(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（１）に示される塩基配列又はその相補配列を含むプライマーセットと共に、下記の（２）〜（８）に示される塩基配列又はそれぞれの相補配列を含むプライマーセットから選択される少なくともいずれか１つのプライマーセットを含むことを特徴とする、サルモネラ属菌血清型の多重ＰＣＲ判別法用プライマーセット；
（１）invA遺伝子領域を増幅するためのプライマーセットであって、
片方のプライマーが配列番号１に示される塩基配列を含み、
他方のプライマーが配列番号２に示される塩基配列を含むプライマーセットである；
（２）Enteritidis特異的なプライマーセットであって、
片方のプライマーが配列番号３に示される塩基配列を含み、
他方のプライマーが配列番号４に示される塩基配列を含むプライマーセットである；
（３）Typhimurium特異的なプライマーセットであって、
片方のプライマーが配列番号５に示される塩基配列を含み、
他方のプライマーが配列番号６に示される塩基配列を含むプライマーセットである；
（４）Infantis特異的なプライマーセットであって、
片方のプライマーが配列番号７に示される塩基配列を含み、
他方のプライマーが配列番号８に示される塩基配列を含むプライマーセットである；
（５）Choleraesuis特異的なプライマーセットであって、
片方のプライマーが配列番号９に示される塩基配列を含み、
他方のプライマーが配列番号１０に示される塩基配列を含むプライマーセットである；
（６）Dublin特異的なプライマーセットであって、
片方のプライマーが配列番号１１に示される塩基配列を含み、
他方のプライマーが配列番号１２に示される塩基配列を含むプライマーセットである；
（７）Heidelberg特異的なプライマーセットであって、
片方のプライマーが配列番号１３に示される塩基配列を含み、
他方のプライマーが配列番号１４に示される塩基配列を含むプライマーセットである；
（８）Schwarzengrund特異的なプライマーセットであって、
片方のプライマーが配列番号１５に示される塩基配列を含み、
他方のプライマーが配列番号１６に示される塩基配列を含むプライマーセットである。
【請求項２】
（２）〜（８）に示される塩基配列又はそれぞれの相補配列を含むプライマーセットを全て含むことを特徴とする、請求項１に記載の多重ＰＣＲ判別法用プライマーセット。
【請求項３】
被検試料にサルモネラ属菌を増殖させる培養条件下で培養した後、被検菌株を分離して請求項１又は２に記載のプライマーセットを用いて多重ＰＣＲを行うことを特徴とする、サルモネラ属菌血清型の多重ＰＣＲ判別法。
【請求項４】
被検試料にサルモネラ属菌を増殖させる培養条件下で培養した後、被検菌株を分離せずに、請求項１又は２に記載のプライマーセットを用いて多重ＰＣＲを行うことを特徴とする、サルモネラ属菌血清型の多重ＰＣＲ判別法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
家畜生産の現場で問題となるサルモネラ属菌の主要な血清型(Enteritidis, Infantis, Typhimurium, Choleraesuis, Dublin, Heidelberg, Schwarzengrund)についての多重ＰＣＲによる簡易的な判別手法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サルモネラ属菌は、生物学的にはSalmonella enterica及びSalmonella bongoriの２菌種に、S.entericaがさらに６亜種に分類されるが、血清学的には、細胞壁リポ多糖類のＯ抗原と、鞭毛タンパク質のＨ抗原の組み合わせで２，５００を超える血清型（serovar）が存在している。サルモネラ属菌は、健康なヒトの消化管にはほとんど存在していないが、種々の動物の消化管内に常在菌として存在している場合が多い。これらのサルモネラ属菌は、各血清型によって病原性と宿主域が異なり、強い病原性がある血清型は限られており、ヒトへの感染性が問題となる血清型は少数である。日本家畜伝染病予防法における家畜の監視伝染病としては、S.Gallinarum-Pullorum及びS.Gallinarum-Gallinarumの血清型が引き起こす法定伝染病（ひな白痢、鶏チフス）、S.Abortuequiを原因菌とする届出伝染病の馬パラチフス以外には、Enteritidis、Typhimurium、Choleraesuis及びDublinの血清型が原因で引き起こされる食中毒性サルモネラ症のみが届出伝染病に指定されている。
我が国におけるヒトのサルモネラ属菌由来感染症として、かつては猛威をふるったS.Typhi及びS.Paratyphiが引き起こす腸チフスやパラチフス感染症の発生は上下水道の整備により激減したが、食卓の西洋化に伴いサルモネラ属菌による食中毒の発生件数は増加の一途をたどっている。近年、特に汚染鶏卵を用いた加工食品による大規模食中毒や汚染鶏肉を原因とする食中毒が多発しており、Enteritidisが原因菌である場合が最も多い。Enteritidisは、一般のサルモネラ属菌が食中毒を発症するために１０５〜１０６個必要とされるのに対して１０２個以下でも発症することがあり、２次感染を起こしやすい。上記Typhimurium、Choleraesuis及びDublinの血清型は検出される場合も多く、他に鶏を宿主とするInfantis及びHeidelberg血清型も高頻度で検出される。また、最近ではSchwarzengrund血清型による食中毒も増加傾向にあり、当該血清型は多剤耐性株の割合が高いことが問題となる。
以上のように、食中毒性サルモネラ症の原因菌に関しては、食中毒患者を扱う医療現場では、血清型にあった適切な治療をできるだけ早く施すために、感染サルモネラ属菌の血清型を早急に判別する必要がある。家畜生産現場においても、各農場で分離されたサルモネラ属菌の血清型が監視伝染病に含まれる場合には農場が執るべき対応が異なることから、同様に迅速かつ正確なサルモネラ属菌の血清型の判別が必要である。また、農場にどのようなサルモネラが存在するか把握することにより、外部から通常検出されないサルモネラ属菌が侵入した場合に迅速な対応が可能となる。このように、農場の衛生管理においてサルモネラ属菌の血清型を把握することは非常に重要である。
【０００３】
従来、血清型の特定は抗血清との凝集反応を観察する免疫的手法により行われているが、この手法は単離した菌株を用いて抗血清との凝集反応を確認する必要がある。また、サルモネラ属菌においてＨ抗原は複相性であり、血清型の確定には相誘導を行う必要があるため、確定までには増菌培養の終了後、更に１週間以上の検査期間を要する。さらに、凝集を目視で確認する際、擬陽性による誤判定の可能性があった。
このような背景から、近年ＰＣＲによる血清型同定の手法が多数報告されている。血清型を決定するという観点から、Ｏ抗原及びＨ抗原の各タイプ特異的な遺伝子又はその特徴的な一部領域の増幅を行い、増幅産物由来のバンドの出現パターンを解析して判定する手法が報告されている（非特許文献１、２）。これらの手法では、Ｏ抗原及びＨ抗原それぞれの組み合わせで血清型を確定する点では免疫的手法と同様であるため、血清型についての確定的な検査結果を得るには、多重ＰＣＲを適用したとしても１株あたり複数回の増幅工程が必要であり、複数の血清型が混入している可能性のある培養溶液の状態では測定できず、被検菌株の単離工程が必須である。
【０００４】
抗原関連遺伝子以外の血清型特異的配列を対象として検出を行う手法も報告されているが、既報の手法は単独の血清型を検出対象としたＰＣＲ、又は多重ＰＣＲを用いるといっても複数の対象遺伝子断片の増幅パターンを解析するものであり、確実に判別できる血清型は２〜３程度であった（非特許文献３−８）。例えばTyphimuriumとHeidelberg（非特許文献３）、CholeraesuisとParatyphi C（非特許文献４）、EnteritidisとTyphimurium（非特許文献５）について、他の血清型との判別が可能な手法が報告されている。Leaderらは多重ＰＣＲとキャピラリー電気泳動による分離を併用する判別法を報告しており、１６の遺伝子断片の増幅パターンを多重ＰＣＲにより解析し、多数の血清型についての判別を可能とした（非特許文献９）。しかし、この手法においても多重ＰＣＲは、各血清型に特異的な遺伝子断片を対象としているわけではなく、検出対象の遺伝子断片の増幅パターンで判定を行うため、複数の血清型が混在する場合には誤った判定に繋がる恐れがある。
最近報告された先行特許文献（特許文献１）におけるサルモネラ血清型の迅速判別法は、主要な血清型それぞれに特異的な遺伝子に着目するものであり、分離したサルモネラ属菌についてＯ抗原を同定した後、各血清型に特異的な３遺伝子全てで増幅が見られたものを当該血清型と判定する手法であるが、Ｏ抗原を同定する工程が必須である上に、判定しようとする血清型ごとに複数回のＰＣＲを繰り返す必要がある。同様に複数の血清型のサルモネラ菌株が混入した検体についての判定を行うことができないため、被検菌株の単離が必須である。そのために、解析のために最低でも１週間は必要であった。複数の血清型それぞれに特異的な遺伝子断片の検出を１度の多重ＰＣＲによる検出で行おうという試みもある（非特許文献１１、１２）が、いずれも主要な血清型のEnteritidisとDublin又はEnteritidisとTyphimuriumとが１回の多重ＰＣＲでは判別できない不完全なものであった。
したがって、食中毒に関連した病原性の高いサルモネラ菌の主要な血清型である上記Enteritidis、Typhimurium、Choleraesuis、Dublin、Infantis、Heidelberg、Schwarzengrund血清型を１回の多重ＰＣＲを利用して検出、判別できる方法であって、迅速、簡便でありながら高感度に判別できる多重検出法が強く望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−０３５５５２号公報
【特許文献２】米国特許第５６８３８８３号
【特許文献３】特開２００３−１９９５７２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Tennant SM et al., PLoS Negl. Trop. Dis. 4: e621 (2010)
【非特許文献２】Hong Y et al., BMC Microbiol. 8: 178 (2008)
【非特許文献３】McCarthy N et al., J Food Prot. 72: 2350-2357 (2009)
【非特許文献４】Woods DF et al., J Clin. Microbiol. 46: 4018-4022 (2008)
【非特許文献５】Trafny EA et al., Lett. Appl. Microbiol. 43: 673-679 (2006)
【非特許文献６】Kardos G et al., Lett. Appl. Microbiol. 45: 421-425 (2007)
【非特許文献７】Kim HJ et al., J Food Prot. 69: 1653-1661 (2006)
【非特許文献８】Wang SJ and Yeh DB, Lett. Appl. Microbiol. 34: 422-427 (2002)
【非特許文献９】Leader BT et al., J Clin. Microbiol. 47: 1290-1299 (2009)
【非特許文献１０】Elnifro EM et al., Clin. Microbiol. Rev. 13: 559-570 (2000)
【非特許文献１１】de Freitas CG et al., Int J Food Microbiol. 139:15-22(2010)
【非特許文献１２】Park SH et al., FEMS Microbiol Lett. 301:137-146(2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、サルモネラ属菌のうちでも食中毒の原因菌として主に畜産現場で問題となる血清型(Enteritidis, Infantis, Typhimurium, Choleraesuis, Dublin, Heidelberg, Schwarzengrund)について、１回の多重ＰＣＲを利用して検出、判別できる方法であって、より迅速でかつ高い感度で判別できる多重検出法を提供することを目的とする。また、被検試料由来増菌培養液からサルモネラ属菌を単離することなく直接多重ＰＣＲを行うことができる簡易判別法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明者らは、上記課題を解決するために、多重ＰＣＲの利点を最大限に活用するために、対象として選択したEnteritidis、Typhimurium、Choleraesuis、Dublin、Infantis、Heidelberg、Schwarzengrundの７血清型それぞれに特異的な断片を見出して、これら断片を増幅するプライマーセットを設計することができれば、１回のＰＣＲ反応によって、これら７血清型を全て検出しそれぞれを判定できる本来の多重ＰＣＲ法が確立できると発想した。
また、その際にサルモネラ属菌のみに存在する特異的遺伝子も同時に多重ＰＣＲで増幅させ、各血清型判別と同時に被検細菌がサルモネラ属菌に属することを確定してしまうことも発想した。
しかし、そのためには、７血清型それぞれに特異的な遺伝子領域を選択するだけではなく、さらにサルモネラ属菌特異的遺伝子を選定して、それぞれの領域を増幅するための計８種類のプライマーセットを設計する必要がある。頭で思い描くことは簡単でも、実際に正確な多重ＰＣＲの実現にはプライマー間の干渉が生じないプライマーを設計する必要があり（非特許文献１０）、プライマー数が増えるほどその困難性は指数関数的に増大する。また、サルモネラ属菌には非常に多様な血清型が存在するため、血清型特異的な配列を特定し、他の血清型に対する交差反応のないプライマーを作成すること自体も容易なことではない。上記既報の文献（非特許文献３−５、９）でも、１つの血清型に対し複数の増幅産物の出現パターンを検出することで血清型を特定しており、このことは、単一の断片で血清型を特定することが困難であることを示すものでもある。
本発明者らは、このような困難が予想されるにもかかわらず、あえて多重ＰＣＲ判別法の確立に挑み、鋭意研究の結果、上記７血清型それぞれに特異的で他のサルモネラ属菌血清型に対する交差反応のないプライマーセットを設計すると共に、サルモネラ属菌特異的なinvA遺伝子も同時に検出できるプライマーセットを設計することができた。このことにより、１回の多重ＰＣＲ工程を行うことで、被検菌株がサルモネラ属菌の上記７血清型のいずれかであるか否かを迅速かつ再現性よく判別することが可能となった。
しかも、この多重ＰＣＲ判別法は菌株を単離しない増殖培養液の状態でも十分に識別性のある結果を得ることができたことから、増殖培養液に適用する簡易判別法としても用いることができる。
以上の知見を得たことで、本発明を完成することができた。
【０００９】
すなわち、本発明は以下に示すとおりである。
〔１〕  下記の（１）〜（８）に示される塩基配列又はそれぞれの相補配列からなるプライマーセットを含むことを特徴とする、サルモネラ属菌血清型の多重ＰＣＲ判別法用プライマーセット；
（１）invA遺伝子領域を増幅するためのプライマーセットであって、
片方のプライマーが配列番号１に示される塩基配列、又は配列番号１の１もしくは２個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列からなり、
他方のプライマーが配列番号２に示される塩基配列、又は配列番号２の１もしくは２個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列からなる；
（２）Enteritidis特異的なプライマーセットであって、
片方のプライマーが配列番号３に示される塩基配列、又は配列番号３の１もしくは２個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列からなり、
他方のプライマーが配列番号４に示される塩基配列、又は配列番号４の１もしくは２個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列からなるプライマーセットである；
（３）Typhimurium特異的なプライマーセットであって、
片方のプライマーが配列番号５に示される塩基配列、又は配列番号５の１もしくは２個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列からなり、
他方のプライマーが配列番号６に示される塩基配列、又は配列番号６の１もしくは２個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列からなる；
（４）Infantis特異的なプライマーセットであって、
片方のプライマーが配列番号７に示される塩基配列、又は配列番号７の１もしくは２個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列からなり、
他方のプライマーが配列番号８に示される塩基配列、又は配列番号８の１もしくは２個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列からなるプライマーセットである；
（５）Choleraesuis特異的なプライマーセットであって、
片方のプライマーが配列番号９に示される塩基配列、又は配列番号９の１もしくは２個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列からなり、
他方のプライマーが配列番号１０に示される塩基配列、又は配列番号１０の１もしくは２個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列からなるプライマーセットである；
（６）Dublin特異的なプライマーセットであって、
片方のプライマーが配列番号１１に示される塩基配列、又は配列番号１１の１もしくは２個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列からなり、
他方のプライマーが配列番号１２に示される塩基配列、又は配列番号１２の１もしくは２個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列からなる；
（７）Heidelberg特異的なプライマーセットであって、
片方のプライマーが配列番号１３に示される塩基配列、又は配列番号１３の１もしくは２個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列からなり、
他方のプライマーが配列番号１４に示される塩基配列、又は配列番号１４の１もしくは２個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列からなるプライマーセットである；
（８）Schwarzengrund特異的なプライマーセットであって、
片方のプライマーが配列番号１５に示される塩基配列、又は配列番号１５の１もしくは２個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列からなり、
他方のプライマーが配列番号１６に示される塩基配列、又は配列番号１６の１もしくは２個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列からなるプライマーセットである。
〔２〕  被検試料にサルモネラ属菌を増殖させる培養条件下で培養した後、被検菌株を分離して前記〔１〕に記載のプライマーセットを用いて多重ＰＣＲを行うことを特徴とする、サルモネラ属菌血清型の多重ＰＣＲ判別法。
〔３〕  被検試料にサルモネラ属菌を増殖させる培養条件下で培養した後、被検菌株を分離せずに、前記〔１〕に記載のプライマーセットを用いて多重ＰＣＲを行うことを特徴とする、サルモネラ属菌血清型の多重ＰＣＲ判別法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の多重ＰＣＲ判別法は血清型特異的ＰＣＲ産物の検出により特定の血清型の存否を判定するため、抗血清との凝集反応で見られる擬陽性の可能性が低減される。また、単離したコロニーを用いたコロニーＰＣＲのみならず、増菌培養液より調製したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより血清型の判別が可能であり、増菌培養後６〜３０時間以内に結果が得られるので、特に医療現場での迅速な治療計画や農場での迅速な防疫に有効である。また、複数の血清型について一度の多重ＰＣＲ実験で判定可能な簡便性は検査コスト低下につながり、農場に存在するサルモネラ属菌の検査を定期的に行うことを容易にする。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の多重ＰＣＲと従来法との比較
【図２】サルモネラ属菌のEnteritidis血清型特異的プライマーによる増幅
【図３】サルモネラ属菌の各血清型特異的プライマーによる多重ＰＣＲ
【図４】サルモネラ属菌野生株の各血清型特異的プライマーによる多重ＰＣＲ
【図５】増殖培養液由来ＤＮＡを用いた多重ＰＣＲによるサルモネラ属菌の検出と同定
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．本発明の「多重ＰＣＲ血清型判別法」について
本発明において、サルモネラ属菌の「多重ＰＣＲ血清型判別法」というとき、１回の多重ＰＣＲ反応で、すなわち、同一のＰＣＲ反応チューブ内での、各血清型特異的なプローブセット群に基づくＰＣＲ反応（変性工程、アニーリング工程、増幅工程を２０サイクル以上繰り返す）のみで、多種類（本発明では７種類）の血清型に属するサルモネラ属菌であることを判別できる方法を指す。多重ＰＣＲ法を用いる方法であっても従来法のような対象遺伝子の増幅パターンで判別する場合は含まない。
本発明の多重ＰＣＲ血清型判別法を従来法と比較した図を図１として示す。（なお、図１における比較例としては、増幅パターンで認識する手法を用いている典型例である非特許文献３と比較した。）
【００１３】
２．本発明の検出対象となる血清型特異的プライマーセットの構築
（２−１）検出対象の血清型
本発明では、食中毒原因菌として医療現場で注目されている血清型であると共に、特に畜産物、乳製品など食品材料を提供している畜産現場の安全管理においても重要な血清型Enteritidis、Typhimurium、Choleraesuis、Dublin、Infantis、Heidelberg、Schwarzengrundの７血清型を選択した。Enteritidis、Typhimurium、Choleraesuis、Dublinは上述のように届出伝染病の原因菌として指定されており、Infantis、Heidelbergは鶏から高頻度で分離される血清型である。Schwarzengrundは、近年食中毒の発生件数が増加しており、分離株中の多剤耐性株の割合が高いことが報告されている。
【００１４】
（２−２）血清型特異的プライマーセットの構築
公的データベースより入手可能であったサルモネラ属菌のゲノム配列について、塩基配列の比較を行った。入手したゲノム配列は以下のとおりである：Choleraesuis str. SC-B67 (accession No.: NC_006905), Dublin str. CT_02021853 (NC_011205), Enteritidis str. P125109 (NC_011294), Gallinarum str. 287/91 (NC_011274), Heidelberg str. SL476 (NC_011083), Paratyphi A str. ATCC 9150 (NC_006511), Paratyphi B str. SPB7 (NC_010102), Paratyphi C strain RKS4594 (NC_012125), Schwarzengrund str. CVM19633 (NC_011094), Typhi str. CT18 (NC_003198), Typhimurium str. LT2 (NC_003197), Typhimurium str. 14028S (CP001363), Typhimurium str. D23580 (FN424405), Typhimurium SL1344 (FQ312003)。
【００１５】
ゲノム配列の比較には、公知のソフトウェアであるArtemis Comparison Tool (ACT)を用いた。上記の配列を適宜組み合わせて比較し、各血清型に特異的であると考えられる候補配列を探索した。血清型間での相同性がより低い配列を選抜するため、転写・翻訳の単位に拘らず標的配列を選択した。
選択した部位についてＢＬＡＳＴ解析を行い、他属の細菌等を含む既報の配列との相同性が低いことを確認した後、当該部位を検出するプライマーを設計した。Infantisは全ゲノム配列が公開されていなかったため、公開されていた部分配列(accession No.: J03391)を基にプライマーを設計した。
【００１６】
また、血清型特異的プライマーを用いて多重ＰＣＲを行う際に、同時にサルモネラ属菌存否の判定を行うために、サルモネラ属菌特異的な遺伝子としてinvA遺伝子を選択した。invAはほぼすべてのサルモネラ属菌が保持しており、サルモネラ属菌の簡易的な検出法に応用されている。例えば、先行特許文献にてＰＣＲ法やＬＡＭＰ法での検出に用いるプライマーが報告されている（米国特許５６８３８８３、特開２００３−１９９５７２）。当該invA遺伝子を対象とし、各血清型特異的プライマーとは干渉を起こさずに当該遺伝子の特異的な領域を増幅できるプライマーを設計した。
各プライマー設計にあたっては、多重ＰＣＲを行う際にアガロースゲルによる電気泳動で目視による判別が容易となるように各増幅産物の断片長を設定した。具体的には、各増幅産物の断片長がそれぞれに５０〜１２０ｂｐ異なるように複数セットずつ設計した。
【００１７】
（２−３）設計したプライマーの評価
設計したプライマーは、実施例１の（表１、２）に示すサルモネラ属菌ならびに複数の食中毒菌(Escherichia coli O157, E. coli O26, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Listeria monocytogenes, Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Pseundomonas aerginosa, Serratia marcescens)のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、それぞれの血清型に対応して、非特異的な増幅が見られない特異的プライマーが少なくとも１種類以上存在した（同表３、４）。
【００１８】
（２−４）本発明の多重プライマー群
本発明の実施例１の（表３、４）に示される各血清型での特異的プライマーから１種類ずつを選択した多重プライマー群の例を同（表５）に示す。
本発明の多重プライマー群はこの１例に限られるものではなく、表３、４に示す他の特異的プライマーセットを組み合わせる場合も含まれる。
また、本発明でプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチド断片は、１又は２塩基の範囲内の増減又は変異が導入されても各プライマーにより増幅される対象ＤＮＡ領域は同一であるから、１又は２塩基の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列も許容される。これらプライマーは、例えばビオチンやＤＩＧ等の公知の物質により標識してもよい。
【００１９】
３．本発明の血清型多重ＰＣＲ判別法の手順
（３−１）被検試料
被検試料としては、典型的には、家畜生産現場での、家畜の糞便、尿などの排泄物、血液、唾液などの体液、あるいは飼料、飼料添加物などと共に、医療現場での患者からの糞便、尿、血液、組織ホモジェネートなどであるが、畜産加工品、乳製品、鶏卵、卵製品などの飲食品も対象となる。
【００２０】
（３−２）サルモネラ属菌の培養方法
これら被検試料を本発明の多重ＰＣＲの試料として用いる際に、高濃度のサルモネラ属菌の存在が明らかな場合を除き、まず試料を培地に接種して、サルモネラ属菌に好ましい培養条件下で培養し、サルモネラ属菌を増菌させる。
なお、ＰＣＲを進行させるには、プライマーがハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存在すれば十分ではあるので、被検試料から直接核酸抽出してしまうことも可能であるが、再現性の高い結果を得るためには増菌工程を設けることが好ましい。
サルモネラ属菌の増菌培養条件は周知であり、例えば被検試料を緩衝ペプトン水に接種して３５℃にて一晩の培養を行った後に、その一部をＲＶ培地に接種して４２℃にて一晩の培養を行うことが好ましい。
本発明においては、当該増菌培養液から直ちにゲノムＤＮＡを抽出する下記（３−３）工程に移行することもできるが、各菌株ごとのコロニーを形成させる分離培養に供し、菌株を単離することが好ましい。
その場合の分離培養方法及び分離培養条件は周知であり、例えば、ＤＨＬ寒天培地に増菌培養液を塗布し、３７℃にて一晩の培養を行う。
【００２１】
（３−３）被検ＤＮＡ溶液の調製
分離培養で単離された菌株培養液、又は分離工程を省いた増菌培養液に対して溶菌酵素、界面活性剤、アルカリ等を用いる周知のＤＮＡ抽出法を適用する。例えば、培養液を遠心処理して菌体を回収して、細胞溶解液に懸濁し、加熱後遠心分離により回収した上清に対して、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によりＤＮＡを回収する。得られたＤＮＡをＴＥ緩衝液に溶解し、ＰＣＲに供する。
（３−４）ＰＣＲ工程
本発明の多重ＰＣＲで用いるＰＣＲ法では耐熱ポリメラーゼであるＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用い、通常の使用条件の範囲内で増幅させる。具体的には、９０〜９５℃で熱変成させた後、３７〜６５℃でアニーリング操作を行い、５０〜７５℃で重合反応を起こさせ、これを１サイクルとして２０から４２サイクル行って増幅させる。
（３−５）多重ＰＣＲによる増幅産物の検出
本発明の多重ＰＣＲによる増幅産物の分子量はいずれも約１５０〜７５０ｂｐの範囲内であるため、アガロースゲル電気泳動を用いて検出できる。エチジウムブロマイド等の慣用の染料で染色する。ゲル中のバンドの確認は写真から目視確認してもよいし、ゲル写真を映像データとしてコンピュータに入力し、写真の濃淡を解析することにより確認してもよい。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
なお、本発明で引用した先行文献の記載内容は、本明細書の記載内容として参照されるものとする。
【００２３】
［実施例１］各プライマーセットによる増幅の特異性の確認
（１−１）ＤＮＡ溶液の調製
サルモネラ属菌ならびにサルモネラ属に属しない食中毒菌の単離菌株を増菌培地に接種して培養した。培養液を１５，０００×ｇで２分間遠心し、上清を除去して菌体を回収した。回収した菌体を細胞溶解液(PrepMan(登録商標) Ultra Reagent、Applied Biosystems社) ２００μｌに懸濁し、沸騰水中で１０分間加熱した。加熱後の懸濁液を１５，０００×ｇで２分間遠心分離し、上清を回収した。上清からフェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によりＤＮＡを回収し、ＴＥ緩衝液４００μｌで溶解した。調製したＤＮＡ溶液をＰＣＲに供した。  
（１−２）ＰＣＲ
調製したＤＮＡ溶液０．６μｌを鋳型として供し、ＰＣＲを行った。ExTaq DNAポリメラーゼ(Takara社) ０．３７５Ｕ、１× ExTaq buffer、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、ならびに各０．３μＭのプライマーを含む１５μｌの反応液を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー(Bio-Rad社製iCycler）を用いて以下の反応を行った。すなわち、９４℃にて２分間の熱変性反応を行った後、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で４０秒間の３ステップからなるサイクリング反応を３０回繰り返し、サイクリング反応の終了後に７２℃で７分間の伸長反応を行った。
（１−３）検出
ＰＣＲによる増幅産物の検出はアガロースゲル電気泳動により行った。アガロースゲルはゲル濃度２％（Ｗ／Ｖ）とし、１００ｎｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含むものを用いた。ＴＡＥ溶液の入った泳動槽にゲルを浸し、１３５Ｖの定電圧で電気泳動を行った。電気泳動後のゲルにＵＶランプを照射し、増幅産物の検出ならびにＤＮＡ断片長の確認を行った。
（１−４）結果
Enteritidis、Typhimurium、Choleraesuis、Dublin、Infantis、Heidelberg、Schwarzengrundの７血清型について、各血清型に特異的な断片を増幅するプライマーセットをそれぞれ複数セット設計し、増幅の特異性を確認した。サルモネラ属菌標準株４４株（表１、２）のゲノムＤＮＡを鋳型として用いた。設計したプライマーセットの中には、標的血清型で増幅産物が検出されないもの、あるいは標的血清型以外のサルモネラ属菌についても増幅産物が検出されるものもあったため、標的血清型のみを特異的に検出するプライマーセットを選抜した。選抜したEnteritidis特異的プライマーセットによるＰＣＲの結果を図２に例示する。選抜したプライマーセットについて、サルモネラ属以外の食中毒菌のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅産物が検出されないことを確認した（図２、レーン１４〜２２）。invA検出用プライマーについては、サルモネラ属菌のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合のみ増幅産物が検出され、他属の細菌では増幅産物が検出されないことを確認した。
以上の結果から、各血清型について、それぞれ各１セットの血清型特異的なプライマーセットを得ることができた。各血清型の特異的プライマー群及びinvA遺伝子を増幅するプライマーのセットからなる多重ＰＣＲ判別法用プライマー群を表５に示す。
【００２４】
【表１】
0005727255.tif 000002
【００２５】
【表２】
0005727255.tif 000003
【００２６】
【表３】
0005727255.tif 000004
【００２７】
【表４】
0005727255.tif 000005
【００２８】
【表５】
0005727255.tif 000006
【００２９】
［実施例２］多重ＰＣＲ系の構築
（２−１）多重ＰＣＲ
実施例１で選抜した各血清型特異的プライマーセット７セット、ならびにinvA遺伝子を増幅するプライマーセットからなる多重ＰＣＲ判別法用プライマー群（表５）を用いて多重ＰＣＲを行った。
鋳型ＤＮＡ溶液０．６μｌ、ExTaq ＤＮＡポリメラーゼ(Takara社)  ０．３７５Ｕ、１×ExTaq buffer、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、ならびに各６６．７ｎＭのプライマーを含む１５μｌの反応液を調製し、実施例１と同一の条件で反応を行った。多重ＰＣＲ用の酵素を用いる場合には、Takara社製Multiplex PCR Assay Kitを用い、鋳型ＤＮＡ溶液１μｌを含む２０μｌの反応液を調製した。反応条件は、９４℃にて１分間の熱変性反応を行った後、９４℃で３０秒間、５８℃で９０秒間、７２℃で９０秒間の３ステップからなるサイクリング反応を３０回繰り返し、サイクリング反応の終了後に７２℃で１０分間の伸長反応を行うこととした。増幅産物は、実施例１と同様のアガロースゲル電気泳動により確認を行った。
（２−２）結果
サルモネラ属菌標準株４４株、ならびにサルモネラ属以外の食中毒菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、多重ＰＣＲを行った。汎用的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ExTaq）を用いて多重ＰＣＲを行ったところ、Schwarzengrund特異的プライマーセットについての感度が低下し、サルモネラ属以外の食中毒菌の一部で非特異的増幅産物が検出される不都合が確認されたので、Multiplex PCR Assay Kitを用いることとした。当該Assay Kitを用いることで上記不都合は解消された。Multiplex PCR Assay Kitを用いて得られた代表的な結果を図３に示す。
サルモネラ属菌標準株のＤＮＡを鋳型としたところ、すべての株においてinvAの増幅産物が検出された（図３、レーン１〜８）。特異的プライマーを構築した７血清型(Enteritidis、Typhimurium、Choleraesuis、Dublin、Infantis、Heidelberg、Schwarzengrund)については、invAの増幅産物に加え、各血清型特異的断片が検出された（図３、レーン１〜７）。それぞれのゲノムＤＮＡを混合して鋳型ＤＮＡとして用いたところ、それぞれの血清型に由来する特異的断片が検出され、非特異的産物は検出されなかった（図３、レーン９）。また、サルモネラ属以外の食中毒菌のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合には、いずれの増幅産物も検出されなかった（図３、レーン１０〜１８）。
以上の結果から、構築した多重ＰＣＲ系は、invAの増幅によるサルモネラ属菌の検出、ならびにEnteritidis、Typhimurium、Choleraesuis、Dublin、Infantis、Heidelberg、Schwarzengrundの７血清型については各血清型特異的な断片の検出による血清型の判別が可能であることが示された。
【００３０】
［実施例３］野外単離株を用いた多重ＰＣＲの検証
野外検体より単離されたサルモネラ属菌を用い、多重ＰＣＲの検証を行った。用いた菌株の血清型ならびに株数を表６に示す。
Enteritidis、Typhimurium、Choleraesuis、Dublin、Infantisについては、従来の手法で決定された血清型と多重ＰＣＲの結果が一致していた。Ｉ４，５，１２：ｉ：−は、検証した２株でいずれもTyphimurium特異的増幅産物を検出した。該血清型はTyphimuriumの単相型の変異株であると言われており、両者は遺伝的に非常に近いと思われる。このため、両者を判別することは非常に困難であることが容易に推測できる。この両者の判別が必要な場合は、さらに他の手法による確認が必要となる。
他の血清型、ならびに血清型が確定されていない株についてはinvAの増幅産物のみを検出した。
以上のように、本手法はTyphimuriumとＩ４，５，１２：ｉ：−の両者がTyphimuriumと判定されるものの、野外単離株の血清型別に有用であることが示された。
【００３１】
【表６】
0005727255.tif 000007
【００３２】
［実施例４］コロニーＰＣＲによる野外株の血清型別
（４−１）コロニーＰＣＲ
野外から得られた検体から、公定法に準じた作業によりサルモネラ属菌株の分離を行った。すなわち、検体１ｇあたり９ｍｌのリン酸緩衝ペプトン水を加え、３５℃にて２４時間の前増菌培養を行った。培養後、０．１ｍｌの前増菌培養液を増菌培養用培地１０ｍｌに加え、４２℃にて一晩の増菌培養を行った。増菌培養液から１白金耳を寒天培地上に塗布し、一晩培養して菌株を分離した。検出されたコロニーをコロニーＰＣＲに供した。実施例２と同様に調製した１５μｌの反応液にコロニーの一部を懸濁した後、サーマルサイクラーによって実施例１と同一の条件で反応を行った。増幅産物は実施例１と同様の手法により確認した。
（４−２）結果
野外検体より単離された菌株について、コロニーＰＣＲにより血清型別を行った（図４）。レーン１、２、７、８、９、１０、１１、１２、１７、１８について、invAならびにInfantis特異的断片が検出され、Salmonella Infantisであることが推測された。抗血清を用いてこれらの菌株の血清型を確定したところ、Infantisであることが確認され、多重ＰＣＲの結果と一致した。
また、外見上サルモネラ属菌であることが疑われたコロニーについても同様にコロニーＰＣＲを行ったが、増幅産物は検出されなかった（図４、レーン３〜６、１３〜１６、１９、２０）。これらの菌株について16S rDNAの配列を決定したところ、Proteus属の細菌であることが確認された。このため、多重ＰＣＲによりサルモネラ属菌特異的に増幅産物が検出されることが示された。
このように、野外検体より単離した菌株について、コロニーＰＣＲによりサルモネラ属菌であることの確認、ならびに簡易的な血清型別が可能であった。
【００３３】
［実施例５］増菌培養液由来ＤＮＡを用いたサルモネラ血清型迅速判別
（５−１）増菌培養液のＤＮＡ溶液の調製
野外検体から実施例４と同様の手法で増菌培養液を調製した。培養液２ｍｌを１５，０００×ｇで２分間遠心し、上清を除去して菌体を回収した。回収した菌体を細胞溶解液 (PrepMan（登録商標） Ultra Reagent、Applied Biosystems社) ２００μｌに懸濁し、沸騰水中で１０分間加熱した。加熱後の懸濁液を１５，０００×ｇで２分間遠心分離し、上清を回収した。上清からフェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によりＤＮＡを回収し、ＴＥ緩衝液４００μｌに溶解した。得られたＤＮＡ溶液を鋳型として多重ＰＣＲを行った。
（５−２）結果
実施例４と同一の検体から得られた増菌培養液よりＤＮＡを抽出し、それを鋳型として多重ＰＣＲを行った。その結果、５検体にサルモネラ属菌が存在することが確認された（図５、レーン１、４〜６、９）。レーン１、４〜６においてはinvAならびにInfantis特異的断片が検出され、これらの検体中にSalmonella Infantisが存在することが示唆された。実施例３は各検体から得られた単離株（各２株）についてコロニーＰＣＲを行っており、図４の検体１、２（レーン１、２）は図５の検体１（レーン１）から得られた菌株である。このように、検体１、４、５、６については単離菌株を用いたコロニーＰＣＲの結果と一致することが示された。
一方、検体９については、invA、Infantis特異的断片に加えEnteritidis特異的断片が検出された（図５、レーン９）。検体９から得られた分離菌株について、さらに６コロニーを検査したところ、８コロニー中１コロニーがEnteritidisであることが確認された。すなわち、増菌培養液由来ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行うことにより、複数の血清型を検出可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
サルモネラ属菌は罹患した宿主の糞便から検出されるため、糞便に存在するサルモネラ属菌の血清型を把握することは疾病の原因特定において重要である。従来法により糞便中に存在するサルモネラ属菌の血清型を同定するには、前述した理由により、採集した糞便検体からサルモネラ属菌を分離する必要がある。一方、本手法は対象とする血清型は限られるものの、ゲノムＤＮＡの抽出が可能であれば様々な検体に応用できるため、糞便の検査にも応用可能である。糞便からより効率的にゲノムＤＮＡを抽出する手法が開発されれば、本手法を用いた検査の感度も向上すると考えられる。また、糞便中にはＰＣＲを阻害する物質が含まれるため、現状では糞便から直接サルモネラ属菌を検出することは不可能であるが、この阻害を回避するＰＣＲ酵素やＰＣＲ反応緩衝液の開発により、糞便を直接検査する手法の開発に繋がる。
【配列表フリーテキスト】
【００３５】
１．invA-F1   AGTGCCGGTTTTATCGTGAC 
２．invA-R1   ACCGCCAGACAGTGGTAAAG 
・Enteritidis 
３．Ent1      TCAAGCATTGATACGGCAAG 
４．Ent2      CGCATTCTGCTCAATGAAAA 
・Typhimurium 
５．Tpm15     GCGTTGTTCCCTTTGTTCTG 
６．Tpm16     GACGCTGTTACGAGCCATTT 
・Infantis    
７．Inf3      GCGGCAGGTTGGTATTATTC 
８．Inf4      CTAAACGTTTTCCCGCTGTT 
・Choleraesuis       
９．Chs1      TCGCACCATGACCAAAAATA 
１０．Chs2    CACTCCGTCGTTCTGGGTAT 
・Dublin      
１１．Dub11   GCGTGAAGTGGCAACAGTAG 
１２．Dub12   ATATCGGCCAGTGCAGATTC 
・Heidelberg  
１３．Hdb15   TAACCAAACTCAGCGGCTCT 
１４．Hdb16   GGGGCGACTGATGCTATAAA 
・Schwarzengrund     
１５．Swg7    GAAGAGAACGCTCGGACAAC
１６．Swg8    CAGGCAATTCTCCGTCTCTC 
【図１】
0005727255.tif 000008
【図２】
0005727255.tif 000009
【図３】
0005727255.tif 000010
【図４】
0005727255.tif 000011
【図５】
0005727255.tif 000012
【配列表】
0005727255000001.app