(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューロンの死滅を減少させるための医薬の製造のための、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５および３３からなる群より選択される配列を含むポリペプチドの使用であって、１以上のニューロンが該ポリペプチドと接触させられることによってニューロンの死滅が減少させられるものである、使用。
【請求項２】
前記接触ステップがインビボにおいてである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記接触ステップがインビトロにおいてである、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記ニューロンの死滅が神経変性症状によって引き起こされる、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記ニューロンの死滅が毒素によって引き起こされる、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記ニューロンの死滅が損傷によって引き起こされる、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
ニューロンの分化又は増殖を促進するための医薬の製造のための、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５および３３からなる群より選択される配列を含むポリペプチドの使用であって、１以上のニューロンが該ポリペプチドと接触させられることによってニューロンの分化又は増殖が促進させられるものである、使用。
【請求項８】
前記接触ステップがインビボにおいてである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記接触ステップがインビトロにおいてである、請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
アミロイドタンパク質の形成又は蓄積を減少させるための医薬の製造のための、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５および３３からなる群より選択される配列を含むポリペプチドの使用であって、１以上のニューロンが該ポリペプチドと接触させられることによってアミロイドタンパク質の形成又は蓄積が減少させられるものである、使用。
【請求項１１】
神経突起の発達を促進するための医薬の製造のための、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５および３３からなる群より選択される配列を含むポリペプチドの使用であって、１以上のニューロンが該ポリペプチドと接触させられることによって神経突起の発達が促進されるものである、使用。
【請求項１２】
前記接触ステップがインビボにおいてである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記接触ステップがインビトロにおいてである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
神経変性症状の患者を治療するか、又は患者の神経変性症状の１以上の徴候を軽減させるための医薬の製造のための、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５および３３からなる群より選択される配列を含むポリペプチドの使用であって、治療として有効な量の該ポリペプチドが患者に投与されることによって、神経変性症状の患者が治療されるか、又は患者の神経変性症状の１以上の徴候が軽減されるものである、使用。
【請求項１５】
前記神経変性症状が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脳卒中、多発性硬化症、脳の損傷、脊髄損傷、及び末梢神経障害から成る群から選ばれる、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
神経毒性損傷の患者を治療するか、又は患者の神経毒性損傷の１以上の徴候を軽減させるための医薬の製造のための、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５および３３からなる群より選択される配列を含むポリペプチドの使用であって、治療として有効な量の該ポリペプチドが患者に投与されることによって、神経毒性損傷の患者が治療されるか、又は患者の神経毒性損傷の１以上の徴候が軽減されるものである、使用。
【請求項１７】
該ポリペプチドが配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５および３３からなる群より選択される配列からなるものである、請求項１、７、１０、１１、１４または１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５および３３からなる群より選択される配列を含むポリペプチドを含む、ニューロンの死滅を減少させるための医薬組成物。
【請求項１９】
前記ニューロンの死滅が神経変性症状によって引き起こされる、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記ニューロンの死滅が毒素によって引き起こされる、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記ニューロンの死滅が損傷によって引き起こされる、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
該ポリペプチドが配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５および３３からなる群より選択される配列からなるものである、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５および３３からなる群より選択される配列を含むポリペプチドを含む、ニューロンの分化又は増殖を促進するための医薬組成物。
【請求項２４】
該ポリペプチドが配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５および３３からなる群より選択される配列からなるものである、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５および３３からなる群より選択される配列を含むポリペプチドを含む、アミロイドタンパク質の形成又は蓄積を減少させるための医薬組成物。
【請求項２６】
該ポリペプチドが配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５および３３からなる群より選択される配列からなるものである、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５および３３からなる群より選択される配列を含むポリペプチドを含む、神経突起の発達を促進するための医薬組成物。
【請求項２８】
該ポリペプチドが配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５および３３からなる群より選択される配列からなるものである、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５および３３からなる群より選択される配列を含むポリペプチドを含む、ニューロン突起を成長させるための医薬組成物。
【請求項３０】
該ポリペプチドが配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５および３３からなる群より選択される配列からなるものである、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
神経変性症状の患者を治療するか、又は患者の神経変性症状の１以上の徴候を軽減させるための医薬組成物であって、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５および３３からなる群より選択される配列を含むポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項３２】
前記神経変性症状が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脳卒中、多発性硬化症、脳の損傷、脊髄損傷、及び末梢神経障害から成る群から選ばれる、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
該ポリペプチドが配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５および３３からなる群より選択される配列からなるものである、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
神経毒性損傷の患者を治療するか、又は患者の神経毒性損傷の１以上の徴候を軽減させるための医薬組成物であって、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５および３３からなる群より選択される配列を含むポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項３５】
該ポリペプチドが配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５および３３からなる群より選択される配列からなるものである、請求項３４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
当該出願は、２００１年７月３１日に出願された米国特許出願番号第６０／３０９，０７６号に対して優先権を主張する。
【０００２】
本願発明は、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、及びそれらのペプチド・アナログに広く関する。本発明は、糖尿病及び神経変性症状の治療におけるそれらの使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
膵臓のベータ細胞機能不全及び付随するインシュリン産生の減少は、糖尿病をもたらす恐れがある。１型糖尿病において、ベータ細胞は、免疫系によって完全に破壊され、インシュリン産生細胞の欠如をもたらす（インシュリン依存型［１型］糖尿病に対する内科医のガイド：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，  １９８８（非特許文献１））。２型糖尿病において、ターゲット組織がグルコース摂取においてインシュリンの効果に抵抗性をもつようになると、ベータ細胞が徐々に能率的でなくなる。よって、ベータ細胞は、１型糖尿病の人々において不存在であり、そして２型糖尿病の人々において機能的に十分な機能を果たしていない。
【０００４】
現在、ベータ細胞機能不全は、いくつかの異なる方法で治療される。１型糖尿病又は末期の２型糖尿病は、インシュリン補充療法が必要である。たとえ連続的な注入又は複数の注射が複雑な投薬計画で使用されたとしても、インスリン療法、あるいは救命療法は、正常血糖を回復させない。例えば、インシュリン補充療法を受けている個人において、食後のグルコースレベルは、非常に高いままである。よって、インスリン療法は、複数の毎日の注射又は連続的な注入によってなされなければならず、かつ、その効果は、高血糖、低血糖、代謝性アシドーシス、及びケトーシスを避けるために慎重に監視されなければならない。
【０００５】
２型糖尿病の人々は、ベータ細胞からのインシュリン産生及び分泌を刺激する、及び／又はインシュリン感受性を改善する薬物を用いて一般に治療される。しかし、これらの薬の主な問題点は、インシュリン産生及び分泌が血糖値にかかわらず促進されることである。よって、食物摂取は低血糖又は高血糖を避けるために、インシュリン産生及び分泌の促進に対して釣り合わせなければならない。ここ数年で、いくつかの新しい薬剤が２型糖尿病の治療に利用可能になった。これらは、メトフォルミン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、及びアクラボス（Ｂｒｅｓｓｌｅｒ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  １９９７（非特許文献２）を参照のこと）を含んでいる。しかし、これらの新しい薬剤によって得られたヘモグロビンＡ１ｃの低下は、あまり十分ではなく、それらが糖尿病の長期のコントロールを改善しないことを示唆している（Ｇｈａｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７（非特許文献３））。
【０００６】
食物に応答して腸神経内分泌細胞によって通常分泌されているホルモンである、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）が、２型糖尿病の新しい治療として提案された（Ｇｕｔｎｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２（非特許文献４）；  Ｎａｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  １９９３（非特許文献５））。それは、長年の２型糖尿病の患者であっても、ベータ細胞によるインシュリン分泌を増加させる（Ｎａｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，  １９９３（非特許文献６））。ＧＬＰ−１が内性インシュリン分泌を刺激し、それが血糖値が下がったときに止まるので、ＧＬＰ−１治療は、インスリン療法を上回る利点がある（Ｎａｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，  １９９３（非特許文献６）；  Ｅｌａｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４（非特許文献７））。ＧＬＰ−１は、インシュリンの分泌及び合成を増加させることによって正常血糖を促進するので、グルカゴン分泌を抑え、そして胃内容排出を減少させる（Ｎａｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，  １９９３（非特許文献６）；  Ｅｌａｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４（非特許文献７）；  Ｗｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６（非特許文献８）；  Ｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２（非特許文献９）；  Ｄｅ  Ｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７（非特許文献１０））。ＧＬＰ−１は、ヘキソキナー・ｍＲＮＡレベルの増加をも誘発する（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １９９５（非特許文献１１）；  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６（非特許文献１２））。
【０００７】
ＧＬＰ−１は、ベータ細胞においてインシュリン分泌効果をもつこと（Ｔｈｏｒｅｎｓ  ａｎｄ  Ｗａｅｂｅｒ，  １９９３（非特許文献１３）；  Ｏｒｓｋｏｖ，  １９９２（非特許文献１４））、及びインシュリン分泌細胞系に加えられて２４時間、インシュリン生合成及びプロインシュリン遺伝子発現を増加させることが知られている（Ｄｒａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７（非特許文献１５）；  Ｆｅｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｎｅｒ，  １９９２（非特許文献１６））。ＲＩＮ１０４６−３８細胞を使った研究において、ＧＬＰ−１による２４時間の処理が、ＧＬＰ−１が取り除かれた後１時間、及びこの細胞の数回の洗浄後でさえ、グルコース反応性を増加させた（Ｍｏｎｔｒｏｓｅ−Ｒａｆｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４（非特許文献１７））。よって、ＧＬＰ−１は、系から代謝された後でもβ細胞に対する生物学的な効果をもつことが知られているインシュリン分泌刺激剤である。ＧＬＰ−１は、プログルカゴンの転写後修飾の産物である。ＧＬＰ−１の配列、並びにその活性断片ＧＬＰ−１（７−３７）及びＧＬＰ−１（７−３６）アミドが当該技術分野で知られている（Ｆｅｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５（非特許文献１８））。ＧＬＰ−１は、糖尿病の治療における治療薬として提案されたが、それは、たとえ皮下にボーラスによって与えられるとしても（Ｒｉｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５（非特許文献１９））、短い生物学的半減期をもつ（Ｄｅ  Ｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７（非特許文献１０））。１つは、ＧＬＰ−１（及びＧＬＰ−１（７−３６）アミド）の分解は、第８アミノ酸と第９アミノ酸（アラニンとグルタミン酸）の間でポリペプチドを切断する（ｃｌｅａｖｅ）酵素ジペプチジル・ペプチダーゼ（ＤＰＰ１Ｖ）によってである。
【０００８】
ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、アメリカ・ドクトカゲの唾液腺で産生されるポリペプチドである（Ｇｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３（非特許文献２０））。ｅｘｅｎｄｉｎ−４のアミノ酸配列は、当該技術分野で知られている（Ｆｅｈｍａｎｎｅｔ  ａｌ．，  １９９５（非特許文献１８））。それが特殊な非哺乳類の遺伝子の産物であり、かつ、唾液腺だけで発現されると思われたが（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｄｒｕｃｋｅｒ，  １９９７（非特許文献２１））、ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、ＧＬＰ−１と５２％のアミノ酸配列相同性をもち、そして哺乳動物においてＧＬＰ−１受容体と相互作用する（Ｇｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３（非特許文献２０）；  Ｔｈｏｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３（非特許文献２２））。インビトロにおいて、ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、インシュリン産生細胞によるインシュリン分泌を促進し、そして等モルの分量で与えられると、ＧＬＰ−１より強力にインシュリン産生細胞からのインシュリン放出を引き起こすことが示された。さらに、ｅｘｅｎｄｉｎ−４が、齧歯動物及びヒトの両方で、強力にインシュリン分泌を促進して血漿グルコースレベルを下げ、かつＧＬＰ−１より長く作用する。しかし、通常哺乳動物において生じないので、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、ＧＬＰ−１を欠く哺乳動物において潜在的な抗原特性を必ずもっている。
【０００９】
糖尿病で生じるインシュリン産生の減少に加えて、末梢神経障害が、糖尿病に一般に関係する。全糖尿病患者の２０〜３０パーセントが、いつかは末梢神経障害を患う。さらに、心臓病、脳卒中、高血圧症、及び糖尿病によるアルツハイマー症の高い危険性が報告されている（Ｍｏｃｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００（非特許文献２３）；  Ｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９（非特許文献２４））。よって、糖尿病は神経変性疾患に関係する病気でもある。
【００１０】
多数の研究が、ＧＬＰ−１受容体が、齧歯動物（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８（非特許文献２５）、Ｓｈｕｇｈｒｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６（非特許文献２６））及びヒト（Ｗｅｉ  ａｎｄ  Ｍｏｊｓｏｖ  １９９５（非特許文献２７）、Ｓａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００（非特許文献２８））の両方の脳にあることを証明した。分布の化学組成（ｃｈｅｍｏａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）は、視床下部、視床、脳幹、外側中隔、脳弓下器官、及び最後野であり、一般にたくさんのペプチド受容体が配置されている全ての脳室周囲区域に大部分は限られているように思われる。しかし、ＧＬＰ−１のための特定の結合部位は、低密度ではあるが、被殻−尾状核、皮質、及び小脳の全体にわたって検出された（Ｃａｍｐｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４（非特許文献２９），  Ｃａｌｖｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５（非特許文献３０），  Ｇｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５（非特許文献２０））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，  １９８８
【非特許文献２】Ｂｒｅｓｓｌｅｒ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ａｒｃｈ．  Ｉｎｔ．  Ｍｅｄ．  １５７：  ８３６−８４８，  １９９７
【非特許文献３】Ｇｈａｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４６：  ４３３−４３９，  １９９７
【非特許文献４】Ｇｕｔｎｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３２６：  １３１６−１３２２，  １９９２
【非特許文献５】Ｎａｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ９１：  ３０１−３０７，  １９９３
【非特許文献６】Ｎａｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，  ３６：７４１―７４４，１９９３
【非特許文献７】Ｅｌａｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｇｕｌ．  Ｐｅｐ．  ５１：  ６３−７４，  １９９４
【非特許文献８】Ｗｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ８１：  ３２７−３３２，  １９９６
【非特許文献９】Ｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  １５：  ２７０−２７６，  １９９２
【非特許文献１０】Ｄｅ  Ｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．  ５２：  Ｂ２４５−２４９，  １９９７
【非特許文献１１】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：  ４９１０−４９１７，  １９９５
【非特許文献１２】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｅｎｄｏ．  １１６：  ８１−８７，  １９９６
【非特許文献１３】Ｔｈｏｒｅｎｓ  ａｎｄ  Ｗａｅｂｅｒ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４２：  １２１９−１２２５，  １９９３
【非特許文献１４】Ｏｒｓｋｏｖ，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ３５：  ７０１−７１１，  １９９２
【非特許文献１５】Ｄｒａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８４：  ３４３４−３４３８，  １９８７
【非特許文献１６】Ｆｅｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｎｅｒ，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３０：  １５９−１６６，  １９９２
【非特許文献１７】Ｍｏｎｔｒｏｓｅ−Ｒａｆｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３５：  ５８９−５９４，  １９９４
【非特許文献１８】Ｆｅｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．  １６：  ３９０−４１０，  １９９５
【非特許文献１９】Ｒｉｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ３８：  ７２０−７２５，  １９９５
【非特許文献２０】Ｇｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４６：  ４３３−４３９，  １９９３
【非特許文献２１】Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｄｒｕｃｋｅｒ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：  １４０８−４１１５，  １９９７
【非特許文献２２】Ｔｈｏｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４２：  １６７８−１６８２，  １９９３
【非特許文献２３】Ｍｏｃｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５４：  ４１５−４２０，  ２０００
【非特許文献２４】Ｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５３：  １９３７−１９４２，  １９９９
【非特許文献２５】Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｏｍｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ２７１：  ５１９−５３２，  １９８８
【非特許文献２６】Ｓｈｕｇｈｒｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．  １３７（１１）：  ５１５９−５１６２，  １９９６
【非特許文献２７】Ｗｅｉ  ａｎｄ  Ｍｏｊｓｏｖ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３５８（３）：  ２１９−２２４，  １９９５
【非特許文献２８】Ｓａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４１：  １３０１−１３０９，  ２０００
【非特許文献２９】Ｃａｍｐｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３４：  ２１５６−２１６４，  １９９４
【非特許文献３０】Ｃａｌｖｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ６４（１）：  ２９９−３０６，  １９９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
当該技術分野で必要とされているのは、糖尿病の治療及び神経障害、例えばアルツハイマー病及びパーキンソン病の治療、並びに２型糖尿病に関連した末梢神経障害の治療において治療的に価値のあるポリペプチドである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の概要
本願発明の目的に従って、本明細書中に含まれ、かつ、全体的に記載されているとおり、一態様において、本願発明は、ＧＬＰ−１及びｅｘｅｎｄｉｎ−４の新規ポリペプチド・アナログに関する。好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、インシュリン分泌刺激性及び長期作用性である。好ましくは、前記ポリペプチドのインシュリン分泌刺激効果は、等モル量のＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４の効果に匹敵するか又はそれを超える。
【００１４】
本発明は、さらに、精製されたポリペプチド、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２５又は配列番号３３を含むアミノ酸配列に関する。
【００１５】
他の態様において、本発明は、糖尿病の患者の治療方法であって、インシュリン分泌刺激効果がある量で本発明のポリペプチドを上記患者に投与することを含む方法に関する。
【００１６】
本発明のさらなる利点は、以下の記載によりある程度説明され、そしてある程度記載から明らかであるか、又は本発明の実施によって確認されうる。本発明の利点は、特に添付の請求項で指摘された要素及び組み合わせによって実現及び達成される。先の概要及び以下の詳細な説明は共に、請求される本発明の単なる典型及び解説であり、本発明を制限するものではないことは、理解されている。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
この明細書に組み入れられ、かつ、その一部を構成する添付図面は、本発明のいくつかの実施形態を説明し、そして記載と一緒に本発明の原理を明らかにする役割をもつ。
【００１８】
【図１−１】それらのインシュリン分泌刺激性質について試験した３５の合成ポリペプチドについての配列、並びにＧＬＰ−１及びＥｘ−４についての配列を示す。暗い陰影は、ｅｘｅｎｄｉｎ−４に似た残基を示し、明るい陰影は、ＧＬＰ−１に似た残基を示す。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図１−３】図１−１の続きである。
【図２】ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、及び図１に規定した合成ポリペプチドの存在下、ＲＩＮ１０４８−３６細胞におけるインシュリン分泌の比較を示す。レベルを、基礎レベルのパーセンテージとして表す。
【図３】グルコース（５ｍＭ）の存在下、そして１０ｎＭのＧＬＰ−１（配列番号１）、ＧＬＰ−１  Ｇｌｙ８（ペプチド１；配列番号３）、ＧＬＰ−１  ６−アミノヘキサン酸８（ペプチド１１；配列番号８）、ＧＬＰ−１（６−アミノヘキサン酸９）４（ペプチド２５；配列番号２２）、ＧＬＰ−１（６−アミノヘキサン酸９）８（ペプチド２６；配列番号２３）又はカルボキシ末端から３、５、７、１２、２１、及び全てのＤ−アミノ酸を含むＧＬＰ−１の６つのアナログの存在又は不存在下のＲＩＮ１０４８−３８細胞におけるインシュリン分泌の比較を示す。データは、２〜３の実験の平均±ＳＥＭを表す。処理、対、基礎について＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５である。レベルは、インシュリンのｐｇ／タンパク質のμｇで表す。同様に、基礎分泌も示される。
【図４】細胞内ｃＡＭＰの産生におけるＧＬＰ−１アナログの効果を示す。ＣＨＯ／ＧＬＰ−１Ｒ細胞は、３７℃にて３０分間指示されたポリペプチド（１０ｎｍ）と一緒にインキュベートされ、その後にそれらは溶解され、そしてこのライセートがｃＡＭＰ含量の定量のために処理された。データは、ＧＬＰ−１（１０ｎｍ）の存在下で得られた最大値に標準化される。データポイントは、２〜３の実験の平均を表す。治療、対、基礎について＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５である。
【図５】ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１  Ｇｌｙ８（配列番号３）、及びＧＬＰ−１  ６−アミノヘキサン酸８（配列番号８）に関する用量反応曲線を示す。細胞内ｃＡＭＰレベルが、指示された濃度の  ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１  Ｇｌｙ８、ＧＬＰ−１  ６−アミノヘキサン酸８により３７℃で３０分間処理された後のＣＨＯ／ＧＬＰ−１Ｒ細胞において計測された。データは、ＧＬＰ−１（１０ｎＭ）の存在下、各々の実験で得られた最大値に対して標準化された。バーは、トリプリケートで実施された３つの実験の±ＳＥＭを表す。
【図６】ＣＨＯ／ＧＬＰ−１Ｒ細胞に結合している［１２５Ｉ］−ＧＬＰ−１の、ＧＬＰ−１アナログによる置き換えを示す。完全なＣＨＯ／ＧＬＰ−１Ｒ細胞に結合した［１２５Ｉ］−ＧＬＰ−１を、様々な濃度の前記ポリペプチドと競合させた。データは、１０ｎＭのそれぞれのポリペプチドの存在下で得られた最大値に対して標準化される。データポイントは、平均＋トリプリケートで実施された３つの実験の±ＳＥＭを表す。
【図７】等モル濃度のｅｘｅｎｄｉｎ−４及びＧＬＰ−１と比較した場合の、絶食中の糖尿ズッカーラットにおいて、インシュリン分泌を誘発する、０．４ｎｍｏｌ／ｋｇのポリペプチドＥｘ−４ＷＯＴ（配列番号７）及びＧＬＰ−１Ｇｌｙ８（配列番号３）の急性インシュリン分泌活性を示す。
【図８】等モルの濃度のｅｘｅｎｄｉｎ−４及びＧＬＰ−１と比較した場合の、最大２４時間の絶食させた糖尿病ズッカーラットにおける、０．４ｎｍｏｌ／ｋｇのポリペプチド１０（Ｅｘ−４ＷＯＴ（配列番号７））、ポリペプチド１（ＧＬＰ−１Ｇｌｙ８（配列番号３））、及びポリペプチド１１（ＧＬＰ−１  ６−アミノヘキサン酸８（配列番号８））のインシュリン分泌活性のタイムコースを示す。
【図９】ＧＬＰ−１Ｇｌｙ８（配列番号３）及びＧＬＰ−１  ６−アミノヘキサン酸酸８（配列番号８）の生物学的な効果を示す。図９Ａは、ウィスター及びズッカー肥満ラットへのＧＬＰ−１  ６−アミノヘキサン酸８（２４ｎｍｏｌ／ｋｇ）を、そしてズッカーラットだけへのＧＬＰ−１Ｇｌｙ８（２４ｎｍｏｌ／ｋｇ）の皮下注射後の、血糖値に対する効果を示し、そして図９Ｂは、上記の後のインシュリンレベルへの効果を示す。ズッカー及びウィスターラットの両者は、注射前の一晩絶食させた。結果は、平均±ＳＥＭ、１群あたりｎ＝６。
【図１０Ａ】ＣＨＯ／ＧＬＰ−１Ｒ細胞に結合した［１２５Ｉ］ＧＬＰ−１の、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１Ｇｌｙ８、及びＥｘ−４のアナログによる置き換えを示す。完全なＣＨＯ／ＧＬＰ−１Ｒ細胞に結合した［１２５Ｉ］ＧＬＰ−１を、様々な濃度の前記ペプチドと競合させた。図１０Ａ、Ｂ、及びＣの各々は、異なるペプチドに関するデータを示す。データは、１０ｎＭのそれぞれのペプチドの存在下で得られた最大値に対して標準化される。データポイントは、トリプリケートで実施した３つの実験の平均を表す。Ｂ０は、非放射性ペプチドの不存在下で最大の結合である。
【図１０Ｂ】ＣＨＯ／ＧＬＰ−１Ｒ細胞に結合した［１２５Ｉ］ＧＬＰ−１の、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１Ｇｌｙ８、及びＥｘ−４のアナログによる置き換えを示す。完全なＣＨＯ／ＧＬＰ−１Ｒ細胞に結合した［１２５Ｉ］ＧＬＰ−１を、様々な濃度の前記ペプチドと競合させた。図１０Ａ、Ｂ、及びＣの各々は、異なるペプチドに関するデータを示す。データは、１０ｎＭのそれぞれのペプチドの存在下で得られた最大値に対して標準化される。データポイントは、トリプリケートで実施した３つの実験の平均を表す。Ｂ０は、非放射性ペプチドの不存在下で最大の結合である。
【図１０Ｃ】ＣＨＯ／ＧＬＰ−１Ｒ細胞に結合した［１２５Ｉ］ＧＬＰ−１の、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１Ｇｌｙ８、及びＥｘ−４のアナログによる置き換えを示す。完全なＣＨＯ／ＧＬＰ−１Ｒ細胞に結合した［１２５Ｉ］ＧＬＰ−１を、様々な濃度の前記ペプチドと競合させた。図１０Ａ、Ｂ、及びＣの各々は、異なるペプチドに関するデータを示す。データは、１０ｎＭのそれぞれのペプチドの存在下で得られた最大値に対して標準化される。データポイントは、トリプリケートで実施した３つの実験の平均を表す。Ｂ０は、非放射性ペプチドの不存在下で最大の結合である。
【図１１】ＮＧＦ、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ｅｘｅｎｄｉｎ−４ＷＯＴ、及びＧＬＰ−１処理されたＰＣ１２細胞から抽出されたタンパク質の濃度測定による定量化を示す。細胞ライセート及び調整培地サンプルから得られたタンパク質バンドは、２２Ｃ１１モノクローナル抗体（エピトープ：βＡＰＰ  ａａ６６−８１、Ｒｏｃｈｅ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）を用いたウェスタンブロッティングによって分析され、そして免疫プローブされた。データは、細胞ライセートサンプル（Ａ及びＢ）由来のβＡＰＰ誘導体、及び処理３日目に採集されたの調整培地サンプル（Ｃ及びＤ）由来の可溶性ｓＡＰＰの、低血清培地のみで培養した未処理の対照サンプルと比較した、発現のパーセント変化として表される。垂直なエラーバーは、３つの別個の実験値の±標準誤差を表す。未処理からの有意差：＊ｐ＜０．０５、及び＊＊ｐ＜０．０１。
【図１２】ＰＣ１２細胞における神経突起増殖に対する異なる濃度のＮＧＦ及び／又はｅｘｅｎｄｉｎ−４処理の効果を示す。神経突起増殖は、未処理（低血清培地）のものと比較して、神経突起をもつ細胞数の増加パーセントで表される。垂直のエラーバーは、６つの別個の実験値の平均間の差異についての±標準誤差である。未処理からの有意差：＊ｐ＜０．０５、及び＊＊ｐ＜０．０１。
【図１３】ＮＧＦ介在細胞死に対するｅｘｅｎｄｉｎ−４処理の効果を示す。複合処理が、ｅｘｅｎｄｉｎ−４（１又は５ｎｇ／ｍｌ）の存在又不存在下、そして５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦの存在又は不存在下、合計７日間実施された。その後細胞を採集し、そしてさらに３日間完全培地中で回復させた。１０日目に、細胞の生存が、（ＭＴＴ法による）生菌の割合として示される。垂直なエラーバーは、４つの別個の実験値の±標準誤差を表す。
【図１４】ＮＧＦ、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ｅｘｅｎｄｉｎ−４ＷＯＴ、ＧＬＰ−１処理ＰＣ１２細胞から抽出されたシナプトフィジンタンパク質の濃度測定による定量化を示す。細胞ライセートサンプルから得られたタンパク質バンドは、神経分泌小胞を染色するシナプトフィジンモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングによって分析され、そして免疫プローブされた。シナプトフィジンは、分化のマーカーとして使われた。シナプトフィジンタンパク質の濃度は、未処理のものからの差異のパーセントとして示される。垂直なエラーバーは、別々の時間間隔で行われた３つの個々の実験値の±標準誤差である。未処理からの有意差：＊＊ｐ＜０．０１。
【図１５】ＮＧＦ、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ｅｘｅｎｄｉｎ−４ＷＯＴ、及びＧＬＰ−１処理後のＰＣ１２細胞の調整培地中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）レベルの倍増を示す。ＬＤＨレベルは、高いレベルほど細胞の完全性の損失に関係している細胞生存のマーカーである。垂直なエラーバーは、別々の時間間隔で行われた３つの別個の実験値の平均間の差異の±標準誤差を表す。未処理からの有意差：＊ｐ＜０．０５、及び＊＊ｐ＜０．０１。
【図１６】培養された海馬ニューロンにおける、非放射性ＧＬＰ−１による１２５Ｉ−ＧＬＰ−１結合の置き換え（Ａ）、ＧＬＰ−１刺激されたｃＡＭＰ放出（Ｂ）、及びグルタミン酸によって誘発されたアポトーシスに対する保護（Ｃ）を示す。完全な培養海馬ニューロンに結合した１２５Ｉ−ＧＬＰ−１を、様々な濃度のＧＬＰ−１と競合させた。データは、１μＭのＧＬＰ−１の存在下で得られた最大値に対して標準化される。各々のデータポイントは、２つの実験値の平均を表し、それは、非放射性ペプチドの不存在下の最大結合に対するパーセンテージとして示される。ｃＡＭＰレベルは、１０ｎＭのＧＬＰ−１との、３０分間のインキュベーションにわたってアッセイされた（Ｂ）。垂直なエラーバーは、３つの個々の実験値の平均の±標準誤差を表す。１０ｎＭのＧＬＰ−１又は０．３μＭのｅｘｅｎｄｉｎ−４による処理が、１０μＭのグルタミン酸のアポトーシス効果から完全に保護した（Ｃ）。培養物は、一晩処理されて、４％のパラホルムアルデヒドで固定され、そしてＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて染色された。アポトーシス核の数が数えられ、そしてこの値は、１つの処理条件につき６枚の別個の皿の合併平均として示される。垂直なエラーバーは、平均間の差異の±標準誤差である。対照からの有意差：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１７】大脳核におけるコリンアセチルトランスフェラーゼ及びグリア繊維性酸性タンパク質免疫反応性を示す。部分的なイボテン酸病変に対する、同側性の（ＡとＣ）、及び対側性の（ＢとＤ）ＣｈＡＴ−陽性免疫反応性。パネルＡとＢ、そしてＣとＤは、それぞれ、媒質注入、及びＧＬＰ−１注入を受けた個々の動物からの左、及び左の大脳核を描写する。媒質注入（Ａ）を受けた動物の同側大脳核のＣｈＡＴ−陽性免疫反応性は、ＧＬＰ−１注入を受けた動物の同側大脳核のそれより実質的に低かった（Ｃ）。損傷に応答して産生された神経膠星状細胞の反応に関するマーカーであるグリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）免疫反応性は、カニューレ挿入部位を囲んでいる、及び注入部位の周辺の側脳室を裏打ちする陽性免疫反応性の区域を説明した。興味深いことには、ＧＬＰ−１の注入が、病変（Ｅ）の結果として明らかであるもの又は媒質注入後のものより、注入側（Ｆ）の大脳核において高いグリア反応を引き起こした。
【図１８】媒質（人工ＣＳＦ：ａＣＳＦ）、ｅｘｅｎｄｉｎ−４又はＧＬＰ−１の脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）注入を受けた、シャム注射及びイボテン酸動物における、完全な対側の大脳核と関係がある同側の大脳核（病変側）のＣｈＡＴ−免疫反応性細胞体のＡｂｅｒｃｒｏｍｂｉｅ補正された数の差異のパーセンテージを示す。垂直なエラーバーは、平均間の差異の標準誤差を表す。イボテン酸媒質群からの有意差；＊ｐ＜０．０５、及び＊＊ｐ＜０．０１。
【図１９】ＧＬＰ−１及びアナログによるＰＣ１２細胞の処理が、細胞の機能不全なしにβＡＰＰ及びｓＡＰＰタンパク質レベルを顕著に減少させたことを示す。ＮＧＦ、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ｅｘｅｎｄｉｎ−４ＷＯＴ、及びＧＬＰ−１処理は、培地標準と比べて、調整培地サンプルからのＬＤＨレベルの測定によって測定される細胞の機能不全と関係しなかった（パネルＡ）。免疫プローブしたタンパク質の濃度測定による定量化は、低血清培地のみで培養された未処理対照サンプルに対する、細胞ライセートサンプルからのβＡＰＰ誘導体の（パネルＢ）、及び処理の３日目に採集した調整培地サンプルからの可溶性ｓＡＰＰ（パネルＣ）の発現の平均パーセント変化として提供される。Ｘ軸に沿って説明される条件は、パネルＡ、Ｂ及びＣに共通である。垂直なエラーバーは、３つの別個の実験値の標準誤差を表す。未処理からの有意差：＊ｐ＜０．０５、及び＊＊ｐ＜０．０１。
【図２０】ＧＬＰ−１処理が、対照マウスにおける内性Ａβ１−４０レベルを顕著に減らしたことを示す。対照マウスは、ＧＬＰ−１（３．３μｇと６．６μｇ）、ｅｘｅｎｄｉｎ−４（０．２μｇ）、ＮＧＦ（２μｇ）及び対照（媒質）をｉ．ｃ．ｖ．注入された。全脳ホモジェネートの生化学分析が、Ａβ１−４０についてのサンドイッチＥＬＩＳＡによって行われた。Ａβ値は、処理及び未処理動物からのｆｍｏｌ／ｇ±ＳＥＭで平均Ａβ濃度として表されている。対照からの有意差：＊＊ｐ＜０．０１。
【図２１】Ｅｘ−４及びＧＬＰ−１Ｇｌｙ８アナログのいくつかについての用量反応曲線を示す。細胞内ｃＡＭＰレベルが、指示された濃度のペプチドにより３７℃で３０分間処理した後のＲｉｎ１０４６−３８細胞において計測された。このデータは、各々のペプチドについて各々の実験で得られた最大値に対して標準化される。
【図２２Ａ】血糖値に対するペプチドの急性の生物学的な効果を示す。Ｅｘ（１−３６）（円）及びＥＸ（１−３５）（四角）による結果が、図２２Ａに示され、そして追加のペプチドによる結果が、図２２Ｂに示される。血糖値及びインシュリンレベルが、ズッカーラットへの１０ｎｍｏｌ／ｋｇの各々のペプチドのｓｃ注射後に測定された。結果は、平均±ＳＥＭである（図２２Ａについてｎ＝４／群、及び図２２Ｂについてｎ＝３）。
【図２２Ｂ】血糖値に対するペプチドの急性の生物学的な効果を示す。Ｅｘ（１−３６）（円）及びＥＸ（１−３５）（四角）による結果が、図２２Ａに示され、そして追加のペプチドによる結果が、図２２Ｂに示される。血糖値及びインシュリンレベルが、ズッカーラットへの１０ｎｍｏｌ／ｋｇの各々のペプチドのｓｃ注射後に測定された。結果は、平均±ＳＥＭである（図２２Ａについてｎ＝４／群、及び図２２Ｂについてｎ＝３）。
【図２３】対照（白い棒グラフ）及びＥｘ（１−３０）処理動物（黒い棒グラフ）における５１日間にわたる腹部脂肪量の減少を示す。値は、最初の総脂肪量（０日目）のパーセンテージとして表す。各々の群について、総脂肪減少、並びに内臓及び皮下組織画分から減少した脂肪が共に示される。このデータは、対照動物においてより、Ｅｘ（１−３０）処理された動物において、顕著に大量の総脂肪及び内臓脂肪の減少があった。どちらの群も、５１日目の時点で減少した総脂肪量を示した。対照群において、この減少は主に皮下画分からの脂肪の損失のためであり、それは処理された動物と同程度に思われた。＊Ｐ＜０．０５  Ｅｘ（１−３０）、対、対象。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
好ましい実施形態の説明
本発明は、以下の、本発明の好ましい実施形態の詳細な説明及びそこに含まれる実施例、並びに図面及びそれらの上記及び下記の説明を参照することによってより容易に理解される。
【００２０】
当該化合物、組成物、物品、デバイス、及び／又は方法が開示及び記載される前に、本願発明は、それらは当然変化するので、特定の合成方法、特定の投与計画、又は特別な精製手順に制限されないと理解されるべきである。本明細書中に使用された用語が、特定の実施形態のみを記載する目的のためのものであって、制限されることを意図しないと理解されもする。
【００２１】
明細書及び添付した請求項で使われる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、前後関係が別段の明確な指示をしない限り、複数の指示物を含む。
よって、例えば、「ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」への言及は、複数のポリペプチドの混合物を含み、「ａ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃａｒｒｉｅｒ」への言及は、２以上のそのような担体の混合物を含む、そのほかも同様。
【００２２】
範囲は、「約」一方の特有の値から、及び／又は「約」他方の特有の値まで、のように本明細書中で表される。そのような範囲が表現されるとき、他の実施形態は、一方の特有の値から、及び／又は他方の特有の値までを含む。同様に、値が前例の「約」の使用によって、近似値として表現されるとき、特有の値が他の実施形態を形成することが知られる。各々の範囲の終了点が、他の終了点との関係、及び他の終了点からの独立の両方において重要であることはさらに理解されるであろう。本明細書中に使用されるとき、「約」は、任意の値±１０％を表す。
【００２３】
本願明細書及び後に続く請求項において、言及は、以下の意味をもつと規定される多数の用語に対して成される：
「任意に」又は「場合により」は、その後に記載された事件又は情況が生じるかもしれず、そしてこの記載は、上記事件又は状況が生じる場合と生じない場合を含むことを意味する。
【００２４】
全体にわたり使用されるとき、「患者」は、個人を意味する。好ましくは、患者は哺乳動物、例えば霊長類、より好ましくは、ヒトである。よって、「患者」は、飼い慣らされた動物、例えば猫、犬等、家畜（例えば、牛、馬、豚、羊、ヤギ等）、及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット等）を含みうる。
【００２５】
用語「ポリペプチド」は、用語「ペプチド」と互換性をもって本明細書中で使われる。「ポリペプチド」も「ペプチド」もペプチド結合によって接続された一連の天然又は非天然アミノ酸を含んでいる。
【００２６】
「単離されたポリペプチド」又は「精製されたポリペプチド」は、上記ポリペプチドに通常天然又は培養において付随する物質を実質的に含まないポリペプチドを意味する。本発明のポリペプチドは、例えば利用可能であれば（例えば、哺乳類細胞）天然起源からの抽出によって、上記ポリペプチドをコードしている組み換え核酸の発現によって（例えば、細胞又は細胞を含まない翻訳系により）、又は上記ポリペプチドの化学合成によって得ることができる。さらに、ポリペプチドは、完全長のポリペプチドの切断によって得ることができる。ポリペプチドが大きな天然のポリペプチドの断片であるとき、単離されたポリペプチドは短く、そして断片の完全長の、天然のポリペプチドを除外する。
【００２７】
本発明は、ＧＬＰ−１及びｅｘｅｎｄｉｎ−４の新規ポリペプチド・アナログに関する。本明細書中に使用されるとき、「ＧＬＰ−１」は、完全なＧＬＰ−１配列の第７〜３６残基のアミド化型であるＧＬＰ−１  ７−３６アミド、及びＧＬＰ−１  ７−３７と同義的に使われる。ｅｘｅｎｄｉｎ−４の残基は、ＧＬＰ−１、第７〜３６残基とアラインされ、ＧＬＰ−１残基の番号付けに従って番号付けされる。そのような残基番号付けの慣習が、全体にわたり使われる。図１を参照のこと。
【００２８】
好ましい実施形態において、前記ポリペプチドはインシュリン分泌刺激性である。「インシュリン分泌刺激性」は、前記ポリペプチドが、グルコースのみに対する応答の基礎分泌レベルに比べて、グルコースに依存した様式でインシュリン合成、放出又は分泌を増やすことを意味する。好ましくは、インシュリン分泌のそのような増加は、基礎分泌よりも少なくとも１．１５、１．２５、１．５、２．０、２．５、３．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５又は２０．０倍多い。インシュリン分泌の増加は、本技術分野に知られる分析方法を使って、直接的に（例えば、インシュリンレベルの増加を示すことによって）、又は間接的に（例えば、グルコースレベルの減少、又はｃＡＭＰレベルの増加を示すことによって）、インビボで（例えば、血糖値をアッセイすることによって）、又はインビトロで（例えば、培地中のインシュリンレベルをアッセイすることによって）示される。
【００２９】
インシュリン分泌刺激効果は、例えばインシュリン陽性細胞数の増加を含むいくつかの機構のいずれか１つによるかもしれない。インシュリン分泌刺激性ポリペプチドは、例えば幹細胞の、インシュリン陽性細胞への分化を促進することによって、並びに非幹細胞のより分化されていない状態への脱分化を促進し、そしてインシュリン陽性細胞への分化を促進することによって、インシュリンの放出を促進する。２番目の実施形態として、インシュリン分泌刺激効果は、任意の期間において各々のインシュリン陽性細胞で合成された及び／又は放出されたインシュリンの量の増加によって引き起こされる。インシュリン陽性細胞の数が増やされて、そして同様に、各々細胞によって分泌されるインシュリンの量が増やされる場合、合わせたインシュリン分泌刺激効果が、生じることもある。
【００３０】
「基礎分泌」は、第２の放出剤の不存在下で、グルコース刺激に応答して放出されたインシュリンの量を意味する。
【００３１】
「インシュリン陽性細胞」は、例えば膵臓の島細胞、例えばベータ細胞、又は細胞株、例えばＲＩＮ１０４８−３６細胞を含むインシュリンを放出することが示されたあらゆる細胞、インシュリンを放出するように設計されたあらゆる細胞（例えば、インシュリンを含む遺伝学的に修飾された細胞）、又はインシュリンを含んでいるあらゆる細胞を意味する。
【００３２】
「ＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４のアナログ」は、アゴニスト特性を示す（すなわち、ＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４の１以上の生物活性を示す）修飾されたＧＬＰ−１及びｅｘｅｎｄｉｎアミノ酸配列を意味する。そのような修飾は、ＧＬＰ−１中に存在する１以上のアミノ酸残基、又はｅｘｅｎｄｉｎ−４中に存在する１以上のアミノ酸残基を含むキメラポリペプチドを含む。修飾は、ＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４、あるいはキメラポリペプチドの切詰め（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）をも含む。例えば、切詰められたキメラポリペプチドは、ＧＬＰ−１の３６位のＲと交換された３６位のＧをもつｅｘｅｎｄｉｎ−４  ７−３６である。本発明のポリペプチドは、ＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４と比べて機能上の活性のかなりの損失のない、ＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４の、１以上の追加のアミノ酸（すなわち、挿入又は付加）、アミノ酸の欠失、あるいはアミノ酸配列の置換を含む。例えば、欠失は、現在の規定された識別活性に不可欠ではないアミノ酸から成り、そして置換は、保存的であるか（すなわち、塩基性、親水性又は疎水性アミノ酸を同じもので置換する）、又は非保存的である。よって、所望の修飾及び変更は、ＧＬＰ−１及びｅｘｅｎｄｉｎ−４のアミノ酸配列で作製され、そしてタンパク質は、依然として観察される似た特徴をもつと理解されている。生物学的な有用性又は活性のかなりの喪失、及びそのような有用性又は活性の増加の可能性なしに、様々な変更が、ＧＬＰ−１アミノ酸配列又はｅｘｅｎｄｉｎ−４アミノ酸配列（又は基礎をなす核酸配列）で作製される。
【００３３】
本明細書中に使用されるとき、ＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４、あるいはそれと実質的に一致するアミノ酸配列をもつポリペプチドに関する用語「断片」又は「切詰め」は、ＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４、あるいはそれと実質的に一致しているアミノ酸配列をもつポリペプチドのいずれかの少なくとも５つの隣接したアミノ酸のポリペプチド配列を意味し、ここで、上記ポリペプチド配列はインシュリン分泌刺激機能をもつ。
【００３４】
他の修飾は、アミノ酸残基の少なくとも１つの天然Ｌ立体配位が、アミノ酸残基のＤ立体配位と置き換えられている、Ｄ−エナンチオマーを含む。
【００３５】
本発明は、スペーサ、例えばラテラルスペーサの使用を検討する。用語「ラテラルスペーサ」は、化学結合によってアミノ酸配列の中に組み込まれる化合物と規定され、それにより上記化合物は、その位置での又はその付近でのアミノ酸配列の切断（例えば、ＤＰＰ１Ｖによる）を減らすか又は除くために、２つ以上のアミノ酸残基の間の距離を延ばす。例えば、配列Ａ−Ｘ−Ｂ（式中、ＡとＢがアミノ酸残基であり、Ｘがラテラルスペーサである）において、酵素による配列の切断は、ラテラルスペーサの存在しない配列（Ａ−Ｂ）に比べて、減らされるか又は除かれる。好ましくは、１〜４の化合物が、ラテラルスペーサとしてのアミノ酸配列に組み込まれることができる。よって、１，２，３，又は４の化合物が、様々な実施形態において挿入される。
【００３６】
一般的に、ラテラルスペーサは、アミノ酸とペプチド結合を形成することができる、すなわち少なくとも１つのアミノ基と少なくとも１つのカルボキシル基（ＣＯ２−）を含むあらゆる化合物であり、ここで、上記カルボキシル基は、カルボン酸、又はそのエステル若しくはその塩であるかもしれない。一実施形態において、ラテラルスペーサは、式、Ｈ２Ｎ−Ｒ１−ＣＯ２Ｈ（Ｉ）｛式中、Ｒ１は、置換された若しくは置換されていない、分岐若しくは直鎖Ｃ１−Ｃ２０アルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基；置換された又は置換されていないＣ３−Ｃ８シクロアルキル基；置換された又は置換されていないＣ６−Ｃ２０アリール基；あるいは置換されたか又は置換されていないＣ４−Ｃ２０ヘテロアリール基である。｝によって表される。他の実施形態において、Ｒ１が、式（ＣＨ２）ｎ｛式中、ｎが１〜１０である。｝によって表されることができる。好ましい実施形態において、Ｒ１は、（ＣＨ２）３（３−アミノプロピオン酸）又は（ＣＨ２）５（６−アミノヘキサン酸）である。
【００３７】
本発明は、精製されたポリペプチドを提供する、ここで、上記ポリペプチドは、ＧＬＰ−１の第７と第８残基（例えば、ＧＬＰ−１の場合にＡｈａスペーサで指示された、例えば「ＧＬＰ−１Ａｈａ８」）、又は第８と第９残基（ＧＬＰ−１の場合にＡｈａスペーサで指示された、例えば「ＧＬＰ−１Ａｈａ９」）に相当するアミノ酸残基の間にスペーサにより、修飾されたＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４配列、あるいはそのアナログを含む。一実施形態において、ラテラルスペーサは、１以上のアミノプロピオン酸残基である。一実施形態において、スペーサは、６−アミノヘキサン酸スペーサ、及び４つ未満の６−アミノヘキサン酸残基を含む６−アミノヘキサン酸スペーサである。前記ポリペプチドは、例えば第７と第８残基の間に１以上の６−アミノヘキサン酸残基を有するＧＬＰ−１  ７−３６（すなわち、ＧＬＰ−１Ａｈａ８）を含むことができるか、又は第８と第９残基の間に１以上の６−アミノヘキサン酸残基を有するＧＬＰ−１  ７−３６を含むことができる。前記ポリペプチドは、第７と第８残基の間に２以上の６−アミノヘキサン酸残基を有するＧＬＰ−１  ７−３６（すなわち、ＧＬＰ−１Ａｈａ８）を含むことができるか、又は第８と第９残基の間に２以上の６−アミノヘキサン酸残基を有するＧＬＰ−１  ７−３６を含むことができる。前記ポリペプチドは、例えば第７と第８残基の間に３以上の６−アミノヘキサン酸残基を有するＧＬＰ−１  ７−３６（すなわち、ＧＬＰ−１Ａｈａ８）を含むことができるか、又は第８と第９残基の間に３以上の６−アミノヘキサン酸残基を有するＧＬＰ−１  ７−３６を含むことができる。より具体的には、一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号８、配列番号２２又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む。
【００３８】
他の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８又は配列番号４９のアミノ酸配列を含む。代わる実施形態において、ポリペプチドは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２５、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、ここで、上記アミノ酸配列が、ＧＬＰ−１の第７と第８残基、又は第８と第９残基に相当するアミノ酸残基の間にスペーサを含む。
【００３９】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、等モルの量のＧＬＰ−１の効果に匹敵するインシュリン分泌刺激効果をもち、より好ましい実施形態において、等モルの量のｅｘｅｎｄｉｎ−４の効果に匹敵するインシュリン分泌刺激効果をもつ。「効果に匹敵する」は、ＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４の効果の約１０〜１５％以内の効果を意味する。さらにより好ましい実施形態において、ポリペプチドは、ＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４のいずれかのインシュリン分泌刺激効果を超えるインシュリン分泌刺激効果をもつ。ＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４の「効果を超える」は、ＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４と比べてインシュリン分泌刺激効果の増加を、好ましくは、ＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４の効果の約１０％超である増加を意味する。よって、好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４と同程度に強力であり、より好ましい実施形態においては、ＧＬＰ−１のそれより強力であり、場合によりｅｘｅｎｄｉｎ−４のそれより強力である。
【００４０】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＧＬＰ−１より長時間作用する。より好ましい実施形態において、このポリペプチドは、ｅｘｅｎｄｉｎ−４と同程度に長時間作用する。よりさらに好ましい実施形態において、このポリペプチドは、ｅｘｅｎｄｉｎ−４より長時間作用する。「長時間作用する」は、ポリペプチドが少なくとも１つの分解酵素に対して、ＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４より抵抗性であることを意味する。例えば、本発明のポリペプチドの好ましい実施形態は、ＧＬＰ−１より酵素、ジペプチジルジペプチダーゼ（ＤＰＰ１Ｖ）による分解に抵抗性であり、場合によりｅｘｅｎｄｉｎ−４より抵抗性である。１以上の分解酵素に対するそのような抵抗性は、分解物の量（例えば、Ｎ末端分解物の量）、又は分解されなかったポリペプチドの量を検出することによって直接的に評価されることができる。あるいは、１以上の分解酵素に対する抵抗性は、本発明のポリペプチドの投与後の長期にわたるインシュリン分泌刺激効果の減少を評価することによって間接的に検出することができる。例えば、分解酵素が本発明のポリペプチドを切断する場合、血漿インシュリンレベルは、単回投与後に下るはずである。好ましい実施形態において、この低下は、ＧＬＰ−１に関するより緩慢であり、そしておそらくｅｘｅｎｄｉｎ−４より緩慢でさえある。
【００４１】
好ましい実施形態において、ポリペプチドは、ｅｘｅｎｄｉｎ−４と比べて抗原性を低減した。抗原性は、慣用法、例えば中和抗体及びポリペプチドクリアランスを評価するために設計された生物学的アッセイ法を使って評価されることができる。
【００４２】
好ましい実施形態において、ポリペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対するＧＬＰ−１の結合親和性より高い、ＧＬＰ−１受容体に対する結合親和性をもつ。より好ましい実施形態において、ポリペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対するｅｘｅｎｄｉｎ−４の結合親和性より高い、ＧＬＰ−１受容体に対する結合親和性を有する。
【００４３】
好ましい実施形態において、ポリペプチドは、ＧＬＰ−１よりも、基礎レベルを上回る細胞内ｃＡＭＰレベルを促進する。より更に好ましい実施形態において、ポリペプチドは、ｅｘｅｎｄｉｎ−４よりも、基礎レベルを上回る細胞内ｃＡＭＰレベルを促進する。
【００４４】
特に、本発明は、そのアミノ酸配列が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２５、配列番号３３を含む、精製されたポリペプチドを提供する。より具体的には、本発明は、そのアミノ酸配列が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２５、配列番号３３から本質的に成る、精製されたポリペプチドを提供する。さらにより特に、本発明は、そのアミノ酸配列が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２５、配列番号３３から成る、精製されたポリペプチドを提供する。
【００４５】
同様に、本発明は、そのアミノ酸配列が、配列番号３、４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０又は４１を含む、精製されたポリペプチドを提供する。より具体的には、本発明は、そのアミノ酸配列が、配列番号３、４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０又は４１から本質的に成る、精製されたポリペプチドを提供する。さらにより特に、本発明は、そのアミノ酸配列が、配列番号３、４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０又は４１から成る、精製されたポリペプチドを提供する。
【００４６】
本発明のポリペプチドは、溶液法及び固相法を含めた当業者に周知の多数の化学的なポリペプチド合成技術のいずれかを使用して調製できる。ポリペプチド配列のＣ末端アミノ酸が、不溶性の支持体に結合され、続いて配列中の残りのアミノ酸を順次的に付加する固相合成は、ポリペプチドを調製するための合成法の１つである。固相合成に関する技術は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ５５：２１４９−２１５６  （１９６３）によって説明されている。固相ペプチド合成を実施するための多くの自動化されたシステムが、市販されている。
【００４７】
固相合成は、好適な固形支持体へのそのカルボキシル基を介した保護アミノ酸のカップリングによって、ポリペプチドのカルボキシ末端（すなわち、Ｃ末端）から開始される。使用される固形支持体は、重要な特徴ではない、但しペプチド合成手順に利用される試薬に対してそれが実質的に不活性なままでありながらカルボキシル基に結合できなければならない。例えば、開始材料は、クロロメチル化樹脂若しくはヒドロキシメチル樹脂にベンジルエステル結合を介して、又はベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂若しくはｐ−メチルベンズヒロリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂にアミド結合を介してアミノ−保護されたアミノ酸を結合することによって調製されることができる。固形支持体として使用するのに好適な材料は、当業者に周知であり、そしてこれだけに制限されることなく、以下の：クロロメチル樹脂若しくはブロモメチル樹脂のようなハロメチル樹脂；ヒドロキシメチル樹脂；４−（ａ−［２，４−ジメトキシフェニル］−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシ樹脂のようなフェノール樹脂；ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル−ヒドラジド化樹脂；等を含む。そのような樹脂は、市販されており、それらの調製法は、当業者に知られている。
【００４８】
ペプチドの酸性型は、固形支持体としてベンジルエステル樹脂を使った固相ペプチド合成によって調製される。対応するアミドは、固形支持体としてベンズヒドリルアミン樹脂又はメチルベンズヒドリルアミン樹脂を使うことによって製造されうる。当業者は、ＢＨＡ又はＭＢＨＡ樹脂が使用されるとき、固形支持体体からペプチドを切断するための無水フッ化水素酸処理が、末端にアミド基をもつペプチドを産生することを認識している。
【００４９】
合成で使われた各々のアミノ酸のα−アミノ基は、反応性α−アミノ機能に影響を及ぼす副作用を防ぐためにカップリング反応の間保護されるべきである。特定のアミノ酸は、同様に、ペプチド合成の間、化学反応がそれらの部位で生じることを防ぐための適当な保護基により、保護されなければならない反応性側鎖官能基（例えば、スルフィドリル、アミノ、カルボキシル、ヒドロキシル等）をも含む。保護基は、当業者に周知である。例えば、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ３：  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ  （ｅｄｓ．），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８１））を参照のこと。
【００５０】
適当に選ばれたα−アミノ保護基は、カップリング反応の間、不活性なα−アミノ機能を与え、側鎖保護基を取り除かない条件下、カップリング後に容易に除去でき、ペプチド断片の構造を変えることなく、そしてカップリング直前の活性化によるラセミ化を防ぐ。同様に、側鎖保護基は、合成の間、不活性な側鎖官能基を提供するように選ばれる必要があり、α−アミノ保護基を取り除くための条件下で安定している必要があり、そしてペプチドの構造を変えることのない条件下のペプチド合成の完了後に、除去されることができる必要がある。
【００５１】
アミノ酸のカップリングは、当業者に知られた種々の技術によって達成されうる。典型的なアプローチは、ペプチド断片の遊離のＮ末端アミノ基との反応に対しより感受性があるカルボキシル基を提供する、誘導体へのアミノ酸の転換、又は好適なカップリング剤例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジミド（ＤＣＣ）、又はＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）の使用を伴う。しばしば、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）が、これらのカップリング反応の触媒として利用される。
【００５２】
一般的に、ペプチドの合成は、まず、保護基、例えばフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）を用いて、Ｎ−アミノの位置で保護されるＣ末端アミノ酸を固形支持体に連結することによって開始される。Ｆｍｏｃ−Ａｓｎの連結前に、Ｆｍｏｃ残基が、重合体から取り除かれなければならない。例えば、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎは、撹拌しながら、約２５℃で約２時間、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジミド（ＤＣＣ）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を使って、４−（ａ−［２，４−ｄジメトキシフェニル］−Ｆｍｏｃ−アミノ−メチル）フェノキシ樹脂に連結される。前記樹脂支持体へのＦｍｏｃ−保護アミノ酸の連結に続いて、室温にて、ＤＭＦ中２０％のピペリジンを使って、α−アミノ保護基が取り除かれる。
【００５３】
α−アミノ保護基の除去後に、残りのＦｍｏｃ−保護アミノ酸が、所望の順序で段階的に連結される。適切に保護されたアミノ酸は、多数の供給業者（例えば、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  （Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）又はＢａｃｈｅｍ  （Ｔｏｒｒａｎｃｅ，  ＣＡ））から市販されている。個々のアミノ酸の段階的な付加のための選択肢として、１以上のアミノ酸から成る適切に保護されたペプチド断片が、「成長している」ペプチドに連結されることもできる。先で説明されたとおり、適当な連結試薬の選択は、当業者に周知である。
【００５４】
各々の保護アミノ酸又はアミノ酸配列が、過剰に固相反応器内に導入されて、そして連結が、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）、又はその混合物から成る媒質中で実行される。連結が不完全である場合、Ｎ−アミノ基の脱保護及び次のアミノ酸の添加前に、連結反応が繰り返される。連結効率は、当業者に周知の多数の手段によって観察されうる。連結効率の観察の好ましい方法は、ニンヒドリン反応によってである。ペプチド合成反応は、多数の市販のペプチド合成機、例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ  ９５００（商標）合成機（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，  Ｓａｎ  Ｒａｐｈａｅｌ，  ＣＡ）を使って自動的に実施されうる。
【００５５】
０℃で約２０〜９０分間、好ましくは６０分間、アニソール及びジメチルスルフィドの存在下、無水の液体フッ化水素（ＨＦ）中、不溶性担体又は固形支持体を撹拌することによって；選択された保護基に依存して、約室温で６０〜３６０分間、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中、樹脂の１ｍｇ／１０ｍＬの懸濁液をを通して、連続的に臭化水素（ＨＢｒ）をバブリングすることによって；あるいは、又は固相合成のために使った反応カラム内の固形支持体を、９０％のトリフルオロ酢酸、５％の水、及び５％のトリエチルシランと一緒に約３０〜６０分間インキュベートすることによって、ペプチドが切断され、前記保護基が除去される。当業者に周知の他の脱保護法が使われもする。
【００５６】
前記ペプチドは、当業者に周知のペプチド精製によって、前記反応混合物から分離され、精製されることができる。例えば、ペプチドは、既知のクロマトグラフィー手順、例えば逆相ＨＰＬＣ、ゲル透過、イオン交換、サイズ排除、親和性、分配、又は向流分配を使って精製されうる。
【００５７】
本発明のポリペプチドは、他の手段、例えば組み換え技術を含む他の手順によっても調製できるかもしれない。適当なクローニング、及び配列決定技術、そして多くのクローニングの訓練を経験した熟練者に向けられるのに十分な指示が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  ｅｄ．）  Ｖｏｌ．  １−３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ，  （Ｓａｍｂｒｏｏｋ）中に見られる。
【００５８】
本発明は、糖尿病患者を治療する方法をさらに提供し、この方法は、インシュリン分泌刺激効果がある量の本発明のポリペプチドを、上記患者に投与することを含む。「糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ）」は、糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ）を意味する。本発明の方法は、２型糖尿病の患者の治療に役立つと考えられる。前記ポリペプチドが非インシュリン産生細胞のインシュリン産生を促進する場合、本発明の方法は、（例えば、１型糖尿病を含む）他の型の糖尿病に有用であるかもしれない。
【００５９】
本発明のポリペプチドは、神経系に使用される。一実施形態において、前記ポリペプチドは、神経栄養性（すなわち、増殖、分化又は神経突起伸長を促進する）、又は神経保護性（すなわち、ニューロン細胞を救う若しくはニューロン細胞死を減少させる）である。よって、本発明は、１以上のニューロンを、ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、又は神経保護性又は神経栄養性ＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４アナログを含むポリペプチドと接触させることを含むニューロンの死滅を減少させる方法にさらに関する。ニューロンの死滅は、例えば機械的な傷害（例えば、損傷若しくは手術）、中毒性傷害、神経変性疾患、アポトーシス、及び末梢神経障害により生じるかもしれない。当業者は、ニューロンを救うこと（すなわち、細胞死の徴候を示す細胞の生存を促進すること）、及びニューロンの死滅を減らすこと（すなわち、細胞死の徴候を示していない細胞の生存を促進すること）が望まれることを認識している。例えば、続く移植の前に、ニューロンの死滅を減らした化合物を用いた処理が、ニューロン細胞の外植片又は培養物の処理に有用である。同様に、そのような処理は、脳卒中、脳若しくは脊髄損傷、神経損傷、又は神経毒性損傷に続くニューロンを救い、そしてニューロンの死滅を減少させるために使用されうる。さらに、ニューロンを救うこと又はニューロンの死滅を減少させることは、神経変性症状、あるいは、例えばアルツハイマー症、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、及び末梢神経障害を含む病気の治療に有用である。
【００６０】
本発明は、ニューロンの分化又は増殖の促進方法であって、１以上のニューロン又はニューロン前駆細胞を、ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、又は分化を誘発するか若しくは増殖を誘発するＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４アナログを含むポリペプチドと、接触させることを含む方法にも関する。分化は、細胞がニューロンの特性を欠いている細胞状態（例えば、明瞭な核小体、ニューロンの突起、幅広い粗面小胞体、ニューロンマーカーの発現のような特性の欠如）から、ニューロンの表現型によって特徴づけられた細胞状態への移行を伴う。ニューロンの増殖は、幹細胞又はニューロン系統の細胞が分化し、及び／又はニューロンに区別されることを意味する。分化又は増殖の効果は、ニューロン数の増加である。「ニューロン数の増加」は、存在している全てのニューロン総数へのニューロンの追加を意味する。よって、ニューロン細胞死の速度は、分化又は増殖の速度を超えるかもしれないが、しかし新しいニューロンの追加が、全ニューロンを上回る増加であると考えられるので、生存しているニューロンの総数の増加がない状態であっても、そのような数の増加は、それでも治療的な利点をもつ。
【００６１】
本発明は、アミロイドβタンパク質の形成又は蓄積を減少させる方法にも関し、上記方法は、１以上のニューロンを、ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、又はβ−アミロイド前駆体タンパク質代謝に影響するＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４アナログを含むポリペプチドと、接触させることを含む。そのような方法は、アミロイドタンパク質のレベルを下げるか、又はアルツハイマー症の患者において老人斑で観察されるアミロイドタンパク質の沈着を防ぐために有用であるかもしれない。本発明の方法は、β−アミロイド前駆体タンパク質のプロセッシングの様々なポイントにおける作用によってアミロイドβタンパク質の形成又は蓄積を減少させうるであろう。例えば、前記ポリペプチドは、β−アミロイド前駆体タンパク質の合成を減少させるか、アミロイドβタンパク質領域内のβ−アミロイド前駆体タンパク質の切断を促進するか、アミロイドβタンパク質の分泌を減少させることにより、可溶性β−アミロイド前駆体タンパク質の分泌を増やすか、又はアミロイドβタンパク質の分解を増やすかもしれない。
【００６２】
本発明は、ニューロン突起の増殖を促進する方法にも関し、この方法は、１以上のニューロンを、ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、又は突起を促進するＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４アナログを含むポリペプチドと、接触させることを含む。「ニューロン突起の成長」は、体細胞からのニューロン突起の数、ニューロン突起の複雑さの増加（通常、軸索又は樹状突起の分岐点の数の増加による）、又は突起の長さの増加をも意味する。ニューロン突起の成長は、例えば、再生能力の最適化が望まれる、末梢神経損傷又は中枢神経系への傷害の後を含む多くの状況で望まれる。同様に、神経変性症状において、存在しているニューロンは、突起の豊富な領域におけるニューロナル死滅を埋め合わせることができるかもしれない。
【００６３】
本発明は、神経変性症状の患者を治療する、又は神経変性症状の１以上の徴候を減らす方法にも関し、上記方法は、ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、又は治療として有効なＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４アナログを含むポリペプチドを、治療として有効な量で患者に投与することを含む。より特に、前記治療は、アルツハイマー症、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脳卒中、多発性硬化症、脳の損傷、脊髄損傷、及び末梢神経障害から成る群から選ばれる神経変性症状に向けられる。
【００６４】
同様に、神経毒性損傷の患者を治療する方法又は患者の神経毒性損傷による１以上の徴候を減らす方法が提供され、この方法は、ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、又は治療として有効なＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４アナログを含むポリペプチドを、治療として有効な量で上記患者に投与すること含む。そのような投与は、神経毒に晒される前、その間、又はその後であるかもしれない。神経毒は、神経毒性型のアミロイドβ−ペプチド、カンプトセシン、グルタミン酸、エトポシド、制癌剤、ビンカアルカロイド、３−ｎｉｔｒｏｇｎｏｇｎｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、ＭＰＴＰ、ドウモイ酸、カイニン酸、及びイボテン酸を含む。
【００６５】
これらの神経系の方法における接触ステップは、所望した効果に依存してインビボ又はインビトロで実施される。例えば、培養状態のニューロンは、ニューロンの死滅をに引き起こすかもしれない培養中の操作より前に、又はその後に処理されることができる。また、神経系のｉｎ  ｓｉｔｕニューロンは、ニューロンの死滅を引き起こすトリガーに晒されるより前に又はその後で処理されうる。移植組織の典型において、例えば、移植されるドナーのニューロンは、培養物の状態で処理されるかもしれず、次に脳又は脊髄の移植部位が、移植者のニューロン及び移植されたニューロンのニューロンの死滅を防ぐために処理されうる。
【００６６】
神経系への使用に関係するポリペプチドは、ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、及び生物学的に活性なそのアナログ又はそのアゴニストを含むポリペプチドを含む。好ましくは、前記アナログは、ＧＬＰ−１／ｅｘｅｎｄｉｎ−４受容体に結合し、活性化する。前記ポリペプチドは、例えば配列番号１、２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５、３３、４２、４３、４４、４５、４６、４７又は４８のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。他の例は、配列番号：３、４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０又は４１のアミノ酸配列をもつポリペプチドを含む。
【００６７】
同様に、医薬として許容される担体と組み合わせて、ＧＬＰ−１、ｘｅｎｄｉｎ−４、及び生物学的に活性なそのアナログ又はそのアゴニストを含む本発明のポリペプチドを含む医薬組成物が本発明によって提供される。
【００６８】
当業者は、治療の有効性をどのように観察するか、およびそれに沿ってどのように治療を調節すべきか認識しているであろう。例えば、血糖値は、治療の最的な効果である正常血糖により観察されうるであろう。血糖値が好ましいレベルより高ければ、その後投与されるポリペプチドの量は減らされ、そして血糖値が好ましいレベルより低ければ、投与されるポリペプチドの量が増やされる。
【００６９】
好ましくは、本発明のインビボでの方法で使用されるポリペプチドの投与量は、継続的な投与については、約０．１ｐｍｏｌ／ｋｇ／分〜約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ／分、そしてボーラス注射については約０．０１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約４００ｎｍｏｌ／ｋｇにおよぶ。好ましくは、インビボでの方法におけるポリペプチドの投与量は、約０．０１ｎｍｏｌ／ｋｇ／分〜約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ／分におよぶ。必要とされる厳密な量は、患者の種、年齢、及び全身症状、治療される病気の重さ、使用される特定のポリペプチド、その投与様式等に依存してポリペプチドごとに、そして患者ごとに変わる。よって、厳密な「インシュリン分泌刺激量」又はニューロンの病気又は損傷を治療するために有用な量を指定することは不可能である。しかし、適当な量は、日常的な実験だけを使い、当業者によって決定される。
【００７０】
好都合なことに、前記ポリペプチドは、医薬として許容される担体に関連した１以上の化合物から成る医薬組成物中に処方される。前記組成物は、経口的に、静中に、筋中に、腹腔内に、局所的に（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ，  ｌｏｃａｌｌｙ）、経皮的に、全身的に、脳室内に、脳内に、硬膜下に、又はくも膜下に投与される。当業者は、投与の様式、薬理担体、又はインシュリン分泌刺激効果を最適化するための他の指標を修飾することを知っているであろう。もちろん、投与されている活性化合物の量は、治療される患者、患者の体重、投与の様式、及び処方する内科医の判断に依存する。
【００７１】
意図された投与の方式に依存して、医薬組成物は、固体、半固体、又は液体の剤形、例えば錠剤、坐剤、丸剤、カプセル、散剤、液剤、懸濁液剤、ローション剤、クリーム、ゲル等の形態で、好ましくは正確な投与量の単一投与に好適な単位剤形である。先に指摘されたとおり、前記組成物は、有効な量の選ばれた薬物を、医薬として許容される担体と組み合わせて含み、さらに、他の薬剤、医薬品、担体、補助剤、希釈剤等を含むかもしれない。例えば、典型的な担体、及びポリペプチドの製剤の準備に一緒に使用されうる医薬組成物を調製する従来法を開示する、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｂｙ  Ｅ．Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡを参照のこと、そしてここで上記文献を本明細書中に援用する。
【００７２】
固体組成物について、従来の無毒性固体担体は、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウム等を含む。例えば、液体の医薬として投与可能な組成物は、本明細書中に記載の活性化合物、並びにそれによって溶液又は懸濁を形成するための、賦形剤の中の任意の医薬補助剤、例えば水、水性デキストロース生理食塩水、グリセロール、エタノール等を溶かす、分散させる等によって調製されることができる。所望であれば、投与される医薬組成物は、小量の無毒性補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝化剤等、例えば酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレエーと等を含むかもしれない。そのような剤形を調製する実際の方法は、当業者に知られているか、又は明らかである；例えば先に参照したＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照のこと。
【００７３】
経口投与のために、細末又は顆粒剤が希釈剤、懸濁化剤、及び／又は界面活性剤を含み、そして水中若しくはシロップ剤中に、乾燥状態でカプセル若しくはサシェ（ｓａｃｈｅｔ）中に、又は非水性溶液若しくは懸濁化剤が含まれる懸濁液で、結合剤及び潤滑剤が含まれる錠剤で、あるいは水中若しくはシロップ中の懸濁液で提供される。所望の又は必要であれば、調味料、保存料、懸濁化剤、増粘剤、又は乳化剤が含まれる。錠剤及び顆粒剤は、好ましい経口投与形態であり、これらはコートされる。
【００７４】
使用される場合、非経口投与は、一般に注射を特徴とする。注射剤は、液体溶液若しくは懸濁液、注射の前に液体による溶液若しくは懸濁液として好適な固体形態、又は乳液として、従来の形態で調製されうる。非経口投与に関する、ごく最近修正されたアプローチは、一定レベルの投与量が維持されるように、徐放システム（ｓｌｏｗ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｒ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ）の使用を伴う。例えば、米国特許番号第３，７１０，７９５号を参照のこと、そしてここで上記文献を本明細書中に援用する。
【００７５】
局所投与のために、活性化合物が皮膚の表面にデリバリーされうる限り、液剤、懸濁液剤、ローション剤、クリーム、ゲル等が使用されうる。
【実施例１】
【００７６】
実験
以下の実施例は、本明細書中で主張される化合物、組成物、物品、デバイス、及び／又は方法がどのように作製され、そして評価されるのかについての完璧な開示及び説明を当業者に提供するためになされ、そして本発明の純粋な例示として意図され、当該発明者が彼ら発明とみなすものの範囲を制限することはない。数（例えば、数量、温度等）に関して正確度を確保するために努力がなされたが、しかしいくつかの誤り及び偏りが明らかにされるであろう。別段の指示のない限り、部分は、重量による部分であり、温度は、℃又は気温であり、圧力は、大気又はその付近である。
【００７７】
実施例１．ペプチドの設計及び合成
ｅｘｅｎｄｉｎ−４及びＧＬＰ−１の基本的な特徴を取り入れた一連のキメラペプチドを、設計した。３５のペプチドの配列を、ＧＬＰ−１（第７〜第３６残基）、及びｅｘｅｎｄｉｎ−４（番号付けされたＧＬＰ−１残基を用いたｅｘｅｎｄｉｎ−４のアラインメントに従って番号を付けた第７〜第４５残基）の配列とともに図１に示す。それらは、（ｉ）第８と第９アミノ酸の間のＤＤＰ１Ｖの切断作用を最小限にし、（ｉｉ）インシュリン分泌刺激作用のための最小限の要件を評価し、そして（ｉｉｉ）ｅｘｅｎｄｉｎ−４とＧＬＰ−１の間のアミノ酸の差異がＧＬＰ−１に対する効果における前者の１３倍増の原因となることを評価するように設計した。図１に示されたペプチドは、それらの合成にＬ−及びＤ−アミノ酸を利用した。
【００７８】
ペプチドは、脱保護のためにピペリジン−ジメチルホルムアミドを、そしてカップリングのためにＨＯＢｔ／ＨＢＴＵを使用した、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ，  ＣＡ）の自動ペプチド合成機によって、アミノ酸のＦｍｏｃ−誘導体を使いペグ−ポリスチレン樹脂上で合成した。完成したペプチドを、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使って樹脂から切断して、エーテルを用いて沈澱させて、アセトニトリル勾配を使った０．１％のＴＦＡ中、Ｃ−１８疎水性樹脂を用いた逆相ＨＰＬＣを使った精製に共した。最終物質の純度は、逆相ＨＰＬＣを使って確認し、このペプチドの質量は、質量分析を使って確認した。全てのペプチドが、９５％超の純度であった。
他のペプチドを、２−アミノヘキサン酸（６−アミノヘキサン酸）を使ってＤＰＰ１Ｖによる切断を減らすように設計した。表２を参照のこと。
【表１】
0005695097.tif 000002
【実施例２】
【００７９】
実施例２．インビトロでのインシュリン分泌
Ｄｒ．  Ｓａｍｕｅｌ  Ａ．  Ｃｌａｒｋ（Ｂｉｏ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｓｈｒｅｗｓｂｕｒｙ，  ＭＡ）から贈与物であるＲＩＮ１０４８−３６細胞を、インシュリン分泌に対するＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、及びアナログの作用を観察するために使用した。細胞を、１２ウェル皿の底に置いたガラスカバースリップ上に、２．５×１０５細胞／ｃｍ２の密度で播種し、４８時間培養した。その後、それらを、３７℃の加湿インキュベータ内で、それぞれグルコース不含緩衝液（ｍＭの：１４０  ＮａＣｌ、５  ＫＣｌ、１  ＮａＰＯ４、１  ＭｇＳＯ４、２  ＣａＣｌ、２０  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．１％のウシ血清アルブミンを含む）を用いて３０分で２期間プレインキュベートした。その後、細胞を、５ｍＭのグルコース及びペプチド（１×１０−８Ｍ）を伴う同じ緩衝液１ｍＬの存在下、３７℃で１時間インキュベートした。ＧＬＰ−１とｅｘｅｎｄｉｎ−４（１×１０−８Ｍ）を、全てのアッセイの標準として使用した。１時間後、培地を取り除き、そしてＥＩＡ（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ，  Ｄｈｉｃａｇｏ  ＩＩ）によるインシュリンレベルの定量化の前に−８０℃で保存し、そして標準としてウシγ−グロブリンを用いたブラッドフォード法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，  ＣＡ）を使った総タンパク質の測定のために、ＨＣｌ（３００μｌ、０．１Ｍ、２０分、ＲＴ）を用いて細胞を溶解した。
【００８０】
図２に示されるように、アミノ酸修飾のいくつかが、ＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４による誘発に匹敵するか又は超える様式でインシュリン分泌を誘発した。いくつかの修飾が、第８と第９アミノ酸残基の間の切断部位についての、ＤＤＰ１Ｖによる認識力を減らすために使用された。しかし、第８と第９アミノ酸残基付近のＬ−アミノ酸の、Ｄ型による置換は、このペプチドがインシュリン分泌を誘発することができないので、第２、第３及び第５〜第７ペプチドによって示されたとおり効果がないことを証明した。ペプチド４（図１に示されない）、Ｄアミノ酸である第７〜第１４残基をもつＧＬＰ−１配列は、同様にインシュリン分泌を誘発することができなかった。アミノ酸スペーサを第８と第９残基の前又はその間に組み込んだとき、ペプチド１１（配列番号８）（第８残基の前に４つのアミノ酸スペーサを持つ）は、強力にインシュリン分泌を誘発したのに対して、ペプチド２５（配列番号２２）（  第８と第９残基の間に４つのアミノ酸スペーサをもつ）、及びペプチド２６（配列番号２３）（第８と第９残基の間に８つのアミノ酸スペーサをもつ）は、インシュリン分泌を誘発しなかった。ＧＬＰ−１の第８アミノ酸（アラニン：Ａ）の、小さい中性アミノ酸であるｅｘｅｎｄｉｎ−４の対応する位置のペプチド（すなわちグリシン：Ｇ）  による置換は、ｅｘｅｎｄｉｎ−４よりわずかにインシュリン分泌を誘発した。ＧＬＰ−１Ｇｌｙ８（配列番号３）を参照のこと。
【００８１】
ＧＬＰ−１アミノ酸残基の、ｅｘｅｎｄｉｎ−４残基によるさらなる置換は、インシュリン分泌を誘発する能力を保ったペプチドをもたらした。例えば、ペプチド８（配列番号５）（８位でのＡ→Ｇの置換と、１６位でのＶ→Ｌの置換をもつ）、ペプチド９（配列番号６）（  ８、１６、１８、１９及び２０位での、それぞれＡ→Ｇ、Ｖ→Ｌ、Ｓ→Ｋ、Ｙ→Ｑ及びＬ→Ｍの置換をもつ）、ペプチド１０（Ｅｘ−ＷＯＴ；配列番号７）（ペプチド９と同じ置換をもち、さらに２２、２３、２５、２６、２７、３０、３３、３４、３６位での、それぞれＧ→Ｅ、Ｑ→Ｅ、Ａ→Ｖ、Ｋ→Ｒ、Ｅ→Ｌ、Ａ→Ｅ、Ｖ→Ｋ、Ｋ→Ｎ及びＲ→Ｇの置換をもつ）は、全てインシュリン分泌を誘発する能力を保った。実際、ペプチド８（配列番号５）は、ＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４のいずれかよりも、インシュリン分泌に対して実質的に大きな効果をもった。
【００８２】
ペプチド１２（配列番号９）のような、ｅｘｅｎｄｉｎ−４に存在する末端の第８〜第９アミノ酸の、ＧＬＰ−１への付加が、ＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４よりインシュリン分泌に対して実質的に大きな効果をもつペプチドをもたらした。ｅｘｅｎｄｉｎ−４の第８残基（すなわち、グリシン：Ｇ）を、ＧＬＰ−１の第８残基（すなわち、アラニン：Ａ）で置換し、そしてペプチド１３（配列番号１０）のようにｅｘｅｎｄｉｎ−４の末端の第９アミノ酸が維持されるか、又はペプチド１４（配列番号１１）のように除去された場合、どちらのペプチドもインシュリン分泌を誘発する能力を維持した；しかし、ペプチド１３は、修飾なしのｅｘｅｎｄｉｎ−４より実質的に強い効果をもった。
【００８３】
インシュリン分泌を誘発するそれらの能力について、ｅｘｅｎｄｉｎ−４の切詰めも試験した。ペプチド１５〜２４（配列番号１２〜２１）を参照のこと。３２残基以上を含むペプチド（すなわち、ペプチド１５〜１８（配列番号１２〜１５））だけが、インシュリン分泌を誘発した。インシュリン分泌を誘発したそれらの切詰めペプチドについて、ペプチド１５（配列番号１２）（第４３残基以下の残基を含む）、及びペプチド１８（配列番号１５）（第３４残基以下の残基を含む）が、ｅｘｅｎｄｉｎ−４又はＧＬＰ−１のそれを超えた誘発効果をもつ唯一のものである。
【００８４】
ペプチドの荷電に影響するように考えられた修飾が、行われもした。ＧＬＰ−１は、７位、２６位、３４位及び３６位の塩基性アミノ酸に関連する合計４＋の電荷、及び９位、１５位、２１位及び２７位の酸性アミノ酸に関連する合計４−の電荷をもつ、正味中性荷電をもつ。Ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、２１〜２３位の塩基性ドメインに関連する正味負の電荷をもつ。Ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、合計４＋の電荷（７位、１８位、２６位、３３位）、及び合計６−の電荷（９位、１５位、２１位、２２位、２３位、３０位）をもつ一方で、その９つのアミノ酸の末端は中性である。ペプチド３４（配列番号３１）のような、ｅｘｅｎｄｉｎ−４（すなわち、３６位での、小さい中性のグリシン、Ｇの、より大きなアルギニン、Ｒによる置換）の末端に（正電荷を提供する）単一の塩基性アミノ酸の付加は、インビトロのインシュリン分泌におけるペプチドの不活性をもたらす。アルギニン、Ｒは、ＧＬＰ−１の３６位でよく許容され、そして維持されるか又はＧＬＰ−１において中性のグリシン、Ｇであるｅｘｅｎｄｉｎ−４末端によって置換されるとき（ペプチド１２（配列番号９）、それは、活性を維持し、それどころかｅｘｅｎｄｉｎ−４のそれを超える活性をもつ。
【００８５】
興味深いことには、２７位が負電荷をもつ場合に、３０位が酸性のグルタミン酸、Ｅから中性のアラニン、Ａに修飾されるとき（ペプチド３６（配列番号３３））、アルギニン、Ｒは、ｅｘｅｎｄｉｎ−４の３６位でよく許容される。同様に、第３０ペプチド（配列番号２７）と比べて、１８位（ペプチド１（配列番号３））に正電荷を導入するための、中性のセリン、Ｓの、塩基性のリジン、Ｋによる置換は、活性の喪失をもたらす；しかし、隣接する（１９、２０位の）中性のアミノ酸、チロシン、Ｙ及びロイシン、Ｌの、中性のアミノ酸、グルタミン、Ｑ及びメチオニン、Ｍによる置換が、活性を回復させる（ペプチド９（配列番号６）をペプチド３０（配列番号２７）と比べて）。
【００８６】
ＧＬＰ−１と６−アミノヘキサン酸含有ペプチドのインシュリン分泌効果を比較した場合、ＧＬＰ−１Ａｈａ８（ペプチド１１；配列番号８）は、ＧＬＰ−１と同程度の有効性を示した。ＧＬＰ−１Ａｈａ８（ペプチド１１；配列番号８）は、基礎レベルの約１．２倍を上回るインシュリン分泌を誘発した。図３を参照のこと。しかし、ペプチド２５及び２６（配列番号２２〜２３）にあるとおり、追加の６−アミノヘキサン酸残基の挿入は、インシュリン分泌を誘発するペプチドの能力を阻害した。
【実施例３】
【００８７】
実施例３．細胞内ｃＡＭＰの定量
ヒトＧＬＰ−１受容体を安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ＧＬＰ−１Ｒ細胞を、１２ウェルプレート上に６０〜７０％集密まで育て、クレブズ−リンガーリン酸塩緩衝物質（ＫＲＰ）で３回洗浄し、そして加湿気インキュベータ内、３７℃で２時間、０．１％のウシ血清アルブミン含有ＫＲＰ（ＢＳＡ）１ｍｌと一緒にインキュベートした。次に細胞を、研究中のペプチドの存在又は不存在下、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）（１ｍＭ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を伴う、０．１％のＢＳＡを補った１ｍｌのＫＲＰ中でインキュベートした。氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で無傷の細胞を３回洗浄することによって３０分後に反応を止めた。氷冷過塩素酸（０．６Ｍ、１ｍｌ、５分）中で細胞をインキュベートすることによって細胞内のｃＡＭＰを抽出した。炭酸カリウム（５Ｍ、８４μｌ）を使ってサンプルのｐＨを７に調整した後、試料管をボルテックスし、形成された沈殿を、遠心分離（５分、２０００×ｇ、４℃）で沈殿させた。上清を、真空で乾燥させ、４ｍＭのＥＤＴＡ含有０．０５ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）（３００μｌ）中に可溶化した。炭酸ナトリウム（０．１５μＭ）と硫酸亜鉛（０．１５μＭ）を加えたサンプルを、次に氷上で１５分間インキュベートした。得られた塩沈殿物を、遠心分離（５分、２０００×ｇ、４℃）によって除去した。サンプルを、［３Ｈ］ｃＡＭＰ競合的タンパク質結合アッセイキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ）を使って、二重のアリコート（５０μｌ）でアッセイした。
【００８８】
ｃＡＭＰレベルを、ＧＬＰ−１、６−アミノヘキサン酸含有ペプチド、又はＤ−アミノ酸含有ペプチドにより処理された細胞で計測した。ＧＬＰ−１アナログによって産生された細胞内ｃＡＭＰレベルは、当初１０ｎＭ（最大のｃＡＭＰ産生の濃度は、ＧＬＰ−１で見られる）のペプチド濃度で評価した。データを図４に示す。前記ペプチドを、ＴＢＭＸの存在下、ＣＨＯ／ＧＬＰ−１Ｒ細胞と一緒に３７℃で３０分間インキュベートした。インビトロでのインシュリンアッセイからの結果と一致して、ＧＬＰ−１分子全体にわたるＤ−アミノ酸置換は、基礎レベルを上回るわずかな増加だけに終わった、すなわち、それらは、ＩＢＭＸによってのみ得られた。同様に、インシュリン分泌刺激性化合物ＧＬＰ−１Ｇｌｙ８（配列番号３）及びＧＬＰ−１Ａｈａ８（配列番号８）と比べたとき、ＧＬＰ−１（Ａｈａ９）４（配列番号２２）及びＧＬＰ−１（Ａｈａ９）８（配列番号２３）は不活性であった。ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１Ｇｌｙ８、又はＧＬＰ−１Ａｈａ８の濃度の変化に対するｃＡＭＰ誘導における応答を計測した。図５を参照のこと。表３は、３つの化合物全てのＥＤ５０値を示す。ＧＬＰ−１Ａｈａ８（０．５ｎＭ）は、基礎を４倍上回るまで細胞内ｃＡＭＰ産生を刺激したが、しかしそれは、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−１Ｇｌｙ８と比べたとき、より高いＥＤ５０を示した。
【００８９】
【表２】
0005695097.tif 000003
【実施例４】
【００９０】
実施例４．完全な細胞のＧＬＰ−１受容体へのペプチドの競合的結合
結合研究を、Ｍｏｎｔｒｏｓｅ−Ｒａｆｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７ｂ）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：２１２０１−２０６のやり方で実施した。要するに、ＣＨＯ／ＧＬＰ−１Ｒ細胞を、１２ウェルプレート上で集密まで育て、実験の２時間前に無血清Ｈａｍ  Ｆ−１２培地で洗浄した。０．５ｍｌの結合緩衝液（１０）により２回洗浄した後、細胞を、２％ＢＳＡ、１７ｍｇ／ＬのＤｉｐｒｏｔｉｎ  Ａ（Ｂａｃｈｅｍ，  Ｔｏｒｅｎｃｅ，  ＣＡ）、１０ｍＭのグルコース、１〜１０００ｎＭのＧＬＰ−１又は他のペプチド、及び３０，０００  ｃｐｍのＳＩ−ＧＬＰ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ）を含む０．５ｍｌの緩衝液と一緒に、４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション終了後に、上清を捨て、細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、そして０．５ｍｌの０．５  ＮのＮａＯＨ及び０．１％のドデシル硫酸ナトリウムと一緒に室温で１０分間インキュベートした。細胞ライセートの放射活性を、ＩＣＮ  Ａｐｅｃ−Ｓｅｒｉｅｓ  ｇ−ｃｏｕｎｔｅｒで計測した。総結合から、大過剰の非標識ＧＬＰ−１（１μＭ）の存在下でインキュベートした細胞に関する放射活性を差し引いて、特定の結合を決定した。
【００９１】
次に、ヒトＧＬＰ−１受容体に対する競合的結合によって［１２５Ｉ］ＧＬＰ−１を置き換えるこれらのＧＬＰ−１アナログの能力を検査した。濃度を変えたペプチドの不存在及び存在下、ＣＨＯ／ＧＬＰ−１Ｒ細胞を［１２５Ｉ］標識ＧＬＰ−１と一緒にインキュベートした。図６を参照のこと。
【００９２】
ＧＬＰ−１受容体に競合的に結合したそれらの化合物について得られたＩＣ５０値を、表３に示す。６−アミノヘキサン酸部分の挿入は、受容体への結合の減少をもたらした。９位のスペーサ、６−アミノヘキサン酸基の長さの増加により、ＧＬＰ−１受容体に対する親和性の劇的な減少があった。Ｄ−アミノ酸置換された化合物で見られた生物活性の欠損は、それらのＧＬＰ−１受容体に対する結合能力の著しい減少によって説明されうる。化合物ＧＬＰ−１Ｄ２１（ペプチド６）及びＧＬＰ−１Ａ１１Ｄ（ペプチド７）は、標識されたＧＬＰ−１を置き換えなかったように、Ｄ−アミノ酸置換の増加するほど受容体認識の累進的な減少があった。
【実施例５】
【００９３】
実施例５．インビボにおける急性活性
急性最大インシュリン応答を、静中ペプチド投与後のズッカーラットにおける血漿インシュリンレベルの定量によって測定した。特に、一晩の絶食後の体重約４００ｇの糖尿病雄ラットを、５０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールにより麻酔し、そして採血のためにカテーテルをそれらの右大腿動脈に結んだ。その後、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ＧＬＰ−１、又はペプチド（０．４ｎｍｏｌ／ｋｇ）のボーラスを、それらの左伏在静脈中に３０秒で投与した（１つのペプチドにつきＮ＝６）。ペプチド投与前、及びその後５、１５、３０、６０及び９０分で採集した血液を、インシュリン定量のために、ＥＤＴＡ及びアプロチニンを含むヘパリン処理管内に注いだ。血漿を、分離し、取り除き、そして直ちに−７０℃に冷凍した。次にラットインシュリンＥＬＩＳＡキット（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．，  Ｃｈｉｃａｇｏ，  ＩＬ）を使ってインシュリンレベルを定量した。
【００９４】
先のインビトロにおける研究からの２例の効能をもつペプチド、ペプチド番号１０（Ｅｘ−４ＷＯＴ；配列番号７）、及びペプチド１（ＧＬＰ−１Ｇｌｙ８；配列番号３）の急性インビボ活性を、インシュリン分泌を誘発について、絶食、糖尿病ズッカーラットにおいて評価した。ペプチド（０．４ｎｍｏｌ／ｋｇ）の等モル投与の後の、ピークの血漿インシュリン濃度を、図７に示し、等モルのｅｘｅｎｄｉｎ−４及びＧＬＰ−１の後に達成されたものと比較する。Ｅｘ−４ＷＯＴもＧｌｙ−８も、強力に血漿インシュリン濃度を増加させた。
【００９５】
図７で説明されるように、それらのｉ．ｖ．投与の後に、ペプチド１（ＧＬＰ−１Ｇｌｙ８；配列番号３）及びペプチド１０（Ｅｘ−４ＷＯＴ；配列番号７）によって例証されるように、ＲＩＮ１０４８−３６細胞においてインシュリン分泌を誘発するペプチドのインビトロにおける作用は、絶食、糖尿病ズッカーラットにおける血漿インシュリン濃度を急激性に高めるインビボにおける活性と相関関係がある。特に注目すべきことは、ｅｘｅｎｄｉｎ−４の末端第９アミノ酸を欠いているＥｘ−４が等モルのｅｘｅｎｄｉｎ−４がしたよりさらに強力であることが証明されたことである。同様に、ペプチド１（ＧＬＰ−１Ｇｌｙ８）が、等モルのＧＬＰ−１より効さらに強力であることを証明した。
【実施例６】
【００９６】
実施例６．インビボにおける活性の継続時間
インシュリン分泌刺激作用の時間依存的な継続時間を、腹膜内（ｉ．ｐ．）ペプチド投与後のズッカーラットにおける血漿インシュリン及びグルコースレベルの定量によって評価した。具体的には、一晩に絶食した、体重約４００ｇの糖尿病雄ラットを、５０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールで麻酔し、そして採血のためにカテーテルを右大腿動脈に結んだ。その後、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ＧＬＰ−１、又はペプチド（０．４ｎｍｏｌ／ｋｇ）のボーラスをｉ．ｐ．投与した。（１ペプチドにつきＮ≧２）。ペプチド投与前、及びその後３０及び６０分、そして２、４、６及び２４時間に採集した血液を、インシュリン定量のために、ＥＤＴＡ及びアプロチニンを含むヘパリン処理管内に注ぎ、そして分離したサンプルで、グルコースを計測することにした。血漿を分離し、取り除き、そして直ちに−７０℃に冷凍した。次にラットインシュリンＥＬＩＳＡキット（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．，  Ｃｈｉｃａｇｏ，  ＩＬ）を使ってインシュリンレベルを定量し、血漿グルコースをグルコース酸化酵素法によって定量した。
【００９７】
図８で示されるように、特定のアミノ酸修飾は、インビボにおいてインシュリンに対して長期間の作用を提供する。この件に関して、血漿インシュリンレベルに対して、ポリペプチド１０（Ｅｘ−４ＷＯＴ；配列番号７）は、ｅｘｅｎｄｉｎ−４のように、長く作用することが分かった。さらに、急性研究と同様に、糖尿病ラットにおいて、ポリペプチド１０が、等モルのｅｘｅｎｄｉｎ−４よりさらに強力であることを証明した。対照的に、ポリペプチド１（ＧＬＰ−１Ｇｌｙ８；配列番号３）及びポリペプチド１１（ＧＬＰ−１Ａｈａ８；配列番号８）が、ＧＬＰ−１とｅｘｅｎｄｉｎ−４の中間であった；前者より長いが、後者より短い、時間依存的なインシュリン応答に対する作用をもつことが分かった。さらに、急性研究と同様に、糖尿病ラットにおいて、ポリペプチド１及び１１が、等モルのＧＬＰ−１よりさらに強力であることを証明した。
【実施例７】
【００９８】
実施例７．ＭＡＬＤＩ質量スペクトル法
ＧＬＰ−１（２μＭ）とＧＬＰ−１Ａｈａ８（配列番号８）（２μＭ）を、ＰＢＳ中、５ｍＵの組み換えＤＰＰ１Ｖ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）と一緒に、３７℃でそれぞれ１０分間と２時間インキュベートした。両化合物（１００μＭ、１００μｌ）を、同等の量のヒト血清中、３７℃で２時間インキュベートした。全てのケースについて、酸素反応を、トリフルオロ酢酸（０．１％ｖ／ｖの終濃度）の添加によって止めた。マトリックス支援レーザー脱離イオン化法−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を使って、サンプルを直ちに分析した。ＭｉｃｒｏｍａｓｓＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）リフレクトロン機器を、１スペクトルにつき５レーザーショットを用いて、１０００〜６０００  Ｄａの質量範囲にわたり１５〜２５％のレーザーエネルギーで使用した。α−シアノ−４−ヒドロキシシンナミック酸（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を、マトリックスとして使用し、８ｍｇ／ｍｌの炭酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）バッファー中、１０ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した。ＭＡＬＤＩプレートに移す前に、１μｌのサンプルを、マトリックスで５０／５０  ｖ／ｖに希釈した。
【００９９】
ＧＬＰ−１Ａｈａ８（配列番号８）の安定性を、ＤＰＰ１Ｖ及びヒト血清の存在下でＧＬＰ−１と比較した。３７℃で、１０分間のＤＰＰ１Ｖ（５ｍＵ）による、又は２時間の１００％血清によるＧＬＰ−１（２μＭ）の処理は、ＭＡＬＤＩによって計測されるように、Ｎ末端を切り取られた産物の量の顕著な増加を引き起こした（Ｍｒ＝３０８９ｇｍｏｌ−１）。対して、ＧＬＰ−１Ａｈａ８（２μＭ）は、いずれの治療に対しても抵抗力があるように思われた。
【実施例８】
【０１００】
実施例８．インビボにおけるＧＬＰ−１Ａｈａ８の生物活性の測定
６ヶ月齢の雄ズッカーｆａ／ｆａラット（Ｈａｒｌａｎ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）、及び６ヶ月齢のウィスターラットを、この研究で使用した。それらを、食べ物と水を自由摂取させ、１２時間の明、１２時間の暗のサイクル（午前７時に点灯）の状態にした。ズッカーラットの床敷きは、紙ベースの製品「Ｃａｒｅｆｒｅｓｈ」（Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｃｏ．，  Ｂｅｌｉｎｇｈａｍ、ＷＡ）であった。実験の前一晩、床敷きの不存在の状態で、ズッカーラットをワイヤー上で絶食させた。ウィスターラットを、それらの通常の床敷き上で絶食させた。ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）の腹膜内の注射によって全身麻酔を誘発した。採血のために大腿動脈にカニューレを取り付け、そしてポリペプチド（ＧＬＰ−１Ａｈａ８（配列番号８）及びＧＬＰ−１Ｇｌｙ８（配列番号３）、２４ｎｍｏｌ／ｋｇ）を、動物の首筋に皮下注射した（各処置群についてｎ＝５）。血糖値を、Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ  Ｅｌｉｔｅ（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐ．  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，  ＮＹ）を使っやグルコース酸化酵素法によって計測した。
【０１０１】
ＧＬＰ−１Ａｈａ８がインビボにおいて生物活性をもつことを確認するために、前記ポリペプチドを、絶食ズッカー脂肪（ｆａ／ｆａ）ラット及びウィスターラットに皮下投与した（２４ｎｍｏｌ／ｋｇ）。ズッカーラットの他の群は、同投与量のＧＬＰ−１Ｇｌｙ８を受けた。そして次の８時間の間、血糖値を観察した。図９において、結果は、両化合物ともに、急速に血糖を下げたことを示す。ズッカーラットにおいて、グルコース絶食は、その群の中では低かったが、しかし低下の傾斜及び大きさは両化合物に類似していた事実から、血糖の減少は、ＧＬＰ−１Ｇｌｙ８によってより顕著だった。このクラスの化合物によるインシュリン分泌刺激のグルコース依存性を証明した、低血糖の範囲への血糖の低下から、インシュリン分泌は、ＧＬＰ−１Ｇｌｙ８により弱められた。ＧＬＰ−１Ａｈａ８によって処理したズッカーラットが低血糖にならなかった場合、インシュリン分泌刺激応答は、撤回されずに、そして長期間の効果が見られることができた。絶食状態で高血糖ではないウィスターラットにおいて、インシュリンレベルは、ＧＬＰ−１Ａｈａ８によって急激に高められ、低血糖、そして再度のインシュリン分泌刺激応答の迅速な減衰をもたらした。
【実施例９】
【０１０２】
実施例９．Ｅｘｅｎｄｉｎ−４の切詰め、及びＥｘｅｎｄｉｎ−４の第９アミノ酸Ｃ末端の生物学的な重要性
この研究は、Ｅｘ−４の生物活性に対する、第９Ｃ末端アミノ酸の重要性を判断するために実施した。切詰められたＥｘ−４アナログの配列と、第９Ｃ末端配列を付加したＧＬＰ−１アナログを当該研究に使用した。
【０１０３】
材料及び細胞系
先に記載のとおり、ペプチドを合成した。全てのペプチドが、９５％超の純度であった。表４は、研究したＧＬＰ−１及びｅｘｅｎｄｉｎ−４アナログの配列を示す。イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）から購入した。Ｅｘｅｎｄｉｎ−４及びＧＬＰ−１−（７−３６）アミドを、Ｂａｃｈｅｍ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，  ＣＡ）から入手した。クローン化したラットインスリノーマ細胞系ＲＩＮ１０４６−３８は、Ｄｒ．  Ｓａｍｕｅｌ  Ａ．  Ｃｌａｒｋ（ＢｉｏＨｙｂｒｉｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｓｈｒｅｗｓｂｕｒｙ，  ＭＡ）からの贈与物であり、３７℃の加湿５％ＣＯ２−９５％エアーインキュベーター内で、グルコース（１１ｍＭ）、５０  Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及びグルタミン（２ｍＭ）を補充したＥａｒｌｅ’ｓ塩（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．，  Ｈｅｒｎｄｏｎ，  ＶＡ）を伴うＭ１９９中で、日常的に培養された。ＧＬＰ−１受容体遺伝子により安定的にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ／ＧＬＰ−１Ｒ細胞を、先に記載した。血漿インシュリンレベルをＥＬＩＳＡによって計測した（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．，  Ｃｈｉｃａｇｏ  ＩＬＬ）。ＨｂＡ１ｃを、Ｇｒｅｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９に記載のとおり計測した。血糖値を、Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ  Ｅｌｉｔｅ（Ｂａｙｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，  ＮＹ）を使って計測した。
【表３】
0005695097.tif 000004
下線を引かれたアミノ酸が、試験されるｅｘｅｎｄｉｎ−４配列由来のアミノ酸を表す。
【０１０４】
動物
６ヶ月齢の雄ズッカー（ｆａ／ｆａ）ラット（Ｈａｒｌａｎ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）、２ヶ月齢のＣ５７ＢＬＫＳ／Ｊ−Ｌｅｐｒｄｂ／Ｌｅｐｒｄｂマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｂａｒ  Ｈａｒｏｒ，  ＭＡ）、及び２ヶ月齢のフィッシャーラット（Ｈａｒｌａｎ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）を、急性及び慢性の実験で使用した。全ての動物に、食べ物と水を自由摂取させた。動物を、１２時間の明−暗いサイクル（午前７時に点灯）の状態においた。ズッカーラット及びｄｂ／ｄｂマウスのための床敷きは、紙ベースの製品、Ｃａｒｅｆｒｅｓｈ（Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｃｏ．，  Ｂｅｌｉｎｇｈａｍ，  ＷＡ）であり、そしてフィッシャーラットを、通常の床敷きの上に収容した。
【０１０５】
細胞内ｃＡＭＰの定量
１２ウェルプレート上で６０から７０％集密まで培養したＲＩＮ１０４６−３８細胞を、実施例３に記載のとおり処理し、そして適宜にｃＡＭＰ定量を実施した。用量反応曲線を図２１に示す。
【０１０６】
完全な細胞のＧＬＰ−１受容体へのペプチドの競合的な結合
実施例４に記載のとおり結合試験を実施した。表５は、それぞれＣＨＯ  ＧＬＰ−１Ｒ細胞における競合的結合及びＲＩＮ  １０４６−３８細胞におけるｃＡＭＰアッセイから得たＩＣ５０及びＥＣ５０値を示す。
【表４】
0005695097.tif 000005
【０１０７】
統計分析
全ての値を平均±ＳＥＭとして示し、群間の差を、ＡＮＯＶＡを使って分析した。図１及び２の曲線を、反復コンピュータプログラム（２０）を使って４因子Ｓ字状ロジスティック回帰方程式に適合させ、そして表２のＥＣ５０及びＩＣ５０値を適合データから計算した。
【０１０８】
ズッカーｆａ／ｆａラットにおける急性経時変化実験
１０ｎｍｏｌ／ｋｇのペプチドを、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で投与したことを除き、実施例５で先に記載したとおり、６ヶ月齢の雄ズッカーｆａ／ｆａラット（Ｈａｒｌａｎ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）をこの研究で使用した。Ｅｘ（１−３６）及びＥｘ（１−３５）のｓｃ注射後の血糖値を、図２２に示す。
【０１０９】
ｄｂ／ｄｂマウスにおけるＥｘ（１−３０）を用いた慢性研究
動物を、実験開始前にそれらの環境順化を容易にするために、２．５ヶ月間我々の施設に収容した。処理の最初の２０日間、毎日午前９時に、動物にＥｘ（１−３０）（１ｎｍｏｌ／ｋｇ）を腹膜内（ｉｐ）注射で与えた。その後、次の３２日間、午前９時と午後９時位に、動物は、ｉｐでＥｘ（１−３０）（１ｎｍｏｌ／ｋｇ）を受けた。処理プリトコールの最初の２０日の終了時点で、血糖値及びＨｂＡ１ｃを計測した。食物摂取及び動物体重を、毎日午前９時の注射時に測定した。スケジュールの中で失敗した日はない。磁気共鳴像（ＭＲＩ）を、５１日目で取り、そしてＩＰＧＴＴを、５２日目に実施した。
【０１１０】
２０日目におけるＨｂＡ１ｃは、Ｅｘ（１−３０）処理マウスについて７．８±０．４、生理食塩液処理マウスについては７．７±０．３であった。絶食血糖値は、Ｅｘ（１−３０）処理マウスについて４１２±９２ｍｇ／ｄｌ、が生理食塩液処理マウスについては６００±１ｍｇ／ｄｌであった。
【０１１１】
磁気共鳴映像法
１．９  Ｔ、ボア３１ｃｍのＢｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｅｃシステム（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ，  Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、内径２０ｃｍのシールド型グラジエントセット、及び直径５ｃｍのボリューム共鳴器を使って、磁気共鳴イメージを得た。慢性の研究で使用した動物を、イソフルオラン知覚麻痺下に置き、標準Ｔ１強調多重スライススピン−エコー法（ＴＲ＝５００ｍｓ、ＴＥ＝８．５ｍｓ）を、腹部全体を含む領域をカバーする、各２．１ｍｍの厚さの２０の隣接するスライスにわたって得られた。視野は、１２８×１２８画素より高く５×５ｃｍであった。各々のイメージを、約９分の総撮像時間にわたり、８回の収集を使って収集した。全ての動物において、撮像を２つの時点（０日目と５１日目）で実施した。
【０１１２】
内臓と皮下部位の分離を、各々のスライスについて、着目の図面領域（ＲＯＩｓ）によって実施した（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｐａｒａｖｉｓｉｏｎソフトウェア）。各ＲＯＩから得られる強度ヒストグラムを使って、正常な組織からの脂肪の区分けを達成した（ＮＴＨ  Ｉｍａｇｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  ＵＳＡ）。このヒストグラムは、各ＲＯＩにおいて脂肪組織含量が合計できるようにする分界点としてそれらの間の谷を使用して分けられた、２つの十分に分離されたピークを一般的に示した。
【０１１３】
結果を図２３に示す。両セットの動物（対照及びＥｘ（１−３０）投与）で体重が減少したが、Ｅｘ（１−３０）処理した動物は、内臓脂肪沈着の減少を示した。処理された動物は、薬物を受けなかった対照と同ほど速く体重を失わなかった。よって、処理は糖尿病を軽くして、処置した動物はより健康的だった。
【実施例１０】
【０１１４】
実施例１０．β−アミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰ）の代謝に対するＧＬＰ−１とＧＬＰ−１アナログの効果
アルツハイマー症（ＡＤ）の重要な病理的な特徴の１つは、主にアミロイド−βペプチド（Ａβ）より成る老人斑の脳血管沈着である。Ａβは、より大きなグリコシル化膜結合タンパク質β−アミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰ）から誘導される。大部分のβＡＰＰは、Ａβドメインにタンパク質分解によって切断されて、アミロイド生成性断片の形成を防ぐ可溶性誘導体（ｓＡＰＰ）を産生する。この研究は、β−アミロイド前駆体タンパク質のプロセッシングに対するＧＬＰ−１及び２つのアナログの効果を測定するために実施した。
【０１１５】
ＰＣ１２細胞を、１０％の熱不活化ウマ血清、５％の熱不活化胎児ウシ血清、２５ｍＭのＨｅｐｅｓバッファー、及び１×抗生物質−抗真菌性溶液を補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。（全ての培地及び血清を、ＭｅｄｉａＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．から入手した（Ｈｅｒｎｄｏｎ  ＶＡ）。処理を、低血清中、ＧＬＰ−１（３．３、３３及び３３０μｇ／ｍｌ）（Ｂａｃｈｅｍ，  Ｔｏｒｒａｎｃｅ，  ＣＡ）、並びに２つのアナログｅｘｅｎｄｉｎ−４（０．１、１．０及び１０μｇ／ｍｌ）及びｅｘｅｎｄｉｎ−４−ＷＯＴ（ペプチド１０（Ｅｘ−４ＷＯＴ；配列番号７））（０．１及び１．０μｇ／ｍｌ）の存在下で実行した。ＰＣ１２細胞によって調整培地中により多くのｓＡＰＰの分泌をもたらす分泌経路を刺激することが示されているＮＧＦ（５、１０、２５及び５０ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を正の対照として使用した。処置の３日後、未処理（低血清培地のみ）及び処理細胞の調整培地、及び細胞ライセートを、モノクローナル抗体、２２Ｃ１１（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）を使って免疫ブロット分析に共した。そのエピトープ領域が外形質のシステイン含有ドメインのβＡＰＰ６６−８１に割り当てられた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生βＡＰＰに対して産生された、抗体は、細胞膜中に見つかったβＡＰＰの全ての成熟型、並びに調整培地中に分泌されたカルボキシ切詰め可溶性型を認識する。処理又は未処理細胞からの調整培地又は細胞ライセートの典型的な免疫ブロットで、複数の高分子量タンパク質の結合（Ｍｒ  １００〜１４０  ｋＤａ）が、明白だった。免疫ブロットにおける免疫反応性バンドの特徴で観察される差異は、ゲル中へのタンパク質の不均一な添加によるものでなく膜上へのタンパク質のむらがある移行によるものでもなかった。等量の総タンパク質を、ゲルの各々のレーンに添加し、５％の酢酸中、０．１％のＰｏｎｃｅａｕ  Ｓにより膜を染色することによって、電気泳動移行の効率を観察した。
【０１１６】
上方のバンドの濃度測定による定量化は、ＮＧＦ処理後にβＡＰＰの細胞内レベルの急激な上昇を明らかにした（図１１Ａ、棒グラフ１及び２；図１１Ｂ、棒グラフ１及び２）。細胞培養実験間の特有の変化は、１組の研究の中の５ｎｇ／ｍｌと１０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦによる（図面１１ＡとＣ）、並びに異なる組の研究の中の２５ｎｇ／ｍｌと５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦによる（図１１ＢとＤ）処理後の分化の程度の差異を考慮する。ＮＧＦとは対照的に、ＧＬＰ−１及びアナログは、βＡＰＰの細胞内レベルを減少させた（図１１Ａ、棒グラフ３〜５；図１１Ｂ棒グラフ３〜７）。ＮＧＦ及びｅｘｅｎｄｉｎ−４の組み合わせ物は、未処理細胞に対して細胞内βＡＰＰを増加させたが、しかし２つの単独の処理条件のそれの間のレベルであった（図１１Ａ、棒グラフ６）。
【０１１７】
図１１Ｃ及びＤに示されるように、全ての投与量の神経成長因子処理が、調整培地で検出されることができた分泌された、可溶性βＡＰＰ誘導体の急激な上昇をもたらした（図１１Ｃ、棒グラフ１及び２；図１１Ｄ、棒グラフ１及び２）。細胞ライセートからの細胞内βＡＰＰレベルの類似したパターンに続いて、ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４及びｅｘｅｎｄｉｎ−４−ＷＯＴの全ての投与量による処理は、調整培地中への検出可能なレベルのｓＡＰＰの減少を引き起こした（図１１、棒グラフ３〜５；図１１Ｄ、棒グラフ３〜７）。ＮＧＦとｅｘｅｎｄｉｎ−４の組み合わせ物は、未処理細胞に対してｓＡＰＰレベルの少しの変化も引き起こさなかった（図１１Ｃ、棒グラフ６）。
【０１１８】
Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．からの乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）キットを使って、使用した処理及び未処理細胞の両方の、調整培地及び細胞ライセートサンプルにおいて以下に記載のとおりＬＤＨのアッセイを実施した。使用した条件下で処理及び未処理細胞間のＬＤＨレベルで著しい変化は観察されなかった。使用された投与量でのＧＬＰ−１及びアナログによる処理の結果としての毒性の可能性は外される。
【０１１９】
データは、１２細胞におけるＧＬＰ−１処理後に、βＡＰＰの分泌されている誘導体と成熟型のレベルを減少させることを示す。ｓＡＰＰ分泌のこれらの減少は、減少したβＡＰＰ合成の分泌の結果である。
【実施例１１】
【０１２０】
実施例１１．ＧＬＰ−１及びアナログの神経増殖と分化の促進
ラット褐色細胞腫（ＰＣ１２）細胞系において、ニューロンの増殖と分化、及びニューロンタンパク質の代謝に対するＧＬＰ−１とその長期作用性アナログ２種類、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、及びｅｘｅｎｄｉｎ−４  ＷＯＴの効果を、試験した。ＧＬＰ−１及びｅｘｅｎｄｉｎ−４は、神経突起の伸長を誘発し、それは、選択的ＧＬＰ−１受容体拮抗薬、ｅｘｅｎｄｉｎ（９−３９）との同時インキュベーションによって覆された。さらに、ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、神経成長因子（ＮＧＦ）によって開始された分化を促進し、かつ、ＮＧＦ介在撤回に続く細胞の変性を救う。
【０１２１】
材料
７Ｓ  ＮＧＦを、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）から購入した。ＧＬＰ−１及びｅｘｅｎｄｉｎ（９−３９）を、Ｂａｃｈｅｍ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，  ＣＡ）から入手した。Ｅｘｅｎｄｉｎ−４及びそのアナログ、ｅｘｅｎｄｉｎ−４ＷＯＴを合成し、先に記載のとおりＨＰＬＣ分析によって＞９５％の純度であることを評価した。全ての他の化学薬品は、別段の記載のない限り、高純度であって、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）から入手した。
【０１２２】
データ分析
統計分析を、必要に応じて実施した。結果を平均±ＳＥＭ（ＳＥＭ＝平均間の差異の標準誤差）と表現した。ＳＰＳＳバージョンＶＩＩを使って、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実行し、ｐ＜０．０５を、統計的に有意であるとみなした。有意な主効果に続いて、Ｔｕｋｅｙ’ｓ  Ｈｏｎｅｓｔｌｙ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｅｓｔ（テューキーのＨＳＤ）を使って計画比較を行った。
【０１２３】
培養条件
褐色細胞腫細胞を、Ｄｒ．  Ｄ．  Ｋ．  Ｌａｈｉｒｉ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）から入手し、ＲＩＮ１０４６−３８細胞（クローンラットインスリノーマ細胞株）は、Ｄｒ．  Ｓａｍｕｅｌ  Ａ．  Ｃｌａｒｋ（Ｂｉｏ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓｈｒｅｗｓｂｕｒｙ，  ＭＡ）からの贈与物である。ＰＣ１２細胞を、１０％の熱不活化ウマ血清、５％の熱不活化胎児ウシ血清、２５ｍＭのＨｅｐｅｓバッファー、及び１×抗生物質−抗真菌溶液を補ったＲＰＭＩ１６４０中で培養した。ＲＩＮ１０４６−３８細胞を、１２ｍＭのグルコースを含み、５％の熱不活化胎児ウシ血清、０．０３％のグルタミン、５０  Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補った培地１９９中で培養した。細胞培養培地及び血清を、ＭｅｄｉａＴｅｃｈ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）  Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｎｄｏｎ，  ＶＡ）から入手した。細胞を、５．０％のＣＯ２を含む加湿雰囲気中で培養した。それらを、１枚の６０ｍｍ皿につき約２．０×１０６細胞にて播種した。ＰＣ１２細胞を、ラットの尾のコラーゲンで覆われた培養器（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）上で培養した。７Ｓ  ＮＧＦを、１００ｍｇ／ｍｌの濃度で成長培地中への希釈によって調製し、−２０℃で保存した。ＧＬＰ−１及びアナログの原液を、滅菌水中で新たに作製し、−２０℃で保存した。
【０１２４】
各々の処理条件について３枚の皿を、準備した。播種後２４時間、いったん細胞が十分に接着すれば、処理を開始する。培地を吸引し、そして（０．５％の胎児ウシ血清だけを含む）３ｍｌの新鮮な低血清培地を、適当な化合物と一緒に加えた。
【０１２５】
細胞ライセートの準備
イムノブロッティング法によるタンパク質分析のために、調整培地及び細胞ペレットを毎日採集した。細胞ライセートを以下のとおり調製した。プレートからの細胞を、そっと回収し、１０分間８００ｇで遠心分離した。細胞ペレットを、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％のＳＤＳ、０．１７４ｍｇ／ｍｌのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、各々１ｍｇ／ｍｌのアプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、及び４５．９８ｍｇ／ｍｌバナジン酸ナトリウムと１０．５ｍｇ／ｍｌフッ化ナトリウムの混合物４ｍｌを含む溶解バッファー中に懸濁した。懸濁した細胞を、粉砕し、１５分間１４，０００ｇで遠心分離した。上清溶液のタンパク質（細胞ライセート）を、計測し（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，  １９７６）、イムノブロッティング法によって分析した。
【０１２６】
ウェスタンブロッティングによるタンパク質分析
２．６％のビスアクリルアミド（Ｎｏｖｅｘ、サンディエゴＣＡ）を含む１０％のＴｒｉｓ−グリシンゲルを使って、各細胞ライセート及び調整培地からのタンパク質１０μｇを用いて、ウェスタンブロット分析を実施した。タンパク質を、ＰＶＤＦ紙上にブロットした。５％の酢酸（Ｓｉｇｍａ）中、０．１％のＰｏｎｃｅａｕ  Ｓ溶液を用いて膜を染色することによって、移したタンパク質を可視化した。
【０１２７】
Ｅｘｅｎｄｉｎ−４及びＧＬＰ−１の介在した神経突起の伸長
ＰＣ１２細胞を、上記のとおり６０ｍｍ皿上で培養し、４日間培養した。この間神経突起の伸長を毎日定量した。１枚の皿につき、５つの無作為な細胞領域を評価し、そして神経突起をもつ細胞の割合が測定した。１つの領域につき約１００細胞を、細胞体のそれと同等以上の長さの神経突起について記録した。１つの細胞につき１以上の突起をもっていたかもしれないが、１つの細胞を一度だけ記録した。
【０１２８】
神経栄養性化合物の存在しない完全培地で培養された培養されるとき、ＰＣ１２細胞はニューロン細胞型の特徴を全く示さなかった。低血清培地中でＮＧＦに晒されたとき、細胞は、分裂を止め、そして交感神経ニューロンに類似した形態的特徴を発現させた。細胞は、長い突起を伸ばし、あるものは、低血清培地のみで培養した細胞においてより、さらに扁平な外観を示す細胞体を伴って高度に分岐するようになった。
【０１２９】
低血清培地中でのＧＬＰ−１及びｅｘｅｎｄｉｎ−４による処理は、ＮＧＦによって誘発されたものへの分化に対して類似した効果を引き起こした。ＧＬＰ−１及びｅｘｅｎｄｉｎ−４の誘発した神経突起は、ＮＧＦによる処理を受けて産まれた神経突起より、一般に長さが短くて、分岐が少ない。対照的に、ｅｘｅｎｄｉｎ−４との組み合わせでＧＬＰ−１拮抗薬、ｅｘｅｎｄｉｎ（９−３９）は、神経突起伸長を開始できない。
【０１３０】
神経突起の発達に関する毎日の定量化をも実施した。図１２で示した結果は、処理３日目に得たカウントを表し、そして未処理対照のパーセンテージとして表される。低血清培地の存在下、ＰＣ１２細胞の培養は、５〜１０％の細胞が神経突起の突起を伸長する結果となった。分析は、処理条件の有意な主効果を明らかにした（Ｆ＝２６３．５、ｄｆ＝８，８９、ｐ＜０．００１）。期待されるように、ＮＧＦ処理は、本明細書中で試験した３つの投与量；１０、３０及び１００ｎｇ／ｍｌでニューロン表現型を有意に誘発した（全てｐ＜０．０１）。例えば、１０及び３０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦによる細胞の処理は、対照から神経突起の突起の、それぞれ５５０及び７２０％の増加を引き起こした。同じ条件下で、ＰＣ１２細胞をｅｘｅｎｄｉｎ−４で処理した場合、有意な神経突起の伸長は、１μｇ／ｍｌ（未処理に対して９８％の増加、ｐ＜０．０５）、及び１０μｇ／ｍｌ（未処理に対して１６０％の増加、ｐ＜０．０１）の化合物でも観察された。しかし、ｅｘｅｎｄｉｎ−４による神経突起の伸長は、ＮＧＦ処理細胞のそれほどは顕著ではなかった。２つの化合物の相乗効果を測定するために、組み合わせ処理の系列を試した。ｅｘｅｎｄｉｎ−４（１００ｎｇ／ｍｌ）を、１０ｎｇ／ｍｌ又は３０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦのいずれかと同時処理したとき、神経突起伸長の有意な増加を、未処理対照細胞に対して観察した（それぞれ、５９６％及び８１９％増加、ともにｐ＜０．０１）。ＮＧＦ処理単独に対する神経突起伸長の増加は、３０ｎｇ／ｍｌで有意であるのみだった（ｐ＜０．０１）。類似した結果を、単独で又はＮＧＦと組み合わせて、他の投与量のｅｘｅｎｄｉｎ−４によって観察した。これらのデータは、ｅｘｅｎｄｉｎ−４が分化を開始することができて、かつ、ＮＧＦに誘発された分化を促進することができることを示唆している。
【０１３１】
ＮＧＦが介在する細胞死に対するＥｘｅｎｄｉｎ−４の効果
５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦの存在／不存在下、又はｅｘｅｎｄｉｎ−４（１又は５ｍｇ／ｍｌ）存在／不存在下、ＰＣ１２細胞を、完全培地（ＲＰＭＩ１６４０＋５％のウシ胎仔血清＋１０％のウマ血清）中で培養した。４又は７日後に、細胞を採集し、続いてさらに３日間、通常培地中で回復させた。最終日に、細胞を採集し、生細胞の割合を測定するためにＭＴＴアッセイを実施した。２番目の組の実験（阻止）において、４又は７日間、細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ及びｅｘｅｎｄｉｎ−４（１又は５ｍｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。細胞を採集し、前記のとおり回復させた。３番目の組の実験（救済）において、細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦの存在下で４日間培養した。さらに３日間、５ｍｇ／ｍｌのＥｘｅｎｄｉｎ−４を、培地に加えた。７日目に細胞を採集し、前記のとおり回復させた。
【０１３２】
４番目の組の実験（救済）において、細胞をＮＧＦの存在下で培養した。４日目に、さらに３日間、５ｍｇ／ｍｌのｅｘｅｎｄｉｎ−４を加えた。７日目に細胞を採集し、前記のとおり回復させた。以下に記載のとおり、４及び７日目に、トリパンブルー排除法、及びにＭＴＴアッセイを実施することによって、細胞を各々のプレート（４プレート／処理条件）についてカウントした。
【０１３３】
これらの実験で、４日後のＮＧＦ処理中止は、大量の細胞死を引き起こさずに、そして大部分の細胞はほとんど完全に回復することができた。Ｅｘｅｎｄｉｎ−４同時処理は有意な効果を示さなかった。処理の７日後のＮＧＦ処理中止は、細胞の生存度の１５〜２０％の減少を引き起こし、そしてこの細胞は、完全に回復することができなかった（図１３、棒グラフ２）。この場合、ｅｘｅｎｄｉｎ−４の同時処理は、低用量（図１３、棒グラフ４）又は高用量（図１３、棒グラフ６）のいずれも、あるいはＮＧＦ処理の４日に添加された場合にも（図１３棒グラフ７）細胞死を防がなかった。しかしｅｘｅｎｄｉｎ−４処理をＮＧＦ処理中止に続いて実施した場合、回復過程が促進された。例えば、ＰＣ１２細胞をＮＧＦの存在下で４日間培養し、４〜７日目にＮＧＦを処理中止し、ｅｘｅｎｄｉｎ−４を加えたとき（図１３、棒グラフ８及び９）、細胞生存度は、対照値に達した（＞９５％）。これは、高用量（５ｍｇ／ｍｌ）及び低用量（１ｍｇ／ｍｌ）のｅｘｅｎｄｉｎ−４の両方についてであった。
【０１３４】
ＭＴＴ分析
Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）製のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔを、修飾ＭＴＴアッセイにおける生細胞数の測定のための比色分析手順で使用した。この試薬は、新規テトラゾリウム化合物［３−（４，５−ジメチル−２−ｙｌ）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩；ＭＴＳ］、及び電子共役試薬（フェナジンエトスルフェート；ＰＥＳ）を含む。ＰＥＳは化学安定性を高め、それはＭＴＳとの組み合わせを可能にし、安定した溶液を形成した。ＭＴＳテトラゾリウム化合物は、組織培養培地に溶解する、有色のホルマザン産物へと細胞によって生物学的に還元される。代謝的に活性な細胞中のデヒドロゲナーゼ酵素によって産生されるＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨによって、この転換は恐らく達成される（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ  ａｎｄ  Ｔａｎ，  １９９３）。アッセイを、直接的に培養したウェルへの少量の試薬の追加、１〜４時間のインキュベーション、続く９６ウェルプレートリーダーによる４９０ｎｍの吸光度によって実施される。４９０ｎｍの吸光度の値によって計測されるホルマザン産物の量を、培養物中の生細胞の数に直接に比例している。ＭＴＳホルマザン産物は組織培地に溶解するので、本手順は、ＭＴＴのようなテトラゾリウム成分を使う手順よりわずかなステップしか必要としない。
【０１３５】
ＰＫＡ阻害薬による神経突起伸長の部分的な抑制
ＧＬＰ−１及びｅｘｅｎｄｉｎ−４誘発神経突起伸長の機構を決定するために、分化した培養物を、それぞれＥＲＫ  ＭＡＰＫとＰＩ３−Ｋを阻害する５０μＭのＰＤ９８０５９又は４０μＭのＬＹ２９４００２で処理する。ｃＡＭＰに依存したＭＡＰＫリン酸化がＰＫＡによって制御されたかどうかを決定するために、ＧＬＰ−１及びＮＧＦによって誘発した神経突起をＰＫＡの特異的阻害薬、Ｈ８９で処理した。
【０１３６】
具体的には、培養物を、ＧＬＰ−１アンタゴニストであるｅｘｅｎｄｉｎ（９−３９）；ＰＩ３キナーゼ阻害薬であるＬＹ２９４００２（４０μＭ）；ＭＡＰキナーゼ阻害薬であるＰＤ９８０５９（５０μＭ）、又はＰＫＡ阻害薬であるＨ８９（２０μＭ）で４８時間処理した。細胞を、約１×１０５細胞／ｍｌで６０ｍｍ皿上に播種し、そして前記の化合物のそれぞれとともに１０ｎＭのＧＬＰ−１又は０．３μＭのｅｘｅｎｄｉｎ−４で処理した。５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ及びフォルスコリン（ＰＫＡアクチベーター）（２０ｐＭ）を、これらの処理の正の対照として使用した。
【０１３７】
ＰＤ９８０５９及びＬＹ２９４００２の両者は、細胞のＧＬＰ−１及びｅｘｅｎｄｉｎ−４の誘発した神経突起伸長を減少させた。同様に、ＮＧＦに誘発された神経突起の伸長が、ＰＤ９８０５９及びＬＹ２９４００２の処理にを受けて減少した。よって、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼ及びＰＩ３キナーゼシグナル伝達経路の関与が、ＰＣ１２細胞におけるＧＬＰ−１及びｅｘｅｎｄｉｎ−４が介在した神経突起産生に関係する。Ｈ８９での処理が、ＧＬＰ−１及びＮＧＦによって誘発された神経突起伸長に対する多少の阻害効果を証明した。これらのデータは、ＰＫＡがＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路の調節に関与しているが、しかし他のシグナル伝達経路も関与していることを示唆する。
【０１３８】
シナプトフィジン及びＢＥＴＡ−２／ＮｅｕｒｏＤの発現
ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４又はｅｘｅｎｄｉｎ−ＷＯＴの誘発したＰＣ１２細胞の分化の間に生じている分子の変化を検討するために、シナプス小胞膜でよく発現されているリン酸化された３７  ｋＤａのタンパク質である、シナプトフィジンの特徴を試験した。ＰＣ１２細胞の神経分泌液胞を染色するシナプトフィジンモノクローナル抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を使用した。膜を、２０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ７．４、１％（ｗ／ｖ）のカゼイン（ＢｉｏＲａｄ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）によって３７℃で１時間ブロックした。一次抗体を、ブロック中に希釈し、そして４℃で一晩タンパク質と一緒にインキュベートした。前記膜を、２０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）で３回、室温で１５分間強く洗浄した。ブロック中、ペルオキシダーゼ連結二次抗体を、膜と一緒に室温で２時間インキュベートした。ペルオキシダーゼ連結抗マウスＩｇＭ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，  Ｔｅｎｅｃｕｌａ，  ＣＡ）を、シナプトフィジンに対する二次抗体として使用した。過剰な抗体を、ＴＢＳＴで３回強く洗い落とし、その後ＥＣＬプラス（Ａｍｅｒｓｈａｍ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ）中で５分間インキュベーションした。続いて膜を写真用フィルムに焼き付けた。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｔソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を使ってタンパク質バンドの濃度測定による定量化を実施した。
【０１３９】
シナプトフィジン抗体を使った細胞ライセートサンプルのウエスタン免疫ブロット分析は、約３７  ｋＤａの分子量バンドを明らかにした。ＮＧＦ、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−１アナログによる処理は、未処理細胞と比べてのシナプトフィジンタンパク質の発現を著しく減少させた。タンパク質バンドの濃度測定による定量化は、未処理に対して、全ての処理条件について有意な減少を示し（図１４、全てｐ＜０．０１）、それらは、投与量に依存していると考えられる。ＰＣ１２細胞由来の調整培地サンプルの中に、免疫反応性バンドは検出されなかった。
【０１４０】
ＮＧＦ処理の結果としてのＰＣ１２細胞における高度の分化は、未処理対照細胞に対してシナプトフィジン発現の著しい減少によって明らかとなった。神経成長因子は、対照細胞に対して約７０％の最大減少を引き起こす、細胞性シナプトフィジン発現の投与量に関係した変化を証明した。ＧＬＰ−１及びアナログは、ＮＧＦが介在した分化に対して神経突起の伸長への類似した効果を示したが、しかしより低頻度に対してシナプトフィジン発現の比較的わずかな減少しか示さなかった。興味深いことに、組み合わせたＮＧＦとｅｘｅｎｄｉｎ−４は、相加的な形態的効果を反映して、いずれか単独の化合物よりもシナプトフィジン発現の大きな減少を引き起こした（図１４）。総じて、ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、シナプトフィジン発現の点で、ＰＣ１２細胞の分化を、ＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４ＷＯＴのいずれかがしたより顕著な誘導を示した。
【０１４１】
ＧＬＰ−１の誘発したＰＣ１２の分化における転写因子ＢＥＴＡ−２／ＮｅｕｒｏＤの役割を調査するために、細胞ライセートを、ＮｅｕｒｏＤポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡ）によって調査した。ＢＥＴＡ−２／ＮｅｕｒｏＤは、ニューロンと膵臓の内分泌の発達に重要な役割をもつ。ＮｅｕｒｏＤの発現は、ニューロン分化の間の、末梢神経系の知覚及び運動ニューロン、感覚器、並びに脳及び脊髄の一部において短期的であると考えられるが；しかし成人の脳における検出は、成熟したニューロンにおける二次的な役割を示唆する（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。膵臓の内分泌の細胞、腸及び脳におけるＢＥＴＡ−２発現は、インシュリン遺伝子の転写を活性化して、ニューロンの分化を促進しうる。機能的なＢＥＴＡ−２遺伝子を欠く突然変異マウスは、インシュリンを産生するベータ細胞数の顕著な減少を有し、成熟した島の発達を欠き、そして結果としてしばしば周産期死亡をもたらす重度の糖尿病を患う（Ｎａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。よって、ＢＥＴＡ−２／ＮｅｕｒｏＤは、インビボの膵臓の発達、及びニューロンの分化に不可欠である。
【０１４２】
ペルオキシダーゼ連結抗ヤギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）を二次抗体として使用したことを除いて、シナプトフィジン抗体について先に記載のとおり抗ＮｅｕｒｏＤ抗体を使って、ＮｅｕｒｏＤ産生をウェスタンブロット分析によって測定した。未処理、及びＧＬＰ−１で処理したＰＣ１２細胞ライセートの両方ではっきり見える４３ｋＤａバンドを検出し、それは、ＧＬＰ−１処理により増加した。ＢＥＴＡ−２／ＮｅｕｒｏＤ発現は、ＧＬＰ−１での処理により増加し、このインシュリン分泌刺激ポリペプチドのニューロン分化特性のさらなる証拠を提供する。予想されるように、低血清培地のみに晒された培養物は、ＢＥＴＡ−２／ＮｅｕｒｏＤの通常の発現を示した。実際、Ｎｏｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）は、ＮＧＦのような分化を誘発する薬剤なしに、神経突起に似た突起、及びシナプスに似た構造体のような形態的変化が誘発されたトランスフェクトＰＣ１２細胞におけるＮｅｕｒｏＤの過剰発現を示した。
【０１４３】
ＰＣ１２細胞におけるＧＬＰ−１受容体の存在の証明
ＰＣ１２細胞を、３５ｍｍ培養皿内のポリ−Ｌ−リジンコートガラスカバースリップ上に移し、（先に記載のとおり）標準的な条件下で培養した。細胞を、３０分間、０．２５％のグルタルアルデヒドを用いて固定した。内性ペルオキシダーゼ活性を、０．３％のＨ２Ｏ２でクエンチし、ＧＬＰ−１受容体のＮ末端に対して産生された一次ポリクローナル抗体（Ｄｒ．  Ｊｏｅｌ  Ｆ．  Ｈａｂｅｎｅｒ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  ＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，  ＭＡからの贈与物）（希釈係数１：１５００）中でのインキュベーションを、室温で１時間実行した。可視化は、ビオチン化抗ウサギＩｇＧ二次抗体中でのインキュベーションに続く、ジアミノベンジジンジヒドロクロライド（ＤＡＢ）による発色を伴う、アビジン−ビオチンペルオキシダーゼ法を使った。
【０１４４】
ＰＣ１２細胞におけるＧＬＰ−１Ｒ陽性免疫反応性染色の存在は、ＧＬＰ−１受容体の存在を確かにした。より特に、染色は、細胞体上にあり、そして神経突起末端上により少ない。ほとんど全て細胞が、陽性に見えたが、しかし全てのＰＣ１２細胞が同程度に陽性免疫反応性染色を表したわけではない。
【０１４５】
逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＴ−ＰＣＲを、ＧＬＰ−１受容体ｍＲＮＡに関する高感度アッセイとして実施した。ラットインスリノーマ細胞（ＲＩＮ細胞）を、正の対照として使用した。全ＲＮＡを、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉとＳａｃｃｃｈｉ（１９８７）の方法を使ってＰＣ１２細胞から分離した。２．５ｍｇのＲＮＡを我々のＲＴ−ＰＣＲ反応に使用した。５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、３．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのｄＮＴＰ、並びに各々０．４ｍＭのラットＧＬＰ−１Ｒセンス（５’ＡＣＡＧＧＴＣＴＣＴＴＣＴＧＣＡＡＣＣ  ３’）及びアンチセンス（５’ＡＡＧＡＴＧＡＣＴＴＣＡＴＧＣＧＴＧＣＣ  ３’）オリゴヌクレオチドプライマー（膵臓のＧＬＰ−１受容体配列の５’及び３’末端）を含むバッファー５０ｍｌの量でＲＴ−ＰＣＲを行った。［ａ−３２Ｐ］ｄＣＴＰの存在下、３０サイクルで増幅を行った。ラット島細胞を、正の対照として使用した。ＲＴ−ＰＣＲ産物（１０ｍｌ）を、適当なサイズマーカーと一緒に４〜２０％のポリアクリルアミドゲルで分離した。続いて、真空下８０℃で１時間ゲルを乾燥させて、そしてＸ線フィルムに焼き付けた。
【０１４６】
ＧＬＰ−１受容体について予測されるサイズのＲＴ−ＰＣＲ産物を得た。ラット島ｍＲＮＡ及びＰＣ１２細胞ｍＲＮＡ中の９２８−ｂｐのクリアバンドは、ＰＣ１２細胞上のＧＬＰ−１受容体の存在を支持した。
【０１４７】
ｃＡＭＰの測定
ｃＡＭＰの測定の前に、ＰＣ１２細胞を、３日間、３３μｇ／ｍｌのＧＬＰ−１で処理した。トリプリケートの培養物を、処理開始後、合計期間３０分の間、５分の間隔で採集した。処理開始時（ゼロ分）に採集した細胞を、ｃＡＭＰの基礎レベルに使用した。サイクリックＡＭＰを、Ｍｏｎｔｅ−Ｒａｆｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７ａ）の方法に従って計測した。
【０１４８】
ＧＬＰ−１受容体の活性化は、細胞内のｃＡＭＰの増加をもたらす、アデニルシクラーゼを刺激することを示した。サイクリックＡＭＰを、３３ｍｇ／ｍｌのＧＬＰ−１でのＰＣ１２細胞の処理に続いて３０分間アッセイした。刺激の１５分以内にｃＡＭＰレベルで最大１２００倍増加し、それは３０分以内にベースライン近くに戻った。これらの所見は、ＰＣ１２細胞上のＧＬＰ−１受容体の存在及び活性を証明する。
【０１４９】
毒性分析
ｅｘｅｎｄｉｎ−４の考えられる毒性効果を、インビトロにて２つの方法：ＬＤＨ分析及びトリパンブルー排除法によって試験した。ＬＤＨアッセイを、Ｓｉｇｍａキットを使って実施した。処理後に異なる時間間隔で回集した調整培地サンプルを、高感度乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）アッセイに供した。ＬＤＨアッセイは、総細胞質内ＬＤＨを通して又は培地中に放出された細胞質内ＬＤＨの量の関数としての膜の完全性によって、細胞数の尺度を提供した。放出されたＬＤＨの測定は、ＬＤＨの作用によるＮＡＤの減少に基づいた。得られた減少したＮＡＤ（ＮＡＤＨ）を、テトラゾリウム色素の化学量論的変換に利用した。最終有色化合物を、分光光学的にに計測した。培地をアッセイするより前に細胞が溶解された場合、細胞数の増加又は減少が、変換された基質の量の付随する変化をもたらす。これは、試験物質によって引き起こされた胞傷害反応又は膜損傷（細胞毒性）の程度を示した。
【０１５０】
処理に続いて生細胞数の著しい変化はなく、我々の化合物が、検討した条件下で、ＰＣ１２細胞に無毒であることを示唆した。図１５を参照のこと。処理の間の細胞膜の完全性を測定するために、ＬＤＨレベルを、２つの別個の組の実験において、３日目に同じ条件下の対照及び処理細胞からの調整培地で計測した。期待されるように、ＬＤＨレベルは、培地標準（サンプルを処理開始時に採取した）に対して上昇した。しかし、１０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ及び１０μｇ／ｍｌのｅｘｅｎｄｉｎ−４を唯一の特例として、いかなる処理の投与も未処理細胞対照を越えてＬＤＨレベルを大幅に高めなかった。１０μｇ／ｍｌのＥｘｅｎｄｉｎ−４が、対照のそれの１．６５倍までレベルを高め（ｐ＜０．００１）、そしてｌＯｎｇ／ｍｌのＮＧＦが、１．３８倍の増加を示した（ｐ＜０．０５）。
【０１５１】
ブロモデオキシウリジンの取り込みによって測定されたＰＣ１２細胞における細胞ターンオーバー
ＧＬＰ−１が培養においてＰＣ１２細胞の増殖に影響するかどうかを測定するために、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みを観察することによって低血清培地中の細胞増殖を評価した。標識後の抗ＢｒｄＵ抗体を用いた免疫細胞化学を、標識の時点で活発にＤＮＡを複製していた細胞を確認するために使用した。ＰＣ１２細胞を、３３μｇ／ｍｌのＧＬＰ−１又は５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦの存在下又は不存在下で３日間培養した。細胞ＤＮＡを標識するために、４％のパラホルムアルデヒド中に固定する６時間前に、１０μＭのＢｒｄＵを培地に加えた。方法の残りの部分は、増殖キット（Ｒｏｃｈｅ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）に従って行った。増殖している細胞（ＢｒｄＵ標識の時点でＤＮＡ複製を受けていた細胞）は、クロモゲン反応により暗染された核を示した。ＢｒｄＵ取り込みを、処理の１、２及び３日目に定量した。各々の処理条件について３枚の皿をカウントし、細胞総数に対する標識された細胞のパーセンテージとして表した。ＰＣ１２細胞は、ＮＧＦによる処理（未処理に対して９％の上昇）及びＧＬＰ−１による処理（未処理に対して１８％）後、１日目にＢｒｄＵの取り込みの増加を示した。
【実施例１２】
【０１５２】
実施例１２．グルカゴン様ペプチド−１及びＥｘｅｎｄｉｎ−４による、興奮毒性神経損傷の保護及び回復
グルタミン酸によって誘発した細胞死から培養海馬ニューロンを保護する、並びに、成体ラットイにおけるボテン酸で誘発したコリン作用性マーカー欠損を軽減する、ＧＬＰ−１及びその長期作用性アナログ、ｅｘｅｎｄｉｎ−４の能力を試験した。
【０１５３】
培養条件
海馬ニューロン培養物を、前記（Ｍａｔｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）に類似した方法を使って１８日齢の胎仔Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットから調製した。要するに、細胞を、軽いトリプシン処理及び粉砕によって解離させ、そして１０％のＦＢＳ及び１％の抗生物質溶液（１０４  Ｕ／ｍｌのペニシリンＧ、１０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を含む最小必須培地中に蒔いた。海馬ニューロンを、２５ｍｍの直径のポリ−Ｄ−リジンコートガラスカバースリップ上に、１００，０００細胞／ｍｌの密度で蒔いた。細胞を蒔いた３時間後に、培地を、１％のＢ２７−サプリメント（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を含む無血清Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地によって交換した。
【０１５４】
ＭＡＰ−２（ニューロン）とＧＦＡＰ（神経膠星状細胞）について染色した免疫螢光法が、細胞の９８％以上がニューロンであり、そして残りが主に神経膠星状細胞であることを示した。培養物を、プレーティングの７〜１０日以内に使用した。
【０１５５】
結合の検討
結合の検討を、Ｍｏｎｔｒｏｓｅ−Ｒａｆｉｚａｄｅｈ（１９９７ｂ）に記載のとおり実施した。デュプリケートの海馬ニューロン培養物を、０．５ｍｌの結合バッファーで洗浄し、続いて
２％のＢＳＡ、１７ｍｇ／ｌのｄｉｐｒｏｔｉｎＡ（Ｂａｃｈｅｍ，  Ｔｏｒｒａｎｃｅ，  ＣＡ）、１０ｍＭのグルコース、０．００１〜１０００ｎＭのＧＬＰ−１、及び３０，０００  ｃｐｍの１２５Ｉ−ＧＬＰ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，  ＵＫ）を含む０．５ｍｌのバッファー中、４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション終了の時点で、上清を捨て、そして細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、そして０．５ｍｌの、０．５ＭのＮａＯＨ及び０．１％のＳＤＳ中、室温で１０分間インキュベートした。細胞ライセート中の放射活性を、Ａｐｅｃシリーズγカウンター（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，  ＣＡ）えにより計測した。総結合から、大過剰の非標識ＧＬＰ−１（１μＭ）の存在でインキュベートした細胞に関する放射活性を差し引いたものとして、特異的結合を測定した。５０％の結合、ＥＣ５０に関係しているＧＬＰ−１濃度を、ロジットプロット分析によって測定した。
【０１５６】
培養海馬ニューロンへの１２５ＩＧＬＰ−１の結合は、非標識ＧＬＰ−１によって濃度依存的に置き換えられた（図１６Ａ）。結合した１２５ＩＧＬＰ−１の５０％を置き換えるために必要とされるＧＬＰ−１濃度を、ロジットプロット分析によって決定し、培養海馬ニューロンにおいて１４ｎＭのＧＬＰ−１（ｒ＝−０．９９９）の濃度を必要とした。
【０１５７】
ｃＡＭＰの測定
機能性ＧＬＰ−１受容体の存在を証明するために、サイクリックＡＭＰを、Ｍｏｎｔｒｏｓｅ−Ｒａｆｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，の方法に従って計測した（１９９７ａ）。トリプリケートの海馬ニューロンの細胞培養を、１０ｎＭのＧＬＰ−１で処理し、合計で３０分間、薬物処理開始後５分間隔で採集した。薬物処理の開始時（ゼロ分）で採集された細胞を、ｃＡＭＰの基礎レベルに使用した。
【０１５８】
１０ｎＭのＧＬＰ−１による培養海馬ニューロンの処理は、ｃＡＭＰ産生の増加を引き起こした（図１６Ｂ）。刺激の１５分以内にｃＡＭＰレベルの最大で２〜３倍の上昇があり、３０分以内にベースラインの近くに戻った。一元ＡＮＯＶＡは、ｃＡＭＰ産生に対する処理の有意な主効果（Ｆ＝９．４５、ｄｆ＝６，２０、ｐ＜０．００１）を証明した。次のチューキーのＨＳＤ検定を使った連続した多重比較（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ）は、１０（ｐ＜０．０１）及び１５（ｐ＜０．００１）分後のｃＡＭＰ産生の有意な増加を明らかにした。これらのデータは、初代海馬ニューロンが、機能性ＧＬＰ−１受容体を発現し、それを用いてこれらのペプチドの潜在的な保護及び栄養効果を検討するのに適当なインビトロのシステムとなっていることを説明する。
【０１５９】
アポトーシス細胞死
蛍光性ＤＮＡ結合色素Ｈｏｅｓｃｈｔ  ３３３４２を、アポトーシス細胞死を計測するために使用した。ニューロンを、グルタミン酸（１０μＭ）の存在又は不存在下、ＧＬＰ−１（１０ｎＭ）又はｅｘｅｎｄｉｎ−４（０．３μＭ）を伴ったＬｏｃｋｅ’ｓバッファー中で１６時間インキュベートした。使用したＧＬＰ−１の濃度は、ｃＡＭＰの放出を刺激することが証明され、かつ、我々の先のニューロン細胞研究において細胞死を引き起こすことなく分化を誘発した、結合実験によって得られたＥＣ５０値を基にした。細胞を、ＰＢＳ中、４％のパラホルムアルデヒド溶液中で固定し、膜を０．２％のＴｒｉｔｉｏｎＸ−１００によって透過処理した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（１μＭ）との３０分間のインキュベーションに続いて、４０×油浸対物レンズを使ってエピ蛍光照明（３４０ｎｍ励起、５１０ｎｍバリアフィルター）下で核を可視化した。約２００の細胞を、各々の処理条件について少なくとも３枚の別々の皿でカウントし、そして実験を少なくとも２度繰り返した。核ＤＮＡが断片化されるか又は凝集された場合、細胞はアポトーシスであると考えられ、それに対しより拡散した、及び均一な分布の核ＤＮＡをもつ細胞は生き残ったものとみなした。カウントの時点で、調査員は処理群の正体に気付かなかった。凝集又は断片化された核をもつ細胞のパーセンテージを、各々の培養物で測定した。
【０１６０】
初代海馬ニューロンを、１０μＭのグルタミン酸で一晩処理した。固定後、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で染色し、、アポトーシス細胞の数がカウントした。培地のみで培養した細胞において、ニューロンの２３％がアポトーシス核を示した。グルタミン酸処理は、７３％のアポトーシスを生じた（図１６Ｃ）。１０ｎＭのＧＬＰ−１（２４％のアポトーシス細胞）又は０．３μＭのｅｘｅｎｄｉｎ−４（２５％のアポトーシス細胞）のいずれかによる同時処理が、細胞死から完全に保護した（図１６Ｂ）。ＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４単独での処理は、対照レベルのそれを越える、アポトーシス細胞（それぞれ２０％と２３％）のパーセンテージの少しの増加も引き起こさなかった。値は、６つの個々の実験の合併平均を表す。各々の処理条件の結果としてアポトーシスを経験した細胞のパーセンテージを、ＳｔａｔＶｉｅｗ統計ソフトウェア（Ｃａｒｙ，  ＮＣ）を使ってＡＮＯＶＡに供した。有意な主効果に続いて、処理、対、投与の帰納的な比較を、チューキーのＨＳＤ（Ｔｕｋｅｙ’ｓ  Ｈｏｎｅｓｔｌｙ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）検定、合併ＡＮＯＶＡ誤差項、及び自由度を使って得た。一元ＡＮＯＶＡは、各々の障害間の細胞死の程度の著しい有意差を証明し（Ｆ＝３５．３１、ｄｆ＝５，３６、ｐ＜０．００１）、そしてチューキーのＨＳＤ検定（Ｔｃ＝１４．９１及び１８．１６５）を使った連続した多重比較が、グルタミン酸処理後のアポトーシス細胞のパーセンテージについての統計的に有意な増加を明らかにした（ｐ＜０．０１、対照と比べて）。ＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４での培養物の同時処理は、グルタミン酸によって誘発した細胞死から有意に保護した（両方ともｐ＜０．０１、グルタミン酸のみと比べて）。同時グルタミン酸／ペプチド培養物と対照間の有意な差は存在せず、グルタミン酸の効果に対するニューロンの完璧な保護を証明した。
【０１６１】
動物及び外科的処理
各々約３００ｇの体重がある３５匹の生体雄フィッシャー−３４４ラットを、食物及び水を自由摂取できる、制御された明／暗、及び温度条件下で収容した。ラットを、ケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ）とアセプロマジン（０．９１ｍｇ／ｋｇ）で麻酔をかけた。先に記載のとおり定位の手術が実行した。０．１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解したイボテン酸を、１０μｇ／μｌ（０．５μｌ、２箇所）で、内側前脳束の左側支部に注入した；Ｐａｘｉｎｏｓ＆Ｗａｔｓｏｎ（１９９８）によって大脳核と呼ばれた、参考文献を参照のこと。毒素のこの特定の一団の効能に関する先の試験的な調査が、この投与量が、皮質への突起の同程度の減少と共に、脳基底におけるコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）陽性免疫反応性の６０％減少を引き起こしたことを証明した。媒質の注入を受けた２番目のシリーズを、対照として使用した。各々の注入を、２．５分にわたり行い、そしてさらに２．５分がカニューレを引き抜く前の拡散のために与えられた。２週間後、動物を、再度麻酔し、脳室内カニューレを定位的に右側脳室に植え込んだ（ＡＰ＝−０．８ｍｍ、Ｌ＝＋１．４ｍｍ、Ｖ＝−４．０ｍｍ）。
【０１６２】
このカニューレを、カテーテルを介して浸透性ミニポンプ（ＡＬＺＡ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）に付けた。ポンプを、２×１０−８ＭのＧＬＰ−１、２×１０−９Ｍのｅｘｅｎｄｉｎ−４、又は媒質（人工脳脊髄液）で満たした。両ペプチドを媒質で希釈した。このポンプを、１４日間０．２５μｌ／ｈを送り届けるように設定した（合計０．８ｎＭ／ｋｇ／分で５．５４ｎｇのＧＬＰ−１及び０．０８ｎＭ／ｋｇ／分で０．７ｎｇのｅｘｅｎｄｉｎ−４）。脳輸液キットを、挿入術の５〜６時間前に組み立て、そして３７℃で滅菌生理食塩液中に放置した。ミニポンプを、肩甲骨の間の皮下ポケットに挿入し、傷を縫合し、そして動物を回復させた。ＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４の注入を受けた動物は、ペプチドのインシュリン分泌刺激性質の結果として緩やかに失語症（ａｐｈａｇｉｃ）及び無飲症（ａｄｉｐｓｉｃ）となり、体重のわずかな低下をもたらした。
【０１６３】
これは、毎日２度の流体（０．９％の生理食塩液）と柔らかい食事の適用により３〜４日以内に回復し、屠殺のときまで、体重の群間差はなかった。ミニポンプ（１４日）の終了時に、動物に０．１ｍｇ／ｋｇのペントバルビトンナトリウムで最後の麻酔をかけ、そして１５〜２０分間、１００ｍｍ水銀の一定の圧力で、１００〜１５０ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）、その後２５０〜３５０ｍｌの、ＰＢＳ中、４％のパラホルムアルデヒド溶液を心臓経由で灌流した。脳を、免疫細胞化学的評価、並びに病変によって誘発した損害及び前脳基底核のコリン作用性の分担に対するペプチド注入に関して得られた効果の全ての定量化のために採取した。
【０１６４】
免疫組織化学
隣接する前頭面に沿った脳切片を、病変部位を通して４０μｍの厚さで得、そして処理したＣｈＡＴについて；１：１００希釈のポリクローナルヤギ抗ＣｈＡＴ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．，  Ｔｅｍｅｃｕｌａ，  ＣＡ）を使って、及びグリア繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）について；１：７５０希釈のポリクローナルウサギ抗ＧＦＡＰ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を使って、比較的自由に処理した。アビジン−ビオチン／セイヨウワサビペルオキシダーゼプロトコルを使って、陽性の免疫反応性の可視化を行った。さらに、一組の切片を、Ｇｅｕｌａ  ａｎｄ  Ｍｅｓｕｌａｍ，  １９８９によって、修飾された方法を使って前脳基底核のコリン作用性ニューロンについて細胞化学的マーカーとしてのアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）活性について染色した。追加の一組の切片を、ゼラチンコートされたスライド上へのせ、クレシルバイオレットで染色して細胞体を可視化した。
【０１６５】
前脳部部分のＣｈＡＴ陽性免疫反応性細胞体を、×１００の倍率下で可視化し、両側について手作業でカウントした。未加工のカウントを、この部分内の細胞体の総数の評価のためのＡｂｅｒｃｒｏｍｂｉｅ（１９４６）の公式で補正した。イボテン酸病変の結果としての前脳基底核における細胞損失の特徴づけを、右（注入側）に対する左（病変側）カウント、及びパーセント変化として示されたデータの比較によって行われた。細胞のカウントを実験条件に外観的に導かないように動物の名前をコード化した。差異を、分散分析、及び先の通りチューキーのＨＳＤ検定を使って帰納的な比較に供した。有意性を、全ての統計分析についてｐ＜０．０５で受け入れた。
【０１６６】
イボテン酸で誘発されたコリン作用性マーカーの欠損
コリンアセチルトランスフェラーゼ免疫反応性を、前脳基底核全体にわたるコリン作用性ニューロンのマーカーとして使用した。ＣｈＡＴ抗体は、類似したサイズとアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）陽性細胞への分布をもつ非常に多数の大きな多極ニューロンを染色した。免疫細胞化学的染色は、低いバックグラウンドをもち、かつ、細胞形態の明確な写真を提供した（図１７）。媒質の連続注入を伴うイボテン酸の注入は、左大脳核の注射部位から約１ｍｍ半径のＣｈＡＴ−免疫反応性ニューロンの大幅な（４３％）損失をもたらした（図１８、棒グラフ４）。媒質注入を受けたシャム手術対照群は、右大脳核に対する左大脳核のＣｈＡＴ陽性細胞体のパーセンテージの増加を示した（図１８、棒グラフ１）。ＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４注入を受けたイボテン酸損傷動物は、媒質の注入を受けたそれらの損傷動物に対して左大脳核におけるＣｈＡＴ−免疫反応性細胞体の損失の減少をもたらした。より特に、ｅｘｅｎｄｉｎ−４の注入は、媒質注入に続いて現れた４３％から大脳核のそれのたった２４％未満まで、左大脳核のＣｈＡＴ−免疫反応性細胞体の損失の減少をもたらした（図１８、棒グラフ５）。さらに、ＧＬＰ−１注入は、右大脳核のそれのたった６％未満まで左大脳核のＣｈＡＴ陽性免疫反応性細胞体の損失を減少させる、より多くの顕著な逆転を成し遂げた（図１８、棒グラフ６）。標準ＡＮＯＶＡは、処理条件についての全体的な有意な効果を証明した（Ｆ＝２１．３６３、ｄｆ＝５，２８、ｐ＜０．００１）。ペプチド、対、媒質処理の多重比較（Ｔｃ＝１４．１４及び１９．７１）は、イボテン酸による病変の後のｅｘｅｎｄｉｎ−４（ｐ＜０．０５）、及びＧＬＰ−１（ｐ＜０．０１）の注入を受けて左大脳核におけるＣｈＡＴ免疫反応性の有意な改善を明らかにした。イボテン酸による病変後のＧＬＰ−１注入であっても、右側とほぼ対等の値を実現するまで、左大脳核のＣｈＡＴ陽性細胞の損失を減少させ、全体的なパーセント差異は、シャム媒質群より有意に低いままであった（ｐ＜０．００１）。媒質注入を受けたシャム群（ｓｈａｍ  ｇｒｏｕｐ）のＣｈＡＴ−免疫反応性のかなりの増加のため、これは適当である（図１８、棒グラフ１）。
【０１６７】
シャム媒質群（表６）に関して左と右のＣｈＡＴ陽性免疫反応性ニューロンのカウントを分けることは、左（５８６±３２）と右（４７８±４０）の大脳核ＣｈＡＴ−陽性細胞カウント（ｐ＜０．０１）の間の有意差を明らかにした。カニューレ挿入術及び処理デリバリーからの圧力の影響は、右大脳核のＣｈＡＴ免疫反応性の見かけ上の減少の原因である。これらの観測は、組織完全性のあらゆる妨害が、緩やかであるか又は非特異的に、ＣｈＡＴ免疫反応性の機能性崩壊を引き起こしうることを示唆する。さらに、そのような効果が、媒質注入を受けたイボテン酸群におけるＣｈＡＴ陽性免疫反応性の予想したパーセント損失より低い原因である（図１８、棒グラフ４）。群の「中」（すなわち、左対右）を比較するより、さらにこれを検査するために、群の「間」の比較を、シャムａＣＳＦとイボテン酸ａＣＳＦ群（それぞれ、５８６±３２及び２６０±２８）について右大脳核カウント（Ｆ＝６．１３６、ｄｆ＝５，２８、ｐ＜０．００１；表６）を実施した。この群間比較は、ＣｈＡＴ免疫反応性の５６％の損失を明らかにした。これらのデータは、右大脳核の非特異的な損傷が、比較を個々の実験群内で行った場合に全体的なパーセント損失に影響するＣｈＡＴ免疫反応性細胞体の数の減少を引き起こしたことを示す。さらに、右大脳核のＣｈＡＴ陽性細胞カウントを別々に分析したとき、群間の有意な違いがなく（Ｆ＝０．５１２、ｄｆ＝５，２８、ｐ＞０．０５；表６）、組織完全性のそのような崩壊が等しく全ての実験群に影響したことを示唆した。
【表５】
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【実施例１３】
【０１６８】
実施例１３．グルカゴン様ペプチド−１は、アミロイド−βペプチド（Ａβ）産生を減少させ、かつ、Ａβ及び鉄によって誘発された死からニューロンを保護する
Ａβ１−４２又はＦｅ２＋で誘発した細胞死に続くＧＬＰ−１及び／又はｅｘｅｎｄｉｎ−４の保護効果、並びにインビトロにおける、分泌型と細胞内型の間のβＡＰＰプロセッシングに対するＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、及びｅｘｅｎｄｉｎ−４ＷＯＴの効果、そして最終的に、対照マウスにおけるインビボでのＡβペプチドのレベルを試験した。
【０１６９】
培養条件
他の箇所で記載のとおり、ＰＣ１２細胞を、１０％の熱不活化ウマ血清、５％の熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、及び２５ｍＭのＨｅｐｅｓバッファーを補ったＲＰＭＩ  １６４０中で培養した（Ｌａｂｉｒｉ  ｅｔ．  ａｌ．，  ２０００）。全ての培地及び血清を、ＭｅｄｉａＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．  （Ｈｅｒｎｄｏｎ，  ＶＡ）から入手した。細胞を、ラットの尾のコラーゲンでコートした培養器（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）に、約２．０×１０６細胞／６０ｍｍで蒔いた。細胞が十分に接着するとすぐに、播種した２４時間後に処理をトリプリケートで開始した。前記培地を吸引し、適当な化合物を伴った０．５％のＦＢＳを含む、３ｍｌの新鮮な低血清培地を加えた。細胞を、ＧＬＰ−１（３．３、３３及び３３０μｇ／ｍｌ）（Ｂａｃｈｅｍ，  Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，  ＣＡ）、及び２つのＧＬＰ−１アナログ、ｅｘｅｎｄｉｎ−４（０．１、１．０及び１０μｇ／ｍｌ）及びｅｘｅｎｄｉｎ４−ＷＯＴ（０．１及び１．０μｇ／ｍｌ）で処理した。ＮＧＦ（５、１０、２５及び５０ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）によるＰＣ１２細胞の処理を、正の対照として使用した。さらに、５ｎｇ／ｍｌのＮＧＦと０．１μｇ／ｍｌのｅｘｅｎｄｉｎ−４を、組み合わせて同時に加えた。Ｅｘｅｎｄｉｎ−４及びそのアナログのｅｘｅｎｄｉｎ４−ＷＯＴを、合成し、そして高速液体クロマトグラフィー分析によって９５％超純粋であると評価した。
【０１７０】
毒性分析
処理が誘発した細胞毒性を、処理及び未処理のＰＣ１２細胞由来の調整培地の両方で（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ製のＬＤＨキットを使って）分泌された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）レベルの分析によって検査した。予想どおり、ＬＤＨレベルは、薬物処理の開始時点で採取した培地標準に対して上昇した（図１９Ａ）。分散分析は、ＬＤＨ分泌に対する処理の全体的な有意な効果を証明した（Ｆ＝２．２２、ｄｆ＝１１，３５、ｐ＜０．００１）。チューキーのＨＳＤ検定（Ｔｃ＝０．４２，及び０．５１）を使った対照との帰納的な連続した多重比較が、１０μｇ／ｍｌのＥｘ４処理に続くＬＤＨ分泌の単一の有意な増加を明らかにした（１．６５倍上昇；ｐ＜０．０１）。使用した投与量及び時点での、ＧＬＰ−１及びアナログでの処理の結果としての毒性の可能性は；１０μｇ／ｍｌのｅｘｅｎｄｉｎ−４を除いて、外されうる。これは、合計細胞数で全く有意な変化を証明しなかったＧＬＰ−１処理前後に実行した（トリパンブルーによる染色後の）細胞カウントによってさらに実証された。
【０１７１】
ウエスタン分析
３日間の処理に続いて、未処理（低血清培地のみ）及び処理ＰＣ１２細胞由来の調整培地及び（前記のとおり調製された）細胞ライセートを、モノクローナル抗体、２２Ｃ１１（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）を使ったウエスタン免疫ブロット分析に供した。そのエピトープ部位が外形質のシステイン含有ドメイン内の第６６〜８１残基に割り当てられたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生βＡＰＰに対して産生された抗体は、細胞膜で見出されるβＡＰＰの全ての成熟型、及び調整培地中に分泌されるカルボキシル切り詰め可溶性型及びβＡＰＰ様タンパク質（ＡＰＬＰ）を認識する。免疫反応産物の可視化を、化学発光によって行い、ゆえに分子量マーカーは写真用フィルム上で見えなかった。ＰＶＤＦ膜上に目に見える標準分子量マーカーを重ねることによって発光性の産物の分子量の特定を達成した。ＮＩＨイメージを使ってタンパク質バンドの濃度測定による定量化を実施した。
【０１７２】
処理又は未処理細胞由来の細胞ライセートのウエスタン免疫ブロットは、成熟したβＡＰＰ（βＡＰＰ６９５−βＡＰＰ７７０）の異なるイソフォーム及び／又はそれらの翻訳後修飾された誘導体を表すであろう、複数のより高分子量タンパク質バンド（１００〜１４０  ｋＤａ）を明らかにした。分泌されたＡＰＰを、α−又はβ−セクレターゼによって産み出されたβＡＰＰ誘導体を表すであろう、１１０〜１２０  ｋＤａのタンパク質バンドとして処理及び未処理細胞由来の調整培地中に検出された。細胞内タンパク質のイムノブロットにおける免疫反応性バンドの特徴で観察されている差異は、同じブロットにおける（ヒトβ−アクチンのカルボキシル末端の特定の部位に対して産生されたポリクローナルβ−アクチン抗体；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＣＡを使った）同等のβ−アクチン免疫反応性染色によって証明されるとおり、ゲル内のタンパク質の不均一な添加のためでも、膜上へのタンパク質の移行のむらがあるためでもない。可視反応産物を、ビオチン化二次抗体を使ってＰＶＤＦ膜上に直接産生した。これにより、標準分子量マーカーが目視でき、４２  ｋＤａの単一のタンパク質バンドとしてβ−アクチンを確認した。等量の総タンパク質を、ゲルの各々のレーンに添加し、５％の酢酸中、０．１％のＰｏｎｃｅａｕＳにより膜を染色することによって電気泳動トランスファーの効率を観察した。
【０１７３】
βＡＰＰ及びｓＡＰＰブロットの濃度測定による定量化を、それぞれ図１９Ｂ及びＣに示す。定量化βＡＰＰレベル（上の２個の高分子量バンド）の一元ＡＮＯＶＡは、処理の全体的な有意な効果を証明した（Ｆ＝２．２４；ｄｆ＝１１，３４；ｐ＜０．００１）。対照との多重比較を、チューキーのＨＳＤ検定（Ｔｃ＝４７．０及び５５．７５）を使って行ない、両投与量；５ｎｇ／ｍｌ（図１９Ｂ、棒グラフ１；ｐ＜０．０１）及び１０ｎｇ／ｍｌ（図１９Ｂ、棒グラフ２；ｐ＜０．０１）のＮＧＦでの処理に続くβＡＰＰの細胞内レベルの増加を明らかにした。ＮＧＦとは対照的に、ＧＬＰ−１及びアナログは、βＡＰＰの細胞内レベルを大幅に減少させた（図１９Ｂ）；１０ｎｇ／ｍｌのＥｘ４、棒グラフ５（ｐ＜０．０１）、１．０ｎｇ／ｍｌのＥｘ４−ＷＯＴ、棒グラフ１０（ｐ＜０．０１）、３．３ｎｇ／ｍｌのＧＬＰ−１、棒グラフ１１（ｐ＜０．０１）、３３μｇ／ｍｌのＧＬＰ−１、棒グラフ１２（ｐ＜０．０５）、及び３３０ｎｇ／ｍｌのＧＬＰ−１、棒グラフ１３（ｐ＜０．０１）。５ｎｇ／ｍｌのＮＧＦと０．１ｎｇ／ｍｌのＥｘ４の組み合わせ処理は、未処理細胞に対して細胞内βＡＰＰレベルを大幅に増加させた（図１９Ｂ、棒グラフ６；ｐ＜０．０１）。
【０１７４】
調整培地中に検出されたβＡＰＰタンパク質の定量化された分泌可溶性誘導体の分析は、処理の全体的な有意な効果を明らかにした（Ｆ＝２．２２、ｄｆ＝１１，３５、ｐ＜０．００１）。連続した多重比較（Ｔｃ＝２０．１１及び２３．９１）は、両投与量のＮＧＦ処理がｓＡＰＰの有意な増加をもたらすことを明らかにした（５ｎｇ／ｍｌと１０ｎｇ／ｍｌ（両方ｐ＜０．０１）；図１９Ｃ、棒グラフ１−２）。細胞内βＡＰＰに類似したパターンに続く、全ての投与量のＧＬＰ−１（３．３μｇ／ｍｌ（ｐ＞０．０５）、３３μｇ／ｍｌ（ｐ＜０．０１）及び３３０μｇ／ｍｌ（ｐ＜０．０１）；図１９Ｃ、棒グラフ９−１１）、Ｅｘ４（０．１μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌ（全てｐ＜０．０１）；図１９Ｃ、棒グラフ３−５）、並びにＥｘ４−ＷＯＴ（０．１μｇ／ｍｌ及び１．０μｇ／ｍｌ（両方ｐ＜０．０１）；図１９Ｃ、棒グラフ７−８）が調整培地中のｓＡＰＰの検出可能なレベルの減少を引き起こした。ＮＧＦとＥｘ４の組み合わせ処理は、対照細胞のそれからの、ｓＡＰＰレベルのあらゆる有意な変化を引き起こすことはなかった（図１９Ｃ、棒グラフ６）。
【０１７５】
ＧＬＰ−１処理に続くβＡＰＰレベルの低下が分泌Ａβ１−４０レベルの低下を推定させることができるかどうか調査するために、調整培地サンプルをＡβ１−４０についてアッセイした。我々は、先にＰＣ１２細胞におけるＡβ１−４２の非常に低い基礎分泌レベルを証明し、そして一般に検出可能な処理の誘発した効果は有意性に至らない。さらに、が分泌した主なＡβペプチドは、Ａβ１−４０であり、そして神経芽細胞腫細胞を使った類似した研究で（Ｌａｈｉｒｉ  ｅｔ．  ａｌ．，  １９９８）、Ａβ１−４０レベルがＡβ１−４２に対する効果を反映し、Ａβ１−４２の特異的な変化を捜す必要をなくしていた。定量化されたＡβ１−４０レベルを、一元ＡＮＯＶＡに供し、処理の全体的な有意な効果を説明した（Ｆ＝２．２２、ｄｆ＝１１，３５、ｐ＜０．００１）。チューキーのＨＳＤ検定（Ｔｃ＝６９．９１及び８３．１３）を使った多重比較が、ＮＧＦのみの（両方ｐ＜０．０１）又はｅｘｅｎｄｉｎ−４との組み合わせでの（ｐ＜０．０１）処理に続くＡβ１−４０レベルの有意な増加を明らかにした。ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、又はｅｘｅｎｄｉｎ−４  ＷＯＴのみの処理は、対照細胞のそれからＡβ１−４０産生レベルを大幅に変えなかった。
【０１７６】
正常な対照マウスにおけるＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ＮＧＦ、又は媒質の脳室を経由した注入に続くＡβ１−４０レベルについて、脳全体のホモジェネートをアッセイした。動物を、食物と水を自由摂取可能な、明／暗及び温度条件の管理下に収容した。痩せたｄｂ＋／ｄｂ＋対照雄マウス（ｎ＝２４）を、５０ｍｇ／ｋｇペントバルビトンで麻酔し、側頭骨カップホルダーを使ったマウスアダプターをもつ定位の外科フレーム（Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｔｕｊｕｎｇａ，  ＣＡ）に置いた。ＧＬＰ−１（３．３μｇ；ｎ＝３及び６．６μｇ；ｎ＝４）、ｅｘｅｎｄｉｎ−４（０．２μｇ；ｎ＝３）、ＮＧＦ（２μｇ；ｎ＝５）又は媒質（人工脳脊髄液；ｎ＝９）を、４分間にわたり０．２５μｌ／ｍｌで両側の側脳室内に注入した（ＡＰ＝−０．２ｍｍ、Ｌ＝±１．０ｍｍ、Ｖ＝−２．５ｍｍ）。カニューレが引き抜く前に、追加の４分間で拡散させ、動物を縫合し、そして回復させた。４８時間後に、全ての動物を、頸部脱臼によって屠殺し、脳を取り出し、そして液体窒素中で急冷した。脳を粉砕し、Ａβについてアッセイする前に−８０℃で保存した。
【０１７７】
Ａβ分析
サンドイッチＥＬＩＳＡを使って等量の調整培地及び脳全体のホモジェネートを、Ａβ１−４０についてアッセイした（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ．  ａｌ．，  １９９４）。モノクローナル抗体ＢＡＮ５０（Ａβ１−１６に対して産生された）を全ての種類のＡβ（Ａβ１−４０とＡβ１−４２）のための捕獲抗体として使用し、モノクローナル抗体ＢＡ２７を、Ａβ１−４０レベルの特異的な検出のために使用した。アッセイと並行して行なわれた適当な標準曲線から推論されるように、Ａβ１−４０のレベルを、調整培地サンプルに関するｐＭ濃度で、そしてマウス脳ホモジェネートに関してｆｍｏｌ／ｇで表した。
【０１７８】
全ての処理が、媒質と比べてＡβ１−４０のレベルを減少させた（図２０）。処理の有意な主な効果に続く多重比較（Ｆ＝１０．５７７、ｄｆ＝４，１９、ｐ＜０．００１）が、Ａβ１−４０レベルが６．６μｇのＧＬＰ−１（３６％、ｐ＜０．０１）及び２μｇのＮＧＦ（４０％、ｐ＜０．０１）処理に続いて減少させたことを証明した。全ての他の比較は、有意性に至らなかった；３．３μｇのＧＬＰ−１（１６％）、０．２μｇのｅｘｅｎｄｉｎ−４（２３％）（Ｔｃ＝１３９．００及び１７２．３４、独特な群サイズに関する調和平均補正を使った）。
【０１７９】
初代海馬細胞培養
海馬を発生初期１８日目のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから取り出し、細胞を軽いトリプシン処理及び粉砕によって分離し、そして約１５０細胞／ｍｍ２培養面積の密度で、ポリエチレンイミンによって表面をコートしたプラスチック製の直径３５ｍｍの皿上に播種した。培養物を、３７℃で、６％のＣＯ２／９４％の大気雰囲気中、Ｂ−２７サプリメン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ  ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのＨｅｐｅｓ、及び０．００１％の硫酸ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で維持した。これらの条件下で維持されるとき、ニューロン抗原ＮｅｕＮ及び神経膠星状細胞タンパク質グリア繊維酸性タンパク質に対する抗体で免疫染色することによって測定されるように、この海馬培養物は、約９５％のニューロンと５％の神経膠星状細胞から成る。Ａβ１−４２を、Ｂａｃｈｅｍ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，  ＣＡ）から購入し、滅菌水中に１ｍＭの原液として調製した。ＦｅＳＯ４を、滅菌水中に２００μＭの原液として調製した。ＧＬＰ−１及びｅｘｅｎｄｉｎ−４を、生理食塩液中に５００×の原液として調製した。
【０１８０】
先に記載のとおり、ニューロンの生存を定量化した（Ｍａｒｋ  ｅｔ．  ａｌ．，  １９９７）。要するに、前もって指示された領域（１０×対物レンズ）中の生存ニューロンを、実験的な処理の前、及びその後の所定の時点でカウントした。海馬ニューロンを、ＧＬＰ−１（０、１、５、１０及び２０ｎＭ）又はｅｘｅｎｄｉｎ−４（０、５０、１００、２００及び５００ｎＭ）によって２時間前処理した。次に、培養物を、２μＭのＡβ１−４２又は１μＭのＦｅ２＋に２４時間晒した。均一な直径の無傷な神経突起をもつニューロンと、滑らかな丸い外観をもつ細胞体を、生細胞とみなし、それに対し断片化された神経突起をもつニューロンと、空胞化した細胞体を死細胞とみなした。カウントは、培養物の処理歴の知識なしに行った。
【０１８１】
Ａβ１−４２又は鉄（ヒドロキシルラジカル産生と膜脂質過酸化を誘発する）への培養海馬細胞の暴露は、２４時間の間のニューロンの５５〜７５％の死をもたらした。ＧＬＰ−１又はｅｘｅｎｄｉｎ−４がＡβ１−４２及び／又はＦｅ２＋によって誘発された細胞死からニューロンを保護することができるかを判断するために、高濃度のＧＬＰ−１及びｅｘｅｎｄｉｎ−４で細胞を前処理し、そしてＡβ１−４２又はＦｅ２＋に晒した。ＧＬＰ−１は、Ａβ１−４２及びＦｅ２＋によって誘発された死からニューロンを保護し、最大の効果は１０ｎＭのＧＬＰ−１で生じた。同様に、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、Ａβ１−４２及びＦｅ２＋によって誘発された死からニューロンを保護したが、しかし作用は弱く、最大の効果は２００ｎＭのｅｘｅｎｄｉｎ−４で生じた。
【０１８２】
本願出願全体にわたって、様々な刊行物が参照される。これらの刊行物の開示の全体を、本願発明に関する最先端のものをより完全に記載するために本願出願中に援用する。
【０１８３】
本発明の範囲又は本質から逸脱することなく様々な修飾及び変異が本発明によって作製されうることは、当業者にとって明白である。本発明の他の実施形態は、当業者にとって明細書の考慮及び本明細書中に開示された本発明の実施から明白である。前記明細書及び実施例は典型としてのみ考慮されることを意図し、真の本発明の範囲及び本質は請求項によって示される。
【０１８４】
【化１】
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【０１８５】
【化２】
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【０１８６】
【化３】
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【０１８７】
【化４】
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【０１８８】
【化５】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【配列表】
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