(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉ：
【化１】
0005773495.tif 000019
［式中、
アルギニン残基がそのα−アミノ基によって骨格Ｃ＝Ｏと連結し、
Ｘが−ＮＨ−Ｒ−、−Ｏ−Ｒ−、又は−Ｓ−Ｒ−であり、
ここでＲがエタン、エテン又はシクロプロパンから誘導されたヒドロカルビレンであり、骨格ＮＨと連結し、且つ
Ａ１が、その側鎖上にアミノ基を有し、そのカルボキシル基を介して骨格ＮＨと連結し、且つその側鎖アミノ基を介してアスパラギン酸残基のα−カルボキシル基と連結した、アミノ酸残基であり；
該アミノ酸残基が、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、オルニチン（Ｏｒｎ）又はリシン（Ｌｙｓ）から選択される］
のアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）含有環状ペプチド模倣体。
【請求項２】
Ｘが−ＮＨ−Ｒ−、−Ｏ−Ｒ−又は−Ｓ−Ｒ−であり、且つＲがエタンから誘導されたヒドロカルビレンである、請求項１に記載のＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体。
【請求項３】
（ｉ）Ｘが−ＮＨ−Ｒ−であり、Ｒがエタンから誘導されたヒドロカルビレンであり、且つＡ１がＤａｐ、Ｏｒｎ又はＬｙｓである；あるいは
（ｉｉ）Ｘが−Ｏ−Ｒ−であり、Ｒがエタンから誘導されたヒドロカルビレンであり、且つＡ１がＤａｐ又はＬｙｓである；
請求項１又は２に記載のＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか一項に記載のＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体；と
該ペプチド模倣体中のアミノ酸残基Ａ１のα−アミノ基と連結した、
蛍光プローブ、光増感剤、キレート剤、又は細胞毒性薬から選択されるペイロード；
とのコンジュゲート。
【請求項５】
前記ペイロードが、天然若しくは非天然アミノ酸残基、８個を超えないアミノ酸を有する小ペプチド残基、ジアミン残基、Ｃ１〜Ｃ２５ヒドロカルビレン又は可溶性ポリマーから選択されるスペーサーを介して、該ペプチド模倣体中のアミノ酸残基Ａ１のα−アミノ基と連結した、請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
前記アミノ酸がグリシン（Ｇｌｙ）、β−アラニン（β−Ａｌａ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、Ｄ−フェニルアラニン（Ｄ−Ｐｈｅ）、１−ナフチルアラニン（１−Ｎａｌ）、Ｄ−１−ナフチルアラニン（Ｄ−１−Ｎａｌ）、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）又は３−（アミノメチル）安息香酸から選択され、前記ジアミン残基が−ＨＮ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−又は−ＨＮ−（ＣＨ２）４−ＮＨ−であり、前記Ｃ１〜Ｃ２５ヒドロカルビレンがＯＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ３Ｈ、ＣＯＳＨ又はＮＨ２から選択される２個の末端官能基によって置換され、したがってエーテル、エステル、アミド、チオアミド又はスルホンアミド基を形成するＣ１〜Ｃ１０アルキレン又はフェニレンであり、前記可溶性ポリマーが直鎖若しくは分岐鎖ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はそのコポリマー、ポリ乳酸（ＰＬＡ）又はそのコポリマー、ＰＬＡに基づくポリエステル、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、又はそれらのコポリマー、或いはポリメタクリルアミドに基づくポリアミド又はそれらのコポリマーから選択され、前記ポリマーが適切な官能基を有する、請求項５に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
ペイロードが蛍光プローブ、光増感剤、キレート剤、又は細胞毒性薬である、請求項４から６までのいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
前記蛍光プローブがＢＰｈｅｉｄｅタウリンアミド（ＢＴＡ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ダンシル、ローダミン、エオシン又はエリスロシンであり、
前記光増感剤がポルフィリン、クロロフィル又はバクテリオクロロフィルであり、
前記キレート剤がＤＴＰＡ又はＤＯＴＡであり、且つ
前記細胞毒性薬が、
ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びミトキサントロンから選択されるアントラサイクリン系化学療法剤；
分裂阻害剤；トポイソメラーゼＩ阻害剤；又はトポイソメラーゼＩＩ阻害剤である、
請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
（ｉ）    ペイロードがＡ１と直接連結したＢＴＡであり、Ｘが−ＮＨ−Ｒ−であり、Ｒがエタンから誘導されたヒドロカルビレンであり、且つＡ１がＤａｐ、Ｏｒｎ、若しくはＬｙｓである（ここでコンジュゲート１、４及び５をそれぞれ規定）；
（ｉｉ）  ペイロードがＡ１と直接連結したダンシルであり、Ｘが−ＮＨ−Ｒ−であり、Ｒがエタンから誘導されたヒドロカルビレンであり、且つＡ１がＤａｐ、Ｏｒｎ若しくはＬｙｓである（ここでコンジュゲート１９、１８及び１６をそれぞれ規定）；
（ｉｉｉ）ペイロードがＡ１と直接連結したＢＴＡであり、Ｘが−Ｏ−Ｒ−であり、Ｒがエタンから誘導されたヒドロカルビレンであり、且つＡ１がＤａｐ又はＬｙｓである（ここでコンジュゲート７及び８をそれぞれ規定）；
（ｉｖ）  ペイロードがスペーサーによってＡ１と連結したＢＴＡであり、Ｘが−ＮＨ−Ｒ−であり、Ｒがエタンから誘導されたヒドロカルビレンであり、Ａ１がＤａｐであり、且つスペーサーが、ＧＡＢＡ若しくはＤ−Ｐｈｅ残基、又は１，４−ジアミノブタンの残基である（ここでコンジュゲート１１、２８及び３３をそれぞれ規定）；
（ｖ）    ペイロードがスペーサーによってＡ１と連結したＦＩＴＣであり、Ｘが−ＮＨ−Ｒ−であり、Ｒがエタンから誘導されたヒドロカルビレンであり、且つ
（ａ）Ａ１がＤａｐであり、且つスペーサーがβ−Ａｌａ残基である（ここでコンジュゲート１２を規定）、又は
（ｂ）Ａ１がＬｙｓであり、且つスペーサーがβ−Ａｌａ若しくはＧＡＢＡ残基である（ここで、コンジュゲート１３及び１４をそれぞれ規定）；
（ｖｉ）  ペイロードがスペーサーによってＡ１と連結したダンシルであり、Ｘが−ＮＨ−Ｒ−であり、Ｒがエタンから誘導されたヒドロカルビレンであり、Ａ１がＤａｐ若しくはＬｙｓであり、且つスペーサーがＧｌｙ残基である（ここでコンジュゲート２０及び１７をそれぞれ規定）；
（ｖｉｉ）  ペイロードがＡ１と直接連結したバクテリオクロロフィル誘導体Ｐｄ−ＢＴＡであり、Ｘが−ＮＨ−Ｒ−であり、Ｒがエタンから誘導されたヒドロカルビレンであり、且つＡ１がＤａｐである（ここでコンジュゲート３４を規定）；
（ｖｉｉｉ）ペイロードがＡ１と直接連結したＤＴＰＡ又はＤＯＴＡであり、Ｘが−ＮＨ−Ｒ−であり、Ｒがエタンから誘導されたヒドロカルビレンであり、且つＡ１がＤａｐである（ここでコンジュゲート３５及び３６をそれぞれ規定）；
（ｉｘ）    ペイロードがＡ１と直接連結した置換ＢＴＡ（タウリン残基が−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２で置換されている）であり、Ｘが−ＮＨ−Ｒ−であり、Ｒがエタンから誘導されたヒドロカルビレンであり、且つＡ１がＤａｐ又Ｏｒｎである（ここでコンジュゲート３７及び３９をそれぞれ規定）；あるいは
（ｘ）      ペイロードがＡ１と直接連結した置換ＢＴＡ（タウリン残基が−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＨ３で置換されている）であり、Ｘが−ＮＨ−Ｒ−であり、Ｒがエタンから誘導されたヒドロカルビレンであり、且つＡ１がＤａｐ又Ｏｒｎである（ここでコンジュゲート３８及び４０をそれぞれ規定）；          
請求項４又は５に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
請求項４から９までのいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は薬剤として許容されるその塩、及び薬剤として許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１１】
ペイロードが蛍光プローブである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ここで規定されたコンジュゲート１、４、５、７、８、１１〜１４、１６〜２０、２８及び３３から選択されるコンジュゲートを含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
診断目的の、請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
臓器及び組織の可視化用、又は腫瘍の診断用の、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
動的蛍光イメージング、放射線診断技法又は分子の核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）による腫瘍診断用の、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ペイロードが光増感剤である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ここで規定されたコンジュゲート３４及び３７〜４０から選択されるコンジュゲートを含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
光線力学的療法（ＰＤＴ）用の、請求項１６又は１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
腫瘍又は非腫瘍組織のＰＤＴ用の、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記腫瘍が原発腫瘍又はメラノーマ、結腸、乳、肺、前立腺、脳若しくは頭頸部癌からの転移性腫瘍である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
加齢性黄斑変性症の治療用、又は脂肪組織への血液供給を制限することによる肥満の治療用の、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
ペイロードがキレート剤である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
ここで規定されたコンジュゲート３５又は３６を含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
放射線イメージング又は放射線療法において使用するための、請求項２２又は２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ペイロードが細胞毒性薬である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
標的化学療法において使用するための、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
診断目的、光線力学的療法（ＰＤＴ）、放射線イメージング若しくは放射線療法、又は標的化学療法用の医薬組成物を調製するための、請求項４から９までのいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は薬剤として許容されるその塩の使用。
【請求項２８】
診断目的、光線力学的療法（ＰＤＴ）、放射線イメージング若しくは放射線療法、又は標的化学療法用の、請求項４から９までのいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は薬剤として許容されるその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、癌の診断及び治療における、新規なアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）含有環状ペプチド模倣体及びその使用に関する。
【０００２】
略語：ＡｃＯＨ、酢酸；Ａｌｌｏｃ、アリルオキシカルボニル；Ｂｐｈｅｉｄｅ、バクテリオフェオホルビド；ＢＴＡ、（ＢＰｈｅｉｄｅタウリンアミド）、３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミド；ＢＴＣ、ビス（トリクロロメチル）カルボネート；Ｄａｂ、ジアミノ酪酸；Ｄａｐ、ジアミノプロピオン酸；ＤＣＭ、ジクロロメタン、；Ｄｄｅ、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル；ＤＩＣ、ジイソプロピルカルボジイミド；ＤＩＥＡ、ジイソプロピルエチルアミン；ＤＭＢＡ、ジメチルバルビツール酸；ＤＭＦ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＤＯＴＡ、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸；ＤＴＰＡ、ジエチレントリアミン五酢酸；Ｅｔ２Ｏ、ジエチルエーテル；ＦＩＴＣ、フルオレセインイソチオシアネート；Ｆｍｏｃ、フルオレニルメトキシカルボニル；ＧＡＢＡ、γ−アミノ酪酸；ＨＡＴＵ、０−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート；ＨＯＡｔ、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール；ＨＯＢｔ、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール；Ｌｙｓ、リシン；ＭｅＯＨ、メタノール；Ｎａｌ、ナフチルアラニン；Ｏｒｎ、オルニチン；Ｐｂｆ、２，２，４，６，７−ペンタメチル−ジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル；ＰｙＢＯＰ、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート；ＲＰ−ＨＰＬＣ、逆相高速液体クロマトグラフィー；ＲＴ、室温；ＴＦＡ、トリフルオロ酢酸、ＴＦＥ、トリフルオロエタノール；ＴＩＳ、トリイソプロピルシラン。
【背景技術】
【０００３】
フィブロネクチン（Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、１９８４）及びビトロネクチンなどの細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分のアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ；ＲＧＤ）モチーフはインテグリンと結合する（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  ａｎｄ  Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ、１９８７；Ｄ’Ｓｏｕｚａ  ＳＥ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１；Ｊｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３；Ｋｏｉｖｕｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４）。インテグリン仲介の接着は、細胞の生存、増殖及び移動を制御する細胞内のシグナル伝達事象をもたらす。約２５のインテグリンが知られており、且つそれらの少なくとも８つが、それらのリガンドにおける一次認識配列としてＲＧＤモチーフと結合する。
【０００４】
ＲＧＤ含有ペプチドを求めてスクリーニングするためのファージディスプレイ法（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６）によって得たデータは、腫瘍血管の内皮細胞層との、それらの選択的結合を示している（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７）。
【０００５】
インテグリンの発現は、活性状態の内皮細胞（ＥＣ）では高いが、静止状態の内皮細胞（ＥＣ）ではより制限されることが報告されているので、低分子合成ＲＧＤ含有ペプチドは、血管内皮細胞及び腫瘍細胞の増殖を妨害するアンタゴニストとして提案されている。さらにＲＧＤペプチドはシグナル伝達を遅らせ、細胞の移動に影響を与え、且つ腫瘍細胞の退行又はアポトーシスを誘導する（Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）。ＲＧＤアナログは、腫瘍イメージング（Ｈａｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）、抗血管新生手法（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００１；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）で使用され、且つ放射性核種の腫瘍ターゲティング（ｖａｎ  Ｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）及び化学療法剤（Ａｒａｐ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８；Ｚｉｔｚｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）で使用される。
【０００６】
インテグリンは癌細胞においても発現され、癌細胞の浸潤、転移、増殖及びアポトーシスにおいて重要な役割を果たす。選択された臓器への腫瘍細胞の転移浸潤は、腫瘍細胞と臓器特異的内皮マーカーの間の接着相互作用に依存する細胞ホーミング現象を表すものであり得る（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  ａｎｄ  Ｒａｊｏｔｔｅ、２０００）。インテグリンと内皮細胞又は腫瘍細胞のいずれかの結合によって、ＲＧＤペプチドは、転移プロセスに必要不可欠である腫瘍細胞−ＥＣＭ及び腫瘍細胞−ＥＣの結合を阻害することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞移動を調節することができる。いくつかの試験は、ＲＧＤ含有化合物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ｇｏｌｉｇｏｒｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８；Ｒｏｍａｎｏｖ  ａｎｄ  Ｇｏｌｉｇｏｒｓｋｙ  １９９９）及びｉｎ  ｖｉｖｏ（Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９；Ｈａｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３）での腫瘍細胞の転移プロセスに干渉することができることを示している。
【０００７】
個々のインテグリンに特異的であるペプチドは相当興味深く、潜在的な医学的重要性を有する。αｖβ３インテグリンは、腫瘍の血管新生と関係があることが示された最初のインテグリンであった。αｖβ３インテグリンを特異的に阻害するＲＧＤペプチドは、腫瘍及び網膜血管新生の阻害剤、骨粗しょう症の阻害剤としての有望性、並びに腫瘍血管系への薬剤のターゲティングにおける有望性を示す（Ａｓｓａ−Ｍｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）。抗癌剤ドキソルビシン又はアポトーシス促進ペプチドとαｖβ３インテグリン結合ＲＧＤペプチドのカップリングによって、マウスにおいて異種移植腫瘍に対して試験したとき、非修飾薬剤より活性があり毒性が低い化合物が生成される（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、２０００；Ａｒａｐ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８；Ａｒａｐ  ｅｔ  ａｌ．、２００２；Ｅｌｌｅｒｂｙ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９）。したがって、インテグリン結合ペプチド及びペプチド模倣体を設計及び生成する際に、多量の作業が注ぎ込まれた（Ｈａｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６；Ｌｏｃａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９；Ｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９；Ｒａｂｏｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００６；Ｂｅｌｖｉｓｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００５；Ｄｉｊｋｇｒａａｆ  ｅｔ  ａｌ．、２００６；Ｂａｎｆｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００７；米国特許第５，８４９，６９２号）。
【０００８】
米国特許第６，５７６，２３９号、ＥＰ０９２７０４５及びＷＯ９８／０１０７９５は、アミノ酸配列ＲＧＤ又はＮＧＲを含む腫瘍ホーミングペプチドを含むコンジュゲートであって、前記ペプチドが治療用又は診断用成分と連結し、ただし前記成分がファージ粒子ではないコンジュゲートを開示する。治療用成分は細胞毒性薬、又はドキソルビシンなどの癌用化学療法剤であってよい。このコンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与によって血管新生血管系に選択的にホーミングする。腫瘍ホーミングペプチドは、最大２０若しくは３０アミノ酸又は５０〜１００アミノ酸長の直鎖又は環状ペプチドであってよい。１つの好ましいペプチドは、環状ノナペプチドＣＤＣＲＧＤＣＦＣ又はＨ−Ｃｙｓ＊−Ａｓｐ−Ｃｙｓ＊−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ＊−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ＊−ＮＨ２である。
【０００９】
ＷＯ２００８／０２３３７８は、ＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体と、ポルフィリン、クロロフィル又はバクテリオクロロフィルから選択される光増感剤とのコンジュゲートを開示する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様では、本発明は、
一般式Ｉ：
【化１】
0005773495.tif 000002
［式中、
アルギニン残基がそのα−アミノ基によって骨格Ｃ＝Ｏと連結し、
Ｘが−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｒ−、−Ｏ−Ｒ−、−Ｓ−又は−Ｓ−Ｒ−であり、ＲがＣ１〜Ｃ６アルカン、Ｃ２〜Ｃ６アルケン、Ｃ２〜Ｃ６アルキン、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルカン、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルケン、Ｃ６〜Ｃ１４単環又は多環芳香族炭化水素、又は１個若しくは２個のＣ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ２アルケニル又はＣ２アルキニルによって置換されたＣ６〜Ｃ１４単環若しくは多環芳香族炭化水素から誘導されたヒドロカルビレンラジカルであり、又はＲが、それが結合した窒素原子と一緒に、酸素、窒素又はイオウから選択される１〜２個のさらなるヘテロ原子を場合によって含有する５−又は６−員飽和又は不飽和複素環を形成し、且つ
Ａ１が、そのα−若しくは側鎖カルボキシル基によって骨格ＮＨと連結し、且つそのα−若しくは側鎖アミノ基によってアスパラギン酸残基のα−カルボキシル基と連結した、その側鎖上にアミノ基若しくはカルボキシル基のいずれかを有する天然若しくは非天然アミノ酸残基である］、
又は一般式ＩＩ：
【化２】
0005773495.tif 000003
［式中、
Ａ１が、そのα−若しくは側鎖カルボキシル基によってアルギニン残基のα−アミノ基と連結し、且つそのα−若しくは側鎖アミノ基によって骨格Ｃ＝Ｏと連結した、その側鎖上にアミノ基若しくはカルボキシル基のいずれかを有する天然若しくは非天然アミノ酸残基であり、
Ａ２が、そのα−アミノ基によって骨格Ｃ＝Ｏと連結し、且つそのα−カルボキシル基によってＡ３のα−若しくは側鎖アミノ基と連結した、天然若しくは非天然アミノ酸残基であり、且つ
Ａ３が、そのα−若しくは側鎖アミノ基の１つによってＡ２のカルボキシル基と連結し、且つそのα−若しくは側鎖アミノ基のもう１つによってアスパラギン酸残基のα−カルボキシル基と連結した、その側鎖上にアミノ基を有しそのＣ末端でアミド化した天然若しくは非天然アミノ酸残基である］
のＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体に関する。
【００１１】
別の態様では、本発明は、前に定義したＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体と、ペイロードの成分のコンジュゲートであって、Ａ１が側鎖アミノ基を有するとき、前記ペイロード成分が場合によってスペーサーによってＡ１のα−又は側鎖アミノ基のいずれかと連結し、且つＡ１がジカルボン酸アミノ酸残基であるとき、前記ペイロード成分が場合によってスペーサーによってＡ１のα−又は側鎖カルボキシル基のいずれかと連結するという条件で、前記ペイロードの成分が、ペプチド模倣体中でアミノ酸残基Ａ１と連結した蛍光プローブ、光増感剤、キレート剤、又は細胞毒性薬から選択される上記コンジュゲートに関する。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、ＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体と前に定義したペイロード成分とのコンジュゲート、又は薬剤として許容されるその塩、及び薬剤として許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
本発明の医薬組成物は、様々な目的、例えば（ｉ）ペイロードが蛍光プローブであるとき、診断目的用、特に臓器及び組織の可視化用、及び腫瘍の診断用に、（ｉｉ）ペイロードが光増感剤であるとき、光線力学的療法（ＰＤＴ）用、特に腫瘍又は非腫瘍組織のＰＤＴ用に、（ｉｉｉ）ペイロードがキレート剤であるとき、放射線イメージング又は放射線療法用に、（ｉｖ）ペイロードが細胞毒性薬であるとき、標的化学療法用に使用することができる。
【００１４】
さらに別の態様では、したがって本発明は、診断目的、光線力学的療法（ＰＤＴ）、放射線イメージング若しくは放射線療法、又は標的化学療法用の医薬組成物を調製するための、ＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体と前に定義したペイロード成分とのコンジュゲート、又は薬剤として許容されるその塩の使用に関する。
【００１５】
他のさらなる態様では、本発明は、診断目的、光線力学的療法（ＰＤＴ）、放射線イメージング又は放射線療法、又は標的化学療法用の、ＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体と前に定義したペイロード成分とのコンジュゲート、又は薬剤として許容されるその塩に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】ＣＤ−１ヌードマウスの乳房中の同所性ヒト乳ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ原発性巨大腫瘍における、コンジュゲート１の蓄積パターンを示す図である。マウスは材料及び方法中に記載したように処置し、腫瘍細胞とコンジュゲートの両方の蛍光を、Ｘｅｎｏｇｒａｐｈ  ＩＶＩＳ（登録商標）システム（光子の単位のカラースケール／秒／ｃｍ２／ステラジン）を使用して第１〜７日にモニタリングした。上図は腫瘍によって生じた蛍光シグナルを示し（赤色蛍光イメージング）、下図はコンジュゲートによって生じた蛍光シグナルを示す（近赤外蛍光イメージング）。腫瘍によって生じたシグナルとコンジュゲートによって生じたシグナルの一致は、腫瘍中のコンジュゲートの蓄積を示唆する。
【図１Ｂ】ＣＤ−１ヌードマウスの乳房中の同所性ヒト乳ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ原発性巨大腫瘍における、コンジュゲート４の蓄積パターンを示す図である。マウスは材料及び方法中に記載したように処置し、腫瘍細胞とコンジュゲートの両方の蛍光を、Ｘｅｎｏｇｒａｐｈ  ＩＶＩＳ（登録商標）システム（光子の単位のカラースケール／秒／ｃｍ２／ステラジン）を使用して第１〜７日にモニタリングした。上図は腫瘍によって生じた蛍光シグナルを示し（赤色蛍光イメージング）、下図はコンジュゲートによって生じた蛍光シグナルを示す（近赤外蛍光イメージング）。腫瘍によって生じたシグナルとコンジュゲートによって生じたシグナルの一致は、腫瘍中のコンジュゲートの蓄積を示唆する。
【図１Ｃ】ＣＤ−１ヌードマウスの乳房中の同所性ヒト乳ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ原発性巨大腫瘍における、コンジュゲート４１の蓄積パターンを示す図である。マウスは材料及び方法中に記載したように処置し、腫瘍細胞とコンジュゲートの両方の蛍光を、Ｘｅｎｏｇｒａｐｈ  ＩＶＩＳ（登録商標）システム（光子の単位のカラースケール／秒／ｃｍ２／ステラジン）を使用して第１〜７日にモニタリングした。上図は腫瘍によって生じた蛍光シグナルを示し（赤色蛍光イメージング）、下図はコンジュゲートによって生じた蛍光シグナルを示す（近赤外蛍光イメージング）。腫瘍によって生じたシグナルとコンジュゲートによって生じたシグナルの一致は、腫瘍中のコンジュゲートの蓄積を示唆する。
【図２Ａ】乳癌腫瘍の壊死領域におけるコンジュゲート１の蓄積を示す図である。マウスは材料及び方法中に記載したように処置し、蛍光はＸｅｎｏｇｒａｐｈ  ＩＶＩＳ（登録商標）システム（光子の単位のカラースケール／秒／ｃｍ２／ステラジン）を使用して注射後第６日にモニタリングした。示すように、腫瘍の中心部分中の壊死領域は赤色蛍光を失うが（左図）、コンジュゲートの蓄積を示す（右図）。
【図２Ｂ】乳癌腫瘍の壊死領域におけるコンジュゲート４の蓄積を示す図である。マウスは材料及び方法中に記載したように処置し、蛍光はＸｅｎｏｇｒａｐｈ  ＩＶＩＳ（登録商標）システム（光子の単位のカラースケール／秒／ｃｍ２／ステラジン）を使用して注射後第６日にモニタリングした。示すように、腫瘍の中心部分中の壊死領域は赤色蛍光を失うが（左図）、コンジュゲートの蓄積を示す（右図）。
【図２Ｃ】乳癌腫瘍の壊死領域におけるコンジュゲート４１の蓄積を示す図である。マウスは材料及び方法中に記載したように処置し、蛍光はＸｅｎｏｇｒａｐｈ  ＩＶＩＳ（登録商標）システム（光子の単位のカラースケール／秒／ｃｍ２／ステラジン）を使用して注射後第６日にモニタリングした。示すように、腫瘍の中心部分中の壊死領域は赤色蛍光を失うが（左図）、コンジュゲートの蓄積を示す（右図）。
【図３Ａ】ＭＬＳ卵巣腫瘍と比較したＬＮＣａＰ前立腺癌腫瘍における、コンジュゲート１の蓄積を示す図である。マウスは材料及び方法中に記載したように処置し、移植腫瘍中のコンジュゲートの蓄積を、Ｘｅｎｏｇｒａｐｈ  ＩＶＩＳ（登録商標）システムを使用して注射後の特定時間地点（コンジュゲート１に関して８、１１、１４、２４及び４８時間）でモニタリングした。前立腺腫瘍中（上図）と卵巣腫瘍中（下図）のコンジュゲートの蓄積プロファイルはほぼ同じであった。両方の場合において、最高蛍光レベルは注射後８〜１１（コンジュゲート１）時間で観察し、コンジュゲートはコンジュゲート１の場合最大４８時間腫瘍中に残った。上左図中の矢印は前立腺腫瘍の場所を示す。各図中の右図は注射後１４時間で摘出した臓器を示し、肝臓及び腎臓において観察した高い蛍光レベルはこれらの臓器を介したコンジュゲートの除去を示唆する。
【図３Ｂ】ＭＬＳ卵巣腫瘍と比較したＬＮＣａＰ前立腺癌腫瘍における、コンジュゲート４の蓄積を示す図である。マウスは材料及び方法中に記載したように処置し、移植腫瘍中のコンジュゲートの蓄積を、Ｘｅｎｏｇｒａｐｈ  ＩＶＩＳ（登録商標）システムを使用して注射後の特定時間地点（コンジュゲート４に関して８、１４、２４及び４８時間）でモニタリングした。前立腺腫瘍中（上図）と卵巣腫瘍中（下図）のコンジュゲートの蓄積プロファイルはほぼ同じであった。両方の場合において、最高蛍光レベルは注射後８〜１４（コンジュゲート４）時間で観察し、コンジュゲートはコンジュゲート４の場合最大４８時間腫瘍中に残った。上左図中の矢印は前立腺腫瘍の場所を示す。各図中の右図は注射後１４時間で摘出した臓器を示し、肝臓及び腎臓において観察した高い蛍光レベルはこれらの臓器を介したコンジュゲートの除去を示唆する。
【図３Ｃ】ＭＬＳ卵巣腫瘍と比較したＬＮＣａＰ前立腺癌腫瘍における、コンジュゲート４１の蓄積を示す図である。マウスは材料及び方法中に記載したように処置し、移植腫瘍中のコンジュゲートの蓄積を、Ｘｅｎｏｇｒａｐｈ  ＩＶＩＳ（登録商標）システムを使用して注射後の特定時間地点（コンジュゲート４１に関して８、１２及び２４時間）でモニタリングした。前立腺腫瘍中（上図）と卵巣腫瘍中（下図）のコンジュゲートの蓄積プロファイルはほぼ同じであった。両方の場合において、最高蛍光レベルは注射後８〜１２（コンジュゲート４１）時間で観察し、コンジュゲートはコンジュゲート４１の場合最大２４時間腫瘍中に残った。上左図中の矢印は前立腺腫瘍の場所を示す。各図中の右図は注射後１４時間で摘出した臓器を示し、肝臓及び腎臓において観察した高い蛍光レベルはこれらの臓器を介したコンジュゲートの除去を示唆する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
一態様では、本発明は、前に定義したαｖβ３及びαｖβ５インテグリンリガンドである、新規なアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ；ＲＧＤ）含有環状ペプチド模倣体を提供する。
【００１８】
本明細書で互換的に使用する用語「ＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体」、「環状ペプチド模倣体」及び「αｖβ３及びαｖβ５インテグリンリガンド」は、ＲＧＤモチーフを有するペプチドを模倣する、ＲＧＤモチーフとも呼ばれるＲＧＤ配列を含有する環状非ペプチド化合物を指す。本発明の環状ペプチド模倣体は、前に定義した一般式Ｉ又は一般式ＩＩのいずれかを有する任意の環状化合物であってよい。
【００１９】
本明細書の以後のスキーム１中に詳細に示すように、一般式ＩのＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体はＲＧＤモチーフを含有する環状化合物であり、その中で側鎖アミノ基（Ａ１）を有するジカルボン酸アミノ酸又はアミノ酸のいずれかの残基は、アミド結合によって一方側でＲＧＤモチーフ中のアスパラギン酸残基のα−カルボキシル基、及び他方側で骨格ＮＨと連結しており、前記骨格ＮＨは様々な考えられる架橋形成単位によってＲＧＤモチーフ中のアルギニン残基のα−アミノ基と連結している。さらに示すように、一般式ＩＩのＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体はＲＧＤモチーフを含有する環状化合物であり、その中で側鎖アミノ基（Ａ１）を有するジカルボン酸アミノ酸又はアミノ酸のいずれかの残基は、アミド結合によって一方側でＲＧＤモチーフ中のアルギニン残基のα−アミノ基、及び他方側でそのアミノ基によって骨格Ｃ＝Ｏと連結しており、骨格Ｃ＝Ｏは別のアミノ酸残基のα−アミノ基（Ａ２）と連結しており、それは、アミド結合によってＲＧＤモチーフ中のアスパラギン酸残基のα−カルボキシル基と連結した、側鎖アミノ基を有しそのＣ末端でアミド化したさらなるアミノ酸の残基（Ａ３）とアミド結合によって連結している。
【００２０】
用語「ヒドロカルビレン」は、飽和若しくは不飽和、直鎖若しくは分岐鎖、環状若しくは非環状、又は芳香族であってよく、Ｃ１〜Ｃ６アルカン、Ｃ２〜Ｃ６アルケン、Ｃ２〜Ｃ６アルキン、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルカン、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルケン、Ｃ６〜Ｃ１４単環又は多環芳香族炭化水素、或るいは１個若しくは２個のＣ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ２アルケニル又はＣ２アルキニルによって置換されたＣ６〜Ｃ１４単環又は多環芳香族炭化水素から誘導されてよい、炭素及び水素原子のみを含有する二価ラジカルを指す。
【化３】
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【００２１】
用語「Ｃ１〜Ｃ６アルカン」は、１〜６個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖炭化水素を典型的には意味し、例えば、メタン、エタン、ｎ−プロパン、イソプロパン、ｎ−ブタン、イソブタン、ｎ−ペンタン、２，２−ジメチルプロパン、ｎ−ヘキサンなどを含む。好ましいのはＣ１〜Ｃ４アルカン、より好ましいのはエタンである。用語「Ｃ２〜Ｃ６アルケン」及び「Ｃ２〜Ｃ６アルキン」は、２〜６個の炭素原子及びそれぞれ１個の二重又は三重結合を有する直鎖及び分岐鎖炭化水素を典型的には意味し、エテン、３−ブテン、２−エテニルブテンなど、及びプロピン、２−ブチン、３−ペンチンなどを含む。用語「Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルカン」は、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサンなどの環式又は二環式炭化水素を意味し、用語「Ｃ６〜Ｃ１４単環又は多環芳香族炭化水素」は、ベンゼン、ナフタレン及びアントラセンなどの芳香族カルボン酸分子を示す。
【００２２】
基ＮＨＲ中では、Ｒは前に定義したヒドロカルビレンであり、又はＲが、それが結合した窒素原子と一緒に、酸素、窒素又はイオウから選択される１又は２個のさらなるヘテロ原子を場合によって含有する飽和、好ましくは５−又は６−員複素環を形成する。このような環は、環、例えばピペラジン環中の第二窒素原子において、例えば１又は２個のＣ１〜Ｃ６アルキル基で、又は１個のアルキル若しくはヒドロキシアルキル基で置換することができる。
【００２３】
用語「アミノ酸」は、それらのＬ及びＤ立体異性体での天然と非天然アミノ酸の両方を指し、特に、側鎖アミノ基を有するアミノ酸及びジカルボン酸アミノ酸を含む。側鎖アミノ基を有するアミノ酸の非制限的な例にはリシン（Ｌｙｓ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）及びオルニチン（Ｏｒｎ）があり、ジカルボン酸の例には、非制限的に、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）及びアミノアジピン酸がある。
【００２４】
一実施形態では、本発明のＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体は、Ｘが−ＮＨ−又は−ＮＨ−Ｒ−であり、即ち、尿素成分がアルギニン残基のα−アミノ基で形成され、且つＲが直鎖Ｃ２〜Ｃ６アルカン、Ｃ２〜Ｃ６アルケン又はＣ２〜Ｃ６アルキンから、好ましくはＣ２〜Ｃ４アルカン、Ｃ２〜Ｃ４アルケン又はＣ２〜Ｃ４アルキンから、より好ましくはエタンから誘導されたヒドロカルビレンである、一般式Ｉの環状化合物である。
【００２５】
別の実施形態では、本発明のＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体は、Ｘが−ＮＨ−Ｒ−であり、且つＲが２個のＣ１〜Ｃ２アルキルによって置換されたＣ６〜Ｃ１４単環又は多環芳香族炭化水素、好ましくは１，３−ジメチルベンゼン−１，３−ジイル、即ち、メチル基によって連結したｍ−キシレンから誘導されたヒドロカルビレンである、一般式Ｉの環状化合物である。
【００２６】
さらなる実施形態では、本発明のＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体は、Ｘが−ＮＨ−Ｒ−であり、且つＲが、それが結合した窒素原子と一緒に、５−又は６−員飽和又は不飽和複素環、好ましくはピペリジン−１，４−ジイル、即ち、位置１及び４を介して連結したピペリジンを形成する、一般式Ｉの環状化合物である。
【００２７】
さらに別の実施形態では、本発明のＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体は、Ｘが−Ｏ−Ｒ−であり、即ち、カルバメート成分がアルギニン残基のα−アミノ基で形成され、且つＲが直鎖Ｃ２〜Ｃ６アルカン、Ｃ２〜Ｃ６アルケン又はＣ２〜Ｃ６アルキンから、好ましくはＣ２〜Ｃ４アルカン、Ｃ２〜Ｃ４アルケン又はＣ２〜Ｃ４アルキンから、より好ましくはエタンから誘導されたヒドロカルビレンである、一般式Ｉの環状化合物である。
【００２８】
なお別の実施形態では、本発明のＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体は、Ｘが−Ｓ−又は−Ｓ−Ｒ−であり、即ち、カルバモチオ成分がアルギニン残基のα−アミノ基で形成され、且つＲが直鎖Ｃ２〜Ｃ６アルカン、Ｃ２〜Ｃ６アルケン又はＣ２〜Ｃ６アルキンから、好ましくはＣ２〜Ｃ４アルカン、Ｃ２〜Ｃ４アルケン又はＣ２〜Ｃ４アルキンから、より好ましくはエタンから誘導されたヒドロカルビレンである、一般式Ｉの環状化合物である。
【００２９】
他のさらなる実施形態では、本発明のＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体は、Ａ１がＬｙｓ、Ｄａｐ、Ｄａｂ及びＯｒｎ、好ましくはＬｙｓなどの側鎖アミノ基を有するアミノ酸の残基、又はＧｌｕ、Ａｓｐ及びアミノアジピン酸などのジカルボン酸アミノ酸の残基である、一般式ＩＩの環状化合物である。
【００３０】
なおさらなる実施形態では、本発明のＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体は、Ａ２がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、Ｄ−フェニルアラニン（Ｄ−Ｐｈｅ）、バリン（Ｖａｌ）、Ｇｌｙ及びＡｓｐなどのアミノ酸の残基である、一般式ＩＩの環状化合物である。
【００３１】
なお別の実施形態では、本発明のＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体は、Ａ３が、そのＣ末端でアミド化したＬｙｓ、Ｄａｐ、Ｄａｂ及びＯｒｎなどの側鎖アミノ基を有するアミノ酸の残基である、一般式ＩＩの環状化合物である。
【００３２】
本発明のＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体は、例えば、本明細書の以後の材料及び方法中に記載したように、当技術分野で知られている任意の方法によって調製することができる。
【００３３】
好ましい一実施形態では、本発明のＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体は、Ｘが−ＮＨであり、且つＡ１がＤａｐである、一般式Ｉの環状化合物である。
【００３４】
他の好ましい実施形態では、本発明のＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体は、Ｘが−ＮＨ−Ｒ−であり、Ｒがエタンから誘導されたヒドロカルビレンであり、且つＡ１がＤａｐ、Ｄａｂ、Ｏｒｎ又はＬｙｓである、一般式Ｉの環状化合物である。
【００３５】
さらなる好ましい実施形態では、本発明のＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体は、Ｘが−ＮＨ−Ｒ−であり、Ｒがプロパン、ｎ−ブタン又はｎ−ヘキサンから誘導されたヒドロカルビレンであり、且つＡ１がＯｒｎである、一般式Ｉの環状化合物である。
【００３６】
なお他の好ましい実施形態では、本発明のＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体は、Ｘが−Ｏ−Ｒ−であり、Ｒがエタンから誘導されたヒドロカルビレンであり、且つＡ１がＤａｐ又はＬｙｓである、一般式Ｉの環状化合物である。
【００３７】
他のさらなる好ましい実施形態では、本発明のＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体は、Ａ１がＬｙｓであり、Ａ２がＰｈｅ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｐｈｅ又はＡｓｐであり、且つＡ３がそのＣ末端でアミド化したＤａｐである、一般式ＩＩの環状化合物である。
【００３８】
なおさらなる好ましい実施形態では、本発明のＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体は、Ａ１がＬｙｓであり、Ａ２がＰｈｅであり、且つＡ３がそのＣ末端でアミド化したＤａｂ、Ｏｒｎ又はＬｙｓである、一般式ＩＩの環状化合物である。
【００３９】
本発明のαｖβ３及びαｖβ５インテグリンリガンドは、卵巣癌、結腸、乳及び前立腺癌などのαｖβ３及びαｖβ５を発現する腫瘍中に蓄積し、したがって様々な「ペイロード」成分との結合による診断法と治療法の両方において使用することができる。
【００４０】
別の態様では、したがって本発明は、前に定義したＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体、即ち一般式Ｉ又はＩＩの環状ペプチド模倣体と、ペイロードの成分とのコンジュゲートであって、Ａ１が側鎖アミノ基を有するとき、前記ペイロード成分が場合によってはスペーサーによってＡ１のα−又は側鎖アミノ基のいずれかと連結し、且つＡ１がジカルボン酸アミノ酸残基であるとき、前記ペイロード成分が場合によってはスペーサーによってＡ１のα−又は側鎖カルボキシル基のいずれかと連結するという条件で、前記ペイロードの成分が、ペプチド模倣体中でアミノ酸残基Ａ１と連結した蛍光プローブ、光増感剤、キレート剤、又は細胞毒性薬から選択される上記コンジュゲートに関する。
【００４１】
一実施形態では、コンジュゲートのペイロード成分は、環状ペプチド模倣体のアミノ酸残基Ａ１と直接連結する。
【００４２】
別の実施形態では、ペイロード成分は、スペーサーによって環状ペプチド模倣体のアミノ酸残基Ａ１と連結する。
【００４３】
ペイロード成分と本発明の環状ペプチド模倣体中のアミノ酸残基Ａ１を連結するスペーサーは、天然若しくは非天然アミノ酸の成分、８個を超えないアミノ酸を有する小ペプチドの成分、ジアミン残基、Ｃ１〜Ｃ２５ヒドロカルビレン、又は可溶性ポリマーの成分から選択することができる。
【００４４】
一実施形態では、スペーサーは、Ｇｌｙ、β−アラニン（β−Ａｌａ）、Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、１−ナフチルアラニン（１−Ｎａｌ）、Ｄ−１−ナフチルアラニン（Ｄ−１−Ｎａｌ）、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）及び３−（アミノメチル）安息香酸だけには限られないが、これらなどの、天然又は非天然アミノ酸の成分である。環状ペプチド模倣体のＡ１が側鎖アミノ基を有するアミノ酸の残基である場合、これらのスペーサーは、それらのα−カルボキシル基によってＡ１のα−又は側鎖アミノ基と、且つそれらのα−アミノ基によってペイロードのカルボキシル基と連結する。或いは、Ａ１がジカルボン酸アミノ酸残基の残基である場合、スペーサーは、それらのα−アミノ基によってＡ１のα−又は側鎖カルボキシル基と、且つそれらのα−カルボキシル基によってペイロードのアミノ基と連結する。
【００４５】
別の実施形態では、スペーサーは、８個を超えないアミノ酸を有する小ペプチドの成分である。環状ペプチド模倣体のＡ１が側鎖アミノ基を有するアミノ酸の残基である場合、これらのスペーサーは、それらのＣ末端カルボキシル基によってＡ１のα−又は側鎖アミノ基と、且つそれらのＮ末端アミノ基によってペイロードのカルボキシル基と連結する。或いは、Ａ１がジカルボン酸アミノ酸残基の残基である場合、スペーサーは、それらのＮ末端アミノ基によってＡ１のα−又は側鎖カルボキシル基と、且つそれらのＣ末端カルボキシル基によってペイロードのアミノ基と連結する。
【００４６】
さらなる実施形態では、スペーサーは一般式−ＨＮ−Ｒ’−ＮＨ−のジアミン残基であり、前式でＲ’は不在である、又は飽和若しくは不飽和、直鎖若しくは分岐鎖、環状若しくは非環状、又は芳香族であってよく、Ｃ１〜Ｃ１２アルカン、Ｃ２〜Ｃ１２アルケン、Ｃ２〜Ｃ１２アルキン、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルカン、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルケン、Ｃ６〜Ｃ１４単環又は多環芳香族炭化水素、或いは１個若しくは２個のＣ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ２アルケニル又はＣ２アルキニルによって置換されたＣ６〜Ｃ１４単環又は多環芳香族炭化水素から誘導されてよい、炭素及び水素原子のみを含有する二価ラジカルである。そこからこのような残基を誘導することができるジアミンの非制限的な例には、ヒドラジン、１，２−エチレンジアミン、１，３−プロピレンジアミン、１，４−ジアミノブタン、１，５−ジアミノペンタン、１，６−ジアミノヘキサン、１，７−ジアミノヘプタン、１，８−ジアミノオクタン、１，９−ジアミノノナン、１，１０−ジアミノデカン、１，１１−ジアミノウンデカン、１，１２−ジアミノドデカン、ｐ−フェニレンジアミン、シクロペンタン１，３−ジアミン、シクロヘキサン１，４−ジアミン、シクロヘプタン１，４−ジアミン、シクロオクタン１，５−ジアミン、ナフタレン−２，６−ジアミン及び９Ｈ−フルオレン−３−６−ジアミンがある。
【００４７】
さらに別の実施形態では、スペーサーは、Ｃ１〜Ｃ２５ヒドロカルビレン、好ましくは２個の末端官能基によって置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキレン又はフェニレンであり、それによってスペーサーは、一方で環状ペプチド模倣体のアミノ酸Ａ１のα−若しくは側鎖アミノ又はカルボキシルのいずれかと、及び他方ではペイロード成分と結合する。このような末端官能基は、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ３Ｈ、ＣＯＳＨ又はＮＨ２から選択することができ、したがってエーテル、エステル、アミド、尿素、チオアミド又はスルホンアミド基を形成することができる。
【００４８】
なお別の実施形態では、スペーサーは、直鎖若しくは分岐鎖ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はそのコポリマー、ポリ乳酸（ＰＬＡ）又はそのコポリマー、ＰＬＡに基づく適切な官能基を有するポリエステル、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、又はそれらのコポリマー、或いはポリメタクリルアミドに基づくポリアミド又はそれらのコポリマーだけには限られないが、これらなどの可溶性ポリマーであり、前記ポリマーは環状ペプチド模倣体のアミノ酸残基Ａ１及びペイロード成分と連結するのに適した官能基を有し、前記官能基は、例えばヒドロキシ、アミノ、カルボキシル、メルカプト、スルホン酸基などである。
【００４９】
本明細書の以後の例１は、太字のアラビア数字１〜３６によって本明細書で識別する、様々なコンジュゲートの合成を記載し、その中で一般式Ｉの異なるαｖβ３及びαｖβ５インテグリンリガンドは、蛍光プローブ、特に、ＢＴＡ、ＦＩＴＣ若しくはダンシル、バクテリオクロロフィル誘導体、特にＰｄ−ＢＴＡ、又はキレート剤、特にＤＴＰＡ若しくはＤＯＴＡと直接、又はスペーサーによってのいずれかで連結する。調製したコンジュゲート、及びそれらの構造特性の一覧は表１中に要約する。例２は、太字のアラビア数字４１〜４８によって本明細書で識別する、様々なコンジュゲートの合成を記載し、その中で一般式ＩＩの異なるαｖβ３及びαｖβ５インテグリンリガンドは、モデルペイロードとしての蛍光プローブＢＴＡの成分と直接連結する。調製したコンジュゲート、及びそれらの構造特性の一覧は表２中に要約する。環状ペプチド模倣体と連結したときの、使用した様々なペイロード成分の化学構造はスキーム２中に示す。
【００５０】
コンジュゲート１〜３６を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏインテグリン結合アッセイとｉｎ  ｖｉｖｏ卵巣癌モデルの両方を使用して、ＭＬＳヒト卵巣癌細胞との結合に関して試験した。これらのコンジュゲートのいくつかは、ｉｎ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方でＨＴ２９ヒト結腸癌細胞との結合に関しても試験し、コンジュゲート１及び４は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方でＬＮＣａＰ前立腺癌細胞との結合に関してさらに試験した。コンジュゲート４１〜４８は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏインテグリン結合アッセイを使用して、ＭＬＳヒト卵巣癌細胞との結合に関して試験し、活性コンジュゲートは、同様にｉｎ  ｖｉｖｏ卵巣癌モデルを使用して試験した。コンジュゲート４１及び４２は、ｉｎ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方でＨＴ２９ヒト結腸癌細胞との結合に関して試験し、コンジュゲート４１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方でＬＮＣａＰ前立腺癌細胞との結合に関してさらに試験した。
【００５１】
一般式ＩのＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体に基づく異なるコンジュゲートの生物活性をスクリーニングしたとき、環状ペプチド模倣体の特定の構造特性、即ち、環状化合物の環の大きさ、及びいくつかの環状化合物中に存在するジアミン残基の大きさ及び構造、並びに環状化合物とペイロード成分を連結するスペーサーは、本明細書で以後記載するようにコンジュゲートの生物活性に影響を与える可能性があることが分かっている。
【００５２】
本明細書の以後の例３は、異なる環の大きさを有する一般式Ｉの環状ペプチド模倣体を含む様々な蛍光プローブ−コンジュゲートの生物活性を示す。環状ペプチド模倣体の環の大きさは、環状化合物の２つの構造パラメーター、特に（ｉ）そのα−又は側鎖カルボキシル基によって骨格ＮＨと連結し、且つそのα−又は側鎖アミノ基によってアスパラギン酸残基のα−カルボキシル基と連結したアミノ酸残基、即ち一般式Ｉ中のＡ１、及び（ｉｉ）骨格カルボニルと骨格ＮＨで架橋形成するラジカル、即ち一般式Ｉ中のラジカルＸを変更することによって変えた。使用した特異的アミノ酸残基Ａ１は、それぞれ側鎖中に１〜４個のメチレン単位を有するＤａｐ、Ｄａｂ、Ｏｒｎ又はＬｙｓの残基であり、使用した異なるラジカルＸは、骨格ＮＨと一緒にヒドラジン又は特定アルキルジアミンのいずれかの成分を形成する、−ＮＨ−、−ＮＨ（ＣＨ２）２〜４−及び−ＮＨ（ＣＨ２）６−であった。特に示すように、試験したコンジュゲートの生物活性は１６原子から１９〜２０原子への環状ペプチド模倣体の環の大きさの増大と共に増大したが、しかし、それは環の大きさのさらなる増大と共に低下した。これらの結果は、アルギニン残基のα−アミノ基とラジカルＸを架橋形成する尿素結合によって環状化合物はさらに剛性になる一方で、最大１９〜２０原子を有するより大きな環はインテグリンとの結合に望ましい立体配座をとるほどさらに柔軟であることを示す。他方で、環状ペプチド模倣体の環の大きさが２０原子を超える場合、環状化合物は、インテグリンとの結合に望ましい立体配座をおそらくとることができない。
【００５３】
例４は、アミド結合によってアミノ酸残基Ａ１のα−又は側鎖カルボキシル基のいずれかと連結し、且つ骨格Ｃ＝Ｏによってアルギニン残基のα−アミノ基と連結した異なるジアミン残基を有する、一般式Ｉの環状ペプチド模倣体を含む様々なＢＴＡ−コンジュゲートの生物活性を示す。試験した具体的なコンジュゲートは、その中でアミノ酸残基Ａ１がＯｒｎであり、ＢＴＡ成分がペプチド模倣体環のＮ末端と直接連結し、且つＸで示すラジカルが式−ＮＨ（ＣＨ２）２〜４−、１，３−ジメチルベンゼン−１，３−ジイル又はピペリジン−１，４−ジイルのラジカルであるようなコンジュゲートであった。特に示すように、その中でアルキルジアミン残基がＡ１と骨格Ｃ＝Ｏで架橋形成するコンジュゲートの生物活性は、アルキル鎖の長さの増大と共に低下した。さらに、Ｘで示すラジカルがｍ−キシレン又はピペリジンから誘導された場合、生物活性は測定されず、このようなコンジュゲート中のペプチド模倣体環は剛性であり、インテグリンとの相互作用に望ましくない立体配座をとることが示された。
【００５４】
例５は、環状ペプチド模倣体のＮ末端と蛍光プローブ成分を連結する異なるスペーサーを有する、一般式Ｉの環状ペプチド模倣体を含む様々な蛍光プローブ−コンジュゲートの生物活性を示す。使用した特異的スペーサーは、異なる天然若しくは非天然アミノ酸、特にＧｌｙ、β−Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、１−Ｎａｌ、Ｄ−１−Ｎａｌ、ＧＡＢＡ及び３−（アミノメチル）安息香酸の成分、又は異なるジアミン、特に１，２−エチレンジアミン及び１，４−ジアミノブタンの残基であった。示すように、おそらくＢＴＡ成分は環状化合物とインテグリンの結合に干渉しないので、その中で蛍光プローブ成分が環状ペプチド模倣体と直接連結したＢＴＡコンジュゲートは高い生物活性を示した。それとは対照的に、その中でＧｌｙ又はβ−Ａｌａ成分をスペーサーとして使用し、環状ペプチド模倣体とＢＴＡ成分の間の距離が増大したコンジュゲートは、おそらく多量のＢＴＡ成分のため低い活性を示した。興味深いことに、環状ペプチド模倣体とＢＴＡ成分の間の距離を、スペーサーとしてＧＡＢＡ成分を使用してさらに増大したとき、このコンジュゲートの生物活性は、その中でＧｌｙ又はβ−Ａｌａ成分をスペーサーとして使用したコンジュゲートのそれより高く、おそらくＧＡＢＡはインテグリンと結合するさらなる自由度を環状ペプチド模倣体に与えるほど十分長いが、しかし、ペプチド模倣体環を超えるＢＴＡ成分のフォールディングを引き起こすほど長すぎないことが示された。ＢＴＡより小さいＦＩＴＣ及びダンシルを使用した場合、蛍光プローブ成分と環状ペプチド模倣体のＮ末端の間の距離は、コンジュゲートの生物活性に対して全く影響がなかった。さらに示すように、その中でＰｈｅ、１−Ｎａｌ、Ｄ−Ｐｈｅ又はＤ−１−Ｎａｌ成分をスペーサーとして使用したＢＴＡコンジュゲートは、おそらくインテグリンの疎水性ポケットとの相互作用をもたらすフェニルアラニン又はナフチルアラニンの芳香族側鎖のため、その中でＧｌｙ成分を使用した対応するコンジュゲートより活性があった。その中でＤ−Ｐｈｅ成分をスペーサーとして使用したコンジュゲートの生物活性は、その中でＰｈｅ又は１−Ｎａｌ成分を使用したコンジュゲートのそれより高かったことは注目すべきであり、Ｄ形状はＬ形状より良くインテグリンの疎水性ポケットに適合する可能性があることを示す。Ｄ−１−ＮａｌはＤ−Ｐｈｅより反応性が低く、フェニル環はナフチルより良く疎水性ポケットに適合することを示す。その中でそれぞれ１，２−エチレンジアミン又は１，４−ジアミノブタンの残基をスペーサーとして使用し、且つ尿素結合が環状ペプチド模倣体とスペーサーの間で形成されるコンジュゲート３２及び３３は、コンジュゲート１０及び１１のそれと類似した生物活性を有しており、尿素結合はアミド結合とほぼ同じ活性を有し、それがペプチド模倣体の立体配座に影響を与えないことを示すことに留意しなければならない。コンジュゲート３２のそれと比較したコンジュゲート３３の強い生物活性は、インテグリンの結合部位と相互作用するさらなる自由度をペプチド模倣体環に与える、ペプチド模倣体環とペイロード成分の間の４個のメチレン単位の距離に原因がある可能性がある。
【００５５】
他方で例６は、その中で尿素成分がアルギニン残基のα−アミノ基によって形成される一般式Ｉの環状ペプチド模倣体を含むＢＴＡ−コンジュゲートは、その中でカルバメート成分が形成された対応するコンジュゲートのそれと類似した生物活性を有していたことを示し、アルギニン残基のα−アミノ基で形成された成分の性質は、コンジュゲートの生物活性に対して全く影響がないことが示された。
【００５６】
例７は、その中でタウリンが異なる求核試薬によって置換されたＢＴＡ誘導体成分と直接連結した一般式Ｉの異なるαｖβ３及びαｖβ５インテグリンリガンドからなる、アラビア数字３７〜４０によって本明細書で識別する４個の非金属バクテリオクロロフィル誘導体−コンジュゲートの合成を記載する。示すように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏインテグリン結合アッセイを使用して測定した、これらのコンジュゲートの生物活性は類似しており、これらの場合において、アミノ基は生物活性に対して全く影響がないこと、及びその挙動はタウリン中スルホネートのそれとほぼ同じであることが示された。
【００５７】
一般式ＩＩのＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体に基づく異なるコンジュゲートの生物活性をスクリーニングしたとき、環状ペプチド模倣体の特定の構造特性、即ち、環状化合物の環の大きさ、及びアミノ酸残基Ａ２の特性は、本明細書で以後記載するようにコンジュゲートの生物活性に影響を与える可能性があることが分かっている。
【００５８】
本明細書の以後の例８〜９は、異なる環の大きさを有する一般式ＩＩの環状ペプチド模倣体を含む様々なＢＴＡ−コンジュゲートの生物活性を示す。環状ペプチド模倣体の環の大きさは、環状化合物の２つの構造パラメーター、特に（ｉ）アスパラギン酸残基のα−カルボキシル基及びＡ２のカルボキシル基と連結したアミノ酸残基、即ちアミノ酸残基Ａ３、及び（ｉｉ）そのα−アミノ基によって骨格Ｃ＝Ｏと、且つそのα−カルボキシル基によってアミノ酸残基Ａ３と連結したアミノ酸残基、即ちアミノ酸残基Ａ２を変更することによって変えた。コンジュゲート活性に対するＡ３の影響を試験するために、異なるアミノ酸残基Ａ３ではなく同じアミノ酸残基Ａ１及びＡ２、特にそれぞれ側鎖中に１〜４個のメチレン単位を有するＤａｐ、Ｄａｂ、Ｏｒｎ及びＬｙｓを有するＢＴＡ−コンジュゲートを試験した。同様に、コンジュゲート活性に対するＡ２の影響を試験するために、異なるアミノ酸残基Ａ２ではなく同じアミノ酸残基Ａ１及びＡ３、特にＰｈｅ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ及びＡｓｐを有するＢＴＡ−コンジュゲートを試験した。例８中に示すように、試験したコンジュゲートの生物活性は、２０原子から２３原子への環状ペプチド模倣体の環の大きさの増大と共に低下し、最適な環の大きさは２０原子であること、及びそれを超える環の大きさはインテグリンの結合部位に適合しないことが示された。例９は、疎水性アミノ酸残基Ａ２を有するコンジュゲートの生物活性は、おそらくインテグリンの結合部位中の疎水性ポケットとの疎水性相互作用のため、より極性が高いコンジュゲートのそれより高かったことを示し、Ｄ形状は疎水性ポケットに完全には適合しないことをさらに示唆する。
【００５９】
例１０は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用した、ヒトαｖβ５インテグリンと本発明の特定のコンジュゲートの競合結合レベルを示し、定性的に同じｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合を有するコンジュゲート１、４、７、２８及び４１は、コンジュゲート５及び１１より活性があることを具体的に実証する。
【００６０】
例１１は、その中で巨大乳癌腫瘍におけるコンジュゲート１、４及び４１の蓄積パターンを、注射後第１〜７日にモニタリングした試験を記載する。示すように、腫瘍の壊死領域中にこれらのコンジュゲートは蓄積し、本発明のコンジュゲートは診断用途に使用することができることが示された。壊死性コアの検出は、様々な型の癌、例えば乳癌において重要な予後マーカーであり、腫瘍境界の検出は腫瘍の完全な除去に必須であるからである。
【００６１】
例１２は、その中でαｖβ３インテグリンを発現する前立腺癌細胞におけるコンジュゲート１、４及び４１の蓄積パターンを、注射後第２日までモニタリングした試験を記載する。示すように、注射後８〜１１〜１４時間で腫瘍領域において最高蛍光レベルを観察し、コンジュゲートはコンジュゲート１及び４の場合最大４８時間、及びコンジュゲート４１の場合最大２４時間腫瘍中に残った。さらに示すように、前立腺腫瘍中と卵巣腫瘍中のこれらのコンジュゲートの蓄積プロファイルはほぼ同じであった。
【００６２】
例１３は、前記コンジュゲートの注射後第５日で、５０ｍｇ／ｋｇの用量において、肝臓中又は腎臓中で壊死又は炎症の証拠を観察しなかったことを示し、これらのコンジュゲートは試験した用量において毒性ではないことを示唆する、コンジュゲート１、４及び４１の毒性試験を記載する。
【００６３】
前述の全てを鑑みて、一実施形態において、本発明のコンジュゲートのペイロード成分は、ＢＴＡ、ＦＩＴＣ、ダンシル、ローダミン、エオシン及びエリスロシンだけには限られないが、これらなどの蛍光プローブの成分である。
【００６４】
好ましい一実施形態では、本発明のコンジュゲートは、一般式ＩのＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体と蛍光プローブの成分のコンジュゲートであり、この場合前記蛍光プローブはアミノ酸残基Ａ１と直接、即ちスペーサーなしで連結したＢＴＡであり、Ｘは−ＮＨ−であり、且つＡ１はＤａｐである（本明細書で識別するコンジュゲート２）。
【００６５】
他の好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは、一般式ＩのＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体と蛍光プローブの成分のコンジュゲートであり、この場合前記蛍光プローブはＡ１と直接連結したＢＴＡであり、Ｘは−ＮＨ−Ｒ−であり、且つ（ｉ）Ｒはエタンから誘導されたヒドロカルビレンであり、且つＡ１はそのα−若しくは側鎖アミノ基によってＢＴＡと連結したＤａｐ、Ｄａｂ、Ｏｒｎ、若しくはＬｙｓであり（それぞれ本明細書で識別するコンジュゲート１、３、４、５及び６）、（ｉｉ）Ｒはプロパン、ｎ−ブタン若しくはｎ−ヘキサンから誘導されたヒドロカルビレンであり、且つＡ１はＯｒｎであり（それぞれ本明細書で識別するコンジュゲート２４、２５及び２６）、又は（ｉｉｉ）Ｒは１，３−ジメチルベンゼン−１，３−ジイル若しくはピペリジン−１，４−ジイルであり、且つＡ１はＯｒｎである（それぞれ本明細書で識別するコンジュゲート１５及び２３）。
【００６６】
さらなる好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは、一般式ＩのＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体と蛍光プローブの成分のコンジュゲートであり、この場合前記蛍光プローブはＡ１と直接連結したダンシルであり、Ｘは−ＮＨ−Ｒ−であり、且つ（ｉ）Ｒはエタンから誘導されたヒドロカルビレンであり、Ａ１はＤａｐ、Ｏｒｎ又はＬｙｓであり（それぞれ本明細書で識別するコンジュゲート１９、１８及び１６）、又は（ｉｉ）Ｒはｎ−ブタンから誘導されたヒドロカルビレンであり、Ａ１はＯｒｎである（本明細書で識別するコンジュゲート２１）。
【００６７】
他のさらなる好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは、一般式ＩのＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体と蛍光プローブの成分のコンジュゲートであり、この場合前記蛍光プローブはＡ１と直接連結したＢＴＡであり、Ｘは−Ｏ−Ｒ−であり、Ｒはエタンから誘導されたヒドロカルビレンであり、且つＡ１はＤａｐ又はＬｙｓである（それぞれ本明細書で識別するコンジュゲート７及び８）。
【００６８】
なお他の好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは、一般式ＩのＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体と蛍光プローブの成分のコンジュゲートであり、この場合前記蛍光プローブはスペーサーによってＡ１と連結したＢＴＡであり、Ｘは−ＮＨ−Ｒ−であり、Ｒはエタンから誘導されたヒドロカルビレンであり、Ａ１はＤａｐであり、且つスペーサーはＧｌｙ、β−Ａｌａ、ＧＡＢＡ、Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、１−Ｎａｌ、Ｄ−１−Ｎａｌ若しくは３−（アミノメチル）安息香酸の成分、又は１，２−エチレンジアミン若しくは１，４−ジアミノブタンの残基である（それぞれ本明細書で識別するコンジュゲート９、１０、１１、２７、２８、２９、３０、３１、３２及び３３）。
【００６９】
他のさらなる好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは、一般式ＩのＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体と蛍光プローブの成分のコンジュゲートであり、この場合前記蛍光プローブはスペーサーによってＡ１と連結したＦＩＴＣであり、Ｘは−ＮＨ−Ｒ−であり、Ｒはエタンから誘導されたヒドロカルビレンであり、且つ（ｉ）Ａ１はＤａｐであり、且つスペーサーはβ−Ａｌａ成分であり（本明細書で識別するコンジュゲート１２）、又は（ｉｉ）Ａ１はＬｙｓであり、且つスペーサーはβ−Ａｌａ又はＧＡＢＡの成分である（それぞれ本明細書で識別するコンジュゲート１３及び１４）。
【００７０】
なおさらなる好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは、一般式ＩのＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体と蛍光プローブの成分のコンジュゲートであり、この場合前記蛍光プローブはスペーサーによってＡ１と連結したダンシルであり、Ｘは−ＮＨ−Ｒ−であり、且つ（ｉ）Ｒはエタンから誘導されたヒドロカルビレンであり、Ａ１はＤａｐ又はＬｙｓであり、且つスペーサーはＧｌｙ成分であり（それぞれ本明細書で識別するコンジュゲート２０及び１７）、又は（ｉｉ）Ｒはｎ−ブタンから誘導されたヒドロカルビレンであり、Ａ１はＯｒｎであり、且つスペーサーはβ−Ａｌａ成分である（本明細書で識別するコンジュゲート２２）。
【００７１】
他の好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは、一般式ＩＩのＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体と蛍光プローブの成分のコンジュゲートであり、この場合前記蛍光プローブはＡ１と直接連結したＢＴＡであり、Ａ１はＬｙｓであり、Ａ２はＰｈｅ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ又はＡｓｐであり、且つＡ３はそのＣ末端でアミド化したＤａｂである（それぞれ本明細書で識別するコンジュゲート４１、４２、４３、４４及び４５）。
【００７２】
さらなる好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは、一般式ＩＩのＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体と蛍光プローブの成分のコンジュゲートであり、この場合前記蛍光プローブはＡ１と直接連結したＢＴＡであり、Ａ１はＬｙｓであり、Ａ２はＰｈｅであり、且つＡ３はそのＣ末端でアミド化したＤａｂ、Ｏｒｎ又はＬｙｓである（それぞれ本明細書で識別するコンジュゲート４６、４７及び４８）。
【００７３】
光線力学的療法（ＰＤＴ）は、光増感剤と呼ばれる非毒性薬剤を光と共に投与して、細胞を不活性化することができる細胞毒性反応酸素種をｉｎ  ｓｉｔｕで生成する、腫瘍の非外科手術治療である。二元治療モダリティであるので、一般に使用される化学療法又は放射線療法と比較したとき、ＰＤＴはさらに高い特異性を与え、より選択的、ただし低くはない破壊性である可能性がある。
【００７４】
ポルフィリンは臨床分野において主な光増感剤として利用されている。光による最適な組織透過はおそらく６５０〜８００ｎｍの間で行う。ポルフィマーナトリウム（Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）、Ａｘｃａｎ  Ｐｈａｒｍａ  Ｉｎｃ．）は、食道及び気管支内非小細胞性肺癌の治療に関してＦＤＡの承認を得た酸を用いた処理によって、ヘマトポルフィリン−ＩＸから得るモノマー、ダイマー、及び高次オリゴマーの複合及び非分離混合物である。
【００７５】
好ましいスペクトル領域（６５０〜８５０ｎｍ）中のその強烈な吸収及び処置後のその容易な分解のため、クロロフィル及びバクテリオクロロフィル誘導体は、腫瘍のＰＤＴ用の卓越した増感剤として、且つポルフィリンと比較して優れた性質を有すると同定されている。特に、バクテリオクロロフィルはクロロフィルと比較して有用である可能性がある。それらは、クロロフィル誘導体より強烈な近赤外バンド、即ち、相当長い波長を示すからである。
【００７６】
腫瘍細胞自体ではなく腫瘍血管系を破壊するための光線力学療法用試薬のターゲティングは、腫瘍細胞の増殖及び発生は連続的な酸素及び栄養素供給に非常に依存するので、治療上の利点をもたらす可能性がある。さらに、腫瘍血管内皮細胞（ＥＣ）層のターゲティングは、治療用マクロ分子による腫瘍間質のわずかな透過を回避すると予想される。腫瘍血管は腫瘍微小環境によって影響を受け、腫瘍関連の「痕跡」を得る可能性があるが、それらは悪性ではなく、薬剤耐性を示す可能性は低い。さらに、ターゲティングされる抗血管新生剤が腫瘍細胞に対しても活性があるとき、さらなる有効性の利点が予想され得る。したがって、一薬剤において抗血管性と抗腫瘍細胞毒性活性を組み合わせることによって、その有効性は増大すると予想することができ、必要とされる有効細胞毒性用量は、したがって低下する可能性がある。
【００７７】
選択的血管ターゲティングは、腫瘍及び正常血管の治療剤に対する差次的感受性及び結果として生じる応答に依存し得る。或いは、差次的エンドサイトーシスは、細胞毒性薬又は他の治療剤の選択的取り込みを促進する可能性がある。インテグリンαｖβ３、αｖβ５及びα５β１が、例えば腫瘍を伴う血管新生した血管内皮細胞に典型的な発現パターンにおいて同定されている。
【００７８】
この目標を達成するために異なる戦略が進められている。血管系中の特定部位をターゲティングする、循環ペプチド、ペプチド模倣体又は抗体は、大部分が血管壁などの生理的障壁を越えて位置する腫瘍細胞を直接ターゲティングするようなコンジュゲートに優る理論上の利点をもたらす、治療剤及び診断剤の担体として魅力的である。
【００７９】
Ｃｈａｌｅｉｘ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）は、非金属ポルフィリン大員環が、４−メチルフェニル又はアセチル化グルコシルオキシフェニルによって位置１０、１５、２０の各々において、及びスペーサーアームによって大員環と連結した直鎖ＲＧＤ含有ペプチドの残基によって位置５において置換された、ＰＤＴ用途の考えられる候補としてのＲＧＤ−ポルフィリンコンジュゲートの合成を開示する。
【００８０】
別の実施形態では、本発明のコンジュゲートのペイロード成分は、したがって、ポルフィリン、クロロフィル又はバクテリオクロロフィルだけには限られないが、これらなどの光増感剤の成分である。
【００８１】
本発明の目的は、増感剤を腫瘍血管系に特異的にターゲティングする光増感剤コンジュゲートを提供することである。従来の化学療法による血管ターゲティングに優る血管用光増感剤によるターゲティングのいくつかの利点が存在する。第一に、ターゲティングされる従来の薬剤は、その蓄積中、プロドラッグでない限り活性状態であることが多く、一方でターゲティングされる光増感剤は、局所照射するまで活性状態ではない。第二に、ターゲティングされる従来の薬剤はホーミング性を示す望ましくない標的とも結合及び作用し、一方でターゲティングされる光増感剤は関連照射部位でのみ活性化し得る。さらに、腫瘍中の血管新生内皮のシグネチャーへとターゲティングされる光増感剤を用いたＰＤＴは、光線力学的療法による内皮細胞損傷を誘導する際に非常に選択的である可能性がある。
【００８２】
インテグリンαｖβ３は、腫瘍増殖中に既存の血管系からの新たな血管の成長を含む腫瘍転移及び血管新生において、重要な役割を果たすことが報告されているので、腫瘍増殖及び拡大の考えられるマーカーであり得る。したがって、リアルタイムでαｖβ３インテグリンの発現を視覚的にモニタリングするための非侵襲的イメージング法は、治療的介入を評価するため、及び転移を検出するための機会を与える。
【００８３】
インテグリンはＲＧＤモチーフを認識することによって細胞の細胞内細胞骨格と細胞外マトリクスを結合させる。ＲＧＤペプチドはインテグリン受容体部位と相互作用し、細胞のシグナル伝達プロセスを開始させ、多くの異なる疾患に影響を与えることができる。したがって、インテグリンＲＧＤ結合部位は魅力的な薬剤標的である。インテグリンαｖβ３は、ＲＧＤ結合部位、及びホーミングしαｖβ３インテグリンのアンタゴニストとして作用するＲＧＤ配列を含有するペプチド又はペプチド模倣体を有する。
【００８４】
本発明の二官能性コンジュゲートでは、ホーミング性はＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体によって与えられ、一方ＰＤＴ効果は光増感剤によって与えられる。これらのコンジュゲートは、診断目的及び光線力学的療法による破壊のために、原発性固形腫瘍の新たな血管及びおそらく個々の転移に増感剤をターゲティングすることができるはずである。それらはさらに抗血管新生剤として働き、新生内皮及び血管露出腫瘍細胞のアポトーシスによる破壊を開始することができる。
【００８５】
好ましい実施形態では、ペイロード成分は、金属又は非金属であってよく、且つアルキル、アリール、ヘテロアリール及び／又は官能基などの異なる置換基によって末端において場合によっては置換されていてよい、ポルフィリン、クロロフィル又はバクテリオクロロフィル誘導体である。これらの官能基は、正に帯電した基、負に帯電した基、生理条件下で正に帯電した基に転換される塩基性基、及び生理条件下で負に帯電した基に転換される酸性基から選択することができる。
【００８６】
用語「正に帯電した基」は、Ｎ含有基から誘導されたカチオン、又はＮを含有しないオニウム基から誘導されたカチオンを指す。腫瘍内皮は多数のアニオン部位によって特徴付けられるので、正に帯電した基又は生理条件下で正に帯電した基に転換される塩基性基は、本発明のコンジュゲートのターゲティング効率を高める可能性がある。
【００８７】
用語「負に帯電した基」は酸から誘導されたアニオンを指し、カルボキシレート（ＣＯＯ−）、チオカルボキシレート（ＣＯＳ−）、スルホネート（ＳＯ３−）、及びホスホネート（ＰＯ３２−）を含み、且つ「生理条件下で負に帯電した基に転換される酸性基」は、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）、チオカルボン酸（−ＣＯＳＨ）、スルホン酸（−ＳＯ３Ｈ）及びホスホン酸（−ＰＯ３Ｈ２）基を含む。
【００８８】
より好ましい実施形態では、ペイロード成分は、修飾が大員環中に施された、及び／又は周辺及び／又は中心Ｍｇ原子が不在である可能性がある、又はそれが診断の目的及び／若しくはＰＤＴの目的に適した他の金属原子によって置換された化合物を含めた、クロロフィル又は、最も好ましくは、クロロフィル又はバクテリオクロロフィルの天然若しくは合成非天然誘導体であってよいバクテリオクロロフィル誘導体である。このような金属の例には、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｓｎ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｉｎ、Ｅｕ、Ｆｅ、Ａｕ、Ａｌ、Ｇｄ、Ｅｒ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｇａ、Ｙ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｒｅ、Ｔｌ及びＴｃ並びにその同位体があるが、これらだけには限られない。
【００８９】
特定の好ましい一実施形態では、本発明のコンジュゲートは、一般式ＩのＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体とバクテリオクロロフィル誘導体の成分のコンジュゲートであり、この場合前記バクテリオクロロフィル誘導体はＡ１と直接連結したＰｄ−ＢＴＡであり、Ｘは−ＮＨ−Ｒ−であり、Ｒはエタンから誘導されたヒドロカルビレンであり、且つＡ１はＤａｐである（本明細書で識別するコンジュゲート３４）。
【００９０】
さらなる実施形態では、本発明のコンジュゲートのペイロード成分はキレート剤、即ち、テクネチウム−９９ｍ（９９ｍＴｃ）などの放射性核種をキレート化することができる作用物質である。このようなキレート剤の非制限的な例には、ＤＴＰＡ及びＤＯＴＡがある。このようなコンジュゲートは、放射線イメージング及び放射線療法の作用物質として有用である可能性がある。
【００９１】
好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは、一般式ＩのＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体とキレート剤の成分のコンジュゲートであり、この場合前記キレート剤はＡ１と直接連結したＤＴＰＡ又はＤＯＴＡであり、Ｘは−ＮＨ−Ｒ−であり、Ｒはエタンから誘導されたヒドロカルビレンであり、且つＡ１はＤａｐである（それぞれ本明細書で識別するコンジュゲート３５及び３６）。
【００９２】
現在使用されている化学療法剤の大部分は正常細胞に対しても毒性があるので、標的化学療法、即ち、腫瘍細胞を特異的にターゲティングする化学療法剤の開発は非常に重要である。ターゲティングされる細胞毒性ペプチドコンジュゲートは、腫瘍細胞上の受容体及び細胞毒性成分と結合するペプチド担体から構成されるハイブリッド分子である。この手法は、化学療法における細胞毒性薬の特異性及び有効性を効率よく増大させ、毒性副作用も低下させるはずである。
【００９３】
したがって、他のさらなる実施形態では、本発明のコンジュゲートのペイロード成分は細胞毒性薬である。
【００９４】
好ましい一実施形態では、本発明の細胞毒性薬はアントラサイクリン系化学療法剤である。アントラサイクリン系化学療法剤は、ドキソルビシン（アドリアマイシンとしても知られる）、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びミトキサントロンを含めた、アントラサイクリンファミリーの任意の化学療法剤であってよい。より好ましい実施形態では、アントラサイクリン系化学療法剤は、キニン含有アントラサイクリンであり腫瘍学の分野で利用される最も広く処方される有効な化学療法剤である、ドキソルビシンである。ドキソルビシンは膀胱、胃、卵巣、肺及び甲状腺の腫瘍を含めた広範囲のヒト悪性腫瘍において示され、乳癌並びに急性リンパ性及び骨髄性白血病、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、ユーイング及び骨形成腫瘍、軟部組織肉腫、並びに神経芽細胞腫及びウィルムス腫瘍などの小児癌を含めた他の兆候の治療に利用可能な、最も活性がある作用物質の１つである。
【００９５】
他の好ましい実施形態では、細胞毒性薬は、肺、卵巣、乳癌、頭頸部癌、及び進行形カポジ肉腫を有する患者の治療、並びに再狭窄の予防に現在使用されているパクリタキセルなどの分裂阻害剤、カンプトテシンなどのトポイソメラーゼＩ阻害剤、又はエリプチシンなどのトポイソメラーゼＩＩ阻害剤である。
【００９６】
さらなる態様では、本発明は、ＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体と前に定義したペイロード成分のコンジュゲート、又は薬剤として許容されるその塩、及び薬剤として許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００９７】
一実施形態では、医薬組成物は、前に定義した環状ペプチド模倣体、即ち一般式Ｉ又はＩＩの環状ペプチド模倣体と、蛍光プローブの成分のコンジュゲートを含む。好ましい実施形態では、医薬組成物は、前に定義したコンジュゲート１〜３３及び４１〜４８からなるコンジュゲートの群から選択されるコンジュゲートを含む。このような医薬組成物は、例えば、血管標的化イメージング（ｖａｓｃｕｌａｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｍａｇｉｎｇ）（ＶＴＩ）の、より好ましくは腫瘍の診断の方法において、診断目的、好ましくは臓器及び組織の可視化に使用することができる。
【００９８】
別の実施形態では、医薬組成物は、前に定義した環状ペプチド模倣体、即ち一般式Ｉ又はＩＩの環状ペプチド模倣体と、前に定義した光増感剤の成分のコンジュゲートを含む。好ましい実施形態では、医薬組成物は、前に定義したコンジュゲート３４及び３７〜４０からなるコンジュゲートの群から選択されるコンジュゲートを含む。このような組成物は光線力学的療法（ＰＤＴ）中で使用することができる。一実施形態では、医薬組成物は腫瘍学において、特に腫瘍のＰＤＴに使用するためのものである。任意の適切な固形腫瘍、原発腫瘍と、メラノーマ、結腸、乳、肺、前立腺、脳若しくは頭頸部癌だけには限られないが、これらから選択される転移性腫瘍の両方が本発明によって包含される。別の実施形態では、医薬組成物は非腫瘍疾患に、非腫瘍組織又は臓器のＰＤＴに使用するためのものである。一実施形態では、医薬組成物は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）などの血管疾患、又は脂肪組織への血液供給を制限し、それによってその増殖を阻害することにより肥満などの障害の治療に使用する。
【００９９】
さらなる実施形態では、医薬組成物は、前に定義した環状ペプチド模倣体、即ち一般式Ｉ又はＩＩの環状ペプチド模倣体と、放射性核種をキレート化することができる作用物質の成分のコンジュゲートを含む。好ましい実施形態では、医薬組成物は、前に定義したコンジュゲート３５又は３６を含む。このような組成物は、適切な放射性核種で標識したとき、放射線イメージング又は放射線療法に使用することができる。
【０１００】
なお別の実施形態では、医薬組成物は、前に定義した環状ペプチド模倣体、即ち一般式Ｉ又はＩＩの環状ペプチド模倣体と、前に定義した細胞毒性薬の成分のコンジュゲートを含む。このような組成物は、標的化学療法に使用することができる。
【０１０１】
本発明によって提供する医薬組成物は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、１９ｔｈ  Ｅｄ．、１９９５中に記載されたように、従来の技法によって調製することができる。組成物は固体、半固体又は液体形であってよく、薬剤として許容される充填剤、担体又は希釈剤、及び他の不活性成分及び賦形剤をさらに含むことができる。さらに、医薬組成物はコンジュゲートの徐放用に設計することができる。組成物は任意の適切な経路、例えば静脈内、経口、非経口、直腸、又は経皮によって投与することができる。用量は患者の状態に依存し、当業者によって適切であると考えられるように決定する。
【０１０２】
投与の経路は、適切又は所望の作用部位に活性化合物を効率よく運ぶ任意の経路であってよく、静脈内経路が好ましい。固形担体を経口投与に使用する場合、調製物を錠剤化し、粉末又はペレット形で硬質ゼラチンカプセル中に置くことができ、又はそれはトローチ剤の形であってよい。液体担体を使用する場合、調製物はシロップ、エマルジョン、又は軟質ゼラチンカプセルの形であってよい。タルク及び／又は炭水化物担体又は結合剤などを有する錠剤、糖衣錠又はカプセルは、経口施用に特に適している。錠剤、糖衣錠又はカプセルに好ましい担体には、ラクトース、コーンスターチ及び／又はジャガイモデンプンがある。
【０１０３】
なお別の態様では、したがって本発明は、診断目的、光線力学的療法（ＰＤＴ）、放射線イメージング若しくは放射線療法、又は標的化学療法用の医薬組成物を調製するための、ＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体と、前に定義したペイロード成分のコンジュゲート、又は薬剤として許容されるその塩の使用に関する。
【０１０４】
他のさらなる態様では、本発明は、診断目的、光線力学的療法（ＰＤＴ）、放射線イメージング若しくは放射線療法、又は標的化学療法用の、ＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体と、前に定義したペイロード成分のコンジュゲート、又は薬剤として許容されるその塩に関する。
【０１０５】
ここで本発明を、以下の非制限的な実施例によって例示する。
【実施例】
【０１０６】
材料及び方法
（ｉ）材料。２−クロロトリチルクロリド樹脂、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−Ｏ−アリル、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＧＡＢＡ−ＯＨ、モノＦｍｏｃ−ジアミン、ＨＯＢｔ、ＰｙＢＯＰ、ＨＡＴＵ及びＨＯＡｔはＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（米国）から購入した。Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨはＢａｃｈｅｍ（スイス）から購入した。Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ、１−Ｆｍｏｃ−４−アミノピペリジンヒドロクロリド及び４−（Ｂｏｃ−アミノメチル）−アニリンはＮｅｏＭＰＳ（フランス）から購入した。ＦＩＴＣ、塩化ダンシル、ＤＩＥＡ、ＤＩＣ、ＤＭＢＡ、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム塩、ＴＦＥ、ＴＩＳ、ＴＦＡ、乾燥ＤＣＭ及びＭｅＯＨはＳｉｇｍａ（米国）から購入した。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウムはＡｃｒｏｓ（ベルギー）から購入した。ＤＭＦ、ＤＣＭ及びアセトニトリルはＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（米国）から購入した。ＤＴＰＡ及びＤＯＴＡはＭａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ（米国）から購入した。
【０１０７】
Ｓｈｉｍａｄｚｕ１２４０  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を使用してＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを得た。ＨＰＬＣ  ＭＳの分析値は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  １５０ＥＸ  ｓｉｎｇｌｅ−ｑｕａｄ質量分析計と接続した、ＹＭＣ  Ｐｒｏ−ＲＰ−Ｃ１８逆相カラムを備えるＡｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣを使用して得た。ＨＰＬＣ分析は（他に記さない限り）、標準条件、２０〜９５％アセトニトリル水中（ｐＨ＝４．５、酢酸によって維持）勾配、３０分間、０．２ｍｌ／分の流速で実施した。調製ＨＰＬＣは、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ  ｖ３．０５プログラムによって制御される、Ｗａｔｅｒｓ４８６ＵＶ−ＶＩＳ可変吸光度検出器及びＷａｔｅｒｓフラクションコレクターを備えるＷａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔａ  Ｐｒｅｐ４０００システムを使用して実施した。流速は調製カラム（Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８、２１８ＴＰ１０１５５０、５０×２５０ｍｍ、１０〜１５μｍ）を使用して７５ｍｌ／分に設定した。ＨＰＬＣ精製において使用した溶媒は、溶媒Ａ（５０ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液）及び溶媒Ｂ（アセトニトリル）であった。ＥＬＩＳＡプレートはＴｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ装置で読みとった。蛍光イメージングは、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ（登録商標）１００シリーズイメージングシステム（Ａｌａｍｅｄａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して実施した。
【０１０８】
（ｉｉ）Ｈ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（αＯ−アリル）−２−クロロトリチル樹脂とモノＦｍｏｃ−ジアミンのカップリングに関する一般的な手順。モノＦｍｏｃ−ジアミンヒドロクロリド（１．０５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍｌ）に溶かした。ＤＩＥＡ（１．２６ｍｍｏｌ）を溶液に加え１分間攪拌し、次にＢＴＣ（０．３５ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（３．１５ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液をＤＣＭで事前に洗浄した０．２１ｍｍｏｌペプチジル樹脂に加え、１時間反応させた。カップリング後、樹脂をＤＣＭ（３×６ｍｌ、それぞれ１分）及びＤＭＦ（６×６ｍｌ、それぞれ１分）で洗浄した。カップリングの終了は定性ニンヒドリン試験（カイザー試験）によってモニタリングした。
【０１０９】
（ｉｉｉ）ペプチジル樹脂とＢＴＡ又はＰｄ−ＢＴＡのカップリングに関する一般的な手順。ＢＴＡ（０．４２ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（０．４２ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（０．４２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶かし、次いでＤＩＥＡ（１．８９ｍｍｏｌ）を溶液に加え、５分間攪拌した。得られた溶液を０．２１ｍｍｏｌペプチジル樹脂に加え、アルゴン下で２時間振とうした。カップリング後、樹脂をＤＭＦ（６〜８×６ｍｌ、１分）で洗浄した。カップリングの終了は定性ニンヒドリン試験によってモニタリングした。環状ペプチジル樹脂とＰｄ−ＢＴＡのカップリングは、ＢＴＡに関して記載したのと同じカップリング条件下で実施した。
【０１１０】
（ｉｖ）ペプチジル樹脂とＦＩＴＣのカップリングに関する一般的な手順。ＤＭＦ（５ｍｌ）にＦＩＴＣ（０．６３ｍｍｏｌ）を溶かした溶液を０．２１ｍｍｏｌペプチジル樹脂に加え、１．５時間振とうした。カップリング後、樹脂をＤＭＦ（６×６ｍｌ、それぞれ１分）で洗浄した。カップリングの終了は定性ニンヒドリン試験によってモニタリングした。
【０１１１】
（ｖ）ペプチジル樹脂と塩化ダンシルのカップリングに関する一般的な手順。ＤＣＭ（５ｍｌ）に塩化ダンシル（１．０５ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１．４７ｍｍｏｌ）を溶かした溶液を、ＤＣＭで事前に洗浄した０．２１ｍｍｏｌペプチジル樹脂に加え、１時間反応させた。カップリング後、樹脂をＤＣＭ（５×５ｍｌ、１分）及びＤＭＦ（２×５ｍｌ、１分）で洗浄した。カップリングの終了は定性ニンヒドリン試験によってモニタリングした。
【０１１２】
（ｖｉ）保護ジペプチドＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−ＯＨ、ペプチド合成の構成単位の調製。乾燥ＤＣＭ（１００ｍｌ）にＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（４．１６２ｇｒ；１４ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（９．７５５ｇｒ；５６ｍｍｏｌ）を溶かした溶液を、１０ｇｒの２−クロロトリチルクロリド樹脂（置換１．４ｍｍｏｌ／ｇｒ）と共に１時間室温で攪拌した。混合物は焼結ガラス底を備える反応器に移し、樹脂はＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＥＡ（１７：２：１）（３×１００ｍｌ）、ＤＣＭ（３×１００ｍｌ）、ＤＭＦ（３×１００ｍｌ）、ＤＣＭ（２×１００ｍｌ）、ＭｅＯＨ（２×１００ｍｌ）及びＤＭＦ／ＤＣＭ（１：１）（３×１００ｍｌ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ基は５％ピペリジンＤＭＦ／ＤＣＭ（１：１）中（１００ｍｌ、１０分）、次に２０％ピペリジンＤＭＦ（１００ｍｌ、５分及び２×１５分）を用いた処理によって除去し、ＤＭＦ（７×１００ｍｌ）で樹脂を洗浄した。ＤＭＦ（１３０ｍｌ）に溶かしたＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（１８．１７ｇｒ；２８ｍｍｏｌ）を、室温で１５分間ＤＩＣ（４．３４ｍｌ；２８ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（４．２９ｇｒ；２８ｍｍｏｌ）で活性化し、反応容器に加えた。混合物は室温で２時間振とうした。ペプチジル樹脂はＤＭＦ（５×１００ｍｌ）、ＤＣＭ（３×１００ｍｌ）、ＭｅＯＨ（２×１００ｍｌ）及びＤＣＭ（３×１００ｍｌ）で洗浄し、３時間真空中で乾燥させた。保護ジペプチドは、１時間室温でＡｃＯＨ／ＴＦＥ／ＤＣＭ（１：１：３）（２５０ｍｌ）の溶液と攪拌することによって樹脂から切断した。樹脂を濾過し同じ溶液（３×５０ｍｌ）で洗浄した。組み合わせた濾液をｎ−ヘキサンと混合して共沸混合物としてのＡｃＯＨを除去し、蒸発させて油状残渣を得て、それを低温エーテルによる処理によって凝固させた（１ｌ）。濾過及び低温エーテル（１５０ｍｌ）による洗浄によって、約９９％の均一性（ＨＰＬＣ）で白い粉末（８．６４ｇ；８７．５％）を得た。Ｃ３６Ｈ４３Ｎ５Ｏ８Ｓ。ＭＳ（ＬＣ−ＭＳ）計算上ｍ／ｚ＝７０５．８４；実測：７０６．３０（Ｍ＋Ｈ）。産物はさらなる精製なしで使用した。
【０１１３】
（ｖｉｉ）樹脂からのペプチドコンジュゲートの切断に関する一般的な手順。結合後、ペプチジル樹脂をＤＭＦ（５×３ｍｌ）及びＤＣＭ（５×３ｍｌ）で洗浄し、次いで減圧下において３時間乾燥させた。ペプチドコンジュゲートは、５分間０℃で、次いで１時間室温で、ＴＦＡ／チオアニソール／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（８５：５：５：５）（６ｍｌ）の切断剤カクテルを使用して樹脂から切断した。樹脂を濾過し、同じ切断剤カクテル（４ｍｌ）で洗浄した。組み合わせた濾液はＮ２流によって約半分の体積まで蒸発させ、ペプチドは低温エーテル（２５ｍｌ）を加えることによって沈降させた。エーテル層の遠心分離及びデカンテーション、並びに低温エーテル（２×２５ｍｌ）を用いた追加処理により非保護ペプチドを得て、６時間真空中で乾燥させた。粗製産物はＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【０１１４】
（ｖｉｉｉ）ＥＬＩＳＡによるインテグリン結合試験。Ｎｕｎｃイムノモジュールストリップ（Ｎｕｎｃｌｏｎ、カタログ番号１６７００８、Ｄａｎｉｅｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、イスラエル）を、０．０６Ｍ炭酸塩−重炭酸塩バッファーに溶かした２μｇ／ｍｌヒトインテグリンαＶβ３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＣＣ１０２０、Ｂｉｏｔｅｓｔ、イスラエル）で一晩コーティングした。ストリップはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）に溶かした２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−９６４７、イスラエル）で室温で２時間ブロッキングした。アッセイバッファー（５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ＝７．７、０．５％ＢＳＡ、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）に希釈したｃ［ＲＧＤｆＫ］−ビオチン（１０−３Ｍ）と異なる濃度（１０−２、１０−３、１０−４及び１０−５Ｍ）の試験化合物の混合物を、コーティングしたストリップに加え、振とうしながら室温で一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、アルカリホスファターゼによって標識した抗ビオチン抗体（１：２００）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｌｍｏｇ、イスラエル）を加え、室温で１時間インキュベートした。サンプルはｐ−ニトロフェニルホスフェート基質（ｐ−ＮＰＰ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｍｅｒｃｕｒｙ、イスラエル）とインキュベートし、４０５ｎｍで読みとった。
【０１１５】
（ｉｘ）Ｉｎ−ｖｉｖｏ卵巣癌モデル。メスのＣＤ−１ヌードマウス（７〜９週齢、２３〜２８ｇｒ）に麻酔をかけ、（Ｐｒｏｆ．Ｍ．Ｎｅｅｍａｎ、ｔｈｅ  Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、イスラエルから得た）ＭＬＳヒト卵巣癌細胞縣濁液（２〜３×１０６個の細胞／マウス）を皮下（ＳＣ）移植した。腫瘍は２〜３週間以内に治療サイズ、直径６〜８ｍｍに達した。
【０１１６】
２％イソフルオラン（Ｍｅｄｅｖａ、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、パレスチナ自治区）を含有する７：３のＮ２Ｏ：Ｏ２の混合物を含むガスによって、又は５ｍｇ／ｋｇのケタミン（Ｒｈｏｎｅ  Ｍｅｒｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、フランス）と１ｍｇ／ｋｇのポンパン（Ｂａｙｅｒ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ、ドイツ）（８５：１５、ｖ：ｖ）の混合物の腹腔内（ＩＰ）注射によって動物に麻酔をかけた。
【０１１７】
（ｘ）Ｉｎ−ｖｉｖｏ結腸癌モデル。このモデルは、ＨＴ２９ヒト結腸癌細胞（ＡＴＣＣ、米国、２〜３×１０６個の細胞／マウス）をＭＬＳヒト卵巣癌細胞の代わりに使用した事実以外、前の（ｉｘ）中に記載したｉｎ  ｖｉｖｏ卵巣癌モデルと同様である。
【０１１８】
（ｘｉ）Ｉｎ−ｖｉｖｏ前立腺癌モデル。ＬＮＣａＰ細胞（３×１０６個の細胞／マウス）を重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスの背部にＳＣ移植した。腫瘍は６０〜７０日間増殖させた。腫瘍が治療サイズ（０．７〜０．８ｃｍ３）に達したとき、動物に麻酔をかけ、試験化合物溶液を静脈内（ＩＶ）注射した。ＩＶＩＳにおけるイメージは注射後第８、１１、１４、２４及び４８時間で得た。
【０１１９】
（ｘｉｉ）Ｉｎ−ｖｉｖｏ乳癌モデル。メスのＣＤ−１ヌードマウス（６〜８週齢、２０〜２５ｇ、Ｈａｒｌａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  イスラエル、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエルから得た）に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰヒト乳癌細胞（４×１０６個の細胞／マウス）を移植した。実際これらの細胞は、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子でトランスフェクトし、したがって赤色蛍光を有する、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞（ＡＴＣＣ、米国）である。腫瘍が壊死腫瘍に関する１〜１．５ｃｍ３の大きさに達したとき、８５：１５のケタミン：キシラジンの３０μｌ混合物のＩＰ注射によってマウスに麻酔をかけ、次いで試験コンジュゲート（１５ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈に注射した。
【０１２０】
（ｘｉｉｉ）ＢＴＡ−ＲＧＤコンジュゲートに関する蛍光イメージングプロトコル。試験化合物（８ｍｇ／ｋｇ）を、ＩＰ麻酔した腫瘍含有マウスの尾静脈に注射した。ガス麻酔した動物のイメージは、ＩＶＩＳ（登録商標）１００シリーズイメージングシステムを使用して注射後第６、８、１０、１２、１４及び２４時間（いくつかの場合さらに第４８及び７２時間）で得た。励起及び蛍光フィルターは、ＩＶＩＳにおいてそれぞれ７１０〜７６０ｎｍ及び８１０〜８６０ｎｍに設定した。ＩＶＩＳの標準構成で利用可能なフィルターの中で、化合物の発光ピークに最も近い波長を有する蛍光フィルターを選択した。
【０１２１】
（ｘｉｖ）ＦＩＴＣ−ＲＧＤコンジュゲートに関する蛍光イメージングプロトコル。試験化合物（８ｍｇ／ｋｇ）を、ＩＰ麻酔した腫瘍含有マウスの尾静脈に注射した。ガス麻酔した動物のイメージは、注射後第６及び８時間で得た。動物は第８時間で屠殺し、臓器（腫瘍、腎臓、肝臓）を摘出し、臓器のイメージはＩＶＩＳ（登録商標）１００シリーズイメージングシステムを使用して得た。励起及び蛍光フィルターは、ＩＶＩＳにおいてそれぞれ４４５〜４９０ｎｍ及び５１５〜５７５ｎｍに設定した。ＩＶＩＳの標準構成で利用可能なフィルターの中で、ＦＩＴＣの発光ピークに最も近い波長を有する蛍光フィルターを選択した。
【０１２２】
（ｘｖ）Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ結合アッセイ。ＭＬＳヒト卵巣癌細胞を、１ｇ／ｌのＤ−グルコース、ｐＨ７．４、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（０．０６ｍｇ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を含有する最小必須培地（ＭＥＭ−アルファ）中で単層として培養し、５％ＣＯ２−湿度雰囲気において３７℃において増殖させた。実験４８時間前に、細胞を６ウエルプレートに接種した（３×１０５個細胞／ウエル）。
【０１２３】
ＭＬＳ細胞におけるαＶβ３インテグリンの発現。細胞はカバーガラス上で増殖させた。一晩の血清飢餓、４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、イスラエル）での固定及び０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ、イスラエル）での浸透処理後、細胞はブロッキング溶液（１０％のウマ血清）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）中で室温で１時間インキュベートした。次いで細胞を、マウス抗ヒトαＶβ３インテグリン抗体（１：１００）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｂｉｏｔｅｓｔ、イスラエル）と共に室温において１時間インキュベートした。二次ウサギＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（１：２００）（Ｓｉｇｍａ、イスラエル）を、室温で１時間細胞に施した。イメージングはデジタルカメラ（ＤＶＣ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を備える蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｏｐｔｉｐｈｏｔ２、日本）によって実施した。
【０１２４】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイ。ＲＧＤコンジュゲートを最初にＤＭＳＯに溶かして４×１０−３Ｍを得た。次いでストック溶液を培養培地に１：４０に希釈し、ＭＬＳ又はＨＴ２９細胞（１００μＭ／ウエル）に加えた。細胞は３時間５％ＣＯ２−湿度雰囲気において３７℃でインキュベートした。次いで細胞はＰＢＳで３回洗浄し、イメージングはＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ（登録商標）１００シリーズイメージングシステムで実施した。ＢＴＡ−ＲＧＤに関してＩＶＩＳにおいて設定した励起及び蛍光フィルターは、それぞれ７１０〜７６０ｎｍ及び８１０〜８６０ｎｍであり、ＦＩＴＣ−ＲＧＤに関してはそれぞれ４４５〜４９０ｎｍ及び５１５〜５７５ｎｍであった。
【０１２５】
（ｘｖｉ）競合結合実験（ＩＣ５０の決定）。イムノモジュールストリップＭＡＸＩＳＯＲＰ（Ｎｕｎｃ、Ｄａｎｙｅｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、イスラエル）を、５０μｌ／ウエルの２μｇ／ｍｌヒトαＶβ３インテグリン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、米国）で一晩コーティングし、室温で２時間２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、イスラエル）でブロッキングした。トリス緩衝生理食塩水−Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）バッファーで洗浄した後、ＲＧＤペプチドｃ［ＲＧＤｆＫ］−ビオチン（１０−３Ｍ）と異なる濃度（１０−２、１０−３、１０−４及び１０−５Ｍ）の試験したＲＧＤコンジュゲートの混合物を三連で加え、一晩インキュベートし室温で振とうした。ＰＢＳバッファーで洗浄した後、アルカリホスファターゼによって標識した抗ビオチン抗体（１：２００）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、ドイツ）を加え、室温で１時間インキュベートした。サンプルはｐ−ＮＰＰ基質と共にインキュベートし、Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｌａｂｏｔａｌ、イスラエル）において４０５ｎｍで読みとった。データはＲＧＤコンジュゲートの濃度からの結合率の依存性のグラフにプロットし、ＩＣ５０値を決定した。
【０１２６】
（例１．一般式ＩのＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体に基づくコンジュゲートの合成）
１（ｉ）ＢＴＡ−及びＰｄ−ＢＴＡ−環状ペプチド模倣体コンジュゲート、本明細書で識別するコンジュゲート１、３〜６、１５、２３〜２６及び３４の合成−方法Ａ
トリペプチドＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（αＯ−アリル）−２−クロロトリチル樹脂を、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−ＯＨと樹脂結合Ｈ−Ａｓｐ−Ｏ−アリル残基のカップリングによって固相で調製した。
【０１２７】
第一アミノ酸の結合は、２−クロロトリチルクロリド樹脂（３００ｍｇ、置換１．４ｍｍｏｌ／ｇｒ）とＦｍｏｃ−Ａｓｐ−Ｏ−アリル（８３ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１４７μｌ、０．８４ｍｍｏｌ）を５ｍｌ乾燥ＤＣＭに溶かした溶液を室温で１時間攪拌して約０．７ｍｍｏｌ／ｇの充填をもたらすことによって実施した。カップリング終了時に、相当する体積の溶媒及び試薬溶液で、材料及び方法中に記載したように樹脂を処理（洗浄及びＦｍｏｃ除去）した。Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−ＯＨ（２２３ｍｇ、０．３１５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（４８ｍｇ、０．３１５ｍｍｏｌ）及びＤＩＣ（４９μｌ、０．３１５ｍｍｏｌ）を５ｍｌのＤＭＦに溶かし、室温で２０分間攪拌した。生成した溶液を洗浄したＨ−Ａｓｐ−Ｏ−アリル樹脂に加え、混合物は室温で２時間振とうした。ペプチジル樹脂はＤＭＦ（５×５ｍｌ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ基の除去は、２０％ピペリジン（５ｍｌ）ＤＭＦ中（２×１５分）の添加、次にＤＭＦ洗浄（７×５ｍｌ、１分）によって行った。材料及び方法中に記載したようにモノＦｍｏｃ−ジアミンのカップリングを実施し、次にＦｍｏｃ脱保護及びＤＭＦ洗浄を実施した。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ、並びにＦｍｏｃ−Ｄａｐ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨとテトラペプチドのカップリングは、ＨＯＢｔ（０．６３ｍｍｏｌ）及びＤＩＣ（０．６３ｍｍｏｌ）で（１５分間）予め活性化したＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ（０．６３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５ｍｌ）を加えることによって、１時間のカップリング時間で実施した。カップリング後、樹脂をＤＭＦで洗浄した（６×５ｍｌ、１分）。カップリングの終了は定性ニンヒドリン試験（カイザー試験）によってモニタリングした。アリル及びＡｌｌｏｃの脱保護は、アルゴン下において室温で２時間、ＤＣＭ（５ｍｌ）に溶かした［（Ｃ６Ｈ５）３Ｐ］４Ｐｄ０（０．２５２ｍｍｏｌ）及びＤＭＢＡ（３．５７ｍｍｏｌ）の溶液とペプチジル樹脂を攪拌することによって行った。樹脂はＤＣＭ（３×５ｍｌ、１分）、ＤＭＦ（３×５ｍｌ、１分）、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム塩（０．５％、ＤＭＦ中、４×５ｍｌ、２分）及び最後にＤＭＦ（５×５ｍｌ、１分）で洗浄した。樹脂上での環化は、室温で２時間、ＤＭＦ（４ｍｌ）に溶かしたＰｙＢＯＰ（０．６３ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１．２６ｍｍｏｌ）の溶液を使用することによって行った。Ｆｍｏｃの脱保護後、ＢＴＡと非保護ペプチジル樹脂の結合、及び樹脂からペプチドの切断は、材料及び方法中に記載したように実施した。産物はＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【０１２８】
１（ｉｉ）ＢＴＡ−環状ペプチド模倣体コンジュゲート、本明細書で識別するコンジュゲート２の合成−方法Ｂ
Ｈ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（αＯ−アリル）−２−クロロトリチル樹脂の合成を、方法Ａに関して前に記載したように実施した。
【０１２９】
非保護トリペプチドとＦｍｏｃ−ＮＨ−ＮＨ２塩酸塩のカップリング。モノＦｍｏｃ−ヒドラジン塩酸塩（１．０５ｍｍｏｌ）を、ジオキサンと１，３−ジクロロプロパン（１０ｍｌ）の１：１混合物に溶かした。ＤＩＥＡ（１．２６ｍｍｏｌ）をこの溶液に加え、１分間攪拌し、次にＢＴＣ（０．３５ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（３．１５ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を（１：１ジオキサン：１，３−ジクロロプロパンで予め洗浄した）ペプチジル樹脂（０．２１ｍｍｏｌ）に加え、５５℃で１時間反応させた。カップリング後、樹脂をＤＣＭ（３×６ｍｌ、１分）、次にＤＭＦ（６×６ｍｌ、１分）で洗浄した。カップリングの終了は定性ニンヒドリン試験（カイザー試験）によってモニタリングした。合成の残り部分は方法Ａに関して記載した通りである。産物はＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【０１３０】
１（ｉｉｉ）ＢＴＡ−環状ペプチド模倣体コンジュゲート、本明細書で識別するコンジュゲート９〜１１及び２７〜３３の合成−方法Ｃ
シクロペンタペプチドの合成を、方法Ａに関して前に記載したように実施した。
【０１３１】
アミノ酸スペーサーとシクロペンタペプチドのカップリング。Ｆｍｏｃアミノ酸（０．６３ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＧＡＢＡ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−１−Ｎａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−１−Ｎａｌ−ＯＨ又はＦｍｏｃ−３−アミノメチル安息香酸）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶かし、ＨＯＢｔ（０．６３ｍｍｏｌ）及びＤＩＣ（０．６３ｍｍｏｌ）を次いで加え、１５分間反応させた。溶液をＦｍｏｃ脱保護シクロペンタペプチド−２−クロロトリチル樹脂（０．２１ｍｍｏｌ）に加え、１時間振とうした。樹脂をＤＭＦ（６×５ｍｌ、１分）で洗浄し、次にＦｍｏｃを脱保護した。ＢＴＡのカップリング及び樹脂からのペプチドの切断は、材料及び方法中に記載したように実施した。産物はＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【０１３２】
ジアミンスペーサーとシクロペンタペプチドのカップリング。モノＦｍｏｃ−ジアミン塩酸塩（１．０５ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−エチレンジアミン塩酸塩又はＦｍｏｃ−ジアミノブタン塩酸塩）をＤＣＭ（１０ｍｌ）に溶かした。ＤＩＥＡ（１．２６ｍｍｏｌ）を溶液に加え１分間攪拌し、次にＢＴＣ（０．３５ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（３．１５ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液はＤＣＭで予め洗浄した０．２１ｍｍｏｌペプチジル樹脂に加え、１時間反応させた。カップリング後、樹脂をＤＣＭ（３×６ｍｌ、それぞれ１分）及びＤＭＦ（６×６ｍｌ、それぞれ１分）で洗浄した。カップリングの終了は定性ニンヒドリン試験（カイザー試験）によってモニタリングした。ＢＴＡのカップリング及び樹脂からのペプチドの切断は、材料及び方法中に記載したように実施した。産物はＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【０１３３】
１（ｉｖ）ＢＴＡ−環状ペプチド模倣体コンジュゲート、本明細書で識別するコンジュゲート７及び８の合成−方法Ｄ
Ｈ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（αＯ−アリル）−２−クロロトリチル樹脂の合成を、方法Ａに関して前に記載したように実施した。
【０１３４】
Ｆｍｏｃ脱保護トリペプチドとＦｍｏｃグリシノールのカップリング。Ｆｍｏｃグリシノール（１．０５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍｌ）に溶かし、次いでＢＴＣ（０．３５ｍｍｏｌ）をこの溶液に加え、次にＤＩＥＡ（３．１５ｍｍｏｌ）を加えた。５分間攪拌した後、得られた溶液はＤＣＭで予め洗浄したペプチジル樹脂（０．２１ｍｍｏｌ）に加え、室温で１時間反応させた。樹脂はＤＣＭ（３×６ｍｌ、１分）及びＤＭＦ（６×６ｍｌ、１分）で洗浄した。カップリングの終了は定性ニンヒドリン試験（カイザー試験）によってモニタリングした。合成の残り部分は方法Ａに関して記載したように実施した。樹脂からのペプチドコンジュゲートの切断は、１５％ＤＣＭ＋５％ＴＩＳ及び５％チオアニソールを含有するＴＦＡ溶液（６ｍｌ）を用いて実施した。産物はＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【０１３５】
１（ｖ）ＦＩＴＣ−環状ペプチド模倣体コンジュゲート、本明細書で識別するコンジュゲート１２〜１４の合成−方法Ｅ
シクロペンタペプチドの合成を、方法Ａに関して前に記載したように実施した。Ｆｍｏｃの脱保護後、ＤＭＦ（５ｍｌ）に溶かしたＦｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ又はＦｍｏｃ−ＧＡＢＡ−ＯＨ（０．６３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．６３ｍｍｏｌ）及びＤＩＣ（０．６３ｍｍｏｌ）の溶液を１５分間混合し、ペプチジル樹脂（０．２１ｍｍｏｌ）に加え、１時間反応させた。樹脂はＤＭＦ（６×５ｍｌ、１分）で洗浄した。Ｆｍｏｃ基の除去は、２０％ピペリジンＤＭＦ中（２×１５ｍｌ、１５分）を加え、次にＤＭＦで洗浄すること（６×５ｍｌ、１分）によって実施した。ＦＩＴＣと非保護ペプチジル樹脂のカップリング及び樹脂からのペプチドの切断は、材料及び方法中に記載したように実施した。産物はＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【０１３６】
１（ｖｉ）ダンシル−環状ペプチド模倣体コンジュゲート、本明細書で識別するコンジュゲート１６〜２２の合成−方法Ｆ
環状ペプチドの合成を方法Ａに関して前に記載したように実施し、Ｆｍｏｃの脱保護後、材料及び方法中に記載したように、これらの化合物を塩化ダンシルと直接反応させた。
【０１３７】
スペーサーを含有する化合物を、方法Ｅに関して記載したのと同じ条件下でＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、又は代替的にＦｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨと最初に反応させ、次に塩化ダンシルとカップリングさせた。樹脂からのペプチドの切断は、材料及び方法中に記載したように実施した。産物はＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【０１３８】
１（ｖｉｉ）ＤＴＰＡ−環状ペプチド模倣体コンジュゲート、本明細書で識別するコンジュゲート３５の合成−方法Ｇ
環状ペプチドの合成を方法Ａに関して前に記載したように実施した。Ｆｍｏｃの脱保護後、ＨＡＴＵ（０．４２ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（０．４２ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０．４２ｍｍｏｌ）によって活性化したＤＭＦ（３ｍｌ）中のＤＴＰＡ−テトラ（ｔ−Ｂｕエステル）（０．４２ｍｍｏｌ）の溶液をペプチジル樹脂（０．１４ｍｍｏｌ）に加え、室温で２時間振とうした。樹脂はＤＭＦで洗浄した（４ｍｌ、５回、各回１分）。樹脂からのペプチドの切断は、材料及び方法中に記載したように実施した。
【０１３９】
１（ｖｉｉｉ）ＤＯＴＡ−環状ペプチド模倣体コンジュゲート、本明細書で識別するコンジュゲート３６の合成−方法Ｈ
環状ペプチドの合成を方法Ａに関して前に記載したように実施した。Ｆｍｏｃの脱保護後、ＨＡＴＵ（０．４２ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（０．４２ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０．４２ｍｍｏｌ）によって活性化したＤＭＦ（３ｍｌ）中のＤＯＴＡ−トリス（ｔ−Ｂｕエステル）（０．４２ｍｍｏｌ）の溶液をペプチジル樹脂（０．１４ｍｍｏｌ）に加え、６０℃で３時間振とうした。樹脂はＤＭＦで洗浄した（４ｍｌ、５×１分）。樹脂からのペプチドの切断は、材料及び方法中に記載したように実施した。
【０１４０】
表１は、合成したコンジュゲート、及びそれらの構造特性を列挙する。
【表１】
0005773495.tif 000005
【０１４１】
（例２．一般式ＩＩのＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体に基づくＢＴＡ−コンジュゲートの合成）
焼結ガラス底を備える反応容器内で、リンクアミドＭＢＨＡ樹脂（３００ｍｇ、置換０．５８ｍｍｏｌ／ｇ）を、一晩の攪拌によってＤＭＦ中で膨張させた。１５分間（３ｍｌ）の２０％ピペリジンＤＭＦ中を用いた処理によって樹脂からＦｍｏｃ基を除去した。この動作を２回繰り返した。樹脂はＤＭＦで洗浄した（４ｍｌ、２分、５回）。Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ、並びにＦｍｏｃ−Ｄａｂ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨと樹脂のカップリングは、ＨＯＢｔ（０．５２ｍｍｏｌ）及びＤＩＣ（０．５２ｍｍｏｌ）で（１５分間）予め活性化したＦｍｏｃ−Ｄａｐ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ（０．５２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２．５ｍｌ）を加えることによって、１時間のカップリング時間で実施した。カップリング後、樹脂をＤＭＦで洗浄した（４ｍｌ、２分、５回）。カップリングの終了は定性ニンヒドリン試験（カイザー試験）によってモニタリングした。Ｆｍｏｃ除去及びＦｍｏｃ脱保護後のＤＭＦ洗浄は、前に記載したように実施した。Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨのカップリング、並びに各カップリング間のＦｍｏｃ脱保護は、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨに関して記載したのと同じ条件下で実施した。
【０１４２】
ペンタペプチドＬｙｓ（Ｄｄｅ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｘ−リンクアミド樹脂とアミノ酸アリルエステルのカップリングに関する一般的な手順
ＴｓＯＨ塩（０．８７ｍｍｏｌ）としてのアミノ酸アリルエステルをＤＣＭ（７ｍｌ）に溶かした。ＤＩＥＡ（１．０５ｍｍｏｌ）を溶液に加え１分間攪拌し、次にＢＴＣ（０．２９ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（２．６ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液はＤＣＭで予め洗浄した０．１７４ｍｍｏｌペプチジル樹脂に加え、１時間反応させた。カップリング後、樹脂をＤＣＭ（３×６ｍｌ、それぞれ１分）及びＤＭＦ（６回×６ｍｌ、それぞれ１分）で洗浄した。カップリングの終了は定性ニンヒドリン試験によってモニタリングした。
【０１４３】
アミノ酸アリルエステルのカップリング及びＤＭＦ洗浄後、樹脂をＤＣＭで洗浄した（４回、４ｍｌ、それぞれ１分）。アリル及びＡｌｌｏｃの脱保護は、アルゴン下において室温で２時間、ＤＣＭ（５ｍｌ）に溶かした［（Ｃ６Ｈ５）３Ｐ］４Ｐｄ０（０．２１ｍｍｏｌ）及びＤＭＢＡ（２．６１ｍｍｏｌ）の溶液とペプチジル樹脂を攪拌することによって行った。樹脂はＤＣＭ（３×５ｍｌ、１分）、ＤＭＦ（３×５ｍｌ、１分）、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム塩（０．５％、ＤＭＦ中、４×５ｍｌ、２分）及び最後にＤＭＦ（５×５ｍｌ、１分）で洗浄した。樹脂上での環化は、室温で２時間、ＤＭＦ（４ｍｌ）に溶かしたＰｙＢＯＰ（０．５２ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１．０４ｍｍｏｌ）の溶液を使用することによって行った。環化後、２％ヒドラジン一水和物ＤＭＦ中（３回、各回３分）の添加、次にＤＭＦ洗浄（４ｍｌ、６回、各回２分）によってＤｄｅ基を除去した。ＢＴＡと非保護ペプチジル樹脂の結合、及び樹脂からペプチドの切断は、材料及び方法中に記載したように実施した。産物はＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【０１４４】
表２は、合成したコンジュゲート、及びそれらの構造特性を列挙する。
【表２】
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【０１４５】
（例３．一般式Ｉの環状ペプチド模倣体の環の大きさは、それに基づくコンジュゲートの生物活性に影響を与える）
一般式ＩのＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体の環の大きさが、コンジュゲートの生物活性に影響を与えるかどうかを調べるために、異なる環の大きさを有する一般式Ｉの環状ペプチド模倣体に基づく様々な蛍光プローブ−コンジュゲートの活性を、材料及び方法中に記載したようにヒト卵巣癌細胞を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏ卵巣癌モデルとｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイの両方において試験した。
【０１４６】
ＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体の環の大きさは、環状化合物の２つの構造パラメーター、特に（ｉ）そのα−又は側鎖カルボキシル基によって骨格ＮＨと、且つそのα−又は側鎖アミノ基によってアスパラギン酸残基のα−カルボキシル基と連結したアミノ酸残基、即ち一般式Ｉ中のラジカルＡ１、及び（ｉｉ）骨格カルボニルと骨格ＮＨで架橋形成するラジカル、即ち一般式Ｉ中のラジカルＸを変更することによって変えた。使用した特異的アミノ酸残基は、それぞれ側鎖中に１〜４個のメチレン単位を有するジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、オルニチン（Ｏｒｎ）及びリシン（Ｌｙｓ）の残基であり、使用した異なるラジカルＸは、骨格ＮＨと一緒にそれぞれヒドラジン、ジアミノエタン、ジアミノプロパン、ジアミノブタン及びジアミノヘキサンの成分を形成し、Ａ１と骨格カルボニルで架橋形成する、ＮＨ、ＮＨ（ＣＨ２）２、ＮＨ（ＣＨ２）３、ＮＨ（ＣＨ２）４及びＮＨ（ＣＨ２）６であった。
【０１４７】
表３は、試験した様々な蛍光プローブ−コンジュゲート、及びそれらの生物活性を示す。示すように、試験したコンジュゲートの活性は１６原子から１８〜２０原子への環状ペプチド模倣体の環の大きさの増大と共に増大したが、しかし、それは環の大きさのさらなる増大と共に低下した。これらの結果は、アルギニン残基のα−アミノ基とラジカルＸを架橋形成する尿素結合によって環状化合物はさらに剛性になる一方で、最大１８〜２０原子を有するより大きな環はインテグリンとの結合に望ましい立体配座をとるほどさらに柔軟であることを示す。他方で、環状ペプチド模倣体の環の大きさが２０原子を超える場合、環状ペプチド模倣体は、インテグリンとの結合に望ましい立体配座をおそらくとることができない。
【表３】
0005773495.tif 000007
【０１４８】
（例４．一般式Ｉの環状ペプチド模倣体中のジアミン残基の大きさ及び構造は、それに基づくコンジュゲートの生物活性に影響を与える）
アミド結合によって一般式Ｉ中のアミノ酸残基Ａ１のα−又は側鎖カルボキシル基のいずれかと、且つ骨格カルボニルによってアルギニン残基のα−アミノ基と連結したジアミン残基の大きさ及び構造が、コンジュゲートの生物活性に影響を与えるかどうかを調べるために、前に定義した異なるジアミン残基を有する一般式Ｉの環状ペプチド模倣体に基づく様々なＢＴＡ−コンジュゲートの活性を、材料及び方法中に記載したようにヒト卵巣癌細胞を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏ卵巣癌モデルとｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイの両方において試験した。
【０１４９】
試験した具体的なコンジュゲートは、その中でアミノ酸残基Ａ１がオルニチンであり、ＢＴＡ分子がスペーサーなしでペプチド模倣体環のＮ末端と連結し、一般式Ｉ中のＸで示すラジカルがそれぞれ−ＮＨ（ＣＨ２）２〜４−、１，３−ジメチルベンゼン−１，３−ジイル又はピペリジン−１，４−ジイルである、コンジュゲート４、２４、２５、１５及び２３であった。
【０１５０】
表４は、試験した様々なコンジュゲート、及びそれらの生物活性を示す。示すように、コンジュゲート４の生物活性は、その中でアルキルジアミン残基がＡ１と骨格Ｃ＝Ｏで架橋形成するコンジュゲートの中で最高であり、これらのコンジュゲートの生物活性は、アルキル鎖の長さが増大すると低下することが示された。さらに、ペプチド模倣体環が剛性になるとき、アルキルジアミン残基以外のラジカルを使用したコンジュゲート１５及び２３の場合と同様に、生物活性は測定されず、このようなコンジュゲート中のペプチド模倣体環は、インテグリンとの相互作用に望ましくない立体配座をとることが示された。
【表４】
0005773495.tif 000008
【０１５１】
（例５．一般式Ｉの環状ペプチド模倣体とペイロード成分を連結するスペーサーは、コンジュゲートの生物活性に影響を与える）
この実験では、環状ペプチド模倣体のＮ末端、即ちアミノ酸残基Ａ１のα−又は側鎖アミノ基のいずれかと蛍光プローブ成分を連結する異なるスペーサーを有する、一般式Ｉの環状ペプチド模倣体に基づく様々な蛍光プローブ−コンジュゲートの生物活性を、材料及び方法中に記載したようにヒト卵巣癌細胞を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏ卵巣癌モデルとｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイの両方において試験した。使用した具体的なスペーサーは、様々な天然又は合成アミノ酸、特にグリシン、β−アラニン、フェニルアラニン、Ｄ−フェニルアラニン、１−ナフチルアラニン（１−Ｎａｌ）、Ｄ−１−ナフチルアラニン（Ｄ−１−Ｎａｌ）、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）及び３−（アミノメチル）安息香酸の成分であった。
【０１５２】
表５は、試験した様々なコンジュゲート、及びそれらの生物活性を示す。示すように、おそらくＢＴＡ分子は環状ペプチド模倣体とインテグリンの結合に干渉しないという事実によって、ＢＴＡ分子と環状ペプチド模倣体の間にスペーサーを有さないコンジュゲート１は高い生物活性を示した。それとは対照的に、その中でグリシン又はβ−アラニン成分をスペーサーとして使用し、環状ペプチド模倣体とＢＴＡ分子の間の距離が増大したコンジュゲートは、おそらく多量のＢＴＡ分子のためより低い生物活性を示した。スペーサーとしてＧＡＢＡ成分を使用した、即ち環状ペプチド模倣体とＢＴＡ分子の間の距離がさらに増大したコンジュゲート１１の場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方の結果が高い蛍光を示し、おそらくＧＡＢＡはインテグリンと結合するさらなる自由度をペプチド模倣体環に与えるほど十分長いが、しかし、ペプチド模倣体環を超えるＢＴＡ分子のフォールディングを引き起こすほど長すぎないことが示された。
【０１５３】
より小さい蛍光プローブ、即ちＦＩＴＣ又はダンシルを使用した場合、蛍光プローブ成分とペプチド模倣体環のＮ末端の間の距離は、コンジュゲートの生物活性に対して全く影響がなかった。
【０１５４】
その中でそれぞれフェニルアラニン及びＤ−フェニルアラニン成分をスペーサーとして使用したコンジュゲート２７及び２８は、おそらくインテグリンの疎水性ポケットとの相互作用をもたらすフェニルアラニンの芳香族側鎖のため、その中でグリシン成分をスペーサーとして使用したコンジュゲート９より活性があった。コンジュゲート２７のそれより高かったコンジュゲート２８の生物活性は、フェニルアラニンのＤ形状はＬ形状より良くインテグリンの疎水性ポケットに適合する可能性があり、したがって結合を改善することをさらに示し得る。
【０１５５】
その中でそれぞれ１，２−エチレンジアミン及び１，４−ジアミノブタンの残基をスペーサーとして使用し、且つ尿素結合が環状ペプチド模倣体とＢＴＡ成分の間で形成されるコンジュゲート３２及び３３は、コンジュゲート１０及び１１とほぼ同じ生物活性を有しており、尿素結合はアミド結合とほぼ同じ活性を有し、それがペプチド模倣体の立体配座に影響を与えないことが示された。
【表５】
0005773495.tif 000009
【０１５６】
（例６．その中で尿素成分がアルギニン残基のα−アミノ基によって形成された一般式Ｉの環状ペプチド模倣体に基づくコンジュゲートの生物活性は、その中でカルバメート成分が形成されたコンジュゲートのそれと同等である）
この実験では、その中で尿素成分がアルギニン残基のα−アミノ基によって形成された一般式Ｉの環状ペプチド模倣体に基づくコンジュゲート、特にＢＴＡ−コンジュゲートの生物活性を、その中でカルバメート成分が形成されたコンジュゲートのそれと比較した。
【０１５７】
試験した具体的なコンジュゲートは、その中で一般式Ｉ中のアミノ酸残基Ａ１がそれぞれジアミノプロピオン酸又はリシン残基であり、ＢＴＡ分子がスペーサーなしで環状ペプチド模倣体のＮ末端と連結し、且つ一般式Ｉ中のＸで示すラジカルが−ＮＨ（ＣＨ２）２−であるコンジュゲート１及び５、並びにＸで示すラジカルが−ＮＨ（ＣＨ２）２−の代わりに−Ｏ（ＣＨ２）２−である類似した構造を有するコンジュゲート７及び８であった。コンジュゲートの生物活性は、材料及び方法中に記載したようにヒト卵巣癌細胞を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイの両方中で、結腸癌モデル及び卵巣癌モデルにおいて試験した。
【０１５８】
卵巣癌モデルにおけるコンジュゲート１及び５の生物活性は表３中に記載する。表６中に示すように、その中で尿素成分がアルギニン残基のα−アミノ基によって形成されたコンジュゲートは、その中でカルバメート成分が形成された対応するコンジュゲートのそれと同等の生物活性を有しており、アルギニン残基のα−アミノ基によって形成された成分の性質は、コンジュゲートの生物活性に対して影響を与えないことが示された。
【表６】
0005773495.tif 000010
【０１５９】
（例７．その中でＢＴＡのタウリン残基が異なるジアミンによって置換された一般式Ｉの環状ペプチド模倣体に基づくＢＴＡ誘導体−コンジュゲートの生物活性は、対応する非誘導体化コンジュゲートのそれと同等である）
一般式Ｉの環状ペプチド模倣体に基づく４個の異なるバクテリオクロロフィル誘導体−コンジュゲート、本明細書で識別するコンジュゲート３７〜４０を合成し、ＭＬＳヒト卵巣癌細胞におけるそれらの生物活性を、インテグリン結合アッセイを使用して試験した。これらのコンジュゲートは、その中でＢＴＡ成分中のタウリン残基（−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｈ）が異なる求核試薬、特に−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２及び−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＨ３によって置換されたコンジュゲート１及び４に基づいた。
【０１６０】
これらのコンジュゲートの環状ペプチド模倣体は、前に記載した方法Ａに従い合成した。環化及びＤｄｅの除去後、ＤＭＦ中ＰｙＢｏＰ（２当量）、ＨＯＢｔ（２当量）、ＤＩＥＡ（６当量）によって活性化したＢｐｈｅｉｄｅ（２当量）の溶液をペプチジル樹脂に加え、アルゴン下で２時間振とうした。樹脂はＤＭＦで８回洗浄した（ニンヒドリン試験によってモニタリング）。ＤＭＦ中ジアミン（３０当量）の溶液をペプチジル樹脂に加え、アルゴン下で１時間振とうし、次にＤＭＦで洗浄した。材料及び方法中に記載したように樹脂からペプチドを切断し、粗製コンジュゲートはＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。表７中に示すように、これら全てのコンジュゲートの生物活性は類似しており、これらの場合において、アミノ基は生物活性に対して全く影響がないこと、及びその挙動はタウリン中のスルホネートのそれとほぼ同じであることが示された。
【表７】
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【０１６１】
（例８．一般式ＩＩの環状ペプチド模倣体の環の大きさは、それに基づくコンジュゲートの生物活性に影響を与える）
一般式ＩＩの環状ペプチド模倣体の環の大きさが、コンジュゲートの生物活性に影響を与えるかどうかを調べるために、異なるアミノ酸残基Ａ３ではなく同じアミノ酸残基Ａ１（Ｌｙｓ）及びＡ２（Ｐｈｅ）、特にそれぞれ側鎖中に１〜４個のメチレン単位を有するＤａｐ、Ｄａｂ、Ｏｒｎ及びＬｙｓを有する一般式ＩＩの環状ペプチド模倣体に基づく様々なＢＴＡ−コンジュゲートの活性を、材料及び方法中に記載したようにヒト卵巣癌細胞を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏ卵巣癌モデルとｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイの両方において試験した。
【０１６２】
表８は、試験した様々なＢＴＡ−コンジュゲート、及びそれらの生物活性を示す。示すように、試験したコンジュゲートの生物活性は、２０原子から２３原子への環状ペプチド模倣体の環の大きさの増大と共に低下し、２０原子を超える環の大きさはインテグリンの結合部位に適合しないことが示された。
【表８】
0005773495.tif 000012
【０１６３】
（例９．一般式ＩＩの環状ペプチド模倣体中のアミノ酸残基Ａ２の特性は、それに基づくコンジュゲートの生物活性に影響を与える）
そのα−アミノ基によって骨格Ｃ＝Ｏと、且つそのα−カルボキシル基によってアミノ酸残基Ａ３と連結した、一般式ＩＩの環状ペプチド模倣体中のアミノ酸残基Ａ２の大きさ及び構造が、コンジュゲートの生物活性に影響を与えるかどうかを調べるために、異なるアミノ酸残基Ａ２ではなく同じアミノ酸残基Ａ１（Ｌｙｓ）及びＡ３（Ｄａｐ）、特にＰｈｅ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ及びＡｓｐを有する一般式ＩＩの環状ペプチド模倣体に基づく様々なＢＴＡ−コンジュゲートの活性を、材料及び方法中に記載したようにヒト卵巣癌細胞を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏ卵巣癌モデルとｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイの両方において試験した。
【０１６４】
表９は、試験した様々なＢＴＡ−コンジュゲート、及びそれらの生物活性を示す。示すように、疎水性アミノ酸残基Ａ２を有するコンジュゲート４１、４２及び４３の生物活性は、おそらくインテグリンの結合部位中の疎水性ポケットとの疎水性相互作用のため、より極性が高いコンジュゲート４４及び４５のそれより高かった。コンジュゲート４３はコンジュゲート４１より活性が低かったという事実は前者の形状が原因である可能性があり、Ｄ形状は疎水性ポケットに完全には適合しないこと示唆した。
【表９】
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【０１６５】
（例１０．ヒトαＶβ３インテグリンと本発明の様々なＢＴＡ−コンジュゲートの競合結合）
この試験では、ヒトαＶβ３インテグリンと本発明の様々なＢＴＡ−コンジュゲートの競合結合レベル、即ちＩＣ５０を、材料及び方法中に記載したようにビオチン−ｃ［ＲＧＤｆＫ］に対して試験した。試験した具体的なコンジュゲートは、コンジュゲート１、４、５、７、１１及び２８（一般式ＩのＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体に基づく、例１参照）、並びにコンジュゲート４１（一般式ＩＩのＲＧＤ含有環状ペプチド模倣体に基づく、例２参照）であり、これらのコンジュゲートに関して測定したＩＣ５０値は表１０中に示す。
【０１６６】
示すように、コンジュゲート１、７、２８及び４１は最も低いＩＣ５０（１０−４Ｍ）、即ち最も高い生物活性を示し、コンジュゲート４のＩＣ５０は若干高く（３×１０−４Ｍ）、コンジュゲート５及び１１のＩＣ５０は最も高かった（３×１０−３Ｍ）。
【表１０】
0005773495.tif 000014
【０１６７】
（例１１．コンジュゲート１、４及び４１は、ＭＤＡ壊死性腫瘍の壊死性コア中に蓄積する）
この試験では、腫瘍によって生じた蛍光シグナル、及びこれらのコンジュゲートによって生じた蛍光シグナルによってモニタリングした乳癌モデルの同所性原発性病変におけるコンジュゲート１、４及び４１の特異的蓄積パターンを調べた。経時的な腫瘍中のコンジュゲートの局在も決定した。動物は材料及び方法中に記載したように治療し、腫瘍細胞とコンジュゲート１、４及び４１の両方の蛍光を、ＩＶＩＳ（登録商標）１００イメージングシステムによって第１〜７日にモニタリングした。
【０１６８】
図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃは、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ（登録商標）システムを使用した、ＣＤ−１ヌードメスマウスの乳房中の同所性ヒト乳ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ原発性巨大腫瘍における、それぞれコンジュゲート１、４及び４１の蓄積パターンを示す。全動物のイメージを、励起フィルター５００〜５５０ｎｍ及び蛍光フィルター５７５〜６５０ｎｍを含むフィルターセットを使用して同時に記録した。組織自己蛍光の控除用のバックグラウンドフィルターセット、励起フィルター４６０〜４９０ｎｍ及び蛍光フィルター５７５〜６５０ｎｍ。光増感剤イメージングメインフィルターセット、励起フィルター６６５〜６９５ｎｍ、蛍光フィルター８１０〜８７５ｎｍ。
【０１６９】
全てのコンジュゲートは肝臓から完全に除去される一方で腫瘍中に蓄積し、第３日以降からフォローアップ期間の最後、注射後第７日まで選択的腫瘍イメージング、及びその後の非常に遅いクリアランスを得た。腫瘍の大きさ及び位置は、ｉｎ  ｖｉｖｏの赤色の全身イメージによって見られるように実験を通じて変わらなかった。図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃ中に示すように、注射後第６日でのこれらのコンジュゲートの局在は腫瘍の壊死領域中であった。
【０１７０】
（例１２．前立腺癌細胞におけるコンジュゲート１、４及び４１の生物活性）
この試験では、αｖβ３インテグリンを発現するＬＮＣａＰ前立腺癌細胞におけるコンジュゲート１、４及び４１の生物活性を調べた。前に示したように、これらの具体的なコンジュゲートは、卵巣癌、結腸癌及び乳癌細胞において活性を示した。
【０１７１】
移植腫瘍中のコンジュゲートの蓄積を、Ｘｅｎｏｇｒａｐｈ  ＩＶＩＳ（登録商標）システムを使用して注射後第８、１１、１４、２４及び４８時間でモニタリングし、図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃ中に示すように、それぞれコンジュゲート１、４及び４１を参照すると、注射後８〜１１〜１４時間で腫瘍領域において最高蛍光レベルを観察し、コンジュゲートはコンジュゲート１及び４の場合最大４８時間、及びコンジュゲート４１の場合最大２４時間腫瘍中に残った。さらに示すように、前立腺腫瘍中と卵巣腫瘍中のこれらのコンジュゲートの蓄積プロファイルはほぼ同じであった。
【０１７２】
（例１３．ラットにおけるコンジュゲート１、４及び４１の毒性）
コンジュゲート１、４及び４１の毒性試験を、ウィスターラット（５匹のメス、１７０〜１９０ｇ、及び５匹のオス、２８８〜３１５ｇ）で実施した。様々なコンジュゲートを５０ｍｇ／ｋｇの用量で、１〜２分間尾静脈に注射した。動物は生存し、如何なる挙動又は運動性の問題も示さなかった。５日後、これらの動物の肝臓又は腎臓中で壊死又は炎症の証拠は見られず、これらのコンジュゲートは試験した用量において毒性ではないことを示唆した。
【化４】
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（参考文献）
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【配列表】
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