(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
未清澄化チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ブロス中の標的抗体を該未清澄化チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ブロスを含む水性液体から単離する方法であって、
（ａ）容器内で前記水性液体を、親水性の熱応答性ポリマー並びにＮａＣｌ、Ｎａ2ＰＯ4、ＫＰＯ4、ＮａＳＯ4、クエン酸カリウム、(ＮＨ4)2ＳＯ4、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム及びこれらの組合せからなる群から選択される１００〜３００ｍＭの濃度の１種以上の添加塩と合わせる段階と、
（ｂ）（ａ）で得られた液体混合物を、前記熱応答性ポリマーの曇り点より高い条件下で穏やかに混合して、前記標的抗体が、熱応答性ポリマーが濃縮されていない相中に分配され、非標的化合物及び粒子は相界面又は熱応答性ポリマーリッチ相に様々に異なる程度に分配された１ポリマー二相系を形成せしめる段階と、
（ｃ）標的抗体を単離する段階と
を含んでいて、前記熱応答性ポリマーがエチレンオキシドプロピレンオキシド（ＥＯＰＯ）コポリマーである、方法。
【請求項２】
（ｉ）標的含有相を新しい相補的な相と混合することによって別の分配に付す段階と、
（ｉｉ）標的抗体が濃縮された相から標的抗体を回収する段階と
をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
（ｉｉｉ）ポリマーリッチ相からのポリマーを分配単位操作に再循環させる段階
をさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
標的含有相を、クロマトグラフィー段階に直接使用する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記水性液体中の標的抗体の濃度が１０ｇ／Ｌを超える、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体から標的化合物を濃縮する方法であって、２種類の水性相間での分配の差によって実施される１以上の単離段階を含む方法に関する。これは抗体又は抗体由来の標的に特に適しており、ウイルスワクチン処理のような他の用途にも適している。
【背景技術】
【０００２】
最新のバイオ医薬品の開発及びヒトゲノムのマッピングを始めとするバイオテクノロジーの変革は、クロマトグラフィー及び電気泳動のような分離方法の発達によって可能となってきた。かかる方法はスモールスケールでもラージスケールでも使用でき、生物学的物質を含む各種の物質に対して有用な融通のきく方法として知られている。しかし、これらは技術及び設備の点で要求が厳しい。加えて、分取電気泳動のような若干の方法のスケーリングでは、加熱及び冷却要件の非線形スケーリングのために一層複雑な設備が必要となる。このような複雑化はまた、かかる方法のモデル化及び（小容積のマイクロタイターを用いる）高スループットスクリーニング方法によるその最適化を妨げる。
【０００３】
代替的な方法は、水性ポリマー相系中の相間における分配である。これは１９５０年代から研究されてきたが、その商業的応用は良好な処理能力（標的溶解度）を与える経済的に実用可能な（安価な）相系がないことによって厳しく制限されてきた。凝集、結晶化及びサイズ排除のような分離方法と共に、分配は古典的な分離技法と見なされている。それは、２相間において標的及び他の物質を差別的に分配することに関係する。「分配」という用語は、（ａ）古典的な捕捉クロマトグラフィーにおけるような液体−固体分配、（ｂ）２以上の液相間（それぞれ二相系又は多相系）における分配、（ｃ）移動液相と固相担体の表面に固定化された別の液相との間における分配、及び（ｄ）液相と２相間の相界面との間における粒子の分配を意味し得る。本特許出願の目的のためには、分配はｂ、ｃ又はｄのような状況、即ち液相間での分配をいう。この定義では、標的処理能力は固相表面積でなくむしろ液相容量の関数である。その結果、処理能力は非常に大きくなり得る（下記参照）。分配は１相中の濃度及び別の相中の濃度に関係する係数（Ｋ）として表されるのが通例であり、溶質に関しては、Ｋは一般にブレンステッド式に従う。したがって、Ｋは静電相互作用及び／又は疎水性相互作用のような各種の相互作用に応じて指数関数的に変化すると予想され、また溶質サイズ（即ち、液相との相互作用面積）に敏感であると予想される。粒子が界面張力によって液−液相界面に保持され得る界面分配の場合には、Ｋは界面張力及び相組成因子に応じて指数関数的に変化すると予想される。
【０００４】
古典的な液−液二相系は、通常は相間における顕著な極性差並びに顕著な界面張力を有する有機及び水性二相系である。かかる系は、タンパク質又は細胞のような生物学的材料に対してあまり有用でない。これは、顕著に非極性溶液及び顕著な界面張力を有する相系の混合に関係する剪断損傷によってかかる生物学的材料が変性される傾向があるからである。生物学的材料に対して一層有用なのは、低張力の水性ポリマー二相系である。後者は、標的溶解度の向上、液相極性の低下、泡立ちの低下、殺菌剤としての作用などのために添加される若干の有機溶媒（例えば、エタノール）その他の有機添加剤を含み得ることが広く認められている。
【０００５】
ポリマー二相系は、特定の親水性かつ通例は中性ポリマーを水溶液中で混合することで形成できる。これらのポリマーには、デキストラン（ポリグルコース）及びポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリスクロース（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ（商標））及びＰＥＧ、又は直鎖ポリアクリルアミド及びＰＥＧがある。各ポリマーの典型的な濃度は５〜１０％ｗ／ｗである。かかる濃度では、エントロピーその他の力が二相の形成を推進する傾向があり、両相は通例９０％（ｗ／ｗ）を超える水を含むが、極性、水素結合特性、凝固点などについては僅かな差しか示さない。これらの相は、通例は一方のポリマーで富化されていて低い界面張力を有する。相密度の差は、重力又は遠心分離による相の分離を推進する。バイオテクノロジー分野では、ＰＥＧ及びデキストラン型の二相系の利点の１つは、標的タンパク質をＰＥＧリッチで低密度の上部相に優先的に分配し得る一方、細胞破片や若干の夾雑物を界面または相補的な下部相に分配し得る（又は沈降させ得る）ことである。
【０００６】
バイオプロセスの液流に２種のポリマーを添加し、次いでこれらを除去するという問題とは別に、デキストラン−ＰＥＧ及び類似のポリマー二相系の大きな欠点はポリマーのコストである。これは特に、バイオプロセス相系中で使用するためにはそれ自体を精製しなければならない天然のバイオプロダクトであるデキストランについて言える。かかるコストを低減させようとして、科学者達は２つの道を検討してきた。第１の道は、デキストランをデンプンその他の安価なポリマーで置き換えることである。しかし、かかるポリマーは純度が低く、ＭＷの制御が容易でなく、一層粘稠な相を形成し、しかも独自の問題を引き起こす場合が多い（Ｊｏｓｅｆｉｎｅ Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ｄａｎａ Ｃ．Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｐｈｉｌｉｐ Ｍ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．９０，（２００５）４４２−４５１）。別のアプローチは、比較的高い濃度（１０％ｗ／ｗ）のＰＥＧ及び硫酸カリウムのような塩（３％ｗ／ｗ）を合わせることで形成される二相系を用いて仕事することであった。かかる系中におけるタンパク質分配に関しては、Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ａｓｅｎｊｏ，１９９６及びＡｚｅｖｅｄｏ ｅｔ ａｌ．，２００７（以下に一層詳しく論議される）を参照されたい。他方、プラスミド分配に関する最新の総説については、Ｆ．Ｒａｈｉｍｐｏｕｒ，Ｆ．Ｆｅｙｚｉ，Ｓ．Ｍａｇｈｓｏｕｄｉ，Ｒ．Ｈａｔｔｉ−Ｋａｕｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９５，６２７−６３７，２００６を参照されたい。残念ながら、ＰＥＧ濃度および塩濃度の増加は、プロセスのコストにマイナスの影響を与える問題を生み出す。これらの問題には、粘稠な相、塩試薬のコスト、塩処理及び設備腐食の問題、並びに処理能力に関係する標的溶解度の問題がある。例えば、これらの系における抗体処理能力は多くの場合に１ｇ／Ｌであり、これは１０ｇ／Ｌの発現抗体を含む（清澄化）発酵ブロスを分配に先立って１０倍に希釈しなければならないことを意味している。それはまた、相系を構築するために１リットル当たり５ドルかかるとすれば、商品のコストに１グラム当たり少なくとも５ドルが加算されることも意味している。このような希釈並びにそれに関連するプロセス容量、プロセス時間及びコストの増加は大きな妨げである。
【０００７】
ある種の親水性ポリマーは逆熱溶解度を示す。その結果、温度がポリマーの低臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）に関係する一定の曇り温度（Ｔｃ）を超えて上昇すると、それは自己会合して特有のポリマーリッチ相を形成し始める。一般の文献中には、エチレンオキシド（ＥＯ）及びプロピレンオキシド（ＰＯ）モノマー基の混合物を用いて形成されるコポリマー又はブロックコポリマー（いわゆるＥＯＰＯポリマー）、ＥＯ、ＰＯ又は類似の基で修飾された多糖類（例えば、エチルヒドロキシエチルセルロース又はＥＨＥＣ）、及びＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡＭ）を用いて形成されるポリマーを始めとして、かかるポリマーのいくつかの例が示されている。希薄緩衝液中でのＰＥＧ（重合ＥＯ）のＴｃは約１００℃であり、したがって大抵のバイオテクノロジー用途には適さないのに対し、ＥＯＰＯ及びＮＩＰＡＡＭポリマーのＴｃは、溶液の塩組成及び他の因子に応じて２０〜４０℃というバイオテクノロジー的に一層有用な範囲内にあることが多い。熱応答性ポリマーに加えて、ある種の親水性ポリマーはｐＨ依存性の自己会合を示す（例えば、国際公開第２００４／０８２８０１号）。国際公開第２００４／０２０６２９号（Ｔｊｅｒｎｅｌｄ）は、ＥＯＰＯポリマーの逆熱溶解度を利用して、２ポリマー相系中で既に分配されたプラスミドの分離をさらに容易にすることに関する。室温では、ＥＯＰＯ及びデキストランポリマーを用いて形成される２ポリマー二相系は、ＰＥＧ−デキストラン系と同様にして生じる。ＥＯＰＯ−デキストランポリマーの水性二相系から、低密度の上部ＥＯＰＯリッチ相が単離される。次いで、ＥＯＰＯリッチ相の温度を約３７℃に（即ち、Ｔｃより高くまで）上昇させると、上部相は水リッチ相及び自己会合ＥＯＰＯポリマーリッチ相へのさらなる相分離を受ける。有利には、水リッチ相は所望の標的を含むはずである。一般に、この種のＥＯＰＯ−デキストラン系は、相ポリマー成分の再循環及び効率的な二段分配分離プロセスの設計に関して利点を提供する。しかし、欠点はやはり、生物学的に導かれる高価なデキストランポリマーを用いる相の構築に関連するコストである。かかる系中のデキストランをデンプンポリマーのような一層安価なポリマーで置き換えることもできるが（Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ，２００５）、プロセス液流に２種のポリマーを添加し、次いでこれらを除去しなければならないことに関連する問題はなおも存在している。
【０００８】
上記の文献例では、一般の文献と同じく、インタクト細胞又は溶解細胞及び細胞破片を含む相発酵ブロスに遠心分離を施すことで形成された清澄化供給液から標的を精製するために相系が使用されている。
【０００９】
バイオテクノロジー分野では、２種のポリマーを用いて形成され、又は顕著な添加塩の存在下で１種のポリマーを用いて形成される水性ポリマー二相系が広く関心を集めている。これは、一層大きな容量にスケールアップする場合にも効率の損失又はコストの劇的な変化を生じることなく、かかるポリマー二相系がスモールスケールの分離並びにラージスケールの分離で容易に利用されるからである。また、電荷に基づく分離、疎水性に基づく分離、親和性に基づく分離、又はサイズに基づく分離のような任意の標準的分離アプローチをポリマー二相系中で実施することもできる。一般に、多くの不要成分（例えば、細胞破片、内毒素、核酸、ウイルス）は、ＰＥＧ−デキストラン又はＰＥＧ−塩二相系中の下部相（それぞれデキストランリッチ相又は塩リッチ相）にはっきりと分配される傾向がある。したがって、上部相（ＰＥＧリッチ相）への良好な標的分配をもたらす系を見出すことができれば、効果的な一次分離および標的濃度を得ることができる。しかし、処理能力（即ち、溶解度）、相成分のコスト、相成分の除去、及び他の（下流）単位操作や設備に対する相成分の影響の点で４つの大きなハードルがなおも存在している。特に後者は、既存の標準プロセス中にある種の相系を上流単位操作として容易に組み込むことを妨げる。
【００１０】
標準的なクロマトグラフィー及び／又は濾過処理におけるインターフェーシングに関する欠点を解消し、また理論的分配段階が単位操作当たりただ１つであるという限定を解消しようという努力に際し、１相を該相を優先的に濡らすことができるクロマトグラフィー用又は他の固体担体上に固定化することで、ＰＥＧ−デキストラン又はＰＥＧ−塩のような液−液分配二相系をクロマトグラフィー用途に適合させることが行われた。次いで、相補的な相をカラム中にポンプで送り込むことで、移動相と固定相との間における平衡化の機会を繰り返し提供する。これは、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ社（ダルムシュタット）のＷ．Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．によって１９８０年代に商業的に開発された（米国特許第４，７５６，８３４号）。
【００１１】
上記のアプローチ及び他の相形成ポリマーの様々な組合せが可能である。米国特許第５，０９３，２５４（Ｇｉｕｌｉａｎｏ ｅｔ ａｌ）は、上部相としてポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及び下部相としてマルトデキストリンを使用し、タンパク質分配のための低コスト系を提供する水性二相タンパク質分配系に関する。この系はまた、クロロトリアジン色素の特定の誘導体と共に使用することもできる。かかる誘導体はＰＶＰに対して非共有結合的に結合し、分離すべきタンパク質に対するリガンドとして役立つ。先行技術のＰＥＧ−ヒドロキシプロピルデンプン系において共有結合を形成するために必要なクロマトグラフィー抽出や溶媒抽出を行う必要なしに、かかる色素をポリマー相に対して容易に結合できるので、この系の利点はそのコスト効率にあると述べられている。
【００１２】
最新のバイオ医薬品の多くは、モノクローナル抗体（通例はＩｇＧ型）又は関連する抗体フラグメント（Ｆａｂ）又は抗体の誘導体に基づいている。抗体精製のために相系を使用することは、デキストラン及びＰＥＧ並びに関連する２ポリマーの二相系中における血漿タンパク質分配を含めるならば、３０年以上にわたって研究されてきた。さらにコスト効率のよいＰＥＧ−塩系及び他の系を用いる分配による抗体のラージスケール処理の実行可能性に向けられた研究は、１０年以上にわたって文献中に見られてきた。
【００１３】
Ｂ．Ａ．Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｓ．Ｎｉｅｌｓｅｎ及びＪ．Ａ．Ａｓｅｎｊｏ（Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ６，（１９９６）３０６−３１３）は、様々な系を検討し、要因配置実験を用いて抗体分配のために最適と考えられる若干の系（例えば、７％ｗ／ｗ ＰＥＧ、１４％リン酸Ｎａ及び１２％ ＮａＣｌ）を見出した。かかる系は、１００の抗体分配Ｋ値（下部相に対する上部相中のタンパク質濃度の比）を与えた。彼らはプロセス供給液流夾雑物を表すために血清アルブミン、トランスフェリン及び若干の他のタンパク質を使用し、抗体に関して示されたものとは差別的な分配を実証した。加えて、彼らはハイブリドーマ細胞培養物からのモノクローナル抗体試料のスモールスケール処理を試みた。Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００５及びＡｚｅｖｅｄｏ ｅｔ ａｌ．，２００７と同じく、彼らは遠心分離で清澄化した（無細胞の）試料溶液を用いて研究した。ハイブリドーマによって産生された抗体試料に関する実験において、彼らは純粋なタンパク質試料について得られたＫ値が試料溶液の複雑さによって損なわれるように見えることに注目した。しかし、彼らは１相中への抗体の良好な分配を達成することができた。彼らは、一層低いＮａＣｌを含む系を用いて標的分子を相補的な相中に分配する場合を含め、複数回の抽出を用いて純度を高め得ることを示している。
【００１４】
Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．もまた、ＰＥＧ−塩系によるタンパク質分配一般、特に抗体分配にとって何が主な障害になっているかに注目した。それは、（高い塩濃度のために）タンパク質溶解度が低い（大抵は１ｇ／Ｌ）ことである。抗体及び他の組換えタンパク質が１０ｇ／Ｌ以上のレベルで発現され得ることを考えると、分離プロセスの初期にかかる系を使用するには、プロセス容量を１０倍に増加させることが必要となり、これは処理スケール、コスト及び時間が数倍に増加することを伴う。これらに加えて、塩の除去及びポンプや他の金属設備の腐食の可能性を含め、塩成分に関係するコストも存在する。１０年後、Ａｚｅｖｅｄｏ ｅｔ ａｌ．（Ａｎａ Ｍ．Ａｚｅｖｅｄｏ，Ｐａｕｌａ Ａ．Ｊ．Ｒｏｓａ，Ｉ．Ｆｉｌｉｐａ Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｍ．Ｒａｑｕｅｌ Ａｉｒｅｓ−Ｂａｒｒｏｓ，Ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３２（２００７）２０９−２１７）は、抗体の工業スケールプロセスのために適したＰＥＧ−塩系を発見する努力を拡大した。彼らの最適化方法は、Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．のものに類似した系（即ち、１２％ＰＥＧ６０００、１０％リン酸Ｎａ（ｐＨ６）、１５％ＮａＣｌ）を見出した。これは、Ｍａｂを部分的に精製するために使用した場合、濃縮（及び清澄化）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養上澄み液からは８８％の全収率を与え、ハイブリドーマ培養上澄み液からは９０％の全収率を与えた。しかし、その標的タンパク質濃度はやはり約１ｇ／Ｌであった。
【００１５】
さらに最近になって、Ａｉｒｅｓ−Ｂａｒｒｏｓ ｅｔ ａｌ（Ｉ．Ｆｉｌｉｐａ Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ａｎａ Ｍ．Ａｚｅｖｅｄｏ，Ｐａｕｌａ Ａ．Ｊ．Ｒｏｓａ，Ｍ．Ｒａｑｕｅｌ Ａｉｒｅｓ−Ｂａｒｒｏｓ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｂｙ ｔｈｅｒｍｏｓｅｐａｒａｔｉｎｇ ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，１１９５（２００８）９４−１００）は、ＭＷ ２０００〜５１００のＵＣＯＮ（登録商標）ＥＯＰＯ５０／５０コポリマー（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を含む系中における抗体分配に関し、２ポリマー熱分離性相系を検討した。彼らは、８％ｗ／ｗ ＵＣＯＮ及び５％デキストランＴ５００を含む系中の相間における清澄化ＣＨＯ培養上澄み液（０．１ｇ／ＬのＡｂ）からのＩｇＧの分配を研究した。上部（ＥＯＰＯポリマーリッチ）相中への抗体分配を促進するため、彼らは２０％ｗ／ｗトリエチレングリコール−ジグルタル酸（ＴＥＧ−ＣＯＯＨ）及び１０ｍＭリン酸Ｎａ（ｐＨ８）を添加した。（上記の最終ポリマー濃度及びＴＥＧ−ＣＯＯＨ濃度を達成するため）清澄化上澄み液を５０％で系に添加することができた。若干の実験では、標的タンパク質を約１ｇ／Ｌに増加させるためにポリクローナルＩｇＧ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ（商標），Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ ＡＧ）を添加した。二段階（２ポリマー二相分配、次いで上部相のポリマーリッチ相及び水リッチ相への熱分離、上記参照）の分配プロセスにより、８５％（これは商業的に魅力あるプロセスにとっては比較的低い）の抗体が８８％の純度（これはＧａｍｍａｎｏｒｍの添加によって支援されたのかもしれない）で得られた。Ｔｃは約５０℃に生じたが、これは第２段階の抽出において相系の加熱を必要とした。これらの系は低い塩濃度を提供するものの、相当量のＴＥＧ−ＣＯＯＨを必要とする。これは、それが存在しないと、（ＵＣＯＮ−デキストラン相系の）上部ＵＣＯＮリッチ相中におけるＩｇＧの回収率は５０％より低い（即ち、Ｋ＜１）からであった。
【００１６】
一般に、二段階プロセスでは、熱分離性相はデキストラン（上記のＡｉｒｅｓ−Ｂａｒｒｏｓ ｅｔ ａｌを参照されたい）又は類似の多糖類（上記のＰｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）と共に使用するのが通常であった。したがって、第１の分配段階では標的及び夾雑タンパク質に対する選択性が生じ、次いで（通例はＥＯＰＯポリマーリッチ相の）温度誘起相分離の使用により、標的及びポリマーが自己会合ポリマーリッチ高密度相の上方に浮遊する標的含有水性相中に単離される。独自の系（即ち、１ポリマーであるが塩濃度の低い系）における熱分離性相の使用に関しては、一般的な知識は、それが選択性をほとんど示さないので有用でないことが多く、他のポリマーを含む系中で使用すべきであるというものであった。名高い国際研究グループは、「したがって、水−ＥＯＰＯ系は、疎水性分子（例えば、変性タンパク質又はトリプトファンリッチペプチド）の分配或いは選択的水除去による溶液濃縮のためにしか適さない（同様な議論はミセル二相系についても当てはまる）」と結論するに至った（Ｈａｎｓ−Ｏｌｏｆ Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｇｕｎｎａｒ Ｋａｒｌｓｔｒｏｍ，Ｆｏｌｋｅ Ｔｊｅｒｎｅｌｄ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ａ．Ｈａｙｎｅｓ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，７１１（１９９８）３−１７）。かかる用途に関しては、別のＥＯＰＯポリマー（Ｂｒｅｏｘ ５０Ａ １０００、５０％エチレンオキシド及び５０％プロピレンオキシドからなるランダムコポリマー、数平均分子質量３９００、Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（サウサンプトン、英国）の相分離に対する各種の塩及び他の添加剤の効果が、Ｃｕｎｈａ ｅｔ ａｌ．（Ｍａｒｉａ Ｔｅｒｅｓａ Ｃｕｎｈａ，Ｆｏｌｋｅ Ｔｊｅｒｎｅｌｄ，Ｊｏａｑｕｉｍ Ｍ．Ｓ．Ｃａｂｒａｌ，Ｍａｒｉａ Ｒａｑｕｅｌ Ａｉｒｅｓ−Ｂａｒｒｏｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，７１１（１９９８）５３−６０）によって研究された。
【００１７】
Ｔｅｉｘｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．（Ｍａｒｔｉｎｈａ Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｙｏｕ−Ｔｉｎｇ Ｗｕ，Ａｒｍａｎｄｏ Ｖｅｎａｎｃｉｏ，Ｊｏｓｅ Ｔｅｉｘｅｉｒａ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｊｏｕｒｎａｌ １５（２００３）１３１−１３８）は、ＵＣＯＮ ５０−ＨＢとポリビニルアルコール又はヒドロキシプロピルデンプンとからなる２ポリマー系或いはＵＣＯＮ ５０−ＨＢと比較的高い濃度の硫酸アンモニウムとからなる系中におけるエンド−ポリガラクツロナーゼ（ｅｎｄｏ−ＰＧ）の分配を検討した。後者の系は二相の形成を行うために加熱を必要としたが、試薬コストの点及び試薬を（やはり清澄化された）培養上澄み液に予め添加して最終系の７０％が清澄化培養ブロスからなるようにできる点で最も有望であった。ｅｎｄｏ−ＰＧが１０倍に濃縮されかつ９５％の酵素活性が回収される三段階プロセスにおいて、ＵＣＯＮポリマーを再循環させることができた。この研究に関しては、２つの観察結果が注目に値する。第一に、二相の形成を行うために必要な最小５％のアンモニウム塩濃度（５０ｇ／Ｌ又は約０．３８Ｍ）はなおも相当に高く、しかも１０％のＵＣＯＮを必要とした。温度を４０℃に上昇させることは、これらの値を３％（０．２３Ｍ）の塩及び５％のポリマーに減少させただけであった。このように、系はなおも相当量の添加塩を含んでいた。第二に、３０℃より高い温度では、Ｔｅｉｘｅｉｒａ ｅｔ ａｌは系中で相の逆転を認めた。即ち、室温で上部のポリマープア低密度相が下部の相になったのである。かかる効果は、興味深いものの、特に沈降する傾向のある細胞及び細胞破片を含む系中におけるラージスケール処理に関しては問題を生じることがある。上述した熱分離性相系に加えて、疎水的に修飾されたＥＯＰＯ及び類似のポリマーを含む広範囲の熱分離ミセル系が存在している（これの議論に関しては、上記のＨ．−Ｏ．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９８を参照されたい）。上記の２ポリマー熱分離性水性相系に関する多くの特許は、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ＣｏｍｐａｎｙグループのＧ．Ｅ．Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社によって現在保有されている。
【００１８】
ＰＥＧ−塩二相系が細胞及び細胞破片を界面に分配させ、したがって部分清澄化を行うために相分配を使用できることは、かなり長い期間にわたって知られていた。Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．は、直接にバイオリアクター内で７．５％ｗ／ｗ ＰＥＧ１５００−１４％リン酸カリウム二相系を形成し、それを用いてＥ．ｃｏｌｉ中の組換えタンパク質を精製し（Ｋｒｉｓｔｉｎａ Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂｊｏｒｎ Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ａｎｄｒｅｓ Ｖｅｉｄｅ，Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｈｕｍａｎ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−Ｉ ａｎｄ II ａｓ ａ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｃｕｌｔｕｒｅ ｂｒｏｔｈ ｂｙ ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，３（１９９２−１９９３）２４１−２５０）、約９０％の細胞が標的含有相中にないことを認めた。しかし、かかるプロセスでは完全な相分離を行うためになおバッチ遠心分離が使用され、ラージスケール用途のためには連続遠心分離モードでの実施が提唱された。かかるポリマー−高塩系は、低い塩濃度で形成されるポリマー−ポリマー系よりずっと高い界面張力を有しており、比較的高い界面張力のためにある程度の清澄化を達成するように機能することが期待できる。しかしこれらは、高い塩濃度が要求されるため、恐らくは処理能力（標的溶解度）の点でなお制限を受けるであろう。Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．は、系に添加されるバイオマスが若干の分配結果に影響を及ぼしたことに注目した。組換えタンパク質（特に抗体）を処理するための最適化系の発見に関する研究の多くは清澄化供給液を用いて行われてきたので、発見された系は清澄化供給液に関しては最適化されていないばかりか、機能さえしない可能性がある。本研究において若干の未清澄化供給液が使用された理由はそこにある。
【００１９】
上記の議論からわかる通り、二相分配は複合供給液流からのバイオ医薬品を含むタンパク質のような各種物質の一次処理（清澄化及び標的の部分精製）のための方法として非常に有望である。しかし、これまでのところ、若干の問題が解消されていない。これらの問題には、試薬（ポリマー及び塩、又は２種のポリマー）のコスト、標的含有プロセス液流の所要希釈度に関係する処理能力の問題、標的の分配を増加させるために各種の親和性物質（例えば、ＴＥＧ−ＣＯＯＨ）を添加する必要の可能性、さらなる下流処理段階前又は段階中における相系形成物質の除去、及びさらなる下流処理を可能にするための標的含有相の変更がある。単純さという点から見れば、（ミセル形成や特殊な疎水的に修飾された熱応答性ポリマーの使用を伴わない）熱応答性ポリマー−水系は、通例は中性でありかつ場合によっては生体適合性であるので最も魅力的であり得る。その上、標的含有相中の残留ポリエトキシ及び他のポリマーは比較的不活性の物質と見られるだけではない。これらは、（ａ）多段階分配によるさらなる処理に際して、（ｂ）標的含有溶液の噴霧乾燥（例えば、Ｊｅｓｓｉｃａ Ｅｌｖｅｒｓｓｏｎ，Ａｎｎａ Ｍｉｌｌｑｖｉｓｔ−Ｆｕｒｅｂｙ，Ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ａｓ ａ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｐｔ ｆｏｒ ｓｐｒａｙ−ｄｒｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２９４（２００５）７３−８７）に際して、並びに（ｃ）その公知の凍結防止性及び酸化防止性のため、さらなる処理に先立つ標的含有相溶液の低温中間貯蔵に際して多少の利益を与えることがある。しかし、確立された知識及び経験によれば、その形成には比較的高いポリマー濃度及び塩濃度が必要とされた上、形成された相は選択性をほとんど示さず、かなり高い塩濃度を要求し、しかも清澄化を行うためには働かないことがあった。
【００２０】
長年にわたり、バイオ医薬品の発酵、精製及びポリッシング／製剤化は別々のプロセス領域と見られてきた。これの主な理由は、これらがしばしば異なる単位操作及び容量スケールを含んでいたことにある。これらはいずれも、標的物質の濃度に関係し、逆に異なる処理段階で扱われるプロセス容量に関係していた。即ち、発酵は恐らく１ｍｇ／ｍＬで行われ、親和性又はイオン交換による精製で濃度は恐らく３０ｍｇ／ｍＬに上昇し、そしてポリッシング及びそれに続く製剤化段階は標的を１００ｍｇ／ｍＬ（液体）又は１００ｍｇ／ｇ（固体）に持っていく。その結果、最初の処理段階は製剤化段階より１００倍大きいプロセス容量を扱うことがある。抗体及び他のバイオ医薬品は発酵供給液中で３０ｍｇ／ｍＬに達することがあり、また初期のイオン交換その他の精製段階は１００ｍｇ／ｍＬを達することがあるので、これらの区別はあいまいである。製剤化はしばしば、タンパク質その他のバイオ医薬品を、Ｄｅｘｔｒａｎ（商標）、ポリ（エチレングリコール）又はＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ（商標）（ポリエトキシル化ソルビタン及びラウレート）を含むポリマー並びにＴｅｒｇｉｔｏｌ（商標）又はＰｌｕｒｏｎｉｃ（商標）のようなオキシエチレン又はオキシプロピレンの各種市販コポリマー又はブロックコポリマーのような付形剤と合わせることを含んでいる。アルブミンのような他のタンパク質（即ち、帯電した両親媒性バイオポリマー）の使用を含め、付形剤は帯電していることがある。付形剤は貯蔵中にバイオ医薬品を安定化し、凝集を誘起せずに高い濃度を維持し、体内での迅速な溶解及び取込みを可能にする。若干のポリマー付形剤その他の付形剤は、例えばアジュバント作用を介して、薬物の送達ばかりでなくその薬理学的性質を向上させることがある。上記の事実を仮定すれば、生体適合性ポリマーを用いて溶液中の抗体その他の標的タンパク質或いは不溶性複合体を局在させるいかなる分配、沈殿その他の単位操作方法も、バイオ医薬品の精製ばかりでなくその製剤化、貯蔵、送達及び効力に関しても興味の対象とすべきであることは当然である。１つの重要な点として、任意の商業的に実行可能な方法は、タンパク質その他の標的を比較的高い濃度（例えば、＞１０ｇ／Ｌ）で含む複合供給液を取り扱うことができ、しかも顕著な（即ち、＞２×の）希釈なしにそれを処理することができなければならない。上記の考察内容は、組換えタンパク質、核酸及び他のバイオ医薬品ばかりでなく、ワクチン及び他のバイオ治療薬や生体粒子にも適用できる。
【００２１】
ワクチン、特にウイルスワクチンは、インフルエンザワクチンの処理によって例示される一連の興味深い処理問題を提起する。多くのインフルエンザワクチンは卵中で製造される。これは、ウイルス標的からオボアルブミンタンパク質及び他の夾雑物を除去するという興味深い問題を生じる。これは、大抵はショ糖密度勾配遠心分離によって行われる。しかし、最新の処理は、懸濁培養又は（細胞がコロイド担体に付着して増殖する）付着培養で増殖させた細胞（通例はＭＤＣＫ又はＶｅｒｏ腎細胞株）中でのウイルスワクチン処理に移行しつつある。いずれの場合にも、増殖細胞はウイルスに感染していて、これらは細胞が自然に溶解するか或いは各種の化学的又は物理的処理によって容易に溶解される点まで増殖する。いずれの場合にも、最終結果は、様々な大きい（＞１ミクロンの）粒子、細胞破片、（精製すべき標的である）インタクトウイルス及びウイルス関連の破片（例えば、ウイルスタンパク質を含む細胞膜フラグメント）を含む複合供給液である。遠心分離その他の方法を用いて細胞及び関連する破片を除去した後、ショ糖密度勾配法を用いてウイルス関連画分をインタクト画分及び破片画分に分離することができる。もちろん、かかる方法は数十年前からの古い技術であり、水性ポリマー二相分配又はカラムクロマトグラフィーのような新しい分離方法を使用とする試みが行われてきた。ウイルスの分配に関係する研究の大部分は１０年以上前に行われ、Ｌｅｎａ Ｈａｍｍａｒ（Ｌｅｎａ Ｈａｍｍａｒ，Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ：Ｖｉｒｕｓ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｖｉｒａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ６２，ｐｐ．６２７−６５８，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２２８，ＡｑｕｅｏｕｓＴｗｏ−Ｐｈａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈ．Ｗａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｇ．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４）によって総説されている。そこで彼女は、「大量の材料からのウイルス精製が必要とされる場合及び不安定なウイルスを取り扱う場合には水性ポリマー系における抽出が魅力的な選択肢であり続ける」ことを認めた。Ｈａｍｍａｒの文献及び関連する文献は、医学的に重要な多種多様のウイルスの分配に関する多くの事例を提供している。ウイルスの不安定は、一般に、単一ポリマー−高塩（例えば、ＰＥＧ−リン酸ナトリウム）系より低い界面張力を与える２ポリマー（通例はＰＥＧ−デキストラン）相系を使用することを要求する。もちろん、かかる系を用いたウイルスの分別は、分配による抗体その他の高分子標的の処理に関係するものと同し欠点の多くを有している。これには、２種のポリマーのコスト、及びプロセスへの独立した分配段階の追加がある。ある種のワクチンプロセスでは、遠心分離による清澄化及びそれに続くショ糖密度勾配法による分別後のウイルス生成物の回収率は僅か２０％にすぎないことがある。清澄化段階及び密度勾配段階の一方又は両方の代わりに使用されて良好又は一層良好な回収率を与える安価な分配系は、特にそれが固定ライン遠心機内ではなく使い捨てバッグ方式で実施できるならば望ましいもの��ある。ウイルスワクチンの分配処理の商業的実行可能性はまた、優れた選択性を与える新しい安価な系に依存しなければならない。かかる目標は本願において達成される。
【発明の概要】
【００２２】
本発明は、液体から標的化合物を濃縮する方法であって、２種類の水性相間での差別的な分配によって実施される１以上の単離段階を含む方法に関する。本発明では、かかる相は、溶液が一方の相をポリマーリッチとする１ポリマー二相系に分離するような熱的条件及び他の条件下においてただ１種の熱応答性で自己会合性（即ち、曇り性）の親水性ポリマー及び任意には若干の追加塩を水性生物学的溶液（例えば、発酵試料又は生物分離プロセスの液流）に添加することで形成される。標的化合物はポリマーが濃縮されていない相中に見出すことができる一方、多いが様々に異なる割合の夾雑物（例えば、細胞又は細胞破片）は相界面又はポリマーリッチ相に差別的に分配される。したがって、本方法を発酵ブロスその他の複合バイオマス含有溶液に関して実施して顕著な程度の清澄化及び精製を達成することで、クロマトグラフィーのような追加の標準分離操作によって標的含有相をさらに直接処理することが可能となる。
【００２３】
本発明者らは、Ｂｒｅｏｘのような市販の熱応答性ポリマーを少量の添加塩（０．１Ｍ以下のリン酸Ｎａ）と共に未清澄化発酵ブロスに直接添加し、バイオリアクター培養温度で自己会合ポリマーリッチ相及び標的含有水性相からなる二相系の形成をもたらし得る条件を発見した。未清澄化ＣＨＯ供給液（ブロス）中の抗体、Ｅ．ｃｏｌｉブロス中の緑色蛍光タンパク質及び抗体フラグメントのような数種の標的タンパク質が、細胞破片を含まない上部相中にほぼ完全に回収されることが示されている。宿主細胞タンパク質、核酸及び粒子状夾雑物は、ポリマーリッチ相又は相界面に様々に異なる程度に分配される。塩濃度が比較的低いため、標的含有相は次いで、濾過又はクロマトグラフィーのような常用下流処理段階で直接に使用できる。この場合、残留ポリマーは標的の精製に対していかなるマイナスの影響も示さず、単位操作の追加又は顕著な変更を必要としない方法で標的から単離できる。
【００２４】
かかる系は、標的濃度が１０ｇ／Ｌを超える濃厚細胞含有溶液を首尾よく処理することができる。分配段階は、使い捨て又は固定のバイオリアンクター或いは他の容器内においてミリリットル乃至数千リットルのスケールで実施でき、有利なコストで一次清澄化、予備標的精製及び若干のプロセス容量低減を行うことができる。それはポリマー再循環又は多回抽出フォーマットでの使用が可能である。それは、培養ブロス或いはさらにはミルク又は血漿のような多種多様の複合生物学的溶液に対する使用に適すると共に、高スループットプロセスの開発又は分析、各種のキットフォーマット及び各種の標的に対して適している。培養真核細胞からのインフルエンザウイルスワクチン製造では、かかる系は、商業的に興味のあるウイルス画分の回収を可能にする条件下で細胞破片の清澄化及びタンパク質の分配を行うことができる。したがって、かかる系は多数のウイルス及び他のコロイド粒子やナノメートル乃至マイクロメートルスケールの粒子の処理に使用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、本発明のような分配段階を含むプロセス及び含まないプロセスで精製されるモノクローナル抗体又は類似の組換えタンパク質に関する簡易化プロセスフローチャートを示している。
【図２】図２は、本発明に係る分配段階が各種の組換え体発酵供給液中の非標的タンパク質を低減させ得ることを実証するＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲルを示している。ＡはＭＷ標準、Ｂは粗Ｍａｂ供給液１、ＣはＭａｂ供給液１を含む０．２Ｍ ＮａＰ系の上部相、Ｄは粗Ｍａｂ供給液２、ＥはＭａｂ供給液２を含む０．２Ｍ ＮａＰ系の上部相、ＦはＭａｂ供給液２を含む０．１Ｍクエン酸Ｎａ系の上部相である。レーンＢ〜Ｆ中の主要バンドはモノクローナル抗体に関する。
【図３】図３は、本発明に係る分配段階が組換えモノクローナル抗体（Ｍａｂ）発酵液（供給液２）中の非標的タンパク質を低減させ得ること、及び上部相中のＭａｂを親和性（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ）カラム上に直接装填し得ることを実証する非還元ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲル（ゲル勾配８〜２５％）を示している。
【図４】図４は、プロテインＡに基づくＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｓｕｒｅ親和性カラム上へのＭａｂ含有相の直接適用を示している。後に粗供給液試料も対照として試験した。プロテインＡに基づく親和性カラム上に粗供給液を載せることもできるが、これはカラムの汚損を招くので通例は行われないことに注意されたい。
【図５】図５は、本発明に係る１ポリマー熱分離水性相系における分配によって最初に処理されたＭａｂのＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ多モードクロマトグラフィーを示している。Ａは通過液、Ｂは溶出液、ＣはＣＩＰである。
【図６】図６は、図５のアフィニティークロマトグラフィーからの溶出液及び他の画分の、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ上でのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果を示している。様々な曲線は、それぞれ通過液、溶出液及び定置洗浄液（ＣＩＰ）を表す図５のピークＡ、Ｂ及びＣに対応している。供給液もまた含めた。左から右に向かって、ピークは減少するＭＷのタンパク質を表している。顕著な抗体を含む試料は供給液及び溶出液のみである。
【図７】図７は、表９中の系４の水リッチ上部相からのＭａｂのＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ親和性捕捉を示すクロマトグラムである。溶出液ピークは自動的に積分された。カラムは、標準条件下で動作させた標準のＨｉＴｒａｐ（商標）５ｍｌベッド容量カラムであった。
【図８】図８は、供給液中のＭａｂ濃度のＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅアフィニティークロマトグラフィー分析結果であって、小さいピークで表されるモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の存在を示している。２番目のＡ215nmピークがＭａｂである。標準の１ｍｌ ＨｉＴｒａｐカラムを通常のＭａｂＳｅｌｅｃｔ動作条件下で使用した。
【図９】図９は、系３の上部相（表９及び表１０）によって例示される典型的な水リッチ相中のＭａｂ濃度のＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラムに基づく分析結果を示している（図８と比較されたい）。２番目のＡ215nmピークがＭａｂ含有溶出液である。標準の１ｍｌ ＨｉＴｒａｐカラムを通常のＭａｂＳｅｌｅｃｔ動作条件下で使用した。
【図１０】図１０は、試料系３の上部相（表９及び表１０参照）によって例示される、分配及びＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ上での親和性精製後の濃縮されかつ明らかに天然のままのＭａｂに関する、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ親和性カラムに基づく分析結果を示している。この分析のためには、標準の１ｍｌ ＨｉＴｒａｐカラムを通常のＭａｂＳｅｌｅｃｔ動作条件下で使用した。
【図１１】図１１は、細胞発酵培養物を含むＷａｖｅ（商標）バッグに相形成ポリマー及び塩を直接添加することによって４０℃で二相系が形成されることを示している。この例では、可視化を助けるため、バッグは長軸が垂直になるように配置され、したがってベッド高さは大容量条件下で見られるものに似せることができた。相界面に自発的に集まる白色の細胞層を見ることができる。
【図１２】図１２は、この例では長軸が垂直になるように配置されたＷａｖｅ（商標）バッグ中に管を挿入することでＭａｂ標的含有上部相を単離することを示している。下部相は、長軸が垂直になるように配置された場合、バッグの右側下部コーナーにある管を通して集めた。
【図１３】図１３は、二重反復実験におけるウイルス及び各種夾雑物の回収率を添加ポリマー濃度の関数として示している。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、生体分子又は標的化合物を単離するために水性ポリマー二相系を有利に使用することに関する。かかる標的化合物とは、化合物並びに分子及び細胞、即ち液体から単離することが望まれる任意の実在物を意味する。
【００２７】
かくして本発明は、１種以上の生体分子又は標的化合物を液体から単離する方法であって、容器内で親水性ポリ（エーテル）、１種以上の塩、及び１種以上の生体分子又は標的化合物を含む液体を合わせる段階、得られた液体混合物を少なくとも２相が形成されるまで穏やかに混合する段階、並びに任意には所望の生体分子又は標的化合物を１相から回収する段階を含む方法に関する。
【００２８】
本発明で使用される液体混合物及び多相系中で使用されるポリマーは、これらを水と合わせた場合に水性相が形成されるという意味で水性である。さらに、当業者には理解される通り、本発明の文脈中で「液体混合物」という用語は、単に本明細書中で定義された成分の組合せをいう。いかなる条件下でかかる液体混合物が一相、二相又はそれ以上の多相として存在するかは、状態図から推論できる。本発明の液体混合物の利点の１つは、標的含有相中のポリマー濃度が非常に低い（通例＜３％ｗ／ｗ）ので、それが生じる相は多くの一般に研究されているポリマー−塩又は２種のポリマーの相系より粘度が低く、光学的に透明であり、さらなる処理が容易であることである。
【００２９】
有利な実施形態では、親水性ポリ（エーテル）は、エチレンオキシド単位を含む合成ポリマーである。有利な実施形態では、エチレンオキシドポリマーは、ポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）、ランダムコポリマー型（例えば、Ｂｒｅｏｘ（登録商標）又はＵＣＯＮポリマー）又はブロックポリマー型（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））のエチレンオキシドプロピレンオキシド（ＥＯＰＯ）、エトキシ含有多糖類及びイソプロピルアクリルアミド修飾ポリマーを含む水溶性ポリ（エーテル）からなる群から選択される。この分野の当業者には理解される通り、これらのポリマーは様々に修飾された形態（例えば、モノメトキシ型のＰＥＧ）を含み得る。有利な実施形態では、親水性ポリ（エーテル）はＥＯＰＯである。当業者には公知の通り、ＥＯＰＯはその曇り温度（Ｔｃ）より高くなると二相に分離し、したがって熱分離性ポリマーと見なされる。
【００３０】
一実施形態では、親水性ポリ（エーテル）の分子量は９００〜１０００００Ｄａ、例えば１０００〜２００００Ｄａの範囲内にある。一実施形態では、分子量は４００〜１００００００Ｄａという広い範囲内にあり、その範囲内で熱応答性ポリマーを商業的に得ることができる。
【００３１】
熱応答性ポリマーは界面活性剤及び他の用途で使用されているので、熱応答性ポリマーの相分離については多くのことが知られている。したがって当業者は、状態図データ及び任意には非常に簡単な日常的実験に基づき、本発明の液体混合物から二相系のような多相系が形成される好適な条件（例えば、ｐＨ及び温度）を容易に決定することができる。一実施形態では、本発明の液体混合物のｐＨ値は中性に近い。温度は、バイオプロセシングに適した二相系を形成するためには、４〜５０℃、例えば室温乃至４０℃の範囲内にあり得る。ポリエチレングリコールのような若干の熱分離性ポリマーは１００℃に近いＴｃ値を有することに注意されたい。
【００３２】
当業者には理解される通り、本発明のポリ（エーテル）は十分な塩（大抵は２００ｍＭ）の存在下で水性二相系を形成し得るように選択される。標的含有溶液（例えば、培養ブロス）が０．１５Ｍ ＮａＣｌのような塩を含むならば、５０〜１００ｍＭのリン酸Ｎａその他の塩を添加すれば事足りるであろう。同様に、培養ブロスのような標的含有溶液が既にＴｃ（例えば、３７℃）以上であれば、相分離を行うための加熱はほとんど又は全く必要ないかもしれない。本発明の液体混合物から形成される二相系は、ポリマーに結合した親和性リガンドのような他の帯電基及び非帯電基を含むことができる。
【００３３】
古典的なポリマー−ポリマー及びポリマー−塩二相系と比べた新規な１ポリマー二相系の若干の利点を表１に示す。
【００３４】
本発明の系の具体的な実施形態では、全塩濃度は１〜５００ｍＭ、例えば１００〜３００ｍＭの範囲内にある。当業者には理解される通り、二相系を形成するために必要な塩の量はポリマーのＭＷ、濃度および物理的状態によって左右される。
【００３５】
有利な実施形態では、塩はＮａＣｌ、Ｎａ2ＰＯ4、ＫＰＯ4、ＮａＳＯ4、クエン酸カリウム、(ＮＨ4)2ＳＯ4、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム及びこれらの組合せからなる群から選択される。他の塩（例えば、酢酸アンモニウム）も使用できる。
【００３６】
本発明の液体混合物の全ポリマー濃度は、それぞれの想定される用途に対して最適化することができる。例えば、比較的多量の水溶性ポリマーを添加することで、タンパク質及び他の高分子を溶液から沈殿させ得ることはよく知られている。したがって、本発明に係る系をタンパク質分離において使用する場合、全ポリマー濃度が高すぎると、コスト効率のよい分離を達成するために十分なタンパク質溶解度が得られないであろう。かくして、生体分子及び／又は粒子の単離のために有利な本発明の液体混合物の一実施形態では、全ポリマー含有量は系全体の約４〜２０％（ｗ／ｗ）を占める。しかし、相分離後には、１相中のポリマー濃度は通例１〜３％ｗ／ｗにすぎないことがあり、ポリマーの大部分はポリマーリッチ相中で自己会合している。
【００３７】
【表１】
0005785098.tif 000002
【００３８】
相系自体は、その用途及び必要に応じて配合及び混合することができる。相及び相混合の粘度及び界面張力が比較的低いことは、磁気撹拌棒による撹拌、使い捨ての（Ｗａｖｅ（商標））バイオリアクターバッグの前後揺動、又は固定反応器内の通常の機械的撹拌パドルを用いるような各種の標準アプローチで混合を達成し得ることを意味している。
【００３９】
一実施形態では、相系はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーで修飾された親和性リガンドを含んでいる。ＥＯＰＯは自己会合するので、かかるポリマーはＥＯＰＯポリマーリッチ相から排除される。かかるＰＥＧ−親和性リガンドは、ポリマーブア相中への標的移動を促進するために使用できる。Ｂｒｉｊ（登録商標）及びＭｒｉｊ（登録商標）系列のもののような市販のＰＥＧ−脂肪アシル界面活性剤である若干の疎水性リガンドを始めとして、多くの公知ＰＥＧ−親和性リガンドが存在している。具体的な実施形態では、多相系は１以上のクロマトグラフィーリガンドを含んでいる。かかるクロマトグラフィーリガンドは、本発明の液体混合物を生体分子又は化合物の単離のために適用する場合にツールとして使用できる。そのような場合、リガンドは特定の標的化合物と結合し、前記標的化合物を該リガンドによって好まれる相に分配することができる。一実施形態では、リガンドは親和性リガンドであり、受容体とリガンド又は抗体−抗原のような「鍵穴／鍵」型の極めて特異的な相互作用によって標的分子と結合することができる。例示的な親和性リガンドは、例えば、プロテインＡ又はプロテインＡベースのリガンドである。有利な実施形態では、親和性リガンドは特異的な相への分配を促進するために修飾されている。別の実施形態では、修飾された親和性リガンドを添加することで、相互作用する標的をポリマープア相に分配する。
【００４０】
本発明の方法で単離される生体分子又は標的化合物は、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、細胞、ウィルス或いは上述のもののいずれか１つの任意の部分、フラグメント又は融合生成物であり得る。このように、一実施形態では、標的化合物はモノクローナル抗体のような抗体或いはそのフラグメント又は融合生成物である。例示的な抗体フラグメントは、例えばＦａｂフラグメントである。別の実施形態では、標的化合物はＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸であり、例えばプラスミド、ゲノムＤＮＡ、アプタマー又はオリゴヌクレオチドである。追加の実施形態では、標的化合物は真核細胞又は原核細胞のような細胞であり、例えば成体細胞又は前駆細胞である。このように、本発明の方法の一実施形態では、生体分子は抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。別の実施形態では、標的化合物はＦａｂフラグメントである。
【００４１】
一実施形態では、生体分子又は標的化合物はポリマープア相から単離される。有利な実施形態では、ポリマープア相は少なくとも二相の上部相である。
【００４２】
一態様では、本発明は、１種以上の生体分子又は標的化合物を単離する多段階方法であって、親水性ポリ（エーテル）及び１種以上の塩を含む多相系の相間における分配を用いて供給液の清澄化を実施し、次いでアフィニティークロマトグラフィーのような１以上の捕捉段階を実施することを含む方法である。有利には、分配段階はまた、清澄化標的リッチ相中における宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）及び他の夾雑物のレベルを低下させる。供給液は、細菌細胞又は真核細胞発酵培養物を含む発酵ブロス又は生物学的液体のような、生体分子又は標的化合物を産生させた任意の液体である。必要ならば、本方法は、本発明に係る二相系での清澄化に先立ち、細胞を溶解して生体分子又は標的化合物を放出させる段階を含む。
【００４３】
有利な実施形態では、水性二相系は発酵を実施した容器（例えば、発酵容器）内で形成される。
【００４４】
別の有利な実施形態では、標的リッチ相はポリマープア相であり、これは好ましくは少なくとも二相の上部相である。発酵容器又は使い捨て容器内では、下部相及び相界面を除去してさらなる処理のために利用できる上部の標的含有相を残すことにより、上部相の捕集が一層簡便に達成できる。
【００４５】
別の実施形態では、ポリマーが濃縮されていない相中における約１〜３％の残留ポリマーは標的タンパク質その他の物質に対して多少の保護効果をもたらすことができる。例えば、溶液中におけるポリエーテルの凍結防止効果及び酸化防止効果は共によく知られている。したがって残留ポリマーは、付形剤として、及び精製される薬剤の効力を一層高めるために有用であり得る。別の実施形態では、標的を含む相中の残留ポリマーは、例えば米国特許出願公開第２００７／２１３５１３号（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に従って捕捉クロマトグラフィーを向上させるという点で、さらなる下流処理を助けることができる。
【００４６】
このように一実施形態では、新規な水性二相系は、供給液の簡単かつ効果的な清澄化並びに標的化合物又は生体分子の一次濃縮（容量の低減）及び精製（非標的濃度の低下）をもたらす。これは、プラスチックマイクロタイタープレート並びに固定金属発酵容器又は使い捨てプラスチック発酵容器のような各種の容器内で、広い液体スケール範囲（ミリリットル（グラム）乃至千リットル（メートルトン））にわたって実施できる。我々の結果は、残留量（大抵は１％）の生体適合性ポリマーしか含まない水性相中に標的を非常に高いレベルで回収でき、かかるポリマーは通常のやり方ではさらなる下流処理にマイナスの影響を及ぼさず、また標準の単位操作又は関連する手順の顕著な変更も必要としないことが示唆される。
【００４７】
上述した方法は、標的化合物及び生体分子を希釈せず、しかも不当に高い塩濃度を必要としたり、過度に粘稠な溶液中に標的化合物を生じたりすることのないやり方で標的化合物及び生体分子を分配するのに有効であるので、かかる方法はスタックディスク遠心分離からクロマトグラフィー及び濾過にまでわたる他の常用分離段階と容易にインライン連結することができる。したがって、標的生体分子又は化合物を含む相はさらに、僅かな変更又は変更なしで１以上の液体クロマトグラフィー段階に付される。
【００４８】
新しいアプローチがいかにして使用できるかを表す１つの可能なスキームを図１に示す。左側には、例えばＭａｂ精製で使用できる通常の３クロマトグラフィー段階分離プロセスが示されている。発酵及び（必要ならば）細胞溶解後、発酵供給液を遠心分離して細胞及び細胞破片を除去する。次いで、それを濾過し、緩衝液を変更した後に親和性カラムに適用する。次いで、それを溶出させ、低ｐＨウイルス滅菌を施す。別の緩衝液変更後、さらに２つのクロマトグラフィー段階（例えば、イオン交換クロマトグラフィー及びそれに続く別のイオン交換クロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィー）に付す。場合によっては、上記の非親和性段階の一方を混合モードのクロマトグラフィー段階で置き換えることもできる。右側には、本発明で提唱されるワークフローの一例が示される。（供給塩及び温度の二重使用を伴う）供給液中に相系が形成されることで、細胞及び細胞破片の一次除去（清澄化）並びに非標的宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、核酸、内毒素及びウイルスのような各種夾雑物の（相系に応じた）ある程度の可能な低減が迅速に達成されることがわかる。標的含有上部相を親和性カラムに直接適用することができるが、簡単なデプス濾過の使用がカラム寿命を向上させるはずである。上流に分配ベースの精製段階が含まれる結果、他の精製段階の数を減少させることができ、或いはかかる段階を捕捉モードではなく通過モードで実施できる点を除けば、プロセスは通常のやり方で継続される。プロセス液流中の残留ポリエーテルポリマーは、クロマトグラフィーの性能に悪影響を及ぼさないと予想される（例えば、米国特許出願公開第２００７／２１３５１３号）。
【００４９】
一実施形態では、液体クロマトグラフィーはプロテインＡリガンドへの結合のようなアフィニティークロマトグラフィーからなる。プロテインＡクロマトグラフィーは公知の方法であり、本発明の文脈中では、組換え又は天然のプロテインＡ、或いは抗体に対する選択性を保持しているプロテインＡの部分又はプロテインＡのその他任意の修飾形態を含む任意の樹脂への吸着を包含すると理解される。商業的に入手できるプロテインＡ樹脂には、例えばＭａｂＳｅｌｅｃｔ系列（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）のものがある。他の親和性方法には、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）がある。
【００５０】
上記のクロマトグラフィー段階に続いて、１以上の追加クロマトグラフィー段階及びウイルス除去のための任意段階を実施できる。一実施形態では、上記のクロマトグラフィーに続いてアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）が実施される。陰イオン交換体、陽イオン交換体及びＨＩＣ樹脂は公知であり、商業的に入手できる。
【００５１】
別の実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーに続いて多モードイオン交換クロマトグラフィーが実施される。多モードイオン交換クロマトグラフィーも公知であり、疎水基に近接したイオン交換基のような２以上の官能基を含むリガンドを使用する。その実例はＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ及びＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）である。
【００５２】
別の実施形態では、最初のアフィニティークロマトグラフィー段階を１以上の標的サイズ排除段階で置き換えることができ、或いは恐らくはイオン交換、疎水性相互作用又は混合モード相互作用に関係する捕捉又は通過段階（クロマトグラフィー又は濾過など）で置き換えることもできる。
【００５３】
ポリ（エーテル）ポリマーに基づく１ポリマー二相系は、Ｍａｂ、Ｆａｂ及び他の標的に関係するラージスケールバイオプロセシング操作で使用するのに理想的である。これらは、遠心分離に基づく清澄化の必要性を排除又は低減させる。清澄化並びにある程度の予備精製及び濃縮を相中で達成でき、それを（任意には濾過しながら）クロマトグラフィー捕捉媒体に直接適用できる。
【００５４】
かかる系はコスト（１ポリマー、低塩）及びその他（標的溶解度）の点で顕著な利益を与えるが、これは該系を発酵と捕捉クロマトグラフィーとの間に挿入して清澄化のために使用する必要がある遠心分離その他の能動プロセスに置き換えるのに理想的であり得ることを示唆している。かかる分配は広く適当可能であるように思われ、タンパク質の高密度で粘稠な供給液を処理することができる。もちろん、分配アプローチは、遠心分離又は濾過に基づく清澄化を使用するプロセスにおいて標的回収率を向上させるためにも使用できる。
【００５５】
別の態様では、本発明は、１種以上の抗体を液体から単離する方法であって、合成親水性ポリ（エーテル）及び１種以上の塩を含む多相系中で分配する段階を含む方法である。
【００５６】
本方法の有利な実施形態では、抗体はモノクローナル抗体であり、これは系のポリマープア相から回収される。したがって、特定の実施形態では、モノクローナル抗体のような抗体を単離するために使用される多相系は、約４〜２０％のＥＯＰＯを１００〜５００ｍＭの塩と共に含む水性ポリマー二相系である。
【００５７】
本発明は、夾雑物を含む発酵液その他の複合供給液からモノクローナル抗体のような抗体を分離するための有利な方法を提供する。
【００５８】
一実施形態では、本方法は、上述したような二相系を形成し、次いでＥＯＰＯのような熱分離性ポリマーに富む相を除去することを含んでいる。
【００５９】
別の態様では、本発明は、生体分子、細胞又は粒子のような１種以上の標的化合物の分離における、上述したような液体混合物又は多相系の使用に関する。
【００６０】
別の態様では、分配段階は、ウイルスその他のナノメートル乃至マイクロメートルサイズの粒子の処理に関係する供給液その他の複合溶液を予備的に清澄化しかつ精製（二次分別）するために使用される。
【００６１】
別の態様では、１種の熱分離性ポリマーを供給液その他の標的含有溶液に添加することを含む本発明の分配段階を繰り返すことで、特定の標的をさらに精製することができる。かかる反復分配段階は、全く同一の条件下又は相異なる条件下で行うことができる。後者は、特定のタンパク質その他の画分の逐次精製を可能にするであろう。
【００６２】
別の態様では、本発明は、相形成ポリマーを自己会合ポリマーリッチ相の形態で回収して再循環させることができる方法に関する。
【００６３】
さらに別の態様では、本発明は、モノクローナル抗体のような１種以上の標的化合物を単離するためのキットであって、上述したような液体混合物又は多相系を含むキットである。有利な実施形態では、本キットは、合成ポリ（エーテル）である１種以上のポリマーを水溶液又は乾燥形態で含んでいる。
【００６４】
本発明の他の特徴及び利点は以下の実施例及び特許請求の範囲から明らかとなろう。
【実施例】
【００６５】
Ａ．細胞、抗体及び他の生体分子に関する実施例
一般実験手順
１．１  材料
化学薬品
Ｂｒｅｏｘ ５０Ａ １０００（エチレンオキシド及びプロピレンオキシドの等量コポリマー（ＥＯＰＯ））、Ｍｗ ３９００、下記参照。
【００６６】
ポリオキシエチレン１００ステアレート（Ｍｙｒｊ５９）、Ｍｗ ５４５０、Ｓｉｇｍａ社、Ｒｅｆ．Ｐ−３６９０。
【００６７】
Ｇａｍｍａｎｏｒｍ（ポリクローナルＩｇＧ）（ｐＩ約７）、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ社、Ｂａｔｃｈ Ｃ１９Ａ８６０１。
【００６８】
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（およそｐＩ ５．６）、Ｓｉｇｍａ社、Ａ７６３８。
【００６９】
ミオグロビン（およそｐＩ ７）、Ｓｉｇｍａ社、Ｍ１８８２。
【００７０】
本研究で使用した他の化学薬品はすべて分析用のものであって、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ社（ダルムシュタット）又はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。
【００７１】
特記しない限り、ＥＯＰＯポリマーとは、５０％エチレンオキシド及び５０％プロピレンオキシドからなる（数平均）分子質量３９００ダルトンのランダムコポリマーであるＢｒｅｏｘ ５０Ａ １０００をいう。これはある種の用途についてＦＤＡの承認を得ており、（現在はＣｏｇｎｉｓ社（ｗｗｗ．ｃｏｇｎｉｓ．ｃｏｍ）の一部である）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（サウサンプトン、英国）から入手した。
【００７２】
モノクローナル抗体及び発酵試料
精製モノクローナル抗体（Ｍａｂ）
次の２種の専売Ｍａｂ（Ｍａｂ０１及びＭａｂ０３）を使用した。
Ｍａｂ０１
プロテインＡを用いて精製し、陰イオン交換クロマトグラフィーで１０倍に濃縮した。
【００７３】
ＣＨＯ細胞中で産生させ、リン酸グリセリン（ｐＨ７．８及び５．２ｍＳ／ｃｍ）中に貯蔵した。
【００７４】
濃度４．４ｍｇ／ｍｌ、ＭＷ推定値１５０ｋＤａ、ｐＩ推定値９。
Ｍａｂ０３
プロテインＡを用いて精製し、陰イオン交換クロマトグラフィーで１０倍に濃縮した。
【００７５】
ＣＨＯ細胞中で産生させ、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ５．８及び１６．２ｍＳ／ｃｍ）中に貯蔵した。
【００７６】
濃度５．８ｍｇ／ｍｌ、ＭＷ推定値１５０ｋＤａ、ｐＩ推定値７。
実際の供給液試料
４種の「実際の」未濾過かつ未清澄化Ｍａｂ発酵供給液をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞ベースの発酵で得た。これらは相異なるＭａｂを含み、供給液１、２、３及び４と呼ばれる。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）はＥ．Ｃｏｌｉ中で発現させた。
【００７７】
１．１  方法
以下に示す原液の適当な量／容量を混合することで、各々の水性二相系（ＡＴＰＳ）溶液を（特記しない限り）直接に１０ｍｌ Ｓａｒｓｔｅｄｔ管中で調製した。各系の最終容量は５ｍｌであった。混合物を約３０秒間渦動させ、次いで４０℃の水浴中に約１５分間放置して相形成させた。
【００７８】
原液
ＥＯＰＯ、２０％（ｗ／ｗ）：１０ｇのＥＯＰＯを４０ｇのＭＱ水に溶解することで調製した。
【００７９】
ＥＯＰＯ、４０％（ｗ／ｗ）：２０ｇのＥＯＰＯを３０ｇのＭＱ水に溶解することで調製した。
【００８０】
Ｍｙｒｊ５９（８μＭ）：３．６ｍｇのＭｙｒｊ５９を１００ｍｌのＭＱ水に溶解することで調製した。
【００８１】
Ｍｙｒｊ５９（４００μＭ）：０．１８ｇのＭｙｒｊ５９を１００ｍｌのＭＱ水に溶解することで調製した。
【００８２】
ＮａＰ（リン酸Ｎａ、０．８Ｍ）：０．８Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4及び０．８Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4を混合することで様々なｐＨ（ｐＨ５、６、７、８）とした。
【００８３】
クエン酸Ｎａ（０．８Ｍ）：０．８Ｍクエン酸ナトリウム及び０．８Ｍクエン酸を混合することでｐＨ７の原液を調製した。
【００８４】
ＮａＣｌ（５Ｍ）：１４．６ｇのＮａＣｌを５０ｍｌのＭＱ水に溶解することで調製した。
【００８５】
実施例１：ＡＴＰＳの形成に対するリン酸Ｎａ濃度及びｐＨの効果
適当な量／容量の原液を混合することで、１種のポリマー（ＥＯＰＯ）に基づく水性二相系（ＡＴＰＳ）を直接に１０ｍｌ Ｓａｒｓｔｅｄｔ管中で調製した。各系の最終容量は５ｍｌであった。混合物を３０秒間渦動させ、次いで水浴中で約４０℃に約１５分間加熱して相形成させた。
【００８６】
８％ＥＯＰＯ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び５０〜２００ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ４、６、７及び８）に基づくＡＴＰＳを調製した。水浴中において４０℃で約１５分間インキュベートした後、試験したすべてのｐＨで二相系が形成された。
【００８７】
別の一連の実験では、異なる濃度のリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７）を用いて、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む８％ＥＯＰＯのＡＴＰＳを調製した。
【００８８】
結果は以下のことを示唆していた。
（１）低濃度（２０ｍＭ）のリン酸Ｎａを使用した場合には、いかなる二相系も形成されなかった。しかし、リン酸Ｎａ濃度を５０ｍＭに増加した場合、二相系が形成された。
（２）５０ｍＭリン酸Ｎａを用いて形成されたＡＴＰＳでは、１００〜３００ｍＭリン酸Ｎａを用いて形成された他の系の容量比が４であるのに比べて、高い相容量比（５．２５）が得られた。
これは、その張度（重量オスモル濃度）が生細胞を溶解せずに分配するのに適する程度に低い塩濃度を有するＥＯＰＯベースの二相系を開発するのが可能であることを示唆している。これは、（１）ＥＯＰＯ濃縮物を添加して二相系を形成するため、最初は増殖培地中に等張性緩衝塩を使用することが望まれる用途、（２）生細胞の外部に輸送される標的タンパク質を含む発酵液を清澄化すると共に、細胞を溶解して宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を放出させることなしに細胞を処理することが望まれる用途、及び（３）（２）のような状況であって、細胞が連続培養状態に保たれるか、或いは他の方法によってインタクトな形態で処理される場合において重要である。
【００８９】
Ｕｃｏｎ（登録商標）ポリマーはＢｒｅｏｘ ＥＯＰＯに非常に類似しているので、Ｔｃの変化に関連して温度を僅かに変更すれば、Ｂｒｅｏｘ ＥＯＰＯ（下記参照）の代わりにこれを使用することができた。Ｐｌｕｒｏｎｉｃポリマーを始めとして、その他多くの類似ポリマーが存在する。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ−８１（１０％ＥＯ及び９０％ＰＯ、Ｍｗｔ ２７００）を試験したところ、ポリマー濃度が水又はリン酸緩衝液中で１０〜２０％であった場合、二相系が室温で成功裡に形成された。このことは、操作者が（例えば、プロテアーゼ活性を妨げるため）発酵液を室温に冷却するのを望むような状況下で使用するために重要であり得る。
【００９０】
実施例２：ＡＴＰＳ形成及びタンパク質相分配に対する抗体濃度の効果、又はＧＦＰ含有溶解Ｅ．ｃｏｌｉ細胞ペーストの使用
実施例１の記載に従って、１種のポリマー（ＥＯＰＯ）に基づくＡＴＰＳを調製した。表２は条件の異なる４つの系を示しており、これらを用いてポリクローナルＩｇＧ Ｇａｍｍａｎｏｒｍ又は組換え緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）含有溶解Ｅ．ｃｏｌｉ細胞ペースト試料を試験した。
【００９１】
【表２】
0005785098.tif 000003
【００９２】
結果は以下のことを表している。
（１）試験した条件下では、低濃度（２０ｍＭ）のリン酸Ｎａを使用した場合にはいかなる二相系も形成されなかった。しかし、リン酸Ｎａ濃度が２００ｍＭであった場合には二相系が形成された。
（２）８〜１０％ｗ／ｗ ＥＯＰＯ系では、Ｇａｍｍａｎｏｒｍポリクローナルヒト抗体由来の全吸収の９０〜１００％は上部のポリマープア相中に得られた。
（３）４９０ｎｍで測定したＧＦＰ活性のすべては、系４の上部相中に見出された。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞破片は単位重力（ｇ）下で界面に分配された。試験管を３０００×ｇで５分間遠心した場合、全ての細胞破片は分離した相を全く乱すことなく管の底部に沈降した。
【００９３】
相容量比及び標的回収率に対するＥＯＰＯ濃度の効果を調べた。５ｍｇ Ｇａｍｍａｎｏｒｍ、５〜１４％Ｂｒｅｏｘ ＥＯＰＯポリマー並びに１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２００ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７）を用いて、最終容量５ｍｌの系を調製した。４０℃では、相容量比はＥＯＰＯ濃度に逆比例して減少し、５％ＥＯＰＯでは１１．５の容量比が得られ、１４％ＥＯＰＯでは２．３３の容量比が得られた。相形成後、相を分離し、各相の吸光度を分光光度計によって２８０ｎｍでモニターした。分配係数（Ｋ）及び上部相中における各Ｆａｂの％濃度（Ｃ／Ｃｏ）を算出した。すべての系が高いＫ値（＞２００）及び１００％の標的回収率を示した。この結果は実用上重要である。なぜなら、Ｂｒｅｏｘ及び関連ポリマーは比較的安価であるので、標的タンパク質が回収される液体の容量の顕著な低減を達成し、そしてプロセスの初期に標的の濃縮を達成することができるならば、ＥＯＰＯ系を６％から１２％に移行することは正当化できるからである。
【００９４】
ＥＯＰＯに基づくＡＴＰ系中でのタンパク質溶解度を検討するため、５ｍｌのＡＴＰＳ系（８％ＥＯＰＯ、２００ｍＭリン酸Ｎａ（ｐＨ７．４）及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中に様々な量のＧａｍｍａｎｏｒｍを用いて一連の実験を実施した。相形成後、相を分離し、各相の吸光度を分光光度計によって２８０ｎｍでモニターした。上部相中における各タンパク質の分配係数（Ｋ）は高かった（＞２００）。これらの条件下でのＥＯＰＯ系は、実質的に１００％のＧａｍｍａｎｏｒｍ回収率を生じた。２０％ＥＯＰＯ系を用いた別のセットの実験では、処理能力は同一の塩条件下で２０ｇ／Ｌに達し、＞９７％の回収率を与える。かかる結果は、ＥＯＰＯ系が高い処理能力を有することを示唆している。これは、ＰＥＧ／塩系（約１ｇ／Ｌ）及びＰＥＧ／デキストラン系（約５ｇ／Ｌ）に比べて非常に勝っている。
【００９５】
一般的に有用であるためには、かかるアプローチは細胞培養液に対して役立つべきである。我々は、細胞培養液がＥＯＰＯ−ＡＴＰＳ中での相形成に影響を与え得るかどうかを検討した。８％ＥＯＰＯ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２００ｍＭリン酸Ｎａからなる５ｍｌのＡＴＰＳ中で細胞培養液（２．６ｍｌ）を試験した。結果は、試験したすべての細胞培養液（Ｅｘ−ｃｅｌｌ ＣＡ ＣＨＯ−３ Ｓｉｇｍａ １２６Ｋ８０４２、ＢＤ ＣＨＯ ｒｅｆ．２２０２２９、Ｐｏｗｅｒ ＣＨＯ−１−ＣＰ Ｌｏｎｚａ ０７０９２０及びＣＡ ＯＰＴＩ ＣＨＯ ｒｅｆ １２６８１−０１１−（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に関して二相系が形成されたことを示している。これは、Ｅ．ｃｏｌｉブロス／ペーストを用いて行った試験の成功、並びにＥＯＰＯ及び塩をタンパク質含有溶液に直接添加して行った試験の成功に追加されるものである。しかし、処理を促進するためには、乾燥粉末ではなく濃縮原液を添加するのが一層良いかもしれない（下記参照）。
【００９６】
実施例３：クエン酸塩に基づくＥＯＰＯ系１ポリマーＡＴＰＳ
リン酸塩は、Ｂｒｅｏｘポリマーを用いた相系形成のために適している。これは、一つにはリン酸塩が比較的低い塩濃度（ある種のＰＥＧ−塩二相系の塩濃度の１０分の１）で系を形成するからであり、また形成された系が良好な標的タンパク質回収率及び非標的タンパク質に関してある程度の選択性を与えるように思われるからである。しかし、リン酸塩は購入するのに高くつく上、処分するのにも高くつく。それとは対照的に、クエン酸塩は安価であり、生態学的にもやさしい。ここでは、新しい系の調製に際してクエン酸ナトリウム緩衝液を試験した。８％ＥＯＰＯ及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む系を調製するため、表３に示すように、様々な濃度のクエン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７）を様々な温度で使用した。
【００９７】
結果は以下のことを示していた。
●５０〜２００ｍＭのクエン酸Ｎａ濃度を約４０℃の温度で用いて二相系を形成することができる。
●２５０ｍＭ以上のクエン酸Ｎａ濃度をＲＴで用いて二相系を形成することができるが、相逆転によって相の順序が逆になった（ポリマー相が上部相になり、水相が下部相になる）。かかる系の水相中におけるＩｇＧの回収率は約９６％であった。
●２５０ｍＭ以上のクエン酸Ｎａ濃度をＲＴで用いて形成した系では、それより低い低いクエン酸Ｎａ濃度を４０℃で用いて形成した系に比べて低い相比が得られた。
これは、クエン酸Ｎａを主要塩の１種として用いて好適なＥＯＰＯ系を生成できることを証明した（ただし、高いｐＨでの緩衝能力を高めるために若干のリン酸塩を添加することもできる）。認められた相逆転は、以前に報告されていた（Ｍ．Ｐｅｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｊｏｕｒｎａｌ １５（２００３）１３１−１３８）。この場合の著者らは、３０℃及び４０℃のＵｃｏｎ−(ＮＨ4)2ＳＯ4系を用いて遠心分離発酵試料上澄み液中のポリガラクツロナーゼ（Ｍａｂでない）の分配を観察していた。
【００９８】
【表３】
0005785098.tif 000004
【００９９】
クエン酸塩に基づくＥＯＰＯ ＡＴＰ系中での相形成に対するＮａＣｌ濃度の効果を、１００〜２５０ｍＭクエン酸Ｎａ緩衝液を４０℃及びＲＴで使用して評価した。結果は、１００〜２００ｍＭクエン酸Ｎａ緩衝液を使用した場合、ＮａＣｌは４０℃での相形成にほとんど影響を与えないことを示している。しかし、２５０ｍＭクエン酸Ｎａ緩衝液を使用した場合には、ＲＴでの相形成のために１５０ｍＭ以上のＮａＣｌ濃度が必要であった。８％ＥＯＰＯに基づく系中で２種の実際の未清澄化Ｍａｂプロセス供給液（２及び３）を用いて、ｐＨ変化の効果を試験した。上部相からの画分のＭａｂ含有量をプロテインＡクロマトグラフィー分析によって分析したところ、ｐＨ７〜８で１５０ｍＭクエン酸Ｎａ及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを用いて９８％より高いＭａｂ回収率が得られることが示唆された。もちろん、他の塩の存在が上記の結果に影響を及ぼすことはあった。
【０１００】
実施例４：ＥＯＰＯ ＡＴＰＳ中におけるＨＣＰ分配
ｐＨ及び疎水的親和性リガンドの効果：
これらの実験では、８％ＥＯＰＯ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び２００ｍＭリン酸Ｎａ（ｐＨ６及び８）又は（ＰＥＧ−アルキル疎水的親和性リガンドとして作用するように添加した）８μＭ Ｍｙｒｊ５９界面活性剤を含む２００ｍＭリン酸Ｎａ（ｐＨ８）からなる５ｍｌの系中で粗Ｍａｂ供給液１を分配した。水浴中において４０℃で約１５分間インキュベートした後、相を分離し、ＨＣＰ含有量を分析した（表４）。結果は、高ｐＨ（ｐＨ８）の緩衝液を用いれば良好なＨＣＰ低減率が得られることを示唆している。
【０１０１】
【表４】
0005785098.tif 000005
【０１０２】
本試験では、ＨＣＰ濃度に関して、ｐＨ６からｐＨ８になるとＨＣＰの上部相分配の劇的な減少（即ち、下部相分配の増加）が見られる。疎水的親和性リガンドはｐＨ８では僅かな効果しか示さなかったが、これは分析されたＨＣＰ実在物が比較的非疎水性タンパク質であったことに原因するのかもしれない。
【０１０３】
クエン酸Ｎａに基づくＥＯＰＯ ＡＴＰＳ中でのＨＣＰ分配に対するｐＨの効果：
粗供給液及びＡＴＰＳ処理供給液に関するＨＣＰデータを測定した。結果（表５参照）は以下のことを示唆している。
●１３〜２３％のＨＣＰ低減率が生じた。
●ＨＣＰの低減率は緩衝液のｐＨの上昇と共に増加する。
●ＨＣＰの低減率はポリマー濃度の上昇と共に増加する。
これらの結果は、かかる系がポリマープア相を好む疎水性活量塩基性タンパク質（例えば、多くの抗体）に関しては多くの他の系と同様に挙動する一方、ＨＣＰ混合物のある種の成分（通例は数種の酸性タンパク質及び負に帯電したタンパク質を含む）はポリマーリッチ相中により高度に分配されるという考えに合致している。タンパク質の分子量（及び疎水性）もまた、一定の役割を演じることがある。
【０１０４】
【表５】
0005785098.tif 000006
【０１０５】
実施例５：粗供給液からのＭａｂの濃縮
８％ＥＯＰＯ及び２００ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．４）に基づく約１０ｍｌのＡＴＰＳを、０．８ｇの１００％ＥＯＰＯポリマー、固体リン酸塩（８７ｍｇのＮａＨ2ＰＯ4、２４．５ｍｇのＮａ2ＨＰＯ4）及び９．２ｍｌのＭａｂ供給液２から調製した。混合し、水浴中において４０℃で約１５分間インキュベートしたところ、二相系が形成された。相の全容量は９．５ｍｌであって、これは７．７ｍｌの水リッチ相及び１．８ｍｌのポリマーリッチ下部相からなり、４．２７の相容量比を与える。この容量比は、４０％ＥＯＰＯ溶液を０．８Ｍリン酸Ｎａ緩衝液と共に用いて調製した系からの容量比（５．２５）より低い。したがって、濃縮ＥＯＰＯポリマー及び固体リン酸塩から調製したＡＴＰＳを用いればＭａｂ供給液を１６％濃縮できる。
【０１０６】
以前の結果は、相容量比がＥＯＰＯポリマー濃度に逆比例して変化することを表している。Ｂｒｅｏｘ濃度を８％から１２％に移行すると、回収率に影響を与えることなしに標的含有相の容量を低減させ得ることが認められた。我々は、Ｍａｂ供給液２を使用しながら、様々な塩タイプ（リン酸塩及びクエン酸塩）及び塩濃度を有する１２％ＥＯＰＯポリマーの系中でのＭａｂの回収率を検討した。プロテインＡクロマトグラフィー分析を用いて水リッチ相中のＭａｂ回収率を測定した。結果は以下のことを示している。
●系が７〜８のｐＨ範囲で１００ｍＭクエン酸Ｎａ及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む場合、両方のＭａｂ供給液試料に関して約１００％の回収率が得られた。
●８％ＥＯＰＯに基づく系（４．０〜４．１ｍｌ）に比べて少ない容量（３．５〜３．６ｍｌ）の水相が得られた。これは、ＥＯＰＯ濃度を上昇させた場合には高いＭａｂ濃度が得られることを意味している。
我々は、２０％ＥＯＰＯのポリマー濃度で様々な塩濃度を試験した。結果は、１５０ｍＭ ＮａＣｌの存在又は不存在下で１００ｍＭリン酸Ｎａを使用すれば、Ｍａｂ含有水相をそれぞれ１９％及び２８％だけ濃縮できることを示している。
【０１０７】
実施例６：リン酸緩衝液及びクエン酸緩衝液系を用いた粗供給液からのＭａｂの精製
この一連の実験では、８％ＥＯＰＯ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び様々な濃度のリン酸Ｎａ又はクエン酸Ｎａ緩衝液に基づく（かつ２．６ｍｌの粗Ｍａｂ供給液１又は２を含む）１０ｍｌのＥＯＰＯ−ＡＴＰＳを調製した。２５０ｍＭの相逆転した系はＲＴに保った。その他の系は、相を分離させるため、水浴中において４０℃で約１５分間インキュベートした。若干の系からの相の純度をＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動（ゲル勾配８〜２５％）によって分析した（図２）。粗供給液及びＡＴＰＳ実験後の回収Ｍａｂに関するＨＣＰデータを表６に示す。得られた結果からは、以下のような結論を下すことができる。
●リン酸Ｎａ又はクエン酸Ｎａ緩衝液系のいずれについても、ＭａｂはＡＴＰＳによって部分的に精製された（図２参照）。
●２００ｍＭリン酸Ｎａ系に基づくＡＴＰＳによって２０％を超えるＨＣＰを低減させることができ、２５０ｍＭクエン酸Ｎａ緩衝液系では約３０％を達成できる（表６参照）。
●リン酸Ｎａ緩衝液系に比べて、２５０ｍＭクエン酸Ｎａ緩衝液系ではより小さい容量の水相が得られた（８．２ｍｌに対して６．５ｍｌ、表６参照）。これは、クエン酸Ｎａ系の上部相中におけるＭａｂ濃度がより高いことを意味している。
【０１０８】
【表６】
0005785098.tif 000007
【０１０９】
この場合にも、相系がＨＣＰを低減させ得ることがわかる。これらの試験では、ＨＣＰは下部相又は相界面に移動すると推測された。後者の場合、それは細胞破片と会合していたのかもしれない。
【０１１０】
実施例７：ＡＴＰＳ系のさらなる特性決定
水相の導電率
アフィニティークロマトグラフィーその他の捕捉クロマトグラフィーのような後続の分離段階に対する適合性を調べるため、８％ＥＯＰＯ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び様々な濃度の緩衝液（リン酸Ｎａ又はクエン酸Ｎａ）から調製した５ｍｌのＡＴＰＳを（２．６ｍｌの）粗Ｍａｂ供給液の存在下又は不存在下で用いて水相の導電率を測定した。結果は、水リッチ（ポリマープア）標的含有相の導電率が約３０〜４０ｍＳ／ｃｍであったことを示している。我々は、（約３５の導電率を有する）ＡＴＰＳで予備処理したＭａｂをさらなる精製のためＭａｂＳｅｌｅｃｔ（プロテインＡ関連）親和性カラムに直接適用できることを以下に実証する。我々は、これらの溶液が疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びある種の形態の混合モードクロマトグラフィー（又は捕捉濾過）にも適することを提唱する。これらはまた、ある種の形態の標的通過イオン交換又は標的捕捉イオン交換にも適している。試料をイオン交換カラムに直接適用するのであれば、多少の希釈が必要となることもある。しかし、Ｍａｂ又はＦａｂのような標的タンパク質が高度に帯電していれば、２５ｍＳ／ｃｍでも良好な結合を達成するのが可能であり得ることが最近証明された（例えば、Ｃ．Ｈａｒｉｎａｒａｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９５（２００６）７７５−７８７）。
【０１１１】
二相中におけるポリマー含有量の分析
８％ＥＯＰＯ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２００ｍＭ ＮａＰ又はクエン酸Ｎａ緩衝液から調製した水相及びポリマー相中におけるＥＯＰＯポリマーの含有量を、全炭素含有量（ＴＯＣ）法によって分析した。結果は、水相中のＥＯＰＯポリマー含有量が約１％（ｗ／ｗ）にすぎないことを示している。それに対し、ポリマーリッチ相中の含有量は約４０％（ｗ／ｗ）であった。この結果は、１０％（ｗ／ｗ）Ｂｒｅｏｘ ５０Ａ １０００−水二相系に関する文献値（Ｃｕｎｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，７１１（１９９８）５３−６０）に勝っている。この文献中では、相分離を達成して、８の相容量比並びにそれぞれ約３％及び６０％の上部相及び下部相ポリマー濃度を有する系を得るためには温度を６０℃に上昇させることが必要であった。このように本系では、（濾過に続いてカラム上に直接装填すべき）標的含有相中のポリマー含有量は、恐らくはリン酸塩又はクエン酸塩が２００ｍＭで含まれるため、Ｃｕｎｈａ ｅｔ ａｌ．の１／３である。さらに、４０％ＥＯＰＯの下部相は６０％（ｗ／ｗ）ＥＯＰＯの系よりも高度に非標的タンパク質を分配させる能力を有すると予想できる。
【０１１２】
１４％の微小凝集体を含むＭａｂ試料の分離
人工的に自己会合抗体（多量体凝集体）を富化したＭａｂ試料を、８％ＥＯＰＯ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２００ｍＭ リン酸Ｎａ（ｐＨ７）中での分配にかけた。結果は、凝集体濃度の減少も増加も見られないことを示唆している。高度の分配を可能にするＭａｂの表面構造が凝集体表面上になお存在するとすれば、これは恐らく意外なことではない。同様な結果はＭａｂ二量体についても予想される。したがって分配は、理想的には、ＭａｂＳｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィー又はＡｄｈｅｒｅ多モードクロマトグラフィーのような選択的マルチプレート分離方法と組み合わせるべきである。凝集体が相界面張力によって保持され得るサイズに到達すれば、分配は一部の大きい凝集体を除去するはずである。
【０１１３】
実施例８：ＡＴＰＳ及びプロテインＡカラムを用いたＭａｂの精製
粗Ｍａｂ供給液１（２．６ｍｌ Ｍａｂ）を、上述したような（８％ＥＯＰＯ、２００ｍＭリン酸Ｎａ（ｐＨ７）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）系による処理にかけた。上部相からの２ｍｌ画分を集め、さらなる精製のためＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラム上に適用した。適用された試料は約３５ｍＳ／ｃｍの導電率を有していた。カラムをｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で予備平衡化し、６０ｍＭクエン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ３．４）で溶離した。対照として、ＥＯＰＯ−ＡＴＰＳではなく遠心分離及び濾過によって処理した同量の粗Ｍａｂ供給液１（導電率１２ｍＳ／ｃｍ）を同じカラム上で精製した。溶出画分の純度をＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動によって分析した。粗Ｍａｂ並びにＡＴＰＳ及びプロテインＡクロマトグラフィー実験後の回収Ｍａｂに関する（商業的ＥＬＩＳＡからの）タンパク質回収率及びＨＣＰデータを表７及び表８に示す。これらの実験からの結果は、以下のことを示唆している。
●Ｍａｂは、ＡＴＰＳにより、１００％の回収率で部分的に精製された（図３、表７）。
●ＡＴＰＳで予備処理されたＭａｂ試料はＭａｂＳｅｌｅｃｔ上に直接適用できる（図４）。
●（試験した供給液及びＡＴＰＳ系については）ＡＴＰＳによって２０％を超えるＨＣＰ低減率を得ることができる（表８参照）。
【０１１４】
ＡＴＰＳ処理及びＳｕｒｅ処理からの試料間における相対抗体バンド位置のシフトは、（溶出）試料のｐＨ及び導電率の差（即ち、Ｓｕｒｅ溶出試料の低いｐＨ）並びにＡＴＰＳ試料中における残留ポリマーの存在に原因すると考えられる。下部のポリマーリッチ相中に認められる拡散した非バンド化は、該相中に分配されて該相中のタンパク質と相互作用する宿主細胞タンパク質に原因すると考えられる。
【０１１５】
プロテインＡカラムからの回収率は、この試料に関しては、ＡＴＰＳ試料及び供給液試料のいずれについても６０〜７０％の範囲内にある。これはプロテインＡとしては比較的低い（通例１００％が正常である）。しかし、ある種のＭａｂはこのような結果を示すことがある。それでも、ＡＴＰＳ分配は１００％回収率を生じ、Ｍａｂ供給液試料に比べてカラムの性能を変えなかった。
【０１１６】
【表７】
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【０１１７】
【表８】
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【０１１８】
ＡＴＰＳ段階はカラムに適用されるＨＣＰ負荷を低減させる（表８）が、プロテインＡクロマトグラフィー後の低減率に影響を与えなかった。しかし、２２％（この場合）というＨＣＰ負荷の低減は、非特異的汚損の減少及びカラム寿命の増加の点でプロセスに利益をもたらすことができよう。
【０１１９】
実施例９：ＡＴＰＳ及びＣａｐｔｏ ＭＭＣカラムを用いたＭａｂの精製
ここでの目的は、ＡＴＰＳからの水リッチ標的含有相が多モード陽イオン交換体Ｃａｐｔｏ ＭＭＣを含む後続のクロマトグラフィー段階に適合し得るかどうかを検証することであった。実際のＭａｂ供給液１である未清澄化供給液（ｐＨ７）を使用した。Ｍａｂの概略ｐＩは６．５であり、その濃度は０．４ｍｇ／ｍｌであった。ＭＭＣには、熱誘起相の分配後における水リッチ標的含有相を装填した。対照として、遠心分離によって清澄化した供給液を使用した。ＡＴＰＳ系の組成は、８％ＥＯＰＯ、２００ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌであった。いずれの場合にも、装填溶液のｐＨはクロマトグラフィーに先立って５に調整した。
【０１２０】
Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ媒体をＴｒｉｃｏｎ ５／１００中に約１０ｃｍのベッド高さ及び約２ｍｌの全容量で充填した。試料は、１ｍｌの（遠心分離を受けていない）標的含有相又は清澄化供給液であった。流量はすべての試験について１ｍｌ／分（３００ｃｍ／ｈ）であった。ＭａｂをｐＨ勾配によって溶離した。画分容量は２ｍｌであった。緩衝液Ａは５０ｍＭ 酢酸（ｐＨ４．７５）であり、緩衝液Ｂは５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）であった。分析は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０ ＧＬカラムにＰＢＳを０．３ｍｌ／分で流すゲル濾過によって行った。
【０１２１】
最初の実験はややゆがんだ吸収ピークを示し、分析は通過液中へのＭａｂの漏れを示した。加えて、溶出液中には多少の夾雑物が検出された。したがって、我々は供給液試料を半分に希釈して約０．２ｍｇ／ｍｌ Ｍａｂにした。希釈試料をＡＴＰＳ及びＣａｐｔｏ ＭＭＣ分離方法にかけ、ゲル濾過によって分析した。通過液中へのＭａｂの漏れがなかった（図５及び図６）ので、分析はＣａｐｔｏ ＭＭＣ媒体に対するＭａｂの良好な結合を示した。
【０１２２】
Ｃａｐｔｏ ＭＭＣは「高塩クロマトグラフィー樹脂」として推奨されている。これらの結果は、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣが未希釈の標的含有上部相に関連する導電率で試験したＭａｂを結合できたことを示している。ｐＨをタンパク質のｐＩ付近又はそれ以上の点に上昇させることが、結合タンパク質を溶離するための最も効率的な方法である。回収率は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔの結果と同様な６０〜７０％であった。ＨＣＰの低減率は供給液の結果と同様な約９０％であるが、ＭａｂＳｅｌｅｃｔより低い。
【０１２３】
実施例１０：ＡＴＰＳ及びプロテインＡカラムを用いるＭａｂのスケールアップ精製
ここで我々は、本発明に係る分配が、凝集体の形成を増加させたり、回収率を低下させたり、或いはプロテインＡ段階に関して回収率及び純度を低下させたりするようにしてＭａｂを妨害しないことを示す。即ち、ＡＴＰＳは清澄化兼分離段階として作用し、プロテインＡカラムの汚損を引き起こすことがある大きい粒子又は凝集体の含有量を低減させることができた。ＡＴＰＳを直接に発酵容器（又は発酵液を移した容器）内で形成することにより、分配を同一単位操作の一部とすることができ、時間の損失がない。第２の段階として、上述した場合と同様にして、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅを用いてＭａｂ含有画分（水リッチ相）をさらに精製した。
【０１２４】
出発原料は、遠心分離によって清澄化したＭａｂ含有ＣＨＯ細胞発酵供給液２であった。清澄化供給液を使用したのは、それが相分離動力学に従わせるのが容易だったからである。Ｍａｂ濃度は約０．４ｇ／ｌであった。供給液試料は、ゲル濾過で判断したところ、１５〜２０％（Ａ２８０による）の抗体二量体及び凝集体を含んでいた。
【０１２５】
１００％ＥＯＰＯポリマー及び適量の固体リン酸塩を使用した系５を除き、４０％（ｗ／ｗ）ＥＯＰＯポリマー及び０．８Ｍ緩衝液の原液の適当な量／容量を混合することにより、水性二相系を直接に１リットルのガラスシリンダー内で調製した。各系の最終容量は、供給液の添加によって８００ｍｌに調整した。各系を混合し、次いで耐候試験機内において４０℃でインキュベートした。ただし、系３は室温に保った。相の形成後、相形成時間、各相の容量及び相容量比を記録した（表９参照）。次いで、各系からのＭａｂ含有水リッチ相をさらなる精製のために取り出した。
【０１２６】
表９は、様々な二相系からのデータを示している。一部の欄は２つの値を含んでいる。これは中間相のサイズに原因するものである。中間相はいくつかの方法で集めることができる。系５では、塩を最終濃度になるように固体結晶として添加した。
【０１２７】
【表９】
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【０１２８】
これらの８００ｍＬ系は、３０分から１２０分までの様々な時間にわたって相分離を示したことがわかる。相分離は、容量よりも相系の高さ（深さ）に大きく依存することに注意すべきである。即ち、２０ｃｍの高さを有する１Ｌ系は、２０ｃｍの高さを有する５００Ｌ系と同様にして相分離し得る。これは、２０ｃｍの高さを有する５００Ｌ系を半径９０ｃｍの容器内で処理できるので重要である。
【０１２９】
プロテインＡクロマトグラフィー
クロマトグラフィーは５ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅを用いて実施した。分析は、１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラム及びＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０ ＧＬを用いて実施した。試料は５０ｍｌの供給液又は水リッチ相であり、緩衝液Ａは０．１５Ｍ ＮａＣｌ中の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）であり、緩衝液Ｂは５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ＝３．０）であった。流量は５ｍｌ／分（１５０ｃｍ／ｈ）、勾配は０〜１００％の階段勾配であった。通過液及び溶出液を集め、さらにＭａｂ、ＨＣＰ及び凝集体レベルを分析した。回収率の推定及びその他の分析を一層正確に（カラムを汚損することがある大きい凝集体に関係しないように）するため、水リッチ相を遠心分離してから後続のクロマトグラフィー段階に適用した。したがって、この遠心分離段階はクロマトグラフィーに先立つテプス濾過と同等なものと見なされた。
【０１３０】
試料の分析
ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラムを用いてＭａｂの濃度を測定した。５０μｌの試料を１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラムに適用した。溶出液ピークの面積を積分し、それぞれ供給液及び水相の容量を掛けた。ＡＴＰＳを用いた抽出に関する回収率を、面積単位の総数を比較することで算出した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ段階に関するＭａｂの回収率を同様にして算出した。試料：５０μｌの供給液又は水相、カラム：１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ、緩衝液Ａ：ＰＢＳ、緩衝液Ｂ：１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ＝３．０）、流量：１ｍｌ／分（１５０ｃｍ／ｈ）、勾配：０〜１００％Ｂの階段勾配。
【０１３１】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０ ＧＬゲル濾過カラムを用いて、二量体及び凝集体（さらにＭａｂ濃度）を測定した。二量体ピーク及び単量体ピークの面積をＵＮＩＣＯＲＮソフトウェアによって自動的に積分した。供給液及び水相からの二量体の総面積を比較した。試料：５０μｌの供給液又は水相、カラム：３ｍｌ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０ ＧＬ、緩衝液：ＰＢＳ、流量：０．３ｍｌ／分（４５ｃｍ／ｈ）。
【０１３２】
結果
いかなる希釈或いはｐＨ又は導電率の変化もなしに、水相をＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラムに直接適用することが可能であった（図７）。
【０１３３】
ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラムを用いて、供給液及び水相からのＭａｂ濃度の分析を行った（図８）。図８では、粗供給液を分析した。図からわかる通り、大部分のタンパク質及び他の２８０ｎｍＵＶ吸収化合物はカラムを直ぐに通過した。
【０１３４】
図９は、系３の上部相に関するＭａｂ濃度の分析結果を示している（表９）。このクロマトグラムは全体的な形状が図８に類似しているが、これは予想されたことである。図１０は、親和性カラムを通過させた上部相に関する溶出液試料の親和性分析結果を示している。図８及び図９と比較すれば、Ｍａｂ（２番目のピーク）に対する親和性カラムの濃縮効果がわかる。
【０１３５】
表１０は、表９中の様々な試験で得られた結果を示している。二相抽出からのＭａｂ回収率は、１例を除くすべての場合について＞９５％であることが示されている。試験した条件下では、このＭａｂ試料の場合、二相抽出はＨＣＰの低減率にあまり寄与せず、それは１０％未満であった。しかし、この場合、系はＭａｂ回収率を最適化するように選択された。単量体と二量体との比が変化しなかったことから判断すると、凝集体濃度の明らかな低減は存在しなかった。
【０１３６】
表１０はまた、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ試験からの結果の要約も示している。即ち、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラムからの溶出液を出発原料と比較した。出発原料は供給液又は様々な標的含有水リッチ相であった。予想された通り、回収率はほぼ１００％であり、ＨＣＰの低減率は＞９９％であった。二量体／凝集体の低減率は不確実であり、分析方法の変動の範囲内にあるのかもしれない。供給液及びこの段階からの溶出液中の二量体／凝集体比を比較すると、差が存在している。供給液では、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ段階前の比は０．１７であるのに対し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ段階後には０．１４〜０．１５である。
【０１３７】
【表１０】
0005785098.tif 000011
【０１３８】
結果の分析に関しては、Ａｋｔａクロマトグラフィーユニット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で動作させたＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラムを用いてＭａｂ濃度を測定した。５０μｌの試料を１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラムに適用した。緩衝液Ａは１０ｍＭリン酸Ｎａ（ｐＨ７．２）中の１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ＰＢＳ）、緩衝液Ｂは１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３）、流量は１ｍｌ／分（１５０ｃｍ／ｈ）、勾配は０〜１００％Ｂの階段勾配であった。溶出液ピークの面積を積分し、それぞれ供給液及び水相の容量を掛けた。ＡＴＰＳを用いた抽出に関する回収率を、面積単位の総数を比較することで算出した。
【０１３９】
（分配後の）ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ段階に関するＭａｂの回収率を同様にして算出した。若干の場合には、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０ ＧＬゲル濾過カラムを用いて、二量体及び凝集体（さらにＭａｂ濃度）を測定した。二量体ピーク及び単量体ピークの面積をＵＮＩＣＯＲＮソフトウェアによって自動的に積分した。供給液及び水相からの二量体の総面積を比較した。試料：５０μｌの供給液又は水相、カラム：３ｍｌ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０ ＧＬ、緩衝液：ＰＢＳ、流量：０．３ｍｌ／分（４５ｃｍ／ｈ）。ＧｙｒｏＬａｂを用いて宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を測定した。
【０１４０】
例えば、回収率が１１０％を超える場合（系５の溶出液）及び系８の溶出液に関して７６％である場合には、２つの結果をアウトライヤーと見なすのは容易である。多年の経験によれば、回収率は試験した条件下ではすべてのプロテインＡ媒体について常に１００％に近いはずであることが示唆されている。
【０１４１】
水相及び出発原料中のＨＣＰ含有量（図１０）を比較すると、相対ＨＣＰ濃度の僅かな低下が見られる。即ち、ＡＴＰＳはＨＣＰ含有量を低減させる。二量体／凝集体の低減になると、一部のＡＴＰＳは二量体の濃度を僅かに増加させたように思われた。その差は小さく、分析方法の分散の範囲内にあるものかもしれない。
【０１４２】
ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ段階後、予想された通り、ＨＣＰの大きな低減が見られた。２つの方法、即ち「Ｓｕｒｅ」方法及びゲル濾過によってそれぞれ回収率を測定した。これらの間には差があるが、いずれの方法も相系及び後続のプロテインＡからわの高い回収率を示した。
【０１４３】
実施例１１：リン酸Ｎａ及びクエン酸Ｎａに基づくＡＴＰＳ中におけるＦａｂの分配
Ｍａｂタンパク質は、それが比較的疎水性でありかつ通例は正の正味電荷を有するため、リン酸塩又はクエン酸塩のような塩を含むＥＯＰＯ−水ＡＴＰＳ中の水リッチ相を好む傾向があると推測される。極めて疎水性であるＧＦＰも高いＫ値を示すとすれば、ブレンステッド式によって予測されるようにサイズが二次的な役割を演じることがある。その予測は、系が分子集合体、二量体及びモノマーＭａｂ形態を差別的に分配できないこと（上記参照）によって裏付けられる。幸いにも、それはまた、分配が抗体のＦａｂフラグメントタンパク質（Ｆａｂ）に対しても適していることを示唆している。リン酸Ｎａ及びクエン酸Ｎａ緩衝液に基づくＥＯＰＯ−ＡＴＰＳにおいて、系分配中に０．５ｍｇ Ｆａｂを各系に添加することで、ＭＷが約５．５ｋＤａのポリクローナルＦａｂ（ｐＩ：５．５〜９．５）の分配を試験した。４０℃での相形成後、相を分離し、各相の吸光度を分光光度計によって２８０ｎｍでモニターした。分配係数（Ｋ）及び上部相中における各Ｆａｂの％濃度（（Ｃ／Ｃｏ）×１００％）を算出した（表１１参照）。結果は、クエン酸Ｎａ緩衝液に基づく水相中におけるＦａｂの回収率がリン酸Ｎａ緩衝液に基づく類似の相中（６０％）より高い（７９％）ことを示している。これらの分配値は、この報告中で注目されたＭａｂ及びポリクローナルＩｇに関する典型値より低い。しかし、試験した系はＦａｂでなくＭａｂに対して最適化されていた。加えて、Ｆａｂ試料は明らかにｐＩが極めて酸性であるタンパク質を多少含んでいたので、その分配Ｋ値が低いことがあるのは意外でない。
【０１４４】
【表１１】
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【０１４５】
実施例１２：ＥＯＰＯ系ＡＴＰＳ中におけるタンパク質選択性
８％ＥＯＰＯ、２００ｍＭリン酸Ｎａ（ｐＨ７．４）及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５ｍｌの系中において、様々なｐＩを有するタンパク質を４０℃で分配した。系中の全タンパク質濃度は１ｍｇ／ｍｌであった。相形成後、相を分離し、各相の吸光度を分光光度計によって２８０ｎｍでモニターした。分配係数（Ｋ）を算出し、表１２にまとめて示す。結果は、塩基性タンパク質が完全に水相中に分配されたのに対し、最も酸性のタンパク質は上部相及び下部相の両方に分配されたことを示唆している。ポリクローナルＩｇ試料は約７の平均ｐＩを有していたにもかかわらず、恐らくは疎水性及びサイズのために（以前に認められたような）高いＫ値を示した。
【０１４６】
【表１２】
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【０１４７】
分配は、親水性（水リッチ相を好む陽性タンパク質による単位面積当たりの正味電荷）及び疎水性（自己会合したＥＯＰＯ相が排除するので水リッチ相中により多く存在する疎水性タンパク質）の両方に関係するはずである。試験した系は相当量のリン酸Ｎａ及びＮａＣｌを含み、したがって大部分のタンパク質が顕著な上部相分配を示したことは意外でないかもしれない。しかし、かかる系に関しても、ある程度の選択性が実証された。ここに述べた他の結果に基づけば、ＮａＣｌ及びリン酸Ｎａを１００ｍＭ ＮａＣｌに減少させかつｐＨを８に上昇させると、α−ラクトアルブミン、ＢＳＡ及びミオグロビンに関するＫ値を低下させてより選択的な系を導くことができる。しかし、かかる系は抗体のような標的に関して最良の回収率を与えないかもしれない。低分配タンパク質が標的タンパク質である場合、その分配は、塩、ｐＨ、疎水的親和性リガンドの含有、又は上記実施例中に記載された他の変量を変化させることで増加させ得る。
【０１４８】
実施例１３：ミルク又は血液に対する二相系の形成
植物、ミルク、血液などに含まれる組換えタンパク質又は天然タンパク質のような各種の生物関連試料に対して二相系を使用する可能性に関し、ミルク系又は血液系の溶液を処理できるか否かを調べるための研究を実施した。ミルクに関する実験では、二相の形成について４種の条件をスクリーニングした（表１３参照）。一部の条件で相系が形成されたが、その相形成は脂肪物質の存在並びに（恐らくは）高カルシウムレベルによって複雑化されることが認められた。後者は、オキシポリマー及びリン酸塩とキレート化し、リン酸緩衝食塩水水のＰＥＧに塩化カルシウムを添加した場合に生じるような沈殿を形成し得ることが知られている。結果は、本プロセスがスキムミルクに対して一層良く働くことを示唆している。
【０１４９】
【表１３】
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【０１５０】
血液に関する実験では、Ｂｒｅｏｘ ５０Ａ ＥＯＰＯポリマー原液及びクエン酸Ｎａ（ｐＨ７．４）原液を７ｍｌの血液（これは天然に１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む）に添加することで、１５ｍｌのキャップ付きプラスチック円錐管中に１０％ＥＯＰＯ及び容量１０ｍｌの約７０％（ｖ／ｖ）血液等張溶液を生成した。手で穏やかに転倒させることにより３７℃で混合した後、混合物は１０分以内に２つの液相及び細胞領域に分離した。このように処理した血液試料に関しては、良好な相形成、清澄化及び相分離が見られた（データベースは示さず）。
【０１５１】
実施例１４：Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ８１による二相系の形成
Ｂｒｅｏｘ及びＵｃｏｎポリマーは、ＥＯ及びＰＯのランダムコポリマーである。Ｐｌｕｒｏｎｉｃは、(ＥＯ)x(ＰＯ)y(ＥＯ)x型のコブロックコポリマーである。（１０％ＥＯ及び９０％ＰＯを含みかつ約２７００の全ポリマーＭＷを有する）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ８１ポリマーに基づくＡＴＰＳ中におけるＭａｂの回収率を調べるため、Ｍａｂ供給液２を用いて、相異なる塩タイプ（リン酸塩及びクエン酸塩）に関する若干の実験を行った。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ８１は上記の研究の多くで使用したＢｒｅｏｘポリマーより低いＴｃを有しており、室温で使用するのに適するかもしれない。ポリマー濃度が１０〜２０％である場合、二相系は室温で形成されたが、これは他の熱応答性クラウディングポリマーも本発明の方法で使用するのに適していることを表している。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ分析を用いて、水リッチ相中の（供給液２からの）Ｍａｂ回収率を測定した。ＥＯＰＯに基づくＡＴＰＳを対照として使用した。結果を表１４に示すが、これはＥＯＰＯ系に関して９２％以上及び（非最適化）Ｌ８１系に関して８６％以上のＭａｂ回収率を示している。
【０１５２】
【表１４】
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【０１５３】
実施例１５：使い捨てバイオリアクター内における１４リットルスケールの分配
ここで我々は、１４リットルスケールで遠心分離なしに細胞除去（清澄化）を可能にするため、Ｂｒｅｏｘ（ＥＯＰＯ）ポリマーを塩との濃縮状態で直接にＷＡＶＥ（商標）バッグ中の１０Ｌ Ｍａｂ細胞培養物に添加してなる水性二相系（ＡＴＰＳ）を使用することを示す。この研究では、容量低減を最適化するのではなく混合の容易さを助けるため、ポリマー及び塩原液を添加する方法が選択されたことに注意されたい。その上、相系は迅速な分離及び良好なＭａｂ回収率を達成するようにも選択された。それは、Ｍａｂ回収率と宿主細胞タンパク質除去とのバランスを取るように最適化されたわけではなかった。上記の実施例に基づけば、ＨＣＰ及び他の夾雑物の除去に関する試薬添加方法及び系最適化は、機能し得るモデル系が実証できれば明らかであるように感じられた。
【０１５４】
実際の供給液４のＭａｂ細胞培養物はＣＨＯ細胞株で発現される。培養期間は１８日であり、培養容器は２０Ｌのバッグ及びｐＨ／オキシウェルを有するＷＡＶＥバイオリアクター系２０／５０であった。培養液は、５ｇ／Ｌの加水分解物ＵＦ８８０４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を含みかつ必要に応じてグルコース及びグルタミンを供給したＰｏｗｅｒＣＨＯ２（Ｌｏｎｚａ社）であった。供給液試料は、細胞の平均生存率が４０％を下回った場合に収穫可能と定義された。ＷＡＶＥバッグの内容物は、ポリマー−塩溶液を添加した場合、４２℃に温度安定化された。
【０１５５】
ＡＴＰＳポリマー系は、９．５ｋｇのＭａｂ供給液４を含むＷＡＶＥバッグ中に原液混合物を直接ポンプ注入することで調製した（図１１参照）。
【０１５６】
【表１５】
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【０１５７】
１０％（ｗ／ｗ）ＥＯＰＯ、２００ｍＭリン酸Ｎａ（ｐＨ８．０）及び１５０ｍＭ ＮａＣｌの最終濃度を達成するためには、表１５に従って原液を予備混合した。かくして、総量８．３７Ｌのこの混合物を４０℃まで加熱し、次いで蠕動ポンプを用いて（ほぼ同じ温度を有する）ＷＡＶＥバッグ中の供給液材料に注入した。ポリマー混合物のポンプ注入時間は約５０分であった。ＷＡＶＥリアクター上に混合物を放置して１５分間振盪した後、バッグホルダーを含めたＷＡＶＥバッグをリアクターから取り外し、長軸が垂直になるようにして実験台上に配置した（図１１参照）。これは、相形成の可視化を助けると共に、バッグのチューブ挿入口をバッグの上部及び下部に位置させた。それはまた、一層ラージスケールのプロセスにおいて予想されるものに一致するように相の高さを調整した（上記の議論を参照されたい）。二相系の形成は５分後に認められ、３０分後に完了した。図１２に見られるように、細胞破片の層が界面に形成された。次いで、ＷＡＶＥバッグの上部からチューブを挿入し、それを蠕動ポンプに連結することで、上部相を複数の瓶に移した（図１２参照）。次いで、ＷＡＶＥバッグを長軸が垂直になるように配置した場合にその下部コーナーになる部分に取り付けたチューブを用いて、下部（ポリマー）相を瓶に移した（図１１参照）。
【０１５８】
複数の瓶からの集めた上部相材料をプールし（約１３．５Ｌ）、次いで６インチＵｌｔｒａ ＨＣ ０．２μｍフィルターに連結した６インチＵｌｔｒａ ０．６μｍ ＧＦを用いて濾過した。７リットルの材料を濾過した後、圧力が２．５バールに増加したので、６インチＵｌｔｒａ ０．６μｍ ＧＦを新しいフィルターと交換した。濾過した材料をＷＡＶＥバッグ中に集め、次いで４℃に保った。
【０１５９】
ＡＴＰＳ後の上部ポリマープア相画分中におけるＭａｂの回収率を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ分析（上記参照）を用いて測定した。粗供給液及びＡＴＰＳ実験後の回収Ｍａｂに関するＭａｂ回収率及び宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）データを表１６に示す。これらの実験からの結果は、ＭａｂがＡＴＰＳによって＞９９％の回収率で部分的に精製され（表１６）、細胞破片の顕著な除去（図１１及び図１２）も見られることを示していた。この実験で使用した水性ポリマー二相系によってＨＣＰの顕著な低減は得られなかった（表１６）。
【０１６０】
【表１６】
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【０１６１】
９．５ｋｇのＭａｂ細胞培養物（供給液４）を含む２０ＬのＷＡＶＥバッグに、８Ｌを超えるポリマー溶液をポンプ注入した。二相系の形成は５分後に既に認められ、３０分後に完了した。細胞及び破片の層が界面に形成された。ＡＴＰＳによれば、細胞及び破片は成功裡に除去され、標的Ｍａｂタンパク質は水性上部相中にほぼ完全に回収された。実際の供給液に関するスモールスケール研究の場合と同じく、簡単な濾過後、清澄化Ｍａｂ含有相をＭａｂの損失又はカラム性能の低下なしにＭａｂＳｅｌｅｃｔ親和性カラムに直接適用することができた。
【０１６２】
実施例１６：ウイルス及びウイルスワクチンの処理
一般実験手順
ウイルス関連の実験は、上記の抗体発酵供給液及びそれに関連する実験からの代表的な系をウイルスワクチン処理に関連する実験に適用することを含んでいた。したがって、同様なポリマー、塩、系及び技法を使用した。２種のウイルス株を用いて２つの例示的な実験を行った。第１のものはＣＨＯ細胞タンパク質で増強されたショ糖勾配精製ウイルスを用いた分配を含み、第２のものは（同一供給源からの）清澄化かつ濃縮ウイルスで増強された実際のウイルス供給液であった。
【０１６３】
化学薬品、試薬及びウイルス株
Ｂｒｅｏｘ（商標）５０Ａ １０００1、ＭＷ ３９００、上記参照。
【０１６４】
本研究で使用した他の化学薬品はすべて分析用のものであって、ＭＥＲＣＫ社から購入した。
【０１６５】
1本研究で使用したＢｒｅｏｘ（商標）は通常の工業用界面活性剤であり、いくつかの供給源から入手できる。同様なポリマーはバイオ医薬品の処理及び製剤化で使用されていて、その場合にこれらは様々な機能を果たす。Ｂｒｅｏｘ ５０Ａ １０００は、５０％エチレンオキシド及び５０％プロピレンオキシドからなるランダムコポリマーである。その分子質量（数平均）は３９００Ｄａであり、膜タンパク質の抽出のために有用なＢｒｅｏｘ−洗浄剤二相系（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，ｖｏｌ ７１１，ｐｐ．５３−６０，１９９８を参照されたい）に関連した大規模研究で使用するためにはＫＴＨ（バイオテクノロジー部）によってＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（サウサンプトン、英国）から入手した。Ｂｒｅｏｘ系列のポリマーは極めて安全で生体適合性を有するように思われ、ある種の製剤中に使用されている。
【０１６６】
ウイルス材料
２種の生物学的材料の試料を使用した。第１のものは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞発酵液からＭａｂＳｅｌｅｃｔ親和性カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）通過液（ＦＴ）を取り出すことで得たワクチン増強ＣＨＯ細胞系供給液であった。ＦＴはＭａｂをほとんど又は全く含んでいなかったが、標準的なＣＨＯ宿主細胞タンパク質及び他の夾雑物は含んでいた。それをＡ／Ｈ１Ｎ１／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａインフルエンザウイルスの４０％ショ糖勾配で精製されたインタクトウイルス画分（ホルムアルデヒド処理、赤血球凝集素（ＨＡ）濃度約２００μｇ／ｍｌ）で富化した。
【０１６７】
第２の試料（ウイルス供給液という）は、約１３．８μｇ／ｍｌのＨＡ濃度を有する（ＭＤＣＫ細胞中で増殖させた）活性Ａ／Ｈ１Ｎ１／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓインフルエンザウイルスの粗収穫物に基づいていた。結果を一層容易に評価するため、９ｍｌの清澄化かつ濃縮Ａ／Ｈ１Ｎ１／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓインフルエンザウイルス（約７３μｇ／ｍｌ）を５１ｍｌの粗収穫物に添加することでウイルス供給液中のウイルス濃度を増加させた。このウイルス材料はまた、１０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ７．４）及び０．１５Ｍ ＮａＣｌを含んでいた。
【０１６８】
分配方法
以下の表１７に示す原液の適当な量／容量を混合することで、各々の水性二相系（ＡＴＰＳ）を直接に１５ｍｌ Ｓａｒｓｔｅｄｔ管中で調製した。かかるＡＴＰＳは、１００ｍＭ ＮａＰ（ｐＨ７）及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ中の８〜１２％ＥＯＰＯ系に基づいていた。ウイルス供給液混合物の添加後、各系の最終容量をＰＢＳで１０ｍｌに調整した（表参照）。混合物を約３０秒間渦動させ、次いでオーブン内において４０〜４５℃で約１時間放置して相形成させた。次いで、形成された相を分離し、以下に示す方法で分析した。
【０１６９】
原液
ＢＲＥＯＸ ５０Ａ １０００、１００％（ｗ／ｗ）：そのまま使用した。
【０１７０】
ＮａＰ（リン酸Ｎａ、０．８Ｍ）：０．８Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4及び０．８Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4の適量を混合することでｐＨ７とした。
【０１７１】
ＮａＣｌ（５Ｍ）：１４．６ｇのＮａＣｌを５０ｍｌのＭＱ水に溶解することで調製した。
【０１７２】
【表１７】
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【０１７３】
分析
ショ糖勾配で精製されたウイルス増強ＣＨＯ細胞試料に関する分配結果を、インタクトなウイルス粒子を検出する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法（宝酒造）を用いて分析した。これは、ショ糖密度勾配で精製された試料のインタクトウイルス画分からのウイルスでＣＨＯ ＦＴ供給液を増強した場合（上記）に一致している。
【０１７４】
実際のワクチン供給液試料の結果を標準の商業的に利用できるアッセイに従って分析した。総タンパク質はＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって分析し、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は（ＭＤＣＫ細胞のゲノムＤＮＡに対する）ｑＰＣＲアッセイ及びＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）によって分析し、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）は（ＭＤＣＫ細胞に対するウサギポリクローナル抗体を用いる）Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に基づく表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイの使用によって分析し、ウイルスＨＡはＢｉａｃｏｒｅ ＳＰＲアッセイ（Ｃ．Ｅｓｔｍｅｒ Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ ２８（２０１０）７５９−７６６参照）によって分析した。Ｂｉａｃｏｒｅ ＨＡアッセイはウイルスＨＡタンパク質を検出し、したがってウイルス関連夾雑物（ＨＡ）を含む他のウイルス破片及び細胞破片のすべてに対しても感受性を有する。
【０１７５】
前述した通り、上部相中のＢｒｅｏｘ ＥＯＰＯポリマー濃度は約１％（ｗ／ｗ）である一方、下部相中ではそれは遙かに高い（例えば、７０％）と予想される。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイに対するＥＯ（ポリエチレングリコール）及びデキストランのような親水性ポリマーの効果が、Ｂａｒｂａｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｄｅｘｔｒａｎ ｏｒ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）（ＰＥＧ）ａｎｄ ｄｅｘｔｒａｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｂｒａｄｆｏｒｄ ｍｅｔｈｏｄ．Ｈｅｌｄｅｒ Ｂａｒｂｏｓａ，Ｎｉｇｅｌ Ｋ．Ｈ．Ｓｌａｔｅｒ，Ｊｏａｏ Ｃ．Ｍａｒｃｏｓ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９５（２００９）１０８−１１０）を始めとする複数の著者によって研究されている。彼らは、１０％を超えるＰＥＧ濃度がアッセイ感度の実質的な低下をもたらすと結論づけている。
【０１７６】
結果及び考察
相異なるＢｒｅｏｘポリマー濃度（８〜１２％ｗ／ｗ）を有する３相系を二重反復実験で試験した。系及び塩の組合せは、タンパク質処理に関して試験したものと同じであった。４０℃より高く加熱したところ、供給液試料中に二相が容易に形成された。下部相は高いポリマー濃度のために分析するのが困難であったが、上部相は加熱前の一相系と同様に容易に分析された。若干の場合には、熱応答性ＥＯＰＯブロックコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ８１）を用いて同様な結果が得られた（データは示さず）。全体の結果を図１３に示す。３種のＥＯＰＯポリマー濃度のいずれにおいても、実際のウイルス供給液試料は基本的に同様な結果を与えたことがわかる。即ち、Ｂｉａｃｏｒｅ ＨＡアッセイによる上部相中のウイルスＨＡは約２０％であり、上部相中のＨＣＰは６０〜７０％であり、上部相中の総（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質は７０〜８０％であり、上部相中のＤＮＡは５％未満であった。供給液が清澄化ＣＨＯ細胞供給液で増強されたインタクトなショ糖勾配精製ウイルスである別の実験では、（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）アッセイで測定された）上部相へのＤＮＡ分配は７０％であったのに対し、ＥＬＩＳＡアッセイによって分析されたインタクトウイルスの上部相分配は７０〜１００％であった。ＤＮＡ分配は、ＥＯＰＯの２ポリマー系に関して国際公開第２００４／０２０６２９号に記載されたものと一致している。
【０１７７】
かかるデータは、供給液中に形成された単一応答性ポリマーの二相系を用いて、さらなる処理のためにウイルス供給液の清澄化及びインタクトウイルス粒子の一次回収を行うのが可能であることを示している。Ｍａｂ処理の場合と同じく、上部相は多少のＨＣＰ及び多少のＤＮＡ並びにウイルスを含むが、アフィニティークロマトグラフィーその他の方法によるさらなる処理を施すことができるはずである。実験は、使用するアッセイ又は供給液のタイプに応じてウイルス及びＤＮＡの分配係数に顕著な差があることを示唆している。これは、一部では、相間におけるインタクトウイルス及びウイルス破片の不均等な分配の関数であるのかもしれない。細胞及びウイルス破片を含む試料においてやや意外にも上部相中へのＤＮＡ分配がないことは、部分的には、ＤＮＡと細胞及びウイルス破片との相互作用によってＤＮＡが破片と共に界面に集積することで説明できる。
【０１７８】
本明細書中で言及された特許、特許出願公開及びその他の公表参考文献のすべては、各々が個別かつ詳細に本明細書中に組み込まれた場合と同じく、その全体が援用によって本明細書の内容の一部をなしている。以上、本発明の好ましい例示的な実施形態を記載してきたが、当業者には、限定のためでなく例示を目的として示した記載の実施形態以外のやり方でも本発明を実施できることが容易に理解されよう。本発明は、以下に示す特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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