(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受入番号ＰＴＡ−８６９４、ＰＴＡ８６９５又はＰＴＡ８６９６でＡＴＣＣに寄託されている弱毒化マイコプラズマ・ボビス細菌株、及び、そのあらゆる弱毒化子孫マイコプラズマ・ボビス細菌株からなる群から選択される、弱毒化された非病原性のマイコプラズマ・ボビス細菌株の生細菌を含有する免疫原性組成物。
【請求項２】
さらに医薬的に許容できる担体を含有する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記免疫原性組成物が１投与当たり前記弱毒化された非病原性のマイコプラズマ・ボビス細菌の生細菌を少なくとも１０Ｅ３ＣＦＵ含有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記免疫原性組成物が１投与当たり前記弱毒化された非病原性のマイコプラズマ・ボビス細菌の生細菌を１０Ｅ３〜１０Ｅ１０ＣＦＵ含有することを特徴とする、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記免疫原性組成物が１投与当たり前記弱毒化された非病原性のマイコプラズマ・ボビス細菌の生細菌を１０Ｅ６〜１０Ｅ１０ＣＦＵ含有することを特徴とする、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記免疫原性組成物の１回投与が１又は２ｍＬに調剤されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記免疫原性組成物が、単回投与後１４日以内に免疫発現を刺激するのに効果的であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記免疫原性組成物が、その免疫原性組成物の単回投与後少なくとも４２日間の免疫持続を刺激するのに効果的であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記免疫原性組成物が、動物に投与されると免疫応答を引き起こす又は誘発することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記免疫原性組成物がワクチンであることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
弱毒化された非病原性のマイコプラズマ・ボビス株の生細菌を医薬的に許容できる担体と混合する工程を有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を製造する方法であって、
前記弱毒化された非病原性のマイコプラズマ・ボビス株が、受入番号ＰＴＡ−８６９４、ＰＴＡ８６９５又はＰＴＡ８６９６でＡＴＣＣに寄託されている弱毒化マイコプラズマ・ボビス細菌株、及び、そのあらゆる弱毒化子孫マイコプラズマ・ボビス細菌株からなる群から選択される、前記方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の有効量を動物（人間を除く）に投与する工程を有する、マイコプラズマ・ボビスによって引き起こされる感染を治療又は予防する方法。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の有効量を動物（人間を除く）に投与する工程を有する、マイコプラズマ・ボビス感染の兆候を減少させる方法。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の有効量を動物（人間を除く）に投与する工程を有する、マイコプラズマ・ボビス感染の臨床兆候の重症度又はその発症を減少させる方法。
【請求項１５】
前記動物（人間を除く）に１回だけ投与することを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記免疫原性組成物を生後１日以上の動物（人間を除く）に投与することを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫原性組成物を生後１日から生後１６週までの動物（人間を除く）に投与することを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記動物（人間を除く）に２回投与することを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
２回目の投与が１回目の投与の１０日後以降に行われることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
２回目の投与が、１回目の投与の１４日後から２８日後の間に行われることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記動物が牛であることを特徴とする、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００７年１０月２９日に米国に出願された米国仮出願番号６０／９８３，４９２及び２００８年６月２５日に米国に出願された米国仮出願番号６１／０７５，５５２に基づき優先権を主張し、その教示内容は参照することによりここに援用される。
［配列リスト］
本出願は紙形式及びコンピュータ可読形式の配列リストを有しており、その教示内容は参照することによりここに援用される。
【背景技術】
【０００２】
マイコプラズマ・ボビス（Ｍ．  ｂｏｖｉｓ）は、マイコプラズマの中で病原性の高い種の１つであると考えられ、世界中で著しい経済的損失を引き起こす。マイコプラズマは全年齢の牛において重度の臨床兆候を引き起こす。Ｍ．ボリスは、牛における肺炎、乳腺炎及び関節炎を引き起こすことが判明している最もよく見られるマイコプラズマ病原体であり、その病因的役割は雌牛及び雄牛における耳炎、角結膜炎（ｋｅｒａｔｏｃｏｎｊｕｃｔｉｖｉｔｉｓ）、滑膜炎並びに生殖障害にも関係してきた。一般的に、マイコプラズマは細胞壁又は細胞膜がなく、一般的に用いられる広域抗生物質治療のいくつかに対して耐性になる傾向があるため、治療することが難しい。マイコプラズマは大半のウイルスよりも大きく、細胞に侵入するよりもむしろ細胞表面に付着し破壊することにより組織細胞にダメージを与えるという点で、マイコプラズマはウイルスと異なる。Ｍ．ボビスに感染した動物では免疫応答が低下しており、発熱、鬱病（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、食欲不振、呼吸困難（ｌａｂｏｒｅｄ  ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）、鼻汁及び眼漏、咳、くしゃみ、あえぎ（ｇａｓｐｉｎｇ）、うめき（ｇｒｕｎｔｉｎｇ）、跛行及び関節腫脹（ｌａｍｅｎｅｓｓ  ａｎｄ  ｓｗｏｌｌｅｎ  ｊｏｉｎｔｓ）、乳腺炎、中耳炎、流産、横臥（ｒｅｃｕｍｂｅｎｃｅ）、並びに死亡などのＭ．ボビス感染の兆候を示し得る。この微生物は、不衛生で暖かく湿った環境で存続する。マイコプラズマはミルク中で生存でき、感染に応答して産生される多数の白血球の存在下でも増殖するように思われる。
Ｍ．ボビスワクチンを開示している当技術分野で入手可能な参考文献がいくつか存在する。米国特許番号６，５４８，０６９は、少なくとも２つの死滅したＭ．ボビス株を有する全細胞不活性化細菌ワクチン（バクテリン）を包含するワクチン組成物を開示している。他の入手可能な参考文献には、不活性化ワクチンを製造するために１０回よりも少なくＭ．ボビス株を継代することが開示されているが、連続継代を介して感染性又は病原性のＭ．ボビス株を弱毒化することや、そのような弱毒化生Ｍ．ボビス株を非病原性の生培養ワクチンの本質とすることは述べられていない。
先行技術は、死滅したＭ．ボビスがマイコプラズマ・ボビス感染と関連する臨床症状の重症度を軽減するのに効果的又は効率的ではないという点で不十分である。低レベルでの継代を行っても、臨床症状が大きく軽減されるほど高い有効性を有するマイコプラズマワクチンは産生されない。低代継代で不活性化された入手可能なＭ．ボビスワクチンは、臨床症状の重症度において大きな軽減を示さない。また、前記米国特許番号６，５４８，０６９は、高代継代したＭ．ボビスの弱毒化株を免疫原性又はワクチン組成物に用いるという思想を以下の教示により意識的に強く排除している。
「マイコプラズマ分離株は培養中でその抗原を急速に変えるため、約５０回を超える高代継代株を本発明の細菌ワクチン中に用いると、その高代継代株は感染性を失い、より乏しい免疫応答を引き起こし得る。従って、新しい分離株や未だ病原性を有する培養株、すなわち、宿主動物に感染する能力を保持している株を用いることが好ましい。世代の臨界数が存在することは知られていないが、本発明は、大量生産前に約１０回以下、好ましくは約５回以下継代したマイコプラズマ株から開始することが好ましい。培養中の低世代（ｆｅｗｅｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ）の株を用いることにより、抗原がその自然状態を保ち、これにより感染性微生物に対する防御免疫応答を引き起こすと考えられる。」
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００７／００７７２６０号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Vaccine,2003,21(27-30),p.4270-4
【非特許文献２】Res.Vet.Sci.,1980,29(3),p.328-32
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、当該技術において必要なものは、Ｍ．ボビスに対する免疫応答を引き起こすのに効果的な免疫原性組成物である。さらに必要なものは、Ｍ．ボビス感染の兆候の重症度を軽減したり、その兆候の発生を低減するのに効果的な免疫原性組成物である。さらに必要なものは、Ｍ．ボビス感染の兆候の発生を低減又は排除するのに効果的なワクチンである。さらに必要なものは、Ｍ．ボビス感染の兆候の重症度を軽減したり、その兆候の発生を低減するのに効果的で、それを必要とする動物に安全に投与できる免疫学的組成物である。さらに必要なものは、交差防御（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）をもたらし、免疫学的組成物中で用いられるＭ．ボビス株又は分離株とは異なるＭ．ボビス株及び分離株に対する免疫応答を引き起こす前記免疫学的組成物である。さらに必要なものは、１回投与、２回投与又は複数回投与（初回投与後に追加投与）の免疫療法として適した安全且つ効果的な免疫学的組成物、複数の投与法による投与に好適且つ便利な免疫学的組成物、並びに、混合ワクチンの製造に用いる他の免疫原及び免疫学的組成物と混合可能な免疫学的組成物である。最後に、必要なものは、必要とする動物に対して迅速な防御開始と長期持続防御を与える前記免疫学的組成物である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、非病原性で弱毒化されたＭ．ボビス株、好ましくは高代継代のＭ．ボビス株を提供することにより、先行技術において存在する問題を解消する。前記組成物又はワクチンは、製薬学的に又は獣医学的に許容できる担体と組み合わせることができ、野生型のＭ．ボビス株による感染と比較すると、好ましくは現在入手可能なワクチンと比較しても、Ｍ．ボビス感染の兆候及び／又はＭ．ボビス感染それ自体及び／又は発症又は重症度が減少するほど有効性が向上した免疫原性組成物として用いることが出来る。すなわち、本発明によるワクチンを接種された子牛は、Ｍ．ボビス感染の兆候を起こすリスクが低く、臨床兆候が生じたとしてもその臨床兆候は、ワクチンを受けずにＭ．ボビスに感染した動物や、本発明によらないワクチンを受けた動物よりも重症度が低く、又は、まん延しないであろう。また、非ワクチン接種で感染した動物、好ましくは従来入手可能なワクチンでワクチン接種された動物と比較すると、本発明によるワクチンを動物に投与する場合には、群れ中で感染した動物がいてもその感染動物の数は少ないであろう。有利なことに、本発明のワクチンは、迅速な発現と長期持続防御の両方を提供する有効性の高い安定ワクチン組成である。先行技術の教示を背景として、Ｍ．ボビスの株、好ましくはＭ．ボビスの高代継代株が弱毒化され、生存しており、免疫原性組成物の成分として従来よりも非常に効果的であるという点で、本発明の組成物は驚くべき結果を提供した。
【０００７】
本明細書に開示された発明は、動物に投与すると免疫応答を引き起こす又は誘発するＭ．ボビスの非病原性で弱毒化した株又は分離株、好ましくは高代継代されたＭ．ボビスの弱毒化株を提供する。有利なことに、前記免疫応答は、本発明の組成物の投与を受けている動物を防御し、その結果個々の動物はＭ．ボビス感染の兆候を引き起こすリスクが低くなる。また、そのような兆候が起きてもその兆候は、当該組成物を接種されていない動物や、本発明により製造されたものではないワクチンや組成物を接種されている動物に比べて、重症度が低く、まん延しない。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】鼻、扁桃及び肺のサンプルからの培養採取の頻度（０日目、１４日目、２８日目、３５日目及びポスト）
【図２】鼻、扁桃及び肺のサンプルからのＰＣＲ検出の頻度（０日目、１４日目、２８日目、３５日目及びポスト）
【図３】血清サンプルからのＭ．ボビス特異的抗体に対する平均グループスコア（０日目、１４日目、２８日目、３５日目及び４２日目）
【図４】生ワクチンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及び非ワクチングループに関する血清学的比較（鼻腔内投与＋皮下投与の場合のみ）
【図５】様々な投与方法を用いての生ワクチンに対する血清学的比較
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明において、「分離株」及び「株」という用語は互換性を持って用いられ、個々の株又は分離株間の相違点はＤＮＡフィンガープリンティング法を用いて検出され得る（すなわち、異種の株又は分離株は異なるフィンガープリントを有する。）ことを述べる。
【００１０】
ある態様において、Ｍ．ボビスの高代継代株と製薬学的に許容できる担体とを有する免疫原性組成物が開示される。前記Ｍ．ボビス株は弱毒化され非病原性であることが好ましい。本発明の免疫原性組成物は、牛におけるＭ．ボビスに対する免疫原性応答を生み出す。当該免疫原性組成物の投与により生じる又は引き起こされるＭ．ボビス感染に対する免疫原性応答は、Ｍ．ボビス感染の兆候の重症度やその発症を大幅に減少させる。他の態様において、高代継代のＭ．ボビス株、好ましくは高代継代の弱毒化された非病原性のＭ．ボビス株を有する免疫原性組成物の製造方法が開示される。他の態様において、子牛における免疫原性組成物を用いた迅速かつ長期持続性の血清学的体液性免疫応答を刺激し、その結果して疾病を予防する方法が開示される。また、他の態様において、本発明の免疫原性組成物を有効量で投与することにより、子牛にＭ．ボビス感染に対する免疫を与える方法が開示される。本発明の免疫原性又はワクチン組成物を子牛に投与した後にＭ．ボビスの野生型株でチャレンジすると、Ｍ．ボビス感染と通常関連する臨床症状、肺病変、跛行、及び関節病変の減少を含むＭ．ボビス感染の兆候の減少を示した。特に、ワクチン接種されたグループにおいて、肺病変の減少及び関節臨床症状及び関連する跛行のかなりの減少が観察された。本発明の他の態様において、好ましくは本発明による及び／又は本明細書に開示された弱毒化された非病原性Ｍ．ボビス細菌のいずれかを投与することにより、Ｍ．ボビス感染の兆候を減少させる方法が開示される。Ｍ．ボビス感染兆候の減少は、本発明の免疫原性組成物の投与によって達成される。
【００１１】
本発明の好ましい態様においては、それぞれＭ．ボビスの高代継代の弱毒化株及び製薬学的に許容できる担体を含む３種の生ワクチン又は免疫原性組成物を子牛に投与する。当該Ｍ．ボビスの高代継代株は、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養中で、好ましくは１０回より多く継代され、好ましくは２０回以上、より好ましくは３０回以上、さらにより好ましくは４０回以上、さらにより好ましくは５０回以上、さらにより好ましくは５５回以上、さらにより好ましくは６０回以上、さらにより好ましくは７０回以上、さらにより好ましくは８０回以上、さらにより好ましくは９０回以上、さらにより好ましくは９５回以上、さらにより好ましくは１００回以上、さらにより好ましくは１０２回以上、最も好ましくは１０６回以上継代される。ワクチン又は免疫原性組成物中で有益なＭ．ボビス株は、どのような株又は分離株であってもよい。３つの代表的な株として、ブダペスト条約の条項により２００７年１０月１６日にバージニア州マナッサスにあるＡＴＣＣに寄託されＰＴＡ−８６９４と指定された０５２８２３Ａ１０６、同じくブダペスト条約の条項により２００７年１０月１６日にバージニア州マナッサスにあるＡＴＣＣに寄託されＰＴＡ８６９６と指定された０５２４９Ａ１０２、及び、同じくブダペスト条約の条項により２００７年１０月１６日にバージニア州マナッサスにあるＡＴＣＣに寄託されＰＴＡ８６９５と指定された０５１９０２１Ｂ１０６が挙げられる。継代前のこれらの株はいずれも病原性であるが、上記のようにこれらの株を各々継代した後、特に１００回より多く継代した後には、得られる継代株は弱毒化され非病原性であり、当該株の免疫原性組成物が投与された動物において免疫応答をもたらした。その後、前記子牛は、自然に起こる病気の発生から得られたＭ．ボビス分離株でチャレンジされた。本明細書中の全ての例において、チャレンジ分離株は、ワクチン接種に用いられた分離株とは異なる「フィンガープリント」（下記で決定される）を有していた（すなわち、異種のチャレンジであった）。有利なことに、継代された株を投与すると、Ｍ．ボビスの病原株又は野生型株でチャレンジした後にＭ．ボビス感染の臨床症状の重症度及び／又は発症を低減する免疫応答が引き起こされた。
【００１２】
従って他の態様によれば、本発明は、野生型のＭ．ボビス株による感染に比べて、好ましくは現在入手可能なワクチンに比べてもＭ．ボビス感染の兆候及び／又はＭ．ボビス感染それ自体及び／又は発症又は重症度が減少するという向上した効果を奏し、迅速な発現と長期持続防御が得られるという高い効果を奏する免疫原性組成物中で用いることの出来る、受入番号ＰＴＡ−８６９４、ＰＴＡ８６９５又はＰＴＡ８６９６でＡＴＣＣに寄託された弱毒化Ｍ．ボビス細菌株のいずれかに関し、好ましくは、前述の寄託された弱毒化Ｍ．ボビス細菌株のいずれかの弱毒化された子孫Ｍ．ボビス細菌株のいずれかにも関する。
【００１３】
他の態様によれば、本発明は、受入番号ＰＴＡ−８６９４、ＰＴＡ８６９５若しくはＰＴＡ８６９６でＡＴＣＣに寄託された弱毒化Ｍ．ボビス細菌株のいずれか、又は前述の寄託されたＭ．ボビス細菌株のいずれかの弱毒化された子孫Ｍ．ボビス細菌株のいずれかを有する、本明細書記載の免疫原性組成物をも提供する。好ましくは、これらの免疫原性組成物は、受入番号ＰＴＡ−８６９４、ＰＴＡ８６９５又はＰＴＡ８６９６でＡＴＣＣに寄託された弱毒化Ｍ．ボビス細菌株のいずれかを有する。特定の前述のＭ．ボビス細菌株のいずれも用いることが出来る。また、本発明は、例えばＭ．ボビスの病原株又は野生型株でチャレンジした後にＭ．ボビス感染の臨床症状の重症度及び／又は発症を低減することを目的とした、本明細書記載のこれらの特定の弱毒化Ｍ．ボビス株のいずれかの獣医学的使用にも関する。
【００１４】
他の態様によれば、本発明は、受入番号ＰＴＡ−８６９４、ＰＴＡ８６９５又はＰＴＡ８６９６でＡＴＣＣに寄託されたＭ．ボビス細菌株と同じ性質を有する弱毒化Ｍ．ボビス細菌にも関する。「受入番号ＰＴＡ−８６９４、ＰＴＡ８６９５又はＰＴＡ８６９６でＡＴＣＣに寄託されたＭ．ボビス細菌株と同じ性質を有する」とは、そのような細菌株が弱毒化されており、皮下投与若しくは経鼻投与により子牛に２．１Ｅ９ＣＦＵの単回投与した後１４日以内に子牛体内での体液性免疫応答を引き出すことができ、病原性Ｍ．ボビス野生型株に感染することによって通常生ずる臨床兆候を引き起こさないことを意味する。参照方法として、体液性免疫応答は、検査キット付きのプロトコルを用いてＢＩＯＶＥＴ  Ｍ．ボビス  ＥＬＩＳＡ−Ｋｉｔにより求められる。これらの株の各々は、皮下投与又は経鼻投与により子牛に２Ｅ９ＣＦＵの単回投与を行った後１４日以内に、検査キット付きのプロトコルを用いてＢＩＯＶＥＴ  Ｍ．ボビス  ＥＬＩＳＡ−Ｋｉｔにおいて、光学濃度（Ｏ．Ｄ．）測定値で表すと１．５以上の相対的ＥＬＩＳＡスコアを有する体液性免疫応答を引き起こすことが好ましい。
【００１５】
本発明の組成物は、どのような従来方法でも投与することが出来る。投与方法の例としては、免疫系細胞による当該免疫原性組成物への接触を可能とするあらゆる方法：経口、経皮／皮内、静脈内、皮下、筋肉内、眼内、腹腔内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内、肺内又はこれらのあらゆる組み合わせの投与方法が挙げられる。好ましい投与方法は、筋肉内、皮下及び鼻腔内投与であって、皮下及び鼻腔内投与が特に好ましい。希望又は必要に応じて、ある程度の期間をおいて１回又は複数回、追加予防接種をしてもよい。そのようなワクチンの投与後、動物内で免疫応答が引き起こされ、病原型のＭ．ボビスでチャレンジした後に野生型の細菌又は分離株にさらすと、Ｍ．ボビス感染の兆候の発症及び／又は重症度が減少する。また、本発明のワクチン又は免疫原性組成物は、継代により弱毒化された後に抗原成分として用いられる株以外のＭ．ボビス株に対して、効果的な交差防御（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）を示した。
【００１６】
好ましい形態において、当該ワクチンの投与量は５ｍＬ以下であり、より好ましくは３ｍＬ以下であり、さらにより好ましくは２ｍＬ以下である。最も好ましい実施態様において、該投与量は２ｍＬであり、鼻腔内投与で１ｍＬがそれぞれの鼻孔内に投与されることが好ましく、皮下投与がより好ましく、単回投与として一度に鼻腔内及び皮下の両方に投与されることが最も好ましい。いくつかの好ましい形態において、免疫原性組成物の２回目又はそれ以降の投与が、１回目の投与の後に行われる。そのような後続投与は、初回投与から１０日後以降に行われることが好ましく、１０日後以降から３２日の間がより好ましく、１２日後以降から３０日の間がさらにより好ましく、１４日後以降がさらにより好ましく、１４日後以降から２８日の間が最も好ましい。最も好ましい形態において、該ワクチンは、単回投与として０日目に投与され、又は、代替的な形態において、０日目とその後１４〜２８日目に投与され、免疫投与計画の終了後に初めて病原型のＭ．ボビスにさらす。最も好ましい１形態において、追加免疫は必要ではなく、該ワクチンは１回のみ投与される。該ワクチンは、生後１日から成獣期までの動物に、好ましくは生後１日から生後２年の若年成牛までの子牛に、より好ましくは１日齢から１６週齢の子牛に、最も好ましくは生後６週から生後１２週の子牛に投与される。そのような投与により、下記のようにＭ．ボビス感染の兆候が減少する。実際、本明細書中の調査では、上記のようにワクチン接種されたグループにおけるＭ．ボビス感染の兆候が、非ワクチン接種グループと比較すると５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらにより好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは７５％以上減少したことが示されている。肺病変の評価、具体的には様々な種について習慣的に採点されるＭ．ボビスが原因の病変に起因する肺硬化の割合が、死体解剖後になされ、非ワクチン接種グループと比較すると、３３％以上、より好ましくは５０％以上、さらにより好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上減少していた。
【００１７】
他の好ましい実施態様において、本発明のワクチンは適切なアジュバントと組み合わされる。本明細書で用いられる「アジュバント」（補助薬）として、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム、Ｑｕｉｌ  Ａ，ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ），ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）などのサポニン、Ｗ／Ｏ（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ）エマルジョン、Ｏ／Ｗ（ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）エマルジョン、Ｗ／Ｏ／Ｗ（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）エマルジョンが挙げられる。該エマルジョンは特に、軽質液体パラフィンオイル（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅａ  ｔｙｐｅ）；スクアラン若しくはスクアレンなどのイソプレノイドオイル；アルケン、特にイソブテン若しくはデケンのオリゴマー形成から得られるオイル；直鎖アルキル基を有する酸若しくはアルコールのエステル、特には植物オイル、エチルオレアート、プロピレングリコールジ−（カプリラート／カプラート）、グリセリルトリ−（カプリラート／カプラート）若しくはプロピレングリコールジオレアート；分岐鎖状の脂肪酸若しくはアルコールのエステル、特にイソステアリン酸エステルをベースにすることが出来る。当該オイルは乳化剤と組み合わせて用いてエマルジョンを形成する。前記乳化剤は、非イオン性界面活性剤、特に、エトキシ化されていてもよい、ソルビタンのエステル、マンニド（ｍａｎｎｉｄｅ）のエステル（例えば、無水マンニトールオレアート）、グリコールのエステル、ポリグリセロールのエステル、プロピレングリコールのエステル、及びオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸若しくはヒドロキシステアリン酸のエステル、並びに、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン共重合体ブロック、特に、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）製品、特にはＬ１２１が好ましい。Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ（Ｅｄ．Ｓｔｅｗａｒｔ−Ｔｕｌｌ，Ｄ．Ｅ．Ｓ．）を参照することが出来る。  ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ｐｐ５１−９４（１９９５）及びＴｏｄｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：５６４−５７０（１９９７）を参照することができる。
例えば、Ｍ．Ｐｏｗｅｌｌ及びＭ．Ｎｅｗｍａｎ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５による「Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」の第１４７ページに記載されているＳＰＴエマルジョンや、同じくこの本の第１８３ページに記載されているエマルジョンＭＦ５９を用いることが出来る。
【００１８】
アジュバントの別例は、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー、及び無水マレイン酸とアルケニル誘導体との共重合体から選択される化合物である。有利なアジュバント化合物は、特に糖類のポリアルケニルエーテル若しくはポリアルコールで架橋されたアクリル酸又はメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物は、カルボマーという用語で知られている（Ｐｈａｍｅｕｒｏｐａ  Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．２，Ｊｕｎｅ  １９９６）。当業者であれば、少なくとも３個のヒドロキシ基、好ましくは８個以下のヒドロキシ基を有するポリヒドロキシ化された化合物と架橋し、これにより該少なくとも３個のヒドロキシル基の水素原子が少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族基に取って換えられたアクリル系ポリマーについて述べたＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．２，９０９，４６２にも言及することが出来る。好ましい基（不飽和脂肪族基）は炭素数２〜４のものであり、例えば、ビニル基、アリル基、及び他のエチレン性不飽和基である。該不飽和基は、それ自体メチル基などの他の置換基を有していてもよい。カルボポル（Ｃａｒｂｏｐｏｌ（ＢＦ  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ））という名称で売られている製品が特に適当である。この製品はアリルスクロース又はアリルペンタエリスリトールと架橋している。これらの中で、カルボポル９７４Ｐ、９３４Ｐ及び９７１Ｐが挙げられる。カルボポル９７１Ｐを用いることが最も好ましい。無水マレイン酸とアルケニル誘導体の共重合体の中には、無水マレイン酸とエチレンの共重合体である共重合体ＥＭＡ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）がある。これらのポリマーを水に溶解させると酸溶液になり、その後、免疫原性、免疫学的又はワクチン組成物それ自体を包含するアジュバント溶液を得るために、該溶液は好ましくは生理的ｐＨに中和される。
【００１９】
さらに適したアジュバントとしては、数ある中でも、ＲＩＢＩアジュバントシステム（Ｒｉｂｉ  Ｉｎｃ．）、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ，Ａｔｌａｎｔａ  ＧＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ  ＣＡ）、モノホスホリルリピドＡ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ脂質−アミンアジュバント、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の熱−不安定エンテロトキシン（組み換え若しくはその他）、コレラトキシン、ＩＭＳ１３１４、又はムラミルジペプチド、又は自然発生若しくは組み換えのサイトカイン若しくはそのアナログ、又は内在性サイトカイン放出刺激剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
当該アジュバントは、１投与当たり約１００μｇ〜約１ｇの量で添加されることが好ましい。当該アジュバントは、１投与当たり約１００μｇ〜約５００ｍｇの量で添加されることがより好ましい。当該アジュバントは、１投与当たり約５００μｇ〜約２５０ｍｇの量で添加されることがさらにより好ましい。当該アジュバントは、１投与当たり約７５０μｇ〜約１００ｍｇの量で添加されることがさらにより好ましい。当該アジュバントは、１投与当たり約１ｍｇ〜約５０ｍｇの量で添加されることがさらにより好ましい。当該アジュバントは、１投与当たり約１ｍｇ〜約１０ｍｇの量で添加されることがさらにより好ましい。当該アジュバントは、１投与当たり約１ｍｇの量で添加されることが最も好ましい。
【００２１】
また、本発明の免疫原性及びワクチン組成物は、１又は複数の獣医学的に許容できる担体を含み得る。本明細書で用いられるように、「獣医学的に許容できる担体」には、あらゆる全ての溶媒、分散媒、被覆剤、アジュバント（補助剤）、安定剤、希釈剤、防腐剤、抗細菌及び抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｄｅｌａｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）などが含まれる。いくつかの好ましい実施態様、特に凍結乾燥された免疫原性組成物を含む実施態様においては、本発明中で使用される安定剤には凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）用又はフリーズドライ（ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｙｉｎｇ）用の安定剤が含まれる。
「希釈剤」には、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどが含まれ得る。等張剤には、特に、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースが含まれ得る。安定剤には、特に、アルブミン及びエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩が含まれる。
【００２２】
「免疫原性又は免疫学的組成物」とは、目的とする組成物又はワクチンに対する細胞性及び／又は抗体介在性の免疫応答という宿主中の免疫応答を引き起こす、少なくとも１つの抗原を有する物の組成物を意味する。通常、「免疫応答」は以下の効果を１又は複数含むが、これらに限定されるものではない：抗原又は目的の組成物若しくはワクチン中に含まれる抗原に特異的な抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、及び／又は細胞障害性Ｔ細胞及び／又はガンマ−デルタＴ細胞の産生又は活性化。宿主は、治療免疫応答か防御免疫応答のいずれかを示し、その結果新たな感染に対する抵抗性が高まる及び／又は病気の臨床的重症度が減少することが好ましい。そのような防御は、感染した宿主が通常示す臨床兆候の減少若しくは欠如、回復期間の短縮、及び／又は感染した宿主の組織、体液若しくは排せつ物中での存続期間の低下や細菌力価（タイター）の低下により実証される。
【００２３】
「Ｍ．ボビス感染の兆候」とは、Ｍ．ボビスによって引き起こされる感染や疾患の発現を意味し、野生型のＭ．ボビスに感染した牛が一般に経験する臨床症状及び病変の両方を含む。これらの感染若しくは疾患の発現は多くの形を取ってよく、その中には発熱、鬱病、食欲不振、呼吸困難、鼻汁及び眼漏、咳、くしゃみ、あえぎ、うめき、跛行及び関節腫脹、中耳炎、内耳炎からくる分泌、流産及び他の生殖障害、横臥、呼吸器感染、頭位傾斜、運動失調、関節炎、乳腺炎、耳炎、角結膜炎、滑膜炎、胸膜炎、肺病変、肺硬化、肺における結節形成、滑液の増加、関節包の肥厚、並びに死亡も含まれるが、これらに限定されることはない。
【００２４】
この開示における「高代継代株」とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養中で１０回より多く継代されたＭ．ボビス株を意味し、好ましくは２０回以上、より好ましくは３０回以上、さらにより好ましくは４０回以上、さらにより好ましくは５０回以上、さらにより好ましくは５５回以上、さらにより好ましくは６０回以上、さらにより好ましくは７０回以上、さらにより好ましくは８０回以上、さらにより好ましくは９０回以上、さらにより好ましくは９５回以上、さらにより好ましくは１００回以上、さらにより好ましくは１０２回以上、最も好ましくは１０６回以上継代されたＭ．ボビス株を意味する。
「肺病変の評価」とは、死体解剖後の肺の観察を意味し、硬化、病変及び結節形成の評価並びに胸膜炎及び液体貯留を含む胸腔の評価を含むが、これらに限定されることはない。
【００２５】
「弱毒化」とは病原体の病原性（毒性）の減少を意味する。本発明において、「弱毒化」は「非病原性」と同義である。本発明において、弱毒化された細菌は、標的とする哺乳動物においてＭ．ボビス感染の臨床兆候を生じずに免疫応答を引き起こすことのできるほど毒性（病原性）の減少した細菌であるが、非弱毒化Ｍ．ボビスに感染し該弱毒化ウイルスを接種されていない「コントロール群」の動物と比較すると、弱毒化Ｍ．ボビスに感染した動物における臨床兆候の発症及び重症度が減少するということを意味してもよい。この文脈において、「減少／減少する」とは、上記で定義したコントロールグループと比較して、１０％以上、好ましくは２５％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは１００％より多くの減少を意味する。従って、弱毒化された非病原性のＭ．ボビス株は、改変した生Ｍ．ボビス細菌を有する免疫原性組成物への組み込みに適したものである。
本発明において、「有効量」とは、動物におけるＭ．ボビス感染の発症を低減する又はその重症度を軽減する免疫応答を引き起こすことのできる免疫原性組成物の量を意味する。特に、有効量とは、１投与当たり１０Ｅ３〜１０Ｅ１０、好ましくは１０Ｅ６〜１０Ｅ１０のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を意味する。
【００２６】
「ワクチン接種された動物がＭ．ボビスにさらされるか野生型のＭ．ボビス株による感染症を患う場合に、現在入手可能なワクチンに比べてＭ．ボビス感染に関連する臨床症状及び／又はＭ．ボビス感染自体が減少するほど向上した有効性」とは、本発明により教示されるように継代された株から製造されたワクチンを本発明前に入手可能であったＭ．ボビスワクチンと比較すると、Ｍ．ボビス感染の臨床兆候の発症又は重症度が減少することを意味する。この文脈において、ワクチン接種を受けていない動物、又は本発明前に入手可能なＭ．ボビスワクチンをワクチン接種された動物は、本発明によるＭ．ボビス免疫原性組成物を投与された動物よりも３０％以上、且つおそらく好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらにより好ましくは６０％以上、さらにより好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは７５％以上、さらにより好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上重症度又は流行度が増したＭ．ボビス感染の臨床兆候を有するであろう。
【００２７】
「長期持続防御」とは、少なくとも３週間持続する「向上した有効性」を意味するものとするが、肉用動物については好ましくは６ヶ月以上、より好ましくは１年以上、さらにより好ましくは２年以上、及び、乳用動物については６ヶ月以上、好ましくは１年以上、より好ましくは２年以上、さらにより好ましくは３年以上、さらにより好ましくは４年以上持続する「向上した有効性」を意味するものとする。乳用動物及び肉用動物について、肉用動物が肉の市場に出される平均年齢まで、及び、乳用動物が搾乳の生産生活を終える平均寿命まで、前記長期持続防御が持続することが最も好ましい。
本明細書において用いられる「そのような投与を必要としている」又は「そのような投与治療を必要としている」とは、前記投与／治療が、本発明による免疫原生組成物を接種される動物の健康若しくは健康に関する他の有益な医学的効果の向上又は改善に関連することを意味する。
【００２８】
本明細書で用いられる「ＤＮＡフィンガープリンティング」とは、ＷＯ２００８−０３０６１９に記載されているように挿入配列間のＤＮＡを増幅し、増幅産物のパターンを測定することによって、細菌株を素早く特定することを意味する。簡潔に述べると、ＰＣＲと細菌の挿入配列（転移因子）用に設計された外側対向プライマーの組み合わせとを用いて、細菌種の株に特有なパターンを作り出す。その後、疫学又は系統学などの物事に関してこれらのパターンを比較することが出来る。ＤＮＡフィンガープリンティングの好ましい方法の１つは、ＰＣＲと１又は複数の細菌挿入配列に対して設計された外側対抗プライマーとを用いる。そのような方法を用いた場合、隣接する挿入配列（ＩＳ）からの増幅産物が得られる。ＰＣＲ増幅を終えると、該産物は分離され（寒天ゲル）、該増幅産物の分子量に従って、細菌種の株に特有のバンドパターンが得られる。好ましい方法は、外側対向プライマーを用いて多重（マルチプレックス）ＰＣＲを実行することである。多重ＰＣＲ法はＰＣＲの変法であって、多数のプライマー対を用いることにより１つの反応中で関心のある多くの標的を同時に増幅することができる。もちろん、分子に基づいた公知の他のフィンガープリンティング法を使用してもよい。
【００２９】
「挿入配列」（ＩＳ）とは、転移因子として作用する短いＤＮＡ配列である。ＩＳは一般的に約７００〜２５００ｂｐの長さであり、他種の転移因子と比べると比較的小さい。これらは転移活性にかかわるタンパク質をコードしており、該タンパク質は前記ＩＳの移動を可能とする酵素反応を触媒する。ＩＳ因子は特定の種に固有であるか又は分類群の間で共有され得る。通常これらの挿入配列の複数のコピーが存在するが、これらは特定の転移因子に固有の位置に配置される。
従って、他の態様によると、本発明は、上記のように複数回継代又は連続的弱毒化を介して弱毒化されたＭ．ボビス株の、薬、好ましくは動物用薬（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ）としての使用に関する。
【００３０】
本発明の他の態様によると、上記のように弱毒化されたＭ．ボビス株は、Ｍ．ボビスによって引き起こされる感染の予防又は治療を目的とした本明細書記載の医薬組成物を製造するために用いることが出来る。上記の通り、これらの医薬組成物／ワクチン組成物は、Ｍ．ボビスによる感染しやすい動物の治療及び／又は予防に用いることが出来る。
本発明の他の態様において、ワクチン接種を受けていないか本発明の前に入手可能であったワクチンを接種した動物と比較して、本発明による免疫原性組成物を投与した群れにおける野生型感染の発症の低下や、当該免疫原性組成物を投与した野生型Ｍ．ボビス感染動物に関連するＭ．ボビス感染の兆候の重症度の軽減を含む治療方法又は予防方法が提供される。また、本発明によるワクチンを投与することにより、群れ中のＭ．ボビスに感染する動物の数が減少する。そのような方法は、一般的に、そのような治療を必要とする対象又は対象の群れに、上記の方法を介して弱毒化されたＭ．ボビス株を治療的に有効な量投与することを含む。好ましくは、ワクチン接種を受けていないか本発明前に入手可能であったＭ．ボビス免疫原性組成物をワクチン接種された動物であってその後に野生型のＭ．ボビスに感染した動物と比較すると、臨床症状の発症又はその重症度が１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらにより好ましくは４０％以上、さらにより好ましくは５０％以上、さらにより好ましくは６０％以上、さらにより好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上減少する。
【００３１】
［好ましい実施形態の詳細な説明］
以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様の代表例である。実施例に記載のいずれも、発明の全体的な範囲を限定するものではないと理解される。
【実施例】
【００３２】
［実施例１］
この実施例により、２つの異なるチャレンジモデルを１つの標的種に用いて、実験的生Ｍ．ボビスワクチンの有効性を評価した。
＜＜材料及び方法＞＞
４〜８週齢の初乳非給与ホルスタイン子牛３５頭を用いた。全ての動物が試験対象患者基準を満たした。すなわち、全ての動物がＭ．ボビスに陰性反応を示し、チャレンジ時に健康であった。最初に、子牛をランダムに４グループの１つに割り当てた。グループ１〜３は各々９頭の子牛を有し、グループ４は８頭の子牛を有していた。グループ１及び２の子牛に、１０６回継代したＭ．ボビス分離株０５２８２３（０５−２８２３−１Ａ−３Ａ  Ｐ１０６＋）（ＡＴＣＣ指定番号：ＰＴＡ−８６９４）の未加工培養である生ワクチン１（Ｌｉｖｅ  Ｖａｃ１）でワクチン接種した。一方、グループ３及び４の子牛には培地のみでワクチン接種した。グループ１及び２に対するワクチン分離株は、自然に生じる病気発生から得られ、その後Ｍ．ボビスに適した培地で連続的に１０６回継代された。調査前に決定した適切な量の種培養を植菌した後、３７℃で２４±２時間培養した。その分離株を希釈することなく用いた。平均的なワクチン接種前接種後濃度は２．１Ｅ９（ＣＦＵ／ｍＬ）であった。そのワクチンを皮下投与で２ｍＬ、鼻腔内投与で２ｍＬ（それぞれの鼻孔に１ｍＬ）投与した。自然に起きる感染及び疾患を引き起こすために、病原性のＭ．ボビスで調査対象の全子牛をチャレンジした。なお、グループ１及び３には高チャレンジ用量を、グループ３及び４には低チャレンジ用量を接種した。
テスト材料の投与量と投与方法を表１にまとめる。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
鼻を綿棒でぬぐったものと血液サンプルを、０日目、１４日目、２８日目、３５日目、４２日目に採取した。死体解剖で、全ての子牛から肺のサンプルを採取して扁桃を綿棒でぬぐったものを採取し、臨床的異常を有する動物から関節を綿棒でぬぐったものを採取した。また、部位病変を示す特定の動物の他の部位からサンプルを採取した。全ての場合において、出来る限り無菌状態で、当該領域の周りで３本の滅菌綿棒を数秒間こすった後に取り除いた。その綿棒のうち２本を、培地を有する個々の輸送容器に入れ、残りの１本を培地のない輸送容器に入れた。各子牛から採取したサンプルを表２にまとめる。
【００３５】
【表２】
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【００３６】
＜＜検査＞＞
微生物の検査に関して、綿棒でぬぐったものを輸送培地に入れ、Ｍ．ボビス分離株の有無を調べるために組織サンプルを輸送した。簡潔に述べると、綿棒でぬぐったものを５ｍＬのマイコプラズマ選択的培養液中で回転させた。肺サンプルから小さなサンプル（約５ｍｍ）を切り出し、２ｍＬのマイコプラズマ培地中でホモジネートした。１００μＬのホモジネートを、当該マイコプラズマ選択的培養液に加えた。３７℃／５％ＣＯ2で培養物をインキュベートした。４〜１４日後、増殖の有無についてその培養液を調べ、単離するためにプレートに二次培養した。全ての陽性二次培養サンプルを−７０℃で保存した。
ＰＣＲに関して、輸送培地に入れられていない各子牛から綿棒でぬぐったもの及び組織サンプルを、ＤＮＡ抽出及びＭ．ボビスのｕｖｒＣ遺伝子に特異的なプライマーとプルーブを用いたＰＣＲによる検査のために輸送した。ＰＣＲ検査の結果を、Ｍ．ボビスＤＮＡ検出に陽性又は陰性で表現した。
血清学検査に関して、検査キットを備えたプロトコルを使用し、市場で入手できるＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｖｅｔ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、血清サンプルを検査した。ＥＬＩＳＡの結果を、光学濃度（ＯＤ）測定値として表した。サンプルのＯＤを、検査キット中に含まれる陽性コントロールが規定する陽性度レベル（平均ＯＤｐ×０．３）と比較した。その後、陽性結果を以下の基準で解釈した。
【００３７】
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【００３８】
組織病変／ＩＨＣ検査に関して、ヘマトキシリン／エオシン染色したスライドとＭ．ボビス特異的なモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学により、ホルマリンで固定した組織を検査した。
臨床的検査に関して、０日目〜２８日目まで毎日の一般的観察を行い、その後２８日目から安楽死及び死体解剖まで毎日の臨床的観察を行った。基準から外れた臨床的及び一般的観察に注目し、それを記した。
死体解剖で、各子牛の胸腔及び気管を調べ、肉眼観察を記録した。各子牛の肺及び約６インチの気管を、更なる調査及びサンプル採取のために無傷で取り除いた。各セットの肺について、各々適切な耳標を傍らにつけて背面及び前面の肺表面の写真を撮った。
肺病変に関し、Ｍ．ボビスが原因で各肺葉当たりどの程度の病変が（割合として）存在するかを求めるために、各肺葉を視診及び触診により調べた。その後、各肺葉の割合を測定し合計して、病変を有する肺全部の割合を求めた。
感染した関節を調査し肉眼観察を記録することにより、関節病変を検査した。
データを分析するために、データを集約した。臨床症状と肉眼で見える病変の減少率（％）を、以下の式を用いて計算した。
減少率（％）＝［１−（治療／非治療）］×１００
また、グループ２及び３各々の動物１頭とグループ４の動物２頭を、３７日目に人道的理由で除いた。
【００３９】
＜＜結果＞＞
１日目〜２６日目まで、チャレンジ前の臨床評価を行った。調査期間中に、緩い／水っぽい排泄物、鬱病、垂れ耳及び嗜眠が観察された。適切な獣医医療を施した。どの観察日のどのグループからも、有害な部位反応やマイコプラズマ特異的臨床症状は見られなかった。２７日目〜４３日目まで、チャレンジ後の臨床評価を行った。この調査期間中に見られた全ての臨床的観察は、咳、努力性呼吸、鬱病、食欲不振、関節腫脹、跛行、及び垂れ耳であった。チャレンジ後の期間中の臨床スコアの発生率を下記の表３にまとめる。グループ１では９頭中２頭の子牛が感染の少なくとも１つの臨床兆候を伴って感染しており、そのうち２頭は呼吸兆候を示し、１頭は関節感染の兆候を示していた。グループ３では、全ての子牛が少なくとも１つの臨床兆候を伴って感染しており、そのうち７頭の子牛が呼吸兆候を示し、３頭の子牛が関節感染の兆候を示していた。グループ２では、９頭中４頭の子牛が少なくとも１つの臨床兆候を伴って感染しており、呼吸兆候を示した子牛はおらず、４頭の子牛が関節感染の兆候を示していた。グループ４では、７頭の子牛が少なくとも１つの臨床兆候を伴って感染しており、そのうち１頭の子牛が呼吸兆候を示し、７頭の子牛が関節感染の兆候を示していた。
【００４０】
【表３】
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【００４１】
グループ１＝ワクチンあり／高用量呼吸器チャレンジ
グループ２＝ワクチンあり／低用量呼吸器チャレンジ
グループ３＝ワクチンなし／高用量呼吸器チャレンジ
グループ４＝ワクチンなし／低用量呼吸器チャレンジ
【００４２】
死体解剖で肺を採取し、Ｍ．ボビス感染と関連する病変の有無を観察した。動物は、硬化や結節形成などの多様な病理学的特徴を示した。Ｍ．ボビス感染に関連する肉眼で見える病変を有する肺の合計割合（％）を反映するスコアリングシステムを用いて、肺病変の結果をパーセントとして表した。いくつかのケースでは、癒着や病変の非定型性質により肺の割合が決定できなかった。肺病変の量及びパーセント範囲／平均パーセント肺病変を示す個々の割合を表４に示す。肺病変スコアに関し、グループ３が感染した子牛の数が最も多く（９／９）、グループ２が感染した子牛の数が最も少なかった（２／９）。
【００４３】
【表４】
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【００４４】
死体解剖で、過去に臨床症状（腫れ又は跛行）を示した動物の関節について、肉眼で見える病変がないか調べた。感染した部位は動物によって異なり、手根（ｃａｒｐｕｓ）、飛節（ｈｏｃｋ）、膝関節（ｓｔｉｆｌｅ）、球節（ｆｅｔｌｏｃｋ）及び／又は肘を含み得た。動物は、肉眼で見える腫れ、滑液の増加、異常な体液発生及び関節包の肥厚を示した。より重篤に感染した子牛では、関節表面のびらんのようにフィブリンが存在していた。関節液のサンプル及び／又は表面を綿棒でぬぐったものにＭ．ボビスが存在するか否かを、培養により検査した。関節における肉眼で見える病理学的特徴の存在を、下記表５にまとめる。
【００４５】
【表５】
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【００４６】
グループ１＝ワクチンあり／高投与量呼吸器チャレンジ；グループ２＝ワクチンあり／低投与量呼吸器チャレンジ；グループ３＝ワクチンなし／高投与量呼吸器チャレンジ；グループ４＝ワクチンなし／低投与量チャレンジ（ＮＲ＝記録なし）。
【００４７】
０日目、１４日目、２８日目、及び３５日目に、綿棒で鼻孔をサンプリングした後、死体解剖でもサンプリングした（４３日目）。また、死体解剖の間、綿棒で扁桃のサンプルを取り、代表的な肺組織を採取した。図１，２は、マイコプラズマ選択的培養による回収の頻度又はＭ．ボビス特異的ＰＣＲによる検出の頻度を示す。図１に示すように、死体解剖後に扁桃をサンプリングすると、全てのグループから１００％の回収があった。死体解剖後の肺において、グループ１及び３で１００％の回収があった。グループ２は、肺から回収した量が最も少なく（約６０％）、グループ４は約９０％回収した。調査３５日目に鼻でサンプルが取られるまでＭ．ボビス細菌の回収を示すグループはなく、３５日目に回収を示した唯一のグループがグループ４であった（２５％）。グループ２を除いた全てのグループが、死体解剖後の鼻のサンプルにおいて回収を示した。
【００４８】
【表６】
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【００４９】
培養
０＝Ｍ．ボビス増殖なし
１＝Ｍ．ボビス増殖あり
Ｍ＝入り混じり／又はその他
ＰＣＲ
０＝Ｍ．ボビス陰性
１＝Ｍ．ボビス陽性
ＥＬＩＳＡ
０＝陰性
１＝１．７５×までの陽性度
２＝１．７５×から２．３×まで陽性度
３＝２．３×から３．０×まで陽性度
４＝３．０×以上の陽性度
ＮＳ＝サンプルなし
ＮＴ＝検査せず
【００５０】
Ｍ．ボビスに対する血清学的反応をモニターするために、ＢｉｏｖｅｔのＭ．ボビスＥＬＩＳＡで全てのサンプルを検査した。陽性度ＯＤをグループ化された乗数に従って、セロコンバージョンを採点した。以下の表は、０日目、１４日目、２８日目、３５日目及び４２日目に各グループから検出された平均血清学的スコアを示す。図３は、血清サンプルから得られたＭ．ボビス特異的抗体に対する平均グループスコアを示す。効果的な体液性免疫応答を指し示すセロコンバージョンは、ワクチンを１回投与後１４日以内に検出された。また、この免疫応答がよく持続することが、１回のワクチン接種後少なくとも４２日間及び２回のワクチン接種後２８日間、Ｍ．ボビスに対する血清学的反応が測定可能であったことから明らかであった。２８日目からのグループ１のスコアは、他の全てのグループよりも常に高かった。グループ１，２は、１４日目では等しかった（１．５ＥＬＩＳＡスコア）。グループ４は１４〜３５日目において最も低かったが、４２日目では３番目になった（約２．２）。
【００５１】
＜＜結論＞＞
この調査により、子牛における皮下及び鼻腔内の両方に２回投与される生Ｍ．ボビスワクチンの有効性、並びに、標的種におけるチャレンジモデルが評価された。当該チャレンジモデルには高用量呼吸器チャレンジ及び低用量呼吸器チャレンジが含まれた。また、この調査により、１回及び２回のワクチン投与後の有効性、免疫発現、及び間接的な評価による免疫持続期間、セロコンバージョン又は体液性免疫応答も評価された。ワクチン接種後に起きる免疫発現と免疫持続は確かに証明された。
チャレンジＭ．ボビス分離株とワクチンＭ．ボビス分離株は、自然感染した異なる動物が起源であった。チャレンジとして用いられた分離株は、実験的チャレンジの間に肺疾患と関節疾患の両方を引き起こすことが過去に示され、混合分離株チャレンジ研究において主流であった。ワクチン分離株は、元々は診断用試料に由来する高代継代した分離株である（継代回数１０６）。また、本明細書に記載されるフィンガープリント法を用いたところ、チャレンジ分離株及びワクチン分離株の遺伝子型は非類似であることが示された。
【００５２】
高用量の呼吸器チャレンジされたグループ（１及び２）において、呼吸器臨床症状の減少（７２％）及び肺病変の減少（３３％）がワクチン接種されたグループで観察された。非ワクチン接種グループにおける呼吸器臨床症状のほとんどは、チャレンジ後２日目から３日目の間に起きた。表３に示すように、当該ワクチンはＭ．ボビスが原因の関節疾患の発症をも減少させた。
低用量の呼吸器チャレンジされたグループ（２及び４）において、肺病変の減少（９６％）がワクチン接種されたグループで観察された。また、ワクチン接種したグループは、関節臨床症状の相当な減少（５０％）を示した。
【００５３】
肺サンプル（ＩＨＣ、ＰＣＲ及び培養）及び関節サンプル（ＰＣＲ及び培養）の実験室試験は、大半の場合における肉眼で見える病変と一致した。不一致は、サンプリング部位又は検査用に提出されたサンプル間の細菌分布が原因かもしれない。ワクチン分離株は、ワクチン候補を検出しチャレンジ分離株を検出しないことを目的とした実験的ＰＣＲアッセイにより検査された肺サンプルからは検出されなかった。
【００５４】
鼻腔内及び皮下の両経路を介して２回投与され、２回のワクチン接種の間に２週間のインターバルを有する、新規の高代継代した弱毒化生Ｍ．ボビスワクチン候補（０５−２８２３  Ｐ１０６）は、様々なチャレンジ条件を用いて、初乳非給子牛におけるマイコプラズマ・ボビス感染に関連する臨床症状及び病変（呼吸器及び関節）の両方を含むＭ．ボビス感染の兆候の減少をもたらしたことにより、安全且つ効果的であると示された。また、Ｍ．ボビスワクチン及び免疫学的組成物は、単回投与後１４日以内に免疫発現を刺激するのに効果的であり、単回投与後少なくとも４２日の持続期間を有していた。
【００５５】
［実施例２］
この調査の目的は、３種の生ワクチン候補の安全性と有効性を求めることにある。
＜＜材料及び方法＞＞
調査に用いられた子牛は６±２週齢であり、６グループに分けられた。表７に示すように、グループ１は１０頭の動物からなり、調査０日目（Ｄ０）と１４日目（Ｄ１４）にＭ．ボビス生ワクチンＩでワクチン接種された。グループ１は、０日目及び１４日目に、２ｍＬを皮下投与で２ｍＬを鼻腔内投与でワクチン接種された。グループ２は１０頭の動物からなり、調査０日目及び１４日目に、２ｍＬのＭ．ボビス生ワクチンＩを皮下投与でワクチン接種された。グループ３は、０日目及び１４日目に、Ｍ．ボビス生ワクチンＩでワクチン接種された９頭の子牛から構成されていた。グループ３は、２ｍＬを鼻腔内投与でワクチン接種された。グループ４はコントロールであり、ワクチンを投与されなかった。グループ５は、Ｍ．ボビス生ＩＩワクチンでワクチン接種された子牛２頭から構成されていた。グループ５は、０日目及び１４日目に、２ｍＬを皮下投与で２ｍＬを鼻腔内投与でワクチン接種した。グループ６は、Ｍ．ボビス生ワクチンＩＩＩを投与した子牛２頭から構成されていた。グループ６の子牛は、０日目及び１４日目に、２ｍＬを皮下投与で２ｍＬを鼻腔内投与で投与された。その後、１２０ｍＬのチャレンジ材料を用いて全てのグループをチャレンジした。全ての動物は２８日目にチャレンジされた。
表８に記載するように、０日目、１４日目、２７日目、３５日目及び４１日目に、全ての子牛から鼻を綿棒でぬぐったものを採取した。死体解剖時に、全ての子牛から扁桃を綿棒でぬぐったものを採取した。臨床的異常を有する動物から、関節を綿棒でぬぐったものを取った。また、部位病変を示す特定の動物の他の部位からサンプルを採取した。０日目、１４日目、２７日目、３５日目及び４１日目に全ての子牛から血液を採取した。血液は、各子牛の頸静脈から無菌条件で採取された。死体解剖後、肺病変について肺を採点した。
【００５６】
【表７】
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【００５７】
【表８】
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【００５８】
＜＜結果及び考察＞＞
＜チャレンジ前の臨床兆候＞
−１日目〜２８日目まで、チャレンジ前の臨床的評価を行った。この調査期間中に見られた臨床的観察は、緩い／水っぽい排泄物、眼漏、鬱病及び嗜眠であり、いずれもワクチン接種の効果に起因するものではなかった。注入部位の観察をしたところ、１４日目に１回目の注入部位で腫れを示した６１３４の子牛（グループ６）を除いて、有害な部位反応は見られなかった。
＜チャレンジ後の臨床兆候＞
２８日目〜４２日目まで、臨床的観察を行った。この調査期間中に見られた臨床的観察は、咳、努力性呼吸、鬱病、関節腫脹、跛行、及び垂れ耳であった。臨床兆候は、マイコプラズマ・ボビス感染に特有な３タイプ（呼吸器、関節及びその他）に分けられた。呼吸兆候には、咳、多呼吸／努力性呼吸、及び鼻汁が含まれた。関節兆候には、関節腫脹及び跛行が含まれた。他の兆候には、垂れ耳、頭位傾斜、鬱病及び食欲不振が含まれた。下記の表９に個々の結果を示す。
【００５９】
【表９】
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【００６０】
臨床兆候の記号表
１：咳
２：多（努力性）呼吸
３：鼻汁
４：関節腫脹
５：跛行
６：垂れ耳
７：頭位傾斜
８：鬱病
９：食欲不振
Ａ：下痢
Ｂ：眼漏
Ｃ：脚の裂傷（Ｌｅｇ  Ｌａｃｅｒａｔｉｏｎ）
黒色の枠＝調査から除かれた動物
【００６１】
【表１０】
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【００６２】
表１０は、マイコプラズマ・ボビス感染に特有の呼吸臨床群及び確認済みの（培養及び／又はＰＣＲ）関節臨床群に細分されている。また、重篤な関節病変による早期除去率を示す。
【００６３】
＜＜肺病変＞＞
死体解剖で肺を採取し、Ｍ．ボビス感染と関連する病変の有無を観察した。動物は、硬化や結節形成などの多様な病理学的特徴を示した。Ｍ．ボビス感染に関連する肉眼で見える病変を有する肺全部の割合を反映するスコアリングシステムを用いて、肺病変の結果をパーセントとして表した。いくつかのケースでは、癒着や病変の非定型性質により肺の割合が決定できなかった。下記は、肺病変の量及びパーセント範囲／平均パーセント肺病変を示す個々の割合を有する表である。
【００６４】
【表１１】
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【００６５】
＜＜関節病変＞＞
死体解剖で、肉眼で見える病変の有無について、過去に臨床症状（腫れ及び／又は跛行）を示した動物の関節を調べた。感染部位は動物によって異なり、手根関節、飛節、膝関節、球節及び／又は肘関節を含み得る。動物は、肉眼で見える腫れ、滑液の増加、異常な体液発生及び関節包の肥厚を示した。より重篤に感染した子牛では、フィブリンと関節表面のびらんが存在していた。関節液のサンプル及び／又は表面を綿棒でぬぐったものにＭ．ボビスが存在するか否かを、培養及びＰＣＲにより検査した。弱毒化生ワクチンのいずれかをワクチン接種すると、感染した子牛の合計数が成功裏に減少した。
【００６６】
【表１２】
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【００６７】
グループ１＝ワクチンＩ（皮下投与＋鼻腔内投与）；グループ２＝ワクチンＩ（皮下投与のみ）；グループ３＝ワクチンＩ（鼻腔内投与のみ）；グループ４＝ワクチンなし；グループ５＝ワクチンＩＩ（皮下投与＋鼻腔内投与）；グループ６＝ワクチンＩＩＩ（皮下投与＋鼻腔内投与）。
注意：ＰＣＲ及び／又は培養がＭ．ボビスに陽性を示した場合に、サンプルを実験的に確認されたものとして報告した。
【００６８】
＜＜鼻及び肺サンプルからのＭ．ボビスのＰＣＲによる検出＞＞
０日目、１４日目、２７日目、３５日目及び４１日目若しくは死体解剖の日に、各動物から綿棒で鼻孔をサンプリングした。また、死体解剖の間、綿棒で扁桃のサンプルを取り、代表的な肺組織を採取した。一般的なＭ．ボビスのマーカー（ｕｖｒＣ）を標的とするリアルタイムＰＣＲを用いた検出頻度を下記表に示す。また、Ｍ．ボビスチャレンジ分離株では見つからず、全てのワクチン候補で見つかるマーカーを標的とする近年開発されたエンドポイントＰＣＲアッセイを用いて、扁桃及び肺組織を分析した。予想通り、ＰＣＴにより、鼻の綿棒サンプル中にＭ．ボビスワクチン及び／又はチャレンジ微生物が検出された。
【００６９】
【表１３】
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【００７０】
グループ１＝ワクチンＩ（皮下投与＋鼻腔内投与）；グループ２＝ワクチンＩ（皮下投与のみ）；グループ３＝ワクチンＩ（鼻腔内投与のみ）；グループ４＝ワクチンなし；グループ５＝ワクチンＩＩ（皮下投与＋鼻腔内投与）；グループ６＝ワクチンＩＩＩ（皮下投与＋鼻腔内投与）。
注意：一般的なＭ．ボビスマーカー（ｕｖｒＣ）を標的とするリアルタイムＰＣＲによるＰＣＲ検出。
【００７１】
【表１４】
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【００７２】
グループ１＝ワクチンＩ（皮下投与＋鼻腔内投与）；グループ２＝ワクチンＩ（皮下投与のみ）；グループ３＝ワクチンＩ（鼻腔内投与のみ）；グループ４＝ワクチンなし；グループ５＝ワクチンＩＩ（皮下投与＋鼻腔内投与）；グループ６＝ワクチンＩＩＩ（皮下投与＋鼻腔内投与）。
注意：一般的＝一般的Ｍ．ボビスマーカー（ｕｖｒＣ）を標的とするリアルタイムＰＣＲによるＰＣＲ検出；非チャレンジ＝Ｍ．ボビスチャレンジ分離株中には見られず全てのワクチン候補には見られるマーカーを標的とするエンドポイントＰＣＲによるＰＣＲ検出。
【００７３】
再び、予想通り、ＰＣＲにより、鼻腔内ワクチン接種後、扁桃において弱毒化生ワクチンが成功裏に検出された。一方、チャレンジ微生物が肺及び扁桃のサンプルの両方で高い割合で検出された。
【００７４】
＜＜Ｍ．ボビス血清学＞＞
Ｍ．ボビスに対する血清学的反応をモニターするために、ＢｉｏｖｅｔのＭ．ボビスＥＬＩＳＡで全てのサンプルを検査した。陽性度ＯＤのグループ化された乗数に従って、セロコンバージョンを採点した。下記の表において、０日目、１４日目、２７日目、３５日目及びポスト（ポストとは、特定の動物が早期除去されるため、３７日目から４１日目までの調査日を意味する）において、各グループから検出された平均血清学的スコアを示す。ワクチン接種後に見られるセロコンバージョンは、これらの新しいワクチンが、子牛などのワクチン接種された動物において速やかな発現と長期持続を有する適切な免疫応答を引き起こすという結論を強固にする（図４参照）。
【００７５】
＜＜考察＞＞
この調査の目的は、標的種において、１４日間間隔をあけた様々な２ｍＬ投与方法（皮下、鼻腔内、皮下＋鼻腔内）と双対チャレンジモデル用いて、ワクチン（０５−２８２３  Ｐ１０６）（ＰＴＡ−８６９４）を含む３種の新規且つ実験的な生マイコプラズマ・ボビスワクチンの有効性を評価することである。当該チャレンジモデルは、気道を介した投与と非経口投与を用いた。また、２つの異なる生ワクチン候補（０５−２４９  Ｐ１０２  （ＰＴＡ−８６９６）及び０５−１９０２−１  Ｐ１０６  （ＰＴＡ−８６９５））については、皮下投与と鼻腔内投与と組み合わせてのみを用いて有効性を評価した。
チャレンジ及びワクチン候補のＭ．ボビス分離株は、異なる自然感染した飼育場を起源とした。合計１２０ｍＬのチャレンジ分離株を用いる手法は、投与すると、実験的チャレンジ中に肺病変と関節疾患の両方を引き起こすことが過去に示されており、混合分離株チャレンジ研究において主流であった。生ワクチン候補は、元々は診断用試料に由来する高代継代した分離株である。当該ワクチン候補の高代継代は、マイコプラズマ好適培地への連続制限希釈関与により行われた。高代継代のワクチン候補０５  ２８２３  Ｐ１０６はいくつかのマイコプラズマ選択的寒天調合物上で増殖が制限されていたのに対し、低代継代の親分離株（ｐａｒｅｎｔ  ｉｓｏｌａｔｅ）は同様の特性を示さなかった。また、チャレンジ及びワクチン候補の遺伝子型は（フィンガープリンティング法で求められるように）異なっていることが示された。
【００７６】
ワクチンの利益を評価するために、この調査中に多数のパラメーターを調べた。これらのパラメーターの中で、動物除去率及び関節臨床症状を関節防御の主要な標識として用いた。肺病変（肉眼で見える肺病変の割合）を肺防御の主要な標識として用いた。ワクチン接種後のＭ．ボビスに対するセロコンバージョンと同様に、組織からの生物の検出、関節の分布及び血清学などの他のデータは、確認用の追加データを提供した。
【００７７】
肺病変、関節臨床症状、及び動物除去率の減少で示されているように、投与方法又は投与方法の組み合わせに関わらず、ワクチン候補マイコプラズマ・ボビス生ワクチンＩ（０５−２８２３  Ｐ１０６）を接種した後、全てのグループが疾患低減性の肺及び関節防御効果を示した。皮下投与及び鼻腔内投与の組み合わせ（グループ１）は、単独投与のみを用いたグループと比較すると、肺病変が最も大きく減少した（８６％）。また、肺病変、関節臨床症状、及び除去率の減少結果は、皮下投与と鼻腔内投与の組み合わせにより、２つの他のワクチン候補である生ワクチンＩＩ（５−２４９  Ｐ１０２）及び生ワクチンＩＩＩ（０５−１９０２−１  Ｐ１０６）を接種することにより得られる利益を確認する。ＥＬＩＳＡの結果により、全てのワクチン候補でのワクチン接種に対する強い体液性応答反応が実証され、ワクチン単回接種の後１４日ほどで免疫発現が起こり、免疫持続期間が少なくとも４１日であることが確認された（図５参照）。
【００７８】
全てのワクチン候補で安全性が実証された。ワクチンを接種されたいずれのグループの動物もワクチン接種期間中に臨床症状を示さなかった。生ワクチンＩＩＩ（０５−１９０２−１  Ｐ１０６）を接種された１頭の動物のみが注入部位で反応性を示したが、この反応性はたいしたことはなかった。また、ＰＣＲの結果は、鼻腔内投与によりワクチン候補を接種されたグループのみの扁桃組織から非チャレンジＭ．ボビス株が検出されたことを示し、鼻腔内投与及び皮下投与の両方で生ワクチンＩ（０５−２８２３  Ｐ１０６）を接種された１頭の動物でのみ肺組織から非チャレンジＭ．ボビス株が検出されたことを示した。
これらのデータは、一般的に、本発明により製造され様々な投与方法により与えられた新規の弱毒化された生Ｍ．ボビスワクチンは、野生型の病原性Ｍ．ボビスに感染することにより生じる様々な疾患兆候を予防・低減するための子牛のワクチン接種用免疫学的組成物として、安全且つ効果的であり、迅速に発現し、予防効果が長期持続するという結論を支持する。
【００７９】
［実施例３］
この実施例では、ＷＯ２００８−０３０６１９に開示された方法とプライマーを用いてＤＮＡを単離、増幅及び検出することによりＭ．ボビス株を区別するために用いられるＤＮＡフィンガープリンティング方法について記載する。
＜＜材料及び方法＞＞
マイコプラズマ属をこの調査に用いた。分離株は、社内にあったもの（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ  ｓｏｕｒｃｅｓ）から得られた分離株か、感染動物から得られた野外分離株であった。分離株を、マイコプラズマ選択的寒天及びブロスの組み合わせを用いて１〜７日間培養した。ＤＮＡを単離するために、ブロス培養を回転させてペレット化した。その後、ペレットからＤＮＡを抽出した（Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔを用い、分子細胞学グレードの水に再懸濁した）。ゲノムＤＮＡをＰｉｃｏｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて定量化した。細菌ゲノム（マイコプラズマ・ボビス）に存在する公知の挿入配列（転移因子）を基にプライマーを設計した。このプライマーは、ＷＯ２００８−０３０６１９に開示されている。５５〜５８℃のＴｍでエレメントエンド（末端反復領域を除く）から外側対向プライマーを手作業で選択した。その後、マルチプレックスＰＣＲマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ）を用いてＰＣＲ反応を実行した。該反応には、１×のマスターミックス、３００ｎＭの各プライマー及び１ｎｇのテンプレートＤＮＡが含まれていた。サーマルサイクル条件は、９５℃で１５分加熱した後、９４℃３０秒、５６．１℃９０秒及び７２℃２分のサイクルを３５回繰り返し、７２℃４分で最終伸張させた後、４℃に保った。増幅産物を、エチジウムブロマイド入りの４％アガロースゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｅ−ｇｅｌ）上で分離し、室温で５０分泳動し、ＵＶ光下で撮影した。
【００８０】
＜＜結果及び考察＞＞
結果として、本明細書中で用いられる分離株は各々特有のフィンガープリントを有していた。しかしながら、実施例２に示すように、各分離株は効果的な弱毒化された生培養ワクチンでもあり、ワクチン候補のいずれとも異なるフィンガープリントを有するチャレンジ分離株に対する交差防御を提供するという点で効果的であった。３種の野外分離株である０５−２８２３  Ｐ１０６（ＰＴＡ−８６９４）、０５−２４９  Ｐ１０２（ＰＴＡ−８６９６）及び０５−１９０２−１−Ｐ１０６（ＰＴＡ−８６９５）を培養し、前記プロトコルに従ってＤＮＡを単離した。ＷＯ２００８−０３０６１９に開示されたシークエンスＩＤ番号１〜８として特定されたＩＳプライマー４セットを複合的に用いて、前記プロトコルに従って各分離株から得た２〜５ｎｇのＤＮＡを増幅した。増幅された産物を、（製造業者に従って）エチジウムブロマイド入りのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｅ−ｇｅｌ４％アガロースゲル上で５０分間分離し、ＵＶ光下で視覚化した。全ての分離株が固有のパターンを作り出した。当該パターンは、サンプルＰＣＲ反応条件下、独立した一定分量を用いて再度作り出すことが出来た。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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