(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
無細胞合成システムを用いて、ポリペプチドの事前に選択された位置に非天然アミノ酸を導入するためのインビトロにおける方法であって、前記方法は：
ａ）第１センスコドンおよび第２センスコドンを含む核酸鋳型を得る工程であって、該第１センスコドンおよび該第２センスコドンは、同じ天然アミノ酸に対応するが、それぞれのヌクレオチド配列が異なる、工程；
ｂ）細胞溶解産物を生成する工程；
ｃ）該天然アミノ酸をアミノアシル化する天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を該細胞溶解産物から枯渇させる工程；
ｄ）該核酸鋳型の該第１センスコドンに対応する第１イソ受容センスｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する第１外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を該溶解産物に加える工程；
ｅ）非天然アミノ酸および該核酸鋳型の該第２センスコドンに対応する第２イソ受容センスｔＲＮＡを含むチャージ反応混合物を含む反応容器に触媒性アミノアシル化剤を加える工程；
ｆ）該第２イソ受容センスｔＲＮＡを該非天然アミノ酸でアミノアシル化することにより、ｔＲＮＡ：非天然アミノ酸をチャージした部分を得る工程；
ｇ）該細胞溶解産物を：
１）該ｔＲＮＡ：非天然アミノ酸をチャージした部分；および
２）該第１センスコドンおよび該第２センスコドンを含む核酸鋳型
と、該鋳型からタンパク質を生成するのに適切な条件下で混合する工程；および
ｈ）該反応物が、該核酸鋳型の該第２センスコドンに対応する位置に非天然アミノ酸を有する該ポリペプチドを生成することを可能にする工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記触媒性アミノアシル化剤が、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、前記ｔＲＮＡ：非天然アミノ酸をチャージした部分を前記細胞溶解産物と混合する前に前記チャージ反応混合物から除去される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記触媒性アミノアシル化剤が、リボザイムである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞抽出物の酸化的（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）リン酸化システムが、タンパク質合成中に機能している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞溶解産物が、細菌由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞溶解産物が、大腸菌由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記非天然アミノ酸が、グリコールで修飾されたアミノ酸、金属含有アミノ酸、アリール−アジド含有アミノ酸およびケトン含有アミノ酸からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、ウサギ網状赤血球である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞のアルギニンデカルボキシラーゼが枯渇している、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程ｂ）〜ｃ）が、以下の工程：
ｂ’）細胞溶解産物を生成するために使用される前記細胞を１つの遺伝子で形質転換する工程であって、該遺伝子は、該細胞溶解産物からの前記天然アミノ酸をアミノアシル化する天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を置き換えることができる、捕捉部分に融合されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を発現する、工程；
ｃ’）該天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素遺伝子の発現を阻害するように該細胞を変化させる工程；
ｄ’）該細胞溶解産物を生成し、該細胞溶解産物から、該捕捉部分に融合されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を枯渇させる工程
によって置き換えられ、ここで、該捕捉部分は、タグ、抗体、親和性支持体、マトリックス、樹脂、カラムおよびコーティングされたビーズからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記捕捉部分に融合されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、前記細胞溶解産物を形成する前記細胞と異種である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
アフィニティークロマトグラフィーによって、前記捕捉部分に融合されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を枯渇させる工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記アフィニティークロマトグラフィーが、イムノアフィニティークロマトグラフィーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記捕捉部分に融合されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、該捕捉部分を認識する抗体を使用する免疫沈降によって枯渇される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程ｂ）〜ｄ）が、以下の工程：
ｂ”）細胞溶解産物を生成するために使用される前記細胞を第１遺伝子および第２遺伝子で形質転換する工程であって、該第１遺伝子は、前記第１外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を発現し、該第２遺伝子は、第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を発現し、該第１および第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の各々が、それぞれ前記第１および第２イソ受容センスｔＲＮＡを特異的にアミノアシル化する、工程；
ｃ”）前記天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の発現を阻害するように該細胞を変化させる工程；
ｄ”）該細胞溶解産物を生成し、該細胞溶解産物から該第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を枯渇させる工程
によって置き換えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素および前記第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ由来である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、捕捉部分に融合されており、アフィニティークロマトグラフィーによって枯渇され、該捕捉部分はタグである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記アフィニティークロマトグラフィーが、イムノアフィニティークロマトグラフィーである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、捕捉部分に融合されており、該捕捉部分を認識する抗体を使用する免疫沈降によって枯渇される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、該第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を特異的に認識する抗体を使用するイムノアフィニティークロマトグラフィーによって枯渇される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、該第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を特異的に認識する抗体を使用する免疫沈降によって枯渇される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素に特異的なアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素インヒビターを導入することによって、前記細胞溶解産物から該第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が機能的に枯渇される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を特異的に認識する抗体を使用する免疫沈降によって、前記細胞溶解産物から該天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が枯渇される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を特異的に認識する抗体を使用するイムノアフィニティークロマトグラフィーによって、前記細胞溶解産物から該天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が枯渇される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素に特異的なアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素インヒビターを導入することによって、前記細胞溶解産物から該天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が機能的に枯渇される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
溶解前に前記第１外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子で前記細胞を形質転換した結果として、前記第１イソ受容センスｔＲＮＡを選択的に認識する該第１外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、前記溶解産物に加えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
無細胞合成システムを用いて、ポリペプチドの事前に選択された位置に非天然アミノ酸を導入するためのインビトロにおける方法であって、前記方法は：
ａ）第１センスコドンおよび第２センスコドンを含む核酸鋳型を得る工程であって、該第１センスコドンおよび該第２センスコドンは、同じ天然アミノ酸に対応するが、それぞれのヌクレオチド配列が異なる、工程；
ｂ）天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を含む細胞溶解産物を生成する工程であって、該合成酵素は、該核酸鋳型の該第１センスコドンに対応する第１イソ受容センスｔＲＮＡと、該核酸鋳型の該第２センスコドンに対応する第２イソ受容センスｔＲＮＡとの両方をアミノアシル化する能力を有する、工程；
ｃ）該核酸鋳型の該第２センスコドンに対応する天然の第２イソ受容センスｔＲＮＡを不活性化する工程であって、該天然の第２イソ受容センスｔＲＮＡは、該天然の第２イソ受容センスｔＲＮＡに選択的に結合するアンチセンスＤＮＡを加えることによって不活性化される、工程；
ｄ）非天然アミノ酸および該核酸鋳型の該第２センスコドンに対応する第２イソ受容センスｔＲＮＡを含むチャージ反応混合物を含む反応容器に触媒性アミノアシル化剤を加える工程；
ｅ）該第２イソ受容センスｔＲＮＡを該非天然アミノ酸でアミノアシル化することにより、ｔＲＮＡ：非天然アミノ酸をチャージした部分を得る工程；
ｆ）該細胞溶解産物を：
１）該ｔＲＮＡ：非天然アミノ酸をチャージした部分；および
２）該第１センスコドンおよび該第２センスコドンを含む核酸鋳型
と、該鋳型からタンパク質を生成するのに適切な条件下で混合する工程；および
ｇ）該反応物が、該核酸鋳型の該第２センスコドンに対応する位置に非天然アミノ酸を有する該ポリペプチドを生成することを可能にする工程
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、米国特許法第１．１１９（ｅ）項の下、２００９年１月１２日に出願された米国仮特許出願６１／１４４，０９７号、６１／１４４，０８３号、および６１／１４４，０３号の利益を主張し、これらは各々あらゆる目的のために、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
連邦支援の研究開発の下に行われた発明の権利に関する陳述
該当せず
コンパクトディスクにて提出する「配列表」、表またはコンピュータプログラム一覧の補遺への言及
該当せず
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
タンパク質合成は、ポリペプチド治療学、ワクチン、診断学および工業用酵素の開発の基礎をなす基本的な生物学的プロセスである。組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術の登場により、所望のタンパク質を生成するために細胞の触媒機構を利用することが可能になった。これは、細胞に由来する溶解産物を用いて細胞環境内またはインビトロにおいて達成することができる。
【０００４】
天然には２０種のアミノ酸だけがタンパク質に組み込まれるので、所望のタンパク質を生成することには限界がある。例えば、治療薬として潜在的に有用なペプチドは、患者内にプロテアーゼが存在する結果として、患者に投与されると直ちに分解されるかまたは別途不活性化されることがある。同様に、細菌またはウイルスなどの感染病原体は、天然に存在するアミノ酸だけを含むペプチドに対して耐性を発達させる可能性が高い。これは、ペプチド薬物を不活性化し得る、細菌またはウイルスによって産生される酵素が、非天然アミノ酸を含むペプチドとは対照的に、天然に存在するアミノ酸を含むペプチドを不活性化する可能性が高いことを理由に生じる。このような限界は、有機小分子（任意の構造変化が生じることによってその化合物の機能的特性が影響され得る）の合成と比較すると、なお明らかである。結果として、治療上使用するためには、非天然アミノ酸を含むタンパク質が有望になってくる。さらに、治療でない研究目的（例えば、タンパク質の構造的および機能的な調査に関する用途、コンビナトリアルケミストリー用のペプチドライブラリーの構築、ならびにプロテオミクス研究）のためには、非天然アミノ酸を含むペプチドが極めて有用である。
【０００５】
天然に存在する２０種のアミノ酸は、翻訳後修飾によって修飾され得るが、新規の生物学的特性、化学的特性または物理的特性を有するさらなる非天然アミノ酸を含めるように遺伝暗号を拡張することが、そのような新規の非天然アミノ酸を含むタンパク質の有用性を高めることになる。タンパク質の特性としては、そのタンパク質のサイズ、酸性度、求核性、水素結合または疎水性が挙げられ得る。
【０００６】
非天然アミノ酸を含むペプチドを合成するために、様々なストラテジーが利用されている。この目的のために、合成ペプチド化学が日常的に用いられている。例えば、非特許文献１を参照のこと。しかしながら、通例の固相ペプチド合成は、通常、１００残基未満の小さいペプチドに限定される。最近、ペプチドフラグメントの酵素的ライゲーションおよび天然の化学的ライゲーションが開発されてきたので、より大きなタンパク質を生成することが可能である。しかしながら、これらの方法は、容易に拡大できない。例えば、非特許文献２を参照のこと。
【０００７】
遺伝的にコードされた天然または組換えのＤＮＡ配列からタンパク質を効率的に合成するためおよび翻訳後修飾するために、生細胞を用いたインビボ翻訳が広く使用されている。しかしながら、タンパク質が封入体内で発現される場合は、フォールディングが非効率になることがある。最も重要なことには、このような方法では、複数の非天然アミノ酸を選択的に組み込むことまたは翻訳後修飾プロセスを制御することが、難しい。
【０００８】
インビトロでのタンパク質合成、すなわち無細胞タンパク質合成は、従来のインビボタンパク質発現方法に対して、いくつかの利点を提供する。無細胞システムは、細胞の全部ではないがほとんどの代謝資源を１種類のタンパク質の独占的な生成に向けることができる。さらに、インビトロでは細胞壁および膜成分を欠くということが、合成環境の制御を可能にするので、その点は都合がよい。例えば、発現される遺伝子のコドン使用頻度を反映するようにｔＲＮＡレベルを変更することができる。細胞の成長または生存率に関する懸念が無いので、レドックス電位、ｐＨまたはイオン強度もまた、インビボタンパク質合成よりも融通性が高くなるように変更することができる。さらに、適切に折り畳まれた精製タンパク質産物を直接回収することも容易に達成することができる。
【０００９】
無細胞システムの生産力は、近年、約５μｇ／ｍｌ−時から約５００μｇ／ｍｌ−時に２桁超改善された。このような改善によって、インビトロタンパク質合成は、実験室規模の研究用の実用的な手法になり、ハイスループットタンパク質発現のためのプラットフォーム技術がもたらされた。このことは、インビボでのタンパク質医薬の大規模商業生産に対する代替手段として無細胞技術を使用することの実行可能性をさらに示唆する。
【００１０】
非天然アミノ酸をタンパク質に組み込むことについては、インビボとインビトロの両方でのタンパク質合成システムにおいて課題が残っている。この試みの領域における主なハードルは、非天然アミノ酸によるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の認識を促進することである。アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、特定のアミノ酸をその同族（ｃｏｇｎａｔｅ）ｔＲＮＡ分子に結合することを触媒する酵素である。ほとんどの場合、天然に存在する各アミノ酸は、そのアミノ酸をその適切なｔＲＮＡ分子に対してアミノアシル化する１つの特異的なアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を有する（このアミノアシル化はｔＲＮＡチャージとして知られる）。遺伝暗号の縮重によって、アミノ酸が１種より多いイソ受容（ｉｓｏａｃｃｅｐｔｉｎｇ）センスｔＲＮＡ分子にチャージされることができるという事実を考慮しているアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、比較的少ない。したがって、タンパク質への非天然アミノ酸の組み込みの成功は、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素による非天然アミノ酸の認識に左右され、タンパク質翻訳の忠実度を保証するために、その認識は通常、高い選択性（ｈｉｇｈ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ）を要求される。アミノアシル化の忠実度は、基質識別の段階と、非同族中間体とタンパク質産物の両方のプルーフリーディングの段階との両方において維持される。
【００１１】
１つのストラテジーは、プルーフリーディング機構を欠くという理由で、自然の対応物と構造的に似ている非天然アミノ酸を判別することができないアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を用いて非天然アミノ酸をタンパク質に組み込むことであった。アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素のプルーフリーディング活性が無能であるので、誤って活性化された自然アミノ酸の構造アナログは、この合成酵素の編集機能を免れ得、所望のとおり伸長中のペプチド鎖に組み込まれ得る。例えば、非特許文献３を参照のこと。
【００１２】
前述のストラテジーの主な限界は、タンパク質全体にわたって特定の自然アミノ酸に対応するすべての部位が、置き換えられる点である。細胞内の同族の自然アミノ酸を完全に枯渇させることは困難であるので、自然および非天然のアミノ酸の組み込みの程度もばらつき得る。アナログが複数の部位に組み込まれることによってしばしば毒性が生じるので、これらのストラテジーが生細胞における変異タンパク質研究を困難にするという点が、別の限界である。最終的には、ゲノム内のすべての部位において置換が許容されなければならないので、この方法は、一般に通常のアミノ酸に近い構造アナログに対してのみ適用可能である。
【００１３】
最近になって、直交ｔＲＮＡ（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｔＲＮＡ）、および直交ｔＲＮＡに所望の非天然アミノ酸をチャージする対応の直交アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、以前の限界を克服するストラテジーとして用いられている。直交ｔＲＮＡは、正常ではアミノ酸と会合しないコドン（例えば、終止コドンまたは４塩基対コドンなど）と塩基対形成するｔＲＮＡである。重要なことには、直交性の成分は、宿主生物内の内因性のｔＲＮＡ、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素、アミノ酸またはコドンのいずれとも交差反応しない。
【００１４】
非天然アミノ酸を組み込むために通常使用される直交システムは、アンバーサプレッサー直交ｔＲＮＡである。終止コドンＵＡＧを認識し、非天然アミノ酸で化学的にアミノアシル化されるサプレッサーｔＲＮＡが、このシステムを用いるときに調製される。従来の部位特異的突然変異誘発を用いることにより、そのタンパク質遺伝子の目的の部位に終止コドンＴＡＧが導入される。アミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡと変異遺伝子とが、インビトロ転写／翻訳システムにおいて組み合わされるとき、非天然アミノ酸が、そのＵＡＧコドンに応答して組み込まれて、指定の位置に非天然アミノ酸を含むタンパク質が生じる。例えば、非特許文献４を参照のこと。所望の非天然アミノ酸が、ＵＡＧコドンによって指定された位置に組み込まれるという証拠、およびその非天然アミノ酸が、そのタンパク質内の他のいずれの部位にも組み込まれないという証拠が示されている。例えば、非特許文献５；非特許文献６を参照のこと。非天然アミノ酸を組み込む直交性の翻訳システム、ならびにそれらの生成および使用のための方法に関するさらなる考察については、非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；および非特許文献１１もまた参照のこと。
【００１５】
しかしながら、直交性の成分を用いた非天然アミノ酸の組み込みは、終結因子と競合する本質的に非効率的なサプレッサーｔＲＮＡに頼っているので、収率の低さに悩まされる。さらに、異なる２０種類のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素のｔＲＮＡチャージ活性およびプルーフリーディング活性によって触媒される、自然アミノ酸からのアミノ酸センスコドンにおける競合を理由に、ならびに第２の終止コドン（ＵＧＡ）を使用する試みがリボソームによる読み過ごしに起因して失敗することが多いことを理由に、非天然アミノ酸を組み込むために直交性の成分を使用することは、３種類のナンセンス終止コドンのうちのただ１つ（ＵＡＧアンバー終止コドン）における、１つのタンパク質あたりただ１つの非天然アミノ酸の選択的組み込みに制限されている。例えば、非特許文献１２を参照のこと。
【００１６】
センスコドンを認識するｔＲＮＡを用いて非天然アミノ酸をタンパク質に組み込む試みがいくつか行われたが、そのような試みは、純粋な再構成インビトロ翻訳システムを用いて行われた。非特許文献１３；Ｆｏｒｓｔｅｒら、特許文献１を参照のこと。しかしながら、そのような純粋な再構成翻訳システムは、精製された翻訳成分を必要し、これは、研究の状況を除いては非現実的であって非常に費用のかかるものであり、高度に効率的であると示されていない。
【００１７】
当該分野では、直交ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素対を回避することができ、非天然アミノ酸でアミノアシル化された天然のイソ受容ｔＲＮＡが、センスコドンを認識し、続いてそのセンスコドンによって規定される位置に非天然アミノ酸を伸長中のポリペプチド鎖に組み込み、数多くの非天然アミノ酸が、規定の位置に組み込まれ得、純粋な再構成インビトロ翻訳システムの非実用性、費用および非効率性を回避する粗製の無細胞タンパク質合成システムを使用することができる、非天然アミノ酸を伸長中のポリペプチド鎖に組み込む必要性が存在する。以下の開示を検討すると明らかになるように、本明細書中に記載される発明は、これらおよび他の要求を満たすものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国特許第６，９７７，１５０号明細書
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｅｃｋｅｒｔら、Ｃｅｌｌ  ９９：１０３−１５（１９９９）
【非特許文献２】Ｄａｗｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋｅｎｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６９：９２３（２０００）
【非特許文献３】Ｄｏｒｉｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：５０１（２００１）
【非特許文献４】Ｓａｙｅｒｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７９１−８０２（１９８８）
【非特許文献５】Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２−８８（１９８９）
【非特許文献６】Ｅｌｌｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１９７−２００（１９９２）
【非特許文献７】Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１：１−１１（２００２）
【非特許文献８】Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２２７−３８（２００５）
【非特許文献９】Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：５４８−５５４（２００５）
【非特許文献１０】Ｗａｎｇら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．３５：２２５−４９（２００６）
【非特許文献１１】Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：７７５−８２（２００６）
【非特許文献１２】Ｃｌｏａｄら、Ｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｌ．３：１０３３−３８（１９９６）
【非特許文献１３】Ｔａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２７９−９０（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
発明の簡単な要旨
本発明は、無細胞合成システムを用いて、タンパク質の事前に選択された位置に非天然アミノ酸を導入するための方法を開示し、この方法は、１）縮重センスコドンを含む核酸鋳型を得る工程、２）細胞集団を溶解することにより、天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が枯渇した細胞溶解産物を得る工程、３）第１イソ受容センスｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を溶解産物に加える工程、４）別個のｔＲＮＡチャージ反応において第２イソ受容センスｔＲＮＡをアミノアシル化する工程（前記第２イソ受容センスｔＲＮＡは、非天然アミノ酸でチャージされる）、５）それぞれの非天然アミノ酸でチャージされた第２イソ受容センスｔＲＮＡおよび核酸鋳型を細胞溶解産物に加え、その反応物が、鋳型の第２センスコドンに対応する位置に非天然アミノ酸を有するタンパク質を生成することを可能にする工程を包含する。
【００２１】
より詳細には、本発明は、無細胞合成システムを用いて、タンパク質の事前に選択された位置に非天然アミノ酸を導入するインビトロにおける方法であって、この方法は：
ａ）縮重センスコドンを含む核酸鋳型を得る工程（第１センスコドンおよび第２センスコドンは、同じ天然アミノ酸に対応するが、それぞれのヌクレオチド配列が異なる）；
ｂ）細胞集団を溶解することにより、細胞溶解産物を得る工程（前記溶解産物は、前記天然アミノ酸をアミノアシル化する天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が枯渇されている）；
ｃ）核酸鋳型の第１センスコドンに対応する第１イソ受容センスｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する第１外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を溶解産物に加える工程；
ｄ）非天然アミノ酸および核酸鋳型の第２センスコドンに対応する第２イソ受容センスｔＲＮＡを含むチャージ反応混合物（ｃｈａｒｇｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ）を含む反応容器に触媒性アミノアシル化剤を加える工程；
ｅ）第２イソ受容センスｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化することにより、ｔＲＮＡ：非天然アミノ酸をチャージした部分（ｎｏｎ−ｎａｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｈａｒｇｅｄ  ｍｏｉｅｔｙ）を得る工程；
ｆ）工程２の細胞溶解産物を：
１）ｔＲＮＡ：非天然アミノ酸をチャージした部分；および
２）第１および第２センスコドンを含む核酸鋳型
と、鋳型からタンパク質を生成するのに適切な条件下で混合する工程；および
ｇ）その反応物が、核酸鋳型の第２センスコドンに対応する位置に非天然アミノ酸を有するタンパク質を生成することを可能にする工程
を包含する。
【００２２】
溶解する前に細胞集団を変化させることによる天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の上記方法が、必要に応じて行われ、ここで、その変化とは、天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を、捕捉部分に融合された天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子で置き換えるものである。この方法は、捕捉部分でタグ化された天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を用いて行われ得、ここで、その合成酵素は、細胞溶解産物を形成する細胞と異種である。タグ化された天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降によって除去され得る。天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、捕捉部分でタグ化されずに免疫沈降によって必要に応じて除去され得る。第２イソ受容センスｔＲＮＡ分子をアミノアシル化するｔＲＮＡチャージ反応は、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素またはリボザイムを触媒性アミノアシル化剤として利用し得る。第１外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、合成されて溶解産物混合物に加えられてもよいし、溶解前に第１外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子で細胞を形質転換した結果として加えられてもよい。
【００２３】
関連方法において、本発明は：
ａ）細胞溶解産物を生成するために使用される細胞を、天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の発現を阻害するように変化させることによって、細胞溶解産物から天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を枯渇させる工程；
ｂ）第１遺伝子および第２遺伝子で前記細胞を形質転換する工程（前記第１遺伝子は、第１外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を発現し、前記第２遺伝子は、第２イソ受容センスｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を発現する）；および
ｃ）細胞溶解産物から第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を枯渇させる工程
によって実施される。
【００２４】
上記方法は、Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ由来の第１および第２アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を用いて行われることが好ましい。前記天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を変異させることによって天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が枯渇される上記方法が、実施され得る。第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、必要に応じて、前記合成酵素を捕捉部分に融合し、アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降によって前記合成酵素を枯渇させることによって行われる。第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、前記外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を認識する抗体を用いる免疫沈降によって枯渇され得る。
【００２５】
上記方法は、細菌、好ましくは、大腸菌由来の細胞溶解産物を用いて実施され得る。細胞集団は、ウサギ網状赤血球からなるものであってもよい。さらに、記載される方法は、アルギニンデカルボキシラーゼが枯渇した細胞において行われ得る。
【００２６】
本発明はさらに、インビトロタンパク質合成用の無細胞合成溶解産物を提供し、その溶解産物は、１つのアミノ酸に対応する単一のイソ受容センスｔＲＮＡだけを選択的にアミノアシル化する外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を含み、前記アミノ酸に対応する天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が枯渇している。この溶解産物は、細菌細胞、好ましくは、大腸菌由来であり得る。上記溶解産物は、ウサギ網状赤血球由来であり得る。上記溶解産物は、必要に応じて、アルギニンデカルボキシラーゼを含まないことがあるか、機能的な酸化的リン酸化システムを示し得るか、消泡剤を含み得るか、またはタンパク質をコードし、かつアミノ酸に対して縮重センスコドンを含む核酸鋳型を含み得る。
【００２７】
本発明はさらに、無細胞合成システムを用いて、タンパク質の事前に選択された位置に非天然アミノ酸を導入するための方法を開示し、この方法は、１）縮重センスコドンを含む核酸鋳型を得る工程、２）細胞集団を溶解することにより、細胞溶解産物を得る工程、３）第２センスコドンを認識するイソ受容ｔＲＮＡを不活性化する工程、４）別個のｔＲＮＡチャージ反応において第２イソ受容センスｔＲＮＡをアミノアシル化する工程（前記第２イソ受容センスｔＲＮＡは、非天然アミノ酸でチャージされる）、５）それぞれの非天然アミノ酸でチャージされた第２イソ受容センスｔＲＮＡおよび核酸鋳型を細胞溶解産物に加え、その反応物が、鋳型の第２センスコドンに対応する位置に非天然アミノ酸を有するタンパク質を生成することを可能にする工程を包含する。
【００２８】
より詳細には、本発明は、さらに：
ａ）縮重センスコドンを含む核酸鋳型を得る工程（第１センスコドンおよび第２センスコドンは、同じ天然アミノ酸に対応するが、それぞれのヌクレオチド配列が異なる）；
ｂ）天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を含む細胞溶解産物を生成する工程（前記合成酵素は、核酸鋳型の第１センスコドンに対応する第１イソ受容センスｔＲＮＡと、核酸鋳型の第２センスコドンに対応する第２イソ受容センスｔＲＮＡの両方をアミノアシル化する能力を有する）；
ｃ）核酸鋳型の第２センスコドンに対応する天然の第２イソ受容センスｔＲＮＡを不活性化する工程；
ｄ）非天然アミノ酸および核酸鋳型の第２センスコドンに対応する第２イソ受容センスｔＲＮＡを含むチャージ反応混合物を含む反応容器に触媒性アミノアシル化剤を加える工程；
ｅ）第２イソ受容センスｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化することにより、ｔＲＮＡ：非天然アミノ酸をチャージした部分を得る工程；
ｆ）細胞溶解産物を：
１）ｔＲＮＡ：非天然アミノ酸をチャージした部分；および
２）第１および第２センスコドンを含む核酸鋳型
と、鋳型からタンパク質を生成するのに適切な条件下で混合する工程；および
ｇ）反応物が、核酸鋳型の第２センスコドンに対応する位置に非天然アミノ酸を有するポリペプチドを生成することを可能にする工程
を開示する。
【００２９】
第２イソ受容ｔＲＮＡが不活性化される１つの実施形態において、前記不活性化は、天然の第２イソ受容センスｔＲＮＡに選択的に結合するアンチセンスＤＮＡを加えることによって実施される。いくつかの実施形態において、第２イソ受容センスｔＲＮＡは、天然の第２イソ受容センスｔＲＮＡを選択的に切断する特異的なｔＲＮＡリボヌクレアーゼまたはその活性なフラグメントを加えることによって不活性化される。いくつかの実施形態において、第２イソ受容センスｔＲＮＡは、コリシンＤまたはコリシンＤの活性なフラグメントを加えることによって不活性化される。
【００３０】
さらに、事前に選択されたアミノ酸を有するチャージしたｔＲＮＡを有し、センスコドンを認識し、かつ事前に選択されたアミノ酸を有するチャージしたｔＲＮＡに対して著しい合成酵素活性を有しない、細菌細胞溶解産物を含むチャージしたｔＲＮＡ溶液を、本発明は提供し、そのチャージしたｔＲＮＡ溶液は、特異的または非特異的な合成酵素インヒビターを含まない。
（項目１）
無細胞合成システムを用いて、ポリペプチドの事前に選択された位置に非天然アミノ酸を導入するためのインビトロにおける方法であって、前記方法は：
ａ）縮重センスコドンを含む核酸鋳型を得る工程であって、第１センスコドンおよび第２センスコドンは、同じ天然アミノ酸に対応するが、それぞれのヌクレオチド配列が異なる、工程；
ｂ）細胞溶解産物を生成する工程；
ｃ）該天然アミノ酸をアミノアシル化する天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を枯渇させる工程；
ｃ）該核酸鋳型の該第１センスコドンに対応する第１イソ受容センスｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する第１外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を該溶解産物に加える工程；
ｄ）非天然アミノ酸および該核酸鋳型の該第２センスコドンに対応する第２イソ受容センスｔＲＮＡを含むチャージ反応混合物を含む反応容器に触媒性アミノアシル化剤を加える工程；
ｅ）該第２イソ受容センスｔＲＮＡを該非天然アミノ酸でアミノアシル化することにより、ｔＲＮＡ：非天然アミノ酸をチャージした部分を得る工程；
ｆ）該細胞溶解産物を：
１）該ｔＲＮＡ：非天然アミノ酸をチャージした部分；および
２）該第１センスコドンおよび該第２センスコドンを含む核酸鋳型
と、該鋳型からタンパク質を生成するのに適切な条件下で混合する工程；および
ｇ）該反応物が、該核酸鋳型の該第２センスコドンに対応する位置に非天然アミノ酸を有する該ポリペプチドを生成することを可能にする工程
を包含する、方法。
（項目２）
前記触媒性アミノアシル化剤が、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、前記ｔＲＮＡ：非天然アミノ酸をチャージした部分を前記細胞溶解産物と混合する前に前記チャージ反応混合物から除去される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記触媒性アミノアシル化剤が、リボザイムである、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記細胞抽出物の酸化的（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）リン酸化システムが、タンパク質合成中に機能している、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記細胞溶解産物が、細菌由来である、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記細胞溶解産物が、大腸菌由来である、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記非天然アミノ酸が、グリコールで修飾されたアミノ酸、金属キレート基、アリール−アジド含有アミノ酸およびケトン含有アミノ酸からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記細胞が、ウサギ網状赤血球である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記細胞のアルギニンデカルボキシラーゼが枯渇している、項目１に記載の方法。
（項目１１）
ａ）前記細胞溶解産物を生成するために使用される前記細胞を１つの遺伝子で形質転換する工程であって、該遺伝子は、前記天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を機能的に置き換えることができる、捕捉部分に融合されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を発現する、工程；
ｂ）該天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素遺伝子の発現を阻害するように該細胞を変化させる工程；および
ｃ）該細胞溶解産物から、該捕捉部分に融合されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を枯渇させる工程
をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記捕捉部分に融合されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、前記細胞溶解産物を形成する前記細胞と異種である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
アフィニティークロマトグラフィーによって、前記捕捉部分に融合されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を枯渇させる工程をさらに包含する、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記アフィニティークロマトグラフィーが、イムノアフィニティークロマトグラフィーである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記捕捉部分に融合されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、該捕捉部分を認識する抗体を使用する免疫沈降によって枯渇される、項目１１に記載の方法。
（項目１６）
ａ）前記細胞溶解産物を生成するために使用される前記細胞を１つの遺伝子で形質転換する工程であって、該遺伝子は、前記天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を機能的に置き換えることができる不安定な組換えアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を発現する、工程；ｂ）該天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素遺伝子の発現を阻害するように該細胞を変化させる工程；および
ｃ）該細胞溶解産物から該不安定な組換えアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を枯渇させる工程
をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記組換えアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、熱的に不安定である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
ａ）前記細胞溶解産物を生成するために使用される前記細胞を第１遺伝子および第２遺伝子で形質転換する工程であって、該第１遺伝子は、前記第１外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を発現し、該第２遺伝子は、第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を発現する、工程；
ｂ）前記天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の発現を阻害するように該細胞を変化させる工程；および
ｃ）該細胞溶解産物から該第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を枯渇させる工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記第１アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素および前記第２アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ由来である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、不安定である、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、熱的に不安定である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、捕捉部分に融合されており、アフィニティークロマトグラフィーによって枯渇される、項目１８に記載の方法。
（項目２３）
前記アフィニティークロマトグラフィーが、イムノアフィニティークロマトグラフィーである、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、捕捉部分に融合されており、該捕捉部分を認識する抗体を使用する免疫沈降によって枯渇される、項目１８に記載の方法。
（項目２５）
前記第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、該第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を特異的に認識する抗体を使用するイムノアフィニティークロマトグラフィーによって枯渇される、項目１８に記載の方法。
（項目２６）
前記第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、該第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を特異的に認識する抗体を使用する免疫沈降によって枯渇される、項目１８に記載の方法。
（項目２７）
前記第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素に特異的なアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素インヒビターを導入することによって、前記細胞溶解産物から該第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が枯渇される、項目１８に記載の方法。
（項目２８）
前記天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を特異的に認識する抗体を使用する免疫沈降によって、前記細胞溶解産物から前記天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が枯渇される、項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を特異的に認識する抗体を使用するイムノアフィニティークロマトグラフィーによって、前記細胞溶解産物から前記天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が枯渇される、項目１に記載の方法。
（項目３０）
前記天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素に特異的なアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素インヒビターを導入することによって、前記細胞溶解産物から該天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が枯渇される、項目１に記載の方法。
（項目３１）
溶解前に前記第１外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子で前記細胞を形質転換した結果として、前記第１イソ受容センスｔＲＮＡを選択的に認識する該第１外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、前記溶解産物に加えられる、項目１に記載の方法。
（項目３２）
１つのアミノ酸に対応する単一のイソ受容センスｔＲＮＡだけを選択的にアミノアシル化する外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を含み、該アミノ酸に対応する天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が枯渇されている、インビトロタンパク質合成用の無細胞合成溶解産物。
（項目３３）
前記溶解産物が、細菌細胞由来である、項目３２に記載の無細胞合成溶解産物。
（項目３４）
前記溶解産物が、大腸菌由来である、項目３３に記載の無細胞合成溶解産物。
（項目３５）
前記溶解産物が、アルギニンデカルボキシラーゼを含んでいない、項目３３に記載の無細胞合成溶解産物。
（項目３６）
前記溶解産物が、ウサギ網状赤血球由来である、項目３２に記載の無細胞合成溶解産物。
（項目３７）
前記溶解産物が、消泡剤を含む、項目３２に記載の無細胞合成溶解産物。
（項目３８）
前記溶解産物が、機能的な酸化的リン酸化システムを示す細菌抽出物である、項目３２に記載の無細胞合成溶解産物。
（項目３９）
前記溶解産物が、ポリペプチドをコードし、かつ前記アミノ酸に対する縮重センスコドンを含む核酸鋳型を含む、項目３２に記載の無細胞合成溶解産物。
（項目４０）
無細胞合成システムを用いて、ポリペプチドの事前に選択された位置に非天然アミノ酸を導入するためのインビトロにおける方法であって、前記方法は：
ａ）縮重センスコドンを含む核酸鋳型を得る工程であって、第１センスコドンおよび第２センスコドンは、同じ天然アミノ酸に対応するが、それぞれのヌクレオチド配列が異なる、工程；
ｂ）天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を含む細胞溶解産物を生成する工程であって、該合成酵素は、該核酸鋳型の該第１センスコドンに対応する第１イソ受容センスｔＲＮＡと、該核酸鋳型の該第２センスコドンに対応する第２イソ受容センスｔＲＮＡとの両方をアミノアシル化する能力を有する、工程；
ｃ）該核酸鋳型の該第２センスコドンに対応する天然の第２イソ受容センスｔＲＮＡを不活性化する工程；
ｄ）非天然アミノ酸および該核酸鋳型の該第２センスコドンに対応する第２イソ受容センスｔＲＮＡを含むチャージ反応混合物を含む反応容器に触媒性アミノアシル化剤を加える工程；
ｅ）該第２イソ受容センスｔＲＮＡを該非天然アミノ酸でアミノアシル化することにより、ｔＲＮＡ：非天然アミノ酸をチャージした部分を得る工程；
ｆ）該細胞溶解産物を：
１）該ｔＲＮＡ：非天然アミノ酸をチャージした部分；および
２）該第１センスコドンおよび該第２センスコドンを含む核酸鋳型
と、該鋳型からタンパク質を生成するのに適切な条件下で混合する工程；および
ｇ）該反応物が、該核酸鋳型の該第２センスコドンに対応する位置に非天然アミノ酸を有する該ポリペプチドを生成することを可能にする工程
を包含する、方法。
（項目４１）
前記天然の第２イソ受容センスｔＲＮＡが、該天然の第２イソ受容センスｔＲＮＡに選択的に結合するアンチセンスＤＮＡを加えることによって不活性化される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記天然の第２イソ受容センスｔＲＮＡが、該天然の第２イソ受容センスｔＲＮＡを選択的に切断する特異的なｔＲＮＡリボヌクレアーゼまたはその活性なフラグメントを加えることによって不活性化される、項目４０に記載の方法。
（項目４３）
前記天然の第２イソ受容センスｔＲＮＡが、コリシンＤまたはコリシンＤの活性なフラグメントを加えることによって不活性化される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
事前に選択されたアミノ酸を有するチャージしたｔＲＮＡを有する細菌細胞溶解産物を含み、センスコドンを認識し、かつ該事前に選択されたアミノ酸を有する該チャージしたｔＲＮＡに対して著しい合成酵素活性を有しない、チャージしたｔＲＮＡ溶液であって、
ここで、該チャージしたｔＲＮＡ溶液は、特異的な合成酵素インヒビターを含まない、チャージしたｔＲＮＡ溶液。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、（ａ）インビトロ転写のために使用される
【００３２】
【化１】
0005798489.tif 000002
ＨＤＶリボザイムプラスミドＤＮＡ鋳型、（ｂ）Ｔ７プロモーター、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイム配列に融合された
【００３３】
【化２】
0005798489.tif 000003
コード配列の方向を詳述しているＤＮＡ鋳型のフラグメント、および（ｃ）その結果得られる、赤色のアンチコドン配列ＧＡＡを有する大腸菌イソ受容転写物（配列番号６）の二次構造（下付き文字は、対応するアンチコドン配列を表す）を示している。
【図２】図２は、新規ｎｎＡＡ−ｔＲＮＡを生成するために必要な工程を図示しているプロセスの流れ図を示しており、そのプロセスは、（ａ）ｔＲＮＡ−ＨＤＶリボザイムＤＮＡ鋳型（部分配列＝配列番号７）のインビトロ転写、（ｂ）サイズ排除クロマトグラフィーによるｔＲＮＡ２，３’−環状リン酸の単離、（ｃ）Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）を用いたｔＲＮＡ２，３’−環状リン酸の酵素的加水分解、および（ｄ）操作されたアミノ酸ｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）によって触媒される、操作されたイソ受容ｔＲＮＡのｎｎＡＡでのアミノアシル化を包含する。
【図３】図３は、異なる２つの操作された大腸菌
【００３４】
【化４】
0005798489.tif 000004
構築物のインビトロ転写の最適化のために使用されたプロトコル１〜４に対するＴＢＥ／尿素ゲルを示している。両方の構築物が、Ｕ３４Ｃにおいて変異していることにより、ＣＵＣアンチコドンを生成し；右側の構築物は、理論的に転写収量を高めるはずのさらなる著明な変異を含む。
【図４】図４は、それぞれ大腸菌およびピロリ菌に由来する異なる２つの操作された
【００３５】
【化５】
0005798489.tif 000005
構築物に対するインビトロ転写プロトコル１〜４のＴＢＥ／尿素ゲルを示している。
【図５】図５は、（ａ）３’の均一なｔＲＮＡ（配列番号８〜１２）を生成するために使用されるデルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）コンセンサス配列の図示を示している。その自己触媒性リボザイムは、ｔＲＮＡの３’末端で切断して、２’，３’−環状リン酸をもたらし、それはその後、アミノアシル化の前に除去される。（ｂ）自己切断されたＨＤＶリボザイムと７３ヌクレオチドのｔＲＮＡ２’，３’−環状リン酸産物との分離を図示している転写産物のサイズ排除クロマトグラフィー分離。
【図６】図６は、ＲＮＡ安定性に対する様々な添加物の影響を示している。
【図７】図７は、（ａ）酸／尿素ゲル電気泳動を用いた反応物および生成物の分離、または（ｂ）マラカイトグリーンリン酸塩放出アッセイを使用することによって測定された、ＰＮＫ処理によるｔＲＮＡ２’−３’−環状リン酸の脱リン酸化の時間依存性を示している。
【図８】図８は、非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）でｔＲＮＡをチャージするために使用された（ａ）大腸菌ＧｌｕＲＳ  ６×Ｈｉｓおよび（ｂ）ピロリ菌ＧｌｕＲＳ２（ＮＤ）酵素のＩＭＡＣ精製プロファイルを示している。
【図９】図９は、（ａ）Ａ２９４Ｇを含むアミノ酸認識部位およびアンチコドン認識部位を図示している相同のＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＰｈｅＲＳの二量体の構造、（ｂ）６×Ｈｉｓでタグ化された（配列番号１３）ＰｈｅＳ（Ａ２９４Ｇ）ドメインによる二量体複合体のプルダウン（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ）を示している、無細胞生成されたＰｈｅＲＳ（Ａ２９４Ｇ）のＩＭＡＣ精製プロファイルを示している。
【図１０】図１０は、無細胞タンパク質合成によって生成されたいくつかのＰｈｅＲＳ（Ａ２９４Ｇ、Ａ７９４Ｘ）バリアントの精製を示している。
【図１１】図１１は、ＰｈｅＲＳ（Ａ２９４Ｇ）によって３０分間触媒された［３０−３２Ｐ］
【００３６】
【化６】
0005798489.tif 000006
のＰｈｅアミノアシル化のパーセントの解析を示している。（ｂ）
【００３７】
【化７】
0005798489.tif 000007
の（ａ）Ｐ１ヌクレアーゼ消化によって［３２Ｐ］Ｐｈｅ−ＡＭＰがもたらされ、それは、ＰＥＩセルロースＴＬＣプレート上で遊離［３２Ｐ］ＡＭＰから分離され得、オートラジオグラフィーを用いて像を得ることができる。
【図１２】図１２は、様々な条件下でＰｈｅＲＳ（Ａ２９４Ｇ）によって触媒された
【００３８】
【化８】
0005798489.tif 000008
バリアントのパラ−アセチルＰｈｅ（ｐＡＦ）アミノアシル化のパーセントの解析（末端標識された［３２Ｐ］−３’ｔＲＮＡを用いるオートラジオグラフィーによって測定したもの）を示している。
【図１３】図１３は、オートラジオグラフィーによって測定したときの、（ａ）
【００３９】
【化９】
0005798489.tif 000009
および（ｂ）
【００４０】
【化１０】
0005798489.tif 000010
の形成の時間依存性を示している。
【図１４】図１４は、（ａ）最適化された条件下で［３２Ｐ］−３’ｔＲＮＡ末端標識アッセイを用いて測定したとき、大腸菌ＧｌｕＲＳが
【００４１】
【化１１】
0005798489.tif 000011
を同族のグルタメートで強くアミノアシル化し得ることを示している。モノ−フルオログルタメート（Ｆ−Ｇｌｕ）ＡＭＰは、これらのクロマトグラフィー条件下では［３２Ｐ］−ＡＭＰと分離されない。（ｂ）ピロリ菌ＧｌｕＲＳ２（ＮＤ）は、ピロリ菌
【００４２】
【化１２】
0005798489.tif 000012
をＧｌｕおよびＦ−Ｇｌｕでアミノアシル化し得るが、Ｆ−Ｇｌｕ  ＡＭＰは、これらのクロマトグラフィー条件下ではＡＭＰと分離されない。
【図１５】図１５は、（ａ）疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いた、
【００４３】
【化１３】
0005798489.tif 000013
からの、アミノアシル化された
【００４４】
【化１４】
0005798489.tif 000014
との分離、および（ｂ）酸−尿素ゲル電気泳動による、アミノアシル化された
【００４５】
【化１５】
0005798489.tif 000015
２’，３’環状リン酸のクロマトグラフィーの移動度を示している。
【図１６】図１６は、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いた、（ａ）アミノアシル化された
【００４６】
【化１６】
0005798489.tif 000016
と
【００４７】
【化１７】
0005798489.tif 000017
との分離、および（ｂ）
【００４８】
【化１８】
0005798489.tif 000018
と
【００４９】
【化１９】
0005798489.tif 000019
との分離を示している。
【図１７】図１７は、酸／尿素ゲル電気泳動によって測定されたときの、（ａ）野生型大腸菌ｔＲＮＡＧｌｕおよび（ｂ）インビトロにおいて転写された大腸菌
【００５０】
【化２０】
0005798489.tif 000020
が、モノ−フルオログルタメートで強くチャージされ得ることを示している。
【図１８】図１８は、抽出物に加えられたリジン、フェニルアラニンまたはグルタミン酸の濃度に対するＧＭＣＳＦの無細胞合成収量を示している。
【図１９】図１９は、（ａ）操作されたイソ受容ｔＲＮＡの内因性大腸菌ＰｈｅＲＳによるバックグラウンドリチャージを含む、無細胞合成反応における蛍光ｔｕｒｂｏＧＦＰへの非天然アミノ酸の組み込みに関与する種の線図、（ｂ）ＰｈｅＲＳの活性部位特異的インヒビターである５’−Ｏ−［Ｎ−（フェニルアラニル）スルファモイル］アデノシン，Ｐｈｅ−ＳＡの化学構造、および（ｃ）加えられたインヒビターＰｈｅ−ＳＡ（ＩＣ５０＝０．８ｎＭ）またはＧｌｕ−ＳＡ（ＩＣ５０＝５４ｎＭ）に応じた、ｔｕｒｂｏＧＦＰの無細胞合成の速度の阻害に対するＩＣ５０の測定を示している。
【図２０】図２０は、ｔｕｒｂｏＧＦＰ無細胞合成の速度に対する、加えられたＰｈｅアミノ酸と［Ｐｈｅ−ＳＡ］インヒビターとの関係を記載している反応表面を示している。
【図２１】図２１は、モノチャージ組み込みを説明している模式図を示している。
【図２２】図２２は、５０位におけるパラ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）の組み込みを確立するために使用されたｔｕｒｂｏＧＦＰ  Ｙ５０ＴＡＧアンバーサプレッサータンパク質の顕著な特色を図示している。
【図２３】図２３は、様々な濃度のＰｈｅ−ＳＡインヒビターの存在下における、ＧＦＰ発色団の上流に位置するアンバー（ＵＡＧ）コドンの抑制に対する、蛍光レポーターとしてのｔｕｒｂｏＧＦＰＹ５０ＴＡＧの無細胞合成についての時間経過を示している。チャージされていない約２０μＭの
【００５１】
【化２１】
0005798489.tif 000021
またはおよそ７０％のチャージした
【００５２】
【化２２】
0005798489.tif 000022
を、時間ゼロにおいて反応物に加えた。（●）は、ｔｕｒｂｏＧＦＰＹ５０コントロールである。
【図２４】図２４は、（ａ）
【００５３】
【化２３】
0005798489.tif 000023
の構造、（ｂ）
【００５４】
【化２４】
0005798489.tif 000024
の存在下において行われた無細胞反応物のＳＤＳ  ＰＡＧＥ解析、および（ｃ）蛍光性のタンパク質合成反応産物の逆相ＨＰＬＣ精製を示している。
【図２５】図２５は、ｐＡＦを組み込むためのタンパク質の無細胞翻訳における、アミノ酸と、ｔＲＮＡ合成酵素と、イソ受容（ｉｓｏａａｃｃｅｐｔｉｎｇ）ｔＲＮＡとの間の様々な同族相互作用（太い黒線）、非同族相互作用（細い灰色線）または弱い非同族相互作用（太い灰色線）を示している。ＰｈｅＲＳおよびＰｈｅと
【００５５】
【化２５】
0005798489.tif 000025
との弱い非同族相互作用は、図２３に示されるようなｔｕｒｂｏＧＦＰＹ５０ＴＡＧ鋳型を含む無細胞合成反応物に
【００５６】
【化２６】
0005798489.tif 000026
が加えられたときに観察された低速のタンパク質合成として反映される。
【図２６】図２６は、改変され、コドン交換されたＧＭ−ＣＳＦ遺伝子が、ＴＴＴ  Ｐｈｅ１２０位におけるｐＡＦの組み込みのために使用されることを示している。
【図２７】図２７は、ＧＭ−ＣＳＦへのｐ−アセチル（ａｃｅｔｙ）Ｐｈｅの組み込みの逆相ＨＰＬＣ解析の結果を示している。
【図２８】図２８は、本明細書中に記載されるような無細胞タンパク質合成システムを示している概略図である。この実施例では、天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、細胞溶解前に枯渇され、２種類の外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（その各々が、異なるイソ受容センスｔＲＮＡ分子を認識する）で置き換えられている。天然ａａＲＳとは、天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素のことを指す。外因性ａａＲＳ１およびａａＲＳ２とは、外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素のことを指す。ｔＲＮＡ２とは、第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によって特異的にチャージされる第２イソ受容センスｔＲＮＡのことを指す。ＮＡＡは、天然アミノ酸を表し、ｎｎＡＡは、非天然アミノ酸を表す。
【図２９】図２９は、本明細書中に記載されるような無細胞タンパク質合成システムを示している概略図である。この実施例では、天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、細胞溶解後に枯渇され、第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、宿主細胞集団において発現される。省略形は、図２７において使用されたものと同じである。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
発明の詳細な説明
Ｉ．緒言
本発明は、無細胞合成システムを用いて、タンパク質の事前に選択された位置に非天然アミノ酸を組み込む新規手段を提供する。本方法は、遺伝暗号によってコードされる非直交性で天然のイソ受容センスｔＲＮＡの使用を含む。このような方法は、直交アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素に頼らずに、センスコドンを使用することによって数多くの非天然アミノ酸を組み込むことを可能にする。
【００５８】
本発明にとって重要なことは、そのようなｔＲＮＡが、本来、天然では同じアミノ酸でチャージされるにもかかわらず、天然または非天然のアミノ酸をタンパク質に差次的に組み込むイソ受容センスｔＲＮＡを利用することである。本発明は、天然アミノ酸をタンパク質に組み込む（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｖｅ）能力を損なわずに、ｍＲＮＡセンスコドン配列に基づいて非天然アミノ酸を伸長中のポリペプチド鎖に組み込むために遺伝暗号の縮重を活用する。細胞を溶解した後、タンパク質合成に必要なすべての細胞成分を含む溶解産物を作製する。次いで、非天然アミノ酸が組み込まれる位置を指定するセンスコドンを有する核酸鋳型を加える。天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、一般に、両方のイソ受容センスｔＲＮＡをチャージする能力を有するので、いくつかの実施形態では、タンパク質合成反応の前に目的の天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が溶解産物から枯渇されることにより、チャージされていないイソ受容センスｔＲＮＡ分子が、望まれないアミノ酸でチャージされることが防がれる。天然アミノ酸でチャージされる第１イソ受容センスｔＲＮＡは、溶解産物中で直接チャージされる。天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が枯渇される実施形態では、第１イソ受容センスｔＲＮＡだけを選択的にチャージする第１外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を溶解産物に加えることが必要である。その第１外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、細胞を溶解する前に宿主細胞集団において発現されていてもよいし、細胞を溶解した後に溶解産物に直接加えられてもよい。他の実施形態では、天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、枯渇されない。代わりに、第２イソ受容ｔＲＮＡが不活性化され、そして天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、単純に、第１イソ受容ｔＲＮＡをチャージするように放置される。
【００５９】
第２イソ受容ｔＲＮＡは、別個のｔＲＮＡチャージ反応において非天然アミノ酸でチャージされ、アミノアシル化される。タンパク質合成反応とは別の反応において非天然アミノ酸だけが、１種類のイソ受容センスｔＲＮＡにチャージされるので、本発明のこの局面は、「モノチャージ（ｍｏｎｏ  ｃｈａｒｇｉｎｇ）」と呼ばれる。アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が別個のチャージ反応のために利用されるか否かに関係なく、ｔＲＮＡ分子をアミノアシル化するいずれの方法も十分である。例えば、精製リボザイムまたは任意の機能的なアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、第２イソ受容センスｔＲＮＡ分子を別々にチャージするために使用され得る。次いで、非天然アミノ酸でチャージされた第２イソ受容センスｔＲＮＡが、チャージ反応混合物から精製される（その精製は、その反応容器において使用され得る任意のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素からの単離を含む）。次いで、非天然アミノ酸でアミノアシル化された上記精製イソ受容センスｔＲＮＡ分子が、溶解産物に加えられ、イソ受容センスｔＲＮＡによって認識される様々な配列によって指定される位置に天然アミノ酸と非天然アミノ酸の両方を含む所望のタンパク質を生成するように、タンパク質合成反応が起きる。
【００６０】
非天然アミノ酸を含むタンパク質の用途には、タンパク質の構造および／または機能の所望の変更が含まれ、その変更としては、サイズ、酸性度、求核性、水素結合、疎水性またはプロテアーゼ標的部位の到達性の変更が挙げられ得る。非天然アミノ酸を含むタンパク質は、向上した触媒的特性もしくは物理的特性または全く新しい触媒的特性もしくは物理的特性（例えば、改変された、毒性、体内分布、構造的特性、分光学的特性、化学的特性および／または光化学的特性、触媒能、血清半減期、ならびに他の分子と共有結合的または非共有結合的に反応する能力）を有し得る。少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むタンパク質は、以下に限定されないが、新規の治療学、診断学、触媒性酵素、結合タンパク質、ならびにタンパク質の構造および機能の研究に有用である。
【００６１】
本発明の無細胞で非天然アミノ酸を組み込む方法は、当該分野において以前に使用されていた非天然アミノ酸の組み込み方法と異なる。最も著しくは、本発明は、センスコドンを認識するイソ受容ｔＲＮＡを使用するものであり、非天然アミノ酸を組み込むために、直交ｔＲＮＡおよび直交アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を利用しなければならないという必要性を回避するものである。直交ｔＲＮＡの使用は、本質的に非効率的なサプレッサーｔＲＮＡに頼るものである。この非効率性は、終結因子と競合する本質的に非効率的なサプレッサーｔＲＮＡに加えて、異なる２０種類のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素のｔＲＮＡチャージ活性およびプルーフリーディング活性によって触媒される自然アミノ酸による非直交センスコドンでの競合の結果（ｒｅｓｕｌｔ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）である。このことにより、３種類の終止コドンのうちのただ１つ：ＵＡＧ「アンバー」コドンにおいて、１つのタンパク質あたりただ１つの非天然アミノ酸の選択的な組み込みがもたらされる。そのうえ、アンバー終止コドンを利用して非天然アミノ酸を組み込む直交タンパク質合成システムは、リボソームによる読み過ごしに起因して、第２終止コドンにおいて終結しないことが多い。例えば、Ｃｌｏｕｄら、Ｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｌ．３：１０３３−３８（１９９６）を参照のこと。非天然アミノ酸を組み込むためにセンスコドンの認識を利用する試みが行われているが（例えば、Ｔａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２７９−９０（２００５）；Ｆｏｒｓｔｅｒら、米国特許第６，９７７，１５０号を参照のこと）、そのような純粋な再構成翻訳システムは、精製された翻訳成分を必要とし、これは、研究の状況を除いては非現実的であって非常に費用のかかるものであり、高度に効率的であると示されていない。
【００６２】
本タンパク質合成反応は、上に記載したような所望のタンパク質をコードする核酸を得る工程、天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を欠くが、イソ受容センスｔＲＮＡをチャージすることができるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を含む、上に記載したような溶解産物を得て、そのイソ受容センスｔＲＮＡが、溶解産物中で直接、天然アミノ酸でチャージされることを可能にする工程、別個のｔＲＮＡチャージ反応において非天然アミノ酸でチャージされた別のイソ受容センスｔＲＮＡを得る工程、ならびに核酸および非天然アミノ酸でチャージされたイソ受容センスｔＲＮＡを細胞溶解産物と混合することにより、タンパク質合成反応混合物を形成する工程によって実施される。
【００６３】
改変タンパク質は、所望のタンパク質、選択されたタンパク質または標的タンパク質とも呼ばれ得る。本明細書中で使用されるとき、改変タンパク質とは、通常、約５より多いアミノ酸を有する任意のペプチドまたはタンパク質のことを指す。改変タンパク質は、所定の部位に少なくとも１つの非天然アミノ酸を含み、複数の非天然アミノ酸を含み得る。非天然アミノ酸が、ポリペプチド内の２つ以上の部位に存在する場合、それらの非天然アミノ酸は、同じであり得るか、または異なり得る。非天然アミノ酸が異なる場合、各非天然アミノ酸に対するｔＲＮＡコドンもまた、異なる。
【００６４】
改変タンパク質（例えば、細菌の無細胞抽出物において生成される、ヒトタンパク質、ウイルスタンパク質、酵母タンパク質など）は、無細胞溶解産物が由来する細胞と同種であってもよいし、異種、すなわち、外来であることを意味する外因性であってもよい。改変タンパク質としては、分子、例えば、レニン、ヒト成長ホルモンを含む成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ−１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子およびフォン・ビルブラント因子）；プロテインＣなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；プラスミノゲンアクチベーター（例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ））；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−アルファおよび−ベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌｌｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；レラキシンＡ鎖；レラキシンＢ鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；ベータ−ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；ＤＮａｓｅ；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子に対するレセプター；インテグリン；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子（例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６））またはＮＧＦ−（３などの神経成長因子；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦおよびｂＦＧＦなどの線維芽細胞成長因子；上皮成長因子（ＥＯＦ）；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）（例えば、ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータ（ＴＧＦ−（３１、ＴＧＦ−（３２、ＴＧＦ−（３３、ＴＧＦ−（３４，またはＴＧＦ−（３５を含む））；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（ｌ−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質（例えば、ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８およびＣＤ−Ｉ９）；エリトロポイエチン；骨誘導因子（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒｓ）；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン（例えば、インターフェロン−アルファ、−ベータおよび−ガンマ）；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン；調節タンパク質；抗体；および上に列挙したポリペプチドの��ずれかのフラグメントが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００６５】
ＩＩ．定義
「アミノアシル化」または「アミノアシル化する」とは、ｔＲＮＡがその正しいアミノ酸で「チャージされる」完全なプロセス（アミノアシル基を化合物に付加する結果であるプロセス）のことを指す。「アミノアシル化」または「アミノアシル化する」が本発明に関係するとき、アミノアシル化を受けるｔＲＮＡまたはアミノアシル化されたｔＲＮＡは、アミノ酸でチャージされたｔＲＮＡであり、アミノアシル化を受けるアミノ酸またはアミノアシル化されたアミノ酸は、ｔＲＮＡ分子にチャージされたアミノ酸である。
【００６６】
「アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素」または「ｔＲＮＡ合成酵素」または「合成酵素」または「ａａＲＳ」または「ＲＳ」とは、アミノ酸とｔＲＮＡ分子との間の共有結合を触媒する酵素のことを指す。これは、エステル結合を介して付着されたそれぞれのアミノ酸を有するｔＲＮＡ分子である、「チャージされた」ｔＲＮＡ分子または「アミノアシル化された」ｔＲＮＡ分子をもたらす。
【００６７】
「結合部分」とは、タンパク質上に遺伝的に操作されるタグのことを指す。そのようなタグとしては、Ｈｉｓ−タグ、ＧＦＰ−タグ、ＧＳＴ−タグ、ＦＬＡＧ−タグなどが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００６８】
「捕捉部分」とは、望まれないアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を反応混合物から除去することに関与する分子会合の一部である任意の基質またはリガンドのことを指す。そのようなリガンドまたは基質部分としては、抗体、親和性支持体、マトリックス、樹脂、カラム、コーティングされたビーズが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００６９】
「触媒性のアミノアシル化試薬」とは、ｔＲＮＡ分子をチャージする能力を有する任意の酵素または分子のことを指す。そのようなアミノアシル化試薬とは、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素またはリボザイムカラムのことを指し得るが、これらに限定されない。
【００７０】
「無細胞合成システム」とは、生物学的抽出物および／または規定の試薬を含む反応混合物中におけるポリペプチドのインビトロ合成のことを指す。その反応混合物は、高分子、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどを生成するための鋳型；合成される高分子に対するモノマー、例えば、アミノ酸、ヌクレオチドなど；ならびに合成に必要な補因子、酵素および他の試薬、例えば、リボソーム、チャージされていないｔＲＮＡ、非自然アミノ酸でチャージされたｔＲＮＡ、ポリメラーゼ、転写因子などを含み得る。
【００７１】
「チャージしたｔＲＮＡ（ｃｈａｒｇｅｄ  ｔＲＮＡ）」または「アミノアシル化されたｔＲＮＡ」とは、アミノ酸付着部位において結合されたアミノ酸を有するｔＲＮＡ分子のことを指す。タンパク質合成中、そのアミノ酸は、伸長中のポリペプチド鎖に運搬され、ｔＲＮＡを放出する（そのｔＲＮＡは、「放出されたｔＲＮＡ」と呼ばれる）。
【００７２】
「チャージ反応混合物」とは、イソ受容センスｔＲＮＡがそのそれぞれのアミノ酸でチャージされるインビトロ反応混合物のことを指す。その混合物は、チャージされる特定のコドン配列とともにイソ受容ｔＲＮＡを含む。自然、非天然および／または恣意的な（ａｒｂｉｔｒａｒｙ）ｔＲＮＡを自然、非天然および／または恣意的なアミノ酸でチャージするための方法は、当該分野で公知であり、その方法としては、化学的アミノアシル化、生物学的ミスアシル化、改変されたアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素によるアシル化、リボザイムベースの方法およびタンパク質核酸に媒介される方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
「縮重コドン」とは、１種類のアミノ酸が１種類より多いコドンによってコードされ得るような、遺伝暗号の縮重のことを指す。コドンは、アミノ酸を指定する３ヌクレオチド配列である。縮重は、６４種類のコドンが存在し得るにもかかわらず、すべてのタンパク質がたった２０種類のアミノ酸から構成される結果である。
【００７４】
「ＤＮＡ」とは、共有結合的に結合された、天然に存在するかまたは改変された２つ以上のデオキシリボヌクレオチドの配列のことを指す。
【００７５】
「外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素」とは、細胞溶解産物を生成する細胞によって内因的に産生されない任意のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素のことを指す。外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、本発明に関係するとき、宿主細胞内で発現され得る。外因性合成酵素が、宿主細胞内で発現される場合、その外因性合成酵素は、内因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素と協力して機能し得るか、または内因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、本明細書中に記載される方法のいずれかによって非機能性にされる場合、その内因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を機能的に置き換え得る。さらに、外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、発現されて精製され得、続いて、ｔＲＮＡチャージ反応物または無細胞タンパク質合成反応物に加えられ得る。外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、タンパク質合成抽出物が由来する宿主細胞またはそのような合成酵素を発現することができる他の任意の細胞から精製され得る。外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、組換えの天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素または組換えの非天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素であり得る。
【００７６】
「遺伝子」とは、特定の染色体位置を有するＤＮＡの配列からなる遺伝的単位のことを指す。遺伝子は、発現されることにより、タンパク質産物を生成する。
【００７７】
「異種」は、本発明に関係するとき、発現される宿主細胞とは異なる種が起源であるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素のことを指す。
【００７８】
「イソ受容センスｔＲＮＡ」とは、同じアミノ酸に対する代わりのコドンに結合する様々なｔＲＮＡ種のことを指す。
【００７９】
「溶解産物」は、タンパク質合成機構に必要な成分を含む、任意の細胞に由来する調製物であり、ここで、そのような細胞成分は、所望のタンパク質をコードする核酸を発現することができ、ここで、生物学的成分の大部分は、再構成された濃縮物ではなく、細胞の溶解に起因する濃縮物中に存在する。さらなる細胞成分、例えば、アミノ酸、核酸、酵素などが溶解産物に補充されるように、その溶解産物は、さらに変更され得る。溶解産物はまた、溶解された後にさらなる細胞成分が除去されるように変更され得る。
【００８０】
「天然アミノ酸」とは、遺伝暗号によってコードされる天然に存在する１つ以上のアミノ酸のことを指す。「内因性天然アミノ酸」とは、溶解産物を生成するために使用される宿主細胞によって産生される天然アミノ酸のことを指す。
【００８１】
「天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素」とは、天然に見られる、宿主細胞のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素のことを指す。天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、本発明によって規定されるように、合成され得、そして溶解産物またはｔＲＮＡ反応容器に外因的に加えられ得る。天然アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素としては、植物、微生物、原核生物、真核生物、原生動物、細菌、哺乳動物、酵母、大腸菌またはヒトのうちの１つ以上に由来する自然アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
「天然のイソ受容センスｔＲＮＡ」とは、無細胞タンパク質合成反応のために使用される溶解産物を作製するために使用される細胞の宿主集団によって生成される第１または第２イソ受容センスｔＲＮＡのことを指す。
【００８３】
「非天然アミノ酸」または「ｎｎＡＡ」とは、すべてのタンパク質に対する構成要素であるが、タンパク質に組み込まれるように生物学的に操作されることが可能な、天然に存在する２０種類のアミノ酸のうちの１つではないアミノ酸のことを指す。非天然アミノ酸には、天然に存在する２０種類のアミノ酸のうちの１つのＤ−ペプチドエナンチオマーまたは任意の翻訳後修飾が含まれ得る。多種多様の非天然アミノ酸が、本発明の方法において使用され得る。非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸の所望の特徴、例えば、非天然アミノ酸の機能（例えば、タンパク質の生物学的特性（例えば、毒性、体内分布または半減期）、構造的特性、分光学的特性、化学的特性および／または光化学的特性、触媒的特性、他の分子と（共有結合的または非共有結合的に）反応する能力などの改変）に基づいて選択され得る。本発明の方法において使用され得る非天然アミノ酸としては、チロシンアミノ酸の非天然アナログ；グルタミンアミノ酸の非天然アナログ；フェニルアラニンアミノ酸の非天然アナログ；セリンアミノ酸の非天然アナログ；トレオニンアミノ酸の非天然アナログ；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｙｎｌ）、エーテル、チオール、スルホニル（ｓｕｆｏｎｌｙ）、セレノ、エステル、チオ酸、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環式、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケトもしくはアミノで置換されたアミノ酸またはそれらの任意の組み合わせ；光活性化可能な架橋剤を有するアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；新規官能基を有するアミノ酸；別の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用するアミノ酸；金属結合アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージド（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）アミノ酸および／または光異化可能な（ｐｈｏｔｏｉｓｏｍｅｒｉｚａｂｌｅ）アミノ酸；ビオチン含有またはビオチンアナログ含有アミノ酸；グリコシル化されたアミノ酸または炭水化物で改変されたアミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸；重原子で置換されたアミノ酸；化学的に切断可能なアミノ酸または光切断可能なアミノ酸；長い側鎖を有するアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖で置換されたアミノ酸、例えば、糖で置換されたセリンなど；炭素結合型糖を含むアミノ酸、例えば、糖で置換されたセリンなど；炭素結合型糖を含むアミノ酸；酸化還元活性の１つのアミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；α，α二置換アミノ酸；β−アミノ酸；プロリン（ｐｒａｌｉｎｅ）以外の環状アミノ酸などが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００８４】
「ポリペプチド」または「ペプチド」または「タンパク質」とは、１つ以上のペプチド結合によって結合された２つ以上の天然に存在するアミノ酸のことを指す。
【００８５】
「反応容器」とは、ｔＲＮＡチャージ反応が起きる封じ込め物のことを指す。
【００８６】
「リボザイム」とは、化学反応を触媒することができるＲＮＡ分子のことを指す。リボザイムは、本発明に関係するとき、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素とは無関係の、ｔＲＮＡ分子をチャージするようなアミノアシル化活性を有する。
【００８７】
「ＲＮＡ」とは、２つ以上の共有結合的に結合された、天然に存在するリボヌクレオチドまたは改変されたリボヌクレオチドの配列のことを指す。
【００８８】
「センスコドン」とは、アミノ酸を指定する、タンパク質コード配列における１組の３ヌクレオチドのことを指す。センスコドンは、本発明において使用されるとき、終止シグナルまたは終止コドンを含まない。
【００８９】
「ｔＲＮＡ」または「転移ＲＮＡ」とは、翻訳中のタンパク質合成のリボソーム部位において特定のアミノ酸を伸長中のポリペプチド鎖に運搬する小さいＲＮＡ分子のことを指す。ｔＲＮＡは、対応するｍＲＮＡコドンと対形成する３塩基コドンを含む。遺伝暗号の縮重の結果として、アミノ酸は、複数のｔＲＮＡと会合し得るが、各タイプのｔＲＮＡ分子は、１タイプのアミノ酸とだけ会合し得る。
【００９０】
「ｔＲＮＡチャージ反応」とは、アミノ酸が自然であるか天然でないかに関係なく、合成された天然ｔＲＮＡがタンパク質合成反応とは別にそのそれぞれの前記アミノ酸でチャージされる反応のことを指す。
【００９１】
「ｔＲＮＡ：非天然アミノ酸をチャージした部分」とは、通常、イソ受容第１ｔＲＮＡ分子に対するイソ受容ｔＲＮＡ分子であるが、天然アミノ酸の代わりに非天然アミノ酸でチャージされたｔＲＮＡ分子のことを指す。
【００９２】
細胞または細胞の集団を「形質転換する」とは、宿主細胞または溶解産物が由来する細胞の遺伝子発現の変更のことを指す。細胞を形質転換するとは、本発明において使用されるとき、組換えタンパク質を発現する外因性核酸配列が導入されるように細胞が変更されるプロセスのことを指す。
【００９３】
ＩＩＩ．鋳型
本発明のタンパク質を生成するためには、核酸鋳型が必要である。無細胞タンパク質合成用の鋳型は、ｍＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。その鋳型は、任意の特定の目的の遺伝子をコードすることができ、完全長ポリペプチドまたはその任意の長さのフラグメントをコードし得る。鋳型の配列決定に役立つ核酸は、必要に応じて自然の起源に由来するか、または合成もしくは組換えのものであり得る。例えば、ＤＮＡは、組換えＤＮＡ、例えば、プラスミド、ウイルスなどであり得る。本発明の性質は、非天然アミノ酸を組み込むためにセンスコドンを使用し、当該分野で通常見られるような直交性の成分の必要性を回避する。結果として、本発明の好ましい実施形態は、非天然アミノ酸が組み込まれるために選択されるか否かに関係なく、完全かつ機能的なタンパク質を翻訳することができる鋳型を使用する。
【００９４】
目的の遺伝子を含むＤＮＡ鋳型は、少なくとも１つのプロモーターおよび１つ以上の他の調節配列（リプレッサー、アクチベーター、転写エンハンサーおよび翻訳エンハンサー、ＤＮＡ−結合タンパク質などを含むがこれらに限定されない）に作動可能に連結される。本明細書中で使用するための適当量のＤＮＡ鋳型は、周知のクローニングベクターおよび宿主において、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、そのＤＮＡを増幅することによって生成され得る。
【００９５】
好ましい実施形態では、細菌の溶解産物が使用される。ＤＮＡ鋳型は、所望のタンパク質をコードするＤＮＡをプロモーター配列と細菌のリボソーム結合部位（シャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ）配列）の両方に作動可能に連結することによって、細菌での発現のために構築される。本発明の無細胞転写−翻訳方法におけるそのＤＮＡ鋳型との使用に適したプロモーターには、細菌抽出物が由来する細菌においてインビボで転写を促進することができる任意のＤＮＡ配列が含まれる。宿主細胞内で転写を効率的に開始することができるプロモーターが好ましい。所望のタンパク質をコードするＤＮＡならびに所望のプロモーターおよびシャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列を含むＤＮＡは、当該分野で公知の種々の方法によって調製され得る。あるいは、所望のＤＮＡ配列は、既存のクローンから得ることができるか、または利用できるものがない場合は、ＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリークローンから所望のＤＮＡ配列を構築することによって得ることができる。
【００９６】
目的のタンパク質をコードするＲＮＡ鋳型は、所望の遺伝子のコード配列に作動可能に連結された細菌のリボソーム結合部位（ＳＤ配列）を有するｍＲＮＡを発現するように構築されたベクターで形質転換された組換え宿主細胞から便利に生成され得、反応混合物中のリボソームは、そのようなｍＲＮＡに結合し、翻訳することができる。したがって、そのベクターは、ＲＮＡ鋳型合成のために使用される特定の宿主細胞においてＤＮＡの転写を促進することができる任意のプロモーターを有する。
【００９７】
細菌から未分解のＲＮＡを抽出することは困難であるので、高等真核細胞培養物が、ＲＮＡ鋳型を生成するために好ましい。原則としては、脊椎動物と無脊椎動物の両方の細胞培養物を含む任意の高等真核細胞培養物が、使用可能である。そのＲＮＡ鋳型は、宿主細胞培養物から抽出された全細胞ＲＮＡ画分として便利に単離され得る。全細胞ＲＮＡは、当該分野で公知の任意の方法によって宿主細胞培養物から単離され得る。所望のＲＮＡ鋳型が、真核生物宿主細胞によって認識されるポリアデニル化シグナルを３’末端に含むように設計されている場合、そのＲＮＡ鋳型は、細胞ｍＲＮＡのほとんどとともに単離され得る。したがって、その宿主細胞は、ポリアデニレート（ポリ（Ａ））テイルを有するＲＮＡ鋳型を生成する。ポリアデニル化されたｍＲＮＡは、当該分野で公知の任意の方法を用いるオリゴデオキシチミジレート（オリゴ（ｄＴ））−セルロースカラムにおけるアフィニティークロマトグラフィーによって、細胞ＲＮＡの大部分から分離され得る。所望のタンパク質をコードするｍＲＮＡのサイズが既知である場合、そのｍＲＮＡ調製物は、そのＲＮＡのアガロースゲル電気泳動によって特定サイズのｍＲＮＡ分子についてさらに精製され得る。
【００９８】
組換え核酸を生成するための適切な分子手法の例、および多くのクローニング（ｃｌｏｓｉｎｇ）の演習を通して当業者を指導するのに十分な指示は、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．１９８７）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．１９９０）に見られる。生物学的試薬および実験機器の製造者からの製品情報もまた、公知の生物学的方法における有用な情報を提供する。そのような製造者としては、ＳＩＧＭＡ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒｓ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）ならびに当業者に公知の他の多くの商業的供給源が挙げられる。
【００９９】
ＩＶ．溶解産物の生成
本発明は、標的タンパク質のインビトロ翻訳のために細胞溶解産物を利用する。便宜のため、溶解産物の起源として使用される生物は、起源生物または宿主細胞と呼ばれることがある。宿主細胞は、細菌、酵母、哺乳動物もしくは植物の細胞、またはタンパク質合成が可能な他の任意のタイプの細胞であり得る。溶解産物は、所望のタンパク質をコードするメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を翻訳することができる成分を含み、必要に応じて、所望のタンパク質をコードするＤＮＡを転写することできる成分を含む。そのような成分としては、例えば、ＤＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡポリメラーゼ）、所望のタンパク質をコードするＤＮＡの転写を開始するために必要な任意の転写アクチベーター、転移リボ核酸（ｔＲＮＡ）、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素、７０Ｓリボソーム、Ｎ１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸、ホルミルメチオニン−ｔＲＮＡｆＭｅｔ合成酵素、ペプチジルトランスフェラーゼ、開始因子（例えば、ＩＦ−１、ＩＦ−２およびＩＦ−３）、伸長因子（例えば、ＥＦ−Ｔｕ、ＥＦ−ＴｓおよびＥＦ−Ｇ）、終結因子（例えば、ＲＦ−１、ＲＦ−２およびＲＦ−３）などが挙げられる。
【０１００】
１つの実施形態において、第１イソ受容ｔＲＮＡをチャージする第１外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が溶解前の宿主細胞において発現されていない溶解産物が調製される。別の実施形態において、第１および第２イソ受容ｔＲＮＡをチャージするそれぞれ第１と第２の両方の外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が溶解前の宿主細胞において発現されている溶解産物が調製される。ｔＲＮＡチャージ反応の前の必要なアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の貯留または枯渇は、この詳細な説明の次の項で論じられる。
【０１０１】
ある実施形態では、溶解産物が由来する細菌細胞を使用する。任意の菌株の細菌に由来する細菌の溶解産物が、本発明の方法において使用され得る。その細菌の溶解産物は、以下のとおり得ることができる。最適な細菌を、いくつかの培養培地のいずれかにおいて、当該分野で周知でありかつ特定の細菌の成長に対して従事者によって容易に最適化される成長条件下で一晩生育する。例えば、合成のための普通の環境は、グルコースおよびリン酸塩を含む培地中で生育された細菌細胞に由来する細胞溶解産物を利用し、ここで、そのグルコースは、少なくとも約０．２５％（重量／体積）、より一般には少なくとも約１％；かつ一般には多くとも約４％、より一般には多くとも約２％の濃度で存在する。そのような培地の例は、２ＹＴＰＧ培地であるが、しかしながら、大腸菌などの細菌の生育に適した多くの培地が公開されているので、当業者は、規定の栄養分の起源と未規定の栄養分の起源の両方を用いて多くの培養液をこの目的のために適応することができることを認識するだろう。細胞ペレットを適当な細胞懸濁緩衝液に懸濁し、懸濁された細胞を超音波処理によって破壊するか、懸濁された細胞を連続的な流動高圧均質化であるフレンチプレスにおいて壊すか、または効率的な細胞溶解に有用な当該分野で公知の他の任意の方法によって、一晩回収された細胞を溶解することができる。次いで、その細胞溶解産物は、遠心分離されるか、または濾過されることにより、大きなＤＮＡフラグメントが除去される。
【０１０２】
別の実施形態では、溶解産物が由来するウサギ網状赤血球細胞を使用する。網状赤血球溶解産物は、各ロットにおいて信頼できかつ一貫した網状赤血球の生成を保証するフェニルヒドラジンをウサギに注射した後に調製される。その網状赤血球を精製することにより、最終的な溶解産物の翻訳特性を別途変化させ得る混入細胞を除去する。次いで、細胞ペレットを適当な細胞懸濁緩衝液に懸濁し、懸濁された細胞を超音波処理によって破壊するか、懸濁された細胞をフレンチプレスにおいて壊すか、または効率的な細胞溶解に有用な当該分野で公知の他の任意の方法によって、上記細胞を溶解することができる。網状赤血球を溶解した後、内因性ｍＲＮＡを破壊するがゆえにバックグラウンド翻訳を減少させるために、溶解産物を小球菌ヌクレアーゼおよびＣａＣｌ２で処理する。さらにＥＧＴＡを加えることによりＣａＣｌ２をキレートし、それによってそのヌクレアーゼを不活性化する。ヘミンは、開始因子ｅＩＦ２αのインヒビターの抑制因子であるので、ヘミンもその網状赤血球溶解産物に加えてよい。ヘミンの非存在下では、短時間のインキュベートの後、網状赤血球溶解産物におけるタンパク質合成は、停止する（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｒ．ａｎｄ  Ｈｕｎｔ，Ｔ．１９８３  Ｍｅｔｈ．Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．９６，５０）。酢酸カリウムおよび酢酸マグネシウムが、ほとんどのｍＲＮＡ種の翻訳に対して推奨されるレベルで加えられる。ウサギ網状赤血球溶解産物の調製に関するさらなる詳細については、当業者は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照することができる。
【０１０３】
ある実施形態では、コムギ胚芽溶解産物などの植物溶解産物が使用され得る。一般に、コムギ胚芽溶解産物は、コムギ胚芽を抽出緩衝液中で粉砕した後、遠心分離して細胞残屑を除去することによって調製される。次いで上清を、内因性アミノ酸および翻訳に抑制的である植物色素とクロマトグラフィーによって分離する。また、その溶解産物を小球菌ヌクレアーゼで処理することにより、内因性ｍＲＮＡを破壊し、バックグラウンド翻訳を最小限にまで減少させる。その溶解産物は、タンパク質合成に必要な細胞成分（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡならびに開始因子、伸長因子および終結因子）を含む。その溶解産物は、ホスホクレアチンキナーゼおよびホスホクレアチン（ｐｈｏｓｐｏｃｒｅａｔｉｎｅ）からなるエネルギー産生システムを加えることによってさらに最適化され、酢酸マグネシウムが、ほとんどのｍＲＮＡ種の翻訳に対して推奨されるレベルで加えられる。コムギ胚芽溶解産物の調製に関するより詳細については、例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｗ．ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（Ｖｏｌ．１０１，ｐ．６３５；１９８３）によって記載された修正に従うＲｏｂｅｒｔｓ，Ｂ．Ｅ．ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｍ．（１９７３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｖｏｌ．７０，Ｎｏ．８，ｐｐ．２３３０−２３３４）を参照のこと。
【０１０４】
溶解産物は、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．；Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉｌｌ．；およびＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．などの製造者から商業的に入手可能でもある。
【０１０５】
本発明のいくつかの実施形態において、第１外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、溶解産物に加えられなければならない。この必要性は、溶解後に天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が枯渇される実施形態、および天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、宿主細胞において、各々、特定のイソ受容センスｔＲＮＡを認識する２種類のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素で置き換えられない実施形態に存在する。この必要性はさらに、第２イソ受容ｔＲＮＡが不活性化される実施形態に存在する。これらの実施形態では、溶解産物に直接加えられる第１アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素だけが第１イソ受容センスｔＲＮＡを認識することが、肝要である。これには、第１イソ受容ｔＲＮＡに特異的なアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を操作する必要がある。イソ受容ｔＲＮＡを認識する操作されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、溶解前の宿主細胞内でも発現され得る。
【０１０６】
アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、一般にタンパク質指向進化に使用される種々の方法を用いて、イソ受容ｔＲＮＡを認識するように操作され得る。溶解産物中で直接、第１イソ受容センスｔＲＮＡをチャージすることができる新規アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を生成するために使用される様々なタイプの突然変異誘発が、当該分野で周知である。例えば、Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１００９２−７（１９９７）を参照のこと。Ｌｉｕらは、変異アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素のライブラリーを生成するために、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発とともにＤＮＡシャフリング（ランダム点突然変異誘発およびインビトロ相同組換え）を利用した。次いで、それらの合成酵素を、所望のｔＲＮＡを選択的にチャージする能力について選択した。これらおよび他のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の操作手法は、当該分野で周知である。アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を操作する他の適当な方法は、インビトロでのｔＲＮＡのアミノアシル化が説明される以下でさらに論じられる。
【０１０７】
Ｖ．天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の枯渇
本発明は、イソ受容センスｔＲＮＡを天然または非天然のアミノ酸で差次的にチャージすることを必要とする。それゆえ、本発明のいくつかの実施形態は、チャージされていないイソ受容センスｔＲＮＡ分子が、溶解産物内で第２センスコドンに対する非天然アミノ酸と競合し得る間違った天然アミノ酸でチャージされることを防ぐための、天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の枯渇を含む。天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、宿主細胞集団を溶解する前に細胞溶解産物から、または宿主細胞集団を溶解した後に溶解産物から直接、枯渇され得る。本発明のいくつかの実施形態はさらに、溶解後に溶解産物から第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を枯渇するための方法を提供する。
【０１０８】
Ａ．溶解前の天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の枯渇
天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が溶解前に細胞溶解産物から枯渇される実施形態において、その天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、捕捉部分と呼ばれるタグに融合されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素で置き換えられるように、宿主細胞集団が変更され得る。その天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、不安定であるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素でも置き換えられ得る。その天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、前記細胞をある遺伝子で形質転換することによって置き換えられ、ここで、前記遺伝子は、天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を機能的に置き換えることができる最適な組換えアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を発現する。天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を、タグ化されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素または不安定であるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素で置き換える目的は、天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の非存在下における宿主細胞集団の生存を保ちつつ、両方のイソ受容センスｔＲＮＡをチャージすることができるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を溶解産物から除く単純な様式を提供することである。天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素または捕捉部分に融合された天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を枯渇させる方法は、以下でさらに詳細に論じられる。
【０１０９】
天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が溶解前に細胞溶解産物から枯渇される他の実施形態では、天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、第１および第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素で置き換えられるように、宿主細胞集団が変更され得る。第１および第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の各々は、それぞれ第１および第２イソ受容センスｔＲＮＡを特異的にアミノアシル化する。その天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、前記細胞を２つの遺伝子で形質転換することによって置き換えられ、ここで、１つの遺伝子は、第１外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を発現し、第２の遺伝子は、第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を発現する。これを達成することができる１つの方法は、イソ受容センスｔＲＮＡに特異的であり、天然に見られる差別的なアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を使用することによるものである。そのようなアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、例えば、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓに存在する。例えば、Ｓａｌａｚａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００：１３８６３−６８（２００３）を参照のこと。
【０１１０】
天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を、異なるイソ受容センスｔＲＮＡを選択的にチャージする２種類のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素で置き換える目的は、第１センスコドンが細胞溶解産物中において天然アミノ酸で直接アミノアシル化される機構を提供することである。これは、天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を後に除去しなくても、または精製された第１アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を溶解産物に直接加えなくても、起きる。これらの実施形態において、第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、第２イソ受容センスｔＲＮＡが天然アミノ酸でチャージされることを防ぐために、溶解産物から枯渇されなければならない。これらの実施形態における溶解産物からの第２アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の枯渇は、以下で論じられる。
【０１１１】
溶解前に天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を機能的に置き換える組換えアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を使用するとき、天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の発現が阻害されるように宿主細胞を変化させる必要もある。これは、当該分野で公知の任意の方法によって達成され得、その方法としては、合成酵素のｍＲＮＡをコードするＤＮＡ配列全体に対して欠失を有する宿主細胞株を作製すること；結果として得られる任意の合成酵素タンパク質が機能的でなくなるように合成酵素のｍＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の一部を欠失させること（欠失された部分は、エキソン、イントロン、プロモーターまたはエンハンサー配列を含み得る）；またはその合成酵素の機能を破壊するかまたは完全に阻害するように機能する任意のタイプの外因性介在配列（例えば、トランスポゾン）を内因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素のコード配列もしくは調節配列に導入することが挙げられるがこれらに限定されない。内因性遺伝子の機能を破壊する方法は、当該分野で周知であり、論じたこれらだけに限定されるべきでない。そのような方法は、当該分野で周知であり、分子生物学の実施にとって通常のものである。そのような手法に関するさらなる詳細については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２０００）を参照のこと。
【０１１２】
溶解前に天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を機能的に置き換えるためにアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が捕捉部分に融合される実施形態では、両方のイソ受容センスｔＲＮＡを同じアミノ酸でアミノアシル化し得る任意の交差反応性を防ぐために、その捕捉部分に融合されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素自体が、溶解後に溶解産物から枯渇されなければならない。捕捉部分に融合されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、タグ化されたタンパク質を溶解産物から除去することを可能にする当該分野で公知の任意の方法によって溶解産物から枯渇され得、その方法としては、アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１１３】
捕捉部分に融合されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素がアフィニティークロマトグラフィーによって細胞溶解産物から枯渇される実施形態では、当該分野で公知の種々のタグが利用され得る。通常のタグは、例えば、ニッケルイオンまたはコバルトイオンに対して親和性を有するヒスチジン−タグ（Ｈｉｓ−タグ）である。本明細書中、枯渇されるタグ化されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、発現されたタンパク質の一部として存在するＨｉｓ−タグを有する所望の合成酵素を発現する組換えタンパク質に操作され得る。ニッケルイオンまたはコバルトイオンが樹脂カラム上に固定化される場合、ヒスチジンタグ化されたタンパク質に特異的に結合する親和性支持体が、作製され得る。ニッケルイオンまたはコバルトイオンで固定化された樹脂は、本発明に関するとき、結合部分である。Ｈｉｓタグを有する、溶解産物中の唯一のタンパク質が、Ｈｉｓ−タグに融合されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素であるので、その合成酵素は、上記樹脂に結合する唯一のタンパク質である（その結果、他のすべてのタンパク質がそのカラムを通過する）。このような手法は、当該分野で周知であり、Ｈｉｓ−タグベクターは、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｒｏｔｋｒｅｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｓａｎ  Ｌｕｉｓ  Ｏｂｉｓｐｏ，Ｃａｌｉｆ．）およびＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）などの製造者から商業的に入手可能である。
【０１１４】
イムノアフィニティークロマトグラフィーを使用することによってもまた、捕捉部分に融合されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を溶解産物から枯渇させてもよい。イムノアフィニティークロマトグラフィーは、抗体によって認識される捕捉部分でアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素をタグ化することによって達成されるアフィニティークロマトグラフィーの方法である。その捕捉部分は、商業的に入手可能でありかつ商業的に入手可能な抗体によって認識される、任意のタグであり得る。そのようなタグとしては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグおよびＦＬＡＧ−タグタグが挙げられ得るが、これらに限定されない。イムノアフィニティークロマトグラフィー法は、当該分野で周知である。アフィニティークロマトグラフィーまたはイムノアフィニティークロマトグラフィーに関するより詳細については、例えば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９８８）およびＤｏｏｎａｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６）を参照のこと。
【０１１５】
本発明の別の実施形態では、捕捉部分に融合されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、免疫沈降によって溶解産物から枯渇され得る。この実施形態では、捕捉部分に対して抗体が産生されるが、そのようなシステムは、商業的に入手可能な組換えタグに対して産生された商業的な抗体を使用することが多い。次いで、その抗体は、固相基材の結合部分（微小超常磁性ビーズまたは微小アガロースビーズが挙げられ得るがこれらに限定されない）に固定化される。これらのビーズは、最適な基材に結合し、細胞溶解産物に加えられると、その抗体によって標的化されるタンパク質が、その基材上に結合する。あるいは、それらの抗体は、溶解産物に直接加えられ、枯渇される標的化されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素と会合することが可能になり得る。次いで、プロテインＡ／Ｇ中でコーティングされたビーズが、その抗体／アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素混合物に加えられ、その時点で、その抗体および結合した合成酵素が、プロテインＡ／Ｇビーズに結合する。次いで、その基材は、例えば、超常磁性の基材の場合は磁場を介して、または微小アガロース基材の場合は遠心分離を介して、溶解産物から除去され得る。免疫沈降法は、当該分野で周知である。例えば、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８８）を参照のこと。
【０１１６】
本発明のいくつかの実施形態において、天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、溶解前に枯渇され、熱的に不安定なアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を生成する組換えアミノアシル−ｔＲＮＡ遺伝子で宿主細胞集団を形質転換することによって機能的に置き換えられる。細胞溶解の後、熱を用いることにより、熱的に不安定なアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を分解することにより、溶解産物内のイソ受容ｔＲＮＡ分子の望まれないチャージを防ぐことができる。同様に、宿主細胞集団が、イオン的、物理的または化学的な条件下で不安定なアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を発現する組換えアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素遺伝子で置き換えられ得る。
【０１１７】
Ｂ．溶解後の天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の枯渇
溶解後に天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が細胞溶解産物から枯渇される実施形態では、捕捉部分でタグ化されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素または不安定な組換え合成酵素でアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を置き換えることは、不要である。これらの実施形態では、イムノアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降を用いることにより、内因性天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が枯渇され得る。この実施形態には、天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素に対する抗体を産生することが必要である。いったん天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を十分に認識する抗体が産生されると、上に記載したようなイムノアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降を用いることにより、天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が溶解産物から枯渇され得る。
【０１１８】
天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が細胞溶解後に枯渇される他の実施形態では、天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、枯渇されることが望まれる合成酵素に特異的なアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素インヒビターを使用して、機能的にも枯渇され得る。多くのアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素インヒビターは、特異的なアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を阻害するアミノ酸アナログであるが、特定のインヒビターは、時折、１つより多いアミノ酸と会合したアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を阻害し得る。アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素に特異的なインヒビターは、ＢｉｏＩｎｆｏＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｉａ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｐｌ／）などのデータバンクで検索することもできる。当業者は、特異的なインヒビターが、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の入手可能な構造モデルに基づいて設計され得、スクリーニングされ得、試験され得ることも容易に認識し得る。
【０１１９】
アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素インヒビターの例としては、Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン；Ｌ−アスパラギンアミド；４−アザ−ＤＬ−ロイシン；ＤＬ−セリンヒドロキサメート；プロフラビン（ヘミ硫酸塩）；Ｌ−イソロイシノール；Ｎ−フェニルグリシン；Ｌ−ロイシノール；Ｌ−メチオニノール；ｐｈｅ−ｌｅｕ−アミド；チラミン；Ｌ−イソロイシノール；３，４−デヒドロ−ＤＬ−プロリン；Ｓ−カルバミル−Ｌ−システイン；α−メチル−ＤＬ−メチオニン；クロロ−Ｌ−アラニン；ｃｉｓ−ヒドロキシプロリン；Ｌ−プロリノール；Ｌ−ヒスチジノール（ｈｉｓｔｉｄｏｎｏｌ）；Ｌ−トリプトファン（ｔｙｒｐｒｏｐｈａｎ）ヒドロキサメート；ＤＬ−４−チアイソロイシン；ＤＬ−アミノ−．イプシロン．−カプロラクタム；Ｌ−アスパラギン酸アミド；ＤＬ−β−ヒドロキシノルバリン；ｃｉｓ−４−フルオロ−Ｌ−プロリン；ｔｒａｎｓ−４−フルオロ−Ｌ−カルボン酸；α−メチル−ＤＬ−ヒスチジン；Ｎ−ホルミル−Ｌ−ヒスチジン；Ｌ−２−アミノ−３−スルファモイルプロピオン酸；Ｌ−アスパラギン酸−β−ヒドロキサメート；β−シアノ−Ｌ−アラニン；セレノシスタミン；４−アミノ−ｎ−酪酸アミド；ＤＬ−５−ヒドロキシリジン；Ｌ−リジンヒドロキサメート（ｌｙｓｉｎｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ）；３−（Ｎ−フェニルアセチル）アミノ−２，６−ピペリジンジオン（アンチネオプラストンＡ１０）；４−アミノ−４ホスホノ酪酸；エチオナミド；１，２−ジアミノ−３（４−イミダゾリル）プロパン（ヒスチジンアミン）；α−メチルヒスチジン；（Ｓ）−２−メチルブチルアミン；Ｌ−Ｏ−メチルトレオニン；ＤＬ−アルメントマイシン（２−アミノ−４，４−ジクロロ酪酸）；ＤＬ−３−デヒドロアルメントマイシン；ＤＬ−３−ヒドロキシロイシン；５，５，５−トリフルオロ−ＤＬ−ロイシン；β−（３−アミノシクロヘキシル）−ＤＬ−アラニン；ＤＬ−ｐ−クロロアンフェタミン；ｔｒａｎｓ−２，６−ジアミノヘキサ−４−エン酸；ＤＬ−２，６−ジフタルイミドカプロン酸メチルエステル；ＤＬ−５−ヒドロキシリジン；Ｌ−リジンヒドロキサメート；ＤＬ−４−オキサリジン；ＤＬ−４−セレナリジン；Ｌ−メチオニンアミド；２−アミノ−４−メチルヘキサ−４−エン酸；（１Ｓ，２Ｓ）−２−アミノ−１−フェニル−１，３−プロパンジオール；Ｎ−ベンジル−Ｄ−アンフェタミン；Ｎ−ベンジル−Ｌ−フェニルアラニン；Ｎ−ベンジル−Ｄ−フェニルエチルアミン；１，３−ビス（アセトキシ）−２−ニトロ−１−フェニルプロパン（フェニトロパン）；１，２−ジアミノ−３−（２，６−ジクロロフェニル）プロパン；１，２−ジアミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン；１，２−ジアミノ−３−フェニルプロパン；Ｎ−（２，６−ジクロロベンジリデン）−２−フェニルエチルアミン；Ｎ−（２，６−ジクロロベンジル）−２−フェニルエチルアミン；Ｎ−（４−フルオロベンジル）−Ｌ−フェニルアラニン；ＤＬ−２−フルオロフェニルアラニン；２−ヒドロキシエチル−２−フェニルアンモニウムスルフェート；α−およびβ−メチル−ＤＬ−フェニルアラニン；Ｌ−フェニルアラニノール；Ｌ−α−フェニルグリシン；ＤＬ−トレオ−β−フ��ニルセリン；β−２−チエニル−ＤＬ−アラニン；Ｎ−トリフルオロアセチル（ｔｒｉｆｌｕｒｏａｃｅｔｙｌ）−Ｌ−フェニルアラニンシクロヘキシルエステル；２−アミノメチル−４−イソプロピルオキシピロリジンオキサレート；２−アミノ−メチルピロリジン；Ｌ−４−チアプロリン；Ｎ−ベンジルエタノールアミン；Ｎ−（２，６−ジクロロベンジル）エタノールアミン；Ｎ−（２，６−ジクロロベンジリデン）エタノールアミン；ＤＬ−β−ヒドロキシロイシン；１，２−ジアミノ−５−フェニル−３−ペンタノール；ＤＬ−７−アザトリプトファン；ＤＬ−４−およびＤＬ−６−フルオロトリプトファン（ｆｌｕｒｏｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）；５−ヒドロキシトリプタミン；Ｌ−５−ヒドロキシトリプトファン；ＤＬ−α−メチルトリプタミン；α−およびβ−メチル−ＤＬ−トリプトファン；トリプタミン；ＤＬ−２−アミノ−１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−プロパノール；ＤＬ−３−フルオロチロシン；３−ヨード−Ｌ−チロシン；３−ニトロ−Ｌ−チロシン；Ｌ−チロシノール．ＨＣｌ；Ｌ−トレオ−２−アミノ−３−クロロ酪酸；ヘキサフルオロ−ＤＬ−バリン；ＤＬ−ノルバリン；Ｌ−４−チアリジン；ＤＬ−エチオニン；Ｎ，Ｎ’−ジ−ＣＢＺ−Ｌ−リジン；ＤＬ−３−フルオロフェニルアラニン；ＤＬ−４−フルオロフェニルアラニン；ならびにＤＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンが挙げられる。これらの化合物は、当該分野で公知である。
【０１２０】
Ｃ．溶解後の外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の枯渇
天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、宿主細胞内で２種類の外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によって機能的に置き換えられる実施形態では、第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、上で述べたように、溶解後に溶解産物から除去されなければならない。
【０１２１】
第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を捕捉部分に融合し、アフィニティークロマトグラフィー、捕捉部分を認識する抗体を用いるイムノクロマトグラフィーまたは捕捉部分を認識する抗体を用いる免疫沈降によって前記第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を溶解産物から枯渇させることによって、第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、細胞溶解産物から枯渇され得る。第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、不安定、例えば、熱的に不安定である場合、前記合成酵素は、さらに除去され得る。宿主細胞集団が２種類の外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を発現する実施形態では、第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素はさらに、第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を特異的に認識する抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーもしくは免疫沈降を使用することによって、または第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素に特異的な競合性インヒビターを使用することによって、溶解産物から除かれ得る。これらの手法は、天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の枯渇に関して上でさらに詳細に論じられている。
【０１２２】
上に列挙された、タンパク質を枯渇させるための方法は、当該分野において最もよく使用されるが、本発明の方法は、上に記載した手順だけに限定されるべきでない。天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を枯渇させるためのいずれの機能的手段も、本発明において特許請求されるような非天然アミノ酸を組み込む方法と適合する。
【０１２３】
無細胞溶解産物を提供する実施形態において、その溶解産物は、多種多様の細胞に由来し得る。実施形態は、ウサギ網状赤血球細胞を利用する。好ましい実施形態は、細菌細胞、詳細には、大腸菌細胞を利用する。細菌細胞を使用する実施形態は、機能的な酸化的リン酸化システムを示す溶解産物を利用する。実施形態は、アルギニンデカルボキシラーゼが欠損している溶解産物をさらに提供する。
【０１２４】
ＶＩ．ｔＲＮＡ分子の不活性化
本発明が実施され得る１つの様式は、天然の第２イソ受容ｔＲＮＡを不活性化することによるものである。これらの実施形態では、天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、通常は第１イソ受容ｔＲＮＡにアシル化される天然アミノ酸で前記第１イソ受容ｔＲＮＡをチャージするために必要なアミノアシル化合成酵素として機能するために、枯渇されずに、溶解産物内で保存される。天然アミノ酸の起源は、宿主細胞集団によって産生されるものであるので、溶解の直後に溶解産物内に存在する。
【０１２５】
第２イソ受容ｔＲＮＡを不活性化する本発明の実施形態は、アンチセンスＤＮＡを使用する。ここで、そのアンチセンスＤＮＡは、その標的ｔＲＮＡのアンチコドン配列を認識し、ゆえに、天然のイソ受容ｔＲＮＡがそのｍＲＮＡコドン配列と会合することを妨げる。
【０１２６】
ｔＲＮＡ分子の不活性化および枯渇は、当該分野で周知である。例えば、Ｌｉｎｄｓｌｅｙ  ａｎｄ  Ｇｕａｒｎｅｒｏｓ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４８：１２６７−７４（２００３）；Ｊａｃｋｓｏｎら、ＲＮＡ  ７：７６５−７３（２００１）；Ｋａｎｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２７０：１１３６−９（２０００）；Ｋａｎｄａら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４４０：２７３−７６（１９９８）；Ｋａｎｄａら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８：６７５−７９；Ｓｃｈｍｉｄｔ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，ＰＮＡＳ  ９０：６９１９−２３（１９９３）を参照のこと。
【０１２７】
特異的なｔ−ＲＮＡリボヌクレアーゼ（ｔＲＮＡｓｅ）を用いることにより、特異的なｔＲＮＡを選択的に切断することによって特異的なｔＲＮＡを不活性化することができる。特異的なｔＲＮＡｓｅの例としては、コリシンＤ、コリシンＥ５およびＰｒｒＣが挙げられる。例えば、Ｔｏｍｉｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：８２７８−８３（２０００）；Ｍｏｒａｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２６８４２−９（１９９３）；Ｏｇａｗａら、２８３：２０９７−２１００（１９９９）；ｄｅ  Ｚａｍａｒｏｚｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ８：１５９−１６８（２００１）を参照のこと。これらの特異的なｔ−ＲＮＡリボヌクレアーゼの活性なフラグメント、例えば、コリシンＤまたはコリシンＥ５のＣ末端ドメインが、本発明のために使用され得る。特異的なｔ−ＲＮＡリボヌクレアーゼはさらに、それらの標的ｔ−ＲＮＡのサブセットを不活性化するように操作され得るか、または異なるｔＲＮＡ標的を不活性化するように変更され得る。リボヌクレアーゼ活性が、望まれなくなったときは、そのｔＲＮＡｓｅは、インヒビター、例えば、ＩｍｍＤタンパク質によって阻害され得る（例えば、ｄｅ  Ｚａｍａｒｏｚｙらを参照のこと）。
【０１２８】
ＶＩＩ．インビトロでのｔＲＮＡのアミノアシル化
ｔＲＮＡチャージ反応は、本明細書中で使用されるとき、非天然アミノ酸でアミノアシル化される第２イソ受容センスｔＲＮＡがチャージされるインビトロでのｔＲＮＡのアミノアシル化反応のことを指す。ｔＲＮＡチャージ反応物は、チャージ反応混合物、イソ受容センスｔＲＮＡおよび非天然アミノ酸を含む。
【０１２９】
非天然アミノ酸でチャージされる第２イソ受容センスｔＲＮＡは、タンパク質合成反応物とは別のｔＲＮＡチャージ反応物中に存在するので、本発明は、モノチャージシステムである。第１イソ受容センスｔＲＮＡは、ｔＲＮＡチャージ反応においてチャージされるのではなく、細胞溶解産物内または溶解前の宿主細胞内において直接天然アミノ酸でチャージされる。天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が細胞溶解後に枯渇される本発明の１つの実施形態では、第１イソ受容センスｔＲＮＡだけを認識する第１外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、細胞溶解後の溶解産物に加えられる。天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が２種類の外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素で置き換えられる別の実施形態では、第１外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、細胞溶解前の宿主細胞内で発現されるがゆえに、溶解後の溶解産物中に既に存在する。第２イソ受容ｔＲＮＡが不活性化される別の実施形態では、第１イソ受容ｔＲＮＡは、天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によって、溶解産物中で直接、内因性天然アミノ酸でチャージされる。このパラグラフ内で述べられるすべての実施形態において、第２イソ受容センスｔＲＮＡは、タンパク質合成反応とは別のｔＲＮＡチャージ反応において非天然アミノ酸でチャージされる。
【０１３０】
別個のｔＲＮＡチャージ反応は、タンパク質合成反応とは別で、ｔＲＮＡ分子を所望のアミノ酸でアミノアシル化する任意の反応であり得る。この反応は、抽出物、人工的な反応混合物またはその両方の組み合わせにおいて起き得る。
【０１３１】
ｔＲＮＡアミノアシル化の適当な反応条件は、当業者に周知である。代表的には、ｔＲＮＡアミノアシル化は、６．５〜８．５の範囲のｐＨ値、０．５〜１０ｍＭ高エネルギーリン酸塩（例えば、ＡＴＰ）、５〜２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０〜２００ｍＭ  ＫＣｌを有する生理学的緩衝液中で行われる。好ましくは、その反応は、還元剤（例えば、０〜１０ｍＭジチオトレイトール）の存在下において行われる。アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、外因的に加えられる場合、その合成酵素の濃度は、代表的には、１〜１００ｎＭである。当業者は、これらの条件が、ｔＲＮＡアミノアシル化の最適化（例えば、事前に選択されたアミノ酸に対する高特異性、高収率および最低の交差反応性）のために変動し得ることを容易に認識するだろう。
【０１３２】
上記反応は、４〜４０℃、またはより好ましくは、２０〜３７℃の範囲の温度において行われ得る。細胞溶解産物が、好熱性細菌に由来する場合、その反応は、より高い温度（例えば、７０℃）で行われ得る。熱的に不安定なアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が使用される場合、その反応は、好ましくは、より低い温度（例えば、４℃）において行われる。反応温度もまた、ｔＲＮＡのアミノアシル化を最適化するために変動し得る。イソ受容センスｔＲＮＡがｔＲＮＡチャージ反応においてアミノ酸でチャージされる正確な反応条件は、本明細書中に提供される実施例において例証される。
【０１３３】
本発明の好ましい実施形態において、第２イソ受容センスｔＲＮＡは、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によってチャージされる。この実施形態において、第１イソ受容センスｔＲＮＡに対するコドンと異なるコドン配列であるが同じアミノ酸と会合する第２イソ受容ｔＲＮＡは、タンパク質合成反応が進む溶解産物とは別のｔＲＮＡチャージ反応において、非天然アミノ酸でチャージされ得る。第２イソ受容ｔＲＮＡチャージ反応は、別個の反応において起き得るので、どのタイプのアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が第２イソ受容ｔＲＮＡをチャージするために使用することができるかに関する制限は、最小である。
【０１３４】
したがって、第２イソ受容センスｔＲＮＡチャージ反応は、チャージされるｔＲＮＡに特異的な天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素、本発明について述べられる実施形態のいくつかに対しては宿主細胞において発現される第２外因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素、非天然アミノ酸を認識するように操作されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素、または１つより多いタイプのアミノ酸でｔＲＮＡ分子をチャージすることができる「ごたまぜ（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）」アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を利用することができる。ごたまぜアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、時折天然に見られる内因的に生成されるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を含み得る。
【０１３５】
第２イソ受容ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でチャージするために有用な、操作されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、一般にタンパク質指向進化のために使用される種々の方法を用いて操作され得る。そのような突然変異誘発の方法は、溶解産物の調製に関して上で論じられているが、それらの方法としては、部位特異的、ランダム点突然変異誘発、相同組換え（ＤＮＡシャフリング）、ウラシル含有鋳型を用いる突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップが入れられた二重鎖ＤＮＡを用いる突然変異誘発なども挙げられ得るがこれらに限定されない。さらなる適当な方法としては、点ミスマッチ修復（ｐｏｉｎｔ  ｍｉｓ−ｍａｔｃｈ
ｒｅｐａｉｒ）、修復欠損宿主株を用いる突然変異誘発、制限−選択および制限−精製、欠失突然変異誘発、全遺伝子合成による突然変異誘発、二本鎖切断修復などが挙げられる。次いで、所望の活性に対する機能的アッセイを用いて変異体がスクリーニングされる。例えば、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の校正機能が、削除され得る。突然変異誘発、例えば、キメラ構築物を必要とする突然変異誘発もまた用いられ得る。非天然アミノ酸を認識するようにアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を操作することは、当該分野で周知になっている。例えば、Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１００９２−７（１９９７）；Ｆｕｒｔｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，７：４１９（１９９８）；Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：４５０４−０９（１９９７）；Ｏｈｎｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３０：４１７−２３（２００１）；Ｋｉｇａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：９７１５−９７２３（２００２）を参照のこと。
【０１３６】
改変されたｔＲＮＡおよび／または非天然アミノ酸を効率的にチャージするために、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、天然の反応条件に類似の条件下で、改変されたｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化するように操作され得る。ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素対の操作は、上で述べられている。操作された合成酵素の例は、その合成酵素の活性部位にＡｌａ２９４→Ｇｌｙ変異を有する、Ａｌａ２９４→Ｇｌｙ  Ｐｈｅ−ＲＳである。いくつかの実施形態では、操作された合成酵素のおかげで、改変されたｔＲＮＡおよび／または非天然アミノ酸を通常の反応条件に類似の条件下でアミノアシル化することが可能になる。
【０１３７】
あるいは、改変されたｔＲＮＡおよび／または非天然アミノ酸は、穏やかに変性する反応条件下、例えば、高ｐＨ、高ＭｇＣｌ２濃度、界面活性剤、ＤＭＳＯまたはスペルミジンの添加において、チャージされ得る。そのような反応条件の例としては：１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．１、７５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＡＴＰ、４０ｍＭ  ＫＣｌ、１．４Ｍ  ＤＭＳＯ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０〜１００μＭ  ｔＲＮＡｐｈｅ、５〜２０ｍＭ  ｐ−アセチル−フェニルアラニンおよび１〜１０μＭ  Ａｌａ２９４→Ｇｌｙ  Ｐｈｅ−ＲＳが挙げられる。いくつかの実施形態において、改変されたｔＲＮＡおよび／または非天然アミノ酸は、穏やかに変性する反応条件下で天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によってチャージされ得る。
【０１３８】
いくつかの生体システムでは、イソ受容コドンは天然に、同じｔＲＮＡによってサービスされ（ｓｅｒｖｉｃｅｄ）、第１コドンは、そのｔＲＮＡと完全にマッチし、第２コドンは、ゆらぎ塩基対によってミスマッチする。これらのシステムでは、熱力学的に第２コドンを好む、すなわち、第２コドンと完全にマッチする、改変されたｔＲＮＡを導入することが可能である。
【０１３９】
それゆえ、チャージ反応に有用な操作されたｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素対は、天然ｔＲＮＡに由来する改変されたｔＲＮＡを利用するシステムをさらに含む。その天然ｔＲＮＡは、天然アミノ酸をコードする第１センスコドンとワトソン−クリック塩基対を形成し、同じ天然アミノ酸をコードする１つ以上のゆらぎ縮重センスコドンとゆらぎ塩基対を形成する。本発明に記載の改変されたｔＲＮＡは、ゆらぎ縮重センスコドンのうちの１つと完全なワトソン−クリック塩基対を形成する、改変されたアンチコドン配列を含む。
【０１４０】
例えば、細菌システムまたは他のシステムに有用な、操作されたｔＲＮＡの例としては、アンチコドンＧＵＵがアンチコドンＡＵＵに改変されているアスパラギンｔＲＮＡ（ＧＵＵ→ＡＵＵ）；ＧＣＡ→ＡＣＡシステインｔＲＮＡ；ＵＵＣ→ＣＵＣグルタミンｔＲＮＡ；ＧＵＧ→ＡＵＧヒスチジンｔＲＮＡ；ＵＵＵ→ＣＵＵリジンｔＲＮＡ；ＣＧＵ→ＡＧＵトレオニンｔＲＮＡが挙げられる。チャージされる非天然アミノ酸の例としては、さらに、例えば、フルオロ（ｆｌｕｒｏ）−グルタミンおよびパラ−アセチル−フェニルアラニンが挙げられる。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、改変されたｔＲＮＡは、操作されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によって非天然アミノ酸でチャージされる。操作されたｔＲＮＡの例は、アンチコドンＧＡＡがアンチコドンＡＡＡに改変されている、操作された大腸菌フェニルアラニンｔＲＮＡである（Ｋｗｏｎら、ＪＡＣＳ  １２５：７５１２−７５１３，２００３を参照のこと）。操作されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の例は、改変されたフェニルアラニン−ｔＲＮＡ合成酵素、例えば、Ｔｈｒ４１５Ｇｌｙ変異体である。操作されたｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素対を用いてチャージされる非天然アミノ酸の例は、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン（Ｎａｌ）である。
【０１４２】
別個のチャージ反応におけるイソ受容センスｔＲＮＡのアミノアシル化の後、チャージされたイソ受容センスｔＲＮＡは、それを無細胞タンパク質合成反応物に加えるために、精製されなければならない。本発明のこの局面には、そのチャージ反応に利用される合成酵素が、タンパク質合成反応において、ｔＲＮＡおよび／またはアミノ酸と確実に交差反応しないようにするために、チャージされたイソ受容センスｔＲＮＡが、ｔＲＮＡチャージ反応に使用されるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素から単離される必要がある。
【０１４３】
アミノアシル化されたｔＲＮＡは、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固定化された、大腸菌またはＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ由来の伸長因子−Ｔｕ（Ｅｆ−Ｔｕ）を用いて、未反応のｔＲＮＡおよび任意のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素から精製され得る。Ｄｅｒｗｎｓｋｕｓ，Ｆｉｓｃｈｅｒ，＆  Ｓｐｒｉｎｚｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３６，１６１（１９８４）を参照のこと。簡潔には、固定化されたタンパク質が、ＧＴＰ、ピルビン酸キナーゼおよびホスホエノールピルビン酸塩の存在下において活性化されることにより、アミノアシル化されたｔＲＮＡに特異的に結合する、固定化されたＥｆ−Ｔｕ−ＧＤＰが生成される。そのカラムを、低イオン強度緩衝液（１０ｍＭ  ＫＣｌ；５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；ｐＨ７．４）で洗浄し、高塩緩衝液で溶出することにより、精製されたアミノアシル化されたｔＲＮＡが得られる。
【０１４４】
別の実施形態は、アミノアシル基をリボザイムの５’−ＯＨから（オリゴヌクレオチドドナーによってチャージされた後に）ｔＲＮＡ分子の３’−ＯＨに転移することができるリボザイムカラムを用いて、第２イソ受容センスｔＲＮＡを非天然アミノ酸でチャージする。当該分野において現在使用されているリボザイムは、広範囲のｔＲＮＡと非天然アミノ酸との間の反応を触媒する能力をもたらし、インビトロ翻訳反応を用いるときに、非天然アミノ酸でアミノアシル化されたｔＲＮＡを作製するために特に有用である。当該分野で現在知られているリボザイムはさらに、アミノアシル化された生成物の効率的な親和性精製を可能にし、適当な基材の例としては、アガロース、セファロースおよび磁気ビーズが挙げられる。このような方法は、適切なｔＲＮＡチャージのためのアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の必要性を迂回する。リボザイムを用いてアミノアシル化されるイソ受容ｔＲＮＡは、種々の方法で得ることができる。１つの適当な方法は、あるカラムについて、ＥＤＴＡなどの緩衝液を用いて、アミノアシル化されたイソ受容ｔＲＮＡを溶出することである。例えば、Ｂｅｓｓｈｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：７２３−２８（２００２）；Ｌｅｅら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２０：１７９７−８０６（２００１）を参照のこと。
【０１４５】
ｔＲＮＡチャージ反応において使用されるｔＲＮＡ分子は、適切な５’および３’プライマーの存在下におけるＰＣＲによる増幅に従って、任意の最適なｔＲＮＡに対する合成ＤＮＡ鋳型から合成され得る。次いで、得られたＴ７−プロモーター配列を含む二本鎖ＤＮＡ鋳型が、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロにおいて転写されることにより、ｔＲＮＡ分子が生成され、続いてそれがｔＲＮＡチャージ反応物に加えられ得る。Ｓｈｅｒｌｉｎら、ＲＮＡ  ２００１  ７：１６７１−１６７８を参照のこと。
【０１４６】
本明細書中に記載されるインビトロにおけるｔＲＮＡのアミノアシル化に関して、本発明は、センスコドンを認識する、事前に選択されたアミノ酸を有するチャージしたｔＲＮＡを有する細胞溶解産物を含む新規チャージしたｔＲＮＡ溶液も提供する。本発明は、無細胞システムに加えられるインビトロｔＲＮＡチャージ溶液の使用を含む。いくつかの実施形態において、チャージｔＲＮＡ溶液は、著しい合成酵素活性を欠く。適当な細胞溶解産物の例としては、細菌細胞溶解産物が挙げられる。事前に選択されたアミノ酸の例としては、非天然アミノ酸が挙げられる。
【０１４７】
事前に選択されたアミノ酸を有するチャージしたｔＲＮＡは、本発明に記載される方法を用いて作製され得るか、または当該分野で公知の他の方法を用いて作製され得る。例えば、事前に選択されたアミノ酸を有するチャージしたｔＲＮＡは、ｔＲＮＡの化学修飾によって調製され得る（例えば、Ｓａｎｄｏら、ＪＡＣＳ  １２７：７９９８−７９９９，２００５を参照のこと）。
【０１４８】
本発明に記載の（ａｃｏｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ）チャージしたｔＲＮＡ溶液は、事前に選択されたアミノ酸を有するチャージしたｔＲＮＡに対して著しい合成酵素活性を有しないことがある。事前に選択されたアミノ酸を有するチャージしたｔＲＮＡに対する合成酵素または合成酵素活性は、Ｖ項に記載された方法によって枯渇され得る。例えば、事前に選択されたアミノ酸を有するチャージしたｔＲＮＡに対する著しい合成酵素活性が、イムノアフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｍ）またはアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素インヒビターの添加によってｔＲＮＡ溶液から枯渇され得る。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、事前に選択されたアミノ酸を有するチャージしたｔＲＮＡに対する合成酵素活性は、インヒビターを用いる合成酵素阻害以外の方法を用いて枯渇される。例えば、事前に選択されたアミノ酸を有するチャージしたｔＲＮＡを有し、センスコドンを認識し、かつ、事前に選択されたアミノ酸を有するチャージしたｔＲＮＡに対する著しい合成酵素活性を有さない、細菌細胞溶解産物を、チャージしたｔＲＮＡ溶液は含み、そのチャージしたｔＲＮＡ溶液は、合成酵素インヒビターまたは特異的な合成酵素インヒビターを含まない。
【０１５０】
ＶＩＩＩ．無細胞タンパク質合成反応
第１および第２コドンと会合した、上に記載されたチャージしたイソ受容センスｔＲＮＡは、ここで、事前に選択された位置に非天然アミノ酸を有する所望のタンパク質の合成用の核酸鋳型とともに、細胞溶解産物と混合される。
【０１５１】
その反応混合物はさらに、合成される高分子に対するモノマー、例えば、アミノ酸、ヌクレオチドなど、ならびにその合成に必要なそのような補因子、酵素および他の試薬、例えば、リボソーム、ｔＲＮＡ、ポリメラーゼ、転写因子などを含む。無細胞抽出物、遺伝的鋳型およびアミノ酸などの上記成分に加えて、タンパク質合成のために特に必要とされる材料が、その反応物に加えられ得る。それらの材料としては、塩、フォリン酸、サイクリックＡＭＰ、タンパク質分解酵素または核酸分解酵素に対するインヒビター、タンパク質合成のインヒビターまたは制御因子、酸化／還元電位の調整物質、非変性界面活性物質、緩衝成分、スペルミン、スペルミジン、プトレシンなどが挙げられる。望ましくない酵素活性に対する代謝インヒビターが、反応混合物に加えられ得る。あるいは、望ましくない活性に関与する酵素または因子が、その抽出物から直接除去され得るか、または望ましくない酵素をコードする遺伝子が、不活性化され得るかもしくは染色体から除かれ得る。
【０１５２】
無細胞合成反応は、大規模リアクター、小規模リアクターを利用し得るか、または複数の同時合成を行うために多重化され得る。連続反応は、試薬の流れを導入する供給機構を使用し、そのプロセスの一部として最終生成物を単離し得る。追加の試薬が導入されることにより活性な合成の時間が延長され得るバッチシステムもまた興味深い。リアクターは、任意の様式（例えば、バッチ、拡張（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）バッチ、セミバッチ、半連続的、フェドバッチおよび連続的、ならびに適用目的に従って選択される様式）において行われ得る。
【０１５３】
ＤＮＡ鋳型を使用することによりインビトロタンパク質合成が駆動される実施形態において、タンパク質合成反応混合物の個別の成分は、任意の都合のよい順序で混ぜられ得る。ＲＮＡポリメラーゼが反応混合物に加えられることにより、ＤＮＡ鋳型の転写が高められる。本明細書中の用途に適したＲＮＡポリメラーゼとしては、細菌抽出物が由来する細菌において機能する任意のＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。インビトロタンパク質合成を駆動するためにＲＮＡ鋳型が使用される実施形態において、反応混合物の成分は、任意の都合のよい順序で混ぜられ得るが、好ましくは、ＲＮＡ鋳型が最後に加えられる順序で混ぜられる。
【０１５４】
その反応混合物は、転写および／または翻訳の反応に適した任意の温度でインキュベートされ得る。その反応混合物は、インキュベート中、撹拌され得るか、または撹拌されない。撹拌を用いて、反応成分の濃度を終始一定に維持し、１つ以上の重要な成分の枯渇によって低速の合成が引き起こされるポケットの形成を回避することによって、タンパク質合成の速度および効率が高められ得る。この反応は、許容され得る特定の速度もしくは容量比（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｒａｔｅ）でタンパク質合成が起きている間、または所望のとおりタンパク質合成が停止するまで、継続させることができる。この反応は、氷上で反応混合物をインキュベートするか、または水もしくは適切な緩衝液で迅速に希釈することによって、都合よく停止することができる。この反応は、限定的かつ再使用不可能な転写成分および翻訳成分を連続的に供給することによって、望まれる限り維持することができる。
【０１５５】
様々な無細胞合成反応システムが、当該分野で周知である。例えば、Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６６：１８０−８（１９９９）；Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１６：３８５−９０（２０００）；Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７４：３０９−１６（２００１）；Ｓｗａｒｔｚら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６７：１６９−８２（２００４）；Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８５：１２２−２９（２００４）；Ｊｅｗｅｔｔ，Ｍ．Ｃ．ａｎｄ  Ｓｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｒ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８６：１９−２６（２００４）；Ｙｉｎ，Ｇ．ａｎｄ  Ｓｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｒ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８６：１８８−９５（２００４）；Ｊｅｗｅｔｔ，Ｍ．Ｃ．ａｎｄ  Ｓｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｒ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：４６５−７２（２００４）；Ｖｏｌｏｓｈｉｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｒ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９１：５１６−２１（２００５）を参照のこと。
【０１５６】
無細胞タンパク質合成は、細胞機構の触媒能力を活用し得る。インビトロにおいて最大のタンパク質収量を得るには、適切な基質の供給、例えば、ヌクレオシド三リン酸およびアミノ酸、恒常性の環境、触媒の安定性、ならびに抑制性副産物の除去または回避が必要である。インビトロでの合成反応の最適化には、迅速に成長する生物のインビボ状態の再現が有効である。それゆえ、本発明のいくつかの実施形態において、無細胞合成は、酸化的リン酸化が活性化される反応、すなわち、ＣＹＴＯＭＩＭＴＭシステムにおいて行われる。ＣＹＴＯＭＩＭＴＭシステムは、最適化されたマグネシウム濃度を有する、ポリエチレングリコールの非存在下の反応条件を用いることによって規定される。従来の二次エネルギー源は、リン酸塩の蓄積を生じる一方、ＣＹＴＯＭＩＭＴＭシステムは、タンパク質合成を阻害すると知られている、リン酸塩の蓄積をもたらさない。
【０１５７】
反応混合物中のマグネシウムの濃度は、合成全体に影響する。細胞溶解産物中にマグネシウムが存在することが多く、次いで、そのマグネシウムは、濃度を最適化するためにさらなるマグネシウムで調整され得る。ＣＹＴＯＭＩＭＴＭシステムは、好ましい濃度のマグネシウム、少なくとも約５ｍＭ、通常、少なくとも約１０ｍＭ、好ましくは、少なくとも約１２ｍＭ、および多くとも約２０ｍＭ、通常、多くとも約１５ｍＭの濃度のマグネシウムを利用する。ＣＹＴＯＭＩＭＴＭシステムに関して合成を高め得る他の変更は、ＨＥＰＥＳ緩衝液およびホスホエノールピルビン酸塩を反応混合物から除去することである。ＣＹＴＯＭＩＭＴＭシステムは、本明細書中で参考として援用される米国特許第７，３３８，７８９号に記載されている。
【０１５８】
本発明のいくつかの実施形態において、無細胞合成は、反応混合物中のレドックス条件が最適化されている反応物中で行われる。これには、適切なジスルフィド結合を形成するための適切な酸化環境を維持するために反応混合物にレドックス緩衝液を加えることが含まれ得る。この反応混合物はさらに、還元活性を有する内因性分子の活性を低下させるように改変され得る。好ましくは、そのような分子は、遊離スルフヒドリル基を不可逆的に不活性化する化合物で処理することによって、無細胞タンパク質合成の前に化学的に不活性化され得る。還元活性を有する内因性酵素の存在は、そのような酵素、例えば、チオレドキシンレダクターゼ、グルタチオンレダクターゼなどに不活性化変異を有する遺伝的に改変された細胞から調製された抽出物を使用することによってさらに減少され得る。あるいは、そのような酵素は、その調製中に細胞抽出物から選択的に除去することによって除去され得る。レドックス条件の最大化は、本明細書中で参考として援用される米国特許第６，５４８，２７６号および同第７，０４１，４７９号に記載されている。
【０１５９】
本発明のいくつかの実施形態において、無細胞合成は、やっかいにも特定のアミノ酸を代謝するように作用する酵素を阻害することによって、最適なアミノ酸濃度が維持される反応において行われる。アミノ酸の代謝を触媒する酵素の阻害は、抑制性化合物を反応混合物に加えること、関与する酵素活性を低下させるかもしくは無くすように反応混合物を改変すること、またはその両方の組み合わせによって達成され得る。好ましい実施形態では、アルギニンデカルボキシラーゼが排除される。タンパク質合成反応混合物から排除される他のそのような抑制性化合物としては、トリプトファナーゼ、アラニングルタミン酸トランスアミナーゼまたはピルビン酸オキシダーゼが挙げられ得るが、これらに限定されない。無細胞タンパク質合成中のアミノ酸代謝を最適化するために酵素活性を無くすことは、本明細書中で参考として援用される米国特許第６，９９４，９８６号に記載されている。
【０１６０】
インビトロ合成反応の後、非天然アミノ酸を含む合成されたタンパク質は、当該分野において標準的であるように精製され得る。本発明のタンパク質は、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出または塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含むがこれらに限定されない方法によって回収され得、精製され得る。非天然アミノ酸を含む新しく合成されたタンパク質は、正しく折り畳まれなければならない。適切なフォールディングは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィーまたは高純度が望まれる他の適当な方法を用いて達成され得る。種々の精製方法／タンパク質フォールディング方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．１９９０）；Ｂｏｌｌａｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．１９９６）。
【０１６１】
精製の後、非天然アミノ酸を含むタンパク質は、関連性のあるポリペプチドの所望のコンフォメーションとは異なるコンフォメーションを有し得る。一般に、場合によっては、発現されたポリペプチドを変性し、還元し、次いで、そのポリペプチドが好ましいコンフォメーションに再度折り畳まれることが望ましい。例えば、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥおよび／またはシャペロンが、目的の翻訳産物に加えられ得る。タンパク質を還元し、変性し、そして再生する方法は、当業者に周知である。例えば、Ｄｅｂｉｎｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４０６５−７０（１９９３）；Ｂｕｃｈｎｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：２６３−７０（１９９２）を参照のこと。
【０１６２】
本発明の方法は、天然タンパク質に匹敵する生物学的活性を有する、非天然アミノ酸を含む改変されたタンパク質を提供する。組成物中のタンパク質の比活性は、機能的アッセイにおいて活性レベルを測定すること、非機能的アッセイに存在するタンパク質の量を定量すること（例えば、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、クーマシー（ｃｏｏｍａｓｉｅ）染色ゲルまたは銀染色ゲルにおける定量など）、および生物学的に活性なタンパク質と総タンパク質との比を測定することによって、測定され得る。一般に、このように規定されるような比活性は、天然タンパク質の比活性の少なくとも約５％、通常、天然タンパク質の比活性の少なくとも約１０％であり、約２５％、約５０％、約９０％またはそれ以上であり得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照のこと。
【０１６３】
インビトロ合成反応およびそれに続く精製の後、非天然アミノ酸を含む所望のタンパク質は、必要に応じて、例えば、アッセイ成分、治療用試薬、または抗体作製のための免疫原として、使用され得る。
【０１６４】
この明細書において引用されたすべての刊行物および特許出願は、各個別の刊行物または特許出願が、参考として援用されると詳細かつ個別に示されたかのように、本明細書中で参考として援用される。
【０１６５】
前述の本発明は、理解を明確にする目的で例証および例示の意図でいくらか詳細に記載されてきたが、ある特定の変更および改変が、添付の請求項の精神または範囲から逸脱することなく本発明に対して行われ得るということが、本発明の教示に照らして容易に当業者に明らかになるだろう。
【実施例】
【０１６６】
以下の実施例は、限定の意図ではなく例証のみの意図で提供される。当業者は、本質的に類似の結果を得るために変更され得るかまたは改変され得る種々の重大でないパラメータを容易に認識するだろう。
【０１６７】
実施例１
一般法
分子生物学における標準的な方法は、報告されている（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｙｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｗｕ（１９９３）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｖｏｌ．２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）。標準的な方法は、ＲＮＡの取扱いおよび解析についての詳細な方法を記載しているＢｉｎｄｅｒｅｉｆ，Ｓｃｈｏｅｎ，＆  Ｗｅｓｔｈｏｆ（２００５）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ＲＮＡ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙにも見られる。
【０１６８】
タンパク質精製、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離および結晶化についての方法は、報告されている（Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。無細胞合成についての方法は、Ｓｐｉｒｉｎ  ＆  Ｓｗａｒｔｚ（２００８）Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙに記載されている。無細胞合成を用いて非天然アミノ酸をタンパク質に組み込むための方法は、Ｓｈｉｍｉｚｕら（２００６）ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２７３，４１３３−４１４０に記載されている。
【０１６９】
実施例２
ｔＲＮＡ２’，３’−環状リン酸のインビトロにおける転写および単離
非天然アミノ酸でアミノアシル化されたイソ受容ｔＲＮＡは、図１における例によって図示される設計されたｔＲＮＡ−ＨＤＶリボザイム鋳型ＤＮＡから、図２に図示されるように、インビトロ転写の後、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による精製、２’，３’−環状リン酸の酵素的除去、および操作されたｔＲＮＡ合成酵素を用いた非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）でのｔＲＮＡのチャージによって、生成され得る。転写収量を最適化するために、異なる４つのインビトロ転写プロトコルを、図３および図４に図示されるｔＲＮＡ転写物について試験した。４つの異なるインビトロ転写プロトコルのすべてによって、同様のｔＲＮＡ収量がもたらされた。転写の最適化は、通常、５０μＬの反応物において３７℃で２〜３時間にわたって行われた。反応条件は、以下のとおりだった：（１）４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭスペルミジン、４Ｕ／ｍｌピロホスファターゼ、０．４Ｕ／ｍｌ  ｓｕｐｅＲＮＡｓｅ−ｉｎ（Ａｍｂｉｏｎ）、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＮＴＰ、０．０２４ｍｇ／ｍｌ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、０．０２８ｍｇ／ｍｌプラスミドＤＮＡ鋳型、（２）８０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＤＴＴ、２２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭスペルミジン、０．１２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１Ｕ／ｍｌピロホスファターゼ、０．４Ｕ／ｍｌ  ＳｕｐｅＲＮＡｓｅ−ｉｎ、３．７５ｍＭ  ＮＴＰｓ、０．０２４ｍｇ／ｍｌ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、０．０２８ｍｇ／ｍｌプラスミドＤＮＡ鋳型、（３）３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）１０ｍＭ  ＤＴＴ、ＭｇＣｌ２、２ｍＭスペルミジン、１Ｕ／ｍｌピロホスファターゼ、０．４Ｕ／ｍｌ  ｓｕｐｅＲＮＡｓｅ−ｉｎ、４ｍＭ  ＮＴＰｓ、０．０２４ｍｇ／ｍｌ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、０．０２８ｍｇ／ｍｌプラスミドＤＮＡ鋳型、（４）４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＤＴＴ、４６ｍＭ  ＭｇＣｌ２；２ｍＭスペルミジン、０．４Ｕ／ｍｌ  ｓｕｐｅＲＮＡｓｅ−ｉｎ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＮＴＰ、０．０２４ｍｇ／ｍｌ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、０．０２８ｍｇ／ｍｌプラスミドＤＮＡ鋳型。以前の知見（Ｂｉｎｄｅｒｅｉｆ，Ｓｃｈｏｎ，＆  Ｗｅｓｔｈｏｆ（２００５））とは対照的に、本発明者らは、ｔＲＮＡの１位または２位にウラシルをコードする鋳型（例えば、構築物１および４）がＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写にとって深刻な欠陥はないことを見出した。結果として、構築物１
【０１７０】
【化２７】
0005798489.tif 000027
が、好ましかった。プロトコル１を用いて生成されたｔＲＮＡ産物が、最も均質だったので、このプロトコルが、以下に記載することを除外して大規模転写に使用された。
【０１７１】
大量の
【０１７２】
【化２８】
0005798489.tif 000028
構築物１を生成するために、１００ｍＬの転写物をＲＮＡｓｅフリー保証の５０ｍｌコニカルチューブ内で準備した。例えば、０．４Ｕ／μＬピロホスファターゼおよび０．０４Ｕ／μＬ  ｓｕｐｅｒＲＮＡｓｅ−ｉｎを含む、
【０１７３】
【化２９】
0005798489.tif 000029
構築物１に対する大規模反応物を使用した。転写反応物を３７℃において２時間インキュベートし、さらに０．０２４ｍｇ／ｍｌ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを補充し、３７℃においてさらに２時間インキュベートし、次いで、０．２０μｍ  ＰＥＳフィルター（ＶＷＲカタログ＃８７００６−０６２）で濾過した。
【０１７４】
代表的には、５０ｍＬの転写物のアリコートを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５）、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＡＫＴＡを用いてＸＫ５０／１００カラムにおける２ＬのＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００またはＳ−３００サイズ排除樹脂の上に充填することにより、ｔＲＮＡ−２，３’環状リン酸を前駆体ＲＮＡ転写物および切断されたＨＤＶリボザイムＲＮＡと分離した（図５）。２５ｍＬの画分を回収し、ｔＲＮＡピーク画分をＴＢＥ／尿素ＰＡＧＥゲル電気泳動によって測定した。１／１０体積の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および等体積のイソプロパノールを加えた後、−８０℃において３０分間インキュベートし、遠心分離（ＦｉｂｅｒＬｉｔｅ  Ｆ−１３ローターにおける３０分間の２０，０００×ｇ）によってｔＲＮＡをペレットにすることによって、ｔＲＮＡ−２，３’環状二リン酸を沈殿させた。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、短く風乾し、次いで、１ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．４）に再懸濁した。
【０１７５】
プロトコル１を用いてピロリ菌
【０１７６】
【化３０】
0005798489.tif 000030
（２ｍｌ）の生成を行った。２６／６０Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００サイズ排除カラムを用いてｔＲＮＡ精製を行った（図２ａおよび２ｂ）。サイジングカラム緩衝液からＥＤＴＡを取り除いた。ピロリ菌ｔＲＮＡＧｌｎを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）に再懸濁した。
【０１７７】
これらの実験の過程で、本発明者らは、おそらく、ＮＴＰｓ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ＃：Ｕ６６２５；Ｇ８８７７、Ｃ１５０６、Ａ７６００）へのかなりのＲＮＡｓｅの混入に起因するＲＮＡの分解が、転写反応物における（１）０．１ｍＭ  ＥＤＴＡの添加および（２）ＲＮＡｓｅインヒビターの添加によって妨げられることを見出した（図６Ａのレーン１および２を比較のこと）。図６Ｂに示されるように、ＮＴＰｓとともに３７℃で一晩インキュベートされた、精製されたインタクトなｔＲＮＡＧｌｕが、完全に分解された（レーン２）が、ＲＮＡｓｅインヒビターを加えることによって、この分解は無くなった（レーン３）。ＥＤＴＡの添加が、分解レーンに影響しなかった（レーン４）ので、この分解は、単純な金属依存性切断に起因する可能性は低かった（ＥＤＴＡ単独とのインキュベートによってｔＲＮＡは分解されない（レーン５））。第２に、ＥＤＴＡの添加によって損傷／分解を無くすことができるので（レーン３）、たぶんｔＲＮＡの重金属の混入に起因して、サイジングカラム緩衝液中にＥＤＴＡを含まずかつ再懸濁緩衝液中にキレート剤を含まずに精製されたｔＲＮＡが、還元剤の存在下において損傷／分解を場合によっては受けやすいこと（図６Ｃ；レーン１および２を比較のこと）を本発明者らは見出した。
【０１７８】
実施例３
活性なｔＲＮＡを放出するためのｔＲＮＡ２’，３’−環状リン酸の脱リン酸化
ＨＤＶリボザイムによって切断されたｔＲＮＡからの２’−３’環状リン酸の除去に必要とされるＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）（図２および５を参照のこと）を以下のとおり生成した：Ｎ末端の６−ヒスチジンタグ（配列番号１３）を有するＰＮＫ遺伝子を、遺伝子合成し（ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ．，ＣＡ）、プラスミドｐＹＤ３１７にクローニングした。そのプラスミドＴ４ＰＮＫ＿ｐＹＤ３１７を用いて、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。これらの細胞をＢｒａｕｎ１０Ｌ発酵槽内の自己誘導培地（Ｓｔｕｄｉｅｒ  Ｆ．Ｗ．（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，４１：２０７−２３４）において、最終ＯＤが２１になるまで１８時間生育した。遠心分離によって細胞を回収したところ、２４０ｇの細胞ペレットが得られた。４０ｇの細胞ペレットを５００ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）、３００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）に再懸濁し、均質化によって溶解し、遠心分離によって不純物を除去し、３５ｍＬのＮｉ−ＩＭＡＣカラムに充填した。そのカラムを５カラム体積の緩衝液Ａで洗浄した。緩衝液Ａ＋０．５ｍＭ  ＢＭＥ、３００ｍＭイミダゾール、０．１μＭ  ＡＴＰおよび１０％グリセロール（ｖ／ｖ）を溶出のために使用した。凝集を防ぐために、ＰＮＫ含有画分を直ちに、２０％グリセロールを含む緩衝液Ａで４×希釈した。ＰＮＫ含有画分をプールし、緩衝液を、１．２ｍｇ／ｍＬの最終濃度でＰＮＫ貯蔵緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ、５０％グリセロール）に交換した。
【０１７９】
ｔＲＮＡ−２’，３’−環状リン酸（４０μＭ）を、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．５）中の５０μｇ／ｍｌ  ＰＮＫ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１ｍＭ  ＥＤＴＡとともに３７℃で１時間インキュベートしてｔＲＮＡの３’末端に２’，３’−ＯＨ基をもたらした後、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール抽出し、無機リン酸塩および過剰なフェノールを除去するために０．３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）で事前に平衡化されたＰＤ１０（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）サイズ排除カラムを用いて緩衝液を交換した。等体積のイソプロパノールを加え、−８０℃で３０分間インキュベートし、２０，０００×ｇで３０分間遠心することによってｔＲＮＡを沈殿させ、７０％エタノールで洗浄し、２０，０００×ｇで１０分間遠心し、風乾し、０．１ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．４）に再懸濁した。７０℃に加熱し、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を加え、次いで、室温までゆっくりと冷却することによって、ｔＲＮＡをリフォールディングした。１Ａ２６０＝４０μｇ／ｍＬとしてＮａｎｏＤｒｏｐ１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｔＲＮＡ濃度を測定し、ＴＢＥ／尿素ゲル電気泳動によって確かめた。１００ｍＬの転写反応から、約２〜１０ｍｇという活性なチャージ可能ｔＲＮＡの収量を達成することができた。同様に、以下の相違点：ｔＲＮＡ濃度が８．６μＭだった；ＰＮＫ反応において、ＰＮＫ濃度が０．０２０ｍｇ／ｍｌであり、ＥＤＴＡを取り除き、１ｍＭ  β−メルカプトエタノールを加えたという点を含むこのプロトコルの前半の反復を用いて、ピロリ菌ｔＲＮＡＧｌｎを調製した。精製後、そのｔＲＮＡをＤＥＰＣ処理滅菌水に再懸濁した。
【０１８０】
脱リン酸化の程度を、酸／尿素ゲル電気泳動、およびＭａｌａｃｈｉｔｅ  Ｇｒｅｅｎリン酸塩検出アッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）を用いるリン酸塩放出によってアッセイした。図７は、酸／尿素ゲル電気泳動（Ｂｉｎｄｅｒｅｉｆ，Ｓｃｈｏｎ，＆
Ｗｅｓｔｈｏｆ（２００５））において、脱リン酸化されたｔＲＮＡの移動度が低下したことを示している。３μｇの脱リン酸化されたｔＲＮＡを含むアリコートを、ローティング緩衝液（１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、７Ｍ尿素、１ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー色素）で２倍希釈し、６．５％１９：１アクリルアミド、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、７Ｍ尿素のゲル（４０ｃｍ×３４ｃｍ）に充填し、４０Ｗで一晩電気泳動した。０．０６％メチレンブルー、０．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を使用してゲルを３０分間染色し、脱イオン水で脱染した。両方のアッセイが、１時間後の本質的に完全かつ定量的な脱リン酸化を示唆した。
【０１８１】
実施例４
アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の組換え発現：ベクター、酵素発現および精製
図２の最後の工程に図示されている別個のｔＲＮＡアミノアシル化（チャージ）反応には、イソ受容ｔＲＮＡ分子をアミノアシル化する、操作されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の使用が必要である。この合成酵素は、以下の実施例に記載されるような組換え操作された合成酵素を発現させることによって得ることができる。
【０１８２】
大腸菌グルタミル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＧｌｕＲＳ）を、クローニングし、発現させ、ＩＭＡＣクロマトグラフィーによって精製した。大腸菌ＧｌｕＲＳ発現構築物をＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。コロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンが補充された２ｍｌのＬＢブロス（ＬＢ−ＡＭＰ）に接種し、飽和するまで３７℃で生育した。この培養物を１００ｍｌのＬＢ−ＡＭＰに希釈し、飽和するまで３７℃で生育した。この培養物全体を使用することにより、Ｂｉｏｆｌｏ３０００発酵槽内の、１００μｇ／ｍｌアンピシリンが補充された１０Ｌの自己誘導培地（Ｓｔｕｄｉｅｒ（２００５），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．；４１，２０７−３４）に接種した。この培養物を、ＯＤが約１２に達するまで３７℃で１８時間生育した。Ｓｈａｒｐｌｅｓ遠心機において細胞を回収し、−８０℃で凍結した。３０ｇの細胞ペレットを５００ｍｌのＧｌｕＲＳ溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール）に再懸濁し、Ａｖｅｓｔｉｎ  Ｃ５５Ａホモジナイザーに通すことによって溶解した。ＪＡ−１７（Ｂｅｃｋｍａｎ）ローターにおける３０分間の４０，０００×ｇでの遠心分離によって、溶解産物から不純物を除去した。上清を、ＧｌｕＲＳ溶解緩衝液で平衡化された３０ｍｌのＮｉ２＋  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｆａｓｔ
Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムに通した。次いで、図８ａに図示されるように、そのカラムを１５カラム体積のＧｌｕＲＳ洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８．０；３００ｍＭ塩化ナトリウム；２０ｍＭイミダゾール；１０％グリセロール）で洗浄し、５カラム体積のＧｌｕＲＳ溶出緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８．０；３００ｍＭ塩化ナトリウム；３００ｍＭイミダゾール；１０％グリセロール）で溶出した。ピーク画分をプールし、２Ｌの２×ＧｌｕＲＳ貯蔵緩衝液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．０；４０ｍＭ塩化ナトリウム；１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）；．２ｍＭ  ＥＤＴＡ）に２回透析し、１００％グリセロールで２倍希釈した。約９４５ｍｇのＧｌｕＲＳが、３０ｇの細胞ペレットから回収された。長期間の場合は−８０℃でタンパク質を保存し、いったん解凍したら−２０℃で保存した。
【０１８３】
ピロリ菌ＧｌｕＲＳ２（ＮＤ）（非差別的（ＮＤ）合成酵素とも呼ばれる）を、以下のとおり、クローニングし、発現させ、ＩＭＡＣによって精製した。ピロリ菌ＧｌｕＲＳ２（ＮＤ）発現構築物をＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換し、２枚のＬＢ−ＡＭＰプレートに３７℃でプレーティングした。翌朝、１０ｍｌのＬＢをそのプレートに加え、次いで、滅菌ピペットを用いてこすり取り、すべてのコロニーを再懸濁した。その再懸濁物を２ＬのＬＢ−ＡＭＰに加え、３７℃で生育した。以前の研究（Ｓｋｏｕｌｏｕｂｒｉｓ，Ｒｉｂａｓ  ｄｅ  Ｐｏｕｐｌａｎａら（２００３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１００，１１２９７−３０２）を踏まえて、ＧｌｕＲＳ２（ＮＤ）自体の発現の結果としてのそのグルタミンコドンにおけるグルタメートの組み込みを回避するために、ＯＤ６００約．９において、１ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシドを用いて過剰発現を３０分間だけ誘導した。Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−３Ｂ遠心機において４５００ｒｐｍで３０分間遠心分離することによって細胞を回収し、−８０℃で凍結した。２Ｌの培養物からの細胞ペレットを、２５０μＬの細菌プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ）が補充された２５ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．５；３００ｍＭ  ＮａＣｌ；１０％グリセロール；１０ｍＭイミダゾール）に再懸濁した。リゾチームを（１ｍｇ／ｍｌになるように）加え、２２ゲージのブラント針に１０回通すことによって細胞を溶解した。３５，０００×ｇにおける３０分間の遠心分離によって、全溶解産物から不純物を除去した。溶解産物を、溶解緩衝液に３倍希釈し、次いで、ＮｉＳＯ４でチャージされ溶解緩衝液に平衡化された１ｍｌのＩＭＡＣ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅにバッチモードで１０分間結合させた。図８ｂに図示されているように、その樹脂を、．５ｍＭ  ＤＴＴが補充された１０カラム体積の溶解緩衝液で洗浄し、次いで、１ｍｌのＧｌｕＲＳ２（ＮＤ）溶出緩衝液（３００ｍＭイミダゾールおよび０．５ｍＭ  ＤＴＴが補充された溶解緩衝液）で５回溶出した。ピーク画分をＶｉｖａｓｐｉｎ  １０ｋＤ  ＭＷＣＯ限外濾過によって濃縮した。濃縮されたタンパク質を４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．２、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴに予備透析することによって、ＧｌｕＲＳ２（ＮＤ）を沈殿させた。塩化ナトリウムを加えることにより再可溶化し、代わりにタンパク質をＧｌｕＲＳ２（ＮＤ）貯蔵緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．５；３００ｍＭ  ＮａＣｌ；１０％グリセロール；０．５ｍＭ  ＤＴＴ；０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に透析した。タンパク質を少量のアリコートとして−８０℃で保存した。約０．６ｍｇのＧｌｕＲＳ２（ＮＤ）がその精製物から回収された。
【０１８４】
大腸菌フェニルアラニル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＰｈｅＲＳ）は、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ由来の相同酵素について図９ａに図示されているように、２つのサブユニットＰｈｅＳおよびＰｈｅＴからなる絶対（ｏｂｌｉｇａｔｅ）二量体である。非天然のパラ置換フェニルアラニンアナログ（Ｄａｔｔａ，Ｗａｎｇら（２００２）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ
Ｓｏｃ，１２４，５６５２−３）のチャージパーセントを上げるために、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）および重複プライマーを用いて変異Ａ２９４Ｇを大腸菌ＰｈｅＳに導入した。得られた６×ＨｉｓＰｈｅＳ（Ａ２９４Ｇ）遺伝子を、ＮｄｅＩからＳａｌＩまでの制限酵素認識部位を用いてｐＥＴ２１（ａ）にサブクローニングした。このプラスミドを使用することにより、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルを形質転換した。細胞を自己誘導培地中で一晩生育して、封入体に入ったＰｈｅＳ（Ａ２９４Ｇ）サブユニットを得た。細胞を均質化によって溶解し、封入体を遠心分離によってペレットにし、６Ｍグアニジンに完全に再懸濁し、次いで、最終濃度２Ｍグアニジン−ＨＣｌになるようにＰＢＳで希釈した。ＰｈｅＴ遺伝子を、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩの制限酵素認識部位を含むプライマーを用いて大腸菌ゲノムＤＮＡから増幅した。そのＰＣＲフラグメントをｐＥＴ２４（ｂ）にサブクローニングし、ＰｈｅＳ（Ａ２９４Ｇ）と同一の自己誘導培地を用いて発現させた。ＰｈｅＳ（Ａ２９４Ｇ）とは対照的に、発現されたＰｈｅＴサブユニットは、可溶性だった。細胞をＮｉ親和性精製充填緩衝液：５０ｍＭ  ＮａＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび５ｍＭイミダゾール中で溶解した。その溶解産物から不純物を除去し、次いで、２Ｍグアニジン−ＨＣｌ中のＰｈｅＳ（Ａ２９４Ｇ）を、撹拌しながらゆっくり加えた。リフォールディングされたＰｈｅＲＳを、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィーの後にＳ１００サイズ排除樹脂を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって単離した。
【０１８５】
あるいは、およびさらに効率的に、ＰｈｅＲＳ（Ａ２９４Ｇ）およびＰｈｅＴドメインのアンチコドン認識部位におけるバリアントを、表１に要約されているような、ｐＹＤ３１７にクローニングされた別個のＰｈｅＳ遺伝子およびＰｈｅＴ遺伝子から無細胞合成によって作製した：
【０１８６】
【表１】
0005798489.tif 000031
ｐＹＤ３１７  ＰｈｅＳ（Ａ２９４Ｇ）バリアントおよびｐＹＤ３１７  ＰｈｅＴバリアントのプラスミドを  ｕｇ／ｍＬの濃度で同時に無細胞反応物に加え、無細胞合成を  時間行った。ヘテロ二量体タンパク質バリアントを図１０に示されているようにＩＭＡＣによって精製し、続いて、それを使用することにより、イソ受容ｔＲＮＡをチャージすることができる。
【０１８７】
実施例５
ｎｎＡＡによるｔＲＮＡアミノアシル化をモニターするための放射性の方法
ｔＲＮＡの３’末端のアデノシンヌクレオチドを、報告されているように（Ｌｅｄｏｕｘ  ＆  Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ（２００８），Ｍｅｔｈｏｄｓ，４４，７４−８０）大腸菌ＣＣＡヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を用いてα−３２Ｐ−ＡＭＰと交換した。過剰のＰＰｉを用いて３’−ＡＭＰを除去するように、次いでＰＰｉａｓｅを用いてＡＭＰを付加するように、反応条件を駆動させる。活性なｔＲＮＡを、５０ｍＭグリシンｐＨ９．０、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．３μＭ  α−３２Ｐ−ＡＴＰ、０．０５ｍＭ  ＰＰｉ中のＣＣＡ酵素とともに３７℃で５分間インキュベートした。１μｌの１０μＭ  ＣＴＰおよび１０Ｕ／ｍｌ（１単位）の無機ピロホスファターゼ（酵母−Ｓｉｇｍａ）を加え、２分間以上インキュベートし、次いで、１／１０の体積の３Ｍ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ５．２を各アリコートに加えた。得られた３’末端が放射標識されたｔＲＮＡを水で１：５希釈し、使用する前にリフォールディングさせた。
【０１８８】
ｔＲＮＡＰｈｅへのｎｎＡＡのアミノアシル化を、最適化された条件を用いて行った。野生型
【０１８９】
【化３１】
0005798489.tif 000032
アミノアシル化に対する条件は、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、４０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＡＴＰ、８〜４０μＭ  
【０１９０】
【化３２】
0005798489.tif 000033
、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１０〜１００ｍＭアミノ酸（Ｐｈｅまたはパラ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ））および１〜１００μＭ  ＰｈｅＲＳまたはＰｈｅＲＳ  Ａ２９４Ｇだった。末端が標識されたｔＲＮＡの反応物を、Ｐ１ヌクレアーゼを用いて室温で２０〜６０分間消化し、１μｌを、事前に洗浄された（水）ＰＥＩセルロースＴＬＣプレート上にスポットし、風乾させた。Ｓｔｏｒｍ８４０ＰｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒとともにＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ貯蔵リン光体スクリーン（ｓｔｏｒａｇｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒ  ｓｃｒｅｅｎ）を用いてオートラジオグラフィーによってモニターして、ＡＭＰを酢酸／１Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ／ｄｄＨ２Ｏ（５：１０：８５）中でａａ−ＡＭＰと分割する（図１１および１２）。図１１に示される結果とは対照的に、ＰｅｔｅｒｓｏｎおよびＵｈｌｅｎｂｅｃｋ（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１，１０３８０−９）は、限定的な
【０１９１】
【化３３】
0005798489.tif 000034
の下では、フェニルアラニンによるチャージが非常に非効率的であることを示した。
【０１９２】
ｐＡＦによる
【０１９３】
【化３４】
0005798489.tif 000035
のアミノアシル化の動態を、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．１、４０ｍＭ  ＫＣｌ、７５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＡＴＰ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１．４Ｍ  ＤＭＳＯ、．０２５Ｕ／μｌ無機ピロホスファターゼ、８〜４０μＭ  
【０１９４】
【化３５】
0005798489.tif 000036
、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１０〜１００ｍＭ  ｐＡＦおよび１〜１００μＭ  ＰｈｅＲＳまたはＰｈｅＲＳ（Ａ２９４Ｇ）においてモニターした。図１３は、この反応の条件下でｐＡＦが効率的にチャージされることにより、
【０１９５】
【化３６】
0005798489.tif 000037
が形成されることを示している。
【０１９６】
本発明者らは、チャージ反応において高濃度（各々１８μＭ）の大腸菌ＧｌｕＲＳおよび
【０１９７】
【化３７】
0005798489.tif 000038
を使用した。通常のチャージ条件は：１０μＬの反応物を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ  ＤＴＴ；１０ｍＭ  ＡＴＰ；１０ｍＭグルタミン酸，ｐＨ７．５；１０Ｕ／ｍｌピロホスファターゼ；および末端が［３２Ｐ］で標識された１μＬの
【０１９８】
【化３８】
0005798489.tif 000039
中で３７℃において３０分間インキュベートすることだった。１μＬの３Ｍ酢酸ナトリウムで反応をクエンチした。有望なことには、そのような高い濃度のｔＲＮＡおよびＧｌｕＲＳとともに通常の緩衝液条件を用いたときでさえも、本発明者らは、変異
【０１９９】
【化３９】
0005798489.tif 000040
が７５％まで同族のグルタメートでチャージされ得ることを見出した（図１４ａ、レーン２）。反応物のｐＨを８．１に変更し、Ｍｇ２＋濃度を７０ｍＭに上げることによって、チャージが、７７％までわずかに増加した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を２．５Ｍまで、およびＴｗｅｅｎ−２０を０．２５％までさらに加えることにより、８４％のチャージにまでさらに増加した（図１４ａ、レーン４）。野生型ｔＲＮＡＧｌｕに対する、フルオロ置換されたグルタメートのチャージは、薄層クロマトグラフィーにおけるフルオロ置換されたグルタメート−ＡＭＰとＡＭＰとの分離が不十分であることに起因して（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎら（２００７）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２，ｅ９７２）、このアッセイの条件下では検出することができなかった（図１４ａ、レーン５）。
【０２００】
本発明者らはまた、ピロリ菌ｔＲＮＡＧｌｎ３．４μＭ、ピロホスファターゼ５０Ｕ／ｍｌ、および［３２Ｐ］で末端標識された０．５μＬのピロリ菌ｔＲＮＡＧｌｎを用いて、精製されたピロリ菌ＧｌｕＲＳ２（ＮＤ）（１．９μＭ）の活性が、各反応に含められていたことを確かめた。同様に、モノフルオロ置換されたグルタメートのチャージは、このアッセイを用いて観察されなかった（図１４ｂ）。
【０２０１】
実施例６
ｎｎＡＡによるｔＲＮＡアミノアシル化をモニターするための非放射性の方法
放射標識されていない（Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏｌａｂｌｅｄ）
【０２０２】
【化４０】
0005798489.tif 000041
を、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、４０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＡＴＰ、８〜４０μＭ  
【０２０３】
【化４１】
0005798489.tif 000042
、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１０〜１００ｍＭアミノ酸（ＰｈｅまたはｐＡＦ）および１〜１００μＭ  ＰｈｅＲＳまたはＰｈｅＲＳ  Ａ２９４Ｇ中でアミノアシル化した。
【０２０４】
【化４２】
0005798489.tif 000043
のアミノアシル化のための条件は、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．１、４０ｍＭ  ＫＣｌ、７５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＡＴＰ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１．４Ｍ  ＤＭＳＯ、８〜４０μＭ  
【０２０５】
【化４３】
0005798489.tif 000044
、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１０〜１００ｍＭ  ｐＡＦおよび１〜１００μＭ  ＰｈｅＲＳまたはＰｈｅＲＳ  Ａ２９４Ｇだった。反応物を３７℃で１５分間インキュベートし、２．５体積の３００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５でクエンチする。クエンチされたサンプルを、２５：２４：１フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールｐＨ５．２（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて抽出し、２分間ボルテックスし、次いで、４℃、１４，０００×ｇで１０〜３０分間遠心することにより、水相（ｔＲＮＡ）と有機相（タンパク質）とを分離した。水相（チャージしたｔＲＮＡを含む）を取り出し、分子のサイズに基づいて分離する、事前に平衡化された（３００ｍＭ  ＮａＯＡｃ）Ｇ２５ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂サイズ排除カラムに加えた。溶出物を２．５体積の１００％エタノールと混ぜ、−８０℃で１５〜３０分間インキュベートし、約１４，０００×ｇで３０〜４５分間遠心した。ペレットにされた、アミノアシル化されたｔＲＮＡを、ＨＰＬＣに注入するためおよび／または無細胞合成反応において使用するために、−８０℃で保存するか、またはわずかに酸性の緩衝液に再懸濁する。
【０２０６】
放射標識されていない
【０２０７】
【化４４】
0005798489.tif 000045
のアミノアシル化を、図１５および図１６に示されるように、ｔＲＮＡのアミノアシル化された部分とアミノアシル化されていない部分とを分割するＨＰＬＣ疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によってモニターした。ＨＰＬＣ  Ｃ５カラムを、緩衝液Ａ（５０ｍＭリン酸カリウムおよび１．５Ｍ硫酸アンモニウムｐＨ５．７）中で平衡化し、次いで、１００μｌの２×緩衝液Ａと混ぜられた１〜１０μｇのペレットにされたアミノアシル化されたｔＲＮＡを注入し、緩衝液Ａから緩衝液Ｂ（５０ｍＭリン酸カリウムおよび５％イソプロパノール）への勾配を用いて、５０分間にわたって分離した。ピーク面積によって判定されるアミノアシル化されたｔＲＮＡの画分は、同じ条件下で行われた反応物に対する、図１３におけるような末端が［３２Ｐ］で標識されたｔＲＮＡを用いて測定された画分との良好な一致を示した。
【０２０８】
あるいは、モノ−フルオログルタメートでアミノアシル化するために大腸菌ＧｌｕＲＳを用いてチャージされた
【０２０９】
【化４５】
0005798489.tif 000046
または
【０２１０】
【化４６】
0005798489.tif 000047
（図１５）を、酸／尿素ポリアクリルアミド４０ｃｍ×３４ｃｍゲル電気泳動を用いて分離した。
【０２１１】
【化４７】
0005798489.tif 000048
をチャージする場合、反応条件は：１２．５μＬの反応物を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．１；７０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ  ＤＴＴ；１０ｍＭ  ＡＴＰ；１０ｍＭアミノ酸，ｐＨ８．１；１６．６Ｕ／ｍｌピロホスファターゼ中において、３０分間３７℃でインキュベートすることだった。（チャージ反応物中にＲＮＡｓｅが存在しないことを保証するために、ｔＲＮＡを加える前に、その緩衝液を３０００ダルトン分子量のカットオフ膜（Ｍｉｃｒｏｓｅｐ  ３Ｋ  Ｏｍｅｇａ；Ｐａｌｌ  ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）で限外濾過した。反応物を１．２５μＬの３Ｍ酢酸ナトリウムでクエンチし、ローディング緩衝液（１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．２；７Ｍ尿素；１ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー色素）に２倍希釈し、６．５％１９：１アクリルアミド；１００ｍＭ酢酸ナトリウム，ｐＨ５．２；７Ｍ尿素のゲルに充填し、４０Ｗで一晩電気泳動した。０．１８％メチレンブルー、０．５Ｍ酢酸ナトリウム，ｐＨ５．２を用いてゲルを３０分間染色し、脱イオン水で脱染した。同族のグルタメートまたは非天然フルオログルタメートでの、野生型ｔＲＮＡＧｌｕ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｌｏｃｋ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）またはインビトロで転写された
【０２１２】
【化４８】
0005798489.tif 000049
のチャージは、最大７０％観察することができた（図１７）。
【０２１３】
実施例７
ｎｎＡＡの組み込みを操るための無細胞タンパク質合成
本質的にはＬｉｕらによって報告されているように（Ｌｉｕ，Ｚａｗａｄａら（２００５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，２１，４６０−５）、高細胞密度発酵の大腸菌ＫＧＫ１０株の急成長（Ｋｎａｐｐ，Ｇｏｅｒｋｅら（２００７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，９７，９０１−８）を用いてリボソーム収率を最大にするために、無細胞の抽出物または溶解産物を生成した。均質化の後、細胞溶解産物にＤＬ−ジチオトレイトールを加えなかった。改変された「流出（ｒｕｎ−ｏｆｆ）手順」を用いて無細胞抽出物を調製した。十分な無細胞抽出物を生成するための発酵体積は、代表的には、所望の無細胞反応物の体積の２．５×だった。細胞抽出物の還元活性を不活性化するために、様々な濃度のヨードアセトアミド（ＩＡＭ）を、以前に報告されているように（Ｙａｎｇ，Ｋａｎｔｅｒら（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，２０，１６８９−９６）加えた。遺伝子発現は、Ｔ７プロモーターの支配下にあった。翻訳の開始を促進するために、−６から＋３７位におけるｍＲＮＡのΔＧｆｏｌｄによって測定される、ｍＲＮＡの不安定性について最適化されたＡＴＧ開始コドン（Ｎ末端のメチオニン残基）を有する遺伝子の５’末端において同義語コドンを用いて遺伝子を合成し（ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）（Ｋｕｄｌａ，Ｍｕｒｒａｙら（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２４，２５５−２５８）、稀なコドンを置き換えた。８ｍＭグルタミン酸マグネシウム、１０ｍＭグルタミン酸アンモニウム、１３０ｍＭグルタミン酸カリウム、３５ｍＭピルビン酸ナトリウム、１．２ｍＭ  ＡＭＰ、０．８６ｍＭのＧＭＰ、ＵＭＰおよびＣＭＰの各々、２ｍＭアミノ酸（チロシンについては１ｍＭ）、４ｍＭシュウ酸ナトリウム、１ｍＭプトレシン、１．５ｍＭスペルミジン、１５ｍＭリン酸カリウム、１００ｎＭ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、２〜５０ｎＭ  ＤＮＡ鋳型、１〜１０μＭ大腸菌ＤｓｂＣ、ならびにＩＡＭで処理された２４〜３０％（ｖ／ｖ）の無細胞抽出物を含む無細胞反応を、３０℃において行った。約５ｍＭの総濃度まで還元型（ＧＳＨ）および酸化型（ＧＳＳＧ）のグルタチオンを加えることによって、レドックス電位を操った。３０℃およびｐＨ７におけるＧＳＨ／ＧＳＳＧ対の標準的な電位としてＥ０＝−２０５ｍＶを用い（Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ  ａｎｄ  Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２，７１７−７２６）、Ｎｅｒｎｓｔ方程式を使用して、開始時のレドックス電位を計算した。その無細胞タンパク質合成システム中で３０℃において６時間、ＧＭＣＳＦを発現させた。図１８は、加えられたアミノ酸であるＬｙｓおよびＰｈｅ（Ｇｌｕではない）の濃度を、無細胞反応物中で操ることにより、タンパク質合成がどのように影響され得るかを図示している。
【０２１４】
実施例８
内因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の枯渇
大腸菌ＫＧＫ１０から調製される細胞抽出物を調製するためにグルタメート−ｔＲＮＡ合成酵素（ｇｌｔＸ）の活性を維持しつつ、ＦＬＡＧ−タグアフィニティークロマトグラフィーを使用してその合成酵素活性を無くすために、その合成酵素のゲノムコピーをＣ末端のＦＬＡＧ−タグでタグ化した。ＧＥＮＥ  ＢＲＩＤＧＥＳ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製のＱｕｉｃｋ＆Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ００６）をその製造者が提案するプロトコルに従って使用して、遺伝子挿入を行った。７０８−ＦＬＰｅｃｍＲ発現プラスミド（Ａ１０５，ＧＥＮＥ  ＢＲＩＤＧＥＳ）を使用することにより、大腸菌染色体から選択マーカーを排除した。ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  ｐｆｘ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をその製造者が提案するプロトコルに従って使用するＰＣＲ伸長によって、ＤＮＡ挿入カセットを増幅した。ＤＮＡ鋳型は、Ｑｕｉｃｋ＆Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ＫｉｔのＦＴＲ−ＰＧＫ−ｇｂ２−ｎｅｏ−ＦＲＴ鋳型ＤＮＡだった。プライマーは：
【０２１５】
【化４９】
0005798489.tif 000050
を含んでいた。ＱＩＡＧＥＮ  ＤＮＡ精製キットを用いてＰＣＲフラグメントを精製した後、エレクトロポレーションによって大腸菌ＫＧＫ１０を形質転換した。ｇｌｔＸの３’末端および下流を含むＤＮＡフラグメントを、プライマー
【０２１６】
【化５０】
0005798489.tif 000051
を使用してＫＧＫ１０ΔｇｌｔＸ：：ｇｌｔＸ−Ｆｌａｇの染色体ＤＮＡから増幅した。プライマー
【０２１７】
【化５１】
0005798489.tif 000052
を使用することによって、Ｆｌａｇ−タグのコード配列を確かめた。まず、ｇｌｔＸの３’末端にＦｌａｇ−タグのコード配列を含むＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅するために、プライマーを設計した。そのＦｌａｇ−タグ配列
【０２１８】
【化５２】
0005798489.tif 000053
を、ジペプチドＧＧを介してグルタメート−ｔＲＮＡ合成酵素のＣ末端に接続した。そのタグペプチド配列は、ＤＮＡ配列
【０２１９】
【化５３】
0005798489.tif 000054
に逆翻訳された。そのＦＬＡＧ−タグのコード配列のすぐ後ろに終止コドンＴＡＡを付加した。順方向プライマーは、５’末端にグルタメート−ｔＲＮＡ合成酵素（ＧｌｕＲＳ）のＣ末端をコードする５０Ｎｔ相同配列、中央にＦｌａｇ−タグ配列、および３’末端に増幅配列
【０２２０】
【化５４】
0005798489.tif 000055
を含んでいた。増幅配列
【０２２１】
【化５５】
0005798489.tif 000056
を、ｇｌｔＸ遺伝子の下流に位置する５０Ｎｔ相同配列に接続することによって逆方向プライマーを設計した。第２に、ＦＬＡＧ−タグ配列を挿入するための直鎖状フラグメントを増幅し、ＫＧＫ１０に形質転換することにより、ｇｌｔＸの下流の４４１ｂｐ配列を置き換えた。ＫＧＫ１０のゲノムＤＮＡに挿入されたカナマイシン耐性マーカーによって、Ｆｌａｇ−タグ挿入変異体を選択した。次いで、その選択用のカナマイシン耐性マーカーを、７０８−ＦＬＰｅｃｍＲ発現プラスミドを用いて排除した。最後に、変異体ＫＧＫ１０ΔｇｌｔＸ：：ｇｌｔＸ−Ｆｌａｇから増幅されたＰＣＲフラグメントを配列決定することによって、そのＦＬＡＧ−タグのコード配列を確かめた。ＤＮＡ配列
【０２２２】
【化５６】
0005798489.tif 000057
を、ＫＧＫ１０染色体内のｇｌｔＸ遺伝子の３’末端に付着した。このフラグメントは、アミノ酸配列
【０２２３】
【化５７】
0005798489.tif 000058
、２つのＧｌｙ残基およびＦＬＡＧ−タグをコードする。無細胞抽出物からのＦＬＡＧタグ化されたＧｌｕＲＳタンパク質の取り出しは、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２磁気ビーズ（Ｓｉｇｍａ  ｃａｔ＃Ｍ８８２３）の上に抽出物を通過させ、そのビーズを取り出すことによって達成される。
【０２２４】
実施例９
活性部位特異的インヒビターＰｈｅ−およびＧｌｕ−スルファモイルアデノシン（Ｐｈｅ−ＳＡおよびＧｌｕ−ＳＡ）を用いた内因性ａａＲＳ活性の枯渇
図１９は、無細胞反応物に加えられたイソ受容チャージした（ｉｓｏａｃｃｅｐｔｉｎｇ  ｃｈａｒｇｅｄ）ｎｎＡＡ−ｔＲＮＡの反応性が、活性部位特異的インヒビターを用いて調節されることにより、加えられたイソ受容ｔＲＮＡのバックグラウンドリチャージをどのように制限し得るかを図示している。
【０２２５】
５’−Ｏ−［Ｎ−（アミノアシル）スルファモイル］アデノシンインヒビターＰｈｅ−ＳＡ（図１９ｂ）を以下のとおり合成した：０℃のＤＭＡＣ（７０ｍＬ）中のアルコールの溶液（７ｇ，１７．０３ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ）に、ＤＩＥＡ（１０．６２ｍＬ，５９．６１ｍｍｏｌ，４．０ｅｑ）およびスルファモイルクロリド（４ｅｑ）を加え、その反応混合物を室温において１５時間撹拌した。その反応混合物を酢酸エチル（３００ｍＬ）で希釈し、水で洗浄した（４×５０ｍＬ）。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸発させ、カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭからＤＣＭ中の２０％ＭｅＯＨ）で精製することにより、活性化されたスルファメートを得た（４．５ｇ，９．１８ｍｍｏｌ，５４％収率）。ＤＣＭ（４５ｍＬ）中の、スルファメート（２．０ｇ，４．０７ｍｍｏｌ，１ｅｑ）、ＤＣＣ（０．８４１ｇ，４．０７ｍｍｏｌ，１ｅｑ）、ＤＭＡＰ（０５０ｇ，４．０７ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ）の溶液に、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ（１．１ｇ，４．０７ｍｍｏｌ，１ｅｑ）を加え、その反応混合物を室温で１０時間撹拌した。その反応混合物を酢酸エチル（４５０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、水、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸発させた。粗生成物をＭｅＯＨ／ｎ−ブチルアミン（３０ｍＬ／３０ｍＬ）に溶解し、室温で３時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃから１０％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）で精製することにより、Ｐｈｅ−ＳＡインヒビターを得た（０．９０ｇ，１．４ｍｍｏｌ，３５％収率）。
【０２２６】
ＧＦＰレポータータンパク質であるｔｕｒｂｏＧＦＰの無細胞合成における５’−Ｏ−［Ｎ−（アミノアシル）スルファモイル］アデノシンインヒビター（Ｐｈｅ−ＳＡおよびＧｌｕ−ＳＡ）の作用が、図１９ｃに図示されている。３０℃での無細胞合成反応物を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５プレートリーダーにおいて、粘着性カバー（ＶＷＲ，９５０３１３０）を用いて蛍光（λＥｘ＝４７６ｎｍおよびλＥｍ＝４９０ｎｍ）によって５時間モニターした。アミノアシル合成酵素インヒビターＰｈｅ−ＳＡおよびＧｌｕ−ＳＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｏｗａ）を、ＴＥ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１２０９０）中の原液からＤＥＰＣ水で３倍に段階希釈し、９６ウェルＶ底ポリプロピレンプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，６５１２０７）に移した。そのマイクロプレートに上記無細胞反応混合物を２５μＬの最終反応体積になるようにインヒビターとともに直ちに加えた。蛍光の変化の最大速度（Ｖ０（ＲＦＵ／秒）＝インヒビターなし、Ｖ＝インヒビターの存在下）を測定し、示されるように加えたインヒビター濃度に応じて、パーセント相対活性を測定した。重要なことには、図２０に示されるように＞１０μＭ  ＰｈｅＲＳ（Ａ２９４Ｇ）を加えると１ｎＭ  Ｐｈｅ−ＳＡインヒビターの存在下におけるｔｕｒｂｏＧＦＰ蛍光活性（約５０％活性）を完全に回復することができるので、これらのインヒビターは、それぞれのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＰｈｅＲＳおよびＧｌｕＲＳ）に対して競合的に特異的である。様々な［Ｐｈｅ−ＳＡ］と、加えられたＬ−フェニルアラニンとの両方の関数としてのＧＦＰ活性の表面反応解析は、Ｐｈｅ−ＳＡ阻害の競合的かつ特異的な性質と一致する。
【０２２７】
実施例１０
ＴｕｒｂｏＧＦＰ  Ｙ５０ＴＡＧへのパラ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）の組み込み：
非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を含むタンパク質の無細胞合成を制御するためおよび最適化するために（図２１）、本発明者らは、プロセス全体の個別の工程の動態および熱力学を説明する定量的フレームワークを確立することを目指した（図１９ａを参照のこと）。そのようなフレームワークは、そのプロセスにおける各関与物の機能および機構を理解する上での手掛かりとなり、タンパク質へのｎｎＡＡの無細胞組み込みの徹底的な解析および最適化のための基礎として役立つ。
【０２２８】
本発明者らは、Ａｎｔｈｒｏｐｏｄａ由来の緑色蛍光タンパク質であるｔｕｒｂｏＧＦＰの無細胞合成（Ｅｖｄｏｋｉｍｏｖ，Ｐｏｋｒｏｓｓら（２００６）ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ，７，１００６−１２）に基づいて、最小のキネティクスモデル（図１９を参照のこと）を構築し、解析した。アンバー（ＵＡＧ）コドンをそのタンパク質配列の５０位に導入することにより、プラスミドｔｕｒｂｏＧＦＰ  Ｙ５０ＴＡＧを得た（図２２）。加えられるサプレッサーｔＲＮＡの非存在下では、予想される６ｋＤの切断型タンパク質だけが合成される。
【０２２９】
マイクロタイタープレート形式での蛍光性ｔｕｒｂｏＧＦＰの無細胞合成のキネティクスを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５プレートリーダーにおいて、粘着性カバー（ＶＷＲ，９５０３１３０）を用いて蛍光（λＥｘ＝４７６ｎｍおよびλＥｍ＝４９０ｎｍ）によって５時間モニターした。ｔｕｒｂｏＧＦＰプラスミド（ＵＡＧ終止コドンを含まない）を用いたポジティブコントロール反応を、ポジティブコントロールとして使用した。外因的に（ｅｘｏｇｅｏｎｏｕｓｌｙ）加えられるｔＲＮＡの非存在下（ネガティブコントロール）では蛍光が検出されないことを確実にするために、ｔｕｒｂｏＧＦＰ  Ｙ５０ＴＡＧプラスミドを含む反応を、加えられるｔＲＮＡなしでも行った。蛍光シグナルが存在しないことは、以前に観察されたおよそ６ｋＤの切断型生成物と一致する（図２２を参照のこと）。加えられるＰｈｅ−ＳＡの阻害の非存在下では、チャージされていない
【０２３０】
【化５８】
0005798489.tif 000059
が、ｔｕｒｂｏＧＦＰＹ５０ＴＡＧにおけるアンバーコドンを抑制したが、加えられた
【０２３１】
【化５９】
0005798489.tif 000060
よりも効率的ではなかったことから、無細胞抽出物中の内因性ａａＲＳのうちの１つによってそれが認識され、アミノアシル化されたことが示唆される。ＰｈｅＲＳが、外因的に加えられた
【０２３２】
【化６０】
0005798489.tif 000061
のリチャージに関与したか否かを判定するために、ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）でチャージされたＵＡＧ特異的サプレッサーである大腸菌フェニルアラニンｔＲＮＡの
【０２３３】
【化６１】
0005798489.tif 000062
を用いたアンバーコドンの抑制を、ＰｈｅＲＳの内因性活性を調節する様々な濃度のＰｈｅ−ＳＡインヒビターの存在下において測定した（図２３）。単独で
【０２３４】
【化６２】
0005798489.tif 000063
が加えられたときよりも１０倍多い、ｔｕｒｂｏＧＦＰＹ５０ＴＡＧへのｐＡＦの最大の組み込みが、以前に測定されたＰｈｅ−ＳＡのＩＣ５０に近いインヒビター濃度（図１９ｃ）において観察された。そのインヒビターは、７〜８時間後にその有効性を失い始める。
【０２３５】
本発明者らは、ｔｕｒｂｏＧＦＰへのｐＡＦの組み込みが、タンパク質の比較的高収量をもたらすが、図１９ａに図示されるように
【０２３６】
【化６３】
0005798489.tif 000064
のリチャージが、大きく低下すると結論づける。これらの結果は、内因性合成酵素活性を制御しつつ、外因的にチャージされたｎｎＡＡ−ｔＲＮＡ部分を加えることによって、部位特異的ｎｎＡＡを含むタンパク質を効率的に合成するために無細胞合成を使用することができること（図２１を参照のこと）を示している。
【０２３７】
実施例１１
【０２３８】
【化６４】
0005798489.tif 000065
を介したタンパク質への蛍光タグの組み込み
タンパク質に蛍光タグを組み込む実行可能性を証明するために、イプシロン標識されたＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ  ｌｙｓｌ−ｔＲＮＡである
【０２３９】
【化６５】
0005798489.tif 000066
を、１１１位に単一のＡＡＡコドンを有するｒｈＧＭ−ＣＳＦに対するプラスミドを含む無細胞反応物に加えた（図２４）。その無細胞反応物は、５０μＬの無細胞反応物あたり２μＬの
【０２４０】
【化６６】
0005798489.tif 000067
（ＦｌｕｏｒｏＴｅｃｔ  ＧｒｅｅｎＬｙｓ  Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む、８ｍＭグルタミン酸マグネシウム、１０ｍＭグルタミン酸アンモニウム、１３０ｍＭグルタミン酸カリウム、３５ｍＭピルビン酸ナトリウム、１．２ｍＭ  ＡＭＰ、０．８６ｍＭのＧＭＰ、ＵＭＰおよびＣＭＰの各々、２ｍＭアミノ酸（チロシンについては１ｍＭ）、４ｍＭシュウ酸ナトリウム、１ｍＭプトレシン、１．５ｍＭスペルミジン、１５ｍＭリン酸カリウム、１００ｎＭ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、２〜５０ｎＭ  ＤＮＡ鋳型、１〜１０μＭ大腸菌ＤｓｂＣ、ならびにＩＡＭで処理された２４％（ｖ／ｖ）の無細胞抽出物を含んでいた。コントロールとして、
【０２４１】
【化６７】
0005798489.tif 000068
の非存在下および存在下においてプラスミドを含まない無細胞反応を平行して行った。ＴＣＡによって沈殿可能な（ｐｒｅｃｉｐａｔｉｂｌｅ）可溶性タンパク質および総タンパク質を測定することによって、ｌ−［Ｕ−１４Ｃ］−ロイシン（３００μＣｉ／μモル；ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）の組み込みによって生成されたタンパク質をモニターした。無細胞反応物を９６ウェルＶ底ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において３０℃で振盪しながらインキュベートした。総タンパク質のアリコート（５μＬ）、または不溶性タンパク質凝集物を除去するために４℃、６１００×ｇで１０分間遠心したサンプルからの可溶性タンパク質を、予め湿らせたポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）フィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上にブロットした。乾燥したそのプレートを、２００μＬの５％ＴＣＡで３回洗浄した後、１００μＬの無水エタノールで洗浄した。Ｏｐｔｉｐｈａｓｅシンチレーションカクテル（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を、５０μＬの体積になるように加え、１４Ｃ放射能をＷａｌｌａｃ  １４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｐｌｕｓカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）において測定した。可溶性の無細胞反応物の各々の３μＬのアリコートを１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥに充填し、電気泳動した後にＳｔｏｒｍ８４０Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてそのゲルをスキャンすることにより、ｎｎＡＡ組み込みを示唆する放射能値と蛍光の両方をモニターした。図２４に示されるように、蛍光性ｔＲＮＡ結合体からのバックグラウンド蛍光は、１１ｋＤと２１ｋＤとの間を移動する。標識されたＧＭＣＳＦの蛍光は、放射性標識されたコントロールＧＭ−ＣＳＦとともに移動することから、無細胞反応物に
【０２４２】
【化６８】
0005798489.tif 000069
を加えることによって、蛍光性ＢＯＤＩＰＹがタンパク質に導入されていることが示唆される。２５０μＬスケールで行われた
【０２４３】
【化６９】
0005798489.tif 000070
の存在下における無細胞反応の産物を、勾配溶出（緩衝液Ａ：１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム，ｐＨ７．０；緩衝液Ｂ：７０％アセトニトリル、１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム，ｐＨ７．０）による逆相ＨＰＬＣ（ＺＯＲＢＡＸ  ３００ＳＢ−Ｃ８  ５μｍ，４．６×２５０ｍｍ，Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して精製し、図２４に示されるように２１４ｎｍと４８０ｎｍの両方（蛍光性ＢＯＤＩＰＹの組み込みを検出するため）においてモニターした。
【０２４４】
実施例１２
ｒｈＧＭ−ＣＳＦへのｐＡＦの組み込み
突然変異誘発および相補性研究は、単一のイソ受容大腸菌
【０２４５】
【化７０】
0005798489.tif 000071
内のＧ３４がアミノアシル化に必要であることを示している。Ｇ３４ＡまたはＧ３４Ｃ  Ａ３５Ｕの変異は、通常のｋｃａｔ／ＫＭ反応条件下において、それぞれ６４０倍のｔＲＮＡおよび＞１０００倍（ｆｏｌｏｄ）低いアミノアシル化をもたらす（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｃ．Ｔ．＆  Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｏ．Ｃ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：１０３８０−１０３８９）。図２５における太い灰色線によって示されるような、通常の無細胞条件下での内因性Ｐｈｅ  ｔＲＮＡ合成酵素（ＰｈｅＲＳ）による
【０２４６】
【化７１】
0005798489.tif 000072
の相互チャージは、最小にされるべきである。さらに、内因性ＰｈｅＲＳ活性は、活性部位特異的インヒビターを加えることおよびまたはタグ化されたＰｈｅＲＳを無細胞抽出物から除去することによって、ある程度まで制御され得る。
【０２４７】
このアプローチは、拡張によって、他のｎｎＡＡの組み込みのために他のゆらぎコドンを用いても可能であるはずである。どのゆらぎコドンを「乗っ取る」かの選択は、相互作用の好ましい自由エネルギーに依存する。また、いくつかのアンチコドン塩基が、ゆらぎコドンの認識を嫌うように翻訳後に修飾される（例えば、Ｓｙｌｖｅｒｓ，Ｌ．Ａ．，Ｒｏｇｅｒｓ，Ｋ．Ｃ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｍ．，Ｏｈｔｓｕｋａ，Ｅ．ａｎｄ  Ｓｏｅｌｌ，Ｄ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：３８３６−３８４１を参照のこと）。それゆえ、改変されたｔＲＮＡが、翻訳後修飾なしにインビトロにおいて合成される場合、「乗っ取られた」センスコドンに対する選択性は、高いことがある。
【０２４８】
ＧＭ−ＣＳＦは、５つのＰｈｅ残基：Ｐｈｅ４８、Ｐｈｅ１０４、Ｐｈｅ１０７、Ｐｈｅ１１４およびＰｈｅ１２０を含む。ＴＴＴによってコードされるＰｈｅ１２０だけを有する遺伝子（図２６）を構築し、ｐＹＤ３１７にクローニングした。このＴＴＣからＴＴＴにコドンが交換されたＧＭ−ＣＳＦプラスミドＤＮＡを使用するとき、組み込み実験物は、８ｍＭグルタミン酸マグネシウム、１０ｍＭグルタミン酸アンモニウム、１３０ｍＭグルタミン酸カリウム、３５ｍＭピルビン酸ナトリウム、１．２ｍＭ  ＡＭＰ、０．８６ｍＭのＧＭＰ、ＵＭＰおよびＣＭＰの各々、フェニルアラニンを除く２ｍＭのアミノ酸（チロシンについては１ｍＭ）、４ｍＭシュウ酸ナトリウム、１ｍＭプトレシン、１．５ｍＭスペルミジン、１５ｍＭリン酸カリウム、１００ｎＭ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、２０ｎＭ  ＤＮＡ鋳型、１０μＭ大腸菌ＤｓｂＣ、ならびに無細胞反応物に加えられるおよそ８０％チャージされた２０μＭ  
【０２４９】
【化７２】
0005798489.tif 000073
を含む、ＩＡＭで処理された２４％（ｖ／ｖ）の無細胞抽出物を含み、濃度は、確実にｐＡＦを１２０位に特異的に組み込むようにするために十分に過剰量の
【０２５０】
【化７３】
0005798489.tif 000074
を与えるものであるべきである。図２５における太い灰色線によって示される、脱アシル化された
【０２５１】
【化７４】
0005798489.tif 000075
のリチャージを低下させるために、無細胞反応物に加えられる
【０２５２】
【化７５】
0005798489.tif 000076
の濃度および反応時間を変更することに加えて、無細胞反応物にフェニルアラニンを加えなかった。
【０２５３】
【化７６】
0005798489.tif 000077
の相互チャージを制限するための０．５ｎＭ  Ｐｈｅ−ＳＡインヒビターの添加も試験した。無細胞反応物を３０℃で最大４時間インキュベートした。
【０２５４】
【化７７】
0005798489.tif 000078
の存在下における無細胞反応の生成物を、勾配溶出（緩衝液Ａ：１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム，ｐＨ７．０；緩衝液Ｂ：７０％アセトニトリル、１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム，ｐＨ７．０）による逆相ＨＰＬＣ（ＺＯＲＢＡＸ  ３００ＳＢ−Ｃ８
５μｍ，４．６×２５０ｍｍ，Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して精製し、図２７に示されるように２８０ｎｍでモニターした。サンプルを質量分析による解析にまわした。未改変のＧＭ−ＣＳＦは、１４６０４Ｄａの質量を有した。
【０２５５】
実施例１３
鋳型の入手
本発明には、無細胞タンパク質合成反応のために核酸鋳型の使用が必要である。以下は、所望のポリペプチド内に非天然アミノ酸を配置することに基づいて構築されたコドン配列を有する鋳型を生成する実施例を提供する。
【０２５６】
ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｈＧＭＣＳＦ）のアミノ酸配列を、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＲＣＳＢ）タンパク質データバンク（ＰＤＢ）から入手する。ｈＧＭＣＳＦタンパク質をコードする構造ＤＮＡ遺伝子が、デノボ合成され（ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）、２番目を除くすべてのグルタミンアミノ酸残基が、第１コドンＣＡＡによってコードされる。そのタンパク質のＮ末端から２番目のグルタミンは、コドンＣＡＧによってコードされる。その遺伝子は、Ｔ７プロモーターおよびターミネーターに隣接しており、大腸菌の複製起点およびカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターに挿入されている。大腸菌のＸＬ１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ
Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）株を形質転換し、その培養物を３７℃で一晩生育し、精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してＤＮＡを精製することによって、環状プラスミドＤＮＡ鋳型を調製する。
【０２５７】
実施例１４
インビトロでのタンパク質合成に有用な溶解産物の生成
非天然アミノ酸を含むタンパク質を発現するために有用な溶解産物を生成しなければならない。この実施例では、後の実施例に記載されるように前記合成酵素を枯渇させるために有用な６×Ｈｉｓ−タグ（配列番号１３）とともに天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が発現されるように改変された大腸菌から溶解産物を生成することを示す。
【０２５８】
６×Ｈｉｓ−タグ（配列番号１３）をコードするＤＮＡフラグメントが、大腸菌染色体内のＧｌｎ−ＲＳにＣ末端に付け加えられるように、まず、大腸菌Ａ１９ΔｅｎｄＡΔｔｏｎＡΔｓｐｅＡΔｔｎａＡΔｓｄａＡΔｓｄａＢΔｇｓｈＡΔｇｏｒＴｒｘＢＨＡｍｅｔ＋を改変する。さらに、第２イソ受容Ｇｌｎ−ｔＲＮＡではなく第１イソ受容Ｇｌｎ−ｔＲＮＡだけをチャージすることができる適切に操作されたＧｌｎ−ＲＳを構成的プロモーターの下の染色体に挿入する。
【０２５９】
次いで、大腸菌細胞を１０ＬのＢｒａｕｎ  Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｃ発酵槽において生育する。ｐＨをｐＨ７．０に制御しながら、その細胞をバッチモードで２ＹＰＴＧ培地において生育する。１時間当たり＞０．７の成長速度の３．２ＯＤ（５９５）において細胞を回収する。６０００ｇ，４℃における２５分間の遠心分離によって細胞を培地から分離し、得られた細胞ペーストを−８０℃で保存する。湿重量１ｇの細胞ペーストあたり１ｍＬの緩衝液の割合で、Ｓ３０緩衝液（１０ｍＭ  ＴＲＩＳ酢酸塩ｐＨ８．２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１４ｍＭ酢酸マグネシウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および６０ｍＭ酢酸カリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））中、４℃でその細胞ペーストを解凍する。再懸濁された細胞を高圧ホモジナイザー（Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ  Ｃ−５０，Ａｖｅｓｔｉｎ  Ｉｎｃ．，Ｏｔｔａｗａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）に通す。圧力降下（ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｄｒｏｐ）を２００００ｐｓｉに設定する。次いで、均質化された混合物を３００００ｇ，４℃において３０分間遠心する。この手順を２回繰り返し、両方の時点において上清を確保する。その混合物をロータリーシェーカーにおいて３７℃で８０分間インキュベートする。インキュベート後、５０００ＭＷＣＯ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に通すタンジェンシャルフロー（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ）濾過を用いて４℃において１０透析体積（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）のＳ３０緩衝液で抽出物を透析する。
【０２６０】
実施例１５
内因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の枯渇
本発明には、内因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の不活性化が必要である。この不活性化の目的は、通常、非天然アミノ酸でチャージされ得る未チャージのイソ受容ｔＲＮＡが、天然アミノ酸で誤ってアミノアシル化されることを防ぐことである。
【０２６１】
ゲノムＤＮＡの標的化された相同組換えを用いて、ｔＲＮＡ合成酵素の核酸配列またはそれらのプロモーターを不活性化するかまたは「ノックアウトする」ことによって、内因性ｔＲＮＡ合成酵素の発現を低下させることができる（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：２３０−２３４（１９８５）；Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ  ５１：５０３−５１２（１９８７）；Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １８：１３１４−１３１８（２０００）を参照のこと）。例えば、内因性ｔＲＮＡ合成酵素に相同的なＤＮＡに隣接する非機能性の変異ｔＲＮＡ合成酵素（または完全に無関係のＤＮＡ配列）（セリルｔＲＮＡ合成酵素のコード領域または調節領域）を、選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーを伴ってまたは伴わずに使用することにより、内因性ｔＲＮＡ合成酵素を発現する細胞を形質転換することができる。標的化された相同組換えを介してそのＤＮＡ構築物を挿入することによって、そのｔＲＮＡ合成酵素が不活性化される。
【０２６２】
標的化された相同組換えを用いることにより、上に記載したように、タグ化された変異ｔＲＮＡ合成酵素を含むＤＮＡ構築物を細胞に挿入することができる。別の実施形態では、標的化された相同組換えを用いることにより、その細胞に存在するものとは異なるｔＲＮＡ合成酵素ポリペプチドバリアントをコードする核酸を含むＤＮＡ構築物を挿入することができる。
【０２６３】
あるいは、ｔＲＮＡ合成酵素遺伝子の調節領域（すなわち、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的化して、標的細胞内でのｔＲＮＡ合成酵素の転写を妨げる三重らせん構造を形成することによって、内因性ｔＲＮＡ合成酵素の発現を低下させることができる。
【０２６４】
上記の大腸菌抽出物中の内因性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、上に記載したような鋳型ＤＮＡを加える前のヨードアセトアミドによる前処理中にマイクロモル濃度の５¢−Ｏ−［Ｎ−（フェニアラニルアシル）スルファモイル］アデノシンを加えることによって非活性化され得る。
【０２６５】
実施例２に記載したような染色体にインテグレートされた天然の６×ｈｉｓ−タグｔＲＮＡ合成酵素を除去するために、適切に操作された多量のＳ３０抽出物を、使用前の事前に平衡化された様々な体積のＮｉ−ＮＴＡ磁気ビーズ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５）とともに４℃で３０分間インキュベートした。磁気選別機を活用してそのビーズを除去した後、残った抽出物をタンパク質合成に使用する。
【０２６６】
実施例１６  
アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の組換え発現：ベクター、酵素発現および精製
別個のｔＲＮＡチャージ反応には、イソ受容ｔＲＮＡ分子をアミノアシル化するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の使用が必要である。この合成酵素は、この実施例に記載されるように組換え合成酵素を発現させることによって得ることができる。
【０２６７】
大腸菌Ｇｌｎ−ｔＲＮＡ合成酵素（ｓｙｎｔｈｔａｓｅ）に対する構造遺伝子を、表２に示されるような順方向および逆方向プライマーを用いて大腸菌ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ＃１０７９８Ｄ−５）からＰＣＲ増幅する。次いで、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで二重消化することにより、プラスミドｐＥＴ２３ｂ−ＧｌｎＲＳＨ（ヒスチジンタグ化されたもの）およびｐＥＴ２３ｂ−ＧｌｎＲＳを得た後、ＰＣＲ産物をｐＥＴ２３ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）にクローニングする。得られたプラスミドは、過剰発現のためのＴ７プロモーターの支配下にある６×ヒスチジン−タグ（配列番号１３）を有するかまたは有しないＧｌｎ−ＲＳ配列を含む。
【０２６８】
表２．
各タイプの発現ベクターを構築するために使用されるプライマー
【０２６９】
【表２】
0005798489.tif 000079
制限酵素認識部位の配列に下線を引いている。終止コドンは、太字で示されている。
【０２７０】
ＧｌｎＲＳ過剰産生プラスミド（ｐＥＴ２３ｂ−ＧｌｎＲＳＨ）を、化学的にコンピテントなＢＬ−２１細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に形質転換し、ＬＢ／カルベニシリンプレートにプレーティングする。シングルコロニーをＴＢ／１００μｇ／ｍＬカルベニシリン中で一晩生育し、次いで、それを用いて大量の培養液に１：５０希釈で接種する。その細胞を富栄養培地中で中対数期（ｍｉｄ−ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）まで３７℃で生育した後、１ｍＭ  ＩＰＴＧで５時間誘導する。その後のすべての精製工程は、４℃で行う。５０００ｇでの遠心分離の後、高圧下で細胞溶解することによって、粗細胞抽出物を調製する。その抽出物を、溶解緩衝液で事前に平衡化された５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ樹脂と混ぜる。タンパク質を氷上で１時間インキュベートすることにより、その樹脂に結合させた後、この混合物を１０ｍＬのカラムに注ぎ込む。溶出液のＡ２８０が０．１未満に下がるまで、洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム，ｐＨ６．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１０％グリセロール）を用いて、弱く結合したタンパク質を除去する。タンパク質は、洗浄緩衝液中の０〜０．５Ｍの勾配のイミダゾールで溶出される。活性またはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特定されるピーク画分をプールし、５０ｍＭリン酸カリウム，ｐＨ７．０、１００ｍＭ  ＫＣｌおよび１０ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含む緩衝液に対して４℃で一晩透析する。次いで、タンパク質を４０％グリセロール中、１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで濃縮し、次いで、−２０℃で保存する。
【０２７１】
実施例１７
アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素バリアントの操作
非天然アミノ酸は、通常、天然に存在するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によってイソ受容センスｔＲＮＡ分子にチャージされるはずがない。場合によっては、イソ受容ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でチャージする能力を有する「ごたまぜ」アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、あらかじめ存在することがある。そのような能力を有するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が存在しない他の場合では、所望の非天然アミノ酸が、別個のｔＲＮＡチャージ反応においてｔＲＮＡ分子にチャージされ得るように、新しいアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を操作しなければならない。
【０２７２】
基質の認識に関与すると知られている熱安定性のｔＲＮＡ合成酵素の活性部位残基を、Ｐｙｍｏｌ分子閲覧ソフトウェアを用いて同定する。アミノ酸側鎖の５〜１０Å以内の残基を同定する。同定された残基に対応する部位特異的バリアントの２×２０アミノ酸＝４００メンバーの「ライブラリー」を、以下のとおり構築する。コドンの各側においてアミノ酸をコードするセンス鎖またはアンチセンス鎖を表す３５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドのカセットライブラリーを、ＮＮＫ（ここで、Ｎ＝Ｇ、Ａ、Ｔ、ＣおよびＫ＝ＧまたはＴヌクレオシド三リン酸）を用いて合成する（Ｏｐｅｒｏｎ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）。Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉｓｉｔｅ突然変異誘発プロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、プールされたオリゴを鋳型ＤＮＡにアニールさせ、ＤＮＡポリメラーゼによって増幅し、プラスミド鋳型をＤｐｎ１で分解し、ライブラリーを形質転換して、プレーティングする。９６個のクローンの配列決定を行うことにより、ライブラリーの多様性を確かめる。
【０２７３】
実施例１８
非天然ｔＲＮＡをチャージするためのアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素バリアントのスクリーニング
実施例５に記載したように操作されたバリアントのハイスループット発現を、以下のとおり９６ウェル形式で行う。プレーティングされたコロニーを、滅菌つまようじで９６ウェル深ウェルプレートに移し、ＯＤ６００＝０．５まで富栄養培地中で生育した後、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、一晩生育する。精製は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ濾過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）を使用する９６ウェル形式で行われる。細胞を回収して溶解し、その溶解産物を４×体積のＰＢＳ緩衝液で希釈し、２００μＬを、ＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎプレートにおけるＮｉ−キレート化セファロース媒体上に充填する。イミダゾールの濃度を上げることによって、酵素の溶出を最適化する。その濾液を真空濾過によって濾過し、高収量の純粋な組換えタンパク質が得られる。
【０２７４】
各バリアントの酵素活性は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（またはＨｅｐｅｓ）ｐＨ７．５、２０ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンおよび一連のアミノ酸、ＡＴＰならびにｔＲＮＡ濃縮物中、［３Ｈ］標識されたｎｎＡＡ−ｔＲＮＡｎｎＡＡの３７℃での形成をモニターする不連続定常状態アッセイによって、放射標識された非天然アミノ酸を用いてアッセイされる。その活性を、放出されたピロホスフェートを測定する共役酵素アッセイを用いて蛍光によって独立して測定された酵素濃度に対して正規化する。
【０２７５】
実施例１９
非天然アミノ酸の合成：
ＧａｌＮＡｃ  Ｌ−トレオニンは、非天然アミノ酸の例であり、商業的に入手可能なＧａｌＮＡｃ  Ｌ−トレオニン（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−Ｌ−トレオニン（Ｖ−Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎ，ＬＡ）から合成される。この合成は、ジクロロメタン中のピペリジンによるＦｍｏｃ基の選択的な脱保護により、遊離アミノ酸を得た後、リパーゼＷＧを用いるその炭水化物の酢酸塩の選択的な酵素的加水分解によって起きる（このサンプルは、逆相ＨＰＬＣを用いて精製される）。
【０２７６】
実施例２０
ｔＲＮＡチャージ反応
本発明には、タンパク質合成反応とは別のチャージ反応において、イソ受容センスｔＲＮＡを天然または非天然アミノ酸でチャージすることが必要である。
【０２７７】
ｔＲＮＡ合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）は、その配列の５’末端に対応するセンス鎖が、３’アンチセンス鎖と１０ｂｐの重複を有するように設計される。大腸菌ｔＲＮＡ２Ｇｌｎ遺伝子を構築するために使用されるオリゴヌクレオチドは：
【０２７８】
【化７８】
0005798489.tif 000080
であり、ここで、ｍＴおよびｍＧは、５’−Ｏ−メチルヌクレオチドのことを表し、下線部分は、重複領域を表す。太字は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを示す。オリゴヌクレオチドを、４００ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、７．５ｍＭ  ＤＴＴおよび５０Ｕ／ｍＬ  Ｋｌｅｎｏｗフラグメントポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む反応溶液中、等モル濃度の４ｍＭと混ぜる。その混合物を、８サイクルにわたって３０秒間隔で１０℃と３７℃との間をサイクルした後、そのＤＮＡを６５％エタノール／０．３Ｍ酢酸ナトリウム中に沈殿させ、ペレットにし、１００ｍＬのＰＭＳ緩衝液（５ｍＭ  ＰＩＰＥＳ，ｐＨ７．５／１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４）に再懸濁する。２５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７＋５、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭスペルミジン、４０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、５ｍｇ無機ピロホスファターゼ（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、５０Ｕ  ＲＮａｓｉｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、４０ｍｇ／ｍＬ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、およびＫｌｅｎｏｗ伸長反応からの１ｍＭ  ＤＮＡ鋳型を含む溶液中で転写を行う。２ｍＬ反応混合物を３７℃で８〜１０時間インキュベートし、その時点でＲＱ１  ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を１０Ｕ／ｍＬになるように加え、インキュベートをさらに２〜３時間続ける。次いでその反応物を、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．５、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２００ｍＭ  ＮａＣｌで事前に平衡化された５ｍＬのＤＥ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）カラムに充填する。そのカラムを３０ｍＬの平衡化緩衝液で洗浄し、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．５、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、６００ｍＭ  ＮａＣｌの溶液でＲＮＡを溶出する。ｔＲＮＡを含む画分をＰＭＳ緩衝液に透析し、７０℃に加熱した後、室温までゆっくりと冷却することによって、リフォールディングする。
【０２７９】
ＧａｌＮＡｃ  Ｌ−Ｇｌｎ−ｔＲＮＡ２  チャージされたＧａｌＮＡｃ  Ｌ−Ｇｌｎ−ｔＲＮＡ２の形成は、以下のとおり、組換えａａＲＳによって触媒される。代表的な反応混合物は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（またはＨｅｐｅｓ）ｐＨ７．５、２０ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、１〜５ｎＭ  ａａＲＳおよび一連のアミノ酸、ＡＴＰならびにｔＲＮＡ濃縮物を含む。チャージされたｔＲＮＡは、前に記載したような固定化されたＥｆ−Ｔｕクロマトグラフィーによって精製され得る。このチャージ反応に使用される組換えａａＲＳは、Ｒａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６：１５６５４−５５（２００４）に記載されている。
【０２８０】
実施例２１
インビトロでのタンパク質合成反応
実施例２に記載したように生成され、続いて実施例３に記載したように天然アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が枯渇された、大腸菌溶解産物とともに、表３に要約されている試薬を、無細胞タンパク質合成反応物は含む。
【０２８１】
表３  無細胞タンパク質発現システムに加えられる試薬の要約
【０２８２】
【表３】
0005798489.tif 000081
抽出物を、２１℃において３０分間、１００μＭヨードアセトアミドで前処理する。プラスミドは、標的タンパク質をコードする構造遺伝子を含み、上で説明したように構築される。ＧａｌＮＡｃ  Ｌ−Ｇｌｎ−ｔＲＮＡ２は、上に記載したようなチャージしたｔＲＮＡである。１ｍＬの反応混合物をペトリ皿（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）の底に広げ、密閉された加湿恒温器内の３０℃において４時間インキュベートする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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