(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養物中で再集合体インフルエンザウイルスを生成する方法であって、
ａ）  インフルエンザウイルスゲノムを含む複数のベクターを、宿主細胞の集団に導入すること、ここで、複数のベクターは、第１のインフルエンザ株の６つの内部ゲノムセグメント；Ｋ１１９Ｅ、Ｋ１１９ＮおよびＡ１８６Ｄからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする第１のゲノムセグメントおよびノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第２のゲノムセグメントを含み、かつ集団は、インフルエンザウイルスの複製を支持することができる、と
ｂ）  前記宿主細胞の集団を培養することと
ｃ）  複数の再集合体インフルエンザウイルスを回収することと
を含む方法。
【請求項２】
前記第１のゲノムセグメントが、前記Ｋ１１９ＥおよびＡ１８６Ｄアミノ酸置換を含む配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のゲノムセグメントが、前記Ｋ１１９ＮおよびＡ１８６Ｄアミノ酸置換を含む配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ノイラミニダーゼポリペプチドがＮ１ノイラミニダーゼである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ノイラミニダーゼポリペプチドが配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のインフルエンザ株が、弱毒化、低温適応型および温度感受性からなる群から選択される１以上の表現型特性を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のインフルエンザ株が、Ａ／アナーバー／６／６０、Ａ／プエルトリコ／８／３４、Ａ／レニングラード／１３４／１７／５７、およびＡ／レニングラード／１７からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記再集合体インフルエンザウイルスが、鼻腔内ワクチン製剤での投与に好適である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
Ｋ１１９Ｅ、Ｋ１１９ＮおよびＡ１８６Ｄからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
Ｋ１１９ＥおよびＡ１８６Ｄ置換を含む配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに
Ｋ１１９ＮおよびＡ１８６Ｄ置換を含む配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、から選択されるポリペプチドを含む、再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルス。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、Ｋ１１９ＥおよびＡ１８６Ｄアミノ酸置換を含む配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルス。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、Ｋ１１９ＮおよびＡ１８６Ｄアミノ酸置換を含む配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルス。
【請求項１２】
前記再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスが、弱毒化、低温適応型および温度感受性からなる群から選択される１以上の表現型特性を含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルス。
【請求項１３】
前記再集合体インフルエンザウイルスが、Ａ／アナーバー／６／６０、Ａ／プエルトリコ／８／３４、Ａ／レニングラード／１３４／１７／５７、およびＡ／レニングラード／１７からなる群から選択されるウイルスの少なくとも６つの内部ゲノムセグメントを含む、請求項１２に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項１４】
請求項９〜１３のいずれかに記載の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスを含む免疫原性組成物。
【請求項１５】
請求項９〜１３のいずれかに記載の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスを含むインフルエンザワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２００９年６月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／２２０，４２６号；２００９年７月２３日に出願された同第６１／２２７，９８６号；２００９年８月１４日に出願された同第６１／２３４，０２１号；および２００９年１１月６日に出願された同第６１／２５８，８９０号の恩典を主張する。これらの出願の各々は、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
２００９年４月のヒトにおけるブタ起源のＡ型インフルエンザ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスの世界的な広がりは、ここ４１年で初めてのインフルエンザパンデミックとなった。２００９年６月１５日の時点で３５，０００人を超える人々がこの新規のＨ１Ｎ１ウイルスに感染した。前世紀に、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスは、深刻な１９１８〜１９年のパンデミックも引き起こした。さらに、ブタ由来のＨ１Ｎ１ウイルスは、１９７６年にパンデミック寸前にまで行った。１９１８年のインフルエンザウイルスは、１９１８年の春に軽い感染、そして、その年の秋には世界規模で致死的な高まりを生み、世界中で５０００万人もの人々を死亡させた。２００９年のブタ起源のＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスは、２００９年の初めには軽いとみなされたが、このウイルスが、２００９年の秋までに突然変異し、より毒性が強くなる可能性が存在する。それゆえ、２００９年のＨ１Ｎ１ウイルスによって引き起こされる深刻なパンデミックを予防するために有効なワクチンを開発する差し迫った必要性がある。
【０００３】
生ワクチンと死菌ワクチンの両方のワクチン開発に有用な６：２再集合体インフルエンザウイルス（ブタ起源のＡ型インフルエンザ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスのＨＡおよびＮＡセグメントと弱毒化インフルエンザウイルスの「バックボーン」セグメントとを有する）が単離されているが、これまでに単離されたほとんどの株は、卵の中で低い力価を示す。同じ単離株はＭＤＣＫ細胞に感染しにくく、また、ＣＰＥに乏しい小さいプラークを形成する。さらに、ウイルスの濾過後に、ウイルス効力の深刻な喪失が観察される。したがって、当初単離されたＨ１Ｎ１再集合体インフルエンザウイルス株は、ワクチン株の開発には不十分な候補である。
【０００４】
本発明は、多くの種類のワクチンの生成に、および研究、診断などに使用することができる新しいおよび／または新しく単離されたブタインフルエンザＨ１ヘマグルチニン変異体を提供する。本発明はさらに、Ｈ１インフルエンザウイルスの複製効率を改善する方法を提供する。以下を検討することにより、数々の他の利益が明らかになるであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書に記載されたように、Ｈ１Ｎ１ワクチンの開発において使用するのに好適な６：２再集合体インフルエンザ株は、リバースジェネティックスによって作製された。当初単離された、卵の中であまり増殖しない、野生型ＨＡおよびＮＡゲノムセグメントを含む再集合体ウイルスは、卵の中でのその増殖が大きく改善されるように修飾された。修飾された再集合体ウイルスの配列解析から、Ｈ１ブタヘマグルチニンの位置１１９、１５３、１５４および１８６におけるアミノ酸変化が、卵およびＭＤＣＫ細胞における増殖優位性に関与することが示された。ブタ１９７６年型ウイルスの複製を増大させることが以前に示されたＨＡ残基１５５におけるアミノ酸置換も、卵の中での再集合体Ａ／ＣＡ／７／０９ウイルス複製を増大させることが分かった。ＨＡ残基１１９および１８６におけるアミノ酸変化を有するウイルスは、ウイルスの抗原性をそれほど変化させずに卵での増殖を増大させた。本明細書に記載のＨ１  ＨＡ変異体は、ＰＲ８またはＡ／アナーバー／６／６０ウイルス株の６つの内部ゲノムセグメントを含む６：２再集合体ウイルスに増大した増殖表現型を付与した。さらに、ｃａ  Ａ／アナーバー／６／６０バックボーンとＨＡ残基１１９または１８６におけるアミノ酸置換を有するＨ１  ＨＡ変異体とを含む変異体ウイルスは、弱毒化されており、かつフェレットにおいて極めて免疫原性であった。これらのデータは、ＨＡ残基１１９および／または１８６におけるアミノ酸置換を含む再集合体インフルエンザウイルス変異体がヒトで使用されるＨ１Ｎ１ブタインフルエンザワクチンの開発に好適であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】ＭＤＣＫ細胞から選択された変異体および導入されたアミノ酸変化を含む示された変異体のプラーク形態（Ａ）。３３℃で４日間インキュベートし、Ａ型インフルエンザウイルスに対するポリクローナル抗血清で免疫染色したＭＤＣＫ細胞でプラークアッセイを行なった。パネルＢでは、二重突然変異体Ｖ５−１１９Ｅ／１８６Ｄのプラーク形態が、単一の１１９Ｅおよび１８６Ｄ突然変異体と比較されている。
【図１Ｂ】ＭＤＣＫ細胞から選択された変異体および導入されたアミノ酸変化を含む示された変異体のプラーク形態（Ａ）。３３℃で４日間インキュベートし、Ａ型インフルエンザウイルスに対するポリクローナル抗血清で免疫染色したＭＤＣＫ細胞でプラークアッセイを行なった。パネルＢでは、二重突然変異体Ｖ５−１１９Ｅ／１８６Ｄのプラーク形態が、単一の１１９Ｅおよび１８６Ｄ突然変異体と比較されている。
【図２】Ａ／カリフォルニア／７／０９、Ａ／ブタ／アイオワ／１／１９７６（ヌクレオチド配列アクセッションコードＣＹ０２２０６９）、Ａ／ブタ／１９３１（ヌクレオチド配列アクセッションコードＣＹ００９６２８）、およびＡ／サウスダコタ／６／０７のＨＡ１タンパク質配列の比較。位置１１９、１５３、１５４、１５５、１８６および２７８のアミノ酸が強調されている。
【図３Ａ】孵化卵から精製されたウイルス調製物のタンパク質組成。
【図３Ｂ】孵化卵から精製されたウイルス調製物のタンパク質組成。
【図４】孵化卵から精製されたウイルス調製物のタンパク質組成。
【図５Ａ】（Ａ）４８時間および（Ｂ）６０時間で孵化卵から回収された精製ウイルス調製物のタンパク質組成。
【図５Ｂ】（Ａ）４８時間および（Ｂ）６０時間で孵化卵から回収された精製ウイルス調製物のタンパク質組成。
【図６】孵化卵中で２種の再集合体Ｈ１Ｎ１ウイルスによって生成されたＨＡ１タンパク質の量的比較。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、インフルエンザヘマグルチニンのポリペプチド配列およびポリヌクレオチド配列ならびにそのような配列を含むベクター、ウイルス、ワクチン、組成物などならびにそれらの使用法を含む。本発明のさらなる特徴は、本明細書でより詳細に記載されている。
【０００８】
いくつかの態様では、本発明は、単離されたヘマグルチニンポリペプチドまたは組換えヘマグルチニンポリペプチドを提供する。一実施形態では、本発明の単離されたＨＡポリペプチドまたは組換えＨＡポリペプチドは、Ｈ１  ＨＡポリペプチドである。別の実施形態では、本発明の単離されたＨＡポリペプチドまたは組換えＨＡポリペプチドは、ブタインフルエンザＨＡポリペプチドであり得る。
【０００９】
一実施形態では、本発明の単離されたＨＡポリペプチドまたは組換えＨＡポリペプチドは、配列番号１の位置１１９のアミノ酸残基に対応する位置または配列番号１の位置１８６のアミノ酸残基に対応する位置に非天然のアミノ酸を含み得る。別の実施形態では、本発明の単離されたＨＡポリペプチドまたは組換えＨＡポリペプチドは、配列番号１の位置１１９のアミノ酸残基に対応する位置および配列番号１の位置１８６のアミノ酸残基に対応する位置に非天然のアミノ酸を含み得る。さらなる実施形態では、本発明の単離されたＨＡポリペプチドまたは組換えＨＡポリペプチドは、Ｋ１１９Ｅ、Ｋ１１９ＮおよびＡ１８６Ｄからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【００１０】
特定の実施形態では、本発明の単離されたＨＡポリペプチドまたは組換えＨＡポリペプチドは、Ｋ１１９Ｅ、Ｋ１１９ＮおよびＡ１８６Ｄからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む配列番号１のアミノ酸配列を含む。別の特定の実施形態では、本発明の単離されたＨＡポリペプチドまたは組換えＨＡポリペプチドは、配列番号１の位置１１９のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基におけるグルタミン酸（Ｅ）と、配列番号１の位置１８６のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基におけるアスパラギン酸（Ｄ）とを含み得る。さらなる特定の実施形態では、本発明の単離されたＨＡポリペプチドまたは組換えＨＡポリペプチドは、配列番号１の位置１１９のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基におけるアスパラギン（Ｎ）と、配列番号１の位置１８６のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基におけるアスパラギン酸（Ｄ）とを含み得る。
【００１１】
さらなる実施形態では、本発明の単離されたＨＡポリペプチドまたは組換えＨＡポリペプチドは、Ｈ２７３Ｙ置換をさらに含み得る。
【００１２】
さらなる実施形態では、本発明の単離されたＨＡポリペプチドまたは組換えＨＡポリペプチドは、Ｄ２２２Ｇおよび／またはＱ２２３Ｒ置換をさらに含み得る。
【００１３】
特定の実施形態では、本発明のＨＡポリペプチドは配列番号６または８のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本発明のＨＡポリペプチドは、配列番号６または８のアミノ酸配列との少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、本発明のＨＡポリペプチドは、３個未満、５個未満、１０個未満、１５個未満、２０個未満、２５個未満、３０個未満のアミノ酸置換、欠失または挿入を含む配列番号６または８のアミノ酸配列を含む。
【００１４】
特定の実施形態では、本発明のＨＡポリペプチドは、配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本発明のＨＡポリペプチドは、配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列との少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、本発明のＨＡポリペプチドは、３個未満、５個未満、１０個未満、１５個未満、２０個未満、２５個未満、３０個未満のアミノ酸置換、欠失または挿入を含む配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸と、そのような本発明のポリペプチドおよび／または核酸を含む再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスとを包含する。
【００１６】
特定の実施形態では、本発明の核酸は、配列番号７のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、本発明の核酸は、配列番号７のヌクレオチド配列との少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。さらなる実施形態では、本発明の核酸は、３個未満、５個未満、１０個未満、１５個未満、２０個未満、２５個未満、３０個未満のヌクレオチド置換、欠失または挿入を含む配列番号７のヌクレオチド配列を含む。
【００１７】
特定の実施形態では、本発明の核酸は、配列番号７の残基８４〜１０６４のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、本発明の核酸は、配列番号７の８４〜１０６４のヌクレオチド配列との少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。さらなる実施形態では、本発明の核酸は、３個未満、５個未満、１０個未満、１５個未満、２０個未満、２５個未満、３０個未満のヌクレオチド置換、欠失または挿入を含む配列番号７の８４〜１０６４のヌクレオチド配列を含む。
【００１８】
一実施形態では、本発明の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、Ａ／アナーバー／６／６０由来の６つの内部ゲノムセグメントと、第１の配列番号６または８のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードするゲノムセグメントと、ノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第２のゲノムセグメントとを含む。特定の実施形態では、第１のゲノムセグメントは、配列番号６または８のアミノ酸配列との少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードし得る。特定の実施形態では、第１のゲノムセグメントは、３個未満、５個未満、１０個未満、１５個未満、２０個未満、２５個未満、３０個未満のアミノ酸置換、欠失または挿入を含む配列番号６または８のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードし得る。特定の実施形態では、第２のゲノムセグメントは、配列番号５のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ノイラミニダーゼポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、孵化卵中で少なくとも約７．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約８  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約８．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約９  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約９．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約１０  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約１０．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌまたは少なくとも約１１  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌという力価まで増殖する。特定の実施形態では、再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、組織培養物中で少なくとも約７．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約８  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約８．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約９  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約９．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約１０  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約１０．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌまたは少なくとも約１１  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌという力価まで増殖する。
【００１９】
別の実施形態では、本発明の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、Ａ／アナーバー／６／６０由来の６つの内部ゲノムセグメントと、配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードする第１のゲノムセグメントと、ノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第２のゲノムセグメントとを含む。特定の実施形態では、第１のゲノムセグメントは、配列番号６の残基１〜３２７のアミノ酸配列との少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードし得る。特定の実施形態では、第１のゲノムセグメントは、３個未満、５個未満、１０個未満、１５個未満、２０個未満、２５個未満、３０個未満のアミノ酸置換、欠失または挿入を含む配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードし得る。特定の実施形態では、第２のゲノムセグメントは、配列番号５のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ノイラミニダーゼポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、孵化卵中で少なくとも約７．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約８  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約８．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約９  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約９．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約１０  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約１０．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌまたは少なくとも約１１  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌという力価まで増殖する。特定の実施形態では、再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、組織培養物中で少なくとも約７．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約８  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約８．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約９  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約９．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約１０  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約１０．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌまたは少なくとも約１１  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌという力価まで増殖する。
【００２０】
一実施形態では、本発明の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、Ａ／プエルトリコ／８／３４由来の６つの内部ゲノムセグメントと、第１の配列番号６または８のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードするゲノムセグメントと、ノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第２のゲノムセグメントとを含む。特定の実施形態では、第１のゲノムセグメントは、配列番号６または８のアミノ酸配列との少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードし得る。特定の実施形態では、第１のゲノムセグメントは、３個未満、５個未満、１０個未満、１５個未満、２０個未満、２５個未満、３０個未満のアミノ酸置換、欠失または挿入を含む配列番号６または８のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードし得る。特定の実施形態では、第２のゲノムセグメントは、配列番号５のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ノイラミニダーゼポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、孵化卵中で少なくとも約７．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約８  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約８．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約９  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約９．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約１０  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約１０．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌまたは少なくとも約１１  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌという力価まで増殖する。特定の実施形態では、再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、組織培養物中で少なくとも約７．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約８  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約８．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約９  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約９．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約１０  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約１０．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌまたは少なくとも約１１  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌという力価まで増殖する。
【００２１】
別の実施形態では、本発明の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、Ａ／プエルトリコ／８／３４由来の６つの内部ゲノムセグメントと、配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードする第１のゲノムセグメントと、ノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第２のゲノムセグメントとを含む。特定の実施形態では、第１のゲノムセグメントは、配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列との少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードし得る。特定の実施形態では、第１のゲノムセグメントは、３個未満、５個未満、１０個未満、１５個未満、２０個未満、２５個未満、３０個未満のアミノ酸置換、欠失または挿入を含む配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードし得る。特定の実施形態では、第２のゲノムセグメントは、配列番号５のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ノイラミニダーゼポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、孵化卵中で少なくとも約７．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約８  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約８．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約９  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約９．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約１０  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約１０．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌまたは少なくとも約１１  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌという力価まで増殖する。特定の実施形態では、再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、組織培養物中で少なくとも約７．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約８  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約８．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約９  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約９．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約１０  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約１０．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌまたは少なくとも約１１  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌという力価まで増殖する。
【００２２】
一実施形態では、本発明の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、Ａ／アナーバー／６／６０由来の６つの内部ゲノムセグメントと、配列番号７のヌクレオチド配列を含む第１のゲノムセグメントと、ノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第２のゲノムセグメントとを含む。別の実施形態では、本発明の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、Ａ／アナーバー／６／６０由来の６つの内部ゲノムセグメントと、配列番号７の残基８４〜１０６４のヌクレオチド配列を含む第１のゲノムセグメントと、ノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第２のゲノムセグメントとを含む。さらなる実施形態では、本発明の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、Ａ／プエルトリコ／８／３４由来の６つの内部ゲノムセグメントと、配列番号７のヌクレオチド配列を含む第１のゲノムセグメントと、ノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第２のゲノムセグメントとを含む。別の実施形態では、本発明の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、Ａ／プエルトリコ／８／３４由来の６つの内部ゲノムセグメントと、配列番号７の残基８４〜１０６４のヌクレオチド配列を含む第１のゲノムセグメントと、ノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第２のゲノムセグメントとを含む。特定の実施形態では、第２のゲノムセグメントは、配列番号５のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ノイラミニダーゼポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、孵化卵中で少なくとも約７．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約８  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約８．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約９  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約９．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約１０  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約１０．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌまたは少なくとも約１１  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌという力価まで増殖する。特定の実施形態では、再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、組織培養物中で少なくとも約７．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約８  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約８．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約９  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約９．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約１０  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約１０．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌまたは少なくとも約１１  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌという力価まで増殖する。
【００２３】
他の態様では、本発明は、上で列挙された１以上のポリペプチド、またはその断片を含む滅菌組成物を含む。本発明はまた、免疫学的有効量の１以上の上記のポリペプチドを含む免疫原性組成物、および個体の免疫系を刺激して、インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を生じさせるための方法であって、個体に免疫学的有効量の１以上の上記のポリペプチドを投与することを含む方法を包含する。特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、配列番号６または８のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。別の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、配列番号６または８のアミノ酸配列との少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。さらなる実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、３個未満、５個未満、１０個未満、１５個未満、２０個未満、２５個未満、３０個未満のアミノ酸置換、欠失または挿入を含む配列番号６または８のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。別の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列との少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。さらなる実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、３個未満、５個未満、１０個未満、１５個未満、２０個未満、２５個未満、３０個未満のアミノ酸置換、欠失または挿入を含む配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００２４】
一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、１種の再集合体インフルエンザウイルスを含む一価の免疫原性組成物である。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、３種の再集合体インフルエンザウイルスを含む三価の免疫原性組成物である。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、２種の再集合体Ａ型インフルエンザウイルスと１種の再集合体Ｂ型インフルエンザウイルスとを含む三価の免疫原性組成物である。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、１種のタイプＨ１の再集合体Ａ型インフルエンザウイルスと、１種のタイプＨ３の再集合体Ａ型インフルエンザウイルスと、１種の再集合体Ｂ型インフルエンザウイルスとを含む三価の免疫原性組成物である。別の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、４種の再集合体インフルエンザウイルスを含む四価の免疫原性組成物である。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、２種の再集合体Ａ型インフルエンザウイルスと２種の再集合体Ｂ型インフルエンザウイルスとを含む四価の免疫原性組成物である。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、１種のタイプＨ１の再集合体Ａ型インフルエンザウイルスと、１種のタイプＨ３の再集合体Ａ型インフルエンザウイルスと、ビクトリア系統の１種の再集合体Ｂ型インフルエンザウイルスと、山形系統の１種の再集合体Ｂ型インフルエンザウイルスとを含む四価の免疫原性組成物である。特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、配列番号６または８のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードするゲノムセグメントを含む再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスを含む。別の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、配列番号６または８のアミノ酸配列との少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードするゲノムセグメントを含む再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスを含む。さらなる実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、３個未満、５個未満、１０個未満、１５個未満、２０個未満、２５個未満、３０個未満のアミノ酸置換、欠失または挿入を含む配列番号６または８のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードするゲノムセグメントを含む再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスを含む。特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードするゲノムセグメントを含む再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスを含む。別の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列との少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードするゲノムセグメントを含む再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスを含む。さらなる実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、３個未満、５個未満、１０個未満、１５個未満、２０個未満、２５個未満、３０個未満のアミノ酸置換、欠失または挿入を含む配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードするゲノムセグメントを含む再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスを含む。
【００２５】
さらに、本発明は、１以上の上記のポリペプチドをコードするゲノムセグメントを含む再集合体インフルエンザウイルスを包含する。さらに、本発明は、免疫学的有効量のそのような再集合体インフルエンザウイルスを含む免疫原性組成物を包含する。個体の免疫系を刺激して、インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を生じさせるための方法であって、生理学的に許容される担体中の免疫学的有効量のそのような再集合体インフルエンザウイルスを投与することを含む方法もまた、本発明の一部である。一実施形態では、本発明の再集合体インフルエンザウイルスは、１以上のドナーウイルス（例えば、Ａ／ＡＡ／６／６０またはより一般的にＰＲ８として知られるＡ／プエルトリコ／８／３４）由来の６つの内部ゲノムセグメントを含み、かつさらに２つのゲノムセグメント（通常および好ましくはＨＡもしくはＮＡまたはそれらの断片をコードする）を含む６：２再集合体ウイルスである。そのような再集合体（組換え）ウイルスを含む免疫原性組成物もまた、本発明の特徴である。
【００２６】
一実施形態では、本発明の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、Ａ／アナーバー／６／６０の６つの内部ゲノムセグメントとＨＡポリペプチドをコードするゲノムセグメントとを含む。ＨＡポリペプチドは、少なくとも１つの置換、欠失または挿入を有する配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。ＨＡポリペプチドは、Ｈ２７３Ｙ置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。ＨＡポリペプチドは、Ｄ２２２Ｇおよび／またはＱ２２３Ｒ置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。ＨＡポリペプチドは、Ｋ１１９Ｅ、Ｋ１１９ＮおよびＡ１８６Ｄからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態では、本発明の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、Ａ／アナーバー／６／６０の６つの内部ゲノムセグメントと、Ｄ２２２Ｇ、Ｋ１１９ＥおよびＡ１８６Ｄ置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードするゲノムセグメントとを含む。特定の実施形態では、本発明の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、Ａ／アナーバー／６／６０の６つの内部ゲノムセグメントと、Ｑ２２３ＲおよびＡ１８６Ｄ置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードするゲノムセグメントとを含む。特定の実施形態では、本発明の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、Ａ／アナーバー／６／６０の６つの内部ゲノムセグメントと、Ｑ２２３Ｒ、Ｈ２７３ＹおよびＡ１８６Ｄ置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードするゲノムセグメントとを含む。特定の実施形態では、本発明の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、Ａ／アナーバー／６／６０の６つの内部ゲノムセグメントと、ＨＡ配列番号６または８のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードするゲノムセグメントとを含む。特定の実施形態では、ＨＡゲノムセグメントは、配列番号６または８のアミノ酸配列との少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードし得る。特定の実施形態では、ＨＡゲノムセグメントは、３個未満、５個未満、１０個未満、１５個未満、２０個未満、２５個未満、３０個未満のアミノ酸置換、欠失または挿入を含む配列番号６または８のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードし得る。特定の実施形態では、ＨＡゲノムセグメントは、配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードし得る。特定の実施形態では、ＨＡゲノムセグメントは、配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列との少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードし得る。特定の実施形態では、ＨＡゲノムセグメントは、３個未満、５個未満、１０個未満、１５個未満、２０個未満、２５個未満、３０個未満のアミノ酸置換、欠失または挿入を含む配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードし得る。
【００２７】
一実施形態では、本発明の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、Ａ／プエルトリコ／８／３４（ＰＲ８）の６つの内部ゲノムセグメントとＨＡポリペプチドをコードするゲノムセグメントとを含む。ＨＡポリペプチドは、少なくとも１つの置換、欠失または挿入を有する配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。ＨＡポリペプチドは、Ｄ２２２Ｇおよび／またはＱ２２３Ｒ置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。ＨＡポリペプチドは、Ｋ１１９Ｅ、Ｋ１１９ＮおよびＡ１８６Ｄからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。ＨＡポリペプチドは、Ｈ２７３Ｙ置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態では、本発明の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、Ａ／プエルトリコ／８／３４（ＰＲ８）の６つの内部ゲノムセグメントと、Ｄ２２２Ｇ、Ｋ１１９ＥおよびＡ１８６Ｄ置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードするゲノムセグメントとを含み得る。特定の実施形態では、本発明の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、Ａ／プエルトリコ／８／３４（ＰＲ８）の６つの内部ゲノムセグメントと、Ｑ２２３ＲおよびＡ１８６Ｄ置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードするゲノムセグメントとを含み得る。特定の実施形態では、本発明の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、Ａ／プエルトリコ／８／３４（ＰＲ８）の６つの内部ゲノムセグメントと、Ｑ２２３Ｒ、Ｈ２７３ＹおよびＡ１８６Ｄ置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードするゲノムセグメントを含む。特定の実施形態では、本発明の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、Ａ／プエルトリコ／８／３４（ＰＲ８）の６つの内部ゲノムセグメントと、ＨＡ配列番号６または８のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードするゲノムセグメントとを含む。特定の実施形態では、ＨＡゲノムセグメントは、配列番号６または８のアミノ酸配列との少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードし得る。特定の実施形態では、ＨＡゲノムセグメントは、３個未満、５個未満、１０個未満、１５個未満、２０個未満、２５個未満、３０個未満のアミノ酸置換、欠失または挿入を含む配列番号６または８のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードし得る。特定の実施形態では、ＨＡゲノムセグメントは、配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードし得る。特定の実施形態では、ＨＡゲノムセグメントは、配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列との少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードし得る。特定の実施形態では、ＨＡゲノムセグメントは、３個未満、５個未満、１０個未満、１５個未満、２０個未満、２５個未満、３０個未満のアミノ酸置換、欠失または挿入を含む配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドをコードし得る。
【００２８】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む再集合体インフルエンザウイルスもまた本発明の範囲内である。一実施形態では、そのような再集合体ウイルスは、１以上のドナーウイルス（例えば、Ａ／ＡＡ／６／６０またはＡ／プエルトリコ／８／３４）由来の６つの内部ゲノムセグメントと、本発明のヘマグルチニンポリペプチドをコードする第１のゲノムセグメントと、ノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第２のゲノムセグメントとを含む６：２再集合体ウイルスである。免疫学的有効量のそのような再集合体／組換えインフルエンザウイルスを含む免疫原性組成物もまた、本発明の範囲内である。
【００２９】
本発明の再集合体ウイルスまたは組換えウイルスは、組織培養物または孵化卵中で高い複製率を示す。一実施形態では、再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、孵化卵中で少なくとも約７．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約８  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約８．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約９  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約９．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約１０ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約１０．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌまたは少なくとも約１１  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌという力価まで増殖する。別の実施形態では、再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスは、組織培養物中で少なくとも約７．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約８  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約８．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約９  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約９．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約１０  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも約１０．５  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌまたは少なくとも約１１  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌという力価まで増殖する。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドを有する宿主細胞を培養することによって再集合体／組換えインフルエンザウイルスを生成する方法も想定されている。
【００３１】
本明細書における他の実施形態では、本発明は、免疫学的有効量の１以上の上記の本発明の再集合体インフルエンザウイルスを有する免疫原性組成物を含む。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、本発明の生ウイルスを含む。他の実施形態は、個体の免疫系を刺激して、インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を生じさせるための方法であって、（任意で生理学的に有効な担体中の）免疫学的有効量の１以上の上記の再集合体インフルエンザウイルスを個体に投与することを含む方法を含む。
【００３２】
本発明はまた、本発明の組換えインフルエンザウイルスまたは再集合体インフルエンザウイルスを含むワクチンを包含する。一実施形態では、本発明のワクチンは、スプリットワクチンまたは死菌ワクチンである。別の実施形態では、本発明のワクチンは、弱毒化生インフルエンザウイルスワクチンである。さらなる実施形態では、本発明のワクチンは、一価、二価、三価または四価のワクチンであり得る。
【００３３】
インフルエンザウイルスワクチンを生成する方法もまた本発明に含まれる。一実施形態では、本発明のワクチンは、一価、二価、三価または四価のワクチンであり得る。
【００３４】
本発明はまた、例えば、孵化鶏卵および／または細胞培養物中でインフルエンザウイルスの複製能を増大させるための方法および組成物に関する。本発明は、増大した複製能力と関連する特定のＨ１タンパク質アミノ酸の同定に一部基づいている。これらの特定のアミノ酸のうちの１つまたは複数を含むＨ１  ＨＡタンパク質をコードするＨ１  ＨＡ遺伝子を使用することによって、改善されたインフルエンザウイルス収量を達成することができる。一実施形態では、再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスの複製能力を増大させるための方法であって、配列番号１の位置１１９または１８６のアミノ酸残基に対応する位置でヘマグルチニンポリペプチドのアミノ酸残基を改変し、それにより、再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスの複製能力を増大させることを含む方法が提供される。本方法によって生成される組換えインフルエンザウイルスも提供される。
【００３５】
本発明はまた、例えば、孵化鶏卵および／または細胞培養物中で、Ｈ１Ｎ１再集合体インフルエンザウイルスの複製能力を増大させるための方法および組成物に関する。一実施形態では、Ｈ１Ｎ１再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスの複製能力を増大させるための方法であって、配列番号１の位置１１９または１８６のアミノ酸残基に対応する位置でヘマグルチニンポリペプチドのアミノ酸残基を改変し、それにより、再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスの複製能力を増大させることを含む方法が提供される。本方法によって生成される組換えインフルエンザウイルスも提供される。
【００３６】
一実施形態では、非天然のアミノ酸を有する本発明のヘマグルチニンポリペプチドを含む、本発明の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスの複製能力は、同じ位置で非天然のアミノ酸を含まない同じ再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスと比べて少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍増加している。別の実施形態では、非天然のアミノ酸を有する本発明のヘマグルチニンポリペプチドを含む、本発明の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスの複製能力は、同じ位置で非天然のアミノ酸を含まない同じ再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスと比べて２倍〜１０倍、２倍〜２０倍、２倍〜４０倍、２倍〜１００倍、５倍〜１０倍、５倍〜２０倍、５倍〜４０倍、または５倍〜１００倍増加している。
【００３７】
一実施形態では、非天然のアミノ酸を有する本発明のヘマグルチニンポリペプチドを含む、本発明の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスの孵化卵におけるピーク力価は、同じ位置で非天然のアミノ酸を含まない同じ再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスと比べて少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍増加している。別の実施形態では、非天然のアミノ酸を有する本発明のヘマグルチニンポリペプチドを含む、本発明の再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスの孵化卵におけるピーク力価は、同じ位置で非天然のアミノ酸を含まない同じ再集合体インフルエンザウイルスまたは組換えインフルエンザウイルスと比べて２倍〜１０倍、２倍〜２０倍、２倍〜４０倍、２倍〜１００倍、５倍〜１０倍、５倍〜２０倍、５倍〜４０倍、または５倍〜１００倍増加している。
【００３８】
特定の実施形態では、Ｈ１Ｎ１ウイルスのＨＡポリペプチドを含み、このポリペプチドがＫ１１９Ｅ、Ｋ１１９ＮおよびＡ１８６Ｄからなる群から選択されるアミノ酸を含む、組換えインフルエンザウイルスが提供される。特定の実施形態では、Ｈ１Ｎ１ウイルスのＨＡポリペプチドを含み、このポリペプチドが、Ｋ１１９ＸおよびＡ１８６Ｘからなる群から選択されるアミノ酸を含み、ここで、Ｘは、該Ｈ１Ｎ１ウイルスにおいて天然には生じない任意のアミノ酸である、組換えインフルエンザウイルスが提供される。特定の実施形態では、本発明の組換えインフルエンザウイルスは、弱毒化ウイルスの（または弱毒化ウイルスに由来する）少なくとも５つまたは６つのセグメントを含む６：２再集合体ウイルスである。特定の実施形態では、本発明の組換えインフルエンザウイルスは、アナーバー／６／６０（Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０）、Ａ／プエルトリコ／８／３４（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４）、Ａ／レニングラード／１３４／１７／５７（Ａ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／１３４／１７／５７）、およびＡ／レニングラード／１７（Ａ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／１７）からなる群から選択される弱毒化ウイルスの（または弱毒化ウイルスに由来する）少なくとも５つまたは６つのセグメントを含む６：２再集合体ウイルスである。特定の実施形態では、本発明の組換えインフルエンザウイルスは、配列番号６または８のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドを含む。別の実施形態では、本発明の組換えインフルエンザウイルスは、配列番号６または８のアミノ酸配列との少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドを含む。さらなる実施形態では、本発明の組換えインフルエンザウイルスは、３個未満、５個未満、１０個未満、１５個未満、２０個未満、２５個未満、３０個未満のアミノ酸置換、欠失または挿入を含む配列番号６または８のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドを含む。特定の実施形態では、本発明の組換えインフルエンザウイルスは、配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドを含む。別の実施形態では、本発明の組換えインフルエンザウイルスは、配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列との少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドを含む。さらなる実施形態では、本発明の組換えインフルエンザウイルスは、３個未満、５個未満、１０個未満、１５個未満、２０個未満、２５個未満、３０個未満のアミノ酸置換、欠失または挿入を含む配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドを含む。
【００３９】
特定の実施形態では、本発明の組換えインフルエンザウイルスは、本発明のＨＡポリペプチドを含む６：２再集合体または７：１再集合体ウイルスである。特定の実施形態では、本発明の組換えインフルエンザウイルスは、本発明のＨＡポリペプチドと、Ａ／アナーバー／６／６０、Ａ／プエルトリコ／８／３４、Ａ／レニングラード／１３４／１７／５７、およびＡ／レニングラード／１７からなる群から選択される弱毒化ウイルスの（または弱毒化ウイルスに由来する）少なくとも５つまたは６つのセグメントとを含む６：２再集合体または７：１再集合体ウイルスである。一実施形態では、本発明の組換えインフルエンザウイルスは、（例えば、位置１１９、１８６における）１個、２個、または３個の置換を有するＡ／ＣＡ／０４／０９もしくはＡ／ＣＡ／０７／０９の（またはＡ／ＣＡ／０４／０９もしくはＡ／ＣＡ／０７／０９に由来する）ＨＡポリペプチドを含む。一実施形態では、本発明の組換えインフルエンザウイルスは、アミノ酸位置１１９のグルタミン酸またはアスパラギンと位置１８６のアスパラギン酸とを有するＡ／ＣＡ／０４／０９もしくはＡ／ＣＡ／０７／０９の（またはＡ／ＣＡ／０４／０９もしくはＡ／ＣＡ／０７／０９に由来する）ＨＡポリペプチドを含む。一実施形態では、本発明の組換えインフルエンザウイルスは、アミノ酸位置１１９および位置１８６にアミノ酸置換を有するＡ／ＣＡ／０４／０９もしくはＡ／ＣＡ／０７／０９の（またはＡ／ＣＡ／０４／０９もしくはＡ／ＣＡ／０７／０９に由来する）ＨＡポリペプチドを含む。一実施形態では、本発明の組換えインフルエンザウイルスは、アミノ酸位置１１９および位置１８６にアミノ酸置換を有するＨ１Ｎ１ブタインフルエンザウイルスの（またはＨ１Ｎ１ブタインフルエンザウイルスに由来する）ＨＡポリペプチドを含む。特定の実施形態では、本発明の組換えインフルエンザウイルスは、配列番号６または８のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドを含む。別の実施形態では、本発明の組換えインフルエンザウイルスは、配列番号６または８のアミノ酸配列との少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドを含む。さらなる実施形態では、本発明の組換えインフルエンザウイルスは、３個未満、５個未満、１０個未満、１５個未満、２０個未満、２５個未満、３０個未満のアミノ酸置換、欠失または挿入を含む配列番号６または８のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドを含む。特定の実施形態では、本発明の組換えインフルエンザウイルスは、配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドを含む。別の実施形態では、本発明の組換えインフルエンザウイルスは、配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列との少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドを含む。さらなる実施形態では、本発明の組換えインフルエンザウイルスは、３個未満、５個未満、１０個未満、１５個未満、２０個未満、２５個未満、３０個未満のアミノ酸置換、欠失または挿入を含む配列番号６または８の残基１〜３２７のアミノ酸配列を含むＨＡポリペプチドを含む。
【００４０】
当業者であれば、アミノ酸の正確な位置は、本発明のベクター、方法、およびウイルスにおいて使用される特定のインフルエンザ株によって様々に異なり得ることを認識するであろう。例えば、特定のインフルエンザ株のＨＡタンパク質は、配列番号１の位置１１９に対応する位置が、例えば、その特定のインフルエンザ株のＨＡタンパク質の残基９３または９７で見出されるように、ＨＡタンパク質をコードするＨＡ遺伝子に挿入または欠失を含み得る。特に、表３に示すように、Ａ／ＣＡ／０７／０９  ＨＡポリペプチド（配列番号１）の位置１１９および１８６は、それぞれ、Ａ／サウスダコタ／６／０７  Ｈ１  ＨＡポリペプチドの位置１１８および１８５に対応する。当業者であれば、当技術分野に従来からある手法を用いて、特定のアミノ酸位置が、改変されたときに複製能力の増大と関連する位置に対応するかどうかをすぐに認識することができるであろう。１つのそのような手法は、当技術分野で利用可能なアルゴリズムを用いて、配列番号１のアミノ酸配列と特定のインフルエンザ株ＨＡポリペプチドとを整列させることである。
【００４１】
本発明のこれらのおよび他の目的および特徴は、以下の詳細な説明を添付の図面および特許請求の範囲と併せて読んだときにより完全に明白になるであろう。
【００４２】
定義
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。以下の定義は、当技術分野におけるそれらの意味を補足し、本出願に対するものであって、必ずしも関連する事例または無関係の事例（例えば、一般に所有される特許または特許出願）にまで及ぶべきものではない。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を、本発明の試験の実施において使用することができるが、好ましい材料および方法が本明細書に記載されている。したがって、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態のみを記載するためのものであり、限定することを意図するものではない。さらなる用語が、全体を通じて定義および記載されている。
【００４３】
２つの核酸またはポリペプチド（例えば、ＨＡもしくはＮＡ分子をコードするＤＮＡ、またはＨＡもしくはＮＡ分子のアミノ酸配列）に関する「実質的に同一」という語句は、配列比較アルゴリズムを用いるかまたは目視検査によって測定される、最大一致を求めて比較し、整列させたときに少なくとも約９０％、好ましくは９１％、最も好ましくは９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％またはそれより大きいヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する３以上の配列またはサブ配列を指す。
【００４４】
ポリペプチドに関する「変異体」という用語は、参照配列に対して１以上のアミノ酸によって改変されているアミノ酸配列を指す。変異体は、「保存的」な変化を有することがあり、その場合、置換されるアミノ酸は構造的または化学的に同様の特性を有する（例えば、ロイシンとイソロイシンとの置換）。あるいは、変異体は、「非保存的」な変化、例えば、グリシンとトリプトファンとの置換を有することもある。同様の小さい変異には、アミノ酸の欠失もしくは挿入、またはその両方も含まれることがある。生物学的または免疫学的な活性を消失させずに、どのアミノ酸残基を置換、挿入、または欠失できるかを決定する上での指針を、当技術分野で周知のコンピュータプログラム（例えば、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア）を用いて見出すことができる。保存的な置換の例も、本明細書に記載されている。
【００４５】
本発明の「ノイラミニダーゼ」ポリペプチドは、インフルエンザウイルス由来の１以上の既知のノイラミニダーゼ分子との免疫学的交差反応性を示す。文献には、そのような既知のノイラミニダーゼの実例が多数存在する（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＣＤＣからの刊行物など）。同様に、本発明の「ヘマグルチニン」ポリペプチドは、インフルエンザウイルス由来の１以上の既知のヘマグルチニン分子との免疫学的交差反応性を示し得る。これについても、文献にそのような既知のヘマグルチニン分子の実例が多数存在する。
【００４６】
遺伝子には、例えば、他のタンパク質の認識配列を形成する非発現核酸セグメントも含まれる。非発現調節配列には、転写因子などの調節タンパク質が結合して、隣接配列または近接配列の転写をもたらす「プロモーター」および「エンハンサー」が含まれる。「組織特異的」プロモーターまたはエンハンサーは、特定の組織型または細胞型（単数または複数）において転写を調節するプロモーターまたはエンハンサーである。
【００４７】
「遺伝子の発現」または「核酸の発現」は通常、文脈が示すものに応じて、ＤＮＡのＲＮＡへの転写（場合によっては、ＲＮＡの修飾（例えば、スプライシング）を含む）もしくはＲＮＡのｍＲＮＡへの転写、ＲＮＡのポリペプチドへの翻訳（場合によっては、その後のポリペプチドの修飾、例えば、翻訳後修飾を含む）、または転写と翻訳の両方を意味する。
【００４８】
「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、遺伝子）を翻訳することが可能である読み枠であり、ポリペプチドへの翻訳が可能である。すなわち、このリーディングフレームは、終止コドンによって中断されない。しかしながら、ポリヌクレオチドが実際にポリペプチドに翻訳されることを、ＯＲＦという用語が必ずしも示すわけではないことに留意すべきである。
【００４９】
「ベクター」という用語は、生物、細胞、または細胞構成要素の間で核酸を伝播および／または転移することができる手段を指す。ベクターとして、自律的に複製するかまたは宿主細胞の染色体に組み込むことができる、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などが挙げられる。ベクターは、自律的に複製しない裸のＲＮＡポリヌクレオチド、裸のＤＮＡポリヌクレオチド、同一鎖中にあるＤＮＡとＲＮＡの両方から構成されているポリヌクレオチド、ポリリジンコンジュゲートされたＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチドコンジュゲートされたＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソームコンジュゲートされたＤＮＡなどであることもできる。全てではないが、多くの一般的な実施形態において、本発明のベクターは、プラスミドである。
【００５０】
「発現ベクター」は、その中に組み込まれている核酸の発現および複製を促進することができるベクター（例えば、プラスミド）である。通常、発現される核酸は、プロモーターおよび／またはエンハンサーに「機能的に連結」されており、かつプロモーターおよび／またはエンハンサーによる転写調節制御を受ける。
【００５１】
「二方向性発現ベクター」は、両方向に発現が開始され、例えば、プラス（＋）またはセンス鎖ＲＮＡ、およびマイナス（−）またはアンチセンス鎖ＲＮＡの転写を生じることできるように、２つのオルタナティブなプロモーターがこれら２つのプロモーター間に配置されている核酸に関して反対向きに配置されていることを特徴とする。
【００５２】
本発明との関連において、「単離された」という用語は、その天然に生じる環境下で、通常はそれに付随するかまたはそれと相互作用する構成要素を実質的に含まない生体物質（例えば、ウイルス、核酸またはタンパク質）を指す。単離された生体物質は、場合により、その天然の環境（例えば、細胞または野生型ウイルス）ではこの物質とともに見出されないさらなる物質を含む。例えば、この物質がその天然の環境（例えば、細胞）にある場合、この物質はその環境で見出されるそのような物質が存在しない細胞内の位置（ゲノムまたは遺伝子エレメントなど）に配置されている可能性がある。例えば、天然に生じる核酸（例えば、コード配列、プロモーター、エンハンサーなど）が、天然には生じない手段で、その核酸が存在しないゲノムの座（例えば、プラスミドベクターもしくはウイルスベクターなどのベクター、またはアンプリコン）に導入されている場合、それは、単離されたことになる。そのような核酸は、「異種」核酸とも呼ばれる。単離されたウイルスは、例えば、野生型ウイルスの生息環境（例えば、感染した個体の鼻咽頭）以外の環境（例えば、細胞培養系、または細胞培養物から純化された環境）にある。
【００５３】
ウイルスに言及する場合の「キメラの」または「キメラ」という用語は、ウイルスが、２以上の親ウイルス株または供給源に由来する遺伝子および／またはポリペプチド構成要素を含むことを示す。同様に、ウイルスタンパク質に言及する場合の「キメラの」または「キメラ」という用語は、ウイルスが、２以上の親ウイルス株または供給源に由来するポリペプチド構成要素（すなわち、アミノ酸サブ配列）を含むことを示す。本明細書で明白となるように、そのようなキメラウイルスは、通常、再集合体／組換えウイルスである。したがって、いくつかの実施形態では、キメラは、例えば、Ｂ型インフルエンザウイルス（例えば、Ｂ／ＡＡ／１／６６など）から構成されるか、もしくはＢ型インフルエンザウイルスから構築される／Ｂ型インフルエンザウイルスに由来するバックボーンに置かれているＡ型インフルエンザウイルス由来の（例えば、ＨＡおよび／もしくはＮＡの）配列、または例えば、Ａ／ＡＡ／６／６０などのようなＡ型インフルエンザウイルスバックボーン（すなわち、ドナーウイルス）に置かれているＢ型インフルエンザウイルス配列を任意で含むことができる。
【００５４】
「組換え（体）」という用語は、物質（例えば、核酸またはタンパク質）がヒトによる介入によって人工的にまたは合成的に（非天然に）改変されていることを示す。改変は、その天然の環境もしくは状態にある物質、またはそのような環境もしくは状態から取り出した物質に対して行なうことができる。特に、例えば、組換え核酸の発現によって生成される場合、そのインフルエンザウイルスは組換え体である。例えば、「組換え核酸」は、例えば、クローニング、ＤＮＡシャッフリングもしくは他の処置の間に核酸を組み換えることによって、または化学的もしくは他の突然変異導入によって作製される核酸であり、「組換えポリペプチド」または「組換えタンパク質」は、組換え核酸の発現によって生成されるポリペプチドまたはタンパク質であり、また、「組換えウイルス」（例えば、組換えインフルエンザウイルス）は、組換え核酸の発現によって生成される。
【００５５】
ウイルス（本明細書では、通常、インフルエンザウイルス）に言及する場合の「再集合体」という用語は、１以上の親ウイルス株または供給源に由来する遺伝子および／またはポリペプチド構成要素を含むウイルスを示す。例えば、７：１再集合体は、第１の親ウイルス由来の７つのウイルスゲノムセグメント（または遺伝子セグメント）と、例えば、本明細書に記載のヘマグルチニンまたはノイラミニダーゼをコードする、単一の相補的なウイルスゲノムセグメントとを含む。６：２再集合体は、６つのゲノムセグメント（最も一般的には、第１の親ウイルス由来の６つの内部ゲノムセグメント）と、１以上の異なる親ウイルス由来の２つの相補的なセグメント（例えば、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼゲノムセグメント）とを含む。再集合体ウイルスは、本明細書中の文脈によって、「キメラ」および／または「組換え」と呼ばれることもある。
【００５６】
異種核酸または単離された核酸に言及する場合の「導入された」という用語は、真核細胞または原核細胞への核酸の組込みを指し、その場合、核酸は、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチドもしくはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれるか、自律性レプリコンに変換されるか、または一過的に発現される（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）可能性がある。この用語は、「感染」、「トランスフェクション」、「形質転換」および「形質導入」のような方法を含む。本発明との関連において、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、脂質媒介性トランスフェクション（リポフェクションなどをはじめとする、種々の方法を用いて、核酸を細胞に導入することができる。
【００５７】
「宿主細胞」という用語は、ベクターまたはウイルスなどの異種核酸を含有し、その核酸の複製および／または発現を支持する細胞を意味する。宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核細胞または酵母細胞、昆虫細胞、両生類細胞、鳥類細胞またはヒト細胞を含む哺乳動物細胞などの真核細胞であることができる。例示的な宿主細胞としては、例えば、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル腎臓）細胞、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞、ニワトリ腎臓初代（ＰＣＫ）細胞、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞、２９３細胞（例えば、２９３Ｔ細胞）、およびＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞）などが挙げられる。他の実施形態では、場合により、宿主細胞として、卵（例えば、鶏卵、孵化鶏卵など）を挙げることができる。
【００５８】
インフルエンザウイルスの「免疫学的有効量」とは、後に起こるインフルエンザウイルスへの曝露に対する個体（例えば、ヒト）自体の免疫応答を増強するのに十分な量のことである。誘発された免疫レベルは、プラーク中和アッセイ、補体結合アッセイ、酵素連結免疫吸着アッセイ、または微量中和アッセイによって、分泌抗体および／または血清抗体を中和する量を測定することにより、モニタリングすることができる。
【００５９】
インフルエンザウイルスに対する「防御免疫応答」は、個体（例えば、ヒト）が示す免疫応答を指し、この免疫応答は、個体が後に野生型インフルエンザウイルスに曝露され、かつ／またはそれに感染した場合、疾患から防御するものである。いくつかの例において、野生型（例えば、自然に蔓延している）インフルエンザウイルスはそれでも感染を引き起こすことができるが、深刻なまたは生命を脅かす感染を引き起こすことはできない。通常、防御免疫応答は、同じ株および／またはサブグループ（そしておそらくは、異なる、非ワクチン株および／またはサブグループ）のウイルスを、インビトロおよびインビボで中和することができる検出可能なレベルの血清抗体および分泌抗体を宿主で生じさせる。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「抗体」は、実質的にまたは部分的に、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によってコードされる１以上のポリペプチドを含むタンパク質である。認識されている免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμの定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリンの可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、これらは、免疫グロブリンのクラスであるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥをそれぞれ規定する。典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。各四量体は、２つの同一ポリペプチド鎖対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０個またはそれより多くのアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。抗体は、インタクトの免疫グロブリンとしてまたは様々なペプチダーゼで消化されて生成されたいくつかの十分に特徴付けされた断片として存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合より下で抗体を消化し、Ｆ（ａｂ）’２を生成させる。Ｆ（ａｂ）’２はＦａｂの二量体であり、それ自体は、ジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に結合した軽鎖である。Ｆ（ａｂ）’２を、穏やかな条件の下で還元して、ヒンジ領域のジスルフィド結合を破壊し、それにより（Ｆａｂ’）２二量体をＦａｂ’単量体に変換し得る。Ｆａｂ’単量体は、本質的には、ヒンジ領域の一部を含むＦａｂである（他の抗体断片についてのより詳細な説明については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９９）を参照されたい）。様々な抗体断片は、インタクトの抗体の消化に関して規定されるが、当業者であれば、そのようなＦａｂ’断片が、化学的にまたは組換えＤＮＡの手法を用いて、デノボで合成され得ることを理解するであろう。したがって、本明細書で使用する場合、抗体という用語は、全抗体の修飾によって生成されるかまたは組換えＤＮＡの手法を用いてデノボで合成されるかのいずれかの抗体または断片を含む。抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重鎖抗体または単鎖抗体（可変重鎖と可変軽鎖が（直接的にまたはペプチドリンカーを介して）１つに結合して、連続したポリペプチドを形成する単鎖Ｆｖ（ｓＦｖまたはｓｃＦｖ）抗体を含む）、ならびにヒト化抗体またはキメラ抗体が挙げられる。
【００６１】
インフルエンザウイルス
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、インフルエンザのＨＡおよび／またはＮＡ配列の変異体である。例えば、下記の図１および図２の配列表を参照されたい。一般に、インフルエンザウイルスは、セグメント化された一本鎖ＲＮＡゲノムを含有する内部リボ核タンパク質コアとマトリックスタンパク質で裏打ちされた外側のリポタンパク質エンベロープとで構成されている。インフルエンザウイルスのゲノムは、免疫原性のヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質、ならびに６つの内部コアポリペプチド（ヌクレオカプシド核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、非構造タンパク質（ＮＳ）および３つのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２）タンパク質）をコードする、線状の（−）鎖リボ核酸（ＲＮＡ）の８つのセグメントから構成される。複製の間に、ゲノムウイルスＲＮＡは、宿主細胞の核内で（＋）鎖メッセンジャーＲＮＡと（−）鎖ゲノムｃＲＮＡに転写される。８つのゲノムセグメントの各々は、ＲＮＡの他に、ＮＰとポリメラーゼ複合体（ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡ）とを含むリボ核タンパク質複合体へとパッケージングされる。ヘマグルチニン分子は表面糖タンパク質からなり、宿主細胞表面受容体上のＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）（別名、シアル酸）に結合するよう作用する。本明細書におけるいくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド（および本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド）は、インビトロまたはインビボを問わず、ＮｅｕＮＡｃに結合するよう作用することができる。そのような作用は、いくつかの実施形態では、ヘマグルチニン活性を保持するヘマグルチニンの断片によってなされることもできる。ヘマグルチニンは、ＨＡ１およびＨＡ２という２つのサブユニットでできており、構造全体は、約５５０アミノ酸長で、約２２０ｋＤである。ノイラミニダーゼ分子は、インフルエンザウイルスの細胞表面受容体から末端シアル酸残基を切断し、それによって、感染細胞からビリオンを放出させる。ノイラミニダーゼは、新たに作られたヘマグルチニン分子およびノイラミニダーゼ分子からもシアル酸を取り除く。本明細書におけるいくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド（および本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド）は、インビトロまたはインビボを問わず、シアル酸残基を切除するよう作用することができる。この作用は、いくつかの実施形態では、ノイラミニダーゼ活性を保持するノイラミニダーゼの断片によってなされることもできる。本発明のノイラミニダーゼポリペプチドは、インフルエンザウイルス由来の１以上の既知のノイラミニダーゼ分子との免疫学的交差反応性を示す。文献には、そのような既知のノイラミニダーゼの実例が多数存在する（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＣＤＣからの刊行物など）。同様に、本発明のヘマグルチニンポリペプチドは、インフルエンザウイルス由来の１以上の既知のヘマグルチニン分子との免疫学的交差反応性を示す。これについても、文献にそのような既知のヘマグルチニン分子の実例が多数存在する。
【００６２】
インフルエンザは一般的に、Ａ型インフルエンザおよびＢ型インフルエンザのカテゴリー、ならびに通常あまり重要でないＣ型のカテゴリーに分類される。Ａ型インフルエンザウイルスとＢ型インフルエンザウイルスは各々、負の極性を有する８つの一本鎖ＲＮＡのセグメントを含有する。Ａ型インフルエンザゲノムは、１１個のポリペプチドをコードする。セグメント１〜３は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを構成する３つのポリペプチドをコードする。セグメント１は、ポリメラーゼ複合体タンパク質ＰＢ２をコードする。残りのポリメラーゼタンパク質ＰＢ１およびＰＡは、それぞれ、セグメント２およびセグメント３によってコードされる。さらに、いくつかのインフルエンザ株のセグメント１は、ＰＢ１コード領域内の別のリーディングフレームによって生成される小タンパク質ＰＢ１−Ｆ２をコードする。セグメント４は、感染の間の細胞への接着および侵入に関与するヘマグルチニン（ＨＡ）表面糖タンパク質をコードする。セグメント５は、ウイルスＲＮＡと関連する主要な構造成分であるヌクレオカプシド核タンパク質（ＮＰ）ポリペプチドをコードする。セグメント６は、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）エンベロープ糖タンパク質をコードする。セグメント７は、異なるようにスプライシングされたｍＲＮＡから翻訳される、Ｍ１およびＭ２と命名された２つのマトリックスタンパク質をコードする。セグメント８は、選択的にスプライシングされたｍＲＮＡ変異体から翻訳される２つの非構造タンパク質である、ＮＳ１およびＮＳ２をコードする。Ｂ型インフルエンザの８つのゲノムセグメントは１１個のタンパク質をコードする。最も大きな３つの遺伝子は、ＲＮＡポリメラーゼの構成要素であるＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡをコードする。セグメント４は、ＨＡタンパク質をコードする。セグメント５は、ＮＰをコードする。セグメント６は、ＮＡタンパク質とＮＢタンパク質をコードする。ＮＢとＮＡの両タンパク質は、バイシストロニックなｍＲＮＡの重複するリーディングフレームから翻訳される。Ｂ型インフルエンザのセグメント７もまた、２つのタンパク質（Ｍ１およびＢＭ２）をコードする。最も小さいセグメントは、２つの産物をコードし、ＮＳ１は、全長ＲＮＡから翻訳され、一方、ＮＳ２は、スプライシングされたｍＲＮＡ変異体から翻訳される。
【００６３】
Ａ型インフルエンザとＢ型インフルエンザは、通常、ヒト集団におけるインフルエンザ発生と関連する。しかしながら、Ａ型インフルエンザは、他の種（例えば、トリ、ブタ、および他の動物）にも感染する。Ａ型ウイルスは、そのヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼの表面糖タンパク質抗原における違いに基づいてサブタイプに分類される。Ａ型ウイルスのヘマグルチニンには１６の既知のサブタイプがあり、ノイラミニダーゼには、９つの既知のサブタイプがある。ヒトでは、現在、およそ４つの異なるヘマグルチニンサブタイプと２つの異なるノイラミニダーゼサブタイプ（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｎ１、およびＮ２）しか知られていない。特に、Ａ型インフルエンザの２つの主要なサブタイプ（すなわち、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）はヒトで活性がある。しかしながら、最近では、Ｈ１Ｎ２が懸念されている。Ｂ型インフルエンザウイルスは、そのヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼタンパク質に基づいてサブタイプに分類されない。
【００６４】
異なるインフルエンザ株を、例えば、インフルエンザが赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）（ＲＢＣまたは赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ））を凝集させる能力に基づいて分類することができる。特定のインフルエンザ株に特異的な抗体はウイルスに結合することができ、そのため、そのような凝集を防ぐことができる。そのような阻害に基づいて株の種類を決定するアッセイは、通常、ヘマグルチニン阻害アッセイ（ＨＩアッセイまたはＨＡＩアッセイ）として知られており、インフルエンザ株を特徴付けるための、当技術分野において標準的でかつ周知の方法である。当然、当業者であれば、それを用いてインフルエンザ株を特徴付ける他のアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、間接蛍光抗体アッセイ、免疫組織化学、ウェスタンブロットアッセイなど）に精通しているであろうし、ＨＩアッセイの本明細書における使用および考察は、必ずしも限定的なものであると解釈されるべきではない。
【００６５】
簡潔に述べると、典型的なＨＩアッセイでは、フェレットで生成されることが多い、タイピングまたは分類に使用される血清を、様々な希釈（例えば、２倍など）で赤血球サンプルに添加する。その後、赤血球が１つの塊になる（すなわち、凝集する）かまたは懸濁される（すなわち、凝集しない）かを光学的に測定する。細胞が塊にならないならば、そのインフルエンザに特異的な血清中の抗体による阻害のために、凝集が起こらなったのである。したがって、インフルエンザのタイプは、同じ株に含まれるものであると定義される。いくつかの例では、ある株は、他の株の「様」である（例えば、株ｘは、「ｙ様」株である、など）と記載される。例えば、２つのサンプルが、ＨＩアッセイで測定したときに互いに４倍の力価の範囲内である場合、それらは同じ株に属する（例えば、両方とも「ニューカレドニア」株に属するまたは両方とも「モスクワ様」株に属する、など）と記載することができる。言い換えれば、これらの株は、通常、それらの免疫原性または抗原性プロファイルに基づいて分類される。ＨＡＩ力価は、通常、血球凝集を完全に阻害する血清の最大希釈として定義される。例えば、Ｓｃｈｉｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｕｌｌ．Ｗｌｄ  Ｈｌｔｈ  Ｏｒｇ．，１９７３，４８：２６９−２７８などを参照されたい。この場合もやはり、当業者であれば、インフルエンザの株へのカテゴリー化および分類ならびにそれを行なう方法によく精通しているであろう。
【００６６】
上記のことから、本発明は、本明細書に列挙された特定の配列だけでなく、様々なベクター（例えば、プラスミドの再集合およびレスキューに使用されるベクター、下記参照）内の配列ならびに本明細書に列挙された配列と同じ株に含まれるヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼの配列も含むことが理解されるであろう。また、様々なベクター（例えば、通常、プラスミドの再集合およびレスキューに使用されるベクター（例えば、Ａ／アナーバー／６／６０もしくはＢ／アナーバー／１／６６、Ａ／プエルトリコ／８／３４、Ｂ／レニングラード／１４／１７／５５、Ｂ／１４／５／１、Ｂ／ＵＳＳＲ／６０／６９、Ｂ／レニングラード／１７９／８６、Ｂ／レニングラード／１４／５５、またはＢ／イングランド／２６０８／７６など））に含まれるのと同じ株も含まれる。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「同様の株」という用語は、第１のインフルエンザウイルスが第２のインフルエンザウイルスと同じ株または関連する株であることを示すものと理解されるべきである。典型的な実施形態では、そのような関連は、一般的に、ＨＡＩアッセイを使用することによって決定される。したがって、ＨＡＩアッセイで互いに４倍の力価の範囲に収まるインフルエンザウイルスは、「類似株」である。しかしながら、当業者であれば、類似株を決定するための他のアッセイなど（例えば、ＦＲＩＤ、中和アッセイなど）に精通しているであろう。本発明はまた、本明細書中の様々なプラスミド、ベクター、ウイルス、方法などにおいて、そのような類似株（すなわち、本明細書中の配列表に存在する株と類似した株）を含む。したがって、文脈上、そうでないと明確に示されない限り、特定の配列（例えば、配列表にある配列）またはその断片についての本明細書における記載は、それらの類似株由来の配列（すなわち、本明細書中のプラスミド、ベクター、ウイルスなどにこれらの配列を含むそれらの株の類似株）も含むと考えられるべきである。したがって、そのような類似株に含まれるＮＡポリペプチドおよびＨＡポリペプチドは、「類似株」間で比較した場合、「類似ポリペプチド」となることも理解されるであろう。
【００６８】
インフルエンザウイルスワクチン
本明細書中の配列、組成物および方法は、主にワクチン用のインフルエンザウイルスの生成に関係するが、それだけではない。歴史的に、インフルエンザウイルスワクチンは、主に、選択されたウイルス株または関連株の経験的な予測に基づくウイルス株を用いて孵化鶏卵で生成されている。最近では、承認された弱毒化温度感受性マスター株に関連して、選択されたヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼ抗原を組み込んだ再集合体ウイルスが生成されている。鶏卵での複数回の継代でウイルスを培養した後、インフルエンザウイルスを回収し、場合によって、例えば、ホルムアルデヒドおよび／またはβ−プロピオラクトンを用いて、不活化する（または代わりに弱毒化生ワクチンで使用する）。このように、（本発明に見られる）ＨＡおよびＮＡ配列が、インフルエンザワクチンを構築するのに極めて有用であることが理解されるであろう。
【００６９】
細胞培養で組換えワクチンおよび再集合体ワクチンを生成する試みは、ワクチン生成用に承認された株のうちのいくつかが、標準的な細胞培養条件の下で効率的に増殖できないことにより妨げられている。しかしながら、本願発明者らおよびその共同研究者らによる先の研究は、培養で組換えウイルスおよび再集合体ウイルスを生成するためのベクター系、および方法を提供し、したがって、１つまたは多数の選択された抗原性ウイルス株（例えば、Ａ株またはＢ株のいずれか）、様々なサブタイプまたは亜株など（例えば、本明細書中のＨＡおよびＮＡ配列を含むもの）に対応するワクチンを迅速に作製することが可能となった。全て「Ｍｕｌｔｉ−Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ．」というタイトルの米国特許出願第６０／４２０，７０８号（２００２年１０月２３日出願）、米国特許出願第１０／４２３，８２８号（２００３年４月２５日）、および米国特許出願第６０／５７４，１１７号（２００４年５月２４日）を参照されたい。通常、培養物を、制御された湿度およびＣＯ２の下、温度レギュレーター（例えば、温度が３５℃を超えないことを保証するサーモスタット）を用いて一定の温度にした、細胞培養インキュベーターなどのシステムで維持する。再集合体インフルエンザウイルスは、マスターインフルエンザウイルスのゲノムセグメントを、対象となる株（例えば、本明細書中のＨＡおよび／またはＮＡ抗原変異体）由来の相補的セグメントと組み合わせたものに対応するベクターのサブセットを導入することによって、容易に得ることができる。通常、マスター株は、ワクチン投与に関する望ましい特性に基づいて選択される。例えば、ワクチン生成のために（例えば、弱毒化生ワクチンの生成のために）、マスタードナーウイルス株を弱毒化表現型、低温適応型および／または温度感受性について選択し得る。本明細書中の別の場所、および例えば、米国特許出願第１０／４２３，８２８号などで説明されているように、本発明の様々な実施形態は、Ａ／アナーバー（ＡＡ）／６／６０またはＢ／アナーバー／１／６６またはＡ／プエルトリコ／８／３４、またはＢ／レニングラード／１４／１７／５５、Ｂ／１４／５／１、Ｂ／ＵＳＳＲ／６０／６９、Ｂ／レニングラード／１７９／８６、Ｂ／レニングラード／１４／５５、またはＢ／イングランド／２６０８／７６インフルエンザ株を、ＨＡおよび／またはＮＡ遺伝子（例えば、本明細書に列挙された配列など）を付加する「バックボーン」として利用して、望ましい再集合体ウイルスを生成させる。したがって、例えば、６：２再集合体では、２つの遺伝子（すなわち、ＮＡおよびＨＡ）は、免疫原性反応が望まれるインフルエンザ株に由来するが、他の６つの遺伝子は、アナーバー株または他のバックボーン株などに由来する。アナーバーウイルスは、低温適応型、弱毒化、温度感受性という特性があるので有用である。当然、本明細書中のＨＡおよびＮＡ配列は、いくつかの他のウイルス遺伝子またはウイルス型との再集合が可能であることが理解されるであろう（例えば、いくつかの異なる「バックボーン」（例えば、Ａ／プエルトリコ／８／３４など）は、再集���体に存在する他のインフルエンザ遺伝子（すなわち、非ＨＡ遺伝子および非ＮＡ遺伝子）を含有する。ヒトインフルエンザウイルスに対する弱毒化Ａ型生インフルエンザウイルスワクチンが最近米国で認可された。上記を参照されたい。そのようなワクチンは、Ａ／アナーバー（ＡＡ）／６／６０（Ｈ２Ｎ２）低温適応型（ｃａ）ウイルスの内部タンパク質遺伝子によって、ＡＡ  ｃａウイルスの低温適応型、弱毒化および温度感受性表現型が再集合体ウイルス（すなわち、非アナーバー株由来のヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ遺伝子を有するウイルス）に付与される再集合体Ｈ１Ｎ１およびＨ１Ｎ２ウイルスである。いくつかの実施形態では、再集合体は、７：１再集合体を含むこともできる。言い換えれば、ＨＡまたはＮＡのみがバックボーンまたはＭＤＶ株に由来しない。以前の研究は、場合によって、本発明の様々な実施形態の範囲内にある好適なバックボーンドナーウイルス株に関して報告されている。例えば、全て「Ｍｕｌｔｉ−Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ」というタイトルの米国特許出願第６０／４２０，７０８号（２００２年１０月２３日出願）、米国特許出願第１０／４２３，８２８号（２００３年４月２５日出願）、および米国特許出願第６０／５７４，１１７号（２００４年５月２５日出願）；Ｍａａｓｓａｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．，１９８２，１４６：７８０−７９０；Ｃｏｘ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９８８，１６７：５５４−５６７；Ｗａｒｅｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２００１，１９：３３２０−３３３０；Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．，１９９０，１６１（５）：８６９−７７などを参照されたい。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本発明中の配列は、場合により、（核酸配列またはアミノ酸配列の両方または一方において）除去された特定の領域を有することができる。例えば、多塩基性切断部位を有する分子については、場合により、そのような部位を除去することができる。本明細書中のいくつかの実施形態におけるそのような切断部位は、例えば、その配列が、（例えば、切断を不能にするまたはそこでの切断を低下させる、などのために）そのような配列が由来した野生型配列と比較して修飾または改変されている。そのような修飾／改変は、出発配列における切断部位の配列が様々であるため、異なる株または配列で異なっている可能性がある。例えば、４つの多塩基性残基（ＲＲＫＫ）は通常、（ｗｔと比較したとき）いくつかのＨＡ配列で除去されている。様々な実施形態では、そのような多塩基性切断部位をいくつかの方法で修飾することができる（その全てが本発明に含まれる）。例えば、多塩基性切断部位を一度に１アミノ酸除去することができる（例えば、１つのＲを除去する、２つのＲを除去する、ＲＲＫを除去する、またはＲＲＫＫを除去する）。さらに、切断部位のすぐ上流にあるアミノ酸残基もまた、除去または改変する（例えば、ＲからＴへ、など）ことができる。また、切断部位の直後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドも修飾することができる。当業者であれば、そのような特定の領域を除去する様々な方法に精通しているであろう。結果として得られる短縮された配列も本発明に含まれる。例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１７９：１１３２−８，１９９９を参照されたい。
【００７１】
任意で本発明の配列を包含するウイルスに対して適用される（通常、ワクチンとしてまたはワクチン生成のために使用される）「温度感受性」、「低温適応型」および「弱毒化」という用語は、当技術分野で周知である。例えば、「温度感受性」（「ｔｓ」）という用語は、例えば、Ａ型インフルエンザ株について、ウイルスが、３３℃と比べて３９℃で１００倍以上の力価の減少を示すこと、またはＢ型インフルエンザウイルス株について、ウイルスが、３３℃と比べて３７℃で１００倍以上の力価の減少を示すことを示す。「低温適応型」（ｃａ）という用語は、ウイルスが、３３℃でのその増殖の１００倍以内の増殖を２５℃で示すことを示し、一方、「弱毒化」（ａｔｔ）という用語は、ウイルスが、フェレットの上気道では複製するが、その肺組織では検出されず、また、動物でインフルエンザ様の病気を引き起こさないことを示す。中間の表現型を有するウイルス、すなわち、３９℃（Ａ株ウイルスの場合）もしくは３７℃（Ｂ株ウイルスの場合）で１００倍未満の力価減少を示すか、または３３℃でのその増殖よりも１００倍大きい（例えば、２００倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍未満の）２５℃での増殖を示し、かつ／またはフェレットの上気道での増殖と比べて肺での増殖の減少（すなわち、部分的弱毒化）および／もしくは動物でのインフルエンザ様疾病の低下を示すウイルスもまた、有用なウイルスであり、かつ本明細書中のＨＡおよびＮＡ配列とともに使用することができる。
【００７２】
したがって、本発明は、培養細胞中でのインビトロのワクチン生成と比べて望ましい特性（例えば、弱毒化された病原性または表現型、低温適応型、温度感受性など）を有する、例えば、適切な培養条件下での、ウイルス株（Ａ株とＢ株の両方のインフルエンザウイルス）の増殖を利用することができる。インフルエンザウイルスは、クローン化されたウイルスゲノムセグメントを組み込んだ複数のベクターを宿主細胞に導入し、細胞を３５℃を超えない温度で培養することによって生成することができる。インフルエンザウイルスゲノムを含むベクターをトランスフェクトした場合、ワクチンとして好適な組換えウイルスを標準的な精製手順によって回収することができる。本発明のベクター系および方法を用いて、ワクチン生成に関するその望ましい特性について選択された株の６つの内部遺伝子セグメントと、選択された、例えば、病原性の株由来の免疫原性ＨＡおよびＮＡセグメント（例えば、本明細書中の配列表にあるもの）とを組み込んだ再集合体ウイルスを、組織培養で迅速かつ効率的に生成することができる。したがって、本明細書に記載の系および方法は、弱毒化生ワクチン（例えば、鼻腔内投与に好適なワクチン）をはじめとするワクチンとして使用するのに好適なウイルスを含む組換えＡ型インフルエンザウイルスおよび再集合体Ａ型インフルエンザウイルスならびに組換えＢ型インフルエンザウイルスおよび再集合体Ｂ型インフルエンザウイルスの細胞培養物の迅速な生成に有用である。
【００７３】
そのような実施形態では、通常、単一のマスタードナーウイルス（ＭＤＶ）株が、ＡサブタイプおよびＢサブタイプの各々について選択される。弱毒化生ワクチンの場合、マスタードナーウイルス株は、通常、ワクチン生成に関するその望ましい特性、例えば、温度感受性、低温適応型および／または弱毒化について選択される。例えば、例示的なマスタードナー株としては、それぞれ、Ａ／アナーバー／６／６０およびＢ／アナーバー／１／６６のそのような温度感受性株、弱毒化株および低温適応型株、ならびに全体を通して言及した他の株が挙げられる。
【００７４】
例えば、選択されたマスタードナーＡ型ウイルス（ＭＤＶ−Ａ）、またはマスタードナーＢ型ウイルス（ＭＤＶ−Ｂ）は、ウイルスゲノムを構成する複数のクローニングされたウイルスｃＤＮＡから生成される。実施形態は、組換えウイルスが８つのクローニングされたウイルスｃＤＮＡから生成されたものである。ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、ＨＡ、ＮＡ、ＭおよびＮＳの選択されたＭＤＶ−Ａ配列またはＭＤＶ−Ｂ配列のいずれかに相当する８つのウイルスｃＤＮＡは、ウイルスゲノムＲＮＡを一方の鎖に由来するＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ）プロモーターから転写することができ、かつウイルスｍＲＮＡをもう一方のＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）プロモーターから合成することができるように、任意でプラスミド（例えば、ｐＡＤ３０００）などの二方向性発現ベクターにクローニングされる。任意で、（例えば、多重塩基性切断部位（別名、多塩基性切断部位）を除去するために）ＨＡセグメントを含む任意の遺伝子セグメントを修飾することができる。
【００７５】
次に、８つのウイルスｃＤＮＡを担持するプラスミドを適切な宿主細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、共培養されたＭＤＣＫ／２９３ＴまたはＭＤＣＫ／ＣＯＳ７細胞）にトランスフェクトした後に、感染性の組換えＭＤＶ−ＡまたはＭＤＶ−Ｂウイルスを回収することができる。本明細書に、ならびに例えば、全て「Ｍｕｌｔｉ−Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ」というタイトルの米国特許出願第６０／４２０，７０８号（２００２年１０月２３日出願）、米国特許出願第１０／４２３，８２８号（２００３年４月２５日出願）、および米国特許出願第６０／５７４，１１７号（２００４年５月２４日出願）；Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｅ．，２０００，ＰＮＡＳ，９７（１１）：６１０８−６１１３；Ｈｏｆｆｍａｎｎに対する米国公開特許出願第２００２０１６４７７０号；ならびにＰａｌｅｓｅらに対する米国特許第６，５４４，７８５号（２００３年４月８日発行）に記載されているプラスミドおよび方法を用いて、本発明は、例えば、選択されたウイルス（例えば、ＭＤＶ−Ａ、ＭＤＶ−Ｂ）の６つの内部遺伝子（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、ＭおよびＮＳ）を、異なる対応する型（ＡまたはＢ）のインフルエンザウイルスに由来するＨＡおよびＮＡ（例えば、本明細書中の配列表に示されているもの）と共トランスフェクトすることによって、６：２再集合体インフルエンザワクチンを作製するのに有用である。例えば、ＨＡセグメントは、ワクチン生成のために通常行なわれているように、病原性に関連するＨ１株、Ｈ３株またはＢ株から好都合に選択される。同様に、ＨＡセグメントを、病原性株（例えば、本明細書中の配列表に示されているもの）としての新たな関連性を有する株から選択することができる。ＭＤＶの７つのゲノムセグメントと、選択された株のＨＡまたはＮＡ遺伝子のいずれかとを組み込んだ再集合体（７：１再集合体）も生成することができる。全体を通して詳述しているように、場合によっては、本発明の分子を任意の望ましい組合せで組み合わせることができることが理解されるであろう。例えば、本明細書中のＨＡおよび／またはＮＡ配列を、例えば、再集合体バックボーン、例えば、６：２再集合体または７：１再集合体などの中のＡ／ＡＡ／６／６０、Ｂ／ＡＡ／１／６６、Ａ／プエルトリコ／８／３４（すなわち、ＰＲ８）など）に入れることができる。したがって、以下でより完全に説明するように、ドナーウイルス（この場合も、例えば、Ａ／ＡＡ／６／６０など）由来の６つの内部ゲノムセグメントと、第２の株（例えば、野生型株、ドナーウイルスではない）由来の２つのゲノムセグメントとが存在することになる。そのような２つのゲノムセグメントは、好ましくはＨＡおよびＮＡ遺伝子である。同様の状況は７：１再集合体についても生じるが、この集合体では、ドナーウイルス由来の７つのゲノムセグメントと異なるウイルス（通常、野生型またはそれに対する免疫応答が望ましいウイルス）由来の１つのゲノムセグメント（ＨＡまたはＮＡのいずれか）とが存在する。また、本明細書中の配列（例えば、図１の配列表にある配列など）を本明細書中の様々な実施形態においていくつかの手���で組み合わせることができることが理解されるであろう。したがって、本明細書中の配列はいずれも、７：１再集合体中に単独で存在する（すなわち、本発明の配列は、７つのドナーウイルスゲノムセグメントとともに存在する）ことができ、かつ／または６：２再集合体中に本発明の別の配列とともに存在することができる。そのような６：２再集合体において、本発明の配列はいずれも、任意で、本発明の任意の他の配列とともに存在することができる。しかしながら、典型的かつ好ましい実施形態は、同じもとの野生型株（または修飾された野生型株、例えば、修飾された多塩基性切断部位を有するもの）由来のＨＡおよびＮＡを含む。例えば、典型的な実施形態は、ドナーウイルス（例えば、Ａ／ＡＡ／６／６０）由来の６つの内部ゲノムセグメントと、本明細書に記載のＨＡおよびＮＡゲノムセグメントとを有する６：２再集合体を含むことができる。当然、この場合も、本発明は、ＨＡおよびＮＡゲノムセグメントが類似の株に由来する再集合体ウイルスをも含むことが理解されるであろう。上記の参照は、あらゆる目的のために、例えば、特に、プラスミド、ウイルス（インフルエンザウイルス）のプラスミドレスキュー、ウイルスレスキュー／生成のための多重プラスミド系などに関するその教示のために、その全体が本明細書に具体的に組み込まれる。
【００７６】
また一方、本発明のＨＡおよびＮＡ配列は、場合により、そのようなプラスミド再集合ワクチンで（ならびに／または他のｔｓ、ｃｓ、ｃａ、および／もしくはａｔｔウイルスおよびワクチンで）利用される。しかしながら、本発明のＨＡおよびＮＡ配列などは、特定のワクチン組成物または生成方法に限定されるものではなく、したがって、株特異的なＨＡおよびＮＡ抗原（例えば、本発明の配列）を利用する実質的に全てのワクチンタイプまたはワクチン生成方法において利用可能であることに留意すべきである。
【００７７】
ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）
これまでに述べたように、インフルエンザワクチンの非常に多くの例および型が存在する。例示的なインフルエンザワクチンは、ＦｌｕＭｉｓｔ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｔ．Ｖｉｅｗ，ＣＡ）であり、これは、インフルエンザ疾患から子供および大人を守る弱毒化生ワクチンである（Ｂｅｌｓｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｌｉｖｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ，ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄ，ｔｒｉｖａｌｅｎｔ，ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３８：１４０５−１２；Ｎｉｃｈｏｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｌｉｖｅ，ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ，ｗｏｒｋｉｎｇ  ａｄｕｌｔｓ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ  ＪＡＭＡ  ２８２：１３７−４４）。典型的でかつ好ましい実施形態では、本発明の方法および組成物は、好ましくは、ＦｌｕＭｉｓｔワクチンの生成に適合／使用される。しかしながら、本明細書中の配列、方法、組成物などは、同様のまたは異なるウイルスワクチンの生成にも適合可能であることが、当業者に理解されるであろう。
【００７８】
ＦｌｕＭｉｓｔワクチン株は、例えば、野生型株に由来するＨＡおよびＮＡ遺伝子セグメントを含み、この野生型株（または、場合によって、関連株）に由来するＨＡおよびＮＡ遺伝子セグメントに対して、一般的なマスタードナーウイルス（ＭＤＶ）に由来する６つの遺伝子セグメント（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、ＭおよびＮＳ）とともに、ワクチンが対処されている。したがって、本明細書中のＨＡ配列は、場合によって、様々なＦｌｕＭｉｓｔ製剤の一部である。ＦｌｕＭｉｓｔのＡ型インフルエンザ株用のＭＤＶ（ＭＤＶ−Ａ）は、連続してより低い温度でニワトリ腎臓組織の初代培養物にて野生型Ａ／アナーバー／６／６０（Ａ／ＡＡ／６／６０）株を連続継代することにより作出された（Ｍａａｓｓａｂ（１９６７）  Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ａｔ  ２５  ｄｅｇｒｅｅｓ  Ｃ  Ｎａｔｕｒｅ  ２１３：６１２−４）。ＭＤＶ−Ａは、２５℃で効率的に複製する（ｃａ、低温適応型）が、その増殖は、３８℃および３９℃で制限される（ｔｓ、温度感受性）。さらに、このウイルスは、感染したフェレットの肺では複製しない（ａｔｔ、弱毒化）。ｔｓ表現型は、気道の最も冷えた領域を除く全ての領域でその複製を制限することによって、ヒトでのワクチンの弱毒化に寄与すると考えられている。この特性の安定性は、動物モデルおよび臨床研究で実証されている。化学的突然変異導入によって作出されたインフルエンザ株のｔｓ表現型とは対照的に、ＭＤＶ−Ａのｔｓ特性は、感染したハムスターで継代した後、または子供から排出された分離株で戻らない（最近の総説については、Ｍｕｒｐｈｙ  ＆  Ｃｏｅｌｉｎｇｈ（２００２）  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｌｉｖｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：２９５−３２３）を参照されたい）。
【００７９】
１２種の別個の６：２再集合体株を伴う２０，０００人を超える成人および子供における臨床研究により、これらのワクチンが、弱毒化されており、安全で、かつ有効であることが示された（Ｂｅｌｓｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｌｉｖｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ，ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄ，ｔｒｉｖａｌｅｎｔ，ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３８：１４０５−１２；Ｂｏｙｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ａｎｄ  ｕｎａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌｌｙ  ｔｏ  ｈｅａｌｔｈｙ  ａｄｕｌｔｓ  Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：２１７−２６；Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｃｏｌｄ  ａｄａｐｔｅｄ  ａｎｄ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｄｉｓｅａｓｅ  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １６９：６８−７６；Ｎｉｃｈｏｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｌｉｖｅ，ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ，ｗｏｒｋｉｎｇ  ａｄｕｌｔｓ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ  ＪＡＭＡ  ２８２：１３７−４４）。ＭＤＶ−Ａの６つの内部遺伝子と、野生型ウイルスの２つのＨＡおよびＮＡ遺伝子セグメントとを担持する再集合体（すなわち、６：２再集合体）は、一貫してｃａ、ｔｓおよびａｔｔ表現型を保持する（Ｍａａｓｓａｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｌｄ−ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｆｅｒｒｅｔｓ  Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１４６：７８０−９００）。
【００８０】
Ｂ型インフルエンザ株を用いたそのような再集合体ウイルスの生成はより困難であるが、最近の研究（例えば、例えば、全て「Ｍｕｌｔｉ−Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ」というタイトルの米国特許出願第６０／４２０，７０８号（２００２年１０月２３日出願）、米国特許出願第１０／４２３，８２８号（２００３年４月２５日出願）、および米国特許出願第６０／５７４，１１７号（２００４年５月２４日出願））により、クローニングされたｃＤＮＡに完全に由来するＢ型インフルエンザウイルスを作製するための８つのプラスミド系が示された。ワクチン製剤（例えば、鼻腔内投与に有用な生ウイルスワクチン製剤）に好適な弱毒化Ａ型およびＢ型インフルエンザ生ウイルスの生成方法も示された。
【００８１】
これまでに記載したシステムおよび方法は、弱毒化生ワクチン（例えば、鼻腔内投与に好適なワクチン）を含むワクチンとしての使用に好適なウイルスをはじめとする、組換えおよび再集合体のＡ型およびＢ型インフルエンザの細胞培養物における迅速な生成に有用である。ワクチン用のウイルスを生成するために、本発明の配列、方法などを、場合によって、例えば、ワクチン生成用の再集合体インフルエンザウイルスを伴うこれまでの研究とともに、またはそのような研究と組み合わせて使用する。
【００８２】
ワクチンを予防投与するための方法および組成物
上記のように、ＦｌｕＭｉｓｔ（商標）ワクチンの生成で使用する代わりに、またはそれに加えて、本発明を他のワクチン製剤で使用することができる。一般に、本発明の組換えウイルスおよび再集合体ウイルスを、免疫学的に有効な量でかつ適切な担体または賦形剤中で予防的に投与して、ＨＡおよび／またはＮＡ配列によって決定されるようなインフルエンザウイルスの１つまたは複数の株に特異的な免疫応答を刺激することができる。通常、担体または賦形剤は、薬学的に許容される担体または賦形剤、例えば、滅菌水、生理食塩水溶液、緩衝生理食塩水溶液、ブドウ糖水溶液、グリセロール水溶液、エタノール、非感染鶏卵由来の尿膜腔液（すなわち、正常尿膜腔液もしくはＮＡＦ）、またはそれらの組合せである。滅菌性、ｐＨ、等張性、および安定性を保証するそのような溶液の調製は、当技術分野で確立されたプロトコルに従って達成される。一般に、担体または賦形剤は、アレルギーおよび他の望ましくない効果を最小限にするように、かつ特定の投与経路（例えば、皮下、筋肉内、鼻腔内など）に適するように選択される。
【００８３】
本発明の関連態様は、個体の免疫系を刺激して、インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を生じさせるための方法を提供する。この方法では、免疫学的有効量の組換えインフルエンザウイルス（例えば、本発明のＨＡおよび／もしくはＮＡ分子）、免疫学的有効量の本発明のポリペプチド、ならびに／または免疫学的有効量の本発明の核酸を、生理学的に許容される担体中で個体に投与する。
【００８４】
一般に、本発明のインフルエンザウイルスを、インフルエンザウイルスの１つまたは複数の株に（すなわち、本発明のＨＡおよび／またはＮＡ株に対して）特異的な免疫応答を刺激するのに十分な量で投与する。好ましくは、インフルエンザウイルスの投与によって、そのような株に対する防御免疫応答を誘発する。１以上のインフルエンザ株に対する防御免疫応答を誘発するための投与量および方法は当業者に公知である。例えば、米国特許第５，９２２，３２６号；  Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３７：３９７−４００（１９８２）；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ５２：５６−６３（１９７３）；およびＷｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．８８：９３１−９３６（１９７６）を参照されたい。例えば、インフルエンザウイルスを、１回の投与当たり、約１〜１０００  ＨＩＤ５０（ヒト感染用量）、すなわち、約１０５〜１０８ｐｆｕ（プラーク形成単位）の範囲で投与する。通常、この用量を、例えば、年齢、身体の状態、体重、性別、食事、投与時間、および他の臨床的要因に基づいて、この範囲内で調整する。予防的ワクチン製剤を、例えば、針とシリンジ、または無針注射装置を用いる皮下または筋肉内注射により全身投与する。あるいは、ワクチン製剤を、液滴、大きな粒子状エアロゾル（約１０ミクロンよりも大きい）、または上気道への噴霧のいずれかにより鼻腔内投与する。上記の送達経路はいずれも、防御的な全身性の免疫応答を生じさせるが、鼻腔内投与は、インフルエンザウイルスの侵入部位で粘膜免疫系を誘発するという追加の利点を与える。鼻腔内投与については、多くの場合、弱毒化生ウイルスワクチンが好ましい（例えば、弱毒化、低温適応型および／または温度感受性の組換えインフルエンザウイルスまたは再集合体インフルエンザウイルス）。上記を参照されたい。単回用量を用いて防御免疫応答を刺激することが好ましいが、さらなる投与量を、同じまたは異なる経路で投与して、所望の予防的効果を達成することができる。
【００８５】
通常、ワクチンで使用されるような本発明の弱毒化組換えインフルエンザは、感染の症状、または少なくとも重篤な感染の症状が、その弱毒化インフルエンザウイルスで免疫化された（またはさもなければそれに感染した）大半の個体で現われない程度に十分に弱毒化されている。いくつかの例では、弱毒化インフルエンザウイルスは、それでもなお、軽度の疾患（例えば、軽度の上部呼吸器疾患）の症状を生じさせ、かつ／またはワクチン接種をしていない個体に拡散することが可能である。しかしながら、その病原性は、重篤な下気道感染がワクチン接種した宿主または偶然の宿主で生じない程度に十分に無効になっている。
【００８６】
あるいは、免疫応答を、本明細書中の配列を含むインフルエンザウイルスを用いて、樹状細胞をエクスビボまたはインビボでターゲッティングすることによって刺激することができる。例えば、増殖している樹状細胞を、十分な量で、かつこの樹状細胞がインフルエンザ抗原を捕捉することができるほど十分な時間、ウイルスに曝露させる。次に、これらの細胞を、標準的な静脈内移植法により、ワクチン接種される対象に移す。
【００８７】
単回用量を用いて防御免疫応答を刺激することが好ましいが、さらなる投与量を、同じまたは異なる経路で投与して、所望の予防的効果を達成することができる。新生児および幼児では、例えば、十分なレベルの免疫を誘発するために複数回投与が必要になる場合がある。投与は、野生型インフルエンザ感染に対して十分なレベルの防御を維持する必要に応じて、幼児期を通して間をおいて継続することができる。同様に、成人（特に、繰り返しまたは重篤なインフルエンザ感染を受けやすい人（例えば、医療従事者、介護士、幼い子供、高齢者および心肺機能不全の人の家族））は、防御免疫応答を確立および／または維持するために複数回の免疫化を必要とする場合がある。誘導された免疫のレベルは、例えば、分泌抗体および血清抗体を中和する量を測定することによってモニタリングすることができ、かつ所望のレベルの防御を誘発および維持する必要に応じて、投与量を調整するかまたはワクチン接種を繰り返すことができる
【００８８】
場合によって、インフルエンザウイルスを予防投与するための製剤はまた、インフルエンザ抗原に対する免疫応答を増強するための１以上のアジュバントを含む。好適なアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性剤（例えば、リゾレシチン）、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油または炭化水素エマルジョン、カルメットゲラン桿菌（ＢＣＧ）、コリネバクテリウム・パルウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、ならびに合成アジュバントのＱＳ−２１およびＭＦ５９が挙げられる。
【００８９】
望ましい場合、インフルエンザウイルスの予防ワクチン投与を、１以上種の免疫刺激分子の投与とともに行うことができる。免疫刺激分子としては、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３など）；増殖因子（例えば、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）コロニー刺激因子（ＣＳＦ））などの、免疫刺激活性、免疫増強活性、および炎症促進活性を有する様々なサイトカイン、リンホカインおよびケモカインならびに他の免疫刺激分子（例えば、マクロファージ炎症性因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１、Ｂ７．２など）が挙げられる。免疫刺激分子を、インフルエンザウイルスと同じ製剤中で投与することができるか、または別々に投与することができる。タンパク質（例えば、本発明のＨＡおよび／もしくはＮＡポリペプチドまたはタンパク質をコードする発現ベクターのいずれかを投与して、免疫刺激効果をもたらすことができる。
【００９０】
上記の方法は、治療的または予防的に有効なＨＡおよび／もしくはＮＡポリペプチド（もしくはペプチド）またはＨＡおよび／もしくはＮＡ  ＲＮＡ（例えば、アンチセンスＲＮＡもしくはリボザイム）をコードする異種ポリヌクレオチドを含む本発明のベクターを、標的細胞の集団にインビトロ、エクスビボまたはインビボで導入することによって、疾患または障害（通常、インフルエンザ）を治療的および／または予防的に処置するのに有用である。通常、対象となるポリペプチド（もしくはペプチド）またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、例えば、本明細書に記載されたような適切な調節配列に機能的に連結されている。場合によって、２以上の異種コード配列が、単一のベクターまたはウイルスに組み込まれている。例えば、治療活性または予防活性のあるＨＡおよび／もしくはＮＡポリペプチドまたはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの他に、ベクターは、さらなる治療的または予防ポリペプチド（例えば、抗原、共刺激分子、サイトカイン、抗体など）、および／またはマーカーなども含むことができる。
【００９１】
特定のサブグループの特定の株の弱毒化インフルエンザウイルスを個体にワクチン接種することにより、異なる株および／またはサブグループのインフルエンザウイルスに対する交差防御を誘導することができるが、望ましい場合、少なくとも２種、少なくとも３種、または少なくとも４種のインフルエンザウイルス株または亜株（例えば、そのうちの少なくとも２種は、異なるサブグループに相当し得る）由来の弱毒化インフルエンザウイルスを個体にワクチン接種することにより、交差防御を増強することができる。例えば、弱毒化インフルエンザウイルスの少なくとも４種の株または亜株を個体にワクチン接種することは、Ａ型インフルエンザウイルスの少なくとも２種の株または亜株と、Ｂ型インフルエンザウイルスの少なくとも２種の株または亜株を個体にワクチン接種することを含み得る。弱毒化インフルエンザウイルスの少なくとも４種の株または亜株を個体にワクチン接種することは、Ａ型インフルエンザウイルスの少なくとも３種の株または亜株と、Ｂ型インフルエンザウイルスの少なくとも３種の株または亜株を個体にワクチン接種することを含み得る。少なくとも４種のインフルエンザウイルス株または亜株を個体にワクチン接種することは、少なくとも４種の弱毒化インフルエンザウイルス株または亜株の全てを含む１回の四価ワクチンの投与を必要とし得る。あるいは、ワクチン接種は、複数回のワクチン（その各々は、弱毒化インフルエンザウイルス株または亜株の１種、２種、または３種を含む）の投与を必要とし得る。さらに、ワクチンの組み合わせ物は、場合により、流行性ワクチンと非流行性株の混合物を含む。ワクチン混合物（または複数回のワクチン接種）は、ヒト株および／または非ヒトインフルエンザ株（例えば、トリおよびヒトなど）に由来する成分を含むことができる。同様に、本発明の弱毒化インフルエンザウイルスワクチンは、場合により、他の感染性因子に対する防御免疫応答を誘導するワクチンと組み合わせることができる。一実施形態では、本発明のワクチンは、３種の再集合体インフルエンザウイルスを含む三価ワクチンである。一実施形態では、本発明のワクチンは、２種の再集合体Ａ型インフルエンザウイルスと１種の再集合体Ｂ型インフルエンザウイルスとを含む三価ワクチンである。一実施形態では、本発明のワクチンは、１種のタイプＨ１の再集合体Ａ型インフルエンザウイルスと、１種のタイプＨ３の再集合体Ａ型インフルエンザウイルスと、１種の再集合体Ｂ型インフルエンザウイルスとを含む三価ワクチンである。別の実施形態では、本発明のワクチンは、４種の再集合体インフルエンザウイルスを含む四価ワクチンである。一実施形態では、本発明のワクチンは、２種の再集合体Ａ型インフルエンザウイルスと２種の再集合体Ｂ型インフルエンザウイルスとを含む四価ワクチンである。一実施形態では、本発明のワクチンは、１種のタイプＨ１の再集合体Ａ型インフルエンザウイルスと、１種のタイプＨ３の再集合体Ａ型インフルエンザウイルスと、ビクトリア系統の１種の再集合体Ｂ型インフルエンザウイルスと、山形系統の再集合体Ｂ型インフルエンザウイルスとを含む四価ワクチンである。
【００９２】
組換えウイルスの生成
マイナス鎖ＲＮＡウイルスを、組換えリバースジェネティックスの手法を用いて遺伝子操作し、回収することができる（Ｐａｌｅｓｅらに対する米国特許第５，１６６，０５７号）。そのような方法は、もともと、インフルエンザウイルスゲノムを操作するために適用され（Ｌｕｙｔｊｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｃｅｌｌ  ５９：１１０７−１１１３；Ｅｎａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１１５６３−１１５６７）、かつセグメント化されたおよびセグメント化されていない多種多様なマイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、狂犬病（Ｓｃｈｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：４１９５−４２０３）；ＶＳＶ（Ｌａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４４７７−４４８１）；麻疹ウイルス（Ｒａｄｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：５７７３−５７８４）；牛痘ウイルス（Ｂａｒｏｎ  ＆  Ｂａｒｒｅｔｔ（１９９７）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５−１２７１）；ヒトパラインフルエンザウイルス（Ｈｏｆｆｍａｎ  ＆  Ｂａｎｅｒｊｅｅ（１９９７）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３２７２−３２７７；Ｄｕｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３−３３２）；ＳＶ５（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３７：２４９−２６０）；イヌジステンパーウイルス（Ｇａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１０７３７−４４）；およびセンダイウイルス（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：５５３７−５５４１；Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９）に首尾よく適用されている。当業者であれば、本発明のＨＡおよびＮＡ配列を含むインフルエンザウイルスを生成するためのこれらのおよび同様の技術に精通しているであろう。１以上の本発明の核酸および／またはポリペプチドを含む組換えインフルエンザウイルスと同様に、そのような方法によって生成される組換えインフルエンザウイルスもまた本発明の特徴である。当然、当業者に理解されるように、一般のインフルエンザウイルスは（そして、本発明のインフルエンザウイルスも）、マイナス鎖ＲＮＡウイルスである。したがって、インフルエンザウイルスが、例えば、図１の配列などを含むものとして本発明に記載されるとき、それは、通常、その配列の対応するマイナス鎖ＲＮＡバージョンを意味すると理解されるべきである。図１のヌクレオチド配列は、（ヌクレオチド配列中の一部の非翻訳領域とともに）遺伝子のＤＮＡバージョン（例えば、コードするプラスセンスなど）を含む。当業者は、ＲＮＡ配列とＤＮＡ配列（例えば、ＵからＴへの変換など）、および相補的ヌクレオチド配列同士（ＲＮＡ、ＤＮＡを問わない）などを容易に変換することができる。したがって、例えば、当業者は、ヌクレオチド配列から、対応するアミノ酸配列または対応する相補的配列（ＤＮＡ、ＲＮＡを問わない）などに容易に変換することができる。また、明らかなことであるが、そのようなＨＡおよび／またはＮＡ配列��ＤＮＡベクター（例えば、プラスミドなど）中に記載されている場合、通常、その配列の対応するＤＮＡバージョンが理解されるべきである。この場合も、本発明の核酸は、本明細書中の配列表にある明示的な配列、およびそのような配列（ＲＮＡとＤＮＡの両方）の相補体、配列表にある配列の二本鎖形態、配列表にある配列の対応するＲＮＡ形態（配列表にある明示的な配列のＲＮＡ相補体としてまたは例えば、同じセンスだが、Ｔの代わりにＵを含むＲＮＡから構成される、配列表にある配列のＲＮＡバージョンとして、など）を含む。
【００９３】
細胞培養および発現宿主
本発明はまた、本発明のベクターが導入（形質導入、形質転換またはトランスフェクト）された宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの生成方法に関する。宿主細胞は、本発明のベクター（例えば、発現ベクター）を用いて遺伝子操作（すなわち、形質導入、形質転換またはトランスフェクト）されている。上記のように、ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であることができる。適切な発現宿主の例としては、細菌細胞（例えば、大腸菌、ストレプトミセス、およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞（例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、およびアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；または昆虫細胞（ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およびヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）が挙げられる。
【００９４】
最も一般的には、哺乳動物細胞を用いて、本発明のＨＡおよびＮＡ分子を培養する。（例えば、本明細書中のＨＡおよび／またはＮＡ配列を有する）インフルエンザウイルスを複製するのに好適な宿主細胞としては、例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ７細胞をはじめとする、２９３細胞およびＣＯＳ細胞などが挙げられる。一般的には、複製効率を改善するために、上記の細胞株のうちの２つ（例えば、ＭＤＣＫ細胞と２９３Ｔ細胞またはＣＯＳ細胞のいずれか）を含む共培養物を、例えば、１：１の割合で使用する。通常、細胞を、標準的な市販の培養培地（例えば、血清（例えば、１０％胎仔ウシ血清）を補充したダルベッコ改変イーグル培地）または無血清培地中、制御された湿度および中性に緩衝されたｐＨ（例えば、ｐＨ７．０〜７．２）を維持するのに好適なＣＯ２濃度の下で培養する。場合により、培地は、細菌の増殖を防ぐための抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンなど）、および／または追加の栄養素（例えば、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、有利な増殖特性を促進するためのさらなる添加物（例えば、トリプシン、β−メルカプトエタノールなど））を含む。
【００９５】
操作された宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択、または例えば、ウイルスの生成による挿入されたポリヌクレオチド配列の増幅に適するように改変された従来の栄養培地中で培養することができる。温度、ｐＨなどの培養条件は通常、発現用に選択される特定の宿主細胞で以前に使用された条件であり、当業者にとって、また例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋおよびその中の引用文献をはじめとする、本明細書に引用された参考文献中で明らかである。他の役立つ参考文献としては、例えば、Ｐａｕｌ（１９７５）  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，第５版，Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ；Ａｄａｍｓ（１９８０）  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ｗｏｒｋ  ａｎｄ  Ｂｕｒｄｏｎ（編）  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍが挙げられる。インビトロでのインフルエンザウイルスの生成において特に関心の高い組織培養方法に関するさらなる詳細としては、例えば、Ｃｏｈｅｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｆｆｅｒｍａｎ（編）Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＶａｃｃｉｎｅｓにおけるＭｅｒｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎが挙げられ、これは、あらゆる目的のために、その全体が本明細書に組み込まれる。さらに、本発明に適合されたそのような方法のバリエーションは、日常的な実験によって容易に決定され、かつ当業者によく知られている。
【００９６】
（例えば、本発明のＨＡおよび／またはＮＡ配列を有する）インフルエンザウイルスを生成するための細胞を、血清含有培地または無血清培地中で培養することができる。場合によって、例えば、精製ウイルスを調製するために、通常、無血清条件で宿主細胞を増殖させることが望ましい。細胞を小規模（例えば、２５ｍｌ未満の培地）の培養チューブもしくは培養フラスコで、または大きなフラスコで撹拌しながら、回転ボトル中で、またはフラスコ、ボトルもしくはリアクター培養中のマイクロキャリアビーズ（例えば、ＤＥＡＥ−デキストランマイクロキャリアビーズ（Ｄｏｒｍａｃｅｌｌ，Ｐｆｅｉｆｅｒ  ＆  Ｌａｎｇｅｎなど）、スーパービーズ（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、スチレンコポリマー−トリメチルアミンビーズ（例えば、Ｈｉｌｌｅｘ，ＳｏｌｏＨｉｌｌ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ））上で培養することができる。マイクロキャリアビーズは、（直径１００〜２００ミクロンの範囲の）小さな球であり、付着細胞増殖用に細胞培養物の容量当たりの大きな表面積を提供する。例えば、１リットルの培地は、２０００万個を上回るマイクロキャリアビーズを含み、８０００ｃｍ２以上の増殖表面を提供することができる。ウイルスの商業的生産のために（例えば、ワクチン生産のために）、細胞をバイオリアクターまたは発酵槽中で培養することが望ましいことが多い。バイオリアクターは、１リットル未満から１００リットルを超える容量まで利用可能である（例えば、Ｃｙｔｏ３バイオリアクター（Ｏｓｍｏｎｉｃｓ，Ｍｉｎｎｅｔｏｎｋａ，ＭＮ）；ＮＢＳバイオリアクター（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）；Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製の実験室または商業的規模のバイオリアクター（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））。
【００９７】
培養の容量とは無関係に、本発明の多くの望ましい態様において、培養物を適切な温度に維持し、温度依存性の多重プラスミド系（例えば、全て「Ｍｕｌｔｉ−Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ」というタイトルの米国特許出願第６０／４２０，７０８号（２００２年１０月２３日出願）、米国特許出願第１０／４２３，８２８号（２００３年４月２５日出願）および米国特許出願第６０／５７４，１１７号（２００４年５月２４日出願）を参照されたい）、濾過するためのウイルス溶液の加熱などを用いて、組換えインフルエンザウイルスおよび／または再集合体インフルエンザウイルスの効率的な回収を保証することが重要である。通常、レギュレーター（例えば、サーモスタット、または細胞培養系および／もしくは他の溶液の温度を感知し、維持するための他の装置）を用いて、温度が、適当な期間（例えば、ウイルス複製の間など）、正確なレベルであることを保証する。
【００９８】
本明細書中のいくつかの実施形態（例えば、再集合体ウイルスをベクター上のセグメントから生成しようとする場合）において、インフルエンザゲノムセグメントを含むベクターを、真核細胞に異種核酸を導入するための当技術分野で周知の方法（例えば、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、およびポリアミントランスフェクション試薬を用いたトランスフェクションを含む）に従って宿主細胞に導入（例えば、トランスフェクト）する。再集合体ウイルスなどを生成するために、例えば、ベクター（例えば、プラスミド）を、製造元の指示に従って、ポリアミントランスフェクション試薬であるＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ）を用いて、宿主細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、２９３Ｔ細胞またはＣＯＳ細胞もしくは２９３Ｔ細胞とＭＤＣＫ細胞の組合せ）にトランスフェクトすることができる。したがって、一実施形態では、約１μｇの各ベクターを、１６０μｌの培地（好ましくは、無血清培地）に希釈した約２μｌのＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１とともに総容量２００μｌで宿主細胞の集団に導入する。ＤＮＡとトランスフェクション試薬の混合物を、室温で４５分間インキュベートし、その後、８００μｌの培地を添加する。トランスフェクション混合物を、宿主細胞に添加し、細胞を、当業者に周知の他の方法によって記載した通りに培養する。したがって、細胞培養で組換えウイルスまたは再集合体ウイルスを生成するために、８つのゲノムセグメント（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡおよびＮＡ（例えば、本発明のもの））の各々を組み込んだベクターを、約２０μｌのＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１と混合し、宿主細胞にトランスフェクトする。場合によって、トランスフェクション前に、血清含有培地を無血清培地（例えば、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ）と交換し、４〜６時間インキュベートする。
【００９９】
あるいは、エレクトロポレーションを用いて、インフルエンザゲノムセグメントを組み込んだそのようなベクターを宿主細胞に導入することができる。例えば、Ａ型インフルエンザウイルスまたはＢ型インフルエンザウイルスを組み込んだプラスミドベクターを、以下の手順に従ってエレクトロポレーションを用いて、Ｖｅｒｏ細胞に好都合に導入する。簡潔に述べると、例えば、１０％の胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を補充した改変イーグル培地（ＭＥＭ）中で増殖した約５×１０６個のＶｅｒｏ細胞を、０．４ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭに再懸濁し、エレクトロポレーションキュベットに入れる。最大２５μｌの容量中の２０μｇのＤＮＡをキュベット中の細胞に添加し、次に、それをタッピングして穏やかに混合する。エレクトロポレーションを、製造元の指示に従って、３００ボルト、９５０マイクロファラッド、２８〜３３ｍｓｅｃの時定数で行なう（例えば、Ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ  Ｅｘｔｅｎｄｅｒ  Ｐｌｕｓが接続されたＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ）。細胞を穏やかにタッピングして再び混合し、エレクトロポレーションから約１〜２分後、１０％のＦＢＳを含む０．７ｍｌのＭＥＭをキュベットに直接添加する。次に、細胞を、２ｍｌのＭＥＭ、１０％のＦＢＳを含む標準的な６ウェル組織培養ディッシュの２つのウェルに移す。残存する細胞を回収するためにキュベットを洗浄し、この洗浄懸濁液を２つのウェルに分ける。最終容量は、約３．５ｍＬである。次に、細胞を、ウイルスの増殖を許容する条件下（例えば、低温適応型株の場合、約３３℃）でインキュベートする。
【０１００】
哺乳動物の宿主細胞において、いくつかの発現系（例えば、ウイルスに基づく系）を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、コード配列を場合によって、後期プロモーターと３つに分かれたリーダー配列とからなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に連結する。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域に挿入することにより、感染した宿主細胞で対象となるポリペプチドを発現することができる生存可能なウイルスが得られる（Ｌｏｇａｎ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ（１９８４）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１：３６５５−３６５９）。さらに、転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー）を用いて、哺乳動物の宿主細胞における発現を増加させることができる。
【０１０１】
宿主細胞株は、場合によって、挿入された配列の発現を調節する能力または発現されたタンパク質を所望の様式で処理する能力について選択される。そのようなタンパク質の修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が挙げられるが、これらに限定されない。（前駆形態を切断して成熟形態にする）タンパク質の翻訳後プロセシングは、正確な挿入、折畳みおよび／または機能にとって重要である場合がある。さらに、宿主細胞内の適切な位置（例えば、細胞表面上）もまた重要である。異なる宿主細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、２９３、２９３Ｔ、ＣＯＳ７など）は、そのような翻訳後活性に関する特異的な細胞機構や特徴的なメカニズムを有し、その時導入されている外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実に行なうように選択することができる。
【０１０２】
本発明のポリヌクレオチドにコードされているか、または本発明のポリヌクレオチドにコードされているサブ配列を有する組換えタンパク質を長期間、高収率で生成するために、安定した発現系を場合により使用する。例えば、本発明のポリペプチドを安定に発現する細胞株を、ウイルスの複製または内在性発現エレメントの起点と選択可能なマーカー遺伝子とを含む発現ベクターを用いてトランスフェクトする。例えば、ベクターを導入した後、細胞を富栄養培地中で１〜２日間増殖させ、その後、選択培地に移し換える。選択可能なマーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、それが存在することによって、導入した配列をうまく発現している細胞の増殖および回収が可能になる。したがって、例えば、単一の細胞型に由来する安定に形質転換した細胞の耐性集団を、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。
【０１０３】
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞を、場合により、コードされたタンパク質の発現および細胞培養物からの回収に好適な条件下で培養する。該タンパク質を発現する細胞を、選別、単離および／または精製することができる。組換え細胞によって生成されたタンパク質またはその断片は、分泌されるか、膜に結合するか、または細胞内に保持されることができるが、それは、配列（例えば、膜保持シグナルなどをコードする融合タンパク質）および／または使用されるベクターによって決まる。
【０１０４】
本発明の核酸に対応する発現産物は、動物以外の細胞（例えば、植物、酵母、真菌、細菌など）で生成することもできる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ（全て下記）の他に、Ｐａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびＡｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ（編）  Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬに細胞培養に関する詳細を見出すことができる。
【０１０５】
細菌系において、いくつかの発現ベクターを、発現される産物に意図される用途に応じて選択することができる。例えば、大量のポリペプチドまたはその断片が抗体の生成に必要とされる場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を導くベクターを好都合に利用する。そのようなベクターとしては、多機能性の大腸菌クローニングおよび発現ベクター（例えば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））（このベクター中では、対象となるコード配列（例えば、本明細書に見出されるものを含む配列など）を、アミノ末端翻訳開始メチオニン、それに続く７残基のβ−ガラクトシダーゼ（触媒として活性のあるβガラクトシダーゼ融合タンパク質を生じる）の配列とともにインフレームでベクターに連結することができる）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４：５５０３−５５０９）；  ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）などが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、構成的または誘導性プロモーター（例えば、α因子、アルコール酸化酵素およびＰＧＨ）を含むいくつかのベクターを、所望の発現産物を生成するために使用することができる。概説については、Ａｕｓｕｂｅｌ（下記）、およびＧｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３：５１６−５４４を参照されたい。
【０１０６】
対象となる生体分子のクローニング、突然変異導入および発現
本発明に適用できる分子生物学的技術（例えば、クローニング、突然変異、細胞培養など）が記載されている一般的な教科書としては、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１５２巻  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），第１〜３巻，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（２００２年まで増補）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」））が挙げられる。これらの教科書には、突然変異導入、ベクターの使用、プロモーターおよび他の多くの関連トピック（例えば、ＨＡおよび／またはＮＡ分子の生成など）が記載されている。
【０１０７】
場合によって、例えば、新規もしくは新たに単離されたＨＡおよび／もしくはＮＡ分子を生成および／もしくは単離し、かつ／または本発明のポリペプチド（例えば、ＨＡおよびＮＡ分子）をさらに修飾する／突然変異させるために、様々なタイプの突然変異導入を本発明で使用する。突然変異導入としては、部位特異的、ランダム点突然変異導入、相同組換え（ＤＮＡシャッフリング）、ウラシル含有鋳型を用いた突然変異導入、オリゴヌクレオチド特異的突然変異導入、ホスホロチオアート修飾型ＤＮＡ突然変異導入、ギャップのある二本鎖ＤＮＡを用いた突然変異導入などが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる好適な方法としては、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を用いた突然変異導入、制限選択および制限精製、欠失突然変異導入、全遺伝子合成による突然変異導入、二本鎖切断修復などが挙げられる。例えば、キメラ構築物を伴う突然変異導入も本発明に含まれる。一実施形態では、突然変異導入を、天然の分子または改変したもしくは突然変異させた天然の分子に関する既知の情報（例えば、配列、配列比較、物理的特性、結晶構造など）によって導くことができる。
【０１０８】
上記の教科書および本明細書に見られる実施例には、これらの方法ならびに以下の出版物（およびその中で引用されている参考文献）が記載されている：Ｓｉｅｂｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：４５６−４６０（２００１）；Ｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２５４（２）：１５７−１７８（１９９７）；Ｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５７：３６９−３７４（１９９６）；Ｉ．Ａ．Ｌｏｒｉｍｅｒ，Ｉ．Ｐａｓｔａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３，３０６７−８（１９９５）；Ｗ．Ｐ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０，３８９−９１（１９９４）；Ａｒｎｏｌｄ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４５０−４５５（１９９３）；Ｂａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｎｔ  Ｔｒｐ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｗ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：２４０−２４５（１９８８）；Ｆｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １６：６９８７−６９９９（１９８８）；Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １６：７２０７（１９８８）；Ｓａｋａｍａｒ  ａｎｄ  Ｋｈｏｒａｎａ，Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｒｏｄ  ｏｕｔｅｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ），Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １４：６３６１−６３７２（１９８８）；Ｓａｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙ−Ｔ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １６：７９１−８０２（１９８８）；Ｓａｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅ��ｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ，（１９８８）  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １６：８０３−８１４；Ｃａｒｔｅｒ，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５４：３８２−４０３（１９８７）；Ｋｒａｍｅｒ  ＆  Ｆｒｉｔｚ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｖｉａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５４：３５０−３６７（１９８７）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．  ａｎｄ  Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ））（１９８７）；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５４，３６７−３８２（１９８７）；Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｍｐｌａｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２３７：１−７（１９８６）；Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｌａｒｇｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １４：５１１５（１９８６）；Ｍａｎｄｅｃｋｉ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８３：７１７７−７１８１（１９８６）；Ｎａｋａｍａｙｅ  ＆  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｎｃｉ  Ｉ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｇｒｏｕｐｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １４：９６７９−９６９８（１９８６）；Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ，Ｐｈｉｌ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ａ  ３１７：４１５−４２３（１９８６）；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  ＆  Ｓｈｏｒｔｌｅ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１１９３−１２０１（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １３：４４３１−４４４３（１９８５）；Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  ‘ｓｈｏｔ−ｇｕｎ’  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １３：３３０５−３３１６（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２（１９８５）；Ｓｍｉｔｈ，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １９：４２３−４６２（１９８５）；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｐｒｅｐａｒｅ  ｎｉｃｋｅｄ  ＤＮＡ，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １３：８７４９−８７６４（１９８５）；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １３：８７６５−８７８７（１９８５）；Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｉｔｅｓ，Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３（１９８５）；Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １２：９４４１−９４５６（１９８４）；Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｉｎｔ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｐａｉｒ，Ｃｅｌｌ  ３８：８７９−８８７（１９８４）；Ｎａｍｂｉａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９−１３０１（１９８４）；Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｃｌｏｎｅｄ  ｉｎｔｏ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １００：４６８−５００（１９８３）；ａｎｄ  Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎｙ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １０：６４８７−６５００（１９８２）。上記の方法の多くについてのさらなる詳細を、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  Ｖｏｌｕｍｅ  １５４に見出すことができ、これには、様々な突然変異導入、遺伝子の単離、発現および他の方法についてのトラブルシューティングの問題に関する役に立つ操作が記載されている。
【０１０９】
例えば、本発明の突然変異導入（例えば、本発明のＨＡおよび／またはＮＡ分子のライブラリーを突然変異させること、または改変すること）において使用されるオリゴヌクレオチドは、通常、例えば、Ｎｅｅｄｈａｍ-ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１２：６１５９−６１６８（１９８４）に記載されているような自動合成装置を用いて、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ  ２２（２０）：１８５９-１８６２，（１９８１）によって記載された固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従って化学的に合成される。
【０１１０】
さらに、本質的に全ての核酸は、種々の商業的供給源のいずれかから注文される特注品または標準品であることができる。同様に、ペプチドおよび抗体は、種々の供給源のいずれかから注文される特注品であることができる。
【０１１１】
本発明はまた、本発明のＨＡおよび／もしくはＮＡ分子もしくは他のポリペプチドおよび／もしくは核酸を含む宿主細胞および生物またはそのようなＨＡおよび／もしくはＮＡもしくは様々なベクター内の他の配列（例えば、６：２再集合体インフルエンザウイルス、プラスミドレスキューシステムにおけるプラスミドなど）に関する。宿主細胞は、本発明のベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る）を用いて、遺伝子操作（例えば、形質転換、形質導入またはトランスフェクト）される。ベクターは、例えば、プラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド、またはコンジュゲートされたポリヌクレオチドの形態であることができる。ベクターは、エレクトロポレーション（Ｆｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２，５８２４（１９８５）を参照されたい）、ウイルスベクターによる感染、小さなビーズもしくは粒子のマトリックスの内部または表面のいずれかに核酸を有する小さな粒子による高速弾道貫通（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２７，７０−７３（１９８７））をはじめとする標準的な方法によって、細胞および／または微生物に導入される。Ｂｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌには、種々の適切な形質転換方法が提供されている。上記を参照されたい。
【０１１２】
標的核酸を細菌細胞に導入するいくつかの周知の方法が利用可能であり、これらの方法のうちのいずれかを本発明で使用することができる。これらの方法としては、レシピエント細胞とＤＮＡを含む細菌プロトプラストとの融合、エレクトロポレーション、粒子衝突（ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、およびウイルスベクターによる感染などが挙げられる。細菌細胞を用いて、本発明のＤＮＡ構築物を含むプラスミドの数を増幅することができる。細菌を対数期まで増殖させ、細菌内のプラスミドを当技術分野で公知の種々の方法によって単離することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照されたい）。さらに、細菌からプラスミドを精製するための多くのキットが市販されている（例えば、ＥａｓｙＰｒｅｐ（商標）、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（商標）（両方ともＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）；ＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；およびＱＩＡｐｒｅｐ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を参照されたい）。次に、単離および精製されたプラスミドをさらに操作して、細胞にトランスフェクトするために用いられるかまたは生物に感染させるために関連ベクターに組み入れられる他のプラスミドを生成する。通常のベクターは、転写および翻訳ターミネーター、転写および翻訳開始配列、ならびに特定の標的核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは、場合により、少なくとも１つの独立したターミネーター配列、真核生物もしくは原核生物またはその両方においてカセットの複製を可能にする配列（例えば、シャトルベクター）ならびに原核生物および真核生物の両方の系のための選択マーカーを含む一般的な発現カセットを含む。ベクターは、原核生物、真核生物、または好ましくは両方における複製および組込みに好適である。Ｇｉｌｉｍａｎ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ６４３５：１０（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｂｅｒｇｅｒ（全て上記）を参照されたい。クローニングに有用な細菌およびバクテリオファージのカタログは、例えば、ＡＴＣＣによって提供されている（例えば、ＡＴＣＣによって発行されているＴｈｅ  ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９２）  Ｇｈｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．（編））。シークエンシング、クローニングおよび分子生物学の他の態様のための、理論的考察に基づく、さらなる基本的な方法は、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  第２版  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，ＮＹに見出される。上記を参照されたい。
【０１１３】
ポリペプチド生成および回収
いくつかの実施形態では、好適な宿主細胞株（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）または株（ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎ）に形質導入し、適切な細胞密度まで宿主細胞を増殖させた後、選択されたプロモーターを、適切な手段（例えば、温度変化または化学物質による誘導）によって誘導し、細胞をさらなる期間培養する。いくつかの実施形態では、次に、分泌型ポリペプチド産物（例えば、分泌型融合タンパク質形態のＨＡおよび／またはＮＡポリペプチド）を培養培地から回収する。他の実施形態では、１以上の本発明のＨＡおよび／またはＮＡポリペプチドを含むウイルス粒子を細胞から生成させる。あるいは、細胞を遠心分離によって回収し、物理的または化学的手段によって破壊し、得られた粗抽出物をさらなる精製のために保持することができる。タンパク質の発現に使用される真核細胞または微生物細胞を、凍結融解の繰返し、超音波処理、機械的破壊、もしくは細胞溶解剤の使用、または他の方法をはじめとする、当業者によく知られた任意の好都合な方法によって破壊することができる。さらに、本発明のＨＡおよび／またはＮＡポリペプチド産物を発現する細胞を、細胞からポリペプチドを分離することなく利用することができる。そのような状況では、本発明のポリペプチドは、場合によって、細胞表面に発現され、それゆえ、（例えば、ＨＡおよび／もしくはＮＡ分子、またはそれらの断片を有する（例えば、融合タンパク質などを含む）ことによって）細胞表面結合抗体で調べられる。そのような細胞もまた、本発明の特徴である。
【０１１４】
発現されたポリペプチドは、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー（例えば、当業者に公知のタグ化システムのいずれかを用いるもの）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーをはじめとする、当技術分野で周知のいくつかの方法のいずれかによって、組換え細胞の培養物から回収および精製することができる。望ましい場合、成熟型タンパク質の構造を完成させるのに、タンパク質の折畳み工程を使用することができる。また、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程で利用することができる。本明細書に記述した参考文献の他に、種々の精製方法が当技術分野で周知であり、そのような方法としては、例えば、Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；ａｎｄ  Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，第２版  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ（１９９０）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  第３版  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｙｄｅｎ（１９９８）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ；およびＷａｌｋｅｒ（１９９８）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪに示されているものが挙げられる。
【０１１５】
本発明の発現ポリペプチドをウイルス中で生成する場合、通常、感染（トランスフェクト）した細胞が増殖した培養培地からウイルスを回収する。通常、インフルエンザウイルスを濃縮する前に粗培地を清澄化する。一般的な方法としては、限外濾過、硫酸バリウムへの吸着および溶出、ならびに遠心分離が挙げられる。例えば、感染培養物に由来する粗培地をまず、細胞破片および他の大きな微粒子物質を除去するのに十分な時間（例えば、１０〜３０分間）遠心分離する（例えば、１０００〜２０００×ｇ）ことにより、清澄化することができる。場合によっては、次に、清澄化した培地上清を遠心分離して（例えば、１５，０００×ｇで、約３〜５時間）、インフルエンザウイルスをペレット化する。ＳＴＥ（０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；０．１５Ｍ  ＮａＣｌ；０．０００１Ｍ  ＥＤＴＡ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）などの適切な緩衝液にウイルスペレットを再懸濁した後、ショ糖（６０％〜１２％）または酒石酸カリウム（５０％〜１０％）を用いた密度勾配遠心分離によってウイルスを濃縮する。連続的または段階的勾配（例えば、１２％ずつ４段階の１２％〜６０％のショ糖勾配）が好適である。回収される明確なバンドへとウイルスが濃縮されるのに十分な速度で、かつ回収される明確なバンドへとウイルスが濃縮されるのに十分な時間、勾配を遠心分離する。あるいは、最大規模の商業的用途のために、ウイルスを連続的な様式で操作するゾーン遠心分離ローターを用いて密度勾配から浄化する。組織培養物からインフルエンザウイルスを調製するように当業者を導くのに十分なさらなる詳細は、例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（編）  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｐｐ．３２４−３３２におけるＦｕｒｍｉｎｇｅｒ．Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ；Ｍｅｒｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｃｏｈｅｎ  ＆  Ｓｈａｆｆｅｒｍａｎ（編）  Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｐｐ．１４１−１５１、および米国特許第５，６９０，９３７号に提供されている。望ましい場合、回収されたウイルスを、安定剤としてのショ糖−ホスファート−グルタマート（ＳＰＧ）の存在下、−８０℃で保存することができる。
【０１１６】
修飾アミノ酸
本発明の発現ポリペプチドは、１以上の修飾アミノ酸を含むことができる。修飾アミノ酸の存在は、例えば、（ａ）ポリペプチド血清の半減期の増大、（ｂ）ポリペプチドの抗原性の低下／増大、（ｃ）ポリペプチドの保存安定性の増大などにおいて好都合であることができる。アミノ酸は、例えば、組換え生成の間に、翻訳と同時にもしくは翻訳後に修飾されるか（例えば、哺乳動物細胞での発現の間のＮ−Ｘ−Ｓ／ＴモチーフにおけるＮ結合型グリコシル化）または合成手段によって（例えば、ＰＥＧ化によって）修飾される。
【０１１７】
修飾アミノ酸の非限定的な例としては、グリコシル化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、プレニル化（例えば、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化）アミノ酸、アセチル化アミノ酸、アシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、カルボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸など、および例えば、脂質部分または他の有機誘導化剤へのコンジュゲーションによって修飾されたアミノ酸が挙げられる。アミノ酸を修飾する際に当業者の案内となるのに適した参考文献は、本文献の全体を通して多数見られる。例となるプロトコルは、Ｗａｌｋｅｒ（１９９８）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｗａｔａ，ＮＪに見出される。
【０１１８】
融合タンパク質
本発明はまた、本発明の配列（例えば、ＨＡおよび／またはＮＡポリペプチドをコードするもの）またはその断片と、例えば、免疫グロブリン（またはその一部）、例えば、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）または他の同様のマーカーなどをコードする配列との融合体を含む融合タンパク質を提供する。そのような融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本発明の別の態様である。本発明の融合タンパク質は、場合によって、例えば、本発明の非融合タンパク質と同様の用途（例えば、本明細書に記載されたような治療的、予防的、診断的、実験的用途などを含む）に使用される。免疫グロブリン配列とマーカー配列との融合に加えて、本発明のタンパク質はまた、場合によって、例えば、融合タンパク質の選別および／または融合タンパク質の特定の細胞型、領域などへのターゲティングを可能とする配列と融合される。
【０１１９】
抗体
本発明のポリペプチドを用いて、本明細書に示されたポリペプチドおよび／または本発明のポリヌクレオチド（例えば、本明細書に示されたもの）によってコードされるポリペプチド、ならびにそれらの保存的変異体に特異的な抗体を生成することができる。上述のポリペプチドに特異的な抗体は、例えば、診断および治療目的（例えば、標的ポリペプチドの活性、分布および発現に関するもの）に有用である。例えば、そのような抗体は、場合によって、本明細書中のＨＡ／ＮＡ配列と同じ株に含まれる他のウイルスを規定するのに利用することができる。
【０１２０】
本発明のポリペプチドに特異的な抗体は、当業者に周知の方法で生成することができる。そのような抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、単鎖、Ｆａｂ断片およびＦａｂ発現ライブラリーにより生成される断片を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１２１】
ポリペプチドは、抗体生成のための生物学的活性を必要としない（例えば、全長の機能的ヘマグルチニンまたはノイラミニダーゼは必要ではない）。しかしながら、ポリペプチドまたはオリゴペプチドは、抗原性でなければならない。特異的抗体を誘導するために用いられるペプチドは通常、少なくとも約４アミノ酸、多くの場合、少なくとも５または１０アミノ酸のアミノ酸配列を有する。ポリペプチドの短いストレッチを、別のタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン）、およびキメラ分子に対して生成される抗体と融合させることができる。
【０１２２】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を生成するための数々の方法が当業者に知られており、また、これらの方法は、本発明のポリペプチド、および／または本発明のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドなどに特異的な抗体を生成するように適合させることができる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ；Ｐａｕｌ（編）（１９９８）  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８９）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（編）  Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）  Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ，ＣＡ、およびその中に引用されている参考文献；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ならびにＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７を参照されたい。抗体調製のための他の好適な技術としては、ファージまたは同様のベクター中の組換え抗体のライブラリーの選択が挙げられる。Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；およびＷａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６を参照されたい。特異的なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびに抗血清は通常、例えば、少なくとも約０．１μＭ、少なくとも約０．０１μＭ以下、通常、少なくとも約０．００１μＭ以下のＫＤで結合する。
【０１２３】
特定の治療用途のためには、ヒト化抗体が望ましい。キメラ（ヒト化）抗体を調製するための詳細な方法は、米国特許第５，４８２，８５６号に見出すことができる。ヒト化ならびに他の抗体生成および改変技術についてのさらなる詳細は、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（編）（１９９５）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第２版  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）、およびＰａｕｌ（１９９５）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｗａｔａ，ＮＪ（Ｐａｕｌ）に見出すことができる。特定の手順に関するさらなる詳細は、例えば、Ｏｓｔｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３），Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：３６１−３６７、Ｏｓｔｂｅｒｇ、米国特許第４，６３４，６６４号、およびＥｎｇｅｌｍａｎら、米国特許第４，６３４，６６６号に見出すことができる。
【０１２４】
核酸およびポリペプチド配列変異体
本明細書に記載されるように、本発明は、核酸のポリヌクレオチド配列およびポリペプチドのアミノ酸配列（例えば、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ配列）、ならびに例えば、該配列を含む組成物および方法を提供する。該配列の例は、本明細書に開示されている。しかしながら、当業者であれば、本発明が本明細書に開示されたそれらの配列に必ずしも限定されるわけではなく、本発明が本明細書に記載された機能を有する多くの関連配列および無関係な配列（例えば、ＨＡ分子および／またはＮＡ分子をコードするもの）も提供することを理解するであろう。
【０１２５】
また、当業者であれば、開示された配列の多くの変異体が本発明に含まれることを理解するであろう。例えば、機能的に同一の配列を生じる開示された配列の保存的変異が本発明に含まれる。核酸ポリヌクレオチド配列の変異体は、その変異体が少なくとも１つの開示された配列にハイブリダイズする場合、本発明に含まれると考えられる。例えば、標準的な配列比較技術によって決定されるような、本明細書に開示された配列の特有の部分配列もまた本発明に含まれる。
【０１２６】
サイレント変異
遺伝暗号の縮重のために、本発明のポリペプチドおよび／またはウイルスをコードする種々の核酸配列のどれかが場合によって生成され、そのうちのいくつかは、ＨＡおよびＮＡ核酸ならびに本明細書中のポリペプチド配列との低いレベルの配列同一性を有する可能性がある。以下に、多くの生物学および生化学の教科書に見られる、遺伝暗号を特定する典型的なコドン表を提供する。
【表１】
0005745511.tif 000002
【０１２７】
このコドン表は、多くのアミノ酸が、２以上のコドンによってコードされていることを示す。例えば、コドンのＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、およびＣＧＵは全ては、アミノ酸のアルギニンをコードする。したがって、コドンによってアルギニンが特定される、本発明の核酸の全ての位置で、コードされるポリペプチドを変化させることなく、コドンを上記の対応するコドンのいずれかに変化させることができる。ＲＮＡ配列中のＵは、ＤＮＡ配列中のＴに対応することが理解される。
【０１２８】
そのような「サイレント変異」は、以下で論じられる「保存的に改変された変異」の１種である。当業者であれば、核酸中の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＴＧ、および通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＴＧは除く）を、標準的な技術によって、機能的に同一のポリペプチドをコードするように改変することができることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、どの記載された配列にも内在する。それゆえ、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の生じ得る各々のおよび全ての変異を明示的に提供するものであり、この変異は、可能性のあるコドン選択に基づいて組合せを選択することによって作り出すことができる。本発明のヘマグルチニンまたはノイラミニダーゼポリペプチドをコードする核酸配列に適用するときに、これらの組合せを標準的な３文字遺伝暗号（例えば、表１に示したもの、または当技術分野で一般に利用可能なもの）に従って作り出す。本明細書中の全ての核酸のそのような変異は全て、遺伝暗号と組み合わせて配列を考慮することによって、具体的に提供および記載される。当業者は、本明細書中の方法を用いて、これらのサイレントな置換を十分に行なうことができる。
【０１２９】
保存的変異
遺伝暗号の縮重のために、「サイレント置換」（すなわち、コードされたポリペプチドに変化をもたらさない核酸配列中の置換）は、アミノ酸をコードする本発明の全ての核酸配列の黙示的な特徴である。同様に、アミノ酸配列中の１個または数個のアミノ酸における「保存的アミノ酸置換」は、高度に類似した特性を有する異なるアミノ酸で置換されており、これはまた、開示された構築物（例えば、本明細書中の構築物）と高度に類似したものとして容易に同定される。各々開示された配列のそのような保存的変異は本発明の特徴である。
【０１３０】
特定の核酸配列の「保存的変異」とは、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、またはアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す（下記の表２を参照されたい）。当業者であれば、コードされた配列中の１つのアミノ酸または小さな割合のアミノ酸（典型的には５％未満、より典型的には４％、３％、２％または１％未満）を、変化させるか、付加するかまたは欠失させる個々の置換、欠失または付加が、「保存的に改変された変異」であり、その場合、その変化によって、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または化学的に類似したアミノ酸とのアミノ酸置換が生じることを認識するであろう。したがって、列挙された本発明のポリペプチド配列の「保存的変異」は、同じ保存的置換基の保存的に選択されたアミノ酸との、小さな割合（ポリペプチド配列のアミノ酸の典型的には５％未満、より典型的には４％、３％、２％または１％未満）の置換を含む。最後に、コードされた核酸分子の活性を変化させない配列の付加（例えば、非機能的配列の付加）は、基本的核酸の保存的変異である。
【表２】
0005745511.tif 000003
【０１３１】
配列比較、同一性、および相同性
３以上の核酸またはポリペプチド配列との関連において、「同一の」または「同一性」パーセントという用語は、下記の配列比較アルゴリズム（もしくは当業者に利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを用いて、または目視検査によって測定される、最大一致を求めて比較および整列させたときに、同一であるか、または同一である特定の割合のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する３以上の配列またはサブ配列を指す。
【０１３２】
２つの核酸またはポリペプチド（例えば、ＨＡもしくはＮＡ分子をコードするＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡ、またはＨＡもしくはＮＡ分子のアミノ酸配列）との関連において、「実質的に同一な」という語句は、配列比較アルゴリズムを用いて、または目視検査によって測定される、最大一致を求めて比較および整列させたときに、少なくとも約９０％、好ましくは９１％、最も好ましくは９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％またはそれより大きいヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する３以上の配列またはサブ配列を指す。そのような「実質的に同一の」配列は通常、実際の祖先を参照することなく、「相同」であると考えられる。好ましくは、「実質的な同一性」は、少なくとも約２００残基の長さのアミノ酸配列の領域にわたって、より好ましくは、少なくとも約２５０残基の領域にわたって存在し、最も好ましくは、配列は、アミノ酸がヘマグルチニンまたはヘマグルチニン断片である場合、少なくとも約３００残基、３５０残基、４００残基、４２５残基、４５０残基、４７５残基、４８０残基、４９０残基、４９５残基、４９９残基、５００残基、５０２残基、５５９残基、５６５残基、もしくは５６６残基にわたって、または比較される２つの配列の全長にわたって実質的に同一であるか、またはアミノ酸がノイラミニダーゼまたはノイラミニダーゼ断片である場合、連続する少なくとも約３５０アミノ酸にわたって、少なくとも約４００アミノ酸にわたって、少なくとも約４３６アミノ酸にわたって、少なくとも約４５０アミノ酸にわたって、少なくとも約４５１アミノ酸にわたって、少なくとも約４６５アミノ酸にわたって、少なくとも約４６６アミノ酸にわたって、少なくとも約４６９アミノ酸にわたって、少なくとも約４７０アミノ酸にわたって、または少なくとも約５６６アミノ酸にわたって実質的に同一である。
【０１３３】
配列比較および相同性決定のために、通常、１つの配列が参照配列としての役割を果たし、これに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いた場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合、サブ配列座標を指定し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次に、配列比較アルゴリズムを、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを算出する。
【０１３４】
比較のための配列の最適アライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ  Ａｐｐｌ  Ｍａｔｈ  ２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによるか、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによるか、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によるか、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中のアルゴリズム（例えば、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる実行によるか、または目視検査によって実施することができる（一般に、Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）を参照されたい）。
【０１３５】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに好適なアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公に利用可能である。このアルゴリズムはまず、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させたときに、一致するかまたは何らかの正の値を持つ閾値スコアを満たすかのいずれかの、クエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコアの閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，上記を参照されたい）。これらの初期の近傍ワードヒットは、検索を開始し、それらを含むより長いＨＳＰを見付けるためのシードとしての役割を果たす。次に、ワードヒットを、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（一致する残基対に対する報酬スコア；常に０よりも大きい）およびＮ（不一致の残基に対するペナルティスコア；常に０よりも小さい）を用いて算出する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて、累積スコアを算出する。各方向へのワードヒットの伸長は、累積アライメントスコアが、その最大達成値から量Ｘだけ減少するとき；累積スコアが、１以上のネガティブスコア残基アライメントの蓄積により、０以下になるとき；またはいずれかの配列の末端に到達したときに停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータ（Ｗ、Ｔ、およびＸ）は、アライメントの感度および速度を決定する。（ヌクレオチド配列についての）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスをデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照されたい）。
【０１３６】
配列同一性パーセントの算出に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計学的分析も行なう（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって与えられる類似性の１つの尺度は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸とを比較したときの最小和確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列と類似していると考えられる。
【０１３７】
有用な配列アライメントアルゴリズムの別の例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、漸進的な一対アライメントを用いて一群の関連配列から複数の配列アライメントを生成する。これは、アライメントを生成するために使用されるクラスター形成の関連性を示す系統樹をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰでは、Ｆｅｎｇ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８７）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０の漸進的アライメント法を単純化したものが使用される。使用される方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ（１９８９）  ＣＡＢＩＯＳ５：１５１−１５３に記載された方法に類似している。このプログラムは、例えば、最長５，０００文字の３００配列までを整列させることができる。多重アライメント法は、整列した２つの配列のクラスターを生じさせる、２つの最も類似する配列の一対アライメントから開始される。次に、このクラスターは、整列した配列の次に最も関連する配列またはクラスターと整列させることができる。２つ配列クラスターは、２つの個々の配列の一対アライメントを単に伸長することによって整列させることができる。最終的なアライメントは、一連の漸進的な一対アライメントによって達成される。このプログラムを用いて、クラスター形成の関係性を示す樹形図または系統樹をプロットすることもできる。このプログラムは、配列比較の領域に対して特定の配列およびそのアミノ酸またはヌクレオチド座標を指定することによって実行される。
【０１３８】
複数の核酸またはアミノ酸の配列アライメントに好適なアルゴリズムのさらなる例は、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０）。ＣＬＵＳＴＡＬＷは、配列群間の多重一対比較を行ない、それらをアセンブルして相同性に基づく多重アライメントを作る。ギャップオープンおよびギャップ伸長ペナルティーは、例えば、それぞれ１０および０．０５であることができる。アミノ酸アライメントについては、ＢＬＯＳＵＭアルゴリズムを、タンパク質重量マトリックスとして用いることができる。例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９を参照されたい。
【０１３９】
デジタルシステム
本発明は、本明細書中の核酸および単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド（例えば、本明細書に示した配列を含む）ならびに様々なサイレント置換およびその保存的置換についての本明細書中の配列情報に対応する文字列を含むデジタルシステム（例えば、コンピュータ、コンピュータ可読媒体および統合システム）を提供する。統合システムは、例えば、文字列に対応する遺伝子を作製するための遺伝子構成装置をさらに含むことができる。
【０１４０】
当技術分野で公知の様々な方法を用いて、異なる文字列間の相同性または類似性を検出することができるか、またはこれらの方法を用いて、他の望ましい機能を実施する（例えば、出力ファイルを制御する、配列などを含む情報を提示するための基礎を提供する）ことができる。例としては、上に論じられたＢＬＡＳＴが挙げられる。本発明のコンピューターシステムは、そのようなプログラムを、例えば、本明細書に記述されるような配列を含む１以上のデータファイルまたはデータベースとともに含むことができる。
【０１４１】
したがって、様々なＨＡもしくはＮＡ配列または断片間の様々なストリンジェンシーおよび長さに関する異なる種類の相同性および類似性を、本明細書中の統合システムにおいて検出および認識することができる。例えば、生体ポリマーの配列を比較分析するために、ワードプロセシングでスペルチェックを行なうために、および様々なデータベースからデータを回収するために、多くの相同性決定法が設計されている。天然ポリヌクレオチド中の４つの主要なヌクレオ塩基間の二重らせんの一対の相補的相互作用を理解することによって、相補的な相同ポリヌクレオチド鎖のアニーリングをシミュレーションするモデルを、配列アライメントまたは本明細書中の配列に対応する文字列に対して通常行われる他の操作（例えば、ワードプロセシング操作、配列またはサブ配列の文字列を含む図面の構築、出力表の構築など）の基盤として用いることができる。
【０１４２】
したがって、標準的なデスクトップアプリケーション、例えば、ワードプロセシングソフトウェア（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄ（商標）またはＣｏｒｅｌ  ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔ（商標））およびデータベースソフトウェア（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（商標）、Ｃｏｒｅｌ  Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｐｒｏ（商標）などの表計算ソフトまたはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ａｃｃｅｓｓ（商標）、Ｐａｒａｄｏｘ（商標）、ＧｅｎｅＷｏｒｋｓ（商標）もしくはＭａｃＶｅｃｔｏｒ（商標）もしくは他の同様のプログラムなどのデータベースプログラム）を、１以上の本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド（核酸もしくはタンパク質のいずれか、または両方）に対応する文字列を入力することによって本発明に適合させることできる。例えば、本発明のシステムは、例えば、本明細書中の配列に対応する文字列を操作するためのユーザインターフェース（例えば、Ｗｉｎｄｏｗｓ、ＭａｃｉｎｔｏｓｈまたはＬＩＮＵＸシステムなどの標準的なオペレーティングシステムにおけるＧＵＩ）とともに使用される、適切な文字列情報を有する前述のソフトウェアを含むことができる。述べたように、特殊化したアライメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ）を、核酸またはタンパク質（または対応する文字列）のアライメントのために本発明のシステムに組み込むこともできる。
【０１４３】
本発明のシステムは通常、本明細書中の配列のいずれかを含むソフトウェアシステムに入力されたデータセットを備えるデジタルコンピュータを備える。コンピュータは、例えば、ＰＣ（Ｉｎｔｅｌ  ｘ８６もしくはＰｅｎｔｉｕｍチップ互換性ＤＯＳ（商標）、ＯＳ２（商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ（商標）、ＷＩＮＤＯＷＳＮＴ（商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ９５（商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ２０００（商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ９８（商標）、ＬＩＮＵＸベースのマシン、ＭＡＣＩＮＴＯＳＨ（商標）、Ｐｏｗｅｒ  ＰＣ、もしくはＵＮＩＸベースの（例えば、ＳＵＮ（商標）ワークステーション）マシン）または当業者に公知の他の市販のコンピュータであることができる。配列を整列させるかもしくは別の形で操作するためのソフトウェアが利用可能であるか、または標準的なプログラミング言語（例えば、Ｖｉｓｕａｌｂａｓｉｃ、ＰＥＲＬ、Ｆｏｒｔｒａｎ、Ｂａｓｉｃ、Ｊａｖａなど）を用いて当業者により容易に構築され得る。
【０１４４】
どのコントローラまたはコンピュータも任意でモニターを備え、モニターは、多くの場合、陰極線管（「ＣＲＴ」）ディスプレイ、フラットパネルディスプレイ（例えば、アクティブマトリックス方式液晶ディスプレイ、液晶ディスプレイ）などである。コンピュータ回路網は、多くの場合、数多くの集積回路チップ（例えば、マイクロプロセッサ、メモリ、インターフェース回路など）を備えるボックス内に配置されている。このボックスは任意でハードディスクドライブ、フロッピーディスクドライブ、高容量のリムーバブルドライブ（書き込み可能なＣＤ−ＲＯＭ）、および他の一般的な周辺素子も備える。キーボードまたはマウスなどの入力装置は任意で、ユーザーからの入力、および関連コンピューターシステムにおいて比較されるかまたは別の形で操作される配列のユーザー選択を提供する。
【０１４５】
コンピュータは通常、（例えば、ＧＵＩ中の）セットパラメーターフィールドへのユーザーの入力の形態か、または予めプログラムされた指示（例えば、種々の異なる特定の操作のために予めプログラムされたもの）の形態かのいずれかで、ユーザーの指示を受けるための適切なソフトウェアを備える。次に、ソフトウェアは、これらの指示を、例えば、適切なメカニズムまたはトランスポートコントローラの操作を指示して、所望の操作を実施するための適切な言語に変換する。ソフトウェアはまた、（例えば、本明細書中の配列もしくは配列アライメントに基づく）核酸合成、示差的な遺伝子発現についての試料の比較、または他の操作を制御するための出力エレメントを備えることができる。
【０１４６】
キットおよび試薬
本発明は、場合により、キットとしてユーザーに提供される。例えば、本発明のキットは、本明細書に記載の１以上の核酸、ポリペプチド、抗体、または細胞株（例えば、本発明のＨＡおよび／もしくはＮＡ分子を含むか、または有するもの）を含む。キットは、診察用の核酸またはポリペプチド（例えば、抗体）、プローブセット（例えば、好適な容器に梱包されたｃＤＮＡマイクロアレイ）、または他の核酸（例えば、１以上の発現ベクター）を含むことができる。キットは、通常、発現産物、チューブおよび／または他の付属物を標識するための１以上の追加の試薬（例えば、基質、標識、プライマー）、サンプルを回収するための試薬、緩衝液、ハイブリダイゼーションチャンバー、カバーガラスなどをさらに含む。キットは、場合により、発見のためにキットの構成要素を用いる好ましい方法、または診断セットの用途などを詳述した指示セットまたはユーザーマニュアルをさらに含む。
【０１４７】
指示書に従って用いる場合、キットを、例えば、疾患状態もしくは疾病を評価するため、細胞または生物における疾患状態もしくは疾病の進行に対する薬学的薬剤もしくは他の治療的介入の効果を評価するため、またはワクチンとして使用するためなどに使用することができる。
【０１４８】
さらなる態様において、本発明は、本明細書中の方法、組成物、システムおよび装置を具現化するシステムキットを提供する。本発明のシステムキットは任意で以下のうちの１つまたは複数を含む：（１）装置、システム、システム構成要素または装置構成要素；（２）本明細書に記載の方法を実施するため、および／または本明細書中の装置または装置構成要素を操作するため、および／または本明細書中の組成物を使用するための指示書。さらなる態様では、本発明は、本明細書中の任意の装置、装置構成要素、組成物もしくはキットの使用、本明細書中の任意の方法もしくはアッセイの実施、および／または本明細書中のアッセイもしくは方法を実施するための任意の装置もしくはキットの使用を提供する。
【０１４９】
さらに、キットは、１以上の上述のような翻訳系（例えば、細胞）を、適切な梱包材料、キットの構成要素を収納するための容器、本明細書中の方法を実施するための説明資料などとともに含むことができる。同様に、翻訳系の産物（例えば、ＨＡおよび／またはＮＡ分子などのタンパク質）を、例えば、キットの構成要素を収納する容器、本明細書中の方法を実施するための説明資料などとともに、キットの形態で提供することができる。さらに、キットは、本明細書中のＨＡおよび／またはＮＡ配列を含む弱毒化生ワクチン（例えば、ＦｌｕＭｉｓｔ）などの様々なワクチン（例えば、プラスミドレスキュープロトコルによって生成されるもの）を含むことができる。
【０１５０】
本発明の方法および組成物の使用を容易にするために、ワクチン成分および／または組成物（例えば、尿膜液中の再集合体ウイルスなど）、ならびに実験または治療ワクチン目的のためのインフルエンザウイルスのパッケージングおよび感染に有用な追加成分（例えば、緩衝液、細胞、培養培地）のいずれかを、キットの形態で梱包することができる。通常、キットは、上記の構成要素に加えて、さらなる材料を含み、この材料としては、例えば、本発明の方法を実施するための説明書、梱包材料、および容器を挙げることができる。
【実施例】
【０１５１】
次に、以下の実施例に関して本発明を記載する。これらの実施例は例示の目的のためにのみ与えられ、本発明はこれらの実施例に限定されると決して解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に与えられる教示の結果として明らかになる任意のおよび全ての変形を包含すると解釈されるべきである。
【０１５２】
材料および方法
組換えウイルスの作製：野生型（ｗｔ）Ａ型インフルエンザＨ１Ｎ１ウイルスである、ＭＤＣＫ細胞から単離されたＡ／ＣＡ／４／０９と卵から単離されたＡ／ＣＡ／７／０９とを米国疾病対策センター（ＣＤＣ）から得た。Ａ／ＣＡ／４／０９卵適合ウイルスＲＮＡは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）のＺｉｐｉｎｇ  Ｙｅ博士によって提供された。Ａ／ＣＡ／４／０９およびＡ／ＣＡ／７／０９のＨＡおよびＮＡ遺伝子セグメントを、ＨＡおよびＮＡ遺伝子の末端配列に共通するプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲで増幅させ、プラスミドベクターｐＡＤ３０００（Ｈｏｆｆｍａｎ（２０００）  ＰＮＡＳ  ９７：６１０８−６１１３）にクローニングした。特定の変化をＨＡ遺伝子に導入するために、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて部位特異的突然変異導入を行ない、シークエンシング解析によってＨＡ配列を確認した。６：２再集合体ワクチン株は、Ｈ１Ｎ１ウイルスのＨＡおよびＮＡならびに低温適応型（ｃａ）Ａ／アナーバー／６／６０（ＭＤＶ−Ａ、Ａ型インフルエンザウイルスのマスタードナーウイルス）の６つの内部遺伝子セグメントをコードする８つのｃＤＮＡプラスミドを、共培養された２９３Ｔ細胞およびＭＤＣＫ細胞に共トランスフェクトすることによって作製した。生成に使用されるワクチン株は、エレクトロポレーションによって無血清Ｖｅｒｏ／ＣＥＫ細胞で生成される。ウイルスを１０〜１１日齢の孵化鶏卵の尿膜腔の中で繁殖させた。レスキューしたウイルスのＨＡおよびＮＡ配列は、ｖＲＮＡから増幅されたＲＴ−ＰＣＲ  ｃＤＮＡのシークエンシングによって確認した。
【０１５３】
ウイルス力価測定：ウイルス力価は蛍光フォーカスアッセイで測定し、ｌｏｇ１０ＦＦＵ（蛍光フォーカスユニット単位）／ｍｌとして表した（Ｆｏｒｒｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：１０４２−１０５３）。ウイルスプラークの形態を以前に記載されたようなプラークアッセイで調べた（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３０６，１８−２４）。
【０１５４】
受容体結合アッセイ：ニワトリ赤血球（ｃＲＢＣ）（ＨＥＭＡ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｙ，Ｉｎｃ．）を以前に記載されたように脱シアリル化および再シアリル化した（）。１００μｌの１０％ｃＲＢＣを５０ｍＵのコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）ノイラミニダーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とともに３７℃で１時間インキュベートして、シアル酸を除去した。１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１ｍｌのＰＢＳに細胞を再懸濁し、１．５ｍＭのＣＭＰ−ＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加えて、２．５ｍＵのα２，３（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）または２ｍＵのα２，６（Ｎ）シアリルトランスフェラーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）とともに３７℃で１．５時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、再シアリル化したｃＲＢＣを０．５％（ｖ／ｖ）としてＰＢＳに再懸濁した。結合活性について、Ｖ底の９６ウェルマイクロ力価プレート中で、血液凝集アッセイ（ＨＡ）を行なった。５０μｌの２倍連続希釈ウイルスを、５０μｌの０．５％のｃＲＢＣ、α２，３、またはα２，６再シアリル化ｃＲＢＣとともに室温で６０分間インキュベートした。ＨＡ力価をＲＢＣを凝集させる最大希釈として定義した。
【０１５５】
フェレット研究：３匹からなる群にしたＳｉｍｏｎｓｏｎ（Ｇｉｌｒｏｙ，ＣＡ）からの８〜１０週齢の雄および雌のフェレットを用いて、気道におけるウイルス複製とワクチンの免疫原性とを評価した。フェレットを個別に飼育し、０．２ｍｌ用量につき７．０  ｌｏｇ１０ＦＦＵのウイルスを鼻腔内に接種した。感染３日後、フェレットを安楽死させ、肺および鼻甲介（ＮＴ）を摘出した。肺およびＮＴにおけるウイルス力価をＥＩＤ５０アッセイで決定し、組織１グラム当たりの５０％卵感染用量（ｌｏｇ１０ＥＩＤ５０／ｇ）として表した。免疫原性研究に割り当てたフェレットから、感染後１４日目、２１日目および２８日目に採血し、ＨＡＩによる抗体力価について、血清をアッセイした。
【０１５６】
ＨＡＩアッセイによる血清抗体検出：感染後のフェレット血清中の同種および異種ウイルスに対するＨ１Ｎ１特異的抗体のレベルをＨＡＩアッセイで測定した。血清学的解析の前に、フェレット血清をバイアル当たり１０ｍＬの０．９％ＮａＣｌで再構成した受容体破壊酵素（ＲＤＥ）（Ｄｅｎｋａ  Ｓｅｉｋｅｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で処理した。０．１ｍＬの血清を０．１５ｍＬのＲＤＥと混合し、３７℃で１８時間インキュベートし、０．１５ｍＬの０．９％クエン酸ナトリウムを添加して最終的な１：４希釈となるよう調整し、その後、５６℃で４５分間インキュベートした。０．５％のｔＲＢＣを用いて種特異的血清ＨＡＩ力価を決定した。このＨＡＩは、血球凝集を阻害した最大血清希釈の逆数として示される。
【０１５７】
結果
再集合体候補ワクチン株の作製
ｗｔ  Ａ／ＣＡ／４／０９由来のＨＡおよびＮＡ遺伝子セグメントを、感染させたＭＤＣＫ細胞のＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ増幅後にクローニングした。ヌクレオチド配列解析により、各々のＨＡまたはＮＡ由来の合計１２個のｃＤＮＡクローンが同一であることが分かった。このｗｔ  Ａ／ＣＡ／４／０９のＨＡ配列およびＮＡ配列を表すプラスミドを、ＭＤＶ−Ａの６つの内部タンパク質遺伝子セグメントを表すプラスミドと一緒に２９３／ＭＤＣＫ細胞にトランスフェクトしたが、ＭＤＣＫ細胞または卵のいずれにおいても生きた再集合体子孫を回収することができなかった。ｗｔ  Ａ／ＣＡ／４／０９卵分離株からクローニングされたＨＡ  ｃＤＮＡは、２つのアミノ酸位置において異種であった（表３）。解析した１２個のクローンから、以下の変化：Ｌ１９１Ｉ（４２％）、Ｑ２２３Ｒ（５０％）が観察され、１つ（８％）には、Ｌ１９１ＩとＱ２２３Ｒの両方があった。これらの異なるＨＡ配列を表すプラスミドを組み合わせて、ＭＤＶ−Ａ内部タンパク質遺伝子とともに２９３／ＭＤＣＫ細胞にトランスフェクトすると、再集合体ウイルスがすぐにレスキューされた。
【０１５８】
残基２２２または２２３にアミノ酸変化を持たないＡ／ＣＡ／７／０９からクローニングされたＨＡプラスミドは、子孫ウイルスを生成するようにレスキューすることができた。これにより、ＣＡ／７／０９におけるＴ１９７Ａ変化が、効率的なＡ／ＣＡ／７／０９のレスキューの一因であることが示唆された。他のＡ／ＣＡ／７／０９クローンは、Ｄ２２２ＧまたはＱ２２３Ｒのいずれかの変化を有し、ＨＡ中のＤ２２２ＧまたはＱ２２３Ｒを含有するウイルスもレスキューされた。Ａ／ＣＡ／４／０９のＨＡとＡ／ＣＡ／７／０９のＨＡには高度の類似性があるため、およびＮＡ配列はこれら２つの株で同一であるため、Ａ／ＣＡ／７／０９由来の変異体をさらに開発した。
【表３】
0005745511.tif 000004
【０１５９】
孵化鶏卵中でより良好に増殖するワクチン株の選択
表３に示すように、レスキューされたＡ／ＣＡ／４／０９およびＡ／ＣＡ／７／０９再集合体ワクチン株は、ニワトリ孵化卵において、季節性Ｈ１Ｎ１ワクチン株よりも少なくとも１０倍低い７．４〜７．８ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌという力価で複製された。さらに、回収されたＡ／ＣＡ／７／０９再集合体ワクチン候補は、ＭＤＣＫ細胞で非常に小さいプラークを形成した。ＭＤＣＫ細胞および卵におけるワクチンウイルス増殖を改善するために、Ａ／ＣＡ／７／０９候補（Ｖ５およびＶ６）をＭＤＣＫ細胞において４．０、０．４および０．０４というｍｏｉで２回継代し、その後、上清中に存在するウイルスをプラークアッセイで調べた。ＭＤＣＫで継代したウイルスは全て、親ウイルスよりも遙かに大きい（２〜４ｍｍ）プラークを含有していた（図１）。ＭＤＣＫで継代したＶ５およびＶ６ワクチン候補由来の１２個のプラークのＨＡ遺伝子セグメントをシークエンシングした。大きいプラーク形態の分離株の各々のＨＡは、以下の位置：Ｋ１１９ＮまたはＫ１１９Ｅ、Ｋ１５３Ｅ、Ｋ１５４Ｅ（Ｖ５由来）およびＡ１８６Ｄ（Ｖ６由来）のうちの１つに単一のアミノ酸変化を有していた。
【０１６０】
Ａ／ＣＡ／７／０９のＨＡ配列をブタが起源である２つの初期のＨ１Ｎ１ウイルス、Ａ／ブタ／アイオワ／１／１９７６およびＡ／ブタ／１９３１、ならびに最近のヒトＨ１Ｎ１ウイルスであるＡ／サウスダコタ／６／０７（Ａ／ＳＤ／０７）とも比較した。図２に示すように、Ｋ１１９、Ｋ１５３およびＫ１５４は、ブタＨ１Ｎ１ウイルスの間で高度に保存されている。Ａ／ＳＤ／６／０７は、Ｋ１１９およびＫ１５４残基も含有していた。１８６のアミノ酸は、図２に示した４つのウイルス間でより多様であった。以前の研究（Ｂｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：６９９６−７０００）では、Ｇ１５５Ｅ変化が卵中での高いウイルス増殖の一因であることが示された。これらのデータは、１５３〜１５５領域の負電荷を有するＥ残基が、ＭＤＣＫ細胞および卵中でのウイルス複製に好ましいことを示している。Ａ／ＮＪ／７６ウイルスについて以前に報告されたＧ１５５Ｅ変化もまた、卵中でのＡ／ＣＡ／７／０９ウイルス複製を改善することができるかどうかを調べるために、Ｇ１５５ＥをＶ５およびＶ６に導入した。さらに、大きいプラークで同定されたアミノ酸が、卵中でウイルス増殖優位性を付与したことを確認するために、同定された突然変異の各々をＨＡに導入し、再集合体ワクチン候補株をレスキューした。さらに、Ｖ６で同定されたＡ１８６Ｄ変化をＶ５およびＶ５−１１９Ｅにも導入した。同様に、Ｖ５で見出された１１９Ｎ突然変異をＶ６およびＶ６−１８６Ｄにも導入し、卵中でのウイルス複製に対する単一または二重アミノ酸変化の影響を評価した。同様に、Ｖ５で見出された１１９Ｎ突然変異をＶ６およびＶ６−１８６Ｄにも導入し、卵中でのウイルス複製に対する単一または二重アミノ酸変化の影響を評価した。ＨＡ配列解析によって、Ａ／ＣＡ／０９株が残基２７８に独特のグリコシル化を含有することも示された（図２）。この追加のグリコシル化部位がウイルス増殖に影響を及ぼすかどうかを評価するために、Ｔ２７８Ｋ変化をＶ５およびＶ６にそれぞれ導入した。
【０１６１】
レスキューされたウイルスを卵中でのその増殖について調べた。表４に示すように、導入されたＨＡ突然変異を含有する変異体の大半は、Ｖ５およびＶ６よりも有意に良好に増殖した。Ｖ５−２７８ＫおよびＶ６−２７８Ｋは、Ｖ５およびＶ６と類似した７．６および７．７Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌという力価を有していた。したがって、２７８グリコシル化部位の除去は、卵中でのウイルス力価に最小限の影響を及ぼした。１１９、１８６、１５３、１５４、１５５および１８６部位での変化は、０．２〜１．２ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌだけウイルス力価を増大させた。Ｖ５において１１９Ｅ変化と１８６Ｄ変化を組み合わせると、１１９Ｅまたは１８６Ｄのどちらかだけよりもわずかに高い力価が得られた。
【表４】
0005745511.tif 000005
【０１６２】
ワクチン変異体のその抗原性についての評価
Ｈ１  ＨＡに導入されたアミノ酸変化のいずれかが、ウイルス抗原性に影響を及ぼしたかどうかを明らかにするために、ＨＡＩアッセイを用いて、Ａ／ＣＡ／７／０９変異体を、様々な感染後フェレット血清との反応性について評価した（表５）。低温適応型（ｃａ）ウイルスである、２２３Ｒ残基を有するＡ／ＣＡ／４／０７（Ｖ３）、２２２Ｇ残基を有するＡ／ＣＡ／７／０９（Ｖ５）および２２３Ｒ残基を有するＡ／ＣＡ／７／０９（Ｖ６）は、ｗｔ  Ａ／ＣＡ／４／０９、ｃａ  Ａ／ＣＡ／４／０９（Ｖ３）、ｃａ  Ａ／ＣＡ／７／０９（Ｖ５）およびｃａ  Ａ／ＣＡ／０７／０９（Ｖ６）で免疫化したフェレット由来の４つの参照血清と同様に反応した。Ｖ５の位置１１９および１８６にアミノ酸変化が導入された変異体は、Ｖ５と同様の抗原性を有していた。しかしながら、位置１５３、１５４および１５５に変化を有するウイルスは、これらの血清との反応性が遙かに低く、４倍を超える力価の低下が検出された。したがって、これらのデータは、残基１５３〜１５４での突然変異がワクチン株中に存在すべきでないことを示している。位置１１９および１８６での変化は、ウイルス抗原性に影響を及ぼすことなくワクチン株に導入することができた。
【表５】
0005745511.tif 000006
【０１６３】
Ａ／ＣＡ／７／０９ワクチン候補は、フェレットにおいて弱毒化されているが、免疫原性である
Ａ／ＣＡ／７／０９ワクチン変異体を、その弱毒化表現型および抗体応答を誘導するその能力について評価するために、フェレットに７．０ｌｏｇ１０ＦＦＵのウイルスを０．２ｍｌの投与容量で鼻腔内接種し、フェレットの上下気道におけるウイルス複製をＥＩＤ５０アッセイで明らかにした。表６に示すように、Ａ／ＣＡ／７／０９変異体は全て、ＮＴ組織では効率的に複製したが、肺ではウイルスが検出されなかった。これらのデータにより、これらのウイルスがフェレットにおいて弱毒化されていること（これは、ＭＤＶ−Ａの６つの内部タンパク質遺伝子セグメントによって付与される特徴的な表現型である）が確認された。
【０１６４】
フェレットの感染後血清を鼻腔内接種後１４日目に回収し、ＨＡＩアッセイで抗体力価を評価した（表６）。Ｖ５変異体は全て、非常に免疫原性が強く、ＨＡＩ力価が２５６〜１０２４の範囲の、Ｈ１Ｎ１特異的抗体応答を誘導した。いくつかのＶ６変異体も、その免疫原性について評価し、Ｖ５よりも免疫原性が低いことがわかった（データは示さない）。残基１１９および１８６に突然変異を有する変異体は、ｗｔウイルスと同様の抗原性を維持したが、１５４Ｅおよび１５５Ｅ変異体とはあまり反応しなかった。１５４Ｅおよび１５５Ｅ変異体感染フェレット血清で感染させたフェレット由来の血清もまた、ｗｔウイルス、Ｖ５、ならびに１１９Ｅおよび１８６Ｄ変化を有するＶ５変異体とはあまり反応せず；それらの力価の違いは２倍以内であった。Ｖ５−１５４Ｅおよび１５５Ｅ感染後フェレット血清は、他の変異体よりも４倍を超えて高い同種ＨＡＩ力価を有していた。興味深いことに、１８６Ｄでの突然変異は、１５４Ｅおよび１５５Ｅ変異体との反応性を大きく低下させた。これらのデータは、Ａ／ＣＡ／０７／０９（Ｈ１Ｎ１）の１１９および１８６ＨＡ変異体が、ウイルス抗原性または免疫原性を変化させることなく、卵中での高い増殖を付与し、そのため、ブタ起源のＨ１Ｎ１ウイルスの潜在的なワクチン候補となることを示している。
【表６】
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【０１６５】
Ａ／ＣＡ／７／０９ 変異体の受容体結合特異性
卵中での野生型Ａ／ＣＡ／４／０９およびＡ／ＣＡ／７／０９ウイルスの増殖によって、ＨＡ受容体結合部位におけるアミノ酸変化（Ｄ２２２ＧおよびＱ２２３Ｒ）が生じた。これらの位置は、卵で継代した後の他のＨ１Ｎ１株で以前に同定されており、ＨＡ受容体結合特異性に関与している。ワクチンウイルス変異体が異なる受容体結合特異性を有するかどうかを明らかにするために、Ｖ５、Ｖ６ならびにＶ５−１１９およびＶ５−１８６変異体を、ＲＢＣ結合アッセイにより、その受容体結合特異性について評価した（表７）。（２２２および２２３が変化していない）Ｖ４は、α２，３  ＳＡよりもα２，６  ＳＡに結合する傾向があった。Ｖ５（Ｄ２２２Ｇ）は、α２，３  ＳＡおよびα２，６  ＳＡで再シアリル化されたＲＢＣに同程度によく結合した。しかしながら、Ｖ６（Ｑ２２３Ｒ）は、α２，３  ＳＡで再シアリル化されたＲＢＣにしか結合することができず、これら２つの残基がウイルス受容体結合特異性に影響を及ぼすことが確認された。Ｖ５−１１９Ｅ／ＮおよびＶ５−１８６Ｄウイルスは、Ｖ５と同様の結合特異性を有していた。二重ＨＡ突然変異体Ｖ５−１１９Ｅ／１８６Ｄは、α２，３  ＳＡよりもα２，６  ＳＡに良好に結合する傾向があった。Ｖ６に導入された１１９Ｅおよび１８６Ｄ残基は、α２，６  ＳＡに対するその結合を回復することができなかった（データは示さない）。したがって、１１９および１８６残基における変化は、ウイルス受容体結合特異性にそれほど影響を及ぼさない。
【表７】
0005745511.tif 000008
【０１６６】
Ａ／ＣＡ／７／０９再集合体のタンパク質組成
感染させた卵から回収した１３ｍｌの尿膜腔液を２ｍｌの３０％ショ糖クッションに２５ｋｒｐｍで１時間通してペレット化した。ウイルスペレットを０．２ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。５μｌのウイルス懸濁液を４〜２０％ポリアクリルアミドゲルに充填し、クマシーブルーで染色したサンプルの順番は以下の通りであった。
図３Ａ
レーン１．組換えＨＡＡ／ＮＣ／２０／９９  ０．５μｇ
レーン２．組換えＨＡＡ／ＮＣ／２０／９９  ２μｇ
レーン３．ＭＤＶＡ−Ｖ５−１１９Ｅ／１８６Ｄ（ＦＦＡ  ８．６）
レーン４．ＭＤＶＡ−Ｖ６（ＦＦＡ  ７．９）
レーン５．ＭＤＶＡ−Ｖ６−１８６Ｄ（ＦＦＡ  ８．１）
レーン６．ＰＲ８−Ｖ５−１１９Ｅ／１８６Ｄ（ＦＦＡ  ８．２）
レーン７．ＰＲ８−Ｖ６（ＦＦＡ  ７．８）
レーン８．ＰＲ８−Ｖ６−１８６Ｄ（ＦＦＡ  ８．５）
レーン９．ＮＹＭＣ  Ｘ−１７９Ａ（ＦＦＡ  ８．５）
レーン１０．ＰＲ８サウスダコタ（ＦＦＡ  ８．７）
図３Ｂ
レーン１．ＮＹＭＣ  Ｘ−１７９Ａ（ＦＦＡ  ８．５）
レーン２．ＭＤＶＡ−Ｖ５−１１９Ｅ／１８６Ｄ（ＦＦＡ  ８．６）
レーン３．ＭＤＶＡ−Ｖ５−１１９Ｅ／１８６Ｄ／ＰＡ−Ｓ３９５Ｎ（ＦＦＡ８．９）
レーン４．サウスダコタ（ＦＦＡ  ８．７）
【０１６７】
標準的な方法を用いて、ＦＦＡおよびピーク力価の値を決定した。その名称に「ＭＤＶＡ」が含まれる再集合体ウイルスは、Ａ／アナーバー／６／６０の６つの内部ゲノムセグメントを含む。その名称に「ＰＲ８」が含まれる再集合体ウイルスは、ＰＲ８の６つの内部ゲノムセグメントを含む。
【０１６８】
Ａ／カリフォルニア／７／０９変異体のＨＡタンパク質収量の比較
ＰＲ８由来の６つの内部ゲノムセグメントと、Ａ／ＣＡ／７／０９由来のＨＡおよびＮＡゲノムセグメントとを含む６：２再集合体インフルエンザウイルスを作製した。ＰＲ８由来の６つの内部ゲノムセグメントと、Ａ／ＣＡ／７／０９由来のＮＡゲノムセグメントと、本明細書に記載のＨ１  ＨＡ変異体ポリペプチドをコードするＨＡゲノムセグメントとを含むさらなる６：２再集合体ウイルスを作製した。Ａ／Ｔｅｘａｓ／５／２００９  ＲＧ１５（Ａ／ＴＸ／７／０９  ＲＧ１５）およびＡ／カリフォルニア／０７／０９  ＮＹＭＣ  Ｘ１７９Ａとともに、様々なＡ／ＣＡ／７／０９ＨＡ変異体を含む６：２再集合体ウイルスをニワトリ孵化卵中で拡大し、そのピーク力価をＦＦＡで決定した。アッセイしたウイルス株を表８に示す。６：２ＰＲ８−サウスダコタは、ＰＲ８由来の６つの内部ゲノムセグメントと、Ａ／サウスダコタ／６／０７由来のＨＡおよびＮＡゲノムセグメントとを含む６：２再集合体ウイルスである。６：２ＡＡ−Ｖ５−１１９Ｅ／１８６Ｄは、Ａ／アナーバー／６／６０由来の６つの内部ゲノムセグメントと、Ａ／ＣＡ／７／０９由来のＮＡゲノムセグメントと、Ｖ５−１１９Ｅ／１８６Ｄ  変異体ＨＡゲノムセグメントとを含む６：２再集合体ウイルスである。本明細書に記載のＨ１  ＨＡ変異体ゲノムセグメントを含むＰＲ８再集合体ウイルスは、ＴＩＶ生成に利用可能な最高収量株であるＸ１７９Ａと同程度の力価を有していた。
【表８】
0005745511.tif 000009
【０１６９】
ピーク力価の測定の他に、本発明者らは、表８に列挙された再集合体ウイルスのうちのいくつかのＨＡタンパク質収量も決定した。５０個の卵に各々１０３ＦＦＵ／卵のＭＯＩで感染させることにより、選択されたウイルスを増幅させた。３３℃で６２時間のインキュベーションの後、ウイルスを回収した。その後、等量の尿膜腔液（２５０ｍｌ）をショ糖勾配で精製した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、次いでクマシーブルー染色により、ウイルスタンパク質を解析した。
【０１７０】
結果の代表的なサンプルを図４に示す。図４Ａに示すように、Ｘ１７９Ａ、６：２ＰＲ８−Ｖ６−１８６Ｄおよび６：２ＡＡ−Ｖ５−１１９Ｅ／１８６Ｄの総タンパク質収量は、ぞれぞれ、４６０、３００、および３５０μｇであった。６：２ＡＡ−Ｖ５−１１９Ｅ／１８６Ｄは、Ａ／ＣＡ／７／０９  Ｘ１７９Ａよりも総タンパク質収量が低かったにもかかわらず、６：２ＡＡ−Ｖ５−１１９Ｅ／１８６ＤのＨＡタンパク質収量が最大であった。この実験で６：２ＡＡ−Ｖ５−１１９Ｅ／１８６Ｄについて見られたより低い総タンパク質収量は、アッセイのばらつきによる可能性が高かった。図４Ｂに示すように、６：２ＰＲ８−Ｖ５−１１９Ｅ／１８６ＤおよびＸ１７９Ａの総タンパク質収量は、それぞれ、７８０および７２０μｇであった。６：２ＰＲ８−Ｖ５−１１９Ｅ／１８６ＤのＨＡタンパク質収量はまた、Ａ／ＣＡ／７／０９  Ｘ１７９ＡのＨＡタンパク質収量よりも高かった。
【０１７１】
ＰＲ８バックボーンと変異体Ａ／カリフォルニア／７／０９  Ｈ１ポリペプチドとを含む再集合体ウイルス
ＰＲ８由来の６つの内部ゲノムセグメントと、Ａ／ＣＡ／７／０９  Ｈ１  ＨＡゲノムセグメントの変異体と、Ａ／ＣＡ／７／０９  ＮＡゲノムセグメントとを含むさらなる６：２再集合体インフルエンザウイルスを作製した。Ｈ１  ＨＡアミノ酸変異を表９にまとめる。
【表９】
0005745511.tif 000010
【０１７２】
試験した変異体ＨＡのうち、Ｖ５−１１９Ｅ／１８６Ｄ／１９０Ｒにおける変化のみが抗原性を低下させた（表９）。ＨＡタンパク質収量を決定するために、様々なＡ／ＣＡ／７／０９  ＨＡ変異体を含む６：２再集合体ウイルスをニワトリ孵化卵中で拡大した。３３℃で４８時間（図５Ａ）または６０時間（図５Ｂ）のインキュベーションの後、ウイルスを回収した。その後、ショ糖勾配沈降でウイルスを精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでクマシーブルー染色により、精製ウイルスのタンパク質組成を解析した。１つ１つのレーンに、等量の精製ウイルス（図５Ａ）または等容量の回収された尿膜腔液から精製したウイルス（図５Ｂ）のいずれかを含むサンプルを充填した。ＡＡ−Ｖ５−ＥＤ（Ｖ５−１１９Ｅ／１８６Ｄ変異体ＨＡおよびＡ／アナーバー／６／６０バックボーンを含む）ならびにＸ１７９Ａウイルスから調製されたサンプルを対照として含めた。ＰＲ８−Ｃウイルスは、Ｘ１７９Ａよりも高い収量のＨＡポリペプチドを生成した。
【０１７３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでクマシーブルー染色を用いて、Ｘ１７９ＡのＨＡ収量と比べたＰＲ８−ＣおよびＡＡ−Ｖ５−ＥＤのＨＡ収量をさらに測定した。様々な容量（１０、７．５、５および２．５マイクロリットル）のＰＲ８−ＣおよびＡＡ−Ｖ５−ＥＤサンプルならびに１０マイクロリットルのＸ１７９ＡサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。画像解析ソフトウェアを用いて、各サンプルに見られるＨＡ１タンパク質の相対量を測定した。測定の結果を図６に示す。ＡＡ−Ｖ５−ＥＤおよびＰＲ８−Ｃウイルスは、Ｘ１７９Ａよりも１〜１．５倍多いＨＡタンパク質を生成する。
【０１７４】
前述の発明は、明瞭性と理解を目的として少し詳細に記載されているが、本開示を読むことによって、形態および細部における様々な変更が、本発明の真の範囲から逸脱することなく行なわれ得ることが当業者には明らかとなるであろう。例えば、上記の全ての技術および装置は、様々な組合せで使用することができる。全ての出版物、特許、特許出願、または本出願に引用される他の文献は、あたかも各々の個々の出版物、特許、特許出願、または他の文献が、あらゆる目的のために参照により組み込まれるように示されているのと同じ程度まで、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。特に、以下の特許出願：米国仮出願第６１／２２０，４２６号（２００９年６月２５日出願）、同第６１／２２７，９８６号（２００９年７月２３日出願）、および同第６１／２３４，０２１号（２００９年８月１４日出願）は、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
【図１Ａ】
0005745511.tif 000011
【図１Ｂ】
0005745511.tif 000012
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
0005745511.tif 000015
【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
0005745511.tif 000019
【配列表】
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