(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの水性の連続相および少なくとも１つの油性の分散相を含み、
分散相が、１０nm以上２００nm以下の平均径を有し、少なくとも１つの植物起源の天然油およびC8〜C18の飽和脂肪酸グリセリドに富む少なくとも１つの結晶性油で構成される少なくとも１つの生体適合性の油の滴で構成され、
前記油の滴が、６４０から９００nmの間の波長において吸収および放射する少なくとも１つの親油性蛍光体を含み、
前記滴が、滴の周縁に位置する界面活性剤層により安定化されており、
前記層が、少なくとも１つの両親媒性の界面活性剤および少なくとも１つのステルス性補助界面活性剤を混合物として含み、
前記ステルス性補助界面活性剤が、ポリエチレンオキシド（PEO）単位の数が２〜５００の範囲であるPEO鎖で完全にまたは部分的に構成される親水性部分を有する両親媒性分子、および多糖類から選択され、
前記C8〜C18の飽和脂肪酸グリセリドに富む少なくとも１つの結晶性油が、以下の質および量の組成：
C8：０．１〜０．９％
C10：０．１〜０．９％
C12：２５〜５０％
C14：１０〜２４．９％
C16：１０〜２４．９％
C18：１０〜２４．９％
を有することを特徴とする水中油型の蛍光エマルジョン。
【請求項２】
エマルジョン内の油滴のサイズが、１０から８０nmの間（境界値を含む）であることを特徴とする、請求項１に記載のエマルジョン。
【請求項３】
植物起源の天然油が大豆油であることを特徴とする、請求項１または２に記載のエマルジョン。
【請求項４】
植物起源の天然油／C8〜C18の飽和脂肪酸グリセリドに富む結晶性油の重量比が、１０／９０から９０／１０の間（境界値を含む）の範囲であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のエマルジョン。
【請求項５】
両親媒性界面活性剤が、８〜３０個の炭素原子を含む直鎖状もしくは分岐鎖状で飽和または不飽和の鎖を含む親油性部分を有する化合物から選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のエマルジョン。
【請求項６】
界面活性剤が、リン脂質、コレステロール、リゾ脂質、スフィンゴミエリン、トコフェロール、糖脂質、ステアリルアミン、天然または合成起源のカルジオリピン；エーテルまたはエステル官能性による親水性の基に結合している脂肪酸で構成される分子；重合脂質、ポリエチレンオキシド（PEG）の短鎖にコンジュゲートしている脂質；糖エステルから選択され、前記界面活性剤が単独または混合物として用いられ得ることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のエマルジョン。
【請求項７】
界面活性剤が、大豆レシチン、リン脂質およびコレステロールから選択されることを特徴とする、請求項６に記載のエマルジョン。
【請求項８】
親油性蛍光体が、６４０から９００nmの間で吸収および放射する基で官能化した脂肪酸、スフィンゴ脂質、ステロイド、リポ多糖類およびリン脂質から選択されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載のエマルジョン。
【請求項９】
親油性蛍光体が、シアニン、ローダミン、フルオレセイン、クマリン、スクアライン、アズレン、キサンテン、オキサジン、4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン、1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドジカルボシアニンパークロレートおよび1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドトリカルボシアニンイオダイドから選択されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載のエマルジョン。
【請求項１０】
ステルス性補助界面活性剤が、ポリエチレングリコール／ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）コンジュゲート化合物、ポリエチレングリコールの脂肪酸エーテル、ポリエチレングリコールの脂肪酸エステルおよびエチレンオキシド／ポリエチレンオキシドブロックコポリマーから選択されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のエマルジョン。
【請求項１１】
エマルジョンの油滴の周縁に位置する界面活性剤層が、興味対象の生物活性をターゲティングする少なくとも１つのターゲティング剤を含み、
前記ターゲティング剤が、生物学的リガンドに共有結合している親水性部分を有する両親媒性グラフト補助界面活性剤であり、以下の式（I）
【化１】
0005837279.tif 000008
［式中：
- Aは、両親媒性グラフト補助界面活性剤（CoTA）の親油性部分であり、
- X1およびX2は、同一であるか、または異なって、前記補助界面活性剤（CoTA）の親水性部分を構成し、ポリオキシエチレンまたはデキストラン単位で構成される鎖から選択されるフレキシブルスペーサーアームで構成され；
- Y1およびY2は、同一であるか、または異なって、それぞれX1およびB1、X2およびB2に共有結合で結合し得るアミド基、オキシム基およびチオエーテル基から選択され；
- B1およびB2は、同一であるか、または異なって、生物学的リガンドであり、末端の１つは、それぞれX1、X2と形成する共有結合に含まれ；
- nは、１から２０の間（境界値を含む）の整数であり；
- qは、０または１に等しい整数であり；
- mは、０から２０の間（境界値を含む）の整数であるが、q =０の場合、m =０と理解され；
- pは、０から１０の間（境界値を含む）の整数であり；
- rは、０から１０の間（境界値を含む）の整数であり；
- pおよびrが共に０の場合を除く］
の化合物から選択されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のエマルジョン。
【請求項１２】
式（I）のターゲティング剤の単位B1／B2として用いられ得る生物学的リガンドが、
i）ペプチド、タンパク質、抗体；単糖類、オリゴ糖類、多糖類；オリゴヌクレオチド、DNA；ターゲティング活性が興味対象の領域の細胞表面において過剰発現している受容体によるこれらのリガンドの分子認識による有機分子、有機金属複合体；
ii）酵素活性のためのマーカーである生物学的リガンド、および蛍光の阻害剤からラベルを隔てるジスルフィドブリッジを含むリガンド
から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載のエマルジョン。
【請求項１３】
エマルジョンの連続相が、水および／または生理学的に許容される緩衝液あるいは塩化ナトリウム溶液で構成される水性相であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のエマルジョン。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項で定義された少なくとも１つの蛍光エマルジョンを含むことを特徴とする、興味対象の生物活性の診断のための診断試薬。
【請求項１５】
インビボの診断試薬であることを特徴とする、請求項１４に記載の試薬。
【請求項１６】
蛍光イメージングによりインビボで興味対象の生物活性を診断するための診断試薬の調製のための、ならびに／または治療用手段の開発および最適化を支援するための診断試薬の調製のための請求項１〜１３のいずれか１項で定義された少なくとも１つの蛍光エマルジョンの使用。
【請求項１７】
時間分解蛍光イメージングによりインビボで興味対象の生物活性を診断するための診断試薬の調製のための請求項１〜１３のいずれか１項で定義された少なくとも１つの蛍光エマルジョンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非侵襲性のインビボ機能的イメージングの分野に用い得るナノエマルジョンの形態にある蛍光プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
インビボにおいて、最近の光学的方法の発展は、機能的イメージングの新たな地平を開いた。現在、リアルタイムでかつ非侵襲的に、発光分子に起こっていること、それらの生体内分布を追うこと、診断を確立すること、およびこれらの分子により治療の効果を評価することが可能となる。光学イメージングは、磁気共鳴イメージング（MRI）、陽電子射出断層撮影（PET）イメージングおよび単一光子放射形コンピュータ断層撮影（SPECT）イメージングのような他の機能的イメージング技術と比較して、いくつかの利点を有する：
-  放射性分子の取り扱いを避け、そしてそれらに伴う制約および危険（放射線防護、廃棄物の取扱い、PETラベルのためのシンクロトロン線源）を除外する；
-  設備に多額の費用を必要としない；
-  注射されるラベル量の点で、MRIと比較して良好な感度を有する。
【０００３】
これらの光学的機能的イメージング技術について短期的に構想された適用は、これらの技術が長期的なモニタリングを可能にするので、小動物において、腫瘍またはアテローム斑を標的にするためのバイオマーカーの発見、新しい治療薬の発見および評価、ならびに毒性検討において犠牲となる動物の数の減少のための支援である。より短期的には、ヒトにおける適用は、例えば腫瘍切除の境界をよりよく定めることを可能にする目的で外科手術の術中において構想された。他に、皮膚病学における乳癌、または内視鏡検査による前立腺癌もしくは前癌性の結腸ポリープの診断のための道具として中期的な適用が探られる。
【０００４】
蛍光イメージングは、光学プローブの事前の注射を必要とし、これは核医学におけるトレーサー、またはMRIもしくはX線断層撮影における造影剤との等価物である。この光学プローブは、一般に、少なくとも蛍光の吸収および放射の原因である物質に対応する蛍光ラベルで構成される分子の集まりである。このラベルは、例えば、有機蛍光体、ランタニド錯体、または他の発光半導性ナノクリスタル（CdSe、CdTe、InP、Siなどのような「量子ドット」）であり得る。
【０００５】
これらの光学プローブは、１つ以上の次の物質：
a）特定の生物学的工程をイメージングし得る生物学的リガンド。そのようなリガンドとしては次のものが挙げられる：
i）生物学的ターゲティングリガンド：ある細胞（例えば、S. Achilefuによる文献（Technology in Cancer Research & Treatment, 2004, 3, 393-408）に記載される腫瘍細胞）またはある器官の特異的認識を可能にする生物学的物質（抗体、ペプチド、糖類など）または化学的物質（例えば、葉酸）、
ii）所定の生物活性、例えば、酵素活性のためのマーカーである生物学的リガンド。例えば、これらの生物学的リガンドは、ラベルの蛍光の阻害剤がグラフトされる末端において所定のプロテアーゼにより切断され得るペプチドであろう。このタイプのリガンドは、C.H.Tungによる文献（Biopolymers, 2004, 76, 391-403）に報告されるように、プロテアーゼの酵素活性を特異的に撮像することを可能にする。別の例は、ラベルの蛍光の阻害剤から前記ラベルを隔てるジスルフィドブリッジを含む生物学的リガンドからなる。そして、この生物学的リガンドにより、例えば、番号FR 2 888 938のもとに公開されるフランス特許出願に記載されるように、細胞における光学プローブの内部移行を特異的に撮像することが可能となる；
b）ステルス剤：これは、光学プローブを免疫系に認識されないようにし（ステルス）、生体内での循環時間を増加させ、その排出を遅らせるために光学プローブに添加される物質である；
c）「集合ベクター（assembly vector）」：これは、蛍光ラベルおよび／または生物学的ターゲティングリガンドおよび／またはステルス剤および／または１つもしくは他の機能性（例えば、薬物の送達、他のイメージング様式、治癒機能）を集めることを可能にできる物質である。
【０００６】
この一般的原理に基づいて、プローブの４つの主なタイプが、小動物における非侵襲性蛍光イメージングについて文献に記載されている。
光学プローブの第１の主なタイプは、ラベルとして、生物学的リガンドに直接グラフトされる１つの（またはそれより多い）有機蛍光体を有する光学プローブに相当する。蛍光イメージングに用いられた最初の有機蛍光体、ICG（インドシアニングリーン）は、非常に初期に「裸」（蛍光体単独の注射）で、血管における血管新生および循環のイメージングのために用いられたが、これらの有機蛍光体は、その後さまざまな細胞をターゲティングするために、タンパク質または抗体にグラフトされた。しかしながら、これらの大きな分子への結合は、ターゲティングおよび薬物動態の点で欠点を有し、そしてこの理由のために、より最近では、小さいペプチドでの蛍光体の官能化が好ましい。
【０００７】
一般に、この第１のタイプの光学プローブは、以下の欠点を有する：
-  生物学的リガンドは、少数の蛍光ラベルでしか標識されない（概して、１つのペプチドに対して１つの蛍光体、１つの抗体に対して３〜４）。蛍光体の数を増加させるために、それにもかかわらず、複合ベクター分子構造を使用することが必要である（以下を参照されたい）。それゆえ、それらは、弱い蛍光シグナルをもたらす光学プローブである；
-  吸収および放射の波長が近赤外域（６５０から９００nmの間）内であり、光吸収および生物組織における散乱についての光学的領域（window）が最小である、用いられる有機蛍光体は、一般にフォトブリーチに対し、特に水性緩衝液中において、感受性がある（経時的な蛍光の損失）。生体分子にグラフトでき、水性緩衝液に可溶性の有機蛍光体の有効性は、この波長範囲において、さらに限られている。（例：Amershamにより販売されるシアニン、InvitrogenによりAlexa（登録商標）の商品名で販売される一連の製品）、これらは非常に高価であるのに対して、多くの他の安価な近赤外線用の蛍光体は、他の供給業者から入手可能である。しかし、残念ながら、それらは水性媒体中で溶解できないので、この適用に使用できない；
-  光学プローブは、それらがごくわずかしか標的にたどり着かないので、多量に静脈注射できなければならない。実際、標的-リガンド認識の動態は、しばしば遅く、生体による排出過程と競合する。ステルス剤の添加により、この点は改善し得る。それにもかかわらず、これがこれらの光学プローブの第４の欠点である；
-  （任意に、生物学的リガンド当たりの蛍光ラベルの数を増加するか、または多様相（multimodality）もしくは薬物の送達のような他の機能を追加するような）ステルス剤の添加は、光学プローブの様々な要素を集めるために「集合ベクター」の使用を必要とする。そして、これらの光学プローブの合成は、より大いに複雑となる。
【０００８】
光学プローブの第２の主なタイプは、ラベルとして、発光半導性ナノクリスタル（CdSe、CdTe、InP、Siなどのような「量子ドット」）を有し、生物学的リガンドで官能化された光学プローブに相当する。
【０００９】
これらのナノ粒子の例外的な光学特性（吸収、放射、蛍光の量子収量）により、過去数年にわたり、それらは小動物における非侵襲性イメージングにとって好ましいラベルであった（X. Michaletら, Science, 2005, 307, 538-544）。しかしながら、これらの実験中は毒性が見られなかったが、これらのナノクリスタルのコアにおける重金属の存在は、ヒトにおける臨床適用を構想した場合に、かなり躊躇させるものである（R. Hardman, Environmental Health Perspectives, 2006, 114, 165-172）。生物組織とのそれらの相互作用特性の制御もまた、非侵襲性イメージングのためのこれらのプローブの使用を現在、阻害する。実際に、これらの特性は、これらのナノ粒子の表面の状態（ポリエチレングリコール（PEG）鎖の存在）およびそれらのサイズに高度に依存する。
【００１０】
光学プローブの第３のタイプは、ラベルとして、例えば、有機蛍光体またはランタニドキレートを被包し、および／またはこれらがグラフトされたシリカのナノ粒子のような酸化物の無機ナノ粒子を有する光学プローブに相当する。このタイプのラベルの合成は、文献に十分に記載されているが、現在まで、ナノ医学におけるP.Prasadのチームによる研究（I.Royら, PNAS, 2005, 102(2), 279-284）以外では、ほとんどの研究において、このタイプの光学プローブはインビボで使用されていない。上記の半導性ナノクリスタルのように、これらの無機ナノ粒子は、ステルス剤をそれらにグラフトするために、非常に高度な表面化学を必要とし、これによりそれらは生体に適合する。
【００１１】
最後に、光学プローブの第４の主なタイプは、ラベルとして、有機蛍光体またはランタニドキレートを被包し、および／またはこれらがグラフトされた有機ナノ粒子を有する光学プローブに対応する。
これらのナノ粒子のうち、以下のものが列挙される：
-  例えば、V. Holzapfelらによる文献（J. Phys.: Condens. Mater., 2006, 18, S2581S2594）に記載される有機蛍光体を被包するポリマーナノ球体；
-  それらの部分が脂質で構成されるリポソームと同様の様式のポリマー二重層で構成されるナノ球体の形態の両親媒性合成ポリマーの集まりであるポリマーソーム（polymersomes）。これらのポリマーソームは、例えば、米国特許出願2005/0019265またはP.Ghoroghchianらによる文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 102(8), 2922-2927）に記載される有機蛍光体を被包するのに用い得る。
【００１２】
これらのナノ粒子系は有機体であるが、それらはいくつかの欠点を有する。ポリマーソームおよびリポソームは、化学的および物理学的安定性の問題を示す。ポリマーナノ球体については、それらの細胞毒性およびそれらの化学合成（残留溶媒の問題）が、それらの使用を制限する。インビトロにおいて良好な生物分解性および低い細胞毒性を示す、乳酸ポリマー（PLA）、ポリ（β-ヒドロキシブチレート）（PHB）ポリマーまたは代わりにポリ（ラクチド-コ-グリコリド）のような合成ポリマーでさえ、それらがナノ粒子の形態で送達される場合は毒性効果を有する。
【００１３】
それゆえ、文献においてこれまで述べられてきた蛍光イメージングに用いられる光学プローブは、一般に、１つ以上の以下の欠点：
-  特に生物媒体中における、生物学的リガンド当たりの弱い蛍光
-  フォトブリーチの傾向、
-  複雑な表面官能化または集合体化学、
-  無機ナノ粒子の形態である場合の潜在的毒性。このため、それらを生体適合性にするために付加的な表面化学の使用が必要となり、そしてヒトでのイメージングにおける使用を困難にする；
-  複雑な合成。無機ナノ粒子に関する限りは、特に大量合成が困難であり、トリオクチルホスフィン（TOP）およびトリオクチルホスフィンオキシド（TOPO）のような毒性溶媒、ならびに危険な原料（Cd(Me)2など）の使用が必要となる。さらに、これらの合成の費用価格は非常に高い；
-  弱い安定性および比較的、再現不可能な有機ナノ粒子（ポリマーソーム）の合成；ポリマーの有機ナノ粒子の細胞毒性および大規模合成はまだ克服されていない；
-  時間分解蛍光イメージングへのそれらの使用を妨げる、非常に短い蛍光寿命
を有する。
【００１４】
時間分解蛍光法の使用は、定常（stationary）法に比べて多くの利点を有する。
第１に、測定されるシグナルが、媒体の構造および蛍光体についての全ての情報を潜在的に含むので、この方法は、蛍光様式で動作させる場合に好適な技術である。実際に、連続波（CW）シグナルを使用する技術は、入射（incident）シグナルの減少の単純な測定に基づく。蛍光分子の分布は、蛍光分子の局所濃度に直接比例する蛍光シグナルの測定により決定される。それゆえ、この技術は、周囲の散乱媒体の（吸収および散乱の）光学特性についての認識を前提とし、寿命に関する蛍光体の固有特性を考慮に入れない。時間分解シグナル（経時的な振幅の点で調節されたシグナルまたはパルスシグナル）の使用により、媒体の（散乱および吸収の）光学特性に関する不明確性を取り除くこと（これにより光伝播の物理現象のより良好なモデリングを得ることが可能となる）、および蛍光体の寿命に関する情報を用いて、より正確にその位置を確認することの両方の可能性が提供される。
【００１５】
第２に、インビボでの細胞の検出のために、生物組織または動物もしくはヒトにおいてであっても、パルス技術の使用は、適用される全照射量を減少することも可能とし、一方、同時に、非常に敏感な検出に十分なピーク出力レベルを有する。しかしながら、生物組織がそうであるように、高散乱性および自己蛍光性の媒体中にある場合においては、蛍光プローブの特異的シグナルの検出感度は、媒体の自己蛍光または非特異的散乱性により減少され得る。問題は、媒体が、その固有の自己蛍光特性が弱いものであるとしても、検出される蛍光体と比較して圧倒的な量で存在することである。どんな実験的構成（蛍光反射率イメージング：FRIまたは透過蛍光イメージング：TFI）を用いても、自己蛍光および励起シグナルの散乱から蛍光体の蛍光を光学的に取り出すことだけではなく、検出器に集まったシグナルについて、自己蛍光および励起シグナルの散乱から蛍光体の蛍光を区別することもできるはずである。
【００１６】
媒体の自己蛍光の寿命は、一般にとても短い（概して、２００〜５００psのオーダーである）。蛍光プローブとこの自己蛍光バックグラウンドとをできる限り多く区別し、定常法と比較して時間分解法により完全に利益を得るために、したがって、０．５nsを超える、「長い」蛍光寿命を有する高発光性蛍光プローブを用いることが有利である。他方、長すぎる寿命の蛍光体の使用により、２つの獲得物（acquisitions）間のシグナルの減衰を正確に記録できない。そして、連続励起を使用する測定で得られる情報と比較して、付加的情報がない。さらに、これは２つの収集物間のシグナルをゼロに戻すこともできない。臨床分野において用いられるパルス光学的収集系は、概して８MHzで作動する。約１０MHzを超えて作動させることはできず、さもなければ、組織は燃えてしまう。しかし、低すぎる周波数において作動させる場合、シグナル感度は失われる。それゆえ、時間分解法の利点を活用するために、１００〜１２５ns（８〜１０MHzの周波数）の獲得ウィンドウの推移の間に、シグナルをゼロ付近に戻すために、蛍光寿命が１０〜２０ns未満の蛍光体を使用することが必要である。
【００１７】
したがって、時間分解蛍光イメージングのための理想的な蛍光体の寿命範囲は、０．５nsから１０nsの間である。現在、生物媒体または混濁媒体における適用のために、組織による光の散乱および吸収または組織の自己蛍光が可視域と比較して減少される近赤外域（６４０〜９００nm）において機能させることは、絶対に不可欠である。現在では、近赤外域（６４０〜９００nm）で吸収および放射し、蛍光寿命が０．５から１０nsの間である好適な蛍光体は、実質的に存在しない。
【００１８】
ナノエマルジョンは、ミニエマルジョン、超微細エマルジョンまたは代わりにサブミクロンエマルジョンとも呼ばれるが、一般に、直径が１０から２００nmの間であるエマルジョンである。要するに、エマルジョンは、連続相および分散相で構成される２つの不混和性の液体物質の混合物である。第１の物質は、第２の物質（連続相）中に小滴の形態（分散相）で分散する。混合物は、乳化剤または界面活性剤と呼ばれる、２つの相の境界面に配置される両親媒性分子の作用により、安定なままである。エマルジョンは、準安定性の超分子構造である。これらの構造は、ポリマーソームおよびミセルと区別されるものである。
【００１９】
ポリマーソーム（リポソームを含むファミリー）は、直径数十〜数千nmの小胞である。これらの小胞は、小胞内の媒体を外部の媒体（２つの媒体は同じ性質（水性）である）から隔て得る界面活性剤の１つ以上の二重層で構成される。
ミセルは、自己集合した界面活性剤の凝集物からなり、直径数ナノメートルである。該界面活性剤は、それらの親水性部分を外部（溶媒）に向け、それらの疎水性鎖をミセルの中心へ向けるようにして組織化される。
【００２０】
医療分野における様々な適用を意図したエマルジョン系は、すでに文献において記載されている：
-  これは必須脂肪酸、親油性ビタミンおよびエネルギーの供給源として静脈注射される脂質に基づくエマルジョンである非経口的栄養補給系。これらのエマルジョンは、一般に、天然起源の油（植物油または魚油）の混合物で構成される；
-  薬物送達系。これは水に比較的不溶な活性成分の被包のために特に研究および使用される水中油型のエマルジョンである。これらのエマルジョンは、それらが含む活性成分の生物学的利用能を改善し、それらの副作用を減少させる利点だけではなく、それらの加水分解を制限することにより、それらの安定性を増加させる利点も有する。エマルジョンは、３つの異なる投与方法：点眼／非経口／経口で用いられる。非経口的に投与されたエマルジョンの代謝を制限するために、ある製剤でステルス性補助界面活性剤を使用し、そして血流系におけるエマルジョンの循環時間を増加させている；
-  癌性腫瘍の切除術のための組織マーカーとして用い得る色素を含む系。そのようなエマルジョンは、例えば、国際出願WO98/48845に記載され、これは特定の発色団、５０７nmの波長を吸収するスダンIIIを含むごま油で構成される油滴の水中油型エマルジョンを特に説明する；
-  エマルジョンに基づく造影剤を用いるイメージング系。これらの系は、例えば、P.M. Winterらによる文献（Cancer Research, 2003, 63, 5838-5843）に記載されるように磁気共鳴イメージング（MRI）のために、そして、例えば、特許出願US 2005/0079131に記載されるようにX線イメージングのために開発された。
【００２１】
Winterらにより設計されたMRIのための造影剤（上記）は、界面活性剤層で水中において安定化されたフルオロカーボン油（例えば、パーフルオロオクチルブロミド）のエマルジョンである。用いられる界面活性剤の混合物は、含有量３０％（mol）のガドリニウムジエチレントリアミンペンタ酢酸ビスオレエート（Gd-DTPA-BOA）のようなガドリニウムキレートで特に構成される。これらの化合物は、それらの磁気特性によりMRIラベルとして作用するキレート剤である。腫瘍のターゲティングは、界面活性剤層（０．５％mol）におけるavβ3インテグリンの模擬ペプチドアンタゴニストに結合したジステアロイルホスファチジルエタノールアミンポリ（エチレングリコール2000）-マレイミド（DSPE-PEG（2000）-マレイミド）の少量の添加により行われる。そして、ナノ粒子は、腫瘍増殖に伴う血管形成に関連するタンパク質であるavβ3インテグリンを発現する細胞を標的にする。
【００２２】
それゆえ、これらのナノ粒子における造影剤の特性は、界面活性剤により与えられる。さらに、これらの粒子径は、約２７０nmで比較的大きく、かつ多分散性は高い。さらにWinterらの著者は、腫瘍へのナノ粒子の拡散はそれらの大きなサイズにより制限されると評価する。しかしながら、これらのナノ粒子により、ターゲット領域においてMRIシグナルを１２６％まで増加することが可能となる。
【００２３】
特許出願US 2005/0079131に記載されるナノ粒子もまた、水中油型のエマルジョンであり、これはZ＞３６のような高い原子番号（Z）を有する元素に結合した親油性化合物により形成され、レシチンおよびコレステロールに基づく界面活性剤層により安定化される。マイクロフルイダイザ（microfluidizer）により調製されたこの製剤において、重い原子Z＞３６によりX線造影剤として作用するものは油である。ここでも、ターゲティングは、avβ3インテグリンの模擬ペプチドアンタゴニストに結合したDSPE-PEG（2000）-マレイミドの使用により行われる。粒子の見かけのサイズは、２００nm未満である。しかしながら、この特許出願は、このタイプのエマルジョンを用いる生きた動物におけるインビボの生物学的試験について全く言及していない。さらに、体内での造影剤の均質な生体分布を可能にするように、ステルス剤が表面にグラフトされていない。さらに、この特許出願では、ナノ粒子がその表面において（界面活性剤層内で）蛍光体も含むことができ、前記蛍光体は、補助撮像剤として、特にフルオレセインであり得ることが示唆されている。しかしながら、フルオレセインは、近赤外域で吸収／放射する蛍光体ではないこと、そして、それゆえ小動物における非侵襲性のインビボイメージングには使用できないことに注目すべきである。そのうえ、油中の高い原子番号の元素の存在は、ナノ粒子の蛍光を阻害する欠点を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
それゆえ、既存の系の製造または使用の間に遭遇する全ての問題を改善するために、本発明者らは、本発明の主題を形成するものを開発した。
実際に、本発明者らは、現在入手できる蛍光プローブの欠点を有さず、特に小動物における非侵襲性インビボイメージングにおける調製および使用が容易である蛍光プローブを提供するという目標を設定した。本発明者らは、より具体的には、一方では、近赤外域で放射し吸収する蛍光体化合物の蛍光の量子収量を任意に増加すること、および他方では、蛍光寿命を０．５nsよりも長い値まで増加することを可能にすることにより、散乱媒体中での時間分解蛍光イメージング技術（インビボパルスイメージング）の使用を可能にする製剤を提供するという目標を設定した。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
それゆえ、本発明の主題は、少なくとも１つの水性の連続相および少なくとも１つの油性の分散相を含み、分散相が、１０nm以上２００nm以下の平均径を有する少なくとも１つの生体適合性の油の滴で構成され、前記油の滴が、６４０から９００nmの間の波長において吸収および放射する少なくとも１つの親油性蛍光体を含み、前記滴が、滴の周縁に位置する界面活性剤層により安定化されており、前記層が、少なくとも１つの両親媒性界面活性剤および少なくとも１つのステルス性補助界面活性剤を混合物として含むことを特徴とする水中油型の蛍光エマルジョンである。
【発明の効果】
【００２６】
このエマルジョンは、以下の利点を有する：
-  生体適合性の有機原料で構成され、その大部分が、それが注射される生体により同化され得る；
-  とりわけ粒子サイズおよび蛍光特性に関しては、経時的に特に安定である；
-  小動物における（インビボ）蛍光イメージングのための、蛍光有機分子が被包され、それゆえ生体に認識されない分子プローブを構成する；
-  この分子プローブは、生体内で長い循環時間を有するように設計されている。これによりターゲット-リガンド認識の機会が増加する；
-  油滴の周縁ではなく油滴の中心、すなわち、油滴の内部に蛍光体が直接存在することにより、多数の蛍光分子が、リガンドによるターゲットの認識に関連しており、これによってより良好な検出感度をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
添付の図面において：
【図１】図１は、蛍光イメージングのための光学プローブを構成し得る種々の物質の概略図である。
【図２】図２は、ミセル系(c)およびポリマーソーム(a)と比較した、ナノエマルジョン(b)の構造の比較図であり、構造(a)、(b)および(c)では全て、共通して、水が分散体の連続相である。
【図３】図３は、水性連続相が、特にガドリニウムキレートで構成された界面活性剤で安定化されたパーフルオロオクチルブロミドの滴(約２７０nmの直径)の分散体を含有する水中油型エマルジョンで構成され、そのいくつかにはavβ3インテグリンの模擬ペプチドアンタゴニストに結合したDSPE PEG (2000)-マレイミドが付着している、Winterら（上記）により記載される造影剤の図に相当する。
【図４】図４は、特許出願US 2005/0079131に記載される造影剤の図に相当し、この造影剤は、水性連続相が、原子番号＞３６の元素に結合した親油性化合物を含む油滴(約２００nmの平均径)の分散体を含有する水中油型エマルジョンの形であり、この滴は、補助撮像剤が挿入された界面活性剤の層で安定化され、生物分子のターゲティングが、avβ3インテグリンの模擬ペプチドアンタゴニストに結合したDSPE PEG (2000)-マレイミドにより提供される。
【図５】図５は、水性連続相が、その中心に少なくとも１つの親油性蛍光体が被包された油滴（平均径＜２００nm）の分散体を含む本発明による水中油型エマルジョンの図に相当し、該滴は、少なくとも１種の界面活性剤と、少なくとも１種のステルス補助界面活性剤と、興味対象の生物活性を標的にする少なくとも１種の剤とを含む周縁界面活性剤層で安定化される。
【図６】図６は、油滴がInvitrogen社によりリファレンスD-307の下で販売される蛍光体DiDを含有する大豆油で構成される、本発明によるエマルジョンの吸収／放射スペクトルを表す。この図において、任意単位で表される強度は、nmで表される波長の関数であり、吸収は左の曲線に相当し、蛍光の発光は、右にわずかにシフトした曲線に相当する。
【図７】図７は、Cy5-NHS (Amersham)のもの(値を任意に１００に固定する)と比較した、媒体(メタノール溶液、ナノエマルジョンに取り込まれた、および水溶液)の関数としてのDiD蛍光体の量子収量を示す。
【図８】図８は、実施例１に従って製造した本発明のエマルジョンの容量重みつきサイズ分布を表す。この図において、容量パーセントは、nmでのサイズの関数である。
【図９】図９は、本発明による、すなわち、実施例３に記載されるようにDiD蛍光体を含有し、cRGDで官能化された蛍光エマルジョンの、Ts/Apc腫瘍を有するマウス(乳癌、マウスモデル)での経時的な分布の変化を示す。分布は、腫瘍領域での著しい蓄積を示す。
【図１０】図１０は、本発明の一部分でない蛍光プローブ、すなわちDiD蛍光体の親水性アナログであるシアニンCy5-NHS (Amersham)の、マウスでの経時的な分布の変化を示す。シアニンはエマルジョンに被包されておらず、ターゲティング剤を有さない。蛍光体は、まず、腎臓に貯蔵され、次いで排出される。
【図１１】図１１は、本発明による、すなわちターゲティング剤なしでDiD蛍光体を含有する蛍光エマルジョンの、マウスでの経時的な分布の変化を示す。組織でのナノ粒子の分布は非常に均質であり、排出がない。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の目的のために、用語「滴」は、液体の油の滴自体と、また、用いられる油が結晶性油である、水中油型のエマルジョン由来の固体粒子との両方を包含する。後者の場合は、用語「固体エマルジョン」が次に用いられる。
【００２９】
親油性蛍光体が油滴に直接組み込まれるという事実は、以下のさらなる利点を提供する：
-  水性の環境から蛍光体を保護する。その環境では、蛍光体のフォトブリーチ（光の存在下での蛍光の損失）がより急速である、
-  多数の蛍光体を被包すると同時に、生物学的リガンドでのナノ粒子の官能化のために、ナノ粒子の表面のグラフト機能を遊離のままにする。そして、ナノ粒子の表面にグラフトするための結合は、蛍光体をグラフトするために犠牲になる必要がない；それらの結合は全て、ターゲティングリガンドをグラフトするために使用し得る、そして表面密度は高くなり得る；
-  本発明によるエマルジョンの油滴の中心に存在する蛍光体の選択により；本発明に用いられる蛍光体は、近赤外域で吸収／放射する親油性蛍光体である；
-  ナノ粒子に適切な薬力学を与えるようなステルス剤の存在により：これらのステルス剤は、エマルジョンの安定性を増加することと、また生体の免疫防御を「欺く」こととの両方を可能とする；
-  蛍光寿命の増加、および油滴の中心に存在する蛍光体化合物の量子収量のある程度の増加により；これにより、散乱媒体中での時間分解蛍光（パルス蛍光）イメージングを利用することができる。そして特に、水中および水性緩衝液中において：本発明のナノエマルジョン中に配合された場合、1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドトリカルボシアニンイオダイド（DiR）では２４％および1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドジカルボシアニンパークロレート（DiD）では３７％の、この波長範囲では等しくない量子収量を得ることが可能となるのに対し、本発明者らの知る限りでは、例えば、Alexa 750（Invitrogen社より販売される）、Cy7およびCy7.5（GE-Healthcare社より販売される）、またはIR dye 800（Li-Cor社より販売される）のような市販されている有機蛍光体を含む、６４０から９００nmの間で吸収および放射する有機蛍光体は、これらが水中または水性緩衝液中に配合された場合、蛍光の量子収量は最大１０〜１５％である。
【００３０】
エマルジョン中の油滴のサイズは、好ましくは１０から８０nmの間（境界値含む）である。本発明者らは、細胞への内部移行の閾値が８０nmであることを実際に観察した。より大きなサイズでは、内部移行は観察されない。
本発明によれば、生体適合性油は、植物または動物起源の天然油、合成油およびそれらの混合物から選択される。これらの油は、エマルジョンの形成の前に、化学的または物理的修飾をしないで用いられる。
【００３１】
油の中でも、特に、植物起源の油、その中でも特に大豆油、パーム油、落花生油、オリーブ油、亜麻油、ブドウ種油およびヒマワリ油；動物起源の油、その中でも特に魚油；合成油、その中でも特にトリグリセリド、ジグリセリドおよびモノグリセリドが挙げられる。前記油は、単独または混合物として用い得る。
これらの油は、初めて圧搾したもの、精製または内部エステル化（interesterified）した油でありえる。
【００３２】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、これらの油は、水に非常に難溶性、すなわち、例えば大豆油のような、親水性-親油性バランス（HLB）が一般に８未満であり、より好ましくは３から６の間である油から選択されるか、または代わりに、Suppocire（登録商標）Nの商品名でGattefosse社により販売される半合成グリセリドの混合物のようなC8〜C18、主にC12〜C14の飽和脂肪酸グリセリドに富む結晶性油（ワックス）から選択される。
そのような混合物の中でも、Suppocire（登録商標）NCの商品名でGattefosse社により販売される製品が特に好ましい。この製品は、周囲温度において固体であり、脂肪酸およびグリセロールの直接のエステル化により得られる。それは、以下の質および量の組成を有する：
C8：０．１〜０．９％
C10：０．１〜０．９％
C12：２５〜５０％
C14：１０〜２４．９％
C16：１０〜２４．９％
C18：１０〜２４．９％
【００３３】
本発明の特定の好ましい実施形態によれば、油性相は、少なくとも１つの植物油または動物油およびC8〜C18の飽和脂肪酸グリセリドに富む少なくとも１つの結晶性油で構成される。
そのような混合物の使用により、油性相内での蛍光体の可溶化を改善し、そして被包された蛍光体の光学特性を改善することができる。
この場合、植物油または動物油／グリセリドに富む結晶性油の重量比が、好ましくは１０／９０から９０／１０の間（境界値を含む）の範囲、より好ましくは２０／８０から８０／２０の間（境界値を含む）の範囲である。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態によれば、油性相は、少なくとも１０重量％の、２０℃における粘度が１００cP以上である油で構成される（粘度の値は、例えば、Handbook of Chemistry and Physics, CRC Press, 第88版, 2007にまとめられる）。油性相におけるそのような油の存在により、ナノエマルジョン中に配合された蛍光体に、インビボ時間分解蛍光イメージングのために特に好適な蛍光寿命を与えることができる。
【００３５】
本発明によれば、エマルジョン内の油滴の安定化を提供する両親媒性界面活性剤の性質は、重要ではない。これらの両親媒性界面活性剤（親水性部分および親油性部分を含む）は、一般に、８〜３０個の炭素原子を含む直鎖状もしくは分岐鎖状で飽和または不飽和の鎖を含む親油性部分を有する化合物から選択される。それらは、リン脂質、コレステロール、リゾ脂質、スフィンゴミエリン、トコフェロール、糖脂質、ステアリルアミン、天然または合成起源のカルジオリピン；ソルビタンエステルのような、エーテルまたはエステル官能基性による親水性の基に結合している脂肪酸で構成される分子、例えば、Sigma社によりSpan（登録商標）の名称で販売されるソルビタンモノオレエートおよびモノラウレート；重合脂質；ICI Americas Inc社によりTween（登録商標）の商品名で、およびUnion Carbide Corp社によりTriton（登録商標）の商品名で販売される非イオン性界面活性剤のような、ポリエチレンオキシド（PEG）の短鎖にコンジュゲートしている脂質；スクロースモノラウレートおよびジラウレート、スクロースモノパルミテートおよびジパルミテート、ならびにスクロースモノステアレートおよびジステアレートのような糖エステルから選択され；前記界面活性剤は単独または混合物として用いることができる。
【００３６】
本発明によれば、界面活性剤は、好ましくは、大豆レシチン、リン脂質およびコレステロールのような天然起源で、同化できる（生体適合性である）界面活性剤である。
親油性蛍光体がインビボ蛍光イメージングに適合し、６４０から９００nmの間の波長において吸収および放射するならば、本発明のエマルジョンに用い得る親油性蛍光体の性質は、重要ではない。これは、励起光および蛍光体により放射される光が組織を透過できるようにするために、近赤外域で吸収および放射する蛍光体を使用することが望ましいからである。親油性蛍光体として、例えば、Invitrogenのカタログの第１３章（「脂質および膜のためのプローブ」（“Probes for Lipids and Membranes”））に記載の化合物が挙げられる。
【００３７】
より具体的には、蛍光体として、脂肪酸アナログ；近赤外域（６４０〜９００nm）で吸収および放射する基で官能化したスフィンゴ脂質、ステロイド、リポ多糖類およびリン脂質、ならびにそれらの両親媒性誘導体が特に挙げられる。そのような蛍光体の中でも、さらに、シアニン、ローダミン、フルオレセイン、クマリン、スクアライン、アズレン、キサンテン、オキサジンおよび4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン（ボロンジピロメテン）の誘導体、ならびに前記蛍光体の両親媒性誘導体が特に挙げられる。
【００３８】
例として、より具体的に、Invitrogen社により商品名Bodipy（登録商標）665/676（Ex/Em）で販売される蛍光製品；Invitrogen社によりリファレンスD307の下で販売される1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドジカルボシアニンパークロレート（DiD）およびInvitrogen社によりリファレンスD12731の下で販売される1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドトリカルボシアニンイオダイド（DiR）のようなジアルキルカルボシアニンの両親媒性誘導体が特に挙げられる。
本発明の好ましい実施形態によれば、蛍光体は、ジアルキルカルボシアニンの両親媒性誘導体から選択される。
【００３９】
本発明によるエマルジョンに用い得るステルス性補助界面活性剤は、好ましくは、親水性部分がポリエチレンオキシド鎖（PEOまたはPEG）で完全にまたは部分的に構成され、そのPEO単位の数が好ましくは２から５００の間の範囲である両親媒性分子である。ステルス性補助界面活性剤はまた、例えば、デキストランのような多糖類化合物であり得る。
本発明により、用いることができるステルス性補助界面活性剤の例として、ポリエチレングリコール／ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）コンジュゲート化合物、Brij（登録商標）（例えば、Brij（登録商標）35、58、78または98）の商品名でICI Americas Inc社により販売される製品のようなポリエチレングリコールの脂肪酸エーテル、Myrj（登録商標）（例えば、Myrj（登録商標）45、52、53または59）の商品名でICI Americas Inc社により販売される製品のようなポリエチレングリコールの脂肪酸エステル、およびPluronic（登録商標）（例えば、Pluronic（登録商標）F68、F127、L64またはL61）の商品名でBASF AG社により販売される製品またはSynperonic（登録商標）（例えば、Synperonic（登録商標）PE/F68、PE/L61またはPE/L64）の商品名でUnichema Chemie BV社により販売される製品のようなエチレンオキシド／プロピレンオキシドブロックコポリマーが特に挙げられる。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態の１つによれば、エマルジョンの油滴の周縁に位置する界面活性剤層は、興味対象の生物活性を標的とする少なくとも１つのターゲティング剤を含み、前記ターゲティング剤は、生物学的リガンドに共有結合している親水性部分を有する両親媒性グラフト補助界面活性剤で構成される。ターゲティング剤の存在により、特定の興味対象の生物学的工程を標的とすることができる。
【００４１】
本発明の有利な形態の１つによれば、前記ターゲティング剤は、以下の式（I）：
【化１】
0005837279.tif 000002
［式中：
-  Aは、両親媒性グラフト補助界面活性剤（CoTA）の親油性部分であり、
-  X1およびX2は、同一であるか、または異なって、前記補助界面活性剤（CoTA）の親水性部分を構成し、例えば、N、O、PおよびSから選択される１つ以上のヘテロ原子、および／または、例えば、C1〜C4アルキルもしくはC1〜C4アルコキシ基から選択される１つ以上の基、またはエーテル、エステル、アミド、カルボニル、カルバメート、尿素、チオ尿素およびジスルフィド官能基から選択される１つ以上の官能基で任意に置換、挿入および／または終結されてもよい飽和もしくは不飽和で直鎖状または分岐鎖状の炭素ベースの鎖から選択されるフレキシブルスペーサーアームで構成され；
-  Y1およびY2は、同一であるか、または異なって、それぞれX1およびB1、X2およびB2に共有結合で結合し得る化学基から選択され；
-  B1およびB2は、同一であるか、または異なって、生物学的リガンドであり、末端の１つは、それぞれX1、X2と形成する共有結合に含まれ；
-  nは、１から２０の間（境界値を含む）の整数であり；
-  qは、０または１に等しい整数であり；
-  mは、０から２０の間（境界値を含む）の整数であるが、q =０の場合、m =０と理解さ        れ；
-  pは、０から１０の間（境界値を含む）の整数であり；
-  Rは、０から１０の間（境界値を含む）の整数である］
の化合物から選択される。
【００４２】
式（I）のターゲティング剤中のグラフト補助界面活性剤CoTAの親油性部分（A）は、周縁の界面活性剤層内の油滴の表面に自らを固定することができる。それは、飽和もしくは不飽和で直鎖状または分岐鎖状のC6〜C26アルキル鎖で特に構成され得る。
上記の式（I）の化合物のスペーサーアームX1およびX2を構成するCoTAの親水性部分は、ポリオキシエチレンまたはデキストラン単位で構成される鎖から特に選択され得る。
【００４３】
本発明の有利な実施形態の１つによれば、B1／B2単位にX1／X2を結合させる共有結合（官能基Y1／Y2）は、B1／B2とのその反応の前にCoTAの親水性部分が最初から有する化学的官能基と、それぞれX1、X2とのそれらの反応の前に生物学的リガンドB1／B2が有する相補的な化学官能基との間の反応に由来する。非制限的で非排他的な例として：
-  結果としてアミド結合が形成される、例えば、N-スクシンイミジル基との活性化されたアミンおよびエステルの反応；
-  結果として、オキシム結合が形成される、オキシアミンおよびアルデヒドの反応、；および
-  結果として、チオエーテル結合が形成される、マレイミドおよびチオールの反応、
から得られる共有結合が特に挙げられる。
【００４４】
上記の式（I）のターゲティング剤のB1／B2単位として用いられ得る生物学的リガンドの中でも、以下のものが特に挙げられる：
i）ペプチド、例えば、RGDペプチド（直鎖状または環化）、それらの誘導体およびそれらのアナログ（例えば：オクテオトレート（octeotrate）ペプチド、ソマトスタチンのアナログ、ボンベシン、ニューロテンシン、EGF、VIPなどのアナログ）；タンパク質、抗体、それらの誘導体およびそれらのアナログ；グルコースのような単糖類、オリゴ糖類、多糖類、それらの誘導体およびそれらのアナログ；オリゴヌクレオチド、DNA、それらの誘導体およびそれらのアナログ；ターゲティング活性が興味対象の領域の細胞表面において過剰発現する受容体によるこれらのリガンドの分子認識による、葉酸エステル、ビスホスフォネートパミドロネートおよび有機金属錯体のような有機分子のようなある細胞を特異的に標的とすることができる生物学的リガンド；
ii）所定の生物活性、例えば酵素活性のためのマーカーである生物学的リガンド。そのようなリガンドの例として、例えば、ラベルの蛍光の阻害剤がグラフトされる末端において所定のプロテアーゼにより切断され得るペプチドが挙げられる。このタイプのリガンドは、プロテアーゼの酵素活性を特異的に撮像することを可能にする（C.H.Tung、上記）。別の例は、その蛍光の阻害剤からラベルを隔てるジスルフィドブリッジを含む生物学的リガンドである。そして、そのような生物学的リガンドにより、例えば、特許出願FR 2 888 938で記載されるように、細胞における光学プローブの内部移行を特異的に撮像することが可能となる。
【００４５】
グラフト補助界面活性剤CoTAへの生物学的リガンドの結合は、乳化の前または乳化の後に行われ得る。後者の場合、採用される化学反応は、エマルジョンのコロイド安定性に適合することが必要である。反応は、過度に酸性でもなく過度に塩基性でもないpH（pH５〜１１）で、水性溶液中において特に行われるべきである。
【００４６】
本発明によるエマルジョンの連続相は、水性相であり、好ましくは、水および／またはリン酸緩衝液、例えば、PBS（リン酸緩衝生理食塩水）のような生理学的に許容される緩衝液あるいは塩化ナトリウム溶液で構成される。
【００４７】
本発明によるエマルジョンは、エマルジョンを調製するための当業者に知られたいずれの通常の方法、例えば、以下の工程を含む方法によって調製され得る：
a）溶媒の蒸発後に、分散相のための均質な油性プレミックスを得るように、例えば、クロロホルムのような有機溶媒中に種々の生体適合性の油性成分を混合することからなる、エマルジョンの分散相のための油性プレミックスの調製、
b）近赤外域で吸収および放射する少なくとも１つの親油性蛍光体との前記油性プレミックスの均質な混合によるエマルジョンの分散相自体の調製；
c）水性相において、好ましくは高温の状況下で、少なくとも１つの両親媒性界面活性剤、少なくとも１つのステルス性補助界面活性剤および任意に興味対象の生物活性をターゲティングする少なくとも１つのターゲティング剤を混合することによるエマルジョンの連続相の調製。前記ターゲティング剤は、生物学的リガンドに共有結合している親水性部分を有する両親媒性グラフト補助界面活性剤で構成される；
d）分散相への連続相の添加および油滴の平均径が１０nmより大きく、２００nmより小さい均質なエマルジョンが得られるまでの得られた混合物の乳化。この乳化は、例えば、４から１０分間、超音波処理機を用いることによって行われ得る。
【００４８】
特定の実施形態の１つによれば、ナノエマルジョンの油性相が少なくとも１つの植物油もしくは動物油またはC8〜C18の脂肪酸グリセリドに富む少なくとも１つの結晶性油で構成される場合、ナノエマルジョンを安定化するために用いられる界面活性剤は、上記の工程b）の間に分散相へ完全にまたは部分的に組み込まれ得る。この実施形態は、本発明によるナノエマルジョンの調製の間のリポソーム形成を防ぐことを可能とし、前記界面活性剤が大豆レシチンである場合に特に有利である。
【００４９】
エマルジョンの使用の前に、該エマルジョンを、例えば、５０／５０に希釈し、例えば、ろ過により滅菌することが好ましい。さらに、このろ過工程により、エマルジョンの調製の間に形成されたかもしれない凝集物を除去することが可能となる。
【００５０】
上で十分に記載および説明したように、本発明による蛍光エマルジョンは、インビボで興味対象の生物活性を検出するために用いられ得る。
それゆえ、本発明の第２の主題は、少なくとも１つの上記の本発明の蛍光エマルジョンを含むことを特徴とする、興味対象の生物活性を診断するための診断試薬である。
本発明の特定の好ましい実施例によれば、該試薬はインビボの診断試薬である。
【００５１】
最後に、本発明の主題は、蛍光イメージングおよび特に時間分解蛍光（パルス蛍光）イメージングによりインビボで興味対象の生物活性を診断するための、ならびに／または医薬品のような治療用手段の開発および最適化を支援するための診断試薬の製造のための少なくとも１つの上記の蛍光エマルジョンの使用である。実際に、そのような試薬は：
-  蛍光イメージングにより、好ましくは非侵襲性蛍光イメージングにより、動物、任意にヒトにおける癌性細胞の検出；
-  蛍光イメージングにより、好ましくは非侵襲性蛍光イメージングにより、動物、任意にヒトにおけるアテローム斑の検出；
-  蛍光イメージングにより、好ましくは非侵襲性蛍光イメージングにより、動物、任意にヒトにおける神経変性疾患に特徴的なβ-アミロイド線維の検出；
-  蛍光イメージングにより、好ましくは非侵襲性蛍光イメージングにより、動物、任意にヒトにおける酵素的過程のインビボモニタリング；
-  蛍光イメージングにより、好ましくは非侵襲性蛍光イメージングにより、動物における遺伝子発現のインビボモニタリング；
-  蛍光イメージングにより、好ましくは非侵襲性蛍光イメージングにより、動物における治療の評価；または他に
-  薬物の生体内分布、調節された薬物の送達、およびそれらの有効性のモニタリング；
を可能にする。
【００５２】
上記の態様に加えて、本発明は、本発明による蛍光エマルジョンの製造例、インビボ蛍光イメージングのためにこのようなエマルジョンを用いる比較例、ならびに蛍光寿命および蛍光の量子収量に対するナノエマルジョンの形の蛍光体化合物の形成の影響、ならびに添付の図面１〜１１に言及する上記の記載から明らかになるその他の態様も含む。
【実施例】
【００５３】
しかし、これらの実施例は、本発明の説明のためにのみ与えられるものであり、いずれの限定を構成するものでもないことが理解されるべきである。
実施例１：非官能化蛍光ナノエマルジョンの製造
１）分散相のためのプレミックスの製造
大豆油(Sigma-Aldrich) 15重量%、Suppocire (登録商標) NC (Gattefosse)の商品名で販売される半合成グリセリド45重量%、およびLipoid社からLipoid (登録商標) S75の商品名で販売される大豆レシチン（ホスファチジルコリン中で75%に濃縮）40重量%で構成されるプレミックスを製造した。これらの化合物を、クロロホルムに溶解し、溶液を、その後、減圧下に蒸発させ、50℃で乾燥させて、冷却により固化する粘性油の形のプレミックスを得た。
【００５４】
２）分散相の製造
前の工程で上記のようにして製造したプレミックス0.833 gのサンプルをとり、約70℃の温度にて、Invitrogen社によりリファレンスD-307の下で販売される油性蛍光体である1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドジカルボシアニン(DiD) 1.5 mgを、このプレミックスに加えた。溶液をボルテックスによりホモジナイズし、乳化相を見越して70℃に維持した。
【００５５】
３）連続相の製造
連続相は、グリセロール0.125 g、Myrj (登録商標) 53の商品名でICI Americas Inc.により販売される、50 molのエチレンオキシドを含むポリオキシエチレンステアレート0.55 g、および4.166 gの重量にするリン酸緩衝溶液(PBS)で構成された。この溶液を、乳化を見越して70℃に加熱した。
【００５６】
４）乳化
連続相を分散相に加え、混合物を、3 mm径の円錐形プローブを備えたAV505 (登録商標)超音波処理器(Sonics, Newtown)を用いて、6000ジュールの合計エネルギーで6分間、乳化した。
【００５７】
５）マウスの静脈内注射のための調製物
上記のようにして得られたエマルジョンを、次いで、PBSを用いて6.25倍に希釈し、Millipore CorporationによりMillex (登録商標) GVの商品名で販売される0.22μmのポリビニリデンフルオライド(PVDF)フィルタを通してろ過して、凝集物を除去し、また、滅菌もした。
このエマルジョンは、その後、インビボ機能的イメージングのための蛍光プローブとしてそのまま用いることができる。
【００５８】
このエマルジョンの吸収および放射スペクトルを、添付の図６に示し、ここでは、任意単位で表される強度は、nmで表される波長の関数である。この図において、吸収は、左の曲線に相当し、蛍光の放射は、わずかに右にシフトした曲線に相当する。
このエマルジョンの量子収量は、添付の図７に示すように、Cy5-NHSのものより1.3倍大きい。
ALV社によりリファレンスALV 5000/EPPの下で販売される装置での動的光散乱により測定されたナノ粒子の見かけのサイズは、70 nm未満であった。サイズ分布曲線を、添付の図８に示す。
【００５９】
実施例２：乳化前に官能化した蛍光ナノエマルジョンの製造
１）グラフト補助界面活性剤で官能化されたターゲティングペプチドの製造
Ansynth Service BV社(The Netherlands)により販売され、以下の文章においてcRGDとよばれる、メルカプト酢酸の形で保護されたチオール基を有する、内皮細胞の表面で過剰発現されたαvβ3インテグリンを標的にする環状ペプチドであるc(RGDf[ε-S-アセチルチオアセチル])K (添付の配列表にて配列番号1で同定される)を、Avanti Polar Lipids, Inc.により販売される、グラフト補助界面活性剤であるジステアロイルホスファチジルエタノールアミン ポリ(エチレングリコール2000)-マレイミド(すなわち、DSPE-PEG (2000)-マレイミド)に結合させた。後者を、cRGDと、1:1のモル比で、ヒドロキシルアミン濃度0.05 Mの(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸/エチレンジアミン四酢酸(HEPES/EDTA)緩衝液中で混合した。溶液を、周囲温度にて4時間、わずかなアルゴン流の下でゆっくりと撹拌し、減圧下で蒸発させ、次いで、第２工程の観点からクロロホルム中に再溶解した。
【００６０】
２）分散相のためのプレミックスの製造
プレミックスは、大豆油(Sigma-Aldrich) 15重量%、Suppocire (登録商標) NC (Gattefosse) 45重量%、Lecithin (登録商標) S 75 (Lipoid) 38重量%およびcRGDに結合したDSPE-PEG(2000)-マレイミド(Aventi Polar Lipids, Inc.) 2重量%で構成された。これらの化合物を、クロロホルムに溶解し、次いで、溶液を減圧下に蒸発させ、50℃で乾燥させて、冷却により固化する粘性油を得た。
【００６１】
３）分散相の製造
第２工程で上記のようにして製造したプレミックス0.833 gのサンプルをとり、次いで、約70℃の温度にて、1.5 mgの蛍光体D-307 (Invitrogen)を加えた。溶液を、次いで、ボルテックスによりホモジナイズし、乳化相を見越して70℃に維持した。
【００６２】
４）連続相の製造
連続相は、0.125 gのグリセロール、0.55 gのMyrj (登録商標) 53および4.166 gの重量にするPBS緩衝液で構成された。この溶液を、乳化を見越して70℃に加熱した。
【００６３】
５）乳化
連続相を、分散相に加え、混合物を、次いで、3 mm径の円錐形プローブを備えたAV505 (登録商標)超音波処理器(Sonics, Newtown)を用いて、6000ジュールの合計エネルギーで6分間、乳化した。
【００６４】
６）マウスの静脈内注射のための調製物
上記のようにして得られたエマルジョンを、次いで、PBSを用いて6.25倍に希釈し、次いで、0.22μmのフィルタを通してろ過して、凝集物を除去し、また、滅菌もした。
このエマルジョンは、インビボ機能的イメージングのための蛍光プローブとしてそのまま用いることができる。
【００６５】
実施例３：乳化後に官能化された蛍光ナノエマルジョンの製造
１）分散相のためのプレミックスの製造
プレミックスは、大豆油(Sigma-Aldrich) 15重量%、Suppocire (登録商標) NC (Gattefosse) 45重量%、レシチンS 75 (Lipoid) 38重量%およびDSPE-PEG (2000)-マレイミド(Aventi Polar Lipids) 2重量%で構成された。これらの化合物を、クロロホルムに溶解し、溶液を減圧下に蒸発させ、50℃で乾燥させて、冷却により固化する粘性油を得た。
【００６６】
２）分散相の製造
上記の1)に記載されるプレミックス0.833 gのサンプルを約70℃の温度にてとり、Invitrogen社によりリファレンスD-307の下で販売される蛍光体DiD 1.5 mgを加えた。溶液を、ボルテックスによりホモジナイズし、乳化相を見越して70℃に維持した。
【００６７】
３）連続相の製造
連続相は、0.125 gのグリセロール、0.55 gのMyrj (登録商標) 53および4.166 gの重量にするPBS緩衝液で構成された。この溶液を、乳化を見越して70℃に加熱した。
【００６８】
４）乳化
連続相を、分散相に加え、混合物を、3 mm径の円錐形プローブを備えたAV505 (登録商標)超音波処理器(Sonics, Newtown)を用いて、6000ジュールの合計エネルギーで6分間、乳化した。
【００６９】
５）官能化
エマルジョンを、0.05 Mヒドロキシルアミンを含有するHEPES/EDTA緩衝液で希釈した。溶液から、アルゴン流で30分間、酸素を除去し、保護されたチオール基を有するcRGDペプチド(c(RGDfK(Ac-S-CH2CO)), Ansynth Service BV, The Netherlands) 2 mgを加えた。反応混合物を、周囲温度にて4時間、わずかなアルゴン流の下でゆっくりと撹拌した。溶液を、次いで、PBSに対して、12000に等しいカットオフ閾値を有するSpectra/Por (登録商標)透析膜を用いて透析して、反応しなかったcRGDを除去した。
【００７０】
６）マウスの静脈内注射のための調製物
上記のようにして得られたエマルジョンを、次いで、PBSを用いて6.25倍に希釈し、次いで、0.22μmのフィルタを通してろ過して、凝集物を除去し、また、滅菌もした。
このエマルジョンは、インビボ機能的イメージングのため、特にマウスでの腫瘍検出のための蛍光プローブとしてそのまま用いることができる。
【００７１】
このために、病原体フリーの条件下に維持した5〜6週齢の雌性ヌードマウス(IFFA-Credo, Marcy l'Etoile, France)を、動物モデルとして用いた。Ts/Apc細胞(マウス乳癌モデル)を、10%の胎児ウシ血清、50 U/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシン、および50μg/mlの2.5×10-5 Mでの2-メルカプトエタノールを含有するRPMI 1640培養培地で培養した(これらの物質は全てSigma-Aldrich社により販売される)。細胞を、5% CO2の湿潤環境下で37℃にて維持した。106細胞を、その後、本実施例で上記のようにして製造したナノエマルジョンの注射の2週間前に、マウスの背に皮下注射した。注射は、マウスあたり200μlの溶液の割合で、尾に静脈内で行った。全ての注射および画像の取得は、マウスを、通常のガス麻酔(イソフルラン)下に維持しながら行った。
【００７２】
麻酔にかけた動物を、633 nmで発光する(照射動力50μW.cm-2)、励起源としての干渉フィルタを備えたLEDのクラウンを含む蛍光反射イメージング(fluorescence reflectance imaging；FRI)装置を用いて、例えばI. Texierら、「Luminescent probes for optical in vivo imaging(インビボ光学イメージングのための発光プローブ)」、Proceedings of the SPIE、2005、5704、16〜22の文献に記載されるようにして、撮像した。画像を、励起波長での光学密度が＞5のRG665着色フィルタによるフィルタ通過後に、20 msの露光時間でCCDカメラ(Orca BTL, Hamamatsu)により収集した。シグナルを、画像処理ソフトウェアを用いて定量した。cRGDで官能化され、DiD蛍光体を被包したナノエマルジョンの注射の30分後、5時間後、24時間後、および48時間後に記録した画像は、経時的に、腫瘍内に蛍光シグナルが徐々に蓄積することを示す(図９)。図９のt0の画像は、ナノエマルジョンの注射前のマウスの蛍光画像を示す。
【００７３】
実施例４：マウスへの静脈内注射後の、官能化されていないナノ粒子および被包されていない親水性蛍光体の生体内分布の比較
実施例1で上記のようにして製造した、10 nmolの蛍光体に相当するエマルジョン200μl (InvitrogenによりリファレンスD-307の下で販売されるDiD蛍光体を用いたエマルジョン)を、病原体フリーの条件下に維持した6〜8週齢の雌性ヌードマウス(IFFA-Credo, Marcy l'Etoile, France)の尾に静脈内注射した。麻酔をかけた動物を、実施例３に記載した蛍光反射イメージング装置を用いて撮像した。
比較のために、実施例1のエマルジョンと同様の条件下で、エマルジョンの形でない、20 nmolの蛍光体Cy5 NHS (Amersham)を含有する比較組成物200μlもマウスに注射した。
得られた結果を添付の図１０に報告し、この図は、Cy5-NHSシアニン(Amersham)の経時的な分布の変化を示す。特に、この図では、腎臓および膀胱に蛍光体が迅速に蓄積され、蛍光体を組織内で撮像できる時間を制限することがわかる。
【００７４】
比較のために、添付の図１１は、DiD蛍光体を載せた滴の経時的な分布の変化を示す。特に、いくつかの器官は、蛍光体を載せた滴のかなりの部分を最初に取り込むが(例えば肝臓および肺)、蛍光は時間とともに均質になることがわかる。これらの結果は、よって、油滴中に蛍光体を被包することにより、循環時間が改善され、腸、肝臓または腎臓のようなある器官によるその排出が低減され、動物の体全体のよりよい診査が可能になることを示す。
【００７５】
実施例５：蛍光寿命に対する、脂質ナノ粒子内への蛍光体の被包の影響の研究
本実施例の目的は、油相への蛍光体化合物の被包の、蛍光寿命に対する影響を示す。
このために、Invitrogenにより販売される脂質蛍光体DiRを、実施例１に記載される方法に従って、水中油型エマルジョンタイプの脂質ナノ粒子に被包した。
75重量%のSuppocire (登録商標) NCおよび25重量%の大豆油で構成される脂質コアを含むこれらのナノエマルジョンの組成を、以下の表１に示す。
【００７６】
【表１】
0005837279.tif 000003
【００７７】
10 mMの濃度でDMSO中の溶液である200μlのDiR蛍光体およびレシチンを、油混合物(大豆油/Suppocire (登録商標) NC)に加えた。得られた混合物を、50〜60℃に加熱した。グリセロールおよび界面活性剤(Myrj (登録商標) 53)を、PBS溶液に分散させた。溶液を、乳化の前に、高温(50〜60℃)に維持した。水溶液を、次いで、油/レシチン混合物に加えた。2相溶液を、次いで、40℃にて5分間、30%最大動力に設定した、3 mm径の円錐形プローブを備えたAV505 (登録商標)超音波処理器(Sonics, Newtown)を用いて乳化した。得られたエマルジョンは、直径35 nmであり(Malvern InstrumentsからのZetasizer Nano (登録商標)機器を用いて測定)、蛍光体濃度が400μMであった。
【００７８】
比較として、蛍光寿命に対する被包の影響を観察できるように、メタノール中に10 mMのDiR蛍光体溶液も製造した。
メタノール溶液中で遊離の蛍光体、またはPBS (10 mM、pH 7.3)中に分散された、水中油型エマルジョンタイプの脂質ナノ粒子に被包された蛍光体の蛍光の減衰を、700 nm〜1000 nmの波長で変更可能なネオジウム-バナデート連続波レーザ[Millennia Pro, Spectra-Physics, USA], (532 nm, 5W)励起(pumped)サファイア-チタンレーザ[Tsunami, Spectra-Physics, USA] (80 MHz, 100フェムト秒)を用いる測定系で測定した。この装置の操作モードに応じて、レーザを、検討されるサンプルについての励起ファイバ(excitatory fiber)として用いたマルチモード光ファイバ内に注入した。第2(検出)光ファイバは、放射された蛍光またはフィルタ系により散乱したレーザを収集する。シグナルは、TCSPC計数基板[Becker&Hickel, Germany]に結合されたフォトマルチプライヤチューブ[Hamamatsu, Japan]により測定する。後者は、光ファイバに注入する前に、高速(rapid)フォトダイオード(PD) [Becker&Hickel, Germany]を介して、レーザシグナル(パルス列)の分析部分(4%)により制御する。
【００７９】
測定は、740 nmのパルス励起波長を用いて行った。蛍光強度(任意単位)は、蛍光減衰を反映する曲線をプロットするために測定した(時間(ps)の関数として表す蛍光強度(任意単位))。曲線は示さない。
蛍光寿命を、その後、装置応答関数(FRI)に関してデコンボリューションした蛍光減衰の曲線の1つの単一指数的減衰(Xr2=1.0)による調節により、SPCImageソフトウェア(Becker Hickl GmbH)を用いて得た。これらを、以下の図２に示す。
【００８０】
【表２】
0005837279.tif 000004
【００８１】
これらの結果は、ナノエマルジョンタイプの脂質ナノ粒子への蛍光体の被包が、蛍光寿命の増加を導くことを示す。
【００８２】
実施例６：蛍光の量子収量に対する、脂質ナノ粒子中へのDiD蛍光体の被包の影響の研究
実施例１に記載したものと同じ組成を有するが、Invitrogenにより販売されるDiD蛍光体とのドープのレベルが400μMであるナノエマルジョンを製造した。
蛍光の量子収量(Φ)は、以下の等式により表される：Φ = (放射された光子数)／(吸収された光子数)。
参照標準のものに対する量子収量を、当業者に既知の方法により測定することは、通常行われることである。この処方の量子収量は、0.27に等しい既知の量子収量値を有する参照標準サンプル(エタノール中のナイルブルーパークロレート、Invitrogenにより販売)を用いる比較により算出した。同じ測定(Varian分光光度計、モデルCary 300およびPerkin Elmer分光蛍光計、モデルLS 50を用いて行う)および計算は、メタノール(MeOH)中のDiD蛍光体の溶液について行った。
得られた結果を、以下の表３に示す。
【００８３】
【表３】
0005837279.tif 000005
【００８４】
これらの結果は、水中油型ナノエマルジョンの油滴のコアへの蛍光体の被包が、蛍光の量子収量の増大を可能にすることを示す。
【００８５】
実施例７：種々の組成の油性コアを有する脂質ナノ粒子へのDiDの被包
DiDドーピングのレベルが400μMで得られたが、種々の組成の脂質コアを有する種々の処方を製造した。これらのナノエマルジョンを製造する方法は、実施例1に記載されるものと同様であるが、以下の表４および５に記載されるように、その組成を改変した。これらの処方のそれぞれについて、蛍光寿命を、実施例５で説明した方法に従って算出した。励起波長は、630 nmであった。
これらの処方を、メタノール中のDiDの400μM溶液(処方A)とも比較した。
【００８６】
【表４】
0005837279.tif 000006
【００８７】
【表５】
0005837279.tif 000007
【００８８】
DiDの蛍光寿命の増加が、ナノエマルジョンの形の処方において明確に観察され、このことは、試験した全ての脂質組成物についてあてはまる。
【図１】
0005837279.tif 000009
【図２】
0005837279.tif 000010
【図３】
0005837279.tif 000011
【図４】
0005837279.tif 000012
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0005837279.tif 000016
【図９】
0005837279.tif 000017
【図１０】
0005837279.tif 000018
【図１１】
0005837279.tif 000019
【配列表】
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