(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体またはそのフラグメントであって、前記抗体またはフラグメントが、
（ｉ）ＹＷ６８．４．２（配列番号１）もしくはＹＷ６８．４．２．３６（配列番号２）の重鎖および軽鎖可変領域配列を含む；または
（ｉｉ）フレームワーク領域における配列同一性が少なくとも９５％である、（ｉ）の抗体の改変体である、
抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体またはそのフラグメント。
【請求項２】
ＹＷ６８．４．２（配列番号１）、ＹＷ６８．４．２．３６（配列番号２）またはこれらのフラグメントのアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体。
【請求項３】
ＹＷ６８．４．２．３６（配列番号２）またはこのフラグメントのアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体。
【請求項４】
二重特異的である請求項１から３のいずれか１項に記載の抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体。
【請求項５】
前記フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびｓｃＦｖ断片からなる群から選択される、請求項１から４のいずれか１項に記載の抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体。
【請求項６】
前記抗体、またはそのフラグメントもしくは改変体が、キメラ化またはヒト化されている、請求項１から５のいずれか１項に記載の抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体。
【請求項７】
薬学的に受容可能なキャリアと混合した状態で請求項１から６のいずれか１項に定義の抗体、フラグメントまたは改変体を含む組成物。
【請求項８】
薬学的に受容可能なキャリアと混合した状態で有効量の請求項１から６のいずれか１項に記載の抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体を含む、腫瘍転移の予防または処置のための薬学的組成物。
【請求項９】
抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体またはそのフラグメントを含む、哺乳動物被験体においてリンパ性内皮細胞の遊走を阻害するための組成物であって、前記抗体またはフラグメントが、
（ｉ）ＹＷ６８．４．２（配列番号１）もしくはＹＷ６８．４．２．３６（配列番号２）の重鎖および軽鎖可変領域配列を含む；または
（ｉｉ）フレームワーク領域における配列同一性が少なくとも９５％である、（ｉ）の抗体の改変体である、
組成物。
【請求項１０】
前記抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体がＹＷ６８．４．２（配列番号１）、ＹＷ６８．４．２．３６（配列番号２）またはこれらのフラグメントのアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体がＹＷ６８．４．２．３６（配列番号２）またはこのフラグメントのアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体が二重特異的である、請求項９から１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体のフラグメントが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびｓｃＦｖ断片からなる群から選択される、請求項９から１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体、フラグメントまたは改変体が、キメラ化またはヒト化されている、請求項９から１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記哺乳動物被験体がヒト患者である、請求項９から１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ヒト患者が癌と診断されている、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ヒト患者が腫瘍転移を発症しているかまたは腫瘍転移を発症する危険性がある、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記転移がリンパ系における転移または遠隔の器官における転移である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記癌が、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平癌腫、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌、消化管癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、頚部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫もしくは子宮癌腫、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｏｒ  ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肝臓癌、前立腺癌、外陰部の癌、甲状腺癌、肝性癌腫および種々の型の頭頚部癌、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；毛様細胞性白血病；慢性骨髄芽球性白血病；移植後リンパ球増殖性障害（ＰＴＬＤ）、母斑症に伴う腹部脈管増殖、脳腫瘍に伴う浮腫およびメイグス症候群からなる群より選択される、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
抗ＶＥＧＦ抗体と組み合わせて投与されるものである、請求項９から１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ＶＥＧＦ抗体がベバシツマブである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体またはそのフラグメントを含む、ヒト癌患者における腫瘍転移を阻害または治療するための組成物であって、前記抗体またはフラグメントが、
（ｉ）ＹＷ６８．４．２（配列番号１）もしくはＹＷ６８．４．２．３６（配列番号２）の重鎖および軽鎖可変領域配列を含む；または
（ｉｉ）フレームワーク領域における配列同一性が少なくとも９５％である、（ｉ）の抗体の改変体である、
組成物。
【請求項２３】
前記抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体がＹＷ６８．４．２．３６（配列番号２）またはこのフラグメントのアミノ酸配列を有する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体が二重特異的である請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記癌が、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平癌腫、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌、消化管癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、頚部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫もしくは子宮癌腫、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｏｒ  ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肝臓癌、前立腺癌、外陰部の癌、甲状腺癌、肝性癌腫および種々の型の頭頚部癌、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；毛様細胞性白血病；慢性骨髄芽球性白血病；移植後リンパ球増殖性障害（ＰＴＬＤ）、母斑症に伴う腹部脈管増殖、脳腫瘍に伴う浮腫およびメイグス症候群からなる群より選択される、請求項２２から２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記腫瘍転移がリンパ系における転移である、請求項２２から２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記腫瘍転移が遠隔の器官における転移である、請求項２２から２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
抗ＶＥＧＦ抗体と組み合わせて投与されるものである、請求項２２から２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ＶＥＧＦ抗体がベバシツマブである、請求項２８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ニューロピリン−２（Ｎｒｐ２）アンタゴニスト、特に、抗Ｎｒｐ２抗体と、腫瘍転移の予防および処置におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
血管新生は種々の障害の病因に関与していることが現在十分に確立されている。これらとしては、固形腫瘍および転移、アテローム性動脈硬化症、後水晶体線維増殖症、血管腫、慢性炎症、増殖性網膜症（例えば、糖尿病性網膜症）のような眼内血管新生疾患、加齢関連横斑変性症（ＡＭＤ）、血管新生緑内障、移植した角膜組織および他の組織の免疫拒絶、慢性関節リウマチおよび乾癬が挙げられる。非特許文献１；非特許文献２；および非特許文献３。
【０００３】
腫瘍が成長している場合、血管新生は、過形成から腫瘍新生（ｎｅｏｐｌａｓｉａ）への移行のため、そして、腫瘍の成長および転移のための栄養を提供するために重要であるようである。非特許文献４。新生血管形成は、腫瘍細胞が、正常細胞と比較して成長上の優越と増殖の自律性とを獲得することを可能にする。腫瘍は通常、利用可能な毛細管床からの距離に起因して２〜３ｍｍ３の大きさまで成長し得るのみの単一の異常な細胞として始まり、そして、長期間にわたってさらに成長することも拡散することもなく「休止状態」に留まり得る。いくつかの腫瘍細胞はその後、脈管形成の表現型に切り替わって、内皮細胞を活性化し、新しい毛細血管へと増殖および成熟させる。これらの新たに形成された血管は、原発性腫瘍の継続的な成長を可能にするだけでなく、転移性の腫瘍細胞の拡散および再転移増殖をも可能にする。したがって、腫瘍切片における微細血管の密度と、乳癌およびいくつかの他の腫瘍における患者の生存との間には、相関関係が見られる。非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７。脈管形成への切り替わりを制御する厳密な機構は十分には理解されていないが、腫瘍塊の新生血管形成は、多数の血管新生の刺激因子および抑制因子の最終的なバランスから生じるものと考えられている（非特許文献８）。
【０００４】
現在、転移は、固形腫瘍からの死の大部分（推定９０％）の原因と受け取られている（非特許文献９）。転移の複雑なプロセスは、原発性腫瘍からの腫瘍細胞の脱離、腫瘍細胞のリンパ管もしくは血管への管内異物混入（ｉｎｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）、そして、二次的な部位における腫瘍細胞の浸出および成長を含む、一連の別個の段階を伴う。多数の腫瘍型における限局的なリンパ節の解析は、リンパ管構造がヒトの癌の拡散のための重要な経路であることを示唆している。さらに、ほとんど全ての癌腫において、リンパ節における腫瘍細胞の存在は、最も重要かつ有害な予後の因子である。以前は、このような転移は、もっぱら腫瘍近くの既存のリンパ管に沿った悪性細胞の通過を伴うものと考えられていたが、最近の実験的な研究および臨床病理学な報告（非特許文献１０および非特許文献１１において概説されたもの）は、リンパ管新生が固形腫瘍によって誘導され得、そして、腫瘍の拡散を促進し得ることを示唆している。これらおよび他の最近の研究は、リンパ管およびリンパ管新生のターゲティングが、癌の転移の発症を制限するための、多くの患者にかなりの利益を有する有用な治療戦略であり得ることを示唆している。
【０００５】
血管内皮細胞因子（ＶＥＧＦ）ファミリーのメンバーであるＶＥＧＦＣは、リンパ管の発生の最も良く研究されたメディエーターの１つである。腫瘍細胞におけるＶＥＧＦＣの過剰発現は、腫瘍に関連したリンパ管新生を促進し、限局的なリンパ節への転移の増強をもたらすことが示された（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。ＶＥＧＦＣの発現はまた、多数のヒトの癌についての腫瘍に関連したリンパ管新生、およびリンパ節転移とも相関関係にある（特許文献１０において概説されている）。さらに、ＶＥＧＦＣにより媒介されるシグナル伝達の遮断は、マウスにおける腫瘍リンパ管新生およびリンパ節転移を抑制することが示されている（非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０）。
【０００６】
ＶＥＧＦＣは、少なくとも２つの細胞表面レセプターファミリー、すなわち、チロシンキナーゼＶＥＧＦレセプターおよびニューロピリン（Ｎｒｐ）レセプターに結合することが知られる。
【０００７】
３つのＶＥＧＦレセプターのうち、ＶＥＧＦＣはＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３に結合してレセプターの二量体化（非特許文献２１）、キナーゼの活性化および自己リン酸化（非特許文献２２；非特許文献２３）につながり得る。リン酸化されたレセプターは、複数の物質の活性化を誘導し、血管新生およびリンパ管新生につながる（非特許文献２４）。
【０００８】
ニューロピリン（Ｎｒｐ）ファミリーは、２つの相同なタンパク質、すなわち、ニューロピリン−１（Ｎｒｐ１）およびニューロピリン−２（Ｎｒｐ２）から構成される。ＶＥＧＦレセプターに加えて、ＶＥＧＦＣはまた、クラス３セマフォリン（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ）レセプターおよび軸索誘導のメディエーターとして最初に同定されたＮｒｐ２にも結合する（非特許文献２５；非特許文献２６）。多種多様な系統の証拠が、血管系およびリンパ系の発生におけるＮｒｐ２の関与を示している。ホモ接合性のＮｒｐ２変異体は、胎内で細いリンパ管および毛細管の深刻な減少を示す（非特許文献２７）。さらに、ホモ接合性Ｎｒｐ１変異体マウスで見られる劇的な胚性致死の脈管の欠陥は、より早く死に至るＮｒｐ２機能の欠失によって増強される（非特許文献２８）。しかしながら、成体の血管およびリンパ管の生物学、より具体的には、転移の調節におけるＮｒｐ２の役割は知られていない。
【０００９】
Ｎｒｐ類は、酵素活性またはシグナル伝達活性を有することが知られていない短い細胞内ドメインを有する。Ｎｒｐ類はリガンド−ＶＥＧＦレセプターの結合を増強することによってＶＥＧＦＲシグナル伝達を増強するように機能することが提唱されている（非特許文献２５；非特許文献２６）。さらに、Ｎｒｐ２のセマフォリンリガンドであるｓｅｍａ３Ｆｇは、インビトロおよびインビボで内皮細胞の挙動を調節することが示されている（非特許文献２９；非特許文献２５）。しかしながら、最近の報告は、Ｎｒｐ類がＶＥＧＦレセプターまたはセマフォリンの機能とは独立して、内皮細胞（ＥＣ）遊走を調節するように機能し得るという代替的な可能性を示唆した（（非特許文献３０；非特許文献３１；非特許文献３２）。
【００１０】
抗ＶＥＧＦ中和抗体は、ヌードマウスにおいて多様なヒト腫瘍細胞株の成長を抑制し（非特許文献３３；非特許文献３４；非特許文献３５；非特許文献３６）、そしてまた、虚血性の網膜障害モデルにおいて眼内血管新生を抑制する。非特許文献３７。したがって、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体またはＶＥＧＦ作用の他のインヒビターは、腫瘍および種々の眼内血管新生障害の処置のための有望な候補である。このような抗体は、例えば、１９９８年１月１４日に公開された特許文献１；ならびに、共に１９９８年１０月１５日に公開された特許文献２および特許文献３に記載される。抗ＶＥＧＦ抗体の１つであるベバシツマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）は、転移性の結腸直腸癌（ＣＲＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を処置するための、化学療法レジメンと組み合わせた使用がＦＤＡにより認可されている。さらに、ベバシツマブは、種々の癌の適応症を処置するための多くの現在進行中の臨床治験において検討されている。
【００１１】
他の抗ＶＥＧＦ抗体および抗Ｎｒｐ１抗体もまた知られており、例えば、非特許文献３８；非特許文献３１；および非特許文献３９に記載されている）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】欧州特許第８１７，６４８号明細書
【特許文献２】国際公開第９８／４５３３１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９８／４５３３２号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｆｏｌｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１０９３１−１０９３４（１９９２）
【非特許文献２】Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５３：２１７−２３９（１９９１）
【非特許文献３】Ｇａｒｎｅｒ  Ａ．，”Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ”，Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ａ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇａｒｎｅｒ  Ａ．，Ｋｌｉｎｔｗｏｒｔｈ  ＧＫ編、第２版（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，１９９４），ｐｐ  １６２５−１７１０
【非特許文献４】Ｆｏｌｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：５８（１９８９）
【非特許文献５】Ｗｅｉｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ  ３２４：１−６（１９９１）
【非特許文献６】Ｈｏｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３４０：１１２０−１１２４（１９９２）
【非特許文献７】Ｍａｃｃｈｉａｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３４０：１４５−１４６（１９９２）
【非特許文献８】Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １（１）：２７−３１（１９９５）
【非特許文献９】Ｇｕｐｔａ  ａｎｄ  Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｃｅｌｌ  １２７，６７９−６９５（２００６）
【非特許文献１０】Ａｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９４（２００６），１３５５−１３６０
【非特許文献１１】Ｎａｔｈａｎｓｏｎ，Ｃａｎｃｅｒ  ９８，４１３−４２３（２００３）
【非特許文献１２】Ｋａｒｐａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆａｓｅｂ  Ｊ  ２０，１４６２−１４７２（２００１）
【非特許文献１３】Ｍａｎｄｒｉｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  ２０，６７２−６８２（２００１）
【非特許文献１４】Ｓｋｏｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７，１９２−１９８（２００１）
【非特許文献１５】Ｓｔａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２，５７３−５８３（２００２）
【非特許文献１６】Ｓｔａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆａｓｅｂ  Ｊ  １６，９２２−９３４（２００２）
【非特許文献１７】Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５，９００４−９０１１（２００５）
【非特許文献１８】Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ９４，８１９０８２５（２００２）
【非特許文献１９】Ｋｒｉｓｈｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３，７１３−７２２（２００３）
【非特許文献２０】Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５，６９０１−６９０９（２００５）
【非特許文献２１】Ｓｈｉｎｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３，３１２８３−３１２８８（１９９８）
【非特許文献２２】Ｈｅｌｄｉｎ，Ｃｅｌｌ  ８０，２１３−２２３（１９９５）
【非特許文献２３】Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９，２６９８８−２６９９５（１９９４）
【非特許文献２４】Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，６６９−６７６（２００３）
【非特許文献２５】Ｆａｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０８，１２４３−１２５０（２００６）
【非特許文献２６】Ｓｏｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ８５，３５７−３６８（２００２）
【非特許文献２７】Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９，４７９７−４８０６（２００２）
【非特許文献２８】Ｔａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９，３６５７−３６６２（２００２）
【非特許文献２９】Ｂｉｅｌｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１４，１２６０−１２７１（２００４）
【非特許文献３０】Ｍｕｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０５，１９９２−１９９９（２００５）
【非特許文献３１】Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １１，５３−６７（２００７）
【非特許文献３２】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８，４８８４８−４８８６０（２００３）
【非特許文献３３】Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：８４１−８４４（１９９３）
【非特許文献３４】Ｗａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１７８９−１７９７（１９９５）
【非特許文献３５】Ｂｏｒｇｓｔｒｏｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：４０３２−４０３９（１９９６）
【非特許文献３６】Ｍｅｌｎｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：９２１−９２４（１９９６）
【非特許文献３７】Ａｄａｍｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１４：６６−７１（１９９６）
【非特許文献３８】Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３６６，８１５−８２９（２００７）
【非特許文献３９】Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１，９５１−９６１（２００６）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、少なくとも部分的に、Ｎｒｐ２に対する高い親和性の機能ブロッキング抗体によって得られた実験結果に基づいている。この抗体を用いて得られた結果は、Ｎｒｐ２がリンパ性内皮細胞（ＬＥＣ）遊走の調節において役割を担うこと、そして、その機能が、ＶＥＧＦレセプターの活性化の増強因子としての以前に割り当てられた役割を超えることを示している。さらに、これらの結果は、Ｎｒｐ２のブロックがリンパ管新生の阻害と、リンパ節および遠位臓器への転移の劇的な減少につながることを実証している。
【００１５】
一局面では、本発明は、必要とする哺乳動物被験体に有効量のニューロピリン−２（Ｎｒｐ２）アンタゴニストを投与する工程を包含する、リンパ性内皮細胞の遊走を阻害するための方法に関する。
【００１６】
別の局面では、本発明は、腫瘍を担持する哺乳動物被験体に有効量のニューロピリン−２（Ｎｒｐ２）アンタゴニストを投与する工程を包含する、腫瘍性のリンパ管新生を阻害するための方法に関する。
【００１７】
なお別の局面では、本発明は、腫瘍を担持する哺乳動物被験体に有効量のニューロピリン−２（Ｎｒｐ２）アンタゴニストを投与する工程を包含する、腫瘍転移を阻害するための方法に関する。
【００１８】
あらゆる実施形態において、哺乳動物被験体は好ましくはヒト患者（例えば、転移と診断されたかまたは転移を発症する危険性があり得るヒト癌患者）である。
【００１９】
一実施形態において、癌は、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病からなる群より選択される。
【００２０】
別の実施形態において、癌は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平癌腫、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌、消化管癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、頚部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫もしくは子宮癌腫、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｏｒ  ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肝臓癌、前立腺癌、外陰部の癌、甲状腺癌、肝性癌腫および種々の型の頭頚部癌、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；毛様細胞性白血病；慢性骨髄芽球性白血病；移植後リンパ球増殖性障害（ＰＴＬＤ）、母斑症に伴う腹部脈管増殖、脳腫瘍に伴う浮腫、ならびにメイグス症候群からなる群より選択される。
【００２１】
別の実施形態では、Ｂ細胞リンパ腫は、軽度悪性（ｌｏｗ  ｇｒａｄｅ）／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中等度悪性（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｇｒａｄｅ）／濾胞性ＮＨＬ；中等度悪性びまん性ＮＨＬ；高度悪性（ｈｉｇｈ  ｇｒａｄｅ）免疫芽球性ＮＨＬ；高度悪性リンパ芽球性ＮＨＬ；高度悪性小型非切れ込み核細胞性（ｓｍａｌｌ  ｎｏｎ−ｃｌｅａｖｅｄ  ｃｅｌｌ）ＮＨＬ；巨大腫瘤病変（ｂｕｌｋｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症からなる群より選択される。
【００２２】
限定はされないが、Ｎｒｐ２アンタゴニストは、抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体および抗Ｎｒｐ２Ａ抗体を含む抗Ｎｒｐ２抗体（例えば、抗体ＹＷ６８．４．２、ＹＷ６８．４．２．３６、ＹＷ１２６．２０など）、ならびにこれらのフラグメントもしくは改変体（例えば、これらの親和性成熟した改変体）であり得る。
【００２３】
別の局面では、本発明は、ＹＷ６８．４．２、ＹＷ６８．４．２．３６からなる群より選択される抗体の重鎖および／もしくは軽鎖可変領域配列、ならびに、これらのフラグメントもしくは改変体を含む抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体に関する。
【００２４】
なお別の局面では、本発明は、ＹＷ１２６．２０の重鎖および／もしくは軽鎖可変領域配列、または、これらのフラグメントもしくは改変体を含む抗Ｎｒｐ２Ａ抗体に関する。
【００２５】
本発明はさらに、薬学的に受容可能なキャリアと混合した状態で請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の抗体を含む組成物に関する。
【００２６】
さらなる局面では、本発明は、薬学的に受容可能なキャリアと混合した状態で有効量のＮｒｐ２アンタゴニストを含む、腫瘍転移の予防または処置のための薬学的組成物に関する。
【００２７】
他の局面では、本発明は、腫瘍転移の予防または処置において使用するためのＮｒｐ２アンタゴニスト、ならびに、腫瘍転移の予防または処置において使用するための抗Ｎｒｐ２抗体のようなＮｒｐ２アンタゴニストの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１−１】図１。抗Ｎｒｐ２ＢｍＡｂの特徴づけ。（Ａ）抗Ｎｒｐ２Ｂエピトープ領域と比較した、Ｎｒｐ２上のＳｅｍａ結合領域およびＶＥＧＦ結合領域の概略図。（Ｂ）抗Ｎｒｐ２ＢがｈＮｒｐ２  ＥＣＤ（黒四角）およびｈＮｒｐ２のＢ１−Ｂ２ドメイン（黒丸）には結合したが、ｈＮｒｐ１  ＥＣＤ（白四角）またはｈＮｒｐ２のＡ１−Ａ２ドメイン（白丸）には結合しないことを示すＥＬＩＳＡアッセイ。（Ｃ）抗Ｎｒｐ２ＢによるＮｒｐ２へのＶＥＧＦＣ結合のブロッキング。増大する量のｍＡｂを、１〜２時間の間、ヒトＮｒｐ２  ＥＣＤ（５μｇ／ｍｌ）でコーティングしたプレートでプレインキュベートし、続いて、予め力価決定したビオチン化ヒトＶＥＧＦＣ（１ｎＭ）を１５分間加えた。結合したＶＥＧＦＣの割合をストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体によって検出した。（Ｄ）抗Ｎｒｐ２ＢによるＮｒｐ２へのＶＥＧＦ１６５の結合のブロッキング。（Ｅ）ＬＥＣへのＳｅｍａ３Ｆの結合のブロッキング。ＬＥＣを、抗Ｎｒｐ２Ｂの存在下または非存在下で、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）（ＲＥＦ）に融合させたＳｅｍａ３Ｆを含有する馴化培地と共にインキュベートした。Ｓｅｍａ３Ｆ−ＡＰに結合したＡＰ活性由来の形態を同じ発色時間で比色法により決定した。ＡＰでは結合は観察されなかった（左パネル）。抗Ｎｒｐ２Ｂは、ＬＥＣへのＳｅｍａ３Ｆの結合をブロックしなかった（中央パネル）。結合のブロッキングのためのポジティブコントロールとしてＮｒｐ２  ＥＣＤを使用した（右パネル）。スケールバー
【図１−２】図１。抗Ｎｒｐ２ＢｍＡｂの特徴づけ。（Ａ）抗Ｎｒｐ２Ｂエピトープ領域と比較した、Ｎｒｐ２上のＳｅｍａ結合領域およびＶＥＧＦ結合領域の概略図。（Ｂ）抗Ｎｒｐ２ＢがｈＮｒｐ２  ＥＣＤ（黒四角）およびｈＮｒｐ２のＢ１−Ｂ２ドメイン（黒丸）には結合したが、ｈＮｒｐ１  ＥＣＤ（白四角）またはｈＮｒｐ２のＡ１−Ａ２ドメイン（白丸）には結合しないことを示すＥＬＩＳＡアッセイ。（Ｃ）抗Ｎｒｐ２ＢによるＮｒｐ２へのＶＥＧＦＣ結合のブロッキング。増大する量のｍＡｂを、１〜２時間の間、ヒトＮｒｐ２  ＥＣＤ（５μｇ／ｍｌ）でコーティングしたプレートでプレインキュベートし、続いて、予め力価決定したビオチン化ヒトＶＥＧＦＣ（１ｎＭ）を１５分間加えた。結合したＶＥＧＦＣの割合をストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体によって検出した。（Ｄ）抗Ｎｒｐ２ＢによるＮｒｐ２へのＶＥＧＦ１６５の結合のブロッキング。（Ｅ）ＬＥＣへのＳｅｍａ３Ｆの結合のブロッキング。ＬＥＣを、抗Ｎｒｐ２Ｂの存在下または非存在下で、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）（ＲＥＦ）に融合させたＳｅｍａ３Ｆを含有する馴化培地と共にインキュベートした。Ｓｅｍａ３Ｆ−ＡＰに結合したＡＰ活性由来の形態を同じ発色時間で比色法により決定した。ＡＰでは結合は観察されなかった（左パネル）。抗Ｎｒｐ２Ｂは、ＬＥＣへのＳｅｍａ３Ｆの結合をブロックしなかった（中央パネル）。結合のブロッキングのためのポジティブコントロールとしてＮｒｐ２  ＥＣＤを使用した（右パネル）。スケールバー
【図２−１】図２。抗Ｎｒｐ２Ｂは、インビトロおよびインビボでＶＥＧＦＣ誘導性の機能を低下させる。（Ａ）抗Ｎｒｐ２Ｂ（５０μｇ／ｍｌ）もしくはＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（５０μｇ／ｍｌ）の存在下もしくは非存在下で、１８時間にわたって、２００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＣに応答して移動する、染色されたＬＥＣの代表的な像。（Ｂ）２００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＣに応答したＬＥＣ遊走の定量（各条件についてｎ＝６）。（Ｃ）抗Ｎｒｐ２Ｂ（５０μｇ／ｍｌ）またはＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（５０μｇ／ｍｌ）の存在下もしくは非存在下での１０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ１６５に応答したＬＥＣ遊走の定量。各条件についてｎ＝６。（Ｄ）（Ｅ）に記載した角膜マイクロポケットアッセイからのピクセルカウントの定量。＊ｐ＜０．０５。（Ｅ）ＶＥＧＦＣ（Ｐ）の１５０ｎｇペレットの角膜内への配置、および、抗Ｎｒｐ２Ｂ（１０ｍｇ／ｋｇを週２回）またはＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（２５ｍｇ／ｋｇを週２回）での全身処置の効果を示す、ＬＹＶＥ−１染色した角膜の代表的な像。ＬＹＶＥ−１染色は擬似カラーで赤色にし（ｐｓｅｕｄｏｃｏｌｏｒｅｄ  ｒｅｄ）、視覚化を促進した。＊ｐ＜０．０５；エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【図２−２】図２。抗Ｎｒｐ２Ｂは、インビトロおよびインビボでＶＥＧＦＣ誘導性の機能を低下させる。（Ａ）抗Ｎｒｐ２Ｂ（５０μｇ／ｍｌ）もしくはＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（５０μｇ／ｍｌ）の存在下もしくは非存在下で、１８時間にわたって、２００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＣに応答して移動する、染色されたＬＥＣの代表的な像。（Ｂ）２００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＣに応答したＬＥＣ遊走の定量（各条件についてｎ＝６）。（Ｃ）抗Ｎｒｐ２Ｂ（５０μｇ／ｍｌ）またはＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（５０μｇ／ｍｌ）の存在下もしくは非存在下での１０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ１６５に応答したＬＥＣ遊走の定量。各条件についてｎ＝６。（Ｄ）（Ｅ）に記載した角膜マイクロポケットアッセイからのピクセルカウントの定量。＊ｐ＜０．０５。（Ｅ）ＶＥＧＦＣ（Ｐ）の１５０ｎｇペレットの角膜内への配置、および、抗Ｎｒｐ２Ｂ（１０ｍｇ／ｋｇを週２回）またはＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（２５ｍｇ／ｋｇを週２回）での全身処置の効果を示す、ＬＹＶＥ−１染色した角膜の代表的な像。ＬＹＶＥ−１染色は擬似カラーで赤色にし、視覚化を促進した。＊ｐ＜０．０５；エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【図２−３】図２。抗Ｎｒｐ２Ｂは、インビトロおよびインビボでＶＥＧＦＣ誘導性の機能を低下させる。（Ａ）抗Ｎｒｐ２Ｂ（５０μｇ／ｍｌ）もしくはＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（５０μｇ／ｍｌ）の存在下もしくは非存在下で、１８時間にわたって、２００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＣに応答して移動する、染色されたＬＥＣの代表的な像。（Ｂ）２００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＣに応答したＬＥＣ遊走の定量（各条件についてｎ＝６）。（Ｃ）抗Ｎｒｐ２Ｂ（５０μｇ／ｍｌ）またはＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（５０μｇ／ｍｌ）の存在下もしくは非存在下での１０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ１６５に応答したＬＥＣ遊走の定量。各条件についてｎ＝６。（Ｄ）（Ｅ）に記載した角膜マイクロポケットアッセイからのピクセルカウントの定量。＊ｐ＜０．０５。（Ｅ）ＶＥＧＦＣ（Ｐ）の１５０ｎｇペレットの角膜内への配置、および、抗Ｎｒｐ２Ｂ（１０ｍｇ／ｋｇを週２回）またはＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（２５ｍｇ／ｋｇを週２回）での全身処置の効果を示す、ＬＹＶＥ−１染色した角膜の代表的な像。ＬＹＶＥ−１染色はは擬似カラーで赤色にし、視覚化を促進した。＊ｐ＜０．０５；エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【図３−１】図３。Ｎｒｐ２Ｂ処理は、ＶＥＧＦレセプター活性化の低下をもたらし、そして、Ｎｒｐ２／ＶＥＧＦレセプター複合体の形成を阻害する。（Ａ）コントロール抗体（１０μｇ／ｍｌ；緑色の線）または抗Ｎｒｐ２Ｂ（１０μｇ／ｍｌ）での５分間（青色の線）もしくは２０時間（赤色の線）の処理後の、ＬＥＣ表面上のＮｒｐ２、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３レベルのＦＡＣＳ解析。（Ｂ）抗Ｎｒｐ２Ｂ（５０μｇ／ｍｌ）またはＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（５０μｇ／ｍｌ）の存在下もしくは非存在下での、２０ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦに応答したＬＥＣ遊走の定量。各条件についてＮ＝６。（Ｃ）全ＶＥＧＦＲ２またはチロシンリン酸化されたＶＥＧＦＲ２を認識する抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイによって検出されたＬＥＣにおけるＶＥＧＦＲ２リン酸化レベル。抗Ｎｒｐ２Ｂ（１０μｇ／ｍｌ）またはＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下もしくは非存在下で１０分間ＶＥＧＦＣ（記された濃度）を加え、ＶＥＧＦＲ２のリン酸化を誘導した。各条件についてｎ＝３。抗Ｎｒｐ２Ｂ（１０μｇ／ｍｌ）処理した細胞におけるＶＥＧＦＲ２リン酸化レベルは、２００ｎｇ／ｍｌでのＶＥＧＦＣ刺激とは有意に異なり、一貫して１７５ｎｇ／ｎｌのＶＥＧＦＣによって誘導されたリン酸化レベルと１５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＣによって誘導されたリン酸化レベルとの間であった。（Ｄ）抗Ｎｒｐ２Ｂ（１０μｇ／ｍｌ）またはＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下もしくは非存在下での、ＶＥＧＦＣ（記された濃度）に応答したＬＥＣ遊走の定量。５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＣにおいて、または、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤでブロッキングした場合に、遊走のかなりの減少が認められた。＊ｐ＜０．０５；エラーバーは、平均の標準誤差を表す。各実験は、最低でも３回繰り返した。（Ｅ）ＣＯ−ＩＰ。
【図３−２】図３。Ｎｒｐ２Ｂ処理は、ＶＥＧＦレセプター活性化の低下をもたらし、そして、Ｎｒｐ２／ＶＥＧＦレセプター複合体の形成を阻害する。（Ａ）コントロール抗体（１０μｇ／ｍｌ；緑色の線）または抗Ｎｒｐ２Ｂ（１０μｇ／ｍｌ）での５分間（青色の線）もしくは２０時間（赤色の線）の処理後の、ＬＥＣ表面上のＮｒｐ２、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３レベルのＦＡＣＳ解析。（Ｂ）抗Ｎｒｐ２Ｂ（５０μｇ／ｍｌ）またはＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（５０μｇ／ｍｌ）の存在下もしくは非存在下での、２０ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦに応答したＬＥＣ遊走の定量。各条件についてＮ＝６。（Ｃ）全ＶＥＧＦＲ２またはチロシンリン酸化されたＶＥＧＦＲ２を認識する抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイによって検出されたＬＥＣにおけるＶＥＧＦＲ２リン酸化レベル。抗Ｎｒｐ２Ｂ（１０μｇ／ｍｌ）またはＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下もしくは非存在下で１０分間ＶＥＧＦＣ（記された濃度）を加え、ＶＥＧＦＲ２のリン酸化を誘導した。各条件についてｎ＝３。抗Ｎｒｐ２Ｂ（１０μｇ／ｍｌ）処理した細胞におけるＶＥＧＦＲ２リン酸化レベルは、２００ｎｇ／ｍｌでのＶＥＧＦＣ刺激とは有意に異なり、一貫して１７５ｎｇ／ｎｌのＶＥＧＦＣによって誘導されたリン酸化レベルと１５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＣによって誘導されたリン酸化レベルとの間であった。（Ｄ）抗Ｎｒｐ２Ｂ（１０μｇ／ｍｌ）またはＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下もしくは非存在下での、ＶＥＧＦＣ（記された濃度）に応答したＬＥＣ遊走の定量。５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＣにおいて、または、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤでブロッキングした場合に、遊走のかなりの減少が認められた。＊ｐ＜０．０５；エラーバーは、平均の標準誤差を表す。各実験は、最低でも３回繰り返した。（Ｅ）ＣＯ−ＩＰ。
【図３−３】図３。Ｎｒｐ２Ｂ処理は、ＶＥＧＦレセプター活性化の低下をもたらし、そして、Ｎｒｐ２／ＶＥＧＦレセプター複合体の形成を阻害する。（Ａ）コントロール抗体（１０μｇ／ｍｌ；緑色の線）または抗Ｎｒｐ２Ｂ（１０μｇ／ｍｌ）での５分間（青色の線）もしくは２０時間（赤色の線）の処理後の、ＬＥＣ表面上のＮｒｐ２、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３レベルのＦＡＣＳ解析。（Ｂ）抗Ｎｒｐ２Ｂ（５０μｇ／ｍｌ）またはＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（５０μｇ／ｍｌ）の存在下もしくは非存在下での、２０ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦに応答したＬＥＣ遊走の定量。各条件についてＮ＝６。（Ｃ）全ＶＥＧＦＲ２またはチロシンリン酸化されたＶＥＧＦＲ２を認識する抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイによって検出されたＬＥＣにおけるＶＥＧＦＲ２リン酸化レベル。抗Ｎｒｐ２Ｂ（１０μｇ／ｍｌ）またはＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下もしくは非存在下で１０分間ＶＥＧＦＣ（記された濃度）を加え、ＶＥＧＦＲ２のリン酸化を誘導した。各条件についてｎ＝３。抗Ｎｒｐ２Ｂ（１０μｇ／ｍｌ）処理した細胞におけるＶＥＧＦＲ２リン酸化レベルは、２００ｎｇ／ｍｌでのＶＥＧＦＣ刺激とは有意に異なり、一貫して１７５ｎｇ／ｎｌのＶＥＧＦＣによって誘導されたリン酸化レベルと１５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＣによって誘導されたリン酸化レベルとの間であった。（Ｄ）抗Ｎｒｐ２Ｂ（１０μｇ／ｍｌ）またはＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下もしくは非存在下での、ＶＥＧＦＣ（記された濃度）に応答したＬＥＣ遊走の定量。５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＣにおいて、または、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤでブロッキングした場合に、遊走のかなりの減少が認められた。＊ｐ＜０．０５；エラーバーは、平均の標準誤差を表す。各実験は、最低でも３回繰り返した。（Ｅ）ＣＯ−ＩＰ。
【図４−１】図４。Ｎｒｐ２は腫瘍担持マウスのリンパ系において発現される。（Ａ〜Ｄ）正常な成体マウスの（Ａ）腸および（Ｂ）リンパ節における、ＬＹＶＥ−１染色（左列−赤色）標識したリンパ系、Ｎｒｐ２染色（中央列−緑色）および重ね合わせ。Ｎｒｐ２シグナルはいずれの器官においてもＬＹＶＥ−１標識したリンパ系とともに局在化しない。Ｎｒｐ２染色された炎症性細胞は、腸の絨毛の線維基質コア（ｆｉｂｒｏｓｔｒｏｍａｌ  ｃｏｒｅ）内およびリンパ節の胚中心内にはほとんど存在しない。（Ｃ）腫瘍担持動物からのリンパ節では、Ｎｒｐ２シグナルは、ＬＮ洞の内層にあるＬＹＶＥ−１陽性のリンパ管とともに局在化する。さらなるＮｒｐ２染色された炎症性細胞もまた存在する。（Ｄ）強いＮｒｐ２染色もまた、６６ｃ１４腫瘍内のリンパ管において見られる。弱い膜性の染色もまた腫瘍細胞上に見られ得る。二次抗体のみで染色したコントロールはシグナルを全く示さなかった。四角で囲んだ領域は、差込み図（ｉｎｓｅｔ）内に高倍率で示される。スケールバー  Ａ〜Ｃについて＊＊＊、そしてＤについて＊＊。
【図４−２】図４。Ｎｒｐ２は腫瘍担持マウスのリンパ系において発現される。（Ａ〜Ｄ）正常な成体マウスの（Ａ）腸および（Ｂ）リンパ節における、ＬＹＶＥ−１染色（左列−赤色）標識したリンパ系、Ｎｒｐ２染色（中央列−緑色）および重ね合わせ。Ｎｒｐ２シグナルはいずれの器官においてもＬＹＶＥ−１標識したリンパ系とともに局在化しない。Ｎｒｐ２染色された炎症性細胞は、腸の絨毛の線維基質コア内およびリンパ節の胚中心内にはほとんど存在しない。（Ｃ）腫瘍担持動物からのリンパ節では、Ｎｒｐ２シグナルは、ＬＮ洞の内層にあるＬＹＶＥ−１陽性のリンパ管とともに局在化する。さらなるＮｒｐ２染色された炎症性細胞もまた存在する。（Ｄ）強いＮｒｐ２染色もまた、６６ｃ１４腫瘍内のリンパ管において見られる。弱い膜性の染色もまた腫瘍細胞上に見られ得る。二次抗体のみで染色したコントロールはシグナルを全く示さなかった。四角で囲んだ領域は、差込み図（ｉｎｓｅｔ）内に高倍率で示される。スケールバー  Ａ〜Ｃについて＊＊＊、そしてＤについて＊＊。
【図４−３】図４。Ｎｒｐ２は腫瘍担持マウスのリンパ系において発現される。（Ａ〜Ｄ）正常な成体マウスの（Ａ）腸および（Ｂ）リンパ節における、ＬＹＶＥ−１染色（左列−赤色）標識したリンパ系、Ｎｒｐ２染色（中央列−緑色）および重ね合わせ。Ｎｒｐ２シグナルはいずれの器官においてもＬＹＶＥ−１標識したリンパ系とともに局在化しない。Ｎｒｐ２染色された炎症性細胞は、腸の絨毛の線維基質コア内およびリンパ節の胚中心内にはほとんど存在しない。（Ｃ）腫瘍担持動物からのリンパ節では、Ｎｒｐ２シグナルは、ＬＮ洞の内層にあるＬＹＶＥ−１陽性のリンパ管とともに局在化する。さらなるＮｒｐ２染色された炎症性細胞もまた存在する。（Ｄ）強いＮｒｐ２染色もまた、６６ｃ１４腫瘍内のリンパ管において見られる。弱い膜性の染色もまた腫瘍細胞上に見られ得る。二次抗体のみで染色したコントロールはシグナルを全く示さなかった。四角で囲んだ領域は、差込み図（ｉｎｓｅｔ）内に高倍率で示される。スケールバー  Ａ〜Ｃについて＊＊＊、そしてＤについて＊＊。
【図５−１】図５。抗Ｎｒｐ２Ｂ処置は６６ｃ１４腫瘍モデルにおける肺転移の低下をもたらす。（Ａ）６６ｃ１４腫瘍モデル研究の平均腫瘍容積グラフを以下のように解析した。腫瘍が１００ｍｍ３の平均サイズに達すると、動物に、１０ｍｇ／ｋｇの抗Ｎｒｐ２Ｂまたはコントロール抗体を週２回ｉ．ｐ．投薬し、そして、研究の間中投薬した。（Ｂ）コントロールおよび抗Ｎｒｐ２Ｂ処置した動物における肺あたりの転移性小結節の数の目視による定量。（Ｃ）コントロール（左）および抗Ｎｒｐ２Ｂ（右）処置した動物からの肺の代表的な像。肺を、固定前に、右心室灌流によって膨らませた。視覚化を促進するため、小結節を白色で強調している。（Ｄ、Ｅ）コントロール（Ｄ）および抗Ｎｒｐ２Ｂ（Ｅ）処置した動物における転移性小結節（赤色）を示す、代表的なマイクロ−ＣＴスキャンした肺の３次元透視図。縦断面（上の差込み図）および横断面（下の差込み図）の位置は、それぞれ、黒色および赤色の点線で示される。この解析は、ほとんどの小結節が肺表面上にあることを確認する。（Ｆ）肺のマイクロ−ＣＴ解析による、肺あたりの転移性小結節の数の定量。（Ｇ）インビトロ培養した６６ｃ１４腫瘍細胞の表面上のＮｒｐ２レベルのＦＡＣＳ解析。（Ｈ）転移性の腫瘍細胞を示す、肺小結節のＨ＆Ｅ染色。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。スケールバー  Ｃについて＊＊＊、そしてＨについて＊＊。
【図５−２】図５。抗Ｎｒｐ２Ｂ処置は６６ｃ１４腫瘍モデルにおける肺転移の低下をもたらす。（Ａ）６６ｃ１４腫瘍モデル研究の平均腫瘍容積グラフを以下のように解析した。腫瘍が１００ｍｍ３の平均サイズに達すると、動物に、１０ｍｇ／ｋｇの抗Ｎｒｐ２Ｂまたはコントロール抗体を週２回ｉ．ｐ．投薬し、そして、研究の間中投薬した。（Ｂ）コントロールおよび抗Ｎｒｐ２Ｂ処置した動物における肺あたりの転移性小結節の数の目視による定量。（Ｃ）コントロール（左）および抗Ｎｒｐ２Ｂ（右）処置した動物からの肺の代表的な像。肺を、固定前に、右心室灌流によって膨らませた。視覚化を促進するため、小結節を白色で強調している。（Ｄ、Ｅ）コントロール（Ｄ）および抗Ｎｒｐ２Ｂ（Ｅ）処置した動物における転移性小結節（赤色）を示す、代表的なマイクロ−ＣＴスキャンした肺の３次元透視図。縦断面（上の差込み図）および横断面（下の差込み図）の位置は、それぞれ、黒色および赤色の点線で示される。この解析は、ほとんどの小結節が肺表面上にあることを確認する。（Ｆ）肺のマイクロ−ＣＴ解析による、肺あたりの転移性小結節の数の定量。（Ｇ）インビトロ培養した６６ｃ１４腫瘍細胞の表面上のＮｒｐ２レベルのＦＡＣＳ解析。（Ｈ）転移性の腫瘍細胞を示す、肺小結節のＨ＆Ｅ染色。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。スケールバー  Ｃについて＊＊＊、そしてＨについて＊＊。
【図５−３】図５。抗Ｎｒｐ２Ｂ処置は６６ｃ１４腫瘍モデルにおける肺転移の低下をもたらす。（Ａ）６６ｃ１４腫瘍モデル研究の平均腫瘍容積グラフを以下のように解析した。腫瘍が１００ｍｍ３の平均サイズに達すると、動物に、１０ｍｇ／ｋｇの抗Ｎｒｐ２Ｂまたはコントロール抗体を週２回ｉ．ｐ．投薬し、そして、研究の間中投薬した。（Ｂ）コントロールおよび抗Ｎｒｐ２Ｂ処置した動物における肺あたりの転移性小結節の数の目視による定量。（Ｃ）コントロール（左）および抗Ｎｒｐ２Ｂ（右）処置した動物からの肺の代表的な像。肺を、固定前に、右心室灌流によって膨らませた。視覚化を促進するため、小結節を白色で強調している。（Ｄ、Ｅ）コントロール（Ｄ）および抗Ｎｒｐ２Ｂ（Ｅ）処置した動物における転移性小結節（赤色）を示す、代表的なマイクロ−ＣＴスキャンした肺の３次元透視図。縦断面（上の差込み図）および横断面（下の差込み図）の位置は、それぞれ、黒色および赤色の点線で示される。この解析は、ほとんどの小結節が肺表面上にあることを確認する。（Ｆ）肺のマイクロ−ＣＴ解析による、肺あたりの転移性小結節の数の定量。（Ｇ）インビトロ培養した６６ｃ１４腫瘍細胞の表面上のＮｒｐ２レベルのＦＡＣＳ解析。（Ｈ）転移性の腫瘍細胞を示す、肺小結節のＨ＆Ｅ染色。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。スケールバー  Ｃについて＊＊＊、そしてＨについて＊＊。
【図６−１】図６。抗Ｎｒｐ２Ｂ処置は、Ｃ６腫瘍モデルにおける肺転移の低下をもたらす。（Ａ）Ｃ６腫瘍モデル研究の平均腫瘍容積グラフを以下のように解析した。腫瘍が１００ｍｍ３の平均サイズに達すると、動物に、抗Ｎｒｐ２Ｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（２５ｍｇ／ｋｇ）またはコントロール抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）を週２回ｉ．ｐ．投薬し、そして、研究の間中投薬した。（Ｂ）コントロール、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤおよび抗Ｎｒｐ２Ｂ処置した動物における肺あたりの転移性小結節の数の目視による定量。（Ｃ）コントロール（左）、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（中央）および抗Ｎｒｐ２Ｂ（右）処置した動物からの肺の代表的な像。肺を、固定前に、右心室灌流によって膨らませた。視覚化を促進するため、小結節を白色で強調している。（Ｄ）コントロール（左）および抗Ｎｒｐ２Ｂ（右）処置した動物における転移性小結節（赤色）を示す、代表的なマイクロ−ＣＴスキャンした肺の３次元透視図。縦断面（上の差込み図）および横断面（下の差込み図）の位置は、それぞれ、黒色および赤色の点線で示される。この解析は、ほとんどの小結節が肺表面上にあることを確認する。（Ｅ）インビトロ培養した６６ｃ１４腫瘍細胞の表面上のＮｒｐ２レベルのＦＡＣＳ解析。（Ｆ）転移性の腫瘍細胞を示す、肺小結節のＨ＆Ｅ染色。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。スケールバー  Ｃについて＊＊＊、そしてＦについて＊＊。
【図６−２】図６。抗Ｎｒｐ２Ｂ処置は、Ｃ６腫瘍モデルにおける肺転移の低下をもたらす。（Ａ）Ｃ６腫瘍モデル研究の平均腫瘍容積グラフを以下のように解析した。腫瘍が１００ｍｍ３の平均サイズに達すると、動物に、抗Ｎｒｐ２Ｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（２５ｍｇ／ｋｇ）またはコントロール抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）を週２回ｉ．ｐ．投薬し、そして、研究の間中投薬した。（Ｂ）コントロール、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤおよび抗Ｎｒｐ２Ｂ処置した動物における肺あたりの転移性小結節の数の目視による定量。（Ｃ）コントロール（左）、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（中央）および抗Ｎｒｐ２Ｂ（右）処置した動物からの肺の代表的な像。肺を、固定前に、右心室灌流によって膨らませた。視覚化を促進するため、小結節を白色で強調している。（Ｄ）コントロール（左）および抗Ｎｒｐ２Ｂ（右）処置した動物における転移性小結節（赤色）を示す、代表的なマイクロ−ＣＴスキャンした肺の３次元透視図。縦断面（上の差込み図）および横断面（下の差込み図）の位置は、それぞれ、黒色および赤色の点線で示される。この解析は、ほとんどの小結節が肺表面上にあることを確認する。（Ｅ）インビトロ培養した６６ｃ１４腫瘍細胞の表面上のＮｒｐ２レベルのＦＡＣＳ解析。（Ｆ）転移性の腫瘍細胞を示す、肺小結節のＨ＆Ｅ染色。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。スケールバー  Ｃについて＊＊＊、そしてＦについて＊＊。
【図６−３】図６。抗Ｎｒｐ２Ｂ処置は、Ｃ６腫瘍モデルにおける肺転移の低下をもたらす。（Ａ）Ｃ６腫瘍モデル研究の平均腫瘍容積グラフを以下のように解析した。腫瘍が１００ｍｍ３の平均サイズに達すると、動物に、抗Ｎｒｐ２Ｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（２５ｍｇ／ｋｇ）またはコントロール抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）を週２回ｉ．ｐ．投薬し、そして、研究の間中投薬した。（Ｂ）コントロール、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤおよび抗Ｎｒｐ２Ｂ処置した動物における肺あたりの転移性小結節の数の目視による定量。（Ｃ）コントロール（左）、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（中央）および抗Ｎｒｐ２Ｂ（右）処置した動物からの肺の代表的な像。肺を、固定前に、右心室灌流によって膨らませた。視覚化を促進するため、小結節を白色で強調している。（Ｄ）コントロール（左）および抗Ｎｒｐ２Ｂ（右）処置した動物における転移性小結節（赤色）を示す、代表的なマイクロ−ＣＴスキャンした肺の３次元透視図。縦断面（上の差込み図）および横断面（下の差込み図）の位置は、それぞれ、黒色および赤色の点線で示される。この解析は、ほとんどの小結節が肺表面上にあることを確認する。（Ｅ）インビトロ培養した６６ｃ１４腫瘍細胞の表面上のＮｒｐ２レベルのＦＡＣＳ解析。（Ｆ）転移性の腫瘍細胞を示す、肺小結節のＨ＆Ｅ染色。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。スケールバー  Ｃについて＊＊＊、そしてＦについて＊＊。
【図７−１】図７。抗Ｎｒｐ２Ｂ処置は、腫瘍リンパ管の減少をもたらす。（Ａ、Ｂ）コントロール抗体または抗Ｎｒｐ２Ｂで処置した６６ｃ１４腫瘍における、ＰＥＣＡＭ−１  ＩＨＣによって検出した血管密度（Ａ）およびＬＹＶＥ−１  ＩＨＣによって検出したリンパ管密度（Ｂ）の定量。脈管の密度は、１群につき６つの腫瘍の各々からの６つの代表的な像から決定し、そして、ＩｍａｇｅＪによって平均ピクセル数を評価した。（Ｃ）コントロール抗体（左列）、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（中央列）または抗Ｎｒｐ２Ｂ（右列）で処置したＣ６腫瘍における、ＰＥＣＡＭ−１染色した血管（上の行）およびＬＹＶＥ−１染色したリンパ管（中央および下の行）の代表的な像。中央の行に輪郭を描かれる四角で囲まれた領域は、下の行により高い倍率で示される。血管密度（上のグラフ）およびリンパ管密度（下のグラフ）の定量は、これらの像の右側にある。（Ｄ）４日目（回収１）および１１日目（回収２）に回収した抗Ｎｒｐ２Ｂ処置した動物（下パネル）からのＬＹＶＥ−１染色した腫瘍は、コントロール処置した動物（上パネル）と比較して、リンパ管の崩壊を示す。成長曲線に対する回収日を左側に示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。スケールバー＊＊＊。
【図７−２】図７。抗Ｎｒｐ２Ｂ処置は、腫瘍リンパ管の減少をもたらす。（Ａ、Ｂ）コントロール抗体または抗Ｎｒｐ２Ｂで処置した６６ｃ１４腫瘍における、ＰＥＣＡＭ−１  ＩＨＣによって検出した血管密度（Ａ）およびＬＹＶＥ−１  ＩＨＣによって検出したリンパ管密度（Ｂ）の定量。脈管の密度は、１群につき６つの腫瘍の各々からの６つの代表的な像から決定し、そして、ＩｍａｇｅＪによって平均ピクセル数を評価した。（Ｃ）コントロール抗体（左列）、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（中央列）または抗Ｎｒｐ２Ｂ（右列）で処置したＣ６腫瘍における、ＰＥＣＡＭ−１染色した血管（上の行）およびＬＹＶＥ−１染色したリンパ管（中央および下の行）の代表的な像。中央の行に輪郭を描かれる四角で囲まれた領域は、下の行により高い倍率で示される。血管密度（上のグラフ）およびリンパ管密度（下のグラフ）の定量は、これらの像の右側にある。（Ｄ）４日目（回収１）および１１日目（回収２）に回収した抗Ｎｒｐ２Ｂ処置した動物（下パネル）からのＬＹＶＥ−１染色した腫瘍は、コントロール処置した動物（上パネル）と比較して、リンパ管の崩壊を示す。成長曲線に対する回収日を左側に示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。スケールバー＊＊＊。
【図７−３】図７。抗Ｎｒｐ２Ｂ処置は、腫瘍リンパ管の減少をもたらす。（Ａ、Ｂ）コントロール抗体または抗Ｎｒｐ２Ｂで処置した６６ｃ１４腫瘍における、ＰＥＣＡＭ−１  ＩＨＣによって検出した血管密度（Ａ）およびＬＹＶＥ−１  ＩＨＣによって検出したリンパ管密度（Ｂ）の定量。脈管の密度は、１群につき６つの腫瘍の各々からの６つの代表的な像から決定し、そして、ＩｍａｇｅＪによって平均ピクセル数を評価した。（Ｃ）コントロール抗体（左列）、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（中央列）または抗Ｎｒｐ２Ｂ（右列）で処置したＣ６腫瘍における、ＰＥＣＡＭ−１染色した血管（上の行）およびＬＹＶＥ−１染色したリンパ管（中央および下の行）の代表的な像。中央の行に輪郭を描かれる四角で囲まれた領域は、下の行により高い倍率で示される。血管密度（上のグラフ）およびリンパ管密度（下のグラフ）の定量は、これらの像の右側にある。（Ｄ）４日目（回収１）および１１日目（回収２）に回収した抗Ｎｒｐ２Ｂ処置した動物（下パネル）からのＬＹＶＥ−１染色した腫瘍は、コントロール処置した動物（上パネル）と比較して、リンパ管の崩壊を示す。成長曲線に対する回収日を左側に示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。スケールバー＊＊＊。
【図８】図８。抗Ｎｒｐ２Ｂ処置は、機能的な腫瘍リンパ管の減少をもたらし、そして、原発性のリンパ節への転移の遅延につながる。（Ａ、Ｂ）ポリスチレン蛍光マイクロビーズ（緑色）は、皮内リンパ管造影法後に、もっぱらＬＹＶＥ−１  ＩＨＣ（赤色）で標識したリンパ管において見られる。Ａの四角で囲んだ領域はＢにおいて高倍率で示される。（Ｃ〜Ｄ）抗Ｎｒｐ２Ｂ処置は、Ｃ６腫瘍（Ｃ）（Ｐ＝０．０３５）および６６ｃ１４腫瘍（Ｄ）（Ｐ＝０．００５）内のエバンスブルーの減少をもたらし、これらの処置された腫瘍における機能的リンパ系の減少を示す。（Ｅ）コントロール（黒色）および抗Ｎｒｐ２Ｂ処置（赤色）マウスの耳への腫瘍移植後の種々の時点での□−ｇａｌを発現するＣ６腫瘍細胞を含むＳＬＮを持つ動物の割合。抗Ｎｒｐ２Ｂ処置はＳＬＮにおける細胞の到達の遅延をもたらす（Ｐ＝０．００６）。処置条件につき、そして、時間ごとにＮ＝７の動物。
【図９】図９。異なるヒト悪性疾患におけるＮｒｐ２の発現。（Ａ〜Ｆ）正常な結腸および結腸直腸腺癌（Ａ）、正常な頭頚部組織および頭頚部の扁平細胞癌腫（Ｂ）、正常な膵臓および膵臓腺癌（Ｃ）、正常な皮膚および悪性黒色腫（Ｄ）、正常な甲状腺および副甲状腺癌腫（Ｅ）、ならびに、正常な胸部およびＨｅｒ２−浸潤性腺管癌（Ｆ）におけるＮｒｐ２発現についてのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａ  ａｎｄ  Ｂ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）マイクロアレイデータ。各データ点は１人の患者を表す。
【図１０】図１０。抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体ＹＷ６８．４．２およびＹＷ６８．４．２．３６  Ｆａｂフラグメントのアミノ酸配列。
【図１１】図１１。抗Ｎｒｐ２Ａ抗体ＹＷ１２６．２０  Ｆａｂフラグメントのアミノ酸配列。
【図１２】図１２。抗Ｎｒｐ２Ａ抗体ＹＷ１２６．２０軽鎖可変ドメイン配列の、ヒトκ１配列とのアラインメント。
【図１３】図１３。抗Ｎｒｐ２Ａ抗体ＹＷ１２６．２０重鎖可変ドメイン配列の、ヒトＩＩＩ（ｈｕｍ  ＩＩＩ）配列とのアラインメント。
【図１４】追加図１。インビトロ培養したＬＥＣの表面上のＶＥＧＦ軸レセプター（ａｘｉｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）レベルのＦＡＣＳ解析。培養ＬＥＣ上のＮｒｐ１、Ｎｒｐ２、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３のＦＡＣＳ解析。
【図１５】追加図２。抗Ｎｒｐ２ＢはＶＥＧＦ１６５誘発性の遊走をブロックしない。（Ａ〜Ｂ）抗Ｎｒｐ１Ｂ、抗Ｎｒｐ２Ｂ（５０μｇ／ｍｌ）またはこの両方の抗体（５０μｇ／ｍｌ）の存在下もしくは非存在下での、１８時間にわたる２００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦに応答して遊走するＨＵＶＥＣ（Ａ）およびＬＥＣ（Ｂ）の定量。＊ｐ＜０．０５；エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【図１６】追加図３。ＶＥＧＦＣにより媒介される増殖および脈管透過性および関連する細胞内シグナル伝達に対する抗Ｎｒｐ２Ｂの効果。（Ａ）ＢｒｄＵの取り込みによって決定した、抗Ｎｒｐ２Ｂ（５０μｇ／ｍｌ）またはＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（５０μｇ／ｍｌ）の存在下もしくは非存在下での２００ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦＣによって誘導されるＬＥＣ増殖の定量（条件につきｎ＝６）。（Ｂ）マウスの皮膚血管透過性アッセイ。像は同じ動物の皮膚から撮った。青い染色は、抗Ｎｒｐ２Ｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（２５ｍｇ／ｋｇ）での全身処置後のＶＥＧＦＣの皮内送達に応答した、脈管構造からのエバンスブルーの漏れを示す。（Ｃ）透過性アッセイにおける皮膚サンプルから抽出したエバンスブルー染料の定量。示される値は、６回の独立した実験の平均値である。＊ｐ＜０．０５；エラーバーは平均の標準誤差を表す。
【図１７】追加図４。抗Ｎｒｐ２ＢはＳｅｍａ３Ｆ誘発性の成長円錐の崩壊をブロックしない。（Ａ）ローダミンを結合させたファロイジンで染色した、Ｅ  １７．５の海馬成長円錐の像。コントロールの成長円錐は、各軸の先端に大きなアクチンリッチな構造を示すが、これは、Ｓｅｍａ３Ｆ処置により減少する。抗Ｎｒｐ２Ｂ（５０μｇ／ｍｌ）は、この崩壊をブロックしない。対照的に、Ｎｒｐ２  ＥＣＤ（１０μｇ／ｍｌ）はこの崩壊をブロックする。（Ｂ）抗Ｎｒｐ２免疫組織化学の精度管理。像は、新たに調製した凍結切片におけるＩＨＣにおいて機能するＮｒｐ２を認識したファージ由来のクローンを示す。Ｎｒｐ２タンパク質の発現は、インサイチュハイブリダイゼーションを用いた際に見られるＮｒｐ２発現と同様である（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  １９，５４７−５５９（１９９７））。その後、この抗体を、新たに調製した凍結腫瘍切片におけるＩＨＣに用いた。（スケールバー  主たる像＝＊＊μｍ、差込み像＝＊＊μｍ）。
【図１８】追加図５。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（発明の詳細な説明）
（定義）
用語「ニューロピリン」、「ＮＲＰ」または「Ｎｒｐ」は、交換可能に使用され、そして、Ｒｏｓｓｉｇｎｏｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７０：２１１−２２２に記載されるように、ニューロピリン−１（ＮＲＰ１、Ｎｒｐ１）、ニューロピリン−２（ＮＲＰ２、Ｎｒｐ２）、ならびにこれらのアイソフォームおよび改変体をまとめて称する。ニューロピリンは１２０〜１３０ｋＤａの非チロシンキナーゼレセプターである。複数のＮＲＰ−１およびＮＲＰ−２スプライス改変体および可溶性アイソフォームが存在する。ニューロピリンの基本構造は、５つのドメインから構成される：３つの細胞外ドメイン（ａ１ａ２、ｂ１ｂ２およびｃ）、１つの膜貫通ドメインおよび１つの細胞質ドメイン。ａ１ａ２ドメインは、補体成分Ｃ１ｒおよびＣ１ｓ（ＣＵＢ）と相同であり、一般に、２つのジスルフィド架橋を形成する４つのシステイン残基を含む。ｂ１ｂ２ドメインは、第ＶおよびＶＩＩＩ凝固因子と相同である。ｃドメインの中央部分は、メプリン（ｍｅｐｒｉｎ）、Ａ５およびレセプターチロシンホスファターゼμタンパク質に対するその相同性に起因して、ＭＡＭと称される。ａ１ａ２ドメインおよびｂ１ｂ２ドメインは、リガンドへの結合を担っているのに対し、ｃドメインは、ホモ二量体化もしくはヘテロ二量体化に重要である。Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１８０６９−７６；ＨｅおよびＴｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ（１９９７）Ｃｅｌｌ  ９０：７３９−５１。
【００３０】
「ニューロピリンにより媒介される生物学的活性」とは一般に、ニューロピリン−１および／またはニューロピリン−２が実質的な役割を担う生理学的もしくは病理学的な事象をいう。このような活動の非限定的な例は、胚の神経系発生もしくはニューロン再生中の軸索誘導、血管新生（脈管モデリングを含む）、腫瘍形成および腫瘍転移である。
【００３１】
「ニューロピリン−２により媒介される生物学的活性」または「Ｎｒｐ２により媒介される生物学的活性」とは、本明細書中で使用される場合、一般に、Ｎｒｐ２が実質的な役割（例えば、ＶＥＧＦレセプター活性化の増強、そして特に、リンパ性内皮細胞（ＥＣ）の遊走を調節する能力、成体のリンパ管新生（特に、腫瘍性のリンパ管新生および腫瘍転移）における役割）を担う生理学的もしくは病理学的な事象をいう。
【００３２】
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、そして、具体的には、モノクローナル抗体（全長のモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、そして、所望の生物学的活性を示す限りは、抗体のフラグメントに及ぶ。
【００３３】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書中で使用される場合、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体をいい、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る可能性のある天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対して指向される。さらに、代表的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体の特性を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとしては解釈されない。例えば、本発明にしたがって使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されても、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作製されてもよい。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７に記載される技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【００３４】
本明細書におけるモノクローナル抗体は、具体的には、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種から誘導された抗体または特定の抗体分類もしくは下位分類に属する抗体における対応配列と同一であるかまたは相同である一方で、鎖の残りの部分は、別の種から誘導された抗体または別の抗体分類もしくは下位分類に属する抗体における対応配列と同一であるかまたは相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびに、所望の生物学的活性を示す限りは、このような抗体のフラグメントを含む（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５）。
【００３５】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の配列を最小限しか含まないキメラ抗体である。多くの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域が、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基で置き換えられた、所望の特異性、親和性および効力を有するヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒトの残基で置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見い出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに改良するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、代表的には２つの可変ドメインの実質的に全体を含み、ここで、超可変ループの全体または実質的に全体が、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、そして、ＦＲ領域の全体もしくは実質的に全体がヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（代表的にはヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９；およびＰｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６を参照のこと。
【００３６】
「種依存性抗体」とは、第二の哺乳動物種由来の抗原のホモログに対する結合親和性よりも強い、第一の哺乳動物種由来の抗原に対する結合親和性を有するものである。通常、種依存性抗体は、ヒト抗原に対して「特異的に結合する」（すなわち、約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは約１×１０−８Ｍ以下、最も好ましくは約１×１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有する）が、第二の非ヒト哺乳動物種由来の抗原のホモログに対して結合親和性を有し、この結合親和性は、ヒト抗原に対する結合親和性よりも、少なくとも約５０倍、または少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍弱い。種依存性抗体は、上に規定したような種々の型の抗体のいずれかであり得るが、好ましくは、ヒト化抗体またはヒト抗体である。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「抗体変異体」または「抗体改変体」とは、種依存性抗体の１以上のアミノ酸残基が改変された、種依存性抗体のアミノ酸配列改変体をいう。このような変異体は必ず、種依存性抗体に対して１００％未満の配列の同一性もしくは類似性を有する。好ましい実施形態では、抗体変異体は、種依存性抗体の重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインのいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性もしくは類似性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に関する同一性もしくは類似性は、本明細書において、必要な場合、配列をアラインメントしてギャップを導入して、最大の％配列同一性を達成した後の、候補配列中の、種依存性抗体残基と同一（すなわち、同じ残基）または類似（すなわち、共通の側鎖特性に基づいて同じ群からのアミノ酸残基、以下を参照のこと）のアミノ酸残基の割合として定義される。Ｎ末端、Ｃ末端、または、可変ドメインの外側の抗体配列への内部伸長、欠失もしくは挿入は、配列の同一性もしくは類似性に影響を及ぼすものと考えられない。
【００３８】
「単離された」抗体は、同定され、そして、その自然な環境の成分から分離および／または回収された抗体である。その自然な環境の汚染成分は、抗体の診断的使用もしくは治療的使用を干渉する物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性もしくは非タンパク質性の溶質が挙げられ得る。好ましい実施形態では、抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって決定したときに９５重量％超、最も好ましくは９９重量％超の抗体まで、（２）スピニングカップシークェネーターを用いて、Ｎ末端もしくは内部のアミノ酸配列のうち少なくとも１５残基を得るに十分な程度まで、または（３）クーマシーブルー染色もしくは好ましくは銀染色を用いる、還元もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質となるまで精製される。単離された抗体は、抗体の自然な環境の少なくとも１つの成分が存在していないので、組換え細胞内の限局された場所にある抗体を含む。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「抗体の可変ドメイン」とは、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）およびフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖および重鎖の部分をいう。ＶＨは、重鎖の可変ドメインを指す。ＶＬは、軽鎖の可変ドメインを指す。本発明において使用される方法によれば、ＣＤＲおよびＦＲに割り当てられるアミノ酸部分は、Ｋａｂａｔ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７および１９９１））に従って定義され得る。抗体または抗原結合フラグメントのアミノ酸番号付けもまた、Ｋａｂａｔの方法に従う。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）」は、その存在が抗原への結合に必須である抗体可変ドメインのアミノ酸残基をいう。各可変ドメインは、代表的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として同定される３つのＣＤＲ領域を有する。各相補性決定領域は、Ｋａｂａｔによって定義されるような「相補性決定領域」由来のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン内の残基２４〜３４付近（Ｌ１）、残基５０〜５６付近（Ｌ２）および残基８９〜９７付近（Ｌ３）、ならびに、重鎖可変ドメイン内の残基３１〜３５付近（Ｈ１）、残基５０〜６５付近（Ｈ２）および残基９５〜１０２付近（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））および／または「超可変ループ」由来の残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン内の残基２６〜３２付近（Ｌ１）、残基５０〜５２付近（Ｌ２）および残基９１〜９６付近（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン内の残基２６〜３２付近（Ｈ１）、残基５３〜５５付近（Ｈ２）および残基９６〜１０１付近（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）を含み得る。いくつかの例では、相補性決定領域は、Ｋａｂａｔに従って定義されるＣＤＲ領域と超可変ループの両方からのアミノ酸を含み得る。例えば、抗体４Ｄ５の重鎖のＣＤＲＨ１は、アミノ酸２６〜３５を含む。
【００４１】
「フレームワーク領域」（本明細書中では以下ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは代表的には、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４として同定される４つのＦＲを有する。ＣＤＲがＫａｂａｔに従って定義される場合、軽鎖のＦＲ残基は、残基１〜２３付近（ＬＣＦＲ１）、残基３５〜４９付近（ＬＣＦＲ２）、残基５７〜８８付近（ＬＣＦＲ３）および残基９８〜１０７付近（ＬＣＦＲ４）に位置し、そして、重鎖のＦＲ残基は、重鎖残基内の残基１〜３０付近（ＨＣＦＲ１）、残基３６〜４９付近（ＨＣＦＲ２）、残基６６〜９４付近（ＨＣＦＲ３）および残基１０３〜１１３付近（ＨＣＦＲ４）に位置する。ＣＤＲが超可変ループからのアミノ酸残基を含む場合、軽鎖ＦＲ残基は、軽鎖内の残基１〜２５付近（ＬＣＦＲ１）、残基３３〜４９付近（ＬＣＦＲ２）、残基５３〜９０付近（ＬＣＦＲ３）および残基９７〜１０７付近（ＬＣＦＲ４）に位置し、そして、重鎖のＦＲ残基は、重鎖残基内の残基１〜２５付近（ＨＣＦＲ１）、残基３３〜５２付近（ＨＣＦＲ２）、残基５６〜９５付近（ＨＣＦＲ３）および残基１０２〜１１３付近（ＨＣＦＲ４）に位置する。いくつかの例では、ＣＤＲがＫａｂａｔに従って定義されるＣＤＲと超可変ループの両方からのアミノ酸を含む場合、ＦＲ残基はそれに従って調整される。例えば、ＣＤＲＨ１がアミノ酸Ｈ２６〜Ｈ３５を含む場合、重鎖のＦＲ１残基は１〜２５位にあり、ＦＲ２残基は３６〜４９位にある。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「コドンセット」とは、所望の改変体アミノ酸をコードするために使用される異なるヌクレオチドのトリプレット配列のセットをいう。オリゴヌクレオチドのセットは、例えば、固相合成によって合成され得、コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの全ての可能な組み合わせを表し、かつ、所望のアミノ酸グループをコードする配列を含む。コドンの呼称の標準的な形態は、ＩＵＢコードのものであり、これは、当該分野で公知であり、かつ本明細書中に記載される。コドンセットは、代表的に、３つの斜体の大文字で表される（例えば、
【００４３】
【数１】
0005745840.tif 000002
など）。したがって、「ランダムでないコドンセット」とは、本明細書中で使用される場合、本明細書中に記載されるアミノ酸選択のための基準を部分的、好ましくは完全に満たす選択されたアミノ酸をコードするコドンセットをいう。特定の位置に選択されたヌクレオチドの「縮重」を持つオリゴヌクレオチドの合成は当該分野で周知であり、例えば、ＴＲＩＭアプローチ（Ｋｎａｐｐｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６）；Ｇａｒｒａｒｄ  ＆  Ｈｅｎｎｅｒ（１９９３）Ｇｅｎｅ  １２８：１０３）がある。このような特定のコドンセットを持つオリゴヌクレオチドのセットは、市販の核酸合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能）を用いて合成され得るか、または、市販品を入手し得る（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから）。したがって、特定のコドンセットを持つ合成されたオリゴヌクレオチドのセットは代表的に、異なる配列を持つ複数のオリゴヌクレオチドを含み、その違いは、全体的な配列におけるコドンセットによって確立される。オリゴヌクレオチドは、本発明に従って使用される場合、可変ドメインの核酸鋳型に対するハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、そしてまた、例えば、クローニングの目的のために有用な制限酵素部位を含み得るが、必ずしも含んでいるわけではない。
【００４４】
「Ｆｖフラグメント」は、完全な抗原の認識および結合部位を含む抗体フラグメントである。この領域は、密接に関連した（これは、自然な状態では（例えば、ｓｃＦＶでは）共有結合であり得る）１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとの二量体から構成される。この構成では、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を規定する。まとめると、６つのＣＤＲまたはそのサブセットが、抗体に対する結合特異性を抗原に与える。しかし、単一の可変ドメイン（または、抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを有するＦｖの半分）でも、抗原を認識し、抗原に結合する能力を有するが、通常は、その親和性は全結合部位より低いものである。
【００４５】
「Ｆａｂ」フラグメントは、軽鎖の可変ドメインおよび定常ドメイン、ならびに、重鎖の可変ドメインおよび第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、一般に、間にあるヒンジ領域のシステインによって、そのカルボキシ末端付近で共有結合された一対のＦａｂフラグメントを含む。抗体フラグメントの他の化学カップリングもまた当該分野で公知である。
【００４６】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、ＦｖポリペプチドはさらにＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを含み、それにより、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することが可能となる。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌ  １１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。
【００４７】
用語「二価抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）」とは、２つの抗原結合部位を持つ小さな抗体フラグメントをいい、これらのフラグメントは、同じポリペプチド鎖内に、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨおよびＶＬ）。同じ鎖上の２つのドメイン間での対形成を可能にするには短か過ぎるリンカーを用いることで、これらのドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対形成して、２つの抗原結合部位を生成せざるを得ない。二価抗体は、例えば、ＥＰ  ４０４，０９７；ＷＯ  ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８においてより完全に記載される。
【００４８】
表現「線形抗体」とは、Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ，８（１０）：１０５７−１０６２）に記載される抗体をいう。簡単に述べると、これらの抗体は、相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒になって一対の抗原結合領域を形成する、一対の直列式に並んだＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線形抗体は、二重特異的または単特異的であり得る。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「ライブラリー」は、複数の抗体もしくは抗体フラグメントの配列（例えば、本発明のポリペプチド）、または、これらの配列をコードする核酸をいい、これらの配列は、本発明の方法に従ってこれらの配列に導入された改変体アミノ酸の組み合わせが異なる。
【００５０】
「ファージディスプレイ」は、改変体ポリペプチドが、ファージ（例えば、糸状ファージ、粒子）の表面上の被膜タンパク質の少なくとも一部に融合タンパク質としてディスプレイされる技術である。ファージディスプレイの有用性は、ランダム化されたタンパク質改変体の大規模なライブラリーが迅速かつ効率的に高い親和性で標的抗原に結合する配列について区分けされ得るという事実にある。ファージ上のペプチドおよびタンパク質ライブラリーのディスプレイは、特異的な結合特性を持つものについて、数百万のポリペプチドをスクリーニングするために使用される。多価ファージディスプレイ法は、糸状ファージの遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかへの融合を介して、小さくかつランダムなペプチドと小さなタンパク質をディスプレイするために使用される。ＷｅｌｌｓおよびＬｏｗｍａｎ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：３５５−３６２、この文献において引用される参考文献。多価ファージディスプレイでは、タンパク質またはペプチドのライブラリーは、遺伝子ＩＩＩまたはその一部に融合され、そして、野生型の遺伝子ＩＩＩタンパク質の存在下では低いレベルで発現され、その結果、ファージ粒子は、１コピーの融合タンパク質をディスプレイするか、または、融合タンパク質をディスプレイしない。アビディティ効果は、多価のファージと比較して低下しており、その結果、区分けは、固有のリガンド親和性に基づいて行われ、そして、ＤＮＡの取り扱いを単純にするファージミドベクターが使用される。ＬｏｗｍａｎおよびＷｅｌｌｓ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３：２０５−０２１６。
【００５１】
「ファージミド」は、細菌の複製起点（例えば、Ｃｏ１Ｅ１）と、１コピーのバクテリオファージ固有の領域とを有するプラスミドベクターである。ファージミドは、糸状バクテリオファージおよびラムダ状バクテリオファージを含むあらゆる既知のバクテリオファージ上で使用され得る。プラスミドはまた、一般に、抗生物質耐性についての選択マーカーを含む。これらのベクター内にクローニングされたＤＮＡのセグメントは、プラスミドとして増加させられ得る。これらのベクターを有する細胞に、ファージ粒子の生成に必須の全遺伝子が提供されると、プラスミドの複製様式は、プラスミドＤＮＡの１本鎖のコピーを生成し、そして、ファージ粒子をパッケージングする、ローリングサークル複製へと変化する。ファージミドは、感染性または非感染性のファージ粒子を形成し得る。この用語は、異種ポリペプチド遺伝子に連結されたファージの被膜タンパク質遺伝子またはそのフラグメントを、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面上にディスプレイされるような遺伝子融合物として含むファージミドを包含する。
【００５２】
用語「ファージベクター」は、異種遺伝子を含み、かつ複製が可能な二本鎖の複製可能な形態を意味する。ファージベクターは、ファージの複製とファージ粒子の形成を可能にするファージの複製起点を有する。ファージは、好ましくは、Ｍ１３ファージ、ｆ１ファージ、ｆｄファージ、Ｐｆ３ファージもしくはこれらの誘導体のような糸状バクテリオファージ、または、λ、２１、φ８０、φ８１、８２、４２４、４３４など、もしくはこれらの誘導体のようなラムダ状ファージである。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、「溶媒アクセス可能な位置」とは、抗体もしくは抗原結合フラグメントの構造、構造の集合体および／もしくは立体構造（ｍｏｄｅｌｅｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）に基づいて、溶媒アクセスおよび／もしくは分子（例えば、抗体特異的な抗原）との接触に潜在的に利用可能であるとして決定された、供給源となる抗体もしくは抗原結合フラグメントの重鎖および軽鎖の可変領域内のアミノ酸残基の位置をいう。これらの位置は代表的には、ＣＤＲ内およびタンパク質の外側に見い出される。抗体もしくは抗原結合フラグメントの溶媒アクセス可能な位置は、本明細書において定義される場合、当該分野で公知の多数のアルゴリズムのいずれかを用いて決定され得る。好ましくは、溶媒アクセス可能な位置は、抗体の３次元モデルからの座標を用いて、好ましくは、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩプログラム（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のようなコンピュータプログラムを用いて決定される。溶媒アクセス可能な位置はまた、当該分野で公知のアルゴリズムを用いても決定され得る（例えば、ＬｅｅおよびＲｉｃｈａｒｄｓ（１９７１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５，３７９ならびにＣｏｎｎｏｌｌｙ（１９８３）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．１６，５４８）。溶媒アクセス可能な位置の決定は、タンパク質モデリングおよび抗体から得られた３次元構造情報に適したソフトウェアを用いて行われ得る。これらの目的のために利用され得るソフトウェアとしては、ＳＹＢＹＬ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ｍｏｄｕｌｅソフトウェア（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）が挙げられる。一般に、そして、好ましくは、アルゴリズム（プログラム）がサイズパラメータのユーザによる入力を必要とする場合、計算に使用されるプローブの「サイズ」は、半径約１．４Å以下に設定される。さらに、パーソナルコンピュータのためのソフトウェエアを用いた溶媒アクセス可能な領域と面積の決定方法は、Ｐａｃｉｏｓ（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１８（４）：３７７−３８６によって記載されている。
【００５４】
「血管新生因子（ｆａｃｔｏｒ  ｏｒ  ａｇｅｎｔ）」は、血管の発生を刺激する、例えば、血管新生、内皮細胞増殖、血管の安定性および／または脈管形成などを促進する増殖因子である。例えば、血管新生因子としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：例えば、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦファミリーのメンバー、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦファミリー、線維芽細胞増殖因子ファミリー（ＦＧＦｓ）、ＴＩＥリガンド（アンギオポエチン）、エフリン、Ｄｅｌ−１、線維芽細胞増殖因子：酸性（ａＦＧＦ）および塩基性（ｂＦＧＦ）、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／分散因子（ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ）（ＳＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、レプチン、ミドカイン（Ｍｉｄｋｉｎｅ）、ニューロピリン、胎盤成長因子、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血小板由来増殖因子、特に、ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦＲ−β、プリオトロフィン（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）（ＰＴＮ）、プログラヌリン（Ｐｒｏｇｒａｎｕｌｉｎ）、プロリファリン（Ｐｒｏｌｉｆｅｒｉｎ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）など。また、成長ホルモン、インシュリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ＶＩＧＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＣＴＧＦおよびそのファミリーのメンバー、ならびに、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βのような創傷治癒を加速する因子も挙げられる。例えば、ＫｌａｇｓｂｒｕｎおよびＤ’Ａｍｏｒｅ（１９９１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５３：２１７−３９；ＳｔｒｅｉｔおよびＤｅｔｍａｒ（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：３１７２−３１７９；Ｆｅｒｒａｒａ  ＆  Ａｌｉｔａｌｏ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（１２）：１３５９−１３６４；Ｔｏｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：６５４９−６５５６（例えば、公知の血管新生因子を列挙する表１）；ならびにＳａｔｏ（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８：２００−２０６を参照のこと。
【００５５】
「抗血管新生因子」または「血管新生インヒビター」とは、血管新生、脈管形成または所望でない脈管透過性を直接的もしくは間接的のいずれかで阻害する、低分子量物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、単離されたタンパク質、組換えタンパク質、抗体またはこれらの結合体もしくは融合タンパク質をいう。抗血管新生因子が、血管新生因子またはそのレセプターに結合し、その血管新生活性をブロックする因子を含むことが理解されるはずである。例えば、抗血管新生因子は、上で定義したような血管新生因子に対する抗体もしくは他のアンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦ−ＡもしくはＶＥＧＦ−Ａレセプター（例えば、ＫＤＲレセプターもしくはＦｌｔ−１レセプター）に対する抗体、ＧｌｅｅｖｅｃＴＭ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ  Ｍｅｓｙｌａｔｅ）のような抗ＰＤＧＦＲインヒビターである。抗血管新生因子はまた、ネイティブな血管新生インヒビター（例えば、アンギオスタチン、エンドスタチンなど）も含む。例えば、ＫｌａｇｓｂｒｕｎおよびＤ’Ａｍｏｒｅ（１９９１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５３：２１７−３９；ＳｔｒｅｉｔおよびＤｅｔｍａｒ（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：３１７２−３１７９（例えば、悪性黒色腫における抗血管新生治療を列挙する表３）；Ｆｅｒｒａｒａ  ＆  Ａｌｉｔａｌｏ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（１２）：１３５９−１３６４；Ｔｏｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：６５４９−６５５６（例えば、公知の血管新生因子を列挙する表２）；ならびにＳａｔｏ（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８：２００−２０６（例えば、臨床治験において使用される抗血管新生因子を列挙する表１）を参照のこと。
【００５６】
用語「ＶＥＧＦ」または「ＶＥＧＦ−Ａ」は、本明細書中で使用される場合、その天然に存在する対立遺伝子形態およびプロセシングされた形態とまとめて、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１３０６およびＨｏｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ，５：１８０６に記載されるような、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子と関連の１２１アミノ酸、１８９アミノ酸および２０６アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子をいう。用語「ＶＥＧＦ」はまた、マウス、ラットもしくは霊長類のような非ヒト種由来のＶＥＧＦをいう。ときおり、特定の種由来のＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦについてはｈＶＥＧＦ、マウスＶＥＧＦについてはｍＶＥＧＦなどのような用語によって示される。用語「ＶＥＧＦ」はまた、１６５アミノ酸のヒト血管内皮増殖因子のアミノ酸８〜１０９または１〜１０９を含むポリペプチドの短縮型形態をいうためにも使用される。任意のこのような形態のＶＥＧＦに対する参照は、本願において、例えば、「ＶＥＧＦ（８−１０９）」、「ＶＥＧＦ（１−１０９）」または「ＶＥＧＦ１６５」によって同定され得る。「短縮型」のネイティブなＶＥＧＦについてのアミノ酸位置は、ネイティブなＶＥＧＦ配列において示されるとおりに番号付けされる。例えば、短縮型のネイティブなＶＥＧＦにおけるアミノ酸位置１７（メチオニン）はまた、ネイティブなＶＥＧＦにおいても位置１７（メチオニン）である。短縮型のネイティブなＶＥＧＦは、ネイティブなＶＥＧＦに匹敵するＫＤＲおよびＦｌｔ−１レセプターに対する結合親和性を有する。
【００５７】
「抗ＶＥＧＦ抗体」は、十分な親和性および特異性でＶＥＧＦに結合する抗体である。好ましくは、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が関与する疾患もしくは状態を標的とし、これらと干渉する際の治療剤として使用され得る。抗ＶＥＧＦ抗体は通常、ＶＥＧＦ−ＢまたはＶＥＧＦ−Ｃのような他のＶＥＧＦホモログにも、ＰＩＧＦ、ＰＤＧＦもしくはｂＦＧＦのような他の増殖因子にも結合しない。好ましい抗ＶＥＧＦ抗体は、ハイブリドーマＡＴＣＣ  ＨＢ  １０７０９によって産生されるモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である。より好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体は、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９に従って作製された組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体であり、ベバシツマブ（ＢＶ；ＡｖａｓｔｉｎＴＭ）として知られる抗体が挙げられるがこれに限定されない。
【００５８】
「ｒｈｕＭａｂ  ＶＥＧＦ」または「Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）」としても知られる抗ＶＥＧＦ抗体「ベバシツマブ（ＢＶ）」は、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９に従って作製された組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。この抗体は、変異を有するヒトＩｇＧ１フレームワーク領域と、ヒトＶＥＧＦのそのレセプターへの結合をブロックするマウス抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ４．６．１由来の抗原結合相補性決定領域とを含む。フレームワーク領域の大部分を含む、ベバシツマブのアミノ酸配列のおよそ９３％は、ヒトＩｇＧ１由来であり、配列の約７％がマウス抗体Ａ４．６．１由来である。ベバシツマブは、約１４９，０００ダルトンの分子量を有し、グリコシル化されている。
【００５９】
用語「ＶＥＧＦＣ」および「ＶＥＧＦ−Ｃ」は交換可能に使用され、そして、Ｊｏｕｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １５，２９０−９８（１９９６）およびＥＭＢＯ  Ｊ  １５，１７５１（１９９６）によって最初に書かれた、４１９アミノ酸のヒトポリペプチド（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ：ＶＥＧＦＣ＿ＨＵＭＡＮ  Ｐ４９７６７）およびその非ヒト哺乳動物オルソログをいう。
【００６０】
用語「Ｎｒｐ２アンタゴニスト」は、リンパ管内皮細胞（ＥＣ）遊走または成体リンパ管新生（特に、腫瘍性のリンパ管新生）および腫瘍転移を調整するＮｒｐ２の能力を中和、ブロック、抑制、阻害、低減もしくは干渉し得る分子をいうために本明細書において使用される。
【００６１】
「ＶＥＧＦアンタゴニスト」は、ＶＥＧＦ活性（１以上のＶＥＧＦレセプターへのその結合が挙げられるがこれに限定されない）を中和、ブロック、抑制、阻害、低減もしくは干渉し得る分子をいう。ＶＥＧＦアンタゴニストとしては、抗ＶＥＧＦ抗体およびその抗原結合フラグメント、ＶＥＧＦに対して特異的に結合し、それによって、その１以上のレセプターへの結合を封鎖するレセプター分子および誘導体、抗ＶＥＧＦレセプター抗体およびＶＥＧＦレセプターアンタゴニスト（例えば、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの低分子インヒビター）が挙げられるがこれらに限定されない。用語「ＶＥＧＦアンタゴニスト」は、本明細書中で使用される場合、特に、ニューロピリン−１および／またはニューロピリン−２（Ｎｒｐ−１および／またはＮｒｐ−２）に結合し、そして、ＶＥＧＦ活性を中和、ブロック、抑制、阻害、低減もしくは干渉し得る分子（抗体、抗体フラグメント、他の結合ポリペプチド、ペプチドおよび非ペプチド低分子を含む）を含み、これらとしては、抗Ｎｒｐ１抗体および抗Ｎｒｐ２抗体、ならびに、ＶＥＧＦ活性を中和、ブロック、抑制、阻害、低減もしくは干渉し得るという条件で、Ｎｒｐ１およびＮｒｐ２と交差反応する抗体が挙げられるがこれらに限定されない。したがって、用語「ＶＥＧＦ活性」は、具体的には、ニューロピリンにより媒介されるＶＥＧＦの生物学的活性（本明細書において上に定義されたようなもの）を含む。
【００６２】
「セマフォリンアンタゴニスト」は、セマフォリン活性（１以上のセマフォリンレセプターへのその結合が挙げられるがこれに限定されない）を中和、ブロック、抑制、阻害、低減もしくは干渉し得る分子をいう。セマフォリンアンタゴニストとしては、抗セマフォリン抗体およびその抗原結合フラグメント、セマフォリンに対して特異的に結合し、それによって、その１以上のレセプターへの結合を封鎖するレセプター分子および誘導体、抗セマフォリンレセプター抗体およびセマフォリンレセプターアンタゴニスト（例えば、セマフォリンの低分子インヒビター）が挙げられるがこれらに限定されない。用語「セマフォリンアンタゴニスト」は、本明細書中で使用される場合、特に、ニューロピリン−１および／またはニューロピリン−２（Ｎｒｐ−１および／またはＮｒｐ−２）に結合し、そして、セマフォリン活性を中和、ブロック、抑制、阻害、低減もしくは干渉し得る分子（抗体、抗体フラグメント、他の結合ポリペプチド、ペプチドおよび非ペプチド低分子を含む）を含み、これらとしては、抗Ｎｒｐ１抗体および抗Ｎｒｐ２抗体、ならびに、セマフォリン活性を中和、ブロック、抑制、阻害、低減もしくは干渉し得るという条件で、Ｎｒｐ１およびＮｒｐ２と交差反応する抗体が挙げられるがこれらに限定されない。したがって、用語「セマフォリン活性」は、具体的には、ニューロピリンにより媒介されるクラス３セマフォリンの生物学的活性（本明細書において上に定義されたようなもの）を含む。このような生物学的活性としては、例えば、胚の神経系発生およびニューロン再生中の神経成長抑制作用が挙げられる。
【００６３】
「処置」は、治療的な処置と、予防的な（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方をいう。処置を必要とする個体としては、既に障害を有する個体、ならびに、障害が予防されるであろう個体が挙げられる。
【００６４】
「障害」は、処置から利益を享受するあらゆる状態をいう。例えば、異常な血管新生（過剰、不適切もしくは制御できない血管新生）もしくは血管透過性に苦しんでいるか、または、これらに対する予防を必要とする哺乳動物。これには、哺乳動物を当該の障害に罹りやすくする病理学的状態を含む、慢性および急性の障害もしくは疾患が含まれる。本明細書において処置されるべき障害の非限定的な例としては、悪性および良性の腫瘍；非白血病性かつリンパ球性の悪性腫瘍；ならびに、特に、腫瘍（癌）の転移が挙げられる。
【００６５】
用語「癌」および「癌性」とは、代表的には制御できない細胞増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態をいうか、または記載する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病が挙げられるがこれらに限定されない。このような癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平癌腫を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｏｒ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）（消化管癌を含む）、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、頚部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫もしくは子宮癌腫、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｏｒ  ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肝臓癌、前立腺癌、外陰部の癌、甲状腺癌、肝性癌腫および種々の型の頭頚部癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（軽度悪性／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中等度悪性／濾胞性ＮＨＬ；中等度悪性びまん性ＮＨＬ；高度悪性免疫芽球性ＮＨＬ；高度悪性リンパ芽球性ＮＨＬ；高度悪性小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；毛様細胞性白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ球増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症に伴う腹部脈管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍に伴うもの）およびメイグス症候群が挙げられる。
【００６６】
用語「抗新生物形成組成物」とは、少なくとも１つの活性な治療剤（例えば、「抗癌剤」）を含む、癌の処置において有用な組成物をいう。治療剤（抗癌剤）の例としては、例えば、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害剤、放射線治療において使用される薬剤、抗血管新生剤、アポトーシス性因子（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、抗チューブリン因子、および、癌を処置するための他の因子、例えば、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＤ２０抗体、上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）アンタゴニスト（例えば、チロシンキナーゼインヒビター）、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲインヒビター（例えば、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）（ＴａｒｃｅｖａＴＭ））、血小板由来増殖因子インヒビター（例えば、ＧｌｅｅｖｅｃＴＭ（メシル酸イマチニブ））、ＣＯＸ−２インヒビター（例えば、セレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、以下の標的：ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−ｂｅｔａ、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡまたはＶＥＧＦレセプター、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２のうち１以上に結合するアンタゴニスト（例えば、中和抗体）、ならびに、他の生物活性因子、有機化学因子などが挙げられるがこれらに限定されない。これらの組み合わせもまた、本発明に包含される。
【００６７】
用語「細胞傷害剤」は、本明細書中で使用される場合、細胞の機能を阻害もしくは妨害し、そして／または、細胞の破壊を引き起こす物質をいう。この用語は、放射性同位体（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０およびＲｅ１８６）、化学療法剤、および、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素により活性となる毒素のような毒素またはそのフラグメントを包含することが意図される。
【００６８】
「化学療法剤」は、癌の処置に有用な化合物である。化学療法剤の例としては、癌の処置に有用な化合物が挙げられる。化学療法剤の例としては、以下が挙げられる：アルキル化剤（例えば、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド）；スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファン）；アジリジン（ａｚｉｒｉｄｉｎｅ）（例えば、ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン（ｃａｒｂｏｑｕｏｎｅ）、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；エチレンイミンおよびメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロロメラミンを含む）；アセトゲニン（ａｃｅｔｏｇｅｎｉｎ）（特に、ブラタシン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎ）およびブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ））；カムプトテシン（合成アナログであるトポテカンを含む）；ブリオスタチン（ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ）；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン（ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ）、カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）およびビゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）という合成アナログを含む）；クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎ）（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）；デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）（合成アナログであるＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリューセロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード）；ニトロソ尿素類（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ））；抗生物質（例えば、エンジイン（ｅｎｅｄｉｙｎｅ）抗生物質（例えば、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、特に、カリケアミシンγ１ＩおよびカリケアミシンωＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ（１９９４）Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：１８３−１８６を参照のこと））；ジネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）（ジネミシンＡを含む）；ビスホスホネート（例えば、クロドロネート（ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ））；エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）；ならびに、ネオカルジノスタチンクロモフォア（ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ  ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）および関連の色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア）、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏ���ｙｓｉｎ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンＣ）、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス（ｕｂｅｎｉｍｅｘ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）；代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸アナログ（例えば、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリンアナログ（例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニン）；ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン（ａｎｃｉｔａｂｉｎｅ）、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール（ｃａｒｍｏｆｕｒ）、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロクスウリジン）；アンドロゲン（例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール（ｅｐｉｔｉｏｓｔａｎｏｌ）、メピチオスタン（ｍｅｐｉｔｉｏｓｔａｎｅ）、テストラクトン）；抗アドレナリン作動薬（例えば、アミノグルテチミド、ミトーテン、トリロスタン）；葉酸補充物質（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）（例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ））；アセグラトン（ａｃｅｇｌａｔｏｎｅ）；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸（ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；エニルウラシル（ｅｎｉｌｕｒａｃｉｌ）；アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビザントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）；ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エポシロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕ���ｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン（ｌｅｎｔｉｎａｎ）；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）（例えば、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）およびアンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ））；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトザントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトレリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）；ロソザントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；シゾフィラン（ｓｉｚｏｆｉｒａｎ）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）；トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコセシン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａおよびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール（ｍｉｔｏｂｒｏｎｉｔｏｌ）；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド（ｔａｘｏｉｄ）（例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭパクリタキセルのクレモフォアフリーなアルブミン加工されたナノ粒子処方物（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ））；クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金アナログ（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；ミトザントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）；ノボアントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）；エダトレキセート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）；ダウノマイシン；アミノプレリン；キセロダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロネート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ−１１）（５−ＦＵおよびロイコボリンとイリノテカンによる処置レジメンを含む）；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド（例えば、レチノイン酸）；カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂ��ｎｅ）；コンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）（オキサリプラチン処置レジメン（ＦＯＬＦＯＸ）を含む）；細胞増殖を低下させるＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲのインヒビター（例えば、エルロチニブ（ＴａｒｃｅｖａＴＭ））およびＶＥＧＦ−Ａのインヒビター、ならびに、上記のいずれかの薬学的に受容可能な塩、酸もしくは誘導体。
【００６９】
また、この定義には、以下も含まれる：抗エストロゲン類および選択的エストロゲンレセプター調節因子（ＳＥＲＭ）のような腫瘍に対するホルモンの作用を調節もしくは阻害するように作用する抗ホルモン因子（例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）およびＦＡＲＥＳＴＯＮトレミフェンを含む）；副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素であるアロマターゼを阻害するアロマターゼインヒビター（例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、フォルメスタニー（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール（ｖｏｒｏｚｏｌｅ）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）ロトロゾール（ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）およびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）など）；および抗アンドロゲン類（例えば、フルタミド、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ロイプロリドおよびゴセレリン）；ならびに、トロキサシタビン（ｔｒｏｘａｃｉｔａｂｉｎｅ）（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシナナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路内の遺伝子（例えば、ＰＫＣ−α、ＲａｆおよびＨ−Ｒａｓ）の発現を阻害するもの；ＶＥＧＦ発現インヒビター（例えば、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）リボザイム）およびＨＥＲ２発現インヒビターのようなリボザイム；遺伝子治療ワクチンのようなワクチン（例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチンおよびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン）；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１インヒビター；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ビノレルビンおよびエスペラミシン（Ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）（米国特許第４，６７５，１８７号を参照のこと）、ならびに、上記のいずれかの薬学的に受容可能な塩、酸もしくは誘導体。
【００７０】
用語「プロドラッグ」は本願で使用される場合、腫瘍細胞に対する細胞傷害性が親薬物に比して低く、かつ、酵素的により活性な親形態へと活性化もしくは変換され得る、薬学的に活性な物質の前駆体もしくは誘導体形態をいう。例えば、Ｗｉｌｍａｎ（１９８６）「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１４，ｐｐ．３７５−３８２，６１５ｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ＢｅｌｆａｓｔおよびＳｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ，（ｅｄ．），ｐｐ．２４７−２６７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。本発明のプロドラッグとしては、ホスフェート含有プロドラッグ、チオリンホスフェート含有プロドラッグ、スルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、必要に応じて置換されたフェノキシアタミド含有プロドラッグもしくは必要に応じて置換されたフェニルアセタミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよびより活性な細胞傷害性のない薬物へと変換され得る他の５−フルオロウリジンプロドラッグが挙げられるがこれらに限定されない。本発明において使用するためのプロドラッグ形態へと誘導体化され得る細胞傷害性薬物の例としては、上述される化学療法剤が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７１】
「低分子」とは、本明細書において、約５００ダルトン未満の分子量を有するものと定義される。
【００７２】
「単離された」核酸分子は、抗体核酸の自然に存在する供給源において通常付随する少なくとも１つの汚染性核酸から同定および分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、自然に見い出される形態もしくは状態以外のものである。したがって、単離された核酸分子は、自然に存在する細胞内に存在する核酸分子とは区別される。しかしながら、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が自然に存在する細胞の染色体位置とは異なる染色体位置にある場合、通常抗体を発現する細胞中に含まれる核酸分子を包含する。
【００７３】
表現「コントロール配列」は、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発現に必須のＤＮＡ配列をいう。原核生物に適したコントロール配列としては、例えば、プロモーター、必要に応じて、オペレーター配列およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが公知である。
【００７４】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係で配置される場合、「作動可能に連結される」。例えば、プレ配列（ｐｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）または分泌リーダーについてのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドについてのＤＮＡに作動可能に連結される；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結される；または、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置決めされる場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結される」とは、連結されるＤＮＡ配列が連続しており、そして、分泌リーダーの場合には、連続しており、かつ、読み取り相（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続している必要はない。連結は、簡便な制限部位におけるライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、慣習にしたがって合成のオリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。
【００７５】
本明細書中で使用される場合、表現「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は交換可能に使用され、そして、全てのこのような呼称は子孫を含む。従って、語句「形質転換体」および「形質転換細胞」は、初代の被験体細胞と、転移の数に関係なく、そこから誘導した培養物とを包含する。また、全ての子孫は、計画的な変異もしくは故意でない変異に起因して、ＤＮＡ内容が正確に同一でない場合があることも理解される。元の形質転換細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫が含まれる。別の呼称が意図される場合は、文脈から明らかである。
【００７６】
（発明を実施するための形態）
一局面では、本発明は、Ｎｒｐ２機能のブロックが腫瘍転移を阻害することを示す実験データに基づく。
【００７７】
転移の多段階プロセスにおける重要な事象は、腫瘍細胞が原発性の腫瘍塊から離れて出て行くことを伴う。固形腫瘍については、リンパ系がしばしば、外れた細胞のための経路を提供する。ＶＥＧＦは、多くの腫瘍モデルにおけるリンパ管新生および転移の重要な調節因子であることが知られ、そして、ＶＥＧＦ軸索の阻害は、転移の発生を阻害するための有望な戦略と考えられる。本発明以前は、ＶＥＧＦＣの補レセプターであるＮｒｐ２は、おそらくは成体Ｎｒｐ２変異マウスにおいてリンパ系の欠陥がないことに起因して、腫瘍転移阻害のための標的とはみなされない。
【００７８】
以下の実施例に示される、本発明の根底にある研究は、非常に部分的にＶＥＧＦＲ３シグナル伝達を調節することによる、腫瘍のリンパ管新生および転移におけるＮｒｐ２の重要な役割を支持する。さらに、実施例に示されるデータは、腫瘍内の機能的リンパ管の存在を実証し、そして、抗Ｎｒｐ２Ｂでの処置がこれらの機能的リンパ管の減少をもたらすことを示している。
【００７９】
（Ｎｒｐ２は、部分的にＶＥＧＦレセプター活性化とは別の機構を介して、選択的なＶＥＧＦＣ機能を調節した）
細胞の遊走および増殖の誘導は、今日までに記載されているＶＥＧＦＣの中心的な細胞機能のうちの２つである（Ｊｏｕｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ  １６，３８９８−３９１１（１９９７））。したがって、抗Ｎｒｐ２ＢでＮｒｐ２をブロックすると、ＬＥＣの遊走はブロックしたが、増殖はブロックしなかった（図２、３）という本発明の知見は驚くべきものであった。この選択性は、Ｎｒｐ２  ｓｉＲＮＡノックダウン実験によって最近報告されているが、これは実験技術の限界によるものであった（Ｆａｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０８，１２４３−１２５０（２００６））。本明細書中に示されるデータは、Ｎｒｐ２の機能的な選択性はまたインビボでも認められ、抗Ｎｒｐ２Ｂ処理がＶＥＧＦＣ駆動性のリンパ管新生の低下をもたらしたが、血管透過性の低下はもたらさなかったことを示す（図２、３）。これらの観察は、抗Ｎｒｐ２Ｂでの阻害が、単純にＶＥＧＦＣシグナル伝達を中断させることによって機能するのではないことを示唆する。しかしながら、Ｎｒｐ２のブロッキングが実際にＶＥＧＦレセプターリン酸化における限られた低下をもたらすということが決定され（図３）、これは、Ｎｒｐ２の役割の１つがＶＥＧＦレセプター機能の増強であるという機構を支持している。このことは、異なるＶＥＧＦＣ誘導性の生理学的事象が異なるレベルのＶＥＧＦレセプター活性化を必要とし得るという可能性を高めた。したがって、レセプター活性の低下は、遊走に影響を与えるには十分であるが、増殖または血管透過性に影響を与えるには十分ではない場合がある。
【００８０】
これを調べるため、ＶＥＧＦレセプターリン酸化のＶＥＧＦＣ用量応答を、ＬＥＣ遊走の用量応答と比較した（図３）。抗Ｎｒｐ２Ｂ処理で見られるものと同等なレセプターリン酸化レベルをもたらすＶＥＧＦＣの用量は、遊走を低下も阻害もしなかった。このことは、レセプター活性の低下のみでは抗Ｎｒｐ２Ｂの作用をブロックする機能の説明とならないことを示した。
【００８１】
したがって、Ｎｒｐ２をブロックすることで選択的に遊走に影響を及ぼし得るような他の機構（例えば、接着もしくは移動の調節）を検討した。抗Ｎｒｐ２Ｂ処理は、ＶＥＧＦ１６５（図２）、ＨＧＦ（図３）またはＦＧＦ−２により誘導されるＬＥＣにより媒介される接着もしくは遊走に対し何の影響もなく、抗Ｎｒｐ２Ｂ処理は一般に、運動性を断つことによって遊走に影響を及ぼしているのではなかったことが示された。さらに、Ｎｒｐ２の別のリガンドであるｓｅｍａ３Ｆは、ＬＥＣまたはＥＣの遊走を調節し、化学嫌性物質（ｃｈｅｍｏｒｅｐｅｌｌａｎｔ）として作用し得ることが提唱されている（Ｂｉｅｌｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１４，１２６０−１２７１（２００４）；Ｆａｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０８，１２４３−１２５０（２００６））。しかしながら、抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体は、ｓｅｍａ３ＦのＮｒｐ２への結合（図１）も、応答性ニューロンに対するｓｅｍａ３Ｆの機能的影響（追加図４）も、阻害も助長もしなかった。したがって、抗Ｎｒｐ２ＢによるＶＥＧＦＣ誘導性の遊走の低下は、ｓｅｍａ３Ｆ機能の調節によっては説明できないようである。
【００８２】
Ｎｒｐ２／ＶＥＧＦレセプター複合体の形成に対する抗Ｎｒｐ２Ｂの作用もまた評価されている。Ｎｒｐ１とは対照的に、Ｎｒｐ２は、リガンドの非存在下で、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３と複合体を形成する（Ｆａｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，上掲；Ｋａｒｐａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆａｓｅｂ  Ｊ  ２０，１４６２−１４７２（２００６））。重要なことに、抗Ｎｒｐ２Ｂは、これらの複合体の形成を強力に阻害する。この観察は、Ｎｒｐ２がＶＥＧＦレセプター機能のほんの増強だけ以上に重要であるという事実に加えて、Ｎｒｐ２が遊走を特異的に調節するというさらなる機能を提供し、そして、ＶＥＧＦレセプター複合体にさらなる機構を移す可能性がある。
【００８３】
（Ｎｒｐ２は成体のリンパ管新生の調節において重要な役割を果たす）
Ｎｒｐ２  ＫＯマウスの解析は、Ｎｒｐ２が発生段階のリンパ管新生の調節因子であり、この調節はおそらくはそのＶＥＧＦＣ補レセプターとしての役割を介するものであることを実証している（Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，上掲）。しかしながら、これらの変異体マウスは生後機能的なリンパ管を形成し、欠陥がリンパ管成長の阻害ではなく遅延を示すのか、または、別の分子メディエーターによる機能の補償が存在しているかのいずれかであることを示している。したがって、成熟なリンパ管の維持および成体でのリンパ管新生におけるＮｒｐ２の役割は不明なままである。発現解析（図４）は、リンパ管の維持におけるＮｒｐ２の役割を支持しない。興味深いことに、Ｎｒｐ２は、腫瘍内および腫瘍に隣接するＬＮ内に存在するリンパ管において強く発現されており、Ｎｒｐ２がリンパ管の活性化もしくは成長において役割を担い得ることが示唆される。インビトロでの観察は、抗Ｎｒｐ２ＢがこれらのプロセスにおけるＮｒｐ２の役割の評価において有効なツールであることを実証している。したがって、抗Ｎｒｐ２Ｂを、角膜マイクロポケットアッセイを用いてインビボで試験した（図２）。抗Ｎｒｐ２Ｂは、驚くべきことに、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤと同等に、ＶＥＧＦＣ誘導性のリンパ管新生を効率的にブロックした。興味深いことに、抗Ｎｒｐ２Ｂは、インビボでも選択的な阻害機能を示し、ＶＥＧＦＣ誘導性の欠陥透過性に影響を及ぼさなかった。このことは、Ｎｒｐ２がリンパ管新生に重要なプロセスである遊走を特異的に調節するというインビトロでの観察と合致しているが、血管透過性においては役割は担っていないようである。最後に、これらの抗Ｎｒｐ２Ｂ処置された正常な成体動物は腸のリンパ管に対して何ら変化を示さず、Ｎｒｐ２が成熟なリンパ管の維持において役割を担っていないことが確認された。
【００８４】
（Ｎｒｐ２阻害は、−−おそらくは腫瘍細胞がリンパ管経路を介して中心的な腫瘍塊から離れることを阻害することによって、腫瘍内の機能的リンパ管の減少および転移の減少をもたらす）
最も頻繁にはＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤの使用によるＶＥＧＦＣ軸索の阻害は、転移を減少させるためのより一般に利用される戦略の一つである（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５．上掲；Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，上掲；Ｋｒｉｓｈｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，上掲；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，上掲）。ＶＥＧＦＣは、リンパ管新生を開始し、それによって、ＬＥＣと接触する表面積を増大させることによって、ＬＥＣの接着特性もしくはサイトカイン発現を調節することによって、または、血管透過性を増大させることによって、転移を促進する可能性があり得る（ＡｌｉｔａｌｏおよびＣａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １，２１９−２２７（２００２））。抗Ｎｒｐ２Ｂは、ＶＥＧＦＣ誘導性の成体におけるリンパ管新生の阻害を含む選択的なＶＥＧＦＣにより媒介される機能を調節するので、次に、転移に対するＮｒｐ２のブロックの影響が検討された。混乱させる変数を最小限にし、そして、転移に対する抗Ｎｒｐ２Ｂの役割を明白に評価するために、我々は、Ｎｒｐ２のブロックが原発性腫瘍の成長に影響を及ぼさないモデルを選択し、さらに、研究において、同じ時点で全ての動物から摘出した（ＷｉｔｈｅｒｓおよびＬｅｅ，Ｓｅｍｉｎ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  １６，１１１−１１９（２００６））。
【００８５】
６６ｃ１４腫瘍モデルならびにＣ６腫瘍モデルの両方において、抗Ｎｒｐ２Ｂ処置は、目視による転移性肺小結節の有意な減少をもたらした（図５、６）。これは、より高感度の定量的マイクロ−ＣＴによって確認された（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ５，１４７−１５５（２００６））。抗Ｎｒｐ２Ｂ処置とＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ処置との比較は、ＶＥＧＦＲ３処置での原発性腫瘍サイズの減少に起因して、６６ｃ１４腫瘍においては可能ではなかった。しかしながら、この解析は、その成長がＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ処置によって影響を受けなかったことから、Ｃ６腫瘍において行われた。角膜マイクロポケットアッセイを用いると、抗Ｎｒｐ２Ｂ処置は、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤと比較したとき、転移の同等なブロックをもたらした。
【００８６】
原発性腫瘍の組織学的解析は、我々が主として腫瘍細胞に影響を及ぼしていなかったことを示した。したがって、我々は、腫瘍細胞に対して利用可能であった２つの潜在的な転移経路である、血管とリンパ管とを評価した（図７）。抗Ｎｒｐ２Ｂでの処置は、血管の構造または密度に影響を及ぼさなかった。インビトロおよびインビボでの角膜マイクロポケットデータに基づくと、Ｎｒｐ２のブロックは、腫瘍リンパ管の減少をもたらすはずであると仮定された。抗Ｎｒｐ２Ｂ処置は、リンパ管の密度を劇的に減少させ、この場合もまた、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ処置と同じ程度までであった。しかしながらこれらの２つの処置は、結果として生じるリンパ管の形態が異なった。ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ処置は、不健康に見えるリンパ球が並んだ希薄なリンパ管ネットワークの形成をもたらした。他方で、抗Ｎｒｐ２Ｂ処置は、分離した健康に見えるリンパ球の短い管およびポケットの発生をもたらした。これらの差は、さらに、Ｎｒｐ２が単にＶＥＧＦレセプター活性化を増大させるように機能するだけでなく、また、ＶＥＧＦＣ生物学を媒介する独特の機能をもたらすようなモデルを支持する。これらの結果はまた、試験した実験パラダイムについて、抗Ｎｒｐ２Ｂがリンパ管新生を阻害するように機能することを実証する（図７）。しかしながら、抗Ｎｒｐ２Ｂがまた、腫瘍内のより確立されたリンパ管を崩壊させることは除外され得ない。
【００８７】
我々はまた、腫瘍内リンパ管が機能的であり、それゆえ、転移を容易にする能力があるかどうかを決定しようと試みた。リンパ管造影法を用いて、まばらな機能的腫瘍内リンパ管を同定した（図８）。使用した技術は、機能的な腫瘍内リンパ管の割合を決定するためには十分に分析的ではなかった。しかしながら、これらは、全リンパ管集団の小さな部分を表すようである（Ｐａｄｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  １，９−１５（２００２））。（抗Ｎｒｐ２Ｂに対して異なる感受性を有し得る）機能的血管を残しつつ全リンパ管密度を低下させることが可能だったので、我々は、機能的リンパ管の形成に対するＮｒｐ２のブロックの作用を評価した。抗Ｎｒｐ２Ｂは、機能的な脈管の形成を低下させ、それにより、より直接的に腫瘍リンパ管に対する作用を観察された転移の減少と結び付けた。
【００８８】
最後に、機能的なリンパ管を減少させる結果を確認するために、ＳＬＮへの転移に対する抗Ｎｒｐ２Ｂの作用を評価した。ＳＬＮは、リンパ管を介して腫瘍から出た後に腫瘍細胞が遭遇する最初の組織である。したがって、これは、遠位の器官への転移における最も早い段階のうちの一つを表す（ＳｔｒａｃｋｅおよびＬｉｏｔｔａ，Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ６，３０９−３１６（１９９２））。予測されたように、抗Ｎｒｐ２Ｂ処置は、ＳＬＮ微小転移の発生の遅延をもたらし、これは、より少ない細胞が原発性腫瘍塊から流出したという概念と一致していた。これは、ＶＥＧＦＣがリンパ管の過形成と、癌細胞のリンパ節への送達の増大とを誘導することによって転移を増加させるという証拠と一致している（Ｈｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６，８０６５−８０７５（２００６））。したがって、この証拠の重要性は、Ｎｒｐ２のブロックが機能的な腫瘍リンパ管の減少をもたらし、それによって、腫瘍細胞が原発性腫瘍塊から出ることで転移プロセスを開始することを防止する機構を示している。
【００８９】
（転移の標的としてのＮｒｐ２）
多数の臨床病理学研究が、ＶＥＧＦＣおよびＶＥＧＦＲ３の発現が多数のヒト癌におけるリンパ節転移および遠位への転移と相関していることが報告されている（Ｓｔａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，２００２，上掲；Ｓｔａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆａｓｅｂ  Ｊ，２００２，上掲およびＨｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，上掲において包括的に概説されている）。しかしながら、Ｎｒｐ２の発現とその転移との関係性に関しては限られた情報しかない。実際、結び付けは、特に膵臓癌（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２８４，３９５−４０３（２００１）；Ｆｕｋａｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０，５８１−５９０（２００４））および肺癌（Ｋａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ９５，２１９６−２２０１（２００２）；Ｌａｎｔｕｅｊｏｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００，３３６−３４７（２００３））における、Ｎｒｐ２の発現と悪性との間でしかなされていない。同様に、Ｎｒｐ２は、膵臓だけでなく、結腸腺癌、頭頚部扁平細胞癌腫、黒色腫、乳頭状甲状腺癌種および胸部の浸潤性管腺癌においてもまた、そのそれぞれのコントロール組織と比してより高いレベルで発現されることが見い出された（図９）。より重要なことには、これらの腫瘍を転移性の群と非転移性の群とに分けると、Ｎｒｐ２の発現は、これらの腫瘍型の多くで、転移性の群において統計的により高いことが認められた。興味深いことに、これらの腫瘍型では全て腫瘍内リンパ管新生が確認され、そしてこれはさらに、リンパ節転移と相関していた（Ａｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，上掲；ＡｃｈｅｎおよびＳｔａｃｋｅｒ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １１９，１７５５−１７６０（２００６））。このことは、考察される実験上の知見が種々の腫瘍型を有するヒト患者へと拡張することが期待されることを示している。
【００９０】
まとめると、本明細書中で考察され、以下の実施例に示されるデータは、Ｎｒｐ２がＶＥＧＦＣ駆動性の細胞遊走の調節において役割を担うことを示し、そして、Ｎｒｐ２が、ＶＥＧＦレセプター活性化の増強、およびＶＥＧＦレセプターのシグナル伝達とは無関係の機構を含む多数の機構を介して作用し得る証拠を提供する。さらに、抗Ｎｒｐ２Ｂを用いたＮｒｐ２機能のブロッキングは、成体マウスにおけるＶＥＧＦＣ誘導性のリンパ管新生の劇的な減少をもたらす。この処置はまた、おそらくは、機能的なリンパ管の発生の減少を介して、転移の減少をもたらす。これらのデータは、多数のヒト腫瘍におけるＮｒｐ２発現の解析と共に、Ｎｒｐ２が転移を調節するための有効な標的であることを示唆している。
【００９１】
（抗Ｎｒｐ２抗体の産生）
本明細書における発明は、抗ＮＲＰ２抗体の産生および使用を包含する。抗体を作製するための例示的な方法は、以下の節により詳細に記載される。
【００９２】
抗ＮＲＰ２抗体は、哺乳動物種由来のＮＲＰ２抗原を用いて選択される。好ましくは、抗原はヒトＮＲＰ２（ｈＮＲＰ２）である。しかしながら、マウスＮＲＰ２（ｍＮＲＰ２）のような他の種由来のＮＲＰ２もまた標的抗原として使用され得る。種々の哺乳動物種由来のＮＲＰ２抗原は、自然に存在する供給源から単離され得る。他の実施形態では、抗原は、組換えにより産生されるか、または、当該分野で公知の他の合成法を用いて作製される。
【００９３】
選択される抗体は通常、ＮＲＰ２抗原に対する十分強い結合親和性を有する。例えば、抗体は、約５ｎＭ以下、好ましくは約２ｎＭ以下、より好ましくは約５００ｐＭ以下のＫｄ値でｈＮＲＰ２と結合し得る。抗体親和性は、表面プラスモン共鳴ベースのアッセイ（例えば、実施例に記載されるようなＢＩＡｃｏｒｅアッセイ；酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）；および競合アッセイ（例えば、ＲＩＡ））によって決定され得る。
【００９４】
また、抗体は、例えば、その治療薬としての有効性を評価するために、他の生物学的活性のアッセイに供され得る。このようなアッセイは、当該分野で公知であり、標的抗原および抗体の意図される用途に依存する。例としては、ＨＵＶＥＣ阻害アッセイ（以下の実施例に記載されるようなもの）；腫瘍細胞成長阻害アッセイ（例えば、ＷＯ  ８９／０６６９２に記載されるようなもの）；抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体媒介性細胞傷害性（ＣＤＣ）アッセイ（米国特許第５，５００，３６２号）；およびアゴニスト活性もしくは造血アッセイ（ＷＯ  ９５／２７０６２を参照のこと）が挙げられる。
【００９５】
関心のある抗原上の特定のエピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されるもののような慣用的な交差ブロッキングアッセイが行われ得る。あるいは、抗体が関心のあるエピトープに結合するかどうかを決定するために、例えば、Ｃｈａｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４に記載されるようなエピトープマッピングが行われ得る。
【００９６】
（合成抗体ファージライブラリーからの抗ＮＲＰ２抗体の作製）
好ましい実施形態では、抗ＮＲＰ２抗体は、独特のファージディスプレイアプローチを用いて選択される。このアプローチは、単一のフレームワークテンプレートに基づいた合成抗体ファージライブラリーの作製、可変ドメイン内の十分な多様性の設計、多様化された可変ドメインを有するポリペプチドのディスプレイ、標的ＮＲＰ抗原に対して高い親和性を持つ候補抗体の選択、および選択した抗体の単離を伴う。
【００９７】
ファージディスプレイ法の詳細は、例えば、２００３年１２月１１日に公開されたＷＯ０３／１０２１５７に見い出され得る。
【００９８】
一局面では、抗体ライブラリーは、抗体可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲにおける溶媒アクセス可能な位置および／または高度に多様な位置を変異させることによって作製され得る。いくつかもしくは全てのＣＤＲが、本明細書中に提供される方法を用いて変異され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ１とＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３における位置を変異させて単一のライブラリーを形成させるか、または、ＣＤＲＬ３とＣＤＲＨ３における位置を変異させて単一のライブラリーを形成させるか、または、ＣＤＲＬ３とＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３における位置を変異させて単一のライブラリーを形成させることによって、多様な抗体ライブラリーを作製することが好ましくあり得る。
【００９９】
例えば、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の溶媒アクセス可能な位置および／または高度に多様な位置に変異を有する抗体の可変ドメインのライブラリーが作製され得る。ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３内に変異を有する別のライブラリーが作製され得る。これらのライブラリーはまた、所望の親和性の結合剤（ｂｉｎｄｅｒ）を生成するよう、互いに組み合わせて使用され得る。例えば、標的抗原への結合のための重鎖ライブラリーの１回以上のラウンドの後に、結合剤の親和性を増大させるためのさらなるラウンドの選択のために、重鎖結合剤の集団に、軽鎖ライブラリーが補充され得る。
【０１００】
好ましくは、ライブラリーは、重鎖配列の可変領域のＣＤＲＨ３領域において、元のアミノ酸を改変体アミノ酸で置換することによって作製される。得られたライブラリーは、複数の抗体配列を含み得、ここで、配列の多様性は、主として重鎖配列のＣＤＲＨ３にある。
【０１０１】
一局面では、ライブラリーは、ヒト化抗体４Ｄ５配列の状況において、または、ヒト化抗体４Ｄ５配列のフレームワークアミノ酸の配列の状況において作製される。好ましくは、ライブラリーは、重鎖の少なくとも残基９５〜１００ａの、ＤＶＫコドンセットによってコードされるアミノ酸での置換によって作製され、ここで、ＤＶＫコドンセットは、これらの位置の全てについての改変体アミノ酸のセットをコードするために使用される。これらの置換を作製するために有用なオリゴヌクレオチドセットの例は、配列（ＤＶＫ）７を含む。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、残基９５〜１００ａの、ＤＶＫコドンセットおよびＮＮＫコドンセットの両方によってコードされるアミノ酸での置換によって作製される。これらの置換を作製するために有用なオリゴヌクレオチドセットの例は、配列（ＤＶＫ）６（ＮＮＫ）を含む。別の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも残基９５〜１００ａの、ＤＶＫコドンセットおよびＮＮＫコドンセットの両方によってコードされるアミノ酸での置換によって作製される。これらの置換を作製するために有用なオリゴヌクレオチドセットの例は、配列（ＤＶＫ）５（ＮＮＫ）を含む。これらの置換を作製するために有用なオリゴヌクレオチドセットの別の例は、配列（ＮＮＫ）６を含む。適切なオリゴヌクレオチド配列の他の例は、本明細書中に記載される基準に従って、当業者によって決定され得る。
【０１０２】
別の実施形態では、高親和性の結合剤を単離するため、そして、種々のエピトープに対する結合剤を単離するために、異なるＣＤＲＨ３設計が利用される。このライブラリーにおいて作製されるＣＤＲＨ３の長さの範囲は、１１〜１３アミノ酸であるが、これとは異なる長さもまた作製され得る。Ｈ３の多様性は、ＮＮＫ、ＤＶＫおよびＮＶＫコドンセットを用いることにより、ならびに、Ｎおよび／またはＣ末端におけるより限定された多様性を用いることにより拡大され得る。
【０１０３】
多様性はまた、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２にも作製され得る。ＣＤＲ−Ｈ１およびＨ２の多様性の設計は、以前の設計よりも自然な多様性により密接にマッチする多様性に焦点を当てた修飾を用いて、記載されてきたような自然に存在する抗体レパートリーを模倣するようなターゲティング戦略に従う。
【０１０４】
ＣＤＲＨ３における多様性について、複数のライブラリーが異なる長さのＨ３を用いて別個に構築され得、次いで、標的抗原に対する結合剤を選択するために組み合され得る。複数のライブラリーがプールされ、そして、以前に記載され、かつ本明細書において以下に記載されるような、固体支持体選択および溶液選別法（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて選別され得る。複数の選別戦略が用いられ得る。例えば、１つのバリエーションは、固体上に結合した標的上での選別と、その後の、融合ポリペプチド上に存在し得るタグ（例えば、抗ｇＤタグ）についての選別と、その後の、固体上に結合した標的上での別の選別を伴う。あるいは、ライブラリーは、最初に固体表面に結合した標的上で選別され得、次いで、減少する濃度の標的抗原による液相結合を用いて溶出された結合剤が選別される。異なる選別法の組み合わせを利用することで、高度に発現された配列のみが選択されることを最小限にし、そして、多数の異なる高親和性クローンの選択を提供することになる。
【０１０５】
標的ＮＲＰ２抗原に対する高親和性結合剤が、ライブラリーから単離され得る。Ｈ１／Ｈ２領域における限られた多様性は、縮重を約１０４〜１０５倍低下させ、そして、より多くのＨ３の多様性がより高親和性の結合剤を提供することを可能にする。（例えば、ＤＶＫまたはＮＶＴを利用して）ＣＤＲＨ３内に異なる型の多様性を持つライブラリーを利用することで、標的抗原の異なるエピトープに結合し得る結合剤の単離が提供される。
【０１０６】
上記のようなプールされたライブラリーから単離された結合剤から、親和性が、軽鎖に限られた多様性を提供することによりさらに改善され得ることが発見された。軽鎖の多様性は、この実施形態では、以下のように作製される：ＣＤＲＬ１において：アミノ酸位置２８は、ＲＤＴによってコードされる；アミノ酸位置２９は、ＲＫＴによってコードされる；アミノ酸位置３０は、ＲＶＷによってコードされる；アミノ酸位置３１は、ＡＮＷによってコードされる；アミノ酸位置３２は、ＴＨＴによってコードされる；必要に応じて、アミノ酸位置３３は、ＣＴＧによってコードされる；ＣＤＲＬ２において：アミノ酸位置５０は、ＫＢＧによってコードされる；アミノ酸位置５３は、ＡＶＣによってコードされる；そして必要に応じて、アミノ酸位置５５は、ＧＭＡによってコードされる；ＣＤＲＬ３において：アミノ酸位置９１は、ＴＭＴもしくはＳＲＴまたはこの両方によってコードされる；アミノ酸位置９２は、ＤＭＣによってコードされる；アミノ酸位置９３は、ＲＶＴによってコードされる；アミノ酸位置９４は、ＮＨＴによってコードされる；そして、アミノ酸位置９６は、ＴＷＴもしくはＹＫＧまたはこの両方によってコードされる。
【０１０７】
別の実施得形態では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３領域に多様性を有するライブラリーが作製される。この実施形態では、ＣＤＲＨ３における多様性は、種々の長さのＨ３領域を用い、そして、主としてコドンセットＸＹＺとＮＮＫもしくはＮＮＳとを用いて作製される。ライブラリーは個々のオリゴヌクレオチドを用いて形成され、そして、プールされ得るか、または、ライブラリーのサブセットを形成するためにオリゴヌクレオチドがプールされ得る。この実施形態のライブラリーは、固体に結合した標的に対して選別され得る。複数の選別から単離されたクローンは、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて特異性および親和性についてスクリーニングされ得る。特異性については、クローンは、所望の標的抗原ならびに他の非標的抗原に対してスクリーニングされ得る。標的ＮＲＰ１抗原に対するこれらの結合剤は、その後、溶液結合競合ＥＬＩＳＡアッセイまたはスポット競合アッセイにおいて親和性についてスクリーニングされ得る。高親和性の結合剤は、上述のようにして調製されたＸＹＺコドンセットを利用してライブラリーから単離され得る。これらの結合剤は、細胞培養物において高い収率で抗体または抗原結合フラグメントとして容易に産生され得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ３領域の長さにより大きな多様性を持つライブラリーを作製することが望ましくあり得る。例えば、約７〜１９アミノ酸の範囲のＣＤＲＨ３領域を持つライブラリーを作製することが望ましくあり得る。
【０１０９】
これらの実施形態のライブラリーから単離された高親和性の結合剤は、細菌および真核生物細胞培養物において高い収率で容易に産生される。ベクターは、ｇＤタグ、ウイルス被膜タンパク質成分の配列のような配列を容易に除去し、そして／また、定常領域配列中に追加して、高い収率での全長抗体もしくは抗原結合フラグメントの産生を提供するように設計され得る。
【０１１０】
ＣＤＲＨ３に変異を持つライブラリーは、他のＣＤＲの改変体バージョン（例えば、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１および／またはＣＤＲＨ２）を含むライブラリーと組み合され得る。したがって、例えば、一実施形態では、ＣＤＲＨ３ライブラリーは、所定のコドンセットを用いてヒト化４Ｄ５抗体配列の状況において作製された位置２８、２９、３０、３１および／または３２に改変体アミノ酸を持つＣＤＲＬ３ライブラリーと組み合わされる。別の実施形態では、ＣＤＲＨ３への変異を持つライブラリーは、改変体ＣＤＲＨ１および／またはＣＤＲＨ２重鎖可変ドメインを含むライブラリーと組み合され得る。一実施形態では、ＣＤＲＨ１ライブラリーは、位置２８、３０、３１、３２および３３に改変体アミノ酸を持つヒト化抗体４Ｄ５配列を用いて作製される。ＣＤＲＨ２ライブラリーは、所定のコドンセットを用いて、位置５０、５２、５３、５４、５６および５８に改変体アミノ酸を持つヒト化抗体４Ｄ５の配列を用いて作製され得る。
【０１１１】
（抗ＮＲＰ２抗体変異体）
ファージライブラリーから作製された抗ＮＲＰ２抗体はさらに、親抗体を上回る改善された物理的特性、化学的特性および／または生物学的特性を持つ抗体変異体を作製するように改変され得る。使用されるアッセイが生物学的活性アッセイである場合、抗体変異体は好ましくは、選択したアッセイにおける親抗体の生物学的活性よりも、少なくとも約１０倍良好、好ましくは少なくとも約２０倍良好、より好ましくは少なくとも約５０倍良好、そしてときおり、少なくとも約１００倍もしくは２００倍良好なそのアッセイにおける生物学的活性を有する。例えば、抗ＮＲＰ１抗体変異体は好ましくは、親抗ＮＲＰ抗体の結合親和性よりも、少なくとも約１０倍強力、好ましくは少なくとも約２０倍強力、より好ましくは少なくとも約５０倍強力、そしてときおり、少なくとも約１００倍もしくは２００倍強力なＮＲＰに対する結合親和性を有する。
【０１１２】
抗体変異体を作製するために、１以上のアミノ酸変更（例えば、置換）が親抗体の１以上の超可変領域に導入される。あるいは、もしくは加えて、フレームワーク領域の残基の１以上の変更（例えば、置換）が、親抗体に導入され得、この場合、これにより、第二の哺乳動物種に由来する抗原に対する抗体変異体の結合親和性における改善がもたらされる。改変するためのフレームワーク領域の残基の例としては、抗原に対して直接的に非共有結合するもの（Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：７４７−７５３）；ＣＤＲの立体配座と相互作用／影響するもの（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）；および／または、ＶＬ−ＶＨ界面に関与するもの（ＥＰ  ２３９  ４００Ｂ１）が挙げられる。特定の実施形態では、１以上のこのようなフレームワーク領域の残基の改変は、第二の哺乳動物種に由来する抗原に対する抗体の結合親和性の増強をもたらす。例えば、本発明のこの実施形態では、約１〜約５のフレームワーク残基が変更され得る。ときおり、これは、超可変領域の残基がいずれも変更されていない場合でも、前臨床治験における使用に適した抗体変異体をもたらすのに十分であり得る。しかしながら、通常は、抗体変異体は、さらなる超可変領域の変更を含む。
【０１１３】
変更される超可変領域の残基はランダムに変更され得、これは特に、親抗体の最初の結合親和性がこのようにランダムに産生された抗体変異体が容易にスクリーニングされ得るようなものである場合になされる。
【０１１４】
このような抗体変異体を作製するための１つの有用な手順は、「アラニン走査変異誘発」（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）と呼ばれる。ここでは、第二の哺乳動物種に由来する抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を与えるために、１以上の超可変領域の残基がアラニンまたはポリアラニン残基で置き換えられる。置換に対して機能的な感受性を示すこれらの超可変領域の残基は、次いで、置換の部位にさらなる変異もしくは他の変異を導入することによって改良される。このように、アミノ酸配列のバリエーションを導入するための部位は予め決定されているものの、変異の性質事態は予め決定されている必要はない。この方法で生成されたａｌａ変異は、本明細書中に記載されるようなその生物学的活性についてスクリーニングされる。
【０１１５】
通常は、「好ましい置換」との見出しで以下に示されるもののような保存的置換から出発する。このような置換が生物学的活性（例えば、結合活性）の変化をもたらす場合、以下の表において「例示的な置換」と称され、また、アミノ酸の分類を参照して以下にさらに記載されるような、より本質的な変化が導入され、そして、生成物がスクリーニングされる。
【０１１６】
好ましい置換：
【０１１７】
【表１】
0005745840.tif 000003
抗体の生物学的特性においてなおより本質的な改変は、（ａ）置換の領域におけるポリペプチドバックボーンの構造（例えば、シートまたはヘリックスの立体配座）、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さ、を維持することに対するその影響が大いに異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通する側鎖の特性に基づいていくつかの群に分けられる：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性疎水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ａｓｎ、ｇｌｎ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の方位に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；そして
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０１１８】
非保存的置換は、これらの分類のうちの１つのメンバーを別の分類のものと交換することを含意する。
【０１１９】
別の実施形態では、改変のために選択される部位は、ファージディスプレイ（上記を参照のこと）を用いて親和性成熟される。
【０１２０】
アミノ酸配列変異をコードする核酸分子は、当該分野で公知の種々の方法によって調製される。これらの方法としては、オリゴヌクレオチド媒介性（または部位指向性）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、および、親抗体の前以って調製された変異もしくは非変異バージョンのカセット突然変異誘発が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい変異作製法は、部位指向性突然変異誘発（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８を参照のこと）である。
【０１２１】
特定の実施形態では、抗体変異体は、単一の超可変領域残基のみが置換されている。他の実施形態では、親抗体の超可変領域の２以上の残基が置換されている（例えば、約２〜約１０の超可変領域置換）。
【０１２２】
通常、改善された生物学的特性を持つ抗体変異体は、親抗体の重鎖もしくは軽鎖のいずれかの可変ドメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％の、より好ましくは少なくとも８０％の、より好ましくは少なくとも８５％の、より好ましくは少なくとも９０％の、そして最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性もしくは類似性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に関する同一性もしくは類似性は、本明細書において、必要な場合、配列をアラインメントしてギャップを導入して、最大の％配列同一性を達成した後の、候補配列中の、親抗体残基と同一（すなわち、同じ残基）または類似（すなわち、共通の側鎖特性に基づいて同じ群からのアミノ酸残基、上記を参照のこと）のアミノ酸残基の割合として定義される。Ｎ末端、Ｃ末端、または、可変ドメインの外側の抗体配列への内部伸長、欠失もしくは挿入は、配列の同一性もしくは類似性に影響を及ぼすものと考えられない。
【０１２３】
抗体変異体を生成した後、その分子の生物学的活性が親抗体と比して決定される。上述のように、これは、抗体の結合親和性および／または他の生物学的活性の決定を包含し得る。本発明の好ましい実施形態では、抗体変異体のパネルが調製され、そして、ＮＲＰ１のような抗原またはそのフラグメントに対する結合親和性についてスクリーニングされる。この最初のスクリーニングから選択された１以上の抗体変異体は、必要に応じて、増強された結合親和性を持つその抗体変異体が例えば前臨床研究に実際に有用であることを確認するために、１以上のさらなる生物学的活性のアッセイに供される。
【０１２４】
こうして選択された抗体変異体は、しばしば抗体の意図される用途に依存して、さらなる改変に供され得る。このような改変は、以下に詳述されるもののような、アミノ酸配列のさらなる変更、異種ポリペプチドへの融合、および／または、共有結合性の改変（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を包含し得る。アミノ酸配列の変更に関して、例示的な改変は上で詳述される。例えば、抗体変異体の適切な立体配座の維持に関与していない任意のシステイン残基はまた、分子の酸化的安定性を高め、そして、異常な架橋を防ぐために、一般にセリンで置換され得る。逆に、その安定性を高めるためにシステイン結合が追加され得る（特に、抗体がＦｖフラグメントのような抗体フラグメントである場合）。別の型のアミノ酸変異体は、変更されたグリコシル化パターンを有する。これは、抗体において見い出される１以上の炭化水素部分を欠失させ、そして／または、抗体中には存在しない１以上のグリコシル化部位を付加させることによって達成され得る。抗体のグリコシル化は、代表的には、Ｎ連結またはＯ連結のいずれかである。Ｎ連結とは、アスパラギン残基の側鎖への炭化水素部分の結合をいう。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭化水素部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を生じる。Ｏ連結グリコシル化とは、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースもしくはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸（最も一般には、セリンまたはスレオニン）への結合をいうが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた使用され得る。（Ｎ連結グリコシル化部位について）抗体へのグリコシル化部位の付加は、１以上の上記トリペプチド配列を含むようにアミノ酸配列を変更することによって簡便に達成される。（Ｏ連結グリコシル化部位について）変更はまた、元の抗体の配列に対して、１以上のセリンもしくはスレオニン残基を付加もしくは置換することによってなされ得る。
【０１２５】
（ベクター、宿主細胞および組換え法）
本発明の抗Ｎｒｐ２抗体は、容易に入手可能な技術および物質を用いて、組換え的に生成され得る。
【０１２６】
抗ＮＲＰ２抗体の組換え生成のために、これをコードする核酸は、単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために、複製可能なベクターへと挿入される。抗体をコードするＤＮＡは、簡便な手順を用いて（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡに特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、容易に単離もしくは合成される。多くのベクターが利用可能である。ベクターの成分は一般に、以下のうちの１以上を含むがこれらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列。
【０１２７】
（ｉ）シグナル配列成分
本発明の抗体は、直接的に組換えによって生成され得るだけでなく、異種ポリペプチド（好ましくは、成熟なタンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位を持つシグナル配列もしくは他のポリペプチド）と融合ポリペプチドとしても生成され得る。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞よって認識およびプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。ネイティブな抗体シグナル配列を認識もプロセシングもしない原核生物宿主細胞については、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物のシグナル配列で置き換えられる。酵母分泌物については、ネイティブなシグナル配列は、例えば、酵母インバーターゼリーダー、α因子リーダー（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓのα因子リーダーを含む）、もしくは、酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのグルコアミラーゼリーダー、または、ＷＯ  ９０／１３６４６に記載されるシグナルによって置き換えられ得る。哺乳動物細胞での発現では、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー（例えば、単純疱疹ウイルスｇＤシグナル）が利用可能である。
【０１２８】
このような前駆体領域についてのＤＮＡは、抗体をコードするＤＮＡに対して読み枠フレームで連結される。
【０１２９】
（ｉｉ）複製起点成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは共に、１以上の選択した宿主細胞におけるベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいては、この配列は、宿主の染色体ＤＮＡとは独立したベクターの複製を可能にするものであり、複製起点または自律複製配列が挙げられる。このような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、多くのグラム陰性細菌に適しており、２μプラスミドの起点は酵母に適しており、そして、種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターには必要とされない（代表的に、ＳＶ４０起点は初期プロモーターを含んでいるという理由だけで使用され得る）。
【０１３０】
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含み得る。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートもしくはテトラサイクリン）に対する耐性を与えるか、（ｂ）栄養要求性欠陥を補完するか、または（ｃ）複合培地からは利用可能でない重要な栄養分（例えば、Ｂａｃｉｌｌｉについて、Ｄ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）を供給するタンパク質をコードする。
【０１３１】
選択スキームの一例は、宿主細胞の増殖を停止するために薬物を利用する。異種遺伝子で首尾よく形質転換された細胞は、薬物耐性を与えるタンパク質を生成し、したがって、選択レジメンを生き残る。このような優勢選択の例は、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸およびハイグロマイシンを使用する。
【０１３２】
哺乳動物細胞についての適切な選択マーカーの別の例は、抗体の核酸の取得能力のある細胞を同定することを可能にするもの（例えば、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩ（好ましくは霊長類のメタロチオネイン遺伝子）、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなど）である。
【０１３３】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、まず、ＤＨＦＲの競合アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含む培養培地中で全ての形質転換体を培養することによって同定される。野生型ＤＨＦＲが用いられる場合、適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。
【０１３４】
あるいは、抗体、抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質および別の選択マーカー（例えば、アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ））で形質転換もしくは同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性のＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、アミノグリコシド系抗生物質（例えば、カナマイシン、ネオマイシンまたはＧ４１８）のような選択マーカーについての選択因子を含む培地中で細胞を成長させることによって選択され得る。米国特許第４，９６５，１９９号を参照のこと。
【０１３５】
酵母において使用するための適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：３９）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の変異株、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１についての選択マーカーを提供する。Ｊｏｎｅｓ（１９７７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５：１２。酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１病巣の存在は、次に、トリプトファンの非存在下で成長させることによる形質転換体を検出するための効率的な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ  ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する公知のプラスミドによって補完される。
【０１３６】
さらに、１．６μｍ環状プラスミドｐＫＤ１由来のベクターが、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ酵母の形質転換に使用され得る。あるいは、Ｋ．ｌａｃｔｉｓについて、組換えウシキモシンの大規模産生のための発現系が報告された。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：１３５。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの産業株による成熟な組換えヒト血清アルブミンの分泌に適したマルチコピー発現ベクターもまた開示されている。Ｆｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９６８−９７５。
【０１３７】
（ｉｖ）プロモーター成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは通常、宿主生物によって認識され、そして抗体の核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。原核生物宿主と共に使用するのに適したプロモーターとしては、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系およびｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかしながら、他の公知の細菌性プロモーターも適している。細菌系において使用するためのプロモーターはまた、抗体をコードするＤＮＡに対して作動可能に連結されたＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。
【０１３８】
真核生物についてのプロモーター配列は公知である。実質的に全ての真核生物遺伝子が、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチな領域を有する。多くの遺伝子の転写開始部位から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、ここで、Ｎはあらゆるヌクレオチドであり得る。多くの真核生物遺伝子の３’末端には、ＡＡＴＡＡＡ配列があり、これは、コード配列の３’末端にポリＡテイルを付加するためのシグナルであり得る。これらの配列は全て、真核生物発現ベクター内に適切に挿入される。
【０１３９】
酵母宿主と共に使用するための適切なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホ−フルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼ）についてのプロモーターが挙げられる。
【０１４０】
成長条件によって制御される転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、マルトースとガラクトースの利用を担う酵素についてのプロモーター領域である。酵母での発現において使用するために適したベクターおよびプロモーターは、ＥＰ  ７３，６５７においてさらに記載される。酵母エンハンサーもまた、酵母プロモーターと共に有益に使用される。
【０１４１】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗体の転写は、例えば、ウイルス（例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、そして、最も好ましくは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０））のゲノムから得たプロモーターによって、異種の哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター）から、ヒートショックプロモーターから制御されるが、ただし、このようなプロモーターは、宿主細胞系と適合性であるものとする。
【０１４２】
ＳＶ４０ウイルスの初期および後期のプロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点もまた含むＳＶ４０制限フラグメントとして簡便に入手される。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして簡便に入手される。ベクターとしてウシパピローマウイルスを用いる哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現させるための系が、米国特許第４，４１９，４４６号に開示される。この系の改変が、米国特許第４，６０１，９７８号に記載される。単純疱疹ウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関しては、Ｒｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８−６０１もまた参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復がプロモーターとして使用され得る。
【０１４３】
（ｖ）エンハンサーエレメント成分
本発明の抗体をコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、しばしば、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増大される。哺乳動物遺伝子（グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインシュリン）に由来する多くのエンハンサー配列が現在公知である。しかしながら、代表的には、真核生物細胞であるウイルスに由来するエンハンサーを使用する。例としては、複製起点の後期側（ｂｐ１００〜２７０）にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターのエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマのエンハンサーおよびアデノウイルスのエンハンサーが挙げられる。真核生物プロモーターの活性化のための増強エレメントに関しては、Ｙａｎｉｖ（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体をコードする配列に対して５’または３’の位置で、ベクターに接合され得るが、好ましくは、プロモーターの５’側の部位に位置する。
【０１４４】
（ｖｉ）転写終結成分
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または、他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、一般に、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’（ときおり３’）の非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分に、ポリアデニル化されたフラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６およびこの文献に開示される発現ベクターを参照のこと。
【０１４５】
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択および形質転換
本明細書中のベクターにおいてＤＮＡをクローニングまたは発現させるために適切な宿主細胞は、上述した、原核生物、酵母またはより高級な真核生物の細胞である。この手順のために適した原核生物としては、以下が挙げられる：グラム陰性生物もしくはグラム陽性生物のような真正細菌（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）およびＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢａｃｉｌｌｉ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ  ２６６，７１０に開示されるＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ４１Ｐ））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ。１つの好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）であるが、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）のような他の株も適切である。これらの例は、限定的なものではなく、例示的なものである。
【０１４６】
原核生物に加え、糸状菌または酵母のような真核生物微生物が、抗体をコードするベクターについての適切なクローニングもしくは発現の宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは一般的なパン酵母は、低級の真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用されるものである。しかしながら、以下のような多数の他の属、種および系統が市販されており、本明細書において有用である：Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓおよびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ  ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ  １８３，０７０）のようなＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ  ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓのようなＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ；例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍのような糸状菌、ならびに、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ．ｎｉｇｅｒのようなＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主。
【０１４７】
グリコシル化された抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物由来のものである。無脊椎細胞の例としては、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株および改変体、ならびに、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（イモムシ）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ミバエ）およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉのような宿主由来の対応する許容性の昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株が公的に入手可能であり（例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１改変体およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株）、そして、このようなウイルスは、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、本発明に従って本明細書中のウイルスとして使用され得る。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物もまた宿主として利用され得る。
【０１４８】
しかしながら、最大の関心は脊椎動物細胞にあり、そして、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は慣用的な手順となってきている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３細胞、または、懸濁培養において成長させるためにサブクローニングされた２９３細胞，Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）；新生仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ（１９８０）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１）；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頚部癌腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏ  ｒａｔ）肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス胸部腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８）；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒトヘパトーム株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０１４９】
宿主細胞は、抗体生成のために上述のような発現ベクターもしくはクローニングベクターで形質転換され、そして、プロモーター、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、または、所望の配列をコードする遺伝子を増幅させるために適切なように改変された簡便な栄養培地中で培養される。
【０１５０】
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を生成するために使用される宿主細胞は、種々の培地中で培養され得る。宿主細胞の培養には、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、基礎培地（Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）（（ＭＥＭ），（Ｓｉｇｍａ））、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコの改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）のような市販の培地が適している。さらに、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；もしくは同第５，１２２，４６９号；ＷＯ  ９０／０３４３０；ＷＯ  ８７／００１９５；または米国再発行特許第３０，９８５号に記載される培地のいずれかが、宿主細胞の培養培地として使用され得る。これらの培地はいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび／もしくは他の成長因子（例えば、インシュリン、トランスフェリンまたは上皮増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸）、緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮＴＭ薬物）、微量元素（通常はμＭ範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）およびグルコースまたは等価なエネルギー源を補充され得る。当業者に公知の任意の他の必要な補充物もまた適切な濃度で含められ得る。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞と共に以前から使用されているものであり、そして、当業者にとり明らかである。
【０１５１】
（ｉｘ）抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は、ペリプラズム空間において細胞内で生成され得るか、または、培地中に直接分泌され得る。抗体が細胞内で生成される場合、第一の工程として、宿主細胞または溶解されたフラグメントのいずれかの粒子状破片が、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７は、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間に分泌される抗体を単離するための手順を記載している。簡単に述べると、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分かけて細胞のペーストを解凍させる。細胞破片は遠心分離により除去され得る。抗体が培地中に分泌される場合、一般に、このような発現系からの上清は、まず、市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ製の限外濾過ユニット）を用いて濃縮される。タンパク質分解を阻害するため、ＰＭＳＦのようなプロテアーゼインヒビターが上記工程のいずれかにおいて含められ得、そして、外来の汚染物の成長を防止するため、抗生物質が含められ得る。
【０１５２】
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製され得るが、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの適切さは、抗体中に存在するあらゆる免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用され得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプとヒトγ３について推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５）。アフィニティリガンドが結合されるマトリクスは、最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリクスも利用可能である。制御されたポアを持つガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定なマトリクスは、アガロースを用いた場合に達成され得るよりも速い流速とより短い処理時間とを可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が精製に有用である。イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ上でのクロマトグラフィー、陰イオンもしくは陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）上でのクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈降のようなタンパク質精製のための他の技術もまた、回収される抗体に依存して利用可能である。
【０１５３】
任意の予備的な精製工程に続いて、目的の抗体と汚染物とを含む混合物は、約２．５〜４．５の間のｐＨの溶出緩衝液を用いて、好ましくは、低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で行われる、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供され得る。
【０１５４】
（薬学的処方物）
抗体の治療用処方物は、凍結乾燥された処方物もしくは水溶液の形態で、所望の程度の純度を持つ抗体を、任意の生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤もしくは安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって、保存のために調製される。受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、用いられる投与量および濃度においてレシピエントに対して無毒であり、そして、以下のようなものが挙げられる：緩衝剤（例えば、リン酸、クエン酸および他の有機酸）；抗酸化物質（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン類（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノールおよびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン）；単糖類、二糖類および他の糖質（グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む）；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖類（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））。
【０１５５】
本明細書中の処方物はまた、処置される特定の適応症に必要とされる１以上の活性な化合物、好ましくは、互いに有害に影響しない相補的な活性を持つ化合物を含み得る。例えば、免疫抑制剤、抗癌剤、抗血管新生因子、抗新生物形成因子、細胞傷害剤および／または化学療法剤をさらに提供することが望ましくあり得る。このような分子は、意図される目的に有効な量で適切に組み合わされて存在する。
【０１５６】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル中に被包され得る（例えば、それぞれ、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）または高分子エマルジョン中の、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示される。
【０１５７】
インビボ投与のために使用される処方物は、滅菌状態でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。
【０１５８】
持続放出調製物が調製され得る。持続放出調製物の適切な例としては、抗体を含有する固形の疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは、成形物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。持続放出マトリクスの例としては、以下が挙げられる：ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射用のマイクロスフェア））、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸）。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日を超えて分子を放出することが可能であるが、特定のヒドロゲルは、より短い期間にわたってタンパク質を放出する。被包された抗体が長時間にわたり体内に留まる場合、これらは、３７℃における湿気に対する曝露の結果として変性または凝集し得、生物学的活性の喪失と、免疫原性の変化の可能性とを生じる。関与する機構に依存して、安定化のための合理的な戦略が案出され得る。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を介した分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが見い出される場合、安定化は、スルフヒドリル残基を改変し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含量を制御し、適切な添加物を用い、そして、特定のポリマーマトリクス組成を開発することによって達成され得る。
【０１５９】
（治療用途）
本発明の抗体は、哺乳動物を処置するために使用され得ることが企図される。例えば、一実施形態では、抗体は、臨床データを得る目的のために非ヒト哺乳動物に投与される。処置される例示的な非ヒト哺乳動物としては、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類、および、臨床研究が行われる他の哺乳動物が挙げられる。このような哺乳動物は、抗体で処置されるべき疾患についての確立された動物モデルであり得るか、または、関心のある抗体の毒性を研究するために使用され得る。これらに実施形態の各々において、用量増大研究が哺乳動物において行われ得る。例えば、抗体が抗ＮＲＰ２抗体である場合、抗体は、固形腫瘍モデルにおける宿主のげっ歯類に対して投与され得る。
【０１６０】
さらに、または代替として、抗体は、ヒト（例えば、その抗体の投与から利益を享受し得る疾患または障害を罹患する患者）を処置するために使用される。
【０１６１】
本発明は、腫瘍性のリンパ管新生の予防および処置、腫瘍転移の予防および処置、ならびに、栄養分を供給して腫瘍成長を支援するために必要とされる腫瘍血管の発生を阻害することをねらいとした新規癌処置戦略である抗血管新生癌治療を包含する。本発明は、具体的には、原発性部位における腫瘍の悪性成長を阻害すること、ならびに、二次的な部位における腫瘍の転移の予防および／または処置し、したがって、他の治療による腫瘍の攻撃を可能にすることを包含する。本明細書において処置（予防を含む）される癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病が挙げられるがこれらに限定されない。このような癌のより具体的な例としては、以下が挙げられる：扁平上皮癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平癌腫を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｏｒ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）（消化管癌を含む）、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、頚部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫もしくは子宮癌腫、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｏｒ  ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肝臓癌、前立腺癌、外陰部の癌、甲状腺癌、肝性癌腫および種々の型の頭頚部癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（軽度悪性／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中等度悪性／濾胞性ＮＨＬ；中等度悪性びまん性ＮＨＬ；高度悪性免疫芽球性ＮＨＬ；高度悪性リンパ芽球性ＮＨＬ；高度悪性小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；毛様細胞性白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ球増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症に伴う腹部脈管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍に伴う浮腫）、およびメイグス症候群。より具体的には、本発明の抗体による処置になじみやすい癌としては、乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、軟部組織肉腫、カポジ肉腫、類癌腫、頭頚部癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、および多発性骨髄腫が挙げられる。
【０１６２】
腫瘍のような種々の疾患を処置するために使用される場合、本発明の抗体は、同じかもしくは同様の疾患に適した他の治療剤と組み合され得ることが企図される。癌を処置するために使用される場合、本発明の抗体は、従来の癌治療（例えば、外科手術、放射線療法、化学療法またはこれらの組み合わせ）と組み合わせて使用され得る。
【０１６３】
特定の局面では、本発明の抗体と組み合わせた癌治療に有用な他の治療剤としては、他の抗血管新生因子が挙げられる。多くの抗血管新生因子が同定されており、そして、ＣａｒｍｅｌｉｅｔおよびＪａｉｎ（２０００）によって列挙されたものを含め、当該分野において公知である。
【０１６４】
一局面では、本発明の抗体は、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ改変体、可溶性ＶＥＧＦレセプターフラグメント、ＶＥＧＦもしくはＶＥＧＦＲをブロッキングし得るアプタマー、抗ＶＥＧＦＲ中和抗体、ＶＥＦＲチロシンキナーゼのインヒビターおよびこれらの任意の組み合わせのようなＶＥＧＦアンタゴニストもしくはＶＥＧＦレセプターアンタゴニストと組み合わせて使用される。あるいは、もしくは加えて、２以上の抗ＮＲＰ１抗体が患者に対して同時に投与され得る。より好ましい実施形態では、本発明の抗ＮＲＰ１Ａ抗体または抗ＮＲＰＢ抗体は、相加もしくは相乗作用を生じるよう抗ＶＥＧＦ抗体と組み合わせて使用される。好ましい抗ＶＥＧＦ抗体としては、抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１のような同じエピトープに結合するものが挙げられる。より好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体は、ベバシツマブまたはラニビツマブ（ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）である。
【０１６５】
いくつかの局面では、本発明の抗体と組み合わせた腫瘍治療に有用な他の治療剤としては、腫瘍の成長に関与する他の因子（例えば、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２としても公知）、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４またはＴＮＦ）のアンタゴニストが挙げられる。好ましくは、本発明の抗ＮＲＰ１抗体は、ＶＥＧＦレセプター、ＦＧＦレセプター０、ＥＧＦレセプターおよびＰＤＧＦレセプターのような１以上のチロシンキナーゼレセプターを標的とする、低分子レセプターチロシンキナーゼインヒビター（ＲＴＫＩ）と組み合わせて使用され得る。多くの治療用低分子ＲＴＩＫＩが当該分野で公知であり、以下が挙げられるがこれらに限定されない：バタラニブ（ｖａｔａｌａｎｉｂ）（ＰＴＫ７８７）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ＯＳＩ−７９０４、ＺＤ６４７４（ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標））、ＺＤ６１２６（ＡＮＧ４５３）、ＺＤ１８３９、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、セマキサニブ（ｓｅｍａｘａｎｉｂ）（ＳＵ５４１６）、ＡＭＧ７０６、ＡＧ０１３７３６、イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））、ＭＬＮ−５１８、ＣＥＰ−７０１、ＰＫＣ−４１２、ラパチニブ（Ｌａｐａｔｉｎｉｂ）（ＧＳＫ５７２０１６）、ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、ＡＺＤ２１７１、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、ＸＬ８８０およびＣＨＩＲ−２６５。
【０１６６】
本発明の抗Ｎｒｐ抗体は、単独または第二の治療因子（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）との組み合わせのいずれでも、さらに、１以上の化学療法剤と組み合わせて使用され得る。種々の化学療法剤が本発明の組み合わせ治療法において使用され得る。企図される化学療法剤の例示的かつ非限定的なリストは、本明細書における「定義」のもとに提供される。抗Ｎｒｐ抗体が第二の治療因子と同時に投与される場合、第二の治療因子が最初に投与され、その後に抗Ｎｒｐ抗体が投与され得る。しかしながら、抗Ｎｒｐ抗体の同時投与または抗Ｎｒｐ抗体を先に投与することもまた企図される。第二の治療因子についての適切な投薬量は、以前から使用されてきたものであり、そして、この因子および抗Ｎｒｐ抗体の組み合わせ作用（相乗作用）に起因して減じられ得る。
【０１６７】
疾患の予防または処置について、抗体の適切な投薬量は、処置される疾患の型、疾患の重篤度および経過、抗体が予防目的で投与されるか、治療目的で投与されるか、以前の治療、患者の臨床上の病歴および抗体に対する応答性、ならびに、主治医の裁量に依存する。抗体は、一度に、または、一連の処置の間中、適切に投与される。
【０１６８】
疾患の型および重篤度に依存して、例えば、１以上の別々の投与によるものであれ、連続注入によるものであれ、約１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が患者への投与のための最初の候補投薬量である。代表的な一日の投薬量は、上述のような要因に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。状態に依存した数日以上にわたる反復投与については、処置は、疾患症状の所望される抑制が生じるまで持続される。しかしながら、他の投薬レジメンが有用であり得る。好ましい局面では、本発明の抗体は、２〜３週間毎に、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。より好ましくは、このような投薬レジメンは、転移性の結腸直腸癌を処置するための最良の治療として、化学療法レジメンと組み合わせて使用される。いくつかの局面では、化学療法レジメンは、伝統的な高用量での断続的な投与を伴う。いくつかの他の局面では、化学療法剤は、計画された中断（「規則正しい化学療法」）を伴うことなく、より少量かつ高頻度の用量を用いて投与される。本発明の治療の進捗は、簡便な技術およびアッセイによって容易にモニタリングされる。
【０１６９】
抗体組成物は、ＧＭＰ（優良医療規範：ｇｏｏｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）と矛盾しない様式で処方、投薬および投与される。この文脈において考慮すべき要因としては、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、因子の送達部位、投与方法、投与計画、および医療専門家に公知の他の要因が挙げられる。投与されるべき抗体の「治療有効量」は、このような考慮点によって支配される、疾患もしくは障害を予防、緩和もしくは処置するために必要な最低の量である。抗体は、必ずしもそうある必要はないが、必要に応じて、問題となっている障害を予防もしくは処置するために現在使用されている１以上の因子と共に処方される。このような他の因子の有効量は、処方物中に存在する抗体の量、障害もしくは処置の型、および上述のような他の要因に依存する。これらは一般に、本明細書において先に使用してきたものと同じ投薬量および投与経路で、または、本明細書において先に用いてきた投薬量の約１〜９９％の量で使用される。一般に、疾患もしくは障害の軽減もしくは処置は、疾患もしくは障害に伴う１以上の症状もしくは医学上の問題を減じることを包含する。癌の場合、薬物の治療有効量は、以下のうちの１つまたは組み合わせを達成し得る：癌細胞数の減少；腫瘍サイズの縮小；末梢器官への癌細胞浸潤の阻害（すなわち、ある程度までの減少および／または停止）；腫瘍転移の阻害；ある程度までの腫瘍成長の阻害；および／または、癌に伴う１以上の症状のある程度までの緩和。薬物が既存の癌細胞の成長を防止し、そして／または、殺傷し得る限り、薬物は細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、被験体または哺乳動物における疾患または障害の発症または再発を防止するために使用され得る。
【０１７０】
以下の実施例は、単に本発明の実施を例示するために意図されるものであり、限定するものとして提供されるものではない。本明細書中で援用される全ての特許および科学文献の開示は、明示的にその全体が参考として援用される。
【実施例】
【０１７１】
（実施例１  抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体の作製および特徴付け）
抗Ｎｒｐ２Ｂを、先に記載されたように、ヒト合成抗体ファージライブラリーから単離した（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３４０，１０７３−１０９３  （２００４））。簡単に述べると、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）内の溶媒に曝露される位置に合成的に多様性を導入することによって、単一のヒトフレームワークに対してファージディスプレイ合成抗体ライブラリーを構築した。ライブラリーの性能を高めるために、一価および二価の抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）ライブラリーを構築し、そして、アミノ酸組成およびＣＤＲの長さを変化させることによって、多様なＣＤＲ−Ｈ３の多様性を探究した。次に、このライブラリーを、ＣＤＲ−Ｈ３の長さの多様性を増やし、そして、天然に存在するＣＤＲ−Ｈ３配列のアミノ酸組成を模倣するように合わせたコドンを用いることによって拡大した。完全に合成のＣＤＲが単一の足場上にディスプレイされるこれらのライブラリーを用いて、高親和性の抗体を生成した。単一の鋳型を用いた合成抗体ライブラリーの作製のための戦略および方法のさらなる詳細については、例えば、２００３年１２月１１日に公開されたＷＯ０３／１０２１５７（この全開示は明示的に本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０１７２】
抗Ｎｒｐクローンについての選択手順は、当該分野で公知の固体により支持された選別（ｓｏｌｉｄ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  ｓｏｒｔｉｎｇ）および溶液−結合による選別（ｓｏｌｕｔｉｏｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｏｒｔｉｎｇ）の種々の組み合わせから構成された。固体により支持された選別では、抗体ファージライブラリーは、５μｇ／ｍｌの濃度で、ＮＵＮＣ  ９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ免疫プレート上にコーティングした標的抗原を用いてパニングした。溶液−結合による選別法では、ファージライブラリーを、減少する溶液中のビオチン化抗原の濃度と共にインキュベートし、次いで、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート上にコーティングしたノイトラビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）（２〜５μｇ／ｍｌ）により捕捉させた。減少する濃度は、よりしっかりとした結合剤を探し出すためのパニングにおいてより高いストリンジェンシーを可能にした。
【０１７３】
固体により支持された選別と溶液−結合による選別とを組み合わせた結果、ＶＨライブラリーからの１つのクローン（ＹＷ６８．４）と、ＶＨＶＬライブラリーからの別のクローン（ＹＷ１２６．２０）を、ＮＲＰ−２結合剤として同定した。結合親和性アッセイ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）およびブロッキングアッセイ（例えば、セマフォリン誘導性成長円錐崩壊アッセイおよびＨＵＶＥＣアッセイ）を含む一連のインビトロアッセイを行って、選択した新規抗ＮＲＰ抗体の特性および活性を調べた。
【０１７４】
ナイーブなクローンのＣＤＲを加工して、その親和性および安定性を高め、抗Ｎｒｐ２抗体ＹＷ６８．４．２およびＹＷ６８．４．２．３６を作製した。ｍＮｒｐ２（ａ１ａ２ｂ１ｂ２）−Ｈｉｓ、ｈＮｒｐ２（ａ１ａ２ｂ１ｂ２）−Ｆｃ融合タンパク質を発現したＣＨＯ細胞と、ｈＮｒｐ２（ｂ１ｂ２）を発現した昆虫細胞を、抗体のスクリーニングおよび特徴付けに使用した。抗Ｎｒｐ２Ｂファージ抗体（最初にＹＷ６８．４．２．３６と命名）のＶＬ領域およびＶＨ領域を、それぞれ、哺乳動物発現ベクター中にクローニングした。抗Ｎｒｐ２ＢヒトＩｇＧ１またはｍＩｇＧ２ａを哺乳動物ＣＨＯ細胞中で発現させ、そして、プロテインＡアフィニティカラムで精製した。
【０１７５】
抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体ＹＷ６８．４．２およびＹＷ６８．４．２．３６のアミノ酸配列は図１０に示される。抗Ｎｒｐ２Ａ抗体ＹＷ１２６．２０のアミノ酸配列は図１１に示される。抗Ｎｒｐ２Ａ抗体ＹＷ１２６．２０の軽鎖可変ドメインと、ヒトκ１配列とのアラインメントが図１２に示される。抗Ｎｒｐ２Ａ抗体ＹＷ１２６．２０の重鎖可変ドメインと、ヒトＩＩＩ（ｈｕｍ  ＩＩＩ）配列とのアラインメントが図１３に示される。
【０１７６】
以下の実施例では、抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体ＹＷ６８．４．２．３６（以後、＜＜抗Ｎｒｐ２Ｂ＞＞と称する）を用いた。この抗体は、Ｎｒｐ２の第Ｖ／ＶＩＩ凝固因子（ｂ１−ｂ２）ドメイン（図１Ａ）に対して標的化されたものである。なぜなら、これらのドメインは、ニューロピリンへのＶＥＧＦＣ結合に必要とされるからである（Ｋａｒｐａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆａｓｅｂ  Ｊ  ２０，１４６２−１４７２（２００６））。さらに、この抗体は、マウスおよびヒトのＮｒｐ２に対して同様の親和性で結合するが、Ｎｒｐ１には結合しない（図１Ｂ）。抗Ｎｒｐ２Ｂは、もっぱらｂ１−ｂ２ドメインに結合し、セマフォリン結合を主として担うヒトＮｒｐ２のＣＵＢ（ａ１−ａ２）ドメインには結合しないことが確認されている（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ２１，１２８３−１２９０（１９９８）；Ｇｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ２１，１０７９−１０９２（１９９８））。
【０１７７】
抗Ｎｒｐ２Ｂ  ＩｇＧ１抗体の結合親和性を決定するために、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−３０００機器を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＲＰ）測定を用いた。まず、抗Ｎｒｐ２ＢヒトＩｇＧをウサギ抗ヒトＩｇＧでコーティングしたＣＭ５バイオセンサーチップで捕捉させ、約２００の応答単位（ＲＵ）を達成した。動力学測定については、マウスまたはヒトのＮｒｐ２（ａ１ａ２ｂ１ｂ２）（０．５ｎＭ〜２５０ｎＭ）の２倍段階希釈を、３０μｌ／分の流速で、２５℃にて、ＰＢＴ緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０）中で別々に注入した。単純な１対１対応のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を用いて、結合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして平衡解離定数（ＫＤ）を算出した。
【０１７８】
表面プラズモン共鳴測定により推定したところ、抗Ｎｒｐ２Ｂは、４．９ｎＭのＫｄでマウスＮｒｐに、そして、５．３ｎＭのＫｄでヒトＮｒｐ２に結合する。
【０１７９】
ＥＬＩＳＡ形式および細胞ベースの結合アッセイの両方においてＮｒｐ２に対するＶＥＧＦＣの結合をブロックする抗Ｎｒｐ２Ｂの能力を検討した。
【０１８０】
ＥＬＩＳＡベースの結合特異性試験では、ＰＢＳＴ（ＰＢＴ緩衝液＋０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）中の抗Ｎｒｐ２Ｂ  ＩｇＧの３倍段階希釈物（０．００２ｎＭ〜５００ｎＭ）を、１μｇ／ｍｌの抗原でコーティングした９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートと共に少なくとも１時間インキュベートし、そして、このプレートをＰＢＴで洗浄した。結合した抗体を、ＰＢＳＴ緩衝液中１：２５００希釈した抗ヒト抗体ＨＲＰ結合体で検出し、ＴＭＢ基質で約５分間発色させ、１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４でクエンチし、そして、４５０ｎｍにおいて分光側光器で読み取った。
【０１８１】
ＶＥＧＦ結合からのＮｒｐ２のブロッキングを評価するために、抗Ｎｒｐ２Ｂ  ＩｇＧの３倍段階希釈物をまず、ＰＢＳＴ緩衝液中、ＮＲＰ２−Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）でコーティングした９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートと共に少なくとも２時間インキュベートし、その後、ビオチン化したＶＥＧＦ１６５またはＶＥＧＦＣ（全長）を１５分間加えた。ストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体によって、Ｎｒｐ２に結合したビオチン化ＶＥＧＦの量を検出した。
【０１８２】
細胞への結合を評価するため、先に記載されたように、ＬＥＣに対するビオチン化したＶＥＧＦ１６５またはＶＥＧＦＣの結合を行い（Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１，１３４９３−１３５０２（２００６））、そして、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体によって結合を検出した。Ｓｅｍａ３Ｆの結合を、先に記載されたようにして行った（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，上掲）。
【０１８３】
抗Ｎｒｐ２Ｂは、Ｎｒｐ２（図１Ｃ）、そして、全長Ｎｒｐ２でトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞に対するＶＥＧＦＣの結合を強くブロックした。Ｎｒｐ２はまた、おそらく同じドメインを利用してＶＥＧＦにも結合し得る（Ｇｌｕｚｍａｎ−Ｐｏｌｔｏｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，２９９２２（２０００））ので、Ｎｒｐ２に対するＶＥＧＦ１６５の結合をブロックする抗Ｎｒｐ２Ｂの能力もまた検討した。抗Ｎｒｐ２Ｂはまた、同様のＩＣ５０（０．１ｎＭ）にて、Ｎｒｐ２に対するＶＥＧＦ１６５の結合を強くブロックする（図１Ｄ）。しかしながら、抗Ｎｒｐ２ＢはＮｒｐ２を強力に発現する（追加図１）ＬＥＣに対するＳｅｍａ３Ｆの結合をブロックできなかった（図１Ｅ）。これらの結果は、ａ１−ａ２ドメインがセマフォリン結合を主として担い、そして、ｂ１−ｂ２ドメインがＶＥＧＦ結合を主として担う（図１Ａ）という先の観察と一致している。
【０１８４】
（実施例２  抗Ｎｒｐ２Ｂはインビトロで選択的なＶＥＧＦＣにより媒介される機能をブロックする）
（材料および方法）
（細胞培養）
ＨＭＶＥＣ−ｄＬｙＡｄ  −  ヒト皮膚微小リンパ管内皮細胞（ＬＥＣ）およびＨＵＶＥＣはＣａｍｂｒｅｘから購入し、そして、ＥＧＭ−２培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）中で培養した。Ｃ６  ＬａｃＺ細胞はＡＴＣＣから購入した。６６Ｃ１４は、親切にＦｒｅｄ  Ｒ  Ｍｉｌｌｅｒ博士からご提供いただいた。腫瘍細胞は、１０％  ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。全ての細胞を、５％  ＣＯ２、湿度９５％のインキュベーターにおいて３７℃に維持した。
【０１８５】
（細胞増殖アッセイ）
９６ウェルの黒−透明底プレート（ＶＷＲ）を、３７℃にて２時間、５μｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でコーティングした。ＬＥＣを回収し、アッセイ培地（０．１％  ＢＳＡ、ＥＧＭ−２）中に３０００細胞／１００μｌで再懸濁させ、ウェルに加えた。細胞を３７℃にて１６時間インキュベートした。ＢｒｄＵ標識溶液（Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡキット；Ｒｏｃｈｅ）を加え、そして、細胞を３７℃にてさらに２４時間インキュベートした。ＢｒｄＵの取り込みを、化学発光免疫アッセイによって決定した（各条件につき６ウェル）。
【０１８６】
（結果）
ＶＥＧＦＣにより媒介される遊走および増殖に対するＮｒｐ２の役割を検討した。これらは、ＶＥＧＦＣによって誘導される重要な細胞の活動である（Ｊｏｕｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ  １６，３８９８−３９１１（１９９７））。ＬＥＣは、以前に、ＶＥＧＦＣに対して高度に応答性であることが示されている（Ｍａｋｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２０，４７６２−４７７３（２００１）；Ｖｅｉｋｋｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆａｓｅｂ  １７，２００６−２０１３（２００３）；Ｗｈｉｔｅｈｕｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｙｍｐｈａｔ  Ｒｅｓ  Ｂｉｏｌ  ４，１１９−１４２（２００６））。トランスウェルシステム（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｓｙｓｔｅｍ）を用い、ヒトＬＥＣを上部チャンバに導入する一方で、ＶＥＧＦＣを底部チャンバに加え、遊走を促進した。その後、底部に遊走したＬＥＣを固定し、染色し（図２Ａ）、そして、定量した（図２Ｂ）。ＶＥＧＦＲ３の最初の３つの（リガンド結合）Ｉｇドメインを含むＶＥＧＦＲ３細胞外ドメインタンパク質（ＥＣＤ）を、この実験および続く実験におけるＶＥＧＦＣにより駆動される遊走のブロックについてのポジティブコントロールとして用いた（Ｍａｋｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７，１９９−２０５（２００１））。Ｎｒｐ２の機能がＬＥＣの遊走に必要とされたかどうかを決定するために、ＶＥＧＦＣを加える直前に、上部チャンバ内の細胞に抗Ｎｒｐ２Ｂ  ｍＡｂを加えた。抗Ｎｒｐ２Ｂは、ＶＥＧＦＣにより媒介されるＬＥＣの遊走を有意に低下させ得た（図２Ａ、２Ｂ；ｐ＝０．００４）。阻害レベルは、ＶＥＧＦＣにより媒介されるＬＥＣの遊走を完全に阻害したＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤで見られたものよりも少なかった（図２Ａ、２Ｂ；コントロールに対してｐ＜０．００１；抗Ｎｒｐ２Ｂに対してｐ＝０．００２）。別のＶＥＧＦＣ応答性原発性細胞株であるＨＵＶＥＣを用いた場合も同様の結果が得られた。
【０１８７】
抗Ｎｒｐ２ＢはまたＮｒｐ２に対するＶＥＧＦ１６５の結合もブロックするので、ＶＥＧＦ１６５により媒介される遊走の調節におけるＮｒｐ２の役割を評価した。ＶＥＧＦ１６５は、以前に記載されたように、ＬＥＣにおける遊走を強く誘導した（Ｈｉｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６２，５７５−５８６（２０３）；Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆａｓｅｂ  Ｊ  １８，１１１１−１１１３（２００４）；Ｍａｋｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２０，４７６２−４７７３（２００１）；Ｖｅｉｋｋｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆａｓｅｂ  Ｊ  １７，２００６−２０１３（２００３））。交差種反応性の抗ＶＥＧＦ抗体（Ｂ２０．４．１）をＶＥＧＦにより駆動される遊走のブロックについてのポジティブコントロールとして用いた（Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１，９５１−９６１（２００６））。興味深いことに、抗Ｎｒｐ２Ｂは、ＶＥＧＦ１６５により媒介される遊走に対して何ら影響を有さなかった（図２Ｃ）。これはおそらく、Ｎｒｐ１の存在に起因するものである（追加図１）。抗Ｎｒｐ１  ｍＡｂである抗Ｎｒｐ１Ｂ（Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １１，５３−６７（２００７））を利用したＮｒｐ１機能のブロッキングは、ＶＥＧＦにより媒介される遊走を劇的に低下させ、この仮説を裏づけた（追加図２）。抗Ｎｒｐ１Ｂおよび抗Ｎｒｐ２Ｂの両方を加えても、抗Ｎｒｐ１Ｂ単独で見られた阻害と比較して任意のさらなる阻害を生じず（追加図２）、Ｎｒｐ２がＶＥＧＦ１６５により媒介される遊走において役割を担っていないことが示された。
【０１８８】
次に、ＶＥＧＦＣにより誘導されるＬＥＣ増殖に対する抗Ｎｒｐ２Ｂの効果を調べた。顕著なことに、抗Ｎｒｐ２Ｂは、ＬＥＣ増殖に対して効果がなかったのに対し、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤは強いブロックを提供した（追加図３）。これは、Ｎｒｐ２  ｓｉＲＮＡがＶＥＧＦＣにより誘導される内皮細胞の増殖を阻害できなかったという以前の報告と一致している（Ｆａｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０８，１２４３−１２５０（２００６））。したがって、Ｎｒｐ２は、ＶＥＧＦＣにより駆動される遊走には重要であるが、増殖には重要でないようである。
【０１８９】
その後、抗Ｎｒｐ２Ｂがセマフォリン機能を調節する能力について検討した。本発明者らは、海馬のニューロン成長円錐崩壊アッセイを用いた。このアッセイは、Ｎｒｐ２がアクチンリッチな構造のＳｅｍａ３Ｆにより媒介される収縮に必要とされることを以前に実証したものである（Ｐｏｚａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。抗Ｎｒｐ２Ｂの添加は、セマフォリンにより誘導される崩壊に対して何ら効果がなかったが、組換えＮｒｐ２  Ａ１Ａ２ドメインまたはＮｒｐ２  ＥＣＤのいずれかの添加は、この崩壊を完全に阻害した（追加図４）。この結果は、抗Ｎｒｐ２Ｂがセマフォリン結合領域に結合せず、そして、Ｎｒｐ２へのＳｅｍａ３Ｆの結合と干渉しないという本発明者らによる以前の観察と一致している。したがって、抗Ｎｒｐ２Ｂは、Ｎｒｐ２機能の特定の局面をブロックするように機能し、ＶＥＧＦＣにより媒介される細胞応答は阻害するが、ＶＥＧＦまたはＳｅｍａ３Ｆにより媒介される細胞応答は阻害しない。
【０１９０】
（実施例３  抗Ｎｒｐ２ＢはインビボでＶＥＧＦＣにより媒介されるリンパ管形成をブロックする）
（材料および方法）
（マウス角膜マイクロポケットアッセイ）
先に記載されたように、成体ＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ）に麻酔をかけ、微小切開によって、上皮内に角膜の中心から１ｍｍの場所に２×３ｍｍのポケットを作製した（Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９８，４４０−４５０（１９９１））。リンパ管形成活性について試験する因子を不活性なヒドロン（ｈｙｄｒｏｎ）ペレット（２×２ｍｍ）内に固定した。続いて、このペレットをポケットの底に埋め込んだ。動物を、２週間にわたって週２回、コントロール抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）、抗Ｎｒｐ２Ｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（２５ｍｇ／ｋｇ）のＩＰ処置を施した。続いて、動物を屠殺し、角膜を切開した。抗ＬＹＶＥ−１抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １：５００）を用いたホールマウントＩＨＣによってリンパ管を可視化した。角膜を撮像し、そして、縁から生じているＬＹＶＥ−１陽性のリンパ管を定量した。
【０１９１】
（マウスの皮膚血管透過性アッセイ）
成体Ｃ５７ＢＬ６Ｊ雌性マウスの背部および側腹部を悌毛し、４つの処置領域に区分した。続いて、これらに、１５０μｌ  ０．５％のエバンスブルー溶液をｉ．ｖ．注射した。エバンスブルー溶液の注射から１時間後に、抗体（０．５ｍｇ／ｍｌ）を含むかまたは含まない、ＢＳＡまたはｈＶＥＧＦ（７．５μｇ／ｍｌ）を含有する２０μｌのＰＢＳを、４つのゾーンのうちの１つに無作為に皮内注射した。１時間後、動物を屠殺し、皮膚を切開し、そして画像化した。各注射ゾーンについての皮膚サンプルを切り出し、そして、５５℃にて４８時間ホルムアミド溶液中でインキュベートして、青色の色素を抽出下。続いて、６００ｎｍにてこの溶液の吸光度を分光光度計で測定した。
【０１９２】
（結果）
インビトロでＮｒｐ２をブロッキングすることによって、ＬＥＣ遊走の有意な低下が観察されたので、次に、Ｎｒｐ２がインビボにおけるＶＥＧＦＣ機能の調節に必要とされるかどうかを検討した。本発明者らは、２つの十分に特徴付けられたＶＥＧＦＣにより媒介されるインビボ活性−−リンパ管新生および血管透過性について検討した（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ９４，６６４−６７０（２００４）；Ｊｏｕｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３，６５９９−６６０２（１９９８）；Ｋｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９，８８６８−８８７３（２００２）；Ｓａａｒｉｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆａｓｅｂ  Ｊ  １６，１０４１−１０４９（２００２））。リンパ管新生について検討するために、マウス角膜マイクロポケットアッセイ（Ｋｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，上掲）を利用した。このアッセイでは、ＶＥＧＦＣのペレットを成体マウスの血管のない角膜に導入した。１４日間にわたり、ＶＥＧＦＣに応答して、リンパ管の密集した叢が縁から角膜内へと成長した（図２Ｅ；ＶＥＧＦＣ処置で１２，０００ピクセル２であったのに対し、コントロールでは２２８４ピクセル２）。これらの脈管を、ＬＹＶＥ−１免疫組織化学（ＩＨＣ）で標識し、その後定量した（図２Ｄ）。ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤの全身投与は、このＶＥＧＦＣにより誘導されるリンパ管新生をほぼ完全にブロックした（２６７１ピクセル２；ｐ＜０．００１）。抗Ｎｒｐ２Ｂはまた、角膜のリンパ管形成応答も効率的にブロックした（３２８１ピクセル２；ｐ＜０．００１）。このブロックは、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤを用いて観察されたブロックの程度と同様であった（図２Ｅ、２Ｄ；ｐ＝０．６７）。
【０１９３】
血管透過性を評価するために、Ｍｉｌｅｓアッセイ（Ｂｒｋｏｖｉｃ  ａｎｄ  Ｓｉｒｏｉｓ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １００，７２７−３７（２００７）；Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０７，５３２−１５３８（２００３））を用いた。このアッセイは、血管透過性を誘導するためにＶＥＧＦＣの皮内注射を、そして、皮膚の脈管における透過性を検出および定量するためにトレーサとしてエバンスブルーの脈管内注射を用いる（追加図３）。顕著なことに、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ処置で観察されたブロックとは対照的に、抗Ｎｒｐ２Ｂでの処置は、ＶＥＧＦＣにより誘導された透過性に対して効果がなかった（ｐ＝０．０３８）。これらの結果は、本発明者らによるインビトロでの観察と一致して、Ｎｒｐ２がインビボでもＶＥＧＦＣにより媒介される選択的な機能に重要であるようであることを実証する。
【０１９４】
（実施例４  抗Ｎｒｐ２Ｂは、Ｎｒｐ２／ＶＥＧＦレセプター複合体の形成を阻害することによってＶＥＧＦＣ機能を調節する）
（材料および方法）
（細胞遊走アッセイ）
改変したＢｏｙｄｅｎチャンバを８μＭポアサイズのＦａｌｃｏｎ  ２４−マルチウェルインサートシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に用いて遊走アッセイを行った。プレートを、３７℃にて２時間、５μｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でコーティングした。１００μｌのアッセイ培地（０．１％  ＧＳＡ、ＥＧＭ−２）中の細胞を、抗体有り／無しで底部チャンバに加えた。化学遊走物質を５００μｌアッセイ培地中、底部チャンバに加え、そして、細胞を３７℃にて１６時間インキュベートした。上部メンブレン上の細胞をスポンジスワブで除き、そして、底部表面上の細胞を７０％エタノール中で固定し、Ｓｙｔｏｘグリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。ウェルの全底部表面から像を撮り、そして、遊走した細胞の数をカウントした。（各条件につき６ウェル）。
【０１９５】
（ＦＡＣＳ解析）
コンフルエントなＬＥＣを、コントロールまたは抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体（１０μｇ／ｍｌ）と共に、３７℃にて５分間、２時間または２０時間インキュベートした。細胞を、酵素を含まない細胞分離バッファー（Ｇｉｂｃｏ）を用いて回収し、そして、５％正常マウス血清、２％正常ラット血清および１０％  １０μｇ／ｍｌヒトＩｇＧを含有するＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２％  ＦＢＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％アジ化ナトリウム）中１：１００のビオチニル化抗体と共にインキュベートした。ＦｌｕｏＲｅｐｏｒｔｅｒミニ−ビオチン−ｘｘタンパク質標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて抗体をビオチン化した。次いで、細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、そして、ストレプトアビジン−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。データはＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。
【０１９６】
（細胞接着アッセイ）
サブコンフルエントなＬＥＣをコントロールまたは抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体（１０μｇ／ｍｌ）と共に、１００μｌのＭｅｄｉｕｍ  １９９中、３７℃にて３０分間プレインキュベートし、次いで、１μｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｒｏｃｈｅ）でコーティングしたＮＵＮＣ  ｍａｘｉｓｏｒｐ平底９６ウェルプレート（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中に１ウェルあたり１０，０００細胞でプレーティングした。プレートを１４０ｇで１分間遠心分離して、基質との細胞の接触を同調させ、３７℃にて３０分間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、そして−８０℃にて凍結させた。細胞密度をＣｙＱｕａｎｔキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて決定した。
【０１９７】
（ＶＥＧＦレセプターシグナル伝達アッセイ）
コンフルエントなＨＵＶＥＣを、コントロールまたは抗Ｎｒｐ２Ｂ抗体の存在下もしくは非存在下、２００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＣで１０分間刺激した。細胞を溶解させ、そして、ＶＥＧＦレセプターのシグナル伝達における役割を担うことが知られる多くのメディエーターについてアッセイした。総ＶＥＧＦＲ２およびホスホ−ＶＥＧＦＲ２のＥＬＩＳＡアッセイ（ＤｕｏＳｅｔ  ＩＣ  ＥＬＩＳＡキット，Ｒ＆Ｄ）を用いてＶＥＧＦＲ２の活性化を評価した。以前に記載されたように、ＶＥＧＦＲ３−２９３細胞株と共にキナーゼレセプター活性化アッセイ（ＫＩＲＡ）を用いてＶＥＧＦＲ３の活性化を評価した（Ｓａｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｎａｌ  １９，８８３−８９１（１９９９））。簡単に述べると、全長Ｆｌａｇをタグ化されたヒトｈＶＥＧＦＲ３を発現する安定な２９３細胞株を、刺激後のレセプターリン酸化についてアッセイした。５×１０４細胞を一晩栄養枯渇状態にし（ＤＭＥＭ＋０．１％  ＢＳＡ）、次いで、４０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦＡ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）または２００ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦＣ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）で８分間刺激した。細胞を１％トリトンおよびオルトバナジン酸ナトリウムを含有するＰＢＳ中で溶解させた。ＥＬＩＳＡプレートを捕捉Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でコーティングした。このプレートを一晩コーティングし（ＰＢＳ＋１μｇ／ｍｌの抗体）、そして１時間ブロッキングした（ＰＢＳ＋０．５％  ＢＳＡ）。３回の洗浄の後（ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）、溶解物を２時間加え、３回洗浄し、その後、リン酸検出抗体４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｅｄ，ＮＹ）を２時間加えた。検出は、ＨＲＰ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）およびＴＭＢ基質を用いて行った。プレートを４５０ｎｍにて読み取った。ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ製のサンドイッチＥＬＩＳＡキットを用いて総ＡＫＴ、ホスホ−ＡＫＴ、総Ｅｒｋ１／２、ホスホ−Ｅｒｋ１／２、総Ｓｒｃ、ホスホ−Ｓｒｃ、総ｐ３８  ＭＡＰＫおよびホスホ−ｐ３８  ＭＡＰＫを評価した。
【０１９８】
（結果）
抗Ｎｒｐ２ＢがＶＥＧＦＣの作用を妨害するという知見は、抗Ｎｒｐ２ＢがＮｒｐ２へのＶＥＧＦＣの結合をブロックするという事実と一致した。さらに、抗Ｎｒｐ２Ｂがインビトロおよびインビボの両方で選択的な機能のみをブロックするという事実は、大いに予想外であった。ＬＥＣの遊走およびリンパ管新生の中断は観察されたものの、ＬＥＣの増殖または血管透過性は観察されなかったことの１つの可能性のある説明は、抗Ｎｒｐ２Ｂが、一般に、おそらくはＬＥＣの細胞外マトリクスへの接着を途絶させることによって、遊走を阻害し得るというものである。これを検討するため、多数のＬＥＣマイトジェンにより誘導される遊走に対する抗Ｎｒｐ２Ｂの作用を評価した。抗Ｎｒｐ２ＢはＶＥＧＦ（図２Ｃ）、ＨＧＦ（図３Ｂ）またはＦＧＦにより誘導された遊走に対しいかなる作用も有さなかった。したがって、抗Ｎｒｐ２Ｂは一般にＬＥＣの遊走を途絶さえなかった。さらに、抗Ｎｒｐ２Ｂは、２つの細胞外マトリクス基質であるフィブロネクチンまたはコラーゲンに対するＬＥＣの接着に対してもいかなる作用も有さなかった。
【０１９９】
第二の可能性は、抗Ｎｒｐ２ＢｍＡｂがＮｒｐ２の内在化を引き起こし得るというものである（Ｊａｒａｍｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ３１２，２７７８−２７９０（２００６））。Ｎｒｐ２はリガンドの非存在下でさえＶＥＧＦＲ３と複合体を形成するので（Ｆａｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，上掲；ＫａｒｋｋａｉｎｅｎおよびＡｌｉｔａｌｏ，Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １３，９−１８（２００２））、これは、ＶＥＧＦＣにより媒介される特定の機能に影響を及ぼす、ＶＥＧＦＲ３の選択的な同時内在化をもたらし得る。この可能性はさらに、ＶＥＧＦＣにより駆動される血管透過性がＶＥＧＦＲ２によって媒介されるがＶＥＧＦＲ３によっては媒介されないという知見によっても確認された（Ｊｏｕｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，上掲）。この可能性を検討するため、ＬＥＣを抗Ｎｒｐ２Ｂと共に３７℃にて５分間、２時間または２０時間インキュベートし、次いで、Ｎｒｐ２、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３に対する抗体を用いたＦＡＣＳ解析を行って、細胞表面上のレセプターレベルを決定した。処理間に差は見られず、抗Ｎｒｐ２ＢはＮｒｐ２、ＶＥＧＦＲ２またはＶＥＧＦＲ３の有意な内在化を引き起こさなかったことが示唆された（図３Ａ）。
【０２００】
Ｎｒｐ２はＶＥＧＦレセプターシグナル伝達を増大させるものと提唱されているので（Ｆａｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，上掲）、次に、ＶＥＧＦＣの刺激により、レセプターの二量体化および自己リン酸化をもたらす、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３の活性化に対する抗Ｎｒｐ２Ｂの作用を検討した。先のインビトロおよびインビボでのデータと一致して、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤは、ＶＥＧＦＣにより媒介されるＶＥＧＦＲ２（図３Ｃ；ｐ＜０．００１）およびＶＥＧＦＲ３のリン酸化を完全にブロックした。抗Ｎｒｐ２Ｂ処理は、ＶＥＧＦＲ２（図３Ｃ；ｐ＜０．００１）およびＶＥＧＦＲ３の活性化の低減をもたらしたが、その程度はＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ処理よりも有意に低いものであった（ｐ＜０．００１）。この観察は、抗Ｎｒｐ２Ｂの選択的な阻害活性が、遊走と増殖のためのＶＥＧＦレセプター活性化の示差的な要件の結果であり得、遊走は、増殖よりも高いレベルのレセプター活性化を必要とするという可能性を提起した。この可能性を検討するため、ＶＥＧＦＣ刺激に対するＶＥＧＦＲ２リン酸化の用量応答を評価した（図３Ｃ）。抗Ｎｒｐ２Ｂ処理によって引き起こされるＶＥＧＦＲ２リン酸化の低減が、１７５ｎｇ／ｍｌまたは１５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＣでの刺激によって得られたＶＥＧＦＲ２リン酸化と同等であったことが一貫して観察された。次に、ＶＥＧＦＣ刺激に対する遊走の用量応答解析を行った（図３Ｄ）。１７５ｎｇ／ｍｌまたは１５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＣで刺激されたＬＥＣは、２００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＣで刺激された細胞と同等に遊走したことが注目される。実際、遊走における有意な低減は、ＶＥＧＦＣレベルが５０ｎｇ／ｍｌに減少するまでは観察されなかった。したがって、本発明者らは、抗Ｎｒｐ２Ｂにより誘導されるＶＥＧＦＲ２リン酸化の低減は、それ自体では、遊走を低減させるには不十分であったと結論付けた。
【０２０１】
本発明者らはさらに、ＶＥＧＦレセプターにより媒介される下流のシグナル伝達事象に対する抗Ｎｒｐ２Ｂの作用を評価した。抗Ｎｒｐ２Ｂでの処理または１７５ｎｇ／ｍｌまたは１５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＣでの刺激は、Ｎｒｐ１の場合に観察されたもの（Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）と同様に、Ｅｒｋ１／２、Ａｋｔまたはｐ３８  ＭＡＰＫ（それぞれ、ＶＥＧＦＲ２により媒介される増殖、透過性および運動性を調節する）の活性化を有意には低減しなかった。このことは、Ｎｒｐ２がＶＥＧＦレセプターの活性化または下流のシグナル伝達の増強以外の機構によってＬＥＣの遊走およびリンパ管新生を調節し得ることを示した。
【０２０２】
最後に、本発明者らは、Ｎｒｐ２／ＶＥＧＦレセプター複合体形成に対する抗Ｎｒｐ２Ｂの作用を検討した。先に報告されたように、Ｎｒｐ２は、ＶＥＧＦＣの存在下もしくは非存在下で、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３により同時に免疫沈降され得る（Ｆａｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６上掲；Ｋａｒｐａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，上掲）（図３Ｅ）。この相互作用は、抗Ｎｒｐ２Ｂによって劇的に低減された（図３Ｅ）。この結果は、Ｎｒｐ２／ＶＥＧＦレセプター複合体が、ＶＥＧＦＣにより媒介される特定の機能にとって重要であることを示唆する。さらに、Ｎｒｐ２の役割は、もっぱらリガンド刺激に応答したＶＥＧＦレセプターのシグナル伝達を増強するものではない。
【０２０３】
（実施例５  Ｎｒｐ２は腫瘍関連のリンパ管において発現される）
（材料および方法）
（免疫組織化学）
１８μｍの組織切片を切断し、そして、ガラススライド上にマウントした。切片を一次抗体（抗Ｎｒｐ２Ｂ（その発現が十分に特徴付けられたＥ１２．５マウスの脊髄において行った１：５００のコントロール染色）、抗ＬＹＶＥ−１（Ｒ＆Ｄ、１：２００）、抗ＰＥＣＡＭ−１（Ｂｅｎｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、１：５００）、抗ＰＲＯＸ−１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、１：１０００）またはＫｉ６７（Ｎｅｏｖｉｓｉｏｎ、１：１００））と共に４℃にて一晩インキュベートした。次いで、サンプルを、Ａｌｅｘａ  ４８８またはＡｌｅｘａ  ５６８二次抗体（１：２００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて室温にて４時間染色した。二次抗体のみの染色をコントロールとして用いた。市販のキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＴＵＮＮＥＬ染色を行った。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ蛍光顕微鏡を用いて撮像した。各群６つの腫瘍の各々からの６つの像から血管およびリンパ管の領域を決定し、ＩｍａｇｅＪによって平均ピクセル数について評価した。
【０２０４】
（結果）
Ｎｒｐ２が成体のリンパ管生物学において役割を担うかどうかを決定するために、成体のリンパ管におけるＮｒｐ２の発現を評価した。脈管系では、Ｎｒｐ２の発現は、これまでに、静脈およびリンパ管において記載されている（Ｈｅｒｚｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １０９，１１５−１１９（２００１）；Ｍｏｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２８，３３５９−３３７０（２００１）；Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９，４７９７−４８０６（２００２））。上述のように、培養中のＬＥＣはＮｒｐ２を強く発現する（追加図１）。しかしながら、本発明者らは、正常な成体マウスの結腸ＬＹＶＥ−１陽性リンパ管におけるＩＨＣによってＮｒｐ２を検出することができなかった（図４Ａ；ポジティブコントロールの染色については追加図４を参照のこと）。結腸は、かなり型にはまった様式のリンパ管の豊かな叢を有するので、結腸を評価した。本発明者らはまた、正常な成体マウスからのリンパ節（図４Ｂ）および皮膚のリンパ管におけるＩＨＣによってもＮｒｐ２の発現を検出することができなかった。これらの結果は、Ｎｒｐ２インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）によって確認された。対照的に、同所移植もしくは異所移植した腫瘍に隣接するリンパ節におけるＬＹＶＥ−１＋リンパ管において、強いＮｒｐ２の発現が観察された（図４Ｃ）。これは、同所移植されたマウス乳腺癌株６６ｃ１４（ＡｓｌａｋｓｏｎおよびＭｉｌｌｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５２，１３９９−１４０５（１９９２））および異所移植されたラット神経膠芽細胞腫株Ｃ６（データ示さず）を含む多数の腫瘍株で観察された。Ｎｒｐ２はまた、６６ｃ１４、Ｃ６およびＰＣ３（ヒト前立腺癌腫株）を含む多数の腫瘍株について、腫瘍周囲および腫瘍内のリンパ節においても観察された（図４Ｄ）。この発現は、腫瘍型の一部におけるＩＳＨによって確認された。
【０２０５】
（実施例６  抗Ｎｒｐ２Ｂは複数の腫瘍モデルにおける肺転移を低減する）
（材料および方法）
全ての動物研究は、ＮＩＨによって出版されたＧｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ８５−２３，１９８５改訂）に従った。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）は全ての動物実験プロトコールを承認した。
【０２０６】
（腫瘍モデル）
６６ｃ１４については、トリプシン処理により細胞を回収し、洗浄し、１０μｌのＰＢＳ中２×１０５細胞の濃度でＰＢＳ中に再懸濁させた。７５ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび７．５ｍｇ／ｋｇのキシラジンを用いてマウスに麻酔をかけ、そして、右前肢の下部に切開を設けた。１０μｌ  ＰＢＳ中の２×１０５細胞を６〜８週齢の雌性ｂａｌｂ−Ｃマウスの露出された第４乳房脂肪体に直接注射した。Ｃ６については、１００μｌ  ＰＢＳ中の２×１０６腫瘍細胞を６〜８週齢の雌性ｂａｌｂ−Ｃヌードマウスの右側腹部に皮下注射した。両方の研究セットについて、腫瘍成長を週３回モニタリングした。腫瘍が８０〜１２０ｍｍ３の平均サイズに達すると、マウスをほぼ同一な群平均腫瘍サイズを与えるように選別し、処置を開始した。これを、各研究についての１日目とみなした。動物を、研究終了まで、コントロール抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）、抗Ｎｒｐ２Ｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤ（２５ｍｇ／ｋｇ）で週２回ＩＰにより処置した。全ての研究は３回繰り返し、再現性を確保した。
【０２０７】
研究の終了時に、動物に麻酔をかけ、４％ＰＦＡで灌流した。腫瘍を摘出し、凍結保護処理し、そして、ＯＣＴ（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）中で凍結させた。１０ｍｌのＰＢＳ、その後４％  ＰＦＡでの右心室灌流により肺を膨張させ、マイクロ−ＣＴ解析の前に、転移性病巣の視覚によるカウントを行った。
【０２０８】
耳内へのＣ６腫瘍細胞の異所移植によりＳＬＮ転移を評価した。簡単に述べると、動物のコホートを、腫瘍細胞移植の１日前、そして、その後週２回、コントロール抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）または抗Ｎｒｐ２Ｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）で予備処置した。１×１０５のＣ６  ｌａｃＺ細胞を７０匹の雌性ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの耳内に皮下注射した。マウスを３日目、６日目、９日目、１３日目および１５日目に屠殺し、皮内リンパ管造影法によってセンチネルリンパ節を同定し、その後切開して摘出した。リンパ節をホモジェナイズし、そして、溶解物をβ−ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした（Ｐｉｅｒｃｅ）。
【０２０９】
以下のようにして、コントロールおよび腫瘍担持マウスに対して皮内リンパ管造影法を行った。１％  ２０ｎｍポリスチレン蛍光マイクロビーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を含有する２μｌのエバンスブルー色素（３重量％）を、腫瘍の先端に皮内注射した。動物を２時間回復させ、次いで屠殺した。腫瘍周辺組織を含めないよう注意して腫瘍を切開して摘出した。これらに対して、固定して次いで組織化学的に解析するか、または、ホルムアミド中でインキュベートしてエバンスブルーを抽出し、分光光度計によるＯＤ６００測定を用いて定量するかのいずれかを行った。
【０２１０】
（肺のマイクロ−ＣＴ解析）
肺を１０％  ＮＢＦ中に２４時間含浸させ、その後、ヨウ素ベースのＸ線コンピュータ断層撮影用造影剤であるＩｓｏｖｕｅ３７０（Ｂｒａｃｃｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）をＰＢＳで希釈した２０％溶液中に２４時間含浸させた。次いで、肺を２０ｍｌの大豆油（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む気管カニューレ中に含浸させ、そして、０．２５ｍｌ／分の速度で灌流させた。大豆油を用いて過剰な造影剤を除き、そして、造影のためのバックグラウンド媒体を提供した。
【０２１１】
マウスの肺を、ＶｉｖａＣＴ（ＳＣＡＮＣＯ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｂａｓｓｅｒｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）Ｘ線マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロ−ＣＴ）システムを用いてエキソビボで造影した。従来の平面Ｘ線に似た矢状スカウト像を得て、一連のマイクロ−ＣＴ断像の軸位取得の開始点と終了点を規定した。肺の全範囲を提供するよう軸位像の位置および数を選択した。肺をバックグラウンド媒体として大豆油中に含浸させた。４５ｋＶのエネルギーレベル、１６０μＡの電流および４５０ミリ秒の集積時間でＸ線管を操作することによりマイクロ−ＣＴ像を生成した。軸位像は、２１μｍの等方性解像度にて得た。熟練した読み手による目視の工程を含む半自動画像解析アルゴリズムにより肺腫瘍の推定値（数および容積）を得た。肺腫瘍は、正常な肺の多孔性のメッシュ様構造に対して、非常にコントラストが強い充実塊として見える。これは、肺に含まれる充実構造（気管支および肺胞壁、腫瘍、気管、縦隔（ｍｅｄｉａｌ  ｓｔｅｉｎｕｍ））によるヨウ素造影剤の吸収に起因するものである。過剰の造影剤は油による灌流工程によって満たされた空間から清浄した。潜在的な腫瘍塊を、一連の画像処理工程により抽出した。画像解析ソフトウェアは、社内で開発した。このソフトウェアは、Ｃ＋＋で書かれ、そして、Ａｎａｌｙｚｅ（ＡｎａｌｙｚｅＤｉｒｅｃｔ  Ｉｎｃ．，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ，ＵＳＡ）画像解析ソフトウェア機能ライブラリーを採用した。このアルゴリズムは、あらゆる潜在的な腫瘍塊を抽出するために、強度閾値、形態的フィルタリングおよび領域拡張を用いた。強度閾値（１４８０  Ｈｏｕｎｓｆｉｅｌｄ  Ｕｎｉｔｓ）は、アルゴリズムの開発に用いられた５つの任意の肺のヒストグラム解析によって決定し、そして、腫瘍のボクセル（ｖｏｘｅｌ）を含め、あらゆるバックグラウンド信号を除外するように最適な閾値を選択した。形態的（侵食、拡張）および領域拡張演算を適用して、ボクセルの非常にコントラストが強い領域を連結し、そして、気管支および肺胞の薄壁に見られるのと同様の密度のあらゆるボクセルを除いた。領域拡張工程は、２３００の連結されたボクセル（０．０２３１ｍｍ３より大きい）の最低容積が対象（塊）として認められることを要する。同定された対象を次に、Ａｎａｌｙｚｅ  ３Ｄ視覚化ソフトウェアを用いて熟練した読み手により評価した。個々の対象を、対象の外観および肺におけるその位置に基づいて、潜在的な腫瘍として容認または否認した。対象は、肺の外側（例えば、縦隔、外来組織片）にある場合、または、血の詰まった血管に似ている場合、退けた。各肺について、腫瘍カウント、個々の腫瘍容積および総腫瘍容積を決定した。この解析技術は、十分に確立された腫瘍転移モデルで確認した。４Ｔ１乳腺癌腫瘍細胞の同所移植を受けた１１匹の動物を、このマイクロ−ＣＴ技術によって肺転移について評価し、その後、一連の肺の組織学的解析を行った。肺腫瘍容積の推定値は、腫瘍サイズの組織学的推定値（ピクセル数；追加図５）と高度に相関していた（ｒ＝０．９、ｐ＝０．０００２）。
【０２１２】
（結果）
転移阻害のための１つの主要なアプローチは、ＶＥＧＦＣ軸索の阻害によるものである（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５，９００４−９０１１（２００５）；Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ９４，８１９−８２５（２００２）；Ｋｒｉｓｈｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３，７１３−７２２（２００３）；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５，６９０１−６９０９（２００５））。Ｎｒｐ２機能のブロッキングがまた、転移の発生を調節し得るかどうかを決定するため、肺転移の形成に対する抗Ｎｒｐ２Ｂ処置の作用を２つの異なる腫瘍モデル６６ｃ１４乳癌モデルおよびＣ６神経膠芽細胞腫モデルにおいて検討した。６６ｃ１４は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの自然発生した乳癌由来のマウス乳腺癌株である（Ａｓｌａｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５２，１３９９−１４０５（１９９２））。これらの細胞は、ＶＥＧＦＣを発現し、リンパ系を介して肺に対して転移する（Ａｓｌａｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２，上掲）。Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるこれらの細胞の同所移植は、再現性のある腫瘍の発生と肺の転移とをもたらした。抗Ｎｒｐ２Ｂ処置は、腫瘍の初期段階の成長速度に対して影響を及ぼさなかった（図５Ａ）。ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤは初期段階の腫瘍成長速度を劇的に低下させたので、あらゆるさらなる転移の解析から除外した。両方の処置アームからの同様のサイズの腫瘍を持つ動物のコホート（各群につきＮ＝６）を、同時に屠殺し、そして、肺を切開して摘出して、転移性小結節の解析を容易にするために膨張させた。抗Ｎｒｐ２Ｂは、コントロールのＩｇＧ処置動物（図５Ｂ、Ｃ）と比較して、平均３．５から０．８への、１肺あたりの目視により検出された転移性小結節の平均数の劇的な減少を引き起こした（Ｐ＝０．０３）。この結果を確認し、そして、目視による検査になじまなかった肺実質組織内の転移に本発明者らの評価を拡張させるため、本発明者らは、検死後に肺のマイクロ−ＣＴ解析（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ５，１４７−１５５（２００６））を行った。この解析は、抗Ｎｒｐ２Ｂ処置した動物が、コントロール処置動物（図５Ｄ〜Ｆ）と比較したときに、肺転移数の減少を有したことを確認した。しかし、マイクロ−ＣＴ解析は両方の群における転移性小結節の大きな絶対数をもたらす目視による解析よりも感受性であった。マイクロ−ＣＴはまた、肺内の総転移性負荷を決定することを可能にした。抗Ｎｒｐ２Ｂ処置はまた、コントロール処置（１．７８ｃｍ３）と比較して、総転移容積の減少（０．７４ｃｍ３）をもたらした。さらに、この解析は、コントロール処置動物および抗Ｎｒｐ２Ｂ処置動物の両方における肺の表面上には、膨大な数の病巣が存在していることを確認した。したがって、抗Ｎｒｐ２Ｂは、表面から肺実質組織へと小結節を移動させるによって転移の減少を引き起こさなかった。
【０２１３】
実施例４に記載したように行ったＦＡＣＳ解析は、Ｎｒｐ２は、６６ｃ１４腫瘍細胞上で発現していたが、ＶＥＧＦＲ２もＶＥＧＦＲ３も発現していなかったことを示した。これにより、抗Ｎｒｐ２Ｂでの処置が転移に直接的に影響を及ぼす腫瘍細胞の挙動に影響していた可能性が提起された。これは、抗Ｎｒｐ２Ｂ処置では原発性腫瘍の成長に対する作用の欠如を与える見込みはなかった。さらに、抗Ｎｒｐ２Ｂは、インビトロでの腫瘍細胞増殖、アポトーシスまたは遊走に対して何ら作用を有さなかった。しかしながら、転移の減少が腫瘍細胞に対する抗Ｎｒｐ２Ｂの作用に起因するものであったという可能性を検討するため、本発明者らはまた、Ｃ６ラット神経膠芽細胞腫モデルにおける抗Ｎｒｐ２Ｂの作用を評価した。これらの細胞は、その表面上に認識できる程度までのＮｒｐ２を発現しておらず（図６Ｅ）、ＶＥＧＦＣを発現しており、そして、リンパ系を介して肺へと転移するものと考えられる（ＢｅｒｎｓｔｅｉｎおよびＷｏｏｄａｒｄ，１９９５）。さらに、これらは、β−ガラクトシダーゼを発現するように加工されており、このβ−ガラクトシダーゼは、腫瘍細胞の検出を容易にするためのマーカーとして使用され得る。
【０２１４】
ヌードマウスにおけるこれらの細胞の皮下移植は、一貫した腫瘍の発生と肺転移とをもたらした。抗Ｎｒｐ２Ｂ処置は、これらの腫瘍の初期段階の成長速度に影響を及ぼさなかった（図６Ａ）。さらに、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤは、この腫瘍モデルにおいて初期段階の成長速度を劇的に低下させなかった。これにより、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤおよび抗Ｎｒｐ２の抗転移作用の比較が可能となった。再度、全処置アームからの同じサイズの腫瘍を持つ動物のコホート（Ｎ＝１０）を屠殺し、そして、肺を切開して摘出し、転移性小結節についての解析を容易にするため膨張させた。抗Ｎｒｐ２ＢおよびＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤの両方での処置は、肺あたりの目視により検出された転移性小結節の平均数の減少を引き起こした（図６Ｂ、Ｃ）。抗Ｎｒｐ２Ｂで認められた減少は、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤで見られたものと匹敵していた。肺のマイクロ−ＣＴ解析は、これらの知見を確認し（図６Ｄ）、そして、全ての処置アームにおける肺の表面上には、膨大な数の転移が局在化していたことを確認した。小結節は、両方の腫瘍モデルにおいて、組織学的に転移性病巣であることが確認された（図５Ｈおよび６Ｇ）。さらに、全身の検死からは、いずれの腫瘍モデルにおいても、他の器官の表面上での小結節が示されなかった。
【０２１５】
上述の記載において、本発明は特定の実施形態に関して例示されているが、本発明はこのように限定されるものではない。実際、本明細書中に示され、記載されるものに加え、本発明の種々の改変が、上述の記載から当業者には明らかであり、そして、添付の特許請求の範囲に包含される。
【０２１６】
本明細書を通じて引用される全ての参考文献およびこれらにおいて引用される参考文献は、その全体が本明細書によって明示的に参考として援用される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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