(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルメロ種子の、７０％以上の濃度のエタノールによる抽出物を有効成分とするコラーゲン産生促進剤。
【請求項２】
マルメロ種子の、７０％以上の濃度のエタノールによる抽出物を有効成分とするコラーゲンゲル収縮剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の剤を含有するシワ改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン産生促進剤、コラーゲンゲル収縮剤及びそれを含有するしわ改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
シワは、加齢や太陽光線による皮膚の老化（光老化）などにより発生する。皮膚老化は環境因子による障害の蓄積が大きく作用していると考えられる。とりわけ紫外線は、皮膚加齢やシワ形成に関与する最大の環境因子と考えられ、紫外線により産生される各種フリーラジカル（特にスーパーオキシド、ハイドロキシラジカル、一重項酸素等の活性酸素）は、日焼け等の急性炎症の原因となるのみならず、その産生が慢性的に繰り返されることにより光老化を誘発することが知られている。活性酸素は、真皮成分のＤＮＡ−蛋白クロスリンク（架橋結合）、コラーゲンやエラスチンの蛋白クロスリンクの障害又は変性、ＳＯＤ等の抗酸化酵素の不活化、細胞成分の膜脂質過酸化とその結果としての細胞機能の劣化などを惹起し、その結果、皮膚の老化やシワの形成を引き起こすと考えられている（非特許文献１）。
【０００３】
皮膚老化やシワの形成を予防し又は治療するために、ビタミンＥのような抗酸化剤の利用（特許文献１）、シリマリンなど植物エキスの肌への供給（特許文献２）、ヒアルロン酸等細胞外マトリクスの肌への補給（特許文献３）、レチノイン酸やα−ヒドロキシ酸の利用などが提案されている。近年、健康で美しい肌状態を実現することが老若男女を問わず重大な関心事になっている。
一方紫外線によるシワの形成モデルが確立され、これを用いてシワ形成を抑制する成分に探索が行われるようになった。たとえばヒノキ科の植物のアスナロ抽出物がマウスに紫外線を照射することにより形成するシワを抑制する効果を有することが見出されたシワ防止剤として提案されている。（特許文献４：特許第３９１９２５０号公報）。さらに最近ではシリビンとコラーゲントリペプチドを含有する製剤の投与により皮膚の基底層の細胞の増殖を促進させてシワを改善する技術が提案されている（特許文献５）。しかし満足できる物質はあまり発見されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭６２−２６３１１０号公報
【特許文献２】再表２００４−８５４２９号公報
【特許文献３】特開平４−４７１０１６号公報
【特許文献４】特許第３９１９２５０号公報
【特許文献５】特開２００７−９１６３号公報
【特許文献６】特開平９−１６５３１６号公報
【特許文献７】特開２０００−２７３０１５号公報
【特許文献８】特開平７−１７８７３号公報
【特許文献９】特開２００１−２１３７５０号公報
【特許文献１０】特開２００５−６８０３４号公報
【特許文献１１】特開２００５−６８０８４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】丸善株式会社刊  化粧品事典  ５２７−５２８、平成１５年
【非特許文献２】芋川玄爾監修  機能性化粧品開発のための実験手法、ｐ６９−８１、  シーエムシー出版、2007年5月31日  第１刷発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はヒフ細胞のコラーゲン産生促進剤、コラーゲンゲル収縮剤およびこれを含有するシワ改善剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、マルメロ種子のアルコール抽出物に強いコラーゲン産生促進作用を見出したので、本発明を提案する。
本発明は以下の構成である。
（１）マルメロ種子の、７０％以上の濃度のエタノールによる抽出物を有効成分とするコラーゲン産生促進剤。
（２）マルメロ種子の、７０％以上の濃度のエタノールによる抽出物を有効成分とするコラーゲンゲル収縮剤。
（３）（１）又は（２）に記載の剤を含有するシワ改善剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によりコラーゲン産生促進剤ならびにコラーゲンゲル収縮剤が提供される。またコラーゲン産生促進剤及び／又はコラーゲンゲル収縮剤を含有するシワ改善剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】マルメロ種子のエタノール抽出物のコラーゲン産生促進作用と細胞毒性を評価した結果を示すグラフである。左図はアスコルビン酸２グルコシド、右図はマルメロ抽出物のデータである。
【図２】マルメロ種子のエタノール抽出物のコラーゲンゲル収縮効果を評価した画像である。
【図３】マルメロ種子のエタノール抽出物のコラーゲンゲル収縮効果を数値化しグラフ化した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明に用いるマルメロ（Ｃｙｄｏｎｉａ  ｏｂｌｏｎｇａ）は、ヨーロッパやアジア南部（おもにイラン）を原産とするバラ科の植物である。マルメロの種子の水抽出物は化粧品の増粘剤として汎用されている（特許文献６、特許文献７）。またマルメロ果実のアルコール抽出物はチロシナーゼインヒビター、α−アミラーゼインヒビターとしての効果が知られている（特許文献８）。更にまたマルメロ全草の水蒸気蒸留水の香料としての使用（特許文献９）、マルメロ果実エタノール抽出物を保湿、美肌、肌荒れ改善効果を有する化粧料に配合すること、マルメロ種子アルコール抽出物を油性クレンジングに配合すること（特許文献１０）、マルメロ種子の１，３−ブタンジオール抽出物をフォーム状洗浄料に配合すること（特許文献１１）が知られている。しかし本発明のコラーゲン産生促進作用やコラーゲン収縮作用、シワ改善作用は知られていない。
【００１１】
本発明に用いるマルメロの抽出部位は種子、果実、花、葉、枝、根のいずれでも良く、種子が特に好ましい。本発明に用いる有機溶媒として、アルコール類、アセトン、アセトニトリル等が挙げられ、親油性有機溶媒としてヘキサン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチルエーテル、トルエン等が挙げられる。マルメロの有機溶媒抽出物の調製に用いる抽出溶媒としては、親水性有機溶媒が好ましい。親水性有機溶媒としてアルコールが特に好ましい。アルコールとしてはエタノール、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、１，３−ブチレングリコール等が挙げられる。エタノールが特に好ましい。また、親水性有機溶媒を用いる際は、本発明の効果を損なわない範囲で水と混合して用いることができる。マルメロの抽出溶媒として、親水性有機溶媒と水の混合物を用いる場合は、親水性有機溶媒と水の質量比が５０：５０〜１００：０が好ましく、７０：３０〜１００：０が特に好ましい。使用する有機溶媒は抽出するマルメロの状態により異なるが、抽出対象物の重量の１０倍乃至１００倍量の有機溶媒を用いる。
【００１２】
抽出にあたっては、新鮮な果実や種子、枝、葉から有機溶媒で直接抽出することもできるが、マルメロの乾燥物を粉砕したものから有機溶媒で抽出する方法が効率的に抽出できるので好ましい。抽出する際には、還流冷却器を付した加熱還流抽出方法が好ましいが、可能な限り低温で抽出する。抽出時間は５〜２４時間循環抽出することで高活性の抽出液を回収することができる。抽出後は、ロータリーエバポレーターなどを用いて低温で溶媒を留去する。
【００１３】
溶媒を除去した抽出物は、直接又は水や生理食塩水などに希釈してコラーゲン産生促進剤、コラーゲンゲル収縮剤として用いることができる。また賦型剤や安定剤、等張剤など製剤化に必要な成分を添加して製剤化することができる。又凍結乾燥など乾燥操作を行って粉末化することもできる。かくして得られたコラーゲン産生促進剤及び／又はコラーゲンゲル収縮剤を医薬品、化粧品として用いる場合は、直接目的の剤として使用するか、あるいは油剤などに分散・溶解させて配合することができる。化粧品に配合することによりしわ改善剤とすることができる。この化粧品としてのしわ改善剤には、通常の化粧品に用いられる植物油、脂肪酸類、高級アルコール、シリコーン類、界面活性成分、水溶性合成高分子、増粘成分、粉体成分、保湿成分、紫外線吸収剤、紫外線遮蔽物、香料、金属キレート剤、ｐＨ調製剤などの公知の化粧料用成分を含有させることができる。さらには、抗炎症成分、活性酸素消去成分、血行促進成分、美白成分あるいは、その他の公知の添加剤である有効成分を配合することもできる。
【００１４】
化粧料や医薬部外品あるいは外用剤をしわ改善剤とする場合は、有機溶媒抽出物を乾燥重量換算で化粧料全質量の０．０００１〜５質量％、好ましくは０．００１〜１質量％配合することが適切である。食品や内服剤をしわ改善に用いる場合は一日あたり１００ｍｇ〜１０ｇを経口摂取する。
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明する。
【００１５】
[マルメロ種子のエタノール抽出物の調製]
マルメロの種子の乾燥物を高速ブレンダ―で粉状に粉砕し、粉砕物１０ｇを５００ｍｌの１００％エタノール（含水率０．５％以下）中で常法に従って還流冷却器を付して３日間還流抽出し、抽出物を回収した。抽出物は２．７０ｇで、抽出率は２７％であった。
【００１６】
[マルメロ種子のエタノール抽出物のコラーゲン産生促進効果の測定]
（Ａ）測定方法
上記抽出物の添加時と非添加時の線維芽細胞のコラーゲン産生量を比較することによりコラーゲンの産生促進作用を評価した。
１．サンプル
試験区はマルメロ種子エタノール抽出物を添加したサンプル群、アスコルビン酸２グルコシドを添加した陽性対照群、マルメロ種子エタノール抽出物、アスコルビン酸２グルコシドのいずれも添加していないコントロール群を設定し、各サンプルを任意の濃度、１％ペニシリンストレプトマイシン添加ＤＭＥＭ培地（invitrogen 11995-073）に溶解し、終濃度０．５％ＤＭＳＯを添加したものを培養溶液とした。マルメロ種子エタノール抽出物を添加したサンプル群およびアスコルビン酸２グルコシドを添加した陽性対照群は、終濃度６２．５、１２５、２５０、５００μｇ／ｍｌの各４段階の濃度とした。
【００１７】
２．培養方法
新生児ヒト包皮由来線維芽細胞（ＰＤＬ：１８）を用いて実験を行った。９６ウェルプレートに細胞を１×１０４個／ウェルの密度で播種し、１０％の牛胎児血清と１％ペニシリンストレプトマイシンを加えたＤＭＥＭ培地（invitrogen 11995-073）２００μｌで９０％コンフレントになるまで７２時間、３７℃５％ＣＯ２下で前培養を行った。
前培養後、細胞は、ＰＢＳ-で洗浄後、それぞれ調整していたサンプル群、陽性対照群、コントロール群の培地を２００μｌ添加し、３７℃５％ＣＯ2下で４８時間培養を行った。
【００１８】
３．コラーゲン産生量測定
培養終了後、ポリプロピレン製の９６ウェルプレート（nunc 267245）に培地を全量回収し、-３０℃で保管した。培地を取り除いた細胞はＭＴＴアッセイに供した。
線維芽細胞が産生したコラーゲン量は、培地中の１型コラーゲンＣ末ペプチド量に比例することが知られている。そこで、培地中に溶解した１型プロコラーゲンＣ末ペプチドの量を測定し、コラーゲン産生量を算出した。１型コラーゲンＣ末ペプチドの量はPIPEIAキット（タカラバイオ  MK101）ELISA法で測定した。測定の際、保存していた培養上清はＰＢＳ-により１０倍に希釈した。コントロール群の培地上清の１型コラーゲンの量をＡ、サンプル群および陽性対照群の各濃度下における培地上清の１型コラーゲン量をＡｓとして、コントロール群の培地上清の１型コラーゲンの量を１００％としたときのコラーゲン産生量の比率を下記の式より算出した。
コラーゲン産生量の比率（％ of control）＝Ａｓ／Ａ×１００
【００１９】
４．ＭＴＴアッセイ
マルメロ抽出物の毒性評価を細胞生存率で評価した。細胞生存率はＭＴＴアッセイにより求めた。培地を取り除いたプレートにＭＴＴ０．５ｍｇ／ｍｌを含んだＤＭＥＭ培地１００μｌを添加し、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、培地を取り除き、イソプロパノールを１００μl添加し１５分撹拌しながらホルマザンを溶解した。マイクロプレートリーダーにて溶解液の５７０nmと６３０nmの波長における吸光度を測定し、その吸光度の差をＭＴＴ定量値とした。コントロール群のＭＴＴ定量値をＢ、サンプル群および陽性対照群の各濃度下のＭＴＴ定量値をＢｓとして、細胞生存率を下記式より算出した。
細胞生存率（％）＝Ｂｓ／Ｂ×１００    
【００２０】
５．統計処理
サンプル、陽性対照はすべて３点ずつ測定した（ｎ＝３）。コラーゲン産生量の比率、細胞生存率ともに分散分析によって統計処理し、コントロール群の値を対照としてDunnettの検定により５％有意水準でサンプル添加時の値を比較した。
【００２１】
６．結果
コラーゲン産生能の測定結果、細胞毒性の評価結果を図１に示す。
アスコルビン酸２グルコシド、マルメロ種子エタノール抽出物のコラーゲン産生量の比率はともに濃度依存的に増加し、マルメロ種子エタノール抽出物では、５００μg／ｍｌ添加時に有意差が認められた。
【００２２】
細胞生存率は、アスコルビン酸２グルコシドでは０−５００μｇ／ｍｌの濃度下では差は認められなかった。マルメロ種子エタノール抽出物では、１２５μｇ／ｍｌおよび２５０μg／ｍｌ添加時に若干の低下が認められるものの、５００μｇ／ｍｌではサンプル無添加（コントロール）と差が認められないことからマルメロ種子エタノール抽出物による毒性はないと判断した。
【００２３】
以上の結果から、マルメロ種子エタノール抽出物は、細胞の生存率に大きな影響を与えることなくコラーゲン産生量を増加することから、安全なコラーゲン産生促進剤として利用可能であることが明らかとなった。
【００２４】
[コラーゲンゲル法による、マルメロ種子エタノール抽出物のコラーゲンゲル収縮作用の評価]
真皮の状態を再現した皮膚モデルとして、線維芽細胞を1型コラーゲンゲルに包埋したコラーゲンゲルが知られている。コラーゲンゲルはゲル内の線維芽細胞の産生するコラーゲンとそれにより形成されるコラーゲン繊維によって、真皮に類似した状態となる。このコラーゲンゲルは、アクチンやインテグリンなどの作用によりゲルに張力がかかり収縮する。生体内においても、同様のメカニズムによって、皮膚のハリが維持される。そこで、コラーゲンゲルを用いてしわ、ハリを改善する指標とすることができる（非特許文献２）。この評価系を用いてシワの改善を評価した。
【００２５】
１．コラーゲンゲル収縮作用の評価方法
線維芽細胞（ＰＤＬ２０）を包埋したコラーゲンゲルの収縮率を本発明の抽出物の添加時と非添加時で比較し、コラーゲンゲル収縮作用を評価した。
【００２６】
１．１  細胞包埋コラーゲンゲルの作成並びに培養方法
細胞を包埋したコラーゲンゲルは、コラーゲンゲルキット（新田ゼラチン）によって作成した。氷冷下で、CellmatrixTipe1-A(Ａ液)（新田ゼラチン）を終濃度２ｍｇ／ｍｌ（添加量１６ｍｌ）、１０倍濃度ＭＥＭハンクス（Ｂ液）（新田ゼラチン）を終濃度１倍（添加量２ｍｌ）、１倍濃度ＭＥＭハンクスで調整した新生児ヒト包皮由来線維芽細胞（ＰＤＬ：２０）の細胞懸濁液４．２×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｌ(終濃度)を泡を立てないように混合した後、２ｍｌの再構成用緩衝液（Ｃ液）を混合し、細胞包埋コラーゲンゲルの溶液を作成した。温度が上昇しないようにしながら、作成した細胞包埋コラーゲンゲルの溶液を１２ウェルマルチプレート（住友ベークライト）に８００μｌ添加した。添加終了後、３７℃５％ＣＯ２条件下で２時間インキュベートし、細胞包埋コラーゲンゲルの溶液を完全にゲル化した。
メスおよびスパチュラを用いて、ゲル化したコラーゲンゲルの縁と底面をウェルプレートより剥離した。剥離時のゲル面積をサンプル添加前のゲル面積とし、この時のゲル面積はウェル底面積と同じ３．８ｃｍ2であった。剥離したゲルを入れたウェルプレートにジメチルスルホキシドに各種の濃度で溶解したサンプル（マルメロ種子エタノール抽出物）を１ｍｌ、１％ペニシリンストレプトマイシン添加ＤＭＥＭ培地（invitrogen11995-073）を１ｍｌ添加し、コラーゲンゲルを５日間浮遊させて培養した。この時、培地中に含まれるＤＭＳＯの濃度は０．５％とし、サンプル濃度は０、２０、１００、５００μｇ／ｍｌの４段階を設定した。
浮遊培養後、コラーゲンゲルを、常温で１０％ホルマリン中に２４時間浸漬し、固定した。
コラーゲンゲルの写真を撮影し、Image Jによって画像解析してサンプル添加培養後のコラーゲンゲルの面積を測定した。
次式により、コラーゲンゲルの収縮率を求めた。
ゲル収縮率（％）＝１００-Ａｓ／Ａ×100  
Ａ：サンプル添加前のコラーゲンゲルの面積  （３．８ｃｍ２）
Ａｓ：サンプルを添加し、５日間浮遊培養後のコラーゲンゲルの面積
ゲルの収縮状態を撮影した画像を図２に示す。
【００２７】
１．３  統計処理
サンプルはすべて３点ずつ測定した（ｎ＝３）。分散分析によって統計処理し、サンプル濃度０μｇ／ｍｌのときのゲル収縮率を対照として、Dunnettの検定により５％有意水準でサンプル濃度２０、１００、５００μｇ／ｍｌのときのゲル収縮率を比較した。ゲルの収縮率を評価した結果を図３に示す。
【００２８】
２．結果
培養期間中、ゲル中で正常な細胞増殖が認められた。
サンプル濃度０μｇ／ｍｌを添加したときのコラーゲンゲルの収縮率は３３．４±１．５％であった。
サンプル濃度２０、１００、５００μｇ／ｍｌでは、抽出物の濃度依存的にコラーゲンゲルは収縮した。１００μｇ／ｍｌ添加した場合の収縮率は４１．４±１．９％であり、サンプル濃度０μｇ／ｍｌのときと比べて有意水準５％の差が認められた。５００μｇ／ｍｌ添加した場合の収縮率は４７．４±３．２％であり、サンプル濃度０μｇ／ｍｌのときと比べて有意水準１％の差が認められた。
マルメロ種子エタノール抽出物は、高濃度で添加しても細胞毒性を示さず、コラーゲンゲル収縮能を有することが明らかとなった。したがって、マルメロ種子エタノール抽出物は皮膚のたるみやしわを予防し、改善すると考えられる。
【００２９】
以下にマルメロ抽出物を配合したしわ改善剤の処方例を示す。
［処方例１］クリーム
下記の処方（単位は重量％）により、クリームを製造した。
（１）  ステアリルアルコール                      ６．０
（２）  ステアリン酸                              ２．０
（３）  水添ラノリン                              ４．０
（４）  スクワラン                                ９．０
（５）  オクチルドデカノール                    １０．０
（６）  ＰＯＥ（２５）セチルアルコールエーテル    ３．０
（７）  モノステアリン酸グリセリン                ２．０
（８）  マルメロ種子エタノール抽出物              ０．１
（９）  防腐剤                                    適量
（１０）香料                                      適量
（１１）１，３ブチレングリコール                  ６．０
（１２）ＰＥＧ１５００                            ４．０
（１３）精製水                                    残余
〔製法〕上記成分（１）〜（１０）を８０℃に加熱溶解し油相とする。成分（１１）〜（１３）を７０℃に加熱溶解し水相とする。油相に水相を徐々に加え乳化し、攪拌しながら４０℃まで冷却し、さらに３０℃まで攪拌冷却してクリームを得た。
【００３０】
［実施例２］錠剤
下記の処方（単位は重量％）により、錠剤を製造した。
（１）マルメロ種子エタノール抽出物              ２０．０
（２）乳糖                                      ６５．０
（３）コーンスターチ                            １４．０
（４）グアーガム                                  １．０
【００３１】
［処方例３］乳液
下記の処方（単位は重量％）により、乳液を製造した。
（１）ジプロピレングリコール                                        ９．０００
（２）マルメロ種子エタノール抽出物                                  １．０００
（３）（ヒドロキシエチルアクリル酸／アクリルジメチルタウリンＮａ）
コポリマー                                                          ０．１８８
（４）スクワラン                                                    ０．１２７
（５）ポリソルベート６０                                            ０．０２８
（６）ラウロイルグルタミン酸ジ（フィトステリル／オクチルドデシル）  １．０００
（７）グリセリン                                                    ５．０００
（８）ジメチコン                                                    ３．０００
（９）精製水                                                      ７４．７４２
（１０）カルボマー                                                  ０．２００
（１１）ベタイン                                                    ２．０００
（１２）エタノール                                                  ３．０００
（１３）水酸化カリウム                                              ０．０６５
（１４）精製水                                                      ０．６５０
〔製法〕上記成分（１）に（２）を加え８０℃に加熱溶解する。成分（３）〜（８）を加え、８０℃に加熱溶解し油相とする。成分（９）〜（１１）を７０℃に加熱溶解し水相とする。油相に水相を徐々に加え乳化し、攪拌しながら３０℃まで冷却する。成分（１２）および（１３）を（１４）に攪拌溶解したものを加え、攪拌冷却して乳液を得た。
【図１】
0005714956.tif 000002
【図２】
0005714956.tif 000003
【図３】
0005714956.tif 000004