(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オオムギ植物体またはその一部から調製される飲料であって、前記飲料は、含むＴ２Ｎポテンシャルが、オオムギ栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製した飲料のＴ２Ｎポテンシャルと比較して５０％未満であり、前記オオムギ植物体またはその一部が、機能的なリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）−１酵素の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、機能的なＬＯＸ−２酵素の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異とを含む飲料。
【請求項２】
モルト飲料である、請求項１に記載の飲料。
【請求項３】
ビールである、請求項１から２のいずれか一項に記載の飲料。
【請求項４】
オオムギビールである、請求項１に記載の飲料。
【請求項５】
３７℃で８週間にわたる保存後において、オオムギの栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製した飲料と比較して、５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３５％未満、なおより好ましくは３０％未満、さらにより好ましくは２５％未満の遊離Ｔ２Ｎを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の飲料。
【請求項６】
機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異とを含む、オオムギ植物体またはその一部。
【請求項７】
前記植物体のＬＯＸ−１をコードする遺伝子が、未熟終止コドンを含む、請求項６に記載のオオムギ植物体またはその一部。
【請求項８】
前記植物体のＬＯＸ−１をコードする遺伝子が、ナンセンスコドンを含み、前記コドンが、配列番号１２の塩基番号３５７２〜３５７４に対応する、請求項７に記載のオオムギ植物体またはその一部。
【請求項９】
前記植物体のＬＯＸ−２をコードする遺伝子が、未熟終止コドンを含む、請求項６から８のいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
【請求項１０】
前記植物体のＬＯＸ−２をコードする遺伝子が、配列番号１の２６８９位のヌクレオチドにおいて終止コドンの形成をもたらす変異を有する、請求項９に記載のオオムギ植物体またはその一部。
【請求項１１】
前記植物体が「オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  Ｌ．）：Ａ６８９系統」と称し、ＰＴＡ−９６４０の寄託番号でＡＴＣＣへと寄託された植物体と、それらの子孫植物体とからなる群から選択される、請求項６から９のいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
【請求項１２】
請求項６から１１のいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部から調製される、請求項１から５のいずれか一項に記載の飲料。
【請求項１３】
加工されたオオムギ植物体またはその一部を含む、植物生成物であって、前記オオムギ植物体が請求項６から１１のいずれかに記載のオオムギ植物体である、植物生成物。
【請求項１４】
前記植物生成物が、加工されたオオムギ植物体またはその一部を含む、モルト組成物であり、前記オオムギ植物体が、請求項６から１１のいずれかに記載のオオムギ植物体である、請求項１３に記載の植物生成物。
【請求項１５】
請求項６から１１のいずれかに記載のオオムギ植物体またはその一部を用いるか、あるいは前記オオムギ植物体もしくはその一部、またはこれらの混合物から調製されたモルト組成物を用いて調製されたウォート組成物である、請求項１３に記載の植物生成物。
【請求項１６】
前記ウォート組成物がオオムギのウォートである、請求項１５に記載の植物生成物。
【請求項１７】
請求項１４から１６のいずれか一項に記載の植物生成物から調製される、請求項１から５のいずれかに記載の飲料。
【請求項１８】
オオムギシロップ、モルトシロップ、オオムギ抽出物、およびモルト抽出物からなる群から選択される、請求項１３に記載の植物生成物。
【請求項１９】
Ｔ２Ｎポテンシャルレベルが極めて低い飲料を生成させる方法であって、
（ｉ）請求項６から１１のいずれかに記載のオオムギ植物体またはその一部を含む組成物を調製するステップと；
（ｉｉ）（ｉ）の組成物を飲料へと加工するステップと
を含み、これらにより、Ｔ２Ｎポテンシャルレベルが極めて低い飲料を得る方法。
【請求項２０】
遊離Ｔ２Ｎレベルが極めて低いモルト組成物を生成させる方法であって、
（ｉ）請求項６から１１のいずれか一項に記載のオオムギ植物体の穀粒を供給するステップと；
（ｉｉ）前記穀粒をスティーピングするステップと；
（ｉｉｉ）前記スティーピングされた穀粒を、所定の条件下で発芽させるステップと；
（ｉｖ）発芽した穀粒を加熱処理するステップと
を含み、これらにより、遊離Ｔ２Ｎレベルが極めて低いモルト組成物を生成させる方法。
【請求項２１】
ＡＴＣＣの受託番号がＰＴＡ−５４８７であるオオムギの変異体Ｄ１１２から同じ方法で調製したモルト組成物中における遊離Ｔ２Ｎと比較して、前記遊離Ｔ２Ｎの極めて低いレベルが、最大で５０％のＴ２Ｎである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異とを含むオオムギ植物体を調製する方法であって、
（ｉ）機能的ＬＯＸ−１酵素を完全に喪失させたオオムギ植物体またはその一部を供給するステップと；
（ｉｉ）前記オオムギ植物体、ならびに／または前記オオムギ植物体に由来するオオムギ細胞、および／もしくはオオムギ組織、および／もしくはオオムギ穀粒、および／もしくはオオムギ胚芽を変異誘発し、これにより、Ｍ０世代のオオムギを得るステップと；
（ｉｉｉ）前記変異誘発されたオオムギ植物体、オオムギ穀粒、および／またはオオムギ胚芽を、少なくとも２世代にわたり育種し、これにより、Ｍｘ（ここで、ｘは、≧２の整数である）世代のオオムギ植物体を得るステップと；
（ｉｖ）前記Ｍｘ世代のオオムギ植物体から胚芽を得るステップと；
（ｖ）前記胚芽を発芽させるステップと；
（ｖｉ）前記発芽させた胚芽またはその一部におけるＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性を決定するステップと；
（ｖｉｉ）前記発芽させた胚芽におけるＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性を完全に喪失させた植物体を選択するステップと；
（ｖｉｉｉ）ＬＯＸ−１をコードする遺伝子における、およびＬＯＸ−２をコードする遺伝子における変異の存在または不在を決定するステップと；
（ｉｘ）ＬＯＸ−１をコードする遺伝子における、およびＬＯＸ−２をコードする遺伝子における変異を保有する植物体を選択するステップと
を含み、これらにより、機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異とを含むオオムギ植物体を得る、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願で引用されるすべての特許参考文献および非特許参考文献は、それらの全体において、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、植物体のバイオテクノロジーにおける進歩に関し、２つのリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）酵素であるＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２の合成を欠損させたオオムギ植物体およびそれらの生成物の開示を可能とする（これにより、多様に用いられる新規の原料を提供する）。前記原料は、例えば、飲料を生産するのに用いる場合、蓄積させる異臭化合物ｔｒａｎｓ−２−ノネナール（Ｔ２Ｎ）レベルが顕著に低い（含有するＴ２Ｎポテンシャルレベルが低くとどめられるというさらなる利益を有する）、より示差的で風味の安定したビールを新規に製造する能力の配備を容易にする。
【背景技術】
【０００３】
大部分のビールは、世界の大部分で生育している単子葉作物であるオオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ，  Ｌ．）に基づいて生産される。オオムギを繁殖させるのは、ビールなど、産業製品の供給源としての経済的重要性のためだけでなく、また、動物試料の供給源としての経済的重要性のためでもある。
【０００４】
残念ながら、所与の遺伝子および対応するタンパク質の発現を完全に欠くトランスジェニックのオオムギ植物体を調製する方法は与えられていない。オオムギの場合一般に、アンチセンス法の適用を用いて、タンパク質の一部をやはり発現するトランスジェニック植物を生成することができる（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓら、１９９８年；Ｓｔａｈｌら、２００４年；Ｈａｎｓｅｎら、２００７年を参照されたい）。また、オオムギ植物体におけるキメラＲＮＡ／ＤＮＡまたは部位指向変異誘発を用いて特異的な変異を調製するのに有効な方法も開発されていない。実際に、オオムギにおけるオリゴヌクレオチド指向の遺伝子標的化の成功例は、１つも公表されていない。ＩｉｄａおよびＴｅｒａｄａ（２００５年）は、トウモロコシ、タバコ、およびコメにおいて、オリゴヌクレオチド指向の遺伝子標的化が追及されている（しかし、オオムギにおいてではなく、すべての場合において、ＡＬＳ遺伝子が標的とされている）ことに言及している。研究の結論の一部は、適切な改変を加えた戦略が、ＡＬＳ遺伝子など、直接的に選択可能な遺伝子以外の遺伝子に適用可能であり得るかどうかは、いまだに分かっていないということであった。ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いる標的化変異誘発は、基礎的な植物生物学を研究し、または作物植物を改変するのに将来使用し得る別のツールを表す（Ｄｕｒａｉら、２００５年；ＴｚｆｉｒａおよびＷｈｉｔｅ、２００５年；Ｋｕｍａｒら、２００６年）。この場合もまた、オオムギでは、変異誘発が追及されていないか、または有効に適用されていない。
【０００５】
しかし、アジドナトリウム（ＮａＮ３；図１）で処理することによるなど、化学的処理または照射を用いる無作為的な変異誘発により、オオムギの変異体を調製することができる。例は、低フィチン酸の変異体を同定するために、ＮａＮ３でオオムギ穀粒を変異誘発させ、高レベルの遊離リン酸を有するものを求めたそれらのスクリーニングである（ＲａｓｍｕｓｓｅｎおよびＨａｔｚａｃｋ、１９９８年；スクリーニングされた２，０００個の穀粒から、計１０個の変異体が同定された）。しかし、ＮａＮ３処理後における特定の変異体の同定は、有効なスクリーニング法を必要とし、常に成功することからは遠い。
【０００６】
１９７０年に、ビールに段ボール様の風味をもたらす分子が単離され、揮発性のＣ９アルケナールであるＴ２Ｎとして同定された（ＪａｍｉｅｓｏｎおよびＧｈｅｌｕｗｅ、１９７０年）。ヒトにおけるＴ２Ｎの風味閾値レベルは極めて低く、既に、約０．７ｎＭまたは０．１ｐｐｂであると同定されている（Ｍｅｉｌｇａａｒｄ、１９７５年）ので、微小なレベルであっても、アルデヒドを伴う製品は、その異臭風味のために、劣化していると見なされる。しかし、新鮮なビールでは一般に、Ｔ２Ｎレベルが極めて低く（Ｌｅｒｍｕｓｉｅａｕら、１９９９年）、このため、保存時において、Ｔ２Ｎ付加物から遊離Ｔ２Ｎが放出される可能性があると推測されている（Ｎｙｂｏｒｇら、１９９９年）。この考えは、ウォート中におけるＴ２Ｎポテンシャルが、製品保存後におけるＴ２Ｎの形成と相関するという、その後の観察により裏付けられた（Ｋｕｒｏｄａら、２００５年）。
【０００７】
オオムギの穀粒は、ＬＯＸ−１、ＬＯＸ−２、およびＬＯＸ−３として公知である３つのＬＯＸ酵素を含有する（ｖａｎ  Ｍｅｃｈｅｌｅｎら、１９９９年）。ＬＯＸ−１は、リノール酸からの、９−ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸（９−ＨＰＯＤＥ；ＬＯＸ経路の部分的な概要については、図２を参照されたい）（Ｔ２Ｎおよびトリヒドロキシオクタデカン酸（ＴＨＡと略記する）の両方の前駆体）の形成を触媒する。ＬＯＸ−２は、１３−ＨＰＯＤＥへのリノール酸の転換を主に触媒し、１３−ＨＰＯＤＥは、風味閾値が約０．４ｐｐｍと高いＣ６アルデヒドであるヘキセナール（ｈｅｘａｎａｌ）へとさらに代謝される（Ｍｅｉｌｇａａｒｄ、前出）。ＬＯＸ−３の作用は、２つの理由のために：オオムギ穀粒内の対応する遺伝子の発現レベルが極めて低く、ＬＯＸ−３の生成物特異性がいまだ不明であるために、本出願に関しては、おそらく関与的でない。
【０００８】
まず、ＬＯＸ−１により触媒されてリノール酸が９−ＨＰＯＤＥへと転換され、次いで、９−ヒドロペルオキシドリアーゼの作用を介して９−ＨＰＯＤＥが切断されることを伴う生化学経路を介してＴ２Ｎが生成されることに、複数の報告が言及している（例えば、Ｋｕｒｏｄａら、２００３年、２００５年；Ｎｏｏｄｅｒｍｅｅｒら、２００１年を参照されたい）ことは、前述のデータを裏付ける。
【０００９】
モルト中における全体的なＬＯＸ活性と、ウォートのノネナールポテンシャルとの間には相関が見られないと考えられている。しかし、ＬＯＸ−１活性と、ウォートのＴ２Ｎポテンシャルとの間の著明な相関については推測がなされており、これは主に、ウォート中におけるＴ２Ｎポテンシャルの形成に関して、ＬＯＸ−２活性がそれほど重要でないと考えられていたためである（Ｋｕｒｏｄａら、２００５年）。
【００１０】
上記に述べたＬＯＸ経路の一部を、図２に示すが、ここでは、リノール酸からＴ２Ｎへの生化学反応に焦点が当てられている。ＬＯＸ−１酵素の主要な活性は、リノール酸が、Ｔ２Ｎの形成をもたらす生化学経路の上流の代謝物である９−ＨＰＯＤＥへと転換されることに関する。これに対し、ＬＯＸ−２の主要な活性は、リノール酸が、１３−ＨＰＯＤＥへと転換されることに関し、これは、前述のＴ２Ｎへの生化学経路とは別個である。ＬＯＸ−１酵素およびＬＯＸ−２酵素が、基質としてリノール酸を用い得ることは注目に値するが、これに対応する経路はＴ２Ｎの形成をもたらさないので、この活性は、本出願の範囲外にある。
【００１１】
ＬＯＸ−１は、モルト中における主要なＬＯＸ活性に寄与すると考えられている（例えば、Ｋｕｒｏｄａら、２００３年を参照されたい）。
【００１２】
ＬＯＸ−１活性の低下または欠如を特徴とする、複数の異なるオオムギ植物体が開発されている。例えば、Ｄｏｕｍａ，Ａ．Ｃ．らによるＰＣＴ出願第ＷＯ０２／０５３７２１号では、ＬＯＸ−１活性が低いオオムギ穀粒およびオオムギ植物体が開示された。そして、Ｂｒｅｄｄａｍ，Ｋ．らによるＷＯ２００５／０８７９３４では、ＬＯＸ−１活性を欠損させた、２つの異なるオオムギの変異体（スプライス変異体、および未熟翻訳終止コドンを有する変異体）が注目された。これらは、図１に示す通り、変異した植物体を繁殖させ、スクリーニングした後で同定された。上述の変異体が、ＮａＮ３により変異誘発されたオオムギをスクリーニングすることにより同定されたのに対し、Ｈｉｒｏｔａ，Ｎ．らは、ＥＰ１６０９８６６において、オオムギ在来種のコレクションをスクリーニングすることにより同定された、ＬＯＸ−１活性を示さないオオムギ植物体について記載した。
【００１３】
合成するＬＯＸレベルが低い、変異した植物体については、複数の例が公知である。しかし、複数のリポキシゲナーゼ活性を欠損させたオオムギ植物体、例えば、ＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２の両方の活性を欠損させたオオムギ植物体は、記載されていない。植物体の遺伝子操作を可能とする方法は、植物体の特定の種類に特異的であることが多く、したがって（少数のコメ植物体、ダイズ植物体、またはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属の植物体は、含むＬＯＸレベルが低いことが公知であるが）、このような植物体を調製する方法を、ＬＯＸ活性が低いか、またはＬＯＸ活性が見られないオオムギ植物体を作製するのに用いることはできない。加えて、１つの植物種のＬＯＸ変異体は、別の植物種のＬＯＸ変異体と比較して、異なる特性を示し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ウォートは、ビールなど、モルトベースの飲料を作製するのに重要な液体の複合体である（図３は、ビールの全生産工程についての概要を示す）。ＬＯＸ−１活性を欠損させたオオムギ植物体から生成されるウォートは、実際には、かなりのレベルのＴ２Ｎポテンシャルを含むことを特徴とするが、前記レベルは、野生型オオムギから調製されたウォートの場合より低い。前記ウォート中のポテンシャルは、保存後におけるビール中において形成されるＴ２Ｎと相関する（Ｋｕｒｏｄａら、２００５年）ので、これにより、Ｔ２Ｎポテンシャルレベルが実質的に低いウォートを生成させるのに有用なオオムギ植物体が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
加熱処理によりＬＯＸ活性を低下させる方法が記載されている。しかし、加熱処理は一般に、モルト化時および／またはウォートの調製時においてなされ、このため、オオムギ内では、加熱処理を行うまで、ＬＯＸ活性を有する生成物の蓄積が可能となる。オオムギの解析により、モルト化の前であっても、オオムギ内には、著明量のＬＯＸ活性を有する生成物が存在することが明らかとなった（ＷａｃｋｅｒｂａｕｅｒおよびＭｅｙｎａ、２００２年）。
【００１６】
本発明は、ＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性を欠損させたオオムギ植物体を提供し、前記オオムギ植物体が、複数の重大で驚くべき利点を有することを開示する。本明細書の上記で述べた通り、Ｋｕｒｏｄａら（前出）は、モルト中におけるＬＯＸ活性と、ウォート中におけるＴ２Ｎポテンシャルとの相関の欠如について記載し、これを、ＬＯＸ−２活性が存在するためであると考えた。したがって、Ｋｕｒｏｄａら（２００５年）は、Ｔ２Ｎポテンシャルの形成に関して、ＬＯＸ−２の役割は重要でないと仮定した。
【００１７】
醸造研究者は、何が遊離Ｔ２ＮおよびＴ２Ｎポテンシャルの形成を決定付けているのかを理解することに努力してきた。したがって、本発明が実験的証拠を提供して、ＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性の両方を欠損させたオオムギ植物体を用いると、Ｔ２Ｎポテンシャルレベルが極めて低いウォートを生成させるのに有益な効果が得られることを開示すれば、それは予想外のことであり、おそらく当惑を招くことである。また、ＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性の両方を欠損させたオオムギ植物体から調製されたウォート中における遊離Ｔ２Ｎレベルも、ヌルＬＯＸ−１オオムギから調製されたウォートより低いことが判明した。
【００１８】
オオムギ植物体またはその一部から調製される飲料であって、含むＴ２Ｎポテンシャルレベルが極めて低い（前記オオムギ植物体またはその一部が、機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失など、ＬＯＸ−１活性の機能の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、活性ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失など、ＬＯＸ−２活性の機能の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異とを含む）飲料を提供することが、本発明の１つの目的である。
【００１９】
本発明はまた、本発明の飲料を調製するのに有用なオオムギ植物体を提供することも目的とする。したがって、本発明は、機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失など、ＬＯＸ−１活性の機能の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失など、ＬＯＸ−２活性の機能の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異とを含む、オオムギ植物体またはそれらの一部の作製について記載する。
【００２０】
加えて、本発明は、機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失など、ＬＯＸ−１活性の機能の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失など、ＬＯＸ−２活性の機能の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異とを含む、加工オオムギ植物体またはその一部を含む植物生成物も提供する。限定せずに述べると、前述の植物生成物は、例えば、モルト組成物の場合もあり、ウォート組成物の場合もあり、飲料（モルトベースの飲料、例えば、ビール、または非アルコール性のモルトベースの飲料）の場合もあり、オオムギベースの飲料の場合もあり、モルトおよびオオムギ、ならびに、場合によって、他の成分の混合物に基づく飲料でもあり得る。植物生成物はまた、オオムギシロップ、モルトシロップ、オオムギ抽出物、およびモルト抽出物でもあり得る。
【００２１】
さらに、本発明はまた、Ｔ２Ｎポテンシャルレベルが極めて低いことを特徴とする飲料を作製する方法であって、
（ｉ）機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失など、ＬＯＸ−１活性の機能の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、活性ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失など、機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異とを含む、オオムギ植物体またはその一部を含む組成物を調製するステップと；
（ｉｉ）（ｉ）の組成物を飲料へと加工するステップと
を含み、これらにより、Ｔ２Ｎポテンシャルレベルが極めて低いことを特徴とする飲料を得る方法にも関する。
【００２２】
本発明はまた、（ＬＯＸ−１活性の機能の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、ＬＯＸ−２活性の機能の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異とを含むことに加え）１または複数のさらなる有用な変異も含むオオムギ植物体にも関する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
オオムギ植物体またはその一部から調製される飲料であって、前記飲料は、含むＴ２Ｎポテンシャルレベルが極めて低く、前記オオムギ植物体またはその一部が、機能的なリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）−１酵素の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、機能的なＬＯＸ−２酵素の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異とを含む飲料。
（項目２）
モルト飲料である、項目１に記載の飲料。
（項目３）
発酵モルト飲料である、項目１および２のいずれか一項に記載の飲料。
（項目４）
ビールである、項目１から３のいずれか一項に記載の飲料。
（項目５）
オオムギビールである、項目１および４のいずれか一項に記載の飲料。
（項目６）
非アルコールモルト飲料である、項目１から３のいずれか一項に記載の飲料。
（項目７）
前記飲料が、オオムギの栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製した飲料のＴ２Ｎポテンシャルと比較して、５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３５％未満のＴ２Ｎポテンシャルを含む、項目１から６のいずれか一項に記載の飲料。
（項目８）
前記飲料が、ヌルＬＯＸ−１オオムギ変異体から同じ方法で調製した飲料と比較して、７０％未満、好ましくは６０％未満のＴ２Ｎポテンシャルを含む、項目１から７のいずれか一項に記載の飲料。
（項目９）
３７℃で８週間にわたる保存後において、オオムギの栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製した飲料と比較して、５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３５％未満、なおより好ましくは３０％未満、さらにより好ましくは２５％未満の遊離Ｔ２Ｎを含む、項目１から８のいずれか一項に記載の飲料。
（項目１０）
２〜４ｐｐｍの範囲内の亜硫酸塩の存在下、３７℃で２週間にわたる保存後において、オオムギの栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製した飲料と比較して、５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３５％未満の遊離Ｔ２Ｎを含む、項目１から９のいずれか一項に記載の飲料。
（項目１１）
３７℃で８週間にわたる保存後において、ヌルＬＯＸ−１オオムギから同じ方法で調製した飲料と比較して、７０％未満、好ましくは６０％未満、なおより好ましくは５５％未満の遊離Ｔ２Ｎを含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の飲料。
（項目１２）
３７℃で２週間にわたる保存後において、ヌルＬＯＸ−１オオムギから同じ方法で調製した飲料と比較して、８０％未満、好ましくは７５％未満の遊離Ｔ２Ｎを含む、項目１から１１のいずれか一項に記載の飲料。
（項目１３）
３７℃で２週間にわたる保存後において、熟練の試飲パネルが評価し、０を「なし」として５を「極めて強い」とする０〜５段階でスコア付けする場合の、栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製した飲料の紙の風味についてのスコアより、少なくとも０．５、好ましくは少なくとも０．７、より好ましくは少なくとも１．０低い紙の風味についてのスコアを有する、項目１から１２のいずれか一項に記載の飲料。
（項目１４）
前記保存が、２〜６ｐｐｍの範囲内の亜硫酸塩の存在下で実施される、項目９から１
３のいずれか一項に記載の飲料。
（項目１５）
機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異とを含む、オオムギ植物体またはその一部。
（項目１６）
前記植物体のＬＯＸ−１をコードする遺伝子が、未熟終止コドンを含む、項目１５に記載のオオムギ植物体またはその一部。
（項目１７）
前記植物体のＬＯＸ−１をコードする遺伝子が、開始コドンの最大で７０５コドン下流、好ましくは最大で６６５コドン下流に位置する未熟終止コドンを含む、項目１５から１６のいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
（項目１８）
前記植物体のＬＯＸ−１をコードする遺伝子が、ナンセンスコドンを含み、前記コドンが、ＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号２の塩基番号３５７２〜３５７４に対応する、項目１６に記載のオオムギ植物体またはその一部。
（項目１９）
前記植物体のＬＯＸ−２をコードする遺伝子が、未熟終止コドンを含む、項目１５から１８のいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
（項目２０）
前記植物体のＬＯＸ−２をコードする遺伝子が、開始コドンの最大で７０７コドン下流、好ましくは最大で６８４コドン下流に位置する未熟終止コドンを含む、項目１５から１９のいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
（項目２１）
前記植物体のＬＯＸ−２をコードする遺伝子が、配列番号１の２６８９位のヌクレオチドにおいて変異を有し、終止コドンの形成をもたらす、項目２０に記載のオオムギ植物体またはその一部。
（項目２２）
「オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  Ｌ．）：Ａ６８９系統」と称し、ＰＴＡ−９６４０の寄託番号でＡＴＣＣへと寄託された植物体と、それらの子孫植物体とからなる群から選択される、項目１５から２１のいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
（項目２３）
前記オオムギ植物体の前記一部が、穀粒（複数可）である、項目１５から２２のいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
（項目２４）
（ｉ）ＬＯＸ−１活性を完全に喪失させたオオムギ植物体またはその一部を供給するステップと；
（ｉｉ）前記オオムギ植物体、ならびに／または前記オオムギ植物体に由来するオオムギ細胞、および／もしくはオオムギ組織、および／もしくはオオムギ穀粒、および／もしくはオオムギ胚芽を変異誘発し、これにより、Ｍ０世代のオオムギを得るステップと；
（ｉｉｉ）前記変異誘発されたオオムギ植物体、オオムギ穀粒、および／またはオオムギ胚芽を、少なくとも２世代にわたり育種し、これにより、Ｍｘ（ここで、ｘは、≧２の整数である）世代のオオムギ植物体を得るステップと；
（ｉｖ）前記Ｍｘ世代のオオムギ植物体から胚芽を得るステップと；
（ｖ）前記胚芽を発芽させるステップと；
（ｖｉ）前記発芽させた胚芽またはその一部におけるＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性を決定するステップと；
（ｖｉｉ）前記発芽させた胚芽におけるＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性を完全に喪失させた植物体を選択するステップと；
（ｖｉｉｉ）ＬＯＸ−１をコードする遺伝子における、およびＬＯＸ−２をコードする遺伝子における変異の存在または不在を決定するステップと；
（ｉｘ）ＬＯＸ−１をコードする遺伝子における、およびＬＯＸ−２をコードする遺伝子における変異を保有する植物体を選択するステップと
を含み、これらにより、ＬＯＸ−１をコードする遺伝子における、およびＬＯＸ−２をコードする遺伝子における変異を保有し、ＬＯＸ−１活性の完全な喪失およびＬＯＸ−２活性の完全な喪失を引き起こすオオムギ植物体を得る方法により作製されるか、またはこの方法により作製される植物体の子孫である、項目１５から２３のいずれかに記載のオオムギ植物体またはその一部。
（項目２５）
項目１５から２４のいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部から調製される、項目１から１４のいずれか一項に記載の飲料。
（項目２６）
項目１５から２４のいずれかに記載のオオムギ植物体またはその一部を含む組成物。
（項目２７）
項目１５から２４のいずれかに記載のオオムギ植物体である加工オオムギ植物体またはその一部を含む、植物生成物。
（項目２８）
項目１５から２４のいずれかに記載のオオムギ植物体である加工オオムギ植物体またはその一部を含む、モルト組成物である、項目２７に記載の植物生成物。
（項目２９）
前記オオムギ植物体の前記一部が、穀粒（複数可）である、項目２８に記載のモルト組成物。
（項目３０）
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）の受託番号がＰＴＡ−５４８７であるオオムギの変異体Ｄ１１２から同じ方法で調製したモルト組成物と比較して、最大で６０％の遊離Ｔ２Ｎを含む、項目２８から２９のいずれかに記載のモルト組成物。
（項目３１）
栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製したモルト組成物と比較して３０％未満、より好ましくは２０％未満、なおより好ましくは１０％未満の遊離Ｔ２Ｎを含む、項目２０から２２のいずれかに記載のモルト組成物。
（項目３２）
項目１５から２４のいずれかに記載のオオムギ植物体またはその一部を用いるか、あるいは前記オオムギ植物体もしくはその一部、またはこれらの混合物から調製されたモルト組成物を用いて調製されたウォート組成物である、項目２７に記載の植物生成物。
（項目３３）
前記植物体の前記一部が、穀粒（複数可）である、項目３２に記載のウォート組成物。
（項目３４）
前記ウォート組成物がオオムギのウォートである、項目３２および３３のいずれか一項に記載のウォート組成物。
（項目３５）
野生型オオムギから同じ方法で調製したウォート組成物と比較して、５０％未満、より好ましくは４０％未満、なおより好ましくは３０％未満の遊離Ｔ２Ｎを含む、項目３２から３４のいずれか一項に記載のウォート組成物。
（項目３６）
野生型オオムギから同じ方法で調製したウォート組成物と比較して、５０％未満、より好ましくは４０％未満、なおより好ましくは３０％未満の遊離Ｔ２Ｎを含む、項目３２から３５のいずれか一項に記載のウォート組成物。
（項目３７）
前記モルト組成物が、項目２８から３１のいずれかに記載のモルト組成物である、項目３２から３６のうちのいずれか一項に記載のウォート組成物。
（項目３８）
７０℃を超えない温度、好ましくは６９℃を超えない温度においてマッシングするステップを用いて生成させた、項目３２から３７のいずれか一項に記載のウォート組成物。
（項目３９）
マッシングするステップの間に、７０℃より高温の時間が２５分間を超えない方法により生成させた、項目３２から３８のいずれか一項に記載のウォート組成物。
（項目４０）
（ｉ）項目１５から２４のいずれかに記載のオオムギ植物体またはその一部を含む組成物と；
（ｉｉ）項目２８から３１のいずれかに記載のモルト組成物と
の混合物から調製される組成物である、項目２７に記載の植物生成物。
（項目４１）
項目４０に記載の組成物から調製したウォート組成物であるか、または飲料である、項目２７に記載の植物生成物。
（項目４２）
項目２８から３１のいずれか一項に記載のモルト組成物、または項目３２から３９のいずれか一項に記載のウォート組成物から調製される、項目１から１４のいずれかに記載の飲料。
（項目４３）
オオムギシロップ、モルトシロップ、オオムギ抽出物、およびモルト抽出物からなる群から選択される、項目２７に記載の植物生成物。
（項目４４）
Ｔ２Ｎポテンシャルレベルが極めて低い飲料を生成させる方法であって、
（ｉ）項目１５から２４のいずれかに記載のオオムギ植物体またはその一部を含む組成物を調製するステップと；
（ｉｉ）（ｉ）の組成物を飲料へと加工するステップと
を含み、これらにより、Ｔ２Ｎポテンシャルレベルが極めて低い飲料を得る方法。
（項目４５）
前記極めて低レベルのＴ２Ｎポテンシャルが、オオムギの栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製した飲料のＴ２Ｎポテンシャルの最大で５０％、好ましくは最大で４０％、より好ましくは最大で３５％である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記極めて低レベルのＴ２Ｎポテンシャルが、ヌルＬＯＸ−１オオムギ変異体から同じ方法で調製した飲料と比較して、７０％未満、好ましくは６０％未満である、項目４２または４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
ステップ（ｉ）が、前記オオムギ植物体またはその一部の穀粒に由来するモルト組成物を調製するステップを含む、項目４４から４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記組成物を飲料へと加工するステップが、マッシングするステップを含み、これによりウォート組成物を生成させる、項目４４から４７のいずれかに記載の方法。
（項目４９）
前記組成物を飲料へと加工するステップが、マッシングするステップおよびスパージングするステップを含み、これらによりウォート組成物を生成させる、項目４４から４８のいずれかに記載の方法。
（項目５０）
前記マッシングするステップが、破砕モルトのマッシング、または破砕オオムギのマッ
シング、または破砕モルトおよび破砕オオムギの混合物のマッシングを伴う、項目４８および４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記組成物を飲料へと加工するステップが、前記ウォートの発酵を含む、項目４８から５０のいずれかに記載の方法。
（項目５２）
遊離Ｔ２Ｎレベルが極めて低いモルト組成物を生成させる方法であって、
（ｉ）項目２３に記載の穀粒を供給するステップと；
（ｉｉ）前記穀粒をスティーピングするステップと；
（ｉｉｉ）前記スティーピングされた穀粒を、所定の条件下で発芽させるステップと；
（ｉｖ）発芽した穀粒を加熱処理するステップと
を含み、これらにより、遊離Ｔ２Ｎレベルが極めて低いモルト組成物を生成させる方法。
（項目５３）
ＡＴＣＣの受託番号がＰＴＡ−５４８７であるオオムギの変異体Ｄ１１２から同じ方法で調製したモルト組成物中における遊離Ｔ２Ｎと比較して、前記遊離Ｔ２Ｎの極めて低いレベルが、最大で５０％のＴ２Ｎである、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異とを含むオオムギ植物体を調製する方法であって、
（ｉ）機能的ＬＯＸ−１酵素を完全に喪失させたオオムギ植物体またはその一部を供給するステップと；
（ｉｉ）前記オオムギ植物体、ならびに／または前記オオムギ植物体に由来するオオムギ細胞、および／もしくはオオムギ組織、および／もしくはオオムギ穀粒、および／もしくはオオムギ胚芽を変異誘発し、これにより、Ｍ０世代のオオムギを得るステップと；
（ｉｉｉ）前記変異誘発されたオオムギ植物体、オオムギ穀粒、および／またはオオムギ胚芽を、少なくとも２世代にわたり育種し、これにより、Ｍｘ（ここで、ｘは、≧２の整数である）世代のオオムギ植物体を得るステップと；
（ｉｖ）前記Ｍｘ世代のオオムギ植物体から胚芽を得るステップと；
（ｖ）前記胚芽を発芽させるステップと；
（ｖｉ）前記発芽させた胚芽またはその一部におけるＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性を決定するステップと；
（ｖｉｉ）前記発芽させた胚芽におけるＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性を完全に喪失させた植物体を選択するステップと；
（ｖｉｉｉ）ＬＯＸ−１をコードする遺伝子における、およびＬＯＸ−２をコードする遺伝子における変異の存在または不在を決定するステップと；
（ｉｘ）ＬＯＸ−１をコードする遺伝子における、およびＬＯＸ−２をコードする遺伝子における変異を保有する植物体を選択するステップと
を含み、これらにより、機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異とを含むオオムギ植物体を得る、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、ＮａＮ３変異誘発されたオオムギ穀粒が、どのように繁殖することができるかについての一例を示す図である。Ｍ０世代の穀粒は、Ｍ１世代の穀粒を発達させる植物体に成長する。これらの種子をまき、Ｍ２世代の新しい穀粒を生成するＭ１植物体に発達させることができる。次に、Ｍ２植物体が成長し、Ｍ３世代の穀粒を実らせる。  例えば、Ｍ３世代の発芽植物体の子葉鞘を解析するために、Ｍ３世代の穀粒を発芽させることができる。加えて、Ｍ３世代の植物体の穀粒に由来する花を、オオムギの系統または栽培品種との異種交配に用いて、Ｍ４世代の植物体を得ることができる。Ｂｒｅｄｄａｍ，Ｋ．らによるＰＣＴ特許出願第ＷＯ２００５／０８７９３４号の図１Ａと同様の図を示す。
【図２】図２は、リノール酸が、Ｔ２Ｎへと転換および分解される生化学経路の概略表示である。ＬＯＸ−１は、９−ＨＰＯＤＥへのリノール酸の転換を主に触媒し、９−ＨＰＯＤＥは、ｃｉｓ−ノネナールへと酵素的に分解される。この化合物は、Ｔ２Ｎへの自発的、化学的な異性化を経る。ＬＯＸ−２は、１３−ＨＰＯＤＥへのリノール酸の転換を主に触媒し、１３−ＨＰＯＤＥは、２−Ｅ−ヘキセナール（ｈｅｘａｎａｌ）へと転換され得る（図示しない）。
【図３】図３は、好ましいビール生成プロセスの簡略化した図による概説を示す図である。生成プロセスは、オオムギ子実をスティーピングするステップ（１）と、モルト製造するステップ（２）と、キルン乾燥するステップ（３）と、乾燥モルトを粉砕するステップ（４）と、マッシングするステップ（５）と、濾過するステップ（６）と、添加されたホップの存在下でウォートを煮沸するステップ（７）と、酵母の存在下で発酵させるステップ（８）と、ビールを成熟させるステップ（９）と、ビールを濾過するステップ（１０）と、詰めるステップ、例えば、瓶、缶などに詰めるステップ（１１）と、ラベルを貼るステップ（１２）とを含む。個々のプロセスは、モルト生成（１−３）と、ウォート生成（４−７）と、発酵（８−９）と、完成したビールの調製（１０−１２）とで構成されるセクションに分類することができる。好ましい方法を例示したが、示したステップの一部を省略する他の方法を想定することができる（例えば、濾過を省略してよく、またはホップを添加しなくてよい、あるいは、補助剤、砂糖、シロップまたは炭酸の添加など付加的なステップを加えることができる）。
【図４−１】図４は、Ｍ３世代（Ａ）、Ｍ４世代（Ｂ）、およびＭ５世代（Ｃ）の発芽穀粒内における総ＬＯＸ活性を比較した結果を示す図である。前記活性は、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９、ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２、およびヌルＬＯＸ−１育種系列Ｃａ２１１９０１の発芽穀粒から単離した胚芽の抽出物中において測定した。同じ試料の熱不活化させた抽出物のアリコートを、実験用対照として用いた［Ｃでは：ヌルＬＯＸ−１原変異体Ｄ１１２（＊）、ヌルＬＯＸ−１育種系列Ｃａ２１１９０１（＊＊）］。また、解析された植物体試料のＬＯＸ−１遺伝子型およびＬＯＸ−２遺伝子型も示す（ｗｔ：野生型）。
【図４−２】図４は、Ｍ３世代（Ａ）、Ｍ４世代（Ｂ）、およびＭ５世代（Ｃ）の発芽穀粒内における総ＬＯＸ活性を比較した結果を示す図である。前記活性は、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９、ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２、およびヌルＬＯＸ−１育種系列Ｃａ２１１９０１の発芽穀粒から単離した胚芽の抽出物中において測定した。同じ試料の熱不活化させた抽出物のアリコートを、実験用対照として用いた［Ｃでは：ヌルＬＯＸ−１原変異体Ｄ１１２（＊）、ヌルＬＯＸ−１育種系列Ｃａ２１１９０１（＊＊）］。また、解析された植物体試料のＬＯＸ−１遺伝子型およびＬＯＸ−２遺伝子型も示す（ｗｔ：野生型）。
【図４−３】図４は、Ｍ３世代（Ａ）、Ｍ４世代（Ｂ）、およびＭ５世代（Ｃ）の発芽穀粒内における総ＬＯＸ活性を比較した結果を示す図である。前記活性は、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９、ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２、およびヌルＬＯＸ−１育種系列Ｃａ２１１９０１の発芽穀粒から単離した胚芽の抽出物中において測定した。同じ試料の熱不活化させた抽出物のアリコートを、実験用対照として用いた［Ｃでは：ヌルＬＯＸ−１原変異体Ｄ１１２（＊）、ヌルＬＯＸ−１育種系列Ｃａ２１１９０１（＊＊）］。また、解析された植物体試料のＬＯＸ−１遺伝子型およびＬＯＸ−２遺伝子型も示す（ｗｔ：野生型）。
【図５】図５は、４８時間にわたり発芽させたオオムギ胚芽における９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥの形成についてのアッセイに用いたＨＰＬＣ解析のクロマトグラムを示す図である。２３４ｎｍにおける吸光度を測定することによりＨＰＯＤＥを検出した（結果は相対吸光度単位（ＡＵ）で示す）。９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥに対応する溶出プロファイルのピークを、矢印で示す。（Ａ）９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥの基準物質についてのクロマトグラムを示す図である。（Ｂ）ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２の発芽胚芽から調製した抽出物中において形成されたＨＰＯＤＥについてのクロマトグラムを示す図である。（Ｃ）Ｍ４世代である、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９の発芽胚芽から調製した抽出物中において形成されたＨＰＯＤＥについてのクロマトグラムを示す図である。
【図６】図６は、７２時間にわたりマイクロモルト化させた穀粒の胚芽における９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥの形成についてのアッセイに用いたＨＰＬＣ解析のクロマトグラムを示す図である。２３４ｎｍにおける吸光度を測定することによりＨＰＯＤＥを検出した（結果は相対吸光度単位（ＡＵ）で示す）。９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥに対応する溶出プロファイルのピークを、矢印で示す。（Ａ）野生型の栽培品種Ｂａｒｋｅにおいて形成された９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥについてのクロマトグラムを示す図である。（Ｂ）ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２の胚芽の抽出物中において形成されたＨＰＯＤＥについてのクロマトグラムを示す図である。（Ｃ）Ｍ５世代である、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９の抽出物中において形成されたＨＰＯＤＥについてのクロマトグラムを示す図である。
【図７】図７は、野生型のオオムギ栽培品種Ｐｏｗｅｒ、ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２、およびＭ５世代である、変異体Ａ６８９の３つの潜在的な二重ヌルＬＯＸ系列のマイクロモルト化試料中において形成された遊離Ｔ２Ｎのレベルを示す図である。また、解析されたオオムギ試料のＬＯＸ−１遺伝子型およびＬＯＸ−２遺伝子型も示す（ｗｔ：野生型）。
【図８】図８は、野生型の栽培品種Ｐｏｗｅｒ、ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２、およびＭ５世代である、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９のマイクロモルト化穀粒から生成された煮沸ウォート試料中において形成された遊離Ｔ２Ｎのレベルを示す図である。また、解析されたオオムギ試料のＬＯＸ−１遺伝子型およびＬＯＸ−２遺伝子型も示す（ｗｔ：野生型）。
【図９】図９は、野生型の栽培品種Ｐｏｗｅｒ、ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２、およびＭ５世代である、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９のマイクロモルト化穀粒から生成された煮沸ウォート試料中におけるＴ２Ｎ前駆体レベルを示す図である。
【図１０】図１０は、栽培品種Ｐｏｗｅｒ、ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２、および二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９のモルトを用いる、２００ｌの大規模醸造実験において作製されたビール中におけるＴ２Ｎ前駆体レベルを示す図である。用いられたモルトのＬＯＸ−１遺伝子型およびＬＯＸ−２遺伝子型を示す（ｗｔ：野生型）。
【図１１】図１１は、オオムギの醸造により、または通常のモルト化およびマッシングにより生成された、２００ｌの大量の煮沸ウォートから採取された表示試料のアリコート中における遊離Ｔ２Ｎレベルの比較を示す図である。用いられた原料のＬＯＸ−１遺伝子型およびＬＯＸ−２遺伝子型を示す（ｗｔ：野生型）。
【図１２】図１２は、オオムギの醸造により、または通常のモルト化およびマッシングを用いることにより生成された、２００ｌの大量の煮沸ウォートから採取された表示試料のアリコート（図１１を参照されたい）中におけるＴ２Ｎ前駆体レベルの比較を示す図である。また、用いられた原料のＬＯＸ−１遺伝子型およびＬＯＸ−２遺伝子型も示す（ｗｔ：野生型）。
【図１３−１】図１３は、表示のオオムギ栽培品種およびオオムギ変異体を原料として用いる、２００ｌの大規模醸造試験によるビール中における、Ｔ２Ｎ発生の態様を示す図である。（Ａ）強制劣化時における遊離Ｔ２Ｎの発生に焦点を当てた、オオムギ醸造ビールだけについての解析を示す図である。５０ｐｐｔのＴ２Ｎの風味閾値レベルを、水平の点線で示す。別個の実験では、オオムギ醸造による新鮮なビールと、通常醸造による新鮮なビールとにおけるＴ２Ｎ前駆体レベルを比較し（Ｂ）；（Ｃ）では、３７℃で２週間後におけるレベル（黒色バー）と比較した、新鮮なビール中における遊離Ｔ２Ｎレベル（白色バー）を示す。また、用いられた原料のＬＯＸ−１遺伝子型およびＬＯＸ−２遺伝子型も示す（ｗｔ：野生型）。
【図１３−２】図１３は、表示のオオムギ栽培品種およびオオムギ変異体を原料として用いる、２００ｌの大規模醸造試験によるビール中における、Ｔ２Ｎ発生の態様を示す図である。（Ａ）強制劣化時における遊離Ｔ２Ｎの発生に焦点を当てた、オオムギ醸造ビールだけについての解析を示す図である。５０ｐｐｔのＴ２Ｎの風味閾値レベルを、水平の点線で示す。別個の実験では、オオムギ醸造による新鮮なビールと、通常醸造による新鮮なビールとにおけるＴ２Ｎ前駆体レベルを比較し（Ｂ）；（Ｃ）では、３７℃で２週間後におけるレベル（黒色バー）と比較した、新鮮なビール中における遊離Ｔ２Ｎレベル（白色バー）を示す。また、用いられた原料のＬＯＸ−１遺伝子型およびＬＯＸ−２遺伝子型も示す（ｗｔ：野生型）。
【図１３−３】図１３は、表示のオオムギ栽培品種およびオオムギ変異体を原料として用いる、２００ｌの大規模醸造試験によるビール中における、Ｔ２Ｎ発生の態様を示す図である。（Ａ）強制劣化時における遊離Ｔ２Ｎの発生に焦点を当てた、オオムギ醸造ビールだけについての解析を示す図である。５０ｐｐｔのＴ２Ｎの風味閾値レベルを、水平の点線で示す。別個の実験では、オオムギ醸造による新鮮なビールと、通常醸造による新鮮なビールとにおけるＴ２Ｎ前駆体レベルを比較し（Ｂ）；（Ｃ）では、３７℃で２週間後におけるレベル（黒色バー）と比較した、新鮮なビール中における遊離Ｔ２Ｎレベル（白色バー）を示す。また、用いられた原料のＬＯＸ−１遺伝子型およびＬＯＸ−２遺伝子型も示す（ｗｔ：野生型）。
【図１４】図１４は、オオムギ醸造ビール（Ａ）と、通常モルトを用いて作製したビール（Ｂ）との両方におけるＴＨＡレベルおよびＴＨＡ比の比較を示す図である。９，１２，１３−ＴＨＡおよび９，１０，１３−ＴＨＡは、それぞれ、ＬＯＸ−１経路およびＬＯＸ−２経路の部分的に未知の反応により生成される。
【図１５】図１５は、栽培品種Ｐｏｗｅｒ（黒色バー）、ヌルＬＯＸ−１（グレーバー）、および二重ヌルＬＯＸ（白色バー）の原料を用いる、２００ｌスケールのオオムギ醸造ビールにおける、「紙」の異臭（Ａ）および「劣化」異臭（Ｂ）の経時的な発生についての図示である。０（異臭なし）〜５（異臭が極めて強い）のスケールを用いて、専門家によるビール試飲パネルがビールを判定した。
【図１６】図１６は、オオムギ醸造ビール（Ａ）と、モルトベースのビール（Ｂ）とにおいて、どの程度の泡が発生するかを示す図である。いずれの実験においても、栽培品種Ｐｏｗｅｒ（細点線）、ヌルＬＯＸ−１（細実線）、および二重ヌルＬＯＸ（太実線）の原料を用いて作製されたビールとの比較で、市販のラガービール（太点線）を基準として用いた。
【図１７】図１７は、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＡ）に及ぶ領域に焦点を当てた、オオムギゲノムのＬＯＸ−２遺伝子の構成についての配置図である。３２２９ｂｐの配列は、６つのエクソン（黒色帯）および５つのイントロン（棒線）からなることが判明した。二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９のＬＯＸ−２遺伝子内で同定される変異を、垂直の矢印により示す。二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９はまた、ＬＯＸ−１遺伝子において、未熟翻訳終止コドンも含有することが注目に値する（米国特許第７，４２０，１０５号の図１５で示される変異体Ｄ１１２を参照されたい）。
【図１８−１】図１８は、遺伝子型解析をどのように用いてヌルＬＯＸ変異体を同定するかを示す図である。焦点は、ＳＮＰ支援による二重ヌルＬＯＸオオムギ植物体の検出、すなわち、ＬＯＸ−１遺伝子の３４７４位におけるＧ→Ａ変異と、ＬＯＸ−２遺伝子の２６８９位におけるＧ→Ａ変異とを組み合わせた検出を達成する方法に関する。（Ａ）表示のプライマー対を用いて表示の鋳型ＤＮＡから増幅された（すなわち、プライマーＦＬ１０３５およびＦＬ１０３９を用いることにより野生型のＬＯＸ−２遺伝子を増幅し得る一方、プライマーＦＬ１０３４およびＦＬ１０３９を用いることによりヌルＬＯＸ−２変異体遺伝子を増幅することができる）ＰＣＲ断片によるアガロースゲル電気泳動についてのダイアグラムである。（Ｂ）プライマー対ＦＬ８２０およびＦＬ８２３（星印により示されるヌルＬＯＸ−１特異的な変異に相補的な３’側塩基を含有する）と、プライマー対ＦＬ１０３４（星印により示されるヌルＬＯＸ−２変異に相補的な３’側塩基を含有する）およびＦＬ１０３９とによるＰＣＲが、前記ヌルＬＯＸ変異が存在する場合に、それぞれ、１６６ｂｐおよび２００ｂｐのＰＣＲ産物をどのようにして生成させるかを示すダイアグラムである。（Ｃ）マーカーＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動後の結果（レーン１および４）と、ヌルＬＯＸ−１変異およびヌルＬＯＸ−２変異を検出するために、前述のプライマーの組合せを用いてＰＣＲ増幅した、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９のＤＮＡについてのアガロースゲル電気泳動後の結果（レーン２）を示す図である。野生型のオオムギによるＰＣＲ反応は、対応するＰＣＲ産物をもたらさなかった（レーン３）。
【図１８−２】図１８は、遺伝子型解析をどのように用いてヌルＬＯＸ変異体を同定するかを示す図である。焦点は、ＳＮＰ支援による二重ヌルＬＯＸオオムギ植物体の検出、すなわち、ＬＯＸ−１遺伝子の３４７４位におけるＧ→Ａ変異と、ＬＯＸ−２遺伝子の２６８９位におけるＧ→Ａ変異とを組み合わせた検出を達成する方法に関する。（Ａ）表示のプライマー対を用いて表示の鋳型から増幅された（すなわち、プライマーＦＬ１０３５およびＦＬ１０３９を用いることにより野生型のＬＯＸ−２遺伝子を増幅し得る一方、プライマーＦＬ１０３４およびＦＬ１０３９を用いることによりヌルＬＯＸ−２変異体遺伝子を増幅することができる）ＰＣＲ断片によるアガロースゲル電気泳動についてのダイアグラムである。（Ｂ）プライマー対ＦＬ８２０およびＦＬ８２３（星印により示されるヌルＬＯＸ−１特異的な変異に相補的な３’側塩基を含有する）と、プライマー対ＦＬ１０３４（星印により示されるヌルＬＯＸ−２変異に相補的な３’側塩基を含有する）およびＦＬ１０３９とによるＰＣＲが、前記ヌルＬＯＸ変異が存在する場合に、それぞれ、１６６ｂｐおよび２００ｂｐのＰＣＲ産物をどのようにして生成させるかを示すダイアグラムである。（Ｃ）マーカーＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動後の結果（レーン１および４）と、ヌルＬＯＸ−１変異およびヌルＬＯＸ−２変異を検出するために、前述のプライマーの組合せを用いてＰＣＲ増幅した、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９のＤＮＡについてのアガロースゲル電気泳動後の結果（レーン２）を示す図である。野生型のオオムギによるＰＣＲ反応は、対応するＰＣＲ産物をもたらさなかった（レーン３）。
【図１９】図１９は、二重ヌルＬＯＸオオムギとの異種交配に由来する子孫植物体についての、ＳＮＰ支援による解析についての例を示す図である。（Ａ）本明細書上記の図１８に対するキャプションにおいて詳述したプライマーの組合せ、すなわち、ＰＣＲベースでヌルＬＯＸ−１変異およびヌルＬＯＸ−２変異を検出するためのプライマーを用いる場合についての概略表示である。左から１番目のレーン（該レーンの下方に記される「ａ」のバンドパターンを示す）が、２つの変異の存在に特異的なＰＣＲ産物を含有しない［すなわち、いずれの鋳型領域も、野生型（Ｗ）配列を有した］のに対し、バンドパターン「ｂ」を示す次のレーンは、ヌルＬＯＸ−１変異体の植物体（Ｍ）に由来するＰＣＲ産物を明示する。バンドパターン「ｃ」を示す３番目のレーンは、ヌルＬＯＸ−２植物体に由来し、バンドパターン「ｄ」を示す４番目のレーンの産物は、二重ヌルＬＯＸ植物体の産物である。（Ｂ）野生型、ヌルＬＯＸ−１、ヌルＬＯＸ−２、および二重ヌルＬＯＸオオムギ遺伝子型についてのアガロースゲル電気泳動を示す図である。上記の（Ａ）で説明したパターンによる、バンド形成パターンについての解析は、レーン２、６、１０、１２、１８、および２２が、ヌルＬＯＸ−１変異を保有する植物体に由来する増幅産物を含有する（レーン下方の「ｂ」によりマークした）のに対し、レーン１、３、９、１１、１９、２１、および２３は、ヌルＬＯＸ−２変異を保有する植物体に由来する産物を含有する（レーン下方の「ｃ」によりマークした）ことを明らかにした。レーン７、１５、および１７は、ＬＯＸ−１遺伝子の変異およびＬＯＸ−２遺伝子の変異の組合せを保有する二重ヌルＬＯＸ植物体に由来するＰＣＲ産物を含有した（レーン下方の「ｄ」によりマークした）。レーン４、５、８、１３、１４、１６、および２０は、いずれのヌルＬＯＸ対立遺伝子を保有する植物体に由来する増幅産物も含有しなかった（レーン下方の「ａ」によりマークした）、すなわち、該植物体は、被験配列に関して野生型であった。マーカーＤＮＡは、「ＭＷ」によりマークして、レーン内で区別した。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
以下の説明、図、および表では、多くの用語が用いられる。このような用語に所与の範囲を含め、本明細書および特許請求の範囲を記載する目的で、以下の定義を与える。
【００２５】
本明細書で用いられる「ある」とは、それが用いられる文脈に応じて、１または複数を意味し得る。
【００２６】
「農業形質」という用語は、その効力または経済的価値に寄与する、植物体の表現型形質または遺伝形質について説明する。このような形質には、病害耐性、虫害耐性、ウイルス耐性、線虫耐性、干ばつ忍容性、高塩分忍容性、収量、草高、成熟日数、穀粒の粒ぞろい（すなわち、穀粒サイズの画分）、穀粒の窒素含量などが含まれる。
【００２７】
「アンチセンスのヌクレオチド配列」とは、そのヌクレオチド配列の通常の５’から３’へのコード方向と逆方向の配列を意図する。植物細胞内に存在する場合、アンチセンスのＤＮＡ配列は、内因性遺伝子のヌクレオチド配列の正常な発現を低下させ、対応する天然タンパク質の生成を破壊し得ることが好ましい。オオムギ植物体において、アンチセンスヌクレオチドの発現は一般に、前記天然タンパク質の発現を低下させるだけであり、その発現を阻止することはない。
【００２８】
特に、ビールおよびオオムギベースの飲料の製造工程に関して、特に、モルト化工程を説明するのに用いる場合の「オオムギ」という用語は、オオムギの穀粒を意味する。別段に指定しない限り、他のすべての場合、「オオムギ」が任意の育種系統または栽培品種または品種を含めたオオムギ植物体（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ，  Ｌ．）を意味するのに対し、オオムギ植物体の一部とは、オオムギ植物体の任意の部分、例えば、任意の組織または細胞であり得る。
【００２９】
「病害耐性」とは、植物体が、植物体−病原体間相互作用の結果である病害症状を回避することを意図する。このようにして、病原体が、植物病害、ならびに関連する病害症状を引き起こすことが予防される。代替的に、病原体により引き起こされる病害症状は、最小化または軽減されるか、またはなお予防される。
【００３０】
本明細書で用いられる「二重ヌルＬＯＸ」という用語は、ＬＯＸ−１活性の機能の完全な喪失およびＬＯＸ−２活性の機能の完全な喪失を指す。したがって、「二重ヌルＬＯＸ」は、機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失と、機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失とを特徴とし得る。したがって、「二重ヌルＬＯＸオオムギ植物体」とは、ＬＯＸ−１活性の機能の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、ＬＯＸ−２活性の機能の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異とを含むオオムギ植物体である。したがって、「二重ヌルＬＯＸオオムギ植物体」は、機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失と、機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失とを特徴とし得る。「二重ヌルＬＯＸ穀粒」とは、ＬＯＸ−１活性の機能の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、ＬＯＸ−２活性の機能の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異とを含む穀粒である、なども同様である。したがって、「二重ヌルＬＯＸ穀粒」は、機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失と、機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失とを特徴とし得る。
【００３１】
本明細書で定義される「穀類」植物とは、主にそれらのデンプン含有種子または穀粒のために栽培される、Ｇｒａｍｉｎｅａｅ（Ｇｒａｍｉｎａｅ）科植物のメンバーである。穀類植物には、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ属）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ属）、コメ（Ｏｒｙｚａ属）、トウモロコシ（Ｚｅａ属）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ属）、オートムギ（Ａｖｅｎａ属）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ属）、ならびにライムギとコムギとの交配種であるライコムギが含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
特定の核酸との関連における「コードする」または「コードされる」とは、特定のタンパク質へと翻訳される情報を含むことを意味する。タンパク質をコードする核酸またはポリヌクレオチドは、その翻訳領域内において非翻訳配列、例えば、イントロンを含む場合もあり、例えば、ｃＤＮＡにおいて、このように介在する非翻訳配列を欠く場合もある。タンパク質をコードする情報は、コドンを用いることにより指定される。
【００３３】
核酸と関連して本明細書で用いられる「発現」とは、核酸断片に由来するセンスｍＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡの転写および蓄積として理解されるものとする。タンパク質との関連で用いられる「発現」とは、ｍＲＮＡがポリペプチドへと翻訳されることを指す。
【００３４】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡ断片を意味し、該コード領域に先行および後続する領域（プロモーター領域およびターミネーター領域）を包含する。さらに、植物の遺伝子は一般に、イントロンを介在させるエクソンからなる。ＲＮＡへと転写されると、スプライシングによりイントロンが除去されて、成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が生成される。エクソンとイントロンとの間の「スプライス部位」は、一次ＲＮＡ転写物からのイントロンの欠失と、切除されたイントロンの両側において残存するＲＮＡ端の接合または融合とからなる、スプライシング過程のスプライスシグナルとして作用するコンセンサス配列により決定されることが典型的である。場合によって、スプライシングの代替的であるかまたは異なるパターンは、同じ単一のＤＮＡの連なりから、異なるタンパク質を生成させ得る。天然の遺伝子を、「内因性遺伝子」と称することができる。
【００３５】
核酸との関連において本明細書で用いられる「異種」とは、外来種に由来するか、または、同じ種に由来する場合、意図的で人為的な介入により、組成および／または遺伝子座が、その天然形態から実質的に改変されている核酸である。
【００３６】
本明細書で用いられる「発芽」という用語は、天然で見出される通常の土壌など、各種の組成物中において、オオムギ穀粒の成長が開始または再開されることを意味する。したがって、発芽胚芽とは、発芽を経過しつつある胚芽である。発芽はまた、成長チャンバーなどの中に置いたポットの土壌中で生じる場合もあり、例えば、標準的な実験室用ペトリディッシュ内に置いて湿らせた濾紙上で生じる場合もあり、モルト化時において（例えば、モルト化工場のスティープタンクまたは発芽箱内において）生じる場合もある。発芽は一般に、穀粒の水和、穀粒の膨潤、および胚芽の成長の誘導を包含すると理解される。発芽に影響する環境因子には、水分、温度、および酸素レベルが含まれる。根および芽の発育が観察される。
【００３７】
本明細書で用いられる「単離」という用語は、物質を、その元の環境から取り出すことを意味する。例えば、生体内に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然系において共存する物質の一部または全部から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部の場合もあろうし、かつ／またはこのようなポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは組成物の一部の場合もあろうが、このようなベクターまたは組成物はその天然環境の一部ではないので、これらはやはり単離されている。
【００３８】
「穀粒」という用語は、また、内種子とも称する穀類の頴果、外頴、および内頴を含むものと定義される。大半のオオムギ品種では、外頴および内頴が頴果に付着し、脱穀後における穀粒の一部をなす。しかし、裸性のオオムギ品種もまた生じる。これらにおいては、頴果が、外頴および内頴から遊離しており、コムギの場合と同様に、脱穀により完全に遊離する。本明細書では、「穀粒（ｋｅｒｎｅｌ）」および「穀粒（ｇｒａｉｎ）」という用語を互換的に用いる。
【００３９】
「穀粒の発生」とは、花粉細胞による卵細胞の受精で始まる期間を指す。受精の間、代謝による貯蔵物質、例えば、糖、オリゴ糖、デンプン、フェノール性物質、アミノ酸、およびタンパク質が、液胞の標的化を伴い、また、これを伴わずに、穀粒（穀粒）内の各種の組織、例えば、内胚乳、種皮、糊粉、および胚芽盤へと蓄積され、これにより穀粒（穀粒）の拡大、穀粒（穀粒）の充実がもたらされ、穀粒（穀粒）の乾燥により終わる、を指す。
【００４０】
「機能の完全な喪失」という用語は、所与の酵素活性の欠如を指す。したがって、ＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性の「機能を完全に喪失」させたオオムギ植物体とは、検出可能なＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性を示さないオオムギ植物体である。ＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２は他の活性も有し得るが、本発明の文脈におけるＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性は、リノール酸からの９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥの形成を決定するアッセイ手順により決定される。リノール酸からの９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥの形成は、本明細書下記の実施例４で説明される通りに決定することが好ましい。活性は、発芽胚芽のタンパク質抽出物を用いて決定するものとする。本発明の文脈では、実施例４で説明されるアッセイを用い、リノール酸を基質として用いる場合に生成されるクロマトグラムピークが、図５Ａに示される基準物質の９−ＨＰＯＤＥピークの５％未満、好ましくは３％未満に対応し、かつ／またはこの場合に生成されるピークが、図５Ａに示される基準物質の１３−ＨＰＯＤＥピークの５％未満、好ましくは３％未満に対応するならば、これを、検出可能なＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性が存在しないと考える。ＬＯＸ活性の機能の完全な喪失を得る分子的手法は、前記酵素の転写物の完全な不在を引き起こすか、もしくは対応するコードされた酵素の完全な不在を引き起こす変異か、またはコードされた酵素を完全に不活化する変異の発生を含む。
【００４１】
「ＬＯＸ−１活性」という用語は、オオムギＬＯＸ−１酵素の酵素活性を指す。「ＬＯＸ−１活性」とは、リノール酸から９−ＨＰＯＤＥをもたらし、これよりはるかに劣る程度で１３−ＨＰＯＤＥをもたらす二原子酸素添加反応を酵素により触媒することである。ＬＯＸ−１酵素は、他の反応を触媒することも可能であるが、本発明によるＬＯＸ−１活性を決定する目的では、９−ＨＰＯＤＥ形成活性および１３−ＨＰＯＤＥ形成活性だけを考えるべきである。図２は、リノール酸が９−ＨＰＯＤＥへと転換される生化学経路を概観する。
【００４２】
「ＬＯＸ−２活性」という用語は、オオムギＬＯＸ−２酵素の酵素活性を指す。「ＬＯＸ−２活性」とは、リノール酸から１３−ＨＰＯＤＥをもたらし、これよりはるかに劣る程度で９−ＨＰＯＤＥをもたらす二原子酸素添加反応を酵素により触媒することである。ＬＯＸ−２酵素は、他の反応を触媒することも可能であるが、本発明によるＬＯＸ−２活性を決定する目的では、１３−ＨＰＯＤＥ形成活性および９−ＨＰＯＤＥ形成活性だけを考えるべきである。図２は、リノール酸が１３−ＨＰＯＤＥへと転換される生化学経路を概観する。
【００４３】
「モルト飲料」という用語、または「モルトベースの飲料」という用語は、モルトを用いて調製される飲料、好ましくは、モルトを熱湯と共にインキュベートするステップを包含する方法により調製される飲料を指す。モルト飲料は、例えば、ビールまたはモルティナであり得る。
【００４４】
「発酵モルト飲料」という用語は、発酵させたモルト飲料、すなわち、酵母と共にインキュベートしたモルト飲料を指す。
【００４５】
「モルト化」とは、モルト化工場のスティープタンクおよび発芽箱を含むが、これらに限定されない、制御された環境条件下で生じる、オオムギ穀粒発芽の特殊な形態である。本発明の工程によれば、モルト化は、オオムギ穀粒がスティーピングされる間および／またはスティーピングされた後で生じ始める。モルト化工程は、例えば、キルン乾燥工程においてオオムギ穀粒を乾燥させることにより、停止させることができる。モルトがキルン乾燥されていない場合は、「グリーンモルト」と称する。ＬＯＸ二重ヌルのオオムギから調製されたモルト組成物は、純粋のＬＯＸ二重ヌルのモルト、またはＬＯＸ二重ヌルのモルトを含む任意のモルトブレンドなど、ＬＯＸ二重ヌルのモルトを含むものと理解される。モルトは、例えば、破砕することにより加工することができ、したがってモルトは、「破砕モルト」または「粉末モルト」と称し得る。
【００４６】
「マッシング」とは、水中における破砕モルトのインキュベーションである。マッシングは、特定の温度、および特定の水量で実施することが好ましい。温度および水量は、モルトに由来する酵素活性の低下率に影響を及ぼし、このため、とりわけ、生じ得るデンプンの加水分解量に影響を及ぼすので重要であり、プロテアーゼ作用もまた重要であり得る。マッシングは、全穀粒として、または粗引き穀物もしくはデンプンなどの加工生成物としてのオオムギ（ＬＯＸ二重ヌルのオオムギを含めた）、オオムギシロップ、またはトウモロコシ、またはコメなどであるがこれらに限定されない、モルト以外の任意の炭水化物供給源を含むものと理解される添加物の存在下で行い得る。前述の添加物のすべてを、抽出物のさらなる供給源として主に用いることができる（ウォート煮沸時にはシロップを投与することが典型的である）。醸造における添加物を加工するための要件は、用いられる添加物の状態および種類、ならびに、特に、デンプンのゼラチン化温度または液化温度に依存する。該ゼラチン化温度が通常のモルトの糖化のためのゼラチン化温度より高温である場合は、マッシュに添加する前に、デンプンをゼラチン化および液化させる。
【００４７】
「変異」には、遺伝子のコード領域および非コード領域内における欠失、挿入、置換、トランスバージョン、および点変異が含まれる。欠失は、全遺伝子を対象とする場合もあり、遺伝子の一部だけを対象とする場合もあり、この場合、非コード領域は、プロモーター領域、またはターミネーター領域、またはイントロンであることが好ましい。点変異は、１塩基または１塩基対の変化に関する場合があり、その結果として、終止コドン、フレームシフト変異、またはアミノ酸置換をもたらし得る。体細胞変異は、植物体の特定の細胞または組織内だけにおいて生じ、次世代には遺伝しない変異である。生殖細胞系列変異は、植物体の任意の細胞内において見出すことができ、遺伝する。本明細書の図１（この図は、変異したオオムギの穀粒が、育種プログラムにおいて、どのようにして繁殖し得るかについての概要を提示する）を参照すると、Ｍ３世代の穀粒、ならびにこれらから直接的に繁殖した穀粒、またはそれらの植物体を含めた、任意の後続世代の穀粒を、「生の変異体」と称することができる。さらに、なおも本明細書の図１を参照すると、「育種系統」という用語は、栽培品種の植物体との異種交配の結果の場合もあり、別個の特異的な形質を有する別の育種系統との異種交配の結果の場合もある、Ｍ４世代の穀粒、ならびにこれらの植物体を含めた任意の後続世代を指す。
【００４８】
「ヌルＬＯＸ」という用語は、ＬＯＸをコードする遺伝子に変異が存在し、コードされるＬＯＸ酵素（ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−２）の機能の完全な喪失を引き起こすことを指す。ＬＯＸをコードする遺伝子において、未熟終止（ナンセンス）コドンを発生させる変異は、それによりＬＯＸ活性の機能の完全な喪失を得ることができる１つの機構を表すに過ぎない。ＬＯＸ酵素の機能の完全な喪失を得る分子的手法は、前記酵素の転写物の完全な不在をもたらす変異、またはコードされる酵素の完全な不活化を引き起こす変異の発生を含む。植物体との関連における「ヌルＬＯＸ」とは、指定されたＬＯＸ酵素の機能の完全な喪失を示す植物体を指す。
【００４９】
「作動可能に連結された」とは、一方の機能が、他方により影響を受けるような、単一のポリヌクレオチド上における、２つ以上の核酸断片の会合を指すのに用いられる用語である。例えば、コード配列の発現に影響を及ぼすことが可能である場合、すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある場合、そのプロモーターは、そのコード配列と作動可能に連結されている。コード配列は、センス方向において制御配列と作動可能に連結される場合もあり、アンチセンス方向において制御配列と作動可能に連結される場合もある。
【００５０】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特定のＤＮＡ断片を増幅するのに用いられる技法として、当業者により周知である（Ｍｕｌｌｉｓ，  Ｋ．Ｂ．らによる米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，８００，１５９号）。
【００５１】
「植物体」または「植物物質」とは、植物細胞、植物プロトプラスト、ならびに、それからオオムギ植物体が再生される植物細胞組織の培養物（植物体のカルス、および、胚芽、花粉、胚珠、花、穀粒、葉、根、根端、葯、または植物体の任意の部分もしくは生成物など植物体において完全である、または植物体の部分である植物細胞を含めた）を包含する。
【００５２】
「植物生成物」という用語は、植物体または植物体の一部を加工する結果として得られる生成物を意味する。したがって、前記植物生成物は、例えば、モルト、ウォート、発酵飲料もしくは非発酵飲料、食物生成物、または飼料生成物であり得る。
【００５３】
タンパク質との関連において本明細書で用いられる「組換え」とは、外来種に由来するか、または、同じ種に由来する場合、意図的で人為的な介入により、組成がその天然形態から実質的に改変されているタンパク質である。
【００５４】
本出願の意味の範囲内における「専門家によるビール試飲パネル」とは、アルデヒド、紙の風味（ｐａｐｅｒｙ  ｔａｓｔｅ）および古い風味に特別の焦点を当てて、ビールの風味を味わい、説明することにおいて高度に熟練した専門家によるパネルである。風味成分を評価するための分析ツールは多数存在するが、風味活性成分の相対的重要性を分析的に評価することは難しい。しかし、風味の専門家によれば、このような複雑な特性を評価することができる。彼らの持続的な訓練には、標準的なビール試料の試飲および評価が含まれる。
【００５５】
「スプライス部位」という用語は、遺伝子のエクソンとイントロンとの間の境界部位を意味する。したがって、スプライス部位は、エクソンからイントロンへと移行する境界部位（「ドナー部位」と呼ばれる）の場合もあり、イントロンをエクソンから隔てる境界部位（「アクセプター部位」と呼ばれる）の場合もある。植物体におけるスプライス部位は、コンセンサス配列を含むことが典型的である。イントロンの５’端は、一般に、保存的なＧＴジヌクレオチド（ｍＲＮＡではＧＵ）からなり、イントロンの３’端は、通常、保存的なＡＧジヌクレオチドからなる。したがって、イントロンの５’側スプライス部位は、イントロンの５’端を含み、該３’側スプライス部位は、イントロンの３’端を含む。本発明の文脈の範囲内では、イントロンのスプライス部位は、（一般にＧＴである）該イントロンの大半の５’側ジヌクレオチドからなる、５’側スプライス部位；または（一般にＡＧである）該イントロンの大半の３’側ジヌクレオチドからなる、３’側スプライス部位であることが好ましい。
【００５６】
別段に言及しない限り、「Ｔ２Ｎ」とは、遊離形態におけるｔｒａｎｓ−２−ノネナール（Ｔ２Ｎ）を意味する。Ｔ２Ｎはまた、場合によって、２−Ｅ−ノネナールも指すことがある。
【００５７】
「Ｔ２Ｎポテンシャル」という用語により、１または複数の反応において、Ｔ２Ｎを放出するか、またはＴ２Ｎへと転換される能力を有する化学物質について述べる。本明細書の文脈において、Ｔ２Ｎポテンシャルは、１００℃、ｐＨ４．０で２時間にわたるインキュベーション中において、溶液、例えば、ウォートもしくはビール中へと放出されるＴ２Ｎの濃度として定義される。実用的に述べると、出発Ｔ２Ｎ濃度を決定し、その後、１００℃、ｐＨ４．０で２時間にわたり溶液をインキュベートした後で、Ｔ２Ｎ濃度を測定する。出発Ｔ２Ｎ濃度と、終末Ｔ２Ｎ濃度との差を、Ｔ２Ｎポテンシャルと称する。熱処理、酸処理により、Ｔ２Ｎポテンシャルから、例えば、「Ｔ２Ｎ付加物」（この用語は、タンパク質（複数可）、亜硫酸塩、細胞破砕物、細胞壁などが含まれるがこれらに限定されない、１または複数の物質にコンジュゲートしたＴ２Ｎについて述べるのに用いられる）からＴ２Ｎを遊離させる。一般に、Ｔ２Ｎ付加物自体を異臭として人が感知することはない。しかし、前記Ｔ２Ｎ付加物から放出されるＴ２Ｎは、異臭を発生させ得る。
【００５８】
「組織培養物」とは、種類が同じであるかもしくは異なる単離細胞、または、例えば、プロトプラスト、カルス、胚芽、花粉、葯などを含む植物体の一部へと組織化されたこのような細胞の集合を含む組成物を指す。
【００５９】
「形質転換」とは、ＤＮＡが、染色体外エレメント（組込みおよび安定的な遺伝がなされない）として、または染色体への組込み体（遺伝子的に安定な遺伝）として維持されるように、ＤＮＡを生物内へと導入することを意味する。別段に言及しない限り、本明細書で用いられる、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換する方法は、ＣａＣｌ２ベースの方法（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ、前出）であった。オオムギを形質転換するには、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属を介する形質転換（宿主として代替的な栽培品種を用い得る場合を除き、Ｔｉｎｇａｙら（１９９７年）またはＷａｎｇら（２００１年）により説明される通りであることが好ましい）を実施することができる。
【００６０】
「トランス遺伝子」とは、形質転換手順によりゲノム内へと導入された遺伝子である。
【００６１】
本明細書で用いられる「トランスジェニック」とは、異種核酸を導入することにより改変された細胞への言及、または細胞が、このようにして改変された細胞に由来することへの言及を包含する。したがって、例えば、トランスジェニック細胞は、細胞の天然形態内では同一の形態で見出されない遺伝子を発現するか、または意図的で人為的な介入の結果として、別の異常な形で発現するか、過小発現するか、またはまったく発現しない天然遺伝子を発現する。植物体、特に、オオムギ植物体との関連において本明細書で用いられる「トランスジェニック」という用語は、従来の植物育種法による細胞の変化（例えば、ＮａＮ３ベースの変異誘発、または意図的で人為的な介入を伴わない天然のイベントによる）を包含しない。
【００６２】
「野生オオムギ」（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  ｓｓｐ．  ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ）は、現行のオオムギの栽培形態の前駆体であると考えられる。野生状態から栽培状態へのオオムギの移行は、「オオムギ在来種」への該植物体の栽培化と符合したと考えられている。これらは、野生オオムギより、新型栽培品種との遺伝子的類縁性がより密接である。
【００６３】
「野生型」オオムギという用語は、従来の方法で生成されたオオムギ植物体を指す。好ましくは、該用語は、本発明のオオムギ植物体が由来するオオムギ植物体、すなわち、親植物体を指す。野生型オオムギ穀粒は、一般に、例えば、種子メーカーから、「栽培品種」または「品種」、すなわち、米国国立の植物育種機関により列挙される遺伝子的に類似の穀粒として市販されている。複数のヌルＬＯＸ−１オオムギ栽培品種（例えば、栽培品種ＣｈａｍｏｎｉｘおよびＣｈａｒｍａｙ）が入手可能であるが、本明細書では、本発明をよりよく理解する目的で、すべてのヌルＬＯＸ−１植物体、ヌルＬＯＸ−２植物体、および二重ヌルＬＯＸ植物体を変異体の植物体と考え、野生型の植物体は変異体の植物体とは考えない。本明細書では、「栽培品種」および「品種」という表記法は、互換的に用いられる。
【００６４】
「ウォート」という用語は、モルト、例えば、破砕モルトもしくはグリーンモルト、または破砕グリーンモルトの液体抽出物を意味する。オオムギの醸造において、ウォートはまた、モルト化させていないオオムギの抽出物を、オオムギ成分を加水分解する酵素の混合物と共にインキュベートすることによっても調製することができる。前記モルトまたはオオムギ由来の抽出物に加えて、該液体抽出物は、モルトと、発酵性の糖へと部分的に転換されるさらなるデンプン含有物質など、さらなる成分とから調製することができる。ウォートは、一般に、マッシングにより得られるが、場合によって、「スパージング」、マッシング後において、ビール粕から、残存する糖および他の化合物を熱湯により抽出する工程をその後で実施する。スパージングは、ロイタータン、マッシュフィルター、またはビール粕から抽出される水の分離を可能とする別の装置内で実施することが典型的である。マッシング後において得られるウォートを、一般に、「一番ウォート」と称するのに対し、スパージング後において得られるウォートを、一般に、「二番ウォート」と称する。指定しない限り、ウォートという用語は、一番ウォートの場合もあり、二番ウォートの場合もあり、両者の組合せの場合もある。ビール生産時には、一般に、ウォートをホップと共に煮沸する。ホップを伴うが煮沸していないウォートをまた、「スイートウォート」とも称し得るのに対し、ホップを伴って煮沸したウォートは、「煮沸ウォート」と称し得る。
【００６５】
オオムギ植物体
オオムギとは、植物の科である。「野生オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  ｓｓｐ．  ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ）」は、今日におけるオオムギの栽培形態の前駆体であると考えられる。野生状態から栽培状態へのオオムギの移行は、多数の遺伝子座における対立遺伝子の根本的な変化の頻度と符合したと考えられている。希少な対立遺伝子、および新規の変異イベントは、「オオムギ在来種」と称する栽培化された植物体集団内において新規の形質を迅速に確立した農耕民により、肯定的に選択された。これらは、野生オオムギより、新型栽培品種との遺伝子的類縁性がより密接である。１９世紀後半まで、オオムギ在来種は、早期世代における無作為的な異種交配に由来する少数の植物体を含めた、近交系と交配分離種との高度にヘテロ接合型の混合体として存在した。該在来種の大半は、先進農業において、純粋系統の栽培品種により置き換えられている。中等レベルまたは高レベルの遺伝子的多様性が、残りの在来種を特徴付けている。当初、「新型オオムギ」栽培品種は、在来種からの選択を表していた。これらは後に、地理的起源が多様な純粋系統など、確立された純粋系統間における異種交配の継起的サイクルに由来した。最終的な結果は、多くの、おそらくはすべての先進農業における遺伝的基盤の顕著な狭小化であった。在来種と比較して、新型オオムギ栽培品種は、例えば、
（ｉ）穀粒が皮裸性であること；
（ｉｉ）種子の休眠；
（ｉｉｉ）病害耐性；
（ｉｖ）環境忍容性（例えば、干ばつまたは土壌ｐＨに対する耐性）；
（ｖ）リシンおよび他のアミノ酸の比率；
（ｖｉ）タンパク質含量；
（ｖｉｉ）窒素含量；
（ｖｉｉｉ）炭水化物組成；
（ｉｘ）ホルデイン含量および組成；
（ｘ）（１−３，１−４）−β−グルカンおよびアラビノキシラン含量；
（ｘｉ）収量；
（ｘｉｉ）茎の堅さ；
（ｘｉｉｉ）草高
などであるがこれらに限定されない１または複数の多くの特性が改善されている（Ｎｅｖｏ、１９９２年；ｖｏｎ  Ｂｏｔｈｍｅｒら、１９９２年）。
【００６６】
本発明の範囲内において、「オオムギ植物体」という用語は、任意のオオムギ植物体を含む。したがって、本発明は、ＬＯＸ−１活性の機能の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、ＬＯＸ−２活性の機能の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異とを含む、任意のオオムギ植物体に関する。したがって、本発明は、機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異とを含む、任意のオオムギ植物体に関する。
【００６７】
しかし、本発明により用いるのに好ましいオオムギ植物体は、新型オオムギ栽培品種または純粋系統である。本発明により用いられるオオムギ栽培品種は、例えば、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ、Ｃｅｌｅｓｔｅ、Ｌｕｘ、Ｐｒｅｓｔｉｇｅ、Ｓａｌｏｏｎ、Ｎｅｒｕｄａ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｋｌａｇｅｓ、Ｍａｎｌｅｙ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｓｔｉｒｌｉｎｇ、Ｃｌｉｐｐｅｒ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ａｌｅｘｉｓ、Ｂｌｅｎｈｅｉｍ、Ａｒｉｅｌ、Ｌｅｎｋａ、Ｍａｒｅｓｉ、Ｓｔｅｆｆｉ、Ｇｉｍｐｅｌ、Ｃｈｅｒｉ、Ｋｒｏｎａ、Ｃａｍａｒｇｕｅ、Ｃｈａｒｉｏｔ、Ｄｅｒｋａｄｏ、Ｐｒｉｓｍａ、Ｕｎｉｏｎ、Ｂｅｋａ、Ｋｙｍ、アサヒ５号、ＫＯＵ  Ａ、Ｓｗａｎ  Ｈａｌｓ、カントウナカテゴールド、ハカタ２号、キリン直１号、関東後期品種ゴールド、フジニジョウ、ニューゴールデン、サツキオニジョウ、セイジョウ１７号、アカギニジョウ、アズマゴールデン、アマギニジョウ、ニシノゴールド、ミサトゴールデン、ハルナニジョウ、Ｓｃａｒｌｅｔｔ、およびＪｅｒｓｅｙ、好ましくは、ハルナニジョウ、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ、Ｃｅｌｅｓｔｅ、Ｌｕｘ、Ｐｒｅｓｔｉｇｅ、Ｓａｌｏｏｎ、Ｎｅｒｕｄａ、およびＰｏｗｅｒからなる群から、好ましくは、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｋｌａｇｅｓ、Ｍａｎｌｅｙ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｓｔｉｒｌｉｎｇ、Ｃｌｉｐｐｅｒ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ａｌｅｘｉｓ、Ｂｌｅｎｈｅｉｍ、Ａｒｉｅｌ、Ｌｅｎｋａ、Ｍａｒｅｓｉ、Ｓｔｅｆｆｉ、Ｇｉｍｐｅｌ、Ｃｈｅｒｉ、Ｋｒｏｎａ、Ｃａｍａｒｇｕｅ、Ｃｈａｒｉｏｔ、Ｄｅｒｋａｄｏ、Ｐｒｉｓｍａ、Ｕｎｉｏｎ、Ｂｅｋａ、Ｋｙｍ、アサヒ５号、ＫＯＵ  Ａ、Ｓｗａｎ  Ｈａｌｓ、カントウナカテゴールド、ハカタ２号、キリン直１号、関東後期品種ゴールド、フジニジョウ、ニューゴールデン、サツキオニジョウ、セイジョウ１７号、アカギニジョウ、アズマゴールデン、アマギニジョウ、ニシノゴールド、ミサトゴールデン、ハルナニジョウ、Ｓｃａｒｌｅｔｔ、およびＪｅｒｓｅｙからなる群から、好ましくは、ハルナニジョウ、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ、Ｔａｎｇｅｎｔ、Ｌｕｘ、Ｐｒｅｓｔｉｇｅ、Ｓａｌｏｏｎ、Ｎｅｒｕｄａ、Ｐｏｗｅｒ、Ｑｕｅｎｃｈ、ＮＦＣ  Ｔｉｐｐｌｅ、Ｂａｒｋｅ、Ｃｌａｓｓ、およびＶｉｎｔａｇｅからなる群から選択することができる。
【００６８】
したがって、本発明の一実施形態では、オオムギ植物体が、機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失など、ＬＯＸ−１活性の機能の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失など、ＬＯＸ−２活性の機能の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異とを含む新型オオムギ栽培品種（好ましくは、本明細書の上記で説明したオオムギ栽培品種の群から選択される栽培品種）である。したがって、この実施形態では、オオムギ植物体が、オオムギ在来種ではないことが好ましい。
【００６９】
オオムギ植物体は、任意の適切な形態であり得る。例えば、本発明によるオオムギ植物体は、生存オオムギ植物体、乾燥植物体、ホモジナイズされた植物体、または破砕オオムギ穀粒であり得る。植物体は、成熟植物体、胚芽、発芽穀粒、モルト化穀粒、破砕モルト化穀粒などであり得る。
【００７０】
オオムギ植物体の一部は、穀粒、胚芽、葉、茎、根、花、またはこれらの断片など、該植物体の任意の適切な部分であり得る。断片は、例えば、穀粒、胚芽、葉、茎、根、または花の切片であり得る。オオムギ植物体の一部はまた、ホモジネートの断片、または破砕オオムギ植物体もしくは破砕穀粒の断片でもあり得る。
【００７１】
本発明の一実施形態では、オオムギ植物体の一部が、前記オオムギ植物体の細胞、好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで組織培養物中で増殖させ得る生細胞であり得る。特に、一実施形態では、前記細胞が、全オオムギ植物体へと成熟することが不可能な細胞、すなわち、生殖材料ではない細胞であり得る。
【００７２】
ＬＯＸ活性の機能の喪失
本発明は、第１および第２の変異を有するオオムギ植物体（またはそれらの一部、またはそれらの生成物）に関し、該第１の変異が、ＬＯＸ−１活性の機能の完全な喪失をもたらし、該第２の変異が、ＬＯＸ−２活性の機能の完全な喪失をもたらす。したがって、例えば、第１の変異は、機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失をもたらし、第２の変異は、機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失をもたらす。
【００７３】
ＬＯＸ−１活性の機能の完全な喪失（機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失など）と、ＬＯＸ−２活性の機能の完全な喪失（機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失など）とは、異なる機構に個別に基づき得る。例えば、ＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性の一方または両方の機能の完全な喪失は、オオムギ植物体内において機能不全のタンパク質、すなわち、検出可能な９−ＨＰＯＤＥ形成活性（例えば、実施例４で説明される通りに決定される）を示さない、変異ＬＯＸ−１タンパク質、および／または検出可能な１３−ＨＰＯＤＥ形成活性（例えば、実施例４で説明される通りに決定される）を示さない、変異ＬＯＸ−２タンパク質など、機能不全のＬＯＸ−１タンパク質および／またはＬＯＸ−２タンパク質により引き起こされ得る。
【００７４】
ＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性の一方または両方の機能の完全な喪失は、ＬＯＸ−１タンパク質および／またはＬＯＸ−２タンパク質の欠如により引き起こされ得る。ＬＯＸ−１タンパク質の欠如が、機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失をもたらし、ＬＯＸ−２タンパク質の欠如が、機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失をもたらすことは明らかである。したがって、オオムギ植物体は、ＬＯＸ−１タンパク質および／またはＬＯＸ−２タンパク質を含まない（またはこれらをごく少量しか含まず、より好ましくは、検出可能なＬＯＸ−１タンパク質および／またはＬＯＸ−２タンパク質を含まない）ことが好ましい。ＬＯＸ−１タンパク質および／またはＬＯＸ−２タンパク質は、当業者に公知の任意の適切な手段により検出することができる。しかし、該タンパク質（複数可）は、ＬＯＸ−１タンパク質が、ＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２に対するポリクローナル抗体など、ＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２に対する特異的抗体により検出される技法により検出されることが好ましい。前記技法は、例えば、ウェスタンブロット法の場合もあり、ＥＬＩＳＡ法の場合もある。前記抗体は、モノクローナル抗体の場合もあり、ポリクローナル抗体の場合もある。しかし、前記抗体は、ＬＯＸ−１タンパク質およびＬＯＸ−２タンパク質それぞれの内における複数の異なるエピトープを認識するポリクローナル性質であることが好ましい。ＬＯＸ−１タンパク質および／またはＬＯＸ−２タンパク質はまた、例えば、ＬＯＸ−１活性を決定する方法によって、またはＬＯＸ−２活性を決定する方法によって間接的に検出することもできる。本発明の好ましい一実施形態では、ＬＯＸ−１タンパク質が、国際特許出願第ＷＯ２００５／０８７９３４号の実施例４で概観された方法を用いて検出される。ＬＯＸ−２タンパク質は、ＬＯＸ−２に結合する抗体を用いて、同様の方法で検出することができる。
【００７５】
ＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性の一方または両方の機能の完全な喪失はまた、ＬＯＸ−１転写物および／またはＬＯＸ−２転写物の発現が見られない結果の場合もあり、これらがごくわずかしか見られない結果の場合もあるが、これらの発現が見られない結果の場合が好ましい。当業者は、ＬＯＸ−１転写物またはＬＯＸ−２転写物の不在がまた、それぞれ、翻訳されるＬＯＸ−１タンパク質またはＬＯＸ−２タンパク質の不在も結果としてもたらすことを認めるであろう。代替的に、ＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性の一方または両方の機能の完全な喪失（例えば、機能的ＬＯＸ−１酵素および機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失）はまた、異常なＬＯＸ−１転写物および／または異常なＬＯＸ−２転写物が発現する結果でもあり得る。異常なＬＯＸ−１転写物および／または異常なＬＯＸ−２転写物は、例えば、スプライス部位における変異に起因する、転写物のスプライシングの異常により引き起こされ得る。したがって、本発明のオオムギ植物体は、５’側スプライス部位または３’側スプライス部位、例えば、イントロンの最も５’側の２ヌクレオチドのうちの１つ、またはイントロンの最も３’側のヌクレオチドのうちの１つなど、スプライス部位内において変異を保有し得る。ＬＯＸ−１転写物のスプライシングの異常を示す変異体の例は、ＷＯ２００５／０８７９３４において、変異体Ａ６１８として記載されている。ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−２をコードする転写物の発現は、例えば、ノーザンブロット実験により検出することもでき、ＲＴ−ＰＣＲ実験により検出することもできる。
【００７６】
本発明のオオムギ植物体における機能的ＬＯＸ−１酵素および機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失は、変異により引き起こされる。したがって、本発明のオオムギ植物体は、一般に、ＬＯＸ−１遺伝子において変異を保有する。前記変異は、制御領域内、例えば、プロモーター内またはイントロン内の場合もあり、コード領域内の場合もある。同様に、本発明のオオムギ植物体は、一般に、ＬＯＸ−２遺伝子において変異を保有する。前記変異は、制御領域内、例えば、プロモーター内またはイントロン内の場合もあり、コード領域内の場合もある。したがって、機能的ＬＯＸ−１酵素および／または機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失の原因はまた、ＬＯＸ−１をコードする遺伝子内、またはＬＯＸ−２をコードする遺伝子内の変異を同定することによっても検出することができる。ＬＯＸ−１をコードする遺伝子内の変異は、例えば、前記遺伝子を配列決定することにより検出することができる。変異を同定した後で、ＬＯＸ−１活性および／またはＬＯＸ−２活性について調べることにより、機能の完全な喪失を確認することが好ましい。
【００７７】
「ＬＯＸ−１タンパク質」という用語は、ＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号３、またはＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号７で示されるオオムギの全長ＬＯＸ−１タンパク質またはその機能的相同体を対象とすることを意図する。ＬＯＸ−１の活性部位は、該酵素のＣ末端部分に位置する。特に、アミノ酸残基５２０〜８６２の範囲の領域またはその一部が、ＬＯＸ−１活性に関与すると予測される。したがって、一実施形態では、ヌルＬＯＸ−１オオムギが、ＬＯＸ−１のアミノ酸５２０〜８６２のうちの一部または全部を欠く、ＬＯＸ−１の変異形態をコードする遺伝子を含むことが好ましい。前記変異ＬＯＸ−１はまた、野生型のＬＯＸ−１には存在する他のアミノ酸残基も欠く可能性がある。
【００７８】
したがって、本発明の二重ヌルＬＯＸオオムギは、機能的でないＬＯＸ−１の切断形態（Ｎ末端切断形態またはＣ末端切断形態など）を含み得る。前記切断形態は、含むＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号３のＬＯＸ−１の連続アミノ酸が、８００以下、より好ましくは７５０以下、なおより好ましくは７００以下、さらにより好ましくは６９０以下、なおより好ましくは６８０以下、さらにより好ましくは、ＬＯＸ−１の６６５以下、例えば、６５０以下など、６００以下、例えば、５５０以下など、５００以下、例えば、４５０以下など、４２５以下、例えば、３９９以下の連続アミノ酸など、６７０以下であることが好ましい。前記切断形態は、ＬＯＸ−１のＮ末端断片だけを含むことが好ましく、含むＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号３のＮ末端アミノ酸が、好ましくは最大で８００、より好ましくは最大で７５０、なおより好ましくは最大で７００、さらにより好ましくは最大で６９０、なおより好ましくは最大で６８０、さらにより好ましくは最大で６７０、さらにより好ましくは、ＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号３の６６５以下、例えば、６５０以下など、６００以下、例えば、最大で５５０など、最大で５００、例えば、最大で４５０など、最大で４２５、例えば、最大で３９９のＮ末端アミノ酸など、最大で６６５であることが好ましい。
【００７９】
極めて好ましい一実施形態では、切断形態が、ＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号３のアミノ酸１〜６６５からなり得る。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のオオムギ植物体が、野生型ＬＯＸ−１  ｍＲＮＡの終止コドンの上流において、ナンセンスコドンまたは終止コドンを含むｍＲＮＡへと転写される、ＬＯＸ−１コード遺伝子を含む。本明細書では、このようなナンセンスコドンを、未熟ナンセンスコドンと称する。前記植物体のｍＲＮＡへと転写されるすべてのＬＯＸ−１コード遺伝子は、未熟ナンセンスコドンまたは未熟終止コドンを含む。該ナンセンスコドンまたは終止コドンは、開始コドンの最大で８００コドン下流に位置することが好ましく、より好ましくは最大で７５０コドン、なおより好ましくは最大で７００コドン、さらにより好ましくは最大で６９０コドン、なおより好ましくは最大で６８０コドン、さらにより好ましくは最大で６７０コドン、なおより好ましくは最大で６６５コドン下流に位置する。ＬＯＸ−１をコードする野生型ゲノムＤＮＡの配列は、ＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号１、またはＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号５において与えられる。
【００８１】
好ましい一実施形態では、本発明のオオムギ植物体が、ＬＯＸ−１をコードする遺伝子を含み、前記遺伝子から転写されるプレｍＲＮＡが、ＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号２に対応する配列を含む。
【００８２】
本発明の極めて好ましい実施形態では、本発明による二重ヌルＬＯＸオオムギ植物体の変異体ＬＯＸ−１をコードする遺伝子が、ナンセンス変異を含み、前記変異が、ＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号１の３５７４位におけるＧ→Ａ置換に対応する。
【００８３】
「ＬＯＸ−２タンパク質」という用語は、本公開の配列番号５で示されるオオムギの全長ＬＯＸ−２タンパク質またはその機能的相同体を対象とすることを意図する。ＬＯＸ−２の活性部位は、ＬＯＸ−２のＣ末端部分に位置する。特に、アミノ酸残基５１５〜７１７の範囲の領域またはその一部が、ＬＯＸ−２活性に関与すると予測される。ダイズＬＯＸ−１の結晶構造についての検討に基づくと、オオムギのＬＯＸ−２酵素の活性部位の裂け目について予測される配列の連なりは、アミノ酸残基５１５〜５２５および７０７〜７１７により表される。翻訳された、変異ＬＯＸ−２タンパク質、すなわち、二重ヌルＬＯＸオオムギの変異体Ａ６８９のＬＯＸ−２のＣ末端切断形態が含有する残基は最大で６８４であり、したがって、活性部位の裂け目の第２の配列の連なりを欠く（これを不活化する）。したがって、本発明の一実施形態では、本発明の二重ヌルＬＯＸオオムギが、ＬＯＸ−２のアミノ酸５１５〜７１７のうちの一部または全部を欠く、好ましくはアミノ酸７０７〜７１７のうちの一部または全部を欠く、なおより好ましくはアミノ酸７０７〜７１７のうちの全部を欠く、ＬＯＸ−２の変異形態をコードする遺伝子を含むことが好ましい。前記変異体のＬＯＸ−２はまた、野生型のＬＯＸ−２には存在する他のアミノ酸残基も欠く可能性がある。
【００８４】
したがって、二重ヌルＬＯＸオオムギは、Ｎ末端切断形態またはＣ末端切断形態など、機能的でないＬＯＸ−２の切断形態を含み得る。前記切断形態は、含む本公開の配列番号５のＬＯＸ−２の連続アミノ酸が、８００以下、より好ましくは７５０以下、なおより好ましくは７２５以下、さらにより好ましくは７００以下、なおより好ましくは６９０以下、さらにより好ましくは６８４以下であることが好ましい。前記切断形態は、ＬＯＸ−２のＮ末端断片だけを含むことが好ましい。よって、前記切断形態は、含む本公開の配列番号５のＮ末端アミノ酸が、好ましくは最大で８００、より好ましくは最大で７５０、なおより好ましくは最大で７２５、さらにより好ましくは最大で７００、なおより好ましくは最大で６９０、さらにより好ましくは最大で６８４である。
【００８５】
極めて好ましい一実施形態では、切断形態が、本公開の配列番号５のアミノ酸１〜６８４からなり得る。
【００８６】
本発明の好ましい実施形態では、オオムギ植物体が、野生型ＬＯＸ−２  ｍＲＮＡの終止コドンの上流において、ｍＲＮＡナンセンスコドンまたは終止コドンを含む、ＬＯＸ−２のｍＲＮＡへと転写される遺伝子を含む。本明細書では、このようなナンセンスコドンを、未熟ナンセンスコドンと称する。前記植物体のＬＯＸ−２をコードするｍＲＮＡへと転写されるすべての遺伝子は、未熟ナンセンスコドンまたは未熟終止コドンを含む。該ナンセンスコドンまたは終止コドンは、開始コドンの最大で８００コドン下流に位置することが好ましく、より好ましくは最大で７５０コドン、なおより好ましくは最大で７２５コドン、さらにより好ましくは最大で７００コドン、なおより好ましくは最大で６９０コドン、さらにより好ましくは最大で６８４コドン下流に位置する。ＬＯＸ−２をコードする野生型ゲノムＤＮＡの配列は、本公開の配列番号１において与えられる。
【００８７】
本発明の極めて好ましい実施形態では、二重ヌルＬＯＸオオムギ植物体の変異ＬＯＸ−２をコードする遺伝子が、ナンセンス変異を含み、前記変異が、配列番号１の２６８９位におけるＧ→Ａ置換に対応する。
【００８８】
本発明によるオオムギ植物体は、当業者に公知の任意の適切な方法により、好ましくは、本明細書下記の節「二重ヌルＬＯＸオオムギの調製」で概観される方法のうちの１つにより調製することができる。
【００８９】
本発明の一実施形態では、本発明による、二重ヌルＬＯＸオオムギ植物体が、野生型オオムギと同等の、植物体生育の生理学的特徴および穀粒の発生学的特徴を有することが好ましい。よって、本明細書では、ヌルＬＯＸ−１オオムギ植物体が、草高、植物体１体当たりのひこばえ数、開花の開始、および／または１穂当たりの穀粒数に関して、野生型オオムギと同様であることが好ましい。
【００９０】
また、本発明による二重ヌルＬＯＸオオムギ植物体は、草高、開花日、病害耐性、倒伏、穂の切れ毛、成熟期、および収量に関して、野生型と同様、特に、栽培品種Ｂａｒｋｅと同様であるであることが好ましい。本明細書の文脈において、「同様」とは、数の場合、同一±１０％として理解すべきである。これらのパラメータは、本明細書下記の実施例５で説明する通りに決定することができる。
【００９１】
本発明の極めて好ましい実施形態では、オオムギ植物体が、「オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  Ｌ．）：Ａ６８９系統」という名称で、２００８年１２月４日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ），  Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１１０，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓにその種子が寄託（受託番号ＰＴＡ−９６４０）されたオオムギ植物体である。したがって、本発明のオオムギ植物体は、Ａ６８９系統（ＡＴＣＣ特許受託番号：ＰＴＡ−９６４０）のオオムギ、またはその任意の子孫オオムギ植物体であり得る。
【００９２】
オオムギ変異体の調製
本発明によるオオムギ植物体は、当業者に公知の任意の適切な方法により調製することができる。本発明のオオムギ植物体は、オオムギ植物体またはそれらの一部、例えば、オオムギ穀粒を変異させるステップの後で、機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失など、ＬＯＸ−１活性の機能の完全な喪失と、機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失など、ＬＯＸ−２活性の機能の完全な喪失とを特徴とするオオムギ植物体をスクリーニングおよび選択するステップを含む方法により調製する。好ましい一実施形態では、オオムギ植物体またはそれらの一部（例えば、オオムギ穀粒）を変異させるステップを伴う方法であって、前記オオムギ植物体が、機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失を引き起こす変異を既に保有する方法によりオオムギ植物体を調製することができる。このようなオオムギ植物体は、例えば、国際特許出願第ＷＯ２００５／０８７９３４号において記載されている。
【００９３】
興味深い一態様では、本発明が、ＬＯＸ−２活性の完全な喪失を引き起こす変異を保有するオオムギ植物体の同定を可能とする、新規で極めて有効なスクリーニング法に関する。新規で再現可能なスクリーニング法により、ＬＯＸ−２活性をまったく示さないか、またはＬＯＸ−２活性が極めて低いオオムギ植物体の同定が可能となる。この新規のスクリーニング法は、出発材料として発芽胚芽を用いることを包含する。興味深いことに、最大で２１，０００個の成熟胚芽をスクリーニングしたところ、単一ヌルＬＯＸ−２オオムギ変異体も明らかにならなかったことに基づき、出発材料として成熟胚芽を用いることが、ＬＯＸ−２活性をスクリーニングするのにあまり好ましくないことを、本発明者らは見出した。
【００９４】
したがって、新規のスクリーニング法の１つの重要な特徴は、ＬＯＸ−２活性を検出するための出発物質として発芽胚芽を用いることに関する。
【００９５】
したがって、二重ヌルＬＯＸオオムギ植物体を調製する方法であって、
（ｉ）機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失など、ＬＯＸ−１活性の機能を完全に喪失させたオオムギ植物体またはその一部を供給するステップと；
（ｉｉ）前記オオムギ植物体、ならびに／または前記オオムギ植物体に由来するオオムギ細胞、および／もしくはオオムギ組織、および／もしくはオオムギ穀粒、および／もしくはオオムギ胚芽を変異誘発し、これにより、Ｍ０世代のオオムギを得るステップと；
（ｉｉｉ）前記変異誘発されたオオムギ植物体、オオムギ穀粒、および／またはオオムギ胚芽を、少なくとも２世代にわたり育種し、これにより、Ｍｘ（ここで、ｘは、≧２の整数である）世代のオオムギ植物体を得るステップと；
（ｉｖ）前記Ｍｘ世代のオオムギ植物体から胚芽を得るステップと；
（ｖ）前記胚芽を発芽させるステップと；
（ｖｉ）前記発芽した胚芽またはそれらの一部の内におけるＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性を決定するステップと；
（ｖｉｉ）該発芽した胚芽におけるＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性を完全に喪失させた植物体を選択するステップと；
（ｖｉｉｉ）ＬＯＸ−１遺伝子およびＬＯＸ−２遺伝子内の変異について解析するステップと；
（ｉｘ）ＬＯＸ−１遺伝子内およびＬＯＸ−２遺伝子において変異を保有する植物体を選択するステップと
を含み、これらにより、ＬＯＸ−１遺伝子内およびＬＯＸ−２遺伝子において変異を保有し、ＬＯＸ−１活性の完全な喪失およびＬＯＸ−２活性の完全な喪失を引き起こすオオムギ植物体を得る方法を提供することが、本発明の目的である。
【００９６】
ＬＯＸ−１活性を完全に喪失させた前述のオオムギ植物体は、例えば、ＷＯ２００５／０８７９３４において記載される、ＬＯＸ−１活性を完全に喪失させたオオムギ植物体のうちのいずれかであり得、変異体Ｄ１１２またはその子孫植物体であることが好ましい。
【００９７】
前述の列挙におけるステップ（ｉｉ）は、オオムギ植物体、オオムギ細胞、オオムギ組織、オオムギ穀粒、およびオオムギ胚芽からなる群から選択され、好ましくは、オオムギ植物体、オオムギ穀粒、およびオオムギ胚芽からなる群から選択される生存物質、より好ましくは、オオムギ穀粒を変異誘発するステップを伴い得る。
【００９８】
変異誘発は、任意の適切な方法により実施することができる。一実施形態では、オオムギ植物体、またはその一部（例えば、オオムギ穀粒またはオオムギに由来する個々の細胞）を、変異誘発剤と共にインキュベートすることにより、変異誘発を実施する。前記薬剤は当業者に公知であり、例えば、アジドナトリウム（ＮａＮ３）、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、アジドグリセロール（ＡＧ、３−アジド−１，２−プロパンジオール）、メチルニトロソウレア（ＭＮＵ）、およびマレインヒドラジド（ＭＨ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９９】
別の実施形態では、例えば、オオムギ植物体または穀粒などその一部を紫外線で照射することにより、変異誘発を実施する。本発明の好ましい実施形態では、本明細書下記の節「化学的変異誘発」において概観される方法のうちのいずれかにより、変異誘発を実施する。適切な変異誘発プロトコールの非限定的な例は、実施例２において与えられている。
【０１００】
変異誘発は、Ｍ３世代のオオムギをスクリーニングするとき、所望の変異体の予測頻度が、穀粒１０，０００個当たり０．５〜５個の範囲内など、少なくとも０．５個、例えば、０．９〜２．３個の範囲内であるように実施することが好ましい。好ましい実施形態では、オオムギ穀粒を対象として変異誘発を実施する。変異原に適用される穀粒を、Ｍ０世代と称する（図１もまた参照されたい）。
【０１０１】
ＬＯＸ活性は、発芽オオムギ胚芽に由来する試料中において、好ましくは、発芽オオムギ胚芽に由来する液体抽出物中において決定することができる。前記抽出物などの前記試料は、前記発芽胚芽の任意の適切な部分から調製することができる。一般に、前記試料の抽出物を調製し、ＬＯＸ−２活性を決定する前に、任意の適切な方法を用いて、オオムギ試料をホモジナイズしなければならない。特に、発芽胚芽またはその一部からタンパク質抽出物を調製し、前記タンパク質抽出物を用いてＬＯＸ活性を決定することが好ましい。ホモジナイゼーションは、例えば、機械的な力を用いて、例えば、ガラスビーズまたは砂ビーズなど、ビーズの存在下において振とうすることによるなど、振とうまたは撹拌することにより実施することができる。
【０１０２】
好ましい実施形態では、発芽胚芽が、Ｍｘ（ここで、ｘは、≧２の整数であり；ｘは、好ましくは２〜１０の範囲内、より好ましくは３〜８の範囲内の整数である）世代である。極めて好ましい実施形態では、ＬＯＸ活性を、Ｍ３世代の発芽胚芽、またはこのような胚芽に由来する試料中において決定する。その実施形態では、変異誘発したＭ０世代のオオムギ穀粒を成長させてオオムギ植物体を得、これを異種交配させてＭ１世代の穀粒を得ることが好ましい。Ｍ３世代の穀粒が得られるまで、この手順を反復する（図１も参照されたい）。
【０１０３】
ＬＯＸ活性の決定は、任意の適切なアッセイを用いて、好ましくは、本明細書の下記で概観する方法のうちの１つにより実施することができる。特に、アッセイは、ＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２により、リノール酸から、９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥをもたらす二原子酸素添加反応についてのデータを提供することが好ましい。したがって、一般に、アッセイするステップは、
（ｉ）発芽したオオムギ胚芽またはその一部から調製されたタンパク質抽出物を供給するステップと；
（ｉｉ）リノール酸を供給するステップと；
（ｉｉｉ）前記タンパク質抽出物を、前記リノール酸と共にインキュベートするステップと；
（ｉｖ）リノール酸から９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥをもたらす二原子酸素添加反応を検出するステップと
を伴う。
【０１０４】
該方法のステップ（ｉｖ）は、前記発芽胚芽において、好ましくは前記発芽胚芽から調製されたタンパク質抽出物内において、９−ＨＰＯＤＥレベルおよび１３−ＨＰＯＤＥレベルを決定するステップを含むことが好ましい。該ステップは、９−ＨＰＯＤＥレベルおよび１３−ＨＰＯＤＥレベルを直接的または間接的に決定することを含み得る。全ＨＰＯＤＥの総レベルを決定することができるが、この場合は、確認のために９−ＨＰＯＤＥの特異的な測定および１３−ＨＰＯＤＥの特異的な測定を実施することが好ましい。例えば、１つの方法は、発芽胚芽からのタンパク質抽出物を、９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥを形成させるための基質としてのリノール酸と共にインキュベートする方法であり得るであろう。その場合、前記ＨＰＯＤＥは、各種の方法により検出することができる。１つの方法は、色素など、検出可能な化合物の生成を伴い得る。例えば、該方法は、ヘモグロビンの存在下において、３−ジメチルアミノ安息香酸と、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとを酸化的に結合させ、形成されたＨＰＯＤＥによる触媒でインダミン色素を形成することであり得、これを、分光光度計を用いて、Ａ５９５で測定することができる。このような方法の例を、本明細書下記の実施例１および２で説明する。このアッセイを用いると、吸光度の読取り値が、０．２Ａ５９５単位未満であれば、ＬＯＸ−１活性の不在およびＬＯＸ−２活性の不在を示すものとして考えられる。しかし、ＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性を決定するより正確な方法は、発芽胚芽からのタンパク質抽出物を、リノール酸と共にインキュベートし、その後、９−ＨＰＯＤＥ含量および１３−ＨＰＯＤＥ含量を決定することである。９−ＨＰＯＤＥ含量および１３−ＨＰＯＤＥ含量は、例えば、ＨＰＬＣベースの解析を用いて決定することができる。
【０１０５】
リノール酸から９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥをもたらす二原子酸素添加反応は、直接的に測定することもでき、間接的に測定することもできる。任意の適切な検出法を、本発明と共に用いることができる。本発明の一実施形態では、リノール酸ヒドロペルオキシドが検出される。９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥは、例えば、実施例４で説明されるＨＰＬＣなどのクロマトグラフィー法により直接的に検出することができる。
【０１０６】
本発明は、発芽胚芽からタンパク質を抽出する手順の特定の側面が極めて重要であることを開示する。したがって、酸性緩衝液、好ましくはｐＨが２〜６の範囲内、より好ましくは３〜５の範囲内、なおより好ましくは３．５〜５の範囲内、さらにより好ましくは４〜５の範囲内にある、なおより好ましくはｐＨが４．５の緩衝液を用いてタンパク質を抽出することが好ましい。抽出に用いられる緩衝液は、有機酸に基づくことが好ましく、乳酸緩衝液であることがより好ましい。タンパク質抽出物は、ｐＨ４．５の１００ｍＭ乳酸緩衝液を用いて調製されることが最も好ましい。
【０１０７】
本発明の一部の実施形態は、ヌルＬＯＸ−１およびヌルＬＯＸ−２植物体を検出する方法であって、９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥが、色素、例えば、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンと反応することを伴う方法を開示する。前記色素、例えば、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンは、リノール酸を添加した後で、タンパク質抽出物に添加することが好ましい。該色素は、タンパク質抽出物を、リノール酸と接触させた、好ましくは少なくとも１分後、より好ましくは少なくとも５分後、なおより好ましくは、１〜６０分間の範囲内、例えば、５〜３０分間の範囲内など、１０〜２０分間の範囲内など、少なくとも１０分後に添加することが好ましい。
【０１０８】
本発明によるオオムギ植物体を選択するのに好ましい方法については、本明細書下記の実施例２で詳述する。
【０１０９】
選択手順を、マイクロ滴定プレートベースのアッセイ手順、または他の公知の反復的なハイスループットアッセイフォーマットについて調整して、多くの試料の迅速なスクリーニングを可能とすることができる。少なくとも７５００個体など、少なくとも５０００個体、例えば、少なくとも１５，０００個体など、少なくとも１０，０００体、例えば、少なくとも２５，０００個体など、少なくとも２０，０００個体の変異誘発したオオムギ植物体を、ＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性について解析することが好ましい。
【０１１０】
ＬＯＸ−１をコードする遺伝子内の変異の決定は、複数の異なる方法により実施することができる。例えば、ＬＯＸ−１遺伝子を完全にまたは部分的に配列決定することができ、該配列を、ＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号１またはＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号５と比較することができる。特定の変異を検索する場合は、ＳＮＰ解析を適用することができる。当業者は、ＬＯＸ−１のコード配列内において未熟終止コドン（例えば、本明細書の上記で説明した未熟終止コドンのうちのいずれか）をもたらす変異など、所与の特異的な変異を検出するのに有用なプライマーをデザインすることができるであろう。ＬＯＸ−１遺伝子の３４７４位のヌクレオチドにおけるＧ→Ａ変異を検出するのに有用なプライマーによりＳＮＰ解析を実施する方法のうちの一例については、本明細書下記の実施例１０で説明する。
【０１１１】
ＬＯＸ−２をコードする遺伝子内の変異の決定は、複数の異なる方法により実施することができる。例えば、ＬＯＸ−２遺伝子を完全にまたは部分的に配列決定することができ、該配列を、本公開の配列番号１と比較することができる。特定の変異を検索する場合は、ＳＮＰ解析を適用することができる。当業者は、ＬＯＸ−２のコード配列内において未熟終止コドン（例えば、本明細書の上記で説明した未熟終止コドンのうちのいずれか）をもたらす変異など、所与の特異的な変異を検出するのに有用なプライマーをデザインすることができるであろう。ＬＯＸ−２遺伝子の２６８９位のヌクレオチドにおけるＧ→Ａ変異を検出するのに有用なプライマーによりＳＮＰ解析を実施する方法のうちの一例については、本明細書下記の実施例１０で説明する。
【０１１２】
本明細書の本節上記で説明した、二重ヌルＬＯＸオオムギ植物体を調製する方法のステップ（ｖｉｉｉ）および（ｉｘ）を、ステップ（ｖｉ）および（ｖｉｉ）の前に実施することができ、この場合、該方法は、ステップ（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｖｉ）、および（ｖｉｉ）を、この順序で含む。特に、これは、例えば、既に同定された二重ヌルＬＯＸオオムギ植物体の子孫植物体内において特定の変異を検索する場合であり得るであろう。
【０１１３】
ＬＯＸ−１遺伝子において特定の変異を含有し、ＬＯＸ−２遺伝子において特定の変異を含有する（上述の変異のうちのいずれかなどの変異を含有する）、二重ヌルＬＯＸオオムギ植物体を同定したら、当業者に周知の育種法など、従来の育種法により、同一の変異を示すさらなるオオムギ植物体を作製することができる。例えば、前記二重ヌルＬＯＸオオムギ植物体は、別のオオムギ栽培品種と戻し交配することができる。
【０１１４】
ＬＯＸ−１機能およびＬＯＸ−２機能を完全に喪失させた、有用なオオムギ植物体を選択した後で、場合によって、１または複数のさらなるスクリーニングを実施することができる。例えば、選択された変異体を、さらに繁殖させることができ、新世代の植物を、機能的ＬＯＸ−１酵素および機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失について調べることができる。
【０１１５】
有用なオオムギ植物体を選択した後で、これらを、従来の育種などの育種にかけることができる。育種法は、本明細書下記の節「植物体の育種」において説明する。
【０１１６】
植物生成物
本発明は、二重ヌルＬＯＸオオムギ植物体またはそれらの一部から調製された、Ｔ２Ｎポテンシャルレベルの低い飲料または他の植物生成物に関する。
【０１１７】
したがって、本発明は、上記で説明したオオムギ植物体またはそれらの一部を含む組成物の場合もあり、前記オオムギ植物体またはそれらの一部から調製された植物生成物など、前記オオムギ植物体またはそれらの一部から調製された組成物の場合もある。前記オオムギ植物体は、ＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性を欠くため、一般に、この組成物が含むＴ２Ｎポテンシャルレベルが極めて低い。機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失など、ＬＯＸ−１活性の機能の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失など、ＬＯＸ−２活性の機能の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異とを有するオオムギ植物体を含むか、またはこれらから調製される有用な組成物の例については、本明細書の下記で説明する。
【０１１８】
前記組成物は、野生型のオオムギ植物体、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製した同様の組成物と比較して、
（ｉ）含む遊離Ｔ２Ｎが、６０％未満、なおより好ましくは５０％未満、さらにより好ましくは、３０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満など、４０％未満であり；かつ／または
（ｉｉ）含むＴ２Ｎポテンシャルが、６０％未満、なおより好ましくは５０％未満、さらにより好ましくは、３０％未満、好ましくは２５％未満など、４０％未満である
ことが好ましい。Ｔ２Ｎの特異的な低下は、組成物の種類に応じて異なり得る。前述のＴ２Ｎの低下は、モルト、ウォート、および劣化飲料からなる群から選択される組成物に特に関与する。
【０１１９】
加えて、前記組成物は、ＷＯ２００５／０８７９３４で記載されるオオムギの変異体Ｄ１１２から同じ方法で調製した同様の組成物と比較して、
（ｉ）含む遊離Ｔ２Ｎが、８０％未満、好ましくは７０％未満、なおより好ましくは、５０％未満など、６０％未満であり；かつ／または
（ｉｉ）含むＴ２Ｎポテンシャルが、８０％未満、好ましくは７０％未満、なおより好ましくは、５０％未満など、６０％未満である
ことが好ましい。
【０１２０】
一態様では、本発明が、ＬＯＸ−１活性の機能の完全な喪失（機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失など）を結果としてもたらす第１の変異と、ＬＯＸ−２活性の機能の完全な喪失（機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失など）を結果としてもたらす第２の変異とを有するオオムギ穀粒に関する。本発明はまた、前記穀粒を含む組成物、および前記穀粒から調製される組成物の他、前記穀粒から調製される植物生成物にも関する。
【０１２１】
オオムギを高温処理および／または乳酸処理にかける場合がある浸漬工程により、オオムギ穀粒内のリポキシゲナーゼ活性を低下させ得ることが記載されている。このような処理は、所望の酵素活性、例えば、フィターゼ活性を低下させるなど、他の有害作用を示し得る。加えて、このような処理は、リポキシゲナーゼ活性を、加熱処理を行った時点と比べて低下させるだけであり、したがって、それ以前におけるリポキシゲナーゼ生成物の蓄積には影響を及ぼさない。
【０１２２】
したがって、一実施形態では、オオムギ穀粒を、少なくとも７０℃の温度での浸漬にはかけない方法を用いて、本発明による植物生成物を調製する。また、オオムギ穀粒を、乳酸の存在下において、少なくとも５７℃の温度での浸漬にはかけない方法を用いて、本発明による植物生成物を調製することも好ましい。
【０１２３】
一態様では、本発明が、モルト化により、二重ヌルＬＯＸオオムギから調製されるモルト組成物に関する。「モルト化」という用語により、制御された環境条件下で生じる、スティーピングされたオオムギ穀粒の発芽（例えば、図３、ステップ２および３で示される）が理解されるものとする。
【０１２４】
前記モルト組成物は、含む遊離Ｔ２Ｎが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製したモルト組成物と比較して、好ましくは３０％未満、より好ましくは２０％未満、なおより好ましくは１０％未満である。前記モルト組成物は、含む遊離Ｔ２Ｎが、ＷＯ２００５／０８７９３４で記載されるオオムギのヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２から同じ方法で調製したモルト組成物と比較して６０％未満、より好ましくは５０％未満であることがより好ましい。前記モルト組成物は、含むＴ２Ｎポテンシャルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製したモルト組成物と比較して６０％未満、好ましくは５０％未満、より好ましくは４０％未満、なおより好ましくは３０％未満、より好ましくは２０％未満、なおより好ましくは１０％未満であることがさらに好ましい。前記モルト組成物は、含むＴ２Ｎポテンシャルが、ＷＯ２００５／０８７９３４で記載されるオオムギのヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２から同じ方法で調製したモルト組成物と比較して６０％未満、より好ましくは５０％未満であることがより好ましい。モルト化とは、オオムギ穀粒を制御された形でスティーピングし、発芽させた後で、これを乾燥させる、好ましくは、これをキルン乾燥させる工程である。乾燥させる前の、スティーピングされて発芽したオオムギ穀粒を「グリーンモルト」と称するが、これもまた、本発明による植物生成物を表し得る。このイベントの連鎖は、主に、死滅した内胚乳の細胞壁を脱重合化させ、穀粒の栄養物質を移動させ、他の解重合酵素を活性化する過程において、穀粒の改変を引き起こす多数の酵素を合成するのに重要である。その後の乾燥させる工程では、化学褐色化反応によって、風味および色が生成される。モルトは主に、飲料を生産するのに用いられるが、それはまた、例えば、製パン業における酵素供給源として、またはモルトもしくは粉末モルトなど、食物産業における芳香剤および着色剤として、あるいは間接的に、モルトシロップなどとして、他の産業工程でも用いることができる。
【０１２５】
一態様では、本発明が、前記モルト組成物を生成させる方法に関する。該方法は、
（ｉ）ＬＯＸ二重ヌルオオムギ穀粒を供給するステップと；
（ｉｉ）前記穀粒をスティーピングするステップと；
（ｉｉｉ）該スティーピングされた穀粒を、所定の条件下で発芽させるステップと；
（ｉｖ）前記発芽した穀粒を乾燥させるステップと
を含み、これらにより、ＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性が完全に喪失したモルト組成物を生成させる。例えば、モルトは、Ｂｒｉｇｇｓら（１９８１年）およびＨｏｕｇｈら（１９８２年）により説明される方法のうちのいずれかにより生成させることができる。しかし、モルトを焙煎する方法などが含まれるがこれらに限定されない、特殊モルトを生成させるための方法など、モルトを生成させるのに適する他の任意の方法もまた用いることができる。非限定的な例については、実施例６および８で説明する。
【０１２６】
モルトは、例えば、破砕することにより、さらに加工することができる。したがって、本発明による植物生成物は、未加工モルト、または破砕モルト、もしくはその粉末など、任意の種類のモルトであり得る。破砕モルトおよびその粉末は、モルトの化学成分および再発芽する能力を欠く死滅細胞を含む。
【０１２７】
別の態様では、本発明による植物生成物が、オオムギシロップまたはオオムギモルトシロップなどのシロップを含み、またはさらにそれからなる。植物生成物はまた、オオムギまたはモルトの抽出物でもあり得る。
【０１２８】
別の態様では、本発明は、ＬＯＸ二重ヌルの穀粒に由来するモルト組成物から調製されるウォート組成物である植物生成物の種類に関する。前記モルトは、ＬＯＸ二重ヌルの穀粒だけから調製することもでき、他の穀粒も含む混合物から調製することもできる。本発明はまた、単独で、または他の成分と混合されたＬＯＸ二重ヌルのオオムギまたはその一部を用いて調製されるウォート組成物にも関する。
【０１２９】
前記ウォート組成物は、含む遊離Ｔ２Ｎが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製したウォート組成物と比較して３０％未満、より好ましくは２０％未満、なおより好ましくは１０％未満であることが好ましい。前記ウォート組成物は、含む遊離Ｔ２Ｎが、ＷＯ２００５／０８７９３４で記載されるオオムギの変異体Ｄ１１２から同じ方法で調製したウォート組成物と比較して６０％未満、より好ましくは５０％未満であることがより好ましい。前記ウォート組成物は、含むＴ２Ｎポテンシャルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製したウォート組成物と比較して好ましくは４０％未満、より好ましくは３０％未満、なおより好ましくは２５％未満であることがさらに好ましい。前記ウォート組成物は、含むＴ２Ｎポテンシャルが、ＷＯ２００５／０８７９３４で記載されるオオムギの変異体Ｄ１１２から同じ方法で調製したウォート組成物と比較して６０％未満、より好ましくは５０％未満であることがより好ましい。
【０１３０】
前記ウォートは、一番ウォート、および／または二番ウォート、および／またはさらなるウォートであり得る。ウォート組成物は、スイートウォートの場合もあり、煮沸ウォートの場合もあり、これらの混合物の場合もある。ウォート組成物はまた、オオムギウォートの場合もある。一般に、ウォート組成物は、高レベルのアミノ窒素と、発酵性炭水化物とを含有し、後者は主にマルトースである。図３では、ステップ４〜６により、モルトからウォートを調製する一般的な方法を示す。一般に、ウォートは、モルトと水とを混合およびインキュベートすることにより、すなわち、マッシング工程において調製する。マッシング時において、モルト／液体組成物には、炭水化物に富むさらなる添加組成物、例えば、破砕したオオムギ添加物、トウモロコシ添加物、またはコメ添加物を補充することができる。モルト化させていない穀類添加物は一般に、含有する活性酵素が少量であるか、または活性酵素を含有せず、このため、モルトまたは外因性酵素を補充して、糖転換に必要な酵素を供給することが重要となる。
【０１３１】
一般に、ウォート生成は、水が、マッシング相にある穀粒粒子に到達し得るように、モルトを破砕するステップで開始される。前記マッシングは、基本的には、酵素により基質を脱重合化するモルト化工程の拡張である。マッシング時には、破砕モルトを、水などの液体画分と共にインキュベートする。インキュベーション温度は、一般に、一定に保つ（等温マッシング）か、または段階的に上昇させる。いずれの場合も、モルト化およびマッシングにおいて生成される可溶性物質は、前記液体画分中に放出される。その後の濾過により、ウォートと、残留する固体粒子との分離がなされ、後者をまた、「ビール粕」とも称する。前記ウォートはまた、「一番ウォート」とも称する。スパージングおよび濾過後、「二番ウォート」を得ることができる。該手順を繰り返すことにより、さらなるウォートを調製することができる。ウォートを調製するのに適する手順の非限定的な例は、Ｂｒｉｇｇｓら（前出）およびＨｏｕｇｈら（前出）により説明されている。
【０１３２】
酵素を加熱処理することにより、リポキシゲナーゼ活性を低下させ得ることが記載されている。ウォートを加熱処理してリポキシゲナーゼ活性を低下させることができ、かつ／またはマッシングを高温で実施することが記載されている。しかし、加熱処理は、リポキシゲナーゼ活性を低下させることに加え、他の酵素活性を低下させることなど、他の有害作用を有し得る。加えて、加熱処理は、リポキシゲナーゼ活性を、それを行った時点と比べて低下させるだけであり、したがって、それ以前におけるリポキシゲナーゼ生成物の蓄積には影響を及ぼさない。
【０１３３】
したがって、一実施形態では、初期のマッシング温度が７０℃を超えず、好ましくは６９℃を超えず、したがって、例えば、初期のマッシング温度が、５５℃〜６９℃の範囲内、例えば、５５℃〜６５℃の範囲内など、５０℃〜６９℃の範囲内であり得る方法を用いて、本発明によるウォートを調製する。また、本発明によるウォートは、マッシング時において７０℃以上の温度下に置いた時間が、２５分間を超えず、好ましくは２０分間を超えず、より好ましくは１５分間を超えないことも好ましい。マッシング温度が高すぎると、マッシュ中における酵素活性に影響が及び、所望の酵素活性を低下させるか、またはさらに無化する可能性があり、この結果、ウォートの品質が変化する。
【０１３４】
一番ウォート、二番ウォート、およびさらなるウォートを混合し、その後、煮沸にかけることができる。純粋の一番ウォートであれ、混合ウォートであれ、煮沸されていないウォートをまた「スイートウォート」とも称し、煮沸後のウォートは、「煮沸ウォート」と称する。ウォートをビールの生産に用いる場合、煮沸前にホップを添加することが多い。
【０１３５】
ウォート組成物はまた、モルト化させていない二重ヌルＬＯＸ穀粒、特に、モルト化させていない二重ヌルＬＯＸ破砕穀粒またはそれらの一部など、二重ヌルＬＯＸオオムギ植物体またはそれらの一部を、酵素組成物または酵素混合物による組成物、例えば、Ｃｅｒｅｆｌｏ、Ｕｌｔｒａｆｌｏ、またはＯｎｄｅａ  Ｐｒｏ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）など、１または複数の適切な酵素と共にインキュベートすることによっても調製することができる。このようにして調製されたウォートから飲料を作製する方法はまた、「オオムギ醸造」とも称し、これによるウォート組成物を、「オオムギウォート」または「オオムギ醸造」ウォートとも称することができる。ウォート組成物はまた、モルトと、モルト化させていないオオムギ植物体またはその一部との混合物、またはモルト化させていないオオムギだけを用いて調製することもでき、場合によって、前記調製時において、１または複数の適切な酵素、特に、アミラーゼ、グルカナーゼ［好ましくは、（１−４）−グルカナーゼおよび／または（１−３，１−４）−β−グルカナーゼ］、および／もしくはキシラナーゼ（アラビノキシラナーゼなど）、および／もしくはプロテアーゼ、または前述の酵素のうちの１または複数を含む酵素混合物を添加して、例えば、酵素混合物であるＯｎｄｅａ  Ｐｒｏ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）を添加して調製することもできる。
【０１３６】
本発明の特定の一実施形態では、本発明によるウォート組成物が、煮沸オオムギウォート、すなわち、モルト化させていない（かつ、好ましくは破砕した）二重ヌルＬＯＸ穀粒を、水と共にインキュベートすることにより、好ましくはマッシングおよびスパージングすることにより調製されたウォートなど、オオムギウォートである。このようなオオムギウォートは、Ｔ２ＮレベルおよびＴ２Ｎポテンシャルレベルが極めて低いことを特徴とする。したがって、前記オオムギウォートは、含む遊離Ｔ２Ｎが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製したオオムギウォート組成物と比較して、好ましくは５０％未満、より好ましくは４０％未満、なおより好ましくは３０％未満である。前記ウォート組成物は、含む遊離Ｔ２Ｎが、ＷＯ２００５／０８７９３４で記載されるオオムギの変異体Ｄ１１２から同じ方法で調製したウォート組成物と比較して７０％未満、より好ましくは６０％未満であることがより好ましい。さらに、前記オオムギウォートは、１３〜１６の範囲内、好ましくは１４〜１５の範囲内の°ｐ、より好ましくは１４．５°ｐに調整される場合、含む遊離Ｔ２Ｎが、最大で０．１５ｐｐｂであることが好ましい。前記オオムギウォートは、含むＴ２Ｎポテンシャルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製したオオムギウォート組成物と比較して５０％未満、より好ましくは４０％未満、なおより好ましくは３０％未満であることがさらに好ましい。また、前記オオムギウォートは、含むＴ２Ｎ前駆体が、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製したオオムギウォート組成物と比較して５０％未満、より好ましくは４０％未満、なおより好ましくは３０％未満であることも好ましい。
【０１３７】
本発明はまた、二重ヌルＬＯＸオオムギ植物体またはそれらの一部を含む、食物組成物、飼料組成物、および香料の原料組成物であり得る植物生成物に関する。食物組成物は、例えば、モルト化させたオオムギ穀粒およびモルト化させていないオオムギ穀粒、オオムギ粉末、パン、ポリッジ、オオムギを含む穀類混合物、オオムギを含む飲料などの健康製品、オオムギシロップ、およびフレーク状オオムギ組成物、破砕オオムギ組成物、または押出し成形したオオムギ組成物であり得るがこれらに限定されない。飼料組成物には、例えば、オオムギ穀粒および／またはオオムギ粉末を含む組成物が含まれる。香料の原料組成物については、本明細書の下記で説明する。
【０１３８】
本発明はまた、本発明の組成物の混合物にも関する。例えば、一態様では本発明が、
（ｉ）機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失など、ＬＯＸ−１活性の機能の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失など、ＬＯＸ−２活性の機能の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異とを含むオオムギ植物体またはその一部を含む組成物と；
（ｉｉ）二重ヌルＬＯＸ穀粒から調製されるモルト組成物と
の混合物により調製される組成物に関する。
【０１３９】
好ましい態様では、本発明が、飲料、より好ましくはモルト飲料、なおより好ましくは、発酵モルト飲料、好ましくは、安定的な感覚刺激性の品質を有するビールなどのアルコール飲料などの発酵飲料に関し、前記飲料は、二重ヌルＬＯＸオオムギまたはその一部を用いて調製される。したがって、本発明の好ましい一実施形態では、飲料を、二重ヌルＬＯＸオオムギ、またはその一部、またはその抽出物を発酵させることにより、例えば、単独の、または他の成分と組み合わせた二重ヌルＬＯＸモルトからウォートを発酵させることにより調製することが好ましい。
【０１４０】
しかし、本発明の他の実施形態では、飲料が、非発酵飲料、例えば、ウォート、好ましくは、ＬＯＸ二重ヌルのモルトから調製したウォートである。前記飲料を、モルト化させていないオオムギ植物体、またはその一部から調製し得ることもまた、本発明の範囲内に含まれる。
【０１４１】
飲料は、非アルコール性ビール、またはモルティナなどの非アルコール性モルト飲料など、他の種類の非アルコール性飲料などの非アルコール性飲料であり得る。
【０１４２】
しかし、前記飲料は、ＬＯＸ二重ヌルのオオムギ穀粒から調製されるモルト組成物から調製することが好ましい。前記飲料は、ビールであることがより好ましい。これは、当業者に公知の任意の種類のビールであり得る。一実施形態では、ビールが、例えば、ラガービールである。ビールは、発芽した二重ヌルＬＯＸオオムギを含むモルト組成物を用いて醸造することが好ましく、前記ビールは、発芽した二重ヌルＬＯＸオオムギだけから調製したモルト組成物を用いて醸造することがより好ましい。しかし、モルト組成物はまた、例えば、野生型オオムギ、ＬＯＸ−１ヌルのオオムギ、コムギ、および／もしくはライムギ、または、シロップ組成物を含め、モルト化させた原料もしくはモルト化させていない原料に由来する糖もしくは組成物を含む、発芽させていない原料も含み得る。しかし、前記ビールを調製するのに用いられる、すべてのモルト化させたオオムギ、および／もしくはモルト化させていないオオムギ、ならびに／または発芽させたオオムギ、および／もしくは発芽させていないオオムギなど、好ましくはすべてのオオムギが、二重ヌルＬＯＸオオムギであることが好ましい。
【０１４３】
好ましい実施形態では、本発明による飲料が、好ましくは、マッシング、および、場合によってスパージングすることにより、キルン処理されたモルトから調製されたウォートから作製したビールである。本明細書では、このようなビールはまた、「モルト化」されているとも称する。しかし、本発明による飲料はまた、オオムギウォートから調製されたビールでもあり得る。このようなビールはまた、「オオムギビール」とも称する。
【０１４４】
好ましい実施形態では、本発明による飲料は、含むＴ２Ｎポテンシャルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製した飲料のＴ２Ｎポテンシャルと比較して５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは、３０％未満など、３５％未満である。また、本発明による飲料は、含むＴ２Ｎポテンシャルが、ＷＯ２００５／０８７９３４で記載されるオオムギのヌルＬＯＸ−１変異体、好ましくはオオムギの変異体Ｄ１１２から同じ方法で調製した飲料と比較して７０％未満、好ましくは、５０％未満など、６０％未満であることも好ましい。また、本発明による飲料がそれに基づく、元の抽出物中における°ｐが、１０〜１２°ｐの範囲内、より好ましくは１１°ｐに調整される場合、該飲料は、含むＴ２Ｎポテンシャルが、最大で２ｐｐｂ、より好ましくは、最大で１ｐｐｂなど、最大で１．５ｐｐｂであることも好ましい。
【０１４５】
好ましい実施形態では、本発明による飲料は、含むＴ２Ｎ前駆体が、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製した飲料のＴ２Ｎ前駆体と比較して、５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは、３０％未満など、３５％未満である。また、本発明による飲料は、含むＴ２Ｎ前駆体が、ＷＯ２００５／０８７９３４で記載されるオオムギの変異体Ｄ１１２から同じ方法で調製した飲料と比較して７０％未満、好ましくは、５０％未満など、６０％未満であることも好ましい。また、本発明による飲料がそれに基づく、元の抽出物中における°ｐが、１０〜１２°ｐの範囲内、より好ましくは１１°ｐに調整される場合、該飲料は、含むＴ２Ｎ前駆体が、最大で２ｐｐｂ、より好ましくは、最大で１ｐｐｂなど、最大で１．５ｐｐｂであることも好ましい。
【０１４６】
本発明の特定の一実施形態では、飲料がオオムギビールであり、含むＴ２Ｎポテンシャルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製したオオムギビールのＴ２Ｎポテンシャルと比較して５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３５％未満である。この実施形態ではまた、前記オオムギビールは、含むＴ２Ｎ前駆体が、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製したオオムギビールのＴ２Ｎ前駆体と比較して５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３５％未満であることも好ましい。この実施形態ではまた、本発明によるオオムギビールは、含むＴ２Ｎポテンシャルが、最大で２ｐｐｂ、より好ましくは最大で１．５ｐｐｂ、なおより好ましくは最大で１．２ｐｐｂであることも好ましい。この実施形態では、本発明によるオオムギビールがそれに基づく、元の抽出物中における°ｐが、１０〜１２°ｐの範囲内、より好ましくは１１°ｐに調整される場合、該飲料は、含むＴ２Ｎ前駆体が、最大で２ｐｐｂ、より好ましくは最大で１．５ｐｐｂ、なおより好ましくは最大で１．２ｐｐｂであることがさらに好ましい。
【０１４７】
本発明の別の特定の実施形態では、飲料がモルトから調製されるビールであって、含むＴ２Ｎポテンシャルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製したビールのＴ２Ｎポテンシャルと比較して５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３０％未満のビールである。この実施形態ではまた、前記ビールは、含むＴ２Ｎ前駆体が、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製したビールのＴ２Ｎ前駆体と比較して５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３０％未満であることも好ましい。この実施形態ではまた、本発明によるビールは、含むＴ２Ｎポテンシャルが、最大で２ｐｐｂ、より好ましくは最大で１．５ｐｐｂ、なおより好ましくは最大で１ｐｐｂであることも好ましい。この実施形態では、本発明によるビールがそれに基づく、元の抽出物中における°ｐが、１０〜１２°ｐの範囲内、より好ましくは１１°ｐに調整される場合、該飲料は、含むＴ２Ｎ前駆体が、最大で２ｐｐｂ、より好ましくは最大で１．５ｐｐｂ、なおより好ましくは最大で１ｐｐｂであることがさらに好ましい。
【０１４８】
「感覚刺激性」とは、ヒトの嗅覚および味覚に訴える品質を意味する。例えば、熟練の専門家による試飲パネルがこれらを解析する。前記試飲パネルは、Ｔ２Ｎなど、アルデヒドの異臭を認識するように専門的に訓練されていることが好ましい。一般に、試飲パネルは、３〜３０人の範囲内のメンバー、例えば、５〜１５人の範囲内のメンバー、好ましくは８〜１２人の範囲内のメンバーからなる。試飲パネルは、紙の異臭、酸化による異臭、劣化による異臭、およびパンの異臭など、各種の風味の存在について評価し得る。本発明との関連では、紙の異臭および／または劣化による異臭を特に低下させることが好ましい。飲料の「感覚刺激性」を判定する方法は、国際特許出願第ＷＯ２００５／０８７９３４号の実施例６で説明されている。飲料の「感覚刺激性」を判定する別の好ましい方法については、本明細書下記の実施例８および９で説明する。好ましい実施形態では、安定的な感覚刺激性の品質が、少なくとも部分的には、Ｔ２ＮレベルまたはＴ２Ｎポテンシャルレベルが低いことの結果である。
【０１４９】
本発明による飲料は、約２０℃など、１５〜２５℃の範囲内で少なくとも１０カ月にわたる保存後における紙の風味が、ＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性を含有するオオムギ植物体から同じ方法で調製した同様の飲料と比較して弱いことを特徴とすることが好ましい。前記紙の風味は、熟練の試飲パネルによる評価で９０％未満、より好ましくは、７０％未満など、８０％未満である。
【０１５０】
また、本発明による飲料は、高温での保存後における紙の風味が、野生型のオオムギから調製した同様の飲料と比較して軽減されることも好ましい。熟練の専門家による試飲パネルが、「紙の風味」の特性を判定する（上記で説明した通りであり、０を「なし」として５を「極めて強い」とする０〜５段階でスコア付けする）場合、本発明の飲料は、紙の風味についての以下のスコア：
（ｉ）３７℃で１週間にわたるインキュベーション後において、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製した飲料の紙の風味についてのスコアより、少なくとも０．５、好ましくは少なくとも０．７、より好ましくは少なくとも１．０低い、紙の風味についてのスコア；
（ｉｉ）３７℃で２週間にわたるインキュベーション後において、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製した飲料の紙の風味についてのスコアより、少なくとも０．５、好ましくは少なくとも０．７、より好ましくは少なくとも１．０低い、紙の風味についてのスコア；
（ｉｉｉ）３７℃で３週間にわたるインキュベーション後において、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製した飲料の紙の風味についてのスコアより、少なくとも０．５、好ましくは、少なくとも１．０など、少なくとも０．７低い、紙の風味についてのスコア；
（ｉｖ）３７℃で１週間にわたるインキュベーション後において、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製した飲料の紙の風味についてのスコアの最大で９０％、好ましくは最大で８０％、より好ましくは最大で７０％、なおより好ましくは最大で６０％、さらにより好ましくは最大で５０％である、紙の風味についてのスコア；
（ｖ）３７℃で２週間にわたるインキュベーション後において、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製した飲料の紙の風味についてのスコアの最大で９０％、好ましくは最大で８０％、より好ましくは最大で７０％、なおより好ましくは最大で６０％である、紙の風味についてのスコア；
（ｖｉ）３７℃で３週間にわたるインキュベーション後において、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製した飲料の紙の風味についてのスコアの最大で９０％、好ましくは最大で８０％である、紙の風味についてのスコア
のうちの１または複数、好ましくは、少なくとも３つ、例えば、すべてなど、少なくとも２つを示すことが好ましい。
【０１５１】
飲料は、保存後においても含む遊離Ｔ２Ｎレベルが極めて低い場合に、「安定的な感覚刺激性の品質」を有するという。したがって、二重ヌルＬＯＸオオムギ植物体を用いて製造された飲料（安定的な感覚刺激性の品質を示すビールなど）を提供することが、本発明の目的である。このような飲料は、（少なくとも１週間、好ましくは少なくとも２週間、より好ましくは少なくとも３週間、なおより好ましくは、１〜３カ月間の範囲内、例えば、３〜６カ月の範囲内など、６〜１２カ月間の範囲内、例えば、複数年間にわたるなど、少なくとも４週間にわたる保存後において）含むＴ２Ｎポテンシャルレベルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒからから同じ方法で調製した飲料と比較して極めて低い（好ましくは５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３０％未満、例えば、２０％未満など、１０％未満など、３５％未満である）ことが好ましい。
【０１５２】
さらに、本発明による飲料は、（少なくとも１週間、好ましくは少なくとも２週間、より好ましくは少なくとも３週間、なおより好ましくは、２０〜３０℃の範囲内の温度で１〜３カ月間の範囲内、例えば、３〜６カ月の範囲内など、６〜１２カ月間の範囲内、例えば、複数年間にわたるなど、３０〜４０℃の範囲内の温度、好ましくは３７℃で少なくとも４週間にわたる保存後において）含む遊離Ｔ２Ｎレベルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒからから同じ方法で調製した飲料と比較して極めて低い（好ましくは５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３５％未満、なおより好ましくは３０％未満、例えば、２５％未満である）ことが好ましい。
【０１５３】
特に、本発明による飲料は、（３７℃で２週間にわたる保存後において）含む遊離Ｔ２Ｎレベルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒからから同じ方法で調製した飲料と比較して極めて低い（好ましくは５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３５％未満である）ことが好ましい。また、本発明による飲料は、３７℃で２週間にわたる保存後において含む遊離Ｔ２Ｎが、５０ｐｐｔ未満、なおより好ましくは４０ｐｐｔ未満、なおより好ましくは３０ｐｐｔ未満であることも好ましい。その存在下で前記保存が実施される亜硫酸塩レベルは、１０ｐｐｍを超えず、好ましくは１〜１０ｐｐｍの範囲内、より好ましくは１〜８ｐｐｍの範囲内、より好ましくは２〜６ｐｐｍの範囲内、さらにより好ましくは、４ｐｐｍなど、３〜５ｐｐｍの範囲内の亜硫酸塩レベルであることが好ましい。
【０１５４】
また、本発明による飲料は、（３７℃で２週間にわたる保存後において）含む遊離Ｔ２Ｎが、ヌルＬＯＸ−１オオムギ、好ましくは、ＷＯ２００５／０８７９３４で記載されるオオムギの変異体Ｄ１１２からから同じ方法で調製した飲料と比較して８０％未満、好ましくは、６０％未満など、７５％未満であることも好ましい。その存在下で前記保存が実施される亜硫酸塩レベルは、１０ｐｐｍを超えず、好ましくは１〜１０ｐｐｍの範囲内、より好ましくは１〜８ｐｐｍの範囲内、より好ましくは２〜６ｐｐｍの範囲内、さらにより好ましくは２〜４ｐｐｍの範囲内の亜硫酸塩レベルであることが好ましい。
【０１５５】
また、本発明による（ビール、例えば、オオムギビールなどの）飲料は、（３７℃で８週間にわたる保存後において）含む遊離Ｔ２Ｎレベルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒからから同じ方法で調製した飲料と比較して極めて低い（好ましくは５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３５％未満、なおより好ましくは３０％未満、さらにより好ましくは２５％未満である）ことも好ましい。該飲料（ビール、例えば、オオムギビールなど）は、３７℃で８週間にわたる保存後において含む遊離Ｔ２Ｎが、最大で５０ｐｐｔ、なおより好ましくは最大で４０ｐｐｔ、さらにより好ましくは最大で３０ｐｐｔ、なおより好ましくは最大で２０ｐｐｔであることがさらに好ましい。その存在下で前記保存が実施される亜硫酸塩レベルは、１０ｐｐｍを超えず、好ましくは１〜１０ｐｐｍの範囲内、より好ましくは１〜８ｐｐｍの範囲内、より好ましくは１〜６ｐｐｍの範囲内、さらにより好ましくは、３ｐｐｍなど、２〜４ｐｐｍの範囲内の亜硫酸塩レベルであることが好ましい。
【０１５６】
また、該飲料は、（３７℃で８週間にわたる保存後において）含む遊離Ｔ２Ｎレベルが、ヌルＬＯＸ−１オオムギ、好ましくは、ＷＯ２００５／０８７９３４で記載されるオオムギの変異体Ｄ１１２からから同じ方法で調製した飲料と比較して７０％未満、好ましくは６０％未満、なおより好ましくは５５％未満であることも好ましい。その存在下で前記保存が実施される亜硫酸塩レベルは、１０ｐｐｍを超えず、好ましくは１〜１０ｐｐｍの範囲内、より好ましくは１〜８ｐｐｍの範囲内、より好ましくは２〜６ｐｐｍの範囲内、さらにより好ましくは２〜４ｐｐｍの範囲内の亜硫酸塩レベルであることが好ましい。
【０１５７】
さらに、（少なくとも１週間、好ましくは少なくとも２週間、より好ましくは少なくとも３週間、なおより好ましくは、２０〜３０℃の範囲内の温度で１〜３カ月間の範囲内、例えば、３〜６カ月の範囲内など、６〜１２カ月間の範囲内、例えば、複数年間にわたるなど、３０〜４０℃の範囲内の温度、好ましくは３７℃で少なくとも４週間にわたる保存後において含むＴ２Ｎおよび／またはＴ２Ｎポテンシャルが、ＷＯ２００５／０８７９３４で記載されるオオムギの変異体Ｄ１１２からから同じ方法で調製した飲料と比較して７０％未満、好ましくは、５０％未満など、６０％未満であり、より好ましくは、含む遊離Ｔ２Ｎが７０％未満、好ましくは、５０％未満など、６０％未満であることが好ましい）二重ヌルＬＯＸオオムギ植物体を用いて製造されるビールなどの飲料を提供することが、本発明の目的である。
【０１５８】
特に、本発明による（ビール、例えば、オオムギビールなどの）飲料は、３７℃で８週間にわたる保存後において含む遊離Ｔ２Ｎレベルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒからから同じ方法で調製した飲料と比較して極めて低い（好ましくは７０％未満、好ましくは６０％未満、より好ましくは５５％未満、なおより好ましくは５２％未満である）ことが好ましい。その存在下で前記保存が実施される亜硫酸塩レベルは、１０ｐｐｍを超えず、好ましくは１〜１０ｐｐｍの範囲内、より好ましくは１〜８ｐｐｍの範囲内、より好ましくは１〜６ｐｐｍの範囲内、さらにより好ましくは、３ｐｐｍなど、２〜４ｐｐｍの範囲内の亜硫酸塩レベルであることが好ましい。
【０１５９】
本発明による飲料はまた、含む亜硫酸塩が、１００万分率（ｐｐｍ）で１〜１０の範囲内、より好ましくは２〜８ｐｐｍの範囲内、より好ましくは３〜７ｐｐｍの範囲内、さらにより好ましくは４〜６ｐｐｍの範囲内であることが好ましい。本発明の飲料は、１５℃〜４０℃の範囲内、好ましくは３０℃〜３７℃の範囲内の温度、より好ましくは３７℃で、少なくとも１週間、好ましくは少なくとも２週間、より好ましくは少なくとも３週間、なおより好ましくは、１〜３カ月間の範囲内、例えば、３〜６カ月の範囲内など、６〜１２カ月間の範囲内、例えば、複数年間にわたるなど、少なくとも４週間にわたる保存後において含む遊離Ｔ２Ｎが、１０億分率（ｐｐｂ）の最大で０．０７、好ましくは最大で０．０６、より好ましくは最大で０．０５、なおより好ましくは、最大で０．０３など、最大で０．０４であることが好ましい。本発明の好ましい一実施形態では、本発明による飲料は、４〜６ｐｐｍの範囲内の亜硫酸塩の存在下、３７℃で４週間にわたる保存後において含む遊離Ｔ２Ｎが、最大で０．０３ｐｐｂ、好ましくは最大で０．０２５ｐｐｂ、より好ましくは最大で０．０２ｐｐｂ（１０億分率）である。
【０１６０】
本発明による、安定的な感覚刺激性の品質を示す飲料は、含むＴ２Ｎポテンシャルレベルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒからから同じ方法で調製した同様の飲料と比較して低く、好ましくは４０％未満、より好ましくは３０％未満、なおより好ましくは２５％未満である。
【０１６１】
一実施形態では、本発明が、特定のトリヒドロキシオクタデカン酸（また、ＴＨＡとも称する）レベルが低いビールなどの飲料、特に、９，１２，１３−ＴＨＡレベルおよび９，１０，１３−ＴＨＡレベルが低い飲料に関する。ＴＨＡは、苦味の風味を特徴とし（ＢａｕｒおよびＧｒｏｓｃｈ、１９７７年；Ｂａｕｒら、１９７７年）、したがって、望ましくないと考えられる。
【０１６２】
したがって、９，１２，１３−ＴＨＡレベルおよび９，１０，１３−ＴＨＡレベルは、可能な限り低い、好ましくは、１ｐｐｍより低いなど、１．３ｐｐｍより低いことが望ましい。しかし、モルトに由来する飲料（ビールなど）中における９，１２，１３−ＴＨＡおよび９，１０，１３−ＴＨＡの総濃度はまた、前記特定の飲料を調製するのに用いられるモルトの量にも依存する。したがって、一般に、強いビールは、含む９，１２，１３−ＴＨＡおよび９，１０，１３−ＴＨＡが、より軽いビールより多く、このため、より強いビールでは、許容される９，１２，１３−ＴＨＡおよび９，１０，１３−ＴＨＡの総レベルがより高くなる。したがって、本発明による飲料は、含む９，１２，１３−ＴＨＡレベルおよび９，１０，１３−ＴＨＡレベルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒからから同じ方法で調製した同様の飲料より低いことが好ましい。特に、本発明による飲料は、９，１２，１３  ＴＨＡレベルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒからから同じ方法で調製した飲料中のレベルと比較して最大で５０％、好ましくは最大で４０％、より好ましくは最大で３０％であることが好ましい。本発明による飲料は、９，１２，１３  ＴＨＡレベルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒからから同じ方法で調製した飲料中のレベルと比較して最大で７０％、好ましくは最大で６０％であることがさらに好ましい。このような飲料は、二重ヌルＬＯＸオオムギを用いることにより調製することができる。
【０１６３】
本発明の一実施形態では、飲料の泡の品質が改善されている。これは、飲料がビールである場合、特に重要である。したがって、泡の品質が優れたビールなどの飲料を提供することが、本発明の目的である。本発明の飲料は、６０〜８０分間、好ましくは８０分間において生成させる泡が、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒからから同じ方法で調製した飲料と比較して、少なくとも１０％多く、好ましくは少なくとも２０％多く、さらにより好ましくは少なくとも２５％多いことが好ましい。前記泡の生成は、本明細書下記の実施例９で説明する通りに決定される。
【０１６４】
本発明はまた、前記飲料を作製する方法にも関する。該方法は、
（ｉ）発芽した二重ヌルＬＯＸ穀粒を含むモルト組成物を供給するステップと；
（ｉｉ）前記モルト組成物を飲料へと加工するステップと
を含み、これらにより、より安定的な感覚刺激性の品質を示す飲料を得ることが好ましい。
【０１６５】
好ましい一実施形態では、飲料はビールである。この場合は、加工するステップが、例えば、本明細書の上記で説明した方法のうちのいずれかにより、前記モルト組成物からウォートを調製するステップと、前記ウォートを発酵させるステップとを含むことが好ましい。
【０１６６】
一般的に述べると、アルコール飲料（ビールなど）は、モルト化させたオオムギ穀粒および／またはモルト化させていないオオムギ穀粒から製造することができる。ホップおよび酵母に加えて、モルトが、ビールの風味および色に寄与する。さらに、モルトは、発酵性糖および酵素の供給源として機能する。ビール生産の一般的な工程についての図式的表示を図３に示すが、モルト化および醸造に適切な方法の例についての詳細な説明は、例えば、Ｂｒｉｇｇｓら（１９８１年）およびＨｏｕｇｈら（１９８２年）による刊行物中において見出すことができる。オオムギ生成物、モルト生成物およびビール製品の解析については、定期的に更新される多数の方法を用いることができ、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ（１９９５年）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｅｗｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ（１９９２年）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｒｅｗｅｒｙ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ（１９９８年）、およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｒｅｗｉｎｇ（１９９７年）があるが、これらに限定されない。所与のビール醸造業者毎に、多くの特殊な手順が用いられており、その最も顕著な多様性は、各地の消費者選好に関するものであると理解される。本発明と共に、ビールを生産する任意のこのような方法を用いることができる。非限定的な例については、実施例８および実施例９で説明する。
【０１６７】
前述した飲料（ビール、モルト飲料、または非発酵ウォートなど）のモルト組成物は、例えば、本明細書の上記で説明した方法のうちのいずれかにより得ることができる。ウォートは、本明細書の上記で説明した前記モルト組成物から調製することができる。
【０１６８】
ウォートからビールを生産する最初のステップは、前記ウォートを煮沸するステップを伴うことが好ましい。煮沸時には、例えば、ビールに典型的な苦味および香ばしさの特徴をもたらすホップなど他の成分を添加することができる。ウォートの煮沸はまた、ポリフェノールと変性したタンパク質との凝集物ももたらし、これは、ウォート冷却の後続の段階において主に沈殿する。冷却後、ウォートを、酵母を含有する発酵タンクへと移送する。好ましくは、前記酵母は、ビール酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓである。ウォートは、任意の適切な時間、一般には１〜１００日間の範囲内で発酵させる。数日間にわたる発酵工程において、糖はアルコールおよびＣＯ２へと転換され、これと同時に一部の風味物質が生成される。
【０１６９】
その後、ビールはさらに加工され、例えば、冷却される。それはまた、濾過および／またはラガリング（快い芳香を生成させ、酵母風味を軽減する工程）を経る場合もある。また、添加物を添加することもできる。さらに、ＣＯ２を添加することもできる。最後に、ビールを殺菌および／または濾過して、詰める（例えば、ボトルまたは缶に封入する）。
【０１７０】
ビール生産の領域では進歩がなされているが、ビール中におけるＴ２ＮレベルおよびＴ２Ｎポテンシャルレベルを低下させることは有益であろう。したがって、完成したビールに対して、異臭の少ない形で寄与する新規の原料、特に、オオムギおよびモルトが依然として必要とされている。したがって、このようなオオムギ植物体およびモルトを提供することが、本発明の目的である。
【０１７１】
オオムギ植物体または植物生成物が、ＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２遺伝子における、機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失および機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失を引き起こす変異を保有するオオムギ植物体から調製されるかどうかを判定するには、各種の方法を用いることができる。植物生成物は、一般に、その生成に用いられる植物体に由来する少なくとも一部のゲノムＤＮＡを含む。したがって、モルトは、大量のゲノムＤＮＡを含有するが、ウォートなど、オオムギまたはモルトの抽出物であっても、前記オオムギまたはモルトに由来するゲノムＤＮＡまたはその断片を含み得る。ビールなど、オオムギベースの飲料もまた、前記植物体に由来するゲノムＤＮＡまたはその断片を含み得る。植物生成物中のＤＮＡを解析することにより、そこから植物生成物が調製される植物体が、ＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２遺伝子における、機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失および機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失を引き起こす変異を保有するかどうかを確立することができる。前記変異は、例えば、本明細書上記の節「ＬＯＸ活性の機能の喪失」で説明した、ＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２遺伝子内の変異のうちのいずれかであり得るであろう。ゲノムＤＮＡは、配列決定などの任意の有用な方法により、またはＰＣＲベースの方法を含めた増幅ベースの方法により解析することができる。ＬＯＸ−１遺伝子および／またはＬＯＸ−２遺伝子における特定の変異が推定される場合は、例えば、ＳＮＰ解析などの多型解析を用いることができる。このような解析は、本明細書下記の実施例１０で説明する通りに実施することができる。当業者は、これらの実施例で説明される特定のＳＮＰ解析を、他の変異または他の出発物質と共に用いるのに適合させることができるであろう。
【０１７２】
上述の植物生成物が、ＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２遺伝子における、機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失および機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失を引き起こす変異を保有するオオムギ植物体だけから調製される場合は、オオムギのＬＯＸ−１  ｍＲＮＡおよびＬＯＸ−２  ｍＲＮＡならびに／またはＬＯＸ−１タンパク質およびＬＯＸ−２タンパク質の存在対不在もまた、前記植物生成物が、ＬＯＸ二重ヌルのオオムギ植物体から調製されているかどうかを示し得る。植物生成物を、ウェスタンブロット解析または他のタンパク質解析により検討することもでき、ＲＴ−ＰＣＲにより、またはノーザンブロット解析により、または他のｍＲＮＡ解析により植物生成物を検討することもできる。このような解析は、植物生成物がモルトである場合、特に有用である。
【０１７３】
化学的変異誘発
本発明による二重ヌルＬＯＸオオムギ植物体（すなわち、機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異とを含む植物体）を作製するには、任意の適切な変異誘発法により、例えば、オオムギ穀粒の化学的変異誘発を用いることにより、極めて多数のオオムギ変異体を調製する。この方法は、無作為的に変異を誘導することが公知である。オオムギの変異誘発は、任意の変異誘発化学物質を用いて実施することができる。しかし、オオムギの変異誘発は、穀粒をＮａＮ３で処理し、生存する穀粒を発芽させた後、子孫植物体を解析することにより実施することが好ましい。Ｍ０世代と称する、変異誘発させた穀粒から成長する植物体世代は、任意の所与の変異について、ヘテロ接合体のキメラを含有する。自己授粉後に回収された子孫植物体を、Ｍ１世代と称するが、ここでは、所与の変異が、対応するヘテロ接合体およびホモ接合体へと分離する（図１を参照されたい）。
【０１７４】
処理後における穀粒は、一部の非変異体細胞と、ＤＮＡの変異を有する各種の細胞とを含有するので、穀粒をＮａＮ３で処理することは、単一の細胞を処理することと等価ではない。生殖細胞系列をもたらさない細胞系統では変異が失われるので、これは、生殖組織へと生育し、Ｍ１世代の発生に寄与する少数の細胞を、変異誘発物質の標的とすることが目的である。
【０１７５】
全体的な変異効率を評価するため、Ｍ０世代およびＭ１世代において、アルビノキメラおよびアルビノ植物体をカウントすることができる。変異体の数を生存植物体数の関数として評価することにより、変異の効率についての推定値が得られる一方、変異体数を、処理した種子数の関数として評価することにより、変異の効率と、穀粒死滅との両方についての組合せが測定できる。
【０１７６】
細胞が、遺伝子発現のほとんどどの段階でも、変異の損傷的効果をおそらく緩和する、品質保証機構を有することは注目に値する。真核生物において十分に研究されている一例は、ＮＭＤと称し、潜在的に有害な、未熟の切断型タンパク質の合成を防止する、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構（ＭａｑｕａｔおよびＣａｒｍｉｃｈａｅｌ、２００１年；Ｗｕ  ら、２００７年）である。ＮＭＤでは、終止コドンが、下流の不安定化エレメントに対するその位置により未熟であると同定される。未熟終止（ナンセンス変異）コドン（ＰＴＣ）を発生させる変異は、場合によって、原因変異をスキップし、これにより、タンパク質機能を潜在的に保全する、代替的なスプライス転写物のレベルを上昇させることがある（ＭｅｎｄｅｌｌおよびＤｉｅｔｚ、２００１年）。
【０１７７】
植物体の育種
本発明の一実施形態では、二重ヌルＬＯＸ形質を含む、農業的に有用なオオムギ植物体を提供することが目的である。作物の育成は、新規の形質の導入と共に始まる、長期間にわたる困難な過程であることが多い。しかし、植物育種家の視点からすると、このステップは、ほとんど常に、農業形質の全体的プロファイルの所望の程度が、市販される現行の品種より劣る植物体を結果としてもたらす。
【０１７８】
ＬＯＸ二重ヌルの形質に加えて、市販のモルト化オオムギ品種を生成させる技術分野でもまた考慮し得るさらなる因子も存在し、例えば、穀粒の収量および穀粒のサイズ、ならびにモルト化の効力または醸造の効力に関する他のパラメータがある。関与的な形質の多く（すべてではないにせよ）は、遺伝子の制御下にあることが示されているため、本発明はまた、本公開で開示される二重ヌルＬＯＸオオムギ植物体との異種交配から調製され得る、最新で、ホモ接合型の、高収量をもたらすモルト化栽培品種も提供する。このようなオオムギ植物体の穀粒は、Ｔ２Ｎポテンシャルを生成させる能力が低い新規の原料を提供する、すなわち、このような穀粒から生成されるモルトは、Ｔ２Ｎポテンシャルが、ＷＯ２００５／０８７９３４で記載される、オオムギのヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２から同じ方法で生成されたモルトと比較して５０％未満である。オオムギ育種の当業者は、（二重ヌルＬＯＸオオムギと異種交配させた後で、）優れた栽培品種を結果としてもたらすオオムギ植物体を、選択および育成することができるであろう。代替的に、オオムギの育種家は、本発明の植物体を用いて、さらなる変異誘発をもたらし、ＬＯＸ二重ヌルのオオムギに由来する新規の栽培品種を生成させることができる。
【０１７９】
二重ヌルＬＯＸ形質が、後代系統において維持されることを確認する１つの方法は、ＬＯＸ−１遺伝子およびＬＯＸ−２遺伝子についてのＳＮＰ解析に関する。ＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性もまた決定することが好ましい。
【０１８０】
本発明によるオオムギ植物体は、任意の適切な育種のスキームへと導入することができる。
【０１８１】
本発明の別の目的は、ＬＯＸ二重ヌルの形質を含む、農業的に優良のオオムギ植物体を提供することである。したがって、本発明はまた、第１の親オオムギ植物体を、第２の親オオムギ植物体と異種交配させることにより、新規のＬＯＸ二重ヌルのオオムギ植物体を作製する方法であって、該第１および第２の植物体が、ＬＯＸ二重ヌルのオオムギである方法も対象とする。加えて、第１および第２の親オオムギ植物体はいずれも、ＬＯＸ二重ヌルのオオムギ品種に由来することができる。したがって、ＬＯＸ二重ヌルのオオムギ品種を用いる、自家受粉、戻し交配、品種集団との異種交配などのうちのいずれかのこのような方法は、本発明の一部である。ＬＯＸ二重ヌルのオオムギ品種に由来する品種から発生した植物体を含め、ＬＯＸ二重ヌルのオオムギ品種を親として用いて作製されるすべての植物体は、本発明の範囲内にある。ＬＯＸ二重ヌルのオオムギはまた、ＬＯＸ二重ヌルの植物体または植物体組織に外因性のＤＮＡを導入し、これを発現させる場合における遺伝子形質転換にも用いることができる。
【０１８２】
本発明と共に戻し交配法を用いて、変異したオオムギ植物体のＬＯＸ二重ヌル形質を、別の栽培品種、例えば、栽培品種Ｓｃａｒｌｅｔｔまたは栽培品種Ｊｅｒｓｅｙ（これらのいずれもが、高収量をもたらす新型のモルト化オオムギ栽培品種である）など、別の栽培品種へと導入することができる。標準的な戻し交配のプロトコールでは、対象の元の品種、すなわち、反復親植物体を、形質導入される対象の変異体ＬＯＸ遺伝子を保有する第２の品種（一回親植物体）と異種交配させる。この異種交配から結果として得られるＬＯＸ二重ヌルの子孫植物体を、その後、該反復親植物体へと異種交配させ、該一回親植物体の該ＬＯＸ二重ヌルの形質に加えて、該反復親により指定される本質的にすべての特徴が、生成される植物体内で復帰するオオムギ植物体が得られるまで、該過程を反復する。最終的に、該戻し交配により最後に生成された植物体を自家受粉させて、純粋なＬＯＸ二重ヌルの育種用子孫植物体を得る。
【０１８３】
植物体の育種過程を加速化させる方法は、組織培養物法および組織再生法を適用することにより、生成された変異体を初期繁殖させることを含む。したがって、本発明の別の態様は、増殖および分化するとＬＯＸ二重ヌルの形質を有するオオムギ植物体を生成させる細胞を提供することである。例えば、育種は、従来の異種交配、葯に由来する造精植物体の調製、または小胞子培養の使用を伴い得る。
【０１８４】
ＬＯＸ経路による生成物
各種の実施形態では、本発明は、含むＴ２Ｎポテンシャルレベルが低い、オオムギ植物体およびそれらの生成物に関する。ＬＯＸ酵素は、ｃｉｓ−１，ｃｉｓ−４ペンタジエン系を伴うポリ不飽和脂肪酸の二原子酸素添加反応を触媒する。オオムギでは、Ｃ１８のポリ不飽和脂肪酸であるリノール酸（１８：２Δ９，１２）およびα−リノール酸（１８：３Δ９，１２，１５）が、主要なＬＯＸ基質である。脂肪酸代謝のリポキシゲナーゼ経路は、アシル鎖のＣ−９位（ＬＯＸ−１により大半が触媒される）またはＣ−１３位（ＬＯＸ−２により大半が触媒される）において酸素分子を付加することにより開始され、対応する９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥをもたらす［基質がα−リノール酸の場合は、９−ヒドロペルオキシオクタデカトリエン酸および１３−ヒドロペルオキシオクタデカトリエン酸（ＨＰＯＴＥ）が生成物であるが、ＨＰＯＴＥは、Ｔ２Ｎの前駆体としては機能しない］。ＬＯＸ経路のヒドロペルオキシドリアーゼ分枝では、９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥの両方が、短鎖のオキソ酸およびアルデヒドへと切断され得る（図２を参照されたい）。特に、９−ＨＰＯＤＥが切断されて、Ｔ２Ｎへと転換されるｃｉｓ−ノネナールを形成し得るのに対し、１３−ＨＰＯＤＥは、２−Ｅ−ヘキセナールの前駆体である。したがって、ＬＯＸ−２により触媒されるリノール酸の二原子酸素添加反応の主要な生成物である１３−ＨＰＯＤＥが、Ｔ２Ｎの劣化臭を形成させる該経路内の上流の構成要素であるとは予測されていなかった。
【０１８５】
本発明は、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−２により触媒される反応の直接的な生成物として生成されるわけではないが、後続の一連の反応の結果として生成される、ＬＯＸ−１触媒およびＬＯＸ−２触媒による下流の代謝物の生成に影響を及ぼすことも包含することが認識される。これらには、自発性、因子誘導性、または酵素触媒性の異性体形成および転換が含まれる。したがって、これらの下流の代謝物の生成には、該経路の他の構成要素、例えば、ヒドロペルオキシドリアーゼ（ＨＰＬ）の発現を調節することにより影響を及ぼし得るであろう。
Ｔ２Ｎポテンシャル
本発明の重要な目的は、Ｔ２Ｎポテンシャルを低下させるかまたは無化することである。したがって、Ｔ２Ｎ前駆体およびアルデヒド付加物の形成を低減することが本発明の目的である。ビールの劣化に関する複数の化学反応は、依然として解明されていないが、Ｔ２Ｎポテンシャルからの遊離Ｔ２Ｎの生成は、ビール製品中において劣化臭が発生する主要な原因であると認識されている（Ｋｕｒｏｄａら、前出）。したがって、Ｔ２Ｎポテンシャルレベルの低い飲料、ならびにＴ２Ｎ前駆体レベルの低い飲料を提供することが、本発明の目的である。
【０１８６】
Ｔ２Ｎポテンシャルの大半は、ウォートから完成したビールへと移り、ここで、遊離Ｔ２Ｎが放出され得る（Ｌｉｅｇｅｏｉｓら、２００２年）が、この過程では、酸性条件および温度条件が重要な因子である。本発明との関連では、Ｔ２Ｎポテンシャルを、本明細書上記の定義で説明した通りに定義する。Ｔ２Ｎポテンシャルレベルを決定する他の方法もまた、用いることができる。混乱を避ける目的で、本文脈における「Ｔ２Ｎポテンシャル」の意味は、本明細書上記の定義で説明した通りである。本明細書では、Ｔ２Ｎを放出するか、またはＴ２Ｎへと転換される能力を有する化学物質を「Ｔ２Ｎ前駆体」と称し、Ｔ２Ｎポテンシャルを決定する方法以外の代替的な方法により決定または測定されるＴ２Ｎ前駆体を、「Ｔ２Ｎ前駆体」と称する。Ｔ２Ｎ前駆体は、まず、Ｔ２Ｎを放出するか、またはＴ２Ｎへと転換される能力を有するその化学物質のうちの本質的にすべて（好ましくはすべて）が、実際に、それぞれ、Ｔ２Ｎを放出し、かつ／またはＴ２Ｎへと転換されるように、試料を処理することにより、特に決定することができる。その後、Ｔ２Ｎレベルを決定する。
【０１８７】
本発明のオオムギ穀粒は、ＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性を含まない。興味深いことに、このようなオオムギ穀粒が含有するＴ２Ｎポテンシャルは極めて少量である。
【０１８８】
したがって、二重ヌルＬＯＸオオムギ穀粒を用いて生産されるビールは、保有するＴ２Ｎレベルが極めて低いだけでなく、保有するＴ２Ｎポテンシャルレベルも極めて低い。含有するＴ２Ｎポテンシャルレベルが極めて低く、野生型のオオムギ（好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒ）からから同じ方法で生産した同様のビール製品のＴ２Ｎポテンシャルレベルの好ましくは４０％未満、より好ましくは３０％未満、なおより好ましくは２５％未満であるビール製品をもたらす二重ヌルＬＯＸオオムギ穀粒は、本発明の範囲内にある。したがって、前記ビール製品は、含むＴ２Ｎポテンシャルが、ＷＯ２００５／０８７９３４で記載されるオオムギの変異体Ｄ１１２から同じ方法で生産される同様のビール製品の好ましくは６０％未満、より好ましくは５０％未満である。
【０１８９】
また、二重ヌルＬＯＸオオムギ穀粒に由来する植物生成物は、保有するＴ２Ｎ前駆体レベルが極めて低いことも好ましい。二重ヌルＬＯＸオオムギ穀粒から調製される植物生成物であって、含有するＴ２Ｎ前駆体レベルが、野生型のオオムギ（好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒ）からから同じ方法で生成された同様の植物生成物の４０％未満、より好ましくは３０％未満、なおより好ましくは２５％未満である植物生成物は、本発明の範囲内にある。したがって、前記植物生成物は、含むＴ２Ｎ前駆体が、ＷＯ２００５／０８７９３４で記載されるオオムギの変異体Ｄ１１２から同じ方法で生成される同様の植物生成物の、好ましくは６０％未満、より好ましくは５０％未満である。
【０１９０】
マイクロモルト化させた原料の試料中、ならびにこれに由来する製品中において測定されるＴ２Ｎ値は、より大きなスケールで、例えば、３０ｋｇの大規模パイロットモルト化試料により作製された原料に由来するＴ２Ｎ値よりも高値であることが多いことは注目に値する。しかし、大スケールでの実験と、小スケールでの実験との間の相対的な、実験によるＴ２Ｎ値は、一般に同様である。
【０１９１】
同様に、マイクロモルト化させた原料の試料中、ならびにこれに由来する製品中において測定されるＴ２Ｎポテンシャル（およびＴ２Ｎ前駆体）値は、より大きなスケールで、例えば、３０ｋｇの大規模パイロットモルト化試料により作製された原料に由来するＴ２Ｎポテンシャル（およびＴ２Ｎ前駆体）値よりも高値であることが多いことは注目に値する。しかし、大スケールでの実験と、小スケールでの実験との間の相対的な、実験によるＴ２Ｎポテンシャル値は、一般に同様である。
【実施例】
【０１９２】
本明細書における実施例は、本発明の好ましい実施形態を例示するものであり、本発明を限定するものとして考えるべきではない。
【０１９３】
別段に示さない限り、核酸および細菌を操作するには、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ（２００１年）において説明される基本的な分子生物学の技法を実施した。
【０１９４】
（実施例１）
変異したヌルＬＯＸ−１集団のＭ３世代による、変異した成熟胚芽における、低ＬＯＸ−２活性についてのスクリーニング
ＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２はいずれも、成熟オオムギ胚芽（ＬＯＸ−１が主要な酵素である）において、また、発芽胚芽（両方の酵素レベルが同等である）においても合成した。何千個もの試料中おいてＬＯＸ活性を決定するには、オオムギ胚芽の抽出物を用いるアッセイが、最も簡便であろう。ＬＯＸ−２レベルについてのアッセイでは、変異誘発したヌルＬＯＸ−１オオムギ穀粒をスクリーニングすることが高度に有利であろう（ＷＯ２００５／０８７９３４を参照されたい）。
【０１９５】
穀粒は、ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２（ＷＯ２００５／０８７９３４において記載され、ＰＴＡ−５４８７の受託番号でＡＴＣＣに寄託されている）のオオムギ植物体から採取し、変異原であるＮａＮ３と共にインキュベートして、オオムギのゲノムＤＮＡ内において点変異を誘導した。実験手順は、Ｋｌｅｉｎｈｏｆｓら（前出）により示される推奨に従った。
【０１９６】
次に、Ｍ１世代の変異した穀粒を、後続する２世代にわたり圃場試験区において繁殖させ、これにより、最終的に、スクリーニングを目的とする、Ｍ３世代のホモ接合性植物体が高比率でもたらされた（手順の概要については、図１を参照されたい）。変異したＭ３世代の穀粒は、穀粒１０，０００個当たり、０．９〜２．３個の頻度で、遺伝子の変異を含有すると予測された（Ｋｌｅｉｎｈｏｆｓら、前出）。
【０１９７】
従来のＬＯＸ−１アッセイにより測定される通り、ヌルＬＯＸ−１変異体の成熟胚芽におけるＬＯＸ−２活性は低いことが判明した。ここでは、反応混合物の原液を、抽出物（ＷＯ２００５／０８７９３４で記載される）と同時に混合した。本出願では、アッセイ感度を改善する方法であって、酵素抽出条件ならびに反応混合物原液の混合の両方を変更した方法について詳述する。
【０１９８】
ＬＯＸ抽出物について、本発明者らは、興味深いことに、ｐＨ４．５の１００ｍＭ乳酸緩衝液を用いることにより、ＨＰＯＤＥ消費活性のバックグラウンドレベルが著明に低下し、これにより、アッセイ緩衝液中におけるＨＰＯＤＥの蓄積が可能となることを見出した。加えて、本発明者らは、残りのアッセイ反応物質を添加する前に、形成されたＨＰＯＤＥの小画分に、それに結合した鉄原子のＦｅ＋＋→Ｆｅ＋＋＋酸化を介してＬＯＸ−２を活性化させ、最終的に青色のインダミン色素を形成することにより、アッセイをさらに改善し得ることを見出した。
【０１９９】
略述すると、２００μｌの抽出緩衝液（ｐＨ４．５の１００ｍＭ乳酸）を用いて、単離された成熟胚芽からＬＯＸ−２酵素を抽出した。１．２ｍｌずつの各ウェルが５ｍｍの球形ガラスビーズを含有する９６ウェルプレート内において、抽出を実施した。氷上で１０分間にわたりプレートをインキュベートした後、ＭＭ  ３００実験用ミル（Ｒｅｔｓｃｈ社製）へと移し、３５秒間にわたり２７秒−１の頻度で振とうするように電子的に調整した。その後、プレートを、Ａｌｌｅｇｒａ  ６Ｒ遠心分離機（Ｂｅｃｈｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）内において、４℃で１０分間にわたり、４，０００ｒｐｍで遠心分離して不溶性物質を沈殿させ、その後、最長で２時間にわたり氷上に保持した後、さらに加工した。さらにピペッティングするために、９６ウェルプレートを、Ｂｉｏｍｅｋ  ２０００  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｂｅｃｈｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）へと移した。まず、９６×４０μｌの胚芽抽出物を、標準的な９６ウェルマイクロ滴定プレート（Ｎｕｎｃ社製）へと移した後、９０μｌの試薬Ａ［１２．５ｍＭの３−（ジメチルアミノ）安息香酸、０．６２５ｍＭのリノール酸］（これは、１３４ｍｇの遊離酸に対応する１５５μｌのリノール酸（Ｓｉｇｍａ社製、Ｌ−１３７６）と、２５７μｌのＴｗｅｅｎ−２０とをまず混合し；次いで、５ｍｌの容量までＨ２Ｏを添加した後、６００μｌの１Ｍ  ＮａＯＨを添加することにより作製した）を添加した。透明化した溶液を、Ｈ２Ｏにより２０ｍｌに調整した。１０分間にわたり混合物をインキュベートした後で、９０μｌの試薬Ｂ（０．２５ｍＭの３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン、０．１２５ｍｇ／ｍｌのヘモグロビン）を添加した。さらに５分間にわたるインキュベーションの後、Ｆｌｕｏｒｏｓｔａｒ  Ｇａｌａｘｙ分光光度計（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、プレートの９６個のウェルの各々の内においてＡ５９５を測定した（色の形成が、ＬＯＸ−２により触媒される二原子酸素添加反応を介してもたらされるＨＰＯＤＥの存在を反映する（したがって、活性は、Ａ５９５単位で与えられる））。
【０２００】
上記で説明した手順を用いて、合計２１，０００系統のオオムギ変異体を、ＬＯＸ−２活性についてアッセイし、ＬＯＸ−２活性が低いことに基づき、そのうちの１，５５０系統を選択した。これらの系統を、圃場においてさらに繁殖させ、その後、成熟穀粒内におけるＬＯＸ−２活性を測定した。しかし、該系統のうちのいずれもが、低ＬＯＸ−２の形質を次世代へと伝えないことが判明した。
【０２０１】
（実施例２）
発芽オオムギ胚芽における低ＬＯＸ−２活性についてのスクリーニング
改良型スクリーニング材料：ヌルＬＯＸ−１系統であるＣａ２１１９０１（異種交配（ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２×Ｊｅｒｓｅｙ）×Ｓｅｂａｓｔｉａｎにより作製した）のオオムギ植物体から採取した穀粒を、Ｋｌｅｉｎｈｏｆｓら（前出）により示される詳細に従い、変異原であるＮａＮ３と共にインキュベートした。この手順は、オオムギのゲノムＤＮＡ内において点変異を誘導し、最終的に、変異誘発されたＤＮＡによりコードされるタンパク質内におけるアミノ酸残基の置換、またはタンパク質の切断をもたらすことが公知であるので選択された。本公開の変異誘発実験では、Ｍ１世代の変異した穀粒を、後続する２世代にわたり圃場試験区において繁殖させることを選択し、これにより、最終的に、スクリーニングを目的とする、高比率のホモ接合性植物体がもたらされた（図１を参照されたい）。Ｍ２世代の穀粒は、主に、比較的高比率のヘテロ接合性点変異を含有すると予測されたため、スクリーニングしなかったのに対し、Ｍ３世代の変異体穀粒をスクリーニング材料として用い、穀粒１０，０００個当たり、０．９〜２．３個の変異を予測した（Ｋｌｅｉｎｈｏｆｓら、前出）。
【０２０２】
驚くべきことに、本発明者らは、発芽胚芽の解析により、成熟胚芽の抽出物の解析（上記の実施例１で説明した）と比較して、アッセイ結果がはるかに改善されることを見出した。これにより、その胚芽盤組織を含め、発芽胚芽におけるＬＯＸ−２活性を測定する、ハイスループットのスクリーニング手順を確立した。
【０２０３】
３５，１２５穂のオオムギ（ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２のＭ４世代２０，９７７系統、ヌルＬＯＸ−１系統であるＣａ２１１９０系統のＭ３世代１４，１４８系統）による成熟穀粒から胚芽２つずつを単離し、９６ウェル保存プレート（ＡＢｇｅｎｅ社製）へと移した。各ウェルに２０μｌの水を添加し、湿らせたＫｉｍｎｅｔｔティッシュおよびプラスチック製のふたによりこれを覆った後で、胚芽の発芽を開始させた。プラスチック製のバッグ内、２０℃で４８時間にわたり、プレートをインキュベートした。インキュベーション後、ＬＯＸ−２酵素を抽出した；まず、各ウェルに５ｍｍのガラスビーズおよび２００μｌの抽出緩衝液（ｐＨ４．５の１００ｍＭ乳酸溶液）を添加した後で、ＭＭ  ３００実験用ミル（Ｒｅｔｓｃｈ社製）内において、３５秒間にわたり２７秒−１の頻度で破砕した。その後、プレートを、Ａｌｌｅｇｒａ  ６Ｒ遠心分離機（Ｂｅｃｈｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）内において、４℃で１０分間にわたり、４，０００ｒｐｍで遠心分離し、不溶性物質を沈殿させた。ＬＯＸ−２活性は、基本的に、成熟胚芽抽出物のＬＯＸ−２活性の解析（実施例１）について説明した通りに決定したが、アッセイ１回当たりに用いる抽出物が、４０μｌではなく、３０μｌに過ぎない点だけが異なる。
【０２０４】
潜在的な変異体の同定：上記で説明した通り、上述の３５，１２５系統のオオムギ各々について、穀粒２つずつをＬＯＸ−２活性について解析し、前記活性が、ヌルＬＯＸ−１穀粒および野生型の穀粒と比較した場合に大きく低下する穀粒を同定することを目的とした。Ｃａ２１１９０１系統のＭ３世代では、合計７個の潜在的原変異体が同定された。これらを温室内でさらに繁殖させ、収穫し、次いで、極めて低度のＬＯＸ活性に関する形質についてスクリーニングした。最終的に、変異体Ａ６８９と称する（本明細書ではまた、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９とも称する）、Ｃａ２１１９０１系統で唯一の変異体が、ＬＯＸ−２活性を本質的に示さないことが示された。ＬＯＸ活性がほぼＬＯＸ−２だけによりもたらされる発芽胚芽の抽出物により、総ＬＯＸ活性の詳細な測定が実施されている（Ｓｃｈｍｉｔｔおよびｖａｎ  Ｍｅｃｈｅｌｅｎ、１９９７年）。変異体Ａ６８９のＭ３世代の穀粒の発芽胚芽では、総ＬＯＸ活性（比色分析によるＬＯＸアッセイ（実施例１；表１）により決定された）が、Ａ５９５単位で０．１６３±５．５％／発芽胚芽１個であったのに対し、ヌルＬＯＸ−１母品種であるＣａ２１１９０１の総ＬＯＸ活性は、Ａ５９５単位で１．２２４±３．８％／発芽胚芽１個（ヌルＬＯＸ−１原変異体Ｄ１１２の対応する値は、Ａ５９５単位で１．２１５±６．０％／発芽胚芽１個）であった。
【０２０５】
（実施例３）
オオムギの変異体Ａ６８９
Ｍ４世代およびＭ５世代のヌルＬＯＸ−２植物体が、対応する変異体の表現型についてホモ接合性であるかどうかを確立するために、解析を実施した。この種の解析を行うと、変異が、遺伝子的に劣性であるかまたは優性であるかを判定するのに役立つであろう。加えて、Ｍ３世代の植物体が、優性変異についてヘテロ接合性であれば、後続世代の個体は、この表現型について分離するであろう。
【０２０６】
変異体Ａ６８９のＭ３世代、Ｍ４世代、およびＭ５世代のオオムギ胚芽において、総ＬＯＸ活性を測定し、活性を、母系統であるＣａ２１１９０１の胚芽の総ＬＯＸ活性と比較するだけでなく、ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２とも比較した。ＬＯＸ活性の決定は、本公開の実施例１で説明した通りに行った。すべての実験において、対照試料には、母系列の発芽胚芽からの基準抽出物の他、ヌルＬＯＸ−１変異体系列であるＣａ２１１９０１および変異体Ｄ１１２の胚芽からの熱不活化された基準抽出物が含まれた。変異体Ａ６８９のＭ４世代穀粒の胚芽では、平均総ＬＯＸ活性が、Ａ５９５単位で０．１５１±２．６％（ｎ＝２４）であったのに対し、変異体Ａ６８９のＭ５世代の発芽胚芽の平均総ＬＯＸ活性は、Ａ５９５単位で０．１６±２．３％（ｎ＝９０）であった。比較として述べると、ヌルＬＯＸ−１Ｃａ２１１９０１系列の発芽胚芽と、変異体Ｄ１１２の発芽胚芽とは、それぞれ、Ａ５９５単位で１．２１０±３．０％（ｎ＝９０；Ｍ４世代）と、Ａ５９５単位で１．１９９±４．６％（ｎ＝９０；Ｍ５世代）とをもたらした。結果を、表１および図４Ａ〜Ｃにまとめる。まとめると、実験データにより、変異体Ｄ１１２のＭ４世代およびＭ５世代の穀粒は、極めて低い総ＬＯＸ活性を指定し、二重ヌルＬＯＸ表現型を反映する遺伝形質について、ホモ接合性であることが裏付けられた。
【０２０７】
【表１】
0005670347.tif 000002
（実施例４）
発芽およびマイクロモルト化させたオオムギにおける、ＨＰＯＤＥについてのＨＰＬＣベースの解析
成熟胚芽ではなく、発芽胚芽を用いる点を除き、本質的に、国際特許出願第ＷＯ２００５／０８７９３４号において記載される通りに、オオムギのＨＰＯＤＥについての解析を実施した。実施例２で説明した通り、Ｍ４世代の穀粒を、４８時間にわたり発芽させた。Ｍ５世代の穀粒を、本質的に、本明細書下記の実施例６で説明する通りに実施されるマイクロモルト化手順にかけたが、特定のＨＰＯＤＥレベルは、発芽の７２時間後において決定し、キルニング手順は省略した。変異体Ａ６８９のＭ４世代およびＭ５世代の発芽胚芽に由来する、タンパク質の粗抽出物と、対照試料とを、基質であるリノール酸と共にインキュベートさせることにより、９−ＨＰＯＤＥレベルおよび１３−ＨＰＯＤＥレベルを決定した。ＨＰＬＣにより、反応生成物を解析した。
【０２０８】
外科用メスを用いて、胚芽盤と内胚乳とを切り離して、オオムギ穀粒から発芽胚芽を切除した。次いで、胚芽４個分ずつの大きさの各試料を、２枚の秤量紙の間に挟み、軽くすりつぶして、均一の粉末を作製した。これを、１．５ｍｌのマイクロ遠心管へと移し、ｐＨ４．５の２００ｍＭ乳酸緩衝液６００μｌを添加し、該遠心管を１０分間にわたり氷上に置いた後で、プラスチック製の乳棒（Ｋｏｎｔｅｓ社製）を用いて、さらにホモジナイズした。その後、各遠心管にＨ２Ｏを６００μｌずつ添加し、試料を２０，０００×ｇで２分間にわたり遠心分離した。結果として得られる上清の１００μｌアリコートを１５ｍｌの遠心管（Ｃｅｌｌｓｔａｒ社製；型番１８８２７１）へと移し、ＬＯＸ活性に従う反応生成物の解析を準備する。２６０μＭのリノール酸を含有する、ｐＨ６．５の１００ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液２ｍｌ［この基質は、ｐＨ６．５の１００ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液１０ｍｌを、２４ｍＭのリノール酸原液１００μｌと混合することにより調製した］。リノール酸原液は、まず、１５５μｌのリノール酸（１３４ｍｇの遊離酸に対応する；Ｓｉｇｍａ社製、Ｌ−１３７６）と、２５７μｌのＴｗｅｅｎ−２０とを混合し、次いで、５ｍｌの容量までＨ２Ｏを添加した後、１Ｍ  ＮａＯＨ  ６００μｌを添加し、溶液が透明となったら、水により容量を２０ｍｌへと調整した。９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥを抽出するため、採血管回転装置上において、約３０ｒｐｍで１５分間にわたるインキュベーションの後、２ｍｌの酢酸エチルを添加し、試料内容物を、５秒間にわたり強く振とうすることにより混合した。次いで、試料を８００×ｇで１０分間にわたり遠心分離し、１ｍｌの酢酸エチルを１．５ｍｌのマイクロ遠心管へと移し、この中において、流入する窒素ガス下で酢酸エチルを蒸発させた。その後、３００μｌメタノール中においてＨＰＯＤＥを再懸濁させ、０．４５μｍの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＮフィルター）により濾過した。ＨＰＬＣにより、ＨＰＯＤＥ含量についての解析を実施した。各試料に由来する合計１５μｌを、４．６×２５０ｍｍのＳｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ社製）を装備したＨＰＬＣ装置（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ社製、ＨＰ  １１００シリーズ）内へと注入した。用いた移動相は、水：メタノール：アセトニトリル：テトラヒドロフラン：トリフルオロ酢酸の１６：１２：１２：１０：０．５（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ）混合物であった。移動相の流量は、１ｍｌ分−１であり、カラム前で測定される圧力は、１４０バールであった。分離は、３０℃で実施した。コンジュゲートした二重結合を伴う、リノール酸ヒドロペルオキシドの検出は、２３４ｎｍで実施した。
【０２０９】
図５に、得られたＨＰＯＤＥプロファイルの比較を示す。９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥの混合物を含む基準試料のクロマトグラムを、図５Ａに示す。４８時間にわたり発芽させた、ヌルＬＯＸ変異体Ｄ１１２のＭ４世代の穀粒から調製された抽出物のクロマトグラム（図５Ｂ）を、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９についてのクロマトグラム（図５Ｃ）と比較したところ、ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２の発芽胚芽から抽出したＬＯＸにより、１３−ＨＰＯＤＥが顕著に形成されることが明らかとなったのに対し、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９の抽出物中では、９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥは観察されないか、またはごく少量が観察されるに過ぎなかった。
【０２１０】
７２時間にわたりマイクロモルト化させた野生型の栽培品種Ｂａｒｋｅの胚芽（図６Ａ）、ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２の胚芽（図６Ｂ）、および二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９の胚芽（図６Ｃ）を解析したところ、同様の特徴が観察された。ここでもまた、野生型の栽培品種Ｂａｒｋｅの成熟胚芽の抽出物（図６Ａ）中では、９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥのいずれもが、著明なレベルで形成された。ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２の胚芽の抽出物による９−ＨＰＯＤＥの形成は極めて低量であったが、１３−ＨＰＯＤＥの形成は高量であり（図６Ｂ）、これにより、ＬＯＸ−１活性の欠如が検証された。ここでもまた、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９の胚芽抽出物により形成される９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥは、低レベルであり（図６Ｃ）、ＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性がいずれも完全に不在であることが裏付けられた。
【０２１１】
（実施例５）
二重ヌルＬＯＸオオムギの変異体Ａ６８９、そのヌルＬＯＸ−１母品種であるＣａ２１１９０１、およびヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２の特性
温室内における植物体の繁殖：二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９と、その母系列であるＣａ２１１９０１とのＭ４世代およびＭ５世代の穀粒を、温室内で発芽させ、１２℃および６５％の相対湿度で毎日２０時間にわたり照光下に置くサイクルにより生育させた。Ｃａ２１１９０１系列の植物体、および二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９の植物体の生育特徴は、草高、植物体１体当たりのひこばえ数、開花の開始、および１穂当たりの穀粒数に関して同等であった（これにより、変異体Ａ６８９の穀粒の発生および生育の生理学的特徴が、野生型様であることが確認される）。
【０２１２】
圃場条件下における変異体Ａ６８９の農業効力：二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９の植物体、およびヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２の植物体、ならびにＣａ２１１９０１系列の植物体を、標準的な圃場試験で比較した（草高、開花日、病害耐性、倒伏、穂の切れ毛、成熟期、および収量に関して可能な差違を同定することを目的とする（表２を参照されたい））。これに従い、前述の穀粒を等量ずつ、７．８８ｍ２の試験区内の１つの場所に播種した（各々が２連ずつを含んだ）。農業特性を全生育期にわたり注意深く観察したところ、ここでもまた前述の特性が確認された。被験植物体のうちのいずれについても、農業形質に関する差違は観察されなかった。
【０２１３】
【表２】
0005670347.tif 000003
（実施例６）
マイクロモルトおよびそのウォートについての解析
マイクロモルト化は、オオムギの変異体Ａ６８９およびＤ１１２、ならびに栽培品種ＢａｒｋｅおよびＰｏｗｅｒの１００ｇずつの試料により実施した。モルト化試験および醸造試験に十分な穀粒材料を得るため、圃場内において、複数の生育期にわたり、変異体の系列を繁殖させた。
【０２１４】
スティーピング：条件は、１６℃のスティーピング水中において８時間にわたる浸漬；１４時間にわたる乾燥；８時間にわたる浸漬；１０時間にわたる乾燥；４時間にわたる浸漬であった。
【０２１５】
モルト化：条件は、１８℃で１２時間；１６℃で２４時間；１４℃で２４時間；１２℃で６０時間であった。キルン乾燥の条件は、６０℃で１２時間；６８℃で３時間；７４℃で４時間；８０℃で３時間であった。完成モルトは、Ｔ２Ｎの測定にかけた。
【０２１６】
加えて、変異体Ａ６８９およびＤ１１２のオオムギ試料およびモルト試料、ならびに栽培品種ＢａｒｋｅおよびＰｏｗｅｒのオオムギ試料およびモルト試料を、標準的なＥＢＣ法による解析にかけた（表３を参照されたい）。
【０２１７】
ウォートの調製：変異体Ａ６８９およびＤ１１２の特性を、栽培品種Ｐｏｗｅｒと比較して調べるため、２５〜２２５ｇのモルト試料を作製し、外部撹拌機と、規定のパターンで温度勾配をかけることが可能なサーモスタットを装備した水浴とを含む実験用マッシングシステム内で用いた。マッシングは小スケールで実施し、完成したマッシュを濾紙により分離し、スイートウォートを得た。ウォートの煮沸は、加熱マンテルと、還流式冷却装置に接続した丸底フラスコとを用い、実験室スケールで実施した。
【０２１８】
スイートウォートおよび煮沸ウォートの両方を、Ｔ２Ｎの測定にかけた（図７〜９を参照されたい）。二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９のＭ５世代の穀粒に由来する試料では、約７５％の顕著なＴ２Ｎレベル（Ａ６８９変異体の３系列の平均）の低下が観察された。加えて、マイクロモルト化させた試料から生成されたウォート中における遊離Ｔ２ＮレベルおよびＴ２Ｎ前駆体レベルについても、顕著な低下が記録された（図８〜９）。
【０２１９】
Ｔ２Ｎレベルは、本質的に、Ｇｒｏｅｎｑｖｉｓｔら（１９９３年）により記載される通り、質量分析による検出を伴うガスクロマトグラフィー（ＧＣ−ＭＳ）の後、Ｏ−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）−ヒドロキシルアミンによりカルボニル基を誘導体化することにより決定した。
【０２２０】
【表３】
0005670347.tif 000004
（実施例７）
二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９のモルトから作製したビール中におけるＴＨＡ
ビール特異的なＴＨＡは、リノール酸に由来する可能性が高い（Ｄｒｏｓｔら、１９７４年）。ビール中におけるＴＨＡの総含量は、５．７〜１１．４μｇ／ｍｌの範囲であることが、複数の報告により検証されている（Ｈａｍｂｅｒｇ、１９９１年；ならびに同文献中の参考文献）。９，１２，１３−ＴＨＡが、通常、ビール中におけるＴＨＡの７５〜８５％を占めるのに対し、９，１０，１３−ＴＨＡの比率は、通常、１５〜２５％であるに過ぎない。見出される他の異性体は、微量である。
【０２２１】
二重ヌルＬＯＸオオムギの変異体Ａ６８９のモルトから調製されたウォートから作製したビール（６０℃の温度でのマッシングを用いたことを除き、実施例８を参照されたい）では、９，１２，１３−ＴＨＡの濃度が、栽培品種Ｐｏｗｅｒのモルトから作製した対照ビールと比較して７５％低下し、ヌルＬＯＸ−１原変異体Ｄ１１２と比較して４５％低下した（表４）。９，１０，１３−ＴＨＡ異性体についてもまた、同様の差違が観察された。これらの測定は、標準的なＨＰＬＣ−質量分析による解析（Ｈａｍｂｅｒｇ、前出）を用いて実施した。
【０２２２】
【表４】
0005670347.tif 000005
（実施例８）
パイロットのモルト化およびパイロット醸造
モルト化：二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９、ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２、および栽培品種Ｐｏｗｅｒの穀粒（すべての場合において、２００７年の収穫）により、実験を実施した。３０ｋｇの大スケールでのモルト化は、モルトハウス内で、以下：
（ｉ）１６℃でのスティーピング：８時間にわたる浸漬；１４時間にわたる乾燥；８時間にわたる浸漬；１０時間にわたる乾燥；４時間にわたる浸漬；
（ｉｉ）モルト化：１８℃で１２時間；１６℃で２４時間；１４℃で２４時間；１２℃で６０時間；
（ｉｉｉ）乾燥：６０℃で１２時間；６８℃で３時間；７４℃で４時間；８０℃で３時間
の通りに実施した。
【０２２３】
オオムギおよびモルトの特性を、表５に列挙する。結果を検討したところ、試料は、醸造において原料を用いる場合のモルト仕様を満たすことが明らかとなった。
【０２２４】
【表５】
0005670347.tif 000006
モルトによるパイロット醸造：その重要な結果を図１０Ａ、Ｂに示す最初の２００ｌ試験は、以下のステップ：
（ｉ）ウォートを調製するステップと；
（ｉｉ）ウォートを分離するステップと；
（ｉｉｉ）ウォートを煮沸するステップと；
（ｉｖ）発酵させるステップと；
（ｖ）ラガリングするステップと；
（ｖｉ）ブライトビールを濾過するステップと；
（ｖｉｉ）ボトル封入するステップと
を伴った。
【０２２５】
野生型の栽培品種Ｐｏｗｅｒ、ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２、および二重ヌルＬＯＸの３０ｋｇずつの大規模モルト試料を用いて、ウォートを調製した。４８℃で２０分間にわたるマッシングインの後、１８分間にわたり加熱したが、このとき、温度を４８℃から６７℃へと上昇させた。６７℃で３０分間にわたり静置して糖化させた後、５分間にわたる７２℃への加熱ステップを実施し、１５分間にわたり静置した後、７８℃でマッシングオフした。本明細書の上記で言及した醸造ステップ（すなわち、ウォートを煮沸および濾過し、泡沫分離し、発酵させ、ラガリングし、緑色ガラスボトル内へと封入するステップ）は、標準的な醸造慣行に応じた仕様に従った。
【０２２６】
実施例６で説明したのと同じ実験手順を用いて、完成したビールのＴ２Ｎ前駆体を決定した（図１０）。この大スケールでの実験の結果により、Ｔ２Ｎ前駆体の相対レベルの傾向が、マイクロモルト化させた穀粒による煮沸ウォート中の場合と同じであることが示され（図９および１０を比較されたい）、ここでもまた、栽培品種Ｐｏｗｅｒと比較して、ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２および二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ８７６のいずれについても、顕著に低い値が示された。より具体的に述べると、ヌルＬＯＸ−１ビール試料中および二重ヌルＬＯＸビール試料中におけるＴ２Ｎ前駆体は、野生型の栽培品種Ｐｏｗｅｒのモルトによるビールと比較した場合、それぞれ、約４０％および約７０％低下した。
【０２２７】
また、前述のパイロット醸造されたビール中の遊離Ｔ２Ｎレベルも測定したところ、ここでもまた、Ｔ２Ｎポテンシャルについて観察されたのと同じ傾向が示された（すなわち、ヌルＬＯＸ−１モルトおよび二重ヌルＬＯＸモルトから作製したビールは、栽培品種Ｐｏｗｅｒのモルトにより醸造されたビールより、Ｔ２Ｎが顕著に低量であった）。したがって、Ｔ２Ｎレベルに関してもまた、二重ヌルＬＯＸモルトによるビールは、ヌルＬＯＸ−１ビールより優れていることが示された。
【０２２８】
別の目的は、二重ヌルＬＯＸ原料を用いて２００ｌのスケールで作製した場合のビールが、強制劣化後における風味の品質において優れているかどうかを確立することであった。したがって、実施例９で説明される、専門家によるビール試飲パネルに、０（なし）〜５（極めて強い）のスコアを用いて、３７℃で１週間にわたり強制劣化させた後における紙の異臭風味について、パイロット醸造された通常ビールを評価するように要請した。栽培品種Ｐｏｗｅｒによるビールが、紙の風味のスコア１．６を示すことが判明したのに対し、ヌルＬＯＸ−１および二重ヌルＬＯＸビールは、それぞれ１．２および０．６であった。この結果は、風味の安定的なビールを生産するのに、二重ヌルＬＯＸ原料がやはり優れていることを示した。
【０２２９】
（実施例９）
通常ビールとオオムギ醸造ビールとの比較
モルト化させていない、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９の穀粒、ヌルＬＯＸ−１オオムギの変異体Ｄ１１２の穀粒、および野生型の栽培品種Ｐｏｗｅｒの穀粒を、各々、２５ｋｇずつの、モルト化させていない破砕オオムギを、２００ｌのビールを作製するための原料として用いる、同一のオオムギ醸造工程に適用した（比較を目的として、並行して実施する実験において、３０ｋｇの破砕モルトを用いて、２００ｌの通常ビールを作製した）。目的は、オオムギ醸造によるウォートおよびビールの特性と、モルトに由来する醸造によるウォートおよびビールの特性とを比較するだけでなく、上述の変異体が、オオムギ醸造ビールと、通常の完成したビールとの両方において、異臭特徴の改善をもたらし得るかどうかを判定することであった。２００ｌの大規模醸造試験は、上記の実施例８で列挙したのと同じ作製ステップを含んだが、特定の詳細については、本明細書の下記で説明する。
【０２３０】
オオムギによるマッシングおよび醸造：本実験では、製造元により示される推奨（すなわち、Ｈ２Ｏ  ８０ｌ当たり、８７．５ｇの酵素混合物）に従い、マッシングインするステップにおいて添加した酵素混合物であるＯｎｄｅａ  Ｐｒｏ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製；バッチ番号ＮＦＮＧ０００５）の存在下において、ウォートを調製した。マッシング条件は、５４℃で３０分間にわたるマッシングイン；温度を６４℃へと上昇させる１０分間の加熱；６４℃で４５分間にわたるインキュベーション；７８℃で１３分間にわたる加熱；７８℃で１０分間にわたる静置であった。ウォートを煮沸および濾過し、泡沫分離し、発酵させ、ラガリングし、緑色ガラスボトル内へと封入する醸造ステップは、標準的な醸造慣行に応じた仕様に従った。
【０２３１】
標準的なモルト化、マッシング、および醸造：モルト化では、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９、ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２、および野生型の栽培品種Ｐｏｗｅｒ（すべて、２００９年の収穫による）のオオムギ穀粒を用いた。１６℃でのスティーピングインキュベーション時間は、８時間にわたる浸漬；１４時間にわたる乾燥；８時間にわたる浸漬；１０時間にわたる乾燥；４時間にわたる浸漬であった。モルト化条件は、１８℃で１２時間；１６℃で２４時間；１４℃で２４時間；１２℃で６０時間であった。キルン乾燥条件は、６０℃で１２時間；６８℃で３時間；７４℃で４時間；８０℃で３時間であった。前述の原料のオオムギおよびモルトについての解析は、標準的なＥＢＣ法により実施した（結果を表６に列挙する）。すべてのモルトは、醸造に適すると考えられた。
【０２３２】
マッシング条件は、４８℃で２０分間にわたる最初のインキュベーション；１８分間にわたる６７℃への加熱；６７℃で３０分間にわたるインキュベーション；次いで、５分間にわたる７２℃への加熱；７２℃で１５分間にわたるインキュベーション；６分間にわたる７８℃への加熱；最後に、７８℃で５分間にわたるインキュベーションであった。ウォートを煮沸および濾過し、泡沫分離し、発酵させ、ラガリングし、緑色ガラスボトル内へと封入する醸造ステップは、標準的な醸造慣行に応じた仕様に従った。
【０２３３】
煮沸ウォートについての解析（遊離Ｔ２Ｎ）：抽出物中におけるＴ２Ｎレベルは、本質的に、Ｇｒｏｅｎｑｖｉｓｔら（１９９３年）により説明される通り（また、実施例５も参照されたい）、質量分析による検出を伴うガスクロマトグラフィー（ＧＣ−ＭＳ）の後、Ｃ１８カラム上において固相抽出し、Ｏ−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）−ヒドロキシルアミンによりカルボニル基を誘導体化することにより決定した。
【０２３４】
栽培品種Ｐｏｗｅｒによる試料およびヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２による試料と直接比較したところ、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９のオオムギ醸造により作製された煮沸ウォート、および二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９の通常モルトから作製された煮沸ウォートのいずれにおける遊離Ｔ２Ｎも、顕著に低下することが観察された（図１１）。ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２から作製された、オオムギ醸造による煮沸ウォートと比較したところ、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９のオオムギ醸造による煮沸ウォートは、遊離Ｔ２Ｎレベルが約４５％低下した（対応するモルト化試料では、約１５％の低下であった）。
【０２３５】
同様に、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９によるビールにおける遊離Ｔ２Ｎについては、栽培品種Ｐｏｗｅｒによるビールと比較して、約７２％の低下が認められた（対応するモルト化試料では、約４５％の低下であった）。
【０２３６】
煮沸ウォートについての解析（Ｔ２Ｎ前駆体）：栽培品種Ｐｏｗｅｒ、ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２、および二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９のオオムギ醸造による煮沸ウォート試料と、通常のウォート試料とにおけるＴ２Ｎ前駆体は、本質的に、Ｇｒｏｅｎｑｖｉｓｔら（前出）により記載される通り、ＧＣ−ＭＳの後、Ｏ−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）−ヒドロキシルアミンによりカルボニル基を誘導体化することにより決定した。
【０２３７】
図１２に示す通り、オオムギ醸造による煮沸ウォートと、通常のウォートとのＴ２Ｎ前駆体は、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９に由来する試料中で顕著に低く、野生型の栽培品種Ｐｏｗｅｒと比較して約７０％の低下となった（また、ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２による試料との比較でも、低下が記録された）。
【０２３８】
オオムギ醸造ビールだけについての解析（強制劣化による遊離Ｔ２Ｎ）：オオムギ醸造によるウォート試料の発酵に由来する（ならびに、同等レベルの亜硫酸塩を含む）ボトル内に封入したビールを、１カ月以内に、Ｔ２Ｎの生成について、経時的に解析した。
【０２３９】
前述のオオムギ醸造ビールを、３７℃で強制劣化させ、本明細書の上記で説明する通りに、遊離Ｔ２Ｎの発生について追跡した。
【０２４０】
図１３Ａに示す通り、３種類のオオムギ醸造ビールは、Ｔ２Ｎ発生動態が顕著に異なる結果として、容易に識別された。オオムギの栽培品種Ｐｏｗｅｒによる基準ビールが、予測通りの効力であった（３７℃で８週間後において６４ｐｐｔのＴ２Ｎ）（Ｔ２Ｎレベルが、同様のモルトベースのビールより１０〜２０％高い（図示しない））のに対し、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９に由来するオオムギビールでは、Ｔ２Ｎの発生が予測外かつ顕著に低く（３７℃で８週間後において１６ｐｐｔのＴ２Ｎ）、最終ビールの遊離Ｔ２Ｎが７５％低下することに対応した。ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２のオオムギ醸造ビールを、野生型穀粒による同種類のビールと比較したところ、８週間で遊離Ｔ２Ｎが５２％低下した。
【０２４１】
強制劣化実験により、解析されたビール間における顕著な差違が確認された。既に１．５週間後において、栽培品種Ｐｏｗｅｒによる基準のオオムギ醸造ビールが、約５０ｐｐｔの風味閾値レベルを超えたのに対し、二重ヌルＬＯＸ変異体６８９によるオオムギ醸造ビールは、はるかに低い約１６ｐｐｔのＴ２Ｎレベルであり、したがって、ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２によるオオムギ醸造ビールの３２ｐｐｔのＴ２Ｎよりはるかに良好であった。
【０２４２】
オオムギ醸造ビールと通常ビールとの比較（Ｔ２Ｎ前駆体）：図１３Ｂに、いずれも２００ｌの容量で作製された、オオムギ醸造原料による新鮮なビールと、モルト化原料による新鮮なビールとにおけるＴ２Ｎ前駆体レベルを特定するデータについての概要を示す。ここでもまた、二重ヌルＬＯＸ原料は、測定された特性が優れており、実際、オオムギ醸造ビール中のＴ２Ｎポテンシャル（１．２ｐｐｂ）が、ヌルＬＯＸ−１モルトにより作製されたビール中（１．５ｐｐｂ）より低かった。
【０２４３】
オオムギ醸造ビールと通常ビールとの比較（Ｔ２Ｎの強制発生）：この場合、すなわち、３７℃でビールを強制劣化させる場合においても、野生型の原料から作製されたビールと、変異体の原料から作製されたビールとでは、顕著な差違が見られた（図１３Ｃ）。野生型の栽培品種Ｂａｒｋｅの穀粒によるオオムギ醸造ビールおよび通常ビールのいずれもが、２週間後において、約５０ｐｐｔのＴ２Ｎを示したのに対し、ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２および二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ８７６の原料では、対応する値が、それぞれ、約５０％および約７５％低下した。同じ傾向は、強制劣化の３週間後においても観察された。したがって、ビールの生産においてＬＯＸ酵素を欠損させた原料を用いることは、劣化時におけるＴ２Ｎの発生を大きく低下させる優れた方法を表すことが実証された。さらにこの点において、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ８７６による原料は、ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２による原料より優れている。
【０２４４】
オオムギ醸造ビールと通常ビールとの比較（ＴＨＡ）：リノール酸に由来するビール特異的なＴＨＡについては、既に、数十年も前に記載されている（Ｄｒｏｓｔら、１９７４年）。それ以来、ビール中における総ＴＨＡ含量が、約５〜１２ｐｐｍの範囲であることは、様々な報告により検証されている（Ｈａｍｂｅｒｇ、１９９１年；ならびに同文献中の参考文献）。９，１２，１３−ＴＨＡが、通常、ビール中におけるＴＨＡの７５〜８５％を占めるのに対し、９，１０，１３−ＴＨＡの比率は、通常、１５〜２５％であるに過ぎない。見出される他の異性体は、微量である。
【０２４５】
ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２および二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９の原料による２００ｌスケールの実験による新鮮なオオムギ醸造ビールでは、ＬＯＸ−１経路およびＬＯＸ−２経路に由来する９，１２，１３−ＴＨＡおよび９，１０，１３−ＴＨＡのレベルは、栽培品種Ｐｏｗｅｒによる対照の場合と比較して、それぞれ、約６０％および約８０％低下することが判明した（図１４Ａ）。ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２によるオオムギ醸造ビールでは、ＬＯＸ経路のＬＯＸ−２分枝に由来する主要なＴＨＡ生成物である９，１０，１３−ＴＨＡが、栽培品種Ｐｏｗｅｒによるビールと比較して、驚くべき高レベル、すなわち、＋４７％で測定された。この結果は、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９により得られた結果（ここでもまた、栽培品種Ｐｏｗｅｒと比較して、６０％の低下が測定された）と対照的であった。個別の実験結果により、前述の結論が裏付けられた。この観察についての分子的基盤はなお不明であるが、一部の細胞機構（複数可）が活性化されて、９，１０，１３−ＴＨＡの形成に関与する酵素の合成を増強することにより、変異体Ｄ１１２におけるＬＯＸ−１の不在を補完すると推測することができる。
【０２４６】
二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９から作製されるオオムギ醸造ビールでは、栽培品種Ｐｏｗｅｒと比較して、著明に低い９，１２，１３−ＴＨＡ：９，１０，１３−ＴＨＡ比がもたらされたのは、このためである。
【０２４７】
９，１２，１３−ＴＨＡレベルおよび９，１０，１３−ＴＨＡレベルの決定を、それらの比の決定と組み合わせることにより、ビールが二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９のオオムギを用いて作製されたかどうかを示す、簡便な最初のツールが得られる。しかし、この問題についてのより確固とした評価は、本出願で説明されるさらなる検討を伴い得る。
【０２４８】
二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９によるモルトから作製されたビールでは、ＬＯＸ経路に由来する９，１２，１３−ＴＨＡおよび９，１０，１３−ＴＨＡが、モルト化させた栽培品種Ｐｏｗｅｒによる対照ビールと比較して、それぞれ、約７５％および約４０％低下することが判明した（図１４Ｂ）。前記ビールではまた、栽培品種Ｐｏｗｅｒによるビールと比較した場合、９，１２，１３−ＴＨＡ：９，１０，１３−ＴＨＡ比も極めて低く計算され得る。すべての場合においてではないが、一般に、モルトベースのビールでは、オオムギ醸造ビールの場合より、ＴＨＡレベルが若干低い（図１４ＡおよびＢを比較されたい）。
【０２４９】
オオムギ醸造ビールだけについての解析（風味（ｔａｓｔｅおよびｆｌａｖｏｒ）の安定性）：風味の専門家パネルが、栽培品種Ｐｏｗｅｒ、ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２、および二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９による、前述の、強制劣化させたオオムギ醸造ビールを評価した。
【０２５０】
一般に、試飲パネルは、すべての種類の新鮮なビールと、３７℃で１週間にわたり強制劣化させた後のビールとについて、満足のゆく風味プロファイルを見出した。しかし、基準ビールについては、「紙の」風味スコアが、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９によるモルトを用いて作製されたビール、およびヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２によるモルトを用いて作製されたビールの場合より著明に高かった（図１５Ａ）、すなわち、基準ビールは、前記異臭のより強い風味を特徴とした。一般に、試飲パネルは、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９から作製されたオオムギ醸造ビールを好んだ。
【０２５１】
熟練の試飲パネルはまた、３０℃で１カ月間および３カ月間にわたりビールを保存した後における、より一般的な「劣化」風味についても評価し、ここでもまた、栽培品種ＰｏｗｅｒによるビールおよびヌルＬＯＸ−１によるビールについての前記風味スコアが、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９の場合より著明に高いことが示された（図１５Ｂ）。
【０２５２】
まとめると、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９によるオオムギ醸造ビールおよび通常ビールの風味安定性の改善は、顕著である（単純に、特に高温での保存後におけるＴ２Ｎレベルが低いため）。したがって、醸造手順におけるＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２の作用は、劣化ビールにおける主要な異臭化合物であるＴ２Ｎの出現についての重要な決定因子を表す。
【０２５３】
オオムギ醸造ビールと通常ビールとの比較（ビールの泡）：超音波浴中で２０分間にわたり、オオムギ醸造ビールおよび対照ビールを脱気させた後に、１５０ｍｌのビールに５０ｍｌのＨ２Ｏを添加した。長さ１６ｃｍ、幅７ｃｍのガラス管（底部および上端部において、それぞれ、ガラスフィルターおよびコネクターを伴う）からなる発泡タワー内へと、該混合物をゆっくりと注入した。Ｎ２ガスが、４００ｍｌ分−１の流速で、前記混合物全体を底部から泡立てて、ビールの泡を生成させた。これを管内に導き、秤の上に置いた沈降分級コーン内に回収した。
【０２５４】
オオムギ醸造ビール（図１６Ａ）およびモルト醸造ビール（図１６Ｂ）のいずれについても、泡の発生が止まるまで５分間隔で泡の総重量を記録した。いずれの場合においても、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９に由来する原料によるビールが、最も多くの泡を発生させた。実際には、モルトベースのビールより、オオムギ醸造ビールにおいて、泡の発生がより良好であった。
【０２５５】
【表６】
0005670347.tif 000007
（実施例１０）
オオムギ変異体Ａ６８９では、ＬＯＸ−２遺伝子が変異している
栽培品種ＢａｒｋｅのＬＯＸ−２をコードするゲノムヌクレオチド配列（配列番号１）と、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９のＬＯＸ−２をコードするゲノムヌクレオチド配列（配列番号２）とは、本明細書の下記で説明する通りに得た。その後、その表現型が、発芽オオムギ穀粒内においてＬＯＸ−２活性が不在であることを特徴とする、変異体Ａ６８９のヌルＬＯＸ−２遺伝子型の分子的基盤を決定するため、得られた配列を比較した。
【０２５６】
前記比較を目的として、植物体ＤＮＡ単離キット（Ｒｏｃｈｅ社製）を用い、苗の若葉から、変異体Ａ６８９に由来するオオムギのゲノムＤＮＡと、野生型の栽培品種Ｂａｒｋｅに由来するオオムギのゲノムＤＮＡとを単離した。変異体Ａ６８９のゲノムＤＮＡ内における、ＬＯＸ−２のタンパク質コード領域と、栽培品種ＢａｒｋｅのゲノムＤＮＡ内における、ＬＯＸ−２のタンパク質コード領域とを対象とする、３３３１ｂｐずつの２つの配列を、プライマー５’−ＣＧＣＡＧＣＧＡＧＣＴＡＡＣＴＴＡＧＡＡＧＣＧＴＧＣＣＡＣＡ−３’（配列番号３）および５’−ＣＣＴＣＡＴＧＣＣＴＴＴＧＴＧＣＴＡＴＣＣＴＴＧＣＴＴＧＣＴ−３’（配列番号４）を用いるＰＣＲにより増幅した（プライマー配列のベースは、ＬＯＸ−２遺伝子のゲノム配列（すなわち、配列番号１）を含んだ）。
【０２５７】
ＰＣＲ反応は、５ピコモルの各プライマーおよび３．０ＵのＦａｉｌＳａｆｅポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を含有する２０μｌの反応緩衝液中に再懸濁させた、１００ｎｇのゲノムＤＮＡからなった。ＰＣＲ増幅は、以下のパラメータ：９８℃で３０秒間の１サイクル；９８℃で１５秒間；６５℃で３０秒間；７２℃で６０秒間の３０サイクル；７２℃で１０分間の１サイクルを用いて、ＭＪサイクラー内で実施した。結果として得られるＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離し、長さにおいて単位複製配列に対応するＤＮＡ断片を、Ｑｉａｅｘ  ＩＩゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製し、これを、プラスミドベクターであるｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ  ＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）内へと挿入した。コード領域を、特異的なオリゴヌクレオチドプライマーによるジデオキシヌクレオチド鎖終結反応へと適用した後、ＭｅｇａＢＡＣＥ  １０００  ＤＮＡ配列決定装置（ＧＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）上において配列決定した。図１７に、ＬＯＸ−２をコードする領域の開始コドンおよび終止コドンにわたるゲノム配列の概略表示を示す。Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ配列解析ソフトウェアパッケージｖｅｒ．５．２（ＤＮＡＳＴＡＲ社製）を用いて配列比較を実施したところ、エクソン６内の配列番号２の２６８９位におけるＧ→Ａ置換の形態で、１つの点変異が明らかとなった（図１７）。
【０２５８】
ＬＯＸ−２の野生型配列は、予測質量が９６．７ｋＤａである、８６４残基の長さのタンパク質をコードする（配列番号５）。変異体Ｄ１１２のＬＯＸ−１コード配列内の６８４位における変異が、未熟終止コドンの導入を引き起こしたのに対し、変異体Ａ６８９のＬＯＸ−２コード遺伝子の変異は、Ｃ末端における１８０アミノ酸の切断を結果としてもたらし、このため７６．８ｋＤａのタンパク質をコードする（配列番号６）。
【０２５９】
表７は、野生型のオオムギ、ヌルＬＯＸ−１オオムギ変異体Ｄ１１２（ＷＯ２００５／０８７９３４において記載される）、およびオオムギの変異体Ａ６８９（二重ヌルＬＯＸ）のＬＯＸ−２遺伝子に関する分子的差違についての概観を示す。
【０２６０】
【表７】
0005670347.tif 000008
（実施例１１）
オオムギの二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９の遺伝的検出
一塩基多型（ＳＮＰ）アッセイは、植物体の変異を同定する簡便な方法を表す。本明細書において、ＳＮＰとは、１つの遺伝子座において少なくとも２つの異なるヌクレオチドを有する、変異点を意味する。前記アッセイは、ゲノムＤＮＡを鋳型として用いる、２セットのＰＣＲ反応を組み合わせて用いることに基づく。いずれの反応も、遺伝子座特異的なプライマーと、２つのＳＮＰプライマーのうちの１つ（配列の各対立遺伝子につき１つずつ）とを含有する。植物系列当たり２セットずつのＰＣＲ反応を実施する（ＰＣＲ反応の結果は、ＳＮＰプライマーが、変異体の配列に結合するか、または野生型の対立遺伝子に結合するかである（図１８Ａ））。複数の方法のうちの１つにおいて、ＳＮＰ解析は、ＰＣＲ産物のゲル電気泳動後におけるバンド形成パターンを評価することにより、変異体系列を同定することに基づくことが可能である。
【０２６１】
製造元の推奨に従い、植物ＤＮＡ単離キット（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、苗の葉組織から、オオムギ育種系列に由来するオオムギのゲノムＤＮＡと、野生型の栽培品種Ｑｕｅｎｃｈに由来するオオムギのゲノムＤＮＡとを単離した。野生型のＬＯＸ−２遺伝子のＳＮＰを増幅するのに用いられるオリゴヌクレオチドプライマーが、５’−ＡＣＣＴＣＡＡＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＧＧ−３’（配列番号７）および５’−ＧＡＧＣＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＣＧＧＡＧ−３’（配列番号８）であったのに対し、対応する変異体の遺伝子のプライマーは、５’−ＡＣＣＴＣＡＡＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＧＡ−３’（配列番号９）および５’−ＧＡＧＣＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＣＧＧＡＧ−３’（配列番号８）であった。これらのプライマーの組合せをＰＣＲ反応で用いて、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９および栽培品種ＱｕｅｎｃｈそれぞれのＬＯＸ−２コード領域の一部を含む２００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した（図１８Ａ）。ＰＣＲ反応は、２５ピコモルのプライマーと、製造元の指示書に従って用いられる、７μｌのＲＥＤＴａｑミックス（Ｓｉｇｍａ社製）とを含有する２０μｌの反応緩衝液中における、１００ｎｇのゲノムＤＮＡからなった。２９サイクルのＰＣＲ増幅を、ＭＪサイクラー内で実施した：９６℃で２分間の１サイクル；９５℃で１分間；６８℃で１分間；７２℃で１分間；最後に、７２℃で１０分間の伸長。
【０２６２】
ＬＯＸ−１変異を保有するホモ接合性のオオムギ植物体と、ＬＯＸ−２変異を保有するホモ接合性の植物体との異花受粉は、４つの異なるイベントを結果としてもたらし得る。ＬＯＸ−１の変異（ＬＯＸ−１遺伝子の３４７４位におけるＧ→Ａ変異）を同定するための１つのＳＮＰプライマーセット（ＦＬ８２０（配列番号１０）およびＦＬ８２３（配列番号１１））と、ＬＯＸ−２遺伝子の変異［ＬＯＸ−２遺伝子（配列番号１）の２６８９位におけるＧ→Ａ変異］を同定するための１つのＳＮＰプライマーセット（ＦＬ１０３４（配列番号９）およびＦＬ１０３９（配列番号８））との２セットのプライマーを用いると、前述の４つの異種交配イベントのうちの１つを同定することが可能となるはずである（図１８Ｂで概観する）。言い換えれば、１回の組合せによるＰＣＲ反応を用いて、前述のＬＯＸ−１変異およびＬＯＸ−２変異のいずれにも特異的なＰＣＲ産物を作製することができる。ＬＯＸ−１遺伝子の３４７４位におけるＧ→Ａ変異のためのＳＮＰ  ＰＣＲ産物を増幅するのに用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは、５’−ＣＡＡＧＧＴＧＣＧＧＴＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣ−３’（配列番号１０）および５’−ＣＴＣＧＣＧＣＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＡＴ−３’（配列番号１１）であり、これらにより、ＬＯＸ−１のコード領域の一部を含む１６６ｂｐのＤＮＡ断片が作製された。ＬＯＸ−２遺伝子の２６８９位におけるＧ→Ａ変異を検出するためのＳＮＰ  ＰＣＲ産物を増幅するのに用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは、５’−ＡＣＣＴＣＡＡＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＧＡ−３’（配列番号９）および５’−ＧＡＧＣＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＣＧＧＡＧ−３’（配列番号８）であり、これらにより、ＬＯＸ−２のコード領域の一部を含む２００ｂｐのＤＮＡ断片が作製された。図１８Ｃのレーン２は、二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９が、前述の変異の両方を保有したことを詳しく示すのに対し、野生型の対照はこれらのいずれも保有しなかった（図１８Ｃ、レーン３）。
【０２６３】
別の実験では、製造元の指示書に従い、ＲＥＤＥｘｔｒａｃｔ−Ｎ−Ａｍｐ植物体ＰＣＲキット（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて、２３の育種系列の苗の葉組織から、オオムギのゲノムＤＮＡを単離し、その後、２５ピコモルのプライマーを含有する２０μｌの反応緩衝液中１００ｎｇのゲノムＤＮＡからなるＰＣＲ反応においてこれを用いた。増幅は、製造元の指示書に従い、ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）内で実施した：９６℃で２分間の１サイクルと；９５℃で１分間、６８℃で１分間、７２℃で１分間の２９サイクルと；最後に、７２℃で１０分間の１サイクル。図１９は、ＰＣＲ産物の電気泳動後におけるバンド形成パターンを示す。解析により、該手順は、ヌルＬＯＸ−１変異と、ヌルＬＯＸ−２変異との所望の組合せを選択するのに有用であることが明らかとなった。
【０２６４】
配列表
配列番号１：栽培品種Ｂａｒｋｅ由来の、ＬＯＸ−２をコードする野生型ゲノムＤＮＡの配列
配列番号２：オオムギ変異体Ａ６８９の、変異体ＬＯＸ−２ゲノムＤＮＡの配列
配列番号３：ＬＯＸ−２のタンパク質コード領域の増幅のためのプライマー（ＦＬ９６０ともいう）
配列番号４：ゲノムＬＯＸ−２  ＤＮＡのタンパク質コード領域の増幅のためのプライマー（ＦＬ９６１ともいう）
配列番号５：野生型オオムギ、栽培品種Ｂａｒｋｅの全長ＬＯＸ−２タンパク質の配列
配列番号６：オオムギ変異体Ａ６８９由来の、ＬＯＸ−２活性を欠く変異体ＬＯＸ−２の配列
配列番号７：野生型ＬＯＸ−２  ＤＮＡの増幅のためのプライマー（ＦＬ１０３５ともいう）
配列番号８：ＬＯＸ−２  ＤＮＡの増幅のためのプライマー（ＦＬ１０３９ともいう）
配列番号９：変異体Ａ６８９の変異体ＬＯＸ−２  ＤＮＡの増幅のためのプライマー（ＦＬ１０３４ともいう）
配列番号１０：変異体Ｄ１１２の変異体のＬＯＸ−１  ＤＮＡの増幅のためのプライマー（ＦＬ８２０ともいう）
配列番号１１：ＬＯＸ−１  ＤＮＡの増幅のためのプライマー（ＦＬ８２３ともいう）
【０２６５】
【数１】
0005670347.tif 000009
【０２６６】
【数２】
0005670347.tif 000010
【０２６７】
【数３】
0005670347.tif 000011
【０２６８】
【数４】
0005670347.tif 000012
【０２６９】
【数５】
0005670347.tif 000013
【図１】
0005670347.tif 000014
【図２】
0005670347.tif 000015
【図３】
0005670347.tif 000016
【図４−１】
0005670347.tif 000017
【図４−２】
0005670347.tif 000018
【図４−３】
0005670347.tif 000019
【図５】
0005670347.tif 000020
【図６】
0005670347.tif 000021
【図７】
0005670347.tif 000022
【図８】
0005670347.tif 000023
【図９】
0005670347.tif 000024
【図１０】
0005670347.tif 000025
【図１１】
0005670347.tif 000026
【図１２】
0005670347.tif 000027
【図１３−１】
0005670347.tif 000028
【図１３−２】
0005670347.tif 000029
【図１３−３】
0005670347.tif 000030
【図１４】
0005670347.tif 000031
【図１５】
0005670347.tif 000032
【図１６】
0005670347.tif 000033
【図１７】
0005670347.tif 000034
【図１８−１】
0005670347.tif 000035
【図１８−２】
0005670347.tif 000036
【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
0005670347.tif 000038
【配列表】
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