(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における肺癌の存在を検出する方法であって、前記方法は、前記被験者からの試料中の一つの標的ＲＮＡのレベルの検出を含み、ここで前記一つの標的ＲＮＡは：
（ｉ）  配列番号１０８９の配列を有する核酸に特異的にハイブリダイズすることができる、あるいは、
（ｉｉ）  配列番号１０８９の配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドと相補的である配列を含み、
ここで前記標的ＲＮＡの正常レベルを超える、前記試料中の一つの標的ＲＮＡのレベルは、前記被験者における肺癌の存在を示す、方法。
【請求項２】
被験者における肺癌の治療の有効性を評価するための方法であって、
（ａ）  前記被験者からの試料中の一つの標的ＲＮＡのレベルを検出することを含み、ここで前記標的ＲＮＡは：
（ｉ）  配列番号１０８９の配列を有する核酸に特異的にハイブリダイズすることができる；あるいは、
（ｉｉ）  配列番号１０８９の配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドと相補的である配列を含み、
ここで前記試料中の一つの標的ＲＮＡのレベルが前記治療前よりも低いことが、前記治療の有効性を示す、方法。
【請求項３】
前記試料中の標的ＲＮＡのレベルの検出は、
（ａ）  前記試料の核酸を、前記試料中の標的ＲＮＡまたはそれらの相補配列と相補的である少なくとも一つのポリヌクレオチドとハイブリダイズさせること；ならびに、
（ｂ）  前記標的ＲＮＡ、前記標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコン、および前記標的ＲＮＡの相補配列から選択される少なくとも一つの核酸とハイブリダイズしたポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの複合体を検出すること
を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法は、前記試料から核酸を単離することをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸は、ＤＮＡから分離されたＲＮＡを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも一つの追加の標的ＲＮＡのレベルが検出される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法であって、ここで前記追加の標的ＲＮＡは：
（ｉ）  配列番号１から３９７、１０６３から１０８８、１０９０から１２１０、２０６４から２１８３、２６７３から２６８０、および２６８９から選択される配列を有する核酸に特異的にハイブリダイズすることができる；あるいは、
（ｉｉ）  配列番号１から３９７、１０６３から１０８８、１０９０から１２１０、２０６４から２１８３、２６７３から２６８０、および２６８９から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドと相補的である配列を含む；あるいは、
（ｉｉｉ）  配列番号７９４から９１６、９１８から１０４３、２５７６から２６７２、および２６９２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含む、
方法。
【請求項７】
少なくとも一つの標的ＲＮＡの正常レベルを超える、少なくとも一つの標的ＲＮＡのレベルの検出が、肺癌の存在を示す、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも二つの標的ＲＮＡの正常レベルを超える、少なくとも二つの標的ＲＮＡのレベルの検出が、肺癌の存在を示す、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも二つの追加の標的ＲＮＡのレベルが検出される、請求項６に記載の方法であって、
ここで前記少なくとも二つの追加の標的ＲＮＡは：
（ｉ）  配列番号１から３９７、１０６３から１０８８、１０９０から１２１０、２０６４から２１８３、２６７３から２６８０、および２６８９から選択される配列を有する核酸に特異的にハイブリダイズすることができるか、あるいは、
（ｉｉ）  配列番号１から３９７、１０６３から１０８８、１０９０から１２１０、２０６４から２１８３、２６７３から２６８０、および２６８９から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドと相補的である配列を含むか、あるいは、
（ｉｉｉ）  配列番号７９４から９１６、９１８から１０４３、２５７６から２６７２、および２６９２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含み、
ならびに、
ここで前記少なくとも二つの追加の標的ＲＮＡは異なっている、方法。
【請求項１０】
少なくとも一つの標的ＲＮＡの正常レベルを超える、少なくとも一つの標的ＲＮＡのレベルの検出が、肺癌の存在を示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも二つの標的ＲＮＡの正常レベルを超える、少なくとも二つの標的ＲＮＡのレベルの検出が、肺癌の存在を示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも三つの標的ＲＮＡの正常レベルを超える、少なくとも三つの標的ＲＮＡのレベルの検出が、肺癌の存在を示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも五つの標的ＲＮＡの前記レベルが検出される、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料は肺組織である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記肺組織は、気管支鏡検査法によって採取された肺細胞の試料である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料は血液または血清である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年２月２５日に出願された米国特許仮出願第６１／１５５，３６４号の優先権を主張し、目的に応じてその全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、世界のがんによる死亡の主要な死因である。肺癌は、小細胞肺癌（「ＳＣＬＣ」）と非小細胞肺癌（「ＮＳＣＬＣ」）の２つの型に分類される。ＳＣＬＣは、予後不良を伴う極めて高悪性型の肺癌であり、診断後の生存期間の中央値は約１ヵ月から３ヵ月である。肺癌症例の約８０％は、ＮＳＣＬＣとして分類され、ＮＳＣＬＣは腺癌、扁平上皮癌と大細胞癌の３つの亜型に分類される。すべてのＮＳＣＬのうちで８５％を超えるのは、腺癌または扁平上皮癌のいずれかである。
【０００３】
肺癌は、外見的症状が何ら現れないこともあるので、初期病期で診断するのが困難である。症状が現れるとき、症状は癌の種類、肺癌の位置および広がるパターンによって変わる可能性があり、したがって、癌と容易に相関がみられない。肺癌がすでに転移しているときに、唯一正確に診断されることが多い。
【０００４】
肺癌を診断するための現在の技法としては、胸部Ｘ線および／またはコンピュータ断層撮影（「ＣＴ」）走査が挙げられる。これらの技法のうちの１つによる診断は通常、より侵襲的な手法、たとえば経皮的肺生検法または経気管支性生検法によって確認されるが、これらの生検は依然として肺癌の誤診をもたらすこともある。（Ｂｕｔｎｏｒ  （２００８）  Ａｒｃｈ．  Ｐａｔｈｏｌ．  Ｌａｂ．  Ｍｅｄ．  １３２：１１１８−１１３２）。
【０００５】
治療（たとえば、手術、化学療法、放射線療法または併用による）における進歩にもかかわらず、肺癌の予後は、依然として不良であり、わずかに１５％の患者が診断の時期から５年以上生存している。最も一般的なＮＳＣＬＣのうち、腺癌はより急速に進行し、したがって扁平上皮癌より予後がさらに悪い。扁平上皮癌は発現するまで数年かかり、したがって、初期病期で診断される可能性が高い。
【０００６】
肺癌の死亡率および罹患率を低下させるための１つの提案は、無症候者において肺癌を検出するおよび治療するためには、リスクの高い個人、たとえば現在喫煙している、または一定期間大量に喫煙していた人たちが定期的なスクリーニングを開始することである。このような方法で、初期病期の肺癌は、外科的切除によって根絶させることができ、この方法は治癒のための唯一の現実的な選択であると考えられる。（Ｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ９９：５５７−５６２）。
【０００７】
肺癌の分子標識に対する必要性が依然として残っている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一部の実施形態では、被験者において肺癌の存在を検出する方法が、提供される。一部の実施形態では、方法は被験者からの試料において少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを検出することを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡは、（ｉ）配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、２０６４〜２１８３、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列を有する核酸に特異的にハイブリッド形成することができる；または（ｉｉ）配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、２０６４〜２１８３、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドに相補的である配列を含む；または（ｉｉｉ）配列番号７９４〜１０４３、２５７６〜２６７２、および２６９２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡの正常なレベルを超える、試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルは、被験者において肺癌の存在を示す。一部の実施形態では、該方法は、試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルと、少なくとも１つの標的ＲＮＡの正常なレベルとを比較することをさらに含む。
【０００９】
一部の実施形態では、被験者において肺癌の検出を容易にする方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、被験者に由来する試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを検出することを含む。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、（ｉ）配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、２０６４〜２１８３、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列を有する核酸に特異的にハイブリッド形成することができる；または（ｉｉ）配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、２０６４〜２１８３、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドに相補的である配列を含む；または（ｉｉｉ）配列番号７９４〜１０４３、２５７６〜２６７２、および２６９２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、方法は、被験者が肺癌を有するかどうか決定する目的で、医師に検出の結果を通知することを含む。
【００１０】
一部の実施形態では、試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを検出すると、試料中の標的ＲＮＡにまたはその相補配列に相補的である少なくとも１つのポリヌクレオチドと試料の核酸をハイブリッド形成することと；標的ＲＮＡ、標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコン、および標的ＲＮＡの相補配列から選択される少なくとも１つの核酸とハイブリッド形成したポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの複合体を検出することとを含む。
【００１１】
一部の実施形態では、被験者において肺癌の存在を検出するための方法は、（ａ）被験者から試料を得ることと；（ｂ）試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを検出するために該試料を研究室に提供することと；（ｃ）試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを示す連絡を研究室から受け取ることとを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡは、（ｉ）配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、２０６４〜２１８３、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列を有する核酸に特異的にハイブリッド形成することができる；または（ｉｉ）配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、２０６４〜２１８３、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドに相補的である１つの配列を含む；または（ｉｉｉ）配列番号７９４〜１０４３、２５７６〜２６７２、および２６９２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡの正常なレベルを超える、少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルは、肺癌の存在を示す。
【００１２】
一部の実施形態では、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも５つの標的ＲＮＡのレベルが検出される。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡの正常なレベルを超える少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも５つの標的ＲＮＡのレベルを検出することで、肺癌の存在を示す。
【００１３】
一部の実施形態では、方法は、（ｉ）配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、２０６４〜２１８３、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列を有する核酸に特異的にハイブリッド形成しない；または（ｉｉ）配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、２０６４〜２１８３、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドに相補的である１つの配列を含まない；および（ｉｉｉ）配列番号７９４〜１０４３、２５７６〜２６７２、および２６９２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含まない、少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを検出することを含む。
【００１４】
一部の実施形態では、方法は、（ａ）表６のポリヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成することができる；または（ｂ）表６のポリヌクレオチド配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドに相補的である１つの配列を含む少なくとも１つの標的ＲＮＡの検出を含む。一部のこのような実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡの正常なレベルを超える少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを検出することで、非小細胞肺癌の存在を示す。
【００１５】
一部の実施形態では、方法は、（ａ）表７のポリヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成することができる；または（ｂ）表７のポリヌクレオチド配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドに相補的である１つの配列を含む少なくとも１つの標的ＲＮＡの検出を含む。一部のこのような実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡの正常なレベルを超える少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを検出することで、扁平上皮癌の存在を示す。
【００１６】
一部の実施形態では、方法は、（ａ）表８のポリヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成することができる；または（ｂ）表８のポリヌクレオチド配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドに相補的である１つの配列を含む少なくとも１つの標的ＲＮＡの検出を含む。一部のこのような実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡの正常なレベルを超える少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを検出することで、腺癌の存在を示す。
【００１７】
一部の実施形態では、方法は、（ａ）表９のポリヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成することができる；または（ｂ）表９のポリヌクレオチド配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドに相補的である配列を含む少なくとも１つの標的ＲＮＡの検出を含む。一部のこのような実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡの正常なレベルを超える少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを検出することで、高悪性度肺癌の存在を示す。
【００１８】
一部の実施形態では、方法は、（ａ）表３２もしくは３３のポリヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成することができる；または（ｂ）表３２もしくは３３のポリヌクレオチド配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドに相補的である配列を含む少なくとも１つの標的ＲＮＡの検出を含む。
【００１９】
一部の実施形態では、被験者からの試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを検出すること含む、肺癌の存在を検出する方法が提供される。ここで、少なくとも１つの標的ＲＮＡは、（ｉ）配列番号１〜３９７、１３６３〜１７０７、および２３１２〜２４５２から選択される配列を有する核酸に特異的にハイブリッド形成することができる；または（ｉｉ）配列番号１〜３９７、１３６３〜１７０７、および２３１２〜２４５２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドに相補的である配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡの正常なレベルと比べて減少している試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルは、被験者において肺癌の存在を示す。一部の実施形態では、方法は、試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを、少なくとも１つの標的ＲＮＡの正常なレベルと比較することを含む。
【００２０】
一部の実施形態では、被験者において肺癌の検出を容易にする方法が提供され、該方法は、（ａ）少なくとも１つの標的ＲＮＡが、（ｉ）配列番号１〜３９７、１３６３〜１７０７、および２３１２〜２４５２から選択される配列を有する核酸に特異的にハイブリッド形成することができる；または（ｉｉ）配列番号１〜３９７、１３６３〜１７０７、および２３１２〜２４５２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドに相補的である配列を含む、被験者に由来する試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを検出することと、（ｂ）被験者が肺癌を有するかどうかを決定する目的で医師に検出の結果を通知することとを含む。
【００２１】
一部の実施形態では、被験者において肺癌の存在を検出する方法が提供され、ここで該方法は、（ａ）被験者から試料を得ることと、（ｂ）少なくとも１つの標的ＲＮＡが、（ｉ）配列番号１〜３９７、１３６３〜１７０７、および２３１２〜２４５２から選択される配列を有する核酸に特異的にハイブリッド形成することができる；または（ｉｉ）配列番号１〜３９７、１３６３〜１７０７、および２３１２〜２４５２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドに相補的である配列を含む、試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを検出するために研究室に試料を提供することと、（ｃ）試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを示す連絡を研究室から受け取ることとを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡの正常なレベルと比べて減少している少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルは肺癌の存在を示す。
【００２２】
一部の実施形態では、方法は、被験者に由来する試料中の少なくとも１つの第２の標的ＲＮＡのレベルを検出することをさらに含み、ここで、少なくとも１つの第２の標的ＲＮＡが、（ｉ）配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、２０６４〜２１８３、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列を有する核酸に特異的にハイブリッド形成することができる；または（ｉｉ）配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、２０６４〜２１８３、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドに相補的である配列を含む；または（ｉｉｉ）配列番号７９４〜１０４３、２５７６〜２６７２、および２６９２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの第２の標的ＲＮＡの正常なレベルを超える試料中の少なくとも１つの第２の標的ＲＮＡのレベルが被験者において肺癌の存在を示す。
【００２３】
一部の実施形態では、方法は、試料から核酸を単離することを含む。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡから分離されたＲＮＡを含む。一部の実施形態では、その成熟型での標的ＲＮＡは、３０未満のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、ミクロＲＮＡである。
【００２４】
一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、複数の合成ポリヌクレオチドを含む組成物が提供される。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは第１の領域を含み、ここで第１の領域は、１〜１６５、２５４〜３６０、１０６３〜１０８１、１０９０〜１１９０、２０６４〜２０９１、２１０７〜２１６８、１３６３〜１６５９、２３１２〜２４４０、および２５７６〜２６８０の配列の１つの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、もしくは少なくとも１５の隣接するヌクレオチドの１つの配列と同一であるかまたは相補的である、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、もしくは少なくとも１５の隣接するヌクレオチドの１つの配列を含む。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは検出可能な標識を含む。一部の実施形態では、この検出可能な標識は、ＦＲＥＴ標識である。一部の実施形態では、第１の領域は標的ＲＮＡのある領域と同一であるまたは相補的である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡのある領域と同一でない、または相補的でない第２の領域をさらに含む。
【００２５】
一部の実施形態では、キット類が提供される。一部の実施形態では、キットは合成ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、キットは、複数の合成ポリヌクレオチドを有する組成物を含む。一部の実施形態では、キットは少なくとも１つのポリメラーゼを含む。一部の実施形態では、キットはｄＮＴＰを含む。
【００２６】
本発明のさらなる実施形態および詳細を後述する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例１に記述したようにＡ５４９ヒト腺癌細胞系に由来する精製した全ＲＮＡの質を評価するために、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ２１００上で得た電気泳動図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
４．１．  肺癌を検出するステップ
４．１．１．  一般法
標的ＲＮＡのレベルを測定することによる肺癌を検出する方法が提供される。一部の実施形態では、ヒトにおいて非肺小細胞癌を検出するための方法が提示される。一部の実施形態では、方法は、少なくとも１つの標的ＲＮＡの正常なレベルと比べて少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルの変化を検出することを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の標的ＲＮＡのレベルの上昇は、肺癌を示している。一部の実施形態では、１つまたは複数の標的ＲＮＡのレベルの減少は、肺癌を示している。一部の実施形態では、方法は、表１、２、６〜９、１８、２０、２３、２７、２８、３０、および３２〜３４の配列から選択される配列に特異的にハイブリッド形成することができる少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルの変化を検出することを含む。一部の実施形態では、方法は、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列に特異的にハイブリッド形成することができる少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルの変化を検出することを含む。一部の実施形態では、方法は、表４、５、および３８のミクロＲＮＡから選択される少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルの変化を検出することを含む。一部の実施形態では、方法は、配列番号７９４〜１０４３、２５７６〜２６７２、および２６９２から選択される配列の少なくもと１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくもと１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくもと２１、少なくとも２２、少なくとも２３、または２４の隣接するヌクレオチドを含む少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルの変化を検出することを含む。一部の実施形態では、方法は、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０，１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列の少なくもと１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくもと１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくもと２１、少なくとも２２、少なくとも２３、または２４の隣接するヌクレオチドに相補的である１つの配列を含む少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルの変化を検出することを含む。一部の実施形態では、レベルの変化は、レベルの上昇である。一部の実施形態では、レベルの変化は、レベルの減少である。一部の実施形態では、方法は、少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルの上昇および少なくとも１つの別の標的ＲＮＡのレベルの減少を検出することを含む。一部の実施形態では、その成熟型での標的ＲＮＡは、３０未満のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、ミクロＲＮＡである。
【００２９】
本開示では、「選択される配列」は「選択される１つの配列」と「選択される１つまたは複数の配列」の両方を包含する。したがって、「選択される配列」が用いられるとき、記載された配列のうちの１つ、または１つもしくは複数が選択されてもよいことが理解されるべきである。
【００３０】
標的ＲＮＡの正常なレベルを超える標的ＲＮＡのレベルを検出すると、試料が採取される患者において肺癌が存在することを示す。一部の実施形態では、この検出するステップは定量的に行われる。別の実施形態では、この検出するステップは定性的に行われる。一部の実施形態では、標的ＲＮＡを検出すると、標的ＲＮＡ、標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコン、および標的ＲＮＡの相補配列から選択されるポリヌクレオチドおよび核酸を含む複合体を形成することを含む。一部の実施形態では、次いで、この複合体のレベルが検出されて、同じ複合体の正常なレベルと比較される。一部の実施形態では、この複合体のレベルは、試料中の標的ＲＮＡのレベルと相関する。
【００３１】
「非小細胞肺癌」すなわち「ＮＳＣＬＣ」は、ヒトで見つかる肺癌の２つのカテゴリーのうちの１つである。肺癌と診断された患者のうちの約８０％は、非小細胞肺癌を有する。ＮＳＣＬＣは、細胞が由来する部位によって、３つの下位カテゴリーにさらに分類される：（ｉ）肺胞の内面を覆い、粘液などの物質を作る細胞に由来する腺癌；（ｉｉ）扁平細胞類に由来する扁平上皮癌または類表皮癌；および（ｉｉｉ）いくつかの異なる種類の大細胞に由来する可能性のある大細胞癌。ＮＳＣＬＣ患者の５０％以上は、腺癌または扁平上皮癌のいずれかを有する。非扁平上皮癌の組織型は、腺癌および大細胞癌の両方を含む。
【００３２】
癌は、臨床病期および病理病期に分けることができる。臨床病期は、腫瘍についてのすべての入手可能な情報、たとえば、理学的検査、放射線検査、内視鏡検査等を通して収集される情報に基づく。病理病期は、腫瘍の顕微鏡的病理所見に基づく。
【００３３】
ＴＮＭ（腫瘍、結節、転移）分類は、腫瘍の大きさと腫瘍が近傍の組織にすでに浸潤しているかどうか、リンパ節への転移、および遠隔転移の３つのパラメータによって癌を分類する。Ｔ（腫瘍）では、原発腫瘍の大きさと程度によって１から４の番号を割り当てられている。Ｎ（結節）では、０から３の番号を割り当てられており、０はリンパ節への転移がないことを意味する。１は最も近いリンパ節への転移であり、３は最も遠いリンパ節への転移であって最大の番号であり、２は１と３の中間である。Ｍ（転移では、遠隔転移がないものに０を割り当て、または領域のリンパ節を越えた遠隔転移に１を割り当てている。
【００３４】
肺癌の場合、総合的な病期分類は、癌に０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ，およびＩＶのローマ数字、ならびに病期によって文字のＡまたはＢを割り当てる。病期０は、上皮内癌であり、通常、腫瘍を形成しない。病期ＩＡ（Ｔ１Ｎ０Ｍ０）およびＩＢ（Ｔ２Ｎ０Ｍ０）は、体の一部に局在している癌である。病期ＩＩＡ（Ｔ１Ｎ１Ｍ０）およびＩＩＢ（Ｔ２Ｎ１Ｍ０およびＴ３Ｎ０Ｍ０）は、局在しているが、さらに進行する癌である。病期ＩＩＩＡ（Ｔ１〜３Ｎ２Ｍ０またはＴ３Ｎ１Ｍ０）およびＩＩＩＢ（いずれかのＴ４もしくはいずれかのＮ３Ｍ０）の癌も局在的に進行する。病期ＩＶ（いずかのＭ１）は、すでに移転した癌である。本明細書で用いる場合、用語「初期病期の癌」とは、病期ＩＡとＩＢ癌の癌および病期ＩＩＡとＩＩＢの癌をいう。
【００３５】
本明細書で用いる場合、肺癌の「高悪性」型は、１つの病期から次の病期まで急速に進行するおよび／または初期病期で転移し、患者にとって予後不良をもたらす肺癌である。
【００３６】
以下の表１および２は、肺癌細胞において標的ＲＮＡと相補的である、またはハイブリッド形成することがわかっている３９７のハイブリッド形成プローブを記載する。これらの標的ＲＮＡは、いくつかの原発腫瘍の細胞系および／またはヒト肺癌細胞系（それぞれ実施例１および２）においてレベルの上昇で、またはレベルの減少で検出された。該プローブのうちの２７５は、ヒト細胞内で発現される新規の標的ＲＮＡ種に相補的であり、かつハイブリッド形成する。残りの１２２のプローブは、他の人たちによってｍｉＲＢａｓｅに追加されてきた公知のミクロＲＮＡに相補的であり、かつハイブリッド形成する（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／；  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３６：１５４−１５８を参照されたい）。これらの後者のプローブは、表１および２で「ｍｉｒ」または「ｌｅｔ」のいずれかで表されている。
【００３７】
以下の表１８〜２１には、いくつかの原発腫瘍においてレベルの上昇で検出された標的ＲＮＡに相補的であり、かつハイブリッド形成することがわかっているハイブリッド形成プローブを記載する（実施例４を参照されたい）。表１８および２０に記載したいくつかのプローブは、ヒト細胞内で発現される新規標的ＲＮＡ種に相補的であり、かつハイブリッド形成する。表１８および２０の他のプローブは、他の人たちによってｍｉＲＢａｓｅに追加されてきた公知のミクロＲＮＡに相補的であり、かつハイブリッド形成する（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３６：１５４−１５８を参照されたい）。これらの後者のプローブは、「ｍｉｒ」または「ｌｅｔ」のいずれかで表されている。
【００３８】
以下の表２３および２４には、いくつかの原発腫瘍においてレベルの減少で検出された標的ＲＮＡに相補的であり、かつハイブリッド形成することがわかっているハイブリッド形成プローブを記載する（実施例４を参照されたい）。表２３および２４に記載したいくつかのプローブは、ヒト細胞内で発現される新規標的ＲＮＡ種に相補的であり、かつハイブリッド形成する。表２３および２４の他のプローブは、他の人たちによってｍｉＲＢａｓｅに追加されてきた公知のミクロＲＮＡに相補的であり、かつハイブリッド形成する（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３６：１５４−１５８を参照されたい）。これらの後者のプローブは、「ｍｉｒ」または「ｌｅｔ」のいずれかで表されている。
【００３９】
以下の表２７および２８には、いくつかの肺癌細胞系においてレベルの上昇で検出された標的ＲＮＡに相補的であり、かつハイブリッド形成することがわかっているハイブリッド形成プローブを記載する（実施例５を参照されたい）。表２７および２８に記載したいくつかのプローブは、ヒト細胞内で発現される新規標的ＲＮＡ種に相補的であり、かつハイブリッド形成する。表２７および２８の他のプローブは、他の人たちによってｍｉＲＢａｓｅに追加されてきた公知のミクロＲＮＡに相補的であり、かつハイブリッド形成する（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／；  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３６：１５４−１５８を参照されたい）。これらの後者のプローブは、「ｍｉｒ」または「ｌｅｔ」のいずれかで表されている。
【００４０】
以下の表３０には、いくつかの肺癌細胞系においてレベルの減少で検出された標的ＲＮＡに相補的であり、かつハイブリッド形成することがわかっているハイブリッド形成プローブを記載する（実施例５を参照されたい）。表３０に記載したいくつかのプローブは、ヒト細胞内で発現される新規標的ＲＮＡ種に相補的であり、かつハイブリッド形成する。表３０の他のプローブは、他の人たちによってｍｉＲＢａｓｅに追加されてきた公知のミクロＲＮＡに相補的であり、かつハイブリッド形成する（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／；  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３６：１５４−１５８を参照されたい）。これらの後者のプローブは、「ｍｉｒ」または「ｌｅｔ」のいずれかで表されている。
【００４１】
表１および２ではそれぞれ、確認した原発腫瘍の各々に対して、および確認した細胞系の各々に対して測定した標的ＲＮＡの発現レベルは、正常ヒト肺の全ＲＮＡで測定された発現レベルと比べると発現の倍数変化として発現される（実施例１および２を参照されたい）。同様に、表１８〜２１、２３、２４、２７、２８、および３０では、確定した原発腫瘍のそれぞれに対して、および確定した細胞系のそれぞれに対して測定した標的ＲＮＡの発現レベルは、正常ヒト肺の全ＲＮＡで測定された発現レベルと比べると発現の倍数変化として発現される（実施例４および５を参照されたい）。
【００４２】
表６には、ＮＳＣＬＣにおいてレベルの増加で表れている表１からの標的ＲＮＡを記載する。表７には、扁平上皮癌でレベルの上昇でより頻繁に現れている標的ＲＮＡを記載する。一部の実施形態では、方法は、表７からの少なくとも１つの標的ＲＮＡのベレルの上昇を検出することを含む。一部のこのような実施形態では、表７からの少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルの上昇を検出すると、扁平上皮癌を示している。表８には、腺癌においてレベルの上昇でより頻繁に現れている標的ＲＮＡを記載する。一部の実施形態では、方法は、表８からの少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルの上昇を検出することを含む。一部のこのような実施形態では、表８からの少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルの上昇を検出すると、腺癌を示している。表９には、高悪性型の肺癌においてレベルの上昇で現れている標的ＲＮＡを記載する。一部の実施形態では、方法は、表９からの少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルの上昇を検出することを含む。一部のこのような実施形態では、表９からの少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルの上昇を検出すると、高悪性型の肺癌を示している。
【００４３】
一部の実施形態では、方法は、単一のプローブで複数のｉｓｏｍｉｒを検出することを含む。１つまたは複数のｉｓｏｍｉｒのレベルの上昇を検出すると、肺癌を示しているとみなされる。複数のミクロＲＮＡが同じ配列を有するが異なる遺伝子から発現されるとき、１つまたは複数の遺伝子は、肺癌患者において上方制御されることがある。これらの遺伝子のいずれか１つから発現されるミクロＲＮＡを検出すると、肺癌を示しているとみなされる。
【００４４】
本明細書での参照の便宜上のためであって、限定する目的ではないが、一部の「標的ＲＮＡ」種は、本明細書に記載する表および実施例１において、「ミクロＲＮＡ」と表示される。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、表１、２、６〜９、１８、２０，２３、２７、２８、３０、および３２〜３４のいずれかに記載するハイブリッド形成プローブに特異的にハイブリッド形成できる単一の成熟ミクロＲＮＡである。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０，１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドに相補的である配列を含む単一の成熟ミクロＲＮＡである。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号７９４〜１０４３、２５７６〜２６７２、および２６９２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドに相補的である配列を含む単一の成熟ミクロＲＮＡである。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは複数の標的ＲＮＡを含むこともあり、それらのすべては、単一の相補的プローブ配列（たとえば、２つ以上の標的ミクロＲＮＡがｉｓｏｍｉｒであるとき）に特異的にハイブリッド形成することができる。一部の実施形態では、「ミクロＲＮＡ」と表示されているのは、１つまたは複数の標的ＲＮＡが成熟ミクロＲＮＡに対する標準的な定義を満たさないように、それぞれのハイブリッド形成プローブに特異的にハイブリッド形成することができる１つまたは複数の標的ＲＮＡである。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、「標的ＲＮＡ」は、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、すなわち動物細胞中で発現されるｓｍａｌｌＲＮＡであり、大きさ（２６〜３１ｎｔ）においてミクロＲＮＡと異なり、かつ転写遺伝子のサイレンシングに関与するＰｉｗｉタンパク質と独特な複合体を形成する。
【００４５】
成熟ヒトミクロＲＮＡは、一般的に１７〜２７の隣接するリボヌクレオチドで構成され、かつ長さが１９〜２５のヌクレオチド、または長さが２１もしくは２２のヌクレオチドであることが多い。本開示によって検出されることができる一部の標的ミクロＲＮＡの配列は、表３、２２、２５、２９、３１、および３７に示すｐｒｅ−ミクロＲＮＡ配列内に見出される（配列番号３９８〜７９３、１２１１〜１３６２、１７０８〜２０６３、２１８４〜２３１１、２４５３〜２５７５、および２６８１〜２６８８、２６９０、および２６９１）。一部の実施形態では、複数の成熟標的ＲＮＡは、表３、２２、２５、２９、３１、および３７に示す単一のｐｒｅ−ミクロＲＮＡに由来する。一部の公知の成熟ミクロＲＮＡの配列は、以下の表４および５に示す（配列番号７９４〜１０４３、および２６９２）。さらに、一部の実施形態では、ミクロＲＮＡは、表３８の配列（配列番号２５７６〜２６７２）のある配列の少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、または少なくとも２６の隣接するヌクレオチドを含む。
【００４６】
理論に束縛されるものではないが、本明細書で記述されるように、哺乳類ミクロＲＮＡは成熟する。ミクロＲＮＡをコードしている遺伝子が転写され、「ｐｒｉ−ミクロＲＮＡ」または「ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ」として知られているミクロＲＮＡ前躯体の産生をもたらす。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、複数のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを含む多シストロン性ＲＮＡの一部になり得る。一部の状況では、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、不適正塩基を含むこともあるステムおよびループによってヘアピンを形成する。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡのヘアピン構造は、リボヌクレアーゼＩＩＩエンドヌクレアーゼタンパク質であるＤｒｏｓｈａによって認識される。Ｄｒｏｓｈａは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ内の末端ループを認識して、らせんターンおよそ２回分をステムに切断して、「ｐｒｅ−ミクロＲＮＡ」または「ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ」として知られている６０〜７０のヌクレオチド前駆体を生成する。Ｄｒｏｓｈａは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを段違い切断によって一般的なリボヌクレアーゼＩＩＩエンドヌクレアーゼに切断して、５’ホスフェートおよび約２つのヌクレオチド３’オーバーハングを有するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡステムループを得ることができる。Ｄｒｏｓｈａ切断部位を越えて伸長しているらせんターン約１回分のステム（約１０のヌクレオチド）は、効率的なプロセシングに不可欠になり得る。続いて、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、Ｒａｎ−ＧＴＰおよび搬出受容体Ｅｘｐｏｒｔｉｎ−５によって核から細胞質に能動的に輸送される。
【００４７】
ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、別のリボヌクレアーゼＩＩＩエンドヌクレアーゼであるＤｉｃｅｒによって認識されることができる。一部の状況では、Ｄｉｃｅｒは、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの二本鎖ステムを認識する。Ｄｉｃｅｒは、ステムループ構造のベースで、５’ホスフェートおよび３’オーバーハングも認識することが可能である。Ｄｉｃｅｒは、ステムループ構造のベースかららせんターン２回分、離れた末端ループを切り離して、追加の５’ホスフェートおよび約２つのヌクレオチド３’オーバーハングを残すことが可能である。結果として生じる、不適正塩基対を含む可能性のあるｓｉＲＮＡ様二本鎖は、成熟ミクロＲＮＡおよびミクロＲＮＡ＊として知られている同様の大きさの断片を含む。ミクロＲＮＡおよびミクロＲＮＡ＊は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡおよびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの対向するアームに由来することもある。次いで、成熟ミクロＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（「ＲＩＳＣ」）、すなわちリボ核酸タンパク質に添加される。一部の実施形態では、ミクロＲＮＡ＊も、遺伝子サイレンシングまたは他の活性を有する。
【００４８】
配列がチミン（Ｔ）塩基を含む場合、標的ＲＮＡは代わりにウラシル（Ｕ）塩基を含むことがあると理解される。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
【表２】
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【００５１】
【表３】
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【００５２】
【表４】
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【００５３】
【表５】
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【００５４】
【表６】
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【００５５】
【表７】
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【００５６】
【表８】
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【００５７】
【表９】
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【００５８】
一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、患者における肺癌の状態または進行をモニターするために、該患者から１回または複数回にわたり収集した試料で測定されることができる。
【００５９】
一部の実施形態では、検査される試料は、肺組織の収集で通常用いられる技法、たとえば気管支鏡検査法、気管支洗浄法、気管支擦過法、または経気管支針穿刺吸引法などの１種類または複数種類の技法を用いて得られる。一部の実施形態では、細胞を採取するために、気管支肺胞洗浄、すなわち、生理食塩水で気道を洗浄することによって損傷なしで患者から試料を採取する。一部の実施形態では、試料は生検によって、たとえばコンピュータ断層撮影（ＣＴ）を用いる針生検によって採取される。
【００６０】
一部の実施形態では、検査される試料は、体液、たとえば血液、痰、粘液、唾液、尿、精液等である。一部の実施形態では、検査される試料は、血液試料である。一部の実施形態では、血液試料は全血である。一部の実施形態では、血液試料は血液細胞の試料である一部の実施形態では、血液試料は血漿である。一部の実施形態では、血液試料は血清である。
【００６１】
一部の実施形態では、検査される臨床試料は、新たに採取される。別の実施形態では、試料は新鮮凍結標本である。一部の実施形態では、試料は組織試料、たとえばホルマリン固定パラフィン包埋試料である。一部の実施形態では、試料は体腔液細胞診の試料である。
【００６２】
一部の実施形態では、本明細書に記述される方法は、肺細胞の試料、たとえば通常の気管支鏡検査法によって採取される試料で肺癌の早期発見のために用いられる。一部の実施形態では、本明細書に記述される方法は、血液または血清の試料中の肺癌の早期発見のために使われる。
【００６３】
一部の実施形態では、検査される臨床試料は、以下の危険因子のうちの１つまたは複数を有する個人から採取される。すなわち、喫煙歴、４５歳以上、ラドンガスへの曝露、間接喫煙または職業性発癌物質（たとえばアスベスト、放射線、ヒ素、クロム酸塩、ニッケル、クロロメチルエーテル、マスタードガスもしくはコークス炉排出物）への曝露、または結核等の先行疾患による肺の瘢痕である。一部の実施形態では、臨床試料は、胸部Ｘ線検査および／もしくはコンピュータ断層撮影（「ＣＴ」）走査の異常診断、咳、限局性胸痛、または嗄声等の肺癌に付随している可能性のある、診断徴候または臨床症状を有する個人から採取される。
【００６４】
したがって、一部の実施形態では、本明細書に記述される方法は、危険因子のない健常な個人の定期的スクリーニングのために使用できる。一部の実施形態では、本明細書に記述される方法を用いて、上述の危険因子のうちの１つまたは複数を有する無症候者をスクリーニングする。
【００６５】
一部の実施形態では、本明細書に記述される方法を用いて、患者において肺癌の治療の有効性を評価することができる。一部の実施形態では、標的ＲＮＡの発現レベルは、治療の間、種々の時期で測定され、および肺癌のいずれかの徴候が現れる前に、または治療を開始する前に、たとえば気管支鏡検査法によって患者から採取された保管試料からの標的ＲＮＡの発現レベルと比較される。一部の実施形態では、標的ＲＮＡ発現レベルは、患者から採取された正常な組織の保管試料、すなわち、患者の肺の腫瘍のない部分から生検によって採取された組織試料からの標的ＲＮＡの発現レベルと比較される。正常な試料での標的ＲＮＡ発現レベルは、標的ＲＮＡ発現レベルにおいて何ら異常な変化がないことを証明することが理想的である。したがって、このような実施形態では、肺癌患者の治療の経過は、同患者が健康であったとき、もしくは治療を開始する前の同患者に由来する肺細胞の試料との比較によって、または同患者に由来する健常な肺細胞の試料との比較によって、評価することができる。
【００６６】
方法が２つ以上の標的ＲＮＡの発現を検出することを含む実施形態では、複数の標的ＲＮＡの発現レベルは、同じアッセイ反応において同時並行してまたは同時に検出されることも可能である。一部の実施形態では、発現レベルは、別々のアッセイ反応において同時並行してまたは同時に検出される。一部の実施形態では、発現レベルは、異なる時点で、たとえば連続するアッセイ反応において検出される。
【００６７】
一部の実施形態では、方法は、被験者に由来する試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを検出することを含む。ここで、少なくとも１つの標的ＲＮＡの正常なレベルを超える少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを検出すると、該被験者において肺癌の存在を示す。一部の実施形態では、方法は、被験者に由来する試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを検出することと、該試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルと少なくとも１つの標的ＲＮＡの正常なレベルとを比較することとを含む。ここで、少なくとも１つの標的ＲＮＡの正常なレベルを超える試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルは、該被験者において肺癌の存在を示す。
【００６８】
一部の実施形態では、被験者において肺癌の診断を容易にする方法が提供される。このような方法は、被験者に由来する試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを検出することを含む。一部の実施形態では、被験者に由来する試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルに関する情報は、医師に伝えられる。本明細書で用いる場合、「医師」とは、患者を診断するおよび／または治療する個人もしくは実体、たとえば病院、クリニック、診療所、医師、看護師、もしくは前述の実体および個人のいずかれかのエージェントをいう。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを検出することは、医師または医師のエージェントから被験者の試料を受け取った研究室で行われる。該研究室は、本明細書に記述される方法を含む任意の方法によって検出を行い、次いでその結果を医師に通知する。本明細書で用いる場合、結果は、何らかの方法によって医師に提供されるとき、「通知された」とする。一部の実施形態では、この通知は、口頭もしくは書面によることもあり、電話による、直接に、電子メールによる、郵送もしくは他の宅配便によることもあり、またはたとえば医師がアクセスできるデータベース（医師によって制御されていない複数のデータベースを含む）にこの情報を直接入れることによって行うこともある。一部の実施形態では、情報は電子形式で維持される。一部の実施形態では、情報は、記憶装置または他のコンピュータで読取り可能な媒体、たとえばＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリ、コンピュータチップ、デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）、コンパクトディスク（ＣＤ）、ハードディスク装置（ＨＤＤ）、磁気テープ等に保管されることができる。
【００６９】
一部の実施形態では、肺癌の存在を検出する方法が提供される。一部の実施形態では、肺癌を診断する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、被験者から試料を得ることと、該試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡレベルの検出のために該試料を研究室に提供することとを含む。一部の実施形態では、方法は、該試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡレベルを示す連絡を研究室から受け取ることをさらに含む。一部の実施形態では、試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルが、少なくとも１つの標的ＲＮＡの正常なレベルを超える場合、肺癌が存在する。本明細書で用いる場合、「研究室」とは、本明細書に記述される方法を含む任意の方法によって、試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを検出して、医師にそのレベルを通知するいずれかの施設である。一部の実施形態では、研究室は医師の管理下にある。一部の実施形態では、研究室は医師の管理下にはない。
【００７０】
一部の実施形態では、研究室が医師に少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを通知するとき、研究室は、正常なレベルに関する数値を提供しても提供しなくても、試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを表す数値を通知する。一部の実施形態では、研究室は、「高い」、「上昇した」等の質的評価を提供することによって少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを通知する。
【００７１】
本明細書で用いる場合、方法が肺癌を検出すること、肺癌の存在を決定すること、および／または肺癌を診断することに関するとき、該方法は、行われる方法のステップにおける活動を含むが、その結果は肺癌の存在に対して陰性である。すなわち、肺癌を検出すること、決定すること、および診断することは、陽性または陰性のいずれかの結果（たとえば標的ＲＮＡのレベルが正常であるか、または正常を超えるかどうか）をもたらす様々な方法を実行する例を含む。
【００７２】
本明細書で用いる場合、用語「被験者」とは、ヒトを意味する。一部の実施形態では、本明細書に記述される方法は、非ヒト動物に由来する試料で用いられることも可能である。
【００７３】
ゲノムにおいて互いに物理的に近位にある標的ＲＮＡの共通発現、または協調発現は、本明細書での方法においてこのような近位染色体の標的ＲＮＡの情報価値のある使用を可能にする。
【００７４】
表３は、表１および２の配列番号１〜３９７のうちの１つに同じく存在するある配列を含む核酸に特異的にハイブリッド形成することができる３９７の標的ＲＮＡのそれぞれの染色体上の位置を特定している。表２２は、表１８および２０の配列番号１０６３〜１２１０のうちの１つに同じく存在するある配列を含む核酸に特異的にハイブリッド形成することができる標的ＲＮＡの染色体上の位置を特定している。表２５は、表２３の配列番号１３６３〜１７０７のうちの１つに同じく存在するある配列を含む核酸に特異的にハイブリッド形成することができる標的ＲＮＡの染色体上の位置を特定している。表２９は、表２７および２８の配列番号２０６４〜２１８３のうちの１つに同じく存在するある配列を含む核酸に特異的にハイブリッド形成することができる標的ＲＮＡの染色体上の位置を特定している。表３１は、表３０の配列番号２３１２〜２４５２のうちの１つに同じく存在するある配列を含む核酸に特異的にハイブリッド形成することができる標的ＲＮＡの染色体上の位置を特定している。このように、一部の実施形態では、表３、２２、２５、２９、および３１の染色体上の位置の約１キロベース（ｋｂ）以内、約２ｋｂ以内、約５ｋｂ以内、約１０ｋｂ以内、約２０ｋｇ以内、約３０ｋｂ以内、約４０ｋｂ以内、および約５０ｋｂ以内にも位置する１つまたは複数の標的ＲＮＡの発現レベルは、本明細書に記述される方法においてそれぞれ表に記載された標的ＲＮＡの発現の測定の代わりに、または測定に追加して検出される。Ｂａｓｋｅｒｖｉｌｌｅ，  Ｓ．およびＢａｒｔｅｌ  Ｄ．Ｐ．  （２００５）  ＲＮＡ  １１：２４１−２４７を参照されたい。
【００７５】
一部の実施形態では、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリッド形成することができる１つまたは複数の標的ＲＮＡを検出することと、および／または配列番号７９４〜１０４３、２５７６〜２６７２、および２６９２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含む１つまたは複数の標的ＲＮＡを検出することと、および／または配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドに相補的である配列を含む１つまたは複数の標的ＲＮＡを検出することとを組み合わせて、本明細書の方法は、ヒトｍｉＲＮｏｍｅに由来する少なくとも１つのミクロＲＮＡの発現レベルを検出することをさらに含む。
【００７６】
一部の実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡは、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリッド形成することができる。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡは、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列の少なくとも一部分に相補的である少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡは、配列番号７９４〜１０４３、２５７６〜２６７２、および２６９２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、その成熟型での標的ＲＮＡは、３０未満のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、ミクロＲＮＡである。
【００７７】
一部の実施形態では、２つ以上の標的ＲＮＡは、単一の反応で同時に検出される。一部の実施形態では、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも５つ、または少なくとも１０の標的ＲＮＡは、単一の反応で同時に検出される。一部の実施形態では、すべての標的ＲＮＡは、単一の反応で同時に検出される。
【００７８】
一部の実施形態では、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、２０６４〜２１８３、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリッド形成することができる１つまたは複数の標的ＲＮＡのレベルの増加は、その試料が採取された個人において肺癌の存在を示している。一部の実施形態では、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、２０６４〜２１８３、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列の少なくとも一部分に相補的である少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含む１つまたは複数の標的ＲＮＡのレベルの増加は、その試料が採取された個人において肺癌の存在を示している。一部の実施形態では、配列番号７９４〜１０４３、２５７６〜２６７２、および２６９２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含む１つまたは複数の標的ＲＮＡのレベルの増加は、その試料が採取された個人において肺癌の存在を示している。一部の実施例形態では、配列番号１〜３９７、１３６３〜１７０７、および２３１２〜２４５２から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリッド形成することができる１つまたは複数の標的ＲＮＡのレベルの減少は、その試料が採取された個人において肺癌の存在を示している。一部の実施形態では、配列番号１〜３９７、１３６３〜１７０７、および２３１２〜２４５２から選択される配列の少なくとも一部分に相補的である少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含む１つまたは複数の標的ＲＮＡのレベルの減少は、その試料が採取された個人において肺癌の存在を示している。一部の実施形態では、配列番号７９４〜１０４３、２５７６〜２６７２、および２６９２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含む１つまたは複数の標的ＲＮＡのレベルの減少は、その試料が採取された個人において肺癌の存在を示している。
【００７９】
一部の実施形態では、表６のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成することができる１つまたは複数の標的ＲＮＡのレベルの増加は、非小細胞肺癌の存在を示している。
【００８０】
一部の実施形態では、表７のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成することができる１つまたは複数の標的ＲＮＡのレベルの増加は、扁平上皮癌を示している。
【００８１】
一部の実施形態では、表８のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成することができる１つまたは複数の標的ＲＮＡのレベルの増加は、腺癌を示している。
【００８２】
一部の実施形態では、表９のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成することができる１つまたは複数の標的ＲＮＡのレベルの増加は、高悪性度肺癌を示している。
【００８３】
一部の実施形態では、表３２または３３のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成することができる１つまたは複数の標的ＲＮＡのレベルの増加は、肺癌を示している。
【００８４】
一部の実施形態では、表３４のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成することができる１つまたは複数の標的ＲＮＡのレベルの減少は、肺癌を示している。
【００８５】
一部の実施形態では、配列番号１５、２６、２７、３０、１２９、１６４、１８４、１９１、１９６、１９７、２０５、２０７、２１４、２１９、２２５、２４６、および２４８から選択される配列に特異的にハイブリッド形成することができる１つまたは複数の標的ＲＮＡのレベルの増加は、非小細胞肺癌を示している。
【００８６】
一部の実施形態では、配列番号１５、２６、２７、および１９１から選択される配列に特異的にハイブリッド形成することができる１つまたは複数の標的ＲＮＡのレベルの増加、ならびに配列番号９２および１７１から選択される配列に特異的にハイブリッド形成することができる１つまたは複数の標的ＲＮＡのレベルの減少は、扁平上皮癌または腺癌を示している。
【００８７】
一部の実施形態では、配列番号４、３６、５０、９３、１２２、１２５、１３９、１４０、１４４、１４６、１５９、２２６、２３９、および２４１から選択される配列に特異的にハイブリッド形成することができる１つまたは複数の標的ＲＮＡのレベルの増加は、扁平上皮癌または腺癌を示している。
【００８８】
一部の実施形態では、配列番号１９、２７、３３、４８、５５、７２、７３、９４、１０１、１０５、１１２、１１７、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１４３、１５５、１５８、１６０、１６１、１６３、１６５、２２１、２３８、２４０、および２４６から選択される配列に特異的にハイブリッド形成することができる１つまたは複数の標的ＲＮＡのレベルの増加は、扁平上皮癌を示している。
【００８９】
一部の実施形態では、配列番号１９、２７、３３、４８、５５、７２、７３、９４、１０１、１０５、１１２、１１７、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１４３、１５５、１５８、１６０、１６１、１６３、１６５、２２１、２３８、２４０、および２４６から選択される配列に特異的にハイブリッド形成することができる１つまたは複数の標的ＲＮＡのレベルの減少は、腺癌を示している。
【００９０】
一部の実施形態では、配列番号２７、７２、７３、１６１、または２４６から選択される配列に特異的にハイブリッド形成することができる１つまたは複数の標的ＲＮＡのレベルの増加は、高悪性型の腺癌を示している。
【００９１】
４．１．２．  代表的な対照群
一部の実施形態では、各標的ＲＮＡに対する正常なレベル（「対照」）は、正常ヒト肺細胞または他の参照試料に特有である平均レベルもしくは範囲として決定されることができ、そのレベルもしくは範囲に対して、試料中で測定されたレベルが比較されることができる健常被験者における標的ＲＮＡの決定された平均レベルまたは範囲は、肺癌を示す標的ＲＮＡの正常以上のレベルまたは正常以下のレベルを検出するための基準として使われることが可能である。一部の実施形態では、標的ＲＮＡの正常なレベルは、たとえば、非小細胞肺癌の病期Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩＡのために外科的切除を受けた患者に由来する正常肺組織から、１人または複数の個人に由来する個別のもしくはプールされたＲＮＡ含有試料を用いて、決定されることが可能である。
【００９２】
一部の実施形態では、標的ＲＮＡの発現の正常なレベルを決定することは、標的ＲＮＡ、該標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコン、および該標的ＲＮＡの相補配列から選択される核酸にハイブリッド形成されるプローブを含む複合体を検出することを含む。すなわち、一部の実施形態では、発現の正常なレベルは、標的ＲＮＡそれ自体よりはむしろ標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコンまたは標的ＲＮＡの相補配列を検出することによって、決定されることができる。一部の実施形態では、この複合体の正常なレベルは決定されて、対照として用いられる。一部の実施形態では、複合体の正常なレベルは、標的ＲＮＡの正常なレベルと相関する。このように、標的の正常なレベルが本明細書で考察されるとき、一部の実施形態では、そのレベルは、この複合体を検出することによって決定されることが可能である。
【００９３】
一部の実施形態では、対照は、単一の個人の細胞、たとえば、病期Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩＡの非小細胞肺癌のために外科的切除を受けた患者に由来する正常組織からのＲＮＡを含む。一部の実施形態では、対照は、検査試料を採取した個人の肺の解剖学的におよび／または細胞学的に正常な領域から取り出される。一部の実施形態では、対照は複数の個人に由来する細胞のプールからのＲＮＡを含む。一部の実施形態では、対照は、複数の個人に由来する血液、たとえば全血または血清のプールからのＲＮＡを含む。一部の実施形態では、対照は、市販されているヒトＲＮＡ、たとえばヒト肺全ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ；ＡＭ７９６８）を含む。一部の実施形態では、正常なレベルまたは正常範囲は、レベルの上昇に対して試料を検査する前にすでにあらかじめ定められている。
【００９４】
一部の実施形態では、標的ＲＮＡの正常なレベルは、１つまたは複数の継代細胞系、通常は、正常ヒト肺細胞において発現のレベルに近い少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現レベルを有することが以前に示されている細胞系から決定されることが可能である。
【００９５】
一部の実施形態では、方法は、少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現レベルを検出することを含む。一部の実施形態では、方法は、少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現レベルを少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現の正常なレベルと比較することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現レベルを少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現の対照レベルと比較することをさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現の対照レベルは、正常な細胞の少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現レベルである。一部のこのような実施形態では、対照レベルは、正常なレベルと呼ばれることもある。一部の実施形態では、正常な細胞内の少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現レベルと比べて、少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現のより大きなレベルは、肺癌を示す。一部の実施形態では、正常な細胞内の少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現レベルと比べて少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現のレベルの減少は、肺癌を示す。
【００９６】
一部の実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現レベルは、たとえば肺癌確定患者からの発現の参照レベルと比較される。一部のこのような実施形態では、参照試料と比べて少なくとも１つの標的ＲＮＡの同様の発現レベルは、肺癌を示す。
【００９７】
一部の実施形態では、それぞれ少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現の正常なレベルもより少なくとも約２倍を超える、少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現レベルは、肺癌の存在を示す。一部の実施形態では、正常な細胞で構成される対照試料中のそれぞれ少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルもより少なくとも約２倍を超える、少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現レベルは、肺癌の存在を示す。種々の実施形態では、正常な細胞で構成される対照試料中のそれぞれ少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現レベルもより少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍を超える、少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現レベルは、肺癌の存在を示す。種々の実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現の正常なレベルもより少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍を超える、少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現レベルは、肺癌の存在を示す。
【００９８】
一部の実施形態では、それぞれ少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現の正常なレベルと比べると少なくとも約２倍減少している、少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現のレベルは、肺癌の存在を示す。一部の実施形態では、正常な細胞で構成される対照試料中のそれぞれ少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルと比較すると少なくとも約２倍減少している、少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現レベルは、肺癌の存在を示す。種々の実施形態では、正常な細胞で構成される対照試料中のそれぞれ少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現レベルと比較すると少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍減少している、少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現レベルは、肺癌の存在を示す。種々の実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現の正常なレベルと比較すると少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍減少している、少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現レベルは、肺癌の存在を示す。
【００９９】
一部の実施形態では、標的ＲＮＡの発現の対照レベルは、試料中の標的ＲＮＡの発現レベルとして、同じ期間の間に、たとえば同じアッセイで、またはアッセイのバッチで決定される。一部の実施形態では、標的ＲＮＡの発現の対照レベルは、試料中の標的ＲＮＡの発現レベルとして、同じ時期の間に決定されない。一部のこのような実施形態では、発現の対照レベルは、前もって決定されている。
【０１００】
一部の実施形態では、たとえばその標的ＲＮＡが正常な細胞では、極めて低いレベルで発現される、または全く発現されないことがわかっているとき、標的ＲＮＡの発現レベルは、発現の対照レベルと比較されない。一部のこのような実施形態では、試料中の標的ＲＮＡの高いレベルを検出すると、肺癌を示している。あるいは、標的ＲＮＡが正常な細胞で高いレベルで発現されることが知られている場合、試料中の極めて低レベルの標的ＲＮＡが検出されると、肺癌を示している。
【０１０１】
４．１．３．  ＲＮＡを調製する代表的な方法
標的ＲＮＡは、任意の適切な方法によって調製されることが可能である。全ＲＮＡは、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，  Ｍ．  （１９８８）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６（２２）：  １０，９３３；およびＷｉｌｋｉｎｓｏｎ，  Ｍ．  （１９８８）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６（２２）：  １０９３４に記載のプロトコルを含むがこれらに限定されない任意の方法によって、またはたとえばＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））、全ＲＮＡ抽出キット（ｉＮｔＲＯＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、全ＲＮＡ精製キット（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ  Ｃｏｒｐ．）、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）、ＭａｇＭＡＸ(商標）（Ａｍｂｉｏｎ）、ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）等の市販されているキットもしくは試薬を用いることで、単離されることが可能である。
【０１０２】
一部の実施形態では、ｓｍａｌｌＲＮＡは単離されるか、または濃縮される。一部の実施形態では、「ｓｍａｌｌＲＮＡ」とは、約２００ヌクレオチド（ｎｔ)長より小さいＲＮＡ分子をいう。一部の実施形態では、「ｓｍａｌｌＲＮＡ」とは、約１００ｎｔより小さい、約９０ｎｔより小さい、約８０ｎｔより小さい、約７０ｎｔより小さい、約６０ｎｔより小さい、約５０ｎｔより小さい、または約４０ｎｔより小さいＲＮＡ分子をいう。
【０１０３】
ｓｍａｌｌＲＮＡの濃縮は、方法によって達成されることが可能である。この方法としては、有機抽出に続いて、特殊な結合溶液および洗浄液を用いることによるガラス繊維フィルタ上での核酸分子の吸着を含む方法、およびスピンカラム精製を用いる方法が挙げられるがこれらに限定されない。ｓｍａｌｌＲＮＡの濃縮は、市販されているキット、たとえばｍｉｒＶａｎａ（商標）単離キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ｍｉｒＰｒｅｍｉｅｒ（商標）ミクロＲＮＡ単離キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ｍｉＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｍｉＲＣＵＲＹ（商標）ＲＮＡ単離キット（Ｅｘｉｑｏｎ）、ミクロＲＮＡ精製キット（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ  Ｃｏｒｐ．）、ｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）等を用いて達成されることが可能である。一部の実施形態では、精製はＴＲＩｘｏｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の方法によって達成されることが可能であり、該方法は、フェノール／イソチオシアナート溶液を使用し、この溶液にクロロホルムを加えてＲＮＡ含有水相を分離する。続いて、ｓｍａｌｌＲＮＡは、イソプロピルアルコールを用いる沈殿によって水相から回収される。一部の実施形態では、ｓｍａｌｌＲＮＡは、クロマトグラフ法、たとえばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なｆｌａｓｈＰＡＧＥ（商標）フラクショネーターを使用するゲル電気泳動を用いて精製されることができる。
【０１０４】
一部の実施形態では、ｓｍａｌｌＲＮＡは、他のＲＮＡ分子から単離されて、ｓｍａｌｌＲＮＡ画分（たとえば、２００以下のヌクレオチド長であるＲＮＡ分子、たとえば１００未満のヌクレオチド長、たとえば５０未満のヌクレオチド長、たとえば約１０〜約４０のヌクレオチド長を含む）が実質的に純粋になるように、標的ＲＮＡを濃縮する。これは、より大きいＲＮＡ分子に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％純度以上であるが、１００％純度未満であることを意味する。あるいは、ｓｍａｌｌＲＮＡの濃縮は、倍濃縮基準で表すこともできる。一部の実施形態では、試料中のＲＮＡ単離物または全ＲＮＡにおけるより大きいＲＮＡの濃度に対して、ｓｍａｌｌＲＮＡは、約、少なくとも約、または多くても約５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、２１０倍、２２０倍、２３０倍、２４０倍、２５０倍、２６０倍、２７０倍、２８０倍、２９０倍、３００倍、３１０倍、３２０倍、３３０倍、３４０倍、３５０倍、３６０倍、３７０倍、３８０倍、３９０倍、４００倍、４１０倍、４２０倍、４３０倍、４４０倍、４５０倍、４６０倍、４７０倍、４８０倍、４９０倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、６０００倍、７０００倍、８０００倍、９０００倍、１０，０００倍、あるいはそれ以上、またはその中で誘導可能ないずれかの範囲で濃縮される。
【０１０５】
さらに別の実施形態では、発現は、ＲＮＡが最初に細胞から精製されていない試料で測定される。
【０１０６】
一部の実施形態では、標的ＲＮＡが検出される前に、ＲＮＡは修飾される。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡは、全ＲＮＡである。別の実施形態では、修飾ＲＮＡは、全ＲＮＡから、またはたとえばＲＮＡが２００未満のヌクレオチド長、たとえば１００未満のヌクレオチド長、たとえば５０未満のヌクレオチド長、たとえば約１０〜約４０のヌクレオチド長の細胞可溶化物から精製されたｓｍａｌｌＲＮＡである。本明細書に記述される方法で利用可能なＲＮＡ修飾としては、化学的にまたは酵素的に達成可能なポリ−ｄＡ尾部もしくはポリ−ｄＴ尾部の付加、および／またはビオチン等の小分子の付加が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０７】
一部の実施形態では、１つまたは複数の標的ＲＮＡが逆転写される。一部の実施形態では、存在する場合は、ＲＮＡが逆転写されるとき、たとえば逆転写の間にポリ−ｄＡ尾部またはポリ−ｄＴ尾部がｃＤＮＡに付加されるとき、ＲＮＡは修飾される。別の実施形態では、ＲＮＡは、逆転写される前に、修飾される。一部の実施形態では、全ＲＮＡは転写される。別の実施形態では、ＲＮＡが逆転写される前に、ｓｍａｌｌＲＮＡは単離されるか、または濃縮される。
【０１０８】
標的ＲＮＡが逆転写されるとき、標的ＲＮＡの相補配列が形成される。一部の実施形態では、標的ＲＮＡそれ自体（またはそのＤＮＡコピー）よりはむしろ、標的ＲＮＡの相補配列が検出される。このように、本明細書で考察される方法が、標的ＲＮＡが検出される、または標的ＲＮＡのレベルが決定されることを示すとき、このような検出または決定は、標的ＲＮＡそれ自体の代わりに、またはそれ自体に加えて標的ＲＮＡの相補配列上で行われることが可能である。一部の実施形態では、標的ＲＮＡよりはむしろ、標的ＲＮＡの相補配列が検出されるとき、該標的ＲＮＡの相補配列に相補的であるプローブが用いられる。このような実施形態では、プローブは、ウリジンの代わりにチミジンを含み、および／または別の修飾ヌクレオチドも含むこともあるが、標的ＲＮＡの順序どおりに同一である少なくとも一部分を含む。
【０１０９】
一部の実施形態では、１つまたは複数の標的ＲＮＡを検出する方法は、前述の標的ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを増幅することを含む。この増幅は、任意の方法によって達成されることができる。代表的な方法としては、リアルタイムＰＣＲと、エンドポイントＰＣＲと、ｃＤＮＡとアニーリングされるＴ７プロモーターに由来するＴ７ポリメラーゼ、たとえばＩｍｐｌｅｎ、ＧｅＲＮＡｎｙから入手可能なＳｅｎｓｅＡｍｐ  Ｐｌｕｓ(商標）キットによって提供される等を用いる増幅とが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１０】
一部の実施形態では、標的ＲＮＡに相補的な標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡが増幅されるとき、標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコンが形成される。ＤＮＡアンプリコンは一本鎖または二本鎖であってもよい。一部の実施形態では、ＤＮＡアンプリコンが一本鎖のとき、ＤＮＡアンプリコンの配列は、順方向または逆方向のいずれかで標的ＲＮＡに関連する。一部の実施形態では、標的ＲＮＡそれ自体よりはむしろ、標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコンが検出される。このように、本明細書で考察される方法が、標的ＲＮＡが検出される、または標的ＲＮＡのレベルが決定されることを示すとき、このような検出または決定は、標的ＲＮＡそれ自体の代わりに、またはそれ自体に追加して標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコン上で行われることが可能である。一部の実施形態では、標的ＲＮＡよりはむしろ、標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコンが検出されるとき、標的ＲＮＡの相補配列と相補的であるプローブが使われる。一部の実施形態では、標的ＲＮＡよりはむしろ、標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコンが検出されるとき、標的ＲＮＡに相補的であるプローブが用いられる。さらに、一部の実施形態では、複数のプローブが使われてもよく、かつ一部のプローブは標的ＲＮＡに相補的であってもよく、一部のプローブは標的ＲＮＡの相補配列に相補的であってもよい。
【０１１１】
一部の実施形態では、１つまたは複数の標的ＲＮＡを検出する方法は、後述するようにＲＴ−ＰＣＲを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の標的ＲＮＡを検出することは、ＲＴ−ＰＣＲ反応のリアルタイムモニタリングを含む。これは、任意の方法で達成されることができる。このような方法としては、ＴａｑＭａｎ（登録商標）、分子標識、またはＳｃｏｒｐｉｏｎプローブ（すなわちＦＲＥＴプローブ）およびインターカレート色素、たとえばＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、ＥｖａＧｒｅｅｎ、チアゾールオレンジ、ＹＯ−ＰＲＯ、ＴＯ−ＰＲＯ等の使用が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１２】
４．１．４．  代表的な解析方法
上述のように、患者に由来する試料において肺癌を検出するための方法が提示される。一部の実施形態では、この方法は、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、２０６４〜２１８３、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリッド形成することができる少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現レベルを検出することを含み、試料中の発現レベルは、正常な肺細胞に由来する試料等の対照試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現の正常なレベルを超える。一部の実施形態では、方法は、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、２０６４〜２１８３、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドに相補的である配列を含む少なくとも１つまたは複数の標的ＲＮＡのレベルを検出することを含み、試料中のレベルは、対照試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現の正常なレベルを超える。一部の実施形態では、方法は、配列番号７９４〜１０４３、２５７６〜２６７２、および２６９２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含む少なくとも１つまたは複数の標的ＲＮＡのレベルを検出することを含み、試料中のレベルは、対照試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現の正常なレベルを超える。
【０１１３】
一部の実施形態では、方法は、配列番号１〜３９７、１３６３〜１７０７、２３１２〜２４５２から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリッド形成することができる少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現レベルを検出することを含み、試料中の発現レベルは、正常な肺細胞に由来する試料等の対照試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現の正常なレベルと比べると減少する。一部の実施形態では、方法は、配列番号１〜３９７、１３６３〜１７０７、２３１２〜２４５２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドに相補的である配列を含む１つまたは複数の標的ＲＮＡのレベルを検出することを含み、試料中のレベルは、対照試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現の正常なレベルと比べると減少する。一部の実施形態では、配列番号７９４〜１０４３、２５７６〜２６７２、および２６９２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含む１つまたは複数の標的ＲＮＡのレベルを検出することを含み、試料中のレベルは、対照試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現の正常なレベルと比べると減少する。
【０１１４】
一部の実施形態では、その成熟型での標的ＲＮＡは、３０未満のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、ミクロＲＮＡである。
【０１１５】
一部の実施形態では、たとえば上述の場合、方法は、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリッド形成せず、かつ配列番号７９４〜１０４３、２５７６〜２６７２、および２６９２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含まない、ヒトｍｉＲＮｏｍｅの少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現レベルを検出することをさらに含み、試料中の発現レベルは、対照試料中の少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現の正常なレベルと比べると変化する。本明細書で用いる場合、用語「ヒトｍｉＲＮｏｍｅ」とは、ヒト細胞およびそこから産生される成熟ミクロＲＮＡ内のすべてのミクロＲＮＡ遺伝子をいう。
【０１１６】
所望の少なくとも１つの標的ＲＮＡの特異的検出および定量化できる（または半定量化できる）検出を可能にする能力があるいずれかの解析手順を、本明細書で提示される方法で用いることが可能である。このような解析手順としては、実施例１、２、４、および５に記載のマイクロアレイ方法、実施例３に記載のミクロビーズ方法、および当業者にとって既知の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
一部の実施形態では、標的ＲＮＡの検出は、標的ＲＮＡまたはその相補配列に相補的であるポリヌクレオチドと、標的ＲＮＡ、該標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコン、および該標的ＲＮＡの相補配列から選択される核酸とを含む複合体を形成することを含む。このように、一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは標的ＲＮＡと複合体を形成する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、たとえば、標的ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ等の標的ＲＮＡの相補配列と複合体を形成する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコンと複合体を形成する。本明細書で用いる場合、二本鎖ＤＮＡアンプリコンが複合体の一部であるとき、該複合体は該ＤＮＡアンプリコンの一方の鎖または両方の鎖を含むことがある。したがって、一部の実施形態では、複合体はＤＮＡアンプリコンの１つの鎖だけを含む。一部の実施形態では、複合体は、三重鎖であって、ポリヌクレオチドおよびＤＮＡアンプリコンの両方の鎖を含む。一部の実施形態では、複合体は、ポリヌクレオチドと、標的ＲＮＡ、該標的ＲＮＡの相補配列、または該標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコンとの間のハイブリッド形成によって形成される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、プライマーまたはプローブである。
【０１１８】
一部の実施形態では、方法は、複合体を検出することを含む。一部の実施形態では、複合体は、検出時期に関連する必要はない。すなわち、一部の実施形態では、複合体は形成され、次いで該複合体は分離されるか、またはある方法で破壊されて、該複合体から構成成分が検出される。このようなシステムの例は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドがプライマーであるとき、複合体の検出は、標的ＲＮＡ、該標的ＲＮＡの相補配列、または標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコンの増幅を含むこともある。
【０１１９】
一部の実施形態では、本明細書に記載する方法において少なくとも１つの標的ＲＮＡを検出するために使用される解析方法は、リアルタイム定量化ＲＴ−ＰＣＲ法を含む。Ｃｈｅｎ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３３：  ｅ１７９およびＰＣＴ公報番号第ＷＯ２００７／１１７２５６号を参照されたい。これら全体は参照によって本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡを検出するために用いられる解析方法は、米国特許出願公開番号第２００９／０１２３９１２  Ａ１号に記載された方法を含む。この特許公開の全体は参照によって本明細書に組み込まれる。該米国特許出願公開に記載された代表的な方法では、第１の部分および第２の部分を含み、該第１の部分は特定のミクロＲＮＡの３’末端と選択的にハイブリッド形成し、および該第２の部分はユニバーサルプライマーの配列を含む、伸長プライマーを用いて、ミクロＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡを作製する。次いで、ミクロＲＮＡの５’末端に選択的にハイブリッド形成する逆方向プライマーおよびユニバーサルプライマーを用いて、定量ＰＣＲ反応でｃＤＮＡを増幅する。
【０１２０】
一部の実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡを検出するために用いられる解析方法は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの使用を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡを検出するために用いられる解析方法は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ、たとえばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．から販売されているＴａｑＭａｎ（登録商標）ミクロＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓがある。代表的なＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイでは、全ＲＮＡは試料から単離される。一部の実施形態では、このアッセイを用いて、ミクロＲＮＡを含有する約１０ｎｇの全ＲＮＡ入力試料、たとえば約９ｎｇの入力試料、たとえば約８ｎｇの入力試料、たとえば約７ｎｇの入力試料、たとえば約６ｎｇの入力試料、たとえば約５ｎｇの入力試料、たとえば約４ｎｇの入力試料、たとえば約３ｎｇの入力試料、たとえば約２ｎｇの入力試料、および約１ｎｇもの少量の入力試料でも解析することができる。
【０１２１】
ＴａｑＭａｎ（登録商標)アッセイは、標的ＲＮＡの３’末端に特に相補的であるステムループプライマーを使用する。代表的なＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイでは、ステムループプライマーの標的ＲＮＡへのハイブリット形成の後に、標的ＲＮＡ鋳型の逆転写が続き、該プライマーの３’末端の伸長をもたらす。逆転写の結果は、そのアンプリコンの５’末端にステムループプライマー配列を有し、かつ３’末端に標的ＲＮＡのｃＤＮＡを有するキメラ（ＤＮＡ）アンプリコンである。標的ＲＮＡの定量化は、すべてのステムループ標的ＲＮＡプライマーの５’末端の配列に相補的である配列を有するユニバーサル逆方向プライマーと、標的ＲＮＡ特異的順方向プライマーと、標的ＲＮＡ配列特異的ＴａｑＭａｎ(登録商標）プローブとを用いるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって達成される。
【０１２２】
このアッセイは、蛍光共鳴エネルギー転移（「ＦＲＥＴ」）を用いて、合成ＰＣＲ産物を検出して定量化する。通常は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、５’末端に結合する蛍光色素分子と、３’末端に結合する消光分子とを含み、その結果色素分子と消光分子が近接近して、該消光分子がＦＲＥＴを介して該色素分子の蛍光シグナルを抑制することが可能になる。ポリメラーゼは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが結合するキメラアンプリコン鋳型を複製すると、ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼが該プローブを切断して、該色素分子と該消光分子を分離し、その結果ＦＲＥＴが消失して、蛍光シグナルが生成される。蛍光は、切断されるプローブの量に比例して各ＲＴ−ＰＣＲサイクルとともに増加する。
【０１２３】
ＲＮＡ検出および／または定量化のためのさらに代表的な方法は、たとえば、米国特許出願公開第２００７／００７７５７０号（Ｌａｏ  ｅｔ  ａｌ．）、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ２００７／０２５２８１号（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許出願公開第２００７／００５４２８７号（Ｂｌｏｃｈ）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６／０１３０７６１号（Ｂｌｏｃｋ）、およびＰＣＴ公開番号第ＷＯ２００７／０１１９０３号（Ｌａｏ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。目的に応じてこれら全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１２４】
一部の実施形態では、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果の定量化は、既知の濃度の核酸から標準曲線を作成し、次いで未知の濃度の標的ＲＮＡに対する定量的情報を補外することによって行われる。一部の実施形態では、標準曲線を生成するために使用される核酸は、既知の濃度のＲＮＡ（たとえばミクロＲＮＡ）である。一部の実施形態では、標準曲線を生成するために使用される核酸は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成された精製二本鎖のプラスミドＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡである。
【０１２５】
一部の実施形態では、標的核酸および内在性参照の増幅効率がほぼ等しい場合、定量化は、比較Ｃｔ（サイクル閾値、たとえば蛍光シグナルがバックグラウンド以上に上昇するために必要とされるＰＣＲの回数）法によって達成される。Ｃｔ値は、試料中の核酸標的の量に反比例する。一部の実施形態では、関心の標的ＲＮＡのＣｔ値は、対照またはキャリブレーター、たとえば正常組織からのＲＮＡ（たとえばミクロＲＮＡ）と比較することができる。一部の実施形態では、キャリブレーターおよび関心の標的ＲＮＡ試料のＣｔ値は、適当な内在性ハウスキーピング遺伝子に標準化される。
【０１２６】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイに加えて、本明細書に提示される方法においてＰＣＲ産物の検出および定量化に有用な他のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ化学反応としては、以下に考察される分子標識、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブおよびインターカレート色素、たとえばＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、ＥｖａＧｒｅｅｎ、チアゾールオレンジ、ＹＯ−ＰＲＯ、ＴＯ−ＰＲＯが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２７】
一部の実施形態では、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出は、単一の標的ＲＮＡの発現を特異的に検出して、定量化するために行われる。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリッド形成することができる標的ＲＮＡから選択される。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドと相補的である配列を含む。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号７９４〜１０４３、２５７６〜２６７２、および２６９２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、表６のプローブ配列から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリッド形成する。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、表７のプローブ配列から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリッド形成する。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、表８のプローブ配列から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリッド形成する。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、表９のプローブ配列から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリッド形成する。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、表３２および３３のプローブ配列から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリッド形成する。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、表３４のプローブ配列から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリッド形成する。
【０１２８】
一部の実施形態では、その成熟型での標的ＲＮＡは、３０未満のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、ミクロＲＮＡである。
【０１２９】
種々の実施形態では、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出を利用して、単一の多重反応で、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つの標的ＲＮＡを検出する。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡは、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリッド形成することができる。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡは、配列番号７９４〜１０４３、２５７６〜２６７２、および２６９２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡは、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドに相補的である配列を含む。一部の実施形態では、その成熟型での標的ＲＮＡは、３０未満のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、ミクロＲＮＡである。
【０１３０】
一部の実施形態では、方法は、ある多重ＲＴ−ＰＣＲ反応において、各標的ＲＮＡが表６のプローブ配列に特異的にハイブリッド形成することができる、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、または少なくとも１５の標的ＲＮＡの発現を検出することを含む。一部の実施形態では、方法は、単一の多重ＲＴ−ＰＣＲ反応を用いて、各標的ＲＮＡが表７のプローブ配列に特異的にハイブリッド形成することができる、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５の標的ＲＮＡの発現を検出することを含む。一部の実施形態では、方法は、単一の多重ＲＴ−ＰＣＲ反応を用いて、各標的ＲＮＡが表８のプローブ配列に特異的にハイブリッド形成することができる、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つの標的ＲＮＡの発現を検出することを含む。一部の実施形態では、方法はある多重ＲＴ−ＰＣＲ反応を用いて、各標的ＲＮＡが表９のプローブ配列に特異的にハイブリッド形成することができる、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０の標的ＲＮＡの発現を検出することを含む。一部の実施形態では、方法はある多重ＲＴ−ＰＣＲ反応を用いて、各標的ＲＮＡが表３２または３３のプローブ配列に特異的にハイブリッド形成することができる、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、または少なくとも標的ＲＮＡの発現を検出することを含む。一部の実施形態では、方法は、ある多重ＲＴ−ＰＣＲ反応において、各標的ＲＮＡが表３４のプローブ配列に特異的にハイブリッド形成することができる、少なくとも２つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、または少なくとも６０の標的ＲＮＡの発現を検出することを含む。
【０１３１】
一部の多重実施形態では、たとえばＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ等、異なるＲＮＡ標的にそれぞれ特異的な複数のプローブが使用される。一部の実施形態では、各標的ＲＮＡに特異的なプローブは、同じ多重反応で使用される別のプローブとスペクトル的に識別できる。
【０１３２】
一部の実施形態では、リアルタイムＲＴ−ＰＣR産物の定量化は、二本鎖ＤＮＡ産物に結合する色素、たとえばＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、ＥｖａＧｒｅｅｎ、チアゾールオレンジ、ＹＯ−ＰＲＯ、ＴＯ−ＰＲＯ等を用いて達成される。一部の実施形態では、アッセイは、ＱｉａｇｅｎのＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲアッセイである。このアッセイでは、全ＲＮＡは最初に試料から単離される。続いて全ＲＮＡは、３’末端でポリアデニル化され、次いで５’末端でポリ−ｄＴを有するユニバーサルプライマーを用いて逆転写される。一部の実施形態では、単一の逆転写反応は、複数の標的ＲＮＡをアッセイするのに十分である。次いで、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、標的ＲＮＡ特異的プライマーと、５’末端にポリ−ｄＴ配列を含むｍｉＳｃｒｉｐｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒとを用いて達成される。ＳＹBＲ  Ｇｒｅｅｎ色素は、二本鎖ＤＮＡに非特異的に結合して、励起されると、発光する。一部の実施形態では、高度に特異的なプライマーのアニーリングをＰＣＲ鋳型（たとえば、ＱｉａｇｅｎからのＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキットで利用できる）に促進するバッファ条件を用いて、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎに結合して、定量化に悪影響を与えることになる非特異的ＤＮＡ二本鎖およびプライマー二量体が形成されないようにする。このように、ＰＣＲ産物が蓄積すると、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎからのシグナルが上昇して、特定の産物の定量化を可能にする。
【０１３３】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、当技術分野で利用可能な任意のＲＴ−ＰＣＲ計測手段を用いて、行われる。通常、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲデータ収集および解析で使用される計測手段は、サーマルサイクラー、蛍光励起および発光収集のための光学、および任意にコンピュータとデータ収集と解析ソフトウェアを含む。
【０１３４】
一部の実施形態では、本明細書に記述される方法で用いられる解析方法は、ＤＡＳＬ（登録商標）（ｃＤＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｎｎｅａｌｉｎｇ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ）Ａｓｓａｙ、たとえば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．から入手可能なＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ａｓｓａｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ＭｉｃｒｏＲＮＡＡｓｓａｙＷｏｒｋｆｌｏｗ．ｐｄｆを参照されたい）がある。一部の実施形態では、全ＲＮＡは、任意の方法によって解析されるべく試料から単離される。さらに、一部の実施形態では、ｓｍａｌｌＲＮＡは、任意の方法によって解析されるべく試料から単離される。次いで、全ＲＮＡまたは単離したｓｍａｌｌＲＮＡは、ポリアデニル化されることが可能である（＞１８Ａの部分は、反応混合物中のＲＮＡの３’末端に加えられる）。このＲＮＡは、ＰＣＲプライマー部位と、試料ＲＮＡのポリ−ｄＡ尾部に結合するポリ−ｄＴ領域とを有する配列を５’末端から３’末端に含むビオチン標識ＤＮＡプライマーを用いて、逆転写される。次いで、結果として生じるビオチン化ｃＤＮＡ転写物は、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を介して固体支持体とハイブリッド形成し、次いで１つまたは複数の標的ＲＮＡ特異的ポリヌクレオチドと接触する。標的ＲＮＡ特異的ポリヌクレオチドは、５’末端から３’末端に、ＰＣＲプライマー部位を含む領域と、アドレス配列を含む領域と、標的ＲＮＡ特異的配列とを含む。
【０１３５】
一部のＤＡＳＬ（登録商標）実施形態では、標的ＲＮＡ特異的配列は、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９のうちの１つの配列内に、または相補的な領域内に同じく存在する配列を有する、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、または少なくとも２４の隣接するヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的ＲＮＡ特異的配列は、ヒトｍｉＲＮｏｍｅのミクロＲＮＡの少なくとも一部に相補的であるプローブ配列を含む。
【０１３６】
ハイブリッド形成の後、標的ＲＮＡ特異的ポリヌクレオチドは、伸長され、次いで伸長産物は固定化ｃＤＮＡアレイから溶出される。蛍光標識ユニバーサルプライマーを用いる第２のＰＣＲ反応は、標的ＲＮＡ特異的配列を含む蛍光標識ＤＮＡを生成する。次いで、この標識ＰＣＲ産物は、検出および定量化のためにミクロビーズアレイとハイブリッド形成する。
【０１３７】
一部の実施形態では、本明細書に記述される方法において、少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現を検出して定量化するために用いられる解析方法は、ビーズベースのフローサイトメトリーアッセイである。Ｌｕ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：８３４−８３８を参照されたい。その全体は参照によって本明細書に組み込まれる。ビーズベースのフローサイトメトリーアッセイの例は、Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ｉｎｃ．のｘＭＡＰ（登録商標）技術である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｕｍｉｎｅｘｃｏｒｐ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌを参照されたい）。一部の実施形態では、全ＲＮＡは試料から単離され、次いでビオチンで標識される。次いで、この標識ＲＮＡは、異なる蛍光強度を有する２種類の色素でそれぞれ標識されたミクロビーズに共有結合する標的ＲＮＡ特異的捕獲プローブ（たとえば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｕｍｉｎｅｘｃｏｒｐ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｓｓａｙｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌのＬｕｍｉｎｅｘ，Ｉｎｃ．から販売されているＦｌｅｘｍｉＲ（商標）製品）とハイブリッド形成する。ストレプトアビジンに結合したリポーター分子（たとえば、ストレプトアビジン−フィコエリトリン（「ＳＡＰＥ」としても知られている））は、捕獲した標的ＲＮＡに付着し、次いで各ビーズの固有のシグナルはフローサイトメトリーを使用して読まれる。一部の実施形態では、ＲＮＡ試料（全ＲＮＡまたは濃縮ｓｍａｌｌＲＮＡ）は、最初にポリアデニル化され、続いて、試料ＲＮＡの３’末端のポリ−ｄＡ尾部およびビオチン化デンドリマーに付着したポリヌクレオチドの５’末端に相補的である架橋ポリヌクレオチドを用いて、ビオチン化３ＤＮＡ（商標）デンドリマー（つまり、それに結合した多数のビオチン分子をもつ多重アームＤＮＡ）、たとえばＶａｎｔａｇｅ（商標）ミクロＲＮＡ  ＬａｂｅｌｉｎｇキットとしてＭａｒｉｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから販売されている等で標識される。次いで、フローサイトメトリーによる解析の前に、ストレプトアビジン結合リポーター分子は、ビオチン化デンドリマーに付着される。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｒｌｉｇｅｎ．ｃｏｍ／ｖａｎｔａｇｅ−ｍｉｃｒｏｒｎａ−ｌａｂｅｌｉｎｇ−ｋｉｔ．ｈｔｍｌを参照されたい。一部の実施形態では、ビオチン標識ＲＮＡは、最初にＳＡＰＥに曝露され、続いてＲＮＡ／ＳＡＰＥ複合体は、ＤＮＡデンドリマーに付着した抗フィコエリトリン抗体に曝露され、これで９００もの数のビオチン分子に結合することができる。これによって、複数のＳＡＰＥ分子に、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を介してビオチン化デンドリマーと結合することを可能にする。このようにしてアッセイからのシグナルが増加する。
【０１３８】
一部の実施形態では、本明細書に記述される方法において少なくとも１つの標的ＲＮＡの発現を検出するおよび定量化するために用いられる解析方法は、ゲル電気泳動および標識プローブ（たとえば放射標識または化学発光標識で標識されたプローブ）による検出、たとえばＮｏｒｔｈｅｒｎブロッティングによる等がある。一部の実施形態では、全ＲＮＡは、試料から単離され、次いでＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によってサイズ分離される。分離されたＲＮＡは、次いで、膜上にブロットされて、放射標識された相補的プローブとハイブリッド形成する。一部の実施形態では、代表的なプローブとしては、以下に考察される場合、１つまたは複数の親和性を高めたヌクレオチド類似体、たとえば、デオキシリボースまたはリボース糖の代わりに二環式糖部分を含有するロックド核酸（「ＬＮＡ」）類似体が挙げられる。たとえば、Ｖａｒａｌｌｙａｙ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ３（２）：１９０−１９６を参照されたい。その全体は参照によって本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、全ＲＮＡ試料は、さらに精製されて、ｓｍａｌｌＲＮＡのために濃縮することができる。一部の実施形態では、たとえば、標的ＲＮＡの両末端に相補的である（「パドロックプローブ」）長いプローブを用いるローリングサークル増幅、プローブを環状化させるための連結によって、それに続いて、プライマーとして環状化プローブとハイブリッド形成した標的ＲＮＡを用いるローリングサークル複製によって、標的ＲＮＡは増幅されることができる。たとえば、Ｊｏｎｓｔｒｕｐ，  Ｓ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．（２００６）  ＲＮＡ  １２：１−６を参照されたい。その全体は参照によって本明細書に組み込まれる。次いで、増幅産物は、たとえば、ゲル電気泳動およびＮｏｒｔｈｅｒｎブロッティングを用いて、検出され、定量化されることができる。
【０１３９】
代替実施形態では、標識プローブは、単離された全ＲＮＡと溶液中でハイブリッド形成し、その後ＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ、たとえばプローブの非ハイブリッド形成部分または非ハイブリッド形成標的ＲＮＡについて速やかなリボヌクレアーゼ消化を受ける。これらの実施形態では、次いで、リボヌクレアーゼ処理した試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび放射標識プローブの検出、たとえばＮｏｒｔｈｅｒｎブロッティングによって解析される。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇ／ＣａｔＮｕｍ．ｐｈｐ？１５５２で、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．から販売されているｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ検出キット製品カタログを参照されたい。
【０１４０】
一部の実施形態では、本明細書に記述される方法において少なくとも１つの標的ＲＮＡを検出して定量化するために用いられる解析方法は、マイクロアレイとのハイブリッド形成による。たとえば、Ｌｉｕ，  Ｃ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１：９７４０−９７４４；  Ｌｉｍ，  Ｌ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｎａｔｕｒｅ  ４３３：７６９−７７を参照されたい。それぞれ、その全体は参照によって本明細書に組み込まれる。実施例１、２、４、および５を参照されたい。
【０１４１】
一部の実施形態では、マイクロアレイを用いることによる標的ＲＮＡの検出および定量化は、表面プラズモン共鳴法によって達成される。たとえば、ｈｔｔｐ：／／ｎａｎｏ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｎｅｗｓ＿ｃｅｎｔｅｒ／ｎａｎｏｔｅｃｈ＿ｎｅｗｓ＿２００６−１０−３０ｂ．ａｓｐから入手可能なＮａｎｏｔｅｃｈ  Ｎｅｗｓ  （２００６）を参照されたい。これらの実施形態では、全ＲＮＡは、検査される試料から単離される。任意選択で、ＲＮＡ試料は、ｓｍａｌｌＲＮＡの集団を濃縮するためにさらに精製される。精製後、ＲＮＡ試料は、マイクロアレイ上の定義された部位にプローブを含有するアドレス指定できるマイクロアレイに結合する。非限定的な代表的プローブとしては、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９に記載される配列を含むプローブが挙げられる。代表的なプローブは、配列番号７９４〜１０４３、２５７６〜２６７２、および２６９２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドに相補的である領域を含むプローブがあるがこれらにも限定されない。代表的なプローブは、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含むプローブがあるがこれらにも限定されない。一部の実施形態では、以下に考察される場合、１つまたは複数の親和性を高めたヌクレオチド類似体、たとえばロックド核酸（「ＬＮＡ」）ヌクレオチド類似体を含有する。マイクロアレイとのハイブリッド形成後、該アレイにハイブリッド形成するＲＮＡは、まずポリアデニル化され、次いで該アレイは、それら粒子に結合したポリ−ｄＴを有する金粒子に曝露される。結合した標的ＲＮＡの量は、表面プラズモン共鳴法を使用して定量化される。
【０１４２】
一部の実施形態では、マイクロアレイは、ＲＮＡプライム、アレイベースＫｌｅｎｏｗ酵素（「ＲＡＫＥ」）アッセイで利用される。Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｐ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １（２）：１−７；  Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｐ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．（２００６）  ＲＮＡ  １２（２）：１−５を参照されたい。それぞれの全体は参照によって本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、全ＲＮＡは試料から単離される。一部の実施形態では、ｓｍａｌｌＲＮＡは、試料から単離される。次いで、ＲＮＡ試料は、アドレス指定できるアレイ上の５’末端で固定化されたＤＮＡプローブとハイブリッド形成する。一部の実施形態では、ＤＮＡプローブ類は、５’末端から３’末端に、すべてのプローブに対して同じである「スペーサー」配列を有する第１の領域と、ヌクレオシスを含有する３つのチミジンを有する第２の領域と、関心の標的ＲＮＡに相補的である配列を有する第３の領域とを含む。
【０１４３】
代表的な関心の標的ＲＮＡとしては、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリッド形成することができる標的ＲＮＡと；配列番号７９４〜１０４３、２５７６〜２６７２、および２６９２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドと同一である領域を含む標的ＲＮＡと；配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドと相補的である領域を含む標的ＲＮＡとが挙げられるがこれらに限定されない。標的ＲＮＡは、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリッド形成しないｍｉＲＮｏｍｅ内の標的ＲＮＡも含む。一部の実施形態では、その成熟型での標的ＲＮＡは、３０未満のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、ミクロＲＮＡである。
【０１４４】
試料はアレイとハイブリッド形成した後、エキソヌクレアーゼＩに曝露され、非ハイブリッド形成したいずれかのプローブも消化される。次いで、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ酵素断片は、ビオチン化ｄＡＴＰとともに適用され、ハイブリッド形成した標的ＲＮＡに、鋳型としてＤＮＡプローブを用いるこの酵素に対してプライマーとして作用することを可能にする。次いで、スライドを洗浄して、フルオロフォア標識ストレプトアビジンを適用し、ハイブリッド形成してＫｌｅｎｏｗ伸長した標的ＲＮＡを含むアレイ上のスポットを試料から検出して定量化する。
【０１４５】
一部の実施形態では、ＲＮＡ試料は逆転写される。一部の実施形態では、ＲＮＡ試料は、ビオチン／ポリ−ｄＡランダム８量体プライマーを使用して逆転写される。そのプライマーが用いられるとき、ＲＮＡ鋳型は消化されて、ビオチン含有ｃＤＮＡは、標的ＲＮＡの特異的検出を可能にするプローブが結合したアドレス指定可能なマイクロアレイとハイブリッド形成する。一部の実施形態では、マイクロアレイは、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列内に、または相補的な領域内に同じく存在する、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、または少なくとも２４の隣接するヌクレオチドを有する少なくとも１つのプローブを含む。マイクロアレイへのｃＤＮＡのハイブリッド形成の後、マイクロアレイは、検出可能なマーカー、たとえば蛍光色素が結合したストレプトアビジンに曝露され、次いで結合したｃＤＮＡが検出される。Ｌｉｕ  Ｃ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４４：２２−３０を参照されたい。その全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１４６】
一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、マイクロタイタープレートのウェル内の結合されたプローブを用いるＥＬＩＳＡ様アッセイで検出され、定量化される。Ｍｏｒａ  Ｊ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｇｅｔｔｓ  Ｒ．Ｃ．  （２００６）  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４１：４２０−４２４およびＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４１（４）：１−５の補足資料；Ｇｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許出願公開第２００６／００９４０２５号を参照されたい。それぞれの全体は参照によって本明細書に組み込まれる。これらの実施形態では、ｓｍａｌｌＲＮＡに濃縮されたＲＮＡの試料は、ポリアデニル化されるか、または逆転写されてそのｃＤＮＡがポリアデニル化されるかのいずれかである。ＲＮＡまたはｃＤＮＡは、マイクロタイタープレートのウェル内の固定化されたプローブとハイブリッド形成する。ここで、各プローブは、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９のうちの１つの配列内に、または相補的な領域内に同じく存在する配列、またはたとえば、ＲＮＡもしくはｃＤＮＡが該アレイとハイブリッド形成したかどうかに応じて、ヒトｍｉＲＮｏｍｅの標的ＲＮＡ（またはその逆相補配列）の１つまたは複数の配列等の配列を含む。一部の実施形態では、ハイブリッド形成したＲＮＡは、たとえば、複数のビオチン分子または複数の西洋ワサビペルオキシダーゼ分子で標識されているＤＮＡデンドリマー（たとえばＧｅｎｉｓｐｈｅｒｅ，  Ｉｎｃ．，  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ．ｃｏｍ／ａｂｏｕｔ＿３ｄｎａ．ｈｔｍｌから入手可能なもの）、ならびに捕獲核酸のポリ−ｄＡ尾部に結合するポリ−ｄＴ配列を５’末端に、および捕獲配列の領域に相補的である配列を３’末端に含有する架橋ポリヌクレオチド等の捕獲配列を用いて標識される。捕獲配列がビオチン化されている場合、次いでマイクロアレイは、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンに曝露される。標的ＲＮＡのハイブリッド形成は、たとえばテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）等の西洋ワサビペルオキシダーゼ基質を付加することによって、およびこの溶液の吸光度を４５０ｎＭで測定することによって検出される。
【０１４７】
さらに別の実施形態では、アドレス指定可能なマイクロアレイを用いて、量子ドットを使用する標的ＲＮＡを検出する。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｕｂｍｅｄｃｅｎｔｒａｌ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ａｒｔｉｃｌｅｒｅｎｄｅｒ．ｆｃｇｉ？ａｒｔｉｄ＝５４８３７７から入手可能なＬｉａｎｇ，  Ｒ．Ｑ．  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３３（２）：ｅ１７を参照されたい。その全体は参照によって本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、全ＲＮＡは試料から単離される。一部の実施形態では、ｓｍａｌｌＲＮＡは、試料から単離される。標的ＲＮＡの３’末端は、ビオチン−Ｘ−ヒドラジドを用いてビオチン化される。ビオチン化標的ＲＮＡは、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９のうちの１つもしくは複数の配列内に、または相補的な領域内に同じく存在する配列を有する固定化プローブおよび／またはヒトｍｉＲＮｏｍｅの１つまたは複数のミクロＲＮＡに相補的な配列以外の配列を有するプローブを含むマイクロアレイ上で捕獲される。次いで、ハイブリッド形成された標的ＲＮＡは、ビオチン−ストレプトアビジン結合を介して、量子ドッドで標識される。共焦レーザーは、量子ドットに蛍光を発せさせて、そのシグナルが定量化されることができる。代替実施形態では、ｓｍａｌｌＲＮＡは、比色アッセイを用いて検出されることができる。これらの実施形態では、ｓｍａｌｌＲＮＡは、金粒子標識に続いて銀強化したストレプトアビジンで標識される。ハイブリッド形成された標的ＲＮＡに結合した金のナノ粒子は、銀イオンの金属銀への還元を触媒する。次いで金属銀は、ＣＣＤカメラを用いる比色測定で検出されることが可能になる。
【０１４８】
一部の実施形態では、１つまたは複数の標的ＲＮＡの検出および定量化は、マイクロ流体デバイスと単一分子検出法を用いて達成される。一部の実施形態では、単離した全ＲＮＡの試料中の標的ＲＮＡは、２つのプローブとハイブリッド形成する。第１のプローブは、標的ＲＮＡの５’末端の核酸に相補的であり、第２のプローブは、標的ＲＮＡの３’末端の核酸に相補的である。一部の実施形態では、各プローブは、１つまたは複数の親和性を高めたヌクレオチド類似体、たとえばＬＮＡヌクレオチド類似体を含み、および各プローブは、異なる蛍光発光スペクトルを有する異なる蛍光色素で標識される。次いで、この試料は、マイクロ流体キャピラリーを通して流される。該キャピラリー内では、光子の固有の同時発生バーストが特定の標的ＲＮＡを同定し、かつ光子の固有の同時発生バーストの数がカウントされて試料中の標的ＲＮＡの量を定量化できるように、複数のレーザーが蛍光プローブを励起する。Ｎｅｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許出願公開第２００６／０２９２６１６号を参照されたい。その全体は参照により本明細書によって組み込まれる。一部の代替実施形態では、標的ＲＮＡに特異的なプローブは、たとえば、フルオロフォア、電子スピン標識等から選択される３つ以上の相異なる標識で標識され、次いで、たとえば全ＲＮＡ、またはｓｍａｌｌＲＮＡに濃縮される試料等のＲＮＡ試料とハイブリッド形成することができる。次いで、標的ＲＮＡ／プローブ二重体は、マイクロ流体デバイス内のチャネルを通される。チャネルは３つの標識の固有のシグナルを記録する検出器を含む。このように、個々の分子は、それらの固有のシグナルによって検出され、カウントされる。Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  Ｉｎｃ．に対する米国特許第７，４０２，４２２号および第７，３５１，５３８号を参照されたい。それぞれの全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１４９】
非限定的な代表的な標的ＲＮＡ特異的プローブとして、配列番号１〜３９７から選択される配列を含むプローブ類が挙げられる。非限定的な代表的な標的ＲＮＡ特異的プローブとして、配列番号１〜３９７から選択される配列に相補的な配列を含むプローブ類が挙げられる。非限定的な代表的な標的ＲＮＡ特異的プローブとして、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチド、または少なくとも１５の隣接するヌクレオチドの相補配列を含むプローブ類も挙げられる。
【０１５０】
任意選択で、試料ＲＮＡは、ハイブリッド形成の前に修飾される。次いで、ＲＮＡ／プローブ二重体は、マイクロ流体デバイス内のチャネルを通される。チャネルは３つの標識の固有のシグナルを記録する検出器を含む。このように、個々の分子は、それらの固有のシグナルによって検出され、カウントされる。Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  Ｉｎｃ．に対する米国特許第７，４０２，４２２号および第７，３５１，５３８号を参照されたい。それぞれの全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１５１】
一部の実施形態では、１つまたは複数の標的ＲＮＡの検出および定量化は、溶液に基づいたアッセイ、たとえば修飾インベーダーアッセイによって達成される。Ａｌｌａｗｉ  Ｈ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  ＲＮＡ  １０：１１５３−１１６１を参照されたい。その全体は参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、修飾インベーダーアッセイは、未分画の細胞の界面活性剤溶解物上で行われることができる。別の実施形態では、修飾インベーダーアッセイは、細胞から単離された全ＲＮＡ上で、またはｓｍａｌｌＲＮＡに濃縮された試料上で行われることができる。試料中の標的ＲＮＡは、ヘアピン構造を形成する２つのプローブとアニーリングされる。第１のプローブは、標的ＲＮＡの５’末端と、標的ＲＮＡの５’末端の領域の配列に相補的である配列を有する３’末端の領域とにヘアピン構造を有する。第１のプローブの３’末端は「侵襲性ポリヌクレオチド」である。第２のプローブは、５’末端から３’末端に、標的ＲＮＡに相補的でない第１の「フラップ」領域と、標的ＲＮＡの３’末端に相補的な配列を有する第２の領域と、ヘアピン構造を形成する第３の領域とを有する。これらの２つのプローブが標的ＲＮＡ標的に結合すると、該プローブは、標的ＲＮＡ鋳型上にプローブの重複構造を作製し、該構造は第２のプローブのフラップを溶液に放出するＣｌｅａｖａｓｅ酵素によって認識される。次いで、フラップ領域は、第２の反応鋳型（「ＳＲＴ」）の３’末端の相補的な領域に結合する。ＦＲＥＴポリヌクレオチド（５’末端に結合した蛍光色素と、３’末端近くに結合した蛍光色素を消光するクエンチャーとを有する）は、ＳＲＴの５’末端の相補的な領域に結合し、その結果、フラップ領域の３’末端とＦＲＥＴポリヌクレオチドの５’末端の重複構造が作製される。Ｃｌｅａｖａｓｅはこの重複構造を認識して、ＦＲＥＴポリヌクレオチドの５’末端を切断し、蛍光色素が溶液に放出されるときに蛍光シグナルを生成する。
【０１５２】
４．１．５．  代表的なポリヌクレオチド
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドが提供される。合成ポリヌクレオチドとは、本明細書で用いる場合、化学的に、または酵素的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されたポリヌクレオチドをいう。ポリヌクレオチドの化学合成は、ポリヌクレオチドシンセサイザー、たとえば、ＯｇｉｌｏＰｉｌｏｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＡＢＩ３９００  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等を使用することによる合成が挙げられるがこれらに限定されない。酵素合成は、酵素増幅、たとえばＰＣＲによるポリヌレクレオチドの生成が挙げられるが、これに限定されない。
【０１５３】
一部の実施形態では、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９、ならびに配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９に相補的な配列から選択される配列の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９のいずれかに見出されない配列、またはいずれかに相補的でない配列を有する領域をさらに含む。一部の実施形態では、配列番号７９４〜１０４３、２５７６〜２６７２、および２６９２、ならびに配列番号７９４〜１０４３、２５７６〜２６７２、および２６９２に相補的な配列から選択される配列の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号７９４〜１０４３、２５７６〜２６７２、および２６９２のいずれかに見出されない配列、またはいずれかに相補的でない配列を有する領域をさらに含む。
【０１５４】
「領域」とは、特定の配列、たとえば配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、７９４〜１０４３、および２５７６〜２６７２のいずれかの完全長の配列、または完全長の配列の相補配列を含むことができ、または特定の配列、たとえば配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、７９４〜１０４３、および２５７６〜２６７２のいずれかの下位配列、または下位配列の相補配列を含むことができる。一部の実施形態では、このような下位配列は、特定の配列番号もしくはその相補配列からの８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９またはそれ以上の隣接するヌクレオチドを含むこともある。
【０１５５】
種々の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５００未満、３００未満、２００未満、１５０未満、１００未満、７５未満、５０未満、４０未満、または３０未満のヌクレオチドを含む。種々の実施形態では、ポリヌクレオチドは、８と２００の間、８と１５０の間、８と１００の間、８と７５の間、８と５０の間、８と４０の間、または８と３０の間のヌクレオチド長である。
【０１５６】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはプライマーである。一部の実施形態では、プライマーは検出可能な部分で標識されている。一部の実施形態では、プライマーは標識されていない。プライマーとは、本明細書で用いる場合、標的ＲＮＡに、または該標的ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡに、または標的ＲＮＡもしくはｃＤＮＡ（総称して「鋳型」と呼ぶ）から増幅されたアンプリコンに特異的にハイブリッド形成することができ、かつ鋳型、ポリメラーゼおよび適切なバッファと試薬の存在下で伸長されてプライマー伸長産物を形成することができるポリヌクレオチドである。
【０１５７】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはプローブである。一部の実施形態では、プローブは、検出可能な部分で標識されている。検出可能な部分とは、本明細書で用いる場合、たとえば蛍光色素等の直接的に検出可能な部分、およびたとえば結合対のメンバー等の間接的に検出可能な部分が挙げられる。一部の実施形態では、検出可能な部分が結合対のメンバーであるとき、プローブは、その結合対の第２のメンバーに結合した検出可能な標識とともに該プローブをインキュベートすることによって検出可能になり得る。一部の実施形態では、プローブが捕獲プローブ、たとえばマイクロアレイ上またはビーズ上のプローブであるとき、プローブは標識されない。一部の実施形態では、プローブは、たとえばポリメラーゼによって、伸長できない。別の実施形態では、プローブは伸長可能である。
【０１５８】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはＦＲＥＴプローブであり、一部の実施形態においてＦＲＥＴプローブは、５’末端で蛍光色素（ドナー）で標識され、かつ３’末端でクエンチャー（アクセプター）、すなわちこれらの化学基が近接近にあるとき（すなわち同一のプローブに付着される）、蛍光色素からの蛍光発光を吸収する（すなわち抑制する）化学基で標識される。別の実施形態では、該ドナーおよびアクセプターは、ＦＲＥＴプローブの末端に存在しない。したがって、一部の実施形態では、ドナー部分の発光スペクトルは、アクセプター部分の吸収スペクトルとかなり重複しなければならない。
【０１５９】
４．１．５．１．  代表的なポリヌクレオチド修飾
一部の実施形態では、本明細書に記述される少なくとも１つの標的ＲＮＡを検出する方法は、修飾された１つまたは複数のポリヌクレオチド、たとえば１つまたは複数の親和性を高めたヌクレオチド類似体を含むポリヌクレオチドを使用する。本明細書に記述される方法で有用な修飾ポリヌクレオチドには、逆転写用のプライマー、ＰＣＲ増幅プライマー、およびプローブが挙げられる。一部の実施形態では、親和性を高めたヌクレオチドを組み込むことで、デオキシリボヌクレオチドだけを含有するポリヌクレオチドと比較すると、その標的核酸に対する結合親和性および特異性が上昇し、かつより短いポリヌクレオチドの使用を可能にする、またはポリヌクレオチドと該標的核酸の間のより短い領域の相補性を可能にする。
【０１６０】
一部の実施形態では、親和性を高めたヌクレオチド類似体には、１つまたは複数の塩基修飾、糖修飾、および／または骨格修飾を含むヌクレオチド類が挙げられる。
【０１６１】
一部の実施形態では、親和性を高めたヌクレオチド類似体での使用のための修飾塩基類としては、５−メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、２−クロロ−６−アミノプリン、キサンチンおよびヒポキサンチンが挙げられる。
【０１６２】
一部の実施形態では、親和性を高めたヌクレオチド類似体としては、２’置換糖類等の修飾糖類、たとえば、２’−Ｏ−アルキル−リボース糖類、２’−アミノ−デオキシリボース糖類、２’−フルオロ−デオキシリボース糖類、２’−フルオロ−アラビノース糖類、および２’−Ｏ−メトキシエチル−リボース（２’ＭＯＥ）糖類を有するヌクレオチド類が挙げられる。一部の実施形態では、修飾糖類は、アラビノース糖類、またはｄ−アラビノ−ヘキシトール糖類である。
【０１６３】
一部の実施形態では、親和性を高めたヌクレオチド類似体は、たとえばペプチド核酸（ＰＮＡ；たとえばアミノ酸骨格によって結合したヌクレオベ−スを含むオリゴマー）の使用等の骨格修飾を含む。他の骨格修飾には、ホスホロチオネート結合、ホスホジエステル修飾核酸、ホスホジエステルとホスホロチオネート核酸の組合せ、メチルホスホナート、アルキルホスホナート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオア−ト、ホスホロアダート、カルバマート、カルボナート、ホスファートトリエステル、アセトアミダート、カルボキシメチルエステル、メチルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ｐ−エトキシ、およびそれらの組合せが挙げられる。
【０１６４】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドには、修飾塩基を有する少なくとも１つの親和性を高めたヌクレオチド類似体、修飾糖質を有する少なくともヌクレオチド（同一のヌクレオチドであってもよい）、および／または自然に存在しない少なくとも１つのヌクレオチド間結合が挙げられる。
【０１６５】
一部の実施形態では、親和性を高めたヌクレオチド類似体は、二環式糖である、ロックド核酸（「ＬＮＡ」）糖を含む。一部の実施形態では、本明細書に記述される方法で使用するためのポリヌクレオチドは、ＬＮＡ糖を有する１つまたは複数のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＬＮＡ糖類を有するヌクレオチドからなる１つまたは複数の領域を含む。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドが組み入れられているＬＮＡ糖類を有するヌクレオチドを含む。たとえばＦｒｉｅｄｅｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｄｅｓ．  １４（１１）：１１３８−１１４２を参照されたい。
【０１６６】
４．１．５．２．  代表的なプライマー
一部の実施形態では、プライマーが提供される。一部の実施形態では、プライマーは、標的ＲＮＡの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、または少なくとも２４の隣接するヌクレオチドと同一である、または相補的である。一部の実施形態では、プライマーは、標的ＲＮＡと同一でない、または相補的でない部分もしくは領域を含むこともある。一部の実施形態では、標的ＲＮＡと同一でない、または相補的でないプライマーの領域は、該標的ＲＮＡと同一でない、または相補的でないプライマーのいずれかの領域も同一の領域または相補的な領域を破壊しないように、隣接している。
【０１６７】
一部の実施形態では、プライマーは、標的ＲＮＡ内に同じく存在する部分を含む。一部のこのような実施形態では、標的ＲＮＡ内に同じく存在する領域を含むプライマーは、該ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡと、または該標的ＲＮＡもしくはｃＤＮＡの増幅によって生成されたアンプリコンと選択的にハイブリッド形成することができる。一部の実施形態では、用いられる特定のアッセイの条件下で、ｃＤＮＡまたはアンプリコンと選択的にハイブリッド形成できるように、プライマーは、該ｃＤＮＡまたはアンプリコンの十分な部分に相補的である。
【０１６８】
本明細書で用いる場合、「選択的にハイブリッド形成する」とは、たとえばプライマーまたはプローブ等のポリヌクレオチドが、ハイブリッド形成する領域内に異なるヌクレオチド配列を有する同じ試料中に存在する別の核酸とハイブリッド形成するよりも少なくとも５倍を超える親和性で、試料中の特定の核酸とハイブリッド形成することを意味する。代表的なハイブリッド形成の条件は、実施例１で考察される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ハイブリッド形成する領域内に異なるヌレオチド配列を有する同じ試料中に存在する別の核酸と該ポリヌクオチドがハイブリッド形成するよりも少なくとも１０倍を超える親和性で該試料中の特定の核酸とハイブリッド形成することになる。
【０１６９】
非限定的な代表的なプライマーとしては、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列内に同じく存在する配列、またはある領域に相補的である配列を含むプライマー類が挙げられる。代表的なプライマーとしては、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドと同じであるか、または相補的である領域を含むプライマー類も挙げられるが、これらに限定されない。代表的なプライマーとしては、配列番号７９４〜１０４３、２５７６〜２６７２、および２６９２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドと同じであるか、または相補的である領域を含むプライマー類も挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７０】
一部の実施形態では、プライマーを用いて、たとえば本明細書に考察される場合、標的ＲＮＡを逆転写する。一部の実施形態では、プライマーを用いて、標的ＲＮＡまたはそれから逆転写されたｃＤＮＡを増幅する。一部の実施形態では、この増幅は、たとえば、本明細書に考察される場合、定量ＰＣＲである。一部の実施形態では、プライマーは検出可能な部分を含む。
【０１７１】
４．１．５．３．  代表的なプローブ
種々の実施形態では、肺癌の存在を検出する方法は、プローブによるヒト試料の核酸をハイブリッド形成することを含む。一部の実施形態では、プローブは、標的ＲＮＡに相補的である部分を含む。一部の実施形態では、プローブは、標的ＲＮＡ内に同じく存在する部分を含む。一部のこのような実施形態では、標的ＲＮＡに相補的なプローブは、用いられる特定のアッセイの条件下で、該プローブが標的ＲＮＡと選択的にハイブリッド形成するように、標的ＲＮＡの十分な部分に相補的である。一部の実施形態では、標的ＲＮＡに相補的であるプローブは、該標的ＲＮＡの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、または少なくとも２４の隣接するヌクレオチドに相補的である。一部の実施形態では、標的ＲＮＡに相補的であるプローブは、該標的ＲＮＡの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、または少なくとも２４の隣接するヌクレオチドに相補的である領域を含む。すなわち、標的ＲＮＡに相補的であるプローブは、該標的ＲＮＡに相補的でない部分または領域を含むこともある。一部の実施形態では、標的ＲＮＡに相補的であるプローブの領域は、該標的ＲＮＡに相補的でないプローブのいずれかの領域が相補的な領域を破壊しないように、隣接している。
【０１７２】
一部の実施形態では、プローブは、標的ＲＮＡ内に同じく存在する部分を含む。一部のこのような実施形態では、標的ＲＮＡ内に同じく存在する領域を含むプローブは、該ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡと、または標的ＲＮＡもしくはｃＤＮＡの増幅によって生成されたアンプリコンと選択的にハイブリッド形成することができる。一部の実施形態では、用いられる特定のアッセイの条件下で、ｃＤＮＡまたはアンプリコンと選択的にハイブリッド形成するように、プローブは、該ｃＤＮＡまたはアンプリコンの十分な部分に相補的である。一部の実施形態では、ｃＤＮＡまたはアンプリコンに相補的であるプローブは、該ｃＤＮＡまたはアンプリコンの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、または少なくとも２４の隣接するヌクレオチドに相補的である。一部の実施形態では、標的ＲＮＡに相補的であるプローブは、該ｃＤＮＡまたはアンプリコンの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、または少なくとも２４の隣接するヌクレオチドに相補的な領域を含む。すなわち、ｃＤＮＡまたはアンプリコンに相補的であるプローブは、該ｃＤＮＡまたはアンプリコンに相補的でない部分または領域を含むこともある。一部の実施形態では、ｃＤＮＡまたはアンプリコンに相補的であるプローブの領域は、該ｃＤＮＡまたはアンプリコンに相補的でないプローブのいずれかの領域が、相補的な領域を破壊しないように、隣接する。
【０１７３】
非限定的な代表的なプローブとしては、配列番号１〜３９７に記載される配列を含むプローブ類が挙げられる。非限定的な代表的なプローブとしては、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列内に同じく存在する配列、または領域に相補的である配列を含むプローブ類が挙げられる。代表的なプローブとしては、配列番号１〜３９７、１０６３〜１２１０、１３６３〜１７０７、２０６４〜２１８３、２３１２〜２４５２、２６７３〜２６８０、および２６８９から選択される配列と同じである領域、または選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドに相補的である領域を含むプローブ類が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７４】
一部の実施形態では、１つまたは複数の標的ＲＮＡを検出できるように定量化する方法は、（ａ）全ＲＮＡを単離することと；（ｂ）標的ＲＮＡを逆転写して、該標的ＲＮＡに相補的であるｃＤＮＡを生成することと；（ｃ）（ｂ）からのｃＤＮＡを増幅することと；（ｄ）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて標的ＲＮＡの量を検出することとを含む。
【０１７５】
上述のように、一部の実施形態では、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出は、ＦＲＥＴプローブを用いて行われる。このＦＲＥＴプローブとしては、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、分子標識プローブ、およびＳｃｏｒｐｉｏｎプローブが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出および定量化は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、すなわち通常、ＤＮＡの一端に共有結合した蛍光色素と、該ＤＮＡの他端に共有結合した消光分子とを有する直鎖状プローブを用いて行われる。ＦＲＥＴプローブは、ＦＲＥＴプローブがｃＤＮＡとハイブリッド形成するとき、蛍光色素が消光されるように、およびｃＤＮＡの増幅の間、プローブが消化されるとき、蛍光色素がプローブから放出されて、蛍光シグナルを生成するように、ｃＤＮＡの領域に相補的である配列を含む。このような実施形態では、試料中の標的ＲＮＡの量は、ｃＤＮＡ増幅の間に測定される蛍光の量と比例する。
【０１７６】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは通常、該プローブが、もたらされるＰＣＲアンプリコンと特異的にハイブリッド形成できるように、標的ＲＮＡの領域に相補的である、または標的ＲＮＡ鋳型から逆転写されるその相補的ｃＤＮＡに相補的である配列（すなわち、プローブ領域の配列は、検出されるべき標的ＲＮＡに相補的であるか、または該標的ＲＮＡ内に同じく存在する）を有する隣接するヌクレオチドの領域を含む。一部の実施形態では、プローブは、標的ＲＮＡ鋳型から逆転写されたｃＤＮＡの領域に完全に相補的である配列、または領域内に同じく存在する配列を有する少なくとも６の隣接するヌクレオチドの領域、たとえば、検出されるべき標的ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡの領域に相補的である配列、または領域に同じく存在する配列を有する少なくとも８の隣接するヌクレオチド、少なくとも１０の隣接するヌクレオチド、少なくとも１２の隣接するヌクレオチド、少なくとも１４の隣接するヌクレオチド、または少なくとも１６の隣接するヌクレオチドの領域を含む。
【０１７７】
一部の実施形態では、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ配列に相補的である配列を有するｃＤＮＡの領域は、ｃＤＮＡ分子の中心に、または中心付近に存在する。一部の実施形態では、相補性領域の５’末端および３’末端にｃＤＮＡの少なくとも２つのヌクレオチド、少なくとも３つのヌクレオチド、少なくとも４つのヌクレオチド、少なくとも５つのヌクレオチドが非比依存的に存在する。
【０１７８】
一部の実施形態では、分子標識を用いて、ＰＣＲ産物を検出して定量化することができる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）のように分子標識は、ＦＲＥＴを用いて、プローブの両端に付着した蛍光色素およびクエンチャーを有するプローブを介して、ＰＣＲ産物を検出して定量化する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）とは異なり、分子標識は、ＰＣＲサイクルの間、インタクトのままである。分子標識プローブは、溶液中に遊離すると、ステムループ構造を形成し、それによって色素およびクエンチャー十分に近接近して、蛍光消光を引き起こすことが可能になる。分子標識が標的とハイブリッド形成するとき、ステムループ構造は消滅し、その結果色素とクエンチャーが間隙を介して分離されて、色素が蛍光を発する。分子標識は、たとえば、Ｇｅｎｅ  Ｌｉｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｌｉｎｋ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓｉｔｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍｂｉｎｔｒｏ．ａｓｐを参照されたい）から入手可能である。
【０１７９】
一部の実施形態では、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブは、配列特異的プライマーとしておよびＰＣＲ産物の検出と定量化のための両方で使用されることが可能である。分子標識の様に、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブは、標的核酸とハイブリッド形成されないときに、ステムループ構造を形成する。しかし、分子標識とは異なり、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブは、配列特異的プライミングとＰＣＲ産物検出の両方を達成する。蛍光色素分子は、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブの５’末端に付着し、クエンチャーは３’末端に付着する。Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブの３’末端部分は、ＰＣＲプライマーの伸長産物と相補的であり、この相補的部分は、非増幅可能な部分によって該プローブの５’末端に結合される。Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーが伸長されると、該プローブの標的特異的配列は、伸長したアンプリコン内のその相補配列に結合する。このようにしてステムループ構造が開くと、５’末端上の色素が蛍光を発生させシグナルを生成することが可能になる。Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブは、たとえばＰｒｅｍｉｅｒ  Ｂｉｏｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｍｉｅｒｂｉｏｓｏｆｔ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈ＿ｎｏｔｅｓ／Ｓｃｏｒｐｉｏｎ．ｈｔｍｌを参照されたい）。
【０１８０】
一部の実施形態では、ＦＲＥＴプローブ上で使用することができる標識としては、Ａｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒ色素等の比色標識および蛍光標識、ＢＯＤＩＰY  ＦＬ等のＢＯＤＩＰＹ色素；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ；たとえば、７−アミノ−４−メチルクマリン、アミノクマリンおよびヒドロキシクマリン等のクマリンとその誘導体；たとえばＣｙ３およびＣｙ５等のシアニン色素；エオシンとエリトロシン；たとえばフルオレセインイソチオシアナート等のフルオレセインとその誘導体；たとえばＱｕａｎｔｕｍ  Ｄｙｅ（商標）等のランタニドイオンの大環状キレート；Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ；Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ；ローダミンレッド、テトラメチルローダミンおよびローダミン６Ｇ等のローダミン色素；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ；たとえばチアゾールオレンジ−エチジウムヘテロ二量体等の蛍光エネルギー移動色素；およびＴＯＴＡＢが挙げられる。
【０１８１】
色素の具体例としては、上記で特定したものと以下を含むがこれらに限定されない：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０；たとえば、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６５５、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、およびＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ等のアミン反応ＢＯＤＩＰＹ色素；Ｃｙ３、Ｃｙ５、６−ＦＡＭ、フルオレセインイソチオシアナート、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＲＥＧ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ、Ｒｅｎｏｇｒａｐｈｉｎ、ＲＯＸ、ＳＹＰＲＯ、ＴＡＭＲＡ、２’，４’，５’，７’−テトラブロモスルホンフルオレセイン、およびＴＥＴ。
【０１８２】
本明細書に記述される方法の一部の実施形態で用いるためのＲＴ−ＰＣＲプローブの調製において有用な蛍光標識されたリボヌクレオチドの具体例としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  （Ｉｎｔｒｏｇｅｎ）から入手可能であり、これらには、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−５−ＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−１４−ＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６−１４−ＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−５−ＵＴＰ、およびＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−１４−ＵＴＰが挙げられる。他の蛍光リボヌクレオチド、たとえばＣｙ３−ＵＴＰおよびＣｙ５−ＵＴＰは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から入手可能である。
【０１８３】
本明細書に記述される方法で用いるためのＲＴ−ＰＣＲプローブの調製において有用な蛍光標識されたデオキシリボヌクレオチドの例は、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）−１’−ｄＵＴＰ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ−７−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−５−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８−５−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−１４−ｄＵＴＰ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ−５−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２−５−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−１４−ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６−１４−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８−５−ｄＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−１２−ｄＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−５−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−１４−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４−５−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０−１４−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５−１４−ｄＵＴＰ；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−７−ＯＢＥＡ−ｄＣＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６−１６−ＯＢＥＡ−ｄＣＴ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４−７−ＯＢＥＡ−ｄＣＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７−１２−ＯＢＥＡ−ｄＣＴＰが挙げられる。蛍光標識されたヌクレオチドは、市販されており、たとえば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入することが可能である。
【０１８４】
一部の実施形態では、色素および他の部分、たとえばクエンチャーは、本明細書に記述した方法で用いられるポリヌクレオチド、たとえばＦＲＥＴプローブに、修飾ヌクレオチドを介して導入される。「修飾ヌクレオチド」とは、化学的に修飾されているが、依然としてヌクレオチドとして機能するヌクレオチドをいう。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、共有結合した、色素またはクエンチャー等の化学残基を有し、かつたとえば、ポリヌクレオチドの固相合成を目的として、ポリヌクレオチドに導入されることができる。別の実施形態では、修飾ヌクレオチドとしては、該修飾ヌクレオチドを核酸に組み入れる前、組み入れる間、組み入れた後、色素またはクエンチャーと反応することができる１つまたは複数の反応基が挙げられる。具体的な実施形態では、修飾ヌクレオチドは、アミン修飾ヌクレオチド、すなわち反応アミン基を有するように修飾されたヌクレオチドである。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、修飾塩基残基、たとえばウリジン、アデノシン、グアノシンおよび／またはシトシンを含む。具体的な実施形態では、アミン修飾ヌクレオチドは、５−（３−アミノアリル）−ＵＴＰ；８−［（４−アミノ）ブチル］−アミノ−ＡＴＰおよび８−［（６−アミノ）ブチル］−アミノ−ＡＴＰ；Ｎ６−（４−アミノ）ブチル−ＡＴＰ、Ｎ６−（６−アミノ）ブチル−ＡＴＰ、Ｎ４−［２，２−オキシ−ビス−（エチルアミン）］−ＣＴＰ；Ｎ６−（６−アミノ）ヘキシル−ＡＴＰ；８−［（６−アミノ）ヘキシル］−アミノ−ＡＴＰ；５−プロパルギルアミノ−ＣＴＰ、５−プロパルギルアミノ−ＵＴＰから選択される。一部の実施形態では、異なる核酸塩基残基を有するヌクレオチドは、たとえば、５−（３−アミノアリル）−ＵＴＰの代わりの５−（３−アミノアリル）−ＧＴＰ）等、同様に修飾されている。多くのアミン修飾ヌクレオチドは、たとえばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｉｇｍａ、Ｊｅｎａ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅおよびＴｒｉＬｉｎｋから市販されている。
【０１８５】
代表的な検出可能な部分は、結合のメンバー類が挙げられるがこれらに限定されない。一部のこのような実施形態では、結合対の第１のメンバーは、ポリヌクレオチドに結合される。結合対の第２のメンバーは、たとえば蛍光標識等の検出可能な標識に結合される。結合対の第１のメンバーに結合されたポリヌクレオチドが、検出可能な標識に結合された結合対の第２のメンバーとともにインキュベートされるとき、結合対の第１および第２のメンバーは会合して、該ポリヌクレオチドが検出されることができる。代表的な結合対としては、ビオチンとストレプトアビジン、抗体と抗原等が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１８６】
一部の実施形態では、複数の標的ＲＮＡは、単一の多重反応で検出される。一部のこのような実施形態では、固有のｃＤＮＡを標的にする各プローブは、プローブから放出されるとき、スペクトル的に識別可能である。このように、各標的ＲＮＡは、固有の蛍光シグナルによって検出される。
【０１８７】
当業者は、選択されたアッセイのための適切な検出方法、たとえばリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを選択することができる。選択された検出方法は、必ずしも上述の方法である必要はなく、かつ任意の方法でよい。
【０１８８】
４．２．  代表的な組成物およびキット
他の態様では、組成物は提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に述べる方法において使用するために提供される。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも一つのポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも一つのプライマーを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも一つのプローブを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも一つのプライマー、および少なくとも一つのプローブを含む。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、少なくとも一つの標的ＲＮＡ特異的プライマーを含む組成物が提供される。“標的ＲＮＡ特異的プライマー”という用語は、（ｉ）配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９の一つと同一である配列、または（ｉｉ）配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９の一つに見られる隣接するヌクレオチド領域の配列と相補的である配列、を有する隣接するヌクレオチド領域を有するプライマーを含む。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、少なくとも一つの標的ＲＮＡ特異的プローブを含む組成物が提供される。“標的ＲＮＡ特異的プローブ”という用語は、（ｉ）配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９の一つと同一である配列、または（ｉｉ）配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９の一つに見られる隣接するヌクレオチド領域の配列と相補的である配列、を有する隣接するヌクレオチド領域を有するプライマーを含む。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ特異的プライマーおよび標的ＲＮＡ特異的プローブはデオキシリボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、標的ＲＮＡ特異的プライマーおよび標的ＲＮＡ特異的プローブは、少なくとも一つのヌクレオチド類似体を含む。非限定的で例示的なヌクレオチド類似体は、ＬＮＡ類似体とペプチド核酸（ＰＮＡ）類似体を含む本明細書記載の類似体を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ特異的プライマーおよび標的ＲＮＡ特異的プローブは、ハイブリッド形成結合エネルギーを増加させる少なくとも一つのヌクレオチド類似体を含む（例えば上記で述べた親和性増強ヌクレオチド類似体）。いくつかの実施形態では、本明細書に述べる組成物中の標的ＲＮＡ特異的プライマーまたは標的ＲＮＡ特異的プローブは、試料中の一つの標的ＲＮＡと結合する。いくつかの実施形態では、単一のプライマーまたはプローブは、例えば複数の異性体といった複数の標的ＲＮＡと結合する。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、単一の標的ＲＮＡに特異的である一より多いプライマーまたはプローブが組成物中に存在し、そのプライマーまたはプローブは、標的ＲＮＡ内の重なり合うまたは空間的に分離した領域と結合し得る。
【０１９４】
理解されるであろうことは、下記に明確に記述されていないとしても、いくつかの実施形態では、本明細書に述べる組成物は標的ＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡにハイブリッド形成するようにデザインされており、組成物は、標的ＲＮＡ（またはそれらの領域）と同一である配列を有する少なくとも一つの標的ＲＮＡ特異的プライマーまたは標的ＲＮＡ特異的プローブ（またはそれらの領域）を含むことである。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、表６、表７、表８、表９、表３２、表３３、または表３４の一つ内の少なくとも一つのプローブ配列に特異的にハイブリッド形成する能力を有する。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号７９４から１０４３、２５７６から２６７２、および２６９２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドと相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、その成熟形では、３０未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ミクロＲＮＡである。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、または少なくとも８個の標的ＲＮＡのそれぞれに関して、標的ＲＮＡ特異的プライマーおよび／または標的ＲＮＡ特異的プローブを複数含み、標的ＲＮＡは、配列番号７９４から１０４３、２５７６から２６７２、および２６９２の一つと同一である配列を有する隣接するヌクレオチド領域を含む。いくつかの実施形態では、その複数には、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、または少なくとも１２個の標的ＲＮＡのそれぞれに関して、標的ＲＮＡ特異的プライマーおよび／または標的ＲＮＡ特異的プローブが含まれ、標的ＲＮＡは、配列番号７９４から１０４３、２５７６から２６７２、および２６９２の一つと同一である配列を有する隣接するヌクレオチド領域を含む。いくつかの実施形態では、その複数には、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも７５個、または少なくとも１００個の標的ＲＮＡのそれぞれに関して、標的ＲＮＡ特異的プライマーおよび／または標的ＲＮＡ特異的プローブが含まれ、標的ＲＮＡは、配列番号７９４から１０４３、２５７６から２６７２、および２６９２の一つと同一である配列を有する隣接するヌクレオチド領域を含む。理解されるであろうことは、いくつかの実施形態では、本明細書に述べる標的ＲＮＡは、表４、表５、および表３８の少なくとも一つ内で述べられる配列と同一である配列を含むことである。理解されるであろうことは、配列がチミン（Ｔ）塩基を含む場所は、標的ＲＮＡではウラシル（Ｕ）塩基を代わりに含み得ることである。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、組成物は、水性組成物である。いくつかの実施形態では、水性組成物は、下記に述べるように例えばリン酸塩、トリス、ＨＥＰＥＳなどの緩衝成分および／またはさらなる成分を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、例えば凍結乾燥されるといった乾燥物であり、液体の添加による再構成に適している。乾燥組成物は、緩衝成分および／またはさらなる成分を含み得る。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、組成物は、一またはそれ以上のさらなる成分を含む。追加的成分は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、およびＭｇＣｌ２といった塩類；熱安定性ポリメラーゼを含むポリメラーゼ；ｄＮＴＰ；ＲＮアーゼ阻害剤；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）など；例えばβ‐メルカプトエタノールといった還元剤；ＥＤＴＡなど；その他、を含むが、これらに限定されない。当業者は、組成物の使用意図に依存し、適した組成物成分を選択し得る。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、基板に付着する標的ＲＮＡ特異的プローブを含む、アドレス指定可能なマイクロアレイ（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）成分が提供される。
【０２００】
本明細書に述べる方法で使用されるマイクロアレイは、プローブが共有結合でまたは非共有結合で付着する固体の基板を含む。いくつかの実施形態では、一またはそれ以上の標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡにハイブリッド形成することができるプローブは、定義した位置で基板に付着する（“アドレス指定可能なアレイ”）。当業者により理解されるであろうことは、プローブは、多種多様な方法で基板に付着し得る。いくつかの実施形態では、プローブは、最初に合成され、次に、基板に付着される。他の実施形態では、プローブは基板上で合成される。いくつかの実施形態では、プローブは、例えば光重合やフォトリソグラフィーといった技術を使用して基板表面上で合成される。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、固体の基板は、プローブの付着またはプローブの関連付けに適した別々の個別のサイトを含むために修飾され、また少なくとも一つの検出方法を受け入れる。基板の代表的な例には、ガラスや修飾ガラスや官能化ガラス、プラスチック（アクリル樹脂、スチレンからのポリスチレン、他材料の共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、ＴｅｆｌｏｎＪなどを含む）、多糖、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、シリコンや修飾シリコンを含むシリカまたはシリカベースの材料、炭素、金属、無機ガラス、およびプラスチックを含む。いくつかの実施形態では、基板は、はっきりとした蛍光なしに、光学的検出を可能にする。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、基板は平面である。他の実施形態では、プローブは、例えば、試料量を最小にするためのフロースルー試料解析（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓａｍｐｌｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）のために、チューブの内側表面に置かれる。他の実施形態では、プローブは、マルチウェルプレートのウェル内に置かれ得る。さらに他の実施形態では、プローブは、アドレス指定可能なマイクロビーズアレイに付着され得る。しかし他の実施形態では、プローブは、例えば、特別なプラスチックで作られる独立気泡フォームを含む軟質フォームといった、軟質基板へと付着され得る。
【０２０３】
基板とプローブは、後の両者の付着のために、官能基で誘導体化され得る。例えば、いくつかの実施形態では、基板は、これらに限定されないが、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基、およびチオール基を含む一またはそれ以上の化学的官能基で誘導体化される。いくつかの実施形態では、プローブは、一またはそれ以上の官能基によって、基板に直接付着する。いくつかの実施形態では、プローブは、リンカー（すなわち、ハイブリッド形成と検出に関与するプローブ領域を、基板表面から遠ざけるためのスペースである隣接するヌクレオチド領域）によって、基板に間接的に付着する。いくつかの実施形態では、プローブは、５’末端によって、固体基板に付着する。他の実施形態では、プローブは、３’末端によって、付着する。さらに他の実施形態では、プローブは、内部ヌクレオチドによって、基板に付着する。いくつかの実施形態では、プローブは、固体基板に非共有結合で付着し、例えば、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用があり、そこでプローブはビオチン化され、基板表面はストレプトアビジンとの共有結合で覆われる。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、組成物は、基板に付着するプローブを有するマイクロアレイを含み、そこで少なくとも一つのプローブ（またはそれらの領域）は、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９の、一つと同一であるまたは一つの領域と相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、または少なくとも１００個のプローブは、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９の、一つと同一であるまたは一つの領域と相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９の、一つと同一であるまたは一つの領域と相補的である配列を含む、少なくとも一つの標的ＲＮＡ特異的プローブ、ならびにヒトｍｉＲＮｏｍｅの標的ＲＮＡ領域と同一であるまたは相補的である配列を含む、少なくとも一つの標的ＲＮＡ特異的プローブを、含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、各標的ＲＮＡ特異的プローブを、マイクロアレイ上の一つの位置のみで含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、少なくとも一つの標的ＲＮＡ特異的プローブを、マイクロアレイ上の複数の位置で含む。
【０２０５】
本明細書では、標的ＲＮＡ（またはその標的領域）と“相補的な”または“部分的に相補的な”という用語を使用し、そして標的ＲＮＡ配列へのプローブ配列の“相補性”の割合は、標的ＲＮＡ配列の逆相補配列への“同一性”の割合である。本明細書に述べる組成物に使用されるプローブ（またはそれらの領域）と、本明細書に開示する標的ＲＮＡとの間での“相補性”の程度を決定することにおいて、“相補性”の程度は、プローブ（またはそれらの領域）の配列と、標的ＲＮＡ配列の最良の配列の逆相補配列との間の同一性の割合として表わされる。割合は、２つの配列間で同一な配列塩基の数を数え、プローブ中の隣接するヌクレオチドの合計数で割り、１００を掛けることで計算される。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、標的ＲＮＡの標的領域に完全に相補的である配列を有する領域を有する少なくとも一つのプローブを含む。他の実施形態では、マイクロアレイは、標的ＲＮＡの最良配列領域の配列と比較する場合、一またはそれ以上の塩基ミスマッチを含む配列を有する領域を有する少なくとも一つのプローブを含む。
【０２０７】
上記で述べたように、本明細書で使用するプローブまたは標的ＲＮＡの“領域”は、特定の配列番号またはその相補配列からの８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、またはそれ以上の隣接するヌクレオチド、を含み得るまたはからなり得る。いくつかの実施形態では、領域は、プローブまたは標的ＲＮＡと同じ長さである。他の実施形態では、領域は、プローブまたは標的ＲＮＡの長さより短い。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９の、一つと同一であるまたは一つの領域と相補的である配列を有する、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、または少なくとも２５個の隣接するヌクレオチドの領域を有する少なくとも一つのプローブを含む。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、表６、表７、表８、表９、表３２、表３３、および表３４の一つのプローブ配列、と同一であるまたはその領域と相補的である配列を有する領域を有する少なくとも一つのプローブを含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、表６、表７、表８、表９、表３２、表３３、および表３４の一つのプローブ配列、と同一であるまたはその領域と相補的である配列を有する領域を有さない少なくとも一つのプローブをさらに含む。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、表６内のプローブ配列、と同一であるまたはその領域と相補的である配列を有する領域をそれぞれが含む、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも１０個、または少なくとも１５のプローブを、含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、表７内のプローブ配列、と同一であるまたはその領域と相補的である配列を有する領域をそれぞれが含む、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、または少なくとも２５個のプローブを、含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、表８内のプローブ配列、と同一であるまたはその領域と相補的である配列を有する領域をそれぞれが含む、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも６個、または少なくとも７個のプローブを、含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、表９内のプローブ配列、と同一であるまたはその領域と相補的である配列を有する領域をそれぞれが含む、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、または少なくとも５０個のプローブを、含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、表３２内または表３３内のプローブ配列、と同一であるまたはその領域と相補的である配列を有する領域をそれぞれが含む、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、または少なくとも４０個のプローブを、含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、表３４内のプローブ配列、と同一であるまたはその領域と相補的である配列を有する領域をそれぞれが含む、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、または少なくとも７０個のプローブを、含む。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、ヒトｍｉＲＮｏｍｅ（すなわち、マイクロアレイを作製する時点での、ｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）に他者らによって登録される公に知られるミクロＲＮＡ）の大部分を、例えばヒトｍｉＲＮｏｍｅの少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％を含む標的ＲＮＡと相補的である配列を有する領域を有するプローブを、含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、ヒトｍｉＲＮｏｍｅの大部分を、例えばヒトｍｉＲＮｏｍｅの少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％を含む標的ＲＮＡと同一である配列を有する領域を有するプローブを、含む。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、成分は、例えばＬｕｍｉｎｅｘにより販売されているマイクロビーズに付着するプローブを含み、各マイクロビーズは、各ビーズに固有のシグナルを作成するために異なる強度で赤色の赤外線フルオロフォアで内部を染色される。いくつかの実施形態では、本明細書に述べる方法を実行するのに役立つ組成物は、各々が固有のスペクトル特性を有する複数のマイクロビーズを含む。ビーズ内の染料から発せられる固有のスペクトル特性は特定のプローブ配列と関連しているように、各々が固有に標識されたマイクロビーズは、固有の標的ＲＮＡ特異的プローブに付着する。非限定的で例示的なプローブ配列は、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９を含む。また、非限定的で例示的なプローブ配列は、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９から選択される配列、と同一であるまたはその配列と相補的である領域を有するプローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブ配列は、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９の、一つと同一であるまたは一つの領域と相補的である、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、または少なくとも２４個の隣接するヌクレオチドを、含む。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、固有に標識したマイクロビーズは、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９の、一つと同一であるまたは一つの領域と相補的である配列を有する領域を有するプローブに、付着する。他の実施形態では、固有に標識したマイクロビーズは、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９から選択される最も類似した配列、ならびに配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９と相補的である配列、と比較した場合一またはそれ以上の塩基ミスマッチを含む配列を有する領域を有するプローブに付着する。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、固有に標識した複数のマイクロビーズを含む組成物が提供され、そこで少なくとも一つのマイクロビーズは、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９の、一つと同一であるまたは一つの領域と相補的である配列を有する、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、または少なくとも２５個の隣接するヌクレオチドの領域を有するプローブに付着する。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、固有に標識した複数のマイクロビーズを含む組成物が提供され、そこで少なくとも一つのマイクロビーズは、表６、表７、表８、表９、表３２、表３３、および表３４の一つ内のプローブ配列、と同一であるまたはその領域と相補的である配列を有する、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、または少なくとも２５個の隣接するヌクレオチドの領域を有するプローブに付着する。いくつかの実施形態では、組成物は、表６、表７、表８、表９、表３２、表３３、および表３４の一つ内のプローブ配列、と同一であるまたはその領域と相補的である領域を有さないプローブに付着する、固有に標識した少なくとも一つのマイクロビーズを、さらに含む。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、組成物は、表６内のプローブ配列、と同一であるまたはその領域と相補的である配列を有する領域を有する固有の標的ＲＮＡ特異的プローブにそれぞれが付着する、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも１０個、または少なくとも１５の固有に標識したマイクロビーズを、含む。いくつかの実施形態では、組成物は、表７内のプローブ配列、と同一であるまたはその領域と相補的である配列を有する領域を有する固有の標的ＲＮＡ特異的プローブにそれぞれが付着する、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、または少なくとも２５個の固有に標識したマイクロビーズを、含む。いくつかの実施形態では、組成物は、表８内のプローブ配列、と同一であるまたはその領域と相補的である配列を有する領域を有する固有の標的ＲＮＡ特異的プローブにそれぞれが付着する、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも６個、または少なくとも７個の固有に標識したマイクロビーズを、含む。いくつかの実施形態では、組成物は、表９内のプローブ配列、と同一であるまたはその領域と相補的である配列を有する領域を有する固有の標的ＲＮＡ特異的プローブにそれぞれが付着する、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、または少なくとも５０個の固有に標識したマイクロビーズを、含む。いくつかの実施形態では、組成物は、表３２内または表３３内のプローブ配列、と同一であるまたはその領域と相補的である配列を有する領域を有する固有の標的ＲＮＡ特異的プローブにそれぞれが付着する、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、または少なくとも４０個の固有に標識したマイクロビーズを、含む。いくつかの実施形態では、組成物は、表３４内のプローブ配列、と同一であるまたはその領域と相補的である配列を有する領域を有する固有の標的ＲＮＡ特異的プローブにそれぞれが付着する、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、または少なくとも７０個の固有に標識したマイクロビーズを、含む。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、組成物は、固有に標識した複数のマイクロビーズを含み、そこで複数は、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９の、一つと同一であるまたは一つの領域と相補的である配列を有する領域を有するプローブに付着する少なくとも一つのマイクロビーズを含む。いくつかの実施形態では、複数は、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９の、一つと同一であるまたは一つの領域と相補的である配列を有する領域を有するプローブにそれぞれが付着する、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７５個、または少なくとも１００個のマイクロビーズを、含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９の、いずれにも同一ではないまたはいずれの領域にも相補的ではない配列を有する領域を有する標的ＲＮＡ特異的プローブに付着する、固有に標識した少なくとも一つのマイクロビーズを含む。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、組成物は、固有に標識した複数のマイクロビーズを含み、複数の少なくとも一つは、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９の、一つと同一であるまたは一つの領域と相補的である配列を有する領域を有するプローブに付着し、また少なくとも第二のビーズは、ヒトｍｉＲＮｏｍｅからの標的ＲＮＡ、と同一であるまたはその領域と相補的である配列を有する領域を有するプローブに付着する。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、組成物は、固有に標識した複数のマイクロビーズを含み、複数の各々は、例えばヒトｍｉＲＮｏｍｅ  の少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％といった、ヒトｍｉＲＮｏｍｅ  の大部分を含む標的ＲＮＡと相補的である領域を有する固有のプローブに付着する。いくつかの実施形態では、組成物は、例えばヒトｍｉＲＮｏｍｅ  の少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％といった、ヒトｍｉＲＮｏｍｅ  の大部分を含む標的ＲＮＡと同一である配列を有する領域を有する固有のプローブに付着する、固有に標識した複数のマイクロビーズを、含む。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、少なくとも一つの標的ＲＮＡを検出するための少なくとも一つのポリヌクレオチドを含む組成物は提供される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、逆転写酵素反応のためのプライマーとして使用される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、増幅のためのプライマーとして使用される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＴ−ＰＣＲのためのプライマーとして使用される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも一つの標的ＲＮＡを検出するためのプローブとして使用される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、検出可能なように標識される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＦＲＥＴプローブである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、モレキュラービーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ）、またはスコーピオンプローブである。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９の、一つと同一であるまたは一つの領域と相補的である配列を有する、少なくとも一つのＦＲＥＴプローブを、含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９の、異なる一つと同一であるまたは異なる一つの領域と相補的である配列をそれぞれが有する、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７５個、または少なくとも１００個のＦＲＥＴプローブを、含む。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、ＰＣＲ反応中にプローブが分解される際に、特定の標的ＲＮＡに関連する固有の蛍光放射が生成されるように、ＦＲＥＴプローブはドナー／アクセプターのペアで標識される。いくつかの実施形態の中では、組成物が複数のＦＲＥＴプローブを含む場合には、ＰＣＲ反応中にプローブが分解される際に、特定のプローブ配列および／または特定の標的ＲＮＡに関連する固有の蛍光放射が各プローブによって生成されるように、各プローブは異なるドナー／アクセプターのペアで標識される。いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴプローブの配列は、標的ＲＮＡの標的領域と相補的である。他の実施形態では、ＦＲＥＴプローブは、標的ＲＮＡの最良配列領域の配列と比較する場合、一またはそれ以上の塩基ミスマッチを含む配列を有する。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、または少なくとも２５個のヌクレオチドからなるＦＲＥＴプローブを含み、そこで少なくとも配列の一部は、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９の、一つと同一であるまたは一つの領域と相補的である。いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴプローブの少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、または少なくとも２５個のヌクレオチドは、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９の、一つと同一であるまたは一つの領域と相補的である。いくつかの実施形態では、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９の一つ、の配列またはその相補配列と比較する場合、ＦＲＥＴプローブは一つ、二つ、または三つの塩基ミスマッチを有する配列を有する。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、または少なくとも２５個のヌクレオチドからなるＦＲＥＴプローブを含み、そこで少なくとも配列の一部は、表６、表７、表８、表９、表３２、表３３、または表３４の一つ内のプローブ配列、と同一であるまたはその領域と相補的である。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、組成物は、表６内のプローブ配列、と同一であるまたはその領域と相補的である配列をそれぞれが含む、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも１０個、または少なくとも１５の固有標識化標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブを、含む。いくつかの実施形態では、組成物は、表７内のプローブ配列、と同一であるまたはその領域と相補的である配列をそれぞれが含む、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、または少なくとも２５個の固有標識化標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブを、含む。いくつかの実施形態では、組成物は、表８内のプローブ配列、と同一であるまたはその領域と相補的である配列をそれぞれが含む、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも６個、または少なくとも７個の固有標識化標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブを、含む。いくつかの実施形態では、組成物は、表９内のプローブ配列、と同一であるまたはその領域と相補的である配列をそれぞれが含む、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、または少なくとも５０個の固有標識化標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブを、含む。いくつかの実施形態では、組成物は、表３２内または表３３内のプローブ配列、と同一であるまたはその領域と相補的である配列をそれぞれが含む、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、または少なくとも４０個の固有標識化標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブを、含む。いくつかの実施形態では、組成物は、表３４内のプローブ配列、と同一であるまたはその領域と相補的である配列をそれぞれが含む、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、または少なくとも７０個の固有標識化標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブを、含む。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、キットは、上記で述べたポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、キットは、上記で述べた少なくとも一つのプライマーおよび／またはプローブを含む。いくつかの実施形態では、キットは、例えば熱安定性ポリメラーゼといった少なくとも一つのポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、キットは、ｄＮＴＰを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に述べるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法で使用するキットは、標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブを一またはそれ以上、および／あるいは標的ＲＮＡの逆転写用の一またはそれ以上のプライマー、および／あるいは標的ＲＮＡ増幅用のまたはそれから逆転写されたｃＤＮＡ増幅用の一またはそれ以上のプライマーを含む。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、一またはそれ以上のプライマーおよび／またはプローブは“線形”である。“線形”のプライマーは、一本鎖分子であるポリヌクレオチドを指し、典型的には例えば少なくとも３個、４個、または５個の隣接するヌクレオチドの短い領域を含まず、隣接するヌクレオチドはプライマーが内部二本鎖を形成するように同一ポリヌクレオチド内の他領域と相補的である。いくつかの実施形態では、逆転写で使用するプライマーは、３’末端に少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、またはそれ以上の隣接するヌクレオチドの領域を含み、これは標的ＲＮＡの５’末端の少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、またはそれ以上の隣接するヌクレオチドの領域と相補的である。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、キットは、標的ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを増幅するために線形プライマーの一またはそれ以上のペア（“順方向プライマー”と“逆方向プライマー”）を含む。したがって、いくつかの実施形態では、第一のプライマーは、標的ＲＮＡの５’末端の少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個の隣接するヌクレオチドの領域の配列と同一である配列を含む、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個の隣接するヌクレオチドの領域を、含む。さらに、いくつかの実施形態では、第二のプライマーは、標的ＲＮＡの３’末端の少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個の隣接するヌクレオチドの領域の配列と相補的である配列を含む、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個の隣接するヌクレオチドの領域を、含む。いくつかの実施形態では、キットは、標的ＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡを増幅するための第一のプライマーセットを含み、プライマーセットは、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９の一つと同一である配列を含む核酸と、ならびに／または配列番号７９４から１０４３、２５７６から２６７２、および２６９２から選択される配列を有する少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含む標的ＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡと、特異的にハイブリッド形成することができる。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７５個、または少なくとも１００個のプライマーセットを含み、各プライマーセットは、異なる標的ＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡを増幅するためのものであり、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９から選択される配列と、ならびに／または配列番号７９４から１０４３、２５７６から２６７２、および２６９２から選択される配列を有する少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含む標的ＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡと、特異的にハイブリッド形成することができる。いくつかの実施形態では、キットは、試料中の標的ＲＮＡから逆転写される一またはそれ以上のｃＤＮＡを増幅し得る、少なくとも一つのプライマーセットを含む。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、本明細書に述べる組成物に使用されるプローブおよび／またはプライマーは、デオキシリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に述べる組成物に使用されるプローブおよび／またはプライマーは、デオキシリボヌクレオチドと、例えば上記で述べたＬＮＡアナログや他の二本鎖安定化ヌクレオチドアナログといった一またはそれ以上のヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に述べる組成物に使用されるプローブおよび／またはプライマーは、すべてのヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、プローブおよび／またはプライマーは、相補性領域内に、例えばＬＮＡアナログといった一またはそれ以上の二本鎖安定化ヌクレオチドアナログを含む。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、本明細書に述べる組成物は、標的ＲＮＡの量を標準化するのに使用される一またはそれ以上のハウスキーピング遺伝子に特異的なプローブ、そしてＲＴ−ＰＣＲの場合にはプライマー、も含む。そのようなプローブ（とプライマー）は、Ｕ６  ｓｎＲＮＡ、ＲＮＵ４４、ＲＮＵ４８、Ｕ４７、７ＳＬ  ｓｃＲＮＡ、Ｕ１  ｓｎＲＮＡ、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、およびＵ８７  ｓｃａＲＮＡから選択されるハウスキーピング遺伝子の一またはそれ以上の生成物に特異的なものを含む。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、本明細書に述べるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法に使用されるキットは、逆転写反応と増幅反応に使用される試薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、例えば逆転写酵素といった酵素と、例えばＴａｑポリメラーゼといった熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、キットは、逆転写と増幅に使用するためのデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含む。さらなる実施形態では、キットは、プローブやプライマーの特定のハイブリッド形成のために最適化されたバッファを含む。
【０２３３】
４．２．１  ＲＮＡレベルの標準化の例
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ発現レベルの定量には、一細胞当たりの全ＲＮＡ量についておよび試料調製中での試料損失程度について推定する必要がある。異なる試料間、または異なる条件下で調製した試料間での違いを修正するために、いくつかの実施形態での標的ＲＮＡ量は、少なくとも一つの内在性ハウスキーピング遺伝子の発現で標準化される。
【０２３４】
本明細書に述べる方法において標準遺伝子として使用するのに適した遺伝子は、正常試料と肺癌患者からの試料との間で、または異なる細胞株の間で、または異なる成長条件および試料調製条件の間で、生成物の量が変化しないものを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に述べる方法での標準化対照として有用な内在性ハウスキーピング遺伝子は、Ｕ６  ｓｎＲＮＡ、ＲＮＵ４４、ＲＮＵ４８、Ｕ４７、７ＳＬ  ｓｃＲＮＡ、Ｕ１  ｓｎＲＮＡ、５．８ＳｒＲＮＡ、およびＵ８７  ｓｃａＲＮＡを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ミクロＲＮＡの測定量を標準化するのに使用する少なくとも一つの内在性ハウスキーピング遺伝子は、Ｕ６  ｓｎＲＮＡ、ＲＮＵ４４、ＲＮＵ４８、Ｕ４７、７ＳＬ  ｓｃＲＮＡ、Ｕ１  ｓｎＲＮＡ、５．８ＳｒＲＮＡ、およびＵ８７  ｓｃａＲＮＡから選択される。いくつかの実施形態では、一つのハウスキーピング遺伝子は、標準化に使用される。いくつかの実施形態では、一つより多いハウスキーピング遺伝子は、標準化に使用される。
【０２３５】
４．２．２．  定性的方法の例
いくつかの実施形態では、方法は、正常な標的ＲＮＡプロファイル（いくつかの例示的実施形態では、対照試料の標的ＲＮＡプロファイル）と比較して、ヒト試料から生じる標的ＲＮＡプロファイルの質的変化を検出することを含む。発現プロファイルでのいくつかの質的変化は、被験者からの試料中での肺癌の存在を示す。“標的ＲＮＡプロファイル”という用語は、同一試料中の複数の標的ＲＮＡの同時発現に関する一連のデータを指す。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、複数の標的ＲＮＡの、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも１０個、または少なくとも１５の標的ＲＮＡは、表６内のプローブ配列に特異的にハイブリッド形成し得る。いくつかの実施形態では、複数の標的ＲＮＡの、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、または少なくとも２５個の標的ＲＮＡは、表７内のプローブ配列に特異的にハイブリッド形成し得る。いくつかの実施形態では、複数の標的ＲＮＡの、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも６個、または少なくとも７個の標的ＲＮＡは、表８内のプローブ配列に特異的にハイブリッド形成し得る。いくつかの実施形態では、複数の標的ＲＮＡの、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、または少なくとも５０個の標的ＲＮＡは、表９内のプローブ配列に特異的にハイブリッド形成し得る。いくつかの実施形態では、複数の標的ＲＮＡの、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、または少なくとも４０個の標的ＲＮＡは、表３２または表３３の一つ内のプローブ配列に特異的にハイブリッド形成し得る。いくつかの実施形態では、複数の標的ＲＮＡの、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、または少なくとも７０個の標的ＲＮＡは、表３４内のプローブ配列に特異的にハイブリッド形成し得る。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、複数の標的ＲＮＡの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７５個は、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドと相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、複数の標的ＲＮＡの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個は、配列番号７９４から１０４３、２５７６から２６７２、および２６９２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、その成熟形において、３０未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡはミクロＲＮＡである。
【０２３８】
標的ＲＮＡ発現プロファイルの作成に使用する定性的発現データは、本明細書に示す解析手法を含むあらゆる適切な解析手法を使用して得られる。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、例えば、同時発現データは、上記で述べた例えばマイクロアレイを使用して得られる。したがって、上記で述べたように特定の標的ＲＮＡの定量的発現レベルのアッセイを使用することに加えて、ｍｉＲＮｏｍｅの大部分と相補的である配列を有するプローブを含むマイクロアレイが、標的ＲＮＡ発現パターンの解析に関して、標的ＲＮＡ遺伝子発現プロファイリングを行なうために使用され得る。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの特異的な特徴は、肺癌に関する確立したマーカーに関連する。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの特異的な特徴は、例えばグラム陽性細菌感染に起因する肺癌、グラム陰性細菌感染に起因する肺癌、またはマイコバクテリア感染に起因する肺癌といった、細菌感染に起因する肺癌に関する確立したマーカーに関連する。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの特異的な特徴は、ウイルス感染に起因する肺癌に関する確立したマーカーに関連する。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの特異的な特徴は、例えば、細菌とウイルスによる重感染、あるいは一より多いウイルス株によるまたは一より多い細菌株による重感染といった、複数の感染に起因する肺癌に関する確立したマーカーに関連する。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの特異的な特徴は、肺癌の重症度レベルに直接関連する。
【０２４１】
発現プロファイリング方法によると、いくつかの実施形態では、肺癌を有する疑いの被験者から採取した試料からの全ＲＮＡは、定量的に逆転写され、試料中のＲＮＡと相補的な標識オリゴヌクレオチドのセットを提供する。次に、オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡ特異的プローブを含むマイクロアレイにハイブリッド形成し、試料のハイブリッド形成プロファイルを提供する。結果は、試料のハイブリッド形成プロファイルであり、試料中の標的ＲＮＡの発現パターンを表わす。ハイブリッド形成プロファイルは、試料から逆転写されたオリゴヌクレオチドがマイクロアレイの標的ＲＮＡ特異的プローブに結合することから発せられるシグナルを含む。いくつかの実施形態では、プロファイルは、結合の有りまたは無し（シグナル対０シグナル）として記録される。いくつかの実施形態では、記録されるプロファイルは、各ハイブリッド形成からの信号の強度を含む。プロファイルは、正常試料、すなわち非特異的試料またはいくつかの実施形態では、対照試料、から生じたハイブリッド形成プロファイルと比較される。
【０２４２】
４．３．  代表的な付加的標的ＲＮＡ
いくつかの実施形態では、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９から選択される配列を含む核酸と特異的にハイブリッド形成することができる一またはそれ以上の標的ＲＮＡを検出すること、ならびに／あるいは、配列番号７９４から１０４３、２５７６から２６７２、および２６９２から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含む一またはそれ以上の標的ＲＮＡを検出すること、ならびに／あるいは、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、１３６３から１７０７、２０６４から２１８３、２３１２から２４５２、２６７３から２６８０、および２６８９から選択される配列の少なくとも１５の隣接するヌクレオチドと相補的である配列を含む一またはそれ以上の標的ＲＮＡを検出すること、を組合せて、本明細書の方法は、肺癌に関連する少なくとも一つの他のマーカーの発現レベルを検出することをさらに含む。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、本明細書に述べる方法は、特殊なヘアピン型を有する肺癌関連の低分子ＲＮＡの発現変化を検出することをさらに含む。
【０２４４】
他の実施形態では、本明細書に述べる方法は、染色体の共依存、すなわちヒトゲノムにおいて互いが近くにクラスター化する標的ＲＮＡのことでありともに制御される傾向がある、を検出することをさらに含む。したがって、さらなる実施形態では、方法は、表３、表２２、表２５、表２９、および表３１内のミクロＲＮＡ前駆体の染色体位置から５０，０００  ｂｐ以内の染色体上にそれぞれが位置する一またはそれ以上の標的ミクロＲＮＡの発現を検出することを、含む。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、方法は、第８染色体では、８ｐ２１．３〜２１．２、８ｐ１２、８ｐ１１．２１、８ｑ１１．２１、８ｑ２１．１１、または８ｑ２４．２２〜２４．３；第９染色体では、９ｐ２１．３、９ｐ１３．３、９ｐ１１．２、９ｑ２２．３２、９ｑ３１．３〜３４．１１、または９ｑ３４．３；第１０染色体では、１０ｑ２１．３〜２３．３１、１０ｑ２４．１、１０ｑ２４．３２、１０ｑ２５．３、または１０ｑ２６．３；第１１染色体では、１１ｐ１５．５、１１ｐ１４．１、１１ｑ１２．１〜２３．２、１１ｑ１３．４〜１４．１、１１ｑ２３．２〜２４．１、または１１ｑ２５；第１２染色体では、１２ｐ１３．３２〜１３．３１、１２ｐ１３．１、１２ｐ１２．１、１２ｑ１２〜１４．１、１２ｑ１４．３〜２１．１、１２ｑ２１．３２〜２３．２、または１２ｑ２４．２３；第１３染色体では、１３ｑ１３．３、１３ｑ１４．２、１３ｑ２１．３３、１３ｑ２２．３、または１３ｑ３１．３；第１４染色体では、１４ｑ１１．１〜１３．２、１４ｑ２４．３〜３１．１、または１４ｑ３２．２〜３２．３１；第１５染色体では、１５ｑ３、１５ｑ２３〜２４．３２、または１５ｑ２５．３〜２６．２；第１６染色体では、１６ｐ１３．３〜１３．２、１６ｐ１１．２、または１６ｑ１２．１〜２２．３；第１７染色体では、１７ｐ１３．３、１７ｐ１３．１〜１１．２、１７ｑ１２〜２１．１、１７ｑ２２〜２３．３、または１７ｑ２５．３ｌ；第１８染色体では、１８ｑ１１．２、１８ｑ２１．３１〜３３、または１８ｑ２２．３；第１９染色体では、１９ｐ１３．３〜１３．２、１９ｐ１３．１２〜１２、１９ｑ１２、または１９ｑ１３．３２〜１３．４２；第２０染色体では、２０ｐ１３、２０ｐ１１．１、２０ｑ１２、または２０ｑ１３．３２；第２１染色体では、２１ｑ２１．１〜２２．１１；第２２染色体では、２２ｑ１１．２１または２２ｑ１２．１〜１３．３１；Ｘ染色体では、Ｘｐ１１．４〜１１．２２、Ｘｑ１３．１〜１３．３、Ｘｑ２２．３、Ｘｑ２５〜２７．１、またはＸｑ２７．３〜２８にクラスター化する一またはそれ以上の標的ＲＮＡの発現を検出する。
【０２４６】
４．４．  医薬組成物と治療方法
いくつかの実施形態では、開示は、例えば個人の肺癌細胞において下方制御されるまたは上方制御されるといった、標的ＲＮＡの発現が脱制御される肺癌、の治療方法に関連する。癌細胞内で少なくとも一つの標的ＲＮＡが上方制御される場合では、方法は、肺癌細胞の増殖を阻害するように、少なくとも一つの標的ＲＮＡの発現を阻害する少なくとも一つの化合物を有効量で個人に投与することを含む。あるいは、いくつかの実施形態では、癌細胞内で少なくとも一つの標的ＲＮＡが上方制御される場合では、方法は、肺癌細胞の増殖を阻害するように、少なくとも一つの標的ＲＮＡの活性を阻害する少なくとも一つの化合物を有効量で個人に投与することを含む。そのような化合物は、いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、を含むポリヌクレオチドであり得る。
【０２４７】
肺癌細胞内で少なくとも一つの標的ＲＮＡが下方制御される場合では、方法は、個体内の肺癌細胞の増殖を阻害するように、単離した標的ＲＮＡ（すなわち、いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、化学的に合成されるか組み換え技術によって発現されるか自然環境から精製される）、または単離したバリアント、またはそれらの生物学的に活性な断片、の有効量を投与することを、含む。
【０２４８】
本開示は、肺癌を治療するための医薬組成物をさらに提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも一つの単離した標的ＲＮＡ、または単離したバリアント、またはそれらの生物学的に活性な断片、および医薬的に許容され得るキャリヤを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも一つの単離した標的ＲＮＡは、正常レベルと比較して（いくつかの例示的実施形態では、対照試料中の標的ＲＮＡレベルと比較して）、肺癌細胞において減少した発現レベルを示す標的ＲＮＡに相当する。いくつかの実施形態では、単離した標的ＲＮＡは、配列番号１から３９７、１３６３から１７０７、および２３１２から２４５２の一つと同一である配列を含む少なくとも一つの核酸プローブに選択的にハイブリッド形成することができる標的ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、正常レベルと比較して、肺癌細胞において減少した発現レベルを示す単離した標的ＲＮＡは、配列番号  ９２または１７１の一つと同一である配列、あるいは表３４内のプローブ配列と同一である配列、を含む少なくとも一つの核酸プローブに選択的にハイブリッド形成することができる。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、腺癌の治療に有用であり、また配列番号４、３６、５０、９３、１２２、１２５、１３９、１４０、１４４、１４６、１５９、２２６、２３９、または２４１の一つと同一である配列を含む少なくとも一つの核酸プローブに選択的にハイブリッド形成することができる単離した標的ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、腺癌の治療に有用であり、また配列番号１９、２７、３３、４８、５５、７２、７３、９４、１０１、１０５、１１２、１１７、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１４３、１５５、１５８、１６０、１６１、１６３、１６５、２２１、２３８、２４０、または２４６の一つと同一である配列を含む少なくとも一つの核酸プローブに選択的にハイブリッド形成することができる単離した標的ＲＮＡを含む。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、単離した標的ＲＮＡは、癌細胞中で下方制御される内在性の野生型標的ＲＮＡ遺伝子からの生成物（例えば、表３に述べる遺伝子からの生成物）と同一である。いくつかの実施形態では、単離した標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡバリアント、またはそれらの生物学的に活性な断片である。本明細書で使用する“バリアント”は、関連する野生型標的ＲＮＡに対して１００％未満の配列同一性を有するが野生型標的ＲＮＡの一またはそれ以上の生物学的活性（例えば、肺癌に関連した、標的ＲＮＡ分子発現や細胞プロセスを阻害する能力）を持ち続ける標的ＲＮＡ遺伝子生成物を、指す。標的ＲＮＡの“生物学的に活性な断片”は、野生型標的ＲＮＡの一またはそれ以上の生物学的活性を有する標的ＲＮＡ遺伝子生成物の断片である。いくつかの実施形態では、単離した標的ＲＮＡは、化学療法、放射線療法、およびそれらの組合せを含むがこれらに限定されない一またはそれ以上のさらなる抗癌治療、と併用して投与され得る。いくつかの実施形態では、単離した標的ＲＮＡは、さらなる抗癌治療と併用して投与される。いくつかの実施形態では、単離した標的ＲＮＡは、さらなる抗癌治療に連続して投与される。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、標的ＲＮＡの発現を阻害する少なくとも一つの化合物を含む。いくつかの実施形態では、化合物は、正常レベルと比較して（いくつかの代表的な実施形態では、対照試料中の標的ＲＮＡレベルと比較して）肺癌細胞において増加した発現を有する一またはそれ以上の標的ＲＮＡに、特異的である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ発現阻害剤は、配列番号１から３９７、１０６３から１２１０、２０６４から２１８３、２６７３から２６８０、および２６８９の一つと同一である配列を含む少なくとも一つの核酸プローブに選択的にハイブリッド形成することができる少なくとも一つの標的ＲＮＡに、特異的である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ発現阻害剤は、配列番号１５、２６、２７、または１９１の一つと同一である配列を含む少なくとも一つの核酸プローブに選択的にハイブリッド形成することができる少なくとも一つの標的ＲＮＡに、特異的である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ発現阻害剤は、配列番号  １５、２６、２７、３０、１２９、１６４、１８４、１９１、１９６、２０５、２０７、２１４、２１９、２２５、２４６または２４８の一つと同一である配列を含む少なくとも一つの核酸プローブに選択的にハイブリッド形成することができる少なくとも一つの標的ＲＮＡに、特異的である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ発現阻害剤は、表６、表７、表８、表９、表３２、または表３３の一つ内の少なくとも一つの核酸プローブに選択的にハイブリッド形成することができる少なくとも一つの標的ＲＮＡに、特異的である。いくつかの実施形態では、表６内の少なくとも一つの核酸プローブに選択的にハイブリッド形成することができる少なくとも一つの標的ＲＮＡに特異的である、標的ＲＮＡ発現阻害剤は、非小細胞肺癌の治療に有用である。いくつかの実施形態では、表７内の少なくとも一つの核酸プローブに選択的にハイブリッド形成することができる少なくとも一つの標的ＲＮＡに特異的である、標的ＲＮＡ発現阻害剤は、扁平上皮癌の治療に有用である。いくつかの実施形態では、表８内の少なくとも一つの核酸プローブに選択的にハイブリッド形成することができる少なくとも一つの標的ＲＮＡに特異的である、標的ＲＮＡ発現阻害剤は、腺癌の治療に有用である。いくつかの実施形態では、表９内の少なくとも一つの核酸プローブに選択的にハイブリッド形成することができる少なくとも一つの標的ＲＮＡに特異的である、標的ＲＮＡ発現阻害剤は、高悪性度肺癌の治療に有用である。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、扁平上皮癌の治療に有用であり、また配列番号４、３６、５０、９３、１２２、１２５、１３９、１４０、１４４、１４６、１５９、２２６、２３９、または２４１の一つと同一である配列を含む少なくとも一つの核酸プローブに選択的にハイブリッド形成することができる標的ＲＮＡに特異的である標的ＲＮＡ発現阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、扁平上皮癌の治療に有用であり、また配列番号１９、２７、１９、２７、３３、４８、５５、７２、７３、９４、１０１、１０５、１１２、１１７、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１４３、１５５、１５８、１６０、１６１、１６３、１６５、２２１、２３８、２４０、または２４６の一つと同一である配列を含む少なくとも一つの核酸プローブに選択的にハイブリッド形成することができる標的ＲＮＡに特異的である標的ＲＮＡ発現阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、扁平上皮癌の治療に有用であり、また表７内の少なくとも一つの核酸プローブに選択的にハイブリッド形成することができる標的ＲＮＡに特異的である標的ＲＮＡ発現阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、腺癌の治療に有用であり、また表８内の少なくとも一つの核酸プローブに選択的にハイブリッド形成することができる標的ＲＮＡに特異的である標的ＲＮＡ発現阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、高悪性度肺癌の治療に有用であり、また表９内の少なくとも一つの核酸プローブに選択的にハイブリッド形成することができる標的ＲＮＡに特異的である標的ＲＮＡ発現阻害剤を含む。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ阻害剤は、二本鎖ＲＮＡ、アンチセンス核酸、および酵素的ＲＮＡ分子から選択される。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ阻害剤は、低分子阻害剤である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ阻害剤は、化学療法、放射線療法、およびそれらの組合せを含むがこれらに限定されない他の抗癌治療、と併用して投与され得る。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ阻害剤は、他の抗癌治療と併用して投与される。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ阻害剤は、他の抗癌治療に連続して投与される。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、Ｓｅｍｐｌｅらの２０１０年１月１７日付のＮａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｄｖａｎｃｅ  ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．１６０２）によって説明されまた投与されており、あらゆる目的に関してそのすべてを参照として本明細書に組み込む。
【０２５５】
本明細書で使用する“治療する”、“治療している”、“治療”という用語は、肺癌の症状の発症を防止するか遅延させること、および／または肺癌の症状の重症度か頻度を減少させることを含む、肺癌に関連した症状を改善することを、指す。
【０２５６】
標的ＲＮＡの、または標的ＲＮＡ発現阻害剤の、または標的ＲＮＡ活性阻害剤の“有効量”という用語は、肺癌に苦しむ個体における癌細胞の増殖を阻害するのに十分な量のことである。本明細書に開示する医薬組成物に使用する化合物の有効量は、例えば、治療を受ける個人のサイズおよび重量、疾患の病期、年齢、個人の健康状態および性別、投与経路、ならびに投与は局所か全身かどうか、といった因子を考慮して、当業者によって容易に決定される。
【０２５７】
単離した標的ＲＮＡ、または標的ＲＮＡ阻害剤、またはそれらの医薬的に許容され得る塩に加えて、本明細書に開示する医薬組成物は、水、バッファ水、生理食塩水、０．４％食塩水、０．３％グリシン、およびヒアルロン酸を含むがこれらに限定されない、医薬的に許容され得るキャリアを、含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、例えばリポソーム中に、カプセル化された単離した標的ＲＮＡまたは標的ＲＮＡ発現阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、例えば、上記のセクション４．１．５で述べた核酸骨格の修飾によって、ヌクレアーゼ抵抗性である、単離した標的ＲＮＡまたは標的ＲＮＡ発現阻害剤を、含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、例えば安定剤、抗酸化剤、オスモル濃度調節剤、およびバッファといった、医薬的に許容され得る賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、アルキル化剤、抗代謝剤、エピポドフィロトキシン、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、植物性アルカロイド、植物性テルペノイド、モノクローナル抗体、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、白金化合物、プロテインキナーゼ阻害剤、およびアンチセンス核酸を含むがこれらに限定されない少なくとも一つの化学療法剤、をさらに含む。
【０２５８】
医薬組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、タブレット、錠剤、小粒、カプセル、液体を含むカプセル、パウダー、徐放性製剤、坐薬、乳剤、エアロゾル、スプレー、懸濁液、または使用に適したあらゆる他の形、といった形で摂取され得る。投与方法は、経口、非経口、静脈内、経口、および吸入によるものを含むがこれらに限定されない。
【０２５９】
次の実施例は、例示することのみを目的とし、限定的であることを決して意図しない。
【０２６０】
５．  実施例
５．１  実施例１：原発性肺腫瘍からのミクロＲＮＡ
マイクロアレイ解析を使用して、原発性肺腫瘍において特定のミクロＲＮＡは脱制御される（例えば、過剰に発現されるまたは発現が低下させられる）ことを実証した。
【０２６１】
全ＲＮＡは、下記に述べるように、凍結組織試料から調製された表１０内の各原発性腫瘍から抽出された。
【０２６２】
凍結組織試料からのＲＮＡ調製
保存された凍結腫瘍標本または凍結させたばかりの腫瘍標本を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールズバッド、カリフォルニア州）のＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬中で、すり鉢とすりこぎでホモジナイズし、メーカーのプロトコールに従ってＲＮＡをさらに抽出した。全ＲＮＡ試料は、ＲＮアーゼなしの水で希釈し、そして−８０℃で保存した。
【表１０】
0005755569.tif 000092
0005755569.tif 000093
【０２６３】
Ｅｐｉ４、Ｅｐｉ７、Ｅｐｉ５、Ａｄｋ１、Ａｄｋ３、Ａｄｋ１１、Ａｄｋ８、Ａｄｋ９、およびＡｄｋ２は、１０例の患者から切除された原発性腫瘍を特定する。Ｅｐｉ（類表皮）は扁平上皮癌であり、一方Ａｄｋ（腺癌）は非扁平上皮癌である。
【０２６４】
上記の  表１０内では、“ｎａ”は、情報が入手可能ではなかったことを示す。病期カラム内の“Ｙ”は、患者が外科的切除の前に治療を受けたことを示す。“Ｐ”は、患者が外科的切除の前に治療を受けなかったことを示す。
【０２６５】
病期は、ＮＳＣＬＣのための“ＴＮＭ”病期システムに従う。ＮＳＣＬＣのための“Ｔ”カテゴリーは次のことを示す：（ａ）Ｔ１が示すのは、腫瘍は、その径が３ｃｍ以下であり、肺を囲む膜に達しておらず、気管支の主気管支に影響を及ぼさないことである；（ｂ）  Ｔ２の腫瘍は、次の特徴を一またはそれ以上有する：（ｉ）腫瘍径が３ｃｍを超える；（ｉｉ）主気管支に及ぶが、竜骨（気管が左主気管支と右主気管支に分かれる地点）より２ｃｍ以上離れている；（ｉｉｉ）肺を囲む膜に浸潤している；または、（ｉｖ）気道を部分的に塞ぐが、肺全体を崩壊させることはないまたは肺炎を発症させることはない；（ｃ）Ｔ３が示すのは、次の特徴の一またはそれ以上を有するあらゆるサイズの腫瘍である：（ｉ）腫瘍は、胸壁、横隔膜、二つの肺の間の空間を囲む膜、または心臓を囲む嚢の膜に浸潤している；（ｉｉ）腫瘍は、主気管支に浸潤し、竜骨まで２ｃｍ未満であるが、竜骨自体には及んでいない；または、（ｉｉｉ）腫瘍は、肺全体を崩壊させる程または肺全体に肺炎を発症させる程、気道に浸潤している。“Ｎ”番号は、リンパ節の関与を示し、次のことを示す：（ａ）Ｎ０は、癌がリンパ節付近に広がっていないことを示す；（ｂ）Ｎ２は、竜骨付近のリンパ節への、または胸骨の後ろで縦隔の前の空間内のリンパ節への広がりを示す。浸潤を受けるリンパ節は、原発性腫瘍と同側にある；および、（ｃ）ＮＸは、付近のリンパ節を判定できないことを示す。
【０２６６】
患者から切除された正常な肺組織（この場合では、腫瘍から可能な限り遠位の肺の場所からのもの）からの全ＲＮＡと、肺腫瘍に隣接する場所からの正常な肺組織（Ａｍｂｉｏｎ）からの全ＲＮＡは、対照として使用された。
【０２６７】
全ＲＮＡの調製および解析
全ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）の標準的プロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、単離した。２個の７５ｃｍ２フラスコのコンフルエントからの細胞を、培養した（＝約１０７細胞）。全ＲＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールズバッド、カリフォルニア州）のＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬を使用して、メーカーのプロトコールに従って調製した。全ＲＮＡ試料は、ＲＮアーゼなしの水で希釈し、そして−８０℃（−１１２°Ｆ）で保存した。
【０２６８】
ＲＮＡの質は、ＯＤ  ２６０／２８０比率を計算することにより評価した。全ＲＮＡ試料の質は、Ａ５４９ヒト腺癌細胞株からの全ＲＮＡから得られた図１に示すエレクトロフェログラムによって例示するように、またＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ  ２１００を使用して評価されるように、高いものであった。同様のエレクトロフェログラムは、他の原発性腫瘍試料からの全ＲＮＡに関しても得られた。
【０２６９】
ミクロＲＮＡ精製
ミクロＲＮＡの精製は、Ｆｌａｓｈ  ＰＡＧＥ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して行なった。Ａｍｂｉｏｎゲル精製プロトコールは、ミクロＲＮＡを含めた４０ヌクレオチド（ｎｔ）長未満の低分子ＲＮＡを濃縮する。簡潔には、全ＲＮＡ試料は、Ｆｌａｓｈ  ＰＡＧＥ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒを使用して、プレキャストゲルで泳動する。４０  ｎｔ未満の全ＲＮＡ画分（“ミクロＲＮＡ画分”）は、ゲル泳動後に回収され、そしてＲＮアーゼなしの水中に再懸濁された。
【０２７０】
マイクロアレイ解析
プローブのデザインおよびスポッティング
マイクロアレイ調製に使用するオリゴヌクレオチドプローブは、５’−ＮＨ２−（Ｃ）６−（スペーサー）−（オリゴマープローブ配列）−３’構造を有した。５’−アミノ基は、アレイ基板上に化学結合することを可能にした。オリゴヌクレオチドプローブとアレイ基板との非特異的な相互作用を防止するために、下記に示すように、各プローブは１５  ｎｔの同一のスペーサー配列も含んでいた：
５’アミノＣ６−ＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡ―オリゴプローブ配列（配列番号：１０４４）
表１内および表２内に示すプローブ配列は、リンカーを省略する。
【０２７１】
プローブは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ（エーバースベルク、ドイツ）による標準的なプロトコールに従って合成した。Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ（Ｓｃｈｏｔｔ）マイクロアレイスライド・ガラスは、固体基板としてマイクロアレイに使用した。
【０２７２】
スポッティングに使用するオリゴヌクレオチドプローブ濃度は、２５  μｍｏｌであった。プローブは、Ｓｃｈｏｔｔからアレイガラス基板とともに提供されたＮｅｘｔｅｒｉｏｎスポッティングバッファを使用し、より大きなスッポットのサイズを可能とするために１％ＳＤＳ（ナトリウムドデシルスルファート）を添加し（例えば、ＳＤＳなしで７０〜１００ミクロンと比較して、１００〜１５０ミクロン）、二連でスポットした。スポッターは、Ｓｔｅａｌｔｈ  ＳＭＰ３ピン（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ）を備えたＱＡｒｒａｙ  ｍｉｎｉ  （Ｇｅｎｅｔｉｘ）を使用した。一通りのスポットをつけた後に、スポッティング用針は、次の一通りのプローブをスポットする前に６０ｍＭ  ＮａＯＨで５回洗浄した。各スライドは、スポットされたプローブの３２ブロックでデザインされており、各ブロックはスポットされたプローブが２０ｘ２０の四角である。各プローブは、二連でスポットされた。スポットされたスライドガラスは、使用されるまで４℃で保存された。
【０２７３】
ミクロＲＮＡの標識化
ミクロＲＮＡ画分の標識化は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＧｒｏｕｐによってＥＭＢＬ（ハイデルベルク、ドイツ）で開発された出版プロトコール（Ｃａｓｔｏｌｄｉらの“Ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｒｒａｙ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  （ｍｉＣｈｉｐ）  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  （ＬＮＡ）”（ロック核酸（ＬＮＡ）に基づくミクロＲＮＡ発現プロファイリング（ｍｉＣｈｉｐ）のための高感度アレイ）、ＲＮＡ  ２００６  Ｍａｙ；１２（５）：９１３−２０．  Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｍａｒ  １５、そのすべてを参照として本明細書に組み込む）に従い行った。簡潔には、ミクロＲＮＡ画分は、ＲＮアーゼなしの水で１Ｘに希釈したＡｍｂｉｏｎバッファ中で１０  μＭの色素標識の四ヌクレオチド（５’−ｒＵｒＵｒＵｒＵ  −Ｃｙ５−  ３’）  （またはその代替として、５’−ｒＵｒＵｒＵｒＵ  −Ｃｙ３−３’）  （Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇ、ドイツ）、８％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、２  ｍＭアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、およびＴ４  ＲＮＡリガーゼ（０．７Ｕ／μｌ）を含む混合物とともに、４℃で６時間にわたりインキュベートした。標識化反応は、６５℃で１５分間にわたり混合物を加熱することにより行った。この手順は、すべてのミクロＲＮＡの３’末端にポリ−Ｕ色素標識尾部を結合させた。標識試料は、ハイブリッド形成を行う前は、４℃で保存した。
【０２７４】
アレイのハイブリッド形成
標識ミクロＲＮＡ画分は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｉｏｎ（Ｖｅｎｔａｎａ、ツーソン、アリゾナ州）を使用して、スポットしたアレイとハイブリッド形成された。簡潔には、１％ＢＳＡ、２Ｘ  ＳＳＣ、および０．２％ＳＤＳの混合物２  ｍＬは、４２℃で３０分間にわたりチップとインキュベートされた。次に、チップは、ＥＺ  Ｐｒｅｐバッファ（Ｖｅｎｔａｎａ）で一回洗浄され、そして次に、Ｒｉｂｏｗａｓｈ（Ｖｅｎｔａｎａ）でさらに三回洗浄された。次に、標識ミクロＲＮＡ混合物２０  μｌとＣｈｉｐＨｙｂｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｖｅｎｔａｎａ）  １８０μｌは、アレイに添加された。アレイは、３７℃で６分間にわたり加熱され、次に、４２℃で  ８時間にわたりインキュベートされ、この後に加熱は停止された。チップは、Ｒｉｂｏｗａｓｈ（Ｖｅｎｔａｎａ）で一回洗浄され、次に、３７℃で２分間にわたり加熱された。チップは、ＣｈｅａｐＣｌｅａｎ（Ｖｅｎｔａｎａ）１滴を添加したＲｉｂｏｗａｓｈ（Ｖｅｎｔａｎａ）で再度洗浄され、そして３７℃で２分間にわたりインキュベートされた。チップは、Ｒｉｂｏｗａｓｈ（Ｖｅｎｔａｎａ）を使用して、さらに二回洗浄された。チップは、乾燥状態で一晩保存された。次の日に、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｉｏｎに関するＶｅｎｔａｎａの使用説明書に従い、最終的な洗浄が行われた。スライドは、２Ｘ  ＳＳＣ＋０．２Ｘ  ＳＤＳバッファで二回洗浄され、次に、０．１Ｘ  ＳＳＣでさらに１回洗浄された。すべてのスライドは、Ａｒｒａｙｉｔ（ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、サニーベール、カリフォルニア州）から入手した高速遠心分離機を使用して室温で乾燥され、そしてスキャンの前には暗所に保存された。
【０２７５】
ＣｈｉｐＨｙｂｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ溶液（溶液１）の代替として、次に示す溶液（溶液２）は、１．５Ｘ  ＴＭＡＣ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを２で試料を１（体積比）で混合することによってプローブ：標的ＲＮＡハイブリッドを形成するためにハイブリッド形成に使用され得るが、したがって最終的な成分濃度は３Ｍ  ＴＭＡＣ、０．１０％  Ｓａｒｋｏｓｙｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、および４ｍＭ  ＥＤＴＡであり、４２℃で８時間にわたりアレイ上でインキュベートされる。
【表１１】
0005755569.tif 000094
＊ＴＭＡＣはテトラメチルアンモニウムクロリドである。
【０２７６】
各生体試料とハイブリッド形成することに関する技術的反復（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）を、下記の表１１に示す。
【表１２】
0005755569.tif 000095
【０２７７】
アレイイメージの獲得
アレイは、Ａｘｏｎ（商標）スキャナ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、サニーベール、カリフォルニア州）とそれらのＧｅｎｅｐｉｘ（商標）ソフトウェアを使用して、スキャンされた。イメージは、ｔｉｆｆ形式にフォーマットされ、１６ビット／ピクセル（１６００＊１６００）のイメージ色深度により定義された。そのような設定では、ピクセルは、０から６５，５３５の範囲の強度値を推測し得る。最大強度値を示すピクセルは、“飽和”しており、６５，５３５値を割り当てられる。アレイスキャンの解像度は１０  μｍ／ピクセルに設定された。異なる蛍光色素（例えばＣｙ５やＣｙ３）を使用するハイブリッド形成実験のために、光電子増倍管（ＰＭＴ）は、高強度スポットに合わせられた（Ｃｙ３は、Ｃｙ５より低いＰＭＴ設定でスキャンされる）。
【０２７８】
アレイイメージの解析
レーザースキャナのＰＭＴは、スライド上に与えられた各“地点”に関して撮られた蛍光強度をデジタル化し、その地点に対応するピクセルとして数値を保存した。そのようなピクセルから構成される画像は、次に、解析される。
【０２７９】
画像解析のための最初のタスクは、分割と呼ばれるプロセスを使用して、スポット位置を検出することであった。スポットは、可変半径または固定半径のサークルによって分割された。正確に分割し定量するには、スポットの直径は、５〜６ピクセルを超えることが必要であった。分割を行う前に、スポットのおよその位置を示すインデキシンググリッドが与えられた。分割することはそれ自身で、グリッドサークル近くのスポット末端を検出した。簡潔には、Ｇｅｎｅｐｉｘソフトウェアは、アレイ上の各スポットにサークルを割り当てる（分割）。分割は、完全な長方形のグリッド上にスポットがほとんど乗らないことのように、スポッティングが不完全であることおよび／または基板に歪みがあることのために、若干柔軟に行わなければならなかった。
【０２８０】
ソフトウェアによる分割の後、サークルは手作業で修正され、アレイ上のすべてのスポットが明確に同定されるまでサークルはスポット上に調整された。この段階で、実際のスポットをそのバックグラウンドと区別するのを妨げるような高いバックグラウンドノイズをアレイが示した場合、アレイをさらなる解析には使用しなかった。
【０２８１】
イメージ解析の第２のタスクは、スポットを定量し、そのデータを結果ファイルへとエクスポートすることであった。ひとたびスポットがイメージ上に位置づけられたならば、これは比較的容易で明確に定義されたタスクであった。スポット強度を定量するのに最も頻繁に使用される統計的アプローチは、スポットに属するピクセルの平均値または中央値であった。中央値によるアプローチは、ピクセルの外れ値が存在する場合に、平均値よりもロバスト性であった。しかしながら、実際には、平均値または中央値を使用して得られた結果に差異はほとんどみられなかった。
【０２８２】
アレイデータの解析
すべてのアレイデータは、Ｒ  ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｐａｃｋａｇｅ（“Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：  ｏｐｅｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ”（Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：計算生物学とバイオインフォマティクスのためのオープンソフトウェア開発）、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．  ２００４；５（１０）：Ｒ８０．  Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｓｅｐ  １５、そのすべてを参照として本明細書に組み込む）を使用して解析した。
【０２８３】
アレイデータは、内部対照（表１２）に関してスポット強度を比較することによって、最初にその質に関して検証された。一つの内部対照（配列番号１０４６）は、標識化対照として使用され（この合成ＲＮＡは、標識化する前に、精製ミクロＲＮＡ画分に添加される）、７つの他の内部対照（配列番号１０４７〜１０５２、および１０４５）は、データの正規化のために使用された（これらの合成ＲＮＡ対照は、ハイブリッド形成を行う前に、アレイごとにそれぞれを５２０  ｆｍｏｌで全ＲＮＡ画分に添加される）。
【表１３】
0005755569.tif 000096
【表１４】
0005755569.tif 000097
【０２８４】
スポットの強度が、その位置のバックグラウンド強度の平均値に標準偏差の１．５倍を加えた数値を超えるすべての配列を、発現ミクロＲＮＡに分類した。アレイ強度データを、さらなる解析に有効であるとみなすために、次の基準を満たすことが必要であった：
１．  ハイブリッド形成対照の特異性は、許容基準内になければならなかった（例えば、ＣＴＬ２６に対してそれに対応する単一塩基変異体であるＣＴＬ２６＿ＭＵＴ、またはＣＴＬ１３に対してそれに対応する単一塩基変異体であるＣＴＬ１３＿ＭＵＴ）。
２．  陽性対照（ポジティブコントロール６）の反復でのシグナル強度のおおよその均一性。
３．  各ブロックのための陽性対照に基づいたシグナル強度のブロック中央値の間でのおおよその均一性。
４．  検出されたすべての配列に基づいたアレイシグナル中央値の間でのおおよその均一性。
５．  精製と標識化の対照（ＣＴＬ３０）のシグナル強度。
【０２８５】
データの統計的正規化は、Ｌｏｇ２ｒａｔｉｏを計算することによってなされ、そこでＬｏｇ２ｒａｔｉｏは、二連スポットのシグナルの平均強度／ブロックのためのすべての陽性対照の強度の中央値、に等しい。アレイのすべてのブロックでの非均質的な標識化を回避するために、正規化は各ブロックで行った。このブロックごとの正規化は、スライドの全体での正規化を使用するよりもより効率的であることが示されてきた。得られた値は、Ｌｏｇ２値である。
【０２８６】
各オリゴヌクレオチドプローブのスポットの強度は、原発性肺腫瘍からの試料に対して正常な肺組織からの試料で比較され、各ミクロＲＮＡでの相対的な発現を評価することとなった。
【０２８７】
発現の倍率変化は、２（Ｌｏｇ２ｒａｔｉｏ）に相当する。Ｌｏｇ２ｒａｔｉｏは、比較される二つの条件間での比率であり、またはｌｏｇ２（Ｘ細胞株／Ｘ正常）であり、これは（ｌｏｇ２Ｘ細胞株−ｌｏｇ２Ｘ正常）と同じであり、そこでＸは測定された強度値である。“正常”条件からのシグナルがない場合では、実験での最低の測定強度値がベースラインとして使用され、この数値から倍率変化発現値が計算された。ゼロ未満の倍率変化値は、（１／倍率変化）倍の下方制御に相当する。
【０２８８】
データを表１に示す。表１に述べる数値は、各腫瘍細胞試料における特定プローブへのハイブリッド形成に関して測定されたシグナル強度と、対照試料（ＮＨＢＥ細胞）における同プローブへのハイブリッド形成に関して測定されたシグナル強度とを、比較することにより計算した倍率変化を示す。特定プローブへのハイブリッド形成に関して検出されたシグナルが、対照試料と腫瘍細胞試料の両方において閾値未満である場合には、表内には“ｎｄ”の記号が付与され、倍率変化は計算されなかった。同様に、特定アレイプローブへのハイブリッド形成が対照試料に検出されたが腫瘍細胞試料には検出されなかった場合には、倍率変化計算値の前に“ｎｄ”が付与される。対照試料にシグナルが検出されなかった場合には、倍率変化計算のために閾値が使用された。これは、対照試料と比較して、腫瘍細胞試料の倍率変化の過小評価が生じ、それは標的ＲＮＡの上方制御と下方制御に関して、表１ではそれぞれ“＞”記号または“＜”記号により示された。
【０２８９】
５．２  実施例２：肺癌細胞株からの標的ＲＮＡの解析
細胞株
全ＲＮＡは、肺癌に関する研究で一般に使用される異なる三つの肺細胞株から調製された。ＲＮＡは、標的ＲＮＡアレイのプロファイリングに使用された。
【０２９０】
下記の表１４に述べるように、細胞株は、腺癌、扁平上皮癌、および大細胞癌に由来する多様なものから選択された。すべての細胞株は、ＬＧＣ  Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ（ＡＴＣＣ）から購入され、ＡＴＣＣのガイドラインに従って培養された。
【表１５】
0005755569.tif 000098
0005755569.tif 000099
【０２９１】
実施例１に述べたように、マイクロアレイデータの獲得および解析を行った。
【０２９２】
正常ヒト気管支上皮細胞（ＮＨＢＥ、ＡＴＣＣ  ｎｏ．  ＣＣ−２５４０）からの全ＲＮＡは、対照として使用された。
【０２９３】
データを表２に示す。示す数値は、原発性腫瘍細胞試料において特定アレイプローブへのハイブリッド形成に関して測定されたシグナル強度と、対照試料において同プローブへのハイブリッド形成に関して測定されたシグナル強度の平均値とを、比較することにより計算した倍率変化に相当する。シグナルが、対照試料と原発性腫瘍細胞試料の両方において閾値未満である場合には、倍率変化は計算されなかった（表２では“ｎｄ”で示される）。特定プローブへのハイブリッド形成が対照試料に検出されたが原発性腫瘍細胞試料には検出されなかった場合には、倍率変化計算値の前に“ｎｄ”が付与される。対照試料においてアレイプローブへのハイブリッド形成に関してシグナルが検出されなかった場合には、倍率変化計算のために閾値が使用され、これによって、対照試料と比較して、原発性腫瘍細胞試料の倍率変化の過小評価が生じた。これは表２では、標的ＲＮＡの上方制御と下方制御に関して、それぞれ“＞”記号または“＜”記号により示された。
【０２９４】
５．３  実施例３：Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｐｌａｔｆｏｒｍにおける標的ＲＮＡの解析
Ｌｕｍｉｎｅｘテクノロジー（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．、Ａｕｓｔｉｎ、テキサス州）は、プローブ標識ビーズへの液相でのハイブリッド形成の後に、蛍光色素を異なる比率で有するビーズをフローサイトメトリーによって検出することに基づく。１００種類までの異なる色素比率を有するビーズが利用可能であり、これは、単一試料を、同時に１００個までの検査項目に関して調べることを可能にする。
【０２９５】
Ｌｕｍｉｎｅｘビーズへのプローブのカップリング
実施例１および表１に述べるような配列を有する各５’−アミノ基修飾プローブの一定分量を、分子生物学等級水中に０．１ｎｍｏｌ／μＬ濃度で調製した。プローブは、メーカーのプロトコール（Ｌｕｍｉｎｅｘビーズカップリングプロトコール）に従って、カルボジイミド化学を使用し、ビーズに結合される。プローブ結合ビーズは、４℃で保存される。
【０２９６】
Ｌｕｍｉｎｅｘ解析のための全ＲＮＡ調製
７つの内部対照（アレイの対照に使用したものと同じ合成ＲＮＡ）をそれぞれ５０  ｆｍｏｌ、生体試料から単離した全ＲＮＡ画分に添加する。Ｌｕｍｉｎｅｘビーズとハイブリッド形成を行う前に、全ＲＮＡ調製物は、単一ＲＮＡ分子の環状化や、他のＲＮＡ分子への連結の結果生じるデンドリマーの形成を回避するために処理を受ける。デンドリマーの形成を回避するために、ＲＮＡは、子ウシ腸ホスファターゼ（ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＣＩＰ）で前処理し、５’リン酸基を除去する。ＣＩＰ試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールズバッド、カリフォルニア州）から入手できる、またＣＩＰ反応はメーカーのプロトコールに従って行う。
【０２９７】
ビーズ標識化とハイブリッド形成
ＣＩＰ処理をした後、次に、全ＲＮＡ画分は、Ｖａｎｔａｇｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ｍａｒｌｉｇｅｎ）を使用して、ビオチンで標識化される。標識画分は、Ｍａｒｌｉｇｅｎのプロトコールを使用して、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズにハイブリッド形成される。簡潔には、オリゴヌクレオチドビーズは、Ｍａｒｌｉｇｅｎハイブリッド形成溶液（１．５Ｘ  ＴＭＡＣ）と標識全ＲＮＡと混合される。ハイブリッド形成は、暗所で６０℃で１時間にわたり行なわれる。ハイブリッド形成の後、ビーズは、Ｌｕｍｉｎｅｘ標準６Ｘ  ＳＳＰＥＴ洗浄用バッファ（リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＥＤＴＡ、トリトンＸ−１００、ｐＨ  ７．４）を使用して洗浄される。
【０２９８】
ビーズハイブリッド形成の検出
Ｌｕｍｉｎｅｘビーズの検出は、ストレプトアビジンフィコエリトリン（ＳＡＰＥ）（  Ｅｕｒｏｐａ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、ケンブリッジ、英国）を使用して行われる。ＳＡＰＥは、Ｌｕｍｉｎｅｘのプロトコールに従って、洗浄済みビーズに添加される。次に、ビーズは、より優れた解能力のために高ゲイン設定を使用したＬｕｍｉｎｅｘ  ＩＳ−２００機器を使用して読み取られる。
【０２９９】
データ獲得とデータ解析
Ｌｕｍｉｎｅｘ  ＩＳ−２００は、反応混合物中の各色素比率の少なくとも２５個のビーズを読み取る。各色素比率ビーズは、特定のプローブ配列に相当し、そして、強度値は、すべての読み取ったビーズの平均値として戻ってくる。平均蛍光強度（ＭＦＩ）データは、合成ＲＮＡ対照を使用して標準化され、そして、正常試料と疾患試料との間の倍率変化は、Ｂｉｏｐｌｅｘソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）とＲ  ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｐａｃｋａｇｅ  （“Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：  ｏｐｅｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ”（Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：計算生物学とバイオインフォマティクスのためのオープンソフトウェア開発）、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．  ２００４；５（１０）：Ｒ８０．  Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｓｅｐ  １５）を使用して計算される。
【０３００】
５．４  実施例４：さらなる原発性肺腫瘍からの標的ＲＮＡの解析
実施例１で解析した３つの原発性肺腫瘍は、本解析に含まれた（Ａｄｋ−９、Ａｄｋ−１０、およびＥｐｉ−４）。実施例１でのそれらの腫瘍から単離されたミクロＲＮＡ画分は、下記に述べるマイクロアレイ実験で使用された。
【０３０１】
患者コホート
上記にリストアップした（および、表１５の最初の３行に含まれる）３つの腫瘍に加えて、肺癌と診断された１５例の患者は、コホートに含まれ、男性９例で女性６例であった。さらなる患者（Ｋｓａｒｃ−１７）からの正常組織も、本研究に含まれた。肺扁平上皮癌と肺非扁平上皮癌は、最も頻繁に生じる肺癌タイプの２つであり（すべての肺癌の７０％を超える）、以前の扁平上皮癌患者（Ｅｐｉ−４）および非扁平上皮癌患者（Ａｄｋ−９およびＡｄｋ−１０）に加えて、扁平上皮癌を診断された患者４例（Ｋｍａｌｐ−２１、Ｋｍａｌｐ−２５、Ｅｐｉ−４２、およびＫｍａｌｐ−４４）、非扁平上皮癌を診断された患者７例（Ａｄｋ−４０、Ａｄｋ−４１、Ａｄｋ−４８、Ａｄｋ−４９、Ａｄｋ−１５、Ａｄｋ−２３、およびＡｄｋ−２９）が含まれた。さらに、カルチノイドを診断された１例（Ｃａｒ−１３）、肉腫様癌を診断された１例（Ｋｓａｒｃ−１９）、小細胞肺癌を診断された１例（Ｓｃｃ−２７）、および大細胞神経内分泌癌を診断された１例（Ｌｃｎｅｃ−３１）も選択された。表１５は、患者のリストと各患者の様々な臨床的特徴を示す。
【表１６】
0005755569.tif 000100
0005755569.tif 000101
ＰＴ＝原発性腫瘍
ＤＮＴ＝遠位の正常組織
ＮＡ＝情報は入手できず
【０３０２】
患者の内５例は、高悪性度肺癌を有しており、Ｋｓａｒｃ−１９（肉腫様癌）、Ａｄｋ−９、Ａｄｋ−１０、Ａｄｋ−２９（すべて腺癌）、Ｌｃｎｅｃ−３１であった。患者Ｋｓａｒｃ−１９は、手術後１カ月で再発し、そして６カ月後に死亡した。患者Ｃａｒ−１３（カルチノイド）は、ゆっくり進行する形の肺癌を有していた。
【０３０３】
原発性腫瘍のみが、患者６例から採取され（以前の４例の患者からも同様であり、合計１０例となる）、一方、原発性腫瘍と遠位の正常組織は、患者９例から採取された。患者１例（Ｋｓａｒｃ−１７）からは、遠位の正常組織のみが使用された。原発性腫瘍中の腫瘍細胞対正常細胞の相対量は、すべての患者に関して９０％と１００％との間であった。遠位の正常組織は、原発性腫瘍から可能な限り離れた位置から採取され、検出可能な腫瘍細胞を含んでいなかった。
【０３０４】
組織試料
原発性肺腫瘍に由来する、保存凍結標本または凍結させたばかりの標本を使用した。組織試料は、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）中で、すり鉢とすりこぎでホモジナイズし、メーカーのプロトコールに従ってＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ試料は、ＲＮアーゼなしの水で希釈し、そして−８０℃（−１１２°Ｆ）で保存した。
【０３０５】
ミクロＲＮＡ調製：
全試料は、Ｆｌａｓｈ  ＰＡＧＥ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、ミクロＲＮＡ画分に関して濃縮された。簡潔には、全ＲＮＡ試料は、Ｆｌａｓｈ  ＰＡＧＥ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒを使用して、プレキャストゲルで泳動された。４０  ｎｔ未満の全ＲＮＡ画分（“ミクロＲＮＡ画分”）は、ゲル泳動後に回収され、そしてＲＮアーゼなしの水中に再懸濁された。
【０３０６】
マイクロアレイ解析
プローブのデザインおよびスポッティング
マイクロアレイ調製に使用するオリゴヌクレオチドプローブは、５’−ＮＨ２−（Ｃ）６−（スペーサー）−（オリゴマープローブ配列）−３’構造を有した。５’−アミノ基は、アレイ基板上に化学結合することを可能にした。ポリヌクレオチドプローブとアレイ基板との非特異的な相互作用を防止するために、下記に示すように、各プローブは１５  ｎｔの同一のスペーサー配列も含んでいた：
５’アミノＣ６−ＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡ―オリゴプローブ配列（配列番号１０４４）。
表内に示すプローブ配列は、リンカーを省略する。
【０３０７】
プローブは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ（エーバースベルク、ドイツ）による標準的なプロトコールに従って合成した。Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ（Ｓｃｈｏｔｔ）マイクロアレイスライドガラスは、固体基板としてマイクロアレイに使用した。
【０３０８】
スポッティングに使用するオリゴヌクレオチドプローブ濃度は、２５  μｍｏｌであった。プローブは、Ｓｃｈｏｔｔからアレイガラス基板とともに提供されたＮｅｘｔｅｒｉｏｎスポッティングバッファを使用し、より大きなスポットのサイズを可能とするために１％ＳＤＳ（ナトリウムドデシルスルファート）を添加し（例えば、ＳＤＳなしで７０〜１００ミクロンと比較して、１００〜１５０ミクロン）、二連でスポットした。スポッターは、Ｓｔｅａｌｔｈ  ＳＭＰ３ピン（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ）を備えたＱＡｒｒａｙ  ｍｉｎｉ  （Ｇｅｎｅｔｉｘ）を使用した。一通りのスポットをつけた後に、スポッティング用針は、次の一通りのプローブをスポットする前に６０ｍＭ  ＮａＯＨで５回洗浄した。各スライドは、スポットされたプローブの４８ブロックでデザインされており、各ブロックはスポットされたプローブが２０ｘ１８の四角である。各プローブは、二連でスポットされた。スポットされたスライドガラスは、使用されるまで４℃で保存された。
【０３０９】
ミクロＲＮＡの標識化
ミクロＲＮＡ画分の標識化は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＧｒｏｕｐによってＥＭＢＬ（ハイデルベルク、ドイツ）で開発された出版プロトコール（Ｃａｓｔｏｌｄｉらの“Ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｒｒａｙ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  （ｍｉＣｈｉｐ）  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  （ＬＮＡ）”（ロック核酸（ＬＮＡ）に基づくミクロＲＮＡ発現プロファイリング（ｍｉＣｈｉｐ）のための高感度アレイ）、ＲＮＡ  ２００６  Ｍａｙ；１２（５）：９１３−２０．  Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｍａｒ  １５、そのすべてを参照として本明細書に組み込む）に従い行った。簡潔には、ミクロＲＮＡ画分は、ＲＮアーゼなしの水で１Ｘに希釈したＡｍｂｉｏｎバッファ中で１０  μＭの色素標識の四ヌクレオチド（５’−ｒＵｒＵｒＵｒＵ  −Ｃｙ５−  ３’）  （またはその代替として、５’−ｒＵｒＵｒＵｒＵ  −Ｃｙ３−３’）  （Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇ、ドイツ）、８％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、２  ｍＭアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、およびＴ４  ＲＮＡリガーゼ（０．７Ｕ／μｌ）を含む混合物とともに、４℃で６時間にわたりインキュベートした。標識化反応は、６５℃で１５分間にわたり混合物を加熱することにより行った。この手順は、すべてのミクロＲＮＡの３’末端にポリ−Ｕ色素標識尾部を結合させた。標識試料は、ハイブリッド形成を行う前は、４℃で保存した。
【０３１０】
アレイのハイブリッド形成
表１６は、各腫瘍試料のために行なわれたアレイ反復の回数を示す。
【表１７】
0005755569.tif 000102
【０３１１】
標識ミクロＲＮＡ画分は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｉｏｎ（Ｖｅｎｔａｎａ、ツーソン、アリゾナ州）を使用して、スポットしたアレイとハイブリッド形成された。簡潔には、１％ＢＳＡ、２Ｘ  ＳＳＣ、および０．２％ＳＤＳの混合物２  ｍＬは、４２℃で３０分間にわたりチップとインキュベートされた。次に、チップは、ＥＺ  Ｐｒｅｐバッファ（Ｖｅｎｔａｎａ）で一回洗浄され、そして次に、Ｒｉｂｏｗａｓｈ（Ｖｅｎｔａｎａ）でさらに三回洗浄された。次に、標識ミクロＲＮＡ混合物２０  μｌとＣｈｉｐＨｙｂｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｖｅｎｔａｎａ）  １８０μｌは、アレイに添加された。アレイは、３７℃で６分間にわたり加熱され、次に、４２℃で  ８時間にわたりインキュベートされ、この後に加熱は停止された。チップは、Ｒｉｂｏｗａｓｈ（Ｖｅｎｔａｎａ）で一回洗浄され、次に、３７℃で２分間にわたり加熱された。チップは、ＣｈｅａｐＣｌｅａｎ（Ｖｅｎｔａｎａ）１滴を添加したＲｉｂｏｗａｓｈ（Ｖｅｎｔａｎａ）で再度洗浄され、そして３７℃で２分間にわたりインキュベートされた。チップは、Ｒｉｂｏｗａｓｈ（Ｖｅｎｔａｎａ）を使用して、さらに二回洗浄された。チップは、乾燥状態で一晩保存された。次の日に、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｉｏｎに関するＶｅｎｔａｎａの使用説明書に従い、最終的な洗浄が行われた。スライドは、２Ｘ  ＳＳＣ＋０．２Ｘ  ＳＤＳバッファで二回洗浄され、次に、０．１Ｘ  ＳＳＣでさらに１回洗浄された。すべてのスライドは、Ａｒｒａｙｉｔ  （ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、サニーベール、カリフォルニア州）から入手した高速遠心分離機を使用して室温で乾燥され、そしてスキャンの前には暗所に保存された。
【０３１２】
アレイイメージの獲得
アレイは、Ａｘｏｎ（商標）スキャナ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、サニーベール、カリフォルニア州）とそれらのＧｅｎｅｐｉｘ（商標）ソフトウェアを使用して、スキャンされた。イメージは、ｔｉｆｆ形式にフォーマットされ、１６ビット／ピクセル（１６００＊１６００）のイメージ色深度により定義された。そのような設定では、ピクセルは、０から６５，５３５の範囲の強度値を推測し得る。最大強度値を示すピクセルは、“飽和”しており、６５，５３５値を割り当てられる。アレイスキャンの解像度は１０  μｍ／ピクセルに設定された。異なる蛍光色素（例えばＣｙ５やＣｙ３）を使用するハイブリッド形成実験のために、光電子増倍管（ＰＭＴ）は、高強度スポットに合わせられた（Ｃｙ３は、Ｃｙ５より低いＰＭＴ設定でスキャンされる）。
【０３１３】
アレイイメージの解析
レーザースキャナのＰＭＴは、スライド上に与えられた各“地点”に関して撮られた蛍光強度をデジタル化し、その地点に対応するピクセルとして数値を保存した。そのようなピクセルから構成される画像は、次に、解析される。画像解析のための最初のタスクは、分割と呼ばれるプロセスを使用して、スポット位置を検出することであった。スポットは、可変半径または固定半径のサークルによって分割された。正確に分割し定量するには、スポットの直径は、５〜６ピクセルを超えることが必要であった。分割を行う前に、スポットのおよその位置を示すインデキシンググリッドが与えられた。分割することはそれ自身で、グリッドサークル近くのスポット末端を検出した。簡潔には、Ｇｅｎｅｐｉｘソフトウェアは、アレイ上の各スポットにサークルを割り当てる（分割）。分割は、完全な長方形のグリッド上にスポットがほとんど乗らないことのように、スポッティングが不完全であることおよび／または基板に歪みがあることのために、若干柔軟に行わなければならなかった。
【０３１４】
ソフトウェアによる分割の後、サークルは手作業で修正され、アレイ上のすべてのスポットが明確に同定されるまでサークルはスポット上に調整された。この段階で、実際のスポットをそのバックグラウンドと区別するのを妨げるような高いバックグラウンドノイズをアレイが示した場合、アレイをさらなる解析には使用しなかった。
【０３１５】
イメージ解析の第２のタスクは、スポットを定量し、そのデータを結果ファイルへとエクスポートすることであった。ひとたびスポットがイメージ上に位置づけられたならば、これは比較的容易で明確に定義されたタスクであった。スポット強度を定量するのに最も頻繁に使用される統計的アプローチは、スポットに属するピクセルの平均値または中央値であった。中央値によるアプローチは、ピクセルの外れ値が存在する場合に、平均値よりもロバスト性であった。しかしながら、実際には、平均値または中央値を使用して得られた結果に差異はほとんどみられなかった。
【０３１６】
アレイデータの解析
すべてのアレイデータは、Ｒ  ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｐａｃｋａｇｅ（“Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：  ｏｐｅｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ”（Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：計算生物学とバイオインフォマティクスのためのオープンソフトウェア開発）、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．  ２００４；５（１０）：Ｒ８０．  Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｓｅｐ  １５、そのすべてを参照として本明細書に組み込む）を使用して解析した。
【０３１７】
アレイデータは、内部対照に関してスポット強度を比較することによって、最初にその質に関して検証された。一つの内部対照（配列番号１０４６；表１７）は、標識化対照として使用され（この合成ＲＮＡは、標識化する前に、精製ミクロＲＮＡ画分に添加される）、６つの他の内部対照（配列番号１０４７〜１０５２）は、データの正規化のために使用された（これらの合成ＲＮＡ対照は、ハイブリッド形成を行う前に、アレイごとにそれぞれを５２０  ｆｍｏｌで全ＲＮＡ画分に添加される）。表１７に、合成ＲＮＡに結合するプローブ配列と、変異プローブ配列も示す（配列番号１０５４から１０６１）。
【表１８】
0005755569.tif 000103
0005755569.tif 000104
【０３１８】
スポットの強度が、その位置のバックグラウンド強度の平均値に標準偏差の１．５倍を加えた数値を超えるすべての配列を、発現ミクロＲＮＡに分類した。アレイ強度データを、さらなる解析に有効であるとみなすために、次の基準を満たすことが必要であった：
１．  ハイブリッド形成対照の特異性は、許容基準内になければならなかった（例えば、ＣＴＬ２６に対してそれに対応する単一塩基変異体であるＣＴＬ２６＿ＭＵＴ）。
２．  陽性対照の反復でのシグナル強度のおおよその均一性。
３．  各ブロックのための陽性対照に基づいたシグナル強度のブロック中央値の間でのおおよその均一性。
４．  検出されたすべての配列に基づいたアレイシグナル中央値の間でのおおよその均一性。
５．  精製と標識化の対照（ＣＴＬ３０）のシグナル強度。
【０３１９】
データの統計的正規化は、Ｌｏｇ２ｒａｔｉｏを計算することによってなされ、そこでＬｏｇ２ｒａｔｉｏは、二連スポットのシグナルの平均強度／ブロックのためのすべての陽性対照の強度の中央値、に等しい。アレイのすべてのブロックでの非均質的な標識化を回避するために、正規化は各ブロックで行った。このブロックごとの正規化は、スライドの全体での正規化を使用するよりも効率的であることが示されてきた。得られた値は、Ｌｏｇ２値である。
【０３２０】
各ポリヌクレオチドプローブのスポットの強度は、腫瘍からの試料に対して正常組織からの試料で比較され、各ミクロＲＮＡでの相対的な発現を評価することとなった。
【０３２１】
発現の倍率変化は、２（Ｌｏｇ２ｒａｔｉｏ）に相当する。Ｌｏｇ２ｒａｔｉｏは、比較される二つの条件間での比率であり、またはｌｏｇ２（Ｘ細胞株／Ｘ正常）であり、これは（ｌｏｇ２Ｘ細胞株−ｌｏｇ２Ｘ正常）と同じであり、そこでＸは測定された強度値である。“正常な”条件からのシグナルがない場合では、実験での最低の測定強度値がベースラインとして使用され、この数値から倍率変化発現値が計算された。ゼロ未満の倍率変化値は、（１／倍率変化）倍の下方制御に相当する。
【０３２２】
結果
マイクロアレイデータは、検証した腫瘍試料の半数を超えるものにおいて、増加レベルが存在した標的ＲＮＡを同定するために解析された。表１８と表１９には、標的ＲＮＡ、腫瘍試料の何パーセントが増加レベルで存在するのか、および、増加レベルで存在するそれらの腫瘍試料の増加倍率の平均、を示す。６例の腫瘍のデータを表１８に示し、残りの１３例の腫瘍のデータを表１９に示す。表１８には、標的ＲＮＡを検出するのに使用したプローブ配列も示す。
【０３２３】
マイクロアレイデータは、腫瘍試料の５０％未満において、正常レベルよりも少なくとも５倍高いレベルで存在する標的ＲＮＡを同定するために、さらに解析された。表２０と表２１には、標的ＲＮＡ、腫瘍試料の何パーセントが増加レベルで存在するのか、および、増加レベルで存在するそれらの腫瘍試料の増加倍率の平均、を示す。６例の腫瘍のデータを表２０に示し、残りの１３例の腫瘍のデータを表２１に示す。表２０には、標的ＲＮＡを検出するのに使用したプローブ配列も示す。ついに、表２２には、表１８から表２１の各標的ＲＮＡに関する、ミクロＲＮＡ前駆体配列と、ミクロＲＮＡ前駆体遺伝子の染色体位置を示す。
【０３２４】
次に、マイクロアレイデータは、検証した腫瘍試料の半数を超えるものにおいて、少なくとも５倍の減少レベルで存在した標的ＲＮＡを同定するために解析された。表２３と表２４には、標的ＲＮＡ、標的ＲＮＡを検出するのに使用したプローブ配列、腫瘍試料の何パーセントが増加レベルで存在するかを示す。６例の腫瘍のデータを表２３に示し、残りの１３例の腫瘍のデータを表２４に示す。表２５には、表２３と表２４の各標的ＲＮＡに関する、ミクロＲＮＡ前駆体配列と、ミクロＲＮＡ前駆体遺伝子の染色体位置を示す。
【０３２５】
ついに、上記の表９には、最も悪性度が高い癌の５例（Ｋｓａｒｃ−１９、Ａｄｋ−９、Ａｄｋ−１０、Ａｄｋ−２９、およびＬｎｅｃ−３１）の内少なくとも３例において、高レベルが存在した標的ＲＮＡを示す
【表１９】
0005755569.tif 000105
0005755569.tif 000106
【表２０】
0005755569.tif 000107
0005755569.tif 000108
【表２１】
0005755569.tif 000109
0005755569.tif 000110
0005755569.tif 000111
0005755569.tif 000112
0005755569.tif 000113
0005755569.tif 000114
【表２２】
0005755569.tif 000115
0005755569.tif 000116
0005755569.tif 000117
0005755569.tif 000118
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【０３２６】
実施例５：さらなる肺癌細胞株からの標的ＲＮＡの解析
全ＲＮＡは、表２６にリストアップした８つの細胞株（７つの肺癌細胞株および１つの正常な肺細胞株）から調製された。細胞株は、ＬＧＣ  ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ（ＡＴＣＣ）から購入され、ＡＴＣＣガイドラインに従って培養された。
【表２７】
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【０３２７】
実施例４に述べたように、マイクロアレイデータの獲得および解析は行なわれた。
【０３２８】
正常ヒト気管支上皮細胞（ＮＨＢＥ）からの全ＲＮＡは、対照として使用された。
【０３２９】
マイクロアレイデータは、検証した細胞株の少なくとも４つにおいて、増加レベルで存在した標的ＲＮＡを同定するために解析された。表２７には、標的ＲＮＡ、標的ＲＮＡを検出するのに使用したプローブ配列、ＮＨＢＥ細胞と比較した際の各細胞株における倍率増加を示す。
【０３３０】
マイクロアレイデータは、２つまたは３つの細胞株において増加レベルで存在したが、標的ＲＮＡのレベルの増加の平均がＮＨＢＥ細胞と比較して少なくとも５倍である標的ＲＮＡを同定するために、さらに解析された。表２８には、標的ＲＮＡ、標的ＲＮＡを検出するのに使用したプローブ配列、ＮＨＢＥ細胞と比較した際の各細胞株における倍率増加を示す。表２９には、表２７と表２８の各標的ＲＮＡに関する、ミクロＲＮＡ前駆体配列と、ミクロＲＮＡ前駆体遺伝子の染色体位置を示す。
【０３３１】
次に、マイクロアレイデータは、少なくとも４つの細胞株において少なくとも５倍の減少レベルで存在する標的ＲＮＡを同定するために、解析された。表３０には、標的ＲＮＡ、標的ＲＮＡを検出するのに使用したプローブ配列、ＮＨＢＥ細胞と比較した際の各細胞株における倍率増加を示す。表３０には、同一の標的ＲＮＡに少なくとも２倍の増加レベルが存在する細胞株の数も示す。表３１には、表３０の各標的ＲＮＡに関する、ミクロＲＮＡ前駆体配列と、ミクロＲＮＡ前駆体遺伝子の染色体位置を示す。
【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【０３３２】
５．６  実施例６：原発性腫瘍および細胞株における標的ＲＮＡレベル
実施例４と実施例５からのデータは、原発性肺腫瘍と肺癌細胞株の両方において発現増加がみられる標的ＲＮＡを同定するために、分析された。表３２は、表２７からの標的ＲＮＡ（すなわち、少なくとも４つの細胞株において増加レベルが存在した標的ＲＮＡ）のリストであり、これらは表１８から表２１にも存在する（すなわち、検証した原発性肺腫瘍の５０％超えるものにおいて増加レベルが存在した標的ＲＮＡ、および検証した原発性肺腫瘍の５０％未満において少なくとも５倍の増加レベルで存在する標的ＲＮＡ）。表３３は、表２８からの標的ＲＮＡ（すなわち、２つまたは３つの細胞株において少なくとも５倍の増加レベルが存在した標的ＲＮＡ）のリストであり、これらは表１８から表２１にも存在する。
【表３３】
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【表３４】
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【０３３３】
ついに、表３４には、正常組織または正常細胞株と比較して、原発性腫瘍と原発性細胞株の両方において減少レベルで存在する標的ＲＮＡを示す。
【表３５】
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【０３３４】
５．７  実施例７：原発性腫瘍からのさらなる標的ＲＮＡ
実施例４で同定した標的ＲＮＡに加えて、いくつかの新たな標的ＲＮＡは、扁平上皮癌（ＳＣＣ）において高レベルで存在したため、その実験中に同定された。さらに、一つの新たな標的ＲＮＡ（ｍｉＲ−３２０ｃ）は、実施例４での最も悪性度の高い腫瘍の少なくとも３つにおいて発現が上昇したため、同定された。それらの新たな標的ＲＮＡと、ｍｉＲ−３２０ｃは、各原発性腫瘍での倍率変化ともに表３５と表３６に示す。６例の腫瘍のデータを表３５に示し、残りの１３例の腫瘍のデータを表３６に示す。表３５には、標的ＲＮＡを検出するのに使用したプローブ配列も示す。表３７には、表３５と表３６の各標的ＲＮＡに関する、ミクロＲＮＡ前駆体と、ミクロＲＮＡ前駆体遺伝子の染色体位置を示す。
【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【０３３５】
５．８  実施例８：ミクロＲＮＡ同定のためのバイオインフォマティク解析
例えば、表１、表２、表６から表９、表１８から表２１、表２３、表２７、表２８、表３０、および表３２から表３４に示すプローブで検出されたミクロＲＮＡを同定するために、低分子ＲＮＡ配列（ｓｍＲＮＡＳｅｑ）データセットは、プローブ配列を使用して解析され、それらの配列によって検出された発現ミクロＲＮＡが同定された。その解析は、明確な末端部を有する９７個の配列を同定した。それら９７個のミクロＲＮＡ配列候補を、表３８に示す。
【表３９】
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【０３３６】
本出願で述べたすべての出版物、特許、特許出願、および他の文書は、あらゆる目的に関してそのすべてを参照として組み込まれるものとして出版物、特許、特許出願、または他の文書がそれぞれ個々に示されているように、それと同程度に、あらゆる目的に関してそのすべてを参照として本出願に組み込む。
【０３３７】
様々な特定の実施形態が例示され述べられたが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、変更され得ることが理解されるであろう。
【図１】
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