(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に潜在的に存在する１つ以上のアフラトキシンの存在または非存在を検出する装置であって、
ａ．チャンバの境界を画定する少なくとも１つの壁を有する容器であって、前記チャンバが光化学反応を行うためのものであり、前記チャンバがチャンバ体積の境界を画定し、第１の窓、第２の窓、入口、および出口を有し、前記入口が、１つ以上の光反応アフラトキシンを潜在的に含みうる溶液のソースと流体連通して配置されるためのものであり、前記出口が、光化学反応の生成物を排出するためのものであり、前記第１の窓が、光子を受け取るために光源と光学的に通じて配置されるためのものであり、前記チャンバが、滞留時間を規定するために時間をかけて光反応アフラトキシンを潜在的に含みうる溶液を受け取るためのものであり、前記第２の窓が、光化学反応の生成物の蛍光から光子を放出するためのものである容器と、
ｂ．光子を放出するために前記第１の窓と光学的に通じた光源であって、放出される光子は前記第１の窓により受け取られ前記チャンバに運ばれるようになっており、かつ前記光源が、流束１．０×１０１５から１００×１０１５光子／秒で３６５ｎｍ、２４１ｎｍ、または３１３ｎｍからなる群から選択される励起波長で光子を放出するように構成されている光源と、
ｃ．光反応アフラトキシンを潜在的に含みうる溶液のソースであって、前記ソースが１つ以上の試料を受け取るように構成され、溶液中で１つ以上の試料を１つ以上の光反応アフラトキシンと非アフラトキシン化合物とにクロマトグラフィで分離し、前記ソースが前記容器の前記入口と流体連通し、滞留時間０．２５から２０．０秒／チャンバ体積を以って前記チャンバ内に前記溶液を配置するように構成されているソースと、
ｄ．蛍光からの光子を受け取ることで光反応アフラトキシンの存在を検出し、光子が無い場合には光反応アフラトキシンが存在しないことを示すように構成され、前記第２の窓と光学的に通じる蛍光検出器と
を備える、装置。
【請求項２】
試料中に潜在的に存在する１つ以上のアフラトキシンの存在または非存在を検出する装置であって、
ａ．チャンバの境界を画定する少なくとも１つの壁を有する容器であって、前記チャンバが光化学反応を行うためのものであり、前記チャンバがチャンバ体積の境界を画定し、第１の窓、第２の窓、入口、および出口を有し、前記入口が、１つ以上の光反応アフラトキシンを潜在的に含みうる溶液のソースと流体連通して配置されるためのものであり、前記出口が、光化学反応の生成物を排出するためのものであり、前記第１の窓が、光子を受け取るために光源と光学的に通じて配置されるためのものであり、前記チャンバが、滞留時間を規定するために時間をかけて光反応アフラトキシンを潜在的に含みうる溶液を受け取るためのものであり、前記第２の窓が、光化学反応の生成物の蛍光から光子を放出するためのものである容器と、
ｂ．光子を放出するために前記第１の窓と光学的に通じた光源であって、放出される光子は前記第１の窓により受け取られ前記チャンバに運ばれるようになっており、かつ前記光源が、流束１．０×１０１５から１００×１０１５光子／秒で３６５ｎｍ、２４１ｎｍ、または３１３ｎｍからなる群から選択される励起波長で光子を放出するように構成されている光源と、
ｃ．光反応アフラトキシンを潜在的に含みうる溶液のソースであって、前記ソースが１つ以上の試料を受け取るように構成され、溶液中で１つ以上の試料を１つ以上の光反応アフラトキシンと非アフラトキシン化合物とにクロマトグラフィで分離し、前記ソースが前記容器の前記入口と流体連通し、滞留時間０．２５から２０．０秒／チャンバ体積を以って前記チャンバ内に前記溶液を配置するように構成されているソースと、
ｄ．前記出口と流体連通し、かつ光反応の生成物の存在から前記試料中の光反応アフラトキシンの存在を示し、また光反応の生成物が存在しなければ前記試料中にアフラトキシンが存在しないことを示すように構成されている蛍光検出器と
を備える、装置。
【請求項３】
前記光反応アフラトキシンがＰ１、Ｑ１、Ｍ１、Ｂ１、Ｇ１、Ｂ２、およびＧ２からなる群から選択される、請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
光反応アフラトキシンを潜在的に含む溶液の前記ソースが流体クロマトグラフィカラムである、請求項１から３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５】
試料中に潜在的に存在する１つ以上の光反応アフラトキシンの存在または非存在を検出する方法であって、
容器と、光源と、１つ以上の光反応アフラトキシンを潜在的に含みうる溶液のソースと、蛍光検出器とを有する装置を提供するステップであって、ここで
ａ．前記容器が、チャンバの境界を画定する少なくとも１つの壁を有し、前記チャンバが、光化学反応を行うためのものであり、前記チャンバがチャンバ体積の境界を画定し、かつ第１の窓と、第２の窓と、入口と、出口とを有し、前記入口が、光反応アフラトキシンを潜在的に含みうる溶液のソースと流体連通して配置されるためのものであり、前記出口が光化学反応の生成物を排出するためのものであり、前記第１の窓が、光子を受け取るために光源と光学的に通じて配置されるためのものであり、前記チャンバが、滞留時間を規定するために時間をかけて光反応アフラトキシンを潜在的に含みうる溶液を受け取るためのものであり、前記第２の窓が光子を放出するためのものであり、
ｂ．前記光源は、光子を放出するために前記第１の窓と光学的に通じ、放出される光子は前記第１の窓により受け取られ前記チャンバに運ばれるようになっており、かつ前記光源が、流束１．０×１０１５から１００×１０１５光子／秒で、３６５ｎｍ、２４１ｎｍ、または３１３ｎｍの励起波長で光子を放出するものであり、
ｃ．前記ソースが、１つ以上の試料を受け取って、溶液中で１つ以上の試料を１つ以上の光反応アフラトキシンと非アフラトキシン化合物とにクロマトグラフィで分離されるように構成され、かつ前記ソースが、前記容器の前記入口と流体連通し、滞留時間０．２５から２０．０秒／チャンバ体積を以って前記チャンバ内に前記溶液を配置するように構成されており、
ｄ．前記蛍光検出器が、前記出口と流体連通し、光反応の生成物の存在から前記試料中の光反応アフラトキシンの存在を示し、また光反応の生成物が存在しなければ前記試料中にアフラトキシンが存在しないことを示すように構成されている
というステップと、
前記装置を用いて、前記試料中のアフラトキシンの有無を検出するステップと
を含む、方法。
【請求項６】
試料中に潜在的に存在する１つ以上の光反応アフラトキシンの存在または非存在を検出する方法であって、
容器と、光源と、１つ以上の光反応アフラトキシンを潜在的に含みうる溶液のソースと、蛍光検出器とを有する装置を提供するステップであって、ここで
ａ．前記容器が、チャンバの境界を画定する少なくとも１つの壁を有し、前記チャンバが、光化学反応を行うためのものであり、前記チャンバがチャンバ体積の境界を画定し、かつ第１の窓と、第２の窓と、入口と、出口とを有し、前記入口が、光反応アフラトキシンを潜在的に含みうる溶液のソースと流体連通して配置されるためのものであり、前記出口が光化学反応の生成物を排出するためのものであり、前記第１の窓が、光子を受け取るために光源と光学的に通じて配置されるためのものであり、前記チャンバが、滞留時間を規定するために時間をかけて光反応アフラトキシンを潜在的に含みうる溶液を受け取るためのものであり、前記第２の窓が光子を放出するためのものであり、
ｂ．前記光源は、光子を放出するために前記第１の窓と光学的に通じ、放出される光子は前記第１の窓により受け取られ前記チャンバに運ばれるようになっており、かつ前記光源が、流束１．０×１０１５から１００×１０１５光子／秒で、３６５ｎｍ、２４１ｎｍ、または３１３ｎｍの励起波長で光子を放出するものであり、
ｃ．前記ソースが、１つ以上の試料を受け取って、溶液中で１つ以上の試料を１つ以上の光反応アフラトキシンと非アフラトキシン化合物とにクロマトグラフィで分離されるように構成され、かつ前記ソースが、前記容器の前記入口と流体連通し、滞留時間０．２５から２０．０秒／チャンバ体積を以って前記チャンバ内に前記溶液を配置するように構成されており、
ｄ．前記蛍光検出器が、前記第２の窓と光学的に通じ、蛍光からの光子を受け取ることで光反応アフラトキシンの存在を検出し、光子が無い場合には光反応アフラトキシンが存在しないことを示すように構成されている
というステップと、
前記装置を用いて、前記試料中のアフラトキシンの有無を検出するステップと
を含む、方法。
【請求項７】
前記光反応アフラトキシンが、Ｐ１、Ｑ１、Ｍ１、Ｂ１、Ｇ１、Ｂ２、およびＧ２からなる群から選択される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
光反応アフラトキシンを潜在的に含む溶液の前記ソースが、流体クロマトグラフィカラムである、請求項５から７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全体の内容が参照により本明細書に組み込まれる、２００８年４月３０日に提出された米国仮出願第６１／０４９０３８号明細書の優先権および利益を主張する。
【０００２】
連邦政府の支援による研究または開発に関する記載
なし。
【０００３】
共同研究契約の当事者の名称
なし。
【０００４】
配列表への参照
なし。
【０００５】
本発明は光化学反応の分野に関し、詳細にはアフラトキシンの存在または非存在を検出するための分析方法および分析装置に関する。
【背景技術】
【０００６】
本文書は、本発明の理解を促進するために、以下に定義される方法で幾つかの用語および語句を使用する。本明細書で使用されるように、「光化学反応」という用語は、光子が存在する所で１つ以上の反応物が生成物を形成する反応を指す。幾つかのアフラトキシンが、水、共反応性溶媒、または光化学反応の別の関与物（ｐａｒｔｉｃｉｐａｎｔ）および光子が存在する所で光反応性がある。アフラトキシンは菌類により生成される自然発生する毒素である。ある波長で特徴的な蛍光を生成するアフラトキシンがある。アフラトキシンの光化学反応生成物の中には蛍光を発生させるものもある。
【０００７】
名称が示唆するように、アフラトキシンはヒトおよびほとんどの動物に対して毒性がある。食糧および動物用飼料が日常的に検査されている。しかし、試験は時間がかかり、試薬を大量に用いる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
試料中のアフラトキシンを同定することができる装置および方法を有することが望ましい。本明細書で使用されるように、「試料」という用語は試験されるべき物質を表すために広く使用される。アフラトキシンの関係では、このような試料は一般に、食品加工または医薬品処理、準備および製造で使用される組織、食品、加工済みまたは未加工の物質、ならびに拭き取り、綿棒、もしくは流体分取を用いて固体表面または流体から採取される物質である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は光化学反応を行うための装置および方法を対象とする。本発明の方法および装置は、アフラトキシンの存在を探す試料の試験に具体的な適用分野がある。装置を対象とする、溶液中で光反応する化合物の光化学反応を行うための本発明の一実施形態が、以下の主要な要素、即ち容器および光源を有する。容器はチャンバの境界を画定する少なくとも１つの壁を有する。光化学反応を行うためのチャンバは、チャンバ体積、第１の窓、入口、および出口を有する。入口は、溶液中で光反応する化合物のソースと流体連通して置かれるためのものである。出口は、光化学反応の生成物を放出するためのものである。第１の窓は、光を受け取るために、光伝播に対して透過性があり、光源と光学的に通じて配置される。チャンバは滞留時間を規定するために時間をかけて溶液を入れるためのものである。溶液は、濃度を有する１つ以上の光反応化合物を潜在的に有する。装置は、光子を放出するために第１の窓と光学的に通じる光源をさらに含み、光源の光子は第１の窓により受け取られ、チャンバの中に運ばれる。光源は、励起波長で光子を放出し、各光反応する化合物分子が濃度１．０×１０−１３から１．０×１０−６モル／リットルのチャンバを通り抜けて生成物を形成するために、溶液中に少なくとも５から５０，０００個の光子を配置する強度を有する。
【００１０】
本明細書で使用されるように、「生成物」という用語は、光子と反応物との相互作用により引き起こされる光化学反応の生成物を指す。
【００１１】
好ましい光源は、少なくとも流束１．０×１０１５から１．０×１０１７光子／秒を有し、波長およそ３６５ｎｍ、もしくは２４１ｎｍまたは３１３ｎｍを有する光子を生成する。これらの波長は、アフラトキシンにより効果的受け取られ、およそ３６５ｎｍが最も好ましい。Ｐ１、Ｑ１、Ｍ１、Ｂ１、Ｇ１、Ｂ２、およびＧ２からなる群から好ましいアフラトキシンが選択される。好ましい光源は、水銀キセノンランプまたは発光ダイオードなどのレーザまたはランプである。
【００１２】
チャンバは０．０５から４．０の範囲のチャンバ体積／秒の滞留時間を有する試料のソースと協力するように構成および配列されることが好ましい。さらに、滞留時間が０．２５から２．０のチャンバ体積／秒であることがより好ましい。入口は、４．０×１０−６モル／リットルもの溶液を受け取ることが好ましい。
【００１３】
１つの好ましい装置が、１つ以上の光反応する化合物を潜在的に含む溶液のソースを含む。好ましいソースは、システムが光反応化合物を、互いからおよび別の非光反応化合物から分離することができるクロマトグラフィシステムである。１つの好ましいクロマトグラフィシステムが、カラムを備える液体クロマトグラフポンプを備える。クロマトグラフィフカラムは、１つ以上のアフラトキシンを潜在的に含む試料を受け取り、各アフラトキシンを互いからおよび別の化合物から分離する。
【００１４】
チャンバは、蛍光検出器と光学的に通じる第２の窓を有することが好ましい。蛍光検出器は、前記光反応する化合物が溶液中に存在する場合、１つ以上の生成物を検出することができる。好ましい検出器はモノクロメータである。幾つかのアフラトキシンの光化学反応生成物が、アフラトキシンＢ１反応生成物については励起波長４２０ｎｍと４６０ｎｍの間の放出波長で、アフラトキシンＧ１反応生成物については４４５ｎｍから４６５ｎｍまでの放出波長で、波長およそ３６５ｎｍの光を使った励起で蛍光性がある。
【００１５】
本発明の別の実施形態が、液体中で光反応する化合物の光化学反応を行う方法を対象とする。方法は、容器および光源を有する装置を提供するステップを含む。容器は光化学反応を行うために、チャンバの境界を画定する少なくとも１つの壁を有する。チャンバはチャンバ体積を画定し、第１の窓、入口、および出口を有する。入口は液体中で光反応する化合物のソースと流体連通して配置されるためのものである。出口は光化学反応の生成物を排出するためのものである。窓は光子の伝播に対して透過性があり、光子を受け取るために光源と光学的に通じて配置される。チャンバは滞留時間を規定するために時間をかけて溶液を受け取る。溶液は光反応する化合物の分子の濃度を有する、または潜在的に有する。光源は窓と光学的に通じ、光子を放出し、光源の光子は前記窓により受け取られ、チャンバの中に運ばれる。光源は、励起波長で、各光反応する化合物分子が濃度１．０×１０−１３から１．０×１０−６モル／リットルのチャンバを通り抜けて生成物を形成するために、溶液中で少なくとも５から５０，０００光子を配置する強度を有する光子を放出する。さらに、方法は、生成物を形成するために前記光源がチャンバの中に光子を導くときに、光反応する化合物を含む、または光反応する化合物を潜在的に含む溶液をチャンバの中に導くステップを含む。
【００１６】
光源は少なくとも流束１．０×１０１５から１．０×１０１７光子／秒を有することが好ましい。チャンバは滞留時間０．０５から４．０チャンバ体積／秒を有することが好ましい。チャンバは、４．０×１０−６光反応物化合物のモル／リットルを有する溶液を効果的に処理することができる。光反応化合物のこの少数が蛍光検出装置により検出されることが好ましい。例えば、制限なく、本発明の実施形態が、Ｍ１、Ｂ１、Ｇ１、Ｂ２、およびＧ２からなる群から選択されるアフラトキシンを含む１つ以上のアフラトキシンの存在または非存在を検出するために使用される。これらのアフラトキシンは低濃度で検出され、この結果、検出には大きな健康安全性上の利点があることになる。これらのアフラトキシンは、光化学反応以外にさらに誘導体化および修飾することなく低濃度で検出される。
【００１７】
溶液中の光反応する化合物のソースは、液体クロマトグラフィカラムであることが好ましい。クロマトグラフィカラムは、１つ以上のアフラトキシンを潜在的に含む試料を受け取り、各アフラトキシンを互いからおよび別の化合物から分離する。
【００１８】
チャンバは、モノクロメータなどの蛍光検出器と光学的に通じる第２の窓を有することが好ましい。蛍光検出器は、光反応する化合物が溶液中に存在する場合、１つ以上の生成物を検出する。従って、好ましい方法は、１つ以上の光反応化合物の存在を示す信号を探す検出器を監視するステップを含む。信号がないことは、光反応化合物の非存在を示す。
【００１９】
図面を見て以下の詳細な説明を読むと、これらおよび別の特徴ならびに利点が当業者には明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の特徴を具現化する装置を示す図である。
【図２】本発明の特徴を具現化する装置により行われるアフラトキシンのクロマトグラムである。
【図３】水／メタノール／アセトニトリルの６４／１８／１８溶媒混合液に対するベースライン放射スペクトルと共に、１ｐｐｂ溶液Ｇ１およびＢ１アフラトキシンに対する放出スペクトルおよび励起スペクトルである。
【図４】水／メタノール／アセトニトリルの６４／１８／１８溶媒混合液に対するベースライン放射スペクトルと共に、１ｐｐｂ溶液Ｇ１およびＢ１アフラトキシンに対する放出スペクトルおよび励起スペクトルである。
【図５】本発明の特徴を具現化する装置でのＭ１アフラトキシンに対する信号対滞留時間を示す図である。
【図６】本発明の特徴を具現化する装置でのＧ２アフラトキシンに対する信号対滞留時間を示す図である。
【図７】本発明の特徴を具現化する装置でのＧ１アフラトキシンに対する信号対滞留時間を示す図である。
【図８】本発明の特徴を具現化する装置でのＢ２アフラトキシンに対する信号対滞留時間を示す図である。
【図９】本発明の特徴を具現化する装置でのＢ１アフラトキシンに対する信号対滞留時間を示す図である。
【図１０】本発明の特徴を具現化する装置でのＧ１アフラトキシンに対する信号対濃度を示す図である。
【図１１】本発明の特徴を具現化する装置でのＢ１アフラトキシンに対する信号対濃度を示す図である。
【図１２】様々な波長での蛍光検出器からの信号を示す図である。
【図１３】Ｇ１および光反応を起こしたＧ１のクロマトグラフを示す図である。
【図１４】Ｂ１および光反応を起こしたＢ１のクロマトグラフを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、光化学反応を行うための装置および方法を対象とする。本発明の方法および装置は、検出することなく光化学反応を行うために本発明の実施形態が有用であるという理解の下でアフラトキシンの存在または非存在を探す、およびアフラトキシン以外の化合物を探す試料の試験に具体的な適用分野がある。
【００２２】
ここで図１に移ると、溶液中で光反応する化合物の光化学反応を行うための、一般に数字１１で示される装置が示されている。装置１１は、以下の主要な要素、即ち、反応組立１３、固相分離装置１７を備えるクロマトグラフィシステム１５、蛍光検出器１９、および制御手段２１を有する。
【００２３】
反応組立１３は、ハウジング２５、容器２７、および光源２９を備える。概略の形で示されるハウジング２５は、容器２７および光源２９を含む構造となっている。示されるタイプのハウジングは、当該技術分野では知られており、保護カバー、ならびに容器２７および光源２９を互いに動作する関係で固定する手段を提供する一般に金属製ボックスに似た組立である。
【００２４】
容器２７は、一部切り取られて示され、チャンバ３３の境界を画定する少なくとも１つの壁３１を有する。チャンバ３３は光化学反応を行うためのものであり、チャンバ体積、第１の窓３５、第２の窓３７、入口３９、および出口４１を有する。容器２７は、チタン、鋼、ステンレス鋼、黄銅、アルミニウム、金属合金などの金属、および例としてガラスまたはプラスチックなどの別の剛体の構造物質からできている。壁３１は、光子が壁３１により吸収されないように、チャンバ３３内に含まれるべき溶液よりも小さな屈折率を有する非晶質フッ素樹脂などの物質で被覆されることができる。このような場合、チャンバ３３に向けられる光ビームの角度範囲が正しく選択されるという条件で、光化学反応の効率が、光を導く効果により高められることができる。好ましいフッ素樹脂が商標ＴＥＦＬＯＮ  ＡＦ（登録商標）（Ｄｅｌａｗａｒｅ州ＷｉｌｍｉｎｔｏｎのＤｕｐｏｎｔ社）の下で販売されている。
【００２５】
チャンバ体積は、滞留時間０．０５から４．０チャンバ体積／秒を有するように、例えばクロマトグラフィシステム１５といった試料のソースと協力するように構成および配列されることが好ましい。例えば、制限なく、チャンバ３３は長さおよそ５．０ｍｍ、および横断面およそ１．６０ｍｍ×１．６０ｍｍの一般に長方形の形状を有する。総容積が１２．８マイクロリットルであることが好ましい。これらの寸法および容積は、ＡＬＬＩＡＮＣＥ（登録商標）クロマトグラフィシステム（ＭＡ州、ＭｉｌｆｏｒｄのＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）と共同して販売されるフローセルに適合する。
【００２６】
第１の窓３５は、所望の波長での光伝播に対して透過性があり、光源２９と光学的に通じている。例えば、第１の窓３５は石英ガラスから作られることができる。
【００２７】
好ましい光源は、レーザ、または発光ダイオード（図示せず）、または示されたランプシステムである。光源２９を備えるランプシステムには、ランプ４３、収束要素４５、回折格子４７、およびスリット４９などの波長選択要素がある。光源がレーザ発光ダイオードである場合、このようなレーザは、以下により完全に説明されるように所望の波長で放出するように選択される、調整される、または設定されることを当業者は理解する。さらに当然、レーザは補助する電源および制御装置を備える。
【００２８】
描かれているように、集束要素４５はレンズとして示されているが、回折格子４７上に光を集め、このような光を集束させるための集束要素として鏡（図示せず）を使用するのが慣例である。回折格子４７は、特定の波長が別の集束要素（図示せず）と組み合わせてスリット４９に導かれることができるように、光を波長に分解する。回折格子４７は、同じ機能を行うがより効率的でないことがあるプリズム（図示せず）と置き換えられることがある。スリット４９は、光源２９の一部として描かれている。しかし、スリット４９はまた、第１の窓に一体化されることがある。好ましいランプ４３は水銀キセノンランプである。
【００２９】
光源２９は励起波長で光子を放出する。水銀キセノンランプはアフラトキシンに対して励起波長で強い放出を有する。波長は、回折格子４７およびスリット４９を調節することにより、またはレーザもしくは発光ダイオードの場合にはレーザを選択するもしくはレーザを特定の波長に調整することにより設定される。光源２９からの放射出力は、各光反応する化合物分子が濃度１．０×１０−１３から１．０×１０−６モル／リットルのチャンバを通り抜けて生成物を形成するために、溶液中に少なくとも５から５０，０００個の光子を配置する強度を有する。好ましい濃度はおよそ１．０×１０−１０モル／リットルである。
【００３０】
好ましい光源２９は、少なくとも流束１．０×１０１５から１．０×１０１７光子／秒を有する。アフラトキシンに関しては、３６５ｎｍ、または２４１ｎｍまたは３１３ｎｍの群から選択される波長を有する光子が好ましい。これらの波長はアフラトキシンにより効果的に吸収され、３６５ｎｍが最も好まれる。
【００３１】
Ｍ１、Ｂ１、Ｇ１、Ｂ２、およびＧ２からなる群から好ましいアフラトキシンが選択される。これらのアフラトキシンは以下に説明される式１から５で描かれる。
【００３２】
【化１】
0005686727.tif 000002
【００３３】
【化２】
0005686727.tif 000003
【００３４】
【化３】
0005686727.tif 000004
【００３５】
【化４】
0005686727.tif 000005
【００３６】
【化５】
0005686727.tif 000006
これらのアフラトキシン、ならびに具体的にはＢ１およびＧ１は、フラン環内の二重結合にわたり光補助的反応を起こす。これらの反応は以下に説明される反応式１で説明される。
【００３７】
【化６】
0005686727.tif 000007
本発明の実施形態が、別の反応容器内でアフラトキシンを化学的に修飾するステップを追加することなく低濃度でのアフラトキシンの検出を可能にする。
【００３８】
入口３９は、溶液中で光反応する化合物のソースと流体連通して配置されるためのものである。入口３９は、４．０×１０−６モル／リットルも有し、このような溶液をチャンバ３３の中に向ける溶液を受け取ることが好ましい。
【００３９】
好ましいソースがクロマトグラフィシステム１５であり、カラム１７などの固相抽出装置を備える。この適用分野の関係で使用されるように、「カラム」という用語は、モノリス分離装置、充填層装置、カートリッジ、および窪みを含むすべての固相抽出装置を包含するものとする。クロマトグラフィシステム１５およびカラム１７は、光反応化合物を互いからおよび別の非光反応化合物から分離する。クロマトグラフィシステム１５およびカラム１７は当該技術分野でよく知られ、例えば、ＡＬＬＩＡＮＣＥ（登録商標）およびＡＣＱＵＩＴＹ（登録商標）クロマトグラフィシステム、ならびにＯＡＳＩＳ（登録商標）、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）、ＸＢＲＩＤＧＥ（商標）、ＡＴＬＡＮＴＩＳ（登録商標）、ＸＴＥＲＲＡ（商標）、およびＳＹＭＭＥＴＲＹ（登録商標）カラム（ＭＡ州、ＭｉｌｆｏｒｄのＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）といった幾つかの販売業者から入手できる。
【００４０】
出口４１は、光化学反応の生成物を排出するためのものである。従って、出口４１は、入れ物（図示せず）または１つ以上の別の検出器と一般に流体連通している。例えば、制限なく、出口は、質量分析計もしくは別のモノクロメータ（図示せず）などの１つ以上の検出器、またはさらに分析するためにチャンバ３３を通って溶出する先端が別個の試料ガラス瓶に捕獲される、制御システム２１により監視されるフラクションコレクタなどのサンプリングシステムに接続されることができる。
【００４１】
第２の窓３７は、アフラトキシンからの蛍光により生成される光子、および、または光化学反応の生成物を受け取る。第２の窓３７は、第１の窓３５の方法で石英ガラスから作られる。蛍光に対応する光子の量は通常、第１の窓３５からチャンバ３３に入射する光のほんのわずかであり、第２の窓３７はこのように入射する光の光路に対して９０°に設定されることが好ましい。
【００４２】
第２の窓３７は、蛍光検出器１９と光学的に通じている。幾つかのアフラトキシンの光化学反応生成物が、励起波長およそ３６５ｎｍで、ならびにアフラトキシンＢ１反応生成物については４２０ｎｍと４６０ｎｍの間の放出波長で、およびアフラトキシンＧ１反応生成物については４４５ｎｍから４６５ｎｍの放出波長で蛍光性がある。蛍光検出器１９は、モノクロメータの特徴を有する。当該技術分野で知られているこれらの特徴は、別の詳細に関してわかりやすいように図面から省かれている。蛍光検出器は回折格子またはプリズム、および光検出器などの光の波長を分離する手段を備えることを当業者は理解する。回折格子またはプリズムは、分析物により放出されることが知られている波長に調整される。
【００４３】
蛍光検出器１９からの信号は制御手段２１により受け取られる。制御手段２１は１つ以上のコンピュータ処理ユニット（ＣＰＵ）を備えるデータ管理システムである。ＣＰＵは当該技術分野でよく知られ、多数の提供業者から入手できる。制御手段２１を備えるＣＰＵが、クロマトグラフィシステム１５に組み込まれることができ、またはメイン・フレーム・コンピュータ、サーバ、パーソナルコンピューティング装置、ラップトップコンピュータなどの別個のコンピュータ装置内に収容されることもできる。蛍光検出器１９からの信号は制御手段２１により処理され、アフラトキシンに関連する値と比較される。アフラトキシンに関連するしきい値以上の信号は、アフラトキシンの存在について陽性であると推定され、このような値未満の信号は陰性であると推定される。これらのデータは印刷される、またはスクリーン上に表示される。
【００４４】
制御手段２１は、クロマトグラフィシステム１５および光源２９と信号で伝達するように描かれている。光源２９の励起波長、または放出波長の変化が望まれる場合、制御手段２１はこのような変化をもたらす指令を発行する。制御手段２１はクロマトグラフィシステム１５に射出時間、流速、溶媒、および勾配を決定するように指令する。
【００４５】
ここで、溶液中で光反応する化合物の光化学反応を行う方法を対象とする本発明の一実施形態が、装置１１の動作に関して説明される。方法は容器２７および光源２９を有する装置１１を提供するステップを含む。容器２７は、光化学反応を行うために、チャンバ３３の境界を画定する少なくとも１つの壁３１を有する。チャンバ３３はチャンバ体積の境界を画定し、第１の窓３５、第２の窓３７、入口３９、および出口４１を有する。入口３９は溶液中で光反応する化合物のソース、クロマトグラフィシステム１５、およびカラム１７と流体連通している。出口４１は光化学反応の生成物を放出するためのものである。
【００４６】
第１の窓３５は、光子の伝播に対して透過性があり、光子を受け取るために光源２９と光学的に通じている。チャンバ３３は、滞留時間を規定するために時間をかけて溶液を受け取る。溶液は光反応する化合物の分子の濃度を有する、または潜在的に有する。光源２９は光子を放出し、光源２９の光子が第１の窓３５により受け取られチャンバ３３の中に運ばれる。光源２９は、励起波長で、各光反応する化合物分子が濃度１．０×１０−１３から１．０×１０−６モル／リットルのチャンバを通り抜けて生成物を形成するために溶液中に少なくとも５から５０，０００個の光子を配置する強度を有する光子を放出する。
【００４７】
さらに、方法は、生成物を形成するために前記光源２９が光子をチャンバ３３の中に向けるとき、光反応する化合物を含む、または潜在的に光反応する化合物を含む溶液をチャンバ３３に向けるステップ、および蛍光検出器１９を使って蛍光を探して第２の窓３７から放出を監視するステップを含む。
【００４８】
これらの特徴および利点が、以下の実施例に関連してさらに説明される。
【実施例１】
【００４９】
アフラトキシン分析の最適な励起波長および放出波長
この研究ではアフラトキシンの５つすべてについて、光源２９での励起波長が３６５ｎｍに設定された。３６５ｎｍの励起波長は、Ｈｇ−Ｘｅランプからの強い水銀輝線と一致する。放出波長は、Ｇアフラトキシンについては４５６ｎｍ、ならびにＢおよびＭのアフラトキシンについては４３４ｎｍだった。これらの波長はＧ１およびＢ１の溶液の励起ならびに放出のスキャンに基づき選択された。
【００５０】
図３および４は、規定された条件での水／メタノール／アセトニトリルの６４／１８／１８溶媒混合液に対するベースライン放出スペクトルと共に、Ｇ１およびＢ１のアフラトキシンの１ｐｐｂ溶液に対する放出ならびに励起のスペクトルを描く。図３は、放出および励起のスキャンを使ってＧ１アフラトキシンを描く。Ｄｉｆｆ曲線は、Ｅｍスペクトルと６４／１８／１８ベースラインスペクトルの差である。差はアフラトキシンの放出スペクトルである。３６５ｎｍの励起波長がこのシステムにとって最善の選択であることを示す励起曲線が含まれる。
【００５１】
Ｇ１励起曲線は、２２８ｎｍ、３１３ｎｍ、３６５ｎｍ、４０４ｎｍ、および４５６ｎｍにピークを有する。２２８ｎｍのピークは、放出モノクロメータの中に散乱され４５６ｎｍに２次として見られる励起光であり、蛍光を示さない。４５６ｎｍのピークは、放出システムにより見られる散乱励起光であり、この場合も蛍光を示さない。３１３ｎｍ、３６５ｎｍ、および４０５ｎｍのピークは、励起蛍光からのものであり、３６５ｎｍのピークは、この他のピークよりも明らかに何倍か大きいため、Ｈｇ−Ｘｅソースからの最適の励起波長である。ここで図４に移ると、Ｂ１励起曲線が２１７ｎｍ、３１３ｎｍ、３６５ｎｍ、４０５ｎｍ、および４３４ｎｍに大きなピークを有する。２１７ｎｍのピークは、散乱され放出モノクロメータに入る励起光であり、４３４ｎｍに２次として見られ、蛍光を示さない。４３４ｎｍのピークは、放出システムにより見られる散乱励起光であり、この場合も蛍光を示さない。３１３ｎｍ、３６５ｎｍ、および４０５ｎｍのピークは、励起蛍光からのものであり、３６５ｎｍのピークはこの場合もこの他のピークよりも数倍大きいため、Ｈｇ−Ｘｅ光源２９からの最適な励起波長である。
【実施例２】
【００５２】
滞留時間（ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ  ｔｉｍｅまたはｄｗｅｌｌ  ｔｉｍｅ）の研究
チャンバ３３内でのアフラトキシンの滞留時間の影響に関する研究が始められた。光化学反応は分子に遭遇する光子の数に依存し、ランプ４３の出力は固定しているので、分子は流速を低下させることによりチャンバ３３を通って流れるとき、より多くの光子にさらされることができる。溶媒混合液組成の影響も評価された。方法は水／メタノール／アセトニトリルの６４／１８／１８混合液を現在使用している。表１は、アフラトキシンのそれぞれに対して試験された溶媒組成を示す。
【００５３】
流速は、所与の溶媒組成中で所与のアフラトキシンを流す間に段階的に変更された。使用された流速は、１、０．５、０．２５、０．１、および０．０５ｍｌ／分であった。各アフラトキシンおよび溶媒組成に対して異なる流速で蛍光信号が監視された。
【００５４】
様々な溶媒組成でのアフラトキシンの１ｐｐｂ溶媒に対する結果が、図２のクロマトグラムに示されるような溶出の順序で図５から９に提示されている。データは蛍光信号（縦座標）対滞留時間（横座標）のプロットとして提示されている。滞留時間はチャンバ体積を流速で割ったものとして計算される。線形部分の曲線の傾きが反応速度を示す。
【００５５】
非光反応性または弱い光反応性のアフラトキシン（Ｍ１、Ｇ２、およびＢ２）は、試験されたすべての溶媒組成で滞留時間に対して比較的平坦から少し陰性の反応を有することがわかる。
【００５６】
Ｇ１アフラトキシンは、最短の滞留時間で純粋なアセトニトリル中で最も蛍光性があったが、蛍光は純粋なアセトニトリル中で滞留時間が増加すると共に低下し、１．５６秒を超える滞留時間でこの他の溶媒混合液の一部で測定される信号よりも小さく低下した。この他の溶媒組成のすべてが滞留時間の増加と共に信号が増加する傾向を示した。滞留時間が延長されると共に信号の最終的な平坦化を示す曲線は、できるだけ完全にフローセル条件で光反応を起こした化学種を表すものと理解される（必ずしも全面転換ではない。）。
【００５７】
Ｂ１アフラトキシンは、滞留時間に対して信号が平坦な応答を示したアセトニトリルを除いて、滞留時間の増加と共に信号が増加する傾向を示した。Ｂ１アフラトキシンはまた、一部の溶媒混合液でより長い滞留時間で信号の平坦化を示した。
【００５８】
光化学反応が濃度の広い範囲にわたり起こるかどうかを評価するために、濃度の広い範囲にわたり流す別の一続きが、Ｇ１およびＢ１のアフラトキシンを使って６４／１８／１８移動相で行われた。これらの溶液に対する結果が図１０および１１に示される。実験は、評価された範囲にわたりよい線形性を示した。クロマトグラフィ測定全体に先行する較正ステップにより、この場合いわゆる放出単位（ＥＵ）で測定された装置応答と分析物濃度の間の関係が確立された。この較正ステップは当該技術分野で知られており、定期的に行われ、ランプ４３の出力の低下、または光源２９、容器２７、もしくは検出器１９内部の様々な構成要素の光伝播特徴などの装置特性の変化を補償する。
【００５９】
Ｂアフラトキシンに対する放出波長を４３４ｎｍから４５０ｎｍに変更することが、検出感度を改善する場合がある。放射波長を溶媒のラマン放出からさらに離すことにより、背景レベルが４分の１から５分の１に低減される。４５０ｎｍへの変更は、ピーク値の約８０％にまでしかアフラトキシン蛍光信号を下げない。放出波長のこの変化が、ベースライン雑音に２倍の改善をもたらし、改善されるＳ／Ｎ性能にはほぼ同じ改善をもたらすことができる。
【００６０】
【表１】
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【実施例３】
【００６１】
光変換および信号への波長の影響
この実施例は、アフラトキシンの一定組成の溶液を２つの検出器を通して連続して流すものである。
【００６２】
第１の検出器では、励起波長が２４１ｎｍ、３１３ｎｍ、３６５ｎｍ、および４０５ｎｍの間で変更された。光シャッタ機構が光源２９と第１の窓３５の間に置かれた。シャッタを「開」の位置にすると、励起光がチャンバ３３の中に進むことが可能になった。「閉」の位置では光子が溶液に到達するのを妨げられた。
【００６３】
チャンバ３３からの流出を監視するために第２の蛍光検出器（図示せず）が使用された。この検出器は、励起波長３６５ｎｍ、およびＢ１溶液については放出波長４３４ｎｍ、Ｇ１溶液については放出波長４５６ｎｍを採用した。典型的な結果が以下の表３に示されている。このデータを作成するために使用された、０．５ｍｌ／分で１００ｐｐｂのＧ１を流す１つの例が図１２に示されている。図１２で、シャッタ開での信号はシャッタ閉での信号よりも常に大きいことが理解されることができ、このことは光化学増強がチャンバ３３内部で起きていることを示す。さらに、増強はチャンバ３３に入射する光子の波長がおよそ３６５ｎｍであるときに最大となる。
【００６４】
【表２】
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【００６５】
単位ＥＵ／光子で表現された各波長に対する効率が、（シャッタ開信号−シャッタ閉信号）／（光子／秒／滞留時間フローセル）として計算される。これらの流しに対する計算された効率因子が以下の表４に示され、表４では、因子が、特定の流速および組成での励起波長３６５ｎｍに関連する効率因子に正規化されている。これらの正規化効率はこの表では「比率（Ｆｒａｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる。
【００６６】
【表３】
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【００６７】
効率因子は、３６５ｎｍが最も効率的な波長であり、２４１ｎｍおよび３１３ｎｍが続くことを示す。２４１ｎｍでのフローセルへのランプ出力は、約３．２ｅ１５光子／秒であるのに対して、３１３ｎｍおよび３６５ｎｍでは約１．３ｅ１６光子／秒である。光子流束がおおよそ４分の１であると共に２４１ｎｍで効率が少しより低い結果、２４１ｎｍでかなりより低いＦＬＲとなる。
【実施例４】
【００６８】
光化学反応生成物の質量分析およびクロマトグラフィ
流速０．５ｍｌ／分でチャンバ３３を通して標準的な６４／１８／１８溶媒混合液中にＢ１またはＧ１のアフラトキシンの一定組成溶媒１００ｐｐｂを流すことにより、光化学反応生成物の試料が生成された。これらの試料を生成するために励起波長が３６５ｎｍに設定された。次に、光化学反応前に見られなかった新しいピークだけでなく未反応のＢ１またはＧ１のアフラトキシンを探すために、アフラトキシン法を使用してクロマトグラフィ分離用試料として注入される出口４１で、このようにさらされた試料が収集された。各試料の一部はまた、生成された反応生成物の構成／組成を理解するために、質量分析により分析された。
【００６９】
Ｇ１標準と、Ｇ１＊というラベルのついた光反応を起こしたＧ１溶液とのクロマトグラフの比較が図１３に示されている。Ｇ１試料もＧ１＊試料も３．８２分に主要なＧ１ピークがあることがわかるが、Ｇ１＊試料には１．３７分、１．６４分、２．８５分、および３．４６分にもピークがある。これらの別のピークは、Ｇ１の光化学反応で形成された化合物であり、３．８２分のピークは試料中に依然として存在する未反応のＧ１である。
【００７０】
同様に、Ｂ１標準と、Ｂ１＊とラベルのつけられた光反応を起こしたＢ１溶液とのクロマトグラムが図１４に示されている。Ｂ１標準については５．４分の単一の主要なピークしか見えないが、Ｂ１＊試料には１．６５分、２．０８分、３．８８分、４．８０分、および５．４分に主要なピークがある。これらの別のピークは、Ｂ１の光化学反応で形成された化合物であり、５．４分のピークは未反応のＢ１である。
【００７１】
Ｂ１およびＧ１、ならびに光反応を起こしたＢ１＊およびＧ１＊の同じ１００ｐｐｂ溶液に対して質量分析が行われた。光反応を起こした試料には親質量より上の＋１８質量単位および＋３２質量単位に質量ピークがある。＋１８は水の付加と解釈され、＋３２はメタノールの付加と解釈される。光反応を起こした試料に対するクロマトグラフには、２つだけでないこれ以外の別のピークがある。これらの結果は、Ｂ１およびＧ１の信号の意外で予期しない増加を示す。ピークの中には、フラン環内の二重結合にわたり水またはメタノールの化学種が付加されたことに起因すると信じられているものがある。
【００７２】
このように、本発明は変更および修正することが可能であるということを理解したうえで、本発明の好ましい実施形態について詳細に述べてきた。従って、本発明は正確な詳細に限定されるべきではないが、以下の特許請求の範囲の内容、およびこれらの均等物を包含すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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