(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を複数段階に傾斜させる試料傾斜手段と、
前記試料傾斜手段によって設定された各傾斜角度において得られる透過電子顕微鏡像を取得する像取得手段と、
取得した傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像に基づき試料の三次元像を構築する三次元像構築手段とを含み、
試料の三次元像の構築に用いる透過電子顕微鏡像の領域の幅を、傾斜角度に応じて傾斜軸に垂直な方向に変化させ、
前記像取得手段は、
各傾斜角度において、対物レンズの焦点位置を変化させて得られる複数の透過電子顕微鏡像を取得し、
前記三次元像構築手段は、
各傾斜角度に対応する複数の透過電子顕微鏡像から焦点の合っている領域を抽出して組み合わせることで傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像を生成する、電子顕微鏡。
【請求項２】
請求項１において、
前記三次元像構築手段は、
取得した傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像を、傾斜角度に応じて傾斜軸に垂直な方向に変化させた幅でトリミングし、トリミングした傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像に基づき試料の三次元像を構築する、電子顕微鏡。
【請求項３】
請求項１において、
前記像取得手段は、
試料上を走査する電子線の走査領域の幅を傾斜角度に応じて傾斜軸に垂直な方向に変化させて得られる傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像を取得する、電子顕微鏡。
【請求項４】
試料を複数段階に傾斜させる試料傾斜工程と、
前記試料傾斜手段によって設定された各傾斜角度において得られる透過電子顕微鏡像を取得する像取得工程と、
取得した傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像に基づき試料の三次元像を構築する三次元像構築工程とを含み、
試料の三次元像の構築に用いる透過電子顕微鏡像の領域の幅を、傾斜角度に応じて傾斜軸に垂直な方向に変化させ、
前記像取得工程において、
各傾斜角度において、対物レンズの焦点位置を変化させて得られる複数の透過電子顕微鏡像を取得し、
前記三次元像構築工程において、
各傾斜角度に対応する複数の透過電子顕微鏡像から焦点の合っている領域を抽出して組み合わせることで傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像を生成する、三次元像構築方法。
【請求項５】
請求項４において、
前記三次元像構築工程において、
取得した傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像を、傾斜角度に応じて傾斜軸に垂直な方向に変化させた幅でトリミングし、トリミングした傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像に基づき試料の三次元像を構築する、三次元像構築方法。
【請求項６】
請求項４において、
前記像取得工程において、
試料上を走査する電子線の走査領域の幅を傾斜角度に応じて傾斜軸に垂直な方向に変化させて得られる傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像を取得する、三次元像構築方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電子顕微鏡及び三次元像構築方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、試料の三次元像を構築する機能を備えた電子顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１）。この電子顕微鏡では、試料を一定の角度毎に傾斜させて一連の透過像を取得し、取得した透過像にＣＴ法（Computerized Tomography Method）を適用して再構成を行い断面像（二次元像）を取得し、取得した二次元像を重ね上げることで三次元像を得ることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−１９２１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来の電子顕微鏡では、傾斜角度０°のときに傾斜軸に垂直な方向の幅がａの透過像をＣＴ法を用いて再構成を行う場合に、傾斜角度θのときにおいても傾斜軸に垂直な方向の幅がａである画像を用いて再構成を行っている。しかしながら、本来傾斜角度が大きくなるほど再構成に用いる透過像の領域は小さくなるはずである。この再構成に用いる領域以外の領域を再構成に用いることで、再構成に用いる領域以外の領域にアーティファクト（例えば、極端に輝度が低い部分）が存在する場合に、ＣＴ法によって得られる再構成断面像（及び再構成断面像から得られる三次元像）の分解能が低下してしまう。
【０００５】
本発明は、以上のような問題点に鑑みてなされたものであり、本発明のいくつかの態様によれば、ＣＴ法によって得られる三次元像の画質を向上させることが可能な、電子顕微鏡及び三次元像構築方法を提供することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（１）本発明に係る電子顕微鏡は、
試料を複数段階に傾斜させる試料傾斜手段と、
前記試料傾斜手段によって設定された各傾斜角度において得られる透過電子顕微鏡像を取得する像取得手段と、
取得した傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像に基づき試料の三次元像を構築する三次元像構築手段とを含み、
試料の三次元像の構築に用いる透過電子顕微鏡像の領域の幅を、傾斜角度に応じて傾斜軸に垂直な方向に変化させ、
前記像取得手段は、
各傾斜角度において、対物レンズの焦点位置を変化させて得られる複数の透過電子顕微鏡像を取得し、
前記三次元像構築手段は、
各傾斜角度に対応する複数の透過電子顕微鏡像から焦点の合っている領域を抽出して組み合わせることで傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像を生成する。
【０００７】
本発明において、透過電子顕微鏡像は、ＴＥＭ像でもよいし、ＳＴＥＭ像（走査透過電子顕微鏡像）でもよい。
【０００８】
また本発明において、傾斜角度０°のときの三次元像の構築（断面像の再構成）に用いる透過電子顕微鏡像の領域の傾斜軸に垂直な方向の幅をａとすると、傾斜角度θのときの試料の三次元像の構築に用いる透過電子顕微鏡像の領域の傾斜軸に垂直な方向の幅をａｃｏｓθとしてもよい。
【０００９】
本発明によれば、試料の三次元像の構築に用いる透過電子顕微鏡像の領域の幅を、傾斜角度に応じて傾斜軸に垂直な方向に変化させることで、本来再構成すべき領域のみを再構成に用いて三次元像を構築することが可能となり、ＣＴ法によって得られる三次元像の画
質を向上させることができる。また、本発明によれば、ほぼ全ての領域で焦点の合った過電子顕微鏡像を傾斜角度毎に取得することができ、ＣＴ法によって得られる三次元像の画質を向上させることができる。
【００１０】
（２）本発明に係る電子顕微鏡では、
前記三次元像構築手段は、
取得した傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像を、傾斜角度に応じて傾斜軸に垂直な方向に変化させた幅でトリミングし、トリミングした傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像に基づき試料の三次元像を構築するようにしてもよい。
【００１１】
本発明において、取得した透過電子顕微鏡像の傾斜軸に垂直な方向の幅をａとすると、取得した傾斜角度θ毎の透過電子顕微鏡像を、傾斜角度θに応じて傾斜軸に垂直な方向の幅ａｃｏｓθでトリミングするようにしてもよい。
【００１２】
本発明によれば、本来再構成すべき領域のみを再構成に用いて三次元像を構築することが可能となり、ＣＴ法によって得られる三次元像の画質を向上させることができる。
【００１３】
（３）本発明に係る電子顕微鏡では、
前記像取得手段は、
試料上を走査する電子線の走査領域の幅を傾斜角度に応じて傾斜軸に垂直な方向に変化させて得られる傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像を取得するようにしてもよい。
【００１４】
本発明において、傾斜角度０°のときの電子線の走査領域の傾斜軸に垂直な方向の幅をａとすると、傾斜角度θのときの電子線の走査領域の傾斜軸に垂直な方向の幅をａｃｏｓθとしてもよい。
【００１５】
本発明によれば、本来再構成すべき領域のみを再構成に用いて三次元像を構築することが可能となり、ＣＴ法によって得られる三次元像の画質を向上させることができる。
【００１８】
（５）本発明に係る三次元像構築方法は、
試料を複数段階に傾斜させる試料傾斜工程と、
前記試料傾斜手段によって設定された各傾斜角度において得られる透過電子顕微鏡像を取得する像取得工程と、
取得した傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像に基づき試料の三次元像を構築する三次元像構築工程とを含み、
試料の三次元像の構築に用いる透過電子顕微鏡像の領域の幅を、傾斜角度に応じて傾斜軸に垂直な方向に変化させ、
前記像取得工程において、
各傾斜角度において、対物レンズの焦点位置を変化させて得られる複数の透過電子顕微鏡像を取得し、
前記三次元像構築工程において、
各傾斜角度に対応する複数の透過電子顕微鏡像から焦点の合っている領域を抽出して組み合わせることで傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像を生成する。
【００１９】
本発明において、透過電子顕微鏡像は、ＴＥＭ像でもよいし、ＳＴＥＭ像（走査透過電子顕微鏡像）でもよい。
【００２０】
また本発明において、傾斜角度０°のときの三次元像の構築（断面像の再構成）に用いる透過電子顕微鏡像の領域の傾斜軸に垂直な方向の幅をａとすると、傾斜角度θのときの試料の三次元像の構築に用いる透過電子顕微鏡像の領域の傾斜軸に垂直な方向の幅をａｃｏｓθとしてもよい。
【００２１】
本発明によれば、試料の三次元像の構築に用いる透過電子顕微鏡像の領域の幅を、傾斜角度に応じて傾斜軸に垂直な方向に変化させることで、本来再構成すべき領域のみを再構成に用いて三次元像を構築することが可能となり、ＣＴ法によって得られる三次元像の画質を向上させることができる。また、本発明によれば、ほぼ全ての領域で焦点の合った過電子顕微鏡像を傾斜角度毎に取得することができ、ＣＴ法によって得られる三次元像の画質を向上させることができる。
【００２２】
（６）本発明に係る三次元像構築方法では、
前記三次元像構築工程において、
取得した傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像を、傾斜角度に応じて傾斜軸に垂直な方向に変化させた幅でトリミングし、トリミングした傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像に基づき試料の三次元像を構築するようにしてもよい。
【００２３】
本発明において、取得した透過電子顕微鏡像の傾斜軸に垂直な方向の幅をａとすると、取得した傾斜角度θ毎の透過電子顕微鏡像を、傾斜角度θに応じて傾斜軸に垂直な方向の幅ａｃｏｓθでトリミングするようにしてもよい。
【００２４】
本発明によれば、本来再構成すべき領域のみを再構成に用いて三次元像を構築することが可能となり、ＣＴ法によって得られる三次元像の画質を向上させることができる。
【００２５】
（７）本発明に係る三次元像構築方法では、
前記像取得工程において、
試料上を走査する電子線の走査領域の幅を傾斜角度に応じて傾斜軸に垂直な方向に変化させて得られる傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像を取得するようにしてもよい。
【００２６】
本発明において、傾斜角度０°のときの電子線の走査領域の傾斜軸に垂直な方向の幅をａとすると、傾斜角度θのときの電子線の走査領域の傾斜軸に垂直な方向の幅をａｃｏｓθとしてもよい。
【００２７】
本発明によれば、本来再構成すべき領域のみを再構成に用いて三次元像を構築することが可能となり、ＣＴ法によって得られる三次元像の画質を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本実施形態に係る電子顕微鏡の構成の一例を示す図。
【図２】電子線が試料を透過している様子を示す模式図と、透過像を示す図。
【図３】電子線が試料を透過している様子を示す模式図と、透過像を示す図。
【図４】傾斜角度に対するｂ／ａのグラフを示す図。
【図５】本実施形態の第１の手法について説明するための図。
【図６】本実施形態の第１の手法で得られた透過像の一例を示す図。
【図７】従来の手法で得られた再構成断面像と、本実施形態の第１の手法で得られた再構成断面像を示す図。
【図８】本実施形態の第２の手法について説明するための図。
【図９】電子線が試料を透過している様子を示す模式図と、透過像を示す図。
【図１０】合焦点透過像を取得する手法について説明するための図。
【図１１】合焦点透過像を取得する手法について説明するための図。
【図１２】傾斜角度６０°のときに取得されたＴＥＭ像を示す図。
【図１３】本実施形態の手法により生成した合焦点透過像を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明の好適な実施形態について図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。
【００３２】
１．構成
図１に、本実施形態に係る電子顕微鏡の構成の一例を示す。ここでは、電子顕微鏡が、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の構成を有する場合について説明するが、電子顕微鏡は、走査透過型電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）の構成を有していてもよい。なお本実施形態の、電子顕微鏡は図１の構成要素（各部）の一部を省略した構成としてもよい。
【００３３】
図１に示すように、電子顕微鏡１００は、電子線源１と、照射レンズ系２と、偏向器４と、試料Ｓを保持するステージ６と、ステージ制御装置７と、対物レンズ８と、対物レンズ制御部９と、投影レンズ１０と、検出器１２と、鏡筒１４と、処理部２０と、操作部３０と、表示部３２と、記憶部３４と、情報記憶媒体３６とを含んでいる。
【００３４】
電子線源１、照射レンズ系２と、偏向器４、ステージ６、対物レンズ８、投影レンズ１０、検出器１２は、鏡筒１４の内部に収容されている。鏡筒１４の内部は、排気装置（図示省略）によって減圧排気されている。
【００３５】
電子線源１は、陰極から放出された電子を陽極で加速し電子線を放出する。電子線源１の例として、公知の電子銃を挙げることができる。
【００３６】
照射レンズ系２は、電子線源１の後段に配置されている。照射レンズ系２は、複数の集束レンズ（図示省略）で構成されている。照射レンズ系２は、試料Ｓに照射される電子線（入射電子線）の量を調整する。
【００３７】
偏向器４は、照射レンズ系２の後段に配置されている。偏向器４は、複数の偏向コイルと、当該複数の偏向コイルに流れる電流量を制御するための電流制御部（図示省略）とを有する。偏向器４は、電流制御部で各偏向コイルに流れる電流を制御することにより入射電子線を二次元的に偏向させる。これにより、試料Ｓに対する入射電子線の入射角度を変えることができるため、透過波の光路および散乱波の光路を変えることができる。偏向器４により、入射電子線を対物レンズ８の光軸に一致させるための軸合わせを行うことができる。
【００３８】
ステージ６は、試料Ｓを偏向器４の後段に位置させるように保持している。ステージ６は、ステージ制御装置７により制御され、試料Ｓを水平方向や垂直方向に移動させ、また試料Ｓを回転、傾斜させる。ステージ４は、光軸ＯＡに直交する傾斜軸ＴＡを中心として左右に傾斜可能に構成されている。
【００３９】
対物レンズ８は、試料Ｓの後段に配置されている。対物レンズ８は、対物レンズ制御装置９により制御され、試料Ｓを透過した電子線を結像させる。投影レンズ１０は、対物レンズ８の後段に配置されている。投影レンズ１０は、対物レンズ８によって結像された像をさらに拡大し、検出器１２上に結像させる。
【００４０】
検出器１２は、投影レンズ１０の後段に配置されている。検出器１２は、投影レンズ１０によって結像された透過電子顕微鏡像を検出する。検出器１２の例として、二次元的に配置されたＣＣＤ(Charge Coupled Device)で形成された受光面を有するＣＣＤカメラを挙げることができる。検出器１２が検出した透過電子顕微鏡像の像情報は、処理部２０に出力される。
【００４１】
操作部２０は、ユーザが操作情報を入力するためのものであり、入力された操作情報を処理部２０に出力する。操作部２０の機能は、キーボード、マウス、タッチパネル型ディスプレイなどのハードウェアにより実現することができる。
【００４２】
表示部３２は、処理部２０によって生成された画像を表示するものであり、その機能は、ＬＣＤ、ＣＲＴなどにより実現できる。表示部３２は、処理部２０により生成された、透過電子顕微鏡像や、再構成断面像、三次元像を表示する。
【００４３】
記憶部３４は、処理部２０のワーク領域となるもので、その機能はＲＡＭなどにより実現できる。情報記憶媒体３６（コンピュータにより読み取り可能な媒体）は、プログラムやデータなどを格納するものであり、その機能は、光ディスク（ＣＤ、ＤＶＤ）、光磁気ディスク（ＭＯ）、磁気ディスク、ハードディスク、或いはメモリ（ＲＯＭ）などにより実現できる。処理部２０は、情報記憶媒体３６に格納されるプログラムに基づいて本実施形態の種々の処理を行う。情報記憶媒体３６には、処理部２０の各部としてコンピュータを機能させるためのプログラムを記憶することができる。
【００４４】
処理部２０は、ステージ制御装置７、対物レンズ制御装置９等を制御する処理や、透過電子顕微鏡像を取得する処理、試料の三次元像を構築する処理などの処理を行う。処理部２０の機能は、各種プロセッサ（ＣＰＵ、ＤＳＰ等）、ＡＳＩＣ（ゲートアレイ等）などのハードウェアや、プログラムにより実現できる。処理部２０は、制御信号生成部２２と、像取得部２４と、三次元像構築部２６とを含む。
【００４５】
制御信号生成部２２は、各種制御信号を生成してステージ制御装置７や対物レンズ制御装置９に出力する。例えば、制御信号生成部２２は、ステージ６（試料Ｓ）を複数段階に傾斜させるための制御信号を生成してステージ制御装置７に出力する。すなわち、本発明の試料傾斜手段は、ステージ６とステージ制御装置７と制御信号生成部２２により構成される。また、制御信号生成部２２は、対物レンズ８の焦点位置を変化させるための制御信号を生成して対物レンズ制御装置９に出力する。
【００４６】
また、電子顕微鏡１００が走査透過型電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）の構成を有する場合には、制御信号生成部２２は、電子線の試料Ｓ上での走査を行うための走査コイルを制御する走査コイル制御装置に制御信号を出力する。また、制御信号生成部２２は、試料Ｓ上を走査する電子線の走査領域の幅を、ステージ６（試料Ｓ）の傾斜角度に応じて傾斜軸ＴＡに垂直な方向に変化させるための制御信号を生成して走査コイル制御装置に出力するようにしてもよい。
【００４７】
像取得部２４は、検出器１２から出力された像情報を取り込むことで透過電子顕微鏡像（ＴＥＭ像或いはＳＴＥＭ像）を取得する処理を行う。像取得部２４は、ステージ６（試料Ｓ）が各傾斜角度に設定されたときに得られる傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像を取得する。例えば、像取得部２４は、ステージ６（試料Ｓ）が−６０°から＋６０°まで１°ステップで１２１段階に傾斜されたときに得られる１２１枚の透過電子顕微鏡像を取得する。
【００４８】
三次元像構築部２６は、像取得部２４によって取得された傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像に基づき試料の三次元像を構築するための処理を行う。具体的には、三次元像構築部２６は、傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像から断面像を再構成し、得られた断面像のシリーズを重ね合わせることで三次元像を構築する。
【００４９】
また、三次元像構築部２６は、取得された傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像を、傾斜角度に応じて傾斜軸ＴＡに垂直な方向に変化させた幅でトリミングし、トリミングした傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像に基づき三次元像を構築するようにしてもよい。
【００５０】
また、電子顕微鏡１００が走査透過型電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）の構成を有する場合には、像取得部２４は、試料Ｓを走査する電子線の走査領域の幅を傾斜角度に応じて傾斜軸ＴＡに垂直な方向に変化させて得られる傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像（ＳＴＥＭ像）を取得し、三次元像構築部２６は、このように取得された傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像に基づき試料の三次元像を構築するようにしてもよい。
【００５１】
また、像取得部２４は、対物レンズ８の焦点位置を変化させて得られる複数の透過電子顕微鏡像を、ステージ６（試料Ｓ）が各傾斜角度に設定される度に取得し、三次元像構築部２６は、各傾斜角度に対応する複数の透過電子顕微鏡像から焦点の合っている領域を抽出して組み合わせることで傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像を生成し、生成した傾斜角度毎の透過電子顕微鏡像に基づき三次元像を構築するようにしてもよい。
【００５２】
２．本実施形態の手法
次に本実施形態の手法について図面を用いて説明する。
【００５３】
２−１．トリミング幅を変化させる手法（第１の手法）
図２（Ａ）は、試料Ｓ（ステージ６）の傾斜軸ＴＡ周りの傾斜角度が０°に設定された場合に、電子線が試料Ｓを透過している様子を示す模式図であり、図２（Ｂ）は、このときに取得される透過像（透過電子顕微鏡像）を示す図である。同図では、試料Ｓは試料断面を表しており、上から下に向けて電子線が試料断面に入射している。
【００５４】
同図のａは、電子線の照射領域の幅（傾斜軸ＴＡに垂直な方向の幅）及び取得される透過像ＴＩの幅（傾斜軸ＴＡに垂直な方向の幅）を示している。また、同図のｂは、三次元像の構築（断面像の再構成）に用いられる透過像の領域の幅（傾斜軸ＴＡに垂直な方向の幅）を示している。試料Ｓの傾斜角度が０°である場合には、電子線の照射領域の幅（及び透過像の幅）ａと、三次元像の構築に用いられる領域（再構成可能領域）の幅ｂは一致している。
【００５５】
図３（Ａ）は、図２（Ａ）の試料Ｓの傾斜角度が高傾斜に設定された場合の模式図であり、図３（Ｂ）は、このときに取得される透過像を示す図である。
【００５６】
図３（Ａ）に示すように、電子線の照射領域（及び透過像）の傾斜軸ＴＡに垂直な方向の幅ａは、試料Ｓの傾斜角度θによらず一定であるが、再構成可能領域の傾斜軸ＴＡに垂直な方向の幅ｂは、傾斜角度θが大きくなるほど小さくなる。ここで、再構成可能領域の幅ｂは、
ｂ＝ａ×ｃｏｓθ
で表すことができる。
【００５７】
図４は、傾斜角度θに対するｂ／ａのグラフである。例えば、傾斜角度θが６０°のときの、再構成可能領域の傾斜軸に垂直な方向の幅ｂは、
ｂ＝０．５×ａ
となり、傾斜角度θが０°のときの半分となる。すなわち、三次元像の構築に必要な透過像の領域（再構成可能領域）は、透過像ＴＩの傾斜軸ＴＡに平行な方向の幅をｃとすると、ａｃｏｓθ×ｃとなる。
【００５８】
本実施形態の第１の手法では、図５（Ａ）に示すように、取得した傾斜角度θ毎の一連の透過像のそれぞれを、傾斜軸ＴＡに垂直な方向に、再構成可能領域の幅ｂ（＝ａｃｏｓθ）でトリミングする処理（切り出し処理）を行う。なお、傾斜角度θが０°の場合には、ａｃｏｓθ＝ａとなるため、トリミングは行わない。
【００５９】
また、本実施形態の第１の手法では、図５（Ｂ）に示すように、透過像ＴＩにおける切り出した領域以外の領域ＣＡ（切り取った領域）に、切り出し処理を行う前の透過像の輝度の平均値を画素値として有する平均値画像ＡＩを足し合わせて、切り出し処理を行う前の透過像ＴＩと同一サイズの画像ＣＩを生成する。そして、切り出し処理と平均値画像ＡＩの足し合わせ処理を行った傾斜角度θ毎の透過像ＣＩに基づいて、断面像の再構成と三次元像の構築処理を行う。
【００６０】
図６（Ａ）〜図６（Ｃ）は、本実施形態の第１の手法で得られた透過像の一例である。ここでは、試料Ｓとして、汎用的な高分子材料の１つである、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン重合合成樹脂（ＡＢＳ樹脂）を用いた。まず、ＡＢＳ樹脂からウルトラミクロトームを用いて１μｍ厚みの試料切片を切り出し、ＴＥＭ・ＳＴＥＭ観察用銅製のグリッドの上に乗せた。その後、四酸化オスミウム溶液の蒸気により、ポリブタジエン（ＰＢ）相を金属染色させ、ＳＴＥＭを用いて染色した試料のＳＴＥＭ像を得た。
【００６１】
図６（Ａ）は、傾斜角度０°のときに取得されたＳＴＥＭ像であり、図６（Ｂ）は、傾斜角度６０°のときに取得されたＳＴＥＭ像である。また、図６（Ｃ）は、図６（Ｂ）のＳＴＥＭ像に対して、切り出し処理と平均値画像ＡＩの足し合わせ処理を施した画像である。各図中の破線の領域は、再構成可能領域を示す。
【００６２】
図６（Ｂ）に示すように、再構成可能領域外に、極端に輝度の低い異物ＡＦ（アーティファクト）があると、再構成断面像と三次元像に影響を及ぼす恐れがある。そこで、本実施形態の第１の手法では、図６（Ｃ）に示すように、再構成可能領域以外の領域を切り取り、切り取った領域に平均値画像ＡＩを足し合わせることで、再構成可能領域外に存在する異物ＡＴによる影響を排除している。
【００６３】
図７（Ａ）は、従来の手法（取得した透過像をそのまま用いて断面像を再構成する手法）で得られた再構成断面像であり、図７（Ｂ）は、本実施形態の第１の手法で得られた再構成断面像である。図７（Ａ）の断面像には、図６（Ｂ）の異物ＡＴに由来する虚像が現れていることが分かる。一方、図７（Ｂ）の断面像では、本実施形態の手法により異物部分が切り取られているため虚像が現れず、分解能の高い像が取得できている。
【００６４】
このように、本実施形態の手法によれば、取得した傾斜角度θ毎の透過像から断面像の再構成及び三次元像の構築に必要な部分だけを切り出して断面像の再構成及び三次元像の構築を行うことで、分解能の高い再構成断面像及び三次元像を得ることができる。
【００６５】
２−２．電子線走査領域を変化させる手法（第２の手法）
本実施形態の第２の手法は、電子顕微鏡１００が走査透過型電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）の構成を有する場合に適用可能な手法である。
【００６６】
本実施形態の第２の手法では、取得した傾斜角度θ毎の透過像を再構成可能領域の幅ｂでトリミングすることに代えて、試料上Ｓを走査する電子線の走査領域の幅を傾斜角度θに応じて変化させることで、再構成可能領域に含まれる透過像のみを取得する。
【００６７】
すなわち、図８（Ａ）に示すように、電子線の走査領域の傾斜軸ＴＡに垂直な方向の幅を、再構成可能領域の傾斜軸ＴＡに垂直な方向の幅ｂ（＝ａｃｏｓθ）とすることで、傾斜軸ＴＡに垂直な方向の幅がｂである傾斜角度θ毎の一連の透過像ＴＩを取得する。
【００６８】
本実施形態の第２の手法によっても、第１の手法と同様に、再構成可能領域外に存在する異物による影響を排除して分解能の高い再構成断面像及び三次元像を得ることができる。また、第２の手法によれば、試料の傾斜角度θが大きくなるほど、走査領域の傾斜軸ＴＡに垂直な方向の幅が小さくなるため、傾斜角度θの大きな透過像の画像取得時間（露光時間、走査時間）を短縮することができ、一連の透過像を取得するための全体としての画像取得時間も短縮することができる。
【００６９】
なお、再構成可能領域以外の範囲も用いて傾斜角度θ毎の一連の透過像の位置合わせ（アライメント）を行う場合には、図８（Ｂ）に示すように、まず、短い露光時間で、走査領域の幅を傾斜角度が０°のときの走査領域の幅ａとすることで、傾斜軸ＴＡに垂直な方向の幅がａである第１の透過像ＴＩ１を取得する。次に、長い露光時間（必要な露光時間）で、走査領域の幅を再構成可能領域の幅ｂとすることで、傾斜軸ＴＡに垂直な方向の幅がｂである第２の透過像ＴＩ２を取得する。そして、第１の透過像ＴＩ１に第２の透過像ＴＩ２に重ね合わせることで傾斜角度θにおける透過像ＴＩを取得する。このようにしても、一連の透過像の画像取得時間を短縮することができる。
【００７０】
２−３．合焦点透過像の取得
図９（Ａ）、図９（Ｂ）に示すように、試料Ｓをθだけ傾斜させたとき、被写界深度をｆ（単位：ｎｍ）とすると、取得される透過像ＴＩにおいて、焦点（フォーカス）が合っている合焦点領域の傾斜軸ＴＡに垂直な方向の幅ｗ（単位：ピクセル）は、
ｗ＝ｆ／（ｐ×ｔａｎθ）
と表すことができる。ここでｐは、１ピクセルの大きさ（単位：ｎｍ）である。
【００７１】
図９（Ｂ）の透過像ＴＩにおいて、合焦点領域ｗ以外の左右の領域は、アンダーフォーカス又はオーバーフォーカス領域となる。
【００７２】
本実施形態では、各傾斜角度において、対物レンズ８の焦点位置を変化させて得られる複数の透過像を取得し、各傾斜角度に対応する複数の透過像のそれぞれから焦点の合っている領域を抽出して組み合わせることで、ほぼ全ての領域で焦点のあった傾斜角度毎の透過像を生成する。
【００７３】
具体的には、図１０に示すように、傾斜角度θにおいて、対物レンズ８の焦点位置を変化させて、合焦点領域ｗを互いにΔｗだけ重なり合うように（オーバーラップするように）ずらしながら複数の透過像を取得する。
【００７４】
そして、図１１に示すように、合焦点領域をずらしながら取得した傾斜角度θに対応する複数の透過像（同図では、透過像Ａ〜Ｄ）のそれぞれから、合焦点領域ｗを切り出す（抽出する）処理を行う。次に、切り出した複数の画像について、互いに重なりあう領域Δｗで画像の相関をとって位置合わせを行い、位置合わせを行った複数の画像を重ね合わせる（合成する）ことで、傾斜角度θに対応する透過像ＴＩを生成する。
【００７５】
このようにすると、試料Ｓを高傾斜させた場合であっても、ほぼ全ての領域で焦点のあった透過像（合焦点透過像）を得ることができ、合焦点透過像を用いて断面像の再構成及び三次元像の構築を行うことで、分解能の高い再構成断面像及び三次元像を得ることができる。例えば、本実施形態の第１の手法により三次元像を構築する場合には、傾斜角度θ毎の合焦点透過像に対して、再構成可能領域の幅ｂで切り出す処理と、平均値画像ＡＩの足し合わせ処理とを施すようにすればよい。
【００７６】
なお、ＳＴＥＭについては、傾斜軸に平行な方向の走査ライン毎にフォーカスを合わせるダイナミックフォーカス法が既に提案されているが、ＴＥＭについては、ダイナミックフォーカス法に相当する手法は提案されていない。本実施形態の合焦点透過像を取得する手法は、ＴＥＭに適用することが可能である点で有効な手法である。
【００７７】
図１２は、傾斜角度６０°のときに取得されたＴＥＭ像である。ここでは、図６（Ａ）〜図６（Ｃ）の例と同様に、試料Ｓとして金属染色させたＡＢＳ樹脂を用いている。図１２のＴＥＭ像において、微小な黒色の像は金粒子の像である。図１２を見ると、合焦点領域ｗ以外の領域（合焦点領域ｗの上下の領域）では、金粒子の像がぼけていることがわかる。
【００７８】
図１３は、本実施形態の手法により、傾斜角度６０°のときに合焦点領域ｗをずらしながら複数の透過像を取得し、複数の透過像から切り出した合焦点領域ｗの画像をΔｗの領域で位置合わせを行って合成した透過像である。図１３を見ると、図１２のＴＥＭ像とは異なり、透過像の全領域に渡って焦点が合っていることがわかる。
【００７９】
なお、本発明は、上述の実施の形態に限定されるものではなく、種々の変形が可能である。本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【００８０】
１  電子線源、２  照射レンズ系、４  偏向器、６  ステージ、７  ステージ制御装置、８  対物レンズ、９  対物レンズ制御装置、１０  投影レンズ、１２  検出器、１４  鏡筒、２０  処理部、２２  制御信号生成部、２４  像取得部、２６  三次元像構築部、３０  操作部、３２  表示部、３４  記憶部、３６  情報記憶媒体
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図６】
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【図７】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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