(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８５６６として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８５６６の下に寄託された単離細胞、または配列番号３のポリペプチド配列および配列番号４のポリペプチド配列を含む抗体を産生するその子孫細胞。
【請求項３】
ＰＡＧ４、ＰＡＧ６、ＰＡＧ９、ＰＡＧ１６、ＰＡＧ１７、ＰＡＧ１９、ＰＡＧ２０およびＰＡＧ２１に特異的に結合する抗体重鎖または軽鎖ドメインをコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記重鎖または軽鎖ドメインが、
ａ）配列番号１と少なくとも９７％の配列同一性を有するポリペプチド配列；
ｂ）配列番号２と少なくとも９２％の配列同一性を有するポリペプチド配列；
ｃ）配列番号１を含むポリペプチド配列；および
ｄ）配列番号２を含むポリペプチド配列
から成る群より選択される、単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号３または配列番号４のポリペプチド配列をコードする、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号５または配列番号６を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
ＰＡＧ４、ＰＡＧ６、ＰＡＧ９、ＰＡＧ１６、ＰＡＧ１７、ＰＡＧ１９、ＰＡＧ２０およびＰＡＧ２１に特異的に結合する抗体重鎖または軽鎖ドメインを含む単離ポリペプチドであって、前記重鎖または軽鎖ドメインが、
ａ）配列番号１と少なくとも９７％の配列同一性を有するポリペプチド配列；
ｂ）配列番号２と少なくとも９２％の配列同一性を有するポリペプチド配列；
ｃ）配列番号１を含むポリペプチド配列；および
ｄ）配列番号２を含むポリペプチド配列
から成る群より選択される、単離ポリペプチド。
【請求項７】
ウシ科の動物における妊娠を検出するための方法であって、
ａ）ウシ科の動物から試料を得ること；
ｂ）前記試料を請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させること；および
ｃ）前記試料が、前記抗体またはその抗原結合フラグメントによって特異的に結合され得る少なくとも第一のＰＡＧを含むか否かを測定することであって、ここで試料におけるＰＡＧの存在が妊娠を示す、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
i）前記試料が少なくとも第一のＰＡＧを含むか否かを測定することが、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット法を含む；
ii）前記試料が少なくとも第一のＰＡＧを含むか否かを測定することが、基質に固定された前記抗体またはその抗原結合フラグメントおよび酵素で標識された第二の抗体製剤へのＰＡＧの結合を含むサンドイッチＥＬＩＳＡを含む；
iii）前記ＰＡＧが、ＰＡＧ４、ＰＡＧ６、ＰＡＧ９、ＰＡＧ１６、ＰＡＧ１７、ＰＡＧ１９、ＰＡＧ２０およびＰＡＧ２１から成る群より選択される；または
iv）前記ＰＡＧが、ＰＡＧ６である
ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント；および
（ｂ）前記抗体またはその抗原結合フラグメントのための容器
を含むキット。
【請求項１０】
i）前記キットが、前記抗体またはその抗原結合フラグメントと少なくとも第一のＰＡＧの間の特異的結合を検出するための手段を含む；
ii）前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、支持体に結合されている；
iii）前記支持体が、ポリスチレンプレート、試験管または試験紙である；
iv）前記キットが、検出可能な標識をさらに含む；
v）前記キットが、蛍光または化学発光タグである検出可能な標識をさらに含む；
vi）前記キットが、酵素である検出可能な標識をさらに含む；または
vii）前記キットが、アルカリホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼである検出可能な標識をさらに含む
ことを特徴とする請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
少なくとも第一のＰＡＧを精製する方法であって、
ａ）少なくとも第一のＰＡＧを含む試料を得ること；および
ｂ）請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントに対するＰＡＧの親和性に基づき前記試料に対してＰＡＧを精製すること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
i）前記試料が、５０日目から２５０日目のウシ胎盤から得られる；
ii）前記試料が、６１日目から２５０日目のウシ胎盤から得られる；または
iii）ＰＡＧの親和性に基づき前記試料に対してＰＡＧを精製することが、免疫沈降法、ウエスタンブロット法またはイムノアフィニティークロマトグラフィー法を含む
ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許仮出願第６１／０１３，６０３号（２００７年１２月１３日出願）の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、一般に獣医学、生殖生物学および診断法の分野に関する。より詳細には、本発明は、早期段階の妊娠を検出するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
妊娠診断は、酪農業および牛肉産業における健全な繁殖管理を可能にする。一般に、人工受精の成功率は５０％未満であり、生産者は、発情回帰の明白な徴候（見逃されやすい）に頼るか、または妊娠の失敗が前述の方法の１つによって確認されるまで再交配（ｒｅｂｒｅｅｄｉｎｇ）を遅延させねばならない。そのような遅延は極めてコストがかかり、この産業にとって重大な経済的損失となる。
【０００４】
早期に実施でき、且つ偽陽性率が低い、ウシのための正確な妊娠検査が長年にわたって探し求められてきた。いくつかの妊娠検査が利用可能であり、乳プロゲステロンアッセイ（Ｏｌｔｅｎａｃｕら、１９９０；Ｍａｒｋｕｓｆｅｌｄら、１９９０）、硫酸エストロン分析（Ｈｏｌｄｓｗｏｒｔｈら、１９８２；Ｗａｒｎｉｃｋら、１９９５）、直腸触診（Ｈａｔｚｉｄａｋｉｓら、１９９３）、超音波検査（Ｂｅａｌら、１９９２；ＣａｍｅｒｏｎとＭａｌｍｏ，１９９３）、および妊娠特異抗原についての血液試験が含まれる。
【０００５】
これらの手順の各々が、実際的な農場での使用に関しては期待外れであった。例えば、１８〜２２日目頃の乳または血清中プロゲステロンの測定は、受け入れられないほど高い割合の偽陽性を生じる（Ｏｌｔｅｎａｃｕら、１９９０；Ｍａｒｋｕｓｆｅｌｄら、１９９０）。直腸触診は３５日目の早期に妊娠を検出するために使用できるが、この手順は５〜１０％またはそれ以上の胚死亡率を導き得る（Ｏｌｔｅｎａｃｕら、１９９０；Ｈａｔｚｉｄａｋｉｓら、１９９３）。５０日目の直腸触診は、胚に損傷を引き起こすことは少ないが、この遅い時点では経済的な価値が極めて限られる（Ｏｌｔｅｎａｃｕら、１９９０）。超音波検査法は、特に４５日目以前に、精度において直腸触診に勝る利点を有する（Ｂｅａｌら、１９９２；ＣａｍｅｒｏｎとＭａｌｍｏ，１９９３）が、装置が高価であり、その使用にはかなりの訓練を必要とし、限定されてはいるが動物に対する危険性がある。関連技術であるドップラー超音波検査法は直腸触診よりも正確である（ＣａｍｅｒｏｎとＭａｌｍｏ，１９９３）が、やはり十分に訓練された人員を必要とする。尿または血清中の硫酸エストロンの存在は別の検査を提供するが、濃度が上昇する１００日後にしか有用でない（Ｈｏｌｄｓｗｏｒｔｈら、１９８２；Ｗａｒｎｉｃｋら、１９９５）。
【０００６】
妊娠特異的タンパク質Ｂ（ＰＳＰ−Ｂ）の発見（Ｂｕｔｌｅｒら、１９８２）は、このタンパク質が妊娠の第４週までに妊娠ウシの血液中で検出できるため、妊娠診断への新しいアプローチを提供した（Ｓａｓｓｅｒら、１９８６；Ｈｕｍｂｌｏｔら、１９８８）。他の研究者たちは、同一の抗原または免疫学的に類似の抗原に基づき得る免疫検定法を開発した（Ｚｏｌｉら、１９９２ａ；Ｍｉａｌｏｎら、１９９３；Ｍｉａｌｏｎら、１９９４）。ある場合には、抗原（分子量約６７ｋＤａ）はウシ妊娠関連糖タンパク質（ｂｏＰＡＧ；現在はｂｏＰＡＧ−１）と呼ばれた（Ｚｏｌｉら、１９９２ａ）；２番目の場合には、この抗原は妊娠血清タンパク質６０（ＰＳＰ６０）と称された（Ｍｉａｌｏｎら、１９９３；Ｍｉａｌｏｎら、１９９４）。ＰＳＰ−Ｂ／ｂｏＰＡＧ１／ＰＳＰ６０に関する免疫検定法にはいくつかの難点がある。第一に、妊娠第４週の陽性診断は、血液中の抗原濃度が低く、いくぶん可変的であるので、多少の不確実さが残る。第二に、ｂｏＰＡＧ１は分娩時に著明に上昇し（Ｓａｓｓｅｒら、１９８６；Ｚｏｌｉら、１９９２ａ；Ｍｉａｌｏｎら、１９９３）、この分子の循環半減期が長いため（Ｋｉｒａｃｏｆｅら、１９９３）、産後８０〜１００日目でもまだ抗原が検出できるので、産後の早い期間内に交配されるウシにおける妊娠診断に影響を及ぼす（Ｚｏｌｉら、１９９２ａ；Ｍｉａｌｏｎら、１９９３；Ｍｉａｌｏｎら、１９９４；Ｋｉｒａｃｏｆｅら、１９９３）。そのため、この検査は、人工授精（「ＡＩ」）が産後７０日目またはそれ以降に行われる場合にのみ、３０日目の乳牛において実施できる。
【０００７】
妊娠関連糖タンパク質（ＰＡＧ）は構造的にペプシンに関連する。それらは有蹄哺乳動物に限定されると考えられ、胎盤の外上皮細胞層（絨毛膜／栄養外胚葉）において特異的に発現されることを特徴とする（Ｇｒｅｅｎら、２０００；Ｈｕｇｈｅｓら、２００３；Ｘｉｅら、１９９７）。少なくともいくらかのＰＡＧはプロテイナーゼとして触媒的に不活性であるが、各々はペプチドに結合することができるクレフトを有すると思われる（Ｇｕｒｕｐｒａｓａｄら、１９９６）。ウシ、ヒツジ、そしてほぼ確実にすべての反芻動物の偶蹄目（Ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）が数十のＰＡＧ遺伝子を有すると推定される。ＰＡＧは配列が極めて多様であり、超可変領域は主として表面露出ループに限局される。
【０００８】
ウシ妊娠関連糖タンパク質（ｂｏＰＡＧ／ＰＳＰＢ／ＰＳＰ６０）は、家畜のための妊娠検査を開発する試みの中で発見された（Ｂｕｔｌｅｒら、１９８２；Ｓａｓｓｅｒら、１９８６；Ｚｏｌｉら、１９９１；Ｚｏｌｉら、１９９２ａ）。各々の試みにおいて、ウサギに胎盤分葉の抽出物を注射し、胎盤抗原に対するものではない抗体を、非妊娠動物からの組織抽出物で吸着することによって除去した。生じた抗血清は、受精後１か月という早期のウシおよびヒツジのための正確な妊娠検査の基礎を提供した。
【０００９】
初期試験においてさえも（Ｂｕｔｌｅｒら、１９８２；Ｚｏｌｉら、１９９１；Ｘｉｅら、１９９１；Ｘｉｅら、１９９４；Ｘｉｅら、１９９６）、ｂｏＰＡＧが分子量および電荷において不均一であることは明らかであり、また、より多くのアイソフォームが精製されると共に、それらがアミノ末端配列においても異なることが明白になった（Ａｔｋｉｎｓｏｎら、１９９３；Ｘｉｅら、１９９７ａ）。さらなるライブラリースクリーニングにより、反芻動物における付加的な転写産物（Ｘｉｅら、１９９４；Ｘｉｅら、１９９５；Ｘｉｅら、１９９７ｂ）、およびブタなどの非反芻動物種におけるＰＡＧの存在（Ｓｚａｆｒａｎｓｋａら、１９９５）が明らかにされた。ＰＡＧ様タンパク質（「ペプシノーゲンＦ」または「ペプシンＦ」としても知られる）は、ウマおよびネコにおいて記述されている（Ｇｒｅｅｎら、１９９９；Ｇｕｒｕｐｒａｓａｄら、１９９６）。記述されたウシＰＡＧの中でも特に、ｂｏＰＡＧ２、ｂｏＰＡＧ４、ｂｏＰＡＧ５、ｂｏＰＡＧ６、ｂｏＰＡＧ７、ｂｏＰＡＧ９、ｂｏＰＡＧ７ｖ、ｂｏＰＡＧ９ｖ、ｂｏＰＡＧ１５、ｂｏＰＡＧ１６、ｂｏＰＡＧ１７、ｂｏＰＡＧ１８、ｂｏＰＡＧ１９、ｂｏＰＡＧ２０およびｂｏＰＡＧ２１が挙げられる（米国特許第６，８６９，７７０号）。そのようなＰＡＧを検定することによって初期妊娠を診断するための方法に関する情報は、例えば、米国特許第６，８６９，７７０号および米国特許出願公開番号２００５０１００９７５に見出される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ウシにおける妊娠を検出するために利用可能な検査の大部分は、交配後３０日より前には精度が低い。さらに、既存の検査の多くについて、熟達した人員が必要とされる。そのため、交配後３０日より前に迅速且つ容易に実施できるウシにおける正確で感受性のある妊娠検査が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
それゆえ、本発明の１つの態様は、早期妊娠についての感受性のある正確な検査を提供する。本発明は、１つの実施形態では、ＰＡＧに対して高度に特異的であるドメインを含む特定ポリペプチドが、妊娠の第４週の終わりより前に高い度合の感受性と特異性で検出できる早期妊娠検査を提供する。そのような早期に妊娠を診断できることは、動物が、通常一日のうち少なくとも一部の時間は収容され、集中的な管理が実施される酪農業において特に有用である。さらに、本発明の実施形態は他の動物のための交配プログラムにおいて利用できる。
【００１２】
もう１つの態様では、本発明は、動物における妊娠を検出するための方法であって、（ａ）動物から試料を得ること；（ｂ）試料を、２Ｄ９抗体またはそのフラグメント若しくは変異体を含む、抗体または抗体フラグメントと接触させること；および（ｃ）試料中の少なくとも１つの妊娠関連抗原（ＰＡＧ）と抗体または抗体フラグメントの接触を検出することであって、ここでＰＡＧの検出が、動物が妊娠していることを示す、を含む方法を提供する。１つの実施形態では、使用される抗体は、配列番号１と９７％より大きい配列同一性または配列番号２と９２％より大きい配列同一性を有するドメインを含む。いくらかの実施形態では、動物は反芻動物亜目（Ｒｕｍｉｎａｎｔｉａ）の成員である。特定実施形態では、前記反芻動物はウシ科（Ｂｏｖｉｄａｅ）の成員である。他の実施形態では、動物は、ヤギ、ヒツジ、ウマ目（Ｐｅｒｉｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）の成員、ウマ、サイ、イヌ、ネコ種、ヒトまたはパンダである。
【００１３】
２Ｄ９を産生するハイブリドーマ細胞株は、２００７年８月２日にＰａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．，２０１１０−２２０９に寄託され、特許受託番号ＰＴＡ−８５６６（同定参照番号ＭＯＮ−ＰＡＧ−２Ｄ９）を割り当てられた。この寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて維持される。この寄託物は単に当業者にとって好都合なように作製されたものであり、寄託物が米国特許法§１１２の下で要求されることの承認ではない。
【００１４】
ある実施形態では、前記ドメインは、配列番号１と９８％以上の配列同一性、例えば、配列番号１と９９％以上の配列同一性を有する。さらなる実施形態では、ドメインは配列番号１を含む。
【００１５】
いくらかの実施形態では、前記ドメインは、配列番号２と９２％以上の配列同一性、例えば、配列番号２と少なくとも９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％またはより大きい配列同一性を有する。いくらかの特定実施形態では、ドメインは配列番号２を含む。
【００１６】
いくらかの実施形態では、前記抗体または抗体フラグメントは、少なくとも１本の軽鎖と少なくとも１本の重鎖を含む抗体としてさらに定義される。特定実施形態では、軽鎖は配列番号１と９７％より大きい配列同一性を有し得る。さらなる実施形態では、重鎖は配列番号２と９５％より大きい配列同一性を有する。より特定の実施形態では、重鎖は配列番号２と９８％より大きい配列同一性を有する。他の実施形態では、重鎖は配列番号２を含む。
【００１７】
いくらかの他の特定実施形態では、抗体は、配列番号３を含む軽鎖および配列番号４を含む重鎖を含有する。
【００１８】
抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。１つの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体２Ｄ９である。
【００１９】
検出されるＰＡＧは、ｂｏＰＡＧ４、ｂｏＰＡＧ６、ｂｏＰＡＧ９、ｂｏＰＡＧ１６、ｂｏＰＡＧ１７、ｂｏＰＡＧ１９、ｂｏＰＡＧ２０およびｂｏＰＡＧ２１などの任意のＰＡＧであり得る。１つの実施形態では、ＰＡＧはｂｏＰＡＧ６である。
【００２０】
さらなる実施形態では、本発明は、ウシ科の動物における妊娠を検出するための方法であって、（ａ）動物から試料を得ること；（ｂ）試料を２Ｄ９モノクローナル抗体と接触させること；および（ｃ）試料中のｂｏＰＡＧ４、ｂｏＰＡＧ６、ｂｏＰＡＧ９、ｂｏＰＡＧ１６、ｂｏＰＡＧ１７、ｂｏＰＡＧ１９、ｂｏＰＡＧ２０またはｂｏＰＡＧ２１の１または複数と抗体の接触を検出することであって、ここでＰＡＧの検出が、動物が妊娠していることを示す、を含む方法に関する。妊娠を検出するための方法は、例えば、人工受精後１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日目またはそれ以降に実施することができる。
【００２１】
試料は、ＰＡＧを含むことが既知であるまたはＰＡＧを含むことが疑われる任意の試料であり得る。特定実施形態では、試料は唾液、血清、血漿、血液、乳または尿である。任意の有効量の試料を動物から得ることができる。例えば、前記量は、約５μｌ、１０μｌ、１５μｌ、２０μｌ、２５μｌ、３０μｌ、４０μｌ、５０μｌ、６０μｌ、７０μｌ、８０μｌ、９０μｌ、１００μｌ、１５０μｌ、２００μｌ、２５０μｌ、３００μｌ、３５０μｌ、４００μｌ、４５０μｌ、５００μｌ、５５０μｌ、６００μｌ、７００μｌ、８００μｌ、９００μｌ、１ｍｌ、１．５ｍｌ、２．０ｍｌ、２．５ｍｌ、３．０ｍｌ、３．５ｍｌ、４．０ｍｌ、４．５ｍｌ、５．０ｍｌまたはより多い量であり得る。
【００２２】
当業者に公知である、ＰＡＧと抗体または抗体フラグメントの接触を検出する任意の方法が本発明の方法によって意図される。例えば、前記方法はＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット法を含み得る。特定実施形態では、検出されるべきＰＡＧは、ｂｏＰＡＧ２、ｂｏＰＡＧ４、ｂｏＰＡＧ５、ｂｏＰＡＧ６、ｂｏＰＡＧ７、ｂｏＰＡＧ９、ｂｏＰＡＧ７ｖ、ｂｏＰＡＧ９ｖ、ｂｏＰＡＧ１５、ｂｏＰＡＧ１６、ｂｏＰＡＧ１７、ｂｏＰＡＧ１８、ｂｏＰＡＧ１９、ｂｏＰＡＧ２０またはｂｏＰＡＧ２１である。特定実施形態では、ＰＡＧはｂｏＰＡＧ６である。本発明の方法のいくらかの実施形態では、各々の試料中の２以上のＰＡＧが検出される。ウシ以外の種に適用される場合、本発明は、栄養膜（前胎盤）が母体の子宮壁に付着または着床し始める時点で産生される他のＰＡＧの検出を可能にする。これらの種における「早期」ＰＡＧは、ウシにおける早期妊娠を検出するうえで有用なＰＡＧと免疫学的に交差反応し得る。
【００２３】
特定実施形態では、ＥＬＩＳＡは、基質に固定された抗体または抗体フラグメントおよび酵素で標識された第二の抗体製剤へのＰＡＧの結合を含むサンドイッチＥＬＩＳＡである。例えば、抗体または抗体フラグメントが固定される基質は、チューブ、ウエル、バイアル、細片、試験紙またはバイオセンサーであり得る。酵素は、例えば、アルカリホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼまたは任意の酵素タグであり得る。
【００２４】
本発明はまた、一般に、配列番号１と９７％より大きい配列同一性または配列番号２と９２％より大きい配列同一性を有するドメインによってコードされる、単離され、精製されたポリペプチドに関する。特定実施形態では、ドメインは配列番号１と９８％より大きい配列同一性を含む。より特定の実施形態では、ドメインは配列番号１を含む。ドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかに結合した１または複数の付加的なアミノ酸残基が存在してもよい。特定実施形態では、ポリペプチドは配列番号１である。いくらかの実施形態では、ドメインは配列番号２と９５％より大きい配列同一性を含む。より特定の実施形態では、ドメインは配列番号２と９８％以上の配列同一性を含む。さらなる特定実施形態では、ポリペプチドは配列番号２である。他の実施形態では、ポリペプチドは配列番号３を含む。さらなる実施形態では、ポリペプチドは配列番号４を含む。
【００２５】
本発明はまた、配列番号１と９７％より大きい配列同一性または配列番号２と９２％より大きい配列同一性を有するドメインを含むポリペプチドをコードする、単離され、精製されたポリヌクレオチドを包含する。いくらかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１と９８％より大きい配列同一性を有するポリペプチドをコードする。特定実施形態では、ポリヌクレオチドは配列番号１をコードする。いくらかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２と９５％より大きい配列同一性を有するドメインを含むポリペプチドをコードする。より特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２と９８％より大きい配列同一性を有するドメインを含むポリペプチドをコードする。より特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２を含むポリペプチドをコードする。いくらかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５と９８％より大きい同一性または配列番号６と９５％より大きい同一性を有する核酸配列を含む。いくらかの特定実施形態では、ポリヌクレオチドは配列番号５であり、さらなる特定実施形態では、ポリヌクレオチドは配列番号６である。
【００２６】
本発明はまた、一般に、モノクローナル抗体２Ｄ９を分泌するハイブリドーマ細胞に関する。
【００２７】
本発明はまた、動物におけるＰＡＧの存在を検出するためのキットであって、抗体または抗体フラグメントを含むキットに関する。いくらかの実施形態では、前記抗体または抗体フラグメントは、配列番号３を含む軽鎖を含有する。さらなる実施形態では、前記抗体または抗体フラグメントは、配列番号４を含む重鎖を含有する。１つの実施形態では、抗体または抗体フラグメントは支持体に結合されている。例えば、支持体は、ポリスチレンプレート、試験管、細片、試験紙またはバイオセンサーであり得る。
【００２８】
いくらかの実施形態では、前記キットは検出可能な標識をさらに含む。例えば、検出可能な標識は、抗体または抗体フラグメントに結合された蛍光タグであり得る。他の実施形態では、検出可能な標識は化学発光タグである。さらなる実施形態では、検出可能な標識は、アルカリホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素である。キットは、酵素のための基質をさらに含み得る。さらなる実施形態では、キットは緩衝液または希釈剤を含む。キットはまた、場合により使い捨てピペットを含み得る。試薬の容器、指示書等を含む他のキット成分は当業者に周知であり、それらも本明細書で述べるキットにおける使用に関して意図される。
【００２９】
本発明はまた、一般に、動物における妊娠を検出するための方法であって、（ａ）動物から試料を得ること；（ｂ）試料を本発明によって提供される抗体または抗体フラグメントと接触させること；および（ｃ）抗体または抗体フラグメントと接触させることによって試料中のＰＡＧを検出することであって、ここで、すべての可能な組み合わせを含む、ｂｏＰＡＧ４、ｂｏＰＡＧ６、ｂｏＰＡＧ９、ｂｏＰＡＧ１６、ｂｏＰＡＧ１７、ｂｏＰＡＧ１９、ｂｏＰＡＧ２０またはｂｏＰＡＧ２１の１または複数の検出が、動物が妊娠していることを示す、を含む方法に関する。
【００３０】
本発明の他の目的、特徴および利点は以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、詳細な説明および特定実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、本発明の精神と範囲内で様々な変更および修正がこの詳細な説明から当業者に明白になるので、単なる例示として提供されるものであることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
以下の図面は本明細書の一部を構成し、本発明の一部の態様をさらに明らかにするために包含される。本発明は、本明細書で提示される特定実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１または複数を参照することによってより良く理解され得る。
【図１】２Ｄ９軽鎖の核酸配列（配列番号５）。プロセシングされた形態の開始コドン（Ｎ末端アミノ酸）および終結コドンを太字で示す。
【図２】２Ｄ９重鎖の核酸配列（配列番号６）。プロセシングされた形態の開始コドン（Ｎ末端アミノ酸）および終結コドンを太字で示す。
【図３】図３Ａ−ｂｏＰＡＧ６のペプチド配列（上のパネル）およびＬＣ−ＭＳ−ＭＳ分析で同定されたペプチド配列（下のパネル）（配列番号７〜１８）は、ＰＡＧ富化製剤の免疫沈降反応後に２Ｄ９被覆磁気ビーズから溶出されたＰＡＧが主としてｂｏＰＡＧ６に対応することを示した。すべての２Ｄ９結合成分を同定するため、ＰＡＧ富化製剤のイムノアフィニティークロマトグラフィー精製を実施した。イムノアフィニティーカラムで精製した物質をＬＣ−ＭＳ−ＭＳ分析に供した。この分析は、ｂｏＰＡＧ６が主要な２Ｄ９結合ＰＡＧであり、ｂｏＰＡＧ−４、ｂｏＰＡＧ−９、ｂｏＰＡＧ−２０およびｂｏＰＡＧ２１はより重要でない２Ｄ９結合ＰＡＧであることを明らかにした。図３Ｂ−５５日目のウシ胎盤から調製した組織抽出物の２Ｄ９イムノアフィニティークロマトグラフィーから精製したＰＡＧの変性ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウエスタンブロット分析。ＰＡＧポリクローナル抗体によるクマシー染色ゲルおよびウエスタンブロット分析の両方が、２Ｄ９結合ＰＡＧとして６７ｋＤ、５５ｋＤおよび５０ｋＤの３つのタンパク質バンドを示した。「Ｍｚ」＝質量対電荷比：ペプチドの質量対イオン化ペプチドの電荷、マイナス水；「電荷」＝イオンの電荷状態；「分子量（算定）」＝ペプチドの算定分子量；「開始」＝ペプチドが整列するタンパク質の開始アミノ酸；「終結」＝ペプチドが整列するタンパク質の終結アミノ酸；「スコア」＝ペプチド配列の信頼性の程度。
【図４】子宮小丘（子宮内膜）および胎盤分葉（胎盤）組織抽出物のイムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製された２Ｄ９結合ＰＡＧを示すクマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。タンパク質バンド１〜７を切り出し、トリプシン消化とそれに続くＬＣ−ＭＳ−ＭＳ分析に供した（配列番号７〜１８）。
【図５】２Ｄ９抗体で被覆したＥＬＩＳＡプレートおよびイムノアフィニティー精製したＰＡＧを標準品として用いて作成したＰＡＧ  ＥＬＩＳＡ標準曲線のｌｏｇ−ｌｏｇｉｔ変換。アッセイは、０．５ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌまでの線形応答を示した。
【図６】提示する表は、２つの試験施設、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎおよびＣａｌｉｆｏｒｎｉａにおける２８日目の超音波検査での妊娠診断と比較した、検査室ベースの（ｌａｂ−ｂａｓｅｄ）ＥＬＩＳＡを使用することによる２８日目の妊娠診断の精度を示す。乳牛の繁殖管理における２８日目の妊娠検査の経済性をこのβ試験において検討した。ポリクローナル抗体による検査室ベースのＰＡＧ  ＥＬＩＳＡを妊娠診断のために使用した。Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎの施設は厳密な同時交配（ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ）を使用したのに対し、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａの施設は同時交配プラス発情交配（ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｔｏ  ｈｅａｔ）を使用した。各施設当たり約１０００頭のウシを試験において使用した。血液試料を２８日目に採集し、妊娠検査のために検査室に輸送した。交配の決定を可能にするため結果を２４時間以内に農場に送達した。妊娠の状態を、２８日目の採血の時点で超音波検査によっても測定した。
【図７】Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎの施設の試験における交配パラメータの分析結果。この施設は、２８日目の妊娠検査（早期再同期化群）または４５日目の触診（対照群、後期再同期化）を伴う厳密な同時交配プログラムを使用した。結果は、後期再同期化群（対照群）と比較して、早期同期化群（２８日目の妊娠検査）における受精の間の日数および空胎日数の有意の低減を示す。
【図８】Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａの施設の試験における交配パラメータの分析結果。この施設は、２８日目の妊娠検査を伴う（早期再同期化群）および伴わない（後期再同期化群）同時交配プラス発情交配を使用した。結果は、後期再同期化群と比較して、受精の間の日数、受精の回数および空胎日数の有意の低減を示す。
【図９】呈色試験ベース。２Ｄ９モノクローナル抗体を捕捉抗体とし、ビオチン標識ウサギポリクローナル抗体を二次抗体として実施したＰＡＧ免疫検定法の結果。妊娠２８日目および５５日目に収集した血漿試験パネル（空胎２０頭および妊娠２０頭）の試料は、妊娠ウシ（桃色）と比較して空胎ウシ（青色）の完全な分離を示した。空胎ウシについて得られたゼロに近いＰＡＧ値は、試験血漿中の免疫反応性ＰＡＧの定性的検出のためにＰＡＧ標準品が必要でない可能性があることを示唆した。
【図１０】呈色試験において全血試料に関して実施したウシ妊娠診断の結果。結果は目視によって読み取っている。青色反応溶液を示す試験管（試験管１、３、６、９、１０、１４および１５）は妊娠状態についての陽性結果であり、透明なバックグラウンドを示す試験管（試験管２、４、５、７、８、１１、１２、１３および１６）は妊娠状態に関して陰性（非妊娠）である。分光光度計での読取りのために、等容量（０．４ｍｌ）の反応停止溶液（１Ｎ  ＨＣｌ）を各々の試験管に添加し得る。反応停止溶液の添加により色が黄色になる。次に、各々の試料の光学密度（ＯＤ）を６３０ｎｍで分光光度計において測定することができる。
【図１１】２Ｄ９被覆プラスチックチューブで実施した呈色試験の結果。図１１Ａ−２８日目の血漿パネル。図１１Ｂ−５５日目の血漿パネル。２８日目および５５日目の試験パネルにおけるすべての空胎ウシ試料は０．２ＯＤ以下の色強度を生じ、一方妊娠血漿試料は１．０ＯＤ単位という高い色強度を生じた。このアッセイにおいて、２８日目の血漿試料は、０．２ＯＤの色強度をカットオフ値として設定した場合、１００％の感受性と１００％の特異性を示した。同じ色強度カットオフ値で、５５日目の血漿試料はプラスチックチューブアッセイにおいて９５％の感受性と１００％の特異性を示した。
【図１２】ポリクローナル抗体（Ｐｏｌｙ：Ｐｏｌｙ、上のパネル）および２Ｄ９モノクローナル抗体とポリクローナル抗体（Ｍｏｎｏ：Ｐｏｌｙ、下のパネル）を用いて実施したＰＡＧサンドイッチＥＬＩＳＡによる新鮮血漿試料の妊娠検査の比較。０．２ＯＤのカットオフ色強度を使用することによって容易に識別される空胎ウシ試料の明瞭な分離に注目されたい。すべての妊娠ウシ試料は＞０．２ＯＤ単位の色強度を有していた。Ｍｏｎｏ：Ｐｏｌｙアッセイは、この実験において１００％の感受性と１００％の特異性を有していた。
【図１３】血液試料に関する呈色試験の圃場検定。交配後３３〜３４日目に収集した５４の血液試料を試験し、３名の人員が目視によって色を読み取った。３名の個人間で結果の目視スコアリングに不一致は認められなかった。
【図１４】５４の試料の超音波検査結果と比較した呈色試験の圃場検定結果。試験はすべての妊娠ウシを同定し（１００％の感受性）、超音波検査結果と比較して１例の偽陽性結果を生じた。呈色試験において不確定結果となり、後程「空胎」ウシであることが認められた２つの試料があった。しかしながら、呈色試験は、超音波検査と比較して４０頭の空胎ウシのうち３７頭を同定した（９２．５％の特異性）。
【図１５】ＢｉｏＥｄｉｔ（バージョン７．０．５．３；ｗｗｗ．ｍｂｉｏ．ｎｃｓｕ．ｅｄｕ／ＢｉｏＥｄｉｔ／ＢｉｏＥｄｉｔ．ｈｔｍｌ；Ｈａｌｌ，１９９９）内のＰＲＯＴＤＩＳＴ（バージョン３．５ｃ）の近隣系統樹（Ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｒｅｅ）解析パッケージによって作成したＰＡＧアイソフォームタンパク質配列クラスター。
【図１６】ＰＡＧアイソフォーム１、４、６、９、１６、１７、１９、２０および２１の直接アラインメント。ＰＡＧアイソフォームおよび変異体についてのタンパク質配列を、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ２９４３２、Ｏ４６４９２、Ｏ４６４９４、Ａ５ＰＪＷ４、Ｏ４６４９７、Ａ４ＦＶ１６、Ｑ９ＴＴＶ８、Ｑ９ＴＴＶ７、Ａ７ＭＢＡ４、Ｑ９ＴＴＶ５、Ｑ９ＴＴＶ４およびＱ９ＴＴＶ３に由来する配列番号５１〜６２に示す。
【図１７】５０〜７５ｋＤの３つのＰＡＧバンド（上、中央および下のバンド）を示す、クマシーブルーで染色した精製ＰＡＧバッチ（各５μｇ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。１）タンパク質標準品（Ｂｉｏ−Ｒａｄカタログ番号１６１−０３７４）；２）５５日目の子宮小丘；３）５５日目の胎盤分葉；４）５５日目の子宮小丘と胎盤分葉の組合せ；５）２１５日目の子宮小丘；６）２１５日目の胎盤分葉；７）２１５日目の子宮小丘と胎盤分葉の組合せ；８）タンパク質標準品（Ｂｉｏ−Ｒａｄカタログ番号１６１−０３７４）。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
妊娠を検出するいくつかのアッセイが利用可能であるにもかかわらず、特に分娩後２〜３か月以内またはより早期に交配されるウシにおいて、妊娠の正確で早期の検出のための改善されたアッセイを提供する必要性が残されている。本発明のいくつかの実施形態は、ウシの妊娠の指標であるＰＡＧに結合する抗体、モノクローナル抗体２Ｄ９などのポリペプチドと、動物から得た試料中のＰＡＧとの結合を測定する呈色試験を実施することによってウシの妊娠状態を決定する方法に関する。呈色試験は受精後２６日目などの早期に実施することができる。呈色試験は、試験管またはＥＬＩＳＡプレートなどの様々な形式のいずれかで使用できる。特定実施形態では、試験は、二次抗体を用いるサンドイッチ免疫検定法の原理を利用する。青色などの色が陽性試験を指示し、透明な試験管が陰性試験を指示する。本発明の方法の実施形態は、人工受精後３０日より前に容易に実施でき、高度に感受性で特異的である。さらに、多数の試料を同時に容易且つ迅速に分析することができ、このことは本発明の方法の価値をさらに高める。
【００３３】
対象における妊娠を検出する方法において適用できる特定の新規ＰＡＧ結合ポリペプチド、および本明細書で述べるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供される。残りの部分の開示は、本発明の様々な特徴およびそれらの実施を説明する。
【００３４】
Ｉ．ポリペプチド
本明細書で述べる本発明のいくらかの実施形態は、配列番号１と９７％より大きい配列同一性または配列番号２と９２％より大きい配列同一性を有するＰＡＧ結合ドメインを含む、単離され、精製されたポリペプチドに関する。いくらかの実施形態では、ＰＡＧ結合ドメインは、配列番号１と９７．１％、９７．３％、９７．５％、９７．７％、９７．９％、９８．１％、９８．３％、９８．５％、９８．７％、９８．９％、９９．１％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．９％より大きいか、または１００％の配列同一性を有する。いくらかの実施形態では、ＰＡＧ結合ドメインは、配列番号２と９２．２％、９２．６％、９３．０％、９３．４％、９３．８％、９４．２％、９４．６％、９５．０％、９５．４％、９５．８％、９６．２％、９６．６％、９７．０％、９７．４％、９７．８％、９８．２％、９８．６％、９９．０％、９９．４％、９９．８％より大きいか、または１００％の配列同一性を有する。
【００３５】
本明細書で使用される「ポリペプチド」は、任意の長さの連続するアミノ酸セグメントを指す。本発明の方法のいくらかの実施形態では、使用されるポリペプチドは、配列番号１と９７％より大きい配列同一性または配列番号２と９２％より大きい配列同一性を有するアミノ酸配列をその配列内に含む、連続するアミノ酸である。当業者は、当業者に周知の多くの実験的方法のいずれかを使用し、本明細書で述べる開示を考慮してそのようなポリペプチドを作製する方法を理解する。
【００３６】
「パーセント配列同一性」という用語は、当該技術分野において公知のように、配列を比較することによって決定される、２以上のポリペプチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該技術分野では、「同一性」もまた、一連のそのような配列間の一致によって決定される、場合によってポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」および「類似性」は公知の方法によって容易に算定でき、そのような方法は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（１９９１）に記載されているものを含むが、これらに限定されない。同一性を決定するための好ましい方法は、試験する配列間で最大の一致が得られるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいて体系化されている。配列アラインメントおよびパーセント同一性の算定は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピュータパッケージソフトのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）を用いて実施し得る。配列の多重アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ法のアラインメント（ＨｉｇｇｉｎｓとＳｈａｒｐ（１９８９））をデフォルトパラメータ（ギャップペナルティー＝１０、ギャップ長ペナルティー＝１０）で使用して実施し得る。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用したペアワイズアラインメントについてのデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ  １、ギャップペナルティー＝３、ウインドウ＝５およびダイアゴナルズセイブド（ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ）＝５である。  
【００３７】
「ポリペプチド」の定義において固有であるのは、分子の定義された部分内で作製されてよく、且つ、依然として許容されるレベルの配列同一性または機能、例えば、ＰＡＧに結合する能力を備えた分子を生じさせ得る変化の数に制限があるという概念であることは当業者によってよく理解されている。
【００３８】
ポリペプチドが指定される配列同一性を保持する限り、任意の長さのアミノ酸配列が本明細書で述べるポリペプチドの定義の中で意図される。本明細書で述べるポリペプチドのＰＡＧ結合ドメインは、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかに付加的なアミノ酸を有し得る。例えば、ポリペプチド等価物は、ＰＡＧ結合ドメインのＣ末端またはＮ末端のいずれかに結合した４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはより多数の付加的な核酸を含み得る。
【００３９】
言うまでもなく、異なる置換を有する複数の別個のポリペプチドが本発明に従って容易に作製され、使用され得る。
【００４０】
本発明は、天然源からまたは組換え生産された物質から精製されたポリペプチドを利用し得る。当業者は、組換え生産された物質からこれらのポリペプチドを生成する方法を理解している。この物質は、天然に合成されるタンパク質の中の２０の共通アミノ酸、または１もしくは複数の修飾もしくは異常アミノ酸を使用し得る。一般に、「精製された」とは、様々な他のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを除去するための分画に供されたポリペプチド組成物であって、その活性を実質的に保持するポリペプチド組成物を指す。精製は、そのポリペプチドが主要な種である場合、実質的精製であり、または精製レベルが正確な分解配列決定を許容する場合、均一精製であり得る。
【００４１】
アミノ酸配列変異体は本発明に包含され、「ポリペプチド」の定義に含まれる。ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、置換変異体または挿入変異体であり得る。挿入変異体は、典型的にはペプチド内の非末端部位における物質の付加を含む。これは、数個の残基；免疫反応性エピトープ；または単に１個の残基の挿入を含み得る。付加された物質は、例えば、メチル化、アセチル化等によって修飾され得る。あるいは、付加的な残基がペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加され得る。
【００４２】
アミノ酸置換は、一般にアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、大きさ等に基づく。アミノ酸側鎖置換基の大きさ、形状およびタイプの分析は、アルギニン、リシンおよびヒスチジンがすべて正に荷電した残基であること；アラニン、グリシンおよびセリンがすべて類似の大きさであること；ならびにフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンのすべてが概ね類似の形状を有することを明らかにする。それゆえ、これらの考慮事項に基づき、アルギニン、リシンおよびヒスチジン；アラニン、グリシンおよびセリン；ならびにフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、本明細書では生物学的な機能的等価物と定義される。
【００４３】
変化を作製する場合、アミノ酸の疎水親水指数が考慮され得る。各々のアミノ酸には、それらの疎水性と電荷特性に基づき疎水親水指数が割り当てられており、これらは以下のとおりである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００４４】
タンパク質に相互作用性の生物学的機能を付与する場合の疎水親水アミノ酸指数の重要性は当該技術分野において一般的に理解されている（参照により本明細書に組み込まれる、ＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。特定のアミノ酸が、類似の疎水親水指数またはスコアを有する他のアミノ酸に置換されて、なおも同様の生物学的活性を保持し得ることは公知である。疎水親水指数に基づいて変化を作製する場合は、疎水親水指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、±０．５以内であるものがさらに一層好ましい。
【００４５】
アミノ酸が、類似の親水性値を有する別のアミノ酸で置換され、なおも生物学的に等価のタンパク質を与え得ることは理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【００４６】
類似の親水性値に基づいて変化を作製する場合は、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、±０．５以内であるものがさらに一層好ましい。
【００４７】
ＩＩ．ポリヌクレオチド
本発明の様々な態様は、配列番号１と９７％より大きい配列同一性または配列番号２と９２％より大きい配列同一性を有するドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本明細書で述べる他の実施形態は、配列番号１と９７％より大きい配列同一性または配列番号２と９２％より大きい配列同一性を有するドメインを含むポリペプチドをコードする、単離され、精製されたポリヌクレオチドに関する。また、配列番号５と９８％より大きい配列同一性または配列番号６と９５％より大きい配列同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドも開示される。配列番号５は、２Ｄ９の軽鎖をコードするｃＤＮＡの核酸配列を指し、配列番号６は、２Ｄ９の重鎖をコードするｃＤＮＡの核酸配列を指す。
【００４８】
いくらかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、配列番号５と９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％の配列同一性を有する。いくらかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、配列番号６と９５．２％、９５．４％、９５．６％、９５．８％、９６．０％、９６．２％、９６．４％、９６．６％、９６．８％、９７．０％、９７．２％、９７．４％、９７．６％、９７．８％、９８．０％、９８．２％、９８．４％、９８．６％、９８．８％、９９．０％、９９．２％、９９．４％、９９．６％、９９．８％より大きいか、または１００％の配列同一性を有する。
【００４９】
前記ポリヌクレオチドは、天然源から入手され得るかまたは当業者に公知の任意の方法を使用して化学合成され得る。本発明はまた、これらの配列の化学合成された変異体を包含する。
【００５０】
ある実施形態では、他のエレメントを含む構築物、例えば、Ｃ−５プロピンピリミジンを含むものを使用することが望ましいと考えられる。ウリジンおよびシチジンのＣ−５プロピン類似体を含むオリゴヌクレオチドは、高い親和性でＲＮＡに結合することが示された（Ｗａｇｎｅｒら、１９９３）。いくらかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ＰＡＧに結合し得る１または複数の付加的なアミノ酸セグメントをコードする。
【００５１】
ＩＩＩ．抗体および抗体フラグメント
本発明の特定実施形態は、抗体または抗体フラグメントを含む。「抗体」という用語は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を指すために使用され、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）等のような抗体フラグメントを包含する。様々な抗体に基づく構築物およびフラグメントを作製し、使用するための手法は当該技術分野において周知である。抗体を作製し、特徴づけるための手段も当該技術分野で周知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８参照）。
【００５２】
「ミニ抗体」または「ミニボディ」も本発明に関する使用について意図される。ミニボディは、ヒンジ領域によってｓＦｖから分離された、Ｃ末端にオリゴマー化ドメインを含むｓＦｖポリペプチド鎖である。Ｐａｃｋら（１９９２）。オリゴマー化ドメインは、付加的なジスルフィド結合によってさらに安定化され得る、自己会合するαへリックス、例えば、ロイシンジッパーを含む。オリゴマー化ドメインは、ポリペプチドの機能的結合タンパク質へのインビボでの折りたたみを促進すると考えられるプロセスである、膜を横断する一方向性フォールディング（ｖｅｃｔｏｒｉａｌ  ｆｏｌｄｉｎｇ）と適合性であるように設計される。一般に、ミニボディは当該技術分野で周知の組換え法を使用して生成される。例えば、Ｐａｃｋら（１９９２）；Ｃｕｍｂｅｒら（１９９２）参照。
【００５３】
抗体様結合ペプチドミメティックも本発明において意図される。Ｌｉｕら、２００３は、短縮抗体（ｐａｒｅｄ−ｄｏｗｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）として働き、より長い血清中半減期ならびにより簡単な合成方法という特定の利点を有するペプチドである、「抗体様結合ペプチドミメティック（ＡＢｉＰ）」を述べている。
【００５４】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、いくつかの利点、例えば、再現性および大規模生産などの利点を有することが認識されており、それらの使用は一般に好ましい。本発明は、それゆえ、ヒト、マウス、サル、ラット、ハムスター、ウサギ、およびさらにはニワトリ起源のモノクローナル抗体を提供する。作製が容易であり、試薬が容易に入手できることから、マウスモノクローナル抗体がしばしば好ましい。
【００５５】
しかしながら、ヒト定常領域および／または可変領域ドメインを担持するマウス、ラットまたは他の種からのキメラ抗体、二重特異性抗体、組換えおよび操作された抗体、ならびにそれらのフラグメントと同様に、「ヒト化」抗体も意図される。本明細書で使用される、「ヒト化」免疫グロブリンという用語は、ヒトフレームワーク領域および非ヒト（通常はマウスまたはラット）免疫グロブリンからの１または複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む免疫グロブリンを指す。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖とヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。
【００５６】
「抗体」という用語は、酵素切断、ペプチド合成または組換え技術などの、しかしこれらに限定されない任意の公知の手法によって提供される、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、可溶性または結合形態で標識できる抗体、ならびにそのフラグメント、領域または誘導体を包含する。本明細書で述べる抗体はＰＡＧに結合することができる。
【００５７】
「ポリクローナル抗体」は、本明細書では、抗原で免疫された動物の血清に由来する抗体分子の不均一な集団を指すと定義される。これらの種々の抗体は、同じ抗原上のいくつかのエピトープを認識し得る。「モノクローナル抗体」は、抗原に特異的な抗体の実質的に均一な集団を含み、前記集団は実質的に類似のエピトープ結合部位を含む。ＭＡｂは当業者に公知の方法によって入手し得る。例えば、その内容が各々参照により本明細書に組み込まれる、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５；米国特許第４，３７６，１１０号；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２）；ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ，１９８８；Ｃｏｌｌｉｇａｎら、１９９３参照。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤおよびその任意のサブクラスを含む、任意の免疫グロブリンクラスのものであり得る。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロ、インサイチューまたはインビボで培養され得る。インビボまたはインサイチューでの高い力価のｍＡｂの生産により、これは現在好ましい生産方法となっている。
【００５８】
「キメラ抗体」は、その種々の部分が異なる動物種に由来する分子、例えば、マウスｍＡｂに由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有するものであり、これらは主として、適用される際の免疫原性を低下させ、生産の収率を高めるために使用される。キメラ抗体およびその生産のための方法は当該技術分野において公知である。例示的な生産方法は、各々その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｂｉｌｌｙら、１９８４；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、１９８４；およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８５に記載されている。
【００５９】
「抗イディオタイプ抗体」（抗Ｉｄ）は、一般に抗体の抗原結合部位に関連する固有の決定基を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、ｍＡｂの供給源と同じ種および遺伝子型（例えば、マウス系統）の動物を、それに対する抗Ｉｄを作製しようとするｍＡｂで免疫することによって作製され得る。免疫された動物は、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体（抗Ｉｄ抗体）を産生することによって免疫抗体のイディオタイプ決定基を認識し、それに応答する。そのような抗体を作製する例示的な方法は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６９９，８８０号に認められる。
【００６０】
本発明の抗体は、少なくとも１本の重鎖、少なくとも１本の軽鎖、重鎖定常領域、重鎖可変領域、軽鎖可変領域および／または軽鎖定常領域を含んでよく、ポリクローナルＡｂ、モノクローナルＡｂ、そのフラグメントおよび／または領域は、ＰＡＧの一部に結合する少なくとも１つの重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含む。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態は、動物から試料を得ること、その試料を、ｂｏＰＡＧ４、ｂｏＰＡＧ６、ｂｏＰＡＧ９、ｂｏＰＡＧ２０および／またはｂｏＰＡＧ２１の１または複数と結合するドメインを含む抗体または抗体フラグメントと接触させること、ならびに試料中のＰＡＧと前記抗体または抗体フラグメントの接触を検出することであって、ここでＰＡＧの検出が、動物が妊娠していることを示す、動物において妊娠を検出するための方法に関する。当業者に公知の任意の方法が、ＰＡＧに結合する抗体を同定するために使用できる。ＩｇＧの可変領域を定義するための方法を取り上げた参考文献の例は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏら（１９９３）およびＬｅｉｂｉｇｅｒら（１９９９）を含む。
【００６２】
ＩＶ．検出方法およびアッセイ形式
本発明のいくつかの実施形態は、動物から得た試料を本明細書で提供される抗体と接触させること、および試料中の少なくとも１つの妊娠関連抗原を検出することであって、ここでＰＡＧの検出が、動物が妊娠していることを示す、動物において妊娠を検出する方法に関する。当業者に公知の任意の方法が、試料中のＰＡＧに結合した抗体または抗体フラグメントを検出するために使用できる。
【００６３】
本発明は、それゆえ、ＰＡＧの免疫学的検出における抗体の使用を提供する。種々の有用な免疫検出法が、例えば、Ｎａｋａｍｕｒａら（１９８７）などの学術文献に記載されている。免疫検定法は、それらの最も単純で直接的な意味において、結合アッセイである。ある種の免疫検定法は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫検定法（ＲＩＡ）である。組織切片を使用した免疫組織化学的検出法も特に有用である。しかしながら、検出はそのような手法に限定されず、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、ＦＡＣＳ分析等も本発明に関連して使用し得ることは容易に認識される。
【００６４】
一般に、免疫結合法は、タンパク質、ペプチドまたは抗体を含むことが疑われる試料を得ること、および免疫複合体の形成を可能にするために有効な条件下で、場合によって、本発明に従って抗体またはタンパク質またはペプチドと試料を接触させることを含む。好ましい試料は、本発明によれば、乳、尿、血液、血清または唾液などの体液である。
【００６５】
特定実施形態では、抗体は試験管またはウエルの内壁などの固体支持体に結合され、ＰＡＧを含むことが疑われる試料が、固定化された抗体に適用される。
【００６６】
抗体被覆された試験管系は、各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第３，６４６，３４６号および国際公開公報ＷＯ９８／１６８３２に記載されている。ＰＡＧ−抗体複合体の存在を、その後、特定条件下で検出することができる。場合により、そのような免疫複合体を定量してもよい。
【００６７】
選択した生物学的試料を、免疫複合体（一次免疫複合体）の形成を可能にするために有効な条件下で、そのために十分な時間、抗体と接触させることは、一般に、単に抗体組成物を試料に添加し、抗体が試料中に存在する何らかのＰＡＧと免疫複合体を形成する、すなわち結合するのに十分な時間、前記混合物をインキュベートすることである。この時間後、試料−抗体組成物を、一般に、何らかの非特異的に結合した抗体種を除去するために洗浄し、一次免疫複合体中の特異的に結合した抗体だけが検出されるようにする。
【００６８】
一般に、免疫複合体形成の検出は当該技術分野において周知であり、数多くのアプローチの適用を介して達成され得る。これらの方法は、一般に、放射性、蛍光、生物学的および酵素タグのいずれかのような、標識またはマーカーの検出に基づく。そのような標識の使用に関する米国特許は、各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号および同第４，３６６，２４１号を含む。タンパク質の免疫学的測定のための方法および前記方法を実施するためのキットは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７２１，１０５号に認められる。
【００６９】
特定実施形態では、前記方法は、当該技術分野で公知のように、第二の抗体および／またはビオチン／アビジンリガンド結合形態（ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）などの二次結合リガンドの使用を含む。検出において使用される二次抗体は、それ自体が検出可能な標識に連結されていてもよく、その後、単にこの標識を検出し、それによって組成物中の一次免疫複合体の量が測定され得る。免疫捕捉、ビオチン／アビジン増幅、およびホースラディッシュペルオキシダーゼ発色を使用した被検試料中の生体分子の検出のための方法は、米国特許出願公開番号２００３／５０８３８１に認められる。
【００７０】
通常、一次免疫複合体は、ＰＡＧまたはＰＡＧ特異的な最初の抗体に対して結合親和性を有する第二の結合リガンドによって検出され得る。これらの場合、第二の結合リガンドは検出可能な標識に連結され得る。第二の結合リガンドはしばしばそれ自体が抗体であり、それゆえ「二次」抗体と称され得る。二次免疫複合体の形成を可能にするために有効な条件下で、そのために十分な時間、一次免疫複合体を、標識した二次結合リガンドまたは抗体と接触させる。次に二次免疫複合体を、一般に、何らかの非特異的に結合した標識二次抗体またはリガンドを除去するために洗浄し、その後二次免疫複合体中の残りの標識を検出する。
【００７１】
さらなる方法は、２段階アプローチによる一次免疫複合体の検出を含む。ＰＡＧに対して結合親和性を有する抗体または抗ＰＡＧ抗体などの第二の結合リガンドを使用して、上述したように二次免疫複合体を形成する。第二の結合リガンドは、基質を検出可能な生成物へとプロセシングし、それゆえ、経時的にシグナルを増幅することができる酵素を含む。洗浄後、二次免疫複合体を基質と接触させ、検出を可能にする。
【００７２】
本発明の１つの実施形態では、酵素結合免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用し得る。例えば、Ｅｎｇｖａｌｌ，１９８０；Ｅｎｇｖａｌｌ，１９７６；Ｅｎｇｖａｌｌ，１９７７；Ｇｒｉｐｅｎｂｅｒｇら、１９７８；Ｍａｋｌｅｒら、１９８１；Ｓａｒａｎｇａｄｈａｒａｎら、１９８４参照。ＥＬＩＳＡは、実験室条件下での取り扱いを容易にするために物質がプラスチックなどの固体支持体に受動的に吸着されることを可能にする。ＥＬＩＳＡに関する包括的な説明については、当業者は、“ＥＬＩＳＡ；Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｓｅ”（Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，１９９５）が参照できる。
【００７３】
ＥＬＩＳＡ法の感受性は、使用される酵素の代謝回転および酵素反応の生成物の検出の容易さに依存する。これらのアッセイ系の感度の増強は、酵素に対する蛍光および放射性基質の使用によって達成され得る。本発明に包含される免疫検定法は、米国特許第４，３６７，１１０号（二重モノクローナル抗体サンドイッチアッセイ）および米国特許第４，４５２，９０１号（ウエスタンブロット法）に記載されているものを含むが、これらに限定されない。他のアッセイは、インビトロおよびインビボの両方での、標識リガンドの免疫沈降法および免疫細胞化学を含む。
【００７４】
１つの実施形態では、本発明は、本発明の抗ＰＡＧ抗体をポリスチレンマイクロタイタープレートのウエル、試験管または試験紙などの選択した表面に固定化する、「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡを含む。次に、ＰＡＧを含むことが疑われる試験組成物、例えば、臨床試料を前記表面と接触させる。結合させ、非特異的に結合した免疫複合体を除去するために洗浄した後、結合抗原をＰＡＧに対する第二の抗体によって検出し得る。
【００７５】
もう１つの例示的ＥＬＩＳＡでは、試料からのポリペプチドを表面に固定化し、抗ＰＡＧ抗体と接触させる。結合させ、非特異的に結合した免疫複合体を除去するために洗浄した後、結合抗体を検出する。最初の抗体が検出可能な標識に連結されている場合は、一次免疫複合体を直接検出し得る。あるいは、第二の抗体が検出可能標識に連結されている場合は、第一の抗体に対して結合親和性を有する第二の抗体を使用して免疫複合体を検出し得る。
【００７６】
ＰＡＧが固定化されているもう１つのＥＬＩＳＡは、検出における抗体競合の使用を含む。このＥＬＩＳＡでは、標識抗体をウエルに添加し、ＰＡＧに結合させて、それらの標識によって検出する。試料中のＰＡＧの量は、被覆したウエルとのインキュベーションの前またはインキュベーションの間に試料を標識抗体と混合することによって測定される。試料中のＰＡＧの存在は、ウエルへの結合のために利用可能な抗体の量を低減し、それゆえ最終的なシグナルを低減するように働く。
【００７７】
使用される形式にかかわりなく、ＥＬＩＳＡは、被覆、インキュベーションまたは結合、非特異的結合種を除去するための洗浄、および結合免疫複合体の検出などの、共通するいくつかの特徴を有する。プレートを抗原または抗体のいずれかで被覆する場合、一般にプレートのウエルを抗原または抗体の溶液と共に一晩または指定された時間インキュベートする。次にプレートのウエルを洗浄して、不完全に吸着された物質を除去する。その後、ウエルの残りの利用可能な表面を、試験抗血清に対して抗原的に中性である非特異的タンパク質で「被覆」する。これらは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、粉乳の溶液または他の抗原的に中性のタンパク質を含み得る。被覆は、固定化表面上の非特異的吸着部位をブロックすることを可能にし、それゆえ、表面への抗血清の非特異的結合によって引き起こされるバックグラウンドを低減する。
【００７８】
「免疫複合体（抗原／抗体）の形成を可能にするために有効な条件下で」は、条件が、好ましくは、抗原および抗体をＢＳＡ、ウシγグロブリン（ＢＧＧ）、無糖練乳または粉乳、およびリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）／ＴＷＥＥＮなどの溶液で希釈することを含むことを意味する。これらの添加物質はまた、非特異的バックグラウンドの低減を助ける傾向がある。
【００７９】
「適切な」条件も、インキュベーションが有効な結合を可能にするために十分な温度および期間であることを意味する。インキュベーション工程は、典型的には約１時間〜２時間〜４時間で、好ましくは約２５℃〜２７℃の温度であり、または約４℃前後で一晩であってもよい。
【００８０】
検出手段を提供するため、第二または第三の抗体は、検出を可能にする関連標識を有する。しばしば、これは、適切な発色基質と共にインキュベートしたとき色の発現を生じさせる酵素である。それゆえ、例えば、第一または第二の免疫複合体を、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたは水素ペルオキシダーゼ結合抗体と接触させ、前記抗体と共に、さらなる免疫複合体形成の進行に好ましい期間および条件下でインキュベートすること（例えば、ＰＢＳ−ＴＷＥＥＮなどのＰＢＳ含有溶液中にて室温で２時間のインキュベーション）が望ましい。
【００８１】
標識抗体とのインキュベーション後、および非結合物質を除去するための洗浄の後に、例えば、ペルオキシダーゼが酵素標識である場合は、尿素とブロモクレゾールパープルまたは２，２’−アジド−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホン酸［ＡＢＴＳ］とＨ２Ｏ２のような発色基質とのインキュベーションによって、標識の量を定量化する。次に、例えば、可視スペクトルの分光光度計を使用して、色の生成の程度を測定することによって定量化が達成される。
【００８２】
ＥＬＩＳＡの変法は、ユニバーサルな検出系として標識酵素ＲＶＶ−ＸＡと組み合わせた凝固カスケードを使用する、酵素結合凝固アッセイまたはＥＬＣＡ（米国特許第４，６６８，６２１号）である。本発明にとってのこの系の利点は、凝固反応が多種多様な緩衝液に存在下に生理的ｐＨで実施できることである。それゆえ、複雑な分析物の完全性を保持することが可能である。
【００８３】
免疫組織化学（ＩＨＣ）も、本発明に従ってＰＡＧの同定において使用し得る。これは、新鮮凍結組織ブロックと、ＩＨＣによる試験から調製した、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した組織ブロックの両方の試験を含む。例えば、各々の組織ブロックは、残留「粉砕（ｐｕｌｖｅｒｉｚｅｄ）」胎盤組織５０ｍｇから成る。これらの微粒子標本から組織ブロックを調製する方法は、例えば、乳房における、これまでの様々な予後因子のＩＨＣ試験において成功裏に使用されており、当業者に周知である（Ｂｒｏｗｎら、１９９０；Ａｂｂｏｎｄａｎｚｏら、１９９０；Ａｌｌｒｅｄら、１９９０）。
【００８４】
簡単に述べると、凍結切片は、凍結した「粉砕」胎盤組織５０ｍｇを、小さなプラスチックカプセル内でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）にて室温で再水和し、遠心分離によって粒子をペレット化して、それらを粘性包埋剤（ＯＣＴ）に再懸濁し、カプセルを反転させて、遠心分離によって再びペレット化し、−７０℃のイソペンタン中で瞬間凍結して、プラスチックカプセルを切断し、凍結組織柱（ｆｒｏｚｅｎ  ｃｙｌｉｎｄｅｒ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ）を取り出して、組織柱を低温ミクロトームのチャック（ｃｒｙｏｓｔａｔ  ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ  ｃｈｕｃｋ）上に固定し、平均約５００の著明に無傷の胎盤細胞を含む２５〜５０の連続切片を切り出すことによって調製し得る。
【００８５】
永久切片は、試料５０ｍｇをプラスチック微量遠心管において再水和し、ペレット化して、１０％ホルマリンに再懸濁して４時間固定し、洗浄／ペレット化して、温かい２．５％寒天に再懸濁し、ペレット化して、氷水中で冷却して寒天を固化し、組織／寒天ブロックを微量遠心管から取り出して、そのブロックをパラフィン中に浸潤させて包埋し、５０までの連続永久切片を切り出すことを含む、同様の方法によって調製し得る。
【００８６】
Ｖ．タンパク質の精製
いくつかの実施形態は、単離もしくは精製されたポリペプチド、または単離もしくは精製されたポリペプチドを使用する方法に関する。タンパク質精製技術は当業者に周知である。これらの技術は、あるレベルでは、細胞環境をポリペプチド画分と非ポリペプチド画分に粗分画することを含む。ポリペプチドが他のタンパク質から分離されれば、対象とするポリペプチドをクロマトグラフィーまたは電気泳動技術を使用してさらに精製し、部分的または完全な精製（または均一精製）を達成し得る。純粋なペプチドの調製に特に適する分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に効率的な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー、さらにはＨＰＬＣである。
【００８７】
本発明のいくつかの態様は精製に関し、特定実施形態では、コードされるタンパク質またはポリペプチドの実質的な精製に関する。本明細書で使用される「精製されたポリペプチド、タンパク質またはペプチド」という用語は、他の成分から単離可能な組成物を指すことが意図されており、その場合、タンパク質またはペプチドは、その天然に得られる状態と比較して任意の程度に精製されている。精製タンパク質またはペプチドはまた、それゆえ、それが天然に存在し得る環境から解き放たれたタンパク質またはペプチドを指す。
【００８８】
一般に、「精製された」は、様々な他の成分を取り除くための分画に供されたタンパク質またはペプチド組成物であって、その発現される生物活性を実質的に保持する組成物を指す。「実質的に精製された」という用語が使用される場合、この呼称は、そのタンパク質またはペプチドが組成物の主要成分を形成する、例えば、組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％またはより多くを構成する組成物を指す。
【００８９】
タンパク質精製における使用に適する様々な技術は当業者に周知である。これらは、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体等による沈殿、または夾雑タンパク質の熱もしくは酸性ｐＨによる変性とそれに続く遠心分離；イオン交換、ゲルろ過、逆相、ヒドロキシルアパタイトおよびアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー工程；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；ならびにそのような技術や他の技術の組合せを含む。一般に当該技術分野で公知のように、様々な精製工程を実施する順序は変更し得る、または特定の工程を省略して、なおも実質的に精製されたタンパク質またはペプチドを調製するための適切な方法を生じさせ得ると考えられる。
【００９０】
ポリペプチドが常にその最も精製された状態で提供されるという一般的な必要条件はない。実際に、それほど実質的に精製されていない生成物がいくつかの実施形態で有用性を有することが考慮される。部分的精製は、より少ない精製工程を組み合わせて使用することによって、または同じ一般的精製スキームの異なる形態を利用することによって達成され得る。例えば、ＨＰＬＣ装置を利用して実施される陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般に低圧クロマトグラフィーシステムを利用する同じ手法よりも「倍数」レベルの高い精製を生じさせる。より低い度合の相対的精製を示す方法は、タンパク質生成物の全体回収において、または発現されるタンパク質の活性を維持するうえで利点を有し得る。
【００９１】
ＶＩ．キット
さらなる実施形態では、本発明は、ＰＡＧの検出のための上述した免疫検出に関する使用のためのキット、例えば、ウシにおける妊娠を診断するための免疫検出キットを提供する。特定実施形態では、配列番号１と９７％より大きい配列同一性または配列番号２と９２％より大きい配列同一性を有するドメインを含む抗体がキットに含まれる。キットは１または複数の容器を含み得る。容器は、例えば、バイアル、チューブ、フラスコ、バイアルまたは注射器であり得る。
【００９２】
特定実施形態では、抗体はモノクローナル抗体２Ｄ９である。特定実施形態では、キットは、あらかじめ結合された抗体を有する１または複数のチューブまたはマイクロタイタープレートのウエルを含む。あるいは、キットは、カラムマトリックスにあらかじめ結合された抗体を含み得る。キットは、単一試料のアッセイまたは２以上の試料のアッセイを可能にし得る。いくらかの実施形態では、キットは、多数の試料の同時または連続的免疫検出を可能にする、抗体で被覆された複数のマイクロタイタープレートまたはチューブを含む。
【００９３】
キットの免疫検出試薬は、所与の抗体に関連するおよび／または連結された検出可能な標識を含む、様々な形態のいずれか１つをとり得る。二次結合リガンドに関連するおよび／または連結された検出可能な標識も意図される。例示的な二次リガンドは、第一抗体に対して結合親和性を有する二次抗体である。
【００９４】
いくらかの実施形態では、キットは、第一抗体に対して結合親和性を有する二次抗体を含む。第二の抗体は、検出可能標識に連結されていてもよくまたは連結されていなくてもよい。いくらかのさらなる実施形態では、キットは、第二の抗体に対して結合親和性を有する第三の抗体を含み、前記第三の抗体は検出可能標識に連結されている。上記のように、多くの例示的な標識が当該技術分野において公知であり、および／またはすべてのそのような標識が本発明に関連して使用され得る。
【００９５】
キットは、場合により、陽性対照を提供するためにＰＡＧの適切に等分された組成物を含む。キットの成分は、水性媒質中でおよび／または凍結乾燥形態で包装され得る。
【００９６】
ＶＩＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を明らかにするために含まれるものである。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実施において良好に機能するように本発明者によって発見された手法であり、それゆえ、その実施のための好ましい様式を構成するとみなし得ることが当業者に認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本発明の開示に照らして、開示される特定実施形態において多くの変更を加えることができ、なおも本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果を得ることができることを認識するべきである。
【実施例１】
【００９７】
２Ｄ９結合ＰＡＧの同定
２Ｄ９に結合するタンパク質を同定するため、２Ｄ９抗体を特徴づけ、配列決定するため、および２Ｄ９へのＰＡＧの結合部位をマッピングするための試験を実施した。これを達成するため、２つのアプローチ（以下で述べる）を採用した。
【００９８】
材料および方法
２Ｄ９被覆磁気ビーズによるＰＡＧの免疫沈降反応。
精製２Ｄ９を、製造者の指示（Ｄｙｎａｌ）に従って、トシル活性化Ｄｙｎａｌ磁気ビーズに結合した。抗体被覆した磁気ビーズをＰＡＧ富化製剤（５５日目の胎盤から得た）１００μｇと共に１×ＰＢＳ中で３０分間インキュベートし、同じ緩衝液で十分に洗浄した。ｐＨ３．０の酢酸を使用して結合タンパク質を溶出し、ゲル電気泳動とウエスタンブロット分析に供した。ウエスタンブロットをウサギ抗ＰＡＧポリクローナル抗体で展開した。免疫反応性タンパク質バンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥから切り出し、トリプシン消化後ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ分析に供した（図３）。
【００９９】
妊娠５５日目のウシの子宮小丘（子宮内膜）および胎盤分葉（胎盤）組織から調製した組織抽出物のイムノアフィニティークロマトグラフィー。簡単に述べると、精製２Ｄ９（１０ｍｇ）を、製造者の指示（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）に従って、ＣＮＢｒ活性化セファロース１ｇに結合した。２Ｄ９親和性樹脂（約５．０ｍｌ）を、ｐＨ７．０で組織抽出物２５ｍｌと共に結合のために一晩インキュベートした。翌日、樹脂をカラムに充填し、１×ＰＢＳで洗浄して非結合物質を除去し、ｐＨ３．０の酢酸で溶出した。溶出した物質のｐＨを、溶出の直後に１Ｍ  ＴｒｉｓでｐＨ７．０に中和した。溶出した物質をゲル電気泳動とウエスタンブロット分析に供した。ウエスタンブロットをウサギ抗ＰＡＧポリクローナル抗体で展開した。タンパク質バンド１〜７をＳＤＳ−ＰＡＧＥから切り出し、トリプシン消化後ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ分析に供した（図４）。ＢＬＡＳＴ解析を使用してペプチド配列の同一性を決定した。
【０１００】
２Ｄ９に対するＰＡＧの結合親和性を、２Ｄ９結合抗原をＰＡＧ標準品（イムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製した）として作成したＥＬＩＳＡデータのｌｏｇ−ｌｏｇ変換（図５）によって決定した。アッセイは、０．０５ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ（０．０８３ｎＭ〜８．３ｎＭ）の範囲の一連のＰＡＧ標準品を用いて実施した。ＥＬＩＳＡアッセイを８回反復した。データをＳｏｆｔＭａｘ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で解析した。
【０１０１】
結果
２Ｄ９結合磁気ビーズによるＰＡＧの免疫沈降反応。
磁気ビーズ溶出物質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析は、６７ｋＤの単一タンパク質バンドを示した。ペプチドフィンガープリンティングおよびＬＣ−ＭＳ−ＭＳ分析はこのタンパク質バンドをｂｏＰＡＧ６と同定した（図３）。しかしながら、この分析は免疫沈降実験のためにＰＡＧ富化製剤１００μｇを使用したので、２Ｄ９に結合するすべてのＰＡＧを明らかにしたわけではなかった。この物質をｐＨ５．０で胎盤組織抽出物のペプスタチンアフィニティークロマトグラフィーによって単離し、続いてｐＨ９．５で溶出した。この製剤を、早期ＰＡＧ抗原の富化製剤、「酸性ＰＡＧ」とも称した。２Ｄ９に結合するすべてのＰＡＧを同定するため、組織抽出物に関するイムノアフィニティークロマトグラフィーを実施した（以下参照）。
【０１０２】
２Ｄ９イムノアフィニティークロマトグラフィーで組織抽出物から精製したＰＡＧの分析。
イムノアフィニティーカラムで溶出した物質のクマシーブルー染色は、分子量６７ｋＤ、５５ｋＤおよび５０ｋＤの３つのタンパク質バンドを示した。３つのタンパク質バンドすべてが、ウサギ抗ＰＡＧ抗体によるウエスタンブロット分析においても免疫反応性であることが認められた。これらの結果に基づき、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にすべてのタンパク質バンドを切り出し（図４）、ペプチドフィンガープリンティングおよびＬＣ−ＭＳ−ＭＳに供した。生じたペプチド配列の同一性をＢＬＡＳＴ解析によって決定した。表１は、ＢＬＡＳＴ解析によるペプチド配列結果およびｂｏＰＡＧ−４、ｂｏＰＡＧ−６、ｂｏＰＡＧ−９、ｂｏＰＡＧ−２０およびｂｏＰＡＧ２１配列に対応するＰＡＧとしてのそれらの同定の要約を示す。表１中のパラメータの意味については、図３の説明参照。
【０１０３】
【表１−１】
0005679818.tif 000002
【０１０４】
【表１−２】
0005679818.tif 000003
【０１０５】
【表１−３】
0005679818.tif 000004
【０１０６】
【表１−４】
0005679818.tif 000005
【０１０７】
【表１−５】
0005679818.tif 000006
【０１０８】
この解析は、３つのタンパク質バンドの各々が２以上のＰＡＧを有することを示した（表１）。６７ｋＤのバンドは、ｂｏＰＡＧ６およびｂｏＰＡＧ２０に対応するペプチドを含んでいた。５５ｋＤのタンパク質バンドは、ｂｏＰＡＧ６およびｂｏＰＡＧ９に属するペプチドを含んでいた。５０ｋＤのタンパク質バンドはｂｏＰＡＧ４とｂｏＰＡＧ２１に対応し、ｂｏＰＡＧ９を少量成分として含んでいた。これらの結果は、２Ｄ９モノクローナル抗体がｂｏＰＡＧ４、ｂｏＰＡＧ６、ｂｏＰＡＧ９、ｂｏＰＡＧ２０およびｂｏＰＡＧ２１に結合することを示す。このモノクローナル抗体は、５つのＰＡＧすべてに共通するエピトープに結合する。配列比較は、これらのＰＡＧの間で高い度合の配列同一性を示した。
【０１０９】
２Ｄ９結合ＰＡＧを標準品として使用することによって得たＰＡＧ  ＥＬＩＳＡの結果（図５）を、ＳｏｆｔＭａｘ（商標）を用いてＫｄ値を算定するために使用した。２Ｄ９のＫｄ値は０．９ｎＭと決定された（図５）。それゆえ、２Ｄ９はＰＡＧに対して高親和性のモノクローナル抗体である。これらの結果は、ＰＡＧモノクローナル抗体、２Ｄ９が、５５日目の胎盤組織抽出物からのｂｏＰＡＧ４、ｂｏＰＡＧ６、ｂｏＰＡＧ９、ｂｏＰＡＧ２０およびｂｏＰＡＧ２１に結合することを示す。ＬＣ−ＭＳ−ＭＳによって得たペプチド配列の同一性は、これらの５つのＰＡＧ（ｂｏＰＡＧ４、ｂｏＰＡＧ６、ｂｏＰＡＧ９、ｂｏＰＡＧ２０およびｂｏＰＡＧ２１）のこれまでに特徴づけられた配列と一致した。
【実施例２】
【０１１０】
タンパク質およびｍＲＮＡの配列決定
精製２Ｄ９のタンパク質配列決定。
２Ｄ９のＰＡＧ抗原結合配列を同定するため、２Ｄ９の配列決定を実施した。２Ｄ９の配列決定は、タンパク質およびＤＮＡ配列決定法によって実施した。最初に、２Ｄ９抗体の重鎖と軽鎖を変性ゲル電気泳動によって分離した。ゲルのバンドを切り出し、別々にトリプシンおよびキモトリプシン酵素消化に供した。生じたペプチドを分離し、ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析−質量分析）法によって配列決定した。質量分析および配列分析において＞９０％の信頼度スコアを有するペプチドを選択した。得られたペプチド配列を使用して、軽鎖配列の約８０％および重鎖配列の約５０％を構築した。
【０１１１】
２Ｄ９重鎖および軽鎖ｍＲＮＡの配列決定。
２番目のアプローチでは、２Ｄ９重鎖および軽鎖に対応するｍＲＮＡを、２Ｄ９  ＰＡＧハイブリドーマ細胞から調製した全ＲＮＡによる逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）技術を使用して配列決定した。
【０１１２】
簡単に述べると、ＰＡＧモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を無血清組織培養培地で増殖させ、１×１０６細胞を生産した。細胞を遠心分離し、生じた細胞ペレットを液体窒素中で瞬間凍結した。細胞ペレットを使用時まで−８０℃で保存した。第一の鎖の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸから購入したＣｅｌｌ−ｔｏ−ｃＤＮＡキットＩＩを使用して作製した。ハイブリドーマ細胞のＲＮＡを逆転写して、別途のＲＮＡ抽出工程なしでｃＤＮＡを作製した。生じたｃＤＮＡ鋳型を、マウス重鎖および軽鎖のすべてのサブクラスを増幅するために設計されたプライマーのセットによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによって軽鎖および重鎖を増幅するために使用した（Ｃｈａｒｄｅｓら、１９９９）。生じたＰＣＲ産物を配列決定した。配列データをＤＮＡ  ＳＴＡＲ（商標）ソフトウエアパッケージで収集した。配列の正確さを確実にするために試験全体を反復した。ＰＣＲ増幅および配列決定の２回目の反復には、対象範囲を増大させるために付加的なプライマーを含めた。
【０１１３】
配列分析は、２Ｄ９重鎖がマウスＩｇＧ１γサブクラスに由来し、軽鎖がκ型に由来することを示した。重鎖は４４８アミノ酸残基から成り、軽鎖は２１９アミノ酸残基から成った。２Ｄ９軽鎖のアミノ酸配列を配列番号３に示す。２Ｄ９重鎖のアミノ酸配列を配列番号４に示す。２Ｄ９軽鎖の核酸配列を配列番号５に示す（図１）。２Ｄ９重鎖の核酸配列を配列番号６に示す（図２）。
【実施例３】
【０１１４】
ウシにおける免疫検定法に基づく妊娠検査の実行可能性試験
乳牛の繁殖管理における２８日目の早期妊娠検査の経済性を評価するため、大規模試験を実施した。試験動物は２つの異なる施設に所在し、１つはＣａｌｉｆｏｒｎｉａ、１つはＷｉｓｃｏｎｓｉｎであった。各施設につき１，０５０頭の動物が割り当てられた。初期交配に続いて、以下で述べる免疫検定法に基づく妊娠検査、または標準的な触診を実施した。試料を翌日検査室に輸送した。試験は、ウサギ抗ＰＡＧポリクローナル抗体による最適化したサンドイッチＥＬＩＳＡを使用した。ＰＡＧ  ＥＬＩＳＡは、試行試験に基づき１．７ｎｇ／ｍｌのカットオフ値を使用した。血液試料を２８日目に採集し、妊娠検査のために検査室に輸送した。妊娠診断をＰＡＧ  ＥＬＩＳＡによって実施し、結果の報告を作成して、２４時間以内に農場の職員に送達した。早期再同期化群についてはＰＡＧ試験からの妊娠診断結果に基づいて交配の決定が行われた。後期再同期化群（対照）についての交配の決定は、３５〜４５日目の触診に基づいて為された。２つの施設からの結果を図６〜８に示す。
【０１１５】
図６は、超音波検査に基づく妊娠診断と比較した、ＰＡＧ  ＥＬＩＳＡによる検査室ベースの妊娠診断の精度を示す。図６は、２つの試験施設、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎとＣａｌｉｆｏｒｎｉａにおける２８日目の超音波検査での妊娠診断と比較した、検査室ベースのＥＬＩＳＡを使用することによる２８日目の妊娠診断の精度を示す。乳牛の繁殖管理における２８日目の妊娠検査の経済性をこのβ試験において検討した。ポリクローナル抗体による検査室ベースのＰＡＧ  ＥＬＩＳＡを妊娠診断のために使用した。Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎの施設は厳密な同時交配を使用したのに対し、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａの施設は同時交配プラス発情交配を使用した。各施設当たり約１０００頭のウシを試験において使用した。血液試料を２８日目に採集し、妊娠検査のために検査室に輸送した。交配の決定を可能にするため結果を２４時間以内に農場に送達した。妊娠の状態を２８日目の採血の時点で超音波検査によっても測定した。
【０１１６】
図７および図８は、２つの異なる交配スキームで乳牛の繁殖管理における早期妊娠検出の経済性を測定するために使用した交配パラメータの結果を示す。結果は、対照群と比較して早期再同期化群では空胎日数の１０〜１５日間の有意の低減が存在することを明らかに示す。加えて、受精の間の日数の低減も両施設で認められた。
【０１１７】
これらの結果は、受精の２７〜３０日後のＰＡＧ  ＥＬＩＳＡによる早期妊娠検査が触診と比較してより早期の交配を可能にしたことを示す。早期妊娠検査は、ウシの再交配における「空胎日数」を有意に低減した。加えて、早期妊娠検査は受精の間の日数を有意に低減した。早期妊娠検査を伴う発情交配戦略は、受胎当たりの受精の回数を低減することが示された。
【実施例４】
【０１１８】
農場での検査の概念：ウシ妊娠検査（試験紙）
試験紙による「農場での（ｏｎ−ｆａｒｍ）」妊娠検査を開発するうえでの２Ｄ９の使用の実行可能性を評価するため、さらなる試験を実施した。試験紙は、家庭用妊娠検査で使用されるのと同じ技術である、側方流動技術を使用した。側方流動試験紙は、試料を適用する末端にコロイド状金結合抗体を有し、試験紙の中央部にはテストラインとして位置づけられた捕捉抗体を有する。試験抗原（ＰＡＧ）が試料中に存在する場合には、金結合抗体が抗原に結合し、生じた複合体がテストラインの方へ移動する。テストラインにおいて、捕捉抗体（同じくＰＡＧに対して惹起された）はこの複合体に結合し、ラインに集中する。十分な複合体が抗体サンドイッチとしてテストラインに保持されたとき、試験抗原に結合したコロイド状金標識抗体のために目に見える紫色のラインが出現する。抗体（捕捉抗体としての２Ｄ９を含む）の４０以上の組合せを有する側方流動試験紙を作成し、試験した。試験したいずれの側方流動試験紙の組合せも、許容される感受性と特異性を生じなかった。結果として、他の迅速な診断検査形式を「農場での」検査を開発するために評価した。評価した形式の中で、内部フィンを有するプラスチックチューブが有望な結果を示した。このことから、チューブ形式を呈色試験としてのさらなる最適化のために選択した。
【実施例５】
【０１１９】
農場での検査の概念：ウシ妊娠検査（マルチウエルプレート）
さらなる試験において、確認された２８日目の妊娠ウシから採集した血漿試料を使用して、呈色試験の感受性と特異性を測定した。試料溶液を２Ｄ９で被覆したマルチウエルプレートに移すことによって色の強さを測定した。プレートをプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）で読み取った。血漿パネルは、２０の妊娠試料と２０の空胎（非妊娠）試料から成った。各々の試料を２回検定した。４０の試料から得た色強度の光学密度に基づき、０．２ＯＤ単位のカットオフ値をバックグラウンドの色として使用することにより、試験は１００％の感受性と１００％の特異性を示した（図９）。
【実施例６】
【０１２０】
農場での検査の概念：ウシ呈色妊娠検査（プラスチックチューブ）
材料および方法。
以下のプロトコールは、２Ｄ９被覆プラスチックチューブによる妊娠検査のための最適化手順を述べる。検査は、Ｋ３ＥＤＴＡ採血管で収集した全血試料または血漿試料に関して実施することができる。
【０１２１】
材料。
内部リブを有するチューブ（Ｎｏ．２１４−２１３１−０１０）をＥｖｅｒｇｒｅｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａより購入した。ＰＡＧモノクローナル抗体、２Ｄ９およびウサギポリクローナル抗体は、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ウサギポリクローナル抗体のビオチン標識化は、Ｒｏｃｈｅビオチン標識化キット（Ｎｏ．１−４１８−１６５，Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）を製造者の指示に従って使用して実施した。ストレプトアビジン−ＰｏｌｙＨＲＰ２０（登録商標）（Ｎｏ．ＲＤＩ−ＰＨＲＰ２０−ＳＡ）はＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡより購入した。Ｓｕｒｅ  Ｂｌｕｅ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（登録商標）（Ｎｏ．５３−００−０３）はＫＰＬ，Ｉｎｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤより調達した。ＴＷＥＥＮ２０（登録商標）（Ｎｏ．３７５１６）とＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋはＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬより入手した。既知の濃度を有するリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）中の精製２Ｄ９モノクローナル抗体；被覆緩衝液：０．１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ９．３；洗浄緩衝液：０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳ；希釈緩衝液：洗浄緩衝液中の１０％ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（商標）。
【０１２２】
ポリクローナル抗体のビオチン標識化。
精製ウサギポリクローナル抗体（１ｍｇ）を、キット製造者（Ｒｏｃｈｅ）による推奨手順に従ってビオチン標識化のために使用した。簡単に述べると、ＤＭＳＯ中の活性化ビオチン試薬７．６μｌを１．５ｍｌチューブ内のＰＢＳ溶液１．０ｍｌ中の抗体１ｍｇに添加した。チューブを、４５ｒｐｍに設定した回転振とう器上に室温で２時間置いた。この工程後、内容物を透析カセットＳｌｉｄｅ−Ａ−ｌｙｚｅｒ（商標）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｎｏ．６３３８０）に移し、緩衝液を２回交換して１×ＰＢＳに対して４℃で１６時間透析した。ビオチン標識ＩｇＧをＳｌｉｄｅ−Ａ−ｌｙｚｅｒから回収し、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡを含む１：１００希釈保存溶液として保存した。この溶液を、妊娠検査のために使用の前に希釈緩衝液で１：２０００に希釈した。
【０１２３】
チューブの抗体被覆。
精製モノクローナル抗体２Ｄ９を、チューブを被覆するために０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．３）で１．２５μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。チューブを、被覆のために炭酸ナトリウム緩衝液０．４ｍｌ中の抗体０．５μｇで４℃にて１６〜１８時間被覆した。インキュベーションのために、チューブを、堅く閉じた気密蓋と湿潤さのための湿ったペーパータオルの付いたプラスチック容器の内側に置き、４℃に保持した。インキュベーション後、抗体溶液を取り出し、チューブを洗浄緩衝液で２回洗った。次にチューブをＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ−ＴＷＥＥＮ２０  ０．４ｍｌで３７℃にて１時間ブロックした。インキュベーション後、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋを取り出し、チューブを室温で２時間乾燥室に置くことによって乾燥した。この工程後、チューブを密封し、使用時まで湿度フリーのプラスチック容器において４℃で保存した。被覆したチューブは、検査性能の最小限の損失で６か月間使用可能であった。
【０１２４】
試料の採集。
ＯｖＳｙｎｃｈ同期化プロトコールを使用してウシを発情同期化交配させた。約２００頭のウシを各々の同時交配のために使用した。合計８１５頭のウシを人工授精（ＡＩ）によって交配し、ＡＩの日を０日目とした。２６日目と２８日目に、８００頭のウシからの血液試料を抗凝固剤Ｋ３ＥＤＴＡ（ＢＤ  Ｎｏ．３６６６４３）を含むチューブに採集し、翌日配達によって氷中で検査室に輸送した。血液試料を、受領後直接呈色試験において使用した。ウシを約２９日目に超音波検査によって妊娠状態を確認し、約６０日目に直腸触診によって再確認した。７９７頭のウシの妊娠診断データが試験の終了時に利用可能であり、検査の精度の分析のために使用した。
【０１２５】
呈色試験手順：
試料の移動を容易にするために血液試料を１０回まで反転させることによって混合した。血液４００μｌ（０．４ｍｌ）を各々のチューブに移し、チューブを３７℃の水浴で１５分間インキュベートした。このインキュベーション後、血液試料を吸引し、チューブを洗浄緩衝液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳ）で満たした。洗浄緩衝液を吸引し、チューブを洗浄緩衝液でさらに２回洗浄した。３回目の洗浄後、希釈緩衝液（洗浄緩衝液中に１０％ＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋＴ２０（商標））に１：２０００希釈したビオチン標識抗ＰＡＧポリクローナル抗体０．４ｍｌを各々のチューブに添加し、水浴にて３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、チューブを吸引し、洗浄緩衝液で２回洗浄した。次に、希釈緩衝液中のストレプトアビジン−ＰｏｌｙＨＲＰ２０（１：３０，０００）０．４ｍｌを各々のチューブに添加し、水浴にて３７℃で１５分間インキュベートした。３回目のインキュベーション後、各チューブの内容物を吸引し、チューブを洗浄緩衝液で２回洗浄した。次に、ＨＲＰ基質、ＳｕｒｅＢｌｕｅＲｅｓｅｒｖｅ（商標）０．４ｍｌを添加し、室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、妊娠ウシからの試料を添加したチューブにおいて深青色が認められた（図１０）。非妊娠動物からの試料を添加したチューブは透明なままであった（図１０）。色を目視で読み取って、妊娠状態を推測することができる。しかしながら、検査室において色を定量化するため、等容量（０．４ｍｌ）の反応停止溶液（１Ｎ  ＨＣｌ）を各々のチューブに添加して、青色を黄色にした。次に各々の試料からのアリコート（０．２ｍｌ）をＥＬＩＳＡプレートに移し、光学密度を４３０ｎｍで記録した。０．２に等しいまたはそれ以上のＯＤ値を「妊娠」とみなし、それより下の値を「空胎」とみなした。０．２ＯＤの色強度カットオフ値は、妊娠診断のために使用した血漿試験パネル試料に関して事前に確立した。
【０１２６】
以下はチューブ試験手順のための工程の簡単な要約である：
１．試料４００μｌを添加する、３７℃で１５分間
２．血液については３回、血漿については２回洗浄する
３．ビオチン標識４００μｌを添加する、３７℃で１５分間
４．２回洗浄する
５．ＰｏｌｙＨＲＰ２０  ４００μｌを添加する、３７℃で１５分間
６．２回洗浄する
７．ＳｕｒｅＢｌｕｅＲｅｓｅｒｖｅ（商標）４００μｌを添加する
８．読み取る−５分間〜１５分間（青色＝妊娠；透明＝空胎（非妊娠））
【０１２７】
試験分析パラメータの定義：
感受性：妊娠ウシを妊娠と同定する血液検査の能力
特異性：空胎（非妊娠）ウシを空胎と同定する血液検査の能力
【０１２８】
呈色試験の利点：
試験の必要品は、血液採集のための紫色のキャップの血液チューブ（３．０ｍｌ、Ｋ２ＥＤＴＡを含む）、あらかじめ被覆したチューブ、試薬、噴出式のビン（ｓｑｕｉｒｔ  ｂｏｔｔｌｅ）、およびホールピペットを含む。３７℃のインキュベーター／湯沸かし装置（ｗａｔｅｒｂａｃｋ）／ブロックが必要である。プレートＥＬＩＳＡと異なり、全血を試験において直接使用できるので、この試験は血漿を分離するための遠心機を必要としない。この試験はまた、プレート振とう器のような装置、洗浄のための装置（プレートウォッシャー）または読取りのための装置（プレートリーダー）も必要としない。洗浄は噴出式のビンで実施でき、ホールピペットを各々の洗浄の間での洗浄緩衝液の除去のために使用する。色は目視で読み取ることができる。しかしながら、検査室では、呈色試験の最後に（工程８の後）反応停止溶液１Ｎ  ＨＣｌ  ０．４ｍｌをすべてのチューブに添加し、アリコート（０．２ｍｌ）をＥＬＩＳＡプレートに移して、色強度をプレートリーダーに記録する。総検定時間は、従来のプレートＥＬＩＳＡ（４時間）と比較して約２時間である。この色検定は、場合により、９６穴、４８穴または２４穴プレートなどで多重化することができる。
【０１２９】
結果。
２８日目の血漿試験パネル（２０の空胎試料と２０の妊娠試料）に関する呈色試験の結果を図１１Ａに示し、５５日目の血漿試験パネル（２０の空胎試料と２０の妊娠試料）に関する試験の結果を図１１Ｂに示す。すべての空胎試料は≦０．２ＯＤの色強度値を有し、一方妊娠試料は＞０．２ＯＤの色強度を示した。このカットオフ値を使用することにより、両方の試験パネル（図１１Ａおよび１１Ｂ）が＞９５％の感受性と特異性を示した。ひと組の新鮮血漿試料もこのシステムにおいて試験し、空胎ウシと妊娠ウシの明確な分離を提供することが示された（図１２）。
【実施例７】
【０１３０】
農場での検査の概念：ウシ呈色妊娠検査（プラスチックチューブ）
検査は、３７℃の水浴を使用し、付加的な装置なしで前述したように「農場で」実施した。この圃場試験では、５８の血液試料を検査した。呈色試験を血液試料０．４ｍｌに関して実施し（図１３）、超音波検査によって妊娠の確認を行った（図１４）。色は３名の職員が読み取り、検査結果の目視スコアリングに不一致はなかった。呈色試験は１４頭の妊娠ウシすべてを同定することができた。３名全員が、２つの試料を青色のバックグラウンドのために「不確定」と判定し、試料は「空胎」であることが認められた。この圃場試験は、超音波検査と比較して１００％の感受性と９２．５％の特異性（３７／４０）を示した。
【実施例８】
【０１３１】
サンドイッチ免疫検定法に基づく呈色妊娠検査（プラスチックチューブ）
材料および方法。
サンドイッチ免疫検定法に基づく検査を、捕捉抗体としてＰＡＧモノクローナル抗体２Ｄ９、および第二の抗体としてビオチン標識ウサギポリクローナル抗体を使用することによって開発した。ＰＡＧモノクローナル抗体を透明プラスチックチューブまたはウエルの内側に被覆し、トラップとして使用する。使用したチューブは、抗体被覆のための表面積を増大させるために内部にリブを備えたチューブであった（Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）。複合体はストレプトアビジン−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）／ＨＲＰ基質系で検出する。ストレプトアビジンＰｏｌｙ−ＨＲＰ２０はＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡより入手し、ホースラディッシュペルオキシダーゼはＫＰＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤより入手した。複合体の検出はチューブまたはウエルの色（青色または黄色）によって指示され、試料中のＰＡＧの存在を示す。妊娠ウシおよび未経産ウシの血清中のＰＡＧの検出のためのＥＬＩＳＡの一般的確立に関する情報は、Ｇｒｅｅｎら、２００５に認められる。アッセイ標準は０．５ｎｇ〜６．０ｎｇであった。検査は完了までに約４時間を要する。
【０１３２】
検査は、農場または同様の場所で簡単な検査用品を用いて実施できる。この実施例では、３７℃のインキュベーターとピペットが、試薬必要品を別にして必要とされる唯一の品である。呈色試験の概念は、ウシのための繁殖管理ツールの一部として排卵同期化（Ｏｖｓｙｎｃｈ）、再同期化（Ｒｅｓｙｎｃｈ）、および定時人工授精法（Ｔｉｍｅｄ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｉｎｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ（ＴＡＩ））と組み合わせることができる。この検査の概念はまた、診断の精度を高めるためまたは２６日より前の妊娠の検出を促進するためにプロゲステロンおよび他の妊娠抗原などの他の分析物に拡大適用できる。多重化は、例えば、９６穴または４８穴トレイを使用することによってまたは多数のチューブを使用することによって実施できる。
【０１３３】
【表２】
0005679818.tif 000007
【０１３４】
結果。２６日目と２８日目の動物から採集した７９７の血液試料の妊娠検査を、２９日目の超音波検査および６０日目の直腸触診結果と比較することによって感受性と特異性に関して評価した。血漿試料を得た。妊娠診断のための０．２ＯＤ単位のカットオフ値。表３は、２９日目の超音波に基づく妊娠診断および６０日目の直腸触診と比較した血液検査の精度を示す。
【０１３５】
【表３】
0005679818.tif 000008
【０１３６】
これらの結果は、ＰＡＧモノクローナル抗体、２Ｄ９に関して開発されたウシ妊娠検査が、低い偽陰性結果で商業的に許容される精度を提供することを示す。この抗体は、交配後２６日目の早期に高い感受性と特異性でウシの妊娠状態を検出するための迅速な検査形式を開発する際に適用できる。さらなる分析は、カットオフ値を０．３５ＯＤ単位に調整することによって検査精度を９９％の感受性と９４％の特異性に改善できることを示した。
【実施例９】
【０１３７】
ウシ妊娠検査を開発するのに適した早期ＰＡＧタンパク質の小群の単離
組織の収集。
胎児側胎盤分葉組織を、受精後５０〜６０日目の早期妊娠ウシから収集した。妊娠５０〜６０日目は、早期ＰＡＧタンパク質の小群が妊娠のこの段階またはその前後に総ＰＡＧタンパク質の高いパーセンテージを占めるので、好ましい妊娠期である。しかしながら、望ましい早期ＰＡＧタンパク質のパーセンテージは受精後５０〜６０日目またはその前後に高いが、総タンパク質および利用可能な組織の量が少ない。受精後６１〜２５０日目またはその前後には、総ＰＡＧタンパク質ならびに胎児側胎盤分葉および子宮小丘組織の量がはるかに多い。
【０１３８】
２Ｄ９に結合するタンパク質を同定するためおよび２Ｄ９へのＰＡＧの結合部位をマッピングするために実施し得る方法。
２Ｄ９に結合するタンパク質を同定するため、２Ｄ９抗体を特徴づけ、配列決定するため、および２Ｄ９へのＰＡＧの結合部位をマッピングするために採用し得る４つのアプローチがある。以下の試験を実施した：
【０１３９】
１．２Ｄ９被覆磁気ビーズによるＰＡＧ（５５日目の胎盤から得た）の免疫沈降反応。
精製２Ｄ９を、製造者の指示（Ｄｙｎａｌ）に従って、トシル活性化Ｄｙｎａｌ磁気ビーズに結合した。抗体被覆した磁気ビーズをＰＡＧ富化製剤１００μｇと共に１×ＰＢＳ中で３０分間インキュベートし、同じ緩衝液で十分に洗浄した。ｐＨ３．０の酢酸を使用して結合タンパク質を溶出し、ゲル分析とウエスタンブロット分析に供した。ウエスタンブロットをウサギ抗ＰＡＧポリクローナル抗体で展開した。免疫反応性タンパク質バンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥから切り出し、トリプシン消化後ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ分析に供した。
【０１４０】
以下の方法は、実施し得る代替的な免疫沈降法である：
【０１４１】
２．２Ｄ９被覆磁気ビーズによるＰＡＧ（６１〜２５０日目の胎盤から得た）の免疫沈降反応。
精製２Ｄ９を、製造者の指示（Ｄｙｎａｌ）に従って、トシル活性化Ｄｙｎａｌ磁気ビーズに結合し得る。抗体被覆した磁気ビーズを、ＰＡＧ富化製剤１００μｇと共に１×ＰＢＳ中で３０分間インキュベートし、同じ緩衝液で十分に洗浄し得る。ｐＨ３．０の酢酸を使用して結合タンパク質を溶出し、ゲル分析とウエスタンブロット分析に供し得る。ウエスタンブロットはウサギ抗ＰＡＧポリクローナル抗体で展開し得る。次に免疫反応性タンパク質バンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥから切り出し、トリプシン消化後ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ分析に供し得る。早期ＰＡＧタンパク質（特にＰＡＧ４、６、９、２０および２１）の小群の高度に精製された製剤を、この手順を使用して精製し得る。
【０１４２】
以下の試験を実施した：
【０１４３】
３．妊娠５５日目のウシの子宮小丘（子宮内膜）および胎盤分葉（胎盤）組織から調製した組織抽出物のイムノアフィニティークロマトグラフィー。
簡単に述べると、精製２Ｄ９（１０ｍｇ）を、製造者の指示（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）に従って、ＣＮＢｒ活性化セファロース１ｇに結合した。２Ｄ９親和性樹脂（約５．０ｍｌ）を、ｐＨ７．０で組織抽出物２５ｍｌと共に結合のために一晩インキュベートした。翌日、樹脂をカラムに充填し、１×ＰＢＳで洗浄して非結合物質を除去し、ｐＨ３．０の酢酸で溶出した。溶出した物質のｐＨを、溶出の直後に１Ｍ  ＴｒｉｓでｐＨ７．０に中和した。溶出した物質をゲル分析とウエスタンブロット分析に供した。ウエスタンブロットをウサギ抗ＰＡＧポリクローナル抗体で展開した。タンパク質バンド１〜７をＳＤＳ−ＰＡＧＥから切り出し、トリプシン消化後ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ分析に供した。ＢＬＡＳＴ解析を使用してペプチド配列の同一性を決定した。
【０１４４】
以下は、実施し得る代替的クロマトグラフィー手順である：
【０１４５】
４．妊娠６１〜２５０日目のウシの子宮小丘（子宮内膜）および胎盤分葉（胎盤）組織から調製した組織抽出物のイムノアフィニティークロマトグラフィー。
簡単に述べると、精製２Ｄ９（１０ｍｇ）を、製造者の指示（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）に従って、ＣＮＢｒ活性化セファロース１ｇに結合し得る。２Ｄ９親和性樹脂（約５．０ｍｌ）を、ｐＨ７．０で組織抽出物２５ｍｌと共に結合のために一晩インキュベートし得る。翌日、樹脂をカラムに充填し、１×ＰＢＳで洗浄して非結合物質を除去し、ｐＨ３．０の酢酸で溶出し得る。溶出した物質のｐＨを、溶出の直後に１Ｍ  ＴｒｉｓでｐＨ７．０に中和し得る。溶出した物質をゲル分析とウエスタンブロット分析に供し得る。ウエスタンブロットはウサギ抗ＰＡＧポリクローナル抗体で展開し得る。タンパク質バンド１〜７をＳＤＳ−ＰＡＧＥから切り出し、トリプシン消化後ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ分析に供し得る。ＢＬＡＳＴ解析を使用してペプチド配列の同一性を決定し得る。早期ＰＡＧタンパク質（特にＰＡＧ４、６、９、２０および２１）の小群の高度に精製された製剤を、この手順を使用して精製し得る。
【実施例１０】
【０１４６】
付加的な２Ｄ９結合ＰＡＧの同定
実施例１で要約したようにＭＡｂ  ２Ｄ９は５つのＰＡＧアイソフォーム（４、６、９、２０および２１）を認識することが認められた。これらのアイソフォームは、交配後５５日目に採集した胎盤組織から得た精製ＰＡＧ試料のＬＣ／ＭＳ／ＭＳペプチド配列決定によって同定された。ＭＡｂ  ２Ｄ９を、ＣＮＢｒ活性化樹脂にこの抗体を結合してイムノアフィニティーカラムを作製することにより、ＰＡＧの精製および同定のためにさらに利用した。精製試料中に存在するＰＡＧは２Ｄ９によって結合（認識）され得る。同様に、ＰＡＧ  ＥＬＩＳＡにおいてウシ全血または血漿試料中に存在するＰＡＧは２Ｄ９によって結合され、妊娠を指示する陽性ＥＬＩＳＡ応答を惹起し得る。免疫精製手順の間の精製ＰＡＧの溶出を、ｐＨを３．０から２．５に調整することによって変化させ、溶離液収集の間に直ちにｐＨ７．０に中和した。精製試料に関するＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製ＰＡＧの視覚化を、基本的に上述したように（例えば、実施例１）実施した。５０〜７５ｋＤａの３つの主要なバンドを示す、同様のバンドパターンが認められた。
【０１４７】
交配後５５日目のウシから採集した胎盤組織に加えて、交配後２１５日目のウシから採集した胎盤組織からもＰＡＧを精製した。ＰＡＧタンパク質ファミリーのいくつかの成員（アイソフォーム）は、他の成員よりも妊娠の早期に発現される。妊娠のより早期に発現されるＰＡＧのセットは一般に早期ＰＡＧと称され、妊娠のより後期に発現されるＰＡＧのセットは一般に後期ＰＡＧと称される。交配後５５日目からの胎盤組織は早期ＰＡＧを発現する妊娠期間を代表し、交配後２１５日目からの胎盤組織は後期ＰＡＧ発現を含む妊娠期間を代表する。５５日目と２１５日目の胎盤組織からのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製ＰＡＧの視覚化は、両者について５０〜７５ｋＤａの同じ３つのバンドを示すが、より高い分子量のバンドの割合（強度）は２１５日目の胎盤組織からの方が大きい。
【０１４８】
５５日目と２１５日目の胎盤組織からのＰＡＧ試料からのペプチドを２Ｄ９イムノアフィニティーカラムで精製し、試料中に存在するＰＡＧアイソフォームを同定するためにＬＣ／ＭＳ／ＭＳペプチド配列決定によって分析した。ペプチド配列を、表４に列挙するＵｎｉＰｒｏｔデータベース（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）から得たＰＡＧアイソフォーム配列と比較した。表５は、ペプチド配列結果およびＢＬＡＳＴ解析によるｂｏＰＡＧ−１６、ｂｏＰＡＧ−１７およびｂｏＰＡＧ−１９配列に対応するＰＡＧとしてのそれらの同定の要約を示す。表５の中で言及される「レーン」および「バンド」（下、中央）は図１７に示されている。精製ＰＡＧ試料において特徴づけられたＰＡＧアイソフォームの要約を表６に示す。
【０１４９】
【表４】
0005679818.tif 000009
【０１５０】
【表５】
0005679818.tif 000010
【０１５１】
【表６】
0005679818.tif 000011
【０１５２】
表４に示すポリペプチド配列を、例えば、ＰＨＹＬＩＰパッケージ（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ，１９８９）からの、ＰＲＯＴＤＩＳＴバージョン３．５ｃを使用して整列した。ＰＲＯＴＤＩＳＴの近隣系統樹解析パッケージを整列した配列に関して使用し、図１５に示す系統樹を作成した。ＰＡＧのアラインメントを図１６に示す。ＰＡＧアイソフォーム１、４、６、９、１６、１７、１９、２０および２１のこの解析は、それらの類似性の領域と相違の領域に基づいてアイソフォームの近縁性を視覚化するために実施した。解析によれば、ＰＡＧ１を別にして、ＰＡＧ４、６、９、１６、１７、１９、２０および２１は一つに集まる。
【０１５３】
本明細書で開示し、特許請求する組成物および方法のすべてが、本明細書の開示を考慮して過度の実験を必要とせずに作製され、実施され得る。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態の観点から説明したが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書で述べる組成物に対しておよび本明細書で述べる方法の工程または工程の順序において変形を適用し得ることは当業者に明白である。より具体的には、同じまたは類似の結果を達成しつつ、化学的および生理的に関連するいくつかの物質を本明細書で述べる物質の代わりに使用し得ることは明白である。当業者に明白であるそのような類似の置換および変更のすべてが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念内であるとみなされる。
【０１５４】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書中に記載したものを補足する例示的な手順上またはその他の詳細を提供する範囲で、参照として明確に本明細書に組み入れられる：
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米国特許第３，８１７，８３７号
米国特許第３，８５０，７５２号
米国特許第３，９３９，３５０号
米国特許第３，９９６，３４５号
米国特許第４，２７５，１４９号
米国特許第４，２７７，４３７号
米国特許第４，３６６，２４１号
米国特許第４，３６７，１１０号
米国特許第４，３７６，１１０号
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【０１５５】
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Ｚｏｌｉら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、４６：８３−９２、１９９２。
【図１】
0005679818.tif 000012
【図２】
0005679818.tif 000013
【図３Ａ】
0005679818.tif 000014
【図３Ｂ】
0005679818.tif 000015
【図４】
0005679818.tif 000016
【図５】
0005679818.tif 000017
【図６】
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【図７】
0005679818.tif 000019
【図８】
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【図９】
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【図１０】
0005679818.tif 000022
【図１１Ａ】
0005679818.tif 000023
【図１１Ｂ】
0005679818.tif 000024
【図１２】
0005679818.tif 000025
【図１３】
0005679818.tif 000026
【図１４】
0005679818.tif 000027
【図１５】
0005679818.tif 000028
【図１６】
0005679818.tif 000029
【図１６−１】
0005679818.tif 000030
【図１６−２】
0005679818.tif 000031
【図１７】
0005679818.tif 000032
【配列表】
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