使用するため、コスト高になるという課題を有している。
【０００６】
また、リグノセルロースはセルロースのみでなくヘミセルロースも含むため、糖化酵素としてセルラーゼとヘミセルラーゼを同時に作用させ、かつ、同時にリサイクルできることが望ましい。しかし、上記（ａ）〜（ｄ）の方法は、セルラーゼの回収・リサイクルに適用されており、ヘミセルラーゼ、またはセルラーゼとヘミセルラーゼの混合物に関する回収・リサイクルの報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−９８９５１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Biotechnology and Bioengineering, 51, 375-383 (1996)
【非特許文献２】Biotechnology and Bioengineering, 45, 328-336 (1995)
【非特許文献３】Biotechnology and Bioengineering, 34, 291-298 (1989)
【非特許文献４】Biotechnology Letters, 6(6), 369-374 (1984)
【非特許文献５】Applied Biochemistry and Biotechnology, 143, 93-100 (2007)
【非特許文献６】Applied Biochemistry and Biotechnology, 8, 25-29 (1983)
【非特許文献７】Enzyme Microb. Technol, 6, 338-340 (1984)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、リグニン含量の高いリグノセルロース系バイオマスに適用でき、糖化に用いた酵素を高い回収率で回収可能な酵素回収工程を含むリグノセルロース系バイオマスの糖化方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の発明を包含する。
［１］リグノセルロース系バイオマスを酵素で糖化する糖化工程と、糖化工程終了後に酵素を回収する酵素回収工程を含むリグノセルロース系バイオマスの糖化方法であって、
酵素回収工程が、以下の（Ａ）および（Ｂ）の工程のうち少なくとも１つを含むことを特徴する糖化方法。
（Ａ）糖化反応スラリーにアルカリを添加して、糖化反応残渣に吸着した酵素を脱着させた後、糖化反応スラリーの固液分離を行って酵素を含有する酵素回収液を回収する工程
（Ｂ）糖化反応スラリーの固液分離により得られた糖化反応残渣にアルカリを添加して、糖化反応残渣に吸着した酵素を脱着させて酵素を含有する酵素回収液を回収し、その際、酵素回収液のｐＨが漸増するように糖化反応残渣にアルカリを添加する工程
［２］糖化工程の前に、リグノセルロース系バイオマスの酵素糖化効率を高める処理を行う前処理工程を有することを特徴とする前記［１］に記載の糖化方法。
［３］酵素がセルラーゼおよびヘミセルラーゼの混合物である前記［１］または［２］に記載の糖化方法。
［４］セルラーゼが少なくともセロビオヒドロラーゼ、β−グルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼを含み、ヘミセルラーゼが少なくともキシラナーゼおよびβ−キシロシダーゼを含むことを特徴とする前記［３］に記載の糖化方法。
［５］（Ｂ）の工程において、ｐＨ漸増の終点における酵素回収液のｐＨが７〜１３の範囲内であることを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれかに記載の糖化方法。
［６］酵素回収工程において、酵素回収液を回収後速やかに、酵素回収液のｐＨを弱酸性〜中性に調整することを特徴とする前記［１］〜［５］のいずれかに記載の糖化方法。
［７］前処理工程が、リグノセルロース系バイオマスをアルカリ処理するものであり、その際に生じたアルカリ廃液を、酵素回収工程のアルカリとして用いることを特徴とする前記［２］〜［６］のいずれかに記載の糖化方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、リグニン含量の高いリグノセルロース系バイオマスに適用でき、糖化に用いた酵素を高い回収率で回収可能な酵素回収工程を含むリグノセルロース系バイオマスの糖化方法を提供することができる。回収した酵素をリサイクル使用して糖化工程を行うことにより、酵素使用量を減らし、酵素コストを大幅に低減することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、リグノセルロース系バイオマスの糖化方法を提供する。本発明の糖化方法は、リグノセルロース系バイオマスを酵素で糖化する糖化工程と、糖化工程終了後に酵素を回収する酵素回収工程を必須の工程として含むものであればよい。好ましくは、糖化工程の前に、リグノセルロース系バイオマスの酵素糖化効率を高める処理を行う前処理工程を含む。
【００１３】
本発明の糖化方法の原料は、リグノセルロース系バイオマスを含むものであればよい。リグノセルロース系バイオマスは、主としてセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンから構成されており、木本植物、草本植物、それらの加工品、それらの廃棄物などが該当する。具体的には、例えば、木材、間伐材、製材残材、建築廃材、樹皮、果房、果実殻、茎葉、稲わら、麦わら、バガス、古紙などが挙げられる。好ましくは、アブラヤシ、ナツメヤシ、サゴヤシ、ココヤシ等のヤシ類（幹、茎葉、空果房、果実繊維）、サトウキビ（バガス、葉）、トウモロコシ（穂軸、茎葉）、稲わら、麦わら、スウィッチグラス、および、ユーカリ、ポプラ、スギ等の木材（樹皮、木部）である。より好ましくはヤシ類の空果房、サトウキビバガス、トウモロコシ穂軸、稲わら、麦わら、ユーカリ、スギであり、さらに好ましくはアブラヤシの空果房である。リグノセルロース系バイオマスの大きさ、形状等は特に限定されないが、各工程における反応効率を向上させる観点から、予め粉砕され、チップ状にされたものが好ましい。
【００１４】
前処理工程では、リグノセルロース系バイオマスの酵素糖化効率を高める処理を行う。前処理を行うことにより、セルロースおよびヘミセルロースへの酵素の接触が容易となり、酵素反応の効率が向上する。リグノセルロース系バイオマスの酵素糖化効率を高める処理としては、例えば、リグニンを可溶化する処理、セルロースおよびヘミセルロースとリグニンとの結合を切断する処理、セルロースおよびヘミセルロースの表面積を増大させる処理、セルロースの結晶性を低下させる処理などが挙げられる。本発明の糖化方法において前処理工程は必須ではなく、例えば古紙等のようにリグニン含量の低いリグノセルロース系バイオマスを用いる場合には省略することができる。前処理方法は、公知の方法から適宜選択することができる。例えば、アルカリ処理、酸処理、水熱処理、爆砕処理、有機溶媒処理、イオン性液体処理、マイクロ波処理、白色腐朽菌などのリグニン分解菌による処理、粉砕処理などが挙げられ、好ましくはアルカリ処理、酸処理、水熱処理であり、さらに好ましくはアルカリ処理である。
【００１５】
前処理がアルカリ処理の場合、アルカリとしては、ナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウムの水酸化物、酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、アンモニアなどが使用でき、好ましくは水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カルシウム、酸化カルシウム、アンモニアであり、さらに好ましくは水酸化ナトリウム、水酸化カルシウムである。アルカリは液状物（アルカリ液、好ましくはアルカリ水溶液）を用いてもよく、固状物を用いてもよい。固状のアルカリを用いる場合は、別途水を添加することが好ましい。アルカリ添加量は特に限定されないが、好ましくはリグノセルロース系バイオマスを含む原料に対して約１〜３０ｗｔ％、より好ましくは約５〜１５ｗｔ％添加する。なお、原料に対するｗｔ％は原料の乾燥重量（絶乾重量）に対するｗｔ％とし、以下も同様とする。処理温度は特に限定されないが、好ましくは約２０〜２００℃、より好ましくは約５０〜１５０℃である。処理時間は特に限定されないが、好ましくは約０．１〜１００時間、より好ましくは約１〜３０時間である。アルカリ処理後に、ろ過、遠心分離等により固液分離し、固形分を糖化工程に供する。分離後の固形分は、水等で洗浄してアルカリおよび可溶化リグニンを除去することが好ましい。また、洗浄後に乾燥させてもよいが、乾燥させずに糖化工程に供することが好ましい。また、リグニン分解を促進させるために、アントラキノン、スルホン化アントラキノンなどのアントラキノン類を添加してアルカリ処理を行ってもよい。
【００１６】
前処理が酸処理の場合は、硫酸、塩酸、硝酸、酢酸、リン酸等の酸類が使用でき、水溶液で用いるのが好ましく、希硫酸がさらに好ましい。酸添加量は特に限定されないが、好ましくはリグノセルロース系バイオマスを含む原料に対して約０．１〜１０ｗｔ％添加する。処理温度は特に限定されないが、好ましくは約１００〜２００℃である。処理時間は特に限定されないが、好ましくは約０．１〜１０時間である。固液分離、洗浄を行い、糖化工程に供する。
【００１７】
前処理が水熱処理の場合は、リグノセルロース系バイオマスを含む原料に水を添加し、高温高圧下で処理する。水の添加量は特に限定されないが、好ましくはリグノセルロース系バイオマスを含む原料に対して約１〜２０倍の重量を添加する。処理温度は特に限定されないが、好ましくは約１００〜２５０℃である。処理時間は特に限定されないが、好ましくは約０．１〜１０時間である。固液分離、洗浄を行ってもよいが、水熱処理の場合は、固液分離、洗浄を行わずに、糖化工程に供することもできる。
【００１８】
これらの中でも、アルカリ処理が好ましい。後述するように、前処理工程におけるアルカリ処理により生じたアルカリ廃液を酵素回収工程のアルカリとして用いることにより、酵素回収の効率が向上することが確認されている（実施例７、実施例１０参照）。
【００１９】
糖化工程では、リグノセルロース系バイオマスを酵素で糖化する。糖化工程の原料には、上記前処理工程後のリグノセルロース系バイオマスを用いることが好ましい。用いる酵素は、セルロースを単糖（グルコース）に加水分解できる酵素、またはヘミセルロースを単糖（キシロース、マンノース、アラビノース等）に加水分解できる酵素を含むものであればよい。このような酵素は、一般にセルラーゼ、ヘミセルラーゼと称され、複数の酵素で構成される。本発明の糖化方法に用いる酵素は、セルラーゼまたはヘミセルラーゼを含むものであればよいが、糖化効率を向上させるために、両者の混合物を用いることが好ましい。セルラーゼとしては、セロビオヒドロラーゼ、β−グルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼを含むものであることが好ましい。ヘミセルラーゼとしては、キシラナーゼおよびβ−キシロシダーゼを含むものであることが好ましい。他のヘミセルラーゼとしては、アセチルキシランエステラーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、マンナナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、キシログルカナーゼ、ペクトリアーゼ、ペクチナーゼなどが挙げられる。また、植物細胞壁分解に関わる他の酵素、例えば、フェルラ酸エステラーゼ、クマル酸エステラーゼ、プロテアーゼなどを含んでいてもよい。これらの酵素を含有しているか否かは、各酵素の基質を用いて酵素活性を調べることにより、確認することができる。
【００２０】
酵素の由来としては特に限定されないが、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ファネロケエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属、フーミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物などに由来する酵素が挙げられ、好ましくはトリコデルマ属、アクレモニウム属、アスペルギルス属由来の酵素であり、さらに好ましくはトリコデルマ属由来の酵素である。
【００２１】
これらの酵素は市販されており、本発明の糖化方法に好適に用いることができる。市販の酵素製剤としては、ノボザイムズ社製のＣｅｌｌｉｃシリーズ（ＣＴｅｃ２、ＨＴｅｃ２、ＣＴｅｃ、Ｈｔｅｃ）、ノボザイム１８８、Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ、Ｐｕｌｐｚｙｍｅ、ジェネンコア社製のＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅシリーズ（Ｄｕｅｔ、１５００、ＸＹ、ＸＣ、ＢＧ）、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔシリーズ、明治製菓社製のメイセラーゼ、ヤクルト社製のオノズカ、アマノエンザイム社製のセルラーゼ（Ａ、Ｔ）などが挙げられる。好ましくはＣｅｌｌｉｃ ＣＴｅｃ２、Ｃｅｌｌｉｃ ＨＴｅｃ２、ＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅＤｕｅｔである。これらの酵素製剤はセロビオヒドロラーゼ、β−グルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼを含んでおり、原料のリグノセルロース系バイオマスの組成や含有酵素活性を考慮して、単独、あるいは複数を組み合わせて用いることができる。セルラーゼ活性の高い酵素製剤とヘミセルラーゼ活性の高い酵素製剤を組み合わせて用いる方法は本発明の好適な実施形態であり、特にＣｅｌｌｉｃ ＣＴｅｃ２とＣｅｌｌｉｃ ＨＴｅｃ２を組み合わせて混合して用いることが好ましい。
【００２２】
また本発明ではアルカリで酵素を回収して再利用することから、高いアルカリ安定性、および熱安定性を有する酵素を使用することが好ましい。酵素を化学的、あるいは遺伝子工学的（タンパク質工学的）に修飾してもよい。修飾することで、酵素安定性を高めたり、糖化反応残渣への吸着性を低減させたり、酵素回収効率を高めることができるため、本発明で好適に用いることができる。
【００２３】
糖化工程において、リグノセルロース系バイオマスを酵素処理して糖化する方法は特に限定されず、リグノセルロース系バイオマスを含む原料（以下「バイオマス原料」という。）と酵素が接触して単糖が生成される方法であればどのようなものでもよい。例えば、バイオマス原料に酵素および水を添加してスラリーを調製し、攪拌しながら反応させる方法が挙げられる。スラリーを攪拌せずに静置状態で反応を行ってもよいが、糖化反応促進のため攪拌することが好ましい。酵素の使用量としては特に限定されないが、好ましくはバイオマス原料に対して、酵素活性成分の重量として、約０．０１〜１０ｗｔ％、より好ましくは約０．０５〜３ｗｔ％添加する。水の添加量としては特に限定されないが、好ましくはバイオマス原料（乾燥重量）に対して約１〜２０倍、さらに好ましくは２〜１０倍量添加する。反応系には、酵素反応の妨げとならない限りバイオマス原料および酵素以外のものが添加されてもよい。例えば、テトラサイクリン塩酸塩、シクロヘキシミドなどの抗生物質を雑菌による糖消費の抑制の目的で添加してもよい。
【００２４】
反応条件は、酵素による加水分解が進行する条件であれば特に限定されない。反応温度は通常約２０〜８０℃、好ましくは約３０〜６０℃である。反応時間は通常約１〜３００時間、好ましくは約１０〜１００時間である。反応ｐＨは酵素の至適ｐＨに従って設定すればよいが、通常ｐＨ約３〜７、好ましくはｐＨ約４．５〜６である。ｐＨコントロールのために、酢酸、クエン酸、コハク酸、リン酸などのバッファー成分を添加してもよい。ｐＨ調整には、酸、アルカリを適宜選択して用いることができる。一般に前処理工程としてアルカリ処理を行った場合には、バイオマス原料がアルカリ性になっているため、酸を使用して糖化に適したｐＨに調整する。この場合、使用する酸としては特に限定されないが、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、二酸化炭素などが挙げられ、好ましくは硫酸、塩酸、酢酸、二酸化炭素である。また酵素のバイオマス原料への非特異的吸着を低減させるために、添加剤を添加してもよい。このような添加剤としては、タンパク質、界面活性剤、リグニン分解物などが挙げられ、好ましくは真菌や細菌などの微生物を培養して得られるタンパク質（菌体由来、および菌体外分泌タンパク質）、非イオン性界面活性剤、および脂肪酸由来の界面活性剤である。酵素の非特異的吸着を低減させることで、糖化速度の向上、酵素回収率の向上などが見込めるため、このような添加剤を添加することは本発明の好適な実施形態の一つである。
【００２５】
糖化工程により、酵素糖化反応の反応生成物である糖化反応スラリー（以下、単に「反応スラリー」という。）が得られる。この反応スラリーを、次の酵素回収工程に供する。反応スラリーは、糖化反応液（以下、単に「反応液」という。）と糖化反応残渣（以下、単に「反応残渣」という。）との混合物である。反応液には、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース等の単糖類および遊離の酵素が含まれている。反応残渣は反応液回収後の残りかすであり、未分解の糖質、リグニン、これらに吸着した酵素などが含まれている。
【００２６】
酵素回収工程では、反応残渣に吸着した酵素を、アルカリを添加することで脱着させて回収する。本発明者らは、反応残渣と酵素との吸着／脱着状態は、系のｐＨに依存して変化することを見出した。すなわち、ｐＨを高くすると脱着率が高くなり（吸着率が低くなり）、ｐＨを低くすると吸着率が高くなる（脱着率が低くなる）ことを見出した。これは、反応残渣中のイオン性残基（カルボキシル基やフェノール性水酸基など）が、高ｐＨではイオン化されて親水化し、酵素／反応残渣の疏水的相互作用が弱まるためと考えられる。酵素の脱着率は、基本的には系のｐＨを高めるほど高くなるが、高いｐＨではアルカリによる酵素の失活が問題となる。そこで、本発明者らは、アルカリとの接触を制限しながら効率的に酵素回収を行うことが重要であると認識し、鋭意検討した結果、以下の（Ａ）および（Ｂ）の工程のうち少なくとも１つを含む酵素回収方法を見出した。
（Ａ）糖化反応スラリーにアルカリを添加して、糖化反応残渣に吸着した酵素を脱着させた後、糖化反応スラリーの固液分離を行って酵素を含有する酵素回収液を回収する工程
（Ｂ）糖化反応スラリーの固液分離により得られた糖化反応残渣にアルカリを添加して、糖化反応残渣に吸着した酵素を脱着させて酵素を含有する酵素回収液を回収し、その際、酵素回収液のｐＨが漸増するように糖化反応残渣にアルカリを添加する工程
本発明の糖化方法における酵素回収工程は、好ましくは工程（Ｂ）を含むものであり、より好ましくは工程（Ａ）および工程（Ｂ）を含むものである。
【００２７】
背景技術で述べたリサイクル方法（ｃ）（非特許文献３、４、５参照、以下「方法（ｃ）」という。）は、本発明の酵素回収工程と同様にアルカリを用いて酵素回収を行うものである。しかしながら、方法（ｃ）は、固液分離後の反応残渣にアルカリを添加し酵素回収を行うのに対して、本発明の酵素回収工程における工程（Ａ）は、固液分離前の段階でアルカリを添加し酵素回収を行う点で異なっている。また、方法（ｃ）では、一定ｐＨのアルカリ液を用いて単一の酵素回収を行うのに対して、本発明の酵素回収工程における工程（Ｂ）は、低いｐＨから高いｐＨへ酵素回収液のｐＨを漸増させて酵素回収を行う点で異なっている。方法（ｃ）での酵素回収率は最大５０％程度にとどまっているが（ｐＨ１０付近）、これは、高いｐＨで単一のアルカリ処理をすることにより、酵素が失活しているためと考えられる。本発明の糖化方法における酵素回収工程は、よりマイルドな条件で酵素回収を行うものであるため、アルカリ失活することなく、高い酵素回収率を達成できるという点で優位である。
【００２８】
工程（Ａ）は、糖化工程で得られた反応スラリーに対して、まずアルカリを添加して反応スラリーのｐＨをアルカリ側にシフトさせ、反応残渣に吸着した酵素を一部脱着させて遊離の酵素を増加させる。続いて、ｐＨをシフトさせた反応スラリーの固液分離を行い、反応残渣を分離し、酵素回収液（＝反応液、単糖と遊離酵素を含む）を回収する。この操作により、遊離の酵素を増加させて単糖類と共に酵素回収液（＝反応液）中に回収できるため、より簡便に（酵素回収液を増加させずに）酵素回収率を高めることができる。すなわち、工程（Ａ）は、糖化工程後の反応液と反応残渣の固液分離の段階で酵素回収率を高めることができるという点が特徴であり、メリットである。酵素回収率をさらに高めたい場合は、分離した反応残渣からさらに酵素回収を行ってもよい。分離した反応残渣からさらに酵素を回収する方法は特に限定されないが、水洗浄、アルカリ添加が好ましく、さらに好ましくは後述する工程（Ｂ）の方法である。
【００２９】
工程（Ａ）で反応スラリーに添加するアルカリとしては、アルカリ液が好ましく、アルカリ水溶液がより好ましい。アルカリ液またはアルカリ水溶液のｐＨは特に限定されないが、ｐＨが約７〜１４の範囲が好ましく、さらに好ましくはｐＨ約８〜１３の範囲である。アルカリとしては、ナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウムの水酸化物、酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、アンモニアなどが使用でき、好ましくは水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カルシウム、酸化カルシウム、アンモニアであり、さらに好ましくは水酸化ナトリウム、水酸化カルシウムである。ホウ酸、リン酸などのバッファー成分を含んでいてもよい。またアルカリ液は酵素脱着を促進させるための添加剤を含んでいてもよい。このような添加剤としては、タンパク質、界面活性剤、リグニン分解物などが挙げられ、好ましくは真菌や細菌などの微生物を培養して得られるタンパク質（菌体由来、および菌体外分泌タンパク質）、非イオン性界面活性剤、および脂肪酸由来の界面活性剤である。
【００３０】
工程（Ａ）におけるアルカリ添加後の反応スラリーのｐＨは、中性〜弱アルカリ性であることが好ましい。これはアルカリによる酵素失活を抑制するためである。具体的には、ｐＨ約６〜１０であるのが好ましく、ｐＨ約６．５〜９であるのがさらに好ましい。添加するアルカリの量は、上記ｐＨを達成できる量であればよいが、アルカリ液として添加する場合は、反応スラリーの重量に対して約０．００１〜１００ｗｔ％の範囲が好ましく、約０．０１〜１０ｗｔ％の範囲がさらに好ましい。アルカリ添加後、反応残渣からの酵素脱着を促進させるために、攪拌、加熱等を行ってもよい。脱着時の温度は、約５〜６０℃の範囲が好ましく、約１０〜４０℃がさらに好ましい。脱着時間（アルカリ添加から固液分離までの時間）は、温度との兼合いで脱着率が最大化する時間を適宜設定すればよいが、一般的には約０．０１〜１０時間の範囲であり、約０．１〜３時間が好ましい。酵素脱着後の反応スラリーの固液分離方法は特に限定されず、例えば、ろ過、遠心分離、遠心ろ過、サイクロン、フィルタープレス、デカンターなどを使用することができる。工程（Ａ）においてアルカリ添加を行う反応スラリーは、糖化工程で得られる反応スラリーの全部でもよく、一部でもよい。工程（Ａ）における酵素回収は、回分式で行うことが好ましい。すなわち、アルカリ添加、脱着および固液分離は、段階的に行うことが好ましい。
【００３１】
工程（Ｂ）は、まず糖化工程で得られた反応スラリーの固液分離を行い、反応液と反応残渣を分離する。続いて、得られた反応残渣に対して、アルカリを添加して酵素脱着を行い、酵素を含有する酵素回収液を回収する。工程（Ｂ）は、この反応残渣からの酵素回収において、回収された酵素を含む酵素回収液のｐＨが漸増するように反応残渣にアルカリを添加することを特徴する。ｐＨが漸増するとは、低いｐＨから高いｐＨへ徐々に変化することを意味する。この変化は連続的であっても、段階的であってもよいが、低いｐＨから酵素回収を開始し、ｐＨを増しながら酵素回収を行うことが重要である。セルラーゼおよびヘミセルラーゼはそれぞれ複数の酵素で構成されているが、個々の酵素が異なる反応残渣吸着特性および安定性（特にアルカリに対して）を有していることを本発明者らは確認している。ｐＨを漸増させて酵素回収を行うことで、アルカリとの接触を制限しながら、個々の酵素の特性に合ったｐＨ領域で酵素回収が行えるため、失活することなく高い酵素回収率を得ることができる。
【００３２】
工程（Ｂ）における反応スラリーの固液分離は、上記工程（Ａ）で述べた方法と同様の方法で行うことができる。反応スラリーとしては、糖化工程で得られた反応スラリーをそのまま用いてもよいが、工程（Ａ）によってアルカリ性に調整された反応スラリーを用いてもよい。反応残渣へのアルカリの添加は、反応残渣を適当な容器に入れ、アルカリを添加して反応残渣に吸着した酵素を脱着させる。容器は、糖化工程で用いた反応器をそのまま用いてもよい。添加するアルカリは、上記工程（Ａ）で述べたものと同様のものを用いることができ、添加剤も同様のものを用いることができる。アルカリと水とを別々に反応残渣に添加してもよいが、その場合は混合させて得られる溶液をアルカリ液として考える。また本発明者らは、塩濃度が高すぎると反応残渣からの酵素脱着が阻害されることを見出した。塩濃度は、アルカリ液中の塩濃度として、約０．０００１〜２００ｍＭであることが好ましく、さらに好ましくは約０．００１〜５０ｍＭである。添加するアルカリ液の総量としては、反応残渣（乾燥重量）に対して約１〜５００倍の範囲が好ましく、約３〜１００倍の範囲がさらに好ましい。アルカリ添加後、反応残渣からの酵素脱着を促進させるために、攪拌、加熱等を行ってもよい。脱着の条件は上記工程（Ａ）で述べた条件と同様の条件で行うことができる。続いて、ろ過、遠心分離等によりアルカリ脱着後の反応残渣を分離し、脱着した酵素を含む液を酵素回収液として回収する。回収した酵素回収液のｐＨが漸増していることは、酵素回収液を経時的に採取してｐＨを測定することで確認することができる。少なくともアルカリ添加後最初に採取した酵素回収液のｐＨより後に採取した酵素回収液のｐＨが高ければ、回収した酵素回収液のｐＨが漸増していると認められる。
【００３３】
工程（Ｂ）での反応残渣からの酵素回収は、連続式で行ってもよく、回分式で行ってもよい。連続式の方が、より少ないアルカリ液の量で効率的に酵素回収を行えるため、好ましい。工程（Ｂ）を連続式で行う場合は、アルカリ液の添加および脱着した酵素を含む酵素回収液の回収を、いずれも連続的に行うことができる。連続的に添加するアルカリ液の組成、ｐＨは、添加開始から添加終了まで一定でもよく、変化してもよい。変化する場合は、添加開始時のｐＨより添加終了時のｐＨが高いことが好ましい。アルカリ液のｐＨの変化は連続的であってもよく、段階的であってもよい。酵素回収液のｐＨが漸増していることは、例えば、回収開始時、回収途中、回収終了時の酵素回収液を適宜採取してｐＨを測定することで確認することができる。測定した酵素回収液のｐＨが、回収開始時＜回収途中＜回収終了時となっていればよい。
【００３４】
工程（Ｂ）を回分式で行う場合は、反応残渣へのアルカリ液の添加および脱着した酵素を含む酵素回収液の回収を少なくとも２回以上繰り返す。１回目に添加するアルカリ液の組成、ｐＨと、２回目以後に添加するアルカリ液の組成、ｐＨは同じでもよく、異なってもよい。１回目と２回目以後に異なるｐＨのアルカリ液を添加する場合は、後の回のアルカリ液のｐＨが前の回のアルカリ液のｐＨより高いことが好ましい。酵素回収液のｐＨが漸増していることは、各回の酵素回収液のｐＨを測定することにより確認することができる。後の回の酵素回収液のｐＨが、前の回の酵素回収液のｐＨより高くなっていればよい。
【００３５】
工程（Ｂ）において、反応残渣にアルカリを添加後、ｐＨ漸増の終点における酵素回収液のｐＨは、約７〜１３であることが好ましく、約７．５〜１１であることがより好ましい。当該ｐＨ範囲で酵素回収を終了することで、十分に高い酵素回収率を得ることができる。「ｐＨ漸増の終点」とは、酵素回収液のｐＨを漸増させて酵素回収を行う区間の終点を意味する。通常、酵素回収区間の全範囲が酵素回収液のｐＨを漸増させて酵素回収を行う区間に該当するので、ｐＨ漸増の終点における酵素回収液は酵素回収終了時の酵素回収液を意味することになる。すなわち、通常ｐＨ漸増の終点における酵素回収液は、連続式で酵素回収液を回収する場合には、酵素回収終了時の回収液を含み、ｐＨ測定が可能となる一定量（通常約１０〜１００ｍＬ）の酵素回収液を意味し、回分式で酵素回収液を回収する場合には、最終回の酵素回収液を意味する。ただし、酵素回収工程の途中または終了時にｐＨを低下させる操作を行う場合には、ｐＨを低下させる操作を行う前に存在する酵素回収液のｐＨ漸増区間の終点が、「ｐＨ漸増の終点」になる。
酵素回収工程における工程（Ｂ）の特徴は、反応残渣からの酵素回収において酵素回収液のｐＨを漸増させることであるので、酵素回収開始時の酵素回収液のｐＨは、酵素回収終了時よりも低いｐＨであればよく、特に限定されない。反応残渣からの酵素回収開始時の酵素回収液のｐＨは、ｐＨ約４〜１１であることが好ましく、ｐＨ約５〜９であることがより好ましい。また、酵素回収工程において、アルカリ添加による酵素回収区間の途中または終了後に、水などを用いて反応残渣を洗浄し、残存する酵素を回収してもよい。
【００３６】
リグノセルロース系バイオマスから単糖への糖化効率を高めるために、糖化工程で用いる酵素として複数のセルラーゼおよび複数のヘミセルラーゼの混合物を用いることが好ましいが、個々の酵素が糖化反応残渣から脱着し易いｐＨはそれぞれ異なることが確認されている。例えば、セルラーゼ活性を有するβ−グルコシダーゼはｐＨが１０を超えるような領域のほうが脱着しやすく、同じくセルラーゼ活性を有するセロビオヒドロラーゼはより低いｐＨの領域でも脱着することを、本発明者らは確認している（実施例２〜５参照）。また一方、アルカリ安定性に関しては、β−グルコシダーゼは高く、セロビオヒドロラーゼは低いという違いがあることも、本発明者らは確認している。酵素回収工程における工程（Ｂ）は、酵素回収液のｐＨが漸増するように反応残渣にアルカリを添加するものであるため、脱着容易なｐＨおよび安定性が異なる複数の酵素混合物（例えば、複数のセルラーゼおよび複数のヘミセルラーゼの混合物）を糖化酵素として使用した場合でも高い酵素回収率を実現することができる点で、非常に有用である。
【００３７】
前処理工程がアルカリ処理の場合、前処理工程においてリグノセルロース系バイオマスをアルカリ処理して生じたアルカリ廃液を、酵素回収工程における工程（Ａ）および／または工程（Ｂ）のアルカリとして用いることが好ましい。本発明者らは、前処理工程で生じたアルカリ廃液を、酵素回収工程のアルカリ液に対して１０ｗｔ％添加して酵素回収を行うことにより、アルカリ廃液を添加していないアルカリ液で酵素回収を行う場合より酵素回収効率が向上すること（実施例６参照）を見出した。また、前処理工程で生じたアルカリ廃液を、酵素回収工程のアルカリ液に対して５ｗｔ％添加して酵素回収を行うことにより、アルカリ廃液を添加していないアルカリ液で酵素回収を行う場合より少ない処理回数で同等の酵素回収率が得られること（実施例１０）を見出した。このアルカリ廃液の添加効果は、廃液中のリグニン水溶化物などの疎水性化合物によって、酵素の反応残渣からの脱着が促進されるため、回収効率が向上すると考えられる。酵素回収工程のアルカリとして、前処理工程で生じたアルカリ廃液のみ（アルカリ廃液１００ｗｔ％）を用いてもよいが、前処理工程で生じたアルカリ廃液の添加量は、酵素回収工程のアルカリ液に対して約５０ｗｔ％以下が好ましく、約２５ｗｔ％以下がより好ましい。さらに好ましくは、酵素回収工程のアルカリ液に対して約１〜１０ｗｔ％である。
【００３８】
工程（Ａ）および／または工程（Ｂ）で得た酵素回収液は、回収後速やかに酸を添加してｐＨを弱酸性〜中性に調整することが好ましい。酸を添加後の酵素回収液のｐＨとしては、ｐＨ４〜７であるのが好ましく、ｐＨ４．５〜６であるのがさらに好ましい。酵素回収液は回収後、速やかに酸を添加することが好ましいが、酸を添加するまでの時間としては、０〜２４時間であることがより好ましく、０〜１０時間であることがさらに好ましい。このような方法で酵素回収液を管理することで、アルカリによる酵素失活を防ぐことができる。添加する酸としては、例えば、硫酸、塩酸、硝酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、リン酸などが挙げられる。
【００３９】
得られた酵素回収液は、糖化工程に再利用することができる。必要に応じて、酵素回収液を限外ろ過などの方法で濃縮してから再利用する。また反応スラリーを固液分離して得られた反応液も遊離の酵素（および単糖類）を含むため、限外ろ過などの方法で酵素と単糖類とを分離して酵素を再利用することが好ましい。またバイオマス原料への吸着現象を利用して、酵素を簡便に再利用することもできる。すなわち、単糖類などを含む反応液、もしくは酵素回収液をフレッシュのバイオマス原料と接触させる。バイオマス原料には酵素のみが吸着するため、固液分離によって単糖類と酵素（バイオマス原料に吸着した状態）を分離することができる。また、単糖類を発酵原料として用いる場合には、単糖類を含む酵素回収液をそのまま発酵に供してもよい。この場合、得られる発酵液から菌体および発酵生産物を除去した後、発酵液残渣（酵素を含む）を糖化工程に利用することで、簡便に酵素の再利用を行うことができる。酵素回収液を糖化反応に再利用する際は、フレッシュな酵素を一部追加してもよい。追加する酵素は、初回に使用した酵素組成と同様でもよいが、回収酵素は酵素構成が変化している場合があるので、回収酵素の活性に合わせて、適宜追加の酵素を選択することが好ましい。例えば、β−グルコシダーゼは反応残渣に吸着しやすく、他の酵素に比べて回収率が低くなる場合があるため、そのような場合はβ−グルコシダーゼを多く含む酵素液を追加することが好ましい。
【００４０】
得られた単糖類の用途は特に限定されないが、発酵原料、化学品原料、飼料、肥料などに好適に用いることができる。発酵原料として用いる場合には、エタノール、１−ブタノール、イソブタノール、２−プロパノール、乳酸、コハク酸、酢酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、ピルビン酸、クエン酸、１，３−プロパンジオールなどの化学品の発酵生産に好適に用いることができる。
【００４１】
各工程で用いる装置は特に限定されないが、前処理工程、および糖化工程で用いる反応器は、例えばバッチ式、連続式、半連続式の装置などを用いることができる。具体的には、フィルターを備えたバッチ式反応槽、スクリューフィーダー式の連続反応器、原料添加と反応液抜き出しを連続的に行う半連続式反応槽、カラム式の充填反応槽などが挙げられる。固液分離装置としては、フィルタープレス、遠心分離、遠心ろ過、サイクロン、デカンターなどを用いることができる。酵素回収工程では、糖化工程と同様の装置（反応器）を用いることができるが、好ましくはアルカリ液の添加と酵素回収液の抜き出しを連続的に行うことができる装置である。糖化工程の装置をそのまま用いてもよい。
【００４２】
本発明の糖化方法を用いて回収される酵素の回収率（糖化工程で使用した酵素の酵素活性に対する回収された酵素の酵素活性）は非常に高いので、回収された酵素を有効にリサイクル使用することができる。本発明の糖化方法において、反応残渣から回収される酵素と、反応液から回収される酵素を合わせると、糖化工程で使用した酵素量に対して、酵素活性として少なくとも約５０％以上、条件により約７０％以上が回収可能である。したがって、本発明の糖化方法は、リグノセルロース系バイオマスの糖化に用いる酵素の使用量を減らし、酵素コストを大幅に低減することができる点で、非常に有用な技術である。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４４】
〔実験材料〕
（１）バイオマス
リグノセルロース系バイオマスとして、パーム油を生産する際に排出されるアブラヤシの空果房（以下「ＥＦＢ」という。）を原料に用いた（産地インドネシア）。
（２）糖化酵素
ノボザイムズ社の酵素液Ｃｅｌｌｉｃ ＣＴｅｃ２（以下「ＣＴｅｃ」という。）およびＣｅｌｌｉｃ ＨＴｅｃ２（以下「ＨＴｅｃ」という。）を用いた。これらの酵素液は、セルラーゼとしてセロビオヒドロラーゼ（以下「ＣＢＨ」という。）、β−グルコシダーゼ（以下「ＧＬＤ」という。）、β−グルカナーゼ（以下「ＣＭＣ」という。）を含有し、ヘミセルラーゼとしてキシラナーゼ（以下「ＸＹＮ」という。）、キシロシダーゼ（以下「ＸＬＤ」という。）を含有している。
【００４５】
〔分析方法〕
酵素活性の測定、および酵素回収率の算出は、以下のようにして行った。なお、ここで使用したバッファーは０．１Ｍ、ｐＨ５．０の酢酸バッファーである。
（１）ＣＢＨ活性
ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシド（ＰＮＰ−ＣＢ）を基質とした比色法により測定した。すなわち、１．５ｍｌのマイクロチューブに２１５μｌのバッファーをとり、酵素含有のサンプル溶液を１０μｌ加えた。これに基質溶液（ＰＮＰ−ＣＢの１．２５ｗｔ％バッファー溶液）を２５μｌ加えて酵素反応を開始し、水浴上で４０℃、１時間保温して酵素反応を行った。１時間経過後、０．１Ｍのグリシン水溶液（ｐＨ１０．０）を５００μｌ添加し、酵素反応の停止と発色を行った。得られたサンプルの吸光度（波長４０５ｎｍ）を測定し、酵素活性の指標とした。測定は、吸光度が１．５を越えない範囲で、適宜バッファーで希釈したサンプル溶液を用いて行った。酵素回収液、および糖化反応に使用したものと同じ酵素液（初期投入酵素液）の酵素活性を測定し、以下の式に従って回収酵素活性（＝酵素回収率）を算出した。
回収酵素活性（％）＝［酵素回収液中の酵素活性総量／初期投入酵素液中の酵素活性総量］×１００
（２）ＧＬＤ活性
ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＰＮＰ−ＧＰ）を基質とした比色法により測定した。ＣＢＨ活性と全く同様の方法で、ただし基質をＰＮＰ−ＧＰ、酵素反応条件を４０℃、３０分に変え、測定を行った。
【００４６】
（３）ＣＭＣ活性（β−グルカナーゼ）
カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を基質とした比色法により測定した。還元糖量の測定にはＤＮＳ（ジニトロサリチル酸）法を用いた。すなわち、１．５ｍｌのマイクロチューブに１８０μｌの基質溶液（カルボキシメチルセルロースナトリウム塩、シグマ社製Ｃ５６７８の４ｗｔ％バッファー溶液）をとり、酵素含有のサンプル溶液を２０μｌ加えて酵素反応を開始し、水浴上で５０℃、１時間保温して酵素反応を行った。１時間経過後、３００μｌのＤＮＳ溶液Ａ（１％３，５−ジニトロサリチル酸、０．２％フェノール、１％水酸化ナトリウム、０．０５％亜硫酸ナトリウムの水溶液）および１００μｌのＤＮＳ溶液Ｂ（４０％ロッシェル塩水溶液）を加え、沸騰水中で１０分間加熱して発色させ、水冷後、６００μｌの水を加えて希釈した。得られたサンプルの吸光度（波長５４０ｎｍ）を測定した（吸光度１）。サンプル中の初期含有糖量を差し引くために、酵素反応を行わないサンプル（酵素サンプルをＤＮＳ溶液の後に加える）を同様に調製し、発色を行って吸光度を測定した（吸光度２）。吸光度１と吸光度２の差を酵素活性の指標とした。測定は各吸光度が１．５を越えない範囲で、適宜バッファーで希釈したサンプル溶液を用いて行った。回収酵素活性はＣＢＨ活性と同様に算出した。
【００４７】
（４）ＸＹＮ活性
可溶性キシランを基質とした比色法により測定した。ＣＭＣ活性と全く同様の方法で、ただし基質を可溶性キシラン（２ｗｔ％キシラン、シグマ社製Ｘ０５０２、のバッファー溶液を調製し、不溶分を遠心分離で取り除いた上清画分を使用）、および酵素反応条件を４０℃、３０分に変え、測定を行った。
（５）ＸＬＤ活性
ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド（ＰＮＰ−ＸＰ）を基質とした比色法により測定した。ＣＢＨ活性と全く同様の方法で、ただし基質をＰＮＰ−ＸＰに変え、測定を行った。
【００４８】
糖化反応における生成糖類の定量分析は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を使用して行った。カラムは東ソー社ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０を用い、示差屈折計（ＲＩ）にて検出を行った。移動相としてはアセトニトリル／水＝７５／２５（体積比）を用い、カラム温度は８０℃にて分析を行った。
糖類の収率は重量基準で算出した。すなわち、以下の式で算出した。
糖収率（ｗｔ％）＝［生成糖の重量／原料バイオマスの乾燥重量］×１００
【００４９】
〔実施例１〕
（１）前処理工程（アルカリ前処理、１０ｗｔ％ＮａＯＨ）
１００ｍｌの高圧反応器に、粉砕処理（１ｍｍスクリーン）を施した原料ＥＦＢ（６．０ｇ、含水率７．３％）、水酸化ナトリウム（０．６ｇ＝１０ｗｔ％対原料ＥＦＢ）、および水（２９．４ｇ）を加えて密閉した。反応器を１２０℃のオイルバスで３時間加熱し、冷却後、ろ過により固液分離を行い、さらに固形分を水洗浄した。得られた固形分を１０５℃で３時間乾燥し、前処理ＥＦＢ−１（４．１ｇ、含水率８．７％、絶乾基準の重量収率６７．３％）を取得した。
【００５０】
（２）糖化工程
１０ｍｌのガラス容器に、前処理ＥＦＢ−１（０．４４ｇ）を加え、さらに酵素溶液（ＣＴｅｃ３ｍｇ／ｍｌ、ＨＴｅｃ３ｍｇ／ｍｌ、酢酸バッファー（ｐＨ５．５）０．０５Ｍ、テトラサイクリン塩酸塩４０μｇ／ｍｌ、シクロヘキシミド３０μｇ／ｍｌを含有）を６ｍｌ加え、密閉した。これを恒温振とう機で振とうしながら、４５℃で２４時間、糖化反応を行い、反応スラリーを得た。
【００５１】
（３）酵素回収工程（工程（Ｂ））
得られた反応スラリーを遠心ろ過カラム（モビテック社のモビコール、フィルター細孔径３０μｍ）に入れ、遠心分離にかけ、反応液と反応残渣に固液分離した（以下、各実施例の番号を付して「反応液１」、「反応残渣１」等という。）。反応液１を分析したところ、グルコース収率は４３．１ｗｔ％、キシロース収率は１５．５ｗｔ％で合計５８．６ｗｔ％の単糖類の生成が確認された（前処理ＥＦＢ基準）。なお未処理の原料ＥＦＢ基準に換算すると、グルコース収率は２９．０ｗｔ％、キシロース収率は１０．４ｗｔ％で合計３９．４ｗｔ％となる。
得られた反応残渣１にｐＨ８．０のアルカリ液（０．０５Ｍホウ酸ナトリウムバッファー）を５ｍｌ添加し、室温で３０分間攪拌混合して吸着酵素の脱着処理を行った。遠心ろ過を行い、酵素回収液１−１（ｐＨ７．１）と残渣に分離した。次にｐＨ９．０のアルカリ液（０．０５Ｍホウ酸ナトリウムバッファー）５ｍｌを用いて同様に脱着処理を行い、酵素回収液１−２（ｐＨ８．８）と残渣を得た。続いてｐＨ１０．０のアルカリ液（０．０５Ｍホウ酸ナトリウムバッファー）５ｍｌを用いて同様に脱着処理を行い、酵素回収液１−３（ｐＨ９．８）と残渣を得た。なお酵素回収液には速やかに酢酸バッファーを添加し、ｐＨを５〜７の範囲に調整して保存した。
【００５２】
反応液１、酵素回収液１−１〜３に含まれる５種の酵素活性（ＣＢＨ、ＧＬＤ、ＣＭＣ、ＸＹＮ、ＸＬＤ）を測定し、回収酵素活性（初期投入量に対する％で表示）を表１に示した。表１の結果から、アルカリ液のｐＨを徐々に上げてアルカリ処理することで酵素回収液のｐＨを徐々に上げることにより、高い酵素回収率が得られることが分かった。特に、吸着率の高いＧＬＤも高い割合で回収可能であることが分かった。
【００５３】
【表１】
0005714396.tif 000002
【００５４】
（４）酵素再利用工程
反応液１、酵素回収液１−１〜３を混合し、限外ろ過を行った。すなわち、遠心分離式の限外ろ過装置（クラボウ社のセントリカット、限外ろ過膜の材質はポリスルホン、分画分子量１万）を用い、回収酵素液を濃縮した。さらに酢酸バッファー（０．０５Ｍ、ｐＨ５．５）で洗浄を行い、最終的に酵素液を約４ｍｌに調整し、酵素回収液１−４を得た。続いて、上記初回の糖化工程と同様の方法で前処理ＥＦＢ−１の糖化反応を行った。ただし、酵素溶液としては、酵素回収液１−４に初回の２０％分のフレッシュ酵素（ＣＴｅｃとＨＴｅＣの比率は１対１）を補充したものを使用した。４５℃、２４時間の糖化反応で、グルコース収率は４３．０ｗｔ％、キシロース収率は１３．５ｗｔ％、合計５６．５ｗｔ％（前処理ＥＦＢ基準）であり、１００％フレッシュ酵素を用いた初回の反応と同等の糖収率が得られた。すなわち、酵素使用量の８０％が削減できた。
【００５５】
〔実施例２〕
（１）前処理工程、糖化工程
実施例１と同様に前処理工程を行い、ＥＦＢ前処理品を得た。糖化工程においては、酵素濃度をＣＴｅｃ４．８ｍｇ／ｍｌ、ＨＴｅｃ１．２ｍｇ／ｍｌ（割合にして８対２）に変更し、反応温度および時間を５０℃、７２時間に変更した以外は実施例１と同様に行い、反応スラリーを得た。
【００５６】
（２）酵素回収工程（工程（Ｂ））
続いて、実施例１と同様に得られた反応スラリーを遠心ろ過にかけ、反応液２と反応残渣２に分離した。反応液２を分析したところ、グルコース収率は４６．８ｗｔ％、キシロース収率は２３．３ｗｔ％で合計７０．１ｗｔ％の単糖類の生成が確認された（前処理ＥＦＢ基準）。得られた反応残渣２にｐＨ９．０のアルカリ液（０．１Ｍホウ酸ナトリウムバッファー）を５ｍｌ添加し、室温で３０分間攪拌混合して吸着酵素の脱着処理を行った。遠心分離を行い、上澄みの酵素回収液（ｐＨ８．４）と残渣に分離した。再度、ｐＨ９．０のアルカリ液（０．１Ｍホウ酸ナトリウムバッファー）５ｍｌを用いて同様に脱着処理を行い、酵素回収液（ｐＨ８．８）と残渣を得た。再び、ｐＨ９．０のアルカリ液（０．１Ｍホウ酸ナトリウムバッファー）５ｍｌを用いて同様に脱着処理を行い、酵素回収液（ｐＨ９．０）と残渣を得た。得られた３つの酵素回収液は混合し、酵素回収液２とした。
【００５７】
反応液２および酵素回収液２のＧＬＤ活性およびＣＢＨ活性を測定した。ＧＬＤは、反応液２中に５％、酵素回収液２中に５１％の回収酵素活性が確認された。ＣＢＨは、反応液２中に６０％、酵素回収液２中に２２％の回収酵素活性が確認された。アルカリ処理のｐＨパターン（酵素回収液のｐＨ）と共に表２に回収酵素活性をまとめた。ｐＨが同じアルカリ液を用いて脱着処理を３回繰り返した場合、酵素回収液のｐＨは段階的に上がり、高い酵素回収率が得られることが分かった。
【００５８】
〔実施例３〜５〕
実施例２と同様に前処理、糖化、酵素回収工程（工程（Ｂ））を実施した。ただし酵素回収工程では、アルカリ液として、実施例３ではｐＨ９．５、実施例４ではｐＨ１０．０、実施例５ではｐＨ１０．５の０．１Ｍホウ酸ナトリウムバッファーを用いて、それぞれ３回の脱着処理を行い酵素回収液３〜５を得た。酵素回収液中のＧＬＤ活性およびＣＢＨ活性を測定し、得られたＧＬＤおよびＣＢＨの回収酵素活性と、３回のアルカリ処理のｐＨパターンを表２に示した。
実施例２〜５の結果から、ＧＬＤに関しては高いｐＨの方がより高い回収率が得られ、ＣＢＨに関しては低いｐＨの方がより高い回収率が得られることが分かった。このように、酵素種によって脱着しやすいｐＨ条件が異なることが分かった。
【００５９】
【表２】
0005714396.tif 000003
【００６０】
〔実施例６〕
実施例２と同様に前処理、糖化、酵素回収工程（工程（Ｂ））を実施した。ただし酵素回収工程では、アルカリ液として、前処理工程で得られたアルカリ廃液（固液分離後のろ液原液）を０．１Ｍホウ酸バッファーに対して１０ｗｔ％添加した溶液（ｐＨ９．０）を用い、３回の脱着処理（アルカリ処理のｐＨパターンは実施例２と同じ）を行って酵素回収液６を得た。ＧＬＤ活性を測定したところ、酵素回収液６中に５８％の活性が確認された。同ｐＨ条件の実施例２と比較して（５１％）、回収率の向上が観察され、前処理液に酵素脱着促進効果が有ることが分かった。
【００６１】
〔実施例７〕
（１）前処理工程（アルカリ前処理、７．５ｗｔ％ＮａＯＨ）
１００ｍｌの高圧反応器に、実施例１で用いた原料ＥＦＢ粉砕品を１．００ｇ、水酸化ナトリウムを７５ｍｇ（＝７．５ｗｔ％対原料ＥＦＢ）、および水１０．０ｇを加えて密閉した。反応器を１５０℃のオイルバスで３時間加熱し、冷却後、ろ過により固液分離を行い、さらに固形分を水洗浄して前処理ＥＦＢ−２（水ウェット体）を得た。得られた固形分は乾燥工程を経ずに次の糖化工程に供した。
【００６２】
（２）糖化工程
２０ｍｌのガラス容器に、前処理ＥＦＢ−２を全量、ＣＴｅｃを３０ｍｇ、ＨＴｅｃを３０ｍｇ、０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を５ｍｌ、テトラサイクリン塩酸塩を４００μｇ、シクロヘキシミドを３００μｇ加えた。１０％酢酸水溶液でｐＨを５．５に調整した後、最後に反応液の重量を水で１１．０ｇに調整した。これを振とうしながら、４５℃で４４時間糖化反応を行い、反応スラリーを得た。
【００６３】
（３）酵素回収工程（工程（Ｂ））
続いて、実施例１と同様に得られた反応スラリーを遠心ろ過にかけ、反応液７と反応残渣７に分離した。反応液７を分析したところ、グルコース収率は３２．７ｗｔ％、キシロース収率は１２．７ｗｔ％で合計４５．４ｗｔ％の単糖類の生成が確認された（未処理の原料ＥＦＢ基準）。得られた反応残渣７に水を５ｍｌ加え、攪拌混合してスラリーとした。続いて、スラリーのｐＨを測定しながら、０．１％のＮａＯＨ水溶液（ｐＨ１２．４）を適量添加し、スラリーｐＨを６．６に調整した。これを３０℃で３０分間振とうし、アルカリ液による酵素脱着操作を行った。続いて遠心ろ過を行い、酵素回収液７−１（ｐＨ６．６）と残渣を得た。残渣に対して更に同様の操作を２回繰り返し（表３に示したｐＨに調整）、酵素回収液７−２（ｐＨ７．１）および酵素回収液７−３（ｐＨ８．２）を得た。本実施例では、０．１％ＮａＯＨ水溶液を用いて、処理液のｐＨを段階的に上げる方法で脱着操作を行った。
【００６４】
反応液７、酵素回収液７−１〜３に含まれる５種の酵素活性を測定し、回収酵素活性（初期投入量に対する％で表示）を表３に示した。
【００６５】
【表３】
0005714396.tif 000004
【００６６】
〔実施例８〕
実施例７と同様に、前処理、糖化、酵素回収工程（工程（Ｂ））を行った。ただし酵素回収工程では、アルカリ処理ｐＨを表４に示したｐＨパターンに変えて、３回の脱着操作を行った。得られた反応液８、回収酵素液８−１〜３に含まれる５種の酵素活性を測定し、回収酵素活性（初期投入量に対する％で表示）を表４に示した。
【００６７】
【表４】
0005714396.tif 000005
【００６８】
〔実施例９〕
実施例７と同様に、前処理、糖化、酵素回収工程（工程（Ｂ））を行った。ただし酵素回収工程では、０．１％ＮａＯＨの代わりに、０．１％Ｃａ（ＯＨ）２水溶液を用いて、ｐＨの調整を行った。また、アルカリ処理ｐＨは、表５に示したｐＨパターンで３回の脱着操作を行った。得られた反応液９、回収酵素液９−１〜３に含まれる５種の酵素活性を測定し、回収酵素活性（初期投入量に対する％で表示）を表５に示した。
【００６９】
【表５】
0005714396.tif 000006
【００７０】
〔実施例１０〕
実施例７と同様に、前処理、糖化、酵素回収工程（工程（Ｂ））を行った。ただし酵素回収工程では、アルカリ液として、前処理工程で得られたアルカリ廃液（固液分離後のろ液原液）を０．１％のＮａＯＨ水溶液に対して５ｗｔ％添加した溶液（ｐＨ１２．４）を用いた。また脱着操作は３回ではなく、２回に変更した。得られた反応液１０、回収酵素液１０−１、２に含まれる５種の酵素活性を測定し、回収酵素活性（初期投入量に対する％で表示）を表６に示した。この結果から、前処理液を添加することで、２回の脱着操作で３回の脱着操作（実施例７）と同等の回収率が得られることが分かった。
【００７１】
【表６】
0005714396.tif 000007
【００７２】
〔実施例１１〕酵素回収工程：工程（Ａ）
実施例７と同様に、前処理、糖化工程を行った。得られた反応スラリー（ｐＨ５．５）に１％水酸化ナトリウム水溶液を適量加え、ｐＨを７．９に上げて、吸着酵素の一部脱着を行った。続いて、実施例７と同様に遠心ろ過で固液分離を行い、酵素回収液１１−１と反応残渣１１を得た。反応残渣１１に水を５ｍｌ加え、攪拌混合して３０℃で３０分間振とうし、水による洗浄操作を行った。遠心ろ過を行い、酵素回収液１１−２（ｐＨ８．２）と残渣を得た。
【００７３】
酵素回収液１１−１〜２に含まれる５種の酵素活性を測定し、回収酵素活性を表７に示した。実施例７と比較して、反応液（酵素回収液１１−１）中に含まれる酵素活性が増加しており、反応スラリーのｐＨを上げることで遊離の酵素量を増やすことができ、より効率的に酵素回収を行うことができることが分かった。
【００７４】
【表７】
0005714396.tif 000008
【００７５】
〔実施例１２〕
（１）前処理工程（アルカリ前処理、１０ｗｔ％ＮａＯＨ、アントラキノン添加）
実施例７と同様に行った。ただしここでは、加えるＮａＯＨの量を１００ｍｇ（＝１０ｗｔ％対原料ＥＦＢ）に変更し、さらに助剤としてアントラキノン−２−スルホン酸ナトリウム１水和物（東京化成）を１０ｍｇ加え、加熱条件を１２０℃、３時間にして実験を行い、前処理ＥＦＢ−３を得た。得られた前処理品は乾燥工程を経ずに次の糖化工程に供した。
【００７６】
（２）糖化工程
実施例７と同様に行った。ただしここでは、糖化反応時間を４８時間に変更して実験を行い、反応スラリー１１．０ｇを得た。反応スラリーのｐＨは５．６であった。反応スラリーから反応液を少量抜き出し（反応液１２とする）、分析したところ、グルコース収率は３３．５ｗｔ％、キシロース収率は１４．９ｗｔ％で合計４８．３ｗｔ％の単糖類の生成が確認された（未処理の原料ＥＦＢ基準）。
【００７７】
（３）酵素回収工程（工程（Ａ）と工程（Ｂ）の組み合わせ）
反応スラリーに、１％ＮａＯＨ水溶液を０．４５ｍｌ加えてアルカリ側にｐＨをシフトさせ、３０℃で３０分間振とうし、一部の吸着酵素を遊離させる操作を行った。振とう後の糖化反応スラリーのｐＨは６．９であった。続いて、実施例７と同様に遠心ろ過を行い、酵素回収液１２−１（ｐＨ６．９）約１０ｇと反応残渣１２約１ｇを得た。さらに、連続的酵素回収を模擬した方法で酵素回収を行った。すなわち遠心カラム中で、反応残渣１２に５０ｐｐｍのＮａＯＨ水溶液（ｐＨ９．１）を１．２ｍｌ加え、混合して３０℃で２０分間振とうした。続いて遠心ろ過を行い、酵素回収液と残渣を得た。この酵素回収操作（１．２ｍｌの５０ｐｐｍＮａＯＨ水溶液での脱着および遠心ろ過）を合計５回行い、各酵素回収液を混合して、酵素回収液１２−２を得た（合計約６ｇ）。さらに２回、酵素回収操作を繰り返し、酵素回収液１２―３を得た（合計約２ｇ）。酵素回収液のｐＨは、酵素回収操作１回目でｐＨ７．２、３回目でｐＨ７．７、５回目でｐＨ８．４、最終７回目でｐＨ８．６と漸増していた。なお得られた酵素回収液１２−１〜３には、速やかに極微量の硫酸を加え、ｐＨを５．０に調製し、保管した。
酵素回収液１２−１〜３に含まれる５種の酵素活性を測定した。回収酵素活性を表８に示す。少量のアルカリ液（１．２ｍｌ×７＝８．４ｍｌ）でも高い酵素回収率を得ることができた。
【００７８】
【表８】
0005714396.tif 000009
【００７９】
（４）酵素再利用工程
実施例１と同様に、酵素回収液１２−１の限外ろ過を行った。約１０ｇの液量を約０．５ｇまで限外ろ過で濃縮し、つづいて酵素回収液１２−２を加え、液量を約１ｇまで濃縮し、さらに酵素回収液１２−３を加え、液量を約１ｇまで濃縮して、最終的に酵素回収液１２−４を得た。続いて、上記初回の糖化工程と同様の方法で、前処理ＥＦＢ−３の糖化反応を行った。ただし、添加する酵素としては、酵素回収液１２−４に初回の２０％分のフレッシュな酵素（ＣＴｅｃ６ｍｇ、ＨＴｅｃ６ｍｇ）を補充したものを使用した。４５℃、４８時間の糖化反応で、グルコース収率は３５．５ｗｔ％、キシロース収率は１３．９ｗｔ％、合計４９．４ｗｔ％（未処理の原料ＥＦＢ基準）であり、１００％フレッシュ酵素を用いた初回の反応と同等の糖収率が得られた。すなわち、酵素使用量の８０％が削減できた。
【００８０】
〔比較例１〕
実施例７と同様に、前処理、糖化、酵素回収工程を行った。ただし酵素回収工程では、処理液として非特許文献７に記載の０．５Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）を用いて、同じ脱着操作を計２回行った。得られた反応液１１、回収酵素液１１−１、２に含まれる５種の酵素活性を測定し、回収酵素活性（初期投入量に対する％で表示）を表７に示した。表７から明らかなように、０．５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）によるｐＨを変えない脱着方法では、残渣からの酵素回収率は極めて低かった。
【００８１】
【表９】
0005714396.tif 000010
【００８２】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。