(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型光合成微生物と比較して低下した量のグリコーゲンを蓄積する改変された光合成微生物であって、前記改変された光合成微生物は、
（ａ）野生型光合成微生物と比較して、グルコース−１−リン酸アデニルトランスフェラーゼ（ｇｌｇＣ）遺伝子、ホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）遺伝子、およびグリコーゲンシンターゼ（ｇｌｇＡ）遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現が低下している、および
（ｂ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）、またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている、１つまたは複数の導入されたポリヌクレオチドを含む、改変された光合成微生物であって、
前記改変された光合成微生物は、ＤＧＡＴをコードしている前記導入されたポリヌクレオチドを有する、前記１つまたは複数の遺伝子の発現の低下も変異もない光合成微生物と比較して、増加した量のトリグリセリド、ワックスエステル、またはその両方を蓄積し、
前記光合成微生物がラン藻である、
改変された光合成微生物。
【請求項２】
野生型光合成微生物と比較して、ストレス条件下で低下した量のグリコーゲンを蓄積する、請求項１に記載の改変された光合成微生物。
【請求項３】
野生型光合成微生物と比較して、増加した量の脂質を蓄積する、請求項１から２のいずれかに記載の改変された光合成微生物。
【請求項４】
前記１つまたは複数の遺伝子が完全または部分的な遺伝子欠失を含む、請求項１に記載の改変された光合成微生物。
【請求項５】
前記ラン藻がＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓである、請求項１から４のいずれかに記載の改変された光合成微生物。
【請求項６】
前記Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓがＰＣＣ  ７９４２株である、請求項５に記載の改変されたラン藻。
【請求項７】
Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２株の塩耐性変異体である、請求項６に記載の改変されたラン藻。
【請求項８】
前記ラン藻がＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２である、請求項１から４のいずれかに記載の改変された光合成微生物。
【請求項９】
前記ラン藻がＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３である、請求項１から４のいずれかに記載の改変された光合成微生物。
【請求項１０】
野生型光合成微生物と比較して、ストレス条件下で低下した量のグリコーゲンを蓄積する改変された光合成微生物を作製する方法であって、前記方法は：
（ａ）グルコース−１−リン酸アデニルトランスフェラーゼ（ｇｌｇＣ）遺伝子、ホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）遺伝子、およびグリコーゲンシンターゼ（ｇｌｇＡ）遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが、野生型光合成微生物における前記ｇｌｇＣ遺伝子の発現レベルと比較して低下しているように、光合成微生物を改変する工程、および
（ｂ）光合成微生物内に、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチドを導入する工程を含む、方法であって、
前記改変された光合成微生物は、ＤＧＡＴをコードしている前記導入されたポリヌクレオチドを有する、前記１つまたは複数の遺伝子の発現の低下も変異もない光合成微生物と比較して、増加した量のトリグリセリド、ワックスエステル、またはその両方を蓄積し、
前記光合成微生物がラン藻である、
方法。
【請求項１１】
前記１つまたは複数の遺伝子が完全または部分的な遺伝子欠失を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記光合成微生物がＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓである、請求項１０から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓがＰＣＣ  ７９４２株である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓがＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２株の塩耐性変異体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記光合成微生物がＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２である、請求項１０から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記光合成微生物がＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３である、請求項１０から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
グリコーゲン以外の炭素ベースの生成物を産生させる方法であって、前記方法は、改変された光合成微生物中で前記炭素ベースの生成物を産生させる工程を含み、前記改変された光合成微生物は：
（ａ）グルコース−１−リン酸アデニルトランスフェラーゼ（ｇｌｇＣ）遺伝子、ホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）遺伝子、およびグリコーゲンシンターゼ（ｇｌｇＡ）遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現が低下している、および
（ｂ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている、導入されたポリヌクレオチド
を有する、方法であって、
前記改変された光合成微生物は、ＤＧＡＴをコードしている前記導入されたポリヌクレオチドを有する、前記１つまたは複数の遺伝子の発現の低下も変異もない光合成微生物と比較して、増加した量のトリグリセリド、ワックスエステル、またはその両方を蓄積し、
前記光合成微生物がラン藻である、
方法。
【請求項１８】
前記光合成微生物が、野生型光合成微生物と比較して、ストレス条件下で低下した量のグリコーゲンを蓄積する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記光合成微生物が、野生型光合成微生物と比較して、増加した量の前記炭素ベースの生成物を蓄積する、請求項１７から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記１つまたは複数の遺伝子が完全または部分的な遺伝子欠失を含む、請求項１７から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記光合成微生物がＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓである、請求項１７から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓがＰＣＣ  ７９４２株である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓがＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２株の塩耐性変異体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記光合成微生物がＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２である、請求項１７から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記光合成微生物がＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３である、請求項１７から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記炭素ベースの生成物が脂質を含む、請求項１７から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記脂質が脂肪酸である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記炭素ベースの生成物がトリグリセリド、ワックスエステルまたはその両方である、請求項１７から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記１つまたは複数のポリヌクレオチドが前記光合成微生物の天然のゲノムに対して外因性である、請求項１７から２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記炭素ベースの生成物が、生物燃料または他の特殊化学製品の供給原料である、請求項１７から２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記炭素ベースの生成物が、生物燃料または他の特殊化学製品である、請求項１７から２９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００８年１２月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／１４０，５４５号の利益を主張する。この仮出願は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本出願に関連する配列表は、紙書類の代わりにテキストフォーマットで提供し、本明細書中に参考として組み込まれている。配列表を含有するテキストファイル名は８９００７１＿４０２ＰＣ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。テキストファイルは２７４ＫＢであり、２００９年１２月２２日に作成し、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子提出した。
【０００３】
本発明は、一般に、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路を無能とした、ラン藻を含めた遺伝子改変された光合成微生物、ならびに、遺伝子改変されたラン藻を供給原料として、たとえば、生物燃料および他の特殊化学製品（ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌ）を生成するために使用する関連方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
トリグリセリドとは、３個の脂肪酸分子でエステル化されたグリセロールからなる中性の極性分子である。トリグリセリドは、植物および藻類を含めたほとんどの真核生物、ならびに放線菌の特定の種およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属のメンバーを含めた特定の原核生物によって、炭素およびエネルギー貯蔵分子として利用されている。
【０００５】
また、トリグリセリドは、生物燃料および／または様々な特殊化学製品の生成における供給原料としても利用し得る。たとえば、トリグリセリドをエステル交換反応に供してもよく、その場合、アルコールを植物油、動物性脂肪、再処理油脂中に含有されるものなどのトリグリセリド油と反応させて、脂肪酸アルキルエステルなどのバイオディーゼルを生成する。また、そのような反応ではグリセリンも副産物として生成され、これは、製薬および化粧品の業界で使用するために精製することができる。
【０００６】
特定の生物を生物燃料の生成においてトリグリセリド源として利用することができる。たとえば、藻類はトリグリセリドをエネルギー貯蔵分子として天然に産生し、特定の生物燃料関連技術は、現在、生物燃料の供給原料としての藻類の使用を中心としている。藻類は光合成生物であり、藻類などのトリグリセリド産生生物の使用は、太陽光、水、ＣＯ２、多量要素、および微量栄養素からバイオディーゼルを生成する能力を提供する。しかし、藻類は容易に遺伝子操作することができず、培養条件下では野生よりもはるかに少ない油（すなわちトリグリセリド）しか産生しない。
【０００７】
藻類と同様、ラン藻は光合成からエネルギーを得て、クロロフィルＡおよび水を利用してＣＯ２を還元する。特定のラン藻は、太陽光、水、ＣＯ２、および無機塩のみから炭水化物、タンパク質、および脂肪酸などの代謝物を産生することができる。藻類とは異なり、ラン藻は遺伝子操作することができる。たとえば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２（「Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２」とも呼ばれる）は、低栄養素レベル条件下でもよく育つ、遺伝子操作可能な栄養不良のラン藻であり、野生では、脂肪酸を脂質膜の形態で、乾重量で約４％または８％まで蓄積する。しかし、ラン藻は典型的にはトリグリセリド合成に関与する必須酵素を欠くため、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓなどのラン藻はトリグリセリドエネルギー貯蔵分子を産生しない。その代わりに、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓは、野生では、典型的にはその主な炭素貯蔵形態としてグリコーゲンを蓄積する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、明らかに、当分野では、たとえば生物燃料および／または様々な特殊化学製品の生成において供給原料として使用する、トリグリセリドおよび脂肪酸を産生できる、ラン藻を含めた改変された光合成微生物の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
様々な実施形態では、本発明は、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路を無能とした改変された光合成微生物、およびトリグリセリドを合成することができる改変された光合成微生物、ならびに、たとえば生物燃料および他の特殊化学製品を生成するための供給原料として遺伝子改変された光合成微生物を使用する関連方法を提供する。特定の実施形態では、改変された光合成微生物はラン藻である。
【００１０】
一実施形態では、本発明には、野生型光合成微生物、たとえば同じ種の野生型光合成微生物における１つまたは複数の遺伝子の発現レベルと比較して、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが低下している、改変された光合成微生物が含まれる。特定の実施形態では、改変された光合成微生物は、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の１つまたは複数の遺伝子中に突然変異を含む。特定の実施形態では、突然変異は完全または部分的な遺伝子欠失である。
【００１１】
関連する実施形態では、本発明には、グリコーゲン分解経路のタンパク質またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている１つまたは複数の導入されたポリヌクレオチドを含む、改変された光合成微生物が含まれる。特定の実施形態では、導入されたポリヌクレオチドは、光合成微生物の天然のゲノムに対して外因性である、たとえば、これは異なる種に由来するポリヌクレオチドであり得る。他の実施形態では、導入されたポリヌクレオチドは、光合成微生物のゲノムにネイティブなポリヌクレオチド、すなわち、光合成微生物中に通常存在する遺伝子またはタンパク質に対応するものであるが、たとえば導入した発現ベクターから過剰発現される。特定の実施形態では、ベクターは誘導性ベクターである。特定の実施形態では、導入されたポリヌクレオチドは、一過的にまたは安定して光合成微生物中に存在する。したがって、様々な実施形態では、導入されたポリヌクレオチドを光合成微生物またはその先祖内に導入する。特定の実施形態では、導入されたポリヌクレオチドは、グリコーゲンホスホリラーゼ（ＧｌｇＰ）、グリコーゲン脱分枝酵素（ＧｌｇＸ）、アミロマルターゼ（ＭａｌＱ）、ホスホグルコムターゼ（Ｐｇｍ）、グルコキナーゼ（Ｇｌｋ）、および／もしくはホスホグルコースイソメラーゼ（Ｐｇｉ）、またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている。
【００１２】
さらなる関連する実施形態では、本発明には、野生型光合成微生物における１つまたは複数の遺伝子の発現レベルと比較して、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが低下しており、また、グリコーゲン分解経路のタンパク質またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている１つまたは複数の導入されたポリヌクレオチドも含む、改変された光合成微生物が含まれる。
【００１３】
特定の実施形態では、本発明の改変された光合成微生物、たとえばラン藻（Ｃｙｎａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）は、野生型光合成微生物と比較して、ストレス条件下で低下した量のグリコーゲンを合成または蓄積する。関連する実施形態では、この光合成微生物は、野生型光合成微生物と比較して増加した量の脂質を合成または蓄積する。特定の実施形態では、ストレス条件は低窒素条件である。様々な他の実施形態では、本発明の改変された光合成微生物は、非ストレス条件下の野生光合成微生物と比較して、低下した量のグリコーゲンおよび／または増加した量の脂質を合成または蓄積する。
【００１４】
特定の実施形態では、本発明の改変された光合成微生物において発現が低下している１つまたは複数の遺伝子は、グルコース−１−リン酸アデニルトランスフェラーゼ（ｇｌｇＣ）、ホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）、および／またはグリコーゲンシンターゼ（ｇｌｇＡ）から選択される。特定の実施形態では、改変された光合成微生物は、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の１つまたは複数の遺伝子の突然変異を含む。具体的な一実施形態では、光合成微生物は、ｇｌｇＣ遺伝子またはｐｇｍ遺伝子の突然変異を含む。具体的な一実施形態では、光合成微生物は、ｇｌｇＣ遺伝子およびｐｇｍ遺伝子の突然変異を含む。様々な実施形態では、突然変異は完全または部分的な遺伝子欠失である。
【００１５】
特定の実施形態では、改変された光合成微生物はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓである。一実施形態では、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓはＰＣＣ  ７９４２株である。特定の実施形態では、改変された光合成微生物は、Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２の塩耐性変異体である。他の実施形態では、改変された光合成微生物はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２またはＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３である。
【００１６】
さらなる関連する実施形態では、本発明は、光合成微生物におけるグリコーゲンの生合成または貯蔵経路の１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが低下するように光合成微生物を改変すること、および／あるいは、光合成微生物内にグリコーゲン分解経路のタンパク質またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチドを導入することを含む、野生型光合成微生物と比較して低下した量のグリコーゲンを蓄積する光合成微生物、たとえばラン藻を生成する方法を提供する。特定の実施形態では、発現が低下している１つまたは複数の遺伝子は、グルコース−１−リン酸アデニルトランスフェラーゼ（ｇｌｇＣ）、ホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）、および／またはグリコーゲンシンターゼ（ｇｌｇＡ）である。特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子を突然変異させる。特定の実施形態では、突然変異は、遺伝子の一部分または全体を欠失させることを含む。特定の一実施形態では、ｇｌｇＣ遺伝子およびｐｇｍ遺伝子を突然変異させる。特定の実施形態では、改変された光合成微生物は、ストレス条件下で低下した量のグリコーゲンを蓄積する。一実施形態では、ストレス条件は低窒素条件である。他の実施形態では、改変された光合成微生物は、非ストレス条件下で低下した量のグリコーゲンを蓄積する。
【００１７】
別の関連する実施形態では、本発明は、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが低下している、および／あるいは、グリコーゲン分解経路のタンパク質またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む、改変された光合成微生物、たとえばラン藻において、前記炭素ベースの生成物を産生させることを含む、グリコーゲン以外の炭素ベースの生成物を産生させる方法を提供する。特定の実施形態では、光合成微生物は、野生型光合成微生物と比較して、ストレス条件下、たとえば低窒素条件下で低下した量のグリコーゲンを蓄積する。特定の実施形態では、光合成微生物は、野生型光合成微生物と比較して、増加した量の前記炭素ベースの生成物を蓄積する。特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子は、グルコース−１−リン酸アデニルトランスフェラーゼ（ｇｌｇＣ）、ホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）、および／またはグリコーゲンシンターゼ（ｇｌｇＡ）である。特定の一実施形態では、光合成微生物は、発現が低下している１つまたは複数の遺伝子中に突然変異を含む。特定の実施形態では、遺伝子には、ｇｌｇＣ遺伝子および／またはｐｇｍ遺伝子が含まれる。一部の実施形態では、突然変異は完全または部分的な遺伝子欠失である。
【００１８】
本発明の方法の特定の実施形態では、光合成微生物はラン藻である。特定の実施形態では、ラン藻はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓである。一実施形態では、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓはＰＣＣ  ７９４２株である。特定の実施形態では、改変された光合成微生物は、Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２の塩耐性変異体である。他の実施形態では、改変された光合成微生物はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２またはＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３である。
【００１９】
本発明の組成物および方法の様々な実施形態では、炭素ベースの生成物は脂質を含む。一実施形態では、脂質は脂肪酸である。一実施形態では、炭素ベースの生成物はトリグリセリドである。
【００２０】
特定の実施形態では、上述の改変された光合成微生物のうちの任意のものは、脂肪酸、トリグリセリド、または脂質の生合成に関連する１つまたは複数の酵素をコードしている１つまたは複数の導入されたポリヌクレオチドをさらに含む。特定の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、光合成微生物の天然のゲノムに対して外因性である。特定の実施形態では、１つまたは複数の酵素には、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）が含まれる。特定の実施形態では、１つまたは複数の酵素は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）またはホスファチジン酸ホスファターゼを含む。
【００２１】
本発明の特定の実施形態では、炭素ベースの生成物は、生物燃料または他の特殊化学製品の供給原料である。一実施形態では、炭素ベースの生成物は、生物燃料または他の特殊化学製品である。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
野生型光合成微生物と比較して低下した量のグリコーゲンを蓄積する改変された光合成微生物であって、前記光合成微生物は、
（ａ）野生型光合成微生物と比較して、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の１つまたは複数の遺伝子の発現が低下している、および／あるいは
（ｂ）グリコーゲン分解経路のタンパク質、またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている、１つまたは複数の導入されたポリヌクレオチドを含む
、改変された光合成微生物。
（項目２）
ラン藻である、項目１に記載の改変された光合成微生物。
（項目３）
野生型光合成微生物と比較して、ストレス条件下で低下した量のグリコーゲンを蓄積する、項目１または項目２に記載の改変された光合成微生物。
（項目４）
野生型光合成微生物と比較して、増加した量の脂質を蓄積する、項目１から３のいずれかに記載の改変された光合成微生物。
（項目５）
前記１つまたは複数の遺伝子が、グルコース−１−リン酸アデニルトランスフェラーゼ（ｇｌｇＣ）遺伝子、ホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）遺伝子、およびグリコーゲンシンターゼ（ｇｌｇＡ）遺伝子からなる群から選択される、項目１から４のいずれかに記載の改変された光合成微生物。
（項目６）
前記１つまたは複数の遺伝子が前記ｇｌｇＣ遺伝子を含む、項目５に記載の改変された光合成微生物。
（項目７）
前記１つまたは複数の遺伝子が前記ｐｇｍ遺伝子を含む、項目５に記載の改変された光合成微生物。
（項目８）
前記１つまたは複数の遺伝子が前記ｇｌｇＡ遺伝子を含む、項目５に記載の改変された光合成微生物。
（項目９）
前記１つまたは複数の遺伝子が前記ｇｌｇＣ遺伝子および前記ｐｇｍ遺伝子を含む、項目５に記載の改変された光合成微生物。
（項目１０）
前記１つまたは複数の遺伝子が完全または部分的な遺伝子欠失を含む、項目１に記載の改変された光合成微生物。
（項目１１）
前記光合成微生物が、ラン藻であり、前記ラン藻がＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓである、項目２から１０のいずれかに記載の改変された光合成微生物。
（項目１２）
前記Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓがＰＣＣ  ７９４２株である、項目１１に記載の改変されたラン藻。
（項目１３）
Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２株の塩耐性変異体である、項目１２に記載の改変されたラン藻。
（項目１４）
前記光合成微生物が、ラン藻であり、前記ラン藻がＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２である、項目２から１０のいずれかに記載の改変された光合成微生物。
（項目１５）
前記光合成微生物が、ラン藻であり、前記ラン藻がＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３である、項目２から１０のいずれかに記載の改変された光合成微生物。
（項目１６）
グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の１つまたは複数の遺伝子の発現が低下している、項目１から１５のいずれかに記載の改変された光合成微生物。
（項目１７）
グリコーゲン分解経路の１つまたは複数のタンパク質、またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている１つまたは複数の導入されたポリヌクレオチドを含む、項目１から１５のいずれか一項に記載の改変された光合成微生物。
（項目１８）
トリグリセリドまたは脂質の生合成に関連する１つまたは複数の酵素をコードしている１つまたは複数の導入されたポリヌクレオチドを含む、項目１から１７のいずれかに記載の改変された光合成微生物。
（項目１９）
前記１つまたは複数の酵素がアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）を含む、項目１８に記載の改変された光合成微生物。
（項目２０）
前記１つまたは複数の酵素がホスファチジン酸ホスファターゼを含む、項目１８に記載の改変された光合成微生物。
（項目２１）
前記１つまたは複数の酵素がアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）およびホスファチジン酸ホスファターゼを含む、項目１８に記載の改変された光合成微生物。
（項目２２）
前記１つまたは複数のポリヌクレオチドが１つまたは複数の発現ベクター中に存在する、項目１８から２１のいずれかに記載の改変された光合成微生物。
（項目２３）
野生型光合成微生物と比較して、ストレス条件下で低下した量のグリコーゲンを蓄積する改変された光合成微生物を作製する方法であって、前記方法は：
（ａ）グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが、野生型光合成微生物における前記１つまたは複数の遺伝子の発現レベルと比較して低下しているように、光合成微生物を改変する工程、および／あるいは
（ｂ）光合成微生物内に、グリコーゲン分解経路の１つまたは複数のタンパク質またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチドを導入する工程
を含む、方法。
（項目２４）
前記光合成微生物がラン藻である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記１つまたは複数の遺伝子が、グルコース−１−リン酸アデニルトランスフェラーゼ（ｇｌｇＣ）遺伝子、ホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）遺伝子、およびグリコーゲンシンターゼ（ｇｌｇＡ）遺伝子から選択される、項目２３または項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記１つまたは複数の遺伝子が前記ｇｌｇＣ遺伝子を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記１つまたは複数の遺伝子が前記ｐｇｍ遺伝子を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記１つまたは複数の遺伝子が前記ｇｌｇＡ遺伝子を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２９）
前記１つまたは複数の遺伝子が前記ｇｌｇＣ遺伝子および前記ｐｇｍ遺伝子を含む、項目２５に記載の方法。
（項目３０）
前記１つまたは複数の遺伝子が完全または部分的な遺伝子欠失を含む、項目２３から２９のいずれかに記載の方法。
（項目３１）
前記光合成微生物がＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓである、項目２３から３０のいずれかに記載の方法。
（項目３２）
前記Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓがＰＣＣ  ７９４２株である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓがＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２株の塩耐性変異体である、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記光合成微生物がＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２である、項目２３から３０のいずれかに記載の方法。
（項目３５）
前記光合成微生物がＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３である、項目２３から３０のいずれかに記載の方法。
（項目３６）
グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが、野生型光合成微生物における前記１つまたは複数の遺伝子の発現レベルと比較して低下しているように、光合成微生物を改変する工程を含む、項目２３から３５のいずれかに記載の方法。
（項目３７）
前記光合成微生物内に、グリコーゲン分解経路の１つまたは複数のタンパク質またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチドを導入する工程を含む、項目２３から３５のいずれかに記載の方法。
（項目３８）
グリコーゲン以外の炭素ベースの生成物を産生させる方法であって、前記方法は、改変された光合成微生物中で前記炭素ベースの生成物を産生させる工程を含み、前記改変された光合成微生物は：
（ａ）グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の１つまたは複数の遺伝子の発現が低下している、および／あるいは
（ｂ）グリコーゲン分解経路のタンパク質またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている、導入されたポリヌクレオチド
を有する、方法。
（項目３９）
前記光合成微生物がラン藻である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記光合成微生物が、野生型光合成微生物と比較して、ストレス条件下で低下した量のグリコーゲンを蓄積する、項目３８または項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記光合成微生物が、野生型光合成微生物と比較して、増加した量の前記炭素ベースの生成物を蓄積する、項目３８から４０のいずれかに記載の方法。
（項目４２）
前記１つまたは複数の遺伝子が、グルコース−１−リン酸アデニルトランスフェラーゼ（ｇｌｇＣ）遺伝子、ホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）遺伝子、およびグリコーゲンシンターゼ（ｇｌｇＡ）遺伝子から選択される、項目３８から４１のいずれかに記載の方法。
（項目４３）
前記１つまたは複数の遺伝子が前記ｇｌｇＣ遺伝子を含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記１つまたは複数の遺伝子が前記ｐｇｍ遺伝子を含む、項目４２に記載の方法。
（項目４５）
前記１つまたは複数の遺伝子が前記ｇｌｇＡ遺伝子を含む、項目４２に記載の方法。
（項目４６）
前記１つまたは複数の遺伝子が前記ｇｌｇＣ遺伝子および前記ｐｇｍ遺伝子を含む、項目４２に記載の方法。
（項目４７）
前記１つまたは複数の遺伝子が完全または部分的な遺伝子欠失を含む、項目３８から４６のいずれかに記載の方法。
（項目４８）
前記光合成微生物がＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓである、項目３８から４７のいずれかに記載の方法。
（項目４９）
前記Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓがＰＣＣ  ７９４２株である、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓがＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２株の塩耐性変異体である、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記光合成微生物がＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２である、項目３８から４７のいずれかに記載の方法。
（項目５２）
前記光合成微生物がＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３である、項目３８から４７のいずれかに記載の方法。
（項目５３）
前記炭素ベースの生成物が脂質を含む、項目３８から５２のいずれかに記載の方法。
（項目５４）
前記脂質が脂肪酸である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記炭素ベースの生成物がトリグリセリドである、項目３８から５２のいずれかに記載の方法。
（項目５６）
前記光合成微生物が、トリグリセリドまたは脂質の生合成に関連する１つまたは複数の酵素をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチドを含み、前記１つまたは複数のポリヌクレオチドが前記光合成微生物の天然のゲノムに対して外因性である、項目３８から５５のいずれかに記載の方法。
（項目５７）
前記１つまたは複数の酵素がジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）を含む、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記１つまたは複数の酵素がホスファチジン酸ホスファターゼを含む、項目５６に記載の方法。
（項目５９）
前記１つまたは複数のポリヌクレオチドが１つまたは複数の発現ベクター中に存在する、項目５６から５８のいずれかに記載の方法。
（項目６０）
前記炭素ベースの生成物が、生物燃料または他の特殊化学製品の供給原料である、項目３８から５９のいずれかに記載の方法。
（項目６１）
前記炭素ベースの生成物が、生物燃料または他の特殊化学製品である、項目３８から５９のいずれかに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、空のベクター対照と比較した、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｉｉからのジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＤＰ１−ＤＧＡＴ）遺伝子で形質転換させたＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２株の、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって測定した脂質含有率を示す図である。ＤＧＡＴ遺伝子の発現はＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下であった。
【図２】図２は、ＩＰＴＧで誘発していないまたは誘発した、４つの異なるＤＧＡＴ遺伝子（ＡＤＧＡＴｄ、ＡＤＧＡＴｎ、ＳｃｏＤＧＡＴ、もしくはＡｂｏＤＧＡＴ）のうちの１つまたはベクター対照を保有するＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２株から得られた抽出物中に存在する、トリアシルグリセリド（ｔｒｉａｃｙｌｇｌｃｅｒｉｄｅ）（ＴＡＧ）および脂肪酸の薄層クロマトグラフィーアッセイを示す図である。対照ＴＡＧ（Ｃ１６ＴＡＧ）および脂肪酸（パルミチン酸）の標準物質も示す。
【図３】図３は、誘導後の、野生型Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２（実線）と比較した、ＡＤＧＡＴｄを発現するＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２（破線）からの脂質抽出物のＨＰＬＣ分析の結果を示すグラフである。ｙ軸は、様々な脂質種、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、リン脂質、およびＴＡＧのピークの強度を示し、ｘ軸は対応する保持時間を示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、ＴＬＣによって単離されたＴＡＧのガスクロマトグラフィーによって決定した、誘導後の、ＡＤＰ１−ＤＧＡＴまたはＳｃｏＤＧＡＴを発現するＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２によって産生されたＴＡＧのアシル鎖の組成を示すグラフである。図４Ａは、ＡＤＧＡＴｄを発現する細胞からのＴＡＧ中の様々なアシル鎖の量を示し、図４Ｂは、ＳｃｏＧＡＴを発現する細胞からのＴＡＧ中の様々なアシル鎖の量を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、ＡＤＰ１−ＤＧＡＴを保有する２つの異なる株から得られたトリアシルグリセリド（ＴＡＧ）の薄層クロマトグラフィーアッセイを示す図である。図５Ａは、誘導後に、ＡＤＰ１−ＤＧＡＴ（＋）またはベクター対照（−）を保有するＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．株ＰＣＣ  ６８０３によって発現されたＴＡＧを示す。図５Ｂは、塩水中で成長させた場合に、ＩＰＴＧで誘導していない（−）または誘導した（＋）、ＡＤＰ１−ＤＧＡＴを保有する塩耐性Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２によって発現されるＴＡＧを示す。対照ＴＡＧ（Ｃ１６ＴＡＧ）および脂肪酸（パルミチン酸）の標準物質も示す。
【図６】図６は、Ａｄｐ１−ＤＧＡＴまたはＳｃｏ−ＤＧＡＴのどちらかを、単独でまたはＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２のＡＣＣａｓｅと組み合わせて過剰発現したＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２株から得られた抽出物中に存在するトリアシルグリセリド（ＴＡＧ）の薄層クロマトグラフィーアッセイを示す図である。対照ＴＡＧ標準物質を示す。
【図７】図７は、Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２のｐｇｍおよびｇｌｇＣ欠失変異体のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるゲノムＤＮＡ分析を示す図である。ＰｇｍおよびｇｌｇＣに特異的なプライマーにより、そのそれぞれのΔｐｇｍおよびΔｇｌｇＣのＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２クローンにおけるこれらの遺伝子の欠失が確認される。
【図８】図８Ａ〜８Ｂは、１×Ｎまたは０．１×Ｎで５日間成長させた後の、野生型（ＷＴ）、Δｐｇｍ（図８Ａ）、およびΔｇｌｇＣ（図８Ｂ）のＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２株中のグリコーゲン含量を示す図である。
【図９】図９Ａ〜９Ｂは、１×Ｎもしくは０．１×Ｎで５日間成長させた後の、％ＦＡＭＥ／乾重量によって表すＷＴおよびΔｐｇｍのＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２株中の脂肪酸（脂質）含有率（図９Ａ）、または、１×Ｎもしくは０．１×Ｎで５日間成長させた後の、ＷＴおよびΔｇｌｇＣ株中の脂肪酸（脂質）含有率（図９Ｂ）を示す図である。
【図１０】図１０は、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２およびｇｌｇＣノックアウト変異体（株１７６−５６、「ｇｌｇＣ」と標識）における全ＦＡＭＥのガスクロマトグラフィー分析を示すグラフである。
【図１１】図１１は、様々な窒素条件下における、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３の野生型および２つのｇｌｇＣ部分二倍体（ｇｌｇＣ−２およびｇｌｇＣ−３）中の全ＦＡＭＥ含有率のガスクロマトグラフィー分析を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、部分的に、グリコーゲン合成に関与する特定の遺伝子の発現レベルを、突然変異または欠失などによって低下させることで、ラン藻などの改変された光合成微生物においてグリコーゲンの合成および／または貯蔵もしくは蓄積の低下がもたらされるという発見に関する。たとえば、グルコース−１−リン酸アデニリルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｌｇＣ）、ホスホグルコムターゼ遺伝子（ｐｇｍ）、および／またはグリコーゲンシンターゼ遺伝子（ｇｌｇＡ）の欠失を、個々にまたは様々な組合せで含有する、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓなどのラン藻は、野生型ラン藻と比較して顕著に低下したレベルのグリコーゲンを産生および蓄積し得る。グリコーゲンの合成または蓄積の低下は、窒素の低下を含めたストレス条件下で特に顕著であり得る。さらに、本発明はさらに、ラン藻を含めた光合成微生物における、グリコーゲン分解に関与する遺伝子またはタンパク質の過剰発現も、グリコーゲンの合成および／または貯蔵の低下をもたらすという発見に関する。
【００２４】
したがって、本発明はさらに、ラン藻などの改変された光合成微生物において、たとえば遺伝子の突然変異もしくは欠失によって天然のグリコーゲンの合成および貯蔵経路を遮断、破壊、もしくはダウンレギュレーションすることによって、または、天然のグリコーゲン分解経路を増加、増強、もしくはアップレギュレーションすることによって、生じる光合成微生物の株では他の生合成経路への炭素流動が増加するという発見に関する。他の生合成経路の例には、既存の脂質生合成経路などの既存の経路、または、脂肪酸もしくはトリグリセリド生合成経路などの遺伝子操作を介して導入される経路が含まれる。
【００２５】
したがって、本発明は、一般に、野生型光合成微生物と比較して低下したレベルのグリコーゲンを産生または保存するように改変した、改変されたラン藻を含めた改変された光合成微生物、およびその使用方法に関する。特定の実施形態では、改変された光合成微生物を遺伝子改変する。特定の実施形態では、改変された光合成微生物は、前記光合成微生物が、野生型光合成微生物と比較して、たとえばストレス条件下、たとえば低窒素下で、低下した量のグリコーゲンを合成または蓄積するように、グリコーゲンの生合成もしくは貯蔵経路の１つもしくは複数の遺伝子の発現レベルが低下している、および／またはグリコーゲン分解経路の１つもしくは複数の遺伝子もしくはタンパク質を過剰発現する。一実施形態では、改変された光合成微生物は、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数の突然変異または欠失を含み、これは、たとえば、完全または部分的な遺伝子欠失であり得る。他の実施形態では、改変された光合成微生物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などの、グリコーゲンの生合成もしくは貯蔵経路の１つもしくは複数の遺伝子もしくはｍＲＮＡを標的とする、たとえばそれとハイブリダイズするアンチセンスＲＮＡ配列を含む、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、または、１つまたは複数のそのようなポリヌクレオチドを発現するベクターを含む。
【００２６】
特定の実施形態では、改変された光合成微生物は増加した量のグリコーゲン以外の炭素ベースの生成物を産生する。そのような炭素ベースの生成物の例には、脂質、脂肪酸、たとえば遊離脂肪酸、および／またはトリグリセリドが含まれる。さらに、破壊された／低下したグリコーゲンの生合成もしくは貯蔵経路および／または増強されたグリコーゲン分解経路を有する本発明の所定の光合成微生物を、トリグリセリドの産生に必要な脂質または脂肪酸などの他の炭素分子の産生を増加させるためにさらに改変することによって、また、トリグリセリドが産生されるようにその光合成微生物を改変することによって、本発明の改変された光合成微生物のうちの特定のものを用いて、光合成微生物中のグリコーゲン経路の破壊を利用して他の炭素分子の産生を増加させることができるという発見が存在しなかった場合に可能であったよりも高い量のトリグリセリドを産生させることができる。
【００２７】
これらの発見に鑑みて、本発明の実施形態は、本明細書中、および２００９年１０月２３日に出願の、題名がトリグリセリドを産生させるための改変された光合成微生物（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ）である国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６１９３６号中に記載のように、天然ではトリグリセリドを産生しないＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓなどのラン藻を含めた光合成微生物を、トリグリセリドを合成するように遺伝子改変することができるという関連の発見と組み合わせて有用であり得る。たとえば、トリグリセリド合成に関連する１つまたは複数の酵素をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチド配列の付加により、ラン藻に、それが天然に発生する脂肪酸をトリグリセリドエネルギー貯蔵分子へと変換する能力が与えられる。トリグリセリド合成に関連する酵素の例には、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有する酵素およびジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性（ＤＧＡＴ）を有する酵素が含まれる。具体的には、ホスファチジン酸ホスファターゼ酵素は、トリグリセリドの直前の前駆体であるジアシルグリセロール分子の産生を触媒し、ＤＧＡＴ酵素は、ジアシルグリセロール前駆体をトリグリセリドへと変換することによってトリグリセリド合成の最終ステップを触媒する。
【００２８】
また、本発明の態様は、本明細書および国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６１９３６号中に記載のように、脂肪酸の産生を増加させるために、ラン藻などの光合成微生物を他の様式で遺伝子改変することができるという発見とも組み合わせることができる。脂肪酸はトリグリセリドの出発物質を提供するため、本明細書および国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６１９３６号中に記載のように、遺伝子改変された光合成微生物における脂肪酸の産生の増加を利用してトリグリセリドの産生を増加させ得る。炭素利用をグリコーゲン合成から逸らして脂質産生に向けることに加えて、本発明の光合成微生物は、脂肪酸合成に関連する１つまたは複数の酵素をコードしている１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチド配列を導入することによって、脂肪酸の産生が増加するように改変することもできる。特定の態様では、外因性ポリヌクレオチド配列はアシル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）活性を含む酵素をコードしており、これは、典型的にはＡＣＣａｓｅの発現を増加させ、したがって細胞内ＡＣＣａｓｅ活性の増加を可能にする。この酵素は脂肪酸合成の「コミットメントステップ」を触媒するため、増加した細胞内ＡＣＣａｓｅ活性は脂肪酸の産生の増加に寄与する。具体的には、ＡＣＣａｓｅは、脂肪酸合成前駆体分子であるマロニル−ＣｏＡの産生を触媒する。特定の実施形態では、ＡＣＣａｓｅをコードしているポリヌクレオチド配列は、光合成微生物のゲノムにネイティブなものではない。
【００２９】
定義
別段に定義しない限りは、本明細書中で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の技術者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載のものに類似または等価な任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料を記載する。本発明の目的のために、以下の用語を以下に定義する。
【００３０】
本明細書中で使用する冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１つから複数（すなわち少なくとも１つ）の、冠詞の文法上の目的語をいう。例として、「ａｎ要素」は、１つの要素または複数の要素を意味する。
【００３１】
「約」とは、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、大きさ、量、重量または長さの３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％まで変動する数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、大きさ、量、重量または長さを意味する。
【００３２】
参照のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の断片に適用する用語「生物活性のある断片」とは、参照配列の少なくとも約０．１、０．５、１、２、５、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００％またはそれより高い活性を有する断片をいう。用語「参照配列」とは、一般に、別の配列を比較する核酸コード配列、またはアミノ酸配列をいう。
【００３３】
本発明の範囲には、参照のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの活性を有するポリペプチドを含むまたはそれをコードしている、少なくとも約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、５００、６００個またはそれより多く（その間のすべての整数が含まれる）の連続的なヌクレオチドまたはアミノ酸残基の長さの、生物活性のある断片が含まれる。代表的な生物活性のある断片は、一般に、相互作用、たとえば、分子内または分子間の相互作用に関与する。分子間相互作用は、特異的結合の相互作用または酵素的相互作用であることができる。酵素的な相互作用または活性の例には、本明細書中に記載のように、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性、および／またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ活性が含まれる。
【００３４】
「コード配列」とは、遺伝子のポリペプチド産物のコードに寄与する任意の核酸配列を意味する。対照的に、用語「非コード配列」とは、遺伝子のポリペプチド産物のコードに寄与しない任意の核酸配列をいう。
【００３５】
本明細書全体にわたって、内容によりそうでないことが必要とされる場合以外は、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、記述したステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群が含まれることを暗示するが、任意の他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の排除を暗示しないことを理解されたい。
【００３６】
「からなる」とは、語句「からなる」に続くものが含まれ、それに限定されることを意味する。したがって、語句「からなる」とは、記載した要素が必要または必須であり、他の要素は存在し得ないことを示す。
【００３７】
「から本質的になる」とは、この語句の後に記載した任意の要素が含まれ、記載した要素の開示中に指定した活性または作用を妨害しないまたはそれに寄与する他の要素に限定されることを意味する。したがって、語句「から本質的になる」とは、記載した要素が必要または必須であるが、他の要素は任意選択であり、記載した要素の活性または作用に影響を与えるかどうかに応じて存在しても存在しなくてもよいことを示す。
【００３８】
用語「相補的」および「相補性」とは、塩基対合のルールによって関連するポリヌクレオチド（すなわちヌクレオチドの配列）をいう。たとえば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に相補的である。相補性は、核酸の塩基の一部のみが塩基対合のルールに従って一致している、「部分的」であってもよい。あるいは、核酸間に「完全」または「全」相補性が存在していてもよい。核酸鎖間の相補性の度合は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に顕著な影響を与える。
【００３９】
「に対応する」または「に対応すること」とは、（ａ）参照ポリヌクレオチド配列のすべてもしくは一部分に実質的に同一もしくは相補的であるヌクレオチド配列を有する、またはペプチドもしくはタンパク質中のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチド、あるいは、（ｂ）参照のペプチドまたはタンパク質中のアミノ酸の配列に実質的に同一であるアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを意味する。
【００４０】
「誘導体」とは、改変、たとえば、他の化学的部分とのコンジュゲーションもしくは複合体化（たとえばｐｅｇ化）または当分野で認識されている翻訳後修飾技法によって、基本配列から誘導したポリペプチドを意味する。また、用語「誘導体」には、その範囲内に、機能的に等価な分子をもたらす付加または欠失を含めた、親配列に行った変更も含まれる。
【００４１】
「酵素反応性条件」とは、酵素が機能することを可能にする環境において任意の必要な条件（すなわち、温度、ｐＨ、阻害物質の欠如などの要因）が利用可能であることを意味する。酵素反応性条件は、試験管内などのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは細胞内などのｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかであることができる。
【００４２】
本明細書中で使用する用語「機能」および「機能的」などとは、生物学的、酵素的、または治療的な機能をいう。
【００４３】
「遺伝子」とは、染色体上の特定の座位を占有し遺伝の単位を意味し、転写および／もしくは翻訳調節配列ならびに／またはコード領域および／もしくは非翻訳配列（すなわち、イントロン、５’および３’非翻訳配列）からなる。
【００４４】
「相同性」とは、同一であるかまたは保存的置換を構成するアミノ酸のパーセンテージ数をいう。相同性は、本明細書中に参考として組み込まれているＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒａｕｘら、１９８４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２巻、３８７〜３９５頁）などの配列比較プログラムを用いて決定し得る。このようにして、本明細書中に引用するものと同様または実質的に異なる長さの配列を、アラインメント内にギャップを挿入することによって比較することができ、そのようなギャップは、たとえばＧＡＰによって使用される比較アルゴリズムによって決定する。
【００４５】
用語「宿主細胞」には、本発明の任意の組換えベクター（複数可）または単離したポリヌクレオチドのレシピエントとなることができる、またはそうなった、個々の細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には単一の宿主細胞の子孫が含まれ、子孫は、天然、偶発的、または意図的な突然変異および／または変化が原因で（形態学または全ＤＮＡ相補性において）元の親細胞と必ずしも完全に同一でない場合がある。宿主細胞には、本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドを用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質移入または感染した細胞が含まれる。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、組換え宿主細胞である。
【００４６】
「単離した」とは、そのネイティブ状態においてそれに通常付随する構成要素を実質的または本質的に含まない物質を意味する。たとえば、本明細書中で使用する「単離したポリヌクレオチド」とは、天然に存在する状態においてそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、たとえば、ＤＮＡ断片に通常隣接する配列から取り出された断片をいう。あるいは、本明細書中で使用する「単離したペプチド」または「単離したポリペプチド」などとは、その天然の細胞環境および細胞の他の構成要素との会合からの、ペプチドまたはポリペプチド分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏの単離および／または精製をいう。
【００４７】
「増加した」または「増加させる」とは、改変していないラン藻または異なる様式で改変されたラン藻などの対照光合成微生物と比較して、より多い量の所定の脂肪酸、脂質分子、またはトリグリセリドを産生または保存する、１つまたは複数の改変された光合成微生物、たとえばラン藻の能力を意味する。脂肪酸の産生は、ナイルレッド染色、薄層クロマトグラフィーおよびガスクロマトグラフィーなどの当分野で知られている技法に従って測定することができる。トリグリセリドの産生は、たとえば、グリセロール−３−リン酸−オキシダーゼを用いた比色酵素試験を含めた市販の酵素試験を用いて測定することができる。特定の実施形態では、所定の脂肪酸、脂質分子、またはトリグリセリドの産生または貯蔵は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％増加する。特定の実施形態では、所定の脂肪酸、脂質分子、またはトリグリセリドの産生または貯蔵は５０％〜２００％増加する。
【００４８】
特定の場合では、「減少した」または「低下した」とは、改変していないラン藻または異なる様式で改変されたラン藻などの対照光合成微生物と比較して、より少ない量（たとえば統計的に有意な量）のグリコーゲンなどの所定の炭素ベースの生成物を産生または蓄積する、１つまたは複数の改変された光合成微生物、たとえばラン藻の能力を意味する。グリコーゲンおよび関連分子の産生は、本明細書中に例示するように当分野で知られている技法に従って測定することができる（実施例６、およびＳｕｚｕｋｉら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１７７０巻：７６３〜７７３頁、２００７年を参照）。特定の場合では、「減少した」または「低下した」とは、改変していないラン藻または異なる様式で改変されたラン藻などの対照光合成（ｐｈｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）微生物における発現レベルと比較して、改変された光合成微生物、たとえばラン藻による、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路に関連する１つまたは複数の遺伝子がより少ない発現レベル（たとえば統計的に有意な量）であることを意味する。特定の実施形態では、炭素ベースの生成物の産生もしくは蓄積、またはグリコーゲンの生合成もしくは貯蔵に関連する１つもしくは複数の遺伝子の発現は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％低下する。特定の実施形態では、炭素ベースの生成物の産生もしくは蓄積、またはグリコーゲンの生合成もしくは貯蔵に関連する１つもしくは複数の遺伝子の発現は、５０〜１００％低下する。
【００４９】
「ストレス条件」とは、環境的および物理的ストレスをどちらも含めた、ラン藻にストレスを課す任意の条件をいう。ストレスの例には、それだけには限定されないが、標準と比較して低下もしくは増加した温度、栄養素の欠乏、標準と比較して低下もしくは増加した露光、たとえば強度もしくは持続期間、標準と比較して低下もしくは増加した窒素、鉄、硫黄、リン、および／もしくは銅への曝露、標準と比較して変更されたｐＨ、たとえば多少の酸性もしくは塩基性、標準と比較して変更された塩条件、ＤＮＡ合成阻害もしくはタンパク質合成阻害を引き起こす薬剤への曝露、ならびに標準と比較して増加もしくは減少した培養密度が含まれる。様々なラン藻の標準の成長および培養条件は当分野で知られている。
【００５０】
「低窒素条件」または「窒素制限」の条件とは、一般に、標準の窒素濃度の特定の分率またはパーセンテージが培養培地中に存在する培養条件をいう。そのような分率には、典型的には、それだけには限定されないが、標準の窒素条件の約１／５０、１／４０、１／３０、１／１０、１／５、１／４、または約１／２が含まれる。そのようなパーセンテージには、典型的には、それだけには限定されないが、標準の窒素条件の約１％未満、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、または５０％が含まれる。「標準の」窒素条件は、本明細書中に例示されおり、当分野で知られているように、たとえば、ＢＧ１１培地中に存在する窒素の量によって推定することができる。たとえば、ＢＧ１１培地は、通常、窒素をＮａＮＯ３の形態で、約１．５グラム／リットルの濃度で含有する（たとえばＲｉｐｐｋａら、Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１１１巻：１〜６１頁、１９７９年を参照）。
【００５１】
「から得られた」とは、たとえばポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの試料が、所望の生物または所望の生物内の特定の組織などの特定の供給源から単離される、またはそれに由来することを意味する。また、「から得られた」とは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、特定の生物または生物内の組織から単離される、またはそれに由来する状況もいうことができる。たとえば、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、および／またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素をコードしているポリヌクレオチド配列は、様々な原核もしくは真核生物、または特定の真核生物内の特定の組織もしくは細胞から単離し得る。
【００５２】
本明細書中で使用する用語「作動可能に連結した」とは、遺伝子をプロモーターの調節性制御下に置くことを意味し、これは遺伝子の転写および任意選択で翻訳を制御する。異種プロモーター／構造遺伝子の組合せの構築においては、一般に、遺伝子配列またはプロモーターを、その遺伝子配列またはプロモーターとそれがその天然の設定において制御する遺伝子（すなわち遺伝子配列またはプロモーターが由来する遺伝子）との間の距離とほぼ同じである、遺伝子転写開始部位からの距離で配置することが好ましい。当分野で知られているように、機能の喪失なしに、この距離はある程度の変動に順応できる。同様に、その制御下に置く異種遺伝子に対する調節配列要素の好ましい配置は、その天然の設定における要素（すなわちそれが由来する遺伝子）の配置によって定義される。「構成的プロモーター」は、典型的にはほとんどの条件下で活性がある、すなわち転写を促進する。「誘導性プロモーター」は、典型的には、所定の分子要因（たとえばＩＰＴＧ）または所定の環境条件（たとえば、特定のＣＯ２濃度、栄養素レベル、光、熱）の存在下など、特定の条件下でのみ活性がある。その条件の非存在下では、誘導性プロモーターは、典型的には有意または測定可能なレベルの転写活性を可能にしない。たとえば、誘導性プロモーターは、温度、ｐＨ、ホルモン、代謝物（たとえば、ラクトース、マンニトール、アミノ酸）、光（たとえば波長特異的）、浸透ポテンシャル（たとえば塩誘導）、重金属、または抗生物質に従って誘導され得る。数々の標準的な誘導性プロモーターが当業者に公知であろう。
【００５３】
本明細書中で使用する記述「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡを指定する。この用語は、典型的には、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドまたはどちらかの種類のヌクレオチドの改変した形態のいずれかである、少なくとも１０個の塩基の長さのヌクレオチドの多量体をいう。この用語には、ＤＮＡの一本鎖および二本鎖の形態が含まれる。
【００５４】
用語「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」などとは、参照のポリヌクレオチド配列に実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、または本明細書中以下で定義するストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドをいう。また、これらの用語には、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失または置換によって参照ポリヌクレオチドから区別されるポリヌクレオチドも包含される。したがって、用語「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」には、１つまたは複数のヌクレオチドを付加もしくは欠失させた、または様々なヌクレオチドで置き換えたポリヌクレオチドが含まれる。この観点から、突然変異、付加、欠失および置換を含めた特定の変更を参照ポリヌクレオチドに行うことができ、それによって、変更されたポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能もしくは活性を保持している、または参照ポリヌクレオチドに関連して増加した活性を有する（すなわち最適化されている）ことは、当分野で十分に理解されている。ポリヌクレオチド変異体には、たとえば、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、および／またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素をコードしている参照ポリヌクレオチド配列と、少なくとも５０％（および少なくとも５１％〜少なくとも９９％ならびにその間のすべての整数のパーセンテージ、たとえば、９０％、９５％、または９８％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドが含まれる。また、用語「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」には、これらの酵素をコードしている天然に存在する対立遺伝子変異体および相同分子種も含まれる。
【００５５】
ポリヌクレオチドに関して、用語「外因性」とは、野生型の細胞または生物においては自然に存在せず、典型的には分子生物学的技法によって細胞内に導入するポリヌクレオチド配列をいう。外因性ポリヌクレオチドの例には、所望のタンパク質をコードしているベクター、プラスミド、および／または人工の核酸構築体が含まれる。ポリヌクレオチドに関して、用語「内在性」または「ネイティブ」とは、所定の野生型の細胞または生物中に見つかり得る、天然に存在するポリヌクレオチド配列をいう。たとえば、特定のラン藻種は、典型的にはＤＧＡＴ遺伝子を含有せず、したがって、ＤＧＡＴポリペプチドをコードする「内在性」のポリヌクレオチド配列を含まない。また、分子生物学的技法によって第１の生物から単離して第２の生物に移した特定のポリヌクレオチド配列は、典型的には、第２の生物に関して「外因性」ポリヌクレオチドであるとみなされる。
【００５６】
「グリコーゲンの生合成または貯蔵経路」の遺伝子に関する記述「突然変異」または「欠失」とは、一般に、グリコーゲンの合成および／または貯蔵に関してその遺伝子の産物を非機能的にさせる、または機能を低下させる、光合成微生物、たとえばラン藻における変化または変更をいう。そのような変化または変更の例には、転写レベルであるか翻訳レベルであるかにかかわらず、その遺伝子によってコードされているポリペプチドの発現を破壊、排除、ダウンレギュレーション、または顕著に低下させる、標的とした遺伝子（たとえば、ｇｌｇＡ、ｇｌｇＣ、およびｐｇｍ）のコードまたは調節配列に対するヌクレオチドの、全体または部分的な置換、欠失、または付加が含まれる。選択マーカーを有するベクターを用いた組換えによるものなどの、そのような変更または変化を生じさせる技法は、本明細書中に例示されており、また分子生物学の分野で公知である。特定の実施形態では、遺伝子の１つまたは複数の対立遺伝子、たとえば２つまたはすべての対立遺伝子を、光合成微生物内で突然変異または欠失させ得る。特定の実施形態では、本発明の改変された光合成微生物、たとえばラン藻は、部分二倍体または部分的な二倍体である。
【００５７】
また、標的とした遺伝子の「欠失」は、当分野で知られている様々なアンチセンス技術（たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡ）を用いることによってなど、その遺伝子のｍＲＮＡの標的化によっても達成し得る。したがって、標的とした遺伝子は、その遺伝子によってコードされているポリペプチドもしくは酵素が改変された光合成微生物によって発現されない場合、または、改変された光合成微生物が改変していないもしくは異なる様式で改変された光合成微生物よりも少ないグリコーゲンを産生または蓄積するような、無視できる量で発現される場合に、「非機能的」であるとみなされ得る。
【００５８】
特定の態様では、標的とした遺伝子は、改変されたポリペプチドが発現されるが、そのポリペプチドの活性部位、その細胞局在、その安定性、または当業者に明らかな他の機能的特長を改変するかにかかわらず、グリコーゲンの生合成または貯蔵に関して低下した機能または活性を有するように、コードされているポリペプチドのアミノ酸配列を変更する、ヌクレオチドレベルでの変化または突然変異によって、「非機能的」とし得る。グリコーゲンの生合成または貯蔵に関与するポリペプチドのコード配列に対するそのような改変は、所定の光合成微生物のゲノムレベルでの部位特異的突然変異誘発および／または天然の選択（すなわち定向進化）などの、当分野の公知の技法に従って達成し得る。
【００５９】
本明細書中で互換性があるように使用する「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」および「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーならびにその変異体および合成類似体をいう。したがって、これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体などの合成の天然に存在しないアミノ酸であるアミノ酸ポリマー、および天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。特定の態様では、ポリペプチドには、典型的には様々な化学反応を触媒する（すなわちその速度を増加する）酵素ポリペプチド、または「酵素」が含まれ得る。
【００６０】
記述、ポリペプチド「変異体」とは、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって参照ポリペプチド配列から区別されるポリペプチドをいう。特定の実施形態では、ポリペプチド変異体は、保存的または非保存的であり得る１つまたは複数の置換によって参照ポリペプチドから区別される。特定の実施形態では、ポリペプチド変異体は保存的置換を含み、この観点から、一部のアミノ酸を、ポリペプチドの活性の性質を変化させずに幅広く類似の特性を有する他のものに変化させ得ることが、当分野で十分に理解されている。また、ポリペプチド変異体には、１つまたは複数のアミノ酸を付加もしくは欠失させた、または様々なアミノ酸残基で置き換えたポリペプチドも包含される。
【００６１】
本発明は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性、および／またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有する完全長酵素の変異体、グリコーゲン分解経路に関連するポリペプチド、これらの完全長の酵素およびポリペプチドの切断断片、切断断片の変異体、ならびにその関連する生物活性のある断片の、本明細書中に記載の方法における使用を企図する。典型的には、ポリペプチドの生物活性のある断片は、相互作用、たとえば、分子内または分子間の相互作用に関与し得る。分子間相互作用は、特異的結合の相互作用または酵素的相互作用であることができる（たとえば、相互作用は一過性である可能性があり、共有結合が形成または切断される）。ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性、および／もしくはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチド／酵素の生物活性のある断片、またはグリコーゲン分解経路に関連するポリペプチドには、（推定上の）完全長の参照ポリペプチド配列のアミノ酸配列に十分に類似の、またはそれに由来するアミノ酸配列を含むペプチドが含まれる。典型的には、生物活性のある断片は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼポリペプチド、ホスファチジン酸ホスファターゼポリペプチド、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼポリペプチド、またはグリコーゲン分解経路に関連するポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含み、様々な活性ドメインのうちの１つまたは複数（かつ一部の例ではすべて）が含まれ得る。ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼポリペプチド、またはグリコーゲン分解経路に関連するポリペプチドの生物活性のある断片は、たとえば、参照ポリペプチド配列の１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９，３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４５０、５００、６００個またはそれより多く（その間のすべての整数が含まれる）の連続的なアミノ酸であるポリペプチド断片であることができる。特定の実施形態では、生物活性のある断片は、本明細書中の他の箇所に記載されており、かつ当分野で知られている、保存された酵素配列、ドメイン、またはモチーフを含む。適切なことに、生物学的に活性のある断片は、それが由来する野生型ポリペプチドの活性の約１％以上、１０％、２５％、５０％を有する。
【００６２】
本明細書中で使用する記述「配列同一性」、または、たとえば「〜に５０％同一である配列」を含むとは、ヌクレオチドに基づいてまたはアミノ酸に基づいて、比較のウィンドウにわたって配列が同一である程度をいう。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較のウィンドウにわたって２つの最適にアラインメントした配列を比較し、同一の核酸塩基（たとえば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（たとえば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が両方の配列中に存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得て、一致した位置の数を比較のウィンドウ中の位置の全数（すなわちウィンドウの大きさ）で除算し、結果を１００で乗算して配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算し得る。
【００６３】
２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列の関係性を説明するために使用する用語には、「参照配列」、「比較のウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」および「実質的な同一性」が含まれる。「参照配列」とは、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含めた、少なくとも１２個であるが、しばしば１５〜１８個、多くの場合少なくとも２５個の単量体単位の長さである。２つのポリヌクレオチドは、それぞれ（１）２つのポリヌクレオチド間で類似の配列（すなわち、完全ポリヌクレオチド配列の一部分のみ）、および（２）２つのポリヌクレオチド間で相違する配列を含み得るため、２つ（以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、２つのポリヌクレオチドの配列を「比較のウィンドウ」にわたって比較することによって行って、配列類似度の局所領域を同定および比較する。「比較のウィンドウ」とは、少なくとも６個、通常は約５０〜約１００個、より通常には約１００〜約１５０個の連続的な位置の概念的なセグメントをいい、そのセグメント内で配列と同じ数の連続的な位置の参照配列とを、２つの配列を最適にアラインメントした後に比較する。比較のウィンドウは、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわちギャップ）を約２０％以下しか含み得ない。比較のウィンドウをアラインメントするための配列の最適なアラインメントは、コンピュータによるアルゴリズムの実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅリリース７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または視察によって実施してよく、最良のアラインメント（すなわち、比較のウィンドウにわたって最高のパーセンテージ相同性をもたらす）が選択した様々な方法のうちの任意のものによって生じる。また、たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９頁によって開示されているようにＢＬＡＳＴプログラムファミリーも参照し得る。配列解析の詳細な記述は、Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ、１９９４〜１９９８頁、第１５章のユニット１９．３中に見つけることができる。
【００６４】
本明細書中で使用する用語「トリグリセリド」（トリアシルグリセロールまたは中性脂肪）とは、グリセロールの脂肪酸トリエステルをいう。トリグリセリドは典型的には非極性かつ非水溶性である。ホスホグリセリド（またはグリセロリン脂質）は生体膜の主要な脂質構成要素であり、たとえば、グリセロール部分に付着した少なくとも１つのＯ−アシルまたはＯ−アルキルまたはＯ−アルコ−１’−エニル残基と窒素性塩基、グリセロール、またはイノシトール単位からなる極性頭部とを含有する、ｓｎ−グリセロ−３−リン酸の任意の誘導体が含まれる。また、ホスホグリセリドは、アシルグリセロールとリン酸とのエステルおよび別のヒドロキシル化された化合物によって形成される両親媒性脂質としても特徴づけることができる。
【００６５】
「形質転換」とは、宿主細胞ゲノム内への外来ＤＮＡの取り込みおよび組み込みから生じる、細胞の永久的な遺伝性の変更をいい、また、外因性遺伝子の１つの生物から別の生物のゲノム内への移転もいう。
【００６６】
「ベクター」とは、ポリヌクレオチドをそれの中に挿入またはクローニングすることができる、たとえばプラスミド、バクテリオファージ、酵母またはウイルスに由来するポリヌクレオチド分子、好ましくはＤＮＡ分子を意味する。ベクターは、好ましくは１つまたは複数のユニークな制限部位を含有し、標的細胞もしくは組織またはその前駆細胞もしくは組織を含めた定義した宿主細胞中での自律複製が可能であるか、またはクローニングした配列が複写可能であるように定義した宿主のゲノムに組み込み可能であることができる。したがって、ベクターは、その複製が染色体の複製から独立している、自己複製するベクター、すなわち、染色体外物質として存在するベクター、たとえば、直鎖状もしくは閉環プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、または人工染色体であることができる。ベクターは自己複製を保証するための任意の手段を含有することができる。あるいは、ベクターは、宿主細胞内に導入した場合に、ゲノム内に組み込まれ、それが組み込まれた染色体（複数可）と一緒に複製されるものであることができる。そのようなベクターは、宿主染色体の特定の所望の部位内への組換えを可能にする特異的配列を含み得る。ベクター系は単一のベクターまたはプラスミド、２つ以上のベクターまたはプラスミドを含むことができ、それらは一緒になって、宿主細胞のゲノム内に導入する全ＤＮＡ、またはトランスポゾンを含有する。ベクターの選択は、典型的には、ベクターとベクターを導入する宿主細胞との適合性に依存する。本例の場合、ベクターは、好ましくは、ラン藻細胞などの光合成微生物細胞中で作動可能に機能的なものである。ベクターには、コードされているポリペプチドのうちの１つもしくは複数とインフレームで融合させるか、または別々に発現させることができる、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などのレポーター遺伝子が含まれることができる。また、ベクターには、適切な形質転換体の選択に使用することができる抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーも含まれることができる。
【００６７】
互換性があるように使用する用語「野生型」および「天然に存在する」とは、遺伝子または遺伝子産物をいい、それらは天然に存在する供給源から単離した場合にその遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する。野生型の遺伝子または遺伝子産物（たとえばポリペプチド）とは、集団中で最も頻繁に観察されるものであり、したがって、遺伝子の「正常」または「野生型」の形態と任意に設計される。
【００６８】
改変された光合成微生物
本発明の特定の実施形態は、ラン藻を含めた改変された光合成微生物およびその使用方法に関し、改変された光合成微生物は、対照光合成微生物における１つまたは複数の遺伝子の発現レベルと比較して、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが低下している。特定の実施形態では、改変された光合成微生物は、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数の突然変異または欠失を含む。特定の実施形態では、前記１つまたは複数の遺伝子には、グルコース−１−リン酸アデニルトランスフェラーゼ（ｇｌｇＣ）、ホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）、および／またはグリコーゲンシンターゼ（ｇｌｇＡ）の遺伝子が含まれる。本発明は、改変されたラン藻が野生型ラン藻と比較して低下した量のグリコーゲンを蓄積する（たとえば低窒素条件下で）限りは、グリコーゲンの生合成または貯蔵に関連する１つまたは複数の遺伝子中の任意の種類の突然変異または欠失の使用を含めた、改変された光合成微生物において１つまたは複数の遺伝子の発現を低下させる任意の方法の使用を企図する。
【００６９】
本発明の特定の実施形態は、ラン藻を含めた改変された光合成微生物およびその使用方法に関し、改変された光合成微生物は、対照または改変していない光合成微生物と比較して、グリコーゲンの分解、除去、および／もしくは排除に関連する１つもしくは複数の酵素もしくはタンパク質をコードしている１つもしくは複数のポリヌクレオチド、またはその機能的断片の発現レベルが増加している。特定の実施形態では、改変された光合成微生物は、グリコーゲンの分解、除去、および／もしくは排除に関連する１つもしくは複数の酵素もしくはタンパク質をコードしている１つもしくは複数のポリヌクレオチド、またはその機能的断片を含む。特定の実施形態では、前記１つまたは複数のポリヌクレオチドは、グリコーゲンホスホリラーゼ（ＧｌｇＰ）、グリコーゲン脱分枝酵素（ＧｌｇＸ）、アミロマルターゼ（ＭａｌＱ）、ホスホグルコムターゼ（Ｐｇｍ）、グルコキナーゼ（Ｇｌｋ）、および／もしくはホスホグルコースイソメラーゼ（Ｐｇｉ）、またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている。Ｐｇｍ、Ｇｌｋ、およびＰｇｉは、条件次第でグリコーゲンの合成または分解を促進することができる双方向の酵素である。本発明は、改変された光合成微生物が野生型光合成微生物と比較して低下した量のグリコーゲンを蓄積する（たとえばストレス条件下で）限りは、グリコーゲンの分解、除去、および／または排除に関連するタンパク質または酵素をコードしている任意の種類のポリヌクレオチドの使用を企図する。
【００７０】
特定の実施形態では、本発明には、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが低下しており、また、グリコーゲンの分解、除去、および／もしくは排除に関連する１つもしくは複数の酵素もしくはタンパク質、またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている、１つまたは複数のポリヌクレオチドの発現レベルが増加している、ラン藻などの改変された光合成微生物が含まれる。特定の実施形態では、改変された光合成微生物は、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数の突然変異または欠失、および、グリコーゲンの分解、除去、および／もしくは排除に関連する１つもしくは複数の酵素もしくはタンパク質、またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている、１つまたは複数の導入されたポリヌクレオチドを含む。
【００７１】
また、本発明の特定の実施形態は、改変された光合成微生物、たとえばラン藻、およびその使用方法にも関し、改変された光合成微生物は、（１）グリコーゲンの生合成または貯蔵の１つまたは複数の１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが低下していること、および／あるいは（２）グリコーゲンの分解、除去、および／もしくは排除に関連する１つもしくは複数の酵素もしくはタンパク質をコードしている１つもしくは複数のポリヌクレオチド、またはその機能的断片もしくは変異体の発現レベルが増加していることのうちの一方または両方を有し、改変された光合成微生物は、（３）酵素がジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）活性および／またはホスファチジン酸ホスファターゼ活性を含む場合など、トリグリセリド生合成に関連する１つまたは複数の酵素をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、改変された光合成微生物は、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の１つまたは複数の遺伝子の突然変異または欠失を含む、および／あるいは、グリコーゲンの分解、除去、および／もしくは排除に関連する１つもしくは複数の酵素もしくはタンパク質、またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている、１つまたは複数の導入されたポリヌクレオチドを含む。本発明は、これらのＤＧＡＴおよびホスファチジン酸ホスファターゼ酵素の天然に存在するおよび天然に存在しない変異体、ならびにそれらをコードしているポリヌクレオチドの変異体の使用を企図する。特定の態様では、ＤＧＡＴをコードしているポリヌクレオチド配列はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｉｉ（ＡＤＰ１−ＤＧＡＴ）に由来し、ホスファチジン酸ホスファターゼをコードしているポリヌクレオチド配列はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ｙＰａｈ１）からのものである。しかし、これらの酵素のコード配列は、適切なＤＧＡＴまたはホスファチジン酸ホスファターゼ酵素を有する任意の生物に由来する場合があり、任意の最適化したコード配列（すなわちコドン最適化したポリヌクレオチド）または最適化したポリペプチド配列などの、その任意の人工変異体も含まれ得る。したがって、特定の実施形態では、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数の突然変異または欠失を含む改変されたラン藻は、トリグリセリド生合成に関連する１つまたは複数の酵素をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチドも含み得る。
【００７２】
特定の実施形態では、本発明の改変された光合成微生物は、ＤＧＡＴをコードしている２つ以上のポリヌクレオチドまたはその変異体もしくは断片を含み得る。特定の実施形態では、２つ以上のポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｔｏｉｄｅｓ）は、同一であるか、または同じＤＧＡＴを発現する。特定の実施形態では、これら２つ以上のポリヌクレオチドは、異なり得るか、または２つの異なるＤＧＡＴポリペプチドをコードし得る。たとえば、一実施形態では、ポリヌクレオチドの一方はＡＤＧＡＴｄをコードしていてよく、一方で、別のポリヌクレオチドはＳｃｏＤＧＡＴをコードしていてよい。特定の実施形態では、以下のＤＧＡＴは、以下の二重ＤＧＡＴ株のうちの１つを使用して、改変された光合成微生物、たとえばラン藻中で同時発現される：ＡＤＧＡＴｄ（ＮＳ１）：：ＡＤＧＡＴｄ（ＮＳ２）、ＡＤＧＡＴｎ（ＮＳ１）：：ＡＤＧＡＴｎ（ＮＳ２）、ＡＤＧＡＴｎ（ＮＳ１）：：ＳＤＧＡＴ（ＮＳ２）、ＳＤＧＡＴ（ＮＳ１）：：ＡＤＧＡＴｎ（ＮＳ２）、ＳＤＧＡＴ（ＮＳ１）：：ＳＤＧＡＴ（ＮＳ２）。ＮＳ１ベクター、ｐＡＭ２２９１では、ＥｃｏＲＩがＡＴＧに続き、これはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一部である。ＮＳ２ベクター、ｐＡＭ１５７９では、ＥｃｏＲＩがＡＴＧに続き、これはＯＲＦの一部である。ＥｃｏＲＩヌクレオチドがＡＴＧに続くＤＧＡＴは、ｐＡＭ２２９１またはｐＡＭ１５７９中のどちらかにクローニングしてもよく、そのようなＤＧＡＴはＡＤＧＡＴｄと呼ばれる。他の実施形態では、Ｎｄｅ／ＢｇｌＩＩ部位を有するＮＳ１ベクターであるベクターｐＡＭ２３１４ＦＴｒｃ３、またはＮｄｅ／ＢｇｌＩＩ部位を有するＮＳ２ベクターであるベクターｐＡＭ１５７９ＦＴｒｃ３を利用する。ＥｃｏＲＩヌクレオチドを有さないＤＧＡＴを、これら最後２つのベクター中のどちらかにクローニングし得る。そのようなＤＧＡＴはＡＤＧＡＴｎと呼ばれる。添付の実施例中に示すように、異なるＤＧＡＴを発現する改変された光合成微生物は、異なる脂肪酸組成を有するＴＡＧを発現する。したがって、本発明の特定の実施形態は、様々な脂肪酸組成を有するＴＡＧを産生させるために２つ以上の異なるＤＧＡＴを発現させることを企図する。
【００７３】
関連する実施形態は、２つ以上の異なるホスファチジン酸ホスファターゼおよび／または２つ以上の異なるアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの発現を企図する。
【００７４】
また、本発明の実施形態は、改変された光合成微生物、たとえばラン藻、およびその使用方法にも関し、改変された光合成微生物は、（１）グリコーゲンの生合成または貯蔵の１つまたは複数の１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが低下していること、および／あるいは（２）グリコーゲンの分解、除去、および／もしくは排除に関連する１つもしくは複数の酵素もしくはタンパク質をコードしている１つもしくは複数のポリヌクレオチド、またはその機能的断片もしくは変異体の発現レベルが増加していることの一方または両方を有し、改変された光合成微生物は、（３）前記ポリヌクレオチドが光合成微生物の天然のゲノムに対して外因性である場合など、脂肪酸生合成に関連する酵素をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、改変された光合成微生物は、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の１つまたは複数の遺伝子の突然変異または欠失を含む、および／あるいは、グリコーゲンの分解、除去、および／もしくは排除に関連する１つもしくは複数の酵素もしくはタンパク質、またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている、１つまたは複数の導入されたポリヌクレオチドを含む。特定の態様では、脂肪酸合成に関連する酵素は、そのような酵素の天然に存在するおよび天然に存在しない機能的変異体ならびにそれらをコードしているポリヌクレオチドを含めた、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）活性を含む。特定の実施形態では、ＡＣＣａｓｅ酵素をコードしているポリヌクレオチド配列はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２（７００２−ＡＣＣａｓｅ）に由来する。しかし、上述のように、これらのＡＣＣａｓｅ酵素のコード配列は適切なＡＣＣａｓｅ酵素を有する任意の生物に由来する場合があり、任意の最適化したコード配列（すなわちコドン最適化したポリヌクレオチド）または最適化したポリペプチド配列などの、その任意の人工変異体も含まれ得る。
【００７５】
上述のように脂肪酸はトリグリセリド産生の出発物質を提供するため、脂肪酸産生が増加した遺伝子改変された光合成微生物、たとえばラン藻を利用して全体的なトリグリセリドの産生を向上させ得る。したがって、特定の実施形態は、さらに改変された光合成微生物およびその使用方法に関し、改変された光合成微生物は、脂肪酸合成およびトリグリセリド合成に関連する酵素をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。したがって、特定の実施形態では、本発明の改変された光合成微生物は、ＤＧＡＴ活性、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性、および／またはＡＣＣａｓｅ活性を含む酵素をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。さらに、特定の実施形態では、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが増加している（たとえば、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数の突然変異または欠失の存在による）、ならびに／あるいは、グリコーゲン（ｌｙｃｏｇｅｎ）の分解、除去、および／または排除に関連する１つまたは複数の酵素またはタンパク質をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチドの発現レベルが増加している（たとえば、グリコーゲンの分解、除去、および／もしくは排除に関連する１つもしくは複数の酵素もしくはタンパク質をコードしている１つもしくは複数の導入されたポリヌクレオチド、またはその機能的断片もしくは変異体（ｖａｒｉａｎ）の存在による）、改変された光合成微生物は、当業者には明らかである脂肪酸生合成および／またはトリグリセリド生合成に関連する酵素をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチドを、その様々な組合せを含めてさらに含み得る。
【００７６】
特定の一実施形態では、改変された光合成微生物、たとえばラン藻は、本明細書中に記載のグリコーゲンの生合成または貯蔵経路の１つまたは複数の遺伝子中に１つまたは複数の突然変異を含む場合があり、また、ＤＧＡＴ活性、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性、および／またはＡＣＣａｓｅ活性を含む酵素をコードしている１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含む場合がある。
【００７７】
別の特定の実施形態では、改変された光合成微生物、たとえばラン藻は、本明細書中に記載のグリコーゲン分解に関連する１つまたは複数のポリペプチドをコードしている１つまたは複数の導入されたポリヌクレオチドを含む場合があり、また、ＤＧＡＴ活性、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性、および／またはＡＣＣａｓｅ活性を含む酵素をコードしている１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含む場合がある。
【００７８】
光合成微生物
本発明の改変された光合成微生物は、任意の種類の光合成微生物を用いて作製し得る。これらには、それだけには限定されないが、光合成細菌、緑藻類、およびラン藻が含まれる。光合成微生物は、たとえば、ラン藻などの天然の光合成微生物、または人工的な光合成細菌などの操作した光合成微生物であることができる。天然に光合成するまたは光合成するように操作することができる例示的な微生物には、それだけには限定されないが、細菌、真菌、古細菌、原生生物、緑藻類などの真核生物、ならびにプランクトン、プラナリア、およびアメーバなどの動物が含まれる。天然に存在する光合成微生物の例には、それだけには限定されないが、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｍａｘｉｍｕｍ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ、Ｂｏｔｒｙｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｓｅｒｅｎａｓｔｒｕｍ  ｃａｐｒｉｃｏｍｕｔｕｍ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ａｕａｄｒｉｃａｕｄａ、Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ａｃｕｔｕｓ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ、Ａｎａｂａｅｎｏｐｓｉｓ、Ａｕｌｏｓｉｒａ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、および／またはＴｏｌｙｐｏｔｈｒｉｘが含まれる。
【００７９】
本発明の改変されたラン藻は、遺伝子操作可能である、すなわち外因性遺伝物質の導入および発現を許容できる、任意のラン藻の属または種に由来し得る。本発明の方法に従って操作することができるラン藻の例には、それだけには限定されないが、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｏｓｔｏｃ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ、およびＧｌｏｅｏｂａｃｔｅｒの属が含まれる。
【００８０】
ラン藻は、藍藻、藍色細菌、または藍藻植物としても公知であり、光合成を介してそのエネルギーを得る細菌の門である。ラン藻は、炭水化物、タンパク質、脂質および核酸などの代謝物をＣＯ２、水、無機塩および光から産生することができる。任意のラン藻を本発明に従って使用し得る。
【００８１】
ラン藻には単細胞種およびコロニー形成種がどちらも含まれる。コロニーは、線維、シートまたはさらには中空の球を形成し得る。一部の糸状コロニーは、好都合な成長条件下で形成される正常な光合成細胞である栄養細胞、環境条件が厳しくなった際に形成され得る気候耐性胞子であるアキネート、および窒素固定に重要な酵素ニトロゲナーゼを含有する厚壁の異質細胞などの、いくつかの異なる細胞種へと分化する能力を示す。
【００８２】
また、異質細胞は、窒素が必要な際はいつでも適切な環境条件（たとえば嫌気性）下で形成され得る。異質細胞形成種は窒素固定に特化しており、植物によって使用されることができない気体窒素を、植物によって吸収され、タンパク質および核酸へと変換されることができるアンモニア（ＮＨ３）、亜硝酸イオン（ＮＯ２−）、または硝酸イオン（ＮＯ３−）へと固定することができる。
【００８３】
また、多くのラン藻は連鎖体と呼ばれる運動型線維を形成し、これは、主バイオマスから移動して離れ、他の箇所で出芽して新しいコロニーを形成する。連鎖体中の細胞は、多くの場合、栄養状態にあるときよりも薄く、運動型鎖の両末端の細胞は先細になっている場合がある。親コロニーから離脱するために、連鎖体は、多くの場合、ネクリジウム（ｎｅｃｒｉｄｉｕｍ）と呼ばれる線維中のより弱い細胞を引き裂かなければならない。
【００８４】
それぞれの個々のラン藻細胞は、典型的には厚いゼラチン状の細胞壁を有する。ラン藻は、クオラムセンシング分子である自己誘導物質−２およびアシル−ホモセリンラクトンが存在しないという点で他のグラム陰性細菌とは異なる。これらは鞭毛を欠くが、連鎖体および一部の単細胞種は表面に沿って滑ることによって動き回り得る。水柱中では、一部のラン藻は古細菌のようにガス胞を形成することによって浮く。
【００８５】
ラン藻は、光合成において機能する精巧かつ高度に組織化された内膜系を有する。ラン藻における光合成では、一般に、水を電子供与体として使用し、酸素を副産物として産生するが、一部のラン藻は他の光合成細菌と同様に硫化水素も使用し得る。二酸化炭素はカルビンサイクルを介して還元されて炭水化物が形成される。ほとんどの形態では、光合成の機構は、チラコイドと呼ばれる細胞膜のひだ内に埋め込まれている。好気性条件下で窒素を固定するその能力により、ラン藻は、多くの場合、とりわけ真菌（たとえば地衣類）、サンゴ、シダ植物（たとえばＡｚｏｌｌａ）、および被子植物（たとえばＧｕｎｎｅｒａ）などのいくつかの他の生物群との共生生物として見つかる。
【００８６】
ラン藻は、好気性条件下で窒素および炭素を還元することができる唯一の生物群である。水を酸化する光合成は、光化学系（ＰＳ）ＩＩおよびＩの活性を連結させることによって達成される（Ｚ−スキーム）。また、嫌気性条件下では、ラン藻は、紅色光合成細菌と同様、水以外の電子供与体（たとえば、硫化水素、チオスルフェート、または分子水素）を用いてＰＳ  Ｉ（すなわち環状光リン酸化）しか使用することができない。さらに、ラン藻は、古細菌の特性である、暗所で嫌気性呼吸によって元素硫黄を還元する能力を共有する。ラン藻の光合成電子伝達系は呼吸電子伝達の構成要素と同じ区画を共有する。典型的には、形質膜は呼吸鎖の構成要素のみを含有する一方で、チラコイド膜は呼吸および光合成電子伝達をどちらも受け入れる。
【００８７】
チラコイド膜に付着したフィコビリソームが、ラン藻の光化学系の集光アンテナとして働く。フィコビリソーム構成要素（フィコビリタンパク質）がほとんどのラン藻の青緑色の色素の原因となっている。色の変動は主にカロテノイドおよびフィコエリスリンが原因であり、これらは細胞に赤茶色っぽい色を与え得る。一部のラン藻では、光の色がフィコビリソームの組成に影響を与える。緑色の光の中では、細胞はより多くのフィコエリスリンを蓄積する一方で、赤色の光の中では、これらはより多くのフィコシアニンを産生する。したがって、細菌は赤い光の中では緑色に見え、緑色の光の中では赤色に見える。このプロセスは補色適応として公知であり、細胞が光合成のために利用可能な光の使用を最大限にする方法を表している。
【００８８】
特定の実施形態では、ラン藻は、たとえば海洋性のラン藻または淡水性のラン藻であり得る。海洋性のラン藻（Ｃｙｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の例には、それだけには限定されないが、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＷＨ８１０２、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＲＣＣ３０７、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＮＫＢＧ  １５０４１ｃ、およびＴｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍが含まれる。淡水性のラン藻（Ｃｙａｏｂａｃｔｅｒｉａ）の例には、それだけには限定されないが、Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ＰＣＣ  ６８０３、Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ  ｂｏｒｙａｎｕｍ、およびＡｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．が含まれる。所望の酵素をコードしている外因性遺伝物質は、特定の自己複製ベクター中などで一過的に、または組み込み（たとえば組換え）によってなど安定して、ラン藻の天然のゲノム内に導入し得る。
【００８９】
他の実施形態では、本発明の遺伝子改変されたラン藻は汽水または塩水中で成長することが可能であり得る。淡水性のラン藻を使用する場合、トリグリセリドの産生の全体的な純費用は、培養物を成長させるために必要な栄養素および淡水の値段のどちらにも依存する。淡水は将来限りある資源となることが予測され、その場合、淡水の代替方法を見つけることが、対費用効果がより高くなる。２つのそのような代替方法には、（１）処理施設からの廃水の使用、および（２）塩水または汽水の使用が含まれる。
【００９０】
海洋中の塩水は３．１％〜３．８％の塩分範囲である場合があり、平均は３．５％であり、これは、完全にではないが、ほとんどが塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）イオンから構成される。他方で、汽水は淡水よりも多い塩分を有するが、海水ほど多くはない。汽水は．０．５％〜３％の塩分を含有し、したがって広い範囲の塩分レジームが含まれ、したがって正確に定義されない。廃水とは、ヒトの作用を受けた任意の水である。これは、家庭用および商業用の不動産、工業、ならびに／または農業から放出された液体廃棄物からなり、広範囲の潜在的な汚染物質を様々な濃度で包含する場合がある。
【００９１】
海洋中には幅広いラン藻の分布が存在し、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓは単に１つの生物学的地位を占めるのみである。具体的には、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２（以前はＡｇｍｅｎｅｌｌｕｍ  ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｕｍ株ＰＲ−６として公知）は汽水中で成長し、単細胞性であり、３８℃の最適成長温度を有する。この株は高塩条件での成長に十分に適している一方で、淡水中では非常にゆっくりと成長する。特定の実施形態では、本発明は、廃水または塩／汽水のいずれ中でも成長が可能となるように変更されたラン藻Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２の使用を企図する。塩化ナトリウムストレスに耐性のあるＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２変異体が記載されており（Ｂａｇｃｈｉ，  Ｓ．Ｎ．ら、Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈ  Ｒｅｓ．、２００７年、９２巻：８７〜１０１頁）、塩水中での成長に耐性がある遺伝子改変したＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２が記載されている（Ｗａｄｉｔｅｅ，  Ｒ．ら、ＰＮＡＳ、２００２年、９９巻：４１０９〜４１１４頁）。また、塩水耐性ラン藻は添付の実施例に記載のようにも調製し得る。本発明によれば、塩水耐性株は、０．５％〜４．０％の塩分範囲の塩分を有する水または培地中で成長することができるが、この範囲によって包含されるすべての塩分中で必ずしも成長できるとは限らない。一実施形態では、塩耐性株は、１．０％〜２．０％の塩分範囲の塩分を有する水または培地中で成長することができる。別の実施形態では、塩水耐性株は、２．０％〜３．０％の塩分範囲の塩分を有する水または培地中で成長することができる。
【００９２】
本明細書中に記載の方法に従って利用および／または遺伝子改変し得るラン藻の例には、それだけには限定されないが、Ａｐｈａｎｏｃａｐｓａ、Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ、Ｃｈａｍａｅｓｉｐｈｏｎ、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｈｒｏｏｇｌｏｅｏｃｙｓｔｉｓ、Ｃｏｅｌｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｙａｎｏｂｉｕｍ、Ｃｙａｎｏｄｉｃｔｙｏｎ、Ｃｙａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ、Ｄａｃｔｙｌｏｃｏｃｃｏｐｓｉｓ、Ｇｌｏｅｃａｐｓａ、Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ、Ｍｅｒｉｓｍｏｐｅｄｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｒａｄｉｏｃｙｓｔｉｓ、Ｒｈａｂｄｏｄｅｒｍａ、Ｓｎｏｗｅｌｌａ、Ｓｙｎｙｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、およびＷｏｒｏｎｉｃｈｉｎｉａの属からのＣｈｒｏｏｃｏｃｃａｌｅｓラン藻、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｂａｅｎｏｐｓｉｓ、Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ、Ａｕｌｏｓｉｒａ、Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ、Ｃｏｌｅｏｄｅｓｍｉｕｍ、Ｃｙａｎｏｓｐｉｒａ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｓｉｓ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｆｒｅｍｙｅｌｌａ、Ｇｌｅｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｈａｅｔｅ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ、Ｎｏｓｔｏｃ、Ｒｅｘｉａ、Ｒｉｃｈｅｌｉａ、Ｓｃｙｔｏｎｅｍａ、Ｓｐｒｉｒｅｓｔｉｓ、およびＴｏｙｐｏｔｈｒｉｘの属からのＮｏｓｔａｃａｌｅｓラン藻、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ、Ｇｅｉｔｌｅｒｉｎｅｍａ、Ｈａｌｏｍｉｃｒｏｎｅｍａ、Ｈａｌｏｓｐｉｒｕｌｉｎａ、Ｋａｔａｇｎｙｍｅｎｅ、Ｌｅｐｔｏｌｙｎｇｂｙａ、Ｌｉｍｎｏｔｈｒｉｘ、Ｌｙｎｇｂｙａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ、Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘ、Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ、Ｐｓｅｕｄｏａｎａｂａｅｎａ／Ｌｉｍｎｏｔｈｒｉｘ、Ｓｃｈｉｚｏｔｈｒｉｘ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ、Ｓｙｍｐｌｏｃａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ、Ｔｙｃｈｏｎｅｍａの属からのＯｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓラン藻、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｉｄｉｏｐｓｉｓ、Ｄｅｒｍｏｃａｒｐａ、Ｄｅｒｍｏｃａｒｐｅｌｌａ、Ｍｙｘｏｓａｒｃｉｎａ、Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａ、Ｓｔａｎｉｅｒｉａ、Ｘｅｎｏｃｏｃｃｕｓの属からのＰｌｅｕｒｏｃａｐｓａｌｅｓラン藻、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｔｈｒｉｘの属からのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅｓラン藻、ならびにＣａｐｓｏｓｉｒａ、Ｃｈｌｏｒｏｇｅｏｅｐｓｉｓ、Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａ、Ｈａｐａｌｏｓｉｐｈｏｎ、Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｄｏｐｓｉｓ、Ｎｏｓｔｏｃｈｏｐｓｉｓ、Ｓｔｉｇｏｎｅｍａ、Ｓｙｍｐｈｙｏｎｅｍａ、Ｓｙｍｐｈｏｎｅｍｏｐｓｉｓ、Ｕｍｅｚａｋｉａ、およびＷｅｓｔｉｅｌｌｏｐｓｉｓの属からのＳｔｉｇｏｎｅｍａｔａｌｅｓラン藻が含まれる。特定の実施形態では、ラン藻は、それだけには限定されないが、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｉｇｒａｎｕｌａｔｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｅｏｐｏｌｉｅｎｓｉｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、およびＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｓｃｅｎｓを含めた、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属からのものである。
【００９３】
特定の実施形態では、ラン藻は、Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．株ＰＣＣ  ７１２０、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．株ＰＣＣ  ６８０３、Ｎｏｓｔｏｃ  ｍｕｓｃｏｒｕｍ、Ｎｏｓｔｏｃ  ｅｌｌｉｐｓｏｓｐｏｒｕｍ、またはＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．株ＰＣＣ  ７１２０である。特定の好ましい実施形態では、ラン藻はＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７９４２株である。
【００９４】
本明細書中に提供する方法において利用し得るラン藻のさらなる例には、それだけには限定されないが、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．株ＷＨ７８０３、ＷＨ８１０２、ＷＨ８１０３（典型的にはコンジュゲーションによって遺伝子改変）、ベオサイト形成Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｉｄｉｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．（典型的にはコンジュゲーション／電気穿孔によって改変）、異質細胞非形成糸状株Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘ  ｓｐ．、Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ  ｂｏｒｙａｎｕｍ  Ｍ１０１（典型的には電気穿孔によって改変）、および異質細胞形成株Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．株ＡＴＣＣ  ２９４１３（典型的にはコンジュゲーションによって改変）、Ｔｏｌｙｐｏｔｈｒｉｘ  ｓｐ．株ＰＣＣ  ７６０１（典型的にはコンジュゲーション／電気穿孔によって改変）ならびにＮｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ株ＡＴＣＣ  ２９１３３（典型的にはコンジュゲーション／電気穿孔によって改変）が含まれる。
【００９５】
特定の好ましい実施形態では、ラン藻は、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７９４２株またはＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２（元はＡｇｍｅｎｅｌｌｕｍ  ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｕｍとして公知）であり得る。
【００９６】
特定の実施形態では、本発明の遺伝子改変された光合成微生物、たとえばラン藻は、任意の合理的な所望されるスケールのルーチン的な培養技法を用いて、太陽光、水、空気、および最小限の栄養素のみからトリグリセリドおよび／または他の炭素ベースの生成物を産生させるために使用し得る。特定の実施形態では、本発明は、定義された成長条件下で成長の利点を実証する、光合成微生物の自発性変異体の使用を企図する。他の利点の中でとりわけ、大量のトリグリセリドを最小限のエネルギーおよび栄養素の投入で産生する能力により、本発明の改変された光合成微生物、たとえばラン藻が、続いて生産するバイオディーゼルなどの生物燃料およびグリセリンなどの特殊化学製品のどちらに関しても、容易に管理可能かつ効率的な供給原料源となる。
【００９７】
改変された光合成微生物の作製方法
また、本発明の実施形態には、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが低下しているように光合成微生物を改変することを含む、野生型光合成微生物と比較して、ストレス条件下、たとえば低窒素下で低下した量のグリコーゲンを蓄積する、改変された光合成微生物、たとえばラン藻を作製する方法も含まれる。特定の実施形態では、前記１つまたは複数の遺伝子には、グルコース−１−リン酸アデニルトランスフェラーゼ（ｇｌｇＣ）、ホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）、および／またはグリコーゲンシンターゼ（ｇｌｇＡ）が含まれる。特定の実施形態では、発現または活性は、前記１つまたは複数の遺伝子の一部分またはすべてを突然変異または欠失させることによって低下させる。特定の実施形態では、発現または活性は、前記１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数の対立遺伝子をノックアウトまたはノックダウンすることによって低下させる。特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子の発現または活性は、光合成微生物を、前記１つまたは複数の遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは干渉ＲＮＡ、たとえばｓｉＲＮＡと接触させることによって低下させる。特定の実施形態では、前記１つまたは複数の遺伝子とハイブリダイズするポリヌクレオチド、たとえばアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡを発現するベクターを、前記光合成微生物内に導入する。
【００９８】
光合成微生物、たとえばラン藻は、たとえば、遺伝子の一部分もしくはすべてを欠失させるため、または機能的ポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを導入するために、当分野で知られている技法に従って遺伝子改変し得る。上述のように、特定の態様では、光合成微生物、たとえばラン藻における遺伝子操作は、ネイティブ光合成微生物配列、目的の外因性遺伝子、および選択マーカーまたは薬物耐性遺伝子を含有する非複製ベクターを導入することによって行うことができる。光合成微生物内に導入する際、ベクターは相同組換えによって光合成微生物のゲノム内に組み込まれ得る。このようにして、目的の外因性遺伝子および薬物耐性遺伝子が光合成微生物のゲノム内に安定に組み込まれる。その後、そのような組換え細胞は、薬物選択によって非組換え細胞から単離することができる。細胞の形質転換方法およびラン藻用の選択マーカーも当分野で周知である（たとえば、そのそれぞれが、ラン藻内への遺伝子移入のその説明およびラン藻に関する他の情報について参考として組み込まれている、Ｗｉｒｔｈ、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ、２１６巻：１７５〜７頁、１９８９年、ならびにＫｏｋｓｈａｒｏｖａ、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、５８巻：１２３〜３７頁、２００２年、ならびにＴＨＥ  ＣＹＡＮＯＢＡＣＴＥＲＩＡ：  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  ＧＥＮＥＴＩＣＳ，  ＡＮＤ  ＥＶＯＬＵＴＩＯＮ（Ａｎｔｏｎｉｏ  ＨｅｒｒｅｒａおよびＥｎｒｉｑｕｅ  Ｆｌｏｒｅｓ編）Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００８年を参照）。
【００９９】
グリコーゲンの生合成または貯蔵に関連する１つまたは複数の遺伝子のうちの任意のものの欠失または突然変異の作製は、本明細書中に記載および例示したものを含めた、当分野で知られている様々な方法に従って達成することができる。たとえば、本出願は、所定の遺伝子（たとえば、ｇｌｇＣ、ｐｇｍ）の上流および下流のフランキング領域を標的とし、これらのフランキング領域でラン藻ゲノムと組換えられて内在性コード配列をベクター配列で置き換える、非複製の選択可能なベクター系の使用を記載する。ベクター配列中に薬物選択マーカーなどの選択マーカーが存在することを考慮すると、遺伝子欠失を含有するラン藻細胞を容易に単離、同定および特徴づけることができる。そのような選択ベクターに基づく組換え方法は、上流および下流のフランキング領域の標的化に必ずしも限定される必要はなく、本明細書中に記載のようにその遺伝子が「非機能的」とされる限りは、所定の遺伝子内の内部配列も標的とし得る。
【０１００】
また、欠失または突然変異の作製は、アンチセンスに基づく技術を用いて達成することもできる。たとえばラン藻は、鉄調節性の転写物の中心部分に対してアンチセンスで転写され、大規模な塩基対合を介してその蓄積を遮断する１７７−ｎｔ  ｎｃＲＮＡ（たとえばＤｕｅｈｒｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０３巻：７０５４〜７０５８頁、２００６年を参照）、およびアンチセンスＲＮＡ（α−ｆｕｒＡ  ＲＮＡ）として作用してｆｕｒＡの転写物の翻訳を妨害する、完全ｆｕｒＡ遺伝子と重複し、かつそれに相補的なａｌｒ１６９０  ｍＲＮＡ（たとえばＨｅｒｎａｎｄｅｚら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３５５巻：３２５〜３３４頁、２００６年を参照）などの、アンチセンス調節に依存する天然の調節事象を含有することが示されている。したがって、本明細書中に記載のように、グリコーゲンの生合成または貯蔵に関与する遺伝子を標的としたアンチセンス分子の組み込みも、同様にこれらの遺伝子の発現を負に調節し、これらを「非機能的」にすると予測される。
【０１０１】
本明細書中で使用するアンチセンス分子には、遺伝子またはｍＲＮＡの標的コード鎖に相補的な配列を有する鎖を含む、一本鎖および二本鎖のポリヌクレオチドがどちらも包含される。したがって、アンチセンス分子には、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび二本鎖ｓｉＲＮＡ分子がどちらも含まれる。
【０１０２】
また、本発明は、天然に存在する脂肪酸の産生を増加するため、および／またはトリグリセリドを産生させるために、遺伝子改変などによって改変された光合成微生物を調製する方法にも関する。したがって、特定の態様では、改変された光合成微生物、たとえばラン藻は、（ｉ）低下した量のグリコーゲンの生合成もしくは貯蔵経路に関連する１つもしくは複数の遺伝子、および／または増加した量のグリコーゲン分解経路に関連するポリペプチドをコードしている１つもしくは複数のポリヌクレオチドを発現するように、光合成微生物を改変するステップと、（ｉｉ）脂肪酸および／またはトリグリセリド生合成に関連する１つまたは複数の酵素をコードしている１つまたは複数の所望のポリヌクレオチドを光合成微生物内に導入するステップとによって調製し得る。この方法は、（ｉｉｉ）１つまたは複数の所望のポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｔｏｄｅｓ）の導入が成功した光合成微生物について選択するステップであって、ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）が、たとえば、抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーを発現するベクター中に存在するステップをさらに含み得る。一例として、選択および単離には、当分野で知られている抗生物質耐性マーカー（たとえば、カナマイシン、スペクチノマイシン、およびストレプトマイシン）の使用が含まれ得る。
【０１０３】
特定の実施形態では、トリグリセリド合成に関連する１つまたは複数の酵素は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）酵素活性および／またはホスファチジン酸ホスファターゼ酵素活性を含む。特定の実施形態では、脂肪酸生合成に関連する１つまたは複数の酵素は、アシル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）酵素活性を含む。
【０１０４】
光合成（Ｐｈｏｔｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）微生物は、当分野で公知の技法に従って培養し得る。たとえばラン藻は、Ｎｅｄｂａｌら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．、１００巻：９０２〜１０頁、２００８年）に記載のものなどの光バイオリアクターに基づく技法に加えて、Ａｃｒｅｍａｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３巻：１９３〜１９４頁、１９９４年）に記載のものなどの当分野で知られている技法に従って培養または栽培し得る。ラン藻の典型的な実験室の培養条件の一例は、ＢＧ−１１培地（ＡＴＣＣ培地６１６）中、３０℃で、通気培養フラスコ中、常時撹拌および３０〜１００μモル光子ｍ−２秒−１の常時照度を用いて成長させることである。
【０１０５】
様々な培地がラン藻を培養するために利用可能であり、とりわけ、たとえば、ＡｉｂａおよびＯｇａｗａ（ＡＯ）培地、ＡｌｌｅｎおよびＡｒｎｏｎ培地＋硝酸塩（ＡＴＣＣ培地１１４２）、Ａｎｔｉａ（ＡＮＴ）培地、Ａｑｕｉｌ培地、Ａｓｈｂｅｙ無窒素寒天、ＡＳＮ−ＩＩＩ培地、ＡＳＰ２培地、ＡＳＷ培地（人工海水および誘導体）、ＡＴＣＣ培地６１７（海洋性藍藻用のＢＧ−１１、改変したＡＴＣＣ培地６１６［ＢＧ−１１培地］）、ＡＴＣＣ培地８１９（青緑色窒素固定培地、ＡＴＣＣ培地６１６［ＢＧ−１１培地］、ＮＯ３を含まない）、ＡＴＣＣ培地８５４（ＡＴＣＣ培地６１６［ＢＧ−１１培地］、ビタミンＢ１２を含む）、ＡＴＣＣ培地１０４７（ＡＴＣＣ培地９５７［ＭＮ海洋性培地］、ビタミンＢ１２を含む）、ＡＴＣＣ培地１０７７（窒素固定海洋性培地、ＡＴＣＣ培地９５７［ＭＮ海洋性培地］、ＮＯ３を含まない）、ＡＴＣＣ培地１２３４（ＢＧ−１１ウラシル培地、ＡＴＣＣ培地６１６［ＢＧ−１１培地］、ウラシルを含む）、Ｂｅｇｇｉａｔｏａ培地（ＡＴＣＣ培地１３８）、Ｂｅｇｇｉａｔｏａ培地２（ＡＴＣＣ培地１１９３）、藍藻用ＢＧ−１１培地（ＡＴＣＣ培地６１６）、青緑色（ＢＧ）培地、Ｂｏｌｄ基本（ＢＢ）培地、Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｔｚ  Ｄ培地、改変Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｔｚ  Ｄ培地（好塩性ラン藻）、Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｔｚ  ＤＧ培地、Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｔｚ  ＤＧＮ培地、Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｔｚ  ＮＤ培地、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓブロス、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ培地（ＡＴＣＣ培地９２０）、Ｃｈｕ＃１０培地（ＡＴＣＣ培地３４１）、改変Ｃｈｕ＃１０培地、改変Ｃｈｕ＃１１培地、ＤＣＭ培地、ＤＹＩＶ培地、Ｅ２７培地、Ｅ３１培地および誘導体、ｆ／２培地、ｆ／２培地誘導体、Ｆｒａｑｕｉｌ培地（淡水微量金属緩衝培地）、藻類用Ｇｏｒｈａｍ培地（ＡＴＣＣ培地６２５）、ｈ／２培地、Ｊａｗｏｒｓｋｉ（ＪＭ）培地、Ｋ培地、Ｌ１培地および誘導体、ＭＮ海洋性培地（ＡＴＣＣ培地９５７）、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｅｒｄｓｃｈｒｅｉｂｅｒ（ＰＥ）培地、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ＰＣ培地、プロテオースペプトン（ＰＰ）培地、Ｐｒｏｖ培地、Ｐｒｏｖ培地誘導体、Ｓ７７＋ビタミン培地、Ｓ８８＋ビタミン培地、塩水栄養素寒天（ＳＮＡ）培地および誘導体、ＳＥＳ培地、ＳＮ培地、改変ＳＮ培地、ＳＮＡＸ培地、土壌／水二相（Ｓ／Ｗ）培地および誘導体、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ用ＳＯＴ培地：ＡＴＣＣ培地１６７９、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ（ＳＰ）培地、ｖａｎ  ＲｉｊｎおよびＣｏｈｅｎ（ＲＣ）培地、Ｗａｌｓｂｙ培地、Ｙｏｐｐ培地、ならびにＺ８培地が含まれる。
【０１０６】
特定の実施形態では、改変された光合成微生物、たとえばラン藻は、トリグリセリドおよび／または脂肪酸の産生に好都合な条件下で成長させる。特定の実施形態では、光強度は１００〜２０００ｕＥ／ｍ２／秒、または２００〜１０００ｕＥ／ｍ２／秒である。特定の実施形態では、培養培地のｐＨ範囲は７．０〜１０．０である。特定の実施形態では、ＣＯ２は、１％〜１０％の範囲のレベルまで培養装置内に注入する。特定の実施形態では、ＣＯ２の範囲は２．５％〜５％である。特定の実施形態では、栄養素の添加は成長の直線期中に行う。これらの条件のそれぞれがトリグリセリド産生に望ましい。
【０１０７】
核酸およびポリペプチド
特定の実施形態では、本発明の改変された光合成微生物、たとえばラン藻は、それだけには限定されないが本明細書中に記載のもののうちの任意のものを含めた、グリコーゲンの分解またはトリグリセリドもしくは脂肪酸の生合成に関連する活性を有するポリペプチドをコードしている、１つまたは複数の外因性または導入した核酸を含む。特定の実施形態では、外因性核酸は、微生物のゲノムにネイティブな核酸配列を含まない。特定の実施形態では、外因性核酸は、微生物のゲノムにネイティブな核酸配列を含むが、これは、たとえば、微生物における核酸および／またはそのコードされているポリペプチドの発現を増加させるために、たとえばベクター中でまたは分子生物学技法によって、微生物内に導入されたものである。
【０１０８】
様々な実施形態では、本発明の改変された光合成微生物、たとえばラン藻は、グリコーゲンの合成および／または貯蔵に関連する１つまたは複数の遺伝子の発現が低下している。特定の実施形態では、これらの改変された光合成微生物は、グリコーゲンの合成および／または貯蔵に関連する遺伝子が突然変異または欠失している。特定の実施形態では、これらの改変された光合成微生物は、突然変異または欠失した遺伝子の一部分が含まれるベクター、たとえば、突然変異または欠失した遺伝子の１つまたは複数の対立遺伝子のノックアウトまたはノックダウンを生じるために使用する標的化ベクターを含む。特定の実施形態では、これらの改変された光合成微生物は、グリコーゲンの合成および／または貯蔵に関連する遺伝子によって発現されるｍＲＮＡと結合するアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを含む。
【０１０９】
グリコーゲンの合成および貯蔵
特定の実施形態では、改変された光合成微生物は、グリコーゲンの合成もしくは貯蔵経路に関連する１つまたは複数の遺伝子の発現が低下している、および／または、グリコーゲン分解経路に関連するタンパク質、またはその機能的変異体もしくは断片をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチドの発現が増加している。
【０１１０】
グリコーゲンとは、動物および細菌細胞を含めたほとんどの細胞において炭素およびエネルギーの貯蔵手段として機能する、グルコースの多糖である。より具体的には、グリコーゲンは、約９０％のα−１，４−グルコシド結合および１０％のα−１，６結合を含有する、非常に大きな分枝状グルコースホモポリマーである。特に細菌では、α−１，４−ポリグルカンの形態のグリコーゲンの生合成および貯蔵が、環境における一過性の飢餓条件に対処するための重要な戦略を表す。
【０１１１】
グリコーゲン生合成はいくつかの酵素の作用を含む。たとえば、細菌グリコーゲン生合成は、一般に、以下の一般ステップによって起こる：（１）ホスホグルコムターゼ（Ｐｇｍ）によって触媒されるグルコース−１−リン酸の形成、次いで、（２）グルコース−１−リン酸アデニリルトランスフェラーゼ（ＧｌｇＣ）によって触媒される、ＡＴＰおよびグルコース１−リン酸からのＡＤＰ−グルコースの合成、次いで、（３）グリコーゲンシンターゼ（ＧｌｇＡ）によって触媒される、ＡＤＰ−グルコースから既存のα−１，４グルカンプライマーへのグルコシル部分の転移。このグリコーゲン合成の後者のステップは、典型的には、ＡＤＰ−グルコースを、α−１，４−グリコシド鎖を伸長するためのグルコシルドナーとして利用することによって起こる。
【０１１２】
細菌中では、グリコーゲン合成の主な調節ステップは、ＡＤＰ−グルコース合成のレベル、または上記ステップ（２）である、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼとしても公知のグルコース−１−リン酸アデニリルトランスフェラーゼ（ＧｌｇＣ）によって触媒される反応で起こる（たとえばＢａｌｌｉｃｏｒａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、６巻：２１３〜２２５頁、２００３年を参照）。対照的に、哺乳動物のグリコーゲン合成における主な調節ステップはグリコーゲンシンターゼのレベルで起こる。本明細書中に示すように、ラン藻などの光合成微生物のグリコーゲン合成経路における調節および／または他の活性構成要素を変更し、それによりグリコーゲンの生合成および貯蔵を低下させることによって、そうでなければグリコーゲンとして保存されたであろう炭素が前記光合成微生物によって利用されて、脂質、脂肪酸、およびトリグリセリドなどの他の炭素系の貯蔵分子を合成することができる。
【０１１３】
したがって、特定の本発明の改変された光合成微生物、たとえばラン藻は、突然変異、欠失、またはこれらのステップのうちの１つもしくは複数を破壊する（すなわち、グリコーゲンの生合成および／もしくは貯蔵に関して１つもしくは複数のステップを「非機能的」にする）、あるいは、これらのステップに直接関与する酵素のうちの任意の１つもしくは複数、またはそれらをコードしている遺伝子を変更する、任意の他の変更を含み得る。上述のように、そのような改変された光合成微生物、たとえばラン藻は、典型的には、野生型光合成微生物と比較して増加した量の脂肪酸などの脂質を産生および／または蓄積することができる。
【０１１４】
ａ．ホスホグルコムターゼ遺伝子（ｐｇｍ）
一実施形態では、改変された光合成微生物、たとえばラン藻は、低下した量のホスホグルコムターゼ遺伝子を発現する。特定の実施形態では、これは、その調節要素（たとえば、プロモーター、エンハンサー、転写因子、正または負の調節タンパク質など）のうちの任意のものを含めた、ホスホグルコムターゼ遺伝子中の突然変異または欠失を含み得る。遺伝子ｐｇｍによってコードされているホスホグルコムターゼ（Ｐｇｍ）は、典型的には酵素と結合した中間体グルコース１，６−二リン酸を介して、グルコース１−リン酸からグルコース６−リン酸への可逆的変換を触媒する（たとえばＬｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７６巻：５８４７〜５８５１頁、１９９４年を参照）。この反応は可逆的であるが、グルコース−６−リン酸の形成が顕著に支持される。
【０１１５】
しかし、典型的には、大量のグルコース−６−リン酸が存在する場合、Ｐｇｍは１−炭素のリン酸化およびｃ−炭素の脱リン酸化を触媒し、グルコース−１−リン酸がもらされる。その後、生じたグルコース−１−リン酸はＧｌｇＣの触媒活性を含めたいくつかの中間ステップによってＵＤＰ−グルコースへと変換され、その後、これは以下に記載のようにグリコーゲンシンターゼの活性によってグリコーゲン貯蔵分子に付加されることができる。したがって、特定の条件下では、Ｐｇｍ酵素はグリコーゲンの生合成および貯蔵において中間的な役割を果たす。
【０１１６】
ｐｇｍ遺伝子は、すべてではないとしてもほとんどのラン藻を含めた、広範囲の生物において発現される。また、ｐｇｍ遺伝子はラン藻間で適度に保存されており、これは、ラン藻由来の様々なｐｇｍ遺伝子のポリヌクレオチド配列を提供する配列番号３７（Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２）、７５（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３）、および７９（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＷＨ８１０２）を比較した際に理解することができる。
【０１１７】
Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓなどのラン藻中のｐｇｍ遺伝子の欠失が、前記ラン藻においてグリコーゲンの蓄積を低下させ、また、脂質および脂肪酸などの他の炭素ベースの生成物の産生を増加させることは、本発明で初めて実証された。
【０１１８】
ｂ．グルコース−１−リン酸アデニリルトランスフェラーゼ（ｇｌｇＣ）
一実施形態では、改変された光合成微生物、たとえばラン藻は、低下した量のグルコース−１−リン酸アデニリルトランスフェラーゼ（ｇｌｇＣ）遺伝子を発現する。特定の実施形態では、これは、その調節要素のうちの任意のものを含めた、ｇｌｇＣ遺伝子中の突然変異または欠失を含み得る。ｇｌｇＣ遺伝子によってコードされている酵素（たとえばＥＣ２．７．７．２７）は、一般に、以下の化学反応を触媒することによってデンプン、グリコーゲンおよびスクロースの代謝に関与する：
ＡＴＰ＋アルファ−Ｄ−グルコース１−リン酸⇔二リン酸＋ＡＤＰ−グルコース
したがって、この酵素の２つの基質はＡＴＰおよびアルファ−Ｄ−グルコース１−リン酸である一方で、その２つの産物は二リン酸およびＡＤＰ−グルコースである。ｇｌｇＣにコードされている酵素は、植物中のデンプン生合成および細菌中のグリコーゲン生合成において第１のコミットメントおよび律速ステップを触媒する。これは、植物および細菌における貯蔵多糖の蓄積の調節の酵素部位であり、エネルギー流束の代謝物によってアロステリックに活性化または阻害される。
【０１１９】
ｇｌｇＣ遺伝子によってコードされている酵素は、トランスフェラーゼ、具体的にはリン含有ヌクレオチド基を転移するトランスフェラーゼ（すなわちヌクレオチジル−トランスフェラーゼ）のファミリーに属する。この酵素クラスの系統名は、典型的にはＡＴＰ：アルファ−Ｄ−グルコース−１−リン酸アデニリルトランスフェラーゼと呼ばれる。一般的に使用されている他の名称には、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、グルコース１−リン酸アデニリルトランスフェラーゼ、アデノシン二リン酸グルコースピロホスホリラーゼ、アデノシンジホスホグルコースピロホスホリラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、ＡＤＰ−グルコースシンターゼ、ＡＤＰ−グルコース合成酵素、ＡＤＰＧピロホスホリラーゼ、およびＡＤＰ：アルファ−Ｄ−グルコース−１−リン酸アデニリルトランスフェラーゼが含まれる。
【０１２０】
ｇｌｇＣ遺伝子は、すべてではないとしてもほとんどのラン藻を含めた、広範囲の植物および細菌において発現される。また、ｇｌｇＣ遺伝子はラン藻間で適度に保存されており、これは、ラン藻由来の様々なｇｌｇＣ遺伝子のポリヌクレオチド配列を記載している配列番号６７（Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２）、５９（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３）、７３（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２）、６９（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＷＨ８１０２）、７１（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＲＣＣ  ３０７）、６５（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ  ＩＭＳ  １０１）、６３（Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉｂｉｌｉｓ）、および６１（Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７１２０）を比較した際に理解することができる。
【０１２１】
Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓなどのラン藻中のｇｌｇＣ遺伝子の欠失が、前記ラン藻においてグリコーゲンの蓄積を低下させ、また、脂質および脂肪酸などの他の炭素ベースの生成物の産生を増加させることは、本発明で初めて実証された。
【０１２２】
ｃ．グリコーゲンシンターゼ（ｇｌｇＡ）
一実施形態では、改変された光合成微生物、たとえばラン藻は、低下した量のグリコーゲンシンターゼ遺伝子を発現する。特定の実施形態では、これは、その調節要素のうちの任意のものを含めた、グリコーゲンシンターゼ遺伝子中の欠失または突然変異を含み得る。ＵＤＰ−グルコース−グリコーゲングルコシルトランスフェラーゼとしても公知のグリコーゲンシンターゼ（ＧｌｇＡ）は、ＵＤＰ−グルコースと（１，４−α−Ｄ−グルコシル）ｎとを反応させてＵＤＰおよび（１，４−α−Ｄ−グルコシル）ｎ＋１を得る反応を触媒するグリコシルトランスフェラーゼ酵素である。グリコーゲンシンターゼは、追加のグルコース単量体を成長中のグリコーゲンポリマー上に組み込むためにＡＤＰ−グルコースを使用する、α−保持グルコシルトランスフェラーゼである。本質的に、ＧｌｇＡは、グリコーゲンとして貯蔵するために過剰のグルコース残基を１個ずつポリマー鎖へと変換する最終ステップを触媒する。
【０１２３】
古典的に、グリコーゲンシンターゼ、またはα−１，４−グルカンシンターゼは、配列、糖ドナーの特異性および調節機構の差異に応じて、２つのファミリー、すなわち動物／真菌グリコーゲンシンターゼおよび細菌／植物デンプンシンターゼへと分類されている。しかし、詳細な配列解析、予測される二次構造の比較、およびスレッディング分析により、これら２つのファミリーは構造的に関連しており、動物／真菌のシンターゼの一部のドメインは、これらの細胞種の特定の調節要件を満たすために獲得されたものであったことが示されている。
【０１２４】
特定の細菌グリコーゲンシンターゼの結晶構造が確立されている（たとえばＢｕｓｃｈｉａｚｚｏら、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２３巻、３１９６〜３２０５頁、２００４年を参照）。これらの構造は、報告されているグリコーゲンシンターゼは、グリコーゲンホスホリラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｌｙａｓｅ）およびグリコシルトランスフェラーゼスーパーファミリーの他のグリコシルトランスフェラーゼと同様に組織化された２つのロスマンフォールドドメインへと折り畳まれ、２つのドメイン間に触媒中心が含まれる深い亀裂を有することを示している。このグリコーゲンシンターゼのＮ末端ドメインのコアは、９本鎖の主に平行な中心β−シートおよび両側に隣接する７個のα−ヘリックスからなる。Ｃ末端ドメイン（残基２７１〜４５６）は、６本鎖の平行なβ−シートおよび９個のα−ヘリックスを有する同様の折り畳みを示す。このドメインの最後のα−ヘリックスは位置４５７〜４６０でねじれ、タンパク質の最後の１７個の残基（４６１〜４７７）がＮ末端ドメイン上を交差してα−ヘリックスとして続き、これはグリコシルトランスフェラーゼ酵素の典型的な特長である。
【０１２５】
また、これらの構造は、グリコーゲンシンターゼの全体的な折り畳みおよび活性部位構造がグリコーゲンホスホリラーゼのそれに顕著に類似しており、後者が炭水化物の蓄えの可動化の中心的な役割を果たしていることも示しており、これは共通の触媒機構および比較可能な基質結合特性を示している。しかし、グリコーゲンホスホリラーゼとは対照的に、グリコーゲンシンターゼははるかにより広い触媒間隙を有しており、これは触媒サイクル中に重要なドメイン間「閉合」動作を受けることが予測される。
【０１２６】
特定のＧｌｇＡ酵素の結晶構造が確立されている（たとえば、参考として組み込まれているＪｉｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ、２４巻：６９４〜７０４頁、２００５年を参照）。これらの研究は、ＧｌｇＡのＮ末端触媒ドメインがジヌクレオチド結合ロスマンフォールドと似ており、Ｃ末端ドメインが協同的なアロステリック調節およびユニークなオリゴマー化に関与する左回りの平行ベータヘリックスを採用することを示している。また、調節因子結合部位と活性部位との間の情報伝達は、Ｎ末端、グルコース−１−リン酸結合部位、およびＡＴＰ結合部位を含めた酵素のいくつかの明確な領域を含む。
【０１２７】
ｇｌｇＡ遺伝子は、すべてではないとしてもほとんどのラン藻を含めた、動物、植物、真菌および細菌細胞を含めた広範囲の細胞において発現される。また、ｇｌｇＡ遺伝子はラン藻間で適度に保存されており、これは、ラン藻由来の様々なｇｌｇＡ遺伝子のポリヌクレオチド配列を記載している配列番号５１（Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２）、４３（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｓｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３）、５７（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２）、５３（Ｓｎｙｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＷＨ８１０２）、５５（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＲＣＣ  ３０７）、４９（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ  ＩＭＳ  １０１）、４７（Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、および４５（Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７１２０）を比較した際に理解することができる。
【０１２８】
ｄ．グリコーゲン分解遺伝子
特定の実施形態では、本発明の改変された光合成微生物は、増加した量のグリコーゲン分解経路に関連する１つまたは複数の遺伝子を発現する。特定の実施形態では、前記１つまたは複数のポリヌクレオチドは、グリコーゲンホスホリラーゼ（ＧｌｇＰ）、グリコーゲンイソアミラーゼ（ＧｌｇＸ）、グルカノトランスフェラーゼ（ＭａｌＱ）、ホスホグルコムターゼ（Ｐｇｍ）、グルコキナーゼ（Ｇｌｋ）、および／もしくはホスホグルコースイソメラーゼ（Ｐｇｉ）、またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている。Ｐｇｍ、Ｇｌｋ、およびＰｇｉは、条件次第でグリコーゲンの合成または分解を促進することができる双方向の酵素である。
【０１２９】
トリグリセリドおよび脂肪酸生合成
様々な実施形態では、本発明の改変された光合成微生物、たとえばラン藻は、それだけには限定されないが本明細書中に記載のもののうちの任意のものを含めた、トリグリセリドまたは脂肪酸の生合成に関連する活性を有するポリペプチドをコードしている、１つまたは複数の外因性または導入した核酸を含む。特定の実施形態では、外因性核酸は、微生物のゲノムにネイティブな核酸配列を含まない。特定の実施形態では、外因性核酸は、微生物のゲノムにネイティブな核酸配列を含むが、これは、たとえば、微生物における核酸および／またはそのコードされているポリペプチドの発現を増加させるために、たとえばベクター中でまたは分子生物学技法によって、微生物内に導入されたものである。
【０１３０】
ａ．トリグリセリド生合成
トリグリセリド、またはトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）は、主に３個の脂肪酸でエステル化されたグリセロールからなり、酸化された際に炭水化物またはタンパク質のどちらよりも多くのエネルギーを与える。トリグリセリドは、ほとんどの真核生物においてエネルギー貯蔵の重要な機構を提供する。哺乳動物では、ＴＡＧは脂肪細胞および肝細胞を含めたいくつかの細胞種中で合成および保存される（Ｂｅｌｌら、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４９巻：４５９〜４８７頁、１９８０年）（本明細書中に参考として組み込まれている）。植物では、ＴＡＧの産生は種子油の生成に主に重要である。
【０１３１】
真核生物とは対照的に、原核生物におけるトリグリセリド産生の観察は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、ＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの属のメンバーなどの特定の放線菌、ならびにＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の特定のメンバーに限定されている。特定のＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ種では、トリグリセリドは細胞乾重量のほぼ８０％まで蓄積され得るが、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒでは細胞乾重量の約１５％までしか蓄積されない。一般に、トリグリセリドは球状の脂質体中で保存され、量および直径はそれぞれの種、成長段階、および栽培条件に依存する。たとえば、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓの細胞は、炭素および窒素の含有率が高い複合培地中で栽培した場合には数個のＴＡＧしか含有しないが、窒素対炭素の比が低い鉱酸塩培地中で細胞を栽培した場合はＴＡＧ体の脂質含有量および数が劇的に増加し、後期静止増殖期中に最大が得られる。この段階では、細胞は５０〜４００ｎｍの範囲の直径を示す脂質体でほぼ完全に満たされる場合がある。一例はＲ．ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０であり、脂質は全細胞乾重量の７０％を超える量に達する場合がある。
【０１３２】
細菌では、ＴＡＧの形成は、典型的にはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ酵素が形質膜に結合することから開始され、次いで、小脂質滴（ＳＬＤ）が形成される。これらのＳＬＤは直径が数ナノメートルしかなく、膜結合した酵素と会合したまま保たれる。この脂質蓄積段階では、ＳＬＤは、典型的には、形質膜で乳状の油性（ｏｌｅｏｇｅｎｏｕｓ）層を形成する。持続的な脂質合成中、ＳＬＤは膜と会合したアシルトランスフェラーゼを離れ、膜と結合した脂質前駆体と集塊する。これらの脂質前駆体は、明確な大きさ、たとえば、Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓでは約２００ｎｍ、Ｒ．ｏｐａｃｕｓでは約３００ｎｍに達した後、膜との接触を失い、細胞質内に放出される。遊離および膜と結合した脂質前駆体は、蛍光顕微鏡観察中にＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓで観察されており、また、Ｒ．ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０およびＡ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ  ＡＤＰ１でも確認されているように、細胞質および細胞壁で生じる脂質ドメインに対応する（たとえば、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３１巻：１５６１〜１５７２頁、１９９９年、およびＷａｅｌｔｅｒｍａｎｎら、Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５５巻：７５０〜７６３頁、２００５年を参照）。脂質前駆体中では、ＳＬＤは互いに合体して成熟脂質体中に見つかる均質な脂質コアを形成し、これらは多くの場合、電子顕微鏡観察において不透明に見える。
【０１３３】
細菌ＴＡＧの組成および構造は、微生物および炭素源に応じて相当に変動する。さらに、フェニルデカン酸および４，８，１２トリメチルトリデカン酸などの通常でないアシル部分も、細菌ＴＡＧの構造的多様性に寄与し得る（たとえばＡｌｖａｒｅｚら、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、６０巻：３６７〜７６頁、２００２年を参照）。
【０１３４】
真核生物と同様、原核生物におけるＴＡＧの主な機能は、エネルギーおよび炭素の貯蔵化合物として役割を果たすことである。しかし、ＴＡＧは原核生物において他の機能を提供し得る。たとえば、脂質体は、扱いにくい炭素源での成長中に形成された毒性があるまたは無用の脂肪酸の蓄積物として作用する場合があり、形質膜およびリン脂質（ＰＬ）の生合成から排除しなければならない。さらに、多くのＴＡＧを蓄積する細菌は土壌中に遍在し、この生息環境中では、脱水を引き起こす水不足が頻繁な環境ストレスである。脱水条件下での脂質の炭化水素鎖の酸化は相当な量の水を生じるため、蒸発耐性脂質の貯蔵が、基本的な水の供給を維持するための戦略であり得る。しかし、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓなどのラン藻は、これらの生物がトリグリセリド生合成に必要な酵素を欠くため、トリグリセリドを産生しない。
【０１３５】
トリグリセリドは脂肪酸およびグリセロールから合成される。トリグリセリド（ＴＡＧ）合成の一機構として、「ケネディ経路」を介したグリセロール−３−リン酸の連続的アシル化により、ホスファチデートの形成がもたらされる。その後、ホスファチデートは酵素ホスファチジン酸ホスファターゼによって脱リン酸化されて、１，２ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）が得られる。ＤＡＧを基質として用いて、少なくとも３つの異なるクラスの酵素がＴＡＧ形成を媒介できる。一例として、ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）活性を有する酵素は、アシル−ＣｏＡを基質として使用してＤＡＧのアシル化を触媒する。本質的に、ＤＧＡＴ酵素はアシル−ＣｏＡを１，２ジアシルグリセロール分子と合わせてＴＡＧを形成する。代替方法として、アシル−ＣｏＡ非依存性のＴＡＧ合成は、リン脂質をＤＡＧエステル化のアシルドナーとして使用する、酵母および植物中に見つかるリン脂質：ＤＡＧアシルトランスフェラーゼによって媒介され得る。第３に、動物および植物におけるＴＡＧ合成は、ＤＡＧをアシルのドナーおよびアクセプターのどちらとしても使用するＤＡＧ−ＤＡＧ−トランスアシラーゼによって媒介される場合があり、ＴＡＧおよびモノアシルグリセロールが得られる。
【０１３６】
本発明の改変された光合成微生物、たとえばラン藻は、上述のポリペプチドおよび酵素のうちの１つまたは複数を含むポリペプチドをコードしている、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態では、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドは、ジアシルグリセロールトランスフェラーゼおよび／もしくはホスファチジン酸ホスファターゼ、またはその変異体もしくは機能断片をコードしている。
【０１３７】
野生型ラン藻は、典型的には、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性およびジアシルグリセロールトランスフェラーゼ活性を有する酵素などの、トリグリセリド合成に必要な酵素をコードしていないため、本発明の実施形態には、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有する１つもしくは複数の酵素および／またはジアシルグリセロールトランスフェラーゼ活性を有する１つもしくは複数の酵素をコードしているポリヌクレオチドを含む、遺伝子改変されたラン藻が含まれる。
【０１３８】
さらに、トリグリセリドは典型的には脂肪酸から形成されるため、細胞中の脂肪酸生合成のレベルがトリグリセリドの産生を制限し得る。したがって、脂肪酸生合成のレベルを増加させることで、トリグリセリドの産生の増加が可能となり得る。以下に記述するように、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼが脂肪酸生合成へのコミットメントステップを触媒する。したがって、本発明の特定の実施形態には、脂肪酸生合成および脂質産生を増加させるためにアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有する１つまたは複数の酵素、ならびにトリグリセリド産生を触媒するためにホスファチジン酸ホスファターゼおよび／またはジアシルグリセロールトランスフェラーゼ活性を有する１つまたは複数の酵素をコードしているポリヌクレオチドを含む、ラン藻およびその使用方法が含まれる。
【０１３９】
本明細書中で使用する、本発明の「ホスファチジン酸ホスファターゼ」遺伝子には、酵素反応性条件下でホスファチデート（ＰｔｄＯＨ）の脱リン酸化を触媒してジアシルグリセロール（ＤＡＧ）および無機ホスフェートを与える能力を実証する、任意の細胞源から得ることができるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドなどのアミノ酸をコードしている任意のポリヌクレオチド配列が含まれ、さらに、そのような能力を有するホスファチジン酸ホスファターゼ配列の任意の天然に存在するまたは天然に存在しない変異体が含まれる。
【０１４０】
ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ、３−ｓｎ−ホスファチデートリン酸加水分解酵素）は、ホスファチデート（ＰｔｄＯＨ）の脱リン酸化を触媒して、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）および無機ホスフェートを与える。この酵素は、加水分解酵素、具体的にはリン酸モノエステル結合に作用するもののファミリーに属する。この酵素クラスの系統名は３−ｓｎ−ホスファチデートリン酸加水分解酵素である。一般的に使用されている他の名称には、リン酸ホスファターゼ、酸ホスファチジルホスファターゼ、およびリン酸リン酸加水分解酵素が含まれる。この酵素は、グリセロ脂質代謝、グリセロリン脂質代謝、エーテル脂質代謝、およびスフィンゴ脂質代謝の少なくとも４つの代謝経路に関与する。
【０１４１】
ＰＡＰ酵素は、その産物ジアシルグリセロールを介してリン脂質およびトリアシルグリセロールの合成、ならびに真核細胞における脂質シグナル伝達分子の生成または分解のどちらにおいても役割を果たす。ＰＡＰ酵素は、典型的には、触媒活性におけるその補因子の必要性に関してＭｇ２＋依存性（ＰＡＰ１酵素と呼ばれる）またはＭｇ２＋非依存性（ＰＡＰ２または脂質リン酸ホスファターゼ（ＬＰＰ）酵素）のどちらかとして分類される。酵母および哺乳動物系のどちらにおいても、ＰＡＰ２酵素は脂質シグナル伝達に関与していることが公知である。対照的に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中に見つかるものなどのＰＡＰ１酵素は、新規脂質合成に役割を果たし（Ｈａｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２８１巻：９２１０〜９２１８頁、２００６年）、それによって、２つの種類のＰＡＰが異なる生理的機能を担っていることが明らかとなる。
【０１４２】
酵母および高等真核細胞のどちらにおいても、ＰＡＰ反応は、ＰｔｄＯＨから中間体ＤＡＧを介して形成される貯蔵脂質トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の合成におけるコミットメントステップである。また、反応生成物ＤＡＧは膜リン脂質ホスファチジルコリン（ＰｔｄＣｈｏ）およびホスファチジルエタノールアミンの合成にも使用される。基質ＰｔｄＯＨは、中間体ＣＤＰ−ＤＡＧを介したすべての膜リン脂質（および誘導体イノシトール含有スフィンゴ脂質）の合成に使用される。したがって、ＰＡＰ活性の調節が、細胞がＤＡＧを介して貯蔵脂質およびリン脂質を作製するか、またはＣＤＰ−ＤＡＧを介してリン脂質を作製するかを支配し得る。さらに、ＰＡＰはリン脂質合成の転写調節に関与している。
【０１４３】
ＰＡＰ１酵素は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でＰＡＰ１酵素をコードしていると同定された遺伝子（Ｐａｈ１、以前はＳｍｐ２として公知）が含まれる酵母の膜およびサイトゾル画分から精製され、特徴づけられている。Ｐａｈ１にコードされているＰＡＰ１酵素は細胞のサイトゾルおよび膜画分中に見つかり、膜とのその会合は周辺性の性質である。酵母から精製された複数の形態のＰＡＰ１から予測されるように、ｐａｈ１Δ変異体は依然としてＰＡＰ１活性を含有しており、ＰＡＰ１活性を有する酵素をコードしているさらなる遺伝子または複数の遺伝子の存在が示される。
【０１４４】
Ｐａｈ１にコードされているＰＡＰ１を欠く変異体の分析により、この酵素が脂質合成に使用されるＤＡＧを生成するという証拠が提供されている。ｐａｈ１Δ突然変異を含有する細胞はＰｔｄＯＨを蓄積し、ＤＡＧおよびそのアシル化誘導体ＴＡＧの量が低下している。指数関数的に成長中の酵母においてリン脂質合成はＴＡＧの合成よりも優位である一方で、成長の静止期ではＴＡＧ合成がリン脂質の合成よりも優位である。ＴＡＧ含有率に対するｐａｈ１Δ突然変異の効果は、静止期で最も明白である。たとえば、Ｐａｈ１遺伝子を欠く静止期の細胞は＞９０％のＴＡＧ含有率の低下を示す。同様に、ｐａｈ１Δ突然変異は成長の対数期でリン脂質組成（たとえば、その結果としてのＰｔｄＣｈｏ含有率の低下）に対して最も顕著な効果を示す。リン脂質合成の転写調節におけるその役割のために、細胞の生理学におけるＰａｈ１にコードされているＰＡＰ１酵素の重要性がさらに強調される。
【０１４５】
ＰＡＰ酵素の補因子としてのＭｇ２＋イオンの必要性は、これらの酵素のホスファターゼ反応を支配する触媒モチーフと相関している。たとえば、Ｐａｈ１にコードされているＰＡＰ１酵素は、ハロ酸脱ハロゲン酵素（ＨＡＤ）様ドメイン内にＤｘＤｘＴ（配列番号３０）触媒モチーフを有する（「ｘ」は任意のアミノ酸である）。このモチーフはＭｇ２＋依存性ホスファターゼ酵素のスーパーファミリー中に見つかり、その最初のアスパラギン酸残基が、ホスファターゼ反応におけるホスフェート部分との結合を担っている。対照的に、ＤＰＰ１およびＬＰＰ１にコードされているＰＡＰ２酵素は、膜の親水性表面に局在する３個のドメインの脂質ホスファターゼモチーフを含有する。コンセンサス配列ＫｘｘｘｘｘｘＲＰ（ドメイン１）（配列番号１０）、ＰＳＧＨ（ドメイン２）（配列番号１１）、およびＳＲｘｘｘｘｘＨｘｘｘＤ（ドメイン３）（配列番号１２）を含むこの触媒モチーフは、活性にＭｇ２＋イオンを必要としない脂質ホスファターゼのスーパーファミリーに共通である。ドメイン１中の保存されたアルギニン残基ならびにドメイン２および３中の保存されたヒスチジン残基はＰＡＰ２酵素の触媒活性に重要であり得る。したがって、ホスファチドホスファターゼポリペプチドは、上述の触媒モチーフのうちの１つまたは複数を含み得る。
【０１４６】
ホスファチジン酸ホスファターゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、適切な内在性ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子を有する任意の生物から得られ得る。ホスファチジン酸ホスファターゼをコードしているポリヌクレオチド配列を得るために使用し得る生物の例には、それだけには限定されないが、とりわけ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓが含まれる。本明細書中で使用する、本発明の「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」（ＤＧＡＴ）遺伝子には、酵素反応性条件下で１，２−ジアシルグリセロールおよび脂肪酸アシル基質からのトリアシルグリセロールの産生を触媒する能力を実証する、任意の細胞源から得ることができるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドなどのアミノ酸をコードしている任意のポリヌクレオチド配列、ならびに、そのような能力を有するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ配列の任意の天然に存在する（たとえば、対立遺伝子変異体、相同分子種）または天然に存在しない変異体が含まれる。また、本発明のＤＧＡＴ遺伝子には、多くのＴＡＧ産生細菌中でしばしば見つかるように、ＤＧＡＴ活性およびＣｏＡ：脂肪アルコールアシルトランスフェラーゼ活性、すなわちワックスエステル合成（ＷＳ）活性を示す二重機能的タンパク質などの、二重機能的タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列も含まれる。
【０１４７】
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）は、ステロールまたはジアシルグリセロール（ｄｉａｃｙｇｌｙｃｅｒｏｌｓ）のどちらかをオレオイル−ＣｏＡ依存性の様式でエステル化する、Ｏ−アシルトランスフェラーゼスーパーファミリーのメンバーである。ＤＧＡＴは、特にジアシルグリセロールをエステル化し、この反応は、植物、真菌および哺乳動物におけるトリアシルグリセロールの産生の最終酵素ステップを表す。具体的には、ＤＧＡＴは、アシル基をアシル−補酵素−Ａから１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）のｓｎ−３位へと転移してトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を形成することを担っている。ＤＧＡＴは、一般にＨａｒｗｏｏｄ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ．  Ａｃｔａ、１３０１巻：７〜５６頁、１９９６年）、Ｄａｕｍら（Ｙｅａｓｔ、１６巻：１４７１〜１５１０頁、１９９８年）、およびＣｏｌｅｍａｎら（Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｎｕｔｒ．、２０巻：７７〜１０３頁、２０００年）（そのそれぞれが本明細書中に参考として組み込まれている）に記載されている内在性膜タンパク質である。
【０１４８】
植物および真菌では、ＤＧＡＴは膜および脂質体の画分と会合している。ＴＡＧの触媒において、ＤＧＡＴはエネルギーの蓄えとして使用される炭素の貯蔵に主に寄与する。しかし、動物では、ＤＧＡＴの役割はより複雑である。ＤＧＡＴは、リポタンパク質のアセンブリおよび血漿トリアシルグリセロール濃度の調節に役割を果たすだけでなく（Ｂｅｌｌ，  Ｒ．  Ｍ．ら）、ジアシルグリセロールレベルの調節にも関与する（Ｂｒｉｎｄｌｅｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄｓ，  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ、Ｖａｎｃｅ，  Ｄ．  Ｅ．およびＶａｎｃｅ，  Ｊ．  Ｅ．編（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）、１７１〜２０３頁、およびＮｉｓｈｉｚｕｋａ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８巻：６０７〜６１４頁（１９９２年）（そのそれぞれが本明細書中に参考として組み込まれている））。
【０１４９】
真核生物では、ＴＡＧを形成する能力を有するタンパク質をコードしている、少なくとも３個の独立したＤＧＡＴ遺伝子ファミリー（ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、およびＰＤＡＴ）が記載されている。酵母はＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、およびＰＤＡＴの３つすべてを含有するが、これらの遺伝子ファミリーの発現レベルは生活環の様々な期中に変動する（Ｄａｈｌｑｖｓｔ，  Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９７巻：６４８７〜６４９２頁（２０００年）（本明細書中に参考として組み込まれている）。
【０１５０】
原核生物では、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ  ＡＤＰ１由来のＷＳ／ＤＧＡＴが、細菌ワックスエステルおよびＴＡＧ生シンターゼの広範なクラスの最初に同定されたメンバーを表す。この酵素は、推定上の膜貫通領域を含むが、真核生物由来のＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２ファミリーに配列相同性を示さない。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下では、ＷＳ／ＤＧＡＴは、様々なアシル−ＣｏＡチオエステルのアシル部分のアクセプターとして多種多様の脂肪アルコール、さらにはチオールを利用する、幅広い能力を示す。ＷＳ／ＤＧＡＴアシルトランスフェラーゼ酵素は並外れて幅広い基質特異性を示す。相同的なアシルトランスフェラーゼの遺伝子が、たとえば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｉｉ、Ａ．ｂａｕｍａｎｉｉ、およびＭ．ａｖｉｕｍ、およびＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＣＤＣ１５５１を含めた、中性脂肪を蓄積することができるほとんどすべての細菌中で見つかっており、約１５個の機能的相同体が存在する（たとえば、Ｄａｎｉｅｌら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８６巻：５０１７〜５０３０頁、２００４年、およびＫａｌｓｃｈｅｕｅｒら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２８７巻：８０７５〜８０８２頁、２００３年を参照）。
【０１５１】
ＤＧＡＴタンパク質は、脂肪酸アシル−ＣｏＡおよび脂肪酸アシル−ＡＣＰ分子を含めた様々なアシル基質を宿主細胞中で利用し得る。さらに、ＤＧＡＴは特定の分子に対して優先的な活性を実証する場合があるが、ＤＧＡＴ酵素によって作用されるアシル基質は様々な炭素鎖長および飽和度合を有し得る。
【０１５２】
真核Ｏ−アシルトランスフェラーゼスーパーファミリーの他のメンバーと同様、真核ＤＧＡＴポリペプチドは、典型的には、Ｚｈｏｎｇｍｉｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４２巻：１２８２〜１２９１頁、２００１年）（本明細書中に参考として組み込まれている）に記載のように、ＦＹｘＤＷＷＮ（配列番号１３）ヘプタペプチド保持モチーフ、およびヒスチジン（またはチロシン）−セリン−フェニルアラニン（Ｈ／ＹＳＦ）トリペプチドモチーフを含有する。高度に保存されたＦＹｘＤＷＷＮ（配列番号１３）は脂肪酸アシル−ＣｏＡ結合に関与すると考えられている。
【０１５３】
本発明に従って利用されるＤＧＡＴ酵素は、真核および原核生物を含めた任意の生物から単離し得る。ＤＧＡＴ遺伝子を有する真核生物は当分野で周知であり、様々な動物（たとえば、哺乳動物、ショウジョウバエ、線虫）、植物、寄生生物、ならびに真菌（たとえば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅなどの酵母）が含まれる。原核生物の例には、代表的な属であるＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｋｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｏｃｒｉｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来のものなど、特定の放線菌、高いＧ＋Ｃ比を有するグラム陽性細菌の群が含まれる。ＤＧＡＴ活性をコードしている１つまたは複数の遺伝子を有する放線菌の特定の例には、たとえば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ、Ｒ．ｒｕｂｅｒ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓが含まれる。ＤＧＡＴ活性を有する１つまたは複数の酵素をコードしている原核生物のさらなる例には、Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ａ．ｂａｕｍａｎｉｉ、およびＡ．ｂａｙｌｉｉなどの、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属のメンバーが含まれる。特定の実施形態では、ＤＧＡＴ遺伝子または酵素は、十分に特徴づけたＤＧＡＴ（ＡｔｆＡ）を含有するグラム陰性トリグリセリド形成原核生物であるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｉｉ  ｓｐ．ＡＤＰ１から単離する。
【０１５４】
ｂ．脂肪酸生合成
脂肪酸とは、様々な長さおよび様々な度合の酸化状態の、負荷電の直鎖状の炭化水素鎖の群である。負電荷はカルボキシル末端基に位置し、典型的には生理的ｐＨ値（ｐＫ約２〜３）で脱プロトン化される。脂肪酸の「尾」の長さにより、その水溶性（というよりは不溶性）および両親媒性の特徴が決定される。脂肪酸は、生体膜の一部を形成するリン脂質およびスフィンゴ脂質、ならびに細胞内でエネルギー貯蔵分子として主に使用されるトリグリセリドの構成要素である。
【０１５５】
脂肪酸はアセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡ前駆体から形成される。マロニル−ＣｏＡはアセチル−ＣｏＡのカルボン酸化された形態であり、補酵素Ａと結合した３個の炭素のジカルボン酸、マロン酸を含有する。アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼは、アセチル−ＣｏＡがカルボン酸化されてマロニル−ＣｏＡを形成する、２ステップの反応を触媒する。特に、マロン酸は、アセチル−ＣｏＡから、酵素アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼのビオチン補因子を用いてＣＯ２を付加することによって形成される。
【０１５６】
脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）は脂肪酸生合成の鎖伸長ステップを実施する。ＦＡＳは大きな多酵素複合体である。哺乳動物では、ＦＡＳは２つのサブユニットを含有し、それぞれが複数の酵素活性を含有する。細菌および植物では、個々のタンパク質が１つの大きな複合体へと会合し、これが合成スキームの個々のステップを触媒する。たとえば、細菌および植物では、アシル担体タンパク質は、より小さな独立したタンパク質である。
【０１５７】
脂肪酸合成はアセチル−ＣｏＡから開始され、鎖は「テイル末端」から成長するため、完全脂肪酸の炭素１およびアルファ−炭素は最後に付加される。第１の反応は、大きな哺乳動物脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）タンパク質の領域であるアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）のパントテン酸基への、アセチル基の転移である。この反応では、アセチルＣｏＡが縮合酵素（ＣＥ）ドメインのシステイン−ＳＨ基に付加される：アセチルＣｏＡ＋ＣＥ−ｃｙｓ−ＳＨ→アセチル−ｃｙｓ−ＣＥ＋ＣｏＡＳＨ。機構的に、これは、基がまずＡＣＰ（アシル担体ペプチド）に転移され、その後、縮合酵素ドメインのシステイン−ＳＨ基に転移される、２ステップのプロセスである。
【０１５８】
第２の反応では、マロニルＣｏＡがＡＣＰスルフヒドリル基に付加される：マロニルＣｏＡ＋ＡＣＰ−ＳＨ→マロニルＡＣＰ＋ＣｏＡＳＨ。この−ＳＨ基はＡＣＰのホスホパンテテン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）補欠分子族の一部である。
【０１５９】
第３の反応では、アセチル基がマロニル基に転移されて二酸化炭素が放出される：マロニルＡＣＰ＋アセチル−ｃｙｓ−ＣＥ→ベータ−ケトブチリル−ＡＣＰ＋ＣＯ２。
【０１６０】
第４の反応では、ベータ−ケトアシルレダクターゼ活性によってケト基がヒドロキシル基へと還元される：ベータ−ケトブチリル−ＡＣＰ＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋→ベータ−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰ＋ＮＡＤ＋。
【０１６１】
第５の反応では、ベータ−ヒドロキシアシルデヒドラターゼ活性によってベータ−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰが脱水されてトランス−モノ不飽和脂肪酸アシル基となる：ベータ−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰ→２−ブテノイル−ＡＣＰ＋Ｈ２Ｏ。
【０１６２】
第６の反応では、二重結合がＮＡＤＰＨによって還元されて、最初のものよりも炭素が２つ分長い飽和脂肪酸アシル基が得られる（この場合、アセチル基がブチリル基へと変換された）：２−ブテノイル−ＡＣＰ＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋→ブチリル−ＡＣＰ＋ＮＡＤＰ＋。その後、ブチリル基がＡＣＰスルフヒドリル基からＣＥスルフヒドリルへと転移される：ブチリル−ＡＣＰ＋ＣＥ−ｃｙｓ−ＳＨ→ＡＣＰ−ＳＨ＋ブチリル−ｃｙｓ−ＣＥ。このステップは、以前に元のアセチル基に利用したトランスフェラーゼ活性と同じものによって触媒される。ここで、ブチリル基は新しいマロニル基と縮合する準備ができ（上記第３の反応）、プロセスを繰り返す。脂肪酸アシル基の長さが１６個の炭素になった際、チオエステラーゼ活性でそれを加水分解して、遊離パルミチン酸を形成する：パルミトイル−ＡＣＰ＋Ｈ２Ｏ→パルミチン酸＋ＡＣＰ−ＳＨ。脂肪酸分子は伸長および／または不飽和化などのさらなる修飾を受けることができる。
【０１６３】
改変された光合成微生物、たとえばラン藻は、脂肪酸合成に関与する上記ポリペプチドまたは酵素のうちの任意のものをコードしている１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態では、酵素はアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼまたはその変異体もしくは機能的断片である。
【０１６４】
本明細書中で使用する、本発明の「アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ」遺伝子には、酵素反応性条件下でアセチル−ＣｏＡのカルボキシル化を触媒してマロニル−ＣｏＡを与える能力を実証する、任意の細胞源から得ることができるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドなどのアミノ酸をコードしている任意のポリヌクレオチド配列が含まれ、さらに、そのような能力を有するアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ配列の任意の天然に存在するまたは天然に存在しない変異体が含まれる。
【０１６５】
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）は、アセチル−ＣｏＡの不可逆的カルボキシル化を触媒して、その２つの触媒活性、ビオチンカルボキシラーゼ（ＢＣ）およびカルボキシルトランスフェラーゼ（ＣＴ）を介してマロニル−ＣｏＡを産生する、ビオチン依存性酵素である。ビオチンカルボキシラーゼ（ＢＣ）ドメインは反応の第１のステップ、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＢＣＣＰ）ドメインと共有結合したビオチン補欠分子族のカルボキシル化を触媒する。反応の第２のステップでは、カルボキシルトランスフェラーゼ（ＣＴ）ドメインが（カルボキシ）ビオチンからアセチル−ＣｏＡへのカルボキシル基の転移を触媒する。マロニル−ＣｏＡは、脂肪酸の前駆体として役割を果たす以外は代謝的な役割を有さないため、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）によるマロニル−ＣｏＡの形成は脂肪酸合成のコミットメントステップを表す。このため、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼは脂肪酸の合成における中心的な酵素を表す。
【０１６６】
ほとんどの原核生物では、ＡＣＣａｓｅは複数サブユニットの酵素である一方で、ほとんどの真核生物では、これは１つの大きな複数ドメインの酵素である。酵母では、酵母ＡＣＣａｓｅのＣＴドメインの結晶構造が２．７Ａの解像度で決定されている（Ｚｈａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９９巻：２０６４〜２０６７頁（２００３年））。この構造は、同じ主鎖の折り畳みを共有する２つのドメインを含有する。この折り畳みは、ｂ−ｂ−ａスーパーヘリックスを有するクロトナーゼ／ＣｌｐＰタンパク質ファミリーに属する。ＣＴドメインは、その表面上にＡＣＣａｓｅの二量体化に重要な多くの挿入物を含有する。酵素の活性部位は二量体の界面に位置する。
【０１６７】
Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓなどのラン藻はネイティブＡＣＣａｓｅ酵素を発現するが、これらの細菌は、典型的には顕著な量の脂肪酸を産生も蓄積もしない。たとえば、野生のＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓは、乾重量で合計約４％までの脂肪酸を脂質膜の形態で蓄積する。
【０１６８】
脂肪酸生合成のコミットメントステップにおけるＡＣＣａｓｅの役割を考慮すると、本発明の実施形態には、ラン藻の天然のゲノムに対して外因性のＡＣＣ酵素をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチドを導入することによって、ラン藻において脂肪酸生合成の産生、したがって脂質産生を増加させる方法が含まれる。また、本発明の実施形態には、ラン藻の天然のゲノムに対して外因性のＡＣＣａｓｅ酵素をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む、改変されたラン藻、および前記ラン藻を含む組成物も含まれる。
【０１６９】
ＡＣＣａｓｅ酵素をコードしているポリヌクレオチドは、内在性ＡＣＣａｓｅ遺伝子を含有する任意の原核または真核生物などの任意の生物から単離または得られ得る。ＡＣＣａｓｅ遺伝子を有する真核生物の例は当分野で周知であり、様々な動物（たとえば、哺乳動物、ショウジョウバエ、線虫）、植物、寄生生物、ならびに真菌（たとえば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅなどの酵母）が含まれる。特定の実施形態では、ＡＣＣａｓｅをコードしているポリヌクレオチド配列はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ７００２から得られる。
【０１７０】
ＡＣＣａｓｅ活性を有する酵素をコードしているポリヌクレオチドを得るために利用し得る原核生物の例には、それだけには限定されないが、とりわけ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ  ＡＴＣＣ  ２９１７４、海洋性ガンマプロテオバクテリアＨＴＣＣ２０８０、Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ  ｓｐ．ＨＴＣＣ２６０１、Ｏｃｅａｎｉｃｏｌａ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ  ＨＴＣＣ２５１６、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃａｃｃａｅ  ＡＴＣＣ  ４３１８５、Ｖｉｂｒｉｏ  ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ  １２Ｇ０１、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｔｕｎｉｃａｔａ  Ｄ２、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＥＬＢ１７、海洋性ガンマプロテオバクテリアＨＴＣＣ２１４３、Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＳＫ２０９−２−６、Ｏｃｅａｎｉｃｏｌａ  ｂａｔｓｅｎｓｉｓ  ＨＴＣＣ２５９７、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｔｒｉｆｏｌｉｉ  ＷＳＭ１３２５、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ｎｂ−３１１Ａ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｇｇｒｅｇａｎｓ  ＤＳＭ  ９４８５、Ｃｈｌｏｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｈｅｒｐｅｔｏｎ  ｔｈａｌａｓｓｉｕｍ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、およびＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａが含まれる。
【０１７１】
ポリヌクレオチドおよびベクター
特定の実施形態では、本発明には、グリコーゲン分解またはトリグリセリドもしくは脂肪酸の生合成に関連するポリペプチド、あるいはその変異体または機能的断片をコードしている、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含む改変された光合成微生物が含まれる。したがって、本発明では、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、およびアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼなどの、様々なグリコーゲン分解経路のタンパク質ならびに本明細書中で利用するトリグリセリドおよび脂質生シンターゼをコードしている単離したポリヌクレオチド、任意の機能的な天然に存在する変異体もしくは断片（すなわち、対立遺伝子変異体、相同分子種、スプライシング変異体）またはこれらのネイティブ酵素の天然に存在しない変異体もしくは断片（すなわち操作によって最適化したもの）をコードしているヌクレオチド配列、また、たとえばクローニングおよび発現ベクターを含めた、そのようなポリヌクレオチドを含む組成物を利用する。
【０１７２】
本明細書中で使用する用語「ＤＮＡ」および「ポリヌクレオチド」および「核酸」とは、特定の種の全ゲノムＤＮＡを含まないように単離したＤＮＡ分子をいう。したがって、ポリペプチドをコードしているＤＮＡセグメントとは、１つまたは複数のコード配列を含有するが、ＤＮＡセグメントを得た種の全ゲノムＤＮＡから実質的に単離したまたはそれを含まないように精製した、ＤＮＡセグメントをいう。用語「ＤＮＡセグメント」および「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡセグメントおよびそのようなセグメントのより小さな断片、ならびに、たとえば、プラスミド、コスミド、ファージミド、ファージ、ウイルスなどを含めた組換えベクターが含まれる。
【０１７３】
当業者には理解されるように、本発明のポリヌクレオチド配列には、ゲノム配列、ゲノム外およびプラスミドにコードされている配列、ならびに、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドを発現する、または発現するように適応させ得る、より小さな操作した遺伝子セグメントなどが含まれることができる。そのようなセグメントは、天然に単離したもの、または人間の手によって合成的に改変したものであってもよい。
【０１７４】
当業者には理解されるように、ポリヌクレオチドは一本鎖（コードもしくはアンチセンス）または二本鎖であってよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）またはＲＮＡ分子であってよい。そうである必要はないが、さらなるコードまたは非コード配列が本発明のポリヌクレオチド内に存在していてもよく、また、そうである必要はないが、ポリヌクレオチドは他の分子および／または担体物質と連結されていてもよい。
【０１７５】
ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列（すなわち、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、もしくはその一部分をコードしている内在性配列）を含み得るか、またはそのような配列の変異体もしくは生物学的機能的等価物を含み得る。ポリヌクレオチド変異体は、好ましくはコードされているポリペプチドの酵素活性が改変していないポリペプチドと比較して実質的に減弱していないように、以下にさらに詳述するように１つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有し得る。酵素活性に対する、コードされているポリペプチドの効果は、一般に、本明細書中に記載のように評価し得る。
【０１７６】
本発明の特定の実施形態では、改変された光合成微生物（ｍｃｉｒｏｏｇａｎｉｓｍ）は、グリコーゲン分解に関連する１つもしくは複数のポリペプチド、またはその断片もしくは変異体をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、１つまたは複数のポリペプチドは、グリコーゲンホスホリラーゼ（ＧｌｇＰ）、グリコーゲンイソアミラーゼ（ＧｌｇＸ）、グルカノトランスフェラーゼ（ＭａｌＱ）、ホスホグルコムターゼ（Ｐｇｍ）、グルコキナーゼ（Ｇｌｋ）、および／もしくはホスホグルコースイソメラーゼ（Ｐｇｉ）、またはその機能的断片もしくは変異体である。代表的なｇｌｇＰポリヌクレオチド配列を配列番号３１に提供し、代表的なＧｌｇＰポリペプチド配列を配列番号３２に提供する。代表的なｇｌｇＸポリヌクレオチド配列を配列番号３３に提供し、代表的なＧｌｇＸポリペプチド配列を配列番号３４に提供する。代表的なｍａｌＱポリヌクレオチド配列を配列番号３５に提供し、代表的なＭａｌＱポリペプチド配列を配列番号３６に提供する。代表的なホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）ポリヌクレオチド配列を配列番号３７に提供し、代表的なホスホグルコムターゼ（Ｐｇｍ）ポリペプチド配列を配列番号３８に提供し、他のものは下記に提供する（配列番号７５〜８４）。代表的なｇｌｋポリヌクレオチド配列を配列番号３９に提供し、代表的なＧｌｋポリペプチド配列を配列番号４０に提供する。代表的なｐｇｉポリヌクレオチド配列を配列番号４１に提供し、代表的なＰｇｉポリペプチド配列を配列番号４２に提供する。本発明の特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、これらのポリヌクレオチド配列のうちの１つ、またはその断片もしくは変異体を含むか、あるいは、これらのポリペプチド配列のうちの１つ、またはその断片もしくは変異体をコードしている。
【０１７７】
本発明の特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１、１４、１５、もしくは１８のうちの任意の１つに記載のポリペプチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、またはそれからなるＤＧＡＴをコードしている。配列番号１はＤＧＡＴｎの配列であり、配列番号１４はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＤＧＡＴ（ＳｃｏＤＧＡＴまたはＳＤＧＡＴ）の配列であり、配列番号１５はＡｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓのＤＧＡＴ（ＡｂｏＤＧＡＴ）の配列であり、配列番号１８はＤＧＡＴｄ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｉｉ  ｓｐ．）の配列である。本発明の特定の実施形態では、ＤＧＡＴポリヌクレオチドは、配列番号４、７、１６、１７、もしくは１９のうちの任意の１つに記載のポリヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、またはそれからなる。配列番号４は、ラン藻（Ｃｙａｎｂａｃｔｅｒｉａ）配列中での発現についてコドン最適化されており、ＤＧＡＴｎをコードするものであり、配列番号７は配列番号４に相同性を有するものであり、配列番号１６は、ラン藻配列中での発現についてコドン最適化されており、ＳｃｏＤＧＡＴをコードするものであり、配列番号１７は、ラン藻配列中での発現についてコドン最適化されており、ＡｂｏＤＧＡＴをコードするものであり、配列番号１９は、ラン藻配列中での発現についてコドン最適化されており、ＤＧＡＴｄをコードするものである。ＤＧＡＴｎおよびＤＧＡＴｄは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｉｉのＤＧＡＴ、および開始メチオニンの直後に２つの追加のアミノ酸残基が含まれるその改変した形態に対応する。
【０１７８】
本発明の特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２に記載のポリペプチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、またはそれからなるホスファチジン酸ホスファターゼをコードしている。特定の実施形態では、ホスファチジン酸ホスファターゼポリヌクレオチドは、配列番号５もしくは配列番号８に記載のポリヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、またはそれからなる。配列番号２はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのホスファチジン酸ホスファターゼ（ｙＰＡＨ１）の配列であり、配列番号５は、ラン藻配列中での発現についてコドン最適化されており、ｙＰＡＨ１をコードするものである。
【０１７９】
本発明の特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３、２０、２１、２２、２３、もしくは２８のうちの任意のものに記載のポリペプチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、またはそれからなるアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）をコードしている。特定の実施形態では、ＡＣＣａｓｅポリヌクレオチドは、配列番号６、９、２４、２５、２６、２７、もしくは２９のうちの任意のものに記載のポリヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、またはそれからなる。配列番号３はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ｙＡｃｃ１）の配列であり、配列番号６は、ラン藻配列中での発現についてコドン最適化されており、ｙＡｃｃ１をコードするものである。配列番号２０はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２のＡｃｃＡであり、配列番号２１はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２のＡｃｃＢであり、配列番号２２はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２のＡｃｃＣであり、配列番号２３はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２のＡｃｃＤである。配列番号２４はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２のＡｃｃＡをコードしており、配列番号２５はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２のＡｃｃＢをコードしており、配列番号２６はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２のＡｃｃＣをコードしており、配列番号２７はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２のＡｃｃＤをコードしている。配列番号２８はＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍのＡＣＣａｓｅであり、配列番号２９はこのＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍのＡＣＣａｓｅをコードしている。
【０１８０】
特定の実施形態では、本発明は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼに同一または相補的な配列の、様々な長さの連続的なストレッチを含む、生物活性のある切断酵素をコードしている単離したポリヌクレオチドを提供する。
【０１８１】
本出願の酵素をコードしている例示的なヌクレオチド配列には、完全長のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、および／またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ならびに、これらの遺伝子の完全長もしくは実質的に完全長のヌクレオチド配列の一部分、またはその転写物もしくはそれらの転写物のＤＮＡコピーが包含される。ヌクレオチド配列の一部分は、参照ポリペプチドの生物活性を保持しているポリペプチドの一部分またはセグメントをコードしていてよい。本明細書中に提供する酵素の生物活性のある断片をコードしているヌクレオチド配列の一部分は、少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００個、またはそれより多くの連続的なアミノ酸残基、完全長酵素中に存在するアミノ酸のほぼ全数までをコードしていてよい。このコンテキストおよび本明細書中で使用するすべての他のコンテキストにおいて、「中間の長さ」とは、引用した値の間の任意の長さ、たとえば、１０１、１０２、１０３など、１５１、１５２、１５３など、２０１、２０２、２０３などを意味することが、容易に理解されるであろう。
【０１８２】
本発明のポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さにかかわらず、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、複数のクローニング部位、他のコードセグメントなどの他のＤＮＡ配列と組み合わせてもよく、したがってその全体的な長さは相当に変動し得る。したがって、ほぼ任意の長さのポリヌクレオチド断片を用い得ることが企図され、全長は、好ましくは調製および意図する組換えＤＮＡプロトコルでの使用の容易性によって制限される。
【０１８３】
本発明はまた、本明細書中に提供する方法および組成物に従って利用するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、およびアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼのヌクレオチド配列の変異体も企図する。核酸変異体は、対立遺伝子変異体（同じ座位）、相同体（異なる座位）、および相同分子種（異なる生物）などの天然に存在するものであるか、または天然に存在しないものであることができる。これらなどの天然に存在する変異体は、たとえば、様々なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および当分野で知られているハイブリダイゼーションに基づいた技法を含めた周知の分子生物学的技法を用いて、同定および単離することができる。天然に存在する変異体は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性、および／またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有する１つまたは複数の遺伝子をコードしている任意の生物から単離することができる。したがって、本発明の実施形態には、そのような天然に存在するポリヌクレオチド変異体を含むラン藻が包含される。
【０１８４】
天然に存在しない変異体は、ポリヌクレオチド、細胞、または生物に適用されるものを含めた突然変異誘発技法によって作製することができる。変異体は、ヌクレオチドの置換、欠失、反転および挿入を含有することができる。変動は、コードおよび非コード領域の一方または両方中に起こることができる。特定の態様では、天然に存在しない変異体は、増加した活性、安定性、または任意の他の望ましい特長について酵素を操作およびスクリーニングすることによってなど、ラン藻での使用に最適化されたものであり得る。変動は、保存的および非保存的なアミノ酸置換（元々コードされていた産物と比較して）をどちらも生じることができる。ヌクレオチド配列では、保存的変異体には、遺伝暗号の縮重が原因で、参照ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする配列が含まれる。また、変異体ヌクレオチド配列には、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性、またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ活性のいずれかを有するポリペプチドなど、たとえば部位特異的突然変異誘発を用いることによって作製したが、それでも生物活性のあるポリペプチドをコードしているものなどの、合成によって誘導したヌクレオチド配列も含まれる。一般に、特定の参照ヌクレオチド配列の変異体は、本明細書中の他の箇所に記載した配列アラインメントプログラムによって初期設定パラメータを用いて決定して、その特定のヌクレオチド配列と少なくとも約３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、一般には少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９８％またはそれより高い配列同一性を有する。
【０１８５】
公知のグリコーゲン分解ポリペプチド、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、および／またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼのヌクレオチド配列を使用して、他の生物、特に他の微生物から対応する配列および対立遺伝子を単離することができる。核酸配列をハイブリダイゼーションさせる方法は当分野で容易に利用可能である。他の生物由来のコード配列は、本明細書中に記載のコード配列とのその配列同一性に基づいて、周知の技法に従って単離し得る。これらの技法では、公知のコード配列の全体または一部を、選択した生物由来のクローニングしたゲノムＤＮＡ断片またはｃＤＮＡ断片の集団（すなわち、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリ）中に存在する他の参照コード配列と選択的にハイブリダイズするプローブとして使用する。
【０１８６】
したがって、本発明はまた、参照グリコーゲン分解ポリペプチド、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、もしくはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼのヌクレオチド配列、またはその補体と、以下に記載のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドも企図する。本明細書中で使用する用語「低いストリンジェンシー、中等度のストリンジェンシー、高いストリンジェンシー、または非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」とは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を説明するものである。ハイブリダイゼーション反応を行うための指針は、Ａｕｓｕｂｅｌら、（１９９８年、上記）、セクション６．３．１〜６．３．６中に見つけることができる。この参考文献中には水性および非水性方法が記載されており、どちらも使用することができる。
【０１８７】
本明細書中で言及する「低いストリンジェンシー」条件には、少なくとも約１％ｖ／ｖ〜少なくとも約１５％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩で４２℃でのハイブリダイゼーション、ならびに少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩で４２℃での洗浄が含まれ、かつ包含される。また、低いストリンジェンシー条件には、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％のＳＤＳで６５℃でのハイブリダイゼーション、および（ｉ）２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、または（ｉｉ）０．５％のＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％のＳＤＳで室温での洗浄も含まれ得る。低いストリンジェンシー条件の一実施形態には、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、次いで、０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中、少なくとも５０℃での２回の洗浄が含まれる（低いストリンジェンシー条件では洗浄の温度を５５℃まで上げることができる）。
【０１８８】
「中等度のストリンジェンシー」条件には、少なくとも約１６％ｖ／ｖ〜少なくとも約３０％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約０．５Ｍ〜少なくとも約０．９Ｍの塩で４２℃でのハイブリダイゼーション、ならびに少なくとも約０．１Ｍ〜少なくとも約０．２Ｍの塩で５５℃での洗浄が含まれ、かつ包含される。また、中等度のストリンジェンシー条件には、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％のＳＤＳで６５℃でのハイブリダイゼーション、および（ｉ）２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、または（ｉｉ）０．５％のＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％のＳＤＳで６０〜６５℃での洗浄も含まれ得る。中等度のストリンジェンシー条件の一実施形態には、６×ＳＳＣ中、約４５℃でのでのハイブリダイゼーション、次いで、０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中、６０℃での１つまたは複数の洗浄が含まれる。
【０１８９】
「高いストリンジェンシー」条件には、少なくとも約３１％ｖ／ｖ〜少なくとも約５０％ｖ／ｖのホルムアミドおよび約０．０１Ｍ〜約０．１５Ｍの塩で４２℃でのハイブリダイゼーション、ならびに約０．０１Ｍ〜約０．０２Ｍの塩で５５℃での洗浄が含まれ、かつ包含される。また、高いストリンジェンシー条件には、１％のＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％のＳＤＳで６５℃でのハイブリダイゼーション、および（ｉ）０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、または（ｉｉ）０．５％のＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％のＳＤＳで６５℃を超える温度での洗浄が含まれ得る。高いストリンジェンシー条件の一実施形態には、６×ＳＳＣ中、約４５℃でのでのハイブリダイゼーション、次いで、０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中、６５℃での１つまたは複数の洗浄が含まれる。
【０１９０】
特定の実施形態では、グリコーゲン分解ポリペプチド、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ酵素、ホスファチジン酸ホスファターゼ酵素、またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素は、非常に高いストリンジェンシー条件下で開示したヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされている。非常に高いストリンジェンシー条件の一実施形態には、０．５Ｍのリン酸ナトリウム、７％のＳＤＳ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、次いで、０．２×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ中、６５℃での１つまたは複数の洗浄が含まれる。
【０１９１】
他のストリンジェンシー条件は当分野で周知であり、当業者には、ハイブリダイゼーションの特異性を最適化するために様々な要因を操作できることが理解されるであろう。最終洗浄のストリンジェンシーの最適化は、高い度合のハイブリダイゼーションを保証する役割を果たす場合がある。詳細な例には、Ａｕｓｕｂｅｌら、上記、２．１０．１〜２．１０．１６頁およびＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年、上記）、セクション１．１０１〜１．１０４を参照されたい。
【０１９２】
ストリンジェントな洗浄は典型的には約４２℃〜６８℃の温度で実施するが、当業者には他の温度がストリンジェントな条件に適切であり得ることを理解されよう。最大のハイブリダイゼーション速度は、典型的には、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの形成のＴｍの約２０℃〜２５℃低い温度で起こる。Ｔｍとは、融解温度、または２つの相補的なポリヌクレオチド配列が解離する温度であることは、当分野で周知である。Ｔｍを推定する方法は当分野で周知である（Ａｕｓｕｂｅｌら、上記、２．１０．８頁を参照）。
【０１９３】
一般に、完全に一致したＤＮＡの二重鎖のＴｍは、式：Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−（６００／長さ）［式中、Ｍは、Ｎａ＋の濃度であり、好ましくは０．０１モーラー〜０．４モーラーの範囲であり、％Ｇ＋Ｃは、塩基の全数のパーセンテージとしてのグアノシンおよびシトシン塩基の合計であり、３０％〜７５％Ｇ＋Ｃの範囲内であり、％ホルムアミドは、ホルムアミド濃度の体積によるパーセントであり、長さは、ＤＮＡ二重鎖中の塩基対の数である］による近似として予測し得る。二重鎖ＤＮＡのＴｍは、ランダムなミスマッチ塩基対の数が１％増加するごとに約１℃下がる。洗浄は、一般に、高いストリンジェンシーではＴｍ−１５℃、または中等度のストリンジェンシーではＴｍ−３０℃で実施する。
【０１９４】
ハイブリダイゼーション手順の一例では、固定したＤＮＡを含有する膜（たとえば、ニトロセルロース膜またはナイロン膜）を、終夜４２℃で、標識したプローブを含有するハイブリダイゼーション緩衝液（５０％の脱イオンホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×ラインハルト溶液（０．１％のフィカール（ｆｅｃａｌ）、０．１％のポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｏｌｌｉｄｏｎｅ）および０．１％のウシ血清アルブミン）、０．１％のＳＤＳならびに２００ｍｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ）中でハイブリダイズさせる。その後、膜を２回の連続的な中等度のストリンジェンシーの洗浄（すなわち、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで１５分間、４５℃、次いで、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで１５分間、５０℃）に供し、次いで、２回の連続的なより高いストリンジェンシーの洗浄（すなわち、０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで１２分間、５５℃、次いで、０．２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳの溶液で１２分間、６５−６８℃に供する。
【０１９５】
ポリヌクレオチドおよびその融合体は、当分野で公知かつ利用可能な様々な十分に確立された技法のうちの任意のものを用いて、調製、操作および／または発現させ得る。たとえば、本発明のポリペプチド、またはその融合タンパク質もしくは機能的等価物をコードしているポリヌクレオチド配列を組換えＤＮＡ分子中で使用して、適切な宿主細胞におけるトリグリセリドまたは脂質の生シンターゼの発現を指示し得る。遺伝暗号の固有の縮重が原因で、実質的に同じまたは機能的等価なアミノ酸配列をコードしている他のＤＮＡ配列を生成してもよく、これらの配列を使用して所定のポリペプチドをクローニングおよび発現させ得る。
【０１９６】
当業者には理解されるように、一部の例では、天然に存在しないコドンを保有する、ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を生成することが有利であり得る。たとえば、タンパク質の発現速度を増加するため、または天然に存在する配列から生じる転写物よりも長い半減期などの望ましい特性を有する組換えＲＮＡ転写物を生じるために、特定の原核または真核宿主によって好まれるコドンを選択することができる。そのようなヌクレオチドは、典型的には「コドン最適化した」と呼ばれる。
【０１９７】
さらに、本発明のポリヌクレオチド配列は、それだけには限定されないが、遺伝子産物のクローニング、プロセッシング、発現および／または活性を改変する変更を含めた様々な理由のため、ポリペプチドのコード配列を変更するために、一般に当分野で知られている方法を用いて操作することができる。
【０１９８】
所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドまたは機能的等価物をコードしているヌクレオチド配列を、適切な発現ベクター、すなわち、挿入したコード配列の転写および翻訳のために必要な要素を含有するベクター内に挿入し得る。当業者に周知の方法を用いて、目的のポリペプチドをコードしている配列ならびに適切な転写および翻訳制御要素を含有する発現ベクターを構築し得る。これらの方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝的組換えが含まれる。そのような技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９年）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９年）に記載されている。
【０１９９】
様々な発現ベクター／宿主系が公知であり、ポリヌクレオチド配列を含有および発現させるために利用し得る。本発明のポリヌクレオチドは、典型的には、ラン藻系中に導入して発現させる。したがって、本発明は、様々なラン藻中での使用に適した調節配列（たとえば、プロモーターおよびエンハンサー）を有するベクターおよびプラスミド系の使用を企図する（たとえばＫｏｋｓｈａｒｏｖａら、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、５８巻：１２３〜３７頁、２００２年を参照）。たとえば、乱交雑（Ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）のＲＳＦ１０１０プラスミドは、ＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓおよびＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓの属のいくつかのラン藻中で自律複製をもたらす（たとえばＭｅｒｍｅｔ−Ｂｏｕｖｉｅｒら、Ｃｕｒｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２６巻：３２３〜３２７頁、１９９３年を参照）。別の例として、ｐＦＣ１発現ベクターは乱交雑のプラスミドＲＳＦ１０１０に基づく。ｐＦＣ１は、ラムダｃＩ８５７リプレッサーをコードしている遺伝子およびｐＲプロモーター、次いで、ラムダｃｒｏリボソーム結合部位およびＡＴＧ翻訳開始コドンを保有する（たとえばＭｅｒｍｅｔ−Ｂｏｕｖｉｅｒら、Ｃｕｒｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２８巻：１４５〜１４８頁、１９９４年を参照）。後者はｐＦＣ１のユニークなＮｄｅＩ制限部位（ＣＡＴＡＴＧ）内に位置しており、発現させるタンパク質コード配列とのインフレーム融合のために、この酵素で切断した後に曝露させることができる。
【０２００】
発現ベクター中に存在する「制御要素」または「調節配列」とは、宿主の細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を実施する、ベクターの非翻訳領域、すなわち、エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域である。そのような要素は、その強度および特異性が様々であり得る。利用するベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導性プロモーターを含めた多数の適切な転写および翻訳要素を使用し得る。一般に、強力なＥ．ｃｏｌｉプロモーターがラン藻内で良好に作動することが周知である。また、ラン藻系中にクローニングする際、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）などのハイブリッドｌａｃＺプロモーター等の誘導性プロモーターを使用し得る。ｐＡＭ１５７９およびｐＡＭ２９９１ｔｒｃなどの、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターを含有する他のベクターを本発明に従って利用し得る。
【０２０１】
特定の実施形態では温度誘導系を用い得る。一例として、細菌ファージ左方向プロモーター（ＰＬ）および温度感受性リプレッサー遺伝子ＣＩ８５７を有するオペロンを用いて、ラン藻中で脂肪酸および／またはトリグリセリドを産生させるための温度誘導系を作製し得る（たとえば、本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第６，３０６，６３９号を参照）。許容されない温度（低温、摂氏３０度）では、リプレッサーがオペレーター配列と結合し、したがって、ＲＮＡポリメラーゼがＰＬプロモーターで転写を開始することが妨げられると考えられている。したがって、コードされている遺伝子または複数の遺伝子の発現が抑制される。細胞培養物を許容される温度（摂氏３７〜４２度）に移した場合は、リプレッサーはオペレーターと結合できない。これらの条件下では、ＲＮＡポリメラーゼがコードされている遺伝子または複数の遺伝子の転写を開始することができる。
【０２０２】
ラン藻系では、発現されたポリペプチドの意図する使用に応じていくつかの発現ベクターを選択し得る。大量が必要な場合、コードされているタンパク質の高いレベルの発現を指示するベクターを使用し得る。たとえば、ＡＣＣａｓｅ酵素の過剰発現を利用して脂肪酸生合成を増加させ得る。そのようなベクターには、それだけには限定されないが、ハイブリッドタンパク質が生じるように、目的のポリペプチドをコードしている配列をアミノ末端Ｍｅｔの配列および続くβ−ガラクトシダーゼの７個の残基とインフレームでベクター内にライゲーションし得る、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  ＨｅｅｋｅおよびＳｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６４巻：５５０３〜５５０９頁（１９８９年））などの、多機能的なＥ．ｃｏｌｉクローニングおよび発現ベクターが含まれる。また、ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）を用いて、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させてもよい。
【０２０３】
特定の実施形態では、ラン藻のプロモーターまたは調節オペロンを用い得る。特定の実施形態では、プロモーターは、たとえばＲｏｎｅｎ−Ｔａｒａｚｉら（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１８巻：１４６１〜１４６９頁、１９９５年）に記載のＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのｒｂｃＬＳオペロン、またはたとえばＩｍａｓｈｉｍｉｚｕら（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８５巻：６４７７〜８０頁、２００３年）に記載のＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．株ＰＣＣ  ６７１４のｃｐｃオペロンを含み得る。特定の実施形態では、Ｃｈｕｎｇｊａｔｕｐｏｒｎｃｈａｉら（Ｃｕｒｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３８巻：２１０〜２１６頁、１９９９年）に記載のように、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ由来のｔＲＮＡｐｒｏ遺伝子もプロモーターとして利用し得る。特定の実施形態では、アンモニウムによって抑制され、亜硝酸塩によって誘導される、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７９４２株由来のｎｉｒＡプロモーターを用い得る（たとえば、Ｍａｅｄａら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８０巻：４０８０〜４０８８頁、１９９８年およびＱｉら、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、７１巻：５６７８〜５６８４頁、２００５年を参照）。発現の効率は、文献中に記載されているものなどの、使用する特定のラン藻細胞系に適したエンハンサーを含めることによって増強し得る。
【０２０４】
また、特異的開始シグナルを用いて、目的のポリペプチドをコードしている配列のより効率的な翻訳を達成し得る。そのようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。ポリペプチドをコードしている配列、その開始コドン、および上流配列を適切な発現ベクター内に挿入されている場合、追加の転写または翻訳制御シグナルは必要でない場合がある。しかし、コード配列またはその一部分のみが挿入されている場合、ＡＴＧ開始コドンを含めた外因性翻訳制御シグナルを提供するべきである。さらに、全挿入物の翻訳を確実にするために、開始コドンは正しい読み枠内であるべきである。外因性翻訳要素および開始コドンは、天然および合成の両方の様々なものに由来し得る。
【０２０５】
産物に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のどちらかを用いた、ポリヌクレオチドにコードされている産物の発現を検出および測定するための様々なプロトコルは、当分野で知られている。例には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）が含まれる。これらおよび他のアッセイは、他の箇所の中でとりわけ、Ｈａｍｐｔｏｎら、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０年）およびＭａｄｄｏｘら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１５８巻：１２１１〜１２１６頁（１９８３年）に記載されている。また、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、および／またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼのコードポリペプチドなどの所望のポリヌクレオチドの存在は、ＰＣＲによっても確認し得る。
【０２０６】
様々な標識およびコンジュゲーション技法が当業者に公知であり、様々な核酸およびアミノ酸アッセイで使用し得る。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識したハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを生成する手段には、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識または標識したヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅が含まれる。あるいは、ｍＲＮＡプローブを産生させるために配列またはその任意の一部分をベクター内にクローニングし得る。そのようなベクターは当分野で知られており、市販されており、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６などの適切なＲＮＡポリメラーゼおよび標識したヌクレオチドを付加することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために使用し得る。これらの手順は様々な市販のキットを用いて実施し得る。使用し得る適切なレポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光性、または色素生成性の薬剤、ならびに基質、補因子、阻害剤、磁気粒子などが含まれる。
【０２０７】
目的のポリヌクレオチド配列で形質転換させたラン藻宿主細胞は、タンパク質を細胞培養物から発現および回収するために適切な条件下で培養し得る。組換え細胞によって産生されたタンパク質は、使用する配列および／またはベクターに応じて分泌されるか、または細胞内に含有され得る。当業者には理解されるように、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、コードされているポリペプチドが細胞内の所望の部位に局在化することを指示するシグナル配列を含有するように設計し得る。他の組換え構築体を使用して、目的のポリペプチドをコードしている配列を、コードされているタンパク質の分泌を指示するポリペプチドドメインをコードしているヌクレオチド配列と結合し得る。
【０２０８】
本発明の特定の実施形態では、本発明の改変された光合成微生物は、グルコース−１−リン酸アデニルトランスフェラーゼ（ｇｌｇＣ）、ホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）、および／またはグリコーゲンシンターゼ（ｇｌｇＡ）から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現が低下している。特定の実施形態では、改変された光合成微生物は、これらの遺伝子のうちの１つまたは複数の突然変異を含む。発現を低下させるために、特定のｇｌｇＣ、ｐｇｍ、およびｇｌｇＡ配列を突然変異もしくは改変、または標的とし得る。
【０２０９】
そのようなｇｌｇＣポリヌクレオチド配列の例を配列番号５９（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３）、６１（Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７１２０）、６３（Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、６５（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ  ＩＭＳ  １０１）、６７（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２）、６９（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＷＨ８１０２）、７１（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＲＣＣ  ３０７）、および７３（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２）中に提供し、これらはそれぞれ、配列番号６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、および７４に記載の配列を有するＧｌｇＣポリペプチドをコードしている。
【０２１０】
そのようなｐｇｍポリヌクレオチド配列の例を配列番号７５（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３）、７７（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２）、７９（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＷＨ８１０２）、８１（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＲＣＣ３０７）、および８３（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ７００２）中に提供し、これらはそれぞれ、配列番号７６、７８、８０、８２、および８４に記載の配列を有するＰｇｍポリペプチドをコードしている。
【０２１１】
そのようなｇｌｇＡポリヌクレオチド配列の例を配列番号４３（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３）、４５（Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７１２０）、４７（Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、４９（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ  ＩＭＳ  １０１）、５１（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２）、５３（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＷＨ８１０２）、５５（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＲＣＣ  ３０７）、および５７（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２）中に提供し、これらはそれぞれ、配列番号４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、および５８に記載の配列を有するＧｌｇＡポリペプチドをコードしている。
【０２１２】
ポリペプチド
本発明の実施形態は、前記ラン藻中における脂質産生および／またはトリグリセリドの産生を増加させるための、その切断、変異および／または改変したポリペプチドを含めた、グリコーゲン分解経路に関連するもの、またはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性、および／もしくはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するものを含めた、導入したポリペプチドを含む改変されたラン藻の使用を企図する。
【０２１３】
特定の実施形態では、前記１つまたは複数のポリヌクレオチドは、たとえば、配列番号３２、３４、３６、３８、４０または４１中に提供するものを含めた、グリコーゲンホスホリラーゼ（ＧｌｇＰ）、グリコーゲンイソアミラーゼ（ＧｌｇＸ）、グルカノトランスフェラーゼ（ＭａｌＱ）、ホスホグルコムターゼ（Ｐｇｍ）、グルコキナーゼ（Ｇｌｋ）、および／もしくはホスホグルコースイソメラーゼ（Ｐｇｉ）、またはその機能的断片もしくは変異体をコードしている。本発明に従って有用な追加のＰｇｍポリペプチド配列の例を、配列番号７６、７８、８０、８２、および８４中に提供する。
【０２１４】
本発明の特定の実施形態では、ＤＧＡＴポリペプチドは、配列番号１、１４、１５、もしくは１８のうちの任意の１つに記載のポリペプチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、またはそれからなる。配列番号１はＤＧＡＴｎの配列であり、配列番号１４はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＤＧＡＴ（ＳｃｏＤＧＡＴまたはＳＤＧＡＴ）の配列であり、配列番号１５はＡｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓのＤＧＡＴ（ＡｂｏＤＧＡＴ）の配列であり、配列番号１８はＤＧＡＴｄの配列である。本発明の特定の実施形態では、ＤＧＡＴポリペプチドは、配列番号４、７、１６、１７、もしくは１９のうちの任意の１つに記載のポリヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体によってコードされている。配列番号４は、ラン藻配列中での発現についてコドン最適化されており、ＤＧＡＴｎをコードするものであり、配列番号７は配列番号４に相同性を有するものであり、配列番号１６は、ラン藻配列中での発現についてコドン最適化されており、ＳｃｏＤＧＡＴをコードするものであり、配列番号１７は、ラン藻配列中での発現についてコドン最適化されており、ＡｂｏＤＧＡＴをコードするものであり、配列番号１９は、ラン藻配列中での発現についてコドン最適化されており、ＤＧＡＴｄをコードするものである。
【０２１５】
本発明の特定の実施形態では、ホスファチジン酸ホスファターゼポリペプチドは、配列番号２に記載のポリペプチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、またはそれからなる。特定の実施形態では、ホスファチジン酸ホスファターゼは、配列番号５もしくは配列番号８に記載のポリヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体によってコードされている。配列番号２はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのホスファチジン酸ホスファターゼ（ｙＰａｈ１）の配列であり、配列番号５は、ラン藻配列中での発現についてコドン最適化されており、ｙＰａｈ１をコードするものである。
【０２１６】
本発明の特定の実施形態では、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）ポリペプチドは、配列番号３、２０、２１、２２、２３、もしくは２８のうちの任意のものに記載のポリペプチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、またはそれからなる。特定の実施形態では、ＡＣＣａｓｅポリペプチドは、配列番号６、９、２４、２５、２６、２７、もしくは２９のうちの任意のものに記載のポリヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体によってコードされている。配列番号３はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ｙＡｃｃ１）の配列であり、配列番号６は、ラン藻配列中での発現についてコドン最適化されており、ｙＡｃｃ１をコードするものである。配列番号２０はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２のＡｃｃＡであり、配列番号２１はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２のＡｃｃＢであり、配列番号２２はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２のＡｃｃＣであり、配列番号２３はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２のＡｃｃＤである。配列番号２４はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２のＡｃｃＡをコードしており、配列番号２５はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２のＡｃｃＢをコードしており、配列番号２６はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２のＡｃｃＣをコードしており、配列番号２７はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２のＡｃｃＤをコードしている。配列番号２８はＴ．ａｅｓｔｉｖｕｍのＡＣＣａｓｅであり、配列番号２９はこのＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍのＡＣＣａｓｅをコードしている。
【０２１７】
本出願によって包含される変異体タンパク質は生物活性がある、すなわち、これらは参照ポリペプチドの酵素活性を保有し続ける。そのような変異体は、たとえば、遺伝子の多型または人間の操作から生じ得る。参照のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、および／またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼポリペプチド、または脂肪酸もしくはトリグリセリドの生合成に関与する他のポリペプチドの生物活性のある変異体は、本明細書中の他の箇所に記載した配列アラインメントプログラムによって初期設定パラメータを用いて決定して、参照タンパク質のアミノ酸配列に対して、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、一般に少なくとも７５％、８０％、８５％、通常は約９０％〜９５％またはそれより高く、典型的には約９７％または９８％以上の配列類似度または同一性を有する。参照ポリペプチドの生物活性のある変異体は、一般に、２００、１００、５０もしくは２０個のアミノ酸残基ほど多く、または適切にわずか１〜１５個のアミノ酸残基、わずか１〜１０個、たとえば６〜１０個、わずか５個、わずか４、３、２、もしくはさらには１個のアミノ酸残基がそのタンパク質とは異なり得る。一部の実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号１、２、３、６、８、１０、１２、および１４中の参照配列とは少なくとも１個であるが１５、１０または５個未満のアミノ酸残基が異なる。他の実施形態では、これは、参照配列とは少なくとも１個の残基であるが２０％、１５％、１０％または５％未満の残基が異なる。
【０２１８】
グリコーゲン分解ポリペプチド、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断、および挿入を含めた様々な様式で変更され得る。そのような操作の方法は一般に当分野で知られている。たとえば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列変異体はＤＮＡ中の突然変異によって調製することができる。突然変異誘発およびヌクレオチド配列の変更の方法は当分野で周知である。たとえば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．、８２巻：４８８〜４９２頁）、Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５４巻：３６７〜３８２頁）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，  Ｊ．  Ｄ．ら（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ」、第４版、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，  Ｃａｌｉｆ．、１９８７年）およびそれら中に引用される参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物活性に影響を与えない適切なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆら、（１９７８年）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．）のモデル中に見つけ得る。
【０２１９】
点突然変異または切断によって作製したコンビナトリアルライブラリの遺伝子産物をスクリーニングする方法、および、ｃＤＮＡライブラリを、選択された特性を有する遺伝子産物についてスクリーニングする方法は、当分野で知られている。そのような方法は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、および／またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼポリペプチドのコンビナトリアル突然変異誘発によって作製した遺伝子ライブラリの迅速なスクリーニングに適応可能である。ライブラリ中の機能的突然変異の頻度を高める技法である帰納的集合突然変異誘発（ＲＥＭ）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、ポリペプチド変異体を同定することができる（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（１９９２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：７８１１〜７８１５頁、Ｄｅｌｇｒａｖｅら、（１９９３年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、６巻：３２７〜３３１頁）。以下にさらに詳述するように、１個のアミノ酸を、類似の特性を有する別のもので交換することなどの、保存的置換が望ましい場合がある。
【０２２０】
ポリペプチド変異体は、参照アミノ酸配列と比較して、その配列に沿った様々な位置で保存的アミノ酸置換を含有し得る。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されており、それらは一般に以下のように細分類することができる。
【０２２１】
酸性：生理的ｐＨでＨイオンの損失が原因で残基が負電荷を有し、残基は、水溶液に誘引されて、ペプチドが生理的ｐＨの水性培地中にある場合にそれが含有されるペプチドのコンホメーションにおいて表面の位置を求める。酸性側鎖を有するアミノ酸にはグルタミン酸およびアスパラギン酸が含まれる。
【０２２２】
塩基性：生理的ｐＨまたはその１もしくは２ｐＨ単位以内（たとえばヒスチジン）でＨイオンとの会合が原因で残基が正電荷を有し、残基は、水溶液に誘引されて、ペプチドが生理的ｐＨの水性培地中にある場合にそれが含有されるペプチドのコンホメーションにおいて表面の位置を求める。塩基性側鎖を有するアミノ酸には、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる。
【０２２３】
荷電：生理的ｐＨで残基が帯電しており、したがって、酸性または塩基性側鎖を有するアミノ酸（すなわち、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リシンおよびヒスチジン）が含まれる。
【０２２４】
疎水性：生理的ｐＨで残基が帯電しておらず、残基は、水溶液によってはじかれて、ペプチドが水性培地中にある場合にそれが含有されるペプチドのコンホメーションにおいて内部の位置を求める。疎水性側鎖を有するアミノ酸には、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニンおよびトリプトファンが含まれる。
【０２２５】
中性／極性：生理的ｐＨで残基は帯電していないが、残基は、水溶液によって十分にはじかれないため、ペプチドが水性培地中にある場合にそれが含有されるペプチドのコンホメーションにおいて内部の位置を求める。中性／極性の側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、システイン、ヒスチジン、セリンおよびスレオニンが含まれる。
【０２２６】
また、この説明では、極性基を欠いている場合でも疎水性を与えるにはその側鎖が十分に大きくないため、特定のアミノ酸を「小さい」と特徴づける。プロリンを例外として、「小さな」アミノ酸とは、少なくとも１つの極性基が側鎖上にある場合は４個以下の炭素を有するものであり、そうでない場合は３個以下の炭素を有するものである。小さな側鎖を有するアミノ酸には、グリシン、セリン、アラニンおよびスレオニンが含まれる。遺伝子にコードされている二次アミノ酸プロリンは、ペプチド鎖の二次コンホメーションに対するその公知の効果により特例である。プロリンの構造は、その側鎖がα−アミノ基の窒素およびα−炭素とも結合しているため、他の天然に存在するすべてのアミノ酸と異なる。しかし、いくつかのアミノ酸類似度のマトリックス（たとえば、たとえばＤａｙｈｏｆｆら（１９７８年）、Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．    Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ、Ｍ．  Ｏ．  Ｄａｙｈｏｆｆ（編）、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、５巻、３４５〜３５８頁、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、およびＧｏｎｎｅｔら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻：１４４３０〜１４４５頁、１９９２年）によって開示されている、ＰＡＭ１２０マトリックスおよびＰＡＭ２５０マトリックスには、グリシン、セリン、アラニンおよびスレオニンと同じ群にプロリンが含まれる。したがって、本発明の目的のために、プロリンは「小さな」アミノ酸として分類する。
【０２２７】
極性または無極性として分類するために必要な、誘引またははじく度合は任意であり、したがって、本発明によって具体的に企図されるアミノ酸は、いずれか１つに分類される。具体的に命名されていないほとんどのアミノ酸は公知の挙動に基づいて分類することができる。
【０２２８】
アミノ酸残基は、環状または非環状、および芳香族または非芳香族（残基の側鎖置換基に関して自明の分類）、ならびに小さいまたは大きいとして、さらに細分類することができる。残基は、追加の極性置換基が存在する場合はカルボキシル炭素を含めて合計４個以下、そうでなければ３個以下の炭素原子を含有する場合に、小さいとみなされる。小さな残基は、もちろん常に非芳香族である。その構造的特性に応じて、アミノ酸残基は２つ以上のクラスに属し得る。天然に存在するタンパク質のアミノ酸について、このスキームに従った細分類を表Ａに表す。
【０２２９】
【表１】
0005670346.tif 000002
また、保存的アミノ酸置換には側鎖に基づいた群分けも含まれる。たとえば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群はセリンおよびスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リシン、アルギニン、およびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群はシステインおよびメチオニンである。たとえば、ロイシンをイソロイシンまたはバリンで、アスパラギン酸をグルタミン酸で、スレオニンをセリンで置き換えること、または１つのアミノ酸を構造的に関連するアミノ酸で同様に置き換えることは、生じる変異体ポリペプチドの特性に大きな影響を与えないと予想することが合理的である。アミノ酸の変化が機能的に切断されたおよび／または変異したポリペプチドをもたらすかどうかは、本明細書中に記載のように（たとえば実施例３を参照）、その酵素活性をアッセイすることによって容易に決定できる。保存的置換は、表Ｂに例示的な置換の見出しの下に示す。本発明の範囲の範囲内にあるアミノ酸置換は、一般に、（ａ）置換領域におけるペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位での分子の荷電もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩の維持に対するその効果が顕著に異ならない置換を選択することによって達成される。置換を導入した後、変異体を生物活性についてスクリーニングする。
【０２３０】
【表２】
0005670346.tif 000003
あるいは、保存的置換を行うための類似のアミノ酸は、側鎖の同一性に基づいて３つの分類に群分けすることができる。Ｚｕｂａｙ，  Ｇ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、Ｗｍ．Ｃ．  Ｂｒｏｗｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９３年）に記載のように、第１の群には、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リシン、ヒスチジンが含まれ、これらはすべて荷電側鎖を有し、第２の群には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギンが含まれ、第３の群には、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンが含まれる。
【０２３１】
したがって、グリコーゲン分解ポリペプチド、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼポリペプチド中の予測される非必須アミノ酸残基は、典型的には、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えられる。あるいは、突然変異を飽和突然変異誘発などによってコード配列の全体または一部に沿ってランダムに導入することができ、生じる変異体を、親ポリペプチドの活性についてスクリーニングして、その活性を保持している変異体を同定することができる。コード配列の突然変異誘発後、コードされているペプチドを組換えによって発現させることができ、ペプチドの活性を決定することができる。「非必須」アミノ酸残基とは、その活性のうちの１つまたは複数を消滅または実質的に変更することなしに、一実施形態のポリペプチドの野生型配列から変更することができる残基である。適切なことに、変更はこれらの活性のうちの１つを実質的に消滅させない、たとえば、活性は野生型の少なくとも２０％、４０％、６０％、７０％もしくは８０％、１００％、５００％、１０００％またはそれよりも高い。「必須」アミノ酸残基とは、参照ポリペプチドの野生型配列から変更した場合に、野生型活性の２０％未満しか存在しなくなるように、親分子の活性の消滅がもたらされる残基である。たとえば、そのような必須アミノ酸残基には、様々な供給源由来のポリペプチドの酵素部位中で保存されている配列を含めた、様々な種間にわたってグリコーゲン分解ポリペプチド、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼポリペプチド中で保存されているものが含まれ得る。
【０２３２】
したがって、本発明はまた、天然に存在するグリコーゲン分解ポリペプチド、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、もしくはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼポリペプチド配列またはその生物学的に活性のある断片の変異体も企図し、変異体は、１つまたは複数のアミノ酸残基の付加、欠失、または置換によって天然に存在する配列から区別される。一般に、変異体は、参照ポリペプチド配列に対して少なくとも約３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の類似度または配列同一性を示す。さらに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個またはそれより多くのアミノ酸の付加、欠失、または置換によってネイティブまたは親配列から異なるが、親または参照ポリペプチド配列の特性を保持している配列が企図される。
【０２３３】
一部の実施形態では、変異体ポリペプチドは、少なくとも１個であるが、５０、４０、３０、２０、１５、１０、８、６、５、４、３または２個未満のアミノ酸残基によって、参照のグリコーゲン分解ポリペプチド、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼポリペプチド配列とは異なる。他の実施形態では、変異体ポリペプチドは、残基の少なくとも１％であるが、２０％未満、１５％、１０％または５％によって参照とは異なる。（この比較がアラインメントを要する場合は、配列は最大の類似度についてアラインメントするべきである。欠失もしくは挿入からの「ループ」アウトした配列、またはミスマッチは、異なるとみなされる。）
特定の実施形態では、変異体ポリペプチドには、グリコーゲン分解ポリペプチド、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ参照ポリペプチドの対応する配列に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％またはそれより多くの配列同一性または類似度を有しており、その参照ポリペプチドの酵素活性を保持しているアミノ酸配列が含まれる。
【０２３４】
配列間の配列の類似度または配列同一性（これらの用語は本明細書中で互換性があるように使用する）の計算は以下のように行う。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列を最適な比較目的のためにアラインメントする（たとえば、最適なアラインメントのために第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方中にギャップを導入することができ、比較目的には非相同配列を無視することができる）。特定の実施形態では、比較目的のためにアラインメントした参照配列の長さは、参照配列の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％の長さである。その後、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合は、分子がその位置で同一である。
【０２３５】
２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮して、配列に共通する同一位置の数の関数である。
【０２３６】
２つの配列間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、数学アルゴリズムを用いて達成することができる。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム中に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４８巻：４４４〜４５３頁）のアルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのどちらか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み付け、および１、２、３、４、５、または６の長さの重み付けを用いて決定する。さらに別の好ましい実施形態では、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを使用して、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重み付けおよび１、２、３、４、５、または６の長さの重み付けを用いて決定する。特に好ましいパラメータの組（かつ別段に指定しない限りは使用すべきもの）はＢｌｏｓｓｕｍ６２スコア付けマトリックスであり、ギャップペナルティは１２、ギャップ伸長ペナルティは４、フレームシフトギャップペナルティは５である。
【０２３７】
２つのアミノ酸またはヌクレオチドの配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれているＥ．  ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．  Ｍｉｌｌｅｒ（１９８９年、Ｃａｂｉｏｓ、４巻：１１〜１７頁）のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を用いて決定することができる。
【０２３８】
本明細書中に記載の核酸およびタンパク質配列は、たとえば他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するための、公開データベースに対する検索を行うための「クエリ配列」として使用することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ、２１５巻：４０３〜１０頁）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラムを用いて、スコア＝１００、ワード長＝１２で行って、本発明の核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて、スコア＝５０、ワード長＝３で行って、本発明のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップ付きアラインメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２５巻：３３８９〜３４０２頁）に記載のようにギャップ付きＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（たとえばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータを使用することができる。
【０２３９】
グリコーゲン分解ポリペプチド、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、またはアセチル−ｃｏＡカルボキシラーゼ参照ポリペプチドの変異体は、参照ポリペプチドの変異体のコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって同定することができる。タンパク質コード配列のライブラリまたは断片、たとえば、Ｎ末端、Ｃ末端、または内部断片を使用して、参照ポリペプチドの変異体をスクリーニングおよび続いて選択するために、変化に富んだ断片の集団を生じることができる。
【０２４０】
点突然変異または切断によって作製したコンビナトリアルライブラリの遺伝子産物をスクリーニングする方法、およびｃＤＮＡライブラリを、選択された特性を有する遺伝子産物についてスクリーニングする方法は、当分野で知られている。そのような方法は、ポリペプチドのコンビナトリアル突然変異誘発によって作製された遺伝子ライブラリの迅速スクリーニングに適応可能である。
【０２４１】
本発明はまた、脂質産生を増加させるためおよび／またはトリグリセリドを産生させるための、キメラまたは融合タンパク質の使用も企図する。本明細書中で使用する「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」には、別の参照ポリペプチド（たとえば複数の断片を作製するため）、非参照ポリペプチド、またはその両方と連結している、グリコーゲン分解ポリペプチド、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの参照ポリペプチドまたはポリペプチド断片が含まれる。「非参照ポリペプチド」とは、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼのタンパク質配列とは異なるタンパク質に対応するアミノ酸配列を有しており、同じまたは異なる生物に由来する、「異種ポリペプチド」をいう。融合タンパク質の参照ポリペプチドは生物活性のあるアミノ酸配列の全部または一部分に対応する場合がある。特定の実施形態では、融合タンパク質には、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼタンパク質の、少なくとも１つ（または２つ）の生物活性のある一部分が含まれる。融合タンパク質を形成するポリペプチドは、典型的にはＣ末端からＮ末端に連結しているが、Ｃ末端からＣ末端、Ｎ末端からＮ末端、またはＮ末端からＣ末端で連結する場合もある。融合タンパク質のポリペプチドは任意の順序であることができる。
【０２４２】
融合パートナーは、ポリペプチドの酵素活性に有害な影響を与えない限りは、本質的に任意の所望の目的のために設計および含め得る。たとえば、一実施形態では、融合パートナーは、ネイティブ組換えタンパク質よりも高い収量でタンパク質を発現することを補助する配列（発現エンハンサー）を含み得る。他の融合パートナーは、タンパク質の溶解度もしくは安定性を増加させるため、またはタンパク質が所望の細胞内区画に標的化されることを可能にするために選択し得る。
【０２４３】
融合タンパク質には、リガンドに対して高い親和性を有する部分が含まれることができる。たとえば、融合タンパク質は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ配列がＧＳＴ配列のＣ末端と融合している、ＧＳＴ−融合タンパク質であることができる。そのような融合タンパク質は生じるポリペプチドの精製および／または同定を容易にする場合がある。あるいは、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含有するグリコーゲン分解ポリペプチド、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼタンパク質である場合がある。特定の宿主細胞では、そのようなタンパク質の発現および／または分泌は、異種シグナル配列を使用することによって増加させることができる。
【０２４４】
融合タンパク質は、一般に標準の技法を用いて調製し得る。たとえば、所望の融合体のポリペプチド構成要素をコードしているＤＮＡ配列を個別にアセンブリし、適切な発現ベクター内にライゲーションさせ得る。配列の読み枠が同相（ｉｎ  ｐｈａｓｅ）であるように、１つのポリペプチド構成要素をコードしているＤＮＡ配列の３’末端を、ペプチドリンカーを用いてまたは用いずに、第２のポリペプチド構成要素をコードしているＤＮＡ配列の５’末端にライゲーションさせる。これにより、両方の構成要素ポリペプチドの生物活性を保持する単一の融合タンパク質への翻訳が可能となる。
【０２４５】
所望する場合は、ペプチドリンカー配列を用いて、それぞれのポリペプチドがその二次および三次構造へと折り畳まれることを確実にするために十分な距離によって、第１および第２のポリペプチド構成要素を隔離し得る。そのようなペプチドリンカー配列は、当分野で周知の標準の技法を用いて融合タンパク質内に組み込む。以下の要因に基づいて特定のペプチドリンカー配列を選択し得る：（１）それが柔軟な伸長されたコンホメーションを採れること、（２）それが第１および第２のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用できる二次構造を採れないこと、ならびに（３）ポリペプチド機能的エピトープと反応し得る疎水性または荷電残基を欠くこと。好ましいペプチドリンカー配列はＧｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含有する。ＴｈｒおよびＡｌａなどの他のほぼ中性のアミノ酸もリンカー配列中に使用し得る。リンカーとして有用に用い得るアミノ酸配列には、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ、４０巻：３９〜４６頁（１９８５年）、Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８３巻：８２５８〜８２６２頁（１９８６年）、米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されているものが含まれる。リンカー配列は、一般に１〜約５０個のアミノ酸の長さであり得る。第１および第２のポリペプチドが、機能的ドメインを隔離して立体的妨害を防止するために使用できる非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合は、リンカー配列は必要でない。
【０２４６】
ライゲーションしたＤＮＡ配列は、適切な転写または翻訳調節要素と作動可能に連結し得る。ＤＮＡの発現を司っている調節要素は、第１のポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列の５’側に位置する。同様に、翻訳を終わらせるために必要なストップコドンおよび転写終結シグナルは、第２のポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列の３’側に存在する。
【０２４７】
一般に、ポリペプチドおよび融合ポリペプチド（ならびにそれらをコードしているポリヌクレオチド）は単離されている。「単離した」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとは、その元の環境から取り出されたものである。たとえば、天然に存在するタンパク質は、天然の系において共存する物質の一部または全部から分離されている場合に、単離されている。好ましくは、そのようなポリペプチドは、少なくとも約９０％純粋、より好ましくは少なくとも約９５％純粋、最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である。ポリヌクレオチドは、たとえば、天然の環境の一部ではないベクター内にクローニングされている場合に、単離されているとみなされる。
【０２４８】
炭素ベースの生成物の産生方法
また、上述したもののうちの任意のものを含めた、本発明の改変された光合成微生物、たとえばラン藻において前記炭素ベースの生成物を産生させることを含む、グリコーゲン以外の炭素ベースの生成物を産生させる方法も企図される。特定の実施形態では、改変された光合成微生物は、低下したレベルのグリコーゲンの生合成または貯蔵経路に関連する１つまたは複数の遺伝子を発現する、および／あるいは増加したレベルのグリコーゲン分解に関連するポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは断片を発現する。特定の実施形態では、光合成微生物は、野生型光合成微生物と比較して、低窒素条件下で低下した量のグリコーゲンを蓄積する。特定の実施形態では、改変された光合成微生物は、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の発現が低下している、または１つもしくは複数のその遺伝子中に突然変異を含む。上述のように、特定の実施形態では、前記１つまたは複数の遺伝子には、グルコース−１−リン酸アデニルトランスフェラーゼ（ｇｌｇＣ）、ホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）、および／またはグリコーゲンシンターゼ（ｇｌｇＡ）が含まれ得る。
【０２４９】
他の実施形態では、改変された光合成微生物は、グリコーゲン分解に関連する１つもしくは複数のポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは断片をコードしている、１つまたは複数のポリヌクレオチドの発現レベルが増加している。
【０２５０】
したがって、本発明には、改変された光合成微生物が低下した量のグリコーゲンを産生する条件下で本発明の改変された光合成微生物を成長または培養することを含む、炭素ベースの生成物を産生させる方法が含まれる。特定の実施形態では、改変された光合成微生物はストレス条件下で成長させる。特定の実施形態では、この方法は、たとえば本明細書中に記載の方法を用いて改変された光合成微生物を作製することをさらに含む。
【０２５１】
特定の実施形態では、前記炭素ベースの生成物は、脂肪酸および／またはトリグリセリドなどの脂質である。特定の実施形態では、前記炭素ベースの生成物は、生物燃料または他の特殊化学製品を生成するための供給原料として有用であり得る。特定の実施形態では、前記炭素ベースの生成物は、生物燃料または他の特殊化学製品である。
【０２５２】
本明細書中に提供する方法の特定の実施形態では、グリコーゲンの生合成または貯蔵経路の１つまたは複数の遺伝子中に突然変異を含む光合成微生物は、脂質生合成に関連する１つまたは複数の酵素をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチドも含んでいてよく、前記ポリヌクレオチドは、光合成微生物の天然のゲノムに対して外因性である。特定の実施形態では、前記１つまたは複数の酵素は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）、および／またはホスファチジン酸ホスファターゼを含む。
【０２５３】
また、本発明の実施形態には、トリグリセリド生合成に関連する１つもしくは複数の酵素をコードしている１つもしくは複数のポリヌクレオチドを光合成微生物内に導入すること、および／またはグリコーゲンの生合成もしくは貯蔵に関与する遺伝子の１つもしくは複数の欠失もしくは突然変異を導入することと、トリグリセリド産生を可能にするために十分な時間、光合成微生物をインキュベーションすることによって、光合成微生物中でトリグリセリドを産生させることとを含む、光合成微生物、たとえばラン藻においてトリグリセリドを産生させる方法も含まれる。また、トリグリセリド生合成に関連する１つまたは複数の酵素をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む光合成微生物を培養することを含む、光合成微生物中でトリグリセリドを産生させる方法も企図される。特定の実施形態では、１つまたは複数の酵素は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）酵素活性およびホスファチジン酸ホスファターゼ酵素活性を含む。特定の実施形態では、１つまたは複数の酵素は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）酵素活性、ジアシルグリセロールＤＧＡＴ酵素活性、およびホスファチジン酸ホスファターゼ酵素活性を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドのうちの１つまたは複数は光合成微生物の天然のゲノムに対して外因性である。
【０２５４】
本発明はまた、脂肪酸生合成に関連する１つもしくは複数の酵素をコードしている、１つもしくは複数のラン藻の天然のゲノムに対して外因性であるポリヌクレオチドをラン藻内に導入すること、および／またはグリコーゲンの生合成もしくは貯蔵に関与する１つもしくは複数の遺伝子の１つもしくは複数の欠失もしくは突然変異を導入すること、および脂肪酸産生を増やすことを可能にするために十分な時間、ラン藻を培養することによって、ラン藻中で増加した量の脂肪酸を産生させることを含む、ラン藻において増加した量の脂肪酸、たとえば遊離脂肪酸を産生させる方法にも関する。また、脂肪酸生合成に関連する１つまたは複数の酵素をコードしている、ラン藻の天然のゲノムに対して外因性である１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むラン藻を培養することを含む、ラン藻中で増加した量の脂肪酸を産生させる方法も企図される。特定の実施形態では、１つまたは複数の酵素はＡＣＣａｓｅ酵素活性を含む。トリグリセリドの産生において、本発明の改変されたラン藻は、光バイオリアクターに基づく培養技法などの、当分野で知られており、かつ本明細書中に例示されているルーチン的な技法に従って培養し得る。
【０２５５】
上述の様々な実施形態は、組み合わせてさらなる実施形態を提供することができる。本明細書で言及かつ／または出願データシートに記載した米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許文献のすべては、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている。様々な特許、出願および出版物の概念を用いるために必要な場合は、実施形態の態様を改変してさらなる実施形態を提供することができる。
【０２５６】
上述の説明に鑑みて、これらおよび他の変化を実施形態に行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲では、使用する用語は明細書および特許請求の範囲中に開示された具体的な実施形態に対する主張を限定すると解釈されるべきでなく、そのような特許請求の範囲が権利を有する均等物の完全な範囲と共にすべての可能な実施形態が含まれると解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は開示によって限定されない。
【実施例】
【０２５７】
（実施例１）
ＤＧＡＴおよびＰＡＰを発現するラン藻の調製
グラム陰性のＴＡＧ形成原核生物であるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｉｉ  ｓｐ．ＡＤＰ１は、十分に特徴づけられたＤＧＡＴ遺伝子（ＡｔｆＡ、本明細書中でＡＤＰ１−ＤＧＡＴとも呼ぶ）を含有する。ＡＤＰ１−ＤＧＡＴヌクレオチド配列を合成し、ＤＮＡ２．０を用いてＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２中での発現にコドン最適化し、プラスミド中に受け、確立された分子生物学的技法を用いてＩＰＴＧ誘導性ベクターｐＡＭ２９９１ｔｒｃ（このベクターは、ｌａｃＩ転写リプレッサー、およびＬａｃＩによって制御されるｐＴｒｃプロモーターをコードしている配列を含有する）内にサブクローニングし、Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２の中立部位１（ＮＳ１）内に組み換えた。コロニーをＢＧ１１−ｓｐｅｃ／ｓｔｒｅｐプレートから選択し、単離のために再度画線し、ＰＣＲによって陽性コロニーについて試験した。遺伝子の誘導性転写はリアルタイムＰＣＲによって確認した。
【０２５８】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは３つの特徴づけられたホスファチジン酸ホスファターゼを含有し、その１つは可溶性の非内在性膜タンパク質Ｐａｈ１ｐ（ＹＭＲ１６５Ｃ）である。Ｐａｈ１は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＴＡＧおよびリン脂質の合成に主要な役割を果たす。Ｐａｈ１ヌクレオチド配列を合成し、ＤＮＡ２．０を用いてＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２中での発現にコドン最適化し、プラスミド中に受け、確立された分子生物学的技法を用いてＩＰＴＧ誘導性ベクターｐＡＭ２９９１ｔｒｃ内にサブクローニングし、Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２の中立部位１（ＮＳ１）内に組み換えた。コロニーをＢＧ１１−ｓｐｅｃ／ｓｔｒｅｐプレートから選択し、単離のために再度画線し、ＰＣＲによって陽性コロニーについて試験した。
【０２５９】
上述のＡＤＰ１−ＤＧＡＴおよびＰａｈ１遺伝子を両方発現するＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２株は、ＡＤＰ１−ＤＧＡＴを発現する株（ＮＳ２中で組み換えられる、ＩＰＴＧ誘導性ベクターｐＡＭ１５７９ｔｒｃ−カナマイシン内にサブクローニングしたＡＤＰ１−ＤＧＡＴ）をＮＳ１由来のＰａｈ１（上述）を保有する構築体で形質転換させ、カナマイシン、ストレプトマイシンおよびスペクチノマイシンを含有するプレート上で形質転換体を選択することによって作製した。これらの遺伝子の誘導性転写はリアルタイムＰＣＲによって確認した。
【０２６０】
（実施例２）
ＤＧＡＴおよびＡＣＣａｓｅを発現するラン藻の作製
Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２は、細菌アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（７００２ａｃｃ）の４つのサブユニットをコードしている４つの遺伝子を含有する。これらの遺伝子（ａｃｃＡ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、およびａｃｃＤ）をＰＣＲ増幅し、重複伸長ＰＣＲ技法によるスプライシングを用いて、２つの合成の、２個の遺伝子のオペロンを構築した。合成オペロン１はａｃｃＡＤを含有し、合成オペロン２はａｃｃＢＣを含有する。２つの合成オペロンをベクターｐＴＧ２０８７（ｐＡＭ２３１４Ｆｔｒｃ３．）内にクローニングした。ベクターｐＴＧ２０８７は、Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２の中立部位１（ＮＳ１）内への組換えのための相同性の領域、ｌａｃＩ転写リプレッサーをコードしている配列、およびＬａｃＩによって制御されるｐＴｒｃプロモーターを含有する。合成７００２ａｃｃオペロン１および２を、ｐＴｒｃプロモーターの制御下でｐＴＧ２０８７内に２つの別々の部位でクローニングして、プラスミドｐＴＧ２０８７−７００２ａｃｃを作製した。クローン候補を配列決定して、７００２ａｃｃ遺伝子のいずれのコード配列中にもＰＣＲに誘導された突然変異が存在しないことを確認した。
【０２６１】
ｐＴＧ２０８７−７００２ａｃｃをＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２内に形質転換させ、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンを含有するＢＧ１１培地上にプレートすることによってＮＳ１内への組換え体を選択した。抗生物質の存在下で成長した形質転換体を単離コロニー用に画線し、単一コロニーをＮＳ１中の７００２ａｃｃ遺伝子の存在についてＰＣＲによって試験した。７００２ａｃｃ遺伝子の誘導性転写はリアルタイムＰＣＲによって確認した。
【０２６２】
７００２ａｃｃ遺伝子の機能的発現は、内在性Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２  ａｃｃＤ遺伝子の欠失を補完する能力によって試験した。ＮＳ１内に組み換えた合成オペロン１（７００２ａｃｃＡＤ）を有するＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２を、ネイティブＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ａｃｃＤ遺伝子の損失を補完する能力について試験した。補完の成功により、７００２ａｃｃ遺伝子がＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２中で機能的に発現されたことが示された。
【０２６３】
ＮＳ２内への組換えのために、Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２−７００２  ａｃｃＡＤＢＣ株を２つのＤＧＡＴ遺伝子のうちの１つ（実施例１および７からのＡＤＰ１−ＤＧＡＴまたはＳｃｏＤＧＡＴのどちらか）を含有するベクターで形質転換させた。形質転換体は、カナマイシンを含有する培地上にプレートすることによって選択した。ＮＳ２内へのＡＤＰ１−ＤＧＡＴまたはＳｃｏＤＧＡＴの組換えはＰＣＲによって確認された。これらの株は、実施例３および４に記載の方法を用いて、トリグリセリド産生について試験した。図６に示すように、ＤＧＡＴおよびＡＣＣａｓｅをどちらも発現するように誘導したラン藻は、ＤＧＡＴを発現するように誘導したラン藻に匹敵するレベルのＴＡＧを産生した。
【０２６４】
（実施例３）
ラン藻における増加した脂肪酸産生
実施例１からのＡＤＰ１−ＤＧＡＴを発現するラン藻を、増加したレベルの脂肪酸を産生する能力について試験した。ＡＤＰ１−ＤＧＡＴ陽性クローンの誘導は、培養物がＯＤ７５０＝０．２に達した際に１ｍＭのＩＰＴＧを加えることによって実施した。試料は誘導の２４時間後に採取し、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって脂質含有率を分析した。
【０２６５】
図１に見られるように、ＧＣの結果により、誘導していないベクター対照と比較してＩＰＴＧで誘導したＤＧＡＴで脂質含有率の２倍の増加が示された。
【０２６６】
（実施例４）
ラン藻におけるトリグリセリド産生およびＤＧＡＴのＴＬＣ分析
アシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するいくつかの酵素が文献に記載されており、公的に利用可能なＤＮＡおよびタンパク質のデータベースの相同性検索を実施することによっていくつかの相同体が同定された。いくつかのＤＧＡＴ相同体を合成し、Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２中での発現に最適化し、実施例１に記載のように相同組換えによってそのゲノム内に組み込ませた。
【０２６７】
実施例１からのＡＤＰ１−ＤＧＡＴの改変した形態を、ベクターｐＴＧ２０８７（ｐＡＭ２３１４Ｆｔｒｃ３．）、実施例２に記載の中立部位１発現ベクター内にクローニングした。この形態では、実施例１からのＡＤＰ１−ＤＧＡＴ遺伝子のＡＴＧ開始コドンの直後の６個の塩基が欠失していた。この株はＡＤＰ１−ＤＧＡＴｎと命名した。
【０２６８】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒは、十分に特徴づけられたＤＧＡＴを含有するグラム陽性のＴＡＧ形成原核生物である。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ−ＤＧＡＴ（ＳｃｏＤＧＡＴ）ヌクレオチド配列を合成し、ＤＮＡ２．０を用いてＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２中での発現にコドン最適化した。遺伝子をプラスミド中に受け、確立された分子生物学的技法を用いてｐＴＧ２０８７（ｐＡＭ２３１４Ｆｔｒｃ３．）、実施例２に記載の中立部位１発現ベクター内にサブクローニングし、Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２の中立部位１（ＮＳ１）内に組み換えた。コロニーをＢＧ１１−ｓｐｅｃ／ｓｔｒｅｐプレートから選択し、単離のために再度画線しＰＣＲによって陽性コロニーについて試験した。この遺伝子の誘導性転写はリアルタイムＰＣＲによって確認した。
【０２６９】
Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓは、十分に特徴づけられたＤＧＡＴ（ａｔｆＡ１）を含有する海洋性プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｏｂａｃｔｅｒｉａ）ガンマＴＡＧ形成原核生物である。Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ−ＤＧＡＴ（ＡｂｏＤＧＡＴ）ヌクレオチド配列を合成し、ＤＮＡ２．０を用いてＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２中での発現にコドン最適化した。遺伝子をプラスミド中に受け、確立された分子生物学的技法を用いてｐＴＧ２０８７（ｐＡＭ２３１４Ｆｔｒｃ３．）、実施例２に記載の中立部位１発現ベクター内にサブクローニングし、Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２の中立部位１（ＮＳ１）内に組み換えた。コロニーをＢＧ１１−ｓｐｅｃ／ｓｔｒｅｐプレートから選択し、単離のために再度画線しＰＣＲによって陽性コロニーについて試験した。この遺伝子の誘導性転写はリアルタイムＰＣＲによって確認した。
【０２７０】
ＡＤＰ１−ＤＧＡＴ、ＡＤＰ１−ＤＧＡＴｎ、ＳｃｏＤＧＡＴおよびＡｂｏＤＧＡＴの誘導実験を、実施例３に記載のように行った。試料を誘導の２４時間後に収集し、全脂質抽出物を以下のようにＴＬＣ分析用に調製した。ペレットを１００ｕｌの水中に再懸濁させ、これに３７５ｕｌの１：２のクロロホルム：メタノールの混合物を加えた。頻繁に渦撹拌しながら細胞を１０分間抽出した。これに１２５ｕｌのクロロホルムを加え、抽出物をさらに１分間渦撹拌した。最後に、さらに１分間、渦撹拌しながら１２５ｕｌの１ＭのＮａＣｌを加えることによって相分離を生じた。分離を加速させるために、試料を臨床用遠心分離機で１０分間、ｒｃｆ１９３０で遠心分離した。有機相を新しいチューブに取り出し、真空乾燥機で乾燥させた。乾燥した脂質抽出物を４０ｕｌの２：１のクロロホルム：メタノールの混合物に再懸濁させ、６ｕｌのアリコートまたは全体積のどちらかをＴＬＣプレート（２００ｕｍの厚さのシリカプレート）に適用した。１００ｍｌの溶媒混合物あたり１ｍｌの氷酢酸で酸性化した、７５％のｎ−ヘキサン、２５％のジエチルエーテルからなる移動相を用いて、クロマトグラフィーを流した。流れが完了したものを乾燥させ、脂質をプリムリン（８０％のアセトン溶液に５０ｍｇ／Ｌで溶かした）で画像化した。プリムリンで染色したプレートを励起させるために手持ち型ＵＶランプを用いて、画像をデジタル記録した。
【０２７１】
図２に示すように、４つのＤＧＡＴ遺伝子すべてが、ラン藻中で発現された場合にＴＡＧの産生をもたらした。さらに、ＡＤＰ１−ＤＧＡＴ、ＡＤＰ１−ＤＧＡＴｎ、およびＡｂｏＤＧＡＴを発現する株では脂肪酸の増加が観察されたが、ＳｃｏＤＧＡＴでは観察されなかった。これらの結果は、ラン藻におけるいくつかのＤＧＡＴの異種発現がＴＡＧ形成をもたらすことを実証している。
【０２７２】
（実施例５）
Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓにおけるトリアシルグリセリドおよび遊離脂肪酸の蓄積
実施例１に記載のＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２のＡＤＰ１−ＤＧＡＴ発現株を実施例３に記載の誘導条件下で成長させ、実施例４に記載のように調製した全脂質抽出物をＨＰＬＣ分析に供した。４０μＬの全脂質抽出物を、ＥＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｏｎａ  ＣＡＤ  Ｐｌｕｓ検出器（Ｃｈａｒｇｅｄ  Ａｅｒｏｓｏｌ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、荷電エアロゾル検出器）に接続したＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＵＦＬＣ（Ｕｌｔｒａ  Ｆａｓｔ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ、超高速液体クロマトグラフィー）で分析した。Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｇｏｌｄ  Ｃ８  ３μｍ  １５０×４．６ｍｍのカラム、０．８ｍＬ／分の流速を使用した。移動相Ａ：メタノール／水／酢酸（７５０：２５０：４）および移動相Ｂ：アセトニトリル／メタノール／ＴＨＦ／酢酸（５００：３７５：１２５：４）の二成分勾配系を使用した。典型的な実行の結果を図３に示し、ｙ軸は様々な脂質種のピークの強度を示し、ｘ軸は対応する保持時間を示す。３つの主要な脂質群である遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、リン脂質、およびＴＡＧを示し、これはそれらの脂質種の代表的な標準物質を用いて同定した（示さず）。見ることができるように、誘導した株はＴＡＧを産生した。誘導していない株では、これらは検出不可能であった。したがって、ＴＬＣによって示されるように、ラン藻におけるＤＧＡＴの外因性発現はＴＡＧの形成をもたらす。
【０２７３】
（実施例６）
ＴＡＧのアシル鎖組成
実施例１および４に記載のＡＤＰ１−ＤＧＡＴおよびＳｃｏＤＧＡＴ株を、実施例３に記載のＴＡＧの産生のために誘導した。実施例４に記載の方法に従って、脂質抽出物を調製し、非極性脂質をＴＬＣ上で分離した。対応する標準物質とのその共遊走によって決定した、ＴＡＧに対応するＴＬＣプレート上のスポットは、それぞれのスポットを包含する四角形の面積を切り出すことによってＴＬＣプレートから抽出した。その後、この物質をエステル交換およびＧＣ分析に供した。図４に見ることができるように、これら２つの株によって産生されるＴＡＧの脂肪酸組成は、ＡＤＰ１−ＤＧＡＴ株によって産生されたＴＡＧはＣ１８およびＣ１６アシル鎖の混合物から構成されており（図４Ａ）、他方で、ＳｃｏＤＧＡＴ株からのＴＡＧはＣ１６およびＣ２２アシル鎖の混合物から構成されていた（図４Ｂ）点で異なっていた。このことは、これら２つのＤＧＡＴ酵素の様々なアシル変化特異性を強調しており、２つ以上の異なるＤＧＡＴを改変されたラン藻内に導入して複数の異なるＴＡＧを生じることを支援している。
【０２７４】
（実施例７）
ラン藻におけるトリアシルグリセリドの産生
ＤＧＡＴの発現がＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２の外でＴＡＧの産生と相関しているかどうかを決定するために、ＤＧＡＴをコードしている遺伝子を異なる株、Ｓｙｎｅｃｈｃｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．株ＰＣＣ  ６８０３（本明細書中以降、ＰＣＣ  ６８０３と呼ぶ）内に導入した。２つの変異体をＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．株ＰＣＣ  ６８０３中で構築した。第１の変異体は、ＰＴｒｃプロモーターの制御下のＡＤＰ１−ＤＧＡＴをコードしている遺伝子、カナマイシン耐性（ｎｐｔＡ）およびラクトースリプレッサー（ｌａｃＩ）をコードしている座位を保有していた。陰性対照として、ｎｐｔＡおよびｌａｃＩを保有していたが、ＡＤＰ１−ＤＧＡＴ遺伝子は保有していない株を構築した。どちらの構築体も、ＰＣＣ  ６８０３で使用するために考案した中立部位ベクター中で構築した。
【０２７５】
このベクターは、ＰＣＣ  ６８０３中の中立部位、文献中で非必須であると記載されている２つの収束的に転写されるネイティブ遺伝子間の領域内への組換えを指示する。突然変異誘発は、一般に、形質転換体を簡素なＢＧ−１１プレート上にプレートし、１２および３６時間目に濃縮カナマイシンを寒天パッドの下に注入することによって漸増するカナマイシン濃度に供した以外は、Ｅａｔｏｎ−Ｒｙｅ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４巻、３０９〜３２３頁）のプロトコルに従った。ＡＤＰ１−ＤＧＡＴ遺伝子の組み込みが成功したことは、コロニーＰＣＲを用いて実証された。突然変異誘発に使用したプレートは、１×ＢＧ−１１（パスツール配合物）、１．２５％のＢａｃｔｏａｇａｒ、および３ｇ／Ｌまでのチオ硫酸ナトリウムから構成されていた。
【０２７６】
正しい挿入物を有することが確認された形質転換体を後期対数期まで成長させ、培養物のアリコートを遠心分離し、ＢＧ−１１で洗浄し、再度ペレット化し、カナマイシンを含む５０ｍｌのＢＧ−１１に再懸濁させた。培養物の半量を最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。典型的には、試料は誘導の０、３および６日目に採取した。ペレット化した試料を−８０℃で保存した。
【０２７７】
実施例４に記載のものに類似の方法を使用してＴＬＣを行って、ＡＤＰ１−ＤＧＡＴの発現がどのようにＰＣＣ  ６８０３中のＴＡＧ含有率に影響を与えたかを決定した。図５Ａに示すように、ＡＤＰ１−ＤＧＡＴを保有しない株はＴＬＣ上でＴＡＧを示さず、一方で、ＡＤＰ１−ＤＧＡＴを保有する株はＴＡＧを産生した。これらの実験により、Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２で最初に見られたＴＡＧの操作したＤＧＡＴ依存性の産生がその株にユニークなものではなく、ジアシル−グリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を含有するように操作したラン藻の一般的な特性であることが実証された。
【０２７８】
（実施例８）
塩耐性Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２株の作製
Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２は、高塩中では通常良好に成長しない淡水性のラン藻である。本実施例では、塩または汽水中で成長し、ＴＡＧを産生することができるラン藻Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２変異体の作製を記載する。淡水培地（ＢＧ１１）中で成長できることに加えて、この株は３％までの塩濃度（ＢＧ１１培地中）中で成長することができる。
【０２７９】
変異体Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２株は、高塩（１．５％のＮａＣｌ）液体培地中での数ラウンドの成長および希釈によって選択した。塩耐性株が出現した後（数カ月の選択後）、淡水から作製したＢＧ１１プレート上での数ラウンドの成長後に塩耐容を保持するその能力について試験した。生じた塩耐性株は、ＢＧ１１または１．５％のＮａＣｌ−ＢＧ１１のどちら中でも、１４日間まで同等の密度まで成長した。塩耐性株はＢＧ１１中で野生型と区別不能に成長したが、ＮａＣｌを含有する培地中の野生型ＰＣＣ  ７９４２と比較して鋭い成長の増加を示した。
【０２８０】
Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２のＡＤＰ１−ＤＧＡＴ発現塩耐性株は、上述の塩株を実施例１に記載のＡＤＰ１−ＤＧＡＴ構築体で形質転換させることによって作製した。このＡＤＰ１−ＤＧＡＴ塩耐性株は、３％までの塩を含有する培地中でＡＤＰ１−ＤＧＡＴ非塩耐性株に勝る成長上の利点を示し、ＡＤＰ１−ＤＧＡＴ親非塩耐性株と類似の量のＴＡＧを産生した（図５Ｂ）。この株は、汽水または海水を使用することが有利であり得る産生の設定で有用な可能性がある。
【０２８１】
（実施例９）
グリコーゲン経路欠失株の構築
グリコーゲンとしての炭素の野生型貯蔵から他の潜在的な炭素ベースの生成物への炭素流動を転用することが可能であるかどうかを試験するために、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのグリコーゲン経路中のグリコーゲン生シンターゼを無能化した。特に、Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２株中のリン酸アデニリルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｓｙｎｐｃｃ７９４２＿０６０３、ｇｌｇＣ）およびホスホグルコムターゼ遺伝子（Ｓｙｎｐｃｃ７９４２＿０１５６、ｐｇｍ）遺伝子を、欠失によって個々に失活させて、２つの異なる改変したＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ株、ΔｐｇｍおよびΔｇｌｇＣを作製した。
【０２８２】
ΔｐｇｍおよびΔｇｌｇＣ欠失株は以下のように構築した。ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、ｐｇｍおよびｇｌｇＣ遺伝子に隣接するゲノムＤＮＡ領域を増幅した。増幅した上流および下流のフランキング領域を、プラスミドｐＣＲＧ中のゲンタマイシン耐性マーカーの上流および下流に連続的にクローニングした。ｐＣＲＧプラスミドはＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ中で自律複製することができない。
【０２８３】
確立された方法を用いて生じたプラスミドをＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２内に個々に形質転換させた。ゲンタマイシン含有培地上で選択した後、組換え株を増殖させ、そのゲノムＤＮＡをＰＣＲによって分析して、それぞれのΔｐｇｍおよびΔｇｌｇＣ欠失株中に標的とした遺伝子が欠失していることを確認した（図７を参照）。
【０２８４】
（実施例１０）
グリコーゲン経路欠失株による低下したグリコーゲン産生
窒素制限の条件下におけるＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２の成長は、グリコーゲン蓄積をもたらすことが示されている（たとえばＧｏｅｒｌら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４４巻：２４４９〜２４５８頁、１９９８年を参照）。実施例９に記載の、作製されたＳ．ｅｌｏｎｇａｔｅｓ  ＰＣＣ  ７９４２のΔｐｇｍおよびΔｇｌｇＣ欠失株を、窒素制限条件下で成長させた後に、野生型Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２に対するそのグリコーゲン含有率について分析した。
【０２８５】
野生型（ＷＴ）および欠失株を、窒素が十分なＢＧ１１培地（１×Ｎ）または標準の窒素濃度の１／１０（０．１×Ｎ）を含有するＢＧ１１培地中のどちらかで５日間培養した。グリコーゲン含有率の生化学的アッセイは、Ｓｕｚｕｋｉら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１７７０巻：７６３〜７７３頁、２００７年）に記載のように行った。この実験からのデータは図８に％グリコーゲン／乾重量として示す。このデータにより、Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２のΔｐｇｍ株が顕著に低下したグリコーゲン含有率を示すことが確認され、また、Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２のΔｇｌｇＣ株が検出不可能なレベルのグリコーゲンを示すことも確認される。
【０２８６】
（実施例１１）
グリコーゲン経路欠失変異体による増加した脂質産生
実施例９に記載のＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２欠失株ΔｐｇｍおよびΔｇｌｇＣの脂質産生を測定して、細胞が、そのグリコーゲン経路中の生シンターゼの欠失が原因で炭素をグリコーゲンとして保存できない場合、これらは炭素を他の生合成経路へと転用することを実証した。
【０２８７】
野生型（ＷＴ）および欠失株を、窒素が十分なＢＧ１１培地（１×Ｎ）または標準の窒素濃度の１／１０（０．１×Ｎ）を含有するＢＧ１１培地中のどちらかで５日間培養した。試料を５日目に採取し、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）およびナイルレッド染色によって脂質濃度について試験した。図９は、ＷＴと比較した欠失株の％ＦＡＭＥ／乾重量として表したＧＣ測定値を示す。図９ＡはΔｐｇｍ株のＧＣの結果を示し、図９ＢはΔｇｌｇＣ株のＧＣの結果を示す。比較可能な結果が低窒素条件下（０．１×Ｎ）の塩耐性Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２のΔｇｌｇＣ株で得られた（データ示さず）。
【０２８８】
これらの結果により、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのグリコーゲン合成経路中の生シンターゼの欠失により炭素が他の生合成経路、特に脂質生合成経路へと転用されることが確認される。
【０２８９】
（実施例１２）
Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＰＣＣ  ７００２およびＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ＰＣＣ  ６８０３におけるグリコーゲン経路欠失変異体による増加した脂質産生
上述のように、Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２のΔｐｇｍおよびΔｇｌｇＣ欠失株は、増加した量の脂質を産生した。他の株のグリコーゲン経路変異体も増加した量の脂質を産生することを実証するために、ｇｌｇＣノックアウト株をＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２で作製し、ｇｌｇＣ−部分二倍体をＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３で作製した。完全なｇｌｇＣノックアウトはＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３で作製することができなかった。ｇｌｇＣの突然変異および野生型のコピーをどちらも含有する部分二倍体は容易に得られた。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２およびＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３のノックアウト株は、実施例９にＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２について記載のように作製した。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３で得られた部分二倍体に関して、ｇｌｇＣ遺伝子の突然変異および野生型のコピーは、どちらも複数の形質転換体のゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析によって検出された。
【０２９０】
野生型Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２およびｇｌｇＣノックアウト変異体を、窒素が十分なＢＧ１１培地（１×Ｎ）または標準の窒素濃度の１／１０（０．１×Ｎ）を含有するＢＧ１１培地中のどちらかで６日間成長させた。試料を４および６日目に採取し、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって脂質濃度について試験した。株を硝酸が十分な培地（１×）中で成長させた場合、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．７００２において野生型とｇｌｇＣノックアウトとの間に脂質含有率の顕著な差異は存在しなかった（図１０）。対照的に、硝酸を制限した培地（０．１×）中で成長させた場合は、変異体は４日目に顕著な脂質含有率の増加を示した（図１０）。この差異は少なくとも６日目まで持続する（図１０）。誤差バーは、生物学的複製物間の測定された脂質含有率の分散を反映している。
【０２９１】
Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７００２の野生型およびｇｌｇＣノックアウト変異体について上述したように、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３の野生型および２つの独立したｇｌｇＣ部分二倍体変異体を正常培地中で成長させ、その後、ペレット化し、再懸濁させた。ｇｌｇＣ−３として同定された１つのｇｌｇＣ部分二倍体は、通常の硝酸（１．０×）条件下で大量の炭素を脂肪酸の産生へと流し込んだ（図１１）。対照的に、低硝酸（０．１×）条件下では、第２の部分二倍体であるｇｌｇＣ−２は、１．５倍の脂質含有率の増加を示した（図１１）。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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