(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される第一増幅プライマー及び配列番号２で表される第二増幅プライマー並びに正常を検出する第一検知オリゴヌクレオチドプローブ及び突然変異を検出する第二検知オリゴヌクレオチドプローブを含む反応混合物を用いて、１２４番目のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含むＢＩＧＨ３遺伝子配列を、被験者の生体サンプルから増幅する工程と：
１２４番目のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む増幅されたＢＩＧＨ３遺伝子配列に対して、前記第一検知オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検知オリゴヌクレオチドプローブの少なくとも１つをハイブリダイズする工程と
を含む、アベリノ角膜ジストロフィーの検知を補助する方法。
【請求項２】
前記第一検知オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検知オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号２５及び２６、配列番号２７及び２８、配列番号２９及び３０、配列番号３１及び３２、配列番号３３及び３４、配列番号３５及び３６、配列番号３７及び３８、配列番号３９及び４０、並びに配列番号４１及び４２からなる群から選択されるヌクレオチド配列の対で表される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一検知オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検知オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号２５及び２６のヌクレオチド配列の対で表される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一検知オリゴヌクレオチドプローブを第一標識に結合させ、そして前記第二検知オリゴヌクレオチドプローブを第二標識に結合させた、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記第一標識がＶＩＣであり、そして、前記第二標識がＦＡＭである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
１２４番目のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含むＢＩＧＨ３遺伝子配列を、被験者の生体サンプルから増幅及び決定するための、配列番号１で表される第一増幅プライマー及び配列番号２で表される第二増幅プライマーを含む、反応混合物。
【請求項７】
１２４番目のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む増幅されたＢＩＧＨ３遺伝子配列に対する、第一検知オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検知オリゴヌクレオチドプローブのうちの１つをハイブリダイズするための、前記第一検知オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検知オリゴヌクレオチドプローブをさらに含み、
前記第一検知オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検知オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号２５及び２６、配列番号２７及び２８、配列番号２９及び３０、配列番号３１及び３２、配列番号３３及び３４、配列番号３５及び３６、配列番号３７及び３８、配列番号３９及び４０、並びに配列番号４１及び４２からなる群から選択されるヌクレオチド配列の対で表される、請求項６に記載の反応混合物。
【請求項８】
前記第一検知オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検知オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号２５及び２６のヌクレオチド配列の対で表される、請求項７に記載の反応混合物。
【請求項９】
前記第一検知オリゴヌクレオチドプローブを第一標識に結合させ、そして前記第二検知オリゴヌクレオチドプローブを第二標識に結合させた、請求項７又は８に記載の反応混合物。
【請求項１０】
前記第一標識がＶＩＣであり、前記第二標識がＦＡＭである、請求項９に記載の反応混合物。
【請求項１１】
被験者のアベリノ角膜ジストロフィーヘテロ型検知を通じて、レーザー眼科手術の合併症リスクの予測を補助するための、請求項６〜１０いずれか一項に記載の反応混合物の使用。
【請求項１２】
前記レーザー眼科手術が、レーシック及びエキシマレーザー手術のうちの１つを含む、請求項１１に記載の反応混合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アベリノ角膜ジストロフィー診断用リアルタイムＰＣＲプライマー対プローブに関する。プローブに関し、更に詳しくは、アベリノ角膜ジストロフィーの原因となるＢＩＧＨ３遺伝子のエクソン４の変異の有無を正確に診断できるアベリノ角膜ジストロフィー診断用リアルタイムＰＣＲプライマー対及びプローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
角膜ジストロフィー（corneal dystrophy）は、角膜の中心部に混濁が発生し、年をとるにつれて、徐々に混濁が多くなって視力が低下している常染色体優性遺伝疾患で、アベリノ角膜ジストロフィー（Avellino corneal dystrophy）、顆粒状角膜ジストロフィー（Granular corneal dystrophy）、格子状角膜ジストロフィー（lattice type I corneal dystrophy）と輪状角膜ジストロフィー（Reis-bucklers corneal dystrophy）等があり、βＩＧ−Ｈ３タンパク質をコードする遺伝子の突然変異によって発生する。
【０００３】
このうち、アベリノ角膜ジストロフィー患者は、年齢が進むにつれて、異型接合体（heterozygote）は、視力の大幅な損失を示し、同型接合体（homozygote）の場合には、６才から失明する。アベリノ角膜ジストロフィーは、既存の顆粒状角膜ジストロフィーと総称されていた疾患から離れた症状及び遺伝子の発見のために、１９８８年に分離命名された疾患で、世界で最も一般的な角膜ジストロフィーとして知られており、遺伝子検査の結果、国内の１／３４０〜１／１，０００の間の有病率（heterozygoteの場合）として、かなり一般的な病気である（Holland, E.J. et al., Ophthalmology, 99:1564, 1992; Kennedy, S.M. et al., Br. J. Ophthalmol., 80:489, 1996; Dolmetsch, A.M. et al., Can. J. Ophthalmol., 31:29, 1996; Afshari, N.A. et al., Arch. Ophthalmol., 119:16, 2001; Stewart, H.S. Hum. Mutat., 14:126, 1999）。
【０００４】
本発明者等は、異型接合体のアベリノ角膜ジストロフィー患者が、レーシック手術を受けると、約２年後から、角膜混濁が急激に増加して、失明することを発見した（Jun, R.M. et al., Ophthalmolgy, 111:463, 2004）。以前は、レーシックやエキシマレーザー手術が角膜ジストロフィー患者の混濁を取り除くとの予測を基に、多くの手術が行われ、国内のこれまで施術されたレーシック手術は、約３０万件と推定され、国内のアベリノ角膜ジストロフィーの異型接合子の頻度を最小限の計算値である１／１，０００と見ても３００人が視力を失っているとの推測をすることができる。レーシック手術を受けた患者は、主に２０〜３０代の生産活動を行っている人口で、これらの失明は、社会的、経済的に深刻な問題と判断される。
【０００５】
また、２０００年以降、レーシックの手術の許可が公表された米国の場合、黒人においてもアベリノ角膜ジストロフィー患者のレーシック手術による失明が発見され始め、世界中多くの患者が施術を受けた後、病気が進んでいることを推測することができる。
【０００６】
そのため、レーシック手術の施術前に、アベリノ角膜ジストロフィーの患者に対する正確な診断を行って、レーシック手術による症状の進行を防止しなければならないが、従来の眼科における眼科医が、顕微鏡で眼球混濁を確認するだけで、アベリノ角膜ジストロフィーを診断しており、症状が進行していない患者の場合には発見できず、レーシック手術を施行し、失明に発展する場合も度々発生しており、正確でかつ迅速な角膜ジストロフィーの診断方法が切に求められているのが現状である。
【０００７】
アベリノ角膜ジストロフィーの原因となるＢＩＧＨ３遺伝子の変異診断用プローブを含有するＤＮＡチップが開発されたことがあるが（韓国特許公開１０−２００７−００７６５３２）、前記ＤＮＡチップを用いたアベリノ角膜ジストロフィーの診断は、サンプル中のＤＮＡを増幅させる工程、前記増幅されたＤＮＡとＤＮＡチップを混成化させる段階、前記混成化されたＤＮＡチップを洗浄する工程、及び陽性反応を検出する工程等いくつかの工程を経なければならないとの短所があった。
【０００８】
そこで、本発明者等は、より効率的にアベリノ角膜ジストロフィーを診断できる方法を開発するため、鋭意努力した結果、配列番号１と配列番号２の塩基配列を有するプライマー対と配列番号２５と配列番号２６の塩基配列を持つプローブを利用して、リアルタイムＰＣＲ法によるアベリノ角膜ジストロフィーを診断する場合、従来の方法よりも迅速かつ正確にアベリノ角膜ジストロフィーを診断することができることを確認して、本発明の完成に至った。
【発明の要約】
【０００９】
本発明の主な目的は、リアルタイムＰＣＲ法を利用してアベリノ角膜ジストロフィーを診断するに当り、より効率的かつ正確にアベリノ角膜ジストロフィーを診断するためのプライマー対とプローブを提供することにある。
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明は、配列番号１〜２、配列番号３〜４、配列番号５〜６、配列番号７〜８、配列番号９〜１０、配列番号１１〜１２、配列番号１３〜１４、配列番号１５〜１６、配列番号１７〜１８、配列番号１９〜２０、配列番号２１〜２２及び配列番号２３〜２４からなる群から選択される塩基配列で表されるアベリノ角膜ジストロフィー診断用リアルタイムＰＣＲプライマー対を提供する。
さらに、本発明は、配列番号２５乃至配列番号４２からなる群から選択される塩基配列で表されるアベリノ角膜ジストロフィー診断用リアルタイムＰＣＲプローブを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】リアルタイムＰＣＲ用のプライマーとプローブのデザインによる結果を示したもので、Ａは、最適なプライマーとプローブを用いたリアルタイムＰＣＲの結果であり、Ｂ及びＣは、Ａで使用したのとは別のプライマーでリアルタイムＰＣＲを行った結果を示す。
【図２】本発明に係るリアルタイムＰＣＲ用のプライマーを利用して、アベリノ角膜ジストロフィーを引き起こす遺伝子変異を、リアルタイムＰＣＲ法で確認した結果を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一観点において、本発明は、配列番号１〜２、配列番号３〜４、配列番号５〜６、配列番号７〜８、配列番号９〜１０、配列番号１１〜１２、配列番号１３〜１４、配列番号１５〜１６、配列番号１７〜１８、配列番号１９〜２０、配列番号２１〜２２及び配列番号２３〜２４からなる群から選択される塩基配列で表されるアベリノ角膜ジストロフィー診断用リアルタイムＰＣＲプライマー対に関する。
【００１３】
アベリノ角膜ジストロフィーは、ＢＩＧＨ３遺伝子のエクソン４の部位のＣＧＣ配列がＣＡＣに変異して、ＢＩＧＨ３蛋白質の１２４番目のアミノ酸がアルギニンからヒスチジンに変異（Ｒ１２４Ｈ）された遺伝子の異常が現われる疾患である。
【００１４】
本発明のプライマーを利用するリアルタイムＰＣＲ（real-time PCR）法を利用して、従来のＤＮＡチップを利用する方法よりも迅速かつ正確にアベリノ角膜ジストロフィーを診断することができる。
【００１５】
リアルタイムＰＣＲ法において、プライマー及びプローブの設計は、同じ温度条件での実験が行われるべきであるため、温度の条件設定が非常に複雑であり、特に、アベリノ角膜ジストロフィーのように一つの突然変異の位置のみを検出する場合、プライマーの温度条件とプローブの温度条件が、特定の組み合わせをとることができる条件が必要であり、プローブも突然変異を検出するプローブと正常を検出するプローブとの間に丁度一つの塩基配列が異なる状態で、プローブが結合できる温度は、１〜３度の間であり極めて制限的である。
【００１６】
これらの条件により、プローブやプライマーが目的の遺伝子に結合することができる同一温度条件を見つけることが重要であり、その中でも、変異プローブと通常のプローブとの温度差を限られた範囲内でできるだけ多くの差が生じるように設計することが重要である。すなわち、プライマーとプローブとの間の温度条件がよく合わせられ、それぞれを具体的に説明すると、フォワードプライマーとリバースプライマーの温度条件がよく合わなければ成らず、変異プローブと正常プローブとの間の温度設定が可能な限り差が出ることが好ましい。図１のＡは、よくデザインされたプライマーとプローブを用いた結果を示した例であり、図１Ｂと図１Ｃは、Ａと同じプローブを用いて、プライマーを変えた結果を示したもので、プライマーとプローブのデザインに応じて、結果判断に重大な影響を及ぼすことが分かる。
【００１７】
本発明では、リアルタイムＰＣＲ法を利用して、アベリノ角膜ジストロフィーの診断するに当り、最適なプライマーを作製するために、配列番号１〜２、配列番号３〜４、配列番号５〜６、配列番号７〜８、配列番号９〜１０、配列番号１１〜１２、配列番号１３〜１４、配列番号１５〜１６、配列番号１７〜１８、配列番号１９〜２０、配列番号２１〜２２及び配列番号２３〜２４のプライマー対をデザインし、それぞれのリアルタイムＰＣＲを行い、その結果、配列番号１〜２のプライマー対を使用した場合、最適な結果が示されることを確認した。
【００１８】
他の観点において、本発明は、配列番号２５乃至配列番号４２からなる群から選択される塩基配列で表されるアベリノ角膜ジストロフィー診断用リアルタイムＰＣＲプローブに関する。
【００１９】
本発明では、リアルタイムＰＣＲ法を利用して、アベリノ角膜ジストロフィーを診断するに当り、最適なプローブを作製するために、配列番号２５〜４２のプライマーを設計し、それぞれのリアルタイムＰＣＲを行い、その結果、配列番号２５及び配列番号２６のプローブを用いた場合、最適な結果が示されることを確認した。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは本技術分野において通常の知識を有する者にとって自明である。即ち、下記工程は一つの例示として説明されるだけであり、本発明の範囲がこれらに限定されない。
【００２１】
［実施例１］リアルタイムＰＣＲ用のプライマーとＭＧＢプローブの作製
ＢＩＧＨ３遺伝子のエクソン４の変異を含む部分を増幅させるプライマーをＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ３．０ソフト（Applied Biosystems U.S.A.）を用いて、配列番号１〜２、配列番号３〜４、配列番号５〜６、配列番号７〜８、配列番号９〜１０、配列番号１１〜１２、配列番号１３〜１４、配列番号１５〜１６、配列番号１７〜１８、配列番号１９〜２０、配列番号２１〜２２及び配列番号２３〜２４のプライマー対を設計した。
【００２２】
ACD Fw primer : 5'-TCC ACC ACC ACT CAG CTG TA（配列番号１)
ACD Re primer : 5'-CCA TCT CAG GCC TCA GCT T（配列番号２)（６０ｂｐ）
AV Fw primer : 5'-TGC AGC CCT ACC ACT CTC AA（配列番号３)
AV Re primer : 5'-AGG CCT CGT TGC TAG G（配列番号４)（１５０ｂｐ）
Real Fw primer : 5'-TAG TCT CTT ATT CTA ATA GA（配列番号５)
Real Re primer : 5'-GCT GCA GAC TCT GTG TTT AA（配列番号６)（８６０ｂｐ）
ACD Fw2 primer : 5'-CCA TCC CTC CTT CTG TCT TCT G（配列番号７）
ACD Re2 primer : 5'-CGG GCC CCT CCA TCT C（配列番号８）（１４０ｂｐ）
ACD Fw3 primer : 5'-CAG AGA AGG GAG GGT GTG GTT（配列番号９）
ACD Re3 primer : 5'-GGG CGA AGA TGG TGA AGC T（配列番号１０）（１９０ｂｐ）
ACD Fw4 primer : 5'-TCC TCG TCC TCT CCA CCT GTA（配列番号１１）
ACD Re4 primer : 5'-AGC TGG CAA GGA GGC CC（配列番号１２）
ACD Fw5 primer : 5'-TTT GGG CTT TCC CAC ATG C（配列番号１３）
ACD Re5 primer : 5'-GGC AGA CGG AGG TCA TCT CA（配列番号１４）
ACD Fw6 primer : 5'-GTA GTA CCG TGC TCT CTG（配列番号１５）
ACD Re6 primer : 5'-AGT TCC CCA TAA GAA TCC CCC（配列番号１６）
ACD Fw7 primer : 5'-GGC TGG ACC CCC AGA GG（配列番号１７）
ACD Re7 primer : 5'-ACC CCT CGG GGA AGT AAG G（配列番号１８）
ACD Fw8 primer : 5'-AAC CTT TAC GAG ACC CTG GGA（配列番号１９）
ACD Re8 primer : 5'-GAC TCC CAT CCA TCA TGC CC（配列番号２０）
ACD Fw9 primer : 5'-AGT CGT TGG ATC CAC CAC CA（配列番号２１）
ACD Re9 primer : 5'-GAC GTC ATT TCC TAC TGT TTC AGG（配列番号２２）
ACD Fw10 primer : 5'-CCC CCC AGA AAC AGC CTG（配列番号２３）
ACD Re10 primer : 5'-TTC TAA GGG GTT AAG GAG AAA GCT T（配列番号２４）
【００２３】
ＢＩＧＨ３遺伝子のエクソン４の部位のグアニンがアデニンに置換された変異を確認するために配列番号２５〜４２のプローブを作製した。
変異がない正常遺伝子断片と結合するプローブはＶＩＣで標識し、変異がある遺伝子断片と結合するプローブはＦＡＭで標識し、相補的な遺伝子断片との結合が容易になるよう、ＭＧＢ（minor groove binder）を付けた。
【００２４】
Normal probe1 : VIC-CAC GGA CCG CAC GGA-NFQ（配列番号２５）（１５ｂｐ）
Mutant probe1 : FAM-CAC GGA CCA CAC GGA-NFQ（配列番号２６）
Normal probe2 : VIC-ACA CGG ACC GCA CG-NFQ（配列番号２７）
Mutant probe2 : FAM-ACA CGG ACC ACA CG-NFQ（配列番号２８）（１４ｂｐ）
Normal probe3 : VIC-TAC ACG GAC CGC A-NFQ（配列番号２９）
Mutant probe3 : FAM-TAC ACG GAC CAC A-NFQ（配列番号３０）（１３ｂｐ）
Normal probe4 : VIC-CTG TAC ACG GAC CGC ACG-NFQ（配列番号３１）
Mutant probe4 : FAM-CTG TAC ACG GAC CAC ACG-NFQ（配列番号３２）（１８ｂｐ）
Normal probe5 : VIC-CTG TAC ACG GAC CGC ACG GAG-NFQ（配列番号３３）
Mutant probe5 : FAM-CTG TAC ACG GAC CAC ACG GAG-NFQ（配列番号３４）（２１ｂｐ）
Normal probe6 : VIC-GCT GTA CAC GGA CCG CAC GGA GAA-NFQ（配列番号３５）
Mutant probe6 : FAM-GCT GTA CAC GGA CCA CAC GGA GAA-NFQ（配列番号３６）
Normal probe7 : VIC-ACC GCA CGG AGA AGC-NFQ（配列番号３７）
Mutant probe7 : FAM-ACC ACA CGG AGA AGC-NFQ（配列番号３８）
Normal probe8 : VIC-ACC GCA CGG AGA AGC TGA GGC-NFQ（配列番号３９）
Mutant probe8 : FAM-ACC ACA CGG AGA AGC TGA GGC-NFQ（配列番号４０）
Normal probe8 : VIC-ACC GCA CGG AGA AGC TGA GGC CTG-NFQ（配列番号４１）
Mutant probe8 : FAM-ACC ACA CGG AGA AGC TGA GGC CTG-NFQ（配列番号４２）
【００２５】
［実施例２］リアルタイムＰＣＲを利用したアベリノ角膜ジストロフィーの診断
検査対象者の血液、毛根、口腔上皮細胞からサンプルを採取し、ＤＮＡを分離した。ＤＮＡ分離精製には、フェノール／クロロホルム抽出法（Miller, SA et al., Nucl. Acids Res. 16:1215, 1988）を一部改変して実施し、分離されたＤＮＡは、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）適量に溶解させた後、１％アガローズゲルで電気泳動して確認して、鋳型ＤＮＡとして用いた。
【００２６】
ＰＣＲ反応は、実施例１で作製された変異部位を含む断片の増幅用プライマー（配列番号１〜２４）とプローブ（配列番号２５〜４２）を用いた。
【００２７】
ＰＣＲ反応のため反応液のプライマーの容量は、１０ｐｍｏｌとなるようにしており、プローブの容量は、５ｐｍｏｌとなるようにし、２５ｕＬのマスターミックスを作製して用いた。
【００２８】
リアルタイムＰＣＲ反応は、９５℃・１０分、９２℃・１５秒、６０℃・１分を１サイクルとして、３６サイクルを実行した後、６０℃で５分間反応させた。
【００２９】
各サイクル毎に蛍光を測定し、ＶＩＣ染料に陽性を示すサンプルは、正常遺伝子を持つサンプルで、ＦＡＭ遺伝子に陽性を示すサンプルは、変異遺伝子を持つサンプルと診断した。
【００３０】
その結果、配列番号１〜２のプライマー対と配列番号２５〜２６のプローブを利用した時に、最も正確で効果的な結果を確認することができた（図２）。
【００３１】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明に係るプライマー対及びプローブを用いると、従来のＤＮＡチップやＰＣＲを利用したアベリノ角膜ジストロフィーの診断方法よりも、迅速かつ正確にアベリノ角膜ジストロフィーを診断することができる。
【図１Ａ】
0005738842.tif 000002
【図１Ｂ】
0005738842.tif 000003
【図１Ｃ】
0005738842.tif 000004
【図２】
0005738842.tif 000005
【配列表】
0005738842000001.app