(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）とフォンビルブラント因子（ＦｖＷ）との混合物を含む溶液および（ｉｉ）フォンビルブラント因子（ＦｖＷ）を含む溶液の中から選択される溶液からフォンビルブラント因子（ＦｖＷ）を精製する方法において、
下記（ａ）と（ｂ）の工程から成ることを特徴とする方法：
（ａ）イオン交換クロマトグラフィ濾過-タイプメンブレンでＦｖＷを吸着する工程、この場合、上記濾過-タイプメンブレンはポリエーテルスルホン型強陰イオン交換体であり、
（ｂ）上記イオン交換クロマトグラフィ濾過-タイプメンブレンの溶出緩衝剤のイオン強度値を増加させてフォンビルブラント因子（ＦｖＷ）を溶出させる工程。
【請求項２】
上記イオン交換クロマトグラフィ濾過-タイプメンブレンが第四級アミン基を有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記イオン交換クロマトグラフィ濾過-タイプメンブレンがマクロポーラス-タイプのメンブレンである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記溶液が血漿由来のものである請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
上記溶液が血漿からの冷凍沈殿物である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法を実行することを特徴とする精製されたＦｖＷの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品の活性薬剤として使用するために第ＶＩＩＩ因子およびフォンビルブラント（Von Willebrand）因子を精製する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
第ＶＩＩＩ因子（下記単にＦＶＩＩＩ）はヒトの血漿中に低濃度で存在する血漿タンパクで、これが凝固カスケードのキーポイントを成している。すなわち、このタンパクは第Ｘ因子（または「ＦＸ」）を活性化するために第ＩＸ因子（または「ＦＩＸ」）の共因子として作用する。第Ｘ因子が活性化されるとプロトロンビンをトロンビンへ転換し、それがフィブリノーゲンをフィブリンに転換し、止血フィブリンクロットを形成する。
【０００３】
血友病Ａの患者はＦＶＩＩＩが欠乏し、自然発生的または事故や外科手術による外傷に続いて厳しい出血を生じる。
【０００４】
こうした血友病Ａ患者に対する伝統的な治療方法は精製血漿から作ったＦＶＩＩＩを注射することである。この注射はたびたび行なう必要があり、繰り返す必要があるため、極めて純粋なＦＶＩＩＩの濃縮物が利用できることが重要である。すなわち、ＦＶＩＩＩ濃縮物の精製が不充分であると、望ましくない免疫応答を誘発する危険のあるフィブリノーゲンと免疫グロブリンを高い比率で含むことになる。
【０００５】
従って、治療用に使用する血漿由来タンパクを提供するためには、高純度製品を得ることのできる血漿由来ＦＶＩＩＩの精製方法が必要になる。
【０００６】
第ＶＩＩＩ因子濃縮物は大抵の場合、低温沈殿させたヒトの血漿画分から製造される。一般に、ヒト血漿の工業的処理センターで得られる第ＶＩＩＩ因子濃縮物の純度は約１ｌＵ／ｍｇで、一般に最大範囲は１０〜２０ｌＵ／ｍｇを越えることはない。最も一般的な製造方法ではタンパク由来の汚染物、例えばフィブリノーゲン、フィブロネクチンおよび免疫グロブリンを除去するために沈殿ステップを使用するが、大抵の場合、不充分にしか除去できない。この方法は一般に低温沈降（１０℃）またはＰＥＧ（非特許文献１、２）等の親水性ポリマーのようなタンパク沈澱剤を使用したり、組合せて用いられる。沈降剤としてはポリビニルピロリドン（非特許文献３）、デキストラン、フィコール、パーコール、ヒドロキシエチル澱粉およびアルミナが提案されている。同じく、ThorellおよびBlombackはグリシンと塩化ナトリウムの使用を推薦している（非特許文献４）。別の著者はＰＥＧと、グリシンと、塩化ナトリウムとの３つの沈降剤を使用して１０〜１６ｌＵ／ｍｇの比活性を有する第ＶＩＩＩ因子濃縮物を得ている (非特許文献５）。
【０００７】
また、多孔質シリカビーズと接触させて低分子量のタンパク由来汚染物をトラップする段階を含む生産方法で第ＶＩＩＩ因子濃縮物を得ることもできる(非特許文献６)。しかし、この方法で得られた製品の比活性は低く、１ＵＩ／ｍｇ程度のままである。
【０００８】
純度が極めて高いＶＩＩＩ因子濃縮物を製造できる方法すなわち免疫アフィニティークロマトグラフィ法によって濃縮物を得る方法も提案されている(非特許文献７〜９)。この方法の本質はクロマトグラフ基材に固定した抗第ＶＩＩＩ因子：Ｃ抗体または抗フォンビルブラント因子抗体によって第ＶＩＩＩ因子を精製することにある。この方法は効率的ではあるが第ＶＩＩＩ因子をその抗体またはからフォンビルブラント因子から脱着させるのにドラスチックな溶液を使用する必要がある。従って、望ましくない化学試薬を除去するために追加の限外濾過階段を必要とするが、これは第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性に影響を与える。この方法では第ＶＩＩＩ因子の活性は4000〜10000ｌＵ／ｍｇに達するが、不安定であるため凍結乾燥階段の前にアルブミンのような安定化剤を加える必要がある。この安定化剤は第ＶＩＩＩ因子の比活性を３〜５ｌＵ／ｍｇに低下させる。しかし、この免疫アフィニティー精製法の主たる欠点は動物起源の残存抗体が存在し、従って、これら非ヒトタンパクに対する免疫反応が患者に誘導されることにある。
【０００９】
以上の全ての方法は非ヒトタンパク類、例えば動物起源の抗体を完全に含まない、純度が極めて高い第ＶＩＩＩ因子濃縮物を大規模な工業的な環境に適用できる方法ではない。
【００１０】
特許文献１にはウィルスの失活処理前に冷凍沈殿物をpH値が6.5〜7.5で１〜３Ｕ／ｍlのヘパリンを含む水中に懸濁させ、水酸化アルミニウム懸濁液と反応させ、１０〜１８℃の温度へ冷却し、pH値を６〜７に調節し、遠心分離または濾過し、さらにフラクトゲル（Fractogel）-ＤＥＡＥのような親水性タイプのイオン交換樹脂（DEAE-TOYOPEARLRとよばれ、東ソービオサイエンス社から市販）を使用したクロマトグラフィによる後処理でさらに精製することを特徴とする冷凍沈殿物から第ＶＩＩＩ因子を製造する方法が記載されている。すなわち、この特許方法は極めて特殊な前階段、特にエタノール処理を完全に無くし、フラクトゲル（Fractogel）-ＤＥＡＥのような親水性タイプのイオン交換樹脂を用いた前階段を特徴とする第ＶＩＩＩ因子の精製法である。
【００１１】
特許文献２にはアニオン交換クロマトグラフィを用いた精製法が記載されている。この精製法では後処理を不必要にすることができるような充分によく熟考された条件下で単一のクロマトカラムで予定タンパク類を分離する。この精製法を用いることで第ＶＩＩＩ因子、フィブリノーゲン、フィブロネクチンおよびフォンビルブラント因子タンパクをヒトの動物血漿から分離することができる。この方法は以下のように要約できる：水に可溶化された冷凍沈殿物画分を、架橋したマクロ-ビニルポリマーゲルのタイプのマトリックスを有する陰イオン交換樹脂を使用したクロマトグラフィによる１回の分離を行なって、気孔率の特性によって第ＶＩＩＩ因子-フォンビルブラント因子複合体を保持し、次に、溶出緩衝剤のイオン強度を順次増加させて各種タンパク類を選択的に回収する。この方法はフラクトゲル（Fractogel、登録商標）ＴＳＫ−ＤＥＡＥ６５０の樹脂（ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＲとよばれ、東ソービオサイエンス社から市販）にグラフトしたＤＥＡＥ単位を使用することによって良い結果が得られる。しかし、この方法では第ＶＩＩＩ因子は十分に精製されるが、フォンビルブラント因子の精製は十分に行なえないことが分かっている。
【００１２】
フォンビルブラント因子（下記、「ＦｖＷ」と記載）は２つの明確な機能によって止血（haemostasis）において重要大な役割をする。すなわち、接着タンパクとして血小板を分散、付着させ、血管内皮下層上へ凝集させ、従って、傷付いた導管を迅速に瘢痕形成させる機能と、非共有結合で循環血液中で第ＶＩＩＩ因子を安定化させ、確実に運送させる機能とを有する。
【００１３】
ＦｖＷの先天的欠失またはこの因子の構造的欠陥がフォンウィルブラント病の原因であり、皮膚および粘膜からの出血となって現れる。この病気の臨床的発現は極めて異質で、特に外科手術時に問題になる。フォンウィルブラント病の治療では一次止血（haemostasis）（出血時間）と凝固不能とを正すことが必要である。
【００１４】
従来のこの病気の治療法はＦｖＷ-リッチなヒト血漿誘導体（例えば血漿の低温沈殿画分またはＦｖＷを十分に含んだ第ＶＩＩＩ因子濃縮物）を用いて置換治療を行なうものである。
【００１５】
しかし、ＦｖＷは精製するのが難しいタンパクである。すなわち、フォンビルブラント因子は血漿中を循環する公知の最も大きなタンパクで一組のジスルフィド架橋リンクしたマルティマーから成り、そのベース要素は約260キロダルトン（kDa）の分子量を有する。血漿中での最も小さいＦｖＷは440〜500kDaのダイマーで、最も大きい形は分子量が2000万ダルトンに達する上記ダイマーのマルティマーである。マルティマー中のサブユニットの配列はそれが形成された細胞に特有なものになり、ＦｖＷは巨核球中および血管内皮細胞中で合成され、重合される。
【００１６】
フォンビルブラント因子の分子は複雑で、第ＦＶＩＩＩ因子と結合しているため、その製造法は極めて複雑である。
【００１７】
ＦｖＷ濃縮物を製造するための各種方法は一般に血漿画分を沈殿させて不必要なタンパク類（フィブリノーゲン、フィブロネクチン等）の主要部分を除去する階段および／またはクロマトグラフ階段（イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィ、免疫アフィニティークロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ等）で極めて高い比活性を有する純粋な濃縮物にすると同時に、治療過程に決定的な生物活性を有するマルティマーの形、特に高分子量のものの一体性を維持する段階とを組合せたものである。
【００１８】
特許文献３には、血漿を低温沈殿画分の予備精製階段と、３回の連続したクロマトグラフィ階段とから成る工業的スケールでＦｖＷ濃縮物を製造する方法が記載されており、その第３回目のクロマトグラフィ階段はアガロース固定ゼラチンカラムでのアフィニティークロマトグラフィである。この方法で得られるＦｖＷ濃縮物の比活性は１mgのタンパク当りのリストセチン共因子の活性単位で表される単位で100 VWF：RC0/mg以上で、高分子量マルティマーのレベルは初期血漿中のそれと同じである。
【００１９】
特許文献４には、陰イオン交換クロマトグラフィと陽イオン交換クロマトグラフィとを組合せたＦｖＷ調合剤の方法が記載されている。この方法で得られるＦｖＷ画分は１mgのタンパク当りのＦｖＷ抗体単位で表して100 IU ＦｖＷ：Ag/mg以上の比活性を有するが、さらにある量の第ＶＩＩＩ因子を含んでいる。
【００２０】
特許文献１５には、免疫吸着剤が抗ＦｖＷ抗体である、免疫アフィニティークロマトグラフィによって極めて精製されたＦｖＷを製造する方法が記載されている。ヘパリン上でのアフィニティークロマトグラフィによる追加の精製階段も可能である。しかし、この種の免疫親和性精製法の欠点は免疫反応を誘発する可能性のある残余抗体が存在することにある。
【００２１】
特許文献６には陰イオン交換樹脂上に第ＶＩＩＩ因子を固定するための炭水化物を含む酸性液（pH＝5.5〜6.5）を用いて行なうアニオン交換クロマトグラフィによるＦｖＷ濃縮物の調合剤の製造方法が記載されている。しかし、保持されなかったフィブロネクチンおよびフィブリノーゲンと一緒にＦｖＷを基質の洗浄によって回収するためには追加の沈降階段で精製されたＦｖＷ濃縮物を単離させる必要がある。
【００２２】
特許文献７にはフォンビルブラント因子を含む生物学的製剤画分からマイルドな塩基タイプのビニルポリマー気質を用いたアニオン交換クロマトグラフィによる分離工程を含む、非常に純粋なフォンビルブラント濃縮物の製造方法が記載されている。この方法は非常に簡単に実行でき、第ＶＩＩＩ因子をわずかしか含まない高度に特異的なフォンビルブラント因子を得ることができるという利点がある。
【００２３】
ＦＶＩＩＩとＦｖＷは非常に有用な血漿誘導タンパク質で、その欠乏はある種のヒトに対して重大な止血疾患の原因となる。従って、患者へ繰り返して使用可能な高純度で製品を製造することができる、これらタンパク類の製造方法を開発することが重要である。
【００２４】
上記従来技術に記載の方法によってフォンビルブラント因子の純粋は悪いが純粋な第ＶＩＩＩ因子を得ることはできるか、ＦＶＩＩＩとＦｖＷの両方が純粋なものを得ることができるが、その方法は複雑かつ厄介なものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２５】
【特許文献１】欧州特許第EP 0 343 275号公報
【特許文献２】欧州特許第EP 0 359 593号公報
【特許文献３】欧州特許第EP 0 503 991号公報
【特許文献４】欧州特許第EP 0 934 748号公報
【特許文献５】米国特許第US 6,579,723号明細書
【特許文献６】欧州特許第EP 0 383 234号公報
【特許文献７】欧州特許第EP 1 632 501号公報
【非特許文献】
【００２６】
【非特許文献１】Newman and al., Br. J. Haematol 21:1-20, 1971;
【非特許文献２】Hao and al., in Methods of Plasma Protein Fractionation, Academic Press 1980, pp.57-74
【非特許文献３】Casillas and Simonetti, Br. J. Haemato, 50:665-672, 1982
【非特許文献４】Thorell and Blomback, Thromb Res. 1984 Aug 15;35(4):431-50)
【非特許文献５】Ng and al, Thrombosis Res.,42:825-834, 1986)
【非特許文献６】Margolis and at., Vox Sang. 46: 341-348,1984
【非特許文献７】Zimmerman and Fulcher, Thrombosis Res., Suppl. VII, p. 58, 1987;
【非特許文献８】Berntorp and Nilsson, Thrombosis Res., Suppl. VII, p.60, 1987;
【非特許文献９】Levine and al., Thombosis Res, Suppl. VII, 1987
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
本発明は、ＦＶＩＩＩとＦｖＷとの混合物を含む溶液、または、ＦｖＷ-含有溶液、または、動物、特にヒト以外の動物の分泌物に由来する溶液、または、ＦＶＩＩＩ-含有の植物抽出物を精製する方法において、ＦＶＩＩＩおよびＦｖＷの中から選択される少なくとも一つのタンパクを吸着できるイオン交換クロマトグラフ濾過-タイプのメンブレンでのクロマトグラフィ階段を含むことを特徴とする方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明の対象は、下記：
(i) ＦＶＩＩＩとＦｖＷの混合物を含む溶液、
(ii) ＦｖＷを含む溶液、
(iii)ヒト以外の動物の分泌物に由来する溶液
(iv）ＦＶＩＩＩ-含有植物抽出物に由来する溶液
の中から選択される溶液からＦＶＩＩＩまたはＦｖＷを精製する方法において、
イオン交換クロマトグラフィ濾過-タイプのメンブレンでＦＶＩＩＩまたはＦｖＷを吸着する階段を含むことを特徴とする方法にある。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】フォンビルブラント因子精製法のダイアグラム。
【図２】第ＶＩＩＩ因子精製法のダイアグラム。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
「精製（方）法」とは、媒体中に存在する他の分子からＦＶＩＩＩを分離する方法、または、媒体中に存在する他の分子からＦｖＷを分離する方法、または、ＦＶＩＩＩをＦｖＷから分離する方法、または、媒体中に存在する他の分子からＦＶＩＩＩ/ＦｖＷ複合体を分離する方法を意味する。上記の分子はＦＶＩＩＩおよびＦｖＷとは異なるタンパク類、ウィルス、バクテリア、芽胞、培地、ウシ胎仔血清等であり、これらに限定されるものではない。
【００３１】
「ＦＶＩＩＩ」とはＦＶＩＩＩの任意の形、特にＦＩＸ賦活の共因子（cofactor）として作用し、ＦｖＷと錯体、特に成熟（mature）ＦＶＩＩＩ、非成熟ＦｖＷ、ＦＶＩＩＩ先駆物質、（プレ・プロのＦＶＩＩＩ）、シグナルペプチドおよびプロ−ペプチドの開裂後に得られる成熟したＦＶＩＩＩから成るタンパク構造物を形成する例えばプロ-ペプチドを含むプロ-ＦＶＩＩＩ（pro-ＦＶＩＩＩ）のような成熟ＦＶＩＩＩ生物活性誘導体を形成可能なＦＶＩＩＩの任意の形を意味する。本発明に含まれるその他のＦＶＩＩＩ生物活性誘導体には後翻訳修飾を受けるプロドラッグ、または、生物学的に活性な型、例えば先端を切った形、欠失した形、例えば特許文献８に記載のArg-759とSer-1709との間の領域に位置する一つ以上のアミノ酸を欠失したＦＶＩＩＩ、キメラな形、血漿で自然に成熟した形とは異なる後翻訳修飾された形等が含まれる。
【特許文献８】欧州特許第EP 218 712号公報
【００３２】
これらの各種ＦＶＩＩＩ形は成熟したＦＶＩＩＩの変形、または、血液中で自然に生じるその他の任意の形でよい。このＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチド配列は種々の供与源、好ましくはヒト、ブタ、羊、ウシ、ウマおよびヤギ（Caprinae）供与源を含む哺乳類に由来するものにできるが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
「ＦｖＷ」とはＦｖＷの任意の形を意味し、特に成熟したＦｖＷ、成熟したＦｖＷの生物活性誘導体、例えばプロペプチド、非成熟ＦｖＷから成るタンパク構造物、ＦｖＷ先駆物質（プレプロＦｖＷ）、ＦｖＷプロペプチド（pro−ＦｖＷ）、シグナルペプチドおよびプロペプチドの開裂後に得られる成熟ＦｖＷを含む。本発明に含まれる他のＦｖＷの生物活性誘導体には、後翻訳修飾を受けるプロドラッグ、または、生物活性な形、例えば先端を切った形、欠失した形、例えばプロテオリシス抵抗性のあるＡ２領域を欠失したＦｖＷ(非特許文献１０)、グリコプロテインlb-結合領域およびコラーゲンおよびヘパリンのための結合サイトを含むVal 449とAsn 730との間のＦｖＷ断片(非特許文献１１)、キラルな形、血漿中で自然に成熟した形とは異なる後翻訳修飾した形等がある。
【非特許文献１０】Lankhof and al., Thromb. Haemost. 77: 1008-1013, 1997
【非特許文献１１】Pietu and al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 1339-1347, 1989
【００３４】
これらの各種のＦｖＷの形は例えば成熟ＦｖＷまたは血液中で自然に生じたその他任意の形を修飾して製造することができる。この種のＦｖＷをコードするヌクレオチド配列は種々の供与源に由来でき、好ましくはヒト、ブタ、羊、ウシ、ウマおよびヤギを含む哺乳類の供与源にすることができるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
「ＦＶＩＩＩとＦｖＷの混合物を含む溶液」とは複合した状態または個別の状態でＦＶＩＩＩとＦｖＷとを含む任意の溶液を意味する。これらの溶液は血漿由来、組換え型由来またはトランスジェニック由来のものにすることができる。
【００３６】
組換え型由来の溶液の場合、ＦＶＩＩＩおよびＦｖＷタンパクの発現が誘発されている単細胞系に由来するものにすることができ、これらのタンパクの各々をコードする遺伝子を含むベクターが形質移入された動物またはヒトの細胞株を挙げることができる。この細胞株としては特にCl-Ia-K, CHO-LeC1O, CHO Lec-l, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, YB2/0 (ATCC CRL-1662), BHK, K61-I6, NSO, SP2/0-Ag 14 and P3X63Ag8 653, SK-Hep, HepG2, PERC6 (Crucell)株と、植物細胞、バクテリア系、例えばE. Coli、菌類、ウィルス、特にバクロウイルスを利用した系の中から選択できるが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
これらの細胞系は当業者に周知の方法でＦｖＷおよびＦＶＩＩＩのタンパクを発現する。下記特許文献９を参照できる。この特許の内容は本明細書の一部を成す。
【特許文献９】米国特許第US 5,198,349号明細書
【００３８】
この特許文献にはＦＶＩＩＩとＦｖＷの共発現、特に、ＦＶＩＩＩの暗号配列が挿入されている発現ベクターと、ＦｖＷ暗号配列が挿入された発現ベクターとが共形質転換されたＣＨＯ細胞が記載されている。
【００３９】
トランスジェニック起源の溶液は特にトランスジェニシス（transgenesis）すなわち一つまたは複数の組換え型ＤＮＡ分子を含む動物または植物由来の多数細胞（pluricellular）系から得られる。その適切な例にはイヌ、ネコ、ハツカネズミ、ラット、ハムスター、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、ウマ、昆虫、草木、例えばタバコ、ダイズが含まれるが、これらる限定されるものではない。
【００４０】
動物からのＦＶＩＩＩおよびＦｖＷの場合には、動物の各種分泌物、例えば尿、血液、唾液または乳汁（これらに限定されるものではない）中で産生される。この産生方法は当業者に周知の方法で実行きる、例としては特許文献１０、特許文献１１に記載のものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【特許文献１０】欧州特許第EP 741 515号公報
【特許文献１１】欧州特許第EP 807 170号公報
【００４１】
特許文献１１にはＦＶＩＩＩとＦｖＷを発現し且つ乳汁中に分泌させるためにＦＶＩＩＩとＦｖＷをコードするＤＮＡ分子をゲノム中に安定な状態で一体化したトランスジェニック動物の生産方法が記載されている。
【００４２】
ＦＶＩＩＩおよびＦｖＷが植物から生産する場合もその生産を当業者に周知の方法で実行でき、例えば下記特許文献１２、１３が参照できる。
【特許文献１２】米国特許第US 6,331,416号明細書
【特許文献１３】米国特許第US 5,994,628号明細書
【００４３】
血漿起源の溶液の場合には動物またはヒトからの血漿または冷凍沈殿物または標準的な分画方法を用いて得た画分にすることができる（非特許文献１２)。
【非特許文献１２】Cohn and al., J. Am. Chem. Soc., 68, 459, 1946 and Kistler and al., Vox Sang., 7, 1962, 414-424
【００４４】
これらの画分には必要に応じて水酸化アルミニウム吸着のような予備精製処理をすることができる。
【００４５】
ＦＶＩＩＩとＦｖＷとの混合物とはこれらのタンパクがほぼ同じ量で存在するか、ひとつのタンパクが主に存在するか、他方に対して一方が相対的に多量に存在することを意味する。「ＦｖＷを含む溶液」とはＦｖＷを含む任意の溶液を意味し、ＦＶＩＩＩは実質的に全く含まない、すなわち、ほとんどまたは極めて少量しか含まないということを意味する。この溶液は組換え型でも、トランスジェニックでも、血漿由来でもよい。
【００４６】
組換え型起源の溶液はＦｖＷタンパクの発現が誘発された単細胞系に由来する。その適切な例にはこのタンパクをコードする遺伝子、好ましくはヒトのタンパクをコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された全ての動物またはヒトの細胞系が含まれる。この細胞株は特にCHO-K、CHO-LeC1O、CHO Lec-1、CHO Pro-5、CHO dhfr-、Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、COS-7、293-HEK、YB2/0、BHK、K61-16、NSO、SP02/0-Ag14、P3X63Ag8. 653、SK-Hep、HepG2細胞系、植物細胞、バクテリア系、例えばE. Coli、菌類系、ウィルス使用系、特にバクロウイルスの中から選択できるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
これらの細胞株はＦｖＷタンパクを発現し、当業者に周知の方法で得ることができる。その適当な例としては下記特許文献１４、１５が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【特許文献１４】米国特許第US 5,198,349号明細書
【特許文献１５】国際特許第WO 89/06096号公報
【００４８】
特許文献１４（米国特許第US 5,198,349号明細書）には発現ベクターにヒトのＦｖＷをコードする相補ＤＮＡを挿入したＣＯＳ細胞のヒトＦｖＷ発現が記載されている。
【００４９】
トランスジェニック起源の溶液は複数細胞（pluricellular）系に由来する。特に、トランスジェニシスで得た動物または植物すなわちＦｖＷをコードする組換え型ＤＮＡ分子を入れた一つまたは複数の細胞から得られる。その適切な例はイヌ、ネコ、ハツカネズミ、ラット、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、昆虫、植物、例えばタバコ、大豆を含み、これらに限定されるものではない。
【００５０】
ＦｖＷをトランスジェニック（遺伝子導入実験）動物から生産する場合、動物の各種分泌物、例えば尿、血液、唾液または乳汁（これらに限定されない）から生産できる。この生産方法は当業者に周知の方法で実行できる。その適切な例としては下記特許文献１６、１７が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【特許文献１６】国際特許第WO 2001/022810号公報
【特許文献１７】国際特許第W01999/058699号公報
【００５１】
特許文献１６（国際特許第WO 2001/022810号公報）には乳中にヒトのＦｖＷを生産するメスのトランスジェニックハツカネズミが記載されている。
【００５２】
植物からＦｖＷを生産する方法も当業者に周知の方法で実行できる。その適切な例としては下記特許文献１８、１９が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【特許文献１８】米国特許第US 6,331,416号明細書
【特許文献１９】米国特許第US 5,994,628号明細書
【００５３】
血漿由来の溶液は動物またはヒトの血漿画分または冷凍沈殿物または標準的分画方法で得られる画分にすることができる(非特許文献１３)。
【非特許文献１３】Cohn and al., J. Am. Chem. Soc., 68, 459, 1946 and Kistler and al., Vox Sang., 7, 1962, 414-424
【００５４】
これらの画分には必要に応じて水酸化アルミニウム吸着のような予備精製処理をすることができる。
【００５５】
「ヒト以外の動物の分泌物から得たＦＶＩＩＩを含む溶液」とは任意の分泌物、例えばＦＶＩＩＩ分子を発現するように設計されたトランスジェニック動物が出す血漿、尿、唾液または乳から誘導される任意の溶液も意味する。この場合、トランスジェニック動物はＦｖＷを発現しない。「ＦＶＩＩＩ-含有血漿から得た溶液」とはヒトまたは動物のＦＶＩＩＩを自然に含む血漿すなわちＦｖＷを実質的に含まないものから誘導される任意の溶液を意味する。これは動物またはヒトの血漿画分、冷凍沈殿物または標準的分画方法で得られる画分から得られる（非特許文献１３)。これらの画分には必要に応じて水酸化アルミニウム吸着のような予備精製処理をすることができる。
【００５６】
トランスジェニック動物から分泌物を得る方法も当業者類に周知の手段で実行できる。その適切な例としては下記特許文献２０、２１が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【特許文献２０】米国特許第US 5,880,327号明細書
【特許文献２１】米国特許第US2007/0011752号明細書
【００５７】
特許文献２０（米国特許第US 5,880,327号明細書）にはハツカネズミの乳中にヒトのＦＶＩＩＩを生産させる方法が記載されている。特許文献２１（米国特許第US2007/0011752号明細書）には各種動物の唾液からヒトのタンパク、例えばＦＶＩＩＩを生産する方法が記載されている。
【００５８】
「ＦＶＩＩＩ含有植物抽出物由来の溶液」とはＦＶＩＩＩ分子を発明，源するように設計されたトランスジェニック植物または植物細胞から得られるＦＶＩＩＩタンパク、特に、ヒト起源のタンパクを含む植物からの任意の画分を意味する。
【００５９】
この抽出物は植物細胞にＦＶＩＩＩをコードする遺伝子を含むヌクレオチドベクターを導入して作ることができる。その方法は当業者類に周知で、多数の文献に記載されており、例えば下記文献に記載されている。
【特許文献２２】米国特許第US 2005/0060775号明細書
【００６０】
「イオン交換クロマトグラフィ濾過タイプのメンブレン」とはＦＶＩＩＩおよび／またはＦｖＷのタンパクをメンブレンを通したときにＦＶＩＩＩおよび／またはＦｖＷをイオン交換によって吸着する能力のある任意の物理的な半透過性のバリアを意味する。さらに、このメンブレンはさらに、メンブレンとＦＶＩＩＩおよび／またはＦｖＷとの間のイオン交換作用がそれらを保持するのに充分でなくなっときに、ＦＶＩＩＩおよびＦｖＷを流すことができるものである。
【００６１】
すなわち、本発明ではＦＶＩＩＩまたはＦｖＷを精製するためにイオン交換濾過タイプのメンブレンを使用する。このイオン交換濾過タイプのメンブレンはマクロポーラスな基から成り、この基材に正または負に帯電した被覆物が固定され、この被覆物が濾過タイプのメンブレンにイオン交換特性を与える。一般に正または負に帯電した被覆物は化学的グラフトによって上記マクロポーラス基材上に固定される。
【００６２】
マクロポーラス基材の気孔率（すなわちその平均細孔径は濾過タイプのメンブレンがＦＶＩＩＩおよびＦｖＷを完全に通過できるようなものである。このメンブレンを使用する第１の利点はプロセスの衛生上の安全レベルを改善することができる使い捨て型のイオン交換濾過タイプメンブレンを使用できる点にある。このメンブレンを使用する第２の利点は、本発明の精製（より正確にはイオン交換クロマトグラフィ階段）を被精製溶液を極めて大きな流速で実施できる点にある。
【００６３】
本発明の濾過タイプのメンブレンは任意タイプの物理的バリア基材で実行できる。その例としてはポリマーフィルム、ウイック、中空ファイバー、安定化セルロース、ポリエーテルスルホンまたはＦＶＩＩＩおよびＦｖＷを流通させることができる任意の三次元構造物が挙げられる。
【００６４】
濾過タイプのメンブレンとＦＶＩＩＩおよびＦｖＷタンパクとの間のイオン交換相互作用はマクロポーラスな基材上に固定した正または負に帯電した被覆物により行なわれる。この被覆物は交換可能な塩基性または酸性の官能基から成る。
【００６５】
イオン交換性被覆物は一官能性タイプ、すなわち単一の官能性単位のみから成るタイプか、複数の官能性単位を有する多官能性タイプにすることができる。
【００６６】
従って、上記濾過タイプのメンブレンはＦＶＩＩＩおよびＦｖＷのタンパクをこのタンパクとメンブレンとの間の相互作用によって同時に捕捉または吸着できる。ＦＶＩＩＩおよびＦｖＷを含んだ溶液をメンブレン上に通すとイオン交換作用によってＦｖＷおよびＦＶＩＩＩはメンブレンに保持される。
【００６７】
被精製製品が冷凍沈殿物中に含まれる場合には、汚染菌が完全に無くなった溶液を得るために、本発明の精製法を実行する前に被精製溶液の予備精製階段を実行するのが好ましい。
【００６８】
この予備精製階段は複雑な溶液、例えば多くのタンパクを含む媒体である乳または血漿から誘導される溶液の場合に特に有益である。この予備精製階段は特に特許文献２３に記載の清浄階段または特許文献２４または特許文献２５に記載の抽出階段で行なうことができるが、これらに限定されるものではない。
【特許文献２３】国際特許第WO 2004/076695号公報
【特許文献２４】フランス特許第FR 06 04864号公報
【特許文献２５】フランス特許第FR 06 11536号公報
【００６９】
特許文献２４（フランス特許第FR 06 04864号公報）に記載の乳中に存在するカルシウムイオンに対して親和性を有する少なくとも一つの錯体または非錯体のタンパクを抽出する方法は下記の工程から成る：
(i) 乳を可溶性塩、例えばリン酸ナトリウムと接触させ、得られるカルシウム化合物を沈澱させてタンパクを開放する。可溶性塩のアニオンは媒体中で上記不溶カルシウム化合物が形成でき、タンパクリッチな液相が得られるものを選択する。
(ii)タンパクリッチな液相をカルシウム化合物沈降物から分離する。液相をさらにリピド相とタンパクを含む非リピド水溶相とに分離し、
(iii)タンパクを含んだ非リピド水溶相を回収する。
【００７０】
特許文献２５（フランス特許第FR 06 11536号公報）に記載の、乳の自然なpHで少なくとも一種の疎水性ポケットと負電荷とを有する乳中に存在するタンパクを抽出する方法は下記の工程から成る：
a) 乳をスキミングして脱リピド化し、
b) タンパクを含むスキミングと脱リピド化した画分を疎水性とイオン性の両方の特性を有するリガンド、例えば、4-メルカプト−エチル−ピリジンがグラフトされたクロマトグラフ基材に上記タンパクを上記基材に保持できるpH条件下で通し、
c) タンパクを溶出し、
d) 溶出画分から乳タンパクを除去して溶出画分を精製し、
e) 前記タンパクを回収する。
【００７１】
細胞系から得た溶液の場合、予備精製階段を細胞培養階段後に直ち実行することができる。細胞培養媒体の組成は細胞が作るタンパクを細胞外の媒体中に排出できるように制御する。さらに、得られたタンパクが媒体中に排出されるような細胞を選択する。
【００７２】
その後、本発明の精製階段を実行するのに適した予備精製物を得るためにデープ濾過階段またはタンジェトマイクロ濾過を実施する必要がある。
【００７３】
本発明の複数の実施例の濾過タイプのメンブレンはカチオン交換選択性メンブレンである。このメンブレンに付けた官能基の正の対イオンはＦｖＷおよびＦＶＩＩＩ上の同じ電荷と交換される。
【００７４】
陽イオン交換被覆物として使用可能な官能基にはカルボキシメチル（CM）、ホスホリル、スルホプロピル（SP）、サルフェート（S）等があるが、これらに限定されるものではない。
【００７５】
陽イオン交換濾過タイプのメンブレンを使用する実施例で使用可能な緩衝剤にはトリス−ヒドロキシメチル−アミノメタン、炭酸エステル、エチレンジアミン、イミダゾールまたはトリエタノールアミンがあるが、これらに限定されるものではない。
【００７６】
これらの実施例での緩衝剤のpH値は当業者に周知のルーチン方法に従ってタンパクの等電点に応じて選択される。このpH値でのタンパクは正の全体荷電レベルを有する。
【００７７】
本発明の他の実施例では、濾過タイプのメンブレンがアニオン交換選択的なメンブレンである。このメンブレンが有する官能単位の負の対イオンがＦｖＷおよびＦＶＩＩＩ上の同じ電荷と交換される。
【００７８】
この陰イオン交換被覆物として使用可能な官能単位にはジエチルアミノエチル（DEAE）、ジエチル（2-ヒドロキシプロピル）アミノエチル、四級アンモニウム基（QAE、Q）、ジメチルアミノエチル（DMAE）、トリメチルアミノエチル（TMAE）が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの実施例で使用可能な緩衝剤には酢酸塩、シトラート、リン酸塩、グリシン、バルビツレートが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７９】
これらの実施例での緩衝剤のpH値は当業者に周知のルーチン方法によってタンパクの等電点に従って選択される。このpH値でタンパクは全体として負の帯電レベルを有する。濾過タイプ・メンブレンは強陰イオン交換樹脂から成るイオン交換正被覆物を有するのが好ましい。
【００８０】
「強陰イオン交換樹脂」とは、イオン化の弱いタンパクを吸着可能な任意の陰イオン交換膜を意味する。
【００８１】
この種の濾過タイプのメンブレンは市販されている。その適切な例はQAEまたはQ単位を有するメンブレン、特にムスタング（Mustang Q、登録商標）メンブレン（Pall)またはサルトビンド（Sartobind）Qメンブレン（Sartorious）であるが、これらに限定されるものではない。
【００８２】
ムスタング（Mustang Q、登録商標）メンブレン（Pall)は吸着能およびクロマトグラフ容積流が大きく、単一サイクル（使い捨て）でも複数サイクルでも使用できる点で特に重要である。さらに、このメンブレンは基質の洗浄、例えば再生や衛生化（ウィルス、プリオンセキュリティプロトコル等）の評価階段を実施する必要がないという利点がある。
【００８３】
これらの濾過タイプのメンブレンを使用することで標準的基質でこれまで必要であったエージングテストも不要になる。従って、これらのメンブレンを使用することで現在のものより生産時間を短くすることができる。
【００８４】
被精製溶液と接触する濾過タイプのメンブレンの表面はマクロポーラス基材上に化学的にグラフトした第四アンモニウム基から成る陰イオン交換正の被覆を有するのが好ましい。
【００８５】
本発明のさらに別の実施例では、濾過タイプのメンブレンがマクロポーラスメンブレンである。「マクロポーラス」という用語は寸法が0.3μm〜1.0μmの膜細孔を有する系を意味する。この細孔径は0.5μm〜0.9μmであるのが好ましく、0.8μmであるのが最も好ましい。
【００８６】
本発明で特に好ましいメンブレンの基質の例はポリエーテルスルホン基質である。このポリエーテルスルホンメンブレンの例としてパル（Pall）社から市販のムスタング（Mustang）Ｑメンブレンである。このメンブレンは直径が0.8μmの細孔を有し、四級アミン基がグラフトされている。
【００８７】
本発明の一つの実施例では、被精製溶液はFVllIまたはＦｖＷを含む血漿起源のものである。本発明の好ましい実施例では、被精製溶液はＦＶＩＩＩおよびＦｖＷの混合物を含む血漿由来のものである。
【００８８】
本発明のこの実施例では、溶液は天然のヒトまたは動物の血漿、すなわち、ヒトまたは動物のＦＶＩＩＩおよびＦｖＷを自然に含むヒトまたは動物の血漿に由来する。この場合の動物血漿はブタ、ウサギ、ヤギ等であるが、これらに限定されるものではない。
【００８９】
驚くことに、本発明者は濾過タイプのメンブレン、特にムスタング（Mustang）Qメンブレンは樹脂またはゲルのメンブレンよりＦＶＩＩＩおよび／またはＦｖＷに対する吸着能が高いということを見出した。「吸着能」という用語はゲルに固定された標的タンパクの量を意味し、アニオン樹脂の場合、一般にゲルに固定されたＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の量をゲルまたは樹脂のメーカーが表している。例えば、ＦＶＩＩＩおよび／またはＦｖＷの精製にこれまで使用されてきたDEAE-TOYOPEARL（登録商標）ゲルの場合の吸着能は２５〜３５mg/mlであるが、ムスタング（Mustang）Qメンブレンでは３０mg/ml以上である。
【００９０】
吸着能が高い濾過タイプのメンブレンということは、ゲルまたは樹脂と比べて、同じ量のＦＶＩＩＩおよび／またはＦｖＷを吸着するのに使用するゲルの量を少なくできるということを意味する。例えば、DEAEゲルの吸着量は５０〜８０lU FvWとFVIII/mlであるが、ムスタング（Mustang）Qメンブレンでは200〜250lU FvWとFVIII/mlである。
【００９１】
ゲルまたは樹脂と比較した時の濾過タイプのメンブレンの最高吸着能はイオン化サイトへのＦＶＩＩＩおよび／またはＦｖＷ、特にＦＶＩＩＩ/ＦｖＷ複合体を形成した時のアクセス性を改良することに達成できる。すなわち、これらのタンパク、特にＦＶＩＩＩ/ＦｖＷ複合体が形成されるときには、タンパクが大きな寸法を有するので、マクロポーラス濾過タイプのメンブレン上にグラフトされたイオン化サイトにはより簡単にアクセスできると考えられる。これに対してゲルまたは樹脂では、イオン化サイトは細孔のチャネルの中にあるため大きなタンパクはアクセスできない。
【００９２】
本発明の好ましい実施例では下記工程から成る方法を使用すのが好ましい：
（a)血漿から冷凍沈殿物を作り、
（b)イオン交換クロマトグラフィメンブレン、特にアニオン交換クロマトグラフィメンブレン上に第ＶＩＩＩ因子およびフォンビルブラント因子を捕捉、吸着し、（c)溶出緩衝剤のイオン強度値を順次増加させることによってフォンビルブラント因子および第ＶＩＩＩ因子を選択的に回収する。
【００９３】
血漿から冷凍沈殿物を作る階段の後にアルミナゲルでの第ＶＩＩＩ因子およびフォンビルブラント因子の吸着とコールド沈殿による予備精製階段を実行するのが好ましい。
【００９４】
上記方法の階段（c)で使用する溶出緩衝剤のイオン強度値はＦｖＷおよびＦＶＩＩＩタンパクの各生理化学的性質と濾過タイプメンブレンのイオン交換特性に関する一般的な知識に基づいて当業者が簡単に調節でき、一般には市販の濾過タイプメンブレンのメーカーが推薦する値を使用できる。特に、ＦＶＩＩＩは同じ基質からＦｖＷを溶出するのに必要なイオン強度値より高いイオン強度値を有する緩衝剤でアニオン交換クロマトグラフィ基質から溶出するという一般的な知識を当業者は使用できる。
【００９５】
従って、上記方法の階段（c)では、基質から (i)ＦｖＷ、(ii)ＦｖＷとＦＶＩＩＩまたは(iii)最初にＦｖＷ、続いてＦＶＩＩＩを溶出（脱着）させるのに適したイオン強度値を有する緩衝剤を当業者は使用することができる。最初にＦｖＷ、続いてＦＶＩＩＩを溶出させる変形例(iii)では、当業者はＦｖＷまたはＦＶＩＩをそれぞれに合ったイオン強度値を有する２つの溶出緩衝剤を順次使用することができる。この変形例(iii)の第２の変形例では、当業者はＦｖＷ、続いてＦＶＩＩＩが脱着されるような連続にイオン強度を増加させる勾配を有する緩衝剤を用いて溶出を実行することもできる。
【００９６】
上記方法の階段（c)で行なう「溶出緩衝剤のイオン強度値を連続に増加」という操作には塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カルシウム（これらに限定レレるものではない）を加えて溶出緩衝剤のイオン強度値を線形に増加させることが含まれる。
【００９７】
すなわち、緩衝剤のイオン強度値を増加させることによって最初にＦｖＷが溶出し、それからＦＶＩＩＩを溶出させることができる。従って、ＦｖＷを回収し、ＦｖＷを得た後に溶出を止めることができ、さらに溶出を続けてＦＶＩＩＩを得ることもできる。
【００９８】
「冷凍沈殿物」とは、ヒトまたは動物の血漿から低温沈殿法によって得られる沈降物を意味する。この冷凍沈殿物は当業者に周知の方法で得ることができる。例えば、凍結血漿を約−５℃〜−１５℃の温度にし、それから温度を１℃、必要な場合には４℃を上回まわらない温度で撹拌下にゆっくり暖める。この条件で凍結血漿は溶融し液相と固相とになる。遠心分離して固相すなわち冷凍沈殿物を回収する。冷凍沈殿物は実質的にフィブリノーゲン、フィブロネクチン、第ＶＩＩＩ因子およびフォンビルブラント因子（vWF）から成る。冷凍沈殿物では一般にＦＶＩＩＩはＦＶＩＩＩを安定させるＦｖＷと組合されている。
【００９９】
「選択的に回収」とはＦＶＩＩＩまたはＦｖＷのいずれか、または、ＦＶＩＩＩおよびＦｖＷの混合物を回収する能力を意味する（溶出方法と予想されるタンパクと依存する)。
【０１００】
当業者に周知の方法に従ってpH値を変えるか、溶出緩衝剤のイオン強度値を増加させることによって（実施例1を参照）、ＦｖＷまたはＦＶＩＩＩのいずれかか、ＦＶＩＩＩとＦｖＷとの混合物を得ることができる。
【０１０１】
本発明のさらに他の実施例では、被精製溶液が組換え型またはトランスジェニック由来のＦＶＩＩＩとＦｖＷの混合物を含む。この実施例では下記の工程が使用される：
（a) ＦＶＩＩＩおよびＦｖＷを含む細胞培養の上清または精製済み溶液を作り、
（b) 上記のイオン交換クロマトグラフィ・メンブレン、特にアニオン交換クロマトグラフィメンブレンで第ＶＩＩＩ因子およびフォンビルブラント因子を捕捉し、
（c) 溶出緩衝剤のイオン強度値を順次増加させてフォンビルブラント因子および第ＶＩＩＩ因子を選択的に回収する。
【０１０２】
本発明のさらに他の実施例では、被精製溶液がＦＶＩＩＩまたはＦｖＷのいずれかを含む。この実施例では下記の工程が使用される：
（a) ＦＶＩＩＩまたはＦｖＷを含む細胞培養上清または精製済みの溶液を作り、
（b) 上記イオン交換クロマトグラフィ・メンブレン、特にアニオン交換クロマトグラフィ・メンブレンで第ＶＩＩＩ因子またはフォンビルブラント因子を捕捉し、
（c) フォンビルブラント因子または第ＶＩＩＩ因子を回収する。
【０１０３】
血漿画分を使用することで本発明方法によってフィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビタミンＫ依存因子の量を減らすことができる。特に、被精製溶液がＦＶＩＩＩとＦｖＷの混合物を含む場合、下記の工程を行うことでＦｖＷおよびＦＶＩＩＩを選択的に回収することができる：
（c1) 上記クロマトグラフィメンブレンの平衡緩衝剤のイオン強度値を増加させてＦｖＷを溶出させる。例えば、0.25M塩化ナトリウムを加えてイオン強度値を上げ、浸透圧重量モル濃度を600から約660mOsm/Kgへ増加させることができる。
（c2) 上記クロマトグラフィメンブレンの平衡緩衝剤のイオン強度値をフォンビルブラント因子の回収値より増加させてＦＶＩＩＩを溶出させる。例えば、0.7Mまたは0.35Mの塩化ナトリウムまたは塩化カルシウムを加えることによってイオン強度値を増加させ、浸透圧重量モル濃度を1400から約1700mOsm/Kgまで上げることができる。
【０１０４】
階段（c1）はイオン交換濾過タイプメンブレンからＦｖＷを選択回収する階段で、この段階ではＦｖＷを脱着するのに適したイオン強度値の緩衝液を使用する。
【０１０５】
階段（c2）はイオン交換濾過タイプメンブレンからＦＶＩＩＩを選択回収する階段で、この段階ではＦＶＩＩＩを脱着するのに適したイオン強度値の緩衝液を使用する。階段（c2）で使用する緩衝液のイオン強度値は階段（c1）で使用する緩衝液のイオン強度値より高い。
【０１０６】
これらの階段はイオン交換クロマトグラフィ濾過タイプメンブレン上にＦＶＩＩＩおよびＦｖＷが同時に捕捉された階段の後に実行される。階段（c1）で溶出したＦｖＷはＦＶＩＩＩを極めてわずかしか含まない。これを回収して、精製されたＦｖＷ溶液を得る。階段（c2）で得られるＦＶＩＩＩに含まれるＦｖＷは最初の溶液より少ない。これを回収して、精製されたＦＶＩＩＩ溶液を得る。
【０１０７】
必要な場合には、例えば下記特許文献２６に記載のような、高分子量のＦＶＩＩＩ-ＦｖＷ複合体を分離するための追加の階段を実行することができる。また、必要に応じて、例えば下記特許文献２７に記載のような、気孔率が２０nm以下、特に１５nm以下の親水性フィルターでＦＶＩＩＩの精製溶液を得る追加の濾過階段を実行することもできる。
【特許文献２６】欧州特許第EP1037923号公報
【特許文献２７】国際特許第WO 2005/040214号公報
【０１０８】
本発明のさらに他の実施例では、必要に応じて、イオン交換クロマトグラフィ濾過タイプメンブレンでのＦＶＩＩＩとＦｖＷの同時吸着階段の後に、精製されたＦＶＩＩＩ溶液を得るための下記の工程をさらに実行することができる：
（d)上記クロマトグラフィメンブレンの平衡緩衝剤のイオン強度値を増加させてＦｖＷを溶出させ、
（e)イオン交換クロマトグラフィメンブレン、好ましくは最初のメンブレンと同じタイプのメンブレン上でフォンビルブラント因子を捕捉し、
（f)上記クロマトグラフィメンブレンの平衡緩衝剤のイオン強度値を増加させてフォンビルブラント因子を溶出させる。
【０１０９】
この実施例では、必要に応じて、上記のＦｖＷ溶出段階（d)の後に、上記クロマトグラフィメンブレンの平衡緩衝剤のイオン強度値をフォンビルブラント因子を回収する場合の値より増加させてＦＶＩＩＩを溶出させる。従って、簡単な方法で精製されたＦｖＷ含有溶液と精製されたＦＶＩＩＩ含有溶液とが得られる。
【０１１０】
本発明方法によってＦＶＩＩＩとＦｖＷを含んだ溶液からＦＶＩＩＩおよびＦｖＷを連続的または同時に精製することができる。血漿由来の溶液の場合、ヒトおよび動物の血漿を最大限利用できるので、本発明方法は特に有利である。
【０１１１】
この特定実施例では下記の工程がさらに加わる：
（g)階段（c)で溶出したフォンビルブラント因子リッチな画分をゼラチンリガンドを有する親和性ゲルカラムでクロマトグラフィを実行し、
（h) 保持されない非フィブロネクチンあ全く含まないフォンビルブラント因子画分を回収する。
【０１１２】
フィブロネクチンアッセイは当業者に周知の方法に従って例えば免疫比濁法によって実行できる。従って、本本発明方法の実施例では、イオン交換クロマトグラフィ濾過タイプ・メンブレンでＦＶＩＩＩとＦｖＷとを同時に捕捉する上記階段の後に、下記の工程を実行することによって、精製されたＦＶＩＩＩ溶液と精製されたＦｖＷ溶液とを同時に得ることができ：
（a) 上記クロマトグラフィ・メンブレンの平衡緩衝剤のイオン強度値を増加させてＦｖＷを溶出させ、
（b) 上記クロマトグラフィ・メンブレンの平衡緩衝剤のイオン強度値をフォンビルブラント因子の回収用の値より増加させてＦＶＩＩＩを溶出させ、
（c) 上記イオン交換クロマトグラフィ・メンブレン上にフォンビルブラント因子を捕捉し、
（d) 上記クロマトグラフィ・メンブレンの平衡緩衝剤のイオン強度値を増加させてフォンビルブラント因子を溶出させ、
（e) 階段（d)で溶出させたフォンビルブラント因子リッチな画分をゼラチン・リガンドを有する親和性ゲル・カラム上でクロマトグラフィを実行し、
（f) ゲルアフィニティーに保持されなかったフォンビルブラント因子リッチな画分を回収する。
【０１１３】
この実施例では、精製されたＦＶＩＩＩ溶液と精製されたＦｖＷ溶液とが続けて得られる。すなわち、本発明の多様な実施例によって本発明の簡単な方法でＦＶＩＩＩとＦｖＷとを分離することができる。
【０１１４】
本発明の精製階段はアニオン交換クロマトグラフィ選択的メンブレン上に両方のタンパクを同時に捕捉することによって血漿から第ＶＩＩＩ因子とフォンビルブラント因子とを別々または同時に精製することができる唯一の方法である。
、
【０１１５】
本発明のさらに他の対象は、本発明の精製法を実行することから成る精製されたＦＶＩＩＩの製造方法にある。
本発明のさらに他の対象は、本発明の精製法を実行することから成る精製されたＦｖＷの製造方法にある。
本発明の上記以外の観点および利点は以下の基する本発明の実施例から理解できよう。しかし、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
以下、実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【０１１６】
実施例１
フォンビルブラント因子の精製法
新鮮な凍結血漿を１〜６℃の間の温度で融解して冷凍沈殿物を製造した。遠心分離後、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、フォンビルブラント因子および第ＶＩＩＩ因子を含んだ冷凍沈殿物を回収し、ヘパリンナトリウム（3lU/mL）を含んだ水溶液中にスラリー化した。溶液のpH値を7.0±0.1に合わせた。スラリー化した冷凍沈殿物をビタミンＫ依存因子を除去するためのアルミナゲルでの吸着と、フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンコールド沈降によって予備精製した。すなわち、懸濁液に水酸化アルミニウムを加え、５分間撹拌した。ｐＨ値は０．１Ｍの酢酸を用いて6.5±0.2に合わせた。溶液を撹拌下に１４〜１８℃の温度範囲に冷却した。それから溶液を１４〜１８℃の温度で遠心分離した。上澄を回収し、0.22μm濾紙で濾過して清透化した。
【０１１７】
この精製済みの溶液をウィルス失活階段に送って、外膜ウィルスに対して効果的なPolysorbate ８０（１％、w/v）とTn-nButyl Phosphate（0.3％、v/v）の存在下で溶剤／洗剤で処理した。溶剤／洗剤処理は少なくとも６時間、pH値＝7.1で実行した。
【０１１８】
溶剤／洗剤処理済みのタンパク溶液を強アニオン交換器グラフトメンブレン、例えば塩基性緩衝液で浸透圧レベルが370〜390mOsm/Kgに達するまで塩化ナトリウムの濃度を上げ、ｐＨ６．９〜７．１に予め平衡させたムスタング（Mustang）Ｑカプセルに通した。
【０１１９】
タンパク溶液を通した後にカラム排出液の光学濃度がベースラインに戻るまでカプセルを同じ緩衝液（浸透圧重量モル濃度＝370〜390 mOsm/Kg）でリンスした。メンブレンに吸着されなかったタンパク分画にはフィブリノーゲンと、溶剤／洗剤ベースのウィルス失活処理で加えた化学試薬とが含まれる。
【０１２０】
次に、浸透圧重量モル濃度が600〜660 mOsm/Kgに達するまで塩化ナトリウムを加えてイオン強度値をpH 6.9〜7.1に増加させ、塩基性緩衝液を用いてメンブレンに吸着されたフォンビルブラント因子を溶出させた。溶出画分は浸透圧重量モル濃度が370〜390mOsm/Kgに達するまで塩化ナトリウムを除いたpH 6.9〜7.1の塩基性緩衝液で希釈した。
【０１２１】
次に、希釈された画分を、浸透圧重量モル濃度が370〜390mOsm/Kgに達するまで塩化ナトリウムを加えてpH 6.9〜7.1の塩基性緩衝液で平衡させたMustang Qカプセル・タイプのグラフトされた強陰イオン交換メンブレンに通した。タンパク溶液を通した後、カラム排出液の光学濃度がベースラインに戻るまで同じ緩衝液（浸透圧重量モル濃度＝370〜390 mOsm/Kg）を使用してカプセルをリンスした。次に、メンブレンに吸着されたフォンビルブラント因子を、600〜660 mOsm/Kgの浸透圧重量モル濃度に達するまで塩化ナトリウムを加えてイオン強度値をpH 6.9〜7.1に増加させた塩基性緩衝液を加えて溶出させた。次に、溶出画分を浸透圧重量モル濃度が600〜660 mOsm/Kgに達するまで塩化ナトリウムを加えてイオン強度値を増加させた塩基性緩衝液（pH 6.9〜7.1）で予め平衡させたゼラチンリガンドを用いたゲル上でのアフィニティークロマトグラフィに送った。タンパク溶液を通した後、カラム排出液の光学濃度がベースラインに戻るまで親和性ゲルを同じ緩衝液（浸透圧重量モル濃度＝600〜660 mOsm/Kg）を使用してリスンした。ゲル洗浄物を含む非吸着画分は極めて純粋なフォンビルブラント因子の濃縮画分を表す。精製ダイアグラムは［図1］に示してある。
【０１２２】
結果
【表１】
0005704918.tif 000002
【０１２３】
実施例２
第ＶＩＩＩ因子の精製方法
新鮮凍結血漿を１〜６℃の間の温度で融解して冷凍沈殿物を製造した。遠心分離後にフィブリノーゲン、フィブロネクチン、フォンビルブラント因子および第ＶＩＩＩ因子を含んだ冷凍沈殿物を回収し、ヘパリンナトリウム（３IU/mL）を含む水溶液中にスラリー化した。溶液のpH値は7.0±0.1に合せた。
【０１２４】
スラリー化した冷凍沈殿物をビタミンＫ依存因子を除去するためのアルミナゲル吸着とフィブリノーゲンおよびフィブロネクチンのコールド沈降とによって予備精製した。すなわち、水酸化アルミニウムを撹拌下に懸濁液に５分間で加えた。0.1M酢酸を用いてpH値を6.5±0.2に合わせ、溶液を撹拌下して１４〜１８℃の温度に冷却した。その後、溶液を１４〜１８℃の温度で遠心分離した。上澄を回収し、0.22μm濾紙で濾過して清透化した。
【０１２５】
精製済みの溶液をウィルス失活階段に送り、外膜ウィルスに対して効果的なPolysorbate ８０（１％、w/v）およびTn-nButyl Phosphate（0.3％、v/v）の存在下で溶剤／洗剤処理した。溶剤／洗剤処理は少なくとも６時間、pH値＝7.1で実施した。
【０１２６】
次に、溶剤／洗剤処理したタンパク溶液を、浸透圧重量モル濃度が370〜390mOsm/Kgに達するまで塩化ナトリウムを加えた塩基性緩衝液（pH 6.9〜7.1）で予め平衡させたMustang Qカプセルの強アニオン-交換器グラフトメンブレンに通した。
【０１２７】
タンパク溶液を通した後、カラムの排出液の光学濃度がベースラインに戻るまで上記カプセルを同じ緩衝液（浸透圧重量モル濃度＝370〜390 mOsm/Kg）を用いてリンスした。メンブレンに吸着されなかったタンパク分画は多くのフィブリノーゲンと、溶剤／洗剤処理ベースのウィルス失活処理のために加えた化学試薬とを含む。
【０１２８】
メンブレンに吸着されたフォンビルブラント因子は、浸透圧重量モル濃度が600〜660 mOsm/Kgに達するまで塩化ナトリウムを加えてイオン強度値を増加させたpH＝6.9〜7.1の塩基性緩衝液を加えて溶出させた。フォンビルブラント因子の精製を実施例１に記載の方法で続けた。次に、メンブレンに吸着された第ＶＩＩＩ因子を、浸透圧重量モル濃度が1400〜1700mOsm/Kgに達するまで塩化ナトリウムを加えてイオン強度値を増加させたpH＝6.9〜7.1の塩基性緩衝液を加えて溶出させた。第ＶＩＩＩ因子は塩化カルシウムを加えてイオン強度値を高くしたpH＝6.0の緩衝液で溶出するのが好ましい。
精製ダイアグラムは［図２］に示してある。
【０１２９】
結果
【表２】
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【図１】
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【図２】
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