(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体からの体液の試料において前立腺癌細胞の存在を検出ないし決定するための方法であって、
（i）試料から細胞を単離し、細胞試料を得ること、
（ii）前立腺抗原を結合することができる特異的結合メンバーと該細胞試料とを接触させること、及び／又は、
（iii）一又は複数のミニ染色体維持（ＭＣＭ）ポリペプチドを結合することができる特異的結合メンバーと該細胞試料とを接触させること、そして、
（iv）一又は複数の該特異的結合メンバーの細胞試料への結合を決定すること、を含み、前記体液が尿である方法。
【請求項２】
前立腺抗原が前立腺組織に特異的な抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前立腺抗原が、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＳＡＰ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的Ｇプロテイン結合レセプター（ＰＳＧＲ）及びａ−メチルアシル−補酵素Ａラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＭＣＭがＭＣＭ２、３、４、５、６及び７からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一に記載の方法。
【請求項５】
ＭＣＭがＭＣＭ７である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
特異的結合メンバーが抗体又はその断片である、請求項１から５のいずれか一に記載の方法。
【請求項７】
（i）試料から細胞を単離し、細胞試料を提供する、
（ii）前立腺抗原に対する特異的結合メンバーと該細胞試料を接触させる、
（iii）ミニ染色体維持（ＭＣＭ）ポリペプチドに対する一又は複数の特異的結合メンバーと該細胞試料を接触させる、そして、
（iv）該特異的結合メンバーの細胞試料への結合を決定する、という工程を含む、請求項１から６のいずれか一に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿のような体液における前立腺癌細胞の検出のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
今までの研究により、上皮組織の細胞周期過程における重要な調節因子としてミニ染色体維持タンパク質（ＭＣＭ）が同定された（国際公開９９／２１０１４及びＧｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ；Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｃａｎｃｅｒ，ＶｏＩ  ５：ｐｐ  １３５−１４１，Ｆｅｂ  ２００５を参照のこと）。多重の保存されたメカニズムによりＤＮＡ複製が１細胞周期につき１回に制限されている。ＭＣＭ及びその調節因子が増殖において必須の役割を有するので、癌の検出及び予後において慣例的に臨床で使用するための重要なバイオマーカーとなりうる。
【０００３】
ＭＣＭは「細胞周期状態」の有用なバイオマーカーとして、すなわち細胞が静止状態か又は老化状態かというよりも増殖することができるか否かのバイオマーカーとして同定された。６つすべてのＭＣＭ（ＭＣＭ２−７）の発現は、細胞周期のすべての段階にわたって見られ、細胞周期から休止、分化又は老化へ抜け出した後に下方制御される。これは、他の上皮組織の中でも子宮頚管、膀胱、大腸、及び口腔咽頭を含む多くの組織に及ぶ通常の重層上皮の免疫組織化学の試験により明らかである。これらの症例の各々において、ＭＣＭは、基礎的な増殖区画に限定され、最終的に分化した表在性ケラチン合成細胞には存在しない。それに反して、侵襲前の上皮病変では、増殖区画は組織学的グレードが上がると共に次第に拡大し、これに平行して上皮の表面にＭＣＭ陽性細胞が現れる（例えば子宮頚管の高グレードの扁平上皮病変の９０％以上及び同じ組織の低グレードの扁平上皮内病変のおよそ４０％）。
【０００４】
膀胱の移行上皮癌に罹患した患者の尿からの細胞検出技術を用いた実際の膀胱スクリーニング又は子宮頚管スクリーニングといった、表面上皮から剥離した悪性ないし前悪性の細胞を検出することによる癌スクリーニングアプローチにおける臨床応用の可能性は、静止細胞と周期性細胞を区別するＭＣＭの能力により促される。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は前立腺癌の検出のためのスクリーニングに関する。ＭＣＭは尿といった体液中の悪性細胞の検出の際のターゲットとして用いられうるが、ＭＣＭは組織特異的ではない。したがって、尿中の前立腺癌細胞を特異的に検出する手段が必要である。本発明は、前立腺上皮細胞が悪性腫瘍のために順に分析されうる尿において検出されうる測定法に基づく。
【０００６】
したがって本発明の第一の態様では、被検体からの体液の試料において前立腺癌細胞の存在を検出ないし決定するための方法であって、
（i）試料から細胞を単離し、細胞試料を得ること、
（ii）前立腺抗原を結合することができる特異的結合メンバーと該細胞試料とを接触させること、及び／又は
（iii）ミニ染色体維持（ＭＣＭ）ポリペプチド（一又は複数）を結合することができる特異的結合メンバーと該細胞試料とを接触させること、そして、
（iv）該特異的結合メンバー（一又は複数）の細胞試料への結合を決定すること、を含む方法が提供される。
【０００７】
一般的に、体液は血液又は脳脊髄液ではない。体液は尿又は精液であってよい。あるいは、体液は糞便であってよい。体液は尿であることが好ましい。被検体はヒトであることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】抗体ＭＣＭ−２及びＰＳＡによって標識した前立腺癌細胞（細胞株Ｃ４−２ｂ）の写真。Ａ）ＰＳＡの赤い細胞質染色と共にＭＣＭ−２の濃い核染色を示す前立腺癌細胞；及びＢ）ＭＣＭ−２についての非常に濃い核染色とＰＳＡの存在を示す細胞質の赤色を示す高性能解像度前立腺細胞。
【図２】ＭＣＭ−２及びＰＳＡに対する抗体によって標識した膀胱癌細胞（細胞株ＥＪ２８）の写真。Ａ）ＭＣＭについての標的核染色を示す膀胱癌細胞、ＰＳＡは検出されない；及びＢ）標的核染色細胞を示す高倍率膀胱癌細胞、ＰＳＡは検出されない。
【図３】高倍率の写真。Ａ）ＭＣＭ−２及びＰＳＡに対する抗体によって標識した前立腺癌細胞（細胞株Ｃ４−２ｂ）−これはＭＣＭについてポジティブである濃く染色された核とＰＳＡを示す周囲の赤く染色している細胞質物質を示す。Ｂ）ＭＣＭ−２及びＰＳＡに対する抗体によって標識した膀胱癌細胞（細胞株ＥＪ−２８）−これはＭＣＭを示す濃く染色された核を示すが、ＰＳＡの欠失から細胞質染色が完全に無いことが示される。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
細胞は、当業者に公知な任意の手段によって体液試料から単離されうる。一般的に、細胞は、体液試料の遠心分離法又は濾過のいずれかによって単離される。好ましくは、細胞は体液試料の濾過によって単離される。本発明の好適な方法では、試料は抗原修復（ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）される。抗原修復は当分野において標準的である（例示的な手法を示すＨｉｒａｉｗａ  ｅｔ  ａｌ  ｒｅｆｅｒ  ｔｏ  Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ  （１９９１）  Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６４，６９３−７０２を参照）。抗原修復条件は、水浴又はマイクロ波中で９５℃のｐＨ７．８  ＥＤＴＡバッファに４５分間細胞試料を接触させることを含んでよい。
【００１０】
本発明の方法において、前立腺抗原は、前立腺組織に特異的な抗原であってよい。前立腺抗原は、正常細胞（すなわち非癌性細胞）及び前立腺腫瘍細胞に存在してよい。前立腺抗原の例には、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＳＡＰ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的Ｇプロテイン結合レセプター（ＰＳＧＲ）及びａ−メチルアシル補酵素Ａラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、前立腺抗原はＰＳＡＰ又はＰＳＧＲである。本発明の一実施態様では、前立腺抗原はＰＳＡである。
【００１１】
本発明の方法において、ＭＣＭは、ＭＣＭ２、３、４、５、６及び７からなる群から選択される。ＭＣＭは、２以上の異なるＭＣＭ、例えばＭＣＭ２、３、４、５、６及び７からなる群から選択される２つの異なるＭＣＭの組合せであってよい。例えば、ＭＣＭは、ＭＣＭ２と、ＭＣＭ３、４、５、６及び７から選択される他の一つのＭＣＭとを含んでよい。更なる例として、ＭＣＭは、ＭＣＭ５と、ＭＣＭ２、３、４、６及び７から選択される他の一つのＭＣＭを含んでよい。本発明の好適な方法において、ＭＣＭは、ＭＣＭ２、３、５及び７からなる群から選択される。本発明のさらに好適な方法において、ＭＣＭは、ＭＣＭ２、５及び７からなる群から選択される。
本発明の方法において、ＭＣＭはＭＣＭ２とＭＣＭ５を含んでよい。本発明の更なる方法において、ＭＣＭはＭＣＭ２とＭＣＭ７を含んでよい。本発明のさらに他の方法において、ＭＣＭはＭＣＭ５とＭＣＭ７を含んでよい。
【００１２】
本明細書中で用いる「特異的結合メンバー」は、互いに結合特異性を有する一対の分子のメンバーである。特異的結合対のメンバーは天然由来であっても、完全又は部分的に合成して製造されてもよい。分子の一対の一方のメンバーはその表面に領域を有しており、その領域は突出でも腔であってもよく、その一方のメンバーが特異的に結合するので、分子の対の他方のメンバーのある空間及び極性の組織に対して相補的である。ゆえに、一対のメンバーは互いに結合特異性の性質を有する。
特異的結合対の種類の例は、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモンレセプター、レセプター−リガンド、酵素−基質、ＤＮＡ−ＤＮＡ（例えばオリゴヌクレオチド）である。本発明は概して、抗原−抗体の種類の反応に関するが、本明細書において定められる抗原に結合する小分子にも関する。
【００１３】
本明細書中の「抗体」なる用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部位、すなわち天然であるか又は一部ないし全部が合成されて製造されたものであるかにかかわらず、抗原を特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。また、この用語は、抗体結合ドメインであるか又はそれに相同である結合ドメインを有する任意のポリペプチド又はタンパク質を包含する。これらは天然源に由来するものであってもよいし、一部ないし全体が合成されて製造されていてもよい。抗体の例は、免疫グロブリンアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）及びそれらのアイソタイプサブクラス；抗原結合ドメインを含む断片、例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ；及びダイアボディである。抗体はポリクローナルでもモノクローナルであってもよい。
【００１４】
抗体は多くの方法で修飾されるので、「抗体」なる用語は、任意の特異的結合メンバー又は必要な特異性を有する結合ドメインを有する物質を包含するとみなされるべきである。ゆえに、この用語は、天然であるか全部ないし一部が合成されたかにかかわらず、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む、抗体断片、抗体の誘導体、機能的等価物及び相同体、ヒト化抗体を包含する。
ＭＣＭ又はＰＳＡ、ＰＳＡＰ、ＰＳＧＲ又はＡＭＡＣＲといった対象の標的に特異的である抗体は、当分野で標準的である技術を使用して得られうる。抗体の製造方法は、タンパク質ないしその断片又はそのタンパク質ないし断片を発現する細胞ないしウイルスにて哺乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギ）を免疫化することを含む。抗体は、当分野で公知な様々な技術のいずれかを用いて免疫化した動物から入手し、例えば対象の抗原への抗体の結合を用いてスクリーニングされてよい。
【００１５】
「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部ないし全部に特異的に結合し、それに相補的である領域を含む抗体の部分である。抗原が大きい場合、抗体は抗原のある一部にしか結合せず、その部位はエピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、一又は複数の抗体の可変ドメインによって提供されうる。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでよい。
【００１６】
「特異的」とは、通常、特異的結合対の一方のメンバーがその特異的結合対以外の分子（一又は複数）に何らかの有意な結合を示さない、例えば、何れかの他の分子とおよそ３０％未満、好ましくは２０％、１０％又は１％の交差反応を有する状況を指すために用いられる。
本発明の特異的結合メンバーは、本発明によれば「単離された」形態であるのが好ましい。一般にメンバーは、天然の環境又はインビトロやインビボで実施される組換えＤＮＡ技術によって調整される環境（例えば細胞培養物）において見られる他のポリペプチドといった自然に結合する物質を有さない、又は実質的に有さない。
ゆえに、本発明の特異的結合メンバーは抗体又はその断片であることが好ましい。ゆえに、例えば、（ii）では、特異的結合パートナーメンバーは、前立腺組織に特異的な抗原結合ドメインを有する抗体又はその断片であってよい。例えば、（iii）では、特異的結合メンバーは、ＭＣＭに特異的な抗原結合ドメインを有する抗体又はその断片であってよい。
【００１７】
抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体又は前記何れかの断片であってよい。好ましくは、特異的結合メンバーはモノクローナル抗体である。例えば、（ii） では、特異的結合パートナーメンバーは、前立腺組織に特異的な抗原結合ドメインを有するモノクローナル抗体であってよい。ＰＳＡ（ダコ）、ＰＳＡＰ（シグマ）、ＰＳＧＲ（アブカム）及びＡＭＡＣＲ（ダコ）に特異的なモノクローナル抗体は当分野で公知であり、詳細は添付１に含まれる。例えば、（iii）では、特異的結合メンバーは、ＭＣＭに特異的な抗原結合ドメインを有するモノクローナル抗体であってよい。ＭＣＭに特異的なモノクローナル抗体は当分野で公知であり、例えば、本試験で用いる抗ＭＣＭ２抗体は、ケンブリッジ、ヒルズ通り、ＣＢ２ ＯＸＺ、ハチソン／ＭＲＣリサーチセンターの癌細胞ユニットにより快く提供された。
ハイブリドーマ細胞を使用したモノクローナル抗体の産生は当分野で周知である。モノクローナル抗体を生産するために使用する方法は、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７（１９７５）のＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、及びＳｃｈｗａｒｔｚ編  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖ．ｌｌ，  １９８１のＤｏｎｉｌｌａｒｄ  ａｎｄ  Ｈｏｆｆｍａｎ，”Ｂａｓｉｃ  Ｆａｃｔｓ  ａｂｏｕｔ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”にも開示されており、これらは出典明記によって援用される。
【００１８】
本発明の方法では、本発明の特異的結合メンバーは、検出可能な標識、例えばＩ又は９９Ｔｃといった放射性標識にて標識されてよく、標識は、抗体画像化の分野において公知な従来の化学を用いて本発明の特異的結合メンバーに付着されうる。また、標識には、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼといった酵素標識が含まれる。さらに、標識には、特異的な同族の検出可能な部分、例えば標識されたアビジンへの結合により検出されうるビオチンといった化学的部分が含まれる。
正常及び試験試料における抗体などの特異的結合メンバーの反応性は任意の適切な手段によって決定されうる。他の標識には、スペクトルで単離される吸収又は発光の特徴を有する蛍光色素、リン光体又はレーザ染料が含まれる。好適な蛍光色素にはフルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン及びテキサスレッドが含まれる。好適な色素生産性色素にはジアミノベンジジンが含まれる。他の標識には、直接又は間接的に検出可能なシグナルを生じ、視覚的に観察されうるか、コンピュータ上で観察されうるか、又は記録されうる、着色されたラテックスビーズなどの高分子コロイド粒子又は微粒子物質、磁気性又は常磁性、及び生物学的又は化学的に活性な薬剤が含まれる。これらの分子は、例えば、色を生じるか色を変化させる、又は電気的性質の変化を起こす反応を触媒する酵素であってもよい。それらは分子的に興奮性であるので、エネルギー状態間の電子遷移により特徴的なスペクトル吸収又は発光が生じる。それらには、バイオセンサと共に使用される化学的実在物(entity)が含まれてよい。後述する実施例では、アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた。
【００１９】
本発明の好適な態様では、方法は、
（i）試料から細胞を単離し、細胞試料を提供する、
（ii）前立腺抗原に対する特異的結合メンバーと該細胞試料を接触させる、そして、
（iii）該特異的結合メンバーの細胞試料への結合を決定する、という工程を含む。
本発明の他の態様では、方法は、
（i）試料から細胞を単離し、細胞試料を提供する、
（ii）一又は複数のＭＣＭに対する特異的結合メンバーと該細胞試料を接触させる、そして、
（iii）該特異的結合メンバーの細胞試料への結合を決定する、という工程を含む。
本発明の更なる好適な態様では、方法は、
（i）試料から細胞を単離し、細胞試料を提供する、
（ii）前立腺抗原に対する特異的結合メンバーと該細胞試料を接触させる、
（iii）ミニ染色体維持（ＭＣＭ）ポリペプチドに対する一又は複数の特異的結合メンバーと該細胞試料を接触させる、そして、
（iv）該特異的結合メンバーの細胞試料への結合を決定する、という工程を含む。
【００２０】
前立腺抗原に対する特異的結合メンバーと前記細胞試料とを接触させる工程は、ミニ染色体維持（ＭＣＭ）ポリペプチドに対する一又は複数の特異的結合メンバーと該細胞試料とを接触させる工程と、別々に、順次に又は同時に実施してよい。本発明の一実施態様では、前立腺抗原に対する特異的結合メンバーと前記細胞試料とを接触させる工程は、ミニ染色体維持（ＭＣＭ）ポリペプチドに対する一又は複数の特異的結合メンバーと該細胞試料とを接触させる工程と同時に行われる。
好ましくは、前立腺抗原に対する特異的結合メンバーと前記細胞試料とを接触させる工程は、ミニ染色体維持（ＭＣＭ）ポリペプチドに対する一又は複数の特異的結合メンバーと該細胞試料とを接触させる工程と別々に及び順次に行われる。ゆえに、本発明の好適な態様では、被検体からの体液の試料において前立腺癌細胞の存在を検出するか又は決定する方法であって、
（i）該試料から細胞を単離し、細胞試料を提供する、
（ii）前立腺抗原を結合することができる特異的結合メンバーと該細胞試料を接触させる、
（iii）ミニ染色体維持（ＭＣＭ）ポリペプチド（一又は複数）を結合することができる特異的結合メンバーと該細胞試料を接触させる、そして、
（iv）該特異的結合メンバー（一又は複数）の細胞試料への結合を決定する、という工程を含む方法が提供される。
【００２１】
本発明の更なる態様では、前立腺抗原、例えばＰＳＡ及び／又はＰＳＡＰに対する特異的結合メンバーと、ミニ染色体維持（ＭＣＭ）ポリペプチド、例えばＭＣＭ２及び／又はＭＣＭ５及び／又は７に対する一又は複数の特異的結合メンバーとを含んでなる組成物が提供される。
本発明の更なる態様は、本発明に係る組成物を具備する本発明に係る方法に使用するためのキットを提供する。本明細書中に記載の標識分子といった一又は複数の他の試薬が含まれてよい。他の試薬には、非特異的染色を低減するためのブロック試薬、貯蔵時の特異的結合メンバーの活性を保存するための貯蔵バッファ、例えば抗体染色時に使用する染色バッファ及び／又は洗浄バッファ、ポジティブコントロール、ネガティブコントロールなどの何れかの組み合わせ、又はこれらすべてを含んでよい。ポジティブ及びネガティブコントロールは、本発明に従って使用される試薬の活性及び適切な使用法を有効に利用するために用いられてよく、キットで提供されてよい。コントロールの設定及び使用は標準であり、当分野の通常の技術者の通常の能力の範囲内である。さらに、キットは本発明の方法を実施するための指示書を具備していてよい。
【００２２】
本発明の更なる態様では、被検体の前立腺癌の治療方法であって、
（i） 本発明の第１の態様の方法に従って、該被検体からの体液、例えば尿の試料において前立腺癌細胞の存在を検出するか又は決定すること、
（ii） 前立腺癌細胞が該試料において検出される場合に、該被検体に前立腺癌の治療を投与することを含む方法が提供される。
本発明の他の態様は、前立腺組織を（i）正常又は（ii）潜在的又は実際に前癌性ないし癌性であるか、形成異常であるか又は腫瘍性であるかに分類する方法であって、前立腺抗原を結合することができる特異的結合メンバー及び／又はミニ染色体維持（ＭＣＭ）ポリペプチド（一又は複数）を結合することができる特異的結合メンバーの体液試料への結合を決定することを含む方法を提供する。結合のパターン又は程度は、既知の正常試料及び／又は既知の異常試料に対するものと比較してもよい。
【００２３】
本明細書の記載及び特許請求の範囲の全体にわたって、「含む」及び「含有する」、そしてこれらの変形、例えば「含んでいる」及び「含んでなる」なる言葉は、「〜を含むがこれらに限定されない」ことを意味し、他の部分、添加物、構成成分、整数又は工程を除外することを目的としない（そして除外しない）。
本明細書の記載及び特許請求の範囲の全体にわたって、前後関係により示されない限り、単数は複数を包含する。特に、前後関係により示されない限り、不定形の人工物が用いられる場合、本明細書は、単一だけでなく複数の場合も考慮すると理解される。
本発明の特定の態様、実施態様又は実施例と関連して記載される特徴、整数、形質、化合物、化学物質部分又は基は、矛盾しない限り、本明細書中に記載される他のいかなる態様、実施態様又は実施例にあてはまると理解されるべきである。
本発明は以下の図を参照し例としてのみ記載される。
【実施例】
【００２４】
【表１】
0005727931.tif 000002
【００２５】
実施例１
前立腺癌患者から採取した尿におけるＭＣＭアッセイ
前立腺癌患者から採取した尿をその後実験室に移し、そこで液体ベースの細胞診スライドの調製についての慣例手法を施した。特に、遠心分離のために全量の尿試料をファルコンチューブに分け、標準手順を続け、前立腺特異的上皮細胞を含む細胞ペレットの調整物を調製した。慣例的な評価のためにＰＡＰ対比染色したスライドを細胞病理学研究室を担当するコンサルタントに照会する一方で、免疫細胞化学染色のためのスライドをバッチ染色とその後の処理のために４℃で保存した。細胞免疫病理学研究室染色に関する書類を以下に記載する。特に、抗原修復と水槽中、９５℃のｐＨ７．８のＥＤＴＡ、４５分間を用いることは、細胞診スライドの前染色手順の重要な要素であることがわかった。
【００２６】
材料及び方法
前立腺ＭＣＭのための二重染色プロトコール
このプロトコールはダコ社のエンビジョンＴＭＧ｜２二重染色システム（Ｋ５３６１）を使用し、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織又は固定細胞塗における抗原の検出のために一次マウス及びウサギ抗体の何れかによる免疫組織化学での使用を目的とした。この視覚化システムは、１つの試料で２つの異なる抗原が同時に検出されるように設計されている。このシステムは、手動で又はダコ社の自動染色計測器で用いられてよい。
手順は、第一抗原がＨＲＰ／ＤＡＢ＋を使用して視覚化され、第二抗原がＡＰ／パーマネントレッドを使用して視覚化される連続的な二重染色法である。二重内在性酵素ブロックは、いくつかの組織に存在する内在性アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ及び偽ペルオキシダーゼ活性を阻害する。内在性酵素の反応を止めた後、第一工程では、最適に希釈した一次マウスないしウサギ抗体と試料をインキュベートした後に、ポリマー／ＨＲＰ試薬とインキュベートする。この試薬は、マウス及びウサギの免疫グロブリンへの抗体の運搬も行うＨＲＰ−コンジュゲートデキストランポリマーである。反応は、ＤＡＢ＋色素原によって視覚化される。二重染色ブロック試薬を使用したブロック工程の後に、試料を、第二の最適に希釈した一次マウスないしウサギ抗体と共にインキュベートする。次の工程で、ウサギ／マウス（ＬＩＮＫ）を添加し、その後、抗体をマウス及びウサギの免疫グロブリンに運搬するデキストランポリマーであるポリマー／ＡＰ試薬と共にインキュベートする。パーマネントレッド色素原は第二反応を視覚化する。一次抗体を除き、示したすべての試薬はキットで提供されている。
自動染色器染色プロトコール第一抗体（ＭＣＭ−２）は１：４０の希釈でケンブリッジ、ＭＲＣ、癌細胞ユニットによって供給される。自動染色器染色プロトコール第二抗体（ＭＣＭ−２）は１：４０の希釈でケンブリッジ、ＭＲＣ、癌細胞ユニットによって供給される。
【００２７】
【表２】
0005727931.tif 000003
【００２８】
アルカリホスファターゼ基質
アルカリホスファターゼ（液体パーマネントレッド）、この試薬は、使用の３０分前に準備し、自動染色器にセットしなければならない。
対比染色の後、スライドはアルコール及びキシレンにより脱水してはならず、スライドは単に空気乾燥させ、次いで水性マウント用メディウムにてマウントするか（ダコ社のＦａｒａｍｏｕｎｔ水性マウント用メディウムＳ３０２５を用いる）、又はパーマネントマウントを用い、再度スライドを空気乾燥させ、ダコ社のパーマネントマウントＳ３０２６ないしはその等価物を用いる。「テキサスレッド／ローダミン」フィルターを用いて通常光又は蛍光灯の下で液体レッドを赤色化することを注記する。これは、ＤＡＢとアルカリホスファターゼの染色を識別する際に有効である。
【００２９】
結果
既知の前立腺癌患者からの３８試料を、外来患者前立腺癌クリニックにて採取した。現在まで、３８の試料のうちの２２を処理した。試験した２２のスライドのうち２２は、グレードの変化（グレード１−４）において前立腺癌の存在を確認し、すべてがＭＣＭ陽性細胞、すなわち侵襲性のグレード変化にある悪性腫瘍の明確な所見を示した。
【００３０】
実施例２
材料及び方法
ＬＢＣ尿調製物中の前立腺細胞の単一染色のためのプロトコール（膀胱細胞コントロール）
【表３】
0005727931.tif 000004
【００３１】
実施例３
材料及び方法
前立腺癌患者から採取した尿におけるＭＣＭ及びＰＳＡ二重アッセイ
ＭＣＭ２は、ケンブリッジ、ヒルズ通り、ＣＢ２  ０ＸＺ、ハチソン／ＭＲＣリサーチセンター、癌細胞ユニットにより供給された。ＰＳＡ抗体は、アタッチメントにつき１：３００００希釈で供給された。
【００３２】
前立腺ＭＣＭ−２／ＰＳＡ試験のための二重染色プロトコール
Ａ  前染色プロトコール組織スライド
１．キシレン＞アルコール；蒸留；水からスライドを再水和
２．マイクロ波中でｐＨ６のクエン酸バッファに１０＋１０分間の抗原修復
３．水で洗浄した後、自動染色器に流す
Ｂ  前染色プロトコール細胞診スライド
１．５０％エタノール中で５分間、スライドを浸漬する
２．蒸留水ですすぎ、その後ＴＢＳに置く
３．水槽（又は組織グレードマイクロ波）中で４５分間、９５℃のｐＨ７．８のＥＤＴＡバッファ中で抗原修復
４．室温で２０分間冷ます
５．水、その後バッファですすぎ、自動染色器に置く
Ｃ１  自動染色器染色プロトコール第一抗体（ＭＣＭ−２、１：４０希釈）
（エンビジョンＨＲＰ）ダコ社Ｇ/２二重染色キット（Ｋ５６３１）
１．二重内在性酵素によるブロック、５分間
２．ＴＢＳバッファにて２回すすぐ
３．抗体とコントロールの添加、６０分間
４．ＴＢＳバッファにて２回すすぐ
５．エンビジョンポリマーＨＲＰの添加、３０分間
６．ＴＢＳバッファにて２回すすぐ
７．ＤＡＢ基質、５分間
Ｃ２  第一反応のブロック：
８．自動染色器からスライドを取り除き、水にて３分間洗浄する
９．ｐＨ６のクエン酸バッファ中で５分間、スライドにマイクロ波をかける
１０．タップ水にて３分間洗浄し、次いで自動染色器に流し戻す
Ｃ３  自動染色器染色プロトコール第二抗体（１：３００００希釈のＰＳＡ）
（エンビジョンアルカリホスファターゼ）ダコ社Ｇ/２二重染色キット（Ｋ５６３１）
１１．二重染色のブロック、３分間（補助試薬）
１２．ＴＢＳバッファにて２回すすぐ
１３．第二セットの一次抗体とコントロールを添加、６０分間
１４．ＴＢＳバッファにて２回すすぐ
１５．Ｇ/２ウサギ／マウスＬＩＮＫ、１５分間（二次試薬）
１６．ＴＢＳバッファにて２回すすぐ
１７．エンビジョンポリマーアルカリホスファターゼの添加、１５分間（三次試薬）
１８．ＴＢＳバッファにて２回すすぐ
１９．液体（パーマネント）レッド  アルカリホスファターゼ基質、５分間
Ｄ  染色後プロトコール
１．水ですすぐ
２．ＣｕＳｏ４、５分間
３．水ですすぐ
４．対比染色：ヘマトキシリン、１０秒間
５．水ですすぐ
６．スコットタップ水、４０秒間
７．水ですすぐ
８．スライドを空気乾燥させる
９．非水マウント又はパーマネントマウントによりカバーグラスをかける
【００３３】
結果
前立腺癌細胞株によって十分な結果が得られた。核は茶色に染色され（ＭＣＭ−２）、細胞質は赤色に染色された（ＰＳＡ）。図１から３を参照のこと。コントロール膀胱細胞株はＭＣＭ−２について陽性であったが、ＰＳＡについては陰性であった。しかしながら、臨床試料はＰＳＡについてわずかに弱い陽性を示した（試験した４０）。
【００３４】
実施例４
前立腺癌患者から採取した尿における逆性ＭＣＭ−２及びＰＳＡ二重アッセイ
実施例３の結果から、発明者等は、弱いＰＳＡ染色が、ＭＣＭ−２抗原を回復させるために用いた熱修復プロセスによって破壊されているＰＳＡ抗原によるものであるか否かを調べた。臨床試料に対して抗ＰＳＡ抗体を用いて熱修復を行わずに単一ペルオキシダーゼ（茶色）染色を行った。得られた結果（データは示さない）は、抗ＰＳＡ抗体による臨床試料の強い染色を示した。これらの結果から、ＬＢＣ尿試料における前立腺細胞の存在が確認された。次いで発明者等は、初めにＰＳＡについて、次いで熱修復後、アルカリホスファターゼによる抗ＭＣＭ２について染色することによって二重染色されるか否かを試験した。
【００３５】
材料及び方法
前立腺癌細胞（コントロールとして膀胱癌細胞）のためのＰＳＡ及びＭＣＭ−２二重染色プロトコール
Ａ  前染色プロトコール組織スライド
１．キシレン＞アルコール；蒸留；水からスライドを再水和
２．マイクロ波中でｐＨ６のクエン酸バッファに１０＋１０分間の抗原修復
３．水で洗浄した後、自動染色器に載せる
Ｂ  前染色プロトコール細胞診スライド
１．５０％エタノール中で５分間、スライドを浸漬する
２．蒸留水ですすぎ、その後ＴＢＳに置く（熱修復はないことを注記する）
３．水、その後バッファですすぎ、自動染色器に置く
Ｃ１  自動染色器染色プロトコールダコ社Ｇ/２二重染色キット（Ｋ５６３１）
第一抗体前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）ダコ社ウサギポリクローナル（Ａ０５６２）１：２５０００（エンビジョンＨＲＰ）；１：４０希釈の二次抗体ＭＣＭ−２（エンビジョンアルカリホスファターゼ）
１．二重内在性酵素によるブロック、５分間
２．ＴＢＳバッファにて２回すすぐ
３．抗体とコントロールの添加、３０分間
４．ＴＢＳバッファにて２回すすぐ
５．エンビジョンポリマーＨＲＰの添加、３０分間
６．ＴＢＳバッファにて２回すすぐ
７．ＤＡＢ基質、５分間
８．自動染色器からスライドを取り除き、タップ水にて３分間洗浄する
９．ｐＨ７．８のＥＤＴＡ熱修復バッファにスライドを置き、２０分間（１０＋１０分）マイクロ波を照射する
１０．５分間冷まし、タップ水にて５分間すすぐ
１１．スライドを自動染色器に戻し置く
１２．二重染色のブロック、３分間（補助試薬）
１３．ＴＢＳバッファにて２回すすぐ
１４．第二セットの一次抗体とコントロールを添加、６０分間
１５．ＴＢＳバッファにて２回すすぐ
１６．Ｇ/２ウサギ／マウスＬＩＮＫ、１５分間（二次試薬）
１７．ＴＢＳバッファにて２回すすぐ
１８．エンビジョンポリマーアルカリホスファターゼの添加、１５分間（三次試薬）
１９．ＴＢＳバッファにて２回すすぐ
２０．液体（パーマネント）レッド  アルカリホスファターゼ基質、７分間
注記：この試薬は、二重染色キットに示されるように使用の３０分前に調整し、自動染色器に置く。発明者等は、１ｍｌの基質溶液につき１滴のレバミソール（ダコ社Ｘ３０２１）を添加する。忘れずにレバミソールを添加する。
１７．水ですすぐ
処理／二重染色後プロトコール
通常光の顕微鏡の下でＭＣＭ−２陽性細胞は赤色核を有する。これらがＰＳＡも表す場合、細胞質に濃い茶色として現れるであろう。
追記：
自動染色計測器のプログラミング
ダコ社の自動染色計測器によるエンビジョンＴＭＧ｜２二重染色システムの第一適用の前に、新しいテンプレートを作製した。テンプレート：Ｋ５３６１：＊注記  ２回のバッファによるすすぎの工程を用いる。
アルカリホスファターゼ基質／
染色後プロトコール
１．水ですすぐ
２．ＣｕＳｏ４、５分間
３．水ですすぐ
４．対比染色：ヘマトキシリン、１０秒間
５．水ですすぐ
６．スコットタップ水、３０秒間
７．水ですすぐ
８．スライドをスライドヒーターにて乾燥させる
９．Ｆａｒａｍｏｕｎｔ水性マウント用メディウムＤＡＫＯによりカバーグラスをかける
【００３６】
二重染色プロトコール
アルカリホスファターゼ基質
アルカリホスファターゼ（液体パーマネントレッド）、この試薬は、使用の３０分前に準備し、自動染色器にセットしなければならない（バッチ基質試薬）。対比染色の後、スライドはアルコール及びキシレンにより脱水してはならず、スライドは単に空気乾燥させ、次いで水性マウント用メディウムにてマウントするか（ダコ社のＦａｒａｍｏｕｎｔ水性マウント用メディウムＳ３０２５を用いる）、又はパーマネントマウントを用い、再度スライドを空気乾燥させるかあるいはスライドをスライド（切片）乾燥機、すなわち６０℃に設定したＬＡＭＢヒーターにおく場合には、ダコ社のパーマネントマウントＳ３０２６ないしはその等価物を用いる。自動「カバーグラス器」を用いる場合には、スライドは染色を有意に失わずにキシレンに漬けてよい。「テキサスレッド／ローダミン」フィルターを用いて通常光又は蛍光灯の下で液体レッドを赤色化することを注記する。これは、ＤＡＢとアルカリホスファターゼの染色を識別する際に有効である。
【００３７】
結果
二重染色を逆にすることによって、すなわち抗ＰＳＡ染色の後に抗ＭＣＭ２染色を行うことによって得た結果（示さない）は有意に改善された。
研究室で実験を繰り返すと、初めに１：２５０００のＰＳＡ染色の後に１：４０希釈のＭＣＭ染色を行うと、二重染色の結果が最も良いことが示された。この手法は、その後の分析全体及び多数の異なる前立腺細胞株の試験全体にわたって適していた。
【００３８】
実施例５
前立腺癌患者から採取した尿における前立腺マーカーとＭＣＭ二重アッセイ
実験は以下の通りに行う：
抗前立腺抗原抗体染色（ＰＳＡＰ、ＰＳＡ及びＰＳＧＲ）の後に、抗ＭＣＭ抗体染色（ＭＣＭ２、３、５及び７を単独及び組み合わせて）を行う。
【図１】
0005727931.tif 000005
【図２】
0005727931.tif 000006
【図３】
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