(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のグラム陰性菌またはリポ多糖を検出するための方法であって、
（ａ）前記試料中のタンパク質の分解をもたらす条件下で、前記試料を活性酸性プロテアーゼと接触させるステップと、
（ｂ）前記酸性プロテアーゼを不活性化するステップと、
（ｃ）不活性酸性プロテアーゼの存在下で、前記試料を１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドと接触させるステップと、
（ｄ）前記１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドが前記試料に結合するかどうかを判定するステップであって、結合は、前記試料がグラム陰性菌またはリポ多糖を含有することを示す、ステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記酸性プロテアーゼは、ペプシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酸性プロテアーゼは、真菌酸性プロテアーゼ、微生物酸性プロテアーゼ、および動物酸性プロテアーゼから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記酸性プロテアーゼは、レンニン、キモシン、プラスメプシン、カテプシンＤ、カテプシンＥ、ヒト尿酸プロテアーゼ、ＨＩＶプロテアーゼ、ニューロスポラ・オリゼープロテアーゼ、ムコール・プシルスプロテアーゼ、ムコール・ミエヘイプロテアーゼ、アスペルギルス・ニゲルプロテアーゼ、リゾプス・キネンシスプロテアーゼ、エンダチア・パラシティカプロテアーゼ、酵母プロテイナーゼＡ、アスペルギロペプシノゲン、リゾプスペプシン、ペニシロペプシン、およびエンドチアペプシンから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記活性酸性プロテアーゼが消化緩衝剤中にある、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記酸性プロテアーゼは、６．５以上のｐＨによって不活性化される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドは、変形細胞溶解物のリポ多糖結合ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記変形細胞溶解物は、アメリカカブトガニ、カブトガニ、マルオカブトガニ、およびミナミカブトガニの溶解物から成る群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドは、因子Ｃタンパク質のリポ多糖結合ドメインを含むポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
因子Ｃタンパク質のリポ多糖結合ドメインを含む前記ポリペプチドは、因子Ｃタンパク質のアミノ酸１−３３３、ｓｕｓｈｉ１ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ｓｕｓｈｉ１Δペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ｓｕｓｈｉ３ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ｓｕｓｈｉ３Δペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ｓｕｓｈｉ４ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、およびｓｕｓｈｉ５ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）から成る群より選択され、該因子Ｃタンパク質のアミノ酸１−３３３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸１−３３３である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料を前記１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドと接触させることは、前記試料を、因子Ｃタンパク質のリポ多糖結合ドメインを含む二量体または四量体と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記二量体または四量体は、ｓｕｓｈｉペプチドを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｓｕｓｈｉペプチドは、ｓｕｓｈｉ１ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ｓｕｓｈｉ２ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ｓｕｓｈｉ３ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ｓｕｓｈｉ１Δペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ｓｕｓｈｉ４ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ｓｕｓｈｉ５ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、およびｓｕｓｈｉ３Δペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）から成る群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドは、固体担体に連結される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料は、生体試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記生体試料は、血漿、血液、血清、尿、および唾液から成る群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドと、酸性プロテアーゼとを含む、試料中のグラム陰性菌またはリポ多糖を検出するためのキット。
【請求項１８】
前記１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドは、変形細胞溶解物のリポ多糖結合ポリペプチドである、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記変形細胞溶解物は、アメリカカブトガニ、カブトガニ、マルオカブトガニ、およびミナミカブトガニの溶解物から成る群より選択される、請求項１７に記載のキット。
【請求項２０】
前記酸性プロテアーゼは、ペプシンである、請求項１７に記載のキット。
【請求項２１】
前記酸性プロテアーゼは、レンニン、キモシン、プラスメプシン、カテプシンＤ、カテプシンＥ、ヒト尿酸プロテアーゼ、ＨＩＶプロテアーゼ、ニューロスポラ・オリゼープロテアーゼ、ムコール・プシルスプロテアーゼ、ムコール・ミエヘイプロテアーゼ、アスペルギルス・ニゲルプロテアーゼ、リゾプス・キネンシスプロテアーゼ、エンダチア・パラシティカプロテアーゼ、酵母プロテイナーゼＡ、アスペルギロペプシノゲン、リゾプスペプシン、ペニシロペプシン、およびエンドチアペプシンから成る群より選択される、請求項１７に記載のキット。
【請求項２２】
前記１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドは、因子Ｃタンパク質のリポ多糖結合ドメインを含むポリペプチドである、請求項１７に記載のキット。
【請求項２３】
因子Ｃタンパク質のリポ多糖結合ドメインを含む前記ポリペプチドは、ｓｕｓｈｉ１ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ｓｕｓｈｉ１Δペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ｓｕｓｈｉ３ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ｓｕｓｈｉ３Δペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ｓｕｓｈｉ４ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、およびｓｕｓｈｉ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）ペプチドから成る群より選択される、請求項２２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる、２００８年８月１８日出願の米国出願第１２／１９３，１６９号の便益を請求する。
【背景技術】
【０００２】
リポ多糖（ＬＰＳ）としても知られている内毒素は、グラム陰性菌の細胞膜の不可欠な構成要素であり、グラム陰性菌性敗血症中に発生する毒性作用の全てではなくても多くに関与する。ＬＰＳは、脂質Ａとして知られている、保存グルコサミンベースのリン脂質に共有結合している可変多糖ドメインから成る糖脂質の混合物である。ＬＰＳは、腫瘍壊死因子−Ｉ（ＴＮＦ−Ｉ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、およびインターロイキン−８（ＩＬ−８）を含む、多様な炎症性サイトカインを分泌するように、宿主単球およびマクロファージを直接刺激する。宿主マクロファージによる、これらのサイトカインの過剰放出は、グラム陰性菌性敗血症の発作後に発生する臓器不全および死亡の一因となる。ＬＰＳによって示される炎症誘発性生物活性は、典型的には、脂質Ａ部分の中に存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本明細書では、試料中のグラム陰性菌またはリポ多糖を検出するための方法を提供する。例えば、不活性酸性プロテアーゼの存在下で、試料を１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドと接触させることと、１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドが試料に結合するかどうかを判定することとを含む、試料中のグラム陰性菌またはリポ多糖を検出するための方法を提供する。結合は、試料がグラム陰性菌またはリポ多糖を含有することを示す。また、本明細書では、試料中のタンパク質の分解をもたらす条件下で、試料を活性酸性プロテアーゼと接触させることと、不活性酸性プロテアーゼの存在下で、試料を１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドと接触させることと、１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドが試料に結合するかどうかを判定することとを含む、試料中のグラム陰性菌またはリポ多糖を検出するための方法も提供する。
【０００４】
試料中のタンパク質の分解をもたらす条件下で、試料を活性酸性プロテアーゼと接触させることと、試料を変形細胞溶解物とさらに接触させることと、ゲル化反応が前記変形細胞溶解物において発生するかどうかを判定することとを含む、試料中のグラム陰性菌またはリポ多糖を検出するための方法を提供する。
【０００５】
試料中のグラム陰性菌またはリポ多糖を検出するためのキットを提供する。キットは、酸性プロテアーゼを含む。キットはまた、１つ以上の変形細胞溶解物および／または１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドも含む。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
試料中のグラム陰性菌またはリポ多糖を検出するための方法であって、
（ａ）不活性酸性プロテアーゼの存在下で、前記試料を１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドと接触させるステップと、
（ｂ）前記１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドが前記試料に結合するかどうかを判定するステップであって、結合は、前記試料がグラム陰性菌またはリポ多糖を含有することを示す、ステップと、
を含む、方法。
（項目２）
前記酸性プロテアーゼは、ペプシンである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記酸性プロテアーゼは、真菌酸性プロテアーゼ、微生物酸性プロテアーゼ、および動物酸性プロテアーゼから成る群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記酸性プロテアーゼは、レンニン、キモシン、プラスメプシン、カテプシンＤ、カテプシンＥ、ヒト尿酸プロテアーゼ、ＨＩＶプロテアーゼ、ニューロスポラ・オリゼープロテアーゼ、ムコール・プシルスプロテアーゼ、ムコール・ミエヘイプロテアーゼ、アスペルギルス・ニゲルプロテアーゼ、リゾプス・キネンシスプロテアーゼ、エンダチア・パラシティカプロテアーゼ、酵母プロテイナーゼＡ、アスペルギロペプシノゲン、リゾプスペプシン、ペニシロペプシン、およびエンドチアペプシンから成る群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目５）
ステップ（ａ）の前に、前記酸性プロテアーゼを不活性化することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
ステップ（ａ）の前に、前記試料中のタンパク質の分解をもたらす条件下で、前記試料を活性酸性プロテアーゼと接触させることをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
消化緩衝剤は、前記活性酸性プロテアーゼを含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
ステップ（ａ）の前であるが、前記試料を活性酸性プロテアーゼと接触させる前に、前記酸性プロテアーゼを不活性化させることをさらに含む、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記酸性プロテアーゼは、約７．０のｐＨによって不活性化される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドは、変形細胞溶解物のリポ多糖結合ポリペプチドである、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記変形細胞溶解物は、アメリカカブトガニ、カブトガニ、マルオカブトガニ、およびミナミカブトガニの溶解物から成る群より選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドは、因子Ｃタンパク質のリポ多糖結合ドメインを含むポリペプチドである、項目１に記載の方法。
（項目１３）
因子Ｃタンパク質のリポ多糖結合ドメインを含む前記ポリペプチドは、因子Ｃタンパク質のアミノ酸１−３３３、ｓｕｓｈｉ−１ペプチド、ｓｕｓｈｉ−１Δペプチド、ｓｕｓｈｉ−３ペプチド、ｓｕｓｈｉ−３Δペプチド、ｓｕｓｈｉ４ペプチド、およびｓｕｓｈｉ５ペプチドから成る群より選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドはさらに、レポータータンパク質または親和性標識を含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、アルカリホスフォターゼ、ペルオキシダーゼ、およびルシフェラーゼから成る群より選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記親和性標識は、ポリヒスチジン、アビジン、ストレプトアビジン、またはビオチンである、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドは、検出可能に標識化される、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記検出可能な標識は、蛍光標識である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記試料を前記１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドと接触させることは、前記試料を、因子Ｃタンパク質のリポ多糖結合ドメインを含む二量体または四量体と接触させることを含む、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記二量体または四量体は、ｓｕｓｈｉペプチドを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ｓｕｓｈｉペプチドは、ｓｕｓｈｉ１ペプチド、ｓｕｓｈｉ２ペプチド、ｓｕｓｈｉ３ペプチド、ｓｕｓｈｉ１−ペプチド、ｓｕｓｈｉ４ペプチド、ｓｕｓｈｉ５ペプチド、およびｓｕｓｈｉ３−ペプチドから成る群より選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドは、固体担体に連結される、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記固体担体は、カラムまたはプレートである、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記固体担体は、移動固体担体である、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記移動固体担体は、磁気ビーズである、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記移動固体担体は、蛍光ビーズである、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記試料は、生体試料である、項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記生体試料は、血漿、血液、血清、尿、および唾液から成る群より選択される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
試料中のグラム陰性菌またはリポ多糖を検出するための方法であって、
（ａ）前記試料中のタンパク質の分解をもたらす条件下で、前記試料を活性酸性プロテアーゼと接触させるステップと、
（ｂ）前記試料を変形細胞溶解物とさらに接触させるステップと、
（ｃ）ゲル化反応が前記変形細胞溶解物において発生するかどうかを判定するステップであって、ゲル化反応は、前記試料がグラム陰性菌またはリポ多糖を含有することを示す、ステップと、
を含む、方法。
（項目３０）
前記変形細胞溶解物は、アメリカカブトガニ、カブトガニ、マルオカブトガニ、およびミナミカブトガニの溶解物から成る群より選択される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
変形細胞溶解物と、酸性プロテアーゼとを含む、試料中のグラム陰性菌またはリポ多糖を検出するためのキット。
（項目３２）
前記変形細胞溶解物は、アメリカカブトガニ、カブトガニ、マルオカブトガニ、およびミナミカブトガニの溶解物から成る群より選択される、項目３１に記載のキット。
（項目３３）
前記酸性プロテアーゼは、ペプシンである、項目３１に記載のキット。
（項目３４）
前記酸性プロテアーゼは、レンニン、キモシン、プラスメプシン、カテプシンＤ、カテプシンＥ、ヒト尿酸プロテアーゼ、ＨＩＶプロテアーゼ、ニューロスポラ・オリゼープロテアーゼ、ムコール・プシルスプロテアーゼ、ムコール・ミエヘイプロテアーゼ、アスペルギルス・ニゲルプロテアーゼ、リゾプス・キネンシスプロテアーゼ、エンダチア・パラシティカプロテアーゼ、酵母プロテイナーゼＡ、アスペルギロペプシノゲン、リゾプスペプシン、ペニシロペプシン、およびエンドチアペプシンから成る群より選択される、項目３１に記載のキット。
（項目３５）
１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドと、酸性プロテアーゼとを含む、試料中のグラム陰性菌またはリポ多糖を検出するためのキット。
（項目３６）
前記１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドは、変形細胞溶解物のリポ多糖結合ポリペプチドである、項目３５に記載のキット。
（項目３７）
前記変形細胞溶解物は、アメリカカブトガニ、カブトガニ、マルオカブトガニ、およびミナミカブトガニの溶解物から成る群より選択される、項目３５に記載のキット。
（項目３８）
前記酸性プロテアーゼは、ペプシンである、項目３５に記載のキット。
（項目３９）
前記酸性プロテアーゼは、レンニン、キモシン、プラスメプシン、カテプシンＤ、カテプシンＥ、ヒト尿酸プロテアーゼ、ＨＩＶプロテアーゼ、ニューロスポラ・オリゼープロテアーゼ、ムコール・プシルスプロテアーゼ、ムコール・ミエヘイプロテアーゼ、アスペルギルス・ニゲルプロテアーゼ、リゾプス・キネンシスプロテアーゼ、エンダチア・パラシティカプロテアーゼ、酵母プロテイナーゼＡ、アスペルギロペプシノゲン、リゾプスペプシン、ペニシロペプシン、およびエンドチアペプシンから成る群より選択される、項目３５に記載のキット。
（項目４０）
前記１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドは、因子Ｃタンパク質のリポ多糖結合ドメインを含むポリペプチドである、項目３５に記載のキット。
（項目４１）
因子Ｃタンパク質のリポ多糖結合ドメインを含む前記ポリペプチドは、ｓｕｓｈｉ−１ペプチド、ｓｕｓｈｉ−１Δペプチド、ｓｕｓｈｉ−３ペプチド、ｓｕｓｈｉ−３Δペプチド、ｓｕｓｈｉ４ペプチド、およびｓｕｓｈｉ５ペプチドから成る群より選択される、項目４０に記載のキット。
（項目４２）
前記１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドはさらに、レポータータンパク質または親和性標識を含む、項目４０に記載のキット。
（項目４３）
前記レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、アルカリホスフォターゼ、ペルオキシダーゼ、およびルシフェラーゼから成る群より選択される、項目４２に記載のキット。
（項目４４）
前記親和性標識は、ポリヒスチジンまたはビオチンである、項目４２に記載のキット。
（項目４５）
前記リポ多糖結合ポリペプチドは、検出可能に標識化される、項目３５に記載のキット。
（項目４６）
前記検出可能な標識は、蛍光標識である、項目４５に記載のキット。
（項目４７）
前記リポ多糖結合ポリペプチドは、因子Ｃタンパク質の前記リポ多糖結合ドメインを含む二量体または四量体である、項目３５に記載のキット。
（項目４８）
前記二量体または四量体は、ｓｕｓｈｉペプチドを含む、項目４７に記載のキット。
（項目４９）
前記ｓｕｓｈｉペプチドは、ｓｕｓｈｉ１ペプチド、ｓｕｓｈｉ２ペプチド、ｓｕｓｈｉ３ペプチド、ｓｕｓｈｉ１−ペプチド、ｓｕｓｈｉ４ペプチド、ｓｕｓｈｉ５ペプチド、およびｓｕｓｈｉ３−ペプチドから成る群より選択される、項目４８に記載のキット。
（項目５０）
前記１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドは、固体担体に連結される、項目３５に記載のキット。
（項目５１）
前記固体担体は、カラムまたはプレートである、項目５０に記載のキット。
（項目５２）
前記固体担体は、移動固体担体である、項目５０に記載のキット。
（項目５３）
前記移動固体担体は、磁気ビーズである、項目５２に記載のキット。
（項目５４）
前記移動固体担体は、蛍光ビーズである、項目５２に記載のキット。
（項目５５）
１つ以上の緩衝剤をさらに含む、項目３５に記載のキット。
（項目５６）
前記緩衝剤は、消化緩衝剤である、項目５５に記載のキット。
（項目５７）
前記１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドおよび前記酸性プロテアーゼは、別個の容器の中にある、項目３５に記載のキット。
（項目５８）
前記１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドおよび前記酸性プロテアーゼは、同じ容器の中にある、項目３５に記載のキット。
（項目５９）
前記酸性プロテアーゼは、不活性酸性プロテアーゼである、項目３５に記載のキット。
（項目６０）
不活性酸性プロテアーゼをさらに含む、項目３５に記載のキット。
【０００６】
１つ以上の態様の詳細を、以下の添付図面および説明において記載する。他の特徴、目的、および利点が、説明および図面から、ならびに請求項から明白となるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物（ＢｉｏＤｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）によるペプチドＸの処理を示す。図１Ａは、内毒素検出においてペプチドＸの阻害作用を克服するために必要とされるペプチド希釈の程度を実証する、ＰＰＣ阻害試験のグラフである。図１Ｂは、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物による処理の前後のペプチドＸの試料における１ＥＵ／ｍｌのＰＰＣの回収を実証するグラフである。図１Ｃは、ペプチドＸの試料における規定の内毒素汚染の回収を実証するグラフである。図１Ｄは、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物処理によるペプチドＸ分解を示す、ＰＡＧＥゲルの画像である。
【図１Ｂ】ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物（ＢｉｏＤｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）によるペプチドＸの処理を示す。図１Ａは、内毒素検出においてペプチドＸの阻害作用を克服するために必要とされるペプチド希釈の程度を実証する、ＰＰＣ阻害試験のグラフである。図１Ｂは、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物による処理の前後のペプチドＸの試料における１ＥＵ／ｍｌのＰＰＣの回収を実証するグラフである。図１Ｃは、ペプチドＸの試料における規定の内毒素汚染の回収を実証するグラフである。図１Ｄは、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物処理によるペプチドＸ分解を示す、ＰＡＧＥゲルの画像である。
【図１Ｃ】ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物（ＢｉｏＤｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）によるペプチドＸの処理を示す。図１Ａは、内毒素検出においてペプチドＸの阻害作用を克服するために必要とされるペプチド希釈の程度を実証する、ＰＰＣ阻害試験のグラフである。図１Ｂは、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物による処理の前後のペプチドＸの試料における１ＥＵ／ｍｌのＰＰＣの回収を実証するグラフである。図１Ｃは、ペプチドＸの試料における規定の内毒素汚染の回収を実証するグラフである。図１Ｄは、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物処理によるペプチドＸ分解を示す、ＰＡＧＥゲルの画像である。
【図１Ｄ】ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物（ＢｉｏＤｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）によるペプチドＸの処理を示す。図１Ａは、内毒素検出においてペプチドＸの阻害作用を克服するために必要とされるペプチド希釈の程度を実証する、ＰＰＣ阻害試験のグラフである。図１Ｂは、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物による処理の前後のペプチドＸの試料における１ＥＵ／ｍｌのＰＰＣの回収を実証するグラフである。図１Ｃは、ペプチドＸの試料における規定の内毒素汚染の回収を実証するグラフである。図１Ｄは、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物処理によるペプチドＸ分解を示す、ＰＡＧＥゲルの画像である。
【図２Ａ】ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物によるＳｕｓｈｉ３ペプチドの処理を示す。図２Ａは、内毒素検出においてＳｕｓｈｉ３ペプチドの阻害作用を克服するために必要とされるペプチド希釈の程度を実証する、ＰＰＣ阻害試験のグラフである。図２Ｂは、Ｓｕｓｈｉ３ペプチドの試料における規定の内毒素汚染の回収を実証するグラフである。図２Ｃは、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）処理プロテアーゼ組成物によるＳｕｓｈｉ３ペプチド分解を実証する、ＰＡＧＥゲルの画像である。
【図２Ｂ】ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物によるＳｕｓｈｉ３ペプチドの処理を示す。図２Ａは、内毒素検出においてＳｕｓｈｉ３ペプチドの阻害作用を克服するために必要とされるペプチド希釈の程度を実証する、ＰＰＣ阻害試験のグラフである。図２Ｂは、Ｓｕｓｈｉ３ペプチドの試料における規定の内毒素汚染の回収を実証するグラフである。図２Ｃは、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）処理プロテアーゼ組成物によるＳｕｓｈｉ３ペプチド分解を実証する、ＰＡＧＥゲルの画像である。
【図２Ｃ】ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物によるＳｕｓｈｉ３ペプチドの処理を示す。図２Ａは、内毒素検出においてＳｕｓｈｉ３ペプチドの阻害作用を克服するために必要とされるペプチド希釈の程度を実証する、ＰＰＣ阻害試験のグラフである。図２Ｂは、Ｓｕｓｈｉ３ペプチドの試料における規定の内毒素汚染の回収を実証するグラフである。図２Ｃは、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）処理プロテアーゼ組成物によるＳｕｓｈｉ３ペプチド分解を実証する、ＰＡＧＥゲルの画像である。
【図３Ａ】ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物によるヘモグロビンの処理を示す。図３Ａは、ウシ赤血球からのヘモグロビンの試料における内因性内毒素汚染の回収を実証するグラフである。図３Ｂは、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物処理によるヘモグロビン分解を実証する、ＰＡＧＥゲルの画像である。ゲルは、３つの異なるヘモグロビン集団をもたらす非還元条件下で実行された。各ヘモグロビン集団およびＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼの位置が示されている。
【図３Ｂ】ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物によるヘモグロビンの処理を示す。図３Ａは、ウシ赤血球からのヘモグロビンの試料における内因性内毒素汚染の回収を実証するグラフである。図３Ｂは、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物処理によるヘモグロビン分解を実証する、ＰＡＧＥゲルの画像である。ゲルは、３つの異なるヘモグロビン集団をもたらす非還元条件下で実行された。各ヘモグロビン集団およびＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼの位置が示されている。
【図４Ａ】ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物によるＢＳＡの処理を示す。図４Ａは、ＢＳＡの試料における規定の内毒素汚染の回収を実証するグラフである。図４Ｂは、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物処理によるＢＳＡ分解を実証する、ＰＡＧＥゲルの画像である。ＢＳＡおよびＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼの位置が示されている。
【図４Ｂ】ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物によるＢＳＡの処理を示す。図４Ａは、ＢＳＡの試料における規定の内毒素汚染の回収を実証するグラフである。図４Ｂは、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物処理によるＢＳＡ分解を実証する、ＰＡＧＥゲルの画像である。ＢＳＡおよびＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼの位置が示されている。
【図５Ａ】ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物によるＩｇＧの処理を示す。図５Ａは、血漿からのウサギＩｇＧの試料における規定の内毒素汚染の回収を実証するグラフである。図５Ｂは、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物処理によるＩｇＧ分解を実証する、ＰＡＧＥゲルの画像である。ゲルは、軽鎖および重鎖の分離をもたらす還元条件下で実行された。消化は、大型断片および小型Ｆｃ断片への重鎖の切断をもたらす。軽鎖および重鎖、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ、および消化産物の位置が示されている。
【図５Ｂ】ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物によるＩｇＧの処理を示す。図５Ａは、血漿からのウサギＩｇＧの試料における規定の内毒素汚染の回収を実証するグラフである。図５Ｂは、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物処理によるＩｇＧ分解を実証する、ＰＡＧＥゲルの画像である。ゲルは、軽鎖および重鎖の分離をもたらす還元条件下で実行された。消化は、大型断片および小型Ｆｃ断片への重鎖の切断をもたらす。軽鎖および重鎖、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ、および消化産物の位置が示されている。
【図６】組み換え因子Ｃ（ｒＦＣ）活性に対するペプシンの作用を示すグラフである。示されたデータは、６０分間のＰｙｒｏＧｅｎｅ（登録商標）Ｌｏｎｚａ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）インキュベーションからのものである。データ点に黒丸を伴う黒い実線は、水中のＬＰＳからの結果を示す。データ点に白丸を伴う黒い実線は、０．０５％ペプシンを含有する水中のＬＰＳからの結果を示す。データ点に三角形を伴う点線は、水の値を示す。ペプシンによる処理は、蛍光発光の増加によって証明されるように、ｒＦＣ酵素の活性を強化する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
内毒素が、負電荷、脂質、および炭水化物を含有するため、多くのタンパク質は、内毒素に結合し、それを適正に測定する試験の能力に影響を及ぼすことが知られている。具体的には、内毒素に結合するタンパク質は、標準試験において阻害または強化のいずれかを引き起こし、偽陽性および陰性をもたらし、ならびに精度に影響を及ぼし得る。例えば、ダイズトリプシン阻害因子、アルファ２マクログロブリン、アプロチニン、抗プラスミン、抗トロンビンＩＩＩ、抗トリプシン、およびヒルジン等の、セリンプロテアーゼ阻害因子が、内毒素を検出する方法を阻害する。以下の実施例で説明されるように、酸性プロテアーゼによる、血清および血液試料を含む、そのような試料の処理は、内毒素に影響を及ぼすことなく、試料中のタンパク質を分解し、したがって、内毒素検出試験の精度を増加させる。酸性プロテアーゼは、例えば、ＬＡＬ、因子Ｃ、およびサイトカインＥＬＩＳＡ試験で使用することができる。グラム陰性菌感染の診断のための種々の試験がある。製薬および医療業界で使用されている現在の試験は、カブトガニ変形細胞溶解物（ＬＡＬ）と呼ばれる物質に基づく。溶解物は、内毒素の存在下で反応するタンパク質を含有する。
【０００９】
因子Ｃは、セリンプロテアーゼチモーゲンである。これは、凝固連鎖を開始するようにＬＰＳによって活性化されるマルオカブトガニ変形細胞溶解物（ＣＡＬ）中の鍵酵素である。因子Ｃ活性は、医薬品の品質管理で使用されるフェムトグラムレベルの内毒素に対する高感度試験の基礎である。内毒素の検出における因子Ｃの重要性は、内毒素の検出の感度のバッチ間および季節変動を軽減する代替源として、組み換え因子ＣであるｒＦＣの発現につながっている。
【００１０】
不活性ペプシンおよび不活性ＨＩＶプロテアーゼ等の不活性酸性プロテアーゼは、シャペロンの役割を果たし、適正な立体配座で因子Ｃを維持することによって、因子Ｃの活性を強化する。シャペロンの役割を果たす不活性ペプシンおよび不活性ＨＩＶプロテアーゼの能力が説明されている（Ｈｕｌｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６：６４４−５３（２００７））。
【００１１】
本明細書では、試料中のグラム陰性菌またはリポ多糖を検出するための改良型方法およびキットを提供する。例えば、本明細書では、不活性酸性プロテアーゼの存在下で、試料を１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドと接触させることと、１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドが試料に結合するかどうかを判定することとを含む、試料中のグラム陰性菌またはリポ多糖を検出するための方法を提供する。結合は、試料がグラム陰性菌またはリポ多糖を含有することを示す。随意で、方法はさらに、試料を１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドと接触させる前に、酸性プロテアーゼを不活性化することを含む。随意で、方法はさらに、試料を１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドと接触させる前に、試料中のタンパク質の分解をもたらす条件下で、試料を活性酸性プロテアーゼと接触させることを含む。本明細書では、試料中のタンパク質の分解をもたらす条件下で、試料を活性酸性プロテアーゼと接触させることと、不活性酸性プロテアーゼの存在下で、試料を１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドと接触させることと、１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドが試料に結合するかどうかを判定することとを含む、試料中のグラム陰性菌またはリポ多糖を検出するための方法を提供する。結合は、試料がグラム陰性菌またはリポ多糖を含有することを示す。随意で、方法はさらに、試料を活性酸性プロテアーゼと接触させた後に、酸性プロテアーゼを不活性化することを含む。随意で、消化緩衝剤は、活性酸性プロテアーゼを含む。随意で、酸性プロテアーゼは、約７．０のｐＨによって不活性化される。
【００１２】
また、試料中のタンパク質の分解をもたらす条件下で、試料を活性酸性プロテアーゼと接触させることと、試料を変形細胞溶解物とさらに接触させることと、ゲル化反応が変形細胞溶解物において発生するかどうかを判定することとを含む、試料中のグラム陰性菌またはリポ多糖を検出するための方法も提供する。ゲル化反応は、試料がグラム陰性菌またはリポ多糖を含有することを示す。随意で、変形細胞溶解物は、アメリカカブトガニ、カブトガニ、マルオカブトガニ、およびミナミカブトガニの溶解物から成る群より選択される。
【００１３】
提供された方法およびキットで使用するために好適なリポ多糖結合ポリペプチドは、変形細胞溶解物のリポ多糖結合ポリペプチドを含む。変形細胞溶解物は、随意で、アメリカカブトガニ、カブトガニ、マルオカブトガニ、およびミナミカブトガニの溶解物から成る群より選択される。随意で、１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドは、因子Ｃタンパク質のリポ多糖結合ドメインを含むポリペプチドである。因子Ｃの内毒素／脂質Ａ結合ドメインは、ｒＦＣＥＳによって包含されるタンパク質のアミノ末端部分、つまり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８と番号付けられた最初の３５０個のアミノ酸内に位置する。因子Ｃタンパク質、およびｓｕｓｈｉドメインを含むそのドメインは、その全体で参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第６，７１９，９７３号で説明されている。米国特許第６，７１９，９７３号はまた、因子Ｃタンパク質のｓｕｓｈｉペプチド、およびｓｕｓｈｉペプチドを作製し、使用するための方法も開示している。したがって、因子Ｃタンパク質のリポ多糖結合ドメインは、随意で、ｓｕｓｈｉドメインまたはペプチドである。因子Ｃタンパク質のリポ多糖結合ドメインは、例えば、因子Ｃタンパク質のアミノ酸１−３３３（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸１−３３３）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸２９−３３０、因子Ｃタンパク質のｓｕｓｈｉ１ドメイン（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸２９−２０１）、因子Ｃタンパク質のｓｕｓｈｉ２ドメイン（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸１９５−２６０）、因子Ｃタンパク質のｓｕｓｈｉ３ドメイン（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸２６４−３３０）、因子Ｃタンパク質のｓｕｓｈｉ１ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ｓｕｓｈｉ２ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ｓｕｓｈｉ３ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ｓｕｓｈｉ１Δペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ｓｕｓｈｉ３Δペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ｓｕｓｈｉ４ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、またはｓｕｓｈｉ５ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）である。
【００１４】
随意で、試料を１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドと接触させることは、試料を、因子Ｃタンパク質のリポ多糖結合ドメインを含む二量体または四量体と接触させることを含む。本明細書で使用されるように、因子Ｃ二量体という語句は、一緒に結び付けられた、因子Ｃタンパク質またはその一部の２つの分子を指す。提供された因子Ｃ二量体は、第１および第２のポリペプチドを含み、第１および第２のポリペプチドはそれぞれ、因子Ｃタンパク質のリポ多糖結合ドメインを含む。随意で、第１および第２のポリペプチドは、同じ、または異なるポリペプチドである。随意で、因子Ｃタンパク質のリポ多糖結合ドメインは、ｓｕｓｈｉペプチドである。ｓｕｓｈｉペプチドは、ｓｕｓｈｉ１ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ｓｕｓｈｉ２ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ｓｕｓｈｉ３ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ｓｕｓｈｉ１Δペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ｓｕｓｈｉ３Δペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ｓｕｓｈｉ４ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、またはｓｕｓｈｉ５ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）となり得る。随意で、ｓｕｓｈｉペプチドは、ｓｕｓｈｉ３ペプチドまたはｓｕｓｈｉ３Δペプチドである。随意で、因子Ｃ二量体のポリペプチドは、ジスルフィド結合によって結び付けられる。ジスルフィド結合は、システイン残基間の結合である。随意で、因子Ｃ二量体を含む第１および第２のポリペプチドのそれぞれは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１、２、３、４、５、６、または７から成る。
【００１５】
タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、またはペプチド部分という用語は、ペプチド結合によって結び付けられた２つ以上のアミノ酸を意味するために、本明細書で広範に使用される。ペプチドおよびポリペプチドという用語は、分子を含むアミノ酸の特定のサイズまたは数を示唆するために本明細書で使用されず、ペプチドは、最大で数個以上のアミノ酸残基を含有できることを認識されたい。提供されたペプチドは、ポリペプチド上のタンパク質分解反応、すなわち、ポリペプチドにおけるペプチドの切断時に産生されるペプチドによって産生される。提供されたペプチドは、随意で、合成ポリペプチドを産生するように、化学合成の方法または組み換えＤＮＡ技術の方法を使用して産生される。例えば、提供されたペプチドは、標準Ｆｍｏｃ保護基および疑似プロリンを使用した、２−クロロトリチル樹脂上の段階的固相ペプチド合成を使用して合成される。代替として、ペプチドは、化学的に合成された２つ以上のより小さいペプチドを組み合わせることによって合成される。
【００１６】
前述のペプチド配列、変異体、およびその断片をコード化する核酸も開示する。これらの配列は、特定のポリペプチド配列に関する全ての縮退配列、すなわち、１つの特定のポリペプチド配列をコード化する配列を有する全ての核酸、ならびに、ポリペプチド配列の開示された変異体および誘導体をコード化する縮退核酸を含む、全ての核酸を含む。したがって、それぞれの特定の核酸配列が、本明細書で全部書き出されない場合があるが、開示されたタンパク質配列を通して、あらゆる配列が本明細書で事実上開示され、説明されていることを理解されたい。因子Ｃペプチドならびに断片、イソ型、および変異体を産生するために、多種多様な発現系が使用される。
【００１７】
本明細書で提供される核酸配列は、核酸属の例であり、限定的となることを目的としない。また、ペプチド配列、変異体、またはその断片をコード化する核酸を含む、発現ベクターも提供し、核酸は、発現制御配列に動作可能に結び付けられる。さらに、発現ベクターを含む培養細胞も提供する。そのような発現ベクターおよび培養細胞は、提供されたペプチドを作製するために使用することができる。
【００１８】
単離または精製により、通常は組成物が性質的に関連付けられる材料を含む、他の材料を実質的に含まない組成物（例えば、ポリペプチドまたは核酸）を意味する。本発明のポリペプチド、またはその断片は、例えば、天然源からの抽出によって、（例えば、細胞の中または無細胞翻訳系の中の）ポリペプチドをコード化する組み換え核酸の発現によって、またはポリペプチドを化学合成することによって得られる。
【００１９】
提供された方法およびキットでは、リポ多糖結合ポリペプチドは、随意で、検出可能な部分で標識化され、または、レポータータンパク質あるいは親和性標識をさらに含む。リポ多糖結合ポリペプチドは、直接標識化されるか、または間接的に標識化される（例えば、検出可能な部分で標識化される二次または三次抗体によって）。放射性同位体、蛍光標識、および酵素・基質標識を含むが、それらに限定されない、多数の標識が利用可能である。放射性同位体は、例えば、３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、および１３１Ｉを含む。蛍光標識は、例えば、希土類キレート（ユーロピウムキレート）、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリン、およびテキサスレッドを含む。標識は、随意で、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １  ａｎｄ  ２，Ｃｏｌｉｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．，（１９９１）で開示されている技法を使用して、抗原結合パートナーに共役される。
【００２０】
酵素・基質標識を使用する時、酵素は、好ましくは、種々の技法を使用して測定することができる、発色基質の化学的変質に触媒作用を及ぼす。例えば、酵素は、分光光度法で測定することができる、基質の色の変化に触媒作用を及ぼす。代替として、酵素は、基質の蛍光発光または化学発光を改変する。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起され、次いで、（例えば、化学照度計を使用して）測定することができる光を発し、または蛍光受容体にエネルギーを提供する。酵素標識の例は、ルシフェラーゼ（例えば、蛍ルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸脱水素酵素、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等のペルオキシダーゼ、アルカリホスフォターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ（例えば、ブドウ糖酸化酵素、ガラクトース酸化酵素、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環酸化酵素（ウリカーゼおよびキサンチン酸化酵素等）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、および同等物を含む。酵素を共役させるための技法は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．（ｅｄ  Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ＆Ｈ．Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，７３：１４７−１６６（１９８１）で説明されている。酵素・基質の組み合わせの例は、例えば、基質として水素ペルオキシダーゼを伴う西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、発色基質としてパラ・ニトロフェニルリン酸塩を伴うアルカリホスフォターゼ（ＡＰ）、および発色基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）、または蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを伴うβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）を含む。
【００２１】
試験が随意採用されてもよく、リポ多糖結合ポリペプチドは、例えば、カラム、チップ、またはプレート等の固体担体に付着される。固体担体は、随意で、移動固体担体（例えば、ビーズ）である。被検体または対照に由来する試料は、固体担体を通過させられる（すなわち、固体担体と接触させられる）。次いで、標識化されたリポ多糖結合ポリペプチドが、固体担体に添加される。標的に付着されている検出された標識の量は、試料中の標的の数量と相関する。例えば、リポ多糖結合ポリペプチドは、マイクロタイタープレートの底部で固定化される。次いで、試料中に存在する場合、グラム陰性菌、内毒素、またはリポ多糖へのリポ多糖結合ポリペプチドの結合を可能にする条件下で、検査される試料が、マイクロタイタープレートに添加される。例えば、ビオチンで標識化される、第２のリポ多糖結合ポリペプチドが、マイクロタイタープレートに添加される。標識化されたポリペプチドは、アルカリホスフォターゼに連結されたアビジンで検出される。アルカリホスフォターゼに連結されたアビジンは、４０５ｎｍで測定することができる黄色を生じるｐ−ニトロフェリルリン酸（ｐＮＡ）基質からｐ−ニトロフェノールを解放することによって、結合され、標識化されたポリペプチドを検出する。
【００２２】
ＦＡＣＳ選別が、例えば、蛍光標識化されたビーズを検出し、数量で表すために使用される。例えば、リポ多糖結合ポリペプチドは、ビーズに結び付けられる。次いで、ビーズは、検査される試料と接触させられる。例えば、蛍光標識で標識化される、第２のリポ多糖結合ポリペプチドが、検査試料と接触させられているビーズに添加される。次いで、結合され、標識化されたビーズが、１つ以上の蛍光標識に基づくＦＡＣＳ選別機を使用して、検出され、数量で表される。随意で、ビーズは、磁気ビーズまたは蛍光ビーズである。例えば、リポ多糖結合ポリペプチドは、全血または血清のような血液製剤等の生体試料に添加することができる、ビーズ等の移動固体担体に結び付けられる。随意で、リポ多糖結合ポリペプチドは、鉄ビーズ等の磁気ビーズに結び付けられ、磁場によって除去される。
【００２３】
別の実施例として、リポ多糖結合ポリペプチドは、例えば、カラム、フィルタ、または膜等の不動固体担体上で固定化される。したがって、リポ多糖結合ポリペプチドは、全血または血液製剤から細菌および／または内毒素を除去するように、例えば、血液透析膜または濾過システム上で固定化される。したがって、本明細書で使用されるような担体とは、リポ多糖結合ポリペプチドを固定化する働きをする、当技術分野で公知の固体担体等の、任意の支持マトリクスを指す。好適な担体は、セルロース、アクリレート、ポリアクリレート、ポリヒドロキシメタクリレート、ポリスチレン、デキストラン、アガロース、多糖類、親水性ビニルポリマー、重合誘導体、ならびに任意の多孔性または無孔性マトリクスから成る、またはそれらで被覆される、ガラス、アガロース、プラスチック、シリカ、ポリアクリルアミド、ヒドロゲル、ゲル、膜、フィルタ、メッシュ、ビーズ、または粒子を含むが、それらに限定されない。
【００２４】
随意で、リポ多糖結合ポリペプチドはさらに、レポータータンパク質または親和性標識を含む。好適なレポータータンパク質は、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、アルカリホスフォターゼ、ペルオキシダーゼ、およびルシフェラーゼを含む。親和性標識は、ポリヒスチジン、アビジン、ストレプトアビジン、およびビオチンを含むが、それらに限定されない。
【００２５】
試料は、随意で、生体試料である。本明細書で使用されるように、検査を受ける生体試料は、哺乳類またはヒト等の被検体に由来する試料であり、体液を含む任意の生体液を含むが、それに限定されない。体液の例は、全血、血清、尿、唾液、組織浸潤物、胸水、肺洗浄液、および同等物を含むが、それらに限定されない。生体液は、細胞培養液または培養細胞の浮遊物を含む。例えば、試料は、血液試料または血清試料となり得る。随意で、試料は、例えば、研究室または臨床検査室あるいは病院で使用される、水または他の作用物質等の液体試料である。随意で、試料は、流体、廃棄物、水、および雨試料を含むがそれらに限定されない、環境試料である。随意で、環境試料は、提供された方法で分析するために、例えば、病院内の表面から取得される。例えば、試料は、病院、臨床、または研究室の現場で使用されるデバイスから取得し、グラム陰性菌の存在について分析することができる。随意で、試料は、分析の前に溶液中で希釈される。随意で、検査される試料は、分解を必要とするポリペプチドを含む。したがって、例えば、試料は、標準内毒素試験を阻害するポリペプチド、例えば、セリンプロテアーゼ阻害因子を含む。
【００２６】
本明細書で使用されるように、酸、酸性、アスパラギン、またはアスパラギン酸プロテアーゼとは、低ｐＨで活性であるプロテアーゼを指す。例えば、プロテアーゼは、約０．０から約６．０のｐＨ、または０．０から６．０の間の任意のｐＨで活性である。そのようなプロテアーゼは、約６．０から約１４．０のｐＨで不活性である。本明細書で使用されるように、不活性酸性プロテアーゼとは、タンパク分解性活性がないプロテアーゼを指す（すなわち、ポリペプチドまたはタンパク質等のアミノ酸配列を切断することができないプロテアーゼ）。本明細書で使用されるように、活性酸性プロテアーゼは、タンパク分解性活性を伴うプロテアーゼを指す（すなわち、アミノ酸配列を切断することができるプロテアーゼ）。一例として、活性酸性プロテアーゼは、６．５以上のｐＨによって不活性化することができる（すなわち、プロテアーゼは６．５以上のｐＨの溶液の中にある）。溶液のｐＨは、溶液への化学物質の添加によって変化させることができる。例えば、ｐＨを低減するために塩酸を使用することができ、ｐＨを上昇させるために水酸化ナトリウムを使用することができる。約６．５のｐＨを維持するために、リン酸を使用することができる。随意で、ペプシンを不活性化するためにペプシン阻害因子が使用される。ペプシン阻害因子は、アセトアミジン、Ｎ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ジヨードチロシン、Ｎ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−フェニルアラニン、ｐ−アミノベンズアミジン、ベンズアミジン、ブチルアミン、ジアゾケトン、エチルアミン、ペプスタチン、およびフェニルアセトアミジンを含むが、それらに限定されない。
【００２７】
エンドペプチダーゼ等の酸または酸性プロテアーゼが知られており、３族、すなわち、ペプシン（Ａ１）、レトロペプシン（Ａ２）、およびパラレトロウイルスからの酵素（Ａ３）にグループ分けされている。Ａ１族およびＡ２族の構成要素が相互に関係することが知られている一方で、Ａ３族の構成要素は、Ａ１およびＡ２へのいくらかの関係性を示す。微生物酸性プロテアーゼは、ペプシンと同様である、ペプチド結合の両側にある芳香族または巨大アミノ酸残基に対する特異性を示すが、それらの作用は、ペプシンの作用ほど厳格ではない。酸性プロテアーゼは、微生物、真菌、ウイルス、動物、および植物酸性プロテアーゼを含む。微生物アスパラギン酸プロテアーゼは、（ｉ）アスペルギルス属、青カビ、クモノスカビ、およびアンパンカビによって産生されるペプシン様酵素、および（ｉｉ）エンドチアおよびムコール属によって産生されるレンニン様酵素といった、２つのグループに広く分けることができる（Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６２（３）：５９７−６３５（１９９８）；Ｒｉｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３５：４８１−９０（１９９８））。酸性プロテアーゼの例は、ペプシンＡ、Ｂ、およびＣを含むペプシン、レンニン、キモシン、プラスメプシン、例えば、カテプシンＤおよびカテプシンＥ等のカテプシン、ヒト尿酸プロテアーゼ、およびＨＩＶプロテアーゼのようなウイルスプロテアーゼを含むが、それらに限定されない。真菌プロテアーゼは、ニューロスポラ・オリゼー、ムコール・プシルス、ムコール・ミエヘイ、アスペルギルス・ニゲル、リゾプス・キネンシス、またはエンダチア・パラシティカに由来する真菌プロテアーゼを含むが、それらに限定されない。微生物プロテアーゼは、酵母プロテイナーゼＡ、アスペルギロペプシノゲン、リゾプスペプシン、ペニシロペプシン、およびエンドチアペプシンを含むが、それらに限定されない。
【００２８】
実施例１−６は、通常は内毒素検出を阻害する分子を含有する試料において内毒素検出を強化するために、酸性プロテアーゼを使用できることを実証する。通常は内毒素検出を阻害する分子は、短カチオン性ペプチド（すなわち、ペプチドＸ）、酵素（すなわち、Ｓｕｓｈｉ３ペプチド）、金属タンパク質（すなわち、ヘモグロビン）、循環タンパク質（すなわち、アルブミン）、および免疫グロブリン（すなわち、ＩｇＧ）等の、種々の異なる種類のペプチドを含む。実施例は、総タンパク質および少量のペプチドを含んだ。加えて、内因性および外因性内毒素の検出が実証された。示された全ての実施例では、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物による処理が、内毒素検出の精度を増加させた。
【００２９】
グラム陰性菌またはリポ多糖を検出するためのキットを提供する。キットは、酸性プロテアーゼを含む。キットはまた、１つ以上の変形細胞溶解物および／または１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドを含む。随意で、リポ多糖結合ポリペプチドは、変形細胞溶解物のリポ多糖結合ポリペプチドを含む。随意で、変形細胞溶解物は、アメリカカブトガニ、カブトガニ、マルオカブトガニ、およびミナミカブトガニの溶解物から成る群より選択される。上記で論議されるように、酸性プロテアーゼは、任意の酸性プロテアーゼとなり得る。例えば、酸性プロテアーゼは、ペプシン、レンニン、キモシン、プラスメプシン、カテプシンＤ、カテプシンＥ、ヒト尿酸プロテアーゼ、ＨＩＶプロテアーゼ、ニューロスポラ・オリゼープロテアーゼ、ムコール・プシルスプロテアーゼ、ムコール・ミエヘイプロテアーゼ、アスペルギルス・ニゲルプロテアーゼ、リゾプス・キネンシスプロテアーゼ、エンダチア・パラシティカプロテアーゼ、酵母プロテイナーゼＡ、アスペルギロペプシノゲン、リゾプスペプシン、ペニシロペプシン、およびエンドチアペプシンから成る群より選択される。また、上記で論議されるように、１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドは、例えば、因子Ｃタンパク質のリポ多糖結合ドメインを含むポリペプチドである。キットは、随意で、例えば、カラム、プレート、チップ、または移動固体担体等の等の固体担体を含む。移動固体担体は、例えば、磁気または蛍光ビーズである。随意で、キットはさらに、例えば、消化緩衝剤等の１つ以上の緩衝剤を含む。随意で、１つ以上の変形細胞溶解物および酸性プロテアーゼは、同じまたは別個の容器の中にある。随意で、１つ以上のリポ多糖結合ポリペプチドおよび酸性プロテアーゼは、同じまたは別個の容器の中にある。随意で、酸性プロテアーゼは、不活性である。随意で、キットは、活性酸性プロテアーゼおよび不活性酸性プロテアーゼを含み、活性酸性プロテアーゼは、不活性酸性プロテアーゼと同じであるか、または異なる。したがって、例えば、プロテアーゼが異なる場合、活性プロテアーゼは、ペプシンであり、不活性プロテアーゼは、キモシンである。
【００３０】
開示された方法および組成物に使用することができる、それらと併せて使用することができる、それらに備えて使用することができる、またはそれらの産物である、材料、組成物、および構成要素を開示する。これらの材料および他の材料を本明細書が開示され、これらの材料の組み合わせ、一部、相互作用、グループ等が開示される時に、これらの化合物のそれぞれの種々の個別かつ集合的な組み合わせおよび順列への具体的言及が明示的に開示されなくてもよい一方で、それぞれは本明細書で具体的に検討および説明されることが理解される。例えば、方法が開示および論議され、方法または方法のステップで使用される材料にいくつかの修正を行うことができる場合、特に反対に指示されない限り、方法および可能な修正のあらゆる組み合わせおよび順列が具体的に検討される。同様に、これらの任意の一部および組み合わせも、具体的に検討および開示される。したがって、方法で行うことができる、種々の追加ステップがある場合、これらの追加ステップのそれぞれを、開示された方法の任意の具体的方法ステップまたは方法ステップの組み合わせで行うことができ、それぞれのそのような組み合わせおよび組み合わせの一部は、具体的に検討され、開示されていると考慮されるべきであることが理解される。したがって、いくつかの態様が説明されている。それでもなお、種々の修正が行われてもよいことが理解されるであろう。さらに、１つの特性およびステップが説明される時に、たとえ組み合わせが明示的に記述されていなくても、本明細書の任意の他の特性またはステップと組み合わせることができる。したがって、本明細書で明示的な開示がなくても、開示された作用物質、ステップ、および特性の全ての組み合わせが提供される。
【００３１】
範囲は、およそ１つの特定の値から、および／またはおよそ別の特定の値までとして、本明細書で表現されてもよい。そのような範囲が表現される時、これは、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。同様に、先行する約を使用することによって、値が近似値として表現される時は、特定の値が開示されていると理解されるであろう。
【００３２】
本願の全体を通して、種々の出版物が参照される。これらの出版物の開示は、それらの全体で参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００３３】
以下の実施例は、本明細書で請求される化合物、組成物、部品、デバイス、および／または方法がどのように作製され、評価されるかという完全な開示および説明を当業者に提供するよう提示され、純粋に例示的となることを目的とし、本明細書で提供される方法および材料の範囲を限定することを目的としない。
【実施例】
【００３４】
実施例
一般方法
材料
試験の信頼性を立証するように、１ＥＵ／ｍｌの陽性産物対照（ＰＰＣ）を伴って、および伴わずに、製造業者の仕様に従ってＬｏｎｚａ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）のＰｙｒｏＧｅｎｅ（登録商標）試験で内毒素検出および定量化を行った。試験は、０．００１から１０ＥＵ／ｍｌの検出の範囲を有する。ヘモグロビン（ウシ赤血球）をＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から購入し、３００ＥＵ／ｍｇのレベルで内因性内毒素を含有した。ウサギＩｇＧ（血漿由来）もＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入し、約２ＥＵ／ｍｇを含有した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、＜１ＥＵ／ｍｇ含有した。Ｓｕｓｈｉ３ペプチドをＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によって化学合成し、いずれの検出可能な内毒素も含有しなかった。ペプチドＸが専有源によって供給され、＜１ＥＵ／ｍｇを含有した。内毒素を含まない水は、ＢｉｏＤｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）からのものであった。試料内毒素が低い時は、指示されたレベルまで内因性内毒素を添加した。内毒素は、大腸菌Ｏ５５：Ｂ５リポ多糖の形態でＬｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＣＡ）から購入された。
【００３５】
ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロトコル
ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）キットは、ＢＤＴＩ（登録商標）消化緩衝剤（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５）（ＢｉｏＤｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）およびＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物（ＢＤＴＩ（登録商標）消化緩衝剤中の５％ペプシン原液）から成る。全ての実験は以下のプロトコルで行った。ＢＤＴＩ（登録商標）消化緩衝剤を使用して、好適な作業レベルまでタンパク質試料を希釈した。この溶液の２７０μｌのアリコートを３０μｌのＢＤＴＩ（登録商標）プロテアーゼ溶液と混合し、１０秒間ボルテックスした。消化を伴わずに基準内毒素を判定するように、ＢＤＴＩ（登録商標）プロテアーゼ溶液の代わりに３０μｌのＢＤＴＩ（登録商標）消化緩衝剤を含有する試料を各一式の実験に含んだ。混合後、管をＰａｒａｆｉｌｍで覆い、指示された時間にわたって３７℃水槽中でインキュベートした。処理後、内毒素を含まない水で試料を１：１００に希釈し、ＰｙｒｏＧｅｎｅ（登録商標）検査を受けた。ＢＤＴＩ（登録商標）プロテアーゼ溶液の添加に起因する１０％試料希釈を考慮し、求められた結果に算入した。
【００３６】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
タンパク質分解との内毒素検出の相関を監視するように、ＰＡＧＥ分析を各試料処理とともに行った。ＰＡＧＥ分析のために、４５μｌの内毒素を含まない水、１０μｌの５ｍＭ  ＤＴＴ、および２５μｌのＣＢＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＣｌｅａｒＰＡＧＥ（登録商標）（Ｄｅｌ  Ｍａｒ，ＣＡ）４×試料緩衝剤非還元電気泳動のために追加水がＤＴＴに取って代わった）を含有する混合物に、２０μｌの未希釈消化試料を添加した。この試料を７０℃水槽中で１０分間加熱し、ＣＢＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＣｌｅａｒＰＡＧＥ  １×トリストリシンＳＤＳ実行緩衝剤（還元または非還元）に漬けられたＣＢＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＣｌｅａｒＰＡＧＥ  １０−２０％  ＴＥＯ−ＣＩ  ＳＤＳゲルに１７μｌを装填し、６０から３０ｍＡの電流勾配で２００ボルトにて４５分間電気泳動させた。製造業者の仕様に従って、Ｓｉｇｍａ  ＰｒｏｔｅｏＳｉｌｖｅｒ（登録商標）（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）銀染色キットを使用して、全てのゲルを銀染色した。
【００３７】
ＰＰＣ阻害試験
ＰＰＣ回収に対する阻害の程度を判定するように、ＰＰＣ阻害試験をカチオン性ペプチドで行った。ペプチドの連続１０倍希釈を、内毒素を含まない水で作製した。１ＥＵ／ｍｌの最終内毒素濃度のために、各希釈の２７０μｌのアリコートを、３０μｌの１０ＥＵ／ｍｌ  ＬＰＳを含有する内毒素を含まないガラス管に添加した。５０μｌの各試料をＬｏｎｚａ  ＰｙｒｏＧｅｎｅ（登録商標）（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）試験で検査した。ペプチドを伴わない試料を、対照および参照として含んだ。
【００３８】
ＰｙｒｏＧｅｎｔ（登録商標）ゲル塊試験
ゲル塊試験へのＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物の適用性を検証するために、Ｌｏｎｚａ  ＰｙｒｏＧｅｎｔ（登録商標）システム（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して、消化試料を検査した。試験のために、１００μｌの試料を、内毒素を含まないガラスバイアル中の１００μｌのＰｙｒｏＧｅｎｔ（登録商標）試験溶解物と混合し、１０秒間ボルテックスした。次いで、試料を撹拌することなく３７℃水槽中で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を目視検査によって塊形成について検査した。試料とともに、試験の信頼性を検証するように、０．０３から０．１２ＥＵ／ｍｌに及ぶ一連の基準およびブランクを検査した。
【００３９】
実施例１：ペプチドＸ
ペプチドＸ（専売）は、治療設定において極めて効果的であることが示されている、短カチオン性ペプチドの混合物である。この製品は、３．５ｋＤａの平均サイズで２．０から６．５ｋＤａの分子量範囲を有する。ＬＡＬおよびｒＦＣ試験では、ペプチドＸは、内毒素検出を完全に阻害し、規定の内毒素急増の回復さえも妨げる。予備実験は、阻害作用が内毒素へのペプチドの堅い結合によって引き起こされると判定した。この結合は、塩、洗剤、限外濾過、または加熱によって変位させることができなかった。この阻害の機構はまた、広範な希釈を不十分にさせる。ペプチドＸによる内毒素阻害の程度を実証するために、水中のペプチドの希釈を１ＥＵ／ｍｌ内毒素で急増させ、急増回復についてＰｙｒｏＧｅｎｅ（登録商標）試験で検査した（図１Ａ）。０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で開始すると、最初のいくつかの１０倍希釈は、１００％またはその付近で依然として阻害を示した。内毒素の５０％以上を検出するために、０．１μｇ／ｍｌまでの希釈が要求された。完全内毒素回収のために、ペプチドは、治療用量の２，０００，０００倍希釈を表す１０ｎｇ／ｍｌの濃度まで希釈されなければならなかった。この種類の希釈は、内因性内毒素の検出を妨げる。
【００４０】
タンパク質Ｘは、この阻害活性を除去するように、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）試料調製キットで処理した。ペプチドＸの０．１ｍｇ／ｍｌ試料をＢＤＴＩ（登録商標）消化緩衝剤中で調製し、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物処理を伴って、または伴わずに、ＰＰＣ回収について検査した。上記の結果と一致して、未処理試料のＰＰＣは、１００％阻害された（図１Ｂ）。ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物による処理は、３７℃水槽中のインキュベーションを伴わずに６３％以上までＰＰＣ回収を増加させた。適正なインキュベーションはさらに、７５％以上まで回収を増加させた。このＰＰＣ回収のレベルは、容認可能な試験と見なされるためにＦＤＡによって要求される５０％を超えている。これをさらに検査するために、汚染内毒素の検出を可能にするＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物の能力を調べた。０．１ｍｇ／ｍｌのペプチドＸの新規試料を、約２５０ＥＵ／ｍｇの内毒素を含有するＢＤＴＩ（登録商標）消化緩衝剤中で調製した。ＰＰＣ結果と同様に、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物による処理は、処理の間に０ＥＵ／ｍｌから１５０ＥＵ／ｍｌ以上まで検出を増加させた（図１Ｃおよび表１）。これは、添加された最初の内毒素の計算値の６０％以上の検出を表す。ＰＡＧＥ分析は、内毒素検出の増加がペプチドＸの分解に対応したことを示した（図１Ｄ）。インキュベーションを伴わないＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物の添加は、ペプチドの量を約２５〜３０％低減した。適正なインキュベーションはさらに、３０分の処理後に天然ペプチドの量を１０％未満まで低減し、１２０分後にほぼごく少量まで低減した。
【００４１】
【表１】
0005798483.tif 000002
ＰｙｒｏＧｅｎｅ（登録商標）試験でペプチドＸ消化を検査することに加えて、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物が１種類より多くの内毒素検出システムに適用可能であることを実証するように、Ｌｏｎｚａ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）のＰｙｒｏＧｅｎｔ（登録商標）ゲル塊試験でも検査した。試験は、０．０６ＥＵ／ｍｌの感度を有し、０．１ＥＵ／ｍｌのＰＰＣ急増を伴って、および伴わずに、未処理および処理済みの０．１ｍｇ／ｍｌペプチド試料の両方で行った。対照反応の全てが予想通りの検査結果であった。０．１ｍｇ／ｍｌペプチド試料は、低内因性内毒素を示すＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物処理を伴って、または伴わずに、塊形成を引き起こさなかった（表２）。未処理のペプチド試料が、試験の感度レベルを超える０．１ＥＵ／ｍｌのＰＰＣ急増を含有した時には、塊形成がなく、内毒素がペプチドによって覆い隠されていることを示した。処理済みのペプチド試料が０．１ＥＵ／ｍｌのＰＰＣで急増した時には、阻害因子が消化によって除去されたことを示す塊形成があり、試験が０．０６ＥＵ／ｍｌを超える内毒素レベルを検出していた。
【００４２】
【表２】
0005798483.tif 000003
実施例２：Ｓｕｓｈｉ３ペプチド
因子Ｃは、ＬＡＬおよびｒＦＣ試験において酵素カスケードを開始する酵素である。因子Ｃの内毒素結合部位は、Ｓｕｓｈｉ３（Ｓ３）と称される３４アミノ酸ペプチドに単離されている。Ｓ３は、静電相互作用および疎水性相互作用の両方を介して（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５：１０５５４−６２（２００６）；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３４：２７０−２（２００６））、内毒素に堅く結合することが知られている（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１４：１８０１−１３（２０００））。この結合はとても強力であるため、開発され、内毒素除去媒体で使用するために市販されている（Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．７５９：２３７−４６（２００１））。ペプチドＸに酷似して、内毒素とのＳ３の堅い相互作用は、一般的に使用されている試験で検出されるような活性を覆い隠す。ＰＰＣ阻害検査の結果（図２Ａ）は、１ＥＵ／ｍｌの遮蔽を妨げるためのペプチドの広範な希釈の要求を実証する。完全なＰＰＣ回収のために、ペプチドは０．１μｇ／ｍｌの濃度まで希釈されなければならない。ペプチドＸと同様に、この程度の希釈は、正確な内毒素検出または定量化を妨げる。
【００４３】
Ｓ３の阻害作用を軽減するＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物の能力を検査するために、０．１ｍｇ／ｍｌ試料を、１ｍｇ／ｍｌ原液からＢＤＴＩ（登録商標）消化緩衝剤中で調製した。以前の実験はペプチドが検出可能な内毒素を含有しなかったことを示したため、外因性内毒素を７０ＥＵ／ｍｇの最終濃度まで試料に添加した。ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物を受容しなかった対照試料は、１７ＥＵ／ｍｌという検査結果であり、７５％以上の阻害を示した（図２Ｂ）。ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物による処理は、短いインキュベーション後に２９ＥＵ／ｍｌの内毒素活性を回収し、１２０分のインキュベーション後に５１ＥＵ／ｍｌを回収した。この最終試料は、検出精度の３００％増加を表す。ＰＡＧＥ分析は内毒素回収に対応する（図２Ｃ）。１５〜３０分のインキュベーション後に有意な分解があり、その後に６０分試料でさらなる分解が続く。１２０分の処理後に、ペプチドはほぼ検出不可能である。
【００４４】
実施例３：ヘモグロビン
以前の実施例は、完全またはほぼ完全な内毒素遮蔽を引き起こしたカチオン性ペプチドを伴った。しかしながら、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物は、そのような劇的効果を示さないタンパク質試料における内毒素検出の精度を増加させるために使用することもできる。
【００４５】
ヘモグロビンは、身体の全体を通して酸素を送達することに関与する赤血球中の金属タンパク質である。それは、限外濾過、密度遠心分離、エタノール沈殿、および非変性ＰＡＧＥで示されるように、内毒素に対する中程度の親和性（ｋＤ３．１×１０−８）を有する（Ｒｏｔｈ  ａｎｄ  Ｋａｃａ，Ａｒｔｉｆ．Ｃｅｌｌｓ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔ．Ｉｍｍｏｂｉｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：３８７−９８（１９９４）；Ｋａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５０７８−８４（１９９４））。生物学におけるその重要性と、人工血液開発におけるその潜在的役割とを考慮すると、ヘモグロビンにおける正確な内毒素検出は極めて重要である。
【００４６】
ヘモグロビン（ウシ赤血球）に対するＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物処理の作用を検査するために、１ｍｇ／ｍｌ試料を、５０ｍｇ／ｍｌ原液からＢＤＴＩ（登録商標）消化緩衝剤中で調製し、前述のように処理した。ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物を含有しない未処理の試料は、３３０ＥＵ／ｍｇという値を生じた（図３Ａ）。３０分間のＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物による処理後、測定された内毒素の値は、５６０ＥＵ／ｍｇまでほぼ７０％増加した。この活性の増加は、６０分で６５０ＥＵ／ｍｇの結果、および１２０分後に８５０ＥＵ／ｍｇの結果を伴って、１２０分間の時間的経過にわたって継続した。この最終データ点は、１５０％以上の測定された内毒素の増加を表す。グラフには、時間的経過にわたるヘモグロビン消化の程度を示す、試料のＰＡＧＥ結果が付随している（図３Ｂ）。１６ｋＤａ単量体に加えて、ヘモグロビンは、還元条件で視覚化することができる３２ｋＤａ二量体および６４ｋＤａ四量体を形成する。タンパク質消化の程度は、第１レーンにおける未処理の試料を、ヘモグロビンおよびＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物の両方を含有するが水槽中でインキュベートされなかった第２レーンにおける試料と比較することによって分かる。ここでは、３つ全てのヘモグロビン集団においてすでに有意な低減がある。３７℃での３０分のインキュベーション後、二量体および四量体集団の両方が完全に消化される。加えて、単量体集団が７５％以上減少させられる。１２０分間の処理後、単量体集団はさらに、出発材料の１０％未満まで低減される。
【００４７】
これらの結果は、ヘモグロビンが消化されるにつれて、内毒素活性の付随増加があることを示す。このパターンは、ヘモグロビンが内毒素の検出を阻害することを示す。これは、ヘモグロビンからの増強作用を請求する文献中のいくつかの報告とは対照的である（Ｒｏｔｈ  ａｎｄ  Ｋａｃａ，Ａｒｔｉｆ．Ｃｅｌｌｓ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔ．Ｉｍｍｏｂｉｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：３８７−９８（１９９４）；Ｋａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５０７８−８４（１９９４）；Ｒｏｔｈ，Ｂｌｏｏｄ  ８３：２８６０−５（１９９４）；Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ３３：９１９−２４（１９９３））。増強作用について挙げられる１つの説明は、ヘモグロビンが、ＬＰＳ凝集体サイズを低減し、ＬＰＳ単量体がより生物学的に利用可能となることを可能にする、洗剤様活性を有するこということである。しかしながら、メリチン、リゾチーム、補体タンパク質、ＢＰＩ、およびポリミキシンＢを含む、大部分の内毒素脱凝集分子は、活性の減少を引き起こす。また、増強は、ある試験基準下でのみ可能となる、リン脂質過酸化によるものであってもよいとも示唆されている。この種類の修正は、試験では可能ではなく、なぜいくつかの報告が組成を示す一方で、他の出版物が増強を報告しているのかを説明してもよい。また、タンパク質濃度および試験方法は、内毒素に対するタンパク質作用を伴う、矛盾する結果の寄与因子であることが示されている（Ｋａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５０７８−８４（１９９４））。作用の方向にかかわらず、上記のプロトコルは、試料からヘモグロビンを除去し、内毒素含有量のより正確な判定を可能にする。
【００４８】
実施例４：ウシ血清アルブミン
アルブミンは、約５０ｍｇ／ｍｌ（０．７５ｍＭ）の濃度において最も豊富な循環タンパク質である。それは、身体の全体を通した脂肪酸、ホルモン、ビリルビン、胆汁塩、金属、および薬剤の送達に関与する。それは、３つの相同ドメインから成り、その２つは、内毒素分子の脂質Ａ部分に結合すると考えられる露出疎水ポケットを有する（Ｄａｖｉｄ，Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ（ｅｄ．Ｂｒａｄｅ，Ｈ．）．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ−Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，４１３−２２（１９９９））。これは、非静電相互作用を介してヒト血清アルブミンが脂質Ａに結合することを示唆する、他の報告と一致する（Ｊｕｒｇｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ．Ｒｅｓ．８：１１５−２６（２００２）。
【００４９】
内毒素検出に対するアルブミンの作用を検査するために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の１００ｍｇ／ｍｌ原液を、内毒素を含まない水の中で調製した。この原液から、１ｍｇ／ｍｌ試料をＢＤＴＩ（登録商標）消化緩衝剤中で調製した。以前の実験は、ＢＳＡ原液の内因性内毒素汚染が非常に低い（約０．０５ＥＵ／ｍｇ）と判定したため、外因性内毒素を１００ＥＵ／ｍｇの最終濃度まで添加した。内容物間の潜在的相互作用が確立されることを可能にするように、この試料を試験の前に３０分間室温で置いた。ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物を含有しない未処理の試料は、添加された計算量よりも４０％以上少ない、５８ＥＵ／ｍｌという値を生じた（図４Ａ）。１５分間のＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物による処理後、測定された内毒素の値は６７ＥＵ／ｍｌまで増加した。この同じ時点で、ＰＡＧＥデータは広範なＢＳＡ消化を示す（図４Ｂ）。消化時間の増加は、７７ＥＵ／ｍｌほども検出可能な内毒素のレベルを増加させた。これは、既知の汚染内毒素のほぼ８０％の回収と、未処理の試料と比較して３０％以上の精度の増加とを示す。
【００５０】
文献には、内毒素検出に対するアルブミンの作用に関する合意がない。研究は、アルブミンが内毒素の脂質Ａ部分の溶解性の一因となり、ＬＡＬ試験における発熱性およびゲル化を増加させることを示している（Ｒｉｅｔｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．８：１７３−７（１９７３））。組み換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）による研究は、タンパク質が、典型的には中程度に毒性である立方型から、活性の増加を示す非層状構造へのミセル形成の変化を引き起こすことを示している。しかしながら、このミセル構造の変化は、サイトカインの誘導の微小変化を引き起こした。加えて、ｒＨＳＡによる検査は、いずれの識別可能なパターンも伴わずに、ＬＡＬ凝固試験の複雑な変化を示している（Ｊｕｒｇｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ．Ｒｅｓ．８：１１５−２６（２００２））。精製ＨＳＡによる同様の報告は、発色ＬＡＬ検査による増強活性を示しているが、ゲル化ＬＡＬ試験における作用は示していない（Ｋａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５０７８−８４（１９９４））。他のグループは、比色分析または動態比濁ＬＡＬ試験によって、またはウサギ発熱源検査で判定されるような、内毒素活性に対するＨＳＡの作用を見出していない（Ａｓａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙａｋｕｇａｋｕ．Ｚａｓｓｈｉ．１１４：８８８−９３（１９９４））。現在の検査は、内毒素検出に対するＢＳＡのわずかな阻害作用を示す。それにもかかわらず、ヘモグロビンと同様に、これらの検査は、試験システムに対する悪影響を伴わずに、タンパク質の完全な分解と、増加した検出精度とを示す。
【００５１】
実施例５：ＩｇＧ
ＩｇＧは、全ての血清抗体の約７５％を占める、最も豊富な免疫グロブリンである。それは、２つの重鎖（それぞれ約５０ｋＤａ）および２つの軽鎖（それぞれ約２３ｋＤａ）から成る四量体分子である。各重鎖は、ジスルフィド結合を通して軽鎖に結び付けられる。同様に、重鎖は、ジスルフィド結合でともに結び付けられ、分子に特徴的な「Ｙ」構造を与える。抗体療法の数は、過去１０年で大きく上昇しており、４００より多くの現行の承認前臨床研究を占めている（Ｄｕｂｅｌ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：７２３−９（２００７））。適応症は、関節炎、クローン病、移植技術、乾癬、自己免疫、ＲＳＶ、多発性硬化症、および喘息を含む。これは、白血病、中皮腫、リンパ腫、ならびに結腸癌、乳癌、腎臓癌、肺癌、子宮癌、および膵臓癌に対する有望な抗体候補を現在有する、癌治療学の分野に追加される（Ｄｕｂｅｌ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：７２３−９（２００７）；Ｃｒｅｐｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：１５３−９（２００７）；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２９：８４５−５２（２００７）；Ｎａｙｅｅｍ  ａｎｄ  Ｋｈａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．７：１６５−７０（２００６））。そのような治療法の増加の１つの理由は、組み換え抗体の出現である。これは、有望な技術である一方で、内毒素除去および検出に対してさらに優れた強調および感度を要求する。
【００５２】
文献は、ＩｇＧが内毒素に結合し、中和することを示す、いくつかの報告を含む。内毒素に応じたＴＮＦα発現は、ラットの死亡率の対応する減少とともに、ＩｇＧの存在下で低減される（Ｙｅｎｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ６：２４７−５４（１９９４）；Ｘｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ４７：１９４−２０２（２００１））。ＩｇＧはまた、発色ＬＡＬ試験で分析されるように、用量依存的方法で遊離内毒素を中和することも示されている（Ｘｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４１：１５１２−６（１９９７））。ＩｇＧの阻害因子活性に対するＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物の適用を検査するために、ウサギＩｇＧ（血漿由来）の０．５ｍｇ／ｍｌ試料を、１２．５ｍｇ／ｍｌ原液からＢＤＴＩ（登録商標）消化緩衝剤中で調製した。以前の実験は、低内毒素汚染を示したため、外因性内毒素を約１００ＥＵ／ｍｌの最終濃度まで添加した。ＩｇＧと内毒素との間の潜在的相互作用が形成することを可能にするように、この溶液を試験の前に３０分間室温で置いた。未処理のＩｇＧ試料からの試験結果は、８１ＥＵ／ｍｌの回収を示した（図５Ａ）。ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物による処理は、５０％以上の増加である、１２３ＥＵ／ｍｌほどまでにも内毒素活性を増加させた。ＰＡＧＥ分析は、ＩｇＧ構造の対応する変化を示した（図５Ｂ）。低減状態で、重鎖および軽鎖は、それぞれ、約５３および２３ｋＤａの異なる帯域として及ぶ。ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物の添加により、重鎖集団、ならびに２５〜３０ｋＤａにおける大型断片およびゲルの底部付近の小型Ｆｃ断片の対応する出現の減少があった。文献中の大部分の報告に一致して、これらの結果は、ＩｇＧが内毒素活性に対する阻害作用を有することを示した。この作用は、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物処理で除去された。
【００５３】
各内毒素分子は、長親水性糖鎖、疎水性脂肪酸鎖、および負に帯電したリン酸基を含有する。これらの性質により、内毒素は、多種多様なタンパク質に結合することが知られている。この結合は、ミセルおよび／または凝集体構造を変化させ、活性の変化をもたらすことが知られている。正確な内毒素検出が臨床現場において極めて重要であるため、高感度の検出方法が最重要である。本明細書では、内毒素を含有する試料からタンパク質の作用を除去するためのＥｎｄｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物試料調製システムの使用を説明する。総タンパク質および少量のペプチドの実施例が含まれている。加えて、内因性および外因性内毒素の両方の検出が提示されている。示された全ての実施例では、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物による処理が、古典的ＬＡＬまたはｒＦＣ試験を使用した内毒素定量化の精度を増加させた（表３）。ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物による変化の程度は、検査されているタンパク質に依存していた。例えば、大きな内毒素の急増の回収は、未処理のペプチドＸによって完全に阻害されたが、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物処理後に回収可能であった。逆に、ＢＳＡは、内毒素回収に対してわずかな阻害作用しか及ぼさなかった。しかしながら、この作用も、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物処理で除去された。
【００５４】
【表３】
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実施例６：内毒素を検出する方法の感度を増加させるためのペプシンの使用
以下の実験は、水中の一連のＬＰＳ希釈を、規定量のペプシンを含有する同様の一連の希釈と比較した。これらのデータは、ペプシンがＬｏｎｚａ  ＰｙｒｏＧｅｎｅ（登録商標）試験においてｒＦＣ酵素の活性を強化し、感度の増加をもたらしたことを示す。これは、現在の０．０１ＥＵ／ｍｌのＬＰＳ濃度を下回るＬＰＳ検出を可能にした。
【００５５】
ペプシン原液調製。ペプシンの５％原液（ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物）を作成するために、２５０ｍｇのペプシンを、５ｍｌの消化緩衝剤（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５）中で溶解させた。全てのペプシンが溶液に溶けていくまで、混合物をボルテックスした。５％ペプシン溶液を４℃で保管した。
【００５６】
ＬＰＳ試料調製。一連のＬＰＳ希釈を作成するために、Ｌｏｎｚａ（登録商標）（Ｌｏｎｚａ；Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）ＬＰＳ原液（２０ＥＵ／ｍｌ）を連続的に希釈した。４００μｌの最終体積のために、２００μｌのＬｏｎｚａ（登録商標）原液で２００μｌの水を希釈することによって、１０ＥＵ／ｍｌのＬＰＳ溶液を作成した。５００μｌの最終体積のために、５０μｌの１０ＥＵ／ｍｌ  ＬＰＳ溶液を４５０μｌの水に添加することによって、１ＥＵ／ｍｌのＬＰＳ溶液を作成した。５００μｌの最終体積のために、５０μｌの１ＥＵ／ｍｌ  ＬＰＳ溶液を４５０μｌの水に添加することによって、０．１ＥＵ／ｍｌのＬＰＳ溶液を作成した。５００μｌの最終体積のために、５０μｌの０．１ＥＵ／ｍｌ  ＬＰＳ溶液を４５０μｌの水に添加することによって、０．０１ＥＵ／ｍｌのＬＰＳ溶液を作成した。
【００５７】
ＬＰＳおよびペプシン試料調製。０．０５％ペプシンを同様に同じ一連のＬＰＳ希釈を作成するために、ペプシンの２つの原液を作製した。２００μｌの最終体積のために、１９６μｌの水を４μｌの５％ペプシンに添加することによって、ペプシンの０．１％原液を作製した。１８００μｌの最終体積のために、１７８２μｌの水を１８μｌの５％ペプシンに添加することによって、ペプシンの０．０５％原液を作製した。４００μｌの１０ＥＵ／ｍｌ  ＬＰＳ、０．０５％ペプシン溶液を生じるように、２００μｌの０．１％ペプシン溶液を２００μｌのＬｏｎｚａ（登録商標）ＬＰＳ原液（２０ＥＵ／ｍｌ）に添加した。ペプシンの０．０５％原液を、４本の管に平等に（４５０μｌ）分けた。５０μｌの１０ＥＵ／ｍｌ  ＬＰＳ、０．０５％ペプシン溶液を４５０μｌの０．０５％ペプシン溶液に添加することによって、１ＥＵ／ｍｌ  ＬＰＳ、０．０５％ペプシン溶液を作成した。５０μｌの１ＥＵ／ｍｌ  ＬＰＳ、０．０５％ペプシン溶液を４５０μｌの０．０５％ペプシン溶液に添加することによって、０．１ＥＵ／ｍｌ  ＬＰＳ、０．０５％ペプシン溶液を作成した。５０μｌの０．１ＥＵ／ｍｌ  ＬＰＳ、０．０５％ペプシン溶液を４５０μｌの０．０５％ペプシン溶液に添加することによって、０．０１ＥＵ／ｍｌ  ＬＰＳ、０．０５％ペプシン溶液を作成した。５０μｌの０．０１ＥＵ／ｍｌ  ＬＰＳ、０．０５％ペプシン溶液を４５０μｌの０．０５％ペプシン溶液に添加することによって、０．００１ＥＵ／ｍｌ  ＬＰＳ、０．０５％ペプシン溶液を作成した。
【００５８】
ＰｙｒｏＧｅｎｅ（登録商標）試験。上記で調製された試料の内毒素含有量を検査するために、製造業者の仕様に従って、ＰｙｒｏＧｅｎｅ（登録商標）試験を行った。手短に言えば、５０μｌの各試料を、５０μｌのＰｙｒｏｇｅｎｅ（登録商標）作業試薬（２０μｌのｒＦＣ試験緩衝剤、５μｌのｒＦＣ酵素溶液、および２５μｌの蛍光発生基質）と混合し、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）３６０４試験プレートの単一のウェルに加えた。プレートを３７℃のＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ２  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ；Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）の中でインキュベートし、１５、３０、４５、および６０分時点で蛍光発光測定値を採取した。結果を表４および図６に示す。
【００５９】
【表４】
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未処理および処理済みのＬＰＳ試料の連続希釈について、データを収集した。試料は０．０５％ペプシンで処理した。処理済み試料は、蛍光発光の増加によって証明されるように、組み換え因子Ｃに対して感度が高かった。
【００６０】
実施例１−６は、通常は内毒素検出を阻害する分子を含有する試料において内毒素検出を強化するために、酸性プロテアーゼを使用できることを実証した。通常は内毒素検出を阻害する分子は、短カチオン性ペプチド（すなわち、ペプチドＸ）、酵素（すなわち、Ｓｕｓｈｉ３ペプチド）、金属タンパク質（すなわち、ヘモグロビン）、循環タンパク質（すなわち、アルブミン）、および免疫グロブリン（すなわち、ＩｇＧ）等の、種々の異なる種類のペプチドを含む。実施例は、総タンパク質および少量のペプチドを含んだ。加えて、内因性および外因性内毒素の検出が実証された。示された全ての実施例では、ＥｎｄｏＰｒｅｐ（登録商標）プロテアーゼ組成物による処理が、内毒素検出の精度を増加させた。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図４Ａ】
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【図５Ａ】
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【図６】
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【図１Ｄ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ｂ】
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【配列表】
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