(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価する被験物質の評価方法であって、
（Ａ１）エピモルフィンを発現するケラチノサイトを含む細胞凝集物を足場となる支持体内で被験物質と接触させながら分化条件下で培養するか、または野生型ケラチノサイトを含む細胞凝集物を足場となる支持体内で不飽和脂肪酸および被験物質と接触させながら分化条件下で培養し、細胞構造体を得るステップ、
（Ｂ１）エピモルフィンを発現するケラチノサイトを含む細胞凝集物を足場となる支持体内で分化条件下で培養するか、または野生型ケラチノサイトを含む細胞凝集物を足場となる支持体内で不飽和脂肪酸と接触させながら分化条件下で培養し、細胞構造体を得るステップ、および
（Ｃ１）前記ステップ（Ａ１）で得られた細胞構造体と前記ステップ（Ｂ１）で得られた細胞構造体との間の差異に基づき、前記被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価するステップ
を含む被験物質の評価方法。
【請求項２】
被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価する被験物質の評価方法であって、
（Ａ２）被験物質を含有する培地中でエピモルフィンを発現するケラチノサイトを培養した後、得られたケラチノサイトを、カルシウムイオノフォアを含有する培地中で分化条件下で培養するか、または不飽和脂肪酸と被験物質とを含有する培地中で野生型ケラチノサイトを培養した後、得られたケラチノサイトを、カルシウムイオノフォアを含有する培地中で分化条件下で培養し、細胞構造体を得るステップ、
（Ｂ２）カルシウムイオノフォアを含有する培地中でエピモルフィンを発現するケラチノサイトを分化条件下で培養するか、または不飽和脂肪酸を含有する培地中で野生型ケラチノサイトを培養した後、得られたケラチノサイトを、カルシウムイオノフォアを含有する培地中で分化条件下で培養し、細胞構造体を得るステップ、および
（Ｃ２）前記ステップ（Ａ２）で得られた細胞構造体と前記ステップ（Ｂ２）で得られた細胞構造体との間の差異に基づき、前記被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価するステップ
を含む被験物質の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験物質の評価方法に関する。さらに詳しくは、皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常に対する外用剤、治療剤または予防剤の開発などに有用な被験物質の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの表皮は、下層から順に、基底層と有棘層と顆粒層と角質層とからなる。ヒトの正常な皮膚は、通常、２８日間の周期でターンオーバーする。正常な皮膚のターンオーバーでは、ケラチノサイトが顆粒層から角質層へと押し上げられる。このとき、ケラチノサイトの分化により脱核が生じて有核細胞が消失し、成熟した角質層が形成される。
【０００３】
しかしながら、皮脂中に含まれる不飽和脂肪酸などによって表皮における細胞の増殖が異常に促進された場合、皮膚における角化が異常に促進され、最終分化段階のケラチノサイトにおいて、脱核が起こらないことがある（以下、「不全角化」という）。この場合、角質層における有核細胞の割合が高くなることから、皮膚の角質層のバリア機能が著しく低下する。このようにバリア機能が低下した皮膚は、ニキビ、肌荒れなどが生じやすい傾向にある。そこで、皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常に対する外用剤などが開発されている。
【０００４】
皮脂によって引き起こされる不全角化などの皮膚の状態の異常に対する外用剤などの評価は、例えば、マウスなどの動物の皮膚へのオレイン酸の塗布を繰り返して不全角化を生じさせ、この不全角化に対する外用剤などの影響を調べること、マウスなどの皮膚への粘着テープの貼付および剥離を繰り返して表皮の肥厚化を生じさせ、肥厚化した表皮に対する外用剤の影響を調べることなどによって行なわれている（例えば、特許文献１を参照）。しかしながら、近年、動物愛護の傾向が高まっていることから、動物試験を行なわずに、簡便な操作で、皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常に対する外用剤などの評価をすることができる方法が求められている。
【０００５】
一方、本発明者らは、外因性エピモルフィンを発現するケラチノサイトを三次元で培養した場合、三次元培養によって得られる細胞構造体が不全角化を伴う皮膚の病理学的特徴に似た特徴を示すことを見出している。しかしながら、本発明者らは、現時点では、エピモルフィンによって引き起こされる前記不全角化を伴う皮膚の病理学的特徴に似た特徴を示す状態とオレイン酸などの不飽和脂肪酸によって引き起こされる不全角化などの皮膚の状態の異常とが関連していることや、エピモルフィンまたは不飽和脂肪酸によって引き起こされる細胞や細胞構造体の状態の異常が、皮脂によって引き起こされる不全角化などの皮膚の状態の異常と関連していることを具体的に記載した文献を発見していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−８１８３４号参照
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常を抑制する物質を簡便な操作で評価することができる被験物質の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明の要旨は、
（１）エピモルフィンを発現するケラチノサイトもしくはその分化細胞構築物を被験物質と接触させながら分化条件下で培養するか、または野生型ケラチノサイトもしくはその分化細胞構築物を不飽和脂肪酸および被験物質と接触させながら分化条件下で培養し、得られた細胞構造体の形態を観察し、前記細胞構造体の形態に基づき、前記被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価することを特徴とする被験物質の評価方法、
（２）（Ａ１）エピモルフィンを発現するケラチノサイトを含む細胞凝集物を足場となる支持体内で被験物質と接触させながら分化条件下で培養するか、または野生型ケラチノサイトを含む細胞凝集物を足場となる支持体内で不飽和脂肪酸および被験物質と接触させながら分化条件下で培養し、細胞構造体を得るステップ、
（Ｂ１）エピモルフィンを発現するケラチノサイトを含む細胞凝集物を足場となる支持体内で分化条件下で培養するか、または野生型ケラチノサイトを含む細胞凝集物を足場となる支持体内で不飽和脂肪酸と接触させながら分化条件下で培養し、細胞構造体を得るステップ、および
（Ｃ１）前記ステップ（Ａ１）で得られた細胞構造体と前記ステップ（Ｂ１）で得られた細胞構造体との間の差異に基づき、前記被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価するステップ
を含む前記（１）に記載の被験物質の評価方法、
(３)（Ａ２）被験物質を含有する培地中でエピモルフィンを発現するケラチノサイトを培養した後、得られたケラチノサイトを、カルシウムイオノフォアを含有する培地中で分化条件下で培養するか、または不飽和脂肪酸と被験物質とを含有する培地中で野生型ケラチノサイトを培養した後、得られたケラチノサイトを、カルシウムイオノフォアを含有する培地中で分化条件下で培養し、細胞構造体を得るステップ、
（Ｂ２）カルシウムイオノフォアを含有する培地中でエピモルフィンを発現するケラチノサイトを分化条件下で培養するか、または不飽和脂肪酸を含有する培地中で野生型ケラチノサイトを培養した後、得られたケラチノサイトを、カルシウムイオノフォアを含有する培地中で分化条件下で培養し、細胞構造体を得るステップ、および
（Ｃ２）前記ステップ（Ａ２）で得られた細胞構造体と前記ステップ（Ｂ２）で得られた細胞構造体との間の差異に基づき、前記被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価するステップ
を含む前記（１）に記載の被験物質の評価方法、ならびに
(４)（Ａ３）エピモルフィンを発現するケラチノサイトの分化細胞構築物を被験物質と接触させながら分化条件下で培養するか、または野生型ケラチノサイトの分化細胞構築物を不飽和脂肪酸および被験物質と接触させながら分化条件下で培養し、細胞構造体を得るステップ、
（Ｂ３）エピモルフィンを発現するケラチノサイトの分化細胞構築物を分化条件下で培養するか、または野生型ケラチノサイトの分化細胞構築物を不飽和脂肪酸と接触させながら分化条件下で培養し、細胞構造体を得るステップ、および
（Ｃ３）前記ステップ（Ａ３）で得られた細胞構造体と前記ステップ（Ｂ３）で得られた細胞構造体との間の差異に基づき、前記被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価するステップ
を含む前記（１）に記載の被験物質の評価方法
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の被験物質の評価方法によれば、皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常を抑制する物質を簡便な操作で評価することができるという優れた効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実験例１において、培地の種類とＨａＣａＴ細胞における内因性エピモルフィンの発現量との関係を調べた結果を示す図面代用写真である。
【図２】実験例２において、培地の種類とＨａＣａＴ−ＴＥ細胞の培養上清およびＰＴ６７−ＴＥ細胞の培養上清それぞれにおける分泌エピモルフィンの量との関係を調べた結果を示す図面代用写真である。
【図３】製造例４において、ペプチドのマススペクトルを示すチャートである。
【図４】製造例４において、酸化後のペプチドのマススペクトルを示すチャートである。
【図５】（Ａ）は、実施例１において、実験番号：１１の培地を用いたときの細胞クラスター（細胞構造体）の形態を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は、実施例１において、実験番号：１０の培地を用いたときの細胞クラスター（細胞構造体）の形態を観察した結果を示す図面代用写真である。
【図６】実施例１において、培地の種類と内腔形成率との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図７】（Ａ）は、実施例３において、実験番号：１５の培地を用いたときの細胞クラスター（細胞構造体）の形態を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は、実施例３において、実験番号：１４の培地を用いたときの細胞クラスター（細胞構造体）の形態を観察した結果を示す図面代用写真である。
【図８】実施例３において、培地の種類と内腔形成率との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図９】実施例５において、培地の種類とコーニファイドエンベロープ形成率との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１０】実施例７において、培地の種類または細胞の種類とコーニファイドエンベロープ形成率との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１１】（Ａ）は、実施例９において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液を塗布せずに実験番号：３２の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は、実施例９において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３３の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｃ）は、実施例９において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３４の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｄ）は、実施例９において０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３５の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を示す図面代用写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の被験物質の評価方法は、エピモルフィンを発現するケラチノサイトもしくはその分化細胞構築物を被験物質と接触させながら分化条件下で培養するか、または野生型ケラチノサイトもしくはその分化細胞構築物を不飽和脂肪酸および被験物質と接触させながら分化条件下で培養し、得られた細胞構造体の形態を観察し、前記細胞構造体の形態に基づき、前記被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価することを特徴とする。
【００１２】
本発明者らは、
（ａ）皮脂に含まれる不飽和脂肪酸の１つであるオレイン酸とエピモルフィンを発現するケラチノサイトとを接触させた場合、当該ケラチノサイト外に分泌されるエピモルフィンの量が増加すること、
（ｂ）エピモルフィンを発現するケラチノサイトもしくはその分化細胞構築物または野生型ケラチノサイトもしくはその分化細胞構築物を、オレイン酸と接触させながら分化条件下で培養して得られた細胞構造体では、不全角化を伴う皮膚の病理学的特徴に似た組織形態の異常が見られるのに対して、エピモルフィンを発現するケラチノサイトもしくはその分化細胞構築物または野生型ケラチノサイトもしくはその分化細胞構築物を、オレイン酸およびエピモルフィンの機能を抑制する環状ペプチド化合物（配列番号：１）と接触させながら分化条件下で培養して得られた細胞構造体では、前記組織形態の異常が見られないこと、および
（ｃ）エピモルフィンによって引き起こされる不全角化を伴う皮膚の病理学的特徴に似た組織形態と、皮脂によって引き起こされる不全角化などの皮膚の状態の異常とが互いに関連していること
を見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
【００１３】
本発明の評価方法は、エピモルフィンを発現するケラチノサイトもしくはその分化細胞構築物を被験物質と接触させながら分化条件下で培養するか、または野生型ケラチノサイトもしくはその分化細胞構築物を不飽和脂肪酸および被験物質と接触させながら分化条件下で培養する点に１つの大きな特徴がある。前記分化条件下で培養するという簡便な操作を行なうことにより、エピモルフィンの発現下または不飽和脂肪酸の存在下でのヒトの皮膚の分化の過程を再現し、エピモルフィンまたは不飽和脂肪酸によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生の過程を簡便に再現することができる。このエピモルフィンまたは不飽和脂肪酸によって引き起こされる皮膚の状態の異常は、ヒトの皮膚において、皮脂によって引き起こされる不全角化などの皮膚の状態の異常と関連している。したがって、本発明の評価方法によれば、簡便な操作で、被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価することができる。
【００１４】
皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常としては、例えば、ニキビ、肌荒れ、吹き出物などが挙げられる。
【００１５】
また、本明細書において、「野生型ケラチノサイト」とは、エピモルフィンを発現しないケラチノサイトをいう。
【００１６】
野生型ケラチノサイトとしては、例えば、ヒト野生型ケラチノサイト、マウス野生型ケラチノサイトなどが挙げられる。これらのなかでは、ヒトにおける皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常を十分に再現する観点から、ヒト野生型ケラチノサイトが好ましい。ヒト野生型ケラチノサイトとしては、特に限定されないが、例えば、ＨａＣａＴ細胞、正常ヒト皮膚表皮ケラチノサイトなどが挙げられる。ヒト野生型ケラチノサイトのなかでは、ヒトにおける皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常を十分に再現する観点から、ＨａＣａＴ細胞が好ましい。
【００１７】
エピモルフィンを発現するケラチノサイトは、エピモルフィンをコードする核酸を野生型ケラチノサイトに導入することにより得られる細胞である。
【００１８】
前記エピモルフィンをコードする核酸としては、特に限定されないが、マウスエピモルフィンをコードする核酸、ヒトエピモルフィンをコードする核酸などが挙げられる。なかでも、発現およびエピモルフィンの作用機構に関する情報量が豊富であり、ケラチノサイト内における挙動が把握しやすい観点から、好ましくはマウスエピモルフィンをコードする核酸である。
【００１９】
マウスエピモルフィンをコードする核酸としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｄ１０４７５に示される塩基配列の１５３位〜１０２２位からなる核酸（配列番号：２）などが挙げられる。また、ヒトエピモルフィンをコードする核酸としては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｄ１４５８２に示される塩基配列の９６位〜９９５位からなる核酸（配列番号：４）などが挙げられる。
【００２０】
なお、前記エピモルフィンをコードする核酸は、コードされたポリペプチドがエピモルフィンとしての機能を発現するのであれば、配列番号：２または４に示される塩基配列からなる核酸のバリアントであってもよい。前記バリアントとしては、例えば、
（ａ）縮重を介して配列番号：２または４に示される塩基配列と異なる配列からなる核酸、
（ｂ）配列番号：３または５に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１個、例えば、１個又は数個のアミノ酸残基の挿入、置換又は欠失を有する配列からなり、ケラチノサイト中でエピモルフィンとしての機能を発現するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ）配列番号：２または４に示される塩基配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １、ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ  １１の条件でアライメントして算出される配列相同性の値が、エピモルフィンとしての機能を十分に発現させる観点から、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である塩基配列からなり、かつコードされたポリペプチドがケラチノサイト中でエピモルフィンとしての機能を発現するポリペプチドである核酸、
（ｄ）配列番号：２または４に示される塩基配列に完全に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつコードされたポリペプチドがケラチノサイト中でエピモルフィンとしての機能を発現するポリペプチドである核酸などが挙げられる。
【００２１】
なお、本明細書において、前記ストリンジェントな条件とは、例えば、配列番号：２または４に示される塩基配列からなる核酸と前記核酸に対応するハイブリダイゼーション対象の核酸とを、ハイブリダイゼーション用溶液〔組成：６×ＳＳＣ（組成：０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に調整）、０．５質量％ドデシル硫酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ、５０体積％ホルムアミド〕中で、室温以上の温度、よりストリンジェントな条件として４２℃以上の温度、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で１０時間インキュベーションし、つぎに、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントな条件として０．１×ＳＳＣのイオン強度条件下で、かつ室温以上の温度、よりストリンジェントな条件として４２℃以上の温度、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で洗浄を行なう条件をいう。
【００２２】
前記核酸には、ヒトにおける皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常を十分に再現する観点から、シグナルペプチドがさらに付加されていてもよい。
【００２３】
野生型ケラチノサイトへの核酸の導入は、特に限定されないが、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いる方法〔例えば、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年発行など参照〕などによって行なうことができる。
【００２４】
細胞構造体の形態の観察は、肉眼、位相差顕微鏡などで行なうことができる。
【００２５】
本発明の評価方法は、１つの側面では、
（Ａ１）エピモルフィンを発現するケラチノサイトを含む細胞凝集物を足場となる支持体内で被験物質と接触させながら分化条件下で培養するか、または野生型ケラチノサイトを含む細胞凝集物を足場となる支持体内で被験物質および不飽和脂肪酸と接触させながら分化条件下で培養し、細胞構造体を得るステップ、
（Ｂ１）エピモルフィンを発現するケラチノサイトを含む細胞凝集物を足場となる支持体内で分化条件下で培養するか、または野生型ケラチノサイトを含む細胞凝集物を足場となる支持体内で不飽和脂肪酸と接触させながら分化条件下で培養し、細胞構造体を得るステップ、および
（Ｃ１）前記ステップ（Ａ１）で得られた細胞構造体と前記ステップ（Ｂ１）で得られた細胞構造体との間の差異に基づき、前記被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価するステップ
を含む方法（以下、「評価方法１」という）である。評価方法１は、表皮角化細胞の最終分化段階であるアポトーシスを簡便に追跡することができることから、経皮吸収性の高い皮膚外用剤としての使用を前提とした成分の有効性の評価を目的とする場合に好適である。
【００２６】
ステップ（Ａ１）では、エピモルフィンを発現するケラチノサイトを含む細胞凝集物を足場となる支持体内で被験物質と接触させながら分化条件下で培養するか、または野生型ケラチノサイトを含む細胞凝集物を足場となる支持体内で被験物質および不飽和脂肪酸と接触させながら分化条件下で培養し、細胞構造体を得る。
【００２７】
細胞凝集物は、例えば、エピモルフィンを発現するケラチノサイトまたは野生型ケラチノサイトを細胞との接着性の極めて低い表面を有する培養容器内で旋回培養することなどによって得ることができる。
【００２８】
前記旋回培養における旋回速度は、細胞凝集物を良好に形成させる観点から、好ましくは１０ｍｉｎ-１以上、より好ましくは５０ｍｉｎ-１以上であり、細胞の状態を良好に維持する観点から、好ましくは１８０ｍｉｎ-１以下、より好ましくは１５０ｍｉｎ-１以下である。
【００２９】
前記旋回培養に用いられる培養雰囲気中における二酸化炭素濃度は、ケラチノサイトの種類などによって異なることから、一概には決定することができないため、ケラチノサイトの種類などに応じて適宜設定することが好ましい。前記二酸化炭素濃度は、例えば、ケラチノサイトがヒトケラチノサイトまたはマウスケラチノサイトである場合、通常、５体積％程度である。
【００３０】
前記旋回培養における培養温度は、ケラチノサイトの種類などによって異なることから、一概には決定することができないため、ケラチノサイトの種類などに応じて適宜設定することが好ましい。前記培養温度は、例えば、ケラチノサイトがヒトケラチノサイトまたはマウスケラチノサイトである場合、通常、ケラチノサイトを良好に生育させる観点から、３６〜３８℃であることが好ましく、３６．５〜３７．５℃であることがより好ましい。
【００３１】
旋回培養に用いられる培地は、ケラチノサイトの生育に適した培地であればよい。前記培地としては、例えば、熱不活性化血清含有ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地、熱不活性化血清含有ＤＭＥＭなどが挙げられる。これらのなかでは、ケラチノサイトを良好に生育させる観点から、熱不活性化血清含有ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地が好ましい。かかる培地に用いられる熱不活性化血清としては、例えば、熱不活性化ＦＣＳなどが挙げられる。前記培地は、インスリンなどの細胞増殖促進因子を適宜含有していてもよい。
【００３２】
旋回培養に用いられる培養容器は、細胞凝集物を形成させる観点から、細胞接着性が低いことが好ましく、細胞非接着性であることがより好ましい。なお、「細胞接着性が低い」とは、細胞を播種後、好ましくは細胞凝集物の形成が完了するまで（１０時間以上）静置させても細胞が表面に接着しない程度の接着性であることをいう。
【００３３】
旋回培養における培養時間は、ケラチノサイトの種類などによって異なることから、一概には決定することができないため、ケラチノサイトの種類などに応じて適宜設定することが好ましい。前記培養時間は、例えば、ケラチノサイトがヒトケラチノサイトまたはマウスケラチノサイトである場合、通常、１０時間程度である。
【００３４】
足場となる支持体としては、例えば、コラーゲンゲル、ラミニンとエンタクチンとからなるゲル、コラーゲン、ラミニンなどを含有する合成高分子化合物などが挙げられる。合成高分子化合物としては、例えば、メチルセルロース、ポリビニルアルコールなどが挙げられる。これらのなかでは、細胞凝集物に含まれるケラチノサイトを効率よく分化させる観点から、コラーゲンゲルが好ましい。コラーゲンゲルのなかでは、細胞凝集物に含まれるケラチノサイトを効率よく分化させる観点から、Ｉ型コラーゲンからなるゲルが好ましい。
【００３５】
ステップ（Ａ１）において、支持体がコラーゲンゲルである場合、細胞凝集物は、コラーゲンゲル内に包埋して分化条件下で培養することができる。コラーゲンゲル内への細胞凝集物の包埋は、コラーゲンと培地とを含む混合物中に細胞凝集物を入れ、得られた混合物をゲル化させることによって行なうことができる。コラーゲンゲル内への細胞凝集物の包埋に用いられる培地は、旋回培養における培地と同様である。
【００３６】
分化条件下での培養は、細胞凝集物を含む支持体を培地中に浸漬させてインキュベーションすることによって行なわれる。
【００３７】
評価方法１における分化条件とは、細胞凝集物を支持体中に包埋し、ケラチノサイトの生育に適した培地中で、必要に応じて細胞凝集物の増殖および／または分化を誘導する薬剤の存在下に培養することをいう。
【００３８】
分化条件下での培養における二酸化炭素濃度および培養温度は、旋回培養における二酸化炭素濃度および培養温度と同様である。
【００３９】
分化条件下での培養に用いられる培地としては、特に限定されないが、ウシ胎仔血清をその濃度が５〜２０質量％程度となるようにケラチノサイト用無血清培地に添加した培地などが挙げられる。前記ケラチノサイト用無血清培地としては、特に限定されないが、例えば、ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地、α−ＭＥＭ、ＤＭＥＭなどが挙げられる。
【００４０】
分化条件下での培養における培養時間は、被験物質を用いなかったときに細胞凝集物中のケラチノサイトが分化して細胞クラスターが形成され、かつ細胞クラスターの内部に空間が形成される時間であればよい。前記培養時間は、前記時間を確保する観点から、好ましくは３日間以上、より好ましくは５日間以上であり、分化以外の要因により引き起こされる細胞死を抑制し、被験物質の評価の精度を向上させる観点から、好ましくは１０日以下である。
【００４１】
ステップ（Ａ１）において、エピモルフィンを発現するケラチノサイトを含む細胞凝集物を用いた場合、細胞凝集物と被験物質との接触は、分化条件下での培養に用いられる培地として、被験物質を含む培地を用い、細胞凝集物を含む支持体をかかる被験物質を含む培地に浸漬させることによって行なうことができる。この場合、培地中における被験物質の濃度は、被験物質の種類などによって異なることから、一概には決定することができないため、被験物質の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。
【００４２】
一方、ステップ（Ａ１）において、野生型ケラチノサイトを含む細胞凝集物を用いた場合、細胞凝集物と被験物質および不飽和脂肪酸との接触は、分化条件下での培養に用いられる培地として、被験物質と不飽和脂肪酸とを含む培地を用い、細胞凝集物を含む支持体を、かかる被験物質と不飽和脂肪酸とを含む培地に浸漬させることによって行なうことができる。この場合、培地中における被験物質の濃度は、被験物質の種類などによって異なることから、一概には決定することができないため、被験物質の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。また、培地中における不飽和脂肪酸の濃度は、不飽和脂肪酸の種類などによって異なることから、一概には決定することができないため、不飽和脂肪酸の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。培地中における不飽和脂肪酸の濃度は、通常、ケラチノサイトに対する不飽和脂肪酸による作用を十分に発現させる観点から、好ましくは０．０００５質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上であり、分化以外の要因により引き起こされる細胞死を抑制し、被験物質の評価の精度を向上させる観点から、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０５質量％以下である。
【００４３】
つぎに、ステップ（Ｂ１）では、エピモルフィンを発現するケラチノサイトを含む細胞凝集物を足場となる支持体内で分化条件下で培養するか、または野生型ケラチノサイトを含む細胞凝集物を足場となる支持体内で不飽和脂肪酸と接触させながら分化条件下で培養し、細胞構造体を得る。
【００４４】
ステップ（Ａ１）において、エピモルフィンを発現するケラチノサイトを用いた場合、ステップ（Ｂ１）では、エピモルフィンを発現するケラチノサイトを用いる。また、ステップ（Ａ１）において、野生型ケラチノサイトを用いた場合、ステップ（Ｂ１）では、野生型ケラチノサイトを用いる。
【００４５】
ステップ（Ｂ１）では、分化条件下での培養は、前記ステップ（Ａ１）における分化条件下での培養と同じ操作によって行なう。
【００４６】
また、ステップ（Ｂ１）で用いられる細胞凝集物、支持体、分化条件下での培養に用いられる培地、分化条件下における二酸化炭素濃度、培養温度および培養時間は、前記ステップ（Ａ１）で用いられる細胞凝集物、支持体、分化条件下での培養に用いられる培地、分化条件下における二酸化炭素濃度、培養温度および培養時間と同一である。
【００４７】
なお、ステップ（Ｂ１）において、野生型ケラチノサイトを含む細胞凝集物を用いた場合、細胞凝集物と不飽和脂肪酸との接触は、分化条件下での培養に用いられる培地として、不飽和脂肪酸とを含む培地を用い、細胞凝集物を含む支持体をかかる不飽和脂肪酸とを含む培地に浸漬させることによって行なうことができる。この場合、培地中における不飽和脂肪酸の濃度は、ステップ（Ａ１）における培地中における不飽和脂肪酸の濃度と同一である。
【００４８】
つぎに、ステップ（Ｃ１）では、前記ステップ（Ａ１）で得られた細胞構造体〔細胞構造体（Ａ１）〕と前記ステップ（Ｂ１）で得られた細胞構造体〔細胞構造体（Ｂ１）〕との間の差異に基づき、前記被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価する。
【００４９】
野生型ケラチノサイトを含む細胞凝集物を支持体内で分化条件下で培養した場合、培養時間の経過に伴い、細胞凝集物から、野生型ケラチノサイトと野生型ケラチノサイトの分化細胞とを含む細胞クラスターが形成される。この細胞クラスターでは、当該細胞クラスターの最表部から内部方向に向かって、順に、正常な皮膚と同様に、野生型ケラチノサイトを含有する基底層と、野生型ケラチノサイトの分化細胞を含有する分化細胞層である有棘層、顆粒層および角質層とが形成され、かつ最内部に空間が形成される。
【００５０】
これに対して、細胞構造体（Ｂ１）では、最内部に空間が形成されず、エピモルフィンまたは不飽和脂肪酸によって引き起こされる不全角化の状態が反映された形態が現れる。
【００５１】
ところが、被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質である場合、前記被験物質により、エピモルフィンまたは不飽和脂肪酸によって引き起こされる不全角化が抑制されることから、細胞構造体（Ａ１）は、前記細胞クラスターと同様の形態を示す。
【００５２】
したがって、ステップ（Ｃ１）では、細胞構造体（Ａ１）と細胞構造体（Ｂ１）との間の差異を調べることにより、前記差異に基づき、被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価することができる。
【００５３】
本発明の評価方法は、他の側面では、
（Ａ２）被験物質を含有する培地中でエピモルフィンを発現するケラチノサイトを培養した後、得られたケラチノサイトを、カルシウムイオノフォアを含有する培地中で分化条件下で培養するか、または不飽和脂肪酸と被験物質とを含有する培地中で野生型ケラチノサイトを培養した後、得られたケラチノサイトを、カルシウムイオノフォアを含有する培地中で分化条件下で培養し、細胞構造体を得るステップ、
（Ｂ２）カルシウムイオノフォアを含有する培地中でエピモルフィンを発現するケラチノサイトを分化条件下で培養するか、または不飽和脂肪酸を含有する培地中で野生型ケラチノサイトを培養した後、得られたケラチノサイトを、カルシウムイオノフォアを含有する培地中で分化条件下で培養し、細胞構造体を得るステップ、および
（Ｃ２）前記ステップ（Ａ２）で得られた細胞構造体と前記ステップ（Ｂ２）で得られた細胞構造体との間の差異に基づき、前記被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価するステップ
を含む方法（以下、「評価方法２」という）である。評価方法２は、表皮角化細胞の基底層から中間層への分化が簡便に追跡することができることから、皮膚分化初期に作用する不全角化の予防成分の評価を目的とする場合に好適である。
【００５４】
ステップ（Ａ２）では、被験物質を含有する培地中でエピモルフィンを発現するケラチノサイトを培養した後、得られたケラチノサイトを、カルシウムイオノフォアを含有する培地中で分化条件下で培養するか、または不飽和脂肪酸と被験物質とを含有する培地中で野生型ケラチノサイトを培養した後、得られたケラチノサイトを、カルシウムイオノフォアを含有する培地中で分化条件下で培養し、細胞構造体を得る。
【００５５】
ステップ（Ａ２）において、エピモルフィンを発現するケラチノサイトを用いる場合、まず、被験物質を含有する培地中でエピモルフィンを発現するケラチノサイトを培養し、つぎに、得られたケラチノサイトを、カルシウムイオノフォアを含有する培地中で分化条件下で培養する。この場合、培地中における被験物質の濃度は、被験物質の種類などによって異なることから、一概には決定することができないため、被験物質の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。また、培地中におけるカルシウムウイオノフォアの濃度は、被験物質を用いなかったときにコーニファイドエンベロープが形成される量となるように調整することが好ましい。培地中におけるカルシウムウイオノフォアの濃度は、通常、被験物質を用いなかったときにコーニファイドエンベロープを形成する量となるように培地中におけるカルシウムウイオノフォアの濃度を確保する観点から、好ましく０．０００２質量％以上、より好ましくは０．０００５質量％以上であり、分化以外の要因により引き起こされる細胞死を抑制し、被験物質の評価の精度を向上させる観点から、好ましくは０．００５質量％以下、より好ましくは０．００２質量％以下である。
【００５６】
一方、ステップ（Ａ２）において、野生型ケラチノサイトを用いる場合、まず、被験物質と不飽和脂肪酸とを含有する培地中で野生型ケラチノサイトを分化条件下で培養し、つぎに、得られたケラチノサイトを、カルシウムイオノフォアを含有する培地中で分化条件下で培養する。この場合、培地中における被験物質の濃度は、被験物質の種類などによって異なることから、一概には決定することができないため、被験物質に応じて適宜設定することが好ましい。また、培地中における不飽和脂肪酸の濃度は、不飽和脂肪酸の種類などによって異なることから、一概には決定することができないため、不飽和脂肪酸に応じて適宜設定することが好ましい。培地中における不飽和脂肪酸の濃度は、通常、ケラチノサイトに対する不飽和脂肪酸による作用を十分に発現させる観点から、好ましくは０．０００５質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上であり、分化以外の要因により引き起こされる細胞死を抑制し、被験物質の評価の精度を向上させる観点から、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０５質量％以下である。培地中におけるカルシウムウイオノフォアの濃度は、被験物質を用いなかったときにコーニファイドエンベロープが形成される量となるように調整することが好ましい。培地中におけるカルシウムウイオノフォアの濃度は、通常、被験物質を用いなかったときにコーニファイドエンベロープを形成する量となるように培地中におけるカルシウムイオノフォアの濃度を確保する観点から、好ましく０．０００２質量％以上、より好ましくは０．０００５質量％以上であり、分化以外の要因により引き起こされる細胞死を抑制し、被験物質の評価の精度を向上させる観点から、好ましくは０．００５質量％以下、より好ましくは０．００２質量％以下である。
【００５７】
被験物質を含有する培地は、基本培地に被験物質を添加することにより得ることができる。また、被験物質と不飽和脂肪酸とを含有する培地は、基本培地に被験物質と不飽和脂肪酸とを添加することにより得ることができる。また、カルシウムイオノフォアを含有する培地は、ケラチノサイト用無血清培地にカルシウムイオノフォアを添加することにより得ることができる。基本培地は、前記評価方法１において、分化条件下での培養に用いられる培地と同様である。
【００５８】
評価方法２における分化条件とは、ケラチノサイト用無血清培地にカルシウムイオノフォアを添加した培地中でケラチノサイトを培養することをいう。
【００５９】
分化条件下での培養における二酸化炭素濃度および培養温度は、前記評価方法１のステップ（Ａ１）における二酸化炭素濃度および培養温度と同様である。
【００６０】
分化条件下での培養における培養時間は、被験物質を用いなかったときにコーニファイドエンベロープが形成される時間となるように調整することが好ましい。培養時間は、通常、被験物質を用いなかったときにコーニファイドエンベロープが形成される時間を確保するの観点から、好ましくは３時間以上、より好ましくは５時間以上である。なお、培養時間の上限値は、評価方法の用途によって異なることから、一概には決定することができないので、評価方法の用途に応じて適宜設定することが好ましい。
【００６１】
つぎに、ステップ（Ｂ２）では、エピモルフィンを発現するケラチノサイトを、カルシウムイオノフォアを含有する培地中で分化条件下で培養するか、または野生型ケラチノサイトを、不飽和脂肪酸を含有する培地中で培養した後、得られたケラチノサイトを、カルシウムイオノフォアを含有する培地中で分化条件下で培養し、細胞構造体を得る。
【００６２】
ステップ（Ａ２）において、エピモルフィンを発現するケラチノサイトを用いた場合、ステップ（Ｂ２）では、エピモルフィンを発現するケラチノサイトを用いる。また、ステップ（Ａ２）において、野生型ケラチノサイトを用いた場合、ステップ（Ｂ２）では、野生型ケラチノサイトを用いる。
【００６３】
ステップ（Ｂ２）において、エピモルフィンを発現するケラチノサイトを用いる場合、基本培地中でエピモルフィンを発現するケラチノサイトを培養し、つぎに、得られたケラチノサイトを、カルシウムイオノフォアを含有する培地中で分化条件下で培養する。この場合、培地中におけるカルシウムウイオノフォアの濃度は、ステップ（Ａ２）における培地中におけるカルシウムイオノフォアの濃度と同一である。
【００６４】
ステップ（Ｂ２）において、野生型ケラチノサイトを用いる場合、まず、不飽和脂肪酸を含有する培地中で野生型ケラチノサイトを培養し、つぎに、得られたケラチノサイトを、カルシウムイオノフォアを含有する培地中で分化条件下で培養する。この場合、培地中における不飽和脂肪酸の濃度は、ステップ（Ａ２）における培地中における不飽和脂肪酸の濃度と同一である。また、培地中におけるカルシウムウイオノフォアの濃度は、ステップ（Ａ２）における培地中におけるカルシウムイオノフォアの濃度と同一である。
【００６５】
不飽和脂肪酸を含有する培地は、基本培地に不飽和脂肪酸を添加することにより得ることができる。基本培地は、前記評価方法１において、分化条件下での培養に用いられる培地と同様である。カルシウムイオノフォアを含有する培地は、ケラチノサイト用無血清培地にカルシウムイオノフォアを添加することにより得ることができる。
【００６６】
分化条件下での培養における二酸化炭素濃度、培養温度および培養時間は、前記評価方法１のステップ（Ａ１）における二酸化炭素濃度、培養温度および培養時間と同一である。
【００６７】
つぎに、ステップ（Ｃ２）では、前記ステップ（Ａ２）で得られた細胞構造体〔細胞構造体（Ａ２）〕と前記ステップ（Ｂ２）で得られた細胞構造体〔細胞構造体（Ｂ２）〕との間の差異に基づき、前記被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価する。
【００６８】
カルシウムイオノフォアを含有する培地中で野生型ケラチノサイトを分化条件下で培養した場合、培養時間の経過に伴い、野生型ケラチノサイトは、分化し、コーニファイドエンベロープを形成する。
【００６９】
これに対して、細胞構造体（Ｂ２）では、エピモルフィンまたは不飽和脂肪酸によって引き起こされる不全角化の状態が反映され、コーニファイドエンベロープが形成されない。
【００７０】
ところが、被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質である場合、被験物質により、エピモルフィンまたは不飽和脂肪酸によって引き起こされる不全角化が抑制されることから、細胞構造体（Ａ２）では、コーニファイドエンベロープが形成される。
【００７１】
したがって、ステップ（Ｃ２）では、細胞構造体（Ａ２）と細胞構造体（Ｂ２）との間の差異を調べることにより、前記差異に基づき、被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価することができる。
【００７２】
本発明の評価方法は、さらに他の側面では、
（Ａ３）エピモルフィンを発現するケラチノサイトの分化細胞構築物を被験物質と接触させながら分化条件下で培養するか、または野生型ケラチノサイトの分化細胞構築物を不飽和脂肪酸および被験物質と接触させながら分化条件下で培養し、細胞構造体を得るステップ、
（Ｂ３）エピモルフィンを発現するケラチノサイトの分化細胞構築物を分化条件下で培養するか、または野生型ケラチノサイトの分化細胞構築物を不飽和脂肪酸と接触させながら分化条件下で培養し、細胞構造体を得るステップ、および
（Ｃ３）前記ステップ（Ａ３）で得られた細胞構造体と前記ステップ（Ｂ３）で得られた細胞構造体との間の差異に基づき、前記被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価するステップ
を含む方法（以下、「評価方法３」という）。評価方法３は、皮膚の総合的な分化を追跡することができ、短時間で多くの成分の評価が可能であることから、外用剤に限らず内服での有効成分のスクリーニングを目的とする場合に好適である。
【００７３】
ステップ（Ａ３）では、エピモルフィンを発現するケラチノサイトの分化細胞構築物を被験物質と接触させながら分化条件下で培養するか、または野生型ケラチノサイトの分化細胞構築物を不飽和脂肪酸および被験物質と接触させながら分化条件下で培養し、細胞構造体を得る。
【００７４】
分化細胞構築物は、エピモルフィンを発現するケラチノサイトまたは野生型ケラチノサイトを、多孔性ポリマーに線維芽細胞を包埋させて得られた基材上で三次元に培養することにより得られる。
【００７５】
線維芽細胞は、ヒトにおいて、皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常を十分に再現する観点から、ヒト線維芽細胞が好ましい。前記ヒト線維芽細胞としては、例えば、ＭＲＣ−５細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１７１）、ヒト初代皮膚線維芽細胞などが挙げられる。なかでも、ケラチノサイトの培地と同じ組成で培養できることから、ＭＲＣ−５細胞が好ましい。
【００７６】
前記多孔性ポリマーとしては、例えば、コラーゲンゲル、ポリビニルアルコールなどの合成高分子化合物、キトサンなどが挙げられる。前記多孔性ポリマーには、ケラチノサイトを分化させる物質、基底膜成分と類似の成分などがさらに含まれていてもよい。
【００７７】
前記基材としては、例えば、線維芽細胞包埋コラーゲンゲルなどが挙げられる。これらの支持体のなかでは、皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常を十分に再現する観点から、線維芽細胞包埋コラーゲンゲルが好ましい。コラーゲンゲルのなかでは、ヒトの皮膚を良好に再現する観点から、Ｉ型コラーゲンからなるゲルが好ましい。線維芽細胞包埋コラーゲンゲルは、例えば、Ｉ型コラーゲンを含む溶液にヒト線維芽細胞を播種し、得られた混合物をゲル化させることにより調製することができる。前記コラーゲンゲルは、ヒト線維芽細胞が包埋されることにより、当該ヒト線維芽細胞の作用によって収縮し、真皮相当物として機能を発揮する。
【００７８】
前記基材が、ヒト線維芽細胞包埋コラーゲンゲルである場合、ケラチノサイトをヒト線維芽細胞包埋コラーゲンゲル上に接着させて当該ケラチノサイトの足場を確保する観点から、前記コラーゲンゲルの表面に、フィブロネクチンなどの細胞接着因子を存在させることが望ましい。
【００７９】
エピモルフィンを発現するケラチノサイトまたは野生型ケラチノサイトの三次元での培養に用いる培地は、評価方法１における旋回培養で用いる培地と同様である。なかでも、長期間の高密度培養に適し、かつ細胞のコロニー増殖に適する観点から、熱不活性化ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地が好ましい。
【００８０】
エピモルフィンを発現するケラチノサイト、野生型ケラチノサイトまたはこれらの分化細胞の三次元での培養は、例えば、
（１）前記基材上に、エピモルフィンを発現するケラチノサイト、野生型ケラチノサイトまたはこれらの分化細胞を播種するステップ、
（２）前記ステップ（１）で得られた播種後の基材を、培地に浸漬させて基材上のエピモルフィンを発現するケラチノサイト、野生型ケラチノサイトまたはこれらの分化細胞を培養するステップ、および
（３）前記ステップ（２）で得られた培養物におけるエピモルフィンを発現するケラチノサイト、野生型ケラチノサイトまたはこれらの分化細胞の表面を、空気と前記培地との接触面まで持ち上げて配置し、当該エピモルフィンを発現するケラチノサイト、野生型ケラチノサイトまたはこれらの分化細胞を培養するステップ、
を行なう方法（Ａｉｒ−ｌｉｆｔ法）などによって行なわれる。
【００８１】
評価方法３における分化条件とは、基材上において、エピモルフィンを発現するケラチノサイト、野生型ケラチノサイトまたはこれらの分化細胞をコンフルエントな状態まで培養し、エピモルフィンを発現するケラチノサイト、野生型ケラチノサイトまたはこれらの分化細胞の表面を、空気と培地との接触面まで持ち上げて配置して気相曝露させ、２日に一度培地交換をしながら、１４日以上培養することをいう。
【００８２】
分化条件下での培養に用いられる培地、二酸化炭素濃度および培養温度は、評価方法１における分化条件下での培養に用いられる培地、二酸化炭素濃度および培養温度と同様である。
【００８３】
分化条件下での培養における培養時間は、皮膚におけるターンオーバーを良好に再現する観点から、好ましくは１４日間以上、より好ましくは２０日間以上であり、組織を良好な状態に維持する観点から、好ましくは２８日間以下、より好ましくは２５日間以下である。
【００８４】
ステップ（Ａ３）において、エピモルフィンを発現するケラチノサイトの分化細胞構築物を用いる場合、分化細胞構築物と被験物質との接触は、分化細胞構築物におけるエピモルフィンを発現するケラチノサイトまたはこれらの分化細胞の上表面を、空気と培地との接触面まで持ち上げて配置するとともに、被験物質を含有する溶液を、分化細胞構築物の上表面に塗布し、分化細胞構築物を培養することによって行なわれる。この場合、溶液中における被験物質の濃度は、被験物質の種類などによって異なることから、被験物質に応じて適宜設定することが好ましい。
【００８５】
一方、ステップ（Ａ３）において、野生型ケラチノサイトの分化細胞構築物を用いる場合、分化細胞構築物と被験物質および不飽和脂肪酸との接触は、分化細胞構築物におけるエピモルフィンを発現するケラチノサイトまたはこれらの分化細胞の上表面を、空気と培地との接触面まで持ち上げて配置するとともに、被験物質を含有する溶液および不飽和脂肪酸を含有する溶液を分化細胞構築物の上表面に塗布し、分化細胞構築物を培養することによって行なわれる。この場合、溶液中における被験物質の濃度は、被験物質の種類などによって異なることから一概には決定することができないため、被験物質に応じて適宜設定することが好ましい。また、溶液中における不飽和脂肪酸の濃度は、不飽和脂肪酸の種類などによって異なることから一概には決定することができないため、不飽和脂肪酸に応じて適宜設定することが好ましい。溶液中における不飽和脂肪酸の濃度は、通常、被験物質を用いないときに不飽和脂肪酸による作用を発現するのに十分な量を確保する観点から、好ましくは０．０５質量％以上、より好ましくは０．３質量％以上であり、取り扱いの容易性を確保する観点から、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１質量％以下である。
【００８６】
つぎに、ステップ（Ｂ３）では、エピモルフィンを発現するケラチノサイトの分化細胞構築物を分化条件下で培養するか、または野生型ケラチノサイトの分化細胞構築物を不飽和脂肪酸と接触させながら分化条件下で培養し、細胞構造体を得る。
【００８７】
ステップ（Ｂ３）で用いられる分化細胞構築物および培地ならびに分化条件下での培養における二酸化炭素濃度、培養温度および培養時間は、ステップ（Ａ３）で用いられた分化細胞構築物および培地ならびに分化条件下での培養における二酸化炭素濃度、培養温度および培養時間と同一である。
【００８８】
ステップ（Ａ３）において、エピモルフィンを発現するケラチノサイトの分化細胞構築物を用いた場合、ステップ（Ｂ３）において、エピモルフィンを発現するケラチノサイトの分化細胞構築物を用いる。また、ステップ（Ａ３）において、野生型ケラチノサイトの分化細胞構築物を用いた場合、ステップ（Ｂ３）において、野生型ケラチノサイトの分化細胞構築物を用いる。
【００８９】
ステップ（Ｂ３）において、野生型ケラチノサイトの分化細胞構築物を用いた場合、分化細胞構築物と不飽和脂肪酸との接触は、分化細胞構築物の表面に不飽和脂肪酸を含む溶液を塗布することによって行なうことができる。この場合、不飽和脂肪酸を含む溶液中における不飽和脂肪酸の濃度は、ステップ（Ａ３）における不飽和脂肪酸を含む溶液中における不飽和脂肪酸の濃度の濃度と同一である。
【００９０】
つぎに、ステップ（Ｃ３）では、前記ステップ（Ａ３）で得られた細胞構造体と前記ステップ（Ｂ３）で得られた細胞構造体との間の差異に基づき、前記被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価する。
【００９１】
野生型ケラチノサイトの分化細胞構築物を分化条件下で培養した場合、培養時間の経過に伴い、得られた細胞構造体の最表面に核を有しない成熟した細胞が現れる。
【００９２】
これに対して、細胞構造体（Ｂ３）では、最表面に有核細胞が現れ、エピモルフィンまたは不飽和脂肪酸によって引き起こされる不全角化の状態が反映された形態が現れる。
【００９３】
ところが、被験物質が、皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質である場合、エピモルフィンまたは不飽和脂肪酸によって引き起こされる不全角化が抑制されることから、細胞構造体（Ａ３）では、最表面に核を有しない成熟した細胞が現れる。
【００９４】
したがって、ステップ（Ｃ３）では、細胞構造体（Ａ３）と細胞構造体（Ｂ３）との間の差異を調べることにより、前記差異に基づき、被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価することができる。
【００９５】
なお、本発明では、前記評価方法１のステップ（Ｃ１）、評価方法２のステップ（Ｃ２）および評価方法３のステップ（Ｃ３）それぞれにおいて、陽性対照として、例えば、式（Ｉ）：
【００９６】
【化１】
0005714842.tif 000002
【００９７】
〔式中、Ｘａａ1およびＸａａ5はそれぞれ独立して、置換基を有してもよいセリル基、置換基を有してもよいスレオニル基または置換基を有してもよいチロシニル基、Ｘａａ2は置換基を有してもよいイソロイシル基、置換基を有してもよいバリル基または置換基を有してもよいロイシル基、Ｘａａ3およびＸａａ4はそれぞれ独立して、置換基を有してもよいアスパラギニル基、置換基を有してもよいグルタミニル基、置換基を有してもよいアスパラチル基または置換基を有してもよいグルタミル基、Ｃｙｓはシステイニル基、Ｒ1は式（ＩＩ）：
【００９８】
【化２】
0005714842.tif 000003
【００９９】
（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）
で表される基または式（ＩＩＩ）：
【０１００】
【化３】
0005714842.tif 000004
【０１０１】
（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）
で表される基を示す〕
で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩などを用いてもよい。かかる環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩は、本発明の評価方法により、皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質として選別された物質である。なお、前記式（Ｉ）は、配列番号：１に対応している。
【０１０２】
Ｘａａ1は、置換基を有してもよいセリル基、置換基を有してもよいスレオニル基または置換基を有してもよいチロシニル基である。前記置換基は、本発明の効果を阻害しない官能基であればよい。前記置換基としては、例えば、単糖または多糖から誘導されたチオグリコシル基、単糖または多糖から誘導されたＯ-グリコシル基、単糖または多糖から誘導されたＮ-グリコシル基、リン酸基などが挙げられる。前記Ｘａａ1のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくはセリル基である。
【０１０３】
Ｘａａ2は、置換基を有してもよいイソロイシル基、置換基を有してもよいバリル基または置換基を有してもよいロイシル基である。前記置換基は、本発明の効果を阻害しない官能基であればよい。前記Ｘａａ2のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくはイソロイシル基である。
【０１０４】
Ｘａａ3は、置換基を有してもよいアスパラギニル基、置換基を有してもよいグルタミニル基、置換基を有してもよいアスパラチル基または置換基を有してもよいグルタミル基である。前記置換基は、本発明の目的を阻害しない官能基であればよい。Ｘａａ3が置換基を有してもよいアスパラギニル基である場合、前記置換基としては、単糖または多糖から誘導されたチオグリコシル基、単糖または多糖から誘導されたＯ-グリコシル基、単糖または多糖から誘導されたＮ-グリコシル基などが挙げられる。Ｘａａ3が置換基を有してもよいグルタミニル基である場合、前記置換基としては、アミノ基などが挙げられる。Ｘａａ3が置換基を有してもよいアスパラチル基である場合、前記置換基としては、スクシンイミド基、リン酸基などが挙げられる。Ｘａａ3が置換基を有してもよいグルタミル基である場合、前記置換基としては、カルボキシル基などが挙げられる。前記Ｘａａ3のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくはグルタミル基である。
【０１０５】
Ｘａａ4は、置換基を有してもよいアスパラギニル基、置換基を有してもよいグルタミニル基、置換基を有してもよいアスパラチル基または置換基を有してもよいグルタミル基である。前記置換基は、本発明の効果を阻害しない官能基であればよい。前記置換基としては、前記Ｘａａ3における置換基と同様のものが挙げられる。前記Ｘａａ4のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくはグルタミニル基である。
【０１０６】
Ｘａａ5は、置換基を有してもよいセリル基、置換基を有してもよいスレオニル基または置換基を有してもよいチロシニル基である。前記置換基は、本発明の効果を阻害しない官能基であればよい。前記置換基としては、前記Ｘａａ1における置換基と同様のものが挙げられる。前記Ｘａａ5のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくはセリル基である。
【０１０７】
式（Ｉ）において、ｎは、１〜１０の整数である。前記ｎは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、１０以下、好ましくは８以下であり、より好ましくは５以下、さらに好ましくは３以下、特に好ましくは１である。
【０１０８】
なお、Ｘａａ1〜Ｘａａ5、Ｒ1およびＣｙｓは、それぞれ、Ｌ−体の官能基であってもよく、Ｄ−体の官能基であってもよい。ヒトの皮膚への適応性の観点から、Ｘａａ1〜Ｘａａ5、Ｒ1およびＣｙｓは、好ましくはＬ−体の官能基である。
【０１０９】
薬理的に許容される塩としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば、無機酸塩、有機酸塩などが挙げられる。前記無機酸塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩などが挙げられる。また、有機酸塩としては、クエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩などが挙げられる。塩基付加塩としては、無機塩基塩、有機塩基塩などが挙げられる。無機塩基塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基塩としては、例えば、トリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩などの有機塩基塩などが挙げられる。
【０１１０】
式（Ｉ）で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、式（Ｉ）において、Ｘａａ1がセリル基、Ｘａａ2がイソロイシル基、Ｘａａ3がグルタミル基、Ｘａａ4がグルタミニル基、Ｘａａ5がセリル基であり、Ｒ1が式（ＩＩＩ）で表される基であり、ｎが１である化合物が好ましい。
【０１１１】
以上のように、本発明の評価方法によれば、分化条件下での培養を行なうという簡便な操作を行なうことにより、エピモルフィンの発現下または不飽和脂肪酸の存在下でのヒトの皮膚の分化の過程を再現し、エピモルフィンまたは不飽和脂肪酸によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生の過程を簡便に再現することができる。このエピモルフィンまたは不飽和脂肪酸によって引き起こされる皮膚の状態の異常は、ヒトの皮膚において、皮脂によって引き起こされる不全角化などの皮膚の状態の異常と関連していることから、本発明の評価方法によれば、簡便な操作で、被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価することができる。したがって、本発明の評価方法は、皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常を抑制する物質の開発、スクリーニング、バリデーションなどに有用である。
【実施例】
【０１１２】
つぎに、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。なお、以下において、Ｃｙｓはシステイニル基、Ｓｅｒはセリル基、Ｇｌｎはグルタミニル基、Ｇｌｕはグルタミル基、Ｉｌｅはイソロイシル基、Ｇｌｙはグリシル基を示す。
【０１１３】
（製造例１）
ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２（シグマ−アルドリッチ社製）に、熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を濃度が１０質量％となるように添加し、熱不活性化ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地（以下、「ＤＨ１０培地」という）を得た。
【０１１４】
正常ヒト表皮ケラチノサイト細胞株であるＨａＣａＴ細胞を、前記ＤＨ１０培地中、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で培養した。
【０１１５】
マウスエピモルフィンをコードするｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｅ０６６２９、配列番号：２）におけるエピモルフィンのＮ末端側に対応する部位に、Ｔ７−タグをコードするＤＮＡ（配列番号：６）を付加し、Ｔ７−タグエピモルフィンをコードするｃＤＮＡを調製した。つぎに、前記Ｔ７−タグエピモルフィンをコードするｃＤＮＡを、レトロウイルス発現ベクターｐＱＣＸＩＮ（クローンテック社製）のＥｃｏＲＩ認識部位に挿入し、Ｔ７−タグエピモルフィン用発現プラスミドを調製した。
【０１１６】
得られたＴ７−タグエピモルフィン用発現プラスミドを、遺伝子導入用試薬（インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミンおよびインビトロジェン社製、商品名：プラス試薬）を用いてパッケージング細胞〔クローンテック社製、ＰＴ６７細胞（マウス線維芽細胞由来細胞）〕に導入した。つぎに、得られた細胞のうち、５００μｇ/ｍＬのジェネティシン（ギブコ・ラボラトリー社製、商品名：Ｇ４１８）に対して耐性能を示す細胞から培養上清を回収した。回収された培養上清中から、レトロウイルスを得た。得られたレトロウイルスを前記ＨａＣａＴ細胞に感染させ、５００μｇ／ｍＬジェネティシン（ギブコ・ラボラトリー社製、商品名：Ｇ４１８）の存在下に、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で８日間培養した。その後、培養後の細胞におけるエピモルフィン発現を調べることにより、Ｔ７−タグエピモルフィンを産生するケラチノサイト（ＨａＣａＴ−ＴＥ細胞）を単離した。
【０１１７】
（製造例２）
ＰＴ６７細胞を、ＤＨ１０培地中、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で培養した。
【０１１８】
前記製造例１のＴ７−タグエピモルフィン用発現プラスミドを、遺伝子導入用試薬（インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミンおよびインビトロジェン社製、商品名：プラス試薬）を用いて、ＰＴ６７細胞に導入した。つぎに、得られた細胞を、５００μｇ／ｍＬジェネティシン（ギブコ・ラボラトリー社製）の存在下に、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で８日間培養した。その後、培養後の細胞におけるエピモルフィン発現を調べることにより、Ｔ７−タグエピモルフィンを産生する線維芽細胞（ＰＴ６７−ＴＥ細胞）を単離した。
【０１１９】
（製造例３）
ＩＬ−２シグナルペプチドをコードする核酸（配列番号：７）を、エピモルフィンをコードするｃＤＮＡ（配列番号：２）におけるエピモルフィンのＮ末端に対応する部位に付加し、ＩＬ−２シグナルペプチド結合エピモルフィンをコードする核酸を得た。得られた核酸をレトロウイルス発現ベクター（クローンテック社製、商品名：ｐＱＣＸＩＮ）のＥｃｏＲＩ認識部位に挿入して、細胞表面エピモルフィン用発現プラスミドを調製した。
【０１２０】
得られた細胞表面エピモルフィン用発現プラスミドを、商品名：リポフェクタミン（インビトロジェン社製）およびプラス試薬（インビトロジェン社製）を用いてＰＴ６７に導入した。前記製造例１と同様にして得られたレトロウイルスをＨａＣａＴ細胞に感染させた。つぎに、得られた細胞を、５００μｇ／ｍＬジェネティシン（ギブコ・ラボラトリー社製、商品名：Ｇ４１８）の存在下に、５体積％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で８日間培養した。その後、培養後の細胞におけるエピモルフィン発現を調べることにより、細胞外エピモルフィンを産生する細胞（ＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞）を単離した。
【０１２１】
（実験例１）
ＨａＣａＴ細胞をＤＨ１０培地（実験番号：１）、０．０１体積％オレイン酸含有ＤＨ１０培地（実験番号：２）または０．０２５体積％オレイン酸含有ＤＨ１０培地（実験番号：３）中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で３日間培養した。
【０１２２】
培養後の細胞を単離し、得られた細胞を可溶化試薬〔組成：２体積％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０体積％グリセロール、５体積％２−メルカプトエタノール、０．００８体積％ブロモフェノールブルー、０．６５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ約６．８）〕に溶解させることによって細胞抽出液を得た。
【０１２３】
得られた細胞抽出液と抗エピモルフィン抗体〔Ｒ＆Ｄシステムズ社製〕とを用いてウエスタンブロッティングを行ない、ＨａＣａＴ細胞における内因性エピモルフィンの発現量を調べた。なお、抗エピモルフィン抗体の代わりに抗β−アクチン抗体を用いたことを除き、前記と同様にして、ＨａＣａＴ細胞におけるβ―アクチンの発現量を調べた。
【０１２４】
実験例１において、培地の種類とＨａＣａＴ細胞における内因性エピモルフィンの発現量との関係を調べた結果を図１に示す。図１中、レーン１は実験番号：１の培地を用いたときの内因性エピモルフィンに対応するバンド、レーン２は実験番号：２の培地を用いたときの内因性エピモルフィンに対応するバンド、レーン３は、実験番号：３の培地を用いたときの内因性エピモルフィンに対応するバンドを示す。
【０１２５】
図１に示された結果から、ＨａＣａＴ細胞における内因性エピモルフィンの発現量は、実験番号：１〜３のいずれの培地を用いた場合であっても同程度であることがわかる。なお、ＨａＣａＴ細胞におけるβ―アクチンの発現量も、実験番号：１〜３のいずれの培地を用いた場合であっても同程度であることがわかる。したがって、これらの結果から、オレイン酸は、ＨａＣａＴ細胞における内因性エピモルフィンの発現量にはほとんど影響を与えないことがわかる。
【０１２６】
（実験例２）
製造例１で得られたＨａＣａＴ−ＴＥ細胞または製造例２で得られたＰＴ６７−ＴＥ細胞をＤＨ１０培地（実験番号：４）、０．０１体積％オレイン酸含有ＤＨ１０培地（実験番号：５）または０．０２５体積％オレイン酸含有ＤＨ１０培地（実験番号：６）中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で３日間培養した。また、製造例１で得られたＨａＣａＴ−ＴＥ細胞または製造例２で得られたＰＴ６７−ＴＥ細胞に対して、照射量が１０ｍＪ／ｃｍ2となるように紫外線Ｂ（ＵＶＢ）を照射し、その後、ＤＨ１０培地中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で３日間培養した（実験番号７）。
【０１２７】
得られた培養物を遠心分離〔１０００×ｇ、３０分間〕に供し、培養上清を得た。
【０１２８】
得られた培養上清から、抗Ｔ７タグ抗体〔ノバジェン社製〕と、プロテインＧセファロースビーズ〔ＧＥヘルスケア製〕とを用いて、分泌エピモルフィンを回収した。回収された分泌エピモルフィンとＨＲＰ標識抗Ｔ７タグ抗体〔ノバジェン社製〕とを用いてウエスタンブロッティングを行ない、ＨａＣａＴ−ＴＥ細胞の培養上清およびＰＴ６７−ＴＥ細胞の培養上清それぞれにおける分泌エピモルフィンの量を調べた。
【０１２９】
実験例２において、培地の種類とＨａＣａＴ−ＴＥ細胞の培養上清およびＰＴ６７−ＴＥ細胞の培養上清それぞれにおける分泌エピモルフィンの量の関係を調べた結果を図２に示す。図２中、レーン１は実験番号：４の培地を用いたときの分泌エピモルフィンに対応するバンド、レーン２は実験番号：５の培地を用いたときの分泌エピモルフィンに対応するバンド、レーン３は、実験番号：６の培地を用いたときの分泌エピモルフィンに対応するバンド、レーン４は、実験番号：７の培地を用いたときの分泌エピモルフィンに対応するバンドを示す。
【０１３０】
図２に示された結果から、ケラチノサイトであるＨａＣａＴ−ＴＥ細胞の培養上清における分泌エピモルフィンの量は、オレイン酸の濃度が最も高い実験番号：６の培地を用いた場合、最も多く、ＵＶＢが照射されたＨａＣａＴ−ＴＥ細胞の培養上清における分泌エピモルフィンの量と同程度であることがわかる。一方、ＨａＣａＴ−ＴＥ細胞の培養上清における分泌エピモルフィンの量は、オレイン酸を含まない実験番号：４の培地を用いた場合、最も低くなることがわかる。これに対して、線維芽細胞であるＰＴ６７−ＴＥ細胞の培養上清においては、オレイン酸の濃度とは関係なく、分泌エピモルフィンが検出されないことがわかる。これらの結果から、オレイン酸は、ケラチノサイトからのエピモルフィンの分泌を引き起こすことがわかる。したがって、オレイン酸により引き起こされる皮膚の不全角化とエピモルフィンにより引き起こされる皮膚の状態の異常とが関連していることが示唆される。
【０１３１】
（製造例４）
式（Ｉ）において、Ｘａａ1がセリル基、Ｘａａ2がイソロイシル基を示し、Ｘａａ3がグルタミル基、Ｘａａ4がグルタミニル基、Ｘａａ5がセリル基であり、ｎ＝１である化合物を以下のようにして、合成した。
【０１３２】
（１）ペプチドの合成
出発原料として、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）樹脂〔２-クロロトリチルクロライド樹脂１ｇあたりＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）の量が０．７０ｍｍｏｌ〕０．２５ｍｍｏｌ相当量を、自動ペプチド合成装置〔アプライド・バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）社製、商品名：４３０Ａ〕に入れた。
【０１３３】
まず、自動ペプチド合成装置のプログラムの制御下に、Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体であるＦｍｏｃ−Ｓｅｒ(ＯＢｕ)２ｍｍｏｌをカップリング剤〔０．４５Ｍ  Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（以下、「ＨＢＴｕ」という）と０．４５Ｍ１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（以下、「ＨＯＢｔ」という）とを含むジメチルホルムアミド〕で活性化させ、前記反応槽に入れた。これにより、前記反応槽内において、樹脂上のアミノ酸残基とＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体とのカップリング反応を行ない、Ｆｍｏｃ基保護ペプチド鎖を生成した。
【０１３４】
つぎに、樹脂上のＦｍｏｃ基保護ペプチド鎖中におけるＦｍｏｃ基を２０体積％ピペリジン含有Ｎ−メチルピロリドン溶液で除去し（脱保護）、洗浄した。その後、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−ＧｌｙおよびＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）をこの順で用いて前記と同様の操作を行なうことにより、配列番号：８に示されるアミノ酸配列にしたがって、対応するＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体を樹脂上のＦｍｏｃ基保護ペプチド鎖に逐次導入し、配列番号：８に示されるアミノ酸配列を有するＦｍｏｃ基保護ペプチドを含む樹脂を得た。なお、カップリング反応の成否は、カイザーテストを行なうことにより適宜確認した。
【０１３５】
得られたＦｍｏｃ基保護ペプチドを含む樹脂を、トリフルオロ酢酸（以下、「ＴＦＡ」という）とトリイソプロピルシラン（以下、「ＴＩＳ」という）と水とエタンジチオール（以下、「ＤＴ」という）の混合液〔ＴＦＡ／ＴＩＳ／水／ＤＴ（体積比）が９２．５／２．５／２．５／２．５〕中、室温で２時間インキュベーションして脱保護および樹脂からのペプチド鎖の切り出しを行なった。インキュベーション後の混合液から２-クロロトリチルクロライド樹脂をろ別し、ろ液を得た。得られたろ液を減圧下に濃縮して当該ろ液からＴＦＡを留去した。得られた残渣に、冷却ジエチルエーテルを添加して、ペプチドの粗生成物の沈殿物約７００ｍｇを回収した。
【０１３６】
得られた粗生成物約７００ｍｇを、逆相カラム〔ゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）社製、オクタデシルシリカカラム、カラムの内径：３０ｍｍ、カラムの長さ２５０ｍｍ〕を備えた高速液体クロマトグラフィー分取装置〔（株）島津製作所製、商品名：モデルＬＣ８Ａ〕に供した。そして、０．１体積％トリフルオロ酢酸水溶液と０．１体積％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液とを用い、溶離液中のアセトニトリルの濃度勾配が１〜６０体積％となるように溶離液中のアセトニトリルの濃度を調整しながら、流速：１．０ｍＬ／分で２５分間クロマトグラフィーを行なった。目的のペプチドを含む画分を回収し、前記画分からアセトニトリルを留去した。つぎに、残渣を凍結乾燥させ、目的のペプチドのトリフルオロ酢酸塩１１０ｍｇを得た。その後、目的のペプチドのトリフルオロ酢酸塩を脱塩し、目的のペプチド（直鎖状ペプチド）を得た。なお、カイザーテストの結果から、前記ペプチドは、配列番号：８に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることが確認された。
【０１３７】
（２）ペプチドの環化
前記（１）で得られたペプチド１１０ｍｇ（０．１３５ｍｍｏｌ）を５０体積％酢酸水溶液１３０ｍＬに添加した。得られた混合物に、０．５Ｍヨウ素水溶液２１０μＬ（０．８当量）を添加し、撹拌しながら室温で３時間混合した。これにより、ペプチド中の２つのシステイニル基のチオール基を酸化して、ジスルフィド結合を形成させた。その後、得られた混合物にアスコルビン酸７０ｍｇを添加した。
【０１３８】
つぎに、得られた混合物を、逆相カラム〔ズルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）社製、オクタデシルシリカカラム、カラムの内径：３０ｍｍ、カラムの長さ２５０ｍｍ〕を備えた逆相高速クロマトグラフィー分取装置〔（株）島津製作所製、商品名：モデルＬＣ８Ａ〕に供した。そして、０．１体積％トリフルオロ酢酸水溶液と０．１体積％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液とを用い、溶離液中のアセトニトリルの濃度勾配が１〜６０体積％となるように溶離液中のアセトニトリルの濃度を調整しながら、流速：１．０ｍＬ／分で２５分間クロマトグラフィーを行なった。これにより、生成物２０ｍｇを得た。
【０１３９】
（３）環状ペプチド化合物の確認
前記（１）で得られたペプチドおよび前記（２）で得られた生成物（酸化後のペプチド）それぞれを質量分析装置〔（株）島津製作所製、商品名：ＬＣ−ＭＳ−２０１０〕に供し、前記（１）で得られたペプチドおよび前記（２）で得られた酸化後のペプチドそれぞれのマススペクトルを調べた。製造例４において、ペプチドのマススペクトルを図３に、製造例４において、酸化後のペプチドのマススペクトルを図４に示す。
【０１４０】
図３に示された結果から、前記（１）で得られたペプチドのマススペクトルでは、配列番号：８に示されるアミノ酸配列からなるペプチドの理論値付近の８２６．２ｍ／ｚにピークが見られることがわかる。この結果から、前記（１）で得られたペプチドが配列番号：８に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることが裏付けられた。
【０１４１】
また、図３および４に示された結果から、前記（１）で得られたペプチドのマススペクトルでは、８２６．２ｍ／ｚにピークが見られるのに対して（図３参照）、前記（２）で得られた酸化後のペプチドのマススペクトルでは、水素原子２個分少ない８２４．２ｍ／ｚにピークが見られることがわかる。これらの結果から、前記（２）で得られた酸化後のペプチドは、２つのシステイニル基間でジスルフィド結合が形成されることによって、前記（１）で得られたペプチドが環化されていることが裏付けられた。したがって、前記（２）で得られた酸化後のペプチドは、式（Ｉ）において、Ｘａａ1がセリル基、Ｘａａ2がイソロイシル基、Ｘａａ3がグルタミル基、Ｘａａ4がグルタミニル基、Ｘａａ5がセリル基であり、Ｒ1が式（ＩＩＩ）で表される基であり、ｎが１である環状ペプチド化合物であることがわかる。なお、前記環状ペプチド化合物の純度を高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」という）で調べたところ、９８．２％であることが確認された。
【０１４２】
（製造例５）
（１）直鎖状ペプチドの調製
製造例４において、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）樹脂の代わりにＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｕ）−Ａｌｋｏ−樹脂〔樹脂１ｇあたりＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｕ）の量が０．７０ｍｍｏｌ〕０．２５ｍｍｏｌ相当量を用いたことと、Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体として、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−ＧｌｙおよびＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）をこの順に用いる代わりに、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−ＩｌｅおよびＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＢｕ）をこの順に用いたことを除き、製造例４と同様に操作を行ない、配列番号：９に示されるアミノ酸配列からなる直鎖状ペプチドを得た。
【０１４３】
（実施例１）
（１）被験試料の調製
被験物質として製造例４で得られた環状ペプチド化合物をその濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように精製水に溶解させ、被験試料１を得た。また、被験物質として製造例５で得られた直鎖状ペプチドをその濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように精製水に溶解させ、被験試料２を得た。
【０１４４】
（２）培地の調製
以下の実験において、ＤＨ１０培地を実験番号：８の培地として用いた。また、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液を、オレイン酸の濃度が０．０５体積％となるようにＤＨ１０培地に添加し、培地を得た（実験番号：９）。さらに、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と被験試料２とを、オレイン酸の濃度が０．０５体積％となり、かつ直鎖状ペプチドの濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加し、培地を得た（実験番号：１０）。また、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と被験試料１とを、オレイン酸の濃度が０．０５体積％となり、かつ環状ペプチド化合物の濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加し、培地を得た（実験番号：１１）。
【０１４５】
（３）細胞クラスターの形成および内腔形成率の算出
ＨａＣａＴ細胞（野生型ケラチノサイト）を、ＤＨ１０培地中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で培養した。
【０１４６】
つぎに、得られたＨａＣａＴ細胞を、１０００Ｕ／ｍＬ  ＤＮアーゼＩ（シグマ−アルドリッチ社製）含有ＤＨ１０培地３５０μＬに懸濁した。得られた懸濁物を、２４−ウェルディッシュ（コーニング社製、超低接着表面）中、１００ｍｉｎ-1で回転させながら、５体積％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で２４時間旋回培養して、平滑で丸い細胞凝集物を形成させた。
【０１４７】
形成された細胞凝集物を、０．５質量％タイプＩＡコラーゲン溶液〔（株）高研製〕で調製された高密度のコラーゲンゲル中に包埋した。前記コラーゲンゲルは、細胞の足場となる支持体である。
【０１４８】
つぎに、包埋後の細胞凝集物を、実験番号８：の培地、実験番号：９の培地、実験番号：１０の培地または実験番号：１１の培地中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で４日間培養して、細胞クラスター（細胞構造体）を形成させた。得られた細胞クラスターの形態を位相差顕微鏡下で観察した。
【０１４９】
細胞クラスター内において、最外層の細胞は、コラーゲンと接しているために未分化状態を保持している。しかしながら、前記最外層に存在する未分化状態の細胞の内側に位置する細胞は、通常、速やかに分化を開始し、アノイキスに至る。そのため、前記細胞クラスターでは、正常状態では培養開始から３〜４日間経過時において、容易に判別できる内腔が形成される。そこで、ランダムに選択された１００個の細胞クラスターを観察し、全１００個の細胞クラスターにおける明らかな内腔形成が見られた細胞クラスターの割合を調べることにより、内腔形成率を算出した。
【０１５０】
実施例１において、実験番号：１１の培地を用いたときの細胞クラスター（細胞構造体）の形態を観察した結果を図５（Ａ）に、実施例１において、実験番号：１０の培地を用いたときの細胞クラスター（細胞構造体）の形態を観察した結果を図５（Ｂ）に示す。図中、スケールバーは１００μｍの長さを示す。
【０１５１】
また、実施例１において、培地の種類と内腔形成率との関係を調べた結果を図６に示す。図中、レーン１は実験番号：８の培地を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率、レーン２は実験番号：９の培地を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率、レーン３は実験番号：１０の培地を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率、レーン４は実験番号：１１の培地を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率を示す。
【０１５２】
図５（Ａ）、図５（Ｂ）および図６に示された結果から、実験番号：１１の培地を用いたときの細胞クラスターは、内腔形成率が高いのに対して、実験番号：１０の培地を用いたときの細胞クラスターは、内腔形成率が低いことがわかる。これらの結果から、被験試料１を含む実験番号：１１の培地は、オレイン酸により引き起こされる細胞クラスターにおける内腔形成の異常の発生を抑制しているが、被験試料２を含む実験番号：１０の培地は、オレイン酸によって引き起こされる細胞クラスターにおける内腔形成の異常の発生を抑制していないことがわかる。
【０１５３】
前記細胞クラスターにおける内腔形成は、皮膚における分化や状態を反映していることから、オレイン酸によって引き起こされる細胞クラスターにおける内腔形成の異常は、皮脂中に多く含まれているオレイン酸などの不飽和脂肪酸によって引き起こされる皮膚の状態の異常の１つである不全角化を再現していると考えられる。したがって、被験試料１中に含まれる環状ペプチド化合物は、皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であることが示唆される。
【０１５４】
以上の結果から、野生型ケラチノサイトを含む細胞凝集物を、被験試料およびオレイン酸などの不飽和脂肪酸と接触させながら足場となる支持体内で分化条件下で培養して得られた細胞構造体と、野生型ケラチノサイトを含む細胞凝集物を、不飽和脂肪酸と接触させながら足場となる支持体内で分化条件下で培養して得られた細胞構造体との間の差異に基づき、被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価することができることが示唆される。
【０１５５】
（実施例２）
被験物質として、式（Ｉ）で表される環状ペプチド化合物のうち、製造例４で得られた環状ペプチド化合物以外の化合物を用い、実施例１と同様の操作を行ない、当該被験物質が、皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価する。
【０１５６】
その結果、かかる被験物質は、製造例４で得られた環状ペプチド化合物と同様の傾向を示すことがわかる。
【０１５７】
（実施例３）
（１）培地の調製
以下の実験において、ＤＨ１０培地を実験番号：１２の培地として用いた。精製水１μＬをＤＨ１０培地１ｍＬに添加し、培地を得た（実験番号：１３）。さらに、実施例１（１）で得られた被験試料２を直鎖状ペプチドの濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加し、培地を得た（実験番号：１４）。また、実施例１（１）で得られた被験試料１を環状ペプチド化合物の濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加し、培地を得た（実験番号：１５）。
【０１５８】
（２）細胞クラスター（細胞構造体）の形成および内腔形成率の算出
実施例１において、ＨａＣａＴ細胞の代わりに製造例３で得られたＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞を用いたことと、実施例１において、実験番号８：の培地、実験番号：９の培地、実験番号：１０の培地または実験番号：１１の培地の代わりに実験番号１２：の培地、実験番号：１３の培地、実験番号：１４の培地または実験番号：１５の培地を用いたこととを除き、実施例１と同様に操作を行ない、内腔形成率を算出した。
【０１５９】
実施例３において、実験番号：１５の培地を用いたときの細胞クラスター（細胞構造体）の形態を観察した結果を図７（Ａ）に、実施例３において、実験番号：１４の培地を用いたときの細胞クラスター（細胞構造体）の形態を観察した結果を図７（Ｂ）に示す。図中、スケールバーは１００μｍの長さを示す。
【０１６０】
また、実施例３において、培地の種類と内腔形成率との関係を調べた結果を図８に示す。図中、レーン１は実験番号：１２の培地を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率、レーン２は実験番号：１３の培地を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率、レーン３は実験番号：１４の培地を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率、レーン４は実験番号：１５の培地を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率を示す。図中、データは、３回の計数に基づくものであり、平均±標準誤差で示す。また、図中、＊は、Ｐ＜０．０５である。
【０１６１】
図７（Ａ）、図７（Ｂ）および図８に示された結果から、実験番号：１５の培地を用いたときの細胞クラスターは、内腔形成率が高いのに対して、実験番号：１４の培地を用いたときの細胞クラスターは、内腔形成率が低いことがわかる。これらの結果から、被験試料１を含む実験番号：１４の培地は、エピモルフィンにより引き起こされる細胞クラスターにおける内腔形成の異常の発生を抑制しているが、被験試料２を含む実験番号：１５の培地は、エピモルフィンにより引き起こされる細胞クラスターにおける内腔形成の異常の発生を抑制していないことがわかる。
【０１６２】
前記細胞クラスターにおける内腔形成は、皮膚における分化や状態を反映している。また、前記実験例２に示された結果から、オレイン酸により引き起こされる皮膚の不全角化とエピモルフィンにより引き起こされる皮膚の状態の異常とが関連していることが示唆されている。したがって、被験試料１に含まれる環状ペプチド化合物は、皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であることが示唆される。
【０１６３】
以上の結果から、エピモルフィンを発現するケラチノサイトを含む細胞凝集物を、被験試料と接触させながら足場となる支持体内で分化条件下で培養して得られた細胞構造体と、エピモルフィンを発現するケラチノサイトを含む細胞凝集物を、足場となる支持体内で分化条件下で培養して得られた細胞構造体との間の差異に基づき、被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価することができることが示唆される。
【０１６４】
（実施例４）
被験物質として、式（Ｉ）で表される環状ペプチド化合物のうち、製造例４で得られた環状ペプチド化合物以外の化合物を用い、実施例３と同様の操作を行ない、当該被験物質が、皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価する。
【０１６５】
その結果、かかる被験物質は、製造例４で得られた環状ペプチド化合物と同様の傾向を示すことがわかる。
【０１６６】
（実施例５）
（１）培地の調製
以下の実験において、ＤＨ１０培地を実験番号：１６の培地として用いた。また、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液をオレイン酸の濃度が０．０２体積％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：１７）。さらに、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と実施例１（１）で得られた被験試料２とを、オレイン酸の濃度が０．０２体積％となり、かつ直鎖状ペプチドの濃度が０．０００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：１８）。また、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と実施例１（１）で得られた被験試料１とを、オレイン酸の濃度が０．０２体積％となり、かつ環状ペプチド化合物の濃度が０．０００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：１９）。１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と実施例１（１）で得られた被験試料２とを、オレイン酸の濃度が０．０２体積％となり、かつ直鎖状ペプチドの濃度が０．００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：２０）。１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と実施例１（１）で得られた被験試料１とを、オレイン酸の濃度が０．０２体積％となり、かつ環状ペプチド化合物の濃度が０．００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：２１）。また、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と実施例１（１）で得られた被験試料２とを、オレイン酸の濃度が０．０２体積％となり、かつ直鎖状ペプチドの濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：２２）。１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と実施例１（１）で得られた被験試料１とを、オレイン酸の濃度が０．０２体積％となり、かつ環状ペプチド化合物の濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：２３）。
【０１６７】
（２）コーニファイドエンベロープ形成率の算出
ＨａＣａＴ細胞を、実験番号：１６〜２３のいずれかの培地中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で３日間培養した。
【０１６８】
つぎに、得られたＨａＣａＴ細胞を、リン酸緩衝生理的食塩水で洗浄し、ついで、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液〔シグマ（ＳＩＧＭＡ）社製〕５００μＬ中において、３７℃で３分間インキュベーションした。
【０１６９】
その後、得られたＨａＣａＴ細胞を１．０×１０５細胞／ｍＬとなるように無血清ＤＨ培地（ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２、シグマーアルドリッチ社製）に懸濁した。得られた懸濁液に、カルシウム流入を引き起こすカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（シグマ−アルドリッチ社製）を濃度が２０ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、得られた混合物中に含まれるＨａＣａＴ細胞を５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で５時間培養した。
【０１７０】
得られた細胞をリン酸緩衝化生理的食塩水で洗浄した。洗浄後の細胞を可溶化液〔組成：２質量％ＳＤＳ、２０ｍＭジチオスレイトール、残部精製水〕中で１０分間インキュベーションした。その後、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７によるカルシウム流入後の不溶性コーニファイドエンベロープに起因する残存不溶化細胞の数を光学顕微鏡下で計数し、全細胞の数と残存不溶化細胞の数とを用い、コーニファイドエンベロープ形成率を算出した。
【０１７１】
実施例５において、培地の種類とコーニファイドエンベロープ形成率との関係を調べた結果を図９に示す。図中、１は実験番号：１６の培地を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、２は実験番号：１７の培地を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、３は実験番号：１８の培地を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、４は実験番号：１９の培地を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、５は実験番号：２０の培地を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、６は実験番号：２１の培地を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、７は実験番号：２２の培地を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、８は実験番号：２３の培地を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率を示す。図中、データは、３回の計数に基づくものであり、平均±標準誤差で示す。また、図中、＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１である。
【０１７２】
図９に示された結果から、被験試料１を含む実験番号：１９（図中、４）、２１（図中、６）および２３（図中、８）の培地それぞれを用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率は、被験試料２を含む実験番号：１８（図中、３）、２０（図中、５）および２２（図中、７）の培地それぞれを用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率と比べて高くなっていることがわかる。
【０１７３】
コーニファイドエンベロープの形成は、皮膚における分化や状態を反映していることから、オレイン酸存在下におけるコーニファイドエンベロープ形成率は、皮膚の不全角化の場合のコーニファイドエンベロープ形成率と相関していると考えられる。したがって、被験試料１中に含まれる環状ペプチド化合物は、皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であることが示唆される。
【０１７４】
以上の結果から、野生型ケラチノサイトを、被験物質とオレイン酸などの不飽和脂肪酸とカルシウムイオノフォアとを含有する培地中で分化条件下で培養して得られた細胞構造体と、野生型ケラチノサイトを、不飽和脂肪酸とカルシウムイオノフォアとを含有する培地中で分化条件下で培養して得られた細胞構造体との間の差異に基づき、被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価することができることが示唆される。
【０１７５】
（実施例６）
被験物質として、式（Ｉ）で表される環状ペプチド化合物のうち、製造例４で得られた環状ペプチド化合物以外の化合物を用い、実施例５と同様の操作を行ない、当該被験物質が、皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価する。
【０１７６】
その結果、かかる被験物質は、製造例４で得られた環状ペプチド化合物と同様の傾向を示すことがわかる。
【０１７７】
（実施例７）
（１）培地の調製
以下の実験において、ＤＨ１０培地を実験番号：２４または２５の培地として用いた。実施例１（１）で得られた被験試料２を、直鎖状ペプチドの濃度が０．０００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：２６）。また、実施例１（１）で得られた被験試料１を、環状ペプチド化合物の濃度が０．０００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：２７）。実施例１（１）で得られた被験試料２を、直鎖状ペプチドの濃度が０．００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：２８）。実施例１（１）で得られた被験試料１を、環状ペプチド化合物の濃度が０．００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：２９）。また、実施例１（１）で得られた被験試料２を、直鎖状ペプチドの濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：３０）。実施例１（１）で得られた被験試料１を、環状ペプチド化合物の濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：３１）。
【０１７８】
（２）コーニファイドエンベロープ形成率の算出
ＨａＣａＴ細胞を、実験番号：２４の培地中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で３日間培養した。
【０１７９】
また、ＨａＣａＴ-ＥＰＭ細胞を用いた場合、ＨａＣａＴ-ＥＰＭ細胞を、実験番号：２５〜３１のいずれかの培地中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で３日間培養した。
【０１８０】
つぎに、得られたＨａＣａＴ細胞またはＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞を、リン酸緩衝生理的食塩水で洗浄し、ついで、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液５００μＬ中において、３７℃で３分間インキュベーションした。
【０１８１】
その後、得られたＨａＣａＴ細胞またはＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞を１．０×１０５細胞／ｍＬとなるように無血清ＤＨ培地に懸濁した。得られた懸濁液に、カルシウム流入を引き起こすカルシウムイオノフォアＡ２３１８７を濃度が２０ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、得られた混合物中に含まれるＨａＣａＴ細胞を５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で５時間培養した。
【０１８２】
実施例５と同様の操作を行なって、コーニファイドエンベロープ形成率を算出した。
【０１８３】
実施例７において、培地の種類または細胞の種類とコーニファイドエンベロープ形成率との関係を調べた結果を図１０に示す。図中、１は実験番号：２４の培地を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、２は実験番号：２５の培地を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、３は実験番号：２６の培地を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、４は実験番号：２７の培地を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、５は実験番号：２８の培地を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、６は実験番号：２９の培地を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、７は実験番号：３０の培地を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、８は実験番号：３１の培地を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率を示す。図中、データは、３回の計数に基づくものであり、平均±標準誤差で示す。また、図中、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１である。
【０１８４】
図１０に示された結果から、被験試料１を含む実験番号：２７（図中、４）、２９（図中、６）および３１（図中、８）の培地それぞれを用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率は、被験試料２を含む実験番号：２６（図中、３）、２８（図中、５）および３０（図中、７）の培地それぞれを用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率と比べて高くなっていることがわかる。コーニファイドエンベロープの形成は、皮膚における分化や状態を反映していることから、エピモルフィンを発現させたときにおけるコーニファイドエンベロープの形成率は、皮膚の不全角化の場合のコーニファイドエンベロープの形成率と相関していると考えられる。したがって、被験試料１中に含まれる環状ペプチド化合物は、皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であることが示唆される。
【０１８５】
以上の結果から、エピモルフィンを発現するケラチノサイトを、被験物質とカルシウムイオノフォアとを含有する培地中で分化条件下で培養して得られた細胞構造体と、エピモルフィンを発現するケラチノサイトを、カルシウムイオノフォアを含有する培地中で分化条件下で培養して得られた細胞構造体との間の差異に基づき、被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価することができることが示唆される。
【０１８６】
（実施例８）
被験物質として、式（Ｉ）で表される環状ペプチド化合物のうち、製造例４で得られた環状ペプチド化合物以外の化合物を用い、実施例７と同様の操作を行ない、当該被験物質が、皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価する。
【０１８７】
その結果、かかる被験物質は、製造例４で得られた環状ペプチド化合物と同様の傾向を示すことがわかる。
【０１８８】
（実施例９）
（１）試料の調製
以下の実験において、ＤＨ１０培地を実験番号：３２の試料として用いた。精製水１μＬをＤＨ１０培地１ｍＬに添加し、試料を得た（実験番号：３３）。また、実施例１（１）で得られた被験試料１を環状ペプチド化合物の濃度が０．００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：３４）。比較例１（１）で得られた被験試料２を直鎖状ペプチドの濃度が０．００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：３５）。
【０１８９】
（２）三次元培養で得られた細胞構造体の組織形態の観察
ヒト胎児肺線維芽細胞のＭＲＣ−５細胞を、１０質量％熱不活性化ＦＣＳを含有するα−ＭＥＭ（ギブコ・ラボラトリー社製）１０ｍＬ中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で７２時間培養した。
【０１９０】
２４ウェル培養プレートのウェル内に支持体〔ＢＤバイオサイエンス社製、商品名：セルカルチャーインサート〕を設置した。前記支持体中において、前記ＭＲＣ−５細胞とコラーゲンゲル混合溶液（コラーゲンＩ型、新田ゼラチン株式会社製）とを混合した。得られた混合物をゲル化させて、細胞包埋ゲル（１．７×１０5／ｍＬ）を得た。得られた細胞包埋ゲルの上表面に、１ｍｇ／ｍＬフィブロネクチン水溶液（ＢＤバイオサイエンス社製）０．０５ｍｌを添加し、前記細胞包埋ゲルを室温で１時間放置した。つぎに、前記細胞包埋ゲル中のＭＲＣ−５細胞を、ＤＨ１０培地中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で一晩インキュベーションした。
【０１９１】
その後、０．４μｇ／ｍＬヒドロコルチゾン（シグマ−アルドリッチ社製）と１００μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ギブコ・ラボラトリー社製）とインスリン（５μｇ／ｍｌ）と５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸（シグマ−アルドリッチ社製）とを含有するＤＨ１０培地０．２ｍＬに懸濁したＨａＣａＴ細胞（７．０×１０４細胞）を前記細胞包埋ゲル上に播種した。
【０１９２】
つぎに、前記ＨａＣａＴ細胞が播種された細胞包埋ゲルを、２４ウェル培養プレートのウェル中のＤＨ１０に浸漬させた。その後、細胞包埋ゲル中に含まれる細胞を、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で５日間インキュベーションし、細胞構築物を得た。つぎに、得られた細胞構築物中のＨａＣａＴ細胞の表面を、空気とＤＨ１０培地との接触面まで持ち上げて配置し、前記細胞構築物を、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で１５日間培養し、ＨａＣａＴ細胞を含む分化細胞構築物を得た。
【０１９３】
その後、実験番号：３２においては、分化細胞構築物の表面に、実験番号：３６の試料５μＬを塗布し、分化細胞構築物を５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃でさらに１日間培養した。一方、実験番号：３３〜３５においては、分化細胞構築物の表面に、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液５μＬと、実験番号：３３〜３５のいずれかの試料５μＬとを塗布し、分化細胞構築物を５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃でさらに１日間培養した。
【０１９４】
得られた細胞構造体から凍結切片を作製した。かかる凍結切片をヘマトキシリン−エオシン染色により、細胞核を青紫色に染色するとともに、細胞質細胞質物質の大部分を赤色に染色した。染色後の凍結切片を用い、細胞構造体の組織形態を位相差顕微鏡下で観察した。
【０１９５】
実施例９において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液を塗布せずに実験番号：３２の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を図１１（Ａ）に、実施例９において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３３の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を図１１（Ｂ）に、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３４の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を図１１（Ｃ）に、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３５の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を図１１（Ｄ）に示す。図中、スケールバーは、５０μｍの長さを示す。
【０１９６】
図１１（Ａ）および（Ｃ）に示された結果から、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液と被験試料１を含む実験番号：３４の試料とを塗布したときの細胞構造体では、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液を塗布せずに実験番号：３２の試料を塗布したときの細胞構造体と同様に、細胞核が見られないことがわかる。したがって、被験試料１に含まれる環状ペプチド化合物は、オレイン酸によって引き起こされる不全角化の発生を抑制することができることがわかる。
【０１９７】
一方、図１１（Ｂ）および（Ｄ）に示された結果から、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液と実験番号：３３の試料とを塗布したときの細胞構造体ならびに０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液と被験試料２とを含む実験番号：３５の試料とを塗布したときの細胞構造体においては、細胞核が見られることがわかる。したがって、被験試料２に含まれる直鎖状ペプチドは、オレイン酸によって引き起こされる不全角化の発生を抑制することができないことがわかる。
【０１９８】
これらの結果から、被験試料１中に含まれる環状ペプチド化合物は、皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であることが示唆される。
【０１９９】
以上の結果から、エピモルフィンを発現するケラチノサイトの分化細胞構築物を、被験試料と接触させながら分化条件下で培養して得られた細胞構造体と、エピモルフィンを発現するケラチノサイトの分化細胞構築物を、分化条件下で培養して得られた細胞構造体との間の差異に基づき、被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価することができることが示唆される。
【０２００】
（実施例１０）
被験物質として、式（Ｉ）で表される環状ペプチド化合物のうち、製造例４で得られた環状ペプチド化合物以外の化合物を用い、実施例９と同様の操作を行ない、当該被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価する。
【０２０１】
その結果、かかる被験物質は、製造例４で得られた環状ペプチド化合物と同様の傾向を示すことがわかる。
【０２０２】
（実施例１１）
実施例９において、ＨａＣａＴ細胞の代わりに製造例３で得られたＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞を用いたことおよび０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液を用いなかったことを除き、実施例９と同様の操作を行ない、被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価する。
【０２０３】
その結果、実施例９と同様に、製造例４で得られた環状ペプチド化合物が、皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるという評価が得られる。
【０２０４】
（実施例１２）
被験物質として、式（Ｉ）で表される環状ペプチド化合物のうち、製造例４で得られた環状ペプチド化合物以外の化合物を用い、実施例１１と同様の操作を行ない、当該被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価する。
【０２０５】
その結果、かかる被験物質は、製造例４で得られた環状ペプチド化合物と同様の傾向を示すことがわかる。
【０２０６】
以上の結果から、エピモルフィンを発現するケラチノサイトの分化細胞構築物を被験試料と接触させながら分化条件下で培養して得られた細胞構造体と、エピモルフィンを発現するケラチノサイトの分化細胞構築物を分化条件下で培養して得られた細胞構造体との間の差異に基づき、被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価することができることが示唆される。
【０２０７】
また、被験物質が皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかの評価に際して、式（Ｉ）で表される化合物は、皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質の陽性対照として用いることができることが示唆される。
【０２０８】
（比較例１）
実施例１（１）で得られた被験試料１を環状ペプチド化合物の濃度が０．００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：３６）。また、実施例１（１）で得られた被験試料２を直鎖状ペプチドの濃度が０．００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、培地を得た（実験番号：３７）。なお、被験試料１の代わりに、被験試料１に含まれる精製水と同じ量の精製水（対照）を用いたことを除き、前記と同様にして、培地を得た。
【０２０９】
得られた培地中において、製造例３で得られたＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞を５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で培養し、経時的に細胞を採取した。採取された細胞に、細胞計数用キット〔（株）同仁化学研究所製、商品名：Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ〕に添付の試薬Ａ〔（株）同仁化学研究所製、商品名：ＷＳＴ−１〕と溶液Ｂとの混合溶液〔試薬Ａと溶液Ｂとの体積比（試薬Ａ／溶液Ｂ）＝１０／１〕１１０μＬを添加し、３時間インキュベーションした。得られた混合物について、分光光度計〔ワッラック（ＷＡＬＬＡＣ）社製、商品名：ＡＲＶＯｔｍＳＸ  １４２０  ＭＵＬＴＩＬＡＢＥＬ  ＣＯＵＮＴＥＲ〕を用いて波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育への影響を調べた。
【０２１０】
実験番号：３６または３７の培地を用いたときのＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育状態を調べた結果を表１に示す。なお、表１における評価基準は以下のとおりである。
【０２１１】
＋  ：対照を用いたときと比べ、有意にＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育状態が良好である（危険率０．０１以下）。
−  ：ＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育状態が対照を用いたときのＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育状態と同様である。
【０２１２】
【表１】
0005714842.tif 000005
【０２１３】
表１に示された結果から、被験試料１を含む実験番号：３６の培地中で培養したＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育状態は、良好であることがわかる。これに対し、被験試料２を含む実験番号：３７の培地中で培養したＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育状態は、不良であることがわかる。
【０２１４】
しかしながら、これらの結果からは、被験試料１中に含まれる環状ペプチド化合物が不全角化に影響を与えているかどうかまでは不明である。したがって、被験物質によるＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育状態に対する影響を調べることでは、被験物質が、皮脂によって引き起こされる皮膚の状態の異常の発生を抑制する物質であるかどうかを評価することができることができないと考えられる。
【配列表フリーテキスト】
【０２１５】
配列番号：１は、環状ペプチド化合物の配列である。１番目のシステイニル基と８番目のシステイニル基との間には、ジスルフィド結合が形成されている。２番目のＸａａは、−ＣＯ−（ＣＨ2）n−ＮＨ−（式中、ｎは１〜１０の整数である）である。３番目のＸａａは、置換基を有してもよいＳｅｒ、置換基を有してもよいＴｈｒまたは置換基を有してもよいＴｙｒである。４番目のＸａａは、置換基を有してもよいＩｌｅ、置換基を有してもよいＶａｌまたは置換基を有してもよいＬｅｕである。５番目のＸａａは置換基を有してもよいＡｓｎ、置換基を有してもよいＧｌｎ、置換基を有してもよいＡｓｐまたは置換基を有してもよいＧｌｕである。６番目のＸａａは、置換基を有してもよいＡｓｎ、置換基を有してもよいＧｌｎ、置換基を有してもよいＡｓｐまたは置換基を有してもよいＧｌｕである。７番目のＸａａは、置換基を有してもよいＳｅｒ、置換基を有してもよいＴｈｒまたは置換基を有してもよいＴｙｒである。
【０２１６】
配列番号：６は、Ｔ７タグ配列である。
【０２１７】
配列番号：７は、ＩＬ−２シグナルペプチドの配列である。
【０２１８】
配列番号：８は、環状ペプチド化合物の部分配列である。２番目のＸａａは、−ＣＯ−（ＣＨ2）n−ＮＨ−（式中、ｎは１〜１０の整数である）である。３番目のＸａａは、置換基を有してもよいＳｅｒ、置換基を有してもよいＴｈｒまたは置換基を有してもよいＴｙｒである。４番目のＸａａは、置換基を有してもよいＩｌｅ、置換基を有してもよいＶａｌまたは置換基を有してもよいＬｅｕである。５番目のＸａａは置換基を有してもよいＡｓｎ、置換基を有してもよいＧｌｎ、置換基を有してもよいＡｓｐまたは置換基を有してもよいＧｌｕである。６番目のＸａａは、置換基を有してもよいＡｓｎ、置換基を有してもよいＧｌｎ、置換基を有してもよいＡｓｐまたは置換基を有してもよいＧｌｕである。７番目のＸａａは、置換基を有してもよいＳｅｒ、置換基を有してもよいＴｈｒまたは置換基を有してもよいＴｙｒである。
【０２１９】
配列番号：９は、直鎖状ペプチドの配列である。
【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図１１】
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【配列表】
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