(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピタバスタチン又はその塩を有効成分とするクローディン−７遺伝子発現抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乾癬予防治療剤及びクローディン−７遺伝子発現抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
乾癬は、皮膚が赤く盛りあがり、その上に乾燥した白い垢が厚く付着し、それがぽろぽろとはがれ落ちる症状を呈し、痒みを伴なう皮膚疾患である。好発部位としては、肘、膝、腰などであるが、それ以外にも頭、脇の下、陰部、下肢などにも見受けられる。また、皮膚炎以外にも、爪の変形や関節の痛みなどの症状が現れることもある。根本的な原因は未だ解明されておらず、素因のある人に、ストレス、感染症などの種々因子が加わって発症すると考えられている。
乾癬の治療法としては、ステロイド外用薬、ビタミンＤ3外用薬、紫外線療法の他、重症の患者にはビタミンＡの誘導体であるエトレチナートや免疫抑制剤であるシクロスポリンの投与が行なわれているが、どれも治療効果と副作用の両面を満足するものではない。また、特許文献１には、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤であるロバスタチンが種々の皮膚疾患治療に有用であることが記載されているが、実際にはアクネに対する改善効果が確認されているに過ぎない。
【０００３】
通常、乾癬の診断は、特徴的な発疹とその分布、経過より行うが、アトピー性皮膚炎、白癬、サルコイドーシス、表皮内癌等の炎症を伴なう皮膚疾患と症状が類似しているため、診断が困難な場合も多く、他の皮膚疾患と診断された場合には、治療法も誤ることになり、症状が悪化してしまうこともある。特に頭部、爪、関節などの乾癬は専門医でも診断が難しい時がある（非特許文献１、２、３）。
また、前記のように乾癬の原因は不明であることから、その治療剤の開発も困難である
。
【０００４】
一方、上皮あるいは内皮細胞における細胞間接着部位であるタイトジャンクションには、タイトジャンクション構成タンパクが存在しており、これらタンパクの一般的な機能としては、隣接する細胞を面と面で接着させることによって細胞間隙輸送をコントロールすることなどが知られている。タイトジャンクション構成タンパクとしては、例えば、クローディン（ｃｌａｕｄｉｎ）−１、クローディン−３、クローディン−４、クローディン−５、クローディン−６、クローディン−７、クローディン−１１、クローディン−１２、クローディン−１８、オクルディン（ｏｃｃｌｕｄｉｎ）、ＪＡＭ−Ａ、ＺＯ−１、ＺＯ−２、チングリン（ｃｉｎｇｕｌｉｎ）、ＭＵＰＰ−１、シンプレキン（ｓｙｍｐｌｅｋｉｎ）、ａＰＫＣ、Ｐａｒ３、Ｐａｒ６などが確認されているが（非特許文献２）、それらの発現箇所はタイトジャンクション構成タンパクの種類によって大きく異なる。
また、様々な皮膚疾患においてタイトジャンクション構成タンパクの発現量が変化することも知られており、例えば、尋常性魚鱗癬、扁平紅色苔癬においてはオクルディン、クローディン−４、ＺＯ−１の発現が亢進していること、尋常性乾癬においてはクローディン−１の発現が抑制されていることが報告されている（非特許文献４、５）。
さらに、タイトジャンクション構成タンパクの１種であるクローディン−７については、食道癌由来細胞においてノックダウンするとＥ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）の減少と細胞増殖が導かれること（非特許文献６）、正常肺上皮細胞と比べて肺ガン細胞においてクローディン−７遺伝子の発現が増加していることから、クローディン−７が肺ガンの診断マーカーになりうること（特許文献２）などの報告もあるが、皮膚における役割及び疾患に伴った発現変化などに関する報告についてはほとんどない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表平１０−５０５８３８号公報
【特許文献２】ＵＳ２００３／０１４８９９３９
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＪＩＭ  １８巻６号.４６２−４６５、２００８
【非特許文献２】病理と臨床  ２３（７）、７２３−７２９、２００５
【非特許文献３】Ｖｉｓ Ｄｅｒｍａｔｏｌ. ４（６）、５９６−５９７、２００５
【非特許文献４】Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．７２（２）２００９，２８９−９４
【非特許文献５】Ｓｋｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９（２）２００６，７１−７
【非特許文献６】Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１７０（２）２００７，７０９−２１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、新たな乾癬の予防治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明者は、乾癬を生じている皮膚試料における種々のタンパク質の発現量を測定してきたところ、上記のクローディン−７が乾癬皮膚の表皮上層で強く発現しており、正常皮膚ではほとんど発現しないこと、及び当該クローディン−７の皮膚における発現を指標とすれば乾癬の正確な診断及び乾癬予防治療剤のスクリーニングができることを見出した。そして、当該クローディン−７の皮膚における発現の抑制を指標として種々の化合物をスクリーニングしてきたところ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤であるピタバスタチン又はその塩がインビトロ及びインビボで強力な皮膚クローディン−７発現抑制作用を示し、乾癬予防治療剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、ピタバスタチン又はその塩を有効成分とする乾癬予防治療剤を提供するものである。
また、本発明は、ピタバスタチン又はその塩を有効成分とするクローディン−７遺伝子発現抑制剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の医薬を用いれば、皮膚のクローディン−７遺伝子の発現が顕著に抑制され、優れた乾癬の予防治療効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】同一人での乾癬病変部と非病変部（健常部）におけるクローディン−７の発現を示す図である。
【図２】図１の乾癬病変部の拡大図である。
【図３】アトピー性皮膚炎病変部におけるクローディン−７の発現を示す図である。
【図４】ヒト表皮細胞におけるクローディン−７遺伝子発現におよぼすピタバスタチンの影響を示す図である。
【図５】マウス皮膚におけるクローディン−７遺伝子発現におよぼすピタバスタチンの影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の乾癬予防治療剤及びクローディン−７遺伝子発現抑制剤の有効成分はピタバスタチン又はその塩である。ピタバスタチン又はその塩は、例えば米国特許第５８５６３３６号、日本国特許第２５６９７４６号等に記載されている、（３Ｒ，５Ｓ，６Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−３−キノリル］−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプテン酸又はその塩であり、強力なＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害作用を有し、コレステロール低下剤として知られている。しかし、当該ピタバスタチン又はその塩が、乾癬及びクローディン−７に対してどのような作用を示すかについては全く知られていない。ピタバスタチンの塩としては、ナトリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩が挙げられるが、このうちカルシウム塩が特に好ましい。
【００１３】
後記参考例に示すように、クローディン−７遺伝子の発現は皮膚の乾癬の病変部で特異的に高くなっており、クローディン−７遺伝子の発現量を測定すれば乾癬が正確に診断できることが判明した。また、後記試験例に示すように、ピタバスタチン又はその塩は、皮膚中のクローディン−７遺伝子発現量を顕著に抑制する作用を有する。従って、ピタバスタチン又はその塩を投与すれば、乾癬が予防治療できることは明らかである。
【００１４】
また本発明の乾癬予防治療剤及びクローディン−７遺伝子発現抑制剤は、必要に応じて従来から乾癬の治療に用いられている薬剤、例えば、副腎皮質ステロイド、ビタミンＤ3、エトレチナート、シクロスポリン、メトトレキサート、ＴＮＦα阻害薬などを配合または併用することもできる。
【００１５】
本発明におけるピタバスタチン又はその塩の投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与及び静脈内注射剤、筋肉注射剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤等による非経口投与が挙げられる。
またこのような種々の剤型の医薬製剤を調製するには、この有効成分を単独で、又は他の１種以上の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌昧剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００１６】
本発明は上記の投与形態のうち、経口投与及び経皮吸収剤が好ましい。経口投与用製剤の調製にあたっては、有効成分の安定性を考慮してｐＨを調整（特開平２−６４０６号、日本国特許第２，７７４，０３７号、ＷＯ９７／２３２００号等）するのが好ましい。経皮吸収剤の形態としては、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、貼付剤等が好ましい。
【００１７】
これらの医薬の投与量は、患者の体重、年齢、性別及び症状によって異なるが、通常成人の場合、経口投与では、ピタバスタチンとして、一日０．０１〜１００ｍｇ、さらに０．１〜５０ｍｇ、特に１〜３０ｍｇを、１回又は数回に分けて投与するのが好ましい。また非経口投与では、製剤中のピタバスタチン又はその塩の含有量を、０．００１〜２０質量％、さらに０．０１〜１０質量％、特に０．１〜５質量％とするのが好ましい。
【実施例】
【００１８】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００１９】
参考例１
（１）皮膚組織の入手
疾患関連皮膚組織は包括同意が得られている皮膚生検あるいは手術切除における余剰組織を用いた。正常皮膚組織は包括同意の得られたボランティアから採取されたものを用いた。
【００２０】
（２）クローディン−７発現の測定方法
４％中性ホルマリンで固定されパラフィンに包埋された皮膚組織を、ミクロトームを用いて３μｍにて薄切にした。スライドグラス上でキシレン及びアルコールを用いて脱パラフィン処理をしたのち、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて５分づつ３回洗浄した。次に内因性ペルオキシダーゼのブロッキング処理（３％Ｈ2Ｏ2）を行い、再度ＰＢＳにて５分づつ３回の洗浄を行った。引き続き、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＡＫＯ，ＵＳＡ）にてブロッキングを行い、抗クローディン−７抗体（Ａｂｃａｍ，ＵＳＡ）で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄したのち、Ｃｈｅｍ  ｍａｔｅ  ＥＮＶＩＳＩＯＮ  ｋｉｔ（ＤＡＫＯ，ＵＳＡ）を用いてジアミノベンジジン（ＤＡＢ）による発色を行い、クローディン−７を可視化した。
【００２１】
（３）結果
図１及び２に示すように、同一人において乾癬の病変部では表皮上層にクローディン−７の高発現が認められたが、非病変部ではほとんど発現が認められなかった。
一方、図３に示すように、同じ皮膚疾患であるアトピー性皮膚炎の病変部ではクローディン−７の発現は認められなかった。
従って、皮膚のクローディン−７の発現量を指標にすれば、乾癬の診断及び乾癬治療剤のスクリーニングが可能である。
【００２２】
試験例１：成人ヒト表皮角化細胞におけるクローディン−７遺伝子発現におよぼすピタバスタチンの影響
（１）細胞培養及びＲＮＡ抽出
細胞は成人ヒト表皮角化細胞を使用した。細胞（１．０×１０6個）を１０ｃｍφディッシュに播種し、１０ｍＬのＥｐｉｌｉｆｅ培地にて３日間培養した後、ピタバスタチン溶液を培養液に最終濃度０．１μＭとなるよう添加し、６時間培養した。また、ｍｏｃｋ処理として溶媒であるＤＭＳＯのみを同量添加し、培養した（培養条件：５％  ＣＯ2、３７℃）。このとき、ピタバスタチン処理した細胞とｍｏｃｋ処理した細胞が同一継代数となるようにした（各ｎ＝２で実施）。培養終了後、細胞を回収しＳＶ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。
【００２３】
（２）成人ヒト表皮角化細胞由来ＲＮＡの逆転写及びＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ
ピタバスタチン処理した細胞とｍｏｃｋ処理した細胞のクローディン−７遺伝子発現量を比較するためにＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲによる定量を行った。すなわち、それぞれｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ８００ｎｇを用い、逆転写酵素により１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄのｃＤＮＡを合成した。これを鋳型とし、ヒトクローディン−７に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ反応（Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を行った。なお１８Ｓ  ｒＲＮＡを内部標準とした。その結果を図４に示す。
【００２４】
図４から明らかなように、ピタバスタチン処理することによりクローディン−７遺伝子の顕著な抑制効果が認められた。
【００２５】
試験例２：マウス皮膚におけるクローディン−７遺伝子発現におよぼすピタバスタチンの影響
（１）マウス皮内投与及び皮膚ＲＮＡ抽出
ピタバスタチン投与マウス群と生理食塩水投与マウス群（以下、コントロール群）を作成した。各群のマウスとして７週齢のＣ３Ｈ／Ｈｅ雄性マウスを使用し、これらマウスの背部を除毛して、投与部位とした。
翌日、各群において以下の操作を行った。ピタバスタチン投与群のマウスにおいては、ピタバスタチン含有生理食塩水（ピタバスタチン濃度；２００μｇ／ｍＬ）を、５０μＬ／個体で除毛した背部に皮内投与した。コントロール群のマウスにおいては、生理食塩水を５０μＬ／個体で除毛した背部に皮内投与した。投与後２時間後にピタバスタチン群及びコントロール群から各３匹ずつ投与部位の皮膚を採取し、直径６ｍｍのポンチで打ち抜いた。打ち抜いた皮膚切片を４℃のＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）に一晩浸漬させた。
翌日皮膚片よりＲＮｅａｓｙ  Ｆｉｂｒｏｕｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて添付のプロトコールに従いｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。
【００２６】
（２）マウス皮膚由来ＲＮＡの逆転写及びＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ
ピタバスタチン投与群及びコントロール群の皮膚中クローディン−７遺伝子発現量を比較するためにＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲによる定量を行った。すなわち、それぞれｔｏｔａｌ  ＲＮＡ４００ｎｇを用い、逆転写酵素により１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄのｃＤＮＡを合成した。これを鋳型とし、マウスクローディン−７に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ反応（Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を行った。なお１８Ｓ  ｒＲＮＡを内部標準とした。その結果を図５に示す。
【００２７】
図５から明らかなように、ピタバスタチン処理することによりマウス皮膚中のクローディン−７遺伝子は投与後２時間で顕著な抑制効果を示した。従って、ピタバスタチン又はその塩は、乾癬の予防治療剤として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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