(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンタゴニスト性抗神経関連ロイシンリッチリピートタンパク質−１（ＮＬＲＲ−１）モノクローナル抗体の治療上有効量を小分子ＥＧＦＲチロシンキナーゼアンタゴニストと組み合わせて含む、患者における小分子ＥＧＦＲチロシンキナーゼアンタゴニストに耐性がある癌を治療するための医薬であって、
小分子ＥＧＦＲチロシンキナーゼアンタゴニストが、エルロチニブ；ＰＤ１８３８０５（ＣＩ１０３３、２−プロペンアミド、Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［３−（４−モルホリニル）プロポキシ］−６−キナゾリニル］−、ジハイドロクロリド）；Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）（ＺＤ１８３９、ゲフィチニブ）；ＺＭ１０５１８０（（６−アミノ−４−（３−メチルフェニル−アミノ）キナゾリン）；ＢＩＢＸ−１３８２（Ｎ８−（３−クロロ−４−フルオロ−フェニル）−Ｎ２−（１−メチル−ピペリジン−４−イル）−ピリミド［５，４−ｄ］ピリミジン−２，８−ジアミン）；ＰＫＩ−１６６（（Ｒ）−４−［４−［（１−フェニルエチル）アミノ］−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル］フェノール）；（Ｒ）−６−（４−ヒドロキシフェニル）−４−［（１−フェニルエチル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン）；ＣＬ−３８７７８５（Ｎ［４−［（３−ブロモフェニル）アミノ］−６−キナゾリニル］−２−ブチンアミド）；ＥＫＢ−５６９（Ｎ［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−３−シアノ−７−エトキシ−６−キノリニル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテンアミド）；ｌａｐａｔｉｎｉｂ（Ｔｙｋｅｒｂ）；ＺＤ６４７４（Ｚｅｃｔｉｍａ）；ＣＵＤＣ−１０１；ｃａｎｅｒｔｉｎｉｂ（ＣＩ−１０３３）；ＡＥＥ７８８（６−［４−［（４−エチル−１−ピペラジニル）メチル］フェニル］−Ｎ−［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン）及びＰＫＩ１６６（４−［４−［［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル］−フェノール）からなる群から選択される、医薬。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８７３２を有するハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体３Ｄ１．６．９である、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体がキメラ、ヒト又はヒト化モノクローナル抗体である、請求項１に記載の医薬。
【請求項４】
前記キメラ又はヒト化モノクローナル抗体がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８７３２を有するハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体３Ｄ１．６．９の６つ全てのＣＤＲを含む、請求項３に記載の医薬。
【請求項５】
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）が腫瘍細胞で重複していない、請求項１から４のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項６】
前記小分子ＥＧＦＲチロシンキナーゼアンタゴニストがエルロチニブである、請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項７】
小分子ＥＧＦＲチロシンキナーゼアンタゴニストのみと比較して、小分子ＥＧＦＲチロシンキナーゼアンタゴニストと併用するＮＬＲＲ−１アンタゴニストモノクローナル抗体が腫瘍細胞の増殖阻害を増強する、請求項１から６の何れか一項に記載の医薬。
【請求項８】
前記癌が、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、肝癌、膵癌及び卵巣癌からなる群から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の医薬。  
【請求項９】
前記癌がＮＬＲＲ−１及びＥＧＦＲを発現する、請求項１から８のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１０】
アンタゴニスト性抗神経関連ロイシンリッチリピートタンパク質−１（ＮＬＲＲ−１）モノクローナル抗体の治療上有効量を含む、小分子ＥＧＦＲチロシンキナーゼアンタゴニストと組み合わせて患者における小分子ＥＧＦＲチロシンキナーゼアンタゴニストに耐性がある癌を治療するための医薬であって、
小分子ＥＧＦＲチロシンキナーゼアンタゴニストが、エルロチニブ；ＰＤ１８３８０５（ＣＩ１０３３、２−プロペンアミド、Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［３−（４−モルホリニル）プロポキシ］−６−キナゾリニル］−、ジハイドロクロリド）；Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）（ＺＤ１８３９、ゲフィチニブ）；ＺＭ１０５１８０（（６−アミノ−４−（３−メチルフェニル−アミノ）キナゾリン）；ＢＩＢＸ−１３８２（Ｎ８−（３−クロロ−４−フルオロ−フェニル）−Ｎ２−（１−メチル−ピペリジン−４−イル）−ピリミド［５，４−ｄ］ピリミジン−２，８−ジアミン）；ＰＫＩ−１６６（（Ｒ）−４−［４−［（１−フェニルエチル）アミノ］−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル］フェノール）；（Ｒ）−６−（４−ヒドロキシフェニル）−４−［（１−フェニルエチル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン）；ＣＬ−３８７７８５（Ｎ［４−［（３−ブロモフェニル）アミノ］−６−キナゾリニル］−２−ブチンアミド）；ＥＫＢ−５６９（Ｎ［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−３−シアノ−７−エトキシ−６−キノリニル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテンアミド）；ｌａｐａｔｉｎｉｂ（Ｔｙｋｅｒｂ）；ＺＤ６４７４（Ｚｅｃｔｉｍａ）；ＣＵＤＣ−１０１；ｃａｎｅｒｔｉｎｉｂ（ＣＩ−１０３３）；ＡＥＥ７８８（６−［４−［（４−エチル−１−ピペラジニル）メチル］フェニル］−Ｎ−［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン）及びＰＫＩ１６６（４−［４−［［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル］−フェノール）からなる群から選択される、医薬。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（関連出願）
本出願は２００７年１０月０２日出願米国仮出願番号第６０／９７６，８９２号の優先権を主張し、その内容の全ては本願明細書に引用されたものとする。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明は、癌及び他の疾患の治療のために有用な組成物及び方法に係わり、特に癌を治療するために有用な神経関連ロイシンリッチリピートタンパク質−１アンタゴニストに関する。
【０００３】
（発明の背景）
神経関連ロイシンリッチリピート（ＮＬＲＲ）タンパク質は、まずマウス脳ｃＤＮＡライブラリーから同定され、哺乳動物のｔｈｒｅｅ−ｇｅｎｅファミリーによってコード化される（Taguchi等、1996; Taniguchi等、1996）。それらは１１又は１２のＬＲＲｓ、免疫グロブリンドメイン及びＩＩＩ型フィブロネクチン・ドメインを含む新規なＬＲＲタンパク質ファミリーを構成する（Bormann等、1999; Fukamachi等、2001; Hayata等、1998）。構造的特徴から、これらのグリコシル化膜貫通タンパク質は、細胞接着、遊走、形態形成又はシグナリングにおいて役割を果たすと仮定される。ＮＬＲＲファミリー・タンパク質の制御された胚性発現及び細胞位置は、細胞接着、運動又はシグナリングの制御の発達における重要な役割を示唆するが（Haines等、2005）、それらの機能は理解されないままであった。ＥＧＦＲとの物理的な関連を示す証拠はないが、おそらくクラトリン−被覆小窩及びエンドソームにおけるＥＧＦＲとＥＧＦとの関連を促進することによって、ＮＬＲＲ−３は低濃度のＥＧＦに応答してＥＧＦＲシグナリングを強化する役割を有することが示された（Fukamachi等、2002）。ＥＧＦＲのエンドサイトーシスは減衰機構として長く認識されてきたが、いくつかの研究により、エンドソーム複合体がシグナリング活性を保持し、ＥＧＦＲ内部移行がＭＡＰキナーゼ・リン酸化を増幅して細胞生存に導く経路を刺激することが明らかとなった（Haugh等、1999a; Haugh等、1999b; Sato等、2001; Schoeberl等、2002; Wang等、2002）。
ＮＬＲＲ−１（ＬＲＲＮ１として公知）はＮＬＲＲ−３とＣ末端のエンドサイトーシスモチーフの完全な保存を含む相同性を有している。ＮＬＲＲ−１は初期の神経外胚葉発達上のマーカーとして同定され（Aubert等、2003）、原体節発達における筋原の前駆体のサブセットにおいてもまた見られるが（Haines等、2005）、その機能は未だわかっていない。  ヒト疾病状態におけるＮＬＲＲタンパク質の発現に関するデータは限られているが、神経芽細胞腫においてＮＬＲＲ−１の発現はＮＬＲＲ−３と異なり、短い生存及び低い予後の因子と関連している（Hamano等、2004）。  
【０００４】
上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーは、４つの密接に関連した受容体（ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４）を含む。ＥＧＦＲファミリー及び関連リガンドは、細胞増殖、遊走、分化及び生存を制御する一連の細胞内シグナリングのイベントを引き起こす（Wells, 1999）。ＥＧＦＲ経路の活性化は、悪性腫瘍において基本的な役割を果たし、ＥＧＦＲを標的とした腫瘍治療の最近の進歩は、ゲノム増幅、タンパク質発現、変異及び下流エフェクターとしてこのような因子の貢献を含むＥＧＦＲシグナリング及び腫瘍形成の活性化のいくつかの側面を強調した（Dziadziuszko等、2006; Eberhard等、2005; Han等、2005; Lynch等、2004; Oliveira等、2006; Paez等、2004; Shepherd等、2005; Tsao等、2005）。  
ＥＧＦＲキナーゼ又はそのリガンドであるＴＧＦαの過剰発現は、乳房、肺、結腸直腸、卵巣、腎臓細胞、膀胱、頭頚部の癌、神経グリア芽細胞腫及び神経膠星状細胞腫を含む多くの癌と高い頻度で関連し、これらの腫瘍の悪性の増殖に寄与すると考えられている。ＥＧＦＲ遺伝子（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）における特定の欠失突然変異は、細胞腫瘍原性を増強することも見いだされた。ＥＧＦＲ刺激シグナリング経路の活性化は、潜在的に癌促進性（例えば増殖、血管新生、細胞運動性及び浸潤、減少したアポトーシス及び薬剤耐性の誘導）の多数のプロセスを促進する。増加したＨＥＲ１／ＥＧＦＲ発現は、進行した疾患、転移及び予後不良に高い頻度で関連している。例えば、ＮＳＣＬＣ及び胃癌において、増加したＨＥＲ１／ＥＧＦＲ発現が高い転移性速度と相関することが示され、低い腫瘍では異なっている。
ＥＧＦＲのキナーゼ活性を直接阻害する抗腫瘍因子及びＥＧＦＲ活性化をブロックすることによってＥＧＦＲキナーゼ活性を減少させる抗体を作成するために、熱心な研究への努力が行われている（de Bono J.S. and Rowinsky, E.K. (2002) Trends in Mol. Medicine 8: S19-S26; Dancey, J. and Sausville, E.A. (2003) Nature Rev. Drug Discovery 2:92-313）。いくつかの研究により、特定の他の抗癌剤又は化学療法剤又は治療と併用して用いられる場合、ＥＧＦＲキナーゼ・インヒビターは腫瘍細胞又は新形成の死滅を改善するかもしれないことが示され、開示され又は示唆されている（例えばHerbst, R.S. et al. (2001) Expert Opin. Biol. Ther. 1:719-732; Solomon, B. et al (2003) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 55:713-723; Krishnan, S. et al. (2003) Frontiers in Bioscience 8, e1-13; Grunwald, V. and Hidalgo, M. (2003) J. Nat. Cancer Inst. 95:851-867; Seymour L. (2003) Current Opin. Investig. Drugs 4(6): 658-666; Khalil, M.Y. et al. (2003) Expert Rev. Anticancer Ther.3: 367-380; Bulgaru, A.M. et al. (2003) Expert Rev. Anticancer Ther.3: 269-279; Dancey, J. and Sausville, E.A. (2003) Nature Rev. Drug Discovery 2:92-313; Ciardiello, F. et al. (2000) Clin. Cancer Res. 6: 2053-2063; and Patent Publication No: US 2003/0157104）。
【０００５】
エルロチニブ(Erlotinib)（例えばエルロチニブＨＣｌ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）又はＯＳＩ−７７４として知られる））は、ＥＧＦＲキナーゼの経口的に利用可能なインヒビターである。インビトロで、エルロチニブは結腸直腸癌及び乳房癌を含む多くのヒト腫瘍株のＥＧＦＲキナーゼに対して重大な阻害活性を有することを示し（Moyer J.D. et al. (1997) Cancer Res. 57: 4838）、前臨床評価ではＥＧＦＲを発現している多くのヒト腫瘍異種移植片に対しての活性を示した（Pollack, V.A. et al (1999) J. Pharmacol. Exp. Ther. 291:739）。エルロチニブは、頭頚部癌を含む多くの適応症の臨床試験において活性を示した（Soulieres, D., et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22:77), NSCLC (Perez-Soler R, et al. (2001) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 20:310a, abstract 1235), CRC (Oza, M., et al. (2003) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22:196a, abstract 785) and MBC (Winer, E., et al. (2002) Breast Cancer Res. Treat. 76:5115a, abstract 445; Jones, R.J., et al. (2003) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22:45a, abstract 180）。第三相試験において、エルロチニブの単一療法は、進行した治療抵抗性ＮＳＣＬＣを有する患者において、有意に生存を延長し、疾患進行を遅延させ、肺癌関連の症状の悪化を遅延させた（Shepherd, F. et al. (2004) J. Clin. Oncology, 22:14S (July 15 Supplement), Abstract 7022）。２００４年１１月、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）は、少なくとも一つの従来の化学療法投薬計画の失敗の後の、局所的に進行した又は転移性の肺非小細胞癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者の治療のためのＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）を承認した。  
癌の治療の有意な前進にもかかわらず、改良された治療は、まだ求められている。
【０００６】
（発明の概要）
本発明の一態様は、神経関連ロイシンリッチリピートタンパク質−１（ＮＬＲＲ−１）アンタゴニストの有効量を含む組成物と細胞とを接触させることを含む、哺乳動物細胞においてＥＧＦＲシグナリングを阻害する方法を提供する。いくつかの実施態様において、アンタゴニストは、抗ＮＬＲＲ−１抗体又はその抗原結合フラグメント、ｓｉＲＮＡ又は小分子である。いくつかの実施態様において、抗体はモノクローナル抗体（例えばＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８７３２を有するハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体３Ｄ１．６．９）である。他の実施態様において、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８７３２を有するハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体３Ｄ１．６．９と結合を競合する。これまでに他の実施態様において、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８７３２を有するハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体３Ｄ１．６．９と同じエピトープに結合する。これまでに他の実施態様において、抗体は、キメラ、ヒト又はヒト化抗体である。いくつかの実施態様において、キメラ又はヒト化抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８７３２を有しているハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体３Ｄ１．６．９の断片を含む。
いくつかの実施態様において、細胞は癌細胞である。いくつかの実施態様において、細胞は、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、肝癌細胞、膵癌細胞、又は卵巣癌細胞である。  
【０００７】
本発明の別の態様は、ＥＧＦＲ及びＮＬＲＲ−１の相互作用を阻害する薬剤の有効量を含む組成物と細胞とを接触させることを含む、哺乳動物細胞においてＥＧＦＲシグナリングを阻害する方法を提供する。いくつかの実施態様において、アンタゴニストは、抗ＮＬＲＲ−１抗体又はその抗原結合フラグメント、ｓｉＲＮＡ又は小分子である。いくつかの実施態様において、抗体はモノクローナル抗体（例えばＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８７３２を有するハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体３Ｄ１．６．９）である。他の実施態様において、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８７３２を有するハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体３Ｄ１．６．９と結合を競合する。これまでに他の実施態様において、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８７３２を有するハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体３Ｄ１．６．９と同じエピトープに結合する。これまでに他の実施態様において、抗体は、キメラ、ヒト又はヒト化抗体である。いくつかの実施態様において、キメラ又はヒト化抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８７３２を有しているハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体３Ｄ１．６．９からの断片を含む。
いくつかの実施態様において、細胞は癌細胞である。いくつかの実施態様において、細胞は、乳がん細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、肝癌細胞、膵臓癌細胞、又は卵巣癌細胞である。  
本発明の更に別の態様は、対象にＮＬＲＲ−１アンタゴニストの治療上有効量を投与することを含む、対象の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。いくつかの実施態様において、アンタゴニストは、抗ＮＬＲＲ−１抗体又はその抗原結合フラグメント、ｓｉＲＮＡ、又は小分子である。いくつかの実施態様において、抗体はモノクローナル抗体（例えばＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８７３２を有するハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体３Ｄ１．６．９）である。他の実施態様において、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８７３２を有するハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体３Ｄ１．６．９と結合を競合する。これまでに他の実施態様において、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８７３２を有するハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体３Ｄ１．６．９と同じエピトープに結合する。これまでに他の実施態様において、抗体は、キメラ、ヒト又はヒト化抗体である。いくつかの実施態様において、キメラ又はヒト化抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８７３２を有しているハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体３Ｄ１．６．９からの断片を含む。
【０００８】
いくつかの実施態様において、ＥＧＦＲは、腫瘍細胞において増幅されない。いくつかの実施態様において、対象は、ＥＧＦＲアンタゴニストの治療的有効量を更に投与される。いくつかの実施態様において、ＥＧＦＲアンタゴニストは、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合フラグメント、ｓｉＲＮＡ、又は小分子である。いくつかの実施態様において、小分子はエルロチニブである。いくつかの実施態様において、対象の腫瘍細胞はＥＧＦＲアンタゴニスト耐性である。いくつかの実施態様において、対象の腫瘍細胞はエルロチニブ耐性である。いくつかの実施態様において、ＮＬＲＲ−１アンタゴニスト及びＥＧＦＲアンタゴニストの投与は、ＮＬＲＲ−１アンタゴニストの投与を伴わないＥＧＦＲアンタゴニストの投与と比較して、腫瘍細胞増殖の阻害を増加させる。
いくつかの実施態様において、腫瘍細胞は、乳がん細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、肝癌細胞、膵臓癌細胞又は卵巣癌細胞である。
【０００９】
本発明の別の態様は、対象にＮＬＲＲ−１アンタゴニストの効果的量を投与することを含む、対象の癌の治療方法を提供する。いくつかの実施態様において、アンタゴニストは、抗ＮＬＲＲ−１抗体又はその抗原結合フラグメント、ｓｉＲＮＡ、又は小分子である。いくつかの実施態様において、抗体はモノクローナル抗体（例えばＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８７３２を有するハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体３Ｄ１．６．９）である。他の実施態様において、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８７３２を有するハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体３Ｄ１．６．９と結合を競合する。これまでに他の実施態様において、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８７３２を有するハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体３Ｄ１．６．９と同じエピトープに結合する。これまでに他の実施態様において、抗体は、キメラ、ヒト又はヒト化抗体である。いくつかの実施態様において、キメラ又はヒト化抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８７３２を有しているハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体３Ｄ１．６．９からの断片を含む。
いくつかの実施態様において、ＥＧＦＲは、癌において増幅していない。いくつかの実施態様において、対象は、更にＥＧＦＲアンタゴニストの治療上有効量を投与される。いくつかの実施態様において、ＥＧＦＲアンタゴニストは、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合フラグメント、ｓｉＲＮＡ、又は小分子である。いくつかの実施態様において、小分子はエルロチニブである。いくつかの実施態様において、対象の腫瘍細胞はＥＧＦＲアンタゴニスト耐性である。いくつかの実施態様において、対象の腫瘍細胞はエルロチニブ耐性である。いくつかの実施態様において、ＮＬＲＲ−１アンタゴニスト及びＥＧＦＲアンタゴニストの投与は、ＮＬＲＲ−１アンタゴニストの投与を伴わないＥＧＦＲアンタゴニストの投与と比較して、腫瘍細胞増殖の阻害を増加させる。    
いくつかの実施態様において、腫瘍細胞は、乳がん細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、肝癌細胞、膵臓癌細胞又は卵巣癌細胞である。  
【００１０】
本発明の別の態様は、対象へのａＮＬＲＲ−１アンタゴニストの有効量を投与することを含む、ＥＧＦＲアンタゴニストの治療に耐性である患者の癌を治療するための方法を提供する。いくつかの実施態様において、抗体はモノクローナル抗体（例えばＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８７３２を有するハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体３Ｄ１．６．９）である。他の実施態様において、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８７３２を有するハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体３Ｄ１．６．９と結合を競合する。これまでに他の実施態様において、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８７３２を有するハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体３Ｄ１．６．９と同じエピトープに結合する。これまでに他の実施態様において、抗体は、キメラ、ヒト又はヒト化抗体である。いくつかの実施態様において、キメラ又はヒト化抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８７３２を有しているハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体３Ｄ１．６．９からの断片を含む。
いくつかの実施態様において、ＥＧＦＲは癌において増幅していない。いくつかの実施態様において、対象は、更にＥＧＦＲアンタゴニストの治療的有効量を投与される。いくつかの実施態様において、ＥＧＦＲアンタゴニストは、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合フラグメント、ｓｉＲＮＡ、又は小分子である。いくつかの実施態様において、小分子はエルロチニブである。いくつかの実施態様において、癌はＥＧＦＲアンタゴニスト耐性である。いくつかの実施態様において、癌はエルロチニブ耐性のである。いくつかの実施態様において、ＮＬＲＲ−１アンタゴニスト及びＥＧＦＲアンタゴニストの投与は、ＮＬＲＲ−１アンタゴニストの投与を伴わないＥＧＦＲアンタゴニストの投与と比較して、腫瘍細胞増殖の阻害を増加させる。    
いくつかの実施態様において、腫瘍細胞は、乳がん細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、肝癌細胞、膵臓癌細胞又は卵巣癌細胞である。  
【００１１】
本発明の更に別の態様は、患者から単離した試験細胞集団及び対照細胞集団に存在するＮＬＲＲ−１レベルを比較することを含み、試験細胞集団におけるＮＬＲＲ−１発現量の増加がＮＬＲＲ−１アンタゴニストでの治療により患者が恩恵を受けられることを示す、ＮＬＲＲ−１アンタゴニストでの治療により恩恵を受け得る患者を同定するための方法を提供する。    
本発明の更に別の態様は、患者から単離した試験細胞集団及び対照細胞集団に存在するＮＬＲＲ−１レベルを比較することを含み、試験細胞集団はＥＧＦＲの増幅を含まず、試験細胞集団におけるＮＬＲＲ−１発現量の増加がＮＬＲＲ−１アンタゴニスト及びＥＧＦＲアンタゴニストの併用治療により患者が恩恵を受けられることを示す、ＮＬＲＲ−１アンタゴニスト及びＥＧＦＲアンタゴニストの併用治療により恩恵を受け得る患者を同定するための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、悪性度の高い前立腺癌におけるＮＬＲＲ−１発現を示す。１Ａ：マイクロアレイ解析によって測定された前立腺癌のＮＬＲＲ−１転写産物レベル（ダイヤモンド）及び平均発現（正方形）。Ｎｏｒｍ、正常；ＢＰＨ、前立腺肥大症；ＰＩＮ、前立腺上皮細胞間の腫瘍形成；ＡｄＣａ、腺癌。１Ｂ：マイクロアレイ解析によって測定された前立腺腫瘍のレーザー捕捉顕微解剖からのＮＬＲＲ−１転写産物レベル。１Ｃ：前立腺腫瘍におけるＭＵＣ１及びＮＬＲＲ−１転写産物のＲＴ−ＰＣＲ解析。量は、ヒト・ゲノムＤＮＡ標準曲線を用いて決定された。
【図２】図２は、癌の広域スペクトルにわたるＮＬＲＲ−１発現を示す。２Ａ：マイクロアレイ解析によって測定された正常（Ｎ）対腫瘍（Ｔ）のＮＬＲＲ−１転写産物。２Ｂ：マイクロアレイ解析によって測定された多発性骨髄腫及びマントル細胞リンパ腫におけるＮＬＲＲ−１転写産物の発現。２Ｃ：マイクロアレイ解析によって測定された２００３の腫瘍におけるＥＲＢＢ２対ＥＧＦＲの転写産物。２Ｄ：マイクロアレイ解析によって測定された２００３の腫瘍のＮＬＲＲ−１対ＥＧＦＲの転写産物。
【図３】図３は、ＮＬＲＲ−１及びＥＧＦＲの免疫共沈降を示す。３Ａ：ＮＬＲＲ−１、ＥＧＦＲ又はブタクサ(ragweed)モノクローナル抗体で処理され、タンパク質Ｇアガロースビーズで沈降され、ＮＬＲＲ−１ポリクローナル又はＥＧＦＲモノクローナル抗体で免疫ブロットされたＢＴ５４９細胞溶解物。３Ｂ：ＮＬＲＲ−１、ＥＧＦＲ又はブタクサモノクローナル抗体で処理され、タンパク質Ｇアガロースビーズで沈降され、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢｒ３、ＩＧＦ１Ｒ及びアダプチンで免疫ブロットされたＮＣＩ−Ｈ２００９細胞可溶化物。
【図４】図４は、ＮＬＲＲ−１トランスフェクションによるＥＲＫリン酸化を示す。Ｃｏｓ−７細胞は、ｐＥＹＦＰベクター、又は、ＮＬＲＲ−１．ＹＦＰでトランスフェクションされ、飢餓にされ、１００ｎｇ／ｍｌＥＧＦ（４Ａ）又は５０ｎＭＴＧＦαで刺激され、Ｐ−ＥＲＫについてフローサイトメトリーによって解析された。５０，０００のイベントが回収され、ＦＳＣ、ＳＳＣ及びＹＦＰについてゲーティングされた。ベクター（●）；ＮＬＲＲ−１−ＹＦＰ（□）。
【図５】図５は、ＮＬＲＲ１及びＥＧＦＲの細胞表面発現を示す。５Ａ：ＮＬＲＲ−１トランスフェクション細胞のフローサイトメトリーによるＮＬＲＲ−１の検出。ＨＥＫ２９３細胞は、ｐＥＹＦＰベクター、ＮＬＲＲ−１．ＹＦＰ又はＮＬＲＲ−１Ｃ．ＹＦＰで一過性にトランスフェクションされ、モノクローナル抗体に続くマウスＩｇ−ａｌｅｘａ６４７二次抗体で染色された。ＮＬＲＲ−１Ｃはアミノ酸６８１で切断され、クラトリン媒介エンドサイトーシス・モチーフを削除する。１０，０００のイベントが回収され、細胞はＦＳＣ、ＳＳＣ、ＰＩ及びＹＦＰについてゲーティングされた。データは、平均相対蛍光単位を表す。５Ｂ：ＮＬＲＲ−１ｓｉＲＮＡノックダウン後のフローサイトメトリーによるＥＧＦＲの検出。１０，０００のイベントが回収され、ＦＳＣ、ＳＳＣ及びＰＩについてゲーティングされた。メジアン蛍光単位は、グラフで示される。
【図６】図６は、腫瘍細胞株におけるＮＬＲＲ−１のｓｉＲＮＡノックダウンを示す。６Ａ：腫瘍細胞株のコントロール及びＮＬＲＲ−１ｓｉＲＮＡノックダウンについてのＲＴ−ＰＣＲを用いたＮＬＲＲ−１転写産物解析。データは、ＲＰＬ１９発現を用いて標準化される。６Ｂ：コントロールの割合としてグラフで示されるＮＬＲＲ−１ｓｉＲＮＡノックダウンされた腫瘍細胞株の細胞生存率異常。データは、三回の平均±ＳＤで表す。６Ｃ：腫瘍細胞株におけるＮＬＲＲ−１ｓｉＲＮＡノックダウンでの飢餓により誘導されるアポトーシス。アポトーシスは、カスパーゼ３／７活性によって測定され、生存細胞のついて対応する複製物で標準化された。データは、三回の平均±ＳＤで表す。
【図７】図７は、ＥＲＫ及びＡＫＴリン酸化を示す。７Ａ−Ｅ：フローサイトメトリーで測定されるＥＲＫリン酸化。細胞は、飢餓され、ブタクサ又はＮＬＲＲ−１モノクローナル抗体の何れかで処理され、Ａ：１０％血清、Ｂ：５０ｎＭＴＧＦα、Ｃ：１００ｎｇ／ｍｌＥＧＦ、Ｄ：１ｎｇ／ｍｌＥＧＦ、Ｅ：０．０１ｎｇ／ｍｌＥＧＦの時間経過で刺激された。ブタクサ（□）；ＮＬＲＲ−１（▲）。７Ｆ−Ｉ：フローサイトメトリーで測定されるＡＫＴリン酸化。細胞は、飢餓され、ブタクサ又はＮＬＲＲ−１モノクローナル抗体の何れかで処理され、Ｆ：１０％血清、Ｇ：５０ｎＭＴＧＦα、Ｈ：１ｎｇ／ｍｌＥＧＦ、Ｉ：０．０１ｎｇ／ｍｌＥＧＦの時間経過で刺激された。ブタクサ（□）；ＮＬＲＲ−１（▲）。７Ｊ−Ｋ：ブタクサ・コントロールの割合としてグラフで示される、２．５Ｍ及び０．２５Ｍのブタクサ・モノクローナル抗体、ＮＬＲＲ−１モノクローナル抗体及びエルロチニブと比較したＪ：時間経過、Ｋ：１６分における５０ｎＭＴＧＦα刺激後のＥＲＫリン酸化。ブタクサ（□）；ＮＬＲＲ−１（▲）；エルロチニブ２．５Ｍ（●）；エルロチニブ０．２５Ｍ（×）。フローサイトメトリーのために、５，０００〜１０，０００のイベントは回収され、ＦＳＣ及びＳＳＣについてゲーティングされた。
【図８】図８は、ＮＬＲＲ−１ｓｉＲＮＡノックダウン及びエルロチニブの相乗効果を示す。ＥＧＦＲインヒビターエルロチニブに対する応答のアポトーシスは、コントロールｓｉＲＮＡ（●）又はＮＬＲＲ−１ｓｉＲＮＡ（□）を伴う腫瘍細胞株８Ａ：ＮＣＩ−Ｈ６４７、８Ｂ：ＮＣＩ−Ｈ１７８１、８Ｃ：ＮＣＩ−Ｈ２２６、８Ｄ：ＮＣＩ−Ｈ５２０、８Ｅ：ＮＣＩ−Ｈ２００９、８Ｆ：ＳＫ−ＭＥＳ−１（ＮＬＲＲ−１ネガティブ）において測定された。Ｒ、エルロチニブ耐性（ＩＣ５０＞８Ｍ）；Ｓ、エルロチニブ感受性（ＩＣ５０＜２Ｍ）。
【図９】図９は、ＮＬＲＲ−１及びＮＬＲＲ−３の転写産物発現を示す。９Ａ：多発性骨髄腫（ＭＭ）におけるＮＬＲＲ−１のＲＴ−ＰＣＲ解析。多発性骨髄腫ＲＮＡは、骨髄から得られたＣＤ１３８＋で精製された細胞から単離された。データは、ヒト・ゲノムＤＮＡ標準曲線を用いて算出される量を表す。ｈｕＢＭ（ヒト骨髄（Clontech））；ｈｕｓｐｌｅｅｎ（ヒト脾臓（Clontech））；ｎｏｒｍａｌＢ（正常なＢ細胞（Clontech））；ＬｎＣＡＰ（前立腺腫瘍細胞株）。９Ｂ：マイクロアレイ解析で測定された正常（Ｎ）対腫瘍（Ｔ）組織におけるＮＬＲＲ−３発現。
【図１０】図１０は、様々な腫瘍における転写産物レベル比較を示す。１０Ａ：マイクロアレイ解析で測定された２００３の腫瘍におけるＣＢＬ対ＥＧＦＲ。１０Ｂ：マイクロアレイ解析で測定された２００３の腫瘍におけるＥ−カドヘリン（ＣＤＨ１）対ＥＧＦＲ。
【図１１】図１１は、ブタクサ及びＮＬＲＲ−１抗体でのＥＲＫリン酸化を示す。１１Ａ：ブタクサ又はＮＬＲＲ−１モノクローナル抗体、飢餓及び１０％血清での刺激処理後のリン酸化ＥＲＫのフローサイトメトリー・プロット。５，０００〜１０，０００のイベントは回収され、ＦＳＣ及びＳＳＣについてゲーティングされた。１１Ｂ：ブタクサ・コントロールに対する割合としてグラフ化された、独立して行われた５つの実験の１０％血清刺激によるＥＲＫリン酸化のＮＬＲＲ−１抗体阻害の概要。データは、平均±ＳＥを表す。片側Ｔ−検定結果は、８分（ｐ＝０．０１３）及び１６分（ｐ＝０．０２３）において統計学的に有意である（＊）。１１Ｃ：フローサイトメトリで測定される血清刺激によるＮＣＩ−Ｈ５２０ＥＲＫリン酸化。ブタクサ（）；ＮＬＲＲ−１（▲）。
【図１２】図１２は、ＮＬＲＲ−１及びΔＣＹＦＰ融合を示す。１２Ａ：融合タンパク構築物のダイアグラム、ホワイトボックス：ＮＬＲＲ−１細胞外ドメイン、斜線のボックス：膜貫通領域、ブラックボックス：クラトリン媒介エンドサイトーシス・モチーフ、陰をつけられたボックス：ＹＦＰ。１２Ｂ：融合タンパクのフローサイトメトリーによるＮＬＲＲ−１の検出：ＨＥＫ２９３細胞はｐＥＹＦＰベクター、ＮＬＲＲ−１．ＹＦＰ又はＮＬＲＲ−１Ｃ．ＹＦＰで一過性にトランスフェクションされ、モノクローナル抗体に続くマウスＩｇ−ａｌｅｘａ  ６４７二次抗体で染色された。１０，０００のイベントは回収され、細胞はＦＳＣ、ＳＳＣ、ＰＩ及びＹＦＰについてゲーティングされた。
【図１３】図１３は、マイクロアレイ解析で測定されたＴＧＦα（１３Ａ）及びＥＧＦ（１３Ｂ）の正常（Ｎ）及び腫瘍（Ｔ）組織における転写産物レベルを示す。
【図１４】図１４は、ｐＥＹＦＰベクター、ＮＬＲＲ−１．ＹＦＰ又はＮＬＲＲ−１Ｃ．ＹＦＰで一過性にトランスフェクションされ、モノクローナル抗体に続くマウスＩｇ−ａｌｅｘａ６４７二次抗体で染色され、フローサイトメトリーによって解析されたＨＥＫ２９３細胞を示す。１０，０００のイベントは回収され、細胞はＦＳＣ、ＳＳＣ、ＰＩ及びＹＦＰについてゲーティングされた。
【図１５】図１５は、ヒトＮＬＲＲ−１のアミノ酸配列（配列番号：１）を示す。
【００１３】
詳細な説明
定義
ここに用いられる用語「神経関連ロイシンリッチリピート」又は「ＮＬＲＲ」は、別途示されない限り、天然又は変異体（天然又は合成にせよ）ＮＬＲＲポリペチドを意味する。一般に、ＮＬＲＲタンパク質ファミリーは１１又は１２のＬＲＲｓ（免疫グロブリンドメーン）及びＩＩＩ型フィブロネクチン・ドメイを含む（Bormann等、1999; Fukamachi等、2001; Hayata等、1998）。ＮＬＲＲファミリーのメンバーは、ＮＬＲＲ−１、ＮＬＲＲ−２、ＮＬＲＲ−３、ＮＬＲＲ−４、ＮＬＲＲ−５及びＮＬＲＲ−６を含む。ヒトＮＬＲＲ−１は、単離され、特性を決定されている。例えば、Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＡＡＱ８８６７９、米国特許第７，１８９，８１３号及び米国特許公開番号２００５０２０８５２３及び米国特許公開番号２００６０００２９４３を参照のこと（ここにその開示の全てが援用されたものとする）。ヒトＮＬＲＲ−１の核酸配列及びアミノ酸配列は、図１５に提示される。  
用語「野生型ＮＬＲＲ」は、一般に、天然に生じるＮＬＲＲタンパク質のアミノ酸配列を含むポリペチドを意味する。用語「野生型ＮＬＲＲ配列」は、一般に、天然に生じるＮＬＲＲにおいて見いだされるアミノ酸配列を意味する。      
ここに用いられる用語「ＮＬＲＲ変異体」は、一つ以上のアミノ酸変異を天然のＮＬＲＲ配列に含むＮＬＲＲポリペチドを意味する。選択的に、一つ以上のアミノ酸変異は、アミノ酸置換（ｓ）を含む。    
「天然配列」ポリペプチドは、天然に生じるポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。したがって、天然配列ポリペチドは、あらゆる哺乳動物の天然に生じるポリペプチドのアミノ酸配列を有してもよい。このような天然配列ポリペチドは、天然から単離されてもよく、組換え又は合成手段によって製造されてもよい。用語「天然の配列」ポリペプチドは、具体的には天然に生じる切断型又は分泌型のポリペプチド（例えば細胞外ドメイン配列）、天然に生じる変異型（例えば選択的にスプライスされた型）及び天然に生じるアレル変異体を含む。
ポリペプチド「変異体」は、天然配列ポリペプチドと少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性を有する生物学的活性なポリペプチドを意味する。このような変異体は、例えば、一つ以上のアミノ酸残基がＮ−又はＣ末端において付加又は欠失されたポリペプチドを含む。通常、変異体は、天然配列ポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性及びさらにより好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。  
【００１４】
「ＥＧＦＲ」は、Ullrich等（Nature (1984) 309:418425）に記載される受容体チロシンキナーゼ・ポリペプチドである上皮増殖因子受容体を意味し、あるいはＨｅｒ−１及びｃ−ｅｒｂＢ遺伝子産物とその変異体（例えばＥＧＦＲｖＩＩＩ）を意味する。ＥＧＦＲの変異体は、もまた欠失、置換及び挿入の変異体を含み、例えばそれらはLynch等（New England Journal of Medicine 2004, 350:2129）Paez等（Science 2004, 304:1497）、Pao等（PNAS 2004, 101:13306）に記載されている。  
「生体試料」（「試料」又は「組織又は細胞試料」と交換可能に用いられる）は、個体から得られる種々の試料型を含み、診断又はモニタリングアッセイにおいて用いてもよい。定義は、生物学的起源の血及び他の液体試料、固体組織サンプル（例えば生検材料又は組織培養）又は、そこから由来される細胞及びその継代物を含む。定義は、獲得後に、例えば試薬による処理、可溶化又は特定の成分（例えばタンパク質又はポリヌクレオチド）の濃縮、又は切片作製のための半固体又は固体マトリックスへの包埋などのあらゆる操作をされた試料を含む。用語「生体試料」は臨床試料を含み、更に培養細胞、細胞上清、細胞可溶化物、血清、プラズマ、生物学的体液及び組織試料を含む。生体試料の供給源は、生、凍結及び／又は保存された器官又は組織試料又は生検又は吸引物；血液又はあらゆる血液成分；生体体液（例えば脳脊髄液、羊水、腹膜体液又は間質液）；対象の妊娠又は発達のあらゆる時期からの細胞であってもよい。いくつかの実施態様において、生体試料は、原発性又は転移性の腫瘍からの得られる。生体試料は、性質（例えば防腐剤、血液凝固阻止剤、バッファ、固定液、栄養分、抗生物質、等）の天然には混合されない化合物を含んでもよい。  
【００１５】
「ＮＬＲＲ−１アンタゴニスト」」（「ＮＬＲＲ−１インヒビター」と交換可能に用いられる）は、ＮＬＲＲ−１機能と干渉する薬剤である。ＮＬＲＲ−１アンタゴニストの例は、ＮＬＲＲ−１に結合する抗体（「抗ＮＬＲＲ−１抗体」）；小分子ＮＬＲＲ−１アンタゴニスト；アンチセンス及び抑制ＲＮＡ（例えばｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ）分子を含む。好ましくは、ＮＬＲＲ−１アンタゴニストは、ＮＬＲＲ−１に結合する抗体又は小分子である。特定の実施態様では、ＮＬＲＲ−１アンタゴニストは約１，０００ｎＭ以下のＮＬＲＲ−１への結合能（解離定数）を有する。もう一つの実施態様では、ＮＬＲＲ−１アンタゴニストは約１００ｎＭ以下のうＮＬＲＲ−１への結合能を有する。もう一つの実施態様では、ＲＬＬ−１アンタゴニストは約５０ｎＭ以下のＮＬＲＲ−１への結合能を有する。特定の実施態様では、ＮＬＲＲ−１アンタゴニストは１，０００ｎＭ以下のＩＣ５０でＮＬＲＲ−１を阻害する。もう一つの実施態様では、ＮＬＲＲ−１アンタゴニストは５００ｎＭ以下のＩＣ５０でＮＬＲＲ−１を阻害する。もう一つの実施態様では、ＮＬＲＲ−１アンタゴニストは５０ｎＭ以下のＩＣ５０でＮＬＲＲ−１を阻害する。
「ＥＧＦＲアンタゴニスト」（「ＥＧＦＲインヒビター」と交換可能に用いられる）は、ＥＧＦＲ活性化又は機能と干渉する薬剤である。ＥＧＦＲアンタゴニストの例は、ＥＧＦＲに結合するＥＧＦＲ抗体（「抗ＥＧＦＲ抗体」）；  ＥＧＦＲリガンド抗体；小分子ＥＧＦＲアンタゴニスト；  ＥＧＦＲチロシンキナーゼ・インヒビター；アンチセンス及び抑制ＲＮＡ（例えばｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ）分子を含む（ＷＯ２００４／８７２０７参照）。好ましくは、ＥＧＦＲアンタゴニストは、ＥＧＦＲに結合する抗体又は小分子である。いくつかの実施態様において、ＥＧＦＲアンタゴニストはＥＧＦＲを目標とする薬剤である。特定の実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストは約１，０００ｎＭ以下のＥＧＦＲへの結合能（解離定数）を有する。もう一つの実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストは約１００ｎＭ以下のＥＧＦＲへの結合能を有する。もう一つの実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストは約５０ｎＭ以下のＥＧＦＲへの結合能を有する。特定の実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストは１，０００ｎＭ以下のＩＣ５０でＥＧＦＲシグナリングを阻害する。もう一つの実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストは５００ｎＭ以下のＩＣ５０でＥＧＦＲシグナリングを阻害する。もう一つの実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストは５０ｎＭ以下のＩＣ５０でＥＧＦＲシグナリングを阻害する。    
ＥＧＦＲアンタゴニストは、ＥＧＦＲに結合し、ＥＧＦＲ活性化を阻害する治療剤を含む。このような薬剤の例は、ＥＧＦＲに結合する抗体及び小分子を含む。ＥＧＦＲに結合する抗体の例は、ＭＡｂ５７９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ＨＢ  ８５０６）、ＭＡｂ４５５  （ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ＨＢ８５０７）、ＭＡｂ２２５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８５０８）を含む、ＭＡｂ５２８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８５０９）（米国特許第４，９４３５３３号、Mendelsohn等参照）及びその変異体、例えばキメラ化２２５（Ｃ２２５又はＣｅｔｕｘｉｍａｂ；ＥＲＢＵＴＩＸ（登録商標））及び再構築されたヒト２２５（Ｈ２２５）（国際特許公報第９６／４０２１０号、Imclone Systems Inc.参照）；ＩＭＣ−１１Ｆ８（完全にヒトＥＧＦＲを標的とした抗体（Imclone））；ＩＩ型変異ＥＧＦＲに結合する抗体（米国特許第５，２１２，２９０号）；米国特許第５，８９１，９９６号にて説明されるＥＧＦＲに結合するヒト化及びキメラ抗体；及びＥＧＦＲに結合するヒト抗体（例えばＡＢＸ−ＥＧＦ（国際特許公報第９８／５０４３３号（Abgenix）を参照）；ＥＭＤ５５９００（Stragliotto et al. Eur. J. Cancer 32A: 636-640 (1996)）；ＥＭＤ７２００（ｍａｔｕｚｕｍａｂ）（ＥＧＦ及びＴＧＦαとＥＧＦＲとの結合において競合するＥＧＦＲに対するヒト化ＥＧＦＲ抗体）；及びｍＡｂ８０６又はヒト化ｍＡｂ８０６（Johns等、J. Biol. Chem. 279(29): 30375-30384 (2004)）を含む。抗ＥＧＦＲ抗体は細胞障害性剤とコンジュゲートされていてもよく、したがって免疫複合体（ＥＰ６５９，４３９Ａ２、Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨを参照）を作製する。    
【００１６】
ＥＧＦＲアンタゴニストは、ＵＳ５６１６５８２、ＵＳ５４５７１０５、ＵＳ５４７５００１、ＵＳ５６５４３０７、ＵＳ５６７９６８３、ＵＳ６０８４０９５、ＵＳ６２６５４１０、ＵＳ６４５５５３４、ＵＳ６５２１６２０、ＵＳ６５９６７２６、ＵＳ６７１３４８４、ＵＳ５７７０５９９、ＵＳ６１４０３３２、ＵＳ５８６６５７２、ＵＳ６３９９６０２、ＵＳ６３４４４５９、ＵＳ６６０２８６３、ＵＳ６３９１８７４、ＷＯ９８１４４５１、ＷＯ９８５００３８、ＷＯ９９０９０１６、ＷＯ９９２４０３７、ＷＯ９９３５１４６、ＷＯ０１３２６５１、ＵＳ６３４４４５５、ＵＳ５７６００４１、ＵＳ６００２００８、ＵＳ５７４７４９８に記載されている化合物のような小分子を含む。特定の小分子ＥＧＦＲアンタゴニストは、ＯＳＩ−７７４(ＣＰ−３５８７７４、エルロチニブ，OSI Pharmaceuticals)；ＰＤ１８３８０５(ＣＩ１０３３、２-プロペンアミド、Ｎ-[４-[(３-クロロ-４-フルオロフェニル)アミノ]-７-[３-(４-モルホリニル)プロポキシ]-６-キナゾリニル]-、ジハイドロクロリド、ファイザーＩｎｃ.)；Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）(ＺＤ１８３９、ゲフィチニブ、AstraZeneca）；ＺＭ１０５１８０((６-アミノ-４-(３-メチルフェニル-アミノ)キナゾリン、Zeneca)；ＢＩＢＸ−１３８２(Ｎ８-(３-クロロ-４-フルオロ-フェニル)-Ｎ２-(１-メチル-ピペリジン-４-イル)-ピリミド[５,４-ｄ]ピリミジン-２,８-ジアミン、Boehringer Ingelheim)；ＰＫＩ−１６６((Ｒ)-４-[４-[(１-フェニルエチル)アミノ]-１Ｈ-ピロロ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-イル]フェノール)；(Ｒ)-６-(４-ヒドロキシフェニル)-４-[(１-フェニルエチル)アミノ]-７Ｈ-ピロロ[２,３-ｄ]ピリミジン)；ＣＬ−３８７７８５(Ｎ[４-[(３-ブロモフェニル)アミノ]-６-キナゾリニル]-２-ブチンアミド)；ＥＫＢ−５６９(Ｎ[４-[(３-クロロ-４-フルオロフェニル)アミノ]-３-シアノ-７-エトキシ-６-キナゾリニル]-４-(ジメチルアミノ)-２-ブテンアミド)；ｌａｐａｔｉｎｉｂ(Ｔｙｋｅｒｂ、GlaxoSmithKline)；ＺＤ６４７４（Ｚａｃｔｉｍａ、AstraZeneca）；ＣＵＤＣ−１０１(Curis)；ｃａｎｅｒｔｉｎｉｂ（ＣＩ−１０３３）；ＡＥＥ７８８(６-[４-[(4-エチル-1-ピペラジニル)メチル]フェニル]-Ｎ-[(１Ｒ)-１-フェニルエチル]-７Ｈ-ピロロ[２，３-ｄ]ピリミジン-４-アミン, 国際特許公報第２００３０１３５４１号、Novartis）及びＰＫＩ１６６（４-[４-[[(１Ｒ)-１-フェニルエチル]アミノ]-７Ｈ-ピロロ[２，３-ｄ]ピリミジン-６-イル]-フェノール、国際特許公報第９７０２２６６号、 Novartis)を含む。
「ＥＧＦＲ活性化」は、ＥＧＦＲの活性化又はリン酸化を意味する。一般に、ＥＧＦＲ活性化は、例えばＥＧＦＲ又は基質ポリペプチドのチロシン残基をリン酸化するＥＧＦＲ受容体の細胞内キナーゼドメインによって生じるシグナル伝達を生じる。ＥＧＦＲ活性化は、ＥＧＦＲを含むＥＧＦＲダイマーに結合するＥＧＦＲリガンドによって媒介され得る。ＥＧＦＲダイマーへのＥＧＦＲリガンド結合は、ダイマーにおける一つ以上のＥＧＦＲのキナーゼドメインを活性化し、このことにより一つ以上のＥＧＦＲにおけるチロシン残基のリン酸化及び／又は付加的な基質ポリペプチドにおけるチロシン残基のリン酸化を生じさせ得る。
【００１７】
「ＥＧＦＲアンタゴニスト耐性」癌又は「ＥＧＦＲアンタゴニストでの治療に耐性である」癌は、その癌患者がＥＧＦＲアンタゴニスト治療を受けても進行し（すなわち、患者は「ＥＧＦＲ抵抗性」である）、あるいはＥＧＦＲアンタゴニストに基づく治療投薬計画を完了した後１２ヵ月以内（例えば、１、２、３又は６ヵ月以内で）で進行したことを意味する。例えば、Ｔ７９０Ｍ変異ＥＧＦＲを含む癌は、エルロチニブ及びゲフィチニブ治療に耐性である。「ＥＧＦＲアンタゴニスト耐性」腫瘍細胞は、ＥＧＦＲアンタゴニストでの治療に反応しない腫瘍細胞を意味する。例えば、腫瘍細胞は、ＥＧＦＲアンタゴニストでの治療後に生存し、アポトーシスを起こさない。    
「エルロチニブ耐性」癌又は「エルロチニブでの治療に耐性である」癌は、その癌患者がエルロチニブに基づく治療を受けても進行し（すなわち、患者は「エルロチニブ抵抗性」である）、あるいはエルロチニブに基づく治療投薬計画を完了した後１２ヵ月以内（例えば、１、２、３又は６ヵ月以内で）で進行したことを意味する。「エルロチニブ耐性」腫瘍細胞は、エルロチニブでの治療に反応しない腫瘍細胞を意味する。例えば、腫瘍細胞は、エルロチニブでの治療後に生存し、アポトーシスを起こさない。    
ここに用いられる用語「リガンド非依存性」は、例えば受容体シグナル活性に対して用いられると、リガンドの存在に依存しないシグナル活性を意味する。例えば、ＥＧＦＲシグナリングは、ＨＥＲ２などのＨＥＲファミリーの他のメンバーとの二量体化から生じ得る。リガンド非依存的なキナーゼ活性を有する受容体は、キナーゼ活性の付加的な活性化を起こすために、その受容体へのリガンドの結合を必ずしも妨げるわけでない。    
ここに用いられる用語「恒常的」は、例えば受容体キナーゼ活性に対して用いられると、リガンド又は他の活性化分子の存在に依存しない受容体の連続的なシグナル活性を意味する。例えば、多形性神経膠芽腫において共通に見いだされるＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）は、その細胞外ドメインの多くを欠失している。リガンドはＥＧＦＲｖＩＩＩを結合することができないにもかかわらず、それは連続的に活性で、異常な増殖及び生存と関連している。受容体の性質に従い、活性の全ては恒常的であってもよく、受容体の活性は他の分子（例えばリガンド）の結合によって更に活性化されてもよい。受容体の活性化を導く細胞のイベントは、当業者の間で周知である。例えば、活性化は例えば二量体化、三量体形成など高次の受容体複合体へのオリゴマー形成を含んでもよい。複合体は、一種類のタンパク質を含んでもよい（すなわちホモ複合体）。あるいは、複合体は、少なくとも２つの異なるタンパク質種を含んでもよい（すなわちヘテロ複合体）。複合体形成は、例えば、細胞表面に正常又は変異型の受容体の過剰発現によって生じ得る。複合体形成は、特定の変異又は受容体の変異によってもまた生じ得る。
【００１８】
「遺伝子増幅」なる語句は、遺伝子又は遺伝子断片の複数のコピーが特定の細胞又は細胞系統において形成されるプロセスを意味する。複製された領域(増幅されたＤＮＡのストレッチ)は、しばしば「アンプリコン」と称される。通常は、生成されるメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)の量、即ち遺伝子発現レベルも、発現された特定遺伝子の作成されたコピー数に比例して増加する。
「ＥＧＦＲ発現、増幅又は活性化を示す」癌又は生体試料は、診断検査において、ＥＧＦＲを発現（過剰発現を含む）する、増幅されたＥＧＦＲ遺伝子を有する、及び／又はＥＧＦＲの活性化又はリン酸化を示すものである。
「ＥＧＦＲ発現、増幅又は活性化を示さない」癌又は生体試料は、診断検査において、ＥＧＦＲを発現（過剰発現を含む）しない、増幅されたＥＧＦＲ遺伝子を有さない、及び／又はＥＧＦＲの活性化又はリン酸化を示さないものである。
「ＥＧＦＲ活性化を示す」癌又は生体試料は、診断検査において、ＥＧＦＲの活性化又はリン酸化を示すものである。このような活性化は直接的に（例えば、ＥＧＦＲリン酸化をＥＬＩＳＡで測定することによって）又は間接的に決定することができる。
「ＥＧＦＲ活性化を示さない」癌又は生体試料は、診断検査において、ＥＧＦＲの活性化又はリン酸化を示さないものである。このような活性化は直接的に（例えば、ＥＧＦＲリン酸化をＥＬＩＳＡで測定することによって）又は間接的に決定することができる。
「ＥＧＦＲ増幅を示す」癌又は生体試料は、診断検査において、増幅されたＥＧＦＲ遺伝子を有するものである。
「ＥＧＦＲ過剰発現又は増幅」を伴う癌細胞は、同じ組織型の非癌細胞から比較して、ＥＧＦＲタンパク質又は遺伝子の非常に高いレベルを有するものである。このような過剰発現は、遺伝子増幅、又は増加した転写又は翻訳によって生じ得る。ＥＧＦＲ過剰発現又は増幅は、細胞の表面に存在するＥＧＦＲタンパク質の増加したレベルを評価することによって（例えば免疫組織化学アッセイ；  ＩＨＣにより）、診断又は予後のアッセイにおいて決定され得る。あるいは又はさらに、細胞におけるＥＧＦＲ−コード化核酸のレベルは、例えば蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に発行された国際特許公報第９８／４５４７９号を参照）、サザンブロッティング又はポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）技術（例えば定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ））により測定してもよい。上記のアッセイを除いて、様々なインビボ・アッセイは、熟練した実務者にとって利用可能である。例えば、患者の身体内の細胞に選択的に例えば放射性同位元素などで検出可能に標識化された抗体を暴露してもよく、患者の細胞への抗体の結合は、例えば放射能の外部スキャニング又は予め抗体に暴露された患者からの生検を解析することによって評価することができる。
「ＥＧＦＲを過剰発現又は増幅しない」癌細胞は、同じ組織型の非癌細胞と比較して、正常よりも高いＥＧＦＲタンパク質又は遺伝子のレベルを有しないものである。
ここに用いられる用語「変異」は、野生型タンパク質又は核酸と比較して、特定のタンパク質又は核酸（遺伝子、ＲＮＡ）のアミノ酸又は核酸の配列の相違を意味する。
【００１９】
本明細書中で用いる「突然変異」なる用語は、野生型タンパク質又は核酸と比べて、それぞれ特定のタンパク質又は核酸(遺伝子、ＲＮＡ)のアミノ酸配列又は核酸配列の差異を意味する。変異したタンパク質又は核酸は、遺伝子の１の対立遺伝子(ヘテロ接合体)又は両方の対立遺伝子(ホモ接合体)から発現されうるか、遺伝子の１の対立遺伝子(ヘテロ接合体)又は両方の対立遺伝子(ホモ接合体)にみられ、体細胞又は生殖細胞系でありうる。本発明において、通常突然変異は体細胞である。突然変異には、配列再編成、例えば挿入、欠失及び点突然変異(単一のヌクレオチド／アミノ酸多型を含む)が含まれる。
「阻害する」ことは、参照物質と比較して、活性、機能及び／又は量を減らす又は低くすることである。
タンパク質「発現」は、遺伝子にコード化される情報のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転換、次いでタンパク質への転換を意味する。
ここに、対象のタンパク質を「発現する」試料又は細胞は、タンパク質をコード化しているｍＲＮＡ又はタンパク質（その断片を含む）が試料又は細胞に存在することが決定されるものである。「免疫複合体」（「抗体−薬剤コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」と交換可能に称される）は、一つ以上の細胞障害性剤（例えば化学療法剤、薬剤、増殖阻害剤、毒素（例えばタンパク質毒素、バクテリア、菌類、植物又は動物の起源の酵素的に活性な毒素又はその断片）、又は放射性同位元素（すなわちラジオ・コンジュゲート））にコンジュゲートされた抗体を意味する。
【００２０】
本明細書中で用いる「Ｆｃ領域」なる用語は、一般的にイムノグロブリン重鎖のＣ末端ポリペプチド配列を含有してなるダイマー複合体を指すものであり、Ｃ末端ポリペプチド配列は無傷の抗体のパパイン消化により生成されるものである。Ｆｃ領域は天然のＦｃ配列又は変異体Ｆｃ配列を含有しうる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ配列の境界はまちまちであるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ配列は、通常、およそCys226位又はおよそPro230位のアミノ酸残基からFc配列のカルボキシル末端まで延びていると定義される。免疫グロブリンのＦｃ配列は、通常、２つの定常ドメイン、１つのＣＨ２ドメイン及び１つのＣＨ３ドメインを含み、場合によってはＣＨ４ドメインを含む。Ｆｃ領域のＣ末端のリジン（ＥＵ番号付けシステムによる残基４４７）は、例えば抗体の精製中又は抗体をコード化している核酸の組換えエンジニアリングによって取り除かれてもよい。したがって、この発明のＦｃ領域を有する抗体を含む組成物は、Ｋ４４７を有する抗体、全てＫ４４７が取り除かれた抗体、又はＫ４４７残基を有する抗体及び有さない抗体の混合物を含み得る。
ここでの「Ｆｃポリペプチド」はＦｃ領域を形成するポリペプチド鎖の一つを意味する。Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の好適なイムノグロブリンから得ることができる。いくつかの実施態様では、Ｆｃポリペプチドは野生型のヒンジ配列の一部又はすべてを（一般的にはそのＮ末端に）含有してなる。いくつかの実施態様では、Ｆｃポリペプチドは機能的ヒンジ配列又は野生型ヒンジ配列を含有していない
ここで用いる「ヒンジ領域」、「ヒンジ配列」及びその変形例は、例えば、Janeway等, Immuno Biology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (第４版, 1999); Bloom等, Protein Science (1997), 6:407-415; Humphreys等, J. Immunol. Methods (1997), 209:193-202に示すように、当該分野に知られている意味を含む。
本願明細書及び請求項の全体にわたる、免疫グロブリン重鎖の残基の番号付けは、ここに明示的に援用されるKabat等、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)におけるＥＵインデックスである。「カバットに記載のＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基番号付けを意味する。
【００２１】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、特にそれらが所望の生物学的活性度を示す限り、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、一価抗体、多価抗体及び抗体フラグメントを含む。
「抗体断片」は、インタクト抗体の部分のみを含有するものであり、該部分はインタクト抗体中に存在する場合、その部分に通常伴う機能の少なくとも一、好ましくはほとんど又はすべてを保持する。一実施態様では、抗体断片は、完全抗体の抗原結合部位を含有するため、抗原結合能を有する。他の実施態様では、抗体断片、例えばＦｃ領域を含有するものは、完全抗体に存在するＦｃ領域が通常関連する少なくとも一の生物学的機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合を保持する。一実施態様では、抗体断片は、完全抗体と実質的に同じインビボ半減期を有する一価抗体である。例えばそのような抗体断片は、該断片にインビボ安定性を供与しうるＦｃ配列に結合した抗原結合アーム上に含みうる。一実施態様では、本発明の抗体は、国際公開公報２００５／０６３８１６に記載の一アーム形抗体、例えば、「ノブ(knob)」及び「孔(hole)」を構成するFc突然変異を含む抗体である。例えば、孔(hole)突然変異は、Ｆｃポリペプチド内のＴ３６６Ａ、Ｌ３６８Ａ及び／又はＹ４０７Ｖの一又は複数であり、腔(cavity)突然変異はＴ３６６Ｗでありうる。
「遮断(ブロッキング)」抗体又は抗体「アンタゴニスト」は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害するか又は低減するものである。好適な遮断抗体又はアンタゴニスト抗体は、完全に抗原の生物学的活性を阻害する。
別途示されない限り、「多価抗体」という表現は、この明細書の全体にわたって、３つ以上の抗原結合部位を含む抗体を意味するために用いられる。多価抗体は、好ましくは３つ以上の抗原結合部位を有するように設計され、一般に天然配列のＩｇＭ又はＩｇＡ抗体ではない。
【００２２】
「Ｆｖ」断片は、完全な抗原認識および結合部位を含む抗体断片である。この領域は、堅く結合した重鎖可変ドメイン１つと軽鎖可変ドメイン１つの二量体から成り、その結合は自然界では例えばｓｃＦｖにおけるように共有結合である。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面の抗原結合部位を確定するのはこの構成である。この６つのＣＤＲまたはそのサブセットは、共同して抗体に抗原結合特異性を賦与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的なＣＤＲを３つしか含んでいないＦｖの半分）でさえ、通常は結合部位全体より親和性は低いものの、抗原を認識して結合する能力を有する。
本明細書で使われる場合、「抗体可変ドメイン」は相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）ならびにフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む、抗体分子の軽鎖および重鎖の部分を指す。ＶＨは重鎖の可変ドメインを指す。ＶＬは軽鎖の可変ドメインを指す。本発明で使用される方法によると、ＣＤＲとＦＲに割り当てられるアミノ酸位置はカバットに従って規定される(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987及び1991))。抗体または抗原結合断片のアミノ酸のナンバリングも、カバットのそれに準じる。
本明細書で使われるように、用語「相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）は、抗原結合のために存在している必要がある抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは、一般的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と同定される３つのＣＤＲ領域を持つ。各相補性決定領域はカバットが記載しているような「相補性決定領域」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基約２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインの３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）；Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD.(1991))、および／または「超可変ループ」からの残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基約２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインの２６〜３２（Ｈ１），５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）；Chothia及びLesk, J.Mol.Biol.196:901-917頁(1987)）を含んでもよい。いくつかの場合には、相補性決定領域はカバットの記載により定義されているＣＤＲ領域および超可変ループの両方からのアミノ酸を含むことができる。例えば、抗体４Ｄ５の重鎖のＣＤＲＨ１は、アミノ酸２６〜３５を含む。
「フレームワーク領域」（以下ＦＲと称す）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、一般的にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と同定される４つのＦＲを持つ。ＣＤＲがカバットの定義に従うならば、軽鎖ＦＲ残基は残基約１〜２３（ＬＣＦＲ１）、３５〜４９（ＬＣＦＲ２）、５７〜８８（ＬＣＦＲ３）および９８〜１０７（ＬＣＦＲ４）に位置し、重鎖ＦＲ残基は重鎖残基の残基約１〜３０（ＨＣＦＲ１）、３６〜４９（ＨＣＦＲ２）、６６〜９４（ＨＣＦＲ３）および１０３〜１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。ＣＤＲが超可変ループからのアミノ酸残基を含むならば、軽鎖ＦＲ残基は軽鎖の残基約１〜２５（ＬＣＦＲ１）、３３〜４９（ＬＣＦＲ２）、５３〜９０（ＬＣＦＲ３）および９７〜１０７（ＬＣＦＲ４）に位置し、重鎖ＦＲ残基は重鎖残基の残基約１〜２５（ＨＣＦＲ１）、３３〜５２（ＨＣＦＲ２）、５６〜９５（ＨＣＦＲ３）および１０２〜１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。いくつかの場合には、ＣＤＲがカバットの定義によるＣＤＲと超可変ループのそれの両方からのアミノ酸を含む場合、ＦＲ残基はそれに応じて調節されるであろう。例えば、ＣＤＲＨ１がアミノ酸Ｈ２６−Ｈ３５を含むとき、重鎖ＦＲ１残基は位置１〜２５にあり、ＦＲ２残基は位置３６〜４９にある。
「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変および定常ドメインと重鎖の可変ドメインおよび第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は一対のＦａｂ断片を含み、通常これらはその間にあるヒンジシステインによってそのカルボキシ末端の近くで共有結合により連結される。抗体断片の他の化学的結合も当技術分野で公知である。
【００２３】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、ＦｖポリペプチドはＶＨおよびＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このリンカーはｓｃＦｖが抗原結合にとって望ましい構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖのレビューに関しては、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol.113, RosenburgおよびMoore編, Springer-Verlag, New York, 269-315頁(1994)を参照。
用語「ダイアボディ」は、抗原結合部位を２つ備える小さな抗体断片を指し、この抗体断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨおよびＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖の上の２つのドメインの間で対合させるにはあまりに短いリンカーを用いて、このドメインを他の鎖の相補性ドメインと強制的に対合させ、２つの抗原結合部位をつくる。ダイアボディについては、例えば欧州特許第４０４０９７号；ＷＯ９３／１１１６１号；およびHollinger他, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:6444-6448頁(1993)でさらに詳しく記載されている。
表現「線状抗体」はZapata他, Protein Eng., 8(10):1057-1062頁(1995)に記載されている抗体を指す。つまり、これらの抗体は相補性の軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する、一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線状抗体は二重特異性または単一特異性であり得る。
【００２４】
「モノクローナル」との修飾詞は、ほぼ均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生成しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作ることができ、それらの技術には例えばハイブリドーマ法（例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)；Hongo等, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow等, Antibodies: A loboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第２版 1988)；Hammerling等: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)）、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第4,816,567号参照）、ファージディスプレイ法（例えば、Clarkson等, Nature, 352:624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)；Lee等, J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee等, J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)参照）、及びヒト免疫グロブリン座位又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全部を有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生する技術（例えば、WO1998/24893; WO1996/34096；WO1996/33735；WO1991/10741；Jackobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggemann等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第 5,633,425号；及び同第5,661,016号；Marks等, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)；Longerg等, Nature, 368:856-859 (1994)；Morrison, Nature, 368:812-813 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996)；及びLongerg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)）が含まれる。
ここに記載のモノクローナル抗体は、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種から由来するか、特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か相同である一方、鎖の残りが、他の種から由来するか、他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か相同である「キメラ」抗体、並びにそれらが所望の生物活性を示す限りはそのような抗体の断片を含む(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。キメラ抗体は、抗体の抗原結合部位が、例えば興味の抗原により免疫化したマカクザルによって産生される抗体由来であるPRIMATIZED（登録商標）抗体を含む。
【００２５】
非ヒト(例えば齧歯類)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト抗体から得られた最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の抗体特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＦＲ領域は結合親和性を改良する1又は複数のアミノ酸置換を含んでもよい。ＦＲのこれらのアミノ酸置換の数は、典型的にはＨ鎖で６以下であり、Ｌ鎖で３以下である。ヒト化抗体は、場合により免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。
「ヒト抗体」は、ヒトにより生成される抗体のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を有するもの、及び／又はここに開示するようなヒト抗体をつくる既知の技術のいずれかを使用して、つくられたものである。ヒト抗体のこのような定義は、非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を特に除く。ヒト抗体は、様々な従来技術を使用して生成することができる。一実施態様では、ファージライブラリがヒト抗体を発現する場合、そのようなファージライブラリからヒト抗体を選択する（Vaughan他、Nature Biotechnology, 14:309-314, 1996; Sheets他 PNAS, アメリカ合衆国、95:6157-6162,1998; HoogenboomおよびWinter, J. Mol. Biol., 227:381, 1991; Marks他, J. Mol. Biol., 222:581, 1991）。ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン座を、トランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が特異的にまたは完全に非活性化されているマウスに導入することにより生成することができる。実験によりヒト抗体の産生が確認されており、それは遺伝子の再配列、アセンブリ、および抗体のレパートリーを含め、すべての面でヒトに見られる抗体産生に非常に類似している。この方法は、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、およびMarks他, Bio/Technology, 10: 779-783, 1992; Lonberg他, Nature, 368: 856-859, 1994; Morrison, Nature, 368:812-13, 1994; Fishwild他, Nature Biotechnology, 14: 845-51, 1996; Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826, 1996; Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93, 1995。或いは、ヒト抗体は、標的となる抗原を志向する抗体を産生するＢリンパ球（このようなＢリンパ球は個体から回収できるか、またはインビボで免疫することができる）の不死化により調製することもできる。 例えば、Cole他, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985; Boerner他, J. Immunol., 147 (1):86-95, 1991; および米国特許第５，７５０，３７３号を参照のこと。
「裸の抗体」は、異種性の分子、例えば細胞障害性成分又は放射標識にコンジュゲートされない抗体である。
【００２６】
「親和性成熟」抗体は、その１つ以上のＣＤＲに１つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks他は、Bio/Technology, 10:779-783(1992)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier他、Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；およびHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
指定された抗体の「生物学的特徴」を有している抗体は、同じ抗原に結合する他の抗体から区別されるその抗体の生物学的特徴の一つ以上を有するものである。
対象の抗体により結合される抗原上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されているような日常的な交差ブロッキングアッセイを行うことができる。
本発明のアミノ酸配列を含んでいる抗体、又は、ポリペプチドの半減期を増加させるために、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されているように、抗体（特に抗体フラグメント）にサルベージ受容体結合エピトープを付けることができる。
例えば、設計された核酸分子によって発現される融合タンパク質がサルベージ受容体結合エピトープ及び本発明のポリペプチド配列を含むように、サルベージ受容体結合エピトープをコード化している核酸分子は、本発明のポリペプチド配列をコード化している核酸にインフレームで結合させることができる。ここで使用しているように、用語「サルベージ受容体結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又は、ＩｇＧ４）のインビボ血清半減期を増加させる役割を果たすＩｇＧ分子のＦｃ領域のエピトープを意味する（例えばGhetie等、Ann. Rev. Immunol. 18:739-766 (2000)、表１）。そのＦｃ領域における置換及び増加した血清半減期を有する抗体は、国際特許公報第００／４２０７２号、国際特許公報第０２／０６０９１９号； Shields等、J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001); Hinton, J. Biol. Chem. 279:6213-6216 (2004）にも記載されている。もう一つの実施態様では、血清半減期は、例えば他のポリペプチド配列を付けることによっても増加させることができる。例えば、本発明の方法において有用な抗体又は他のポリペプチドは、血清アルブミンが抗体又はポリペプチドに結合するように（例えば、そのようなポリペプチド配列は国際特許公報第０１／４５７４６号に開示される）、ＦｃＲｎ受容体又は血清アルブミン結合ペプチドと結合する血清アルブミン又は血清アルブミンの一部に付けることができる。
【００２７】
「単離された」ポリペプチド又は「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及びタンパク質様又は他の非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリー(Lowry)法によって決定した場合９５重量％以上の、最も好ましくは９９重量％の抗体まで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
「断片」により、対照核酸分子又はポリペプチド完全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはそれより多く含むポリペプチド又は核酸分子の部分を意味する。断片は１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００、２００、３００、４００、５００、６００又はそれより多いヌクレオチド又は１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、１９０、２００アミノ酸又はそれより多くを含む。
「処理」は、治療上の処理及び予防又は防止処置の両方を意味する。処理を必要とするものとして、すでに良性、前癌性又は非転移性の腫瘍を有している、又は癌の発生又は再発が妨げられるべきものを含む。
「治療的有効量」という用語は、哺乳類の疾病や疾患の治療のために有効な薬剤の量に相当する。癌の場合は、治療的有効量の薬剤により、癌細胞の数を減少させ；腫瘍の大きさを小さくし；癌細胞の周辺器官への浸潤を阻害(すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める)し；腫瘍の転移を阻害(すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める)し；腫瘍の成長をある程度阻害し；及び／又は疾患に関連する一又は複数の症状をある程度和らげることが可能である。ある程度、薬剤は、成長を妨げ及び／又は現存の癌細胞を殺すことが可能で、細胞分裂停止性及び／又は細胞障害性である。癌治療に対しては、インビボにおける効力は、例えば生存期間、病状の進行時間(ＴＴＰ)、応答速度(ＲＲ)、応答期間、及び／又は生活の質の測定により測定される。
【００２８】
「癌」及び「癌性」なる用語は、、一般的に調節されない細胞増殖に特徴がある哺乳動物の生理学的状態を指すか又は記述する。癌の例には、限定するものではないが、カルチノーマ、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病又はリンパ性悪性腫瘍が含まれる。このような癌のより具体的な例には、腎臓又は腎性癌、乳癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、肺癌、例として小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、扁平細胞癌(例えば上皮の扁平細胞癌)、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、肝癌、膀胱癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌を含む胃(gastric、stomach)癌、消化管間質腫瘍(ＧＩＳＴ)、膵癌、頭頸部癌、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、莢膜細胞腫、男化腫瘍、肝細胞癌、非ホジキンリンパ腫を含む血液悪性腫瘍(ＮＨＬ)、多発性骨髄腫及び急性の血液系悪性腫瘍、子宮内膜ないし子宮カルチノーマ、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛膜癌、唾液腺カルチノーマ、外陰部癌、甲状腺癌、食道カルチノーマ、肝癌、肛門部のカルチノーマ、陰茎カルチノーマ、上咽頭癌、喉頭のカルチノーマ、カポシ肉腫、メラノーマ、皮膚カルチノーマ、シュワン腫、乏突起細胞腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨原性肉種、平滑筋肉腫、尿路カルチノーマ、甲状腺カルチノーマ、ウィルムス腫瘍、並びにＢ細胞リンパ腫(例えば低グレード／濾胞性非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)；小リンパ球性(ＳＬ)ＮＨＬ；中間グレード／濾胞性ＮＨＬ；中間グレード広汎性ＮＨＬ；高グレード免疫芽細胞ＮＨＬ；高グレードリンパ芽球ＮＨＬ；高グレード小型非分割細胞ＮＨＬ；巨大腫瘤病変(bulky disease)ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連のリンパ腫；及び、 ワルデンシュトレームマクログロブリン血症)；慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)；急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)；線毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び、移植後のリンパ増殖性疾患(ＰＴＬＤ)、並びに母斑症、浮腫(脳腫瘍と関係しているものなど)及びメイグス症候群と関係している異常な血管性増殖が含まれる。本明細書中で用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性のいずれであっても、すべての腫瘍性細胞成長及び増殖、及びすべての前癌性及び癌性の細胞及び組織を指す。 
「癌」という用語には、造血性癌又は血液関連癌、例えばリンパ腫、白血病、骨髄腫又はリンパ性悪性腫瘍に加え、脾臓の癌及びリンパ節の癌が含まれる。そのようなＢ細胞関連癌の具体的な例として、例えば、高悪性度、中悪性度及び低悪性度のリンパ腫（例えば粘膜内リンパ組織Ｂ細胞リンパ腫及び非ホジキンリンパ腫等のＢ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球リンパ腫、周辺帯リンパ腫、拡散性大細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、及びホジキンリンパ腫及びＴ細胞リンパ腫を含む）、白血病（二次性白血病、慢性リンパ性白血病、例えばＢ細胞白血病（ＣＤ５＋Ｂリンパ球）、骨髄性白血病、例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ性白血病、例えば急性リンパ芽球性白血病及び骨髄異形成症候群を含む）、プラズマ細胞悪性腫瘍等の多発性骨髄腫、並びにその他血液学的及び／又はＢ細胞又はＴ細胞関連癌が挙げられる。更には追加的な造血性細胞の癌が含まれ、このような細胞には、好塩基球、好酸球、好中球及び単球等の多形核白血球、樹状細胞、血小板、赤血球及びナチュラルキラー細胞が含まれる。Ｂ細胞癌の起源を説明する。周辺帯Ｂ細胞リンパ腫は周辺帯の記憶Ｂ細胞を起源とし、濾胞性リンパ腫及び拡散性大B細胞リンパ腫は胚中心の軽帯（light zone）の中心細胞を起源とし、多発性骨髄腫はプラズマ細胞を起源とし、慢性リンパ性白血病及び小リンパ球白血病はB１細胞（ＣＤ５＋）を起源とし、マントル細胞リンパ腫はマントル帯のナイーブなＢ細胞を起源とし、バーキットリンパ腫は胚中心の暗帯（dark zone）の中心芽細胞を起源とする。本明細書で「造血性細胞組織」と呼ぶ造血性細胞を含む組織には、胸腺及び骨髄及び末梢性リンパ組織、例えば脾臓、リンパ節、粘膜に関連するリンパ組織、例えば消化管関連のリンパ組織、扁桃腺、バイエル板及び虫垂及びその他粘膜に関連するリンパ組織、例えば気管支内側が含まれる。
【００２９】
用語「前癌性の」は、典型的に癌に先行又は進行する健康状態又は成長を意味する。
「前癌の」成長は、異常な細胞周期調節、増殖又は分化によって特徴づけられる細胞を有し、それは細胞周期調節、細胞増殖、又は、分化のマーカーによって決定されることができる。
「ディスプレシア」は、組織、器官又は細胞のあらゆる異常な増殖又は発達を意味する。
好ましくは、ディスプレシアは悪性度が高い、又は前癌性である。
「転移」は、その原発部位から体の他の場所への癌の拡散を意味する。癌細胞は、原発腫瘍から離れ、リンパ管及び血管に浸潤し、血流中を循環し、体の正常組織の他の遠い病巣において増殖（転移）する。転移は、局所的又は遠位であり得る。転移は逐次的なプロセスであり、腫瘍細胞の原発腫瘍からの離脱、血流を介した移動、遠位での停止が条件となる。新規な部位で、細胞は血液供給を確立し、増殖して致命的な腫瘤を形成し得る。
腫瘍細胞内の刺激性及び抑制の分子経路はこの挙動を制御し、遠位における腫瘍細胞と宿主細胞の相互作用はもまた重要である。
「非転移性」は、良性又は原発部位で残り、リンパ管又は血管システム又は原発部位以外の組織に浸透しない癌を意味する。一般に、非転移性の癌は、ステージ０、Ｉ又はＩＩのあらゆる癌、及び場合によりステージＩＩＩの癌である。
「原発腫瘍」又は「原発癌」は、最初の癌を意味し、患者の身体における他の組織、器官又は場所にある転移性病巣を意味していない。
「良性腫瘍」又は「良性癌」は、起源の部位に残る腫瘍を意味し、浸潤、侵入又は遠位へ転移する能力を有する腫瘍を意味していない。
「腫瘍組織量」は、身体における癌細胞数、腫瘍サイズ又は癌の量を意味する。
腫瘍組織量は、腫瘍量とも称される。
「腫瘍数」は、腫瘍の数を意味する。
「対象」又は「患者」は、ヒト又はウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ又はネコのような非ヒト哺乳動物を含むがこれに限られない。好ましくは、対象又は患者は、ヒトである。
【００３０】
用語「抗癌治療」は、癌の処理に有用な治療を意味する。抗癌治療剤の例は、例えば、化学療法剤、増殖阻害性薬剤、細胞障害性薬剤、放射線療法において用いられる薬剤、抗血管新生薬剤、アポトーシス薬剤、抗チュービュリン薬剤及び癌を処理する他の薬剤、抗CD20抗体、血小板由来増殖因子インヒビター（例えばＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標）、Ｉｍａｔｉｎｉｂ  Ｍｅｓｙｌａｔｅ）、ＣＯＸ−２インヒビター（例えばｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）、インターフェロン、サイトカイン、以下の一つ以上から標的ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−β、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ又はＶＥＧＦ受容体、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２に結合するアンタゴニスト（例えば中和抗体）及び他の生理活性性及び有機性化合物等を含むがこれに限られない。その組合せも本発明に含まれる。
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体(例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６の放射性同位体)、化学治療薬、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素を含むように意図されている。
【００３１】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ (meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン)；カンプトテシン (合成アナログトポテカンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む)；クリプトフィシン(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン(合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む)；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロランブシル、クロロナファジン (chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１（例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186(1994)参照）；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；クロドロン酸のようなビスホスホネート；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン (detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン (potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン (zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)���葉酸アナログ、例えばデノプテリン (denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン (calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル (bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン (defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン (elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン(lonidainine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸 (tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン (verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール (mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；シクロフォスファミド；チオテパ；タキソイド類、例えばＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.）、クレモフォー無添加ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ（パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤）（American  Pharmaceutical  Partners, Schaumberg, Illinois）、及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Rhone- Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲンシタビン；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナアナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン(novantrone)；イリノテカン（Camptosar、ＣＰＴ−１１）（イリノテカンの５-ＦＵ及びロイコボビン(leucovovin)との治療計画を含む）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸のようなレチノイド；カペシタビン(capecitabine)；コンブレタスタチン(combretastatin)；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン(oxaliplatin)の治療計画（ＦＯＬＦＯＸ）を含むオキサリプラチン；細胞増殖を減少させるＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ及びＶＥＧＦ−Ａの阻害剤（例えばエルロチニブ（ＴａｒｃｅｖａＴＭ））及び上述したもののいずれかの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００３２】
またこの定義に含まれるものには、癌の増殖を助けるホルモンの作用を調節、低減、遮断又は阻害するように働き、多くの場合全身処置の形態で使用される抗ホルモン剤がある。それらはそれ自体がホルモンであってもよい。それらは例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレータ(ＳＥＲＭ)を含み、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン；副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、エキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））、フォルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、ボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））、及びアナストロゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標）；抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド(nilutamide)、バイカルタミド(bicalutamide)、ロイプロリド(leuprolide)及びゲセレリン(geserelin)；トロクサシタビン(ａ１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に接着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ−α、Ｒａｆ、及びＨ−Ｒａｓ；リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現阻害剤（例えばＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）リボザイム）及びＨＥＲ２発現阻害剤；ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ビノレルビン及びエスペラミシン（米国特許第４６７５１８７号参照）及び上記のもののいずれかの製薬的に許容される塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００３３】
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬剤に比較して腫瘍細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, :375-382, 615th Meeting, Belfast (1986)、及びStella 等, 「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery, Borchardt等(編), 247-267項, Humana Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定はしないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害性剤の例には、前記の化学療法剤が含まれる。
「放射線療法」は、正常に機能する能力を制限する、又は細胞を破壊するのに充分な障害を細胞に誘導するガンマ線又はβ線の使用を意味する。当該分野において知られる処理の用量及び期間を決定するための多くの方法が存在することはいうまでもない。日につき一回の投与及び１０から２００単位（グレイ）の典型的な用量範囲で、典型的な処理が行われている。
【００３４】
方法及び組成物 
本発明は、治療目的のための本発明の方法を用いて利用され得るＮＬＲＲ−１の特定の新規な特性及び活性を同定する。    
ここに開示されるように、ＮＬＲＲ−１はＥＧＦＲシグナリング複合体に関連し、ＴＧＦαに応答してＭＡＰキナーゼ活性化を促進する。そして、ＮＬＲＲ−１がＥＧＦＲシグナリングにおいて重要な役割を果たすことを示している。さらにまた、ＮＬＲＲ−１との関連は、ＥＧＦＲの内部移行を促進する。内部移行されたＥＧＦＲ複合体からのシグナリングは、ＭＡＰキナーゼ・リン酸化を増幅し、細胞生存に導く経路を刺激し得（Haugh等、1999a; Haugh等、1999b; Sato等、2001; Schoeberl等、2002; Wang等、2002）、ＮＬＲＲ−１の減少により腫瘍細胞で増加するアポトーシスの観察と一致した。さらに、ＮＬＲＲ−１は、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ２ヘテロダイマーと関連し得る。
したがって、本発明の一態様は、ＮＬＲＲ−１アンタゴニストを細胞と接触させることを含む、哺乳動物細胞においてＥＧＦＲシグナリングを阻害する方法を提供する。ＥＧＦＲシグナリングのレベルは、ＮＬＲＲ−１アンタゴニストとの接触に応じて減少する。
本発明の別の態様は、ＮＬＲＲ−１とのＥＧＦＲの相互作用を阻害する剤と細胞と接触させることを含む、哺乳動物細胞におけるＥＧＦＲシグナリングを阻害する方法を提供する。薬剤によるＥＧＦＲとＮＬＲＲ−１との相互作用の阻害は、ＥＧＦＲシグナリングの減少を生じる。    
ＮＬＲＲ−１（ＮＬＲＲ−３のホモログ）の広範囲にわたる発現は、種々の腫瘍において観察され、前立腺腫瘍のより詳細な転写産物解析において、発現は高いグリーソン・スコア及び予後不良の独立して特徴づけられたマーカーであるＭＵＣ１と相関していた（Andren等、2006a; Lapointe等、2004）。実施例に記載されるように、ＮＬＲＲ−１は前立腺腫瘍だけでなく上皮性腫瘍及びいくつかの悪性度の高い血液癌（例えば多発性骨髄腫及びマントル細胞リンパ腫）（図２Ａ，Ｂ；図９Ａ）、膵臓、乳房、肺及び転移性結腸にわたって発現される。  
【００３５】
ＴＧＦαは種々の腫瘍型にわたって過剰発現することが頻繁に見いだされ、より悪性の疾患及び予後不良と相関しており、オートクライン又はパラクラインのいずれかで機能し得、ＥＧＦＲシグナリングの強力な活性化因子（図１３Ａ，Ｂ）（Ebner and Derynck, 1991; El-Obeid等、2002; Jhappan等、1990; Jiang等、1998; Maeda等、2002; Martinez-Arca等、2005; O'Dwyer P and Benson, 2002; Scher等、1995; Wang等、1998）。血清又はＴＧＦαに応答したＭＡＰキナーゼ及びＰＩ３キナーゼ経路活性化のＮＬＲＲ−１に特異的なモノクローナル抗体を用いた減衰は、ＮＬＲＲ−１の腫瘍細胞でのＥＧＦＲ経路活性化における重要な役割を示す。  
実施例に示すように、肺腫瘍細胞株におけるＮＬＲＲ−１の減少は成長不全を生じ、内因性のＮＬＲＲ−１発現の全てのレベルでアポトーシスを増加させた。そして、癌細胞がその生存においてＮＬＲＲ−１に大きく依存していることを示した。ＮＬＲＲ−１の発現は腫瘍全体の高いＥＧＦＲから逆相関している。そして、ＥＧＦＲが増幅されていない場合でも、ＮＬＲＲ−１が腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ経路シグナリングを活性化することを示す。さらに、肺腫瘍細胞株におけるＮＬＲＲ−１の減少は、ＥＧＦＲインヒビターエルロチニブでの処理によりアポトーシスを促進する。感受性の有意な増加はエルロチニブ耐性の細胞株ＮＣＩ−Ｈ６４７で明白であり、ＮＬＲＲ−１ノックダウン及びエルロチニブの相乗効果は耐性の細胞株で観察された。このデータは、ＮＬＲＲ−１がＥＧＦＲシグナリングにおいて重要な役割を果たし、ＮＬＲＲ−１がいくつかの腫瘍によって示されるＥＧＦＲキナーゼ・インヒビター（例えばエルロチニブ）への耐性に寄与し得ることを示す。
したがって、本発明の別の態様は、対象にＮＬＲＲ−１アンタゴニストの治療上有効量を投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。いくつかの実施態様において、腫瘍細胞はＥＧＦＲを発現する。他の実施態様において、腫瘍細胞はＥＧＦＲを発現するが、ＥＧＦＲの発現は増幅されない。    
【００３６】
本発明の更に別の態様は、対象にＮＬＲＲ−１アンタゴニストの有効量を投与することを含む、対象における癌を治療する方法を提供する。いくつかの実施態様において、癌の細胞はＥＧＦＲを発現する。他の実施態様において、癌の細胞はＥＧＦＲを発現するが、ＥＧＦＲの発現は増幅されない。
ある種の実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、ＮＬＲＲ−１アンタゴニストに加えて、対象に投与される。いくつかの実施態様において、処理される腫瘍細胞又は癌は、ＥＧＦＲアンタゴニストによる処理に耐性である。もう一つの実施態様では、ＮＬＲＲ−１アンタゴニストと共に投与されるＥＧＦＲアンタゴニストは、エルロチニブである。もう一つの実施態様では、処理される腫瘍細胞又は癌は、エルロチニブでの処理に耐性である。他の実施態様において、ＮＬＲＲ−１アンタゴニスト及びＥＧＦＲアンタゴニストの投与は、いずれかのアンタゴニストの単独投与と比較して、腫瘍細胞又は癌の増殖阻害を増加させる。他の実施態様において、組合せ治療による腫瘍増殖又は癌の阻害の増加は、ＮＬＲＲ−１アンタゴニスト又はＥＧＦＲアンタゴニストの単独治療と比較して相乗的である。
【００３７】
用語「癌」は、前癌の増殖、良性腫瘍及び悪性腫瘍を含むがこれに限らず、増殖性の疾患の一群を包含する。上記方法によって処理される癌は、固形腫瘍又は非固形腫瘍又は軟部組織腫瘍を含むそれらの癌を含む。軟部組織腫瘍の例は、白血病（例えば慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、成熟したＢ細胞急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、前リンパ球性白血病又はヘアリーセル白血病）、ミエローマ（多発性骨髄腫）又はリンパ腫（例えば非ホジキンリンパ腫、悪性皮膚Ｔ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫又はホジキン病）を含む。固形腫瘍は、血液、骨髄又はリンパ系以外のあらゆる体組織癌を含む。固形腫瘍は、上皮細胞を原発巣とするものと非上皮細胞を原発巣とするものに更に分けられてもよい。上皮細胞固形腫瘍の例は、胃腸管、結腸、乳房、前立腺、肺、腎臓、肝臓、膵臓、卵巣、頭頸部、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、肛門、胆嚢、下唇、鼻いん頭、皮膚、子宮、男性生殖器、泌尿器、膀胱及び皮膚の腫瘍を含む。非上皮細胞を原発巣とする固形腫瘍は、肉腫、脳腫瘍及び骨腫瘍を含む。    
更にここに記載されるように、本発明もまた単独及び併用で上記化合物を含む組成物を提供する。組成物は、対象における病的状態（例えば腫瘍）を処理するために有用である。
【００３８】
ＮＬＲＲ−１アンタゴニスト
本発明の方法において有用なＮＬＲＲ−１アンタゴニストは、ＮＬＲＲ−１に特異的に結合するポリペプチド、ＮＬＲＲ−１抗体（抗ＮＲＬＬ−１抗体）、小分子、受容分子及び誘導体（例えばイムノアドヘシン）（ＮＬＲＲ−１に特異的に結合する）及び融合タンパク質を含む。ＮＬＲＲ−１アンタゴニストは、ＮＬＲＲ−１ポリペプチドのアンタゴニスト性変異体、ＲＮＡアプタマー及びＮＬＲＲ−１に対するペプチボディー(peptibody)も含む。これらの各々の例が以下に記載される。
本発明の方法において有用である抗ＮＬＲＲ−１抗体は、ＮＬＲＲ−１に充分なアフィニティ及び特異性で結合するか、ＮＬＲＲ−１活性を減少又は阻害するか、ＥＧＦＲ又はＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４を含むＥＧＦＲ経路のあらゆるメンバーとのＮＬＲＲ−１の関連を阻害し得るあらゆる抗体を含む。選択される抗体は通常ＮＬＲＲ−１に対して十分に強い結合親和性を有し、例えば抗体は１００ｎＭ−１ｐＭ間のＫｄ値でヒトＮＬＲＲ−１と結合し得る。抗体アフィニティは、例えば表面プラスモン共鳴ベースのアッセイ（例えばＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００５／０１２３５９にて説明したようなＢＩＡｃｏｒｅアッセイ）；酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；及び競合アッセイ（例えばＲＩＡ’ｓ）によって決定されてもよい。好ましくは、本発明の抗ＮＬＲＲ−１抗体は、ＮＬＲＲ−１／ＥＧＦＲ活性が関与する疾患又は健康状態を標的とする、又は干渉する治療剤として用いられてもよい。同様に、抗体は、例えばその治療薬としての効果を評価するために、他の生物学的活性アッセイにかけられてもよい。このようなアッセイは、従来技術において周知であり、抗体の標的抗原及び使用目的に依存する。
ある種の実施態様では、抗ＮＬＲＲ−１抗体は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ受託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８７３２の下で寄託されたハイブリドーマ細胞株（ハイブリドーマ３Ｄ１．６．９）によって産生されるモノクローナル抗体である。他の実施態様において、抗体は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ受託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８７３２の下で寄託されたハイブリドーマ細胞株（ハイブリドーマ３Ｄ１．６．９）によって産生されるモノクローナル抗体の断片を含む。他の実施態様において、抗体は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ受託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８７３２の下で寄託されたハイブリドーマ細胞株（ハイブリドーマ３Ｄ１．６．９）によって産生されるモノクローナル抗体のＣＤＲ配列の一つ以上を含む。他の実施態様において、抗体は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ受託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８７３２の下で寄託されたハイブリドーマ細胞株（ハイブリドーマ３Ｄ１．６．９）によって産生されるモノクローナル抗体と競合する。他の実施態様において、抗体は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ受託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８７３２の下で寄託されたハイブリドーマ細胞株（ハイブリドーマ３Ｄ１．６．９）によって産生されるモノクローナル抗体と同じエピトープに結合する。    
【００３９】
ＥＧＦＲ又はＥＧＦＲ経路の他のメンバーに特異的に結合するＮＬＲＲ−１ポリペプチド又はその断片は、例えば、結合し、ＧＦＲタンパク質を隔絶することによりシグナリングを妨げるなど、本発明の方法において用いられてもよい。好ましくは、ＮＬＲＲ−１ポリペプチド又はその断片は、可溶形態である。いくつかの実施態様において、ポリペプチドの可溶形態はＥＧＦＲに結合することによってＥＧＦＲタンパク質の生物学的活性の阻害作用を行い、それによって、その天然のリガンドとの関連を妨げる。
アプタマーは、標的分子（例えばＮＬＲＲ−１ポリペプチド）に特異的に結合する三次構造を形成する核酸分子である。アプタマーの生成及び治療上の使用は、その分野において確立されている。米国特許番号５，４７５，０９６参照。アプタマーについての付加的な情報は、米国特許出願公開番号２００６０１４８７４８において見つかる。
ペプチボディーは、免疫グロブリン分子の断片又は部分をコード化しているアミノ酸配列に連結されるペプチド配列である。ポリペプチドは、特異的結合のためのあらゆる方法（ファージディスプレー技術を含むがそれに限定されない）によって選択されるランダム化された配列からの誘導されてもよい。好ましい実施態様において、選択されたポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ部分をコード化しているアミノ酸配列に連結していてもよい。特異的にＮＬＲＲ−１を結合しアンタゴナイズするペプチボディーは、本発明の方法においても有用である。
【００４０】
ＥＧＦＲアンタゴニスト
ＥＧＦＲアンタゴニストは、例えばｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ（YM Biosciences）として知られるヒト化モノクローナル抗体などの抗体、完全ヒトＡＢＸ−ＥＧＦ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ、Abgenix Inc.）、Ｅ１．１、Ｅ２．４、Ｅ２．５、Ｅ６．２、Ｅ６．４、Ｅ２．１１、Ｅ６．３及びＥ７．６．３として知られ、米国特許第６，２３５，８８３号に記載されている完全ヒト抗体；ＭＤＸ−４４７（Medarex Inc）を含む。Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ（２Ｃ４）は、ＨＥＲ２に直接に結合するヒト化抗体であるが、ＨＥＲ２−ＥＧＦＲ二量体化を妨害するこのことによりＥＧＦＲシグナリングを阻害している。ＥＧＦＲに結合する抗体の他の例は、ＭＡｂ５７９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ＨＢ  ８５０６）、ＭＡｂ４５５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ＨＢ８５０７）、ＭＡｂ２２５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８５０８）、ＭＡｂ５２８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８５０９）（米国特許第４，９４３号、５３３、Mendelsohn et al.参照）及びその変異体、例えばキメラ化２２５（Ｃ２２５又はＣｅｔｕｘｉｍａｂ；ＥＲＢＵＴＩＸ（登録商標））及び再構築されたヒト２２５（Ｈ２２５）（国際特許公報第９６／４０２１０号（Imclone Systems Inc.）参照）；ＩＭＣ−１１Ｆ８（完全ヒト、ＥＧＦＲ目標抗体（Imclone））；ＩＩ型変異体ＥＧＦＲに結合する抗体（米国特許第５，２１２，２９０号）；米国特許第５，８９１，９９６号にて記載される、ＥＧＦＲと結合するヒト化及びキメラ抗体；及び例えばＡＢＸ−ＥＧＦなどのＥＧＦＲと結合するヒト抗体（ＷＯ９８／５０４３３（Abgenix）を参照）；ＥＭＤ５５９００（Stragliotto et al. Eur. J. Cancer 32A: 636-640 (1996)）；ＥＧＦＲ結合においてＥＧＦ及びＴＧＦαと競合する、ＥＧＦＲに対するヒト化ＥＧＦＲ抗体であるＥＭＤ７２００（ｍａｔｕｚｕｍａｂ）；及びｍＡｂ８０６又はヒト化ｍＡｂ８０６（Johns等、J. Biol. Chem. 279(29): 30375-30384 (2004)）を含む。抗ＥＧＦＲ抗体は、細胞障害性剤とコンジュゲートされてもよく、したがって免疫複合体を作製する（欧州特許第６５９，４３９Ａ２号、Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨを参照）。
本発明の方法において有用である抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲへの充分なアフィニティ及び特異性を有し、ＥＧＦＲ活性を阻害し得るあらゆる抗体を含む。選択される抗体は通常ＥＧＦＲに対して十分に強い結合親和性を有し、例えば抗体は１００ｎＭ−１ｐＭ間のＫｄ値でヒトＥＧＦＲと結合し得る。抗体アフィニティは、例えば表面プラスモン共鳴ベースのアッセイ（例えば国際特許公報第２００５／０１２３５９号にて説明されるＢＩＡｃｏｒｅアッセイ）；酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；及び競合アッセイ（例えばＲＩＡ’ｓ）によって決定されてもよい。好ましくは、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲリガンド活性が関与する疾患又は健康状態を標的とする、又は干渉する治療剤として用いられてもよい。同様に、抗体は、例えばその治療上の効果を評価するために、他の生物学的活性アッセイにかけられてもよい。このようなアッセイは、その分野において周知であり、抗体の標的抗原及び使用目的に依存する。
【００４１】
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＮＬＲＲ−１に結合し得る。他の例では、例示的な二重特異性抗体は、例えばＮＬＲＲ−１タンパク質などの同じタンパク質の２つの異なるエピトープに結合してもよい。あるいは、ＮＬＲＲ−１又はＥＧＦＲアームは、細胞防衛メカニズムをＮＬＲＲ−１又はＥＧＦＲ発現細胞へ集中させるために、Ｔ細胞受容体分子（例えばＣＤ２、又は、ＣＤ３）又はＩｇＧ（ＦｃγＲ）のＦｃ受容体（例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６））のような白血球上のトリガー分子に結合するアームと組み合わせられてもよい。二重特異性抗体は、ＥＧＦＲ又はＮＬＲＲ−１を発現する細胞に、細胞障害性剤を局所化させるためにも用いられ得る。これらの抗体は、ＥＧＦＲ又はＮＬＲＲ−１−結合アーム及び細胞障害性剤（例えばｓａｐｏｒｉｎ、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位元素ハプテン）を結合するアームを有する。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製されてもよい。  
【００４２】
ＥＧＦＲアンタゴニストは、ＵＳ５６１６５８２、ＵＳ５４５７１０５、ＵＳ５４７５００１、ＵＳ５６５４３０７、ＵＳ５６７９６８３、ＵＳ６０８４０９５、ＵＳ６２６５４１０、ＵＳ６４５５５３４、ＵＳ６５２１６２０、ＵＳ６５９６７２６、ＵＳ６７１３４８４、ＵＳ５７７０５９９、ＵＳ６１４０３３２、ＵＳ５８６６５７２、ＵＳ６３９９６０２、ＵＳ６３４４４５９、ＵＳ６６０２８６３、ＵＳ６３９１８７４、ＷＯ９８１４４５１、ＷＯ９８５００３８、ＷＯ９９０９０１６、ＷＯ９９２４０３７、ＷＯ９９３５１４６、ＷＯ０１３２６５１、ＵＳ６３４４４５５、ＵＳ５７６００４１、ＵＳ６００２００８、ＵＳ５７４７４９８に記載されている化合物のような小分子を含む。特定の小分子ＥＧＦＲアンタゴニストはＯＳＩ−７７４（ＣＰ−３５８７７４、エルロチニブ、OSI Pharmaceuticals）；ＰＤ１８３８０５（ＣＩ１０３３（２−プロペンアミド）Ｎ［４［（３−クロロ４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［３（４−モルホリニル）プロポキシ］−６−キナゾリニル］−ジヒドロクロライド、Pfizer Inc.）；イレッサ（登録商標）（ＺＤ１８３９、ゲフィチニブ、AstraZeneca）；ＺＭ１０５１８０（（６−アミノ−４−（３−メチルフェニル−アミノ）−キナゾリン（Zeneca））；ＢＩＢＸ−１３８２（Ｎ８−（３−クロロ４−フルオロフェニル）−Ｎ２（１−メチル−ピペリジン−４−イル）−ピリミド［５，４−ｄ］ピリミジン−２，８−ジアミン（Boehringer Ingelheim））；ＰＫＩ−１６６（（Ｒ）４−［４［（１−フェニルエチル）アミノ］−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル］−フェノール）；（Ｒ）−６（４−ヒドロキシフェニル）−４［（１−フェニルエチル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン）；ＣＬ−３８７７８５（Ｎ［４［（３−ブロモフェニル）アミノ］−６−キナゾリニル］−２−ブチナミド）；ＥＫＢ−５６９（Ｎ−［４−［（３−クロロ４−フルオロフェニル）アミノ］−３−シアノ−７−エトキシ−６−キノリニル（ジメチルアミノ）−２−ブテナミド）；ｌａｐａｔｉｎｉｂ（Tykerb, GlaxoSmithKline）；ＺＤ６４７４（Zactima, AstraZeneca）；ＣＵＤＣ−１０１（Curis）；ｃａｎｅｒｔｉｎｉｂ（ＣＩ−１０３３）；ＡＥＥ７８８（６［４［（４−エチル−１−ピペラジニル）メチル］フェニル］−Ｎ−［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン、国際特許公報第２００３０１３５４１号、Novartis）及びＰＫＩ１６６（４［４［［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル］−フェノール、国際特許公報第９７０２２６６号、Novartis）を含む。
【００４３】
抗体
本発明の抗体は、本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体及びそのような抗体の抗体フラグメントを含む。例示的な抗体は、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、断片、二重特異的、多重特異的、ヘテロコンジュゲート、多価、エフェクター機能含有、などの抗体を含む。
ポリクローナル抗体
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体を含んでもよい。ポリクローナル抗体を調製する方法は、当業者に公知である。例えば、本発明の抗体に対するポリクローナル抗体は、一又は複数の関連抗原及びアジュバントの皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射により動物中で産生される。それは、例えば、免疫化される種において、例えばキーホール  リンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシ・サイログロブリン又はダイズ‐トリプシン阻害因子などの免疫原性であるタンパク質に対する関連抗原を、二機能性又は誘導体化剤（例えばｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ  ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅエステル（システイン残基によるコンジュゲート）、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（リジン残基による）、グルタールアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２又はＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（Ｒ及びＲ１は異なるアルキル基）を用いてコンジュゲートさせるために有用でもよい。
一実施態様において、動物は、３倍量の完全フロインドアジュバントと共に、複数の部位に皮内に溶液を注入することにより、タンパク質又はコンジュゲートの例えば１００μｇ又は５μｇを組み合わせることによって本発明の分子、免疫原性結合体又は誘導体に対して免疫化される（ウサギ又はマウスのそれぞれ）。１ヵ月後に、動物は、複数の部位への皮下注射により、当初の量の１／５〜１／１０のフロインド完全アジュバント中のペプチド又はコンジュゲートで追加免役される。７〜１４日間後に、動物は採血され、血清は抗体価についてアッセイされる。動物は、力価がプラトーになるまで追加免疫される。通常、動物は同じ抗原のコンジュゲートで追加免疫されるが、異なるタンパク質に、及び／又は異なる架橋試薬ではコンジュゲートされない。コンジュゲートはタンパク質融合として組換え細胞培養物において作られてもよい。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
モノクローナル抗体
ここに記載される抗原に対するモノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により初めて記載されているようなハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）を使用することで作製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス又はハムスターやアカゲザルなどの他の適切な宿主動物を上記のように免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103）。調整されたハイブリドーマ細胞は、未融合の不死化細胞の生存又は増殖を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプテリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【００４４】
典型的な不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。これらの中でより好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばSalk Institute Cell Distribution Center（San Diego, California USA）より入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍やAmerican Type Culture Collection（Rockville, Maryland USA）より入手可能であるＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63）。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、対照の標的に対するモノクローナル抗体の存在について検定する。ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、その分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード解析法によって測定することができる。
【００４５】
所望の特異性、アフィニティ及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)）。この目的のための適当な培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０倍地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水腫瘍として増殖させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィ等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地、腹水液又は血清から単離又は精製される。モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えば大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。抗体の組換え産生はより詳細に以下に記載される。
もう一つの実施態様では、抗体又は抗体フラグメントは、McCafferty等、Nature, 348:552-554 (1990)に記載されている技術を用いて作製される抗体ファージライブラリーからの単離されてもよい。それぞれ、Clackson等、Nature, 352:624-628 (1991)及びMarks等、J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)はファージ・ライブラリを用いたマウス及びヒト抗体の単離を記載する。後の公報には、チェイン・シャッフリング(chain shuffling)によって高親和性（nMの範囲）ヒト抗体の産生（Marks等、Bio/Technology, 10:779-783 (1992)）、非常に大きいファージ・ライブラリー（Waterhouse等、Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)）を構築するためのストラテジーとしての組み合わせ感染及びインビボ組換えが記載されている。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な代案である。
また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより（米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison等, Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 6851 (1984)）、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。
このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、ある特異性を持つ１つの抗原結合部位、及び異なる抗原に対する特異性を持つ部位を有するキメラ性二価抗体を生成する。
【００４６】
ヒト化抗体
本発明の抗体には、ヒト化抗体又はヒト抗体を含み得る。ヒト化抗体は非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基を有する。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は、基本的に、ウィンター(Winter)及び共同研究者(Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988))の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。
よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
ヒト化抗体を作る際に用いられるヒト可変ドメイン（軽鎖及び重鎖）の選択は、抗原性を減らすために非常に重要である。いわゆる「最良適合」方法によれば、齧歯類の抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の完全なライブラリーに対してスクリーニングを行われる。齧歯動物のそれに最も近いヒト配列はその時ヒト化抗体のヒト・フレームワーク（FR）として受け入れられる（Sims等、J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia等、J. Mol. Biol., 196:901 (1987)）。他の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークは、いくつかの異なるヒト化抗体で用いられてもよい（Carter等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta等、J. Immnol., 151:2623 (1993)）。
更に、抗体を、抗原に対する高結合親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をコンセンサス及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【００４７】
内因性の免疫グロブリン産生がない状態で、免疫化によりヒト抗体のレパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが現在では可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の移入は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovits等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits等、Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann等、Year in Immuno., 7:33 (1993); 及びDuchosal et al. Nature 355:258 (1992)を参照のこと。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーから誘導されうる（Hoogenboom等、J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks等、J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan et al. Nature Biotech 14:309 (1996)。ヒト抗体はファージディスプレイライブラリーを含む当該分野で知られる様々な技術を用いて産生することができる（Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks等、J. Mol. Biol., 222:581 (1991)）。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、糸状バクテリオファージ（例えばＭ１３又はｆｄ）の主な又はマイナーなコートタンパク遺伝子のいずれかにインフレームにクローニングされ、ファージ粒子の表面に機能的抗体フラグメントとして提示された。糸状の粒子がファージゲノムの一重鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づく選択はそれらの特性を示している抗体をコード化している遺伝子の選択となる。したがって、ファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣する。バクテリオファージディスプレイは、種々のフォーマット（例えば、Johnson, K S. and Chiswell, D J., Cur Opin in Struct Biol 3:564-571 (1993)においてレビューされる）で行われてもよい。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源は、ファージディスプレイのために用いられてもよい。例えば、Clackson等、Nature, 352:624-628 (1991)は、免疫化マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さいランダムな組み合わせライブラリーから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。免疫化されていないヒト提供者からのＶ遺伝子のレパートリは構築され、抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイの抗体は、例えば、Marks等、J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)又はGriffith等、EMBO J. 12:725-734 (1993)によって記載されている技術に基本的に従うことによって単離されてもよい。米国特許番号５，５６５，３３２及び５，５７３，９０５を参照。Cole等及びBoerner等の技術はヒト・モノクローナル抗体の調製においても利用可能である（Cole等、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)及びBoerner等、J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)）。ヒト抗体は、インヴィトロで活性化されたＢ細胞（米国特許５，５６７，６１０及び５，２２９，２７５を参照）によっても作製され得る。
【００４８】
抗体断片
抗体断片もまた本発明に包含される。抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されている（例えば、Morimoto等, J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい）。しかしながら、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は、上述した抗体ファージライブラリーから単離することができる。また、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992)）。他のアプローチによると、抗体断片は組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体断片を生産するための他の技術は当業者には明らかである。他の実施態様において、最適な抗体は、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際特許公開公報９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；及び米国特許第５，５８７，４５８号を参照。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域が欠けている完全な結合部位を有する唯一の種であり、それらはインビボで用いる場合に減少した非特異的結合のために適切である。ＳＦｖ融合タンパクは、ｓＦｖのアミノ末端又はカルボキシ末端においてエフェクター・タンパク質の融合体を産生するように構築されてもよい。Antibody Engineering, ed. Borrebaeck、上掲を参照。例えば米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるように、抗体フラグメントは「線状抗体」であってもよい。このような線形抗体フラグメントは、単一特異性又は二重特異性であってもよい。
多重特異性抗体（例えば、二重特異性）
本発明の抗体はもまた、例えば、多重特異性抗体を含み、それは少なくとも２つの異なる抗原への結合特異性を有する。このような分子が通常２つの抗原（すなわち二重特異性抗体、ＢｓＡｂｓ）に結合するだけであるのに対して、ここに用いられる場合、三重特異性又は他の多重特異性（つまり、一つの分子に含まれる四以上の特異性）抗体のような付加的な特異性を有する抗体がこの表現に含まれる。当該分野において知られるＢｓＡｂｓの例は、腫瘍細胞抗原に対するアーム及び細胞障害性トリガー分子（例えば、抗ＦｃγＲＩ／抗ＣＤ１５（抗ｐ１８５ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６））抗ＣＤ３／抗悪性のＢ細胞（１Ｄ１０）、抗ＣＤ３／抗ｐ１８５ＨＥＲ２、抗ＣＤ３／抗−ｐ９７、抗ＣＤ３／抗−腎細胞癌、抗ＣＤ３／抗−ＯＶＣＡＲ−３、抗ＣＤ３／Ｌ−Ｄ１（抗結腸癌）、抗ＣＤ３／抗−メラニン細胞刺激ホルモンアナログ、抗ＥＧＦ受容体／抗ＣＤ３、抗ＣＤ３／抗−ＣＡＭＡ１、抗ＣＤ３／抗−ＣＤ１９、抗ＣＤ３／ＭｏＶ１８、抗神経細胞付着分子（ＮＣＡＭ）／抗ＣＤ３、抗葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）／抗ＣＤ３、抗原（ＡＭＯＣ−３１）に関連した抗パン癌／抗ＣＤ３）に対する他のアームを有するもの；腫瘍抗原に特異的に結合する及アーム及び抗ｓａｐｏｒｉｎ／抗−Ｉｄ−１、抗ＣＤ２２／抗ｓａｐｏｒｉｎ、抗ＣＤ７／ａｎｔｉｓａｐｏｒｉｎ、抗ＣＤ３８／抗ｓａｐｏｒｉｎ、抗ＣＥＡ／抗リシンＡ鎖、抗インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）／抗ハイブリドーマ・イディオタイプ、抗ＣＥＡ／抗ビンカアルカロイド）などの毒素に結合するアームを有するＢｓＡｂｓ；抗ＣＤ３０／ａｎｔｉ−アルカリホスファターゼ（マイトマイシン・リン酸塩プロドラッグのマイトマイシン・アルコールへの転換に触媒作用を及ぼす）のような転換酵素活性化プロドラッグに対するＢｓＡｂｓ；抗フィブリン／抗組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）、抗フィブリン／抗ウロキナーゼ−型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）などの線維素溶解素として用いられ得るＢｓＡｂｓ；抗低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）／抗Ｆｃレセプター（例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ又はＦｃγＲＩＩＩ）などの細胞表面受容体に対する標的免疫複合体のＢｓＡｂｓ；抗ＣＤ３／抗単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）、抗Ｔ細胞受容体：ＣＤ３複合体／抗インフルエンザ、抗ＦｃγＲ／抗ＨＩＶのような感染症の治療に用いられるＢｓＡｂｓ；インビトロ又はインビボでの腫瘍検出のためのＢｓＡｂｓ（例えば抗ＣＥＡ／抗ＥＯＴＵＢＥ、抗ＣＥＡ／抗ＤＰＴＡ、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／ａ抗ハプテン）；ワクチンのアジュバントとしてのＢｓＡｂｓ；及び抗ウサギＩｇＧ／抗フェリチン、抗ワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／抗ホルモン、抗ソマトスタチン／抗サブスタンスＰ、抗ＨＲＰ／抗ＦＩＴＣ、抗ＣＥＡ／抗β−ガラクトシダーゼなどの診断ツールとしてのＢｓＡｂｓを含む。三重特異性抗体の例は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ４／抗ＣＤ３７、抗ＣＤ３／抗ＣＤ５／抗ＣＤ３７及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ８／抗ＣＤ３７を含む。特定の本発明の態様において、二重特異性抗体の抗体の一つは、マクロファージ特異的細胞マーカー及びその他の樹状細胞特異的細胞マーカーと結合してもよい。ある種の実施形態では、このような抗体は、どちらか一方のマーカーのみ又は他のマーカーを有する細胞よりも、あるマクロファージ特異的な細胞マーカー及びある樹状細胞特異的な細胞マーカーの両方を有する細胞により密接に結合する。
二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体フラグメントとして調製されてもよい（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）。二重特異性抗体を作るための方法は、当該分野において周知である。完全長二重特異性抗体の従来の産生は２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づき、２つの鎖は異なる特異性を有する（Millstein等、Nature, 305:537-539 (1983)）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の任意組合せにより、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を産生し、ただ一つのみが正しい二重特異性の構造を有する。正しい分子の精製（通常アフィニティークロマトグラフィによって行われる）は、かなり扱いにくく、産物収量は低い。同様の手法が、国際特許公報第９３／０８８２９号及びTraunecker等、EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示される。
【００４９】
異なる手法によれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。融合物は好ましくは免疫グロブリン重鎖定常ドメインとであり、少なくともヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む。
軽鎖の結合のために必要な部位（少なくとも１つの融合物に存在する）を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好まれる。免疫グロブリン重鎖融合物、及び所望により免疫グロブリン軽鎖をコード化しているＤＮＡｓは、別々の発現ベクターに挿入され、適切な宿主生物に共トランスフェクションさせる。構築物において用いられる３つのポリペプチド鎖の不均等な比率が最適生産量を提供する場合、実施態様の３つのポリペプチド断片の相互の比率を調整する際の大きなフレキシビリティが提供される。それは、しかしながら、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高い収率を生む、もしくは比率が特に重要でない場合、一つの発現ベクター中で２つ又は全３つのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。
この手法の一実施態様において、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を一つのアームに有する複合型免疫グロブリン重鎖あるアーム、及び他のアームに（第二の結合特異性を提供する）複合型免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアから成る。二重特異性分子の片側半分としての免疫グロブリン軽鎖の存在は分離の安易な方法を提供するので、この非対称の構造は望ましくない免疫グロブリン鎖の結合から所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることが明らかとなった。この手法は、国際特許公報第９４／０４６９０号において開示される。二重特異性抗体作製の詳細は、Suresh等、Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照のこと。
例えば国際特許公報第９６／２７０１１号に記載されている他の手法によれば、一対の抗体分子間の境界面は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーの割合を最大にするために設計されてもよい。好適な境界面は、少なくとも抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの一部を含む。この方法では、第一の抗体分子の境界面の一つ以上の小さいアミノ酸側鎖は、より大きい側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で交換される。大きい側鎖（ｓ）と同一又は類似したサイズの代償性の「キャビティー」は、より小さいアミノ酸側鎖（例えばアラニン又はスレオニン）で大きいアミノ酸側鎖を交換することによって、第二の抗体分子の境界面に作成される。これは、他の望ましくない最終生産物（例えばホモダイマー）よりもヘテロダイマーの産生を増加させるためのメカニズムを提供する。
【００５０】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を作製するための技術も当該分野において知られている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を用いて調製することができる。Brennan等、Science, 229: 81 (1985)は、完全な抗体がＦ（ａｂ’）２断片を作製するためにタンパク分解性に切断される手法を記載する。これらの断片は、近接のジチオールを安定させ、分子間ジスルフィド形成を妨げるために、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下では減少している。作製されるＦａｂ’断片は、チオ・ニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。あるＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体は、メルカプトエチルアミンで還元されることによってＦａｂ’−チオールに再転換され、二重特異性抗体を形成するために他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合される。産生される二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として用いることができる。
最近の進歩により大腸菌からのＦａｂ’−ＳＨ断片の直接の回収が容易となり、二重特異性抗体を形成するために化学的に結合することができる。Shalaby等、J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)は、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生について記載する。それぞれのＦａｂ’断片は、別々に大腸菌から分泌され、二重特異性抗体を形成するために、インビトロで直接的な化学結合が行われた。形成される二重特異性抗体は、ＶＥＧＦ受容体を過剰発現する細胞及び正常なヒトＴ細胞と結合可能であり、ヒト乳房腫瘍標的に対してヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性を起動させることができる。
組換え細胞培養物から直接に二重特異性抗体断片を作製し、単離するための様々な技術も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて産生された。Kostelny等、J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合された。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法は、抗体ホモダイマーの産生のためにも利用することができる。Hollinger等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)に記載さいる「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作るための代替的なメカニズムを提供した。断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間で対合するには短いリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、一つの断片におけるＶＨ及びＶＬドメインは、他の断片の相補的なＶＬ及びＶＨドメインと対合することを強制され、これにより２つの抗原結合部位を形成する。
一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用による二重特異性抗体断片作製のための他のストラテジーも報告されている。Gruber等、J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照。
２つ以上の結合価を有する抗体も意図される。例えば、三重特性抗体を調製することができる。Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)。
【００５１】
ヘテロコンジュゲート抗体
二重特異性抗体は、架橋された抗体又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含み、それらは本発明の抗体である。そのような二重特異性抗体は、例えば、免疫系細胞が望ましくない細胞を標的とするように（米国特許第４，６７６，９８０号）、及びＨＩＶ感染症の治療のために（国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／２００３７３号及び欧州特許第０３０８９号）提案された。ヘテロコンジュゲート抗体は、いかなる簡便な架橋法を用いて製作されてもよい。適切な架橋剤は、公知技術であり、多くの架橋技術とともに、例えば米国特許第４，６７６，９８０号に開示される。
【００５２】
多価抗体
本発明の抗体は多価抗体を含む。多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現している細胞によって、二価抗体よりも急速に内部移行（及び／又は分解）され得る。本発明の抗体は、３以上の抗原結合部位を有する多価抗体（ＩｇＭクラス以外）であり得（例えば四価の抗体）、抗体のポリペプチド鎖をコード化している核酸の組換え発現によって容易に産生することができる。多価抗体は、二量体化ドメインと３以上の抗原結合部位を含み得る。好ましい二量体化ドメインは、Ｆｃ領域又はヒンジ領域を含む（又はそれらからなる）。このシナリオにおいて、抗体は、Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端側の３以上の抗原結合部位とを含む。本明細書における好ましい多価抗体は、３から約８、好ましくは４の抗原結合部位を含む（又はそれらからなる）。多価抗体は、少なくとも一つのポリペプチド鎖（及び好ましくは２つのポリペプチド鎖）を含み、ポリペプチド鎖は２以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖はＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２ｎ）−Ｆｃを含み、ＶＤ１が第１の可変ドメインであるり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖であり、Ｘ１とＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖は以下を含み得る：ＶＨ−ＣＨ１−フレキシブルリンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖。本明細書における多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ（及び好ましくは４つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドを更に含む。本明細書における多価抗体は、例えば、およそ２ないしおよそ８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含み得る。ここで意図される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、場合によってＣＬドメインを更に含む。多価抗体は、同じ抗原に対する複数の結合部位を有するか、２以上の異なる抗原に対する結合部位を有してもよい。
【００５３】
エフェクター機能エンジニアリング
特定の疾患又は疾病の治療において抗体の効果を増強するように、エフェクター機能に関して本発明の抗体を改変することが望ましい。例えば、システイン残基がＦｃ領域に導入されてもよく、それによってこの領域において鎖間ジスルフィド結合が形成される。
したがって、生成されるホモダイマー抗体は、改良された内部移行能及び／又は増強された補体媒介性細胞死滅と抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を有し得る。Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照のこと。
増強された抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体は、Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されるようなヘテロ二機能性架橋剤を用いても調製され得る。あるいは、２つのＦｃ領域を有するように設計でき、それにより増強された補体細胞溶解性とＡＤＣＣ能を有し得る。Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照のこと。抗体の血清半減期を増加させるために、例えば米国特許第５，７３９，２７７号に記載されるように、抗体（特に抗体断片）にサルベージ受容体結合エピトープを組み込んでもよい。本明細書で用いられるように、用語「サルベージ受容体結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）のインビボ血清半減期を増加させる役割を果たすＩｇＧ分子のＦｃ領域のエピトープを意味する。
【００５４】
免疫複合体
本発明は、細胞障害性剤（例えば化学療法剤、薬剤、増殖阻害剤、毒素（例えばタンパク質毒素、バクテリア、菌類、植物又は動物の起源の酵素的に活性な毒素又はその断片）、又は放射性同位元素（すなわちラジオ・コンジュゲート））にコンジュゲートされた本明細書に記載の抗体を含む免疫接合体にも関連する。種々の放射性核種は、ラジオ・コンジュゲート抗体の製造に利用可能である。例えば２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを含むが、これに限定されるものではない。
そのような免疫複合体の生成において有用な化学療法剤は、上述している。例えば、ＢＣＮＵ、ストレプトゾシン、ビンクリスチン、５−フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号及び第５，７７０，７１０号に記載される集合名詞的にＬＬ  Ｅ３３２８８として既知の薬剤群、エスペラミシン（米国特許第５，８７７，２９６号）等（本願明細書に記載の化学療法剤の定義を参照のこと）は、本発明の抗体又はその断片にコンジュゲートすることができる。腫瘍の選択的破壊のために、抗体は高度に放射能を有する原子を含んでもよい。
種々の放射性同位元素は、ラジオ・コンジュゲートされた抗体又はその断片の製造に利用可能である。例えば、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、２１２Ｐｂ、１１１Ｉｎ、Ｌｕの放射性同位元素などが含まれるが、これに限定されるものではない。コンジュゲートが診断のために用いられる場合、シンチグラフィ研究のための放射性原子、例えば９９ｍｔｃ又は１２３Ｉ、又はヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１１、フッ素１９、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄等の核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像（磁気共鳴画像（ＭＲＩ）として公知）のためのスピン標識を含み得る。
放射性又は他の標識は、公知の方法でコンジュゲートに組み込まれ得る。例えば、ペプチドは、生合成されてもよく、例えば水素の代わりにフッ素１９を含む適切なアミノ酸前駆物質を用いた化学的アミノ酸合成によって合成されてもよい。標識（例えば９９ｍｔｃ又は１２３Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ及び１１１Ｉｎ）は、ペプチドのシステイン残基を介して付着させることができる。イットリウム９０はリジン残基を介して付着させることができる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57）は、ヨウ素１２３を組み込むために用いられ得る。詳細に他の方法を記載するMonoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy (Chatal, CRC Press 1989)を参照のこと。
用い得る酵素的に活性な毒素とその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非結合活性断片、炭疽毒素感染防御抗原、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌から得られる）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、αサルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシインヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア・オフィシナリスインヒビター、ゲロニン、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン、フェノマイシン(phenomycin)、ネオマイシンとトリコテシンが含まれる。１９９３年１０月２８日に公開された国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
抗体と細胞障害性剤のコンジュゲートは種々の二機能性タンパク質カップリング剤（例えば、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（例えばアジプイミド酸ジメチルＨＣＬ）、活性エステル（例えばスベリン酸ジサクシンイミジル）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス−（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−  エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えばトルエン２，６−ジイソシアナート）、及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン））を用いて製造することができる。例えば、リシンイムノトキシンは、Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987)に記載されるように調製することができる。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレン−トリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る（Chari et al., Cancer Research 52:127 131 (1992)；米国特許第５，２０８，０２０号）。
あるいは、抗ＶＥＧＦ抗体及び／又は本発明のタンパク質に対する抗体と細胞障害性剤を含む融合タンパクは、例えば、組換え技術又はペプチド合成によって製造されてもよい。
ＤＮＡの長さは、互いに隣接するか、コンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコード化する領域によって分離される、コンジュゲートの２つの部分をコード化するそれぞれの領域を含み得る。
ある実施態様では、抗体は、腫瘍事前標的化の利用のために「レセプター」（例えばストレプトアビジン）にコンジュゲートされ、抗体−レセプターコンジュゲートは患者に投与され、続いて洗浄剤を用いた循環の非結合コンジュゲートの除去、及び細胞障害性剤（例えば放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートされた「リガンド」（例えばアビジン）の投与が行われる。ある実施態様では、免疫複合体は、抗体と核酸分解活性を有する化合物（例えばＲＮＡ分解酵素又はＤＮＡ分解酵素；ＤｎａｓｅなどのＤＮＡエンドヌクレアーゼ）との間で形成される。
【００５５】
メイタンシン及びメイタンシノイド
本発明は、１以上のメイタンシノイド分子にコンジュゲートされた本発明の抗体をさらに提供する。メイタンシノイドは、チュブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは、アフリカ東部の低木Ｍａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａ（米国特許第３，８９６，１１１号）から初めて単離された。その後、特定の微生物が例えばマイタンシノールやＣ  ３マイタンシノールエステル（米国特許第４，１５１，０４２号）などのメイタンシノイドを産生することが発見された。合成マイタンシノール、その誘導体及びその類似体は、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号；米国特許第４，２４８，８７０号；米国特許第４，２５６，７４６号；米国特許第４，２６０，６０８号；米国特許第４，２６５，８１４号；米国特許第４，２９４，７５７号；米国特許第４，３０７，０１６号；米国特許第４，３０８，２６８号；米国特許第４，３０８，２６９号；米国特許第４，３０９，４２８号；米国特許第４，３１３，９４６号；米国特許第４，３１５，９２９号；米国特許第４，３１７，８２１号；米国特許第４，３２２，３４８号；米国特許第４，３３１，５９８号；米国特許第４，３６１，６５０号；米国特許第４，３６４，８６６号；米国特許第４，４２４，２１９号；米国特許第４，４５０，２５４号；米国特許第４，３６２，６６３号；及び米国特許第４，３７１，５３３号に記載される。
本発明の抗体は、抗体又はメイタンシノイド分子の生物学的活性を有意に減少することなくメイタンシノイド分子にコンジュゲートすることができる。毒素／抗体の１つの分子でさえ裸の抗体の使用よりも細胞障害性を増強することが予想されるにもかかわらず、抗体分子につき平均３−４のメイタンシノイド分子は、抗体の機能又は溶解性に悪影響を及ぼすことなく標的細胞の細胞障害性を増強するのに有効であることが示されている。メイタンシノイドは、当技術分野で周知であり、公知の技術で合成するか、天然の供給源から単離することができる。適切なメイタンシノイドは、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号や先に言及された他の特許公表や非特許文献において開示される。一実施態様において、メイタンシノイドは、マイタンシノール及びマイタンシノール分子（例えば様々なマイタンシノールエステル）の芳香環又はの他の位置で改変されたマイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第５，２０８，０２０号又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号及びChari et al., Cancer Research 52:127 131 (1992)に開示されるものを含め、抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを製作するための公知の連結基が数多く存在する。連結基は、上記の特許文献に開示されるように、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、光不安定基、ペプチダーゼ不安定基又はエステラーゼ不安定基を含み、ジスルフィド基とチオエーテル基が好ましい。
抗体とメイタンシノイドのコンジュゲートは、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（例えばアジプイミド酸ジメチルＨＣＬ）、活性エステル（例えばスベリン酸ジサクシンイミジル）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス−（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−  エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えばトルエン２，６−ジイソシアナート）、及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの様々な二機能性タンパク質カップリング剤を用いて製造することができる。典型的なカップリング剤は、ジスルフィド結合を提供するＮ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Carlsson et al., Biochem. J. 173:723 737 [1978]）及びＮ−サクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオール）−ペンタノエート（ＳＰＰ）を含む。
リンカーは、結合の型によって、メイタンシノイド分子の様々な位置に付着し得る。
例えば、エステル結合は、従来のカップリング技術を用いて水酸基との反応によって形成され得る。反応は、水酸基を有するＣ−３位置、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位置、水酸基で修飾されたＣ−１５位置、及び水酸基を有するＣ−２０位置で起こり得る。
結合は、マイタンシノール又はマイタンシノール類似体のＣ−３位置で形成される。
【００５６】
カリケアマイシン
興味深い他の免疫複合体には、１以上のカリケアマイシン分子にコンジュゲートされた本発明の抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、ピコモル以下の濃度で二本鎖ＤＮＡを切断することができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５，７１２，３７４号、第５，７１４，５８６号、第５，７３９，１１６号、第５，７６７，２８５号、第５，７７０，７０１号、第５，７７０，７１０号、第５，７７３，００１号、第５，８７７，２９６号（全てAmerican Cyanamid Company）を参照されたい。用い得るカリケアマイシンの構造アナログは、１Ｉ、２Ｉ、３Ｉ、Ｎアセチル１Ｉ、ＰＳＡＧ及びＩ１を含むが、これに限定されるものではない（Hinman et al., Cancer Research 53:3336 3342 (1993)、Lode et al., Cancer Research 58:2925 2928 (1998)及び上述のAmerican Cyanamidの米国特許）。抗体がコンジュゲートできる他の抗腫瘍薬剤は、抗葉酸剤であるＱＦＡである。カリケアマイシンとＱＦＡは、細胞内作用部位を有しており、原形質膜を容易に通過できない。したがって、抗体媒介性内部移行を介したこれらの薬剤の細胞取り込みは、それらの細胞障害性効果を増強する。
【００５７】
他の抗体改変
本発明の抗体の他の改変も、本願明細書において意図されている。例えば、抗体は、様々な非タンパク質ポリマー（例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマー）の一つに結合してもよい。抗体は、例えば、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル又はマクロエマルジョン）において、コアセルベーション技術又は界面重合法（それぞれ、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）によって調製されるマイクロカプセルに封入されてもよい。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)において開示される。
【００５８】
併用療法
本発明は、治療剤の併用活性の有益な効果又は相乗効果を提供することを意図した特定の療法投薬計画の一部として、ＮＬＲＲ−１アンタゴニストとＥＧＦＲアンタゴニストの併用を提供する。併用の有益な効果は、治療剤の併用により生じる薬物動態学的又は薬力学的相互作用を含むが、これに限定されるものではない。
いくつかの実施態様において、ＮＬＲＲ−１アンタゴニストとＥＧＦＲアンタゴニストで治療される腫瘍細胞又は癌は、ＮＬＲＲ−１アンタゴニストでの治療の非存在下においてＥＧＦＲアンタゴニストでの治療に耐性がある。もう一つの実施態様では、ＮＬＲＲ−１アンタゴニストと共に投与されるＥＧＦＲアンタゴニストは、エルロチニブである。
もう一つの実施態様では、ＮＬＲＲ−１アンタゴニストとエルロチニブとで治療される腫瘍細胞又は癌は、ＮＬＲＲ−１アンタゴニストでの治療の非存在下においてエルロチニブでの治療に耐性がある。他の実施態様において、ＮＬＲＲ−１アンタゴニスト及びＥＧＦＲアンタゴニストの投与は、ＮＬＲＲ−１アンタゴニストの投与なしのＥＧＦＲアンタゴニストの投与と比較して、腫瘍細胞又は癌の増殖阻害を増強させる。他の実施態様において、併用療法を用いた腫瘍又は癌の増殖阻害の増強は、ＮＬＲＲ−１アンタゴニスト又はＥＧＦＲアンタゴニストの何れか単独での治療と比較して、相乗的である。
併用投与は、異なる製剤又は単一の製薬製剤を用いた同時投与又は同時的投与、及び何れかの順番での連続的な投与を含み、好ましくは、両方の（又は全て）の活性剤が同時にそれらの生物学的活性を発揮する時間がある。
【００５９】
診断
ＮＬＲＲ−１は多くの異なる腫瘍において発現され、その発現は上昇したＥＧＦＲ発現と反相関しており、ＮＬＲＲ−１がＥＧＦＲ経路シグナリングを促進し、ＥＧＦＲの増幅を必要としない経路活性化を増強する手段を提供することを示している。さらにまた、ＮＬＲＲ−１発現は、いくつかの腫瘍におけるＥＧＦＲアンタゴニスト（例えばｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）に対する耐性と相関している。ＥＧＦＲアンタゴニストに耐性のある癌細胞におけるＮＬＲＲ−１発現のノックダウンは、ＥＧＦＲを標的とした薬物療法での治療に対する感受性の増加を引き起こす。
したがって、本発明の一態様は、癌などの細胞増殖性疾患を診断するための方法及び組成物を提供する。いくつかの実施態様において、本発明の方法は、試験細胞集団と基準細胞集団のＮＬＲＲ−１レベルを比較することを含み、試験細胞集団におけるＮＬＲＲ−１発現レベルの増加は、癌細胞が含まれることを示す。
本発明の別の態様は、ＥＧＦＲ増幅がない場合に試験細胞集団が活性化ＥＧＦＲ経路を有するかどうかを決定する方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明の方法は、ＥＧＦＲの重複を有していない試験細胞集団と基準細胞集団のＮＬＲＲ−１レベルを比較することを含み、ＮＬＲＲ−１発現レベルの増加は、ＥＧＦＲ経路が活性化されていることを示す。この方法は、ＥＧＦＲ増幅がないことによってＥＧＦＲアンタゴニストでの治療に耐性を有する可能性があるが、ＮＬＲＲ−１アンタゴニストとＥＧＦＲアンタゴニストとの併用治療から恩恵を受け得る患者を同定するのに有用である。
上記の方法において、試験細胞集団は、いかなる数の細胞、つまり１以上の細胞であってもよく、インビトロ、インビボ又はエクスビボで提供され得る。ある種の実施形態では、基準細胞集団の細胞は、試験試料（例えば腫瘍細胞集団）とできる限り類似した組織型に由来する。いくつかの実施態様において、基準細胞集団は、試験細胞集団と同一の対象に由来し、例えば試験細胞集団の起源の部位に近位の部位に由来する。いくつかの実施態様において、基準細胞集団は、試験細胞集団と同じ組織型に由来するが、対象から異なる時間に採取された（例えば試験細胞集団より早く）。いくつかの実施態様において、一連の基準細胞集団試料は、対象から一定の時間間隔で採取される（例えば毎日、毎週、毎月又は毎年）。本発明の一実施例において、基準細胞集団は、複数の細胞に由来する。例えば、基準細胞集団は、前に試験された細胞のＮＬＲＲ−１発現パターンのデータベースにすることができる。
あるいは、コントロールは、基準細胞集団のハウスキーピング遺伝子（例えばアクチンファミリーメンバー）の発現を測定することによって作製することができる。ハウスキーピング遺伝子は、ＮＬＲＲ−１遺伝子の過剰発現を測定する比較コントロールとしての機能を果たす。
他の実施態様において、ＥＧＦＲレベルは、試験細胞集団と基準細胞集団においても測定される。
【００６０】
タンパク質と核酸の検出方法
本発明のタンパク質の存在、活性又は量を検出することは、公知技術を用いて容易に行うことができる。発現は、タンパク質レベルで、すなわちポリペプチドのレベルを測定することによって測定することができる。そのような方法は周知であり、例えばタンパク質に対する抗体を基とするイムノアッセイを含む。試験細胞集団における１以上のタンパク質配列の発現レベルは、基準細胞集団の１以上の細胞におけるその配列の発現レベルと比較することができる。細胞の試験集団及びコントロール集団における配列の発現は、核酸配列の発現を比較するためのこの技術分野において認識されているあらゆる方法を用いて比較することができる。例えば、発現は、米国特許第５，８７１，６９７号及びShimkets et al., Nat. Biotechnol. 17:798-803に記載されるようなＧＥＮＥＣＡＬＬＩＮＧ（登録商標）法を用いて比較することができる。本発明の特定の実施態様において、１、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、２０以上、２５以上のタンパク質配列の発現が測定される。
この技術分野で公知の様々なアッセイ技術、例えば競合結合アッセイ、直接又は間接サンドイッチアッセイ及び均一相又は不均一相の何れかで実施される免疫沈降アッセイも利用できる（Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158）。アッセイで用いられる抗体又はその抗原結合断片は、検出可能な部分で標識することができる。検出可能な部分は、直接的又は間接的に検出可能なシグナルを産生することができる。例えば、検出可能な部分は、ラジオアイソトープ（例えば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ、蛍光又は化学発光化合物（例えばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン）、又は酵素（アルカリホスファターゼ、β‐ガラクトシダーゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼ）であってもよい。Hunter et al., Nature, 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014 (1974)；Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981)；及びNygren, J. Histochem. And Cytochem., 30:407 (1982)に記載されるものを含め、検出可能な部分に抗体をコンジュゲートするためのこの技術分野で公知のいかなる方法が用いられ得る。
核酸検出技術もまたこの技術分野で公知であり、ＮＬＲＲ−１をコード化するｍＲＮＡの存在を評価し、したがって細胞試料が抽出された細胞集団におけるＮＬＲＲ−１の存在又は量を測定するために使用され得る。この技術分野で一般的に公知の核酸の存在、量又は活性を評価するために用いることができる組換えＤＮＡ技術の方法は、例えばAusubel et al. eds. (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY；及びKriegler (1990) Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYに記載されている。そのような技術の例は、蛍光インサイチューハイブリダイゼイション（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公開された国際公開第９８／４５４７９号を参照）、サザンブロッティング又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（例えば定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ））を含む。
場合によって、発現が測定されるパラメータ又は状態から独立しているコントロール核酸について、試験細胞集団と基準細胞集団との間で差次的に発現された配列の比較が行われる。試験核酸と基準核酸におけるコントロール核酸の発現レベルは、比較集団のシグナルレベルを標準化するために用いることができる。適切なコントロール核酸は、従来技術において当業者で容易に測定されることができる。
【００６１】
化学療法剤
本発明の併用療法は、１以上の化学療法剤を更に含むことができる。併用投与は、異なる製剤又は単一の製薬製剤を用いた同時投与又は同時的投与、及び何れかの順番での連続的な投与を含み、好ましくは、両方の（又は全て）の活性剤が同時にそれらの生物学的活性を発揮する時間がある。
化学療法剤は、投与される場合、公知の用量で投与されるか、場合によって薬剤の複合作用又は代謝拮抗化学療法剤の投与に起因するマイナスの副作用により少なくされる。
そのような化学療法剤の調製及び投薬スケジュールは、製造業者の説明書又は熟練した施術者によって経験的に決定されるように用いられる。
併用できる様々な化学療法剤は、先に開示される。併用される好ましい化学療法剤は、タキソイド（ドセタキセル及びパクリタキセルを含む）、ビンカ（例えばビノレルビン又はビンブラスチン）、白金化合物（例えばカルボプラチン又はシスプラチン）、アロマターゼ阻害薬（例えばレトロゾール、アナストロゾール又はエキセメスタン）、抗エストロゲン（例えばフルベストラント又はタモキシフェン）、エトポシド、チオテパ、シクロホスファミド、メトトレキセート、リポソームドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、カペシタビン、ゲムシタビン、ＣＯＸ−２阻害剤（例えばセレコキシブ）又はプロテオゾーム阻害剤（例えばＰＳ３４２）からなる群から選択される。
【００６２】
製剤、用量及び投与
本発明で用いられる治療剤は、望ましい医療行為に一致した方法で調製、服用及び投与される。これに関連する考慮すべき因子には、治療されるべき特定の疾患、治療される特定の対象、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与日程、併用する薬剤の薬物間相互作用及び医師の公知の他の因子が含まれる。
治療製剤は、所望の純度を有する活性成分を、選択的な生理的に許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより、この技術分野で公知の標準法を用いて調製される（Remington's Pharmaceutical Sciences (20th edition), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA）。許容可能な担体には、食塩水又はバッファー（例えばリン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸）；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン、アミノ酸（例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン））；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖、二糖及び他の炭水化物；キレート剤（例えばＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えばマンニトール又はソルビトール）；塩形成対イオン（例えばナトリウム）；及び／又は非イオン性界面活性剤（例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）又はＰＥＧ）が含まれる。
場合によって、しかし好ましくは、製剤には、薬学的に許容可能な塩（好ましくは塩化ナトリウム）が好ましくは生理的濃度で含まれる。場合によって、本発明の製剤には、薬学的に許容可能な防腐剤が含まれてもよい。いくつかの実施態様において、防腐剤の濃度は、０．１から２．０％（一般的にｖ／ｖ）にわたる。適切な防腐剤には、製薬技術分野において公知のものが含まれる。ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン及びプロピルパラベンが好ましい防腐剤である。場合によって、本発明の製剤は、０．００５〜０．０２％の濃度で薬学的に許容可能な界面活性剤を含んでもよい。
本願明細書の製剤は、治療される特定の徴候に必要な複数の活性化合物を、好ましくはお互いに悪影響を与えない相補的な活性を有するものを含み得る。そのような分子は、使用目的に有効な量で併用剤中に適切に存在する。
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法（例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルのそれぞれ）によって調製されるマイクロカプセル、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョン中に封入されてもよい。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences（上記）において開示される。
徐放性製剤も調製され得る。徐放性製剤の適切な例は、抗体を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、マトリックスは造形品（例えばフィルム又はマイクロカプセル）の形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル類、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリラート）、又は、ポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能のミクロスフィア）などの分解可能な乳酸グリコール酸コポリマー及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸グリコール酸のようなポリマーが１００日間以上の分子の放出を可能にするのに対して、特定のヒドロゲルはより短い期間タンパク質を放出する。カプセル化された抗体が長い間身体に残る場合、３７℃で湿気への暴露の結果として変性又は凝集し、生物学的活性度の損失及び潜在的な免疫原性の変化が起こり得る。合理的なストラテジーは、関与されるメカニズムに従って、安定化のために考案され得る。例えば、凝集メカニズムがチオ−ジスルフィド相互交換による分子間Ｓ‐Ｓ結合の形成であることが発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基を改変すること、酸性溶液を凍結乾燥すること、含水量を制御すること、適切な添加物を用いること及び特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって成し遂げられ得る。
本発明の治療薬は、ボーラスのような静脈内投与などの公知の方法に従って、又は筋注、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節腔内、滑液包内、髄こう内、経口、局所又は吸入経路によりある期間にわたる継続投与によってヒト患者へ投与される。ＶＥＧＦアンタゴニストについて、広範囲な副作用又は毒性がＶＥＧＦの拮抗作用と関連している場合、局所投与が特に望まれる。エキソビボストラテジーは、医療適用のためにも用いることができる。エキソビボストラテジーには、対象から得られた細胞を、ＮＬＲＲ−１又はＥＧＦＲアンタゴニストをコード化するポリヌクレオチドで形質移入又は形質導入することが関与する。形質移入又は形質導入された細胞は、次いで対象に戻される。細胞は、広範囲にわたるあらゆる型の細胞でもよく、造血細胞（例えば骨髄細胞、マクロファージ、単核細胞、樹状細胞、Ｔ細胞又はＢ細胞）、繊維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト又は筋細胞を含むがこれに限定されるものではない。
例えば、ＮＬＲＲ−１又はＥＧＦＲアンタゴニストが抗体である場合、抗体は非経口投与、皮下投与、腹腔内投与、肺内投与及び鼻腔内投与、局所的免疫抑制治療を望む場合は病巣内投与を含むあらゆる適当な手段によって投与される。非経口的注入は、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与又は皮下投与を含む。さらに、抗体は、パルス注入、特に抗体の用量減少を伴うパルス注入によって適切に投与される。好ましくは、投薬は、投与が短期間か長期間にわたるかどうかに部分的に依存して、注射（最も好ましくは静脈内注射又は皮下注射）によって与えられる。
他の例では、疾患又は腫瘍の位置が許し、注射が周期的に繰り返すことができる場合、ＮＬＲＲ−１又はＥＧＦＲアンタゴニスト化合物は、例えば直接注射によって局所的に投与される。局所再発又は転移を予防又は減少させるために、腫瘍の外科的切除に続いて、ＮＬＲＲ−１又はＥＧＦＲアンタゴニストは、対象に全身的に送達されても、直接腫瘍細胞（例えば腫瘍又は腫瘍床）に送達されてもよい。
治療剤の併用投与は、一般的に、定義された時間（選択される併用によって、通常、分、時間、日又は週）にわたって実行される。併用療法は、連続した方法におけるこれらの治療剤の投与（つまりそれぞれの治療薬が異なる時間に投与される投与）だけでなく、これらの治療薬又はこれらの治療薬の少なくとも２つが実質的に同時に投与される投与を包含することが意図されている。
治療剤は、同じ経路又は異なる経路で投与され得る。例えば、併用療法のＥＧＦＲインヒビターが経口投与されてもよいのに対して、併用療法のＮＬＲＲ−１アンタゴニストは静脈内注射によって投与されてもよい。あるいは、例えば、治療剤によって、両方の治療薬が経口投与されてもよく、両方の治療薬が静脈内注射によって投与されてもよい。治療薬が投与される順序は、薬剤によって異なる。
疾病の型及び重症度によって、例えば複数回の投与又は継続投与による、それぞれの治療剤の約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１−２０ｍｇ／ｋｇ）が、患者への候補初回投与量である。典型的な１日の用量は、前述の因子によって、約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ以上にまでわたり得る。少なくとも数日間にわたる反復投与では、状態によって、上記した方法で測定されるように、癌が治療されるまで治療は持続される。しかしながら、他の投与計画も有用であり得る。ある例では、ＮＬＲＲ−１又はＥＧＦＲアンタゴニストが抗体である場合、約５ｍｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇまでわたる用量で、本発明の抗体は２〜３週間ごとに投与される。ＮＬＲＲ−１又はＥＧＦＲアンタゴニストが経口小分子化合物である場合、薬剤は約２５ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇまでわたる用量で毎日投与される。さらに、本発明の経口化合物は、従来の高用量間欠投薬計画で投与する、もしくは定期的に中断することなくより低用量かつ頻繁な用量を用いて投与する（「メトロノミック治療」と称する）いずれかで投与することができる。間欠投薬計画が用いられる場合、例えば、薬剤は、１日量及び特定の効能に依存して、２〜３週間毎日投与した後に１週間中断する；又は４週間毎日投与した後に２週間中断して投与される。
本発明の治療の進歩は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
本出願は、遺伝子治療によるＮＬＲＲ−１又はＥＧＦＲアンタゴニストの投与を意図する。
細胞内抗体を生成するための遺伝子治療の使用に関して、１９９６年３月１４日に公開された国際公開第９６／０７３２１号を参照されたい。
核酸（場合によりベクターに含まれる）を患者の細胞に入れるための２つの主要な手法がある；インビボ及びエキソビボにおいて。インビボ送達では、通常抗体が必要である部位で、核酸が直接患者に注入される。エキソビボ治療では、患者の細胞は摘出され、核酸はこれらの単離された細胞に導入され、改質細胞は患者に直接投与されるか、例えば患者に移植される多孔性膜中にカプセル化される（例えば米国特許第４，８９２，５３８号及び第５，２８３，１８７号を参照）。核酸を生存細胞に導入するために利用可能な様々な技術が存在する。技術は、核酸がインビトロで培養細胞に、又はインビボで意図された宿主細胞に移入するかどうかによって変わる。インビトロで哺乳動物細胞への核酸の移入のための適切な技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などの使用を含む。
遺伝子のエキソビボ送達のために一般的に用いられるベクターは、レトロウィルスである。現在推奨されるインビボでの核酸移入技術は、ウイルスベクター（アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス又はアデノ随伴ウイルスのような）及び脂質ベースシステム（遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、例えばＤＯＴＭＡ，ＤＯＰＥ及びＤＣ−Ｃｈｏｌである）によるを含む形質移入である。いくつかの状況において、核酸供給源に標的細胞を標的とする薬剤（例えば標的細胞の細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体、標的細胞上の受容体に対するリガンド）を提供することが望ましい。リポソームが使用される場合、エンドサイトーシスと関連している細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、ターゲティング及び／又は取り込みを容易にするため用いられてもよい（例えば特定の細胞型にカプシドタンパク質又はその断片、循環中に内部移行するタンパク質に対する抗体及び細胞内局在を標的として細胞内半減期を増強するタンパク質）。
受容体媒介性エンドサイトーシスの技術は、例えばWu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)；及びWagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990)に記載される。現在知られる遺伝子標識及び遺伝子治療のプロトコールの説明については、Anderson et al., Science 256:808-813 (1992)を参照されたい。国際公開第９３／２５６７３号及びそこで引用される文献も参照されたい。
【００６３】
製品
本発明の他の一実施態様において、上述の疾患の治療又は診断に有用な材料を含む製品が提供される。製品は、容器、標識及び添付文書を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどを含む。容器はガラス又はプラスチックのような様々な材料で形成することができる。一実施態様において、容器は、疾患を治療するのに有効で、無菌の点検口を有し得る組成物を保持する（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。一実施態様において、組成物中の少なくとも一つの活性剤は、ＮＬＲＲ−１アンタゴニストである。ある実施態様では、組成物はさらにＥＧＦＲアンタゴニストを含む。もう一つの実施態様では、組成物は、ＮＬＲＲ−１アンタゴニスト及び少なくとも第二の活性分子を含み、化学療法剤、サイトカイン、ケモカイン、抗血管新生剤、免疫抑制因子、細胞障害性剤及び増殖阻害剤を含むがこれに限定されるものではない。容器上又は容器に付随する標識は、組成物が疾患の最適の治療に用いられることを示す。製品は、製薬的に許容可能なバッファー（例えばリン酸塩緩衝食塩水、リンゲル液及びブドウ糖溶液）を含む第二容器をさらに含んでもよい。本発明の製品は、さらなる活性薬剤、他のバッファー、希釈液、フィルター、針及びシリンジを含む、商用及び使用者の見地に望ましい他の材料をさらに含んでもよい。製品は、増幅されたＥＧＦＲを有さない癌を有する患者と同定した診断と関連してＮＬＲＲ−１アンタゴニストが用いられるという説明書をさらに含んでもよい。製品は、組成物がＥＧＦＲを標的とする治療に耐性がある癌を有する患者に用いられるという説明書をさらに含んでもよい。
【００６４】
材料の寄託
モノクローナル抗体ｍｕｍａｂ  ３Ｄ１．６．９の培養物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（10801University Blvd., Manassas, VA, USA（ＡＴＣＣ））に寄託され、ＰＴＡ−８７３２と命名された。
この寄託は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約およびそれに基づく規則（ブタペスト条約）の規定に基づいて行われた。これは寄託の日から３０年間、生存できる培養の維持を保証するものである。この生物は、当該米国特許の発行時または米国または他国の特許出願の公開時にいずれが最初になっても公衆に対してその培養の子孫の永続する無制限の利用可能性を保証し、３５ＵＳＣ１２２とそれに準ずる長官規則（８８６ＯＧ６３８に対する特別な参照を伴う３７ＣＦＲ１．１２を含む）に従って与えられるべき特許商標庁長官によって決定された者に対するその子孫の利用可能性を保証する、ジェネンテク，インコーポレイテッドとＡＴＣＣの合意を受けて、ブタペスト条約の約定の下にＡＴＣＣによって利用可能にされるであろう。
欧州特許が要求されるこれらの指摘に関して、寄託微生物のサンプルは、欧州特許の認可の陳述の公開までか、あるいは本出願が拒絶または取り下げ、または取り下げたものとみなされた日まで、サンプルを要求した個人により指名された専門家へのこのようなサンプルの供給によってのみ利用可能にされるであろう。（ルール２８（４）  ＥＰＣ）
本願の出願人は、適当な条件下で培養された時に寄託された培養が死滅するか、失われるか、あるいは破壊された場合、その通知時に直ちに、同じ培養の生存できる標本と交換することを合意している。寄託された株の利用可能性を、あらゆる政府の機関の下にその特許法に従って認可された権利に違反する本発明の実施に対する許諾であるとみなすべきではない。
上記の説明は当業者をして本発明を実施させるに足ると考えられる。寄託された態様は、本発明のある側面を例示するものであるに過ぎず、機能的に等価な構築物（コンストラクト）はすべて本発明の範囲に包含されるので、本発明は寄託された構築物によって範囲を制限されるべきではない。本明細書における物質の寄託は本明細書の記述が本発明のなんらか側面の実施を（その最適な方法を含めて）可能にするに足らないことを認めるものではなく、またそれらが表現する特定の例示に請求の範囲が制限されると見なすべきでもない。実際に、本明細書に示し記述するものに加えて、本発明の様々な変法が、上記の説明から当業者には明らかになるであろうし、これらも請求の範囲に包含される。
以下の実施例は、本発明の特定の実施態様を示すために含まれる。当業者であれば、以下に例示する技術は、本発明の実施例で非常に機能し、より好適な既知の実施形態を構成する発明者により発見された技術を示すものであることを理解するであろう。しかしながら、当業者であれば、本発明の開示を考慮して、開示されかつ同様の結果を得られる特定の実施例において、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変更が可能であることは理解できるであろう。明細書全体にわたる全ての引用文献は、本願明細書にその全てが援用されたものとする。
【実施例】
【００６５】
実施例１
材料及び方法
マイクロアレイ及びＲＴ−ＰＣＲ解析
マイクロアレイ解析：Tackels-Horne等によって記載されているように、ＮＬＲＲ−１転写産物はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ上で腫瘍及び正常組織で解析された（Tackels-Horne等、2001）。ＲＴ−ＰＣＲ解析：前立腺腫瘍は、Bio-Options（Fullerton, CA）及びArdais（Lexington, MA）から得られた。コーティングされたビーズ（Miltenyi Biotec Inc, Auburn, CA）を用いてＣＤ１３８で精製された細胞からなる多発性骨髄腫の試料は、Cureline（South San Francisco, CA）から得られた。ＲＮＡは、標準塩化セシウム手順の後に続くフェノールクロロフォルム抽出を用いて抽出された。抽出されたＲＮＡは、逆転写され、Ｔａｑｍａｎ  Ｇｏｌｄキット（Applied Biosystems, Warrington, UK）及び以下のプライマ及びプローブを用いて定量化された：ＮＬＲＲ−１フォワード：TCAATCCCACTAAATGAGCTGTA（配列番号：２）、リバース：GTCTGCAGAACCATCTTTGTCT（配列番号：３）、プローブ：CCACCACTCATTAACCTCTGGGAAGG（配列番号：４）；ＭＵＣ１フォワード：TGGCAGCAGCCTCTCTTA（配列番号：５）、リバース：CCCCTACAAGTTGGCAGAA（配列番号：６）、プローブ：CACAAACCCAGCAGTGGCAGC（配列番号：7）；ＲＰＬ１９フォワード：GCGGATTCTCATGGAACACA（配列番号：８）、リバース：GGTCAGCCAGGAGCTTCTTG（配列番号：９）、プローブ：CACAAGCTGAAGGCAGACAAGGCCC（配列番号：１０）。全ての実験は、二回行われた。ヒト・ゲノムＤＮＡ（BD Biosciences, San Jose, CA）はＣｔ（サイクル閾値）を量に変換する標準として用いられ、データはＲＰＬ１９で標準化された。
【００６６】
ＮＬＲＲ−１プラスミド構造及びトランスフェクション
ＣＨＯ発現のためのＮＬＲＲ−１．ＥＣＤ．ＨＩＳ構築物：Ｃ末端をＨｉｓで標識された  ＮＬＲＲ−１タンパク質の細胞外ドメインは、標準的なクローニング技術によって作製され、製造業者の説明書によってＦｕｇｅｎｅ６（Roche Diagnostics, Indianapolis, IN）を用いてCHO細胞にトランスフェクションされた。トランスフェクションの４８時間後、高発現クローンは２００ｎＭメトトレキサートを含み、ＧＨＴを含まない培地において選択された。ＮＬＲＲ−１タンパク質は、モノクローナル抗体の生成のためにＮｉ−ＮＴＡスーパーフローカラム（Qiagen, Valencia, CA）を用いて、トランスフェクションされたＣＨＯ細胞培養培地から精製された。バキュロウイルス発現のためのＮＬＲＲ−１．ＥＣＤ．ＨＩＳ構築物：Ｃ末端をＨｉｓで標識された  ＮＬＲＲ−１タンパク質の細胞外ドメインは、標準的なクローニング技術を用いて改変ｐＶＬ１３９３（BD Pharmingen, San Jose, CA）バキュロウイルス発現ベクターにクローニングされ、ＳＦ９昆虫細胞において発現された。タンパク質は、ウサギのポリクローナル抗体産生のためにＱセファロースカラムで精製された。ＮＬＲＲ−１．ＹＦＰ及びＮＬＲＲ−１Ｃ．ＹＦＰ構築物：全長及びＣＹＦＰ融合構築物は、ｐＥＹＦＰ−Ｎ１ベクター（Clontech Laboratories, Mountain View, CA）へのオーバーラップＰＣＲクローニングによって作製され、増強された黄緑色の蛍光タンパク質をコード化する。ＨＥＫ２９３細胞は、製造業者の説明書に基づいてＰｏｌｙｆｅｃｔ（Qiagen）を用いてトランスフェクションされ、ｃｏｓ−７細胞は、製造業者の説明書に基づいてＦｕｇｅｎｅ６を用いて連続二回トランスフェクションされた。ＮＬＲＲ−１Ｃはアミノ酸６８１で切断され、クラトリン媒介エンドサイトーシス・モチーフを削除した。（図１２Ａ−Ｂ）。
【００６７】
ＮＬＲＲ−１抗体の生成及びフローサイトメトリー
バキュロウイルスで発現され、精製されるＮＬＲＲ−１．ＥＣＤ．ＨＩＳタンパク質はウサギにおいてポリクローナル抗体を作製するために用いられた（Invitrogen）。５匹のＢａｌｂ／ｃマウス（Charles River Laboratories, Hollister, CA）は、モノクローナル抗体の生成のために、Ｒｉｂｉアジュバント（Ribi Immunochem Research, Inc., Hamilton, MO）においてバキュロウイルス又はＣＨＯで発現されたポリヒスチジン標識されたヒト細胞外ＮＬＲＲ−１タンパク質で過免疫化された。これらのマウスからＢ細胞（その全ては、直接ＥＬＩＳＡにより高い抗ＮＬＲＲ抗体力価が示され、フローサイトメトリーによりトランスフェクトされた２９３、ＤＰ−１２ＣＨＯ及び内因的に発現しているＬｎＣＡＰ細胞に発現したＮＬＲＲへの特異的結合を示した）は、以前記載されているものと類似した改変プロトコルを用いて（Kohler and Milstein, 1975; Hongo等、1995）、マウス骨髄腫細胞（X63.Ag8.653; American Type Culture Collection, Rockville, MD）と融合させた。１０−１２日後、上清は抗体産生のために、直接ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーによって採取され、スクリーニングされた。合計８つの陽性クローンは、限界希釈によるサブクローニング２回の後に最も高い免疫結合を示し、さらなる特徴付けのために増殖、培養された。それぞれのハイブリドーマ系統から採取された上清は、以前記載されているものと類似した改変プロトコルを用いて（Hongo等、1995）、アフィニティークロマトグラフィ（Pharmacia fast protein liquid chromatography [FPLC]; Pharmacia, Uppsala, Sweden）により精製された。精製された抗体標本はその時、無菌ろ過され（０．２−μｍ細孔径；Nalgene, Rochester NY）、４℃でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に保存された。
精製されたモノクローナル抗体は、ベクター又はＮＬＲＲ−１ＹＦＰ構築物で一過性トランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリーによって試験された。細胞はＮＬＲＲ−１モノクローナル抗体及びそれに続くマウスＩｇ−ａｌｅｘａ６４７二次抗体を用いて氷上でそれぞれ３０分間染色され、ＦＡＣＳｃａｎ（BD Biosciences）で解析された。細胞は前方散乱（ＦＳＣ）、側方散乱（ＳＳＣ）、よう化プロピジウム（ＰＩ）及びＹＦＰについてゲーティングされ、Ｆｌｏｗｊｏ（Treestar, Ashland, OR）で解析された。（図１４）
【００６８】
細胞培養
ヒト腫瘍株ＮＣＩ−Ｈ２００９、ＮＣＩ−Ｈ６４７、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＮＣＩ−Ｈ１７８１、ＮＣＩ−Ｈ２２６及びＳＫ−ＭＥＳ−１は、ＲＰＭＩ１６４０培地において維持された。ＨＥＫ２９３細胞は、Ｆ１２：ＤＭＥＭ高グルコース５０：５０培地において維持された。ＣＨＯＤＰ１２細胞は、ＧＨＴを伴うＦ１２：ＤＭＥＭ  ５０：５０培地において維持された。Ｃｏｓ−７細胞は、Ｆ１２：ＤＭＥＭ  ５０：５０培地において維持された。全ての培地は、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン及びペニシリン−ストレプトマイシンを補充された。
免疫蛍光法
ＮＬＲＲ−１．ＹＦＰ又はＮＬＲＲ−１  Ｃ．ＹＦＰで一過性トランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞は、８つのチェンバーガラススライド上へ播種された。細胞は、室温で２０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＮＬＲＲ−１抗体染色のために、細胞は室温で２０分間、０．４％サポニン・バッファーで透過処理された。細胞はＮＬＲＲ−１ウサギ・ポリクローナル抗体及びそれに続くウサギ−Ｃｙ−３二次抗体により染色された。スライドはＤａｐｉを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウント培地でマウントされた（Vector Lab, Burlingame, CA）。像は、カメラを備えた顕微鏡において６０倍率で得られた。像の重ね合わせは、ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアを用いて作製された。
免疫組織化学
組織マイクロアレイはＣｙｂｒｄｉ（Frederick, MD）から購入された。抗原賦活は、Ｂｏｒｇ  Ｄｅｃｌｏａｋｅｒ、Ｒｅｖｅａｌ又はＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｒｅｖｅａｌ（Biocare Medical, Concord, CA）中で沸騰することによって行われた。ＮＬＲＲ−１ポリクローナル抗体及びコントロール・ウサギＩｇ抗体は、６ｕｇ／ｍｌで用いられた。シグナルは、Biocare Medicalから得られたＭＡＣＨ３システムを用いて検出された。
【００６９】
免疫共沈降及びウエスタンブロット解析
細胞は、プロテアーゼインヒビター・カクテル（Roche, Basel, Switzerland）及びＰＭＳＦを含むＴＢＳ中の０．５％ＮＰ４０において１０分間氷上で溶解された。ＤＮＡは１８ゲージ針によってせん断され、破片は遠心によって取り除かれた。溶解物は４℃で３０分間回転させて、１０ｇ／ｍｌ−ＧＰ１２０モノクローナル抗体を用いて予め除去された（Genentech, Inc）。予め除去された溶解液は、１０ｇ／ｍｌのＮＬＲＲ−１モノクローナル抗体、ＥＧＦＲ（Cell Signaling, Danvers, MA）又はブタクサ（Genentech, Inc., South San Francisco, CA）抗体と共に、４℃で２時間回転させてインキューベートされ、タンパク質Ｇアガロースビーズで沈降された。沈殿物は溶解緩衝液で４回洗浄され、４−１２％Ｂｉｓ−トリス・ゲル（Invitrogen, Carlsbad, CA）で分離された。タンパク質は、ＰＶＤＦ膜（Invitrogen）上に転写され、ＮＬＲＲ−１ポリクローナル １／５００（Genentech, Inc.）、ＥＧＦＲモノクローナル抗体 １／１０００（MBL Corporation, Woburn, MA）、ＥＲＢＢ２ １／１０００（LabVision, Fremont, CA）、Ｈｅｒ３ １／１０００（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）、ＩＧＦ１Ｒ １／１０００（Cell Signaling）及びアダプシン １／５００ (Santa Cruz Biotechnology)を用いたウェスタン解析により検出された。
ＥＲＫリン酸化（Ｐ−ＥＲＫ）及びＡＫＴリン酸化（Ｐ−ＡＫＴ）アッセイ
細胞は、７５−８５％  の培養密度で６０ｍｍのプレートに播種され、オーバーナイトで回復させた。細胞は、ＯｐｔｉｍｅｍＩ（Invitrogen）中で２ｇ／ｍｌの抗体を用いてオーバーナイトでインキュベーションする前に、６〜８時間Ｏｐｔｉｍｅｍ  Ｉ中で飢餓された。細胞は、３７℃で１０％血清、ＥＧＦ又はＴＧＦαで刺激され、直ちに氷上に置かれた。セルスクレーパーは、ホスホ−バッファー（ＰＢＳ中に１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭアジ化ナトリウム、１ｇ／ｍｌ  マイクロシスチン、１ｍＭ−グリセロールリン酸）中の細胞を採取するために用いられた。セルは、氷上で２０分間の氷冷９０％メタノールの透過化処理の前に、３７℃で１０分間、ホスホ−バッファー中の１％ホルムアルデヒドで固定した。細胞は、Cell Signaling Technologies（Danvers, MA）から得られたＰ−ＥＲＫ及びＰ−ＡＫＴ抗体及びそれに続く蛍光性接合二次−ウサギ又は−マウスＩｇで染色された。５，０００〜１０，０００のイベントは、フローサイトメトリーのために回収され、ＦＳＣ及びＳＳＣについてゲーティングされた。ＹＦＰ構築物でトランスフェクションされたＨＥＫ２９３及びＣｏｓ−７細胞は、刺激、採取及び上記のように染色する前に、オーバーナイトで飢餓された。１０，０００〜５０，０００のイベントはフローサイトメトリーのために回収され、細胞はＦＳＣ、ＳＳＣ及びＹＦＰについてゲーティングされた。
【００７０】
ＮＬＲＲ−１のｓｉＲＮＡノックダウン及びアッセイ
ＮＬＲＲ−１ｓｉＲＮＡ二体鎖は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Lafayette,CO）によって設計及び合成された。センス配列はGCCAGAACCUGAAAUUUACUU（配列番号：１１）であり、アンチセンス配列は5'-PGUAAAUUUCAGGUUCUGGCUU（配列番号：１２）である。ＮＣＩ−Ｈ２００９、ＮＣＩ−Ｈ６４７、ＮＣＩ−Ｈ２２６及びＳＫ−ＭＥＳ−１細胞は２８３０／ｃｍ２で播種され、ＮＣＩ−Ｈ５２０及びＮＣＩ−Ｈ１７８１細胞は５６６０／ｃｍ２で播種された。トランスフェクタントが新しい培地に交換される前に、１００ｎＭのｓｉＲＮＡはＤｈａｒｍａＦＥＣＴ４で６〜８時間トランスフェクションされた。非ターゲッティングｓｉＲＮＡ配列（Dharmacon）はネガティブコントロールとして用いられた。ＲＴ−ＰＣＲは、製造業者の説明書に基づいてＲＮｅａｓｙを用いて６０ｍｍのプレートから抽出されたＲＮＡについて行われた（Qiagen, Valencia, CA）。ＥＧＦＲフローサイトメトリー及び免疫ブロット：２４時間のｓｉＲＮＡトランスフェクションの後、細胞は採取され、フローサイトメトリー解析のためにＰＥに接合された−ＥＧＦＲ抗体（BD Pharmingen）及びよう化プロピジウムで染色された。１０，０００のイベントは回収され、細胞はＦＳＣ、ＳＳＣ及びＰＩについてゲーティングされた。イムノブロット分析のために、溶解物はＥＧＦＲ（ＭＢＬ）又はβチューブリン（Santa Cruz Biotechnology）で免疫ブロットされた。増殖アッセイ：ｓｉＲＮＡノックダウンは、説明したように、９６穴プレートにて行われた。細胞増殖は、製造業者の説明書に基づいてＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Promega, Madison, WI）により４日間後に評価された。アポトーシス及びエルロチニブ相乗効果アッセイ：ｓｉＲＮＡトランスフェクションは、説明したように、６０ｍｍのプレートにて行われた。細胞は、１２００／ｗｅｌｌで９６穴プレートに播種された。エルロチニブアッセイのために、細胞は、２ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含む培地で希釈されたエルロチニブで処理された。飢餓を伴うアポトーシス・アッセイのために、細胞はＯｐｔｉｍｅｍＩにおいて飢餓された。両方のアッセイのために、細胞生存率はＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Promega, Madison, WI）で測定され、アポトーシスは２日間後にＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ３／７（Promega）で測定された。図の説明文に示されるように、データは平均±標準偏差（ＳＤ）又は標準誤差（ＳＥ）としてグラフで示される。
【００７１】
実施例２
ＮＬＲＲ−１は前立腺腫瘍において発現され、高悪性度の疾患と関連している
ＮＬＲＲ−１発現は初期発生及び神経芽細胞腫と関連していた（Aubert等、2003; Haines等、2005; Hamano等、2004）。ＮＬＲＲ−１は、いくつかの他の腫瘍型とともに、前立腺腫瘍において発現されることが見いだされた（図１Ａ、Ｂ、図２Ａ）。レーザー捕捉顕微解剖及び発現プロファイリングは前立腺上皮（図１Ｂ）の発現を確認し、ＮＬＲＲ−１の細胞外ドメインに特異的なポリクローナル抗体での前立腺腫瘍の染色は前立腺腫瘍の形質膜染色を明らかにした。
前立腺腫瘍におけるＮＬＲＲ−１の発現は、場合によりグリーソン・スコア７以上のより高い転写レベル及びグリーソン７未満のより低い転写レベルの疾患、前立腺上皮細胞間の腫瘍形成及び前立腺肥大症などの特に悪性度の高い疾患と関連していた。より高いグリーソン・スコアは、前立腺癌におけるより低い予後と関連した臨床パラメータである（Andren等、2006b; Gleason and Mellinger, 1974）。ＮＬＲＲ−１と悪性度の高い疾患及び低い予後との関連の独立試験として、ＭＵＣ１及びＮＬＲＲ−１の転写産物定量は、前立腺腫瘍から単離されたＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析を用いて行われた（図１Ｄ）。ＭＵＣ１は前立腺癌による死の非常に増加したリスク及び前立腺癌の進行と関連し、他の臨床パラメータから独立している（Andren等、2006b; Lapointe等、2004）。ＭＵＣ１及びＮＬＲＲ−１の発現は、ｒ２が０．９３であり非常に相関しており（図１Ｃ）、更に高い悪性度、低い予後の疾患と高いＮＬＲＲ−１発現との関連を裏づける。 
【００７２】
実施例３
ＮＬＲＲ−１は多くの異なる腫瘍において発現され、その発現は上昇したＥＧＦＲと反相関する
転写産物解析は、ＮＬＲＲ−１が、前立腺腫瘍だけでなく上皮性腫瘍及びいくつかの悪性度の高い血液癌（例えば多発性骨髄腫及びマントル細胞リンパ腫）全体にも発現されたことを明らかにした（図２Ａ，Ｂ；図９Ａ）。比較として、高いＮＬＲＲ−３転写産物は、腫瘍試料の非常により小さいサブセットにおいて検出された（図９Ｂ）。対応している正常組織におけるＮＬＲＲ−１の発現はより制限されており、転写産物はほとんど検出されなかった（図２Ａ）。ＮＬＲＲ−１ポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学により、膵臓、乳房、肺及び転移性結腸のこれらの異なる腫瘍型のいくつかにおけるタンパク質の発現が確認された。
このデータは、ＮＬＲＲ−１がＥＧＦＲ経路シグナリングを容易にし、ＥＧＦＲの増幅を必要とすることのない経路活性化を増加させる手段を提供することを示す。腫瘍における１又は他の遺伝子の高い発現が経路刺激に十分であるように、腫瘍におけるいくらか反相関している発現パターンが予想され得る。このようなパターンは、例えば、ＥＧＦＲ及びＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）転写産物に対して、主に乳腫瘍のサブセットにおけるＥＲＢＢ２増幅により観察され（図２Ｃ）、ＮＬＲＲ−１及びＥＧＦＲの転写産物データを前立腺、肺、乳房、結腸、膵臓、腎臓、胃、子宮内膜及び卵巣の腫瘍のトータルで全体を比較する場合もまた明白だった（図２Ｄ）。ＥＧＦＲの高いレベルを発現している大部分の腫瘍はほとんどＮＬＲＲ−１発現を示さず、高いＮＬＲＲ−１転写産物を伴う腫瘍は、よくても適度な、一般的には低いＥＧＦＲのレベルを有していた。ＣＢＬ及びＣＤＨ１（リプレッサ能力のＥＧＦＲと関連しているが、直接にフォワード・シグナリングに関係していない（Levkowitz等、1998; Qian等、2004））のような他のタンパク質は、同じ腫瘍データにおいてこの転写産物反相関のパターンを示さなかった（図１０Ａ，Ｂ）。  
【００７３】
実施例４
ＮＬＲＲ−１は、物理的にＥＧＦＲと関連し、ＭＡＰキナーゼ活性化を促進する
ＮＬＲＲ−１及びＥＧＦＲ間の起こり得る物理的相互作用は、免疫共沈降解析によって調査された。抗ＮＬＲＲ−１又はＥＧＦＲモノクローナル抗体は、ＮＬＲＲ−１を内因的に発現する細胞株からのタンパク質を沈殿させるために用いられ、ＥＧＦＲ又はＮＬＲＲ−１の存在の免疫ブロットによって解析された。乳腫瘍株ＢＴ５４９において抗ＮＬＲＲ−１モノクローナル抗体で細胞を処理することは効果的にＥＧＦＲを共沈降させ、相互実験において抗ＥＧＦＲ抗体はＮＬＲＲ−１を沈降させることが可能だった（図３Ａ）。細胞が無関係なタンパク質（ブタクサ）に対する抗体を用いて同じ条件下で処理された場合、どちらのタンパク質も沈降しなかった。この解析はＮＬＲＲ−１を高レベルで発現する肺腫瘍細胞株ＮＣＩ−Ｈ２００９に対しても拡張された。ＮＬＲＲ−１、ＥＧＦＲ及びＥＲＢＢ２に対する抗体を用いた抗ＮＬＲＲ−１抗体で処理された溶解物のプロービングブロットは全て適切なサイズのバンドを生じたのに対し、ＥＲＢＢ３又は異なる受容体チロシンキナーゼファミリーメンバーであるＩＧＦ１Ｒでは検出されなかった（図３Ｂ）。これらのデータは、ＮＬＲＲ−１がＥＧＦＲと直接又はＥＧＦＲシグナリング複合体の他の成分を経て間接的のいずれかにより、物理的に関連することを示唆する。ＮＬＲＲ−１とクラトリンコート形成タンパク質アダプチン（ＡＰ２Ｂ１）との関連もまた保存されたクラトリン媒介エンドサイトーシス・モチーフに基づいて予想され（Fukamachi等、2002）、これはＮＣＩ−Ｈ２００９細胞の免疫共沈降及びイムノブロット分析（図３Ｂ）によっても検出された。
ＭＡＰキナーゼ・シグナリングを促進する際のＮＬＲＲ−１の役割は、Ｃ末端ＹＦＰ標識ＮＬＲＲ−１を用いて調査された。トランスフェクションされた細胞は、ＹＦＰ発現細胞についてゲーティングされ、ＥＧＦ又はＴＧＦαのいずれかで刺激してリン酸化ＥＲＫについて定量的フローサイトメトリー解析にかけられた（この方法論に関する付加的なデータについては図１１Ａ，Ｂを参照）。シグナリングの増強は、Ｃｏｓ−７細胞（図４Ａ）においてＥＧＦ刺激では検出されなかった。しかしながら、ベクターをトランスフェクションされたコントロールと比較して、ＮＬＲＲ−１でトランスフェクションされた細胞において、ＴＧＦαを用いた刺激はＭＡＰキナーゼ活性化の大きさの有意な増加を産生した（図４Ｂ）。これらの所見は、ＮＬＲＲ−１がＴＧＦα媒介ＥＧＦＲシグナリングを促進するものとして役立つことを示唆する。  
ＮＬＲＲ−１は、クラトリン媒介エンドサイトーシス・モチーフ（おそらく細胞膜でのシグナリング成分のクラスタリング及び内部移行複合体のシグナリングを促進することによって、ＮＬＲＲ−３のそれはＥＧＦの低濃度に応答してシグナリングを容易にする役割を果たす）を含むＣ末端領域の完全な保存を含む、ＮＬＲＲ−３と有意な配列相同性を共有する。正常細胞にトランスフェクションされたＹＦＰ標識欠損構築物のフローサイトメトリーは、ＮＬＲＲ−１のエンドサイトーシス・モチーフがＮＬＲＲ−１の内部移行を促進する働きをすることを示した（図５Ａ）が、ＮＬＲＲ−１はこのモチーフなしで内部移行された。腫瘍細胞におけるＥＧＦＲの内部移行に対するＮＬＲＲ−１発現の効果をより直接的に取り組むために、ＮＬＲＲ−１は、内因的に発現する腫瘍細胞株（図６Ａ）においてｓｉＲＮＡノックダウンを用いて減少され、表面ＥＧＦＲタンパク質レベルをフローサイトメトリーによって解析し、非ターゲッティングｓｉＲＮＡコントロール（図５Ｂ）と比較した。定量的フローサイトメトリー（ＮＣＩ−Ｈ２００９、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ６４７）のための充分なＥＧＦＲを伴う３つの腫瘍株において、表面ＥＧＦＲの増加はＮＬＲＲ−１減少細胞において検出され、その大きさは、最も高い内因性レベルのＮＬＲＲ−１を発現した細胞（ＮＣＩ−Ｈ２００９、図６Ａ；図５Ｂ）において最も大きかった。これらのデータは、ＥＧＦＲシグナリング複合体の取り込み促進におけるＮＬＲＲ−１の役割を裏づける。減少したＮＬＲＲ−１の細胞及びコントロール減少細胞においてトータルＥＧＦＲタンパク質のレベルは不変であり、表面における発現の減少が増加した分解によるものではなかったことを示した。
【００７４】
実施例５
ＮＬＲＲ−１は、内在的に発現する腫瘍細胞株における細胞生存率及びアポトーシスへの耐性にとって重要である
腫瘍細胞におけるＮＬＲＲ−１の役割は、ＮＬＲＲ−１が様々な転写産物レベルで内因的に発現された５つの非小細胞肺癌細胞株（ＮＣＩ−Ｈ２００９、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＮＣＩ−Ｈ６４７、ＮＣＩ−Ｈ１７８１、ＮＣＩ−Ｈ２２６；図６Ａ）のパネルを用いて、更に調査された。ＡＴＰベースの定量的細胞生存アッセイ（図６Ａ、Ｂ）を用いて解析した場合、ｓｉＲＮＡを用いたＮＬＲＲ−１のノックダウンは非ターゲティングｓｉＲＮＡコントロールと比較して、全ての細胞株で類似した増殖異常を生じさせた。対照的に、増殖の重大な異常は、ＮＬＲＲ−１を発現しなかった肺癌細胞株であるＳＫ−ＭＥＳ１におけるＮＬＲＲ−１ｓｉＲＮＡノックダウンでは観察されなかった（図６Ａ，Ｂ）。
腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ経路の活性化は、細胞生存を含む多くの重要な細胞過程に影響を及ぼす。ＥＧＦＲシグナリングは、細胞表面において内部移行された複合体から発生し、エンドソーム関連ＥＧＦＲシグナリングは細胞生存に導くシグナル伝達経路の刺激に関与する（Wang等、2002）。ＥＧＦＲシグナリング複合体のクラスタリング及び内部移行の促進におけるＮＬＲＲ−１の考え得る役割を仮定すると、ＮＬＲＲ−１ノックダウンで観察された生存率異常は、生存率の明らか減少が減少した増殖のみから生じたかどうか、又はアポトーシス細胞死が役割を果たしていたかどうかを決定するために更に調査された。ＮＬＲＲ−１はｓｉＲＮＡを用いてノックダウンされ、細胞はアポトーシスを促進するために飢餓にかけられ、アポトーシスはカスパーゼ３／７活性により測定され、生存細胞で標準化された（図６Ｃ）。ＮＬＲＲ−１を内因的に発現した全ての細胞株は、非ターゲッティング・コントロールＲＮＡと比較して、ＮＬＲＲ−１のノックダウンに応じて、アポトーシスの増加を示した。これらのデータは、ＮＬＲＲ−１がこれらの内因的に発現している腫瘍細胞株の生存率にとって重要であり、アポトーシス細胞死の耐性に寄与することを示す。
【００７５】
実施例６
抗ＮＬＲＲ−１モノクローナル抗体は、腫瘍細胞におけるＭＡＰキナーゼ及びＰＩ３キナーゼの活性化を減らす
ここに示されるように、正常細胞にトランスフェクションする場合、ＥＲＫのリン酸化によって評価されるようにＮＬＲＲ−１はＭＡＰキナーゼ経路活性化を促進する。ＮＬＲＲ−１が腫瘍細胞において同様の役割を果たすかどうかを調査するために、肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２００９は抗体で処理され、血清、ＥＧＦ又はＴＧＦαで刺激され、ＥＲＫのリン酸化はフローサイトメトリーを用いて２５分間隔で定量的に評価された。抗ＮＬＲＲ−１モノクローナル抗体３Ｄ１は、血清及びＴＧＦαへの応答としてＥＲＫリン酸化の大きさを、無関係なタンパク質（ブタクサ）に対するコントロール抗体と比較して有意に減少させることができた（図７Ａ、Ｂ；図１１）。アッセイの堅実性の評価において、いくつかの独立して行われたアッセイを通した血清で刺激された細胞の解析は、ＥＲＫリン酸化の減衰が再現可能であり（図１１Ｂ）、別のＮＬＲＲ１−陽性細胞株（ＮＣＩ−Ｈ５２０）においても明白であったことを示した（図１１Ｃ）。これらのデータは、ＮＬＲＲ−１がＴＧＦα及び血清刺激に応答してＭＡＰキナーゼ経路活性化において重要な役割を果たし得ることを示す。  
ＮＬＲＲ−１でトランスフェクションされた正常細胞におけるＥＧＦを用いたＥＲＫ活性化で見られる効果の欠如と一致して、３Ｄ１抗体は１００ｎｇ／ｍｌ及び１ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの濃度ではＮＣＩ−Ｈ２００９においてＥＧＦ媒介シグナリングに対してほとんど効果がなかった（図７Ｃ（Ｄ））。ＥＲＫ活性化の遅延及び減少した大きさの証拠は、低濃度のＥＧＦでのみ明白であった（０．１ｎｇ／ｍｌ；図７Ｅ）。これらのデータは、ＮＬＲＲ−１がＥＧＦに応答してＭＡＰキナーゼの活性化を促進するという役割が低濃度ＥＧＦにのみ関連することを示唆する。この結果はそれでもなお宿主において増殖因子に限定的な環境で腫瘍細胞と生理的に関連するかもしれない可能性があり、これらのデータは非常に低いＥＧＦ濃度のみで観察されたホモログＮＬＲＲ−３により促進される増加した経路活性化とも一致している。（Fukamachi等、2002）。
ＥＧＦＲ活性化はＰＩ３キナーゼ経路を通したシグナリングをも生じさせ、細胞成長、増殖、生存及び運動性に影響を及ぼす反応カスケードを引き起こし、活発な腫瘍発達に寄与する（Hennessy等、2005; Vivanco and Sawyers, 2002）。腫瘍細胞でのＰＩ３キナーゼ経路シグナリングの促進におけるＮＬＲＲ−１の果たし得る役割は、したがって、１０％血清、ＴＧＦα及びＥＧＦで処理した上で抗ＮＬＲＲ−１モノクローナル抗体３Ｄ１及びリン酸化ＡＫＴの定量的フローサイトメトリーを用いて調査された。ＭＡＰキナーゼ活性化の所見と一致して、３Ｄ１はＴＧＦα又は１０％血清での刺激に応答してＡＫＴリン酸化の大きさを減らした（図７Ｆ（Ｇ））。また、ＥＧＦ刺激では阻害効果はほとんど見られず（図７Ｈ）、リン酸化の考え得る阻害のいくつかの証拠は超低濃度のＥＧＦのみで検出された（０．０１ｎｇ／ｍｌ、図７Ｉ）。
抗ＮＬＲＲ−１抗体３Ｄ１で観察されたＭＡＰキナーゼ活性化の減衰は、選択的ＥＧＦＲインヒビター、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）で生じた減衰と直接比較された。ＮＣＩ−Ｈ２００９細胞は、２ｕＭの以下のＩＣ５０を有し、エルロチニブ感受性として特徴づけられた（Yauch等、2005）。ＮＣＩ−Ｈ２００９細胞は、３Ｄ１、無関係なタンパク質（ブタクサ）に対するコントロール抗体、及び０．２５ｕＭ又は２．５ｕＭのエルロチニブの存在下において、ＴＧＦαで刺激された。２．５ｕＭのエルロチニブと同様に、３Ｄ１抗体は少なくともＭＡＰキナーゼ・リン酸化を減衰させることが可能であった（図７Ｊ、Ｋ）。抗体でのＮＬＲＲ−１のターゲティングが選択的キナーゼ・インヒビターによる直接的なＥＧＦＲのターゲッティングと同様の効果を生じたように、これらのデータはＮＬＲＲ−１発現が内因的に発現する細胞株において経路活性化に重要であることを示す。ＮＬＲＲ−１モノクローナル抗体（図１１Ｃ）でのＮＣＩ−Ｈ５２０におけるＭＡＰキナーゼ活性化の減衰は、エルロチニブ耐性細胞株においてもあてはまることを示す（Yauch等、2005）。  
【００７６】
実施例７
肺腫瘍細胞株におけるＮＬＲＲ−１の減少は、ＥＧＦＲインヒビターエルロチニブでの処理によるアポトーシスを促進する
腫瘍細胞悪性腫瘍に対するＥＧＦＲシグナリングの寄付は細胞生存の促進であり、選択的ＥＧＦＲインヒビターは腫瘍細胞におけるアポトーシスを増加させることを示した（Chinnaiyan等、2005; Moyer等、1997; Ng等、2002; Sordella等、2004）。結腸腫瘍細胞において、小分子インヒビターでのＥＧＦＲ及びＥＲＢＢ２のターゲッティングは、アポトーシスの相乗的増加を生じた（Zhou and Brattain, 2005）。この研究において用いられる肺腫瘍細胞株のいくつかはＮＬＲＲ−１を内因的に発現しており、８ｕＭ以上のＩＣ５０でエルロチニブ耐性として分類された（Yauch等、2005）。エルロチニブは併用療法において腫瘍細胞のアポトーシスを増強することが示された（Chinnaiyan等、2005; Ng等、2002）。内因的に発現する腫瘍株におけるＮＬＲＲ−１のノックダウンが増加したアポトーシスを生じるように、エルロチニブの存在下でのアポトーシスに対する感受性の変化が他の耐性細胞株におけるＮＬＲＲ−１のノックダウンにおいて観察されるかを決定するために研究は行われた。
ＮＬＲＲ−１はｓｉＲＮＡノックダウンを用いて減少され、細胞は増加した濃度のエルロチニブ存在下で培養された。カスパーゼ３／７活性によって評価されるように、これらの細胞株のいくつかはアポトーシスの増加を示した（図８）。感度の有意な増加は他のエルロチニブ耐性の細胞株であるＮＣＩ−Ｈ６４７でも明白であり（Yauch等、2005）（図８Ａ）、ＮＬＲＲ−１ノックダウン及びエルロチニブの相乗効果は、耐性の細胞株ＮＣＩ−Ｈ１７８１（図８Ｂ）、ＮＣＩ−Ｈ２２６（図８Ｃ）についても観察され、場合によりＮＣＩ−Ｈ５２０（図８Ｄ）においてより小さい程度が観察された。ＮＣＩ−Ｈ２００９はエルロチニブに感受性であり（Yauch等、2005）、ＮＬＲＲ−１が減少した細胞（図８Ｅ）における増加したアポトーシスを示さなかった。予想通りに、ＮＬＲＲ−１−ネガティブコントロール腫瘍細胞株であるＳＫ−ＭＥＳ（エルロチニブ感受性）は、ＮＬＲＲ−１のノックダウンによるアポトーシスの増加を示さなかった（図８Ｆ）。これらのデータは、ＮＬＲＲ−１がＥＧＦＲシグナリングにおいて重要な役割を果たすという我々の所見を裏づけており、ＮＬＲＲ−１がいくつかの腫瘍において見られるＥＧＦＲキナーゼ・インヒビター（例えばエルロチニブ）に対する非感受性に潜在的に寄与し得ることを示唆する。
【００７７】
文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図７Ｃ−Ｄ】
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【図７Ｅ−Ｆ】
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【図７Ｇ−Ｈ】
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【図７Ｉ−Ｊ】
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【図７Ｋ】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図８Ｃ−Ｄ】
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【図８Ｅ−Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ−Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ−Ｃ】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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