(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
代謝的に活性な、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイトの精製された調製物であって、２５，０００スポロゾイトあたり８５ナノグラム未満の付随材料を含む、精製された調製物。
【請求項２】
２５，０００スポロゾイトあたり１５ナノグラム未満の付随材料を含む、請求項１に記載の精製された調製物。
【請求項３】
２５，０００スポロゾイトあたり１ナノグラム未満の付随材料を含む、請求項１に記載の精製された調製物。
【請求項４】
２５，０００スポロゾイトあたり０．１２ナノグラム未満の付随材料を含む、請求項１に記載の精製された調製物。
【請求項５】
前記スポロゾイトが、唾液腺材料の精製前調製物から精製されており、ここで、付随材料の少なくとも９８％が、前記精製前調製物から除去されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の精製された調製物。
【請求項６】
前記付随材料の少なくとも９９．９％が前記精製前調製物から除去されている、請求項５に記載の精製された調製物。
【請求項７】
前記付随材料の少なくとも９９．９７％が前記精製前調製物から除去されている、請求項５に記載の精製された調製物。
【請求項８】
無菌的に調製されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の精製された調製物。
【請求項９】
前記スポロゾイトが、一つ以上の導入遺伝子を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の精製された調製物。
【請求項１０】
前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイトの種が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐ．ｋｎｏｗｌｅｓｉおよびＰ．ｏｖａｌｅからなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の精製された調製物。
【請求項１１】
前記スポロゾイトが、宿主の感染後に前記寄生虫がマラリアの疾患病状をもたらすことができないように、十分に弱毒化されており、前記弱毒化が、遺伝性遺伝子改変もしくは遺伝子変異の導入により、または放射線曝露、化学物質暴露、もしくは環境曝露により、確立される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の精製された調製物。
【請求項１２】
前記弱毒化が、放射線曝露により確立され、前記放射線曝露が、少なくとも１００Ｇｙであるが、１０００Ｇｙを超えない照射である、請求項１１に記載の精製された調製物。
【請求項１３】
前記放射線曝露が約１５０Ｇｙである、請求項１２に記載の精製された調製物。
【請求項１４】
ヒト宿主または他の哺乳動物宿主においてＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種寄生虫感染により誘導されるマラリアに対する防御免疫を付与するのに使用するための請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の精製された調製物を含む組成物であって、前記精製された調製物は、無菌的に調製されており、前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の病原性寄生虫への後の曝露時に、前記マラリアの病理学的発現が前記宿主において防止され、前記組成物の少なくとも一用量が投与されるものであることを特徴とする、組成物。
【請求項１５】
少なくとも二用量または少なくとも三用量の前記組成物が投与されるものであることを特徴とする、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ヒト宿主または他の哺乳動物宿主において、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種寄生虫により誘導されるマラリアに対する防御免疫を付与するのに使用するための請求項１〜１０のいずれか１項に記載の精製された調製物を含む組成物であって、前記組成物の少なくとも一用量が、抗マラリア剤と組み合わされて投与されるものであることを特徴とし、防御免疫が、前記ヒト宿主または他の哺乳動物宿主において付与される、組成物。
【請求項１７】
前記抗マラリア剤が、クロロキンである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
代謝的に活性なＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの種の精製のための方法であって、前記方法は、
ａ．Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトと付随非スポロゾイト材料とを含む、水性精製前調製物を提供するステップと；
ｂ．
ｉ）１０ミクロンより大きい付随材料を保持するが、前記スポロゾイトの通過を許容することができる孔径の、第一排除フィルタと；
ｉｉ）約１．２ミクロンより大きい付随材料を保持するが、前記スポロゾイトの通過を許容することができる孔径の、第二排除フィルタと；
ｉｉｉ）１．２ミクロンまたはそれより小さな材料を通過させ、前記スポロゾイトの通過を許容することができる孔径の、第三メンブレンフィルタと；
を含む、一組のサイズ排除フィルタに、前記水性精製前調製物を順次通すステップと；
ｃ．前記スポロゾイトを保持することができる孔径の収集フィルタに、全量濾過により、前記精製されたスポロゾイト調製物を収集するステップと；
ｄ．前記精製されたスポロゾイト調製物を、前記収集フィルタから取り出すステップであって、前記精製されたスポロゾイト調製物が、実質的に精製されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイトを含むステップと
を含み、前記精製されたスポロゾイト調製物が２５，０００スポロゾイトあたり８５ナノグラム未満の付随材料を含む、方法。
【請求項１９】
前記精製前調製物が、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍに感染したＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊の唾液腺に由来する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第一フィルタ、前記第二フィルタ、および前記第三フィルタがシステムにおいて順次接続され、前記スポロゾイトがある流量で前記フィルタを横断して通過する、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記システムが、少なくとも３Ｌ／時／ｍ２であるが１５００Ｌ／時／ｍ２を超えない流量を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記システムが、少なくとも１２５Ｌ／時／ｍ２であるが２５０Ｌ／時／ｍ２を超えない流量を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第一排除フィルタが、少なくとも２．５ミクロンであるが３０ミクロンを超えない公称孔径を有する、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第一排除フィルタが、１０ミクロンの公称孔径を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第二排除フィルタが、少なくとも０．３ミクロンであるが１．２ミクロンを超えない公称孔径を有する、請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第二排除フィルタが、０．６ミクロンの公称孔径を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第三フィルタが、少なくとも１．２ミクロンであるが３ミクロンを超えない孔径を有する、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記第三排除フィルタが、１．２ミクロンの孔径を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記収集フィルタが、０．４ミクロンの孔径を有する、請求項１８〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記精製されたスポロゾイト調製物が、２５，０００スポロゾイトあたり１５ナノグラム未満の付随材料を含む、請求項１８〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記精製されたスポロゾイト調製物が、２５，０００スポロゾイトあたり１ナノグラム未満の付随材料を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記精製されたスポロゾイト調製物が、２５，０００スポロゾイトあたり０．１２ナノグラム未満の付随材料を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
付随材料の少なくとも９８％が前記精製前調製物から除去されている、請求項１８〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記付随材料の少なくとも９９．９％が前記精製前調製物から除去されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記付随材料の少なくとも９９．９７％が前記精製前調製物から除去されている、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、真核病原体および寄生虫、具体的にはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトステージ寄生虫の精製に関する。より具体的には、実質的に純粋な寄生虫ならびにその調製および使用方法に関する。本出願は、弱毒化および非弱毒化精製スポロゾイトステージＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫のワクチンおよび医薬組成物、ならびに、マラリアおよび他の疾患を防止するため、疾患を処置するため、およびマラリアワクチンおよび薬物テストにおいてボランティアを感染させる手段として、組成物をワクチンおよび他の調製物において使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは、毎年３〜５億人を侵し、１００〜３００万人の個体を殺すと推定される疾患である。それは、発展途上世界、特にサハラ以南のアフリカの人々に多大な経済的影響も有する。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍは、世界のマラリアによる死の大部分の原因である。Ｗｏｒｌｄ  Ｔｏｕｒｉｓｔ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎの報告によれば、２０００年に記録された世界中の７億人近くの海外旅行者のうち、およそ９００万人が西アフリカ、アフリカ中部、または東アフリカへの、３，７００万人が東南アジアへの、６００万人が南アジアへの、１，０００万人がオセアニアへの旅行者であった。年間３万人以上の北アメリカ、ヨーロッパ、および日本からの旅行者がマラリアにかかると推定される。１００年以上の間、マラリア伝染がある場所で行われた軍事行動の間にはいつも、敵の攻撃によるものよりもマラリアによる米軍の犠牲者のほうが多かった。第二次世界大戦中には約１，２００万人日、ヴェトナム戦争中には１２０万人日が、マラリアにより失われた。
【０００３】
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫の伝染は、夕暮れから夜明けまで活動する、感染した雌アノフェレス蚊の刺咬および吸血により生じる。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍは、成長のスポロゾイトステージで刺咬部から主に血流を介して肝臓に移動し、肝細胞の中で増殖し、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの場合には感染細胞あたり約１０，０００〜４０，０００の子孫を生じる。これらの肝臓ステージの寄生虫は、スポロゾイトステージでは発現されないいくつかのタンパク質を発現する。このステージでは、寄生虫はメロゾイトとしてスポロゾイトおよび早期肝臓ステージの間に発現されるのと異なるいくつかのタンパク質を発現して再び血流に入り、赤血球に侵入し、さらなる増殖により寄生虫数が４８時間毎におよそ１０〜２０倍増加する。マラリアの症状または兆しは一切誘発しない肝臓における５〜１０日の成長とは異なり、血液ステージの感染は処置しないと溶血、悪寒戦慄、高熱、および衰弱をもたらす。ヒト疾患をもたらすＰｌａｓｍｏｄｉｕｍの主な四種（Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ、およびＰ．ｏｖａｌｅ  ［Ｐ．ｋｎｏｗｌｅｓｉもヒト疾患をもたらしうる］）の中で最も危険なＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの場合には、脳、腎臓および肺等の重要臓器における微小循環血流の障害および代謝変化により疾患が悪化し、緊急に処置しないと死につながることが多い。
【０００４】
Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍマラリアに対する有効なワクチンは、今なお医学の大きな課題の一つである。１００年以上の努力や、数億ドルの研究費や、医師や科学者の生涯をかけた献身や、多くの有望な実験的ワクチンにもかかわらず、人類の大きな伝染病禍の一つを軽減する市販のワクチンはない。
【０００５】
一世代前に、クロロキン、ＤＤＴおよびベクターコントロールプログラムを用いた公衆衛生イニシアティブが、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍマラリアを世界的脅威でなくするかに見えた。有効なワクチンの不足がこれらの努力を難しくしたが、持続可能なコントロールは目前のように見えた。
【０００６】
成功が近いという展望はすぐに消え、失敗の理由は複数あった。有効性が高い手頃な抗マラリア薬物処置に対して寄生虫が抵抗性を強め、ベクターコントロール政策が失効し、発展途上世界の流行地において移住、戦争および経済的混乱がますます多くなった。その結果、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍマラリアが復活し、毎年少なくとも２５億人のヒトが危険にさらされ、３〜９億人の感染がもたらされ、１００〜３００万人の人々が亡くなるようになった。発展途上世界を悩ます多くの社会的、経済的、環境的および政治的問題のうち、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍマラリアはますます、これらの格差の根本原因であり悲惨な結果でもあるとみなされるようになっており、これらの複合的問題を解決する上での唯一の障害である。発展途上世界におけるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍマラリアのコントロールは、有効ワクチンなしでは不可能かもしれない。実際のところ、社会的、政治的および経済的現実を考えると、ワクチンが持続可能なコントロールプログラムの不可欠の要素であり得、世界的根絶キャンペーンに必要となると考えられる。
【０００７】
過去２５年の間は、研究努力の大半が、免疫を付与する寄生虫の抗原性サブユニットの同定に費やされているが、残念ながら満足な結果は得られていない。こうした努力およびそれに伴う適切なワクチン開発における困難が、記載されている（Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ  Ｖ．，Ｆ．およびＲ．Ｓ．Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（１９８９）４５：２８３−３３４；Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｓ．Ｌ．等、Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｓ．Ｌ．編、Ｍａｌａｒｉａ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ａ  Ｍｕｌｔｉ−Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９６）Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．３５−７５；Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｓ．Ｌ．およびＬ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｓ．Ｌ．編、Ｍａｌａｒｉａ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ａ  Ｍｕｌｔｉ−Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．（１９９６）Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１−１３；Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｅ．等、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００７）９：１２−２４；Ｒｉｃｈｉｅ，Ｔ．Ｌ．＆Ａ．Ｓａｕｌ，Ｎａｔｕｒｅ，（２００２）４１５：６９４−７０１）。
【０００８】
サブユニットマラリアワクチンを生産する努力が続けられている。このような試みの中で代表的なものであるＰａｏｌｅｔｔｉ等（特許文献１、１９９８年６月１６日発行）は、マラリアワクチンとして有効である可能性のある、ＮＹＶＡＣ−Ｐｆ７と称される実施形態を含む、一つ以上のスポロゾイト周囲タンパク質をコードするＰｌａｓｍｏｄｉｕｍからのＤＮＡを含む組み換えポックスウイルスを開示する。このコンストラクトをその後テストすると、期待外れであることが分かった（Ｏｃｋｅｎｈｏｕｓｅ，ＣＦ．等、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（１９９８）１７７：１６６４−７３）。
【０００９】
同様に、別の候補サブユニットスポロゾイト周囲ワクチンが提案され、ＲＴＳ，Ｓ／ＡＳ０２Ａとして同定された（Ｓｔｏｕｔｅ  Ｊ．Ａ．等、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（１９９８）１７８：１１３９−４４）。モザンビークの１〜４歳児での、このワクチンの最初のフェーズ２ｂ野外試験の結果（Ａｌｏｎｓｏ，Ｐ．Ｌ．等、Ｌａｎｃｅｔ（２００４）３６４：１４１１−１４２０；Ａｌｏｎｓｏ，Ｐ．Ｌ．等、Ｌａｎｃｅｔ（２００５）３６６：２０１２−２０１８；Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｅ．等、Ｓｕｐｒａ；Ｒｉｃｈｉｅ，Ｔ．Ｌ．，Ｆ．＆Ａ．Ｓａｕｌ，上記）と、乳児での別のフェーズ２ｂ野外試験の結果（Ａｐｏｎｔｅ，Ｊ．Ｊ．等（２００７）Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３７０：１５４３−１５５１；Ｂｅｊｏｎ，Ｐ．等（２００８）ＮＥＪＭ  ３５９：２５２１−３２；Ａｂｄｕｌｌａｈ，Ｓ等（２００８）ＮＥＪＭ  ３５９：２５３３−４４が報告された。ワクチンは、わずかな防御効果を示している。
【００１０】
一方で、レシピエントが後に病原性寄生虫で（とりわけヒト宿主が弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍで）チャレンジされた際の、高レベルの防御免疫の付与における全寄生虫、放射線照射弱毒化スポロゾイト（蚊曝露によりヒト宿主に、静脈内（ｉ．ｖ．）接種により動物宿主に送達）の有効性の実証は、適切なワクチンの探求における早期のマイルストーンであった（Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｓ．Ｌ．等、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（２００２）１８５：１１５５−６４）。最終的にこれは、これらの早期の観察を、無病原体の弱毒化スポロゾイトを含む実用的ワクチンアプローチへと転換する上で存在する技術的ハードルを調査する努力につながった（Ｌｕｋｅ，Ｔ．Ｃ．＆Ｓ．Ｌ．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｊ．ＥｘＰ．Ｂｉｏｌ．，（２００３）２０６：３８０３−３８０８；Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．，およびＴ．Ｃ．Ｌｕｋｅ、特許文献２および米国特許出願公開第２００５／０２０８０７８号）。それにより、弱毒化スポロゾイトを利用したワクチンの実用性に対する一般的関心も高まっている（Ｍｅｎａｒｄ，Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００５）４３３：１１３−１１４；Ｗａｔｅｒｓ，Ａ．Ｐ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２００５）３０７：５２８−５３０；Ｗｙｋｅｓ，Ｍ．Ｆ．＆Ｍ．Ｆ．Ｇｏｏｄ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．（２００７）３７：７０５−７１２；Ｒｅｎｉａ，Ｌ．等、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ，（２００６）５：４７３−４８１；Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｅ．等、上記）。
【００１１】
他の弱毒化の様式も、示されている。例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍベルゲイの遺伝子変更からもたらされる弱毒化スポロゾイトが、Ｐ．ベルゲイマラリアに対してマウスを防御することが示された（Ｋａｐｐｅ等、特許文献３；Ｍｕｅｌｌｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ（２００５）；Ｍｕｅｌｌｅｒ，等、ＰＮＡＳ（２００５）；ｖａｎ  Ｄｉｊｋ等、ＰＮＡＳ（２００５）１０２：１２１９４−１２１９９）；Ｗａｔｅｒｓ，特許文献４；Ｌａｂａｉｅｄ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎ．（２００７）。近年、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのスポロゾイトの遺伝子的弱毒化が開示されている（ｖａｎ  Ｓｃｈａｉｊｋ等、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ（２００８）３：ｅ３５４９）；ＶａｎＢｕｓｋｉｒｋ等、ＰＮＡＳ。
【００１２】
同様に、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの化学的弱毒化も記載されている（Ｐｕｒｃｅｌｌ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（２００８）７６：１１９３−９９；Ｐｕｒｃｅｌｌ等Ｖａｃｃｉｎｅ（２００８）２６：４８８０−８４）。
【００１３】
他の者も、スポロゾイトの非精製調製物を培養し、純培養の肝臓ステージへの寄生虫の分化を誘導する方法を記載している（Ｋａｐｐｅ等、特許文献５）。
【００１４】
上に記載した研究は、一定の限界を示す。例えば、蚊の刺咬によりヒト宿主に送達されるスポロゾイトはマラリアに対する有効な免疫応答を生成するが、そのような送達方法は、明らかにマラリアに対する防御を必要とする集団にワクチン接種をするための実用的な方法ではない。上で言及したマウスにおける追加的研究は、弱毒化スポロゾイトのマウスへの静脈内送達は有効であるが、それと比べて他の送達手段（例えば筋肉内）は有効でないことを示唆している。しかし、静脈内送達方法も、マラリアワクチンが多数の個体（子供および高齢者を含む）に送達されることになる場合には実用的ではない。静脈内送達はリスクが高く、コストが高く、このような方法を用いてワクチン接種を受けることには患者が同意する可能性がはるかに低い。したがって当技術分野において、ワクチンを様々な方法で投与できるような、防御免疫を提供する有効なマラリアワクチンを提供する必要があった。
【００１５】
ヒトワクチンの考慮事項に関しては、免疫原の純度、および免疫原性または有毒でありうる非特異性付随材料の存否が、これまでに解決されていないさらなる重要な問題である。上に記載した研究において用いられる、単離され弱毒化されたスポロゾイトの調製物は、汚染材料および他の付随材料を含む。当技術分野において、ワクチン組成物に用いるための、無菌的に調製された無菌の精製スポロゾイト調製物を利用する、特にヒトにおいて、スポロゾイトベースのワクチンを開発する必要があった。このような無菌的に調製された精製スポロゾイト調製物は、このような調製物が非静脈送達方法により投与された場合に、非精製調製物より有効でもありうる。（例えば筋肉内、腹腔内、皮内、表皮、粘膜、粘膜下、皮膚、または皮下）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第５，７６６，５９７号明細書
【特許文献２】米国特許第７，２２９，６２７号明細書
【特許文献３】米国特許第７，１２２，１７９号明細書
【特許文献４】米国特許第７，５５０，１３８号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００５／０２３３４３５号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
生きた感染性の実質的に精製されたスポロゾイト、特にＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの、弱毒化スポロゾイトならびに病原性スポロゾイトの組成物が開示される。生きた感染性の実質的に精製された寄生虫を生成する方法、および、実質的に精製された弱毒化スポロゾイトの組成物を、マラリアを防止するためのワクチンとして使用する方法も開示される。抗マラリア薬物およびワクチンの有効性を評価するのに有用な精製された病原性寄生虫を使用する方法、ならびに防御免疫を付与するのに有用なクロロキン等の抗マラリア剤（ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ  ａｇｅｎｔ）と併用する方法も、開示される。
【００１８】
一実施形態においては、ヒトおよび他の哺乳動物宿主においてマラリアに対する防御免疫を付与するために、無菌的に生産された、無菌の、感染性の、実質的に精製された弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを使用する方法が提供される。このような方法および組成物は、非精製調製物の使用から生じるうる合併症を伴わずに、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍおよび他のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種によりもたらされるマラリアに対する防御免疫を付与するために用いることができる。
【００１９】
一実施形態においては、実質的に精製された病原性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの組成物、ならびにこれを研究ツールとして、臨床テストにおいて、および予防接種レジメンにおいて、使用する方法が提供される。
【００２０】
生きた感染性の弱毒化された実質的に精製されたスポロゾイトの組成物、ならびにヒトおよび他の哺乳動物の対象に対する投与量、投与レジメンおよび投与経路が提供される。
【００２１】
一実施形態においては、賦形剤中の精製されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫、特に成長のスポロゾイトステージの寄生虫が提供され、当該寄生虫は代謝的に活性で、感染性で、汚染材料を実質的に含まない。別の実施形態では、スポロゾイトは、無菌的に調製される。別の実施形態では、スポロゾイトは、寄生虫の生活環の肝臓ステージを超えた成長（成熟シゾントステージ）を防止するために、十分に弱毒化される。
【００２２】
別の実施形態では、賦形剤中にあり付随材料を実質的に含まないＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の生きた代謝的に活性の感染性の弱毒化スポロゾイトを提供するステップと、当該スポロゾイト調製物の少なくとも一用量を哺乳動物およびヒト宿主に投与するステップとを含む、当該宿主においてＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種によりもたらされるマラリアに対する防御免疫を付与する方法であり、マラリアの病理学的発現が防止され、宿主が後に当該種の病原性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトに対する曝露後にマラリア発症から防御される、方法が提供される。
【００２３】
別の実施形態では、スポロゾイトと付随非スポロゾイト材料とを含む水性精製前調製物を提供し、調製物を、ａ）１０ミクロンより大きい付随材料を保持し、スポロゾイトの通過を許容することができる公称孔径の第一排除フィルタと；ｂ）約０．６ミクロンより大きい付随材料を保持し、スポロゾイトの通過を許容することができる公称孔径の第二排除フィルタと；ｃ）１．２ミクロンより大きい付随材料を実質的にすべて保持し、スポロゾイトの通過を許容することができる正確な孔径の第三サイズ排除メンブレンフィルタを含む一組のサイズ排除フィルタに順次通すことにより、代謝的に活性の感染性寄生虫、特にＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを精製する方法が提供される。それから、実質的に精製されたスポロゾイトが、スポロゾイトを保持することができる孔径の収集フィルタに回収されてから、精製されたスポロゾイト調製物が、収集フィルタから溶出され、所望の濃度で再懸濁される。
【００２４】
別の実施形態では、マラリア関連薬物、ワクチンなどの効能を決定するのに有用な組成物が提供される。本組成物は、生きた実質的に精製された病原性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫を含む。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種寄生虫の実質的に精製された調製物。
（項目２）
前記寄生虫が、代謝的に活性である、項目１に記載の調製物。
（項目３）
前記寄生虫が、感染性スポロゾイトである、項目２に記載の調製物。
（項目４）
賦形剤をさらに含む、項目３に記載の調製物。
（項目５）
前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである、項目４に記載の調製物。
（項目６）
前記賦形剤が、ヒト血清アルブミンを含む、項目４に記載の調製物。
（項目７）
前記スポロゾイトが、蚊から精製される、項目４に記載の調製物。
（項目８）
前記スポロゾイトが、唾液腺材料の精製前調製物から精製される、項目７に記載の調製物。
（項目９）
前記スポロゾイトが、宿主の感染後に前記寄生虫がマラリアの疾患病状をもたらすことができないように、十分に弱毒化される、項目４に記載の調製物。
（項目１０）
前記スポロゾイトが、一つ以上の導入遺伝子を含む、項目４に記載の調製物。
（項目１１）
前記スポロゾイトの種が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである、項目１０に記載の調製物。
（項目１２）
２５，０００スポロゾイトあたり１５ナノグラム未満の付随材料を含む、項目４に記載の調製物。
（項目１３）
２５，０００スポロゾイトあたり１ナノグラム未満の付随材料を含む、項目１２に記載の調製物。
（項目１４）
２５，０００スポロゾイトあたり０．１２ナノグラム未満の付随材料を含む、項目１２に記載の調製物。
（項目１５）
付随材料の少なくとも９８％が、前記精製前材料から除去されている、項目８に記載の調製物。
（項目１６）
付随材料の少なくとも９９．９％が、前記精製前材料から除去されている、項目８に記載の調製物。
（項目１７）
付随材料の少なくとも９９．９７％が、前記精製前材料から除去されている、項目８に記載の調製物。
（項目１８）
前記弱毒化が、遺伝性遺伝子改変もしくは遺伝子変異の導入により、または放射線曝露、化学物質暴露、もしくは環境曝露により、確立される、項目９に記載の調製物。
（項目１９）
前記弱毒化が、放射線曝露により確立される、項目１８に記載の調製物。
（項目２０）
前記放射線曝露が、少なくとも１００Ｇｙであるが、１０００Ｇｙを超えない照射である、項目１９に記載の調製物。
（項目２１）
前記曝露が、１５０Ｇｙである、項目２０に記載の調製物。
（項目２２）
無菌的に調製され、汚染を伴わない、項目１２に記載の調製物。
（項目２３）
ヒト宿主または他の哺乳動物宿主においてＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種寄生虫により誘導されるマラリアに対する防御免疫を付与する方法であり、前記方法は、前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の代謝的に活性の弱毒化スポロゾイトの実質的に精製された調製物の少なくとも一用量の投与を含み、前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の病原性寄生虫への後の曝露時に、前記マラリアの病理学的発現が前記宿主において防止される、方法。
（項目２４）
前記調製物が、賦形剤をさらに含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記賦形剤が、ヒト血清アルブミンを含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
少なくとも二用量の前記調製物の投与を含む、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
三以上の用量の前記調製物の投与を含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記弱毒化が、遺伝性遺伝子改変もしくは遺伝子変異の導入により、または放射線曝露、化学物質暴露、もしくは環境曝露により、確立される、項目２３に記載の方法。
（項目２９）
前記弱毒化が、放射線曝露により確立される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、Ｐ．ｋｎｏｗｌｅｓｉまたはＰ．ｍａｌａｒｉａｅである、項目２３に記載の方法。
（項目３１）
前記種が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
代謝的に活性のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの精製のための方法であり、前記方法は、
（ａ）スポロゾイトと付随非スポロゾイト材料とを含む、水性精製前調製物を提供するステップと；
（ｂ）
（ｉ）１０ミクロンより大きい付随材料を保持するが、前記スポロゾイトの通過を許容することができる孔径の、第一排除フィルタと；
（ｉｉ）約１．２ミクロンより大きい付随材料を保持するが、前記スポロゾイトの通過を許容することができる孔径の、第二排除フィルタと；
（ｉｉｉ）１．２ミクロンまたはそれより小さな材料を通過させ、前記スポロゾイトの通過を許容することができる孔径の、第三メンブレンフィルタと；
を含む、一組のサイズ排除フィルタに、前記スポロゾイト調製物を順次通すステップと；
（ｃ）前記スポロゾイトを保持することができる孔径の収集フィルタに、実質的に精製されたスポロゾイトを収集するステップと；
（ｄ）前記回収された実質的に精製されたスポロゾイトを、前記収集フィルタから除去し、これにより、付随非スポロゾイト材料を実質的に伴わない精製スポロゾイト調製物を
生成するステップと
を含む、方法。
（項目３３）
前記第一フィルタ、前記第二フィルタ、および前記第三フィルタがシステムにおいて順次接続され、前記スポロゾイトがある流量で前記フィルタを横断して通過する、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記システムが、少なくとも３Ｌ／時／ｍ２であるが１５００Ｌ／時／ｍ２を超えない流量を有する、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記流量が、少なくとも１２５Ｌ／時／ｍ２であるが２５０Ｌ／時／ｍ２を超えない、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記第一排除フィルタが、１０ミクロンの公称孔径を有する、項目３３に記載の方法。
（項目３７）
前記第二排除フィルタが、０．６ミクロンの公称孔径を有する、項目３３に記載の方法。
（項目３８）
前記第三フィルタが、１．２ミクロンの孔径を有する、項目３３に記載の方法。
（項目３９）
前記収集フィルタが、０．４ミクロンの孔径を有する、項目３３に記載の方法。
（項目４０）
前記精製スポロゾイト調製物中の前記付随非スポロゾイト材料の量が、２５，０００スポロゾイトあたり１５ナノグラム未満である、項目３３に記載の方法。
（項目４１）
前記精製スポロゾイト調製物中の前記付随非スポロゾイト材料の量が、２５，０００スポロゾイトあたり１ナノグラム未満である、項目３３に記載の方法。
（項目４２）
前記精製スポロゾイト調製物中の前記付随非スポロゾイト材料が、２５，０００スポロゾイトあたり０．１２ナノグラム未満である、項目３３に記載の方法。
（項目４３）
前記精製前調製物中の付随材料の少なくとも９８％が除去されている、項目３３に記載の方法。
（項目４４）
前記精製前調製物中の付随材料の少なくとも９９．９％が除去された、項目３３に記載の方法。
（項目４５）
前記精製前調製物中の付随材料の少なくとも９９．９７％が除去される、項目３３に記載の方法。
（項目４６）
ヒト宿主または他の哺乳動物宿主において、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種寄生虫により誘導されるマラリアに対する防御免疫を付与する方法であり、前記方法が、前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の病原性スポロゾイトの実質的に精製された調製物の少なくとも一用量の投与と同時の抗マラリア剤のレジメンの投与を含み、前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の病原性寄生虫に対する後の曝露時に前記宿主において前記マラリアの病理学的発現が防止される、方法。
（項目４７）
前記抗マラリア剤が、クロロキンである、項目４６に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ＰｆＳＰＺの粗調製物および精製調製物の顕微鏡写真観察である（キャンペーン３）。顕微鏡写真は２００×倍率で撮影された。図１ａは、精製前である。ＳＧＭ＝８３７ｎｇ／２５，０００ＰｆＳＰＺ（サンプルは１５×１０６ＰｆＳＰＺ／ｍｌに調節された）図１ｂは、精製後である。ＳＧＭ＝０．２３ｎｇ／２５，０００ＰｆＳＰＺ（サンプルは１８×１０６ＰｆＳＰＺ／ｍｌに調節された）
【図２】図２は、ＰｆＳＰＺの粗調製物および精製調製物の顕微鏡写真観察である（キャンペーン６）。顕微鏡写真は２００×倍率で撮影された。図２ａは、精製前である。ＳＧＭ＝７８１ｎｇ／２５，０００ＰｆＳＰＺ（サンプルは１７．７８×１０６ＰｆＳＰＺ／ｍｌに調節された）図２ｂは、精製後である。ＳＧＭ＝０．６５ｎｇ／２５，０００ＰｆＳＰＺ（サンプルは１６．７１×１０６ＰｆＳＰＺ／ｍｌに調節された）
【図３】図３は、ＰｆＬＳＡ−１のステージ特異的発現である（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイト対３日目肝臓ステージ寄生虫）。図３ａは、抗ＰｆＣＳＰモノクローナル抗体でインキュベートされたＰｆＳＰＺである。図３ｂは、抗ＰｆＬＳＡ−１ポリクローナル抗体でインキュベートされたＰｆＳＰＺである。図３ｃは、抗ＰｆＬＳＡ−１ポリクローナル抗体でインキュベートされた３日目肝臓ステージ寄生虫である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
ＦＤＡにより認可されたマラリアワクチンは、現在存在しない。しかし、過去３０年の間に発表された結果は、放射線照射により弱毒化された、１，０００匹を超えるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染蚊の刺咬により送達されるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトの投与が、９０％を超える曝露個体において少なくとも４２週間無菌防御免疫を提供し、世界中からのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの複数の単離株に対して有効であったことを示している。これらの観察と同じくらい挑発的であることには、それらは、スポロゾイトの単離および精製、ならびにその無病原体条件下での実行を含む複数の技術的なハードルにより、ワクチンまたはマラリアワクチン開発への明らかなアプローチを示唆しなかった。さらに、多くの科学者による研究から、マウスモデル系において弱毒化スポロゾイトの静脈内投与によってのみ優れた防御が達成されうることが示された。ヒト免疫化で従来使用される投与の非経口非静脈経路、例えば皮下および筋肉内接種は、このマウスモデル系において適切な防御免疫につながらなかったため、ヒト用の弱毒化スポロゾイトワクチンを開発することが可能であるとは考えられなかった。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍによりもたらされるヒトマラリアにより類似すると考えられるマウスモデル系を利用して、スポロゾイトの非経口非静脈内投与が高レベルの防御につながることが分かっている（米国特許出願公開第２００５／０２０８０７８号）。薬剤的に許容可能な生きた弱毒化マラリアワクチンへの他の多くの開発の技術的ハードルも克服されており、付随材料から単離された十分な量のスポロゾイトの無病原体的生産もその一つである（特に参照により本明細書に明示的に組み込まれるＨｏｆｆｍａｎ，ＳＬおよびＴＣ  Ｌｕｋｅ，米国特許第７，２２９，６２７Ｂ２号を参照）。
【００２７】
しかし、ヒト対象におけるルーチン使用に適したワクチンは、実質的に純粋な接種材料を必要とし、スポロゾイト接種材料は、それらが産生されたソースから実質的に精製されているスポロゾイトを必要とする。本明細書に提供されるワクチン組成物は、スポロゾイト自体に特異的でない付随（ソース）材料を実質的に伴わない、実質的に精製された形のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを含む。加えて、本明細書に提供されるワクチン組成物のいくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、汚染材料、微生物および外因性病原体を実質的に伴わない。実質的に精製されたスポロゾイトおよびスポロゾイトを精製する方法、ならびに精製スポロゾイトと賦形剤との組成物が、提供される。
【００２８】
定義
「約」または「およそ」という用語は、当技術分野での慣行通り、一標準偏差以内を意味する。
【００２９】
本明細書において名詞として用いられるところの「添加剤」とは、調製物の保存を促進するためにスポロゾイト調製物に加えられる化合物または組成物である。添加剤は、ＤＭＳＯおよびグリセロール等の凍結保護剤、抗酸化剤などを含みうる。
【００３０】
本明細書で用いられるところの「無病原体」とは、バクテリア、菌類、病原性ウイルス等の他の微生物の検出可能な汚染の導入がないことを意味する。無病原体法によるスポロゾイト調製から、他のいかなるタイプの微生物または感染性因子も伴わない、スポロゾイトの無病原体調製物がもたらされる。無病原体方法論をモニタするために用いられる微生物学的アッセイにより、汚染の存否が評価される。これには、参照により本明細書に組み込まれる微生物限度試験、現行のＵＳＰ＜６１＞が含まれるがこれに限られない。
【００３１】
本明細書で用いられるところの「付随」材料とは、寄生虫自体に特異的でない、寄生虫の粗調製物中の材料を意味する。例えばスポロゾイトの調製物において、付随材料は、スポロゾイト自体に特異的でないものである。付随材料には、スポロゾイトが生育または産生されるソースに特異的な材料、具体的には生物学的デブリ、より具体的にはタンパク質が含まれ、当該材料は粗調製物においてスポロゾイトとともに単離される。調製物を「粗」にするものは、調製物中の付随材料であり、スポロゾイトに関しては、スポロゾイトが成長しまたはスポロゾイトが単離された基質に特異的な材料が含まれる。宿主蚊の唾液腺から解剖および単離されたスポロゾイトに関しては、付随材料は、宿主材料、宿主タンパク質、唾液腺材料、唾液などである。付随材料は、調製物に意図的に加えられている成分、例えば賦形剤、希釈剤、添加剤などを含まない。いくつかの実施形態においては、粗調製物から除去されている付随材料の成分が、宿主に対するスポロゾイトの感染性スポロゾイトの免疫原性、またはスポロゾイトの提示を最適化するために、精製調製物に再び加えられうる。このように再び加えられた材料は、本明細書で定義されるところの付随とはみなされない。
【００３２】
本明細書において使用されるところの「弱毒化」とは、生きた生物を殺さずにその生活環を完了できなくすることを意味する。生物は、いくつかの生活環ステージを通して複製し、タンパク質を発現し、成長する限定された能力を有しうるが、特定の生活環ステージで成長を止め、そのステージを超えては発生的に発達することができない。本明細書において開示される弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫、すなわちスポロゾイトステージで放射線に曝露されている寄生虫に関しては、宿主の肝細胞を感染させ、ステージ特異的タンパク質を発現する能力を保持するが、肝臓ステージを超えて成長することができず、肝臓ステージ後に（メロゾイトステージ）感染宿主の血流に再び入ることができず、マラリアの疾患病状をもたらすことができない。他の弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種寄生虫は、宿主の肝細胞を感染させ、肝臓ステージを超えて成長し、肝臓ステージ後に（メロゾイトステージ）感染宿主の血流に再び入り、赤血球を感染させる能力まで保持しうるが、その後、マラリアの疾患病状が現れるステージの前に成長を止めうる。
【００３３】
本明細書において用いられるところの「防御免疫を付与する」とは、宿主における疾患の臨床兆候、病状、または症状が非処置宿主と比較して減少するように、または、疾患の感染もしくは臨床兆候、病状、または症状が集団内に現れる速度が非処置集団と比較して減少するように、病原体（例えばＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）によりもたらされる疾患（例えばマラリア）から防御するための免疫応答を生成する能力を、集団または宿主（すなわち個体）に与えることをさす。
【００３４】
本明細書で用いられるところの「汚染物質」および汚染とは、バクテリア、ウイルス、マイコプラズマ、菌類などを含むがこれに限られない、外来の微生物またはウイルス汚染または病原性汚染を意味する。無病原体プロセスは汚染の導入を防止するように設計され、無菌調製物は汚染が存在しない。汚染物質は、非生物学的または無機有毒物質でもありうる。汚染物質は、プロセス中の任意のステップで、偶然または不注意により導入されうる。
【００３５】
本明細書で用いられるところの「希釈剤」は、所望の濃度を達成するようにスポロゾイトおよびスポロゾイト組成物が調製される溶媒である。希釈剤は、例えば生理食塩水もしくはリン酸緩衝食塩水、またはｍｅｄｉｕｍ１９９もしくはｍｅｄｉｕｍＥ１９９（アール平衡塩を伴うｍｅｄｉｕｍ１９９）等の溶媒でありうる。
【００３６】
「賦形剤」とは、ワクチン等の医薬調製物の活性成分のための担体、ビヒクル、または希釈剤として使用される不活性物質を意味する。本明細書において用いられるところの、賦形剤とは、プロセスを助け、非特異的相互作用または吸収を最小化し、および／または体積を提供するために、単離および精製プロセスの間に調製物に加えられる成分である。賦形剤の例には、血液から精製されたもの、組み換えタンパク質として生産または合成生産されたものを含むがこれに限られない何らかのソースからの血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン等の不活性タンパク質が含まれる。蚊の唾液腺から解剖されたスポロゾイトが、さらなる処理のために賦形剤中に置かれうる。賦形剤は、精製プロセスの全体にわたり活性維持、安定性増加、または単離したスポロゾイトの不注意による損失の防止を含むいくつかの理由で、医薬品に加えられうる。
【００３７】
本明細書で用いられるところの「免疫応答」とは、抗体および／またはＴ細胞の生産により一般的に特徴づけられるがこれに限られない、弱毒化スポロゾイトの導入に対するレシピエントにおける反応を意味する。一般的に免疫応答は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種エピトープに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導または活性化等の細胞性応答、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ特異的抗体の生産増加の液性応答、あるいは細胞性応答および液性応答の両方でありうる。マラリアワクチンに関しては、スポロゾイトを含むワクチンにより確立される免疫応答には、細胞外スポロゾイトまたは寄生虫が宿主細胞、特に肝細胞および樹状細胞等の単核細胞に入った後の寄生虫のその他のステージにより発現されるタンパク質への応答および／または当該寄生虫の成分に対する応答が含まれるがこれに限られない。本発明においては、後の感染性生物によるチャレンジ時には、免疫応答により、疾患をもたらす無性赤血球ステージへの病原性寄生虫の成長が防止される。
【００３８】
本明細書で定義されるところの「静脈内」とは、静脈等の特定された大きな血管の管腔内への直接的な意図的導入を意味する。
【００３９】
本明細書において用いられるところの「代謝的に活性」とは、生きて、持続的機能およびいくつかの生活環プロセスを実行できることを意味する。弱毒化スポロゾイトに関しては、培養およびｉｎ  ｖｉｖｏで肝細胞に侵入でき、いくつかの成長段階を通して分裂および発達する限定的能力を潜在的に有し、新たにステージ特異的タンパク質を発現するスポロゾイトが含まれるがこれに限られない。
【００４０】
本明細書で定義されるところの「緩和する」とは、本来ならワクチン接種後に現れうるマラリアの強度、症状および／または病状を実質的に減少させ、あるいは和らげることを意味する。
【００４１】
本明細書で定義されるところの、フィルタの孔径に関しての「公称」とは、有効な孔径を意味し、当該サイズの粒子の９０％がフィルタにより排除されるような、球形粒子のフィルタ通過のための見かけの孔径をさす。。
【００４２】
本明細書で定義されるところの「非経口」とは、消化管を通してではなく、皮内、皮下、筋肉内、眼窩内、嚢内、髄腔内、胸骨内、静脈内、経皮などの何らかの他の経路による導入を意味する。
【００４３】
本明細書で定義されるところの、マラリアを防止する文脈で使用される「防止する」とは、マラリアの病状および臨床兆候の大半から全てが現れるのを防ぐことを意味する。
【００４４】
本明細書で定義されるところの、スポロゾイトの調製物に関しての「精製する」とは、付随材料から分離すること、または望ましくないと考えられる材料から分離することを意味する。
【００４５】
本明細書で定義されるところの、スポロゾイトに関しての「無菌」とは、一切の汚染微生物が存在しないことを意味する。スポロゾイトの無菌調製物は、無病原体調製法により得られる。参照により本明細書に組み込まれる、無菌試験（Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔ）現行ＵＳＰ＜７１＞を含むがこれに限られない特異的アッセイにより、調製物の無菌性が決定される。
【００４６】
スポロゾイトの調製物に関しての「実質的に精製された」とは、８５ｎｇ／２５，０００スポロゾイト未満への付随汚染の量の減少、または付随汚染の少なくとも１８倍の減少を意味する。前述の基準のいずれかの達成が、スポロゾイトの調製物を「実質的に精製された」ものとするのに十分である。
【００４７】
本明細書で定義されるところの「治療的」とは、すでに明らかになっている臨床兆候または病状の減少に関する。本明細書で用いられるところの「治療的に有効な量」は、個体における疾患の臨床兆候、病状、または症状を減らすのに十分な量、または疾患の臨床兆候、病状または症状が集団内で現れる速度を減少させるのに十分な量を意味する。
【００４８】
本明細書で用いられるところの「ワクチン」とは、賦形剤、アジュバントおよび／または添加剤あるいは保護剤と潜在的に組み合わせた、免疫原性剤と薬剤的に許容可能な希釈剤とを含む調製物である。免疫原は、感染性因子全体または感染性因子の分子サブセット（合成的または組み換え的に、感染性因子により生産される）からなりうる。ワクチンが対象に投与されると、免疫原が免疫応答を刺激し、これが後の感染性因子によるチャレンジ時に対象を病気から防御し、または感染性因子により生じる病状、症状または臨床兆候を緩和する。治療的（処置）ワクチンは、感染後に与えられ、疾患進行を減少させまたは止めることを目的とする。防止用（予防的）ワクチンは、初期感染を防止しまたは感染の速度もしくは負担を減少させることを目的とする。マラリア等の寄生虫症に対するワクチンにおいて使用される薬剤は、完全死滅（不活性）寄生虫、生きた弱毒化寄生虫（その生活環を通して完全には成長できない）、または寄生虫に伴う精製された分子もしくは人工的に製造された分子、例えば組み換えタンパク質、合成ペプチド、ＤＮＡプラスミド、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍタンパク質を発現する組み換えウイルスまたはバクテリアでありうる。当業者には容易に理解されるように、ワクチンは賦形剤、希釈剤、担体、保存剤、アジュバントまたは他の免疫増強剤、あるいはその組み合わせ等の他の成分とともにスポロゾイトを含みうる。
【００４９】
スポロゾイトの精製
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種寄生虫が、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ種蚊宿主、最も典型的にはＡｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ宿主において、培養ならびにｉｎ  ｖｉｖｏで無菌的に成長させられる。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種肝臓ステージ寄生虫を純培養する方法（Ｋａｐｐｅ等、米国特許出願公開第２００５／０２３３４３５号）、ならびに弱毒化および非弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイトを生産する方法、特に蚊において寄生虫を成長させ弱毒化し、弱毒化および非弱毒化スポロゾイトを採取する方法が当技術分野で公知であり、記載されている（Ｈｏｆｆｍａｎ＆Ｌｕｋｅ，米国特許第７，２２９，６２７号；米国特許出願公開第２００５／０２２０８２２号を参照。
【００５０】
本発明の精製態様は、スポロゾイトを蚊宿主唾液腺材料（以下「ＳＧＭ」）、蚊特異的材料、および他の任意の非スポロゾイト材料または成分等の付随材料から分離し、これにより、スポロゾイトを含む実質的に精製された調製物を達成する。精製の一態様として、スポロゾイトが、ＳＧＭ等の付随汚染材料に対して濃縮される。ここで、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いてスポロゾイトの粗調製物および精製調製物中に存在する付随抗原性ＳＧＭを定量することにより、調製物の純度が測定される（以下に「ＳＧＭ−ＥＬＩＳＡ」）。キャピラリー電気泳動法、質量分析、逆相クロマトグラフィ、免疫ブロット、光散乱およびＵＶスペクトロメトリ等であるがこれに限られない他の方法も、付随材料を測定するために同様に適用されうる。蚊以外のソースからのスポロゾイトの精製に関しては、スポロゾイトが精製されることとなる粗調製物中の付随材料に関連した、ＥＬＩＳＡ等の同様のアッセイが、同様に適用されるだろう。蚊の唾液腺以外のソースからの付随材料の抗原に適応されるこのようなＥＬＩＳＡアッセイの開発は、当業者に周知の類似のプロトコルを用いるだろう。説明のために、付随ＳＧＭの不純物アッセイのプロトコルが提供される。当然のことながら、このプロトコルは説明のために提供され、例えばスケールアップにより修正され、またはその他の方法で修正されうるものであり、請求される本発明の範囲を制限することを目的としない。
【００５１】
精製方法
生きたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種、例えばｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ｖｉｖａｘ、ｍａｌａｒｉａｅ、またはｏｖａｌｅを精製する方法が、本明細書に開示される。
【００５２】
開示の方法は、新規な自明でない仕方でアセンブルされる、様々なタイプの、異なる孔径の一連のサイズ排除フィルタを利用する。この方法論は、生きた運動性寄生虫の調製物から、付随材料を取り除く。この方法の一態様は、順番通りのサイズ排除フィルタの孔径が、先行するサイズ排除フィルタの孔径より必ずしも小さくないということである。別の態様は、いくつかのフィルタが公称孔径のマトリックスを提供し、少なくとも一つのフィルタが、正確な孔直径のトラックエッチドフィルタを提供することである。少なくとも一つのフィルタが、寄生虫の直径に近い孔径またはこれよりわずかに小さい孔径を有する。
【００５３】
例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイトの精製が開示されるが、当業者には当然のことながら、生物の物理的サイズに基づき、フィルタ孔径の調節も類似の精製を生み出す。例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトは、ロッド形であり、約０．８±０．２μｍの直径および８．５±１．５μｍの長さである。Ｈｏｆｆｍａｎ，ＳＬ等Ｉｎ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ第２版、２００６，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ  ｐｇ１０２７；Ｘｕ，Ｌ．Ｈ．等１９８５  Ｚｏｏ．Ｒｅｓ．６：３３−６。
【００５４】
典型的に精製のための調製においては、１５０〜４００匹の蚊から唾液腺が解剖される。針およびシリンジ（粉砕）中の前後への通過により、唾液腺からスポロゾイトが放出され、これらの腺からのスポロゾイトが集合的に精製される。しかし、スケールアップ調製においてはさらに数倍の、一実施形態では１，０００匹まで、別の実施形態では５，０００匹まで、別の実施形態では１０，０００匹までの蚊が解剖されうる。粉砕により唾液腺からスポロゾイトが放出され、粉砕された唾液腺調製物（精製前調製物）が、本明細書に開示されるサイズ排除濾過プロセスにより精製される。スポロゾイトは、精製プロセスの全体にわたり賦形剤、典型的にアール塩（Ｅ−１９９）を伴うＭｅｄｉｕｍ１９９中１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）中に維持される。
【００５５】
Ａ−精製用材料の調製
粉砕された解剖産物（精製前調製物）が、一度に一つの管にまとめて受けられる。これが、ＳＧＭ精製前調製物である。これは約１００，０００〜１０億のスポロゾイト、好ましくは少なくとも１００万のスポロゾイト、より好ましくは少なくとも２，５００万のスポロゾイトに相当する。精製前調製物中のＳＧＭの測定量は、通常２５，０００スポロゾイトあたり３００ｎｇ〜１２，０００ｎｇの間、より典型的には２５，０００スポロゾイトあたり４００ｎｇ〜１，１００ｎｇの間である。それから精製前調製物は、賦形剤により１０ｍｌに希釈される。溶液およびサンプルは、精製の間１５〜３０℃の間に保たれる。
【００５６】
Ｂ−精製手順
蠕動ポンプを用いて、希釈された精製前調製物が、少なくとも１ｍｌ／分であるが１０００ｍｌ／分を超えない、好ましくは少なくとも２ｍｌ／分であるが５００ｍｌ／分を超えない、より好ましくは少なくとも３ｍＬ／分で２００ｍＬ／分を超えない流速で、一連のサイズ排除フィルタを横断してポンプ輸送される。対応する各フィルタを横断する流量は、少なくとも１Ｌ／時／ｍ２であるが２０００Ｌ／時／ｍ２を超えず、好ましくは３Ｌ／時／ｍ２〜１５００Ｌ／時／ｍ２、最も好ましくは少なくとも１２５Ｌ／時／ｍ２であるが２５０Ｌ／時／ｍ２を超えない。フィルタは、通常は医療グレードのシリコーン管により、直列に接続される。最初のフィルタ（フィルタ＃１）または最初の二つのフィルタ（フィルタ＃１および＃２）はマトリックスフィルタであり、ポリプロピレンでできているのが好ましいが、ナイロン、混合セルロースエステルおよびホウ珪酸ガラスまたは当業者に周知のその他の材料が使用されうる。最後から二番目のフィルタ（フィルタ＃３）はメンブレンフィルタであるのが好ましく、トラックエッチドポリカーボネートフィルタであるのが最も好ましいが、当業者に周知の同様の性質を有する他のフィルタが使用されうる。無病原体手順では、フィルタは無菌である。一実施形態においては、三つのフィルタ（フィルタ＃１、フィルタ＃２およびフィルタ＃３）が直列に接続され、フィルタ＃４での全量濾過によりスポロゾイトが捕捉される。追加のフィルタが、用いられうる。あるいは、（第５９段落で後述されるように）一つまたは二つのフィルタだけが使用されうるが、三つのフィルタの使用が最適である。一実施形態においては、フィルタ＃１は、少なくとも約２．５ミクロンであるが約３０ミクロンを超えない、好ましくは少なくとも５ミクロンであるが２０ミクロンを超えない公称孔径のメンブレンマトリクスである。一実施形態においては、使用されるフィルタは、約１０ミクロンの公称孔径と、１７．５ｃｍ２の濾過面積を有する。（Ｐｏｌｙｇａｒｄ（登録商標）−ＣＮ  Ｏｐｔｉｓｃａｌｅ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＮ１ＨＡ４７ＨＨ３）。スケールアップ実施形態においては、濾過面積は１８００ｃｍ２である。フィルタ＃２（これもメンブレンマトリックス）の公称孔径は、少なくとも約０．３ミクロンであるが約１．２ミクロンより大きくない。一実施形態においては、孔径は約０．６ミクロンであり、濾過面積は１７．５ｃｍ２である。（Ｐｏｌｙｇａｒｄ（登録商標）−ＣＮ  Ｏｐｔｉｓｃａｌｅ  ｆｉｌｔｅｒ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＮ０６Ａ４７ＨＨ３）−Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの直径よりも小さい。スケールアップ実施形態においては、濾過面積は、１８００ｃｍ２である。一実施形態においては、フィルタ＃３は、正確な孔直径および一貫した孔径のトラックエッチドメンブレンフィルタであり、少なくとも１．２ミクロンであるが３ミクロンより大きくない、すなわち先行するフィルタの公称孔径より大きな孔径を有する。一実施形態においては、使用されるフィルタは、１．２ミクロンの孔径と１１．３ｃｍ２の濾過面積を有する。（Ｉｓｏｐｏｒｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ，直径４７ｍｍ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ���ＲＴＴＰ０４７００）Ｓｗｉｎ−Ｌｏｃフィルタホルダに保持された（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．４２０４００）。スケールアップ実施形態においては、濾過面積は、１２７ｃｍ２である。濾過された材料は、フィルタ＃４で、直径９０ｍｍで２８．７ｃｍ２の濾過面積の、０．８ミクロンを超えない、好ましくは０．６ミクロンを超えない、好ましくは０．２ミクロンを超えないトラックエッチド孔径の、Ｉｓｏｐｏｒｅメンブレンが取り付けられた撹拌限外濾過セル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ｍｏｄｅｌ  ８２００）に捕捉される。一実施形態においては、孔径は０．４ミクロンである（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＴＴＰ０９０３０）。スケールアップ実施形態においては、濾過面積は１６２ｃｍ２である。別のスケールアップ実施形態においては、濾過面積は６３ｃｍ２である。システムは、溶媒で数回洗浄される。残余分体積が撹拌セルにおいて約４０ｍｌに達したら、撹拌セル容器出口が開かれ、約５〜１０ｍｌの残余残留分を残して重力により排液され、窒素等の圧縮ガスまたはピストン等の機械デバイスからの圧力の印加等の他の方法により残余分体積が減少されてもよいが、重力が好適な方法である。この残余残留分が、精製溶媒を用いた合計約３５ｍｌへの三回の洗浄とともに、典型的には無菌３５ｍｌ  オークリッジまたは同様の遠心管（管のサイズは調製物の体積に応じて変動）に、回収されて移される。３５ｍｌ  オークリッジ管内の溶媒中の精製スポロゾイトが、５，０００ｇ〜２５，０００ｇ、好ましくは１６，３００ｇで、２分〜１２分間、好ましくは５分間の遠心分離されて、スポロゾイトがペレット化される。上清溶媒がデカントされる。このステップは、上清中に残るより小さなさらなる浮遊材料および可溶性材料を除去することにより、スポロゾイト調製物をさらに精製する。
【００５７】
この手順は、３サイズ排除フィルタ方法論を用いて、精製前調製物中の付随材料と比較して、精製スポロゾイト調製物中の付随材料の相当量を超える２００〜１０，０００倍の減少（減少係数（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ））を提供する。無菌精製スポロゾイトの精製調製物中の残余ＳＧＭの量は、ルーチン的に２５，０００スポロゾイトあたり付随材料２５ｎｇ未満（ＳＧＭの初期量に対して９７％を超える減少）、好ましくは２５，０００スポロゾイトあたり１５ｎｇ未満（９８％減少）、より好ましくは２５，０００スポロゾイトあたり１ｎｇ未満である（９９．９％）。本明細書に記載の各精製調製物中の汚染ＳＧＭは、各精製調製物が得られる最初の粉砕精製前唾液腺材料中のＳＧＭに対して、通常数千倍減少される。精製減少係数が少なくとも１５倍であるのが好ましく、精製係数が少なくとも１，５００倍であるのがより好ましく、少なくとも３，５００倍であるのが最も好ましい。実施例１に記載の１０のキャンペーンにおける減少係数の幾何平均は１６２５であり、精製プロセス中のＳＧＭの９９．９３％の減少である。
【００５８】
例えば、実施例１（表２）に示される解剖蚊唾液腺から単離された精製スポロゾイト調製物は、２５，０００のスポロゾイトあたり０．１９ｎｇ〜１．０１ｎｇの範囲のＳＧＭを含み、付随ＳＧＭの減少率は９９．９１％〜９９．９７％の範囲だった。あるいは、下の第５９段落に記載の方法は、２５，０００あたり８５ｎｇのＳＧＭを超えないスポロゾイト調製物を提供し（付随ＳＧＭ材料の９５％減少）、実質的に精製されていると考えられる。表２の（３つのサイズ排除フィルタを使用した）１０の生産キャンペーンからの精製調製物中のＳＧＭの幾何平均は、２５，０００のスポロゾイトあたり０．５１ｎｇ  ＳＧＭであり、９５％信頼区間が２５，０００のスポロゾイトあたり０．３４〜０．６７ｎｇ  ＳＧＭであった。
【００５９】
代替的実施形態では、上の第５６段落に記載のフィルタ列からフィルタ＃３が取り除かれ、２サイズ排除フィルタ方法論（中間フィルタ＃１およびフィルタ＃２）が用いられる。上の第５６段落に記載のように、スポロゾイトが捕捉される。この実施形態の例においては、１，５５５ｎｇ／２５，０００スポロゾイトの粗調製物がロードされ、記載のように（フィルタ＃３はなしで）精製された。（０．４ミクロンまたは０．４５ミクロンフィルタで）回収および再懸濁の後、精製調製物は、８４ｎｇ／２５，０００スポロゾイトを含んだ。ここでは減少係数は１８倍より大きく、９４．６％のＳＧＭ汚染が除去された。この調製物は、実質的に精製されていると考えられる。
【００６０】
精製スポロゾイトの収率の範囲は、開始調製物中のスポロゾイト数の３０％〜１００％の間、通常５０％〜７０％の間であった。
【００６１】
この方法は、スポロゾイト粗調製物の汚染を減少する上で有効である。それから、スポロゾイトが保存される。一実施形態においては、スポロゾイトは、低温保存される（Ｌｅｅｆ  Ｊ．Ｌ．等、Ｂｕｌｌ  ＷＨＯ５７（ｓｕｐｐｌ  １）（１９７９）８７−９１；Ｏｒｊｉｈ  Ａ．Ｕ．，Ｆ．およびＮｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ  ＲＳ．Ａｍ．Ｊ．ＴｒｏＰ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．（１９８０）２９（３）：３４３−７）。一実施形態においては、スポロゾイトは凍結乾燥により保存される。一実施形態においては、スポロゾイトは冷凍により保存される。他の保存方法は、当業者に公知である。
【００６２】
弱毒化
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの弱毒化を誘導するいくつかの手段が、公知である。これらには、遺伝性遺伝子改変、遺伝子変異、放射線曝露、ならびに変異原性化学物質への曝露、代謝阻害化学物質への曝露、および高または低温度または圧力等の環境条件への曝露が含まれる。
【００６３】
放射線曝露によりスポロゾイトの弱毒化を誘導する方法が開示されており（例えばＨｏｆｆｍａｎ＆Ｌｕｋｅ，米国特許第７，２２９，６２７号；米国特許出願公開第２００５／０２２０８２２号を参照）、参照により本明細書に組み込まれる。スポロゾイトは、少なくとも１００Ｇｙであるが１０００Ｇｙを超えない、好ましくは１２０〜２００Ｇｙ、最も好ましくは約１５０Ｇｙにより弱毒化されうる。本明細書に開示のワクチンのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫の弱毒化は、スポロゾイトステージ寄生虫が代謝的に活性のままで、肝細胞に侵入する能力（効力）を伴って感染性であることを可能にし、その一方で寄生虫が完全成熟肝臓シゾントステージには成長せず、宿主血流に再び入り、赤血球に侵入しまたは疾患をもたらす成長段階に達することができないこと（安全性）を確保する。当業者は、寄生虫の成長段階をルーチン的に決定し、必要に応じて弱毒化を調節できる。
【００６４】
肝細胞のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ感染の生物学は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより効力および安全性の両方を実証する機会を提供する。通常、スポロゾイトは、蚊の刺咬部位から主に血流を介して、しかし潜在的にリンパ系を介して、肝臓に移動する。それらは肝臓内では肝細胞中で増殖し、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの場合には、感染細胞あたり約１０，０００〜４０，０００の子孫（メロゾイト）を生じる。これらの肝臓ステージの寄生虫は、スポロゾイトステージまたは後の成長ステージでは発現されない複数のタンパク質を発現する。肝臓でメロゾイトステージに成長した後、それらは肝細胞から放出され、スポロゾイトおよび早期肝臓ステージの間に発現されるのと異なるステージ特異的タンパク質組を発現して再び血流に入り、赤血球に侵入し、さらなる増殖により寄生虫数が４８時間毎におよそ１０〜２０倍増加する。病気の症状または兆しは一切誘発しない肝臓における５〜１０日の成長とは異なり、血液ステージの感染は処置しないと溶血、悪寒戦慄、高熱、および衰弱、ならびにその他の多くのマラリアの症状および兆しをもたらす。
【００６５】
効力アッセイ
精製放射線照射弱毒化Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトの感染効力のレベルは、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ：ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｓｓａｙ）を用いて、ヒト肝細胞培養におけるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ肝臓ステージ抗原−１（ＰｆＬＳＡ−１：Ｌｉｖｅｒ  Ｓｔａｇｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ−１）の発現を測定することにより評価されうる。ＰｆＬＳＡ−１は、スポロゾイトにより発現されないが、肝細胞への侵入に成功後のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ寄生虫（弱毒化および野生型の両方）により発現されるタンパク質である（図３）。ＰｆＬＳＡ−１の発現は、弱毒化スポロゾイトが代謝的に活性であることを示す。
【００６６】
ヒト肝細胞（細胞系統ＨＣ−０４［１Ｆ９］、Ｐｒａｃｈｕｍｓｒｉ，Ｊ．およびＮ．Ｙｉｍａｍｎｕａｙｃｈｏｋ，米国特許第７，０１５，０３６号参照）が、１０％ウシ胎仔血清および２％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を補充した１：１比率のダルベッコ改変イーグル培地およびＦ−１２ハム混合物（ＨＣ−０４増殖培地）を使用して、感染のおよそ２４±６時間前に播種される。細胞は、エンタクチンコラーゲン−ＩＶラミニン（ＥＣＬ：Ｅｎｔａｃｔｉｎ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ＩＶ  Ｌａｍｉｎｉｎ）（Ｕｐｓｔａｔｅ）でコーティングされた８ウェルＬａｂ  Ｔｅｋ  Ｐｅｒｍａｎｏｘ（ＮＵＮＣ）チャンバスライドに、４．０×１０４細胞／０．３ｍｌ／ウェルの濃度で播種され、３７±１℃、５％ＣＯ２および８０％の相対湿度でインキュベートされる。単層集密度が播種後２４±６時間で８０％以上に達したら、培養上清が各ウェルから吸引され、０．３ｍｌの新鮮ＨＣ−０４増殖培地と交換され、インキュベータに戻される。
【００６７】
弱毒化Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトが、ＨＣ−０４増殖培地で５００スポロゾイト／μｌの濃度に希釈される。そして３００μｌの培地を吸引後、５０μｌの希釈寄生虫サンプルが各ウェルに加えられ、合計２．５×１０４の細胞により各ウェル中のＨＣ−０４細胞を感染させる。感染肝細胞が３±０．５時間インキュベートされ、上清の穏やかな吸引によりＨＣ−０４増殖培地で三回洗浄され、ウェルあたり０．３ｍｌの新鮮培地で培養される。培養物は、一切の汚染の存在を示すものにつき３日間毎日観察される。汚染の非存在下において、培養上清が個々のウェルから吸引され、毎日０．３ｍｌの新鮮ＨＣ−０４増殖培地と交換されて、インキュベータに戻される。感染後７２±６時間で、考えうる汚染につき培養物が顕微鏡で観察される。汚染の非存在下において、培養物が０．３ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）を用いて三回洗浄され、０．３ｍｌの冷メタノール（−２０℃保存）により室温で固定され、０．３ｍｌのＰＢＳを用いてさらに三回洗浄され、０．３ｍｌの同に保存される。スライドは、一次抗体としての抗ＰｆＬＳＡ−１ポリクローナルウサギ血清およびＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ−４８８標識抗ウサギ二次抗体を使用した免疫蛍光法のために染色されるまで、７２時間まで２〜８℃で冷蔵庫に保存されうる。染色されたスライドから、プラスチックチャンバおよびガスケットが除去される。スライドは、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ）を用いてマウントされ、カバーｓｌｉＰでカバーされる。落射蛍光位相差顕微鏡を使用してウェルあたりのＰｆＬＳＡ−１を発現する全寄生虫を計数することにより、スライドが評価される（図３）。調製物の汚染がいずれのステップでも存在せず、蛍光寄生虫数が少なくとも２００／ウェルである場合に、スポロゾイトは強力であるとみなされる。
【００６８】
ワクチン組成物
弱毒化および病原性の、生きたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを含む医薬組成物、ならびに、疾患を防止するための防止用ワクチン組成物として、およびワクチンおよび薬物のテストにおいてボランティアを感染させるための病原性チャレンジ組成物として、これらの組成物を使用する方法が提供されている（特にＨｏｆｆｍａｎ、米国特許出願公開第２００５／０２２０８２２号を参照）。様々なカテゴリの弱毒化スポロゾイトが、ワクチン用に検討されている。これらには、遺伝性遺伝子改変、遺伝子変異、放射線曝露、および化学物質曝露を含む様々な方法により弱毒化されたスポロゾイトが含まれる。寄生虫の直接的遺伝子操作によりつくられる様々な弱毒化分離株が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（ｖａｎ  Ｓｃｈａｉｊｋ等、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ（２００８）３：ｅ３５４９）ならびにネズミ特異的Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種（Ｋａｐｐｅ等、米国特許第７，１２２，１７９号；ｖａｎ  Ｄｉｊｋ等、ＰＮＡＳ（２００５）１０２：１２１９４−１２１９９；Ｌａｂａｉｅｄ等、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．（２００７）７５：３７５８）について記載されている。一実施形態においては、ヒト特異的Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの放射線照射弱毒化が、ガンマ放射線への曝露により達成される。（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．等（２００２）１８５：１１５５−１１６４）。本明細書に提供される精製プロセスは、完全感染性スポロゾイトならびに弱毒化スポロゾイトの精製を対象とする。
【００６９】
一実施形態では、弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトが、感染前、感染中または感染後に発現されうる他のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種のまたは他の病原性生物の外因性遺伝子を含むように遺伝的に操作されうる。
【００７０】
精製病原性スポロゾイトを含むワクチン接種方法論も、企図される。例えば、病原性スポロゾイトが、無性赤血球ステージ寄生虫に対して有効な抗マラリア薬（例えばクロロキン）で並行して処置される個体に投与され、または後で無性赤血球ステージ寄生虫に対して有効な抗マラリア薬で処置される個体に投与され、これにより、寄生虫が防御免疫応答を刺激するのを可能にしながら、ｉｎ  ｖｉｖｏで寄生虫により生じる病状を防止しうる。Ｒｏｅｓｔｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．，等（２００９）ＮＥＪＭ  ３６１：４６８−４７８；Ｐｏｍｂｏ，Ｄ．Ｊ．等（２００２）Ｌａｎｃｅｔ  ３６０：６１０−６１７。
【００７１】
無菌の精製された病原性スポロゾイトは、ワクチンおよびワクチン方法論の有効性を、これらのワクチンおよびワクチン方法論で以前に処置されたボランティアのチャレンジ研究において評価するための、チャレンジプロトコルにおいても有用である。同様に、精製された病原性スポロゾイトは、化学予防的薬物および療法の有効性を評価するための研究においてマラリアの症状、兆しまたは病状を生成するのにも有用である。
【００７２】
無菌精製スポロゾイトを含む組成物およびワクチンは、付随材料または汚染により好ましくない免疫応答、外来性感染症または他の予想外の結果がもたらされるリスクを減少または除去するため、精製された無菌の生きた病原性スポロゾイトならびに精製された無菌の生きた弱毒化スポロゾイトは一般的に、それらの非無菌非精製対応物よりも有用である。精製された生きた弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイトを含むワクチンは通常、非経口および本明細書に記載の他の経路により投与される。このようなワクチンは、マラリアの重症度、その兆候、症状またはその病状の防止または減少に有用である。
【００７３】
一実施形態においては、無菌的に調製された弱毒化精製スポロゾイトを含む組成物およびワクチンは、以前にマラリアをもたらす病原体に曝露されていない、または曝露されているが完全に防御されていないヒトおよび他の哺乳動物対象において、部分的防御、増強された防御、または完全な防御を提供する。これらの組成物およびワクチンは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの種、例えばＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍまたはＰ．ｖｉｖａｘなどを含むマラリアをもたらす寄生虫から疾患を生じさせる感染症を発症する可能性を減少し、感染時に病気になる可能性を減少し、感染時に熱等の病気の重症度を減少し、感染者における寄生虫の濃度を減少し、または、マラリア原虫に曝露された集団におけるマラリアによる死亡率を減少するのにも同様に有用である。多くの場合には、部分的防御または免疫を付与されていない個体と比較して免疫化された個体が寄生虫により感染しまたは感染から病気になるのにかかる時間の遅れさえも、有益である。同様に、集団の約３０％にこれらの利益のいずれかをもたらすワクチン処置戦略は、共同体および共同体に住む個体の健康に有意な影響を有しうる。病原性スポロゾイトを含む他の実施形態においては、開示の組成物は、ワクチン、マラリア処置のための薬物、ならびに他のマラリアの処置および防止の効能を実証するために有用である。
【００７４】
対象におけるマラリア防止のための方法が、提供される。本方法は、無菌的に調製されており、実質的に精製された生きた弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを、マラリアを防止するのに有効な量含むワクチンを、対象に投与するステップを含む。
【００７５】
これらの方法に従ってワクチンが投与される対象は、マラリア寄生虫により感染しやすい任意のヒトまたは他の哺乳動物でありうる。このような方法では、投与は、経口投与等消化管を介し得、または投与は、粘膜投与、鼻腔内投与、表皮投与、皮膚投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜下投与、静脈内投与などを含むがこれに限らない非経口投与でありうる。さらに、投与は、連続注入によるもの、または一つまたは複数のボーラスによるもの、ならびに極微針により媒介される送達でありうる。
【００７６】
マラリアの防止および／または処置は、熟練した実務家により、マラリア感染にともなう臨床または病理学的発現、例えば体温上昇、頭痛、疲労、昏睡、または寄生された赤血球の割合の評価により、直ちに確認されうる。したがって、本発明の方法によれば、対象は、精製された生きた弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを含むワクチンの投与後に、マラリアの臨床的兆し、症状または病理学的発現の改善または非存在を示す。
【００７７】
ワクチンおよび免疫原の有効および最適な投与量範囲は、当技術分野において公知の方法を用いて決定されうる。抗マラリア効果を達成するための適切な投与量に関する指針は、本明細書に開示される例示的アッセイから提供される。より具体的には、必要な技術を有する当業者は、本明細書および引用文献に記載される免疫化パターンからの結果から推定して、テストワクチン接種スケジュールを提供しうる。ボランティア対象が予定の間隔で様々な投与量で接種され、テスト血液サンプルが、後の感染寄生虫への曝露時のマラリアに対する防御のレベルにつき評価される。このような結果を用いて、哺乳動物、特にヒト対象の有効な免疫化のための、最適化された免疫化用量および投薬レジメン（スケジュール）を改良しうる。防御免疫を付与するのに有効な用量は、１〜６用量の投薬レジメンにおいて投与される５，０００〜４００，０００精製弱毒化スポロゾイト、より具体的には少なくとも２用量の投薬レジメンにおける１５，０００〜２７０，０００精製弱毒化スポロゾイト、最も具体的には３または４用量の投薬レジメンにおける２５，０００〜１５０，０００精製弱毒化スポロゾイトである。
【００７８】
対象における免疫応答は、抗原特異的または寄生虫ステージ特異的抗体応答の測定；公知技術による末梢血リンパ球の直接測定；ナチュラルキラー細胞細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉ等（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５５：１９−２４）、細胞増殖アッセイ（Ｖｏｌｌｅｎｗｅｉｄｅｒ等（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１４９：１３３−１３５）、免疫細胞およびサブセットの免疫学的アッセイ（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ等（１９９２）Ｃｙｔｏｍ．１３：１６９−１７４；Ｒｉｖｏｌｔｉｎｉ等（１９９２）Ｃａｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４：２４１−２５１）；および細胞媒介性免疫の皮膚テスト（Ｃｈａｎｇ等（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：１０４３−１０５０）を含むがこれに限られない液性および細胞性免疫応答の評価を含むがこれに限られない標準テストにより測定されうる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ等（編）（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓなど、免疫系の強度を測定する様々な方法および分析が、記載されている。
【００７９】
提供されるワクチンは、付随材料を実質的に伴わない精製された生きた弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの無病原体および非無病原体組成物、ならびに、薬剤的に許容可能な希釈剤、賦形剤または担体を伴う組成物を含む。これらのワクチンは、後の感染性寄生虫への曝露時にマラリアを防止または緩和するのに有効である。医薬組成物およびワクチンを調製する方法は、当業者に周知である（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ第２１版，Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，編（ＵＳＩＰ：２００５）を参照）。
【００８０】
精製された生きた弱毒化または非弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを適切な希釈剤およびバッファとともに含む、無菌的にまたは他の方法で調製されたワクチン組成物が、本発明に包含される。希釈剤、一般にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または、生理食塩水（ＮＳ：Ｎｏｒｍａｌ  Ｓａｌｉｎｅ）は、様々なバッファｐＨおよびイオン強度である。このような組成物は、血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン等の賦形剤も含みうる。血清アルブミンは、ヒト血液等の自然に生じるソースから精製されるか、あるいは組み換えＤＮＡまたは合成技術により作られうる。このような組成物は、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、および／または保存剤もしくは低温保存剤等の添加剤も含みうる。ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の高分子化合物の顆粒調製物へのまたはリポソームへの、材料の取り込みも用いられうる。（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（１９９０），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１８０４２）参照により本明細書に組み込まれる１４３５〜１７１２頁を参照。
【００８１】
ワクチンの有効量を決定するために、通常の熟練した実務家は、レシピエントの治療状況、年齢、および健康状態を考慮して、適切な投薬を確認することが可能である。選択される投与量は、所望の治療効果、投与ルート、および所望の処置期間に依存する。投与量レベルを決定するための実験は、通常の技術を有する当業者により、様々な投薬レジメンがマラリアに対する防御を誘導する能力につき評価される適切なヒト臨床試験により、確認されうる。
【００８２】
開示のワクチンおよびこれらのワクチンを使用する開示の方法は、各成分が別々に対象に投与される個別のワクチンを含むワクチンレジメンの、一つの成分として有用でありうる。レジメンは、弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイトおよび他のタイプのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍワクチンによる順次免疫化を含む、いわゆるプライムブースト戦略でありうる。これは、弱毒化スポロゾイトをプライムとして、アジュバント中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ関連リコンビナントタンパク質またはタンパク質類をブーストとして含めばよく、またはその逆でありうる。これは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ関連タンパク質を発現するＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ関連ＤＮＡワクチンまたはアデノウイルス等の組み換えウイルスをプライムとして、精製弱毒化スポロゾイトワクチンをブーストとして含んでもよく、その逆でもありうる。弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイトおよび死滅および生きて弱毒化されたものを含む何らかの形の赤血球ステージ寄生虫による順次免疫化または混合免疫化も含みうる。別個の成分を含む複合ワクチンは、個別のワクチン成分を含むワクチンレジメン、プライム／ブーストレジメン、コンポーネントワクチン、コンポーネントワクチンキットまたはコンポーネントワクチンパッケージと称されうる。例えば、複合ワクチンは、生きた精製無病原体弱毒化スポロゾイトを含むワクチンを成分として含みうる。複合物は、組み換えタンパク質、合成ポリペプチド、これらの要素自体をコードするか、または組み換えウイルス、組み換えバクテリア、もしくは組み換え寄生虫に機能的に取り込まれたＤＮＡを含むがこれに限られない、一つ以上の組み換えまたは合成サブユニットワクチン成分をさらに含みうる。ワクチン成分は、細胞外で早期肝臓ステージに成長させられる無病原体弱毒化純培養スポロゾイトも含みうる。
【００８３】
西アフリカ、東アフリカ、東南アジアなど、世界の様々な地域からのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ株が記載されている。一つの弱毒化スポロゾイト株を接種されたボランティアには、他の株に対する防御がみられる（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．等（２００２）Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１８５：１１５５−１１６４）。一実施形態においては、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の複数の単離株および／または株が、スポロゾイト組成物またはワクチン製剤において組み合わせられる。
【００８４】
いくつかのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種、主にＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍおよびＰ．ｖｉｖａｘが、ヒトにおいてマラリアをもたらすことが知られている。Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ、およびＰ．ｏｖａｌｅを含む他のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種もマラリアをもたらす。Ｐ．ｋｎｏｗｌｅｓｉも、ヒト疾患をもたらすことが知られている。一実施形態においては、二つ以上のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種が、ワクチン処方において組み合わせられる。さらに他の実施形態においては、ワクチンレジメンの個別の成分が、異なる種から、例えばいくつかの用量はＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍから、その他はＰ．ｖｉｖａｘ．から、得られうる。
【００８５】
別の実施形態では、スポロゾイトはトランスジェニックまたは組み換え寄生虫、すなわち本明細書において導入遺伝子と称される、それを含む寄生虫の種とは異質のＤＮＡ配列または遺伝子を含み発現する寄生虫でありうる。（例えばＦｒａｎｋｅ−Ｆａｙａｒｄ，等、Ｍｏｌｅｃ．ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．２００４  Ａ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｌｉｎｅ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ  ＧＦＰ  ａｔ  ａ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌ  ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｌｉｆｅ  ｃｙｃｌｅ．１３７：２３−３３；Ｗｅｎｇｅｌｎｉｋ，Ｋ．等、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９９  Ｔｈｅ  Ａ−ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｏｔｉｆ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ＴＲＡＰ  ａｒｅ  ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｏｆ  ｍｏｓｑｕｉｔｏ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｇｌａｎｄｓ．１８：５１９５−５２０４参照）。当業者には当然のことながら、トランスジェニック寄生虫、すなわち導入遺伝子を含むものは、本明細書に開示の方法論に従って、トランスジェニック寄生虫が作られた親寄生虫と同じ様式で同じ程度に精製されうる。
【００８６】
最近発表された結果は、ヒトマラリア系で生じることにつき高度な予測性を有することを示されている齧歯目マラリア系における異種間防御を報告する（Ｓｅｄｅｇａｈ，Ｍ．等（２００７）Ｐａｒａｓｉｔｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：５５９−５６５）。これは、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍを含むワクチン組成物がＰ．ｖｉｖａｘおよび／または他のヒトＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種に対して防御免疫を提供しうることを示唆する。
【００８７】
医薬組成物は、保存、低温保存、凍結乾燥、噴霧乾燥、冷蔵、または室温で熱安定化されるなどすればよい。
【００８８】
以上の記載および以下の実施例はいずれも、例示的かつ説明的であるにとどまり、請求される本発明を制限するものではない。さらに、本発明は、記載される具体的実施形態に限られず、したがって当然ながら変動しうる。さらに、本発明の範囲はその請求項だけにより制限されるため、具体的実施形態を記載するために用いられる用語は制限を意図しない。
【００８９】
特に断りがない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語の意味は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されているものである。当業者にはさらに当然のことながら、従来技術において本明細書に記載のものと同様または等価の任意の方法および材料も、本発明を実施またはテストするために用いられうる。さらに、本明細書に記載の全ての特許、特許出願および刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられるところの、単数形「１つの（ａ）」、「または」、および「前記（ｔｈｅ）」は、文脈により別の意味が明示されない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば「弱毒化スポロゾイトワクチン（ａｎ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ）」への言及には、複数のこのようなスポロゾイトが含まれ、「前記薬剤」への言及には、一つ以上の薬剤および当業者に公知のその等価物への言及が含まれる、などとなる。
【００９１】
さらに、代謝的に活性で、生きているが、その生活環およびマラリアの臨床兆候および病状をもたらす能力において弱毒化されているスポロゾイトは、弱毒化スポロゾイト、生きた弱毒化スポロゾイト、および代謝的に活性の生きた弱毒化スポロゾイトと様々に呼ばれる。
【００９２】
本明細書および請求項に記載される数値的パラメータは、本発明の所望の性質に応じて変動しうる近似値である。少なくとも、均等論の適用を請求項の範囲に制限しようとするものではないが、各数値的パラメータは少なくとも、報告される有効数字の数に照らして、通常の概算技術を適用して解釈されなければならない。だが、具体的実施例に記載される数値は、できるだけ正確に報告されている。しかし、実験的測定から到達されるいかなる数値も、その実験的測定値の標準偏差からの一定の誤差を本質的に含む。
【００９３】
以上の教示に照らし、本発明の多くの修正および変更が考えられる。したがって当然のことながら、添付の特許請求の範囲内で、本発明は特に記載されているのとは別の方法により実施されうる。
【００９４】
以下の実施例は、本発明をさらに例示する。それらは、本発明を例示し、本発明のある実施形態の様々な有益な性質を開示するにすぎない。これらの実施例は、本発明を制限するものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【００９５】
（実施例１）
付随ＳＧＭの測定−ＥＬＩＳＡ
提供される方法により、任意のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種のスポロゾイトを精製しうる。本明細書に提供される実施例は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのスポロゾイト（ＰｆＳＰＺ）の精製を記載する。しかし、他の実施形態は、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ、および／またはＰ．ｋｎｏｗｌｅｓｉを利用する。さらに他の実施形態は、これらの寄生虫の混合物を利用する。さらに他の実施形態は、各種の弱毒化スポロゾイトを利用する。さらに他の実施形態は、その寄生虫とは異質のＤＮＡ配列または遺伝子を含み発現する弱毒化スポロゾイトを利用する。
【００９６】
Ａ−抗ＳＧＭウサギ抗血清の調製
ｉ）蚊からの唾液腺摘出
蚊唾液腺に対するウサギ抗血清を生成するために、生後１０〜１４日の昆虫飼育場飼育Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ蚊を、４□Ｃの冷蔵庫中におよそ５分間置いて静止させた。静止した蚊を、７０％エタノールを含むペトリ皿に短時間置き、それから、１Ｘリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含むペトリ皿に移した。各蚊から一対の唾液腺を、顕微鏡ガラススライド上で１Ｘ  ＰＢＳ中において手で解剖し、２０〜３０μｌの１Ｘ  ＰＢＳを含む１．７ｍｌ透明無菌マイクロチューブ（Ａｘｙｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．ＣＡ）へ移した。毎日およそ１００の蚊を解剖し、３０μｌのＰＢＳ中の１００対の唾液腺を−７０□Ｃでフリーザ内に置いた。一回の免疫化のために十分な唾液腺が得られたら、バイアルをフリーザから除去し、室温に解凍してプールした。
【００９７】
ｉｉ）唾液腺処理
一次接種のためには、１，０００匹の蚊から唾液腺を解剖し、−７０℃で保存した。接種の日に、ドライアイス／エタノールバスを用い室温で解凍する三つの追加的凍結融解サイクルによりサンプルを解凍し、プールし、溶解した。唾液腺を６００μｌの最終体積の１Ｘ  ＰＢＳにおいて再構築し、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７２０（ＳＥＰＰＩＣ，Ｉｎｃ．，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＮＪ）で乳化した。
【００９８】
その後の全ての免疫化では、毎日５００匹の蚊から唾液腺を解離し、−７０℃で保存した。接種の日に、サンプルを解凍し、プールし、乳棒（Ｋｏｎｔｅｓ  ＥＦ２４８８Ａ）で均質化した。プールに加えた１００μｌのＰＢＳで、乳棒をすすいだ。サンプルを６００μｌＰＢＳの最終体積に再構築し、再構築の３０分後以内に乳化した。
【００９９】
ｉｉｉ）唾液腺乳化
２ｍｌガラスバイアル（アジュバントコントロールの二つのバイアル；アジュバント中唾液腺の二つのバイアル）を得た。７５０μｌのＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７２０アジュバントを、５ミクロンフィルタシリンジに通した。７００μｌの濾過されたアジュバントを、各ガラスバイアルに注射した。３００μｌのＰＢＳをコントロールバイアルに、３００μｌのＰＢＳ中唾液腺を実験バイアルに加えた。バイアルを、ゴムストッパでカバーした。各バイアルを、アルミニウムシールキャップでさらキャップしシールをクリンパで押圧した。バイアルを、ボルテックスパッドの小穴に置き、テープで留め、３０分間ボルテックスした。
【０１００】
ｉｖ）エマルジョンおよび接種量
一次免疫化のためには、二つのガラスバイアルを用いて、１，０００匹の蚊からの抗原を乳化し（各々１，０００μｌの３００：７００体積比の唾液腺／ＰＢＳ：Ｍｏｎｔａｎｉｄｅアジュバントを含む）、合計２ｍｌのエマルジョン体積を得た。後続の免疫化のためには、５００匹の蚊からの抗原を、２，０００μｌの合計体積で同様に乳化した。従って、抗原の濃度の半分が、一次接種材料と同じエマルジョン体積において後続の免疫化で注射された。すべての免疫化におけるコントロールウサギは、３００：７００の体積比のＰＢＳ：アジュバントを含む２ｍｌのエマルジョンを受けた。すべてのエマルジョンが、乳化の１時間以内にウサギに接種された。
【０１０１】
実験ウサギは、２，０００μｌの唾液腺：アジュバント（３００：７００の体積比）エマルジョンを、部位あたり２５０μｌで８部位に皮下注射された。コントロールウサギは、２，０００μｌのＰＢＳ：アジュバント（３００：７００の体積比）エマルジョンを、部位あたり２５０μｌで８部位に皮下注射された。
【０１０２】
ｖ）ウサギ免疫化スケジュール
表１は、本明細書に提供される実施例において使用されるポリクローナル抗体を生成するために用いた免疫化スケジュールを提供する。このスケジュールは、ポリクローナル抗体調製の方法について制限することを目的とせず、本明細書において使用される抗体の例および開示としてのみ提供される
【０１０３】
【表１】
0005738199.tif 000002
Ｂ−ＳＧＭ  ＥＬＩＳＡアッセイ
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、付随材料を定量した。例として、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトの調製物におけるＡ．ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ唾液腺に由来する唾液腺材料（ＳＧＭ）を定量した。ＳＧＭ標準液（非感染蚊の唾液腺から調製）の希釈物および粗唾液腺調製物からのスポロゾイトのサンプルならびに精製スポロゾイト調製物のサンプルを伴うＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｃｅｒｔ，Ｎ／Ｓｔｅｒ，ＰＳ，９６ｗｅｌｌ  Ｆｌａｔ−Ｂｏｔｔｏｍ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．４３９４５４）を、アッセイのために調製した。一次抗体は、１：２００で希釈されたウサギ抗ＳＧＭ血清（上のＡに記載）であった。二次抗体は、１：５，０００で希釈されたアルカリホスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧであった（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ３７３Ｂ）。ＫＰＬ  Ｂｌｕｅ  Ｐｈｏｓ  ＳｕｂｓｔｒａｔｅおよびＳｔｏｐ  Ｋｉｔｓ（ＫＰＬ，Ｃａｔ  Ｎｏ．５０−８８−０６および５０−８９−００）を用いた。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒで、６３５ｎｍでプレートを読みとった。
【０１０４】
スポロゾイト調製物中のＳＧＭを定量するために用いられるアッセイには、二つの要素がある。第一は、既知濃度の参照用ＳＧＭでの標準曲線を生成するステップからなり、第二は、精製前および精製後サンプル中に存在するＳＧＭの量を定量するステップからなる。既知のＳＧＭ濃度のＳＧＭ参照標準（ＲＳ−ＳＧＭ）を捕捉抗原として使用して、アッセイごとに新しい標準曲線が生成される。標準曲線を確立するために、濃度が減少するＲＳ−ＳＧＭ（２．０〜０．０５μｇ／ｍＬ）の希釈系列を、１％ＨＳＡを伴うＥ−１９９において調製した。精製前および精製後スポロゾイト調製物中の残余ＳＧＭを評価するために、これらのサンプルも、１％ＨＳＡを伴うＥ−１９９において系列希釈した。希釈したＲＳ−ＳＧＭサンプルおよびスポロゾイト調製物を、１Ｘ  ＰＢＳを伴う０．２５％ＨＳＡにさらに希釈し、三通りにＥＬＩＳＡプレートに加えた。このＰＢＳへの希釈は、ＨＳＡの含量を低下させるために必要である。ＨＳＡはブロッキング剤として働き、アッセイの感度を減少させうる。ＳＧＭでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを、まずウサギポリクローナル抗ＳＧＭ抗血清（第１００段落を参照）で、その後、酵素標識抗ウサギ抗体で、最後に酵素基質でインキュベートした（第１０１段落を参照）。ＳＧＭの存在下で酵素基質の色が変化し、ウェルの含量の光学濃度（ＯＤ：ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ）が変化する。マイクロプレートリーダを使用して、各サンプルのＯＤを決定した。スポロゾイト調製物中のＳＧＭの量を決定するために、これらのサンプルおよび参照標準のＯＤ値に、共通の漸近線および勾配を有するがサンプルごとに別々のＥＤ５０値を有するロジスティック混合モデルをあてはめた。ＥＤ５０の相対値を参照用サンプル中の既知の（または指定の）ＳＧＭ濃度と組み合わせて用いて、精製前スポロゾイトおよびＶＢＰサンプル中のＳＧＭ濃度を推定した。共通の参照標準およびテストサンプルを含む三つの実験アッセイに基づく変動の推定値を組み込んだ全データから、９５％信頼下限および信頼上限がスポロゾイト調製物につき同様に決定された。各スポロゾイト調製物中に存在すると分かっているスポロゾイトの数から、ＳＧＭのｎｇ／２５，０００スポロゾイト、および付随材料の減少係数ならびに減少率を計算した。
【０１０５】
表２は、１０の生産キャンペーンの結果を示す。「開始」は、感染蚊から解剖された唾液腺の粉砕後プールされた粗調製物中のｎｇ  ＳＧＭ／２５，０００スポロゾイトの測定量を表す。「最終」は、本明細書に提供される方法により精製された調製物中のＳＧＭの対応する測定量を表す。この方法論は、スポロゾイトの９９．９％以上の実質的精製をもたらす。
【０１０６】
ｎｇ  ＳＧＭ／２５，０００スポロゾイトにつき提供される、実験的測定に起因する値は、記載の現行アッセイからの結果に基づき、絶対ではなく、他のアッセイまたは分析の方法が用いられた場合にはいくらか異なりうることが認められる。
【０１０７】
【表２】
0005738199.tif 000003
（実施例２）
キャンペーン３におけるスポロゾイトの精製
本開示のサイズ排除濾過を用いて、粉砕された唾液腺調製物からスポロゾイトを精製した。スポロゾイトは、精製プロセスの間中、精製溶媒中に維持した。精製の終わりに、目視（鏡検）、バイオ負荷テスト（ＵＳＰ＜６１＞）、ミコプラズマおよびスピロプラズマのテスト、ウイルス汚染物質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ決定；ならびにＳＧＭ−ＥＬＩＳＡアッセイのためにサンプルを除去した。
【０１０８】
Ａ−スポロゾイトの精製
精製のための材料の調製：２７２〜３５６匹の間の蚊からの粉砕された解剖産物を、全てまとめて管に受け取った。解剖産物のサンプル（５μｌ）を除去し、プール後目視のために２２ｏＣで取り置いた（図１ａ）。そして、残りの解剖産物を、精製溶媒で１０ｍｌに希釈した。この時点でサンプル（合計１００μｌ）を計数（２０μｌ）およびＳＧＭアッセイ（６０μｌ）のため除去した。すべての溶液およびサンプルを、精製の間約２２℃に保った。
【０１０９】
精製手順：約４ｍｌ／分（約１４０Ｌ／時／ｍ２）の流速で蠕動ポンプを用いて、希釈解剖産物を、直列に接続された三つのフィルタ（フィルタ＃１、フィルタ＃２およびフィルタ＃３）を横断してポンプ輸送し、フィルタ＃４で全量濾過により捕捉した。デプスフィルタであるフィルタ＃１は、１０ミクロンの孔径を有した（Ｐｏｌｙｇａｒｄ（登録商標）−ＣＮ  Ｏｐｔｉｓｃａｌｅ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＮ１ＨＡ４７ＨＨ３）。デプスフィルタであるフィルタ＃２の孔径は、０．６ミクロンであった（Ｐｏｌｙｇａｒｄ（登録商標）−ＣＮ  Ｏｐｔｉｓｃａｌｅ  ｆｉｌｔｅｒ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＮ０６Ａ４７ＨＨ３）。フィルタ＃３は、１．２ミクロンの孔径を有した（Ｉｓｏｐｏｒｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ，直径４７ｍｍ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＲＴＴＰ０４７００）、Ｓｗｉｎ−Ｌｏｃフィルタホルダに保持された（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．４２０４００）。濾過された材料は、直径９０ｍｍおよび０．４μｍの孔径のＩｓｏｐｏｒｅメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＴＴＰ０９０３０）が取り付けられた、フィルタ＃４で撹拌限外濾過セル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ｍｏｄｅｌ  ８２００）に捕捉された。試行（ｒｕｎ）＃１のための合計１００ｍｌの精製溶媒および試行＃２〜５のための合計１２０ｍｌを、希釈解剖産物と共にメンブレンを横断してポンプ輸送した。この後、もう１００ｍｌの精製溶媒をフィルタ＃４に適用した。残余分体積が約５〜１０ｍｌに達したら、合計３５ｍｌの精製溶媒を使用した洗浄により収集し、無菌３５ｍｌオークリッジ遠心管へ移した。さらに３５ｍｌの洗浄を同じように収集し、これも第二無菌３５ｍｌオークリッジ遠心管へ移した。この３５ｍｌオークリッジ管を１６，３４０ｇで５分間遠心分離し、計数のために再懸濁し、約２２℃で保った。
【０１１０】
計数後に、材料を約１５〜１８×１０６スポロゾイト／ｍｌの濃度に再懸濁した。１５０μｌをＳＧＭの評価のために除去し、ＳＧＭ−ＥＬＩＳＡアッセイを行う前に−７０℃で冷凍保存した。２０μｌを精製ＰｆＳＰＺ調製物から除去し、顕微鏡スライドに適用した（図１ｂ）。少なくとも５分間、３０分間までスポロゾイトを沈殿させ、２００×倍率でスポロゾイトを見た。同様の手順を、精製前サンプルにつき実施した（図１ａおよび１ｂ）。キャンペーンの各試行の具体的データが表３に示され、精製前および精製後サンプルの顕微鏡分析（顕微鏡写真）が図１ａおよび１ｂに示される。
【０１１１】
キャンペーン３では、試行あたり２７２〜３５６匹の蚊を用いた七試行で（合計２１４６匹の蚊）、試行あたりの精製スポロゾイトの収率が４０％〜７５％（平均５７％）であり、インプロセスおよび放出アッセイのための全てのサンプルの除去前に合計６１．３×１０６精製スポロゾイトが得られる。ＳＧＭアッセイ（実施例１−表２−キャンペーン３）は、精製スポロゾイトが０．２３ｎｇ  ＳＧＭ／２５，０００スポロゾイトを含むことを示した。プールされた精製前材料のＳＧＭ含量は、８３６．６４ｎｇ／２５，０００スポロゾイトを含んだ。この実施例では、精製プロセスにおいて全体として３，６３７倍のスポロゾイトの精製があった。修正されたＵＳＰ＜６１＞バイオ負荷アッセイは、コロニー形成単位がないこと、換言すれば微生物汚染がないことを示した。
【０１１２】
【表３】
0005738199.tif 000004
（実施例３）
キャンペーン６におけるスポロゾイトの精製
上記の実施例２に記載のようにサイズ排除濾過を用いて、粉砕唾液腺調製物からスポロゾイトを精製した。スポロゾイトは、精製プロセスの間中、精製溶媒中に維持した。目視（鏡検）、微生物学的テスト、およびＳＧＭ−ＥＬＩＳＡアッセイによるサンプル中のＳＧＭの量の定量のためにサンプルを除去した。実施例２のようにサンプルを調製し精製した。
【０１１３】
キャンペーン６においては、試行あたり３４３〜３９５匹の間の蚊を用いた八試行で（合計２９９７匹の蚊）、試行あたりの精製スポロゾイトの収率が５１％〜８７．５％の範囲（平均７２．３％）であり、インプロセスおよび放出アッセイのための全てのサンプルの除去前に合計１６０．５×１０６精製スポロゾイトが得られる（表４）。ＳＧＭ−ＥＬＩＳＡアッセイ（実施例１−表２−キャンペーン６）は、精製スポロゾイトが０．６５ｎｇ  ＳＧＭ／２５，０００スポロゾイトを含むことを示した。プールされた精製前材料のＳＧＭ含量は、７８０．６６ｎｇ／２５，０００スポロゾイトを含んだ。この実施例では、精製プロセスにおいて全体として１，２０１倍のスポロゾイトの精製があった。修正されたＵＳＰ＜６１＞バイオ負荷アッセイは、コロニー形成単位がないこと、換言すれば微生物汚染がないことを示した。精製前および精製後サンプルの顕微鏡分析（顕微鏡写真）が、図２に示される。
【０１１４】
【表４】
0005738199.tif 000005
（実施例４）
キャンペーン５、６および７からの放射線照射（１５０ＧＹ）Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトによるヒト肝細胞系統（ＨＣ−０４［１Ｆ９］）のインフェクション。
【０１１５】
方法。ＰｆＳＰＺをＨＣ−０４（１Ｆ９）細胞とともに３日間インキュベートしてから、ＰｆＬＳＡ−１の発現を評価した。
【０１１６】
【表５】
0005738199.tif 000006
結果および解釈。肝臓ステージ寄生虫において発現されるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ肝臓ステージ抗原−１（ＰｆＬＳＡ−１）の検出は、弱毒化および精製スポロゾイトの効力を示すものである。表５に示すように、スポロゾイトが１５０Ｇｙに曝露された後に、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ肝臓ステージ寄生虫によりＰｆＬＳＡ−１が発現される。
【０１１７】
（実施例５）
放射線照射（１００、１２０、１４２．５、１５０Ｇｙ）または放射線非照射Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトによるヒト幹細胞系統（ＨＣ−０４［１Ｆ９］）のインフェクション。
【０１１８】
方法。スポロゾイトを、ＨＣ−０４（１Ｆ９）細胞において３日間インキュベートしてから、ＰｆＬＳＡ−１の発現を評価した。
【０１１９】
【表６】
0005738199.tif 000007
結果および解釈。表示のように（表６）様々な線量に曝露された２５，０００ＰｆＳＰＺを、ＨＣ−０４（１Ｆ９）細胞を含む８ウェルＬａｂ−Ｔｅｋスライドの各ウェルに加えた。スライドを３日間インキュベートし、ＰｆＬＳＡ−１を発現する寄生虫につき評価した。表６に示すように、放射線非照射Ｐｆスポロゾイトと比較して、１５０Ｇｙに曝露されたＰｆスポロゾイトは、このアッセイにおいて放射線非照射Ｐｆスポロゾイトの活性の９１％を有した。この差は、２テールスチューデントｔ検定（ｐ＝０．２１）において統計的に有意なレベルに達しなかった。
【０１２０】
本発明の他の実施形態は、本明細書において開示される本発明の明細書および実施を考慮することにより当業者に明らかとなる。明細書および実施例は、例示としてのみ考えられることが意図される。さらに、以上において本発明が適切な実施形態に関して記載されているが、これらの実施形態は本発明を理解することだけを目的とする。本発明の真の範囲および精神を提供する請求項から本発明が逸脱しない限り、様々な変更または修正が可能である。
【図１ａ】
0005738199.tif 000008
【図１ｂ】
0005738199.tif 000009
【図２ａ】
0005738199.tif 000010
【図２ｂ】
0005738199.tif 000011
【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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