(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１のホスホラミダイトであって、
【化１】
0005714490.tif 000043
ここで、
Ｙは酸素または硫黄であり；
Ｗは酸素であり；
Ｒ４は三級ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリイソプロピニルシリルオキシメチレン、フルオレニルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、アルキル、アリル及びアセチルからなる群の一員であり；
Ｚはジメトキシトリフェニル（ＤＭＴ）、モノメトキシトリフェニル（ＭＭＴ）及びトリメトキシトリフェニル（ＴＭＴ）からなる保護基であり；
Ｒ１はアルキルまたはアリル基であり；
Ｒ２はアルキルまたはアリル基であり；
Ｒ３はシアノエチル、アルキルまたはアリル基である；及び
Ｂは水素、またはアミン保護基のある各アミンで付加的に機能化する核酸塩基であり、前記核酸塩基は、adenine、guanine、cytosine、thymine、uricil、A(N-Bz)、A(N-Ac)、A(N-tBPac)、A(N-Pac)、C(N-Bz)、C(N-Ac)、C(N-tBPac)、C(N-Pac)、G(N-iBu)、G(N-Ac)、G(N-tBPac)、G(N-Pac)からなる群から選択されるホスホラミダイト。
【請求項２】
以下から選択された構造式によって表されるＲＮＡオリゴマーの合成のための５’から３’方向に対する結合形成によるオリゴヌクレオチドを調製する方法であって、
【化２】
0005714490.tif 000044
前記方法は以下の化合物を反応させるステップを含み、
【化３】
0005714490.tif 000045
ここで、
Ｂは水素、またはアミン保護基のある各アミンで付加的に機能化する核酸塩基であり、前記核酸塩基は、adenine、guanine、cytosine、thymine、uricil、A(N-Bz)、A(N-Ac)、A(N-tBPac)、A(N-Pac)、C(N-Bz)、C(N-Ac)、C(N-tBPac)、C(N-Pac)、G(N-iBu)、G(N-Ac)、G(N-tBPac)、G(N-Pac)からなる群から選択され；
ｎは０から９８であり；
Ｙは酸素または硫黄であり；
Ｗは酸素であり；
Ｒ４は三級ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリイソプロピルシリルオキシメチレン、フルオレニルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、アルキル、アリルまたはアセチルであり；
Ｚはジメトキシトリフェニル（ＤＭＴ）、モノメトキシトリフェニル（ＭＭＴ）、トリメトキシトリフェニル（ＴＭＴ）からなる保護基であり；
Ｒ１及びＲ２はアルキルまたはアリル基から独立して選択され；
Ｒ３はシアノエチル、アルキルまたはアリル基であり；及び
Ｍは水素ラジカル、Ｙ−ＣＯ−であり；ここで、Ｙは固体支持体への付着に安定なリンカーである方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【０００２】
本発明は新規のホスホラミダイトＲＮＡモノマーの合成、及びリバースの5´→3´方向でのＲＮＡオリゴヌクレオチド合成の新規な方法に適した対応する固体支持体に関する。この取り組みは、高純度で治療用グレードのＲＮＡオリゴヌクレオチドを生産するための、３’末端での様々な修飾のきれい且つ効果的な導入を可能にする非常にきれいなオリゴヌクレオチド合成を導く。
【背景技術】
【０００３】
5´→3´方向での定義された配列ＲＮＡ合成は、現在ではよく確立され、非常に多様な治療用グレードのＲＮＡアプタマー、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及び生物学的に活性なＲＮＡ分子の合成と開発に近年用いられている。この取り組みは、リボヌクレオシドと、適したＮ保護基：一般的に５’の保護基、最もよく知られているジメトキシトリフェニル（dimethoxytriphenyl）、すなわち、ＤＭＴ基であり；２’の保護基、最もよく知られている以外はｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（t-Butyldimethylsilyl ether）であり；及び３’ホスホラミダイト、最もよく知られているものはシアノエチルジイソプロピルである（成分１）。そして、この要素は、固体支持体（成分２）に付着したリボヌクレオシドの適したＮ保護基、２’または３’のコハク酸塩のあるヌクレオシドとカップリングする。成分１と5'-OH-n-protected -2',3'-protected-nucleoside（成分３）とのカップリングは、ダイマーやオリゴリボヌクレオチドを導く活性剤の存在下で液相においても達成され、酸化（5´→3´方向の合成）が続き、3'-5'ヌクレオチド間の架橋を有する保護されたジヌクレオチドも導く（Ogilvie, K.K., Can. J. Chem., 58, 2686, 1980）（スキーム１）。
【０００４】
しかしながら、リバース方向（5´-3´方向）でのＲＮＡの合成は、我々が知る限りにおいて達成されていない。
【０００５】
成分１の２’−シリルエーテル（2'-silyl ethers）が広く開発され、それらが著しい安定性を有することが知られている。シリルエーテルの加溶媒分解が広く研究され、大きなアルキルシリルエーテル（alkyl silyl ethers）が高度な安定性を有することが知られている（Bazani, B and Chvalowski, V Chemistry of Organosilicon compounds, Vol. 1, Academic Press, New York, 196）。幅広い研究がオリゴヌクレオチドの合成のための２’の水酸基保護基として、Ogilvieと共同研究者によって、その後行われた（Ogilvie, K.K., Sadana, K.L, Thompson, E.A., Quilliam, M.A., and Westmore, J.B Tetrahedron Letters, 15, 2861-2864, 1974; Ogilvie, K.K., Beaucage, S.L, Entwistle, D. W., Thompson, E. A., Quilliam, M. A., and Westmore, J.B. J. Carbohydrate Nucleosides Nucleotides, 3, 197-227, 1976 ; Ogilvie, K.K. Proceedings of the 5th International Round Table on Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Applications, Rideout, J.L., Henry , D. W., and Beacham L. M., Ill, eds., Academic, London, pp. 209-256,1983）。
【０００６】
これらの研究は、液相と固相の両方のオリゴヌクレオチド合成に従う方法の継続した開発と、ｔＲＮＡの大きさと性状のＲＮＡ分子の最初の化学合成をその後導いた（Usman, N., Ogilvie, K.K., Jiang, M.-Y.,and Cedergren, RJ. J. Am. Chem. Soc. 109, 7845-7854, 1987; Ogilvie, K.K., Usman, N., Nicoghosian, K, and Cedergren, RJ. Proc. Natl. Acad. ScL USA, 85, 5764-5768, 1988 ; Bratty, J., Wu, T., Nicoghosian, K., Ogilvie, K.K., Perrault, J.-P., Keith, G. and Cedergren, R., FEBS Lett. 269, 60-64, 1990）。その文献は、それに続く優れた発表において広くレビューされた（Gait, MJ., Pritchard, C. and Slim, G., Oligonucleotides and Their Analogs: A Practical Approach (Gait, MJ., ed.), Oxford University Press Oxford, England, pp 25-48, 1991）。ＲＮＡ合成に最近利用されている他の保護基は：bis ( 2- acetoxyethyl-oxy) methyl ( ACE), Scaringe, S. A., Wincott, F.E., Caruthers, M.H., J. Am. Chem. Soc, 120: 11820-11821, 1998；triisopropylsilyloxy methyl (TOM), Pitsch, S., Weiss, P. A., Jenny, L., Stutz, A., Wu, X., HeIv. Chim. Acta. 84, 3773-3795, 2001及びt- butyldithiomethyl (DTM) (スキーム１), Semenyuk, A., Foldesi, A., Johansson, T., Estmer-Nilsson , C, Blomgren, P., Brannvall, M., Kirsebom, L.A., Kwiatkowski, M., J.Am. Chem. Soc, 128: 12356-12357, 2006が発表された。しかしながら、これらのプロセスのどれもリバース方向（5´→3´方向）でのＲＮＡ合成を実施しにくく、一方、それらはリバース方向への達成可能なＲＮＡ分子の３’末端での多くのリガンドや発色団の便利で効果的な導入の機能を欠いている。
【０００７】
化学的に修飾されたＲＮＡは、アラビノース、2'-deoxy-2'-fluoro-beta-D-arabinonucleic acid（FANA; 構造２）及び2'-deoxy-4'-thio-2'-fluoro-beta-D-arabinonucleic acid（4'-Thio-FANA; 構造３）をｓｉＲＮＡ活性剤の配列に修飾して合成された（Dowler, T., Bergeron, D., Tedeschi, Anna-Lisa, Paquet, L., Ferrari, N., Damha, M. J., Nucl. Acids Res., 34, 1669-1675, 2006）。いくつかの新しい２’保護基の中で、開発された成分、2'-protecting 2-cyanoethoxymethyl（ＣＥＭ）（構造４）は非常に長いＲＮＡを生成するために示され、しかしながら、従来の、すなわち、3´→5´方向のＲＮＡ合成を実施するものでもある。さらに、これらのプロセスで生産されたＲＮＡの品質は疑問が残る。
【化１】
0005714490.tif 000002
【化２】
0005714490.tif 000003
【化３】
0005714490.tif 000004
【化４】
0005714490.tif 000005
【０００８】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによるin vitroでの転写によってのように、合成の大きさの非効率と制限を回避するので、ＲＮＡの化学合成は好ましい（Helm, M., Brule, H., Giege, R., Florence, C, RNA, 5:618-621, 1999）。ＲＮＡの化学合成は、ＲＮＡの構造と機能の研究に好ましく、官能基の部位特異的な導入のような多くの便利な修飾が選択的に達成されうる（viz., disulphide cross linking as a probe of RNA tertiary structures, Maglott, E. J., Glide, G.D., Nucl. Acids Res., 26: 1301-1308, 1999）。
【０００９】
長いＲＮＡの合成はｔＲＮＡのような生物学的に活性な分子にとって非常に重要であり、そのよな合成が達成された（Persson, T., Kutzke, U., Busch, S., Held, R., Harmann, R.K., Bioorgan. Med. Chem., 9:51-56, 2001; Oglvie, K.K., Usman, N., Nicoghosian, K., Cedrgren, R. J., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:5764-5768, 1988；Bratty, J., Wu, T., Nicoghosian, K., Ogilvie, K.K., Perreault, J. -P., Keith, G., Cedergren, R. J., F.E.B.S. Lett., 269:60-64 , 1990；Gasparutto, D., Livache, T., Bazin, H., Duplaa, A.M., Guy, A., Khorlin, A., Molko, D., Roget, A., Teoule, R., Nucl. Acids. Res., 20:5159-5166, 1992；Goodwin, J.T., Stanick, W. A., Glick, G.D., J.Org. Chem., 59:7941- 7943, 1994）。この段落で述べられた技術のいずれも、リバース方向（5´→3´方向）のＲＮＡの合成を意図するものではなく、一方、３’末端での選択的な導入に要求される数多くの基の実用的で便利な導入が手に入りにくいままである。
【００１０】
本発明は、我々のリバースＲＮＡアミダイドでの、自動オリゴ合成における工程あたりのより高いカップリング効率を観測し、より高い純度の達成と、非常に長いオリゴの生成の卓越した能力を生じる。それらはまた、本発明のプロセスがＭ＋１種類のないオリゴヌクレオチドを導き、種類はＨＰＬＣ分析、または生成、もしくはゲル濾過における所望のピークのショルダーのような不純物をクローザーに導く。
【００１１】
リボヌクレオシドの２’水酸基でのｔ−ブチルジメチルシリル保護基は、３’ホスホラミダイトを作るため、また、３’水酸基の位置にむしろ簡単に移動することを示したオリゴヌクレオチド合成にそれらを利用するための選択肢の一群であった。
【００１２】
これは、十分かつ詳細に実証された（Ogilvie, K.K., and Entwistle, D. W. Carbohydrate Res., 89, 203-210, 1981; Wu, T., and Ogilvie, K.K. J. Org. Chem., 55, 4717-4734, 1990）。そのような移動は所望のホスホラミダイトの合成を困難にし、対応する異性体完全に分離し、最終的なモノマーの如何なるコンタミネーションをも防ぐ効率的な生成方法を要求する。
【００１３】
本発明は、高純度のＲＮＡの合成、特に合成ＲＮＡのオリゴヌクレオチドの３’末端での選択された基を導入するのに好ましい。そのようなＲＮＡは、治療、診断、ドラッグデザイン、及び細胞環境でのＲＮＡ配列の選択的阻害、細胞内に存在する異なるタイプのＲＮＡの機能のブロックにおいて非常に広い応用を有する。
【００１４】
分子をベースとした核酸でのｍＲＮＡレベルでの遺伝子発現のサイレンシングは、魅力的な取り組みである。これらのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は選択的な遺伝子阻害に非常に大きな可能性を提供し、様々な生化学的、薬理学的なプロセスの制御と管理おける応用を非常に大きな期待を示す実績のある取り組みになった。Fire etal., Fire, A., Xu, S., Montgomery, M.K., Kostas, S. A., Driver, S.E., and Mello, CC, Nature, 391, 806-81 1, 1998による初期の研究は、線虫（Caenorhabditis elegans）におけるＲＮＡ干渉が２１及び２２ヌクレオチドＲＮＡ配列によってもたらされることを示した。これは、２１及び２２ヌクレオチドによってもたらされる小さな二重鎖ＲＮＡによる遺伝子発現の特異的な阻害の一般的な現象としてさらに確認された（Genes Dev., 15, 188-200, 2001）。Capie, N.J.、Parrish, S.、Imani, F., Fire, A.及びMorgan , R.A.による同時の研究が、無脊椎動物及び脊椎動物において小さな二重鎖（ｄＳ）ＲＮＡによる特異的な遺伝子発現のそのような現象を確認した。その後に膨大な量の研究が上述の研究の確認につながり、選択的な、非常に特異的な遺伝子の阻害及び制御のための強力なツールとして確立された（Nishikura, K., Cell, 107, 415-418, 2001；Nykanen, A., Haley, B., Zamore, P.D., Cell, 107, 309-321, 2001； Tuschl, T., Nat. Biotechnol., 20, 446- 448, 2002；Mittal, V., Nature Rev., 5, 355-365, 2004; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 6047-6052, 2002；Donze, O. & Picard, D., Nucl. Acids. Res., 30, e46,2002；Sui, G.,Soohoo, C, Affar el, B., Gay, F., Shi, Y., Forrester, W.c, and Shi, Y., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 5515-5520, 2002；Paddison, P.J.,Caudy, A.A., Bernstein, E., Harmon, G.J.; and Conklin, D.S., Genes Dev., 16, 948-959, 2002）。
【００１５】
天然の二重鎖（ｄｓ）ＲＮＡ配列に加えて、化学的に修飾されたＲＮＡが同様の理由を示すか、ｓｉＲＮＡ活性剤の配列に2'-deoxy-2'- fluoro- beta-D-arabinonucleic acid (FANA)を用いて哺乳類細胞におけるＲＮＡ干渉を強化した（Dowler, T., Bergeron, D., Tedeschi, Anna-Lisa, Paquet, L., Ferrari, N., Damha, M. J., Nucl. Acids Res., 34, 1669-1675, 2006）。
【００１６】
ｓｉＲＮＡ特性を改良するための他の様々な修飾が追求され、それはバックボーンの化学的性質、２’糖修飾及び核酸塩基における改変を含み、そのうちのいくつかは最近レビューされた（Nawrot, B, and Sipa, K., Curr. Top. Med. Chem., 6,913-925, 2006; Manoharan, M. Curr. Opin. Chem. Biol., 8, 570-579, 2004）。いくうかの報告が毒性の増加を示し、幾らかの効果の減少を示すが、ｓｉＲＮＡのＰＳ修飾はよく許容される（Harborth, J., Elbasir, S. M., Vandenburgh, K., Manninga, H., Scaringe, S. A., Weber, K., Tuschl, T., Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 13, 83-105, 2003）。これらの中で、Ａ型（ＲＮＡ様の）ヘリックスでを保持するが、２’−Ｏ−メチル（2'-O-methyl）修飾でもあり、配列中の多くのそのような修飾に依存するｓｉＲＮＡ活性を保持または低下を示した（Chiu, Y.L., Rana, T.M., RNA, 9, 1034-1048, 2003）。配列の広範囲な２’−Ｏ−メチル修飾がｓｉＲＮＡ活性の損失なしにセンス鎖において作られることも示された（Kraynack,B.A., Baker, B. F., RNA, 12, 163-176, 2006）。
【００１７】
高い結合親和性を与える二環型のlocked nucleic acids (LNA's)が、特にｓｉＲＮＡ配列の中心の領域が回避されるときに、ｓｉＲＮＡ配列にも導入される（Braash, D.A., Jensen, S., Liu, Y., Kaur, K., Arar, K., White, M.A., and Corey , D.R., Biochemistry, 42, 7967-7995, 2003）。同様にアルトリトール（altritol）糖修飾されたオリゴヌクレオチド（ＡＮＡ）が最近報告された。アルトリトール糖は、硬い構造を与え、配列特異的な方法でＲＮＡと非常に安定な二本鎖を形成することを示し、Ａ（ＲＮＡ型）の構造のままであることを更に示した。ＭＤＲ１遺伝子を標的とするＡＮＡ修飾されたｓｉＲＮＡが、修飾されていないコントロールに比して効率の改善を示し、この修飾がセンス鎖またはアンチセンス鎖の３’末端の近傍にあるときに特に効果的である（Fisher, M., Abramov, M., Aerschot, A.V., Xu, D., Juliano, R.L., Herdewijn, P., Nucl. Acids Res.,35, 1064-1074, 2007）。
【００１８】
行われるのに効果的なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のための様々な要求の中で、数多くの知見と事実が確立された。そして、ＲＮＡが標的の識別領域において二重鎖（ｄｓ）であるべきである。化学的要求に対して、三リン酸に変わるべき５’末端の機能に加えて、Ａ、Ｃ、Ｇの修飾は干渉活性完全に互換性を有することが発見された。２’−フッ化（2'-fluoro）、２’−アミノウラシル（2'-amino uracil）、２’−デオキシチミジン（2'-deoxy thymidine）及び２’−デオキシシチジン（2'-deoxycytidine）のようなＲＮＡのバックボーンの修飾が、二重鎖を生じることにおいて修飾されたＲＮＡの安定化させるように見える。ヌクレオシド塩基修飾５−臭化ウラシル（5- bromouracil）、４−チオウラシル（4- thiouracil）、５−ヨウ化ウラシル（5-iodouracil）、５−（３−アミノアリル）−ウラシル（5-( 3- aminoallyl)- uracil）、イノシン（inosine）は、ＲＮＡ干渉複合体（ＲＮＡｉ及びＲＩＳＣ複合体）にすぐに取り込まれる。同様に、イノシンは、グアノシンに置換されるであろう。コレステロール結合ｓｉＲＮＡが細胞への運搬を達成し、遺伝子発現のサイレンシングを可能にする。さらに、脂質結合ｓｉＲＮＡが示され、胆汁酸及び長鎖脂肪酸がｓｉＲＮＡの細胞への取り込みを媒介し、in vitroでの遺伝子発現をサイレンシングする。組織におけるｓｉＲＮＡ複合体の効率的で選択的な取り込みは、リポタンパク質粒子、リポタンパク質／レセプター相互作用及び膜貫通タンパク質が媒介した取り込みと最大限の関連に依存する。高密度リポタンパク質が肝臓、腸、腎臓及びステロイドを含む臓器へのｓｉＲＮＡの運搬を導くことが示された。ＬＤＬがｓｉＲＮＡを主として肝臓に導くこと、及びＬＤＬレセプターがｓｉＲＮＡの運搬に関与することが更に示された。これらの結果は、治療の開発に活用することが可能な適切な運搬システムによるｓｉＲＮＡの取り込みへの大きな展望を示す（Article by Marcus Stoffel, OTS, 2007, p.64）。
【００１９】
ｓｉＲＮＡがヌクレアーゼ分解に対して保護し、炎症を排除、標的遺伝子のサイレンシングを軽減するために化学的修飾を意図し、その結果、標的遺伝子の有効性を改善すること可能であることが提唱されている。細胞の取り込みを増強させる運搬媒体や、脂質と他の親油性分子との複合体が治療の開発に重要である。そのようなｓｉＲＮＡが、ヒトを対象とした検査、病気の経路の干渉、及び医薬品開発の新たな領域の展開のために最近開発された（Alan Sachs, Merck, Oligonucleotide Therapeutics Conference (OTS), page 80, 2007）。
【００２０】
ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端は修飾することができ、修飾を許容することが示され、siRNA function in RNAi: a chemical modification, Ya-Lin Chiu and Tariq Rana, RNA, 9, 1034-1048, 2003; M. Manoharan, Curr. Opin. Chem.Biol, 6, 570-579,2004; Nawrot, B. and Sipa, K., Curr.Top.Med. Chem., 6, 913-925, 2006; Scaringe, S., Marshall, W.S., Khvorova, A., Naty. Biotechnol., 22, 326-30, 2004などの数多くの重要な出版物に詳述されているように、そのリガンドの付着物がこの末端で最も好都合である。
【化５】
0005714490.tif 000006
【化６】
0005714490.tif 000007
【００２１】
親油性または親水性基の導入及びｓｉＲＮＡの運搬の強化もしくは標的の最適化が取り組まれ、バイオコンジュゲーション（bio-conjugation）を介して達成された（図１）。一般的に、好んでセンス鎖の３’末端で、時折アンチセンス鎖の３’末端に付加が起こる。ヌクレアーゼ耐性のｓｉＲＮＡの設計が、効果的な治療の開発のための最近の激しい研究と開発の目的となっている。そして、２−チオウリン（2-thiouridine）、プソイドウリジン（pseudouridine）、ジヒドロウリジン（dihydrouridine）がＲＮＡ分子の構造における効果、及び関連する生物活性を明らかにした（Sipa, K., Sochacka, E., Kazmierczak-Baranska, J., Maszewska, M., Janicka, M., Nowak, G., Nawrot, B., RNA, 13, 1301-1316, 2007）。２’−修飾されたＲＮＡ、特に２’−フッ化ＲＮＡがヌクレアーゼに対する卓越した耐性を有し、in vivoの生物的に活性であることが示された（Layzer, J.M., McCaffrey, A.P., Tanner, A.K., Huang, Z., Kay, M. A., and Sullenger, B.A., RNA, 10, 766-771, 2004. 2'- O-Alkyl-modification , such as 2'- O-methyl's and 2'- O-MOE, Prakash, S., Allerson, CV.R., Dande,P., Vickers, T.A., Siofi, T.A., Jarres, R., Baker, B.F., Swayze, E.E., Griffey, R.H., and Bhat, B., J.Med. Chem., 48, 4247, 4253, 2005）。同じ著者がｓｉＲＮＡ特性の改善とＲＮＡｉの増強のために、2'- O alkyl修飾の組み合わせに4'-thio修飾した糖ヌクレオシドを用いた（Dande, P., Prakas, T.P., Sioufi, N., Gaus, H., Jarres, R., Berdeja, A., Swayne, E.E., Griffey, R.H., Bhat, B.K, J. Med. Chem., 49, 1624-1634, 2006）。ｓｉＲＮＡのヌクレオチド間リン酸（internucleotide phosphate）のホスホチオエート（phosphorothioate）及びボラノリン酸（boranophosphate）での置換は、in vivoでの展望を示した（Li, Z. Y., Mao, H., Kallick, D.A., and Gorenstein, D. G., Biochem. Biophys. Res. Comm., 329, 1026-1030, 2005；Hall, A.H.S., Wan, J., Shaughnessy, E.E., Ramsay Shaw, B., Alexander, K. A., Nucl. Acids Res., 32, 5991-6000, 2004）。
【００２２】
ｓｉＲＮＡ分子のバイオコンジュゲーション、生物学的なＲＮＡ分子、アプタマー及び合成ＤＭＮＡ分子は、in vivoでの安定性及び適切なヌクレオシドの修飾に加えて、細胞膜透過性の重要な特徴を要求し、不十分な膜通過細胞取り込みがｓｉＲＮＡ、他の一本鎖ＲＮＡまたは様々なＤＮＡ分子の利用を制限する。そして、ｓｉＲＮＡの３’末端に付着したコレステロールは、in vivoでの輸送と治療的な遺伝子のサイレンシングを改善することが示された（Soutschek, J., Akine, A., Bramlage, B., Charisse, K., Constein, R., Donoghue, M., Elbasir, S., Geickk, A., Hadwiger,P., Harborth, J., Nature, 432, 173-0178, 2004）。
【００２３】
様々な結合、加えてコレステロールの中で、以下のものが開発された。
（ａ）天然及び合成のタンパク質形質導入ドメイン（protein transduction domains（PTD））は、細胞透過ペプチド（CPP）または膜透過ペプチド（MPP）とも呼ばれ、細胞膜と相互作用できる短いアミノ酸配列である。ＭＰＰ−ｓｉＲＮＡ複合体の取り込みがすぐに起こる。そのようなペプチドが鎖の３’の位置に好んで結合することができる。
（ｂ）他のポリカチオン分子がＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の何れかの３’末端に結像することができる。
（ｃ）ＰＥＧ（polyethylene glycols-oligonucleotide conjuagates）が、標的細胞に取り込まれた後の様々な複合体処理特異的遺伝子サイレンシング効果に用いられている（Oishi, M., Nagasaki, Y., Itaka, K., Nishiyama, N., and Kataoka, K., J. Am. Chem. Soc, 127, 1624-1625, 2005）。
（ｄ）アプタマーがｓｉＲＮＡの部位特的運搬に用いられている。アプタマーはそれらの標的に対して高い親和性を有するので、ｓｉＲＮＡとの複合体が優れた運搬システムとして機能し、標的の遺伝子発現の効果的な阻害を生じる（Chu, T.C., Twu, K.Y., Ellington, A.D. and Levy, M., Nucl. Acids Res., 34(10), e73, 2006）。これらの分子はｓｉＲＮＡまたは他の生物的に活性なオリゴヌクレオチドの３’末端に再度結合することができる。
（ｅ）３’末端での様々な脂質複合体が本発明を介して達成することができ、オリゴヌクレオチドの効果的な内部移行に利用することができる。親油性の部分は、ホスホラミダイトを合成するための水酸基機能を構成することができる。同様に、親油性の部分は、末端でカルボキシル基の機能を有することができる。後者は、Ｃ−６アミノリンカーアミダイトのようなアミノリンカーの最終的な付加により合成され、リバースの合成オリゴヌクレオチドの、ＤＣＣ（dicyclohexyl cabodiimide）または同様のカップリング試薬を用いるカルボキシル基部分に対するスペーサを有する３’−アミノ基と結合することができる。
【００２４】
この研究は、Paula, De. D., Bentley, M.V.L.B., Mahao, R.L., RNA, 13, 431-456,2007によりすっきりとレビューされた。
【００２５】
ｓｉＲＮＡに緊密なＲＮＡのもう一つのクラスがmicroRNAであり、ｍｉＲＮＡと一般に呼ばれる。これらは、遺伝子制御に大きな役割を有する非コードＲＮＡの大きなクラスである（Bartel, D.P. Cell, 116,281-297, 2004；He, L., Hannon, G.J. Nat. Rev. Genet, 5:522-531, 2004； Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Lendeckel, W., Tuschl, T., Science, 204:853-858,2001）。ヒトのゲノムにおいて、ゲノム全体にわたって点在する少なくとも１０００種類のｍｉＲＮＡがある。これらのmicroRNAの多くが、非常に多くの標的ｍＲＮＡを減少させる（Lim, L. P., Lau, N.C., Garrett- Engele, P., Grimson, A., Schelter, J.M., Castle, J., Bartel, D.P., Linsey, P.S., Johnson, J.M., Nature, 433:769-773, 2005）。ｍｉＲＮＡの異なる組み合わせは、哺乳類細胞における標的遺伝子の制御におそらく関与する。ｓｉＲＮＡがｍｉＲＮＡとして機能できることも示された（Krek, A., Grun, D., Poy, M.N., Wolf, R., Rosenberg, L., Epstein, E.J., MacMenamin, P., da Piedade, I., Gunsalus, K.C., Stoffel, M., Nat. Genet., 37: 495-500, 2005；Doench, J.G., Petersen, C.P., Sharp, P.A., Genes Dev., 17:438-442, 2003）。ｍｉＲＮＡは治療において及び遺伝子制御において大きな可能性を有する（Hammond, S. M., Trends MoI. Med. 12:99-101, 2006）。ｍｉＲＮＡ経路、発達や特に癌に照準を当てた病気におけるそれらの役割を理解するためのおびただしい量の試みが最近当てられた。ｍｉＲＮＡの標的は、治療及び診断の開発のために開発されている。非常に多数のｍｉＲＮＡが同定され、マイクロアレイ、ＰＣＲ及び情報科学を通して、それらの役割が決定されてきている。ｍｉＲＮＡを標的にするように設計されたＲＮＡの合成は、より良い細胞の取り込みのためのＲＮＡ及びバイオコンジュゲーションの安定性のために、ｓｉＲＮＡに要求されるようなＲＮＡ合成及び他の修飾をも要求する。本発明により直面したリバース合成は、この研究と開発のペースを非常に加速させる。
【００２６】
膨大な種類の治療グレードのＲＮＡ及びｓｉＲＮＡの合成はオリゴヌクレオチドの３’末端の修飾またはラベルを要求する。ｓｉＲＮＡの場合、一般的に、それはセンス鎖の３’末端である。親油性、長鎖リガンドまたは発色団を要求し、3´→5´合成方法論を用いる３’末端を修飾したＲＮＡの合成は、対応する個体の支持体要求し、一般に、好ましい疎水性の修飾を含む大量の切断された配列のために、最終的なオリゴヌクレオチドのカップリング効率の低さと純度の低さを一般に生じる。
【００２７】
本発明は、5´→3´方向のＲＮＡ合成のためのリバースＲＮＡモノマーホスホラミダイトを開発することにより、この問題に取り組んだ。この配置は３’末端での様々な修飾の導入を綺麗かつ効率的に可能とする非常にきれいなオリゴヌクレオチド合成を導く。付加的な好ましい生化学的な特性の安定と誘発を強化するように、この技術は、以前開発された２’−５’−架橋したＤＮＡ（構造５）及びＲＮＡ（構造６）を利用することができる。
【化７】
0005714490.tif 000008
【化８】
0005714490.tif 000009
【００２８】
合成ヌクレオシドを含む脂質がＡＺＴのような多くの合成ヌクレオシド試薬の取り込みを増強させることから、ＲＮＡの効率的な運搬のため、オリゴヌクレオチドの細胞内濃度を増加させるために、オリゴヌクレオチドを含む脂質が一般的合成される。Lipipoid核酸がオリゴヌクレオチドの親水性を減少させるために期待される。同様に、コレステロールのような疎水性分子がＬＤＬ粒子やリポタンパク質に結合することができ、オリゴヌクレオチドを輸送するためのこれらのタンパク質に関与する運搬プロセスを活性化する。Lipidoic核酸がオリゴヌクレオチドの効率を改善することも示された（Shea, R.G., Marsters, J.C., Bischofberger, N., Nucleic Acids Res., 18, 3777, 1990；Letsinger, R.L., Zhang, G., Sun, D.K., Ikeuchi, T., Sarin, P.S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6553, 1989；Oberhauser, B., and Wagner, E., Nucleic Acids Res., 20, 533, 1992；Saison,-Behmoaras, T., Tocque, B., Rey, I., Chassignol, M., Thuong, N.T., Helene, C. The EMBO Journal , 10, 11 1 1, 1991；Reed, M.W., Adams, A.D., Nelson, J.S., MeyeR.B., Jr., Bioconjugate Chem., 2, 217, 1991; Polushin,N.N., Cohen, J., J. Nucleic Acids Res., 22, 5492, 1994；Vu, H., Murphy, M., Riegel, Joyce, M., Jayaraman, K., Nucleosides & Nucleotides , 12, 853, 1993；Marasco, Jr., Angelino, N.J., Paul, B., Dolnick, B.J., Tetrahedron Lett., 35, 3029, 1994）。この研究において、アダマンタン（adamantane）（構造７）、エイコセン酸（eicosenoic acid）（構造８）及びコレステロールのような一連の疎水基のＴｍは、３’末端でオリゴデオキシヌクレオチド配列に付着し、相補的なＲＮＡ配列にハイブリダイズし、Ｔｍは影響しないことが発見され、そのような基がオリゴのハイブリダイゼーション特性に干渉しないことを示した（Manoharan, M., Tivel, K.L., Andrade, L. K., Cook, P. D., Tetrahedron Lett., 36, 1995；Manoharan, M., Tivel, K.L., Cook, P.D., Tetrahedron Lett., 36, 3651-3654, 1995；Gerlt, J.A. Nucleases, 2 nd Edition, Linn, S.M., Lloyd, R.S., Roberts, R. J., Eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, p-10, 1993）。
【化９】
0005714490.tif 000010
【化１０】
0005714490.tif 000011
【化１１】
0005714490.tif 000012
【化１２】
0005714490.tif 000013
【００２９】
高い期待を示す前述のｌｉｐｉｄｏｉｃ分子に加えて他のクラスの分子は、短鎖及び長鎖のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である（Bonora, G.M., Burcovich, B., Veronese, F.M., Plyasunova, O., Pokrovsky, A. and Zarytova, V., XII International Round Table Conference, Nucleosides, Nucleotides and their Biological Applications, La Jolla, CA, Sept., 15-19, PPI 89, 1996）。合成ＲＮＡ、及びＤＮＡ分子の効率的な運搬のために、様々なオリゴヌクレオチドのためのＰＥＧ付着物が非常に好ましい特性を示した。ＰＥＧ−オリゴマーは、早い分解を防止することにより、優れた酵素的な安定性を示した。熱融解の挙動は影響せず、それにより、二重鎖構造の特性まだ残していた。
【００３０】
リバースにしたＲＮＡホスホラミダイトを生産するための本発明の取り組みは、５’−ベンゾイル（5'- benzoyl）、アセチル（acetyl）、レブリニル（levulinyl）または、置換された５’−ベンゾイル−ｎ−保護されたリボヌクレオシド（substituted- 5'- benzoyl -n-protected ribonucleoside）のような５’−エステル（5'- ester）の選択的な導入が要求される。2'- tBDsilyl or 2'- TOM ( triisopropyl silyl methoxy; TOM)のような、２’位での適当な保護基のその後の導入が要求される。それらの図において、それらはこれらの目的を達成するための選択された分子の合成を示す。
【００３１】
標的化合物、構造（１６ａ−ｅ）を生成するために、要求される腫瘍な中間体は、2'- silylether-5'- O acylated-N-protected ribonucleoside、化合物（２３ａ−ｅ）であった。これに要求される第１の中間体は、5'- acylated-N-protected ribonucleoside、化合物（２２ａ−ｅ）であった。我々のよく知るところでは、化合物（２１ａ−ｅ）は報告されていない。過去にＲＮＡ合成のために報告された化合物は、構造１１、１２及び１３の中間体を利用した。５’−酢酸塩と共に様々な２’及び３’酢酸塩（viz., 5'- benzoyl protected nucleosides; Reese, B. E., Jarman, M., Reese, CB. , Tetrahedron, 24, 639, 1968；Neilson, T., Werstiuk, E.S., Can. J. Chem. 49, 493, 1971；Neilon, T., Wastrodowski, E.V., Werstiuk, E.S., Can. J. Chem., 51, 1068, 1973；Eckstein, F., Cramer, F., Chem.Ber., 98, 995, 1965；Zemlicka, J., Chladek, S., Tet. Lett., 3057, 1965；Amarnath,V. & Broom, A.D., Chemical Reviews, 77, 183-219,1977）。しかしながら、本発明は、構造（      ２２ａ−ｅ）のような遊離の２’及び３’水酸基を要求する。
【化１３】
0005714490.tif 000014
【化１４】
0005714490.tif 000015
【化１５】
0005714490.tif 000016
【００３２】
本発明において、ＲＮＡの比較的な合成と精製が、従来の方法（3´→5´）及びリバース方向（5´→3´）の両方により行われた。観察結果は、高純度のＲＮＡ、スムーズな３’−結合コレステロール、ＨＥＧ及びＰＥＧ（Polyethylene glycol）、及びリバースＲＮＡ合成におけるＭ＋１が存在しないことの証明。
【００３３】
合成スキームの詳細は、スキーム（２）に概略を述べる。２’，３’−イソプロピリデン（2', 3'- Isopropylidene）機能は、ｎ−保護リボヌクレオシドのリボースの２’，３’水酸基を保護するために利用される。数多くのｎ−保護基がスキーム（２）に示される。５’−水酸基は、一般式２１の化合物を得るために、好ましくはベンゾイル基と共にその後保護される。イソプロピリデン基は、そして、公知の中程度の酸性条件下で選択的に除去される。このステップは、一般式２２の化合物を導く。ＴＢＤＭ塩化シリル（TBDM Silyl chloride）（tert-butyl dimethyl silyl chloride）とのその後の反応は、一般式２３のモノシリル化合物を導く。本発明は３’−ＴＢＤＭＳ基が観察された、すわなち、化合物構造２４の形成は、このプロセスでは好ましくない。その場合のほとんどで、化学的及び分析的方法により構造が２３であると確認されたきれいな生成物を確認した。
【００３４】
上述のプロセスの各ステップで、結晶化またはカラムロマトグラフィのいずれかにより、各ステップで精製が行われた。ピリジンでのジメチルオキシトリチルクロライド（dimethoxytrityl chloride、DMT-chloride）とのその後の反応は、一般式２６の３’−ＤＭＴ−２’−ＴＢＤＭＳ−ｎ−保護ヌクレオシドを導く。各化合物は、カラムクロマトグラフィにより完全に精製された。
【００３５】
２’−ＴＢＤＭＳエーテルを生成するためにＴＢＤＭＳ基を利用したが、他のシリルエーテルが、このステップで利用可能である。慎重な水性／メタノール性のＮａＯＨ加水分解は、一般式２７の遊離の５’−水酸基のある化合物を生じる。
【００３６】
水性／メタノール性塩基での選択的な５’−ベンゾイル除去は公知である。化合物３’−ＤＭＴ−２’−ＴＢＤＭＳ−ｎ−保護ヌクレオシド（構造２７）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィ
により精製された。精製した化合物（構造２７）は、対応するホスホラミダイト（構造１６）を得るために、n,n- diisopropylamino cyanoethyl phosphonamidic chlorideまたは2- cyanoethyl,n,n,n,n- tetraisopropyl phosphaneのようなリン酸化試薬でその後リン酸化した。リン酸化試薬n,n-diisopropylamino cyanoethyl phosphonamidic chlorideまたは2- cyanoethyl, n,n,n,n-tetraisopropyl phosphaneはともに、市場で用意に入手可能であり、対応するホスホラミダイトを生成するためのリン酸化方法は公知である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３７】
本発明は、下記の構造（１４）に示す新規のＲＮＡモノマーホスホラミダイトを提供する。本発明のＲＮＡホスホラミダイトモノマーは、３’−ＤＭＴ基をリボヌクレオシドに含み、5'- cyanoethylphosphoramidite（ＣＥＤ）及び様々なメチルオキシまたはシリル保護基をリボース部分の２’位に保有する（構造１４）。ここで、Ｙは酸素または硫黄であり、Ｗは酸素であり、Ｒ４は三級ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリイソプロピニルシリルオキシメチレン、フルオレニルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、アルキル、アリル及びアセチルからなる群の一員であり、Ｚはジメトキシトリフェニル（ＤＭＴ）、モノメトキシトリフェニル（ＭＭＴ）及びトリメトキシトリフェニル（ＴＭＴ）からなる保護基であり、Ｒ１はアルキルまたはアリル基であり、Ｒ２はアルキルまたはアリル基であり、Ｒ３はシアノエチル、アルキルまたはアリル基である、及び、Ｂは水素、またはアミン保護基のある各アミンで付加的に機能化する核酸塩基であり、前記核酸塩基は、adenine、guanine、cytosine、thymine、uricil、A(N-Bz)、A(N-Ac)、A(N-tBPac)、A(N-Pac)、C(N-Bz)、C(N-Ac)、C(N-tBPac)、C(N-Pac)、G(N-iBu)、G(N-Ac)、G(N-tBPac)、G(N-Pac)からなる群から選択される。固体支持体は、３’−ＤＭＴ基及び５’末端を含む保護されたＲＮＡヌクレオシドは、固体の支持体に付着する（構造１５）。
【化１６】
0005714490.tif 000017
【化１７】
0005714490.tif 000018
【００３８】
ＲＮＡホスホラミダイトは、リバース、5´→3´方向のオリゴヌクレオチド合成において、用いることができる。多数のＲＮＡ合成、従来の（3´→5´）及びリバース方向（5´→3´）が実験の一部として行われる。
【００３９】
ＲＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端での修飾またはラベルが対応するホスホラミダイトまたは活性なエステルを用いることにより、合成の終に付着することができ、特別な固体支持体は要求しない。さらに、本発明の取り組みは、非常にきれいな３’−ラベルしたオリゴヌクレオチドを導き、高価な精製成方法を要求しない。
【００４０】
ＲＮＡの高い純度のレベルは、リバース方向（5´→3´）によるＲＮＡ合成において得られ、コレステロール、ＨＥＧ（hexaethyloxyglycol）及びＰＥＧ（Polyethylene glycol）のような分子のスムーズな３’−結合をもたらす。リバース方向（5´→3´）のＲＮＡ合成において、Ｍ＋１オリゴヌクレオチド不純物が存在しないことをさらに証明もした。
【発明の効果】
【００４１】
本発明の他の特徴および長所が以下の詳細な説明を考察することで明らかになるだろう。本発明は、上記の構造（１４）に示す新規のＲＮＡモノマーホスホラミダイトを提供する。開発された合成経路は、望まれない異性体からのコンタミネーションなしに所望のホスホラミダイトを得ることを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
異なる図面にわたって、同じ部分は同様の符号で参照する図面に示されるように、前述のものは、以下の本発明の例示及び実施形態のさらに特別な記載から明らかである。本発明の実施形態を図示する代わりに、縮小、拡大、強調するために、図面は必要としない。
【００４４】
【図１】N4-Benzoyl-2’O-TBDMS-3'-O-DMT-adenosine-5'-cyanoethyl-N,N-diisopropyl-phosphoramidite（１６ａ）のＨＰＬＣクロマトグラム、９８．６％純度。
【図２】N4-Benzoyl-2’O-TBDMS-3'-O-DMT-adenosine-5'-cyanoethyl-N,N-diisopropyl-phosphoramidite（１６ａ）のNMR31Ｐスペクトル、１４９．４６５ｐｐｍ及び１４９．３０７ｐｐｍでのsharp doublet、delta；０．１５８、純度９８．６％。
【図３】N4-Acetyl-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-cytidine-5'-cyanoethyl-N,N-diisopropyl-phosphoramidite（１６ｃ）、純度９６．９％。
【図４】N4-Acetyl-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-cytidine-5'-cyanoethyl-N,N-diisopropyl-phosphoramidite（１６ｃ）のNMR31Ｐスペクトル、１４９．４４７ｐｐｍ及び１４９．１９７ｐｐｍでのsharp doublet、delta；０．２５０、純度１００％。
【図５】N2-Isobutyryl-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-guanosine-5'-cyanoethyl-N,N-diisopropyl-phosphoramidite（１６ｄ）のＨＰＬＣクロマトグラム、９８．３％純度。
【図６】N2-Isobutyryl-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT- guanosine-5'-cyanoethyl-N,N-diisopropyl-phosphoramidite（１６ｄ）のNMR31Ｐスペクトル、１４９．７３１ｐｐｍ及び１４９．０４８ｐｐｍでのsharp doublet、delta；０．６８３、純度１００％。
【図６ａ】化合物（１６ｄ）N2-Isobutyryl-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-guanosine-S'-cyanoethyl-iN,N-diisopropyl-phosphoramidite（１６ｄ）のマススペクトル、陰イオンマス、９６９．４で観察し、９７０．１８で計算した。
【図６ｂ】化合物（１６ｄ）N2-Isobutyryl-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-guanosine-S'-cyanoethyl-iN,N-diisopropyl-phosphoramidite（１６ｄ）のマススペクトル、陽イオンマス、９９３．０で観察し、９９３．１８（＋Ｎａ）で計算した。
【図７】5´→3´ＲＮＡ合成及び３’−修飾への適用のダイヤグラム表示。
【図８】カップリング効率トリチルヒストグラム要旨（２１塩基ＲＮＡ合成）：カップリング効率（塩基ラベルによるステップ毎の収率）：９９．６％；最終収率（移動平均）：１００％；モノマーＧに対するステップ毎の収率：１００％；モノマーＡに対するステップ毎の収率：９９．２％；モノマーＣに対するステップ毎の収率：９９．６％；モノマーＣに対するステップ毎の収率：９９．６％；モノマーＵに対するステップ毎の収率：１００％。
【図９】従来の方法（3´→5´方向）により精製した粗製のオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の電気泳動図。
【図９ａ】従来の方法（3´→5´方向）により精製したオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の電気泳動図。Expedite Model 8909-1 umole scale。粗製純度；９０．７８％。
【図１０】リバースＲＮＡ合成（5´→3´方向）により作られた粗製２１塩基ＲＮＡの電気泳動図。Expedite Model 8909-1 umole scale。粗製純度；７８．５５％。注記：Ｍ＋１がリバース合成には存在しないと考えられる。
【図１１】従来の方法（3´→5´方向）により作られた粗製のオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の電気泳動図。Expedite Model 8909-1 umole scale。粗製純度；８２．８３％。注記：右側にコブが存在し、Ｍ＋１種のためであるらしい。
【図１２】リバースＲＮＡ合成（5´→3´方向）により作られた粗製のオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の電気泳動図。Expedite Model 8909-1 umole scale。粗製純度；８５．７６％。注記：Ｍ＋１がリバース合成には存在しないと考えられる。
【図１３】３’−コレステロール−ＴＥＧリンカーのある２１塩基ＲＮＡ。リバース方向（5´→3´）合成及びＨＰＬＣ精製。1 umole scale。純度；９９．９％。
【図１４】リバースＲＮＡ合成により作られた粗製のオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４の電気泳動図。粗製純度；５６．６０％。
【図１５】リバース方向（5´→3´方向）により合成された２１塩基ＲＮＡ。ＨＰＬＣ精製後、純度；９４．３９％。
【図１６】リバース合成により作られた粗製のオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３の電気泳動図。３’−ＰＥＧ（Polyethyleneglycol; MW; 2000）との２１塩基ＲＮＡ合成。Expedite Model 8909-1 umole scale合成。粗製純度；９１．８７％。綺麗に分離された巾の広いピークが存在する。
【図１７】リバース合成により作られた粗製のオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４の電気泳動図。３’−ＰＥＧ（Polyethyleneglycol; MW; 2000）との２１塩基ＲＮＡ合成。Expedite Model 8909-1 umole scale合成。逆相ＨＰＬＣ精製した；粗製純度；１００％。
【図１８】３’−ＰＥＧ−２０００付着した２１塩基ＲＮＡ、図１７に示したように精製したＲＮＡのＥＳＩ  マススペクトル分析。合成はリバース方向（5´→3´方向）で行った。ＰＥＧ−２０００は、対応するホスホラミダイト、ChemGenes catalog ;CLP-3119、計算分子量：８６８４．１を介して、最終ステップで付着した。測定された分子量：８６８１．１。注記：ＰＥＧ−２０００とともに計算された分子量の両端にＲＮＡの少なくとも１４のＰＥＧ種の分布がある。そして、８４１７．１から８９４５．３までの種は、グリコール単位（＋／−４４）の分子量の差が存在する。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
一実施形態において、本発明は式１の新規のホスホラミダイトに関連する。
【化１８】
0005714490.tif 000019
ここで、
Ｙは酸素または硫黄であり；
Ｗは酸素、窒素及びフッ素であり；
Ｒ４は三級ブチルジメチルシリル（tert butyl dimethyl silyl）（ＴＢＤＭＳ）、トリイソプロピニルシリルオキシメチレン（triisopropylsilyl oxymethylene）、フルオレニルオキシカルボニル（fluorenylmethyloxycarbonyl）（Ｆｍｏｃ）、アルキル（alkyl）、アリル（aryl）及びアセチル（acetyl）からなる群の一因であり；
Ｚはジメトキシトリフェニル（dimethoxy triphenyl（ＤＭＴ））、モノメトキシトリフェヘニル（monomethoxy triphenyl（ＭＭＴ））及びトリメトキシトリフェニル（trimethoxy triphenyl（ＴＭＴ））からなる保護基であり；
Ｒ１はアルキル（alkyl）またはアリル（aryl）基であり；
Ｒ２はアルキル（alkyl）またはアリル（aryl）基であり；
Ｒ３はシアノエチル（cyanoethyl,）、アルキル（alkyl）またはアリル（aryl）基である；及び
Ｂは水素、またはアミン保護基のある各１級アミンで付加的に機能化するヌクレアーゼである。
【００４６】
もう一つの実施形態において、本発明は式１の新規のホスホラミダイトに関連する。
【化１９】
0005714490.tif 000020
ここで、
Ｙは酸素または硫黄であり；
Ｗは硫黄であり；
Ｒ４はベンゾイル（benzoyl）、アセチル（acetyl）またはジスルフィド（disulfide）であり；
Ｚはジメトキシトリフェニル（dimethoxy triphenyl（ＤＭＴ））、モノメトキシトリフェヘニル（monomethoxy triphenyl（ＭＭＴ））及びトリメトキシトリフェニル（trimethoxy triphenyl（ＴＭＴ））からなる保護基であり；
Ｒ１はアルキル（alkyl）またはアリル（aryl）基であり；
Ｒ２はアルキル（alkyl）またはアリル（aryl）基であり；
Ｒ３はシアノエチル（cyanoethyl,）、アルキル（alkyl）またはアリル（aryl）基であり；及び
Ｂは水素、またはアミン保護基のある各１級アミンで付加的に機能化するヌクレアーゼである。
【００４７】
本発明は、以下から選択された構造式によって表されるＲＮＡオリゴマーの合成のための５’から３’方向に対する結合形成によるオリゴヌクレオチドを調製する方法に関連する。
【化２０】
0005714490.tif 000021
前記方法は以下の化合物を反応させるステップを含む。
【化２１】
0005714490.tif 000022
ここで、
Ｂは水素、またはアミン保護基のある各１級アミンで付加的に機能化するヌクレアーゼであり；
ｎは０から９８であり；
Ｙは酸素または硫黄であり；
Ｗは酸素、窒素、硫黄またはフッ素であり；
Ｒ４はＴＢＤＭＳのようなシリルエーテル（silyl ether）、トリイソプロピルシリルオキシメチレン（triisopropylsilyl oxymethylene）、Ｆｍｏｃ、アルキル（alkyl）、アリル（aryl）またはアセチル（acetyl）であり；Ｗが硫黄の時
Ｒ４はベンゾイル（benzoyl）、アセチル（acetyl）またはジスルフィド（disulfide）であり；
ＺはＤＭＴ、ＭＭＴ、ＴＭＴ保護基であり；
Ｒ１及びＲ２はアルキル（alkyl）またはアリル（aryl）基から独立して選択され；
Ｒ３はシアノエチル（cyanoethyl,）、アルキル（alkyl）またはアリル（aryl）基であり；及び
Ｍは水素ラジカル、Ｙ−ＣＯであり；ここで、Ｙは固体支持体への付着に安定なリンカーである。
【００４８】
単独または「アルキルアルキル（alkylalkyl）」または「シクロアルキルアルキル（cycloalkylalkyl）」のような大きな部分の一部として用いられる用語「アルキル（alkyl）」は、１〜１０の炭素原子を有する直様はた分岐した炭化水素ラジカルを意味し、例えば、メチル（methyl）、エチル（ethyl）、ｎ−プロピル（n-propyl）、イソプロピル（isopropyl）、ｎ−ブチル（n-butyl）、第２級ブチル（sec-butyl）、イソブチル（isobutyl,）、第３級ブチル（tert-butyl）、ｎ−ペンチル（n-pentyl）、イソペンチル（i-pentyl）、ｎ−ヘキシル（n-hexyl）、ｎ−ヘプチル（n-heptyl）、ｎ−オクチル（n-octyl）、ｎ−ノニル（n-nonyl）、ｎ−デシル（n-decyl）などを含む。
【００４９】
用語「シクロアルキルアルキル（cycloalkylalkyl）」は、単環式、二環式または三環式の３〜１２の炭素原子を有する飽和炭化水素環を意味し、例えば、シクロプロピル（cyclopropyl）、シクロブチル（cyclobutyl）、シクロペンチル（cyclopentyl）、シクロヘキシル（cyclohexyl）、シクロヘプチル（cycloheptyl）、シクロオクチル（cyclooctyl）、バイシクロ［２．２．２］オクチル（bicyclo[2.2.2]octyl）、バイシクロ［２．２．１］ヘプチル（bicyclo[2.2.1]heptyl）、スピロ［４．４］ノナン（spiro [4.4]nonane）、アダマンチル（adamantyl）等を含む。
【００５０】
用語「アリル（aryl）」は、単独または「アリルアルキル（arylalkyl）」においてのような大きな部分の一部として用いられ、６〜１０の炭素環式（carbocyclic）、芳香環（aromatic）、単環式（monocyclic）または多環式（polycyclic）環系のメンバーを意味する。例は、フェニル（phenyl）及びナフチル（naphthyl）を含む。用語「アリル（aryl）」は、非芳香族系炭素環式の環またはヘテロ環基に融合したフェニル環をも含む。用語「アリル（aryl）」は、用語「芳香族基（aromatic group）」、「アリル環（aryl ring）」、「芳香環（aromatic ring）」、「アリル基（aryl group）」及び「芳香族基（aromatic group）」と交換可能に用いてもよい。
【００５１】
「ヘテロ（Hetero）」は、Ｎ、Ｓ及びＯから選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子での環系の少なくとも１つの炭素原子メンバーの置換を呼ぶ。ヘテロ環は、ヘテロ原子によって置換される１、２、３または４炭素原子メンバーを有してもよい。
【００５２】
「ヘテロシクリル（Heterocyclyl）」は、Ｏ、Ｎ及びＳから選ばれる１から４の環式ヘテロ原子を含む飽和または不飽和の非芳香族、単環式または多環式の３〜２０原子、３〜１２原子または３〜８原子の環系を呼ぶ。例示的なヘテロシクリルは、pyrrolidine、pyrrolidin-2-one、1 -methylpyrrolidin-2-one、piperidine, piperidin-2-one、2- pyridone、4-pyridone、piperazine、l-(2,2,2-trifluoroethyl)piperazine、piperazin-2-one、5,6-dihydropyrimidin-4-one、pyrimidin-4-one、tetrahydrofuran、tetrahydropyran、tetrahydrothiophene、tetrahydrothiopyran、isoxazolidine、1,3-dioxolane、1,3-dithiolane、1,3- dioxane、1,4-dioxane、1,3-dithiane、1,4-dithiane、oxazolidin-2-one、imidazolidin-2-one、imidazolidine-2,4-dione、tetrahydropyrimidin-2(lH)-one、morpholine、N-methylmorpholine、morpholin-3-one、l,3-oxazinan-2-one、thiomo[phi]holine、thiomo[phi]holine 1,1 -dioxide、tetrahydro-l,2,5-thiaoxazole 1,1 -dioxide、tetrahydro-2H-l,2-thiazine 1,1 -dioxide、hexahydro-l,2,6-thiadiazine 1,1 -dioxide、tetrahydro-l,2,5-thiadiazole 1,1 -dioxide及びisothiazolidine 1,1 -dioxideを含む。
【００５３】
「ヘテロシクリル」は、ヘテロアリル基を含む。用語「ヘテロアリル（heteroaryl）」は、Ｎ、Ｏ及びＳから独立して選ばれる１から４のヘテロ原子を含む一価のヘテロ芳香族単環式または多環式の環状ラジカルの５〜１０のメンバーを意味する。用語「ヘテロアリル」は非芳香族炭素環またはヘテロ環基に融合した単環式のヘテロアリル環をも含む。ヘテロアリル基はfuryl、thienyl、thiophenyl、pyrrolyl、oxazolyl、thiazolyl、imidazolyl、pyrazolyl、isoxazolyl、isothiazolyl、oxadiazolyl、triazolyl、thiadiazolyl、pyridinyl、pyridinyl-N-oxide、pyridazinyl、pyrimidinyl、pyrazinyl、indolizinyl、indolyl、isoindolyl、benzo[b]furyl、benzo[b]thienyl、indazolyl、benzimidazolyl、benzthiazolyl、purinyl、4H-quinolizinyl、quinolinyl、isoquinolinyl、quinazolinyl、benzothienyl、benzofuranyl、2,3-dihydrobenzofuranyl、benzodioxolyl、benzimidazolyl、indazolyl、benzisoxazolyl、benzoxazolyl、benzothiazolyl、cinnolinyl、phthalzinyl、quinazolinyl、quinoxalinyl、1,8-naphthyridinyl、1,2,3 -triazolyl、1 ,2,4-triazolyl、1,3,4-oxadiazolyl、1,2,5- thiadiazolyl、1,2,5-thiadiazolyl-l-oxide、1,2,5-thiadiazolyl- 1,1 -dioxide、1,3,4-thiadiazolyl、1 ,2,4-triazinyl、1,3,5-triazinyl、tetrazolyl及びpteridinylを含む。用途「ヘテロアリル」及び「ヘテロアリル環」はここで交換可能に用いられる。
【００５４】
Ｂは、水素、天然または天然でない核酸塩基、保護された核酸塩基、保護された天然または天然でない核酸塩基、ヘテロサイクルまたは保護されたヘテロサイクルである。例えば、核酸塩基は、アミン保護基と共に第一級アミン毎に付加的に機能化されることもでき、それらに限定されるものではないが、例えば、A(N-Bz)、A(N-Ac)、A(N-tBPac)、A(N-Pac)、C(N-Bz)、C(N-Ac)、C(N-tBPac)、C(N-Pac)、G(N-iBu)、G(N-Ac)、G(N-tBPac)、G(N-Pac)、IまたはUを含む。
【００５５】
公知の固相合成に適した何れの固体支持体も本発明に用いることができる。適した固体支持体の例は、正誤された細孔ガラス、ポリスチレン、poly(dimethylacrylamide)のようなマイクロポーラスポリアミド、及びポリエチレンで被覆したポリスチレンを含む。また、ここで意図したものは、固体支持体に本発明の化合物を付着させるのに適したリンカーの利用である。リンカーは、公知である。
【００５６】
アミン、水酸基及びチオールの保護基は公知である。アミン保護基の例は、Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis (1991), John Wiley & Sons, Inc., pages 309-405を参照し、その教示はその全体において、ここに組み込まれる。好ましくは、アミンは、アミドまたはカルバメートとして保護される。水酸基保護基の例は、Id., pages 10-142を参照し、その教示はその全体において、ここに組み込まれる。好ましい水酸基保護基は、t-butyldimethylsilyl基である。チオール保護基の例は、Id., pages 277-308を参照し、その教示はその全体において、ここに組み込まれる。酸ラベル保護基は、BronstedまたはLewisの酸と基との接触により除去可能な保護基である。酸ラベル保護基は公知である。一般的な酸ラベル保護基の例は、置換されたまたは置換されていないトリチル基（Id., pages 60-62）、置換されたまたは置換されていないtetrahydropyranyl基（Id., pages 31-34）、置換されたまたは置換されていないtetrahydrofuranyl基（Id., pages 36-37）またはpixyl基（Id., page 65）を含む。好ましい酸ラベル保護基は、置換されたまたは置換されていないトリチル基、例えば、4,4'-dimethoxytrityl（以下「ＤＭＴ」)である。トリチル基は、好ましくは、アルコキシ基のような電子供与置換基により置換される。ヌクレオシド塩基は、天然に生じた塩基、例えば、adenine、guanine、cytosine、thymine、及びuricil、及び置換された塩基、例えば、7-deazaguanine、7-deaza-8-azaguanine、5-propynylcytosine、5-propynyluricil、7-deazaadenine、7-deaza-8-azaadenine、7-deaza-6-oxopurine、6-oxopurine、3-deazaadenosine、2-oxo-5-methylpyrimidine、2-oxo-4-methylthio-5-methylpyrimidine、2-thiocarbonyl-4-oxo-5-methylpyrimidine、4-oxo-5-methylpyrimidine、2-amino-purine、5-fluorouricil、2,6-diaminopurine、8-aminopurine、4-triazolo-5-methylthymine、及び4-triazolo-5-methyluricilを含む。保護された核酸塩基は、塩基の反応性の官能基が保護されるヌクレオシド塩基である。同様に、保護されたヘテロサイクルは、ヘテロサイクルの活性な置換基が保護されるヘテロサイクルである。典型的には、ヌクレオシド塩基またはヘテロサイクルがアミドやカルバメートのようなアミン保護基で保護されたアミン基を有する。例えば、アデニンやシトシンのアミン基は、ベンゾイル保護基で保護され、グアニンのアミン基は、典型的にはイソブチル基、アセチル基またはt-butylphenoxyacetyl基により保護される。しかしながら、他の保護スキームを用いてもよい。例えば、速やかな脱保護のために、アデニンやグアニンのアミン基がphenoxyacetyl基で保護され、シトシンのアミン基がイソブチル基またはアセチル基で保護される。核酸塩基またはヘテロサイクル保護基の除去条件は、用いられた保護基に依存する。アミド保護基が用いられた場合、オリゴヌクレオチドを、濃塩化アンモニア溶液、ｎ−メチルアミン溶液または水酸化アンモニウムにｔ−ブチルアミンの溶液などの塩基性溶液で処理することにより除去することができる
【００５７】
本発明のプロセスの主要な特徴、以下で述べられる議論から実験データ及び図９〜１８は以下の知見を含む。
Ｉ．粗製のＲＮＡは、リバースＲＮＡ合成（5´−3´）と比較して、従来の方法（3´−5´方向）において多くの不純物（Ｎ−１）を有する。したがって、精製後のリバースのＲＮＡ合成により合成されたＲＮＡはより純粋である。
ＩＩ．上述の特徴は、ＲＮＡの３’末端に付着したコレステロールの合成に顕著に見られる（図１１対図１２）。したがって、リバースＲＮＡ合成により合成された３’末端でのコレステロールとＲＮＡを精製するのはより簡単である（図１２参照）。
ＩＩＩ．Ｍ＋１不純物は、リバースのＲＮＡ合成方法により合成されたＲＮＡに基本的に存在しない。オリゴヌクレオチドカップリングステップやオリゴヌクレオチド鎖伸張のカップリング時間において、分子中で、ribonucleoside-3'-DMT-2'-tBDsilyl-5'-phosphoramidites、3'- DMTは5-ethylthiotetrazoleや同様の活性剤により切断されないことを前提とする。
ＩＶ．従来の方法（3´→5´方向）による一般的にアクセス出来ない３’末端での巨大分子を含むＲＮＡは、リバースＲＮＡ合成（5´→3´）による合成は容易である。これらのＲＮＡは、高純度で生成される。
Ｖ．３’−ＰＥＧ  ＲＮＡ（２１塩基）が合成され、精製後は基本的に１００％純粋であった（図１６、１７及び１８参照）。
【００５８】
本発明のリバースＲＮＡモノマーホスホラミダイトがリボヌクレオシドに３’−ＤＭＴ基を保有し、2'-tBDsilyl(tBDSi)-5'-cyanoethylphosphoramidite（ＣＥＤ）（構造１６）、3'-DMT-2'-tBDsilyl-5'-succinyl-Icaa CPG-n-protected nucleosides（構造１７）または3'-DMT-2'-triisopropylsiloloxymethyl(TOM)-5'-CED phosphoramidite基（構造１８）を保有する。
【化２２】
0005714490.tif 000023
【化２３】
0005714490.tif 000024
【化２４】
0005714490.tif 000025
【００５９】
本発明は、開示された組成を調製するための方法をも教示する。イソプロピリデン（isopropyliden）保護ヌクレオシド２０を与えるヌクレオシド１９を最初の塩基が保護した。イソプロピリデン基除去が続くベンゾイル化は、５’−ベンゾイル化ヌクレオシド２２を得る。ピリジン中でのＴＢＤＭＳとの連続したシリル化反応は、２’−及び３’−ＴＢＤＭＳ保護されたヌクレオシド（２３及び２４）がそれぞれ３：２の割合の混合物を提供する。カラムクロマトグラフィ後に、異性体は分離され、％収量で単離された。また、異性体２３の反応は、3'-DMT-2'-TBDMS protected nucleoside ２６を提供する。
【００６０】
したがって、３’−水酸基の次の機能化の間、2'-tBdsilyl基の特異的な移動があることが考えられる。
【化２５】
0005714490.tif 000026
【００６１】
３’−水酸基とDMT-(4,4-dimethoxytrityl)との機能化の間、特異的な移動が生じることは観察されなかった。さらに、３’−ＴＢＤＭＳ保護異性体２４も、ピリジン中の異性体２３と塩化ＤＭＴのように、同様のトリチル化が関与し、しかしながら、ヌクレオシド２５はその反応に観察さなかった。したがって、２’−ＴＢＤＭＳ保護ヌクレオシド２３とその異性体２４のコンタミネーションの場合、望まない異性体２５がトリチル化条件で形成されず、所望のヌクレオシド２６が高純度で単離できる。３’−ＴＢＤＭＳ保護ヌクレオシド２４が所望の生成物の合成に利用することができ、スキーム１に概略が述べられた異性化プロセスのために２３に変換することができる。
【００６２】
CEDP及びDIPA tetrazolateを用いる亜リン酸化により続くメタノール中の水酸化ナトリウムとの5 '-benzoyl基の除去が最終的なリバースのホスホラミダイト１６を与える。
【化２６】
0005714490.tif 000027
【００６３】
リバースのホスホラミダイトを用いるオリゴヌクレオチドの合成は、5´→3´方向で行われた。
【００６４】
以下に与えられた例は、本発明を更に説明し、これらは、例示的なものであって、本発明の範囲を限定するように解釈すべきではない。特に以下の例は、本発明の化合物を得るための合成方法を示す。本発明の化合物を調製するために便利な開始材料及びその中間物は市販されており、既知の合成方法と試薬を用いて市販の材料から調製することができる。全てのオリゴヌクレオチド配列が左側の５’末端から右側の３’末端へ記載される。3'-DMT-5'-CED phosphoramiditesのカップリング効率がステップ毎に９９％を超えるカップリングを示し、高純度ＲＮＡを導く。大量のホモポリマーと２０〜２１塩基のオリゴヌクレオチドがこれらのモノマーホスホラミダイトを用いて合成された。典型的なデータは、図（８）に示される。
【００６５】
我々のデータは、3´→5´方向での合成における標準的な３’−ＣＥＤホスホラミダイトと比較して、リバースＲＮＡモノマー（5´→3´方向にたいする）を用いるオリゴ合成の間のカップリング効率における差異がないことを示した（図９及び１０参照）。
【００６６】
もう一つの実施形態において、本発明は、オリゴヌクレオチドの３’末端での修飾またはラベルとともにリボ核酸の合成方法を提供する。親油性、長鎖のリガンドまたは発色団の蛍光プローブ及び消光剤を要求する３’末端を修飾したＲＮＡの合成は、対応するホスホラミダイトを用いて行うことができる。図１１及び１２に保存された我々のデータは、5´→3´方向の合成が従来の方法と比較して非常に明確な利点を有することを示す。
【００６７】
また、ＨＥＧやＰＥＧ−２０００のような固体支持体で可能な３’−修飾が5´→3´方向合成を用いて簡単に導入することができ、逆相ＨＰＬＣにより精製できる。オリゴヌクレオチド  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４がＲＰ  ＨＰＬＣにより精製され、９５〜９８％純度生成物を得た（図１５参照）。
【実施例】
【００６８】
（実施例１）
スキーム２に見られるようなN2-Isobutyryl-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-guanosine-5'-cyanoethyl-N,N- diisopropyl-phosphoramidite（１６ｄ）
N2-Isobutyryl-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-5'--benzoyl-guanosine（２６ｄ）：
６０ｍＬのピリジン中に化合物２３ｄの４ｇ（７．０ｍｍｏｌ）溶液のために、９．５ｇ（２８．０ｍｍｏｌ）の塩化ＤＭＴが一部に室温で４８時間添加された。反応混合物は、２ｍＬの冷たいメタノールで急冷され、溶液の半分が減圧下で取り除かれ、２０ｍＬのクロロホルムで混合され、５０ｍＬの飽和重炭酸ナトリウムと５０ｍＬの塩水で洗浄された。有機層が分離され、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。クロロホルム／ヘキサン／アセトン、５：２：３でのフラシュクロマトグラフィが１．７ｇの化合物２６ｄ（２７．８％）を提供した。ＴＬＣシステム：クロロホルム／ヘキサン／アセトン、５：２：３、Ｒｆ＝０．４２、ＥＳＭＳ  ８９６．１  [C48H55N5O9Si(M+Na)+が要求する896.1]。
【００６９】
N2-Isobutyryl-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-guanosine（２７ｄ）：
１９６ｍＬのピリジンと２１ｍＬのメタノール混合物中に化合物２６ｄの１４ｇ（１６．０ｍｍｏｌ）溶液のために、１６ｍＬの２Ｍ塩化ナトリウム溶液（３２．０ｍｍｏｌ）が２５分間で０〜５℃で攪拌しながら滴下して添加された。反応液は、１５ｍＬの２Ｍ塩酸で中和した。溶媒は減圧下で除去され、残りは、２５ｍＬのクロロホルムの２つの部分で抽出された。有機層は合されて、５０ｍＬの塩水で洗浄され、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。クロロホルム／ヘキサン／アセトン、５：２：３でフラシュクロマトグラフィが１０．４ｇの化合物２７ｄ（８４．３％）を提供した。１Ｈ  ＮＭＲ（CDCl3/D2O）δ -0.54 (s, 3H), 0.01 (s, 3H), 088 (s, 9H), 1.21 (d, 3H, J=7.0 Hz), 1.23 (d, 3H, J=7.0), 2.66 (qq, IH, J=7.0), 2.89 (d, IH, J=12 Hz), 3.28 (s, IH), 3.37 (dd, IH, J5a,5b=15 Hz, J5>4=2.5Hz) 3.80 (s, 6H), 4.24 (d, IH, J=5 Hz), 4.83 (dd, IH, J2>i=8 Hz, J2,3=5 Hz), 5.97 (d, IH, J=8 Hz), 6.84 (dd, 4H, J=9 Hz, J=2 Hz), 7.23 (t, IH, J=7.5 Hz), 7.30 (t, 2H, J=7 Hz), 7.45 (m, 4H), 7.59 (d, 2H, J=7.5 Hz), 7.77 (s, IH). ESMS 792.8 [C41H51N5O8Si(M+Na)+が要求する792.9]。
【００７０】
N2-Isobutyryl-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-guanosine-5'-cyanoethyl-N,N'-diisopropyl-phosphoramidite（１６ｄ）：
１０４ｍＬのアセトニトリル中に、１０．４ｇ（１３．５ｍｍｏｌ）の化合物２７、３．４ｇ（２６．１２ｍｍｏｌ）のethylthiotetrazole、４．７ｍＬ（２７ｍｍｏｌ）のＤＩＰＥＡ及び１．０８ｍＬ（１３．５ｍｍｏｌ）のN-methylimidazoleの溶液のために、８．４ｍＬ（２６．１２ｍｍｏｌ）の2-cyanoethyl-N,N,N,N-tetraisopropylphosphaneを室温でＡｒ下で攪拌しながら滴下して添加した。３時間後、反応混合物は１００ｍＬの酢酸エチルで希釈し、２００ｍＬの飽和重炭酸ナトリウム及び２００ｍＬの塩水で洗浄した。有機物層は分離され、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。クロロホルム／ヘキサン／トリエチルアミン、７：２：１でのフラシュクロマトグラフィが１２ｇ（９２．１％）の化合物１６ｄを提供した。３１Ｐ  ＮＭＲ（CDCl3）δ149.05 and 149.73. ESMS 993.3 [C50H68N7O9PSi (M+Na)+が要求する993.2]。
【００７１】
（実施例２）N4-Acetyl-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-cytidine-5'-cyanoethyl-N,N-diisopropyl-phosphoramidite（１６ｃ）の合成
N4-Acetyl-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-cytidine（２７ｃ）：
５４ｍＬのピリジンと６ｍＬのメタノール混合物中の５ｇ（６．２ｍｍｏｌ）の化合物２６ｃの溶液のために、６．２ｍＬの２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１２．４ｍｍｏｌ）が２５分間で０〜５℃で攪拌しながら滴下して添加された。反応液は、６ｍＬの２Ｍ塩酸で中和した。溶媒は減圧下で除去され、残りは、１５ｍＬのクロロホルムの２つの部分で抽出された。有機層は合されて、５０ｍＬの塩水で洗浄され、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。クロロホルム／ヘキサン／アセトン、５：２：３でフラシュクロマトグラフィが４ｇの化合物２７ｃ（９１．９％）を提供した。１Ｈ  ＮＭＲ（CDCl3/D2O）δ 0.07 (s, 3H), 0.16 (s, 3H), 0.97 (s, 9H), 2.24 (s, 3H), 3.16 (br.d, IH, J5a,5b=12 Hz), 3.55 (br.d, IH, J5a,5b=12 Hz) 3.79 (s, 6H), 4.08 (t, IH, J=4.5 Hz), 4.44 (br.s., IH), 4.78 (br.s., IH), 5.61 (d, IH, J= 4.1), 6.80 (dd, 4H, J=7 Hz, J=3 Hz), 7.22 (t, IH, J=7.5 Hz), 7.27 (t, 2H, J=7 Hz), 7.38 (m, 4H), 7.52 (d, 2H, J=7.3 Hz), 8.08 (br.s, IH). ESMS 724.8 [C38H47N3O8Si (M+Na)+が要求する724.3]。
【００７２】
N4-Acety-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-cytidine-5'-cyanoethyl-iVjiV-diisopropyl-phosphoramidite（１６ｃ）：
N2-Isobutyryl-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-guanosine-5'-cyanoethyl-N,N'-diisopropyl-phosphoramidite（１６ｄ）と同じように調製された。収率は６２．６％である。３１Ｐ  ＮＭＲ（CDCl3）δ149.1 and 149.5. ESMS 925.0 [C47H64N5O9PSi (M+Na)+が要求する924.4]。
【００７３】
（実施例３）
2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-Uridine-5'-cyanoethyl-N,N-diisopropyl-phosphoramidite（１６ｋ）
2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-Uridine（２７ｋ）：
４５０ｍＬのピリジンと４５ｍＬのメタノール混合物中の３０ｇ（３９．３ｍｍｏｌ）溶液のために、４０ｍＬの２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（８０．０ｍｍｏｌ）が２５分間で０〜５℃で攪拌しながら滴下して添加された。反応液は、４０ｍＬの２Ｍ塩酸で中和した。溶媒は減圧下で除去され、残りは、５０ｍＬのクロロホルムの２つの部分で抽出された。有機層は合されて、５０ｍＬの塩水で洗浄され、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。クロロホルム／ヘキサン／アセトン、６．５：２：１．５でフラシュクロマトグラフィが２４ｇの化合物９ｋ（９２．５％）を提供した。１Ｈ  ＮＭＲ（CDCl3）δ 0.06 (s, 3H), 0.14 (s, 3H), 0.97 (s, 9H), 2.12 (br.d, IH, J=4 Hz), 3.16 (br.dd, IH, J5a,5b=12.7 Hz, J5a4=7.6 Hz), 3.55 (br.d, IH, J5a>5b=12.7 Hz J5b4=4.3 Hz) 3.65- 3-64 (m, IH) 3.79 (s, 6H), 4.07 (t, IH, J=4.3 Hz), 4.28 (t, IH, J=4.3 Hz), 5.66 (d, IH, J=4.9 Hz), 5.69 (d, IH, J= 8.1 Hz), 6.82 (dd, 4H, J=7 Hz, J=3 Hz), 7.22 (t, IH, J=7.5 Hz), 7.28 (t, 2H, J=7 Hz), 7.38 (d, 4H, J=8.9 Hz), 7.54 (d, 2H, J=8.8 Hz), 7.68 (d, IH, J=8.2), 8.74 (br.s, IH). ESMS [C36H44N2O8Si (M+Na)+が要求する683.3].
【００７４】
2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-Uridine-5'-cyanoethyl-N,N-diisopropyl-phosphoramidite（１６ｋ）：
１９０ｍＬのＴＨＦ中の２４．０ｇ（３６．４ｍｍｏｌ）化合物２７ｋ、２４ｍＬ（１８２ｍｍｏｌ）のcollidine、２．８８ｍＬのN-methylimidazole溶液のために、１６．２２ｍＬ（７２．８ｍｍｏｌ）の2-cyanoethyl-N,N, diisopropylphosphonamidic chlorideを室温で、Ａｒ下で攪拌しながら滴下して添加した。１．２５時間後、反応混合物は１００ｍＬの酢酸エチルで希釈し、２００ｍＬの飽和重炭酸ナトリウム及び２００ｍＬの塩水で洗浄した。有機物層は分離され、２０ｇの無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。酢酸エチル／ヘキサン／トリエチルアミン、５：４：１でのフラシュクロマトグラフィが１８ｇ（８０．０％）の化合物１６ｋを提供した。３１Ｐ  ＮＭＲ（CDCl3）δ148.9 and 149.6. ESMS 884.1 [C45H61N4O9PSi (M+Na)+が要求する884.0]。
【００７５】
（実施例４）
N4-Benzoyl-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-adenosine-5'-cyanoethyl-N,N-diisopropyl-phosphoramidite（１６ａ）
N4-Benzoyl-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-adenosine（２７ａ）：
１８９ｍＬのピリジンと２１ｍＬのメタノール混合物中の１４ｇ（１５．７ｍｍｏｌ）の化合物２６ａの溶液のために、１５．７ｍＬの２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（３１．４ｍｍｏｌ）が２５分間で０〜５℃で攪拌しながら滴下して添加された。反応液は、１２ｍＬの２Ｍ塩酸で中和した。溶媒は減圧下で除去され、残りは、１５ｍＬのクロロホルムの２つの部分で抽出された。有機層は合されて、５０ｍＬの塩水で洗浄され、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。クロロホルム／ヘキサン／アセトン、６．５：２：１．５でフラシュクロマトグラフィが１１．０ｇの化合物２７ａ（８８．９％）を提供した。収量は％である。１Ｈ  ＮＭＲ（CDCl3/H2O）δ -0.75 (s, 3H), -0.01 (s, 3H), 0.86 (s, 9H), 3.03 (t, IH, J5a,5b=12.8 Hz), 3.29 (s, IH), 3.47 (br.d, IH, J5a,5b=12.8 Hz) 3.80 (s, 6H), 4.35 (d, IH, J=4.9 Hz), 5.17 (dd, IH, J=8 Hz, J=5 Hz), 5.93 (dd, IH, J= 12 Hz, J=2 Hz), 6.15 (d, IH, J=8 Hz), 6.85 (dd, 4H, J=7 Hz, J=3 Hz), 7.23 (t, IH, J=7.5 Hz), 7.30 (t, 2H, J=7 Hz), 7.48 (m, 4H), 7.52 (t, 2H, J=7.3 Hz), 7.62 (d, 3H, J=7.5 Hz), 8.03 (d, 2H, J=7.5 Hz), 8.14 (s, IH), 8.77 (s, IH), 9.07 (s, IH). ESMS [C44H49N5O7Si (M+Na)+が要求する787.3]。
【００７６】
N4-Benzoyl-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-adenosine-5'-cyanoethyl-N,N-diisopropyl-phosphoramidite（１６ａ）：
８８ｍＬの蒸留したＴＨＦ中の１１．０ｇ（１２．０ｍｍｏｌ）の化合物２７ａ、９．２ｍＬ（６０．０ｍｍｏｌ）のcollidine、１．１ｍＬのN-methylimidazole溶液のために、６．２３ｍＬ（２４．０ｍｍｏｌ）の2-cyanoethyl-N,N diisopropylphosphonamidic chlorideを室温で、Ａｒ下で攪拌しながら滴下して添加した。１．２５時間後、反応混合物は５０ｍＬの酢酸エチルで希釈し、１００ｍＬの飽和重炭酸ナトリウム及び１００ｍＬの塩水で洗浄した。有機物層は分離され、１０ｇの無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。酢酸エチル／ヘキサン／トリエチルアミン、５：４：１でのフラシュクロマトグラフィが９．０ｇ（７７．７％）の化合物１６ａを提供した。３１Ｐ  ＮＭＲ（CDCl3）δ143.97 and 144.14. ESMS 987.2 [C53H66N7O8PSi (M+Na)+が要求する987.45]。
【００７７】
3'-O-DMT-2'-O-TBDMS nucleosides ２７ａ、２７ｃ、２７ｄ、２７ｋ、１６ａ、１６ｃ、１６ｄ、１６ｋ及び5'-O-DMT-2'-O-TBDMS nucleosides ２８〜３１
【化２７】
0005714490.tif 000028
【表１】
0005714490.tif 000029
【化２８】
0005714490.tif 000030
【表２】
0005714490.tif 000031
【化２９】
0005714490.tif 000032
【表３】
0005714490.tif 000033
【化３０】
0005714490.tif 000034
【表４】
0005714490.tif 000035
【００７８】
（実施例５）
2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-uridine-5'-succinyl-CPGの合成
2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-Uridine-5'-succinate：
２０ｍＬのピリジン中の２．０ｇ（３．０３ｍｍｏｌ）の化合物２７ｋ及び０．１１ｇ（０．９１ｍｍｏｌ）の溶液のために、３７℃で攪拌しながら０．９ｇ（９．１ｍｍｏｌ）無水コハク酸が添加された。１２時間後、反応混合物は３０ｍＬのクロロホルムで希釈し、５０ｍＬの塩水で洗浄した。有機物層は分離され、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。クロロホルム／ヘキサン／アセトン／ピリジン／メタノール、５：３：２：０．０１：０．０５でのフラシュクロマトグラフィが１．８ｇ（７５．９％）の2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-uridine-5'-succinateを提供した。１Ｈ  ＮＭＲ（CDCl3/H2O）δ 0.05 (s, 3H), 0.07 (s, 3H), 0.96 (s, 9H), 2.21 (dt, IH, J=17 Hz, J=6 Hz), 2.40-2.46 (m, IH), 2.51 (dt, IH, J=17 Hz, J=6 Hz), 2.60-2.66 (m, IH), 3.42 (t, IH, J=3.3 Hz), 3.77 (s, 6H), 3.95-3.98 (m, 2 H), 4.11 (br.d, IH, J=12.8 Hz), 4.16 (m, IH), 5.72 (d, IH, J=2.8 Hz), 5.74 (d, IH, J= 8.1 Hz), 6.79 (dd, 4H, J=9 Hz, J=I.9 Hz), 7.21 (t, IH, J=7 Hz), 7.25 (t, 2H, J=7 Hz), 7.38 (d, 4H, J=8.9 Hz), 7.48 (d, 2H, J=7.2 Hz), 7.61 (d, IH, J=8.2 Hz), 7.72 (t, IH, J=5.9 Hz), 8.61 (br.d, IH, J=4.4 Hz). ESMS 784.2 [C40H48N2O11Si (M+Na)+が要求する783.9]。
【００７９】
2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-uridine-5'-succinyl-CPG：
６０ｍＬのＤＭＦ中の１８ｇのamino-lcca-CPG及び３．６ｍＬのtriethylamineの懸濁液のために、４ｍＬのＤＭＦ中に１．８ｇ（２．３ｍｍｏｌ）のO-TBDMS-3'-O-DMT-uridine-5'-succinate、０．４０８ｇ（３．５５ｍｍｏｌ）のN-hydroxysuccinimide及び０．５８６ｇ（２．７６ｍｍｏｌ）のＤＣＣの溶液を添加した。反応混合物は３７℃に加温された。１６時間後、ＣＰＧが濾過され、３×２０ｍＬの部分のアセトニトリルで洗浄し、ピリジン／N-methylimidazole混合物中の無水酢酸で覆われ、３×２０ｍＬの部分のアセトニトリルで洗浄した。固体支持体は減圧下で乾燥され、ヌクレオシドのロードはＤＭＴ除去工程により測定され、４４．２μｍｏｌ／ｇのロードで１８ｇの最終生成物を得た。
【００８０】
オリゴヌクレオチド合成：
続くオリゴヌクレオチド（表５）が１μｍｏｌスケールで3´→5´方向の標準ＲＮＡホスホラミダイト試薬を用いて合成された。合成は、標準ＲＮＡ  １μｍｏｌを用いてExpedite 8900合成装置で実施された。
【００８１】
合成に続き、制御された細孔ガラス（ＣＰＧ）固体支持体が２ｍＬ微量遠心管に移された。オリゴヌクレオチドはＣＰＧから分けられ、１ｍＬの４０％メチルアミン水溶液に６５℃で３０分間インキュベートすることにより、脱保護し、上清を保存し、乾燥させた。t-butyl-dimethylsilyl保護基は、室温で超音波洗浄器中、２時間、５０μｌの新しい無水triethylammonium-trihydrogen fluorideで処理することにより、ＲＮＡ残基から除去された。オリゴヌクレオチドは１．５ｍＬのｎ−ブタノールにより沈殿され；サンプルは、―７０℃で１時間冷やされ、１０、０００ｇで１０分間遠心した。上清はデカンテーションし、ペレットは、ｎ−ブタノールで１回以上洗浄した。オリゴヌクレオチドは、０．１Ｍのtriethyl-ammonium acetate（ＴＥＡＡ）  ｐＨ７．２にアセトニトリルのリニアグラジェントを用いて、逆相ＨＰＬＣにより精製された。サンプル全体は、Hamilton PRP-1カラム（１．０ｃｍ×２５ｃｍ）にロードし、５％から５０％までの４０分間でアセトニトリルのグラジェントにより溶出した。サンプルは２６０ｎｍでモニタし、所望のオリゴヌクレオチド種に対応するピークが集められ、保存され、凍結乾燥された。
【００８２】
オリゴヌクレオチドサンプルは、２００μｌの蒸留水に溶解され、１ｍｌのLiClO4を添加することにより、沈殿させ、続けて１０，０００ｇで１０分間遠心した。上清はデカンテーションされ、ペレットは１０％のアセトン水溶液で洗浄した。
【００８３】
標準のｄＴ及びオリゴヌクレオチドの合成に適した固体支持体に対応するコレステロールが用いられた。
【表５】
0005714490.tif 000036
【００８４】
以下のオリゴヌクレオチド（表６）は、5´→3´方向のリバースホスホラミダイト試薬を１μｍｏｌスケールで用いて合成された。標準のプロセスと同じ合成サイクルと補助的な試薬がリバース合成のために用いられた。リバースrC-lcaa-CPGが全てのオリゴヌクレオチド合成に用いられた。オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２〜４の３’−修飾がコレステロール、ＰＥＧ−２０００またはＨＥＧホスホラミダイトをそれぞれ用いることにより導入された。
【表６】
0005714490.tif 000037
【００８５】
粗製のオリゴヌクレオチドがＣＥ及びＥＳＩマススペクトルにより分析された。
【００８６】
おびただしい数の応用がオリゴヌクレオチドの３’末端での容易な付着のために可能である。いくつの例を、図７に概略を説明する：
１．コレステロール、Ｃ−１８等の長鎖脂肪族化合物、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコールのようなＲＮＡの３’末端での大きな分子の付着用。
これらのアミダイトとの直接カップリングが容易に達成される。
２．ＲＮＡ分子の３’末端でのＰＥＧ２０００アミダイト及びＰＥＧ４０００アミダイトのようなポリエチレングリコールの付着。
３．３’−チオール修飾の簡単な付着用。容易に用いられるアミダイト、ｖｉｚ、Ｃ−３ジスルフィド、Ｃ−６ジスルフィドからの３’−ジスルフィド。
４．この目的のためにビオチンＣＰＧを防ぎ、１ステップのビオチンアミダイトを介した３’−ビオチン付着。
５．ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端の修飾。アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖が標的認識を導くように、ｓｉＲＮＡのセンス鎖（３’末端）の突出部が標的のｍＲＮＡ複合体に影響することが予想される。ｓｉＲＮＡの運搬の改善のための便利な修飾が容易に設計可能である。
【表７】
0005714490.tif 000038
【００８７】
我々は、以下の記載に様々な革新、利点及び可能性、及び本発明の詳細ないくつかのプロセスを要約する。このリストは、便利で例示的な要約として扱われることを意味し、完全ではなく、網羅的ではなく、限定するものではない。
【００８８】
一般式１の誘導体化されたヌクレオシドとホスホラミダイト：
【化３１】
0005714490.tif 000039
ここで、
Ｙは酸素または硫黄であり；
Ｗは酸素、窒素、硫黄及びフッ素であり；
Ｒ４はＴＢＤＭＳ、トリイソプロピニルシリルオキシメチレンＦｍｏｃ、アルキル、アリル及びアセチルのようなシリルエーテルであり；；Ｗが硫黄の時、Ｒ４はベンゾイル、アセチルまたはジスルフィドであり；
ＺはＤＭＴ、ＭＭＴ及びＴＭＴ保護基であり；
Ｒ１及びＲ２はアルキルまたはアリル基から独立して選択され；
Ｒ３はシアノエチル、アルキルまたはアリル基である。
【００８９】
一般式２の固体支持体に付着した誘導体化されたヌクレオシド：
【化３２】
0005714490.tif 000040
ここで、
Ｍは水素ラジカル、Ｙ−ＣＯであり；
Ｙは２〜２０の長さの原子の鎖であり、基本的に炭化水素鎖からなり、酸素、窒素及び硫黄からなる群から独立して選択された追加的に１つ以上のヘテロ原子により置換され、ＣＰＧ、ポリスチレンまたはオリゴヌクレオチド合成に適した他のいずれかの固体支持体のような、固体支持体への付着に安定なリンカーであり；
Ｗは酸素、窒素、硫黄またはフッ素であり；
ＲはＴＢＤＭＳのようなシリルエーテル、トリイソプロピルシリルオキシメチレン、Ｆｍｏｃ、アルキル（alkyl）、アリルまたはアセチルであり、Ｗが硫黄の時、Ｒはベンゾイル、アセチルまたはジスルフィドであり；
ＺはＤＭＴ、ＭＭＴ、ＴＭＴ保護基である。
【００９０】
５’から３’方向のオリゴヌクレオチド結合形成を介したリバースの方法が合成ＲＮＡオリゴマーにおける式１０に示される。ＲＮＡは、天然または修飾された核酸塩基、gapmer、ホスホジエステル、ホスホチアネート、phosphoselenatesからなる。合成は、自動、半自動のＤＮＡ／ＲＮＡまたは他の合成器または手動で行うことができる。合成は、マイクログラムからキログラムスケールの様々なスケールで行うことができる。
【化３３】
0005714490.tif 000041
【００９１】
対応するホスホラミダイトを用いるＲＮＡ分子の３’末端への修飾の付着方法（式１１）、
ここで、Ｌはビオチンまたはコレステロール、または蛍光プローブ、消光染料、ポリエチレングリコール、及びペプチドからなる群から選ばれるような修飾
【化３４】
0005714490.tif 000042
【００９２】
自動化したリバース方向（5´→3´）ＲＮＡ合成を用いる高純度ＲＮＡの合成は、高純度ＲＮＡをもたらす。
【００９３】
コレステロール、hexaethyloxyglycols（ＨＥＧ）及びPolyethylene glycols（ＰＥＧ）のような巨大分子とのＲＮＡの３’−複合体。
【００９４】
Ｍ＋１オリゴヌクレオチドのない、リバース方向（5´→3´）での自動化したＲＮＡ合成の応用。
【００９５】
上述のこの方法により取り込まれる修飾されたヌクレオシドは、5- Fluoro-U、5-Fluoro dU、5-fluoro-dC、5-Fluro-rC、pseudouridine、5-methyl-dU、5-methyl-rU、5-methyl-dC、5-methyl-rC、5- bromo-dU、5-bromo-rU、5-bromo-dC、5-bromo-rC、5-iodo-dU、5-iodo-rU、5-vinyl-dU、5-vinyl-rU、5-vinyl thymidine、N-3 methyldeoxy uridine、N-3 methyl-ribouridine、N-3 methyl thymidine、4-thio uridine、4-thio-2'-deoxyuridine、2,6-diaminopurine deoxy riboside、N-3 methyl ribothymidine、2、6-diaminopurine riboside、8-bromo 2'- deoxy adenosine、8-bromo-r-adenosine、8-oxo-deoxy adenosine、8-oxo- riboadenosine、8-oxo-2'-deoxy- adenosine、8-oxo-riboadenosine、8-oxo-deoxy inosine、8-oxo-ribo inosine、8-bromo-deoxy inosine、8-bromo-ribo- inosine、N-I methyl-riboadenosine、N-I methyl-2'- deoxy adenosine、N-I methyl 2'-deoxy inosine、N-I methyl riboadenosine、N-I methyldeoxy guanosine、N-I -methyl- riboguanosine、etheno adenosine、etheno 2'-deoxy adenosine、purine 2'-deoxy riboside、purine-ribonucleoside、2-aminopurine-2'-deoxyriboside、2-aminopurine-ribonucleosideに限定されるものではないが、１つ以上のプリンまたはピリミジン修飾からなる。
【００９６】
この方法により合成されたＲＮＡの内部位置のラベルがFluoroscein-C-5 dT、Dabcyl-C-5 thymidine、internal carboxyl group 5-dU-methylacrylate、biotin dT (biotin wattached via spacer to C-5 of dU)、amino-dT (terminal amino attached via C-6 spacer to C-5 dU) に限定されるものではないが、発色団と達成される。
【００９７】
修飾されたヌクレオシドの糖修飾は、本発明の方法により合成されたＲＮＡまたはＤＮＡ配列の１つ以上の位置に、A、C、G、Uのような2'-deoxy-2'-fluoro ribonucleosides (2'-F-ANAs)、Inosine及び2'-Fluoroを含む修飾されたヌクレオシドからなる。
【００９８】
修飾されたヌクレオシドの糖修飾は、本発明の方法により合成されたＲＮＡまたはＤＮＡ配列の１つ以上の位置に、A、C、G、Uのような2'-deoxy-2'-methoxy ribonucleosides (2'-OMe-)、Inosine及び2'-methoxyを含む修飾されたヌクレオシドからなる。
【００９９】
修飾されたヌクレオシドの糖修飾は、本発明の方法により合成されたＲＮＡまたはＤＮＡ配列の１つ以上の位置に、A、C、G、Uのような2'-deoxy-2'-amino ribonucleosides (2'-NH2)、Inosine及び2'-aminoを含む修飾されたヌクレオシドからなる。
【０１００】
修飾されたヌクレオシドの糖修飾は、本発明の方法により合成されたＲＮＡまたはＤＮＡ配列の１つ以上の位置に、A、C、G、Uのような2'-deoxy-2'-terminal amino ribonucleosides (2'-terminal NH2)、Inosine及び2'-terminal aminoを含む修飾されたヌクレオシドからなる。
【０１０１】
修飾されたヌクレオシドの糖修飾は、本発明の方法により合成されたＲＮＡまたはＤＮＡ配列の１つ以上の位置に、A、C、G、Uのような2'-deoxy-2'-methoxy ethoxy ribonucleosides (2'-MOE)、Inosine及び2'-MOEを含む修飾されたヌクレオシドからなる。
【０１０２】
修飾されたヌクレオシドの糖修飾は、本発明の方法により合成されたＲＮＡまたはＤＮＡ配列の１つ以上の位置に、A、C、G、Uのような2'-deoxy-2'-ethoxy, propargyl、butyne ribonucleosides (2'-OEt、O-Propargyl、2'-O-Butyne)のような2'-O-alkyl基、Inosine及び2'- 2'-OEt、O-Propargyl、2'-O-Butyneを含む修飾されたヌクレオシドからなる。
【０１０３】
修飾されたヌクレオシドの糖修飾は、本発明の方法により合成されたＲＮＡまたはＤＮＡ配列の１つ以上の位置に、A、C、G、Uのような2'-deoxy-2'-fluoro arabino nucleosides (2'-F-ANAs)、Inosine及び2'-F-ANAsを含む修飾されたヌクレオシドからなる。
【０１０４】
修飾されたヌクレオシドの糖修飾は、本発明の方法により合成されたＲＮＡまたはＤＮＡ配列の１つ以上の位置に、A、C、G、Uのような2'-deoxy-2'-fluoro 4'-thioarabino nucleosides (4'-S-FANAs)、Inosine及び4'-S-FANAsを含む修飾されたヌクレオシドからなる。
【０１０５】
ＲＮＡは、配列の３’末端でのまたは配列の５’末端での、配列内での１つ以上の２’−５’−架橋で行われる。
【０１０６】
３’末端を有するＲＮＡは、dT、dC、dG、thymidineのようなデオキシヌクレオシド、それらの３’官能基を介して付着したリバースを含む本発明の方法により合成してもよい。
【０１０７】
３’末端を有するＲＮＡは、rT、rC、rG、rUのようなリボヌクレオシド、それらの２’または３’−水産基を介して付着したリバースを含む本発明の方法により合成してもよい。
【０１０８】
リバースＲＮＡ合成は、2'-triisopropylsilyloxy methyl（ＴＯＭ）保護基を含むことで達成してもよい。
【０１０９】
リバースＲＮＡ合成は、2'-1-butyldithiomethyl（ＤＴＭ）保護基を含むことで達成してもよい。
【０１１０】
リバースＲＮＡ合成は、2'-deoxy-2'-fluoro-beta-D-arabinonucleic acid（ＦＡＮＡ）を含む修飾した塩基を含むことで達成してもよい。
【０１１１】
リバースＲＮＡ合成は、4'-thio-2'-deoxy-2'-fluoro-beta-D-arabinonucleic acid (4'-Thio-FANA)を含む修飾した塩基を含むことで達成してもよい。
【０１１２】
リバースＲＮＡ合成は、2'-Omethyl修飾を用いる修飾した糖を用いることで達成してもよい。
【０１１３】
リバースＲＮＡ合成は、Bicyclic locked nucleic acids (LNA's)を用いることで達成してもよい。
【０１１４】
リバースＲＮＡ合成はaltritol sugar modified oligonucleotides (ANA)を含む修飾した糖を用いることで達成してもよい。
【０１１５】
リバースＲＮＡ合成は、疎水部分のアミダイト機能または末端のアミノ基を有するリバース合成したオリゴヌクレオチドの３’末端のアミノリンカーを介したＲＮＡの３’末端で親油性または疎水性基の複合体のステップを含んでもよい。後者の合成は、オリゴヌクレオチドの３’末端でのアミノと、親油性部分のカルボキシリック機能との間のカップリングステップに関する。親油性部分は、triethylene glycol、hexaethylene glycol、polyethylene glycols、様々な脂質等の様々なグリコールからなる。
【０１１６】
リバースＲＮＡ合成は、そのような遊離ペプチドと、リバース合成ＲＮＡの３’末端カルボキシリック機能を利用するような細胞貫通ペプチド（ＣＰＰ）または膜貫通ペプチド（ＭＰＰ）のようなペプチドの複合体のステップを含む。適当なカルボキシル機能を有するＣＰＰ及びＭＰＰは、リバース合成ＲＮＡの３’末端の遊離の末端アミノ機能にカップリングする。
【０１１７】
リバースＲＮＡ合成は、配列の３’末端または配列の５’末端に配列内の２’−５’−架橋したＤＮＡ単位または２’−５’−ＲＮＡ単位を含む。
【０１１８】
当業者はここで述べられた本発明の実施形態の多くの均等物を認識し、日々の経験を用いて確信することができる。そのような均等物は、以下の請求項により包含されることを意図する。従属項で述べられた実施形態の如何なる組合せも本発明の範囲に包含される。
【図１】
0005714490.tif 000046
【図２】
0005714490.tif 000047
【図３】
0005714490.tif 000048
【図４】
0005714490.tif 000049
【図５】
0005714490.tif 000050
【図６】
0005714490.tif 000051
【図６ａ】
0005714490.tif 000052
【図６ｂ】
0005714490.tif 000053
【図７】
0005714490.tif 000054
【図８】
0005714490.tif 000055
【図９】
0005714490.tif 000056
【図９ａ】
0005714490.tif 000057
【図１０】
0005714490.tif 000058
【図１１】
0005714490.tif 000059
【図１２】
0005714490.tif 000060
【図１３】
0005714490.tif 000061
【図１４】
0005714490.tif 000062
【図１５】
0005714490.tif 000063
【図１６】
0005714490.tif 000064
【図１７】
0005714490.tif 000065
【図１８】
0005714490.tif 000066