(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パルボウイルス  Ｈ−１（Ｈ−１ＰＶ）を有効成分とするユーイング肉腫の治療用組成物。
【請求項２】
前記ユーイング肉腫の細胞は、
（ａ）化学療法もしくは放射線療法に耐性がある、又は、
（ｂ）腫瘍細胞を再発する可能性がある、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
静脈内（ｉ．ｖ．）、腫瘍内、又は気管支内投与用に製剤された請求項１又は２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉腫瘍、好ましくは悪性骨腫瘍、例えば局在性および転移性骨腫瘍、特に骨肉腫およびユーイング肉腫を治療するためのパルボウイルス、好ましくはＨ−１ＰＶを提供する。
【背景技術】
【０００２】
肉腫は、軟組織（筋肉、脂肪、神経、もしくは結合組織）または骨の癌である。肉腫は、１群の４０種を超える様々なタイプの腫瘍を含んでいる。一般に、肉腫は、極めて希であると考えられており、軟組織における年間およそ１０，０００例の新規症例および骨における年間２，４００例の新規症例を含めて、全成人癌診断の１％未満しか占めていない。肉腫は、骨癌を原発として（他の癌からの骨転移とは異なる）、または軟組織、例えば筋肉（横紋筋肉腫）、脂肪組織（脂肪肉腫）もしくは平滑筋細胞（平滑筋肉腫）を原発として発生する間葉癌であると考えられる。それらは、発生する組織に基づいて名前が付けられている。例えば、軟骨肉腫は軟骨から発生し、骨肉腫は骨から発生し、線維肉腫は線維形成組織から発生する。
【０００３】
骨肉腫は、骨の肉腫の内で最も一般的なタイプであり、骨腫瘍のおよそ３５％を占める。軟骨肉腫は、成人において２番目に一般的なタイプであり（骨肉腫の３０％を占める）、ユーイング肉腫は、小児において２番目に一般的なタイプである。その他タイプは全て、極めて希であり、各々の占める割合は全ての骨の肉腫の１％未満である。これらのタイプ内に、さらに組織学的サブタイプが有り、例えば、７種の異なるタイプの骨肉腫が存在する（非特許文献１）。
【０００４】
腫瘍崩壊性ウイルスは、正常組織には影響を及ぼさずに形質転換細胞を選択的または優先的に感染させて殺滅するウイルスである。イン・ヴィトロ（in vitro）およびイン・ヴィヴォ（in vivo）の両方において観察された腫瘍崩壊作用に加えて、これらのウイルスはウイルス感染腫瘍細胞の除去を誘導する免疫刺激シグナルも提供する。それによって自然免疫系および獲得免疫系は腫瘍抗原に接近することができ、この結果、交差プライミングおよびワクチン接種作用を生じる。
【０００５】
骨肉腫治療のための腫瘍崩壊性ウイルス療法アプローチの系統的な前臨床的評価は、２種の野生型ウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）（非特許文献２）（１）、およびセネカバレーウイルス（ＳＶＶ、ＮＴＸ−０１０（登録商標））（非特許文献３）（２）を用いて実施されていた。小児科前臨床スクリーニングアプローチの６種の骨肉腫異種移植片ＳＣＩＤマウスモデルでは、セネカバレーウイルス（ＳＶＶ、つまりＮＴＸ−１０（登録商標））を用いた静脈内治療については薄い治療反応しか観察されなかった。６種の異種移植片モデル中１例のみが治療マウスにおいて有意に拡張されたイベントフリー生存率（ＥＦＳ）を示したが、ＯＳに関するデータは示されなかった（非特許文献３）（２）。第２の野生型ウイルスＳＦＶは、ヌードマウスにおける皮下および第２同所性骨肉腫異種移植片モデルの両方において生存率を有意に上昇させることが証明された（非特許文献２）（１）。さらに、骨肉腫に再標的化した２つの組み換えアデノウイルスが試験された（非特許文献４、５）（３、４）。化学療法による治療が無効である樹立ヒト骨肉腫異種移植片内へのＡｄ５−Ｄｅｌｔａ２４ＲＧＤの腫瘍内注射は、有意な腫瘍増殖遅延を誘導した（非特許文献６）（５）。Ａｄ５Ｄｅｌｔａ２４に基づくまた別の条件付きで複製するアデノウイルスＡｄ−ＯＣ−Ｅｌａは、骨マトリックスの細胞およびそれらに由来する悪性細胞へのＡｄ−ＯＣ−Ｅｌａ複製を標的とする骨マトリックスタンパク質オステオカルシンのプロモーターの制御下でウイルスＥ１Ａ遺伝子を発現する。Ａｄ−ＯＣ−Ｅｌａの静脈内投与は、異種移植片マウスモデル内の肺転移性骨肉腫結節のサイズを有意に減少させた（非特許文献７）（６）。
【０００６】
ユーイング肉腫は、骨または軟組織内で発生する（骨外性と呼ばれる）可能性があり、これは治療選択肢が考慮される時点に重要である。大多数の症例は骨内で発生し、１０代で診断されることが最も一般的である。ＰＮＥＴ（未分化神経外胚葉性腫瘍）は、ユーイング肉腫に密接に関連する肉腫の１タイプである。ＰＮＥＴは、骨または中枢神経系で発生する場合がある。骨のＰＮＥＴはユーイング肉腫と同様に治療されるが、脳もしくは脊髄内のＰＮＥＴは、遺伝的に相違する腫瘍であり、異なった方法で治療される。ユーイング肉腫、ＰＮＥＴ、アスキン腫瘍および神経上皮腫は、全て１１−２２染色体間転座（ｔ１１；２２）と呼ばれる同一の遺伝的異常を含有している。この類似性のために、これらの腫瘍はユーイング肉腫ファミリーの腫瘍と呼ばれ、同様に治療される。
【０００７】
ユーイング肉腫の腫瘍崩壊性ウイルスに基づく治療の試みは、これまで少数しか報告されていない。遺伝子組み換えされた腫瘍崩壊性ＨＳＶであるＮＶ１０２０およびＧ２０７もまた、一団の10種の肉腫細胞系を対象に試験されてきた。しかし、ＲＭＳおよび骨肉腫細胞系と比較して、ユーイング肉腫細胞系は、イン・ヴィトロでは腫瘍崩壊性ＨＳＶに対して最低の感受性を示した（非特許文献８）（７）。アデノウイルス媒介性形質導入へのユーイング肉腫細胞系の感受性もまた、アデノウイルス受容体およびコクサッキー−アデノウイルス受容体の発現がこれらの細胞系上で観察されたので、証明することができた。さらに、条件付きで複製する組み換えアデノウイルスは、生体外でのユーイング肉腫細胞系上の有意な腫瘍崩壊作用を誘導した（非特許文献９）（８）。動物モデルでは、２種の腫瘍崩壊性ウイルス：野生型ウイルスＳＶＶおよび抗血管新生可溶性ＶＥＧＦリガンドを発現する組み換えＡＡＶのみが試験された。どちらのウイルスも治療有効性であると証明することはできなかった。抗血管新生可溶性ＶＥＧＦ−リガンドを発現するｒＡＡＶのＳＣＩＤマウスの門脈静脈内への予防的静脈内投与は、ユーイング肉腫異種移植片のその後の移植を妨害した（非特許文献１０）（１０）。４種のユーイング肉腫異種移植片モデルでは、ＳＶＶの系統的な前臨床評価は、有意な治療作用を全く誘導しなかった（非特許文献３）（２）。これまでのところ、ユーイング肉腫への齧歯類パルボウイルスの投与は報告されていない。
【０００８】
典型的には、骨の肉腫の現行療法は、ネオアジュバント多剤化学療法、腫瘍切除および放射線療法を含むＧＰＯＨの療法試験ＥＵＲＡＭＯＳ１（骨肉腫に対して）によると多様式およびリスク適合性である。ＥＷＩＮＧ  ２００８ハイリスク（Ｒ２およびＲ３）によると、ユーイング肉腫患者は、高用量の化学療法を自己幹細胞の移植と組み合わせて受ける。原則的には、放射線および細胞毒性医薬品の点滴静注が組み合わせて使用される。副作用は、短期的および長期的のどちらも重い可能性がある。化学療法の短期的に不都合な副作用には、毛髪および眉の損失、食欲消失、味覚異常、口腔びらん、悪心、嘔吐、軟便もしくは便秘（食物摂取量低下のため）、疲労、精神的曖昧さおよび感染への非抵抗性が含まれる。また別の短期的な欠点は、治療に時間を要する点である。長期的な副作用（癌のタイプに依存する）には、不妊、心臓障害、中枢神経系の損傷または重要器官、例えば肺もしくは肝臓の損傷が含まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｃａｎｃｅｒｔｏｐｉｃｓ／ｐｄｑ／ｔｒｅａｔｍｅｎｔ／ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ／ＨｅａｌｔｈＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ／ｐａｇｅ４
【非特許文献２】Ketola A, Hinkkanen A, Yongabi F, Furu P, Maatta AM, Liimatainen T, et al. Oncolytic Semliki forest virus vector as a novel candidate against unresectable osteosarcoma. Cancer Res 2008;68:8342-50.
【非特許文献３】Morton CL, Houghton PJ, Kolb EA, Gorlick R, Reynolds CP, Kang MH, et al. Initial testing of the replication competent Seneca Valley virus (NTX-010) by the pediatric preclinical testing program. Pediatr Blood Cancer 2010;55:295-303.
【非特許文献４】Witlox MA, Lamfers ML, Wuisman PI, Curiel DT, Siegal GP. Evolving gene therapy approaches for osteosarcoma using viral vectors: review. Bone 2007;40:797-812.
【非特許文献５】Graat HC, van Beusechem VW, Schagen FH, Witlox MA, Kleinerman ES, Helder MN, et al. Intravenous administration of the conditionally replicative adenovirus Ad5-De1ta24RGD induces regression of osteosarcoma lung metastases. Mol Cancer 2008;7:9.
【非特許文献６】Witlox AM, van Beusechem VW, Molenaar B, Bras H, Schaap GR, Alemany R, et al. Conditionally replicative adenovirus with tropism expanded towards integrins inhibits osteosarcoma tumor growth in vitro and in vivo. Clin Cancer Res 2004;10:61- 7.
【非特許文献７】Li X, Jung C, Liu YH, Bae KR, Zhang YP, Zhang HJ, et al. Anti-tumor efficacy of a transcriptional replication-competent adenovirus, Ad-OC-Ela, for osteosarcoma pulmonary metastasis. J Gene Med 2006;8:679-89.
【非特許文献８】Bharatan NS, Currier MA, Cripe TP. Differential susceptibility of pediatric sarcoma cells to oncolysis by conditionally replication-competent herpes simplex viruses. J Pediatr Hematol Oncol 2002;24:447-53.
【非特許文献９】Rice AM, Currier MA, Adams LC, Bharatan NS, Collins MH, Snyder JD, et al. Ewing sarcoma family of tumors express adenovirus receptors and are susceptible to adenovirus- mediated oncolysis. J Pediatr Hematol Oncol 2002;24:527-33.
【非特許文献１０】Rommelaere J, Geletneky K, Angelova AL, Daeffler L, Dinsart C, Kiprianova I, et al. Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics. Cytokine Growth Factor Rev 2010.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このため、本発明の目的は、間葉腫瘍、好ましくは骨肉腫およびユーイング肉腫の効率的治療のための手段であって、現行療法の不都合な点を克服する、つまり効率的であり、現行治療様式と比較して副作用の軽い手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によると、これは特許請求の範囲において規定した主題によって達成される。
【００１２】
本発明は、腫瘍崩壊性非病原性複製可能なパルボウイルスであるＨ−１ＰＶの投与後の骨肉腫およびユーイング肉腫細胞系における腫瘍崩壊の誘導に関する本出願人の観察所見に基づいている。一部の自律的パルボウイルスは、いわゆる腫瘍崩壊性ウイルスのカテゴリーに属する。パルボウイルスは、それから２種の非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２）および２種のカプシド（ＶＰ１、ＶＰ２）タンパク質を発現する５．１ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムを含有する、小さな（２５〜３０ｎｍ）非エンベロープ粒子である。パルボウイルスＨ−１ＰＶは、明確な死滅過程、つまり細胞質移転およびリソソームプロテアーゼ（カテプシン類）の活性化を始動させるという固有の利点を有している。天然宿主が齧歯類であるパルボウイルス属の数種のメンバー（Ｈ−１ＰＶ、ＭＶＭ、ＬｕＩＩＩ）は、それらが宿主細胞を形質転換されなかったこと、ヒトを無症候性感染させる能力、および新生物的に形質転換された細胞を優先的に増殖させて（腫瘍親和性）殺滅する（腫瘍崩壊）能力から、現在は癌遺伝子療法用途についての考慮の対象となっている。ＭＶＭｐおよびＨ−１ＰＶウイルスは、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍抑制活性を発揮することが証明されている、つまり、それらは実験動物において、特発的、化学的またはウイルス的に誘導された腫瘍の形成を阻止することができる。パルボウイルス発現カセットに基づくベクターは、野生型ウイルスの腫瘍親和性特徴を保持している。
【００１３】
Ｈ−１ＰＶの腫瘍崩壊作用は、イン・ヴィヴォおよびイン・ヴィトロにおいて様々なヒト実体、例えばリンパ腫、膵臓癌、神経膠芽細胞腫細胞系、肝細胞癌、乳癌（１０）および神経芽細胞腫（１１）を対象に試験されている。しかし、Ｈ−１ＰＶが小児科の骨の腫瘍に及ぼす作用については、これまで試験されていなかった。本発明を結果として生じた試験では、小児科の骨肉腫およびユーイング肉腫細胞系を治療するための腫瘍崩壊性Ｈ−１ＰＶの投与について前臨床イン・ヴィトロ評価が実施された。Ｈ−１ＰＶの感染効率、ウイルス複製、および腫瘍溶解活性は、様々なｐ５３突然変異状態を備える３例の骨肉腫および２例のユーイング肉腫細胞系において詳細に分析された。
【００１４】
ウイルスの腫瘍選択性は、間葉起源の乳児非悪性細胞の短期培養の感染によって確証された。短期培養中のヒト新生児包皮線維芽細胞およびヒト骨芽細胞は、Ｈ−１ＰＶが細胞１個当たり５０ｐｆｕ（プラーク形成単位）未満のウイルス用量では、細胞の生存性または形態に及ぼす有意な作用を明らかにしなかった。全ての骨腫瘍細胞系は、組み換えＥＧＦＰ発現性複製欠損性ウイルスであるＨ−１ＥＧＦＰを用いた感染によって証明されたように、Ｈ−１ＰＶによって感染させることができた。野生型Ｈ−１ＰＶを用いると、崩壊性感染は骨肉腫細胞系５例中４例（Ｓａ−ＯＳ、ＣＡＬ−７２、Ｕ２−ＯＳ、およびＨ−ＯＳ）ならびに試験したユーイング肉腫細胞系全例（ＭＨＨ−ＥＳ−１、ＴＣ−７１、ＲＤ−ＥＳ、ＳＫ−ＥＳ−１およびＣＡＤＯ−ＥＳ）において誘導された。骨肉腫細胞系５例中３例およびユーイング肉腫細胞系５例中４例は、細胞１個当たり１未満〜５ｐｆｕのＭＯＩでの治療に対して５０％の応答率を示した。Ｈ−１ＰＶの能動的複製は、典型的にはユーイング肉腫細胞系において証明され、感染後９６時間以内に１０倍までのウイルス力価増加が生じた。肉腫細胞系におけるＨ−１ＰＶの崩壊作用は、それらのｐ５３突然変異状態とは無関係に観察された。
【００１５】
非形質転換間葉細胞に対するＨ−１ＰＶの低毒性とともに、感染効率、迅速なウイルス複製ならびにユーイング肉腫および大多数の骨肉腫細胞への重要な崩壊作用により、このパルボウイルスは骨格系の悪性疾患の腫瘍崩壊性ウイルス療法の有望な候補となる。要するに、本発明を結果として生じさせた実験は、間葉悪性腫瘍細胞、例えば骨肉腫もしくはユーイング肉腫細胞のＨ−１ＰＶ感染が副作用の極めて軽い新規で高度に効果的な療法を示すことを証明している。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１ａ】骨肉腫およびユーイング肉腫細胞はＨ−１ＰＶ易感染性である  様々なＭＯＩ（０、１、１０、５０ｐｆｕ／細胞）で、ＧＦＰを発現する組み換え複製欠損性Ｈ−１ウイルス（Ｈ−１ＥＧＦＰ）を用いた、ヒト骨肉腫（Ｕ２−ＯＳ、ＳａＯＳ−２、ＭＧ−６３）およびユーイング肉腫（ＳＫ−ＥＳ−１、ＲＤ−ＥＳ）細胞の感染。骨肉腫およびユーイング肉腫細胞系の他に、陽性コントロールとして神経芽細胞腫細胞系（ＷＡＣ−２）、ならびにヒト非形質転換骨芽細胞および線維芽細胞を感染させた。  Ｈ１−ＥＧＦＰを用いて細胞を感染させた２日後に撮影された位相差（上の列）および蛍光（下の列）顕微鏡写真。倍率：１：２０，０００．
【図１ｂ】骨肉腫およびユーイング肉腫細胞はＨ−１ＰＶ易感染性である  様々なＭＯＩ（０、１、１０、５０ｐｆｕ／細胞）で、ＧＦＰを発現する組み換え複製欠損性Ｈ−１ウイルス（Ｈ−１ＥＧＦＰ）を用いた、ヒト骨肉腫（Ｕ２−ＯＳ、ＳａＯＳ−２、ＭＧ−６３）およびユーイング肉腫（ＳＫ−ＥＳ−１、ＲＤ−ＥＳ）細胞の感染。骨肉腫およびユーイング肉腫細胞系の他に、陽性コントロールとして神経芽細胞腫細胞系（ＷＡＣ−２）、ならびにヒト非形質転換骨芽細胞および線維芽細胞を感染させた。  感染後の様々な時点で様々なＭＯＩ（０、１、１０、５０ｐｆｕ／細胞）でＧＦＰを発現する細胞数を表しているグラフ。播種された１プールの４，０００個の細胞中、ＧＦＰを発現する細胞を蛍光顕微鏡下で計数した。非形質転換骨芽細胞および線維芽細胞を用いた実験のためには、１０４個の細胞を播種した。
【図２】パルボウイルスタンパク質は、骨肉腫およびユーイング肉腫細胞内で発現する  ウイルスカプシドタンパク質１および２（ＶＰ１およびＶＰ２）特異的抗体を使用したウェスタンブロットの結果。細胞を播種し、１２時間後にＨ−１ＰＶを用いて１ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで、または同等の希釈率のイオジキサノールを用いて疑似（mock）感染させた。ウェスタンブロット分析のサンプルは、２４時間毎に収集した。ＶＰ１およびＶＰ２特異的バンドは、Ｈ−１ＰＶ感染させた骨肉腫およびユーイング肉腫細胞の細胞溶解液中に出現する。
【図３】Ｈ−１ＰＶは骨肉腫およびユーイング肉腫細胞内で能動的に複製する
【図４】感染した骨肉腫およびユーイング肉腫細胞内の細胞形態学的変化はＨ−１ＰＶの細胞変性作用を示している  細胞の画像は、細胞毒性試験の実施前、骨腫瘍細胞および陽性コントロールについては第３および６日ならびに非形質転換線維芽細胞および骨芽細胞については第７日に撮影した。Ｕ−２  ＯＳ、ＳＫ−ＥＳ−１、ＷＡＣ−２、線維芽細胞および骨芽細胞の倍率は１：１０４、ＳａＯＳ−２、ＭＧ−６３、およびＲＤ−ＥＳの倍率は１：２０４とした。骨腫瘍細胞の第３日の測定のために１，０００細胞／ウエル、第６日の測定のために５００ｃｅｌｌｓ／ウエルを９６ウエルプレート内に播種した。ＷＡＣ−２については第３および６日の測定の両方のために２００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種した。２，５００細胞／ウエルの非形質転換骨芽細胞および線維芽細胞を同一の９６ウエルプレート内に播種した。
【図５】Ｈ−１ＰＶは用量依存的に骨肉腫細胞系３例中２例およびユーイング肉腫細胞系２例における細胞変性作用を誘導する  ＭＴＴ−試験（左のパネル）：Ｈ−１ＰＶ感染後の骨肉腫およびユーイング肉腫細胞系の細胞生存性を定量するために、ＭＴＴ試験を使用した。細胞播種の１２時間後、これらの細胞をｗｔＨ−１ＰＶを用いて指示したＭＯＩで感染させ、疑似感染コントロール細胞がコンフルエントになるまで増殖させた。感染の３および６日後、代謝活性、つまり細胞生存性をＭＴＴ試験により決定した。代謝活性についての数値は、疑似処理コントロール細胞と比較して表示した。  ＬＤＨ遊離アッセイ（右のパネル）：Ｈ−１ＰＶが骨肉腫およびユーイング肉腫細胞系に及ぼす細胞毒性をＬＤＨ遊離アッセイによって定量した。ＭＴＴ試験のために播種した細胞の上清５０μＬを採取し、ＬＤＨ遊離をＨ−１ＰＶ感染３および６日後に（ＭＴＴ試験と同様に）アッセイして細胞溶解を測定した。上清中のＬＤＨ活性は、トリトン溶解によって完全に溶解した細胞と比較して表示した。ＭＴＴ試験およびＬＤＨ遊離試験の両方について８回の実験からの平均値および各二重標準誤差を示した。
【図６】Ｈ−１ＰＶおよび疑似感染骨肉腫細胞の細胞周期分析  Ｈ−１ＰＶ感染は、骨肉腫細胞系においてアポトーシスを誘導した。ＭＯＩ１での感染およびその後のプロピジウムヨウ素染色後に、細胞周期分析をフローサイトメトリーによって実施した。Ｈ−１ＰＶ感染は、典型的にはＳａＯＳおよびＵ２−ＯＳ骨肉腫細胞系について証明されたように、Ｇ２−停止およびサブ−Ｇ１集団の出現を誘導することができた。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、間葉腫瘍、好ましくは骨腫瘍を治療する方法において使用するためのパルボウイルスを提供する。
【００１８】
本明細書で使用する用語「パルボウイルス」は、野生型ウイルス、複製ウイルス、およびそれらの改変複製可能な誘導体、および非複製ウイルス、ＣＰＧ増強ウイルスならびにそのようなウイルスもしくは誘導体に基づく関連ウイルスもしくはベクターを含む。治療に有用な適切なパルボウイルス、誘導体などは、本明細書の開示に基づくと、過度の実験的努力を伴わずに当該技術分野の範囲内で容易に決定することができる。本発明の使用のためには、複製可能なウイルスが好ましい。治療は、癌細胞の殺滅によって達成される、つまり癌細胞は、これらの細胞が腫瘍をもはや生成することができないように該パルボウイルスの腫瘍崩壊性および細胞毒性活性によって殺滅される。
【００１９】
好ましくは、前記パルボウイルスは、医薬組成物として製剤されるが、このとき該パルボウイルスは有効量で存在し、薬学的に許容される担体と結合される。「薬学的に許容される」は、有効成分の生物学的活性の有効性を妨害しない、およびそれが投与される患者にとって毒性ではないあらゆる担体を含むことを意味する。適切な医薬担体の例は当該技術分野において周知であり、リン酸緩衝生理食塩溶液、水、エマルジョン、例えば油／水型エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌溶液などが含まれる。追加の薬学的に適合する担体には、ゲル、生体吸着性マトリックス材料、該パルボウイルスを含有する移植素子（治療薬）、または任意の他の適切なビヒクル、送達もしくは分注手段または材料を含めることができる。そのような担体は、従来法によって調製することができ、該被験者に有効量で投与することができる。
【００２０】
「有効量」は、該肉腫の治療に十分である有効成分の量を意味する。「有効量」は、当業者には公知の方法を使用して決定することができる（例えば、Fingl et al．， The Pharmocological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, eds. Macmillan Publishing Co., New York, pp.1-46（1975）を参照されたい）。
【００２１】
パルボウイルスの投与は、様々な方法によって、例えば静脈内、腫瘍内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与によって実施することができる。投与経路は、当然ながら、治療の種類に左右される。好ましい投与経路は、静脈内（ｉ．ｖ．）、腫瘍内または気管支内投与である。気管支内ウイルス投与は、骨肉腫および特にユーイング肉腫患者において初回全身再発として発生することが多い肺転移を治療するために使用することができる。血液脳関門を貫通する能力を有する感染性ウイルス粒子が使用される場合、治療は、例えばＨ１ウイルスの静脈内注射によって実施する、または少なくとも開始することができよう。しかし、長期静脈内治療は、Ｈ１ウイルスへの中和抗体の形成によって非効率になる場合があった。このため、異なる腫瘍内ウイルス投与の様式が好ましい場合がある。該パルボウイルスもしくはパルボウイルス由来ベクターも骨腫瘍の肝臓もしくは肺転移内に注射することができる。これは該ウイルスの転移性肺結節内への超音波もしくはＣＴ誘導下肝臓穿刺もしくは気管支鏡支援送達によって達成することができよう。上述の投与方法の組み合わせも可能である。
【００２２】
該パルボウイルスの投与レジメンは、当該技術分野の技術の範囲内で、患者のデータ、観察所見および患者の体格、体表面積、年齢、性別等を含む他の臨床因子、投与する特定のパルボウイルス、投与の時点および経路、間葉腫瘍のタイプ、患者の全身状態、および該患者の受ける他の薬物療法などに基づいて主治医が容易に決定することができる。
【００２３】
また別の特定投与技術として、該パルボウイルスを、該患者の体内に移植された起源から該患者に投与することができる。例えば、シリコーンもしくは他の生体適合性材料のカテーテルを腫瘍切除中または個別の手技によって患者の体内に据え付けられた小型皮下リザーバ（Ｒｉｃｋｈａｍリザーバ）へ接続することにより、パルボウイルスをそれ以上の外科的インターベンションを行わずに様々な時点で局所的に注入することができる。該パルボウイルスを、定位固定外科的技術によって、またはニューロナビゲーションターゲティング技術によって腫瘍内に注入することもできる。
【００２４】
該パルボウイルスの投与は、適切なポンプシステム、例えば蠕動式注入ポンプもしくは対流強化送達（ＣＥＤ）ポンプを使用して、ウイルス粒子もしくはウイルス粒子を含有する流体の移植されたカテーテルを通しての低流量での連続注入によっても実施することができる。
【００２５】
該パルボウイルスのさらにまた別の投与方法は、該パルボウイルスを所望の腫瘍へ分注するために構築および配列されている、移植された機器から注入する方法である。例えば、該パルボウイルス、例えばパルボウイルスＨ１を含浸したウエハを使用することができるが、このとき該ウエハは外科的腫瘍切除術の終了時に切除腔の辺縁に取り付けられる。このような治療的インターベンションにおいては複数のウエハを使用することができる。能動的に該パルボウイルス、例えばパルボウイルスＨ１を生成する細胞を骨腫瘍内、または腫瘍切除後の腫瘍腔内に注入することができる。
【００２６】
本発明による治療は、間葉腫瘍、つまり局在性もしくは転移性骨腫瘍、特に骨肉腫もしくはユーイング肉腫の治療において有用であり、前記疾患の予後を有意に改善することができる。腫瘍崩壊性パルボウイルスでの感染によって高まった抗腫瘍反応は、このウイルスの腫瘍細胞（健常細胞ではない）に対する直接的および特異的細胞毒性を二次的および長期抗腫瘍活性と結合させる。再発の症例では、ユーイング肉腫は治癒的目的では治療することができない。このため、代替治療選択肢、例えばイン・ヴィトロでユーイング肉腫細胞を成人の高悪性度神経膠細胞系に必要とされる用量に匹敵する投入ウイルスの用量で殺滅することができる腫瘍崩壊性パルボウイルス療法は、重要な治療有効性を約束する。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態では、治療対象の間葉腫瘍の細胞は、（ａ）化学療法もしくは放射線療法に耐性がある、または（ｂ）潜在的に腫瘍細胞を再発する。
【００２８】
本発明のさらに好ましい実施形態では、該パルボウイルスは、齧歯類パルボウイルスであり、特に好ましくはパルボウイルスＨ１（Ｈ１ＰＶ）もしくは関連パルボウイルス、例えばＬｕＩＩＩ、マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＰＶ）、ラット微小ウイルス（ＲＭＶ）、ラットパルボウイルス（ＲＰＶ）またはラットウイルス（ＲＶ）である。
【００２９】
本発明による該パルボウイルスによって治療可能な患者には、ヒトならびに非ヒト動物が含まれる。後者の例には、制限なく、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、およびネコ等の動物が含まれる。
【００３０】
パルボウイルスを使用する治療は、また別の種類の療法、例えば化学療法薬、例えばエトポシド、イフォスファミド、アドリアマイシン、ビンクリスチン、ドキシサイクリンを使用する化学療法と組み合わせることができる。
【実施例】
【００３１】
以下の実施例では、本発明をより詳細に説明する。
【００３２】
実施例１
材料および方法
（Ａ）細胞培養
ヒト骨肉腫細胞系Ｈ−ＯＳ、ＣＡＬ−７２、Ｕ２−ＯＳ、ＳａＯＳ−２、およびＭＧ−６３ならびにユーイング肉腫細胞系ＭＨＨ−ＥＳ、ＴＣ−７１、ＳＫ−ＥＳ−１、ＲＤ−ＥＳおよびＣＡＤＯ−ＥＳはＣＬＳ社（Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ社、ドイツ国エッペルハイム）から入手した。５種の骨肉腫細胞系（Ｈ−ＯＳ、ＳａＯＳ−２、ＣＡＬ−７２、Ｕ２−ＯＳおよびＭＧ−６３）は、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補給したダルベッコ改変イーグル培地（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、ドイツ国ミュンヘン）中で、３７℃、５％ＣＯ２の標準条件下で増殖させた。ユーイング肉腫細胞系（ＭＨＨ−ＥＳ、ＴＣ−７１、ＭＨＨ−ＥＳ、ＳＫ−ＥＳ−１およびＲＤ−ＥＳ）は、１０％熱不活性化ＦＢＳ、および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ１６４０細胞培養培地中で増殖させた。
【００３３】
（Ｂ）ウイルスの産生および感染
野生型Ｈ−１ＰＶは、ＮＢＫ−３２４Ｋヒト胚腎細胞を感染させて生成し、ろ過（最大粒径０．２μｍ）およびイオジキサノール勾配遠心分離によって精製した。エンドトキシンによるウイルスストックの汚染は、＜２．５ＥＵ／ｍＬであった。細胞は、細胞計数および播種の後の１２〜２４時間での接着性増殖培養の状態でＨ−１ＰＶで感染させた。
【００３４】
（Ｃ）感染性Ｈ−１ＰＶ粒子の検出
ウイルス力価は、前述のように決定した（１２）。ＮＢ−３２４Ｋ細胞（７．６×１０３細胞）は、アッセイ２４時間前に９６ウエルプレート内に播種した。細胞は、事前に感染させた骨肉腫またはユーイング肉腫細胞系の上清の１０倍連続希釈液によって感染させ、３７℃、５％  ＣＯ２で７２時間インキュベートした。アルカリ溶解（０．７５Ｍ  ＮａＯＨ）後、ＤＮＡをナイロン膜に転写し、架橋させ、Ｐ３２を用いて放射標識したＮＳ−１特異的プローブでハイブリダイズさせた。ブロットは、オーロラジオグラフィーのためにＸ線フィルムへ曝露させた。滴定実験は、常に３回ずつ実施した。ウイルスは、指示した感染多重度（ＭＯＩ、細胞１個当たりのプラーク形成単位、ｐｆｕ、で表示）で投与した。
【００３５】
（Ｄ）ウイルスＤＮＡ抽出および定量的リアルタイムＰＣＲ
感染細胞培養物の上清を感染後の様々な時点で収集した。上清は、１ｍＬ当たり５０Ｕのベンゾナーゼヌクレアーゼ（超純粋グレード、Ｓｉｇｍａ社）を用いて残りのゲノムＤＮＡを消化するために３７℃で３０分間処理した。ビリオンからウイルスＤＮＡを遊離させるために、１０μＬの細胞抽出物をＴＥバッファー中の１Ｍ  ＮａＯＨ中でのアルカリ溶解に５６℃で３０分間供した。溶解は、９６０μＬの４０ｍＭ  ＨＣ１を加えることによって停止させた。等モル濃度のＨＣｌを用いた中和後、サンプルは無菌水を用いて１：１００に希釈し、直接分析した。
【００３６】
上清は５６℃にて３０分間ＴＥバッファー中でインキュベートした。ウイルスＤＮＡの定量は、以下のプライマーＮＳ１−ＦＯＲ、５’−ＧＣＧ  ＣＧＧ  ＣＡＧ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＡＡＣ  Ｔ−３’、ＮＳ１−ＲＥＶ、５’−ＣＣＡ  ＣＣＴ  ＧＧＴ  ＴＧＡ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＡＴ−３’を用いて、ＮＳ１遺伝子内の１４１ｎｔ  ＤＮＡフラグメントのリアルタイムｑＰＣＲ増幅によって実施した。アンプリコンは、別のところで記載したように（１３）、ＮＳ１特異的ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ５’−６−ＦＡＭ−ＡＴＧＣＡＧＣＣＡＧ−ＡＣＡＧＴＴＡ−Ｑ−ＭＧＢ  ３’（Applied Biosystems by Life Technologies社、米国カリフォルニア州カールスバッド）を用いてＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００サーマルサイクラー（Applied Biosystems by Life Technologies社、米国カリフォルニア州カールスバッド）によって検出し、ＳＤＳ  ２．１ソフトウエア（Applied Biosystems by Life Technologies社、米国カリフォルニア州カールスバッド）によって分析した。１０１〜１０８コピーの範囲内の連続希釈率でＮＳ１−配列を含有したプラスミドを使用してｑＰＣＲを標準化した。個々の反応混合物（２０μＬ）は、１×TaqMan Universal PCR Master Mix（商標）（Applied   Biosystems社）、０．３μＭ標識ＮＳ１−TaqMan（商標）プローブ、０．３μＬの各プライマーおよび３μＬのテンプレートから構成した。ＰＣＲ条件は、５０℃で２分間（AmpErase（商標）による汚染しているテンプレートの破壊）、次に９５℃で１０分間、その後に９５℃で１５秒間の４０サイクルの変性および６０℃で６０秒間のアニーリング／伸長であった。
【００３７】
（Ｅ）顕微鏡検査
位相差画像は、倒立位相差顕微鏡（Olympus社、ＣＫＸ４１型）および画像処理のためのCell Ｂソフトウエア（Olympus Europa社、ドイツ国ハンブルク）を使用して生成した。その他の位相差画像は、Leica ＤＦＣ３５０  ＦＸ（商標）カメラ（Leica  Microsystems Biosystems社、ドイツ国ウェツラー）およびMacintosh用のLeica FireCam（商標）ソフトウエアを用いて入手した。
【００３８】
（Ｆ）細胞生存性および溶解の評価
細胞の代謝活性は、製造業者（Sigma-Aldrich社、米国ミズーリ州セントルイス）が推奨するように、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイに基づいて決定した。細胞（１ウエル当たり１，０００〜２．０００細胞）を９６ウエルプレート内で培養し、図に指示したＭＯＩで感染させた。３および６日後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、２時間まで０．５μｇ／ｍＬのＭＴＴ溶液とともにインキュベートした。上清を廃棄して細胞を乾燥させた後、１ウエル当たり１００μＬのイソプロパノールを加えた。吸光値を測光法により５７０ｎｍで決定した（Multiscan Plus（商標）、Titertek Instruments社、米国アラバマ州ハンツビル）。
【００３９】
Cytotox 96 cytotoxicity assay kit（商標）（Promega Biosystems  PromEgA社、米国ワイオミング州マディソン）を製造業者の推奨にしたがって使用し、乳酸デヒドロゲナーゼの培養培地中への遊離を測定して細胞溶解を決定した。
【００４０】
実施例２
骨肉腫およびユーイング肉腫細胞はＨ−１ＰＶ感染に感受性である
Ｈ−１ＰＶが骨肉腫およびユーイング肉腫細胞に感染することができるかを決定するために、ＧＦＰを発現する、組み換え、複製欠損性のＨ−１ウイルス（Ｈ−１ＥＧＦＰ）ウイルスで、細胞１個当たり１〜５０複製ユニットで並行して細胞を曝露させた。ＷＡＣ−２神経芽細胞腫細胞（Prof. O. Witt、CCU Pediatric  Oncology（ＤＫＦＺ、ハイデルベルク）の厚意により提供された）を陽性コントロールとした。ＥＧＦＰ発現は、Ｈ−１ＥＧＦＰを含む全細胞系において検出でき、これは非形質転換間葉細胞および骨癌細胞におけるウイルスプロモーターによって駆動された感染遺伝子発現の成功を示していた（図１ａおよびｂ）。
【００４１】
実施例３
Ｈ−１ＰＶタンパク質は、骨肉腫およびユーイング肉腫細胞内で発現する
ｗｔＨ−１ＰＶのタンパク質が感染骨肉腫およびユーイング肉腫細胞内で発現したことを証明するために、感染細胞内のＶＰ１およびＶＰ２カプシドタンパク質のウエスタンブロット分析を実施した。ＮＳ１およびＮＳ２は宿主細胞の感染に必要とされる非構造タンパク質であり（１４）、ＶＰ１／２はウイルスカプシド構造タンパク質である（１５）。細胞１個当たり１ｐｆｕの野生型Ｈ−１ＰＶでの感染に引き続いて、該ウイルスカプシドタンパク質は感染後９６時間中に検討した全骨癌細胞系内で発現した（図２）。
【００４２】
実施例４
Ｈ−１ＰＶは骨肉腫およびユーイング肉腫細胞内で能動的に複製する
Ｈ−１ＰＶが骨盤細胞内で増殖できるかという問題に取り組むため、骨肉腫およびユーイング肉腫細胞を野生型Ｈ−１ＰＶで感染させた。感染細胞の上清内のウイルスゲノムコピーの力価は、感染２４〜９６時間後の期間にリアルタイムＰＣＲによって決定した。骨肉腫細胞系において効率的ウイルス複製を観察することができなかった。効率的ウイルス複製は、ＲＤ−ＥＳユーイング肉腫細胞系内でのみ証明され（図３）、それは、ヒトの高悪性度（high grade）グリオーマ細胞系内での複製効率（１６）に匹敵する。
【００４３】
感染性子孫Ｈ−１ＰＶの増殖を確証するため、培養内の同じ感染骨癌細胞系の上清を用いた感染性粒子アッセイを実施した。子孫Ｈ−１ウイルスは、生物学的に活性であった、つまりＮＢＫ−３２４Ｋ細胞を感染させることができた。これらを要約すると、Ｈ−１ＰＶは、骨肉腫およびユーイング肉腫細胞を増殖的に感染させると証明することができた。これらの細胞の感染は、必須ウイルスタンパク質の発現を誘導すると証明することができた。しかし、感染性Ｈ−１ＰＶ子孫の効率的ウイルス複製および産生は、２種のユーイング肉腫細胞系中１種のみで証明された。
【００４４】
実施例５
Ｈ−１ＰＶは、骨肉腫およびユーイング肉腫細胞系において崩壊性感染を誘導する
骨肉腫細胞のどの程度までの野生型Ｈ−１ＰＶによる感染が崩壊性であったかを試験するために、感染細胞の細胞形態を位相差顕微鏡によって記録した。感染３日後、Ｈ−１ＰＶは、細胞１個当たり１〜５ｐｆｕ以上のＭＯＩを適用した骨肉腫細胞３個中２個で有意な細胞変性作用を誘導すると証明することができた（図４および５）。感染３日後、Ｈ−１ＰＶは、細胞１個当たり１ｐｆｕ以上のＭＯＩを適用したユーイング肉腫細胞系２種で有意な細胞変性作用を誘導すると証明することができた（図４および５）。
【００４５】
実施例６
Ｈ−１ＰＶは、用量依存的に骨肉腫細胞系３種中２種およびユーイング肉腫細胞系２種上で細胞変性作用を誘導する
骨肉腫細胞系Ｈ−ＯＳ、ＳａＯＳ−２、Ｕ２−ＯＳおよびＭＧ−６３ならびにユーイング肉腫細胞系ＭＨＨ−ＥＳ、ＲＤ−ＥＳおよびＳＫ−ＥＳ−１は、細胞１個当たり０．０１〜１０ｐｆｕの間で用量を増加させながら野生型Ｈ−１ＰＶで感染させた。感染３および６日後、感染細胞生存率をＭＴＴ試験によって決定し、細胞溶解は、溶解細胞によって上清中に遊離された細胞外ＬＤＨ活性の測定によって分析した。界面活性剤（detergent）の適用によって誘導された同一ＭＯＩで感染させた細胞の溶解は、完全溶解についての参考とした（図５）。短期間培養における非形質転換線維芽細胞および骨芽細胞を、陰性コントロールとして機能させた。これらの結果も表１に要約した。
【００４６】
実施例７
骨癌細胞における細胞変性作用はアポトーシスによって媒介されると思われる
骨肉腫およびユーイング肉腫細胞系をプロピジウムヨウ素染色、およびそれに続くＤＮＡ断片化およびアポトーシスの指標であるサブ−Ｇ１  ＤＮＡ含量（２ｎ未満）細胞集団の存在についてのフローサイトメトリーによって分析した。骨肉腫およびユーイング肉腫のＨ−１ＰＶ感染は、典型的にはＳａＯＳおよびＵ２−ＯＳ骨肉腫細胞系について証明されたように、Ｇ２−停止およびサブ−Ｇ１集団の出現を誘導することができた（図６）。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
参照文献のリスト
(1) Ketola A, Hinkkanen A, Yongabi F, Furu P, Maatta AM, Liimatainen T, et al. Oncolytic Semliki forest virus vector as a novel candidate against unresectable osteosarcoma. Cancer Res 2008;68:8342-50. 
(2) Morton CL, Houghton PJ, Kolb EA, Gorlick R, Reynolds CP, Kang MH, et al. Initial testing of the replication competent Seneca Valley virus (NTX-010) by the pediatric preclinical testing program. Pediatr Blood Cancer 2010;55:295-303. 
(3) Witlox MA, Lamfers ML, Wuisman PI, Curiel DT, Siegal GP. Evolving gene therapy approaches for osteosarcoma using viral vectors: review. Bone 2007;40:797-812.
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【図１ａ】
0005793242.tif 000003
【図１ｂ】
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【図２】
0005793242.tif 000005
【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
0005793242.tif 000008
【図５】
0005793242.tif 000009
【図６】
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【配列表】
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