(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓癌予後マーカーであるＣＢＳ（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｂｅｔａ-ｓｙｎｔｈａｓｅ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：２０９８６２８０２；配列番号７９）の発現量、発現パターン、または両者全てを特異的に検出するプライマーを含む肝臓癌予後推定用組成物。
【請求項２】
肝臓癌予後マーカーであるＣＢＳ（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｂｅｔａ-ｓｙｎｔｈａｓｅ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：２０９８６２８０２；配列番号７９）がコーディングするタンパク質の存在量、存在パターン、または両者全てを特異的に検出する抗体を含む肝臓癌予後推定用組成物。
【請求項３】
ＣＢＳの発現量、発現パターン、または両者全てを特異的に検出するプライマーが、ＣＢＳのｍＲＮＡを検出するためのＲＴ‐ＰＣＲ用プライマーである請求項１に記載の肝臓癌予後推定用組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の肝臓癌予後推定用組成物を含む肝臓癌予後推定用キット。
【請求項５】
請求項１または３に記載の肝臓癌予後推定用組成物を対象肝臓癌患者から採取した生物学的試料に処理する第１のステップ；及び
第１のステップの処理結果を基準値と対比して肝臓癌予後マーカーであるＣＢＳ（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｂｅｔａ-ｓｙｎｔｈａｓｅ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：２０９８６２８０２；配列番号７９）の発現量、発現パターン、または両者全ての差を検出する第２のステップ；
を含む肝臓癌予後推定方法。
【請求項６】
請求項２に記載の肝臓癌予後推定用組成物を肝臓癌患者から採取した生物学的試料に処理する第１のステップ；及び
第１のステップの処理結果を基準値と対比して肝臓癌予後マーカーであるＣＢＳ（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｂｅｔａ-ｓｙｎｔｈａｓｅ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：２０９８６２８０２；配列番号７９）がコーディングするタンパク質の存在量、存在パターン、または両者全ての差を検出する第２のステップ；
を含む肝臓癌予後推定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓癌予後マーカー、前記肝臓癌予後マーカーの発現量の変化を検出する物質を含む肝臓癌予後推定用組成物、前記肝臓癌予後推定用組成物を含む肝臓癌予後推定用キット、前記肝臓癌予後マーカーを利用する肝臓癌予後推定方法、前記肝臓癌予後マーカーを活用した肝臓癌治療剤スクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、悪性腫瘍と同一の意味を有し、多様な原因で細胞の増殖調節機能に毀損を受け、このような非正常的な細胞が統制されず、過多に増殖し、周囲の組織及び臓器に侵入して腫塊を形成し、正常組織を破壊する状態を意味する。人体の各種組織で発生する癌は、速い成長、浸潤性（入り込むかまたは広がっていく）成長、転移（元の場所から離れたところまで移動する）などによって生命に危険をもたらすこととなる。
【０００３】
癌のうち肝臓癌は、世界的に最も致命的な癌の１つとして知られており、特に、アジアとサハラ以南のアフリカで毎年約五十万人以上が肝臓癌で死亡していることが報告されている。肝臓癌は、大きく肝細胞自体から発生した原発性肝臓癌（肝細胞癌；ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）と、他組織の癌が肝臓に転移されてきた転移性肝臓癌とに区分することができるが、肝臓癌の約９０％以上は原発性肝臓癌であり、通常、肝臓癌とは、原発性肝臓癌を指称するものとして理解される。
【０００４】
このような肝臓癌の発病原因のうちの多くは、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスによる急性または慢性的な感染ということが報告されているが、肝臓癌の発病及び進行に関する細胞内の分子的メカニズムは、未だ明確に糾明されていない状態である。従来の研究によると、各種の成長因子遺伝子のような原‐腫瘍形成遺伝子（ｐｒｏｔｏ‐ｏｎｃｏｇｅｎｅ）が多様な原因によって腫瘍形成遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）に突然変異し、過発現するかまたは過活性を有する場合、あるいはＲｂタンパク質やｐ５３タンパク質のような腫瘍形成抑制遺伝子（ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ）が多様な原因によって突然変異し、低発現するかまたは機能を失う場合、肝臓癌を始めとした多様な癌の発病と進行を誘発することが報告されている。特に、肝臓癌に関しては、変形されたｐ５３、ベータ‐カテニン、ＡＸＩＮＩ、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）及びｐ２７  Ｋｉｐなどの遺伝子が関連しているということが明らかになったりもしている。しかし、最近は、肝臓癌を始めとした多くの癌の発病及び進行は、特定のいくつかの遺伝子のみによって成されるものではなく、細胞周期、信号伝逹などと関連した多様な各種の遺伝子の複合的な相互作用で発病すると認識されており、従って、個別的な遺伝子やタンパク質の発現や機能にのみ重点を置くことから脱し、多様な遺伝子やタンパク質についての総体的な研究の必要性が台頭している。
【０００５】
肝臓癌の予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）は、肝臓癌が診断された後に肝臓癌の完治可能性、治療後の再発可能性、患者の生存可能性など、肝臓癌による患者の各種の状態を予測することを言うが、これは、疾病の深刻性、診断時点、治療経過などの多様な条件に依存して変わる。肝臓癌は、その予後によって好適に多様な治療方法が適用されて始めて効率的な治療が可能である。例えば、予後が良好であると推定される患者に対しては、攻撃的な化学治療や手術、放射線治療など、患者に深刻な副作用を引き起こす可能性がある危険な治療方法は止揚する必要があり、相対的に穏健且つ保存的で安全な治療方法を選択しなければならない。逆に、予後が不良であると推定される患者に対しては、化学治療や手術、放射線治療のような治療方法を積極的に動員し、生存の期間や確率を高めるために試みなければならない。
【０００６】
現在までの研究によると、既に進行してしまった肝臓癌は、その予後が極めて不良であり、診断後６ヶ月以内に死亡し、平均生存期間が４ヶ月にしかならない高い致命率を示しているのに対し、大きさが３ｃｍ未満の小さな肝臓癌は、予後が良好であり、特別な治療なしでも１年間生存する確率が９０％に達しており、手術をした場合、５年の生存率が４０〜５０％程度となることが知られている。しかし、肝臓癌患者の予後を正確に推定することは、従来の技術では非常に難しい。予後の正確な推定のためには、患者を危険群別に分類する分析方法が必要であるが、現在までは肝臓癌の予後を正確に推定することができる手段なしに、診断時の病理臨床学的な肝臓癌の段階と１次的外科治療にのみ依存して予後を判断している実情である。しかし、不幸にも肝臓癌の段階のみでは、各肝臓癌患者に対する予後を正確に判断することができない。
【０００７】
ＣＢＳタンパク質（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ    ｂｅｔａ‐ｓｙｎｔｈａｓｅ）は、ホモシスチン（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）をシスタチオニン（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ）に変換させる酵素であって、トランス‐硫化経路で作用し、生体内のメチオニンの代謝に重要な役割を果たすことが知られている［Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９４  Ｍａｙ  ２０；２６９（２０）：１４８３５‐４０］。
【０００８】
ＮＮＭＴタンパク質（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  Ｎ‐ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）は、ニコチンアミドとピリジンのＮ‐メチル化作用をする酵素であって、種々な薬物及び生体異物化合物（ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の代謝に関与することが知られている［Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９８  Ｓｅｐ  １５；５２（３）：３１２‐２４］。
【０００９】
ＴＫＴタンパク質（ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ）は、非‐酸化性ペントース‐フォスフェート経路で核心的な役割を果たす酵素であって、その群の一員としては、ＴＫＴＬ１（ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ‐ｌｉｋｅ  １）、ＴＫＴＬ２（ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ‐ｌｉｋｅ  ２）が知られている［Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９３  Ｊａｎ  １５；２６８（２）：１３９７‐４０４］。
【００１０】
ＡＩＦＭ１タンパク質（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ‐ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ、ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，１）は、ＡＩＦとしても知られているプラボタンパク質であり、細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）が起こると、このタンパク質は核に移動し、染色体凝集及び断片化を起こすこととなり、また、ミトコンドリアからシトクロムｃとカスパーゼ‐９の分泌を誘導することが知られている［Ｎａｔｕｒｅ．１９９９  Ｆｅｂ  ４；３９７（６７１８）：４４１‐６］。
【００１１】
ＡＫＴタンパク質は、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３と連関しているタンパク質であり、ホスファチジルイノシトール３‐キナーゼを通じた成長因子信号、すなわち、血小板‐由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インシュリン及びインシュリン‐類似成長因子Ｉ（ＩＧＦ‐Ｉ）などの信号を伝達する役割を果たし、活性化される場合、細胞死滅関連のタンパク質をリン酸化して不活性化することができると知られている［Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８７  Ｊｕｌ；８４（１４）：５０３４‐７］。
【００１２】
ＡＴＧ３タンパク質（ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ３  ｈｏｍｏｌｏｇ）は、ヒトのＡＴＧ８同族体であるＧＡＴＥ‐１６、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＭＡＰ‐ＬＣ３と脂質との結合に関与し、ＡＴＧ３が欠如したマウスは、オートファゴソーム（ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ）が形成できず、生後１日で死ぬことが報告された［Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００２  Ａｐｒ  １９；２７７（１６）：１３７３９‐４４．Ｅｐｕｂ  ２００２  Ｆｅｂ  １］。
【００１３】
ＡＧＴ５タンパク質（ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ５  ｈｏｍｏｌｏｇ）は、自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）に関与するが、ＡＴＧ５は、ＡＴＧ７とＡＴＧ１０の作用を通じてＡＴＧ１２‐ＡＴＧ５の接合を成すようになり、このＡＴＧ１２‐ＡＴＧ５は、オートファゴソームの膜に移動し、ＡＴＧ８とホスファチジルエタノールアミンとの結合に作用し、ＡＴＧ５がないマウスは、オートファゴソームが形成できず、生まれながら死ぬこととなり、切られたＡＴＧ５は、ミトコンドリアからシトクロムｃの分泌とカスパーゼの活性化を誘導することができると知られている［Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１０３２‐１０３６（２００４）］。
【００１４】
ＡＴＧ７タンパク質（ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｒｅｌａｔｅｄ ７ ｈｏｍｏｌｏｇ）は、自食作用に関与するが、ＡＴＧ７は、ＡＴＧ１０と共にＡＴＧ１２‐ＡＴＧ５の接合を成すようになり、これは、ＡＴＧ３と共にＡＴＧ８とホスファチジルエタノールアミンとの結合に関与し、ＡＴＧ７がないマウスは、オートファゴソームが形成できず、生まれながら死ぬことが報告された［Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１  Ｊａｎ  １９；２７６（３）：１７０１‐６．Ｅｐｕｂ  ２０００  Ｎｏｖ  ２８］。
【００１５】
ＡＴＧ１２タンパク質（ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  １２  ｈｏｍｏｌｏｇ）は、自食作用に関与するが、ＡＴＧ１２は、ＡＴＧ７とＡＴＧ１０の作用を通じてＡＴＧ１２‐ＡＴＧ５の接合を成し、このＡＴＧ１２‐ＡＴＧ５は、オートファゴソームの膜に移動し、ＡＴＧ８とホスファチジルエタノールアミンとの結合に作用すると知られている［Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９８  Ｄｅｃ 1８；２７３（５1）：３３８８９‐９２］。
【００１６】
ＢＡＸタンパク質（ＢＣＬ２‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、ＢＣＬ２タンパク質群の１つであって、ＢＣＬ２と結合して細胞死滅促進作用をし、ミトコンドリアの膜電位損失とシトクロムｃの分泌にも関与することが知られている［Ｃｅｌｌ．１９９３  Ａｕｇ  ２７；７４（４）：６０９‐1９］。
【００１７】
ＢＣＬ２タンパク質（Ｂ‐ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）は、ミトコンドリアの膜タンパク質であって、細胞死滅を抑制する作用をし、ミトコンドリアからシトクロムｃの分泌抑制、細胞死滅‐活性化因子との結合を通じてカスパーゼの活性化及び細胞死滅を抑制することが知られている［Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８６  Ｊｕｌ；８３（１４）：５２１４‐８］。
【００１８】
ＢＣＬ２Ｌ１タンパク質（Ｂｃｌ‐２‐ｌｉｋｅ  １  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、ＢＣＬ２タンパク質群の一員であって、ミトコンドリアの外膜に位置し、ミトコンドリアの膜チャネル共有に関与することが知られているが、２つの形態のイソ型で存在しており、より長い形態のＢＣＬ‐ＸＬは細胞死滅を抑制し、より短い形態のＢＣＬ‐ＸＳは細胞死滅を促進することが知られている［Ｃｅｌｌ．１９９３  Ａｕｇ  ２７；７４（４）：５９７‐６０８］。
【００１９】
ＢＮＩＰ３タンパク質（ＢＣＬ２／ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅ１Ｂ  １９ｋＤ‐ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３）は、Ｅ１Ｂ  １９  ｋＤａタンパク質及びＢＣＬ２と結合することができ、細胞死滅と自食作用を誘導する作用をすることが知られている［Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９７  Ｄｅｃ  １５；１８６（１２）：１９７５‐８３］。
【００２０】
ＣＡＳＰ８タンパク質（ｃａｓｐａｓｅ ８、ａｐｏｐｔｏｓｉｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）は、カスパーゼの群に属する酵素であって、ＦＡＳによる細胞死滅メカニズムの初期に作用するカスパーゼであり、これは、ＦＡＤＤとの結合及びタンパク質分解性切断を通じて活性化されると、種々の他のカスパーゼを活性化させることが知られている［Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９６  Ｄｅｃ  １０；９３（２５）：１４４８６‐９１；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９９７  Ａｕｇ  １５；３２６（Ｐｔ１）：１‐１６］］。
【００２１】
ＣＳＥ１Ｌタンパク質（ＣＳＥ１  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  １‐ｌｉｋｅ）は、インポーチン‐αを核から細胞質に再度送り出す役割を果たし、細胞死滅または細胞増殖にも関与することが知られている［Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９５  Ｏｃｔ  ２４；９２（２２）：１０４２７‐３１］。
【００２２】
ＤＩＡＢＬＯタンパク質（Ｄｉｒｅｃｔ  ＩＡＰ‐ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ  ｐＩ）は、ミトコンドリアに位置するタンパク質であり、細胞死滅が起こると、細胞質に移動してＩＡＰ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と結合し、カスパーゼの活性化に役立つことが知られている［Ｃｅｌｌ．２０００  Ｊｕｌ  ７；１０２（１）：４３‐５３］。
【００２３】
ＤＲＡＭタンパク質（ｄａｍａｇｅ‐ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）は、リソソームの膜タンパク質であり、ｐ５３腫瘍抑制子（ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）によって制御される自食作用に関与し、ｐ５３によって制御される細胞死滅にも必須的であると知られている［Ｃｅｌｌ．２００６  Ｊｕｌ  １４；１２６（１）：１２１‐３４］。
【００２４】
Ｅ２Ｆ１タンパク質（Ｅ２Ｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １）は、Ｅ２Ｆ群の転写因子の一員であって、細胞周期と腫瘍抑制子の制御と密接な関連があり、Ｒｂタンパク質と結合して細胞の成長を促進するか、またはｐ５３と関連する細胞死滅を誘導することが知られている［Ｇｅｎｅ．１９９６  Ｓｅｐ  １６；１７３（２）：１６３‐９］。
【００２５】
ＦＡＳタンパク質（ＡＰＯ‐１、ＣＤ９５、ＴＮＦＲＳＦ６）は、ＴＮＦ受容体群の一員であって、ＦＡＳリガンドの信号を受け、ＦＡＤＤ（Ｆａｓ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、カスパーゼ８、カスパーゼ１０と共にＤＩＳＣ（ｄｅａｔｈ‐ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）を構成し、細胞死滅を誘導することが知られている［Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９２  Ｍａｙ ２５；２６７（１５）：１０７０９‐１５］。
【００２６】
ＦＲＡＰ１タンパク質（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ）は、ｍＴＯＲとしても知られており、細胞内のＤＮＡ損傷、栄養枯渇などのストレスに対する反応を媒介し、ＦＲＡＰ１を含むＴＯＲＣ２複合体は、ＦＫＢＰ１２‐ラパマイシン複合体の細胞周期停止と免疫抑制作用のターゲットとなることが知られている［Ｎａｔｕｒｅ．１９９４  Ｊｕｎ  ３０；３６９（６４８３）：７５６‐８］。
【００２７】
ＬＡＭＰ１タンパク質（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）は、ＣＤ１０７ａ抗原としても知られており、膜糖タンパク質の一種であって、癌細胞の転移に関与すると考えられる［Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９０ Ｍａｙ  ５；２６５（１３）：７５４８‐５１］。
【００２８】
ＬＣ３タンパク質（ＭＡＰ１  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ３‐ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）は、微細小管‐連関タンパク質であって、微細小管と細胞骨格の相互作用に関与し、ＬＣ３タンパク質は、酵母のＡＴＧ８同族体であって、種々の自食作用のタンパク質の作用によってホスファチジルエタノールアミンと結合し、オートファゴソームを構成することが知られている［Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９４  Ａｐｒ  １５；２６９（１５）：１１４９２‐７］。
【００２９】
ＰＲＫＡＡ１タンパク質（ＡＭＰ‐ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ、ｃａｔａｌｙｔｉｃ、ａｌｐｈａ‐１）は、ＡＭＰＫの触媒性サブユニットであり、このＡＭＰＫは、細胞内のエネルギー水準を感知する役割を果たすタンパク質であって、ＡＭＰ／ＡＴＰの割合が増加すると活性化され、種々な生合成作用を制限する役割を果たすことが知られている［ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９４  Ｄｅｃ  １２；３５６（１）：１１７‐２１］。
【００３０】
ＰＴＥＮタンパク質（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｎｄ  ｔｅｎｓｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇ）は、腫瘍抑制子として知られており、様々な種類の癌で不活性化されており、タンパク質フォスファターゼであると共にホスファチジルイノシトール‐３，４，５‐トリスフォスフェート  ３‐フォスファターゼであって、ＰＩ３Ｋ‐ＡＫＴ／ＰＫＢ信号の伝達を弱化させる作用をすることが知られている［Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１９９７  Ａｐｒ；１５（４）：３５６‐６２］。
【００３１】
ＵＬＫ１タンパク質（Ｕｎｃ‐５１‐ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １）は、軸索突起の成長に関連するセリン／トレオニンキナーゼであり、ＡＴＧ１同族体としても知られており、自食作用と関連してｍＴＯＲによってリン酸化されることが知られている［Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９８  Ｊｕｌ  １；５１（１）：７６‐８５］。
【００３２】
ＸＩＡＰタンパク質（Ｘ‐ｌｉｎｋｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、ＩＡＰ群の一員であって、ＩＡＰの中でも強い細胞死滅抑制効果を有しており、腫瘍怪死因子受容体‐連関因子ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２との結合を通じた細胞死滅抑制、カスパーゼ活性抑制の作用をすることが知られている［Ｎａｔｕｒｅ．１９９６  Ｊａｎ  ２５；３７９（６５６３）：３４９‐５３］。
【００３３】
しかし、前記タンパク質は、具体的に肝臓癌組織で発現量や発現パターンがどのように変化するか、肝臓癌の予後推定においてどのように活用することができるかについては知られておらず、現在まで前記タンパク質や前記タンパク質をコーディングする遺伝子を肝臓癌の予後マーカーとして用いた例はなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００３４】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ．１９９９  Ｆｅｂ  ４；３９７（６７１８）：４４１‐６
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８７  Ｊｕｌ；８４（１４）：５０３４‐７
【非特許文献３】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００２  Ａｐｒ  １９；２７７（１６）：１３７３９‐４４．Ｅｐｕｂ  ２００２  Ｆｅｂ  １
【非特許文献４】Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１０３２‐１０３６（２００４）
【非特許文献５】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１  Ｊａｎ  １９；２７６（３）：１７０１‐６．Ｅｐｕｂ  ２０００  Ｎｏｖ  ２８
【非特許文献６】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９８  Ｄｅｃ 1８；２７３（５1）：３３８８９‐９２
【非特許文献７】Ｃｅｌｌ．１９９３  Ａｕｇ  ２７；７４（４）：６０９‐1９
【非特許文献８】Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８６  Ｊｕｌ；８３（１４）：５２１４‐８
【非特許文献９】Ｃｅｌｌ．１９９３  Ａｕｇ  ２７；７４（４）：５９７‐６０８
【非特許文献１０】Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９７  Ｄｅｃ  １５；１８６（１２）：１９７５‐８３
【非特許文献１１】Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９６  Ｄｅｃ  １０；９３（２５）：１４４８６‐９１
【非特許文献１２】Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９９７  Ａｕｇ  １５；３２６（Ｐｔ１）：１‐１６
【非特許文献１３】Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９５  Ｏｃｔ  ２４；９２（２２）：１０４２７‐３１
【非特許文献１４】Ｃｅｌｌ．２０００  Ｊｕｌ  ７；１０２（１）：４３‐５３
【非特許文献１５】Ｃｅｌｌ．２００６  Ｊｕｌ  １４；１２６（１）：１２１‐３４
【非特許文献１６】Ｇｅｎｅ．１９９６  Ｓｅｐ  １６；１７３（２）：１６３‐９
【非特許文献１７】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９２  Ｍａｙ ２５；２６７（１５）：１０７０９‐１５
【非特許文献１８】Ｎａｔｕｒｅ．１９９４  Ｊｕｎ  ３０；３６９（６４８３）：７５６‐８
【非特許文献１９】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９０ Ｍａｙ  ５；２６５（１３）：７５４８‐５１
【非特許文献２０】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９４  Ａｐｒ  １５；２６９（１５）：１１４９２‐７
【非特許文献２１】ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９４  Ｄｅｃ  １２；３５６（１）：１１７‐２１
【非特許文献２２】Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１９９７  Ａｐｒ；１５（４）：３５６‐６２
【非特許文献２３】Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９８  Ｊｕｌ  １；５１（１）：７６‐８５
【非特許文献２４】Ｎａｔｕｒｅ．１９９６  Ｊａｎ  ２５；３７９（６５６３）：３４９‐５３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３５】
本発明は、肝臓癌の予後と関連するバイオマーカーを提供し、肝臓癌患者の予後推定が簡便且つ正確に行われるようにし、さらに、肝臓癌の治療剤の開発に重要な始発点を提供することを目的とする。これによって、本発明においては、肝臓癌予後マーカー、前記肝臓癌予後マーカーの発現量の変化を検出する物質を含む肝臓癌予後推定用組成物、前記肝臓癌予後推定用組成物を含む肝臓癌予後推定用キット、前記肝臓癌予後マーカーを利用する肝臓癌予後推定方法、前記肝臓癌予後マーカーを活用した肝臓癌治療剤スクリーニング方法を提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
本発明者は、肝臓癌の発病が確認された多数の患者から採取した肝臓癌組織の遺伝子の発現程度を比較した後、各患者の経過によって特異的に過量または少量発現する遺伝子を検出し、肝臓癌予後推定に用いられ得る肝臓癌予後マーカーを発掘した。
【００３７】
本発明の第１の局面は、下記の遺伝子からなる群より選ばれる１つまたは２つ以上の組み合わせを含む肝臓癌予後マーカーに関する：
ＣＢＳ（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｂｅｔａ‐ｓｙｎｔｈａｓｅ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：２０９８６２８０２；配列番号７９）；
ＮＮＭＴ（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  Ｎ‐ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：６２９５３１３９；配列番号８０）；
ＴＫＴ（ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：２０５２７７４６１；配列番号８１）；
ＡＩＦＭ１（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ‐ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １、ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：２２２０２６２７；配列番号８２）；
ＡＫＴ１（ＲＡＣ‐ａｌｐｈａ  ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ‐ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：６２２４１０１０；配列番号８３）；
ＡＴＧ３（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ‐ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３；ＮＣＢＩ  ＧＩ：３４１４７４９０；配列番号８４）；
ＡＴＧ５（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５；ＮＣＢＩ  ＧＩ：９２８５９６９２；配列番号８５）；
ＡＴＧ７（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ‐ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７；ＮＣＢＩ  ＧＩ：２２２１４４２２５；配列番号８６）；
ＡＴＧ１２（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ‐ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １２；ＮＣＢＩ  ＧＩ：３８２６１９６８；配列番号８７）；
ＢＡＸ（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ＢＡＸ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：３４３３５１１４；配列番号８８）；
ＢＣＬ２（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  Ｂｃｌ‐２；ＮＣＢＩ  ＧＩ：７２１９８１８８；配列番号８９）；
ＢＣＬ２Ｌ１（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  Ｂｃｌ‐Ｘ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：２０３３６３３３；配列番号９０）；
ＢＮＩＰ３（ＢＣＬ２／ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅ１Ｂ  １９  ｋＤａ  ｐｒｏｔｅｉｎ‐ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３；ＮＣＢＩ  ＧＩ：７６６９４８０；配列番号９１）；
ＣＡＳＰ８（Ｃａｓｐａｓｅ‐８；ＮＣＢＩ  ＧＩ：１２２０５６４７０；配列番号９２）；
ＣＳＥ１Ｌ（Ｅｘｐｏｒｔｉｎ‐２；ＮＣＢＩ  ＧＩ：２９０２９５５８；配列番号９３）；
ＤＩＡＢＬＯ（Ｄｉａｂｌｏ  ｈｏｍｏｌｏｇ、ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：２１８５０５８１０；配列番号９４）；
ＤＲＡＭ（Ｄａｍａｇｅ‐ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：１１０８２５９７７；配列番号９５）；
Ｅ２Ｆ１（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｅ２Ｆ１；ＮＣＢＩ  ＧＩ：１６８４８０１０９；配列番号９６）；
ＦＡＳ（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ６；ＮＣＢＩ  ＧＩ：２３５１０４１９；配列番号９７）；
ＦＲＡＰ１（ＦＫＢＰ１２‐ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：２０６７２５５５０；配列番号９８）；
ＬＡＭＰ１（Ｌｙｓｏｓｏｍｅ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  １；ＮＣＢＩ  ＧＩ：１１２３８０６２７；配列番号９９）；
ＬＣ３［ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ］（Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １Ａ／１Ｂ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ３Ａ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：３１５６３５１９；配列番号１００）；
ＰＲＫＡＡ１（５'‐ＡＭＰ‐ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｌｐｈａ‐１；ＮＣＢＩ  ＧＩ：９４５５７３００；配列番号１０１）；
ＰＴＥＮ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ‐３，４，５‐ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ３‐ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｎｄ  ｄｕａｌ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ＰＴＥＮ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：１１０２２４４７４；配列番号１０２）；
ＵＬＫ１（Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ‐ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ＵＬＫ１；ＮＣＢＩ  ＧＩ：２２５６３７５６４；配列番号１０３）；及び
ＸＩＡＰ（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ  ＩＡＰ  ｒｅｐｅａｔ‐ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４；ＮＣＢＩ  ＧＩ：３２５２８２９８；配列番号１０４）。
【００３８】
肝臓癌の予後は、多様な観点から推定することができるが、代表的に再発可能性、生存可能性、無病生存可能性の観点から判断される。本明細書において記述された研究は、多数の肝臓癌患者の肝臓癌組織から遺伝子発現プロファイルを得て、これを再発可能性、生存可能性、無病生存可能性の観点を全て考慮した統計的データ処理過程を経て、有意に発現量の差が発生する遺伝子を検出し、肝臓癌の予後推定を可能にするマーカーを発掘する方式で進められた。
【００３９】
本明細書において、“肝臓癌予後マーカー”とは、肝臓癌発病後、予後が良好または不良な患者を予測する基準となる遺伝子マーカーを指称する。本発明において、このマーカーは、予後が良好な患者の肝臓癌組織内での発現量が、実験的に設定された基準値と比較して特徴的に多いかまたは少ない。具体的に、本発明において、このマーカーは、予後が良好な患者と不良な患者の肝臓癌組織内での発現の差に基づいて算出されるｐ‐値が有意に低い。好ましくは、前記ｐ‐値は０.０５未満である。
【００４０】
本発明は、肝臓癌の発病が確認された多数の患者の肝臓癌組織を対象として、治療経過が良好または不良な患者の肝臓癌組織の遺伝子発現プロファイルを基準値と比較して分析したものであるため、このように確認されたマーカーは、肝臓癌の予後が良好または不良な患者をそうではない患者と特異的に区分することができ、従って、肝臓癌の予後を推定するのに有用に用いられ得る。さらに、このように確認されたマーカーが特定予後の患者の肝臓癌組織で特異的に高発現または低発現するものであるという点を考えると、このマーカーの生理学的機能は、肝臓癌の発病及び進行、特に、前記予後と関連する生理学的機能に直接的に係っているものである可能性があり、従って、このマーカーは、肝臓癌の発病及び進行のメカニズムを研究するか、または肝臓癌治療剤の開発のための標的としても有用に用いられ得る。
【００４１】
特に、本発明の第１の局面の肝臓癌予後マーカーは、従来の由来がない程度の多数の患者の肝臓癌組織を統計的に分析して発掘したものであるため、極めて一部の患者の肝臓癌組織の遺伝子発現プロファイルに基づいて発掘された従来の肝臓癌関連マーカーに比べて、さらに有意性があり、臨床的に活用価値が高いマーカーであり、肝臓癌予後推定において、より正確な予測力を保有するものである。
【００４２】
本発明の第２の局面は、前記第１の局面の肝臓癌予後マーカーの発現量、発現パターン、または両者全てを特異的に検出する物質を含む肝臓癌予後推定用組成物に関する。
ここで、各肝臓癌予後マーカーの発現量や発現パターンは、該当遺伝子の転写によって生成されたｍＲＮＡの量やパターンを確認する通常の生化学的分析方法で検出され得る。このようなｍＲＮＡの量やパターンを確認するための分析方法としては、ＲＴ‐ＰＣＲ、競争的ＲＴ‐ＰＣＲ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＲＴ‐ＰＣＲ）、リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲ（Ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ  ＲＴ‐ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＮａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、ノーザンブロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ）、ＤＮＡマイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）などがあるが、その他にも、当業界において通常行われる如何なる方法であっても用いられ得る。
【００４３】
この分析方法によって、肝臓癌患者の生物学的試料におけるｍＲＮＡの量やパターンを基準値と比較することができ、これに基づいて本発明の肝臓癌予後マーカーの発現量、発現パターン、または両者全ての差を検出し、肝臓癌患者の予後を推定することが可能になる。本明細書において“生物学的試料”とは、肝臓癌予後マーカーの発現量や発現パターン、または肝臓癌予後マーカーがコーディングするタンパク質の存在量や存在パターンを検出することができる人体から分離した細胞、組織などを意味し、尿、血液、血漿、血清などを例として挙げることができるが、特にこれらに制限されるものではない。
【００４４】
ｍＲＮＡの量やパターンをＲＴ‐ＰＣＲで測定するためのキットは、本発明の肝臓癌予後マーカーのｍＲＮＡに特異的なプライマーを含む。本明細書において“プライマー”とは、テンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）と相補的に結合することができ、逆転写酵素またはＤＮＡ重合酵素がテンプレートの複製を開始することができるようにする自由３末端水酸化基（ｆｒｅｅ  ３'  ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｇｒｏｕｐ）を有する核酸配列を意味する。プライマーは、特定遺伝子の核酸配列に相補的な配列を有するヌクレオチドであって、約７ｂｐ〜５０ｂｐの長さ、好ましくは約１０ｂｐ〜３０ｂｐの長さが用いられ得る。その他、ＲＴ‐ＰＣＲキットは、具体的な実施様相によって、テストチューブまたは他の適切なコンテナ、反応緩衝液、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑ‐ポリメラーゼ及び逆転写酵素のような酵素、ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ抑制剤ＤＥＰＣ‐水（ＤＥＰＣ  wａｔｅｒ）、滅菌水などを含むことができる。プライマーは、適切な緩衝溶液及び温度で重合反応（すなわち、ＤＮＡ重合酵素または逆転写酵素）のための試薬及び異なる４つのヌクレオシドトリフォスフェートの存在下でＤＮＡ合成を開始させることができる。プライマーは。ＤＮＡ合成の開始点として作用するプライマーの基本性質を変化させないさらに他の塩基配列を含むこともできる。プライマーは、広く公知になっている方法を用いて化学的に合成することができ、このような核酸配列はまた、当該分野において公知になっている多くの手段を利用して変形させることができる。
【００４５】
本発明の第２の局面における“肝臓癌予後マーカーの発現量、発現パターン、または両者全てを特異的に検出する物質”は、該当肝臓癌予後マーカーの発現量や発現パターンの分析方法において、該当のマーカーに特異的に用いられ得る任意の物質またはそれら２つ以上の組み合わせであり得、必ずしもＲＴ‐ＰＣＲ用プライマーに制限されるものではない。本発明の第２の局面は、対象肝臓癌患者の肝臓癌組織での肝臓癌予後マーカーの発現量や発現パターンを基準値と比較してその差を検出することに技術的特徴があるものであるため、このような差の検出を可能にする物質は、どのようなものであっても“肝臓癌予後マーカーの発現量、発現パターン、または両者全てを特異的に検出する物質”として用いられ得、発明が目的とする技術的効果を達成することができ、当業者であれば、当業界における平均的な知識を参考にして具体的な実施様相によって適当な物質を選択／選別して用いることができるものである。
【００４６】
本発明の第３の局面は、前記第１の局面における肝臓癌予後マーカーがコーディングするタンパク質の存在量、存在パターン、または両者全てを特異的に検出する物質を含む肝臓癌予後推定用組成物に関する。
【００４７】
本発明の肝臓癌予後マーカーの発現量や発現パターンは、前記本発明の第２の局面のように、各マーカーの発現によるｍＲＮＡの量やパターンを検出する方法を用いることの他にも、試料内で各マーカーがコーディングするタンパク質の存在量や存在パターンを検出することにより、各マーカーの発現量や発現パターンを類推する方法を用いることもできる。
【００４８】
本発明において、肝臓癌予後マーカーがコーディングするタンパク質の存在量や存在パターンの特異的な検出は、生物学的試料内に本発明の肝臓癌予後マーカーがコーディングするタンパク質がどれほど存在するか、及びどのようなパターンで存在するかを確認する過程を意味し、例えば、前記肝臓癌予後マーカーがコーディングするタンパク質に対して特異的に結合する抗体を利用してその存在量や存在パターンを確認する過程が活用され得る。本明細書において“抗体”とは、抗原の抗原決定基（ｅｐｉｔｏｐｅ）に特異的に結合することができるタンパク質を意味し、多クローン抗体、単一クローン抗体及び組み換え抗体を全て含む概念である。
【００４９】
抗体を利用してタンパク質の存在量や存在パターンを測定する方法としては、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、放射線免疫分析（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、オークタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）免疫拡散法、ロケット（ｒｏｃｋｅｔ）免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈澱分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）、ＦＡＣＳ、タンパク質チップ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｉｐ）などがあるが、その他にも、当業界において通常行われる如何なる方法であっても用いられ得る。
【００５０】
この分析方法により、対象肝臓癌患者の生物学的試料での抗原‐抗体複合体の形成量やその形成パターンと基準値を比較することができ、これに基づいて本発明の肝臓癌予後マーカーがコーディングするタンパク質の存在量や存在パターンを判断することができ、窮極的に肝臓癌患者の予後を推定することができるようになる。
【００５１】
ここで、“抗原‐抗体複合体”とは、肝臓癌予後マーカーがコーディングするタンパク質とこれに対して特異的な抗体との結合物を意味し、抗原‐抗体複合体の形成量や形成パターンは、通常２次抗体に連係された検出ラベル（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｌａｂｅｌ）のシグナルの大きさ及びパターンを検出することにより測定が可能である。このような検出ラベルは、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微小粒子、レドックス分子、放射線同位元素などを例として挙げることができるが、必ずしもこれらに制限されるものではない。検出ラベルとして酵素が用いられる場合、利用可能な酵素には、β‐グルクロニダーゼ、β‐Ｄ‐グルコシダーゼ、β‐Ｄ‐ガラクトシダーゼ 、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼまたはアルカリ性フォスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヘキソキナーゼとＧＤＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ホスフェノールピルベートデカルボキシラーゼ、β‐ラクタマ‐ゼなどがあるが、これらに制限されない。検出ラベルとして蛍光物が用いられる場合、利用可能な蛍光物には、フルオレセイン、イソチオシアネート、ロダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ‐フタルアルデヒド、フルオレスカミンなどがあるが、これらに制限されない。検出ラベルとしてリガンドが用いられる場合、利用可能なリガンドには、ビオチン誘導体などがあるが、これに制限されない。検出ラベルとして発光物が用いられる場合、利用可能な発光物には、アクリジニウムエステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼなどがあるが、これらに制限されない。検出ラベルとして微小粒子が用いられる場合、利用可能な微小粒子には、コロイド金、着色されたラテックスなどがあるが、これらに制限されない。検出ラベルとしてレドックス分子が用いられる場合、利用可能なレドックス分子には、フェロセン、ルテニウム錯化合物、ビオロゲン、キノン、Ｔｉイオン、Ｃｓイオン、ジイミド、１，４‐ベンゾキノン、ハイドロキノン、Ｋ４Ｗ（ＣＮ）８、［Ｏｓ（ｂｐｙ）３］２＋、［ＲＵ（ｂｐｙ）３］２＋、［ＭＯ（ＣＮ）８］４‐などがあるが、これらに制限されない。検出ラベルとして放射性同位元素が用いられる場合、利用可能な放射性同位元素には３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉまたは１８６Ｒｅなどがあるが、これらに制限されない。
【００５２】
本発明の第３の局面における“肝臓癌予後マーカーがコーディングするタンパク質の存在量、存在パターン、または両者全てを特異的に検出する物質”は、肝臓癌予後マーカーがコーディングするタンパク質の存在量や存在パターンを検出するための分析方法において、そのマーカーがコーディングするタンパク質に対して特異的に用いられ得る任意の物質であり得、必ずしも抗体に制限されるものではない。本発明の第３の局面は、対象肝臓癌患者の生物学的試料で肝臓癌予後マーカーがコーディングするタンパク質の存在量や存在パターンを基準値と比較してその差を検出することに技術的特徴があるものであるため、このような差の検出を可能にする物質であれば、どのようなものであっても“肝臓癌予後マーカーがコーディングするタンパク質の存在量、存在パターン、または両者全てを特異的に検出する物質”として用いられ得、発明が目的とする技術的効果を達成することができ、当業者であれば、当業界における平均的な知識及び公知技術を参考にし、具体的な実施様相によって適当な物質を特別な困難なしに選択／選別して用いることができるものである。
【００５３】
本発明の第４の局面は、前記本発明の第２の局面または第３の局面の肝臓癌予後推定用組成物を含む肝臓癌予後推定用キットに関する。
本発明の肝臓癌予後推定用キットは、肝臓癌予後推定用組成物に含まれる肝臓癌予後マーカーの発現量、発現パターン、または両者全てを特異的に検出する物質、または肝臓癌予後マーカーがコーディングするタンパク質の存在量、存在パターン、または両者全てを特異的に検出する物質の他、遺伝子発現量や発現パターンの分析方法、またはタンパク質の存在量や存在パターンの分析方法に適した１種類またはそれ以上の他の構成成分、溶液または装置をさらに含むことができる。例えば、前記診断キットが遺伝子の発現量や発現パターンを検出するための診断キットである場合は、この診断キットは、ＲＴ‐ＰＣＲを行うために必要な必須成分を含む診断キットであり得、このようなＲＴ‐ＰＣＲキットは、マーカー遺伝子のｍＲＮＡに対する特異的なそれぞれのプライマーの他にも、具体的な実施様相によって、例えば、テストチューブまたは他の適切なコンテナ、反応緩衝液、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑ‐ポリメラーゼ及び逆転写酵素のような酵素、ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ抑制剤ＤＥＰＣ‐水（ＤＥＰＣ  wａｔｅｒ）、滅菌水、定量対照群として用いられる遺伝子に特異的なプライマー対などを含むことができる。一方、前記診断キットがタンパク質の存在量や存在パターンを検出するための診断キットである場合は、この診断キットは、例えば、ＥＬＩＳＡを行うために必要な必須成分を含む診断キットであり得、このようなＥＬＩＳＡキットは、結合した抗体を検出することができる成分、例えば、標識された２次抗体、発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｏｒｅｓ）、酵素（例えば、抗体と接合した酵素）及びその基質、及び定量対照群のタンパク質に特異的な抗体などを含むことができる。また、具体的な実施様相によって、前記診断キットは、ＤＮＡマイクロアレイまたはタンパク質マイクロアレイを含むことができる。
【００５４】
本発明の第５の局面は、前記本発明の第２の局面の肝臓癌予後推定用組成物を対象肝臓癌患者から採取した生物学的試料に処理する第１のステップ；及び第１のステップの処理結果を基準値と対比して第１項の肝臓癌予後マーカーの発現量、発現パターン、または両者全ての差を検出する第２のステップを含む肝臓癌予後推定方法に関する。また、さらに、本発明の第５の局面は、前記本発明の第３の局面の肝臓癌予後用組成物を肝臓癌患者から採取した生物学的試料に処理する第１のステップ；及び第１のステップの処理結果を基準値と対比して第１項の肝臓癌予後マーカーがコーディングするタンパク質の存在量、存在パターン、または両者全ての差を検出する第２のステップを含む肝臓癌予後推定方法に関する。
【００５５】
例えば、肝臓癌の予後が良好な患者の肝臓癌組織でさらに多く発現する肝臓癌予後マーカーの発現量の差を検出する場合は、もし、対象肝臓癌患者の生物学的試料での前記マーカーの発現量が基準値よりも多ければ、これは、肝臓癌の予後が相対的に良好であるという点を提示するものであると言える。一方、例えば、肝臓癌の予後が不良な患者の肝臓癌組織でさらに多く発現する肝臓癌予後マーカーの発現量の差を検出する場合は、もし、対象肝臓癌患者の生物学的試料での前記マーカーの発現量が基準値より多ければ、これは、肝臓癌の予後が相対的に不良であるという点を提示するものであると言える。
【００５６】
一方、例えば、肝臓癌の予後が良好な患者の肝臓癌組織でさらに多く発現する肝臓癌予後マーカーがコーディングするタンパク質の存在量の差を検出する場合は、もし、対象肝臓癌患者の生物学的試料での前記マーカーがコーディングするタンパク質の存在量が基準値より多ければ、これは、肝臓癌の予後が相対的に良好であるという点を提示するものであると言える。一方、例えば、肝臓癌の予後が不良な患者の肝臓癌組織でさらに多く発現する肝臓癌予後マーカーがコーディングするタンパク質の存在量の差を検出する場合は、もし、対象肝臓癌患者の生物学的試料での前記マーカーがコーディングするタンパク質の存在量が基準値より多ければ、これは、肝臓癌の予後が相対的に不良であるという点を提示するものであると言える。
【００５７】
本発明の第６の局面は、本発明の第１の局面の肝臓癌予後マーカーを活用した肝臓癌治療剤のスクリーニング方法に関する。本発明の第１の局面の肝臓癌予後マーカーは、肝臓癌患者の予後による発現様相の差が際立っているものであるため、肝臓癌の発病や進行、特に、前記予後と関連した生理学的機能に直接関与する遺伝子である可能性があり、従って、前記マーカーがコーディングするタンパク質は、肝臓癌の発病や進行のメカニズムを研究するか、または肝臓癌治療剤の開発のための標的タンパク質としても有用に用いられ得るものである。すなわち、本発明の第１の局面の肝臓癌予後マーカーは、肝臓癌の治療剤の開発における重要な前提を解決したものであるため、従って、このマーカーを利用して肝臓癌の治療剤をスクリーニングする方法もまた、本発明の範疇に属する。
【００５８】
本発明の第６の局面の例としては、試験化合物が本発明の第１の局面の肝臓癌予後マーカーの発現を促進または抑制するか否かを確認するステップを含む肝臓癌治療剤のスクリーニング方法を挙げることができる。このような治療剤をスクリーニングする方法としては、例えば、ＲＴ‐ＰＣＲ、競争的ＲＴ‐ＰＣＲ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＲＴ‐ＰＣＲ）、リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲ（Ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ  ＲＴ‐ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＮａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、ノーザンブロット、ＤＮＡマイクロアレイ、ＳＡＧＥ［Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４８４‐７］、ＭＰＳＳ［Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒｅｌｌｅｌ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ．ＵＳＡ．９７、１６６５‐１６７０］などを活用することができるが、その他にも、必要に応じて当業界において知られている多数の公知の方法を用いることができる。
【００５９】
一方、本発明の第６の局面の更なる例としては、本発明の第１の局面の肝臓癌予後マーカーがコーディングするタンパク質に試験化合物を結合させる第１のステップ；及び試験化合物が前記タンパク質の生理学的活性を促進または抑制するか否かを確認する第２のステップを含む肝臓癌治療剤のスクリーニング方法を挙げることができる。このような治療剤をスクリーニングする方法としては、本発明の第１の局面の肝臓癌早期診断用タンパク質性マーカーをアフィニティーコラムに固定させ、これを試料と接触させて精製する方法［Ｐａｎｄｙａ  ｅｔ  ａｌ，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ８７：１３５‐１４３、２００２］、ツー‐ハイブリッド（ｔｗｏ‐ｈｙｂｒｉｄ）方法を利用する方法、ウエスタンブロット、ハイスループットスクリーニング方法［Ｈｉｇｈ‐Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；Ａｖｉｅｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ６：１７１‐７、２００１］などを活用することができるが、その他にも、必要に応じて当業界において知られている多数の公知の方法を用いることができる。
【００６０】
本発明の第６の局面において、スクリーニングに用いるための試験化合物としては、例えば、組織抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成化合物、合成ペプチド、天然化合物などが用いられ得るが、これらに制限されない。
【００６１】
本発明の第７の局面は、本発明の第１の局面の肝臓癌予後マーカーがコーディングするタンパク質を特異的に認識する抗体に関する。
本発明の第１の局面の肝臓癌予後マーカーを特異的に認識する抗体は、肝臓癌予後マーカーがコーディングするタンパク質の存在量や存在パターンを特異的に検出する代表的な物質であり、従って、肝臓癌の予後推定のために有用に用いることができる物質に該当する。さらに、場合によっては、肝臓癌の発病や進行に重要な役割を担当するタンパク質の活性を特異的に促進または抑制することもでき、これによって肝臓癌に対する治療剤としても活用され得る。
【００６２】
本発明の第１の局面の肝臓癌予後マーカーが発掘されたため、これを利用して各肝臓癌予後マーカーがコーディングするタンパク質に対する多クローン抗体、単一クローン抗体及び組み換え抗体を製造することは、当業界において広く公知になっている技術を利用して容易に行われ得る。
【００６３】
多クローン抗体は、前記した本発明の第１の局面の肝臓癌予後マーカーがコーディングするタンパク質抗原を動物に注射し、動物から採血し、抗体を含む血清を得る、当業界において広く公知になっている方法によって生産することができる。このような多クローン抗体は、山羊、兎、羊、猿、馬、豚、牛、犬などの多様な動物種の宿主から製造可能であり、その製造方法は、当業界においてよく知られている。
【００６４】
単一クローン抗体は、当業界において広く公知になっているハイブリドーマ方法（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｍｅｔｈｏｄ）（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｎｒａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５１１‐５１９を参照）、またはファージ抗体ライブラリー（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４‐６２８、１９９１；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ.，２２２：５８，１‐５９７，１９９１）の技術などを利用して製造され得る。通常、ハイブリドーマ方法は、本発明の第１の局面の肝臓癌予後マーカーがコーディングするタンパク質抗原を注射したマウスのような免疫学的に好適な宿主動物からの細胞を利用し、残りの１つの集団としては、癌または骨髓種細胞株を利用する。このような２つの集団の組織をポリエチレングリコールのような当業界において広く公知になっている方法によって融合させてから、抗体‐生産細胞を標準的な組織培養方法によって増殖させる。限界希釈法（ｌｉｍｉｔｅｄ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）によるサブクローニングによって均一な細胞集団を得た後、所望の抗体を生産することができるハイブリドーマを公知の技術に従って試験管内でまたは生体内で大量に培養する。ファージ抗体ライブラリー方法は、所望の抗体の遺伝子を得てこれをファージの表面に融合タンパク質の形態で発現させることにより、抗体ライブラリーを試験管内で作製し、このライブラリーから所望の単一クローン抗体を分離して単一クローン抗体を作製する方法である。前記方法で製造された単一クローン抗体は、ゲル電気泳動、透析、塩沈澱、イオン交換クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィなどの公知の方法を利用して分離することができる。
【００６５】
本発明の第７の局面の抗体は、２つの全長の軽鎖及び２つの全長の重鎖を有する完全な形態だけではなく、抗体分子の機能的な断片を含む。抗体分子の機能的な断片とは、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）、Ｆ（ａｂ'）２及びＦｖなどがある。
【発明の効果】
【００６６】
本発明によって、本発明は、肝臓癌予後マーカー、前記肝臓癌予後マーカーの発現量の変化を検出する物質を含む肝臓癌予後推定用組成物、前記肝臓癌予後推定用組成物を含む肝臓癌予後推定用キット、前記肝臓癌予後マーカーを利用する肝臓癌予後推定方法、前記肝臓癌予後マーカーを活用した肝臓癌治療剤スクリーニング方法が提供される。
【００６７】
前記肝臓癌予後マーカーは、肝臓癌患者の簡便且つ正確な予後推定に有用に用いられ得る。さらに、このマーカーの生理学的機能は、肝臓癌の発病や進行に直接的に係っているものである可能性があり、従って、このマーカーは、肝臓癌の発病または進行のメカニズムを研究するか、または肝臓癌治療剤の開発のための標的としても有用に用いられ得る。
【００６８】
前記肝臓癌予後マーカーは、従来の由来がない程度の多数の患者の肝臓癌組織を統計的に分析して発掘したものであるため、さらに有意性があり、臨床的に活用価値が高いマーカーであり、肝臓癌予後推定において、より正確な予測力を保有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、本願発明の肝臓癌予後マーカーを再発、生存、無病生存の側面から測定して示したカプラン‐マイアー曲線である。
【図２】図２は、本願発明の肝臓癌予後マーカーを再発、生存、無病生存の側面から測定して示したカプラン‐マイアー曲線である。
【図３】図３は、本願発明の肝臓癌予後マーカーを再発、生存、無病生存の側面から測定して示したカプラン‐マイアー曲線である。
【図４】図４は、本願発明の肝臓癌予後マーカーを再発、生存、無病生存の側面から測定して示したカプラン‐マイアー曲線である。
【図５】図５は、本願発明の肝臓癌予後マーカーを再発、生存、無病生存の側面から測定して示したカプラン‐マイアー曲線である。
【図６】図６は、本願発明の肝臓癌予後マーカーを再発、生存、無病生存の側面から測定して示したカプラン‐マイアー曲線である。
【図７】図７は、本願発明の肝臓癌予後マーカーを再発、生存、無病生存の側面から測定して示したカプラン‐マイアー曲線である。
【図８】図８は、本願発明の肝臓癌予後マーカーを再発、生存、無病生存の側面から測定して示したカプラン‐マイアー曲線である。
【図９】図９は、本願発明の肝臓癌予後マーカーを再発、生存、無病生存の側面から測定して示したカプラン‐マイアー曲線である。
【図１０】図１０は、本願発明の肝臓癌予後マーカーを再発、生存、無病生存の側面から測定して示したカプラン‐マイアー曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、これは、本発明の理解を助けるためのものであるだけで、本発明の範囲をどのような方法であっても制限しようとするものではない。
発明を実施するための形態
【実施例】
【００７１】
実施例１：ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成
肝臓癌発病が診断されて進行経過が確認された１２０名の肝臓癌患者の肝臓癌組織及び周辺正常組織を入手した。下記の方式によって各組織のＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した。
【００７２】
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｋｉｔ（ドイツＱｉａｇｅｎ社）を用い、使用者説明書に従って肝臓癌組織及び周辺正常組織から全ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡ抽出物をＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（米国のＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて全ＲＮＡを定量した。抽出ステップにおいてＤＮａｓｅ  Ｉを処理し、ＲＮＡ抽出物で汚染したゲノムＤＮＡを取り除いた。全ＲＮＡ４μｇを含むサンプルを１μＭオリゴｄ（Ｔ）１８プライマー（韓国のＧｅｎｏｔｅｃｈ社）２μｌと共に７０℃で７分間培養し、氷の上で５分間冷やした。酵素混合液［０.１Ｍ  ＤＴＴ（オランダのＤｕｃｈｅｆａ社）２μｌ、１０×逆転写緩衝液２μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μｌ、２００Ｕ／μｌ  ＭＭＬＶ逆転写酵素１μｌ、及び４０Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ阻害子（韓国のＥｎｚｙｎｏｍｉｃｓ社）１μｌ；総計１１μｌ］を別途に準備した。酵素混合液を前記ＲＮＡを含むサンプルに添加し、４２℃で９０分間培養し、次いで、８０℃で１０分間培養し、逆転写酵素を不活性化させた。前記サンプルにジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）‐処理した水を添加し、最終体積が４００μｌとなるようにした。
【００７３】
実施例２：定量的リアルタイムＰＣＲ
実施例１で得られたｃＤＮＡサンプルのそれぞれについて、ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ（米国のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、使用者説明書に従って下記２種の遺伝子マーカーに対してリアルタイムＰＣＲ増幅を行った：
ＣＢＳ（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｂｅｔａ‐ｓｙｎｔｈａｓｅ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：２０９８６２８０２；配列番号７９）；及び
ＮＮＭＴ（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  Ｎ‐ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：６２９５３１３９；配列番号８０）。
【００７４】
リアルタイムＰＣＲ分析は、２×ＴaｑＭａｎ遺伝子発現株混合液（米国のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）５μｌ、５μＭ  フォワード及びリバースプライマーの各１μｌ、１μＭ  プローブ（韓国のＧｅｎｏｔｅｃｈ社）１μｌ、ｃＤＮＡ  ２μｌ（対照群の場合、同量の水）からなる総計１０μｌの体積でリアルタイムＰＣＲ分析を行った。９５℃で１０分間解離ステップを経た後、９５℃で１５秒間解離、６０℃で１分間合成の循環を通じて増幅させた。プライマーとプローブ配列は、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ３.０（米国のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて考案し、全てのプローブ配列は、５'末端にＦＡＭ及び３'末端にＴＡＭＲＡで標識した。各マーカーについて、下記の表１のようなプライマー及びプローブ配列が用いられた：
【００７５】
【表１】
0005745500.tif 000002
【００７６】
各マーカー遺伝子の発現を３回繰り返して測定し、５種の参照遺伝子（Ｂ２Ｍ、ＧＡＰＤＨ、ＨＭＢＳ、ＨＰＲＴ１、及びＳＤＨＡ）の平均的な発現を差し引いて標準化した。各マーカーのＣＴ（基準値を達成するのに所要されるサイクル回数）を測定し、ΔＣＴ値（各マーカーのＣＴ−参照遺伝子の平均ＣＴ）を計算し、ｍＲＮＡのコピー数は、２−ΔＣＴと計算された。ｃＤＮＡサンプルの連続的希釈物の同時的増幅の結果から標準曲線を完成した。
【００７７】
実施例３：統計的分析
実施例２で得られた各マーカーについての標準化された発現、及び各組織を提供した患者の経過を考慮し、カプラン‐マイアー曲線を完成した後、有意性の検定を行った。
【００７８】
肝臓癌組織を提供した１２０名の患者の経過に基づいて再発、生存、無病生存のそれぞれについて、期間が短い順に並べた。生存した患者（または再発した患者）を危険に晒された対象患者の数で分け、区間生存率（または区間再発率）を求めた。累積生存率（または累積再発率）は、条件付きの確率であり、以前までの累積生存率（または累積再発率）に現在の区間生存率（または区間再発率）をかけて求めた。横軸を生存時間（または観察期間）、縦軸を累積生存率（または累積再発率）として、階段関数で描いてカプラン‐マイアー曲線を完成させた。
【００７９】
各マーカーについて、再発、生存、無病生存に関するカプラン‐マイアー曲線を完成させた。実施例２で測定された各マーカーの発現を、実験的に決定された統計的に有意な基準値に基づいて高発現及び低発現に分類し、各マーカーについて高発現及び低発現の場合を分離してカプラン‐マイアー曲線を完成させた。完成したカプラン‐マイアー曲線を図１に示した。
【００８０】
図１から確認できるように、再発（Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）、生存（Ｏｖｅｒａｌｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ）、無病生存（Ｄｉｓｅａｓｅ‐ｆｒｅｅ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ）の側面から完成したカプラン‐マイアー曲線において、各マーカーは、高発現の場合と低発現の場合とが明らかに区分される曲線を形成した。これは、各マーカーが高発現する場合と低発現する場合の区間再発率や区間生存率、及びこれに基づいた累積再発率や累積生存率に顕著な差が発生するということを意味し、結果として各マーカーの発現様相が後で患者の再発可能性や生存可能性を示唆する指標となり得ることを意味するものである。
【００８１】
各マーカー及びその２つの組み合わせについて再発または死亡が生じた時点ごとに観察値と期待値を計算し、交差分析（Ｃｈｉ‐ｓｑｕａｒｅ  ｔｅｓｔ）の統計量を求める方式でログ順位（ｌｏｇ‐ｒａｎｋ）法による有意性の検定を施行し、ｐ‐値を算出した。算出されたｐ‐値は、下記の表２のとおりである。
【００８２】
【表２】
0005745500.tif 000003
【００８３】
前記表２から確認できるように、各マーカーまたはその２つの組み合わせは、再発、生存、無病生存の全てについて有意な程度に低いｐ‐値を示した。特に、２つのマーカーの組み合わせの場合、再発、生存及び無病生存についての全てのｐ‐値が０.０５未満と好ましかった。ｐ‐値が低ければ低いほど、統計的有意性は大きくなるものであるところ、前記低いｐ‐値は、各マーカーまたはその２つの組み合わせによる肝臓癌予後推定が、正確度が高いという点を示唆する。
【００８４】
実施例４：追加のマーカー発掘
１８５名の肝臓癌患者の肝臓癌組織及びその周辺正常組織を入手して実験したことを除いては、前記実施例１〜３と同様の方式で実験し、下記の遺伝子をマーカーとして用いたカプラン‐マイアー曲線とｐ‐値を得た：
ＴＫＴ（ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：２０５２７７４６１；配列番号８１）。
【００８５】
用いられたプライマー及びプローブは、下記の表３のとおりであり、カプラン‐マイアー曲線は、図２のとおりであり、算出されたｐ‐値は、表４のとおりである。
【００８６】
【表３】
0005745500.tif 000004
【００８７】
【表４】
0005745500.tif 000005
【００８８】
図２から確認できるように、再発、生存、無病生存の側面から完成したカプラン‐マイアー曲線において、前記マーカーは、高発現の場合と低発現の場合とが明確に区分される曲線を形成した。これは、前記マーカーが高発現する場合と低発現する場合の区間再発率や区間生存率、及びこれに基づいた累積再発率や累積生存率に顕著な差が発生するということを意味し、結果として前記マーカーの発現様相が後で患者の再発可能性や生存可能性を示唆する指標となり得ることを意味するものである。
【００８９】
前記表４から確認できるように、前記マーカーは、再発、生存、無病生存の全てについてｐ‐値が０.０５未満を示しており、好ましい水準に低いｐ‐値を示した。ｐ‐値が低ければ低いほど、統計的有意性は大きくなるものであるところ、前記低いｐ‐値は、前記マーカーによる肝臓癌予後推定が、正確度が高いという点を示唆する。
【００９０】
実施例５：追加のマーカー発掘
３６９名の肝臓癌患者の肝臓癌組織及びその周辺正常組織を入手して実験した以外は、前記実施例１〜３と同様の方式で実験し、下記２３種の遺伝子をマーカーとして用いたカプラン‐マイアー曲線とｐ‐値を得た：
ＡＩＦＭ１（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ‐ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １、ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：２２２０２６２７；配列番号８２）；
ＡＫＴ１（ＲＡＣ‐ａｌｐｈａ  ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ‐ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：６２２４１０１０；配列番号８３）；
ＡＴＧ３（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ‐ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３；ＮＣＢＩ  ＧＩ：３４１４７４９０；配列番号８４）；
ＡＴＧ５（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５；ＮＣＢＩ  ＧＩ：９２８５９６９２；配列番号８５）；
ＡＴＧ７（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ‐ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７；ＮＣＢＩ  ＧＩ：２２２１４４２２５；配列番号８６）；
ＡＴＧ１２（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ‐ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １２；ＮＣＢＩ  ＧＩ：３８２６１９６８；配列番号８７）；
ＢＡＸ（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ＢＡＸ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：３４３３５１１４；配列番号８８）；
ＢＣＬ２（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  Ｂｃｌ‐２；ＮＣＢＩ  ＧＩ：７２１９８１８８；配列番号８９）；
ＢＣＬ２Ｌ１（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  Ｂｃｌ‐Ｘ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：２０３３６３３３；配列番号９０）；
ＢＮＩＰ３（ＢＣＬ２／ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅ１Ｂ  １９  ｋＤａ  ｐｒｏｔｅｉｎ‐ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３；ＮＣＢＩ  ＧＩ：７６６９４８０；配列番号９１）；
ＣＡＳＰ８（Ｃａｓｐａｓｅ‐８；ＮＣＢＩ  ＧＩ：１２２０５６４７０；配列番号９２）；
ＣＳＥ１Ｌ（Ｅｘｐｏｒｔｉｎ‐２；ＮＣＢＩ  ＧＩ：２９０２９５５８；配列番号９３）；
ＤＩＡＢＬＯ（Ｄｉａｂｌｏ  ｈｏｍｏｌｏｇ、ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：２１８５０５８１０；配列番号９４）；
ＤＲＡＭ（Ｄａｍａｇｅ‐ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：１１０８２５９７７；配列番号９５）；
Ｅ２Ｆ１（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｅ２Ｆ１；ＮＣＢＩ  ＧＩ：１６８４８０１０９；配列番号９６）；
ＦＡＳ（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ６；ＮＣＢＩ  ＧＩ：２３５１０４１９；配列番号９７）；
ＦＲＡＰ１（ＦＫＢＰ１２‐ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：２０６７２５５５０；配列番号９８）；
ＬＡＭＰ１（Ｌｙｓｏｓｏｍｅ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  １；ＮＣＢＩ  ＧＩ：１１２３８０６２７；配列番号９９）；
ＬＣ３［ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ］（Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １Ａ／１Ｂ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ３Ａ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：３１５６３５１９；配列番号１００）；
ＰＲＫＡＡ１（５'‐ＡＭＰ‐ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｌｐｈａ‐１；ＮＣＢＩ  ＧＩ：９４５５７３００；配列番号１０１）；
ＰＴＥＮ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ‐３，４，５‐ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ３‐ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｎｄ  ｄｕａｌ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ＰＴＥＮ；ＮＣＢＩ  ＧＩ：１１０２２４４７４；配列番号１０２）；
ＵＬＫ１（Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ‐ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ＵＬＫ１；ＮＣＢＩ  ＧＩ：２２５６３７５６４；配列番号１０３）；及び
ＸＩＡＰ（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ  ＩＡＰ  ｒｅｐｅａｔ‐ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４；ＮＣＢＩ  ＧＩ：３２５２８２９８；配列番号１０４）
用いられたプライマー及びプローブは、下記の表５のとおりであり、カプラン‐マイアー曲線は、図３〜１０のとおりであり、各マーカーについて算出されたｐ‐値は、表６のとおりである。２種のマーカーが任意に組み合わせられた場合に算出されたｐ‐値は、表７〜９のとおりである。
【００９１】
【表５】
0005745500.tif 000006
【００９２】
【表６】
0005745500.tif 000007
【００９３】
【表７】
0005745500.tif 000008
【００９４】
【表８】
0005745500.tif 000009
【００９５】
【表９】
0005745500.tif 000010
【００９６】
図３〜１０から確認できるように、再発、生存、無病生存の側面から完成したカプラン‐マイアー曲線において、各マーカーは、高発現の場合と低発現の場合とが明確に区分される曲線を形成した。これは、各マーカーが高発現する場合と低発現する場合、区間再発率や区間生存率、及びこれに基づいた累積再発率や累積生存率に顕著な差が発生するということを意味し、結果として各マーカーの発現様相が後で患者の再発可能性や生存可能性を示唆する指標となり得ることを意味するものである。
【００９７】
前記表６〜９から確認できるように、各マーカーまたは２種のマーカーの全ての組み合わせは、再発、生存、無病生存の全てについて有意な程度に低いｐ‐値を示した。ｐ‐値が低ければ低いほど、統計的有意性は大きくなるものであるところ、前記低いｐ‐値は、各マーカーまたはこれらの組み合わせによる肝臓癌予後推定が正確であるという点を示唆する。特に、各マーカーまたは２種のマーカーの任意の組み合わせは、ほとんどが０.０５未満の好適に低いｐ‐値を示した。
【００９８】
３種以上のマーカーの組み合わせについてのｐ‐値は、いずれも０.０５未満であった。最もｐ‐値が低い単一マーカーや２つ以上のマーカーの組み合わせ及び該当ｐ‐値は、下記の表１０のとおりである。
【００９９】
【表１０】
0005745500.tif 000011
【０１００】
前記表１０から、本発明のマーカーは組み合わせられば組み合わせられるほど、ｐ‐値が低くなるという点が分かる。これは、本発明のマーカーは組み合わせられば組み合わせられるほど、さらに有意な程度に低いｐ‐値を示すというものであって、このマーカーの組み合わせに基づいた予後推定の正確度は、さらに向上するという点が分かる。
【０１０１】
実施例６：交差検証
実施例５において統計的に有意に示されたマーカーの組み合わせについて、交差検証を行った。
【０１０２】
３６９名の肝臓癌患者を無作為に２群（陽性群：１８５名；試験群：１８４名）に分け、陽性群に対して前記実施例３と同様の方式で統計的に有意に示される基準値を実験的に設定し、高発現と低発現を分類した。このように設定された基準値を固定したまま、試験群に対して再発、生存、無病生存の側面からｐ＜０.０５またはｐ＜０.００１の水準で予測正確度を計算した。
【０１０３】
再発、生存、無病生存の各側面において、優れた予測正確度を示した代表的な例は次のとおりである。
再発：ＡＩＦＭ１_ＡＫＴ１_ＬＣ３（ｐ＜０.０５の水準で７７.３％）
生存：ＡＴＧ５_ＤＲＡＭ_ＦＡＳ_ＸＩＡＰ（ｐ＜０.００１の水準で８７.３％）
無病生存：ＡＩＦＭ１_ＡＫＴ１_ＬＣ３（ｐ＜０.０５の水準で７１.３％）
【図１】
0005745500.tif 000012
【図２】
0005745500.tif 000013
【図３】
0005745500.tif 000014
【図４】
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【図５】
0005745500.tif 000016
【図６】
0005745500.tif 000017
【図７】
0005745500.tif 000018
【図８】
0005745500.tif 000019
【図９】
0005745500.tif 000020
【図１０】
0005745500.tif 000021
【配列表】
0005745500000001.app