(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
北米型ＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド分子であって、前記ＤＮＡ配列が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、及び配列番号：６からなる群から選択される、前記ポリヌクレオチド分子。
【請求項２】
請求項１で定義されるポリヌクレオチド分子で形質移入された宿主細胞。
【請求項３】
ＰＲＲＳウイルスによる感染に対してブタ動物を保護するためのワクチンであって、（ａ）請求項１で定義されるＤＮＡであるポリヌクレオチド分子によってコードされた北米型ＰＲＲＳウイルス、
（ｂ）請求項１で定義される前記感染性ＲＮＡ分子、
（ｃ）プラスミドの形態の前記ＤＮＡであるポリヌクレオチド分子、又は
（ｄ）前記ＤＮＡであるポリヌクレオチド分子を含んでなるウイルスベクター、及び
獣医学的使用のために適した担体を含んでなり、
ここにおいて、該ＰＲＲＳウイルスは、感染に対して免疫保護を産生するために有効な量において、ＰＲＲＳウイルスによる感染に対して有効な免疫保護的反応を誘発することが可能である、前記ワクチン。
【請求項４】
ＰＲＲＳウイルスをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド分子であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、又は配列番号：６のＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列である、前記ポリヌクレオチド分子。
【請求項５】
ＰＲＲＳウイルスの野生株で天然に感染されたブタ動物と、請求項３で定義されるワクチンでワクチン接種されたブタ動物の間を識別するポリヌクレオチド分子を含んでなる、診断キット。
【請求項６】
前記ワクチンが、野生型Ｐ１２９ＰＲＲＳウイルスと比較して減少したインターフェロン−α阻害効果を有する、請求項３に記載のワクチン。
【請求項７】
配列番号：６のポリヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１又は請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１又は７に記載のいずれかのＤＮＡポリヌクレオチド配列の相補体である、ＲＮＡポリヌクレオチド分子。
【請求項９】
ＰＲＲＳウイルスを産生するインビトロの方法であって、適した宿主細胞を請求項１に記載のポリヌクレオチド配列を含むプラスミドで遺伝子導入することを含んでなる、前記方法。
【請求項１０】
ＰＲＲＳウイルスを産生するインビトロの方法であって、請求項１に記載の配列を持つポリヌクレオチド分子を転写することが可能なプロモーターを持つプラスミドからの転写、続いて、適した宿主細胞中への該ＲＮＡ転写物の遺伝子導入を含んでなる、前記方法。
【請求項１１】
請求項１又は７に記載の配列の単離されたポリヌクレオチド分子を含むプラスミド及び適した宿主細胞中で該ポリヌクレオチド分子を転写することが可能なプロモーターを含んでなるプラスミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物の健康の分野にあり、そしてプラス極性ＲＮＡウイルスの感染性ｃＤＮＡクローン、新規なＲＮＡウイルス及びその改変された生きた形態、並びにワクチン、特に、このようなｃＤＮＡクローンを使用するブタのワクチンの構築に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）は、成獣の雌ブタ及び若い雌ブタにおける流産、死産及び他の生殖上の問題、並びに若年のブタの呼吸器疾病によって特徴づけられる。原因である病原体は、Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ科及びＮｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ目のメンバーのＰＲＲＳウイルス（ＰＲＲＳＶ）である。ニドウイルスは、プラス極性ＲＮＡの一本鎖からなるゲノムを有するエンベロープ付きウイルスである。プラス鎖のＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡは、遺伝子情報の保存及び発現の両方における二重の役割を果たす。ＤＮＡは、ニドウイルスの複製又は転写に関係しない。非構造性タンパク質は、大きいポリタンパク質としてニドウイルスのゲノムＲＮＡから直接翻訳され、そしてその後、ウイルスプロテアーゼによって別個の機能性タンパク質に開裂される。サブゲノムＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の３’−共通末端の入れ子セットは、ゲノムから合成され、そして構造性タンパク質の翻訳のためのメッセンジャーＲＮＡとして使用される。従って、ニドウイルスのゲノムＲＮＡの複製は、ゲノム複製及びｓｇＲＮＡ合成の組合せられた過程である。
【０００３】
１９８０年代後期に、ウイルスの二つの別個の遺伝子型が、一つは北米で、そして他方は欧州で、殆ど同時に出現した。ＰＲＲＳウイルスは、今や殆ど全ての養豚国家において風土性であり、そして全世界の養豚工業に影響する最も経済的に重要な疾病の一つと考えられる。更に、高度に病原性の遺伝子型が中国及び周辺国で単離され、そしてこのような遺伝子型は、一般的に北米型遺伝子型に関連している。
【０００４】
ＰＲＲＳＶの生物学の理解における有意な進歩にもかかわらず、ウイルスの制御は困難なままである。この分野における動物のワクチン接種は、殆ど無効であることが証明されている。ＰＲＲＳは、普通、免疫化された群れに再出現し、そして殆どの農場内ＰＲＲＳＶワクチン接種キャンペーンは、最終的に疾病の制御に失敗している。
【０００５】
理論に制約されるものではないが、野生型ＰＲＲＳＶ又はこの病原体の生の弱毒化形態によるそのワクチン接種によるブタの感染は、不幸にも非中和抗体の過剰増殖性の産生のみを誘発する。この期間中に、例えば、限られた量のインターフェロン（ＩＦＮ）−γ  分泌細胞のみが産生される。従って、ＰＲＲＳＶは、恒常的に豊富な体液性（抗体ベースの）免疫によって識別される不均衡な免疫反応、及び可変であり、そして限定的ではあるが、しかし潜在的に保護性のＴヘルパー（Ｔｈ）１−様ＩＦＮ−γ反応を、本質的に刺激するように見受けられる。獲得免疫の不均衡な発生に寄与する大きな可能性のあるＰＲＲＳＶ感染の一つの特徴は、十分な自然免疫反応の欠如である。通常、ウイルスに感染した細胞は、Ｉ型インターフェロン“ＩＦＮ”（ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βを含む）を分泌し、これは、近隣細胞を感染から保護する。更に、放出されたＩ型ＩＦＮは、ナイーブなＴ細胞のサブセットと相互作用して、ウイルス特異的ＩＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−γ）分泌細胞へのその転換を促進する。対照的に、ＰＲＲＳＶ暴露に対するブタのＩＦＮ−α反応は、殆ど存在しない。病原体によるＩＦＮ−α産生のこのような非効率的な刺激は、ＩＦＮ−αは、ＩＦＮ−γ遺伝子の発現を上方制御するために、宿主の獲得免疫反応の性質に有意な影響を有すると予測されるものである。従って、前者のサイトカインは、獲得免疫の発生を促進する主要な経路、即ち、Ｔ細胞媒介のＩＦＮ−γ反応及びピークの抗ウイルス免疫防御を制御する。
【０００６】
これに関して、ウイルス感染における自然及び獲得免疫間の可能性のある関連付けが、大量のＩ型インターフェロンを産生する能力を有する特別な形の樹状細胞を通して起こり、そしてこれが、Ｔ細胞機能の極性化において重要な役割を演じることが明白となる。具体的には、稀な、しかし、更に天然のＩＦＮ−α／β−産生細胞としても知られる顕著な形の樹状細胞の形質細胞様樹状細胞（ＰＤＣ）は、ナイーブなＴ細胞を、ＩＦＮ−γを分泌する細胞に分化することを起こすその能力によって抗ウイルス免疫において重要な役割を演じる。稀であるが、ＰＤＣは、ＩＦＮ−αの非常に強力な産生者であり、それぞれの細胞は、ウイルスに反応して３−１０ｐｇのＩＦＮ−αを産生することが可能である。対照的に、単球は、細胞当たり基準で５ないし１０倍少ないＩＦＮ−αを産生する。ブタＰＤＣの発現型及び幾つかの生物学的特性は記載されている（Ｓｕｍｍｅｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１０：４４０）。最近の研究は、ＰＲＲＳＶが、ＩＦＮ−αを分泌するためにブタＰＤＣを刺激しないことを決定している（Ｃａｌｚａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １３５：２０）。
【０００７】
この事実は、ワクチン接種時に外因的に加えられたＩＦＮ−αが、ＰＲＲＳＶ特異的ＩＦＮ−γ反応の強度を改良することが見いだされていることの観察（Ｗ．Ａ．Ｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．１０２，ｐｐ  ２９９−３１４，２００４）との組合せで、このウイルスによるブタの感染中にＩＦＮ−αが演じる重要な役割を強調する。保護免疫の発生に対するＩＦＮ−αの明白に重要な役割を考慮すれば、ＩＦＮ−αの産生を刺激及び／又は阻害する異なったＰＲＲＳウイルス原料の能力を決定することは重要なことである。従って、ＰＲＲＳに対して保護する新しい、そして改良され改変された生ワクチンに対する強要された必要性が存在する。以下に記載するように、新規な感染性ｃＤＮＡクローン、ｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ、等から誘導されるウイルスが、野生型のＰ１２９ウイルス又は二つの商業的に入手可能な改変された生ＰＲＲＳワクチンのいずれかとは異なった表現型を有することは明白である。理論に制約されるものではないが、本発明は、ウイルスに対する細胞ベースの免疫反応を促進し、そしてＰＲＲＳワクチンの新しい、そして有効な発生を明確にするワクチンを提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｕｍｍｅｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１０：４４０；
【非特許文献２】Ｃａｌｚａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １３５：２０；
【非特許文献３】Ｗ．Ａ．Ｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．１０２，ｐｐ  ２９９−３１４，２００４。
【発明の概要】
【０００９】
第１の態様において、本発明は、ＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供し、これは、ワクチンとして、これが、ブタ動物においてＰＲＲＳウイルスに対する有効な免疫保護性反応を誘発するように遺伝子的に改変されている。ある側面において、本発明は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、又は配列番号：６、或いはこれらに対する少なくとも７０％の同一性、好ましくはこれらに対する８０％の同一性、そして更に好ましくは、これらに対する８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含む、本明細書中に明記したとおりのＤＮＡ配列を提供する。
【００１０】
ある態様において、本発明は、本明細書中に明記したとおりの単離されたポリヌクレオチド分子を含むプラスミド、及び適した宿主細胞中のポリヌクレオチド分子を転写することが可能なプロモーターを提供する。もう一つの態様において、本明細書中のプラスミドの北米型又は中国型ＰＲＲＳをコードする配列は、更に、一つ又はそれより多い検出可能な異種抗原的エピトープをコードする。本発明は、本明細書中に明記するプラスミドを含む遺伝子導入（トランスフェクション）された宿主細胞を提供する。
【００１１】
もう一つの側面において、本発明は、ＰＲＲＳウイルスによる感染からブタ動物を保護するためのワクチンを提供する。ワクチンは、そのそれぞれが本明細書中に明記されるとおりの単離されたポリヌクレオチド分子によってコードされた感染性ＲＮＡ分子、感染性ＲＮＡ分子、又はプラスミドによってコードされた北米型又は中国型ＰＲＲＳウイルスを含むことができる。なおもう一つの側面において、ワクチンは、本明細書中のポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを含む。本明細書中に明記されるワクチンは、獣医学的使用のために受容可能なワクチン担体を、所望により含んでいてもよい。一つの重要な側面において、ワクチンは、野生型Ｐ１２９−ＰＲＲＳウイルス（ＡＴＣＣ  ２０３４８８、２０３４８９、米国特許第６，５００，６６２号を参照されたい）と比較して、減少したインターフェロン−α阻害効果を有する。
【００１２】
一つの態様において、本発明は、ＰＲＲＳウイルスの野外株で天然に感染されたブタ動物及び本明細書中に明記する改変された生ワクチンでワクチン接種されたブタ動物間を識別する（いわゆるＤＩＶＡ試験）ポリヌクレオチド分子を含む診断キットを提供する。
【００１３】
他の態様において、本発明は、免疫学的に保護的な量の、本明細書中に明記する特許請求の範囲のワクチンを動物に投与することを含むＰＲＲＳウイルスの株による感染からブタ動物を保護する方法を提供する。
【００１４】
本発明の更なる、そして好ましい態様は、単離されたブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）、又はこれをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ここにおいて、ＯＲＦ１ａによってコードされるタンパク質は、次のアミノ酸配列（ここで、下線を引かれた残基は新規であると考えられる）のいずれかを含有するタンパク質からなるグループから選択される：ＡＭＡＮＶＹＤ（配列番号：９）；ＩＧＨＮＡＶＭ（配列番号：１２）；ＴＶＰＤＧＮＣ（配列番号：１５）；ＣＷＷＹＬＦＤ（配列番号：１８）；ＨＧＶＨＧＫＹ（配列番号：２１）；ＡＡＫＶＤＱＹ（配列番号：２４）；ＰＳＡＴＤＴＳ（配列番号：２７）；ＬＮＳＬＬＳＫ（配列番号：３０）；ＡＰＭＣＱＤＥ（配列番号：３３）；ＣＡＰＴＧＭＤ（配列番号：３６）；ＰＫＶＡＫＶＳ（配列番号：３９）；ＡＧＥＩＶＧＶ（配列番号：４２）；ＡＤＦＮＰＥＫ（配列番号：４５）；及びＱＴＰＩＬＧＲ（配列番号：４８）。本発明の更なる好ましい態様において、本発明は単離された北米型又は中国型ＰＲＲＳであって、ＯＲＦ１ａからコードされるタンパク質内部に上述の配列のいずれかを含有するものを提供し、配列はこれらの特定された配列の任意の組合せ（２、３、４、…１７まで）を含む。
【００１５】
本発明は、更に、単離されたブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）であって、ＯＲＦ１ａによってコードされるそのタンパク質が以下のいずれか：ＡＮＶ（配列番号：  ９参照）；ＨＮＡ（配列番号：１２参照）；ＰＤＧ（配列番号：１５参照）；ＷＹＬ（配列番号：１８参照）；ＶＨＧ（配列番号：２１参照）；ＫＶＤ（配列番号：２４参照）；ＡＴＤ（配列番号：２７）；ＳＬＬ（配列番号：３０参照）；ＭＣＱ（配列番号：３３参照）；ＰＴＧ（配列番号：３６参照）；ＶＡＫ（配列番号：３９参照）；ＥＩＶ（配列番号：４２参照）；ＦＮＰ（配列番号：４５参照）；及びＰＩＬ（配列番号：４８参照）を含有するアミノ酸配列からなるグループから選択される、単離されたブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）を提供し、配列はこれらの特定された配列の任意の組合せ（２、３、４、…１７まで）を含む。
【００１６】
更なる好ましい態様において、本発明は、単離された北米型又は中国型ＰＲＲＳを提供し、ここにおいて、ウイルスをコードするポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドからコードされたタンパク質中の任意の点における、如何なる他の特異的ヌクレオチド或いはアミノ酸配列の位置の同一性に関わらず、ＯＲＦ１ａウイルスタンパク質は：
（ａ）以下の規定された配列中の特定のアミノ酸：
アミノ酸配列ＡＮＶ（配列番号：９参照）内のアミノ酸Ｎ；
アミノ酸配列ＨＮＡ（配列番号：１２参照）内のアミノ酸Ｎ；
アミノ酸配列ＰＤＧ（配列番号：１５参照）内のアミノ酸Ｄ；
アミノ酸配列ＷＹＬ（配列番号：１８参照）内のアミノ酸Ｙ；
アミノ酸配列ＶＨＧ（配列番号：２１参照）内のアミノ酸Ｈ；
アミノ酸配列ＫＶＤ（配列番号：２４参照）内のアミノ酸Ｖ；
アミノ酸配列ＡＴＤ（配列番号：２７参照）内のアミノ酸Ｔ；
アミノ酸配列ＳＬＬ（配列番号：３０参照）内のアミノ酸Ｌ．
アミノ酸配列ＭＣＱ（配列番号：３３参照）内のアミノ酸Ｃ；
アミノ酸配列ＰＴＧ（配列番号：３６参照）内のアミノ酸Ｔ；
アミノ酸配列ＶＡＫ（配列番号：３９参照）内のアミノ酸Ａ；
アミノ酸配列ＥＩＶ（配列番号：４２参照）内のアミノ酸Ｉ；
アミノ酸配列ＦＮＰ（配列番号：４５参照）内のアミノ酸Ｎ；及び
アミノ酸配列ＰＩＬ（配列番号：４８参照）内のアミノ酸Ｉ；
のいずれか、これらの定義された配列の任意の組合せ（２、３、４、…１７まで）を含み、を含有するか、或いは
（ｂ）先に規定したとおりの３−残基配列に対応する任意の他の北米型又は中国型ＰＲＲＳウイルスの、規定された３−残基のＯＲＦ１ａペプチド配列中の前記の特定の下線を引かれた単一のアミノ酸を含有し、前記他の特定の３−残基アミノ酸配列は、一つ又は二つの更なるアミノ酸配列の変化を示すことができるが、しかし先に規定した配列になお対応すると認識されることは考慮に入れる。本発明のこの態様の目的のために、“対応する”は、相対的配列が、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９，ｐｐ．１０９１５−１０９１９，１９９２中に記載されているとおりのＢＬＯＳＵＭアルゴリズムを使用して最適に整列することができることを意味する。
【００１７】
本発明の更なる好ましい態様において、単離されたブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）が提供され、ＰＲＦ１ａによってコードされるそのタンパク質は、変種（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の一つ又はそれより多くを含有するアミノ酸配列を有し、ここにおいて、それぞれの前記の変種は、以下の通りに定義される：
変種（ａ）、
アミノ酸配列ＡＮＶ（配列番号：９参照）内のアミノ酸Ｎ；
アミノ酸配列ＨＮＡ（配列番号：１２参照）内のアミノ酸Ｎ；
アミノ酸配列ＰＤＧ（配列番号：１５参照）内のアミノ酸Ｄ，
アミノ酸配列ＷＹＬ（配列番号：１８参照）内のアミノ酸Ｙ；
アミノ酸配列ＶＨＧ（配列番号：２１参照）内のアミノ酸Ｈ、又は変種（ａ）の任意のサブセット；
変種（ｂ）、
アミノ酸配列ＫＶＤ（配列番号：２４参照）内のアミノ酸Ｖ；
アミノ酸配列ＡＴＤ（配列番号：２７参照）内のアミノ酸Ｔ；
アミノ酸配列ＳＬＬ（配列番号：３０参照）内のアミノ酸Ｌ．
アミノ酸配列ＭＣＱ（配列番号：３３参照）内のアミノ酸Ｃ、又は変種（ｂ）の任意のサブセット；
変種（ｃ）、
アミノ酸配列ＰＴＧ（配列番号：３６参照）内のアミノ酸Ｔ；
アミノ酸配列ＶＡＫ（配列番号：３９参照）内のアミノ酸Ａ、又は変種（ｃ）の任意のサブセット；及び
変種（ｄ）、
アミノ酸配列ＥＩＶ（配列番号：４２参照）内のアミノ酸Ｉ；
アミノ酸配列ＦＮＰ（配列番号：４５参照）内のアミノ酸Ｎ；
及びアミノ酸配列ＰＩＬ（配列番号：２０参照）内のアミノ酸Ｉ、又は変種（ｄ）の任意のサブセット。
【００１８】
このようなＰＲＲＳウイルスは、更に、変種（ａ）で特定された五つのアミノ酸の配列の二つ又はそれより多く、及び／又は変種（ｂ）で特定された四つのアミノ酸配列の二つ又はそれより多く、及び／又は変種（ｃ）で特定された二つのアミノ酸の配列、及び／又は変種（ｄ）で特定された三つのアミノ酸配列の二つ又はそれより多くを含有することができる。
【００１９】
本発明は、更に、適した宿主細胞に直接トランスフェクト（形質移入、遺伝子導入）し、そしてこのように形質移入された適した宿主細胞からブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）を発現することが可能なプラスミドを提供し、このプラスミドは：（ａ）ＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列、及び（ｂ）前記感染性ＲＮＡ分子を転写することが可能なプロモーターを含んでなり、ここにおいて、前記ウイルスのＯＲＦ１ａによってコードされるタンパク質は：
（１）アミノ酸配列ＡＮＶ（配列番号：９参照）内のアミノ酸Ｎ；
アミノ酸配列ＨＮＡ（配列番号：１２参照）内のアミノ酸Ｎ；
アミノ酸配列ＰＤＧ（配列番号：１５参照）内のアミノ酸Ｄ，
アミノ酸配列ＷＹＬ（配列番号：１８参照）内のアミノ酸Ｙ；
アミノ酸配列ＶＨＧ（配列番号：２１参照）内のアミノ酸Ｈ、又はこれらの任意のサブセット；及び／又は
（２）アミノ酸配列ＫＶＤ（配列番号：２４参照）内のアミノ酸Ｖ；
アミノ酸配列ＡＴＤ（配列番号：２７参照）内のアミノ酸Ｔ；
アミノ酸配列ＳＬＬ（配列番号：３０参照）内のアミノ酸Ｌ．
アミノ酸配列ＭＣＱ（配列番号：３３参照）内のアミノ酸Ｃ、又はこれらの任意のサブセット；及び／又は
（３）アミノ酸配列ＰＴＧ（配列番号：３６参照）内のアミノ酸Ｔ；
アミノ酸配列ＶＡＫ（配列番号：３９参照）内のアミノ酸Ａ、又はこれらの任意のサブセット；及び／又は
（４）アミノ酸配列ＥＩＶ（配列番号：４２参照）内のアミノ酸Ｉ；
アミノ酸配列ＦＮＰ（配列番号：４５参照）内のアミノ酸Ｎ；
及びアミノ酸配列ＰＩＬ（配列番号：４８参照）内のアミノ酸Ｉ、又はこれらの任意のサブセット；
を含有するアミノ酸配列を有する。
【００２０】
ＯＲＦ１ａがプロテアーゼ機能を含んでなるポリタンパク質をコードし、そしてＯＲＦ１ｂがレプリカーゼ（ＲＮＡポリメラーゼ）及びヘリカーゼ機能を含んでなるポリタンパク質をコードすることは認識されるものである。ＰＲＲＳの各種のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）からコードされるタンパク質に対する機能に関する更なる情報は、例えば、米国特許第７，１３２，１０６号中に見出すことができる。更に、ＯＲＦ７の機能、及び他のオープンリーディングフレームに関しては、米国特許第７，５４４，３６２号を参照されたい。当技術において認識されるものであるように、ＯＦＲ１によりコードされるタンパク質は、既知の及び未知の更なる機能を有することが予測され、そして本発明の実施において有用である新規なアミノ酸の変化は、ＯＲＦ１でコードされたタンパク質のいずれか一つの特異的機能に対するこれらの効果によって制約されるものではない。
【００２１】
更なる好ましい態様において、前記プラスミドは、プロモーターを含有し、これは、標的真核細胞中のＤＮＡの起動（launch）を許容することが可能な真核生物プロモーターであるか、或いはプラスミドのｉｎ  ｖｉｔｒｏの転写を指示することが可能な原核生物又はファージプロモーターである。本発明は、同様に、ＰＲＲＳウイルスを発生する方法を提供し、この方法は、適した宿主細胞を適当なプラスミドで遺伝子導入し、そして遺伝子導入された細胞によって発生されたＰＲＲＳウイルスを得ることを含んでなる。
【００２２】
従って、具体的な、そして好ましい態様において、本発明は、北米型ＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド分子を提供し、ここにおいて、前記ＤＮＡ配列は以下の（ａ）−（ｃ）からなるグループから選択される：
（ａ）配列番号：６；
（ｂ）（ａ）のＤＮＡ配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列であって、そのＯＲＦ１ａによってコードされるタンパク質が：
グループ（ｂ）（１）から
アミノ酸配列ＡＮＶ（配列番号：９参照）内のアミノ酸Ｎ；
アミノ酸配列ＨＮＡ（配列番号：１２参照）内のアミノ酸Ｎ；
アミノ酸配列ＰＤＧ（配列番号：１５参照）内のアミノ酸Ｄ，
アミノ酸配列ＷＹＬ（配列番号：１８参照）内のアミノ酸Ｙ；
アミノ酸配列ＶＨＧ（配列番号：２１参照）内のアミノ酸Ｈ、又はこれらの任意のサブセット；及び／又は
グループ（ｂ）（２）から
アミノ酸配列ＫＶＤ（配列番号：２４参照）内のアミノ酸Ｖ；
アミノ酸配列ＡＴＤ（配列番号：２７参照）内のアミノ酸Ｔ；
アミノ酸配列ＳＬＬ（配列番号：３０参照）内のアミノ酸Ｌ．
アミノ酸配列ＭＣＱ（配列番号：３３参照）内のアミノ酸Ｃ、又は任意のいずれかのサブセット；及び／又は
グループ（ｂ）（３）から
アミノ酸配列ＰＴＧ（配列番号：３６参照）内のアミノ酸Ｔ；
アミノ酸配列ＶＡＫ（配列番号：３９参照）内のアミノ酸Ａ、又はこれらの任意のサブセット；及び／又は
グループ（ｂ）（４）から
アミノ酸配列ＥＩＶ（配列番号：４２参照）内のアミノ酸Ｉ；
アミノ酸配列ＦＮＰ（配列番号：４５参照）内のアミノ酸Ｎ；
及びアミノ酸配列ＰＩＬ（配列番号：２０参照）内のアミノ酸Ｉ、又は任意のいずれかのサブセット；
を含有するアミノ酸配列を有する、配列；並びに
（ｃ）  ６５度Ｃにおける０．５ＭのＮａＨＰｏ４、７％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ中のフィルターに結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーション、及び６８度Ｃにおける０．１ＳＳＣ／０／１％ＳＤＳ中の洗浄を含んでなる、高度に厳密な条件下で（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ配列の相補体にハイブリダイズするＤＮＡ配列。
【００２３】
本発明は、更に、ポリヌクレオチド分子により遺伝子導入された宿主細胞を提供し、そしてＰＲＲＳウイルスによる感染に対してブタ動物を保護するためのワクチンを提供し、このワクチンは：（ａ）前述のこのようなポリヌクレオチド分子によってコードされた遺伝子的に改変された北米型ＰＲＲＳウイルス、又は（ｂ）前記感染性分子、又は（ｃ）プラスミドの形態の前記ポリヌクレオチド分子、或いは（ｄ）前記ポリヌクレオチド分子を含んでなるウイルスベクター、及び獣医学的使用のために適した担体を含んでなり、ここにおいて、ＰＲＲＳウイルスは、感染に対して免疫保護を産生するために有効な量において、ＰＲＲＳウイルスによる感染に対して有効な免疫保護的反応を誘発することが可能である。
【００２４】
本発明は、更に、以下の配列に対応（即ち相補的塩基コード配列を有することによって）するＲＮＡポリヌクレオチド配列を提供する：
（ａ）  配列番号：６のＤＮＡ配列；
（ｂ）  （ａ）のＤＮＡ配列に少なくとも８５％の同一性を有するＤＮＡ配列であって、そのＯＲＦ１ａによってコードされるタンパク質が、以下のいずれか、及び以下のいずれかの任意の組合せ：
アミノ酸配列ＡＮＶ（配列番号：９参照）内のアミノ酸Ｎ；
アミノ酸配列ＨＮＡ（配列番号：１２参照）内のアミノ酸Ｎ；
アミノ酸配列ＰＤＧ（配列番号：１５参照）内のアミノ酸Ｄ，
アミノ酸配列ＷＹＬ（配列番号：１８参照）内のアミノ酸Ｙ；
アミノ酸配列ＶＨＧ（配列番号：２１参照）内のアミノ酸Ｈ；
アミノ酸配列ＫＶＤ（配列番号：２４参照）内のアミノ酸Ｖ；
アミノ酸配列ＡＴＤ（配列番号：２７参照）内のアミノ酸Ｔ；
アミノ酸配列ＳＬＬ（配列番号：３０参照）内のアミノ酸Ｌ．
アミノ酸配列ＭＣＱ（配列番号：３３参照）内のアミノ酸Ｃ；
アミノ酸配列ＰＴＧ（配列番号：３６参照）内のアミノ酸Ｔ；
アミノ酸配列ＶＡＫ（配列番号：３９参照）内のアミノ酸Ａ；
アミノ酸配列ＥＩＶ（配列番号：４２参照）内のアミノ酸Ｉ；
アミノ酸配列ＦＮＰ（配列番号：４５参照）内のアミノ酸Ｎ；
及びアミノ酸配列ＰＩＬ（配列番号：２０参照）内のアミノ酸Ｉ；
を含有するアミノ酸配列を有する；或いは
（ｃ）  ６５度Ｃにおける０．５ＭのＮａＨＰｏ４、７％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ中のフィルターに結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーション、及び６８度Ｃにおける０．１ＳＳＣ／０／１％ＳＤＳ中の洗浄を含んでなる、高度に厳密な条件下で（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ配列の相補体にハイブリダイズするＤＮＡ配列。
【００２５】
従って、本発明は、更に、ＰＲＲＳウイルスの野外株で天然に感染されたブタ動物及び本発明のワクチンでワクチン接種されたブタ動物間を識別するポリヌクレオチド分子を含んでなる診断キットを提供し、このワクチン（ウイルス）は、好ましくは、野生型Ｐ１２９ＰＲＲＳウイルス（配列番号：５）と比較して、減少したインターフェロン−α阻害効果を示す。
【００２６】
表と図の簡単な説明
表１は、ＰＫ−９細胞への遺伝子導入によって誘導された感染性ｃＤＮＡクローン及び対応するウイルスを示す。
【００２７】
表２は、野生型ＰＲＲＳウイルス及び細胞培養物中で増殖するために適合された誘導体のインターフェロン−α阻害効果を示す。
【００２８】
表３は、野生型ＰＲＲＳウイルスｐ１２９及びＣＤ１６３を発現しているＰＫ−９細胞中で増殖するために適合されたその遺伝子的に操作された誘導体のインターフェロン−α阻害効果を記述する。
【００２９】
表４は、野生型Ｐ１２９ウイルス及びＰＲＲＳのインゲルバック（Ｉｎｇｅｌｖａｃ）ワクチンと比較したＰ１２９−ＰＫ−ＦＬ及びＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４ウイルスの減少したインターフェロン−α阻害効果を示す。
【００３０】
表５は、ワクチンウイルスの安全性及び効力を評価するために行った研究の設計を記述する。
【００３１】
表６は、Ｐ１２９の継代０及びＰ１２９−ＰＫ−ＦＬの継代１７間の、全てのヌクレオチドの差及び得られたアミノ酸の差を、ゲノム位置によって示す。
【００３２】
表７は、Ｐ１２９の継代０及びＰ１２９−ＰＫ−ＦＬの継代１７間の、ヌクレオチド及びアミノ酸の差の要約を、ウイルスタンパク質によって示す。
【００３３】
表８は、感染性ｃＤＮＡクローンｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９及びｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬ中で見いだされたＰＲＲＳＶゲノム間の、全てのヌクレオチドの差及び得られたアミノ酸の差を、ゲノム位置によって示す。
【００３４】
表９及び１０は、継代５２のウイルス（配列番号：６）の表現型に寄与するアミノ酸の変化を示す。
【００３５】
図１は、ワクチン接種後の直腸温度を示す。
【００３６】
図２は、病原性ＰＲＲＳＶのＮＡＤＣ２０による誘発後の直腸温度を示す。
【００３７】
図３は、ワクチン接種後及び誘発後の体重を示す。
【００３８】
図４は、ＰＲＲＳ病変による肺のパーセントの誘発後のデータを示す。
【００３９】
図５は、観察された病変の重篤度に対する誘発後の肺の評価得点を示す。
【００４０】
図６は、ワクチン接種後及び誘発後の血清中の抗ＰＲＲＳＶ抗体レベルを記述する柱状図である（ＥＬＩＳＡ  Ｓ／Ｐ比）。
【００４１】
図７は、血清中の誘発後のウイルス負荷のグラフ表示である（ＰＡＭ細胞に対するｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）。
【００４２】
図８は、本明細書中に開示する通りの配列番号：１ないし配列番号：６を含むワクチンを得るために使用した方法の絵画的表示である。
【００４３】
配列の簡単な説明
配列番号：１は、Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬの継代１７の、完全なゲノムを提供する。
【００４４】
配列番号：２は、Ｐ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４の継代１７の、完全なゲノムを提供する。
【００４５】
配列番号：３は、Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬの継代２４の、完全なゲノムを提供する。
【００４６】
配列番号：４は、Ｐ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４の継代３４の、完全なゲノムを提供する。
【００４７】
配列番号：５は、Ｐ１２９の継代０の、完全なゲノムを提供する。
【００４８】
配列番号：６は、Ｐ１２９の継代５２の、完全なゲノムを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、ワクチン接種後の直腸温度を示す。
【図２】図２は、病原性ＰＲＲＳＶのＮＡＤＣ２０による誘発後の直腸温度を示す。
【図３】図３は、ワクチン接種後及び誘発後の体重を示す。
【図４】図４は、ＰＲＲＳ病変による肺のパーセントの誘発後のデータを示す。
【図５】図５は、観察された病変の重篤度に対する誘発後の肺の評価得点を示す。
【図６】図６は、ワクチン接種後及び誘発後の血清中の抗ＰＲＲＳＶ抗体レベルを記述する柱状図である（ＥＬＩＳＡ  Ｓ／Ｐ比）。
【図７】図７は、血清中の誘発後のウイルス負荷のグラフ表示である（ＰＡＭ細胞に対するｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）。
【図８】図８は、本明細書中に開示する通りの配列番号：１ないし配列番号：６を含むワクチンを得るために使用した方法の絵画的表示である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本明細書及び付属する特許請求の範囲中で使用する場合、単数の形態“一つ”、“一つの”、及び“その”は、文脈が明白に他を指示しない限り、複数の言及を含む。従って、例えば、“その方法”に対する言及は、本開示を読むことによって当業者にとって明白となるものである本明細書中に記載される種類の、一つ又はそれより多い方法、及び／又は工程等を含む。
【００５１】
他に定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者によって普通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似又は等価な任意の方法及び材料を、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料は、ここに記載される。
【００５２】
本発明の実施は、具体的に反対に示されない限り、当技術の技能内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学、及び組換えＤＮＡ技術の慣用的な方法を使用するものであり、これらの多くは、例示の目的のために以下に記載される。このような技術は、文献中で完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ  ＆  ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照されたい。
【００５３】
“北米型ＰＲＲＳウイルス”は、制約されるものではないが、１９９０年代初め頃、米国で最初に単離されたＰＲＲＳウイルス（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．４：１１７−１２６を参照されたい）；北米型ＰＲＲＳウイルス分離株ＭＮ−１ｂ（Ｋｗａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６：２９３−２９６）；ＰＲＲＳのケベックＬＡＦ−ｅｘｐ９１株（Ｍａｒｄａｓｓｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４０：１４０５−１４１８）；及び北米型ＰＲＲＳウイルス分離株ＶＲ２３８５（Ｍｅｎｇ，Ｘ．−Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１７９５−１８０１）のような、北米型ＰＲＲＳウイルス分離株に伴う遺伝子的特徴を有するいずれものＰＲＲＳウイルスを意味する。遺伝子的特徴は、北米型ＰＲＲＳウイルス株によって共有される、ゲノムヌクレオチド配列の類似性及びアミノ酸配列の類似性を指す。中国型ＰＲＲＳウイルス株は、一般的に北米型株と約８０−９３％のヌクレオチド配列類似性を示す。
【００５４】
“欧州型ＰＲＲＳウイルス”は、１９９１年頃、欧州で最初に単離されたＰＲＲＳウイルス（例えば、Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｖｅｔ．Ｑ．１３：１２１−１３０を参照されたい）に伴う遺伝子的特徴を有するＰＲＲＳウイルスのいずれもの株を指す。“欧州型ＰＲＲＳウイルス”は、更に当技術において時に“レリスタッドウイルス”とも呼ばれる。
【００５５】
“有効な免疫保護反応”、“免疫保護”、等の用語は、本発明の目的のために、ワクチン接種された動物において病原体による感染に対して保護するために、病原体の一つ又はそれより多い抗原エピトープに対して向けられる免疫反応を意味する。本発明の目的のために、病原体による感染に対する保護は、感染の絶対的予防だけでなく、更に病原体による感染の程度又は速さの減少のいずれもの検出可能な減少、或いはワクチン接種されていない感染された動物と比較した、ワクチン接種された動物における病原体による感染から得られる疾病、又は任意の徴候若しくは症状の重篤度のいずれもの検出可能な減少を含む。有効な免疫保護反応は、以前に病原体で感染されていない及び／又はワクチン接種の時点に病原体で感染されていない動物に誘発することができる。有効な免疫保護反応は、更にワクチン接種の時点で病原体に既に感染している動物においても誘発することができる。
【００５６】
遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスは、これが改変されていない親株より少なく病原性である場合、“弱毒化”されている。ある株は、これが疾病の重篤度を決定する一つ又はそれより多いパラメーターにおいて、統計的に有意な減少を示す場合、“より少なく病原性（less virulent）”である。このようなパラメーターは、ウイルス血症のレベル、発熱、呼吸困難の重篤度、生殖性徴候の重篤度、或いは肺の病変の数又は重篤度、等を含むことができる。
【００５７】
“ＰＲＲＳウイルスの複製を支持することが可能な宿主細胞”は、本発明のウイルスで感染された場合、感染性ＰＲＲＳを発生することが可能な細胞を意味する。このような細胞は、ブタ肺胞マクロファージ細胞及び誘導体のような単球／マクロファージ系列のブタ細胞、ＭＡ−１０４サル腎臓細胞及びＭＡＲＣ−１４５細胞のような誘導体、並びにＰＲＲＳウイルスに対する受容体で遺伝子導入された細胞を含む。用語“ＰＲＲＳウイルスの複製を支持することが可能な宿主細胞”は、更に生きたブタ内の細胞も含む。
【００５８】
“オープンリーディングフレーム”、又は“ＯＲＦ”は、本明細書中で使用する場合、特定のＰＲＲＳウイルスタンパク質をコードするために必要な、介在するストップコドンを伴わない、最小のヌクレオチド配列を意味する。
【００５９】
“ブタの”及び“ブタ”は、本明細書中で互換的に使用され、そして例えば家畜のブタのようなＳｕｉｄａｅ科のメンバーであるいずれもの動物を指す。用語“ＰＲＲＳウイルス”は、本明細書中で使用する場合、他に示さない限り、北米型又は欧州型ＰＲＲＳウイルスのいずれかの全ての株を意味する。
【００６０】
“ＰＲＲＳ”は、ＰＲＲＳウイルス感染によって起こされるブタの病的徴候を包含する。このような徴候の例は、制約されるものではないが、発熱、妊娠したメスの流産、呼吸困難、肺の病変、食欲減退、及び若年のブタの死亡を含む。本明細書中で使用する場合、“ＰＲＲＳを産生することが不可能”であるＰＲＲＳウイルスは、ブタに感染することができるが、しかしブタのＰＲＲＳ感染に通常伴う全ての病的徴候を産生しないウイルスを指す。
【００６１】
ＰＲＲＳＶの“Ｎタンパク質”又は“ＯＲＦ７”は、本明細書中で使用する場合、ＰＲＲＳウイルスの欧州型及び北米型遺伝子型の両方のＯＲＦ７によってコードされるポリペプチドとして定義される。現時点で既知であるＮタンパク質の特異的なアイソタイプの例は、寄託番号ＰＲＵ８７３９２によってジェンバンクに報告されている北米型ＰＲＲＳプロトタイプ分離株ＶＲ２３２２の１２３アミノ酸のポリペプチド、及びジェンバンク寄託番号Ａ２６８４３で報告されている欧州型プロトタイプＰＲＲＳ分離株レリスタッドの１２８残基のＮタンパク質である。
【００６２】
“ＰＲＲＳＶのＮタンパク質のＮＬＳ−１領域”又は“ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７  ＮＬＳ−１領域”は、熟成したＮタンパク質の最初の約１５のＮ末端残基内に位置する、四つの連続した塩基性アミノ酸（リシン又はアルギニン）、又は三つの塩基性残基及びヒスチジン又はプロリンを含有する“ｐａｔ４”又は“ｎｕｃ１”核局在化シグナル（Ｎａｋａｉ  ＆  Ｋａｎｅｈｉｓａ，１９９２；Ｒｏｗｌａｎｄ  ＆  Ｙｏｏ，２００３）を指す。例として、ＶＲ２３３２のＮＬＳ−１領域の配列は、ＫＲＫＫであり、そして残基９−１２に位置し、一方レリスタッド分離株配列は、ＫＫＫＫであり、そしてＮタンパク質の残基１０−１３に位置している。
【００６３】
“ＰＲＲＳＶのＮタンパク質のＮＬＳ−２領域”又は“ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７  ＮＬＳ−２領域”は、一つ又は二つの形態をとることができるＮタンパク質内の二番目の核局在化シグナルを指す。北米型ＰＲＲＳウイルスにおいて、ＮＬＳ−２は、本出願人等が“ｐａｔ８”モチーフと命名したパターンを有し、これは、五つのうち少なくとも三つの塩基性残基（Ｋ又はＲ）を含有する五つの残基の配列によって三つの残基内に続くプロリンから始まる（Ｎａｋａｉ  ＆  Ｋａｎｅｈｉｓａ，１９９２；Ｒｏｗｌａｎｄ  ＆  Ｙｏｏ，２００３によって記載されている“ｐａｔ７”又は“ｎｕｃ２”モチーフの僅かな改変）。例として、このような配列は、北米型ＰＲＲＳＶの分離株ＶＲ２３３２のＮタンパク質残基４１−４７に位置し、そして配列Ｐ．．．Ｋによって表される  欧州型ＰＲＲＳウイルスにおいて、ＮＬＳ−２は、“ｐａｔ４”又は“ｎｕｃ１”モチーフを有し、これは、四つの塩基性アミノ酸又はヒスチジン又はプロリンを伴う三つの塩基性残基の連続した伸長である（Ｎａｋａｉ  ＆  Ｋａｎｅｈｉｓａ，１９９２；Ｒｏｗｌａｎｄ  ＆  Ｙｏｏ，２００３）。欧州型ＰＲＲＳＶの分離株レリスタッドのＮＬＳ−２は、残基４７−５０に位置し、そして配列Ｋ．．Ｋによって表される。
【００６４】
“ＰＲＲＳＶのＮタンパク質のＮｏＬＳ領域”又は“ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７  ＮｏＬＳ領域”は、約３２アミノ酸の全長を有し、そしてそのアミノ末端近辺のＮＬＳ−２領域を組込む核局在化シグナルを指す。例として、ＶＲ２３３２のＮｏＬＳ領域の配列は、残基４１−７２に位置し、そして配列Ｐ．．．Ｒによって表され（Ｒｏｗｌａｎｄ  ＆  Ｙｏｏ，２００３）、そして対応するレリスタッド分離株配列は、残基４２−７３に位置し、そして配列Ｐ．．Ｒによって表される。
【００６５】
“遺伝子導入された宿主細胞”は、米国特許第５，６００，６６２号に記載されているような実際的に任意の宿主細胞を意味し、ＰＲＲＳウイルスで遺伝子導入された場合、ＲＮＡは、ＰＲＲＳビリオンの少なくとも最初の一巡を産生することができる。
【００６６】
“感染性ＤＮＡ分子”は、本発明の目的のために、適した宿主細胞からの機能的ビリオンに複製、転写、及び翻訳を支持するために必要な要素をコードするＤＮＡ分子である。
【００６７】
同様に、“単離されたポリヌクレオチド分子”は、存在する場合、その天然に存在する状態からいずれもの検出可能な程度に精製された本発明のポリヌクレオチド分子を含んでなる物質の成分を指す。
【００６８】
本発明の目的のために、二番目のポリヌクレオチド分子（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）のヌクレオチド配列は、第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に“相同”であるか、又は前記第１のポリヌクレオチド分子に“同一性”を有し、ここにおいて、二番目のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、遺伝子コードの縮重の基づくように、第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列として同じポリアミノ酸をコードするか、又はこれがポリアミノ酸をコードする場合、これは、第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列によってコードされるポリアミノ酸に十分に類似であり、従って本発明の実施において有用である。相同なポリヌクレオチド配列は、更にセンス及びアンチセンス鎖と、そして全ての場合、いずれものこのような鎖の相補体と呼ばれる。本発明の目的のために、ポリヌクレオチド分子は、本発明を実施において有用であり、そして従って相同であるか又は同一性を有し、ここでこれは、感染されたブタの体液或いは組織試料中のＰＲＲＳウイルス又はウイルスのポリヌクレオチドの存在を検出するための診断プローブとして、例えば標準的なハイブリダイゼーション又は増幅技術によって使用することができる。一般的に、二番目のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、これが、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（他にＮＣＢＩとしても知られるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）に基づく第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７０％のヌクレオチド配列の同一性を有する場合、第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に相同である。本発明の実施による計算のための具体的な例において、ＢＬＡＳＴＰ  ２．２．６［Ｔａｔｕｓｏｖａ  ＴＡ  ａｎｄ  ＴＬ  Ｍａｄｄｅｎ，“ＢＬＡＳＴ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ−ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”（１９９９）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０．］に対して言及がなされる。簡単には、１０のギャップ開始ペナルティー、０．１のギャップ伸長ペナルティー、並びにＨｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９．１９９２）の“ｂｌｏｓｕｍ６２”スコアリングマトリックスを使用するアラインメントスコアを最適化するために、二つのアミノ酸配列を整列させる。次いで同一性のパーセントを：同一の対応の全数×１００／長い配列の長さによって割る＋二つの配列を整列するために長い配列に導入されたギャップの数、のように計算する。
【００６９】
好ましくは、相同なヌクレオチド配列は、少なくとも約７５％のヌクレオチド配列同一性を、なお更に好ましくは少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％のヌクレオチド配列同一性を有する。遺伝子コードが縮重されているために、相同なヌクレオチド配列は、任意の数の“サイレント”な塩基変化、即ち、それでも同じアミノ酸をコードするヌクレオチド置換を含むことができる。
【００７０】
相同なヌクレオチド配列は、更に非サイレント変異、即ち、配列が、第１のヌクレオチド配列によってコードされたポリアミノ酸と少なくとも約７０％同一のままである限りは、コードされたポリアミノ酸にアミノ酸の差をもたらす塩基置換、欠失、又は付加を含有することができ、或いは他に、本発明の実施のために有用である。これに関して、一般的に：正に荷電したアミノ酸（そして逆も又真である）、リシン、アルギニン及びヒスチジンに関する；負に荷電したアミノ酸（そして逆も又真である）、アスパルギン酸及びグルタミン酸に関する；そして中性に荷電したアミノ酸（そして全ての場合、更に逆も又真である）のある種のグループ、（１）アラニン及びセリン、（２）アスパラギン、グルタミン、及びヒスチジン、（３）システイン及びセリン、（４）グリシン及びプロリン（５）イソロイシン、ロイシン及びバリン、（６）メチオニン、ロイシン及びイソロイシン、（７）フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン及びチロシン、（８）セリン及びトレオニン、（９）トリプトファン及びチロシン、（１０）並びに例えば、チロシン、トリプトファン（ｔｙｒｐｔｏｐｈａｎ）及びフェニルアラニンに関するような、全体のタンパク質の機能を不活化しないことが認識されている、ある種の保存性アミノ酸置換を行うことができる。アミノ酸は、物理的特性並びに二次及び三次タンパク質構造に対する寄与によって分類することができる。保存的置換は、当技術において一つのアミノ酸の、類似の特性を有するもう一つのアミノ酸との置換として認識される。例示的な保存的置換は、１９９６年９月６日に出願され、１９９７年３月１３日に公開されたＷＯ９７／０９４３３（ＰＣＴ／ＧＢ９６／０２１９７の１０ページに見出すことができる。別の方法として、保存的アミノ酸は、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ：ＮＹ（１９７５），ｐｐ．７１−７７）中に記載されているように分類することができる。更なる適した保存的変化及びその適用は、以下に記載される。
【００７１】
相同なヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の比較によって、例えば上記のＢＬＡＳＴＮを使用することによって決定することができる。別の方法として、相同なヌクレオチド配列は、選択された条件下のハイブリダイゼーションによって決定することができる。例えば、二番目のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、これが配列番号：１の相補体に、中程度に厳密な条件下で、例えば、６５℃における０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡ中のフィルターに結合されたＤＮＡとのハイブリダイゼーション、及び４２℃における０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ  ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９４，ｐｐ．６．０．３  ｔｏ  ６．４．１０を参照されたい）、或いは他の以下に定義されるとおりのＰＲＲＳウイルスをコードする配列のハイブリダイゼーションをもたらすものである条件でハイブリダイズされた場合、配列番号：１（又は任意の他の特定のポリヌクレオイド配列）に相同である。ハイブリダイゼーションの条件の改変は、経験的に決定されるか、又はプローブのグアノシン／シトシン（ＧＣ）塩基ペア形成の長さ及びパーセントに基づいて正確に計算することができる。ハイブリダイゼーションの条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｅｄｓ．）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）ｐｐ．９．４７  ｔｏ  ９．５１ページ中に記載されているように計算することができる。
【００７２】
もう一つの態様において、二番目のヌクレオチド配列は、これが、配列番号：１の相補体に、高度に厳密な条件下で、例えば、６５℃における０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ中のフィルターに結合されたＤＮＡへのハイブリダイゼーション、及び６８℃における０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中の洗浄で、当技術において知られたように（Ａｕｓｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９  ハイブリダイズした場合、配列番号：１（又は本発明のいずれもの他の配列）に相同である。
【００７３】
本発明の単離されたポリヌクレオチド分子及び単離されたＲＮＡ分子が、合成分子及びｉｎ  ｖｉｔｒｏのクローニング及び転写によるような組換え技術によって得られた分子の両方を含むことは更に理解されることである。
【００７４】
ポリヌクレオチド分子は、当技術において既知のような”部位特異的変異誘発、又は化学的変異原又は放射線への暴露によるようなランダム変異誘発によることを含む、当業者にとって既知の組換え技術を使用して遺伝子的に変異することができる。変異は、当技術において既知の標準的な方法、例えば記載されている（例えば、Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，４４０：１９９−２０６）ような、感染性コピーの部位特異的変異誘発（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）によって行うことができる。
【００７５】
従って、本発明は、更に、遺伝子的に改変された北米型ＰＲＲＳウイルスを製造するための方法を提供し、この方法は、先に記載したようにＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を変異し、そして遺伝子的に改変されたＰＲＲＳウイルスを、適した発現系を使用して発現することを含んでなる。遺伝子的に改変されたＰＲＲＳウイルスは、単離されたポリヌクレオチド分子から、一般的に当技術において既知の、その例が本出願中に記載される適した発現系を使用して発現することができる。例えば、単離されたポリヌクレオチド分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、適した宿主細胞中でコードされたウイルスを発現することが可能な、以下に更に詳細に記載されるようなプラスミドの形態であることができる。
【００７６】
北米型ＰＲＲＳＶのＮタンパク質配列は、高度に保存され、そして報告された配列は、互いに約９３−１００％の同一性を有する。北米型及び欧州型ＰＲＲＳＶのＮタンパク質は、約５７−５９％同一であり、そして共通の構造的モチーフを共有する。一般的に、ＰＲＲＳをコードする配列及び分離株を比較した場合、これらは、特異的ヌクレオチド又はコードされたアミノ酸に関して異なって番号付けされることができ、固有の領域の確認は、対象のＰＲＲＳ株中の保存された特徴的アミノ酸を確認し、そしてこれを参照株と整列することによって容易に達成される。
【００７７】
組換えＤＮＡ技術は、核酸をＤＮＡレベルで改変することを目標とする極めて多様な、そして強力な分子生物学技術を含んでなり、そしてゲノムを分子レベルで分析し、そして改変することを可能にする。これに関して、ＰＲＲＳウイルスのようなウイルスは、そのゲノムの中程度の大きさのために、このような操作に特に受け入れられる。然しながら、組換えＤＮＡ技術は、非レトロウイルス型ＲＮＡウイルスに対しては、これらのウイルスがその複製中にＤＮＡ中間体工程を包含していないために、直ちに適用可能ではない。このようなウイルスのために、組換えＤＮＡ技術を改変されたウイルスを発生するそのゲノムに適用することができる前に、感染性ｃＤＮＡクローンを開発しなければならない。感染性クローンは、研究中のウイルスのｃＤＮＡ（ここではＲＮＡのＤＮＡコピーの広い意味で使用され、そしてｍＲＮＡのＤＮＡコピーの厳密な意味のみではない）の全長（ゲノムの長さ）の構築によって誘導することができ、その後、感染性の転写物が全長のｃＤＮＡにより遺伝子導入された細胞中でｉｎ  ｖｉｖｏで合成されるが、しかし感染性転写物は、更に転写混合物の存在中の原核プロモーターを有するプラスミド中で、全長のｃＤＮＡからのｉｎ  ｖｉｔｒｏの転写によって、或いは全ウイルスゲノムを含んでなる連結された全長の一部のｃＤＮＡ断片を使用して、再びｉｎ  ｖｉｖｏで得ることができる。全ての場合、転写されたＲＮＡは、ｃＤＮＡに導入された全ての改変を保有し、そしてこのように改変されたウイルスの更なる継代のために使用することができる。
【００７８】
欧州型ＰＲＲＳウイルスの分離株又はレリスタッドウイルスの感染性クローンの調製は、米国特許第６，２６８，１９９号中に記載され、これは、本明細書中に全てが参考文献として援用される。Ｐ１２９と命名された北米型ＰＲＲＳウイルスの分離株（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）の感染性ｃＤＮＡクローンの調製は、米国特許第６，５００，６６２号中に記載され、これは、本明細書中に全てが参考文献として援用される。Ｐ１２９のｃＤＮＡの配列は、ジェンバンク寄託番号ＡＦ４９４０４２及び米国特許第６，５００，６６２号中に開示されている。以下の本出願人等の仕事は、このような感染性クローンを活用し、これは、プラスミドの状況において、前初期プロモーターＣＭＶによって発現され、そしてｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９と命名され、そして更に米国特許第６，５００，６６２号中に開示されている。米国特許第６，５００，６６２号中に記載されているように、本明細書の使用のために適した他のプラスミド及びプロモーターが存在する。
【００７９】
対象の任意のオープンリーディングフレームの完全な配列及び対象のアミノ酸残基の位置を考慮すると、当業者は、所望の特定の位置における変化を設計するために、コドン表のみを参考にする必要がある。
【００８０】
コドンは、ｍＲＮＡ中のヌクレオチド及びその対応するｃＤＮＡ分子の三塩基配列を構成する。コドンは、ｍＲＮＡ分子中に存在する場合、塩基ウラシル（Ｕ）によって特徴づけられるが、しかしＤＮＡ中に存在する場合、塩基チミジン（Ｔ）によって特徴づけられる。ポリヌクレオチド内の同じアミノ酸残基に対するコドン中の簡単な変化は、コードされたポリペプチドの配列又は構造を変化しないものである。表現が、特定の三つのヌクレオチド配列が、任意の特定のアミノ酸を“コードする”ことを記述する場合、当業者は、上記の表が問題の特定のヌクレオチドを確認する手段を提供することを認識するものであることは明白である。例として、特定の三つのヌクレオチド配列がリシンをコードする場合、上記の表は、二つの可能な三塩基配列が、ＡＡＡ及びＡＡＧであることを開示する。グリシンは、ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＴ（ＲＮＡ中の場合ＧＧＵ）及びＧＧＧによってコードされる。コードされたタンパク質中のリシンをグリシン残基に変化するために、ＡＡＡ又はＡＡＧ三塩基を、コードする核酸中のＧＧＡ及びＧＧＣ、ＧＧＴ又はＧＧＧのいずれかによって置換することができる。
【００８１】
前述のように、本発明は、ＰＲＲＳのワクチン株の提供に関し、ここで、他の反応の中でも、インターフェロン経路によって仲介される宿主のウイルスに対する反応は、下方制御されない。以下に詳細に記載するように、この点において有効な、ウイルスゲノムに対する各種の改変があり、特に本明細書中に開示されるようなＯＲＦ１ａ中に見出される改変、及びこれらの組合せである改変が存在する。更に本明細書（表９を参照されたい）中で開示されるように、類似した複数の改変部位を、ＰＲＲＳゲノムの更なるオープンリーディングフレーム中に見出すことができることは注目すべきである。
【００８２】
ＰＲＲＳポリヌクレオチドの改変に対するある種の他の従来の方法が、得られた弱毒化の正確な原因は一般的に知られていないが、恐らくワクチン使用のための適合性を提供し、ＰＲＲＳウイルスを弱毒化するために成功していることは注目すべきである。例えば、オープンリーディングフレーム７（ＯＲＦ７）中に欠失を含むために、ウイルスのヌクレオカプシド或いはＮタンパク質（ＯＲＦ７によってコードされた）中のＮＳＬ−２領域、ＮｏＬＳ領域、又はＮＥＳ領域を変異或いは欠失することによって病原性ＰＲＲＳウイルスを弱毒化することが開示されている。もう一つの側面において、ＯＲＦ７欠失は、カプシドタンパク質の核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列内にある。ＮＬＳをコードする配列内のＯＲＦ７欠失は、４３−４８位の一つ又はそれより多いアミノ酸の欠失、或いは４３及び４４位のいずれか又は両方のアミノ酸の欠失を含む。例えば、本明細書中に参考文献として援用される米国特許第７，５４４，３６２号の全ての開示を参照されたい。ＯＲＦ７によってコードされるＰＲＲＳＶのヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）は、リン酸化された小さい塩基性のタンパク質であり（Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｒｏｗｌａｎｄ，ａｎｄ  Ｙｏｏ，２００２）、そしてホモダイマーを形成する（Ｗｏｏｔｔｏｎ  ａｎｄ  Ｙｏｏ，２００３）。結晶構造は、最近決定されている（Ｄｏａｎ  ａｎｄ  Ｄｏｋｌａｎｄ，２００３）。Ｎタンパク質は、感染された細胞中で多数の機能を有するように見受けられる。細胞質中で行われる過程として、その中にゲノムＲＮＡが包装された球形のカプシド構造を形成することに加えて、Ｎタンパク質の一部は、核中に、そして特異的に感染された細胞の核小体に運搬される。Ｎタンパク質のアミノ酸配列は、核及び核小体への運搬、及び核からの移行をそれぞれ容易にする二つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）、核小体局在化シグナル（ＮｏＬＳ）、及び核外移行シグナルを含有する（Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｒｏｗｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｙｏｏ，２００３）。一方、核小体において、Ｎタンパク質は、小さい核小体のＲＮＡ付随性タンパク質フィブリラリンと相互作用し、そして好ましいウイルスの複製のために感染された細胞中のｒＲＮＡ加工及びリボソーム生合成を制御することができる（Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。この種類のウイルス変異は、新規なＰＲＲＳワクチンを設計するために、単独で又は他の弱毒化変異との組合せのいずれかで、有用である。弱毒化されたＰＲＲＳウイルスのもう一つの例において、ＯＲＦ１ａに改変されたものが使用された。ＯＲＦ１ａの非構造的タンパク質２をコードする領域中の高頻度可変領域中のアミノ酸６１６ないし７５２間の抗原性エピトープをコードするＤＮＡ配列の欠失が使用される。その全てが参考文献として援用される、米国特許第７，６１８，７９７号を参照されたい。
【００８３】
ＰＲＲＳウイルスの免疫生物学に対する研究は、ＰＲＲＳウイルスのＰＤＣとの相互作用が、試験に値することを示唆する。この細胞型は、ヒト、マウス、ラット、ブタ及びサルの末梢血単核細胞の０．２％−０．８％である。その希少性に関わらず、この細胞は、自然免疫系の重要な成分であり、そしてウイルスの刺激に続いて大量のＩＦＮ−αを分泌することが可能である。ＰＤＣが、これらがナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、及びＴ細胞の機能を促進するために、抗ウイルス性の自然及び獲得免疫を制御することにおいて主要な役割を演じるのは、ＩＦＮ−αの分泌による。更に、ブタ単球由来の樹状細胞（ＭｏＤＣ）の変異は、ＰＤＣによって分泌されるＩＦＮ−αによって援助され、抗原を提示し、そしてＴ細胞を活性化するＭｏＤＣの向上された能力をもたらす。ウイルス感染の後期において、ＰＤＣは、成熟した樹状細胞の独特の形に分化し、これは、Ｔ細胞の機能を直接制御し、そしてＰＲＲＳウイルスを含むウイルスに対する抗ウイルス性免疫の主要な媒介物であるＩＦＮ−γを分泌することが可能な細胞への、Ｔ細胞の分化を指示する。驚くべきことではないが、呼吸器多核体ウイルス及び麻疹ウイルスのようなヒトのウイルスが存在し、これらは、ＩＦＮ−αを分泌するＰＤＣの能力を抑制することが知られている。この阻害効果は、体液性免疫反応の優勢、及びこれらのウイルスによる感染の結果として観察される付随する免疫病理学、並びに二次的細菌及びウイルス感染に対する宿主の増加した感受性において役割を演じると考えられる。
【００８４】
対照的に、野生型ＰＲＲＳＶ分離株、並びにインゲルバックＰＲＲＳワクチン株（以下の実施例５以降を参照されたい）の両方は、ＩＦＮ−αを産生するブタのＰＤＣの精製された集団の能力を阻害し、一方、新規なＰ１２９−ＰＫ−ＦＬ及びＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４ウイルス原料（下記を参照されたい）は、このＰＤＣ機能に対して最小の阻害効果しか示さないか又は全く示さなかった。これらの観察の有意性は、部分的に、ウイルスに対する獲得免疫反応の発生を制御することにおけるＩＦＮ−αの重要性にある。従って、ＩＦＮ−αの抑制が最低限であるウイルスから誘導された弱毒化されたウイルスのワクチンが、強力な抗ウイルス性保護免疫反応を誘発するものである可能性が非常に高い。インゲルバック  ＰＲＲＳ  ＭＬＶワクチンに対するＩＦＮ−αのアジュバント効果が、ウイルス特異的Ｔ細胞仲介ＩＦＮ−γ反応を誘発し、そしてワクチンによって誘発されるウイルス特異的Ｔ細胞仲介ＩＦＮ−γ反応の強度が、現場及び研究所の条件下でウイルスに対する保護免疫と正の相関を有することが従来証明されている。従って、理論に制約されるものではないが、細胞介在免疫反応及び非ＩＦＮ−α阻害性ＰＲＲＳＶによって誘発される保護免疫のレベルが、野生型（ＩＦＮ−α阻害性）の表現型を示すＰＲＲＳＶ分離株のものより有意に大きいものであることを予測することは妥当なものである。
【００８５】
本発明に関して、Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬウイルス、並びにｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ感染性ｃＤＮＡクローンから誘導された全ての五つの欠失変異体が、ＩＦＮ−α産生を阻害する能力を喪失したことは注目に値する。従って、この異常な表現型は、単に欠失のためにすることにはできないが、しかし少なくとも部分的に感染性クローンの構築中に固定されることとなった遺伝子的変化のためのものである筈である。興味あることに、ＰＫ−９細胞上で６３回の連続継代された非クローン化Ｐ１２９ウイルスは、ＩＦＮ誘発を阻害する能力を保持した（表１）。全ての感染性クローン由来のウイルスにおいて見られる普通のＩＦＮ表現型に対する最も可能性のある説明は、感染性クローンの発生中の一つ又はそれより多い変異の組込みである。これらの変異は、感染性クローンを構築するために使用されたウイルスのＲＮＡ中に、恐らく低いレベルで存在したものである。最終的に、変異は、ブタの本来（継代０）のウイルス中に存在することができたか、又はこれらは、１６代の継代間、ＰＫ−９細胞上で増殖するためにウイルスを適合する過程中に発生され、そして富化されることができた。変異が、ＰＣＲ誘発の間違いの結果又はクローン化の人為的結果である可能性を除外することはできない。いずれにせよ、ＩＦＮ−α阻害機能の喪失の原因である変異（類）は、感染性クローンの構築中に“固定”され、そしてこの特定の感染性クローンから誘導された全てのウイルス中に存在することが予測される。
【００８６】
変化したＩＦＮ−α阻害表現型の原因である変異が、ｃＤＮＡクローンを構築するために使用したウイルスＲＮＡ中に前から存在していた可能性は、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる間違いの結果として、ＰＲＲＳＶがランダムな遺伝子の多様性を容易に発生することが知られていることを考慮すれば、可能性がある。ウイルスの多種性（quasi-species）は、ｉｎ  ｖｉｖｏのウイルス複製中に天然に出現する密接に関連する遺伝子的変種の不均一な混合で構成される。なお更に関連するものは、感染性ｃＤＮＡクローンから誘導されたＰＲＲＳＶの多数代のｉｎ  ｖｉｔｒｏの継代後のウイルスの多種性の観察である。これは、従来行われた研究中のウイルスゲノムの出発集団が、遺伝子的に不均一な集団からなり、そして配列の多様性が細胞培養の継代中に急速に発生したために、注目に値する。本研究において、感染性クローンの構築に至るまでの１６代のＰＫ−９の継代よりも前に、オリジナルのＰ１２９ウイルスがクローン化（生物学的に又は分子的に）されていなかったために、ゲノムの不均一性のレベルはより高かったであろう。従って、ＩＦＮ−α阻害機能の喪失の原因であるＰＲＲＳＶのＲＮＡ変種の類似的な種（quasi-species）からの確率選択、及びｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬ感染性ｃＤＮＡクローンへの組込みは、真実味のあることであるように見受けられる。有効な次世代のＰＲＲＳワクチンの開発のための重要性を証明することができるこの特徴的な生物学的表現型を、全ての誘導体のウイルスが共有する筈であったことを考慮すれば、感染性クローンへのこれらの変異の組込みは、幾つかの状況下で幸運であったと考えることができる。
【００８７】
野生型のＰＲＲＳウイルス株Ｐ１２９は、このウイルスの他の株のように、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び形質細胞様樹状細胞（ＰＤＣ）のインターフェロ（ＩＦＮ）−αを産生する能力に対して強力な阻害効果を示す。他方、Ｐ１２９の感染性ｃＤＮＡクローン（ｃＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬ）から誘導されたウイルスは、ＩＦＮ−α阻害表現型の有意な減少を示す。この感染性クローンは、ＣＤ１６３を発現するブタ腎臓細胞系ＰＫ−９上で、１６代の連続継代の経過にわたって増殖するために以前に適合されたウイルスから構築された（その全てが参考文献として援用される米国特許第７，７５４，４６４号を参照されたい）。Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬ及びＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４のＩＦＮ−α阻害性表現型は、低から無視可能までの範囲にあり、そしてその両方が高度に阻害性である二つのインゲルバックＰＲＲＳ改変生ウイルスワクチン株のいずれかによって示されるものと顕著な対比にあった。これらの結果は、Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬ及びＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４ウイルスが、親の低い継代のＰ１２９分離株、他の野生型ＰＲＲＳウイルス、及び両方のインゲルバックＰＲＲＳワクチンと、生物学的に別個であることを示す。減少したＩＦＮ−α阻害性表現型の潜在的な意味、並びに表現型の変化に対する可能な理由が考察される。
【００８８】
本発明のアミノ酸改変
本発明の実施によれば、新規なＰＲＲＳの分離株は、北米型又は中国型遺伝子型に関わらず、ＯＲＦ１からコードされたタンパク質中の特異的位置に特異的なアミノ酸を含有するものとしてフィールドで同定することができ、そしてこれらのウイルスに対して所望の表現型を与える。あるいは、前述のように、標準的な遺伝子的方法を使用して、コードされたＯＲＦ１タンパク質の遺伝子配列（そして従ってアミノ酸配列）を改変することができ、再び改変された北米型及び中国型ＰＲＲＳウイルス、及び感染性クローン、並びにこれらからワクチンを産生することができ、これらの全てはこのような表現型をもたらす。好ましい例において、表現型は、制約されるものではないが、野生型ＰＲＲＳウイルスと比較して減少したインターフェロン−α阻害効果、及び所望により、頑強な免疫反応を誘発するが、しかし僅かな検出可能な病態を伴って宿主動物（ブタ）中で再生又は持続する能力を含む。
【００８９】
従って、本発明の実施において、有用な出発点として役立つことができる北米型ＰＲＲＳ株又は分離株は、開示されたもの、例えば米国特許第６，５００，６６２号；７，６１８，７９７号；７，６９１，３８９号；７，１３２，１０６号；６，７７３，９０８号；７，２６４，９５７号；５，６９５，７６６号；５，４７６，７７８号；５，８４６，８０５号；６，０４２，８３０号；６，９８２，１６０号；６，２４１，９９０号；及び６，１１０，４６８中のものを含む。有用な出発点として役立つ中国型ＰＲＲＳ株及び分離株に関しては、例えば、ＴＪＭ−９２に関する中国出願ＣＮ２０１６３３９０９からの公開された中国出願ＣＮ２００９１００９１２３３．６を参照されたい。
【００９０】
以下の考察に関連して、国際的に認識された一文字又は三文字記号を、ＤＮＡによってコードされる最も普通のアミノ酸：アラニン（Ａｌａ、Ａ）；アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）；アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）；システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）；グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）；グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）；イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）；ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）；リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）；メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）；プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）；セリン（ｓｅｒ、Ｓ）；トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）；トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）；チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）に対して使用する。
【００９１】
表９及び１０は、インターフェロンアルファ活性の減少された阻害と相関し、これによってワクチンに対する安全及び頑強な免疫反応を可能にする、北米型（及び中国型）ＰＲＲＳの病原性の弱毒化の原因である観察されたアミノ酸変化を同定する。表１０は、これに関連するＯＲＦ１内の非常に好ましいアミノ酸改変を同定し、そして他のＰ１２９培養物からの継代培養に関して如何にこれらの変異が起こったかを示す（この経緯の点検が、必要に応じて、本発明のアミノ酸変化のいずれかを有するコードするＤＮＡを（再）構築するための遺伝子変異戦略の設計をも容易にすることは注目すべきである）。これに関連して、ＯＲＦ１ａに対する（Ｐ１２９の継代５２によって示されるような）最も好ましいアミノ酸の改良は：１８２位におけるアスパラギン、１８９位におけるアスパラギン、２７３位におけるチロシン、３０２位におけるヒスチジン、６６５位におけるトレオニン、９４３位におけるシステイン、１４２９位におけるトレオニン、１５０５位におけるアラニン、２４１０位におけるアスパラギンを含み、これは、更に多くのグルコシル化の機会を潜在的に加え、そしてこれは、更にタンパク質の機能を変更することができる。
【００９２】
従って、本発明は、単離されたブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）を提供し、ＯＲＦ１ａによってコードされるそのタンパク質は：
アミノ酸配列ＡＭＡＮＶＹＤ（配列番号：９）内のアミノ酸Ｎ；
アミノ酸配列ＩＧＨＮＡＶＭ（配列番号：１２）内のアミノ酸Ｎ；
アミノ酸配列ＴＶＰＤＧＮＣ（配列番号：１５）内のアミノ酸Ｄ；
アミノ酸配列ＣＷＷＹＬＦＤ（配列番号：１８）内のアミノ酸Ｙ；
アミノ酸配列ＨＧＶＨＧＫＹ（配列番号：２１）内のアミノ酸Ｈ；
アミノ酸配列ＡＡＫＶＤＱＹ（配列番号：２４）内のアミノ酸Ｖ；
アミノ酸配列ＰＳＡＴＤＴＳ（配列番号：２７）内のアミノ酸Ｔ；
アミノ酸配列ＬＮＳＬＬＳＫ（配列番号：３０）内のアミノ酸Ｌ．
アミノ酸配列ＡＰＭＣＱＤＥ（配列番号：３３）内のアミノ酸Ｃ；
アミノ酸配列ＣＡＰＴＧＭＤ（配列番号：３６）内のアミノ酸Ｔ；
アミノ酸配列ＰＫＶＡＫＶＳ（配列番号：３９）内のアミノ酸Ａ；
アミノ酸配列ＡＧＥＩＶＧＶ（配列番号：４２）内のアミノ酸Ｉ；
アミノ酸配列ＡＤＦＮＰＥＫ（配列番号：４５）内のアミノ酸Ｎ；及び
アミノ酸配列ＱＴＰＩＬＧＲ（配列番号：４８）内のアミノ酸Ｉ；
のいずれかを含有するアミノ酸配列からなるグループから選択される。
【００９３】
更に具体的には、本発明は、単離されたブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）を提供し、ここにおいて、ＯＲＦ１ａによってコードされるそのタンパク質は：
アミノ酸配列ＡＮＶ（配列番号：９参照）内のアミノ酸Ｎ；
アミノ酸配列ＨＮＡ（配列番号：１２参照）内のアミノ酸Ｎ；
アミノ酸配列ＰＤＧ（配列番号：１５参照）内のアミノ酸Ｄ；
アミノ酸配列ＷＹＬ（配列番号：１８参照）内のアミノ酸Ｙ；
アミノ酸配列ＶＨＧ（配列番号：２１参照）内のアミノ酸Ｈ；
アミノ酸配列ＫＶＤ（配列番号：２４参照）内のアミノ酸Ｖ；
アミノ酸配列ＡＴＤ（配列番号：２７参照）内のアミノ酸Ｔ；
アミノ酸配列ＳＬＬ（配列番号：３０参照）内のアミノ酸Ｌ．
アミノ酸配列ＭＣＱ（配列番号：３３参照）内のアミノ酸Ｃ；
アミノ酸配列ＰＴＧ（配列番号：３６参照）内のアミノ酸Ｔ；
アミノ酸配列ＶＡＫ（配列番号：３９参照）内のアミノ酸Ａ；
アミノ酸配列ＥＩＶ（配列番号：４２参照）内のアミノ酸Ｉ；
アミノ酸配列ＦＮＰ（配列番号：４５参照）内のアミノ酸Ｎ；及び
アミノ酸配列ＰＩＬ（配列番号：４８参照）内のアミノ酸Ｉ；
のいずれかを含有するアミノ酸配列からなるグループから選択される。
【００９４】
上述のように、北米型及び中国型ＰＲＲＳの多くの既知の株及び分離株が存在し、そして新規な株は、進化し、又は単離され続けている。全てのこれらの株間において、高いレベルのアミノ酸配列の相同性が存在するが、幾つかの変種が実際存在し、そして実際に利益をこれらの差及び類似性から得て、全てのワクチン株の表現型の特性を更に改良することができることを当業者は直ちに認識するものである。
【００９５】
先ず、すぐ上（英文明細書27-28ページ）で特定した配列番号によって定義される全てのアミノ酸のモチーフに関して、下線を引かれ、そして好ましいアミノ酸は（Ｐ１２９の継代５２から得られるように）、隣接するアミノ酸が規定された配列番号の配列から他に変化させられたとしても、一般的に完全に有益なままである。従って、具体的な、そして代表的な例として、ＡＭＡＮＶＹＤ（配列番号：９）に関して、対応するアミノ酸モチーフを見出すために、いずれもの北米型又は中国型ＰＲＲＳからの対応するＯＲＦ１により発現されたタンパク質配列を詳細に調べることは、進化の結果として、置換及び／又は欠失又は付加を起こす更なる変化がこのような他の株に起こったとしても、一般的に可能である。当業者によって認識されるものであるように、Ｐ１２９の継代５２によって示される好ましいアミノ酸の変化は、従って、更に継代５２の規定されたアミノ酸に対して直接的に５’又は３’である全体のアミノ酸配列における他の変化にも関わらず操作可能なままである筈である。これは、対比できるアミノ酸変化が保存性であると考えられる場合、特別なものである。従って、ＡＭＡＮＶＹＤ（配列番号：９）及びその部分配列ＡＮＶに関して、例えば、その中のバリンがイソロイシン又はロイシンで、或いはいずれもの他の残基によって置換された場合、又は残基が、単純に欠失したか或いは更なる残基が加えられた場合、もう一つのＰＲＲＳ株中の対比可能なモチーフを確認することは容易に可能である筈である。整列を確認し、そして従ってポリペプチド配列のモチーフが対応するか否かを決定するための多くのコンピュータープログラム、例えばいわゆるＢｌｏｓｕｍ表（同一性のパーセントの所定のレベルに基づく）が存在し、Ｓ．Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．“Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋｓ”，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８９（２２），ｐｐ．１０９１５−１０９１９，Ｎｏｖ  １５，１９９２を参照されたく、そして、更にＡ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，ＭａｃＭｉｌｌａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎも参照されたい。保存的アミノ酸変化は、更に五つの全体的グループ：スルフヒドリル（ｓｕｌｆｙｄｒｙｌ）（Ｃｙｓ）；芳香族（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐ）；塩基性（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）；脂肪族（Ｖａｌ、Ｉｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ）及び親水性（Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ及びＴｈｒ）への分類に基づいても更に認識される。従って、いずれもの北米型又は中国型ＰＲＲＳをコードするヌクレオチド配列を、適当な、そして対応する位置にＰ１２９の継代５２のために規定されたアミノ酸変化のいずれかを組込むために、指定された位置に隣接する一つ又はそれより多い他のアミノ酸が付加、欠失又は置換されたとしても、改変することは、本発明の実施の範囲内である。
【００９６】
更に、類似の原理に基づけば、好ましいアミノ酸が、本発明の実施によりＯＲＦ１ａのために確認された特異的な継代５２の変化から確認された場合、いずれものこのような継代５２のアミノ酸に対する保存的置換が、次いで更にＰ１２９変種のいずれかにおいて、又はいずれもの他の北米型又は中国型株に関して、意図する継代５２の表現型の実質的保存を伴って使用することができることを当業者は認識するものである。従って、いずれものこのような置換アミノ酸が、本来確認された独特の継代５２のアミノ酸変化と同様に、規定された位置で働くことが、本発明の要求ではないことは容易に認識されるものであるが、代表的な例として：ＳＬＬ（配列番号：３０内）に関して、指定されたロイシン残基は、イソロイシン、バリン又はメチオニンで更に置換することができる；ＦＮＰ（配列番号：４５内）に関して、指定されたアスパラギンは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ及びＴｈｒのいずれかで置換することができる；そしてＶＡＫ（配列番号：３９内）に関して、指定されたアラニンは、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ及びＴｈｒのいずれかで置換することができる；全て等である。勿論、いずれもの他の認識されたモデルによる標準的な保存的アミノ酸変化の使用も、更に本発明において実施される。例えば、そして全ての場合その逆を含み、Ｇｌｕに対してＡｓｐ及びその逆、Ｇｌｎに対してＡｓｎ、Ｌｙｓに対してＡｒｇ、Ｃｙｓ又はＴｈｒに対してＳｅｒ、Ｔｙｒに対してＰｈｅ、Ｌｅｕ又はＩｌｅｕに対してＶａｌ、Ｇｌｙに対してＡｌａ、等である。
【００９７】
更に、本発明の実施の範囲内において、個々の継代５２のアミノ酸変化（上記でＯＲＦ１ａに対して確認されたように）のいずれかは、所望の表現型効果を伴っていずれもの中国型ＰＲＲＳの北米型中に有用に入れることができるが、可能な限り多くの表９又は表１０のアミノ酸選択物を、コードするポリヌクレオチド配列の適当な改変によって典型的に提供されるように、最終構築物中に含むことが更に好ましい。従って、本発明の実施は、２、３、４、５、６、７、８、９個の、そして概略１７までのいずれかの確認された５２継代の、全て最終ウイルス配列内のＯＲＦ１ａ変化（表９）を、任意の特異的ペア、トリプレット、又は全ての完全に確認された継代５２アミノ酸変化の他のより高い組合せを含めるために提供する、中国型又は北米型ＰＲＲＳウイルス（及び対応するコードするポリヌクレオチド）の提供を含む。このようなアミノ酸変化は、勿論、ウイルスの対応するコードするヌクレオチド配列に、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、及び当技術において公知の他の技術によって導入することができる。
【００９８】
特定の遺伝子的に改変された株が弱毒化されることを示すために、以下に記載されるような実験を使用することができる。
【００９９】
グループ当たり少なくとも１０匹の雌ブタが、それぞれの試行に含まれ、これらはＰＲＲＳＶを持たない農場から得る。ブタを、ＰＲＲＳウイルス特異的血清抗体を持たず、そしてＰＲＲＳＶに対して陰性であることを試験する。試行に含めた全てのブタは、同じ供給源及び品種である。ブタのグループへの割当てはランダムである。
【０１００】
誘発は、鼻腔当たり１０５ＴＣＩＤ５０を伴う１ｍｌのＰＲＲＳＶの鼻腔内適用で、妊娠の９０日目に行う。それぞれの試験の設定に対し少なくとも三つのグループ：Ｐ１２９誘発のための一つのグループ；恐らく弱毒化されたウイルスによる誘発のための一つの試験グループ；及び一つの厳密な対照グループがある。
【０１０１】
研究は、厳密な対照が、研究の時間経過にわたってＰＲＲＳＶ陰性のままであり、そして厳密な対照と比較して、Ｐ１２９誘発グループにおいて、少なくとも２５％少ない生きた健康な子ブタが生まれた場合、有効であると見做される。
【０１０２】
弱毒化、言い換えればより低い病原性は、繁殖性能又は他の総体症状（ｓｙｍｐｔｏｍｏｌｏｇｙ）を決定する一つ又はそれより多いパラメーターの統計的に有意な変化として定義され：
改変されない親株で感染されたグループと比較した、試験グループ（恐らく弱毒化されたウイルス）に対する以下のパラメータの少なくとも一つにおける有意な減少は、弱毒化の表示であり：
ａ）死産の頻度
ｂ）妊娠１１２日目又はその前の流産
ｃ）ミイラ化した子ブタの数
ｄ）元気がなく、そして弱い子ブタ
ｅ）離乳前死亡率
更に、改変されない親株で感染されたグループと比較した、試験グループに対する以下のパラメーターの少なくとも一つにおける有意な増加が好ましい：
ｆ）雌ブタ当たりの離乳した子ブタの数
ｇ）雌ブタ当たりの生まれた生きて健康な子ブタの数。
あるいは、呼吸障害の徴候及びＰＲＲＳＶ感染の他の徴候を、弱毒化を確立するために試験することができる。
【０１０３】
弱毒化された株は、ワクチンの処方のために有用である。本発明のワクチンは、これがＰＲＲＳウイルスによる感染に対してブタを保護する場合に有効である。ワクチンは、一匹又はそれより多い未感染のブタへのワクチンの投与後、生物学的に純粋なウイルスの分離株（例えば、ＶＲ２３８５、ＶＲ２３８６、Ｐ１２９等）によるその後の誘発が、低められた重篤度のいずれもの全体的又は組織病理学的変化（例えば、肺の病変）及び／又は疾病の徴候を、保護されていない同様なブタにおける分離株によって典型的に起こされたこれらの変化又は徴候と比較して（即ち、適当な対照に関して）もたらす場合、ＰＲＲＳウイルスによる感染に対してブタを保護する。更に特に、本発明のワクチンは、ワクチンを、それを必要とする一匹又はそれより多い適したブタに投与し、次いで適当な長さの時間後（例えば、４週間）、生物学的に純粋なＰＲＲＳＶ分離株の大量の試料（１０（３−７）ＴＣＩＤ（５０））により誘発することによって、有効であることを示すことができる。次いで血液試料を誘発されたブタから約１週間後に抜出し、そして次いで血液試料からウイルスを単離する試みが行われる。大量のウイルスの単離は、ワクチンが有効であることができなかった表示であり、一方、減少された量のウイルスの単離（又はウイルスが無い）は、ワクチンが有効であることができた表示である。
【０１０４】
従って、本発明のワクチンの有効性は、定量的に（即ち、適当な対照グループと比較した固定された肺組織のパーセントの減少）又は定性的に（例えば、血液からのＰＲＲＳＶの単離、免疫アッセイによる肺、扁桃腺又はリンパ節組織試料中のＰＲＲＳＶ抗原の検出）評価することができる。ブタの繁殖及び呼吸器疾患の徴候は、定量的に（例えば、温度／発熱）、又は半定量的に（例えば、チアノーゼ、肺炎、肺病変等のような一つ又はそれより多い徴候の存在又は非存在、或いは一つ又はそれより多い徴候の重篤度の減少）評価することができる。
【０１０５】
未感染のブタは、ブタ繁殖及び呼吸器疾病感染性病原体に暴露されていないか、又はブタ繁殖及び呼吸器疾病感染性病原体に暴露されたが、しかし疾病の徴候を示していないかのいずれかのブタである。感染されたブタは、ＰＲＲＳの徴候を示すか、又はそれからＰＲＲＳＶを単離することができたものである。
【０１０６】
本発明のワクチンは、標準的な緩衝液、安定剤、希釈剤、保存剤、及び／又は可溶化剤のような、ヒトを含む（適用可能な場合）動物に対して受容可能な担体を含むために受容された習慣に従って処方し、そして更に継続放出を容易にするために処方することができる。希釈剤は、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール、等を含む。等張性のための添加剤は、特に、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースを含む。安定剤は、特にアルブミンを含む。改変された生ワクチンを処方することにおいて特に有用であるものを含む他の適したワクチンベヒクル及び添加剤は、当業者にとって既知であるか、又は明白であるものである。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８ｔｈ  ｅｄ．，１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照されたく、これは、本明細書中に参考文献として援用される。
【０１０７】
本発明のワクチンは、更に、一つ又はそれより多い、例えば、特にアジュバント又はサイトカインのような更なる免疫調節性成分を含んでなることができる。本発明のワクチン中に使用することができるアジュバントの非制約的例は、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ  Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲルのような無機ゲル、水中油乳液、例えばフロイント完全又は不完全アジュバントのような油中水乳液、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ，Ａｔｌａｎｔａ，Ｇａ．）、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｍａｓｓ．）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ  Ｃａｌｉｆ．）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ．ＲＴＭ．アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ  Ａ又は他のサポニン画分、モノホスホリル脂質Ａ、及びアブリジン脂質−アミンアジュバントを含む。本発明のワクチンにおいて有用である水中油乳液の非制約的例は、改変されたＳＥＡＭ６２及びＳＥＡＭ１／２製剤を含む。改変されたＳＥＡＭ６２は、５（容量／容量）％のスクアレン（Ｓｉｇｍａ）、１（容量／容量）％のＳＰＡＮ．ＲＴＭ．８５合成洗剤（ＩＣＩ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、０．７（容量／容量）％のＴＷＥＥＮ．ＲＴＭ．８０合成洗剤（ＩＣＩ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、２．５（容量／容量）％のエタノール、２００ｐｇ／ｍｌのＱｕｉｌ  Ａ、１００［ｍｇｒ］ｇ／ｍｌのコレステロール、及び０．５（容量／容量）％のレシチンを含有する水中油乳液である。改変されたＳＥＡＭ１／２は、５（容量／容量）％のスクアラン、１（容量／容量）％のＳＰＡＮ．ＲＴＭ．８５合成洗剤、０．７（容量／容量）％のＴｗｅｅｎ８０合成洗剤、２．５（容量／容量）％のエタノール、１００．ｍｕ．ｇ／ｍｌのＱｕｉｌ  Ａ、及び５０．ｍｕ．ｇ／ｍｌのコレステロールを含んでなる水中油乳液である。ワクチン中に含むことができる他の免疫調節性薬剤は、例えば、一つ又はそれより多いインターロイキン、インターフェロン、又は他の既知のサイトカインを含む。
【０１０８】
本発明のワクチンは、所望により本発明のウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、又はウイルスベクターの継続放出のために処方することができる。このような継続放出製剤の例は、ウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、又はウイルスベクターを、例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−共−グリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲン等のような生体適合性ポリマーの複合体と組合せて含む。薬物供給ベヒクル中の分解性ポリマーの構造、選択及び使用は、Ａ．Ｄｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ３：２７９−２９２を含む幾つかの刊行物中で総括され、これは、本明細書中に参考文献として援用される。医薬製剤中のポリマーの選択及び使用における更なる指導は、当技術において既知の教科書、例えば、Ｍ．Ｃｈａｓｉｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ（ｅｄｓ），１９９０，“Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ”ｉｎ：Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．４５，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．中に見出すことができ、これも、更に本明細書中に参考文献として援用される。別に、又は更に、ウイルス、プラスミド、又はウイルスベクターは、投与及び効力の改良のために、マイクロカプセル化することができる。抗原をマイクロカプセル化する方法は、当技術において公知であり、そして例えば、米国特許第３，１３７，６３１号；米国特許第３，９５９，４５７号；米国特許第４，２０５，０６０号；米国特許第４，６０６，９４０号；米国特許第４，７４４，９３３号；米国特許第５，１３２，１１７号；及び国際特許出願公開ＷＯ９５／２８２２７中に記載されている技術を含み、これらの全ては本明細書中に参考文献として援用される。
【０１０９】
リポソームも、更にウイルス、プラスミド、又はウイルスベクターの継続放出を提供するために使用することができる。如何にリポソーム製剤を製造し、そして使用するかに関する詳細は、特に、米国特許第４，０１６，１００号；米国特許第４，４５２，７４７号；米国特許第４，９２１，７０６号；米国特許第４，９２７，６３７号；米国特許第４，９４４，９４８号；米国特許第５，００８，０５０号；及び米国特許第５，００９，９５６号中に見出すことができ、これらの全ては、本明細書中に参考文献として援用される。
【０１１０】
いずれもの上記のワクチンの有効な量は、低い投与量のウイルス、ウイルスタンパク質、プラスミド又はウイルスベクターから出発し、そして次いで効果をモニターしながら投与量を増加する、慣用的な手段によって決定することができる。有効な量は、ワクチンの一回の投与後、又はワクチンの多数回の投与後に得ることができる。動物当たりの最適な投与量を決定する場合、既知の因子を考慮することができる。これらは、動物の種、大きさ、年齢及び一般的状態、動物中の他の薬物の存在、等を含む。実際の投与量は、好ましくは、他の動物の研究からの結果の考慮後に選択される（例えば、以下の実施例２及び３を参照されたい）。
【０１１１】
十分な免疫反応が達成されたか否かを検知する一つの方法は、ワクチン接種後の動物中の抗体陽転及び抗体力価を決定することである。ワクチン接種のタイミング及び若しあれば、追加免疫の回数は、好ましくは、全ての関連する因子の分析に基づいて、医師又は獣医師によって決定されるものであり、その幾つかは上述されている。
【０１１２】
本発明のウイルス、タンパク質、感染性ＤＮＡ分子、プラスミド、又はウイルスベクターの有効な投与量は、ワクチン接種される動物の体重のような、当業者によって決定することができる因子を考慮して、既知の技術を使用して決定することができる。本発明のワクチン中の本発明のウイルスの投与量は、好ましくは約１０１から約１０９ｐｆｕ（プラーク形成単位）まで、更に好ましくは約１０２から約１０８ｐｆｕまで、そして最も好ましくは約１０３から約１０７ｐｆｕまでの範囲である。本発明のワクチン中の本発明のプラスミドの投与量は、好ましくは約０．１ｍｇから約１００ｍｇまで、更に好ましくは約１ｍｇから約１０ｍｇまで、なお更に好ましくは約１０ｍｇから約１ｍｇまでの範囲である。本発明のワクチン中の本発明の感染性ＤＮＡ分子の投与量は、好ましくは約０．１ｍｇから約１００ｍｇまで、更に好ましくは約１ｍｇから約１０ｍｇまで、なお更に好ましくは約１０ｍｇから約１ｍｇまでの範囲である。本発明のワクチン中の本発明のウイルスベクターの投与量は、好ましくは約１０１から約１０９ｐｆｕまで、更に好ましくは約１０２ｐｆｕから約１０８ｐｆｕまで、そしてなお更に好ましくは約１０３から約１０７ｐｆｕまでの範囲である。適した投与量の大きさは、約０．５ｍｌから約１０ｍｌまで、そして更に好ましくは１ｍｌから約５ｍｌまでの範囲である。
【０１１３】
本発明の実施によるウイルスタンパク質又はペプチドワクチンに対する適した投与量は、一般的に投与当たり１から５０マイクログラムまで、又は標準的な方法によって決定することができるようなものより高い量の範囲であり、それぞれのこのような物質に関して認識された方法によって決定される量のアジュバントを伴う。ブタのワクチン接種に関する本発明の好ましい例において、ブタのための最適年齢の目標は、離乳前（ｐｒｅ−ｗｅｅｎｉｎｇ）である約１ないし２１日の間であり、更にＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ又はＰＣＶに対するもののような他の計画されたワクチン接種に対応することもできる。更に、飼育中の雌ブタの好ましいワクチン接種の計画は、年間のワクチン再接種計画と同様な投与を含むものである。
【０１１４】
いずれもの上記のワクチンの有効な量は、低投与量のウイルス、プラスミド又はウイルスベクターから出発し、そして次いで効果をモニターしながら投与量を増加する、慣用的な手段によって決定することができる。有効な量は、ワクチンの一回投与後、又はワクチンの多数回投与後に得ることができる。動物当たりの最適投与量を決定する場合、既知の因子を考慮することができる。これらは、動物の種、大きさ、年齢及び一般的状態、動物中の他の薬剤の存在、等を含む。実際の投与量は、好ましくは他の動物研究からの結果の考慮後に選択される。
【０１１５】
十分な免疫反応が達成されたか否かを検知する一つの方法は、ワクチン接種後の動物中の抗体陽転及び抗体力価を決定することである。ワクチン接種の時期及び若しあれば、追加免疫の回数は、好ましくは、全ての関連する因子の分析に基づいて、医師又は獣医師によって決定されるものであり、その幾つかは先に記載されている。
【０１１６】
本発明のウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、又はウイルスベクターの有効な投与量は、ワクチン接種される動物の体重のような当業者によって決定することができる因子を考慮して、既知の技術を使用して決定することができる。例として、ワクチンは、経口、非経口、皮内、皮下、筋肉内、鼻腔内又は静脈内に供給することができる。経口供給は、例えば、組成物を動物の食餌又は飲料に加えることを包含することができる。ワクチンの投与量に関連する因子は、例えば、ブタの体重及び年齢を含む。
【０１１７】
本発明は、更に、本明細書中に記載されるＰＲＲＳウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、又はウイルスベクターを含んでなるワクチンを調製する方法を提供し、この方法は、有効な量の本発明のＰＲＲＳウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、又はウイルスベクターの一つを、医薬又は獣医学的な使用のために受容可能な担体と混合することを含んでなる。
更に、本発明の生弱毒化ワクチンは、既知の組換え技術を使用してＰＲＲＳウイルスゲノム中に挿入される異種抗原エピトープをコードするために、米国特許第６，５００，６６２号に記載されているように改変することができる。更に米国特許第７，１３２，１０６号を参照されたく、これは、その全ては参考文献として援用される。本発明のための異種抗原エピトープとして有用な抗原エピトープは、ＰＲＲＳウイルス以外のブタ病原体からの抗原エピトープを含み、これは、制約されるものではないが、ブタパルボウイルス、ブタサーコウイルス、ブタロタウイルス、ブタインフルエンザ、仮性狂犬病ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタ呼吸器コロナウイルス、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、脳心筋炎ウイルス、ブタパラミクソウイルス、トルクテノウイルス、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｓｙｎｏｖｉａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｍｉｌｉｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓからなる群から選択されるブタ病原体からの抗原エピトープを含む。前述のブタ病原体からの抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列は、当技術において既知であり、そしてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＵＳＡ）からのジェンバンク（GenBank）のようなワールドワイドウェブ上の公開された遺伝子データベースから得ることができる。
【０１１８】
本発明の更なる特徴及び変更は、詳細な説明を含む本出願の全体から当業者にとって明白であるものであり、そして全てのこのような特徴は、本発明の側面として意図されている。同様に、本明細書中に記載される本発明の特徴は、更なる態様に組換えることができ、これらも、更に、特徴の組合せが具体的に側面として先に記述されているか否かに関わらず、本発明の側面又は態様として意図されている。更に、本発明にとって重要であるとして本明細書中に記載されているような制約のみを、本明細書中に重要であるとして記載されていない制約を欠く本発明の変更が本発明の側面として意図されている、として見做されるべきである。本発明が、前記の説明及び実施例中に特別に記載される以外の他の方法で実施することができることは明白であるものである。
【０１１９】
本発明の多くの改変及び変更は、上記の教示に照らして可能であり、そして従って、本発明の範囲内である。
【０１２０】
以下の実施例は、本発明を例示するが、しかし制約するものではない。
【実施例】
【０１２１】
実施例１
ＰＲＲＳＶ分離株Ｐ１２９のＰＫ−９細胞への適合及び弱毒化
病原性ＰＲＲＳ分離株Ｐ１２９を、インディアナの病気のブタから、１９９５年にＰｕｒｄｕｅ大学の動物疾病診断研究所で単離した。このブタからの血清試料を、高い健康状態のブタ中で一代継代して、血清及び肺ホモジネート原料を増加した。ウイルスＲＮＡを血清及び肺ホモジネートから抽出し、そしてＰ１２９の継代０のウイルスの完全なゲノムコンセンサス配列を決定するために使用した。先ずＲＮＡをランダム六量体で予備刺激し、そしてｃＤＮＡを合成するために使用した。ゲノムを高忠実度（プルーフリーディング）ＰＣＲを使用して三つの重複ピース中で増幅した。三つの別個のＰＣＲ反応（ゲノムセグメント当たり）からのＰＣＲ産物を、Ｔ／Ａクローン化し、そして全長のゲノムコンセンサス配列を発生するためのＤＮＡ配列決定のために使用した（配列番号：５を参照されたい）。
【０１２２】
Ｐ１２９の継代０を含有する、ＤＮＡの配列決定するために使用したものと同じブタの血清のアリコートを、一次ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）細胞に感染するために使用した。ＰＡＭ感染からの後代ウイルス（継代１）を、０．１マイクロメートルのシリンジフィルターを通して濾過し、そしてＰＫ−９細胞を感染するために使用した。
【０１２３】
ＰＫ−９細胞は、ＰＫ０８０９ブタ腎臓細胞系を、ブタＣＤ１６３遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子の欠失バージョンをコードするプラスミドで、安定して遺伝子導入することによって誘導された遺伝子導入細胞系である。ＰＫ−９細胞系の構築及び特徴付けの詳細は、先に記載されている。
【０１２４】
ＰＡＭ細胞からの継代１ウイルスのＰＫ−９細胞上で増殖への適合は、困難であり、そして多重の並行した系列による幾つかの試みが必要であった。感染は、ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質に対して特異的なＦＩＴＣ複合モノクローナル抗体ＳＤＯＷ１７（Ｒｕｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，Ｂｒｏｏｋｉｎｇｓ  Ｓｏｕｔｈ  Ｄａｋｏｔａ）を使用して、二重のウェルの免疫蛍光法によってモニターした。初期の継代は、僅かな小さい病巣をもたらしたが、しかし新鮮な単層の感染を開始するために十分な、細胞を含まないウイルス粒子を発生しなかった。これらの継代は、感染された単層をアキュターゼ（トリプシン代替品）で処理し、そして多重ウェル中の細胞を、未感染ＰＫ−９細胞の添加を伴って又は伴わずに、新鮮な培地で再接種することによって達成した。数代のこのような継代後、幾つかの系列は、蛍光性病巣の発生頻度及び大きさの明白な増加を示した。これらの幾つかは、細胞を含まないウイルス流体を使用して継代される能力を獲得した。継代１７（ＰＡＭ細胞上で１代、ＰＫ−９において１６代）までに、一つの系列は、前の継代からの、細胞を含まない流体の希釈物を使用して、確実に持続され、そして数日内に全部の単層の感染をもたらすことができた。ウイルスは、全ての継代レベルでＰＫ−９に対する細胞変性効果を起こさなかった。ＲＮＡを、ウイルス継代１７で感染されたＰＫ−９細胞から抽出し、そして感染性ｃＤＮＡクローンを構築するために使用した。
【０１２５】
実施例２
Ｐ１２９−ＰＫの継代１７の感染性ｃＤＮＡクローンの構築
Ｐ１２９−ＰＫの継代１７ウイルスの感染性ｃＤＮＡクローンを、先に記載したとおり土台（バックボーン）プラスミドを使用して構築した。ウイルスのゲノムを、逆転写及び三つの重複セグメント中のＰＣＲによって、重複の領域中の天然に存在する独特な制限エンドヌクレアーゼ部位で増幅した。三つの別個のＰＣＲ反応からの産物を、クローン化し、そして配列決定し、そしてそれぞれのゲノムセグメントのためのコンセンサス配列を発生するために整列させた。所定のセグメントの三つのクローン化された産物の一つも、そのセグメントに対するコンセンサスの予測アミノ酸配列に合致しない場合、クローンの一つは、これが当該コンセンサスの予測アミノ酸配列に合致するまでサブクローニング及び／又は部位特異的変異誘発によって改変された。三つのゲノムセグメント及びプラスミドバックボーンを、標準的なクローニング技術及び制限エンドヌクレアーゼ部位を使用して結合した。ｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬと命名された得られた全長のクローンは、ＰＫ−９細胞中に遺伝子導入した場合、感染性であった。この感染性ｃＤＮＡクローンの配列を、配列番号：１に与える。ゲノムは、本質的に、これが構築された継代１７のウイルスと同一であり、真正な終端を持ち、そして継代１７のコンセンサス配列に関するいずれもの挿入又は欠失を欠いていた。この感染性ｃＤＮＡクローンのウイルスゲノム内の操作された制限部位又は他の標的化された変化は存在しなかった。
【０１２６】
Ｐ１２９の継代０の完全なゲノムコンセンサス配列及び感染性クローンｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬのゲノム配列間のヌクレオチド並びにアミノ酸の差は、個々に表６に記載している。表６は、ゲノム位置による全てのヌクレオチドの差、及び結果として生じるアミノ酸の差を含む。これらの変異のサブセットは、ＩＦＮ阻害性（継代０）からＩＦＮ非阻害性（継代１７の感染性ｃＤＮＡクローンから誘導された全てのウイルス）への表現型の変化の原因である。表７は、ＰＲＲＳＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又は非構造性タンパク質（ｎｓｐ）による、ヌクレオチド、アミノ酸、及び非保存的アミノ酸の差を要約する。表７の目的のために、特に次のグループ：［Ｋ、Ｒ］、［Ｄ、Ｅ］、［Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ａ］、及び［Ｓ、Ｔ］のアミノ酸が保存的と考えられる。
【０１２７】
実施例３
Ｐ１２９−ＰＫの継代１７における欠失変異体
ゲノムの二つの領域における欠失を、感染性ｃＤＮＡクローンのｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬに操作して、五つの遺伝子的に改変した感染性クローンを発生した。
【０１２８】
改変を受けるゲノムの一つの領域は、ヌクレオカプシドタンパク質の４１−４７のアミノ酸位置に位置する核局在化配列（ＮＬＳ）であった（ＰＲＲＳＶのＯＲＦ７によってコードされる）。二つの種類の欠失が行われた。これらの欠失は、もう一つのＰＲＲＳＶ感染性クローンの文脈において先に記載されている。アミノ酸残基４１−４９の野生型配列は、ＰＧ．．．ＫＮである。更に“ＰＧ−−ＫＳ”としても知られる変異体“ｄ４３／４４”において、リシン残基４３及び４４は欠失され、そしてアスパラギン残基４９はセリンに変化されている。更に“ＰＧ−−Ｓ−ＫＳ”としても知られる変異体“ｄ４３／４４／４６”において、リシン残基４３、４４、及び４６は欠失され、そしてアスパラギン残基４９はセリンに変化されている。これらの欠失を組込むｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬから誘導された感染性クローンは、それぞれｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ｄ４３／４４及びｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ｄ４３／４４／４６である。米国特許第７，５４４，３６２号を参照されたい。
【０１２９】
改変を受けるゲノムの二番目の領域は、ＯＲＦ１ａ内のｎｓｐ２の高頻度可変領域にあった。１３１アミノ酸（３９３ヌクレオチド）の欠失は、もう一つのＰＲＲＳＶ感染性クローンの文脈において先に記載されている。この欠失を組込むｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬから誘導される感染性クローンは、ｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ｎｓｐ２である。
【０１３０】
ＮＬＳ及びｎｓｐ２欠失を組合せた感染性クローンは、更にｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬバックボーン内に発生され、そしてこれらは、ｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ｎｓｐ２−ｄ４３／４４及びｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ｎｓｐ２−ｄ４３／４４／４６と命名された。
【０１３１】
実施例４
ＰＫ−９細胞上のウイルスの発生及び増殖
実施例３に記載された六つの感染性クローンを、ＰＫ−９細胞に遺伝子導入して、六つのウイルスを表１に示すように発生した。ウイルスを、これらの感染性クローンから、リポフェクタミン２０００を使用してＰＫ−９細胞中への環状プラスミドの直接遺伝子導入によって発生させた。遺伝子導入後、回収されたウイルスを、力価を更に増加し、そして病原性を減衰するために、再びＰＫ−９細胞上で連続継代した。原料を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの試験及びｉｎ  ｖｉｖｏの評価のためにワクチン候補として製造した。非改変ｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬ感染性クローンから誘導されたＰ１２９−ＰＫ１７−ＦＬウイルスの場合、ウイルスは、ブタから合計５２継代に達するまで培養された。このウイルスの完全なゲノムは、継代２４（配列番号：３）及び５２（配列番号：６）において配列決定された。
【０１３２】
実施例５
Ｐ１２９−ＰＫの継代１７感染性ＣＤＮＡクローンから誘導されたウイルスによるＩＦＮ−アルファ誘導を阻害する能力の減少
ウイルス及び細胞。  ＭＡＲＣ−１４５及びＳＴ細胞を、５％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）及び抗生物質（５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１００ＵＩのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）で補充された改良イーグル培地（ＭＥＭ）中で増殖させた。ブタ肺胞マクロファージＺＭＡＣ−１細胞を、１０％のＦＢＳで補充されたＲＰＭＩ−１６４０中で増殖させた。ＴＧＥウイルスのＰｕｒｄｕｅ株を、改良イーグル培地中で０．０１の多重度において密集ＳＴ細胞単層の感染によって調製した。ウイルス接種材料を１時間後に除去し、そして細胞を、２．５％のＦＢＳで補充されたＭＥＭ中で、３７℃で５％のＣＯ２雰囲気中でインキュベートした。ウイルスを８０％の細胞変性効果が観察された後、細胞単層の冷凍及び解凍によって放出した。ＴＧＥウイルス原料を３，５００ｒｐｍで４℃で１５分間遠心し、そして−８０℃で使用するまで保存した。ウイルス原料（ＰＫ−９細胞から）は、次の通りであり：Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬ及びＰ１２９−ＰＫ−ｄｎｓｐ２−ｄ４３／４４／４６は、継代８／２５（感染性クローンから８代、ブタから２５代）であった。他の四つのウイルス（Ｐ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４、Ｐ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４／４６、Ｐ１２９−ＰＫ−ｄｎｓｐ２、及びＰ１２９−ＰＫ−ｄｎｓｐ２−ｄ４３／４４）は、継代２１／３８であった。各種のＰＲＲＳウイルスの作業原料は、商業的なワクチンのインゲルバックＰＲＲＳ  ＭＬＶ及びインゲルバックＰＲＲＳ  ＡＴＰを製造業者の説明書によって再構成し、そして感染のために直接使用したことを除き、ＺＭＡＣ−１細胞上の一代継代を製造することによって調製した。
【０１３３】
ブタＰＢＭＣの単離。  新鮮なヘパリン処理された静脈血を、ハンクス液で希釈し、そしてＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ  １０７７（Ｓｉｇｍａ）勾配による密度遠心によって単離した。ハンクス液で二回洗浄した後、細胞を５％の胎児ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１ｘ非必須アミノ酸（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）１００Ｕ／ｍｌのゲンタマイシン及び２５０ｍＭの２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）で補充されたＬ−グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を伴うＲＰＭＩ培地中に懸濁した。
【０１３４】
ブタ形質細胞様樹状細胞の精製。  ブタ形質細胞様樹状細胞の精製を、先に記載されている（Ｃａｌｚａｄａ−Ｎｏｖａ、提示済）ように行い、そしてこれらの細胞によるＣＤ４及びＣＤ１７２の特徴的発現に基づいた（Ｓｕｍｍｅｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）  簡単には、新鮮なブタＰＢＭＣを、０．５％のＢＳＡを伴うＰＢＳ中に懸濁し、そして最適な量のｍＡｂ認識性ブタＣＤ１７２（７４−２２−１５，ＶＭＲＤ）で標識した。一回の洗浄後、次いで細胞をＰＥに結合した二次ヤギ抗マウス抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共に、そして洗浄後、ＦＩＴＣで標識された抗−ＣＤ４（７４−１２−４，ＶＭＲＤ）と共にインキュベートした。ＰＤＣを、反射式セルソーター（ｉＣｙｔ）で選別し、選別ゲートは、ＣＤ４＋／ＣＤ１７２ｌｏｗ集団に設定した。選別後、細胞の純度を再分析によって確認した。全ての場合、純度は、＞９５％であった。
【０１３５】
サイトカイン分泌測定のためのアッセイ。  ＰＢＭＣ又はＰＤＣを、異なった刺激物質で１６時間（３７℃、５％ＣＯ２）刺激するか、又は模擬刺激した。インキュベーション後、刺激された細胞を覆う培地を、ＩＦＮ−αの存在に対して、商業的に入手可能なモノクローナル抗体（抗ブタＩＦＮ−α  ｍＡｂｓ  Ｋ９及びＦ１７）と共に調製したサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して分析した。簡単には、Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＩプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）を、抗ブタＩＦＮ−α  ｍＡｂ  Ｆ１７（ＰＢＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で、一晩の４℃のインキュベーション、その後の５％胎児ウシ血清で補充したＲＰＭＩ培地による遮断によって被覆した。１時間後、培地を廃棄し、そして５０マイクロリットルの試験される上清を、アッセイウェルに二重で加えた。１時間のインキュベーション後、アッセイウェルを４回洗浄し、そして次いで、ビオチン標識された抗ブタＩＦＮ−α  ｍＡｂｓ  Ｋ９（ＰＢＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＨＲＰと結合したストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、及びＴＭＢ基質（ＫＰＬ）と連続してインキュベートした。光学濃度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーで決定した。
【０１３６】
Ｐ１２９−ＰＫの継代１７の感染性ｃＤＮＡクローンから誘導されたウイルスは、ＩＦＮ−アルファ誘導を阻害する能力を欠く。作業ウイルス原料を、四つの異なったＰＲＲＳ野生型ウイルス分離株（Ｐ３４１２、Ｐ１２９、ＩＮＤ５、ＮＡＤＣ２０）のグループから、ブタ肺胞マクロファージ細胞系ＺＭＡＣ−１を使用して調製した。更なる原料を、ＰＫ−９、ＦＫ．Ｄ４又はＭＡＲＣ−１４５細胞中の繰返し継代によって細胞培養物中で増殖するように適合された最初の二つの野生型ウイルスの誘導体からも更に調製した。四つの野生型分離株の三つ（Ｐ１２９、ＩＮＤ５、ＮＡＤＣ２０）は、容易に、そして効率よくＺＭＡＣ−１細胞中で約１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価まで増殖し、一方、Ｐ３４１２野生型分離株は、１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価に達したのみであった。注目すべきことは、ＺＭＡＣ−１細胞系中で調製されたＰ１２９ウイルスの原料は、ウイルスが適合されたＰＫ−９又はＭＡＲＣ−１４５細胞において得られたものより、１０倍高い力価に達した。ＰＢＭＣによってＩＦＮ−αの分泌を刺激するこれらのウイルスの能力の試験は、一つ（分離株Ｐ３４１２クローンＣ）を除いて、試験されたＰＲＲＳウイルス原料のいずれかに対するこれらへの暴露に反応して、非常に少量の（＜５０ｐｇ）ＩＦＮ−αがこれらの細胞によって分泌され、これは、ブタコロナウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥｖ）へのこれらの暴露の結果として、同じ細胞によって産生されるＩＦＮ−αの豊富な分泌（１７，５４０ｐｇ）との比較によって、無視可能であることを明らかにした。
【０１３７】
ＰＲＲＳＶは、ブタＰＢＭＣによるＩＦＮ−α産生を刺激することが不可能であるだけでなく、その産生を活発に阻害する。ＰＲＲＳＶ原料の阻害効果は、ＰＲＲＳＶの存在又は非存在におけるＴＧＥｖに対する暴露に反応してＰＢＭＣによって分泌されるＩＦＮ−αの量を測定することによって決定された。表２に示すように、試験された全ての四つの野生型ＰＲＲＳウイルス分離株、並びに全ての細胞培養物に適合された誘導体は、ＴＧＥｖに対するＰＢＭＣのＩＦＮ−α反応に対して強力な阻害効果（＞８０％）を示した。全長のＰ１２９−ＰＫ−ＦＬウイルスを含む感染性ｃＤＮＡクローン（ｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬ）から誘導されたウイルス原料のグループ、及び幾つかの遺伝子操作された欠失変異体の分析を行った。表３に示すように、親の野生型分離株Ｐ１２９（継代１）の強力な阻害効果（＞９５％）と比較した場合、Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬウイルス及び全ての欠失変異体は、ＰＢＭＣ中のＴＧＥｖによるＩＦＮ−  の誘導を阻害する有意に減少した能力を示した。これらのウイルスのＩＦＮ−α表現型を更に評価するために、その後の実験は、Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬ及びＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４ウイルス、親のＰ１２９野生型株、及び／又はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍによって製造された二つの商業的に入手可能な改変された生ＰＲＲＳＶワクチン（インゲルバックＰＲＲＳ  ＭＬＶ及びインゲルバックＰＲＲＳ  ＡＴＰ）間の直接比較を行うことに焦点を当てた。更なる低継代の参照分離株、ＮＶＳＬ−１４も更に試験した。表４に示すように、四つの独立の実験において、Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬ及びＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４は、親のＰ１２９ウイルス、二つのインゲルバック弱毒化株、又は参照株より有意に少ないＩＦＮ−α阻害効果を示した。一つの事例において、Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬ又はＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４ウイルスによる同時感染は、ＴＧＥｖに対するＩＦＮ−α反応の明白な向上をもたらした。
【０１３８】
表２に示す結果は、野生型ＰＲＲＳウイルス及び細胞培養物中で増殖するために適合された誘導体のインターフェロン−α阻害効果を示している。示したＰＲＲＳウイルス原料は、ＺＭＡＣ−１細胞中で増殖され、そしてこれらの新しく発生された原料の力価は、ＺＭＡＣ−１細胞を使用して決定した。ＴＧＥウイルスの存在又は非存在中の、示されたＰＲＲＳウイルス原料に１８時間暴露されたブタ末梢血単核球細胞の培養上清中に存在するＩＦＮ−αの量は、ＥＬＩＳＡによって決定された。＊単独のＴＧＥｖに対する反応。
【０１３９】
表３に示した結果は、野生型ＰＲＲＳウイルスＰ１２９、及びＣＤ１６３を発現しているＰＫ−９細胞中で増殖するために適合されたその遺伝子操作された誘導体のインターフェロン−α阻害効果を示す。ＴＧＥウイルスの存在又は非存在中の、示されたＰＲＲＳウイルス原料に対して１８時間暴露されたブタ末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）の培養上清中に存在するＩＦＮ−αの量は、ＥＬＩＳＡによって決定された。ｎａ＝適用せず；＊単独のＴＧＥｖに対する反応。
【０１４０】
表４は、Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬ及びＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４ウイルスの、野生型Ｐ１２９ウイルス及びＰＲＲＳインゲルバックワクチンと比較して減少したインターフェロン−α阻害効果を示す。ＴＧＥウイルスの存在又は非存在中の、示されたＰＲＲＳウイルス原料に対して１８時間暴露されたブタ末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）の培養上清中に存在するＩＦＮ−αの量は、ＥＬＩＳＡによって決定された。ｎａ＝適用せず；＊単独のＴＧＥＶに対する反応。
【０１４１】
ＴＧＥＶへのその暴露に反応してＰＢＭＣによって分泌される豊富な量のＩＦＮ−αは、主として、ＰＢＭＣの０．３％より少ない集団を含んでなる細胞のサブセットから誘導される。この稀な、しかし重要な細胞のサブセットは、形質細胞様樹状細胞（ＰＤＣ）で構成され、これは、特徴的な形質細胞様な形態のためにこの名前を授与された。Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬ及びＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４ウイルスのＩＦＮ−α表現型を更に試験するために、ＰＢＭＣから＞９５％の純度で新しく単離されたＰＤＣを使用したことを除き、先に記載したものと同様に、一連の実験を行った。図１に示すように、この一連の実験は、Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬ及びＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４ウイルスが、ＴＧＥＶによるＩＦＮ−α誘導の無視可能な阻害を起こすことを確認した。更に、一つの実験において、Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬ及びＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４ウイルスに反応したＰＤＣによる、ＴＧＥＶ媒介のＩＦＮ−α誘導に対する明白な向上効果が観察された。対照的に、インゲルバックＰＲＲＳ  ＭＬＶウイルスは、図１に示すようにＩＦＮ−α反応に対する強力な阻害効果を示した。
【０１４２】
実験の項に記載した結果は、Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬ及びＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４のＰＲＲＳウイルス、並びにｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬ感染性ｃＤＮＡクローンの他の誘導体が、感染されたＰＢＭＣ又はＰＤＣ細胞中のＴＧＥＶによるＩＦＮ−αの誘導を阻害する大幅に減少した能力を有することを明らかにした。これは、野生型（低継代）のＰＲＲＳウイルス及び二つの商業的に入手可能な改変された生ウイルスワクチン（インゲルバックＰＲＲＳ  ＭＬＶ及びインゲルバックＰＲＲＳ  ＡＴＰ）で観察されたＩＦＮ抑制効果に対する顕著な対比である。Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬ及びＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４ウイルスが、ＰＤＣのこの重要な機能に対して最小に抑制性であったことの観察は、これらの細胞が、ウイルス感染に対する自然免疫を仲介することにおいて演じる主要な役割を考慮すれば、潜在的に有意である。
【０１４３】
本発明が、ＣＤ１６３受容体を組換え的に発現する許容的細胞上で増殖するために適合された臨床的に有効な商業的なワクチンウイルスを提供し、そしてこのようなウイルス及びワクチンが、歴史的な“サル細胞”の培養技術に依存せず、又はいずれの点もそれにより開発されたものではないことは更に注目されるべきである。具体的には、米国特許第７，７５４，４６４号を参照されたい。
【０１４４】
実施例６
ワクチン候補物質の安全性及び効力
ＰＲＲＳに対するワクチンとしてのその安全性及び効力を評価するために、ｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬ感染性ｃＤＮＡクローン、Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬ（継代７／２４）、Ｐ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４（継代１７／３４）及びＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４／４６（継代１７／３４）から誘導された三つのウイルスを、若年のブタの呼吸器疾病モデルで評価した。これらのウイルスの起源を図８に示し、そして実験の設計（処置グループ）を、表５に記載する。低継代の病原性ＰＲＲＳＶ分離株ＮＡＤ２０を、異種誘発のために、生後７週目（ワクチン接種後４週経過）に使用した。対照処置グループは、模擬ワクチン及び商業的ＰＲＲＳワクチンインゲルバックＭＬＶを含んでいた。
【０１４５】
非処置（ＮＴ）グループは、次のとおりであった：ＮＴ１ブタは、元のブタの健康状態をモニターするための標識であった。これらは、別個に収容され、そしてＰＲＲＳＶ誘発の前に剖検された。ＮＴ２ブタは、ワクチン接種されたブタの二つの檻の間の檻に別個に収容された、それぞれのＴ０２ないしＴ０５の処置グループ当たり合計二匹の接触対照であった。ＮＴ３ブタは、ワクチン接種されたブタと共に檻当たり一匹収容された、処置グループ（Ｔ０１ないしＴ０５）当たり合計二匹の接触対照であった。ＮＴ３ブタのみがＴ０１グループに割当てられた。
【０１４６】
ワクチン接種されたブタの直腸温度を、ワクチン接種後測定し、そしてＴ０１（模擬ワクチン）処置グループと比較した。結果を図１に示す。ワクチンのどれも発熱を誘導しなかった。全てのグループは、ワクチン接種後の観察期間を通して１０４℃より低い平均であった。
【０１４７】
ブタの直腸温度を誘発後測定した。結果を図２に示す。ワクチン接種されていないＴ０１ブタは、１０４℃より大きい継続した発熱を示した。対照的に、三つのワクチンは誘発後の発熱を有意に減少した。Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬは、発熱を減少することに最も有効であった。
【０１４８】
ブタの体重をワクチン接種前及び後に記録した。結果を図３に示す。体重を、研究の１（ワクチン接種前）、１０、２４、２７（誘発前）、及び３７日目に記録した。ワクチン接種されないブタにおいて、病原性ＮＡＤ２０ウイルスによる誘発は、１０日間の観察期間中に体重増加を殆ど完全に除去した。ワクチンは、この影響を各種の程度で無効にした。
【０１４９】
誘発されたブタの肺を誘発後の剖検で試験した。病変に関係したそれぞれの肺のパーセントを図４に示す。Ｔ０１模擬ワクチングループは、平均２５．１％の肺の病変への関与であった。ワクチンは、肺の病変を各種の程度に減少した。Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬは、最も有効であり、肺病変の関与を１．１％に減少した。
【０１５０】
肺病変の重篤度を、図５に示すように肺評価得点（ＬＡＳ）を使用して評価した。三つのワクチンはＬＡＳを減少した。Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬは、平均ＬＡＳを、模擬ワクチン接種グループの１．６３から０．１４に減少した。
【０１５１】
ＰＲＲＳＶに対する血清抗体を、ワクチン接種及び誘発の両方によって誘導した。ＩＤＥＸＸ  ＥＬＩＳＡのＳ／Ｐ比を、研究の２７及び３７日目に測定した。結果を図６に示す。Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬによるワクチン接種は、最高のレベルの抗ＰＲＲＳ抗体を誘導した。
【０１５２】
誘発されたブタの血清中のウイルス血症を、ＰＡＭ細胞上で滴定した。結果（ＴＣＬＤ５０／ｍＬ）を図７に与える。Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬは、誘発後のウイルス血症を減少することに最も有効であった。
【０１５３】
本発明は、上記の実施例、及びそのそれぞれの全部の内容が参考としてその全てが援用される添付書類を参照して記載されてきたが、改変及び変更が、本発明の思想及び範囲内に包含されることは理解されるものである。従って、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ制約される。
【０１５４】
実施例７
感染性ＣＤＮＡクローンＰＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９からの感染性ＣＤＮＡクローンＰＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬの誘導
本発明のｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬのＰＲＲＳＶ感染性ｃＤＮＡクローンは、先に記載したＰＲＲＳＶ感染性ｃＤＮＡクローンｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９から、当業者によって、部位特異的変異誘発の技術を使用して容易に誘導することができる。ＰＲＲＳＶ感染性ｃＤＮＡクローンｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９は、米国特許第６，５００，６６２号に記載され、そして寄託番号２０３４８９下でＡＴＣＣに寄託されている。このクローン中のＰＲＲＳＶゲノムのＤＮＡ配列は、更に寄託番号ＡＦ４９４０４２としてジェンバンク（ＮＣＢＩ）データベース中で入手可能である。部位特異的変異誘発キットは、多くの供給者から商業的に入手可能であり、そして大きいプラスミド中の多数の部位における多くの刺激性ヌクレオチド変化を製造することが可能である。このようなキットは、制約されるものではないが、Ｃｈａｎｇｅ−ＩＴＴＭ  多重変異部位特異的変異誘発キット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ＵＳＢ）、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ多重部位特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、及びＡＭＡＰ多重部位特異的変異誘発キット（ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を含む。
【０１５５】
ＰＲＲＳＶ感染性ｃＤＮＡクローンｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９（ＡＴＣＣから入手可能）及び本発明のｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬのＰＲＲＳＶ感染性ｃＤＮＡクローン間のヌクレオチドの差のリストを、表８に与える。全ての変化は、ゲノムのタンパク質コード領域中にある。７４の変異原性プライマー及び商業的な部位特異的変異誘発キットによる多重逐次反応を使用してｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９感染性クローンに誘導して、本明細書中に記載されるｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬと配列が同一であるプラスミド分子を得ることができる、合計７４のヌクレオチド変化が存在する。実際に、互いに約５０−６０のヌクレオチド内の変異のクラスターは、一つの変異原性プライマーを使用して変化することができるために、７４より少ない変異原性プライマーで同じ結果を得ることができる。例えば、ヌクレオチド７３５、７５０、及び７５６は、ヌクレオチド９６５、９９２、及び１００９ができるように、一つの変異原性プライマーを使用して変化することができる。従って、プライマーの数は、約６０まで減少することができる。
【０１５６】
７４のヌクレオチド変化のうち、大部分（４２）は、同義又は“サイレント”であり、これらが同一アミノ酸をコードすることを意味する。これらのヌクレオチド変化は、インターフェロン誘導又はウイルスの阻害表現型に対するいずれもの測定可能な効果を持たない可能性がある。残りの３２のヌクレオチド変化は、非同義又は“非サイレント”であり、そしてウイルスタンパク質中のアミノ酸変化をもたらす。これらの３２のヌクレオチド変化は、ウイルスのインターフェロン誘導／阻害表現型の直接の原因であることが予測され、そして感染性クローンｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９によってコードされたウイルスを、感染性クローンｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬによってコードされたウイルスによって示されるものと同じインターフェロン表現型に転換するために変化されなければならない。このような変化は、多くとも３２の、関連するヌクレオチドの幾つかのクラスター形成を考慮した場合はより少ない、変異原性プライマーを必要とするものである。
【０１５７】
実施例８
感染性ＣＤＮＡクローンＰＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬの新規な合成
部位特異的変異誘発に対する別の方法として、本発明のＰＲＲＳウイルスゲノムは、適当な５’及び３’アダプター配列により、そしてＰＲＲＳ感染性ｃＤＮＡクローンｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９（寄託番号２０３４８９としてＡＴＣＣから入手可能）のために使用されるプラスミドバックボーン、又は類似のプラスミドバックボーンにクローン化して、新規に化学的に合成することができる。長さ５０ｋｂより大きい遺伝子（ＰＲＲＳＶゲノムは約１５．５ｋｂである）の受託合成は：ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，ＤＮＡ  ２．０、及びＢｉｏ  Ｂａｓｉｃ  Ｉｎｃ．（制約されるものではない）を含む多くの業者から商業サービスとして利用可能である。合成ウイルスゲノムは、感染性クローンｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９中のウイルスゲノムを、ゲノムに隣接する５’ＰａｃＩ及び３’ＳｐｅＩ制限酵素部位を使用して置換することによって、ｐＣＭＶ−Ｓベクター中に方向性クローン化される。合成ゲノムを切断するために、２４のヌクレオチド伸長（５’−ＧＣＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＡＡＴＴＡＡＡＣＣＧＴＣ−ゲノム−３’、これは、下線を引かれたＰａｃＩ部位を含む）が合成ゲノムの５’終端に構築され、そして８３のヌクレオチドの伸長（５’−ゲノム−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＡＴＡＴＴＴＡＡＡＴＣＣＣＡＡＧＣＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＴＴＡＣＴＡＧＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’、これは下線を引かれたＳｐｅＩを含む）が、合成ゲノムの３’終端に構築される。プラスミド並びにＰａｃＩ及びＳｐｅＩを伴う合成ゲノムを切断した後、適当な断片を精製し、ＤＮＡリガーゼを使用して結合し、そしてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに、当業者にとって公知の標準的なクローン化技術を使用して、スクリーニング及び繁殖のために形質転換される。
【０１５８】
生物学的材料の寄託
以下の生物学的材料（米国特許第６，５００，６６２号を参照されたい）を、１９９８年１１月１９日に、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，２０１１０−２２０９，ＵＳＡのアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託し、そして以下の寄託番号が指定された。
【０１５９】
プラスミドｐＴ７Ｐ１２９Ａ、寄託番号２０３４８８
プラスミドｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９、寄託番号２０３４８９。
【０１６０】
次の米国特許の完全な文章及び開示は、完全に明記されているかのように、本明細書中に参考文献として援用される：米国特許第６，５００，６６２号、及び米国特許第７，６１８，７９７号。
【０１６１】
【表１】
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【０１６２】
【表２】
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【０１６３】
【表３】
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【０１６４】
【表４−１】
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【０１６５】
【表４−２】
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【０１６６】
【表５】
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【０１６７】
【表６−１】
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【０１６８】
【表６−２】
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【０１６９】
【表７】
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【０１７０】
【表８−１】
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【０１７１】
【表８−２】
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【０１７２】
【表９】
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【０１７３】
【表１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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