(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シナプス伝達の長期増強の機能不全により惹起されるか、またはその機能不全に伴う神経学的障害を治療または予防するための、グルカゴン様ペプチド−１（７−３６）のペプチドアナログを含む医薬組成物であって、ペプチドアナログのアミノ酸配列が配列番号１に示される配列のＮ−末端からの少なくとも最初の１０個のアミノ酸を含み、さらには、位置７のアミノ酸置換または修飾、位置８のアミノ酸置換または修飾、位置９のアミノ酸置換または修飾、位置２６のアミノ酸置換または修飾、および位置３４のアミノ酸置換または修飾からなる群より選択される１または複数のアミノ酸置換または修飾を含む；ただし、位置８で単一のアミノ酸置換がある場合、位置８のアミノ酸はＬ−ＡｌａまたはＬ−Ｇｌｙ以外のアミノ酸である、医薬組成物。
【請求項２】
ペプチドアナログのアミノ酸配列が、配列番号１に示される配列のＮ−末端からの少なくとも最初の１０個のアミノ酸を含み、位置２６のアミノ酸置換または修飾、および位置３４のアミノ酸置換または修飾からなる群より選択される１または複数のアミノ酸置換または修飾を含む、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
位置２６のアミノ酸置換または修飾が、独立して、Ｌ−またはＤ−Ｇｌｕの付加および/またはＣ−１６パルミトイル脂肪酸の付加からなる群より選択される、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
位置３４でのアミノ酸置換がＬ−またはＤ−Ａｒｇである、請求項２または３記載の医薬組成物。
【請求項５】
ペプチドアナログがＡｒｇ（３４）Ｌｙｓ（２６）−（Ｎ−イプシロン−（ガンマ−Ｇｌｕ）（Ｎ−アルファ−ヘキサデカノイル））ＧＬＰ−１（７−３７）である、請求項２−４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ペプチドアナログが配列番号２に示されるアミノ酸配列のポリペプチドを含み、ここでＸ２は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌを含む群より選択されるＬ−またはＤ−アミノ酸からなる、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
Ｘ１がＬ−またはＤ−Ｈｉｓからなり、Ｘ２がＬ−またはＤ−Ｖａｌからなり、Ｘ３がＬ−またはＤ−Ｇｌｕからなる、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
ペプチドアナログが配列番号２に示されるアミノ酸配列のポリペプチドを含み、ここでＸ１がＬ−またはＤ−Ａｓｐからなり、Ｘ２がＬ−またはＤ−Ａｌａからなり、Ｘ３がＬ−またはＤ−Ｇｌｕからなる、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項９】
ペプチドアナログが配列番号２に示されるアミノ酸配列のポリペプチドを含み、ここでＸ１がＬ−またはＤ−Ｈｉｓからなり、Ｘ２がＬ−またはＤ−Ａｌａからなり、Ｘ３がＬ−またはＤ−Ｐｒｏからなる、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ペプチドアナログがさらに、一般式：ＨＯ−（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２）ｎ−Ｈ（ここで、ｎは１と２２の間の整数である）のポリマー部分の結合を含む、少なくとも１回のアミノ酸修飾を含む、請求項１−９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ポリマー部分が、Ｌｙｓ（２６）およびＬｙｓ（３４）からなる群より選択されるリジン残基のアルファまたはイプシロンアミノ基に結合されている、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ペプチドアナログが位置７のアミノ酸のＮ−末端アルファ−アミンでのアセチル化を含む、請求項１−１１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ペプチドアナログが：
（ａ）Ｎ−末端糖化および位置７、８および９のうちの１、２またはすべてでのアミノ酸置換；
（ｂ）位置７、８および９の各々でのアミノ酸置換および/または修飾；および
（ｃ）位置７、８および９の１つでのアミノ酸置換および/または修飾；
ここで、該アミノ酸置換またはアミノ酸修飾は、
（ｉ）位置７、８または９での糖化；
（ｉｉ）位置７、８または９でのアルキル化；
（ｉｉｉ）位置７、８または９でのアセチル化；
（ｉｖ）位置７、８または９でのアシル化；
（ｖ）位置７、８または９でのイソプロピル基の付加；
（ｖｉ）位置７、８または９でのピログルタミン酸の付加；
（ｖｉｉ）位置７でのＤ−アミノ酸による置換；
（ｖｉｉｉ）位置７でのＬ−アミノ酸による置換；
（ｉｘ）位置８でのＬ−アミノ酸による置換、ただしＬ−アミノ酸はＬ−ＡｌａまたはＬ−Ｇｌｙ以外の基である；
（ｘ）位置９でのＤ−アミノ酸による置換；
（ｘｉ）位置９でのＬ−アミノ酸による置換；
（ｘｉｉ）位置７、８または９でのアミノイソ酪酸またはサルコシンによる置換；
（ｘｉｉｉ）位置８でのＤ−アミノ酸による置換；
（ｘｉｖ）Ａｌａ（８）−Ｇｌｕ（９）結合のΨ［ＣＨ２ＮＨ］結合への変換；
（ｘｖ）Ａｌａ（８）−Ｇｌｕ（９）結合の安定した等価結合への変換；および
（ｘｖｉ）位置７、８または９でのベータ-アラニン、オメガ-アミノ酸、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸、オルニチン、シトルリン、ホモアルギニン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、システイン酸またはメチオニンスルホキシドによる置換；
からなる群より選択され；
（ｄ）一般式：ＨＯ−（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２）ｎ−Ｈで表わされるポリマー部分の結合からなるアミノ酸修飾；および
（ｅ）アミノ酸残基のイプシロンアミノ基での、アシル基付加、所望により脂肪酸付加による修飾；
を含む、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ペプチドアナログが、Ｌｙｓ（２６）およびＬｙｓ（３４）からなる群より選択されるリジン残基のアルファまたはイプシロンアミノ基への脂肪酸分子の付加を含む、請求項１−１３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１５】
脂肪酸が、Ｃ−８オクタノイル基、Ｃ−１０デカノイル基、Ｃ−１２ラウロイル基、Ｃ−１４ミリストイル基、Ｃ−１６パルミトイル基、Ｃ−１８ステアロイル基 およびＣ−２０アシル基からなる群より選択される、請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ペプチドアナログが位置７でのＮ−糖化アミノ酸を含む、請求項１−１５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ペプチドアナログのアミノ酸配列が、
(a)配列番号４に示されるアミノ酸配列；
(b)配列番号３に示されるアミノ酸配列；
(c)配列番号１に示される配列のＮ−末端からの少なくとも最初の１０個のアミノ酸および位置７でのＮ−末端糖化；
(d)配列番号５に示されるアミノ酸配列；および
(e) Ａｒｇ（３４）Ｌｙｓ（２６）−（Ｎ−イプシロン−（ガンマ−Ｇｌｕ）（Ｎ−アルファ−ヘキサデカノイル））ＧＬＰ−１（７−３７）
の少なくとも１つを含む、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１８】
シナプス伝達の長期増強の機能不全により惹起されるか、またはその機能不全に伴う神経学的障害を治療または予防するための医薬の製造における、配列番号１に示される配列のＮ−末端からの少なくとも最初の１０個のアミノ酸を含み、さらには、位置７のアミノ酸置換または修飾、位置８のアミノ酸置換または修飾、位置９のアミノ酸置換または修飾、位置２６のアミノ酸置換または修飾、および位置３４のアミノ酸置換または修飾からなる群より選択される１または複数のアミノ酸置換または修飾を含む；ただし、位置８で単一のアミノ酸置換がある場合、位置８のアミノ酸はＬ−ＡｌａまたはＬ−Ｇｌｙ以外のアミノ酸である、ペプチドアナログの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）はプログルカゴン遺伝子の転写産物より誘導され、その遺伝子はヒトの膵臓および小腸にて発現されることが知られている。プログルカゴンが膵臓α細胞で発現することで２９−アミノ酸グルカゴンペプチド、グルカゴン関連性膵臓ペプチド（ＧＲＰＰ）およびメジャープログルカゴンフラグメントが得られる。しかしながら、小腸内分泌細胞にて、グルカゴン関連性膵臓ペプチド（ＧＲＰＰ）、オキシントモデュリン、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２がプログルカゴン遺伝子より合成される。３０−アミノ酸内因性ＧＬＰ−１ペプチドはホルモンのインクレチンファミリーに属し、養分吸収後の代謝恒常性にて多くの役割を果たす。体内でのＧＬＰ−１の主たる供給源は腸Ｌ−細胞であり、ＧＬＰ−１を養分摂取に応じて胃ホルモンとして分泌する。Ｌ−細胞がＧＬＰ−１を分泌するかは小腸管腔での養分の存在に依存する。このホルモンの分泌促進物質として、炭水化物、蛋白および脂質などの主要栄養素が挙げられる。ＧＬＰ−１の生物学的に活性な形態はＧＬＰ−１（７−３７）およびＧＬＰ−１（７−３６）アミドである。ＧＬＰ−１の生物学的活動として、グルカゴンの膵臓からの分泌の阻害、胃内容排出および満腹感を強めることによる食物摂取の阻害が挙げられる。特に、ＧＬＰ−１はインスリン放出に対して調節作用を有する。ＧＬＰ−１受容体の刺激はインスリン生合成、ベータ細胞増殖、膵臓からのグルコース依存性インスリン分泌を強化し、２型真正糖尿病患者の血中グルコース濃度を低下させる（Gaultら、２００３）。ＧＬＰ−１が糖尿病患者の血中グルコースを低下させるとの知見は、ＧＬＰ−１が外因性分泌促進物質に対してベータ細胞感受性を復元しうるとの示唆と一緒になって、ＧＬＰ−１シグナル伝達の強化が糖尿病患者を治療する有用な解決手段であることを示唆する。
【０００２】
神経可塑性は新たな神経連絡を絶え間なく形成することを含むプロセスであり、それは活動と経験に応じて脳が再構成される間に生じる。活動に依存するシナプス可塑性は成長の間にシナプス結合を変形するにおいて極めて重要な役割を果たす。しかしながら、成長の間に生じることはよく知られているが、そのプロセスは成人の脳の中心的な特徴でもある。ニューロン結合が可塑性を有することで、脳は経験に応じて絶え間なく成長することができ、ニューロンに対するトラウマまたはダメージの結果として生じる神経シグナル伝達の損傷を回避することもできる。
【０００３】
このプロセスの間に脳に起こると考えられる２つの型の修飾：１）特にシナプス領域におけるニューロンその物の形態学的変化；および２）ニューロン間のシナプスの数の増加がある。シナプスシグナル伝達の効率は、これらの修飾のいずれか（または両方）に依存することが多い。実際、記憶形成および学習能力などのプロセスはニューロン間の結合の強化を可能とするシナプス効率における交代に依存するとの考えが広く受け入れられている。その上、特定のシナプスでのシナプス可塑性は、脳にて情報を記憶するのに必要かつ十分であると考えられる。
【０００４】
長期増強（ＬＴＰ）が、シナプス結合の強化を達成しうる、作用機序のモデルとして長きにわたって提案されている。高頻度で刺激することでシナプス伝達の効率が増加し続けうることが広く証明されている。この知見に基づき、学習および記憶の少なくとも特定の形態を支持するシナプス変化は、ＬＴＰの発現に必要とされる変化と類似すると考えられる。
【０００５】
その上、ＬＴＰの損傷が認知機能の損傷と関係することが多いことも広く受け入れられている。この点、今日までの長年にわたる研究にて、老齢ラットにおける認知障害を報告している。特に老齢ラットは空間的情報のプロセッシングにて欠損を示すことが明らかにされた。噛歯動物の脳のＣＡ１領域のＬＴＰの欠損が、空間学習の能力における欠損と相関付けられた；損傷が重度の動物ではＬＴＰを維持しなかったのに対して、空間学習が相対的に損傷していない動物ではＬＴＰの維持が観察された。
【０００６】
したがって、認知障害は多くの神経障害の顕著な特徴である。例えば、加齢記憶損傷の徴候は、アルツハイマー病などの神経変性疾患の初期段階に関連する徴候と似ていることが多い。神経科学の分野における主たる目標は、明らかに、加齢、疾患に関連して、あるいはシナプス伝達の損傷をもたらす他の原因で、ＬＴＰが損傷している状況にてＬＴＰを維持することにある。
【０００７】
しかしながら、成熟ニューロンがまた、入力シナプスの強化を妨げる機構を有する可能性があるとする証拠もそろってきている。かかる恒常性制御は、ニューロンがその最適な活動の範囲内にあり、脳の可塑性を高く維持するのに不可欠な工程を確実に行うようにする。このことは、ＣＡ１領域の錐体細胞の各々が、シナプス伝達の活動依存性亢進の可能性と共に数千の興奮性入力を受ける、海馬にて明らかである。シナプス強化を制限する機構が無い場合は、生理学的バランスは危険に曝され、その結果、ＬＴＰプロセスはシャットダウンされ、結局のところ、情報を記憶する完全なニューロンサーキットの能力の軽減に至る。したがって、脱増強作用のプロセスもまた、ニューロン恒常性を制御すること、およびコーディネートされたシナプス伝達の強化の調節を確実にすること、における臨界的要素として作用する。脱増強作用は、今では、記憶から不必要な情報を除去するのに一の役割を果たすと考えられている。脱増強作用それ自体は、認知プロセスが過活動であることに伴う障害にて、潜在的に治療基準として作用しうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本願発明の目的は、シナプス伝達のＬＴＰを増加（または維持）することにより、障害のこれらの型に関連する認知機能を予防、改善または逆転させることにある。その上、ＬＴＰの維持は認知プロセスの損傷の発症を遅らせることで神経疾患の予防に有用であり、神経変性により惹起される認知機能の減少だけでなく、トラウマまたは加齢による機能障害性認知プロセスの治療についても役立つことがわかった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第一の態様によれば、シナプス伝達の長期増強の機能不全により惹起されるか、またはその機能不全に伴う神経学的障害を治療または予防するための、グルカゴン様ペプチド−１（７−３６）のペプチドアナログの使用が提供される；ここで、ペプチドアナログのアミノ酸配列は配列番号１で特定される配列のＮ−末端から少なくとも最初の１０個のアミノ酸からなり、さらには、限定されるものではないが、位置７のアミノ酸置換または修飾、位置８のアミノ酸置換または修飾、位置９のアミノ酸置換または修飾、位置２６のアミノ酸置換または修飾、および位置３４のアミノ酸置換または修飾からなる群より選択される１または複数のアミノ酸置換または修飾を含む；ただし、位置８で単一のアミノ酸置換がある場合、その場合、Ｘ２はＬ−ＡｌａまたはＬ−Ｇｌｙではない。
【００１０】
本発明の第二の態様によれば、シナプス伝達の長期増強の機能不全により惹起されるか、またはその機能不全に伴う神経学的障害を治療または予防するための医薬の製造における、ペプチドアナログの使用が提供される；ここで、ペプチドアナログのアミノ酸配列は配列番号１で特定される配列のＮ−末端から少なくとも最初の１０個のアミノ酸からなり、さらには、限定されるものではないが、位置７のアミノ酸置換または修飾、位置８のアミノ酸置換または修飾、位置９のアミノ酸置換または修飾、位置２６のアミノ酸置換または修飾、および位置３４のアミノ酸置換または修飾からなる群より選択される１または複数のアミノ酸置換または修飾を含む；ただし、位置８で単一のアミノ酸置換がある場合、その場合、ＸはＬ−ＡｌａまたはＬ−Ｇｌｙではない。
【００１１】
本発明の第三の態様によれば、シナプス伝達の長期増強の機能不全により惹起されるか、またはその機能不全に伴う神経学的障害を治療する方法であって、シナプス伝達の長期増強の機能不全により惹起されるか、またはその機能不全に伴う神経学的障害を患っている対象に、治療上有効量のペプチドアナログを投与することを含む方法が提供される；ここで、ペプチドアナログのアミノ酸配列は配列番号１で特定される配列のＮ−末端から少なくとも最初の１０個のアミノ酸からなり、さらには、限定されるものではないが、位置７のアミノ酸置換または修飾、位置８のアミノ酸置換または修飾、位置９のアミノ酸置換または修飾、位置２６のアミノ酸置換または修飾、および位置３４のアミノ酸置換または修飾からなる群より選択される１または複数のアミノ酸置換または修飾を含む；ただし、位置８で単一のアミノ酸置換がある場合、その場合、ＸはＬ−ＡｌａまたはＬ−Ｇｌｙではない。
【００１２】
所望により、ペプチドアナログのアミノ酸配列は配列番号１で特定される配列のＮ−末端から少なくとも最初の１０個のアミノ酸からなり、さらには、限定されるものではないが、位置２６のアミノ酸置換または修飾、および位置３４のアミノ酸置換または修飾からなる群より選択される１または複数のアミノ酸置換または修飾を含んでいてもよい。
【００１３】
所望により、位置２６のアミノ酸置換または修飾は、独立して、アミノ酸の付加、および/またはアシル基、望ましくは脂肪酸の付加からなる群より選択される。さらには所望により、アミノ酸はＬ−またはＤ−Ｇｌｕであり、脂肪酸はＣ−１６パルミトイル基であってもよい。
【００１４】
所望により、または付加的に、位置３４のアミノ酸置換または修飾はＬ−またはＤ−Ａｒｇであってもよい。
【００１５】
所望により、ペプチドアナログは、リラグルチド（Liraglutide）としても知られている、Ａｒｇ（３４）Ｌｙｓ（２６）−（Ｎ−イプシロン−（ガンマ−Ｇｌｕ）（Ｎ−アルファ−ヘキサデカノイル））ＧＬＰ−１（７−３７）である。リラグルチドのアミノ酸配列は配列番号６に示される塩基性アミノ酸配列より誘導される。
【００１６】
「機能不全」なる語は、一のプロセスに異常な機能をもたらす障害を意味し、そのために該プロセスはもはや従来の機能パターンを遂行しない。プロセスの異常な機能は、ＬＴＰの損傷を包含し、ここで処理はＬＴＰの増強を含む。
【００１７】
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）ペプチドアナログは配列番号２で示されるアミノ酸配列のポリペプチドであり、ここでＸ２は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌを含む群より選択されるＬ−またはＤ−アミノ酸からなる。
【００１８】
好ましくは、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）ペプチドアナログは配列番号２で示されるアミノ酸配列のポリペプチドであり、ここでＸ２は疎水性Ｌ−またはＤ−アミノ酸からなる。さらに好ましくは、Ｘ２は脂肪族Ｌ−またはＤ−アミノ酸からなる。最も好ましくは、Ｘ２はＬ−またはＤ−Ｖａｌからなる。所望により、ペプチドアナログは配列番号２で特定される配列のＮ−末端からの少なくとも１０個のアミノ酸残基からなっていてもよく、さらには位置７のアミノ酸置換または修飾、および位置９のアミノ酸置換または修飾からなる群より選択される１または複数のアミノ酸置換または修飾からなっていてもよい。
【００１９】
所望により、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）ペプチドアナログは配列番号２で示されるアミノ酸配列のポリペプチドからなっていてもよく、ここでＸ１は天然に存在するアミノ酸より選択される。さらに好ましくは、Ｘ１は配列番号３に示されるようにＬ−またはＤ−Ａｓｐからなる。
【００２０】
所望により、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）ペプチドアナログは配列番号２で示されるアミノ酸配列のポリペプチドからなっていてもよく、ここでＸ２は天然に存在するアミノ酸より選択される。さらに好ましくは、Ｘ２は配列番号４に示されるようにＬ−またはＤ−Ｖａｌからなる。
【００２１】
所望により、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）ペプチドアナログは配列番号２で示されるアミノ酸配列のポリペプチドからなっていてもよく、ここでＸ３は天然に存在するアミノ酸より選択される。さらに好ましくは、Ｘ３は配列番号５に示されるようにＬ−またはＤ−Ｐｒｏからなる。
【００２２】
ペプチドアナログのフラグメントは配列番号１で特定される配列のＮ−末端からの少なくとも１０個のアミノ酸残基からなり、さらには、限定されるものではないが、位置７のアミノ酸置換または修飾、位置８のアミノ酸置換または修飾、位置９のアミノ酸置換または修飾、位置２６のアミノ酸置換または修飾、および位置３４のアミノ酸置換または修飾からなる群より選択される１または複数のアミノ酸置換または修飾からなる；ただし、位置８で単一のアミノ酸置換がある場合、その場合、Ｘ２はＬ−ＡｌａまたはＬ−Ｇｌｙではない。
【００２３】
ＧＬＰ−１のペプチドアナログは、所望により、ヒトＧＬＰ−１のアナログであってもよい。
【００２４】
好ましくは、ペプチドアナログはジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）による変性に対して耐性である。
【００２５】
所望により、ペプチドアナログはさらに少なくとも１回のアミノ酸修飾を含んでいてもよく、該少なくとも１回のアミノ酸修飾は一般式：ＨＯ−（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２）ｎ−Ｈ（ここで、ｎは１と約２２の間の整数である）のポリマー部分の結合を含む。
【００２６】
ポリマー部分の平均分子量は１０００Ｄａを上回らないことが望ましい。ポリマー部分の平均分子量は１０００Ｄａ未満であることが好ましい。
【００２７】
ｎは１と約１０の間の整数であることが好ましい。ｎは約２と約５の間の整数であることがさらに好ましい。
【００２８】
ポリマー部分は分岐構造であってもよい。分岐構造は少なくとも２個の線状構造のポリマー部分が結合してなっていてもよい。別に、分岐点は各ポリマー部分の構造内にあってもよい。また、ポリマー部分は線状構造を有する。
【００２９】
すべてのモノマーのうちいくつかのモノマーは水分子と結合しうる。ポリマー部分の結合は共有結合を介してなされうる。共有結合は安定な共有結合であってもよい。また、共有結合は可逆的であってもよい。共有結合は加水分解されうる。
【００３０】
当該または各ポリマー部分は、ペプチドアナログの隣接するＮ−末端アミノ酸と；ペプチドアナログの隣接するＣ−末端アミノ酸と；あるいは、限定されるものではないが、リジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニンおよびチロシンを含む群より選択される天然に存在するアミノ酸に結合しうる。
また、該ペプチドアナログはさらに、天然に存在するアミノ酸が、限定されるものではないが、リジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニンおよびチロシンを含む群より選択されるアミノ酸で置換されており；当該または各ポリマー部分が該または各置換アミノ酸に結合されている。当該または各ポリマー部分は隣接するＣ−末端アミノ酸に結合してもよい。さらに、該または各ポリマー部分はＣ−末端アミノ酸に結合してもよい。
【００３１】
該または各ポリマー部分はリジン残基に結合されていてもよい。該または各ポリマー部分はリジンのアルファまたはイプシロンアミノ基に結合されうる。リジン残基はＬｙｓ（２６）およびＬｙｓ（３４）からなる群より選択されうる。
【００３２】
全体を通して用いられる場合の「ミニ−ＰＥＧ」（または「ｍＰＥＧ」）なる語は、本明細書にて上記したように、ｎが１と約２２の間の整数であるところの、ポリエチレングリコールの結合ポリマーの同義語を意味する。
【００３３】
所望により、ペプチドアナログは位置７でアミノ酸修飾を含んでいてもよく、ここで該アミノ酸修飾は、限定されるものではないが、アセチル化などのアシル化である。該ペプチドアナログはＮ−末端に隣接してアシル化（所望により、アセチル化）され得る。所望により、ペプチドアナログはＮ−末端アルファ−アミンでアシル化（所望により、アセチル化）されていてもよい。
【００３４】
所望により、該ペプチドアナログは：
（ａ）位置７、８および９のうちの１、２またはすべてでのＮ−末端糖化およびアミノ酸置換；
（ｂ）位置７、８および９の各々でのアミノ酸置換および/または修飾；および
（ｃ）位置７、８および９の１つでのアミノ酸置換および/または修飾；
ここで、該アミノ酸置換またはアミノ酸修飾は、
（ｉ）位置７、８または９での糖化；
（ｉｉ）位置７、８または９でのアルキル化；
（ｉｉｉ）位置７、８または９でのアセチル化；
（ｉｖ）位置７、８または９でのアシル化；
（ｖ）位置７、８または９でのイソプロピル基の付加；
（ｖｉ）位置７、８または９でのピログルタミン酸の付加；
（ｖｉｉ）位置７でのＤ−アミノ酸による置換；
（ｖｉｉｉ）位置７でのＬ−アミノ酸による置換；
（ｉｘ）位置８でのＬ−アミノ酸による置換、ただしＬ−アミノ酸はＬ−ＡｌａまたはＬ−Ｇｌｙではない；
（ｖｉｉ）位置９でのＤ−アミノ酸による置換；
（ｘ）位置９でのＬ−アミノ酸による置換；
（ｘｉ）位置７、８または９でのアミノイソ酪酸またはサルコシンによる置換；
（ｘｉｉ）位置８でのＤ−アミノ酸による置換；
（ｘｉｉｉ）Ａｌａ（８）−Ｇｌｕ（９）結合のΨ［ＣＨ２ＮＨ］結合への変換；
（ｘｉｖ）Ａｌａ（８）−Ｇｌｕ（９）結合の安定した等価結合への変換；および
（ｘｖ）位置７、８または９でのベータ-アラニン、オメガ-アミノ酸、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸、オルニチン、シトルリン、ホモアルギニン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、システイン酸またはメチオニンスルホキシドによる置換；
からなる群より選択され；
（ｄ）一般式：ＨＯ−（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２）ｎ−Ｈで表わされるポリマー部分の結合からなるアミノ酸修飾；および
（ｅ）アミノ酸残基のイプシロンアミノ基での、アシル基付加、所望により脂肪酸付加による修飾；
からなる。
【００３５】
所望により、ペプチドアナログは配列番号２にて特定される配列のＮ−末端からの１０個のアミノ酸からなっていてもよい。好ましくは、該ペプチドアナログはＧＬＰ−１（７−３７）およびＧＬＰ−１（７−３６）アミドの生物学的活性を保持する。
【００３６】
所望により、ペプチドアナログは、少なくとも１個のアミノ酸残基のアミノ基での、少なくとも１個のアシル基、所望により脂肪酸分子の付加からなる修飾を含んでいてもよい。所望により、該または各々の脂肪酸分子はリジン残基に結合されてもよい。該または各々の脂肪酸分子はリジンのアルファまたはイプシロンアミノ基に結合され得る。該リジン残基はＬｙｓ（２６）およびＬｙｓ（３４）からなる群より選択され得る。
【００３７】
所望により、脂肪酸は飽和脂肪酸であってもよい。さらには所望により、修飾は、限定されるものではないが、Ｃ−８オクタノイル基、Ｃ−１０デカノイル基、Ｃ−１２ラウロイル基、Ｃ−１４ミリストイル基、Ｃ−１6パルミトイル基、Ｃ−１８ステアロイル基 およびＣ−２０アシル基からなる群より選択される脂肪酸の付加からなってもよい。
【００３８】
好ましくは、ペプチドアナログは位置７にてＮ−糖化アミノ酸を含む。さらに好ましくは、該ペプチドアナログは位置７にてＮ−糖化Ｈｉｓ残基を含む。
【００３９】
所望により、ペプチドアナログは位置７にてＮ−アルキル化アミノ酸を含んでよい。さらに所望により、該ペプチドアナログは位置７にてＮ−末端イソプロピル基の付加を含んでよい。さらに所望により、該ペプチドアナログは位置７にてＮ−末端ピログルタミン酸の付加を含んでよい。さらに所望により、該ペプチドアナログは、少なくとも一のリジン残基のイプシロンアミノ基での脂肪酸の付加による修飾、および位置７、８および９のうち１、２またはすべての位置でのアミノ酸置換または修飾を含んでいてもよい。
【００４０】
好ましくは、位置７でのアミノ酸置換はＡｓｐ残基をもたらす。好ましくは、位置８でのアミノ酸置換はＶａｌ残基をもたらす。好ましくは、位置９でのアミノ酸置換はＰｒｏ残基をもたらす。
【００４１】
所望により、ペプチドアナログはさらに、少なくとも１個のアミノ酸残基のアミノ基で、少なくとも１個のアミノ酸の付加からなる修飾を含んでもよい。好ましくは、付加されるアミノ酸はＧｌｕである。所望により、該または各々のアミノ酸はリジン残基に結合されてもよい。該または各々のアミノ酸はリジンのアルファまたはイプシロンアミノ基に結合され得る。リジン残基はＬｙｓ（２６）およびＬｙｓ（３４）からなる群より選択され得る。
【００４２】
本発明のさらなる態様によれば、シナプス伝達の長期増強の機能障害により惹起されるか、またはその機能障害に伴う神経学的障害を治療または予防するためのリラグルチドの使用が提供される。
【００４３】
本願明細書において、本発明は、特定の方法、治療方法または操作に限定されず、それ自体が変化しうることが理解される。さらには、本明細書にて使用される用語は、特定の実施形態を記載するためのもので、限定されるものではない。
【００４４】
明細書全体を通して、「グルカゴン様ペプチド−１」（または「ＧＬＰ−１」）なる語は、全長ＧＬＰ−１、ＧＬＰ（７−３６）およびＧＬＰ−１（７−３６）アミドと同意義である。好ましくは、該語はヒトＧＬＰ−１をいう。
【００４５】
「ポリペプチド」なる語は、本明細書にて、ペプチドなる語と同意義に用いられる。
【００４６】
「対象」なる語は個体を意味する。好ましくは、対象は哺乳動物である。より好ましくは、対象はヒトである。
【００４７】
本願明細書において、位置７はペプチドアナログのＮ−末端アミノ酸をいい、本明細書中に記載されるアミノ酸位置は添付図面にて説明されるアミノ酸位置と同義であることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
本発明の実施形態を添付した図面を用いて説明するが、それらは例示にすぎない：
【図１】ヒトＧＬＰ（７−３６）（配列番号１）およびＧＬＰ−１のペプチドアナログ（配列番号２−５）のポリペプチド配列を示す。
【図２】ベータ−アミロイド（２５−３５）のシナプス伝達の長期増強に対する効果を示す。
【図３Ａ】ＧＬＰ−１のシナプス伝達の長期増強に対する効果を示す。
【図３Ｂ】Ｖａｌ（８）ＧＬＰ−１のシナプス伝達の長期増強に対する効果を示す。
【図４Ａ】Ｖａｌ（８）ＧＬＰ−１とベータ−アミロイド（２５−３５）を共同投与した場合のシナプス伝達の長期増強に対する効果を示す。
【図４Ｂ】ベータ−アミロイド（２５−３５）の１５分前にＶａｌ（８）ＧＬＰ−１を投与した場合のシナプス伝達の長期増強に対する効果を示す。
【図４Ｃ】ベータ−アミロイド（２５−３５）の３０分前にＶａｌ（８）ＧＬＰ−１を投与した場合のシナプス伝達の長期増強に対する効果を示す。
【図５】Ａｓｐ（７）ＧＬＰ−１のシナプス伝達の長期増強に対する効果を示す。
【図６】［Ｎ−糖化］ＧＬＰ−１のシナプス伝達の長期増強に対する効果を示す。
【図７】Ｐｒｏ（９）ＧＬＰ−１のシナプス伝達の長期強化に対する効果を示す。
【図８】リラグルチドのシナプス伝達の長期増強に対する効果を示す。
【００４９】
材料および方法
【００５０】
手術およびＬＴＰ誘発プロトコル
雄ウィスターラット（体重：２２０−２８０ｇ）を、すべての実験が終わるまで、ウレタン（カルバミン酸エチル、１．８ｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉ．ｐ．））で麻酔処理した。該動物は英国（ＵＫ）、ハーランより入手した。カニューレ（２２ゲージ、０．７ｍｍ外径、１１ｍｍ長、ＵＫ、ケント州、ビラニー）を脳室内（ｉｃｖ）注射のために左脳半球（プレグマの前方１．５ｍｍ、正中線の側方０．５ｍｍおよび腹側３．５５ｍｍ）に挿入した。電極（ＵＫ、ケント州、ビラニー、テフロン被覆したタングステン）を、一方的に、正中線の後方３．４ｍｍおよび側方２．５ｍｍに、刺激電極をプレグマの後方４．２ｍｍおよび正中線の側方３．８ｍｍに挿入した。電極を、皮質および海馬の上層を通って、約１０ミリ秒の潜伏時間のある消極的な偏光性興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）が出現するまで、ＣＡ１領域中にゆっくりと下げた。ＥＰＳＰの記録をシャファー・コラテラル／交連経路の刺激に応答して右海馬脳半球のＣＡ１領域での放線状層より行った。
【００５１】
フィールドＥＰＳＰを、そのトリガー閾値が調整可能である、コンピューター処理される刺激および記録ユニット（英国、ＡＤＩインストルメント、Power Lab）上で記録した。トリガーされたユニットは定電流刺激単離ユニット（英国、Neurolog）を活性化させた。データ獲得システムを同時にトリガーさせ、すべての事象を記録させた。サンプリング速度はＥＰＳＰを２０ＫＨｚで記録することであった。
【００５２】
長期増強（ＬＴＰ）を誘発する「強」高周波刺激（ＨＦＳ）プロトコルは、３トレインの２００刺激、刺激間隔５ミリ秒（２００Ｈｚ）、トレイン間隔２秒から構成された。この標準ＨＦＳはこれらの記録条件（Holscherら、１９９７）下で最大ＬＴＰを誘発することが明らかにされた。ＬＴＰを誘発する「弱」ＨＦＳプロトコルは１０トレインの１０刺激、刺激間隔５ミリ秒（２００Ｈｚ）から構成された。強ＨＦＳを用いてＬＴＰを害するペプチドの作用を試験し（ベータ−アミロイド）、弱ＨＦＳを用いてＬＴＰを促進するペプチドを試験した。ＬＴＰのこの形態において、対照群は最大速度で強化されず、ＬＴＰは経時的にゆっくりと崩壊しうる。
【００５３】
刺激強度は最大ＥＰＳＰの７０％であった。ＬＴＰを、薬物を注射する前の３０分間、およびＨＦＳを適用する前の６０分間にわたって記録したベースラインＥＰＳＰ傾斜の％として測定した。ベースラインを３０分間記録し、平均化した。この値をＥＰＳＰ傾斜の１００％とし、記録されるすべての値をこのベースライン値に対して標準化した。
【００５４】
すべての実験は、ＵＳ  Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅレギュレーションにより使用許諾されており、「Principles of laboratory animal care」（ＮＩＨパブリケーションＮｏ．８６−２３、１９８５年改訂）に従った。
【００５５】
ペプチド
この試験に用いるベータアミロイド（２５−３５）および他のペプチドを、標準固相Ｆｍｏｃプロトコルを用い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒ（Ｍｏｄｅｌ  ４３２Ａ）で合成した。ペプチドをＷａｔｅｒｓ  Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ  ２０１０クロマトグラフィーシステムの逆相ＨＰＬＣを用いて純度を判断し、ペプチドをその後、以前に記載されるように、マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を用いて特徴付けした（Genglerら、２００６；Holsherら、２００７）。ペプチドを乾燥形態にて貯蔵し、実験前に再蒸留水に溶かした。５μｌのペプチド溶液をｉｃｖに注射した。
【００５６】
統計
一群６匹の動物から構成された。データを反復測定二方向性ＡＮＯＶＡを用いて、あるいはｐｏｓｔ−ｈｏｃ試験との反復測定３レベル二方向性ＡＮＯＶＡを用いて分析し、群間の差異を明確にした（米国、GraphPad software Inc., PRISM）。
【００５７】
実施例
当業者が発明の完全な開示または記載が得られるように、明細書に以下の実施例が記載されているものであり、該実施例は純粋に発明の例示を意図とするもので、発明の範囲を限定するものではない。
【００５８】
実施例１．ペプチド配列
ヒトＧＬＰ−１（１−４２）のアミノ酸配列およびそのアナログを図１に示す。アミノ酸は以下のように番号を付す。
配列番号１はヒトＧＬＰ−１のアミノ酸配列を示す；
配列番号２はヒトＧＬＰ−１のアナログのアミノ酸配列であって、位置７（Ｘ１で示される）で、位置８（Ｘ２で示される）で、および／または位置９（Ｘ３で示される）でアミノ酸置換により修飾されている、アミノ酸配列を示す；
配列番号３はアナログＡｓｐ（７）ＧＬＰ−１のアミノ酸配列を示す；
配列番号４はアナログＶａｌ（８）ＧＬＰ−１のアミノ酸配列を示す；
配列番号５はアナログＰｒｏ（９）ＧＬＰ−１のアミノ酸配列を示す；および
配列番号６はアナログリラグルチド（Liraglutide）のアミノ酸配列を示す。
【００５９】
実施例２．ベータ−アミロイド（２５−３５）処理のインビボ効果
雄のウィスターラットに、ベータ−アミロイド（βＡ）（２５−３５）の不活性なスクランブルペプチド配列バージョン（対照）１０ナノモル（○）または１００ナノモル（◆）βＡ（２５−３５）のいずれかを脳内室（ｉｃｖ）注射した。ＨＦＳ（強プロトコル）を用いて注射した１５分後にＬＴＰが誘発され、ＥＰＳＰの変化を評価し、グラフを作成してＬＴＰの変化を示した（図２）。３レベルの二方向性反復測定ＡＮＯＶＡにより、群（ＤＦ２，１６；Ｆ＝６．２、ｐ＜０．００１）および時間（ＤＦ２，１１９；Ｆ＝１．９；ｐ＜０．０１）間の全体的違いが分かった。因子間の相互作用は有意ではなかった。２レベルの二方向性反復測定ＡＮＯＶＡは、１００ナノモル群と対照（ＤＦ１，１０；Ｆ＝１６．１；ｐ＜０．００５）および時間（ＤＦ１，１１９；Ｆ＝１．５；ｐ＜０．００１）の間で違いを示した。因子間の相互作用は有意ではなかった。２レベルの二方向性反復測定ＡＮＯＶＡは、１０ナノモル群と対照（ＤＦ１，１０；Ｆ＝９．１；ｐ＜０．０１）および時間（ＤＦ１，１１９；Ｆ＝１．３８；ｐ＜０．００５）の間で違いを示した。因子間の相互作用は有意ではなかった。１０ナノモルと１００ナノモル群の間に違いはなかった。一群Ｎ＝６である。平均したＥＰＳＰをＨＦＳの５分前と、ＨＦＳの１時間後に記録して示す。これらのＥＰＳＰは記録の質を証明するための例である。図示されるように、ＥＰＳＰは刺激後に明らかに変化しており、ノイズはかなり小さく、高品質である。目盛バーは横１０ミリ秒、縦１ｍＶである。一群すべてｎ＝６である。
【００６０】
これらの結果はβＡ（２５−３５）のＬＴＰに対する有害な作用を示す。この損傷の基本的な機構として、Ｋ＋チャネル活性の変化、電位依存性カルシウムチャネル（ＶＤＣＣ）活性の減少、およびＣａ２＋インフレックスが挙げられ、それらは、順次、Ｃａ２＋感受的酵素活性に影響を及ぼし、ベシクル放出を軽減する。興味深いことに、以前の実験では、ベータ−アミロイドの放出はＧＬＰ−１の影響を受け、軽減されることが示された。
【００６１】
実施例３．ＧＬＰ−１（７−３６）アミド、ＧＬＰ−１（９−３６）アミドおよびＶａｌ（８）ＧＬＰ−１を用いる処理のインビボ効果
天然ホルモンＧＬＰ−１（７−３６）アミドを注射（１５ナノモル、５μｌ、ｉｃｖ．）し、弱刺激プロトコルを用いてＬＴＰに対する効果を試験した（図３Ａ）。加えて、不活性な形態のＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１（９−３６）アミドを対照として注射した（１５ナノモル、５μｌ、ｉｃｖ．）。３レベルの二方向性反復測定ＡＮＯＶＡにより、群（ＤＦ２，１６；Ｆ＝７．４、ｐ＜０．００１）および時間（ＤＦ２，１１９；Ｆ＝３．６；ｐ＜０．００１）間の全体的違いが分かった。因子間の相互作用は有意ではなかった。２レベルの二方向性反復測定ＡＮＯＶＡは、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド群と対照（ＤＦ１，１０；Ｆ＝１２．１；ｐ＜０．０１）および時間（ＤＦ１，１１９；Ｆ＝１．６；ｐ＜０．００１）の間で違いを示した。因子間の相互作用は有意ではなかった。２レベルの二方向性反復測定ＡＮＯＶＡは、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド群とＧＬＰ−１（９−３６）アミド群（ＤＦ１，１０；Ｆ＝１２．１；ｐ＜０．０１）および時間（ＤＦ１，１１９；Ｆ＝１．７；ｐ＜０．００１）の間で違いを示した。因子間の相互作用は有意ではなかった。ＧＬＰ−１（９−３６）アミド群と対照群の間に違いはなかった。すべての群はｎ＝６である。
【００６２】
雄のウィスターラットに、ビヒクル（対照）または１５ナノモルのＶａｌ（８）ＧＬＰ−１（◆）のいずれかを脳内室（ｉｃｖ）注射した。ＨＦＳ（弱プロトコル）を用いて注射した３０分後にＬＴＰが誘発され、ＥＰＳＰの変化を評価し、グラフを作成してＬＴＰの変化を示した（図３Ｂ）。２レベルの二方向性反復測定ＡＮＯＶＡは、Ｖａｌ（８）ＧＬＰ−１群と対照（ＤＦ１，１０；Ｆ＝１７．１；ｐ＜０．００３）および時間（ＤＦ１，１１９；Ｆ＝１．８；ｐ＜０．００６）の間で違いを示した。因子間の相互作用は有意ではなかった。群はすべてｎ＝６である。平均したＥＰＳＰをテタヌス（tetanus）の５分前と、テタヌスの１時間後に記録して示す。図示されるように、ＥＰＳＰは刺激後に明らかに変化しており、ノイズはかなり小さく、高品質である。目盛バーは横１０ミリ秒、縦１ｍＶである。
【００６３】
これらの結果は、初めて、Ｖａｌ（８）ＧＬＰ−１がシナプス伝達に対して直接的かつ急性の調整作用を有し、ＬＴＰの誘発を強化しうることを示す。この効果は、かなり長い時間的経過を有する、成長受容体の活性化の後に観察される効果とは異なるものである。したがって、本発明者らは、その結果を、ＧＬＰ−１受容体がおそらくベシクル放出を直接調整することができる前シナプス部位で、該受容体がニューロンに対して活性化されることで、ＬＴＰの速い効果が開始されうると解釈する。理論に拘束されるものではないが、本発明者らは、ＧＬＰ−１が膵臓におけるインスリン放出を向上させる作用機序が、脳での当該実験にて観察されたＬＴＰおよびシナプス伝達に対する効果と同様であると仮定する。
【００６４】
実施例４．  Ｖａｌ（８）ＧＬＰ−１およびベータ−アミロイド（２５−３５）処理のインビボ効果
雄のウィスターラットに、ビヒクル（対照）、１００ナノモルのβＡ（２５−３５）（◆）または１５ナノモルのＶａｌ（８）ＧＬＰ−１と１００ナノモルのβＡ（２５−３５）のコンビネーション（○）のいずれかをｉｃｖ注射した。βＡ（２５−３５）およびＶａｌ（８）ＧＬＰ−１を同時に注射し、ＨＦＳ（弱プロトコル）を用いてβＡ（２５−３５）注射した１５分後にＬＴＰが誘発され、ＥＰＳＰの変化を評価し、グラフを作成してＬＴＰの変化を示した（図４Ａ）。この実験はＶａｌ（８）ＧＬＰ−１がβＡ誘発のＬＴＰの損傷を防止しうるかどうか試験ことであったので、強ＨＦＳプロトコルを用いて最大ＬＴＰを得た。したがって、ＬＴＰは既に最大レベルで誘発されており、Ｖａｌ（８）ＧＬＰ−１でさらに増強され得ないため、このプロトコルではＶａｌ（８）ＧＬＰ−１その物については試験しなかった。本発明者らは弱ＨＦＳプロトコルを用いてＶａｌ（８）ＧＬＰ−１その物を試験し、それではＬＴＰの増強を示した（実施例３を参照のこと）。Ｖａｌ（８）ＧＬＰ−１（１５ナノモル、５μｌ、ｉｃｖ）をベータ−アミロイド（２５−３５）（１００ナノモル、５μｌ、ｉｃｖ）と同時に注射しても、ベータ−アミロイドのＬＴＰに対する損傷作用には影響がなかった。３レベルの二方向性反復測定ＡＮＯＶＡにより、群（ＤＦ２，１６；Ｆ＝３．９、ｐ＜０．０００１）および時間（ＤＦ２，１１９；Ｆ＝１６．５；ｐ＜０．００１）間の全体的違いが分かった。相互作用も有意であった（ＤＦ２，２４０；Ｆ＝１．８；ｐ＜０．００１）。２レベルの二方向性反復測定ＡＮＯＶＡは、ベータ−アミロイド（２５−３５）群と対照（ＤＦ１，１０；Ｆ＝１７．１；ｐ＜０．００１）および時間（ＤＦ１，１１９；Ｆ＝４．５；ｐ＜０．００１）の間で違いを示した。コンビネーション群とベータ−アミロイド（２５−３５）群の間に違いはなかった。すべての群はｎ＝６である。
【００６５】
βＡ（２５−３５）をＶａｌ（８）ＧＬＰ−１の１５分後に注射し、ＬＴＰがＨＦＳ（弱プロトコル）を用いてβＡ（２５−３５）注射の１５分後に誘発され、ＥＰＳＰの変化を評価し、グラフを作成してＬＴＰの変化を示した（図４Ｂ）。Ｖａｌ（８）ＧＬＰ−１（１５ナノモル、５μｌ、ｉｃｖ）をベータ−アミロイド（２５−３５）（１００ナノモル、５μｌ、ｉｃｖ）を注射する１５分前に注射しても、ベータ−アミロイドのＬＴＰに対する損傷作用には有意な影響がなかったが、トレンドが肉眼で見えるようになった。３レベルの二方向性反復測定ＡＮＯＶＡにより、群（ＤＦ２，１６；Ｆ＝６、ｐ＜０．０１）および時間（ＤＦ１，１１９；Ｆ＝５．７；ｐ＜０．００１）間の全体的違いが分かった。相互作用も有意であった（ＤＦ１，２３８；Ｆ＝１．３；ｐ＜０．００１）。２レベルの二方向性反復測定ＡＮＯＶＡは、ベータ−アミロイド（２５−３５）群と対照（ＤＦ１，１０；Ｆ＝１１．３；ｐ＜０．０１）および時間（ＤＦ１，１１９；Ｆ＝５．７；ｐ＜０．０００１）の間で違いを示した。コンビネーション群とベータ−アミロイド（２５−３５）群の間で違いは見られなかった。すべての群はｎ＝６である。
【００６６】
βＡ（２５−３５）をＶａｌ（８）ＧＬＰ−１の３０分後に注射し、ＬＴＰがＨＦＳ（弱プロトコル）を用いてβＡ（２５−３５）注射の１５分後に誘発され、ＥＰＳＰの変化を評価し、グラフを作成してＬＴＰの変化を示した（図４Ｃ）。Ｖａｌ（８）ＧＬＰ−１（１５ナノモル、５μｌ、ｉｃｖ）をベータ−アミロイド（２５−３５）（１００ナノモル、５μｌ、ｉｃｖ）を注射する３０分前に注射すると、ベータ−アミロイドのＬＴＰに対する損傷作用は完全に逆転した。３レベルの二方向性反復測定ＡＮＯＶＡにより、群（ＤＦ２，１６；Ｆ＝９．８、ｐ＜０．００１）および時間（ＤＦ１，１１９；Ｆ＝３．８；ｐ＜０．００１）間の全体的違いが分かった。２レベルの二方向性反復測定ＡＮＯＶＡは、ベータ−アミロイド（２５−３５）群と対照（ＤＦ１，１０；Ｆ＝１８；ｐ＜０．００１）および時間（ＤＦ１，１１９；Ｆ＝１．８；ｐ＜０．００１）の間で違いを示した。対照群と薬物コンビネーション群の間で違いは見られなかった。すべての群はｎ＝６である。
【００６７】
実施例５  ＧＬＰ−１アナログ、Ａｓｐ（７）ＧＬＰ−１を用いる処理のインビボ効果
雄のウィスターラットに、ビヒクル（対照）または１５ナノモルのＤ−Ａｓｐ（７）ＧＬＰ−１（◆）のいずれかをｉｃｖ注射した。ＨＦＳ（弱プロトコル）を用いて注射した３０分後にＬＴＰが誘発され、ＥＰＳＰの変化を評価し、グラフを作成してＬＴＰの変化を示した。二方向性反復測定ＡＮＯＶＡは、薬剤群と対照群の間で違いを示した（ｐ＜０．００１）。すべての群において、ｎ＝６である。平均したＥＰＳＰをテタヌス（tetanus）の５分前と、テタヌスの１時間後に記録して示す。目盛バーは横１０ミリ秒、縦１ｍＶである。
【００６８】
１５ナノモルのＡｓｐ（７）ＧＬＰ−１の注射（ｉｃｖ）は対照と比較して長期増強（ＬＴＰ）を強化した。これらの結果はＡｓｐ（７）ＧＬＰ−１がシナプス伝達に対して直接的かつ急性の調整作用を有し、ＬＴＰの誘発を強化しうることを示す。
【００６９】
実施例６  ＧＬＰ−１アナログ、［Ｎｇｌｙｃ］ＧＬＰ−１を用いる処理のインビボ効果
雄のウィスターラットに、ビヒクル（対照）または１５ナノモルのＤ−ＮｇｌｙｃＧＬＰ−１（◆）のいずれかをｉｃｖ注射した。ＨＦＳ（弱プロトコル）を用いて注射した３０分後にＬＴＰが誘発され、ＥＰＳＰの変化を評価し、グラフを作成してＬＴＰの変化を示した。二方向性反復測定ＡＮＯＶＡは、薬剤群と対照の間で違いを示した（ｐ＜０．０１）。すべての群において、ｎ＝６である。平均したＥＰＳＰをテタヌスの５分前と、テタヌスの１時間後に記録して示す。目盛バーは横１０ミリ秒、縦１ｍＶである。
【００７０】
１５ナノモルのＮ−糖化ＧＬＰ−１の注射（ｉｃｖ）は対照と比較して長期増強（ＬＴＰ）を強化した。これらの結果は［Ｎｇｌｙｃ］ＧＬＰ−１がシナプス伝達に対して直接的かつ急性の調整作用を有し、ＬＴＰの誘発を強化しうることを示す。
【００７１】
実施例７  Ｐｒｏ（９）ＧＬＰ−１を用いる処理のインビボ効果
雄のウィスターラットに、ビヒクル（対照）または１５ナノモルのＰｒｏ（９）ＧＬＰ−１（◆）のいずれかをｉｃｖ注射した。ＨＦＳ（弱プロトコル）を用いて注射した３０分後にＬＴＰが誘発され、ＥＰＳＰの変化を評価し、グラフを作成してＬＴＰの変化を示した。二方向性反復測定ＡＮＯＶＡは、薬剤群と対照の間で違いを示した（ｐ＜０．００１）。すべての群において、ｎ＝６である。平均したＥＰＳＰをテタヌスの５分前と、テタヌスの１時間後に記録して示す。目盛バーは横１０ミリ秒、縦１ｍＶである。
【００７２】
１５ナノモルのＰｒｏ（９）ＧＬＰ−１の注射（ｉｃｖ）は対照と比較して長期増強（ＬＴＰ）を強化した。これらの結果はＰｒｏ（９）ＧＬＰ−１がシナプス伝達に対して直接的かつ急性の調整作用を有し、ＬＴＰの誘発を強化しうることを示す。
【００７３】
実施例８  ＧＬＰ−１誘導体、リラグルチド（Liraglutide）を用いる処理のインビボ効果
雄のウィスターラットに、ビヒクル（対照）または１５ナノモルのリラグルチド（◆）のいずれかをｉｃｖ注射した。ＨＦＳ（弱プロトコル）を用いて注射した３０分後にＬＴＰが誘発され、ＥＰＳＰの変化を評価し、グラフを作成してＬＴＰの変化を示した。二方向性反復測定ＡＮＯＶＡは、薬剤群と対照の間で違いを示した（ｐ＜０．００５）。すべての群において、ｎ＝６である。平均したＥＰＳＰをテタヌスの５分前と、テタヌスの１時間後に記録して示す。目盛バーは横１０ミリ秒、縦１ｍＶである。
【００７４】
１５ナノモルのＧＬＰ−１誘導体、リラグルチドの注射（ｉｃｖ）は対照と比較して長期増強（ＬＴＰ）を強化した。これらの結果はリラグルチドがシナプス伝達に対して直接的かつ急性の調整作用を有し、ＬＴＰの誘発を強化しうることを示す。
【００７５】
当該実験の結果もまた、シナプス可塑性に対する、ＧＬＰ−１およびそのアナログの促進作用が、βＡ（２５−３５）フラグメントがＬＴＰに対して有する有害な作用を防止しうることを示す。Ｖａｌ（８）ＧＬＰ−１がベータ−アミロイドの前に適用されなければならないという結果から、両方の化合物がニューロン上の同じ結合部位で作用することはありそうもない。それよりも、ＧＬＰ−１受容体の活性化は、ＬＴＰを増加させるシナプスをプライムし、ＶＤＣＣおよび他のイオンチャネル活動を変えることで、ベータ−アミロイドがシナプス可塑性に対して有する作用を防止または弱める作用機序を開始させるようである。Ｖａｌ（８）ＧＬＰ−１は、それが膵臓ベータ細胞でのｃＡＭＰレベルを向上させるとの同様に、ニューロンにおいてもｃＡＭＰレベルを向上させるかもしれない。Ｖａｌ（８）ＧＬＰ−１誘発のｃＡＭＰの増加はこの方法にてベシクル放出を強化することができ、シナプス活動を、ベータ−アミロイドによる影響を受ける、ＶＤＣＣ活動に依存させないようにすることができる。ＶＤＣＣ活動は、通常、Ｃａ２＋感受性ヌクレオチドシクラーゼを介してｃＡＭＰレベルを向上させるのに必要とされており、この工程はＶａｌ（８）ＧＬＰ−１の作用により回避され得た。Ｃａ２＋チャネルの慢性的に高い活性化は、フリーラジカルの生成の増加のような神経障害性工程に至るため、ＧＩＰ受容体の活性化がベータ−アミロイドの作用を防止するとの観察により、ベータアミロイドの初期の変性作用が軽減され得ること、および神経変性に至る下流プロセスが防止され得ることが大いに期待できる。加えて、樹枝状細胞の発芽および神経再生の向上によりＧＬＰ−１がニューロンに対して有する成長因子様作用は、ベータ−アミロイド活動およびプラーク誘発性グリオーシスにより誘発される長期損傷の防止または軽減を補助し得た。ＧＬＰ−１およびそのアナログのこれらの特性は、安定したＧＬＰ−１アナログでのＡＤ患者の処理がアルツハイマー秒の効果的な予防的処理であり得ることを示唆する。
【００７６】
結論として、本明細書に記載のＧＬＰ−１アナログの特性は、安定したＧＬＰ−１アゴニストでの対象の処置が、ＬＴＰの損傷により惹起されるか、その損傷に付随する神経学的障害の効果的な予防処理であり得ることを示唆する。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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