(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルファウイルスレプリカーゼを含む、免疫系を調整するためのアジュバントであって、レプリカーゼがRNA依存性RNAポリメラーゼを含む、アジュバント。
【請求項２】
アルファウイルスがセムリキ森林ウイルスである、請求項1記載のアジュバント。
【請求項３】
レプリカーゼのアミノ酸配列がSEQ ID NO:1のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有する、請求項2記載のアジュバント。
【請求項４】
レプリカーゼがnsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>RDRがもたらされる、請求項3記載のアジュバント。
【請求項５】
レプリカーゼがSEQ ID NO:4によってコードされるが、SEQ ID NO:4の位置4129-4131に変異が導入されて、発現時にSEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>RDRがもたらされる、請求項4記載のアジュバント。
【請求項６】
レプリカーゼがnsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>AAAがもたらされる、請求項3記載のアジュバント。
【請求項７】
請求項1〜6のいずれか一項記載のアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクターを含む、免疫系を調整するためのアジュバント。
【請求項８】
発現ベクターがpRSV-RDRである、請求項7記載のアジュバント。
【請求項９】
ベクターがDNAベクターである、請求項7または8記載のアジュバント。
【請求項１０】
アルファウイルスレプリカーゼまたはアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクターが、薬学的に許容される賦形剤および/または構成物と共に処方される、請求項1〜9のいずれか一項記載のアジュバント。
【請求項１１】
アルファウイルスレプリカーゼまたはアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクターがワクチン組成物中に存在する、請求項1-10のいずれか一項記載のアジュバント。
【請求項１２】
請求項1〜10のいずれか一項記載のアジュバントを含む、感染症を予防および/または治療するためのワクチン組成物であって、該RNA依存性RNAポリメラーゼと相互作用するためのcis-シグナルを含有する鋳型RNAを含まない、前記ワクチン組成物。
【請求項１３】
細菌性疾患を予防および/または治療するために用いられる、請求項12記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
請求項1〜10のいずれか一項記載のアジュバントを含む、癌を予防および/または治療するためのワクチン組成物であって、該RNA依存性RNAポリメラーゼと相互作用するためのcis-シグナルを含有する鋳型RNAを含まない、前記ワクチン組成物。
【請求項１５】
レプリカーゼがウイルス性疾患を予防および/または治療するために用いられる、請求項12記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
ウイルス性疾患がHIVである、請求項15記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
タンパク質をベースとするワクチンを含む、請求項12〜16のいずれか一項記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
1つまたは複数の抗原をコードする発現ベクターを含む、請求項12〜16のいずれか一項記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
前記レプリカーゼと前記1つまたは複数の抗原とが同じ発現ベクターによってコードされる、請求項18記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
前記1つまたは複数の抗原をコードする発現ベクターがDNAベクターである、請求項18または19記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
前記ベクターが、以下を含む、哺乳動物細胞において機能する複製起点を欠く発現ベクターである、請求項20記載のワクチン組成物:
(a)異種プロモーターに機能的に連結された、核アンカータンパク質をコードするDNA配列であって、核アンカータンパク質が、
(i)特定のDNA配列に結合するDNA結合ドメイン、および
(ii)核構成要素に結合する機能ドメイン
を含む、DNA配列;ならびに
(b)核アンカータンパク質のための多量体化された(multimerized)DNA結合配列。
【請求項２２】
部分(i)および/または部分(ii)が、ウシパピローマウイルス1型のE2タンパク質に由来する、請求項21記載のワクチン組成物。
【請求項２３】
発現ベクターの1つまたは複数の抗原がHIVの1つまたは複数の構造タンパク質および/または非構造タンパク質を含む、請求項22記載のワクチン組成物。
【請求項２４】
1つまたは複数の抗原をコードする発現ベクターがGTU-Multi-HIVである、請求項23記載のワクチン組成物。
【請求項２５】
SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する、タンパク質。
【請求項２６】
医薬としての使用のための、請求項25記載のタンパク質。
【請求項２７】
SEQ ID NO:4に実質的に開示される配列を含む発現カセットを含む発現ベクターであって、SEQ ID NO:4の位置4126-4133に変異が導入されて、発現時にSEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>AAAがもたらされる(SEQ ID NO:3)、発現ベクター。
【請求項２８】
アルファウイルスレプリカーゼをコードする発現カセットを含む発現ベクターであって、レプリカーゼが実質的にSEQ ID NO:1に一致するが、nsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>RDRがもたらされる、発現ベクター。
【請求項２９】
発現カセットがSEQ ID NO:4に実質的に開示される配列を含み、SEQ ID NO:4の位置4129-4131に変異が導入されて、発現時にSEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>RDRがもたらされる(SEQ ID NO:2)、請求項28記載の発現ベクター。
【請求項３０】
pRSV-RDRである、請求項29記載の発現ベクター。
【請求項３１】
医薬としての使用のための、請求項27〜30のいずれか一項記載の発現ベクター。
【請求項３２】
レプリカーゼをコードする発現ベクターが薬学的に許容される賦形剤および/または構成物と共に処方される、請求項27〜30のいずれか一項に記載される、アルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクター。
【請求項３３】
免疫システムを調節するためのアジュバントとして使用するための、請求項27〜32のいずれか一項記載の発現ベクター。
【請求項３４】
CGGCGGAGからGCCGCCGCへの変異がSEQ ID NO:4の位置4126-4133に導入されている、SEQ ID NO:4に示される核酸。
【請求項３５】
CGGからGACへの変異がSEQ ID NO:4の位置4129-4131に導入されている、SEQ ID NO:4に示される核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫ツールの分野、特に、ワクチン組成物において使用するのに適したワクチンおよびアジュバントの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
哺乳動物の免疫系は、皮膚、腸、上気道および下気道、泌尿生殖路などの多数のニッチにおいてコロニー形成する多種多様な微生物を含む環境において生き残るために進化してきた。結腸および皮膚のようなニッチの一部は、内因性微生物叢が恒常的にコロニー形成しているが、他のニッチ(内部器官および下気道)は、通常、免疫能のある宿主では無菌の状態にある。多くの腸共生細菌の場合のように、微生物の作用が宿主にとってプラスの場合がある。他の場合では、微生物のコロニー形成が宿主にとって有害な場合がある。このようなマイナスの作用は宿主免疫系の状態に左右される。(日和見性病原体として知られる)ある特定の病原体は免疫無防備状態の個体にしか影響を及ぼさない。微生物感染の潜在的な有害作用は様々な宿主防御機構の進化につながった。有顎類には、2種類の防御:自然免疫応答および適応免疫応答がある。これらの主な違いは、病原体の認識に用いられる受容体型、応答の開始に必要な時間遅延、および記憶の有/無である。これらの2種類の防御は互いに完全に独立して機能しない。下記に見られるように、自然免疫系は特定のシグナルを適応免疫系に送って、特定の病原体に対して最も効率的な応答を開始するのを助け、逆もまた同じである。適応免疫応答もまた自然免疫系のいくつかのモジュールを活性化する。
【０００３】
自然免疫応答
健常個体には自然免疫が常に存在し、その主な機能は、微生物およびウイルスの侵入の阻止ならびに宿主組織の侵入に成功した病原体の迅速な排除である。自然免疫は多細胞生物を即時に保護する。
【０００４】
自然免疫系は単一のものではない。進化の異なる段階で現われた別個のモジュールまたはサブシステムが集まったものである。
【０００５】
●病原体侵入から宿主を保護する、抗菌ペプチドを産生する粘膜上皮;
●細胞内細菌および細胞外細菌に対する抗菌機構を有する、食細胞;
●循環中および体液中で働く、急性期タンパク質および補体系;
●ウイルス感染細胞の死滅に関与する、ナチュラルキラー細胞;
●多細胞寄生生物からの防御に関与する、好酸球、好塩基球、およびマスト細胞;
●ウイルス防御において重要な役割を有する、自己誘導性のI型インターフェロンおよびタンパク質。
【０００６】
自然免疫応答は、侵入した微生物の早期検出および破壊を担っており、検出には、一組の限られた生殖細胞系列によりコードされるパターン認識受容体(PRR)に頼っている。免疫応答を開始するために、PRRは病原体関連分子パターン(PAMP)を認識し、いくつかの細胞外活性化カスケード、例えば、補体経路および様々な細胞内シグナル伝達経路を誘導して炎症応答を引き起こす。
【０００７】
自然免疫系は、3種類の区画:体液、細胞膜、および細胞質に存在するPRRを利用する。体液中のPRRは、PAMPオプソニン化、補体経路の活性化、場合によっては、PAMPから他のPRRへの移動において主な役割を果たしている。細胞膜上に位置するPRRは、他のPRRへのPAMPの提示、食作用による微生物取り込みの促進、および主なシグナル伝達経路の開始などの多様な機能を有する。
【０００８】
いくつかの機能的に異なるクラスのPRRがある。最もよく特徴付けられているクラスはToll様受容体(TLR)である。これらは、ウイルス核酸、ならびにリポ多糖およびリポテイコ酸を含む数種類の細菌産物を認識する膜貫通受容体であり、主要なシグナル生成PRRである(Akira, S 2006)。さらに、細胞質PRRは、3つのクラス:インターフェロン(IFN)誘導性タンパク質、カスパーゼ動員ドメイン(CARD)ヘリカーゼ、およびヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン(NOD)様受容体(NLR)に分類することができる。最もよく研究されているIFN誘導性抗ウイルスタンパク質の中には、ミクソウイルス耐性タンパク質(Mx)、プロテインキナーゼR(PKR)、オリゴアデニル酸合成酵素(2'-5'OAS)がある。これらの抗ウイルスタンパク質およびCARDヘリカーゼ、例えば、RIG-IおよびMda5は抗ウイルス防御に関与している。対照的に、NLRは主に抗菌免疫応答に関与している。
【０００９】
Toll様受容体(TLR)
TLRは、PRRの中で最もよく特徴付けられているシグナル生成受容体である。TLRは重要な炎症性応答を開始し、適応免疫も形づくる。哺乳動物において公知の全てのTLR(TLR1-11)は、リガンド認識を担う細胞外ロイシンリッチリピート(LRR)ドメインおよびシグナル伝達開始に必要とされる細胞質Toll-インターロイキン-1受容体ホモロジー(TIR)ドメインを含む、I型膜内在性糖タンパク質である。TLRは、細菌、菌類、寄生生物、およびウイルスにある、核酸を含む極めて多様な微生物構成要素を認識する。TLR3、TLR7、TLR8、およびTLR9を含む、いくつかのTLRは、通常は、細胞外PAMPを検出するために原形質膜に存在するが、細胞内区画、例えば、エンドソーム内でリガンドを認識する。後者のTLRは核酸認識能を共有し、dsRNA(TLR3)、ssRNA(マウスではTLR7、ヒトではTLR8)、および非メチル化CpG DNAモチーフ(TLR9)を検出する。
TLRは、4種類のTIRドメイン含有アダプター分子:MyD88、TIRAP、Trif、およびTRAMの異なる組み合わせを動員することによって、共有のおよび別個のシグナル伝達経路を開始する。TLR3を除き、他の全てのTLRはミエロイド系分化因子88(MyD88)を動員する。MyD88は、IL-受容体関連キナーゼ(IRAK)ファミリーのメンバーに関連する(Mouldy Sioud 2006)。これらのシグナル伝達経路は、全てのTLRに共通する転写因子である核内因子κB(NF-κB)およびアクチベータータンパク質-1(AP-1)を活性化して、炎症性サイトカインおよびケモカインを産生させる。これらはまた、TLR3、4、7、8、および9において、IFN-αおよびIFN-βなどのI型インターフェロンの産生に必要な条件であるインターフェロン調節因子-3(IRF3)および/またはIRF7を活性化する(総説については、Edwards et al 2007, Vercammen et al 2008, Medzitov R 2007)。
【００１０】
自然宿主防御機構の直接活性化に加えて、PRRの中には適応免疫応答の誘導と関連しているものもある。適応免疫系における2つの主要な細胞クラスであるT細胞およびB細胞は、ランダム特異性を有する抗原結合受容体を発現し、従って、自己由来を示す内因性特徴を欠く抗原を認識する。従って、Tリンパ球およびBリンパ球は、これらが認識する抗原の由来を示す指令を必要とする。これらの指令は、PRRによって誘導される特殊なシグナルの形で自然免疫系から生じる。T細胞の場合、この関連性は樹状細胞によって解釈される。I型インターフェロンは樹状細胞の活性化および遊走に関与している(抗ウイルス応答において、さらに詳細に説明する)。活性化された樹状細胞がリンパ節に遊走にすると、病原体由来抗原をPRR誘導性シグナルと共にT細胞に提示する。これにより、T細胞が活性化され、Tヘルパー(Th)細胞がいくつかのタイプのエフェクターTh細胞(Th1、Th2およびTh-17細胞)の1つに分化される。例えば、TLR結合により樹状細胞によるIL-12産生が誘導され、Th細胞がTh1細胞に分化するように向けられる。従って、このタイプのエフェクター応答は自然免疫系によって決まる。さらに、I型インターフェロンはまた、IL-15産生を誘導することによって、細胞傷害性T細胞およびNK細胞の機能を直接的または間接的に調節する。
【００１１】
自然免疫系はまた適応免疫系から正のフィードバックシグナルも受け取る。例えば、エフェクターTh細胞は、自然免疫系の特定のモジュールを活性化する適切なサイトカインを産生する。すなわち、Th1細胞から分泌されたサイトカイン(インターフェロン-γ)によってマクロファージが活性化され、Th-17細胞(インターロイキン-17)細胞によって好中球が活性化され、Th2細胞(インターロイキン-4および-5)によってマスト細胞および好塩基球が活性化される。同様に、結合した抗体(IgG)は補体タンパク質を活性化し、病原体のオプソニン化により食作用を助ける。 
【００１２】
適応免疫応答
適応免疫系はその活動のために広範囲の分子を用いる。これらの分子の一部は自然免疫系によって用いられるもの、例えば、補体タンパク質であり、抗原特異的B細胞およびT細胞受容体を含むその他の分子は適応免疫系に特有のものである。自然免疫と区別される適応免疫系の最も重要な特性は、B細胞受容体およびT細胞受容体の特異性が精巧なこと、応答の発生がゆっくりしていること、抗原への前曝露が記憶されていることである。後者の特性はワクチン接種の基盤となっている。弱毒化病原体により、病原体の選択された構成要素により、または他のやり方での(例えば、病原体に由来する選択された抗原をコードするDNAワクチンによる)感染の模倣により、免疫系が初回抗原刺激されると免疫記憶が生じ、これにより病原体に遭遇した時に応答がより素早くかつ効率的に応答が誘発される。
【００１３】
2つのタイプの適応免疫、体液性免疫および細胞性免疫がある。体液性免疫はB細胞によって媒介される。活性化されたB細胞は循環中および粘液中に受容体を分泌し始める。受容体は、この場合、抗体(免疫グロブリン)と呼ばれる。これらの受容体をコードする遺伝子は、病原体に遭遇する前に体細胞組換え中に可変フラグメントおよび定常フラグメントから組み立てられ、これにより、多様な受容体レパートリーが生じる。B細胞またはT細胞はそれぞれ、特定の分子構造(エピトープ)に結合する単一特性の免疫グロブリンまたはT細胞受容体を合成することができる。抗体は特定の抗原に非共有結合的に結合して抗原を固定するか、抗原を無害にするか、または抗原を(例えば、補体タンパク質もしくはマクロファージにより)破壊するために、および免疫系の他の構成要素により除去するためにタグ化する。細胞性免疫はT細胞によって媒介される。T細胞はほとんどの適応免疫応答における重要なプレーヤーである。T細胞は、感染細胞の排除に直接参加するか(CD8+細胞傷害性T細胞)、または様々なサイトカインを産生することによって他の細胞の活性を組織化および調節する(CD4+Tヘルパー細胞)。また、B細胞による抗体の誘導も、Tヘルパー細胞に依存する大半の事例において起こる。T細胞抗原受容体の顕著な特徴は可溶性分子を認識できないことである。T細胞抗原受容体は、細胞表面上で、主要組織適合複合体(MHC)と呼ばれる特殊なペプチド表示分子に結合したタンパク質抗原のペプチド断片を認識することができる。抗原性ペプチド断片を認識するために、Tヘルパー細胞はMHCクラスII分子を必要とし、細胞傷害性T細胞はMHCクラスI分子を必要とする。この特徴のために、T細胞は、この特徴がなければ免疫系によって検出されない可能性がある細胞内病原体を検出することができる。なぜなら、真核細胞内で合成された全てのタンパク質に由来する短いペプチド(9〜10アミノ酸)(病原体に由来するペプチドを含む)が細胞表面上のMHC分子の「ペプチドポケット」に曝露されるからである。適応免疫応答は、プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)により病原体が捕捉された後に開始する。ナイーブTリンパ球は、APC上のMHC抗原によって提示された抗原を見る必要がある。これらの細胞は、身体と外部環境との境界面である全ての身体上皮に存在する。これに加えて、他のほとんどの器官に存在するAPCの数は少ない。上皮にあるAPCは樹状細胞系列に属する。皮膚において、表皮樹状細胞はランゲルハンス細胞と呼ばれる。樹状細胞は、食作用またはピノサイトーシスのプロセスによって、上皮に侵入した微生物の抗原を捕捉する。抗原が捕捉された後に、樹状細胞は丸くなり、上皮に対する接着性を失い、上皮を離れ、リンパ管を介して、その上皮に流入しているリンパ節に遊走する。遊走プロセスの間に、樹状細胞は、T細胞を刺激することができる細胞に成熟する。この成熟は、T細胞に抗原を提示するMHC分子、および完全なT細胞応答に必要な他の分子である補助刺激分子の合成増大および安定発現に反映される。この一連の事象の結果として、微生物のタンパク質抗原が特定のリンパ節領域に輸送され、ここで、抗原はTリンパ球に遭遇する可能性が高い。ナイーブTリンパ球はリンパ節を介して連続して再循環し、体内の全てのナイーブT細胞は、少なくとも1日に1回、いくつかのリンパ節を介して循環している可能性があると推定されている。従って、リンパ節内でT細胞と抗原は初めて遭遇し、これは初回抗原刺激と呼ばれる。初回抗原刺激されたCD4+Tヘルパー細胞は、免疫系の他の細胞が応答するのを助ける様々なサイトカインを分泌し始める。樹状細胞は、病原体に由来するペプチド断片だけでなく、自然免疫系から送られたPRR誘導性シグナルもリンパ節に運ぶ(前記、I型IFNは樹状細胞の活性化および分化に影響を及ぼす)。樹状細胞は、この情報を、(病原性ペプチドを認識する)特定のT細胞クローンの活性化および適切なタイプのTヘルパー細胞の分化に変換する。CD8+T細胞の初回抗原刺激もまた樹状細胞によって行われるが、完全に機能するキラー細胞へのCD8+T細胞のさらなる増殖および成熟は、Tヘルパー細胞によって分泌されたサイトカインに依存する。
【００１４】
まとめると、自然免疫系と適応免疫系の間には連続した複雑な相互関係がある。ワクチンが現在利用できない「難しい」病原体(HIV-1、TB、およびマラリア)に対するワクチンの開発が成功するかは、防御免疫応答を誘発する全く新しい方法の開発にかかっているだろう。
【００１５】
+鎖RNAウイルスおよびその複製副産物に対する抗ウイルス応答
+鎖RNAウイルス
+鎖RNAウイルスは全てのウイルス属の1/3超を含む。+鎖RNAウイルスゲノムは翻訳および複製の鋳型であり、宿主翻訳因子間での相互作用および複数のレベルでのRNA複製につながる。公知の+鎖RNAウイルスは全て、ゲノム複製において用いられるRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)の遺伝子を有する。しかしながら、他のRNAウイルスとは異なり、このポリメラーゼは+鎖RNAウイルスのキャプシドにない。従って、新たな細胞に感染すると、ゲノムRNAが翻訳されてポリメラーゼが産生されるまで、ほとんどの+鎖RNAウイルスの場合では、さらなる複製因子が産生されるまで、ウイルスRNA複製は開始することができない。特徴付けられた+鎖RNAウイルスは全て細胞内膜上にRNA複製複合体を組み立てる。アルファウイルス様スーパーファミリーの内外で、ウイルスRNAの複製は細胞内膜の球状陥入(spherical invagination)と共に行われる。例えば、アルファウイルスは、複製複合体を組み立てるためにエンドソーム膜およびリソソーム膜を用いる。この膜は、複製因子が配置され、集中する面となる。この構成は、dsRNAにより誘導される宿主防御応答、例えば、RNA干渉またはインターフェロン誘導性応答からdsRNA複製中間体を保護するのにも役立っている(Ahlquist P et al 2003)。
ゲノム組成、ビリオン形態、および宿主域の違いにかかわらず、+鎖RNAウイルスは、ゲノム複製のために基本的に類似した戦略を有する。定義上、ウイルス(+)RNAゲノムは細胞mRNAと同じ方向性を有し、ウイルスゲノムRNAは、直接、細胞翻訳機構によって翻訳される。最初に、非構造タンパク質が前駆体ポリタンパク質として合成され、ウイルスプロテアーゼによって成熟した非構造タンパク質に切断される。ウイルスゲノムの大部分は非構造タンパク質に充てられ、非構造タンパク質はビリオンの一部でなく、ウイルス複製中に重要な機能を果たす。翻訳およびポリタンパク質プロセシング後に、RdRp、さらなるアクセサリー非構造タンパク質、ウイルスRNA、および宿主細胞因子を含む複合体が組み立てられる。これらのいわゆる複製複合体(RC)がウイルスRNA合成を行う。感染の初期にマイナスセンスウイルスRNAが合成され、複製複合体形成後に、この-鎖RNAは、完全長プラスセンスゲノムRNAならびにサブゲノムRNAを合成する鋳型として用いられる。これらの工程を担う重要な酵素がRNA依存性RNAポリメラーゼであり、レプリカーゼ複合体内で働く(Moradpour et al 2007, Miller and Krijnse-Locker 2008)。
【００１６】
ウイルスRNAの検知
+鎖RNAウイルスは、複製プロセスにおいて、-鎖RNA、+鎖RNA、二本鎖RNA(dsRNA)、およびサブゲノムmRNAを生成し、これらはそれ自体が自然免疫応答経路の強力な誘導物質である。この効果は、TLR3(dsRNA)、TLR7/8(ssRNA)、およびssRNAの二次構造にある特定の構造エレメントを認識する他のいくつかのTLRを介して誘導される。例えば、+鎖RNAウイルスである黄熱病ウイルスの弱毒生ワクチンは、まさしく、複数のToll様受容体を介して自然免疫を活性化する、入手可能で最も有効なワクチンの1つであり、Toll様受容体は、持続性の抗原特異的T細胞応答の質に対して特異的効果も誘導する(Querec TDおよびPulendran B Adv Exp Med Biol. 2007;590:43-53)。
【００１７】
前記で述べたように、細胞は、サイトゾルにウイルスが存在することに応答して抗ウイルス遺伝子発現を誘導する受容体およびシグナル伝達経路を有する。インターロイキン-6(IL-6)、IL-12 p40、および腫瘍壊死因子(TNF)を含む、複数のサイトカインがウイルス感染によって誘導されるが、抗ウイルス応答の顕著な特徴はI型インターフェロンの産生である。I型インターフェロンは、種に依存して、イントロンが無い別々の遺伝子によってコードされる複数のサブタイプ、すなわち、1種類のIFN-βおよび13〜14種類のIFN-αのサブタイプを含む。ウイルス感染に応答して、上皮細胞、粘膜表面にある線維芽細胞、および樹状細胞を含む全ての有核細胞がI型インターフェロンを産生することができる。さらに、全ての細胞が全てのサブタイプに結合するI型インターフェロン受容体(IFNAR)を介してI型インターフェロンに応答することができる。
【００１８】
サイトゾルPRRをコードする遺伝子および下流シグナル伝達経路の構成要素はそれ自体がインターフェロン誘導性であり、抗ウイルス自然応答を大幅に増幅することができる正のフィードバックループにつながる。このループは、細胞内でdsRNAが存在することによって動き出すと考えられている。長いdsRNA分子が非感染細胞には存在しないが、RNAウイルス複製中に生成される2本のRNA鎖の相補アニーリングによって形成することができるので、dsRNAはウイルス感染のマーカーになる基準を満たしている。dsRNAは、I型IFNの合成に必須である、核内因子κB(NF-κB)およびインターフェロン調節因子-3(IRF-3)および-7を活性化することが知られている。インターフェロンは、特定の細胞表面受容体IFNARを介して抗ウイルス応答を媒介する。IFNARは細胞質のシグナル伝達兼転写活性因子(STAT)を活性化し、STATは核に移動し、非常に多くのIFN刺激性遺伝子(ISG)を活性化する(Rautsi et al 2007)。
【００１９】
レチノイン酸誘導性遺伝子I(RIG-I)および黒色腫分化関連遺伝子5(MDA5)は、ゲノムRNAなどの細胞内ウイルス産物を検出することができる細胞質IFN誘導性DExD/HボックスRNAヘリカーゼであり、IRF3およびIRF7を活性化するための、ならびにIFN-α、-β、および-λ遺伝子発現を誘導するためのシグナルを伝達する。RIG-Iは、RNA結合ヘリカーゼドメインならびに2つのカスパーゼ活性化動員ドメイン(CARD)を含有するサイトゾルタンパク質である。RIG-Iと同様に、MDA5は、RNAヘリカーゼドメインおよび2つのCARDを有する。これらは両方とも、インターフェロン-βプロモータースティミュレーター-1(IPS-1)を介してシグナル伝達する。シグナルアダプターIPS-1はミトコンドリアに位置し、RIG-IおよびMda5のCARDとホモタイプ相互作用を形成するN末端CARDを含有する。これにより、C末端触媒ドメインが活性化され、シグナル伝達カスケードが開始し、結果として、NF-κBおよびIRF3の活性化を介してサイトカイン遺伝子が転写される。RIG-IおよびMda5は両方とも合成dsRNAであるポリ(I:C)に結合し、共通の経路を介してシグナル伝達するが、異なるウイルスに選択的に応答する。例えば、RIG-Iは、インフルエンザAウイルス、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、およびセンダイウイルス(SeV)を検出するのに対して、MDA5は、ピコルナウイルス、例えば、脳心筋炎ウイルス(EMCV)、タイラー脳脊髄炎ウイルス、およびメンゴウイルスを検出する。一本鎖または二本鎖には関係なく、RNAによるRIG-I刺激の重要な要素は5'-三リン酸が存在することである。これもまた、RIG-Iのウイルス特異性の説明となる。
【００２０】
I型インターフェロンは樹状細胞(DC)の様々なサブタイプに影響を及ぼす。I型インターフェロンは、ある特定の天然インターフェロン産生細胞の自己分泌生存因子として作用し、末梢血単球からDCへの分化を促進し、これらの表現型成熟および機能成熟を誘導することができる。ほとんどの細胞タイプはI型インターフェロンを発現することができるので、非リンパ組織におけるDCの成熟は、隣接する細胞の感染後に誘発されることがある。これらのDCは、リンパ系器官に遊走する能力およびT細胞応答を開始する能力を獲得する(LeBon and Tough 2002)。
【００２１】
I型インターフェロンシグナル伝達はまたDCおよびT細胞によるIFN-γ産生をアップレギュレートし、それによって、Th1細胞の誘導および維持を支持する。さらに、I型インターフェロンは直接的または間接的に作用することによって、様々なサイトカインの発現および機能に影響を及ぼすことができ、例えば、インターロイキン-6(IL-6)シグナル伝達、ならびに抗炎症性トランスフォーミング成長因子β(TGF-β)、IL-1受容体アンタゴニスト、および可溶性腫瘍壊死因子(TNF)受容体の産生を増強することができる。I型インターフェロンまたはこの誘導物質はまた、DCによる高いIL-15発現を誘発し、それによって、記憶表現型CD8+T細胞の強力かつ選択的な刺激を引き起こすことができる(Theofilopoulos et al 2005)。
【００２２】
特定のウイルス病原体感染関連パターン(例えば、ウイルス感染細胞の細胞質におけるdsRNAの蓄積)、これらのパターンに応答する認識因子(例えば、Toll様受容体)、およびこれらの相互作用によって誘発される異なる抗ウイルス防御経路は前述した。この複雑な系は自然免疫と呼ばれ、病原体の認識からウイルス感染細胞の破壊および身体からのウイルス感染の迅速な除去までの事象カスケードを導くことに向けられている。さらに、自然免疫系の活性化は、ウイルス抗原に対して惹起される適応免疫応答の量および質の重要な決定要因である(Germain RN 2004)。
【００２３】
免疫アジュバント
免疫アジュバントは、特定の抗原と組み合わせて用いられると抗原単独より強い免疫応答を生じる物質として、1924年にRamonによって最初に述べられた。この非常に広い定義には多種多様な材料が含まれる。現在利用可能な免疫アジュバントは、大きく2つのカテゴリー:送達系および免疫増強剤に分類される(総説については、Fraser C.K., Diener K.R., Brown M.P. and Hayball J.D. (2007) Expert Reviews in Vaccines 6(4)559-578)。  
【００２４】
送達系はワクチン内の抗原の提示を変えることができ、従って、免疫系への抗原曝露を最大にし、ある特定の形をした抗原を特定の生理学的位置に標的化し、それによって、プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)による抗原の捕捉を確実なものにする。ワクチン製剤中の送達系型アジュバントとして示される免疫アジュバントの例は、ミョウバン、エマルジョン、サポニン、およびカチオン性脂質である。
【００２５】
免疫活性化因子は、適応免疫の誘導に重要な経路を活性化することによって免疫細胞に直接作用する。これらは、外因性の微生物構成要素またはウイルス構成要素、これらの合成誘導体または内因性免疫活性化合物、例えば、サイトカイン、ケモカインおよび補助刺激分子でもよい。このタイプの分子は、標的抗原に対する特異免疫を増強することができる。現在、toll様受容体アゴニスト、ヌクレオチドオリゴマー化ドメイン様受容体アゴニスト、組換え内在性化合物、例えば、サイトカイン、ケモカインまたは補助刺激分子が利用可能であり、免疫増強剤として役立ち得る。しかしながら、サイトカインおよびケモカインは種特異的分子であり、従って、異なる動物において容易に比較できないことを強調することが重要である。これらの場合、それぞれの分子のホモログを使用する必要があり、このために、このようなアジュバントの使用、ならびにある種における実験結果の解釈と別の種へのその外挿がかなり複雑になる。
【００２６】
いくつかの他の遺伝子ワクチンと同様にDNAワクチンが数年にわたって開発されており、実験動物における特異的免疫応答における有望なアプローチとなっている。しかしながら、これらのワクチンは、ヒトおよびさらに大きな動物では有効でないことが判明している。理由の1つは、恐らく、反応性および免疫原性が従来ワクチンより低いことである。この欠陥の考えられる理由は、ヒトを含む非近交系動物では極めて重要な、インビボでのタンパク質発現能力が限られていること、ならびに均一性が高いこと、実際のワクチン調製物における汚染性の病原体由来成分が無いことである。
【００２７】
このために、重大な毒性作用が無く免疫系を活性化することに向けられたワクチンの調製のために、特異的で精巧に調整された免疫アジュバントを開発する必要があった。この必要性の結果として、DNAワクチンと、サイトカイン、または造血成長因子、例えば、GM-CSFのようなケモカインもしくはMIP-1aのようなケモカインを組み合わせる取り組みがなされてきた。この取り組みは、DNAワクチンによってコードされる抗原に対する免疫応答を改善することができる。しかしながら、残念なことに、これらの効果は依然として極めて弱い。タンパク質であるサイトカインおよびケモカインの同時送達では、動物またはヒトにおいて実際に使用するために良質のタンパク質を産生できる前に、多大な作業が必要とされる。
【００２８】
DNAワクチンと併用するためのアジュバント発現用の核酸ベース発現ベクターの使用について、特定のアジュバント分子の発現の適切なレベルおよび部位、ならびにワクチンが投与された組織におけるこの発現効果に関する問題が生じている。
【００２９】
免疫刺激におけるアジュバントの潜在的で有用な効果に関する観察は、初期に、ワクチン接種後に膿瘍を発症したウマにおいて高い抗体価が発生したことを発見したGaston Ramonによってなされた。免疫アジュバントを用いて抗原特異的免疫応答を改善するという概念は、その初期の発見から、免疫アジュバントが汚染物質により炎症プロセスを誘導する能力と不可分の関係にあった。結果として、このような免疫アジュバントの使用は、臨床上容認できない毒性および重大な健康問題を引き起こす可能性がある。従って、ヒトでの使用のために世界的に認可された唯一のアジュバントは、体液性免疫しか誘導することができない弱いアジュバントであるミョウバンである。現在使用可能な、体液性免疫および細胞性免疫を両方とも誘導することができる他のさらに強いアジュバントは全て実験での使用のみに限定されている。
【００３０】
ワクチンアジュバントの現行のレパートリーは、HIV1、マラリア、および結核を含む重大な病原体に対する有効なワクチンを作製するのに十分でないことが示されている(Riedmann et al. 2007; Fraser et al. 20007)。公知のアジュバントを組み合わせると、利用可能なワクチンに関連した問題の一部を克服できるかもしれない。しかしながら、アジュバントの形をした信頼性の高く、安全で、かつ進んだ新世代の免疫モジュレーターが間違いなく必要とされている。
【００３１】
前記で説明された先行技術になお存在する問題を考慮して、本発明の目的は、現在利用可能なワクチンに対する応答に付随する、および現在利用可能なワクチンに対する応答を改善する、より効率的なアジュバントを発見することであった。本発明によるアジュバントは免疫系のモジュレーターであり、このことは、ワクチンが投与された被験体における免疫応答を改善および強化することを意味する。
【発明の概要】
【００３２】
現在、当技術分野において利用可能なアジュバントに関連する前記の問題は、現在利用可能な免疫系調整アジュバントより投与が効率的かつ簡単な種非依存性の免疫系調整アジュバントとしての、アルファウイルスレプリカーゼまたはアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクターの新規の医学的使用を提供することによって、本発明により解決される。
【００３３】
本発明は、RNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)活性を含み、細胞内の正しい区画に区画化された(compartmentalized)アルファウイルスレプリカーゼを単独で提供しても、細胞において自然免疫応答を誘導できるという驚くべき発見に基づいている。これは、ウイルスゲノムも存在しなくても、他のどの非構造ウイルスタンパク質も構造ウイルスタンパク質も存在しなくても可能である。
【００３４】
従って、これは、ワクチンが単独で投与された時よりもワクチン抗原に対して量的および質的に効率的な応答をもたらす、免疫応答を活性化できる効率的なアジュバントの開発を可能にするブレークスルーとなる発見である。
【００３５】
従って、1つの局面において、本発明は、免疫応答を調整するためのアジュバントとして使用するための、RNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)を含むアルファウイルスレプリカーゼを含む。また、本発明は、もちろん、免疫応答を調整するためのアジュバントの製造における、RNA依存性RNAポリメラーゼを含むアルファウイルスレプリカーゼの使用に関する。好ましい態様において、前記レプリカーゼは、免疫系を調整するためのアジュバントとして使用するための発現ベクター、例えば、DNAベクターによってコードされる。1つの好ましい態様において、前記レプリカーゼは、SFV(セムリキ森林ウイルス)レプリカーゼである。
【００３６】
アルファウイルスレプリカーゼの免疫系調整活性の効力は、レプリカーゼのnSP2サブユニットの核局在化領域における特定の変異を介して調整することができる。従って、本発明は、免疫系調整用のアジュバントとして使用するための、野生型レプリカーゼのnSP2領域に特定の変異を有するアルファウイルスレプリカーゼ、および免疫系調整用のアジュバントとして使用するための野生型レプリカーゼのnSP2領域に特定の変異を有するアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクターに関する。これらの変異体は、えり抜きのワクチンと共に投与された時に、被験体における免疫応答誘導の効率がかなり高いことが示されている。この状況において効率的だと示された特定の変異は、野生型SFVレプリカーゼのアミノ酸配列の位置1185-1187において示されたRDR変異およびAAA変異であり、これらは本明細書においてさらに説明される。
【００３７】
アルファウイルスレプリカーゼは、ワクチン、例えば、核酸ベースのワクチンの形をしたワクチンが投与された被験体において免疫応答を増強および増大できることによって、アジュバントとして極めて適していることが示された。本発明者らは、レプリカーゼの形をしたアジュバントがワクチンと共に投与された時のインターフェロン応答が、ワクチンのみが投与された時のインターフェロン応答と比較してインビボで増大することを示す。
【００３８】
さらに、本発明は、免疫応答を調整するためのアジュバントとしての、アルファウイルスレプリカーゼまたはアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクターの使用に関する。本発明はまた、感染症を予防および/または治療するための医薬を製造するためのワクチン組成物における、アジュバントとしての本明細書において開示されるアルファウイルスレプリカーゼの使用に関する。アジュバントに付随する前記ワクチンは、例えば、核酸ベースのワクチンまたはタンパク質ベースのワクチンの形でもよい。さらに、本発明によるアジュバントを含むワクチン組成物を調製するための方法が本明細書において提供される。本発明はまた、レプリカーゼ活性を有する新規のタンパク質ならびに前記レプリカーゼをコードする発現ベクターに関する。
[本発明1001]
免疫系を調整するためのアジュバントとして使用するための、RNA依存性RNAポリメラーゼを含むアルファウイルスレプリカーゼ。
[本発明1002]
アルファウイルスがセムリキ森林ウイルスである、本発明1001のアルファウイルスレプリカーゼ。
[本発明1003]
レプリカーゼのアミノ酸配列がSEQ ID NO:1と実質的に一致する、本発明1002のアルファウイルスレプリカーゼ。
[本発明1004]
nsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>RDRがもたらされる、本発明1003のアルファウイルスレプリカーゼ。
[本発明1005]
nsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>AAAがもたらされる、本発明1003のアルファウイルスレプリカーゼ。
[本発明1006]
免疫系を調整するためのアジュバントとして使用するための、本発明1001〜1005のいずれかのアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクター。
[本発明1007]
DNAベクターである、本発明1006の発現ベクター。
[本発明1008]
薬学的に許容される賦形剤および/または構成物と共に処方される、本発明1001〜1007のいずれかのアルファウイルスレプリカーゼまたはアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクター。
[本発明1009]
免疫系を調整するためのアジュバントとしての、RNA依存性RNAポリメラーゼを含むアルファウイルスレプリカーゼの使用。
[本発明1010]
アルファウイルスがセムリキ森林ウイルスである、本発明1009の使用。
[本発明1011]
レプリカーゼのアミノ酸配列がSEQ ID NO:1と実質的に一致する、本発明1009〜1010のいずれかの使用。
[本発明1012]
レプリカーゼのnsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>RDRがもたらされる、本発明1011の使用。
[本発明1013]
レプリカーゼのnsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>AAAがもたらされる、本発明1011の使用。
[本発明1014]
免疫系を調整するためのアジュバントとしての、本発明1001〜1005のいずれかのアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクターの使用。
[本発明1015]
前記ベクターがDNAベクターである、本発明1014の使用。
[本発明1016]
レプリカーゼが、薬学的に許容される賦形剤および/または構成物と共に処方される、本発明1009〜1015のいずれかの使用。
[本発明1017]
感染症を予防および/または治療するための医薬の製造のためのワクチン組成物における、本発明1009〜1016のいずれかのアルファウイルスレプリカーゼの使用。
[本発明1018]
ワクチン組成物が細菌性疾患を予防および/または治療するために用いられる、本発明1017の使用。
[本発明1019]
癌を予防および/または治療するための医薬の製造のためのワクチン組成物における、本発明1009〜1016のいずれかのアルファウイルスレプリカーゼの使用。
[本発明1020]
レプリカーゼがウイルス性疾患を予防および/または治療するために用いられる、本発明1017の使用。
[本発明1021]
ウイルス性疾患がHIVである、本発明1020の使用。
[本発明1022]
ワクチン組成物が、タンパク質をベースとするワクチンを含む、本発明1017〜1021のいずれかの使用。
[本発明1023]
ワクチン組成物が、1つまたは複数の抗原をコードする発現ベクターを含む、本発明1017〜1021のいずれかの使用。
[本発明1024]
前記レプリカーゼと前記1つまたは複数の抗原とが同じ発現ベクターによってコードされる、本発明1023の使用。
[本発明1025]
前記1つまたは複数の抗原をコードする発現ベクターがDNAベクターである、本発明1023または1024の使用。
[本発明1026]
前記ベクターが、以下を含む、哺乳動物細胞において機能する複製起点を欠く発現ベクターである、本発明1025の使用:
(a)異種プロモーターに機能的に連結された、核アンカータンパク質をコードするDNA配列であって、核アンカータンパク質が、
(i)特定のDNA配列に結合するDNA結合ドメイン、および
(ii)核構成要素に結合する機能ドメイン
を含む、DNA配列;ならびに
(b)核アンカータンパク質のための多量体化された(multimerized)DNA結合配列。
[本発明1027]
部分(i)および/または部分(ii)が、ウシパピローマウイルス1型のE2タンパク質に由来する、本発明1026の使用。
[本発明1028]
SEQ ID NO:3のアミノ酸配列に実質的に一致する、タンパク質。
[本発明1029]
医薬としての使用のための、本発明1028のタンパク質。
[本発明1030]
SEQ ID NO:4に実質的に開示される配列を含む発現カセットを含む発現ベクターであって、SEQ ID NO:4の位置4126-4133に変異が導入されて、発現時にSEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>AAAがもたらされる(SEQ ID NO:3)、発現ベクター。
[本発明1031]
SEQ ID NO:4に実質的に開示される配列を含む発現カセットを含む発現ベクターであって、SEQ ID NO:4の位置4129-4131に変異が導入されて、発現時にSEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>RDRがもたらされる、発現ベクター。
[本発明1032]
pRSV-RDRである、本発明1031の発現ベクター。
[本発明1033]
医薬としての使用のための、本発明1030〜1031のいずれかの発現ベクター。
[本発明1034]
CGGCGGAGからGCCGCCGCへの変異がSEQ ID NO:4の位置4126-4133に導入されている、SEQ ID NO:4と実質的に一致する核酸配列。
[本発明1035]
免疫系を調整するためのアジュバントの製造のための、RNA依存性RNAポリメラーゼを含むアルファウイルスレプリカーゼの使用。
[本発明1036]
アルファウイルスがセムリキ森林ウイルスである、本発明1035のアルファウイルスレプリカーゼの使用。
[本発明1037]
レプリカーゼのアミノ酸配列がSEQ ID NO:1と実質的に一致する、本発明1036のアルファウイルスレプリカーゼの使用。
[本発明1038]
レプリカーゼのnsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>RDRがもたらされる、本発明1037のアルファウイルスレプリカーゼの使用。
[本発明1039]
レプリカーゼのnsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>AAAがもたらされる、本発明1037のアルファウイルスレプリカーゼの使用。
[本発明1040]
免疫系を調整するためのアジュバントの製造のための、本発明1035〜1039のいずれかのアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクターの使用。
[本発明1041]
発現ベクターがpRSV-RDRである、本発明1040の使用。
[本発明1042]
前記ベクターがDNAベクターである、本発明1040または1041の発現ベクターの使用。
[本発明1043]
前記レプリカーゼまたは前記レプリカーゼをコードする発現ベクターが、薬学的に許容される賦形剤および/または構成物と共に処方される、本発明1035〜1042のいずれかのアルファウイルスレプリカーゼまたはアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクターの使用。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】異なるDNA濃度を用いて、RdRpでトランスフェクトされたCop5細胞培養上清から測定されたIFN-β。10ng、200ng、または1000ngの発現ベクターpRSV-Nsp1234、pRSV-RDR、pRSV-AAA、またはHIV多抗原発現ベクターparaDMgB(負の対照、RdRp活性なし)でCop5細胞をトランスフェクトした。細胞培養上清を3つの時点(24h、48h、および72h)で収集し、インターフェロン-β発現についてアッセイした。
【図２】異なるDNA濃度を用いて、RdRpでトランスフェクトされたCop5細胞培養上清から測定されたIFN-β。10ng、200ng、または1000ngのpRSV-RDR、pRSV-GAA、pRSV-RDR-GAA、およびpRSV-AAA-GAAでCop5細胞をトランスフェクトした。細胞培養上清を3つの時点(24h、48h、および72h)で収集し、インターフェロン-β発現についてアッセイした。
【図３】トランスレプリカーゼ(transreplicase)またはRdRp構築物でトランスフェクトされたCop5細胞培養上清から測定されたIFN-β。10ng、200ng、または1000ngのpRSV-SFV-Rluc、pRSV-Nsp1234、およびKS123M4-RL(負の対照、RdRp活性なし)でCop5細胞をトランスフェクトした。細胞培養上清を3つの時点(24h、48h、および72h)で収集し、インターフェロン-β発現についてアッセイした。
【図４】HEK293細胞におけるIFN-β。HEK293細胞を、エレクトロポレーションを使用し、担体DNAを添加してトランスフェクトした。1μgのプラスミドDNAまたはポリ(I:C)を使用した。上清を3つの時点(24h、48h、および72h)で収集し、インターフェロン-β発現についてアッセイした。
【図５】HACAT細胞におけるIFN-aおよび-b。担体DNAを添加して、エレクトロポレーションにより細胞をトランスフェクトした。1μgのプラスミドDNAまたはポリ(I:C)を使用した。上清を3つの時点(24h、48h、および72h)で収集し、インターフェロン-βおよびインターフェロン-αの発現についてアッセイした。レーン1、5、9 pRSV-RDR;レーン2、6、10 pRSV-RDR-GAA;レーン3、7、11ポリ(I:C);レーン4、8、12モックでトランスフェクトした。
【図６】マウスのIFN-γELISPOT。プラスミドDNAとプラスミドpRSV-RDRを4:1の比(800ngワクチンベクターおよび200ngアジュバントベクター)で同時投与した時のマウスにおける細胞性免疫応答の増加。群1 GTU-MultiHIV;群2 GTU-MultiHIV+pRSV-Nsp1234;群3 GTU-MultiHIV+pRSV-RDR;群4対照群。
【図７】インフルエンザウイルスHAおよびNAをコードするプラスミドベクターとDNAプラスミドpRSV-RDRを同時投与した時の、インフルエンザウイルス由来抗原に対する体液性免疫応答の増加。
【図８】GagおよびEnvの中の2つの認められたエピトープに対するIFN-γ ELISPOTの累積結果。群平均。3つのBalb/Cマウス群を、MultiHIV抗原をコードするプラスミドDNAのみ、またはMultiHIV抗原をコードするプラスミドDNAとpRSV-RDRで、2回(0週目および4週目)免疫化した。pRSV-RDRは、1回目の免疫化または2回目の免疫化と共に加えた。4番目の群は未処置であった。2回目の免疫化の10日後に、新鮮に単離された脾臓細胞からインターフェロンγ Elispotを行った。群1 GTU-MultiHIV;群2 GTU-MultiHIV+2回目の免疫化と共にpRSV-RDR;群3 GTU-MultiHIV+1回目の免疫化と共にpRSV-RDR;群4未処置マウス。
【図９】GagおよびEnvの中の2つの認められたエピトープに対するグランザイムB ELISPOTの累積結果。群平均。3つのBalb/Cマウス群を、MultiHIV抗原をコードするプラスミドDNAのみ、またはMultiHIV抗原をコードするプラスミドDNAとpRSV-RDRで、2回(0週目および4週目)免疫化した。pRSV-RDRは、1回目の免疫化または2回目の免疫化と共に加えた。4番目の群は未処置であった。2回目の免疫化の10日後に、新鮮に単離された脾臓細胞からグランザイムB Elispotを行った。群1 GTU-MultiHIV;群2 GTU-MultiHIV+2回目の免疫化と共にpRSV-RDR;群3 GTU-MultiHIV+1回目の免疫化と共にpRSV-RDR;群4未処置マウス。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
定義
「発現ベクター」は、核酸配列の形で遺伝情報を運ぶ、DNAまたはRNAベースのベクターまたはプラスミドを指す。「プラスミド」、「ベクター」、および/または「発現ベクター」という用語は本明細書において同義に用いられることがある。
【００４１】
「RNA依存性RNAポリメラーゼ」または「RdRp」は、RNA鋳型からのRNAの新規合成を触媒する酵素活性を有する、酵素、タンパク質、またはペプチドである。レプリカーゼは、RdRp活性を有し、特定のウイルスRNAの複製を触媒する、ウイルスポリタンパク質またはポリタンパク質プロセシング産物の複合体である。レプリカーゼは、一般的に、RNAゲノムを有するウイルスによってコードされる。従って、レプリカーゼは、RNA依存性RNAポリメラーゼの機能を提供するが、RdRp活性に加えて、他の機能を提供するさらなるウイルス非構造ポリタンパク質サブユニットもさらに含む。「区画化された」RdRp(CRdRp)は、RdRp活性を提供することができ、かつその機能を提供するために細胞内の正しい区画に向かうことができるレプリカーゼのRdRpと本明細書において定義される。
【００４２】
本明細書において言及される「抗原」および「関心対象の遺伝子」という用語は、これらを必要とする被験体に、例えば、発現ベクターの形で、またはペプチドもしくはタンパク質の形で直接的または間接的に投与された時に、これらが投与された被験体において免疫応答を生じ得る実体を含む。抗原が抗原性タンパク質/ペプチドを発現し得る遺伝子の場合、「関心対象の遺伝子」と言及されることもある。関心対象の遺伝子が発現ベクター、例えば、DNAベクターの形で投与されるのであれば、ベクターによってコードされる遺伝子が宿主において発現された時に、免疫応答が誘発される。
【００４３】
本明細書において言及される「ワクチン」は、ある特定の疾患に対する免疫を改善するのに用いられる調製物である。ワクチンは、ワクチンを必要とする被験体に投与された時に1つまたは複数の種類の抗原に対する免疫応答を誘発し、それによって、被験体において免疫を誘導し、この免疫が、問題となっている病原体に後で「本当に」感染した際の防御となる、1つまたは複数の種類の病原体由来抗原を含んでもよい。ワクチンは予防的なものでもよく、例えば、天然病原体による将来の感染を阻止する、または天然病原体による将来の感染の影響を弱めるものでもよく、感染が既に存在する時には治療的に作用するものでもよい。本発明の状況において、アルファウイルスレプリカーゼまたはアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクターは、予防用ワクチンおよび/または治療用ワクチンと共に、免疫応答を調整するためのアジュバントとして用いられることが意図される。ワクチンは、死んだ微生物または不活化された微生物でもよく、これらに由来する精製産物でもよい。一般的に、4つのタイプの従来ワクチンがある。これらは、以前に毒性のあった微生物である不活化微生物、弱毒生ウイルス微生物、不活化された毒性化合物であるトキソイド、または弱毒化微生物もしくは不活化微生物のサブユニットを含有するワクチンである。ワクチンはタンパク質の形をとってもよく、間接的に、1つまたは複数の種類の抗原が発現され、それによって、被験体において免疫応答を誘導する発現ベクターの形をとってもよい。本明細書において開示されるワクチン組成物において、どのワクチンも本発明によるアジュバントと共に投与することができ、ワクチンの例は前記で示される。従って、本発明の状況において、「ワクチン」は、1つもしくは複数の種類の抗原を含む、または関心対象の1つもしくは複数の種類の遺伝子をコードし、投与された時に本明細書において説明されるように免疫応答を生じる任意の実体を指す。「ワクチン」はまた、ワクチンを必要とする被験体への投与を助ける、構成物および/または賦形剤などのさらなる成分を含んでもよく、さらなる成分の例は本明細書において示される。
【００４４】
本明細書において言及される「アジュバント」は、自然免疫系を活性化し、ワクチンなどの他の薬剤の効果を改善することができる免疫学的薬剤と定義することができる。アジュバントは、免疫系を刺激し、ワクチンに対する応答を増大させて、ワクチンのみを投与した時よりも強力かつ効率的な免疫応答を、ワクチン接種した被験体にもたらすことができる薬剤である。従って、アジュバントは、多くの場合、例えば、ワクチンに応答する免疫系をより強く刺激して、ある特定の疾患に対する免疫を高めることによって、ワクチンの効果を増大させる、または他の任意のやり方でワクチンの効果に影響を及ぼすのに用いられる。アジュバントは、進化的に保存された分子の特定のセットを模倣することによって、この仕事を成し遂げることができる。このような分子の例は、リポソーム、リポ多糖(LPS)、細菌細胞壁構成要素、二本鎖RNA(dsRNA)、一本鎖DNA(ssDNA)、および非メチル化CpGジヌクレオチド含有DNAなどである。ワクチンとアジュバントが存在すると、自然感染を模倣することによって、抗原に対する自然免疫応答が大幅に高まる。「アジュバント」が本明細書において言及される時、意図されるものは、アジュバント機能を提供する、本明細書において開示されるRNA依存性RNAポリメラーゼ活性を有するアルファウイルスレプリカーゼまたはアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクターである。アジュバントは、RNA依存性RNAポリメラーゼ活性を含むアルファウイルスレプリカーゼを発現させる発現ベクター、例えば、DNAベクターでもよい。従って、アルファウイルスレプリカーゼはそのままで投与されてもよく、発現ベクターの形で投与されてもよく、発現ベクターから、アジュバント機能をもたらすアルファウイルスレプリカーゼが発現される。本明細書において言及されるワクチン組成物は、一部の態様において、複数のワクチン実体を、例えば、1つもしくは複数の種類の関心対象の遺伝子をコードする1つもしくは複数の種類の発現ベクターの形で含んでもよく、1つまたは複数の種類の抗原を、例えば、タンパク質ベースのワクチンによって提供し、それによって、投与しようとするワクチンのカクテルを、ワクチンを必要とする患者に提供してもよい。
【００４５】
「免疫系の調整」、「免疫応答の調整」、または「免疫系調整活性」とは、本明細書において規定されたアジュバントによって提供される作用または活性を意味し、これらの効果は、前記のアジュバントという用語を伴ってさらに説明される。これは、例えば、ワクチンにより強く応答するように免疫系を刺激する形をとってもよく、および/または特定の疾患に対する免疫を増大させる形をとってもよい。本発明によるアジュバントはワクチンと共に投与された時に、ワクチンの形で投与された抗原に対する応答を、アジュバント無しでワクチンのみで投与された時より増大させることを特徴とする。
【００４６】
本明細書において開示される「発現カセット」は、1つまたは複数の遺伝子またはコード配列をコードし、任意で、遺伝子発現を調節するための様々な調節配列が付随する核酸配列を含む。これらの遺伝子は、発現時に宿主において免疫応答を生じる、様々な抗原をコードするワクチンの一部でもよい。
【００４７】
本明細書において言及される「変異」は、本発明に従ってアジュバント機能の性能を変えるように核酸配列においてなされた欠失、置換、挿入および/または特定の点変異を構成する。本発明によってレプリカーゼのアジュバント特性を改善するためにレプリカーゼに導入された特定の変異は、本明細書においてさらに例示される。
【００４８】
「プロモーター」は、遺伝子のアンチセンス鎖の3'領域に対して上流に位置する調節領域であり、遺伝子転写を調節するための制御点となる。プロモーターは特定のDNA配列を含有し、遺伝子のコード領域からRNAを合成する酵素であるRNAポリメラーゼを補充するプロモーター配列に結合する転写因子によって認識される応答エレメントとも呼ばれる。
【００４９】
この状況において、核酸配列またはアミノ酸配列がある特定の核酸配列またはアミノ酸配列と「実質的に一致する」場合、これは、言及された配列と90％の同一性を有する配列、例えば、本配列と約91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、99％または100％に近い同一性を有する配列を指す。もちろん、一部の態様において、核酸配列またはアミノ酸配列はまた、この特定された配列からなる。
【００５０】
発明の詳細な説明
本発明者らは、機能的なRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)活性を有するアルファウイルスレプリカーゼが単独で投与された時に、免疫系調整効果をもたらすために構造ウイルスタンパク質もしくは非構造ウイルスタンパク質またはゲノム核酸配列がさらに必要とされることなく、免疫系調整効果を引き起こすことができる、すなわち、免疫系調整アジュバントとして作用できることを初めて開示する。
【００５１】
本明細書において、機能的RdRpを含むアルファウイルスレプリカーゼは細胞に単独で投与された時に、I型インターフェロンを誘導できることが初めて示された。I型インターフェロンは自然免疫を活性化し、体液性適応免疫応答および細胞性適応免疫応答の質および有効性を改善する。機能的RdRpを有するアルファウイルスレプリカーゼは、任意のタイプのワクチンまたは抗原と組み合わせて、主に免疫系調整アジュバントとして使用することができると予想される。
【００５２】
さらに、nSP2サブユニットの核局在化シグナル(Rikkonen et al. 1992)として規定されたレプリカーゼの領域に特定の変異を導入することによって、免疫系調整アジュバントとしてのアルファウイルスレプリカーゼの機能をさらに改善できることが示された。
【００５３】
免疫系調整アジュバントとしての活性には、レプリカーゼのRdRpと相互作用するためのcis-シグナルを含有する特定のウイルス鋳型RNAは必要とされないことに留意することが重要である。このことは、理論に拘束されるものではないが、RdRpは、細胞質内でRNA複製中間体の合成を開始する鋳型として何らかの細胞RNAを使用する可能性があることを意味している。これは、アジュバントを構築するための新規のアプローチを提供するブレークスルーであり、このために、免疫応答の活性化を得るためには、他のどのウイルス部分も無く、アルファウイルスレプリカーゼを、例えば、タンパク質の形で、またはDNAベクターなどの発現ベクターによりコードされた形で投与することしか必要としない。
【００５４】
従って、第1の局面において、本発明は、免疫系を調整するためのアジュバントとして使用するための、RNA依存性RNAポリメラーゼを含むアルファウイルスレプリカーゼに関する。本明細書において免疫系を調整するためのアジュバントとして使用するための、RNA依存性RNAポリメラーゼを含むアルファウイルスレプリカーゼについて本明細書において言及される時は必ず、どの態様でも、これは、免疫応答を調整するためのアジュバントを製造するための、RNA依存性RNAポリメラーゼを含むアルファウイルスレプリカーゼの使用についても言及していると理解されるはずである。従って、本発明はまた、類似の局面において、免疫応答を調整するためのアジュバントを製造するための、RNA依存性RNAポリメラーゼを含むアルファウイルスレプリカーゼの使用、例えば、発現ベクターの形でのRNA依存性RNAポリメラーゼを含むアルファウイルスレプリカーゼの使用に関する。
【００５５】
本発明の1つの好ましい局面において、アルファウイルスはセムリキ森林ウイルスである。本明細書においてレプリカーゼが言及される時は必ず、これは、常に、レプリカーゼがSFVレプリカーゼである選択肢を含んでいると理解されるはずである。1つの態様において、セムリキ森林ウイルスのレプリカーゼのアミノ酸配列はSEQ ID NO:1と実質的に一致し、免疫系を調整するためのアジュバントとして使用するのに適している。セムリキ森林ウイルスのレプリカーゼのアミノ酸配列はまた、SEQ ID NO:1に一致する配列からなってもよく、変異体レプリカーゼに一致する配列からなってもよい。1つの好ましい態様において、前記レプリカーゼはnsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>RDRがもたらされて、免疫系を調整するためのアジュバントとして使用するのに適している。この変異配列は、SEQ ID NO: 2において提供されるアミノ酸配列に一致し、これもまた、免疫応答を調整するためのアジュバントとして使用するために本発明により含まれる。別の好ましい態様において、レプリカーゼはnsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>AAAがもたらされて、これも免疫系を調整するためのアジュバントとして使用するのに適している。この変異配列は、SEQ ID NO:3において提供されるアミノ酸配列に一致し、免疫応答を調整するためのアジュバントとして使用するために本発明により含まれる。もちろん、本発明はまた、免疫応答を調整するためのアジュバントとして使用するための、本明細書の任意の態様において規定されるレプリカーゼをコードする発現ベクターにも関する。前記レプリカーゼは、ペプチドおよび/もしくはタンパク質の形ならびに/または発現ベクターによってコードされた形をとり、薬学的に許容される賦形剤および/または構成物と共に処方されてもよい。この例は本明細書において示される。さらに別の態様において、本明細書において述べた変異レプリカーゼおよび/または野生型レプリカーゼの両方またはいずれかの混合物が、免疫応答を調整するためのアジュバントとして用いられ、任意で、これらは1つまたは複数の発現ベクターによって発現される。
【００５６】
本発明者らは、さらなるウイルス抗原が存在することなく、アルファウイルスレプリカーゼそれ自体で免疫系調整アジュバントとして作用できることを最初に発見したことに留意することが重要である。例えば、発現ベクターの形をとっている時に、発現ベクターは発現されると、異種抗原をコードするさらなる核酸配列または他の任意のアルファウイルス核酸配列が同時投与されなくても被験体において免疫系調整効果を引き起こすことができる。この効果をもたらすために、レプリカーゼのRdRp活性は重要なことが示されており、レプリカーゼが細胞質内の正しい区画、すなわち、レプリカーゼの区画化の手順に進む能力が下記でさらに議論される。
【００５７】
理論に拘束されるものではないが、アジュバントが発現ベクターの形で投与された時に、レプリカーゼは、標的組織のトランスフェクト細胞の細胞核内で発現するために活性化されるようである。発現ベクターが転写されたら、レプリカーゼをコードするmRNAは細胞質に輸送され、ここで、細胞質RNA依存性RNAポリメラーゼ活性を有するレプリカーゼタンパク質に翻訳されるとさらに予想される。この酵素は特定の細胞質区画に区画化され、ここで、RNA依存性RNAポリメラーゼ活性は、細胞質内で二本鎖RNAを含むが、恐らくこれに限定されないエフェクター分子を生成する。エフェクター分子は、I型インターフェロン発現の誘導を含む、大きく、強力な、持続性の細胞抗ウイルス応答を誘発する。このタイプの抗ウイルス応答の誘導は普遍的で、種非依存性であり、細胞性免疫応答および体液性免疫応答を両方とも活性化する。
【００５８】
従って、別の局面において、本発明は、免疫系を調整するためのアジュバントとして使用するための、本明細書において規定されたアルファウイルスレプリカーゼ、例えば、SFVレプリカーゼをコードする発現ベクター、好ましくは、DNAベクター、例えば、プラスミドDNA発現ベクターに関する。1つの態様において、プラスミドDNA発現ベクターはpRSV-Nsp1234であり、SEQ ID NO:5に開示される配列に実質的に一致する。セムリキ森林ウイルスのレプリカーゼの核酸配列はまた、SEQ ID NO:5に一致する配列からなってもよく、変異体レプリカーゼに一致する配列からなってもよい。一部の態様において、発現ベクターによってコードされるレプリカーゼはnsP2領域に変異がある。一般参照として、SFVレプリカーゼ(SEQ ID NO:1)のnsP2領域は、おおよそSEQ ID NO:1のアミノ酸位置538-1336に位置する。1つの態様において、発現ベクターは、nsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>RDRがもたらされて、免疫系を調整するためのアジュバントとして使用するのに適しているレプリカーゼをコードする。1つの態様において、前記発現ベクターは、SEQ ID NO:4に実質的に一致する配列によってコードされるが、免疫応答を調整するためのアジュバントとして使用するために、この配列の位置4129-4131に変異、例えば、1つの態様では、CGGからGACへの変異が導入されている。セムリキ森林ウイルスのレプリカーゼの核酸配列はまた、SEQ ID NO:4に一致する配列からなってもよいが、この配列の位置4129-4131に変異、例えば、1つの態様では、CGGからGACへの変異が導入されている。別の態様において、発現ベクターは、nsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>AAAがもたらされている、レプリカーゼをコードし、免疫系を調整するためのアジュバントとして用いられる。1つの態様において、発現ベクターは、SEQ ID NO:4に実質的に一致する配列によりコードされるが、免疫応答を調整するためのアジュバントとして使用するために、この配列の位置4126-4133に変異、例えば、1つの態様では、CGGCGGAGからGCCGCCGCへの変異が導入されている。SFVのレプリカーゼの核酸配列はまた、SEQ ID NO:4に一致する配列からなってもよいが、この配列の位置4126-4133に変異、例えば、1つの態様では、CGGCGGAGからGCCGCCGCへの変異が導入されている。このことは、それぞれのアミノ酸配列において、野生型アミノ酸配列が、それぞれ、SEQ ID NO:1の位置1185-1187においてRRRからRDRおよびAAAに変化したことを意味している。前記発現ベクターは変異していても、変異していなくても、好ましい態様においてDNAベクターでよい。前記ベクターはまた、ウイルス発現ベクター、例えば、アデノウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベースのベクターでもよく、他の任意の使用可能なウイルス発現ベクターでもよい。1つの態様において、発現ベクターはRNAベースのベクターである。さらに別の態様において、アジュバントは、アルファウイルスレプリカーゼmRNAの形で投与される。1つの態様において、本発明は、免疫系を調整するためのアジュバントとして使用するための、pRSV-AAAであり、SEQ ID NO:5に開示される核酸配列に実質的に一致し、位置5126-5133がCGGCGGAGからGCCGCCGCに変異しているアルファウイルスレプリカーゼプラスミドDNA発現ベクターに関する。別の態様において、本発明は、免疫系を調整するため���アジュバントとして使用するための、pRSV-RDRであり、SEQ ID NO:5に実質的に一致し、位置5129-5131がCGGからGACに変異しているアルファウイルスプラスミドDNA発現ベクターに関する。セムリキ森林ウイルスのレプリカーゼの核酸配列はまた、SEQ ID NO:5に一致する配列からなってもよく、前記で述べた変異体レプリカーゼに一致する配列でもよい。
【００５９】
当業者により理解されるように、免疫系を調整するためのアジュバントとして使用するための、レプリカーゼをコードする本発明による発現ベクターはまた、もちろん、ベクターの発現に役立つ、一般的に用いられるさらなる成分、例えば、プロモーター、エンハンサーなどの形をした様々な調節配列を含んでもよい。免疫系を調整するためのアジュバントとして使用するための、本明細書において規定されたレプリカーゼをコードする発現ベクターはまた、WO2005/026364として公開された出願人ら自身の出願において提供される、複製起点および/または選択マーカー、例えば、抗生物質選択マーカーもしくはaraD遺伝子に基づいた選択系を含んでもよい。WO2005/026364に開示される、このような選択系は、araD遺伝子、好ましくは細菌araD遺伝子、例えば、大腸菌(E.coli)に由来するaraD遺伝子、その相補配列、またはその酵素活性のある断片を運ぶベクターが選択マーカーとして付加された、araD遺伝子欠損細菌細胞を含む。araD遺伝子は、機能的L-リブロース-5-リン酸4-エピメラーゼ(EC5.1.3.4.)をコードする。
【００６０】
実験セクションにおいて証明されたように、変異型レプリカーゼの発現も免疫系調整アジュバントとして作用する。さらに、これらの変異は、レプリカーゼのアジュバント活性を調整することができる。すなわち、RDR変異体は、(野生型)wtレプリカーゼ発現と比較してI型IFN誘導の能力を強化した(実施例2)。RRR>AAA変異を有するレプリカーゼは、野生型レプリカーゼと同様に免疫系調整アジュバントとして作用する(実施例2)。異なるヒト細胞およびマウス細胞をレプリカーゼベースの発現ベクターのみでトランスフェクトしても、I型インターフェロン産生の活性化が誘導されたことも実験セクションにおいて証明された(実施例2)。
【００６１】
実験セクションに記載の結果は、レプリカーゼのRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)活性が免疫調整活性に絶対必要であることをはっきりと証明している。ウイルスRNAポリメラーゼの特徴であるGDDモチーフはアルファウイルスレプリカーゼのnsp4領域に位置し、ここにRdRp酵素活性が位置している。このモチーフに変異GDD>GAAがあるとRdRp活性が破壊される(Tomar et al. 2006)。レプリカーゼにGDD>GAA変異が導入されると、I型インターフェロン応答の誘導が完全に無くなる(実施例2)。このことによって、免疫系調整効果にはRdRp活性が必要なことが証明された。
【００６２】
実験データからまた、機能的RdRp活性を有するレプリカーゼを発現させると、トランスフェクト細胞の細胞質にdsRNAが蓄積したが、GDD>GAA変異を有するレプリカーゼを発現させると、dsRNAが蓄積しなかったことも分かった。理論に拘束されるものではないが、これらの結果は、レプリカーゼの免疫系調整活性は、少なくとも部分的には、dsRNA認識経路によって媒介され得ることを示している。dsRNA認識経路において、レプリカーゼは細胞質内で内因性RNAからdsRNAを生成する。しかしながら、他の経路(例えば、キャップのないRNAの認識を介する)が関与していることは除外されない。場合によっては、I型IFN応答の誘導は、細胞質内のdsRNA蓄積が示されることなく観察された(実施例3)。
【００６３】
さらに、IFN応答がSFVレプリカーゼ発現によって誘導された時に、合成dsRNA(ポリI:C)トランスフェクションによる誘導と比較して異なるキネティックパターンが観察された。レプリカーゼ発現ベクタートランスフェクションを用いた実験において、IFNレベルは、トランスフェクション後の最初の日に増大した。対照的に、合成dsRNAトランスフェクション後、IFNレベルは最初の時点 (24h)において最大値を示し、その後に減少した(実施例2)。
【００６４】
実験セクションにおいて示された免疫学的データは、MultiHIV抗原DNAワクチン(Blazevic et al. 2006)とレプリカーゼ、この場合、SFVレプリカーゼをコードする発現ベクターの同時投与が、DNAワクチンのみによる免疫化と比較して細胞性免疫応答(ELISPOTアッセイによって測定)を量的に大幅に強化することをはっきりと証明している(図6)。さらに、RRR>RDR変異を有するレプリカーゼの場合の値は、野生型レプリカーゼより明らかに高かった(実施例4)。従って、免疫学的データはIFN応答誘導の結果と相関関係にある。すなわち、RdRp活性が破壊された(GDD>GAA)変異を有するレプリカーゼとDNAワクチンが同時投与された場合、細胞性免疫に対するプラスの効果は観察されなかった。このことから、本発明によるアジュバント効果をもたらすためにRdRp活性が重要であることがはっきりと分かる。
【００６５】
SFV感染による型IFN応答のような自然免疫応答の誘発は当技術分野において周知である。アルファウイルスの免疫調整活性は、レプリカーゼの非構造ポリペプチドのnsP2領域に変異を導入することによって最適化できることも示された。マウス初代線維芽細胞に、nsP2 NLSに1個の点変異RRR>RDRを有するSFV(セムリキ森林ウイルス)を感染させると、wt SFV感染と比較して、ウイルス感染細胞におけるI型IFNおよび炎症誘発性サイトカインTNF-αの発現が増大した(Breakwell et al. 2007)。しかしながら、Breakwell et al.では、細胞に全ウイルス粒子を感染させて、全ウイルスゲノムを送達、発現および複製し、それによってIFN応答が発生したことに注目すべきである。
【００６６】
しかしながら、先行技術とは異なり、本発明は、IFN応答誘導がウイルス感染およびウイルスゲノム複製それ自体に縛られず、ウイルスゲノムもウイルス粒子も構造タンパク質も含めることなく、ウイルス非構造ポリタンパク質、すなわち、レプリカーゼのみの発現によって得ることができることも証明した。さらに、SFVレプリカーゼは、SFVの天然核酸と相同性の低いコドン最適化cDNAから発現することができ、依然としてアジュバント効果を提供できることが証明された。このようなコドン最適化配列の一例をSEQ ID NO:4に示した。SEQ ID NO:4は発現されると、 SEQ ID NO:1に開示されるアミノ酸配列をもたらす。
【００６７】
本発明の一部をなす、本明細書において言及される核酸配列およびアミノ酸配列はまた、これらの配列と約90％の同一性を有する、例えば、これらの配列と90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有する核酸配列およびアミノ酸配列も含むことが理解されるはずである。これは、配列が、本明細書において開示された配列より短くても長くてもよく、本明細書において開示された配列と同じ長さを有してもよいが、核酸配列またはアミノ酸配列の中の一部の位置が適切に変化していることを意味する。しかしながら、変異アルファウイルスレプリカーゼが用いられる時に、変異配列は常に存在し、従って、本明細書において開示された特定の配列と配列同一性を決定する時に排除される。従って、本発明において用いられる配列は、意図的に、任意の適切なやり方で、例えば、核酸配列内の特定の核酸またはアミノ酸配列内のアミノ酸を導入、変化、および/または除去することによって変えることができる。配列が変えられても、発現ベクターから発現されたレプリカーゼのRNA依存性RNAポリメラーゼ活性が残っていることに留意することが重要である。
【００６８】
本発明の一部の態様において、免疫系を調整するためのアジュバントとして使用するための、本明細書において規定された前記アジュバントは、薬学的に許容される賦形剤および/または構成物と共に処方される。このような薬学的に許容される賦形剤および/または構成物は任意の適切な供給源から選択されてよい。薬学的賦形剤の例は、液体、例えば、水、または石油、動物、野菜、もしくは合成に由来する油、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などを含む油である。薬学的賦形剤は、食塩水、アラビアゴム、ゼラチン、デンプンのり、タルク、ケラチン、コロイドシリカ、尿素などでもよい。さらに、補助剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤、および着色剤を使用することができる。1つの態様において、薬学的に許容される賦形剤は動物に投与される時に無菌である。食塩水ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液もまた、液体賦形剤、特に、注射液用の液体賦形剤として使用することができる。適切な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなども含まれ得る。アジュバントを含む組成物は、所望であれば、微量の湿潤剤もしくは乳化剤またはpH緩衝剤を含有してもよい。本組成物はまた、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル、液体含有カプセル、散剤、徐放性製剤、坐剤、エマルジョン、エアゾール剤、スプレー、懸濁液の形をとってもよく、または使用に適した他の任意の形をとってもよい。1つの態様において、組成物はカプセルの形をしている。適切な薬学的賦形剤の他の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences 1447-1676 (Alfonso R. Gennaro ed., 19th ed. 1995)に記載されている。1つの態様において、本発明によるアジュバントは、ヒトへの経口投与に適合した組成物として日常的な手順に従って処方される。経口送達用の組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、水性懸濁液もしくは油性懸濁液、顆粒剤、散剤、エマルジョン、カプセル、シロップ剤、またはエリキシル剤の形をしていてもよい。経口組成物には、標準的な賦形剤、例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウムが含まれ得る。1つの態様において、賦形剤は薬学グレードの賦形剤である。別の好ましい態様において、アジュバントは静脈内投与用に処方されてもよい。典型的に、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液を含む。必要に応じて、組成物は可溶化剤も含んでもよい。
【００６９】
本発明による発現ベクターの投与方法は、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、鼻腔内投与、硬膜外投与、経口投与、舌下投与、脳内投与、腟内投与、経皮投与、直腸投与、吸入による投与、または局所投与、特に、耳、鼻、眼、もしくは皮膚への投与を含むが、これに限定されない。投与形式は医師の裁量に委ねられてもよい。特に好ましい態様において、本発明によるアジュバントは、任意で、適切なワクチンと組み合わせて、ワクチンを必要とする患者に、Gen Gun法(Klein et al 1992)によって、エレクトロポレーションと併用した注射(「エレクトロポレーションを介したDNA薬物送達」;皮内または筋肉内)によって、(例えば、鼻腔内スプレーの形での)粘膜表面への局所投与によって投与される。遺伝子アジュバントはまた、細胞によるプラスミドDNAの取り込みを容易にする特定の送達アジュバント(例えば、ポリエチレンイミド(polyethylenimide)および他の類似のもの)と組み合わされてもよい。
【００７０】
エレクトロポレーション(EP)では、組織の標的領域における関心対象の薬剤の細胞内送達を増強するためにインビボでの電場印加が用いられる。EP送達法は、関心対象の薬剤が前記組織の間隙空間に分配された後に、標的組織部位全体に閾値水準の電場をかけることに依存している。このように標的組織に電場および治療剤が空間的および時間的に「共存」することは、効率的なDNA送達にとって重要な必要条件である。
【００７１】
エレクトロポレーションは、原核細胞および真核細胞に有効であることが証明されており、高い効率で、DNA、大きな高分子(例えば、抗体)、タンパク質、色素、代謝前駆体(例えば、32P-ATP)、ならびに非浸透性の薬物および代謝産物を細胞に導入することができる(De Lise et al, Developmental Biology Protocols; Jan 21;2000)。
【００７２】
本発明の1つの局面において、アジュバントは、任意で、ワクチンを必要とする患者への1回目の免疫化の時に、えり抜きのワクチンと共にワクチン組成物に入れられて投与されてもよい。本発明者らにより提供される一部の結果は、このようなアジュバント投与形式が、2回目の免疫化においてアジュバントとワクチンを投与した時と比較して改善した免疫応答をもたらし得ることを示した(図8および9を参照されたい)。従って、1つの局面において、本発明は、本明細書において規定されたワクチン組成物を投与する方法に関する。前記ワクチン組成物は本明細書において規定されたアジュバントを含み、前記アジュバントは、前記治療を必要とする患者の1回目の免疫化においてワクチン組成物の一部として投与される。任意で、アジュバントとワクチンはワクチン組成物に入れられて、1回目の免疫化投与の時だけ同時投与される。すなわち、ワクチンを必要とする個体に、さらなる用量のワクチンが後の段階で投与される場合でも、アジュバントは投与されない。
【００７３】
従って、本発明のさらに別の局面は、1回目の免疫化投与として投与されるワクチン組成物において使用するための、RNA依存性RNAポリメラーゼを含むアルファウイルスレプリカーゼに関する。従って、1つの局面において、本発明は、本明細書において規定されたワクチン組成物に入れてアジュバントを投与する方法に関し、前記アジュバントは、RNA依存性RNAポリメラーゼを含むアルファウイルスレプリカーゼを含み、アジュバントの投与は、ワクチンを必要とする患者へのワクチン組成物の1回目の免疫化投与と共に行われる。本発明の状況において、「1回目の免疫化投与」は、1つまたは複数の種類の抗原を含むワクチンが、ワクチンを必要とする患者に初めて投与されて、その後に、ワクチン(すなわち、ワクチンと共に投与された1つまたは複数の種類の抗原)に対する免疫応答を誘発する時を指す。別の局面において、本発明は、ワクチン組成物の製造における、RNA依存性RNAポリメラーゼを含むアルファウイルスレプリカーゼの使用に関し、ここで、前記アジュバントは1回目の免疫化投与と共に投与される。
【００７４】
しかしながら、本発明は、前記の投与形式、すなわち、1回目の免疫化投与と共に投与される(任意で、1回目の免疫化投与でしか投与されない)投与形式に限定されないことに留意すべきであり、当業者が、同様のやり方、および等しく好ましいやり方で機能する、さらなる代わりとなる投与方法を見つけ出すこともあり得る。
【００７５】
別の局面において、本発明は、免疫系を調整するためのアジュバントとしての、RNA依存性RNAポリメラーゼを含むアルファウイルスレプリカーゼまたはアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクターの使用に関する。1つの態様において、前記アルファウイルスはセムリキ森林ウイルスである。さらに別の態様において、免疫系を調整するためのアジュバントとして用いられる前記レプリカーゼは、SEQ ID NO:1に開示されるアミノ酸配列に実質的に一致する。セムリキ森林ウイルスのレプリカーゼのアミノ酸配列はまた、SEQ ID NO:1に一致する配列からなってもよく、変異体レプリカーゼに一致する配列からなってもよい。別の好ましい態様において、本発明は、免疫系を調整するためのアジュバントとしての、RNA依存性RNAポリメラーゼを含むアルファウイルスレプリカーゼであって、nsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>RDRがもたらされ、SEQ ID NO:2により示されるアルファウイルスレプリカーゼの使用に関する。別の好ましい態様において、レプリカーゼはnsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>AAAがもたらされて、SEQ ID NO:2によって示される。一部の態様において、このように規定されるレプリカーゼは発現ベクターによってコードされ、一部の態様において、発現ベクターはDNAベクターである。任意で、前記レプリカーゼは、薬学的に許容される賦形剤および/または構成物と共に処方されてもよい。
【００７６】
実施例5において証明されたように、変異RRR>RDRを有するレプリカーゼはまた、インフルエンザ抗原を発現するDNAワクチンで免疫化することによって惹起される抗体応答の量を増やす。この実験データから、抗体レベルは、SFVレプリカーゼ単位とインフルエンザDNAワクチンを同時投与した場合が最も高く、詳細に明らかにされたアジュバントであるGM-CSF発現ベクターとワクチンベクターを同時投与した時よりさらに高い値を生じた。
【００７７】
さらに別の好ましい局面において、本発明は、感染症を予防および/または治療するための医薬を製造するためのワクチン組成物に存在する時に、免疫応答を調整するためのアジュバントとしての、RNA依存性RNAポリメラーゼを含む、野生型、コドン最適化型、もしくは変異型のアルファウイルスレプリカーゼ、例えば、本明細書においてさらに規定されるRDR変異もしくはAAA変異を有するアルファウイルスレプリカーゼ、または本明細書において規定されたアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクター、例えば、DNAベクターの使用に関する。本発明はまた、ワクチン組成物の製造における、アジュバントとしての本明細書において規定されたアルファウイルスレプリカーゼの使用に関する。前記ワクチン組成物は、好ましくは、感染症を予防および/または治療するために用いられる。本発明はまた、感染症を予防および/または治療するためのワクチン組成物に存在する時に、免疫応答を調整するためのアジュバントとして使用するための、RNA依存性RNAポリメラーゼを含む、野生型、コドン最適化型、もしくは変異型の本明細書において規定されたアルファウイルスレプリカーゼ、例えば、本明細書においてさらに規定されるRDR変異もしくはAAA変異を有するアルファウイルスレプリカーゼ、またはアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクターに関する。本明細書において前に述べたように、レプリカーゼは、SEQ ID NO:1、2または3に開示されるアミノ酸配列と実質的に一致してもよい。さらに、レプリカーゼは、SEQ ID NO:1、2または3に開示される配列からなってもよい。1つの態様において、アルファウイルスレプリカーゼがアジュバントとして存在し、任意で、発現ベクターによってコードされるワクチン組成物は、感染症を予防および/または治療するために用いられる。1つの態様において、アルファウイルスレプリカーゼがアジュバントとして存在し、任意で、発現ベクターによってコードされるワクチン組成物は、細菌性疾患を予防および/または治療するために用いられる。別の局面において、アルファウイルスレプリカーゼがアジュバントとして存在し、任意で、発現ベクターによってコードされるワクチン組成物は、ウイルス性疾患を予防および/または治療するために用いられる。ウイルス性疾患は、好ましくは、潜在的にAIDSとなるHIV(ヒト免疫不全症ウイルス;HIV-I、HIV-II)によって引き起こされる。さらに別の態様において、アルファウイルスレプリカーゼがアジュバントとして存在し、任意で、発現ベクターによってコードされるワクチン組成物は、癌を予防および/または治療するために用いられる。組成物のアジュバント特性を提供するレプリカーゼと組み合わせて投与されるワクチンは、本発明の目的に適した任意のワクチンでよい。一部の態様において、ワクチンはタンパク質ベースであり、他の態様において、ワクチンは、1つまたは複数の種類の抗原または関心対象の遺伝子をコードする発現ベクターである。発現ベクターは、ワクチン組成物が投与された宿主において特異的免疫応答を誘導することができる1つまたは複数の種類の関心対象の遺伝子または抗原をコードする、核酸ベースの任意の適切な発現ベクターでよい。1つの好ましい態様において、ワクチン組成物のベクターはインフ���エンザウイルスに基づくものである。
【００７８】
従って、1つの局面において、本発明は、アジュバント効果をもたらす、本明細書の態様のいずれか1つに規定されたアルファウイルスレプリカーゼ、およびこれも本明細書において規定された、えり抜きのワクチンを含むワクチン組成物に関する。ワクチンは、任意で、GTU-MultiHIVでもよい(Blazevic V, et al. AIDS Res Hum Retroviruses. 2006 Jul;22(7):667-77.)。従って、ワクチン組成物中のワクチンは、一部の局面では、1つまたは複数のえり抜きの構造HIVタンパク質または非構造HIVタンパク質、例えば、出願人ら自身の公報WO02090558に開示された抗原を含有してもよい。
【００７９】
レプリカーゼアジュバントおよび抗原は、本発明の状況において、同じ発現ベクターによってコードされてもよい。ここで、レプリカーゼはアジュバント特性をもたらし、ベクターのワクチン部分は、レプリカーゼとは独立してワクチン機能をもたらす、ベクターの別個の独立した部分である。これにもかかわらず、抗原をコードする任意の発現ベクターにおいて、レプリカーゼは、任意で、他の任意のコード配列と融合されてもよい。アジュバントおよび/またはワクチンをコードする発現ベクターは、一部の態様において、DNAベクターでもよい。当業者によって理解されるように、本発明によるワクチン組成物はまた、複数のワクチン単位を含んでもよい。これは、数種類のワクチンのカクテルが、ワクチンを必要とする被験体に、本発明によるアジュバントと共に投与できることを意味している。
【００８０】
さらに別の局面において、本発明は、感染症を予防および/または治療するための医薬を製造するための、免疫応答を調整するためのアジュバントとしての、ワクチン組成物における本明細書において規定されたアルファウイルスレプリカーゼの使用、またはワクチン組成物を製造するためのアジュバントとしての本明細書において規定されたアルファウイルスレプリカーゼの使用に関する。ここで、1つまたは複数の種類の関心対象の遺伝子を含むワクチンは、以下:
a.異種プロモーターに機能的に連結された、核アンカータンパク質をコードするDNA配列であって、核アンカータンパク質が、
(i)特定のDNA配列に結合するDNA結合ドメイン、および
(ii)核構成要素に結合する機能ドメイン、またはその機能的等価物
を含む、DNA配列;ならびに
b.核アンカータンパク質用の多量体化された(multimerized)DNA結合配列
を含み、哺乳動物細胞において機能する複製起点を欠く発現ベクターである。
【００８１】
本明細書において規定された前記ワクチン組成物は、感染症、例えば、HIV感染症の治療および/または予防において、ならびに細菌性疾患または癌の治療において用いられてもよい。
【００８２】
本発明はまた、感染症を予防および/または治療するためのワクチン組成物において、免疫応答を調整するためのアジュバントとして使用するための本明細書において規定されたアルファウイルスレプリカーゼに関する。ここで、1つまたは複数の種類の関心対象の遺伝子を含むワクチンは、以下:
a)異種プロモーターに機能的に連結された、核アンカータンパク質をコードするDNA配列であって、核アンカータンパク質が、
(i)特定のDNA配列に結合するDNA結合ドメイン、および
(ii)核構成要素に結合する機能ドメイン、またはその機能的等価物
を含む、DNA配列;ならびに
b)核アンカータンパク質用の多量体化されたDNA結合配列
を含み、哺乳動物細胞において機能する複製起点を欠く発現ベクターである。
【００８３】
「核アンカータンパク質」という用語は、特定のDNA配列に結合し、ベクターに核区画化機能を提供することができるタンパク質、すなわち、ベクターを特定の核区画に固定する、または取り付けることができるタンパク質を指す。1つの態様において、前記核アンカータンパク質は、ウシパピローマウイルス1型に由来するE2タンパク質である。別の好ましい態様において、部分i)および/または部分ii)、すなわち、特定のDNA配列に結合するDNA結合ドメインおよび/または核構成要素に結合する機能ドメインは、ウシパピローマウイルス1型のE2タンパク質に由来する。1つの態様において、前記タンパク質は組換えタンパク質および/または合成タンパク質である。核構成要素は、例えば、有糸分裂クロマチン、核マトリックス、核ドメイン10(ND10)、または核ドメインPODでもよい。
【００８４】
本発明によるレプリカーゼアジュバントと共に使用するための、ワクチン組成物の一部となり得るこのようなベクターは、WO02090558として公開された出願人ら自身の出願において、ならびに(Blazevic V, et al. AIDS Res Hum Retroviruses. 2006 Jul;22(7):667-77.)においてさらに開示される。しかしながら、これらのベクターは、本明細書において開示されるワクチン組成物を形成する、本発明によるアジュバントとして使用するためのレプリカーゼと組み合わせることができるベクターの例にすぎないことに留意すべきである。ワクチンとして機能する任意の適切な発現ベクターを、本発明による本明細書においてアジュバントとして使用するためのレプリカーゼと共に処方して、ベクターが投与された被験体において、ワクチンが単独で投与された時よりも強力かつ効率的な免疫応答を生じる組成物を得ることができる。1つの態様において、本発明は、感染症を予防および/または治療するための医薬を製造するための、ワクチン組成物における、免疫系を調整するためのアジュバントとして使用するための、RNA依存性RNAポリメラーゼを含むアルファウイルスレプリカーゼの使用に関する。
【００８５】
レプリカーゼがアジュバントとして用いられるワクチン組成物に関して、本明細書において開示されるアジュバントを伴う治療を必要とする被験体に適した、ワクチン組成物に存在するアジュバントおよび/またはワクチンの投与量および量の決定は当業者次第であることに留意すべきである。1つの好ましい局面において、ワクチン組成物の一部であるレプリカーゼは、発現ベクター、好ましくは、DNAベクターによってコードされる。前記ワクチンはまた、一部の態様において、発現ベクター、例えば、DNAベクターでもよく、タンパク質ベースのワクチンでもよい。
【００８６】
別の局面において、本発明は、アジュバントとして使用するためのアルファウイルスレプリカーゼを含む、本明細書において開示されるワクチン組成物を調製するための方法に関する。前記方法は、適量の、RNA依存性RNAポリメラーゼを含むアルファウイルスレプリカーゼまたはアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクターと適量のワクチンを混合する工程、任意で、薬学的に許容される賦形剤および/または構成物を添加する工程を含む。それぞれの成分の適量は当業者により決定することができる。しかしながら、いくつかの好ましい用量の例も本明細書において示される。
【００８７】
さらに別の局面において、本発明は、本発明によるアジュバントとして使用するための、アルファウイルスレプリカーゼまたはアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクターを含む適量のワクチン組成物を、ワクチン組成物を必要とする被験体に投与する工程を含む方法に関する。ワクチン組成物の投与経路は、当業者により決定される任意の適切な経路でよい。投与経路の例は本明細書において示される。ワクチン組成物を必要とする被験体は、任意の哺乳動物、例えば、ヒトまたは動物でよい。
【００８８】
さらに別の局面において、本発明は、免疫応答を調整するためのアジュバントとして、RNA依存性RNAポリメラーゼを含むアルファウイルスレプリカーゼ、任意で、発現ベクターによってコードされる、RNA依存性RNAポリメラーゼを含むアルファウイルスレプリカーゼを、これを必要とする被験体に投与するための方法に関する。前記アジュバントはワクチンと組み合わせて適量で投与された時に、ワクチンが単独で投与された時と比較して、アジュバントおよびワクチンが投与された被験体において免疫応答の増大をもたらす。
【００８９】
さらに別の局面において、本発明は、SEQ ID NO:3に開示されるアミノ酸配列に実質的に一致するタンパク質に関する。このタンパク質はまた、SEQ ID NO:3に開示されるアミノ酸配列からなってもよい。さらに別の局面において、本発明は、SEQ ID NO:1に実質的に一致するが、SEQ ID NO:1の位置1185-1187においてRRRからAAAへのアミノ酸変化を生じる変異が起こったタンパク質に関する。このタンパク質はまた、SEQ ID NO:1に一致するが、SEQ ID NO:1の位置1185-1187においてRRRからAAAへのアミノ酸変化を生じる変異が起こった配列からなってもよい。さらに別の局面において、本発明は、医薬として使用するための、SEQ ID NO:3に開示されるアミノ酸配列に実質的に一致するタンパク質に関する。さらに別の局面において、本発明は、医薬として使用するための、SEQ ID NO:3に開示されるアミノ酸配列からなるタンパク質に関する。さらに別の局面において、本発明は、免疫応答を調整するためのアジュバントとして使用するための、SEQ ID NO:3に開示されるアミノ酸配列に実質的に一致するタンパク質に関する。さらに別の局面において、本発明は、免疫応答を調整するためのアジュバントを製造するための、SEQ ID NO:3に開示されるアミノ酸配列に実質的に一致するタンパク質の使用に関する。さらに別の局面において、本発明は、SEQ ID NO:4に開示される配列に実質的に一致するが、変異が位置4126-4133に導入されて、CGGCGGAGからGCCGCCGCに変化した核酸配列によってコードされるタンパク質に関する。さらに別の局面において、本発明は、SEQ ID NO:4に開示される配列からなるが、変異が位置4126-4133に導入されて、CGGCGGAGからGCCGCCGCに変化した核酸配列によってコードされるタンパク質に関する。さらに別の局面において、本発明はまた、SEQ ID NO:4に開示される配列に実質的に一致するが、変異が位置4126-4133に導入されて、CGGCGGAGからGCCGCCGCに変化した核酸配列に関する。さらに、本発明はまた、SEQ ID NO:4に開示される配列からなるが、変異が位置4126-4133に導入されて、CGGCGGAGからGCCGCCGCに変化した核酸配列に関する。
【００９０】
さらに別の局面において、本発明は、SEQ ID NO:4に開示される配列に実質的に一致するが、変異がSEQ ID NO:4の位置4126-4133に導入されているので、発現時にSEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>AAAがもたらされる(SEQ ID NO:3)配列を含む発現カセットを含む発現ベクターに関する。さらに別の局面において、本発明は、SEQ ID NO:4に開示される配列に実質的に一致するが、変異がSEQ ID NO:4の位置4126-4133に導入されているので、発現時にSEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>AAAがもたらされる(SEQ ID NO:3)配列からなる発現カセットを含む発現ベクターに関する。さらに別の局面において、本発明は、医薬として使用するための、SEQ ID NO:4に開示される配列に実質的に一致するが、変異がSEQ ID NO:4の位置4126-4133に導入されているので、発現時にSEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>AAAがもたらされて、変異時にSEQ ID NO:3に開示されるアミノ酸配列がもたらされる配列を含む発現カセットを含む発現ベクターに関する。
【００９１】
さらに別の局面において、本発明は、免疫系を調整するためのアジュバントを製造するための、RNA依存性RNAポリメラーゼを含むアルファウイルスレプリカーゼの使用に関する。前記アルファウイルスは、任意で、セムリキ森林ウイルスでもよい。一部の局面において、レプリカーゼのアミノ酸配列はSEQ ID NO:1と実質的に一致する。レプリカーゼのアミノ酸配列はまた、SEQ ID NO:1に一致する配列からなってもよく、本明細書において述べたレプリカーゼの変異バージョンからなってもよい。他の局面において、レプリカーゼはnsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>RDRがもたらされる。さらに別の局面において、レプリカーゼはnsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>AAAがもたらされる。
【００９２】
本発明はまた、免疫系を調整するためのアジュバントを製造するための、本明細書において規定されたアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクターの使用に関する。一部の局面において、前記発現ベクターはDNAベクターである。前記レプリカーゼまたは前記レプリカーゼをコードする前記発現ベクターはまた、薬学的に許容される賦形剤および/または構成物と共に処方されてもよい。
【実施例】
【００９３】
実験セクション
発現ベクター
pRSV-Nsp1234(SEQ ID NO:5)は、RSV LTRプロモーターからコドン最適化SFVレプリカーゼ(SEQ ID NO:4)を発現する10342bpプラスミドベクターである。異種ウサギβグロビン遺伝子に由来するイントロンがレプリカーゼコード配列に導入されている。
主な特徴:
始まり-終わり  説明
9933-268  pUCori
437-963              RSV LTR
1001-8869            SFVレプリカーゼコード配列とイントロン(SEQ ID NO:4)
1213-1785            イントロン
8878-9090  bgh pA
9204-9899  araD選択マーカー
【００９４】
pRSV-AAAは、pRSV-Nsp1234(SEQ ID NO:5)と同一であるが、SEQ ID NO:1のaa1185-1187にRRRからAAAへの変異を含有する。位置5126-5133にあるヌクレオチド配列がCGGCGGAGからGCCGCCGCに変異している。
【００９５】
pRSV-RDRは、pRSV-Nsp1234(SEQ ID NO:5)と同一であるが、SEQ ID NO:1のaa1185-1187にRRRからRDRへの変異を含有する。位置5129-5131にあるヌクレオチド配列がCGGからGACに変異している。
【００９６】
pRSV-GAAは、pRSV-Nsp1234(SEQ ID NO:5)と同一であるが、SEQ ID NO:1のaa2283-2285にGDDからGAAへの変異を含有する。位置8424-8427にあるヌクレオチド配列がACGAからCCGCに変異している。
【００９７】
pRSV-AAA-GAAは、pRSV-Nsp1234(SEQ ID NO:5)と同一であるが、SEQ ID NO:1のaa1185-1187にRRRからAAAへの変異およびNsp1234のaa2283-2285にGDDからGAAへの変異を含有する。位置5126-5133にあるヌクレオチド配列がCGGCGGAGからGCCGCCGCに変異しており、位置8424-8427にあるヌクレオチド配列がACGAからCCGCに変異している。
【００９８】
pRSV-RDR-GAAは、pRSV-Nsp1234(SEQ ID NO:5)と同一であるが、SEQ ID NO:1のaa1185-1187にRRRからRDRへの変異およびNsp1234のaa2283-2285にGDDからGAAへの変異を含有する。位置5129-5131にあるヌクレオチド配列がCGGからGACに変異しており、位置8424-8427にあるヌクレオチド配列がACGAからCCGCに変異している。
【００９９】
pheIF4A1-Nsp1234(SEQ ID NO:6)は、ヒトeIF4A1プロモーターからコドン最適化SFVレプリカーゼ(SEQ ID NO:4)を発現する10248bpプラスミドベクターである。異種ウサギβグロビン遺伝子に由来するイントロンがレプリカーゼコード配列に導入されている。
主な特徴:
始まり-終わり  説明
9839-268  pUCori
367-894              heIF4A1プロモーター
907-8775             SFVレプリカーゼコード配列とイントロン(SEQ ID NO:4)
1119-1691  イントロン
8784-8996  bgh pA
9110-9805  araD選択マーカー
【０１００】
pheIF4A1-AAAは、pheIF4A1-Nsp1234(SEQ ID NO:6)と同一であるが、SEQ ID NO:1のaa1185-1187にRRRからAAAへの変異を含有する。位置5032-5039にあるヌクレオチド配列がCGGCGGAGからGCCGCCGCに変異している。
【０１０１】
pheIF4A1-RDRは、pheIF4A1-Nsp1234(SEQ ID NO:6)と同一であるが、SEQ ID NO:1のaa1185-1187にRRRからRDRへの変異を含有する。位置5035-5037にあるヌクレオチド配列がCGGからGACに変異している。
【０１０２】
phEF1aHTLV-Nsp1234(SEQ ID NO:7)は、ヒトEF1aプロモーター+HTLV UTRからコドン最適化SFVレプリカーゼ(SEQ ID NO:4)を発現する10258bpプラスミドベクターである。異種ウサギβグロビン遺伝子に由来するイントロンがレプリカーゼコード配列に導入されている。
主な特徴:
始まり-終わり  説明
9849-268             pUCori
372-903              hEF1a/HTLV
917-8785             SFVレプリカーゼコード配列とイントロン(SEQ ID NO:4)
1129-1701            イントロン
8794-9006            bgh pA
9120 9815            araD選択マーカー
【０１０３】
phEF1aHTLV-AAAは、phEF1aHTLV-Nsp1234(SEQ ID NO:7)と同一であるが、SEQ ID NO:1のaa1185-1187にRRRからAAAへの変異を含有する。位置5042-5049にあるヌクレオチド配列がCGGCGGAGからGCCGCCGCに変異している。
【０１０４】
phEF1aHTLV-RDRは、phEF1aHTLV-Nsp1234(SEQ ID NO:7)と同一であるが、SEQ ID NO:1のaa1185-1187にRRRからRDRへの変異を含有する。位置5045-5047にあるヌクレオチド配列がCGGからGACに変異している。
【０１０５】
phEF1aHTLV-GAAは、phEF1aHTLV-Nsp1234(SEQ ID NO:7)と同一であるが、SEQ ID NO:1のaa2283-2285にGDDからGAAへの変異を含有する。位置8340-8343にあるヌクレオチド配列がACGAからCCGCに変異している。
【０１０６】
実施例1
nsP2領域に変異RRR>RDRのあるSFVレプリカーゼを発現するDNAプラスミドの構築
以前に、SFVレプリカーゼタンパク質配列(非構造ポリペプチドnsP1234)(SEQ ID NO:1)を逆翻訳(back-translate)し、異種ウサギβグロビン遺伝子由来イントロンを有する(コード配列に導入した)コドン最適化合成cDNAを合成した(SEQ ID NO:4)。コドン最適化コード配列からSFVレプリカーゼを発現させるために、異なる異種PolIIプロモーターおよびUTRエレメントが用いられるように、このcDNAを発現プラスミドに挿入した(図5)。特に、ラウス肉腫ウイルス5'LTR、ヒトeIF4A1プロモーター、およびヒトEF1aプロモーター+HTLV UTRからなるキメラプロモーターを使用した。SFVレプリカーゼ(SEQ ID NO:1)を発現するベクターを、pRSV-Nsp1234(SEQ ID NO 5)、pheIF4A1-Nsp1234(SEQ ID NO 6)、およびphEF1aHTLV-Nsp1234(SEQ ID NO 7)と名付けた。さらに、nsP2 NLS領域にあるアミノ酸1185-1187 RRR>AAAの変異を、ベクターpRSV-Nsp1234、pheIF4A1-Nsp1234、およびphEF1aHTLV-Nsp1234に導入した。これらのプラスミドを、それぞれ、pRSV-AAA、pheIF4A1-AAA、およびphEF1aHTLV-AAAと名付けた。
【０１０７】
野生型SFVレプリカーゼをコードする遺伝子のaa1185-1187に特定の変異RRR>RDRがあると、ウイルス感染細胞におけるIFN応答の誘導が、wtウイルスに感染した細胞と比較して著しく強化されることが文献データによって知られている(Breakwell et al. 2007)。従って、変異RRR>RDRを、ベクターpRSV-Nsp1234、pheIF4A1-Nsp1234、およびphEF1aHTLV-Nsp1234に導入した。これらのプラスミドを、それぞれ、pRSV-RDR、pheIF4A1-RDR、およびphEF1aHTLV-RDRと名付けた。
【０１０８】
アルファウイルスnsP4(SFV Nsp1234のaa2283-2285)タンパク質の高度に保存されたGDDモチーフに変異GDD>GAAがあると、RNA依存性RNAポリメラーゼ活性が完全に無くなることが文献データによって知られている(Tomar et al. 2006)。以前に、GDD>GAA変異を、ベクターpRSV-Nsp1234およびpRSV-AAAによってコードされるレプリカーゼに導入した。クローニングされたベクターを、それぞれ、pRSV-GAAおよびpRSV-AAA-GAAと名付けた。さらに、GDD>GAA変異を、プラスミドpEF1aHTLV-Nsp1234の状況に導入して、ベクターpEF1aHTLV-GAAを得た。nsP2領域にRRR>RDR変異のある対照ベクターを構築するつもりで、GDD>GAA変異をベクターpRSV-RDRに導入して、プラスミドpRSV-RDR-GAAを得た。
【０１０９】
実施例2
RdRp発現によるI型インターフェロン応答の誘導
本発明者らは、I型インターフェロン発現を誘導する能力について異なるレプリカーゼ構築物を区別するために、モデル細胞株としてCop5マウス線維芽細胞細胞株(ATCC番号CRL-1804)を使用した。Cop-5細胞を、10％ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、およびストレプトマイシン-ペニシリンを添加したイスコブ改変ダルベッコ培地(IMDM)中で増殖させた。他の2種類のヒト細胞株HEK293およびHACATも比較のために使用した。細胞を37℃、5％CO2で増殖させ、50〜70％コンフルエンシーまで増殖させた。
【０１１０】
トランスフェクション
Bio-Rad Gene Pulserを用いてエレクトロポレーションを行った。トランスフェクションには、10ng、200ngおよび1000ng の3種類のプラスミドDNA濃度を等モル量の対照プラスミドと共に使用した。全5種類の構築物:pRSV-Nsp1234、pRSV-RDR、pRSV-AAA、pRSV-RDR-GAA、およびpRSV-AAA-GAAを、インターフェロン応答を誘導する能力についてアッセイした。細胞をトリプシンで処理し、遠心分離によって回収し、増殖培地に懸濁し、5mM NaBesを添加した。エレクトロポレーションは、50ugの担体DNA(サケ精子DNA)の存在下で0.4mmキュベットに入れて行い、キュベット内で15分間、放置し、増殖培地で洗浄し、6ウェルプレートに播種した。
【０１１１】
インターフェロン-βアッセイ
トランスフェクションの24時間後、48時間後、および72時間後に、細胞培養上清を回収し、インターフェロン-αおよび-βキット(PBL Biomedical Laboratories)を用いてさらに分析するまで-20℃で凍結した。細胞培養上清を適切に希釈し、酵素結合免疫測定法において製造業者の説明書(PBL Biomedical Laboratories)に従って使用した。
【０１１２】
結果
回収された上清からインターフェロン-βレベルを、酵素結合免疫測定法(ELISA)(PBL Biomedical Laboratories)によって製造業者の説明書に従って定量した。
【０１１３】
結論
インターフェロン応答の発生は、区画化されたRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)複合体内にあるRdRp活性によるものである。ポリメラーゼ単位の活性中心にGAA変異を導入することでRdRpの酵素活性を取り消した時に、RdRpの効果は完全に無くなった(図2)。GAA変異を含有する構築物でトランスフェクションした後の、細胞培養上清から測定したインターフェロン発現プロファイルは、酵素活性をコードしない構築物と類似していた(図1、レーンparaDMgB)。
細胞培養実験に基づいて、RDR変異を導入することによってNsp2領域において核局在化シグナル(NLS)が改変された変異体が、最も見込みのあるアジュバント候補として選択された。NLSの同じ位置に他の改変(AAA)を有する変異体または野生型RdRpも、I型インターフェロン応答を誘導する能力についてアッセイしたが、効果はかなり低かった(図1)。
本発明者らはまた、レプリカーゼ発現ベクターpRSV-Nsp1234 (SEQ ID NO:5)と、レプリカーゼならびに特定のウイルスcis配列を含有する鋳型RNAを両方とも発現するベクターpRSV-SFV-Rlucを比較した。後者は、レプリカーゼの特定の基質として作用する。IFN応答誘導アッセイの結果から、特定の鋳型RNAの存在は、インターフェロン応答の誘導において重要な要因でないことが分かった(図3)。ヒト細胞株HEK293およびHACATにおいて、本発明者らはまた、pRSV-RDRによって特定のインターフェロン-βを示すことができ、それより少ない程度でインターフェロン-α誘導を示すことができた(図4および図5)。
【０１１４】
実施例3
レプリカーゼ発現細胞の細胞質におけるdsRNAの蓄積
SFVゲノムまたはレプリカーゼ鋳型RNAの複製サイクルの間にdsRNA中間体が生成されることが知られている。細胞質区画にdsRNAが存在するとウイルス感染が細胞にシグナル伝達され、I型インターフェロン応答を含む抗ウイルス応答カスケードが開始し得る。
前記(実施例2)で述べたように、SFVレプリカーゼ発現のみで、トランスフェクト細胞においてI型インターフェロン応答が誘導される。さらに、RdRp活性を無くすGDD>GAA変異を有する発現ベクターでトランスフェクトされた後にIFN応答が観察されなかったので、レプリカーゼのRdRp活性はIFN応答に重要であることが確かめられた(実施例2)。
従って、レプリカーゼ発現ベクターのみでトランスフェクトされた細胞におけるdsRNAの存在および局在化を試験した。この目的のために、抗dsRNAモノクローナル抗体J2(Scicons, Hungary)を用いたIF分析を利用した。このアプローチは、+鎖RNAウイルス感染後の細胞内のdsRNAを検出するために以前に用いられた(Weber et al 2006)。簡単に述べると、細胞をレプリカーゼ発現ベクターでトランスフェクトし、トランスフェクション後、翌日に、抗Nsp1抗体および抗dsRNA抗体(混合)を用いて、パラホルムアルデヒド固定細胞の免疫蛍光分析を行った。蛍光顕微鏡によるシグナル検出のために、蛍光色素Alexa488およびAlexa568で標識した二次抗体およびDAPIによる核染色を用いた。
【０１１５】
実験1.
RD細胞を、0.5ugのphEF1aHTLV-Nsp1234または0.5ugのphEF1aHTLV-GAAを含むPEI-DNA複合体によってトランスフェクトした。この結果は、Nsp1シグナルが両培養物において観察されたことをはっきりと証明した。phEF1aHTLV-Nsp1234でトランスフェクトされた細胞では、抗nsP1で染色された球状パターンと共存する細胞質dsRNAシグナルが検出されたが、phEF1aHTLV-Nsp1234-GAAでトランスフェクトされた細胞では観察されなかった。
【０１１６】
実験2.
Cop5細胞を、1ugのpRSV-Nsp1234、pRSV-GAA、pRSV-RDR、またはpRSV-RDR-GAAを用いたエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。結果から、Nsp1シグナルは全ての培養物において観察されたが、レプリカーゼと共存する細胞質dsRNAは、pRSV-Nsp1234またはpRSV-RDRでトランスフェクトされた細胞において検出できたが、プラスミドpRSV-GAAまたはpRSV-RDR-GAAでトランスフェクトされた細胞では検出できなかった。
【０１１７】
実験3.
RD細胞を、0.5ugまたは1ugのpRSV-Nsp1234、pRSV-AAA、またはpRSV-RDRを含むPEI-DNA複合体によってトランスフェクトした。この結果は、Nsp1シグナルが全ての培養物において見られたことを証明した。pRSV-Nsp1234またはpRSV-RDRでトランスフェクトされた細胞では、抗nsP1で染色された球状パターンと共存する細胞質dsRNAシグナルが検出されたが、pRSV-AAAでトランスフェクトされた細胞では検出されなかった。
【０１１８】
結論
wt SFVレプリカーゼ、または本明細書において前に規定されたように、nsP2領域に変異RRR>RDRを有するレプリカーゼが発現されると、nsp1陽性球状パターンと共存する、トランスフェクト細胞の細胞質内の明らかなdsRNA蓄積が誘導されることが証明された。対照的に、細胞が、RdRp活性を無くすGDD>GAA変異を有するレプリカーゼでトランスフェクトされた場合、このようなdsRNA蓄積は検出されなかった。
【０１１９】
従って、これらの結果は、異なるレプリカーゼ変異体によるdsRNA蓄積とI型IFN誘導が相関関係にあることを示している。しかしながら、レプリカーゼのRRR>AAA変異体でトランスフェクトした後にdsRNA蓄積は検出されなかったが、I型IFN応答の誘導は依然として観察された。これは、誘導されたIFN応答はdsRNAシグナル伝達だけでなく、レプリカーゼのRdRp活性に関連する他の経路によっても誘導されることを示しているのかもしれない。しかしながら、レプリカーゼ変異体RRR>AAAによって、使用されたアッセイ条件によって検出できない少量のdsRNAが生成されたことは排除できない。
【０１２０】
実施例4
細胞性免疫応答に対するSFVレプリカーゼ発現のアジュバント効果
3種類のマウス(Balb/c)群(1群あたり5匹のマウス)を、遺伝子銃で2週間の間隔をあけて2回、免疫化した。両免疫化とも、1マイクログラムのプラスミドDNAを投与した。プラスミドベクターGTU-MultiHIV(HIV-1に由来する選択された遺伝子をコードする)は、HIV-1用の実験DNAワクチンである。GTU-MultiHIVプラスミドとアジュバントpRSV-Nsp1234またはpRSV-RDRを同時投与した時には、0.8μgのGTU-MultiHIVおよび0.2μgのアジュバントプラスミドを一緒に混合した。GTU-MultiHIVベクターのみを与えたマウスの場合、1μgのプラスミドDNAを使用した。10日後に、マウスを屠殺した。新鮮に単離された脾細胞を用いて、インターフェロンγELISPOT分析を行った。細胞を刺激するために、HIV-1のp24タンパク質に由来する1つの単一ペプチド(AMQMLKETI)を使用した。このペプチドは、Balb/cマウスのMHCクラスI分子によって提示されることが知られている。もう1つの刺激剤は、DNAワクチンによってコードされるもう1つの構成要素であるHIV-1のRevタンパク質をカバーする重複ペプチドのプールであった。
【０１２１】
この結果から、DNAワクチンとSFV由来レプリカーゼをコードするベクターを同時投与した時に、3倍までの細胞性免疫応答の増加が観察されたことが分かる(図6)。
【０１２２】
実施例5
トリインフルエンザウイルスに対する体液性免疫応答の誘導に対するSFVレプリカーゼ発現の効果
3種類のマウス群(1群あたり5匹のマウス)を、インフルエンザウイルスに由来するHA抗原およびNA抗原をコードするプラスミドベクターpETB-12m-1で免疫化した。前記実施例と同様にマウスを免疫化した(免疫化1回あたり1μgのプラスミドDNA。プラスミドと遺伝子アジュバントを同時投与した時に、4:1の比800ng免疫化ベクターおよび200ngアジュバントベクターを使用した)。2回目の免疫化の2週間後に、ELISA試験において、血液試料に特定の抗体が存在するかどうか分析した。この実験では比較のために、体液性免疫応答を増強することが知られているサイトカインGM-CSFをコードするベクターである別の遺伝子アジュバントを使用した。
これらの結果から、2回の免疫化後、遺伝子アジュバントpRSV-RDRと抗原コードプラスミドを混合した群において最高力価が検出されたことが分かる(図7)。
【０１２３】
実施例6
マウスにおける細胞性免疫応答に対するSFVレプリカーゼ発現のアジュバント効果
1群あたり4匹または5匹のマウス(Balb/c)からなる3種類のマウス群を、遺伝子銃で4週間の間隔をあけて2回、免疫化した。両免疫化とも、1マイクログラムのプラスミドDNAを投与した。プラスミドベクターGTU-MultiHIV(HIV-1に由来する選択された遺伝子をコードする)は、HIV-1用の実験DNAワクチンである。1回目または2回目の免疫化の際に、GTU-MultiHIVプラスミドとアジュバントpRSV-RDRを同時投与した時には、0.8μgのGTU-MultiHIVおよび0.2μgのアジュバントプラスミドを一緒に混合した。GTU-MultiHIVベクターのみを与えたマウスの場合、1μgのプラスミドDNAを使用した。2回目の免疫化の10日後に、マウスを屠殺した。新鮮に単離された脾細胞を用いて、インターフェロンγおよびグランザイムB ELISPOT分析を行った。細胞を刺激するために、HIV-1のp24タンパク質に由来する1つの単一ペプチド(AMQMLKETI)およびHIV-1のEnvタンパク質に由来する1つのペプチド(RGPGRAFVTI)を使用した。これらのペプチドは、Balb/cマウスのMHCクラスI分子によって提示されることが知られている。
【０１２４】
これらの結果から、アジュバントSFVレプリカーゼの同時投与の時期には、細胞性免疫応答に対して複合効果があることが分かる。アジュバントを免疫化混合物に添加すると、GTU-MultiHIVのみを与えた動物と比較してインターフェロンγ応答が増大する。グランザイムB発現分析後に、細胞の異なる機能的能力が明らかになった。アジュバントは、1回目の免疫化と共にマウスに投与された時に、グランザイムB応答をほぼ3倍増大させる。
【０１２５】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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