(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（I）：
【化１】
0005727407.tif 000008
（式中、Ｒは炭素数４〜１４のアルキル基を表す。）で示される２，５−又は３，５−ジヒドロキシ安息香酸エステルである、質量分析用マトリックスの添加剤。
【請求項２】
α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、シナピン酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸及び１，５−ジアミノナフタレンからなる群から選ばれる質量分析用マトリックスに添加される、請求項１に記載の添加剤。
【請求項３】
疎水性ペプチドの質量分析に用いられる、請求項１又は２に記載の添加剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の質量分析用マトリックスの添加剤を用いた質量分析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療及び創薬分野において応用されうるＭＡＬＤＩ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析）アプリケーションに関する。より具体的には、本発明は、質量分析用マトリックスの添加剤となる化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）質量分析法において、測定対象分子の効率的なイオン化を実現する条件が探索されている。
例えば、特開２００５−３２６３９１号公報（特許文献１）に、疎水性ペプチドを予め２−ニトロベンゼンスルフェニル基によって修飾し、α−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸（3-CHCA）、３−ヒドロキシー４−ニトロ安息香酸（3H4NBA）、又はそれらの混合物をマトリックスとして用いた質量分析を行うことで、一般的マトリックスであるα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（4-CHCA）や２，５−ジヒドロキシ安息香酸（DHB）に比べ、疎水性ペプチドを効率よくイオン化する方法が記載されている。
【０００３】
J. Agric. Food Chem., 2004, 52 (16), pp 5011-5020（非特許文献１）に、食品添加物として、３，４−ジヒドロキシ安息香酸のアルキルエステルが開示されている。
【０００４】
Biotechnology Letters, Vol.19, No.6, June 1997, pp.529-532（非特許文献２）に、２，５−ジヒドロキシ安息香酸とオクタノールとのエステル化収率について開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−３２６３９１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリ（Journal of Agricultural and Food Chemistry）、２００４年、第５２巻、第１６号、ｐ．５０１１−５０２０
【非特許文献２】バイオテクノロジー・レターズ、１９９７年６月、第１９巻、第６号、ｐ．５２９−５３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のＭＡＬＤＩ質量分析法においては、測定対象分子の修飾が行われる場合にはある程度のイオン化促進効果が得られるが、修飾が行われない場合には、イオン化効率は十分でない。
このように、特に疎水性ペプチドのようなＭＡＬＤＩイオン化が難しい分子種は、従来の方法によってもイオン化効率が低いという問題がある。
本発明の目的は、測定対象分子の修飾を行うことなく、容易に且つ効率よく、質量分析におけるイオン化効率を向上させることができる物質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討の結果、ある程度の炭素数のアルキル基を有する２，５−ジヒドロキシ安息香酸エステルが、マトリックスとしては機能しないもののマトリックスの添加剤として用いられることによって本発明の目的を達成することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は、以下の発明を含む。
（１）
下記式（I）：
【化１】
0005727407.tif 000002
（式中、Ｒは炭素数４〜１４のアルキル基を表す。）で示される２，５−又は３，５−ジヒドロキシ安息香酸エステルである、質量分析用マトリックスの添加剤。
【００１０】
（２）
α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、シナピン酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸及び１，５−ジアミノナフタレンからなる群から選ばれる質量分析用マトリックスに添加される、（１）に記載の添加剤。
【００１１】
（３）
疎水性ペプチドの質量分析に用いられる、（１）又は（２）に記載の添加剤。
なお、本発明においては、ペプチドにはタンパク質も含まれる。
【００１２】
（４）
（１）〜（３）のいずれかに記載の質量分析用マトリックスを用いた質量分析法。
【００１３】
下記式（I）：
【化２】
0005727407.tif 000003
（式中、Ｒは炭素数４〜１４のアルキル基を表す。）で示される質量分析用マトリックス添加剤と、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、シナピン酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸及び１，５−ジアミノナフタレンからなる群から選ばれる質量分析用マトリックスとを含む、質量分析用マトリックス組成物。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、質量分析測定対象分子（特に疎水性ペプチド）のイオン化効率を向上させることができるマトリックス添加剤を提供することができる。
本発明により、質量分析測定対象分子（特に疎水性ペプチド）の質量分析測定による検出感度向上を達成することができることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の質量分析用マトリックスの添加剤は、下記式（I）で示される２，５−又は３，５−ジヒドロキシ安息香酸エステルである。
【化４】
0005727407.tif 000004
式（I）中、Ｒは炭素数４以上、具体的には４〜１４、好ましくは８〜１４、より好ましくは８〜１０のアルキル基を表す。アルキル基は、直鎖及び分岐を問わない。
【００１６】
上記式（I）で示される化合物は、２，５−又は３，５−ジヒドロキシ安息香酸又はその誘導体を用いたエステル化反応によって、当業者によって適宜合成される。例えば、例えば、Ｒ−Ｘ（Ｒは炭素数４〜１４、好ましくは８〜１４、より好ましくは８〜１０のアルキル基、Ｘはハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）その他の脱離基を表す。）で示される求電子剤を用い、２，５−又は３，５−ジヒドロキシ安息香酸をエステル化することで合成することができる。この場合、求電子剤は、ジヒドロキシ安息香酸の１．０〜２．０当量用いることができる。溶媒としては、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミドなどを用いることができる。反応条件としては、加熱還流条件、２時間以上でありうる。
【００１７】
上記の化合物は、単独では測定対象のイオン化能力はないため、マトリックスとしては機能しない。しかしながら、マトリックスと混合して使用することによって、マトリックスによる測定対象のイオン化能力を増強し、検出限界の向上を図ることができる。
【００１８】
本発明の添加剤と共に使用されるマトリックスとしては特に限定されない。一般的なマトリックスから当業者によって適宜選択されてよいが、例えば、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、シナピン酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸及び１，５−ジアミノナフタレンから選ばれることができる。
【００１９】
本発明の添加剤を用いる質量分析対象は特に限定されない。例えば、分子量が５００〜３００００、好ましくは１０００〜１００００の分子でありうる。好ましくは、質量分析対象は疎水性物質である。
疎水性物質の疎水性の程度としては特に限定されるものではなく、様々な公知の疎水性指標や疎水性度算出法に基づいて、疎水性と判断し得る程度であればよい。
例えば、疎水性物質の疎水性の程度は、当業者がＢＢインデックス（Bull and Breese Index）によって疎水性と判断しうる程度であればよい。より具体的には、ＢＢインデックスは例えば１０００以下、好ましくは−１０００以下でありうる。
あるいは、疎水性物質の疎水性の程度は、当業者がＨＰＬＣインデックスによって疎水性と判断しうる程度であればよい。HPLCインデックスは、C.A.Brownw, H.P.J.Bennett, S.SolomonによりAnalytical Biochemistry, 124, 201-208, 1982で報告された、0.13%ヘプタフルオロ-n-酪酸（HFBA）を含むアセトニトリル水溶液を溶離液として使用した逆相HPLC保持時間に基づく疎水性指数で、HPLC/HFBA retentionとも称される。より具体的には、ＨＰＬＣインデックスは例えば５０以上、好ましくは１００以上でありうる。
【００２０】
本発明においては、特に疎水性ペプチド（本発明においては、ペプチドにはタンパク質も含まれる）のイオン化能増強効果が高い。
疎水性ペプチドであるか否かについても、上述のＢＢインデックスあるいはHPLCインデックスを指標とすることができるが、具体的には、ペプチドを構成するアミノ酸に、より疎水性度の高いアミノ酸残基を、より多く含むものであってよい。例えば疎水性アミノ酸としては、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、グリシンなどが挙げられる。また、システイン、チロシンなどを含むこともある。
疎水性ペプチドは、このようなペプチドの１次構造のみによらず、より疎水性度の高い高次構造を持つものでもありうる。例えば、逆相HPLCカラムが使用される疎水性の固定相表面と相互作用が起こりやすい構造を持つペプチドが挙げられる。
【００２１】
本発明の添加剤とマトリックスとの組み合わせの比率は特に制限はないが、例えば、添加剤が質量分析用マトリックスの０．０１〜５０倍、好ましくは０．０１〜１倍のモル比の量的関係となるように組み合わせることができる。
【００２２】
本発明の添加剤は、通常、マトリックスとの混合溶液に調製される。マトリックスと添加剤との混合溶液は、通常、マトリックス溶液と添加剤溶液とをそれぞれ調製しておき、両溶液を混合することによって調製することができる。溶媒としては、例えば、アセトニトリル（ACN）−トリフルオロ酢酸（TFA）水溶液、アセトニトリル水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液などを用いることができる。アセトニトリル−トリフルオロ酢酸水溶液におけるアセトニトリルの濃度は例えば１０〜９０体積％であり、トリフルオロ酢酸の濃度は例えば０．０５〜１体積％でありうる。
【００２３】
添加剤は、例えば、０．５〜５０ｍｇ/ｍｌ、好ましくは５〜１０ｍｇ/ｍｌ、例えば５ｍｇ/ｍｌの溶液に調製することができる。マトリックスは、例えば、１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度、好ましくは１〜１０ｍｇ/ｍｌ、例えば１０ｍｇ/ｍｌの溶液に調製することができる。これら添加剤溶液及びマトリックス溶液は、例えば、１０：１〜１：１０、例えば１：１の体積比で混合することができる。
【００２４】
本発明の添加剤を用いて使用される質量分析装置としては、MALDIイオン源と組み合わされたものであれば特に限定されない。例えば、MALDI-TOF（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間）型質量分析装置、MALDI-IT（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ）型質量分析装置、MALDI-IT-TOF（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ−飛行時間）型質量分析装置、MALDI-FTICR（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置等が挙げられる。
【実施例】
【００２５】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
［実施例１：添加剤化合物の合成］
【００２６】
【化５】
0005727407.tif 000005
【００２７】
1‐オクタノール（10 mmol）を無水ピリジン（10mL）に溶解し、これに2,5-ヒドロキシ安息香酸クロリド（10 mmol）の無水エーテル溶液を滴下し、８時間室温で撹拌した。冷却後、１M塩酸水及び水で順次洗い、エーテル（100 mL)で2回抽出した。エーテル層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を除去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ヘキサン：酢酸エチル＝8:2(v/v)）により精製し、黄白色の結晶を得た。収量：0.80g（3.0×10-3mol）、収率30％。
【００２８】
［実施例２］
本実施例においては、実施例１で得られた化合物（以下、C8-ADHB-ES）を、マトリックスであるα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（CHCA）の添加剤として用い、疎水性ペプチド（Humanin；ＢＢインデックスは-5800）の測定を行った。比較用として、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（CHCA）を単独マトリックスとして用いた測定及びマトリックスを用いずC8-ADHB-ESのみを用いた測定も行った。
【００２９】
（１）CHCAの10mg/mL(50%ACN/0.05%TFA水溶液中(%は体積を基準とする。以下において同様))溶液と、C8-ADHB-ESの5mg/mL(50%ACN/0.05%TFA水溶液中)溶液とを10:1、1:1及び1:10(v/v)で混合した。得られたマトリックス溶液を、それぞれ、C8-ADHB-ES/CHCA(1/10)、C8-ADHB-ES/CHCA(1/1)及びC8-ADHB-ES/CHCA(10/1)と記載する。
（２）疎水性ペプチドHumaninの2a〜2pmol/μL（50%ACN/0.05%TFA水溶液中）溶液を作成した。
（３）MALDIプレ−ト上に(2)の試料溶液と(1)のマトリックス溶液とを0.5μLずつ滴下し混合した(on-target mix法)。
（４）AXIMA Performance (島津製作所)のリニアTOF、ポジティブ及びネガティブモ−ドで計測した。
【００３０】
（比較用）
（１）CHCA(Laser Bio)の10 mg/mL（50%ACN/0.05%TFA水溶液中）溶液を作成した。
（２）疎水性ペプチドHumaninの2a〜2pmol/μL（50%ACN/0.05%TFA水溶液中）溶液を作成した。
（３）MALDIプレ−ト上に(2)の試料溶液と(1)の溶液とを0.5μLずつ滴下し混合した (on-target mix法)。
（４）AXIMA Performance (島津製作所)のリニアTOF、ポジティブ及びネガティブモ−ドで計測した。
【００３１】
【表１】
0005727407.tif 000006
【００３２】
表１に示すように、添加剤混合マトリックスC8-ADHB-ES/CHCA(10/1)、C8-ADHB-ES/CHCA(1/1)及びC8-ADHB-ES/CHCA(1/10)を使用した全ての場合において、CHCA単独で使用した場合に比べ、ポジティブモード（pos）及びネガティブモード（neg）の両方で感度向上が確認された。より具体的には、C8-ADHB-ES/CHCA(1/1)を使用した場合が最も感度向上効果が高く、ポジティブとネガティブとの両方において、検出限界（fmol/ウェル）が1/100となり、すなわち100倍の感度向上効果が確認された。一方、C8-ADHB-ESを単独で使用した場合は、CHCA単独で使用した場合に比べ、ポジティブモード及びネガティブモードの両方で感度が低下した。
【００３３】
［実施例３］
本実施例においては、C8-ADHB-ESを、マトリックスである２，５−ジヒドロキシ安息香酸（DHB）、シナピン酸（SA）及び１，５−ジアミノナフタレン（DAN）それぞれの添加剤として用い、疎水性ペプチド（Humanin）の測定を行った。比較用として、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（DHB）、シナピン酸（SA）及び１，５−ジアミノナフタレン（DAN）をそれぞれ単独マトリックスとして用いた測定も行った。
【００３４】
（１）マトリックス（DHB、SA及びDAN）の10mg/mL (50%ACN/0.05%TFA水溶液中)溶液とC8-ADHB-ESの5mg/mL(50%ACN/0.05%TFA水溶液中)溶液とを1:1(v/v)で混合してマトリックス溶液を作成した。得られたマトリックス溶液を、それぞれ、C8-ADHB-ES/DHB(1/1)、C8-ADHB-ES/SA(1/1)及びC8-ADHB-ES/DAN(1/1)と記載する。
（２）疎水性ペプチドHumaninの2a〜2pmol/μL（50%ACN/0.05%TFA水溶液中）溶液を作成
した。
（３）MALDIプレ−ト上に(2)の試料溶液と(1)のマトリックス溶液とを0.5μLずつ滴下し混合した(on-target mix法)。
（４）AXIMA Performance (島津製作所)のリニアTOF、ポジティブ及びネガティブモ−ドで計測した。
【００３５】
（比較用）
（１）（DHB、SA及びDAN）の10 mg/mL (50%ACN/0.05%TFA水溶液中)溶液を作成した。
（２）疎水性ペプチドHumaninの2a〜2pmol/μL（50%ACN/0.05%TFA水溶液中）溶液を作成した。
（３）MALDIプレ−ト上に(2)の試料溶液と(1)のマトリックス溶液とを0.5μLずつ滴下し混合した(on-target mix法)。
（４）AXIMA Performance (島津製作所)のリニアTOF、ポジティブ及びネガティブモ−ドで計測した。
【００３６】
【表２】
0005727407.tif 000007
【００３７】
表２中、アスタリスクでマークされた態様(C8-ADHB-ES/1,5-DAN)においては、マトリックス1,5-DANにC8-ADHB-ESを添加しなかった場合(1,5-DAN)に比べて、検出限界は同じであったが、S/Nにおいて5-8倍程度もの感度向上が達成できたことを確認した。
表２に示すように、添加剤混合マトリックスを使用した全ての場合において、マトリックス単独使用の場合に比べ、ポジティブとネガティブとの両方において感度向上が確認された。より具体的には、C8-ADHB-ES/SA(1/1)を使用した場合にはポジティブモードで１０倍、ネガティブモードで１００倍の感度向上が確認され、C8-ADHB-ES/DHB(1/1)を使用した場合にはネガティブモードで１０倍の感度向上が確認され、C8-ADHB-ES/DAN(1/1)を使用した場合にネガティブモードでＳ／Ｎの向上が確認された。
【００３８】
実施例２の結果及び実施例３の結果より、本発明の添加剤C8-ADHB-ESを組み合わせるマトリックスは、CHCA、SA、DHB及びDANの順で感度向上が確認された。