(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１７のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは前記ポリペプチド配列と９５％以上の相同性を有するポリペプチドの開始メチオニンから１１１番目のアミノ酸が、グルタミン酸に置換されかつ１１２番目のアミノ酸がスレオニンまたはヒスチジンに置換されたホモセリンО−アセチルトランスフェラーゼ活性を有する、変異型ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、１１２番目のアミノ酸がヒスチジンに置換されたものである、請求項１に記載の変異型ポリペプチド。
【請求項３】
前記変異型ポリペプチドが、配列番号１９または２０のアミノ酸配列を有するものである、請求項１または２に記載の変異型ポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドのアミノ酸を置換し、メチオニンに対するフィードバック調節が解除されたものである、請求項１に記載の変異型ポリペプチド。
【請求項５】
前記アミノ酸の置換が、２９番目のアミノ酸がプロリンに置換、１１４番目のアミノ酸がグリシンに置換、１４０番目のアミノ酸がセリンに置換、または前記３種のアミノ酸置換のうち、１種以上を組み合わせたものである、請求項４に記載の変異型ポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、さらに、１１２番目のアミノ酸がスレオニンまたはヒスチジンに置換されたものである、請求項５に記載の変異型ポリペプチド。
【請求項７】
前記変異型ポリペプチドが、配列番号２２または２３のアミノ酸配列を有するものである、請求項５または６に記載の変異型ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１に記載の変異型ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２５、２６、２８および２９の塩基配列のいずれか一つの塩基配列を有するものである、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８に記載のポリヌクレオチドが作動可能に連結された、組み換えベクター。
【請求項１１】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む、微生物。
【請求項１２】
さらに、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（acetyl-CoA synthetase）の活性が内在的アセチル−ＣｏＡシンテターゼの活性に比べ強化され、またはパントテン酸キナーゼ（pantothenate kinase）の活性がＣｏＡの蓄積によるフィードバック阻害が解除されるように変形されたものである、請求項１１に記載の微生物。
【請求項１３】
さらに、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼコード遺伝子（ｐｐｃ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼコード遺伝子（ａｓｐＣ）、及びアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼコード遺伝子（ａｓｄ）からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子のコピー数が増加され、または前記遺伝子のプロモーターの活性が増進されたプロモーターに置換されるか、または活性が増進されるように変異された、請求項１１に記載の微生物。
【請求項１４】
請求項１０に記載の組み換えベクターに形質変換された、微生物。
【請求項１５】
前記微生物が、エシェリキア（Escherichia）属である、請求項１４に記載の微生物。
【請求項１６】
前記微生物が、大腸菌である、請求項１５に記載の微生物。
【請求項１７】
前記微生物が、受託番号ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ、ＫＣＣＭ１１１４７Ｐ、ＫＣＣＭ１１２２９Ｐ、またはＫＣＣＭ１１２３０Ｐである、請求項１６に記載の微生物。
【請求項１８】
請求項１１乃至１７のいずれか一項に記載の微生物を培養する段階、及び前記微生物培養過程において生成したО−アセチルホモセリンを得る段階を含む、О−アセチルホモセリンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するように変形されたポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、前記組み換えベクターに形質転換された微生物、及び前記微生物を用いたＯ−アセチルホモセリンの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メチオニンは、生体内の必須アミノ酸の一種であり、飼料及び食品添加剤として広く用いられ、医薬用として輸液剤、医薬品の合成原料として用いられる。メチオニンは、コリン（レシチン）とクレアチンのような化合物の前駆体として作用し、システインとタウリンの合成原料としても用いられる。また、メチオニンは、硫黄を与える役割をする。
【０００３】
Ｓ−アデノシル−メチオニンは、Ｌ−メチオニンに由来し、成体内においてメチル基を与える役割をし、脳の多様な神経伝達物質（neurotransmitter）の合成に関連している。メチオニン及び／またはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）は、成体内における肝と動脈において脂肪蓄積を抑制し、憂鬱、炎症、肝疾患、筋肉痛を緩和する等の多様な役割をする。
【０００４】
このようなメチオニンは、動物飼料を始めとして食品と医薬品において用いるために、化学合成と生物学的合成によって生産することができる。
【０００５】
化学合成は、主に、５−（β−メチルメルカプトエチル）−ヒダントイン（5-(β-methylmercaptoethyl)-hydantoin）を加水分解させる反応によって、Ｌ−メチオニンを生産する。しなしながら、このような化学合成によって生産されたメチオニンは、Ｌ−型とＤ−型が混合した形態で生産されるという短所があった。
【０００６】
生物学的合成として、特許文献１にはＬ−メチオニンを生産する方法として、微生物を作製するために、シスタチオニンシンターゼ（cystathionine synthase）に変異を加え、システインを用いずに、直接Ｈ２ＳまたはＣＨ３ＳＨを用いて、ホモシステン若しくはメチオニンを合成する方法が開示されている。当該方法では、変異されたシスタチオニンシンターゼを直接細胞に導入し、細胞内のメチオニン合成過程によってメチオニンを合成した。しかしながら、この方法では、細胞内におけるメチオニンの代謝経路を用いるため、合成メチオニンによる阻害作用により、極めて少量のメチオニンの生産のみが可能であり、Ｈ２ＳまたはＣＨ３ＳＨが細胞に毒性を引き起こすことから、実効性に劣るという問題があった。
【０００７】
上記した問題点を解決するために、本発明者等は、Ｌ−メチオニン前駆体から酵素転換反応により、Ｌ−メチオニンを生産する二段階工法を開発したことがある（特許文献２）。このような方法で、Ｈ２ＳまたはＣＨ３ＳＨによる細胞毒性の問題、及び生成したＬ−メチオニンによる代謝過程阻害作用の問題が解決された。これだけでなく、Ｄ−メチオニンとＬ−メチオニンの混合形態ではなく、Ｌ−メチオニンのみを選択的に生産することができるという特徴がある。
【０００８】
前記二段階工法では、メチオニン前駆体として用いられるＯ−スクシニルホモセリン（O-succinyl homoserine）とＯ−アセチルホモセリン（O-acetyl homoserine）が使用され得る。メチオニン転換反応の際に、前駆体に対するメチオニンの生産収率の側面から、Ｏ−アセチルホモセリンは、Ｏ−スクシニルホモセリンに比べて有利である。具体的に、Ｏ−アセチルホモセリンは、１モルから０．９１モルのメチオニンを生産するのに対して、Ｏ−スクシニルホモセリンの場合は、１モルから０．６８モルのメチオニンのみを生産することができる。したがって、Ｏ−アセチルホモセリンをメチオニン前駆体として用いると、最終のメチオニンの生産コストを低めるという効果が得られるので、メチオニンの経済的な大量生産のために、Ｏ−アセチルホモセリンを高収率で生産することが極めて重要である。
【０００９】
一方、微生物は、種類に応じて、メチオニン前駆体としてＯ−アセチルホモセリンまたはＯ−スクシニルホモセリンを用いるが、具体的に、エシェリキア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、サルモネラ（Salmonellar）属、バシラス（Bacillus）属の微生物の場合は、ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ（L-homoserine O-succinyl transferase）により、ホモセリンとスクシニルＣｏＡ（succinyl-coA）からＯ−スクシニル−ホモセリンを合成し(非特許文献1)、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、レプトスピラ（Leptospira）属、デイノコッカス（Deinococcus）属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ミコバクテリウム(Mycobacterium)属の微生物の場合は、ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ（L-homoserine O-acetyl transferase）により、ホモセリンとアセチルＣｏＡ（acetyl-coA）からＯ−スクシニルホモセリンを合成する（非特許文献2）。
【００１０】
したがって、実験用及び産業用目的の組み替えタンパク質を生産するために有用に使用されているエシェリキア（Escherichia）属の微生物を用いて、Ｏ−アセチルホモセリンを生合成するためには、外来遺伝子であるｍｅｔＸ遺伝子を導入し、Ｏ−アセチルホモセリントランスフェラーゼを発現させなければならない。しかしながら、食品用として用いられる製品を生産するために使用する微生物の場合は、外来遺伝子の導入に関する消費者の認識が悪く、外来遺伝子の導入に関する安定性を証明しなければならないという問題点が生じ得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＵＳ２００５/００５４０６０Ａ１
【特許文献２】ＰＣＴ/ＫＲ２００７/００３６５０
【特許文献３】ＰＣＴ/ＷО２００８/１２７２４０
【特許文献４】ＰＣＴ/ＷО２００５/１０８５６１
【特許文献５】ＫＲ２００６−００６８５０５
【特許文献６】ＫＲ２０１１−００２３７０３
【特許文献７】ＰＣＴ/ＫＲ２００５/００３４４
【特許文献８】ＥＰ２１０８６９３Ａ２
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Biochemistry. 1999 Oct 26; 38(43): 14416-23
【非特許文献２】JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Mar. 2002, p.1277-1286
【非特許文献３】JOURNAL OF BACTERIOLOGY, July 1997, 4426-4428
【非特許文献４】Nucleic Acids Research, 1999, Vol.27, No.22 4409-4415
【非特許文献５】PNAS(2000)vol.97: 6640−6645
【非特許文献６】Nucleic Acids Res. 1988 August 11; 16(15): 7351-7367
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
そこで、本発明等は、メチオニン生産収率の側面において有利なО−アセチルホモセリンを、外来遺伝子を導入することなく生産するエシェリキア（Escherichia）属菌株を作製するために研究した結果、大腸菌（E. coli）由来のＯ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼの１１１番目のアミノ酸をグルタミン酸に置換した変異型ポリペプチドの場合、ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ活性が、ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ活性に変換されたことが確認され、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の目的は、ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ（Homoserine O-Succinyl transferase）活性を有するポリペプチドを、ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するように変形させた変異型ポリペプチドを提供することにある。
【００１５】
また、本発明の他の目的は、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
【００１６】
また、本発明のさらに他の目的は、前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された組み換えベクターを提供することにある。
【００１７】
また、本発明のさらに他の目的は、前記ポリヌクレオチドを含む微生物を提供することにある。
【００１８】
また、本発明のさらに他の目的は、前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された組み換えベクターに形質転換された微生物を提供することにある。
【００１９】
また、本発明のさらに他の目的は、ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ活性を有する変異型ポリペプチドを発現する微細物を用いて、О−アセチルホモセリンを生産する方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によると、ホモセリンをО−スクシニルホモセリンに転換する酵素を発現する微細物に、外来遺伝子を導入しなくても、ホモセリンからО−スクシニルホモセリンを生産することができ、前記О−アセチルホモセリンは、メチオニン生産のための前駆体として用いられる。したがって、食品用として用いられるメチオニン製品を生産するために、本発明を適用すると、外来遺伝子の導入に対する消費者の不安、誤った認識、及び外来遺伝子の導入に対する安定性を証明しなければならないという問題点を解決することができるというメリットがある。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明による変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された組み換えベクターを示した図である。
【図２ａ】大腸菌変異体(variants)において現われるホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼアミノ酸一次配列の相同性を比較した図である。
【図２ｂ】大腸菌変異体(variants)において現われるホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼアミノ酸一次配列の相同性を比較した図である。
【図３ａ】メチオニンに対するフィードバック調節が解除された変異ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼアミノ酸一次配列の相同性を比較した図である。比較対象は、野生型ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼ、特許文献３に開示されたフィードバック調節解除された変異ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼｍｅｔ１０Ａ、ｍｅｔ１１Ａ、及び 特許文献４に開示されたフィードバック調節解除された変異ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼである。
【図３ｂ】メチオニンに対するフィードバック調節が解除された変異ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼアミノ酸一次配列の相同性を比較した図である。比較対象は、野生型ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼ、特許文献３に開示されたフィードバック調節解除された変異ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼｍｅｔ１０Ａ、ｍｅｔ１１Ａ、及び 特許文献４に開示されたフィードバック調節解除された変異ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼである。
【図４ａ】メチオニンに対するフィードバック調節が解除された変異ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼアミノ酸一次配列の相同性を比較した図である。比較対象は、野生型ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼ、 特許文献3に開示されたフィードバック調節解除された変異ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼｍｅｔ１０Ａ、ｍｅｔ１１Ａ、及び 特許文献４に開示されたフィードバック調節解除された変異ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼである。
【図４ｂ】メチオニンに対するフィードバック調節が解除された変異ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼアミノ酸一次配列の相同性を比較した図である。比較対象は、野生型ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼ、 特許文献3に開示されたフィードバック調節解除された変異ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼｍｅｔ１０Ａ、ｍｅｔ１１Ａ、及び 特許文献４に開示されたフィードバック調節解除された変異ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼである。
【図５】染色体内のａｃｓプロモータをｐｒｏプロモータに交替するために、ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲ法を用いたＦＲＴ−ｏｎｅ ｓｔｅｐ ｄｅｌｅｔｉｏｎのカセット作製図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
上述した目的を達成するための一つの態様として、本発明は、配列番号１７のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは前記ポリペプチド配列と９５％以上の相同性を有するポリペプチドの開始メチオニンから１１１番目のアミノ酸が、グルタミン酸に置換されたホモセリンО−アセチルトランスフェラーゼ活性を有する変異型ポリペプチドを提供する。
本発明において、ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、下記の反応式のとおり、メチオニン生合成経路に存在するホモセリンとスクシニル−ＣｏＡを用いて、О−スクシニルホモセリンを合成する活性を有するポリペプチドを意味する。
【００２３】
Ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ＋Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−ＣｏＡ→Ｏ−Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ
前記ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、エンテロバクター属、サルモネラ属、シュードモナス属、バシラス属、エシェリキア属の微細物に由来するポリペプチドであってもよく、好ましくは、エシェリキア属微生物由来のホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであってもよく、より好ましくは、大腸菌（E. coli）由来のホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００２４】
本発明において、前記ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、前記反応式に示した活性を有するポリペプチドであれば、ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ活性を有する配列番号１７のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそれと９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含んでもよい。
【００２５】
本発明の実施例において、数種の大腸菌のホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼアミノ酸配列の相同性を比較した結果、数種の大腸菌に存在するホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼポリペプチドは、５％未満の変異を含む変異体が存在するが（すなわち、相互間に９５％以上の相同性を有する）、ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼ活性では、大きな差がないことが認められる（図２）。このような結果は、本発明の配列番号１７のポリペプチドと９５％以上の相同性を有するポリペプチドも、同一のホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼ活性を有することができることを示唆するものであり、これは、当業者にとって自明なことであり、本出願人は、これを視覚化したものである。
【００２６】
本発明における用語の「変異型ポリペプチド」は、ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列の一部が置換されることにより、野生型とは異なり、ホモセリンО−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。すなわち、本発明の変異型ポリペプチドは、ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの一部のアミノ酸を置換することにより、基質特異性がスクシニルＣｏＡからアセチルＣｏＡに変換された、すなわち、下記の反応式と同一の活性を示す変異型ポリペプチドを意味する。
【００２７】
Ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ＋Ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ→Ｏ−ＡｃｅｔｙｌＨｏｍｏｓｅｒｉｎｅ
本発明において、前記変異型ポリペプチドは、配列番号１７で表われるポリペプチドまたは前記ポリペプチド配列と９５％以上の相同性を有するポリペプチドの開始メチオニンから１１１番目のアミノ酸がグルタミン酸に置換され（配列番号１８）、さらに１１２番目のアミノ酸がスレオニン（配列番号１９）またはヒスチジン（配列番号２０）に置換された変異型ポリペプチドであってもよい。
【００２８】
上記のように、さらに１１２番目のアミノ酸であるロイシンをスレオニンまたはヒスチジンに変換させた場合、ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ活性が強化されることが確認できる（表２及び表３）。
【００２９】
好適な一具現例によると、前記変異型ポリペプチドは、配列番号１８乃至２０のアミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。
【００３０】
本発明の実施例では、配列番号３９で表わされる塩基配列からなる大腸菌由来のｍｅｔＡ遺伝子によりコードされたホモセリンスクシニルトランスフェラーゼの１１１番のグリシンをグルタミン酸に置換したポリペプチドを発現することができるプラスミド、及び前記置換に加えて、１１２番のアミノ酸をスレオニンまたはヒスチジンに置換したポリペプチドを発現することができるプラスミドを作製した（実施例２）。
【００３１】
また、本発明の実験例を通じて、野生型ｍｅｔＡ遺伝子（配列番号３９）を含むプラスミドにより形質転換された菌株のＣＪＭ２ ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ（ｗｔ）及びＣＪＭ３ ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ（ｗｔ）によっては、О−スクシニルホモセリンのみが生成することが確認された。これに対して、本発明の変異型ポリペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された菌株によっては、О−アセチルホモセリンのみが蓄積されることが確認された（実験例２、表２及び表３）。
【００３２】
これにより、本発明の変異型ポリペプチドを発現する微生物は、ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ活性を示すための外来遺伝子を導入しなくても、メチオニン前駆体として、生産収率の高いО−アセチルホモセリンを生産することができるという利点がある。
【００３３】
本発明において、前記変異型ポリペプチドは、ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの一部のアミノ酸が置換され、メチオニンに対するフィードバック調節が解除された変異型ポリペプチドであってもよい。すなわち、ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼは、培地に添加される微量のメチオニンによってフィードバック調節され、大部分の活性が抑制される特性を示すので、本発明の変異型ポリペプチドは、О−アセチルホモセリンの過量生産のために、メチオニンに対するフィードバック調節が解除された変異型ポリペプチドであってもよい。
【００３４】
本発明において、前記メチオニンに対するフィードバック調節を解除するためのアミノ酸置換は、特許文献３に開示された方法により行うことができ、具体的に、ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの２９番アミノ酸をプロリンに置換、１１４番アミノ酸をグリシンに置換、１４０番アミノ酸をセリンに置換または前記３種のアミノ酸置換の１種以上が組み合わせられたアミノ酸置換によって、メチオニンに対するフィードバック調節を解除することができる。好ましくは２種以上、最も好ましくは３種の全てのアミノ酸が置換されてもよい。
【００３５】
好適な一具現例によると、前記メチオニンに対するフィードバック調節が解除された変異型ポリペプチドは、配列番号２１乃至２３のアミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列を有する変異型ポリペプチドであってもよい。
【００３６】
本発明の実施例では、大腸菌由来のｍｅｔＡ遺伝子によりコードされたホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの２９、１１４番、及び１４０番のアミノ酸を、それぞれプロリン、グリシン、及びセリンに置換し、メチオニンに対するフィードバック調節を解除し、１１１番アミノ酸がグルタミン酸に置換された［ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ＃１１（ＥＬ）］、１１１番及び１１２番アミノ酸が、それぞれグルタミン酸及びスレオニンに置換された［ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ＃１１（ＥＴ）］、１１１番及び１１２番アミノ酸が、それぞれグルタミン酸及びヒスチジンに置換された［ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ＃１１（ＥＨ）］のホモセリンアセチルトランスフェラーゼ活性を有する変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを作製した（実施例３）。
【００３７】
また、本発明の実験例をみると、メチオニンに対するフィードバック調節が解除された変異型ポリペプチドを発現する菌株のうち、１１１番及び１１２番のアミノ酸が、それぞれグルタミン酸及びヒスチジンに置換されたＣＪＭ２ ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ（＃１１）ＥＨ菌株及びＣＪＭ３ ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ(＃１１)ＥＨ菌株のО−アセチルホモセリンの生産量が１１．１ｇ／Ｌ及び２４．８ｇ／Ｌと高いО−アセチルホモセリンの生産量を示し、外来のホモセリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を導入した菌株と類似した水準に、О−アセチルホモセリンが蓄積されることが確認された（実験例２、表
他の一態様として、本発明は、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された組み換えベクターを提供する。
【００３８】
本発明において、前記ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド単量体(monomer)が共有結合により長鎖状に連なったポリヌクレオチドの重合体(polymer)であり、一定の長さ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖であって、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００３９】
本発明において、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２４乃至２９の塩基配列のいずれか一つの塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。
【００４０】
本発明において、前記組み換えベクターは、本発明の変異型ポリペプチドを発現させる微生物を作るために、宿主細胞にＤＮＡを導入し、変異型ポリペプチドを発現させるための手段であって、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター等の公知の発現ベクターを用いることができ、ベクターは、ＤＮＡ組み換え技術を用いた任意の公知の方法により、当業者が容易に製造することができる。
【００４１】
本発明において、前記組み換えベクターは、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ１９２０、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８ベクターを用いることができ、好ましくはｐＣＬ１９２０ベクターが用いることができる。
【００４２】
前記「作動可能に連結された」は、発現調節配列が、変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の転写及び翻訳を調節するように連結されたものをいい、発現調節配列（プロモータを含む）の調節下で、ポリヌクレオチド配列が発現され、ポリヌクレオチド配列によりコードされる変異型ポリペプチドが生成するように正確な読み枠を維持させることを含む。
【００４３】
また他の一態様として、本発明は、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む微生物及び前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された組み換えベクターに形質転換された微生物を提供する。
【００４４】
本発明における用語の「形質転換」とは、遺伝子を宿主細胞内に導入し、宿主細胞内において発現させるようにすることを意味し、形質転換された遺伝子は、宿主細胞内において発現されるものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されまたは染色体外に位置するもののいずれであってもよく、制限されずに含まれる。
【００４５】
また、前記遺伝子は、ポリペプチドをコード可能なポリヌクレオチドであり、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記遺伝子は、宿主細胞内に導入され、発現され得るものであれば、どんな形態で導入されたものであっても構わない。例えば、前記遺伝子は、それ自体内に発現するのに必要な全ての要素を含むポリヌクレオチド構造体である発現カセットの形態で宿主細胞に導入され得る。前記発現カセットは、通常、前記遺伝子に作動可能に連結されているプロモータ、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記遺伝子は、それ自体またはポリヌクレオチド構造体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞における発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよい。
【００４６】
前記微生物は、変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、または変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された組み換えベクターに形質転換され、変異型ポリペプチドを発現することができる原核微生物または真核微生物として、例えば、エシェリキア（Escherichia）属、バシラス（Bacillus）属、アエロバクター（Aerobacter）属、セラチア（Serratia）属、プロビデンシア（Providencia）属、エルウィニア（Erwinia）属、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、エンテロバクター（enterobacteria）属、チゴサッカロミセス（zygosaccharomyces）属、レプトスピラ（Leptospira）属、デイノコッカス（Deinococcus）属、ピチア（Pichia）属、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、カンジダ（Candida）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、デバリオマイセス（Debaryomyces）属、ムコール（Mucor）属、トルロプシス（Torulopsis）属、メチロバクター（Methylobacter）属、サルモネラ（salmonellar）属、ストレプトマイセス（streptomyces）属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ブレビバクテリウム（brevibacterium）属、またはコリネバクテリウム（Corynebacterium）属の微生物であってもよい。
【００４７】
本発明において、前記微生物は、ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現する微生物として、例えば、バシラス属、エシェリキア属、エンテロバクター属、サルモネラ属の微生物であってもよく、好ましくはエシェリキア属微生物であってもよく、より好ましくは大腸菌であってもよい。
【００４８】
本発明の実施例では、本発明の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターに形質転換された大腸菌のＣＪＭ２ ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡＥＬ、ＣＪＭ２ ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡＥＴ、ＣＪＭ２ ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡＥＨ菌株（実施例２及び実験例２）、及びメチオニンに対するフィードバック調節が解除された変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターに形質転換された大腸菌のＣＪＭ２ ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ(＃１１)ＥＬ、ＣＪＭ２ ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ(＃１１)ＥＴ、ＣＪＭ２ ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ(＃１１)ＥＨ菌株を作製した（実施例３及び実験例２）。前記菌株のうち、ＣＪＭ２ ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ(＃１１)ＥＬ、ＣＪＭ２ ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ(＃１１)ＥＴ、ＣＪＭ２ ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ(＃１１)ＥＨ菌株を、それぞれＣＡ０５−０５４６、ＣＡ０５−０５４７及びＣＡ０５−０５４８と命名し、２０１０年１２月１４日に韓国微生物保存センターに寄託し、それぞれ寄託番号ＫＣＣＭ１１１４５Ｐ、ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ及びＫＣＣＭ１１１４７Ｐを付与された。
【００４９】
本発明は、ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの一部のアミノ酸が置換されたホモセリンО−アセチルトランスフェラーゼ活性を有する変異型ポリペプチドを提供するので、ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドのみを発現する微生物に、本発明の変異型ポリペプチドを発現させると、ホモセリンО−アセチルトランスフェラーゼをコードするｍｅｔＸ等の外来遺伝子の導入無しに、ホモセリンО−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現させることができるという利点を有する。
【００５０】
本発明において、前記微生物は、О−アセチルホモセリンを過量生産するために、さらに、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（acetyl-CoA synthetase）の活性が強化されたり、またはパントテン酸キナーゼ（pantothenate kinase）の活性がＣｏＡの蓄積によるフィードバック阻害が解除されるように変形された微生物であってもよい。
【００５１】
本発明において、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、パントテン酸キナーゼは、多様な微生物から由来し、この活性を有したタンパク質をコードする遺伝子は、それぞれａｃｓ、ｃｏａＡと称する。
【００５２】
本発明において、アセチル−ＣｏＡシンテターゼの活性強化は、前記アセチル−ＣｏＡシンテターゼをコードするａｃｓ遺伝子のプロモーター領域及び５’−ＵＴＲ部位の塩基配列を変形させることにより、遺伝子発現を増化させ、当該遺伝子のＯＲＦ部位に変異を導入することにより、タンパク質の活性を増化させ、当該遺伝子を染色体上にさらに導入することにより、タンパク質の発現量を強化させ、当該遺伝子を自家プロモーターまたは活性が増進された別個のプロモーターと一緒に導入し、菌株に形質転換させることにより、タンパク質の発現量を増化させることができる。
【００５３】
より具体的に、本発明は、活性が増進されたプロモーターへの置換、活性が増進されるようにプロモーターの変異誘発、または遺伝子コピー数の増加により、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ活性を強化させることができ、これにより、О−アセチルホモセリンの生産能を向上させる方法、及びこのような方法を用いて作製された大腸菌を提供することができる。前記活性が増進されたプロモーターに置換するために、活性が増進されたプロモーターと知られたｐＴａｃ、ｐＴｒｃ、ｐＰｒｏ、ｐＲ、ｐＬ等のプロモーターが用いられる。
【００５４】
好適な一具現例によると、本発明は、アセチル−ＣｏＡ生合成に関与するａｃｓ遺伝子のプロモーターが、構成的発現プロモーターであるｐｒｏプロモーターに置換され、前記ａｃｓ遺伝子が過発現された、О−アセチルホモセリン生産菌株を提供することができる。前記ｐｒｏプロモーターは、配列番号３０の全体または一部が用いられる。
【００５５】
本発明は、さらに、ＣｏＡ生合成経路上において、ＣｏＡ蓄積によるフィードバック阻害が解除されたパントテン酸キナーゼ変異体が導入された微生物を提供することができる。より具体的に、前記パントテン酸キナーゼのアミノ酸配列において１０６番目の位置のアルギニンがアラニンに置換され（配列番号４０）、ＣｏＡ蓄積によるフィードバック阻害が解除されることにより、О−アセチルホモセリン生産能を向上させることができる。
【００５６】
本発明において、前記微生物は、さらに、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ暗号化遺伝子（ｐｐｃ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ暗号化遺伝子（ａｓｐＣ）、及びアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ暗号化遺伝子（ａｓｄ）からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子のコピー数が増加され、または前記遺伝子のプロモーターが活性が増進されたプロモーターに置換され、または活性が増進されるように変異された微生物であってもよい。
【００５７】
本発明において、前記一連の酵素は、下記の反応式に示すように、ホスホエノールピルビン酸塩からО−アセチルホモセリンを合成する活性を有している。したがって、このような一連の活性を有する遺伝子の発現を強化する場合、細胞内にО−アセチルホモセリンの蓄積を誘導することができる。
【００５８】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）
Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ＋Ｈ２Ｏ＋ＣＯ２⇔Ｏｘａｌｏａｘｅｔａｔｅ＋Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ）
Ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ＋Ｇｌｕｔａｍａｔｅ⇔Ａｓｐａｒｔａｔｅ＋ａ−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ
アスパラギン酸キナーゼ（ｔｈｒＡ）
Ａｓｐａｒｔａｔｅ＋ＡＴＰ⇔Ａｓｐａｒｔｙｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ＋ＡＤＰ
アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）
Ａｓｐａｒｔｙｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ＋ＮＡＤＰＨ⇔Ａｓｐａｒｔａｔｅ−ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ＋Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ＋ＮＡＤＰ＋
ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ｔｈｒＡ）
Ａｓｐａｒｔａｔｅ−ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ＋ＮＡＤＰＨ⇔Ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ
前記反応式において、アスパラギン酸キナーゼとホモセリンデヒドロゲナーゼの二つの役割をする酵素をコードするｔｈｒＡ遺伝子は、実験例２に示すＣＪＭ２菌株にフィードバック解除を通じた強化が既に行われた状態であり、残りの三つの酵素は、遺伝子のコピー数が増加されたり、または前記遺伝子のプロモーターを活性が増進されたプロモーターに置換したり、または活性が増進されるように変異させる方法で活性を強化させることができる。
【００５９】
本発明における用語の「コピー数増加」は、目的遺伝子を染色体上にさらに導入し、または当該酵素の遺伝子を有するプラスミド導入する方法で行うことができる。
【００６０】
本発明の実施例では、ｍｅｔＡ及びｍｅｔＢの遺伝子が欠損した菌株であるＣＪＭ２菌株のａｃｓプロモーターを欠損させ、ｐｒｏプロモーターに交替したＣＪＭ２−ＡＰ菌株を作製し、ＣＪＭ２−ＡＰ菌株においてｆｅｅｄｂａｃｋ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｏａＡ形質を有するように形質を転換し、アセチル−ｃｏＡ ｐｏｏｌが過量増加されているＣＪＭ２−ＡＰ/ＣＯ菌株を作製した後、ｐｐｃ、ａｓｐＣ、ａｓｄの三つの遺伝子のコピー数が２コピー増幅したＣＪＭ３菌株を作製した。以降、本発明では、 ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ＃１１（ＥＬ）、ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ＃１１（ＥＨ）、及びｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ＃１１（ＥＴ）が導入されたＣＪＭ３菌株を、それぞれＣＡ０５−０５７８、ＣＡ０５−０５７９、及びＣＡ０５−０５８０と命名し、２０１１年１２月１２日に韓国微生物保存センターに寄託し、それぞれ寄託番号ＫＣＣＭ１１２２８Ｐ、ＫＣＣＭ１１２２９Ｐ、及びＫＣＣＭ１１２３０Ｐを付与された（実験例２）
また他の一態様として、本発明は、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む微生物、または変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された組み換えベクターに形質転換された微生物を培養する段階、及び前記微生物培養過程において生成されたО−アセチルホモセリンを得る段階を含むО−アセチルホモセリンの生産方法を提供する。
【００６１】
本発明において、変異型ポリペプチドを発現する前記微生物を用いてО−アセチルホモセリンを生産することは、当業界において公知の適当な培地と培養条件によって行われる。このような培養過程は、当業者であれば、選択される菌株に応じて容易に調整して用いることができる。
【００６２】
培養方法の例として、バッチ式、連続式、及び流加培養が挙げられるが、これに限定されるものではなく、培養に用いられる培地は、特定の菌株の要求条件を適宜満足させることができる。
【００６３】
本発明において用いられる培地は、スクロース、ブドウ糖、グリセロール、酢酸のいずれか一つの炭素源、またはこれらの炭素源を複合的に用いることができ、用いられる窒素源は、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、とうもろこし浸漬液、及び大豆のような有機窒素源、及び要素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源が含まれる。これらの窒素源は、単独または組み合わされて用いられる。
【００６４】
前記培地には、リン（Ｐ）源として、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、及び対応するソジウム含有塩が含まれてもよい。また、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含んでもよい。これ以外に、アミノ酸、ビタミン、及び適切な前駆体等が含まれてもよく、これらの培地または前駆体は、培養物にバッチ式または連続式で加えられてもよい。また、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、及び硫酸のような化合物を培養物に適切な方式で添加し、培養物のｐＨを調整することができ、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。
【００６５】
また、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有気体を注入したり、または嫌気及び未好気状態を維持するために、気体の注入無しに、または窒素、水素、または二酸化炭素ガスを注入することができる。培養物の温度は、２７℃乃至３７℃、好ましくは３０℃乃至３５℃であってもよい。培養期間は、所望の有用物質が生成される間は、続けて培養することができ、好ましくは１０乃至１００時間培養してもよい。
【００６６】
以下、本発明を実施例及び実験例によりさらに詳述する。但し、下記の実施例は、本発明の例示に過ぎず、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６７】
〔実施例１〕
ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼ及びホモセリンО−アセチルトランスフェラーゼを含むプラスミドの作製
米国生物資源センター（American Type Culture Collection）から購買した大腸菌Ｗ３１１０菌株（寄託番号ＡＴＣＣ９６３７）の染色体を鋳型とし、配列番号１及び配列番号２のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼをコードするｍｅｔＡ遺伝子を増幅した。
【００６８】
ＰＣＲに用いたプライマーは、米国立衛生研究所ジーンバンク（NIH Gene Bank）に登録されているＮＣ＿０００９１３の大腸菌の染色体の塩基番号に基づいて作製したので、配列番号１及び配列番号２のプライマーは、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲＶ部位及びＨｉｎｄIII部位を有している。
【００６９】
＜配列番号１＞
５’ ＡＡＴＴＧＡＴＡＴＣＡＴＧＣＣＧＡＴＴＣＧＴＧＴＧＣＣＧＧ ３’
＜配列番号２＞
５’ ＡＡＴＴＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＴＣＣＡＧＣＧＴＴＧＧＡＴＴＣＡＴＧＴＧ ３’
デイノコッカスラジオデュランス（Deinococcus radiodurans）の染色体を鋳型とし、配列番号３及び配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼをコードするｍｅｔＡ遺伝子（配列番号４４）を増幅した。配列番号３及び配列番号４のプライマーは、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲＶ部位及びＨｉｎｄIII部位を有している。
【００７０】
＜配列番号３＞
５’ ＡＡＴＴＧＡＴＡＴＣＡＴＧＡＣＣＧＣＣＧＴＧＣＴＣＧＣ ３’
＜配列番号４＞
５’ ＡＡＴＴＡＡＧＣＴＴＴＣＡＡＣＴＣＣＴＧＡＧＡＡＡＣＧＣＣＣＣ ３’
ＰＣＲ条件は、９４℃で３分間変性後、９４℃で３０秒間変性、５６℃で３０秒間アニーリング、７２℃で５分間重合を２５回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。
このように得られたＰＣＲ産物及びｃｊ１プロモーター（特許文献５）が入っているｐＣＬ１９２０プラスミドに、それぞれＥｃｏＲＶ及びＨｉｎｄIIIの制限酵素を処理してクローニングした。クローニングされたプラスミドを用いて大腸菌のＤＨ５αを形質転換した後、スペクチノマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢプレートにおいて形質転換された大腸菌のＤＨ５αを選別してプラスミドを得た。得られたプラスミドをそれぞれｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ及びｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＸｄｒと命名した。
【００７１】
〔実施例２〕
ホモセリンО−アセチルトランスフェラーゼ活性を有する変異型ポリペプチドの作製
ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Stratagene、米国）を用いて、前記実施例１において作製したｐＣＬ＿Pcj１＿ｍｅｔＡのプラスミドを鋳型とし、О−スクシニルトランスフェラーゼの１１１番のアミノ酸であるグリシン（Ｇｌｙ）をグルタミン酸（Ｇｌｕ）に置換した。使用したプライマー配列は、以下のとおりである。
【００７２】
＜配列番号５＞
５’ ｔｔｇｔａａｃｔｇｇｔｇｃｇｃｃｇｃｔｇｇａａｃｔｇｇｔｇｇｇｇｔｔｔａａｔｇａｔｇｔｃ ３’
＜配列番号６＞
５’ ｇａｃａｔｃａｔｔａａａｃｃｃｃａｃｃａｇｔｔｃｃａｇｃｇｇｃｇｃａｃｃａｇｔｔａｃａａ ３’
作製された変異のＧ１１１Ｅ ｍｅｔＡの遺伝子を含むプラスミドをｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ（ＥＬ）と命名した。
【００７３】
また、前記О−スクシニルトランスフェラーゼの１１１番のアミノ酸をグリシンからグルタミン酸に置換し、さらに１１２番のアミノ酸をロイシンからスレオニン（Ｌ１１２Ｔ）またはヒスチジン（Ｌ１１２Ｈ）に置換した。このとき、使用したプライマー配列は、以下のとおりである。
【００７４】
ロイシンをスレオニンに置換
＜配列番号７＞
５’ ｔｇｔａａｃｔｇｇｔｇｃｇｃｃｇｃｔｇｇａａａｃｃｇｔｇｇｇｇｔｔｔａａｔｇａｔｇｔｃｇ ３’
＜配列番号８＞
５’ ｃｇａｃａｔｃａｔｔａａａｃｃｃｃａｃｇｇｔｔｔｃｃａｇｃｇｇｃｇｃａｃｃａｇｔｔａｃａ ３’
ロイシンをヒスチジンに置換
＜配列番号９＞
５’ ｔｇｔａａｃｔｇｇｔｇｃｇｃｃｇｃｔｇｇａａｃａｔｇｔｇｇｇｇｔｔｔａａｔｇａｔｇｔｃｇ ３’
＜配列番号１０＞
５’ ｃｇａｃａｔｃａｔｔａａａｃｃｃｃａｃａｔｇｔｔｃｃａｇｃｇｇｃｇｃａｃｃａｇｔｔａｃａ ３’
作製されたプラスミドのうち、１１１番のアミノ酸がグリシンからグルタミン酸に、１１２番のアミノ酸がロイシンからスレオニンに置換されたｍｅｔＡ遺伝子を含むプラスミドをｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ（ＥＴ）と命名した。同様に、１１１番のアミノ酸がグリシンからグルタミン酸に、１１２番のアミノ酸がロイシンからヒスチジンに置換されたｍｅｔＡ遺伝子を含むプラスミドをｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ（ＥＨ）と命名した。
【００７５】
〔実施例３〕
フィードバック調節解除（feedback-resistance）されたホモセリンアセチルトランスフェラーゼ活性を有する変異型ポリペプチドの作製
前記実施例１において作製されたｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡのプラスミドを鋳型とし、前記実施例２と同様の方法を用いてメチオニンに対するフィードバック調節が解除された特性を有するｍｅｔＡ遺伝子（ｍｅｔＡ ♯１１）を作製した。具体的に、特許文献３に開示された内容によって、О−スクシニルトランスフェラーゼの２９番のアミノ酸をセリンからフロリンに（Ｓ２９Ｐ）、１１４番のアミノ酸をグルタミン酸からグリシンに（Ｅ１１４Ｇ）、１４０番のアミノ酸をフェニルアラニンからセリンに置換（Ｆ１４０Ｓ）した。このとき、使用したプライマー配列は、以下のとおりである。
【００７６】
セリンをプロリンに置換
＜配列番号１１＞
５’ ＡＴＧＡＣＡＡＣＴＴＣＴＣＧＴＧＣＧＣＣＴＧＧＴＣＡＧＧＡＡＡＴＴＣＧ ３’
＜配列番号１２＞
５’ ＣＧＡＡＴＴＴＣＣＴＧＡＣＣＡＧＧＣＧＣＡＣＧＡＧＡＡＧＴＴＧＴＣＡＴ ３’
グルタミン酸をグリシンに置換
＜配列番号７５＞
５’ ＣＧＣＣＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＧＧＴＴＴＡＡＴＧＡＴＧＴＣＧＣＴ ３’
＜配列番号１４＞
５’ ＡＧＣＧＡＣＡＴＣＡＴＴＡＡＡＣＣＣＣＡＣＣＡＧＧＣＣＣＡＧＣＧＧＣＧ ３’
フェニルアラニンをセリンに置換
＜配列番号１５＞
５’ ＣＡＣＧＴＣＡＣＣＴＣＧＡＣＧＣＴＧＡＧＴＧＴＣＴＧＣＴＧＧＧＣＧＧＴ ３’
＜配列番号１６＞
５’ ＡＣＣＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＴＣＡＧＣＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡＣＧＴＧ ３’
それぞれの前記変異を順次導入し、３種の変異を全て導入したｍｅｔＡ（＃１１）遺伝子を含有したプラスミドを製造した後、ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ＃１１と命名した。
以降、前記作製されたｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ＃１１のプラスミドを鋳型とし、前記実施例２のホモセリンО−アセチルトランスフェラーゼ活性を有する変異型ポリペプチドの変異を同様に有するポリペプチドを発現させるためのプラスミドを作製した。
作製されたプラスミドのうち、１１１番のアミノ酸がグリシンからグルタミン酸に置換されたｍｅｔＡ ＃１１遺伝子を含んだプラスミドをｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ＃１１（ＥＬ）に、１１１番のアミノ酸がグリシンからグルタミン酸に、１１２番のアミノ酸がロイシンからスレオニンに置換されたｍｅｔＡ ＃１１遺伝子を含んだプラスミドをｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ＃１１（ＥＴ）に、１１１番のアミノ酸がグリシンからグルタミン酸に、１１２番のアミノ酸がロイシンからヒスチジンに置換されたｍｅｔＡ ＃１１遺伝子を含むプラスミドをｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ＃１１（ＥＨ）と命名した。
【００７７】
実験例１：大腸菌のホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ及びフィードバック調節解除された大腸菌のホモセリンスクシニルトランスフェラーゼの相同性の比較
大腸菌の変異体（variants）Ｅ. ｃｏｌｉ Ｏ９：Ｈ４（ｓｔｒａｉｎ ＨＳ）、Ｅ. ｃｏｌｉ Ｏ１３９：Ｈ２８（ｓｔｒａｉｎ Ｅ２４３７７Ａ）、及びＥ. ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７、Ｅ. ｃｏｌｉ（ｓｔｒａｉｎ ＡＴＣＣ８７３９）において示されるホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼのアミノ酸の一次配列［順に、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３］をＣＬＣ Ｍａｉｎ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ＣＬＣ ｂｉｏ、デンマーク）プログラムを用いて比較してみた。
【００７８】
比較の結果、図２に示すように、大腸菌の変異体において示されるホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼのアミノ酸の一次配列は５％未満の変異が現れることが分かった（図２）。
【００７９】
また、メチオニンに対するフィードバック調節が解除された変異ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼのアミノ酸の一次配列も、前記プログラムを用いて比較してみた。比較した一次配列は、野生型ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼ、特許文献３に開示されたフィードバック調節解除された変異ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼｍｅｔ１０Ａ、ｍｅｔ１１Ａ、及び特許文献４に開示されたフィードバック調節解除された変異ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼである。
比較の結果、図３及び図４に示すように、メチオニンに対するフィードバック調節が解除された変異ホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼのアミノ酸の一次配列は５％未満の変異が存在することが分かった（図３及び図４）。
このような結果は、大腸菌に存在するホモセリンО−スクシニルトランスフェラーゼのポリペプチドは、相互間に９５％以上の相同性を有しており、５％未満の配列差にもかかわらず、ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼの活性には、大きな差がないことが示される。
【００８０】
実験例２：ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ活性を有する変異型ポリペプチドの基質特異性及び活性比較試験
２−１：実験菌株の作製
２−１−１）ｍｅｔＡ及びｍｅｔＡ遺伝子の欠損
О−アセチルホモセリンを過量生産する変異型ポリペプチドの活性を比較するために、ホモセリンを蓄積し、生産されたО−アセチルホモセリンの利用性が欠損した菌株を作製した。前記菌株の作製は、特許文献７に明記されたスレオニン生産菌株であるＦＴＲ２５３３（ＫＣＣＭ １０５４１）菌株に基づいて、特許文献８に開示された実施例１−１乃至１−４の方法で、ｍｅｔＡ及びｍｅｔＡ遺伝子が欠損した菌株を作製し、ＣＪＭ２と命名した。ＣＪＭ２は、菌株内にホモセリンが過量蓄積され、導入される遺伝子により、О−アセチルホモセリンまたはО−スクシニルホモセリンを生産可能な菌株である。
【００８１】
２−１−２）ａｃｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒの交替
О−アセチルホモセリンを過量生産するために、大腸菌内にホモセリンとアセチルＣｏＡの生成が円滑でなければならない。第一に、アセチルＣｏＡの供給を円滑にするために、ａｃｓ（ａｃｅｔｙｌ−ｃｏＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）遺伝子のプロモータを配列番号３０の構成的発現プロモータ（constitutive promoter）であるｐｒｏに置換し、目的遺伝子の常時過剰発現を誘導した。前記プロモータの交替のために、ＦＲＴ−ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＰＣＲの変形された方法を用いた（非特許文献5）。図５に示すようなカセットを作製するために、配列番号３１と配列番号３３を用いて、ｐＫＤ３（PNAS (2000) vol.97: 6640-6645)由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子ＦＲＴカセットをＰＣＲし、配列番号３２と配列番号３４を用いたｐｒｏプロモーター領域をＰＣＲし、両ＰＣＲの結果物をＯｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲ法を用いて、一つのカセット（ａｃｓプロモータ欠損−ｐｒｏプロモータ交替カセット）として作製した（非特許文献6）。変性段階は９４℃で３０秒、アニーリング段階は５５℃で３０秒、延長段階は７２℃で１分間実施し、これを３０回行った。
【００８２】
＜配列番号３１＞
５’ ＡＧＧＧＧＣＴＴＣＡＴＣＣＧＡＡＴＴＧＣＧＣＣＡＴＴＧＴＴＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＴＣ ３’
＜配列番号３２＞
５’ ＧＡＴＡＴＴＣＡＴＡＴＧＧＡＣＣＡＴＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＡＧＣＡＴＴＴＴＴＡＴＣＣ ３’
＜配列番号３３＞
５’ ＧＧＡＴＡＡＡＡＡＴＧＣＴＡＴＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣ ３’
＜配列番号３４＞
５’ ＣＧＡＴＧＴＴＧＧＣＡＧＧＡＡＴＧＧＴＧＴＧＴＴＴＧＴＧＡＡＴＴＴＧＧＣＴＣＡＴＡＴＧＴＡＣＣＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＡ ３’
その結果、得られたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲルにおいて電気泳動した後、約１．２ｋｂｐサイズのバンドからＤＮＡを精製した。回収されたＤＮＡ切片は、ｐＫＤ４６ベクター（非特許文献5）に予め形質転換させたＣＪＭ２菌株にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションのために、ｐＫＤ４６に形質転換されたＣＪＭ２菌株は、１００μｇ／Ｌのアンピシリンと５ｍＭのアラビノース（ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ）が含まれたＬＢ培地を用いて、３０℃でОＤ６００＝０．６まで培養させた後、滅菌蒸留水で１回、１０％グリセロールで２回洗浄して使用した。エレクトロポレーションは、２５００Ｖで加えた。回収された菌株を２５μｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含んだＬＢ平板培地に塗抹し、３７℃で一晩培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
【００８３】
選別された菌株を鋳型とし、同一のプライマーを用いて同じ条件でＰＣＲした後、１．０％アガロースゲル上において、遺伝子のサイズが１．２Ｋｂであることを確認し、これにより、ａｃｓプロモーターの欠損及びｐｒｏプロモーターへの交替を確認した。確認された菌株は、さらにｐＣＰ２０ベクター（ 非特許文献5）に形質転換させ、ＬＢ培地で培養し、さらに同様の条件のＰＣＲによって、１．０％アガロースゲル上において、遺伝子のサイズが１５０ｂｐと小さくなった最終のａｃｓプロモーターの欠損及びｐｒｏプロモーターへの交替菌株を作製し、クロラムフェニコールマーカーが除去されたことが確認された。作製された菌株をＣＪＭ２−ＡＰと命名した。
【００８４】
２−１−３）フィードバック抵抗性ｃｏａＡ代替
前記ＣＪＭ２−ＡＰ菌株において、ｆｅｅｄｂａｃｋ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｏａＡ形質を有するようにするために、ｗ３１１０ ｇＤＮＡを鋳型とし、制限酵素ＥｃｏＲＩが含まれた配列番号３５及び配列番号３６のプライマーを用いたＰＣＲを行い、パントテン酸キナーゼをコードするｃｏａＡ遺伝子を確保した。重合酵素は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭの信頼性の高いＤＮＡポリマラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、ＰＣＲ条件は、変性９６℃、３０秒；アニーリング５０℃、３０秒；及び重合反応７２℃、２分を３０回繰り返した。
【００８５】
前記の方法で得られたｃｏａＡ遺伝子及びｐＳＧ７６Ｃプラスミド（JOURNAL OF BACTERIOLOGY, July 1997, 4426-4428）にそれぞれＥｃｏＲＩ制限酵素を処理した後、連結した。前記方法で作製されたプラスミドを用いて、大腸菌のＤＨ５αに形質転換した後、クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを含むＬＢプレートにおいて、形質転換された大腸菌のＤＨ５αを選別し、ｐＳＧ−７６Ｃ−ｃｏａＡを得た。
【００８６】
＜配列番号３５＞
５’ ＡＴＧＡＧＴＡＴＡＡＡＡＧＡＧＣＡＡＡＣ ３’
＜配列番号３６＞
５’ ＴＴＡＴＴＴＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＡＣＣ ３’
前記で得られたｐＳＧ−７６Ｃ−ｃｏａＡを用いてｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）法で、配列番号３７及び配列番号３８のプライマーを用いてｐＳＧ−７６Ｃ−ｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ)を作製した。
【００８７】
＜配列番号３７＞
５’ＧＧＡＡＡＡＧＴＡＣＡＡＣＣＧＣＣｇｃｃＧＴＡＴＴＧＣＡＧＧＣＧＣＴＡＴＴ ３’
＜配列番号３８＞
５’ＡＡＴＡＧＣＧＣＣＴＧＣＡＡＴＡＣｇｇｃＧＧＣＧＧＴＴＧＴＡＣＴＴＴＴＣＣ ３’
ＣＪＭ２−ＡＰ菌株に前記ｐＳＧ７６Ｃ−ｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）プラスミドを形質転換し、ＬＢ−Ｃｍ（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ/Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ/Ｌ、Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ/Ｌ、クロラムフェニコール ２５μｇ/Ｌ）培地において培養した後、クロラムフェニコール耐性を有するコロニーを選抜した。選抜された形質転換体は、ｐＳＧ７６ｃ−ｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）が遺伝体内のｃｏａＡ部分に１次で挿入された菌株である。
【００８８】
確保されたｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）遺伝子が挿入された菌株をｐＳＧ７６ｃ内に存在するＩ−ＳｃｅＩ部分を切断する制限酵素Ｉ−ＳｃｅＩを発現するベクターであるｐＡＳｃｅＰ（非特許文献3）に形質転換し、ＬＢ−Ａｐ（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ／Ｌ、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｅ １００μｇ／Ｌ）において生長する菌株を選別した。選別された菌株において配列番号３５及び配列番号３６のプライマーを用いてｃｏａＡ遺伝子を増幅し、増幅された遺伝子は、マクロジェン（韓国）シークエンスサービスを通じて、ｃｏａＡ（Ｒ１０６）に交替されたことが確認された（非特許文献4）。このように作製された菌株は、ＣＪＭ２−ＡＰ/ＣＯと命名した。ＣＪＭ２−ＡＰ/ＣＯ菌株は、ホモセリンだけでなく、Ａｃｅｔｙｌ−ｃｏＡ ｐｏｏｌが過量増加されている特性を示す菌株である。
【００８９】
２−１−４）ホモセリン生合成経路のｋｅｙ遺伝子コピー数
ＣＪＭ２またはＣＪＭ２−ＡＰ/ＣＯ菌株は、ホモセリンが過量生産される菌株であるが、ホモセリンの生産性をより向上させるために、ｐｐｃ、ａｓｐＣ、ａｓｄの三つの遺伝子のコピー数の増幅を試みた。特許文献6の実施例＜１−１＞乃至＜１−３＞に開示された方法であり、ｐＳＧ７６ｃ−２ｐｐｃ、ｐＳＧ７６ｃ−２ａｓｐＣ、ｐＳＧ７６ｃ−２ａｓｄのプラスミドを作製し、ＣＪＭ２−ＡＰ/ＣＯ菌株に前記プラスミドを作製し、実施例＜１−５＞の方法で、前記三つの遺伝子を順次に２コピー増幅された菌株を作製した。このように作製された菌株は、ＣＪＭ３と命名した。ＣＪＭ３は、菌株内にホモセリンがＣＪＭ２菌株に比べてさらに過量蓄積され、導入されるプラスミドにより、О−アセチルホモセリンまたはО−スクシニルホモセリンを生産することができる菌株である。
【００９０】
２−２：実験方法及び実験結果
ＣＪＭ２とＣＪＭ３の２種の菌株をコンピテント細胞で作製し、コンピテント細胞に電気穿孔法（electroporation）で、ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＸ、ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ、ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ（ＥＬ）、ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ（ＥＨ）、ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ（ＥＴ）、ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ＃１１、ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ＃１１（ＥＬ）、ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ＃１１（ＥＨ）、 ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ＃１１（ＥＴ）の９種のプラスミドをそれぞれ導入した。
【００９１】
このうち、ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ＃１１（ＥＬ）、ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ＃１１（ＥＨ）、及びｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ＃１１（ＥＴ）が導入されたＣＪＭ２菌株を、それぞれＣＡ０５−０５４６、ＣＡ０５−０５４７及びＣＡ０５−０５４８と命名し、２０１０年１２月１４日に韓国微生物保存センターに寄託し、それぞれ寄託番号ＫＣＣＭ１１１４５Ｐ、ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ、及びＫＣＣＭ１１１４７Ｐを付与された。
【００９２】
また、ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ＃１１（ＥＬ）、ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ＃１１（ＥＨ）、及びｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ＃１１（ＥＴ）が導入されたＣＪＭ３菌株を、それぞれＣＡ０５−０５７８、ＣＡ０５−０５７９及びＣＡ０５−０５８０と命名し、２０１１年１２月１２日に韓国微生物保存センターに寄託し、それぞれ寄託番号ＫＣＣＭ１１２２８Ｐ、ＫＣＣＭ１１２２９Ｐ、及びＫＣＣＭ１１２３０Ｐを付与された。
【００９３】
以降、９種のプラスミドが導入されたそれぞれの菌株が生産するメチオニン前駆体の種類と生産量を比較するために、フラスコテストを行った。フラスコテストは、それぞれの菌株をＬＢプレートにおいて線条接種（streaking）し、３１℃の培養器に１６時間の間培養してから、単一コロニーをＬＢ培地の３ｍｌに接種した後、２００ｒｐｍ／３１℃ま培養器において１６時間の間培養することにより行った。
【００９４】
２５０ｍｌフラスコに、表１のメチオニン前駆体の生産培地２５ｍｌを入れ、予め培養した培養液を５００μｌずつ投入した。以降、フラスコを２００ｒｐｍ／３１℃の培養器において４０時間の間培養した後、ＨＰＬＣを用いて、それぞれのプラスミドが導入された菌株から得られるメチオニン前駆体の種類及び量を比較し、その結果を表２（ＣＪＭ２系菌株についての結果）及び表３（ＣＪＭ３系菌株についての結果）に示した。
【００９５】
【表１】
0005758499.tif 000002
【００９６】
【表２】
0005758499.tif 000003
【００９７】
【表３】
0005758499.tif 000004
【００９８】
その結果、表２及び表３に示すように、野生型ｍｅｔＡ遺伝子を含むｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ（ｗｔ）によっては、О−スクシニルホモセリンのみが生産されたが、本発明による３種の変異ｍｅｔＡ遺伝子を含む菌株によっては、О−アセチルホモセリンのみが蓄積されることが確認された。すなわち、ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸を置換することにより、ポリペプチドの活性がホモセリンアセチルトランスフェラーゼに変更されたことが確認された。
【００９９】
また、ＣＪＭ３系菌株において、前記３種の変異のうち、アミノ酸配列１１１番がグルタミン酸に置換された場合（ＥＬ）は、О−アセチルホモセリンの生産量が２．１ｇ／Ｌであったが、さらに、１１２番のアミノ酸がヒスチジンに置換された場合（ＥＨ）は、３．２ｇ／ＬのО−アセチルホモセリンが生産され、最も多量のО−アセチルホモセリンが生産されたことが確認された。
【０１００】
メチオニンに対するフィードバック調節が解除されたホモセリンアセチルトランスフェラーゼ活性を有する変異型ポリペプチドを発現する菌株でも、同一の傾向性を示した。具体的に、メチオニンに対するフィードバック調節が解除され、１１１番及び１１２番のアミノ酸がそれぞれグルタミン酸及びヒスチジンに置換されたｍｅｔＡ ♯１１（ＥＨ）遺伝子を導入した菌株において、２４．８ｇ／Ｌの最も多量のО−アセチルホモセリンが生産されており、これにより、外来遺伝子としてホモセリンアセチルトランスフェラーゼを導入した場合（ＣＪＭ３ ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＸ、２３．７ｇ/Ｌ）に類似した水準にО−アセチルホモセリンが蓄積されることを確認することができた。
【０１０１】
0005758499.tif 000005
【０１０２】
0005758499.tif 000006
【０１０３】
0005758499.tif 000007
【０１０４】
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【０１０５】
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【０１０６】
0005758499.tif 000010
【図１】
0005758499.tif 000011
【図２ａ】
0005758499.tif 000012
【図２ｂ】
0005758499.tif 000013
【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【配列表】
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