(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１（ＴＮＦＲＩ）ポリペプチドのアミノ酸配列において、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｈ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ、及びＬ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇからなる群から選択されるアミノ酸の修飾を含むアミノ酸配列；
配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドのアミノ酸配列の４１位〜２１１位からなるアミノ酸配列（ＴＮＦＲＩ１７１）において、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｈ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ、及びＬ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇからなる群から選択されるアミノ酸の修飾を含むアミノ酸配列；
配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドのアミノ酸配列の４１位〜１６６位からなるアミノ酸配列（ＴＮＦＲＩ１２６）において、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｈ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ、及びＬ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇからなる群から選択されるアミノ酸の修飾を含むアミノ酸配列；及び
配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドのアミノ酸配列の４１位〜１４５位からなるアミノ酸配列（ＴＮＦＲＩ１０５）において、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｈ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ、及びＬ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇからなる群から選択されるアミノ酸の修飾を含むアミノ酸配列；
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドのアミノ酸配列において、１６１位及び２０７位のうちから選ばれるいずれか一つのアミノ酸残基のアミノ酸の修飾をさらに含むアミノ酸配列；
配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドのアミノ酸配列の４１番〜２１１番からなるアミノ酸配列において、１６１位及び２０７位のうちから選ばれるいずれか一つのアミノ酸残基のアミノ酸の修飾をさらに含むアミノ酸配列；
及び配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドのアミノ酸配列の４１番〜１６６番からなるアミノ酸配列において、１６１位のアミノ酸残基のアミノ酸の修飾をさらに含むアミノ酸配列；
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチド。
【請求項３】
１６１位のＫはＱまたはＮで置換され、そして２０７位のＤはＮで置換されることを特徴とする請求項２に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドのアミノ酸配列において、９３位のアミノ酸残基のアミノ酸修飾をさらに含み、９３位のＥはＰで置換されたアミノ酸配列；
配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドのアミノ酸配列の４１番〜２１１番からなるアミノ酸配列において、９３位のアミノ酸残基のアミノ酸修飾をさらに含み、９３位のＥはＰで置換されたアミノ酸配列；
配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドのアミノ酸配列の４１番〜１６６番からなるアミノ酸配列において、９３位のアミノ酸残基のアミノ酸修飾をさらに含み、９３位のＥはＰで置換されたアミノ酸配列；
及び配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドのアミノ酸配列の４１番〜１４５番からなるアミノ酸配列において、９３位のアミノ酸残基のアミノ酸修飾をさらに含み、９３位のＥはＰで置換されたアミノ酸配列;
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチド。
【請求項５】
Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｑ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｄ２０７Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｑ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｄ２０７Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｈ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｑ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｈ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｈ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｄ２０７Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｑ及びＬ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｎからなる群から選ばれるアミノ酸修飾を含むことを特徴とする請求項２に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチド。
【請求項６】
Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｅ９３Ｐ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇのアミノ酸修飾を含むことを特徴とする請求項４に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号６、１１、１６、２１、２２、２８−３９、４４、４９、５４、５５、６１−７２、７５、７８、８１、８２、及び８６−９８からなる群から選ばれるいずれか一つで表わされるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドの２つまたは３つ以上が共有結合によって連結された、修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドの複合体。
【請求項９】
修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドは、加えて、糖化、アシル化（ａｃｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、ハシル化（ｈａｓｙｌａｔｉｏｎ）、カルバミル化（ｃａｒｂａｍｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、プレニル化（ｐｒｅｎｙｌａｔｉｏｎ）、酸化（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）、グアニジル化（ｇｕａｎｉｄｉｎａｔｉｏｎ）、アミジン化（ａｍｉｄｉｎａｔｉｏｎ）、カルバミル化（ｃａｒｂａｍｙｌａｔｉｏｎ）、トリニトロフェニル化（ｔｒｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｔｉｏｎ）、ニトロ化（ｎｉｔｒａｔｉｏｎ）、またはペグ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子。
【請求項１１】
大腸菌内における発現に適するようにコドンが操作された配列番号５の塩基配列に基づいて製造されることを特徴とする請求項１０に記載の遺伝子。
【請求項１２】
請求項１０に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターで形質転換された細胞。
【請求項１４】
前記細胞は、大腸菌であることを特徴とする請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドを含む医薬製剤。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドを含む、成人呼吸窮迫症候群、食欲不振、癌、慢性疲労症候群、移植片対宿主拒否反応、痛覚過敏、炎症性腸疾患、神経炎症性疾患、脳虚血を含む虚血性／再潅流障害、各々神経変性の原因となり得る外傷、癲癇、出血又は発作の結果としての脳損傷、糖尿病、多発性硬化症、眼病、疼痛、膵炎、肺線維症、リウマチ性関節炎、骨関節炎、若年性関節炎、血清反応陰性多発性関節炎、強直性脊髄炎、ライター症候群及び反応性関節炎、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、血管炎、脳血管炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎及び多発性筋痛、リウマチ性及び巨細胞性動脈炎、敗血性ショック、放射線療法の副作用、全身性紅斑性狼瘡、側頭下顎関節疾患、甲状腺炎及び組織移植からなる群から選ばれるＴＮＦ媒介疾病の予防または治療用医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１０に記載の遺伝子またはこれを含むベクターを含む、成人呼吸窮迫症候群、食欲不振、癌、慢性疲労症候群、移植片対宿主拒否反応、痛覚過敏、炎症性腸疾患、神経炎症性疾患、脳虚血を含む虚血性／再潅流障害、各々神経変性の原因となり得る外傷、癲癇、出血又は発作の結果としての脳損傷、糖尿病、多発性硬化症、眼病、疼痛、膵炎、肺線維症、リウマチ性関節炎、骨関節炎、若年性関節炎、血清反応陰性多発性関節炎、強直性脊髄炎、ライター症候群及び反応性関節炎、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、血管炎、脳血管炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎及び多発性筋痛、リウマチ性及び巨細胞性動脈炎、敗血性ショック、放射線療法の副作用、全身性紅斑性狼瘡、側頭下顎関節疾患、甲状腺炎及び組織移植からなる群から選ばれるＴＮＦ媒介疾病の予防または治療用医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１０に記載の遺伝子またはこれを含むベクターを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）または生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）において腫瘍壊死因子と結合する修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１（ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１）ポリペプチドまたはその断片及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は抗原刺激により起こる身体の防御作用である。しかし、有害な抗原物質が除去された後にも炎症が発生したり、炎症反応が自己抗原のような不適切な刺激により起きたりすると、病理学的に悪化することになる。このような炎症反応には種々のサイトカインが関与し、特に、炎症調節の役割を果たすサイトカインとして腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ；以下、「ＴＮＦ」という。）が確認された。
【０００３】
ＴＮＦは、腫瘍細胞を除去するタンパク質として初めて発見された（Ｃａｒｓｗｅｌｌ等、ＰＮＡＳ  ７２：３６６６−３６７０  １９７５）。ＴＮＦは、単球及び大食細胞を含む多数の細胞形態において産生されるサイトカインで、炎症反応に直接関与する。少なくとも２種類のＴＮＦ（ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β）があり、これらのそれぞれは三量体として作用し、交差結合受容体により細胞内信号伝達を開始するものと知られている（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２６５：１４４９７−１４５０４）。生体内でＴＮＦは炎症反応を誘発することによって細胞免疫反応及び防御機構を調節すると同時に、多数の互いに異なる標的細胞に対する重要な生理学的効果を有する（Ｓｅｌｂｙ等、Ｌａｎｃｅｐ  １：４８３  １９８８）。しかし、ＴＮＦが過量に存在すると、リウマチ性関節炎、退行性関節炎、乾癬、クローン病などのような病的状態が発生し、これを阻害することで疾病への治癒効果があることが確認された（Ｆｅｌｄｍａｎｎ等、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２４５−１２５０  ２００３）。
【０００４】
腫瘍壊死因子受容体（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；以下、「ＴＮＦＲ」という。）は、ＴＮＦと結合するサイトカイン受容体である。
【０００５】
ＴＮＦＲは、今のところ、ｐ５５−ＴＮＦＲＩ及びｐ７５−ＴＮＦＲＩＩとして知られた２種類が発見されている。ＴＮＦＲＩは、哺乳類のほぼ全ての細胞で発現することが知られており、ＴＮＦＲＩＩは、免疫システム及び内皮細胞で限定的に発現することが知られている。
【０００６】
これらの両受容体は２８％のアミノ酸配列の類似性を示す。両受容体とも細胞外ドメインを有し、４個のシステイン−リッチ（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ）ドメインを有している。
【０００７】
ＴＮＦＲＩは、細胞質部分に細胞死滅信号を起こす「デスドメイン（ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ）」を有するが、ＴＮＦＲＩＩにはデスドメインがなく、現在までＴＮＦＲＩＩの機能は明確に定義されていない。また、ＴＮＦＲＩとＴＮＦＲＩＩは、リガンドであるＴＮＦ−αに対する親和力において相違する。ＴＮＦＲＩがＴＮＦＲＩＩに比べて３０倍以上親和力が高いと知られている（Ｔａｒｔａｇｌｉａ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１８５４２−１８５４８  １９９３）。この親和力の相違から、ＴＮＦＲＩに対する医薬品の開発が多く試みられてきている。
【０００８】
細胞表面についているＴＮＦＲは、タンパク質分解酵素により切断されて水溶性ＴＮＦＲを生成し、水溶性ＴＮＦＲは、過量存在するＴＮＦを中和させてＴＮＦの濃度を調節する作用を担う。自己免疫疾患または慢性炎症では、このような調節能力を越えるＴＮＦ濃度を有していると知られている。
【０００９】
人為的にＴＮＦの信号伝達を調節するために、ＴＮＦ合成阻害、ＴＮＦの放出阻害、ＴＮＦの信号伝達阻害などの、様々なＴＮＦ阻害方法が適用されてきた。ＴＮＦ阻害方法のうち、ＴＮＦＲとＴＮＦとの結合を妨害してＴＮＦの信号伝達を阻害する方法が、医薬品の開発に適用されてきた。その一例に、ＴＮＦＲＩＩの細胞膜外部分と抗体のＦｃ部分とを融合して作ったエタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）と、ＴＮＦと結合する抗体としてアダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）などが、リウマチ性関節炎、乾癬、強直性脊髄炎などの治療剤として全世界で用いられている。
【００１０】
上記のリウマチ性関節炎治療剤エタネルセプトと同じ技術を適用して抗体のＦｃとＴＮＦＲＩの細胞外ドメインとを結合させた融合タンパク質であるレネルセプト（Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ）についてヨーロッパ及び米国で臨床２相まで進行し（Ｆｕｒｓｔ等、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．３０：２１２３−２１２６  ２００３）、ＴＮＦＲＩ二量体（ｄｉｍｅｒ）とポリエチレングリコール化水溶性ＴＮＦＲＩ（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ＴＮＦＲＩ）分子に関する研究が進行した（Ｃａｒｌ等、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．５８：１７３−１８１  １９９９；Ｓｏｌｏｒｚａｎｏ等）。
【００１１】
また、ＴＮＦＲＩの免疫原性を下げると共にＴＮＦとの結合力を高めるための方法として、アミノ酸配列を修飾する研究が進行された。特に、ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列の一部を置換して抗体発生を減らしたＴＮＦＲＩ突然変異体、及びＴＮＦＲＩとＴＮＦとの結合力を増大させた突然変異体が知られている（米国特許第７，１４４，９８７号）。
【００１２】
ＴＮＦＲとＴＮＦとの結合に関与する活性部位を見出すための多くの研究が進行されてきた。ＴＮＦＲの４番目のドメインはＴＮＦとの結合に必須のものではなく、２番目と３番目のドメインを欠失させるとＴＮＦ結合活性を喪失することが知られている（Ｃｏｒｃｏｒａｎ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３３：８３１−８４０  １９９４）。また、ＴＮＦＲＩとＴＮＦとの結合に３番目のドメインの一定部位を欠損させることができ、ヒトＴＮＦＲ１ポリペプチド（配列番号１）の５９番から１４３番までのアミノ酸からなるアミノ酸配列が、ＴＮＦＲＩの生物学的活性を示す部位として知られている（米国特許第６，９８９，１４７号）。
【００１３】
したがって、この部位でＴＮＦＲＩとＴＮＦとの結合がなされるため、それ以外の領域では相当な付加基、欠失基または置換基を含むことができる。一方、ＴＮＦＲＩは、生体内利用率を高めるために、完全な長さのＴＮＦＲＩよりはＴＮＦＲＩポリペプチド断片が用いられており、タンパク質分解酵素による切断可能性を最小化しながら細胞透過率を高めるための効果的な注射剤及び経口投与用製剤とするためには、最小限の大きさに製造されることが要求される。
【００１４】
また、タンパク質治療剤は、体内循環で代謝、腎臓におけるろ過作用（ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｆｉｌｔｅｒａｔｉｏｎ）、及び胃腸管、組織、血液などにおけるタンパク質分解酵素による分解などのような一般的な過程により除去されるため、生体内でタンパク質固有の活性を維持しつつ、目的とする場所まで送達することは非常に困難である。特に、タンパク質分解酵素による除去は、経口、血管注射、筋肉注射などによる投与時にタンパク質治療剤の半減期に多大な影響を与える。
【００１５】
タンパク質治療剤の一つとして、生体内のＴＮＦを調節するヒト腫瘍壊死因子阻害剤が注射剤の形態で開発されているが、注射剤投与は痛み及び感染の危険などの問題を招く。そのため、注射投与回数を軽減したり経口投与したりするなどの他の方法が要求される。そのためには、ヒト腫瘍壊死因子の安定性を高めることが必須であるが、上記のタンパク質分解酵素による分解がその大きな障害となる。
【００１６】
一方、天然型ＴＦＮＲＩは、ＴＮＦ−αに結合することにより細胞内ＴＮＦの役割を調節しているが、抗体のような高い結合力を有していない。これにより、天然型ＴＮＦＲＩを用いたＴＮＦ−αの抑制効果は抗体よりも弱く現れる。ＴＮＦＲＩを用いたタンパク質治療剤の開発のためには、ＴＮＦ−αに対する強い結合力を有するＴＮＦＲＩを選別することが必要である。
【００１７】
このため、タンパク質治療剤の開発の重要な目標の一つは、向上した生物学的な活性とタンパク質分解酵素に対する抵抗性とを併せ持つタンパク質治療剤を開発することである。
【００１８】
この課題は、大韓民国、知識経済部、韓国産業技術評価管理院の産業源泉技術開発事業（課題固有番号１００４０２３３）の政府支援下で行われた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）または生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）でＴＮＦに対する向上した結合力を有しながら、胃腸管、細胞質及び血液中に存在するタンパク質分解酵素に対する向上した抵抗性を有する修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１（ＴＮＦＲＩ）ポリペプチドまたはその断片を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
特に定義しない限り、下記の用語は、本発明の詳細な説明及び特許請求の範囲で以下に定義された意味を有するものとする。
【００２１】
本発明で定義された「ヒト腫瘍壊死因子受容体−１」、または「ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチド」（以下、ＴＮＦＲＩまたはＴＮＦＲＩポリペプチド）は、ヒト由来で、４５５個のアミノ酸で構成され、ＴＮＦと結合するポリペプチドのことをいう。
【００２２】
本発明で定義された「ヒト腫瘍壊死因子受容体−１断片」、または「ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチド断片」（以下、ＴＮＦＲＩ断片またはＴＮＦＲＩポリペプチド断片）は、全長ＴＮＦＲＩの配列と互いに対応するアミノ酸の配列が１００％一致し、一つ以上のアミノ酸残基が欠失しているＴＮＦＲＩの一部分である。欠失したアミノ酸残基は、Ｎ末端、Ｃ末端または内部を含む、ポリペプチド内のいずれかの箇所でよい。この断片は、全長ＴＮＦＲＩと一つ以上の生物学的特性を共有する。断片の代表例は、ＴＮＦＲＩのＮ末端４１番目のアミノ酸から１０５個または１２６個または１７１個のアミノ酸を有するもので、これらはそれぞれ、本願においてＴＮＦＲＩ１０５、ＴＮＦＲＩ１２６、ＴＮＦＲＩ１７１と命名する。
【００２３】
本発明で定義された「ＴＮＦＲＩ（突然）変異体」、「ＴＮＦＲＩ断片（突然）変異体」または「修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチド」、「修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチド断片」は、下記に定義されるように、天然または組換え細胞から分離されたＴＮＦＲＩまたはＴＮＦＲＩ断片と１００％未満の配列同一性を有するＴＮＦＲＩまたはＴＮＦＲＩ断片のことを指す。一般に、ＴＮＦＲＩ変異体は、野生型または天然型ＴＮＦＲＩまたはＴＮＦＲＩ断片と約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。配列同一性は、好ましくは約７５％以上でよく、８０％以上、約８５％以上、約９０％以上の順にさらに好ましく、最も好ましくは約９５％以上でよい。
【００２４】
本発明で定義された「四重変異体」は、ヒト腫瘍壊死因子受容体−１またはヒト腫瘍壊死因子受容体−１断片のアミノ酸配列において４箇所に突然変異が生じた変異体のことをいう。
【００２５】
本発明で定義された「五重変異体」は、ヒト腫瘍壊死因子受容体−１またはヒト腫瘍壊死因子受容体−１断片のアミノ酸配列において５箇所に突然変異が生じた変異体のことをいう。
【００２６】
本発明で定義された「六重変異体」は、ヒト腫瘍壊死因子受容体−１またはヒト腫瘍壊死因子受容体−１断片のアミノ酸配列において６箇所に突然変異が生じた変異体のことをいう。
【００２７】
本発明で定義された「七重変異体」は、ヒト腫瘍壊死因子受容体−１またはヒト腫瘍壊死因子受容体−１断片のアミノ酸配列において７箇所に突然変異が生じた変異体のことをいう。
【００２８】
本発明で定義された「ＴＮＦＲＩｍ」は、ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列のうち、Ｎ末端の４１番目のアミノ酸からｍ個のアミノ酸配列からなるＴＮＦＲＩ断片のことをいう。例えば、ＴＮＦＲＩ１０５断片は、ＴＮＦＲＩ  Ｎ末端４１番目のアミノ酸から１０５個のアミノ酸配列を有するＴＮＦＲＩ断片である。他の例として、ＴＮＦＲＩ１２６は、ＴＮＦＲＩ  Ｎ末端４１番目のアミノ酸から１２６個のアミノ酸からなるＴＮＦＲＩ断片である。
【００２９】
本発明で定義された「Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩｍ」は、大腸菌でＴＮＦＲＩを発現させるために、Ｎ末端に、ＴＮＦＲＩアミノ酸配列にないメチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）が添加されたＮ末端４１番アミノ酸からｍ個のアミノ酸個数を有するＴＮＦＲＩ断片のことをいう。
【００３０】
本願で提供されるアミノ酸の様々な配列内に存在するアミノ酸は、それらの公知の三文字表記または一文字表記によって表下される。様々な核酸断片内に存在するヌクレオチドは、当該分野において日常的に用いられる標準単一文字命名法で命名される。
【００３１】
本発明で定義された「ｘＡｚ」は、アミノ酸配列においてＡ番目のアミノ酸ｘがｚに置換されたものを意味する。例えば、Ｋ４８Ｑは、４８番のアミノ酸のリシン（Ｌｙｓ）がグルタミン（Ｇｌｎ）に置換されたものを意味する。
【００３２】
本発明は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）及び／または生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）でＴＮＦとの向上した結合力を有しながら、タンパク質分解酵素に対する向上した抵抗性を有する修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片、及びその製造方法、並びにそれらの用途に関するものである。
【００３３】
本発明者らは、ＴＮＦに対する結合力が向上し、生体内及び／または生体外で安全性の増大したＴＮＦＲＩ変異体を開発するために鋭意研究した結果、ＴＮＦＲＩ内のＴＮＦと結合することが予想される個所のアミノ酸のうち特定の位置の４以上のアミノ酸が置換されたＴＮＦＲＩ変異体が修飾されていないＴＮＦＲＩに比べてＴＮＦに対する増加した結合力を示すことを確認した。但し、これらの結合力が向上した変異体がタンパク質分解酵素に容易に分解されるため、タンパク質分解酵素に対する抵抗性のためのさらなる修飾を選別して付加して天然型ＴＮＦＲＩに比べて同等以上のタンパク質分解酵素に対する抵抗性を有する変異体を選別して本発明を完成するに至った。
【００３４】
したがって、本発明は、天然型ＴＮＦＲＩ断片のアミノ酸配列のうち、特定位置の５以上のアミノ酸を置換することによってＴＮＦとの結合力が向上し、タンパク質分解酵素に対する抵抗性を有する修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を提供する。
【００３５】
本発明の修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は、ＴＮＦと安定的に結合することにより効果的にＴＮＦの作用を抑え、糖鎖を含まなくとも活性を示すことから、動物細胞の他、微生物細胞においても容易に生成することができる。
【００３６】
本発明についてより詳細に説明すると、下記の通りである。
【００３７】
本発明は、配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１（ＴＮＦＲＩ）ポリペプチドのアミノ酸配列またはその機能的に活性である断片のアミノ酸配列において、９２位、９５位、９７位、及び９８位の４個のアミノ酸残基と、６８位、１６１位、２００位及び２０７位のうちから選ばれるいずれか一つのアミノ酸残基から構成された５個のアミノ酸の修飾を含み、天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１（ＴＮＦＲＩ）ポリペプチドと比べて、ＴＮＦとの結合力が向上し、タンパク質分解酵素に対する抵抗性が同等であるか、あるいは、それ以上に増加した、修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を提供する。
【００３８】
本発明は、また、配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１（ＴＮＦＲＩ）ポリペプチドのアミノ酸配列またはその機能的に活性である断片のアミノ酸配列において、９２位、９５位、９７位及び９８位の４個のアミノ酸残基と、６８位、１６１位、２００位及び２０７位のうちから選ばれるいずれか一つのアミノ酸残基から構成された５個のアミノ酸の修飾にさらに９３位のアミノ酸残基のアミノ酸の修飾を含む、修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を提供する。
【００３９】
好ましくは、本発明は、配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１（ＴＮＦＲＩ）ポリペプチドのアミノ酸配列またはその機能的に活性である断片のアミノ酸配列において、６８位、９２位、９５位、９７位及び９８位のアミノ酸の修飾を含む、修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を提供する。さらに、本発明は、配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死受容体−１（ＴＮＦＲＩ）ポリペプチドのアミノ酸配列またはその機能的に活性である断片のアミノ酸配列において、６８位、９２位、９５位、９７位及び９８位に１６１位または２０７位のアミノ酸の修飾をさらに含む、修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を提供する。
【００４０】
本発明は、また、配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１（ＴＮＦＲＩ）ポリペプチドのアミノ酸配列またはその機能的に活性である断片のアミノ酸配列において、９２位、９５位、９７位及び９８位の４個のアミノ酸残基と、６８位、１６１位、２００位及び２０７位のうちから選ばれる２つのアミノ酸残基から構成された６個のアミノ酸の修飾を含む、修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を提供する。
【００４１】
上記アミノ酸修飾は、修飾されていない天然型ＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片に比べて、ＴＮＦとの増加した結合力を持たせると同時に、タンパク質分解酵素に対する抵抗性を維持または増加させるための修飾であり、代表的には、アミノ酸の置換である。しかしながら、増加された結合力を提供し、タンパク質分解酵素に対する抵抗性を維持または増加させる限り、タンパク質翻訳後修飾のような上記位置のアミノ酸に対する他の化学的な修飾、例えば、炭水化物部位による糖化、アシル化（ａｃｙｌａｔｉｏｎ）（例、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）またはサクシニル化（ｓｕｃｃｉｎｙｌａｔｉｏｎ））、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、ハシル化（ｈａｓｙｌａｔｉｏｎ）、カルバミル化（ｃａｒｂａｍｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、プレニル化（ｐｒｅｎｙｌａｔｉｏｎ）、酸化（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）、グアニジル化（ｇｕａｎｉｄｉｎａｔｉｏｎ）、アミジン化（ａｍｉｄｉｎａｔｉｏｎ）、カルバミル化（ｃａｒｂａｍｙｌａｔｉｏｎ）（例、カルバモイル化（ｃａｒｂａｍｏｙｌａｔｉｏｎ））、トリニトロフェニル化（ｔｒｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｔｉｏｎ）、ニトロ化（ｎｉｔｒａｔｉｏｎ）、ペグ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）などを排除しない。
【００４２】
前記アミノ酸修飾がアミノ酸置換である場合、配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１（ＴＮＦＲＩ）ポリペプチドのアミノ酸配列またはその機能的に活性である断片のアミノ酸配列において、６８位のＬはＶで置換され、９２位のＳはＩ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、Ｗ、Ｑ、Ｔ、Ｙ、Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｐ、ＮまたはＲで置換され、９３位のＥはＰで置換され、９５位のＨはＦで置換され、９７位のＲはＰ、ＬまたはＩで置換され、９８位のＨはＡまたはＧで置換され、１６１位のＫはＱまたはＮで置換され、２００位のＥはＱで置換され、２０７位のＤはＮで置換される。好ましくは、前記９２位のＳはＩ、ＭまたはＨで置換され、９７位のＲはＰで置換される。
【００４３】
より好ましくは、本発明は、配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１（ＴＮＦＲＩ）ポリペプチドのアミノ酸配列またはその機能的に活性である断片のアミノ酸配列において、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｈ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｑ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｄ２０７Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｑ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｄ２０７Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｈ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｑ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｈ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｈ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｄ２０７Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｑ及びＬ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｎからなる群から選ばれるアミノ酸修飾を含む、修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片を提供する。
【００４４】
上記配列番号１として記載される天然型ヒトＴＮＦＲＩポリペプチドの機能的に活性である断片は、天然型ヒトＴＮＦＲＩポリペプチドと実質的に同等の効果を示す、天然型ヒトＴＮＦＲＩポリペプチドの一部分を意味する。本願では、特に、配列番号１として記載される天然型ヒトＴＮＦＲＩのアミノ酸配列の４１番〜２１１番からなるアミノ酸配列（配列番号２；ＴＮＦＲＩ１７１）、配列番号１として記載される天然型ヒトＴＮＦＲＩのアミノ酸配列の４１番〜１６６番からなるアミノ酸配列（配列番号３；ＴＮＦＲＩ１２６）、配列番号１として記載される天然型ヒトＴＮＦＲＩのアミノ酸配列の４１番〜１４５番からなるアミノ酸配列（配列番号４；ＴＮＦＲＩ１０５）が用いられる。参考までに、ヒトＴＮＦＲＩポリペプチド（配列番号１）の５９番〜１４３番のアミノ酸からなる断片だけでＴＮＦＲＩの生物学的な活性が現れるということは当分野において周知である（米国特許第６，９８９，１４７号など）。
【００４５】
上記修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドの「断片」は、修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドと実質的に同等の効果を示し、当業者により容易に製造可能な修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドの一部分を意味する。
【００４６】
そのため、本発明のＴＮＦとの結合力が向上し、タンパク質分解酵素に対する抵抗性が同等であるか、あるいは、向上した修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片の範ちゅうには、以下に記述されるものが含まれる。
【００４７】
本発明は、配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドのアミノ酸配列の４１番〜２１１番からなるアミノ酸配列において、６８位のＬはＶで置換され、９２位のＳはＩ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、Ｗ、Ｑ、Ｔ、Ｙ、Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｐ、ＮまたはＲで置換され、９５位のＨはＦで置換され、９７位のＲはＰ、ＬまたはＩで置換され、９８位のＨはＡまたはＧで置換された、修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片を提供する。より好ましくは、配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドのアミノ酸配列の４１番〜２１１番からなるアミノ酸配列において、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｈ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ及びＬ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇからなる群から選ばれるアミノ酸修飾を含む修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片を提供する。
【００４８】
また、本発明は、配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドのアミノ酸配列の４１番〜２１１番からなるアミノ酸配列において、上述の修飾にさらに１６１位または２０７位のアミノ酸の修飾を含み、ここで、１６１位のＫはＱまたはＮで置換され、２０７位のＤはＮで置換された、修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片を提供する。このような本発明の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片は、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｑ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｄ２０７Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｑ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｄ２０７Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｈ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｑ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｈ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｈ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｄ２０７Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｑ及びＬ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｎからなる群から選ばれるアミノ酸修飾を含む。
【００４９】
本発明は、配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドのアミノ酸配列の４１番〜１６６番からなるアミノ酸配列において、６８位のＬはＶで置換され、９２位のＳはＩ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、Ｗ、Ｑ、Ｔ、Ｙ、Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｐ、ＮまたはＲで置換され、９５位のＨはＦで置換され、９７位のＲはＰ、ＬまたはＩで置換され、９８位のＨはＡまたはＧで置換された、修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片を提供する。より好ましくは、配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドのアミノ酸配列の４１番〜１６６番からなるアミノ酸配列において、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｈ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ及びＬ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇからなる群から選ばれるアミノ酸修飾を含む修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片を提供する。
【００５０】
さらに、本発明は、配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドのアミノ酸配列の４１番〜１６６番からなるアミノ酸配列において、上述の修飾にさらに１６１位のアミノ酸の修飾を含み、ここで、１６１位のＫはＱまたはＮで置換された、修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片を提供する。このような本発明の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片は、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｑ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｑ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｈ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｑ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｈ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｑ及びＬ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｎからなる群から選ばれるアミノ酸修飾を含む。
【００５１】
本発明は、配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドのアミノ酸配列の４１番〜１４５番からなるアミノ酸配列において、６８位のＬはＶで置換され、９２位のＳはＩ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、Ｗ、Ｑ、Ｔ、Ｙ、Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｐ、ＮまたはＲで置換され、９５位のＨはＦで置換され、９７位のＲはＰ、ＬまたはＩで置換され、９８位のＨはＡまたはＧで置換された、修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片を提供する。より好ましくは、配列番号１に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドのアミノ酸配列の４１番〜１４５番からなるアミノ酸配列において、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｈ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ及びＬ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇからなる群から選ばれるアミノ酸修飾を含む修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片を提供する。
【００５２】
本発明は、また、配列番号１として記載される天然型ヒトＴＮＦＲＩのアミノ酸配列を有するポリペプチドと９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性を有する他の変異体において、アミノ酸の６８位、９２位、９５位、９７位及び９８位に対応する位置においてアミノ酸修飾を含む、修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片を提供する。これは、配列番号１として記載されたアミノ酸配列の６８位に対応するＬ位がＶで置換され、９２位に対応するＳ位がＩ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、Ｗ、Ｑ、Ｔ、Ｙ、Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｐ、ＮまたはＲで置換され、９５位に対応するＨ位がＦで置換され、９７位に対応するＲ位がＰ、ＬまたはＩで置換され、９８位に対応するＨ位がＡまたはＧで置換されたアミノ酸配列を含む、修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片である。前記修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片は、配列番号１において１６１位に対応するＫ位がＱまたはＮで置換されるか、あるいは、２０７位に対応するＤ位がＮで置換されるさらなるアミノ酸修飾を含むことができる。
【００５３】
本発明は、また、配列番号１として記載されるアミノ酸配列を有するＴＮＦＲＩポリペプチドと実質的に同じポリペプチドにおいて、上述したアミノ酸修飾またはそれに対応する修飾を含む修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を提供する。上記の「配列番号１として記載されるアミノ酸配列を有するＴＮＦＲＩポリペプチドと実質的に同じポリペプチド」とは、ＴＮＦＲＩの本質的な活性を害さない数と種類のアミノ酸修飾、すなわち、アミノ酸置換、欠失、付加またはその他の修飾を含むポリペプチドを意味する。具体的には、本発明は、配列番号１として記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の相同性を有する変異体において上述のアミノ酸修飾に対応する修飾を含む、修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を提供する。
【００５４】
上述の変異体は、配列番号１として記載された配列を有するポリペプチドと、本願において言及されるアミノ酸修飾を除けば、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するもので、ヒトＴＮＦＲＩポリペプチドの対立遺伝子型変異体同種型、組織特異的な同種型及びそれらの対立遺伝子型変異体、一つ以上のアミノ酸突然変異、置換、欠失、挿入または追加を有している合成変異体、核酸を翻訳することによって製造された合成分子、ヒト及び非ヒト組織及び細胞から抽出したタンパク質、キメラＴＮＦＲＩポリペプチド及びその修飾された形態を含むことができる。
【００５５】
上述の「対応する修飾」とは、異なる同種型であるポリペプチド同士間に比較される残基の修飾を意味する。すなわち、配列番号１として記載される天然型ヒトＴＮＦＲＩポリペプチドのアミノ酸配列と配列アラインメント（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）時に、機能的に不変であると把握される残基を有する位置における、本発明の結合力向上及びタンパク質分解酵素に対する抵抗性の維持／向上のためのアミノ酸修飾に対応する修飾を意味する。当業界における熟練者であれば、それらのポリペプチドから対応する残基の修飾を容易に把握することができる。例えば、当業者は、保存的で且つ同一のアミノ酸残基をガイドとして用いてＴＮＦＲＩポリペプチドの配列を整列することによって、対応する残基を同定することができる。
【００５６】
本発明は、好ましくは、配列番号６、１１、１６、２１、２２、２８−３９、４４、４９、５４、５５、６１−７２、７５、７８、８１、８２、８６−９８で表わされるアミノ酸配列を含む修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を提供する。
【００５７】
上記の本発明の修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は、上記アミノ酸修飾に加えて、タンパク質翻訳後修飾のような他の化学的な修飾、例えば、炭水化物部位による糖化、アシル化（ａｃｙｌａｔｉｏｎ）（例、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）またはサクシニル化（ｓｕｃｃｉｎｙｌａｔｉｏｎ））、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、ハシル化（ｈａｓｙｌａｔｉｏｎ）、カルバミル化（ｃａｒｂａｍｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、プレニル化（ｐｒｅｎｙｌａｔｉｏｎ）、酸化（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）、グアニジル化（ｇｕａｎｉｄｉｎａｔｉｏｎ）、アミジン化（ａｍｉｄｉｎａｔｉｏｎ）、カルバミル化（ｃａｒｂａｍｙｌａｔｉｏｎ）（例、カルバモイル化（ｃａｒｂａｍｏｙｌａｔｉｏｎ））、トリニトロフェニル化（ｔｒｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｔｉｏｎ）、ニトロ化（ｎｉｔｒａｔｉｏｎ）、ペグ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）を、タンパク質分解酵素に対する抵抗性の増加、免疫原性の減少、または生物学的活性の維持または増加のために含むことができる。
【００５８】
本発明は、また、上述の修飾されたヒトＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を２つ以上含む多量体ポリペプチド（または、「ポリペプチド複合体」ともいう）を含む。
【００５９】
本発明は、また、上記の修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片をコードする塩基配列を含む遺伝子を提供する。
【００６０】
本発明のＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片をコードする遺伝子は、大腸菌内発現を最適化するために操作された遺伝子を含む。ヒトと大腸菌の遺伝子コドンが異なるため、ヒト遺伝子を大腸菌で発現させる場合に、発現収率が低い。そこで、本発明では、ヒトＴＮＦＲＩ遺伝子に基づいて大腸菌発現に適合するように操作された遺伝子、例えば配列番号５のＴＮＦＲＩ遺伝子を用いることができる。該遺伝子は、大腸菌発現ベクター（例えば、ｐＥＴ４４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ：７１１２２−３））に挿入してコドンなしの大腸菌細胞（例：ＢＬ２１（ＤＥ３））で発現時に、ヒトＴＮＦＲＩ遺伝子よりも高い発現量を示す。そのため、該遺伝子を用いてＴＮＦＲＩ断片及びＴＮＦＲＩ変異体を大腸菌内で効果的に産生することができる。
【００６１】
本発明は、また、上記修飾された遺伝子を含むベクターを提供する。本発明で遺伝子導入のために使用可能なベクターは、当業界に公知のベクターを用いることができ、好ましくは、図１の切断地図を有するベクターを用いることができる。
【００６２】
本発明は、また、上記ベクターで形質転換された細胞（微生物または動物細胞）を提供する。本発明で、ベクターの形質転換のために使用可能な微生物または動物細胞は、当業界で用いられる形質転換のための公知の微生物または動物細胞とすればよく、好ましくは、大腸菌細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などを用いることができ、より好ましくは、大腸菌である細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３））を用いることができる。
【００６３】
本発明は、大腸菌を用いたＴＮＦＲＩの製造方法を提供する。
【００６４】
ＴＮＦＲＩは、動物細胞を用いて産生可能である（Ｂｅｒｎｉｅ等、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．３０１：４１８−４２６  ２００２；Ｓｃａｌｌｏｎ等、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ．７：７５９−７７０  １９９５）。
【００６５】
ＴＮＦＲＩを大腸菌で発現させる場合に、構造的に活性を持たない封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）の形態で発現するから、活性を有するタンパク質へのリフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）過程が要求される（Ｓｉｌｖｉａ等、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３０：８５−９０  １９９５；Ｋａｒｉｎ等、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ．７：２６−３８  １９９５）。そのため、本発明の修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は大腸菌で封入体の形態で発現させ、これをリフォールディング過程を通じて活性を有するＴＮＦＲＩにした後、これをゲルろ過クロマトグラフィ方法などで精製して得ることができる。また、本発明のＴＮＦＲＩポリペプチド断片または修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は、親水性の融合タンパク質をつけて発現する方法、低い温度で培養する方法などを用いて大腸菌で封入体の形態ではなく可溶性タンパク質の形態とすることができる。例えば、親水性のＮｕｓＡタンパク質をＴＮＦＲＩタンパク質のＮ末端に結合させることによって、大腸菌で可溶性のタンパク質としてＴＮＦＲＩを製造することができる。
【００６６】
また、本発明は、上記遺伝子を適当なベクターに導入し、このベクターで宿主細胞を形質転換し、これにより得られた形質転換体を培地で培養してＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を得る、ＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片の製造方法を提供する。
【００６７】
本発明は、また、ＴＮＦにより媒介される疾病や内科症状（以下、「ＴＮＦ媒介疾病」という。）に対する治療方法を提供する。ＴＮＦ媒介疾病、それに伴う後遺症及びその関連症状の例は、次の通りである：成人呼吸窮迫症候群；食欲不振；癌（例えば白血病）；慢性疲労症候群；移植片対宿主拒否反応；痛覚過敏；炎症性腸疾患；神経炎症性疾患；脳虚血を含む虚血性／再潅流傷害；各々神経変性の原因となり得る外傷、癲癇、出血又は発作の結果としての脳損傷；糖尿病（例えば若年性１型糖尿病）；多発性硬化症；眼病；疼痛；膵炎；肺線維症；リウマチ性疾患（例えばリウマチ性関節炎、骨関節炎、若年性（リウマチ性）関節炎、血清反応陰性多発性関節炎、強直性脊髄炎、ライター症候群及び反応性関節炎、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、血管炎、脳血管炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎及びリウマチ性多発性筋痛及び巨細胞性動脈炎）；敗血性ショック；放射線療法の副作用；全身性紅斑性狼瘡；側頭下顎関節疾患；甲状腺炎及び組織移植。このようなＴＮＦ媒介疾病は、当分野において周知である。
【００６８】
本発明は、また、上記の修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を含むリウマチ性関節炎またはＴＮＦ媒介疾病の予防または治療用医薬組成物を提供する。
【００６９】
本発明は、また、上記の修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクターまたは該ベクターで形質転換された微生物または動物細胞を含むリウマチ性関節炎またはＴＮＦ媒介疾病の予防または治療用医薬組成物を提供する。
【００７０】
本発明は、また、前記ＴＮＦ媒介疾病の予防または治療用組成物を対象体に投与することを含むリウマチ関節炎またはＴＮＦ媒介疾病の予防または治療方法を提供する。
【００７１】
本発明の医薬組成物は、経口、舌下、直腸、皮膚、皮下、筋肉、腹腔、静脈、動脈などで投与することができる。この医薬組成物は、目的とする純度を有するＴＮＦＲＩ変異体を、薬剤学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤と混合することによって貯蔵または投与用に製造することができる。これらの物質は、使用する投与量及び濃度において服用者に毒性がないものであり、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩及び他の有機酸塩のような緩衝剤；アスコルビン酸のような酸化防止剤；ポリアルギニン；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゲラチンまたは免疫グロブリン）；低分子量（約１０個未満の残基を有する）ペプチド；ポリビニルピロリドンのような親水性重合体；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、およびセルロースまたはその誘導体を含むその他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成対イオン；および／または、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン界面活性剤を含む。
【００７２】
本発明の医薬組成物は、注射用滅菌組成物の形態で当業界における通常の方法により製造することができる。この注射用滅菌組成物は、賦形剤、例えば、水またはごま油、落花生油または綿実油のような天然植物性オイル、またはオレイン酸エチルのような合成脂肪賦形剤中の活性化合物の溶液または懸濁液を含むことができる。該注射用滅菌組成物には、さらに緩衝剤、防腐剤、酸化防止剤などを、当業界で通常的に用いる様態で混入することができる。
【００７３】
本発明の修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片、またはこれをコードする遺伝子または該遺伝子を含むベクター、該ベクターで形質転換された微生物または動物細胞は、上記ＴＮＦ媒介疾患の治療的に有効な量で医薬組成物中に含まれる。
【００７４】
上記の「治療的に有効な量」は、研究者、獣医師、医師またはその他臨床医により考えられる動物またはヒトにおいて生物学的または医学的反応を誘導する活性成分または薬学的組成物の量を意味するもので、これは、治療される疾患または障害の症状緩和を誘導する量を含む。本発明の有効成分に対する治療上有効投与量及び投与回数は、所望の効果によって変わることは当業者には自明である。そのため、投与される最適の投与量は、当業者が容易に決定することができ、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含まれている有効成分及び他の成分の含量、剤形の種類、及び患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の排出率、治療期間、同時使用される薬物をはじめとする様々な因子によって調節することができる。例えば、成人に対して、本発明のＴＮＦＲＩ変異体を１日１回投与時に、０．０１〜１，０００ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは、０．１〜１００ｍｇ／体重ｋｇの用量で投与することが好ましい。
【００７５】
また、本発明の修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は、他の療法に対する付加物として投与されてもよく、治療される適応症（ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）に適する他の医薬組成物と併用して投与することができる。本発明の修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は、１または２以上の公知のまたは新規の抗炎症性薬物のうちの任意の薬物と別個にまたは併用して投与することができる。かかる薬物に該当する化合物に関する情報は、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ，Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｓｉｘｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ，Ｓｈａｒｐ  ＆  Ｄｏｈｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ、ＮＪ（１９９２）、及びＰｈａｒｍａｐｒｏｊｅｃｔｓ、ピージェイビーパブリケーションリミッテッドから見つけることができる。
【００７６】
上記併用使用の一例として、本発明のＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は、リウマチ性疾病［例えば、ライム病、若年性（リウマチ性）関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、リウマチ性関節炎及び黄色ブドウ球菌誘導性（「敗血性」）関節炎］のような急性及び慢性炎症を含む、ＴＮＦ媒介疾病の治療のために、非ステロイド性、抗炎症性薬物（ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ  ａｎｔｉ−ｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇｓ，ＮＳＡＩＤｓ）として分類される炎症調節のための第一選択薬と共に用いることができる。
【００７７】
上記併用使用の他の例として、本発明の修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は、上記ＴＮＦ媒介疾病及び多発性硬化症治療のために、一つ以上の遅効性抗リウマチ性薬物（ｓｌｏｗ−ａｃｔｉｎｇ  ａｎｔｉｒｈｅｕｍａｔｉｃ  ｄｒｕｇ，ＳＡＡＲＤｓ）または疾病抗リウマチ性薬物（ｄｉｓｅａｓｅ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｄｒｕｇ，ＤＭ  ｄｒｕｇ，ＤＭＡＲＤｓ）、その薬物前駆体エステルまたは薬剤学的に許容される塩のいずれかと共に使用することができる。
【００７８】
上記併用使用の他の例として、本発明のＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は、上記のＴＮＦ媒介疾病の治療のために、一つ以上のＣＯＸ２阻害剤、その薬物前駆体エステルまたは薬剤学的に許容される塩のいずれかと共に使用することができる。
【００７９】
本発明のＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は、上記のＴＮＦ媒介疾病の治療のために、一つ以上の抗菌薬、薬物前駆体エステル、または薬剤学的に許容される塩のいずれかと共に使用することができる。
【００８０】
本発明のＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は、上記のＴＮＦ媒介疾病の治療のために、一つ以上の次の化合物のいずれかと共に使用することができる：顆粒球菌体刺激因子タリドミド、テニダブ、チアパパント、ニメスリド、パナビア、ロリプラム、サルファサラジン（ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ）；バルサラジド（ｂａｌｓａｌａｚｉｄｅ）；オルサラジン（ｏｌｓａｌａｚｉｎｅ）；メサラジン（ｍｅｓａｌａｚｉｎｅ）；プレドニソロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）；ブデソニド（ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ）；メチルプレドニソロン（ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）；ヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）；メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）；シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）；ペプチドＴ；（１Ｒ，３Ｓ）−シス−１−［９−（２，６−ジアミノプリニル）］−３−ヒドロキシ−４−シクロペンテンヒドロクロリド、（１Ｒ，３Ｒ）−トランス−１−［９−（２，６−ジアミノ）プリン］−３−アセトキシシクロペンタン、（１Ｒ，３Ｒ）−トランス−１−［９−アデニル］−３−アジドシクロペンタンヒドロクロリド、及び（１Ｒ，３Ｒ）−トランス−１−［６−ヒドロキシ−プリン−９−イル］−３−アジドシクロペンタン。
【００８１】
本発明の修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は、上記のＴＮＦ媒介疾病の治療のために、一つ以上の付加的ＴＮＦ阻害剤と共に使用することができる。ＴＮＦ阻害剤は、ＴＮＦの生体内合成または細胞外放出を遮断する化合物及びタンパク質であり、次のものを含む：抗ＴＮＦ抗体［例えば、ＭＡＫ  １９５Ｆ  Ｆａｂ抗体（Ｈｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），１ｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１４７）；ＣＤＰ  ５７１抗ＴＮＦモノクロナール抗体（Ｒａｎｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，３４：３３４−３４２）；ＢＡＹ  Ｘ１３５１マウスの抗腫瘍壊死因子モノクロナール抗体（Ｋｉｅｆｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），７ｔｈ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，９）；ＣｅｎＴＮＦ  ｃＡ２抗ＴＮＦモノクロナール抗体（Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｌａｎｃｅｔ，３４４：１１２５−１１２７  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、Ｌａｎｃｅｔ、３４４：１１０５−１１１０）］。
【００８２】
本発明は、また、上記の修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を含む医薬製剤を提供する。好ましくは、本発明の医薬製剤は、薬剤学的に許容される賦形剤をさらに含む。
【００８３】
本発明の医薬製剤は、経口剤、吸入剤、注射剤、粘膜投与製剤、及び外用剤からなる群から選ばれる医薬製剤でよい。
【００８４】
本発明の医薬製剤は、薬剤的に許容可能な希釈剤、保存剤、溶解剤、乳化剤、アジュバントまたは運搬体などを治療に効果的な量で含む。また、本発明の医薬製剤は、当業界で用いられる通常の緩衝溶液（例えば、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタスルファイトナトリウム）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）、そしてバルク希釈剤（例えば、乳糖、マンニトール）のような添加剤を含むことができる。これらの添加剤は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸リポソームなどのポリマー組成物を用いて粒子性物質として提供することができる。また、本発明の医薬製剤は、循環系内の持続性増加のために、ヒアルロン酸を含むことができる。本発明の医薬製剤は、選択的に薬剤学的運搬体、賦形物、あるいは培地として薬剤学的に許容される液体、半固体、あるいは固体希釈物を含むことができる。これらの物質にはポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、澱粉類、砂糖、デキストロース、アカシアガム、カルシウムリン酸塩、ミネラルオイル、ココアバター、及びテオブロマオイルなどを含むことができ、これに限定されない。
【００８５】
本発明の医薬製剤は、また、胃腸管環境、そして腸内における生物学的な活性を有する物質の分泌から保護されるようにする安定した添加物質を含む。
【００８６】
本発明の医薬製剤は、公知の技術、例えば、混合、溶解、顆粒化、ドラジェ化（ｄｒａｇｅｅ−ｍａｋｉｎｇ）、研和（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、封入（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）または錠剤化工程を用いて製造される。
【００８７】
本発明の医薬製剤は、液体（例：懸濁液、エリキシル及び／または溶液）、または固体（例：粉末、錠剤及び／またはカプセル）形態であり、デポ（ｄｅｐｏｔ）形態に剤形化することができる。該デポ製剤は、非デポ製剤よりも一般的に長時間作用性である。該デポ製剤は、適切な重合体または疎水性物質（例：適切なオイルのうちエマルジョン）またはイオン交換樹脂または難溶性誘導体（例えば難溶性塩）を用いて製造する。また、本発明の医薬製剤は、リポソーム及びエマルジョンのような送達システムを含む。特定送達システムは、疎水性化合物を含む製剤を含めて特定医薬製剤を製造するのに有用であり、ジメチルスルホキシドのような有機溶媒を用いることができる。本発明の他の様態として、本発明の医薬製剤は、医薬製剤を特定組織や細胞類型に送達するように考案された一つ以上の組織特異的送達分子を含む。例えば、特定の様態において、医薬製剤は、組織特異的抗体で被覆されたリポソームを含む。
【００８８】
好ましくは、本発明の医薬製剤は、固体形態の経口投与製剤にすることができる。固体投与形態は、錠剤、カプセル、丸薬、トローチ、ペレットなどの形態を含む。
【００８９】
リポソームやプロテイノイドカプセル化も、本発明の組成物を製剤化するのに用いることができる。これらのリポソームは、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、及びスフィンゴミエリン（ＳＭ）のようなリン脂質、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、及びポリアスパラギン酸塩アミドのような親水性ポリマーで製造することができる。
【００９０】
一方、本発明の医薬製剤中に含まれた修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は、必要によっては、経口投与を効果的にするために化学的に修飾することができる。一般に、化学的な修飾は、ＴＮＦＲＩ変異体ポリペプチド内に１または２以上の残基をつけることに相当する。ここで、残基は、タンパク質分解酵素に抵抗性を持たせる物質、または、胃腸管から血流中への吸収を助ける物質でよい。好ましくは、上記化学的修飾のための残基は、本発明の医薬製剤の全体的な安定性を増加させることで、人体内で循環時間を増加させる化学的修飾のための残基でよい。これら残基の例は、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共同複合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びポリポリプロリンなどでよい。使用可能な他のポリマーには、ポリ−１，３−ジオキサン及びポリ−１，３，６−チオキソケインなどがある。最も好ましくは、ポリエチレングリコール残基（ペグ化）が用いられる。
【００９１】
本発明の経口投与用形態の医薬製剤の吸収率を増加させるための運搬体として、ソジウムＮ−（８−［２−ヒドロオキシベンゾイル］アミノ）カプリレート（ＳＮＡＣ）のような修飾されたアリファティックアミノ酸の塩を用いることができる。
【００９２】
本発明の医薬製剤は、顆粒や粒子の大きさが約１ｍｍのペレット形態の多重微粒子状に製剤化することができる。この場合、製剤は、カプセル形態でもよく、多重微粒子状の製剤は、粉末、軽く押された充填物、あるいは錠剤などの形態でもよい。また、該製剤は圧縮によって製造されてもよい。
【００９３】
本発明の医薬製剤は、また、発色剤や香辛料をさらに含み、例えば、リポソームやミクロスフェアカプセルの形態に製剤化することができる。
【００９４】
また、本発明の医薬製剤内有効成分である修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片の吸収を増加させるために、脂肪酸、オレイン酸、リノレン酸などのような添加剤を用いることができる。
【００９５】
一方、本発明の医薬製剤は、放出制御性製剤でよい。このような製剤内有効成分である修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は、非活性の担体に含まれて、拡散あるいは溶解の機序によって制御されて放出される。また、この放出制御性製剤は、徐々に分解される担体、例えば、アルギン酸、多糖類などを含むことができる。該放出制御性製剤の他の形態には、ＯＲＯＳ治療システム（Ｏｓｍｏｔｉｃ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｏｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、アルジャ社製）に基づく形態でよい。この放出制御性製剤は、半透過性膜内に本発明の有効成分であるＴＮＦＲＩ変異体が充填され、その内部に水が流入することで当該有効成分を一つの小さい孔を通して浸透圧効果にてはみ出させる。また、本発明の放出制御性製剤は、腸溶性コーティング物質でコーティングすることによって、遅延された薬物放出効果を示すことができる。
【００９６】
本発明の医薬製剤はまた、フィルムでコーティングされた錠剤の形態でよく、このフィルムコーティングに用いられる物質には、次の２群がある。第一の群は、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキセチルセルロース、メチルヒドロキシル−エチルセルロース、ヒドロキシルプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、ソジウムカルボキシ−メチルセルロース、プロビドンそしてポリエチレングリコールなどのような非腸溶性物質であり、第二の群は、フタル酸のエステルのような腸溶性物質である。具体的には、腸溶性物質には、腸溶性高分子、すなわち、腸溶性セルロース誘導体、腸溶性アクリル酸系共重合体、腸溶性マレイン酸系共重合体、腸溶性ポリビニル誘導体、及びこれらの混合物からなる群から選ばれるいずれかが用いられる。腸溶性セルロース誘導体は、ヒプロメロースアセテートスクシネート、ヒプロメロースフタレート、ヒドロキシメチルエチルセルロースフタレート、セルロースアセテートフタレート、セルロースアセテートスクシネート、セルロースアセテートマレート、セルロースベンゾエートフタレート、セルロースプロピオネートフタレート、メチルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロース及びエチルヒドロキシエチルセルロースフタレートから選ばれる１または２以上の腸溶性アクリル酸系共重合体は、スチレン−アクリル酸共重合体、アクリル酸メチル−アクリル酸共重合体、アクリル酸メチルメタクリル酸共重合体、アクリル酸ブチル−スチレン−アクリル酸共重合体、メタクリル酸−メタクリル酸メチル共重合体（例えば、オイドラギットＬ１００、オイドラギットＳ、デグザ社製）、メタクリル酸・アクリル酸エチル共重合体（例えば、オイドラギットＬ１００−５５、デグザ社製）、及びアクリル酸メチル−メタクリル酸−アクリル酸オクチル共重合体から選ばれる１または２以上の腸溶性マレイン酸系共重合体は、酢酸ビニル−マレイン酸無水物共重合体、スチレン−マレイン酸無水物共重合体、スチレン−マレイン酸モノエステル共重合体、ビニルメチルエーテル−マレイン酸無水物共重合体、エチレン−マレイン酸無水物共重合体、ビニルブチルエーテル−マレイン酸無水物共重合体、アクリロニトリル−アクリル酸メチル・マレイン酸無水物共重合体、及びアクリル酸ブチル−スチレン−マレイン酸無水物共重合体から選ばれる１または２以上、または上記腸溶性ポリビニル誘導体は、ポリビニルアルコールフタレート、ポリビニルアセタールフタレート、ポリビニルブチレートフタレート、及びポリビニルアセトアセタールフタレートから選ばれる１または２以上である。
【００９７】
上記コーティング物質の混合物が最適のフィルムコーティングのために用いられてもよい。フィルムコーティングは、ファンコーター（ｐａｎ  ｃｏａｔｅｒ）、流動層造粒機または圧縮コーティング機で行うことができる。
【００９８】
本発明の放出制御性医薬製剤は、また、持続放出のために、成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセル形態の半透過性固相疎水性重合体マトリックス内に、本発明の修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を含むことができる。この持続放出のためのマトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル［例：Ｌａｎｇｅｒ等、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７，１９８１及びＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５，１９８２に記載されたポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）］、ポリ乳酸（米国特許第３７７３９１９号、ヨーロッパ特許第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸及びガンマエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体（Ｓｉｄｍａｎ等、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６，１９８３）、非分解性エチレン−ビニルアセテート（上記のＬａｎｇｅｒ等の文献）、分解性乳酸−グリコール酸共重合体（例：リュープロンデポ（Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ）（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドからなる注射用ミクロスフェア）及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ヨーロッパ特許第１３３９８８号）を含む。
【００９９】
カプセル化したタンパク質が長期間体内に滞留すると、３７℃で湿気に露出された結果、変性または凝集することがあり、その結果、生物学的活性の損失、免疫原性の変化を招くことがある。そのため、関連メカニズムに基づいて公知の方法を用いてタンパク質安定化を達成することができる。例えば、凝集メカニズムがジスルフィド交換を通じた分子間Ｓ−Ｓ結合を形成するものと知られた場合、スルフヒドリル残基を変性し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含量を調節し、適当な添加剤を使用し、特定重合体マトリックス組成物を開発することによって安定化させることができる。
【０１００】
本発明は、また、本発明のＴＮＦＲＩ変異体、及びこれを含む医薬製剤の使用方法を提供する。当該医薬製剤は、注射、経口投与、鼻腔内投与、経皮投与、または他の方法を用いた投与が可能である。該方法には、静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）、真皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）、筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ）、乳房内（ｉｎｔｒａｍａｍｍａｒｙ）、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）、髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、眼内（ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ）、肺内（ｉｎｔｒａｐｕｌｍｏｎａｒｙ）あるいは皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、舌下（ｓｕｂｌｉｎｇｕａｌ）、肛門（ａｎａｌ）、膣（ｖａｇｉｎａｌ）、外科的注入（ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）などがある。この治療は、単回投与または一定期間にわたる反復投与でよい。
【０１０１】
また、本発明の医薬製剤は、肺を通した送達方法によって伝えられてもよい。本発明の医薬製剤は、ほ乳動物の肺を通して息をする間に送達され、それは肺の上皮細胞を通りながら血流中に吸収される。
【０１０２】
肺を通した薬物の送達のために考案された様々な機械的装置を、本発明の医薬製剤の肺を通した送達のために用いることができる。これらは、ネブライザー、目盛り付き用量吸入器、及び粉吸入器などを含め、当業界で市販されている種々の機器を含む。
【０１０３】
本発明の医薬製剤は、これらの装置への適用を最適化するために適切に製剤化することができる。一般に、それぞれの製剤は、適用された装置の形態によって特異的であり、場合によって、希釈剤、アジュバント、または運搬体にさらに推進剤を適切に併用することができる。
【０１０４】
肺を通した送達のための本発明の医薬製剤は、粒子性物質とすることが好ましく、それの平均粒径は、約１０μｍ以下である。最も好ましくは、０．５〜５μｍにし、遠くの肺まで効果的に送達されるようにする。
【０１０５】
肺を通した送達のための本発明の医薬製剤は、また、運搬体として、トレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトース及びソルビトールのような炭水化物を含むことができる。上記製剤には、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（Ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ＤＯＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＳＰＣ）及びジオレオイルホスファチジルコリン（Ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＯＰＣ）などをさらに挙げることができる。なお、当該製剤は、天然または合成界面活性剤を含むことができる。該製剤は、なお、ポリエチレングリコール環状デキストランのようなデキストラン胆汁酸と他の関連した誘導体、及び緩衝溶液の製剤として用いられるアミノ酸をさらに含むことができる。
【０１０６】
また、本発明の医薬製剤の肺を通した送達のために、リポソーム、マイクロカプセルまたはミクロスフェア、包接錯体または運搬体の他の形態が用いられてもよい。
【０１０７】
本発明の医薬製剤をネブライザーを用いて肺に送達する場合に、ジェットまたは超音波を共に使用することができる。ネブライザーに適用するための本発明の医薬製剤は、溶液１ｍＬ当たり約０．１〜５００ｍｇのＴＮＦＲＩ変異体を含む。また、このネブライザー用製剤は、緩衝溶液と単糖類を含み、これらは、例えば、タンパク質安定化及び浸透圧安定に寄与する。なお、当該ネブライザー用製剤は、エアロゾルの形成において溶液の原子化に起因するタンパク質の凝集を誘発する表面を減らす目的で界面活性剤を含むことができる。
【０１０８】
目盛り付き用量吸入器のための本発明の医薬製剤は、一般に、本発明のＴＮＦＲＩ変異体を含む組成物を細かい粉にして、界面活性剤の補助下に推進剤に混合した形態である。該推進剤は、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、あるいはジクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、及び１，１，１，２−テトラフルオロエタンのようなヒドロカーボン、またはこれらの組み合わせでよい。上記使用可能な適切な界面活性剤は、ソルビタントリオレート及び大豆レシチンを含む。オレイン酸も同様、界面活性剤に用いることができる。
【０１０９】
粉吸入器から放出される本発明の医薬製剤は、本発明のＴＮＦＲＩ変異体を含む組成物を含む細かい乾燥粉状にし、ラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはキシリトールのような希釈剤を含むことができる。これらは、粉状の製剤を機器装置から分散させることを促すことができる。
【０１１０】
なお、本発明の医薬製剤は、鼻腔を通した送達のための製剤でもよい。鼻を通した送達は、タンパク質治療剤が鼻に入ってきた後に直ちに血流中に入るようにし、肺に治療剤が積もることを防ぐ。鼻腔を通した送達のための本発明の医薬製剤は、デキストランまたは環状デキストランなどを含む。本発明の医薬製剤は、その他の粘膜組織を通して伝えられるための製剤でもよい。
【０１１１】
本発明の医薬製剤の投与用量は、上述した疾病を治療する方法について医師により薬物の効果を変形させるような要因、例えば、年齢、状態、体重、性別、食餌、ある感染による重症度、投与時点などのその他臨床学的な条件による要因に基づいて決定しなければならない。
【０１１２】
本発明の医薬製剤は、単回または継続的投与が可能である。ただし、初回投与後に一定の循環系濃度を維持させるために継続的な投与をすることが好ましい。効果的な投与用量及び方法は、当業界で公知の一般技術に基づいて最適化すればよく、反復投与回数は、各患者の薬動学的な因子と投与経路によって可変でよい。なお、投与用量、用法及び投与回数は、投与された薬物の物理的な状態、安全性、生体内放出速度、生体内除去率などに基づいて最適化することができる。また、投与経路に基づく適切な投与用量を、体重、体表面積、臓器の大きさによって計算することができる。適切な用量は、適切な用量−反応資料と血中濃度の資料と共に判断して確定しなければならない。最終の投与法は医師により決定されるが、医師は、薬物の比活性、患者の重症度、薬物に対する患者の反応程度、年齢、調子、体重、性別、食餌及びその他臨床学的な要因を考慮して処方しなければならない。研究が進行されるにつれて、種々の疾病及び条件に対応する適切な投与用量と処方期間に関するより多くの情報が出現すると予想される。
【発明の効果】
【０１１３】
本発明の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片は、天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片と比べて増加されたＴＮＦに対する結合力を示す。また、天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片に比べて維持／増加されたタンパク質分解酵素に対する抵抗性を有するため、生体内において増加された半減期を示し、注射剤または経口剤として投与時に、改善された生体利用率及び吸収率を示す。よって、効果的にＴＮＦの作用を阻害する持続型注射剤及び経口用タンパク質製剤として有用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】ｐＥＴ４４ａベクターにＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１０５またはＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６またはＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１遺伝子を挿入してＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１０５またはＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６またはＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１を発現する大腸菌発現ベクターを製作する過程を示す模式図である。
【図２】Ａは、ゲルろ過クロマトグラムを用いて、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１０５、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１タンパク質の溶出を確認した図であり（分画Ａ４）、Ｂは、精製されたＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１０５、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１を還元状態でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｓｉｌｖｅｒ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）方法で分析した結果を示す写真である。
【図３】ＴＮＦ−αに対するＴＮＦＲＩ断片（ＴＮＦＲＩ１２６、ＴＮＦＲＩ１７１）及びＴＮＦＲＩ変異体断片（ＴＮＦＲＩ１２６−Ａ３０、ＴＮＦＲＩ１７１−Ａ３０）の結合力をＥＬＩＳＡ分析により確認したグラフである。
【図４】Ａは、ＴＮＦＲＩ断片（ＴＮＦＲＩ１２６、ＴＮＦＲＩ１７１）及びＴＮＦＲＩ変異体断片（ＴＮＦＲＩ１２６−Ａ３０、ＴＮＦＲＩ１７１−Ａ３０）の生物学的活性をＴＮＦ−α細胞毒性中和試験により確認したグラフであり、Ｂは、ＥＮＢＲＥＬ（商品名）、ＴＮＦＲＩ断片（ＴＮＦＲＩ１７１）及びＴＮＦＲＩ変異体断片（ＴＮＦＲＩ１７１−Ａ２、ＴＮＦＲＩ１７１−Ａ９）の生物学的活性をＴＮＦ−α細胞毒性中和試験により確認したグラフであり、Ｃは、ＥＮＢＲＥＬ（商品名）、ＴＮＦＲＩ断片（ＴＮＦＲＩ１７１）及びＴＮＦＲＩ変異体断片（ＴＮＦＲＩ１７１−Ａ２１、ＴＮＦＲＩ１７１−Ａ２２）の生物学的活性をＴＮＦ−α細胞毒性中和試験により確認したグラフである。
【図５】ＮｕｓＡタンパク質をコードする遺伝子を有しているｐＥＴ４４ａベクターにＴＮＦＲＩ１０８遺伝子を挿入して、ＮｕｓＡの融合されたＴＮＦＲＩ１０８を発現する大腸菌発現ベクターを作製する過程を示す模式図である。
【図６】ｐＥＴ４４ａ−ＮｕｓＡ−ＴＮＦＲＩ１０８発現ベクターで形質転換された大腸菌においてＮｕｓＡの融合されたＴＮＦＲＩ１０８の発現を確認し、金属親和クロマトグラフィ（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｍｅｔａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）と疎水性クロマトグラフィ（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で純粋に精製した写真である。
【図７】ＴＮＦＲＩ１０８断片及びＴＮＦＲＩ１０８断片単一変異体ＴＮＦＲＩ１０８−Ｒ１４、ＴＮＦＲＩ１０８−Ｒ６４及びＴＮＦＲＩ１０８−Ｒ６８のタンパク質分解酵素に対する抵抗性を確認したグラフである。
【図８】Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１断片及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１断片単一変異体Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−Ｒ８３、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−Ｒ８４、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−Ｒ９２のタンパク質分解酵素に対する抵抗性を確認したグラフである。
【図９】Ａは、ＴＮＦＲＩ１７１断片及びＴＮＦＲＩ１７１断片変異体ＴＮＦＲＩ１７１−Ａ２、ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ３１、ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ５３のタンパク質分解酵素に対する抵抗性を確認したグラフであり、Ｂは、ＴＮＦＲＩ１７１断片及びＴＮＦＲＩ１７１断片変異体ＴＮＦＲＩ１７１−Ａ２２、ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ４７、ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ６３のタンパク質分解酵素に対する抵抗性を確認したグラフである。
【図１０】Ａは、ＴＮＦＲＩ１７１断片変異体の生体内効力をカラギーナン（ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ）誘導浮腫の減少で確認したグラフであり、Ｂは、浮腫を起こした足組織内のＩＬ−６変化を確認したグラフである（左側から順にビヒクル、エンブレル、ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ５４、ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ６２、ＴＮＦＲＩ１７１−Ａ２、ＴＮＦＲＩ１７１−Ａ９、ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ３６、ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ５７、ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ５８、ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ６３）。
【図１１】Ａは、ＴＮＦＲＩ１７１断片及びＴＮＦＲＩ１７１断片変異体の生体内効力をカラギーナン誘導浮腫の減少で確認したグラフであり、Ｂは、浮腫を起こした足組織内のＩＬ−６の変化を確認したグラフである（左側から順にビヒクル、エンブレル、ＷＴ  ２．５ｍｇ／ｋｇ、ＷＴ  ５ｍｇ／ｋｇ、ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ６３  ２．５ｍｇ／ｋｇ、ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ６３  ５ｍｇ／ｍＬ）。
【発明を実施するための形態】
【０１１５】
本発明の利点及び特徴、並びにそれらを達成する方法は、後述する実施例から明確になるであろう。ただし、本発明は、以下に開示される実施例に限定されない。
【０１１６】
本発明の修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を製造するために、既に誘電体が公開されているヒトＴＮＦＲＩ誘電体情報を用いた。
【０１１７】
［製造例１］ＴＮＦＲＩ断片遺伝子及び発現ベクターの製作
（１）ＴＮＦＲＩ１７１断片遺伝子の製作
ヒトＴＮＦＲＩは４個の細胞外ドメインを有しており、そのうち、ＴＮＦＲＩの３つのドメイン（ＴＮＦＲＩ１２６）だけでもＴＮＦ−αに対する結合が可能であり、それ以上の欠損が存在してもＴＮＦ−αとの結合に影響がないと報告されている。そこで、配列番号１として記載されたヒトＴＮＦＲＩポリペプチドの４１番から１７１個のアミノ酸を有するＴＮＦＲＩ１７１、ヒトＴＮＦＲＩの４１番から１２６個のアミノ酸を有するＴＮＦＲＩ１２６、４１番から１０５個のアミノ酸を有するＴＮＦＲＩ１０５を、本発明の変異体を製造するための候補ペプチドとして選定した。このような変異体を産生するために、ＴＮＦＲＩ１７１の塩基配列を、大腸菌内発現に容易となるように、大腸菌に合うコドンを用いて修飾した（配列番号５）。これを、ＰＣＲ方法を用いる遺伝子合成方法で作製した。
【０１１８】
上記合成された遺伝子配列を、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ａ１３８０）ベクターに挿入するために、１μＬのｐＧＥＭ−Ｔベクターに前記合成された遺伝子３μＬを添加し、１μＬリガーゼ（ＮＥＢ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｍ２２００Ｓ）とライゲーション溶液（２ｘ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）を入れた後、常温で１０分間反応させた。反応溶液２μＬを取ってＸＬ１−ｂｌｕｅコンピテント細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）（ＲＢＣ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＲＨ１１９−Ｊ８０）に入れ、３７℃で２分間熱衝撃（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）を加えて形質転換した後、アンピシリンの含まれているＬＢ固体培地で静置培養してコロニーを得た。このコロニーを、アンピシリンの含まれているＬＢ液体培地で培養した後、プラスミドを分離し、ＰＣＲを用いてｄｄＮＴＰに蛍光物質を標識する方式で遺伝子配列を確認した（ソルジェント、韓国）。この遺伝子をｐＧＥＭ−ＴＮＦＲＩ１７１と命名した。以下では、ＴＮＦＲＩ１２６、ＴＮＦＲＩ１０５遺伝子は、先に得られたｐＧＥＭ−ＴＮＦＲＩ１７１遺伝子を用いてＰＣＲ方法で得た。
【０１１９】
（２）ＴＮＦＲＩ発現ベクターの製作：ＴＮＦＲＩ１０５、ＴＮＦＲＩ１２６及びＴＮＦＲＩ１７１発現ベクターの製作
大腸菌におけるＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ（Ｍｅｔで始まるＴＮＦＲＩタンパク質）の発現のために商業的に利用可能なｐＥＴ４４ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ：７１１２２−３）を用いて発現ベクターを構築した。
【０１２０】
具体的に、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１０５遺伝子（配列番号１００）は、前記製作されたｐＧＥＭ−ＴＮＦＲＩ１７１プラスミドを鋳型にＰＣＲを行って得た。このとき、ｐＥＴ４４ａベクターへのクローニングのために、５’末端にＮｄｅＩ、３’末端にＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限酵素認識位置を添加した。
【０１２１】
ＰＣＲ増幅に用いられたプライマーの塩基配列は、下記の通りである。
正方向プライマー: 5’-acatatggatagcgtgtgcccgc-3’
逆方向プライマー: 5’-taagcttattaattaaaacactggaac-3’
【０１２２】
ＰＣＲは、９５℃における５分間の１次変性、９５℃における１分間の２次変性、６０℃における４０秒間のプライマー接合、７２℃における１分間の伸長反応のうち、２次変性から伸長反応までを２５回繰り返し行った後、最終酵素反応を７２℃において１０分間行って反応を終了した。増幅された遺伝子とｐＥＴ４４ａベクターに制限酵素（Ｎｄｅ  Ｉ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ）を添加して３７℃において３時間反応させた。制限酵素を処理した後、１％アガロスゲル電気泳動を行って当該サイズのＤＮＡバンドをかみそりで切り出してＤＮＡ抽出キット（ＧｅｎｅＡｌｌ，Ｃａｔ．Ｎｏ：１０２−１０２）を用いて抽出した。５０ｎｇのｐＥＴ４４ａベクターと２００ｎｇのＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１０５遺伝子を添加し、１μＬリガーゼ（ＮＥＢ，Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｍ２２００Ｓ）とライゲーション溶液（２ｘｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）を入れ、最終的に滅菌された蒸留水を入れて２０μＬにし、反応物を常温下で１０分間反応させた。反応液２μＬを取ってＸＬ１−ｂｌｕｅコンピテント細胞に入れ、３７℃で２分間熱衝撃を加えて形質変換した後、アンピシリンの含まれているＬＢ固体培地で静置培養してコロニーを得た。このコロニーを、アンピシリンの含まれているＬＢ液体培地で培養した後、プラスミドを分離し、遺伝子配列分析により遺伝子配列を確認した。上記の過程を経て得たプラスミドをｐＥＴ４４ａ−Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１０５と命名した（図１）。
【０１２３】
Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６遺伝子（配列番号１０１）は、前記製作されたｐＧＥＭ−ＴＮＦＲＩ１７１プラスミドを鋳型にＰＣＲを行った後に確保した。このとき、ｐＥＴ４４ａベクターへのクローニングのために、５’末端にＮｄｅ  Ｉ、３’末端にＢａｍＨ  Ｉ制限酵素認識位置を添加した。
【０１２４】
ＰＣＲ増幅に用いられたプライマーは、下記の通りである。
正方向プライマー: 5’-acatatggatagcgtgtgcccgc-3’
逆方向プライマー: 5’-cggatccttaacaaactgtattctgcttc-3’
【０１２５】
ＰＣＲ反応は、上記のＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１０５遺伝子確保と同様であり、制限酵素としてＮｄｅ  Ｉ、ＢａｍＨ  Ｉを用いた以外は、大腸菌発現ベクターの製作は、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１０５発現ベクターの製作と同様に行われた。コロニー培養を通じてクローニングされたプラスミドをｐＥＴ４４ａ−Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６プラスミドと命名し、クローニングの完了は、コロニーからプラスミドを分離して遺伝子配列分析により決定した（図１）。
【０１２６】
Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１遺伝子（配列番号１０２）は、ｐＧＥＭ−ＴＮＦＲＩ１７１プラスミドを鋳型にＰＣＲを行った後に確保した。このとき、ｐＥＴ４４ａベクターへのクローニングのために、５’末端にＮｄｅ  Ｉ、３’末端にＢａｍＨ  Ｉ制限酵素認識位置を添加した。
【０１２７】
ＰＣＲ増幅に用いられたプライマーは、下記の通りである。
正方向プライマー: 5’-acatatggatagcgtgtgcccgc-3’
逆方向プライマー: 5’-cggatccttatgtggtgcctgagtcctc-3’
【０１２８】
ＰＣＲ反応及び大腸菌発現ベクターの製作は、上記のＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６遺伝子確保と同様である。コロニー培養を通じてクローニングされたプラスミドをｐＥＴ４４ａ−Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１プラスミドと命名し、クローニングの完了は、コロニーからプラスミドを分離して遺伝子配列分析により決定した（図１）。
【０１２９】
［製造例２］ＴＮＦ−αに対する結合力が向上したＴＮＦＲＩ断片変異体の製造
（１）ＴＮＦＲＩ変異体の設計
ＴＮＦＲＩ１０５、ＴＮＦＲＩ１２６、ＴＮＦＲＩ１７１に適用するアミノ酸修飾の一覧を表１に示す。配列番号１に記載の天然型ヒトＴＮＦＲＩのアミノ酸配列を用いて、ＴＮＦ−αとＴＮＦＲＩとの結合に関与すると認められるＴＮＦＲＩアミノ酸の位置を分析した。これにより決定されたＴＮＦＲＩの各アミノ酸の結合力を高めるために他のアミノ酸で置換した。
【０１３０】
【表１】
0005819439.tif 000002
【０１３１】
上記表１の１番〜３０番に記載のアミノ酸修飾をＴＮＦＲＩ１０５、ＴＮＦＲＩ１２６、ＴＮＦＲＩ１７１にそれぞれ導入した変異体をＴＮＦＲＩ１０５−Ａ１〜ＴＮＦＲＩ１０５−Ａ３０、ＴＮＦＲＩ１２６−Ａ１〜ＴＮＦＲＩ１２６−Ａ３０、ＴＮＦＲＩ１７１−Ａ１〜ＴＮＦＲＩ１７１−Ａ３０と命名した。（前記名称のうち、「Ａ」は、結合力（Ａｆｆｉｎｉｔｙ）増加変異体の候補を意味する。例えば、ＴＮＦＲＩ１０５−Ａ１は、ＴＮＦＲＩ１０５断片における結合力増加変異体候補１番を意味する。）
【０１３２】
（２）ＴＮＦＲＩ変異体をコードするＤＮＡの製造
位置特異的なＴＮＦＲＩ変異体を製作するために、位置指定突然変異体の製作（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）方法によってＴＮＦＲＩ変異体を製作した。表１に記載の３０個のアミノ酸修飾を含むＴＮＦＲＩ変異体の製作に用いたプライマーを下記表２に示す。
【０１３３】
具体的には、前記ＴＮＦＲＩ（先に製作されたｐＥＴ４４ａ−Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１０５またはｐＥＴ４４ａ−Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６またはｐＥＴ４４ａ−Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１）プラスミドを鋳型に下記表２のプライマーの各対を２０ｐｍｏｌｅになるように蒸留水に溶かした後に、Ｐｆｕポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応を行って位置指定突然変異体を製作した。
【０１３４】
先に製作されたｐＥＴ４４ａ−Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１０５またはｐＥＴ４４ａ−Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６またはｐＥＴ４４ａ−Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１プラスミドを鋳型に、ＴＮＦＲＩ１０５−Ａ１、ＴＮＦＲＩ−１２６−Ａ１、ＴＮＦＲＩ−１７１−Ａ１及びＴＮＦＲＩ１０５−Ａ３０、ＴＮＦＲＩ−１２６−Ａ３０、ＴＮＦＲＩ−１７１−Ａ３０をコードするプラスミドを製作するために、表２のＡ３０、Ａ１に該当するプライマーを用いてそれぞれ増幅反応を行った（それぞれｐＥＴ−ＴＮＦＲＩ１０５＿Ａ１、ｐＥＴ−ＴＮＦＲＩ−１２６＿Ａ１、ｐＥＴ−ＴＮＦＲＩ−１７１＿Ａ１及びｐＥＴ−ＴＮＦＲＩ１０５＿Ａ３０、ｐＥＴ−ＴＮＦＲＩ１２６＿Ａ３０、ｐＥＴ−ＴＮＦＲＩ１７１＿Ａ３０という）。次いで、下記表２に示すように、このようにして製作されたプラスミドを鋳型に、ｐＥＴ−ＴＮＦＲＩ＿Ａ２〜ｐＥＴ−ＴＮＦＲＩ＿Ａ２９を製作した。
【０１３５】
増幅反応に用いられた溶液の構成は、下記の通りである。それぞれの鋳型プラスミドＤＮＡ１．０μＬ、２０ｐｍｏｌｅＮ−プライマー１．０μＬ、２０ｐｍｏｌｅＣ−プライマー１．０μＬ、２ＸＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ２５．０μＬ、２００ｕＭ  ｄＮＴＰ４．０μＬ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ，Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｒ０４４Ａ）０．５μＬと１７．５μＬの蒸留水を入れて５０．０μＬの反応溶液を作成した。
【０１３６】
ＰＣＲは、９８℃における５分間の１次変性、９８℃における３０秒間の２次変性、５５℃における３０秒間のプライマー接合、７２℃における９分間の伸長反応のうち、２次変性から伸長反応までを１７回繰り返し行った後に、最終酵素反応を７２℃１０分行って反応を終了した。
【０１３７】
ＰＣＲ産物は、Ｄｐｎ  Ｉ酵素で３７℃において２時間処理して大腸菌由来のＤＮＡを分解し、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡを確保した。ＤＮＡ溶液２μＬを取ってＸＬ１−ｂｌｕｅコンピテント細胞（ＲＢＣ，Ｃａｔ．Ｎｏ：ＲＨ１１９−Ｊ８０）に入れ、４２℃で１分間熱衝撃を加えて形質転換し、アンピシリンの含まれているＬＢ固体培地で静置培養してコロニーを得た。このコロニーを、アンピシリンの含まれているＬＢ液体培地で培養した後、プラスミドを分離し、塩基配列の分析により位置特異的ＴＮＦＲＩ変異体の完成を確認した。
【０１３８】
【表２】
0005819439.tif 000003
0005819439.tif 000004
【０１３９】
（３）大腸菌で生物学的活性を示すＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ変異体の産生
（イ）Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ変異体の発現
上記製作したプラスミド溶液１μＬを取ってＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｃ６０１０−０３）コンピテント細胞に入れ、４２℃で１分間熱衝撃を加えて形質転換し、アンピシリンの含まれているＬＢ固体培地で静置培養してコロニーを得た。発現ベクターを含んでいる大腸菌ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）を、１００μｇ／ｍＬ濃度のアンピシリンの入っている５ｍＬ ＹＰ培地（ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ：Ｍｅｒｃｋ，Ｃａｔ．Ｎｏ：１０３７５３，ｐｅｐｔｏｎｅ：ＢＤ，Ｃａｔ．Ｎｏ：２４３６２０，ＮａＣｌ：Ｍｅｒｃｋ，Ｃａｔ．Ｎｏ：１０６４０４９０２５）に接種して３７℃で１６時間通気培養した。培養された培地は、１００μｇ／ｍＬアンピシリンの入っている２５０ｍＬ ＹＰ培地を有する１Ｌフラスコに６００ｎｍにおける吸光度が０．１になるように接種した。３７℃で培養して６００ｎｍにおける吸光度が３〜４であるときに、最終濃度が１．０ｍＭ濃度になるようにＩＰＴＧを添加して発現を誘導した。発現誘導後、３７℃で３時間さらに通気培養を続けた後、細胞を６，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞を収集した。
【０１４０】
（ロ）未溶解Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ変異体の回収
収集した細胞を再懸濁溶液（５０ｍＭトリス、０．５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．５））で再懸濁させた。懸濁された細胞は、ソニケーター（Ｓｏｎｉｃｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ：ＶＣＸ  ７５０）を用いて破砕した。細胞破砕後、８０００ｘｇ、１０℃、３０分の条件下で遠心分離し、上澄み液を捨て、沈殿されたペレットを洗浄溶液１（５０ｍＭトリス、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．５％トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）（ｐＨ８．０））で懸濁させ、８０００ｘｇ、１０℃、２０分の条件下で遠心分離した。上澄み液を捨て、ペレットを再懸濁溶液で再懸濁させ、８０００ｘｇ、１０℃、２０分の条件下で遠心分離した。前記洗浄されたペレットは、直ちに用いるか、あるいは、−８０℃で凍結保存した。
【０１４１】
（ハ）Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ変異体の可溶化及びリフォールディング
上記のようにして得たペレットに６ｍＬ変性溶液（６〜８Ｍヨウ素（Ｕｒｅａ）または６〜８Ｍ塩化グアニジン（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ）、１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２．０ｍＭＥＤＴＡ、０．２ＭＮａＣｌ）を添加して溶解した。溶解後、０．４５ｕｍシリンジフィルターを用いて未溶解ペレットを除去した。可溶化させたペレット溶液をリフォールディング溶液（５０ｍＭトリス、１．０ｍＭＥＤＴＡ、０．５ＭＬ−アルギニン、６．０ｍＭＧＳＨ、４．０ｍＭＧＳＳＧ、２４０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＫＣｌ（ｐＨ９．０））に２０倍希釈して４℃で１２〜２４時間ゆっくり攪拌しながらリフォールディングを誘導した。
【０１４２】
（ニ）リフォールディングされたＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ変異体の精製
リフォールディングされたＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ変異体を精製するために、リフォールディング溶液を３ｋＤのアミコンウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ：ＵＦＣ９００３２４）を用いて２０倍濃縮した。濃縮後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅ（ＧＥ）レジンをＸＫ２５／７０（ＧＥ，Ｃａｔ．Ｎｏ：１９−０１４６−０１）カラムに詰め込んだゲルろ過クロマトグラフィを用いて精製した。
【０１４３】
具体的に、リフォールディングされた試料をカラムにアプライする前に、４〜５カラム体積の平衡化溶液（５０ｍＭソジウムホスファート、１００ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．０））を用いてカラムを平衡化させた。カラムに２ｍＬ試料をアプライした後、５ｍＬ／分の流速で平衡化溶液を流しながら５ｍＬずつ分画して試料を採取した。採取した試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した後、９０％以上の純度を示す分画のみを取った。上記の過程を通じて、純粋なＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１０５、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１０５変異体と、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６変異体及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１変異体を精製した（図２）。
【０１４４】
［実験例１］リガンド（ＴＮＦ−α）に対するＭｅｔ−ＴＮＦＲＩの結合力の確認
精製して得た純度９０％以上の純度を有するＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ変異体の濃度をブラッドフォード方法を用いて定量し、ＥＬＩＳＡ分析法を用いてＴＮＦ−αに対する結合力を確認した。
【０１４５】
９６ウェルプレートに、ＴＮＦＲＩ１９０（配列番号１のＴＮＦＲＩの２２番のアミノ酸〜２１１番のアミノ酸までの１９０個のアミノ酸からなるタンパク質、Ｒ＆Ｄ社製、Ｃａｔ  Ｎｏ：６３６−Ｒ１−０２５−ＣＦ）１００μＬを、１μｇ／ｍＬの濃度で分注した後、４℃で１６時間固定化した。洗浄溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０，ＰＢＳ，ｐＨ７．４）３００μＬで３回各ウェルを洗浄した後、ブロッキング溶液（５％脱脂乳、ＰＢＳ，ｐＨ７．４）３００μＬを各ウェルに入れ、室温下で２時間反応させた。次いで、洗浄は、上記の方法と同様にして行った。分析しようとする試料を５００ｎＭ、１２５ｎＭ、３１ｎＭ、７．８ｎＭ、１．９ｎＭ、０．４８ｎＭ、０．１２ｎＭ、０．０３ｎＭで製造した後、各ウェルに１００μＬずつデュプリケート分注した。試料の分注された各ウェルに５０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αを１００μＬずつ入れ、室温下で２時間反応させた。洗浄溶液で洗浄した後、１００μｇ／ｍＬのＴＮＦ−α抗体溶液を１／１０００に希釈した後、各ウェルに１００μＬずつ入れ、室温下で２時間反応させた。洗浄溶液で洗浄した後、基質溶液を各ウェルに１００μＬずつ入れ、室温下で１５分間反応させ、基質溶液である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＲｎＤ，Ｃａｔ．Ｎｏ：ＤＹ９９９）を１００μＬ注入した後、常温下で１５分間反応させ、１．０Ｍ硫酸溶液（サムジョン、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｓ２１２９）５０μＬを注入して反応を中止した。４５０ｎｍ、５４０ｎｍのＶｍａｘ読取機（ＭＤ、型番：ＶｅｒｓａＭａｘ）を用いて吸光度を読み取った。
【０１４６】
Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ変異体の結合力は、濃度による吸光度の変化を通じて確認した。ＴＮＦ−αに対するＴＮＦＲＩの結合力は、濃度による吸光度の変化を通じてＩＣ５０値を測定して決定した。これを用いて、天然型ＴＮＦＲＩ対比の相対的な結合力を確認した。その結果を下記表３に示す。なお、代表液な変異体ＴＮＦＲＩ１２６−Ａ３０、ＴＮＦＲＩ１７１−Ａ３０に対する結果を図３に示す。一方、図３に示すように、ＴＮＦＲＩ１２６とＴＮＦＲＩ１７１は、実質的に同じ効果を示すということを確認することができる。また、下記表３から明らかなように、本発明のＴＮＦＲＩ変異体は、天然型ＴＮＦＲＩと比べて、最大１４００％の向上した結合力を示す。
【０１４７】
［実験例２］ＴＮＦ−α細胞毒性中和試験を通じたＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ変異体の生物学的活性の確認
精製されたＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ変異体は、ブラッドフォード方法を用いて定量し、所定の濃度のＴＮＦ−αに感受性を有するＷＥＨＩ細胞（ＡＴＣＣ，Ｃａｔ．Ｎｏ：ＣＲＬ−２１４８）に処理して細胞毒性効果から保護される度合いを測定することにより活性を確認した。
【０１４８】
具体的に、ＷＥＨＩ（ＡＴＣＣ，Ｃａｔ．Ｎｏ：ＣＲＬ−２１４８）細胞を５％牛胎児血清とペニシリン５０Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０ｍｇ／ｍＬを含むＲＰＭＩ培地内に２×１０５細胞／ｍＬの濃度で浮遊させた。この細胞浮遊液１００μＬを９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移し、５％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養した。各ウェルにアクチノマイシン−Ｄを含む培地を用いて、７０ｐｇ／ｍＬ濃度のＴＮＦ−αを１００μＬずつ加えた。ＰＢＳ溶液を用いて１００μｇ／ｍＬの各変異体試料を３．０ｎＭから０．１８ｐＭに希釈した後、ＴＮＦ−αの付加された各ウェルに加えた。このとき、エンブレル（Ａｍｇｅｎ、成分名：エタネルセプト）は３．０ｎＭから０．０４ｐＭに、天然型ＴＮＦＲＩは２００ｎＭから１２ｐＭに処理した。ＷＥＨＩ細胞を５％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養した。培養後、ＭＴＴ細胞増殖分析キット（Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ：１１４５５００７００１）にあるＭＴＴ試薬を各ウェル当たりに添加し、さらに４〜６時間培養した。可溶化試薬を各ウェル当たりに添加した後、２４時間培養して紫色のホルマザン溶解を確認し、５７０ｎｍのＶｍａｘ読取機を用いて吸光度を読み取った。Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ変異体の活性と各変異体の活性は、濃度による吸光度の変化を通じてＮＤ５０値を測定し、これを用いて天然型ＴＮＦＲＩ対比の相対的な活性を確認した。その結果を下記表４に示す。なお、代表的な変異体ＴＮＦＲＩ１２６−Ａ３０、ＴＮＦＲＩ１７１−Ａ２、ＴＮＦＲＩ１７１−Ａ９、ＴＮＦＲＩ１７１−Ａ２１、ＴＮＦＲＩ１７１−Ａ２２及びＴＮＦＲＩ１７１−Ａ３０に対する結果を図４に示す。
【０１４９】
一方、図４Ａに示すように、ＴＮＦＲＩ１２６とＴＮＦＲＩ１７１は、実質的に同じ効果を示すということを確認することができる。また、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ変異体は、ＴＮＦ−α細胞毒性中和試験の結果、天然型ＴＮＦＲＩと比較したときに、ＴＮＦＲＩ１７１−Ａ２、ＴＮＦＲＩ１７１−Ａ２１、ＴＮＦＲＩ１７１−Ａ２２は２００倍以上の生物学的活性を有することを確認した（表４）。これにより、ＴＮＦＲＩ変異体のＴＮＦ−αに対する結合力が増加する場合に、細胞毒性中和力が増大するということを確認することができた。
【０１５０】
［実験例３］Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ変異体のタンパク質分解酵素に対する抵抗性の確認
Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ変異体のタンパク質分解酵素に対する抵抗性は、純粋に分離された精製液の全体のタンパク質濃度を測定して、豚のパンクレアチンを総タンパク質（純粋に分離されたＴＮＦＲＩ精製液の総タンパク質をブラッドフォード法によって定量した値）量の４０％になるように処理し、タンパク質分解酵素に対する抵抗性を確認するために、パンクレアチン（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｐ７５４５）処理による各変異体の半減期を決定した後、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ対比の半減期を測定した。
【０１５１】
具体的に、ブラッドフォード方法で定量されたＭｅｔ−ＴＮＦＲＩと各変異体の濃度をＰＢＳ溶液を用いて１００μｇ／ｍＬの濃度に調整した後、２５０μＬのタンパク質試料を５００μＬの遠心分離チューブに用意した。パンクレアチン１０μｇの含まれている０．１Ｍソジウムホスファート３０μＬを試料に添加して３７℃で反応させた。反応後、０分後、５分後、１０分後、１５分後、２０分後、３０分後、４０分後、６０分後に３０μＬの試料を取って５μＬタンパク質分解酵素阻害剤（Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ：１１８３６１７０００１）の入っている２７０μＬの５％ＢＳＡ溶液に入れて混合した後、液体窒素に保管した。実験の終わった試料は、ＥＬＩＳＡ定量方法（ＲｎＤ，Ｃａｔ．Ｎｏ：ＤＹ２２５）により未切断量を分析してＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ変異体の半減期を求めた。Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩの半減期を基準としたときの各変異体の相対的な半減期を百分率で表示した（表３及び表４）。結合力の向上したＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ変異体は、天然型Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩよりもタンパク質分解酵素に容易に分解されることが確認された。
【０１５２】
【表３】
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【０１５３】
【表４】
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【０１５４】
［製造例３］タンパク質分解酵素に対する抵抗性が増加した変異体の選別
（１）ＴＮＦＲＩ変異体の設計
タンパク質分解酵素に抵抗性を有する変異体を設計した。突然変異位置決定は、ＴＮＦＲＩ１７１アミノ酸配列について、下記の表１に表示された胃腸管、細胞及び血液中に存在する代表的なタンパク質分解酵素１０種に対する切断位置を、Ｅｘｐａｓｙ（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）から提供するｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｕｔｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｕｔｔｅｒ／）プログラムを用いて推定し、推定された切断部位のアミノ酸を、構造的変化が少ないと共にタンパク質分解酵素により切断されないアミノ酸に置換した。置換されるアミノ酸の決定は、ＰＡＭ２５０マトリックス（ｍａｔｒｉｘ）を用いた。ＰＡＭ２５０マトリックスには、それぞれのアミノ酸に対して正数、０、負数の値を有する１９種の対応アミノ酸を参照して、タンパク質分解酵素により切断されないと共に正数または０の値を有するアミノ酸を、置換するアミノ酸と決定した。
【０１５５】
【表５】
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【０１５６】
上記の方法によって設計されたＴＮＦＲＩ変異体の一覧は、下記表６に示す。
【０１５７】
【表６】
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【０１５８】
（＊下記の実施例と関連して、上記表のｘは、変異体番号Ｒ１番〜Ｒ７６番について１０８、１２６または１７１であり、変異体番号Ｒ７７番〜Ｒ８４番について１２６または１７１であり、変異体番号Ｒ８５番〜Ｒ９２番について１７１である。前記名称のうち、「Ｒ」は、タンパク質分解酵素に対する抵抗性増加変異体の候補を意味する。例えば、ＴＮＦＲＩｘ−Ｒ１は、ＴＮＦＲＩｘ断片におけるタンパク質分解酵素に対する抵抗性増加変異体の候補１を意味する。）
【０１５９】
（２）ＴＮＦＲＩ１０８遺伝子及び発現ベクターの製造
大腸菌で可溶性のＴＮＦＲＩ１０８タンパク質を発現するために、ＮｕｓＡ遺伝子を含む商業的に利用可能なｐＥＴ４４ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ：７１１２２−３）を用いて発現ベクターを構築した。
【０１６０】
具体的に、ＴＮＦＲＩ１０８遺伝子は、上記［製造例１］で作製されたｐＧＥＭ−ＴＮＦＲＩ１７１プラスミドを鋳型に下記プライマーを用いてＰＣＲを行って得た。この時、ｐＥＴ４４ａベクターへのクローニングのために、５’末端にＳｍａ  Ｉ、３’末端にＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限酵素認識部位を付加した。
正方向プライマー: 5’- ccccggggcgatgacgatgacaaagatagcgtgtgcccg-3’
逆方向プライマー: 5’- taagcttattacagggagcaattaaaacactgg-3’
【０１６１】
ＰＣＲは、前記［製造例１］の（２）と同じ条件下で行った。増幅された遺伝子２μＬを用いてメーカーで提示した方法によってｐｃＤＮＡ３．３  ＴＯＰＯ  ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｋ８３００−０１）に挿入した。反応溶液２μＬを取ってＸＬ１−ｂｌｕｅコンピテント細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）（ＲＢＣ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＲＨ１１９−Ｊ８０）に入れ、４２℃で１分間熱衝撃（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）を加えて形質転換し、アンピシリンの含まれているＬＢ固体培地で静置培養してコロニーを得た。このコロニーをアンピシリンの含まれているＬＢ液体培地で培養した後、プラスミドを分離し、ｄｄＮＴＰに蛍光物質を標識する方式で遺伝子配列を確認し（ソルジェント、韓国）、ｐｃＤＮＡ３．３−ＴＮＦＲＩ１０８と命名した。
【０１６２】
上記作製されたｐｃＤＮＡ３．３−ＴＮＦＲＩ１０８ベクターとｐＥＴ４４ａベクターにそれぞれ制限酵素（Ｓｍａ  Ｉ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ）を添加し、３７℃で３時間反応させた。制限酵素処理後に１％アガロースゲル電気泳動を行って該当の大きさのＤＮＡバンドをかみそりで切り取り、ＤＮＡ抽出キット（ＧｅｎｅＡｌｌ、Ｃａｔ．Ｎｏ：１０２−１０２）を用いて抽出した。抽出したｐＥＴ４４ａベクターとＴＮＦＲＩ１０８遺伝子ＤＮＡは、リガーゼ（ＮＥＢ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｍ２２００Ｓ）を用いて連結反応をさせた。反応溶液２μＬを取ってＸＬ１−ｂｌｕｅコンピテント細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）（ＲＢＣ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＲＨ１１９−Ｊ８０）に入れて３７℃で２分間熱衝撃（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）を加えて形質転換し、アンピシリンの含まれているＬＢ固体培地で静置培養してコロニーを得た。このコロニーをアンピシリンの含まれているＬＢ液体培地で培養した後プラスミドを分離して、ＴＮＦＲＩ１０８大腸菌発現ベクターを作製した（図５）。作製されたＴＮＦＲＩ１０８大腸菌発現ベクターはｐＥＴ４４ａ−ＮｕｓＡ−ＴＮＦＲＩ１０８プラスミドと命名した。
【０１６３】
（３）ＴＮＦＲＩ１０８単一変異体をコードするＤＮＡの製造
位置特異的ＴＮＦＲＩ１０８単一変異体を作製するために位置指定突然変異体作製（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）方法によりＴＮＦＲＩ１０８単一変異体を作製した。ＴＮＦＲＩ１０８単一変異体の作製に用いたプライマーを、下記表７に示す。
【０１６４】
前記ｐＥＴ４４ａ−ＮｕｓＡ−ＴＮＦＲＩ１０８プラスミドを鋳型に、下記表７のＲ１〜Ｒ７６番変異体に該当するプライマー各対を用いた以外は、前記［製造例２］の（２）に記載の方法と同様にしてＴＮＦＲＩ１０８単一変異体をコードするＤＮＡを製作及び確認した。
【０１６５】
【表７】
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【０１６６】
（４）ＴＮＦＲＩ１０８及びＴＮＦＲＩ１０８変異体の発現
上記作製したプラスミド溶液１μＬを取ってＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｃ６０１０−０３）コンピテント細胞に入れ、４２℃で１分間熱衝撃（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）を加えて形質転換し、アンピシリンの含まれているＬＢ固体培地で静置培養してコロニーを得た。ｐＥＴ４４ａ−ＮｕｓＡ−ＴＮＦＲＩ１０８及びＴＮＦＲＩ１０８変異体ベクターを含んでいる大腸菌（ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３））を、１００μｇ／ｍＬ濃度のアンピシリンの入っている５ｍＬ ＬＢ液体培地（ＢＤ、Ｃａｔ．Ｎｏ：２４４６２０）に接種して３７℃で１６時間通気培養した。培養液を１００μｇ／ｍＬアンピシリンの入っている５０ｍＬ培地に接種して６００ｎｍの吸光度が０．６〜０．８になるまで培養し、最終濃度が１．０ｍＭ濃度になるようにＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｉ９００３）を添加して発現を誘導した。発現誘導後、３７℃で３時間通気培養を続けた。培養細胞を５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞を収集した。
【０１６７】
（５）ＴＮＦＲＩ１０８及びＴＮＦＲＩ１０８変異体の精製
上記収集した細胞を細胞破砕後に上層液を回収し、金属親和クロマトグラフィで１次精製後に疎水性クロマトグラフィで２次精製して、純度９０％以上の試料を得た。
【０１６８】
具体的に、上記収集した細胞を、６００ｎｍ吸光度が１０になるように再懸濁溶液（２５ｍＭトリス溶液（ｐＨ８．５））で再懸濁した。再懸濁した試料をソニケーター（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）（Ｓｏｎｉｃｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＶＣＸ７５０）を用いて細胞破砕して、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して上層液を回収した。９６ウェルフィルタプレート（Ｐａｌｌ、Ｃａｔ  Ｎｏ：ＰＮ５０６５）に３００μＬハイパーセルレジン（Ｐａｌｌ、Ｃａｔ  Ｎｏ：２００９３−０１０）をロードし、４カラム体積の蒸溜水洗浄後に、２カラム体積の０．１Ｍ  ＮｉＣｌ２を付加してニッケルイオンをレジンに結合させた。２カラム体積の蒸溜水を流した後、平衡化溶液（２５ｍＭトリス、０．１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．５））で６カラム体積で洗浄した。２カラム体積の試料を付加した後、４カラム体積の平衡化溶液を用いて結合していない試料を除去した。１０カラム体積の洗浄溶液（２５ｍＭトリス、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾール（Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）（ｐＨ８．５））で洗浄し、カラムに結合しているＴＮＦＲＩ１０８を回収するために、２カラム体積の溶出溶液（２５ｍＭトリス、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．５））で溶出した。
【０１６９】
金属親和クロマトグラフィで溶出されたタンパク質溶液に４００ｍＭ濃度になるように１．０Ｍ硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）溶液を添加した。９６ウェルフィルタプレートに３００μＬのフェニルセファロースレジン（ＧＥ、Ｃａｔ．Ｎｏ：１７−１０８２０１）をロードし、６カラム体積の平衡化溶液（２０ｍＭリン酸ナトリウム（Ｎａ２ＰＯ４）、４００ｍＭ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．０））を流した。金属親和クロマトグラフィ溶出液をカラムに付加し、２カラム体積の平衡化溶液を流して、結合していないタンパク質を除去した。１０カラム体積の洗浄溶液（２０ｍＭリン酸ナトリウム（Ｎａ２ＰＯ４）、１６０ｍＭ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．０））で洗浄して、６カラム体積の溶出溶液（２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））で溶出した。溶出された試料を１００μｇ／ｍＬ以上の濃度に濃縮した後、ブラッドフォード法を用いて定量した。精製した全ての試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて純度を確認した（図６）。
【０１７０】
［実験例４］ＴＮＦＲＩ１０８及びＴＮＦＲＩ１０８変異体のタンパク質分解酵素に対する抵抗性の確認
前記製作されたＴＮＦＲＩ１０８及びＴＮＦＲＩ１０８変異体のタンパク質分解酵素に対する抵抗性は、純粋分離された精製液の全体タンパク質濃度を測定して、豚のパンクレアチンを総タンパク質（純粋分離したＴＮＦＲＩ１０８精製液の総タンパク質をブラッドフォード法により定量した値）量の２４％になるように処理し、ＴＮＦＲＩ１０８断片及びＴＮＦＲＩ１０８断片変異体の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を調べることで、ＴＮＦＲＩ１０８ポリペプチド断片に比べてタンパク質分解酵素に抵抗性を有するＴＮＦＲＩ１０８断片変異体を確認することができた。
【０１７１】
タンパク質分解酵素に抵抗性を有する変異体ＴＮＦＲＩ１０８を同定するために、パンクレアチン（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｐ７５４５）処理による各変異体の半減期を決定した後、ＴＮＦＲＩ１０８に比べて半減期の増加した変異体を選別する方法を用いた。代表的なＴＮＦＲＩ１０８−Ｒ１４、ＴＮＦＲＩ１０８−Ｒ６４、ＴＮＦＲＩ１０８−Ｒ６８変異体のパンクレアチン処理に対する抵抗性増加結果は、図７に示す。２５０μＬのタンパク質試料を用い、６μｇのパンクレアチンを用いた以外は、前記［実験例３］に記載の方法と同様にして行い、その結果を表８に示す。
【０１７２】
【表８】
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【０１７３】
（６）Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６変異体を発現する発現ベクターの製造
前記ＴＮＦＲＩ１０８を用いて確認された単一変異体のタンパク質分解酵素に対する抵抗性をＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６変異体で確認した。このために、ＴＮＦＲＩ１０８−Ｒ７、ＴＮＦＲＩ１０８−Ｒ８、ＴＮＦＲＩ１０８−Ｒ９、ＴＮＦＲＩ１０８−Ｒ１０、ＴＮＦＲＩ１０８−Ｒ１４、ＴＮＦＲＩ１０８−Ｒ６４、ＴＮＦＲＩ１０８−Ｒ６５、ＴＮＦＲＩ１０８−Ｒ６８、ＴＮＦＲＩ１０８−Ｒ７３、ＴＮＦＲＩ１０８−Ｒ７４を選択してＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６の形態で産生してタンパク質分解酵素に対する抵抗性を確認した。
【０１７４】
前記［製造例１］で製作したｐＥＴ４４ａ−Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６プラスミドを鋳型に、上記表７のＲ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１４、Ｒ６４、Ｒ６５、Ｒ６８、Ｒ７３、Ｒ７４番の変異体に該当するプライマー各対を用いた以外は、［製造例２］の（２）に記載の方法と同様にして、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６変異体プラスミドを製作し、位置特異的なＴＮＦＲＩ変異体の完成を確認した。
【０１７５】
（７）Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６変異体の産生及び精製
上記製作されたプラスミド溶液１μＬを用いて、前記［製造例２］の（３）に記載の方法と同様にしてＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６とＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６変異体を産生及び精製した。
【０１７６】
［実験例５］Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６変異体のタンパク質分解酵素に対する抵抗性の確認
ＴＮＦＲＩ１０８に代えてＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６変異体を用いる以外は、上記の実験例４と同じ方法を用いてタンパク質分解酵素に対する抵抗性を評価した（表９）。ＴＮＦＲＩ１０８においてタンパク質分解酵素に対する抵抗性の高い変異体Ｒ１４、Ｒ６４、Ｒ６８、Ｒ７３、Ｒ７４は、依然として高いタンパク質分解酵素に対する抵抗性を示したし、ＴＮＦＲ１０８において低く測定された変異体Ｒ９、Ｒ１０は、低いタンパク質分解酵素に対する抵抗性を示した。
【０１７７】
【表９】
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【０１７８】
（８）Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１変異体を発現する発現ベクターの製造
［製造例３］の（１）表６に設計された単一変異体のうち、ＴＮＦＲＩの４番目のドメインに存在する単一変異体をＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１として産生し、評価を行った。
【０１７９】
そのために、大腸菌でＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１変異体を発現する発現ベクターを作製した。Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１変異体は、前記［製造例１］で製作したｐＥＴ４４ａ−Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１プラスミドを鋳型に、下記表１０の変異体に該当するプライマーを用いてＰＣＲ反応を行って作製した。
【０１８０】
前記［製造例１］で製作したｐＥＴ４４ａ−Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１プラスミドを鋳型に、下記表１０のプライマー各対を用いた以外は、［製造例２］の（２）に記載の方法と同様にしてＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１変異体プラスミドを製作し、位置特異的なＴＮＦＲＩ変異体の完成を確認した。
【０１８１】
【表１０】
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【０１８２】
（９）Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１変異体の産生及び精製
前記製作したプラスミド溶液１μＬを用いて、前記［製造例２］の（３）に記載の方法と同様にしてＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１とＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１変異体を産生及び精製した。
【０１８３】
［実験例６］Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１変異体のタンパク質分解酵素に対する抵抗性の確認
ＴＮＦＲＩ１０８に代えてＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１変異体を用いる以外は上記の［実験例３］と同じ方法を用いてタンパク質分解酵素に対する抵抗性を評価した（表１１）。代表として、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−Ｒ８３、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−Ｒ８４、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−Ｒ９２変異体のパンクレアチン処理に対する抵抗性増加結果を、図８に示す。
【０１８４】
【表１１】
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【０１８５】
［実施例１］ＴＮＦ−αに対する増加された結合力とタンパク質分解酵素に対する抵抗性を併せ持つ変異体（Ｓｕｐｅｒｌｅａｄ）の製作
（１）Ｓｕｐｅｒｌｅａｄ変異体の設計
前記［製造例２］でＴＮＦ−αに対する結合力が向上した変異体は、タンパク質分解酵素に容易に分解されることを確認した。これらのタンパク質分解酵素に対する抵抗性を向上させるために、前記［製造例３］で確認されたタンパク質分解酵素に対する抵抗性の向上のための修飾と、前記［製造例２］で確認された結合力の向上のための修飾とを組み合わせる方法により、下記表１２〜１４に示すように、ＴＮＦＲＩの長さによるＳｕｐｅｒｌｅａｄ変異体を製作した。
【０１８６】
【表１２】
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【０１８７】
【表１３】
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【０１８８】
【表１４】
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【０１８９】
前記修飾を適用したＴＮＦＲＩ１７１、ＴＮＦＲＩ１２６、ＴＮＦＲＩ１０５変異体ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号６〜９９に示す。
【０１９０】
（２）ＴＮＦＲＩ変異体をコードするＤＮＡの製造
変異体を製作するために位置指定突然変異体の製作方法によってＴＮＦＲＩ変異体を製作した。表１２〜１４に記載のアミノ酸修飾を含むＴＮＦＲＩ変異体の製作に用いたプライマーを下記表１５に示す。表１５に示すプライマーを用いた以外は、前記［製造例２］の（２）と同じ方法で行った。
【０１９１】
【表１５】
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0005819439.tif 000020
【０１９２】
（３）大腸菌で生物学的活性を示すＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ変異体の産生
上記製作したＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ変異体を前記［製造例２］の（３）の方法により産生及び精製した。
【０１９３】
［実験例７］リガンド（ＴＮＦ−α）に対するＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ変異体の結合力の確認
[実験例１］と同じ方法を用いて、ＴＮＦ−αに対するＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ変異体の結合力を評価した（表１６〜表１８）。
【０１９４】
［実験例８］Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ変異体のタンパク質分解酵素に対する抵抗性の確認
前記［実験例３］と同じ方法を用いて、タンパク質分解酵素に対する抵抗性を評価した（表１６〜表１８）。代表的に、ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ３１、ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ４７、ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ５３、ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ６３変異体のパンクレアチン処理に対する抵抗性の増加結果を図９に示す。対照群として、ＴＮＦＲＩ１７１断片を用いた。
【０１９５】
【表１６】
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【０１９６】
【表１７】
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【０１９７】
【表１８】
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【０１９８】
［実験例９］カラギーナン誘導足浮腫を起こしたマウスにおけるＴＮＦＲＩ１７１変異体８種（Ｓ５４、Ｓ６２、Ａ２、Ａ９、Ｓ３６、Ｓ５７、Ｓ５８、Ｓ６３）の効力試験
この実験は、変異体の効力を生体内で確認するために行った実験であり、変異体のうち抵抗性及び／または結合力に優れた８種に対してカラギーナン誘導足浮腫を起こしたマウスに皮下投与した後に、足浮腫の大きさ及び足のＩＬ−６の量を測定して生体内効力を確認した。
【０１９９】
８種のＴＮＦＲＩ１７１変異体（ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ５４、ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ６２、ＴＮＦＲＩ１７１−Ａ２、ＴＮＦＲＩ１７１−Ａ９、ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ３６、ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ５７、ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ５８、ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ６３）、野生型（ＷＴ、ＴＮＦＲＩ１７１断片）、ビヒクル（５０ｍＭＮａＰＯ４、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０）及びエンブレル（Ｗｙｅｔｈ）を、エンブレルは０．５ｍｇ／ｍＬの濃度に、ＷＴ及び各候補物質を０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。５週齢のＩＣＲマウス（２０〜２５ｇ）を（株）オリエントバイオ（ＣＲＪ）から供給されて京畿バイオセンター動物室で約７日間適応させて用いた。なお、水及び飼料は自由に摂取させ、温度（２３±２℃）、湿度（５５±５％）及び明暗周期（１２時間）は自動的に調節されるようにした。各群ごとに５匹で実験を行った。浮腫を起こすための起炎剤としてラムダ−カラギーナン（Ｓｉｇｍａ）を蒸留水に１％の濃度で溶かして調製した。調製したカラギーナン溶液５０μＬを、微細注射器（ｆｉｎｅ−ｎｅｅｄｌｅ  ｓｙｒｉｎｇｅ；ＢＤ）を用いて、右側足裏に投与した。
【０２００】
薬物の投与は、各薬物のＰＫ特性に合わせて行った。半減期が長いエンブレルの場合に、カラギーナン投与２時間前に投与したし、変異体８種、ＷＴ及びビヒクルの場合に、カラギーナン投与３０分前に投与した。薬物の投与は、首部位への皮下投与（Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ＳＣ）で行い、エンブレルは５ｍｇ／ｋｇ／１０ｍＬ、ＷＴ及び候補物質は２．５ｍｇ／ｋｇ／１０ｍＬの容量で投与した。
【０２０１】
カラギーナンの投与前、カラギーナンの投与後の１時間、２時間、３時間、４時間後に、浮腫測定機（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ）を用いて、右足の体積を測定した。測定する前に、右足首側に油性ペンで印を付け、測定する度に相違が出ることを防いだ。４時間目に浮腫を測定し、全ての動物をＣＯ２で安楽死させた後、浮腫を起こした右側足を採取して分析時まで超低温冷凍庫（Ｄｅｅｐ  ｆｒｅｅｚｅｒ，Ｔｈｅｒｍｏ）に−７０℃の状態で保管した。浮腫を起こした足組織のＩＬ−６を測定するために組織を解凍して、手術用ハサミを用いて細かく切り、５００μＬのＰＢＳを入れ、ホモジナイザーで粉砕した後、遠心分離機を用いて、１００００ｒｐｍで５分間分離した後、上澄み液を取り、タンパク質定量用１００μＬとＩＬ−６測定用２００μＬをそれぞれ分けて超低温冷凍庫に−７０℃の状態で保管した。タンパク質の定量は、ブラッドフォード法で行い、ＩＬ−６は、ＥＬＩＳＡキット（コマバイオテック社製）のマニュアルに従い測定し、濃度は、タンパク質の量で補正した。ＩＬ−６のグラフは、ビヒクル群の濃度を１００％に換算して示す。その結果を図１０に示す。
【０２０２】
図１０Ａの結果から明らかなように、カラギーナンを足裏に投与してから２時間後に、Ｓ６３とエンブレル群を除く全ての群は、ビヒクル投与群に比べて有意に足裏の浮腫が減少していることを確認した。カラギーナンを足裏に投与してから４時間後に、全ての群は、ビヒクル投与群に比べて有意に（Ｐ＜０．０１）足裏の浮腫が減少していることを確認した。図１０Ｂに示すように、カラギーナンを足裏に投与してから４時間後に足組織を採取して炎症媒サイトカインであるＩＬ−６を測定したところ、全ての群は、ビヒクル投与群に比べて有意に（Ｐ＜０．０１）ＩＬ−６の増加が抑えられていることを確認した。なお、Ｓ５４、Ｓ６２、Ｓ３６、Ｓ５７、Ｓ５８、Ｓ６３群は、エンブレル群に比べて、有意にＩＬ−６の増加が抑えられており、特に、Ｓ５８は、ＩＬ−６の増加が強く抑えられていた（Ｐ＜０．０１）。
【０２０３】
［実験例１０］カラギーナン誘導足浮腫を起こしたマウスにおけるＴＮＦＲＩ１７１変異体ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ６３と野生型（ＴＮＦＲＩ１７１断片）との効力比較試験
ＴＮＦＲＩ１７１変異体のうち、物性及び生体内試験結果を見て１種（ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ６３）を選択して、ビヒクル（５０ｍＭＮａＰＯ４，１００ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．０及びエンブレル（Ｗｙｅｔｈ），ＷＴ（ＴＮＦＲＩ１７１断片）とともに調製した。ＷＴ及び変異体ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ６３は、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で調製し、エンブレルは、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。前記［実験例９］と同じ方法を用いて、足の浮腫の大きさとＩＬ−６の量を測定して、生体内効力を評価した。その結果を図１１に示す。
【０２０４】
図１１Ａの結果から明らかなように、カラギーナンを足裏に投与してから２時間後に、ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ６３の５ｍｇ／ｋｇ投与群は、ビヒクル投与群に比べて有意に足裏の浮腫が減少していることを確認した。カラギーナンを足裏に投与してから４時間後に、エンブレルと変異体ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ６３の５ｍｇ／ｋｇを投与した群は、ビヒクルに比べて、有意に足の浮腫が抑えられていた。変異体ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ６３の５ｍｇ／ｋｇ投与群は、陽性対照群であるエンブレル５ｍｇ／ｋｇ投与群よりもさらに浮腫を抑えていた（図１１Ａ）。
【０２０５】
図１１Ｂに示すように、カラギーナンを足裏に投与してから４時間後に足組織を採取して炎症媒介サイトカインであるＩＬ−６を測定したところ、ＷＴ２．５ｍｇ／ｋｇ群を除く全ての群が、ビヒクル投与群に比べて有意に（Ｐ＜０．０１）ＩＬ−６の増加が抑えられていることを確認した（図１１Ｂ）。特に、変異体ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ６３の２．５ｍｇ／ｋｇ投与群、５ｍｇ／ｋｇ投与群は、エンブレル５ｍｇ／ｋｇ投与群よりもＩＬ−６の増加がさらに強く抑えられていた。なお、ＷＴとエンブレルの場合に、同じ濃度でＩＬ−６をほとんど同様に減少させた。結論的に、変異体ＴＮＦＲＩ１７１−Ｓ６３は、ＷＴやエンブレルよりも浮腫の増加及びＩＬ−６の増加を抑える能力に優れている。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図２Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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