(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者が両アレルのＣＥＢＰＡ変異を保有するか否かを、前記患者から得られた試料中において、表５に示される遺伝子からなる群から選択された、３、４、５、６、またはそれ以上の、少なくとも２個の遺伝子のセットの発現レベルを決定することによって決定するための方法。
【請求項２】
前記遺伝子は、表６に示される遺伝子からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子は、表１１に示される遺伝子からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子は、表１２に示される遺伝子からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子は、表１３に示される遺伝子からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記発現レベルは、表１２に示される全ての遺伝子について決定されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記発現レベルは、表１３に示される全ての遺伝子について決定されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ＣＥＢＰＡについて前記発現レベルが決定され、所定の値と比較され、
前記発現レベルは、ＣＥＢＰＡ遺伝子について、前記所定の値よりも高い発現値を有する各試料において、表１２からの少なくとも２個の他の遺伝子について試験されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項９】
ＣＥＢＰＡの前記発現レベルが決定され、所定の値と比較され、
前記発現レベルは、ＣＥＢＰＡ遺伝子について、前記所定の値よりも高い発現値を有する各試料において、表１３からの少なくとも２個の他の遺伝子について試験されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料は、組織試料、血液試料、尿試料、および痰試料からなる群から取得されることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の分子診断の分野に属する。本発明は、予後良好なＡＭＬ患者を診断するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、単一の疾患ではなく、様々な遺伝子異常、および治療に対して変化しやすい反応を伴う腫瘍の群である。前処理した核型は、ＡＭＬにおける治療法の決定に今でも不可欠である（Mrozek et al., Blood Rev. 2004; 18:115-136）。近年では、多数の新規な分子マーカがＡＭＬの予後に関連付けられている（Mrozek et al., Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2006: 169-177., Estey et al., Lancet. 2006; 368:1894-1907）。
【０００３】
ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（Ｃ／ＥＢＰα）をコードするＣＥＢＰＡの遺伝子の変異は、一般的にＡＭＬに見出される。ＣＥＢＰＡの単一アレルまたは両アレル変異を保持する患者は、ＡＭＬの比較的良好な予後を有する集団に属することが見出された（Barjesteh van Waalwijk et al., Hematol. J. 2003;4, 31-40）。
【０００４】
これらの研究は、通常、解析のための多数の塩基配列、およびリアルタイムＰＣＲを必要とする。より良好と診断されるＡＭＬ患者を識別するための代替的な検出方法が当該分野において依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
我々は、ＣＥＢＰＡ変異を保有する全てのＡＭＬ患者が、必ずしも良好な予後を有し得るとは限らないことを見出した。我々は、２重変異、すなわち、両アレル変異を保有する群のみが、特に良好な予後を有することを見出した。また、我々は、単一アレルＣＥＢＰＡ変異を両アレル変異から区別する方法を見出した。
【０００６】
この方法は、例えば、マイクロアレイにおける遺伝子セットの発現レベルの解析に依存する。遺伝子セットは、以下の実施例において詳述する。
【０００７】
従って、本発明は、本明細書に記載したような分類遺伝子からなる群から選択された少なくとも２個の遺伝子のセットの発現レベルを決定することによって、患者が両アレルのＣＥＢＰＡ変異を保有するか否かを決定する方法に関する。
発明の詳細な説明
【０００８】
ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（ＣＥＢＰＡ）の変異は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の５〜１０％に見出され、良好な臨床結果と関連している。ＣＥＢＰＡ変異を有するＡＭＬの大部分は同時に２つの変異を保持し、通常当該変異は両アレルである（ＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔ）。一方、その他のＡＭＬは、単一のヘテロ変異（ＣＥＢＰＡｓｉｎｇｌｅ−ｍｕｔ）を保持するのみである。ここで、我々は、変性高速液体クロマトグラフィーおよびヌクレオチド配列解析を使用して、新たにＡＭＬと診断された５９８症例のコホートにおいてＣＥＢＰＡ変異４１症例、すなわちＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔ２８症例およびＣＥＢＰＡｓｉｎｇｌｅ−ｍｕｔ１３症例を同定した。ゲノム全体での遺伝子発現プロファイリングと臨床結果の分析によって、ＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔＡＭＬは、単一の遺伝子発現プロファイルと良好な結果に関連付けられることが明らかとなった。これに対して、ＣＥＢＰＡｓｉｎｇｌｅ−ｍｕｔＡＭＬは、識別特性を発現せず、臨床結果に関しては野生型症例と識別することができなかった。これらの結果は、予後判定のための重要な意味を有するＣＥＢＰＡ変異陽性ＡＭＬ内の重要な基本的不均一性を示す。
【０００９】
転写因子であるＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（ＣＥＢＰＡ）の変異は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の５〜１０％で見出される１〜９。ＣＥＢＰＡ変異は、比較的良好な結果に関連付けられているので、有望な新規の予後マーカとして関心を集めている３、４、９、１０。様々な配列のバリエーションが評されているが、２つの変異のプロトタイプ分類が最も高頻度である。Ｎ末端の変異は、同一のオープンリーディングフレームにおける主要な翻訳開始コドンと第２ＡＴＧとの間に位置する。これらの変異は、ｐ４２ＣＥＢＰＡタンパク質の翻訳の早期停止、および全長タンパク質の機能を阻害し得るｐ３０アイソフォームの翻訳の増加を導く６。これに対して、Ｃ末端塩基性ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）領域における変異は、フレーム内であり、２量体化および／またはＤＮＡ結合を減少させ得る７。ＣＥＢＰＡにおいて保存されている変異は、Ｎ末端とｂＺＩＰ領域との間に見出される。
【００１０】
大半のＣＥＢＰＡ変異ＡＭＬは、２つの変異を保有する。最も高頻度には、２つの変異は、Ｎ末端型変異とｂＺＩＰ型変異との組み合わせである７、８、１１。２つのＣＥＢＰＡ変異を有するＡＭＬにおいて、通常、変異は異なるアレルに位置し、それゆえ野生型ＣＥＢＰＡタンパク質は発現されない。同様の状態が、ホモ接合体変異を保持する場合に見出される。しかし、単一のヘテロ変異のみを有するＡＭＬも存在するので、野生型アレルの発現を保持しているＡＭＬも存在する。
【００１１】
ｄｅ ｎｏｖｏ成人ＡＭＬにおけるＣＥＢＰＡ変異の様々な種類の正確な分布および臨床結果に与えるそれらの影響についてより深い洞察を得るために、我々は、５９８症例のコホート研究を行った。変性高速液体クロマトグラフィー（ｄＨＰＬＣ）とそれに続く核酸配列解析を使用して、我々は、２つの異なる変異を有する症例または１つのホモ接合体変異を有する症例（さらに、２重変異と称される、ＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔ）だけではなく、単一のヘテロ変異のみを有する症例（ＣＥＢＰＡｓｉｎｇｌｅ−ｍｕｔ）を識別した。ゲノム全体での遺伝子発現プロファイリング（ＧＥＰ）は、ＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔＡＭＬが非常に特徴的な特性を表すが、一方、ＣＥＢＰＡｓｉｎｇｌｅ−ｍｕｔ症例は表わさないことを明らかにした。さらに予期しないことに、良好な予後効果は２重変異にのみ関連した。これらの結果は、臨床的予後判定に重要な意味を有し得るＣＥＢＰＡ変異を有するＡＭＬの中で未知の不均一性の存在を明らかにした。
【００１２】
ｄｅ ｎｏｖｏ成人ＡＭＬの５９８症例のコホートにおいて、我々は、ＣＥＢＰＡコーディング配列の３つの調査されたアンプリコンの少なくとも１つで異常プロファイルを有する６５症例を識別した（図１Ａ〜Ｂ）。ＣＥＢＰＡ配列の変異の存在は、塩基配列解析によって確認した。挿入型多型１１、１４〜１６、またはアミノ酸の変更を導くことのない変異を保持するのみである症例を野生型とした。２つのさらなる標本は、ｂＺＩＰ領域の外側に未知の特性を有するインフレームの変異を保持していたので、さらなる解析において考慮されなかった。その結果、ＣＥＢＰＡｍｕｔＡＭＬの４１／５９８症例（６．９％）が考慮された。これらは、ＣＥＢＰＡｓｉｎｇｌｅ−ｍｕｔ１３症例、およびＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔ２８症例、すなわちホモまたは２つの別個の変異のどちらかを含んでいた（表２）。記載されたような３アガロースゲル電気泳動分析と核酸配列解析との組み合わせを使用した、保持されているＡＭＬ５４７症例のさらなるスクリーニングは、ｄＨＰＬＣによって見落とされた変異を明らかとはしなかった。
【００１３】
我々は、２４個の遺伝子群から選択される遺伝子の発現レベルが、ＣＥＢＰＡ２重変異の発生を高確率で予測することを見出した。表５に示される２４個の遺伝子群から選択される２個の遺伝子の全ての組み合わせは、許容できるレベルでＣＥＢＰＡ２重変異の発生を予測することが分かった。３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の遺伝子のような２個以上の遺伝子の発現レベルが決定された場合、この方法の感度および特異性は向上した。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態では、前記２個の遺伝子は、表１１に示される遺伝子群から選択される。
【００１５】
本発明の特に好ましい方法では、表１２に示される７個の遺伝子のセットから選択される少なくとも２個の遺伝子の発現が決定され、好ましくは表１２に示される遺伝子の群から選択された３、４、５、６、または７個の遺伝子の発現レベルが決定される。
【００１６】
本発明に係る他の特に好ましい方法では、表１３に示される９個の遺伝子のセットから選択された少なくとも２個の遺伝子の発現が決定され、好ましくは表１３に示される遺伝子の群から選択された３、４、５、６、７、８、または９個の遺伝子の発現レベルが決定される。
【００１７】
表１２の全ての７個の遺伝子、または表１３の全ての９個の遺伝子の発現レベルが決定された場合に最良の結果が得られた。
【００１８】
本明細書において同定された遺伝子の発現レベルは、当該技術分野において公知の様々な方法で決定し得る。特に、本明細書中で特定されたような特定のプローブセットを使用することが好ましい。典型的に有用なプローブセットは、添付の配列表に規定されている。他のプローブセットは、本明細書において特定された遺伝子の一次配列に基づいて当業者によって設計されてもよく、それらは様々な公的な供給源から得ることができる。
【００１９】
さらに好ましい方法において、プレスクリーニングが実行され、プレスクリーニングにおいては、ＣＥＢＰＡ遺伝子の発現レベルが決定され、所定の値と比較される。特定の試料においてＣＥＢＰＡ遺伝子の発現レベルが所定の値を超えているとすれば、前記方法をこれらの試料で実施してもよく、その場合、この組み合わせ解析はさらに信頼性の高い結果を提供することになる。実施例は、所定の値を確実に決定するための方法を提供する。
【００２０】
本明細書において使用される用語において、遺伝子は識別され、配列表に規定されたｃＤＮＡ配列に対して、好ましくは高ストリンジェンシー条件下において、特異的にハイブリダイズすることが可能である核酸配列を含む発現産物をコードすることを特徴とする。好ましくは、前記遺伝子は、配列表に規定された配列について、９２、９４、９６、９７、９８、９９、または１００％のような９０％以上相同である発現産物をコードする。
【００２１】
表１０は、本明細書に記載されたような遺伝子の詳細を提供する。公知のデータベースを参照することによって、当業者は特定の遺伝子の特性および配列を明確に決定することができるであろう。
【００２２】
当業者は、高ストリンジェンシー条件の定義を認識するであろうし、さらなる手引きは、Sambrookらの分子クローニング：実験室マニュアル第三版から得られる。
【００２３】
また、当業者は、本明細書において言及された遺伝子の多くのスプライスバリアントが存在してもよく、必要であれば、そのようなスプライスバリアントについての特定のプライマーおよびプローブを良好に設計することができるという事実を認識するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Ａ．ＣＥＢＰＡ遺伝子の模式図、ならびにフラグメントａ、ｂ、およびｃのｄＨＰＬＣ分析について使用されるＰＣＲプライマーの位置。機能領域、すなわちＮ末端部分における２つのトランス活性化ドメイン（ＴＡＤ１およびＴＡＤ２）、ならびにＣ末端部分における塩基性ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）領域が図示される。ヌクレオチド（ｎｔ）の位置は、主要な翻訳開始部位を基準に示されている。また、アミノ酸（ａａ）の番号、およびｎｔ３５８位置における代替的な翻訳開始部位（ａａ１２０）が図示されている。調査した３つの断片の１つ、すなわち９０試料のランダムな選択におけるアンプリコンｂのｄＨＰＬＣ分析における典型的なプロファイル。ヘテロ２本鎖（様々な色）は、ホモ２本鎖（緑）よりも早く解放されるので、別個のピークとして認識することができる。時間はｘ軸、電圧はｙ軸に図示される。Ｃ．ＣＥＢＰＡ変異（単一または２重変異状態に関わりなく）についての遺伝子発現予測の特徴は、ＣＥＢＰＡｍｕｔ３８症例を含むＡＭＬ５２４症例の設定データで導かれた。各ＣＥＢＰＡｍｕｔ３８症例の予測精度は、本明細書に詳細に記載されたように繰り返し１０分割交差検定を使用して推定された。選択された３８症例のＣＥＢＰＡ変異体標本についての正確な予測の割合を示す（上部パネル）。下部パネルのヒートマップは、ＣＥＢＰＡｍｕｔＡＭＬについて良好に識別する特徴を含む、得られた１９プローブセット遺伝子発現分類を示す（プローブセットの情報については、表６を参照）。強度値（ｌｏｇ２）は、ＡＭＬ５２４症例のコホートについて中央平均化された。可視化のために、前記遺伝子は階層的にクラスタ化（ユークリッド距離、平均連結法）された。細胞は相対的なｌｏｇ２発現値を表しており、明るい緑色（−３）から明るい赤色（＋３）の範囲で色分けされた。Ｄ．カプランメイヤー曲線は、ＣＥＢＰＡｍｕｔＡＭＬとＣＥＢＰＡｗｔＡＭＬとの間のＯＳ（全生存）の相違を示しており、ログランクテストＰ値＝０．０２７である。Ｅ．ＣＥＢＰＡｗｔＡＭＬ対ＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔＡＭＬ（Ｐ＝０．００４）と、ＣＥＢＰＡｗｔＡＭＬ対ＣＥＢＰＡｓｉｎｇｌｅ−ｍｕｔＡＭＬ（Ｐ＝０．００５）との間のＯＳの相違。Ｆ．６０歳未満の患者に対する制限分析：ＣＥＢＰＡｗｔＡＭＬ対ＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔＡＭＬ（Ｐ＝０．００９６）と、ＣＥＢＰＡｗｔＡＭＬ対ＣＥＢＰＡｓｉｎｇｌｅ−ｍｕｔＡＭＬ（Ｐ＝０．０３３）との間のＯＳの相違。Ｇ．正常な細胞遺伝子を有する患者に対する制限分析：ＣＥＢＰＡｗｔＡＭＬ対ＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔＡＭＬ（Ｐ＝０．００６９）と、ＣＥＢＰＡｗｔＡＭＬ対ＣＥＢＰＡｓｉｎｇｌｅ−ｍｕｔＡＭＬ（Ｐ＝０．０２４）との間のＯＳの相違。
【図２】１９のプローブセットのＣＥＢＰＡ変異について、所定の特徴に基づくＧＥＰデータの主成分分析。ＡＭＬ５３４症例における主成分分析は、単一または２重変異状態に関わらず、ＣＥＢＰＡ変異についての所定の特徴を構成する１９のプローブセットに基づいて実施された。それぞれの正方形は、１症例のＡＭＬ症例を表している。ＡＭＬは、ＣＥＢＰＡ状態に基づいて色分けされた：ＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔ（赤色）、ＣＥＢＰＡｓｉｎｇｌｅ−ｍｕｔ（青色）、およびＣＥＢＰＡｗｔ（黄色）。以前に記載した骨髄／Ｔリンパ球性白血病の集団に属する症例は、緑色に色分けされたＣＥＢＰＡのエピジェネティックなサイレンシングによって特徴付けられる。第１の２つの主成分（ＰＣＡ１およびＰＣＡ２）が図示されている。前記図は、第１主成分（ＰＣＡ１）について、ＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔ症例が、完全にＣＥＢＰＡｗｔ症例から分離することができるが、ＣＥＢＰＡｓｉｎｇｌｅ−ｍｕｔ症例は、野生型コホート内で分散していることを示す。ＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔに加えて、野生型コホートから明確に分離される他のいくつかのＡＭＬが存在する。これらは全てＣＥＢＰＡサイレンシングＡＭＬを表す。
【図３】無イベント生存についてのカプランメイヤー曲線。Ａ．ＣＥＢＰＡｍｕｔＡＭＬとＣＥＢＰＡｗｔＡＭＬとの間のＥＦＳにおける相違を示すカプランメイヤー曲線。ログランクテストＰ値＝０．００５０。Ｂ．ＣＥＢＰＡｗｔＡＭＬ対ＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔＡＭＬ（Ｐ＝０．００５）とＣＥＢＰＡｗｔＡＭＬ対ＣＥＢＰＡｓｉｎｇｌｅ−ｍｕｔＡＭＬ（Ｐ＝０．００４）との間のＥＦＳにおける相違点。Ｃ．６０歳未満の患者に対する制限分析：ＣＥＢＰＡｗｔＡＭＬ対ＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔＡＭＬ（Ｐ＝０．０１４）とＣＥＢＰＡｗｔＡＭＬ対ＣＥＢＰＡｓｉｎｇｌｅ−ｍｕｔＡＭＬ（Ｐ＝０．０２６）との間のＥＦＳにおける相違点。Ｄ．正常な細胞遺伝子を有する患者に対する制限分析：ＣＥＢＰＡｗｔＡＭＬ対ＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔＡＭＬ（Ｐ＝０．０８１）とＣＥＢＰＡｗｔＡＭＬ対ＣＥＢＰＡｓｉｎｇｌｅ−ｍｕｔＡＭＬ（Ｐ＝０．０９３）との間のＥＦＳにおける相違点。
【図４】本発明に係る好ましい方法のための手順であり、試料は、ＣＥＢＰＡ遺伝子の上昇した発現について試験され、上述した所定の値よりも高いことが見出された場合、遺伝子のセットは本明細書に記載された群から試験される。
【図５】図４に示す方法のための所定の値の決定。
【図６】表１２に示す７個の分類遺伝子の発現値の目的変数なしの階層的クラスタ分析。クラスタ化ＣＥＢＰＡ２重変異体対非２重変異体；試料をクラスタ化するために７個の遺伝子が使用された（コサイン−コンプリート）。
【図７】図６において得られたデータの主成分分析プロット。
【図８】表１３に示される９個の分類遺伝子の発現値の目的変数なしの階層的クラスタ分析。クラスタ化されたＣＥＢＰＡ２重変異体対非２重変異体；９個の遺伝子が試料のクラスタ化に使用された（コサイン−コンプリート）。
【図９】図８において得られたデータの主成分分析プロット。
【００２５】
【表１】
0005679990.tif 000002
【００２６】
【表２−１】
0005679990.tif 000003
【表２−２】
0005679990.tif 000004
【００２７】
【表３】
0005679990.tif 000005
【００２８】
【表４−１】
0005679990.tif 000006
【表４−２】
0005679990.tif 000007
【００２９】
【表５】
0005679990.tif 000008
【００３０】
【表６】
0005679990.tif 000009
【００３１】
【表７】
0005679990.tif 000010
【００３２】
【表８】
0005679990.tif 000011
【００３３】
【表９−１】
0005679990.tif 000012
【表９−２】
0005679990.tif 000013
【表９−３】
0005679990.tif 000014
【表９−４】
0005679990.tif 000015
【表９−５】
0005679990.tif 000016
【００３４】
【表１０−１】
0005679990.tif 000017
【表１０−２】
0005679990.tif 000018
【表１０−３】
0005679990.tif 000019
【表１０−４】
0005679990.tif 000020
【００３５】
【表１１】
0005679990.tif 000021
【００３６】
【表１２】
0005679990.tif 000022
【００３７】
【表１３】
0005679990.tif 000023
【実施例】
【００３８】
ＡＭＬ試料、ｍＲＮＡ分離、ｄＨＰＬＣ分析、および塩基配列
ｄｅ  ｎｏｖｏＡＭＬ５９８症例の骨髄穿刺または末梢血試料を集め、芽球細胞を精製し、ｍＲＮＡを以前に報告１２したように分離した。全ＣＥＢＰＡコード領域をｄＨＰＬＣおよび核酸配列決定によって調べた。患者の特性および実験手順の詳細については下記を参照のこと。
【００３９】
統計解析
生存率は、カプランメイヤー法に従って評価した。統計的有意性を評価するためにログランク検定を使用した。多変量解析はＣｏｘ比例ハザードモデルを使用して行った。結果のパラメータおよび細胞遺伝学的リスクグループの定義は記載されたとおりである１３。さらなる詳細は以下に示す。
【００４０】
遺伝子発現プロファイリング解析
遺伝子発現プロファイルは、アフィメトリクスＨＧＵ１３３Ｐｌｕｓ２．０のジーンチップを使用して得られた１２。データ処理および解析の詳細は以下に挙げる。
【００４１】
材料と方法
患者の特性と分子解析
ＣＥＢＰＡ変異をｄｅ ｎｏｖｏＡＭＬ５９８症例のコホートで評価した。５２４／５９８症例（表３）において、詳細な臨床および分子特性が利用できた。これらの５２４症例は、Dutch-Belgian Hemato-Oncology Cooperative Group (HOVON)−０４、−１０、−１２、−２９、−３２、−４２、または−４３プロトコルにおいて登録されていた（http://www.hovon.nlにおいて利用可能である）。ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＦＬＴ３−ＴＫＤ、ＮＰＭ１、Ｎ−ＲＡＳ、およびＫ−ＲＡＳについての逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）および配列解析は以前に記載したように行った１−３。
【００４２】
ＣＥＢＰＡの変異の検出
相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、スーパースクリプト逆転写酵素（Invitrogen）を使用して１μｇのｍＲＮＡから生成した。ＣＥＢＰＡコード領域は３つの部分的に重複するアンプリコンに分けられる（図１Ａ）。３つのフラグメントについて（Ａ、Ｂ、およびＣ）のプライマーは、表１４に示されている。３つのフラグメントについてのＰＣＲ増幅は、０．５ｍＭのｄＮＴＰ、１０％ＤＭＳＯ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．４ｍＭフォワードプライマーおよびリバースプライマー、１×ＰＣＲバッファ、ならびに２．５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（Invitrogen）を含む全量５０μｌの混合液中における２μｌのｃＤＮＡを使用して行った。３つの反応の熱サイクル条件、すなわち、９４℃５分間の変性、それに続いて、９４℃１分間、５６℃１分間、および７２℃１分間を３５サイクル、ならびに最後の７２℃５分間の伸長工程、は同一とした。ＰＣＲ増幅後、１０μｌのＰＣＲ産物をＮＢ４細胞株のｃＤＮＡから得られた対応するＰＣＲ産物の１０μｌと混合した。ヘテロ２本鎖は、アプライドバイオシステムズジーンアンプＰＣＲシステム９７００において形成させた（９５℃３分間、５％の傾斜で２０℃に冷却、５分間２０℃に維持、を２サイクル）。続いて、試料について、それぞれ６５．４℃、６６．４℃、および６５．５℃の温度を使用して、トランスゲノミクスＷＡＶＥデバイスにおいて変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）分析を行った。データは、トランスゲノミクスソフトウェアを使用して解析し、異常なピークは、独立して２人の研究者によって評価された。異常なピークを有する試料は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用して、アプライドバイオシステムズ３１００において直接配列解析を行った。変異が見出された場合には、ＰＣＲに誘導される人為的結果を除外するために、新しい入力材料において第２解析を行った。
【００４３】
ｄＨＰＬＣが単一のヘテロ接合体変異を明らかにしたＡＭＬ症例では、第２の変異が見過ごされている可能性を除外するために、ＣＥＢＰＡコード領域を完全に配列決定した。Ｎ末端変異の３症例（＃４３３６、＃５３６２、および＃５３６４）では、この追加の分析は、さらなるｂＺＩＰ型変異を明らかにした。これらの３症例のうちの２症例は、基本的な領域４における保存されたアミノ酸の置換をもたらすと予測された単一のヌクレオチド変化であった。
【００４４】
ｄＨＰＬＣによって明らかに陰性の場合は、以下のようにさらにスクリーニングした。ＣＥＢＰＡのＮ末端部分は、以前に記載したプライマー２および１０を使用して核酸配列解析した５。明らかな異常がある場合、基本的なロイシンジッパードメインにおける挿入または欠失は、以前に記載したエチジウムブロマイドアガロースゲル電気泳動、およびそれに続く核酸配列解析（プライマー４および８）を使用して検出した５。
【００４５】
【表１４】
0005679990.tif 000024
【００４６】
統計解析
統計解析は、Statistical Package for the Social Sciences（SPSS）ソフトウェア、バージョン１６．０を使用して行った。全ての患者は、導入療法を受け、生存解析に含めた。全生存（ＯＳ、任意の原因による死亡に対して）および無イベント生存（ＥＦＳ、１日目に完全寛解の無い症例における不全［ＣＲ１］、または再発、または死亡に対して）の数理計算上の確率は、カプランマイヤー法によって推定され、その有意性はログランク検定によって評価した。Ｃｏｘ比例ハザードモデルを多変量解析に適合させた。細胞遺伝学的リスクグループ（良好、中間、または劣悪）は以前に記載したように定義した１。簡潔には、ｉｎｖ（１６）／ｔ（１６；１６）、ｔ（８；２１）、およびｔ（１５；１７）異常を有する患者は、さらなる細胞遺伝学的異常の存在に関わりなく、良好なリスクカテゴリに属しているとみなされた。これらは細胞遺伝学的には正常であるにも関わらず、ＲＱ−ＰＣＲによって異常が識別された少数の場合を含む。劣悪なカテゴリは、良好なリスク細胞遺伝学的特性の非存在下において、−５／ｄｅｌ（５ｑ）、−７ｄｅｌ（７ｑ）、ｔ（６；９）、ｔ（９；２２）、３ｑ２６ｔ異常、または複雑核型（３つ以上の異常）が存在することによって定義した。その他の全ての患者は、中間リスクとして分類した。全てのテストは２回行い、０．０５未満のＰ値を統計的に有意とみなした。
【００４７】
ＣＥＢＰＡ変異が遺伝子発現に関連するか否かを調べるために、我々はＡＭＬ５２４症例（ＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔ２６症例およびＣＥＢＰＡｓｉｎｇｌｅ−ｍｕｔ１２症例を含む）のＧＥＰデータを検討した。ＡＭＬの臨床特性および分子特性は、表３および４に示されている。目的変数ありのアプローチである、Prediction Analysis for Microarray（PAM）１７を使用して、我々は、ＣＥＢＰＡ変異（図１Ｃ）についての特性が予測できる１９のプローブセットを得た。この区分は、高い特異性（９９％）を示したが、交差検定において限られた感度（６７％）を示した。 驚くべきことに、誤分類は、ほぼ完全にＣＥＢＰＡｓｉｎｇｌｅ−ｍｕｔ症例によるものであったが、一方、ＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔＡＭＬは、ほぼ完璧な精度で予測された（図１Ｃ）。これに伴い、我々は１００％の交差検定感度で２１のプローブセットから構成される、特定のＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔ分類を得ることができた（表５）。さらに、選択された変異体集団からのＧＥＰデータの目的変数なしの分析は、変異状態と関連する根元的な変化を確かなものとした。
【００４８】
次に我々は、我々の観察が臨床結果の違いに関連するかどうかを評価した。以前のデータに伴い、全生存（ＯＳ）および無イベント生存（ＥＦＳ）は、野生型ＣＥＢＰＡ（ＣＥＢＰＡｗｔ）と比較してＣＥＢＰＡｍｕｔ症例が優れていた（図１Ｄ、図３）。しかし、２変異集団についての個別の分析は、ＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔ症例について良好な結果を明らかにしたが、ＣＥＢＰＡｓｉｎｇｌｅ−ｍｕｔ症例について同じものを見出すことはできなかった（図１ＥおよびＧ）。実際には、ＣＥＢＰＡｓｉｎｇｌｅ−ｍｕｔＡＭＬは、ＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔ症例よりも顕著に悪い結果を示した。これらの知見は、多変量解析（表１）に保持された。６０歳未満の患者のみを考慮した場合、同様の結果が認められた（図１Ｆ、表１）。同様に、細胞遺伝学的に正常なＡＭＬの選択された集団における、ＯＳとＥＦＳとにおける顕著な相違がＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔＡＭＬとＣＥＢＰＡｓｉｎｇｌｅ−ｍｕｔＡＭＬとの間に観察された（図１Ｇ、表１）。
【００４９】
我々の症例集団における以前の解析３に基づき、また、調査に基づいて、ＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔ症例の大多数の調査された症例において両方のアレルは、影響を受けた可能性がある。したがって、受け入れやすい仮説は、野生型ＣＥＢＰＡのｍＲＮＡの欠失がＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔ遺伝子発現プロファイルに直接関与していることである。多数の患者の一連の解析は、本明細書に示唆された分類のさらなる改良につながる可能性がある。例えば、我々のデータは、ＤＮＡ結合に直接関与し、潜在的に２重変異と識別されにくいｂＺＩＰ領域の変異を有するＣＥＢＰＡｓｉｎｇｌｅ−ｍｕｔ症例の傾向を示す（症例＃７１８５、＃７３２４、＃２２３７;（図１Ｃ）。
【００５０】
最新の研究は、ＣＥＢＰＡ変異と結果が関連付けられている３、４、９、１８が、単一および２重変異体への細分化を採用していない。何故、ＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔが、単一の変異よりも良好な結果を有するのかは不明である。１つの説明は、単一の変異は白血病のために十分ではなく、さらなる変異が必要であるかもしれないことである。この仮説を支持する可能性として、我々は、ＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔ症例と比較して、ＣＥＢＰＡｓｉｎｇｌｅ−ｍｕｔにおいてＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＦＬＴ３−ＴＫＤ、およびＮＰＭ１変異を顕著に見出した（表４）。現時点では知られていない異常は、同様にＣＥＢＰＡｓｉｎｇｌｅ−ｍｕｔＡＭＬに関連付けられてもよく、比較的劣った結果になりやすくなる。しかし、これらの知見およびそれらの臨床的重要性は、ＡＭＬの独立系列においてさらなる調査および確認を正当化することは明らかであると考えられる。
【００５１】
要約すると、本明細書に示されたデータは、ＣＥＢＰＡ変異ＡＭＬが単一の生物学的および臨床群であると考えるべきではなく、少なくともＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔおよびＣＥＢＰＡｓｉｎｇｌｅ−ｍｕｔの存在によって識別されるべきであろうことを示す。我々は、ｄＨＰＬＣを用いたスクリーニング、それに続く塩基配列解析が迅速に変異症例を識別できることを示唆する。第２に、分類に基づく遺伝子発現は、例えば、本明細書に記載された分類を使用して、ＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔＡＭＬ症例の正確な識別を可能にするであろう。
【００５２】
Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２ジーンチップ遺伝子発現プロファイリング分析
マイクロアレイの生データを１００の強度値を対象としてアフィメトリクスマイクロアレイスイート５（ＭＡＳ５）を使用して処理した。３０以下の強度は３０に設定し、続いて全てのデータをｌｏｇ２転換した。
【００５３】
ＣＥＢＰＡｍｕｔおよびＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔの遺伝子発現の分類は、Ｒバージョン２．１．０におけるPrediction Analysis for Microarrays（PAM）６バージョン１．２８を使用して得た。最短収縮重心法（method of nearest shrunken centroids)は、予め定義された分類を最も特徴付ける遺伝子の集団を識別する。良好な実施ガイドライン７、８に従って、利用可能な全てのデータは、分類の構築のために使用され、推定された予測性能は、以下のように交差検定に基づいた。ＰＡＭは、第１にＡＭＬ５２４症例の全てのデータセットに基づいて分類を調整するために使用した。次に、収縮率の選択（ただ最も有益な遺伝子を使用するのみのために）と同様に分類性能の評価は、変異状態に関してバランスの取れた１０分割へのデータのランダムな分割を含む１０分割交差検定を使用して行った。各分割は、残りの９分割に向けられた分類のための独立した検証として１回使用した。誤って分類された症例の最小数はその後決定され、対応する収縮閾値を記録した。さらに、感度および特異性を算出した。この１０分割ランダム交差検定の全ての手順を１００回繰り返した。報告された最終的な分類は、１００交差検定以上の中央閾値を使用して収縮後に残ったプローブセットを表す。報告された最終的な感度および特異性は、１００交差検定を超える平均を表す。ＣＥＢＰＡｍｕｔ分類の基準は、最小の全誤分類率（すなわち、最小の偽陽性＋偽陰性）とした。報告されたＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔ分類の基準は、２重変異試料の最小誤分類（すなわち、最小偽陰性）とした。
【００５４】
主成分分析は、Spotfire Decision Site（Spotfire, Inc., Somerville, MA）を使用して行った。分析する前に、全てのプローブセットについてデータは中央平均化した。
【００５５】
ＡＭＬプロファイラを用いたＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔ解析
Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２ジーンチッププラットフォームで得られた結果のうちＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔの検出に加えて、我々は、このプラットフォーム用に最適化するためにＡＭＬプロファイラを使用して前記５９８ＡＭＬ症例の５０５症例をハイブリダイズした。また、我々は、事前にフィルタリングした遺伝子発現レベルを追加することで手順のパフォーマンスを向上させた。正規化、スケーリング、インピュテーション、強度の中央平均化、およびｌｏｇ２変換後、最初の基準は、全てのＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔがＣＥＢＰＡ遺伝子自体のために特定の閾値を超える遺伝子発現を有することである。次に、ＬＤＡ分類は、試料がＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔであるか否かを決定する。このことは、これまでのところ最も効率的な方法であることが示された。使用された配列の詳細は、様々な表において提供される。
【００５６】
これらの結果は、分類遺伝子の選択が、本明細書において識別された遺伝子の発現レベルを決定するために使用されるプラットフォームから独立していることを示す。したがって、本特許出願の教示は、全てのプラットフォームに拡張し得る。しかし、依然としてＵ１３３Ｐｌｕｓ２ジーンチッププラットフォームおよびＡＭＬプロファイラプラットフォームが好ましい。
【００５７】
ＡＭＬプロファイラジーンチップ遺伝子発現プロファイリング解析
マイクロアレイの生データは、１５００の強度値を対象としてアフィメトリクスマイクロアレイスイート５（ＭＡＳ５）を使用して処理した。３０よりも低い強度は３０に設定し、続いて全てのデータをｌｏｇ２転換した。データは各プローブについて中央平均化した。全てのコンピュータ解析は、Ｒ（www.r - project.org、バージョン２．９．２）またはMatlab（www.mathworks.com、バージョンＲ２００９ａ）を使用して行った。
【００５８】
ＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔの状態を検出する手順は、２つの連続するステップで構成される（図４を参照）。第１ステップでは、閾値以下のＣＥＢＰＡ発現を有する試料は、全て非２重変異体として予測される。第２ステップでは、分類は、ＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔ対非ＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔを予測するために調整される（線形分類、ＬＤＡ、Dabney et al., Bioinformatics, 2005）。目下のところ、第１ステップで選択した閾値の異なる２つの手順が好ましく、結果的に第２ステップにおいてわずかに異なる分類を有する（図５を参照）。
【００５９】
２重ループクロスバリデーションプロトコルに基づいて（DLCV、Wessels et al., Bioinformatics, 2005）、我々は分類のための遺伝子の最適なセットを決定した。このＤＬＣＶは、外側ループにおいて２６分割、および内側ループにおいて１０分割交差検定をそれぞれ１００回繰り返して実行した。プローブは、一変量（t検定、等分散）で評価し、学習曲線は、最大５０プローブについて構築した。分類は、偽陽性率／偽陰性率の平均が最小になるように最適化した。報告された最終的な特性をＤＬＣＶにおいて推定された数多くの特徴を使用して全ての試料を使用して得た。
【００６０】
手順１について、我々は、全ての超メチル化試料が閾値を大きく下回るようなｔ＝０．９２９５の閾値を選択した（図６を参照）。続いて、７個の遺伝子の分類セットを本発明に係る方法において使用した。両方の試料および遺伝子を階層的にクラスタ化し（図６を参照）、ＰＣＡプロットを構築した（図７を参照）。また、表９は、広範な注釈を付した７個のプローブを挙げる。
【００６１】
手順２について、我々は閾値ｔ＝−０．９５３２を選択した。我々は、分類のために９個の遺伝子のセットの最適化を決定した。両方の試料および遺伝子を階層的にクラスタ化し（図８を参照）、ＰＣＡプロットを構築した（図９を参照）。また、表１０は、広範な注釈を付した９個のプローブを挙げる。
【００６２】
実施例の参考文献
1.  Verhaak RG, Goudswaard CS, van Putten W, et al. Mutations in nucleophosmin (NPM1) in acute myeloid leukemia (AML): association with other gene abnormalities and previously established gene expression signatures and their favorable prognostic significance. Blood. 2005;106:3747-3754.
2.  Valk PJ, Bowen DT, Frew ME, Goodeve AC, Lowenberg B, Reilly JT. Second hit mutations in the RTK/RAS signaling pathway in acute myeloid leukemia with inv(16). Haematologica. 2004;89:106.
3.  Care RS, Valk PJ, Goodeve AC, et al. Incidence and prognosis of c-KIT and FLT3 mutations in core binding factor (CBF) acute myeloid leukaemias. Br J Haematol. 2003;121:775-777.
4.  Vinson CR, Sigler PB, McKnight SL. Scissors-grip model for DNA recognition by a family of leucine zipper proteins. Science. 1989;246:911-916.
5.  Barjesteh van Waalwijk van Doorn-Khosrovani S, Erpelinck C, Meijer J, et al. Biallelic mutations in the CEBPA gene and low CEBPA expression levels as prognostic markers in intermediate-risk AML. Hematol J. 2003;4:31-40.
6.  Tibshirani R, Hastie T, Narasimhan B, Chu G. Diagnosis of multiple cancer types by shrunken centroids of gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99:6567-6572.
7.  Simon R. Roadmap for developing and validating therapeutically relevant genomic classifiers. J Clin Oncol. 2005;23:7332-7341.
8.  Dupuy A, Simon RM. Critical review of published microarray studies for cancer outcome and guidelines on statistical analysis and reporting. J Natl Cancer Inst. 2007;99:147-157.
【００６３】
本文記載の参考文献
1.  Zhang DE, Zhang P, Wang ND, Hetherington CJ, Darlington GJ, Tenen DG. Absence of granulocyte colony-stimulating factor signaling and neutrophil development in CCAAT enhancer binding protein alpha-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94:569-574.
2.  Zhang P, Iwasaki-Arai J, Iwasaki H, et al. Enhancement of hematopoietic stem cell repopulating capacity and self-renewal in the absence of the transcription factor C/EBP alpha. Immunity. 2004;21:853-863.
3.  Barjesteh van Waalwijk van Doorn-Khosrovani S, Erpelinck C, Meijer J, et al. Biallelic mutations in the CEBPA gene and low CEBPA expression levels as prognostic markers in intermediate-risk AML. Hematol J. 2003;4:31-40.
4.  Frohling S, Schlenk RF, Stolze I, et al. CEBPA mutations in younger adults with acute myeloid leukemia and normal cytogenetics: prognostic relevance and analysis of cooperating mutations. J Clin Oncol. 2004;22:624-633.
5.  Gombart AF, Hofmann WK, Kawano S, et al. Mutations in the gene encoding the transcription factor CCAAT/enhancer binding protein alpha in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias. Blood. 2002;99:1332-1340.
6.  Pabst T, Mueller BU, Zhang P, et al. Dominant-negative mutations of CEBPA, encoding CCAAT/enhancer binding protein-alpha (C/EBPalpha), in acute myeloid leukemia. Nat Genet. 2001;27:263-270.
7.  Nerlov C. C/EBPalpha mutations in acute myeloid leukaemias. Nat Rev Cancer. 2004;4:394-400.
8.  Leroy H, Roumier C, Huyghe P, Biggio V, Fenaux P, Preudhomme C. CEBPA point mutations in hematological malignancies. Leukemia. 2005;19:329-334.
9.  Preudhomme C, Sagot C, Boissel N, et al. Favorable prognostic significance of CEBPA mutations in patients with de novo acute myeloid leukemia: a study from the Acute Leukemia French Association (ALFA). Blood. 2002;100:2717-2723.
10.  Schlenk RF, Dohner K, Krauter J, et al. Mutations and treatment outcome in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 2008;358:1909-1918.
11.  Lin LI, Chen CY, Lin DT, et al. Characterization of CEBPA mutations in acute myeloid leukemia: most patients with CEBPA mutations have biallelic mutations and show a distinct immunophenotype of the leukemic cells. Clin Cancer Res. 2005;11:1372-1379.
12.  Valk PJ, Verhaak RG, Beijen MA, et al. Prognostically useful gene-expression profiles in acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 2004;350:1617-1628.
13.  Verhaak RG, Goudswaard CS, van Putten W, et al. Mutations in nucleophosmin (NPM1) in acute myeloid leukemia (AML): association with other gene abnormalities and previously established gene expression signatures and their favorable prognostic significance. Blood. 2005;106:3747-3754.
14.  Wouters BJ, Louwers I, Valk PJ, Lowenberg B, Delwel R. A recurrent in-frame insertion in a CEBPA transactivation domain is a polymorphism rather than a mutation that does not affect gene expression profiling-based clustering of AML. Blood. 2007;109:389-390.
15.  Resende C, Regalo G, Duraes C, Carneiro F, Machado JC. Genetic changes of CEBPA in cancer: mutations or polymorphisms? J Clin Oncol. 2007;25:2493-2494; author reply 2494-2495.
16.  Biggio V, Renneville A, Nibourel O, et al. Recurrent in-frame insertion in C/EBPalpha TAD2 region is a polymorphism without prognostic value in AML. Leukemia. 2008;22:655-657.
17.  Tibshirani R, Hastie T, Narasimhan B, Chu G. Diagnosis of multiple cancer types by shrunken centroids of gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99:6567-6572.
18.  Bienz M, Ludwig M, Leibundgut EO, et al. Risk assessment in patients with acute myeloid leukemia and a normal karyotype. Clin Cancer Res. 2005;11:1416-1424.
19.  Wouters BJ, Jorda MA, Keeshan K, et al. Distinct gene expression profiles of acute myeloid/T-lymphoid leukemia with silenced CEBPA and mutations in NOTCH1. Blood. 2007;110:3706-3714.
【図１−３】
0005679990.tif 000025
【図２】
0005679990.tif 000026
【図１−１】
0005679990.tif 000027
【図１−２】
0005679990.tif 000028
【図３】
0005679990.tif 000029
【図４】
0005679990.tif 000030
【図５】
0005679990.tif 000031
【図６】
0005679990.tif 000032
【図７】
0005679990.tif 000033
【図８】
0005679990.tif 000034
【図９】
0005679990.tif 000035
【配列表】
0005679990000001.app