(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
産業用のバイオリアクターへの供給を行うために硫黄を安定分散液の形態にする硫黄のバイオ適応化のためのシステムであって、
（ａ）硫黄酸化細菌の培養物の上清の希釈物または硫黄酸化細菌の培養物の一部から成る液体培地を含むタンク（１）、
（ｂ）前記タンク（１）から供給が行われる再循環用ポンプ（２）、および、
（ｃ）前記再循環用ポンプ（２）に入力部が接続され、且つ前記タンク（１）に出力部が戻すように接続され、循環閉鎖回路を構成する排出装置（３）を備え、
前記排出装置（３）の供給路内に硫黄の微粉末が供給される硫黄のバイオ適応化のためのシステム。
【請求項２】
上記再循環用ポンプ（２）の出力部に接続され、選択的に流れの方向付けを行うことを可能にする導流手段（４）を含むことを特徴とする、請求項１に記載の硫黄のバイオ適応化のためのシステム。
【請求項３】
上記導流手段（４）は、三方バルブ、または、各々が対応する回路方向への流入を制御する２つのバルブセットに対応することを特徴とする、請求項２に記載の硫黄のバイオ適応化のためのシステム。
【請求項４】
産業用のバイオリアクターへの供給を行うために硫黄を安定分散液の形態にする硫黄のバイオ適応化のための方法であって、
（ａ）硫黄酸化細菌の培養物の上清の希釈物または硫黄酸化細菌の培養物の一部を含む液体培地を含むタンク（１）の内部において、再循環用ポンプ（２）を介した再循環を開始させる工程、および、
（ｂ）前記再循環用ポンプ（２）に入力部で接続された排出装置（３）に対して硫黄の微粉末の供給部を接続し、前記タンク（１）に戻るように入力部を接続する工程を含む硫黄のバイオ適応化のための方法。
【請求項５】
（ｃ）選択的に流れの方向付けを行うことを可能にする導流手段（４）を上記再循環用ポンプ（２）の排出部に接続する工程、および、
（ｄ）再循環流を介して上記排出装置（３）を操作するために、または、上記再循環用ポンプ（２）から直接的に上記タンク（１）へと流れを導くために、前記導流手段（４）によって流れの選択的な切り替えを行う工程をさらに含む、請求項４に記載の硫黄のバイオ適応化のための方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、産業用バイオリアクターへの供給を行うために硫黄を安定分散液の形態にするバイオ適応化のためのシステムを開示する。さらに、本発明は、産業用バイオリアクターへの供給を行うために硫黄をバ安定分散液の形態にするバイオ適応化のための方法を開示する。
【０００２】
〔背景技術〕
バイオリーチングは、バイオマイニングにおける最も重要な処理法であり、微生物の直接または間接作用を使用して酸性培地中の複合マトリクスから金属を浸出させる方法として定義されている。上記処理法に有用な微生物は、細菌または古細菌のドメインに属する微生物とすることが可能である。また、これら微生物は、特定の目的に対する有用性に応じて分類することが可能である。例えば、バイオリーチングに通常用いられる硫黄酸化微生物および鉄酸化微生物を区別することは可能である。
【０００３】
バイオマイニング操作に関しては、バイオリアクターを組み入れてバイオマスを産生することが一般的に行われている。上記バイオリアクターは、細菌増殖の発生する液相系のバイオリアクター（従来のリアクター）である。または、付着細菌を用い、溶液を浸透させる固相充填床系のバイオリアクター（細胞カラムリアクター）である。バイオマイニング用の細菌による鉄および硫黄の酸化処理の重要性を考慮して、鉄酸化微生物用のバイオリアクターおよび硫黄酸化微生物用のバイオリアクターを見出すことが可能である。このうち後者のバイオリアクターが本発明の焦点となる。
【０００４】
硫黄化合物または還元硫黄化合物の使用を伴う産業処理において最も頻繁且つ広く認められる硫黄酸化微生物はアシディチオバチルスチオオキシダンスである。
【０００５】
上記微生物を培養するうえで必須の工程は、細菌の天然基質（硫黄）をリアクターに供給することである。使用される硫黄は、サイズが３０μｍ〜３００μｍの範囲の微粉であるため、取扱いに関する様々な課題を抱えている。
【０００６】
最初の課題として、使用する硫黄は疎水性であるため、バイオリアクター内の酸性の水性環境で溶解させることができない。
【０００７】
次の課題として、硫黄の微粉末は大気などの酸素含有空気と接触した場合に可燃性および爆発性となるので、持続的な供給を必要とするリアクターへの投与供給を行うことが困難になってしまう。
【０００８】
最後の課題として、産業用バイオリアクターはその寸法が大きいため、リアクターへ硫黄を適量投与する操作が中断される事態に結びつく。風またはこれに類似の他の現象が発生した場合、上述の供給操作を一時中断しなければならない。
【０００９】
上記最初の課題は、バイオマスの発生に重要な影響を及ぼす。何れの硫黄酸化細菌の培養物の場合でも、接種材料および硫黄の添加が行われた時点から指数増殖期までの期間に潜伏期が現れる。このことは、硫黄の疎水性に大きく起因しており、硫黄は微生物用の基質として即座に生体利用可能になるわけではないことを意味している。
【００１０】
これら全ての不都合を解決する硫黄供給システムが必要とされている。
【００１１】
本発明者は、産業用バイオリアクターへの供給を行うために硫黄をバイオ適応化させて安定分散液の形態または濃密スラリーとするためのシステムおよび方法を設計した。これにより取得される硫黄の分散液は、硫黄の微粉末に見られる可燃性／爆発性をもはや有さない。上記硫黄は液状であるため、風またはこれに類似の他の現象に関連する取扱い上の課題に直面することなく、上記硫黄を上記タンク内に取り込むことが可能である。驚くべきことに、上記分散液により、確実に、細菌に対して硫黄が即座に生体利用可能となる。これにより、遅滞期が大幅に軽減され、硫黄酸化細菌を用いたバイオリアクター内でバイオマスを発生させる時間を短縮させることが可能になる。
【００１２】
本発明のシステムは、補助タンクに接続されている、再循環回路に関連の排出装置を介して硫黄の微粉末を取り込むように構成されている。上記液体培地は、硫黄酸化細菌の培養物の上清の希釈物または硫黄酸化細菌の培養物の一部である。本発明のシステムは、は、容易に操作を行うことが可能な均質の硫黄の液体である懸濁液を提供するので、硫黄の微粉末が有する危険性を回避している。この結果得られる硫黄の分散液を液相リアクターの基質として直接使用することが可能である。さらに、硫黄の分散液を濃縮し、その結果得られるスラリーを用いて増殖培地を調製した場合、これを充填床リアクターの基質として使用することが可能である。さらに、本発明者らは、上記分散液またはスラリーによって硫黄が即座に生体利用可能になることを見出した。硫黄酸化細菌のバイオマスを発生させるバイオリアクターに上記分散液またはスラリーを基質として直接添加する場合、遅滞期が短縮されるので、バイオマスを発生させる時間も短縮されることになる。
【００１３】
〔従来技術〕
産業用バイオリアクターへの供給を行うために安定分散液の形態の硫黄を取得するという本発明の技術的課題を解決するような従来技術文献はこれまでに発見されていない。
【００１４】
その一方で、可燃性および爆発性などの硫黄粉末に関する課題は従来技術においても認識されていた。例えば、米国特許第３，７７９，８８４号（１９７４年）は、農業目的の硫黄の分散液についてのある方法を開示している。上記米国特許では、水相内に発生する乱流を用いて硫黄の細分化を行うとともに、水中の微細分散を発生させている。このシステムは、分散液の排出が行われるポンプ内を硫黄に通過させるリサイクル設計を含んでいる。本発明は、硫黄酸化細菌の培養物の上清の希釈物または硫黄酸化細菌の培養物の一部から成る液体培地を水に代えて使用しているため、上記米国特許に記載の発明と異なる発明である。さらに、本発明は、分散液を発生させるために排出システムを使用している。
【００１５】
上述の差異により、経時的な安定性を示し、且つ機械的撹拌により再懸濁可能な微粉末としてデカントするバイオ適応性の（バイオ適応可能な）硫黄の分散液が作製される。その一方、上記分散液は水中では不安定である。撹拌が中断されると、硫黄が水面上に浮遊した状態のままとなり、巨視的な硫黄のフロックが形成されてしまう。
【００１６】
その後、本発明者らは、激しく撹拌しながら水流に溶融硫黄を注入して硫黄の微細懸濁液を作製するための方法を記載した米国特許第４，３７２，８７２号（１９８３）の存在を発見した。しかし、上記米国特許では、硫黄が水中で凝集するため、水中で硫黄の分散液を調製することは困難であることについて言及がなされている。さらに、上記米国特許では、外部界活性剤が有用であることが示唆されているが、外部界面活性剤の特定がなされておらず、処理法へ取り入れられてもいない。
【００１７】
米国出願第２００３／０１８５６３７Ａ１（２００３年）は、硫黄粉末を含む硫黄の顆粒の移送方法および硫黄の顆粒に含まれる硫黄粉末の除去を記載している。上記方法は、
排出システムを使用して硫黄顆粒に水を送り込んで、硫黄の顆粒および硫黄粉末を含む水溶液を作製することから構成されている。その後、硫黄粉末および他の不純物を含む水を硫黄の顆粒用の移送水から分離する。最終的には、上記硫黄の顆粒から水を除去し、乾燥状態とした上記硫黄の顆粒を保存する。
【００１８】
上記排出システムは当技術分野において公知であり、液状物質、ガス状物質、または粉末状物質を液組成物中に取り込むために使用される。例えば、米国第４，６９５，３７８号（１９８７）は、処理水に酸素を供給し、これに粉末状の中和剤を添加する排出装置から構成される鉱水の処理システムを記載している。第２の例である、米国特許第６，９８８，８２３Ｂ２号（２００６年）は、「微細固形物を湿らせる」システムを記載している。上記米国特許ではまた、記載の技術により不溶性の化合物が均質の分散液を作製できることを示唆している。上記処理システムは、粉末を水流と混合させるために排出装置を組み入れている。上記米国特許はリサイクル法を使用していない。その代わりに、上記米国特許は、内部撹拌ロッドを使用して溶液／分散液の混合を行うことを記載している。
【００１９】
結論として、硫黄粉末を分散液として移送する解決法は幾つか存在するが、これらは水中で実証されたものであって、本発明の方法およびシステムで得られるバイオ適応性の硫黄の分散液よりも安定性が低い。
【００２０】
産業用バイオリアクターへの供給を行うために安定分散液の形態のバイオ適応性の硫黄を取得するという本発明の技術的課題の解決は、従来技術では取り組まれていないものであった。分析した上述の文献に記載の硫黄の微細スラリーまたは分散液に関する使用は、硫黄を殺菌剤として使用し、リアクターへの供給を考慮していないか、または本発明で行われるような微生物増殖培地としての使用を行っていない農業分野についてのものである。
【００２１】
〔発明の概要〕
本発明は、産業用バイオリアクターへの供給を行うために硫黄（Ｓ）を安定分散液の形態にする硫黄のバイオ適応化のためのシステムであって、（ａ）硫黄酸化細菌の培養物の上清の希釈物または硫黄酸化細菌の培養物の一部から成る液体培地を含むタンク、（ｂ）前記タンクから供給が行われる再循環用ポンプ、および（ｃ）前記ポンプに入力部で接続され、且つ前記タンクに出力部で戻すように接続され、再循環閉鎖回路を構成する排出装置を備えるシステムに関する。上記排出装置の供給路内には微粉末状のＳが供給される。
【００２２】
上記硫黄酸化細菌の培養物の上清または上記硫黄酸化細菌の培養物の一部を硫黄含有培地で１００倍〜１０倍に希釈する。
【００２３】
本発明の第２の態様は、産業用バイオリアクターへの供給を行うために硫黄を安定分散液の形態にする硫黄のバイオ適応化のための方法であって、（ａ）硫黄酸化細菌の培養物の上清の希釈物または硫黄酸化細菌の培養物の一部から成る液体培地を含むタンク内において、再循環用ポンプを介した再循環を開始する工程、および（ｂ）前記再循環用ポンプに入力部で接続され、且つ前記貯蔵部に出力部が戻すように接続された排出装置に対して硫黄粉末の供給部を接続する工程を備える方法を開示する。取り込まれた硫黄は、上記排出装置内で発生する吸引力によって粉砕される。
【００２４】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、本発明の好適な構成のプロセス図を示し、硫黄酸化細菌の培養物の希釈物または硫黄酸化細菌の培養物の一部を含む液体培地を含むタンク（１）、前記タンク（１）から供給が行われる再循環用ポンプ（２）、および前記再循環用ポンプ（２）と入力部で接続され、且つ前記タンク（１）と出力部で戻すように接続され、循環閉鎖回路を構成する
排出装置（３）を備え、前記排出装置（３）は、その供給路内に硫黄粉末が供給される。
【００２５】
図２は、本発明の第２の好適な構成のプロセス図を示す。図１に記載のシステムに加えて、上記第２の好適な構成は、上記再循環用ポンプ（２）の出力部において、上記排出装置内を通過させることなく、その代りに上記タンク（１）へ直接流れるように流れを導くことを可能にする導流手段（４）を含む。
【００２６】
図３は、産業プロセスにおける硫黄のバイオ適応化を行う好適な構成を示す。上記構成では、図１および図２に記載のプロセス図を考慮している。しかし、上記構成は、バイオ適応性の硫黄を取得するために上清または培養物の希釈物のソースとして作動する産業用バイオリアクターを備える。上記バイオ適応性の硫黄は、その後に産業用バイオリアクターへ供給されるように意図されている。
【００２７】
図４は、３つの条件下における１×ＫＭＤ培地内で分取した硫黄の分散液を示す。図４中のａでは、本発明の硫黄のバイオ適応化を示し、硫黄は完全にデカントされている。図４中のｂでは、機械的分散を行ったコントロールを示し、硫黄は大きな凝集塊を形成せず、少量の硫黄はデカントされ、高パーセンテージ分の硫黄は懸濁固形物の凝集によって形成されたフロック状態で表面上に留まっている。図４中のｃでは、機械的分散の行われていないコントロールを示し、硫黄は大きな凝集塊の形態で表面上に留まっている。
【００２８】
図５は、１０６細胞／ｍｌのＬｉｃａｎａｎｔａｙ株ＤＳＭ１７３１８を植菌した、硫黄酸化細菌の３つのバイオリアクター内のｐＨおよびバイオマスの変遷を示す。図中、コントロール（黒四角）は標準的な硫黄微粉（非バイオ適応性）が供給されたもの、（黒三角）は高圧蒸気殺菌法で滅菌が行なわれたバイオ適応性の硫黄を示し、（黒丸）は滅菌が行われたバイオ適応性の硫黄を示す。図５Ａでは、ｐＨが経時的に示され、バイオ適応性の硫黄は上記コントロールよりも速やかにｐＨを低下させたことを示唆している。図５Ｂでは、バイオマスが経時的に示され、バイオ適応性の硫黄は上記対処よりも速やかにバイオマスを増大させ、遅滞期を７５時間から２４時間へと短縮させたことを示している。
【００２９】
図６は、２．３５Ｇ＿Ｓ／Ｋｇ＿Ｑｕａｒｔｚおよび４．６５Ｇ＿Ｓ／ｋｇ＿Ｑｕａｒｔｚという異なる２つの硫黄濃度を使用した石英カラム上で凝集した硫黄についての、硫黄から硫酸への変換率（パーセンテージ）を示す。図中、コントロール（黒三角）は標準的な硫黄微粉（非バイオ適応性）が凝集したものであり、本発明のカラムはバイオ適応性の硫黄（黒菱型）が凝集した。図６Ａは、硫黄濃度のより低い（２．３５Ｇ＿Ｓ／ｋｇ＿Ｑｕａｒｔｚ）カラムについての、硫黄から硫酸への変換パーセンテージを示す。図６Ｂは、硫黄濃度のより高い（４．６５Ｇ＿Ｓ／ｋｇ＿Ｑｕａｒｔｚ）カラムについての、同じものの結果を示す。上記何れの場合においても、バイオ適応性の硫黄を使用した場合では、硫黄から硫酸への変換の速度および効率がより向上した。
【００３０】
図７は、０ｇ／Ｌ（黒丸）、１５ｇ／Ｌ（黒三角）、１８ｇ／Ｌ（白菱型）、および２０ｇ／Ｌ（白四角）の異なる硫酸アルミニウム濃度の存在下における、フラスコ内の細菌の増殖について示す。図７Ａは、フラスコ内に非バイオ適応性の硫黄の微粒粉を含むもの、および図７Ｂは、フラスコ内にバイオ適応性の硫黄を含むものを示す。上記バイオ適応性の硫黄を使用した場合、上記硫酸アルミニウムの毒性作用が減衰した。
【００３１】
〔発明の詳細な説明〕
背景技術で説明したように、硫黄酸化微生物の培養では、硫黄をバイオリアクターに供給することが求められる。硫黄は３０μｍ〜３００μｍの微粉末であり、その取扱いに関しては、硫黄の疎水性、可燃特性、および爆発性などの多くの課題が存在している。
【００３２】
本発明者は、産業用バイオリアクターへの供給を行うために硫黄を安定分散液の形態にするバイオ適応化のためのシステムおよび方法を設計した。
【００３３】
（ａ）本発明は、産業用バイオリアクターへの供給を行うために硫黄を安定分散液の形態にするバイオ適応化のためのシステムを指し、硫黄酸化細菌の培養物の上清の希釈物または硫黄酸化細菌の培養物の一部を含む液体培地を含むタンク（１）、（ｂ）前記タンク（１）から供給が行われる再循環用ポンプ（２）、および（ｃ）前記再循環用ポンプ（２）に入力部で接続され、且つ前記タンク（１）に出力部で戻すように接続され、再循環閉鎖回路を構成する排出装置（３）から構成され、前記排出装置（３）の供給路内に硫黄の微紛末の供給部を備えている。
【００３４】
硫黄の分散に使用する上記培地で、上記硫黄酸化細菌の培養物の上清または上記硫黄酸化細菌の培養物の一部を１００倍〜１０倍に希釈する。これを図１に示す。
【００３５】
さらに、本発明の代替的な構成は、上記排出装置内を通過させることなく、その代りに上記タンク（１）へ直接流れるように流れを導く導流手段（４）を上記再循環用ポンプ（２）の出力部に配置することから構成される。この好適な構成を図２に示す。
【００３６】
第２の態様では、本発明は、産業用バイオリアクターへの供給を行うために硫黄を安定分散液の形態にするバイオ適応化のための方法であって、（ａ）硫黄酸化細菌の培養物の上清の希釈物または硫黄酸化細菌の培養物の一部を含む液体培地を循環させる再循環用ポンプ（２）を介した再循環をタンク（１）内において開始する工程、および（ｂ）前記再循環用ポンプ（２）に入力部で接続された排出装置（３）に硫黄の微粉末の供給部を接続し、且つ前記排出装置（３）の出力部を前記タンク（１）に戻るように接続する工程から構成される。
【００３７】
さらに、本願発明の好適な構成に関しては、上記方法は、（ｃ）選択的に流れを導く（方向付ける）ことを可能にする導流手段（４）を上記再循環用ポンプ（２）の上記出力部で接続する工程と、（ｄ）上記排出装置（３）を再循環流を介して操作するために、または上記再循環用ポンプ（２）から直接上記タンク（１）へ流れるよう流れを導くために、前記導流手段（４）によって流れの選択的な切り替えを行う工程とのさらなる工程から構成されてもよい。
【００３８】
上記排出装置の主な機能は、上記システムに硫黄粉末を供給することであるが、硫黄粉末が全て上記システムに導入されると、上記排出装置は上記流れのなかに小さな気泡を引き込み始める。上記気泡の引き込みは、上記流れと雰囲気との圧力差に起因して行われる。上記気泡により、上記排出装置からの排出と上記タンク内とに乱流が発生し、上記タンク内で硫黄が分散することを可能にする。
【００３９】
バルブによって上記流れが上記排出装置を通過することなく直接上記タンクに向けて流される場合、および上記硫黄粉末が全て導入されて上記上清と強制的に接触させられる場合、上記硫黄酸化細菌の培養物またはその上清に含まれる「バイオ界面活性」化合物の存在によって、上記硫黄の安定分散液の取得または維持が、上記再循環の流れ特性によって可能となる。上記排出装置の「迂回路」が存在するため、上記再循環用ポンプは上記排出装置の水圧抵抗を受けることを回避する。これにより、懸濁液中に含まれる微細な硫黄が凝集されてフロックを形成することが回避される。
【００４０】
さらに、上記導流手段（４）は三方バルブであってもよい。または、それぞれ対応する回線方向への流入を制御する２つのバルブからなるバルブセットであってもよい。
【００４１】
本発明の上記２つの態様である上記システムおよび上記方法は互いに非常に関連している。上記システムおよび上記方法では、バイオ適応性の硫黄として知られる硫黄の安定分散液を得ることが可能である。上記硫黄の安定分散液では、可燃性／爆発性の硫黄の微粉末の特性がもはや消失している。また、上記硫黄の安定分散液は液体であるので、風の問題を考慮することなくこれを上記タンク内に取り込むことが可能となることが意味される。また、上記硫黄の安定分散液を使用して、細菌増殖を生じさせる充填床を形成するための高粘度の硫黄スラリーを調製することも可能である。驚くべきことに、この硫黄の分散液またはスラリーにより、確実に微生物に対して即座に生体利用可能となり、遅滞期を著しく減少させる。さらに、硫黄酸化細菌のバイオリアクター内でのバイオマスの発生を短縮することも可能である。
【００４２】
従来技術の分析において見られたように、報告されている硫黄の分散液では、液状担体として水を使用することが含まれていた。界面活性剤を使用することにより硫黄の分散を向上させられることが認められていたが、これは培養物に対する外部物質の添加を含むものであり、このような外部物質の添加は場合によっては微生物に有害であることが証明されている（Bouffard Sylvie.C., Tshilombo, Paul and West-Sells, Paul G., Mineral Engineering, 2009, Vol 92, 100-103）。産業的な事情を鑑みれば、外部物質の添加はコ
ストを増大させるので、広く利用することが難しくなる。さらに、上記培養物をマイニング工程に供給することが必要な場合、金属カソードの溶媒抽出または電解抽出などの後段のマイニング処理が外部物質によって阻害される可能性が生じるため、外部物質の添加は困難になる。本発明者は、液体培地と硫黄酸化細菌の培養物の上清の希釈物との何れかを使用することで、こうした技術的課題を解決した。なお、上記液体培地と硫黄酸化細菌の培養物の上清の希釈物とは何れも産業処理に対する十分な適合性を有している。硫黄の分散に使用する培地で硫黄酸化細菌の培養物の上清または硫黄酸化細菌の培養物の一部を１００倍〜１０倍に希釈する。この場合、上記処理に対して如何なる外部物質も添加されない。産業レベルでの好適な構成を図３に示す。
【００４３】
上清は、静注後に細菌の増殖が発生するような液体培地に対応するものであり、細菌代謝によって産生される一連のバイオ分子を含んでいるため高度に複合的な溶液であることが知られている。硫黄酸化細菌の培養物の上清は、生物界面活性剤の特性を有する化合物を含むことが知られている。アシディチオバチルスチオオキシダンスなどの硫黄酸化細菌はリン脂質を分泌する。一般的なリン脂質（具体的にはホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、およびホスファチジルイノシトール）は、硫黄酸化細菌によって産生されて水中の硫黄の分散を向上させる作用物質として文献で言及されてきた。
【００４４】
本発明者は、硫黄のバイオ適応化を行う硫黄酸化細菌の培養物の実質的な可能性を認識しており、本発明を開発するために従来の知識の検討を行った。本発明者は、硫黄酸化細菌の上清中の生物界面活性化合物の分散特性と、この生物界面活性化合物による硫黄のコーティングを促進する機械的分散とを合わせた。これにより、硫黄の疎水性に特有の課題を解決するために、両機序の相乗効果を利用する。
【００４５】
上述のように、硫黄のバイオ適応化を実現するために必要な要素を硫黄酸化細菌の培養上清中に発見した。しかし、硫黄酸化細菌の培養上清は、細菌を含まない純上清である必要は無かった。上記培養上清を使用するか、または、上記培養上清とその中で増殖している上記硫黄酸化細菌とを含む培養物全体を使用することで硫黄のバイオ適応化の効果を得られることが本発明者によって見出された。
【００４６】
本発明者により、上記硫黄酸化細菌の培養上清の特徴的な組成物は以下の要素を含んでいることが測定された。
・１０ｇ／Ｌの硫黄を含む培地にＬｉｃａｎａｎｔａｙなどの硫黄酸化細菌を約５×１０９細胞／ｍＬの濃度で含めた場合に得られるような、細菌および微生物の増殖生成物。
・硫黄上にバイオ膜を形成する細菌に用いられるエキソ多糖類（ＥＰＳ）（例えば、５ｇ／Ｌの硫黄を含む培地で増殖させたＬｉｃａｎａｎｔａｙの培養物から分離可能な、総量が２０ｍｇ／リットルのＥＰＳ）。硫黄中で増殖させたＬｉｃａｎａｎｔａｙのＥＰＳは、主に、グルコース、ガラクトース、グルクロン酸、ガラクツロン酸、およびアラビノースから構成される。
・分泌タンパク質または硫黄／細菌の界面（例えば、ＢｉｏＳｉｇｍａ Ｓ.ＡによるＰＣＴ特許出願第ＷＯ２０１１０２４０９６号に記載のタンパク質（主に、Ｌｉｃａｎａｎｔａｓａ））を０．５ｍｇ／Ｌ〜２ｍｇ／Ｌ。
・細胞代謝の結果得られた代謝産物：特定の代謝産物を意図的に分泌させることが可能である一方、他の代謝産物は、細胞溶解により上記培養物中に存在し得る。例えば、質量分析（ＣＥＭＳ）法と組み合わされて培養物中で行われるキャピラリー電気泳動法の測定によれば、グルタミン酸、アスパラギン酸、スペルミジン、プロリン、バリン、およびフェニルアラニンは最も豊富に存在するアミノ酸である。
・細胞外脂質：Ｌｉｃａｎｔａｎｔａｙ細菌などのアシディチオバチルスチオオキシダンスの培養物中に存在する細胞外脂質の約６０％は中性脂質である一方、残りの４０％はリン脂質である。ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、およびホスファチジルイノシトールは培養物中で検出され、硫黄に対するこれらの界面活性作用の試験を行った（Beebe, James L. and Umbreit, WW, Journal of Bacteriology, 1971, Vol 108 (1), 612 -614）。
【００４７】
硫黄酸化細菌の培養物の上清中に存在する一部の化合物は界面活性特性を有しており、細胞外脂質として認識される。これら化合物は、本発明について説明するためのシステムおよび方法において確認される硫黄のバイオ適応化に関与している可能性が高い。上記方法およびシステムの利点は上清または完全培地を使用することであるが、これは、上清または完全培地の使用により上述の処理工程が促進されるためである。
【００４８】
＜実施例１＞
（硫黄のバイオ適応化）
図２に示す好適な構成にしたがって、硫黄のバイオ適応化を行う本発明のシステムを構成した。容量が５０リットルのタンク（１）は、このタンク（１）から供給が行われる２．５Ｈｐの再循環ポンプ（２）に接続される。３／４インチ（１．９１ｃｍ）の排出装置（３）は、入力部が上記再循環ポンプ（２）に接続され、出力部が上記タンク（１）に接続され、再循環閉鎖回路を構成している。上記再循環ポンプ（２）の出力部には導流手段（４）が設置されている。この構成では、上記導流手段（４）は、簡易パイプを介して直接上記タンク（１）へと流れを代替的に方向付けることが可能な三方バルブである。
【００４９】
上記構成では、上記排出装置を使用することなく上記タンクを振動状態に保持している。
【００５０】
上記システムを設置して、３通りの実験を行った。
【００５１】
（１．１．本発明の条件：バイオ適応性の硫黄）
表１に記載するように、３８．８Ｌの１×ＫＭＤ培地を１．２ＬのＬｉｃａｎａｎｔａｙ硫黄酸化細菌の培養物（表１に示すＫＭＤ培地中の３％ｖｏｌ／ｖｏｌ）と一緒にタンクに添加した。排出装置を介して上記培地の再循環を開始した。上記排出装置では、総量８００ｇの硫黄微粉末（濃度：２０ｇ／Ｌ）を投与により添加した。上記硫黄の添加後、上記タンクの内部の機械的撹拌を持続させた。再循環流の経路には上記排出装置が備えられていない。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
上記硫黄の添加から１５分経過後、状態の視覚的評価を行うために、撹拌を行ったままの状態で２００ｍＬのアリコートをビーカーに採取した。この結果を図３中のａに示す。図３中のａでは、上記硫黄が完全にデカントされていることが確認できる。デカントさせた上記硫黄粉末は、撹拌時に水中で安定分散を形成する。
【００５４】
（１．２．機械的分散を行ったコントロール）
表１に記載したような、４０ＬのＫＭＤ１×培地（濃度：２０ｇ／Ｌ）をタンクに添加した。上記ＫＭＤ１×培地の添加と同時に、排出装置を介した上記ＫＭＤ１×培地の再循環を開始した。上記排出装置では、総量８００ｇの硫黄微粉末（濃度：２０ｇ／Ｌ）を投与により添加した。上記硫黄の添加後、上記タンク内の機械的撹拌を上記排出装置を含まない路を介して持続させた。上記硫黄の添加から１５分経過後、撹拌を行ったままの状態で２００ｍＬのアリコートをビーカーに採取し、その状態の視覚的な評価を行った。この結果を図３中のｂに示す。図３中のｂでは、大きな硫黄の凝集体が形成されていなかった。少量の硫黄はデカントしていたが、高パーセンテージの硫黄は懸濁液の表面上に留まり、凝集によって形成される「泡」または「綿状の塊」の様子を呈していた。
【００５５】
（１．３．機械的分散を行っていないコントロール）
表１に示すように、２００ｍＬの１×ＫＭＤ培地および４ｇの硫黄微粉末（濃度：２０ｇ／Ｌ）を撹拌を行うことなくビーカーに直接添加した。上記硫黄の添加から１５分経過後、状態の視覚的な評価を行った。この結果を図３中のｃに示す。図３中のｃでは、上記硫黄は、その疎水性から、大きな凝集塊を形成して表面上に留まっていたことが確認される。
【００５６】
バイオ適応性の硫黄（１．１の場合）を作製する本発明の方法は、水媒体中の硫黄微粉末の分散状態を著しく向上させた。
【００５７】
＜実施例２＞
（硫黄酸化細菌を用いたバイオリアクターの基質としてのバイオ適応性の硫黄の使用）
硫黄酸化細菌の増殖のために、同等の気泡カラム式のバイオリアクターを３つ構成した。上記バイオリアクターの有効容積は１．７Ｌであり、これをＫＭＤ１×培地で充填していた。上記ＫＭＤ１×培地の要素を表１に示す。通気用ポンプを用いて、上記バイオリアクター内に３．５Ｌ／ｍｉｎの流速で空気を供給した。初期ｐＨは１．６とした。各バイ
オリアクターには１０６細胞／ｍｌのＬｉｃａｎａｎｔａｙ株ＤＳＭ１７３１８（アシディチオバチルスチオオキシダンス株；ＢｉｏＳｉｇｍａ Ｓ．Ａ．所有；チリ共和国特許
出願第２１０１−２００５号および米国特許７，７００，３４３号により保護）を植菌した。上記バイオリアクター内の温度は３０℃に維持した。
【００５８】
以下の条件で、上記バイオリアクターに１０ｇ／Ｌの硫黄微粉末を添加した。
【００５９】
（２．１．コントロール）
時点０では、硫黄粉末を基質として直接上記バイオリアクターに添加した。
【００６０】
（２．２．高圧蒸気殺菌法による滅菌を行ったバイオ適応性の硫黄）
確認される効果が本発明の方法により実現されるバイオ適応性の硫黄の分散に起因するものであり、バイオ適応性の硫黄の調製に用いられる培地によって生じる可能性のある接種材料の増大に起因するものではないことを確実にするために、本発明の方法に従って硫黄の調製を行い、このように調製した硫黄に滅菌処理を施した。時点０では、高圧蒸気殺菌法により滅菌した上記バイオ適応性の硫黄を基質として第２のバイオリアクターに添加した。
【００６１】
（２．３．超音波処理により滅菌したバイオ適応性の硫黄）
確認される効果が本発明の方法により得られるバイオ適応性の硫黄の分散に起因するものであり、バイオ適応性の硫黄の調製に用いられる培地によって生じる可能性のある接種材料の増大に起因するものではないことを確実にするために、第２のコントロールとして、本発明の方法に従って硫黄の調製を行い、このように調製した硫黄に滅菌処理を施した。時点０では、超音波処理により滅菌した上記バイオ適応性の硫黄を基質として第３のバイオリアクターに添加した。
【００６２】
各バイオリアクターのバイオマス濃度および培地ｐＨの評価を行った。Ｌｉｃａｎａｎｔａｙなどの硫黄酸化細菌は、硫黄を代謝して硫酸およびバイオマスを産生した。したがって、硫酸の産生の増大は、上記硫黄酸化細菌による硫黄の代謝の増大を示している。上記硫酸の濃度が上昇するにつれて上記培地のｐＨは低下するため、上記培地のｐＨを測定することにより上記硫酸の濃度を簡単に予測することができる。また、各バイオリアクターの目的はバイオマス産生量を増大させることであり、バイオマス濃度としてバイオマス産生量の経時的な評価を行った。
【００６３】
この結果を図４に示す。図４Ａは、上記３つのバイオリアクター内のｐＨの変遷を示す。バイオリアクター２．２および２．３は、反応から５０時間〜２００時間経過後の期間においてより急速なｐＨの低下を示した。上記３つのバイオリアクター全てにおいて、ｐＨが同一の値に到達した。
【００６４】
図４Ｂはバイオマス濃度を示す。バイオ適応性の硫黄を含むバイオリアクター内においてはバイオマスの急激な増大を確認することができる。２４時間経過の時点では、上記コントロールと比較して大規模な差異が生じていた。なお、上記コントロールは約８０時間経過の時点まで１０６の範囲内に収まっていた。８０時間経過の時点では、本発明のバイオ適応性の硫黄を供給した上記バイオリアクター内のバイオマスは、その濃度が１０８細胞／ｍＬ〜１０９細胞／ｍＬであった。驚くべきことに、バイオ適応性の硫黄を用いた場合、上記培養物の遅滞期の存続期間は２４時間未満となった。一方、非バイオ適応性の硫黄を用いた上記コントロールでは、上記培養物の遅滞期は７５時間続いた。
【００６５】
＜実施例３＞
（硫酸発生用カラム内の基質としてのバイオ適応性の硫黄の使用）
異なる２つの硫黄濃度（２．３５ Ｇ＿Ｓ／Ｋｇ＿Ｑｕａｒｔｚおよび４．６５ Ｇ＿Ｓ／Ｋｇ＿Ｑｕａｒｔｚ）を用いて、石英上に硫黄を凝集させた４つのカラムを構成した。バイオ適応性の硫黄のスラリーを用いて２つのカラム（各濃度につき１カラム）を凝集させる一方で、非バイオ適応性の硫黄の微粉体を使用して残りの２つのカラムを凝集させた。これにより、各濃度について、硫黄の微紛体を用いたコントロール用のカラムと、バイオ適応性の硫黄を用いたカラムとの２つの典型的なカラムを用意した。石英上で凝集させた上記硫黄の各々に対して、同一の接種材料のアリコート（０．５ Ｌ＿Ｉｎｏｃｕｌｕ
ｍ／Ｋｇ＿Ｓ）を与え、時点０における各バイオリアクター内の硫黄／細菌の比率を一定の値にした。上記接種材料はＬｉｃａｎａｎｔａｙ株ＤＳＭ１７３１８（アシディチオバチルスチオオキシダンス株；ＢｉｏＳｉｇｍａ Ｓ．Ａ．所有；チリ共和国特許出願第Ｃ
Ｌ２１０１−２００５号および米国特許第７，７００，３４３号により保護）とした。上記接種材料の細胞内濃度は、光学カウント法により、５  １０９／ｍＬであると予測された。
【００６６】
本発明のバイオ適応性の硫黄は、実験室規模の手動凝集化を介して石英などの固相床上で簡易に均質化される。または、産業規模の凝集ドラム内での均質化によって石英などの固相床上で簡易に均質化される。
【００６７】
ｐＨ１．６のＫＭＤ１×溶液を３０℃の恒温室内で浸透させた。この結果、Ｌｉｃａｎａｎｔａｙなどの硫黄酸化細菌の増殖にとって好適な条件が得られた。上記カラムの充填層の高さは約１０ｃｍであり、各カラムに使用される石英の量は５００ｇであった。上記カラムの曝気処理は大気気体の拡散により行い、強制的に曝気を生じさせることはしなかった。各カラムに６ｍＬ／ｈｒの流速で溶液を送達するように調節された蠕動ポンプを用いて上記溶液の浸透を制御した。各カラムより滞留した廃液を毎日回収して、その硫酸濃度を測定した。供給（流入）溶液の硫酸濃度の開始値を把握していたため、上記廃液の硫酸濃度との差異によって、本バイオマスが産生する硫黄代謝作用の酸生成物が示される。
【００６８】
その後、上記カラムにおける硫黄からの硫酸の産生の評価を行って、各カラムの評価を行った。Ｌｉｎｃａｎａｎｔａｙなどの硫黄酸化細菌は硫黄を代謝して硫酸を産生することを考慮すれば、硫酸の産生の増大は、硫黄酸化細菌による硫黄代謝が増大したことを意味する。１質量単位の硫黄の代謝により３質量単位の硫酸が産生されることが知られている。上記硫黄から硫酸への変換は、溶液均衡にしたがい、硫酸に変換された硫黄のパーセンテージとして、変換効率の観点から示される。
【００６９】
この結果を図５に示す。図５Ａは、硫酸濃度のより低い（２．３５Ｇ＿Ｓ／Ｋｇ＿Ｑｕａｒｔｚ）カラムについての硫黄から硫酸への変換率（パーセンテージ）を示している。図５Ｂは、硫酸濃度のより高い（４．６５Ｇ＿Ｓ／Ｋｇ＿Ｑｕａｒｔｚ）カラムについて同様の結果を示している。硫酸を産生する上記２つのカラムに関して、バイオ適応性の硫黄（黒菱型）は、（１）流出物中における硫酸の早期発生、および（２）硫酸の産生速度の上昇（上記グラフのスロープより予測）を可能にし、且つ（３）非バイオ適応性の硫黄の微粉末（黒三角）に対するより良好な硫黄変換を可能にしたことを確認できるであろう。上記硫黄変換率が１００％に到達しない主な理由としては、流出物中の硫黄の阻害によって損失が生じることが挙げられる。また、非バイオ適応性の硫黄の場合では、マクロ凝集硫黄が形成されることが挙げられる。
【００７０】
＜実施例４＞
（細菌増殖を阻害する毒剤の存在下における硫黄酸化細菌のフラスコ培養用の基質としてのバイオ適応性の硫黄の使用）
硫黄酸化細菌を３０℃のＫＭＤ１×培地に含めたフラスコを８つ用意した。硫酸アルミニウムを添加して、アルミニウム濃度が、０ｇ／Ｌ（黒丸）、１５ｇ／Ｌ（黒三角）、１
８ｇ／Ｌ（白菱型）、および２０ｇ／Ｌ（白四角）の４つとなるようにした。高濃度のアルミニウムは、バイオマイニング処理における一般的な不純物質であって、硫黄酸化細菌の増殖を阻害してしまう。本発明者は、バイオ適応性の硫黄を基質として使用することによる動力学的な利点によって上記阻害の効果に対抗できるか否かについての評価を行おうとした。バイオ適応性の硫黄を用いた４つのフラスコを用意し、上記４つのアルミニウム濃度のそれぞれに対応させた。非バイオ適応性の硫黄を用いて、さらに４つのフラスコを用意して、各アルミニウム濃度に対応させた。接種材料はＬｉｃａｎａｎｔａｙ株ＤＳＭ１７３１８（アシディチオバチルスチオオキシダンス株；ＢｉｏＳｉｇｍａ Ｓ．Ａ．所
有；チリ共和国特許出願第ＣＬ２１０１−２００５号および米国特許第７，７００，３４３号により保護）とした。光学カウント法により、上記接種材料の細胞内濃度は５  １０９細胞／ｍＬであると予測した。
【００７１】
図６は、バイオマスの光学カウントを行った場合に得られた増殖曲線を示す。図６Ａは、異なる濃度の毒剤について、非バイオ適応性の硫黄の微粉体を用いたコントロールについての結果示す。溶媒中のアルミニウム濃度が上昇するにつれ、バイオマスの増殖が明らかに阻害された。最も高濃度のアルミニウム濃度（２０ｇ／Ｌ（白四角））の場合ではバイオマスは実質的に如何なる増大も示さず、１７０時間経過の時点において、バイオマス濃度は上記コントロール（黒丸）を大幅に下回っていた。図６Ｂは、本発明の方法およびシステムにより得られた、バイオ適応性の硫黄を基質として用いた同一の反応を示す。硫酸アルミニウムによる阻害効果は、非バイオ適応性の硫黄を基質として使用した場合の阻害と比較して低下していた。バイオ適応性の硫黄を用いた最も高濃度のアルミニウム濃度（２０ｇ／Ｌ（白四角））ではバイオマスの増大を示し、１７０時間経過の時点でのバイオマス濃度は、アルミニウムを用いなかった上記コントロール（黒丸）よりも僅かに低くなった。
【００７２】
上述の結果より、本発明者は、バイオリアクターまたは充填床上の増殖カラム／細胞に硫黄の微粉体を使用することに代えて、本発明の方法により得られたバイオ適応性の硫黄を使用することによる利点を確認することができた。上記バイオ適応性の硫黄は、均質の水分散液として、または固相床上の均質化の容易なスラリーとして容易に使用することが可能であった。これにより、硫黄は硫黄酸化細菌に対してより急速にバイオ利用可能となった。この結果、バイオリアクターおよびカラム／細胞内のバイオマスの増殖が促進された。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】本発明の好適な構成のプロセス図を示す。
【図２】本発明の第２の好適な構成のプロセス図を示す。
【図３】産業プロセスにおける硫黄のバイオ適応化を行う好適な構成を示す。
【図４】３つの条件下における１×ＫＭＤ培地内で分取した硫黄の分散液を示す。
【図５Ａ】１０６細胞／ｍｌのＬｉｃａｎａｎｔａｙ株ＤＳＭ１７３１８を植菌した、硫黄酸化細菌の３つのバイオリアクター内のｐＨの変遷を示す。
【図５Ｂ】１０６細胞／ｍｌのＬｉｃａｎａｎｔａｙ株ＤＳＭ１７３１８を植菌した、硫黄酸化細菌の３つのバイオリアクター内のバイオマスの変遷を示す。
【図６Ａ】硫黄濃度のより低い（２．３５Ｇ＿Ｓ／ｋｇ＿Ｑｕａｒｔｚ）カラムについての、硫黄から硫酸への変換パーセンテージを示す。
【図６Ｂ】硫黄濃度のより高い（４．６５Ｇ＿Ｓ／ｋｇ＿Ｑｕａｒｔｚ）カラムについての、硫黄から硫酸への変換パーセンテージを示す。
【図７Ａ】異なる硫酸アルミニウム濃度の存在下における、非バイオ適応性の硫黄を含むフラスコ内の細菌の増殖について示す。
【図７Ｂ】異なる硫酸アルミニウム濃度の存在下における、バイオ適応性の硫黄を含むフラスコ内の細菌の増殖について示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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