(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基種毎に標識化された分析対象の核酸試料を電気泳動する流路と、
前記流路で電気泳動される前記核酸試料について、前記塩基種毎の標識信号を検出して検出強度の波形データを生成する波形データ形成部と、
前記塩基種毎に前記波形データのピーク値の検出を行うピーク検出部と、
前記各ピーク位置について所定の条件で対応する少なくとも一つの他のピーク位置を選択し、各ピーク位置の信号強度の、前記選択した他ピーク位置の信号強度に対する相対信号強度を算出する相対信号強度算出部と、
前記分析対象の核酸試料の相対信号強度と、予め格納された既知の核酸試料の相対信号強度である既知相対信号強度と、を各ピーク位置において比較して、前記分析対象の核酸試料の塩基配列座標位置における各塩基種の存在に関する情報を生成する分析部と、を備える、
ことを特徴とする遺伝子分析装置。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子分析装置であって、
前記分析部は、
前記分析対象の核酸試料の相対信号強度と、前記既知相対信号強度と、を各ピーク位置において比較して、同一塩基列上の座標位置の前記塩基種の存在比を算出する、ことを特徴とする遺伝子分析装置。
【請求項３】
請求項１に記載の遺伝子分析装置であって、
前記分析部は、
前記分析対象の核酸試料の相対信号強度と、前記既知相対信号強度と、を各ピーク位置において比較して、前記核酸試料の遺伝子変異の分析を行う、ことを特徴とする遺伝子分析装置。
【請求項４】
請求項１に記載の遺伝子分析装置であって、
更に、前記既知相対信号強度を予め格納した記憶部を備える、ことを特徴とする遺伝子分析装置。
【請求項５】
請求項１に記載の遺伝子分析装置であって、
前記相対信号強度算出部は、
少なくとも前記ピークに隣接するピークを前記他ピークとして選択して前記相対信号強度の算出を行う、ことを特徴とする遺伝子分析装置。
【請求項６】
請求項１に記載の遺伝子分析装置であって、
前記分析部は、
前記相対信号強度の平均値又は標準偏差に基づいて前記核酸試料の塩基配列を判定する、ことを特徴とする遺伝子分析装置。
【請求項７】
請求項１に記載の遺伝子分析装置であって、
前記分析部は、
非メチル化シトシンCをウラシルUに変換した前記核酸試料について、前記相対信号強度に基づいてＤＮＡメチル化の有無を判定する、ことを特徴とする遺伝子分析装置。
【請求項８】
塩基種毎に標識化された分析対象の核酸試料を電気泳動し、
前記電気泳動される前記核酸試料について、前記塩基種毎の標識信号を検出して検出強度の波形データを生成し、
前記塩基種毎に前記波形データのピーク値の検出を行い、
前記各ピーク位置について所定の条件で対応する少なくとも一つの他のピーク位置を選択し、各ピーク位置の信号強度の、前記選択した他ピーク位置の信号強度に対する相対信号強度を算出し、
前記分析対象の核酸試料の相対信号強度と、予め格納された既知の核酸試料の相対信号強度である既知相対信号強度と、を各ピーク位置において比較して、前記分析対象の核酸試料の塩基配列座標位置における各塩基種の存在に関する分析を行う、
ことを特徴とする遺伝子分析方法。
【請求項９】
請求項８に記載の遺伝子分析方法であって、
前記分析対象の核酸試料の相対信号強度と、前記既知相対信号強度と、を各ピーク位置において比較して、同一塩基列上の座標位置の前記塩基種の存在比を算出する、ことを特徴とする遺伝子分析方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の遺伝子分析方法であって、
前記分析対象の核酸試料の相対信号強度と、前記既知相対信号強度と、を各ピーク位置において比較して、前記核酸試料の遺伝子変異の分析を行う、ことを特徴とする遺伝子分析方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の遺伝子分析方法であって、
少なくとも前記ピークに隣接するピークを前記他ピークとして用いて前記相対信号強度の算出を行う、ことを特徴とする遺伝子分析方法。
【請求項１２】
請求項８に記載の遺伝子分析方法であって、
前記相対信号強度の平均値又は標準偏差に基づいて前記核酸試料の塩基配列を判定する、ことを特徴とする遺伝子分析方法。
【請求項１３】
請求項８に記載の遺伝子分析方法であって、
前記核酸試料の非メチル化シトシンCをウラシルUに変換し、
前記変換後の前記核酸試料について前記相対信号強度を算出し、
前記算出した前記相対信号強度に基づいてＤＮＡメチル化の有無を判定する、ことを特徴とする遺伝子分析方法。
【請求項１４】
塩基種毎に標識化された分析対象の核酸試料の電気泳動により前記塩基種毎の標識信号を検出し、検出強度の波形データを生成する計測装置と、
既知の核酸試料の塩基配列に関する情報を格納するデータベースと、
前記計測装置と、前記データベースと、に接続可能で、前記計測装置から取得した前記波形データのピーク検出を前記塩基種毎に行い、前記各ピーク位置について所定の条件で対応する少なくとも一つの他のピーク位置を選択し、各ピーク位置の信号強度の、前記選択した他ピーク位置の信号強度に対する相対信号強度を算出し、前記分析対象の核酸試料の相対信号強度と、前記データベースから取得する既知の核酸試料の相対信号強度である既知相対信号強度と、を各ピーク位置において比較して、前記分析対象の核酸試料の塩基配列座標位置における各塩基種の存在に関する情報を生成するデータ解析装置と、を備える、
ことを特徴とする遺伝子分析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子変異の分析方法および遺伝子変異の分析装置、分析システム、分析方法に関する。特に、標的遺伝子の核酸試料から得られる蛍光強度波形データを解釈して、核酸試料の塩基配列座標位置における各塩基種の存在に関する分析を行う分析装置、分析システム、分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNA塩基配列を解読する方法として、サンガー法を用いた核酸の断片化技術、核酸断片の蛍光標識技術、高解像度の電気泳動技術、さらに高感度の蛍光検出技術を組み合わせたDNAシーケンシング法が広く用いられている。【０００３】
上記DNAシーケンシング法は、まず初めに塩基配列を解読したいDNA(鋳型DNA)を用意し、鋳型DNAの一部の配列と相補的な配列を持つプライマーを用いて鋳型DNAの複製反応を行う。その際、反応溶液中にデオキシヌクレオチドと共に鎖停止ヌクレオチドとしてジデオキシヌクレオチドを所定の割合で混合しておくと、ジデオキシヌクレオチドの取込位置で合成反応が停止するため、様々な塩基長の核酸断片が生成される。ここで、プライマーまたはジデオキシヌクレオチドを塩基種毎に異なる色の蛍光色素で標識しておくと、各核酸断片はその末端塩基に応じた色素で標識される。このようにして作成した核酸断片を、キャピラリー電気泳動装置等を用いて泳動させることにより塩基長毎に分離する。泳動の終端で核酸断片にレーザを照射し、各断片の末端塩基から発生する蛍光を検出器により測定する。電気泳動では短い核酸断片ほど速く移動するため、経時的な蛍光測定データとして、塩基配列に対応した蛍光強度波形データが得られる。【０００４】
上記DNAシーケンシング法を用いたDNAシーケンサは、蛍光強度波形データの各ピーク位置での４種類の蛍光信号の強さを比較することにより塩基配列の決定を行う装置である。【０００５】
ヒトなどのゲノムの塩基配列には１塩基多型と呼ばれる遺伝子変異が存在することが知られている。親から子へ遺伝する性質を持つ先天的な遺伝子変異は生殖細胞系列変異と呼ばれる。ヒトを含む多くの生物のゲノムは2倍体で構成されているため、生殖細胞系列変異については、個体内や細胞内に2種の塩基がそれぞれ50%の比率で存在する。このような１塩基多型が存在する領域を上記DNAシーケンサで分析した場合、蛍光強度波形データの１塩基多型該当位置には、2種の塩基に相当する蛍光信号ピークが同時に検出される。【０００６】
しかしながら前述したシーケンシング法では、しばしば前記多型の判定や塩基配列の決定が困難となる蛍光強度波形データが得られる場合がある。その原因としては、核酸試料の量が少なく信号強度が弱い場合や、核酸断片の高次構造等によって余分な信号成分が発生する場合、化学処理時や電気泳動時の条件によって信号に歪みが生じる場合等が考えられる。【０００７】
実際の核酸試料の塩基配列決定においては、ある特定遺伝子の遺伝子変異を調べる場合のように、当該核酸試料の塩基配列の少なくとも一部が既知である場合が少なくない。このような既知の塩基配列が存在する場合、既知の塩基配列から得られた蛍光強度波形データの情報を何らかの方法により参照して新規に取得した蛍光強度波形データを解釈することが可能となる。このような既知の塩基配列が存在する場合、特許文献１や特許文献２に開示されるように、既知の塩基配列から得られた蛍光強度波形データの情報を何らかの方法により参照して新規に取得した蛍光強度波形データを解釈することが可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2002-055080号公報
【特許文献２】特開2005-031051号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
近年のゲノム解析技術の発展により、ヒトの様々な疾患と遺伝子変異の関連性が解明されてきており、遺伝子情報を活用した医薬品開発が行われている。例えば、がんは遺伝子変異がその発症の要因であり、すでに一部の治療薬の選択や処方量の決定に患者個人の遺伝子検査が保険適用されている。【００１０】
がん等の疾患に由来する後天的な遺伝子変異は、先に記載した生殖細胞系列変異に対し、体細胞系列変異と呼ばれる。体細胞系列変異は、ゲノム上での変異発生位置が予測できないこと、また、個体内や組織内における変異存在比率が予測できないことが特徴である。例えば、がん患者から切除したがん組織試料にはがん細胞と正常細胞が含まれ、さらにがん細胞間においても遺伝子変異に多様性があるために、ある特定遺伝子のある特定位置に遺伝子変異を有する細胞の試料中存在比率は、非常に低い場合がある。従って、体細胞系列変異を検出するためには、生殖細胞系列変異に対するよりも高感度な検出方法が必要である。【００１１】
治療方法や治療薬の選択においては、標的遺伝子のある特定位置の遺伝子変異の有無だけではなく、その存在比率を指標とする場合もある。このため、遺伝子変異の高感度な検出に加えて、その存在比率の定量化も重要となる。サンガー法を用いた従来のDNAシーケンサは塩基配列の決定を目的としていたため、微量に存在する体細胞系列遺伝子変異の検出力が不十分であること、またその存在比率を定量できないことが大きな課題であった。【００１２】
さらに、遺伝子配列の変異を伴わない遺伝表現型変異の一つとしてDNAメチル化修飾があり、細胞の発生分化や細胞がん化によってDNAメチル化修飾状態が変化することが知られている。このため、メチル化修飾された塩基配列の位置とその修飾割合を簡便に検出する方法が期待されている。【００１３】
先に記載の特許文献1には、多型の判定と塩基配列の決定を行う際に、蛍光強度波形データの各ピーク位置での信号強度に対する規格化処理を、当該ピーク位置で最大の信号強度を有する塩基種の信号強度を規格化基準として行う方法が提示されている。この規格化方法では、当該位置に変異が存在し、且つその存在比率が一定でない場合、各塩基種の信号強度の定量性が保てない。【００１４】
また、先に記載の特許文献2には、蛍光強度波形データの信号強度に対する規格化処理を、蛍光強度波形データ中の全ピークの平均強度を規格化基準として行う方法が提示されている。しかしながら、蛍光強度波形データ中のピーク強度は波形データ全体で変動し、またその変動の様子はデータ間で異なる。このため、全ピークの平均強度を基準とした規格化方法では、個別のピークの信号強度の規格化精度が不十分となる。特許文献2では主要な塩基配列の決定を目的としていたため規格化精度は大きな問題ではなかったが、遺伝子変異の検出やその存在比率の定量を目的とする場合には、不十分な規格化精度は検出感度の低下や定量精度の悪化の原因となる。【００１５】
本発明は、このような従来技術の問題点に鑑み、微量に存在する体細胞系列遺伝子変異に対しても、遺伝子変異に関する情報を高感度、高精度に得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上述した課題の少なくとも一の課題を解決するための本発明の一態様として、塩基種毎に標識化された分析対象の核酸試料を電気泳動し、塩基種毎の標識信号を検出して検出強度の波形データを生成し、塩基種毎の前記波形データの各ピーク位置について他のピーク位置を選択し、各ピーク位置の信号強度の、選択した他ピーク位置の信号強度に対する相対信号強度を算出し、分析対象の核酸試料の相対信号強度と、既知の核酸試料の相対信号強度と、を各ピーク位置において比較して核酸試料の塩基配列座標位置における各塩基種の存在に関する分析を行う。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、標的とする遺伝子領域に存在する微量な遺伝子変異に関する情報を高感度、高精度に取得することを実現する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明が適用される遺伝子変異分析システムの構成例を示す図。
【図２】遺伝子変異分析装置の計測部の例を示す図。
【図３】塩基配列を決定する際に蛍光強度波形データに対して行う処理を示す図。
【図４】蛍光強度波形データの例を示す図。
【図５】遺伝子変異を検出するための相対信号強度情報を取得する処理の一例を示す図。
【図６】既知情報データベースに保存する遺伝子変異を検出するための相対信号強度情報の一例を示す図。
【図７】本発明における遺伝子変異の検出処理の一例を示す図。
【図８】遺伝子変異存在比率を推定するための相対信号強度情報を取得する処理の一例を示す図。
【図９】本発明が適用される遺伝子変異分析装置の構成例を示す図。
【図１０】本発明における遺伝子変異存在比率の推定処理の一例を示す図。
【図１１】既知情報データベースに保存する遺伝子変異存在比率を推定するための相対信号強度情報の一例を示す図
【図１２】本発明による遺伝子変異存在比率情報の表示例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。ただし、本実施形態は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明を限定するものではない。
【００２０】
図１に、本実施形態における遺伝子変異分析システムの構成例を示す。このシステムは、蛍光強度波形データ計測部1a,1f、制御部1b,1g、蛍光強度波形データ解析部1c、既知情報データベース1dを備える。
【００２１】
図２に蛍光強度波形データ計測部1a,1fの構成例を示す。蛍光強度波形データ計測部1a,1fは、蛍光色素で標識した核酸試料（2a)中の核酸断片を電気泳動する流路(2b)と、蛍光強度を経時的に検出する検出機(2c)を備える。
【００２２】
蛍光強度波形データ計測部1a,1fは、蛍光標識した核酸断片の流路(2b)での電気泳動により、蛍光強度波形データを検出機(2c)にて取得する。この際、蛍光色素ごとに別々に電気泳動することによって、各塩基種の蛍光強度波形データを個別に取得してもよいし、4蛍光色素を混合して電気泳動することによって、4塩基種の蛍光強度波形データを同時に取得してもよい。
【００２３】
蛍光強度波形データ解析部1cでは、蛍光強度波形データを信号処理して塩基配列の決定や変異の検出、定量を行う。なお、図３、図５、図７、図８、図１０、図１１等を用いて後述する蛍光強度波形データ解析部1cの各機能は、蛍光強度波形データ解析部1c内において、それぞれの機能を実現するメモリに格納されたプログラムをプロセッサが解釈して実行することによりソフトウェアで実現することができる。また、蛍光強度波形データ解析部1cの各機能、処理部、処理手段等は、それらの一部又は全部を、例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現してもよい。各機能を実現するプログラム、ファイル、データベース等の情報は、例えば、メモリや、ハードディスク、ＳＳＤ（Ｓｏｌｉｄ  Ｓｔａｔｅ  Ｄｒｉｖｅ）等の記録装置、または、ＩＣカード、ＳＤカード、ＤＶＤ等の記録媒体に置くこともできる。
【００２４】
既知情報データベース1dは、塩基配列と対応する蛍光強度波形データに関連する情報を格納する。制御部1b,1gは、各部間のデータ転送の制御、蛍光強度波形データ計測部1a,1fの計測実行制御、蛍光強度波形データ解析部1cの解析処理内容の制御等を行う。さらに、外部ネットワーク1eと接続して分析に用いる情報や分析結果の送信を行うことも可能である。
【００２５】
また、図１では、解析装置である蛍光強度波形データ解析部1cが、制御装置である制御部1b,1gを介して計測装置である蛍光強度波形データ計測部1a,1fに接続するとともに、既知情報データベース1dに接続してデータベースを参照してデータ取得するシステム構成を示しているが、図９に示すように、上述の蛍光強度波形データ計測部1a、制御部1b、蛍光強度波形データ解析部1c、既知情報データベース1dを備えた遺伝子変異分析装置1xとして実施することも可能である。
【００２６】
図３は、図１の蛍光強度波形データ解析部1cが、核酸試料の塩基配列を決定する際に、蛍光強度波形データに対して行う処理を示すフローチャートである。蛍光強度波形データに対して、まず、スムージング処理(3a)及びバックグランド差引処理(3b)を行う。その後ピークの検出(3c)を行い、各位置で信号強度を抽出する。最後に、各位置での4塩基種の信号強度を比較して、所定の基準に従って主要な信号を判定することにより、塩基種を順次決定する(3d)。
【００２７】
図４に、ある塩基種の蛍光強度波形データの例を示す。データにはノイズが含まれるため、当該塩基種に相当する位置だけではなく他の塩基種に相当する位置においても信号強度が抽出される。図３では、当該塩基種に相当するピーク位置(例えばピーク位置x1、x2、x3、x4、x5)では強いピークが抽出され、当該塩基種の微量な変異が存在するピーク位置(例えば、ピーク位置k)では、変異由来の微小な信号がノイズ信号に加わって抽出される。本実施形態では、 図１の蛍光強度波形データ解析部1cが、上記の図３の塩基配列を決定するための処理に加えて、既知の塩基配列に対して得られた蛍光強度波形データから取得した、各ピーク位置の信号強度の、他ピーク位置の信号強度に対する相対信号強度情報を指標として、塩基配列座標位置の各塩基種の存在有無を判定する機能を有する。以下では、塩基配列座標位置の各塩基種の存在有無を上記相対信号強度情報に基づいて判定する本実施形態のより具体的な構成例として、各配列座標位置での遺伝子変異を検出する機能や、各配列座標位置における各塩基種の存在比率を検出する機能について詳説する。
＜実施例１＞
本実施例では、図５、図６、図７を用いて、塩基配列座標位置の各塩基種の存在有無を、各ピーク位置の信号強度の他ピーク位置の信号強度に対する相対信号強度情報に基づいて判定する本実施形態のより具体的な構成例として、蛍光強度波形データ解析部1cが行う蛍光強度波形データにおける遺伝子変異を検出する解析処理の一例について述べる。
【００２８】
はじめに、図５を用いて、データ解析部1cが、参照用の相対信号強度情報を取得する処理の一例、すなわち、既知の塩基配列に対して得られた当該塩基種の蛍光強度波形データから相対信号強度情報を取得する処理の一例について説明する。なお、ここではピーク位置等の説明のために図４に示した蛍光強度波形データの波形を既知の塩基配列に該当するものと仮定して説明を行う。
【００２９】
図５の処理では、まず、既知の塩基配列に対して得られたある塩基種の複数の蛍光強度波形データセットを用意する(5a)。このデータセットを基に、あるピーク位置において、当該ピーク(ピーク番号k;4a)に隣接する当該塩基種のピーク(ピーク番号x1;4b)を選択する(5b,5c)。次に、当該ピーク位置の信号強度I(k)の隣接ピーク位置の信号強度I(x1)に対する相対信号強度I1の、データセット内での平均値および標準偏差を算出する(5d)。ここで、相対信号強度I1は、以下の式(1)で計算される。
I1 = I(k)/I(x1)      …  (1)
上記一連の手順と同様にして、全ての位置において、相対信号強度I1のデータセット内での平均値および標準偏差を順次算出し(5e,5f)、塩基配列と算出結果を既知情報データベース1dに保存する(5g)。 同様の処理をすべての塩基種に対して行う。
【００３０】
なお、相対信号強度情報は、当該ピークに隣接するピーク以外の他のピークを選択してもよいし、あらかじめ設定した他のピークを用いて算出してもよい。例えば、ある位置に対して、相対信号強度の標準偏差が小さくなるようなピークを選択することもできる。
【００３１】
また、相対信号強度情報は、上記のI1についてだけでなく、当該ピークの近傍にある当該塩基種の複数のピークに着目して、複数の相対信号強度について算出し、既知情報データベース1dに保存してもよい。例えば、当該ピーク(ピーク番号k;4a)の近傍にある当該塩基種の5ピーク(ピーク番号x1,x2,x3,x4,x5;4b,4c,4d,4e,4f)を選択し、以下の式(2)から(6)の5個の相対信号強度I1、I2、I3、I4、I5の、データセット内での平均値および標準偏差を算出し、保存してもよい。
I1 = I(k)/I(x1)      …  (2)
I2 = I(x1)/I(x2)      …  (3)
I3 = I(x1)/I(x3)      …  (4)
I4 = I(x3)/I(x4)      …  (5)
I2 = I(x4)/I(x5)      …  (6)
複数の相対信号強度の組み合わせは、これに限らず他の組み合わせとしてもよい。
【００３２】
相対信号強度情報は、上述のように図１の蛍光強度波形データ解析部1cで取得して、図1のデータベース1dに保存してもよいし、他の装置によって取得されたものを、図1のデータベース1dに保存してもよい。
【００３３】
図６に、前記5個の相対強度について算出した相対信号強度情報を保存する場合の相対信号強度情報のテーブルの一例を示す。この例では、各塩基種について、塩基配列の各座標位置(6a)について、既知の塩基種(6b)と、算出した相対信号強度の平均値および標準偏差(6c)をテーブルに保存する。例えば、塩基種Ａの相対信号強度に関するテーブル601は、それぞれの位置6aにおいて、多型を含まない場合の当該ピーク位置での既知の塩基種6b（例えば99の位置の場合はＴが既知の塩基配列である）と、既知の塩基配列がＴである当該位置において多型である塩基種Ａの相対信号強度（I1）とを対応付けて保存している。さらに、I2  〜I3  のように式（３）〜（６）の算出結果も対応付けて保存している。これらの情報の用い方は以下にて図７を用いて後述する。
【００３４】
以下、図７を用いて、蛍光強度波形データ解析部1cが、上記の手順で取得した参照用の相対信号強度情報（601〜604）を参照して、標的遺伝子の核酸試料から新規に得られた蛍光強度波形データを解釈し、ある塩基種の遺伝子変異を検出する処理の一例について説明する。
【００３５】
図７の処理では、まず既知塩基配列と新規蛍光強度波形データの各ピークとの対応付けを行う(7a)。これには、図1のデータベース1dに保存されている当該標的遺伝子の既知塩基配列と、図３の処理を経て決定した新規蛍光強度波形データの塩基配列とのホモロジー検索を行い、既知塩基配列と新規蛍光強度波形データの各ピークとを対応させる。その後、ある位置において、新規蛍光強度波形データの当該ピーク(ピーク番号k)に隣接する当該塩基種のピークを選択し(7b,7c)、相対信号強度 I1_new を算出する(7d)。なお、相対信号強度 I1_newの算出は、既知塩基配列について図５の5dを用いて上述した相対信号強度についての算出処理と同様である。また、選択する他のピークについては隣接するもの以外としてもよく、あらかじめ設定した他のピークを用いて算出してもよいし、当該ピークの近傍にある当該塩基種の複数のピークに選択して、複数の相対信号強度について算出してもよい。
【００３６】
次に、それぞれのピーク位置（ピーク番号k）について、図６にて上述した既知塩基配列での当該ピーク位置の相対信号強度情報をデータベースから抽出し(7e)、算出した相対信号強度と抽出した相対信号強度情報を基に、各ピーク位置の遺伝子変異を検出する(7f)。当該処理を各塩基種について実行する。上記一連の手順と同様にして、全ての位置において、遺伝子変異を順次検出する(7g,7h)。
【００３７】
この遺伝子変異の検出(7f)は、新規蛍光強度波形データから算出した相対信号強度を、図６にて上述した既知塩基配列の蛍光強度波形データセットから得られた相対信号強度情報と比較し、以下の式(7)、(8)の判定基準に従って行う。例えば、塩基種Ｇの変異有無を判定する場合は、テーブル６０２を参照し、各位置（6a）について、塩基種Ｇの既知の相対強度（I1)と、新規蛍光強度波形データから算出した塩基種Ｇの相対信号強度（I1_new）とを式(7)、(8)に従って比較する。
{I1_new - Mean(I1)} / SD(I1)} ≧ threshold      変異有      …  (7)
{I1_new - Mean(I1)} / SD(I1)} ＜ threshold      変異無      …  (8)
ここで、Mean(I1) は既知塩基配列の蛍光強度波形データセットから得られた I1 の平均値、SD(I1) は既知塩基配列の蛍光強度波形データセットから得られた I1 の標準偏差、threshold は任意に設定された閾値である。
【００３８】
なお、遺伝子変異の検出は、複数の相対信号強度I1、I2、… Inを基に、上記の判定基準を多次元に拡張した以下の式(10)、(11)の判定基準に従って行うこともできる。
I = (I1, I2, …, In)T      …  (9)
として、
(I_new - μ)T S-1 (I_new - μ) ≧ threshold      変異有      …  (10)
(I_new - μ)T S-1 (I_new - μ) ＜ threshold      変異無      …  (11)
ここで、μは既知塩基配列の蛍光強度波形データセットから得られたIの平均、Sは既知塩基配列の蛍光強度波形データセットから得られたIの分散共分散行列、thresholdは任意に設定する閾値とする。
【００３９】
上記の遺伝子変異検出処理は、各塩基種で独立に遂行することができる。すなわち、各塩基種について、すべての位置での変異の有無を調べることができる。
【００４０】
DNAシーケンサによって得られる蛍光強度波形データには，一つの波形データ中でもピークの信号強度に相対的な大小が存在するが，その大小関係は測定対象とする遺伝子配列に依るいう特徴がある。つまり，ほぼ同じ遺伝子配列からなる標的遺伝子の解析を行った場合に観察される同一波形データ中で相対的に大きいピークは測定の試行に依らず大きく，小さいピークは測定に依らず小さいという特徴がある。この特徴は，前述のDNAシーケンス法の原理に由来すると考えられる。前述のように，サンガー法による核酸断片化技術では，鎖停止ヌクレオチドであるジデオキシヌクレオチドが取り込まれることによって核酸が断片化される。デオキシヌクレオチドとジデオキシヌクレオチドの取り込まれやすさの傾向は，主に鋳型DNAとDNA合成酵素が形成する立体構造の影響を受け，立体構造は塩基の配列の仕方によって決まる。従って，ジデオキシヌクレオチドが取り込まれやすい座標に相当する核酸断片は生成量が多くなり，当該座標の信号強度はいつも大きくなる。以上により，蛍光強度波形データ中のピークの信号強度の相対的な大きさは，測定に依らず，主に塩基配列によって決定されると推察できる。従って、各ピークの信号強度を隣接ピークの信号強度で規格化した相対強度は測定間の分散が小さい。これにより、相対強度を用いた変異有無判定では高感度な判定が可能となる。
【００４１】
以下では、本実施例により、モデル試料を用いた微量遺伝子変異の検出例について実験内容を交えてより詳細に説明する。
【００４２】
（モデル試料の調整）
モデル試料の対象遺伝子として、がん関連遺伝子であり保険適用検査の対象となっているEGFR遺伝子及びKRAS遺伝子(それぞれ、塩基配列は既知)を選択した。ヒト大腸癌細胞(HCT116 p21(+))より抽出したゲノムDNAを鋳型としてPCR法によりEGFR遺伝子及びKRAS遺伝子を増幅し、プラスミドにクローニングを行った。得られた野生型遺伝子断片に、EGFR遺伝子については858位のC塩基をA塩基に、KRAS遺伝子については12位のC塩基をT塩基に置換した変異型の遺伝子配列を持つDNAを人工的に作製し、同様にプラスミドクローニングを行った。QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit を用いて、各遺伝子配列を有するプラスミドDNAを調製した。このようにして得られた野生型と変異型のプラスミドDNAをそれぞれ、100%:0%、99%:1%、95%:5%、90%:10%、80%:20%の割合で混合し、変異存在比率の異なる核酸試料を作製した。
【００４３】
（モデル試料の計測）
本発明の評価に用いる蛍光強度波形データの測定は、ABI PRISM BigDye Primer v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit For M13 REV Primersを用いてそれぞれの存在比率試料につき8回の標識反応を行い、3130 Genetic Analyzer にて、各塩基種それぞれ独立のキャピラリーで検出した。これにより、各存在比率の各塩基種につき8個の蛍光強度波形データ(EPFフォーマットデータ)を取得した。
（蛍光強度波形データ処理）
得られた蛍光強度波形データそれぞれに対して、図３で示した処理を行い、ピークを検出した。
【００４４】
（相対信号強度情報の取得）
EGFR遺伝子の塩基種Aについて、存在比率0%の8個の蛍光強度波形データを用いて、変異位置(ピーク番号k;3a)の近傍にある塩基種Aの5ピーク(ピーク番号x1,x2,x3,x4,x5;3b,3c,3d,3e,3f)を選択し、式(2)から(6)の相対信号強度I1、I2、I3、I4、I5の平均値および標準偏差を算出し、保存した。同様に、EGFR遺伝子の塩基種Cについて、存在比率100%の8個の蛍光強度波形データを用いて、変異位置の近傍にある塩基種Cの5ピークを選択し、式(2)から(6)の相対信号強度I1、I2、I3、I4、I5の、平均値および標準偏差を算出し、保存した。
【００４５】
また、KRAS遺伝子の塩基種Tについて、存在比率0%の8個の蛍光強度波形データを用いて、変異位置の近傍にある塩基種Tの5ピークを選択し、式(2)から(6)の相対信号強度I1、I2、I3、I4、I5の、平均値および標準偏差を算出し、保存した。
【００４６】
また、同様に、KRAS遺伝子の塩基種Cについて、存在比率100%の8個の蛍光強度波形データを用いて、変異位置の近傍にある塩基種Cの5ピークを選択し、式(2)から(6)の相対信号強度I1、I2、I3、I4、I5の、平均値および標準偏差を算出し、保存した。
【００４７】
（変異の検出）
EGFR遺伝子の塩基種Aについて、存在比率0%、1%、5%、10%、20%の蛍光強度波形データに対して、それぞれ変異の検出を行った。まず、変異位置の近傍にある塩基種Aの5ピークを選択し、式(2)から(6)の相対信号強度I1_new 、I2_new 、I3_new 、I4_new 、I5_new を算出した。その後、EGFR遺伝子の塩基種Aの相対信号強度情報を基に、式(7)、(8)の判定基準に従って変異の有無を判定した。このとき、threshold=3とした。さらに、式(10)、(11)の判定基準に従って変異の有無を判定した。このとき、threshold=16.75とした。同様に、EGFR遺伝子の塩基種Cについて、存在比率100%、99%、95%、90%、80%の蛍光強度波形データに対して、それぞれ変異の検出を行った。
【００４８】
また、KRAS遺伝子の塩基種Tについて、存在比率0%、1%、5%、10%、20%の蛍光強度波形データに対して、それぞれ変異の検出を行った。また、同様に、KRAS遺伝子の塩基種Cについて、存在比率100%、99%、95%、90%、80%の蛍光強度波形データに対して、それぞれ変異の検出を行った。
【００４９】
この結果、式(7)、(8)の判定基準に従って変異の有無を判定した場合、変異存在比率0%については、すべてのデータで変異無と判定することができ、変異存在比率5%、10%、20%とについては、すべてのデータで変異有と判定することができた。一方、変異存在比率1%については、検出率が減少した。これに対し、式(10)、式(11)の判定基準に従って変異の有無を判定した場合、変異存在比率0%については、すべてのデータで変異無と判定することができ、変異存在比率1%、5%、10%、20%については、すべてのデータで変異有と判定することができた。従来のデータ解析ソフトウェアによる変異検出限界は変異存在比率30%程度であり、本発明の手法により変異検出限界は大幅に向上した。
＜実施例２＞
本実施例では、図８、図９、図１０、図１１、図１２を用いて、塩基配列座標位置の各塩基種の存在有無を、各ピーク位置の信号強度の他ピーク位置の信号強度に対する相対信号強度情報に基づいて判定する本実施形態のより具体的な構成例として、蛍光強度波形データ解析部1cが行う蛍光強度波形データについての各配列座標位置における各塩基種の存在比率を検出する解析処理の一例について述べる。
【００５０】
まず、図８および図９を用いて、参照用の相対信号強度情報を取得する処理の一例、すなわち、既知の塩基配列に対して得られた当該塩基種の蛍光強度波形データから相対信号強度情報を取得する処理の一例について説明する。
【００５１】
図８の処理では、まず、既知の存在比率で変異を含む既知の塩基配列に対して得られたある塩基種の複数の蛍光強度波形データセットを用意する(8a)。このデータセットを基に、ある位置において、当該ピークに隣接する当該塩基種のピークを選択する(8b,8c)。次に、当該ピーク位置の信号強度I(k)の隣接ピーク位置の信号強度I(x1)に対する相対信号強度I1と、存在比率と、の間の回帰式とその標準偏差を導出する(8d)。ここで、相対信号強度I1と、存在比率Rと、の間の回帰式(式12)とその標準偏差(式13)は式(14)から計算される。
I1 = a(R - Mean(R)) +  Mean(I1)    …  (12)
σ2 = 1/(n-2) Σ(I1_i - I1)2    …  (13)
a = {Σ (R_i - Mean(R)) (I1_i - Mean(I1))} / Σ(R_i - Mean(R))2  …  (14)
ここで、nは既知塩基配列の蛍光強度波形データ数、I1_i は、既知塩基配列の蛍光強度波形データi番目の I1 、Mean(I1) は既知塩基配列の蛍光強度波形データセットから得られた I1 の平均値、R_i は既知塩基配列の蛍光強度波形データi番目のR、Mean(R) は既知塩基配列の蛍光強度波形データセットから得られた R の平均値である。上記一連の手順と同様にして、全ての位置において、相対信号強度I1と存在比率との間の回帰式と、その標準偏差と、を順次導出し(8e,8f)、塩基配列と導出結果を保存する(8g)。同様の処理をすべての塩基種に対して行う。
【００５２】
図１１に、前記の相対強度について導出した回帰式とその標準偏差に関する相対信号強度情報を保存する場合の相対信号強度情報のテーブルの一例を示す。この例では、各塩基種について、塩基配列の各座標位置(11a)について、既知の塩基種(11b)と、導出した相対強度と存在比率との間の回帰式(式(12)の傾きa、存在比率の平均値 Mean(R)、相対強度の平均値 Mean(I1) 、回帰式の標準偏差(式(13))、(11c)とをテーブルに保存する。例えば、塩基種Ａの相対信号強度に関するテーブル1101は、それぞれの位置11aにおいて、多型を含まない場合の当該ピーク位置での既知の塩基種11b（例えば99の位置の場合はＴが既知の塩基配列である）と、既知の塩基配列がＴである当該位置において多型である塩基種Ａの、相対信号強度（I1）と存在比率との間の回帰式とその標準偏差に関する情報を、対応付けて保存している。これらの情報の用い方は以下にて図１０を用いて後述する。
【００５３】
相対信号強度情報は、図１の蛍光強度波形データ解析部1cで取得して、図1のデータベース1dに保存してもよいし、他の装置によって取得されたものを、図1のデータベース1dに保存してもよい。
【００５４】
以下、図１０を用いて、上記の手順で取得した相対信号強度と存在比率との回帰式及びその標準偏差を参照して、標的遺伝子の核酸試料から新規に得られた蛍光強度波形データを解釈し、ある塩基種の遺伝子変異の存在比率を推定する処理の一例について説明する。
【００５５】
図１０の処理では、まず既知塩基配列と新規蛍光強度波形データの各ピークとの対応付けを行う(10a)。これには、図1のデータベース1dに保存されている当該標的遺伝子の既知塩基配列と、図３の処理を経て決定した新規蛍光強度波形データの塩基配列とのホモロジー検索を行い、既知塩基配列と新規蛍光強度波形データの各ピークとを対応させる。
【００５６】
その後、ある位置において、新規蛍光強度波形データの当該ピーク(ピーク番号k)に隣接する当該塩基種のピークを選択し(10b,10c)、相対信号強度 I1_new を算出する(10d)。
【００５７】
次に、当該ピーク位置に対する回帰式及びその標準偏差に関する情報をデータベース1ｄから抽出し(10e)、算出した相対信号強度と抽出した回帰式及びその標準偏差に関する情報を基に、各ピーク位置の遺伝子変異の存在比率を推定する(10f)。上記一連の手順と同様にして、全ての位置において、遺伝子変異の存在比率を順次推定する(10g,10h)。
【００５８】
この遺伝子変異の存在比率の推定(10f)は、新規蛍光強度波形データから算出した相対信号強度から、図１１にて上述した既知塩基配列の蛍光強度波形データセットから得られた相対信号強度情報を基に、以下の式(15)、式(16)に従って行う。例えば、塩基種Ｇの変異存在比率を推定する場合は、テーブル１１０２を参照し、各位置(11a)について、新規蛍光強度波形データから算出した塩基種Ｇの相対信号強度（I1_new）から、塩基種Ｇの回帰式とその標準偏差に関する情報を基に、式(15)、式(16)に従って推定する。R_new = (I1_new - Mean(I1))/a + Mean(R)     …  (15)
σ2(R_new) =σ2/a2    …  (16)
図１２に、標的遺伝子の核酸試料に対して、上記の方法で得られた 各塩基種の各位置での変異存在比率を出力する際の表示例を示す。 この例では、塩基配列の各座標位置について、既知の塩基種(12a)と、当該位置において得られたすべての塩基種の存在比率(12b,12c,12d,12e)をそれぞれ表示する。
【００５９】
ここまでで、遺伝子変異の存在比率を推定する場合について述べた。
＜実施例３＞
本実施例では、塩基配列座標位置の各塩基種の存在有無を、各ピーク位置の信号強度の他ピーク位置の信号強度に対する相対信号強度情報に基づいて判定する本実施形態の応用例として、DNAメチル化修飾状態の検出への応用について述べる。
【００６０】
従来のDNAメチル化遺伝子の検出は、(i)バイサルファイト処理によりDNA中のメチル化されていないシトシンC(非メチル化シトシン)をウラシルUに変換、(ii)変換済みDNA試料を鋳型としたPCRによる遺伝子増幅、(iii)遺伝子増幅産物のプラスミドクローニング、(iv)約100クローンのプラスミドDNAの調整、(v)約100クローンの蛍光標識反応、(vi)蛍光標識産物のDNAシーケンサによる分析、(vii)決定した塩基配列を基に、変換ウラシルUの出現数と未変換シトシンCの出現数の比較によるメチル化率の算出、が一般的な手法である。
【００６１】
微量に存在する遺伝子変異を検出可能とする本発明をメチル化遺伝子検出に応用すると、その工程は、(i)バイサルファイト処理によるDNA中のメチル化されていないシトシンC(非メチル化シトシン)をウラシルUに変換、(ii)変換済みDNA試料を鋳型としたPCRによる遺伝子増幅、(iii)遺伝子増幅産物の蛍光標識反応、(iv)蛍光標識産物のDNAシーケンサによる分析、(v)変換ウラシルU由来の相対信号強度と未変換シトシンC由来の相対信号強度の比較によるメチル化率の算出、となる。つまり、クローニングを例とする工程の短縮と、分析する試料数の約100クローンから1クローンへの削減が可能となる。以下、具体的な実施形態を説明する。
【００６２】
まず、標的遺伝子解析による参照情報の作成について述べる。標的とする遺伝子に対して、バイサルファイト処理を行わない場合と行う場合の両方について、参照蛍光強度波形データを収集しておく。バイサルファイト処理を行わない場合、配列中のシトシンCはすべてシトシンCとして判定される。つまり、すべてのシトシンCがメチル化された場合の参照情報となる。バイサルファイト処理を行った場合、配列中のシトシンCはすべてウラシルUとして判定され、すべてのシトシンCがメチル化されていない場合の参照情報となる。
【００６３】
次に検体由来試料の調整について説明する。検体からのゲノムDNA試料に対して、バイサルファイト処理を行った後、標的領域遺伝子領域の増幅を行う。遺伝子増幅方法として一般的なPCR法が利用可能であるが、バイサルファイト処理によって非メチル化シトシンはウラシルに変換されるためプライマー設計はバイサルファイト処理による塩基配列変換を考慮することが望ましい。
【００６４】
次に、検体のメチル化遺伝子検出について述べる。実施例１で述べたように、参照蛍光強度波形データを用いて、すべての塩基種に対して、図５に示す処理により各位置の相対信号強度情報を取得する。その後、検体蛍光強度波形データを入力として図７に示す処理によって各位置の相対信号強度を算出し、シトシンCからウラシルUへの変換の検出を行うことで、各位置でのDNAメチル化の有無を判定する。また、実施例２と同様に、その存在比率からメチル化率の推定を行うこともできる。
【符号の説明】
【００６５】
1a,1f…蛍光強度波形データ計測部、1b,1g…制御部、1c…蛍光強度波形データ解析部、1d…既知情報データベース、1e…外部ネットワーク、1h…通信回路、1x…遺伝子変異分析装置、 2b…流路、2c…検出器、601…塩基種Ａについての相対信号強度情報、602…塩基種Ｇについての相対信号強度情報、603…塩基種Ｃについての相対信号強度情報、604…塩基種Ｔについての相対信号強度情報
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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