(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインキナーゼＡ及びＡＴＰ、又は
カゼインキナーゼII
を含む、ニューロンからの神経突起伸長の阻害の軽減剤であって、
前記ニューロンがＮｏｇｏ受容体を含み、
前記ニューロンのＮｏｇｏ受容体のリン酸化を引き起こすことのできる、前記軽減剤。
【請求項２】
プロテインキナーゼＡ及びＡＴＰと、
カゼインキナーゼIIと
を含む、請求項１に記載の軽減剤。
【請求項３】
リン酸化がＮｏｇｏ受容体のセリン２８１に対応するアミノ酸残基のリン酸化である、請求項１又は２に記載の軽減剤。
【請求項４】
Ｎｏｇｏ受容体がヒトＮｇＲ１である、請求項１〜３のいずれかに記載の軽減剤。
【請求項５】
脊髄損傷のための医薬の製造のための、対象にＮｏｇｏ受容体のリン酸化を引き起こすことのできるプロテインキナーゼＡポリペプチド及びＡＴＰの使用。
【請求項６】
対象にＮｏｇｏ受容体のリン酸化を引き起こすことのできるプロテインキナーゼＡポリペプチド及びＡＴＰを含む、脊髄損傷の治療剤。
【請求項７】
脊髄損傷のための医薬の製造のための、対象にＮｏｇｏ受容体のリン酸化を引き起こすことのできるカゼインキナーゼIIポリペプチドの使用。
【請求項８】
対象にＮｏｇｏ受容体のリン酸化を引き起こすことのできるカゼインキナーゼIIポリペプチドを含む、脊髄損傷の治療剤。
【請求項９】
脊髄損傷のための医薬としての使用のための、対象にＮｏｇｏ受容体のリン酸化を引き起こすことのできるプロテインキナーゼＡ及びＡＴＰと、対象にＮｏｇｏ受容体のリン酸化を引き起こすことのできるカゼインキナーゼIIとを含む組成物。
【請求項１０】
脊髄損傷のための医薬の製造のための、請求項９に記載の組成物の使用。
【請求項１１】
脊髄損傷の治療における使用のための請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
神経突起伸長を引き起こすための医薬の製造のための、
対象にＮｏｇｏ受容体のリン酸化を引き起こすことのできるプロテインキナーゼＡポリペプチド及びＡＴＰ、又は
対象にＮｏｇｏ受容体のリン酸化を引き起こすことのできるカゼインキナーゼIIポリペプチド
の使用。
【請求項１３】
対象にＮｏｇｏ受容体のリン酸化を引き起こすことのできるプロテインキナーゼＡポリペプチド及びＡＴＰ、又は
対象にＮｏｇｏ受容体のリン酸化を引き起こすことのできるカゼインキナーゼIIポリペプチド
を含む神経突起伸長剤。
【請求項１４】
対象にＮｏｇｏ受容体のリン酸化を引き起こすことのできるプロテインキナーゼＡ及びＡＴＰ、又は
対象にＮｏｇｏ受容体のリン酸化を引き起こすことのできるカゼインキナーゼII
を有効量含む、脊髄損傷の治療剤。
【請求項１５】
損傷部位へ局在投与される、請求項１４に記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は神経損傷又は神経疾患の分野に関し、特に本発明は神経突起伸長等の神経再生の阻害の軽減に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニューロンは他のニューロン又は標的組織とコミュニケーションするために神経突起を伸長させる。成人中枢神経系（central nervous system、ＣＮＳ）におけるこの神経回路網は、損傷後に不十分にしか再生しない。これは当技術分野における問題の１つであり、神経回路網損傷後の患者は転帰不良となる。
【０００３】
成体哺乳動物ＣＮＳの再生不全は、一つには損傷したミエリンと関連する神経突起伸長阻害因子による。ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、Ｎｏｇｏ−Ａ（レチクロン４Ａ（Reticulon 4A）としても知られる）及び乏突起膠細胞ミエリン糖タンパク質（oligodendrocyte myelin glycoprotein、ＯＭｇｐ）は神経突起伸長を阻害するミエリン関連阻害因子であり、Ｎｏｇｏ受容体１（Nogo receptor 1、ＮｇＲ１）に結合し得る。これらミエリン関連タンパク質であるＮｏｇｏ−Ａ、ＭＡＧ及びＯＭｇｐは、結合しているＮｏｇｏ受容体を介して乏突起膠細胞からニューロン内へとシグナルを伝達する。このＮｏｇｏシグナリングは中枢神経系（ＣＮＳ）の発達及び維持において決定的に重要な役割を果たす。それはニューロンの分化、移動及び神経突起伸長を阻害し、成人ＣＮＳの損傷からの回復を不十分なものとし得る。
【０００４】
Ｎｏｇｏ−ＡはＮｏｇｏ−６６と呼ばれるドメインを介してＮｇＲ１に結合する。Ｎｏｇｏ−６６ドメインは６６のアミノ酸からなり、Ｎｏｇｏ−Ａの他の領域なしにＮｏｇｏ−６６ドメインのみで、神経突起伸長を阻害するに十分である。ＭＡＧはＮｇＲ１を介してのみならず、ＮｇＲ１の相同タンパク質であるＮｇＲ２をも介して神経突起伸長を阻害し得るが、Ｎｏｇｏ−Ａ及びＯＭｇｐはどちらもＮｇＲ２を介しては神経突起伸長を阻害し得ない（K. Venkatesh, O. Chivatakarn, H. Lee, P. S. Joshi, D. B. Kantor, B. A. Newman, R. Mage, C. Rader, R. J. Giger, The Nogo-66 receptor homolog NgR2 is a sialic acid-dependent receptor selective for myelin-associated glycoprotein. J Neurosci 25, 808-822 (2005)）。
【０００５】
ＮｇＲ１はＬＩＮＧＯ−１とｐ７５ＮＴＲ又はＴＡＪ／ＴＲＯＹとを含むシグナリング複合体を作り出す（McGee, and Strittmatter Trends Neurosci 26, 193-198 (2003); Schwab et al. Trends Mol Med 12, 293-297 (2006)）。ｐ７５ＮＴＲ及びＴＡＪ／ＴＲＯＹの両方がＴＮＦアルファ受容体ファミリーに属し、神経突起伸長阻害のための細胞内シグナルを開始する主成分であると提唱されている。ＮｇＲ２がＬＩＮＧＯ−１とｐ７５ＮＴＲ又はＴＡＪ／ＴＲＯＹとを含む複合体を作り出すかどうかは確かでない。
【０００６】
Ｎｏｇｏシグナリングの役割に関する知識が蓄積される一方で、このシグナリングを制御する機序に関する知識は限られている。これは当技術分野における問題の１つである。ｃＡＭＰの細胞内レベルの上昇により、Ｎｏｇｏシグナリングの神経突起伸長に対する阻害効果が克服されることが知られている（S. S. Hannila, M. T. Filbin, The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury. Exp Neurol 209, 321-332 (2008)）。しかしながら、ｃＡＭＰがこうしたＮｏｇｏシグナリングの効果を克服する機序の詳細は知られていない。
【０００７】
ニューロトロフィン神経成長因子ファミリーのメンバーであるＢＤＮＦは、インビトロで複数のタイプの神経細胞の神経突起伸長を刺激するのみならず（R. H. Fryer, D. R. Kaplan, L. F. Kromer, Truncated trkB receptors on nonneuronal cells inhibit BDNF-induced neurite outgrowth in vitro. Exp Neurol 148, 616-627 (1997); M. Encinas, M. Iglesias, Y. Liu, H. Wang, A. Muhaisen, V. Cena, C. Gallego, J. X. Comella, Sequential treatment of SH-SY5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neurotrophic factor-dependent, human neuron-like cells. J Neurochem 75, 991-1003 (2000); R. Salie, J. D. Steeves, IGF-1 and BDNF promote chick bulbospinal neurite outgrowth in vitro. Int J Dev Neurosci 23, 587-598 (2005); E. Pastrana, M. T. Moreno-Flores, J. Avila, F. Wandosell, L. Minichiello, J. Diaz-Nido, BDNF production by olfactory ensheathing cells contributes to axonal regeneration of cultured adult CNS neurons. Neurochem Int 50, 491-498 (2007)）、脊髄損傷からの回復をも部分的に促進する（B. S. Bregman, M. McAtee, H. N. Dai, P. L. Kuhn, Neurotrophic factors increase axonal growth after spinal cord injury and transplantation in the adult rat. Exp Neurol 148, 475-494 (1997); L. B. Jakeman, P. Wei, Z. Guan, B. T. Stokes, Brain-derived neurotrophic factor stimulates hindlimb stepping and sprouting of cholinergic fibers after spinal cord injury. Exp Neurol 154, 170-184 (1998); Y. Jin, I. Fischer, A. Tessler, J. D. Houle, Transplants of fibroblasts genetically modified to express BDNF promote axonal regeneration from supraspinal neurons following chronic spinal cord injury. Exp Neurol 177, 265-275 (2002); P. Lu, A. Blesch, M. H. Tuszynski, Neurotrophism without neurotropism： BDNF promotes survival but not growth of lesioned corticospinal neurons. J Comp Neurol 436, 456-470 (2001)）。ＢＤＮＦでの前処理は培養ニューロンにおける細胞内ｃＡＭＰレベルを高め、ミエリン関連阻害因子の存在下においてもニューロンの神経突起伸長を可能にする（D. Cai, Y. Shen, M. De Bellard, S. Tang, M. T. Filbin, Prior exposure to neurotrophins blocks inhibition of axonal regeneration by MAG and myelin via a cAMP-dependent mechanism. Neuron 22, 89-101 (1999)）。さらにＢＤＮＦは海馬における損傷誘導性神経突起成長に関わる（C. Dinocourt, S. E. Gallagher, S. M. Thompson, Injury-induced axonal sprouting in the hippocampus is initiated by activation of trkB receptors. Eur J Neurosci 24, 1857-1866 (2006)）。これら報告は、ＢＤＮＦが神経突起伸長を阻害するミエリン関連阻害因子の存在下においてもＣＮＳにおける神経回路網の再生に寄与し得ると示唆する。しかしながら、その効果は限定的であり、神経回路網の完全な再生に十分ではない。
【０００８】
ヒト神経芽細胞腫細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙは、レチノイン酸（ＲＡ）処理５日後にＢＤＮＦ依存性神経突起伸長を示す（M. Encinas, M. Iglesias, Y. Liu, H. Wang, A. Muhaisen, V. Cena, C. Gallego, J. X. Comella, Sequential treatment of SH-SY5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neurotrophic factor-dependent, human neuron-like cells. J Neurochem 75, 991-1003 (2000)）。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞はＲＡに反応してニューロン様細胞へと分化を開始し、ニューロン特異的タンパク質の発現を始める。しかしながら、ＲＡによりＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞から分化した神経細胞は限定的な形態学的変化を示すのみである。ＢＤＮＦ処理はＳＨ−ＳＹ５Ｙ由来神経細胞の効率的な神経突起伸長に必要であり、さもなければより長期間のＲＡ処理が必要である（S. Pahlman, A. I. Ruusala, L. Abrahamsson, M. E. Mattsson, T. Esscher, Retinoic acid-induced differentiation of cultured human neuroblastoma cells： a comparison with phorbolester-induced differentiation. Cell Differ 14, 135-144 (1984)）。
【０００９】
カゼインキナーゼII（ＣＫ２）はニューロンの文脈で研究されてきた。カゼインキナーゼIIはニューロンの２つの異なる表面タンパク質のリン酸化に関わる。どちらのタンパク質もＮｏｇｏ受容体との関連はない。さらに、この分野の研究はカゼインキナーゼII阻害因子の使用に完全に依存してきた。したがって、細胞内ＣＫ２の機能が当技術分野において研究されてきた。細胞内ＣＫ２活性が神経突起伸長自体に必要であることは知られている。細胞外ＣＫ２が存在することは知られている。しかしながら、細胞外ＣＫ２に関しては前述の通りあまり知られていない。さらに詳しくは、アミロイドベータ前駆体タンパク質及びニューログリカンＣが内因性細胞外ＣＫ２によりニューロン表面でリン酸化され得ると示唆されている。しかしながら、これらリン酸化が神経突起伸長に与える（効果があるとすればその）効果は知られていない。
【００１０】
カゼインキナーゼIIはある種のインビトロ調製物中でコラーゲン／ラミニンを処理するために用いられてきた。これら処理が細胞を伴うことは決してなかった。これら処理はこれまで、コラーゲン又はラミニン等の基質タンパク質のインビトロ調製物のみを伴っていた。
【００１１】
細胞のカゼインキナーゼII処理は先行技術において一切知られていなかった。外因性カゼインキナーゼIIの細胞への適用は先行技術において知られていなかった。
【００１２】
Ulloa et al（1993 EMBO vol 12 pp 1633-1640）は、Ｎ２Ａマウス神経芽細胞腫細胞株におけるＣＫ２活性をアンチセンスオリゴ及び特異的阻害因子で阻害した。Ｎ２Ａ細胞はレチノイン酸（ＲＡ）及びＢＤＮＦのどちらでも神経突起を伸長させなかった。Ｎ２Ａ細胞株を用いて彼らは、ＣＫ２の欠乏によりＮ２Ａ細胞からの神経突起伸長が阻害されること、並びに、かかる欠乏により微小管関連タンパク質であるＭＡＰ１Ｂのリン酸化が変化することを見出した。ＭＡＰ１Ｂは神経突起伸長に必要な細胞骨格の再構成に必要である。したがって彼らは、ＭＡＰ１Ｂリン酸化の変化がＣＫ２欠乏による神経突起伸長阻害を引き起こすと結論付けた。ＭＡＰ１Ｂリン酸化は細胞内性である。細胞骨格の再構成と関連する他のタンパク質は、細胞内でＣＫ２によりリン酸化されることが知られている。これら細胞内リン酸化現象は神経突起伸長自体に必要である。Ｎ２Ａ細胞と同様に正常なニューロンはいかなる刺激もなしに神経突起を伸長させ得るので、これら細胞内リン酸化現象はニューロンにおける基礎レベルの細胞内ＣＫ２に触媒されると推定される。この論文はＮｏｇｏシグナリングと関係ない。
【００１３】
リン酸化とＮｏｇｏシグナリングとの間の関連性はこれまで一切知られてない。Ｎｏｇｏシグナリングを制御する機序はこれまで知られていない。
【００１４】
本発明は、先行技術と関連する（諸）問題の克服を目指す。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】K. Venkatesh, O. Chivatakarn, H. Lee, P. S. Joshi, D. B. Kantor, B. A. Newman, R. Mage, C. Rader, R. J. Giger, The Nogo-66 receptor homolog NgR2 is a sialic acid-dependent receptor selective for myelin-associated glycoprotein. J Neurosci 25, 808-822 (2005)
【非特許文献２】McGee,and Strittmatter Trends Neurosci 26, 193-198 (2003)
【非特許文献３】Schwab et al. Trends Mol Med 12, 293-297 (2006)
【非特許文献４】S. S. Hannila, M. T. Filbin, The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury. Exp Neurol 209, 321-332 (2008)
【非特許文献５】R. H. Fryer, D. R. Kaplan, L. F. Kromer, Truncated trkB receptors on nonneuronal cells inhibit BDNF-induced neurite outgrowth in vitro. Exp Neurol 148, 616-627 (1997)
【非特許文献６】M. Encinas, M. Iglesias, Y. Liu, H. Wang, A. Muhaisen, V. Cena, C. Gallego, J. X. Comella, Sequential treatment of SH-SY5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neurotrophic factor-dependent, human neuron-like cells. J Neurochem 75, 991-1003 (2000)
【非特許文献７】R. Salie, J. D. Steeves, IGF-1 and BDNF promote chick bulbospinal neurite outgrowth in vitro. Int J Dev Neurosci 23, 587-598 (2005)
【非特許文献８】E. Pastrana, M. T. Moreno-Flores, J. Avila, F. Wandosell, L. Minichiello, J. Diaz-Nido, BDNF production by olfactory ensheathing cells contributes to axonal regeneration of cultured adult CNS neurons. Neurochem Int 50, 491-498 (2007)
【非特許文献９】B. S. Bregman, M. McAtee, H. N. Dai, P. L. Kuhn, Neurotrophic factors increase axonal growth after spinal cord injury and transplantation in the adult rat. Exp Neurol 148, 475-494 (1997)
【非特許文献１０】L. B. Jakeman, P. Wei, Z. Guan, B. T. Stokes, Brain-derived neurotrophic factor stimulates hindlimb stepping and sprouting of cholinergic fibers after spinal cord injury. Exp Neurol 154, 170-184 (1998)
【非特許文献１１】Y. Jin, I. Fischer, A. Tessler, J. D. Houle, Transplants of fibroblasts genetically modified to express BDNF promote axonal regeneration from supraspinal neurons following chronic spinal cord injury. Exp Neurol 177, 265-275 (2002)
【非特許文献１２】P. Lu, A. Blesch, M. H. Tuszynski, Neurotrophism without neurotropism： BDNF promotes survival but not growth of lesioned corticospinal neurons. J Comp Neurol 436, 456-470 (2001)
【非特許文献１３】D. Cai, Y. Shen, M. De Bellard, S. Tang, M. T. Filbin, Prior exposure to neurotrophins blocks inhibition of axonal regeneration by MAG and myelin via a cAMP-dependent mechanism. Neuron 22, 89-101 (1999)
【非特許文献１４】C. Dinocourt, S. E. Gallagher, S. M. Thompson, Injury-induced axonal sprouting in the hippocampus is initiated by activation of trkB receptors. Eur J Neurosci 24, 1857-1866 (2006)
【非特許文献１５】S. Pahlman, A. I. Ruusala, L. Abrahamsson, M. E. Mattsson, T. Esscher, Retinoic acid-induced differentiation of cultured human neuroblastoma cells： a comparison with phorbolester-induced differentiation. Cell Differ 14, 135-144 (1984)
【非特許文献１６】Ulloa et al (1993 EMBO vol 12 pp 1633-1640)
【発明の概要】
【００１６】
成人神経組織が不十分にしか、或いは全く再生しないことは問題である。外傷又は疾患等の因子により引き起こされる損傷後に、これは特に問題である。再生阻害を制御する様々な機序が同定されてきた。かかる機序の１つが、Ｎｏｇｏ受容体を介するシグナリングによる神経突起伸長阻害である。この経路における様々なリガンド及び受容体が十分に特徴付けられているにもかかわらず、この阻害を軽減する信頼度の高い方法は先行技術において開示されてこなかった。
【００１７】
本発明者らはこれら問題に取り組んだ。Ｎｏｇｏシグナリングの詳細な研究により、本発明者らは前記シグナリングを阻害し得る機序を同定した。さらに本発明者らは、Ｎｏｇｏシグナリング制御の鍵となるＮｏｇｏ受容体内の特定の分子標的を同定した。この標的はＮｏｇｏ受容体のセリン２８１である。この残基のリン酸化は神経突起伸長阻害因子の受容体への結合を消失させ、そのことにより神経再生阻害を軽減する。さらに本発明者らは、これが達成され得る有効な方法を教示及び実証し、かかる方法はプロテインキナーゼＡ及び／又はカゼインキナーゼIIでの処理等による。本発明はこれら驚くべき発見に基づく。
【００１８】
したがって、態様の１つにおいて、本発明はニューロンからの神経突起伸長の阻害の軽減方法を提供し、
前記ニューロンはＮｏｇｏ受容体を含み、
前記方法は前記ニューロンをＮｏｇｏ受容体のリン酸化を引き起こすことのできる組成物と接触させることを含み、前記組成物はプロテインキナーゼＡ又はカゼインキナーゼIIを含む。
【００１９】
好ましくは、前記組成物はプロテインキナーゼＡ及びカゼインキナーゼIIを含む。
【００２０】
好ましくは、前記リン酸化は前記Ｎｏｇｏ受容体のセリン２８１に対応するアミノ酸残基のリン酸化である。
【００２１】
好ましくは、前記Ｎｏｇｏ受容体はヒトＮｇＲ１である。
【００２２】
また別の態様において、本発明は脊髄損傷のための医薬の製造のための、プロテインキナーゼＡポリペプチドの使用に関する。
【００２３】
また別の態様において、本発明は脊髄損傷の治療における使用のためのプロテインキナーゼＡポリペプチドに関する。
【００２４】
また別の態様において、本発明は脊髄損傷のための医薬の製造のための、カゼインキナーゼIIポリペプチドの使用に関する。
【００２５】
また別の態様において、本発明は脊髄損傷の治療における使用のためのカゼインキナーゼIIポリペプチドに関する。
【００２６】
また別の態様において、本発明は医薬としての使用のための、プロテインキナーゼＡ及びカゼインキナーゼIIを含む組成物に関する。
【００２７】
また別の態様において、本発明は脊髄損傷のための医薬の製造のための、前述の組成物の使用に関する。
【００２８】
また別の態様において、本発明は脊髄損傷の治療における使用のための前述の組成物に関する。
【００２９】
また別の態様において、本発明は神経突起伸長を引き起こすための医薬の製造のための、プロテインキナーゼＡポリペプチド又はカゼインキナーゼIIポリペプチドの使用に関する。
【００３０】
また別の態様において、本発明は神経突起伸長を引き起こすことにおける使用のためのプロテインキナーゼＡポリペプチド又はカゼインキナーゼIIポリペプチドに関する。
【００３１】
また別の態様において、本発明は対象の脊髄損傷の治療方法に関し、前記方法は前記対象にＮｏｇｏ受容体のリン酸化を引き起こすことのできる組成物を有効量投与することを含み、前記組成物はプロテインキナーゼＡ又はカゼインキナーゼIIを含む。好ましくは、前記投与は損傷部位への局所投与である。
［本発明の詳細な説明］
【発明を実施するための形態】
【００３２】
ＮｏｇｏシグナリングはＣＮＳにおけるニューロンの神経突起伸長（３、４）、分化（B. Wang, Z. Xiao, B. Chen, J. Han, Y. Gao, J. Zhang, W. Zhao, X. Wang, J. Dai, Nogo-66 promotes the differentiation of neural progenitors into astroglial lineage cells through mTOR-STAT3 pathway. PLoS ONE 3, e1856 (2008); F. Wang, Y. Zhu, The interaction of Nogo-66 receptor with Nogo-p4 inhibits the neuronal differentiation of neural stem cells. Neuroscience 151, 74-81 (2008)）、移動（Z. Su, L. Cao, Y. Zhu, X. Liu, Z. Huang, A. Huang, C. He, Nogo enhances the adhesion of olfactory ensheathing cells and inhibits their migration. J Cell Sci 120, 1877-1887 (2007)）及びシナプス形成（E. M. Aloy, O. Weinmann, C. Pot, H. Kasper, D. A. Dodd, T. Rulicke, F. Rossi, M. E. Schwab, Synaptic destabilization by neuronal Nogo-A. Brain Cell Biol 35, 137-156 (2006)）を阻害し得る。したがって、Ｎｏｇｏシグナリングは生理学的条件下で生じないＣＮＳ再生の主要阻害因子として同定されてきた。
【００３３】
本発明者らは、例えばカゼインキナーゼII（ＣＫ２）等によるＮｏｇｏ受容体のリン酸化が、神経突起伸長等の神経再生を阻害するミエリン関連タンパク質の結合を阻害することを開示する。本発明者らは、神経芽細胞腫由来ニューロンからの神経突起伸長のＮｏｇｏ依存性阻害を抑制する脳由来神経栄養因子（brain-derived neurotrophic factor、ＢＤＮＦ）が、Ｎｏｇｏ受容体のリン酸化を誘導するために任意で用いられ得ることを実証する。さらなる実施形態において、細胞外ＣＫ２処理はミエリン関連タンパク質による神経突起伸長阻害を克服する。これは例えばラット成体ニューロンにおいて実証されている。したがって、本発明はＮｏｇｏシグナリングを、そしてそれゆえ神経再生を制御する新規方略を提供する。
【００３４】
本発明者らはリン酸化とＮｏｇｏシグナリングとの間の関連性を初めて開示する。本発明者らはＮｏｇｏ依存性神経突起伸長阻害に対する外部ドメインリン酸化の効果を初めて開示する。Ｎｏｇｏ受容体のリン酸化は神経突起伸長自体には必要でないかもしれないが、神経突起伸長阻害を克服するのに必要である。神経突起伸長阻害はインビボ条件下で、例えば中枢神経系が外傷を負った後に生じる。
【００３５】
さらに、本発明者らはＮｏｇｏシグナリングがＳＨ−ＳＹ５Ｙ由来神経細胞等の哺乳動物細胞からの神経突起伸長を阻害すること、並びに、ＣＫ２での細胞外処理によりＢＤＮＦなしでかかる阻害が抑制されることを示している。ＣＫ２処理はＮｏｇｏ−６６、ＭＡＧ及びＯＭｇｐの受容体への結合を阻害し、これら神経突起伸長阻害因子の存在下での神経突起伸長を可能にする。したがって、本発明者らは有益なことに、ＢＤＮＦ非依存的な本発明の効果を示している。好ましくは、本発明の方法においてＢＤＮＦは用いられない。好ましくは、ＢＤＮＦは本発明の方法から特に除去される。好ましくは、本発明の組成物はＢＤＮＦを含まない。
【００３６】
定義
「含む（comprises、comprise、comprising）」なる用語は、当技術分野におけるその通常の意味、すなわち、述べられている特徴又は特徴のグループが含まれるが、何らかの他の述べられている特徴又は特徴のグループもまた存在することをその用語は排除しない、という意味を有すると理解されるべきである。
【００３７】
Ｎｏｇｏ受容体
広い意味で、「Ｎｏｇｏ受容体」は神経突起伸長のＮｏｇｏ依存性阻害を媒介するあらゆるタンパク質を指していてもよく、膜に局在するという古典的な意味での受容体（ＮｇＲ）のみを特に指す必要はなく、Ｎｏｇｏシグナリングを媒介するあらゆるＮｏｇｏ結合タンパク質を指していてもよく、かかるＮｏｇｏシグナリングとは例えばＮｇＲファミリーメンバー以外のタンパク質を介するものである。実際のところ、正常ニューロンでの本発明者らの結果は、ＣＫ２処理がかかるＮｇＲ非依存性ＮｏｇｏシグナリングをＮｇＲ依存性シグナリングと同じくらい遮断し得ることを示す。しかしながら好ましくは、「Ｎｏｇｏ受容体」なる用語は本明細書において、当技術分野におけるその従来の意味でないことが文脈により示されない限り、その意味を与えられてもよい。
【００３８】
ＮｇＲ１並びにその相同タンパク質であるＮｇＲ２及びＮｇＲ３は、８つのロイシンリッチリピート領域を有し、細胞内ドメインを有さないグリコシルホスファチジルイノシトール（glycosylphosphatidylinositol、ＧＰＩ）結合タンパク質ファミリーに属する。ＮｇＲ１はＮｏｇｏ−Ａ、ＭＡＧ及びＯＭｇｐと相互作用し得る一方で、ＮｇＲ２はＭＡＧのみとシアル酸依存的な形で相互作用する。この相互作用も神経突起伸長を阻害し得る。ＮｇＲ３のリガンドは知られていない。
【００３９】
ＮｇＲ１はＬＩＮＧＯ−１及びニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲを含む複合体を作り出す。或いは、ｐ７５ＮＴＲの代わりに、広くニューロンに発現するオーファン腫瘍壊死因子受容体ファミリーメンバーであるＴＡＪ／ＴＲＯＹがこの複合体に含まれる。ＮｇＲ１について見られるように、ＮｇＲ２がＬＩＮＧＯ−１、ｐ７５ＮＴＲ又はＴＡＪ／ＴＲＯＹを有する複合体を作り出し得るかどうかは知られていない。
【００４０】
したがって、Ｎｏｇｏシグナリングは乏突起膠細胞において少なくとも３つのリガンドにより開始され得るのであり、少なくとも２つの受容体を介してニューロン内へとシグナルを伝達し得る。Ｎｏｇｏシグナリングにおける特定のリガンド−受容体システムの神経突起伸長阻害への相対的貢献度は、様々な神経細胞タイプによって変化し得る。
【００４１】
本発明は細胞表面上に存在するＮｏｇｏ受容体に関する。実際のところ、標的細胞の細胞表面上のＮｏｇｏ受容体のリン酸化を誘導するために外因性物質が用いられるということは、本発明が特に教示するところである。したがって、本明細書において用いられる「Ｎｏｇｏ受容体」なる用語は、好ましくは、標的細胞の細胞表面に存在するＮｏｇｏ受容体タンパク質を指す。好ましくは、標的細胞は脊椎動物標的細胞、より好ましくは哺乳動物標的細胞、最も好ましくはヒト標的細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は最も好ましくは、治療されるべき対象に含まれるヒト細胞、例えば成人ヒトニューロン等のヒトニューロン等である。
【００４２】
広い態様の１つにおいて、「Ｎｏｇｏ受容体」なる用語はＮｇＲ１、ＮｇＲ２又はＮｇＲ３等の公知のＮｏｇｏ受容体のいずれのポリペプチドを指していてもよい。さらに、Ｎｏｇｏ受容体を標的にする際に、２以上のタイプのＮｏｇｏ受容体がリン酸化されるということであってもよい。このことは、選択された特定の標的細胞上に期せずして発現する特定のＮｏｇｏ受容体タイプに依存しない神経突起伸長阻害の軽減等の利点を本発明にもたらし得る。さらに、多数のＮｏｇｏ受容体タンパク質を標的にすることにより、より強力な効果及び／又はより迅速な効果が達成されるということであってもよい。
【００４３】
公知のＮｏｇｏ受容体のそれぞれがアミノ酸残基番号２８１に保存されたセリンを有することに注目することは重要である。したがって、本発明のＮｏｇｏ受容体変異体への言及はあらゆる公知のＮｇＲポリペプチドを同等に包含し得る。もちろんそれは、かかるポリペプチドが議論されている特定の変異又は置換を有する限りにおいてである。
【００４４】
好ましくは、本発明のＮｏｇｏ受容体は１又は２以上のＮｇＲ１、ＮｇＲ２又はＮｇＲ３である。より好ましくは、本発明のＮｏｇｏ受容体は１又は２以上のＮｇＲ１又はＮｇＲ２である。このことの利点は、これらＮｏｇｏ受容体がより良く特徴付けられており、したがって、インビボでより特異的又は限定的な効果を生み出すのに適しているということである。最も好ましくは、本発明のＮｏｇｏ受容体はＮｇＲ１である。このことには数多くの利点があり、そのうちのいくつかについては実施例で述べる。
【００４５】
本発明は主に哺乳動物等の脊椎動物への適用に関する。したがって好ましくは、本発明のＮｏｇｏ受容体は哺乳動物Ｎｏｇｏ受容体等の脊椎動物Ｎｏｇｏ受容体である。最も好ましくは、本発明のＮｏｇｏ受容体はヒトＮｏｇｏ受容体である。ヒトＮｏｇｏ受容体はヒトＮｏｇｏ受容体アミノ酸配列に対応するポリペプチド配列を有する。当然ながら、本発明のＮｏｇｏ受容体ポリペプチドは非ヒト宿主細胞からの組換え体作製等のあらゆる適切な手段により作製されてよい。しかしながら、理解を容易にするため、非ヒト細胞から作製されるＮｏｇｏ受容体ポリペプチドは、もしそのアミノ酸配列がヒトアミノ酸配列に対応するのであれば、ヒトＮｏｇｏ受容体とみなされる。
【００４６】
Ｎｏｇｏ受容体変異体が本明細書において開示され、議論される。上述の議論から、かかる変異体がＮｇＲ１、ＮｇＲ２、ＮｇＲ３等の数多くの個別のＮｏｇｏ受容体サブタイプのうちの１つを含んでいてもよいと認められるであろう。理解を容易にするため、特定のアミノ酸又は特定の変異は、Ｎｏｇｏ受容体参照配列に沿って議論される。
【００４７】
参照配列
当技術分野において従来なされているように、ポリペプチド上の番号アドレスを用いて特定のアミノ酸残基について議論することが認められるであろう。番号アドレスを用いて特定のアミノ酸残基に言及する際には、ヒトＮｇＲ１のアミノ酸配列を参照配列として用いて番号振りをしている。最も好ましくは、Ｎｏｇｏ受容体参照配列は以下のＮＭ０２３００４のヒトＮｇＲ１アミノ酸配列である：
MKRASAGGSRLLAWVLWLQAWQVAAPCPGACVCYNEPKVTTSCPQQGLQAVPVGIPAASQRIFLHGNRISHVPAASFRACRNLTILWLHSNVLARIDAAAFTGLALLEQLDLSDNAQLRSVDPATFHGLGRLHTLHLDRCGLQELGPGLFRGLAALQYLYLQDNALQALPDDTFRDLGNLTHLFLHGNRISSVPERAFRGLHSLDRLLLHQNRVAHVHPHAFRDLGRLMTLYLFANNLSALPTEALAPLRALQYLRLNDNPWVCDCRARPLWAWLQKFRGSSSEVPCSLPQRLAGRDLKRLAANDLQGCAVATGPYHPIWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAADKASVLEPGRPASAGNALKGRVPPGDSPPGNGSGPRHINDSPFGTLPGSAEPPLTAVRPEGSEPPGFPTSGPRRRPGCSRKNRTRSHCRLGQAGSGGGGTGDSEGSGALPSLTCSLTPLGLALVLWTVLGPC
【００４８】
この配列が、当技術分野において十分理解されているように、当該の残基の位置を特定するのに用いられるべきである。このことは厳密な数え上げ作業ということには必ずしもならない――文脈に注意が払われなければならない。例えば、もしヒトＥＨＤ２等の当該のタンパク質が若干異なる長さを有しているなら、ヒト配列における（例えば）Ｓ２８１に対応する正しい残基の位置の特定には、当該の配列の２８１番目の残基を単純に拾い上げるのではなく、配列を比較すること並びに等価な残基又は対応する残基を選択することが必要となり得る。このことは当業者である読者の能力の範囲内に十分収まる。典型的な配列比較を添付の図に示す。
【００４９】
本発明が主にＮｇＲ１への言及により例証されることは当業者である読者にとって明らかであろう。ＮｇＲ１が他のＮｇＲファミリーポリペプチドと高い配列相同性を示すことに注目すべきである。したがって、いくつかの態様において、本発明は他のＮｇＲファミリータンパク質への適用のための治療法の開発におけるＮｇＲ１の使用に関する。
【００５０】
本発明のいくつかの態様において、特定のポリペプチドがＮｇＲファミリーポリペプチドとみなされるべきかどうかについての機能検査を用いることが望ましくあり得る。配列に基づく前述の基準に加えて、或いはその代わりに、以下の機能的基準を用いてもよい：本明細書に記載のリガンド等のリガンドへの結合。さらに、実施例に記載のＲＡで処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における過剰発現等により、神経突起伸長アッセイにおいて機能する能力もまた基準として用いられてよい。したがって、特定のポリペプチドが実際にＮｇＲファミリーポリペプチドとみなされるべきかどうかを決定するために、そのポリペプチドが神経突起伸長アッセイにおいて機能するかどうかが検査されてもよい。もしそのＮｇＲタンパク質がこの文脈においてＮｏｇｏシグナリングを支持するのであれば、そのポリペプチドはＮｏｇｏ受容体（ＮｇＲファミリーポリペプチド）とみなされてよい。もちろん本発明の目的は神経突起伸長阻害を軽減することであり、このことはＮｇＲタンパク質を評価する際に銘記されなければならない――本発明に従ってキナーゼ処理されていない場合には特に、このアッセイにおいて神経突起伸長を阻害するのは野生型タンパク質である。
【００５１】
本発明のＮｏｇｏ受容体変異体
本発明は、セリン２８１がセリン以外のあらゆる他のアミノ酸に置換されることにより特徴付けられるＮｏｇｏ受容体ポリペプチドに関する。好ましくは、Ｓ２８１は非リン酸アクセプター（non-phosphoacceptor）アミノ酸に置換され、結果として好ましくは、Ｓ２８１はＳ、Ｔ、又はＹでない。
【００５２】
好ましくは、本発明はＳ２８１Ａを有するＮｏｇｏＲを提供する。これは、この部位でリン酸化できないという利点を有する。このことは、この受容体がＣＫII／ＰＫＡによるリガンド結合阻害に耐性があるという生物学的特性を有することを意味する。言い換えれば、かかる変異体はＣＫII／ＰＫＡの存在下でもＮｏｇｏリガンドに応答してシグナリングを行うという新規機能を有する。
【００５３】
好ましくは、本発明はＳ２８１Ｄを有するＮｏｇｏＲを提供する。これはＳ２８１でのリン酸化を模するという利点を有する。これは、この受容体が持続的にスイッチを「オフ」されるという生物学的特性を有し、結果としてこの受容体を用いて神経突起伸長阻害が持続的に軽減されることを意味する。より具体的には、この受容体はＮｏｇｏリガンドと結合しない。言い換えれば、かかる変異体はＣＫII／ＰＫＡの存在にかかわらずＮｏｇｏリガンドに応答して結合する（又はシグナリングを行う）ことがないという新規機能を有する。
【００５４】
好ましくは、本発明のＮｏｇｏ受容体ポリペプチド（ＮｏｇｏＲ’ｓ）は、例えばＳ２８１に対応する残基等の指示された箇所以外、ＮＭ０２３００４の配列を含む。
【００５５】
本発明はまた、ＮＭ０２３００４に対して少なくとも６０％の同一性、好ましくは、ＮＭ０２３００４に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは、ＮＭ０２３００４に対して少なくとも７５％の同一性、好ましくは、ＮＭ０２３００４に対して少なくとも８０％の同一性、好ましくは、ＮＭ０２３００４に対して少なくとも８５％の同一性、好ましくは、ＮＭ０２３００４に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは、ＮＭ０２３００４に対して少なくとも９５％の同一性、好ましくは、ＮＭ０２３００４に対して少なくとも９７％の同一性、好ましくは、ＮＭ０２３００４に対して少なくとも９８％の同一性、好ましくは、ＮＭ０２３００４に対して少なくとも９９％の同一性を有し、残基Ｓ２８１がセリン以外であるという特徴を常に有するＮｏｇｏＲ’ｓに関する。
【００５６】
切断型は好ましくは、かかる切断型の全長にわたってこの配列に対応する。好ましくは、本発明のＮｏｇｏＲポリペプチドは少なくとも３０のアミノ酸、好ましくは、少なくとも８０のアミノ酸、好ましくは、少なくとも１３０のアミノ酸、好ましくは、少なくとも１８０のアミノ酸、好ましくは、少なくとも２３０のアミノ酸、好ましくは、少なくとも２８０のアミノ酸、好ましくは、少なくとも３３０のアミノ酸、好ましくは、少なくとも３８０のアミノ酸、好ましくは、少なくとも３８２のアミノ酸（例えば全長ＮｇＲ２）、好ましくは、少なくとも４０２のアミノ酸（例えば全長ＮｇＲ３）、好ましくは、少なくとも４１７のアミノ酸（例えばＮｇＲ１）を含む。
【００５７】
ポリペプチド及び変異体
Ｎｏｇｏ受容体配列は本発明における使用のために修飾されてもよい。典型的には、セリン２８１（又は前記アドレスにおける置換残基）を含む配列領域を維持する修飾がなされる。修飾配列が必要なＳ２８１残基を維持するという条件で、アミノ酸置換、例えば１、２又は３から１０、２０又は３０までの置換がなされてもよい。アミノ酸置換は、例えば治療上投与されるポリペプチドの半減期を伸ばすための、非自然的に生み出されたアナログの使用を含んでいてもよい。同じことが本発明のＰＫＡ又はＣＫIIポリペプチドについても適用され、この場合、どのような変異体又は置換が導入された後であってもＰＫＡ／ＣＫIIキナーゼ活性が維持されることが常に必要である。
【００５８】
同類置換がなされてもよく、例えば下の表に記載の同類置換がなされる。第２カラムの同じ区画、好ましくは第３カラムの同じ行のアミノ酸は相互に置換されてよい：
【００５９】
【表１】
0005670921.tif 000002
【００６０】
本発明のタンパク質は典型的には組換えという手段、例えば下に記載の手段により作製される。しかしながら、固相合成等の当業者に良く知られている技術を用いる合成手段により作製されてもよい。本発明のタンパク質は、例えば抽出及び精製を補助するため、融合タンパク質として作製されてもよい。融合タンパク質パートナーの例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（glutathione-S-transferase、ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合及び／又は転写活性化ドメイン）及びβ−ガラクトシダーゼが含まれる。融合タンパク質配列の除去を可能にするため、融合タンパク質パートナーと当該のタンパク質配列との間のタンパク質分解切断部位を含むことも便利であるだろう。
【００６１】
本発明のタンパク質は実質的に単離された形であってもよい。このタンパク質は、その意図された目的を妨げない担体又は希釈剤と混合されてもよく、それでも依然として実質的に単離されたものとみなされることが理解されるだろう。本発明のタンパク質は実質的に精製された形であってもよく、この場合、それは概して調製物中にこのタンパク質を含み、調製物中のタンパク質の９０％超、例えば９５％、９８％又は９９％が本発明のタンパク質である。 
【００６２】
本発明の適用
本発明がＮｏｇｏシグナリングを阻害する新規方法に関することは、当業者である読者に注目されるだろう。この新規方法はＮｏｇｏ受容体のリン酸化を伴う。本明細書において開示される技術はまた、Ｎｏｇｏ受容体変異体を伴う。明らかに、これらの若干異なる技術的バリエーションのそれぞれがＮｏｇｏシグナリングの阻害に関する同じ共通の発明の一部である。便宜のため及び理解を容易にするため、本発明は主に神経突起伸長阻害を軽減すること又は減少させることに関して記述された。これは脊髄損傷等の分野において特にその適用を見出す。しかしながら、本発明のより広い態様はニューロンの移動又は分化等のニューロンの他の特性の操作を伴っていてもよい。実際のところ、原則としてＮｏｇｏシグナリングにより制御される、或いはそれに影響を受けるあらゆるプロセス（神経突起伸長阻害等、ニューロンの移動等、又はＮｏｇｏシグナリングに影響を受けるあらゆる他の生物学的現象等）が、Ｎｏｇｏ受容体のリン酸化等の本明細書に開示の技術を用いて調節又は制御されてよい。
【００６３】
理論に束縛されることは望まないが、神経突起伸長の精確な生体力学は依然として積極的な研究の主題である。本明細書において開示されるＮｏｇｏシグナリング技術は、シグナル制御に影響を与えるという意味で神経突起伸長制御に影響を与えるということであってもよく、或いはかかる技術が、神経突起伸長効果を生み出すことに密接に関与し得る、線維形成に関与するタンパク質等の神経突起伸長機構に影響を与えるということであってもよい。本発明自体は神経突起伸長の精確な生体力学に関するものではない。Ｎｏｇｏ受容体のリン酸化状態の操作が、或いは実際のところ、本明細書に開示される特定のＮｏｇｏ受容体変異体の使用が、神経突起伸長調節において有用であるということは、本発明の重要な教示である。この教示並びに本発明が実施される方法は、典型的には、物理的な神経突起伸長自体が生じる際の精確な分子機序に依存しない。
【００６４】
本発明の重要な適用の１つは、脊髄損傷治療におけるものである。特に、本発明は脊髄損傷後の再生促進においてその適用を見出す。具体的には、もし本発明がＮｏｇｏ受容体を介するシグナリングにより引き起こされる神経突起伸長の阻害を軽減するか、或いは減少させるならば、本発明は有用である。Ｎｏｇｏ受容体を介するシグナリングを抑制する、或いは減衰させることにより、有用なことに神経突起伸長阻害が減退した。このことは有益なことに神経突起伸長を可能にし、したがって神経再生を可能にする条件を提供する。
【００６５】
本明細書において提示される数多くの実施例は、本発明の組成物の適用のための対象へのカニューレ挿入を伴う。治療されている対象がヒトである際には、カニューレ挿入が有益なことに回避されることに注目すべきである。カニューレ挿入ではなく、本発明組成物の局所注射又は連続注射が好ましくは用いられるであろう。
【００６６】
インビボ適用は実施例において実証される。全体として、本発明は概して以下のように適用可能である：
・ｎｇ〜μｇのＣＫ２等のキナーゼを、任意で１００μＭ  ＡＴＰと共に、損傷後に、例えば脊髄損傷後に付加する。
【００６７】
実験系の１つにおいて、脊髄に損傷をもたらし、損傷部位にカニューレを挿入してもよい。このカニューレを介して、ＣＫ２等のキナーゼがこの部位に適用されてもよい。
【００６８】
ＣＫ２等のキナーゼをカニューレ挿入なしに、注射で適用することも可能である。このことはヒト対象に関して好ましい。しかしながら実験系に関しては、カニューレ挿入がＣＫ２等のキナーゼを折に触れて付加することを容易にする。
【００６９】
その後、神経突起成長が観察されるかどうかが、例えば組織切片の免疫蛍光法を用いて検査されてもよい。
【００７０】
成長観察後、機能回復を評価するために、行動試験が実施されてもよい。
【００７１】
好ましくは、ＣＫ２のみを用いてもよく、或いはＣＫ２を、また別のＣＮＳ再生阻害因子であるコンドロイチン硫酸を消化し得るコンドロイチナーゼＡＢＣと組み合わせて用いてもよい。
【００７２】
好ましくは、ＰＫＡを用いてもよく、或いはＰＫＡをコンドロイチナーゼＡＢＣと組み合わせて用いてもよい。
【００７３】
好ましくは、本発明の方法はインビトロでの方法であってもよい。
【００７４】
好ましくは、本発明の方法はインビボでの方法、例えばヒト対象等の対象の治療における方法であってもよい。
【００７５】
Ｎｏｇｏ受容体のリン酸化
本発明の実際的な適用又は実施形態の大部分が、Ｎｏｇｏ受容体のリン酸化の誘導を介して、Ｎｏｇｏ受容体シグナリングに影響を及ぼすと想定されている。Ｎｏｇｏ受容体変異体を伴う本発明の実施形態が本明細書において下で議論される。しかしながら、Ｎｏｇｏ受容体のリン酸化の検討について言えば、本発明者らは驚くべきことに、本発明の有益な効果を媒介するＮｏｇｏ受容体内の特定の部位を同定した。この部位はＮｏｇｏ受容体のセリン２８１である。
【００７６】
本発明者らは、セリン２８１及びその周囲のアミノ酸残基の研究に注意を向けた。添付の実施例において提示される配列分析並びに直接実験を含む様々な実験技術が、この驚くべき発見を確証するために用いられた。
【００７７】
本発明者らにより開示される重要な洞察の１つは、Ｎｏｇｏ受容体のセリン２８１が本発明のための標的として至上の重要性を有するということである。さらに本発明者らは、Ｎｏｇｏ受容体のセリン２８１が標的にされ、且つリン酸化され得る多くの方法を開示した。これを達成する最も適切な方法のうち２つは、Ｎｏｇｏ受容体のセリン２８１を直接的にリン酸化するためのプロテインキナーゼＡ及び／又はカゼインキナーゼIIの使用である。したがって、プロテインキナーゼＡ及びカゼインキナーゼIIは互いに必ずしも物理的関連がないにもかかわらず、本発明の文脈でそれらは、本発明を実施可能な複数の代替的方法からなる単一のまとまった技術的グループを形成する。言い換えれば、カゼインキナーゼII及びプロテインキナーゼＡは同じ単一の発明を実施する２つの同等に妥当な方法を示す。したがって、添付の請求項におけるこれら２つの構造的に別個の代替案の存在は、単一の発明概念と完全に整合的である。さらに、これら２つの酵素は本発明の文脈で同じ技術的利益、すなわち、Ｎｏｇｏ受容体のセリン２８１のリン酸化を触媒するという技術的利益を共有する。少なくともこれらの理由から、この適用は明らかに単一の発明概念に関するものとみなされ得る。理解を助け、当業者である読者が本発明の実施において困難のないことを保証するために、本発明の技術的利益を達成する多様な方法が記載される。
【００７８】
セリン２８１
前述の通り、本発明が実施され得る異なる技術的方法が、実際にはそれぞれ同じ技術的効果、すなわち、Ｎｏｇｏ受容体のセリン２８１のリン酸化を生み出すことに関するということは、核となる発明概念の重要な一部である。研究の過程で本発明者らは、この残基がＣＫ２及びＰＫＡの両方について予測されるリン酸アクセプター部位の一部であることを見出した。さらに、この重要な発見は、ＣＫ２及びＰＫＡの両方がこの重要な残基のリン酸化を触媒し、且つ、それゆえ神経突起伸長の阻害の軽減を生み出すという、これら両方のことを実証する実験研究により裏付けられた。
【００７９】
カゼインキナーゼII
好ましくは、カゼインキナーゼIIは脊椎動物カゼインキナーゼII、より好ましくは、哺乳動物カゼインキナーゼIIである。より好ましくは、カゼインキナーゼIIはヒトカゼインキナーゼIIである。
【００８０】
カゼインキナーゼIIは最も一般的には、ヘテロ４量体として生じる。このヘテロ４量体は典型的には、２つのアルファポリペプチドからなる触媒サブユニット及び２つのベータポリペプチドからなる調節サブユニットを含む。かかる複合体は典型的には、キナーゼ活性を有するという意味で恒常的に活性を有する。さらに、これら触媒サブユニットそれ自体（すなわち、２つのアルファポリペプチドのホモ２量体）で、調節サブユニットの非存在下でも触媒活性を有する。
【００８１】
したがって、ＣＫ２のヘテロ４量体型又はＣＫ２のホモ２量体型が本発明において適用されてよく、具体的にはそれらはアルファ−ベータヘテロ４量体ＣＫ２又はアルファ−ホモ２量体ＣＫ２であってよい。
【００８２】
最も好ましくは、ＣＫ２は、New England Bio Labs社等から入手した市販の調製物の形で用いられる。これは好ましくは、ＣＫ２のホロ酵素型である。
【００８３】
最も好ましくは、使用されるＣＫ２は２つのポリペプチド鎖からなり、それぞれのポリペプチド鎖は例えば以下のようなヒトＣＫ２アルファサブユニットの配列を有する：遺伝子名；ＣＳＮＫ２Ａ１、受入番号ＮＭ００１８９５．３、ＮＭ１７７５５９．２、ＮＭ１７７５６０．２（３つのサブタイプ）  遺伝子名；ＣＳＮＫ２Ａ２、受入番号ＮＭ００１８９６．２。
【００８４】
ＣＳＮＫ２Ａ１に関して、ＮＭ００１８９５及びＮＭ１７７５５９は異なる５’非コード領域を有するにもかかわらず、同じタンパク質を生み出し得る。ＮＭ１７７５６０はより短いＮ末端領域を有する。アイソフォームｂをコードする。最も好ましくは、ＮＭ００１８９５及びＮＭ１７７５５９のタンパク質配列が用いられ、それは以下のアイソフォームａである：
MSGPVPSRARVYTDVNTHRPREYWDYESHVVEWGNQDDYQLVRKLGRGKYSEVFEAINITNNEKVVVKILKPVKKKKIKREIKILENLRGGPNIITLADIVKDPVSRTPALVFEHVNNTDFKQLYQTLTDYDIRFYMYEILKALDYCHSMGIMHRDVKPHNVMIDHEHRKLRLIDWGLAEFYHPGQEYNVRVASRYFKGPELLVDYQMYDYSLDMWSLGCMLASMIFRKEPFFHGHDNYDQLVRIAKVLGTEDLYDYIDKYNIELDPRFNDILGRHSRKRWERFVHSENQHLVSPEALDFLDKLLRYDHQSRLTAREAMEHPYFYTVVKDQARMGSSSMPGGSTPVSSANMMSGISSVPTPSPLGPLAGSPVIAAANPLGMPVPAAAGAQQ
【００８５】
ＣＳＮＫ２Ａ２に関して、最も好ましくは、以下の配列が用いられる：
MPGPAAGSRARVYAEVNSLRSREYWDYEAHVPSWGNQDDYQLVRKLGRGKYSEVFEAINITNNERVVVKILKPVKKKKIKREVKILENLRGGTNIIKLIDTVKDPVSKTPALVFEYINNTDFKQLYQILTDFDIRFYMYELLKALDYCHSKGIMHRDVKPHNVMIDHQQKKLRLIDWGLAEFYHPAQEYNVRVASRYFKGPELLVDYQMYDYSLDMWSLGCMLASMIFRREPFFHGQDNYDQLVRIAKVLGTEELYGYLKKYHIDLDPHFNDILGQHSRKRWENFIHSENRHLVSPEALDLLDKLLRYDHQQRLTAKEAMEHPYFYPVVKEQSQPCADNAVLSSGLTAAR
【００８６】
プロテインキナーゼＡ
好ましくは、プロテインキナーゼＡは脊椎動物プロテインキナーゼＡ、より好ましくは、哺乳動物プロテインキナーゼＡである。より好ましくは、プロテインキナーゼＡはヒトプロテインキナーゼＡである。
【００８７】
使用されるプロテインキナーゼＡは２つのアルファサブユニット及び２つのベータサブユニットからなっていてもよい。ベータサブユニットホモ２量体は阻害ドメインであり、ｃＡＭＰがアルファホモ２量体からのベータホモ２量体の解離に必要である。
【００８８】
より好ましくは、使用されるプロテインキナーゼＡはヒトＰＫＡアルファサブユニットの配列を有する２つのアルファポリペプチド鎖からなる（すなわちＰＫＡアルファサブユニットホモ２量体）：遺伝子名ＰＲＫＡＣＡ、受入番号ＮＭ００２７３０．３、ＮＭ２０７５１８．１（２つのサブタイプ）。これは、ベータサブユニット（ＰＫＡアルファ−ベータヘテロ４量体を活性化させるためにｃＡＭＰを必要とする）の使用を回避するという利点を有し、したがって、ｃＡＭＰの使用を回避するというさらなる利点を有する。ＰＲＫＡＣＡに関して、ＮＭ００２７３０は遍在的に発現するアイソフォーム１をコードする。ＮＭ２０７５１８は精子形成細胞特異的ＰＫＡ、アイソフォーム２をコードする。最も好ましくは、アイソフォーム１配列は例えば以下のものが用いられる：
MGNAAAAKKGSEQESVKEFLAKAKEDFLKKWESPAQNTAHLDQFERIKTLGTGSFGRVMLVKHKETGNHYAMKILDKQKVVKLKQIEHTLNEKRILQAVNFPFLVKLEFSFKDNSNLYMVMEYVPGGEMFSHLRRIGRFSEPHARFYAAQIVLTFEYLHSLDLIYRDLKPENLLIDQQGYIQVTDFGFAKRVKGRTWTLCGTPEYLAPEIILSKGYNKAVDWWALGVLIYEMAAGYPPFFADQPIQIYEKIVSGKVRFPSHFSSDLKDLLRNLLQVDLTKRFGNLKNGVNDIKNHKWFATTDWIAIYQRKVEAPFIPKFKGPGDTSNFDDYEEEEIRVSINEKCGKEFSEF
【００８９】
高い特異的活性を有するＰＫＡをNew England Biolabs社から入手可能である。
【００９０】
好ましくは、アルファ−ホモ２量体ＰＫＡが用いられる。
【００９１】
理論に縛られることは望まないが、プロテインキナーゼＡは神経突起伸長における生理学的役割を有さないようである。言い換えれば、インビボの自然発生的な生体系においては、ＰＫＡはＮｏｇｏ受容体と接触しないかもしれず、且つ／或いは、それをリン酸化しないかもしれないということもあり得る。しかしながら、ＰＫＡが実際にはこの重要なリン酸化現象を触媒することが、本明細書において明白に実証される。これら理由から、ＰＫＡを用いた治療はいかなる自然な生物学的プロセスの障害をも回避する点において、さらなる利点を提供するということもあり得る。
【００９２】
セリン２８１を標的とするために用いられ得る酵素の比較から、理論に縛られることは望まないが、ＣＫ２はＮｏｇｏ受容体の「自然な」リン酸化のためのより可能性のある生物学的候補のようである。こうした理由から、本発明の治療のためにＣＫ２を用いることがＰＫＡ等の他の可能な酵素の使用に対してさらなる利点を提供するかもしれないということもあり得る。なぜなら、最も自然的又は生物学的である可能性の高いキナーゼ−基質ペアリングの使用により達成される、より高い生物学的忠実度又は特異性が存在するかもしれないからである。そうでなくとも、本発明者らにより実証されるように、ＣＫ２はＮｏｇｏ受容体のセリン２８１のリン酸化をもたらすための有効な触媒である。
【００９３】
本明細書に記載の当該の特定のキナーゼのサブユニットが、本発明において同等に適用されてもよいことに注目すべきである。サブユニットは典型的にはインビボで活性酵素を構成するタンパク質の集合のサブセットであってもよく、或いは、サブユニットが当該のキナーゼのポリペプチドのうちの１つの断片又は切断型を指していてもよい。特に、当該の酵素の触媒サブユニットのみを用いることは有益であろう。これは、一層の活性を有する型の酵素等の利点を提供してもよく、且つ／或いは、より大きな分子又は複合体を用いることから生じるかもしれない免疫原性又は他の合併症を回避してもよい。実際のところ、偶然に切断された、或いは変異したポリペプチドの使用は、本発明の範囲内であると意図される。変異は例えば、活性を高めるため、或いは用いられている酵素の公知の補因子への非依存性を提供するために生み出されてもよい。もし当業者である読者が当該の酵素の特定の断片又は切断型が本発明の範囲内に収まるかどうかを決定することを望むのであれば、使用される酵素がその機能的触媒性活性を維持することは重要である。より具体的には、Ｎｏｇｏ受容体の残基２８１等におけるように、Ｎｏｇｏ受容体内へのホスフェートの組込みを触媒できる場合にのみ、本発明において使用されるキナーゼは関心の対象となる。このことは例えば、リン酸化を可能にする条件下で当該のキナーゼ又は断片をＮｏｇｏ受容体と組み合わせること、並びに、その後リン酸化実際に生じたかどうかを決定するためにＮｏｇｏ受容体をアッセイすることにより、容易に試験され得る。さらに、当該のキナーゼの活性は例えば、それを細胞に適用すること、並びに、それによる神経突起伸長阻害の軽減を試験することにより、機能的に評価されてもよい。明らかに、こうした神経突起伸長阻害の機能的軽減を生み出すことのできる酵素又は断片のみが、本発明において関心の対象となるか、或いは適用される。この機能性アッセイが実施され得る典型的な方法は、実施例において提示される。
【００９４】
したがって文脈が別様に示唆しない限り、「プロテインキナーゼＡ」又は「カゼインキナーゼII」等の本発明における当該のキナーゼへの言及は、それらキナーゼのサブユニット、断片、変異体又は切断型が、上で説明したＮｏｇｏ受容体のためのキナーゼ触媒活性を、最も好ましくは神経突起伸長阻害の軽減のための機能性アッセイにおいて保持するという条件で、常にそれらのあらゆるサブユニット、断片、変異体又は切断を含むものと理解されるべきである。
【００９５】
好ましくは、本発明において用いられるプロテインキナーゼＡ又はカゼインキナーゼIIは、全長ポリペプチドを含む。より好ましくは、本発明において用いられるプロテインキナーゼＡ又はカゼインキナーゼIIは、ヒト野生型酵素に対応するポリペプチドを含む。最も好ましくは、本発明において用いられるプロテインキナーゼＡ又はカゼインキナーゼIIは、実施例において開示されるものである。
【００９６】
好ましくは、本発明において用いられるプロテインキナーゼＡ又はカゼインキナーゼIIは、Ｅ−ｃｏｌｉ発現組換えタンパク質を含む。
【００９７】
好ましくは、本発明において用いられるプロテインキナーゼＡ又はカゼインキナーゼIIは外因性、すなわち、投与部位に位置する細胞において生成しないが、本発明の組成物等において、外部から或いは外因的に提供される。
【００９８】
組成物
本発明の組成物は、ＮｏｇｏＲセリン２８１のリン酸化を引き起こすことのできる酵素等の１又は２以上の触媒を含む。好ましくは、かかる酵素はＰＫＡである。好ましくは、かかる酵素はＣＫIIである。
【００９９】
本発明の組成物はＰＫＡ及びＣＫIIを含んでいてもよい。
【０１００】
ＣＫ２は好ましくは、５００〜１２００Ｕ／ｍｌ  ＣＫ２終末濃度で、或いは、もし組成物が例えば貯蔵のために乾燥／凍結乾燥又は濃縮されたならば、それと等価な量で存在する。
【０１０１】
実施形態の１つにおいて、本発明は１０〜１００μＭ  ＡＴＰ、５〜０．５μｇ  ＣＫ２、１〜１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２又はＭｇ−アセテート及び１０〜５０ｍＭ  ＫＣｌ又はＫ−アセテートを含む組成物を提供する。
【０１０２】
用いられる酵素がＣＫ２アルファサブユニットホモ２量体である際には、；Ｋイオンは任意である（実際にはＫイオンは不要である）；したがって好ましくは、酵素としてＣＫ２アルファサブユニットホモ２量体のみを含む組成物は、さらなる成分としてＭｇ及びＡＴＰのみを含む。
【０１０３】
ＣＫ２アルファ及びベータヘテロ４量体を用いることには、ベータサブユニットがＣＫ２リン酸化の基質特異性を高め、Ｋイオンがベータサブユニットのこの効果を促進するという利点がある。したがって、酵素としてＣＫ２アルファ及びベータヘテロ４量体を用いる際には、好ましくは、この利点を得るためにＫイオンが含まれる。
【０１０４】
実施形態の１つにおいて、本発明は１０〜１００μＭ  ＡＴＰ、５〜０．０５μｇ  ＰＫＡ及び１〜１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２又はＭｇ−アセテートを含む組成物を提供する。
【０１０５】
本発明のポリペプチドは、好ましくは、本発明の組成物を作製するために様々な成分と組み合わされてもよい。好ましくは、組成物は医薬組成物（これはヒト又は動物における使用のためのものであってもよい）を作製するための薬学的に許容可能な担体又は希釈剤と組み合わされる。適切な担体及び希釈剤は等張食塩水液、例えばリン酸緩衝食塩水を含む。
【０１０６】
本発明の組成物は直接注射により投与されてもよい。
【０１０７】
組成物は脊髄等の神経組織の部位への投与のために処方されてもよく、したがって脳脊髄液又は他のかかる組織と適合するよう処方されてもよい。
【０１０８】
典型的には、それぞれのタンパク質は特定のｍｇ／ｋｇ体重量ではなく、特定の有効投与量で投与されてもよい。投与のための典型的な活性レベルは実施例において示す。例を挙げれば、体積に関して言えば、マウスでは典型的には本発明者らはＣＮＳに約２μｌを注射する。したがってヒトでは、本発明者らは典型的には５０〜２００μｌのキナーゼ＋ＡＴＰ溶液を注射する。有効成分の用量は、本明細書において議論される通りである。
【０１０９】
処方／投与
好ましくは、ＣＫII及び／又はＰＫＡ等の本発明の組成物を送達するために注射が用いられる。
【０１１０】
本発明の組成物（例えば、キナーゼ、ＡＴＰ及び／又はイオンを含む）は、例えば脊髄除圧手術中に、局所的に投与されてもよい。
【０１１１】
もし手術が不要であるなら、注射が投与のための代替的方法として用いられてもよい。
【０１１２】
手術後、本発明の組成物は定期的な注射により有効な期間、例えば１ヶ月まで等の期間、或いは３ヶ月まで等のさらに長い期間にわたって投与され得る。
【０１１３】
マトリゲル（BD Bioscience社製）等の基質が、試薬を投与される領域に保つため、有益なことに用いられてもよい。投与量／放出期間を制御するために、基質の代わりにあらゆる持続放出物質及び／又は装置が用いられ得る。
【０１１４】
ＡＴＰ
一部のニューロンはＡＴＰを分泌し得るので、ＡＴＰは本発明の組成物の本質的な要素でなくともよい。インビトロ条件下で本発明者らは、培養基がＡＴＰを含むがゆえにＡＴＰを付加せずに、ＣＫ２等の外因性キナーゼの効果を実証した。
【０１１５】
好ましくは、本発明の組成物はＡＴＰを含む。これはＮｏｇｏ受容体のリン酸化の促進を助けるＡＴＰを供給するという利点を有する。
【０１１６】
好ましくは、組成物はＣＫ２又はＰＫＡを含む組成物について、０．１〜１ｍＭ  ＡＴＰを含む。
【０１１７】
マグネシウム
好ましくは、組成物は５ｍＭ  Ｍｇ２＋イオン源を含む。
【０１１８】
Ｍｇ２＋イオンはＭｇＣｌ２又は（ＣＨ３ＣＯＯ）Ｍｇ２）等のＭｇＡｃ（マグネシウムアセテート）として提供されてもよい。
【０１１９】
カリウム
本発明の組成物がＣＫ２を含む際には、好ましくは、前記組成物はさらにカリウムイオンを含む。カリウムイオンは典型的にはＰＫＡを含む組成物には不要であるが、例えばＰＫＡを含む組成物がＣＫIIをも含む際には、任意で含まれてもよい。
【０１２０】
カリウムイオンは好ましくは、ＫＣｌ又はカリウムアセテート（ＣＨ３ＣＯＯＫ）等の２５〜５０ｍＭ  Ｋイオンとして提供される。
【０１２１】
ＫＣｌ等のカリウムイオンは本質的に重要ではないが、有益なことに、アルファ−ベータヘテロ４量体ＣＫ２のキナーゼ活性に対する促進効果を有する。
【０１２２】
ｃＡＭＰ
サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）が、特に本発明の組成物がＰＫＡを含む際に、前記組成物に任意で含まれてもよい。具体的には、ＰＫＡのアルファ型のみが用いられる際にはｃＡＭＰは任意である。しかしながら、ＰＫＡのベータ型が用いられる際には、ｃＡＭＰは本発明の組成物に含まれることが望ましく、ＰＫＡ活性を高める／可能にするという利点を有する。
【０１２３】
ｃＡＭＰは好ましくは、ジブチリルｃＡＭＰ又は通常のｃＡＭＰとして提供される。どちらの化合物もSigma Inc.社又はMerck Inc.社等を介して、市販で入手可能である。ジブチリルｃＡＭＰの使用は、細胞透過性であるという利点を有する。さらに、通常のｃＡＭＰは細胞膜（plasma membranes）に浸透しない。本発明の組成物は好ましくは細胞外で適用されるので、好ましくは通常のｃＡＭＰが本発明のｃＡＭＰとして用いられる。なぜならこれは、細胞内シグナリングに対するあらゆる副作用を最少化する又は除去するという利点を提供し、付加されるｃＡＭＰを細胞外の環境に限局し、そのことによりそれが本発明の組成物の酵素と共に局在し続けるのに役立つという利点を提供するからである。
【０１２４】
利点
Ｎｏｇｏ受容体のリン酸化がＮｏｇｏシグナリングを抑制し、神経突起再生を可能にすることは本発明の利点である。
【０１２５】
Ｎｏｇｏ受容体のリン酸化がこれら受容体のアゴニストの結合を遮断することは本発明の利点である 。
【０１２６】
本発明は、脊髄損傷に特にその適用を見出す。
【０１２７】
Ｎｏｇｏ受容体が標的とされることは本発明の利点である。これは、リガンド非依存性な仕方で作用する方法及び組成物を提供するという利点を有する。
【０１２８】
組合せ
本発明をコンドロイチンシグナリングの阻害と組み合わせることが有益であり得る。これを達成する方法の１つとして、コンドロイチナーゼＡＢＣ等のコンドロイチナーゼが、神経突起伸長を可能にする条件を促進するために適用され得る。コンドロイチナーゼがＮｏｇｏ経路と別個の経路を標的とすることは利点である。したがって、神経突起伸長の促進のための二重標的アプローチを提供するためにコンドロイチナーゼを本発明の治療又は組成物と組み合わせることは有益である。
【０１２９】
本発明を、Ｎｏｇｏ経路を標的とするまた別の方法と組み合わせることが有益であり得る。例えば、本発明を抗Ｎｏｇｏ受容体抗体又はＮｏｇｏ受容体のリガンドに対する抗体の適用と組み合わせることが有益であり得る。シグナリング経路における同じ箇所を標的とするために複数の介入手段が用いられていることは、これら実施形態の利点である。したがって、望まれない副作用又は他の経路内への交差シグナリング（crossover signalling）の可能性は、有益なことに回避される。
【０１３０】
本発明を抗ＬＩＮＧＯ抗体と組み合わせることもまた有益であり得る。典型的な抗ＬＩＮＧＯ抗体はBiogen Inc社により提供されるものであるだろう。かかる組合せは異なる物理的分子を標的とするが、依然として同じシグナリング複合体全体内にあるという利点を有する。したがって、このような組合せは、シグナリング忠実度という利点、すなわち、単一の経路のみを標的とするという利点を、複数の異なる分子を標的にし、そのことによりシグナルのより一層強力な遮断を達成することを目指すという利点と組み合わせて提供する。
【０１３１】
本発明を、ニューロンの適切な結合を促進するために有効であり得るリハビリテーションと組み合わせることもまた有益であり得る。かかる組合せはまた有益なことに、異常な結合を減少させ得る。
【０１３２】
本発明の組成物は、神経外科手術等の手術中又は手術後の投与においてその適用を見出し得る。この実施形態において、手術は成人神経組織への損傷の１例である。したがって、キナーゼ、ＡＴＰ及びあらゆる必要な金属イオンが手術中に適用されてもよい。
【０１３３】
本発明の組成物において任意でセスリン（Cethrin）が含まれていてもよい。典型的にはこれは、１回投与量当たり０．３、１、３、６又は９ｍｇで用いられる。
【０１３４】
本発明の組成物における基質の適用又は基質の包含は、付加される試薬が損傷部位に残る又は持続するのに役立つという利点を有する。
【０１３５】
炎症抑制剤が本発明の組成物に含まれてもよく、且つ／或いは、損傷／手術後にそれができるだけ早く適用されてもよい。
【０１３６】
幹細胞移植が、好ましくは炎症が治まった後に（さもなければ、移植細胞は宿主免疫系により死滅させられるかもしれない）実行されてもよい。例を挙げれば、マウスに関しては、細胞は損傷から５日後に移植されるのであり、すなわち炎症後に細胞が移植される。
【０１３７】
したがって、炎症抑制剤、Ｒｈｏ阻害因子（Ｃ３毒素等）及び／又はＥＳ細胞が有用なことに本発明と組み合わされてもよい。ＥＳ細胞に関しては、Ｎｏｇｏシグナリングの強制活性化は神経分化を阻害し、神経幹細胞の神経膠への分化を促進し得る。したがって、もしＮｏｇｏが損傷領域において活性を有するのであれば、移植細胞の分化は有益なことに、Ｎｏｇｏシグナリングの阻害により促進され得る。
【０１３８】
神経突起伸長阻害の軽減
ニューロンの再成長又は再生が損傷した成人神経組織において不十分にしか、或いは一切生じないことは、当技術分野における継続的な問題だった。この文脈において損傷は、外傷による物理的損傷を意味していてもよく、或いは、変性疾患等の神経障害による損傷を意味していてもよい。明らかに、あらゆるかかる状況において、神経組織の再生又は再成長が望ましい。
【０１３９】
神経突起伸長が健常な成人神経組織において阻害されることは十分確立している。この阻害を除去又は軽減することが本発明の目的である。このことの最終的帰結は、神経突起伸長等を介する神経再生の促進又は亢進である。これは神経突起伸長の刺激として言及されるかもしれない。実際のところ、適用の大部分に関して、神経突起伸長の刺激と神経突起伸長阻害の軽減との間に実質的な違いはないだろう。しかしながら、この潜在的システムについて本発明者らにより得られた洞察及び理解ゆえに、本発明は一貫して神経突起伸長阻害の軽減の観点から記載される。これはなぜなら、ある種のＮｏｇｏファミリーリガンドが神経突起伸長の阻害因子であることは確立しているからである。したがって、Ｎｏｇｏ受容体を介するシグナリングにより生み出されるこの阻害の軽減こそが本発明の主題である。もしこの阻害の除去を神経突起伸長の「刺激」とみなすことが有益であれば、これに折に触れて注目又は言及されてもよい。そのことは、神経突起伸長阻害を除去又は緩和し、そのことにより神経突起伸長等を介する神経再生を可能にする又は促進する（又は実際に刺激する）という本発明の目的全体から逸脱しない。
【０１４０】
さらに、本発明は有益なことに、神経突起伸長の１又は２以上の刺激要因と組み合わされてもよく、そのことにより伸長を誘導すると同時にその阻害を除去又は軽減し、より明白な或いはより亢進された再成長又は再生をもたらしてもよい。
【０１４１】
さらなる適用
広い態様の１つにおいて、本発明は医薬としての使用のためのＰＫＡに関する。
【０１４２】
広い態様の１つにおいて、本発明は医薬としての使用のためのＣＫ２に関する。
【０１４３】
広い態様の１つにおいて、本発明はＣＫ２の細胞外での新規使用に関する。
【０１４４】
プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）が、ＣＫ２と同様、Ｎｏｇｏシグナリングを阻害し得ることが開示される。最も好ましくは、本発明において使用されるキナーゼはＰＫＡである。
【０１４５】
本発明は脊髄損傷後の神経突起伸長阻害の軽減に関し、特にＮｏｇｏシグナリングの阻害による軽減に関する。
【０１４６】
本発明の適用は神経突起伸長阻害の軽減のみに限られない。Ｎｏｇｏシグナリングは成長中のニューロンの分化（B. Wang, Z. Xiao, B. Chen, J. Han, Y. Gao, J. Zhang, W. Zhao, X. Wang, J. Dai, Nogo-66 promotes the differentiation of neural progenitors into astroglial lineage cells through mTOR-STAT3 pathway. PLoS ONE 3, e1856 (2008); F. Wang, Y. Zhu, The interaction of Nogo-66 receptor with Nogo-p4 inhibits the neuronal differentiation of neural stem cells. Neuroscience 151, 74-81 (2008)）、シナプス形成（E. M. Aloy, O. Weinmann, C. Pot, H. Kasper, D. A. Dodd, T. Rulicke, F. Rossi, M. E. Schwab, Synaptic destabilization by neuronal Nogo-A. Brain Cell Biol 35, 137-156 (2006)）、及び移動（Z. Su, L. Cao, Y. Zhu, X. Liu, Z. Huang, A. Huang, C. He, Nogo enhances the adhesion of olfactory ensheathing cells and inhibits their migration. J Cell Sci 120, 1877-1887 (2007)）に関与する。それはまた、認知症を引き起こす神経変性障害であるアルツハイマー病にも関与する（J. H. Park, D. A. Gimbel, T. GrandPre, J. K. Lee, J. E. Kim, W. Li, D. H. Lee, S. M. Strittmatter, Alzheimer precursor protein interaction with the Nogo-66 receptor reduces amyloid-beta plaque deposition. J Neurosci 26, 1386-1395 (2006); V. Gil, O. Nicolas, A. Mingorance, J. M. Urena, B. L. Tang, T. Hirata, J. Saez-Valero, I. Ferrer, E. Soriano, J. A. del Rio, Nogo-A expression in the human hippocampus in normal aging and in Alzheimer disease. J Neuropathol Exp Neurol 65, 433-444 (2006); H. Y. Zhu, H. F. Guo, H. L. Hou, Y. J. Liu, S. L. Sheng, J. N. Zhou, Increased expression of the Nogo receptor in the hippocampus and its relation to the neuropathology in Alzheimer's disease. Hum Pathol 38, 426-434 (2007)）。したがって、本発明は有益なことに、神経突起伸長阻害の軽減等の特に適切な分野と同様、これら分野に適用されてもよい。
【０１４７】
特に本発明は、アルツハイマー病及び／又はパーキンソン病等の神経変性疾患一般に適用されてもよい。これは本発明の特に好ましい適用である。なぜなら、ＮｏｇｏＲはアミロイドＢ及びその前駆体であるＡＰＰに結合し得るからである。
【０１４８】
本発明はまた、脳卒中発作等の、より急性の神経障害に適用されてもよい。
【０１４９】
Ｎｏｇｏの阻害はミエリン形成の増加をもたらす。したがって本発明は、多発性硬化症等のあらゆるミエリン形成障害にその適用を見出す。したがって本発明は、多発性硬化症に適用されてもよい。統合失調症は、ミエリン形成不全と結び付けられる神経障害のまた別の例である。したがって本発明は、統合失調症に適用されてもよい。さらに本発明は、ある系においてミエリン形成を増加させるための方法に関し、前記方法は、前記系においてＮｏｇｏ受容体をリン酸化することを含み、それは好ましくは、前記系へのＰＫＡ及び／又はＣＫIIの付加による。
【０１５０】
本発明はまた、Ｎｏｇｏリガンド等の神経突起伸長阻害因子のＮｏｇｏ受容体への結合を阻害する方法に関し、前記方法はセリン２８１等で前記Ｎｏｇｏ受容体のリン酸化を誘導することを含む。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】ＢＤＮＦはＲＡで処理されたＳＨ−ＳＹ５Ｙの神経突起伸長を促進し、ＮｇＲ１のリン酸化を誘導する。（Ａ）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が示されている試薬と共にインキュベートされた。細胞画像が位相差顕微鏡法で撮影された。（Ｂ）４０μｍ超の神経突起様構造を伸長させる細胞の数及び細胞総数が（Ａ）で撮影された画像から計数された。それぞれの試料において３００超の細胞が検査された。４０μｍ超の神経突起様構造を伸長させる細胞の比率が細胞総数に対するパーセントとして示される。３回の実験の平均が示される。エラーバーは実験間のＳ．Ｅ．を示す。データはスチューデントｔ検定で分析された。（Ｃ）ＢＤＮＦと共に、或いはそれなしに２４時間インキュベートされた後のＲＡ処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞から全細胞抽出物が調製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された。イムノブロッティングが示されている抗体を用いて実施された。（Ｄ）ＲＡ及びＢＤＮＦの両方で処理された細胞から調製される全細胞抽出物が、示されている試薬と共に１時間、３７℃でインキュベートされた。イムノブロッティングが抗ＮｇＲ１抗体を用いて実施された。（Ｅ）ＲＡ処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が、以下のもののうちの１つの存在下又は非存在下でＢＤＮＦと共に２４時間インキュベートされた：ＰＫＣ阻害因子−５００ｎＭ  Ｇo６９８３若しくはＧo６９７６；ＰＫＡ阻害因子−２μＭ  ＫＴ５７２０若しくはＰＫＡ阻害因子ペプチド１４〜２２；又はカゼインキナーゼ阻害因子５００ｎＭ若しくは１μＭ。これら細胞から調製された全細胞抽出物がＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された。イムノブロッティングが抗ＮｇＲ１抗体を用いて実施された。
【図２】ＣＫ２はＲＡ処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の神経突起伸長をＢＤＮＦなしで促進する。（Ａ）ＲＡ処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が２４時間、示されている試薬と共にインキュベートされた。細胞画像が位相差顕微鏡法で撮影された。（Ｂ）４０μｍ超の神経突起様構造を伸長させる細胞の数及び細胞総数が（Ａ）で撮影された画像から計数された。それぞれの試料で３００超の細胞が検査された。計算が図１Ｂの通りになされた。ＲＡのみとＲＡ＋ＣＫII＋ＡＴＰとの間のスチューデントｔ検定の結果はｐ＝０．００１４だった。（Ｃ）ＮｇＲ１のＭｙｃ標識した野生型及び変異体バージョンを、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において過剰発現させた。これら細胞をＲＡ、ＣＫ２及びＡＴＰで処理した。過剰発現しているＮｇＲ１−Ｍｙｃを抗Ｍｙｃ抗体を用いて検出した。（Ｄ）２８１Ｓ／Ａ変異体ＮｇＲ１−Ｍｙｃを過剰発現しているＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞がＲＡ及びＮＥＰ１−４０と共にインキュベートされた。（Ｅ）２８１Ｓ／Ｄ変異体ＮｇＲ１−Ｍｙｃを過剰発現しているＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が（Ｃ）と同様に処理された。
【図３】ＣＫ２はＮｇＲ１をリン酸化し、ミエリン関連タンパク質のＮｇＲ１への結合を阻害する。（Ａ）Ｍｙｃ標識した野生型、２８１Ｓ／Ａ又は２８１Ｓ／Ｄ変異体のＮｇＲ１をＣＯＳ７細胞において過剰発現させた。これら過剰発現した細胞が、ＡＴＰとＣＫ２との組合せ又はＮＥＰ１−４０と共に３０分間、３７℃でインキュベートされた。ＰＢＳで洗浄後、細胞はＨｉｓ×６標識Ｎｏｇｏ−ＧＦＰと共に３時間、４℃でインキュベートされた。これら細胞は固定され、免疫蛍光法が抗Ｍｙｃ抗体及び抗ＧＦＰ抗体を用いて実施された。（Ｂ）Ｍｙｃ標識野生型ＮｇＲ１を過剰発現しているＣＯＳ７細胞が（Ａ）に記載の通り処理された。タンパク質を抽出し、抗Ｍｙｃ抗体を用いてＭｙｃ標識ＮｇＲ１を免疫沈降させた。同時沈殿させたＨｉｓ×６標識Ｎｏｇｏ−ＧＦＰが抗ＧＦＰ抗体により検出された。（Ｃ）ＮｇＲ１過剰発現ＣＯＳ７細胞の細胞表面タンパク質がビオチンで標識された。ビオチン標識タンパク質が分画され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された。ビオチン標識ＮｇＲ１−Ｍｙｃが抗Ｍｙｃ抗体を用いて検出された。（Ｄ）野生型ＮｇＲ１−Ｍｙｃ又は２８１Ｓ／Ａ変異体ＮｇＲ１−Ｍｙｃを過剰発現しているＣＯＳ７細胞が、α−３２Ｐ−ＡＴＰと共にＣＫ２の存在下又は非存在下でインキュベートされた。Ｍｙｃ標識タンパク質を免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。タンパク質はＰＶＤＦ膜上へとブロットされ、この膜は組み込まれた３２Ｐを検出するため、Ｘ線フィルムに曝露された。オートラジオグラフィーの後、抗Ｍｙｃ抗体を用いたイムノブロッティングにこの膜を用いた。（Ｅ及びＦ）Ｍｙｃ標識された野生型、２８１Ｓ／Ａ又は２８１Ｓ／Ｄ変異体のＮｇＲ１を過剰発現しているＣＯＳ７細胞が（Ａ）に記載の通り処理された。ＰＢＳで洗浄後、細胞はＨｉｓ標識ＯＭｇｐ（Ｅ）又はＨＡ標識ＭＡＧ（Ｆ）と共に３時間、４℃でインキュベートされた。これら細胞を固定し、免疫蛍光法を抗Ｍｙｃ抗体及び抗Ｈｉｓ抗体（Ｅ）又は抗Ｍｙｃ抗体及び抗ＨＡ抗体（Ｆ）を用いて実施した。
【図４】ヒトＮｇＲ１におけるセリン２８１を含むＣＫ２標的モチーフは、脊椎動物ＮｇＲ１及びＮｇＲ２において保存されている。（Ａ）ヒト（GenBank受入番号ＮＭ  ０２３００４）、マウス（ＮＭ  ０２２９８２）、ラット（ＡＦ４６２３９０）、ダニオ（ＮＭ  ２０３４７８）及びニワトリ（ＸＭ４１５２９２）のＮｇＲ１のＣ末端隣接領域のアミノ酸配列が比較された。ヒトＮｇＲ１と同一のアミノ酸が赤で示される。（Ｂ）ヒトＮｇＲ１（GenBank受入番号ＮＭ  ０２３００４）、ＮｇＲ２（ＮＭ  １７８５７０）及びＮｇＲ３（ＮＭ  １７８５６８）並びにマウスＮｇＲ１（ＮＭ  ０２２９８２）、ＮｇＲ２（ＮＭ  １９９２２３）及びＮｇＲ３（ＮＭ  １７７７０８）のＣ末端隣接領域のアミノ酸配列が比較された。（Ｃ）α−３２Ｐ−ＡＴＰと共にＣＫ２の存在下又は非存在下でインキュベートした後のＭｙｃ標識ＮｇＲ２を過剰発現しているＣＯＳ７細胞から、全細胞抽出物が調製される。Ｍｙｃ標識ＮｇＲ２を全細胞抽出物から免疫沈降させＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。タンパク質がＰＶＤＦ膜上へとブロットされ、この膜は図３ｃに記載の通り処理される。（Ｄ）Ｍｙｃ標識ヒトＮｇＲ２を過剰発現しているＣＯＳ７細胞がＡＴＰ及びＣＫ２の組合せと共に、或いはそれなしに、３０分間、３７℃でインキュベートされた。ＰＢＳで洗浄後、細胞はＨＡ標識ＭＡＧと共に３時間、４℃でインキュベートされた。これら細胞は固定され、免疫蛍光法が抗Ｍｙｃ抗体及び抗ＨＡ抗体を用いて実施された。（Ｅ）ＣＫ２及びＡＴＰと共にインキュベートした後、ＮｇＲ２−Ｍｙｃがゲル中トリプシンで消化され、トリプシンペプチドが質量分析法で分析された。リンペプチドとして検出されたペプチド配列が記載される。
【図５】ＣＫ２は生後ラットニューロンをミエリン関連阻害因子であるＮｏｇｏ、ＭＡＧ及びＯＭｇｐによる神経突起伸長阻害からレスキューする。（Ａ）生後５日目のラットに由来するＤＲＧニューロンがＮｏｇｏ−６６断片と共に、或いはそれなしに、示されている試薬の存在下で培養された。示されている試薬の付加から２４時間後、細胞は固定され、α−チューブリンIIIが免疫蛍光法で検出された。（Ｂ）２０μｍ超の神経突起を伸長させる細胞の数及びα−チューブリンIII陽性細胞総数が（Ａ）で撮影された画像から計数された。２０μｍ超の神経突起様構造を伸長させる細胞集団が総細胞数に対するパーセントとして示される。３つの実験の平均が示される。エラーバーは実験間のＳ．Ｅ．を示す。データがスチューデントｔ検定で分析された。（Ｃ及びＤ）生後５日目のラットに由来するＤＲＧニューロンが、ポリ−Ｄ−リジン及びＭＡＧ（Ｃ）又はＯＭｇｐ（Ｄ）でコートされた８ウェルチェンバースライド上に播種され、ＣＫ２と共に、或いはそれなしに、２４時間インキュベートされた。細胞は固定され、免疫蛍光法が抗αチューブリンIII抗体を用いて実施された。（Ｅ）２０μｍ超の神経突起を伸長させる細胞の数及びα−チューブリンIII陽性細胞総数が、（Ｃ及びＤ）で撮影された画像から計数された。２０μｍ超の神経突起様構造を伸長させる細胞集団を、細胞総数に対するパーセントとして示した。（Ｂ）の通り計算がなされた。（Ｆ）生後８日目のラットに由来するＣＧニューロンが示されているミエリン関連阻害因子と共に、或いはそれなしに、２４時間、ＣＫ２の存在下又は非存在下で培養された。細胞は固定され、α−チューブリンIIIが免疫蛍光法により検出された。（Ｇ）野生型ＮｇＲ１−Ｍｙｃ又は２８１Ｓ／Ａ変異体ＮｇＲ１−Ｍｙｃを過剰発現しているＣＧニューロンがＮｏｇｏ断片と共に、或いはそれなしに、ＣＫ２の存在下又は非存在下で２４時間培養された。過剰発現しているＮｇＲ１−Ｍｙｃが免疫蛍光法により検出された。（Ｈ）２０μｍ超の神経突起を伸長させるＭｙｃ陽性細胞の数及びＭｙｃ陽性細胞総数が（Ｇ）で撮影された画像から計数された。（Ｂ）の通り計算がなされた。
【図６】図６は、脊椎動物のＮｇＲ１のアミノ酸配列を示す。ＮｇＲ１のＮＣＢＩ受入番号は、ラット；ＡＦ  ４６２３９０、ヒト；ＮＭ  ０２３００４、マウス；ＮＭ  ０２２９８２、ダニオ；ＮＭ  ２０３４７８、ニワトリ；ＸＭ  ４１５２９２である。赤字はヒトＮｇＲ１と相同なアミノ酸を示す。緑字はヒトＮｇＲ１と類似したアミノ酸を示す。ＮＦ；Ｎ末端隣接領域、ＬＲＲ；ロイシンリッチリピートモチーフ、ＣＦ；Ｃ末端隣接領域。
【図７】図７は以下のものを示す：Ａ、ＲＡ処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が示されている試薬と共に２４時間培養された。固定後、ベータ−チューブリンIIIが抗ベータ−チューブリンIII抗体を用いて検出された。Ｂ、野生型又は２８１Ｓ／Ａ変異体のＮｇＲ１−ＭｙｃをＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において過剰発現させた。ＲＡでの処理の５日後、これら細胞は５００Ｕ／ｍｌ  ＰＫＡ及び５００ｎＭ（７４ｋＢｑ／ｍｌ）ＡＴＰと共にインキュベートされた。その後、ＮｇＲ１−Ｍｙｃを免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。Ｃ、野生型又は２８１Ｓ／Ａ変異体のＮｇＲ１−Ｍｙｃを過剰発現しているＲＡ処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が５００Ｕ／ｍｌ  ＰＫＡ及び５００ｎＭ  ＡＴＰと共に２４時間インキュベートされ、固定された。ＮｇＲ１−Ｍｙｃが抗Ｍｙｃ抗体を用いて検出された。ＰＫＡはＣＫ２と同様に、ＲＡ処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞からの神経突起伸長を誘導した（図７Ａ）。ＰＫＡが野生型ＮｇＲ１−Ｍｙｃをリン酸化した（図７Ｂ）。セリン２８１における変異生成は、ＰＫＡでのリン酸化（図７Ｂ）及びＰＫＡ処理後の神経突起伸長（図７Ｃ）の両方を強力に阻害した。したがって、ＰＫＡ及びＣＫ２の両方がＮｇＲ１をリン酸化し得るのであり、Ｎｏｇｏシグナリングの神経突起伸長に対する阻害効果を無効にし得る。
【図８】図８はヒトＮｇＲのアミノ酸配列を示す。ＮｇＲのＮＣＢＩ受入番号は図４Ｂの通りである。赤字はヒトＮｇＲ１と相同なアミノ酸を示す。黒三角はヒトＮｇＲ１におけるセリン２８１の位置を示す。
【図９】図９は写真及び配列比較を示す。（Ａ）ＰｉｒＢの全長がＣ末端のストレプトアビジン結合ペプチド（streptoavidine-binding peptide、ＳＢＰ）標識と共にＣＯＳ７細胞に発現した。これらＣＯＳ７細胞はOptiMEM（Invitrogen社製）中の２０００Ｕ／ｍｌ  ＰＫＡ、５ｍＭ  ＭｇＳＯ４及び１００μＭ  ３２Ｐ−ＡＴＰと共に３７℃で１時間インキュベートされた。インキュベーション後、細胞は洗浄され、タンパク質が０．５％TritonX-100、２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌで抽出された。ストレプトアビジン電磁ビーズ（Invitrogen社製）を用いて抽出物からＳＢＰ標識ＰｉｒＢを沈殿させた。ビーズと結合しているタンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析され、組み込まれた３２Ｐがオートラジオグラフィーで検出された。（Ｂ）ＰｉｒＢを過剰発現しているＣＯＳ７細胞が、非標識ＡＴＰを除いて（Ａ）に記載の通り処理された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析されたタンパク質がクマシーブリリアントブルーＧ−２５０で染色された。ＰｉｒＢに対応するバンドが切除され、質量分析法で分析された。質量分析法で検出されたリンペプチドのアミノ酸配列がボックスで囲われた。黒三角はリン酸化されたアミノ酸であるセリン４２５を示す。ヒトＬＩＬＲＢ１、２、３及び５、並びにラット及びマウスＰｉｒＢのリン酸化部位付近のアミノ酸配列が比較された。マウスＰｉｒＢと相同なアミノ酸残基が赤字で示された。
【図１０Ａ】図１０Ａは写真を示す。（Ａ）嗅内野海馬切片の器官型培養物が生後５日目及び６日目の１２９Ｘ１／ＳｖＪＪｍｓＳｌｃ（アルビノ）マウスから調製された。培養基は２日毎に交換された。インビトロでの日数（ＤＩＶ、day in vitro）１０日目、嗅内野海馬投射が滅菌メスの刃で横切された。破壊切片が８日間、１２５０Ｕ／ｍｌ  ＰＫＡ及び１００μＭ  ＡＴＰと共に、或いはそれらなしで培養された。ＤＩＶ１７日目、少分量のＤｉｌペースト（Invitrogen社製）が横切部の嗅内野側に適用された。ＤＩＶ１８日目、嗅内野海馬投射の再生を検査するため、これら切片を共焦点顕微鏡法で観察した。ＤＩＶ１０日目に生み出された損傷部位の位置が白の点線で示される。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは棒グラフを示す。（Ｂ）歯状回付近のＤｉｌシグナルの強度がImageJ（バージョン１．４２q、National institute of health、米国）で測定された。測定された領域（１００μｍ平方）は（Ａ）に中抜きの白四角で示された。強度は対照（破壊されていない）におけるＤｉｌシグナルに対するパーセントで示された。実験は３組で５回反復された。典型的な画像が（Ａ）に示され、５回の独立した実験の平均が（Ｂ）にプロットされた。統計的有意性を評価するため、スチューデントｔ検定が用いられた。
【０１５２】
本発明はここで実施例により説明される。これら実施例は例証的であることが意図されており、添付の請求項を限定することを意図するものではない。
［実施例］
【０１５３】
方法及び試薬
ヒト神経芽細胞腫細胞株であるＳＨ−ＳＹ５ＹはATCC社から購入した。Ham's F12培地、Neurobasal-A培地、マウス抗ＧＦＰモノクローナル抗体及びB27添加剤はInvitrogen社から購入した。レチノイン酸、クレアチン及びクレアチンホスホキナーゼ、マウス抗Ｍｙｃモノクローナル抗体及びポリ−Ｄ−リジンはSigma社から購入した。ラットニューロン及びNSF-1添加剤はLONZA社から購入した。ＢＤＮＦ、Ｇo６９８３、Ｇo６９７６、ＣＫ２阻害因子（４，５，６，７−テトラブロモ−２−アザベンツイミダゾール）、ＫＴ５７２０、ミリストイル化ＰＫＡ阻害因子ペプチド１４〜２２アミド及びＮＥＰ１−４０ペプチドはMerck社から購入した。抗ＬＩＮＧＯ−１抗体はMillipore社から購入した。抗ＮｏｇｏＡ抗体及び抗ＮｇＲ抗体はSanta Cruz社から購入した。ＡＴＰはRoche社から購入した。ＣＫ２及びラムダタンパク質ホスファターゼはNew England Biolab社から購入した。コラーゲンIV、ＯＭｇｐ−Ｈｉｓ及びＮｏｇｏ−ＦｃはR&D社から購入した。ウサギ抗Ｍｙｃポリクローナル抗体はCell Signalling社から購入した。α−３２Ｐ−ＡＴＰはGE healthcare社から購入した。
【０１５４】
細胞培養
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が１０％ウシ胎仔血清を伴うHam's F12培地で３７℃で５％のＣＯ２及び９５％の大気の中で培養された。１５〜２１の継代数が本明細書に記載の実験で用いられる。さらなる継代は自発的分化を誘導し、細胞はＢＤＮＦなしに神経突起を伸長させる傾向にある（データは示されていない）。ＲＡ処理のため、これら細胞はコラーゲンIVにコートされた４ウェルチェンバースライド上に播種される（２００００細胞／ウェル）。２４時間の培養後、培地は１０μＭ  ＲＡ及び１０％ウシ胎仔血清を含むHam's F12培地に交換された。培地は３日目に新鮮な培地へと交換され、培養５日後の細胞が実験のために用いられた。Encinas et al.（M. Encinas, M. Iglesias, Y. Liu, H. Wang, A. Muhaisen, V. Cena, C. Gallego, J. X. Comella, Sequential treatment of SH-SY5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neurotrophic factor-dependent, human neuron-like cells. J Neurochem 75, 991-1003 (2000)）は、ＲＡ処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が血清除去後にアポトーシスを開始するのは、低密度で培養される場合のみであると報告した。本明細書において用いられる細胞密度はEncinas et al.による論文における密度より高く（M. Encinas, M. Iglesias, Y. Liu, H. Wang, A. Muhaisen, V. Cena, C. Gallego, J. X. Comella, Sequential treatment of SH-SY5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neurotrophic factor-dependent, human neuron-like cells. J Neurochem 75, 991-1003 (2000)）、血清又はＢＤＮＦの欠乏による細胞死は顕著ではなかった。本明細書では、ＲＡで５日間処理されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞がＲＡ処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙと呼ばれる。ＢＤＮＦ処理のため、ＲＡ処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は血清非含有Ham's F12培地を用いて洗浄され、２５ｎｇ／ｍｌ  ＢＤＮＦと共に血清非含有Ham's F12培地中で２４時間インキュベートされた。対照（ＲＡのみ）として、ＲＡ処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が血清非含有Ham's F12のみで２４時間インキュベートされた。
【０１５５】
生後５日目のラットに由来するＤＲＧニューロンを２ｍＭグルタミン及び２％NSF-1添加剤を含むNeurobasal-A培地中に再懸濁させ、ポリ−Ｄ−リジンでコートされた８ウェルチェンバースライド上に播種した（５０００細胞／ウェル）。播種から４時間後、培地を新鮮な培地と交換した。
【０１５６】
生後８日目のラットに由来するＣＧニューロンを２５ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭグルタミン及び２％B27添加剤を含むNeurobasal-A培地中に再懸濁させ、ポリ−Ｄ−リジンでコートされた８ウェルチェンバースライド上に播種した（１００００細胞／ウェル）。播種から４時間後、培地を新鮮な培地と交換した。
【０１５７】
細胞のＣＫ２処理
ＲＡ処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のＣＫ２処理のため、これら細胞は血清非含有Ham's F12で洗浄され、１００ｎＭ  ＡＴＰ又は５００Ｕ／ｍｌ  ＣＫ２又はその両方と共に、２５ｍＭ  ＫＣｌ及び５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む血清非含有Ham's F12中で２４時間インキュベートされた。
【０１５８】
生後５日目のラットに由来するＤＲＧニューロンのＣＫ２処理のために、播種から４時間のインキュベーション後、培地が２ｍＭグルタミン、１０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び２％ＮＳＦ−１添加剤を５００Ｕ／ｍｌ  ＣＫ２と共に含むneurobasal-A培地へと交換された。対照（処理なし）として、培地がＣＫ２なしの培地へと交換された。生後８日目のラットに由来するＣＧニューロンのために、２ｍＭグルタミン、２％B27添加剤及び２５ｍＭ  ＫＣｌを含むneurobasal-A培地が用いられた。
【０１５９】
ＣＯＳ７細胞のＣＫ２処理のために、細胞が血清非含有Ham's F12培地で洗浄され、５００μＭ  ＡＴＰ及び１２００Ｕ／ｍｌ  ＣＫ２の両方と共に、或いはそれらなしに、２５ｍＭ  ＫＣｌ及び５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む血清非含有Ham's F12培地中で３０分間、３７℃でインキュベートされた。
【０１６０】
α３２Ｐ−ＡＴＰを伴うＣＫ２によるリン酸化
Ｍｙｃ標識ＮｇＲ１又はＮｇＲ２を過剰発現しているＣＯＳ７細胞の処理のため、細胞が培養皿からこすり取られた。これら細胞はＰＢＳで洗浄され、２５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１２００Ｕ／ｍｌのＣＫ２、２００μＭ  ＡＴＰ（３．７ｋＢｑ／ｍｌ）を含むＰＢＳ中で再懸濁された。３０分間、３０℃でのインキュベーション後、リン酸化を終結させ、タンパク質が０．１％Triton X 100、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び２５ｍＭ  ＥＤＴＡで抽出された。抗Ｍｙｃ抗体を用いてＭｙｃ標識タンパク質を免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０１６１】
ミエリン関連タンパク質の発現及び精製
第１鎖ＤＮＡがヒト胎児脳（TAKARA社製）から精製されたｍＲＮＡから、SuperScript II逆転写酵素（Invitrogen社製）及びオリゴｄＴを用いて合成された。ヒトＮｏｇｏ−ＡのｃＤＮＡが、テンプレートとして第１鎖ＤＮＡを用いたＰＣＲにより増幅された。増幅されたＮｏｇｏ−Ａ（Genbank受入番号ＮＭ  ０２０５３２）断片であるＮｔ  ３４４４〜３７０９が、pEGFP N2（TAKARA社製）内へ組み込まれた。Ｎｏｇｏ−Ａ断片及びＥＧＦＰ領域が切除され、pcDNA 3.1／Hisベクター（Invitrogen社製）内へ組み込まれた。このベクターのＨｉｓ×６、Ｎｏｇｏ−Ａ及びＥＧＦＰ領域がベクターから切除され、pBEn-SBP-SETベクター（Stratagene社製）内へと組み込まれ、その後それをArcticExpress (DE3)RIL E. coli（Stratagene社製）に導入した。Ｈｉｓ×６−Ｎｏｇｏ−Ａ断片−ＥＧＦＰタンパク質の発現が、１ｍＭ  ＩＰＴＧにより一晩かけて１８℃で誘導された。Ｈｉｓ×６  Ｎｏｇｏ−Ａ断片−ＧＦＰがTALONカラム（TAKARA社製）を用いて精製された。
【０１６２】
ヒトＭＡＧ（ＮＭ  ００２３６１）の発現のため、ＭＡＧ（Ｎｔ  １９８〜１６５５）のｃＤＮＡが、第１鎖ＤＮＡをテンプレートとして用いたＰＣＲにより増幅され、終止コドンがＭＡＧ  ｃＤＮＡの３´末端にＰＣＲにより付加される。ＭＡＧ  ｃＤＮＡがpDisplayベクター（Invitrogen社製）内に組み込まれた。このプラスミドをＣＯＳ７細胞内へと導入した。導入した細胞は１０％血清及び６００μｇ／ｍｌのgeneticinを含むＤＭＥＭ（Invitrogen社製）で維持された。ＭＡＧの精製のため、これら細胞は２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを伴うVP-SFM培地（Invitrogen社製）で３日間培養された。ＨＡ標識ＭＡＧが馴化培地からＨＡ標識タンパク質精製キット（Sigma社製）を用いて精製された。
【０１６３】
ＮｇＲ１−Ｍｙｃ及びＮｇＲ２−Ｍｙｃの発現
ＮｇＲ２  ｃＤＮＡが、第１鎖ＤＮＡをテンプレートとして用いたＰＣＲにより増幅された。ＰＣＲ産物はpCR Bluntベクター（Invitrogen社製）内へと連結された。pCR Bluntに挿入されたＮｇＲ２  ｃＤＮＡの配列が確認された。全長ＮｇＲ１をコードするＩＭＡＧＥクローンをGene Service Inc社から購入した。ＮｇＲ１のｃＤＮＡ（ＮＭ  ０２３００４、Ｎｔ．１８４〜１５４３）及びＮｇＲ２（ＮＭ  １７８５７、Ｎｔ．１〜１２００）をそれぞれ、Ｓａｌ１及びＫｐｎ１部位を有するpDisplayベクター内へと導入した。ＮｇＲ、Ｍｙｃ標識及び膜貫通ドメインをコードする領域がこのベクターからＫｐｎ１及びＮｏｔ１と共に切除される。Ｋｐｎ１−Ｎｏｔ１断片がpCEP4（Invitrogen社製）内へと組み込まれた。Nucleoector（amaxa社製）を用いたエレクトロポレーションが導入のために用いられた。ＮｇＲ／pDisplayをＣＯＳ７内へと導入し、ＮｇＲ１−Ｍｙｃ−膜貫通ドメイン／pCEP4をＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞内へと導入した。ラットニューロンへの導入のため、NeuroMagキット（OZ Bioscience社製）が用いられた。Ｎｏｇｏ−６６断片を伴う、或いはそれを伴わない、ラミニンでコートされた８ウェルチェンバースライド上で２４時間培養されたニューロンが、導入のために用いられた。導入後、ニューロンはさらに２４時間培養され、ＣＫ２が培養基内に５００Ｕ／ｍｌの終末濃度まで付加された。ニューロンがＣＫ２と共に２４時間培養され、固定された。
【０１６４】
神経突起伸長アッセイ
ミエリン関連阻害因子での神経突起伸長阻害のため、１μｇのＮｏｇｏ−Ｆｃ、５００ｎｇのＨＡ標識ＭＡＧ又は５００ｎｇのＨｉｓ標識ＯＭｇｐが、ポリ−Ｄ−リジンでコートされた８ウェルチェンバースライドの異なるウェル上にスポットされ、カバーなしにクリーンベンチ上に一晩放置される。ＰＢＳで２度洗浄後、ニューロンが播種され、「細胞培養」に記載の通り処理された。ニューロンが２４時間、３７℃で培養され、ＰＢＳ中で２％パラホルムアルデヒド及び０．１％triton X100で固定された。免疫蛍光法が抗α−チューブリンIIIモノクローナル抗体を用いて実施された。
【０１６５】
ミエリン関連タンパク質の結合アッセイ
ＣＫ２と共に、或いはそれなしに処理後、野生型又は変異体のＮｇＲを過剰発現しているＣＯＳ７細胞が、Ｈｉｓ×６標識Ｎｏｇｏ−ＧＦＰ（１０μｇ／ｍｌ）、ＨＡ−ＭＡＧ（５０μｇ／ｍｌ）又はＨｉｓ×６標識ＯＭｇｐ（１０μｇ／ｍｌ）と共にＰＢＳ中で３時間、４℃でインキュベートされた。細胞は２度洗浄され、ＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒドで２０分間４℃で、その後ＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒド及び０．１％Triton X 100で固定された。細胞表面におけるＮｇＲ１の発現レベルを検査するため、細胞表面タンパク質単離キット（Pierce社製）が用いられた。ＮｇＲ１を過剰発現しているＣＯＳ７細胞の表面タンパク質がビオチンで標識され、抽出された。ストレプトアビジンビーズを用いてビオチン標識タンパク質を沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。５×１０６の細胞から分画されたそれぞれの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０１６６】
イムノブロッティング
細胞が皿からこすり取られ、ＰＢＳで２度洗浄され、その後それら細胞を０．１％Triton X-100及びホスファターゼ阻害因子カクテル（Roche社製）及びＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害因子カクテル（Roche社製）を含むＰＢＳ中で再懸濁させた。１５分間氷上でインキュベーション後、試料を１４０００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離した。３０μｇのタンパク質を含む上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ＰＶＤＦ膜へとブロットした。このＰＶＤＦ膜がブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の５％スキムミルク、０．４％Triton X-100）中で１時間インキュベートされ、第１抗体がブロッキング緩衝液中に希釈され、適切な第２抗体が西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された。結合した抗体がECL又はECL Plusキット（GE healthcare社製）で可視化された。
【０１６７】
免疫蛍光アッセイ
固定された細胞がＰＢＳで洗浄され、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ及び０．５％Triton X-100と共に室温で３０分間インキュベートされ、第１抗体、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ及び０．５％Triton X-100と共に３７℃で２時間インキュベートされた。ＰＢＳで洗浄後、細胞はさらにＰＢＳ中の適切な第２抗体、３％ＢＳＡ及び０．５％Triton X-100と共に３７℃で３０分間インキュベートされた。ＰＢＳで３回洗浄後、細胞はＤＡＰＩを伴うVECTASHIELD封入剤（VECTOR社製）と共にマウントされ、共焦点レーザー走査顕微鏡法で観察された。
【０１６８】
免疫沈降
ＣＫ２処理（図３Ｃ）又はＮｏｇｏ−ＧＦＰと共にインキュベーション（図３Ｂ）後、タンパク質が、ホスファターゼ阻害因子カクテル及びＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害因子カクテルを含むＰＢＳ中の０．１％Triton X100で抽出された。抽出物は２５μｇの抗Ｍｙｃウサギポリクローナル抗体及びプロテインＡ電磁ビーズ（New England Biolab社製）と共に２時間、４℃でインキュベートされた。ＰＢＳ中の０．１％Triton X100で５回洗浄後、ビーズは１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液と共にインキュベートされ、３分間加熱された。
【０１６９】
質量分析
ＮｇＲ２−Ｍｙｃを過剰発現しているＣＯＳ７細胞が、５００Ｕ／ｍｌのＣＫ２及び５００μＭ  ＡＴＰと共に１時間培養された。細胞抽出及び抗Ｍｙｃ抗体を用いたＮｇＲ２−Ｍｙｃの免疫沈降については上に記載した。沈殿させたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、コロイド性クマシーブリリアントブルー染色で可視化した。ＮｇＲ２−Ｍｙｃに対応するバンドがゲルから切除された。ゲル切片中のタンパク質がゲル中トリプシンで消化された。質量分析がケンブリッジプロテオミクスセンター（Cambridge Centre for Proteomics、英国、ケンブリッジ）で実施された。
【実施例１】
【０１７０】
実施例１：ＮｏｇｏシグナリングはＲＡ処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞からの神経突起伸長を阻害する
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は５日間のＲＡ処理後に限定的な形態学的変化を示したが、Encinas et al.により以前に報告されたように（M. Encinas, M. Iglesias, Y. Liu, H. Wang, A. Muhaisen, V. Cena, C. Gallego, J. X. Comella, Sequential treatment of SH-SY5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neurotrophic factor-dependent, human neuron-like cells. J Neurochem 75, 991-1003 (2000)）、５日間のＲＡ処理及び１日間のＢＤＮＦ処理という連続処理後には、効率的な神経突起伸長が観察された（図１Ａ）。本発明者らは、Ｎｏｇｏ−６６のＮｇＲ１への結合の拮抗阻害因子であるＮＥＰ１−４０（T. GrandPre, S. Li, S. M. Strittmatter, Nogo-66 receptor antagonist peptide promotes axonal regeneration. Nature 417, 547-551 (2002)）が、ＲＡによりＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞から分化した神経細胞からの神経突起伸長をＢＤＮＦなしに促進したことを見出した（図１Ａ及びＢ）。このことは、ＮｏｇｏシグナリングがＳＨ−ＳＹ５Ｙ由来神経細胞からの神経突起伸長を阻害すること、並びに、ＢＤＮＦがＮｏｇｏシグナリングのこうした効果を抑制することを示唆する。
【０１７１】
図１Ｃに示されるように、Ｎｏｇｏシグナリングに関与するタンパク質であるＮｏｇｏ−Ａ、ＮｇＲ１及びＬＩＮＧＯ−１は、ＲＡ処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に発現していた。Ｎｏｇｏ−Ａ及びＬＩＮＧＯ−１のいずれもＢＤＮＦ処理後に顕著な変化を示さなかった一方で、ＮｇＲ１の上側のバンドはＢＤＮＦ処理により増加した（図１Ｃ、矢印）。ラムダホスファターゼでの処理はホスファターゼ阻害因子の非存在下でのみ、上側のバンドを減少させた（図１Ｄ）。これら結果は、ＢＤＮＦがＲＡ処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において内因性ＮｇＲ１のリン酸化を促進し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでのより低い移動度に寄与することを示す。どのキナーゼがＮｇＲ１のリン酸化に関与するのかを検討するため、ＲＡ処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞がＢＤＮＦと共にキナーゼ阻害因子の存在下でインキュベートされた。ＰＫＣ阻害因子であるＧo６９８３及びＧo６９７６もＰＫＡ阻害因子であるＫＴ５７２０及びＰＫＡ阻害因子ペプチドも、ＮｇＲ１の上側のバンドのレベルに対する効果を示さない。しかしながら、ＣＫ２阻害因子は上側のバンドを減少させた（図１Ｅ）。このことと一致して、ＢＤＮＦは神経細胞においてＣＫ２を活性化させることが知られている（P. R. Blanquet, Neurotrophin-induced activation of casein kinase 2 in rat hippocampal slices. Neuroscience 86, 739-749 (1998)）。これら結果は、ＣＫ２様活性がＮｇＲ１のリン酸化に関与することを示す。したがって、ＢＤＮＦはＣＫ２様活性によりＮｇＲ１のリン酸化を誘導し、このことはＢＤＮＦによる神経突起伸長の促進と同時に生じる。
【実施例２】
【０１７２】
実施例２：ＲＡ処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞はＣＫ２での細胞外処理後にＢＤＮＦなしで神経突起を伸長させる
ＮｇＲ１はグリコシルホスファチジルイノシトール結合膜タンパク質であり、細胞質ドメインを有さない（W. A. Barton, B. P. Liu, D. Tzvetkova, P. D. Jeffrey, A. E. Fournier, D. Sah, R. Cate, S. M. Strittmatter, D. B. Nikolov, Structure and axon outgrowth inhibitor binding of the Nogo-66 receptor and related proteins. Embo J 22, 3291-3302 (2003); X. L. He, J. F. Bazan, G. McDermott, J. B. Park, K. Wang, M. Tessier-Lavigne, Z. He, K. C. Garcia, Structure of the Nogo receptor ectodomain: a recognition module implicated in myelin inhibition. Neuron 38, 177-185 (2003)）。したがって、ＢＤＮＦ処理後のＮｇＲ１のリン酸化部位は細胞外であり、ＣＫ２での細胞外処理によりリン酸化され得る。培養基へのＡＴＰのみの付加及びＣＫ２のみの付加のいずれもＳＨ−ＳＹ５Ｙ由来神経細胞からの神経突起伸長を誘導しなかった。しかしながら、これら細胞はＣＫ２及びＡＴＰの両方と共に２４時間同時インキュベーション後に、有意な神経突起伸長を示した（図２Ａ及びＢ）。したがって、ＣＫ２での細胞外処理は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ由来神経細胞からの神経突起伸長に対するＮｏｇｏシグナリングの阻害効果をＢＤＮＦなしに抑制する。
【実施例３】
【０１７３】
実施例３：ヒトＮｇＲ１のセリン２８１は、ＮｏｇｏシグナリングのＣＫ２媒介抑制のための重要な標的である
ヒトＮｇＲ１はＣＫ２によるリン酸化のための５つの候補部位、すなわち、トレオニン１７３、セリン１９２、セリン２８１、トレオニン３２５及びセリン３４５を含み、これら候補部位がアラニンに置換された。本実施例において用いられるキナーゼはＣＫ２である。これらＮｇＲ１変異体を過剰発現しているＲＡ処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞がＡＴＰ及びＣＫ２で２４時間処理された際に、ＮｇＲ１のセリン２８１からアラニンへの置換（２８１Ｓ／Ａ）を保持している細胞は、顕著な神経突起伸長を示さなかった（図２Ｃ）。しかしながら、２８１Ｓ／Ａ変異体ＮｇＲ１を保持している細胞は依然として神経突起を伸長させる潜在能力を有していた。なぜならこれら細胞は、ＮＥＰ１−４０で２４時間処理した後に、神経突起伸長を示したからである（図２Ｄ）。これら結果は、２８１Ｓ／Ａ変異体ＮｇＲ１は恒常的には活性を有さず、Ｎｏｇｏの結合がＲＡ処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙからの神経突起伸長阻害に必要であることを示す。
【０１７４】
ＮｇＲ１のセリン２８１がアスパラギン酸へと置換され（２８１Ｓ／Ｄ）、この変異体ＮｇＲ１をＲＡ処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において過剰発現させた（図２Ｅ）。リン酸化されたセリン残基の様に、アスパラギン酸は負の電荷を帯びているにもかかわらず、２８１Ｓ／Ｄ変異体ＮｇＲ１を過剰発現している細胞は、ＣＫ２及びＡＴＰでの同時処理なしのＲＡ処理後に神経突起を伸長させなかった（図２Ｅ）。このことは、２８１Ｓ／Ｄ変異体ＮｇＲ１が恒常的にネガティブなＮｇＲ１変異体ではないことを示す。
【０１７５】
これら結果は、他の膜タンパク質がＣＫ２での細胞外処理によりリン酸化され得るとしても（J. Walter, A. Schindzielorz, B. Hartung, C. Haass, Phosphorylation of the beta-amyloid precursor protein at the cell surface by ectocasein kinases 1 and 2. J Biol Chem 275, 23523-23529 (2000); S. Yamauchi, Y. Tokita, S. Aono, F. Matsui, T. Shuo, H. Ito, K. Kato, K. Kasahara, A. Oohira, Phosphorylation of neuroglycan C, a brain-specific transmembrane chondroitin sulfate proteoglycan, and its localization in the lipid rafts. J Biol Chem 277, 20583-20590 (2002)）、ヒトＮｇＲ１のセリン２８１がＣＫ２によるＮｏｇｏシグナリングの阻害効果抑制にとって本質的に重要であることを示す。
【実施例４】
【０１７６】
実施例４：ＣＫ２はミエリン関連阻害因子の野生型ＮｇＲ１への結合を阻害するが、セリン２８１置換を保持している変異体ＮｇＲ１への結合を阻害しない
Ｎｏｇｏ−６６断片は、野生型ＮｇＲ１を過剰発現しているＣＯＳ７細胞と結合した（図３Ａ）。しかしながら、Ｎｏｇｏ−６６断片はＣＫ２及びＡＴＰでの処理後の細胞に結合しなかった。２８１Ｓ／Ａ変異体ＮｇＲ１を野生型ＮｇＲ１の代わりに過剰発現させた際、ＣＫ２処理はＮｏｇｏ−６６断片の結合を遮断しなかった。ＮＥＰ１−４０は、Ｎｏｇｏ−６６断片による野生型ＮｇＲ１及び２８１Ｓ／Ａ変異体ＮｇＲ１の両方への結合を阻害した。２８１Ｓ／Ｄ変異体ＮｇＲ１が過剰発現する際、Ｎｏｇｏ−６６断片の結合はＣＫ２処理なしでも観察されなかった（図３Ａ右）。図２Ｅの結果と併せて考えると、２８１Ｓ／Ｄ変異体ＮｇＲ１はＮｏｇｏ−６６と結合し得ないし、内因性ＮｇＲ１を介するシグナリングを阻害し得ない。Ｎｏｇｏ−６６断片と過剰発現ＮｇＲ１との間の相互作用もまた、免疫沈降アッセイにおいて観察された（図３Ｂ）。ＡＴＰのみ又はＣＫ２のみでの処理はこの相互作用を阻害しなかった一方で、ＡＴＰ及びＣＫ２での同時処理はＮｏｇｏ−６６断片の過剰発現ＮｇＲ１への結合を阻害した。変異体及び野生型のＮｇＲ１−Ｍｙｃの細胞表面における発現レベルを検査するため、細胞表面タンパク質をビオチン標識した。同等レベルのビオチン標識ＮｇＲ１−Ｍｙｃの野生型、２８１Ｓ／Ａ及び２８１Ｓ／Ｄがウエスタンブロッティングにより検出された（図３Ｃ）。
【０１７７】
さらに、過剰発現ＮｇＲ１がＣＫ２での細胞外処理後にリン酸化される。野生型又は２８１Ｓ／Ａ変異体のＮｇＲ１を過剰発現しているＣＯＳ７細胞がＣＫ２と共にα−３２Ｐ−ＡＴＰの存在下でインキュベートされ、過剰発現ＮｇＲ１を免疫沈降させた。野生型ＮｇＲ１及び２８１Ｓ／Ａ変異体ＮｇＲ１の両方がＣＫ２処理でリン酸化されたにもかかわらず、２８１Ｓ／Ａ変異体ＮｇＲ１のリン酸化は野生型ＮｇＲ１のリン酸化よりもはるかに弱かった（図３Ｄ）。これら結果は、ＮｇＲ１のセリン２８１がＣＫ２による効率的なＮｇＲ１のリン酸化、及び、Ｎｏｇｏ−６６とＮｇＲ１との間の相互作用の阻害の両方に必要であることを示す。
【０１７８】
図３Ｅ及びＦは、ＣＫ２処理がＯＭｇｐ及びＭＡＧの両方の野生型ＮｇＲ１への結合を阻害したが、２８１Ｓ／Ａ変異体ＮｇＲ１への結合は阻害しなかったことを示す。ＯＭｇｐ及びＭＡＧのいずれも、２８１Ｓ／Ｄ変異体ＮｇＲ１を過剰発現しているＣＯＳ７と結合しなかった。これら結果は、ＣＫ２処理がＮｏｇｏ−６６、ＭＡＧ及びＯＭｇｐのＮｇＲ１への結合を阻害し得ること、並びに、ＮｇＲ１のセリン２８１がＣＫ２の効果のため本質的に重要であることを示す。
【実施例５】
【０１７９】
実施例５：ヒトＮｇＲ１のセリン２８１は、脊椎動物ＮｇＲ１及びＮｇＲ２の両方において保存されている
図４Ａは、セリン２８１がヒトＮｇＲ１のロイシンリッチリピートのＣ末端隣接領域にあること（W. A. Barton, B. P. Liu, D. Tzvetkova, P. D. Jeffrey, A. E. Fournier, D. Sah, R. Cate, S. M. Strittmatter, D. B. Nikolov, Structure and axon outgrowth inhibitor binding of the Nogo-66 receptor and related proteins. Embo J 22, 3291-3302 (2003); X. L. He, J. F. Bazan, G. McDermott, J. B. Park, K. Wang, M. Tessier-Lavigne, Z. He, K. C. Garcia, Structure of the Nogo receptor ectodomain: a recognition module implicated in myelin inhibition. Neuron 38, 177-185 (2003)）、並びに、セリン２８１を含むＣＫ２の標的モチーフがヒト、マウス、ラット、ダニオ及びニワトリにおいて保存されていることを示す。マウス、ラット及びニワトリのＮｇＲ１は、ＣＫ２のまた別の候補標的モチーフをＣ末端隣接領域のセリン３０４に有する。しかしながら、後者のセリンはヒト及びダニオＮｇＲ１において保存されていない。
【０１８０】
ＣＫ２標的モチーフに加えて、セリン２８１はＰＫＡ標的モチーフに関与し、ＰＫＡ標的モチーフもまた他種において保存されている（図４Ａ）。このことは、ＰＫＡがＣＫ２と同様にＮｇＲ１をリン酸化し、そのことによりＮｏｇｏシグナリングの神経突起伸長に対する阻害効果を抑制するかもしれないことを示唆する。しかしながら本発明者らは、ＢＤＮＦ処理後のＲＡ処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＮｇＲ１のリン酸化へのＰＫＡの寄与を検出し得なかった（図１Ｅ）。
【０１８１】
さらに、ヒトＮｇＲ１のセリン２８１を含むＣＫ２標的モチーフは、ヒト及びマウスＮｇＲ２において保存されている（図４Ｂ）。ヒトＮｇＲ１のセリン２８１はヒトＮｇＲ２のセリン２８２に対応する。ＮｇＲ３は、ＮｇＲ１及びＮｇＲ２と同様、ＣＫ２によるリン酸化の標的部位候補をＣ末端隣接領域に有するとはいえ、この部位はＮｇＲ１のセリン２８１の１１アミノ酸上流にある。逆に、ＮｇＲ１のセリン２８１を含むＰＫＡ標的モチーフはこれら３つのＮｇＲにおいて保存されている。
【０１８２】
ＮｇＲ２の保存されたＣＫ２標的モチーフと一致して、ＣＫ２はＮｇＲ２をリン酸化し（図４Ｃ）、ＣＫ２処理はＭＡＧのＮｇＲ２を過剰発現しているＣＯＳ７細胞への結合を阻害した（図４Ｄ）。ヒトＮｇＲ２は２つのＣＫ２標的部位、すなわち、セリン２８２及びトレオニン３６６を含むにもかかわらず、セリン２８２を含むＣＫ２標的部位のみがヒトＮｇＲ１において保存されている。ＣＫ２処理後、質量分析によりヒトＮｇＲ２のセリン２８２を含むペプチドのリン酸化が検出されたが、トレオニン３６６を含むペプチドのリン酸化は検出されなかった（図４Ｅ）。
【実施例６】
【０１８３】
実施例６：ＣＫ２はラットニューロンをＮｏｇｏ、ＭＡＧ又はＯＭｇｐによる神経突起伸長阻害からレスキューする。
本発明者らは、ＮｇＲのリン酸化がラットニューロンをミエリン関連阻害因子による神経突起伸長阻害からレスキューし得るかどうかを検査した。生後ラットＤＲＧニューロンがＣＫ２で２４時間処理された際、これらニューロンはＮｏｇｏ−６６断片による神経突起伸長阻害を克服した（図５Ａ及びＢ）。ＡＴＰのみではＮｏｇｏ−６６断片の阻害効果を抑制しなかった（データは示されていない）。ＢＤＮＦはＲＡ処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞からの神経突起伸長を誘導し得るにもかかわらず（図１Ａ及びＢ）、Ｎｏｇｏ−６６断片のＤＲＧニューロンに対する効果を遮断しない（図５Ａ及びＢ）。このことは神経芽細胞腫細胞と正常ニューロンとの間のＢＤＮＦシグナリングにおける違いを示唆し、それはインビボでの神経突起伸長に対するＢＤＮＦの限定的効果と一致する（B. S. Bregman, M. McAtee, H. N. Dai, P. L. Kuhn, Neurotrophic factors increase axonal growth after spinal cord injury and transplantation in the adult rat. Exp Neurol 148, 475-494 (1997); L. B. Jakeman, P. Wei, Z. Guan, B. T. Stokes, Brain-derived neurotrophic factor stimulates hindlimb stepping and sprouting of cholinergic fibers after spinal cord injury. Exp Neurol 154, 170-184 (1998); Y. Jin, I. Fischer, A. Tessler, J. D. Houle, Transplants of fibroblasts genetically modified to express BDNF promote axonal regeneration from supraspinal neurons following chronic spinal cord injury. Exp Neurol 177, 265-275 (2002); P. Lu, A. Blesch, M. H. Tuszynski, Neurotrophism without neurotropism: BDNF promotes survival but not growth of lesioned corticospinal neurons. J Comp Neurol 436, 456-470 (2001); C. Dinocourt, S. E. Gallagher, S. M. Thompson, Injury-induced axonal sprouting in the hippocampus is initiated by activation of trkB receptors. Eur J Neurosci 24, 1857-1866 (2006)）。
【０１８４】
ＣＫ２処理は、ニューロンをＮｏｇｏ−６６断片による神経突起伸長阻害のみならずＭＡＧ又はＯＭｇｐによる神経突起伸長阻害からもレスキューし得る（図５Ｃ−Ｅ）。図５Ｆは、ニューロンがＣＫ２で２４時間処理される際に、生後５日目のラットに由来するＤＲＧニューロンのみならず、生後８日目のラットに由来する小脳顆粒（cerebellar granule、ＣＧ）ニューロンも、Ｎｏｇｏ−６６、ＭＡＧ又はＯＭｇｐの存在下で神経突起を伸長させ得ることを示す。
【実施例７】
【０１８５】
実施例７：ＣＫ２は２８１Ｓ／Ａ変異体ＮｇＲ１を発現しているニューロンをＮｏｇｏ−６６による神経突起伸長阻害からレスキューしない
ＮｇＲ１のセリン２８１の要件を評価するため、野生型及び２８１Ｓ／Ａ変異体のＮｇＲ１を生後８日目のラットに由来するＣＧニューロンにおいて過剰発現させた。野生型及び２８１Ｓ／Ａ変異体のＮｇＲ１を過剰発現している両方のＣＧニューロンが神経突起を伸長させ、それはＮｏｇｏ−６６断片により遮断された。２４時間のＣＫ２処理後、野生型ＮｇＲ１を過剰発現しているニューロンはＮｏｇｏ−６６断片の存在下で神経突起を伸長させた。逆に、２８１Ｓ／Ａ変異体ＮｇＲ１を過剰発現しているニューロンは、ＣＫ２での２４時間の処理後も神経突起を伸長させなかった（図５Ｇ及びＨ）。これら結果は、ＣＫ２が野生型ＮｇＲ１を介するＮｏｇｏシグナリングを阻害し得るが、２８１Ｓ／Ａ変異体ＮｇＲ１を介するＮｏｇｏシグナリングを阻害し得ないことを示し、このことは図２及び３と一致する。したがって、ＮｇＲ１を介するＮｏｇｏシグナリングは、以前に報告されているように（３、４）、生後ラットニューロンからの神経突起伸長を遮断し得るのであり、ＮｇＲ１のセリン２８１はＣＫ２がＮｏｇｏシグナリングの神経突起伸長に対する阻害効果を抑制するために不可欠である。
【実施例８】
【０１８６】
実施例８：被験体における神経突起伸長阻害の軽減方法
ニューロンからの神経突起伸長の阻害の軽減方法が実証される。本実施例において被験体はマウスである。マウスニューロンはＮｏｇｏ受容体を含む。
【０１８７】
脊髄損傷モデルが用いられる。実験的外傷の導入後、前記ニューロンをＮｏｇｏ受容体のリン酸化を引き起こすことのできる組成物と接触させる。このステップにおいて、以下の２つの組成物のうちの１つが典型的には注射により、或いは実験的外傷時に導入されたカニューレを介して適用される：
Ａ）（ＰＫＡ）：
１０〜１００μＭ  ＡＴＰ、５〜０．０５μｇＰＫＡ及び１〜１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２若しくはＭｇ−アセテート。
又は
Ｂ）（ＣＫII）：
１０〜１００μＭ  ＡＴＰ、５〜０．５μｇＣＫ２、１〜１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２若しくはＭｇ−アセテート及び１０〜５０ｍＭ  ＫＣｌ若しくはＫ−アセテート。
【０１８８】
ヒトへの適用のためには、より高いレベルのキナーゼ、典型的には０．０５〜５ｍｇのキナーゼ、すなわちＰＫＡ又はＣＫ２が用いられる。ヒトでの使用のためのイオン及びＡＴＰの濃度は、典型的には上にある通りである。
【実施例９】
【０１８９】
実施例９−ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ
Ｎｏｇｏ−Ａ、ＭＡＧ及びＯＭｇｐはＮｇＲに結合し得るミエリン関連タンパク質である（Gonzenbach, R. R., and Schwab, M. E. (2008). Disinhibition of neurite growth to repair the injured adult CNS: focusing on Nogo. Cell Mol Life Sci 65, 161-176.）。近年、マウスＰｉｒＢ（ペア型Ｉｇ様受容体Ｂ、paired-Ig-like receptor B、ＮＭ０１１０９５）及びそのヒトホモログＬＩＬＲＢ（白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ、leukocyte immunoglobulin-like receptor Bs）が、ミエリン関連タンパク質のための受容体の第２グループであると報告されてきた（Atwal, J. K., Pinkston-Gosse, J., Syken, J., Stawicki, S., Wu, Y., Shatz, C., and Tessier-Lavigne, M. (2008)）。
【０１９０】
ＰｉｒＢは軸索再生を阻害するミエリン阻害因子のための機能的受容体である（Science 322, 967-970.）。ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢの発現は脳のある特定の領域に限定されるようであるとはいえ、それは神経突起伸長阻害のためにＮｇＲと協同し得る（Atwal et al., ibid）。
【０１９１】
図９では、ＰｉｒＢをＣＯＳ７細胞に過剰発現させ、これら細胞がプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の触媒サブユニット及びＡＴＰと共にインキュベートされた。細胞表面上のＰｉｒＢはＰＫＡの基質であり得る（図９Ａ）。
【０１９２】
質量分析は、リン酸化部位がＰｉｒＢの細胞外ドメインのセリン４２５であることを示す。
【０１９３】
ＰＫＡ標的部位はヒト、ラット及びマウスにおいて保存されている（図９Ｂ）。これら結果は、ＰＫＡでの細胞外処理がＮｇＲからのシグナリングに加えて、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢからのシグナリングに対しても有益な効果をもたらし得ることを示唆する。
【０１９４】
したがって、実施形態の１つにおいて本発明は、ニューロンからの神経突起伸長の阻害の軽減方法に関し、前記ニューロンはＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ受容体を含み、前記方法は前記ニューロンをＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢのリン酸化を引き起こすことのできる組成物と接触させることを含み、前記組成物はプロテインキナーゼＡ又はカゼインキナーゼIIを含む。好ましくは、前記組成物はプロテインキナーゼＡ及びカゼインキナーゼIIを含む。好ましくは、前記リン酸化は前記ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢのセリン４２５に対応するアミノ酸残基のリン酸化である。
【０１９５】
Ｎｏｇｏ及びＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢの両方を標的とすることが有益であり得る；この実施形態において本発明は、ニューロンからの神経突起伸長の阻害の軽減方法を提供し、前記ニューロンはＮｏｇｏ受容体及びＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ受容体を含み、前記方法は前記ニューロンをＮｏｇｏ受容体及びＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ受容体のリン酸化を引き起こすことのできる組成物と接触させることを含み、前記組成物はプロテインキナーゼＡ又はカゼインキナーゼIIを含む。好ましくは、前記組成物はプロテインキナーゼＡ及びカゼインキナーゼIIを含む。好ましくは、前記リン酸化は前記Ｎｏｇｏ受容体のセリン２８１に対応するアミノ酸残基のリン酸化及び前記ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢのセリン４２５に対応するアミノ酸残基のリン酸化である。
【実施例１０】
【０１９６】
実施例１０−本発明による哺乳動物ＣＮＳの再生
本実施例において、本発明者らは哺乳動物ＣＮＳに対する本発明の作用を実証する。
【０１９７】
嗅内野のニューロンは、生後期間に海馬の歯状回への強力な投射を形成する。嗅内野海馬系は、アルツハイマー病において影響を受ける最初の領域のうちの１つであり、この系の問題は方向感覚障害及び記憶障害の両方をもたらすと考えられている。
【０１９８】
脳の器官型切片培養物はインビボ系の多くの特徴を保存し、無傷脳のモデルとして広範に用いられている。
【０１９９】
無傷脳における嗅内野海馬投射は、器官型切片インビトロ培養物において保存され得る。生後５〜７日目のマウスから調製される嗅内野海馬切片はインビトロで６日培養後、損傷からの不十分な再生を示す（Kluge, A., Hailer, N. P., Horvath, T. L., Bechmann, I., and Nitsch, R. (1998). Tracing of the entorhinal-hippocampal pathway in vitro. Hippocampus 8, 57-68. Prang, P., Del Turco, D., and Kapfhammer, J. P. (2001). Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase C. Exp Neurol 169, 135-147.)）。
【０２００】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカン及びミエリン関連タンパク質は主要な再生阻害因子であることが知られている（Mingorance, A., Sole, M., Muneton, V., Martinez, A., Nieto-Sampedro, M., Soriano, E., and del Rio, J. A. (2006). Regeneration of lesioned entorhino-hippocampal axons in vitro by combined degradation of inhibitory proteoglycans and blockade of Nogo-66/NgR signaling. FASEB J 20, 491-493.）。
【０２０１】
中枢神経系（ＣＮＳ）の在住マクロファージである小膠細胞の移動が観察され、膠細胞による瘢痕様構造が損傷後の器官型培養物において形成され得る（Mingorance et al., ibid）。損傷に対する嗅内野海馬切片培養物のこれらすべての応答が、インビボの正常脳の応答と類似する。したがって、哺乳動物一般における本発明の適用可能性の例証としてのこのモデル系において本発明を実証することの妥当性は、十分確立されている。
【０２０２】
図１０において、生後５日目又は６日目のマウスに由来する嗅内野海馬切片がインビトロでの日数（ＤＩＶ）１０日目に横切され、ＰＫＡ及びＡＴＰと共に、或いはそれらなしに８日間インキュベートされた。
【０２０３】
Ｄｉｌ（１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’３，−テトラメチルインドカルボシアニンペルクロレート、1,1'-dioctadecyl-3,3,3'3,-tetramethlindocarbocyanine perchlorate）は、側方に拡散して細胞全体を染色する親油性膜染料であるが、細胞間相互作用を介して移動することはできない。したがって、ニューロンの投射をＤｉｌで追跡し得る。
【０２０４】
処理なしの切片又はＰＫＡ若しくはＡＴＰで処理された切片において、Ｄｉｌの位置は横切部の嗅内側に限られており（図１０）、これら脳切片がインビボの脳におけるのと同じくらい不十分にしか神経回路網を再生させ得ないことを示している。これら切片がＡＴＰ及びＰＫＡの両方でインキュベートされた場合にのみ、Ｄｉｌが横切部を越えて海馬の側に観察された（図１０）。
【０２０５】
これら結果は、ＰＫＡ及びＡＴＰの組合せでの処理がＣＮＳ再生の内因性阻害因子を克服し、本発明により神経回路網の再生を促進し得ることを示す。
【０２０６】
しかしながら、ＰＫＡ及びＡＴＰでの処理後もＤｉｌは海馬の歯状回を越えては検出されなかった。このことは、この処理が正常海馬の本質的層構造を変化させないことを示す（図１０）。これは、障害をもたらし得る想定外の再生を回避するためにも、ＣＮＳ再生の促進にとって重要な特徴である。
【０２０７】
したがって、本発明によるＰＫＡの外因的付加は、正常条件下では完全に阻害されるＣＮＳの再生を促進するために有用な方法であると実証される。
［実施例の要約］
【０２０８】
本発明者らは、ＮｏｇｏシグナリングがＮｏｇｏ受容体のリン酸化により抑制され得ると開示する。Ｎｏｇｏ受容体のリン酸化部位は細胞外である（図３及び４）。ＢＤＮＦは、ＲＡによりＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞から分化した神経細胞におけるＮｇＲ１の外部ドメインリン酸化を誘導する（図１）。ＮｇＲの外部ドメインリン酸化は、神経突起伸長を阻害するミエリン関連阻害因子であるＮｏｇｏ−６６、ＭＡＧ及びＯＭｇｐの結合を阻害する（図３及び４）。
【０２０９】
外部ドメインリン酸化は、ニューロン、免疫細胞、上皮細胞及び内皮細胞を含む多くのタイプの細胞で報告されてきた（F. A. Redegeld, C. C. Caldwell, M. V. Sitkovsky, Ecto-protein kinases: ecto-domain phosphorylation as a novel target for pharmacological manipulation? Trends Pharmacol Sci 20, 453-459 (1999)）。外部ドメインリン酸化は、基質タンパク質が細胞膜に局在化した後の外部プロテインキナーゼ及びかかる局在化前の細胞内キナーゼの両方により触媒され得る（S. Yamauchi, Y. Tokita, S. Aono, F. Matsui, T. Shuo, H. Ito, K. Kato, K. Kasahara, A. Oohira, Phosphorylation of neuroglycan C, a brain-specific transmembrane chondroitin sulfate proteoglycan, and its localization in the lipid rafts. J Biol Chem 277, 20583-20590 (2002); J. Walter, A. Capell, A. Y. Hung, H. Langen, M. Schnolzer, G. Thinakaran, S. S. Sisodia, D. J. Selkoe, C. Haass, Ectodomain phosphorylation of beta-amyloid precursor protein at two distinct cellular locations. J Biol Chem 272, 1896-1903 (1997)）。細胞内キナーゼは細胞内ＡＴＰをリン酸基の供給源として用いる一方で、外部プロテインキナーゼは細胞外ＡＴＰを用いる。生理学的条件下での細胞外ＡＴＰの濃度はミクロモルレベルと推定されてきた（E. M. Schwiebert, Extracellular ATP-mediated propagation of Ca(2+) waves. Focus on "mechanical strain-induced Ca(2+) waves are propagated via ATP release and purinergic receptor activation". Am J Physiol Cell Physiol 279, C281-3 (2000)）。組織が損傷した際に、ＡＴＰは瀕死の細胞又は損傷した細胞から損傷した細胞膜を介して放出され得る。組織損傷により誘導され得る炎症は、ニューロンを含む様々な細胞タイプからのＡＴＰの放出をも誘導し得る（J. Sawynok, X. J. Liu, Adenosine in the spinal cord and periphery: release and regulation of pain. Prog Neurobiol 69, 313-340 (2003)）。したがって、細胞外ＡＴＰの濃度は組織損傷により上昇し得る。外部ドメインリン酸化のインビトロ機能が報告されてきたにもかかわらず（F. A. Redegeld, C. C. Caldwell, M. V. Sitkovsky, Ecto-protein kinases: ecto-domain phosphorylation as a novel target for pharmacological manipulation? Trends Pharmacol Sci 20, 453-459 (1999)）、そのインビボ機能は依然として明らかでない。
【０２１０】
近年、コラーゲンXVIIの外部ドメインリン酸化がメタロプロテイナーゼによるその脱落を阻害し得ることが示された（E. P. Zimina, A. Fritsch, B. Schermer, A. Y. Bakulina, M. Bashkurov, T. Benzing, L. Bruckner-Tuderman, Extracellular phosphorylation of collagen XVII by ecto-casein kinase 2 inhibits ectodomain shedding. J Biol Chem 282, 22737-22746 (2007)）。コラーゲンXVIIの外部ドメインリン酸化はＣＫ２により触媒され、そのリン酸化部位はメタロプロテイナーゼの標的部位に位置する（E. P. Zimina, A. Fritsch, B. Schermer, A. Y. Bakulina, M. Bashkurov, T. Benzing, L. Bruckner-Tuderman, Extracellular phosphorylation of collagen XVII by ecto-casein kinase 2 inhibits ectodomain shedding. J Biol Chem 282, 22737-22746 (2007)）。ＮｇＲもメタロプロテイナーゼにより脱落すると知られており（A. R. Walmsley, G. McCombie, U. Neumann, D. Marcellin, R. Hillenbrand, A. K. Mir, S. Frentzel, Zinc metalloproteinase-mediated cleavage of the human Nogo-66 receptor. J Cell Sci 117, 4591-4602 (2004); A. R. Walmsley, A. K. Mir, S. Frentzel, Ectodomain shedding of human Nogo-66 receptor homologue-1 by zinc metalloproteinases. Biochem Biophys Res Commun 327, 112-116 (2005)）、ＣＫ２によりリン酸化され得る（図１−４）一方で、そのリン酸化部位は脱落部位に含まれない。ＮｇＲ１の脱落部位はアミノ酸３５８であり（A. R. Walmsley, G. McCombie, U. Neumann, D. Marcellin, R. Hillenbrand, A. K. Mir, S. Frentzel, Zinc metalloproteinase-mediated cleavage of the human Nogo-66 receptor. J Cell Sci117, 4591-4602 (2004)）、そのリン酸化部位は２８１である（図３及び４）。本発明者らはＲＡ処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をウエスタンブロッティングにより分析した際にＮｇＲ１の消化された断片を検出し得なかった（図１）。ＮｇＲ１の外部ドメインリン酸化はその脱落を制御しないようである。代わりに本発明者らは、ＮｇＲの外部ドメインリン酸化が神経突起伸長を阻害するミエリン関連阻害因子であるＮｏｇｏ、ＭＡＧ及びＯＭｇｐの結合を遮断することを示す（図３及び４）。
【０２１１】
ＢＤＮＦはＮｇＲ１のリン酸化を誘導し、ＲＡ処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のＮｏｇｏシグナリングを克服し得るにもかかわらず（図１）、ラット初代ニューロンからの神経突起伸長に対するＮｏｇｏシグナリングの効果を減弱しない（図５）。さらに、内因性外部ＣＫ２活性が神経細胞と関連すると報告されてきたにもかかわらず（F. A. Redegeld, C. C. Caldwell, M. V. Sitkovsky, Ecto-protein kinases: ecto-domain phosphorylation as a novel target for pharmacological manipulation? Trends Pharmacol Sci 20, 453-459 (1999)）、ＡＴＰのみを伴う神経細胞のインキュベーションはＮｏｇｏシグナリングを阻害しなかった（図２）。したがって、内因性外部ＣＫ２活性はＮｏｇｏシグナリングを阻害するには不十分なようである。これら結果は、ＮｇＲのリン酸化がＣＮＳにおいて自然には生じ得ないことを示唆するのであり、このことは、ＮｏｇｏシグナリングがＣＮＳにおける神経突起伸長を阻害し得るという事実と一致する（３、４）。
【０２１２】
本発明者らは、ＢＤＮＦの代わりに外因性ＣＫ２を用いた細胞外処理が、Ｎｏｇｏシグナリングによる神経突起伸長阻害からニューロンをレスキューすることを示す（図５）。外因性ＣＫ２での細胞外処理はＮｇＲ１のセリン２８１をリン酸化し、このことはＮｏｇｏ、ＭＡＧ及びＯＭｇｐのＮｇＲ１への結合を阻害し得る（図３）。ＮｇＲ１のＣＫ２リン酸化部位であるセリン２８１はＮｇＲ２において保存されており、ＮｇＲ２のリン酸化はＭＡＧの結合を阻害する（図４）。ＮｇＲを介するシグナリングはＮｏｇｏシグナリングの主要な経路と考えられているとはいえ、近年の論文はＮｇＲ１−／−マウスに由来するニューロンが依然としてＮｏｇｏシグナリングによる神経突起伸長阻害に感受性があることを示す（O. Chivatakarn, S. Kaneko, Z. He, M. Tessier-Lavigne, R. J. Giger, The Nogo-66 receptor NgR1 is required only for the acute growth cone-collapsing but not the chronic growth-inhibitory actions of myelin inhibitors. J Neurosci 27, 7117-7124 (2007)）。このことは、ＮｏｇｏシグナリングがＮｇＲを介してのみならず、未知のＮｏｇｏ受容体を介して、ニューロンからの神経突起伸長を阻害し得ることを示唆する。ＮｇＲ１の欠損によってはＮｏｇｏ−６６断片の阻害効果からニューロンがレスキューされない一方で（O. Chivatakarn, S. Kaneko, Z. He, M. Tessier-Lavigne, R. J. Giger, The Nogo-66 receptor NgR1 is required only for the acute growth cone-collapsing but not the chronic growth-inhibitory actions of myelin inhibitors. J Neurosci 27, 7117-7124 (2007)）、ＣＫ２での細胞外処理によりレスキューされ得る（図５）。したがってＣＫ２処理は、ミエリン関連阻害因子であるＮｏｇｏ−６６、ＭＡＧ及びＯＭｇｐによる神経突起伸長阻害の、ＮｇＲ依存的経路及びあらゆる未知の非依存的経路の両方を遮断するはずである。ＣＫ２の標的部位であるセリン２８１はＰＫＡの標的部位でもあるので（図４）、ＰＫＡでの細胞外処理は、ＣＫ２と同様、Ｎｏｇｏシグナリングを遮断する際に有用である。
【０２１３】
要約すると、本発明者らは、ＢＤＮＦがＲＡ処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞においてＣＫ２様活性によりＮｇＲ１のリン酸化を誘導し、そのことがＮｏｇｏシグナリングによる神経突起伸長阻害を克服することを見出す。しかしながら、ＢＤＮＦによるＮｏｇｏシグナリング阻害はラットニューロンでは生じない。ＢＤＮＦの代わりに外因性ＣＫ２を用いた細胞外処理が、Ｎｏｇｏシグナリングによる神経突起伸長阻害からニューロンをレスキューする。ＣＫ２は、ＮｇＲ１及びＮｇＲ２の両方の外部ドメインをリン酸化し、そのことによりＭＡＧのＮｇＲ２への結合並びにＮｏｇｏ、ＭＡＧ及びＯＭｇｐのＮｇＲ１への結合の両方が遮断される。これら結果は、Ｎｏｇｏ受容体のリン酸化がＮｏｇｏシグナリングを抑制し得ることを示す。したがって、Ｎｏｇｏ受容体のリン酸化が、Ｎｏｇｏシグナリングの操作のための新規標的であることが実証される。
【０２１４】
参照文献
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【０２１５】
上で本明細書において言及されたすべての出版物が、本明細書に参照により組み込まれる。記載された本発明の態様及び実施形態の様々な修正及びバリエーションが、本発明の範囲から逸脱することなく当業者にとって明らかであろう。本発明が具体的な好ましい実施形態との関連で説明されたとはいえ、本請求項に記載の本発明がかかる具体的実施形態に不当に限定されるべきでないことは理解されるべきである。実際のところ、本発明を実施するために記載されている様式の、当業者にとって明らかな様々な修正は、添付の請求項の範囲内であることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【配列表】
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