(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第1異種ポリペプチドをエンコードする第1ポリヌクレオチドと、第2異種ポリペプチドをエンコードする第2ポリヌクレオチドと、第3異種ポリペプチドをエンコードする第3ポリヌクレオチドとを含む糸状菌であって、
前記第1異種ポリペプチドがSEQ ID NO: 9で定義される修飾されたトリコデルマ・リーゼイCBHIであり、
前記第2異種ポリペプチドがSEQ ID NO: 12で定義されるトリコデルマ・リーゼイCBHIIであり、
前記第3異種ポリペプチドがトリコデルマ・リーゼイCBHIとアシドサーマス・セルロリティカスエンドグルカナーゼIとが融合したCBHIエンドグルカナーゼＥ１融合ポリペプチドであり、前記糸状菌がCBHIが欠失したトリコデルマ・リーゼイである糸状菌。
【請求項２】
前記第3ポリヌクレオチドが、染色体外のポリヌクレオチドである、請求項１に記載の糸状菌。
【請求項３】
前記第1、第2、及び第3ポリヌクレオチドが、染色体外のポリヌクレオチドである、請求項１に記載の糸状菌。
【請求項４】
請求項１〜３に記載の糸状菌の集団を含む培地。
【請求項５】
請求項１〜３に記載の糸状菌から得られる前記第1異種ポリペプチド、前記第2異種ポリペプチド、及び前記第3異種ポリペプチドから成るポリペプチド混合物。
【請求項６】
前記ポリペプチド混合物がセルラーゼの混合物である、請求項５に記載のポリペプチド混合物。
【請求項７】
請求項１に記載の糸状菌からポリペプチド混合物を得る工程を含む、セルラーゼの混合物を製造する方法であって、前記ポリペプチド混合物が、前記第1異種ポリペプチド、前記第2異種ポリペプチド、及び前記第3異種ポリペプチドから成る、セルラーゼの混合物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連する出願とのクロスリファレンス
この出願は、本願に参照として組み込まれる2007年6月8日出願の米国仮出願番号US 60/933,894に基づく優先権を主張する。
【０００２】
２．政府の研究支援に関する記述
この研究の一部は、米国エネルギー省のPrime Contract No. DE-AC36-99G010337に基づくNational Renewable Energy LaboratoryとのSubcontract No. ZCO-0-30017-01による資金援助を受けた。従って米国政府はこの発明に関し一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
セルロース及びヘミセルロースは、光合成により産出される最も豊富な植物性資源である。  
セルロース等は、ポリマー性物質をモノマー性の糖へ加水分解する細胞外酵素を産出するバクテリア、イースト、及び菌類等の様々な微生物によって分解され、エネルギー源として用いられる。
【０００４】
セルラーゼは、セルロース(β-l,4-グルカン、またはD-グルコシド結合)を加水分解して、グルコース、セロビオース等を産出する酵素である。従来セルラーゼは、エンドグルコナーゼ(EC 3.2.1.4) ("EG")、エクソグルコナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ(EC 3.2.1.91) ("CBH")、及びβ-グルコシダーゼ(β- D-グルコシドグルコヒドラーゼ；EC 3.2.1.21) ("BG")の３種類に大別されている。エンドグルコナーゼは主にセルロース繊維のアモルファスな部分に作用し、一方、セロビオヒドロラーゼは結晶性セルロースを分解する。
結晶性セルロースを効率的にグルコースへ変換するためには、セルラーゼ系にCBH, EG及びBGの各成分が含まれていることが必要である。これは、各成分単独では結晶性セルロースの加水分解の効率が劣るためである(Filhoら、Can. J. Microbiol. 42巻、1-5頁、1996年)。
糸状菌中に多成分セルラーゼ系のセルラーゼを発現させることができれば、工業的スケールのセルラーゼの製造に有用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
以上に鑑み、本願は、非相同ポリペプチドと相同ポリペプチドとの組み合わせを産出する糸状菌、非相同ポリペプチドと相同ポリペプチドとの組み合わせから成るポリペプチド混合物を産出する糸状菌、及びポリペプチド混合物を製造する方法を提供するものである。
【発明を解決するための手段】
【０００６】
いくつかの実施形態では、本願により２種以上の非相同ポリペプチドをエンコードする２以上のポリヌクレオチドと、相同ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドとから成る糸状菌が提供される。
この糸状菌は非相同ポリペプチドと、相同ポリペプチドとを発現することができ、この非相同ポリペプチドと、相同ポリペプチドとが組み合わされて機能性混合物が形成される。
【０００７】
いくつかの実施形態では、本願の糸状菌の個体群を含む培地が提供される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、この発明により２種以上の非相同ポリペプチドと、相同ポリペプチドとから成るポリペプチド混合物が提供される。このポリペプチド混合物は、本願の糸状菌から得られる。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本願によりセルラーゼ混合物を製造する方法が提供される。この方法には、本願の糸状菌から産出される２種以上の非相同ポリペプチドと、相同ポリペプチドとから成るポリペプチド混合物を得ることが含まれる。
いくつかの実施形態では、非相同ポリペプチドは、エクソセロビオヒドロラーゼ及びエンドグルカナーゼで、相同ポリペプチドは、エクソセロビオヒドロラーゼである。非相同エクソセロビオヒドロラーゼと、相同エクソセロビオヒドロラーゼとは、同じエクソセロビオヒドロラーゼの一員であってもよく、そうでなくてもよい。
【００１０】
以下、この発明について詳しく説明する。
【００１１】
５．図面の説明
【００１２】
当業者であれば、添付の図面は説明のためのものであることを理解できよう。これらの図面は、この発明の範囲を限定するためのものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、2656塩基から成る非相同セルラーゼ融合構造を有する、ヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 1)を表わす。
【図２】図２は、図１の核酸配列に基づくセルラーゼ融合蛋白の、予想アミノ酸配列(SEQ ID NO: 2) を表わす。
【図３】図３Ａ〜Ｆは、El触媒ドメインを有するpTrex4ベクターのヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 14) を表わす。
【図４】図４は、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）発現ベクターpTrex3gのプラスミドマップを表わす。
【図５】図５Ａは、実施例の三部構成菌株を作るために用いた発現ベクターpTrex3g-フミコーラ・グリセア(H. grisea)-cbh1を表わす。図５Ｂ〜Ｅは、図５Ａに示す発現ベクターのヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 7)を表わす。
【図６】図６は、四部構成菌株を作るために、cbh1欠損菌株を形質転換した３つのDNA発現フラグメントを表わす。
【図７】図７Ａは、遺伝子組み換えCBHI蛋白を発現するポリヌクレオチドの、開始コドンから終止コドンまでのヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 8) を表わす。図７Ｂは、遺伝子組み換えCBHI蛋白の配列(SEQ ID NO: 9)を表わす。CBHIのシグナルシーケンスは、下線を付した部分である。
【図８】図８Ａは、cbh1発現ベクターpTrex3g-cbh1を表わす。図８Ｂ〜Ｆは、発現ベクターpTrex3g-cbh1のヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 10) を表わす。
【図９】図９Ａは、遺伝子組み換えCBHI蛋白を発現するポリヌクレオチドの、開始コドンから終止コドンまでのヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 11) を表わす。図９Ｂは、遺伝子組み換えCBHII蛋白のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 12)を表わす。CBHIIのシグナルシーケンスは、下線を付した部分である。
【図１０】図１０Ａは、cbhII発現ベクターpExp-cbhIIを表わす。図１０Ｂ〜Ｇは、発現ベクターpExp-cbhIIのヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 13) を表わす。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
６．様々な実施態様の説明
本願について、以下の定義と実施例により説明する。特に断りのない限り、本願で用いるすべての技術用語と科学用語は、この発明の属する分野の当業者が一般的に使用している意味で用いる。
数値範囲には、その上限値及び下限値が含まれる。以下列挙した用語は、明細書全体を参照して把握されるべきこの発明の実施態様または側面を限定するものではない。従って、以下の用語の定義は、明細書全体を参照してより完全に定義される。
【００１５】
本願で「ポリペプチド」と言うときは、複数のアミノ酸残基がペプチド結合した一本鎖から成る化合物を意味する。本願では、「蛋白」という用語と「ポリペプチド」という用語を同義で用いる。
【００１６】
本願では「核酸」という用語と「ポリヌクレオチド」という用語を同義で用い、DNA、RNA、cDNA、及びこれらの一本鎖又は二本鎖、または化学修飾物が含まれる。遺伝子コードは縮重しているため、特定のアミノ酸をエンコードするために１以上のコドンが用いられる。本願には、特定のアミノ酸配列をエンコードするすべてのポリヌクレオチドが含まれる。
【００１７】
細胞、核酸、プロモータ、またはベクターについて「組み換え」という用語を用いるときは、細胞、核酸、プロモータ、またはベクターに、非相同核酸、蛋白、天然核酸又は蛋白の変性物が導入されて修飾されているか、あるいは細胞が変性された細胞に由来するか、あるいは蛋白の発現が、非天然環境下、又は原核生物や真核生物の発現ベクター中等の環境下で行なわれたことを意味する。従って、例えば、組み替えられた細胞は、天然（非組み換え）型細胞では見出せない核酸またはポリペプチドを発現するか、あるいは、天然型遺伝子を発現するか、さもなければ異常な発現、過剰な発現、過小な発現を生じるか、または全く発現しない。
【００１８】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドについて「非相同」というときは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、宿主細胞中において天然には生じ得ない配列を有することを意味する。
いくつかの実施形態では、本願のポリペプチドは商業的に重要な工業用蛋白であり、別の実施形態では非相同ポリペプチドは治療用蛋白である。この用語には、天然由来の遺伝子、成熟遺伝子、および／または、合成遺伝子でエンコードされた蛋白が含まれる。
【００１９】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドについて「相同」というときは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、宿主細胞中において天然に生じる配列を有することを意味する。
【００２０】
本願の「融合核酸」は、操作可能に結合した２以上の核酸から成る。核酸はDNA、ゲノムDNA及びcDNAの両者、RNA、及びRNAとDNAのハイブリッドのいずれかである。ポリペプチドの配列の全部または一部をエンコードする核酸を、融合核酸配列の構築に用いることができる。いくつかの実施形態では、全ポリペプチド配列をエンコードする核酸が用いられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列の一部をエンコードする核酸が用いられる。
【００２１】
本願で「融合ポリペプチド」というときは少なくとも２つの区別可能な異なる領域を有する蛋白を意味し、この２つの領域の由来は同じ蛋白であってもよいし、異なる蛋白であってもよい。例えば、対象とする蛋白に結合したシグナルペプチドであって、シグナルペプチドが対象とする蛋白と無関係の場合、融合ポリペプチドまたは融合蛋白と呼ぶ。
【００２２】
本願では、「回収された」、「単離された」、及び「分離された」という用語は同義で用いられ、蛋白、細胞、核酸、アミノ酸等を本来有している少なくとも１つの成分から回収された蛋白、細胞、核酸、アミノ酸等を意味する。
【００２３】
本願で「遺伝子」というときは、ポリペプチド鎖の産出に関与するポリヌクレオチド（例えばDNAのセグメント）を意味し、このポリヌクレオチドには、例えば5'非翻訳(5' UTR)または「リーダー」配列、および3' UTRまたはトレイラー配列等の前後のコーディング領域、あるいは各コーディングセグメント(エキソン)間の介在配列(イントロン)が含まれていても、含まれていなくてもよく、
【００２４】
本願で「プロモータ」というときは、下流側の遺伝子の転写を調整する核酸配列を意味する。一般にプロモータは、目的とする遺伝子が発現される宿主細胞に適合している。プロモータは、他の転写及び翻訳調整核酸配列（「制御配列」とも呼ばれる）とともに、目的とする遺伝子を発現させるために必要である。
一般に、転写及び翻訳調整配列には、プロモータ配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終止配列、翻訳開始及び終止配列、及びエンハンサーまたは活性化配列が含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
本願で「操作可能に結合」というときは、転写核酸がコーディング配列に対し、転写が開始される位置にあることを意味する。これは一般に、プロモータ及び転写開始または開始配列がコーディング領域の5'位置にあることを意味する。一般に転写核酸は、蛋白の発現に用いられる宿主細胞に適合する。本願の技術分野では、様々な宿主細胞について様々なタイプの適切な発現ベクター、及び適切な調整配列が知られている。
【００２６】
本願で「発現」というときは、遺伝子の核酸シーケンスに基づいてポリペプチドが生み出される過程を意味する。この過程には、転写と翻訳の両方が含まれる。
【００２７】
本願で「ベクター」というときは、１以上の細胞種に核酸を導入するよう設計されたポリヌクレオチド配列を意味する。ベクターには、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、カセット等が含まれる。
【００２８】
本願で「発現ベクター」というときは、異質細胞中に非相同なDNAフラグメントを導入し発現させることができるベクターを意味する。
【００２９】
本願では、「DNA構造体」、「形質転換DNA」及び「発現ベクター」は同義で用いられ、宿主細胞または有機体に配列を導入するために用いられるDNAを意味する。DNAは、PCRや、Sambrookらの著書に記載された標準的な分子生物学的方法等の、公知の方法によりインビトロで作り出すことができる。さらに、発現構造を有するDNAは、例えば化学合成等により人工的に作り出すこともできる。
DNA構造体、形質転換DNA、または遺伝子工学的発現カセットを、プラスミド、染色体、染色体外要素、ミトコンドリアDNA、プラスミドDNA、ウィルス、または核酸フラグメントに導入することができる。
一般に、発現ベクター、DNA構造体、形質転換DNAの遺伝子工学的発現カセット部位には、他の配列のほかに、転写される核酸配列と、プロモータが含まれる。好ましい実施形態では、発現ベクターは宿主細胞中に非相同なDNAフラグメントを導入し、発現させる能力を有する。
【００３０】
核酸配列の細胞への挿入に関する記載において「導入された」というときは、「トランスフェクション」、「形質転換」、「形質導入」を意味し、核酸配列を真核又は原核細胞に組み込むことが含まれ、このようなとき、核酸配列が細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体又はミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれ、自己複製子へ転換されるか、一時的に発現される（例えば、トランスフェクトｍＲＮＡ）。
【００３１】
本願で「宿主細胞」というときは、ベクターを含む細胞であって、発現された構造体の複製、及び／又は転写又は、転写及び翻訳（発現）の場となる細胞である。
【００３２】
本願で「培養」というときは、液体、半固体または固体培地での好適な条件下における細胞集団の増殖を意味する。
【００３３】
本願で「置換された」または「修飾された」という用語は同義で用いられ、天然の配列の欠損、挿入、置換、中断を有するアミノ酸や核酸配列等の配列を意味する。この発明の明細書では、置換された配列は、例えば、天然由来の残基の置換を意味することがある。
【００３４】
本願で「修飾された酵素」というときは、天然の配列の欠損、挿入、置換、中断を有する酵素を意味する。
【００３５】
本願で「変異体」というときは、例えば天然または野生型蛋白等の対照蛋白と比較したとき、１以上の異なるアミノ酸を含む蛋白の領域を意味する。
【００３６】
本願で「セルラーゼ」というときは、セルロース(β-l,4-グルカン、またはベータD-グルコシド結合)ポリマーを、より短いセロオリゴ糖オリゴマー、セロビオース、及び／又はグルコースに分解する能力を有する一群の酵素を意味する。
【００３７】
「エキソ−セロビオヒドラーゼ」(CBH)とは、EC 3.2.1.91、および／または、ある種のGHファミリーに分類される一群のセルラーゼ酵素を意味する。ある種のGHファミリーの酵素の非限定的例示としてGHファミリー5, 6, 7, 9または48が挙げられる。
これらの酵素は、エキソグルカナーゼ又はセロビオヒドラーゼとしても知られている。CBH酵素は、セロビオースを、セルロースの還元末端または非還元末端から加水分解する。一般に、CBHI型の酵素はセロビオースをセルロースの還元末端から選択的に加水分解し、CBHII型の酵素はセロビオースをセルロースの非還元末端から選択的に加水分解する。
【００３８】
本願で「セロビオヒドロラーゼ活性」というときは、l,4-D-グルカンセロビオヒドロラーゼの活性を意味する。l,4-D-グルカンセロビオヒドロラーゼは、セルロース、セロテトリオース、またはβ- l,4結合グルコースを含むポリマーのl,4-β-D-グルコシド結合の加水分解の触媒となり、ポリマー鎖末端からセロビオースを切り離す。
本願のように、セロビオヒドロラーゼ活性は、LeverらがAnal. Biochem. 47(273-279頁、1972年)に開示したPHBAH法で測定した、セルロースからの水溶性還元糖の放出量により求められる。
セロビオヒドロラーゼのエキソグルカナーゼ型加水分解とエンドグルカナーゼ型加水分解との区別は、例えばカルボキシメチルセルロースやヒドロキシエチルセルロース(Ghose, 1987年, Pure & Appl. Chem. 59: 257-268頁) 等の、置換されたセルロースからの還元糖の放出量を、同様の方法で測定することにより行なうことができる。真のセロビオヒドロラーゼは、非常に高い非置換セルロース対置換セルロースの酵素活性比を有する (Baileyら, 1993年, Biotechnol. Appl. Biochem. 17: 65-76頁)。
【００３９】
本願で「エンドグルカナーゼ」(EG)というときは、EC 3.2.1.4、および／または特定のGHファミリーに分類されるセルラーゼ酵素を意味し、特定のGHファミリーの比限定的例示としてGHファミリー5, 6, 7, 8, 9, 12, 17, 31, 44, 45, 48, 51, 61, 64, 74 または81が挙げられる。EG酵素は、セルロースの分子内β-l,4グルコシド結合を加水分解する。
本願の「エンドグルカナーゼ」は、セルロース、セルロース誘導体(例えばカルボキシメチルセルロース) 、リケニン、穀物由来のβ-D-グルカンまたはキシログルカン、及びその他のセルロース系化合物等のβ-1,3グルカンの混合物中のβ-1,4-結合等の、1,4-β-D-グルコシド結合のエンド加水分解の触媒となる、エンド-l,4-(l,3;l,4)-β-D-グルカン 4-グルカノヒドラーゼと定義される。
本願のように、エンドグルカナーゼの酵素活性は、GhoseがPure and Appl. Chem. 59(257-268頁、1987年) に開示した方法に従って、カルボキシメチルセルロース (CMC) の加水分解を測定することにより求めることができる。
【００４０】
本願の「β-グルコシダーゼ」は、EC 3.2.1.21、および／または特定のGHファミリーに分類されるβ-D-グルコシドグルコヒドロラーゼと定義される。特定のGHファミリーの非限定的例示として、セロビオースの加水分解の触媒となってβ-D-グルコースを放出するGHファミリー1,3, 9または48が挙げられる。
本願のように、β-グルコシダーゼの酵素活性は、HPLC等の公知の方法で測定することができる。
【００４１】
本願でいう「セルロース分解活性」には、エキソグルカナーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、又はこれらの両者の酵素活性、さらにβ-グルコシダーゼの酵素活性が含まれる。
【００４２】
本願で「熱的に安定」「熱安定性」というときは、この発明のポリペプチドまたは酵素が高温下、すなわち室温以上の温度に曝されたとき、所定量の生物学的活性、例えば酵素活性を保持していることを意味する。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたは酵素は、所定の温度、例えば40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃または80℃に、例えばpH4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5または8において、2、5、7、10、15、20、30、40、50または60分間曝された後、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%より高い生物学的活性を保持しているとき、熱的に安定であると評価する。
【００４３】
本願で「糸状菌」というときは、当業者が糸状菌と認識している全ての糸状菌を意味する。一般に糸状菌とは、糸状形態を有し、下位分類ユーミコチナ（Eumycotina）に属する真核細胞系微生物である。これらの糸状菌は、キチン、β-グルカン、及びその他の複雑な多糖類から成る細胞壁を備える栄養菌糸を有することを特徴とする。いくつかの実施形態では、この発明の糸状菌は、形態的、生理的、及び遺伝子的に酵素とは異なる。
いくつかの実施形態では、糸状菌の非限定的例示として以下の属が挙げられる。
アスペルギルス属（Aspergillus）、アクレモニウム属（Acremonium）、オーレオバシジウム属（Aureobasidium）、ビューベリア属（Beauveria）、セファロスポリウム属（Cephalosporium）、セリポリオプシス属（Ceriporiopsis）、ケトミウム属（Chaetomium）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、クリソスポリウム属（Chrysosporium）、クラビセプス属（Claviceps）、コチオボラス属（Cochiobolus）、クリプトコカス属（Cryptococcus）、シアツス属（Cyathus）、エンドチア属（Endothia）、エンドチアムコール属（Endothia mucor）、フサリウム属（Fusarium）、ジロクラジウム属（Gilocladium）、フミコーラ属（Humicola）、マグナポルテ属（Magnaporthe）、マイセリオフトーラ属（Myceliophthora）、マイロセシウム属（Myrothecium）、ムコール属（Mucor）、ニューロスポラ属（Neurospora）、ファネロケーテ属（Phanerochaete）、ポドスポラ属（Podospora）、パエキロミセス属（Paecilomyces）、ペニシリウム属（Penicillium）、ピリクラリア属（Pyricularia）、リゾムコール属（Rhizomucor）、リゾパス属（Rhizopus）、シゾフィラム属（Schizophylum）、スタゴノスポラ属（Stagonospora）、タラロマイセス属（Talaromyces）、トリコデルマ属（Trichoderma）、サーモミセス属（Thermomyces）、サーモアスカス属（Thermoascus）、シーラビア属（Thielavia）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）、トリコフィトン属（Trichophyton）、及びトラメテスプルロタス属（Trametes pleurotus）。
いくつかの実施形態では、以下の糸状菌も含まれる。しかし、これらに限定されない。
アスペルギルス・ニジュランス（A. nidulans）、アスペルギルス・ニジェール（A. niger）、例えばNRRL 31 12, ATCC 22342 (NRRL 31 12), ATCC 44733, ATCC 14331 及びUVK 143f菌株等のアスペルギルス・アワモリ（A. awomari）、例えばATCC 1 1490等のアスペルギルス・オリザエ（A. oryzae）、ニューロスポラ・クラッサ（N. crassa）、例えばNRRL 15709, ATCC 13631, 56764, 56765, 56466, 56767等のトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、及び例えばATCC 32098, 32086等のトリコデルマ・ビリディ（Trichoderma viride）。 
【００４４】
本願で「トリコデルマ」又は「トリコデルマ属」というときは、以前トリコデルマ属または菌株に分類されていた真菌生物、または現在ルコデルマ属または菌株に分類されている真菌生物、または、ヒポクレア（Hypocrea）属または菌株に分類されている真菌生物を意味する。
いくつかの実施形態では、これらには、トリコデルマ・ロンギブラチアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・トリコデルマ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ・ビリディ（Trichoderma viride）、ヒポクレア・ジェコリナ（Hypocrea jecorina）が含まれる。
元となる菌株として用いられるものには、トリコデルマ・ロンギブラチアタム／リーゼイ（T. longibrachiatum/reesei）RL-P37 (Sheir-Neiss ら, Appl. Microbiol. Biotechnology, 20 (46-53頁、1984年)； Montenecourt B.S., Can., 1-20頁、1987年参照)等のセルラーゼ過剰発現菌株、及びRut-C30菌株が含まれる。
いくつかの実施形態では、改良の対象となっている菌株におけるセルラーゼの発現は厳密に調節され、また様々な外部環境の影響を受けやすい。
【００４５】
この発明により、２以上の非相同ポリペプチドをエンコードする２以上のポリヌクレオチドと、相同ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドとから成る糸状菌が提供される。このような糸状菌は、非相同ポリペプチド及び同ポリペプチドを発現して、機能性混合物を生成する。
いくつかの実施形態では、糸状菌は、第1非相同ポリペプチド及び第2非相同ポリペプチドをそれぞれエンコードする第1ポリヌクレオチド、及び第2ポリヌクレオチドを含み、さらに、相同ポリペプチドをエンコードする第3ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、糸状菌には第3非相同ポリペプチドをエンコードする更なるポリヌクレオチド、すなわち第4ポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、糸状菌には4以上の非相同ポリペプチドをエンコードする4以上のポリヌクレオチドと、１以上の相同ポリペプチドをエンコードする１以上のポリヌクレオチドとが含まれる。
【００４６】
この発明では、機能性混合物はポリペプチドの混合物を含んでおり、この混合物は、その中に含まれる少なくとも2種または3種のポリペプチドに由来する少なくとも1の生物学的、あるいはその他の機能を有する。換言すれば、ポリペプチドの混合物の機能に対し、少なくとも2種または3種のポリペプチドが、検出可能なレベルで貢献する。
いくつかの実施形態では、機能性混合物には少なくとも3種のポリペプチドが含まれ、この混合物に含まれる少なくとも2種または3種のポリペプチドに由来する機能を有する。
また別の実施形態では、機能性混合物には少なくとも3種のポリペプチドが含まれ、この混合物に含まれる少なくとも2種または3種のポリペプチドに由来する酵素活性を有する。
また別の実施形態では、機能性混合物には少なくとも3種のポリペプチドが含まれ、この混合物に含まれる少なくとも2種または3種のポリペプチドに由来するセルラーゼ活性を有する。
また別の実施形態では、機能性混合物には4種のポリペプチドが含まれ、この混合物に含まれる2種、3種、または4種のポリペプチドに由来する機能を有する。
【００４７】
別の実施形態では、機能性混合物は、例えば、セルラーゼ活性、糖化活性等の分泌型蛋白が有する活性を改善する機能、または改善に相当する機能を有し、あるいは、糸状菌に関する熱安定性、または糸状菌により与えられる熱安定性を改善する機能か、または改善に相当する機能を有する。
いくつかの実施形態では、機能性混合物は、エキソ−セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、またはβ-グルコシダーゼまたはこれらの組合せに由来する機能を有する。いくつかの実施形態では、機能性混合物には、糸状担体蛋白と組み合わされた細菌性酵素は含まれていない。いくつかの実施形態では、機能性混合物は、抗体、またはFabや一本鎖抗体等の抗体フラグメントを形成しない。
【００４８】
いくつかの実施形態では、非相同または相同ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドは1以上のプロモータに、操作可能に結合している。プロモータは、この発明の適するものであれば、既知のプロモータでも未知のプロモータでもよい。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは糸状菌に由来する天然のプロモータの下で発現される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは非相同プロモータの下で発現される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは構成的プロモータまたは誘導プロモータの下で発現される。
使用可能なプロモータの非限定的例示として、セルラーゼプロモータ、キシラナーゼプロモータ、1818プロモータ(以前は、ESTマッピングトリコデルマから高度に発現された蛋白と認定されていた)が挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモータは糸状菌のセルラーゼプロモータである。いくつかの実施形態では、プロモータは、エキソ−セロビオヒドロラーゼプロモータ、エンドグルカナーゼプロモータ、またはβ-グルコシダーゼプロモータのいずれかである。
いくつかの実施形態では、プロモータは、セロビオヒドロラーゼI(cbh 1)プロモータである。プロモータの非限定的例示として、cbh1, cbh2, egl1, egl2, egl3, egl4, egl5, pkil, gpdl, xynl, 及び xyn2プロモータが挙げられる。
さらに、非相同又は相同ポリペプチド、またはその一部をエンコードする2以上のポリヌクレオチドが融合されて、融合ポリヌクレオチドを形成していてもよい。融合ポリヌクレオチドは、上記の適切なプロモータのいずれかに、操作可能に結合していてもよい。
【００４９】
いくつかの実施形態では、第1非相同ポリペプチドをエンコードする第1ポリヌクレオチドは、第1プロモータに操作可能に結合している。第1プロモータは、第2または第3ポリヌクレオチドに操作可能に結合しているプロモータと同じでもよいし、異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、第1ポリヌクレオチドは、相同ポリペプチドをエンコードする遺伝子のプロモータに操作可能に結合している。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは別のポリヌクレオチドと融合して融合ポリヌクレオチドを形成しており、例えば非相同ポリペプチドをエンコードする第2ポリヌクレオチドが、相同ポリペプチドをエンコードする第3ポリヌクレオチドと融合して融合ポリヌクレオチドを形成していてもよい。
融合ポリヌクレオチドを、適切なプロモータに操作可能に結合させることができる。適切なプロモータの例には、相同ポリペプチドをエンコードする遺伝子のプロモータ等が含まれるが、これに限定されない。
融合ポリヌクレオチドは、融合ポリペプチド、または2種の蛋白から成る融合蛋白、またはこれらの蛋白の一部またはドメインで構成される融合ポリペプチドをエンコードする。
ポリペプチドの一部またはドメインは、少なくとも1の生物学的機能またはその他の機能を有するポリペプチド、または融合ポリペプチドと組み合わされたとき機能を発揮するか、あるいは機能性混合物中の他のポリペプチドと組み合わされたとき機能を発揮するポリペプチドの一部またはドメインである。
いくつかの実施形態では、融合蛋白は第2非相同ポリペプチドと、相同ポリペプチドとから成る。
【００５１】
いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、例えばリンカー鎖またはリンカー領域で隔てられた第2非相同ポリペプチドと相同ポリペプチドのような、2種のポリペプチドから成る融合蛋白をエンコードする。
リンカー鎖は、2種のポリペプチドの結合に適していれば、どのようなリンカー鎖でもよい。一般にリンカー領域は、それぞれ独立して折り畳まれている蛋白ドメイン間で、半剛性で伸長したスペーサーの形態となっている。融合蛋白のポリペプチドの間のリンカー領域により、各ポリペプチドはそれぞれ独立して折り畳み構造をとることができる。
いくつかの実施形態では、リンカー鎖はアスペルギルス属に由来するグルコアミラーゼ、及び、トリコデルマ属に由来するCBHIリンカー鎖に由来する。いくつかの実施形態では、リンカー鎖は融合蛋白を構成するポリペプチドの一部であってもよいが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、融合蛋白を構成するポリペプチドは、第2非相同ポリペプチドと、相同ポリペプチドである。
I
【００５２】
いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、リンカー結合またはリンカー領域と、切断部位とで隔てられた2種のポリペプチドから成る融合蛋白をエンコードする。いくつかの実施形態では、融合蛋白の複数のポリペプチドは、第2非相同ポリペプチド及び相同ポリペプチドである。
一般に、切断部位はリンカー領域内にあって、切断部位を境として複数の配列を分離させることができる。切断部位は、従来知られている方法、または今後開発される方法により切断することができる配列であれば、どのような配列でもよい。切断部位の非限定的例示として、プロテアーゼで切断される配列、あるいは特定の薬品で切断される配列が挙げられる。このような配列の非限定的例示として、例えばアミノ酸LysArgのコドンを含むKEX2認識部位、Lys及びArgのトリプシンプロテアーゼ認識部位、エンドプロテイナーゼ-Lys-Cの切断認識部位等のケキシン(kexin)切断部位が挙げられる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、この発明の糸状菌には、さらにポリヌクレオチドをエンコードする選択マーカが含まれる。このようなマーカは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする適切なマーカであれば、どのようなマーカでもよい。一般に、選択マーカは、宿主細胞中において、特定のベクターを含む宿主細胞の選択を容易にする発現が可能な遺伝子である。
本願では、マーカという用語は、宿主細胞が導入された特定のDNAを取り込んだか、または他の反応が生じたことの指標となる遺伝子を意味する。一般に選択マーカは、宿主細胞に抗菌薬耐性または代謝上の効果を賦与する遺伝子であり、外来性DNAを有する宿主細胞と、形質転換操作の間に外来性の配列が導入されなかった宿主細胞との区別を可能にする遺伝子である。
このような選択マーカの非限定的例示として、抗菌耐性（例えばカナマイシン、エリスロマイシン、アクチノマイシン、クロラムフェニコール、及びテトラサイクリン）が挙げられる。このほかの選択マーカの非限定的例示として、トリコデルマ・リーゼイpyr4、アセトラクテート・シンターゼ、スプレプトマイセスhyg、アスペルギルス・ニデュランスamdS遺伝子、及びアスペルギルス・ニジェールpyrG遺伝子が挙げられる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、この発明の糸状菌は第3非相同ポリペプチドをエンコードする第4ポリヌクレオチドをさらに含み、発現することができる。非相同または相同ポリペプチドは、天然のポリペプチド、またはその変異体である。いくつかの実施形態では、1以上の非相同ポリペプチドが、相同ポリペプチドの変異体であってよい。
例えば、第1非相同ポリペプチドは、修飾された相同ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第1及び第2非相同ポリペプチドが修飾された相同ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第1及び第2非相同ポリペプチドが修飾された相同ポリペプチドであり、糸状菌には第3非相同ポリペプチドをエンコードする第4ポリヌクレオチドが含まれる。第3非相同ポリペプチドは、修飾された相同ポリペプチドであってもよいし、修飾された相同ポリペプチドではなくてもよい。
【００５５】
この発明の非相同及び相同ポリペプチドは、この発明の他のポリペプチドと混合されたとき、この混合物に由来する少なくとも２種または３種のポリペプチドによりもたらされる生物学的、またはその他の少なくとも1の機能を有する機能性混合物を生成するポリペプチドであれば、どのようなポリペプチドでもよい。
いくつかの実施形態では、非相同及び相同ポリペプチドの混合により、機能性混合物は糸状菌の活性に関し改良された機能を示す。いくつかの実施形態では、このような活性の非限定的例示として、分泌型蛋白の活性の向上、糖化活性の向上、及び熱安定性、すなわち高温下または異なるpH値における安定性の向上、および／または、同一温度下での、より長時間にわたる活性保持性が挙げられる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、非相同及び相同ポリペプチドには、糸状担体蛋白と組み合わされた細菌性酵素が含まれない。いくつかの実施形態では、非相同及び相同ポリペプチドは、抗体、またはFabや一本鎖抗体等の機能性抗体フラグメントを形成するような態様では結合されない。
【００５７】
いくつかの実施形態では、1以上の第1または第2非相同ポリペプチド、または相同ポリペプチドは、酵素または酵素の一部である。いくつかの実施形態では、第1または第2非相同ポリペプチド、または相同ポリペプチドは、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、またはこれらの一部またはドメインである。
いくつかの実施形態では、第1または第2非相同ポリペプチド、または相同ポリペプチドは、セルラーゼ、またはセルラーゼの一部である。いくつかの実施形態では、第1及び第2非相同ポリペプチド、及び相同ポリペプチドは、組み合わされてセルラーゼの機能性混合物を形成する。
【００５８】
いくつかの実施形態では、第1または第2非相同ポリペプチド、または相同ポリペプチドは、エキソ-セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β-グルコシダーゼ、またはこれらの一部から成る群から選択されるセルラーゼである。
第1または第2非相同ポリペプチド、相同ポリペプチド、または第3非相同ポリペプチドが存在する場合、これらはエキソ-セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β-グルコシダーゼ、またはこれらのドメインから成る群から、特に制限無く選択される
いくつかの実施形態では、1以上のポリペプチド、非相同または相同ポリペプチドは、同一のセルラーゼのクラスまたはグループに属する。例えば、2以上のポリペプチドが、エキソ-セロビオヒドロラーゼのクラスに属していてもよい。
いくつかの実施形態では、複数の非相同ポリペプチドの内の1つが、相同ポリペプチドと同一のセルラーゼのクラスに属していてもよい。
いくつかの実施形態では、非相同及び相同ポリペプチドが同一のクラスに属し、異なる起源に由来する配列を有していてもよい。
【００５９】
いくつかの実施形態では、この発明の糸状菌は、第1非相同ポリペプチド及び第2非相同ポリペプチドをそれぞれエンコードする、第1ポリヌクレオチド及び第2ポリヌクレオチドを含み、ここで、第1非相同ポリペプチドはエキソ-セロビオヒドロラーゼであり、第2非相同ポリペプチドはエンドグルカナーゼである。
いくつかの実施形態では、第1非相同ポリペプチドはEC 3.2.1.91に分類されるエキソ-セロビオヒドロラーゼであり、第2非相同ポリペプチドはEC 3.2.1.4に分類されるエンドグルカナーゼである。
いくつかの実施形態では、第1非相同ポリペプチドはGHファミリー 5, 6, 7, 9, 48から選択されるエキソ-セロビオヒドロラーゼであり、第2非相同ポリペプチドはGHファミリー5, 6, 7, 8, 9, 12, 17, 31, 44, 45, 48, 51, 61, 64, 74及び81から選択されるエンドグルカナーゼである。
【００６０】
上記のように、この発明の非相同及び相同ポリペプチドは、セルラーゼ酵素のクラスから制限無く選択することができる。本願にこれらの酵素の組合せを開示する。
いくつかの実施形態では、第1非相同ポリペプチドはエキソ-セロビオヒドロラーゼであり、第2非相同ポリペプチドはエンドグルカナーゼであり、相同ポリペプチドはエキソ-セロビオヒドロラーゼである。
いくつかの実施形態では、第1非相同ポリペプチドは第1エキソ-セロビオヒドロラーゼであり、第2非相同ポリペプチドはエンドグルカナーゼであり、相同ポリペプチドは第2エキソ-セロビオヒドロラーゼであり、第1エキソ-セロビオヒドロラーゼ及び第2エキソ-セロビオヒドロラーゼは同じセロビオヒドロラーゼの一員であり、例えば第1及び第2エキソ-セロビオヒドロラーゼの両者ともCBHIに属するか、または両者ともCBHIIに属する。
【００６１】
この発明の糸状菌には、当業者にとって公知の糸状菌を用いることができる。
いくつかの実施形態では、糸状菌の非限定的例示として、アスペルギルス属（Aspergillus）、アクレモニウム属（Acremonium）、オーレオバシジウム属（Aureobasidium）、 ビューベリア属（Beauveria）、セファロスポリウム属（Cephalosporium）、 セリポリオプシス属（Ceriporiopsis）、ケトミウム属ペシロミセス（Chaetomium paecilomyces）、クリソスポリウム属（Chrysosporium）、クラビセプス属（Claviceps）、コチオボラス属（Cochiobolus）、クリプトコカス属（Cryptococcus）、シアツス属（Cyathus）、エンドチア属（Endothia）、エンドチアムコール属（Endothia mucor）、フサリウム属（Fusarium）、ジロクラジウム属（Gilocladium）、フミコーラ属（Humicola）、マグナポルテ属（Magnaporthe）、マイセリオフトーラ属（Myceliophthora）、マイロセシウム属（Myrothecium）、ムコール属（Mucor）、ニューロスポラ属（Neurospora）、ファネロケーテ属（Phanerochaete）、ポドスポラ属（Podospora）、パエキロミセス属（Paecilomyces）、ペニシリウム属（Penicillium）、ピリクラリア属（Pyricularia）、リゾムコール属（Rhizomucor）、リゾパス属（Rhizopus）、シゾフィラム属（Schizophylum）、スタゴノスポラ属（Stagonospora）、タラロマイセス属（Talaromyces）、トリコデルマ属（Trichoderma）、サーモミセス属（Thermomyces）、サーモアスカス属（Thermoascus）、シーラビア属（Thielavia）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）、トリコフィトン属（Trichophyton）、及びトラメテスプルロタス属（Trametes pleurotus）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、以下の糸状菌も含まれるが、これらに限定されない。
アスペルギルス・ニデュランス（A. nidulans）、アスペルギルス・ニジェール（A. niger）、例えばNRRL 31 12, ATCC 22342 (NRRL 31 12), ATCC 44733, ATCC 14331 及びUVK 143f菌株等のアスペルギルス・アワモリ（A. awomari）、例えばATCC 1 1490等のアスペルギルス・オリザエ（A. oryzae）、ニューロスポラ・クラッサ（N. crassa）、例えばNRRL 15709, ATCC 13631, 56764, 56765, 56466, 56767等のトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、及び例えばATCC 32098, 32086等のトリコデルマ・ビリディ（Trichoderma viride）。
【００６２】
いくつかの実施形態では、この発明の糸状菌はトリコデルマである。いくつかの実施形態では、この発明の糸状菌はトリコデルマ・リーゼイ(以下、T. reesei)である。
いくつかの実施形態では、非相同ポリペプチドは、フミコーラ・グリセア(Humicola grisea)、アシドサーマス・セルロリティカス(Acidothermus cellulolyticus)、 サーモビフィダ・フスカ(Thermobifida fusca)、及びペニシリウム・フニクロサム(Penicillium funiculosum)の内のいずれかに由来する。
いくつかの実施形態では、非相同ポリペプチドはフミコーラ・グリセア、アシドテルマス・セルロリティカス、サーモモビフィダ・フスカ等のサーモモビフィダ属、及びペニシリウム・フニクロサムの内のいずれかに由来し、相同ポリペプチドはトリコデルマ・リーゼイに由来する。
【００６３】
本願に、非相同及び相同ポリペプチドの組合せを例示する。
いくつかの実施形態では、機能性混合物の非相同及び相同ポリペプチドは、T. reesei EGI, EGII, EGIII (それぞれ、CEL7B, 5 A, 12A)、CEL l2Aの変異体、 フミコーラ・グリセアEGIII、サーモビフィダ・フスカE5及びE3、並びに、アシドサーマス・セルロリティカスEl及びGH74から成る群から選択される。
いくつかの実施形態では、機能性混合物の非相同ポリペプチドはエキソ−エンドセルラーゼ融合構造であってもよい。
いくつかの実施形態では、融合蛋白は真菌性エキソ−セロビオヒドロラーゼに由来する触媒ドメインと、エンドグルカナーゼに由来する触媒ドメインとから成り、セルロース分解活性を有する。好ましい例は、米国特許出願公開20060057672に開示されているが、これに限定されない。
【００６４】
いくつかの実施形態では、機能性混合物の非相同ポリペプチドは、Cel7酵素であるヒポクレア・ジェコリナ(H. jecorina) CBH Iの変異体であってもよい。いくつかの実施形態では、セロビオヒドロラーゼは改良された熱安定性と可逆性を有し、非限定的例示として、米国特許出願公開20050277172及び20050054039に開示されたものが挙げられる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、機能性混合物の非相同ポリペプチドは、Cel7酵素であるH. jecorina CBH 2の変異体であってもよい。いくつかの実施形態では、セロビオヒドロラーゼは改良された熱安定性と可逆性を有し、非限定的例示として、米国特許出願公開20060205042に記載されたものが挙げられる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、宿主糸状菌はT. reeseiであり、第1非相同ポリペプチドはフミコーラ・グリセアCBHI、第2非相同ポリペプチドはアシドサーマス・セルロリティカスのエンドグルカナーゼ1であって、相同ポリペプチドはT. reesei CBHIである。
いくつかの実施形態では、宿主糸状菌はT. reeseiであり、第1非相同ポリペプチド、または第2非相同ポリペプチドはペニシリウム・フニクロサム・セロビオヒドロラーゼCBHI、サーモビフィダ・エンドグルカナーゼE3、サーモビフィダ・エンドグルカナーゼE5、アシドサーマス・セルロリティカスGH74-coreおよびGH48からなる群から選択される。
【００６７】
いくつかの実施形態では、糸状菌には第3非相同ポリペプチドをエンコードする第4ポリヌクレオチドが含まれていてもよい。ここで、第1ポリペプチドは修飾されたT. reesei CBHI、第2非相同ポリペプチドは修飾されたT. reesei CBHII、第3非相同ポリペプチドはアシドサーマス・セルロリティカスのエンドグルカナーゼ1であり、相同ポリペプチドはT. reesei CBHIである。
【００６８】
この発明により、改良された性能、および／または、活性を有する機能性混合物が提供される。
いくつかの実施形態では、第1非相同ポリペプチドはエキソ−セロビオヒドロラーゼであり、第2非相同ポリペプチドはエンドグルカナーゼで、相同ポリペプチドはエキソ−セロビオヒドロラーゼである。ここで、第1非相同ポリペプチド、第2非相同ポリペプチド、及び相同ポリペプチドは、熱安定性セルラーゼの混合物を形成する。
【００６９】
さらに、いくつかの実施形態では、この発明の非相同及び相同ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドは染色体外のもの、すなわちベクターまたはプラスミドであってもよい。あるいは、ポリヌクレオチドは、宿主糸状菌の染色体に組み込まれていてもよい。
いくつかの実施形態では、宿主糸状菌は、そのゲノムに組み込まれた、第1、第2または第3非相同ポリペプチド、または相同ポリペプチドをエンコードする少なくとも１のポリヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態では、宿主糸状菌は、そのゲノムに組み込まれた、第1、第2または第3非相同ポリペプチド、または相同ポリペプチドをエンコードする、少なくとも１のポリヌクレオチドを有し、また、形質転換された宿主中の安定なベクターに含まれる、非相同または相同ポリペプチドをエンコードする、少なくとも１のポリヌクレオチドを有する。
【００７０】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、そのゲノム中に組み込まれ、第1、または第2非相同ポリペプチド、または相同ポリペプチドをエンコードする、少なくとも１のポリヌクレオチドを有するT. reeseiである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、そのゲノム中に組み込まれた2種のポリヌクレオチドを有するT. reeseiである。
これらのポリヌクレオチドは第1、第2非相同ポリペプチド、存在する場合は第3非相同ポリペプチド、及び相同ポリペプチドのいずれかをエンコードする。
いくつかの実施形態では、非相同または相同エキソ−セロビオヒドロラーゼのいずれかを発現する１以上のポリヌクレオチドが、宿主のT. reeseiのゲノムに組み込まれる。
いくつかの実施形態では、非相同エンドグルカナーゼを発現するポリヌクレオチドが、宿主のT. reeseiのゲノムに組み込まれる。
いくつかの実施形態では、非相同エンドグルカナーゼを発現するポリヌクレオチドと、非相同または相同エキソ−セロビオヒドロラーゼのいずれかを発現するポリヌクレオチドが、宿主のT. reeseiのゲノムに組み込まれる。
機能性混合物のポリペプチドをエンコードする3種または4種のポリヌクレオチドの内の、1種または2種しか宿主細胞のゲノムに組み込まれていない場合、残余のポリヌクレオチドは宿主細胞中に形質転換され、ベクターまたはプラスミド中に存在することを理解できよう。
いくつかの実施形態では、糸状菌には、第1非相同ポリペプチド及び第２非相同ポリペプチドをそれぞれエンコードする第1ポリヌクレオチド及び第2ポリヌクレオチドと、相同ポリペプチドをエンコードする第3ポリヌクレオチドが含まれ、これらの3種のポリヌクレオチドは染色体外のものである。
【００７１】
またこの発明により、上記の糸状菌の集団を含む培地が提供される。この培地は、固体状、半固体状、または液状であってよく、使用する宿主細胞と発現するポリペプチドに応じて適宜選択することができる。
【００７２】
さらにこの発明により、本願に開示する糸状菌から得られる第1非相同ポリペプチド、第2非相同ポリペプチド、及び相同ポリペプチドから成るポリペプチド混合物が提供される。いくつかの実施形態では、このポリペプチド混合物は、複数の酵素、またはこれらの酵素のドメインから成る。いくつかの実施形態では、このポリペプチド混合物は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、またはこれらの酵素のドメインの混合物から成る。
【００７３】
さらに、この発明により、本願に開示する糸状菌からポリペプチド混合物を得る工程を含む、ポリペプチドの混合物を製造する方法が提供される。このポリペプチド混合物には、第1非相同ポリペプチド、第2非相同ポリペプチド、及び相同ポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、このポリペプチド混合物には、第3非相同ポリペプチドが含まれる。
上記のように、このポリペプチド混合物は機能性混合物である。いくつかの実施形態では、このポリペプチド混合物は、複数の酵素、またはこれらの酵素のドメインから成る。いくつかの実施形態では、このポリペプチド混合物は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、またはこれらの酵素のドメインの混合物から成る。
【００７４】
いくつかの実施形態では、ポリペプチド混合物は、エキソ−セロビオヒドロラーゼである第1非相同ポリペプチドと、エンドグルカナーゼである第2非相同ポリペプチドと、エキソ−セロビオヒドロラーゼである相同ポリペプチドとから成る、複数のセルラーゼの混合物である。
いくつかの実施形態では、複数のセルラーゼの混合物には、第1エキソ−セロビオヒドロラーゼである第1非相同ポリペプチドと、エンドグルカナーゼである第2非相同ポリペプチドと、第2エキソ−セロビオヒドロラーゼである相同ポリペプチドとが含まれる。ここで、第1エキソ−セロビオヒドロラーゼと第2エキソ−セロビオヒドロラーゼは、同じセロビオヒドロラーゼの一員である。
いくつかの実施形態では、第1及び第2エキソ−セロビオヒドロラーゼはCBHIである。いくつかの実施形態では、第1及び第2エキソ−セロビオヒドロラーゼはCBHIIである。
【００７５】
当業者にとって明らかなように、この発明の糸状菌において、いくつかの別の非相同及び相同ポリペプチドの組合せを発現させることができる。
別のセルラーゼの混合物の一例は、フミコーラ・グリセアCBHIである第1非相同ポリペプチドと、アシドサーマス・セルロリティカスのエンドグルカナーゼ1である第2非相同ポリペプチドと、トリコデルマ・リーゼイCBHIである相同ポリペプチドとから成る。
【００７６】
以下の実施例を参照しながら本願発明について詳しく説明する。これらの実施例はこの発明の範囲を限定するものではない。当業者であれば、本願の要旨から離れることなく、原料や方法を種々変更して実施できることは明らかであろう。
【実施例】
【００７７】
7. 実施例
【実施例１】
【００７８】
7.1  ＜実施例１  三部構成菌株の構築＞
三部構成菌株は、(i)T. reeseセルラーゼ生産菌株、(ii) フミコーラ・グリセア菌株中のフミコーラ・グリセアcbh1遺伝子から成る核酸、並びに、(iii) T. reesei cbh1と、アシドサーマス・セルロリティカスのエンドグルカナーゼ1とが融合したエキソ−エンドセルラーゼ融合体、の三部で構成される。
【００７９】
＜CBH1-El融合ベクターの構築＞
【００８０】
CBH1-El融合構造体には、T. reesei cbhIプロモータ、開始コドンからcbhIリンカーの末端までと、さらにDNA 5'からエンドグルカナーゼのコーディング配列の始点までの追加の12塩基を含むT. reesei cbhI遺伝子配列、エンドグルカナーゼのコーディング配列、終止コドン、及び、T. reesei cbhIターミネータが含まれる。
非相同セルラーゼ融合構造体のヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 1)は2656塩基（図１参照）から成り、T. reesei cbhIのシグナル配列と、T. reesei cbhIの触媒配列と、T. reesei cbhIのリンカー配列と、SKRアミノ酸のコドンを含むケキシン(kexin)切断部位、及びアシドサーマス・セルロリティカスGH5A-E／触媒ドメインをコーディングする配列とが含まれる。
図１の核酸配列から予想されるセルラーゼ融合蛋白のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 2)を、図２に示す。追加の12 のDNA塩基ACTAGT AAGCGG(SEQ ID NO:1のヌクレオチド1565から1576)は、制限エンドヌクレアーゼSpeIと、アミノ酸のThr, Ser, Lys,及びArgをコーディングする。
【００８１】
El遺伝子ローカスのオープン・リーディング・フレームを含むプラスミドEl-pUC19を、PCR法のDNAテンプレートに用いた。（同等のプラスミドが米国特許5,536,655に開示されている。この特許には、放線菌アシドサーマス・セルロリティカスATCC 43068に由来するEl遺伝子のクローンニングが開示されている。発明者Mohagheghi Aら、1986年。）
プラスミドDNAを取り扱う標準的方法、及びポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を利用してDNAを増幅する標準的方法はSambrookら(2001年)が開示している。
【００８２】
以下の２種のプライマーを、Elエンドグルカナーゼの触媒ドメインのコーディング領域を増幅するために用いた。
順方向プライマー1=EL-316 (Spelサイトを含む)
【化１】
0005651466.tif 000002
逆方向プライマー2=EL-317(Asclサイトと終止コドン−逆相補体を含む)
【化２】
0005651466.tif 000003
【００８３】
PLATINUM Pfx DNA Polymeraseキット(Invitrogen社, Carlsbad, CA)の材料を用いた反応条件は次の通りである。
1μリットルのdNTP Master Mix (最終濃度0.2 mM)；1μリットルのprimer 1 (最終濃度0.5μM)；1μリットルのprimer 2 (最終濃度0.5μM)；2μリットルのDNAテンプレート(最終濃度50-200ng)；1μリットルの50 mM MgSO4 (最終濃度1 mM)；5μリットルの10x Pfx Amplification Buffer；5μリットルの10xPCRx Enhancer溶液；1μリットルのPlatinum Pfx DNA Polymerase (トータル2.5U)；33μリットルの水；全反応容量50μリットル。
【００８４】
増幅条件は：ステップ1：94℃において2分間(抗体が結合したポリメラーゼを変性させるため、最初のサイクルのみ)；ステップ2：94℃において45秒間；ステップ3：60℃において30秒間；ステップ4：68℃において2分間；ステップ5：ステップ2を24回反復；ステップ6：68℃において４分間であった。
【００８５】
適切なサイズにしたPCR産物で、Zero Blunt TOPOベクターをクローン化し、次に、化学的適合性のあるTop10 E. coli 細胞 (Invitrogen社)を形質転換し、適切な選択培地(カナマイシンを50ppm含むLA)に塗布し、37℃で一晩培養した。この培地から、幾つかのコロニーを選び出し、選択培地(カナマイシンを50ppm含むLB)において、5mlの培養液中、37℃で一晩培養することにより精製プラスミドを調製した。
適正なサイズの挿入を確認するため、この幾つかのコロニーから得たプラスミドDNAを、制限酵素消化した。DNA塩基配列決定法により、適正な配列であることを確認した。次の配列の検証では、SpeI及びAscIで制限酵素消化することにより、TOPOベクターからEl触媒ドメインを切除した。このフラグメントを、図３に示すように、SpeI及びAscIで制限酵素消化されたpTrex4ベクターに結紮した。
【００８６】
結紮混合物でMM294適格E. coliを形質転換し、選択培地(カーベニシリンを50ppm含むLA)に塗布し、37℃で一晩培養した。この培地から、幾つかのコロニーを拾い出し、選択培地(カーベニシリンを50ppm含むLB)において、5mlの培養液中、37℃で一晩培養することにより、精製プラスミドを調製した。
紮混されたCBHl-E/融合蛋白ベクターであることを、制限酵素消化により確認した。
【００８７】
フミコーラ・グリセア(以下H.grisea) cbh1発現ベクターの構築
【００８８】
H. grisea cbh1発現構造体には、T. reesei cbhIプロモータと、grisea cbhI遺伝子配列と、T. reesei cbh1ターミネータと、アスペルギルス・ニジュランス(A. nidulans) amdS選択マーカとが含まれる。
当業者であれば、これらの配列を様々な方法で結合させることができる。ひとつの方法は以下の通りである。
【００８９】
フミコーラ・グリセア・バー．サーモイデア(umicola grisea var. thermoidea) (CBS 225.63)の菌糸体のサンプルから、ゲノムDNAを抽出した。ゲノムDNAは、公知の方法で単離することができる。以下の手順を用いることができる。
【００９０】
細胞を、20 mlのポテトデキストロース培地(PDB)を用いて45℃で24時間培養した。細胞を新鮮なPDB培地で1:20に希釈し、一晩培養した。2ミリリットルの細胞を遠心分離し、得られたペレットを1 mlのKC (1リットル当たりKCl 60 g、クエン酸2 gを含み、1モルのKOHでpHを6.2に調整)で洗浄した。細胞のペレットを900μlのKC中に再度懸濁させた。
100 μl (20 mg/ml)のNovozymeを添加し、ゆっくり撹拌し、次に、90%を超えるプロトプラストが形成されるまで、37℃で最大２時間、プロトプラスト化を行なった。
細胞を1500 rpm (4600 xG)で10分間、遠心分離した。200 μlのTES/SDS (Tris緩衝液 10 mM、EDTA 50 mM、NaCl 150mM、SDS 1%)を添加、混合し、室温で５分間インキュベートした。
Qiagen 分離精製キット(Qiagen社)によりDNAを単離した。100 μlのmilli-Qウォータでカラムから溶出させたDNAを回収した。
【００９１】
別の方法として、45℃のPDA培地で培養したフミコーラ・グリセア・バー．サーモイデアの遺伝子を単離するFastPrep法を用いた。このシステムは、FastPrep Instrumentと、核酸単離用のFastPrepキットから成る。（FastPrepは、Qbiogene, MP Biomedicals社、米国29525 Fountain Pkwy., Solon, OH 44139から入手できる）
【００９２】
H.grisea cbh1遺伝子をPCR増幅するプライマーは、NCBI ACCESSION D63515に基づく。このプライマーは、H.grisea cbh1をスタートからターミネータまでコーディングして、増幅させるように設計されている。順方向プライマーの配列には、4つのヌクレオチドCACCが含まれており、Gateway クローンニングシステム(Invitrogen社)の使用を可能にし、TOPO pENTRベクター中へのクローン化を促進する。
【００９３】
順方向プライマー：
【化３】
0005651466.tif 000004
【００９４】
逆方向プライマー：
【化４】
0005651466.tif 000005
【００９５】
PCR反応条件
【００９６】
PCR産物は、Invitrogen社の Gateway システムの取扱説明書に従ってpENTR/D中にクローン化した。
このベクターにより、化学的適合性があり、カナマイシン選択性を有するTop10 E. coli 細胞 (Invitrogen社)を形質転換した。
幾つかのクローンのプラスミドDNAを制限酵素消化して、正しいサイズが挿入されたことを確認し、次に、塩基配列決定法により、適正な配列であることを確認した。１つのクローンのプラスミドDNAを、LRクロナーゼ反応 (Invitrogen社、Gatewayシステム)へ、pTrex3g/αmdS目的ベクターDNAとともに添加した。
【００９７】
pTrex3gの構築
【００９８】
ここでは、本願の対象の遺伝子を発現するために用いられる基礎的ベクターの構築について説明する。
pTrex3gベクターは、例えば米国特許出願公開No. 20070015266に開示されている。
このベクターは、64の六量体制限酵素認識配列を含む多数の拡張されたクローン化サイトを有するpUCl 18ファージミドベースのベクター(Brosius, J. (1989年) DNA 8: 759)であるE coliベクターpSLl 180 (Pharmacia Inc.社、Piscataway, NJ, USA)をベースとする。
このベクターは、Gateway目的ベクター(Hartley, J. L.ら、(2000年) Genome Research 10: 1788-1795)となるように遺伝子組み換えされたものであり、Gatewayテクノロジー(Invitrogen社)を用いて、T. reesei cbh1遺伝子のプロモータ領域とターミネータ領域の間に、所望のオープン・リーディング・フレームを挿入することができる。
アスペルギルス・ニジュランスamdS遺伝子を、形質転換において選択マーカとして用いるために挿入した。プロモータとターミネータは、本願が対象とする遺伝子が発現されるように配置した。
【００９９】
pTrex3gの詳細は下記の通りである。
【０１００】
ベクターのサイズは10.3 kbである。
pSLl 180ポリ・リンカー領域には、次のＤＮＡのセグメントを挿入した。(i) T. reesei cbh1遺伝子のプロモータ領域に由来する、ＤＮＡの2.2 bpセグメント；(ii) Invitrogen社から入手した、クロラムフェニコール耐性遺伝子(CmR)とccdB遺伝子に隣接するいずれかの端部にある、attRl及びattR2組換え部位を含む1.7 kbのGateway リーディング・フレームAカセット；(iii) T. reesei cbh1遺伝子のターミネータ領域に由来する、DNAの336 bpセグメント；及び、(iv)天然のプロモータ及びターミネータ領域を有するアスペルギルス・ニジュランスamdS遺伝子を含む、2.7 kbのDNAフラグメント。
図４に、T. reesei発現ベクターpTrex3gのプラスミドマップを示す。
【０１０１】
上記のpENTRベクター中のH. grisea cbh1のクローンを、製造者(Invitrogen社)の取扱説明書に従って、LR クロナーゼ反応によりpTrex3g目的ベクターと組み換えた。
H. grisea cbh1により、pTrex3g目的ベクターのCmR及びccdB遺伝子を、pENTR/Dベクター由来のH. grisea cbh1で組み換えた。組み換えにより、目的ベクターのT. reesei cbhIプロモータと T. reesei cbh1ターミネータの間に、H.grisea cbh1が一方向に挿入された。
組み換えにより、H.grisea cbh1の上流側と下流側の両方に、25 bpのAttB配列がそれぞれ隣接する配列が得られた。LR クロナーゼ反応生成物の一部により、Top10 E. coli細胞(Invitrogen社)を形質転換し、カルベニシリン選択性条件下で一晩培養した。
幾つかのクローンのプラスミドDNAを適切に制限酵素消化して、正しいサイズが挿入されたことを確認し、次に、塩基配列決定法により、適正な配列であることを確認した。
形質転換用のDNAを得るために、適正なクローン由来のプラスミドDNAをエンドヌクレアーゼXba1で消化して、T. reesei cbhIプロモータ、H. grisea cbh1、T. reesei cbhIターミネータ、A. nidulans amdSを含む発現フラグメントを分離させた。
この6.2 kbのフラグメントを公知のアガロースゲル抽出法を用いてE. coli DNAから単離し、市場で入手可能なQM6a菌株に由来するT. reesei菌株を形質転換した。QM6a菌株については後述する。
2つのXba Iサイトを有する発現ベクターを図5Aに模式的に示し、この発現ベクターのヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 7)を図5Bに示す。
【０１０２】
共形質転換とトリコデルマ・リーゼイの発酵
【０１０３】
この発明の構造体による形質転換の宿主株として、セルラーゼの産出を向上させるために、天然cbh1遺伝子の削除(Suominen, P. L. ら、1993年、Mol Gen Genet 241:523-30頁)を含め、種々の突然変異生成が施されたT. reesei宿主株RL-P37 (Sheir-Neissら、1984年)の誘導体を用いた。
【０１０４】
H. grisea cbh1発現構造体と、T. reesei cbh1の融合構造体と、A. セルロリティカス Elとによる、T. reeseiの遺伝子銃形質転換は、以下の手順で行なった。
【０１０５】
T. reeseiのP-37派生株に由来する胞子の懸濁液 (約3.5×108胞子/ml) を調製した。この胞子の懸濁液100μlから200 μlを、MMアセトアミド培地の中心に塗布した。
MMアセトアミド培地の組成は次の通りである。0.6 g/Lのアセトアミド；1.68 g/LのCsCl；20 g/Lのグルコース； 20 g/LのKH2PO4；0.6 g/L のCaCl2・2H2O；1 ml/Lの1000X微量元素溶液(trace elements solution)；20 g/Lのノーブル・アガー(Noble agar)；pH 5.5.の1000X微量元素溶液（5.0 g/1のFeSO4・7H2O、1.6 g/1 のMnSO4-H2O、1.4 g/1のZnSO4・7H2O及び1.0 g/1の CoCl2・6H2Oを含む）。
無菌フード中で、MMアセトアミド培地上の胞子の懸濁液を自然乾燥させた。
【０１０６】
T. reeseiの形質転換は、Bio-Rad (Hercules, CA)のBiolisticTM PDS-1000/He Particle Delivery Systemを用い、取扱説明書に従って行なった。(Lorito, M.ら、1993年、Curr Genet 24:349-56頁)
60 mgのM10タングステン粒子を微小遠心管に入れた。1mLのエタノールを添加し、この混合物液を少し振り混ぜ、15分間放置した。タングステン粒子を、15,000 rpmで15分間遠心分離した。エタノールを除去し、タングステン粒子を滅菌したdH2Oで3回洗浄し、次に滅菌した50% (v/v)グリセロール1 mLを添加した。
約10秒振り混ぜてタングステン粒子を懸濁させた後、タングステン／グリセロール粒子懸濁液25 μlを採取し、微小遠心管に入れた。
【０１０７】
25 μlのタングステン／グリセロール粒子懸濁液を連続的に振り混ぜながら、以下を順次添加し、添加の間に5分間のインキュベーションを行なった：2 μl (100-300 ng/μl)のH. grisea cbh1発現ベクター(Xbal切断フラグメント)、2 μl (100-300 ng/μl)の cbh1-El発現ベクター(Xbal切断フラグメント)、25 μlの2.5M CaCl2、及び10 μlの0.1 Mスペルミジン。
スペルミジンを添加して５分間のインキュベーションを行なった後、粒子を3秒間遠心分離した。上澄みを除去し、得られた粒子を200 μlの70% (v/v)エタノールで洗浄し、次いで3秒間遠心分離した。上澄みを除去し、得られた粒子を200 μlの100% エタノールで洗浄し、次いで3秒間遠心分離した。上澄みを除去し、24 μlの100%エタノールを添加し、ピペッティング操作により混合した。遠心管を超音波洗浄浴に約15分間置き、粒子をエタノール中にさらに再懸濁させた。超音波洗浄浴に置かれた遠心管の中の粒子懸濁液から8 μlを採取し、デシケータ内に置かれたマクロキャリア・ディスク(macrocarrier disk)の中央に滴下した。
【０１０８】
マクロキャリア上のタングステン／DNA溶液が乾燥した後（約15分）、ボンバードメント・チャンバー(bombardment chamber)の中に入れた。次にMMアセトアミドと胞子とを含むプレートを入れ、取扱説明書に従い、1100 psiの破裂板を用いて射撃操作を行なった。胞子が含まれたプレートを、タングステン／DNA粒子で射撃した後、このプレートを28℃でインキュベートした。
5日後、形質転換された大きなコロニーを、第２の新鮮なMMアセトアミドプレートに植えつけ、さらに28℃で３日間インキュベートした。第２のプレート上に成長した複数の密集し不透明なコロニーを、それぞれMMアセトアミドプレートに移し替えた。これらをさらに３日間培養し、ポテトデキストロース寒天培地(PDA) に移し替え、さらに28℃で7-10日間インキュベートして胞子形成を行なった。
【０１０９】
次に、形質転換体からの酵素の発現を、二段階の振蕩フラスコにより評価した。
先ず、以下を含む接種振蕩フラスコ中で形質転換体を培養した：22.5 g/LのProflo、30 g/Lのa-Lactose・H2O、6.5 g/Lの (NH4)2SO4、2 g/LのKH2PO4、0.3 g/LのMgSO4・7H2O、0.26 g/LのCaCL2・2H2O、0.72 g/LのCaCO3、2 mlの10% Tween 80、1 mlの1000x TRI Trace Salts (1000x TRI Trace Saltsは、5 g/LのFeSO4・7H2O、1.6 g/LのMnSO4・H2O、1.4 g/LのZnSO4・7H2Oから成る)。
培養条件は、次の通りであった：4つのバッフルを備える250 mlの振蕩フラスコ (Bellco Biotechnology社、340 Edrudo Road, Vineland, NJ 08360、米国)中の50 ml培地、インキュベート28℃、振蕩速度225 RPM、軌道半径2.5 cm)
形質転換体の接種振蕩フラスコ内への植菌は、形質転換された菌糸体及び胞子を含む4 cm2のPDA片を移し変えることにより行なった。
【０１１０】
接種フラスコ内で２日間培養した後、5 mlを発現振蕩フラスコに移し替えた。発現振蕩フラスコは、以下の組成の培地50mlを備える：5 g/Lの(NH4)2SO4、33 g/LのPIPPS緩衝液、9 g/LのBactoカザミノ酸、 4.5 g/LのKH2PO4、1.32 g/LのCaCl2・2H2O、1 g/LのMgSO4・7H2O、5 mlのMazu DF204消泡剤、 2.5 mlの400x T.reesei Trace Salts (400x T.reesei Trace Saltsは、175 g/Lのクエン酸(無水)、200 g/Lの FeSO4・7H2O、16 g/LのZnSO4.7H2O、3.2 g/LのCuSO4・5H2O、1.4 g/LのMnSO4・H2O、0.8 g/Lの H3BO3から成り、この順に添加される)、調整後のpH5.5、滅菌培地、培地滅菌後に40 mlの40%ラクトースを添加。
発現振蕩フラスコの培養条件は、次の通りであった：4つのバッフルを備える250 mlの振蕩フラスコ、インキュベート28℃、振蕩速度225 RPM。
5日後にサンプルを採取し、上澄みをクーマシー染色したSDS-PAGEプロテインゲルで分析した。
【０１１１】
＜7.2  実施例２  四部構成菌株の構築＞
以下の四部を備える菌株を構築した：(i) cbhI欠損生産株から成る宿主株；(ii) cbhI-El融合遺伝子を発現する核酸配列；(iii) 遺伝子組み換えされた熱安定性T.reesei cbhI遺伝子を発現する核酸配列；及び(iv) 遺伝子組み換えされた熱安定性T.reesei cbhII遺伝子を発現する核酸配列。
図6に示すように、3つの発現フラグメントのDNAは、cbh1欠損生産株を共形質転換している。
【０１１２】
T. reesei形質転換体を、ゲノムに組み込んだ3つの発現フラグメント全ての存在についてスクリーニングした。
3つの各発現フラグメントを増幅するため、PCRプライマー対を消化した。PCRに基づく32の形質転換体が、3つの発現フラグメント全ての存在を示し、これらを振蕩フラスコ発酵に供した。振蕩フラスコによる培養は3日間行い、上澄みのサンプルを採取し、トリス-グリシンSDS泳動緩衝液中で 8%のトリス-グリシンNuPAGE (invitrogen社)ゲル、1 mmで分析した。
サンプルは、100℃で7分間インキュベートし、次に氷の上で5分間インキュベートした後、特に断りの無い限り、20μl／レーンで仕込んだ（8μlの上澄み+2μlの還元剤+10 μlの2X トリス-グリシンSDSサンプル緩衝液) 。
32のサンプルの内のいくつかに、高レベルの発現遺伝子が存在することが蛋白質バンドで示された。
【０１１３】
T.reesei cbhI及びcbhIIの変異体のアミノ酸配列をエンコードするDNAは、公知の様々な方法により調製することができる。このような方法の例は、遺伝子合成、部位指定(またはオリゴヌクレオチド仲介)変異導入、PCR変異導入、及び予め調製したT.reesei cDNA配列をエンコードするDNAによるカセット変異導入等であるが、これらに限定されない。
【０１１４】
成熟アミノ酸配列中に以下に示す変異体を有する遺伝子工学的蛋白をエンコードする、遺伝子組み換え酵素T. reesei cbhI遺伝子を発現するベクターを、pTrex3g中に構築した。
S8P+T41I+N49S+A68T+N89D+S92T+S113N+S196T+P227L+ 
D249K+T255P+S278P+E295K+T296P+T332Y+V403D+S411F
図7Aに示すように、開始コドンから終止コドンまでのDNA配列は1545塩基(SEQ ID NO: 8)であった。
図7Bに、遺伝子組み換えされたCBHI蛋白の配列(SEQ ID NO: 9)を示す(CBHIシグナル配列に下線を付してある)。
図8Aに、cbh1発現ベクターpTrex3g-cbh1を図示した。
図8Bに示すように、発現ベクターpTrex3g-cbh1のDNA配列は10145塩基(SEQ ID NO: 10)であった。
【０１１５】
遺伝子組み換え酵素CBHII蛋白を発現させるためのベクターを構築した。このベクターには、cbhIIプロモータ、遺伝子組み換えcbhII遺伝子、cbhIIターミネータ、選択マーカとしてのA.nidulansアセトアミダーゼ(amdS)、及びcbhIIターミネータの3'フランキング配列が含まれる。このベクターは、シャトルベクターpCR-XL-TOPO (Invitrogen社)を用いて構築した。
このベクターの発現部位を、特異的制限エンドヌクレアーゼNotl 及びSrflを用いてプラスミドを消化させることによりシャトルベクターから切り取り、長さが約10.68 kbのフラグメントを生成させ、このフラグメントをT. reeseiの形質転換に用いた。
【０１１６】
このベクターは、次に示すアミノ酸配列における変異体を有する遺伝子組み換え蛋白をエンコードするT. reesei cbhII遺伝子を発現した：P98L,M134V, T154A, I212V, S316P, 及び S413Y。
図9Aに示すように、開始コドンから終止コドンまでのDNA配列は1416塩基(SEQ ID NO: 11)であった。
図9Bに、そのアミノ酸配列(SEQ ID NO: 12)を示す。(シグナル配列に下線を付した)
図10Aに、cbhII発現ベクターを図示した。
図10Bに示すように、全cbhII発現ベクターpExp-cbhIIのDNA配列は14158塩基(SEQ ID NO: 11)であった。
【０１１７】
3つのDNAフラグメントを用いて、cbhIが欠損したT. reesei 菌株の共形質転換を行った。
【０１１８】
遺伝子交換されたcbhII発現フラグメントは、NotI及びSrfIを用いてプラスミドpExp- cbhIIから切除したものであった。
【０１１９】
発現ベクターpTrex3g中の遺伝子交換されたcbhIは、cbhIプロモータ、遺伝子交換されたcbhI及びcbhIターミネータ(amdSマーカ無し)の直鎖フラグメントを生成させるためのPCRテンプレートとして用いた。
前記実施例に記載したcbhI-El融合フラグメントを、cbhIプロモータ、cbhI-El融合遺伝子、及び、cbhIターミネータ(amdSマーカ無し)から成る直鎖フラグメントを生成させるためのPCRテンプレートとして用いた。
これらの3つのフラグメントで、遺伝子銃による共形質転換用のタングステン粒子をコートした。前記実施例に記載した手順で共形質転換を行なった。
この共形質転換において、タングステン粒子に各フラグメント1, 2, 3を1.5 μlずつ添加した(DNA濃度 100-300 ng/μl)。
形質転換体の選択は、前記のようにしてMMアセトアミド培地で行なった。
【０１２０】
＜6.3  実施例3  形質転換されたトリコデルマ・リーゼイのクローンのセルロース分解活性評価＞
以下の評価方法と基質を用いて、CBHI-EI融合蛋白のセルロース分解活性を評価した。トリコデルマ・リーゼイ菌株Tr-A及びTr-Dは、RL-P37の変異誘発に由来する。
【０１２１】
前処理したトウモロコシ茎葉(PCS)：
トウモロコシ茎葉を、Schell, D.らのJ. Appl. Biochem. Biotechnol. 105:69 - 86頁 (2003年)に記載されているように、2% w/w H2SO4で前処理し、次に脱イオン水でpHが4.5になるまで数回洗浄した。酢酸ナトリウムを最終濃度が50mＭになるまで添加し、滴定した結果pH 5.0であった。
【０１２２】
総蛋白の測定：
蛋白の濃度は、ウシ血清アルブミンを標準に用いたビシンコニン酸法により測定した。(Smith, P. K.ら、(1985年) Anal. Biochem. 150:76-85頁)
【０１２３】
セルロースの転化率(水溶性の糖の測定)は、Bakerらが、Appl. Biochem. Biotechnol. 70-72:395-403頁 (1998年)に記載した方法に従い、HPLCで評価した。
【０１２４】
この実施例では、標準的なセルロース分解性の評価方法を用いた。この評価方法では、酵素と緩衝化した基質を容器に入れ、所定の温度で一晩インキュベートした。反応の停止は、pH 11.0の100 mMグリシンを、反応混合物のpHが少なくとも10になるまで十分に添加することにより行なった。反応が停止したら、反応混合物の一部を採取し、0.2ミクロンのフィルターで濾過して固形分を除去した。濾過した溶液について、上記の方法によりHPLCで水溶性の糖を測定した。
反応混合物中のセルロースの濃度は約7%であった。酵素または酵素混合物は、セルロース１グラムに対し、総蛋白の量が1から60 mgの範囲となるように添加した。
【０１２５】
下記の表１に示すデータから、四部構成菌株は、修飾されたトリコデルマ・リーゼイ菌株Tr-Dよりも優れた性能を有することが分かる。
【表１】
0005651466.tif 000006
下記の表2に示すデータから、三部構成菌株は、トリコデルマ・リーゼイ菌株Tr-A よりも優れた性能を有することが分かる。
【表２】
0005651466.tif 000007
【０１２６】
本願に引用した文献及び刊行物は、参照として本願に組み込まれる。この発明を実施する別の方法が種々存在する。すなわち、実施例は本願発明を説明するためのものであって、限定するためものではなく、本願は明細書の記載により限定されず、この発明の範囲には、請求項の記載及びその均等な範囲が含まれる。
【図１】
0005651466.tif 000008
【図２】
0005651466.tif 000009
【図３Ａ】
0005651466.tif 000010
【図３Ｂ】
0005651466.tif 000011
【図３Ｃ】
0005651466.tif 000012
【図３Ｄ】
0005651466.tif 000013
【図３Ｅ】
0005651466.tif 000014
【図３Ｆ】
0005651466.tif 000015
【図４】
0005651466.tif 000016
【図５Ａ】
0005651466.tif 000017
【図５Ｂ】
0005651466.tif 000018
【図５Ｃ】
0005651466.tif 000019
【図５Ｄ】
0005651466.tif 000020
【図５Ｅ】
0005651466.tif 000021
【図６】
0005651466.tif 000022
【図７Ａ】
0005651466.tif 000023
【図７Ｂ】
0005651466.tif 000024
【図８Ａ】
0005651466.tif 000025
【図８Ｂ】
0005651466.tif 000026
【図８Ｃ】
0005651466.tif 000027
【図８Ｄ】
0005651466.tif 000028
【図８Ｅ】
0005651466.tif 000029
【図８Ｆ】
0005651466.tif 000030
【図９Ａ】
0005651466.tif 000031
【図９Ｂ】
0005651466.tif 000032
【図１０Ａ】
0005651466.tif 000033
【図１０Ｂ】
0005651466.tif 000034
【図１０Ｃ】
0005651466.tif 000035
【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【配列表】
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