(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾されたヒアルロナンまたはその薬学的に許容される塩を含む化合物であって、前記修飾されたヒアルロナンが少なくとも１個の硫酸基を含み、かつＮ−アセチル−グルコサミン残基の少なくとも１個の第１級Ｃ−６ヒドロキシルプロトンが非置換のアルキル基またはフルオロアルキル基で置換された、化合物。
【請求項２】
前記非置換のアルキル基が、Ｃ１〜Ｃ１０分岐または直鎖アルキル基を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記非置換のアルキル基が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチル、またはヘキシルである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
前記フルオロアルキル基が、少なくとも１個のトリフルオロメチル基または−ＣＨ２（ＣＦ２）ｎＣＦ３（式中、ｎは、０〜１０の整数である）を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記Ｎ−アセチル−グルコサミン残基の前記第１級Ｃ−６ヒドロキシルプロトンの１％〜５０％が、アルキル基またはフルオロアルキル基で置換されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
前記ヒアルロナンの分子量が、アルキル化またはフルオロアルキル化前は１０ｋＤａを超える、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
前記ヒアルロナンの分子量が、アルキル化またはフルオロアルキル化前は４０ｋＤａ〜２０００ｋＤａである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
ヒアルロナンのグルクロン酸環上に存在するＣ−２ヒドロキシルプロトンおよび／またはＣ−３ヒドロキシルプロトンが硫酸基で置換されており、前記化合物の硫酸化度が二糖単位当たり０．５〜３．５であり、かつ前記化合物の分子量が２ｋＤａ〜１０ｋＤａである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
ＮＨ４＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、Ｋ＋、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２、Ｆｅ＋２、Ｆｅ＋３、Ｃｕ＋２、Ａｌ＋３およびＺｎ＋２あるいはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、リジン、アルギニンおよびヒスチジンの第４級塩からなる群から選択される、修飾されたヒアルロナンの薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
薬学的に許容される化合物および請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬組成物であって、静脈内、筋肉内、皮下、関節腔内、点眼、膣内、直腸内、鼻腔内、または局所投与することができる、組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、抗炎症剤、解熱剤、ステロイド性および非ステロイド性抗炎症剤、ホルモン、成長因子、避妊薬、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、鎮痛剤、催眠剤、鎮静剤、精神安定剤、抗痙攣薬、筋弛緩剤、局所麻酔剤、鎮痙薬、抗潰瘍薬、ペプチド性アゴニスト、交感神経作用薬、心血管作動薬、抗腫瘍剤、またはオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
皮膚の表面に適用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物または組成物を含む、皮膚障害の治療または予防用医薬組成物。
【請求項１３】
前記皮膚障害が、酒さ、アトピー性皮膚炎（湿疹）、アレルギー性接触皮膚炎、乾癬、ヘルペス状皮膚炎、ざ瘡、糖尿病性皮膚潰瘍および他の糖尿病性創傷、熱傷、日光皮膚炎、瘢痕予防、光線角化症、虫刺されによる炎症、ツタウルシによるかぶれ、放射線皮膚炎／熱傷、または脂漏性皮膚炎を含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
眼に投与するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物または組成物を含む、眼疾患の治療または予防用医薬組成物。
【請求項１５】
前記眼疾患が、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、眼球乾燥症候群、結膜炎、虹彩炎、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、または角膜炎および瘢痕を含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
眼内投与される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
創傷に接触させるための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物または組成物を含む、創傷治癒の改善用医薬組成物。
【請求項１８】
少なくとも１種の薬学的に許容される化合物の送達を必要とする患者にこのような送達を行うための、前記薬学的に許容される化合物を受容することができる少なくとも１つの組織に接触させる医薬組成物であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物または組成物を含み、前記化合物が、前記薬学的に許容される化合物を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
眼科学的状態、尿生殖器状態、呼吸器状態、心血管状態、胃腸疾患、リウマチおよび免疫疾患、腎疾患、変性関節疾患、歯科もしくは口腔疾患、または神経疾患を治療または予防するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物または組成物を含む医薬組成物。
【請求項２０】
歯科または口腔外科において使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物または組成物を含む医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物または組成物の有効量を含む、炎症を軽減または予防するための医薬組成物であって、前記炎症が、癌、多発性硬化症、変形性関節症、関節リウマチ、アルツハイマーのベータアミロイド、歯周疾患、炎症性腸疾患、喘息、鼻炎、副鼻腔炎、慢性閉塞性肺疾患、急性肺傷害、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、炎症性心血管疾患、炎症性肺疾患、炎症性眼疾患、間質性膀胱炎、炎症性脳疾患、または炎症性腸管疾患により生じる、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年４月４日に出願された米国特許仮出願第６１／０４２，３１０号に基づく優先権を主張するものである。この出願の教示全体が本明細書に参考として組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
乾癬、皮膚炎、ざ瘡、酒さ、皮膚の光老化等の炎症性疾患およびＲＡＧＥが媒介するシグナル伝達が関与する数々の疾患によって世界中の人々が苦しめられている。これらの疾患を大局的に見ると、乾癬に悩んでいる人だけでも世界人口の２〜３％すなわち約１億２５００万人に上ることがNational Psoriasis Foundationによって報告されている。これらの炎症状態は見た目が悪くなる場合もあるし、治療せずに放置すると深刻な健康上の問題が生じる可能性もある。
【０００３】
従来から承認されているこれらの状態の治療は、ＵＶ光線療法、コルチコステロイドおよびグルココルチコイド、アシトレチン、シクロスポリン、ならびにメトトレキサートが関与するものであろう。しかしながら、これらの治療はそれぞれ、免疫抑制や肝疾患から、皮膚の菲薄化や先天性欠損症の誘発に至るまで、深刻な副作用を引き起こす可能性がある。これらの治療はある程度または全く無効であるため、その結果に関し患者に不満が残ることが多い。
【０００４】
上述した治療に加えてヘパリン治療も試験的に検討されている。ヘパリンすなわち硫酸化された多糖類の用途は、従来、抗凝血剤にほぼ限られていたが、その抗炎症性についてはよく知られている。ヘパリンおよびその誘導体はこれらの炎症性疾患の治療にある程度の可能性を示している。特にヘパリンおよびその誘導体は、炎症カスケードにおける少なくとも３つの重要な現象を阻害する。まず第１に、ヘパリンは、白血球インテグリン、Ｐ−およびＬ−セレクチンに結合してこれらを阻害する。第２に、ヘパリンおよびその誘導体は、陽性荷電ＰＭＮプロテアーゼ、ヒト白血球エラスターゼ、およびカテプシンＧに結合してこれらを阻害することで炎症カスケードを抑制するため、セレクチンを阻害する最初のヘパリン障壁から逃れたＰＭＮがタンパク質を分解することによる組織損傷が低減される。第３に、ヘパリンおよびその誘導体は、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）とそのリガンドとの相互作用を強力に阻害する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ヘパリンおよびその誘導体がこれらの炎症性疾患を治療する可能性が示されているものの、ヘパリンおよびその誘導体を用いた治療には幾つかの主要な欠点がある。まず第１に、ヘパリンおよびその誘導体は豚から取り出したものであり、したがって、ウイルスの異種間移動の問題が起こる。第２に、ヘパリンの抗凝固性により、この化合物で治療された糖尿病患者が出血過多になる危険性がある。第３に、ヘパリンは、ヘパリンと陽性荷電タンパク質である血小板第４因子（ＰＦ−４）との複合体に対する抗体を産生する特定の個体に血小板減少症を誘発する可能性があり、その結果として、破局的な血小板凝集および全身性の逆説的な動静脈塞栓が起こる。したがって、炎症性疾患の治療に用いることが可能であると同時に、他の治療に見られる数々の副作用が回避される化合物を開発するという重要な要求が満たされていない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
本明細書においては、アルキル化およびフルオロアルキル化された半合成グリコサミノグリカンエーテル（本明細書においては「ＳＡＧＥ」と称する）の合成について記載する。硫酸化されたアルキル化およびフルオロアルキル化ＳＡＧＥの合成についても記載する。本明細書に記載する化合物は、多くの治療および化粧用途ならびに多くの炎症性疾患および皮膚障害の治療に有用である。本発明の利点については、以下の記載においてある程度説明するので、その記載からある程度明らかになるか、または以下に記載する態様を実施することによって理解されるであろう。以下に記載する利点は、添付の特許請求の範囲に具体的に指摘する構成要素および組合せによって実現および達成されるであろう。前述した一般的な説明および以下の詳細な説明はいずれも例示および説明のみを目的とするものであって限定を意図するものではないことを理解されたい。
【０００７】
添付の図面は以下に説明する幾つかの態様を例示するものであり、これらは本明細書に組み込まれ、その一部を構成するものとする。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】アルキル化およびフルオロアルキル化ヒアルロナンならびにその硫酸化誘導体を製造するための合成スキームを示すものである。
【図２】幾つかの例示的なＳＡＧＥの構造を示すものである。
【図３】部分Ｏ−置換およびメチル化されたＨＡ（Ｐ−ＯＳＭＥＨＡまたはＧＭ−１３１２０１）によるＰ−セレクチンの阻害を示すものである。
【図４】アルキル化およびフルオロアルキル化ヒアルロナン（硫酸化もされている）を含む硫酸化ヒアルロナン誘導体によるヒト白血球エラスターゼの阻害を示すものである。
【図５】ハイモビリティー・グループ・ボックス・プロテイン−１（ＨＭＧＢ−１）としても周知のアンホテリンと固定化ＲＡＧＥとの結合に対するＰ−ＯＳＭＥＨＡによる阻害を示すものである。
【図６】Ｓ１００ｂカルグラニュリンと固定化ＲＡＧＥとの結合に対するＰ−ＯＳＭＥＨＡ（ＧＭ−１３１２０１）による阻害を示すものである。
【図７】カルボキシメチルリジン−ＢＳＡ（ＣＭＬ−ＢＳＡ）と固定化ＲＡＧＥとの結合に対するＰ−ＯＳＭＥＨＡ（ＧＭ−１３１２０１）による阻害を示すものである。
【図８】高分子量ヒアルロナン誘導体（硫酸化もされているアルキル化およびフルオロアルキル化ヒアルロナンを含む）のケラチン生成細胞増殖に対する阻害を示すものである。
【図９】低分子量ヒアルロナン誘導体（硫酸化もされているアルキル化およびフルオロアルキル化ヒアルロナンを含む）のケラチン生成細胞増殖に対する阻害を示すものである。
【図１０】ＳＡＧＥ（ＧＭ−１１１１０１）をＬＬ−３７と同時に注射した酒さモデルを示すものである。（ａ）ＬＬ−３７を注射した皮膚部位ならびに（ｂ）ＬＬ−３７およびＳＡＧＥを同時に注射したモデルの肉眼解剖写真である。（ｃ）ＬＬ−３７を注射した皮膚試料をＨ＆Ｅ染色した断面図である。（ｄ）ＳＡＧＥと混合したＬＬ−３７を注射した皮膚部位をＨ＆Ｅ染色した断面図である。（ｅ）ＬＬ−３７のみ、ＳＡＧＥを加えたＬＬ−３７、またはＳＡＧＥのみを注射した群のマウスの皮膚生検により、多形核白血球（ＰＭＮ）の皮膚浸潤を、ＰＭＮ酵素であるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の活性によって測定したものである。ＬＬ−３７のみまたはＳＡＧＥを加えたＬＬ−３７を注射したマウスの（ｆ）紅斑面積および（ｇ）紅斑評点である。
【図１１】ＬＬ−３７酒さモデルのＳＡＧＥ（ＧＭ−１１１１０１）局所治療を示すものである。（ａ）ＬＬ−３７を注射、（ｂ）ＬＬ−３７注射直後にＳＡＧＥ治療、および（ｃ）ＬＬ−３７注射から１２時間後にＳＡＧＥ治療した皮膚部位の肉眼解剖写真を示すものである。（ｄ）ＬＬ−３７を注射した皮膚試料をＨ＆Ｅ染色した断面図である。（ｅ）ＬＬ−３７を注射した直後にＳＡＧＥ治療した皮膚部位をＨ＆Ｅ染色した断面図である。（ｆ）ＬＬ−３７を注射した１２時間後にＳＡＧＥ治療した皮膚部位をＨ＆Ｅ染色した断面図である。（ｇ）ＳＡＧＥ治療計画の異なるＬＬ−３７注射モデルのＭＰＯ活性測定である。ＳＡＧＥの局所塗布によって治療したＬＬ−３７酒さモデルの（ｈ）紅斑面積および（ｇ）紅斑評点を示すものである。
【図１２】自然光下の外皮（ＳＡＧＥ１ｍｇ／ｍＬで治療）（パネルａ）および外皮の蛍光画像（パネルｂ）；自然光下の内皮（パネルｃ）および蛍光条件下の内皮（パネルｄ）を示すものである。
【図１３】ＨＡ誘導体のｎＨＤＦ細胞増殖に与える影響（ａ）およびｎＨＥＫに与える影響（ｂ）を示すものである。異なる濃度のＧＭ−１１１１０１およびＧＭ−２１２１０１で治療したマウスの肉眼解剖写真である。ＧＭ−１１１１０１を０．１ｍｇ／ｍＬ（ｅ）、ＧＭ−１１１１０１を１ｍｇ／ｍＬ（ｆ）、ＧＭ−１１１１０１を１０ｍｇ／ｍＬ（ｇ）、ＧＭ−２１２１０１を０．１ｍｇ／ｍＬ（ｈ）、ＧＭ−２１２１０１を１ｍｇ／ｍＬ（ｉ）、およびＧＭ−２１２１０１を１０ｍｇ／ｍＬ（ｊ）を、無傷の範囲（ｃ）およびギ酸で刺激した範囲（ｄ）で比較した。
【図１４】（ａ）傷を付けた範囲のＳＡＧＥの紅斑評点、（ｂ）傷を付けた範囲のＳＡＧＥの浮腫評点、（ｃ）無傷の範囲のＳＡＧＥの紅斑評点、（ｄ）無傷の範囲のＳＡＧＥの浮腫評点を示すものである。
【図１５】クロトン油炎症モデルを用いたＳＡＧＥ治療を示すものである。クロトン油処理から４時間後の対照（ＣＴＬ）群であり、ＣＴＬ群の同じマウスの右（未処理）（パネルａ）および左（クロトン油塗布）（パネルｂ）耳介を比較したものである。ＰＢＳを塗布した陰性対照（パネルｃ）、クロトン油の陽性対照（パネルｄ）、およびクロトン油の後にＳＡＧＥ治療を行ったもの（パネルｅ）についてＨ＆Ｅ染色を行ったものである。クロトン油陽性対照群の白血球浸潤および浮腫を確認した。ミエロペルオキシダーゼ（Myeloperoxidase）活性（パネルｆ）は、多形核白血球活性化の指標であり、ＳＡＧＥ治療後の耳介パンチについて測定したものである。パネルｇおよびパネルｈは、ＳＡＧＥ治療後の耳介の厚み（浮腫による）および耳介の発赤（炎症による）の変化である（ｐ＜０．０５）。
【図１６】（ａ）ＬＬ−３７を注射した皮膚試料をＨ＆Ｅ染色した断面図、（ｂ）ＨＡで治療したＬＬ−３７注射皮膚部位をＨ＆Ｅ染色した断面図、（ｆ）ＳＡＧＥ（ＧＭ−１１１１０１）で治療したＬＬ−３７注射皮膚部位をＨ＆Ｅ染色した断面図、（ｇ）ＨＡおよびＳＡＧＥで治療したＬＬ−３７注射モデルのＭＰＯ活性測定、（ｈ）紅斑面積の例、ならびに（ｇ）ＨＡおよびＳＡＧＥ治療したＬＬ−３７酒さモデルの紅斑評点を示すものである。
【図１７】ＡＲＰＥ−１９細胞内におけるＡＧＥに誘発されるＲＡＧＥ発現が、ＡＧＥ産物であるカルボキシメチルリジン−ウシ血清アルブミン（ＣＭＬ−ＢＳＡ）上で増殖させることによって増大し、修飾ヘパリンによって阻害されることを示すものである。
【図１８】対照（ａ）と比較すると、ＡＧＥ産物であるＣＭＬ−ＢＳＡがＡＲＰＥ−１９細胞内の細胞死を誘導し（ｂ）、これがＯＤＳＨによって阻害され（ｃ）、ＳＡＧＥ処理によってほぼ解消される（ｄ）ことがわかる。
【図１９】ヒト治療用抗凝固血漿ヘパリン濃度に近い濃度である０．４μｇ／ｍＬにおいても、第ＸＩＩ因子を活性化するヘパリンとは異なり、ＬＭＷ  ＳＡＧＥが第ＸＩＩ因子を活性化しないことを示している。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
詳細な説明
本化合物、組成物、および／または方法を開示および説明する前に、以下に説明する態様は、特定の化合物、合成方法、または使用そのものに限定されるものではなく、変形ももちろん可能であることを理解されたい。本明細書において用いられる専門用語も同様に、特定の態様を説明することのみを目的とするものであって、限定を意図するものではないことを理解されたい。
【００１０】
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲において言及される多くの用語は以下の意味を有するものと定義する。
【００１１】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる単数形「１つの(a)」、「１つの(an)」、および「その(the)」には、文脈上、そうでないことが明確に指示されていない限り、複数の指示対象も包含されることに留意しなければならない。したがって、例えば、「製剤用担体（a pharmaceutical carrier）」に言及した場合は、この種の担体の２種以上の混合物等も包含される。
【００１２】
「任意的な（optional）」または「場合により（optionally）」は、それに続いて記載される事象または状況が起こっても起こらなくてもよいことと、その記載には、当該事象または状況が起こる具体例も起こらない具体例も包含されることとを意味する。例えば、「場合により置換された低級アルキル」という語句は、この低級アルキル基が置換されていてもされていなくてもよいことと、この記載には非置換の低級アルキルおよび置換された低級アルキルの両方が包含されることとを意味している。
【００１３】
本明細書および末尾の特許請求の範囲において、組成物または物品の特定の構成要素または成分の重量部に言及する場合は、重量部で表される当該組成物または物品中の当該構成要素または成分と他の任意の構成要素または成分との重量関係を表している。したがって、成分Ｘを２重量部および成分Ｙを５重量部含有する化合物中に、ＸおよびＹは２：５の重量比で存在し、当該化合物中に含有されるさらなる成分とは無関係にこのような比で存在する。
【００１４】
成分の重量パーセントは、そうでないことが明確に述べられていない限り、当該成分が含まれる配合物または組成物の総重量を基準とする。
【００１５】
本明細書および末尾の特許請求の範囲において用いられる、化学種の残基（residue）とは、当該化学種から特定の反応スキームもしくはそれに続く配合により生成するかまたは化学的に生成する部分を指し、当該部分が実際にその化学種から得られたかどうかは関係ない。例えば、少なくとも１個の−ＯＨ基を含むヒアルロナンは式Ｙ−ＯＨで表すことができ、式中、Ｙは、当該ヒアルロナン分子の残り（すなわち残基）である。
【００１６】
本明細書において用いられる「治療する（treat）」という用語は、既往症の症状を維持または軽減することとして定義される。本明細書において用いられる「予防（prevent）」という用語は、疾患または機能障害の１種またはそれ以上の症状が発生する可能性をなくすかまたは低下させることとして定義される。本明細書において用いられる「阻害（inhibit）」という用語は、本明細書に記載される化合物が、当該化合物の非存在下における活性と比較した場合に、同活性を完全に消失させるかまたは同活性を低下させる能力である。
【００１７】
本明細書においては、アルキル化およびフルオロアルキル化されたヒアルロナンまたはその誘導体について記載する。一態様においては、ヒアルロナンのＮ−アセチル−グルコサミン残基の少なくとも１個の第１級Ｃ−６ヒドロキシルプロトンがアルキル基で置換されている。本明細書において用いられる「アルキル基」という用語は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシル等の、１〜２４個の炭素原子を有する分岐または非分岐の飽和炭化水素基である。一態様においては、アルキル基は、Ｃ１〜Ｃ１０分岐または直鎖アルキル基である。さらなる態様においては、アルキル基はメチルである。アルキル基は、置換されていても非置換であってもよい。アルキル基が置換されている場合、アルキル基上に存在する１個またはそれ以上の水素原子が、これらに限定されるわけではないが、アルキニル、アルケニル、アリール、ハライド、ニトロ、アミノ、エステル、ケトン、アルデヒド、ヒドロキシ、カルボン酸、アラルキル、またはアルコキシ等の１個またはそれ以上の基で置き換えられていてもよい。
【００１８】
他の態様においては、ヒアルロナンのＮ−アセチル−グルコサミン残基の少なくとも１個の第１級Ｃ−６ヒドロキシルプロトンがフルオロアルキル基で置換されている。本明細書において用いられる「フルオロアルキル基」という用語は、１〜２４個の炭素原子を有する分岐または非分岐の飽和炭化水素基であって、少なくとも１個の水素原子がフッ素で置換されているものである。特定の態様においては、フルオロアルキル基は、少なくとも１個のトリフルオロメチル基を含む。他の態様においては、フルオロアルキル基は、式−ＣＨ２（ＣＦ２）ｎＣＦ３（式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の整数である）を有する。一態様においては、フルオロアルキル基は、−ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ３または−ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３である。
【００１９】
本明細書においては、ＳＡＧＥをアルキル化またはフルオロアルキル化する方法について記載する。一態様においては、ＳＡＧＥは、（ａ）ヒアルロナンまたはその誘導体を、Ｎ−アセチル−グルコサミン残基の少なくとも１個の第１級Ｃ−６ヒドロキシルプロトンを脱プロトン化するのに十分な量の塩基と反応させ、そして（ｂ）脱プロトン化されたヒアルロナンまたはその誘導体を、少なくとも１個の脱プロトン化された第１級Ｃ−６ヒドロキシル基をアルキル化またはフルオロアルキル化するのに十分な時間および濃度でアルキル化剤またはフルオロアルキル化剤と反応させることによって製造される。塩基性条件下ではグリコシド結合も開裂し、修飾過程においてより低分子量のヒアルロナン誘導体が生成する可能性もあることが当業者に理解されるであろう。この塩基性条件下では、酸が脱プロトン化されてカルボキシレートになることおよび第２級ヒドロキシル基が脱プロトン化されることと、これらの求核性部分は、それぞれ、平衡状態における相対的な存在量および陰イオン種の求核性に応じてその後に続くアルキル化に関与する場合があることも理解されるであろう。例えば、２−Ｏおよび／または３−Ｏヒドロキシルプロトンは、脱プロトン化およびアルキル化またはフルオロアルキル化され得る。その例を図１に示す。ここでＲは、水素、アルキル基、またはアルキル基であってもよい。
【００２０】
ヒアルロナン出発物質は、遊離酸またはその塩として存在してもよい。本明細書においては、ヒアルロナン出発物質の誘導体も使用してもよい。誘導体としては、アルキル化またはフルオロアルキル化ステップの前にヒアルロナンに任意の修飾を施したものが含まれる。本明細書においては、幅広い分子量のヒアルロナンを使用してもよい。一態様においては、アルキル化またはフルオロアルキル化前のヒアルロナンの分子量は１０ｋＤａを超える。他の態様においては、アルキル化またはフルオロアルキル化前のヒアルロナンの分子量は、２５ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、２５ｋＤａ〜５００ｋＤａ、２５ｋＤａ〜２５０ｋＤａ、または２５ｋＤａ〜１００ｋＤａである。特定の態様においては、ヒアルロナン出発物質またはその誘導体は、動物起源に由来するものではない。これらの態様においては、ヒアルロナンは、細菌等の他の起源に由来するものであってもよい。例えば、組換えバシラス・サブティリス（B.subtilis）発現システムを用いてヒアルロナン出発物質を産生してもよい。
【００２１】
まず最初にヒアルロナン出発物質またはその誘導体を、Ｎ−アセチル−グルコサミン残基の少なくとも１個の第１級Ｃ−６ヒドロキシルプロトンを脱プロトン化するのに十分な量の塩基と反応させる。選択される塩基は変化してもよい。例えば、本明細書においては、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物を使用してもよい。塩基の濃度または量は、所望のアルキル化またはフルオロアルキル化度に応じて変化させてもよい。一態様においては、塩基の量は、ヒアルロナン出発物質またはその誘導体のＮ−アセチル−グルコサミン残基の第１級Ｃ−６ヒドロキシルプロトンの少なくとも０．００１％を脱プロトン化するのに十分なものである。他の態様においては、塩基の量は、ヒアルロナン出発物質またはその誘導体のＮ−アセチル−グルコサミン残基の第１級Ｃ−６ヒドロキシルプロトンの０．００１％〜５０％、１％〜５０％、５％〜４５％、５％〜４０％、５％〜３０％、５％〜２０％、１０％〜５０％、２０％〜５０％、または３０％〜５０％を脱プロトン化するのに十分なものである。溶液の塩基性が高くなるほど、鎖開裂反応が起こりやすくなるとともに、達成することができるアルキル化／フルオロアルキル化度が高くなることが理解される。例えば、ヒアルロナンには他のヒドロキシル基が存在する（例えば、２−ＯＨおよび／または３−ＯＨをアルキル化またはフルオロアルキル化される可能性もある）。一態様においては、ヒアルロナン上に存在するすべてのヒドロキシル基をアルキル化またはフルオロアルキル化してもよい。他の態様においては、ヒアルロナン上に存在するヒドロキシルプロトンの０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、またはその任意の範囲を脱プロトン化し、続いてアルキル化またはフルオロアルキル化してもよい。
【００２２】
ヒアルロナン出発物質またはその誘導体を塩基で処理した後、脱プロトン化されたヒアルロナンをアルキル化剤またはフルオロアルキル化剤と反応させることによってＳＡＧＥが生成する。アルキル化剤の例としては、これらに限定されるものではないが、ハロゲン化アルキルが挙げられる。臭化およびヨウ化アルキルが特に有用である。同様に、フルオロアルキル化剤としては、ハロゲン化フルオロアルキルを挙げることができる。本明細書においては、有機合成に慣用されているアルキル化剤およびフルオロアルキル化剤を使用してもよい。
【００２３】
アルキル化およびフルオロアルキル化ＳＡＧＥを作製するための例示的な合成手順を図１に示す。図１を参照すると、ヒアルロナン（ＨＡ）が塩基（例えば、ＮａＯＨ）およびアルキル化剤（例えば、ＣＨ３Ｉ）で処理され、ヒアルロナンのＮ−アセチル−グルコサミン残基の第１級Ｃ−６ヒドロキシルプロトンがメチル化され、メチル化ヒアルロナン（ＭＨＡ）が生成する。図１に、フルオロアルキル化剤（例えば、ＣＦ３（ＣＦ２）ｎＣＨ２Ｂｒ）を用いたフルオロアルキル化ヒアルロナン（ＦＨＡ）を作製するための例示的な合成手順も示す。
【００２４】
特定の態様においては、上述したアルキル化またはフルオロアルキル化ＳＡＧＥを硫酸化することが望ましい。一態様においては、アルキル化またはフルオロアルキル化ＳＡＧＥは、アルキル化またはフルオロアルキル化ＳＡＧＥを硫酸化剤と反応させることによって硫酸化生成物を生成させることにより硫酸化される。硫酸化度は、部分硫酸化から完全硫酸化まで変化してもよい。一般に、アルキル化またはフルオロアルキル化ヒアルロナンまたはその誘導体上に存在する遊離ヒドロキシル基を硫酸化してもよい。一態様においては、少なくとも１個のＣ−２ヒドロキシルプロトンおよび／またはＣ−３ヒドロキシルプロトンが硫酸基で置換される。他の態様においては、硫酸化度は、アルキル化またはフルオロアルキル化ＳＡＧＥの二糖単位当たり０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、またはその任意の範囲である。一態様においては、アルキル化またはフルオロアルキル化ＳＡＧＥを、１種またはそれ以上のヒドロキシルプロトンを脱プロトン化するために塩基で処理した後に、硫酸化剤を添加してもよい。硫酸化剤は、ヒドロキシル基または脱プロトン化されたヒドロキシル基と反応させることにより硫酸基を生成する任意の化合物である。ＳＡＧＥの分子量は、反応条件に応じて変化してもよい。一態様においては、ＳＡＧＥの分子量は、２ｋＤａ〜５００ｋＤａ、２ｋＤａ〜２５０ｋＤａ、２ｋＤａ〜１００ｋＤａ、２ｋＤａ〜５０ｋＤａ、２ｋＤａ〜２５ｋＤａ、または２ｋＤａ〜１０ｋＤａである。図１に、硫酸化されたアルキル化またはフルオロアルキル化ＳＡＧＥ（それぞれＳＭＨＡおよびＳＦＨＡ）の例示的な合成を示す。
【００２５】
図２に、幾つかの例示的なＳＡＧＥの構造を示す。各ＳＡＧＥは、コードＧＭ−ＸＹＳＴＺＺで識別される：
Ｘは、アルキル基の種類であり（１＝メチル、２＝ペンタフルオロプロピル、３＝ヘプタフルオロブチル、４＝ベンジルグリシジルエーテル）、
Ｙは、ＨＡのサイズであり（１＝低、２＝中、３＝高）、
Ｓは、硫酸化度であり（１＝部分、２＝完全）、
Ｔは、アルキル化度であり（１＝低、２＝高）、
ＺＺ＝ロット番号の連番０１または０２であり（０２は０１のバッチと同様に製造され、性状も同じである）。
【００２６】
表１に、上で定義したコード体系による数種のＳＡＧＥの一覧を示す。
【００２７】
【表１】
0005758797.tif 000002
【００２８】
一態様においては、ＳＡＧＥのアルキル基はメチルであり、ヒアルロナンの少なくとも１個のＣ−２ヒドロキシルプロトンおよび／またはＣ−３ヒドロキシルプロトンが硫酸基で置換されている。他の態様においては、ＳＡＧＥのアルキル基はメチルであり、ヒアルロナンの少なくとも１個のＣ−２ヒドロキシルプロトンおよび／またはＣ−３ヒドロキシルプロトンが硫酸基で置換されており、この化合物をアルキル化した後の分子量は２ｋＤａ〜２００ｋＤａである。この種の化合物の例が、図２に示すＧＭ−１１１１０１である。
【００２９】
本明細書に記載されたアルキル化およびフルオロアルキル化ＳＡＧＥはいずれもその薬学的に許容される塩またはエステルであってもよい。薬学的に許容される塩は、遊離酸を適量の薬学的に許容される塩基で処理することによって調製される。代表的な薬学的に許容される塩基は、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化第１鉄、水酸化亜鉛、水酸化銅、水酸化アルミニウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、リジン、アルギニン、ヒスチジン等である。一態様においては、反応は、水を単独または水と混合可能な不活性有機溶媒との混合物中において約０℃〜約１００℃の温度（室温等）で実施される。構造式Ｉの化合物対使用される塩基のモル比は、任意の特定の塩に所望される比が得られるように選択される。例えば、遊離酸出発物質のアンモニウム塩を調製する場合は、出発物質を約１当量の薬学的に許容される塩基で処理することによって中性塩を得てもよい。
【００３０】
エステル誘導体は、典型的には、以下の実施例に例示するように、化合物の酸形態の前駆体として調製され、したがって、プロドラッグとすることができる。一般に、これらの誘導体は、メチルやエチル等の低級アルキルエステルとなるであろう。アミド誘導体−（ＣＯ）ＮＨ２、−（ＣＯ）ＮＨＲ、および−（ＣＯ）ＮＲ２（式中、Ｒは、上に定義したアルキル基である）は、カルボン酸含有化合物をアンモニアまたは置換アミンと反応させることによって調製してもよい。エステルはまた、脂肪酸エステルであってもよい。例えば、パルミチン酸エステルが調製されており、エステラーゼで活性化されるプロドラッグとして代替的に使用してもよい。
【００３１】
本明細書において記載されるＳＡＧＥを、生物システムまたは実体が許容できる任意の賦形剤と配合することによって医薬組成物を製造してもよい。このような賦形剤の例としては、これらに限定されるものではないが、水、ヒアルロン酸水溶液、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース液、ハンクス液、および他の生理学的バランスのとれた塩の水溶液が挙げられる。不揮発性油、植物油（オリーブ油、ゴマ油等）、トリグリセリド、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射可能な有機エステル（オレイン酸エチル等）等の非水性ビヒクルも使用してもよい。他の有用な配合物としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストラン等の粘度を高める薬剤を含む懸濁液が挙げられる。賦形剤はまた、等張性および化学的安定性を高めることができる物質等の添加剤も少量含んでいてもよい。緩衝剤の例としては、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液、およびトリス緩衝液が挙げられ、一方、防腐剤の例としては、チメロゾール、クレゾール、ホルマリン、およびベンジルアルコールが挙げられる。特定の態様においては、投与形態に応じてｐＨを変更してもよい。例えば、組成物のｐＨは約５〜約６であり、これは局所使用に好適である。さらに、医薬組成物は、本明細書に記載した化合物に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、防腐剤、界面活性剤等を含んでいてもよい。
【００３２】
医薬組成物はまた、本明細書に記載した化合物と組み合わせて使用される１種またはそれ以上の有効成分も含んでいてもよい。結果として得られる医薬組成物は、薬物および他の生物活性薬剤を、適用部位に接しているかまたは離れている組織に持続的かつ連続的に送達する系を提供してもよい。生物活性薬剤は、それが適用される生体系に局所または全身的な生物学的、生理学的、または治療効果を与えることができるものである。例えば、この薬剤は、数ある機能の中でも特に、感染または炎症の抑制および／または予防、細胞増殖および組織再生の亢進、腫瘍増殖の抑制、鎮痛剤としての作用、抗細胞接着の促進、歯槽骨および歯の喪失の低減、軟骨および体重を支える関節の変性の阻止、ならびに骨成長の促進作用を有するものであってもよい。さらに、本明細書に記載した化合物はいずれも薬学的に許容される化合物の２種以上の組合せを含んでいてもよい。この種の化合物の例としては、これらに限定されるものではないが、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤等が挙げられる。これらの組成物を薬剤送達素子（drug delivery device）として使用するための方法を以下に詳述する。
【００３３】
この医薬組成物は、当該技術分野において周知の技法を用いて調製してもよい。一態様においては、この組成物は、本明細書に記載したＳＡＧＥを薬学的に許容される化合物および／または担体と混和（admixing）させることによって調製される。「混和」という用語は、化学反応または物理的相互作用が起きないように２種類の成分を一緒に混合する（mix）こととして定義される。「混和」という用語には、当該化合物と薬学的に許容される化合物とを化学反応または物理的相互作用させることも含まれる。反応性を有する治療用薬物、例えば、求核性基を有するものに当該化合物を共有結合させてもよい。第２に、架橋した多糖中に、薬理活性を有する薬剤を非共有結合的に捕捉してもよい。第３に、静電または疎水性相互作用を用いて、本明細書中に記載した化合物内における薬学的に許容される化合物の維持を促進してもよい。
【００３４】
特定の事例におけるＳＡＧＥの実際の好ましい量は、利用される特定の化合物、配合される具体的な組成、適用方式、ならびに具体的な位置および治療対象に応じて異なることになることが理解されるであろう。所与の宿主の投与量は、従来の検討を行い、例えば、適切な従来の薬理学的試験手順を用いて、例えば、対象化合物と周知の薬剤との活性の差を通例的に比較することによって決定してもよい。医師および製剤技術者（formulator）、医薬化合物の用量を決定する当業者であれば、推奨基準(Physicians Desk Reference,Barnhart Publishing(1999)に従い問題なく用量を決定するであろう。
【００３５】
本明細書に記載する医薬組成物は、局所または全身療法のどちらが所望されるのか、および治療部位に応じて多くの方法で投与することができる。投与は、局所的に（点眼、膣内、直腸内、鼻腔内、経口、または皮膚に直接等）行ってもよい。局所投与製剤としては、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴下剤、坐剤、噴霧剤、液剤、および散剤を挙げることができる。従来の医薬担体、水性、粉末、または油性基剤、増粘剤等が必要であるかまたは望ましい場合もある。投与はまた、エアゾールまたは乾燥微粉末を肺に直接吸入することによって行ってもよい。投与は、炎症または変性した関節の隙間に直接注射することによって行ってもよい。
【００３６】
投与用製剤としては、無菌の水性または非水性の液剤、懸濁剤、および乳剤が挙げられる。非水担体の例としては、水、アルコール性／水性の溶液、乳濁液、または懸濁液（生理食塩水および緩衝化した媒質を含む）が挙げられる。開示した組成物および方法を副次的に使用する際に非経口投与用ビヒクルが必要な場合は、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖液、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または不揮発性油が挙げられる。開示した組成物および方法を副次的に使用する際に静脈投与用ビヒクルが必要な場合は、液体および栄養補給剤、電解質補給液（リンゲルブドウ糖液をベースとするものなど）等が挙げられる。防腐剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス等も存在してもよい。
【００３７】
投薬は、治療すべき状態の重症度および応答性に依存するが、通常は、１日１回またはそれ以上となり、当業者が送達を中止すべきであると判断するまで、数日間から数ヶ月間治療過程を継続することとなる。当業者であれば、最適な用量、投薬方法、および反復速度を容易に決定することができる。
【００３８】
本明細書に記載されるＳＡＧＥおよび医薬組成物は、薬物送達、小分子送達、創傷治癒、炎症性皮膚障害の治療、炎症性歯科疾患（inflammatory dental disorder）の治療、炎症性呼吸器疾患の治療、炎症性眼疾患の治療、熱傷治癒、および組織再生／工学に関連する様々な用途に使用してもよい。一態様においては、本明細書に記載するＳＡＧＥおよび組成物は、創傷治癒の改善を必要とする対象者に対しこのような改善を可能にする。本明細書に記載するＳＡＧＥおよび医薬組成物は生体適合性を有する材料から構成されているので、精製することなく任意の生体系の内部または表面に直接配置してもよい。ＳＡＧＥを配置してもよい部位の例として、これらに限定されるものではないが、筋肉や脂肪等の軟組織；骨や軟骨等の硬組織；組織再生部位；歯周ポケット等の隙間；外科的切開またはそれ以外で形成されたポケットまたは空洞；口腔、膣腔、直腸、鼻腔、関節の隙間、眼の盲嚢等の本来の腔所；腹腔およびその中に収容されている臓器；ならびに内部または表面に化合物を配置してもよい他の部位（切り傷、掻き傷、熱傷部位等の皮膚表面の損傷を含む）が挙げられる。組織は、外傷または変性状態によって損傷する可能性があり、その替わりに、本明細書に記載したＳＡＧＥおよび組成物を、組織の外傷を防ぐために未損傷の組織に適用できることが見込まれている。ＳＡＧＥは生分解性であってもよく、天然の酵素が除々に分解するように作用するであろう。ＳＡＧＥの成分は、ＳＡＧＥの成分が分解されて、生体系、例えば、細胞や組織等に吸収されることになるという意味で「生分解性」であってもよい。さらに、ＳＡＧＥ、特に、再水和していないものを生体系に適用して、対象部位から体液を吸収してもよい。
【００３９】
創傷治癒の場合は、本明細書に記載したＳＡＧＥを注射により投与してもよい。ＳＡＧＥがハイドロゲル薄膜の形態にある場合、多くの臨床使用には注射用ハイドロゲルが好ましく、その理由は主として３つある。まず第１に、注射用ハイドロゲルは、外傷部位において所望される任意の形状に成形することができるであろう。それは、初期のハイドロゲルはゾルまたは成形可能なパテとすることが可能であり、この系を複雑な形状で配置した後に架橋させることによって所望の寸法に適合させることができるためである。第２に、ハイドロゲルは、ゲル形成中に組織に接着することになり、結果として得られる表面の微小な凹凸によって生じる機械的な絡み合いによって組織−ハイドロゲル界面が強化されることになる。第３に、その場で架橋可能なハイドロゲルの導入が、針を用いるかまたは腹腔鏡法によって達成することができ、それによって、手術手技における侵襲が最小限になるであろう。
【００４０】
乾癬、ざ瘡、アトピー性皮膚炎、酒さ、またはＵＶ光に影響される光老化等の炎症性皮膚障害の場合、対象とする状態を予防または治療するために、ＳＡＧＥをエモリエント剤の一部として局所適用してもよい。喘息、慢性閉塞性肺疾患、急性肺傷害、嚢胞性線維症等の呼吸器障害の場合は、気道被覆液に適合する水溶性等張性ビヒクル中にＳＡＧＥを溶解し、吸入用エアゾールとして肺または鼻腔に送達させてもよい。別法として、ＳＡＧＥを微粉末に配合し、乾燥散剤として肺吸入してもよい。眼疾患の場合は、水性ビヒクルにＳＡＧＥを入れて点眼薬として局所適用するかまたは針によるかもしくは薬剤定速送達素子を植え込むかのいずれかによって眼に直接注入してもよい。歯周疾患等の歯科疾患の場合は、ＳＡＧＥを洗口液の成分として添加するかまたは歯肉溝に直接適用するためのクリーム剤もしくは歯肉パック材に配合してもよい。
【００４１】
ＳＡＧＥはまた、糖尿病性血管もしくは腎臓障害または炎症性胃腸疾患等の全身性炎症性疾患を治療または予防するために、非経口的に静脈、筋肉、または皮下のいずれかに注射してもよい。同様に、炎症性および変形性関節症を治療するために関節内にＳＡＧＥを注射してもよい。ＳＡＧＥはまた、炎症性腸疾患を治療するためにカプセル剤で経口投与するかまたは浣腸剤に配合して直腸内投与することにより送達してもよい。
【００４２】
本明細書に記載したＳＡＧＥおよび組成物は、少なくとも１種の薬学的に許容される化合物の送達を必要とする患者に送達させてもよく、この送達には、この薬学的に許容される化合物を受容することができる少なくとも１つの組織に、本明細書に記載した１種またはそれ以上の組成物を用いて接触させることが含まれる。ＳＡＧＥを、ヒトまたは非ヒト動物に対する治癒または治療的価値を有する多種多様な放出可能な生物活性物質の担体として使用してもよい。ＳＡＧＥが担持することができるこのような物質の多くは上述したものである。本発明のゲルに混入させるのに好適な生物活性材料の中には、治療薬、例えば、抗炎症剤、解熱剤、ステロイド性および非ステロイド性抗炎症剤、ホルモン、成長因子、避妊薬、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、鎮痛剤、催眠剤、鎮静剤、精神安定剤、抗痙攣薬、筋弛緩剤、局所麻酔剤、鎮痙薬、抗潰瘍薬、ペプチド性アゴニスト、交感神経作用薬、心血管作動薬、抗腫瘍剤、オリゴヌクレオチドおよびその類縁体等が含まれる。生物活性物質は、医薬有効量で添加される。
【００４３】
一態様においては、本明細書に記載した硫酸化されたアルキル化およびフルオロアルキル化ＳＡＧＥは、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）、Ｐ−セレクチン、またはヒト白血球エラスターゼの活性を阻害することができる。ＲＡＧＥはヒトの皮膚で高度に発現し、皮膚線維芽細胞、樹状細胞、ケラチン生成細胞、内皮細胞、および単球上に存在している。皮膚が日光に曝されると、ＲＡＧＥは、終末糖化産物（ＡＧＥ）およびサイトカインである腫瘍壊死因子−αによって上方制御される。ＲＡＧＥは、ＵＶに誘起される光老化において顕著な役割を果たし、その場合、ＵＶに誘導されるカルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）等のＡＧＥ産物にＲＡＧＥが連結することによって、皮膚線維芽細胞による細胞外マトリックスの産生が刺激され、それによって皮膚の老化が促進される。乾癬の場合は、炎症の惹起が活性化Ｔリンパ球に決定的に依存するため、この疾患におけるＲＡＧＥの役割は一層顕著になる傾向にある。Ｔリンパ球はまた、ざ瘡およびアトピー性皮膚炎の機構においても重要な可能性がある。ざ瘡の場合、皮膚のＣＤ３＋およびＣＤ４＋Ｔリンパ球ならびにマクロファージが増加することによって毛包の導管内におけるケラチン生成細胞の過剰増殖が刺激され、毛包の導管が閉塞することによってざ瘡面皰が形成される。アトピー性皮膚炎の場合は、皮膚の抗原がＴＨ２リンパ球を活性化することにより、インターロイキン−４（ＩＬ−４）やインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）等のサイトカインが分泌され、その結果として、好酸球が皮膚に動員される。今度は、好酸球が主要塩基性タンパク質等の陽性荷電した毒素を放出し、アレルギー性皮膚疾患を生じさせる。したがって、本明細書に記載した化合物の強力なＲＡＧＥ阻害活性は、これらに限定されるものではないが、ざ瘡、湿疹、アトピー性皮膚炎、乾癬、皮膚の光老化等の様々な皮膚疾患の治療に有用となる。
【００４４】
成人期においては、ＲＡＧＥが生体に必ずしも完全に有益なわけではない。悪性腫瘍はオートクライン因子としてアンホテリン（またはハイモビリティー・ボックス・グループ・プロテイン−１、ＨＭＧＢ−１）を分泌し、アンホテリンとＲＡＧＥとの相互作用を利用して原発腫瘍の増殖および転移を促進する。組換え型デコイ（可溶型ＲＡＧＥまたはｓ−ＲＡＧＥ）を用いてＲＡＧＥを阻害すると、腫瘍増殖が減少するとともに転移が阻害される。敗血症の場合は、単球およびマクロファージがアンホテリンを分泌し、これが血管および他の炎症細胞上のＲＡＧＥと相互作用することにより、細菌性ショックの重症度が増大する。この相互作用をＲＡＧＥの抗体によって阻害することにより、重症敗血症における臓器障害が阻止される。成人期においては、ＲＡＧＥは、ＰＭＮ、単球、およびリンパ球の炎症部位への動員を促進する血管内皮細胞接着分子（vascular adhesion receptor）としても機能する。ＲＡＧＥを阻害することにより、炎症細胞の流入が緩やかになる。このことは多発性硬化症の動物モデルで既に実証されており、血管内皮ＲＡＧＥとｓ−ＲＡＧＥとの競合的阻害により、活性化された脳炎惹起性Ｔリンパ球の中枢神経系への流入が阻止され、神経の炎症および変性の発症および進行が遅延される。
【００４５】
ＲＡＧＥはまた、ＰＭＮ、単球、およびリンパ球から分泌される強力な炎症促進因子であるＳ１００カルグラニュリンと呼ばれるカルシウム結合タンパク質ファミリーとも相互作用する。Ｓ１００カルグラニュリンの上昇は、急性肺傷害および嚢胞性線維症患者の気道分泌物におけるＰＭＮ炎症の鋭敏なマーカーである。眼の場合は、加齢黄斑変性においてＳ１００カルグラニュリンとＲＡＧＥとの相互作用が顕著な役割を果たし、結果として失明を招く。ＲＡＧＥはまた、アルツハイマーにおけるβアミロイドペプチドおよびアミロイドタンパクのβシートとも結合する。ＲＡＧＥ−βシート線維の相互作用は、ＲＡＧＥが関与する神経細胞死および炎症誘発を介して、アルツハイマー型認知症および全身アミロイドーシスにおける臓器障害を媒介する。
【００４６】
ＲＡＧＥは糖尿病においても顕著である。血中グルコースが上昇すると、グルコースのアルデヒド基が細胞内タンパク質のアミンにランダムに結合して共有結合付加体となる。ＰＭＮが産生する酸化剤である次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）等の酸化剤の存在下においては、今度はこのグルコース部分が酸化される。この酸化されたグリコシル化タンパク質は終末糖化産物（ＡＧＥ）として周知である。ＡＧＥもＲＡＧＥ受容体に積極的に結合し、ＲＡＧＥを介するシグナル伝達を惹起する。ＡＧＥ−ＲＡＧＥシグナル伝達は、血管内皮機能障害、創傷治癒遅延、およびコントロール状況の悪い糖尿病に特徴的なアテローム性動脈硬化症を加速させる原因となる。眼の場合は、ＡＧＥ−ＲＡＧＥシグナル伝達によって網膜微小血管が増殖し、糖尿病性網膜症および失明の原因となる。腎臓においては、ＡＧＥ−ＲＡＧＥシグナル伝達が、初期腎肥大、その後に、糖尿病性腎不全（糖尿病性腎症）を招く線維症の原因となる。同様に、ＡＧＥ−ＲＡＧＥシグナル伝達は内皮のアポトーシスを起こさせ、血管新生を阻害し、糖尿病皮膚潰瘍の治癒を遅らせる。
【００４７】
ＲＡＧＥを阻害する能力を有するＳＡＧＥは、炎症に特に有用な治療薬となる。ＲＡＧＥは、子宮内において、成長を促進する核タンパクであるアンホテリンすなわちハイモビリティー・ボックス・グループ・プロテイン−１（ＨＭＧＢ−１）に結合する受容体として機能する。ここで、アンホテリン−ＲＡＧＥ相互作用は、神経系の発達に重要な増殖シグナル伝達を惹起する。成人期においては、ＲＡＧＥは、血管壁細胞、神経組織、心筋細胞、単球およびマクロファージ、Ｔリンパ球、腎メサンギウム細胞、ならびに皮膚線維芽細胞、樹状細胞、およびケラチン生成細胞に発現する。したがって、一態様においては、本明細書に記載したＳＡＧＥおよび組成物は、これらに限定されるものではないが、癌、多発性硬化症、変形性関節症、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、炎症性心血管疾患、または炎症性心血管疾患、糖尿病性合併症等のＲＡＧＥ関連疾患に帰属される様々な異なる病気によって生じる対象者の炎症を安全に軽減または予防するために使用することができる。
【００４８】
一態様においては、ＳＡＧＥおよび組成物を陰性荷電物質として投与することによってカテリシジン由来の陽性荷電した皮膚ペプチドに結合させて阻害し、それによって皮膚障害を治療または予防してもよい。例えば、活性カテリシジンペプチドが皮膚で過剰発現することによって発症することが周知の酒さ性ざ瘡として知られる皮膚状態を、本明細書に記載したＳＡＧＥを用いて治療または予防してもよい。ＳＡＧＥを用いて治療または予防することができる皮膚疾患の例としては、これらに限定されるものではないが、酒さ、アトピー性皮膚炎（湿疹）、アレルギー性接触皮膚炎、乾癬、ヘルペス状皮膚炎、ざ瘡、糖尿病性皮膚潰瘍および他の糖尿病性創傷、熱傷（温熱熱傷の痛みの緩和を含む）、日焼け（日焼けの痛みの緩和を含む）、形成外科手術後の瘢痕予防、光線角化症、虫刺され、ツタウルシによるかぶれ、放射線皮膚炎／熱傷、皮膚治癒の亢進、ケロイド瘢痕の予防および治療、または脂漏性皮膚炎の治療が挙げられる。
【００４９】
ＳＡＧＥがＲＡＧＥ活性および他の生物学的メカニズムを阻害する能力を有することから、ＳＡＧＥには皮膚障害の治療または予防以外にも多くの治療用途がある。一態様においては、ＳＡＧＥを、歯肉炎（歯周疾患）およびアフタ性潰瘍を治療するために歯科および口腔外科で使用してもよい。他の態様においては、ＳＡＧＥを眼科用途、例えば、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、眼球乾燥症候群、および他の炎症性結膜炎（inflammatory conjunctivitis）、虹彩炎、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎の治療、白内障手術における消炎補助（anti-inflammatory aid）、または角膜炎症および瘢痕の予防等に使用してもよい。
【００５０】
さらなる態様においては、尿生殖器用途（例えば、尿路感染症予防、膀胱および尿路上皮系の移行上皮癌の治療、間質性膀胱炎の治療、および性感染症予防のための膣潤滑／保護薬としての使用）にＳＡＧＥを使用してもよい。
【００５１】
他の態様においては、嚢胞性線維症、気管支拡張症、鼻炎（アレルギー性および通年性の両方）、副鼻腔炎、肺気腫および慢性気管支炎（ＣＯＰＤ）、急性肺傷害／成人型呼吸窮迫症候群、間質性肺線維症、ＳＡＲＳ、喘息、ならびに呼吸器合胞体ウイルス等の多くの呼吸器疾患の治療にＳＡＧＥを使用してもよい。他の態様においては、ＳＡＧＥは、いびきおよび閉塞型睡眠時無呼吸の予防および治療、ＨＩＶ陽性または造血器腫瘍を有する患者等の免疫不全宿主の一般的な呼吸器病原体による感染（ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、ヘモフィルス・インフルエンザ、ブドウ球菌属（Staphylococcus）、肺炎マイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae）、肺炎クラミジア（Chlamydial pneumonia）、グラム陰性腸内細菌による感染）の予防、または中耳炎の予防および処置に用いることができる。
【００５２】
ＳＡＧＥは、心血管用途（例えば、急性冠症候群またはアテローム性動脈硬化症の治療または予防）；血液学／腫瘍学的用途（例えば、鎌状赤血球貧血の予防および治療；転移性疾患の予防および治療；ならびに悪性腫瘍による凝固亢進状態の予防（トルソー症候群））；感染症の治療（例えば、脳血管閉塞症候群（cerebral vascular occlusive syndrome）、および熱帯性マラリアにおける腎炎、黄熱病、デング熱、全身性敗血症（systemic sepsis）、ならびに標的細胞のウイルス融合および感染を防ぐためのＨＩＶの補助療法）；胃腸疾患の治療（例えば、潰瘍性大腸炎、腸のクローン病、痔核、ならびに胃および食道のストレス潰瘍の予防）；リウマチおよび免疫疾患の治療（例えば、変形性関節症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデスの予防および治療、血管神経性浮腫、シェーグレン症候群、全身性硬化症、全身性アミロイドーシス、および全身性肥満細胞症の予防および治療）；腎疾患（例えば、糖尿病性腎症および糸球体腎炎の予防および治療）；ならびに神経系疾患（例えば、多発性硬化症およびアルツハイマー型認知症）に使用してもよい。
【００５３】
本明細書に記載したＳＡＧＥおよび組成物は、他の関連する療法よりも安全である。例えば、ヘパリンおよび他の硫酸化多糖は動物および臨床研究の両方において糖尿病性合併症を減少させることができ、糖尿病性腎症に特に有効である。しかしながら、抗凝固性を有するヘパリンは、出血の危険性が過度に高くなることから、一般臨床場面で糖尿病性合併症の予防に使用することはできない。本明細書に記載したＳＡＧＥおよび組成物は、以下の実施例に示すが、長期治療に関する重要な考慮事項である抗凝固活性が低い。さらに、このことも実施例で示すが、ＳＡＧＥには毒性がほとんどまたは全くない。
【実施例】
【００５４】
以下の実施例は、本明細書に記載および特許請求した化合物、組成物、および方法を作製および評価する方法を当業者に十分に開示および説明するために述べるものであるが、これは単なる例示を目的とするものであって、本発明者らが本発明者らの発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではない。数値（例えば、量や温度等）が確実に正確になるように努めたが、ある程度の誤差およびずれがあることは考慮されたい。特段の指定がない限り、部は重量部、温度は℃単位であるかまたは周囲温度であり、圧力は大気圧付近である。反応条件、例えば、成分の濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力、ならびに記載した処理により得られる生成物の純度および収率を最適化するのに用いることができる他の反応範囲および条件には多くの変形および組合せがある。このような工程条件を最適化するためには妥当かつ日常的な実験のみが必要であろう。以下に記載する化合物は、上述および図２に示すコード番号で識別される。
【００５５】
Ｉ．アルキル化ＨＡ誘導体の合成
Ａ．メチルＨＡ（ＤＳ−２）の調製
ヒアルロン酸（HA、Novozymes Biopolymers、950kDa）（２．０ｇ）を１００ｍＬビーカー内でＮａＯＨ（４０％ｗ／ｖ）２０ｍＬに溶解し、混合物を室温（ｒｔ）で２時間撹拌した。結果として得られた粘性液体を、イソプロパノール１００ｍＬを含む４００ｍＬビーカーに移して混合を継続した。撹拌した混合物にヨードメタン１０ｍＬを加え、混合物をｒｔで２４時間撹拌した。結果として得られた懸濁液を濾過して粗生成メチル化ＨＡ生成物を回収した。この粗生成ＭｅＨＡを蒸留水２５０ｍＬに溶解し、溶液のｐＨを約７．０に調節し、溶液を蒸留水に対し２４時間透析した。この間、外側の水浴を４回交換した。透析したＭｅＨＡ生成物を凍結乾燥することによりメチルＨＡ１．２５ｇを綿状の網目状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，δ）：１．８５（ｓ，３Ｈ，ＮＣＨ３），３．２０−３．８０（ｍ，１０Ｈ，ＯＣＨ＋ＯＣＨ３）。置換度（ＳＤ）を１Ｈ  ＮＭＲで測定したところ、ＳＤ＝２すなわち二糖単位当たりのメチル基が平均２個と見積もられた。ＳＤ＝［（メチルＨＡのδ３．２０−３．８の積分値）−（ＨＡのδ３．２０−３．８の積分値）］／（ＮＣＨ３の１．８５の積分値）。これは、第１級ヒドロキシルおよび少なくとも１個の第２級ヒドロキシル基の両方がこの工程により修飾されたことを示唆している。
【００５６】
Ｂ．メチルＨＡ（ＤＳ−１）の調製
ヒアルロン酸（HA、Novozymes Biopolymers、950kDa）（２．０ｇ）を１００ｍＬビーカー内でＮａＯＨ（４０％ｗ／ｖ）２０ｍＬに溶解し、混合物を室温（ｒｔ）で２時間撹拌した。結果として得られた粘性液体を、イソプロパノール１００ｍＬを含む４００ｍＬビーカーに移して混合を継続した。撹拌した混合物にヨードメタン４ｍＬを加え、混合物をｒｔで２４時間撹拌した。結果として得られた懸濁液を濾過して粗生成メチル化ＨＡ生成物を回収した。この粗生成ＭｅＨＡを蒸留水２５０ｍＬに溶解し、溶液のｐＨを約７．０に調節し、溶液を蒸留水に対し２４時間透析した。この間、外側の水浴を４回交換した。透析したＭｅＨＡ生成物を凍結乾燥することによりメチルＨＡ１．２５ｇを綿状の網目状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，δ）：１．８５（ｓ，３Ｈ，ＮＣＨ３），３．２０−３．８０（ｍ，１０Ｈ，ＯＣＨ＋ＯＣＨ３）。置換度（ＳＤ）を１Ｈ  ＮＭＲで測定したところ、ＳＤ＝１すなわち二糖単位当たりメチル基が平均１個と見積もられた。ＳＤ＝［（メチルＨＡのδ３．２０−３．８の積分値）−（ＨＡのδ３．２０−３．８の積分値）］／（ＮＣＨ３の１．８５の積分値）。このことは、第１級ヒドロキシルおよび少なくとも１個の第２級ヒドロキシル基がこの工程により修飾されたことを示唆している。
【００５７】
Ｃ．ＦＨＡ−２（ＤＳ−１）の調製
２，２，３，３，４，４−ヘプタフルオロ−１−ブタノール１．０ｇ（５ｍｍｏｌ）を含む２５ｍＬフラスコに三臭化リン１．３ｍＬ（７．５ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。この混合物を６０℃で３０分間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１５ｍＬ）をゆっくりと加えて反応を停止した。この水溶液をジクロロメタン１５ｍＬずつで３回抽出し、臭化ヘプタフルオロブチルを含む有機層を濃縮し、残渣を次のステップでさらなる生成に用いた。
【００５８】
ＨＡ（２．０ｇ）を１００ｍＬビーカー内でＮａＯＨ（４０％ｗ／ｖ）２０ｍＬに溶解し、混合物を室温（ｒｔ）で２時間撹拌した。結果として得られた粘性液体を、イソプロパノール１００ｍＬを含む４００ｍＬビーカーに移して混合を継続した。撹拌した混合物にイソプロパノール１０ｍＬ中の粗生成臭化ヘプタフルオロブチルを加え、混合物をｒｔで２４時間撹拌した。結果として得られた懸濁液を濾過して粗生成ＦＨＡ−２生成物を回収した。この粗生成ＦＨＡ−２を蒸留水２５０ｍＬに溶解し、溶液のｐＨを約７．０に調節し、溶液を蒸留水に対し２４時間透析した。この間、外側の水浴を４回交換した。透析したＦＨＡ−２生成物を凍結乾燥することにより、ＦＨＡ−２として設計された１．５ｇのＦＨＡ−２を綿状の網目状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，δ）：１．８２（ｓ，３Ｈ，ＮＣＨ３），３．１５−３．８０（ｍ，８Ｈ，ＯＣＨ＋ＯＣＨ２）。１９Ｆ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，δ）：−１１５．３，−１２０．８。１Ｈ  ＮＭＲで測定した置換度（ＳＤ）は１．０であった。ＳＤ＝［（ＦＨＡ−２のδ３．１５−３．８０の積分値）−（ＨＡのδ３．２０−３．８の積分値）］／［（ＮＣＨ３の１．８２の積分値）×（２／３）］。
【００５９】
Ｄ．ＦＨＡ−２（ＤＳ−２）の調製
２，２，３，３，４，４−ヘプタフルオロ−１−ブタノール３．０ｇ（１５ｍｍｏｌ）を含む２５ｍＬフラスコに三臭化リン２．５．ｍＬ（１６ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。混合物を６０℃で３０分間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１５ｍＬ）をゆっくりと加えて反応を停止させた。この水溶液をジクロロメタン１５ｍＬずつで３回抽出し、臭化ヘプタフルオロブチルを含む有機層を濃縮し、残渣を精製することなく次のステップに使用した。
【００６０】
ＨＡ（２．０ｇ）を１００ｍＬビーカー内でＮａＯＨ（４０％ｗ／ｖ）２０ｍＬに溶解し、混合物を室温（ｒｔ）で２時間撹拌した。結果として得られた粘性液体を、イソプロパノール１００ｍＬを含む４００ｍＬビーカーに移して混合を継続した。撹拌した混合物にイソプロパノール１０ｍＬ中の粗生成臭化ヘプタフルオロブチルを加え、混合物をｒｔで２４時間撹拌した。結果として得られた懸濁液を濾過して粗生成ＦＨＡ−２生成物を回収した。この粗生成ＦＨＡ−２を蒸留水２５０ｍＬに溶解し、溶液のｐＨを約７．０に調節し、溶液を蒸留水に対し２４時間透析した。この間、外側の水浴を４回交換した。透析したＦＨＡ−２生成物を凍結乾燥することにより、ＦＨＡ−２として設計された１．５ｇのＦＨＡ−２を綿状の網目状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，δ）：１．８２（ｓ，３Ｈ，ＮＣＨ３），３．１５−３．８０（ｍ，８Ｈ，ＯＣＨ＋ＯＣＨ２）。１９Ｆ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，δ）：−１１５．３，−１２０．８。１Ｈ  ＮＭＲで測定した置換度（ＳＤ）は２．０であった。ＳＤ＝［（ＦＨＡ−２のδ３．１５−３．８０の積分値）−（ＨＡのδ３．２０−３．８の積分値）］／［（ＮＣＨ３の１．８２の積分値）×（２／３）］。
【００６１】
Ｅ．ＦＨＡ−１（ＤＳ−１）の調製
２，２，３，３，−ペンタフルオロ−１−プロパノール１．０ｇ（５ｍｍｏｌ）を含む２５ｍＬフラスコに三臭化リン１．３ｍＬ（７．５ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。混合物を６０℃で３０分間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１５ｍＬ）をゆっくりと加えて反応を停止した。この水溶液をジクロロメタン１５ｍＬずつで３回抽出し、臭化ヘプタフルオロブチルを含む有機層を濃縮し、残渣を精製することなく次のステップで使用した。
【００６２】
ＨＡ（２．０ｇ）を１００ｍＬビーカー内でＮａＯＨ（４０％ｗ／ｖ）２０ｍＬに溶解し、混合物を室温（ｒｔ）で２時間撹拌した。結果として得られた粘性液体を、イソプロパノール１００ｍＬを含む４００ｍＬビーカーに移して混合を継続した。撹拌した混合物にイソプロパノール１０ｍＬ中の粗生成臭化ヘプタフルオロブチルを加え、混合物をｒｔで２４時間撹拌した。結果として得られた懸濁液を濾過して粗生成ＦＨＡ−１生成物を回収した。この粗生成ＦＨＡ−１を蒸留水２５０ｍＬに溶解し、溶液のｐＨを約７．０に調節し、溶液を蒸留水に対し２４時間透析した。この間、外側の水浴を４回交換した。透析したＦＨＡ−１生成物を凍結乾燥することにより、ＦＨＡ−１として設計された１．５ｇのＦＨＡ−１を綿状の網目状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，δ）：１．８０（ｓ，３Ｈ，ＮＣＨ３），３．１５−３．８０（ｍ，８Ｈ，ＯＣＨ＋ＯＣＨ２）。１９Ｆ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，δ）：−１１３．６，−１１８．０。１Ｈ  ＮＭＲで測定した置換度（ＳＤ）は１．０であった。ＳＤ＝［（ＦＨＡ−１のδ３．１５−３．８０の積分値）−（ＨＡのδ３．２０−３．８の積分値）］／［（ＮＣＨ３の１．８０の積分値）×（２／３）］。
【００６３】
Ｆ．ＦＨＡ−１（ＤＳ−２）の調製
２，２，３，３，−ペンタフルオロ−１−プロパノール３．０ｇ（１５ｍｍｏｌ）を含む２５ｍＬフラスコに三臭化リン３ｍＬ（１８ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。混合物を６０℃で３０分間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１５ｍＬ）をゆっくりと加えて反応を停止した。この水溶液をジクロロメタン１５ｍＬずつで３回抽出し、臭化ヘプタフルオロブチルを含む有機層を濃縮し、残渣を精製することなく次のステップで使用した。
【００６４】
ＨＡ（２．０ｇ）を１００ｍＬビーカー内でＮａＯＨ（４０％ｗ／ｖ）２０ｍＬに溶解し、混合物を室温（ｒｔ）で２時間撹拌した。結果として得られた粘性液体を、イソプロパノール１００ｍＬを含む４００ｍＬビーカーに移して混合を継続した。撹拌した混合物にイソプロパノール１０ｍＬ中の粗生成臭化ヘプタフルオロブチルを加え、混合物をｒｔで２４時間撹拌した。結果として得られた懸濁液を濾過して粗生成ＦＨＡ−１生成物を回収した。この粗生成ＦＨＡ−１を蒸留水２５０ｍＬに溶解し、溶液のｐＨを約７．０に調節し、溶液を蒸留水に対し２４時間透析した。この間、外側の水浴を４回交換した。透析したＦＨＡ−１生成物を凍結乾燥することにより、ＦＨＡ−１として設計された１．５ｇのＦＨＡ−１を綿状の網目状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，δ）：１．８０（ｓ，３Ｈ，ＮＣＨ３），３．１５−３．８０（ｍ，８Ｈ，ＯＣＨ＋ＯＣＨ２）。１９Ｆ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，δ）：−１１３．６，−１１８．０。１Ｈ  ＮＭＲで測定した置換度（ＳＤ）は２．０であった。ＳＤ＝［（ＦＨＡ−１のδ３．１５−３．８０の積分値）−（ＨＡのδ３．２０−３．８の積分値）］／［（ＮＣＨ３の１．８０の積分値）×（２／３）］。
【００６５】
Ｇ．ＢＧＨＡの調製
ヒアルロン酸（HA、Novozymes Biopolymers、950kDa）（２．０ｇ）を１００ｍＬビーカー内でＮａＯＨ（４０％ｗ／ｖ）２０ｍＬに溶解し、混合物を室温（ｒｔ）で２時間撹拌した。結果として得られた粘性液体を、イソプロパノール１００ｍＬを含む４００ｍＬビーカーに移して混合を継続した。撹拌した混合物にベンジルグリシジルエーテル１０ｍＬを加え、混合物をｒｔで２４時間撹拌した。結果として得られた懸濁液を濾過して粗生成ＢＧＨＡ生成物を回収した。この粗生成ＢＧＨＡを蒸留水２５０ｍＬに溶解し、溶液のｐＨを約７．０に調節し、溶液を蒸留水に対し２４時間透析した。この間、外側の水浴を４回交換した。透析したＢＧＨＡ生成物を凍結乾燥することにより、ＢＧＨＡ１．２５ｇを綿状の網目状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，δ）：１．８５（ｓ，３Ｈ，ＮＣＨ３），３．２０−３．８０（ｍ，１０Ｈ，ＯＣＨ＋ＯＣＨ３）。置換度（ＳＤ）を１Ｈ  ＮＭＲで測定したところ、ＳＤは１未満であった。
【００６６】
Ｈ．低分子量メチルＨＡ（ＤＳ−２）の調製
ヒアルロン酸（HA、Novozymes Biopolymers、53kDa）（２．０ｇ）を１００ｍＬビーカー内でＮａＯＨ（４０％ｗ／ｖ）２０ｍＬに溶解し、混合物を室温（ｒｔ）で２時間撹拌した。結果として得られた粘性液体を、イソプロパノール１００ｍＬを含む４００ｍＬビーカーに移して混合を継続した。撹拌した混合物にヨードメタン１０ｍＬを加え、混合物をｒｔで２４時間撹拌した。結果として得られた懸濁液を濾過して粗生成低分子メチル化ＨＡ生成物を回収した。この粗生成ＬＭＷ  ＭｅＨＡを蒸留水２５０ｍＬに溶解し、溶液のｐＨを約７．０に調節し、溶液を蒸留水に対し２４時間透析した。この間、外側の水浴を４回交換した。透析したＬＭＷ  ＭｅＨＡ生成物を凍結乾燥することにより、メチルＨＡ１．２ｇを綿状の網目状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，δ）：１．８５（ｓ，３Ｈ，ＮＣＨ３），３．２０−３．８０（ｍ，１０Ｈ，ＯＣＨ＋ＯＣＨ３）。１Ｈ  ＮＭＲで測定した置換度（ＳＤ）は２であった。
【００６７】
Ｉ．低分子量メチルＨＡ（ＤＳ−１）の調製
ヒアルロン酸（HA、Novozymes Biopolymers、53kDa）（２．０ｇ）を１００ｍＬビーカー内でＮａＯＨ（４０％ｗ／ｖ）２０ｍＬに溶解し、混合物を室温（ｒｔ）で２時間撹拌した。結果として得られた粘性液体を、イソプロパノール１００ｍＬを含む４００ｍＬビーカーに移して混合を継続した。撹拌した混合物にヨードメタン４ｍＬを加え、混合物をｒｔで２４時間撹拌した。結果として得られた懸濁液を濾過して、粗生成低分子メチル化ＨＡ生成物を回収した。この粗生成ＬＭＷ  ＭｅＨＡを蒸留水２５０ｍＬに溶解し、溶液のｐＨを約７に調節し、溶液を蒸留水に対し２４時間透析した。この間、外側の水浴を４回交換した。透析したＬＭＷ  ＭｅＨＡ生成物を凍結乾燥することにより、ＬＭＷ  ＭｅＨＡ１．２ｇを綿状の網目状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，δ）：１．８５（ｓ，３Ｈ，ＮＣＨ３），３．２０−３．８０（ｍ，１０Ｈ，ＯＣＨ＋ＯＣＨ３）。１Ｈ  ＮＭＲで測定した置換度（ＳＤ）は１であった。
【００６８】
Ｊ．低分子量ＦＨＡ−２（ＤＳ−１）の調製
２，２，３，３，４，４−ヘプタフルオロ−１−ブタノール１．０ｇ（５ｍｍｏｌ）を含む２５ｍＬフラスコに三臭化リン１．３ｍＬ（７．５ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。混合物を６０℃で３０分間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１５ｍＬ）をゆっくりと加えて反応を停止した。この水溶液をジクロロメタン１５ｍＬずつで３回抽出し、臭化ヘプタフルオロブチルを含む有機層を濃縮し、残渣を精製することなく次のステップで使用した。
【００６９】
ＨＡ（２．０ｇ、５３ｋＤａを１００ｍＬビーカー内でＮａＯＨ（４０％ｗ／ｖ）２０ｍＬに溶解し、混合物を室温（ｒｔ）で２時間撹拌した。結果として得られた粘性液体を、イソプロパノール１００ｍＬを含む４００ｍＬビーカーに移して混合を継続した。撹拌した混合物にイソプロパノール１０ｍＬ中の粗生成臭化ヘプタフルオロブチルを加え、混合物をｒｔで２４時間撹拌した。結果として得られた懸濁液を濾過してＬＭＷ  ＦＨＡ−２生成物を回収した。この粗生成ＬＭＷ  ＦＨＡ−２を２５０ｍＬの蒸留水に溶解し、溶液のｐＨを約７に調節し、溶液を蒸留水に対し２４時間透析した。この間、外側の水浴を４回交換した。透析したＬＭＷ  ＦＨＡ−２生成物を凍結乾燥することにより、ＬＭＷ  ＦＨＡ−２として設計された１．５ｇのＬＭＷ  ＦＨＡ−２を綿状の網目状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，δ）：１．８２（ｓ，３Ｈ，ＮＣＨ３），３．１５−３．８０（ｍ，８Ｈ，ＯＣＨ＋ＯＣＨ２）。１９Ｆ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，δ）：−１１５．３，−１２０．８。１Ｈ  ＮＭＲで測定した置換度（ＳＤ）は１．０であった。
【００７０】
Ｋ．低分子量ＦＨＡ−２（ＤＳ−２）の調製
２，２，３，３，４，４−ヘプタフルオロ−１−ブタノール３．０ｇ（１５ｍｍｏｌ）を含む２５ｍＬフラスコに三臭化リン２．５ｍＬ（１６ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。混合物を６０℃で３０分間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１５ｍＬ）をゆっくりと加えて反応を停止した。この水溶液をジクロロメタン１５ｍＬずつで３回抽出し、臭化ヘプタフルオロブチルを含む有機層を濃縮し、残渣を精製することなく次のステップで使用した。
【００７１】
ＨＡ（２．０ｇ、５３ｋＤａ）を１００ｍＬビーカー内でＮａＯＨ（４０％ｗ／ｖ）２０ｍＬに溶解し、混合物を室温（ｒｔ）で２時間撹拌した。結果として得られた粘性液体を、イソプロパノール１００ｍＬを含む４００ｍＬビーカーに移して混合を継続した。撹拌した混合物にイソプロパノール１０ｍＬ中の粗生成臭化ヘプタフルオロブチルを加え、混合物をｒｔで２４時間撹拌した。結果として得られた懸濁液を濾過してＬＭＷ  ＦＨＡ−２生成物を回収した。この粗生成ＬＭＷ  ＦＨＡ−２を２５０ｍＬの蒸留水に溶解し、溶液のｐＨを約７に調節し、溶液を蒸留水に対し２４時間透析した。この間、外側の水浴を４回交換した。透析したＬＭＷ  ＦＨＡ−２生成物を凍結乾燥することにより、ＬＭＷ  ＦＨＡ−２として設計された１．５ｇのＬＭＷ  ＦＨＡ−２を綿状の網目状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，δ）：１．８２（ｓ，３Ｈ，ＮＣＨ３），３．１５−３．８０（ｍ，８Ｈ，ＯＣＨ＋ＯＣＨ２）。１９Ｆ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，δ）：−１１５．３，−１２０．８。１Ｈ  ＮＭＲで測定した置換度（ＳＤ）は２．０であった。
【００７２】
Ｌ．低分子量ＦＨＡ−１（ＤＳ−１）の調製
２，２，３，３，−ペンタフルオロ−１−プロパノール１．０ｇ（５ｍｍｏｌ）を含む２５ｍＬフラスコに三臭化リン１．３ｍＬ（７．５ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。混合物を６０℃で３０分間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１５ｍＬ）をゆっくりと加えて反応を停止した。この水溶液をジクロロメタン１５ｍＬずつで３回抽出し、臭化ヘプタフルオロブチルを含む有機層を濃縮し、残渣を精製することなく次のステップで使用した。
【００７３】
ＨＡ（２．０ｇ、５３ｋＤａ）を１００ｍＬビーカー内でＮａＯＨ（４０％ｗ／ｖ）２０ｍＬに溶解し、混合物を室温（ｒｔ）で２時間撹拌した。結果として得られた粘性液体を、イソプロパノール１００ｍＬを含む４００ｍＬビーカーに移して混合を継続した。撹拌した混合物に、イソプロパノール１０ｍＬ中の粗生成臭化ヘプタフルオロブチルを加え、混合物をｒｔで２４時間撹拌した。結果として得られた懸濁液を濾過してＬＭＷ  ＦＨＡ−１生成物を回収した。この粗生成ＬＭＷ  ＦＨＡ−１を２５０ｍＬの蒸留水に溶解し、溶液のｐＨを約７に調節し、溶液を蒸留水に対し２４時間透析した。この間、外側の水浴を４回交換した。透析したＬＭＷ  ＦＨＡ−１生成物を凍結乾燥することにより、ＬＭＷ  ＦＨＡ−１として設計されたＬＭＷ  ＦＨＡ−１１．５ｇを綿状の網目状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，δ）：１．８０（ｓ，３Ｈ，ＮＣＨ３），３．１５−３．８０（ｍ，８Ｈ，ＯＣＨ＋ＯＣＨ２）。１９Ｆ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，δ）：−１１３．６，−１１８．０。１Ｈ  ＮＭＲで測定した置換度（ＳＤ）は１．０であった。
【００７４】
Ｍ．ＬＭＷ  ＦＨＡ−１（ＤＳ−２）の調製
２，２，３，３，−ペンタフルオロ−１−プロパノール３．０ｇ（１５ｍｍｏｌ）を含む２５ｍＬフラスコに三臭化リン３ｍＬ（１８ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。混合物を６０℃で３０分間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１５ｍＬ）をゆっくりと加えて反応を停止した。この水溶液をジクロロメタン１５ｍＬずつで３回抽出し、臭化ヘプタフルオロブチルを含む有機層を濃縮し、残渣を精製することなく次のステップで使用した。
【００７５】
ＨＡ（２．０ｇ、５３ｋＤａ）を１００ｍＬビーカー内でＮａＯＨ（４０％ｗ／ｖ）２０ｍＬに溶解し、混合物を室温（ｒｔ）で２時間撹拌した。結果として得られた粘性液体を、イソプロパノール１００ｍＬを含む４００ｍＬビーカーに移して混合を継続した。撹拌した混合物にイソプロパノール１０ｍＬ中の粗生成臭化ヘプタフルオロブチルを加え、混合物をｒｔで２４時間撹拌した。結果として得られた懸濁液を濾過してＬＭＷ  ＦＨＡ−１生成物を回収した。この粗生成ＬＭＷ  ＦＨＡ−１を２５０ｍＬの蒸留水に溶解し、溶液のｐＨを約７に調節し、溶液を蒸留水に対し２４時間透析した。この間、外側の水浴を４回交換した。透析したＬＭＷ  ＦＨＡ−１生成物を凍結乾燥することにより、ＬＭＷ  ＦＨＡ−１として設計された１．５ｇのＬＭＷ  ＦＨＡ−１を綿状の網目状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，δ）：１．８０（ｓ，３Ｈ，ＮＣＨ３），３．１５−３．８０（ｍ，８Ｈ，ＯＣＨ＋ＯＣＨ２）。１９Ｆ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，δ）：−１１３．６，−１１８．０。１Ｈ  ＮＭＲで測定した置換度（ＳＤ）は２．０であった。
【００７６】
Ｎ．低分子量ＢＧＨＡの調製
ヒアルロン酸（HA、Novozymes Biopolymers、53kDa）（２．０ｇ）を１００ｍＬビーカー内でＮａＯＨ（４０％ｗ／ｖ）２０ｍＬに溶解し、混合物を室温（ｒｔ）で２時間撹拌した。結果として得られた粘性液体を、イソプロパノール１００ｍＬを含む４００ｍＬビーカーに移して混合を継続した。撹拌した混合物にベンジルグリシジルエーテル１０ｍＬを加え、混合物をｒｔで２４時間撹拌した。結果として得られた懸濁液を濾過してＬＭＷ  ＢＧＨＡ生成物を回収した。この粗生成ＬＭＷ  ＢＧＨＡを２５０ｍＬの蒸留水に溶解し、溶液のｐＨを約７に調節し、溶液を蒸留水に対し２４時間透析した。この間、外側の水浴を４回交換した。透析したＬＭＷ  ＢＧＨＡ生成物を凍結乾燥することにより、ＬＭＷ  ＢＧＨＡ１．２５ｇを綿状の網目状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，δ）：１．８５（ｓ，３Ｈ，ＮＣＨ３），３．２０−３．８０（ｍ，１０Ｈ，ＯＣＨ＋ＯＣＨ３）。１Ｈ  ＮＭＲで測定した置換度（ＳＤ）は１未満であった。
【００７７】
ＩＩ．アルキル化ＨＡ誘導体の硫酸化
１．ＬＭＷ−Ｐ−ＯＳＦＨＡ−１（ＤＳ−１）（ＧＭ−２１１１０１）の調製
最初に、脱イオン水１００ｍＬ中のＬＭＷ  ＦＨＡ−１（１．０ｇ）のｐＨを１ＮのＨＣｌで３．０に調節し、トリブチルアミン１ｍＬを加えることによって、ＬＭＷ  ＦＨＡ−１（ＤＳ−１）のトリブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩を調製した。この混合物を激しく混合し、凍結乾燥した。結果として得られた塩（ＦＨＡ−１−ＴＢＡ）をＤＭＦ２５ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＨＡ中の利用可能なヒドロキシ基１当量当たり６ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（０．４ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水５０ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール７５ｍＬで粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成部分Ｏ−硫酸化ＨＡを蒸留水に溶解し、１００ｍＭのＮａＣｌ溶液に対し２日間透析（溶液を１日４回交換）した後、凍結乾燥することにより、生成物（３３０ｍｇ）を収率７５％で得た。１Ｈ  ＮＭＲで評価した硫酸化ＳＤ＝１．０であった。置換度は、文献（Carbohydrate Research、1998、306、35-43）のＯＣＨのＮＭＲシフトと比較することにより決定した。
【００７８】
２．ＬＭＷ−Ｐ−ＯＳＦＨＡ−２（ＤＳ−１）（ＧＭ−３１１１０１）の調製
蒸留水５０ｍＬ中のＦＨＡ−２（ＭＷ５３ｋＤａのＨＡ由来のＦＨＡ−２）（０．２５ｇ）にトリブチルアミン０．５ｍＬを加え、上述した１と同様に処理することによってＬＭＷ  ＦＨＡ−２のＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＬＭＷ  ＦＨＡ−２−ＴＢＡ）をＤＭＦ２５ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＨＡ中の利用可能なヒドロキシ基１当量当たり６ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（０．４ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水５０ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール７５ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成部分Ｏ−硫酸化ＬＭＷ  ＦＨＡ−２を水に溶解し、１と同様に透析および凍結乾燥することによって生成物（３００ｍｇ）を収率６８％で得た。１Ｈ  ＮＭＲで評価した硫酸化ＳＤ＝１．０であった。
【００７９】
３．ＬＭＷ−Ｐ−ＯＳＭｅＨＡ（ＤＳ−１）（ＧＭ−１１１１０１）の調製
１と同様にして、ＴＢＡ０．５ｍＬおよび蒸留水５０ｍＬ中のＬＭＷ  ＭｅＨＡ（ＤＳ−１）（ＭＷ５３ｋＤａのＨＡ由来）（０．５ｇ）からＬＭＷ  ＭｅＨＡのＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＬＭＷ  ＭｅＨＡ−ＴＢＡ）をＤＭＦ５０ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＭｅＨＡ中の利用可能なヒドロキシ基１当量当たり６ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（０．８ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水１００ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール１５０ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成部分Ｏ−硫酸化ＭｅＨＡを水に溶解し、１と同様に透析および凍結乾燥することによって生成物（５４０ｍｇ）を６２％の収率で得た。１Ｈ  ＮＭＲにより硫酸化ＳＤ＝１．０〜１．５であることが示された。
【００８０】
４．ＬＭＷ−Ｐ−ＯＳＦＨＡ−１（ＤＳ−２）（ＧＭ−２１１２０１）の調製
蒸留水５０ｍＬ中のＦＨＡ−１（ＭＷ５３ｋＤａのＨＡ由来のＦＨＡ−１）（０．２５ｇ）にトリブチルアミン０．５ｍＬを加え、上述した１と同様に処理することによってＬＭＷ  ＦＨＡ−１のＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＦＨＡ−１−ＴＢＡ）をＤＭＦ２５ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＨＡ中の利用可能なヒドロキシ基１当量当たり６ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（０．４ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水５０ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール７５ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成部分Ｏ−硫酸化ＨＡを蒸留水に溶解し、１００ｍＭのＮａＣｌ溶液に対し２日間透析（溶液を１日４回交換）した後、凍結乾燥することによって生成物（３００ｍｇ）を７０％の収率で得た。１Ｈ  ＮＭＲで評価した硫酸化ＳＤ＝１．０であった。
【００８１】
５．ＬＭＷ−Ｐ−ＯＳＦＨＡ−２（ＤＳ−２）（ＧＭ−３１１２０１）の調製
蒸留水５０ｍＬ中のＦＨＡ−２（ＭＷ５３ｋＤａのＨＡ由来のＦＨＡ−２）（０．２５ｇ）にトリブチルアミン０．５ｍＬを加え、上述した１と同様に処理することによってＬＭＷ  ＦＨＡ−２のＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＬＭＷ  ＦＨＡ−２−ＴＢＡ）をＤＭＦ２５ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＨＡ中の利用可能なヒドロキシ基１当量当たり６ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（０．４ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水５０ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール７５ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成部分Ｏ−硫酸化ＬＭＷ  ＦＨＡ−２を水に溶解し、１と同様に透析および凍結乾燥することによって生成物（３１０ｍｇ）を収率７０％で得た。１Ｈ  ＮＭＲで評価した硫酸化ＳＤ＝１．０であった。
【００８２】
６．ＬＭＷ−Ｐ−ＯＳＭｅＨＡ（ＤＳ−２）（ＧＭ−１１１２０１）の調製
１と同様にして、ＴＢＡを０．５ｍＬおよび蒸留水５０ｍＬ中のＬＭＷ  ＭｅＨＡ（ＤＳ−１）（ＭＷ５３ｋＤａのＨＡ由来）（０．５ｇ）からＬＭＷ  ＭｅＨＡのＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＬＭＷ  ＭｅＨＡ−ＴＢＡ）をＤＭＦ５０ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＭｅＨＡ中の利用可能なヒドロキシ基１当量当たり６ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（０．８ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水１００ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール１５０ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成部分Ｏ−硫酸化ＭｅＨＡを水に溶解し、１と同様に透析および凍結乾燥することによって生成物（５６０ｍｇ）を６４％の収率で得た。１Ｈ  ＮＭＲにより、硫酸化ＳＤ＝１．０〜１．５であることが示された。
【００８３】
７．Ｐ−ＯＳＦＨＡ−１（ＤＳ−１）（ＧＭ−２３１１０１）の調製
蒸留水５０ｍＬ中のＦＨＡ−１（ＭＷ９５０ｋＤａのＨＡ由来のＦＨＡ−１）（０．２５ｇ）にトリブチルアミン０．５ｍＬを加えて、上述した１と同様に処理することによってＦＨＡ−１のＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＦＨＡ−１−ＴＢＡ）をＤＭＦ２５ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＨＡ中の利用可能なヒドロキシ基１当量当たり６ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（０．４ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水５０ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール７５ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成部分Ｏ−硫酸化ＨＡを蒸留水に溶解し、１００ｍＭのＮａＣｌ溶液に対し２日間透析（溶液を１日４回交換）した後、凍結乾燥することによって生成物（３００ｍｇ）を６８％の収率で得た。１Ｈ  ＮＭＲで評価した硫酸化ＳＤ＝１．０〜１．５であった。
【００８４】
８．Ｐ−ＯＳＦＨＡ−２（ＤＳ−１）（ＧＭ−３３１１０１）の調製
蒸留水５０ｍＬ中のＦＨＡ−２（ＭＷ９５０ｋＤａのＨＡ由来のＦＨＡ−２）（０．２５ｇ）にトリブチルアミン０．５ｍＬを加えて、上述した１と同様に処理することによってＦＨＡ−２のＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＦＨＡ−２−ＴＢＡ）をＤＭＦ２５ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＨＡ中の利用可能なヒドロキシ基１当量当たり６ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（０．４ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水５０ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール７５ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成部分Ｏ−硫酸化ＦＨＡ−２を水に溶解し、１と同様に透析および凍結乾燥することによって生成物（３２０ｍｇ）を７０％の収率で得た。１Ｈ  ＮＭＲで評価した硫酸化ＳＤ＝１．０〜１．５であった。
【００８５】
９．Ｐ−ＯＳＭｅＨＡ（ＤＳ−１）（ＧＭ−１３１１０１）の調製
１と同様にして、ＴＢＡを０．５ｍＬおよび蒸留水５０ｍＬ中のＭｅＨＡ（ＤＳ−１）（ＭＷ９５０ｋＤａのＨＡ由来）（０．５ｇ）からＭｅＨＡのＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＭｅＨＡ−ＴＢＡ）を、ＤＭＦ５０ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＭｅＨＡ中の利用可能なヒドロキシ基１当量当たり６ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（０．８ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水１００ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール１５０ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成部分Ｏ−硫酸化ＭｅＨＡを水に溶解し、１と同様に透析および凍結乾燥することによって生成物（５１０ｍｇ）を収率６０％で得た。１Ｈ  ＮＭＲにより硫酸化ＳＤ＝１．０〜１．５であることが示された。
【００８６】
１０．Ｐ−ＯＳＦＨＡ−１（ＤＳ−２）（ＧＭ−２３１２０１）の調製
蒸留水５０ｍＬ中のＦＨＡ−１（ＭＷ９５０ｋＤａのＨＡ由来のＦＨＡ−１）（０．２５ｇ）にトリブチルアミン０．５ｍＬを加えて、上述した１と同様に処理することによってＦＨＡ−１のＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＦＨＡ−１−ＴＢＡ）をＤＭＦ２５ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＨＡ中の利用可能なヒドロキシ基１当量当たり６ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（０．４ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水５０ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール７５ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成部分Ｏ−硫酸化ＨＡを蒸留水に溶解し、１００ｍＭのＮａＣｌ溶液に対し２日間透析（溶液を１日４回交換）した後、凍結乾燥することによって生成物（２８０ｍｇ）を収率６８％で得た。１Ｈ  ＮＭＲで評価した硫酸化ＳＤ＝１．０〜１．５であった。
【００８７】
１１．Ｐ−ＯＳＦＨＡ−２（ＤＳ−２）（ＧＭ−３３１２０１）の調製
蒸留水５０ｍＬ中のＦＨＡ−２（ＭＷ９５０ｋＤａのＨＡ由来のＦＨＡ−２）（０．２５ｇ）にトリブチルアミン０．５ｍＬを加えて、上述した１と同様に処理することによってＦＨＡ−２のＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＦＨＡ−２−ＴＢＡ）をＤＭＦ２５ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＨＡ中の利用可能なヒドロキシ基１当量当たり６ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（０．４ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水５０ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール７５ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成部分Ｏ−硫酸化ＦＨＡ−２を水に溶解し、１と同様に透析および凍結乾燥することによって生成物（３００ｍｇ）を収率６９％で得た。１Ｈ  ＮＭＲで評価した硫酸化ＳＤ＝１．０〜１．５であった。
【００８８】
１２．Ｐ−ＯＳＭｅＨＡ（ＤＳ−２）（ＧＭ−１３１２０１）の調製
１と同様にして、ＴＢＡを０．５ｍＬおよび蒸留水５０ｍＬ中のＭｅＨＡ（ＤＳ−１）（ＭＷ９５０ｋＤａのＨＡ由来）（０．５ｇ）から、ＭｅＨＡのＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＭｅＨＡ−ＴＢＡ）を、ＤＭＦ５０ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＭｅＨＡ中の利用可能なヒドロキシ基１当量当たり６ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（０．８ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水１００ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール１５０ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成部分Ｏ−硫酸化ＭｅＨＡを水に溶解し、１と同様に透析および凍結乾燥することによって生成物（５６０ｍｇ）を収率６４％で得た。１Ｈ  ＮＭＲによりＳＤ＝１．０〜１．５であることが示された。
【００８９】
１３．ＬＭＷ−Ｆ−ＯＳＦＨＡ−１（ＤＳ−１）（ＧＭ−２１２１０１）の調製
蒸留水５０ｍＬ中のＦＨＡ−１（ＭＷ５３ｋＤａのＨＡ由来のＦＨＡ−１）（０．２５ｇ）にトリブチルアミン０．５ｍＬを加えて、上述した１と同様に処理することによってＬＭＷ  ＦＨＡ−１のＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＦＨＡ−１−ＴＢＡ）をＤＭＦ２５ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＨＡ中の利用可能なヒドロキシ基１当量当たり１２ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（０．８ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水５０ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール７５ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成部分Ｏ−硫酸化ＨＡを蒸留水に溶解し、１００ｍＭのＮａＣｌ溶液に対し２日間透析（溶液を１日に４回交換）した後、凍結乾燥することによって生成物（３００ｍｇ）を収率７１％で得た。１Ｈ  ＮＭＲで評価したＳＤ＝１．５〜２．０であった。
【００９０】
１４．ＬＭＷ−Ｆ−ＯＳＦＨＡ−２（ＤＳ−１）（ＧＭ−３１２１０１）の調製
蒸留水５０ｍＬ中のＦＨＡ−２（ＭＷ５３ｋＤａのＨＡ由来のＦＨＡ−２）（０．２５ｇ）にトリブチルアミン０．５ｍＬを加えて、上述した１と同様に処理することによってＬＭＷ  ＦＨＡ−２のＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＬＭＷ  ＦＨＡ−２−ＴＢＡ）をＤＭＦ２５ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＨＡ中の利用可能なヒドロキシ基１当量当たり１２ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（０．８ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水５０ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール７５ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成部分Ｏ−硫酸化ＬＭＷ  ＦＨＡ−２を水に溶解し、１と同様に透析および凍結乾燥することによって生成物（２６０ｍｇ）を収率６５％で得た。１Ｈ  ＮＭＲで評価した硫酸化ＳＤ＝１．５〜２．０であった。
【００９１】
１５．ＬＭＷ−Ｆ−ＯＳＭｅＨＡ（ＤＳ−１）（ＧＭ−１１２１０１）
１と同様にして、ＴＢＡを０．５ｍＬおよび蒸留水５０ｍＬ中のＬＭＷ  ＭｅＨＡ（ＤＳ−１）（ＭＷ５３ｋＤａのＨＡ由来）（０．５ｇ）からＬＭＷ  ＭｅＨＡのＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＬＭＷ  ＭｅＨＡ−ＴＢＡ）をＤＭＦ５０ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＭｅＨＡ中の利用可能なヒドロキシ基１当量当たり１２ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（１．８ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水１００ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール１５０ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成部分Ｏ−硫酸化ＭｅＨＡを水に溶解し、１と同様に透析および凍結乾燥することによって生成物（４８０ｍｇ）を収率６０％で得た。１Ｈ  ＮＭＲにより硫酸化ＳＤ＝１．５〜２．０であることが示された。
【００９２】
１６．ＬＭＷ−Ｆ−ＯＳＦＨＡ−１（ＤＳ−２）（ＧＭ−２１２２０１）の調製
蒸留水５０ｍＬ中のＦＨＡ−１（ＭＷ５３ｋＤａのＨＡ由来のＦＨＡ−１）（０．２５ｇ）にトリブチルアミン０．５ｍＬを加えて、上述した１と同様に処理することによってＬＭＷ  ＦＨＡ−１のＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＦＨＡ−１−ＴＢＡ）をＤＭＦ２５ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＨＡ中の利用可能なヒドロキシ基１当量当たり１２ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（０．８ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水５０ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール７５ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成部分Ｏ−硫酸化ＨＡを蒸留水に溶解し、１００ｍＭのＮａＣｌ溶液に対し２日間透析（溶液を１日４回交換）した後、凍結乾燥することによって生成物（３００ｍｇ）を収率７０％で得た。１Ｈ  ＮＭＲで評価した硫酸化ＳＤ＝１．５〜２．０であった。
【００９３】
１７．ＬＭＷ−Ｆ−ＯＳＦＨＡ−２（ＤＳ−２）（ＧＭ−３１２２０１）の調製
蒸留水５０ｍＬ中のＦＨＡ−２（ＭＷ５３ｋＤａのＨＡ由来のＦＨＡ−２）（０．２５ｇ）にトリブチルアミン０．５ｍＬを加え、上述した１と同様に処理することによってＬＭＷ  ＦＨＡ−２のＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＬＭＷ  ＦＨＡ−２−ＴＢＡ）をＤＭＦ２５ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＨＡ中の利用可能なヒドロキシ基１当量当たり１２ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（０．８ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水５０ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール７５ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成部分Ｏ−硫酸化ＬＭＷ  ＦＨＡ−２を水に溶解し、１と同様に透析および凍結乾燥することによって生成物（３００ｍｇ）を収率６８％で得た。１Ｈ  ＮＭＲで評価した硫酸化ＳＤ＝１．５〜２．０であった。
【００９４】
１８．ＬＭＷ−Ｆ−ＯＳＭｅＨＡ（ＤＳ−２）（ＧＭ−１１２２０１）の調製
１と同様にして、ＴＢＡを０．５ｍＬおよび蒸留水５０ｍＬ中のＬＭＷ  ＭｅＨＡ（ＤＳ−１）（ＭＷ５３ｋＤａのＨＡ由来）（０．５ｇ）からＬＭＷ  ＭｅＨＡのＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＬＭＷ  ＭｅＨＡ−ＴＢＡ）をＤＭＦ５０ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＭｅＨＡ中の利用可能なヒドロキシ基１当量当たり１２ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（１．６ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水１００ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール１５０ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成部分Ｏ−硫酸化ＭｅＨＡを水に溶解し、１と同様に透析および凍結乾燥することによって生成物（５５０ｍｇ）を収率６３％で得た。１Ｈ  ＮＭＲにより硫酸化ＳＤ＝１．５であることが示された。
【００９５】
１９．Ｆ−ＯＳＦＨＡ−１（ＤＳ−１）（ＧＭ−２３２１０１）の調製
蒸留水５０ｍＬ中のＦＨＡ−１（ＭＷ９５０ｋＤａのＨＡ由来のＦＨＡ−１）（０．２５ｇ）にトリブチルアミン０．５ｍＬを加え、上述した１と同様に処理することによってＦＨＡ−１のＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＦＨＡ−１−ＴＢＡ）をＤＭＦ２５ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＨＡ中の利用可能なヒドロキシ基１当量当たり１２ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（０．８ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水５０ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール７５ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成部分Ｏ−硫酸化ＨＡを蒸留水に溶解し、１００ｍＭのＮａＣｌ溶液に対し２日間透析（溶液を１日４回交換）した後、凍結乾燥することによって生成物（３００ｍｇ）を収率６８％で得た。１Ｈ  ＮＭＲで評価した硫酸化ＳＤ＝１．５であった。
【００９６】
２０．Ｆ−ＯＳＦＨＡ−２（ＤＳ−１）（ＧＭ−３３２１０１）の調製
蒸留水５０ｍＬ中のＦＨＡ−２（ＭＷ９５０ｋＤａＨＡ由来のＦＨＡ−２）（０．２５ｇ）にトリブチルアミン０．５ｍＬを加えて、上述した１と同様に処理することによってＦＨＡ−２のＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＦＨＡ−２−ＴＢＡ）をＤＭＦ２５ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＨＡ中の利用可能なヒドロキシ基１当量当たり１２ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（０．８ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水５０ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール７５ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成部分Ｏ−硫酸化ＦＨＡ−２を水に溶解し、１と同様に透析および凍結乾燥することによって生成物（３１０ｍｇ）を収率７０％で得た。１Ｈ  ＮＭＲで評価した硫酸化ＳＤ＝１．５〜２．０であった。
【００９７】
２１．Ｆ−ＯＳＭｅＨＡ（ＤＳ−１）（ＧＭ−１３２１０１）の調製
１と同様にして、ＴＢＡを０．５ｍＬおよび蒸留水５０ｍＬ中のＭｅＨＡ（ＭＷ９５０ｋＤａのＨＡ由来）（ＤＳ−１）（０．５ｇ）からＭｅＨＡのＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＭｅＨＡ−ＴＢＡ）をＤＭＦ５０ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＭｅＨＡ中の利用可能なヒドロキシ基１当量当たり１２ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（１．６ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水１００ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール１５０ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成部分Ｏ−硫酸化ＭｅＨＡを水に溶解し、１と同様に透析および凍結乾燥することによって生成物（５００ｍｇ）を収率６０％で得た。１Ｈ  ＮＭＲにより硫酸化ＳＤ＝１．５〜２．０であることが示された。
【００９８】
２２．Ｆ−ＯＳＦＨＡ−１（ＤＳ−２）（ＧＭ−２３２２０１）の調製
蒸留水５０ｍＬ中のＦＨＡ−１（ＭＷ９５０ｋＤａのＨＡ由来のＦＨＡ−１）（０．２５ｇ）にトリブチルアミン０．５ｍＬを加えて、上述した１と同様に処理することによってＦＨＡ−１のＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＦＨＡ−１−ＴＢＡ）をＤＭＦ２５ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＨＡ中の利用可能なヒドロキシ基１当量当たり１２ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（０．８ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水５０ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール７５ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成部分Ｏ−硫酸化ＨＡを蒸留水に溶解し、１００ｍＭのＮａＣｌ溶液に対し２日間透析（溶液を１日４回交換）した後、凍結乾燥することによって生成物（３００ｍｇ）を収率６９％で得た。１Ｈ  ＮＭＲで評価した硫酸化ＳＤ＝１．５〜２．０であった。
【００９９】
２３．Ｆ−ＯＳＦＨＡ−２（ＤＳ−２）（ＧＭ−３３２２０１）の調製
蒸留水５０ｍＬ中のＦＨＡ−２（ＭＷ９５０ｋＤａのＨＡ由来のＦＨＡ−２）（０．２５ｇ）にトリブチルアミン０．５ｍＬを加えて、上述した１と同様に処理することによってＦＨＡ−２のＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＦＨＡ−２−ＴＢＡ）をＤＭＦ２５ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＨＡ中の利用可能なヒドロキシ基１当量当たり１２ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（０．８ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水５０ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール７５ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成部分Ｏ−硫酸化ＦＨＡ−２を水に溶解し、１と同様に透析および凍結乾燥することによって生成物（３００ｍｇ）を収率６９％で得た。１Ｈ  ＮＭＲで評価した硫酸化ＳＤ＝１．５〜２．０であった。
【０１００】
２４．Ｆ−ＯＳＭｅＨＡ（ＤＳ−２）（ＧＭ−１３２２０１）の調製
１と同様にして、ＴＢＡを０．５ｍＬおよび蒸留水５０ｍＬ中のＭｅＨＡ（ＤＳ−１）（ＭＷ９５０ｋＤａのＨＡ由来）（０．５ｇ）からＭｅＨＡのＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＭｅＨＡ−ＴＢＡ）をＤＭＦ５０ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＭｅＨＡ中の利用可能なヒドロキシ基１当量当たり１２ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（１．６ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水１００ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール１５０ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成部分Ｏ−硫酸化ＭｅＨＡを水に溶解し、１と同様に透析および凍結乾燥することによって生成物（５５０ｍｇ）を収率６３％で得た。１Ｈ  ＮＭＲにより硫酸化ＳＤ＝１．５〜２．０であることが示された。
【０１０１】
２５．Ｐ−ＯＳＢＧＨＡ（ＧＭ−４３１１０１）の調製
１と同様にして、ＴＢＡを０．５ｍＬおよび蒸留水５０ｍＬ中のＢＧＨＡ（ＭＷ９５０ｋＤａのＨＡ由来）（０．５ｇ）からＢＧＨＡのＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＢＧＨＡ−ＴＢＡ）をＤＭＦ５０ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＢＧＨＡ中の利用可能なヒドロキシル基１当量当たり６ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（０．８ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水１００ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール１５０ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成Ｏ−硫酸化ＢＧＨＡを水に溶解し、１と同様に透析および凍結乾燥することによって生成物（５００ｍｇ）を収率６０％で得た。１Ｈ  ＮＭＲにより硫酸化ＳＤ＜１であることが示された。
【０１０２】
２６．Ｆ−ＯＳＢＧＨＡ（ＧＭ−４３２１０１）の調製
１と同様にして、ＴＢＡを０．５ｍＬおよび蒸留水５０ｍＬ中のＢＧＨＡ（ＭＷ９５０ｋＤａのＨＡ由来）（０．５ｇ）からＢＧＨＡのＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＢＧＨＡ−ＴＢＡ）をＤＭＦ５０ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＢＧＨＡ中の利用可能なヒドロキシル基１当量当たり１２ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（１．６ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水１００ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール１５０ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成Ｏ−硫酸化ＢＧＨＡを水に溶解し、１と同様に透析および凍結乾燥することによって生成物（５２０ｍｇ）を収率６１％で得た。１Ｈ  ＮＭＲにより硫酸化ＳＤ＜１であることが示された。
【０１０３】
２７．Ｐ−ＯＳＢＧＨＡ（ＧＭ−４１１１０１）の調製
１と同様にして、ＴＢＡを０．５ｍＬおよび蒸留水５０ｍＬ中のＢＧＨＡ（ＭＷ５３ｋＤａのＨＡ由来）（０．５ｇ）からＢＧＨＡのＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＢＧＨＡ−ＴＢＡ）をＤＭＦ５０ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＢＧＨＡ中の利用可能なヒドロキシル基１当量当たり６ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（０．８ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水１００ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール１５０ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成Ｏ−硫酸化ＢＧＨＡを水に溶解し、１と同様に透析および凍結乾燥することによって生成物（５００ｍｇ）を収率６０％で得た。１Ｈ  ＮＭＲにより硫酸化ＳＤ＜１であることが示された。
【０１０４】
２８．Ｐ−ＯＳＢＧＨＡ（ＧＭ−４１２１０１）の調製
１と同様にして、ＴＢＡを０．５ｍＬおよび蒸留水５０ｍＬ中のＢＧＨＡ（ＭＷ５３ｋＤａのＨＡ由来）（０．５ｇ）からＢＧＨＡのＴＢＡ塩を調製した。結果として得られた塩（ＢＧＨＡ−ＴＢＡ）をＤＭＦ５０ｍＬに溶解し、所要の過剰（ＢＧＨＡ中の利用可能なヒドロキシル基１当量当たり１２ｍｏｌ）のピリジン−三酸化硫黄錯体（１．６ｇ）を加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水１００ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール１５０ｍＬを加えて粗生成物を析出させた後、濾過して回収した。結果として得られた粗生成Ｏ−硫酸化ＢＧＨＡを水に溶解し、１と同様に透析および凍結乾燥することによって生成物（５００ｍｇ）を収率６０％で得た。１Ｈ  ＮＭＲにより硫酸化ＳＤ＜１であることが示された。
【０１０５】
ＩＩＩ．蛍光ＳＡＧＥおよびパルミトイル化ＳＡＧＥの調製
ａ．ＬＭＷ−Ｆ−ＯＳＦＨＡ−１（ＤＳ−２）蛍光体複合体の調製
ＬＭＷ−Ｆ−ＯＳＦＨＡ−１（５０ｍｇ）およびＮＨＳ（４０ｍｇ）を水１０ｍＬに溶解し、次いで、ＤＭＦ４ｍＬ中のＡｌａｘａ  ｆｌｕｏ＠４８８（１ｍｇ）を加えた。次いで、ｐＨを４．７５に調節した後、固体形態のＥＤＣＩ１００ｍｇを加えた。ＮａＯＨ溶液を加えてｐＨを４．７５に維持した。溶液をアルミニウム箔で覆って室温で一夜撹拌した。次いで、生成物を蒸留水、続いて、メタノール／水溶液（５０／５０、ｖ／ｖ）で透析（カットオフＭＷ３５００）することにより精製し、さらにゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５）で精製した。さらにＰＤ−１０カラムで精製し、凍結乾燥によって４０ｍｇを得た。
【０１０６】
ｂ．ＬＭＷ−Ｐ−ＯＳＭｅＨＡ（ＤＳ−１）蛍光体複合体の調製
ＬＭＷ−Ｐ−ＯＳＭｅＨＡ（５０ｍｇ）およびＮＨＳ（４０ｍｇ）を水１０ｍＬに溶解した後、ＤＭＦ４ｍＬ中のＡｌａｘａ  ｆｌｕｏ＠４８８（１ｍｇ）を加えた。次いで、ＰＨを４．７５に調節した後、固体形態のＥＤＣＩ１００ｍｇを加えた。ＮａＯＨ溶液を加えてｐＨを４．７５に維持した。溶液をアルミニウム箔で覆って室温で一夜撹拌した。次いで、生成物を蒸留水、続いてメタノール／水溶液（５０／５０、ｖ／ｖ）で透析（カットオフＭＷ３５００）することにより精製し、さらにゲル濾過カラム（Sephadex G-25）で精製した。さらにＰＤ−１０カラムで精製し、凍結乾燥によって４３ｍｇを得た。
【０１０７】
ｃ．パルミトイル化ＳＡＧＥの調製
ＬＭＷ−Ｐ−ＯＳＭｅＨＡ（５０ｍｇ）をＤＭＦ５０ｍＬに溶解し、このＤＭＦ溶液を撹拌しながらトリエチルアミン（０．３ｍＬ）を加えた。５分後に塩化パルミトイル（０．５ｍＬ）を加えた。結果として得られた混合物を一夜撹拌し続けた。溶液を蒸発させ、残渣を蒸留水に溶解し、１日間透析し（水を４回交換した）、凍結乾燥することにより３５ｍｇを得た。
【０１０８】
ＩＶ．ＳＡＧＥは、Ｐ−セレクチン、ヒト白血球エラスターゼ、およびＲＡＧＥとそのあらゆるリガンドとの相互作用の強力な阻害物質である。
材料：ポリクローナルヤギ抗ヒトＲＡＧＥ、組換え型ヒトハイモビリティー・ボックス・プロテイン−１（ＨＭＧＢ−１）、組換え型ヒトＰ−セレクチン／Ｆｃキメラ、組換え型ヒトＲＡＧＥ／Ｆｃキメラ、ヒトアズロシジン、およびポリクローナルヤギ抗ヒトアズロシジンを、R&D Systems（Minneapolis,MN）より購入した。ヒトＳ１００ｂカルグラニュリンはCalbiochem(San Diego,CA)より入手した。終末糖化産物カルボキシメチルリジン−ウシ血清アルブミン（ＣＭＬ−ＢＳＡ）は、ＭＢＬ  International(Woburn,MA)より入手した。Ｕ９３７ヒト単球細胞は、American Type Culture Collection(Manassas,VA)より入手した。Ａタンパク、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧ、炭酸−重炭酸緩衝液、およびウシ血清アルブミンブロッカー（１０×）は、Piercenet(Rockford,IL)より入手した。カルセインＡＭ、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ＨＥＰＥＳ、非必須アミノ酸、ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン溶液、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｌ−グルタミン非含有）、および炭酸水素ナトリウムはInvitrogen(Carlsbad,CA)より入手した。高結合能９６穴マイクロプレートは、Corning Life Sciences(Corning,NY)より入手した。他の明記されていない薬品はすべてSigma-Aldrich(St.Louis,MO)より購入した。
【０１０９】
細胞培養：Ｕ９３７単球を、１０％加熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１００単位／ｍＬ  ペニシリン、および１００ｍｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０を用いて、加湿ＣＯ２（５％）−空気（９５％）中、懸濁培養により３７℃で培養した。１〜５代の細胞を用いて実験を行った。
【０１１０】
細胞結合アッセイ：Ｕ９３７単球とＰ−セレクチンまたはＲＡＧＥとの結合に対するＳＡＧＥの影響を、Ａタンパク８μｇ／ｍＬ（５０μｇ／ウェル）を含む０．２Ｍ炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．４）でコーティングした高結合能マイクロプレートを用いて調査した。プレートを１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−ＢＳＡ）で洗浄し、Ｐ−セレクチン−ＦｃまたはＲＡＧＥ−Ｆｃキメラ（５０μＬ、１μｇ含有）を各ウェルに分注して、それぞれ室温で２時間または４℃で一夜インキュベートした。インキュベート後、ウェルをＰＢＳ−ＢＳＡで洗浄した。２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭカルシウム、および２ｍＭマグネシウム含有）で段階希釈（０〜１０００μｇ／ｍＬ）したＳＡＧＥ５０μＬを各ウェルに加え、室温で１５分間インキュベートした。陰性対照として、カルシウムを捕捉することによって細胞との結合を阻止するように、選択したウェルに１０ｍＭ  ＥＤＴＡ５０μＬを加えた。インキュベーション完了後、Ｕ９３７細胞（１０５細胞／ウェル、製造業者の指示に従いカルセイン標識）５０μＬを各ウェルに加えて、プレートをさらに室温で３０分間インキュベートした。次いで、ウェルをＰＢＳで３回洗浄した後、トリス−ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有緩衝液１００μＬを加えて、結合した細胞を溶解した。マイクロプレートリーダーを用いて４９４ｎｍで励起、５１７ｎｍで発光させて蛍光を測定した。
【０１１１】
固相結合分析：固相結合分析を用いて、ＲＡＧＥとそのリガンドとの結合をＳＡＧＥが阻害する能力を調査した。ＲＡＧＥとリガンドとの結合に及ぼすＳＡＧＥの影響を調査するために、ポリビニル９６穴プレートを特定のリガンド（ＣＭＬ−ＢＳＡ、ＨＭＧＢ−１、またはＳ１００ｂカルグラニュリン）５μｇ／ウェルでコーティングした。プレートを４℃で一夜インキュベートした後、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。これとは別に、ＲＡＧＥ−Ｆｃキメラ（ＰＢＳＴ−０．１％ＢＳＡ中、０．５μｇ／ｍＬ含有）１００μＬを等量の段階希釈したＳＡＧＥ（ＰＢＳＴ−ＢＳＡ中、０．００１から１０００μｇ／ｍＬ）と一緒に４℃でインキュベートした。翌日、ＲＡＧＥ−ＳＡＧＥ混合物各５０μＬを、リガンドをコーティングした各ウェルに移し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄した。結合したＲＡＧＥを検出するために、抗ＲＡＧＥ抗体（０．５μｇ／ｍＬ）５０μＬを各ウェルに加え、混合物を室温で１時間インキュベートし、ウェルを再度ＰＢＳＴで４回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（抗体をＰＢＳＴで１：１００００に希釈；５０μＬ／ウェル）を加え、ウェルを室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで１回洗浄した。テトラメチルベンジジン色素原(TMB single solution色素原)５０μＬを加えて呈色反応を開始し、１５分後、１ＮのＨＣｌを５０μＬ加えることによって停止した。自動マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１１２】
酵素的試験：陽性荷電ＰＭＮプロテアーゼＨＬＥのＳＡＧＥによる阻害を評価するために、活性検定（Fryer A、Huang Y-C、Rao G、Jacoby D、Mancilla E、Whorton R、Piantadosi CA、Kennedy T、Hoidal J、選択的Ｏ−脱硫酸化により肺で薬理活性を維持する非抗凝固性ヘパリンが生成する(Selective O-desulfation produces nonanticoagulant heparin that retains pharmacologic activity in the lung.)、J Pharmacol Exp Ther 282:208-219、1997)を用いて、精製ＨＬＥが発色基質を切断する能力を測定した。ＨＬＥ（１００ｎＭ）をＳＡＧＥ（１〜１００ｎＭ）と一緒に０．５Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中で１５分間インキュベートした。インキュベート後、エラスターゼ基質であるＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ｐ−ニトロアニリン（ｐ−ＮＡ）を反応混合物に加えて最終濃度を０．３ｍＭとした。４０５ｎｍの吸光度を測定することにより、加水分解によるｐ−ＮＡの遊離を１５分間追跡した。ＳＡＧＥが第ＸＩＩ因子または補体を活性化する能力を評価するために、汚染された市販のヘパリンの毒性をスクリーニングするために最近用いられているものと類似の活性検定を用いた(Kishimoto TK、Viswanathan K、Ganguly T、Elankumaran S、Smith S、Pelzer K、Lansing JC、Sriranganathan N、Zhao G、Galcheva-Gargova Z、Al-Hakim A、Bailey GS、Fraser B、Roy S、Rogers-Cotrone T、Buhse L、Whary M、Fox J、Nasr M、Dal Pan GJ、Shriver Z、Langer RS、Venkataranam G、Austen KF、Woodcock J、Sasisekharan R、臨床有害事象と接触系の活性化に関連する汚染ヘハ゜リン(Contaminated hepalin associated with adverse clinical events and activation of the contact system.)、N Engl J Med 358:2457-2467、2008;Guerrini M、Beccati D、Shriver Z、Naggi A、Viswanathan K、Bisio A、Capila I、Lansing JC、Guglieri S、Fraser B、Al-Hakim A、Gunay NS、Zhang Z、Robinson L、Buhse L、Nasr M、Woodcock J、Langer R、Venkataraman G、Linhardt RJ、Casu B、Torri G、Sasisekharan R、過硫酸化されたコンドロイチン硫酸が臨床有害事象に関連するヘパリンの汚染源である(Oversulfated chondroitin sulfate is a contaminant in hepalin associated with adverse clinical events.)、Nat Biotech 26:669-675、2008)。プールしたヒト血漿（５μＬ）をＳＡＨＡ（０．１〜１０００μｇ／ｍＬ）１００μＬと一緒に、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有０．０５Ｍ  ＨＥＰＥＳ中、５℃で５分間インキュベートした。Ｄ−シクロヒドロチロシル−Ｇｌｙｃ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐ−ＮＡを０．５ｍＭを加えて４０５ｎｍの吸光度変化を追跡することにより、ハーゲマン因子に特異的なアミダーゼ活性を測定した(Silverberg M、Dunn JT、Garen L、Kaplan AP、ヒトハーゲマン因子の自己活性化。合成基質を用いた実証(Autoactivation of human Hageman factor. Demonstration using a synthetic substrate.)、J Biol Chem 255:7281-7286、1980)。Ｄ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐ−ＮＡを加えて、４５０ｎｍの吸光度変化を追跡することにより、活性カリクレインに特異的なアミダーゼ活性を測定した。
【０１１３】
結果：検定の結果を表２に示す。ＳＡＧＥはＰ−セレクチンの強力な阻害剤である。Ｐ−セレクチン糖タンパクリガンド−１（ＰＳＧＬ−１）を介してＰ−セレクチンに強力に接着するＵ９３７ヒト単球のコンペティターを介した置換を、蛍光標識細胞を用いて調査した。図３から、ＳＡＧＥがＵ９３７とＰ−セレクチンとの結合を０．５μｇ／ｍＬの５０％阻止濃度（ＩＣ５０）で阻害することがわかる。
【０１１４】
【表２】
0005758797.tif 000003
【０１１５】
第２に、高度に硫酸化されたポリアニオンと同様、アルキル化および硫酸化されたＳＡＧＥは多形核白血球プロテアーゼの強力な阻害剤である。図４は、アルキル化および／またはフルオロアルキル化ならびに硫酸化されたＳＡＧＥがヒト白血球エラスターゼ（ＨＬＥ）を驚くほど強力なＩＣ５０値で阻害することを示すものである。具体的には、アルキル化されていない、完全にＯ−硫酸化されたＨＡ（Ｆ−ＯＳＨＡ）は、ＨＬＥに対するＩＣ５０が０．６６ｎＭである。修飾および硫酸化されたＨＡ誘導体のＩＣ５０値は、部分Ｏ−硫酸化カルボキシメチル化ＨＡ（Ｐ−ＯＳＣＨＭＨＡ）が１．８９ｎＭ、部分Ｏ−硫酸化ＨＡ（Ｐ−ＯＳＨＡ）が１．９７ｎＭ、部分Ｏ−硫酸化メチル化ＨＡ（Ｐ−ＯＳＭＥＨＡ；ＧＭ−１３１１０１）が３．４６ｎＭであった。
【０１１６】
第３に、ＳＡＧＥは、ＲＡＧＥの極めて強力な阻害剤である。ＳＡＧＥは、ＲＡＧＥおよびアンホテリン（ＨＭＧＢ−１）の相互作用をＩＣ５０が１．１μｇ／ｍＬで阻害し（図５）、ＲＡＧＥおよびＳ１００カルグラニュリンの相互作用をＩＣ５０が６０ｎｇ／ｍＬ（図６）で阻害し、ＲＡＧＥとＡＧＥ産物であるカルボキシメチル−リジンＢＳＡとの結合をＩＣ５０が４４ｎｇ／ｍＬで阻害する（図７）。これらの値は、ヘパリンおよび２−Ｏ，３−Ｏ脱硫酸化ヘパリンを用いて本発明者らが測定したＲＡＧＥ−リガンド阻害に関する対応するレベルよりも５〜１０倍強力である。
【０１１７】
第４に、ＳＡＧＥは、ヒトケラチン生成細胞増殖の強力な阻害剤である。これらの検定においては、ヒト新生児表皮ケラチン生成細胞をＳＡＧＥまたは他の阻害剤の存在下および非存在下に培養し、染色液を加えることによって増殖を測定（存在する生細胞数に正比例して低くなる）した。図に示した吸光度値は、対照（相対吸光度を１．０とした）に対して標準化したものである。図８から、高分子量部分Ｏ−硫酸化ＨＡ（Ｐ−ＯＳＨＡ）および完全Ｏ−硫酸化ＨＡ（Ｆ−ＯＳＨＡ）を１００μｇ／ｍＬの濃度で添加した場合、ヘパリン誘導体である２−Ｏ，３−Ｏ脱硫酸化ヘパリン（ＯＤＳＨ）よりもケラチン生成細胞の増殖抑制に関し有効であったことがわかる。部分硫酸化カルボキシメチル化ＨＡ（Ｐ−ＯＳＣＭＨＡ）およびメチル化ＨＡ（Ｐ−ＯＳＭＥＨＡ；ＧＭ−１３１１０１）はケラチン生成細胞増殖の阻害活性がより低いことから、硫酸化度がより高い方が有利であることがわかる。図９から、本検定においては、全体的により高分子量の誘導体よりもより低分子量の（ＬＭＷ）誘導体がケラチン生成細胞増殖の低下に関し有効であることがわかる。特に、ＬＭＷ部分Ｏ−硫酸化ＭｅＨＡ（ＬＭＷ−Ｐ−ＯＭＥＨＡ；ＧＭ−１１１２０１）、部分Ｏ−硫酸化ＣＭＨＡ（ＬＭＷ−Ｐ−ＯＳＣＭＨＡ）、および部分Ｏ−硫酸化５３ｋＤａ  ＨＡそのもの（ＬＭＷ−Ｐ−ＯＳＨＡ）はいずれも１μｇ／ｍＬという低濃度においても対照よりも増殖を低下させている。
【０１１８】
Ｖ．酒さおよび炎症の治療に関するＩｎ  Ｖｉｖｏ試験
材料および方法
薬品：ＧＭ−１１１１０１、ＧＭ−１３１１０１、ＧＭ−３１２１０１、およびＧＭ−２１２１０１について評価した。培地はAmerican Type Culture Collection(ATCC)より購入した。EpiLife培地はInvitrogen(Madison,WI)より購入した。
【０１１９】
細胞：ヒト皮膚線維芽細胞（ｎＨＤＦ）はＡＴＣＣより購入した。ヒト新生児皮膚ケラチン生成細胞（ＨＥＫｎ）はInvitrogen(Madison,WI)より入手した。
【０１２０】
細胞毒性：９６穴平底マイクロプレートの培地１００μＬを含む各ウェルに４０００個のｎＨＤＦ細胞を播種し、５％ＣＯ２中、３７℃で１２時間インキュベートした。すべての培地を、各種硫酸化ヒアルロナン（ＨＡ）誘導体を含む完全培地で、各段の最終濃度が１０、１００、１０００、１００００、１０００００、１００００００ｎｇ／ｍＬとなるように交換した。４８時間後、各ウェルにＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）２０μＬをピペットで分注し、細胞をさらに２時間インキュベートした。試料の４９０ｎｍにおける吸光度を９６穴プレートリーダーで測定した。
【０１２１】
マウスの皮膚刺激性試験：マウスの皮膚に対するＧＭ−１１１１０１およびＧＭ−２１２１０１の皮膚刺激性を判定するためにｉｎ  ｖｉｖｏ試験を実施した。それぞれ０．１ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬの２種の異なる濃度で２種の被験試薬を調製した。１０％ギ酸およびＰＢＳをそれぞれ陽性および陰性対照として用いた（ｎ＝６）。過去に実験に使用したことがなく、試験開始よりも前に皮膚炎、外傷、または臨床に不利な徴候を示していないことが認められているＢａｌｂ／ｃマウスを計画された試験条件に無作為に群分けした。動物の背部毛を、試料を塗布する少なくとも４時間前に電気バリカンですべて刈毛しておいた。被験物質を塗布する直前に、各マウスの被験部位の下側の区域に滅菌針を用いて皮膚に４本の平行な傷を付け、被験部位の上側の区域は無傷のままとした。麻酔下で２種類の被験溶液の試料０．５ｍＬを被験部位全体に塗布し、皮膚の約２．５ｃｍ角の範囲にガーゼを二重にして載せた。この貼布にプラスチックを裏張りし、非反応性テープで覆い、被験部位全体を包帯で巻いた。動物をそれぞれのケージに戻した。試剤を施用してから２４時間後、包帯および濡れた試験用ガーゼを取り除いた。被験部位を水道水で拭き、残留している被験化合物を除去した。化合物を塗布してから２４および７２時間後に被験部位の皮膚反応をＦＨＳＡが推奨するドレイズ評価基準に従い調査した。試験終了後、試験品の一次刺激指数（Ｐ．Ｉ．Ｉ．）を求めることになる。Ｐ．Ｉ．Ｉ．評点が５．００以上の物質が陽性とみなされることになり、この物質が皮膚の一次刺激物とみなされることになる。
【０１２２】
動物：市販のＢａｌｂ／ｃマウスを、Univ.of Utah veterinary medicine department and vivarium承認の供給業者から購入した。受領書に従い規定の期間検疫を行った後、すぐに試験に用いることができる。
【０１２３】
ＬＬ３７ペプチドおよびＳＡＧＥを注射した酒さモデル：皮膚の慢性疾患、特に、酒さが顔面に現れた場合は、患者の人生に忘れ難い傷跡を残す。我々の種は他人の外見を受け容れたり拒否したりし、普通とは違う外見を持つ、自分とは異なる者がいると思わず尻込みしてしまう。皮膚疾患は多くの場合生命に関わることはないが、普通の人には推し量れない形で生活を一変させてしまう。酒さは、このように生活を一変させてしまう病気の１つである。米国の人口の３％すなわち約１４００万人の米国人が酒さを患っている、顔面の見た目が悪くなる一般的な皮膚疾患であり、普通は３０〜５０歳で発症する。主としてケルト系の白人が冒され、男性よりも女性の方が問題を抱えているようである。患者の３分の１以上は家族歴があり、それが遺伝病であることを強く示唆している。顔面紅潮や凸凹した鼻を伴う酒さは、飲酒のし過ぎであるというありがちな誤解を受けることから、特に汚名を着せられやすい病気である。酒さは幾つかの臨床表現型を示す。最も一般に知られている症状は、頬や鼻の毛細血管が拡張することによる一過性または持続性の顔面中心部の紅潮および紅斑を特徴とするものである。この表現型は、「赤ら顔」程度から、容易に認められる持続的な血管拡張に及ぶ。この亜型には有効な局所治療がない。その次に広く知られている症状は、顔の中心の凸状部に発生する丘疹および膿疱であり、紅斑の上に重なることが多い。生検によると、その皮膚には多くのＰＭＮが浸潤している。酒さ性ざ瘡は、抗生物質の局所または全身投与によって経験的に治療が行われているが、皮膚感染症例との関連が明確ではない。マクロライドは、局所または全身のいずれの治療にも最も多く用いられており、その抗菌活性よりもむしろＰＭＮの炎症部位への遊走能を遅延させる能力によって改善が得られる可能性がある。第３に、そしてより稀な表現型であることは幸いであるが、酒さにより、鼻の皮脂腺および結合組織の両方が過形成することによって鼻瘤が生じ、昔で言うところの「W.C.Fields」の鼻または「酔っぱらいの鼻(whiskey nose)」になる。この症状の治療には、肥厚化した組織を除去するために外科的に組織を切除するかまたはレーザー治療が必要となる。第４の表現型においては、酒さによって眼瞼の炎症を伴う眼の乾燥および痒み（眼瞼炎）、光過敏、かすみ目、および結膜炎が生じる場合がある。疾患が長引くと、角膜炎や、それどころか角膜瘢痕が生じる可能性がある。眼瞼および下眼瞼表面にあるマイボーム腺の炎症によって起こるこの表現型は一般的なものであり、臨床的には眼科医がよく診察する「眼球乾燥」症候群と重複する。肌の色が白く眼の色が明るい人の日光が当たる顔面領域のみに酒さが発生することは、この状態を引き起こす太陽放射の病原的意義を示している。
【０１２４】
最近になって酒さの病因が解明された(Yamasaki K、Di Nardo A、Bardan A、Murakami M、Ohtake T、Coda A、Dorschner RA、Bonnart C、Descargues P、Hovnanian A、Morhenn VB、Gallop RL、セリンプロテアーゼ活性の亢進とカテリシジンの増加が酒さによる皮膚の炎症を促進する(Increased serine protease activity and cathelicidin promotes skin inflammation in rosacea.)、Nat Med 13:975-980、2007;Bevins CL、Liu F-T、酒さ：皮膚本来の免疫がうまく機能していない？(Rosacea:skin innate immunity gone awry?)、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １３：９０４−９０６、２００７）。Yamasakiらの見事な研究により、酒さを伴う皮膚には、カテリシジンおよびそのプロセシングプロテアーゼであるＳＣＴＥが高濃度で存在することが実証された。哺乳類の抗菌ペプチドの主要なファミリーであるカテリシジンは、多くの臓器の白血球および上皮細胞で発現し、ここで細菌に対する自然免疫応答を媒介する(Nizet V、Ohtake T、Lauth X、Trowbridge Jk、Rudisill J、Dorschner RA、Prestonjamasp V、Piraino J、Huttner K、Gallop RL、生得的な抗菌ペプチドが侵襲性の細菌感染から皮膚を防御する(Innate antimicrobial peptide protects the skin from invasive bacterial infection.)、Nature 414:454-457、2001)。カテリシジンはまた、血管増殖、ＰＭＮ遊走、および創傷治癒のシグナルも伝達する(Bevins、ibid)。ヒトカテリシジンは、ケラチン生成細胞から１８ｋＤａのｈＣＡＰ１８プロペプチドとして分泌され、ＳＣＴＥによって切断されて、Ｃ末端に活性を持つ抗菌ペプチドＬＬ−３７（３７個のアミノ酸長および２個のＮ末端ロイシンより命名）となる。酒さを伴う皮膚には、不適切な高濃度のカテリシジンおよびＳＣＴＥの両方が確認されているが、刺激となる菌の侵入ははっきりしていない。初代ヒトケリチノサイテスを覆う培地にＬＬ−３７を添加すると、ＩＬ−８等の走化性サイトカインの産生が大幅に増強される。酒さを伴う皮膚に認められる濃度と類似の濃度でＬＬ−３７をマウスに皮内注射すると紅斑が生じ、ＰＭＮの真皮内浸潤が強力に刺激される。ＳＣＴＥを皮内注射した場合も野生型マウスに皮膚の紅斑およびＰＭＮの真皮内浸潤が認められるが、カテリシジン−／−マウスには認められない。したがって、酒さの特徴である炎症、過度の血管新生、および皮脂腺過形成を生じさせる炎症促進性の陽性荷電皮膚ペプチドが局所的に過剰発現することがこの疾患を媒介しているという考えを支持する一連の証拠が増えつつある。酒さ患者のほぼ全員から、両親に一定のパターンの反応性顔面紅潮や発赤があると聞き取ることができることから、酒さに遺伝的要因があることは臨床医には明らかである。
【０１２５】
酒さのモデルを作製するために、ＬＬ−３７を４８時間の間、１２時間毎に皮内注射した。Yamasakiらが報告したように、このモデルの皮膚には、紅斑および多形核白血球（ＰＭＮ）の顕著な皮内浸潤が生じた。Ｂａｌｂ／ｃマウスを調査前に剃毛し、背部の皮膚を剥き出しにした。２４時間後、剃毛した皮膚に、ビヒクル４０μｕＬ（リン酸緩衝生理食塩水ＰＢＳ）、陽性荷電ペプチド（ＰＢＳ中、濃度３２０μＭ）、ＳＡＧＥ（ＰＢＳ中３２０〜１２８０μＭ）、または陽性荷電ペプチド＋ＳＡＧＥ混合物（ペプチド＋１〜４倍モル濃度のＳＡＧＥ）を、３１ゲージの針を用いて、無傷の表皮に水疱が隆起するように計画された方法で皮内注射し、それによって表皮下または真皮レベルに投与していることが認識されるようにした。注射用に選択するＳＡＧＥは、新たに合成した１２種類のＳＡＧＥから選択した。これらは、生化学的試験において、ヒト白血球エラスターゼ（他の陽性荷電タンパク質として）の阻害剤としても、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）の４種類の一般的なリガンドによる活性化の拮抗剤としても、活性が極めて高いという試験結果が得られたものである。
【０１２６】
注射前にＳＡＧＥおよびペプチドをＰＢＳ中で一緒に混合し、注射前に室温で１５分間インキュベートした。その後、１２時間毎に反復注射を行った。最初の注射から４８時間後（合計４回注射）、動物にペントバルビタール２５ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与して軽麻酔を行った。マウスが睡眠状態になったら、皮膚の注射した部位を写真撮影して、紅斑および浮腫の重症度を視認できるように記録した。紅斑の強さを発赤評点（１〜５）で評価し、紅斑の範囲をノギスで測定した。次いで、６ｍｍ穴のパンチを用いて皮膚の注射した範囲を切除生検してヘマトキシリン−エオシン染色によって組織病理学的変化を検査するとともにミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を測定することによってＰＭＮ浸潤を評価した。皮膚表面の代表的な画像および各皮膚の組織像を高倍率のマイクロスコープで観察した。
【０１２７】
ＳＡＧＥで局所治療した酒さモデル：Ｂａｌｂ／ｃマウス背部のＬＬ３７を作用させる皮膚の範囲を予め剃毛した。次いで、ＳＡＧＥを５％（有効エモリエント成分）を含むヒアルロナン−ベースのエモリエント剤またはヒアルロン酸ベースのエモリエント剤を単独でこの皮膚の範囲に１２時間毎に局所塗布することを開始した。２４時間後、ビヒクル４０μＬ（ＰＢＳ）または陽性荷電ペプチド（濃度３２０μＭ）を剃毛した皮膚の皮下に上述した方法で注射した。注射およびエモリエント剤の局所塗布をその後１２時間毎に繰り返した。最初の注射から４８時間後（合計４回注射）、動物を上述したように軽麻酔した。皮膚の注射した範囲の写真を撮影することによって紅斑および浮腫の重症度を視認できるように記録した。紅斑の強さを発赤評点（１〜５）として評価し、紅斑の範囲をノギスで測定した。次いで、注射した皮膚の部位を６ｍｍ穴のパンチを用いて切除生検し、Ｈ＆Ｅ染色によって組織病理学的変化を検査するとともにミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を測定することによってＰＭＮ浸潤を評価した。
【０１２８】
ＳＡＧＥの真皮への侵入：調査を行う前に、Ｂａｌｂ／ｃマウス背部の皮膚の範囲を剃毛して剥き出しにした。１２時間毎にＳＡＧＥを皮膚に局所塗布した。４８時間後、動物を安楽死させて皮膚を生検した。次いで、皮膚の一部を蛍光顕微鏡で調査することによって、ＳＡＧＥが皮膚に侵入した深さを測定した。
【０１２９】
クロトン油炎症モデル：ＰＭＮが媒介する皮膚炎症の他のモデルとしてクロトン油を用いた。クロトン油は、皮膚細胞のプロテインキナーゼＣを活性化するフォルボールエステルを含有している。その結果として、皮膚細胞が大量のケモカインおよびケモタキシンを産生し、そのシグナル伝達によって血液中のＰＭＮが流入する。活性化されたＰＭＮは皮膚組織に紅斑および浮腫を生じさせる。クロトン油に誘発される炎症は、皮膚科で使用される抗炎症化合物のスクリーニングにおいて、ＰＭＮが媒介する皮膚炎症モデルとしてよく用いられている。
【０１３０】
このモデルを作製するために、クロトン油(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)をアセトンと混合して０．８％溶液とした。ピペットを用いてマウスの片方の耳介の各面に１０μＬを塗布し、他方の耳介は対照としてそのままにした。４、８、および２４時間後、軟骨隆起より遠位の頂部付近の耳介の厚みを測定した。そして、対照の耳介の厚みからの変化を浮腫の指標とした。紅斑の強さを発赤評点（１〜５）として評価し、紅斑の範囲をノギスで測定した。２４時間後に測定した後、マウスを安楽死させてすぐに耳介のパンチ生検（６ｍｍ穴パンチ）を実施し、重量を測定し、凍結させて−８０℃で保管し、Ｈ＆Ｅ染色によって組織病理学的変化を検査するとともにミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を測定することによってＰＭＮ浸潤を評価した。手順を標準化し、誤差を減らすために、すべての耳介に関する測定および生検を１人の検査員が行った。残りの耳介を取り除き、免疫組織化学用に包埋して凍結させた。
【０１３１】
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）測定。各マウスに対し組織生検（直径６ｍｍ穴のパンチ）を即座に実施し、重量を測定し、−８０℃で凍結させて保管した。組織のＭＰＯ活性を、Suzukiらの方法(Suzuki K、Ota H、Sasagawa S、Sakatani T、Fujikura T、ヒト多形核白血球中のミエロペルオキシダーゼ測定方法(Assay method for myeloperoxidase in human polymorphonuclear leukocytes.)、Anal Biochem 132:345-352、1983)をYoungら(Young JM、Spires DA、Bedord CJ、Wagner B、Ballaron SJ、De oung LM、局所的なアラキドン酸に対するマウス耳介の炎症応答(The mouse ear inflammatory response to tpical arachidonic acid.)、J Invest Dermatol 82:367-371、1984)によって改変されたものを用いて測定した。各マウスの生検組織を、ヘキサデシルトリメチル−アンモニウムブロミド（ＨＴＡＢ）０．５％を含む８０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ５．４）０．７５ｍＬに入れた。各試料を小型の実験室用Tissue Tearor Homogenizer Model 985-370(Biospec Products,Bartlesville,OK)で４℃で４５秒間ホモジナイズした。ホモジネートを定量的に微小遠心管に移し、ＰＢＳ中のＨＴＡＢを０．７５ｍＬを加えた。試料１．５ｍＬを４℃に維持しながら１２０００×ｇで１５分間遠心分離した。結果として得られた上清の試料３０ｕＬをトリプリケートで９６穴マイクロタイタープレートのウェルに加えた。ＭＰＯ測定を行うため、８０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ５．４）１００ｕＬ、０．２２ＭのＰＢＳ（ｐＨ５．４）８５ｕＬ、および０．０１７％の過酸化水素１５ｕＬを含む混合物２００ｕＬを各ウェルに加えた。８％ジメチルホルムアミド水溶液中の１８．４ｍＭのテトラメチルベンジジンＨＣｌを２０ｕＬを加えて反応を開始した。マイクロタイタープレートを３７℃で３分間インキュベートした後、氷に載せた。１．４６Ｍの酢酸ナトリウム３０ｕＬを加えて反応を停止した。ＭＰＯ酵素活性を波長６３０ｎｍの吸光度で評価した。ＭＰＯ活性を光学濃度（ＯＤ）／生検として表した。
【０１３２】
統計解析。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に関する実験はすべてトリプリケートで実施した。Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ検定を用いて平均値を比較することにより試料の有意差を計算した。ｐ＜０．０５を有意差ありと宣言した。
【０１３３】
結果
ＬＬ３７ペプチドおよびＳＡＧＥを注射した酒さモデル：陽性荷電カテリシジンを直接中和すると皮膚内の炎症活性が阻害されるかどうかを確認するために、ＬＬ３７単独、ＳＡＧＥ（ＧＭ−１１１１０１）単独、ビヒクル（ＰＢＳ）単独、またはＬＬ３７およびＳＡＧＥの混合物をマウス背部の剃毛した範囲に、その後１２時間毎に皮下注射した。４８時間後にマウスを屠殺し、異なる処理群の肉眼解剖写真を撮影した（図１０ａおよび１０ｂ）。ヘマトキシリン−エオシン染色を用いた組織学的研究から、白血球の浸潤の増大および顕著な皮膚の浮腫が認められる一方、誘発直後にＳＡＧＥを投与すると皮膚の腫脹反応が阻止されることが示された（図１０ｃおよび１０ｄ）。
【０１３４】
皮膚の評点の個々の結果を紅斑面積（図１０ｆ）および紅斑の発赤評点（図１０ｇ）で表した。４８時間後、ＳＡＧＥ処理群は、紅斑面積が劇的に減少するとともに発赤評点が大幅に低下することが示された。注射の４８時間後に組織のパンチ生検を行い、ＰＭＮ浸潤の指標としてミエロペルオキシダーゼ活性を測定した。ＳＡＧＥをＬＬ−３７ペプチドと同時投与するとＭＰＯ活性が大幅に（５０％）低下した（図１０ｅ）。したがって、ＳＡＧＥをＬＬ−３７ペプチドと同時に注射することによりＬＬ−３７カテリシジンペプチドの炎症活性が実質的に誘導された。このことは、ＳＡＧＥがＬＬ−３７が媒介する炎症を阻害し、酒さの治療に有用であることを示唆している。
【０１３５】
ＳＡＧＥによる酒さの局所治療モデル：ＳＡＧＥ（ＧＭ−１１１１０１）の局所治療を用いることにより、ＬＬ−３７を作用させてから時間が経過した後に治療を行ってもペプチドに誘発される皮膚炎症を阻止できるのかどうかを試験した。これに従い、マウス背部の皮膚の範囲にＬＬ−３７を注射した直後にＳＡＧＥを塗布した。肉眼解剖写真は、ＬＬ−３７を適用してから４８時間後に強度の浮腫および紅斑が現れたことを示している（図１１ａ、１１ｈ、および１１ｉ）。一方、ＳＡＧＥを用いた局所治療を行うと、直後の治療（図１１ｂ）および１２時間遅れてからの治療（図１１ｃ）の両方において、発赤および患部が大幅に減少した。Ｈ＆Ｅ染色から、２つのＳＡＧＥ治療群と比較して、白血球浸潤および皮膚の浮腫がはるかに高いことが示され、これは、ＳＡＧＥが皮膚腫脹反応およびＭＰＯ活性の阻害剤であるという結果と一致していた（図１１ｇ）。これらの結果は、酒さによるカテリシジンを介した炎症を治療するために、ＳＡＧＥを従来の薬学的に許容されるエモリエント剤中で局所的に適用してもよいことを示唆している。
【０１３６】
ＳＡＧＥの真皮侵入：ＳＡＧＥが真皮に侵入するレベルを確認する。ＳＡＧＥ化合物である蛍光体−ＧＭ−２１２１０１および蛍光体−ＧＭ−１１１１０１を被験品として使用し、Ｂａｌｂ／ｃマウスの背部の皮膚の一部分に傷を付けて触れないようにして、蛍光化合物を０．１ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、および１０ｍｇ／ｍＬを塗布した。２４時間後にマウスを屠殺し、皮膚の被験部位全体を切除し、自然光および長波長ＵＶ光条件下の両方で撮影した（図１２）。自然光およびＵＶ光条件下の両方で、皮膚の治療部位の内側および外側の両方に蛍光物質の層が認められた。ＳＡＧＥの顕著な侵入による分布はマイクロメータースケールにまで及んでいた。
【０１３７】
細胞毒性および皮膚刺激性のｉｎ  Ｖｉｖｏ試験：ＳＡＧＥ誘導体（ＳＡＧＥｓ）であるＧＭ−１３１１０１、ＧＭ−３１２１０１、およびＧＭ−２１２１０１の細胞毒性をｎＨＤＦ細胞内で評価した。結果を図１３ａに示す。どの化合物も濃度１０ｍｇ／ｍＬまではｎＨＥＫにも無毒であることがわかった（図１３ｂ）。ｉｎ  ｖｉｖｏ皮膚刺激性試験に関する異なる治療群のマウスの肉眼解剖写真を図１３ｃ〜１３ｊに示す。被験物質の一次刺激指数を求めたところ、ＧＭ−１１１１０１およびＧＭ−２１２１０１は両方とも０．００であった。マウスの皮膚に炎症は認められなかった（図１４）。ＧＭ−１１１１０１およびＧＭ−２１２１０１は両方とも細胞毒性が認められなかった。この試験から、すべてのＳＡＧＥの濃度閾値を求めることができた。１６  ＣＦＲ  １５００のＦＨＳＡ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓの指針において、実験による評点が５．００未満の物質は皮膚の一次刺激物ではないと定めされているように、この試験条件下におけるこの被験試薬は一次皮膚刺激物ではないとみなされるであろう。これらの結果は、ＳＡＧＥ自体には皮膚刺激性がなく、炎症性皮膚疾患の治療に安全に用いることができることを示している。
【０１３８】
クロトン油炎症モデル：簡便で非常に再現性の高いＰＭＮ媒介皮膚炎症モデルとして、マウス皮膚へのクロトン油塗布を用いた。このモデルを用いてＳＡＧＥの抗炎症活性を試験した。異なる治療群のマウスの肉眼解剖写真を図１５ａおよび１５ｂに示すとともに、治療および未治療の耳介の両方の耳介厚を測定して、５つの群すべてで比較した。個々の皮膚評点の結果を、傷付けた範囲および無傷の範囲の紅斑で表した。この結果から、ＳＡＧＥ（ＧＭ−１１１１０１）治療群の発赤および厚みが未治療群と比較して大幅に低下したことが示された（図１５ｇおよび１５ｈ）。組織病理学検査により、クロトン油を塗布した耳介においては、浸潤白血球数の増加および顕著な真皮の浮腫が見られた一方で、誘発直後にＳＡＧＥを投与すると耳介腫脹反応が阻害される（これはビヒクルで処理したマウスに匹敵していた）ことがわかった。これらの組織学的発見を、測定値によってさらに確認した。クロトン油塗布後の耳介パンチ生検によってＭＰＯ活性も測定した。クロトン油塗布直後からＳＡＧＥ治療を開始して４時間毎に実施したところ、ＭＰＯ活性が有意に低下した（図１５ｆ）。これらの結果は、ＳＡＧＥを酒さ以外の炎症性皮膚疾患の局所治療に用いることができることを示唆している。
【０１３９】
酒さモデルのヒアルロン酸（ＨＡ）による局所治療：前述のＬＬ−３７酒さモデルの局所治療を用いてＳＡＧＥ（ＧＭ−１１１１０１）対ＨＡの比較を行った。その結果から、ＨＡの局所投与では炎症（図１６ｂ、１６ｅ、および７ｆ）およびＭＰＯ活性（図１６ｄ）が軽減されないことがはっきりと示された。これとは逆に、ＳＡＧＥは抗炎症性が非常に増強されており（図１６ｃ〜ｆ）、炎症および酒さの阻害剤とみなすことができるであろう。これらのデータは、ＳＡＧＥの薬理活性はヒアルロン酸には備わっておらず、ヒアルロナンに新規な修飾を施さなければならないことを示唆している。
【０１４０】
ラットの静脈内投与によるＩｎ  Ｖｉｖｏ急性毒性試験：本試験の目的は、ＳＡＧＥであるＧＭ−１１１１０１およびＧＭ−２１２１０１を静脈内投与によりラットに単回投与した場合の急性毒性の評価に加えて、ＧＭ−１１１１０１を７日間の間に１日１回、単回投与量を投与することによる毒性を評価することにあった。
【０１４１】
スプラーグドーリー(Sprague-Dawley)雌雄各３匹のラットから構成される１つの投与群に、ＧＭ−１１１１０１を３ｍｇ／ｋｇを単回投与し、次いで、１週間後にＧＭ−１１１１０１を１０ｍｇ／ｋｇを単回投与し、最後に、最後の単回投与から１週間後に、ＧＭ−１１１１０１を１０ｍｇ／ｋｇの１日１回投与を開始して合計７日間実施した。スプラーグドーリー雌雄各３匹のラットの２つの群には、ＧＭ−１１１１０１を３０または１００ｍｇ／ｋｇを投与した。さらに、スプラーグドーリー雌雄各３匹のラットの２つの群には、ＧＭ−２１２１０１を３０または１００ｍｇ／ｋｇを投与した。スプラーグドーリー雌雄各３匹のラットの２つの群には、塩化ナトリウム０．９％を注射して陰性対照群とした。すべての用量は、投与量を１ｍＬ／ｋｇとし、尾骨静脈から静脈注射することによって投与した。直前に記録された体重に基づき投与量を計算した。
【０１４２】
急激に（単回）投与した動物にはいずれも、注射直後ならびに０日目の用量投与の２時間および４時間後にも同様に、臨床的毒性の明らかな徴候が認められた。さらに、すべての生存動物について、臨床的毒性の目に見える徴候について１日１回、１〜１４日目まで観察した。１日１回、７日間投与したすべての動物について、臨床的毒性の目に見える徴候について１日１回、１〜１４日目まで観察した。０日目（急激投与）または１日目（反復投与）の用量投与前、６または７日目、および１４日目の終了前に体重を記録した。試験から１４日目にそれぞれの生存動物について肉眼的剖検による評価を行った。試験途中に死亡した動物は、死亡率を観察した後、すぐに肉眼的剖検により検査した。
【０１４３】
ＧＭ−２１２１０１を３０ｍｇ／ｋｇ投与した群の１匹の雌動物に、用量投与後の最初の２時間以内に、中等度の歩行異常、中等度の運動失調、および尿が赤みがかった橙色に変色するという臨床徴候が認められた。これらの所見は、軽い運動失調を除いて、４時間後の観察時間の時点では既に存在せず、残りの試験の間はずっとそのままであった。運動失調以外の所見は、用量投与の翌日にはもはや存在しなかった。さらに、ＧＭ−２１２１０１を１００ｍｇ／ｋｇ投与した群の１匹の雄のラットが、用量投与後の最初の４分以内に死亡していた。すべての動物は試験期間中に体重が増加した。試験中に死亡したＧＭ−２１２１０１を１００ｍｇ／ｋｇ投与した群の１匹の動物の胸腺全体に直径約１〜２ｍｍの暗赤色の病巣が観察されたことを除いて、視認できる病変は剖検では観察されなかった。
【０１４４】
この試験結果に基づくと、ＧＭ−１１１１０１は、３、１０、３０、および１００ｍｇ／ｋｇの急激な単回投与ならびに７日間の１０ｍｇ／ｋｇの反復投与を含む、評価を行ったどの用量においても毒性の徴候が見られなかった。したがって、ラットにＧＭ−１１１１０１を静脈内投与した場合の最大無作用量（ＮＯＥＬ）は少なくとも１００ｍｇ／ｋｇとみなされる。ＧＭ−２１２１０１は、３０および１００ｍｇ／ｋｇの用量で毒性または致死性の徴候が見られた。したがって、ラットにＧＭ−２１２１０１を静脈内投与した場合のＮＯＥＬは１０ｍｇ／ｋｇとみなされる。ＧＭ−１１１１０１のすべての用量において死亡が認められず、ＧＭ−２１２１０１を１００ｍｇ／ｋｇ投与した動物の１７％にしか死亡が認められなかったことから、ラットにＧＭ−１１１１０１およびＧＭ−２１２１０１を静脈投与した場合のＬＤ５０は１００ｍｇ／ｋｇを超えるとみなされる。この結果は、ＳＡＧＥが疾患の全身および注射治療に安全に用いられることを示唆している。
【０１４５】
ＶＩ．加齢黄斑変性の治療に関するＳＡＧＥの調査。
活性化された補体およびＲＡＧＥが培養ＲＰＥ細胞における血管形成および炎症促進シグナル伝達を誘発する：培養ＲＰＥ細胞におけるＲＡＧＥの生物学を調査する実験を、ＡＲＰＥ−１９ヒトＲＰＥ細胞株を用いて実施した。免疫ブロットに示すように（図１７）、ＡＲＰＥ−１９細胞は、細胞可溶化物中で４５〜５０ｋＤａの範囲の少なくとも４種のＲＡＧＥのアイソフォームを発現し、これらのアイソフォームを条件培地に分泌する。ＡＧＥ産物であるＣＭＬ−ＢＳＡでコーティングされたプレートで細胞を増殖させた場合、４種類すべてのＲＡＧＥアイソフォームの発現が大幅に上方制御された（図１７の免疫ブロットの右側を左側と比較）。ＲＡＧＥが連結することによって転写因子ＮＦ−κＢが活性化されるため、ＲＡＧＥの発現が増加することによって炎症促進性のシグナル伝達が大幅に促進される。この系に非抗凝固性(nonanticoagulant)ヘパリンである２−Ｏ，３−Ｏ脱硫酸化ヘパリン（ＯＤＳＨ）を加えると、ＡＲＰＥ−１９細胞上でのＣＭＬ−ＢＳＡとＲＡＧＥとの相互作用が阻害されることにより、ＲＡＧＥ発現の上方制御が阻止された。こうすることにより、ＲＡＧＥが連結することによって炎症促進性のＲＡＧＥ自体の発現が「フィードフォワード」的に増大することが阻止されるであろう。
【０１４６】
ＡＧＥ産物がＲＰＥ細胞死を誘導する能力を調査した。ＡＲＰＥ−１９細胞を丸型カバーガラスでコンフルエントになるまで増殖させた後、新しい皿に移し、２５μＭのＡＧＥ−ＢＳＡに４０時間曝露した。次いで、Molecular Probes Fixable Live/Dead Cell Stain Kit(L11101,Eugene,OR)を用いて細胞死の検査を行った。各パネルにカバーガラス全体および生／死細胞界面の拡大図を示す。核がＤＡＰＩによって赤色に染色され、死細胞が緑色に染色される。Ａ．対照ＢＳＡ。カバーガラスの縁部に死細胞が若干認められたが、界面に生および死細胞が散在している。Ｂ．ＡＧＥ−ＢＳＡ（２５μＭ）。顕著な細胞死が縁部周囲に認められ、生および死細胞の境界がはっきりとしている。Ｃ．ＡＧＥ−ＢＳＡ（２５μＭ）＋ＯＤＳＨ（２００μＭ）。ＯＤＳＨによってある程度保護されるようであるが、顕著な細胞死が依然として起こっている。Ｄ．ＡＧＥ−ＢＳＡ（２５μＭ）＋Ｐ−ＯＳＭｅＨＡ（２００μＭ）（ＧＭ−１１１１０１）。
【０１４７】
図１８に示すように、Live/Dead Cell Stain kit(Molecular Probes)を用いた緑色染色により測定すると、培養ＡＲＰＥ−１９細胞をＡＧＥで処理することによって顕著な細胞死が誘導されている（図１８Ｂ）。細胞をＯＤＳＨと共にインキュベートすることにより細胞死が低減されるが（図１８Ｃ）、対応する濃度のＳＡＧＡ  Ｐ−ＯＳＭｅＨＡ（ＧＭ−１１１１０１）ではほぼ完全に阻止された（図１８Ｄ）。細胞死は、丸型カバーガラス上で培養した細胞の縁部から内側に向かって進行しているようであった。ＲＡＧＥはＲＰＥ細胞内で顕著に発現し、他のヒト上皮細胞と同様に、基底膜上で選択的に発現するであろう。したがって、培地中においては、ＡＧＥは最初は縁部の単層の基底に位置するＲＡＧＥにのみ到達して溶解することができ、内側に進行すると予想される細胞死を相次いで起こさせるであろう。これとは対照的に、ＡＧＥが網膜色素上皮およびブルッフ膜の間に蓄積されるドルーゼン内にある場合は、基底に位置するＲＡＧＥにすぐに到達することとなり、加齢黄斑変性においていわゆる「地図状萎縮」を形成する、ＲＰＥの限局的な細胞死を媒介するＡＧＥ／ＲＡＧＥシグナル伝達が最適化される。したがって、ＳＡＧＥであるＧＭ−１１１１０１は、ＡＧＥに誘導されるＲＰＥ細胞死をほぼ完全に阻止する。これらの結果は、失明を招く加齢黄斑変性等の重要な眼疾患の治療にＳＡＧＥが有効となり得ることを示唆している。
【０１４８】
ＳＡＧＥは無毒性であり非抗凝固性である：Ｏ−硫酸化およびメチル化されたＨＡ（Ｐ−ＯＳＭｅＨＡ）、完全Ｏ−硫酸化およびペンタフルオロプロピル化されたＨＡ（Ｆ−ＯＳＦＨＡ−１）ならびに完全Ｏ−硫酸化およびメチル化されたＨＡ（Ｆ−ＯＳＭｅＨＡ）を、培養したヒト皮膚上皮細胞または線維芽細胞に適用し、細胞毒性アッセイ(CellTiter96(登録商標)Aqueous One assay,Promega)により調査すると、濃度が１ｍｇ／ｍＬでさえもＳＡＧＥは増殖を阻害せず、細胞毒性も示さない。ＳＡＧＥはまた、非抗凝固性でもない。低分子量硫酸化フルオロアルキル化ＨＡは抗−Ｘａを示さず、抗ＩＩａ抗凝固活性が＜０．２Ｕ／ｍｇであり、これと比較すると、未分画ヘパリンの場合はそれぞれ１５０Ｕ／ｍｇである。
【０１４９】
ヘパリンとは異なり、高度に帯電した多価陰イオン性高分子は、ハーゲマン因子（第ＸＩＩａ因子）を活性化し、二次的にキニンを活性化する、内因性または接触凝固カスケードの強力な誘発物質である。ＳＡＧＥの内因性凝固を刺激する能力（ハーゲマン因子の活性化）についてスクリーニングを行った。プールしたヒト血漿をヘパリンまたは低分子量（Ｌｍｗ）硫酸化フルオロアルキル化ＨＡ（Ｌｍｗ−ＯＳＦＨＡ−１、Ｌｍｗ−ＯＳＦＨＡ−２）とインキュベートし、Ｄ−シクロヒドロチロシル−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ＮＡを基質として用いてアミド分解活性を測定した。第ＸＩＩ因子の活性化能力について試験すると、図１９に示すように、低分子量（５０ｋＤａ）ＳＡＧＥは、炎症を薬理学的に阻害する濃度よりも１０〜１００倍高いＳＡＧＥ濃度でさえも、市販の医療用ヘパリンよりもはるかに安全性が高いようである。
【０１５０】
本出願を通して様々な刊行物が参照される。本明細書に記載した化合物、組成物、および方法をより十分に説明するために、これらの刊行物の開示内容全体を本出願に参考として組み込むものとする。
【０１５１】
本明細書に記載した化合物、組成物、および方法の様々な修正および変形が可能である。本明細書に記載した化合物、組成物、および方法の他の態様は、本明細書に開示した化合物、組成物、および方法の詳細および実施を考察することによって明らかになるであろう。この詳細および実施例は例示的なものとみなされることを意図している。
0005758797.tif 000004
0005758797.tif 000005
0005758797.tif 000006
【図１】
0005758797.tif 000007
【図２】
0005758797.tif 000008
【図３】
0005758797.tif 000009
【図４】
0005758797.tif 000010
【図５】
0005758797.tif 000011
【図６】
0005758797.tif 000012
【図７】
0005758797.tif 000013
【図８】
0005758797.tif 000014
【図９】
0005758797.tif 000015
【図１０】
0005758797.tif 000016
【図１１】
0005758797.tif 000017
【図１２】
0005758797.tif 000018
【図１３】
0005758797.tif 000019
【図１４】
0005758797.tif 000020
【図１５】
0005758797.tif 000021
【図１６】
0005758797.tif 000022
【図１７】
0005758797.tif 000023
【図１８】
0005758797.tif 000024
【図１９】
0005758797.tif 000025