(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノクローナル抗体とｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）との結合について競合するＴＬＲ３と反応性の単離された抗体又はそのフラグメントであって、
ａ）配列番号２１６の重鎖可変領域及び配列番号４１の軽鎖可変領域を含むか、又は
ｂ）配列番号８２、８６及び８４にそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１、２及び３のアミノ酸配列、並びに配列番号７９、８０及び８７にそれぞれ示される軽鎖ＣＤＲ１、２及び３のアミノ酸配列を含む、抗体又はそのフラグメント。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体又はそのフラグメントであって、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方を含み、かつ、ａ）配列番号２１６の重鎖可変領域、又はｂ）配列番号４１の軽鎖可変領域、又はｃ）配列番号２１６の重鎖可変領域と配列番号４１の軽鎖可変領域、又はｄ）配列番号２２０の重鎖、又はｅ）配列番号１５６の軽鎖、又はｆ）配列番号２２０の重鎖と配列番号１５６の軽鎖を含んでなる、抗体又はそのフラグメント。
【請求項３】
重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方を含むＴＬＲ３と反応性の単離されたモノクローナル抗体又はそのフラグメントであって、
ａ）配列番号８２、１９６及び８４にそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、２及び３のアミノ酸配列であって、配列番号１９６のＨＣＤＲ２が式（Ｖ）
Ｘａａ24-Ｉ-Ｄ-Ｐ-Ｓ-Ｄ-Ｓ-Ｙ-Ｔ-Ｎ-Ｙ-Ｘａａ25-Ｐ-Ｓ-Ｆ-Ｑ-Ｇ
（Ｖ）
式中、
Ｘａａ24はＰｈｅ又はＡｒｇであることができ、
Ｘａａ25はＡｌａ又はＳｅｒであることができる
で示されるとおりにさらに定義される、アミノ酸配列、並びに
ｂ）配列番号７９、８０及び１９５にそれぞれ示される軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、２及び３のアミノ酸配列であって、配列番号１９５のＬＣＤＲ３が式（ＶＩ）
Ｑ-Ｑ-Ｘａａ18-Ｘａａ19-Ｘａａ20-Ｘａａ21-Ｘａａ22-Ｘａａ23-Ｔ
（ＶＩ）
式中、
Ｘａａ18はＴｙｒ、Ｇｌｙ又はＡｌａであることができ、
Ｘａａ19はＧｌｙ、Ｇｌｕ又はＡｓｎであることができ、
Ｘａａ20はＳｅｒ又はＴｈｒであることができ、
Ｘａａ21はＶａｌ、Ｉｌｅ又はＬｅｕであることができ、
Ｘａａ22はＳｅｒ又はＬｅｕであることができ、かつ
Ｘａａ23はＩｌｅ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ又はＴｙｒであることができる、
で示されるとおりにさらに定義される、アミノ酸配列
を含んでなる、抗体又はそのフラグメント。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の単離された抗体又はそのフラグメントであって、完全にヒトであるか、又はヒトに適合化されている抗体又はそのフラグメント。
【請求項５】
請求項４に記載の単離された抗体又はそのフラグメントであって、ポリエチレングリコールに結合している抗体又はそのフラグメント。
【請求項６】
請求項５に記載の単離された抗体又はそのフラグメントであって、ＩｇＧ４イソタイプをもつ、抗体又はそのフラグメント。
【請求項７】
請求項６に記載の単離された抗体又はそのフラグメントであって、ＦｃドメインがＳ２２９Ｐ、Ｐ２３５Ａ又はＬ２３６Ａ変異を含む、抗体又はそのフラグメント。
【請求項８】
請求項２に記載の単離された抗体又はそのフラグメントと製薬上許容され得る担体を含む、製薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）抗体アンタゴニスト、ＴＬＲ３抗体アンタゴニスト又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド、並びに上記の製造及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、細菌、ウイルス、寄生虫、及び場合によりホスト由来のリガンドに応答してシグナル伝達カスケードを開始させることにより、自然免疫反応の活性化を調節し、獲得免疫の発現に影響を及ぼす（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５６３：９４５〜９５５、２００５）。細胞膜に局在するＴＬＲであるＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＴＬＲ６は、細菌及び真菌のタンパク質又は脂質成分を含むリガンドを認識する。主として細胞内に存在するＴＬＲであるＴＬＲ３、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９は、それぞれ２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ及び非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡに対して応答する。ＴＬＲシグナル伝達の異常調節は、多数の問題を引き起こすと考えられ、異常調節に対する治療戦略が開発されている（Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．４：８７９〜８８０，２００５；Ｒｅｚａｅｉ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．６：８６３〜８６９，２００６；Ｗｉｃｋｅｌｇｒｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１２：１８４〜１８７，２００６）。例えば、重度の敗血症及びループスに対して、それぞれＴＬＲ４、並びにＴＬＲ７及び９のアンタゴニストが臨床開発中である（Ｋａｎｚｌｅｒら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３：５５２〜５５９、２００７）。
【０００３】
ＴＬＲ３シグナル伝達は、炎症又はウイルス感染時に壊死細胞から放出される二本鎖ＲＮＡ、ｍＲＮＡ又はＲＮＡによって活性化される。ＴＬＲ３の活性化によってインターフェロン及び炎症性サイトカインの分泌が誘導され、特定の微生物感染において保護作用のある免疫細胞の活性化及び動員が誘導される。例えば、ドミナントネガティブなＴＬＲ３対立遺伝子では、小児期におけるＨＳＶ−１による一次感染時に単純ヘルペス脳炎を発症しやすくなることが示されている（Ｚｈｅｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７：１５２２〜１５２７，２００７）。マウスではＴＬＲ３の欠損は、コクサッキーウイルスによるチャレンジ試験における生存率の低下との関連が示されている（Ｒｉｃｈｅｒら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ４：ｅ４１２７、２００９）。しかしながら、ＴＬＲ３シグナル伝達の非制御又は異常調節は、西ナイルウイルス、フレボウイルス、ワクチニア、及びインフルエンザＡを含む特定のウイルス感染症モデルにおける罹患率及び死亡率の一因となることが示されてきた（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：１３６６〜１３７３、２００４；Ｇｏｗｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：６３０１〜６３０７、２００６；Ｈｕｔｃｈｅｎｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０：４８３〜４９１、２００８；ＬｅＧｏｆｆｉｃら、ＰｌｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．２：Ｅ５３、２００６）。
【０００４】
ヒト及びマウスＴＬＲ３の細胞外ドメインの結晶構造が決定された（Ｂｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、１０２：１０９７６〜８０、２００５；Ｃｈｏｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：５８１〜５８５、２００５；Ｌｉｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２０：３７９〜３８１，２００８）。ＴＬＲ３は、グリカンにより修飾されたソレノイド馬蹄様の全体形状をとり、ロイシンに富んだ繰り返し（ＬＲＲ）モチーフのタンデム単位を２３個有する。二本鎖ＲＮＡ結合部位が、２つの別の領域にマッピングされている（Ｌｉｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２０：３７９〜８１、２００８）。シグナル伝達集合体は、１つの二本鎖ＲＮＡ及び２つのＴＬＲ３細胞外ドメインからなると提案された。（Ｌｅｏｎａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０５：２５８〜２６３、２００８）。
【０００５】
ＴＬＲ３は、例えば、敗血性ショック（Ｃａｖａｓｓａｎｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０５：２６０９〜２６２１、２００８）、急性肺損傷（Ｍｕｒｒａｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．ＣａｒｅＭｅｄ．１７８：１２２７〜１２３７、２００８）、関節リウマチ（Ｋｉｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２４：９〜１７、２００９；Ｂｒｅｎｔａｎｏら、Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ．５２：２６５６〜２６６５、２００５）、喘息（Ｓｕｇｉｕｒａら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：６５４〜６６２、２００９；Ｍｏｒｉｓｈｉｍａら、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：１６３〜１７４、２００８；Ｓｔｏｗｅｌｌら、Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．１０：４３、２００９）、クローン病及び潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患（Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８：４５４８〜４５５６、２００７；Ｚｈｏｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０４：７５１２〜７５１５、２００７）、自己免疫性肝臓疾患（Ｌａｎｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６：２４５６〜２４６３、２００６）及びＩ型糖尿病（Ｄｏｇｕｓａｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５７：１２３６〜１２４５、２００８；Ｌｉｅｎ及びＺｉｐｒｉｓ、Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．９：５２〜６８、２００９）を含む、多種多様の炎症性の免疫介在性及び自己免疫性の疾患における発病機構を促進することが示された。更に、ＴＬＲ３発現の器官特異的な増加は、原発性胆汁性肝硬変における肝臓組織（Ｔａｋｉｉら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．８５：９０８〜９２０、２００５）、関節リウマチにおける関節（Ｏｓｐｅｌｔら、ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ．５８：３６８４〜３６９２、２００８）、及びアレルギー性鼻炎患者における鼻粘膜（Ｆｒａｎｓｓｏｎら、Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．６：１００、２００５）などの、局部炎症性応答が異常調節されたことにより促進される多数の発病状態と相関することが示されてきた。
【０００６】
壊死状態では、内因性のｍＲＮＡを含む細胞内容物が放出されることによってサイトカイン及びケモカインの分泌、及び他の、局所炎症を誘導し、死細胞の残留物の除去を促進し、損傷を修復する因子の分泌が誘導される。壊死はしばしば炎症プロセスを継続させ、慢性炎症又は炎症悪化の一因となる（Ｂｅｒｇｓｂａｋｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ７：９９〜１０９、２００９）。ＴＬＲ３の活性化は、壊死部位においてこれらの異常な炎症プロセスに寄与し、放出されたＴＬＲ３リガンドを介して更に炎症促進性の生のフィードバックループを生じる場合がある。したがって、ＴＬＲ３に対する拮抗作用は、慢性炎症若しくは炎症悪化及び／又は壊死を含むさまざまな疾患において有用であり得る。
【０００７】
ＴＬＲ３活性の下方制御は、腎臓細胞癌、並びに頭部及び頸部扁平上皮細胞癌が含まれる腫瘍学的な兆候に対する、新規の治療法にもなり得る（Ｍｏｒｉｋａｗａら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：５７０３〜５７０９、２００７；Ｐｒｉｅｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２１：２０９〜１５、２００８）。更には、タンパク質を低活性でコードするＴＬＲ３L423F対立遺伝子は、進行性の年齢関連の「乾燥」黄斑変性症（Ｙａｎｇら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５９：１４５６〜１４６３、２００８）に対する防御と関連づけられ、この疾病においてＴＬＲ３アンタゴニストが有益であり得ることを示した。
【０００８】
炎症状態にともなう病理、及び他の例えば感染症にともなう病理が、健康及び経済に及ぼす影響は多大なものである。しかしながら、多くの医学領域における進歩にも拘らず、これらの状態の多くに対する療上の選択肢及び治療法は比較的少ない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、ＴＬＲ３に関連する状態を治療するためにＴＬＲ３活性を抑制することが求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一つの態様は単離された抗体又はそのフラグメントであって、抗体がｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）の、配列番号２のアミノ酸残基；Ｋ４１６、Ｋ４１８、Ｌ４４０、Ｎ４４１、Ｅ４４２、Ｙ４６５、Ｎ４６６、Ｋ４６７、Ｙ４６８、Ｒ４８８、Ｒ４８９、Ａ４９１、Ｋ４９３、Ｎ５１５、Ｎ５１６、Ｎ５１７、Ｈ５３９、Ｎ５４１、Ｓ５７１、Ｌ５９５、及びＫ６１９に結合することを特徴とする。
【００１１】
本発明の別の態様は、単離された抗体又はそのフラグメントであって、抗体がｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）の、配列番号２のアミノ酸残基；Ｓ１１５、Ｄ１１６、Ｋ１１７、Ａ１２０、Ｋ１３９、Ｎ１４０、Ｎ１４１、Ｖ１４４、Ｋ１４５、Ｔ１６６、Ｑ１６７、Ｖ１６８、Ｓ１８８、Ｅ１８９、Ｄ１９２、Ａ１９５、及びＡ２１９に結合することを特徴とする。
【００１２】
本発明の別の態様は、単離された抗体又はそのフラグメントであって、抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域又はそのフラグメントを有し、重鎖可変領域のＣｈｏｔｈｉａ残基；Ｗ３３、Ｆ５０、Ｄ５２、Ｄ５４、Ｙ５６、Ｎ５８、Ｐ６１、Ｅ９５、Ｙ９７、Ｙ１００及びＤ１００ｂ、並びに軽鎖可変領域のＣｈｏｔｈｉａ残基；Ｑ２７、Ｙ３２、Ｎ９２、Ｔ９３、Ｌ９４及びＳ９５により、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＴＬＲ３に結合することを特徴とする。
【００１３】
本発明の別の態様は、単離された抗体又はそのフラグメントであって、抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域又はそれらのフラグメントを有し、重鎖可変領域のＣｈｏｔｈｉａ残基；Ｎ３１ａ、Ｑ５２、Ｒ５２ｂ、Ｓ５３、Ｋ５４、Ｙ５６、Ｙ９７、Ｐ９８、Ｆ９９及びＹ１００、並びに軽鎖可変領域のＣｈｏｔｈｉａ残基；Ｇ２９、Ｓ３０、Ｙ３１、Ｙ３２、Ｅ５０、Ｄ５１、Ｙ９１、Ｄ９２及びＤ９３により、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＴＬＲ３に結合することを特徴とする。
【００１４】
本発明の別の態様は、ＴＬＲ３反応性を有し、以下のａ〜ｉの特性のうち少なくとも１つを有する、単離された抗体である；
ａ．Ｋｄ＜１０ｎＭでヒトＴＬＲ３に結合する；
ｂ．インビトロでのポリ（Ｉ：Ｃ）ＮＦ−κＢレポーター遺伝子アッセイにおいて、１μｇ／ｍＬで、ヒトＴＬＲ３の生物活性を５０％超低減させる；
ｃ．１０μｇ／ｍＬで、１００ｎｇ／ｍＬ未満のポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激されたＢＥＡＳ−２Ｂ細胞からのＩＬ−６又はＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０の産生を６０％超阻害する；
ｄ．０．４μｇ／ｍＬで、１００ｎｇ／ｍＬ未満のポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激されたＢＥＡＳ−２Ｂ細胞からのＩＬ−６又はＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０の産生を５０％超阻害する；
ｅ．５μｇ／ｍＬで、６２．５ｎｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激されたＮＨＢＥ細胞からのＩＬ−６の産生を５０％超阻害する；
ｆ．１μｇ／ｍＬで、６２．５ｎｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激されたＮＨＢＥ細胞からのＩＬ−６の産生を５０％超阻害する；
ｇ．１μｇ／ｍＬで、ＰＢＭＣ細胞による、ポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導されたＩＦＮ−γ、ＩＬ−６又はＩＬ−１２の産生を２０％超阻害する；
ｈ．インビトロでのＮＦ−ｋＢレポーター遺伝子アッセイにおいて、ＩＣ５０＜１０μｇ／ｍＬで、カニクイザルのＴＬＲ３の生物活性を阻害する；
ｉ．インビトロでのＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイにおいて、ＩＣ５０＜５μｇ／ｍＬで、カニクイザルのＴＬＲ３の生物活性を阻害する。
【００１５】
本発明の別の態様は、特定の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３のアミノ酸配列、特定の軽鎖ＣＤＲ１、２及び３のアミノ酸配列、特定の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列、又は特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体とＴＬＲ３との結合について競合する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体である。
【００１６】
本発明の別の態様は、重鎖及び軽鎖可変領域を有し、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体であって、前記抗体は特定の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３、並びに特定の軽鎖ＣＤＲ  １、２及び３のアミノ酸配列を有する。
【００１７】
本発明の別の態様は、重鎖及び軽鎖可変領域を有する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体であって、前記抗体は特定の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列、及び特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を有する。
【００１８】
本発明の別の態様は、重鎖及び軽鎖可変領域を有する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体であって、前記抗体は特定の重鎖のアミノ酸配列、及び特定の軽鎖のアミノ酸配列を有する。
【００１９】
本発明の別の態様は、単離された抗体重鎖であって、前記抗体重鎖は配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１５９、１９８、２００、２０２、１６４、２１２、２１３、２１４、２１５又は２１６に示されるアミノ酸配列を有する。
【００２０】
本発明の別の態様は、単離された抗体軽鎖であって、前記抗体軽鎖は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、１２２、１２３、１９７、１９９、２０１、１６３、２０９、２１０、２１１又は２２５に示されるアミノ酸配列を有する。
【００２１】
本発明の別の態様は、単離された抗体重鎖であって、前記抗体重鎖は配列番号１０２、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１６０、２０４、２０６、２０８、２２０、１６６又は１６８に示されるアミノ酸配列を有する。
【００２２】
本発明の別の態様は、単離された抗体軽鎖であって、前記抗体軽鎖は配列番号１５５、１５６、１５７、１５８、２０３、２０５、２０７、１６５、１６７又は２２７に示されるアミノ酸配列を有する。
【００２３】
本発明の別の態様は抗体重鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記抗体重鎖は配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１５９、１９８、２００、２０２、１６４、２１２、２１３、２１４、２１５又は２１６に示されるアミノ酸配列を有する。
【００２４】
本発明の別の態様は、抗体軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記抗体軽鎖は配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、１２２、１２３、１９７、１９９、２０１、１６３、２０９、２１０、２１１又は２２５に示されるアミノ酸配列を有する。
【００２５】
本発明の別の態様は、抗体重鎖をコードする単離されたポリペプチドであって、前記抗体重鎖は配列番号１０２、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１６０、２０４、２０６、２０８、２２０、１６６又は１６８に示されるアミノ酸配列を有する。
【００２６】
本発明の別の態様は、単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、配列番号１５５、１５６、１５７、１５８、２０３、２０５、２０７、１６５、１６７又は２２７に示されるアミノ酸配列を有する抗体軽鎖をコードする。
【００２７】
本発明の別の態様は、本発明の単離された抗体及び製薬上許容され得る担体を含む製薬学的組成物である。
【００２８】
本発明の別の態様は、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。
【００２９】
本発明の別の態様は、本発明のベクターを有するホスト細胞である。
【００３０】
本発明の別の態様は、本発明のホスト細胞を培養することと、前記ホスト細胞によって産生された抗体を回収することとを含む、ＴＬＲ３反応性を有する抗体の製造方法である。
【００３１】
本発明の別の態様は、治療上の有効量の本発明の単離された抗体を、炎症性疾患の治療又は予防を必要とする患者に、炎症性疾患を治療又は予防するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、炎症性疾患の治療又は予防方法である。
【００３２】
本発明の別の態様は、治療上の有効量の本発明の単離された抗体を、それらを必要とする患者に、全身性の炎症状態を処置又は予防するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、全身性炎症性疾患の処置又は予防方法である。
【００３３】
本発明の別の態様は、治療上の有効量の本発明の単離された抗体を、それらを必要とする患者に、ＩＩ型糖尿病を処置するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、ＩＩ型糖尿病の処置方法である。
【００３４】
本発明の別の態様は、治療上の有効量の本発明の単離された抗体を、それらを必要とする患者に、高血糖を処置するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、高血糖の処置方法である。
【００３５】
本発明の別の態様は、治療上の有効量の本発明の単離された抗体を、それらを必要とする患者に、インスリン抵抗性を処置するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、高インスリン血症の治療方法である。
【００３６】
本発明の別の態様は、治療上の有効量の本発明の単離された抗体を、それらを必要とする患者に、ウイルス感染を処置又は予防するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、ウイルス感染の処置又は予防方法である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＮＦ−κＢレポーター遺伝子アッセイにおける抗ヒトＴＬＲ３（ｈｕＴＬＲ３）ｍＡｂの作用を示す図。
【図２Ａ】ＢＥＡＳ−２Ｂアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ３  ｍＡｂの作用（阻害率（％））を示す図。
【図２Ｂ】ＢＥＡＳ−２Ｂアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ３  ｍＡｂの作用（阻害率（％））を示す図。
【図３Ａ】ＮＨＢＥアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ３  ｍＡｂの作用を示す図。
【図３Ｂ】ＮＨＢＥアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ３  ｍＡｂの作用を示す図。
【図４】ＰＢＭＣアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ３  ｍＡｂの作用を示す図。
【図５Ａ】ＨＡＳＭアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ３  ｍＡｂの作用を示す図。
【図５Ｂ】ＨＡＳＭアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ３  ｍＡｂの作用を示す図。
【図６Ａ】ＴＬＲ３変異体に対する抗ｈｕＴＬＲ３  ｍＡｂの結合を示す図。
【図６Ｂ】ＴＬＲ３変異体に対する抗ｈｕＴＬＲ３  ｍＡｂの結合を示す図。
【図６Ｃ】ＴＬＲ３変異体に対する抗ｈｕＴＬＲ３  ｍＡｂの結合を示す図。
【図７Ａ】ヒトＴＬＲ３  ＥＣＤ上の、ｍＡｂ  １５ＥＶＱ（黒）及びＣ１０６８  ｍＡｂ（灰色）のエピトープ（上の画像）、並びにｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶ（黒、下の画像）のエピトープを示す図。
【図７Ｂ】ｍＡｂ  １５ＥＶＱと複合体を形成させたＴＬＲ３  ＥＣＤタンパク質の局所的Ｈ／Ｄ交換撹乱マップを示す図。
【図８Ａ】Ａ）ＮＦ−κＢレポーター遺伝子アッセイ及びＢ）ＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイにおけるラット／マウスの抗マウスＴＬＲ３  ｍＡｂ  ｍＡｂ  ５４２９（代替抗体）の作用を示す図。
【図８Ｂ】Ａ）ＮＦ−κＢレポーター遺伝子アッセイ及びＢ）ＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイにおけるラット／マウスの抗マウスＴＬＲ３  ｍＡｂ  ｍＡｂ  ５４２９（代替抗体）の作用を示す図。
【図９】ＭＥＦ  ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０アッセイにおける代替ｍＡｂ（ｍＡｂ  ５４２９、ｍＡｂ  ｃ１８１１）の作用を示す図。
【図１０】ＴＬＲ３に対する代替ｍＡｂの結合の特異性を示す図。上側のパネル：アイソタイプコントロール、下側のパネル：ｍＡｂｃ１８１１。
【図１１】ＡＨＲモデルにおけるｐｅｎＨレベルに対する代替ｍＡｂの効果を示す図。
【図１２】ＡＨＲモデルにおけるＢＡＬ液中の全好中球数に対する代替ｍＡｂの効果を示す図。
【図１３】ＡＨＲモデルにおけるＢＡＬ液中のＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０レベルに対する代替ｍＡｂの効果を示す図。
【図１４】ＤＳＳモデルにおける組織病理学のスコアに対する代替ｍＡｂの効果を示す図。
【図１５】Ｔ細胞移植モデルにおける、Ａ）組織病理学のスコア、及びＢ）好中球流入に対する代替ｍＡｂの効果、を示す図。
【図１６】ＣＩＡモデルにおける臨床スコアに対する代替ｍＡｂの効果を示す図。
【図１７】ＣＩＡモデルにおける臨床ＡＵＣスコアに対する代替ｍＡｂの効果を示す図。
【図１８】インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４の経鼻投与の後のＣ５７ＢＬ／６マウスの生存率に及ぼす代替ｍＡｂの効果を示す図。ｍＡｂの投与は１日目に始まった。
【図１９】インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４の投与後の臨床スコアに対する代替ｍＡｂの効果を示す図。ｍＡｂの投与は１日目に始まった。
【図２０】インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４の投与後に代替ｍＡｂを投与した後の１４日にわたる体重変化に及ぼす代替ｍＡｂの効果を示す図。ｍＡｂの投与は１日目に始まった。
【図２１】グルコースチャレンジ後の（Ａ）野生型ＤＩＯ及び（Ｂ）ＴＬＲ３ノックアウトＤＩＯ動物における血中グルコース濃度に対する代替ｍＡｂの効果を示す図。
【図２２】野生型ＤＩＯ動物のインスリンレベルに対する代替ｍＡｂの効果を示す図。
【図２３】ＮＨＢＥ細胞における、（Ａ）ＮＴＨｉ、及び（Ｂ）ライノウイルス誘導ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０及びＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳレベルに対するｍＡｂ  １５ＥＶＱの効果を示す図。
【図２４】ＨＵＶＥＣ細胞における、（Ａ）ｓＩＣＡＭ−１レベル及び（Ｂ）生存率に対する、ｍＡｂ  １５ＥＶＱの効果を示す図。
【図２５】インフルエンザＡの感染３日後に代替ｍＡｂを投与した後の動物の生存率を示す図。
【図２６】インフルエンザＡの感染３日後に代替ｍＡｂを投与した後の臨床スコアを示す図。
【図２７】インフルエンザＡの感染３日後に代替ｍＡｂを投与した後の動物の体重変化を示す図。
【図２８】ＡではｈｕＴＬＲ３  ＥＣＤとＦａｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶ、Ｆａｂ  １５ＥＶＱ及びＦａｂ  ｃ１０６８との四次構造の分子構造をリボン及び表面表示で示す図。ＴＬＲ３  ＥＣＤの、Ｎで標識したＮ末端を薄い灰色で示し、すべてのＦａｂ分子を暗い灰色のリボン表示で示す。Ｂ．エピトープを薄い灰色で着色し、ＡにおけるＦａｂについてのようにＴＬＲ３  ＥＣＤ上で標識した。図２８、２９及び３０では、判り易くするために、Ｆａｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶ、Ｆａｂ  ｃ１０６８及びＦａｂ  １５ＥＶＱの標識を、それぞれ、Ｆａｂ  １２、Ｆａｂ  １０６８及びＦａｂ  １５と略記する。
【図２９】Ｆａｂ  １５ＥＶＱによる中和機構を示す図。Ａ．２つのＴＬＲ３  ＥＣＤ（薄い灰色及び暗い灰色で示す図、並び標識されたＴＬＲ３図）の一方において、Ｆａｂ  １５ＥＶＱエピトープをハイライト（薄い灰色）した二本鎖ＲＮＡ：ＴＬＲ３シグナル伝達ユニット（ＳＵ）を示す。二本鎖ＲＮＡリガンドは薄い灰色の二重らせんとして示される。Ｂ．二本鎖ＲＮＡの結合を立体的に阻害することで、ＳＵの形成を阻害する、Ｆａｂ  １５ＥＶＱの結合が図示される。Ｆａｂ  １５ＥＶＱの結合は高親和性であり、ＳＵの形成を阻害するか、又はすでに形成されているＳＵを分解する。
【図３０】Ｆａｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びＦａｂ  ｃ１０６８及びＴＬＲ３シグナル伝達ユニット（ＳＵ）のクラスター形成の機構を示す図。Ａ．Ｆａｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びＦａｂ  ｃ１０６８は、単一ＳＵを結合（又は共結合）することができる。Ｂ．約７６塩基対の二本鎖ＲＮＡ上の２つのＳＵの最近接クラスター形成のモデルである。判り易くするために３つのエピトープが異なる分子中でハイライトされている。Ｃ．Ｆａｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びＦａｂ  ｃ１０６８の結合は、抗体と、隣接するＳＵとの間の立体的な衝突によりＳＵのクラスター形成を防止する。２つの左を指す矢印は、抗体によるＳＵの分離の異なる度合いを定性的に表す（底部の矢印はＦａｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶに対するものであり、及び頂部の矢印はＦａｂ  ｃ１０６８に対するものである）。
【図３１】代表的な抗体に対する、配列番号と、Ｋａｂａｔによる番号付けと、Ｃｈｏｔｈｉａによる番号付けの対応を示す図。ＣＤＲ及びＨＶを灰色でハイライトしてある。
【図３２】ｍＡｂ  １５ＥＶＱのＶＬと、ヒトＶｋ１フレームワークとのアライメント結果を示す図。Ｃｈｏｔｈｉａによるハイパー可変ループにアンダーラインし、パラトープ残基に二重アンダーラインし、及びフレームワークの差異を灰色でハイライトしてある。特記しない限り、Ｖκ１遺伝子は*０１対立遺伝子である。残基番号付けは連続的に行っている。
【図３３】ｍＡｂ  １５ＥＶＱのＶＨと、ヒトＶｈ５フレームワークとのアライメント結果を示す図。配列の特徴は図３２のように示される。
【図３４】ｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶのＶＬと、ヒトＶｋ３フレームワークとのアライメント結果を示す図。配列の特徴は図３２のように示される。
【図３５】ｍＡｂ  １５ＥＶＱ又はｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶのＶＬ及びＶＨと、ヒトＪκ、Ｊλ又はＪｈフレームワークとのアライメント結果を示す図。配列の特徴は図３２のように示される。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本明細書に引用する特許及び特許出願を含むがそれらに限定されないすべての刊行物は、あたかもその全体が記載されているのと同様に本願に参照によって組み入れるものである。
【００３９】
本明細書で用いる「アンタゴニスト」なる用語は、何らかの機構によって、受容体又は細胞内メディエーターなどの別の分子の作用を部分的又は完全に阻害する分子のことを意味する。
【００４０】
本明細書で用いるとき、「ＴＬＲ３抗体アンタゴニスト」又は「ＴＬＲ３反応性の」抗体とは、ＴＬＲ３の生物活性又はＴＬＲ３受容体の活性化を直接的又は間接的に実質上相殺、低減、又は阻害する能力を有する抗体のことを言う。例えば、ＴＬＲ３反応性を有する抗体は、ＴＬＲ３に直接結合してＴＬＲ３の活性を中和することによって、すなわちＴＬＲ３のシグナル伝達を遮断することによって、サイトカイン及びケモカインの放出、又はＮＦ−κＢの活性化を低減させることができる。
【００４１】
用語「抗体」は、本明細書において広義に用いられ、ポリクローナル抗体、マウス、ヒト、ヒト適合化、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、並びに抗体フラグメントを含む、免疫グロブリン又は抗体分子を含む。
【００４２】
一般に抗体とは、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質又はペプチド鎖である。完全な抗体とは、２個の同一の軽鎖と２個の同一の重鎖とからなるヘテロ４量体の糖タンパク質である。通常、それぞれの軽鎖は１個の共有ジスルフィド結合によって重鎖と結合しているが、ジスルフィド結合の数は、アイソタイプの異なる免疫グロブリン重鎖間で異なる。それぞれの重鎖及び軽鎖はまた、規則的な間隔をおいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。それぞれの重鎖は、一方の末端で可変ドメイン（可変領域）（ＶＨ）を有し、続いて多数の定常性のドメイン（定常領域）を有する。それぞれの軽鎖は一端に可変領域（ＶＬ）を有し、もう一方の端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の第１の定常領域と整列し、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と整列している。あらゆる脊椎動物種の抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づき、カッパー（κ）及びラムダ（λ）の２つの明確に異なるタイプの内のどちらかに分類することができる。
【００４３】
免疫グロブリンは、重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの大きなクラスに分類することができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、ＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4というアイソタイプに更に分類される。
【００４４】
用語、「抗体フラグメント」は完全な抗体の一部を意味し、通常は完全な抗体の抗原結合領域又は可変領域を意味する。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖフラグメント、二重特異性抗体、単鎖抗体分子、及び少なくとも２つの完全な抗体から形成された多特異的抗体が挙げられる。
【００４５】
免疫グロブリンの軽鎖可変領域又は重鎖可変領域は、３つの「抗原結合部位」を取り囲む「フレームワーク」領域からなる。抗原結合部位は、さまざまな用語を次のように使用して定義される：（ｉ）用語相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列可変性に基づく（Ｗｕ及びＫａｂａｔ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１〜２５０、１９７０）。一般に、抗原結合部位は、ＶＨ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）内に３つ及びＶＬ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ）内に３つの６つのＣＤＲを有している（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。（ｉｉ）用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」、又は「ＨＶ」は、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７，１９８７）により定義されているように、構造が超可変性である、抗体の可変ドメイン領域を指す。一般に抗原結合部位は、ＶＨ内に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ内に３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の６つの超可変領域を有している。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋは、構造的に保持されているＨＶを「カノニカル構造」と呼ぶ。（ｉｉｉ）Ｌｅｆｒａｎｃにより提案された「ＩＭＧＴ−ＣＤＲ」（Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５〜７７，２００３）は、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体からのＶドメインの比較に基づくものである。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、これらの領域について標準化された番号及び定義を提供している。各ＣＤＲ、ＨＶ、及びＩＭＧＴの表記間の対応についてはＬｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５〜７７，２００３に述べられている。（ｉｖ）抗原結合部位は特異性決定残基の使用（ＳＤＲＵ）（Ａｌｍａｇｒｏ，Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２〜１４３，２００４）に基づいて概略説明することができる。特異性決定残基（ＳＤＲ）は、抗原との接触に直接関与する免疫グロブリンのアミノ酸残基を指す。ＳＤＲＵは、抗原−抗体複合体についての結晶構造解析により定義される、異なるタイプの抗原に対するＳＤＲの数及び分布の精密な尺度である。（ｖ）抗原結合部位を、抗原抗体複合体の結晶構造から同定される抗体パラトープ残基とも定義することもできる。
【００４６】
用語「複合配列」は、本明細書で使用するとき、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＩＭＧＴによって個別に表記されるすべてのアミノ酸残基又は他の任意の好適な抗原結合領域の表記を含むものとして定義される抗原結合部位を意味する。
【００４７】
用語「Ｃｈｏｔｈｉａ残基」は、本明細書で使用するとき、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３，９２７〜４８，１９９７）に従って番号付けされた抗体ＶＬ残基及びＶＨ残基である。ポリペプチド番号付けに関連して２つの最も使用される番号付けシステム、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５th  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１）とＣｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜１７，１９８７）との間の対応を、本発明の代表的な抗体に対して図３１に示す。
【００４８】
「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」は、抗原結合部位として定義されていない、可変領域の残りの配列である。フレームワークは、通常、それぞれの可変領域中で、３つの抗原結合部位に対して骨格を形成する、４つの領域、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ３に分割される。抗原結合部位は上記に述べたようなさまざまな用語によって定義され得るため、フレームワークの正確なアミノ酸配列は抗原結合部位がどのように定義されるかによって決まる。
【００４９】
「軽鎖可変領域カッパー１（Ｖκ１）フレームワーク」又は「Ｖκ１」は、本発明で使用するとき、ヒトＶκ１機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされている、アミノ酸配列を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトＶκ１遺伝子は、ＩＧＫＶ１−５*０１、ＩＧＫＶ１−６*０１、ＩＧＫＶ１−８*０１、ＩＧＫＶ１−９*０１、ＩＧＫＶ１−１２*０１、ＩＧＫＶ１−１３*０２、ＩＧＫＶ１−１６*０１、ＩＧＫＶ１−１７*０１、ＩＧＫＶ１−２７*０１、ＩＧＫＶ１−３３*０１、ＩＧＫＶ１−３７*０１、ＩＧＫＶ１−３９*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−８*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−１２*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−１３*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−１６*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−１７*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−３３*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−３７*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−４２*０１、又はＩＧＫＶ１Ｄ−４３*０１である。免疫グロブリン遺伝子の命名法は周知されたものである。
【００５０】
「軽鎖可変領域ラムダ３（Ｖλ３）フレームワーク」又は」「Ｖλ３」は、本明細書で使用するとき、ヒトＶλ３機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされたアミノ酸配列を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトＶλ３遺伝子は、ＩＧＬＶ３−１*０１、ＩＧＬＶ３−９*０１、ＩＧＬＶ３−１０*０１、ＩＧＬＶ３−１２*０１、ＩＧＬＶ３−１６*０１、ＩＧＬＶ３−１９*０１、ＩＧＬＶ３−２１*０１、ＩＧＬＶ３−２２*０１、ＩＧＬＶ３−２５*０１、ＩＧＬＶ３−２７*０１、及びＩＧＬＶ３−３２*０１である。
【００５１】
「重鎖可変領域Ｖｈ５フレームワーク」又は「Ｖｈ５」は、本明細書で使用するとき、Ｖｈ５機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされたアミノ酸配列を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトＶｈ５遺伝子は、ＩＧＨＶ５−５１*０１及びＩＧＨＶ５−１*０１である。
【００５２】
「重鎖可変領域Ｖｈ６フレームワーク」又は「Ｖｈ６」は、本明細書で使用するとき、Ｖｈ６機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされたアミノ酸配列を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトＶｈ６遺伝子はＩＧＨＶ６−１*０１である。
【００５３】
「軽鎖カッパーＪ領域（Ｊκ）フレームワーク」又は「Ｊκ」は、本明細書で使用するとき、ヒトＪκ機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされたアミノ酸配列を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトＶκ遺伝子は、ＩＧＫＪ１、ＩＧＫＪ２、ＩＧＫＪ３、ＩＧＫＪ４、及びＩＧＫＪ５である。
【００５４】
「軽鎖ラムダＪ領域（Ｊλ）フレームワーク」又は「Ｊλ」は、本明細書で使用するとき、ヒトＪλ機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされたアミノ酸配列を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトＪλ遺伝子は、ＩＧＬＪ１、ＩＧＬＪ２、ＩＧＬＪ３、ＩＧＬＪ４、ＩＧＬＪ５、ＩＧＬＪ６、及びＩＧＬＪ７である。
【００５５】
「重鎖Ｊ領域（Ｊｈ）フレームワーク」又は「Ｊｈ」は、本明細書で使用するとき、ヒトＪｈ機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされたアミノ酸配列を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトＪｈ遺伝子は、ＩＧＨＪ１、ＩＧＨＪ２、ＩＧＨＪ３、ＩＧＨＪ４、ＩＧＨＪ５、及びＩＧＨＪ６である。
【００５６】
「生殖細胞系列遺伝子」又は「抗体生殖細胞系列遺伝子」は、本明細書で使用するとき、特定の免疫グロブリンの発現のための遺伝的再配列及び変異につながる成熟プロセスを経ていない非リンパ細胞によってコードされる免疫グロブリン配列である。
【００５７】
「スカフォールド」は、本明細書で使用するとき、ヒト生殖細胞系列遺伝子によってコードされる、軽鎖又は重鎖の可変領域のアミノ酸配列を指す。したがって、スカフォールドは、フレームワークと抗原結合部位の両方を包含する。
【００５８】
用語「抗原」は、本明細書で使用するとき、直接又は間接に抗体を生成する能力を有する任意の分子を意味する。「抗原」の定義内には、タンパク質コーディング核酸が含まれる。
【００５９】
用語「ホモログ」は、参照配列との配列同一性が４０％〜１００％であるタンパク質配列を意味する。ヒトＴＬＲ３のホモログには、既知のヒトＴＬＲ３配列との配列同一性が４０％〜１００％であるような他種由来のポリペプチドが含まれる。２つのペプチド鎖の配列の同一性（％）は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩバージョン９．０．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＡｌｉｇｎＸモジュールのデフォルト設定を使用して、配列をペアでアライメントすることによって決定することができる。「ＴＬＲ３」とはヒトＴＬＲ３（ｈｕＴＬＲ３）及びそのホモログの意味である。完全長ｈｕＴＬＲ３のヌクレオチド及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２で示す。ｈｕＴＬＲ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のヌクレオチド及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び配列番号４に示す。
【００６０】
「実質的に同一の」は、本明細書で使用するとき、比較される２つの抗体又は抗体フラグメントのアミノ酸配列が同一であるか、又は「実体のない差異」を有するということを意味する。抗体又は抗体フラグメントのアミノ酸配列における１、２、３、４、５又は６個のアミノ酸の置換が、実体のない差異として挙げられる。本明細書で開示する配列とほぼ同じアミノ酸配列も本願の一部である。特定の実施形態では、配列の同一性は、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い。同一性（％）は、上記に述べたようにして決定することができる。比較するペプチド鎖の例としては、重鎖又は軽鎖の可変領域がある。
【００６１】
用語「〜と組み合わせて」は、本明細書で使用するとき、記述の対象である薬剤が、他の薬剤と共に、混合物として一緒に、又は単独薬剤として同時に、又は単独薬剤として順次に任意の順序で、動物に投与され得ることを意味する。
【００６２】
用語「炎症性状態」は、本明細書で使用するとき、大部分の場合痛み、発赤、腫張、及び組織機能の喪失を特徴とし、サイトカイン、ケモカイン、又は炎症性細胞（例えば、好中球、単球、リンパ球、マクロファージ）により一部介在される、細胞損傷に対する局所化された応答を意味する。用語「炎症性の肺状態」は、本明細書で使用するとき、肺を冒す又は肺と関連する炎症状態を意味する。
【００６３】
「用語モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、本明細書で使用するとき、ほぼ均質な抗体の集団から得られる抗体（又は抗体フラグメント）を意味する。モノクローナル抗体は極めて特異性が高く、通常、単一の抗原決定基を標的とする。「モノクローナル」という修飾語は、抗体のほぼ均質な性質を指して言うものであり、抗体がいずれかの特定の方法によって作製される必要はない。例えば、マウスｍＡｂは、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７、１９７５のハイブリドーマ法によって製造することができる。ドナー抗体（通常はマウス）由来の軽鎖及び重鎖の可変領域を、アクセプター抗体（通常、例えばヒトなどの別の哺乳動物種）由来の軽鎖及び重鎖の定常領域とともに含むキメラｍＡｂを、米国特許第４，８１６，５６７号に開示される方法によって作製することができる。非ヒトドナー免疫グロブリン（通常はマウス）に由来するＣＤＲ、及び１以上のヒト免疫グロブリンに由来するＣＤＲ以外の部分を有する、ヒト適合化ｍＡｂを、米国特許第５，２２５，５３９号に開示されるような当業者には周知の方法によって作製することができる。ヒト適合化に有用なヒトフレームワーク配列は当業者であれば関連するデータベースから選択することができる。場合により、Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６：１００２９〜１００３２，１９８９及びＨｏｄｇｓｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：４２１，１９９１に開示されるような方法によって、結合親和性を維持するために変化させたフレームワーク支持残基を組み込むことによってヒト適合化ｍＡｂを更に改変することができる。
【００６４】
ヒト以外のいかなる配列も持たない完全なヒトｍＡｂは、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６〜８５９，１９９４、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５〜８５１，１９９６、及びＭｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１５：１４６〜１５６，１９９７に参照される方法により、ヒト免疫グロブリン形質転換マウスから作製することができる。同様に、ヒトｍＡｂは、ファージディスプレイライブラリを元に、例えば。Ｋｎａｐｐｉｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７〜８６  ２０００及びＫｒｅｂｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５４：６７〜８４  ２００１で参照されている方法により作製及び最適化することもできる。抗体のフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、及びｄＡｂフラグメントを、抗体の開裂又は遺伝子組み換え操作により生成してもよい。例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントを、抗体をペプシンなどの酵素により処理することにより、生成することもできる。
【００６５】
用語「エピトープ」は、本明細書で使用するとき、抗体が特異的に結合する抗原の部分を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸又は多糖類側鎖のような化学的に活性な（極性、非極性又は疎水性）部分の表面集団からなり、特定の３次元構造特性並びに特定の帯電特性を有し得る。エピトープは直線状のものであってもよく、あるいはアミノ酸の直線状の配列によってではなく、抗原の連続していないアミノ酸間の空間的な関係によって形成される不連続エピトープ（例えば立体構造エピトープ）であってもよい。立体構造エピトープには、抗原の直線状配列の異なる部分のアミノ酸同士が３次元空間で近接するような抗原の折り畳みによって生じるエピトープが含まれる。
【００６６】
用語「パラトープ」は、本明細書で使用するとき、抗原が特異的に結合する抗体の一部を指す。パラトープは元来線状であるか、又は不連続であることができ、抗体のアミノ酸の線状構造よりも、隣接していないアミノ酸間の空間的な関係により形成される。「軽鎖パラトープ」及び「重鎖パラトープ」又は「軽鎖パラトープアミノ酸残基」及び「重鎖パラトープアミノ酸残基」は、それぞれ、抗原と接触する抗体の軽鎖及び重鎖残基を指す。
【００６７】
用語「特異的結合」は、本明細書で使用するとき、抗体が特定の抗原と、他の抗原又はタンパク質に対するよりも高い親和性で結合することを指す。通常、抗体の結合における解離定数（ＫD）は１０-7Ｍ以下であり、抗体が特定の抗原と結合する際のＫDは、特定の抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン、又は他の任意の特定のポリペプチド）と結合する際のＫDと比較して１／２以下である。本明細書では、「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という語句を、「抗原と特異的に結合する抗体」又は「抗原特異的抗体」、例えばＴＬＲ３特異的抗体という用語と互換可能に用いる。解離定数は後述するような標準的な方法を用いて測定することができる。
【００６８】
用語「ＴＬＲ３の生物活性」又は「ＴＬＲ３の活性化」は、本明細書で使用するとき、リガンドとＴＬＲ３との結合によって生ずる任意の活性を指す。ＴＬＲ３のリガンドには、２本鎖ＤＮＡ、ポリイノシンポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））、及び例えば壊死細胞から放出される内因性ｍＲＮＡなどの内因性ｍＲＮＡが含まれる。ＴＬＲ３の活性化の一例では、ＴＬＲ３のリガンドに応じてＮＦ−κＢが活性化される。レポーター遺伝子アッセイを用いることで、ポリ（Ｉ：Ｃ）による受容体の誘導に基づき、ＮＦ−κＢの活性化をアッセイすることができる（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１３：７３２〜７３８，２００１；Ｈａｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１８：６９７３〜６９８２，１９９９）。他の代表的なＴＬＲ３受容体の活性化は、ＴＬＲ３リガンドに対する応答として、インターフェロン応答因子（ＩＲＦ−３、ＩＲＦ−７）の活性化をもたらす。ＴＬＲ３によって介在されるＩＲＦの活性化は、インターフェロン刺激応答配列（ＩＳＲＥ）によって制御されるレポーター遺伝子を用いてアッセイすることができる。別のＴＬＲ３の活性化の例では、例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ５／ＩＰ−１０及びＲＡＮＴＥＳなどの炎症性サイトカイン及びケモカインが分泌される。細胞若しくは組織からの、又は血液循環中へのサイトカイン及びケモカインの放出は、ＥＬＩＳＡ免疫アッセイなどの周知の免疫アッセイによって測定することができる。
【００６９】
本明細書では以下のようにアミノ酸の慣習的な１文字及び３文字の略号を用いる。
【００７０】
【表１】
0005727463.tif 000002
【００７１】
物質の組成物
本発明はＴＬＲ３の生物活性を阻害することが可能な抗体アンタゴニスト及びかかる抗体の使用法を提供する。かかるＴＬＲ３アンタゴニストは、ＴＬＲ３に結合してＴＬＲ３の活性化を阻害する性質を有し得る。かかる抗体によってＴＬＲ３活性が阻害され得る機序の例としては、ＴＬＲ３へのリガンドの結合のインビトロ、インビボ、若しくはインサイチューでの阻害、受容体の２量化の阻害、エンドソーム区画へのＴＬＲ３の局在化の阻害、下流のシグナル伝達経路のキナーゼ活性の阻害、又はＴＬＲ３のｍＲＮＡの転写の阻害が挙げられる。他の機序によってＴＬＲ３の活性を阻害することが可能な他の抗体アンタゴニストもまた、本発明の異なる態様及び実施形態の範囲に含まれるものである。これらのアンタゴニストは、研究用試薬、診断用試薬及び治療薬として有用である。
【００７２】
抗体の多様性は、自然の系では、可変領域をコードする多数の生殖細胞系列遺伝子の使用及びさまざまな体細胞イベントにより作り出される。体細胞イベントとしては、完全なＶＨ領域を作るための多様性（Ｄ）及び接合（Ｊ）遺伝子セグメントを持つ可変遺伝子セグメントの組換え、並びに完全なＶＬ領域を作るための可変及び接合遺伝子セグメントの組換えがある。組み換えプロセスそれ自体は不正確であり、Ｖ（Ｄ）Ｊ接合部におけるアミノ酸の喪失又は追加を生じる可能性がある。多様性のこれらの機序は、抗原暴露に先立つＢ細胞の発生時に起こる。抗原刺激の後、Ｂ細胞中で発現された抗体遺伝子は、体細胞変異を受ける。生殖細胞系列遺伝子セグメント、これらのセグメントのランダムな組み換え、及びランダムなＶＨ−ＶＬの対形成の見積り数に基づいて，１．６×１０7までの異なる抗体が生成可能である（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．（１９９３），ｅｄ．Ｐａｕｌ，ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）。抗体多様性に寄与する他のプロセス（体細胞変異などの）を考慮に入れた場合、１０10以上の異なる抗体が生成可能であると考えられる（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９９５），ｅｄｓ．Ｊｏｎｉｏら、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）。多数のプロセスが抗体多様性の生成において関与するために、同一の抗原特異性を有する独立に由来したモノクローナル抗体が同一のアミノ酸配列を有するということは極めてあり得ないことである。
【００７３】
本発明は、新規の抗原結合部位及びヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに由来する免疫グロブリン鎖を提供する。抗原結合部位を担持するための構造は一般に抗体の重鎖又は軽鎖若しくはそれらの部分であり、抗原結合部位は上記に述べたようにして決定された天然に生じる抗原結合部位に配置される。
【００７４】
本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を有する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、前記抗体は表１ａに示されるような重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）、及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を有している。
【００７５】
【表２】
0005727463.tif 000003
【００７６】
特定の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を有する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、前記抗体は配列番号１９２に示されるようなＨＣＤＲ２のアミノ酸配列を有し、配列番号１９２のＨＣＤＲ２は式（Ｉ）に示されるように定義される。
Ｘａａ6−Ｉ−Ｘａａ7−Ｘａａ8−Ｒ−Ｓ−Ｘａａ9−Ｗ−Ｙ−Ｎ−Ｄ−Ｙ−Ａ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｓ
（Ｉ）
式中、
Ｘａａ6は、Ａｒｇ又はＬｙｓであってよく、
Ｘａａ7は、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ又はＳｅｒであってよく、
Ｘａａ8は、Ｍｅｔ、Ａｒｇ又はＴｙｒであってよく、
Ｘａａ9は、Ｌｙｓ又はＡｒｇであってよい。
【００７７】
他の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を有する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、前記抗体は配列番号１９４に示されるようなＨＣＤＲ２のアミノ酸配列を有し、配列番号１９４のＨＣＤＲ２は式（ＩＩＩ）に示されるように定義される。
Ｉ−Ｉ−Ｑ−Ｘａａ15−Ｒ−Ｓ−Ｋ−Ｗ−Ｙ−Ｎ−Ｘａａ16−Ｙ−Ａ−Ｘａａ17−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｓ
（ＩＩＩ）
式中、
Ｘａａ15は、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ又はＩｌｅであってよく、
Ｘａａ16は、Ａｓｎ又はＡｓｐであってよく、
Ｘａａ17は、Ｖａｌ又はＬｅｕであってよい。
【００７８】
他の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を有する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、前記抗体は配列番号１９６に示されるようなＨＣＤＲ２のアミノ酸配列を有し、配列番号１９６のＨＣＤＲ２は式（Ｖ）に示されるように定義される。
Ｘａａ24−Ｉ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｄ−Ｓ−Ｙ−Ｔ−Ｎ−Ｙ−Ｘａａ25−Ｐ−Ｓ−Ｆ−Ｑ−Ｇ
（Ｖ）
式中、
Ｘａａ24は、Ｐｈｅ又はＡｒｇであってよく、
Ｘａａ25は、Ａｌａ又はＳｅｒであってよい。
【００７９】
他の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を有する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、前記抗体は配列番号１９１に示されるようなＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を有し、配列番号１９１のＬＣＤＲ３は式（ＩＩ）に示されるように定義される。
Ｘａａ1−Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｔ−Ｖ
（ＩＩ）
式中、
Ｘａａ1は、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであってよく、
Ｘａａ2は、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ又はＳｅｒであってよく、
Ｘａａ3は、Ａｓｐ又はＡｓｎであってよく、
Ｘａａ4は、Ｇｌｕ又はＳｅｒであってよく、
Ｘａａ5は、Ｐｈｅ、Ａｌａ又はＬｅｕであってよい。
【００８０】
他の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を有する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、前記抗体は配列番号１９３に示されるようなＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を有し、配列番号１９３のＬＣＤＲ３は式（ＩＶ）に示されるように定義される。
Ｘａａ10−Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｘａａ11−Ｐ−Ｘａａ12−Ｘａａ13−Ｘａａ14−Ｖ
（ＩＶ）
式中、
Ｘａａ10は、Ｇｌｎ又はＳｅｒであってよく、
Ｘａａ11は、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ又はＡｓｐであってよく、
Ｘａａ12は、Ｖａｌ又はＡｓｎであってよく、
Ｘａａ13は、Ｔｙｒ又はＰｈｅであってよく、
Ｘａａ14は、Ｓｅｒ、Ａｓｎ又はＧｌｎであってよい。
【００８１】
他の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を有する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、前記抗体は配列番号１９５に示されるようなＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を有し、配列番号１９５のＬＣＤＲ３は式（ＶＩ）に示されるように定義される。
Ｑ−Ｑ−Ｘａａ18−Ｘａａ19−Ｘａａ20−Ｘａａ21−Ｘａａ22−Ｘａａ23−Ｔ
（ＶＩ）
式中、
Ｘａａ18は、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ又はＡｌａであってよく、
Ｘａａ19は、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ又はＡｓｎであってよく、
Ｘａａ20は、Ｓｅｒ又はＴｈｒであってよく、
Ｘａａ21は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ又はＬｅｕであってよく、
Ｘａａ22は、Ｓｅｒ又はＬｅｕであってよく、
Ｘａａ23は、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ又はＴｙｒであってよい。
【００８２】
本発明は、また、表１ａに示されるような重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を有する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントも提供するものである。
【００８３】
抗原結合部位のアミノ酸配列が表１ａのもの（配列番号４９〜１２１及び１９１〜１９６）と大きくは異ならない抗体は本発明の範囲に含まれるものである。一般に、これには１以上のアミノ酸残基を、同様の電荷、疎水性又は立体化学的特性を有するアミノ酸によって置換することが含まれる。抗原結合部位ではなく、フレームワーク領域における更なる置換も、これらの置換が抗体の特性に悪影響を及ぼさない限りは行うことができる。置換は、例えば安定性又は親和性といった抗体の特性を向上させるために行うことができる。１、２、３、４、５又は６個の置換を抗原結合部位に行うことができる。得られる抗体が所望の特性を保持するならば、フレームワーク残基の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、又は３０％を置換することができる。
【００８４】
保存的な改変では、こうした改変が行われた分子と同様の機能的及び化学的性質を有する分子が生ずる。分子の機能的及び／又は化学的特性における大幅な改変は、（１）置換領域における分子骨格の構造を例えばシート又はヘリックス立体構造として維持する、（２）標的部位における分子の電荷又は疎水性を維持する、又は（３）分子のサイズを維持する効果において、大きく異なるアミノ酸配列中の置換を選択することによって実現することができる。例えば、「保存的アミノ酸置換」では、その位置のアミノ酸残基の極性又は電荷にほとんどあるいはまったく影響しないように天然アミノ酸残基を非天然残基と置換することができる。更に、アラニン・スキャニング変異導入法についてこれまでに述べられているように（ＭａｃＬｅｎｎａｎら、Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．６４３：５５〜６７、１９９８；Ｓａｓａｋｉら、Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５：１〜２４、１９９８）、ポリペプチド内の任意の内因性の残基をアラニンで置換することもできる。所望のアミノ酸置換（保存的又は非保存的であるかによらず）は、当業者であればこうした置換が望ましい時点で決定することができる。例えば、アミノ酸置換を用いることによってその分子の配列の重要な残基を特定したり、又は本明細書で述べる分子の親和性を増大若しくは減少させることができる。アミノ酸置換の例を表１ｂに示す。
【００８５】
特定の実施形態においては、保存的アミノ酸置換には、生物学的システムによって合成されるのではなく一般的に化学的ペプチド合成によって組み込まれる、非天然のアミノ酸残基も含まれる。アミノ酸置換は、例えばＰＣＲ変異誘発（米国特許第４，６８３，１９５号）によって行うことができる。周知の方法を用いて、例えば、ランダムコドン（ＮＮＫ）又は非ランダムコドン、例えば１１個のアミノ酸（ＡＣＤＥＧＫＮＲＳＹＷ）をコードするＤＶＫコドンを用い、実施例１に示すような所望の特性を持つ変異体についてライブラリをスクリーニングすることで、変異体のライブラリを生成させることができる。表１ｃは、抗体の特性を改善するためにＬＣＤＲ３及びＨＣＤＲ２領域内で３つの親ＴＬＲ３抗体アンタゴニストに対して行われた置換を示す。
【００８６】
抗原結合部位の表記に応じて、本発明の抗体の抗原結合部位、次いでフレームワーク残基は、各重鎖及び軽鎖ごとに若干異なってもよい。
【００８７】
【表３】
0005727463.tif 000004
【００８８】
表２ａ及び２ｂは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＩＭＧＴに基づいて表記された本発明の例示的抗体の抗原結合部位の残基及びそれらの複合配列を示したものである。
【００８９】
他の実施形態において、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を有する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、前記抗体は重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を有するとともに表３ａに示されるようなそれぞれの単離された重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を提供する。Ｆ１７、Ｆ１８及びＦ１９は、それぞれ、ファミリー１７、１８及び１９のコンセンサスなアミノ酸配列を有する抗体の変異体を表す（実施例１を参照）。
【００９０】
【表４−１】
0005727463.tif 000005
【００９１】
【表４−２】
0005727463.tif 000006
【００９２】
【表４−３】
0005727463.tif 000007
【００９３】
実施例で説明する実施形態は、１個が重鎖に由来し、１個が軽鎖に由来する１対の可変領域を有しているが、当業者であれば代替的な実施形態は、１個の重鎖又は軽鎖の可変領域を有してもよいということを認識するであろう。単一の可変領域を用いることで、例えばＴＬＲ３に結合することが可能な２ドメイン特異的抗原結合フラグメントを形成することが可能な第２の可変ドメインについてスクリーニングを行うことができる。こうしたスクリーニングは、例えば国際公開第９２／０１０４７号に開示される、階層的に２重であるコンビナトリアルなアプローチを用いたファージディスプレイスクリーニング法によって実現することが可能である。このアプローチでは、Ｈ又はＬ鎖のいずれかのクローンを含む個別のコロニーを用いて他方の鎖（Ｌ又はＨ）をコードするクローンの完全なライブラリに感染させ、得られた２鎖特異的抗原結合ドメインを上記に述べたようなファージディスプレイ法に基づいて選択する。
【００９４】
【表５】
0005727463.tif 000008
【００９５】
他の実施形態では、本発明は、表３ａに示されるような可変領域のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖の可変領域の両方を有し、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供する。
【００９６】
別の態様では、本発明は、表３ｂに示されるような特定の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を有する単離された抗体を提供する。
【００９７】
本発明の別の態様は、本発明の抗体又はその補体のいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドである。特定のポリヌクレオチドの例を本明細書に開示するが、遺伝暗号の縮重及び特定の発現系におけるコドンの選択性を考慮すると、本発明の抗体アンタゴニストをコードする他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。
【００９８】
【表６】
0005727463.tif 000009
【００９９】
【表７】
0005727463.tif 000010
【０１００】
抗体アンタゴニストの例としては、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＭアイソタイプの抗体が挙げられる。更にこうした抗体アンタゴニストは、グリコシル化、異性化、脱グリコシル化、又はポリエチレングリコール部分の付加（ペギレーション）及び脂質化などの非天然の共有結合修飾などの反応によって翻訳後修飾されてもよい。こうした修飾はインビボあるいはインビトロで行われ得る。例えば、本発明の抗体はポリエチレングリコールと結合（ペギレート）させることによって薬物動態的なプロファイルを向上させることができる。結合は当業者には周知の方法によって行うことができる。治療用抗体とＰＥＧの結合は、機能を妨害せずに薬物動態を増強することが示されてきた（Ｄｅｃｋｅｒｔら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８７：３８２〜３９０，２０００；Ｋｎｉｇｈｔら、Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  １５：４０９〜４１８，２００４；Ｌｅｏｎｇら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６：１０６〜１１９，２００１；Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１６：７６１〜７７０，２００３）。
【０１０１】
【表８】
0005727463.tif 000011
【０１０２】
本発明の抗体の薬物動態的性質は、当業者には周知の技法により、Ｆｃ修飾によって向上させることも可能である。例えばＩｇＧ４アイソタイプの重鎖は、ヒンジ領域に重鎖間又は重鎖内ジスルフィド結合を形成することが可能なＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（ＣＰＳＣ）というモチーフを含んでいる。すなわち、ＣＰＳＣモチーフ内の２個のＣｙｓ残基が他の重鎖の対応するＣｙｓ残基とジスルフィド結合する（重鎖間）か、あるいは特定のＣＰＳＣモチーフ内の２個のＣｙｓ残基が互いにジスルフィド結合し得る（重鎖内）。生体内のイソメラーゼ酵素は、ＩｇＧ４分子の重鎖間結合を重鎖内結合に変換し、またその逆反応を行うことが可能であると考えられている（Ａａｌｂｅｒｓｅ及びＳｃｈｕｕｒｍａｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０５：９〜１９、２００２）。したがって、ヒンジ領域に重鎖内結合を有するこうしたＩｇＧ４分子内の重鎖：軽鎖（Ｈ：Ｌ）の各ペアは互いに共有結合していないことからＨ：Ｌモノマーに解離し、更に他のＩｇＧ４分子に由来するＨ：Ｌモノマーと再会合して、２重特異的なヘテロダイマーのＩｇＧ４分子を形成する。２重特異的なＩｇＧ抗体では、抗体分子の２個のＦａｂの結合するエピトープが異なる。ＩｇＧ４のヒンジ領域ＣＰＳＣモチーフ中のＳｅｒ残基をＰｒｏにより置換することによって「ＩｇＧ１様の挙動」が得られる。すなわち、この分子が重鎖間で安定なジスルフィド結合を形成し、それゆえ、他のＩｇＧ４分子とのＨ：Ｌ交換を受けにくい。一つの実施形態では、本発明の抗体は、ＳからＰの変異と共にＣＰＳＣモチーフ中にＩｇＧ４Ｆｃドメインを含む。ＣＰＳＣモチーフの位置は通常、成熟した重鎖の残基２２８に見いだされるが、ＣＤＲの長さに応じて変化し得る。
【０１０３】
更に、本発明の抗体のＦｃＲｎサルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合に影響する部位を除去することもできる。例えば、ＡＤＣＣ活性に関与するＦｃ受容体結合領域を本発明の抗体において除去することができる。例えば、ＩｇＧ１のヒンジ領域のＬｅｕ２３４／Ｌｅｕ２３５のＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａへの変異、又はＩｇＧ４のヒンジ領域のＰｈｅ２３５／Ｌｅｕ２３６のＰ２３５Ａ／Ｌ２３６Ａへの変異によって、ＦｃＲへの結合性が最小となり、補体依存性細胞傷害活性及びＡＤＣＣを介在する免疫グロブリンの能力が低減する。一実施形態では、本発明の抗体は、Ｐ２３５Ａ／Ｌ２３６Ａ変異を有するＩｇＧ４のＦｃドメインを有する。上記で特定したこれらの残基の位置は成熟した重鎖においては典型的なものであるが、ＣＤＲの長さに応じて変化し得る。Ｐ２３５Ａ／Ｌ２３６Ａ変異を有する抗体の例としては、配列番号２１８、２１９又は２２０に示される重鎖アミノ酸配列を有する抗体が挙げられる。
【０１０４】
完全なヒト、ヒト適合化、ヒト化、及び親和性成熟抗体分子又は抗体フラグメントは、融合タンパク質及びキメラタンパク質と同様、本発明の範囲に含まれる。抗原に対する抗体親和性は、ランダム又は部位特異的な変異誘導などの周知の方法を用いる合理的設計（rational design）又はランダムな親和性成熟によるか、あるいはファージディスプレイライブラリを用いることによって高めることができる。例えば、大部分がフレームワーク領域中に存在するバーニア残基又は「親和性決定残基」、ＡＤＲに対して置換を行うことで、抗体の親和性を調整することができる（米国特許第６，６３９，０５５号、国際公開第１０／０４５３４０号）。
【０１０５】
安定性、選択性、交差反応性、親和性、免疫原性、又はタンパク質の所望の生物学的若しくは生物物理学的特性を高めるように改変された完全なヒト、ヒト適合化、ヒト化、親和性成熟抗体分子又は抗体フラグメントは本発明の範囲に含まれる。抗体の安定性は、（１）内在的な安定性に影響する個々のドメインのコアパッキング、（２）重鎖と軽鎖とのペアリングに影響するタンパク質／タンパク質の界面相互作用、（３）極性及び荷電残基の埋め込み、（４）極性及び荷電残基の水素結合ネットワーク、及び（５）分子内及び分子間力の中でも特に表面電荷及び極性残基の分布、などの多くの因子によって影響される。残基を不安定化させる可能性のある構造は、抗体の結晶構造に基づいて、あるいは場合によっては分子モデリングによって識別することが可能であり、抗体の安定性に対するこれらの残基の影響を、識別された残基中で変異を有する変異体を生成及び評価することにより試験することができる。抗体の安定性を高める方法の１つは、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）によって測定される熱転移中点（Ｔｍ）を高くすることである。一般に、タンパク質のＴｍはその安定性との相関を示し、溶液中でのアンフォールディング及び変性のしやすさ、並びにそのタンパク質のアンフォールドのしやすさに依存する分解プロセスと負の相関を示す（Ｒｅｍｍｅｌｅら、Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，１３：３６〜４６，２０００）。多数の研究によって、ＤＳＣにより熱安定性として測定される配合物の物理的安定性と他の方法により測定される物理的安定性のランキングの間に相関性が見出された（Ｇｕｐｔａら、ＡＡＰＳ  ＰｈａｒｍＳｃｉ．５Ｅ８，２００３；Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９３：３０７６〜３０８９，２００４；Ｍａａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，１４０：１５５〜１６８，１９９６；Ｂｅｄｕ−Ａｄｄｏら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，２１：１３５３〜１３６１，２００４；Ｒｅｍｍｅｌｅら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１５：２００〜２０８，１９９７）。これらの配合物の研究は、ＦａｂのＴｍが対応するｍＡｂの長期の物理的安定性と密接な関係があることを示唆している。フレームワーク中又は抗原結合部位内のアミノ酸の差は、Ｆａｂドメインの熱安定性に及ぼす著しい影響を有する可能性がある（Ｙａｓｕｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５３：１４３〜１４６，１９９４）。
【０１０６】
本発明の抗体アンタゴニストは、約１０-7、１０-8、１０-9、１０-10、１０-11又は１０-12Ｍ以下のＫdでＴＬＲ３と結合することができる。抗体などの特定の分子のＴＬＲ３に対する親和性は、任意の適当な方法によって実験的に求めることができる。こうした方法では、当業者には周知であるＢｉａｃｏｒｅ又はＫｉｎＥｘａ装置、ＥＬＩＳＡ又は競合的結合アッセイを使用することができる。
【０１０７】
特定のＴＬＲ３ホモログと所望の親和性で結合する抗体アンタゴニストは、抗体親和性成熟などの方法によって変異体又はフラグメントのライブラリから選択することができる。抗体アンタゴニストは、任意の適当な方法を用いてＴＬＲ３の生物活性の阻害に基づいて同定することができる。こうした方法では、周知の方法を用いた、本願に述べるようなレポーター遺伝子アッセイ又はサイトカイン産生を測定するアッセイを利用することができる。
【０１０８】
本発明の別の実施形態は、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。かかるベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現ベクター、トランスポゾンに基づいたベクター、又は任意の手段によって特定の生物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適した他の任意のベクターであってよい。
【０１０９】
本発明の別の実施形態は、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１５９、１９８、２００、２０２、１６４、２１２、２１３、２１４、２１５又は２１６に示されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖の可変領域、又は配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、１２２、１２３、１９７、１９９、２０１、１６３、２０９、２１０、２１１又は２２５に示されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖の可変領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどの、本発明のポリヌクレオチドのいずれかを有するホスト細胞である。
【０１１０】
本発明の別の実施形態は、配列番号１０２、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１６０、２０４、２０６、２０８、２２０、１６６又は１６８に示されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖の可変領域、又は配列番号１５５、１５６、１５７、１５８、２０３、２０５、２０７、１６５、１６７又は２２７に示されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖の可変領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有するホスト細胞である。かかるホスト細胞は、真核細胞、細菌細胞、植物細胞又は古細菌細胞であってよい。真核細胞の例としては、哺乳動物、昆虫、鳥類又は他の動物由来のものであり得る。哺乳動物真核細胞としては、ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳ０（ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ），Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ，ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８０）マウス細胞株などのハイブリドーマ又はミエローマなどの不死化細胞株が挙げられる。ヒトミエローマ細胞株の一例には、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ  ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）がある。他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６１）、又はＤＧ４４などの、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来するものが挙げられる。
【０１１１】
本発明の別の実施形態は、本発明のホスト細胞を培養することと、前記ホスト細胞によって産生された抗体を回収することとを含む、ＴＬＲ３と反応性を有する抗体の製造方法である。抗体を製造して精製する方法は当該技術分野では周知のものである。
【０１１２】
本発明の別の実施形態は、本発明の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株である。
【０１１３】
本発明の別の実施形態は、ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）の、配列番号２のアミノ酸残基；Ｋ４１６、Ｋ４１８、Ｌ４４０、Ｎ４４１、Ｅ４４２、Ｙ４６５、Ｎ４６６、Ｋ４６７、Ｙ４６８、Ｒ４８８、Ｒ４８９、Ａ４９１、Ｋ４９３、Ｎ５１５、Ｎ５１６、Ｎ５１７、Ｈ５３９、Ｎ５４１、Ｓ５７１、Ｌ５９５、及びＫ６１９に結合する、単離された抗体又はそのフラグメントである。
【０１１４】
別の実施形態は、ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）の、配列番号２のアミノ酸残基；Ｓ１１５、Ｄ１１６、Ｋ１１７、Ａ１２０、Ｋ１３９、Ｎ１４０、Ｎ１４１、Ｖ１４４、Ｋ１４５、Ｔ１６６、Ｑ１６７、Ｖ１６８、Ｓ１８８、Ｅ１８９、Ｄ１９２、Ａ１９５、及びＡ２１９に結合する、単離された抗体又はそのフラグメントである。
【０１１５】
幾つかの周知の方法を用いて本発明の抗体の結合エピトープを決定することができる。例えば、両方の個別の要素の構造が分かっている場合、インシリコでタンパク質−タンパク質のドッキングを行って、適合する相互作用部位を同定することができる。抗原抗体複合体において水素−重水素（Ｈ／Ｄ）交換を行うことによって抗体が結合し得る抗原の領域をマッピングすることができる。抗原のセグメント及び点変異誘導を用いることにより、抗体の結合に重要なアミノ酸の位置を特定することができる。ＴＬＲ３のような大きなタンパク質では、最初にドッキング、セグメント変異誘導、又はＨ／Ｄ交換などによって結合部位の位置をそのタンパク質の特定の領域に限定することで点変異誘導によるマッピングが単純化される。両方の個別の要素の構造が分かっている場合、インシリコでタンパク質−タンパク質のドッキングを行って適合する相互作用の部位を同定することができる。抗体−抗原複合体の共結晶構造を使用して、エピトープ及びパラトープに寄与する残基を同定することができる。
【０１１６】
本発明の別の実施形態は、単離された抗体又はそのフラグメントであって、重鎖可変領域のＣｈｏｔｈｉａ残基；Ｗ３３、Ｆ５０、Ｄ５２、Ｄ５４、Ｙ５６、Ｎ５８、Ｐ６１、Ｅ９５、Ｙ９７、Ｙ１００及びＤ１００ｂ、並びに軽鎖可変領域のＣｈｏｔｈｉａ残基；Ｑ２７、Ｙ３２、Ｎ９２、Ｔ９３、Ｌ９４及びＳ９５により、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＴＬＲ３に結合することを特徴とする。重鎖パラトープ及び軽鎖パラトープＣｈｏｔｈｉａ残基は、重鎖残基の配列番号２１６のＷ３３、Ｆ５０、Ｄ５２、Ｄ５５、Ｙ５７、Ｎ５９、Ｐ６２、Ｅ９９、Ｙ１０１、Ｙ１０４及びＤ１０６並びに軽鎖残基の配列番号４１のＱ２７、Ｙ３２、Ｎ９２、Ｔ９３、Ｌ９４及びＳ９５に対応する。
【０１１７】
本発明の別の実施形態は、単離された抗体又はそのフラグメントであって、重鎖可変領域のＣｈｏｔｈｉａ残基；Ｎ３１ａ、Ｑ５２、Ｒ５２ｂ、Ｓ５３、Ｋ５４、Ｙ５６、Ｙ９７、Ｐ９８、Ｆ９９及びＹ１００、並びに軽鎖可変領域のＣｈｏｔｈｉａ残基；Ｇ２９、Ｓ３０、Ｙ３１、Ｙ３２、Ｅ５０、Ｄ５１、Ｙ９１、Ｄ９２及びＤ９３により、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＴＬＲ３に結合することを特徴とする。重鎖パラトープ及び軽鎖パラトープＣｈｏｔｈｉａ残基は、重鎖残基の配列番号２１４のＮ３２、Ｑ５４、Ｒ５６、Ｓ５７、Ｋ５８、Ｙ６０、Ｙ１０４、Ｐ１０５、Ｆ１０６及びＹ１０７並びに軽鎖残基の配列番号２１１のＧ２８、Ｓ２９、Ｙ３０、Ｙ３１、Ｅ４９、Ｄ５０、Ｙ９０、Ｄ９１及びＤ９２に対応する。
【０１１８】
例えば、パラトープ残基を好適な骨格にグラフトし、作製した骨格を完全な抗体に組立て、得られた抗体を発現させ、及びＴＬＲ３への結合又はＴＬＲ３の生物活性に及ぼす影響について抗体を試験することにより、ＴＬＲ３を結合する特定のパラトープ残基を有する単離された抗体を作製することができる。代表的な骨格は、ヒト生殖細胞系列遺伝子によりコードされたヒト抗体可変領域のアミノ酸配列である。例えば、全体配列同一性、パラトープ残基間の同一性（％）、又は骨格及びｍＡｂ  １５ＥＶＱ又はｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶなどの代表的な抗体との間の正準構造クラス同一性に基づいて、骨格を選択することができる。ヒト抗体生殖細胞系列遺伝子は、例えば、ＴｏｍＬｉｎｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ２２７：７７６〜７９８、及びＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ＿：／／＿ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）で開示されている。例えば、米国特許第６，３００，０６４号で述べられているように、コンセンサスなヒトフレームワーク領域も使用することができる。例えば、国際公開第１０／０４５３４０号に述べられている方法に従って、好適な骨格の選択を行うことができる。
【０１１９】
パラトープ残基をグラフトする骨格として使用可能な代表的なヒト生殖細胞系列遺伝子は、Ｖκ１、Ｖλ３、Ｖｈ５、Ｖｈ６、Ｊκ、Ｊλ、及びＪｈフレームワークによりコードされた遺伝子である。この生殖細胞系列Ｊ領域は、ＦＲ４配列を選択するために、その全体又は一部を使用される。例えば、ｍＡｂ  １５ＥＶＱ軽鎖パラトープ残基を、ＩＧκＪ１によりコードされたＪ領域配列に直接連結されている、ＩＧＫＶ１−３９*０１によりコードされたＶκ１フレームワークにグラフトすることができる。他のＶκ１遺伝子由来の配列を使用することもでき、ＩＧκＪ１の代わりに、他のＪκ遺伝子のＦＲ４配列を置換することもできる。ｍＡｂ  １５ＥＶＱ重鎖パラトープ残基と、続いて、ＨＣＤＲ３及びＩＧＨＪ１によりコードされたＦＲ４配列を構成する約１１〜１３個の残基、例えば１２個の残基を、ＩＧＨＶ５−５１*０１によりコードされたＶｈ５フレームワークにグラフトすることができる。１１〜１３個の残基は、ＦＲ３領域（「ＣＡＲ」）の終端とＦＲ４領域（大部分のＪＨ領域に対するＷＧＱ）の初端の間に懸り、ｍＡｂ  １５ＥＶＱＶｈ由来の４個の規定されたパラトープ残基を含む。他のＶｈ５遺伝子由来の配列を使用することもでき、ＩＧＪＨ１の代わりに他のＪｈ遺伝子のＦＲ４配列を置換することもできる。別の例では、ｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶ軽鎖パラトープ残基を、ＩＧＪＬ２によりコードされたＪ領域配列に直接連結したＩＧＬＶ３−１*０１によりコードされたＶλ３フレームワークにグラフトすることができる。他のＶλ３及びＪλ遺伝子の配列を使用することもできる。ＬＣＤＲ３の長さは、約９〜１１個の残基、例えば、１０個の残基で維持される。これらの約９〜１１個の残基は、ＦＲ３領域（大部分のＶラムダ骨格に対する「ＹＹＣ」）の終端とＦＲ４領域（大部分のＪＬ領域に対する「ＦＧＧ」）の初端との間に懸り、ｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶ由来の３個の規定されたパラトープ残基を含む。ｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶ重鎖パラトープ残基と、続いてＨＣＤＲ３及びＩＧＪＨ１によりコードされたＦＲ４配列を構成する約９〜１１個の残基、例えば１０個の残基を、ＩＧＨＶ６−１*０１によりコードされたＶｈ６フレームワークにグラフトすることができる。これらの約９〜１１個の残基は、ＦＲ３領域（「ＣＡＲ」）の終端とＦＲ４領域（大部分のＪＨ領域に対するＷＧＱ）の初端との間に懸り、ｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶＶｈからの４個の規定されたパラトープ残基を含む。ＩＧＨＪ１の代わりに他のＪｈ遺伝子のＦＲ４配列を置換することもできる。ＴＬＲ３への結合及び得られた抗体の生物活性を、標準的な方法を用いて評価することができる。ｍＡｂ  １５ＥＶＱ及びｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶ軽鎖可変領域及び重鎖可変領域と、代表的なＶκ１、Ｖｈ５、Ｖλ３、Ｖｈ６、Ｊκ、Ｊλ又はＪｈ遺伝子とのアライメントを、図３２〜３５に示す。ラトープをグラフトした、作製された抗体を、バーニア残基又は親和性決定残基の置換により更に改変して、抗体の特性、例えば上述のように親和性を改善することができる。パラトープをグラフトした抗体がＴＬＲ３への結合を保持する限り、パラトープをグラフトした抗体中のフレームワークアミノ酸配列は、ｍＡｂ  ���５ＥＶＱ又は１２ＱＶＱ／ＱＳＶフレームワーク配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であってもよい。
【０１２０】
標準的な方法を用いて、パラトープ残基に追加して抗原結合部位由来の配列をグラフトすることもできる。例えば、完全なＨＣＤＲ３又はＬＣＤＲ３をグラフトしてもよい。
【０１２１】
本発明の別の態様は、単離された抗体又はそのフラグメントであって、特定の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３のアミノ酸配列、特定の軽鎖ＣＤＲ１、２及び３のアミノ酸配列、特定の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列、又は特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体とＴＬＲ３との結合について競合する、ＴＬＲ３反応性を有することを特徴とする。本発明のモノクローナル抗体の例としては、配列番号２１６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号４１に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する単離された抗体、並びに配列番号２１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２１１に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する抗体が挙げられる。
【０１２２】
ＴＬＲ３との結合についての競合は公知の方法によってインビトロでアッセイすることができる。例えば、非標識抗体の存在下でのＭＳＤ  Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ（商標）ＮＨＳ−エステル標識抗体のＴＬＲ３への結合を、ＥＬＩＳＡによって評価することができる。本発明の抗体の例としては、ｍＡｂ  １２、ｍＡｂ  １５及びｍＡｂ  ｃ１８１１がある（表３ａを参照）。前述の抗ＴＬＲ３抗体ｃ１０６８及びその誘導体（国際公開第０６／０６０５１３（Ａ２）号）、ＴＬＲ３．７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号１４−９０３９）、並びにＩｍｇｅｎｅｘ  ＩＭＧ−３１５Ａ（Ｉｍｇｅｎｅｘ  ＩＭＧ−３１５Ａ、ヒトＴＬＲ３のアミノ酸５５〜７０のＶＬＴＨＮＱＬＲＲＬＰＡＡＮに対して生成されたもの）は、実施例５に示されるようにｍＡｂ  １２、１５又はｃ１８１１によるＴＬＲ３への結合と競合しない。
【０１２３】
本発明の別の態様は、ＴＬＲ３反応性を有し、以下のａ〜ｉの特性のうち少なくとも１つを有する、単離された抗体である；
ａ．Ｋｄ＜１０ｎＭでヒトＴＬＲ３に結合する；
ｂ．インビトロでのポリ（Ｉ：Ｃ）ＮＦ−κＢレポーター遺伝子アッセイにおいて、１μｇ／ｍＬで、ヒトＴＬＲ３の生物活性を５０％超低減させる；
ｃ．１０μｇ／ｍＬで、１００ｎｇ／ｍＬ未満のポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激されたＢＥＡＳ−２Ｂ細胞からのＩＬ−６又はＣＸＣＬ５／ＩＰ−１０の産生を６０％超阻害する；
ｄ．０．４μｇ／ｍＬで、１００ｎｇ／ｍＬ未満のポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激されたＢＥＡＳ−２Ｂ細胞からのＩＬ−６又はＣＸＣＬ５／ＩＰ−１０の産生を５０％超阻害する；
ｅ．５μｇ／ｍＬで、６２．５ｎｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激されたＮＨＢＥ細胞からのＩＬ−６の産生を５０％超阻害する；
ｆ．１μｇ／ｍＬで、６２．５ｎｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激されたＮＨＢＥ細胞からのＩＬ−６の産生を５０％超阻害する；
ｇ．１μｇ／ｍＬで、ＰＢＭＣ細胞による、ポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導されたＩＦＮ−γ、ＩＬ−６又はＩＬ−１２の産生を２０％超阻害する；
ｈ．インビトロでのＮＦ−κＢレポーター遺伝子アッセイにおいて、ＩＣ５０＜１０μｇ／ｍＬで、カニクイザルのＴＬＲ３の生物活性を阻害する；
ｉ．インビトロでのＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイにおいて、ＩＣ５０＜５μｇ／ｍＬで、カニクイザルのＴＬＲ３の生物活性を阻害する。
【０１２４】
治療方法
本発明のＴＬＲ３アンタゴニスト、例えばＴＬＲ３抗体アンタゴニストは、免疫系を調節する目的で使用することができる。何らのかの特定の理論に束縛されることも望むものではないが、本発明のアンタゴニストは、ＴＬＲ３へのリガンドの結合、ＴＬＲ３の２量化、ＴＬＲ３の細胞内移行、又はＴＬＲ３の輸送を防止又は低減することによって免疫系を調節し得るものと考えられる。本発明の方法を用いて任意の分類に属する動物患者を治療することができる。こうした動物の例としては、ヒト、齧歯類、犬、猫、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる。例えば本発明の抗体は、ＴＬＲ３活性の中和、炎症、炎症性及び代謝性疾患の治療に有用であるだけでなく、更にこうした治療のための薬剤の調製においても有用であり、その場合、薬剤は本明細書で定義する用量で投与されるように調製される。
【０１２５】
一般的に、本発明のＴＬＲ３抗体アンタゴニストの投与によって予防又は治療することが可能な炎症状態、感染にともなう状態、又は免疫介在性炎症性疾患には、サイトカイン又はケモカインによって介在されるもの、及びＴＬＲ３の活性化又はＴＬＲ３経路を介したシグナル伝達に全体的又は部分的に起因する状態が含まれる。こうした炎症性状態の例としては、敗血症にともなう状態、炎症性腸疾患、自己免疫性疾患、炎症性疾患、及び感染にともなう状態が挙げられる。更に、本発明のＴＬＲ３抗体アンタゴニストの投与によって癌、心血管及び代謝性の状態、神経病及び線維症の状態を予防又は治療することも可能であると考えられる。炎症は組織を冒し、全身性の症状となり得る。罹患する組織の例としては、気道、肺、消化管、小腸、大腸、結腸、直腸、心血管系、心組織、血管、関節、骨及び滑膜組織、軟骨、上皮、内皮、肝又は脂肪組織が挙げられる。全身性の炎症状態の例としては、サイトカインストームすなわち高サイトカイン血症、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、劇症型抗リン脂質症候群、重篤なウイルス感染、インフルエンザ、肺炎、ショック、又は敗血症がある。
【０１２６】
炎症は、侵入する病原体を撃退するための生物による防御反応である。炎症は、多くの細胞性及び体液性のメディエーターが関与するカスケードイベントである。一方で炎症反応の抑制はホストを免疫的に無防備状態にし、炎症を放置した場合には慢性炎症性疾患（例えば、喘息、乾癬、関節炎、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患など）、敗血性ショック、及び多臓器不全などの重篤な合併症を引き起こし得る。重要な点として、これらの多様な疾患状態は、サイトカイン、ケモカイン、炎症性細胞、及びこれらの細胞によって分泌される他のメディエーターなどの共通の炎症性メディエーターを共有している。
【０１２７】
リガンドであるポリ（Ｉ：Ｃ）、２本鎖ＲＮＡ又は内因性のｍＲＮＡによってＴＬＲ３が活性化されるとシグナル伝達経路が活性化され、これにより炎症性サイトカインの合成及び分泌、マクロファージ、顆粒球、好中球及び好酸球などの炎症性細胞の活性化及び動員、細胞死、並びに組織の破壊が引き起こされる。ＴＬＲ３は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１、ＣＸＣＬ５／ＩＰ−１０及びＲＡＮＴＥＳ、並びに免疫細胞の動員及び活性化に関わる他の炎症性サイトカイン及びケモカインの分泌を誘導することにより、自己免疫疾患及び他の炎症性疾患における組織の破壊に寄与する。ＴＬＲ３のリガンドである内因性のｍＲＮＡは炎症時に壊死細胞から放出され、ポジティブフィードバックループを引き起こすことによってＴＬＲ３を活性化し、炎症及び更なる組織破壊を持続させる。ＴＬＲ３抗体アンタゴニストのようなＴＬＲ３アンタゴニストはサイトカインの分泌を正常化し、炎症性細胞の動員を低減し、組織破壊及び細胞死を低減させると考えられる。したがって、ＴＬＲ３アンタゴニストは炎症及び広範な炎症性状態を治療するうえで治療上の可能性を有するものである。
【０１２８】
炎症性状態の１つの例は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血性ショック又は多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）が含まれ得る、敗血症にともなう状態である。ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫感染によって、及び壊死細胞によって放出される２本鎖ＲＮＡは敗血症の発症に寄与し得る。特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、ＴＬＲ３アンタゴニストによる治療は、敗血症にともなう炎症状態を有する患者における生存時間を延ばすか又は局所的な炎症性イベント（例えば肺の）が広がって全身症状となることを防止することにより、あるいは内在的な抗微生物活性を強化することにより、あるいは抗微生物剤と組み合わされる場合に相乗的な活性を示すことにより、あるいは病状に寄与する局所的炎症状態を抑制することにより、あるいは上記の任意の組み合わせにより、所定の治療効果を与え得るものと考えられる。こうした介入は、患者の生存を確実にするために必要とされる更なる治療（例えば基礎となる炎症の治療又はサイトカインレベルの低減）を可能とするうえで充分なものとなり得る。敗血症はＤ−ガラクトサミン及びポリ（Ｉ：Ｃ）を投与することによってマウスなどの動物でモデル化することができる。こうしたモデルにおいて、Ｄ−ガラクトサミンは、敗血症感作物質として機能する肝臓毒素であり、ポリ（Ｉ：Ｃ）は２本鎖ＲＮＡを模倣してＴＬＲ３を活性化させる敗血症誘導分子である。ＴＬＲ３アンタゴニストによる治療は、敗血症のマウスモデルにおいてマウスの生存率を高め得るものであることから、ＴＬＲ３アンタゴニストは敗血症の治療に有用であると考えられる。
【０１２９】
消化管の炎症は消化管の粘膜の炎症であり、急性及び慢性の炎症状態が含まれる。急性炎症は、短時間の発症及び好中球の浸潤又は流入によって一般的に特徴付けられる。慢性炎症は、比較的長期の発症及び単核球の浸潤又は流入によって一般的に特徴付けられる。粘膜層は、腸（小腸及び大腸を含む）、直腸、胃（胃部）壁、又は口腔の粘膜であってよい。慢性の消化管炎症状態の例としては、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、外界からの刺激によって誘導される大腸炎（例えば、化学療法、放射線療法などの投与のような治療レジメンによって引き起こされるかあるいはこれにともなう（例えば副作用として）消化管炎症（例えば大腸炎））、感染性大腸炎、虚血性大腸炎、膠原性又はリンパ性大腸炎、壊死性腸炎、慢性肉芽腫症又はセリアック病などの状態における大腸炎、食品アレルギー、胃炎、感染性胃炎又は小腸結腸炎（例えばヘリコバクター・ピロリの感染による慢性活動性胃炎）、及び感染性病原体によって引き起こされる消化管炎症の他の形態がある。
【０１３０】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）には、例えば潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）などの、一般に病因が不明の一群の慢性炎症性疾患が含まれる。臨床的及び実験的証拠は、ＩＢＤの病因が感受性遺伝子及び環境因子が関与する多因子的なものであることを示唆している。炎症性腸疾患では、組織の傷害は、腸内の微生物叢の、抗原に対する不適切又は過剰な免疫反応によってもたらされる。炎症性腸疾患の幾つかの動物モデルが存在している。最も広く用いられているモデルは、結腸に慢性炎症及び潰瘍形成を誘発する２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸／エタノール（ＴＮＢＳ）誘発大腸炎モデル又はオキサゾロンモデルである（Ｎｅｕｒａｔｈら、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９：５１〜６２、２０００）。別のモデルでは、血性下痢、体重減少、結腸の短縮、及び好中球の浸潤をともなう粘膜の潰瘍形成として発現する急性大腸炎を誘発する硫酸デキストランナトリウム（ＤＳＳ）を使用する。ＤＳＳ誘発大腸炎は、リンパ組織過形成、陰窩傷害（ｆｏｃａｌ  ｃｒｙｐｔ  ｄａｍａｇｅ）、及び上皮潰瘍形成をともなう、基底膜内への炎症性細胞の浸潤によって組織学的に特徴付けられる（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １５：７９〜９４、２００２）。別のモデルは、ナイーブなＣＤ４５ＲＢhigh  ＣＤ４  Ｔ細胞をＲＡＧ又はＳＣＩＤマウスに養子移入することを含む。このモデルでは、ドナーのナイーブＴ細胞がレシピエントの腸を攻撃することにより、ヒトの炎症性腸疾患に似た慢性腸炎症及び症状を引き起こす（Ｒｅａｄ及びＰｏｗｒｉｅ、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｈａｐｔｅｒ  １５  ｕｎｉｔ  １５．１３、２００１）。これらのモデルのいずれかにおいて本発明のアンタゴニストの投与を用いることによって、これらのアンタゴニストが、炎症性腸疾患などの腸内の炎症にともなう症状を改善し、疾患の経過を変化させる潜在的な有効性を評価することができる。ＩＢＤに対しては幾つかの治療選択肢が存在し、例えば抗ＴＮＦα抗体による治療法が、クローン病を治療する目的で１０年前から用いられている（Ｖａｎ  Ａｓｓｃｈｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｐｕｂ  Ｏｃｔ  ２００９）。しかしながら、かなりの割合の患者が現在の治療法に応答しない（Ｈａｎａｕｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ  ３５９：１５４１〜１５４９、２００２；Ｈａｎａｕｅｒら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３０：３２３〜３３３、２００６）ことから、難治性の患者集団を標的とした新たな治療法が求められている。
【０１３１】
炎症状態の別の一例は炎症性の肺状態である。炎症性の肺状態の例としては、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫又はプリオンによる感染にともなうものなどの感染により誘発される肺状態、アレルゲンにより誘発される肺状態、アスベスト症、珪肺症、又はベリリウム肺症などの汚染物質により誘発される肺状態、胃吸引により誘発される肺状態、嚢胞性線維症などの遺伝的素因にともなう免疫調節不全炎症状態、及び人工呼吸器傷害などの物理的外傷により誘発される肺状態が挙げられる。これらの炎症状態には更に、喘息、気腫、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、サルコイドーシス、ヒスチオサイトーシス、リンパ管筋腫症、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症候群、慢性肺疾患、気管支肺異形成症、院外感染性肺炎、院内肺炎、人工呼吸器関連肺炎、敗血症、ウイルス性肺炎、インフルエンザ感染、パラインフルエンザ感染、ロタウイルス感染、ヒトメタニューモウイルス感染、呼吸系発疹ウイルス感染、及びアスペルギルス又は他の真菌感染も含まれる。感染にともなう炎症性疾患の例としては、重症肺炎、嚢胞性線維症、気管支炎、気道増悪、及び急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含むウイルス又は細菌性肺炎が挙げられる。こうした感染にともなう状態は、一次ウイルス感染及び二次ウイルス感染のように複数の感染をともなう場合がある。
【０１３２】
喘息は、気道過敏症（ＡＨＲ）、気管支収縮、喘鳴、好酸球又は好中球性炎症、粘液分泌過多、上皮下線維症、及び高いＩｇＥレベルによって特徴付けられる肺の炎症性疾患である。喘息の患者は、最も一般的には気道の微生物感染（例えばライノウイルス、インフルエンザウイルス、ヘモフィルスインフルエンザなど）により症状の悪化である「増悪」を経験する。喘息の発作は、環境因子（例えば、回虫、昆虫、動物（例えばネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット及び鳥）、真菌、空気汚染物質（例えば煙草の煙）、刺激性ガス、フューム、蒸気、エアゾール、化学物質、花粉、運動、又は冷気によって誘発される。喘息は別にして、肺を冒すいくつかの慢性炎症性疾患、例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、細菌性肺炎及び嚢胞性線維症は、気道への好中球浸潤により特徴付けられ（Ｌｉｎｄｅｎら、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．１５：９７３〜９７７，２０００；Ｒａｈｍａｎら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１５：２６８〜２７６，２００５）、ＣＯＰＤ、アレルギー性鼻炎及び嚢胞性線維症などの疾患は、気道過敏症により特徴付けられる（Ｆａｈｙ及びＯ’Ｂｙｒｎｅ、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１６３：８２２〜８２３，２００１）。喘息及び気道炎症の一般的に用いられる動物モデルとしては、オボアルブミンチャレンジモデル及びメタコリン感作モデル（Ｈｅｓｓｅｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９３：４０１〜４１２、１９９５）が挙げられる。培養したヒト気管支上皮細胞、気管支線維芽細胞又は気道平滑筋細胞からのサイトカイン及びケモカインの産生の阻害をインビトロモデルとして用いることもできる。本発明のアンタゴニストをこれらのモデルのいずれかに投与することによって、喘息、気道炎症、ＣＯＰＤなどの症状を改善し、経過を変化させるためのこれらのアンタゴニストの使用を評価することができる。
【０１３３】
本発明の方法によって予防又は治療し得る他の炎症状態及び神経障害は、自己免疫疾患によって引き起こされるものである。これらの状態及び神経障害としては、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、並びに、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、双極性疾患、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む神経変性及び中枢神経系（ＣＮＳ）疾患、原発性胆汁性硬変、原発性硬化性胆管炎、非アルコール性脂肪性肝疾患／脂肪性肝炎、線維症、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）などの肝臓疾患、糖尿病及びインスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、脳出血、脳卒中、及び心筋梗塞などの心血管疾患、関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎及び若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）、骨粗鬆症、変形性関節症、膵炎、線維症、脳炎、乾癬、巨細胞動脈炎、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、炎症性皮膚状態、移植、癌、アレルギー、内分泌疾患、創傷治癒、他の自己免疫性疾患、気道過敏症、並びに、細胞、ウイルス又はプリオンによって介在される感染症又は疾患が挙げられる。
【０１３４】
変形性関節症、関節リウマチ、怪我による関節炎を有する関節などを含む関節炎は、本発明のアンタゴニストのような抗炎症性タンパク質の治療的使用によって利するところのある一般的な炎症状態である。例えば、関節リウマチ（ＲＡ）は全身を冒す全身性疾患であり、関節炎の最も一般的な形態の１つである。関節リウマチは組織の傷害を引き起こすため、ＴＬＲ３リガンドが炎症部位に存在し得る。ＴＬＲ３シグナル伝達の活性化によって、炎症を起こした関節の炎症及び更なる組織傷害が持続し得る。関節リウマチの幾つかの動物モデルが当該技術分野において知られている。例えばコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルでは、ヒト関節リウマチとよく似た慢性炎症性関節炎をマウスに発症させる。本発明のＴＬＲ３アンタゴニストをＣＩＡモデルマウスに投与することによって、疾患の症状を改善して疾患の経過を変化させるためのこれらのアンタゴニストの使用を評価することができる。
【０１３５】
真性糖尿病すなわち糖尿病は、複数の原因因子によって誘導され、高血糖によって特徴付けられる疾患プロセスのことを指す（ＬｅＲｏｉｔｈら（ｅｄｓ．）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９６、及び本明細書により引用されるすべての参考文献）。制御されない高血糖は、腎障害、神経障害、網膜障害、高血圧、脳血管疾患及び冠状動脈性心疾患などの微小血管及び大血管性疾患のリスクが増大するために死亡率が増加し、若年死をともなう。したがって、グルコースホメオスタシスの制御は糖尿病の治療にとって極めて重要なアプローチである。
【０１３６】
糖尿病を導く欠陥に基づき、糖尿病は、患者の膵線にインスリンを産生するβ細胞が存在しない場合に発症する１型糖尿病（インスリン依存性糖尿病、ＩＤＤＭ）と、β細胞のインスリン分泌不全及び／又はインスリンの作用に対する抵抗性を有する患者において発症する２型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病、ＮＩＤＤＭ）の２つの大きなグループに分類される。
【０１３７】
ＩＩ型糖尿病は、絶対的ではなく、相対的なインスリン欠乏をともなうインスリン抵抗性によって特徴付けられる。インスリン抵抗性の患者では、身体はこの欠陥を補償するために異常に高量のインスリンを分泌する。インスリン抵抗性を補償し、血糖値を適正に制御するために不適切な量のインスリンが存在すると、境界型糖尿病の状態が現れる。多くの患者でインスリン分泌は更に低下し、血漿グルコース濃度が上昇し、糖尿病の臨床状態がもたらされる。肥満症にともなう炎症は、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病、脂質代謝異常、及び心血管疾患の発症に深く関わっていることが示唆されている。肥満脂肪はマクロファージを動員及び維持し、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６などの炎症性サイトカイン、遊離脂肪酸及びアディポカインを過剰に産生する場合があり、インスリンシグナル伝達を妨害してインスリン抵抗性を誘発し得る。マクロファージのＴＬＲ３活性化は、こうした脂肪の炎症誘発状態に寄与し得る。インスリン抵抗性の幾つかの動物モデルが知られている。例えば、食餌誘発肥満モデル（ＤＩＯ）では、動物は体重増加をともなう高血糖症及びインスリン抵抗性を発症する。ＤＩＯモデルに本発明のＴＬＲ３アンタゴニストを投与することによって、２型糖尿病にともなう合併症を改善して疾患の経過を変化させるためのこれらのアンタゴニストの使用を評価することができる。
【０１３８】
癌の例としては、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞又はＴ細胞のＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡｍＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣｍＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、直腸結腸癌、膵臓癌、腎細胞癌、乳癌、鼻咽頭癌、悪性組織球増殖症、悪性の腫瘍随伴症候群／高カルシウム血症、固形腫瘍、腺癌、扁平上皮細胞癌、肉腫、悪性黒色腫、特に転移性黒色腫、血管腫、転移性疾患、癌関連骨吸収、及び癌関連骨痛を含む（ただしこれらに限定されない）、細胞、組織、臓器、動物、又は患者における少なくとも１つの悪性疾患が挙げられる。
【０１３９】
心血管疾患の例としては、心臓性昏倒症候群、心筋梗塞、鬱血性心不全、卒中、虚血性卒中、出血、動脈硬化症、アテローム性硬化症、再狭窄、糖尿病性動脈硬化疾患、高血圧、動脈高血圧、腎血管性高血圧、失神、ショック、心血管系の梅毒、心不全、肺性心、原発性肺高血圧、心臓不整脈、心房異所性収縮、心房粗動、心房細動（持続性又は痙攣性）、潅流後症候群、心肺バイパス炎症反応、多源性（ｃｈａｏｔｉｃ又はｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ）心房頻拍、規則的で狭いＱＲＳ頻拍、特異的不整脈、心室細動、ヒス束不整脈、房室ブロック、脚ブロック、心筋虚血性障害、冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、心筋症、拡張型うっ血性心筋症、拘束型心筋症、心臓弁疾患、心内膜炎、心臓周囲疾患、心臓腫瘍、大動脈及び抹消動脈瘤、大動脈解離、大動脈の炎症、腹部大動脈及びその分枝の閉塞、抹消血管障害、閉塞性動脈障害、抹消性アテローム硬化疾患、閉塞性血栓血管炎、機能性抹消動脈障害、レイノー現象及び障害、先端チアノーゼ、先端紅痛症、静脈疾患、静脈血栓症、静脈瘤血管、動静脈瘤、リンパ水腫、脂肪性浮腫、不安定狭心症、再潅流傷害、ポンプ後症候群、及び虚血性再潅流傷害を含む（ただしこれらに限定されない）、細胞、組織、臓器、動物又は患者における心血管疾患が挙げられる。
【０１４０】
代表的な神経性疾患の例としては、神経変性疾患、多発性硬化症、偏頭痛、ＡＩＤＳ痴呆複合症、例えば多発性硬化症及び急性横断性脊髄炎などの髄鞘脱落性疾患；例えば皮質脊髄系の病変などの錐体外路及び小脳疾患；基底核の疾患又は小脳疾患；脳幹神経節の障害；例えばハンチントン舞踏病及び老年舞踏病などの運動亢進性運動障害；例えばＣＮＳドーパミンレセプターを遮断する薬物によって誘導される運動障害などの薬物誘導性運動障害；例えばパーキンソン病などの運動低下性運動障害；進行性核上性麻痺；小脳の構造的病変；例えば脊髄性運動失調、フリードライヒ運動失調、小脳皮質変性、多発性系変性（Ｍｅｎｃｅｌ、Ｄｅｊｅｒｉｎｅ−Ｔｈｏｍａｓ、Ｓｈｉ−Ｄｒａｇｅｒ及びＭａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ）などの脊髄小脳の変性；全身性疾患（Ｒｅｆｓｕｍ’ｓ疾患、無β−リポタンパク血症、麻痺、毛細管拡張症及びミトコンドリア性多系疾患）；例えば多発性硬化症、急性横断性脊髄炎などの髄鞘脱落性コア疾患；及び神経性筋萎縮などの運動ユニットの障害（例えば筋委縮性測索硬化症、小児性脊髄性筋委縮及び若年性脊髄性筋委縮などの前角細胞変性）；アルツハイマー病；中年のダウン症候群；びまん性レビー小体病；レビー小体型の老年性認知症；ウェルニッケ‐コルサコフ症候群；慢性アルコール中毒；クロイツフェルト・ヤコブ病；亜急性硬化性全脳炎、ハラーフォルデン・シュパッツ病；ボクサー痴呆を含む（ただしこれらに限定されない）細胞、組織、臓器、動物又は患者における神経疾患が挙げられる。
【０１４１】
線維症状態の例としては、肝臓線維症（アルコール性肝硬変、ウイルス性肝硬変、自己免疫性肝炎を含むがこれらに限定されない）；肺線維症（強皮症、特発性肺線維症を含むがこれらに限定されない）；腎臓線維症（強皮症、糖尿病性腎炎、糸球体腎炎、ループス腎炎を含むがこれらに限定されない）；皮膚線維症（強皮症、肥厚性及びケロイド瘢痕、火傷を含むがこれらに限定されない）；骨髄線維症；神経線維腫症；線維腫；腸線維症；及び外科手術による線維化付着などが挙げられる。こうした方法では、線維症は器官特異的な線維症又は全身性線維症であり得る。器官特異的な線維症は、肺線維症、肝線維症、腎線維症、心線維症、血管線維症、皮膚線維症、眼線維症、骨髄線維症、又はその他の線維症の少なくとも１つにともない得る。肺線維症は、特発性肺線維症、薬剤誘発性肺線維症、喘息、サルコイドーシス、又は慢性閉塞性肺疾患のうち少なくとも１つにともない得る。肝臓線維症は、肝硬変、住血吸虫症、又は胆管炎のうち少なくとも１つにともない得る。肝硬変は、アルコール性肝硬変、Ｃ型肝炎後肝硬変、原発性胆汁性肝硬変の中から選択され得る。胆管炎は硬化性胆管炎である。腎線維症は、糖尿病性腎障害又はループス糸球体腎炎にともない得る。心線維症は、心筋梗塞にともない得る。血管線維症は、血管形成術後動脈再狭窄、又はアテローム性動脈硬化にともない得る。皮膚線維症は、火傷瘢痕化、肥厚性瘢痕化、ケロイド、又は腎性線維性皮膚症にともない得る。眼線維症は、後眼窩線維症、白内障手術後又は増殖性硝子体網膜症にともない得る。骨髄線維症は、特発性骨髄線維症又は薬剤誘発性骨髄線維症にともない得る。他の線維症は、ペイロニー病、デュピュイトラン拘縮又は皮膚筋炎から選択され得る。全身性線維症は、全身性硬化症及び移植片体宿主病から選択され得る。
【０１４２】
投与／製薬学的組成物
ＴＬＲ３活性の抑制が所望される病態の治療又は予防に効果的な剤の「治療上の有効量」は、標準的な研究技術により判定され得る。例えば、喘息、クローン病、潰瘍性大腸炎又は関節リウマチなどの炎症状態の治療又は予防において有効となる薬剤の用量は、本明細書に述べるモデルのような関連する動物モデルに薬剤を投与することによって決定することができる。
【０１４３】
更に、場合によりインビトロアッセイを用いて最適な用量範囲を特定することができる。特定の有効用量の選択は、当業者であれば幾つかの因子の考慮に基づいて（例えば臨床試験によって）決定することができる。こうした因子には、治療又は防止しようとする疾患、関与する症状、患者の体重、患者の免疫状態、及び当業者には周知の他の因子が含まれる。製剤に使用される正確な用量は、投与経路、及び疾患の重篤度にも依存し、医師の判断及び各患者の状況に基づいて決定されなければならない。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導出される用量反応曲線から外挿することができる。
【０１４４】
本発明の方法では、ＴＬＲ３アンタゴニストは単独で、又は少なくとも１種類の他の分子と組み合わせて投与することができる。こうした更なる分子は、他のＴＬＲ３アンタゴニスト分子か、又はＴＬＲ３受容体のシグナル伝達によって介在されない治療効果を有する分子であってよい。抗生剤、抗ウイルス剤、緩和剤、及びサイトカインのレベル又は活性を低減する他の化合物はこうした更なる分子の例である。
【０１４５】
本発明の薬剤の治療上の使用のための投与方法は、薬剤をホストに送達する任意の好適な経路でよい。これらの薬剤の製薬学的組成物は、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、又は鼻腔内などの非経口投与に特に有用である。
【０１４６】
本発明の薬剤は、有効量の薬剤を製薬上許容され得る担体中の有効成分として含有する製薬学的組成物として調製することができる。「担体」なる用語は、活性化合物が一緒に投与される希釈剤、助剤、賦形剤、又は溶媒のことを指す。こうした医薬用溶媒は、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの、石油、動物、植物又は合成物由来の水及び油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを使用することができる。これらの溶液は滅菌され、粒子状物質を含まないものである。これらの溶液は、従来の公知の滅菌法（例えば濾過）によって滅菌することができる。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤などの、適切な生理学的状態に必要とされるような、製薬上許容できる補助物質を含有し得る。そのような製剤処方中の本発明の剤の濃度は、幅広く、すなわち、約０．５重量％未満から通常は約１重量％、又は少なくとも約１重量％から、１５又は２０重量％まで変化させることができ、主に、選択された特定の投与様式による、必要とされる投与量、液体の容積及び粘度などに基づいて選択される。
【０１４７】
したがって、筋肉内注射用の本発明の製薬学的組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水、及び約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、又はより好ましくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のＴＬＲ３アンタゴニストを含むように調製することができる。同様に、静脈内注射用の本発明の製薬学的組成物は、２５０ｍＬの滅菌リンゲル溶液、及び約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のアンタゴニストを含むように調製することができる。非経口投与可能な組成物を調製する実際の方法は周知のものであり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、１５ｔｈ  ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにより詳細に記載されている。
【０１４８】
本発明の抗体アンタゴニストは凍結乾燥して保存することができ、使用の前に適切な溶媒中で還元することができる。この方法は従来の免疫グロブリン及びタンパク質の作製において有効であることが示されており、当該技術分野では周知の凍結乾燥及び還元の技術を使用することができる。
【０１４９】
次に以下の具体的かつ非限定的な実施例を参照して本発明を説明する。
【実施例】
【０１５０】
（実施例１）
抗ｈｕＴＬＲ３アンタゴニストｍＡｂの同定及び誘導
ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ（ＨｕＣＡＬ（登録商標））Ｇｏｌｄファージディスプレイライブラリ（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  ＡＧ，Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をヒト抗体フラグメントの供給源として使用し、Ｃ末端にポリヒスチジンタグを有するヒトＴＬＲ３（ｈｕＴＬＲ３）（配列番号４）のアミノ酸１〜７０３を発現させることによって生成した精製ＴＬＲ３抗原に対してパニングさせ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。アミノ酸１〜７０３はｈｕＴＬＲ３の予想される細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と一致している。多様な抗体フラグメント群を固有のものとして同定、配列決定及び確認できるさまざまな方法において、ＴＬＲ３タンパク質を提示することにより、ｈｕＴＬＲ３と特異的に結合したＦａｂフラグメント（Ｆａｂ）を選別した。手法の異なるパニングにより、６２種類の候補物質（Ｖ領域配列が異なる）をｈＴＬＲ３のＥＣＤに結合する固有の物質として同定した。
【０１５１】
ｈｕＴＬＲ３のＥＣＤ結合物質として同定されたこれら６２種類の候補物質を、抗炎症活性の特定に関するさまざまな細胞アッセイにより中和活性についてスクリーニングした。予備活性データ（下記実施例２を参照）を用いて、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）及び軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）のＣＤＲ成熟のための親候補物質として、６２種類の候補物質からファミリー１６〜１９を形成する４種類の候補物質（Ｆａｂ  １６〜１９）を選別した。これらの親候補物質の１つ（候補物質１９）でＨＣＤＲ２にＮ結合型グリコシル化部位が認められたため、この候補物質にＳｅｒ→Ａｌａ（Ｓ→Ａ）の変異を導入してこの部位を除去した。４種類の親候補物質をＣＤＲ成熟させた後、全部で１５種類の子孫候補物質（候補物質１〜１５）が同定され、これを下記実施例２で述べるように更なる特性評価に供した。１９種類の候補物質のそれぞれに存在する軽鎖及び重鎖の可変領域のリストを上記表３に示した。ここで各候補物質は、Ｆａｂであるか完全長の抗体鎖としてクローニングされた（実施例３）ものであるかに応じてｍＡｂ  １〜１９又はＦａｂ  １〜１９と呼ぶものとする。発現ベクターの設計により、すべての候補物質について、可変領域の成熟したアミノ末端は重鎖ではＱＶＥであり、軽鎖ではＤＩであった。これらの末端の好ましい配列は、それぞれの生殖細胞遺伝子内に存在し、候補配列と高い相同性を有する。ファミリー１７及び１８では、生殖細胞系の配列はＶＨでＱＶＱ、ＶＬでＳＹである。ファミリー１９ではこの配列はＶＨでＥＶＱ、ＶＬでＤＩである。ＳＹ配列はλサブグループ３に固有であり、アミノ末端残基がＳ又はＹのいずれかであることについての異種性が報告されている。したがって、有名なλサブグループ１由来のＱＳＶコンセンサス末端は、ファミリー１７及び１８のＶＬのＤＩＥに対するより好適な置換になるものと考えられる。これらの改変を、ファミリー１８から候補物質９、１０及び１２に、ファミリー１９から候補物質１４及び１５に導入した。このプロセスでは、これらの抗体のＶＨ及びＶＬ領域のコドンを最適化した。それぞれ、候補物質９、１０及び１１の軽鎖可変領域のＮ末端生殖細胞変異体のアミノ酸配列を配列番号２０９〜２１１に示し、候補物質９、１０、１２、１４及び１５の重鎖可変領域のＮ末端生殖細胞変異体のアミノ酸配列を配列番号２１２〜２１６に示す。本明細書では、これらの候補物質のＮ末端変異体を候補物質／ｍＡｂ／Ｆａｂ  ９ＱＶＱ／ＱＳＶ、１０ＱＶＱ／ＱＳＶ、１２ＱＶＱ／ＱＳＶ、１４ＥＶＱ又は１５ＥＶＱと呼ぶ。これらのＮ末端生殖細胞変異体をｍＡｂとして発現させたところ、それぞれの親候補物質と比較した場合に、ＴＬＲ３への結合についても、ＴＬＲ３の生物活性を阻害する能力においても何ら影響を示さなかった（データは示されていない）。
【０１５２】
（実施例２）
インビトロでのＴＬＲ３アンタゴニスト活性の判定
上記に述べたＣＤＲを成熟させた１５種類の候補物質を潜在的なヒトの治療物質として選択し、結合範囲及び中和活性を調べた。４種類の親Ｆａｂ（Ｆａｂ  １６〜１９）及びＣＤＲ成熟させた１５種類のＦａｂ（Ｆａｂ  １〜１５）又はこれらの非生殖細胞Ｖ領域変異体についての、活性のアッセイ及び結果を下記に述べる。
【０１５３】
ＮＦ−κＢ及びＩＳＲＥシグナル伝達カスケードの阻害
熱で不活化したＦＢＳを添加したＤＭＥＭ及びＧｌｕｔａＭａｘ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で２９３Ｔ細胞を増殖させ、ｐＮＦ−κＢ又はＩＳＲＥホタルルシフェラーゼレポータープラスミド３０ｎｇ、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター１３．５ｎｇ、ｐｈＲＬ−ＴＫ  ５ｎｇ、及びＦＬＴＬＲ３をコードするｐＣＤＮＡ（配列番号２）１．５ｎｇをトランスフェクトした。ｐｈＲＬ−ＴＫプラスミドは、ＨＳＶ−１チミジンキナーゼプロモーターによって制御されるウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｏｎ，ＷＩ）を有している。ＴＬＲ３抗体を３０〜６０分インキュベートした後、ポリ（Ｉ：Ｃ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を加えた。各プレートを３７℃で６時間又は２４時間インキュベートした後、ＤｕａｌＧｌｏルシフェラーゼ試薬を加えて各プレートをＦＬＵＯｓｔａｒプレートリーダーで読み取った。ホタルルシフェラーゼの相対発光量（ＲＬＵ）をウミシイタケルシフェラーゼのＲＬＵで割ることによって、正規化された値（ルシフェラーゼ比）を求めた。ホタルルシフェラーゼの産生を刺激するＮＦ−κＢ又はＩＳＲＥシグナル伝達カスケードは、ＴＬＲ３アゴニストであるポリ（Ｉ：Ｃ）（１μｇ／ｍＬ）による刺激前に、細胞を抗ＴＬＲ３抗体（０．４、２．０及び１０μｇ／ｍＬ）とインキュベートすることによって特異的に阻害された。ＮＦ−κＢアッセイの結果を図１に示す。図中、５４６５をポジティブコントロール（抗ヒトＴＬＲ３  ｍＡｂを中和する）として、また抗ヒト組織因子ｍＡｂ（８５９）をヒトＩｇＧ４アイソタイプコントロールとして用いて、ホタル／ウミシイタケ比の阻害率（％）を表す。０．４〜１０μｇ／ｍＬのｍＡｂ濃度で５０％を上回る阻害率が得られた。ｃ１０６８及びＴＬＲ３．７は、１０μｇ／ｍＬでＴＬＲ３の生物活性の約３８％及び８％を阻害した。同様の結果がＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイで得られた（データは示されていない）。
【０１５４】
ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞におけるサイトカイン放出
ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞（ＳＶ−４０で形質転換した正常なヒト気管支上皮細胞）を、Ｉ型コラーゲンをコーティングした培養皿に播種し、抗ヒトＴＬＲ３抗体の存在下又は非存在下でインキュベートした後、ポリ（Ｉ：Ｃ）を加えた。処理の２４時間後に上澄み液を回収し、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＣＬ−２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ及びＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０の検出用にカスタムしたマルチプレックスビーズアッセイを用いて、サイトカイン及びケモカインレベルについてアッセイした。結果を、０．４、２．０及び１０μｇ／ｍＬのｍＡｂで処理した後の、サイトカイン／ケモカインの個別の阻害率（％）として図２に示す。５４６５はポジティブコントロールであり、８５９はアイソタイプコントロールである。
【０１５５】
ＮＨＢＥ細胞におけるサイトカイン放出
サイトカインの放出を、正常なヒト気管支上皮（ＮＨＢＥ）細胞（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）においてもアッセイした。ＮＨＢＥ細胞を増殖させ、コラーゲンコーティングした培養皿に移して４８時間インキュベートした後、培地を除去して０．２ｍＬの新鮮な培地を補充した。次いで細胞を抗ヒトＴＬＲ３  ｍＡｂの存在下又は非存在下で６０分間インキュベートした後、ポリ（Ｉ：Ｃ）を加えた。２４時間後に上澄み液を回収し、−２０℃で保存するか、又は直ちにＩＬ−６のレベルについてアッセイした。結果を、投与量０．００１〜５０μｇ／ｍＬでのｍＡｂ処理後の、ＩＬ−６分泌の阻害率（％）として図３にグラフで示す。５４６５はポジティブコントロールであり、８５９はアイソタイプコントロールである。大部分のｍＡｂは１μｇ／ｍＬでＩＬ−６の産生の少なくとも５０％を阻害し、５μｇ／ｍＬで阻害率７５％を達成した。
【０１５６】
ＰＢＭＣ細胞におけるサイトカイン放出
サイトカインの放出を、ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）においてもアッセイした。ヒトドナーから全血をヘパリン回収試験管に回収し、これにＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ溶液を下側に層を形成するようにゆっくりと加えた。試験管を遠心してＦｉｃｏｌｌの直ぐ上に白色の層を形成しているＰＢＭＣを回収して播種した。この後、ＰＢＭＣを抗ヒトＴＬＲ３  ｍＡｂの存在下又は非存在下でインキュベートした後、２５μｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）を加えた。２４時間後に上澄み液を回収し、Ｌｕｍｉｎｅｘ法によってサイトカインのレベルを調べた。５４６５をポジティブコントロールとし、ｈＩｇＧ４をアイソタイプコントロールとして用い、ｍＡｂの単回用量（０．４μｇ／ｍＬ）によるＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２及びＩＬ−６の累積阻害率（％）として、結果を図４にグラフ化して示す。
【０１５７】
ＨＡＳＭ細胞におけるサイトカイン放出
簡潔に言えば、５００ｎｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）及び１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αの相乗効果のある組み合わせを添加する前に、ヒト気道平滑筋（ＨＡＳＭ）細胞を、抗ヒトＴＬＲ３  ｍＡｂｓの存在又は非存在下でインキュベートした。２４時間後に上澄み液を回収し、Ｌｕｍｉｎｅｘ技術を用いて、サイトカインレベルを求めた。結果を、３段階の容量（０．４、２及び１０μｇ／ｍＬ）でｍＡｂを用いた場合のケモカインＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳのレベルとして図５にグラフで示す。５４６５はポジティブコントロールであり、ｈＩｇＧ４はアイソタイプコントロールである。
【０１５８】
ｈｕＴＬＲ３に結合することによりサイトカイン及びケモカインの放出を低減させる本発明の抗体の能力が、ヒト細胞におけるインビトロアッセイの結果によって確認された。
【０１５９】
（実施例３）
完全長の抗体コンストラクト
４種類の親Ｆａｂ（候補物質番号１６〜１９）及び１５種類の子孫Ｆａｂ（候補物質番号１〜１５）の重鎖をＳ２２９Ｐ  Ｆｃ変異を有するヒトＩｇＧ４バックグラウンド上にクローニングした。候補物質９ＱＶＱ／ＱＳＶ、１０ＱＶＱ／ＱＳＶ、１２ＱＶＱ／ＱＳＶ、１４ＥＶＱ又は１５ＥＶＱを、Ｆ２３５Ａ／Ｌ２３６及びＳ２２９Ｐ  Ｆｃ変異を有するヒトＩｇＧ４バックグラウンド上にクローニングした。
【０１６０】
成熟した完全長の重鎖アミノ酸配列を以下のように配列番号９０〜１０２及び２１８〜２２０に示す。
【０１６１】
【表９】
0005727463.tif 000012
【０１６２】
発現のために、これらの重鎖はＭＡＷＶＷＴＬＬＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡ（配列番号１０３）のようなＮ末端のリーダー配列を有してもよい。リーダー配列を有する候補物質１４ＥＶＱ及び１５ＥＶＱの重鎖、及び成熟型（リーダー配列を有さない）をコードするヌクレオチド配列の例を、配列番号１０４及び１０５にそれぞれ示す。同様に、発現のために、本発明の抗体の軽鎖の配列は、ＭＧＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣ（配列番号１０６）のようなＮ末端のリーダー配列を有してもよい。リーダー配列を有するコドン最適化された候補物質１５の軽鎖、及び成熟型（リーダー配列を有さない）をコードするヌクレオチド配列の例を、配列番号１０７及び１０８にそれぞれ示す。
【０１６３】
（実施例４）
抗ＴＬＲ３  ｍＡｂの結合の特性評価
ヒトＴＬＲ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対するｍＡｂの結合のＥＣ５０値をＥＬＩＳＡによって求めた。ヒトＴＬＲ３のＥＣＤタンパク質をＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬの一定分量を９６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）の各ウェルに分配した。４℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳに０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた洗浄緩衝液によりプレートを３回洗浄した。ウェルを２％のＩ−Ｂｌｏｃｋ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）及び０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳからなる２００μＬのブロッキング溶液によりブロッキングした。室温で２時間ブロッキングした後、プレートを３回洗浄し、続いてブロッキング緩衝液に希釈した抗ＴＬＲ３  ｍＡｂ候補物質１〜１９を連続的に添加した。
【０１６４】
【表１０】
0005727463.tif 000013
【０１６５】
抗ＴＬＲ３  ｍＡｂを室温で２時間インキュベートた後３回洗浄した。この後、ブロッキング緩衝液で１：４０００に希釈したペルオキシダーゼ接合ヒツジ抗ヒトＩｇＧ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  ｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を加え、室温で１時間インキュベートした後、洗浄緩衝液で３回洗浄した。結合は、ＴＭＢ−Ｓ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ）中で１０〜１５分間インキュベートすることによって検出した。反応を、２Ｎ  Ｈ2ＳＯ4  ２５μＬにより停止させ、及びＳＰＥＣＴＲＡ  Ｍａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、吸光度を４５０ｎｍで読み取り６５０ｎｍでの値を差し引いた。ＥＣ５０値をＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍプリズムソフトウェア（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して非線形回帰によって求めた。
【０１６６】
ｍＡｂを２．５μｇ／ｍＬ〜０．６ｐｇ／ｍＬまで４倍ずつ希釈した１００μＬの連続希釈液とインキュベートすることにより、ｈｕＴＬＲ３に対する結合についてＥＣ５０値を求めた（表４）。抗ヒト組織因子ｍＡｂ  ８５９及びｈｕ  ＩｇＧ４κをネガティブコントロールとして含めた。
【０１６７】
ｈｕＴＬＲ３  ＥＣＤに対する結合親和性もＢｉａｃｏｒｅ解析によって求めた。データ（示されていない）は、ｍＡｂ  １〜１９ではｈｕＴＬＲ３  ＥＣＤに対するＫｄが１０-8Ｍ未満であることを示した。
【０１６８】
（実施例５）
競合的エピトープ結合
抗ＴＬＲ３抗体競合グループ又は「エピトープビン」を決定するためにエピトープ結合実験を行った。
【０１６９】
競合的ＥＬＩＳＡを行うため、実施例１に述べるようにして作製した５μＬ（２０μｇ／ｍＬ）の精製ヒトＴＬＲ３  ＥＣＤタンパク質を、ＭＳＤ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の各ウェルに室温で２時間コーティングした。１５０μＬの５％  ＭＳＤブロッカーＡ緩衝液（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を各ウェルに加えて室温で２時間インキュベートした。プレートを０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ  ７．４）で３回洗浄した後、標識した抗ＴＬＲ３  ｍＡｂと異なる競合物質の混合液を加えた。標識した抗体（１０ｎＭ）を、濃度を増加させた（１ｎＭ〜２μＭ）非標識抗ＴＬＲ３抗体とインキュベートし、次いで２５μＬの量の混合液を、指定されたウェルに加えた。室温で穏やかに振盪しながら２時間インキュベートした後、プレートを０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ  ７．４）で３回洗浄した。ＭＳＤ  Ｒｅａｄ緩衝液Ｔを蒸留水で希釈し（４倍）、１５０μＬ／ウェルの量で分配してＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００によって分析した。抗体を製造者（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）の使用説明書に従ってＭＳＤ  Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ（商標）ＮＨＳ−エステルで標識した。
【０１７０】
以下の抗ＴＬＲ３抗体を評価した。すなわち、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓヒト組み換え抗体ライブラリより入手したｍＡｂ  １〜１９（表３に示すもの）；ｃ１０６８（国際公開第０６／０６０５１３（Ａ２）号に述べられるもの）、ｃ１８１１（マウスＴＬＲ３タンパク質で免疫性を与えられたラットから作製されるハイブリドーマにより産生されるラット抗マウスＴＬＲ３  ｍＡｂ）、ＴＬＲ３．７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，カタログ番号１４−９０３９）、及びＩＭＧ−３１５Ａ（Ｉｍｇｅｎｅｘ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡより入手したヒトＴＬＲ３アミノ酸５５〜７０（ＶＬＮＬＴＨＮＱＬＲＲＬＰＡＡＮ）に対して生成したもの）。ｍＡｂ  ９、１０、１２、１４及び１５については、変異体９ＱＶＱ／ＱＳＶ、１０ＱＶＱ／ＱＳＶ、１２ＱＶＱ／ＱＳＶ、１４ＥＶＱ、又は１５ＥＶＱをこの実験で使用した。
【０１７１】
競合アッセイに基づき、抗ＴＬＲ３抗体を、次の５つの異なるビンに割り当てた。ビンＡ：ｍＡｂ  １、２、１３、１４ＥＶＱ、１５ＥＶＱ、１６、１９；ビンＢ：ｍＡｂ  ３、４、５、６、７、８、９ＱＶＱ／ＱＳＶ、１０ＱＶＱ／ＱＳＶ、１１、１２ＱＶＱ／ＱＳＶ、１７、１８；ビンＣ：抗体Ｉｍｇｅｎｅｘ  ＩＭＧ−３１５Ａ；ビンＤ：抗体ＴＬＲ３．７、ｃ１０６８；及びビンＥ：抗体ｃ１８１１。
【０１７２】
（実施例６）
エピトープマッピング
実施例５で述べた異なるエピトープビンからの代表的な抗体を更なるエピトープマッピングのために選択した。エピトープマッピングを、ＴＬＲ３セグメント交換実験、変異誘発、Ｈ／Ｄ交換、及びインシリコタンパク質−タンパク質ドッキングを含む各種のアプローチを用いて行った（Ｔｈｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ６，ＧｌｅｎＥ．Ｍｏｒｒｉｓｅｄ．，１９９６）。
【０１７３】
ＴＬＲ３セグメント交換ＴＬＲ３ヒト−マウスキメラタンパク質を用いてＴＬＲ３上の全体の抗体結合ドメインの位置を特定した。ヒトＴＬＲ３タンパク質の細胞外ドメインを３つのセグメント（ＧｅｎＢａｎｋ受諾番号ＮＰ＿００３２５６のヒトＴＬＲ３アミノ酸配列に基づくアミノ酸番号に従ってａａ  １〜２０９、ａａ  ２１０〜４３６、ａａ  ４３７〜７０８）に分割した。ヒトＴＬＲ３のアミノ酸２１０〜４３６及び４３７〜７０８を対応するマウスのアミノ酸（マウスＴＬＲ３、ＧｅｎＢａｎｋ受諾番号ＮＰ＿５６９０５４、アミノ酸２１１〜４３７及び４３８〜７０９）と置き換えることによってＭＴ５４２０キメラタンパク質を作製した。ヒトアミノ酸の位置４３７〜７０８をマウスＴＬＲ３のアミノ酸（マウスＴＬＲ３、ＧｅｎＢａｎｋ受諾番号ＮＰ＿５６９０５４、アミノ酸４３８〜７０９）で置き換えることによってＭＴ６２５１キメラを作製した。すべてのコンストラクトを、標準的なクローニング手法を用いてｐＣＥＰ４ベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）で生成させた。各タンパク質をＨＥＫ２９３細胞内でＶ５−Ｈｉｓ６  Ｃ末端融合タンパク質として一過性に発現させ、実施例１で述べたようにして精製した。
【０１７４】
ｍＡｂ  ｃ１０６８．ｍＡｂ  ｃ１０６８は、ヒトＴＬＲ３  ＥＣＤに高親和性で結合したが、マウスＴＬＲ３には良好に結合しなかった。ｃ１０６８は、ＭＴ５４２０及びＭＴ６２５１の両方に結合する能力を喪失したことから、結合部位がＷＴヒトＴＬＲ３タンパク質のアミノ酸４３７〜７０８内に局在するということが示された。
【０１７５】
ｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶ：ｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶは両方のキメラに結合したが、このことはｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶの結合部位が配列番号２に示される配列を有するヒトＴＬＲ３タンパク質のアミノ酸１〜２０９内に位置していることを示している。
【０１７６】
インシリコタンパク質−タンパク質ドッキングｍＡｂ  １５ＥＶＱ（下記を参照）の結晶構造及び発表されているヒトＴＬＲ３構造（Ｂｅｌｌら、Ｊ．Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｓ．１２：３７５〜３７８，２００６）を、ドッキングの開始モデルとして使用するために、ＣＨＡＲＭｍ（Ｂｒｏｏｋｓら、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔａｔ．Ｃｈｅｍ．４：１８７〜２１７，１９８３）でエネルギー最小化した。タンパク質ドッキングは、ＺＤＯＣＫ  ２．１（Ｃｈｅｎ及びＷｅｎｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ５１：３９７（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）−４０８、２００３）と同様のＺＤＯＣＫｐｒｏ  １．０により６°の角度グリッドで行った。ＺＤＯＣＫアルゴリズム中のエネルギー項により、ヒトＴＬＲ３における既知のＮ結合グリコシル化部位のＡｓｎ残基（Ａｓｎ  ５２、７０、１９６、２５２、２６５、２７５、２９１、３９８、４１３、５０７及び６３６）（Ｓｕｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：１１１４４〜１１１５１，２００６）を、抗体−抗原複合体インターフェースへの参加からブロックした。２０００個の最初のポーズを出力してクラスター化し、ドッキングポーズを再精密化してＲＤＯＣＫで再スコアリングを行った（Ｌｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ５３：６９３〜７０７、２００３）。最初のＺＤＯＣＫスコアが最も高かった２００個のポーズ及びＲＤＯＣＫの上位２００個のポーズを視覚的に調べた。
【０１７７】
Ｆａｂ  １５ＥＶＱの結晶化を２０℃で蒸気拡散法によって行った（Ｂｅｎｖｅｎｕｔｉ及びＭａｎｇａｎｉ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２：１６３３〜５１、２００７）。最初のスクリーニングを、９６穴プレートでＨｙｄｒａロボットを使用してセットアップした。実験を、０．５μＬのタンパク質溶液を０．５μＬのリザーバ溶液に混合した液滴で構成した。液滴を９０μＬのリザーバ溶液に対して平衡化した。５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ  ７．４）中のＦａｂ溶液をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−５ｋＤａセルを使用して１４．３ｍｇ／ｍＬにまで濃縮した。スクリーニングは、Ｗｉｚａｒｄ  Ｉ  ＆  ＩＩ（Ｅｍｅｒａｌｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｌａｎｄ，ＷＡ）及びインハウス結晶化スクリーンによって行った。Ｆａｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶを類似の方法で結晶化させた。
【０１７８】
Ｘ線回折データを収集し、Ｏｓｍｉｃ（商標）ＶａｒｉＭａｘ（商標）共焦光学系、Ｓａｔｕｒｎ９４４ＣＣＤ検出器、及びＸ−ｓｔｒｅａｍ（商標）２０００低温冷却システムを備えたＲｉｇａｋｕ  ＭｉｃｒｏＭａｘ（商標）−００７ＨＦｓ微小焦点Ｘ線発生装置（Ｒｉｇａｋｕ，Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）を使用して処理した。回折強度を、１／２°の像当たり１２０秒の露光時間で２７０°（結晶回転）にわたって検出した。Ｘ線データをＤ*ＴＲＥＫプログラム（Ｒｉｇａｋｕ）により処理した。構造を、Ｐｈａｓｅｒ又はＣＮＸプログラム（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して分子置換法によって決定した。すべてのデータを用いて、原子位置及び温度因子をＲＥＦＭＡＣによりＦａｂ  １５ＥＶＱに対して１５〜２．２Å及びＦａｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶに対して５０〜１．９Åの分解能範囲で精密化した。３σのカットオフレベルを用いて、（Ｆo−Ｆc）電子密度ピークで水分子を追加した。すべての結晶学的計算を、プログラムのＣＣＰ４に適したプログラムにより行った（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｎｕｍｂｅｒ  ４．１９９４．Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  ｓｕｉｔｅ：ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５０：７６０〜７６３）。ＣＯＯＴプログラム（Ｅｍｓｌｅｙら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ６０：２１２６〜２１３２、２００４）を使用して、モデル調整を行った。
【０１７９】
解像されたｍＡｂ  １５ＥＶＱの結晶構造によって、抗体結合部位が重鎖の多数の負に帯電した残基（Ｄ５２、Ｄ５５、Ｅ９９、Ｄ１０６及びＤ１０９）によって特徴付けられることが示された。したがって、ｍＡｂ  １５ＥＱＶとＴＬＲ３との間の認識には正に帯電した残基が関与している可能性が高いと考えられた。実施したタンパク質−タンパク質ドッキングシミュレーションは、正に帯電した残基を複数含む、ＴＬＲ３上の２個の大きなパッチが、抗体に対して優れた相補性を示すことを示唆するものであった。シミュレートしたＴＬＲ３−抗ＴＬＲ３抗体複合体の界面内のＴＬＲ３上の残基は、Ｒ６４、Ｋ１８２、Ｋ４１６、Ｋ４６７、Ｙ４６８、Ｒ４８８、Ｒ４８９及びＫ４９３であった。
【０１８０】
変異誘発実験単一及び組み合わせの変異を、ＴＬＲ３  ＥＣＤの表面残基の内の、上記でｍＡｂ  １２及びｍＡｂ  １５ＥＶＱのエピトープを含んでいることが特定された領域に導入し、この変異タンパク質を抗体結合性について試験した。
【０１８１】
ヒトＴＬＲ３のアミノ酸１〜７０３（ＥＣＤ）をコードするヌクレオチド配列（配列番号４、ＧｅｎＢａｎｋ受諾番号ＮＰ＿００３２５６）を標準的なプロトコールを用いてクローニングした。表５ａに示されるオリゴヌクレオチドを用い、製造者のプロトコールに従ってＳｔｒａｔｅｇｅｎｅ  Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、すべての変異体を、部位特異的な変異の誘導によって作製した。変異はＤＮＡの配列決定によって確認した。タンパク質はＣＭＶプロモーターの制御下で、ＨＥＫ２９３細胞内でＣ末端Ｈｉｓ−タグ融合タンパク質として発現させ、実施例１で述べたようにして精製した。
【０１８２】
結合アッセイヒトＴＬＲ３に対するｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びｍＡｂ  １５ＥＶＱの結合活性及び生成された変異体をＥＬＩＳＡによって評価した。プロセスを促進するため、ｍＡｂ  １５ＥＶＱの結合が予想される部位についての変異体を、ｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶと共にＣ末端Ｈｉｓタグを含むＴＬＲ３  ＥＣＤ変異体と、ＨＥＫ細胞にコトランスフェクトすることで同時発現させた後、金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。回収された試料は、ＴＬＲ３変異体とｍＡｂとの複合体であった。このアプローチは、ｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びｍＡｂ  １５ＥＶＱの結合部位が互いに離れており、したがって一方の部位における点変異が他方の部位のエピトープに影響する可能性が低いことから実行可能であった。これらの複合体をＥＬＩＳＡ結合アッセイで使用した。ＰＢＳに加えた２０μｇ／ｍＬ野生型ＴＬＲ３  ＥＣＤ又は変異タンパク質を各ウェル当たり５μＬずつ、ＭＳＤ  ＨｉｇｈＢｉｎｄプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）にコーティングした。プレートを室温で６０分間インキュベートし、ブロッキングした。
【０１８３】
【表１１】
0005727463.tif 000014
【０１８４】
相補的配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用し、ＭＳＤＢｌｏｃｋｅｒＡ緩衝液（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で４℃で一晩変異誘発反応を行った翌日、プレートを洗浄し、ＭＳＤ  Ｓｕｌｆｏ−タグ標識したｍＡｂ  １５ＥＶＱを５００ｐＭ〜１ｐＭの濃度で１．５時間添加した。洗浄後、ＭＳＤ  Ｒｅａｄ緩衝液Ｔを使用して標識抗体を検出し、ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００を使用してプレートを読み取った。ヒトＴＬＲ３及び変異体に対するｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶの結合活性を評価するため、ｍＡｂ  １５ＥＶＱと同時発現させ、検出抗体を標識ｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶとした以外はｍＡｂ  １５ＥＶＱについて述べたのと同様にして結合ＥＬＩＳＡを行った。
【０１８５】
ｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶ：ｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶの結合部位は、セグメント交換実験において決定されたようにヒトＴＬＲ３タンパク質のアミノ酸１〜２０９内に位置が特定された。以下のＴＬＲ３変異体について評価を行った：Ｄ１１６Ｒ、Ｎ１９６Ａ、Ｎ１４０Ａ、Ｖ１４４Ａ、Ｋ１４５Ｅ、Ｋ１４７Ｅ、Ｋ１６３Ｅ、及びＱ１６７Ａ。野生型ＴＬＲ３及びＶ１４４Ａ変異体は、ｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶに対して同等の結合性を示した（図６Ａ）。抗体はＴＬＲ３  Ｄ１１６Ｒ変異体には結合せず、Ｋ１４５Ｅ変異体に対しては大幅に低い結合親和性を示した。したがって、ＴＬＲ３上で近接して配置されている残基Ｄ１１６及びＫ１４５は、ｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶに対する中心的なエピトープ部位と特定された（図７Ａ）。
【０１８６】
ｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶ結合エピトープのこれら２つの重要な残基は、ＴＬＲ３の外部ドメインのＮ末端セグメントの２本鎖ＲＮＡ結合部位の面の近くに配置されている（Ｐｉｒｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．＆  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５：７６１〜７６３，２００８）。完全なエピトープは、隣接領域に、実施した変異分析によっては明らかにされなかった他の残基を含むと考えられる。いずれの理論に束縛されることも望むものではないが、ｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶがそのＴＬＲ３エピトープに結合すると、ＴＬＲ外部ドメインへの２本鎖ＲＮＡの結合に直接的又は間接的に干渉することにより、受容体の２量化及び下流のシグナル伝達経路の活性化が妨害されるものと考えられる。
【０１８７】
ｍＡｂ  １５ＥＶＱ：以下のＴＬＲ３変異体について評価を行った。すなわち、Ｒ６４Ｅ、Ｋ１８２Ｅ、Ｋ４１６Ｅ、Ｙ４６５Ａ、Ｋ４６７Ｅ、Ｒ４８８Ｅ、Ｒ４８９Ｅ、Ｎ５１７Ａ、Ｄ５３６Ａ、Ｄ５３６Ｋ、Ｑ５３８Ａ、Ｈ５３９Ａ、Ｈ５３９Ｅ、Ｎ５４１Ａ、Ｅ５７０Ｒ、Ｋ６１９Ａ、Ｋ６１９Ｅ、２重変異体Ｋ４６７Ｅ／Ｙ４６８Ａ、３重変異体Ｔ４７２Ｓ／Ｒ４７３Ｔ／Ｎ４７４Ｓ、及び３重変異体Ｒ４８８Ｅ／Ｒ４８９Ｅ／Ｋ４９３Ｅ。野生型ＴＬＲ３、Ｒ６４Ｅ、Ｋ１８２Ｅ、Ｋ４１６Ｅ変異体及び３重変異体Ｔ４７２Ｓ／Ｒ４７３Ｔ／Ｎ４７４Ｓは、ｍＡｂ  １５ＥＶＱに対して同等の結合性を示した（図６Ｂ及び表５ｂ）。抗体は、ＴＬＲ３変異体Ｋ４６７Ｅ、Ｒ４８９Ｅ、Ｋ４６７Ｅ／Ｙ４６８Ａ及びＲ４８８Ｅ／Ｒ４８９Ｅ／Ｋ４９３Ｅには結合しなかった（図６Ｂ及び６Ｃ）。残りの変異体は中間的な結合性を示し、Ｒ４８８Ｅが最も高い作用を示した。これらの変異体のすべてがｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶに結合した。これらの結果は、残基Ｋ４６７及びＲ４８９がｍＡｂ  １５ＥＶＱエピトープの重要な決定因子であることを示すものである。残基Ｒ４８８もエピトープに寄与した。これらの残基は、ＴＬＲ３の同じ表面上に近接して配置されていた（図７Ａ）。この結果はまた、いずれもＫ４６７、Ｒ４８８及びＲ４８９と同じ表面上に位置する残基Ｙ４６５、Ｙ４６８、Ｎ５１７、Ｄ５３６、Ｑ５３８、Ｈ５３９、Ｎ５４１、Ｅ５７０、及びＫ６１９がエピトープに寄与することを示している。この結果は、ｍＡｂ  １５ＥＶＱを用いたＨ／Ｄ交換実験によって更に支持された。図７Ａは、ｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及び１５ＥＶＱ（黒）に対する結合エピトープ部位と、Ｃ１０６８  ｍＡｂ（灰色）に対する結合エピトープ部位とがヒトＴＬＲ３の構造上で重なっていることを示している。ｍＡｂ  １５ＥＶＱに対するエピトープは、残基Ｙ４６５、Ｋ４６７、Ｙ４６８、Ｒ４８８、Ｒ４８９、Ｎ５１７、Ｄ５３６、Ｑ５３８、Ｈ５３９、Ｎ５４１、Ｅ５７０、及びＫ６１９の範囲にわたっている。
【０１８８】
Ｈ／Ｄ交換実験Ｈ／Ｄ交換に対しては、抗体摂動の解析に使用した手順は、以前に述べたもの（Ｈａｍｕｒｏら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：１７１〜１８２，２００３；Ｈｏｒｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５：８４８８〜８４９８，２００６）に類似し、若干の改変を加えたものである。組換えＴＬＲ３  ＥＣＤ（Ｃ末端Ｈｉｓタグを付加してＳｆ９細胞で発現させて精製したもの）を重水素化水溶液中で所定の時間インキュベートして、交換可能な水素原子を重水素と交換した。重水素化ＴＬＲ３  ＥＣＤを、固定されたｍＡｂ  １５ＥＶＱを含むカラムで捕捉した後、水性緩衝液で洗浄した。逆交換した（back-exchanged）ＴＬＲ３  ＥＣＤタンパク質をカラムから溶出し、重水素含有フラグメントの局在性をプロテアーゼ消化及び質量分析により調べた。参照対照として、ＴＬＲ３  ＥＣＤ試料を、抗体カラムで捕捉した後に重水素化水と接触させてから実験試料と同様にして洗浄及び溶出した点を除いて同様に処理した。抗体と結合する領域は比較的交換から保護される部位であり、そのため、基準ＴＬＲ３  ＥＣＤ試料と比較して高い割合の重水素を含むものと推測された。タンパク質の約８０％を特定のペプチドにマッピングすることができた。ｍＡｂ  １５ＥＶＱによるＴＬＲ３  ＥＣＤのＨ／Ｄ交換の攪乱のマップを図７Ｂに示す。分かりやすさのために、ＴＬＲ３の、ｍＡｂ  １５ＥＶＱに影響される部分の周囲のセグメントのみを示した。ＴＬＲ３  ＥＣＤのアミノ末端及びカルボキシル末端に延びる、タンパク質の残りの部分は大きく影響されなかった。
【０１８９】
Ｈ／Ｄ交換実験により、配列番号２のペプチドセグメント465ＹＮＫＹＬＱＬ471、514ＳＮＮＮＩＡＮＩＮＤＤｍＬ526及び529ＬＥＫＬ532が、ｍＡｂ  １５ＥＶＱとの結合によってＴＬＲ３上の交換が特に変化する領域として特定された。その特性上、Ｈ／Ｄ交換は線形マッピング法であり、ペプチド内のどの残基が抗体結合によって最も影響されるかを定義することは通常できない。しかしながら、Ｈ／Ｄ交換と変異の結果が大きく重なっていることは、図７Ａに示される表面がｍＡｂ  １５の結合部位であることの更なる確証を与えるものである。この結合部位は、ｍＡｂ  ｃ１０６８について過去に述べられているもの（国際公開第０６／０６０５１３（Ａ２）号）と同じ直線状アミノ酸配列領域内にあったが、まったく重ならない表面（図７Ａ）上に位置することが判明し、これらの抗体間で交差競合が見られないことと一致する。
【０１９０】
ｍＡｂ  １５ＥＶＱ結合エピトープは、ＴＬＲ３上のＣ末端セグメントにおいて二本鎖ＲＮＡ結合部位に空間的に近位であった（Ｂｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０３：８７９２〜８７９７，２００６；Ｒａｎｊｉｔｈ−Ｋｕｍａｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２８２：７６６８〜７６７８，２００７；Ｌｉｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２０：３７９〜３８１，２００８）。いずれの特定の理論に束縛されることも望むものではないが、ｍＡｂ  １５ＥＶＱがそのＴＬＲ３エピトープと結合すると、リガンドである２本鎖ＲＮＡ分子及び／又は２量体のもう一方との立体障害を生じ、リガンドの結合及びリガンドによって誘導される受容体の２量化が妨げられるものと考えられる。
【０１９１】
【表１２】
0005727463.tif 000015
【０１９２】
（実施例７）
熱安定性が向上した変異体の作製
結晶構造に基づいた機能改変（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を行って高い熱安定性を有する抗体の変異体を作製すると同時に、生物活性を維持しつつ免疫原性を最小に抑えようと試みた。
【０１９３】
ｍＡｂ  １５ＥＶＱを機能改変用に選択した。免疫原性を最小に抑えるため、構造的考慮に基づいて有益であることが予想される生殖細胞の変異のみを行った。ｍＡｂ  １５ＥＶＱのＶＬ及びＶＨの配列（それぞれ配列番号４１及び配列番号２１６）を、ＢＬＡＳＴサーチを使用してヒト生殖細胞の遺伝子と並べた。同定された最近接の生殖細胞系列配列は、ＶＨ及びＶＬに対してそれぞれＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＡＣ０９０９３及びＸ５９３１８であった。生殖細胞のＶＨ及びＶＬとｍＡｂ  １５ＥＶＱのＶＨ及びＶＬ配列との間で以下の違いが特定された。すなわち、（ＶＨ）Ｖ３４Ｉ、Ｇ３５Ｓ、Ｆ５０Ｒ、Ａ６１Ｓ、及びＱ６７Ｈ；（ＶＬ）Ｇ３０Ｓ、Ｌ３１Ｓ、及びＡ３４Ｎ。特定された配列の違いをｍＡｂ  １５ＥＶＱの結晶構造上にマッピングし、パッキング及び界面相互作用を変化させることが予測される残基を機能改変用に選択した。抗体の結晶構造（実施例６を参照）に基づいて、潜在的に構造を不安定にし得る残基を同定した。（１）小さな囲われた空洞がＶ３４の近くのＶＨのコア中で同定された。この空洞は、Ｉｌｅのようなわずかに大きな側鎖が収まるだけの充分な大きさを有していた。（２）ＶＨ  ＣＤＲ３のＥ９９は、水素結合ネットワークに依らずＶＨ／ＶＬ界面に埋め込まれていた。Ｅ９９の負に帯電したカルボキシレート基は概ね疎水性環境にあり、周囲の残基と主としてファンデルワールス（ｖｄｓ）力による接触状態にあった。荷電基を埋め込むことは通常はエネルギー的に好ましくなく、したがって不安定化作用をもたらす。（３）ＶＨのＦ５０は、ＶＨ／ＶＬの界面残基である。その芳香族側鎖は嵩張るため、ペアリングに負の影響を及ぼし得る。Ｆｖの水素結合及びｖｄｗパッキングネットワークを計算し、Ｐｙｍｏｌにより視覚的に調べた（ｗｗｗ：／／＿ｐｙｍｏｌ＿ｏｒｇ）。ＶＨ及びＶＬドメイン内の埋め込まれた空洞はＣａｖｅｒ（Ｐｅｔｒｅｋら、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、７：３１６、２００６）によって計算した。分子のグラフィック図をすべてＰｙｍｏｌで作製した。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｃｈａｎｇｅ−ＩＴ多重変異部位特異的変異誘発キット（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）、又はＱｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  ＩＩ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用し、標準的なクローニング法によって、実施例３で述べたようにして作製したＦａｂフラグメント又はＩｇＧ４完全ヒト抗体をコードする発現ベクターに変異を導入した。反応を、それぞれの製造者の推奨に従って行った。得られたクローンの配列を、確認のために配列決定し、得られた機能改変された変異体を、改変された重鎖又は軽鎖に従ってｍＡｂ  ｓ１５−１〜１５−１０と命名した。ｍＡｂ  １５−１０用の重鎖がｍＡｂ  １５−６からのものであることを除いて、それぞれの変異体鎖（Ｈ又はＬ）を野生型ｍＡｂ  １５ＥＶＱＬ又はＨ鎖により発現させて、抗体を作製した。配列番号のリスト化：ＣＤＲに対して、ｍＡｂ  １５ＥＶＱ及びその機能改変された変異体に対する軽鎖及び重鎖並びに���全長重鎖及び軽鎖の可変領域を、表６に示す。表７は、それぞれの変異体を作製するためのプライマーを示す。
【０１９４】
【表１３】
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【０１９５】
ＴＬＲ３に対するｍＡｂ  １５−１〜１５−９の結合性をＥＬＩＳＡ免疫アッセイによって評価した。ヒトＴＬＲ３  ＥＣＤ（１００μＬの２μｇ／ｍＬ  ＴＬＲ３  ＥＣＤ）を黒色のＭａｘｉｓｏｒｂプレート（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に４℃で一晩結合させた。プレートを洗浄し、ブロッキングし、希釈した抗体を各ウェル当たり５０μＬで二つ組複製で分注した。プレートを穏やかに振盪しながら室温で２時間インキュベートした。ルミネッセンスＰＯＤ基盤（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号１１  ５８２  ９５０  ００１）及びヤギ抗ヒトＦｃ：ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１０９−０３５−０９８）を用いて、結合を検出し、プレートをＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で読み取った。
【０１９６】
ＤＳＣ実験を、ＭｉｃｒｏＣａｌの自動ＶＰ−キャピラリーＤＳＣシステム（ＭｉｃｒｏＣａｌ’ｓ，ＬＬＣ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）で行って、基準細胞と試料細胞との間の温度差を継続的に測定して出力単位に較正した。試料は１０℃〜９５℃まで６０℃／時の加熱速度で加熱した。前走査時間は１５分とし、フィルタリング時間は１０秒間とした。ＤＳＣ実験で使用した濃度は約０．５ｍｇ／ｍＬである。得られたサーモグラムの分析を、ＭｉｃｒｏＣａｌ  Ｏｒｉｇｉｎ  ７ソフトウェア（ＭｉｃｒｏＣａｌ，ＬＬＣ）を用いて行った。
【０１９７】
【表１４】
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【０１９８】
作製した変異体の熱安定性（Ｔｍ）をＤＳＣによって測定した（表８）。ＴＬＲ３に対する抗体の変異体の結合性は親抗体の結合性と同等であった。
【０１９９】
【表１５】
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【０２００】
（実施例８）
代替抗ＴＬＲ３抗体の作製
実施例１で作製したヒト化抗体がマウスＴＬＲ３に対して充分な特異性もアンタゴニスト活性も有さなかったことから、本明細書ではｍＡｂ  ５４２９と命名するキメラアンタゴニストのラット／マウス抗マウスＴＬＲ３抗体を作製して、さまざまなインビボモデルにおいてＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する作用について評価を行った。この代替キメラｍＡｂ  ５４２９及びその親ラット抗マウスＴＬＲ３抗体ｃ１８１１はインビトロ及びインビボでマウスのＴＬＲ３シグナル伝達を阻害し、マウスのいくつかの疾患モデルにおいて発症機構を改善した。
【０２０１】
以下に考察するデータは、有害な炎症の誘発及び持続化におけるＴＬＲ３の役割を示唆するものであり、例えば高サイトカイン血症、喘息及び気道炎症、炎症性腸疾患及び関節リウマチ、ウイルス感染、及びＩＩ型糖尿病などの急性及び慢性の炎症状態におけるＴＬＲ３アンタゴニスト及びＴＬＲ３抗体アンタゴニストの治療的使用の根拠を与えるものである。
【０２０２】
代替ｍＡｂ  ５４２９の作製
通常の方法を用いて生成させた、遺伝子組み換え型マウスＴＬＲ３の外部ドメイン（配列番号１６２のアミノ酸１〜７０３、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＰ＿５６９０５４）により、ＣＤラットに免疫性を与えた。マウスＴＬＲ３に特異的な抗体力価を示す２匹のラット由来のリンパ球を、ＦＯ骨髄腫細胞に融合した。マウスＴＬＲ３に反応性のあるモノクローナル抗体のパネルを同定し、マウスルシフェラーゼレポーター及びマウス胎児線維芽細胞アッセイにおいて、インビトロアンタゴニスト活性について試験した。ハイブリドーマ株Ｃ１８１１Ａを更なる研究のために選択した。ハイブリドーマによって分泌されるｍＡｂ  ｃ１８１１から、機能性可変領域の遺伝子を配列決定した。次いで、クローニングされた重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子をプラスミド発現ベクターにそれぞれ挿入し、ｍＡｂ  ５４２９と表示されるキメララット／Ｂａｌｂ  Ｃ  ｍｕＩｇＧ１／κ  ｍＡｂを常法によって作製するためのコード配列を得た。抗体を実施例３で述べたようにして発現させた。ｍＡｂ  ５４２９の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号１６４及び配列番号１６３にそれぞれ示し、重鎖及び軽鎖の完全長の配列を配列番号１６６及び配列番号１６５にそれぞれ示す。ｍＡｂ  ｃ１８１１の重鎖及び軽鎖の完全長の配列を配列番号１６８及び配列番号１６７にそれぞれ示す。
【０２０３】
ｍＡｂ  ５４２９の特性評価
ｍＡｂ  ５４２９を、ＴＬＲ３シグナル伝達に対する中和能力について一連のインビトロアッセイにおいて特性評価した。活性のアッセイ及び結果を以下に述べる。
【０２０４】
マウスルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ
マウスＴＬＲ３のｃＤＮＡ（配列番号１６１、ＧｅｎＢａｎｋ受諾番号ＮＭ＿１２６１６６）をマウス脾臓ｃＤＮＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）からＰＣＲによって増幅し、標準的な方法を用いてｐＣＥＰ４ベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。２００μＬのＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、完全ＤＭＥＭ中、４×１０4細胞／ウェルの濃度で９６穴白色透明底プレートに播種し、３０ｎｇのｐＮＦ−κＢホタルルシフェラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）又は３０ｎｇのｐＩＳＲＥホタルルシフェラーゼ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）、５ｎｇのｐｈＲＬ−ＴＫコントロールウミシイタケルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）レポータープラスミド、１．５ｎｇの完全長マウスＴＬＲ３をコードするｐＣＥＰ４、及び１３．５ｎｇの空のｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）を使用して、翌日Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）を用いて全ＤＮＡ量を５０ｎｇ／ウェルとし、トランスフェクションに使用した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を抗マウスＴＬＲ３抗体と新鮮な無血清ＤＭＥＭ中で３７℃で３０分〜１時間インキュベートした後、０．１又は１μｇ／μＬのポリ（Ｉ：Ｃ）を加えた。２４時間後にＤｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用してプレートを回収した。相対的な光量単位を、ＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡ多重検出リーダーを使用し、ＯＰＴＩＭＡＬソフトウェア（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により測定した。標準化された値（ルシフェラーゼ比）はホタルルシフェラーゼの相対光量単位（ＲＬＵ）をウミシイタケルシフェラーゼのＲＬＵで割ることによって得た。ｍＡｂ  ５４２９、並びにその親ｍＡｂ  ｃ１８１１及びｍＡｂ  １５（表３ａ）が、用量依存的にポリ（Ｉ：Ｃ）誘発ＮＦ−κＢ及びＩＳＲＥ活性化を低下させたことから（図８Ａ及び８Ｂ）、ＴＬＲ３の活性を中和するこれらの抗体の能力が実証された。ＩＳＲＥアッセイにおいて測定されたＩＣ５０は、ｍＡｂ  ５２４９、ｍＡｂ  １５及びｍＡｂ  ｃ１８１１についてそれぞれ０．５、２２、及び０．７μｇ／ｍＬであった。
【０２０５】
マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）アッセイ
Ｃ５７ＢＬ／６  ＭＥＦ細胞をＡｒｔｉｓ  Ｏｐｔｉｍｕｓより入手した（Ｏｐｔｉ−ＭＥＦ（商標）Ｃ５７ＢＬ／６−０００１）。２００μＬのＭＥＦ培地（ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％熱失活ＦＢＳ、１×ＮＥＡＡ、及び１０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを加えたＤＭＥＭ）中の細胞を、９６穴平底プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に２０，０００細胞／ウェルで播種した。インキュベーションはすべて、３７℃／５％ＣＯ2で行った。播種の２４時間後に、ｍＡｂ  ５４２９又はｍＡｂ  ｃ１８１１を各ウェルに加えた。プレートをｍＡｂと１時間インキュベートした後、各ウェルにポリ（Ｉ：Ｃ）を１μｇ／ｍＬ加えた。２４時間のインキュベーションの後、上澄み液を回収した。ビーズキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）を用い、サイトカインレベルを定量して、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０を製造者のプロトコールに従って検出した。結果をＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフ化した。いずれの抗体もポリ（Ｉ：Ｃ）誘発ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０レベルを用量依存的に低下させたことから、これらの抗体が、内因性のＴＬＲ３を中和してＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する能力が実証された（図９）。
【０２０６】
フローサイトメトリー−表面染色
各群１０匹ずつのＣ５７ＢＬ／６及びＴＬＲ３ノックアウトマウス（ＴＬＲ３  ＫＯ）（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド；雌、８〜１２週齢、Ａｃｅ  Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｃ．）に１ｍＬの３％チオグリコレート培地（Ｓｉｇｍａ）を腹腔内投与し、９６時間後にマウスを安楽死させ、各マウスから得た腹膜を１０ｍＬの滅菌ＰＢＳで洗浄した。チオグリコレートにより腹膜に誘導されたマクロファージをＰＢＳ中に再懸濁し、細胞の生存率をＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ染色によって評価した。細胞を遠心してペレットとし、２５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ−Ｃａ2+−Ｍｇ2+、１％熱失活ＦＢＳ、０．０９％アジ化ナトリウム）に再懸濁し、濡れた氷上に保持した。ＣＤ１６／３２試薬（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を１０μｇ／１０6細胞に１０分間使用してマクロファージ上のＦｃ受容体をブロッキングした。細胞を１００μＬ／ウェル中、１０6個細胞で分配して、表面染色を行った。Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）−接合ｍＡｂ  ｃ１８１１及びｍＡｂ  １６７９（ＴＬＲ３特異性を有さないことからアイソタイプコントロールとして用いられるラット抗マウスＴＬＲ３抗体）を０．２５μｇ／１０6個細胞で加え、氷上、暗所で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、２５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。生存率染色として７−ＡＡＤ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を５μＬ／ウェルで３０分を超えないように加えた後、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒにより試料を取得して死細胞集団を検出した。Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェアを使用してＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒにより、試料を採取した。収集したデータを、ＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓを使用してヒストグラムを作成することによって解析した。
【０２０７】
Ｃ５７ＢＬ／６及びＴＬＲ３ＫＯマウスから得た、チオグリコレートで誘発されたマウス腹膜マクロファージへのｍＡｂ  ｃ１８１１の結合を、フローサイトメトリーにより評価して結合特異性を求めた。このキメラ抗体のマウスＦｃ領域は、非特異的結合に寄与すると予期されたので、ｍＡｂ  ５４２９はこのアッセイで使用しなかった。ｍＡｂ  ｃ１８１１は、ＴＬＲ３ＫＯマクロファージへの結合を示さず、Ｃ５７ＢＬ／６腹膜マクロファージの細胞表面への結合を上昇させたことから、ＴＬＲ３に対するｍＡｂの特異性を示唆した。（図１０）ｍＡｂ  ５４２９は、ｍＡｂ  ｃ１８１１と同一の結合領域を有し、ｍＡｂ  ｃ１８１１と同一の結合特異性を有すると推定される。
【０２０８】
（実施例９）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストはＴＬＲ３介在型の全身性炎症を防御する
モデル
ポリ（Ｉ：Ｃ）誘発全身性サイトカイン／ケモカインモデルを、ＴＬＲ３介在性全身性炎症のモデルとして用いた。このモデルでは、ポリ（Ｉ：Ｃ）（ＰＩＣ）を腹腔内投与することで、ＴＬＲ３によって一部介在される全身性のサイトカイン及びケモカイン応答を誘導した。
【０２０９】
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８〜１０週齢）又は雌ＴＬＲ３ノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド；８〜１０週齢、Ａｃｅ  Ａｎｉｍａｌｓ、Ｉｎｃ．）に、ｍＡｂ  ５４２９を０．５ｍＬのＰＢＳ中、１０、２０又は５０ｍｇ／ｋｇで、ｍＡｂ  ｃ１８１１を、０．５ｍＬのＰＢＳ中、２、１０又は２０ｍｇ／ｋｇで、又は０．５ｍＬのＰＢＳを単独（溶媒コントロール）で皮下投与した。抗体投与の２４時間後、マウスに、０．１ｍＬのＰＢＳに加えた５０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）（Ａｍｅｒｓｈａｍカタログ番号２６−４７３２、ロット番号ＩＨ０１５６）を腹腔内投与した。ポリ（Ｉ：Ｃ）チャレンジの１及び４時間後に後眼窩より血液を採取した。全血より血清を調製してＬｕｍｉｎｅｘによりサイトカイン及びケモカインの濃度について解析した。
【０２１０】
結果
腹腔内投与されたポリ（Ｉ：Ｃ）は、ＴＬＲ３ノックアウト動物においてケモカイン及びサイトカイン群の産生が大幅に低減されたことによって示されるように、ＴＬＲ３によって一部介在される全身性のサイトカイン及びケモカイン応答を誘導した（表９Ａ）。ＴＬＲ３依存性のポリ（Ｉ：Ｃ）誘導型メディエーターは、ポリ（Ｉ：Ｃ）ポストチャレンジ１時間では、ＩＬ−６、ＫＣ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１及びＴＮＦ−αであり、ポリ（Ｉ：Ｃ）ポストチャレンジ４時間では、ＩＬ−１α、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ及びＴＮＦ−αであった。ｍＡｂ  ｃ１８１１及びｍＡｂ  ５４２９は、両方ともこれらのＴＬＲ３依存性のメディエーターのレベルを著しく低下させ、抗体がインビボでＴＬＲ３シグナル伝達を低下させる能力を実証した（表９Ｂ）。表９中の値は、６匹の動物／群±ＳＥＭのｐｇ／ｍＬでの平均のサイトカイン又はケモカイン濃度として示したものである。これらのデータは、ＴＬＲ３の拮抗作用が、サイトカインストーム又は致死的ショックなどの状態における過剰なＴＬＲ３介在サイトカイン及びケモカインレベルを低減させるうえで有用となり得ることを示唆するものである。
【０２１１】
【表１６】
0005727463.tif 000019
【０２１２】
【表１７】
0005727463.tif 000020
【０２１３】
（実施例１０）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは気道過敏症を軽減する。
モデル
気道過敏症をポリ（Ｉ：Ｃ）によって誘発させた。
【０２１４】
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１２週齢）又は雌ＴＬＲ３ノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド；１２週齢、Ａｃｅ  Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｃ．）をイソフルランで麻酔し、５０μＬの滅菌ＰＢＳ中のポリ（Ｉ：Ｃ）を数回投与量（１０〜１００μｇ）で鼻腔内投与した。各投与の間に２４時間の休止時間を置いてポリ（Ｉ：Ｃ）（又はＰＢＳ）を３回マウスに投与した。最後のポリ（Ｉ：Ｃ）（又はＰＢＳ）の投与の２４時間後に、全身プレチスモグラフィー（ＢＵＸＣＯシステム）を用いて肺機能及びメタコリンに対する気道過敏症を測定した。マウスを全身プレチスモグラフチャンバに入れ、少なくとも５分間順応させた。ベースラインの読み取りの後、投与量を増大させた霧状化したメタコリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）にマウスを曝露した。霧状化メタコリンを２分間投与した後、５分間のデータ収集時間、その後、１０分間の休止時間を置いた後、メタコリンの用量を増大させた後続のチャレンジを行った。空気流の抵抗の増加をエンハンストポーズ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐａｕｓｅ）（Ｐｅｎｈ）として測定し、５分間の記録時間にわたった平均のＰｅｎｈ値として表した（ＢＵＸＣＯシステム）。肺機能の測定の後、マウスを安楽死させ、肺にカニューレを挿管した。肺に１ｍＬのＰＢＳを注入し、流出液を回収することによって気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行った。肺組織を切除して凍結した。ＢＡＬ液を遠心（１２００ｒｐｍ、１０分）し、細胞を含まない上澄み液を回収して、解析を行うまでの間−８０℃で保存した。細胞ペレットを２００μＬのＰＢＳに再懸濁して全細胞計数及び分画別の細胞計数を行った。製造者のプロトコール及びＭｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｃｉａ，ＭＡ）に従って多重アッセイを行った。
【０２１５】
結果
過去の観察により、ポリ（Ｉ：Ｃ）の鼻腔内投与はマウスの肺機能にＴＬＲ３によって介在される障害を誘発し、全身プレチスモグラフィー（ＢＵＸＣＯ）におけるベースラインのエンハンストポーズ（ＰｅｎＨ）測定値が高くなり、霧状化されたメタコリンに対する応答性が高くなることが示されている（国際公開第０６／０６０５１３（Ａ２）号）。肺機能のこうした障害は、肺への好中球の動員、及び肺における炎症性サイトカイン／ケモカインのレベルの上昇をともなった。この実験では、肺機能におけるポリ（Ｉ：Ｃ）誘発障害におけるｍＡｂ  １８１１及びｍＡｂ  ５４２９の作用を、ポリ（Ｉ：Ｃ）チャレンジに先立ってそれぞれの抗体を５０ｍｇ／ｋｇで皮下投与することによって評価した。
【０２１６】
ＴＬＲ３によって介在される肺機能の障害は、ポリ（Ｉ：Ｃ）チャレンジに先立って動物をＴＬＲ３抗体アンタゴニストで処置することによって大幅に軽減された。抗ＴＬＲ３抗体で処置された動物ではＴＬＲ３によって介在される、ベースラインＰｅｎＨ及びメタコリンに対する気道の感受性の増大を防止した（図１１）。更に、抗ＴＬＲ３抗体で処置した動物ではＴＬＲ３によって介在される、マウスの肺への好中球の動員及び気道におけるケモカインの生成を低減した。好中球の数（図１２）及びＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０のレベル（図１３）は、回収した気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）から測定した。この実験を少なくとも３回繰り返して同様の結果を得た。図１１、１２、及び１３に示されるデータは、１つの代表的な実験からのものである。各記号は１匹のマウスからのデータポイントを表し、横棒線は群の平均を示す。この実験によって、使用したモデルにおいて、全身投与されたＴＬＲ３抗体アンタゴニストが肺に達し、ＴＬＲ３によって介在される肺機能の障害、気道内への好中球の浸潤、ケモカインの生成及び気道の炎症を軽減したことが示された。したがって、ＴＬＲ３アンタゴニストは、喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び嚢胞性線維症などの、気道過敏症によって特徴付けられる呼吸器疾患の治療又は予防に有用であり得る。
【０２１７】
（実施例１１）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは炎症性腸疾患を防御する。
モデル
ＤＳＳ大腸炎モデルを炎症性腸疾患のモデルとして用いた。
【０２１８】
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週齢未満）又は雌ＴＬＲ３ノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド；８週齢未満で体重１６．５ｇ〜１８ｇ、Ａｃｅ  Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｃ）にγ線照射した餌を１日目から与えた。ＤＳＳ（硫酸デキストラン）（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ，カタログ番号１６０１１０；３５〜５０ｋＤａ；１８〜２０％イオウ，ロット番号８２４７Ｊ）を、オートクレーブにかけた酸性化した飲料水中で５％の最終濃度まで希釈した。ＤＳＳ水を５日間投与し、その後ＤＳＳ水をただの水に置き換えた。マウスには実験全体を通じて自由に水を飲ませた。すべての水ボトルの重量を毎日測定して水の消費量を記録した。０、２、及び４日目にマウスに５ｍｇ／ｋｇ（０．１ｍＬ  ＰＢＳに０．１ｍｇを加えた）のｍＡｂ  ５４２９、マウス抗ＴＮＦ−α抗体、又はコントロールとしてのＰＢＳを腹腔内投与した。マウスを実験の全体を通じて毎日監視し、０〜４日目及び７日目に体重を測定した。マウスを実験の２日目及び７日目に安楽死させた。腹腔を開き、上行結腸を盲腸と連結する位置で切断した。結腸を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。結腸をパラフィンに埋め込み、薄片にスライスし、Ｈ＆Ｅ染色（Ｑｕａｌｔｅｋ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌａｂｓ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）した。下記に述べるように獣医病理学者によって結腸の組織病理学的評価を盲検により行った（ＰａｔｈｏＭｅｔｒｉｘ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）。
【０２１９】
組織病理学的評価
大腸、結腸、及び直腸の２つの切片を評価し、以下の変化についてスコア化した。すなわち、（ｉ）単一の細胞の壊死、（ｉｉ）上皮の潰瘍形成、（ｉｉｉ）上皮の脱落、（ｉｖ）陰窩腫瘍、（ｖ）細胞増殖、（ｖｉ）陰窩細胞増殖、（ｖｉｉ）粘膜固有層における肉芽組織形成、（ｖｉｉｉ）粘膜下組織における肉芽組織、（ｉｘ）粘膜下炎症性細胞の浸潤物、好中球優位性、及び（ｘ）粘膜下浮腫。
【０２２０】
重篤度の単一の全体的スコアを以下の基準に基づいて与えた。すなわち、
０−所見を認めず。
１−軽度、限局性、又は時折認められる。
２−軽度、多病巣である。
３−中度、頻繁だが限定された領域に認められる。
４−重度、提供された組織の多くの領域又は広範囲に認められる。
５−極めて重度、提供された組織の大部分に拡がっている。
【０２２１】
結果
過去の観察によれば、ＴＬＲ３ノックアウト動物は、ＤＳＳの摂取によって誘発された炎症性腸疾患のモデルにおいて、野生型マウスと比較して大幅に軽減された組織病理学的所見を示すことが実証されており（国際公開第０６／６０５１３（Ａ２）号）、このことはＴＬＲ３シグナル伝達がこのモデルにおける病因に一定の役割を有することを示唆するものである。壊死細胞から放出される共生生物のバクテリアＲＮＡ又は哺乳類ＲＮＡは、内因性リガンドとして作用して、ＴＬＲ３シグナル伝達を刺激することができ（Ｋａｒｉｋｏら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２３１６５〜２３１１７５  ２００５；Ｋａｒｉｋｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１２５４２〜１２５５０  ２００４）、それゆえ、腸中の内因性リガンドによるＴＬＲ３刺激は、ＤＳＳ大腸炎モデルにおける炎症を増進させ、及び持続させ得るということが報告された。
【０２２２】
複合組織病理学スコア（図１４）によって評価されるように、ＤＳＳに曝露した動物における疾患重篤度は、抗ＴＬＲ３抗体による処置によって改善された。図１４は、疾患重篤度スコアについて平均、標準偏差及び９５％信頼区間を横棒線として示している。抗ＴＬＲ３抗体で処置した野生型のＤＳＳ曝露動物では、非処置の野生型動物と比較してスコアの有意な低下が認められた（ｐ＜０．０５）。ＤＳＳに曝露したＴＬＲ３ノックアウト動物は、ＤＳＳによって誘発される変化から防御された。抗マウスＴＮＦ−α  ｍＡｂを投与したＤＳＳ曝露動物では、ＤＳＳモデルにおいて組織病理学的所見の改善は認められなかった。したがって、ＤＳＳモデルは、抗ＴＮＦ−αによる治療に応答しないヒト患者集団を対象とする治療法の評価において有用であり得、抗ＴＬＲ３抗体を中和することは、抗ＴＮＦ−αによる治療に応答しない炎症性腸疾患の患者にとって利益となる可能性を有すると考えられる。
【０２２３】
モデル
Ｔ細胞移植モデルを炎症性腸疾患のモデルとして用いた。このモデルでは、免疫応答能のあるマウスから得た制御性Ｔ細胞を含まないナイーブＴ細胞（腸粘膜の抗原提示細胞を攻撃する）の集団を移植することによって、ＳＣＩＤマウスに腸の炎症を誘発した。
【０２２４】
ナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢhighＴ細胞）をＳＣＩＤレシピエントに腹腔内注射することによって慢性大腸炎を誘発した。マウスに、ＰＢＳ（５００μＬ／マウス、腹腔内投与；溶媒コントロール）、ｍＡｂ  ５４２９（０．１ｍｇ／マウス、腹腔内投与）、又は抗ＴＮＦ−α抗体（０．０５ｍｇ／マウス、腹腔内投与；ポジティブコントロール）のいずれかを、Ｔ細胞の移植４８時間後から開始して毎週２回、８週間の実験期間全体を通じて投与した。Ｔ細胞の移植から８週間後（又はマウスが初期の体重の１５％以上を失った時点）に、動物を安楽死させて結腸を取り出した。結腸を固定し、パラフィンに埋め込んでＨ＆Ｅ染色した。組織病理学的所見（細胞浸潤、陰窩腫瘍、上皮びらん、杯細胞喪失、及び腸壁の肥厚）を盲検的に定量的に評価した。
【０２２５】
結果
コントロール動物と比較した場合の組織病理学的スコアの合計の有意な低下（ｐ＜０．０５）（図１５Ａ）によって評価されるように、疾患重篤度は、Ｔ細胞移植を受けた動物において抗ＴＬＲ３抗体による処置に応じて改善された。スコアの合計には、陰窩腫瘍、潰瘍形成、好中球流入、杯細胞喪失、異常陰窩、粘膜固有層の炎症、及び経壁併発（transmural involvement）を評価した。陰窩腫瘍、潰瘍形成、及び好中球流入では有意な低下が認められた（いずれもｐ＜０．０５）（図１５Ｂ）。抗ＴＮＦα抗体を、最適な効果を与えることが知られている用量でポジティブコントロールとして用いた。
【０２２６】
ＤＳＳ及びＴ細胞移植モデルという２つの広く知られた炎症性腸疾患のモデルを用いた実験により、全身投与されたＴＬＲ３抗体アンタゴニストは腸粘膜に達し、２つの異なる病因機構によって誘発された消化管の炎症を軽減させることが実証された。したがって、ＴＬＲ３アンタゴニストは、抗ＴＮＦα不応性の症例及び消化管の他の免疫介在性の病態を含む炎症性腸疾患の治療に有益であると考えられる。
【０２２７】
（実施例１２）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストはコラーゲン誘導性関節炎を防御する。
モデル
コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルを関節リウマチのモデルとして用いた。
【０２２８】
雄Ｂ１０ＲＩＩＩマウス（６〜８週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）を１群当たり１５匹（関節炎群）又は１群当たり４匹（コントロール群）の群に分けた。関節炎群をイソフルランで麻酔し、ＩＩ型コラーゲン（Elastin Products）、及び結核菌（M．tuberculosis）（Difco）を添加したフロイントの完全アジュバントを０及び１５日目に投与した。１２日目にＩＩ型コラーゲン誘導関節炎を発症したマウスを体重により治療群にランダム化し、ｍＡｂ  ５４２９（２５ｍｇ／ｋｇ）、ネガティブコントロール抗体としてＣＶＡＭ（マウスに既知の特異性を示さない組換えｍＡｂ）（５ｍｇ／ｋｇ）、又は抗ＴＮＦ−α抗体（５ｍｇ／ｋｇ、ポジティブコントロール）を、１２、１７、及び２２日目（ｄ１２、ｄ１７、ｄ２２）に皮下投与（ＳＣ）した。更に、マウスのコントロール群に溶媒（ＰＢＳ）又はデキサメタゾン（０．５ｍｇ／ｋｇ、Ｄｅｘ、基準化合物）を１２〜２５日目まで毎日（ＱＤ）皮下投与（ＳＣ）した。動物を１２〜２６日まで毎日観察した。前肢及び後肢を臨床スコアシステム（下記に示す）によって評価した。実験２６日目に動物を安楽死させ、組織病理学的所見を盲検的に評価した（下記にスコアシステムを述べる）。有効性評価は、動物の体重及び臨床的な関節炎スコアに基づいて行った。すべての動物が実験終了時まで生存した。
【０２２９】
前肢及び後肢の臨床的スコアの判定基準
０−正常
１−後肢又は前肢関節が冒される、すなわちわずかなびまん性紅斑及び腫脹を呈する。
２−後肢又は前肢関節が冒される、すなわち軽度のびまん性紅斑及び腫脹を呈する。
３−後肢又は前肢関節が冒される、すなわち中度のびまん性紅斑及び腫脹を呈する。
４−顕著なびまん性紅斑及び腫脹、すなわち４本の指関節が冒される。
５−足全体に重篤なびまん性紅斑及び重篤な腫脹を呈し、指を曲げられない。
【０２３０】
ＩＩ型コラーゲン誘導関節炎を有するマウス関節の組織病理学的スコアリング方法
ＩＩ型コラーゲン誘導関節炎の病変を有するマウスの肢又は足首関節をスコアリングする場合、変化の重篤度及び冒された個々の関節の数を考慮する。中手骨／中足骨／指又は足根骨／脛足根骨の多数の可能性のある関節のうち、１〜３個のみの足又は足首の関節が冒されている場合には、変化の重篤度に応じて下記のパラメータの１、２又は３の最大スコアが任意に与えられる。２個よりも多い関節が関与している場合には、最も重く冒された／大多数の関節に下記の基準を適用する。
【０２３１】
足スコアの臨床データは、１〜１５日目についてＡＵＣによって分析し、コントロールから阻害率（％）を計算した。
【０２３２】
炎症
０−正常
１−冒された関節の滑膜及び関節周囲組織に炎症性細胞が最小限に浸潤している。
２−軽度の浸潤を呈している。足の場合には、冒された関節に限定された軽度の浸潤を呈している。
３−中度の浸潤を呈している。足の場合には、冒された関節に限定された中度の浸潤を呈している。
４−大部分の領域が顕著な浮腫をともなう顕著な浸潤を呈している。
５−重篤な浮腫をともなう重篤なびまん性浸潤を呈している。
【０２３３】
パンヌス
０−正常
１−軟骨及び肋軟骨下骨にパンヌスが最小限に浸潤している。
２−冒された関節の硬組織の周辺帯の破壊をともなう浸潤を呈している。
３−冒された関節の中度の高組織破壊をともなう中度の浸潤を呈している。
４−大部分の関節で関節構造の顕著な破壊をともなう顕著な浸潤を呈している。
５−関節構造の全体的又はほぼ全体的な破壊をともなう重篤な浸潤がすべての関節を冒している。
【０２３４】
軟骨の傷害
０−正常
１−トルイジンブルー染色が最小限〜軽度に損なわれている。冒された関節に明らかな軟骨細胞の損失もコラーゲン破壊も認められない。
２−トルイジンブルー染色が軽度に損傷を受けている。冒された関節に限局性の軽度（表在性）の軟骨細胞の損失及び／又はコラーゲン破壊が認められる。
３−トルイジンブルー染色が中度に損傷を受けている。冒された関節に多病巣性の中度（深部又は中間層）の軟骨細胞の損失及び／又はコラーゲン破壊が認められる。
４−トルイジンブルー染色が顕著に損傷を受けている。大部分の関節に多病巣性の顕著な（深部〜深層）軟骨細胞の損失及び／又はコラーゲン破壊が認められる。
５−トルイジンブルー染色が重度に損傷を受けている。すべての関節に多病巣性の重度（深部〜タイドマーク）の軟骨細胞の損失及び／又はコラーゲン破壊が認められる。
【０２３５】
骨吸収
０−正常
１−小さい範囲の吸収が認められ、最小の程度に生じている。低倍率では容易に確認できず、冒された関節に破骨細胞をほとんど認めない。
２−より多くの範囲の吸収が認められ、軽度に生じている。低倍率では容易に確認できず、冒された関節により多くの破骨細胞が認められる。
３−皮質の厚さ全体の欠損をともなわない髄様骨梁（medullary trabecular）及び皮質骨の明らかな吸収が、中度に生じている。一部の髄様骨梁が損傷し、病変が低倍率で明瞭に確認できる。冒された関節により多くの破骨細胞が認められる。
４−残存する皮質表面の断面の歪みをしばしばともなう、皮質骨の厚さ全体の欠損が、顕著な程度に生じている。髄様骨の顕著な損失、多数の破骨細胞が認められる。大部分の関節が冒されている。
５−皮質骨の厚さ全体の欠損及びすべての関節の関節構造の破壊が認められる。重度。
【０２３６】
結果
デキサメタゾン（Ｄｅｘ）及び抗マウスＴＮＦ−α抗体をポジティブコントロールとして用い、ＰＢＳを溶媒コントロールとして用い、ＣＶＡＭをネガティブコントロール抗体として用いた。すべての処置は、実験の１２日目の関節疾患が進行する間に開始した。溶媒で処置した疾患コントロール動物では疾患発症率は実験２２日目までに１００％となった。溶媒又はＣＶＡＭ抗体で処置したネガティブコントロール群では臨床スコアは最も高かった。Ｄｅｘ（ｄ１８〜ｄ２６についてｐ＜０．０５）、５ｍｇ／ｋｇの抗ＴＮＦ−α抗体（ｄ１８〜２６についてｐ＜０．０５）、又は２５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ  ５４２９（ｄ１８〜ｄ２３及びｄ２５〜ｄ２６についてｐ＜０．０５）で処置した各群では有意に低い臨床スコアが認められた（図１６）。曲線下面積（ＡＵＣ）として表した臨床的関節炎スコアは、２５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ  ５４２９（低下率４３％）、５ｍｇ／ｋｇの抗ＴＮＦ−α抗体（５２％）、又はＤｅｘ（６９％）による処置により、溶媒コントロールと比較して有意に低下した。図１７は、各群についてＡＵＣの平均及び標準偏差を示す。
【０２３７】
各処置の組織病理学的作用についても評価を行った。足の骨吸収は、２５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ  ５４２９（低下率４７％）による処置によって溶媒コントロールと比較して有意に低下した。５ｍｇ／ｋｇの抗ＴＮＦ−α抗体で処置したポジティブコントロールマウスでは、足の炎症（３３％）、軟骨傷害（３８％）、及び合計した足スコア（３７％）は有意に低下した。Ｄｅｘによる処置によって、足の組織病理学的パラメータのすべてが有意に低下した（合計スコアにおいて７３％の低下率）。
【０２３８】
これらのデータは、ＴＬＲ３抗体アンタゴニストが、ＣＩＡモデルにおいて臨床的及び組織病理学的疾患症状を改善することを示すものであり、関節リウマチの治療におけるＴＬＲ３アンタゴニストの使用を示唆するものである。
【０２３９】
（実施例１４）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは急性致死性ウイルス感染を防御する。
モデル
インフルエンザＡウイルスチャレンジモデルを急性致死性ウイルス感染のモデルとして使用した。
【０２４０】
１、４、８及び１２日目に雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１２週齢）又は雌ＴＬＲ３ノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド；１２週齢、ＡＣＥ  Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｃ．、１群当たり１５匹のマウス）に２０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ  ５４２９、又はＰＢＳ単独を皮下投与した。０日目にイソフルランでマウスを麻酔し、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルス（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＤ、ロット番号２１８１７１）を２５μＬのＰＢＳに加えたもの（１０5.55ＣＥＩＤ５０に相当）を鼻腔内投与した。動物を体重変化及び生存率について、１４日間の期間にわたって１日２回観察した。臨床的スコアリングシステムを用いて疾患の進行のレベル及びインフルエンザＡウイルス治療に対するわずかな改善を評価した。
【０２４１】
臨床スコア
０−正常。機敏で反応性があり、目に見える病気の兆候が認められない。
１−毛皮が逆立っている。歩行のわずかな低下が認められるか、又は認められない。
２−歩行時に背中が曲がっている。歩行をいやがる。呼吸困難である。
３−毛皮が逆立っている。呼吸困難である。運動失調。震えが生じている。
４−毛皮が逆立っている。そっと突いても歩行不可能。意識不明。触れると冷たく感じる。
５−死亡。
【０２４２】
結果
この実験では、生存率、毎日の臨床スコア、及び体重変化を評価した。ｍＡｂ  ５４２９（２０ｍｇ／ｋｇ）を投与したインフルエンザＡ感染野生型マウス及びｍＡｂ  ５４２９を投与しないインフルエンザＡ感染ＴＬＲ３ノックアウトマウスのいずれも、インフルエンザウイルスを接種したＣ５７ＢＬ／６マウスと比較して生存率が統計的に有意に増大した（それぞれｐ＜０．００１及びｐ＜０．０１）。このことは、ＴＬＲ３の阻害又は欠損がインフルエンザによって誘発される死を予防し得ることを示すものである（図１８）。臨床スコアは、２０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ  ５４２９を投与した群、及びＴＬＲ３ノックアウト群において有意に低下した（図１９）。マウスの体重をインフルエンザウイルス投与後１４日間にわたって観察した。インフルエンザＡウイルスを投与したＣ５７ＢＬ／６マウスでは体重は安定的に減少した。しかしながら、２０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ  ５４２９を投与したＣ５７ＢＬ／６マウス及びＴＬＲ３ノックアウトマウスのいずれも、インフルエンザウイルスを接種した野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対して有意に大きな体重を示した（図２０）。これらの結果は、ＴＬＲ３抗体アンタゴニストが急性致死性インフルエンザウイルス感染モデルにおける臨床症状及び死亡率を低下させることを示すものであり、ＴＬＲ３アンタゴニストが急性の感染状態にあるヒトに防御を与えることを示唆するものである。
【０２４３】
（実施例１５）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは高血糖を改善し、血症インスリンを低下させる。
モデル
食餌誘発型肥満（ＤＩＯ）モデルを高血糖及びインスリン抵抗性、並びに肥満のモデルとして用いた。
【０２４４】
Ｃ５７ＢＬ／６野生型動物（約３週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）及びＴＬＲ３ノックアウト動物（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド；約３週齢、Ａｃｅ  Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｃ．）に１２〜１６週間持続的に高脂肪の食餌を与えた。ＴＬＲ３ノックアウト及び野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの両方に、通常の固形飼料又は６０．９％  ｋｃａｌの脂肪及び２０．８％  ｋｃａｌの炭水化物からなる高脂肪の食餌（Ｐｕｒｉｎａ  Ｔｅｓｔ  Ｄｉｅｔカタログ番号５８１２６）のいずれかを与えた。マウスには、水及び食餌を自由摂取させ、１２時間／１２時間の明暗サイクル中に維持した。各群の各マウスの体重を毎週測定した。ｍＡｂ  ５４２９を第１週に週２回、その後は全体で７週間にわたり、週１回腹腔内投与した。空腹時に後眼窩から採取した血清試料を、示した時点でのインスリンの測定に用いた。７週目に一晩絶食させた後、１．０ｍｇ／ｇ（体重）のグルコースを腹腔内投与することによって耐糖試験を行った。更に、空腹時のインスリン及びグルコースレベルを測定した。
【０２４５】
以下の式を用いて、空腹時グルコースレベル及びインスリンレベル（１２）に基づきＨＯＭＡ−ＩＲを式から求めた。すなわち、ＨＯＭＡ−ＩＲ＝（（空腹時グルコース（ｍｍｏｌ／ｌ）×空腹時インスリン（ｍＵ／ｌ））／２２．５（Ｗａｌｌａｃｅら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２７：１４８７〜１４９５、２００４）。空腹時血中グルコース（血糖値）（ＢＧ）をグルコースオキシダーゼアッセイによって求めた。空腹時インスリンレベルをインスリンラット／マウスＥＬＩＳＡキット（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ、カタログ番号９００６０）を使用して求めた。
【０２４６】
結果
高脂肪の食餌を１２〜１６週間与えた後、野生型ＤＩＯ動物は高血糖及び高インスリンとなった。ｍＡｂ  ５４２９による処置により、野生型ＤＩＯ動物では耐糖能が改善したがＴＬＲ３ノックアウトＤＩＯ動物では改善が見られなかった。グルコースチャレンジの６０、９０、１２０及び１８０分後に、ｍＡｂ  ５４２９で処置した動物においてコントロール（ＰＢＳのみ）と比較して有意に低い血中グルコース濃度が観察された（図２１Ａ）。ｍＡｂ  ５４２９で処置した野生型ＤＩＯ動物では、ｍＡｂを投与しない野生型ＤＩＯマウスと比較してＡＵＣの約２１％の低下が観察された。ｍＡｂ  ５４２９で処置した野生型ＤＩＯ動物では空腹時インスリンレベルも低下した（図２２）。ＴＬＲ３ノックアウトＤＩＯ動物では、ｍＡｂ  ５４２９による処置により空腹時インスリンに改善は認められなかった。インスリン抵抗性指数（Ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）（ＨＯＭＡ）分析は、ｍＡｂ  ５４２９で処置した野生型ＤＩＯ動物においてインスリン感受性の改善を示したが、ＴＬＲ３ノックアウトＤＩＯ動物では改善を示さなかった。ＨＯＭＡ−ＩＲ値は、野生型ＤＩＯ、５ｍｇ／ｋｇの野生型ＤＩＯ（ｍＡｂ  ５４２９投与）、及び２０ｍｇ／ｋｇの野生型ＤＩＯ（ｍＡｂ  ５４２９投与）動物で、それぞれ１４．０±９．８、８．７±４．９、９．０±３．０であった。ＴＬＲ３ノックアウトＤＩＯ動物では何の効果も認められなかった。
【０２４７】
この実験により、ＴＬＲ３抗体アンタゴニストがＤＩＯモデルにおいて体重の損失をともなわずにインスリン抵抗性を改善し、空腹時グルコースを低下させることが示されたが、このことは、ＴＬＲ３アンタゴニストが高血糖症、インスリン抵抗性、及びＩＩ型糖尿病の治療に有用であり得ることを示唆するものである。
【０２４８】
（実施例１６）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは細菌及びウイルス誘発炎症反応を防御する。
試薬
細菌性増悪したＣＯＰＤ患者から単離された分類不能型ヘモフィルスインフルエンザ（Ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓインフルエンザ）（ＨＮＴＨｉ）株３５をＤｒ．Ｔ．Ｆ．Ｍｕｒｐｈｙ（Ｂｕｆｆａｌｏ  ＶＡ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ）より入手した。ヒトライノウイルス１６を、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）よりＴＣＩＤ（５０）＝２．８×１０7／ｍＬのものを入手した。
【０２４９】
ＮＴＨｉ刺激アッセイ
ＮＨＢＥ細胞（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）をＭｉｃｒｏｔｅｓｔ  ９６穴組織培養プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に１×１０5／ウェルで播いた。寒天プレート上で１６〜２０時間増殖させたＮＴＨｉを増殖培地に約２×１０8ｃｆｕ／ｍｌで再懸濁し、１００μｇ／ｍｌのゲンタマイシンで３０分間処理してから約２×１０7／ウェルでＮＨＢＥを含む９６穴プレートに加えた。３時間後に上澄み液を除去し、抗体（０．０８〜５０μｇ／ｍＬの最終濃度）を添加又は非添加の新鮮な増殖培地に交換した。更に２４時間インキュベートした後、細胞上澄み液中のサイトカイン及びケモカインの存在を、Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００ＩＳ多重蛍光分析器及びリーダーシステム（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）でサイトカイン２５重ＡＢビーズキット、ヒト（ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ１２ｐ４０ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−１を含む）によって３重にアッセイした。
【０２５０】
ライノウイルス刺激アッセイ
ＮＨＢＥ細胞をＭｉｃｒｏｔｅｓｔ  ９６穴組織培養プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に１×１０5細胞／ウェルで播いた。翌日、抗体（０．０８〜５０μｇ／ｍＬの最終濃度）をＮＨＢＥ又はＢＥＡＳ−２Ｂ細胞に加えて１時間インキュベートした後、１０μＬ／ウェルのライノウイルスを加えた。更に２４時間インキュベーションした後、細胞上澄み液中のサイトカイン及びケモカインの存在について上記に述べたようにｌｕｍｉｎｅｘアッセイによってアッセイを行った。
【０２５１】
結果
ｍＡｂ  １５ＥＶＱが、ＮＴＨｉにより誘導されたＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０及びＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５の産生を用量依存的に阻害したのに対して、コントロール抗体であるヒトＩｇＧ４（Ｓｉｇｍａ，Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）はＮＴＨｉによる刺激に対して阻害作用を示さなかった（図２３Ａ）。ｍＡｂ  １５ＥＶＱは、ライノウイルスにより誘導されたＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０及びＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの産生も阻害した（図２３Ｂ）。
【０２５２】
（実施例１７）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは星状細胞における炎症反応を抑制する。
方法
２人のドナーから得た正常なヒト星状細胞（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を２４穴プレートに７５，０００細胞／ウェルで播き、一晩接着させた。翌日、星状細胞を２００ｎｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）及び／又は１０μｇ／ｍＬのｍＡｂ  １８で２４時間処理した。サイトカインをＬｕｍｉｎｅｘによって測定した。
【０２５３】
結果
表１０に示すように、ポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導されたＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１ａ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ及びＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０の産生はｍＡｂ  １８によって阻害された。
【０２５４】
【表１８】
0005727463.tif 000021
【０２５５】
（実施例１８）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは上皮細胞における炎症反応を抑制する。
方法
ＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）をロンザ社の推奨する血清含有増殖培地中で培養した。細胞を無血清培地（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に再懸濁し、９６穴プレートに３×１０5細胞／ｍＬで播き、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ポリ（Ｉ：Ｃ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を濃度を増加させながら（１．５〜１００μｇ／ｍＬ）加え、更に２４時間３７℃でインキュベートした。サイトカイン阻害アッセイを行うため、ｍＡｂ  １５ＥＶＱを細胞に異なる濃度（０〜５０μｇ／ｍＬ）で加えて３０分間インキュベートし、その後、２０μｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）を２４時間加えた。細胞上澄み液を回収し、ヒトサイトカイン３０重キット及びＬｕｍｉｎｅｘ  ＭＡＰ技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）を用いてサイトカインレベルを測定した。ｓＩＣＡＭ−１の発現を測定するため、ＨＵＶＥＣ細胞を２０μｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）及び異なる濃度のｍＡｂ  １５ＥＶＱ（０．８〜５０μｇ／ｍＬ）で処理した。細胞上澄み液をＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によりｓＩＣＡＭ−１の発現について分析した。細胞の生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により測定した。
【０２５６】
結果
ＨＵＶＥＣ細胞は、ポリ（Ｉ：Ｃ）に応答して次のサイトカインを産生した：ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８、ＩＬ−１２（ｐ４０／ｐ７０）、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＦＧＦ−ｂａｓｉｃ、及びＨＧＦ（表１１）。ｍＡｂ  １５ＥＶＱは、ポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導される全サイトカインのレベルを用量依存的に低下させた（表１２）。ポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導されるＴＮＦ−α、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、及びＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０の産生を低下させるｍＡｂ  １５ＥＶＱの能力は、ＴＬＲ３により介在される活性の阻害が、アテローム性動脈硬化症につながり得る白血球及びＴ細胞の浸潤に対する防御を与え得ることを示唆するものである。更に、ｍＡｂ  １５ＥＶＱによるＶＥＧＦの阻害は、各種の癌及び加齢性黄斑変性などの眼疾患における脈管形成を含む、ＶＥＧＦによって介在される病態におけるＴＬＲ３の遮断の潜在的な効果を示唆するものである。
【０２５７】
ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γは白血球の動員において機能し、かつ活性化された内皮上の接着分子の発現を増大させる（Ｄｏｕｋａｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４５：１３７〜４７、１９９４；Ｐｏｂｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３３：４２６〜３３、１９８８）。ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ及びＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０は、単球及びＴ細胞の動員に関与していることが示されており、アテローム性動脈硬化症の発症に寄与する（Ｌｕｎｄｇｅｒｇら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９）。内皮細胞によるＶＥＧＦの生成は、各種の癌において脈管形成時の異常な組織増殖又は腫瘍との関連が示されている（Ｌｉｖｅｎｇｏｏｄら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４９：５５〜６２、２００７）。
【０２５８】
【表１９】
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【０２５９】
可溶性細胞内接着分子１（ｓＩＣＡＭ−１）はタンパク質切断によって生成される、内皮細胞活性化のマーカーである。ＩＣＡＭ−１は白血球の遊走及び活性化において重要な役割を有し、炎症時に内皮細胞及び上皮細胞において発現が上昇して、インテグリン分子ＬＦＡ−１及びＭａｃ−１を介した白血球への接着を介在する。ポリ（Ｉ：Ｃ）は内皮細胞を活性化してｓＩＣＡＭ−１の発現を上昇させたが、この発現上昇はｍＡｂ  １５ＥＶＱによる処理によって低減した（図２４Ａ）。
【０２６０】
【表２０】
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【０２６１】
このことは、ＴＬＲ３抗体アンタゴニストが白血球の輸送を阻害し、したがって炎症性細胞の流入によって引き起こされる組織障害を阻害し得ることを示す。
【０２６２】
生存率アッセイを行うため、上記で述べたようにＨＵＶＥＣを培養、播種し、ポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激した。ｍＡｂ  １５ＥＶＱはポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導されたＨＵＶＥＣ細胞の生存率の低下を用量依存的に回復させた（図２４Ｂ）。
【０２６３】
内皮細胞の活性化の下方調節は、過剰な免疫細胞の浸潤を抑制し、炎症状態において増加するサイトカインによって引き起こされる組織障害を低減させ得る。炎症及び内皮細胞におけるサイトカイン及び接着分子の過剰発現は、アテローム性動脈硬化症及び高血圧の発症の主要な寄与因子である。これらのデータは、脈管炎及び内皮機能不全をともなう血管疾患などの血管の疾患におけるＴＬＲ３アンタゴニストの使用の潜在的な有用性を探求することの根拠を与えるものである。炎症及び過剰発現したサイトカインによって引き起こされる別の疾患として、免疫抑制患者及びＨＩＶ感染患者において一般的に見られ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）によって引き起こされるカポジ肉腫（ＫＳ）がある。ＶＥＧＦ及びサイトカインの産生はＫＳ細胞の生存に寄与する（Ｌｉｖｅｎｇｏｏｄら、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４９：５５〜６２、２００７）。ＴＬＲ３アンタゴニストは、ＫＳ及び他の腫瘍にともなう血管新生のリスクを低減するうえで有用であるばかりでなく、細胞生存率の低下を防止し、内皮バリアの完全性を保護することによって、臓器不全及び敗血症などの重篤な炎症状態にともなう潜在的に重大な状態である血管漏出を防止するうえでも有用であり得る。ＴＬＲ３拮抗作用は、また、フラビウイルス科（例えば、Ｄｅｎｇｕｅ，ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ）、フロビウイルス科（Ｅｂｏｌａ，Ｍａｒｂｕｒｇ）、ブニヤウイルス科（例えば、Ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ，Ｎａｉｒｏｖｉｒｕｓ，Ｐｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ）、及びアレナウイルス科（例えば、Ｌｕｊｏ，Ｌａｓｓａ，Ａｒｇｅｎｔｉｎｅ，Ｂｏｌｉｖｉａｎ，Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ出血熱（Ｓｉｈｉｂａｍｉｙａら、Ｂｌｏｏｄ  １１３：７１４〜７２２，２００９））の多数の属により引き起こされるウイルス出血熱などの内皮細胞病変を含むウイルス感染症においても有益でもあり得る。
【０２６４】
（実施例２０）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストのカニクイザル及びマウスＴＬＲ３との交差反応性
実施例２で述べたようにＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイを用いて、カニクイザル又はマウスＴＬＲ３に対する活性を評価した。カニクイザル（配列番号２１７）及びマウスＴＬＲ３  ｃＤＮＡ（配列番号１６１）を全血から増幅し、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の中にクローニングし、及び上述のように発現させた。ｍＡｂ  １５ＥＶＱは、ヒトＴＬＲ３  ＮＦ−κＢ及びＩＳＲＥアッセイにおけるそれぞれ０．４４及び０．６５μｇ／ｍＬのＩＣ５０と比較して、ｃｙｎｏ  ＮＦ−κＢ及びＩＳＲＥアッセイにおいてそれぞれ４．１８μｇ／ｍＬ及び１．７４μｇ／ｍＬのＩＣ５０を有していた。アイソタイプコントロール抗体はこれらのアッセイでは何の作用も示さなかった。
【０２６５】
（実施例２１）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストの治療用投与は、急性の致命的なウイルス感染症を防御する。
実施例１４は、インフルエンザＡ感染症に対するＴＬＲ３抗体アンタゴニストによる予防的な治療（−１、４、８、及び１２日目に投与）について述べている。この実施例は、ＴＬＲ３抗体アンタゴニストの治療用投与（インフルエンザＡ感染後臨床症状の発症３日後）が生存率の向上において効果的であるということを実証している。
【０２６６】
モデル
動物へのｍＡｂ  ５２４９の投与をインフルエンザＡの感染後３日後に行ったこと、及び投与した動物が８週齢であったことを除いて、インフルエンザＡウイルスチャレンジモデルを、実施例１４に述べたように急性の致命的なウイルス感染症のモデルとして使用した。抗マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロールｍＡｂはＢｉｏＬｅｇｅｎｄからのものであった。インフルエンザＡの感染後３、７及び１１日に動物に投与した。
【０２６７】
この実験では、生存率、毎日の臨床スコア、及び体重変化を評価した。ｍＡｂ  ５２４９を投与したＣ５７Ｂｌ／６マウス及びＴＬＲ３  ＫＯマウスは、抗マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロールｍＡｂ及びインフルエンザウイルスを接種したＣ５７ＢＬ／６マウスと比べて、両方とも生存率の統計的に有意な増加（ｐ＜０．０２８及びｐ＜０．００１）を示した（図２５）。抗マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロールｍＡｂ及びインフルエンザＡを投与したＣ５７ＢＬ／６マウスと比較した場合、ｍＡｂ  ５２４９を投与したＣ５７ＢＬ／６マウス及びＴＬＲ３  ＫＯ動物において臨床的なスコアは低下し（図２６）、体重は増加した（図２７）。これらの結果は、ＴＬＲ３抗体アンタゴニストが急性致死性インフルエンザウイルス感染モデルにおける臨床症状及び死亡率を低下させることを示すものであり、ＴＬＲ３アンタゴニストが急性の感染状態にあるヒトに防御を与えることを示唆するものである。
【０２６８】
（実施例２２）
Ｘ線結晶法によるＴＬＲ３抗体アンタゴニストのエピトープ及びパラトープ。
ヒトＴＬＲ３細胞外ドメインを、ｍＡｂ  １５ＥＶＱ、ｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びｍＡｂ  ｃ１０６８のＦａｂｓと複合体の状態で結晶化させた。
【０２６９】
方法
タンパク質の発現及び精製。
ＴＬＲ３  ＥＣＤ（配列番号２のアミノ酸１〜７０３）の３つのＦａｂの発現及び精製は上述の通りであった。
【０２７０】
ＴＬＲ３  ＥＣＤの３つのＦａｂの四次複合体の作製
１ＴＬＲ３  ＥＣＤ：１．１Ｆａｂのモル比に対応させて、４ｍｇのヒトＴＬＲ３  ＥＣＤを２．４ｍｇのそれぞれのＦａｂと混合し、４℃で３．５時間インキュベートした。複合体をアニオン交換クロマトグラフ法により２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ  ８．５）、１０％のグリセロール（緩衝液Ａ）で平衡化したＭｏｎｏＱ５／５０ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で精製し、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ  ８．５）、１０％のグリセロール、１ＭのＮａＣｌ（緩衝液Ｂ）により溶離した。１．７４ｍＬ中のほぼ２．４８ｍｇの複合体を緩衝液Ａにより１０ｍＬまで希釈し、カラム上に１ｍＬ／ｍｉｎで充填し、Ｂ濃度の０〜４０％の直線的な勾配により４０カラム容積にわたって溶離した。５回の連続的な精製操作を行った。ピーク１由来の区分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ−１５ｍＬのＵｌｔｒａ−３００００  ＭＷＣＯ及びＭｉｃｒｏｃｏｎ  ３００００  ＭＷＣＯにより２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ  ８．５）／２７ｍＭのＮａＣｌ／１０％グリセロール中に、１４．４９ｍｇ／ｍＬまで濃縮した（吸光係数：Ａ280（１ｍｇ／ｍＬ）＝１．３１）。
【０２７１】
結晶化
Ｃｏｒｎｉｎｇプレート３５５０（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）を用いて等容量のタンパク質及びリザーバ溶液を、シッティングドロップ法で分注するＯｒｙｘ４自動タンパク質結晶化ロボット（Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、自動化結晶化スクリーニングを行った。初期のスクリーニングは、Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ＨＴ（ＨＲ２−１３０，Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｌｉｓｏ  Ｖｉｅｊｏ，ＣＡ）により実施した。いくつかの条件から、小さい結晶を使用してシードを生成し、次いでこれをＭｉｃｒｏｓｅｅｄ−Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（ＭＭＳ）で使用した。小さい結晶を与える初期のスクリーニング条件に基づき、何回かの精密化を行った。ＭＭＳに使用するリザーバ条件は、精密化後に小さい結晶を与えた条件に基づくものであった：１８〜２８％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）３３５０、１ＭのＬｉＣｌ、ｐＨ４．５及び２．０〜２．９Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、５％のＰＥＧ４００、ｐＨ４．５、及び探索したｐＨ及び異なる添加物。成分を１タンパク質溶液：０．２５シード原料：０．７５リザーバ溶液の容量比で分注することにより、Ｏｒｙｘ４自動タンパク質結晶化ロボット（Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、ＭＭＳ結晶化スクリーニングを行った。〜１０Åの分解能で回折する結晶は、０．１Ｍの酢酸Ｎａ（ｐＨ  ４．５）、２．９Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、５％メチル−ペンタン−ジオール（ＭＰＤ）及び０．１Ｍの酢酸Ｎａ（ｐＨ  ４．５）、２６％のＰＥＧ３３５０、１ＭのＬｉＣｌから成長させたものであった。
【０２７２】
結晶の分解能を改善するための試みとして、上記の条件を有するＭＭＳを、Ｈａｍｐｔｏｎ  Ａｄｄｉｔｉｖｅ  Ｓｃｒｅｅｎ  ＨＲ２−４２８（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｌｉｓｏ  Ｖｉｅｊｏ，ＣＡ）から選択された成分を容積比：１タンパク質溶液：０．１２５シード原料：０．２添加物溶液：０．６７５リザーバ溶液で用いる、添加物スクリーニングと組み合わせた。ＭＭＳと、０．１Ｍの酢酸Ｎａ（ｐＨ  ４．５）、２８％のＰＥＧ  ３３５０、１ＭのＬｉＣｌ、及び３０ｍＭのＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを含有する溶液からの添加物スクリーニングとの組み合わせを適用した後、Ｆａｂと複合体形成し、約５Åの分解能で回折する、ＴＬＲ３  ＥＣＤのＸ線品質の結晶を得た。
【０２７３】
ＴＬＲ３  ＥＣＤ四次複合体のＸ線データ収集
Ｘ線データを収集するために、結晶（サイズ約１．０×０．５×０．１ｍｍ3）を、合成母液（０．１Ｍの酢酸Ｎａ（ｐＨ  ４．５）、２８％  ＰＥＧ  ３３５０、１ＭのＬｉＣｌ、１６％グリセロール）中に数秒浸漬し、窒素流中１００Ｋで瞬間凍結した。Ｘ線回折データを収集し、Ｏｓｍｉｃ（商標）ＶａｒｉＭａｘ（商標）共焦光学系、Ｓａｔｕｒｎ  ９４４  ＣＣＤ検出器、及びＸ−ｓｔｒｅａｍ（商標）２０００低温冷却システムを備えたＲｉｇａｋｕ  ＭｉｃｒｏＭａｘ（商標）−００７ＨＦ微小焦点Ｘ線発生装置（Ｒｉｇａｋｕ，Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）を使用して処理した。回折強度を、１／２度の像当たり１ｍｉｎの露出時間、５Åの最大分解能で２５０°（結晶回転）にわたって検出した。Ｘ線データを、プログラムＤ*ＴＲＥＫ（Ｐｆｌｕｇｒａｔｈ，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ，５５：１７１８〜１７２５，１９９９）により処理した。この結晶は、単位セルパラメーター：ａ＝２１４．９０Å、ｂ＝１４２．０８Å、ｃ＝１２５．０４Å、及びβ＝１０３．１７の単斜晶系空間群Ｃ２に属する。この非対称ユニットには１分子の複合体を含む。Ｘ線データ統計値を表１３に示す。
【０２７４】
【表２１】
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【０２７５】
構造決定
ＴＬＲ３  ＥＣＤ−Ｆａｂ  １５ＥＶＱ−Ｆａｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶ−Ｆａｂ  ｃ１０６８の結晶構造を、Ｐｈａｓｅｒ（Ｒｅａｄ，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５７：１３７３〜１３８２，２００１）を用い分子置換により決定した。探索モデルはＴＬＲ３  ＥＣＤ（すべてのグルカンを取り除いた、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）構造番号１ｚｉｗ，Ｃｈｏｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：５８１〜５８５，２００５）であり、３つのＦａｂの高分解能結晶構造を決定した（これらのＦａｂ構造に対する結晶データ及び精密化統計値の要約としては表１３を参照のこと）。Ｆａｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶのエルボー角度は、遊離形態におけるものから著しくはずれていることが判明した。エルボー角度を約５°間隔で調整することにより、一連のＦａｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶモデルを生成し、その１つが電子密度とよく一致することが判明した。構造精密化をＰＨＥＮＩＸ（Ａｄａｍｓら、Ｊ．Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔ．１１：５３〜５５，２００４）により行った。ＴＬＲ３  ＥＣＤに対して構造を、Ｆａｂ及び１３個の剛体セグメント（精密化で使用される定義：３０〜６０、６１〜１０８、１０９〜１５６、１５７〜２０６、２０７〜２５７、２５８〜３０７、３０８〜３６３、３６４〜４１５、４１６〜４６４、４６５〜５１４、５１５〜５７０、５７１〜６１８、６１９〜６８７）に対する剛体ドメイン（各Ｖ又はＣドメイン）として、それぞれのＦａｂ剛体に対する１つのＢ因子及びＴＬＲ３  ＥＣＤ全体に対する単一のＢ因子によって精密化した。
【０２７６】
Ｆａｂ剛体のそれぞれに対して並進／回転／回転を伴った並進（ＴＬＳ）精密化を導入し、配列番号２の残基３３０において、ＴＬＲ３  ＥＣＤを２つのＴＬＳセグメントに分割した。グリカン密度は１５個のＮ−グリコシル化部位の１０個に対して目視可能であった。次いで、ヒトＴＬＲ３細胞外ドメイン（Ｃｈｏｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：５８１〜５８５，２００５，ＰＤＢ構造番号１ｚｉｗ）の結晶構造からの炭水化物モデルを付加した。ＴＬＲ３  ＥＣＤ中の短い見えないセグメント（配列番号２の残基３３７〜３４２）に対する密度が剛体の精密化後に目視可能となった。それは、細胞外構造（２ａ０ｚＢｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０２：１０９７６〜１０９８０，２００５，ＰＤＢ構造番号２ａ０ｚ）からの対応するセグメントにより充填されていた。ＴＬＲ３  ＥＣＤのＣ末端は、２ａ０ｚのそれに釣り合う追加の密度を含んでいた。次いで、このセグメント（配列番号２の６４７〜７０３）を２ａ０ｗの（残基６４７〜６８７）により置き換えた。このように、ＴＬＲ３  ＥＣＤモデルは、ＴＬＲ３構造体１ｚｉｗと２ａ０ｚとの間のハイブリッドであり、１３個の剛体セグメント（アミノ酸範囲：３０〜６０、６１〜１０８、１０９〜１５６、１５７〜２０６、２０７〜２５７、２５８〜３０７、３０８〜３６３、３６４〜４１５、４１６〜４６４、４６５〜５１４、５１５〜５７０、５７１〜６１８、６１９〜６８７）として精密化されたものであった。
【０２７７】
Ｆａｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶのＬＣＤＲ３は、遊離形態と異なる立体配置を見掛け上とっていた。マルチスタートシミュレーションアニーリングをＰＨＥＮＩＸの標準的なパラメータにより行った。このＬＣＤＲ３のモデルを電子密度マップで目視的に検査し、「最もよく合う」立体配置を元のモデル上に接合した。精密化のプロセスを、計算開始の前に脇に置いておいた反射の５％に対してＲfreeによりモニターした。最終回では、それぞれの残基に対して１つのＢ因子を含めた。モデル検査、並びにＦａｂ及びタンパク質−タンパク質界面における側鎖のエルボー領域の手動による再組立てを、ＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６０：２１２６〜３２，２００４）を用いて行った。最終のＲcryst及びＲfreeは、５．０Å対する全１５，７９２個の独立の反射のそれぞれについて２６．８％及び３０．０％であった。精密化統計値を表１３及び１４に示す。
【０２７８】
結果
ＴＬＲ３  ＥＣＤ−３つのＦａｂ四次複合体の分子構造
複合体の全体的な分子構造を図２８に示す。非対称単位中に１つのＴＬＲ３  ＥＣＤ及びそれぞれのＦａｂの１分子が存在する。ＴＬＲ３  ＥＣＤに対する構造モデルは、ｈｕＴＬＲ３（配列番号２）の３０〜６８７個のすべての残基を含む。３つのＦａｂに対しては、それぞれの非結合形からのすべての残基を、溶媒イオン及び水分子を除いて含めた。ＴＬＲ３  ＥＣＤ分子は、全体のトポロジー（１ｚｉｗに対して０．７９Åのｒｍｓ、６１３Ｃα’、及び２ａ０ｚに対して１．３７Å、５９５Ｃα’）において以前に報告された構造と極めて類似している。このＦａｂ構造は、方法に記載のＦａｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶのＬＣＤＲ３、並びにＴＬＲ３  ＥＣＤ／Ｆａｂ界面におけるエルボー領域及び一部の側鎖を除いて、それぞれの非結合形とすべて同一である。
【０２７９】
【表２２】
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【０２８０】
最高の分解能シェルに対する値は（）中のものである。
a  Ｒmerge＝Σ｜Ｉ−＜Ｉ＞｜／ΣＩ、式中、Ｉは測定された反射の強度であり、＜Ｉ＞はこの反射のすべての測定値の平均強度である。
b  Ｒcryst＝Σ｜｜Ｆobs｜−｜Ｆcalc｜｜／Σ｜Ｆobs｜、式中、Ｆobs及びＦcalcは測定及び計算された構造因子であり、Ｒfreeは精密化の前に反射のランダムに選択された５％の組に対して計算されたものである。
c  ラマチャンドランプロットをＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ（Ｄａｖｉｓ，Ｉ．Ｗ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３２：Ｗ６１５−９，２００４）により計算した。
【０２８１】
エピトープ及びパラトープ
ＴＬＲ３  ＥＣＤと３つのＦａｂとの間の結合に関与する残基を、図２８Ｂに示す。Ｆａｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶはＴＬＲ３  ＥＣＤのＮ末端近くで結合した。立体配置エピトープは、ＴＬＲ３  ＬＲＲ  ３〜７からの残基（配列番号２のアミノ酸１００〜２２１）から構成されるものであった。Ｆａｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶの結合は、抗原及び抗体上でそれぞれほぼ９２８Å2及び８９６Å2を埋め込んだ。Ｆａｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶに対しては、結晶構造は、次のＴＬＲ３（配列番号２）エピトープ残基：Ｓ１１５、Ｄ１１６、Ｋ１１７、Ａ１２０、Ｋ１３９、Ｎ１４０、Ｎ１４１、Ｖ１４４、Ｋ１４５、Ｔ１６６、Ｑ１６７、Ｖ１６８、Ｓ１８８、Ｅ１８９、Ｄ１９２、Ａ１９５、及びＡ２１９を同定した。Ｆａｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶに対しては、結晶構造は、次のパラトープ残基：軽鎖（配列番号２１１）：Ｇ２８、Ｓ２９、Ｙ３０、Ｙ３１、Ｅ４９、Ｄ５０、Ｙ９０、Ｄ９１及びＤ９２、重鎖（配列番号２１４）：Ｎ３２、Ｑ５４、Ｒ５６、Ｓ５７、Ｋ５８、Ｙ６０、Ｙ１０４、Ｐ１０５、Ｆ１０６及びＹ１０７を同定した。
【０２８２】
Ｆａｂ  １５ＥＶＱ及びＦａｂ  ｃ１０６８は、Ｃ末端近くのＬＲＲ  １５−２３（配列番号２のアミノ酸４０６〜６３５）に懸る、非折りたたみ型エピトープを結合していた。（図２８）。Ｆａｂ  １５ＥＶＱは、抗原及び抗体上でそれぞれ１０８０Å2及び１０６４Å2を埋め込み、Ｆａｂ  ｃ１０６８は抗原及び抗体上でそれぞれ９６３Å2及び９１４Å2を埋め込んでいた。Ｆａｂ  １５ＥＶＱに対するエピトープは、配列番号２で示されるＴＬＲ３の残基Ｋ４１６、Ｋ４１８、Ｌ４４０、Ｎ４４１、Ｅ４４２、Ｙ４６５、Ｎ４６６、Ｋ４６７、Ｙ４６８、Ｒ４８８、Ｒ４８９、Ａ４９１、Ｋ４９３、Ｎ５１５、Ｎ５１６、Ｎ５１７、Ｈ５３９、Ｎ５４１、Ｓ５７１、Ｌ５９５及びＫ６１９を覆う。Ｆａｂ  １５ＥＶＱに対しては、結晶構造は、次のパラトープ残基：軽鎖（配列番号４１）：Ｑ２７、Ｙ３２、Ｎ９２、Ｔ９３、Ｌ９４及びＳ９５、重鎖（配列番号２１６）：Ｗ３３、Ｆ５０、Ｄ５２、Ｄ５５、Ｙ５７、Ｎ５９、Ｐ６２、Ｅ９９、Ｙ１０１、Ｙ１０４及びＤ１０６を同定した。
【０２８３】
Ｆａｂ  ｃ１０６８に対しては、結晶構造は、ＴＬＲ３（配列番号２）上の次のエピトープ残基：Ｅ４４６、Ｔ４４８、Ｑ４５０、Ｒ４５３、Ｒ４７３、Ｎ４７４、Ａ４７７、Ｌ４７８、Ｐ４８０、Ｓ４９８、Ｐ４９９、Ｑ５０３、Ｐ５０４、Ｒ５０７、Ｄ５２３、Ｄ５２４、Ｅ５２７、Ｅ５３０、及びＫ５５９を同定した。Ｆａｂ  ｃ１０６８に対しては、結晶構造は、次のパラトープ残基、軽鎖：Ｈ３０、Ｎ３１、Ｙ３２、Ｎ５０、Ｅ６６、Ｓ６７、Ｇ６８（ｇｌｙｃ）、重鎖：Ｔ３０、Ｔ３１、Ｙ３２、Ｗ３３、Ｈ３５、Ｅ５０、Ｎ５２、Ｎ５４、Ｎ５５、Ｒ５７、Ｎ５９、Ｖ９９、Ｍ１０２、Ｉ１０３、及びＴ１０４を同定した。
【０２８４】
中和の機構及びＴＬＲ３機能との関連
ｍＡｂ  １５ＥＶＱ：ｍＡｂ  １５ＥＶＱエピトープは、ＴＬＲ３残基Ｎ５１７、Ｈ５３９及びＮ５４１を含み、これらはＣ末端二本鎖ＲＮＡ結合部位と折りたたみする。（Ｂｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：８７９２〜７，２００６）．いかなる特定の理論からも束縛されることを望むものではないが、このように、ｍＡｂ  １５ＥＶＱは、リガンドに対して結合するＴＬＲ３に対して競合し、及びシグナル伝達単位の形成に必要とされる、リガンドにより誘起される受容体二量体化を防止すると考えられる。（Ｌｉｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２０：３７９〜８１，２００８）。図２９は、ｍＡｂ  １５ＥＶＱに対するこの直接の競合機構を図示する。抗体濃度に依存して、この機構は、ポリ（Ｉ：Ｃ）の全阻害又は二本鎖ＲＮＡにより誘起されるＴＬＲ３活性化を生じる。
【０２８５】
ｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びｍＡｂ  ｃ１０６８：図３０に示すように、これらの２つの抗体は二本鎖ＲＮＡリガンドとの直接的な衝突を持たない。したがって、これらがＴＬＲ３機能をｍＡｂ  １５ＥＶＱのそれに類似の機構で中和することはありえない。Ｆａｂフラグメントもリガンドから離れて配向する（図３０）。構造的に、ｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びＦａｂ  ｃ１０６８は、両方とも機能を損なわずにシグナル伝達単位（ＳＵ）に結合することができる。立体的に、ｍＡｂ分子の２つのＦａｂフラグメントが、２つのＴＬＲ３分子を１つのＳＵ中で同時に結合し、ひいては二本鎖ＲＮＡ介在型ＴＬＲ３二量体化を防止し得るということはありえない。いかなる特定の理論からも束縛されることを望むものではないが、ＴＬＲ３へのｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶ又はｍＡｂ  ｃ１０６８の結合が、抗体と隣接するシグナル伝達単位との間の立体的な衝突により、シグナル伝達単位のクラスター形成を防止すると考えられる。二本鎖ＲＮＡへのＴＬＲ３の結合は、二本鎖ＲＮＡ：ＴＬＲ３複合体により定義されるシグナル伝達単位に限定されない（Ｌｉｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２０：３７９〜８１，２００８）。多数のＳＵのクラスター形成がシグナル伝達の増強を生じる得、又は効率的なＴＬＲ３シグナル伝達がこのクラスター形成を必要とし得る。ｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びｍＡｂ  ｃ１０６８の配置が、クラスター形成をブロックし、ＴＬＲ３活性の中和を生じることができる。それゆえ、抗体の最大中和効果は、抗体結合によるＳＵの分離の度合いに依存する。図３０に図示するように、ｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶは、ｍＡｂ  ｃ１０６８よりも大きい分離を引き起こし、このことがｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶのより大きい効能に転換する可能性がある。このことは、ｍＡｂ  ｃ１０６８及びｍＡｂ  １５ＥＶＱが、飽和濃度においてそれぞれ約５０％及び１００％のＴＬＲ３中和を生じることができ、ｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶが中間の活性を呈するという観察と一致する。このように、構造及びＴＬＲ３中和を組み合わせた研究は、二本鎖ＲＮＡ：ＴＬＲ３シグナル伝達単位がクラスターを形成して、効率的なシグナル伝達を達成する、ＴＬＲ３シグナル伝達モデルを示唆する。ｍＡｂ  １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びｍＡｂ  ｃ１０６８は、また、リガンド結合又は受容体二量体化を妨害せずにＴＬＲ３シグナル伝達を部分的に調節することができる抗体の類も定義する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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