(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガレクチン−３（ｇａｌｅｃｔｉｎ−３；Ｇａｌ−３）と、以下のいずれか１つのグリコサミノグリカン分子とから構成される結合体；
（ｉｖ）コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ；ＣＨ）
（ｖ）下記式（６）〜（１２）で表されるいずれか１つの構造を有するオリゴ糖鎖
ＣＨ６；ＧｌｃＡ  β１−３（ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３）２ ＧａｌＮＡｃ（６）
ＣＨ７；（ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３）３ ＧａｌＮＡｃ（７）
ＣＨ８；ＧｌｃＡ  β１−３（ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３）３ ＧａｌＮＡｃ（８）
ＣＨ９；（ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３）４ ＧａｌＮＡｃ（９）
ＣＨ１０；ＧｌｃＡ  β１−３（ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３）４ ＧａｌＮＡｃ（１０）
ＣＨ１１；（ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３）５ ＧａｌＮＡｃ（１１）
ＣＨ１２；ＧｌｃＡ  β１−３（ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３）５ ＧａｌＮＡｃ（１２）
ここで、式中のＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミン残基を、ＧｌｃＡはグルクロン酸残基を、β１−４はβ１−４グリコシド結合を、β１−３はβ１−３グリコシド結合をそれぞれ示す。
【請求項２】
ガレクチン−９のＮ−末端糖鎖認識ドメイン（ガレクチン−９Ｎ；ｇａｌｅｃｔｉｎ−９Ｎ；Ｇａｌ−９Ｎ）と、以下のいずれか１つのグリコサミノグリカン分子とから構成される結合体；
（ｉｖ）コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ；ＣＨ）
（ｖ）下記式（６）〜（１５）で表されるいずれか１つの構造を有するオリゴ糖鎖
ＣＨ６；ＧｌｃＡ  β１−３（ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３）２ ＧａｌＮＡｃ（６）
ＣＨ７；（ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３）３ ＧａｌＮＡｃ（７）
ＣＨ８；ＧｌｃＡ  β１−３（ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３）３ ＧａｌＮＡｃ（８）
ＣＨ９；（ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３）４ ＧａｌＮＡｃ（９）
ＣＨ１０；ＧｌｃＡ  β１−３（ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３）４ ＧａｌＮＡｃ（１０）
ＣＨ１１；（ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３）５ ＧａｌＮＡｃ（１１）
ＣＨ１２；ＧｌｃＡ  β１−３（ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３）５ ＧａｌＮＡｃ（１２）
ＣＨ３；ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３  ＧａｌＮＡｃ（１３）
ＣＨ４；ＧｌｃＡ  β１−３  ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３  ＧａｌＮＡｃ（１４）
ＣＨ５；（ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３）２ ＧａｌＮＡｃ（１５）
ここで、式中のＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミン残基を、ＧｌｃＡはグルクロン酸残基を、β１−４はβ１−４グリコシド結合を、β１−３はβ１−３グリコシド結合をそれぞれ示す。
【請求項３】
請求項１または２に記載の結合体を構成するガレクチン分子を固定化した担体を用い、請求項１または２に記載の結合体を構成するグリコサミノグリカン分子を、分離、精製および／または検出する方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の結合体を構成するグリコサミノグリカン分子を固定化した担体を用い、請求項１または２に記載の結合体を構成するガレクチン分子を、分離、精製および／または検出する方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載の結合体を構成するグリコサミノグリカン分子により、該結合体を構成するガレクチン分子の生物学的活性を生体外で促進または阻害する方法。
【請求項６】
請求項１または２に記載の結合体を構成するグリコサミノグリカン分子を含有する、該結合体を構成するガレクチン分子の生物学的活性を促進または阻害する組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物を含有する医療用材料。
【請求項８】
請求項１または２に記載の結合体を含有する医療用材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なガレクチン−グリコサミノグリカン結合体、ガレクチン活性調節剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
本願明細書において以下の略号を使用する。
ガラクトース残基：Gal
Ｎ−アセチルグルコサミン残基：GlcNAc
Ｎ−アセチルノイラミン酸残基：NeuAc
Ｎ−アセチルガラクトサミン残基：GalNAc
グルクロン酸残基：GlcA
Ｃ６位に保持されている硫酸基：６S
α2-3グリコシド結合：α2-3
β1-4グリコシド結合：β1-4
β1-3グリコシド結合：β1-3
【０００３】
ガレクチンは、1992年に提唱された動物レクチンの一家系に対する総称である（非特許文献１）。ガラクトースに対する結合特異性を有することと、ガレクチン家系を特徴づけるアミノ酸一次配列をもつことがガレクチンとしての条件である。哺乳類ガレクチンについては、発見順（GenBankへの登録順）に番号を付して呼ぶことが提唱されている。この方式に従い、現在、哺乳類ではガレクチン１〜１５（種類）が見つかっており、生体内において、ガラクトースを持つ種々の糖鎖と結合することにより、その生理機能を発揮していると考えられている。それぞれの種類のガレクチンは、ガラクトースを有する種々のオリゴ糖鎖に対する結合（認識）特異性がやや異なる。
【０００４】
これまでに１２種類のヒト由来ガレクチンファミリーが同定されている（非特許文献２）。すなわち、ガレクチン−１〜４（ｇａｌｅｃｔｉｎ−１〜４：Ｇａｌ−１〜４）、ガレクチン−７〜１０（ｇａｌｅｃｔｉｎ−７〜１０：Ｇａｌ−７〜１０）そしてガレクチン−１２（ｇａｌｅｃｔｉｎ−１２：Ｇａｌ−１２）である。各ファミリーを構成するメンバーはさらにその構造により３つのサブタイプに分けられている（非特許文献３）。
【０００５】
ガレクチン−１、−２、−７および−１０は、おおよそ１３０〜１４０個のアミノ酸残基からなる一つの糖鎖認識領域（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ；ＣＲＤ）を有するもので、プロトタイプに属するものである。ガレクチン−３は、カルボキシ末端ＣＲＤと異なるタイプのアミノ末端領域とを有するもので、唯一のキメラタイプのものである。ガレクチン−４、−８、−９および−１２は、リンカーペプチドにより連結された二つのＣＲＤを有しており、タンデムリピートタイプに分類されているものである。
【０００６】
プロトタイプおよびキメラタイプのガレクチン類は、一つのＣＲＤを有するものであるが、そのうちガレクチン−１、−２および−３、そしておそらくはガレクチン−７および−１０もダイマー（２量体）／マルチマー（多量体）を形成し、多価性の結合機能を有しており、複合糖質（ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を架橋する能力を備えていると考えられている。
【０００７】
グリコサミノグリカンとは、生体内に細胞外マトリックス成分などとして存在する複合糖質（糖タンパク質、糖脂質、プロテオグリカン）のうち、プロテオグリカンの糖鎖部分をいう（特許文献１〜４）。グリコサミノグリカンとしては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸など、十種類程度が知られており、特徴的な共通構造、即ちＮ−アセチルヘキソサミンとウロン酸（もしくはガラクトース）の交互繰り返し構造を持つ。
【０００８】
酵素、レクチンなどの生体物質と基質アナログ、オリゴ糖鎖間の親和力を高い精度で測定できる方法としてフロンタル・アフィニティー・クロマトグラフィー（以下、ＦＡＣと呼称することがある）が知られている。
【０００９】
ＦＡＣは液体クロマトグラフィーを用いたアフィニティー・クロマトグラフィーの一手法である。ＦＡＣでは、一般的に、ある分子を固定化したカラムを作製し、そこに相互作用させる分子を蛍光標識して溶媒として流す。そして蛍光検出器によって観測された溶出前端（フロント）が、非結合性分子よりも遅延した場合、その程度が分子間結合力に比例することを利用して分子間結合力を決定する（非特許文献４）。
【００１０】
特許文献５および６では、ＦＡＣ技術を用いてガレクチン固定化カラムに対して蛍光標識糖鎖を溶出させ、複合糖質のうち「糖タンパク質」および「糖脂質」に見られる糖鎖とガレクチンとの結合が解析されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開平４−８０２０１号公報
【特許文献２】特開平４−８０２０２号公報
【特許文献３】特開平９−３０９７９号公報
【特許文献４】特開平５−２３６９５１号公報
【特許文献５】特開２００４−２１５６１２号公報
【特許文献６】特開２００３−１８９８７４号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｂａｒｏｎｄｅｓ，Ｓ．  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７６，５９７−５９８，１９９４
【非特許文献２】Ｄｏｕｇｌａｓ Ｎ． Ｗ． Ｃｏｏｐｅｒ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１５７２（２００２）２０９−２３１
【非特許文献３】Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，３：２９７−３０４（１９９３）
【非特許文献４】生化学、第７６巻、第３号、ｐ２５６−２６８、２００４年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、各種ガレクチン分子と各種グリコサミノグリカン分子との新規な結合体（以下、「ガレクチン−グリコサミノグリカン結合体」と呼称することがある）を提供する。
また、これまでにガレクチン分子はガラクトースのみを認識するとされていたが、ガラクトースを持たないグリコサミノグリカン分子とガレクチン分子との新規な結合体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らはＦＡＣを用いて、各種ガレクチン分子（ガレクチン−１、３、８Ｎ、８Ｃ、９Ｎ、９Ｃ；ＮとＣはそれぞれＮ末端側糖鎖認識ドメイン、Ｃ末端側糖鎖認識ドメインを指す）固定化カラムと各種グリコサミノグリカン分子の蛍光標識物との網羅的相互作用解析を行った。その結果、特定のガレクチン分子とグリコサミノグリカン分子との組み合わせにおいて新規の結合性を見出し、本発明を完成した。
【００１５】
すなわち本発明は以下よりなる。
１．ガレクチン−３（ｇａｌｅｃｔｉｎ−３；Ｇａｌ−３）と、以下のいずれか１つのグリコサミノグリカン分子とから構成される結合体；
（ｉｖ）コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ；ＣＨ）
（ｖ）下記式（６）〜（１２）で表されるいずれか１つの構造を有するオリゴ糖鎖
ＣＨ６；ＧｌｃＡ  β１−３  （  ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３  ）２ ＧａｌＮＡｃ（６）
ＣＨ７；（  ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３  ）３ ＧａｌＮＡｃ（７）
ＣＨ８；ＧｌｃＡ  β１−３  （  ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３  ）３ ＧａｌＮＡｃ（８）
ＣＨ９；（  ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３  ）４ ＧａｌＮＡｃ（９）
ＣＨ１０；ＧｌｃＡ  β１−３  （  ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３  ）４ ＧａｌＮＡｃ（１０）
ＣＨ１１；（  ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３  ）５ ＧａｌＮＡｃ（１１）
ＣＨ１２；ＧｌｃＡ  β１−３  （  ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３  ）５ ＧａｌＮＡｃ（１２）
ここで、式中のＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミン残基を、ＧｌｃＡはグルクロン酸残基を、β１−４はβ１−４グリコシド結合を、β１−３はβ１−３グリコシド結合をそれぞれ示す。
２．ガレクチン−９のＮ−末端糖鎖認識ドメイン（ガレクチン−９Ｎ；ｇａｌｅｃｔｉｎ−９Ｎ；Ｇａｌ−９Ｎ）と、以下のいずれか１つのグリコサミノグリカン分子とから構成される結合体；
（ｉｖ）コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ；ＣＨ）
（ｖ）下記式（６）〜（１５）で表されるいずれか１つの構造を有するオリゴ糖鎖
ＣＨ６；ＧｌｃＡ  β１−３  （  ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３  ）２ ＧａｌＮＡｃ（６）
ＣＨ７；（  ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３  ）３ ＧａｌＮＡｃ（７）
ＣＨ８；ＧｌｃＡ  β１−３  （  ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３  ）３ ＧａｌＮＡｃ（８）
ＣＨ９；（  ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３  ）４ ＧａｌＮＡｃ（９）
ＣＨ１０；ＧｌｃＡ  β１−３  （  ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３  ）４ ＧａｌＮＡｃ（１０）
ＣＨ１１；（  ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３  ）５ ＧａｌＮＡｃ（１１）
ＣＨ１２；ＧｌｃＡ  β１−３  （  ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３  ）５ ＧａｌＮＡｃ（１２）
ＣＨ３；ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３  ＧａｌＮＡｃ（１３）
ＣＨ４；ＧｌｃＡ  β１−３  ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３  ＧａｌＮＡｃ（１４）
ＣＨ５；（  ＧａｌＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＡ  β１−３  ）２ ＧａｌＮＡｃ（１５）
ここで、式中のＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミン残基を、ＧｌｃＡはグルクロン酸残基を、β１−４はβ１−４グリコシド結合を、β１−３はβ１−３グリコシド結合をそれぞれ示す。
３．前項１または２に記載の結合体を構成するガレクチン分子を固定化した担体を用い、前項１または２に記載の結合体を構成するグリコサミノグリカン分子を、分離、精製および／または検出する方法。
４．前項１または２に記載の結合体を構成するグリコサミノグリカン分子を固定化した担体を用い、前項１または２に記載の結合体を構成するガレクチン分子を、分離、精製および／または検出する方法。
５．  前項１または２に記載の結合体を構成するグリコサミノグリカン分子により、該結合体を構成するガレクチン分子の生物学的活性を促進または阻害する方法。
６．前項１または２に記載の結合体を構成するグリコサミノグリカン分子を含有する、該結合体を構成するガレクチン分子の生物学的活性を促進または阻害する組成物。
７．前項６に記載の組成物を含有する医療用材料。
８．前項１または２に記載の結合体を含有する医療用材料。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、新規物質としてのガレクチン−グリコサミノグリカン結合体が提供されるとともに、該結合体および該結合体を構成するガレクチン分子の分離、精製、測定ツールとしてのグリコサミノグリカン分子を固定化した担体、並びに、該結合体および該結合体を構成するグリコサミノグリカン分子の構造分離、精製、測定ツールとしてのガレクチン分子固定化した担体が提供される。
【００１７】
また、生体内におけるガレクチン分子の生理的機能を、外部から与えるグリコサミノグリカン分子によって正・負の方向に制御できる可能性があり、それらガレクチン分子結合性のグリコサミノグリカン分子は医療への適用が期待される。特にグリコサミノグリカン分子を含有する、ガレクチン分子の活性調整剤ならびに調整方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のグリコサミノグリカン分子として、下記（１）非還元末端に非硫酸化ガラクトースを有し、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃの繰り返し構造を有する糖鎖、（２）非硫酸化Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を有する糖鎖、（３）非還元末端にシアル酸残基を有する糖鎖の構造上の特徴を有するものが好適に挙げられる。
【００１９】
下記（１）〜（３）の構造上の特徴は、天然に存在しうる高分子量グリコサミノグリカン分子についての特徴であるが、グリコサミノグリカン分子の製造法は特に限定されるものではなく、本発明に使用するグリコサミノグリカン分子は有機化学的合成や酵素化学的合成などによって製造されたものであってもよい。また、本発明に使用するグリコサミノグリカン分子には、広く市販されているものを利用することができる。
【００２０】
本発明に使用するコンドロイチン（ＣＨ）、角膜型ケラタン硫酸（ＫＳ−Ｉ）は広く市販されているもの（生化学工業（株））を用いることができる。また、軟骨型ケラタン硫酸（ＫＳ−ＩＩ）は鮫軟骨から公知の手法により調製することができる。さらに、デルマタン（ＤＮ）はデルマタン硫酸（生化学工業（株））を公知の化学的手法により完全脱硫酸化して調製することができる。
【００２１】
（１）非還元末端に非硫酸化ガラクトースを有し、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃの繰り返し構造を有する糖鎖
本発明に使用する非還元末端に非硫酸化ガラクトースを有し、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃの繰り返し構造を有する糖鎖は、非還元末端に非硫酸ガラクトースを有していれば分子量は問われない。そのようなグリコサミノグリカンとして、ケラタン硫酸が好ましく、角膜型ケラタン硫酸（ｋｅｒａｔａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ−Ｉ；ＫＳ−Ｉ）、および軟骨型ケラタン硫酸（ｋｅｒａｔａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ−ＩＩ；ＫＳ−ＩＩ）がより好ましい。
【００２２】
本発明に使用する非還元末端に非硫酸化ガラクトースを有し、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃの繰り返し構造を有する糖鎖として、ケラタン硫酸を化学的もしくは生化学的手法により任意の程度に低分子化したオリゴ糖鎖（ケラタン硫酸構成オリゴ糖と称する）を用いてもよい。本発明に使用するケラタン硫酸構成オリゴ糖の略号および配列を表１に示す。本発明に使用するケラタン硫酸構成オリゴ糖鎖は、特許公開公報２００６−０４７２４０号に記載の方法により調製することができる。
【００２３】
【表１】
0005704661.tif 000002
【００２４】
表１において、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、6SはＣ６位に硫酸基が保存されていることを、GalNAcはN-アセチルガラクトサミン残基を、GlcAはグルクロン酸残基を、NeuAcはN-アセチルノイラミン残基を示す。
【００２５】
本発明に使用するケラタン硫酸および表１に示すオリゴ糖鎖は、非硫酸化ガラクトースを構造中に一残基以上有すれば、さらに構造修飾されたものであってもよい。また、混合物であっても単一に精製されたものであってもよい。前記非硫酸化ガラクトースを構造中に一残基以上有するオリゴ糖鎖の例として、Ｇ２Ｋ１、Ｇ１Ｌ１、Ｌ２Ｌ２およびＬ２Ｌ４が好適に挙げられる。
【００２６】
本発明の実施例において、ＫＳ−Ｉはガレクチン−１、３、−８Ｎ、−９Ｎおよび９Ｃに結合活性を示した。またＫＳ−ＩＩはガレクチン−３、−９Ｎおよび９Ｃに結合活性を示した。Ｇ２Ｋ１、Ｌ２Ｌ２およびＬ２Ｌ４はガレクチン−１、−３、−９Ｎおよび−９Ｃに結合活性を示し、Ｇ１Ｌ１はガレクチン−３および９Ｎに結合活性を示した。
【００２７】
（２）非硫酸化Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を有する糖鎖
非硫酸化Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を有する糖鎖として、（２−１）デルマタンと（２−２）コンドロイチンが好適に挙げられる。本発明に使用する非硫酸化Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を有する糖鎖は、非硫酸化Ｎ−アセチルガラクトサミンを一残基以上持てば分子量は問われず、また任意の方法で低分子化されていてもよく、さらに、それらの修飾誘導体であってもよい。混合物であっても単一に精製されたものであってもよい。
【００２８】
（２−１）デルマタン（ｄｅｒｍａｔａｎ；ＤＮ）
本発明に使用するデルマタンは、デルマタン硫酸（ＣＳＢ）のうち、その構造中に非硫酸化Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を有する構造のものが好ましく、CSB構造中のＮ−アセチルガラクトサミン残基上の硫酸基を任意の割合で除去した構造のものがより好ましく、ほぼ完全に脱硫酸化された構造のものが特に好ましい。
【００２９】
本発明の実施例において、デルマタンはガレクチン−３、−８Ｎ、および−９Ｎに結合活性を示した。
【００３０】
（２−２）コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ；ＣＨ）
本発明に使用するコンドロイチンは、コンドロイチン硫酸（たとえばＣＳＡ、ＣＳＣ、ＣＳＤ、ＣＳＥなど）のうち、その構造中に非硫酸化Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を有する構造であって、コンドロイチン硫酸構造中のＮ−アセチルガラクトサミン残基上の硫酸基を任意の割合で除去した構造のものが好ましい。
【００３１】
本発明にはコンドロイチンを化学的もしくは生化学的手法により任意の程度に低分子化したオリゴ糖（コンドロイチンオリゴ糖と称する）を用いてもよい。本発明に使用するコンドロイチンオリゴ糖の略号および配列を表２に示す。本発明に使用するコンドロイチンオリゴ糖はＰＣＴ／ＪＰ２００６／３２２８４７に記載の方法により、コンドロイチンから調製することができる。
【００３２】
【表２】
0005704661.tif 000003
【００３３】
表２において、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはN-アセチルグルコサミン残基を、GalNAcはN-アセチルガラクトサミン残基を、GlcAはグルクロン酸残基を示す。
【００３４】
本発明の実施例において、コンドロイチン、およびコンドロイチンオリゴ糖ＣＨ３〜ＣＨ１２はガレクチン−３および９Ｎに長さ依存的な結合活性を示し、特にガレクチン−９Ｎに強く結合することが示された。また、ガレクチン−３はコンドロイチンを低分子化したＣＨ３〜ＣＨ１２の中でも特に６糖以上のもの（ＣＨ６〜ＣＨ１２）に結合活性を有していた。
【００３５】
（３）非還元末端にシアル酸残基を有する構造を持つグリコサミノグリカン糖鎖
本発明に使用する非還元末端にシアル酸残基を有する構造を持つグリコサミノグリカン糖鎖の好適な例として、表１に示したケラタン硫酸構成オリゴ糖のうちＳＬ２Ｌ４が挙げられる。
【００３６】
本発明の実施例において、ＳＬ２Ｌ４はガレクチン−３およびガレクチン−８Ｎに結合活性を示した。
【００３７】
本発明に使用するガレクチン分子の配列は公知となっている配列（非特許文献１）を使用することができる。また、これらのガレクチン分子の糖鎖に対する結合性が損なわれない限り、当該ガレクチン分子はアミノ酸の変異を有しているものであってもよい。
【００３８】
本発明に使用するガレクチン分子は、遺伝子工学的および生化学的に常用される方法を用いて製造することができる。また、本発明のタンパク質合成には、公知のペプチド合成法、例えば液相合成法、固相合成法などの化学合成法を使用することができる。
【００３９】
上記のグリコサミノグリカン分子とガレクチン分子との結合性に基づき、本発明はガレクチン分子と該ガレクチン分子に結合性を示すグリコサミノグリカン分子とから構成される結合体を提供する。また、本発明は該ガレクチン−グリコサミノグリカン結合体を構成するグリコサミノグリカン分子を分離、精製および／または検出するための、該結合体を構成するガレクチン分子を固定化した担体を提供する。さらに、本発明はガレクチン−グリコサミノグリカン結合体を構成するガレクチン分子を精製、分離および／または検出するための、該結合体を構成するグリコサミノグリカン分子を固定化した担体を提供する。
【００４０】
本発明のガレクチン分子またはグリコサミノグリカン分子の担体への固定化は、代表的には組換えポリペプチドを水不溶性担体に固定して行われる。固定化方法としては、（１）担体結合法、（２）包括法等、およびそれらを組み合わせた複合法が挙げられる。該固定化には、当該分野で汎用されている方法を用いることができる。
【００４１】
前記担体結合法としては、例えばイオン相互作用、疎水相互作用、物理的吸着などを利用する方法、共有結合などの化学的結合により行うことができる。
【００４２】
前記イオン相互作用を利用する担体結合方法では、デキストラン、セルロース、アガロース、デンプンなどの多糖類のイオン交換体、例えばＤＥＡＥ基、ＴＥＡＥ基、ＣＭ基、スルホン酸アルキル基などを持つ誘導体、イオン交換樹脂などを担体として用いることができる。
【００４３】
前記疎水相互作用を利用する担体結合方法では、ポリスチレンビーズやガラスビーズ、さらに、ブチル基やフェニル基などの疎水性官能基が結合された一般的な担体などを担体として用いることができる。
【００４４】
前記物理的な吸着を利用する担体結合方法では、例えば活性炭、酸性白土、漂白土、カオリナイト、アルミナ、シリカゲル、ベントナイト、金属酸化物、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウムなどの無機物質、デンプン、キチン、グルテン、セルロース、アガロース、タンニンなどの天然高分子、ポリスチレンなどの合成高分子、疎水性基を持ったアガロース誘導体などを担体として用いることができる。
【００４５】
前記共有結合などの化学的結合による担体結合方法としては、ペプチド法、ジアゾ法、アルキル化法、臭化シアン活性化法、架橋試薬による結合法、ユギ（Ｕｇｉ）反応を利用した固定化法、チオール・ジスルフィド交換反応を利用した固定化法、シッフ塩基形成法、キレート結合法、トシルクロリド法、生化学的特異結合法などが挙げられる。好ましくは、共有結合などのより安定した結合には、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスルフィド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基の反応などを利用して行うことができ、公知の方法あるいは当該分野の当業者が容易になしうる方法、さらにはそれらを修飾した方法の中から適宜選択して適用できる。好ましくは共有結合などのより安定した結合を形成できる化学的結合剤・架橋剤などが使用される。
【００４６】
前記化学的結合剤・架橋剤としては、カルボジイミド、イソシアネート、ジアゾ化合物、ベンゾキノン、アルデヒド、過ヨウ素酸、マレイミド化合物、ピリジルジスルフィド化合物などが挙げられる。好ましい試薬としては、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソチオシアネート、Ｎ，Ｎ’−ポリメチレンビスヨードアセトアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスマレイミド、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネート、ビスジアゾベンジジン、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシンイミジル ３−（２− ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スクシンイミジル （４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル ４−（１−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）コハク酸イミド（ＥＭＣＳ）、イミノチオラン、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物、メチル−３−（４’−ジチオピリジル）プロピオンイミデート、メチル−４−メルカプトブチリルイミデート、メチル−３−メルカプトプロピオンイミデート、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ− アセチルメルカプトアセテートなどが挙げられる。
【００４７】
前記ペプチド法では、担体と所要のポリペプチドとの間にペプチド結合を形成させて固定化される。例えばカルボキシル基を持つ担体をアジド、クロリド、イソシアネートなどの誘導体とし、当該ポリペプチド中の遊離アミノ基との間でペプチド結合を形成させる。
ペプチド合成に用いられる試薬、例えばカルボジイミド試薬、ウッドワード試薬Ｋ（Ｎ−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３’−スルホナート）などが用いられる。担体のアミノ基及びカルボキシル基と所要のポリペプチド中のアミノ基及びカルボキシル基との間でペプチド結合を形成させることもできる。
【００４８】
前記ジアゾ法は、芳香族アミノ基を持つ担体をジアゾニウム化合物とし、これと所要のポリペプチドとをジアゾカップリングさせて固定化するものである。遊離アミノ基、ヒスチジンのイミダゾール基、チロシンのフェノール性水酸基などを持つ当該ポリペプチドに好適に適用できる。担体としては、多糖類、アミノ酸共重合物、ポリアクリルアミド、スチレン系樹脂、エチレン・マレイン酸共重合物、多孔性ガラス・芳香族アミノ誘導体などが挙げられる。
【００４９】
前記アルキル化法は、当該ポリペプチド中の遊離アミノ基、フェノール性水酸基、スルフヒドリル基をハロゲンのような反応性官能基を持つ担体によりアルキル化して固定化する方法である。担体としては、ハロゲン化アセチル誘導体、トリアジニル誘導体、ハロゲン化メタクリル誘導体などが挙げられる。
【００５０】
前記臭化シアン活性化法は、デキストラン、セルロース、アガロース、デンプンなどの多糖類、多孔性ガラスなどを臭化シアンで活性化した後、当該ポリペプチドを固定化するものである。架橋試薬による結合法のうち、特にグルタルアルデヒドなどの二官能性試薬を用いた場合、セルロース、アガロース、アルブミン、ゼラチン、キトサンなどのアミノ基を導入されたあるいは有する天然高分子、合成高分子、多孔性ガラス、多孔性セラミックスなどの無機担体のアミノシラン誘導体などが挙げられる。
【００５１】
前記ユギ反応とは、カルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、イソニトリル基が共存していて反応させると縮合反応が起こることを利用するものである。カルボキシル基又はアミノ基を持つ担体と当該ポリペプチドとを混合した中にアセトアルデヒド及び３−ジメチルアミノプロピルイソシアニドを加えることで反応させるものが挙げられる。担体としては、多糖類、ポリアクリルアミドのアミノ誘導体、ナイロンのイソニトリル誘導体などが挙げられる。
【００５２】
前記生化学的特異結合法においては、特異的結合反応ペア同志の生化学的特異結合反応を利用するもので、例えば抗原とそれに対する抗体、抗体とハプテン、エフェクターとレセプター、酵素と酵素インヒビター、酵素基質、補酵素類、複合蛋白質における補欠分子団、レクチンと糖鎖含有物質、酵素と酵素基質、核酸とその相補的な核酸などが挙げられ、それらは公知のものの中から選んでよい。
【００５３】
前記包括法とは、多糖類や蛋白質などの天然高分子や合成高分子の細いゲル・マトリックスの中に当該ポリペプチドを閉じ込めることによる高分子ゲルを用いる方法と、膜で区切られた空間に当該ポリペプチドを閉じ込める方法とに大別できる。膜包括法には、半透性の固体膜に包み込むマイクロカプセル型膜包括法、半透膜性のホロー・ファイバーや限外濾過膜による空間に包み込む方法、液体状の膜に包み込むリポソーム型などの方法が挙げられる。
【００５４】
前記高分子ゲルを用いる方法は、網目構造を持つ高分子ゲルのマトリックスの中に当該ポリぺプチドを閉じ込めて固定化するもので、固定時にゲルを球状、フィルム状、チューブ状、膜状に自由に成形できる。当該ゲルの調製法としては、モノマーと架橋剤を重合させて高分子ゲルを形成させる方法、プレポリマーあるいはオリゴマーを重合させる方法、高分子を可溶性の状態から不溶の状態に変化させることによりゲルを形成させる方法などが挙げられる。当該ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、光硬化性樹脂、ウレタンポリマーなどの合成高分子、κ−カラギーナン、アルギン酸、ペクチン、キトサン、デンプン、コラーゲンなどの天然高分子などが挙げられる。
【００５５】
前記ポリアクリルアミドを用いる場合、アクリルアミドモノマー、架橋剤Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、重合促進剤Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン、重合開始剤過硫酸カリウムを用いてゲル化させたり、γ線又はＸ線のような放射線を用いたりできる。アルギン酸カルシウムを利用する場合、アルギン酸ナトリウムは水に可溶であるが、そのカルシウム塩やアルミニウム塩は水に不溶であることを利用している。まずアルギン酸ナトリウム水溶液と当該ポリペプチドとを混合し、塩化カルシウム水溶液と接触させる。
【００５６】
前記κ−カラギーナンを用いる場合、κ−カラギーナンは加熱すると水に溶解するが、アンモニウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、脂肪族アミンなどが存在するとゲル化するので、こうして得られたゲルをグルタルアルデヒドやヘキサメチレンジアミンなどで架橋して安定化させる。
【００５７】
前記光硬化性樹脂を用いる場合、適度な重合度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）あるいはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を主鎖とし、その末端にアクリロイル基、メタクリロイル基、シンナモイル基などの光感応性基を組み込んだプレポリマーを用いることができる。該プレポリマーは光増感剤ベンゾインエチルエーテル又はベンゾインイソブチルエーテル存在下、当該ポリペプチドを含む溶液と混合し、紫外線を照射してゲル化させることができる。ウレタンプレポリマーは当該ポリペプチドを含む水溶液と混合するだけでゲル化させることができる。
【００５８】
前記マイクロカプセル型膜包括法は、例えば親水性モノマーと疎水性モノマーとをその界面で重合させる際、当該ポリペプチドを被覆して固定化したり、液中乾燥法で例えばベンゼン、ヘキサン、クロロホルムなどの揮発性の高い有機溶媒にポリマーを溶解し、その中に当該ポリペプチドを含む水溶液を分散させ一次乳化液とし、次にこの一次乳化液をゼラチン、ポリビニルアルコール又は界面活性剤などの保護コロイド物質を含む水溶液中に分散させ、得られた二次乳化液から有機溶媒を除去することによりカプセルを形成させるものである。
【００５９】
前記ホロー・ファイバーや限外濾過膜に当該ポリペプチドを固定化する方法では、複数の当該ポリペプチドを固定化することも可能で、さらに膜に結合すること無く遊離状態で固定化することができる。
【００６０】
参考となる文献としては、例えば文献〔米国特許第４，００３，９８８号；Ｂ． Ｋ． Ｖａｎ Ｗｅｅｍｅｎ 及び Ａ． Ｈ． Ａ． Ｓｃｈｕｕｒｓ， Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ， Ｖｏｌ． １５， Ｎｏ． １５：２３２−２３５（１９７１）；Ｐ． Ｌｅｉｎｉｋｋｉ；Ｓｕｖｉ Ｐａｓｓｉｌａ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈ．， ２９：１１６−１２０（１９７６）；Ｂ． Ｒ． Ｂｒｏｄｅｕｒ， Ｆ． Ｅ． Ａｓｈｔｏｎ及び Ｂ． Ｂ． Ｄｉｅｎａ， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １５， Ｎｏ． １：１−９（１９８１）；Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈ．， ２９：１５０−１５３（１９７６）；石川栄治、他編「酵素免疫測定法」株式会社医学書院、１９７８年〕などを挙げることができる。
【００６１】
前記水不溶性担体とは、固定化、保存、測定などにおいて用いられる液体媒質に実質的に不溶性である担体を指す。当該担体としては、特異的結合反応に使用されるものが種々知られており、本発明においてもこれらの公知のものの中から選んで使用できる。特に好適に使用されるものとしては、例えば架橋化アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、架橋アガロース、セルロース、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテート、架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体などのポリエステル、ナイロンなどのポリアミド、ポリウレタン、ポリエポキシ樹脂などの有機高分子物質を乳化重合して得られたものなどの有機高分子物質、ガラス、例えば活性化ガラス、シリカゲル、シリカ−アルミナ、アルミナなどの無機材料などからなるもので、必要に応じ、シランカップリング剤などで官能性基を導入してあるものが挙げられる。
【００６２】
本発明に係るガレクチン−グリコサミノグリカン結合体を構成するガレクチン分子を固定化した担体をカラムなどに詰めて被検試料を該カラムに通し、該結合体または該結合体を構成するグリコサミノグリカンン分子の分離、精製、および／または検出する方法に用いることができる。また、前記ガレクチン−グリコサミノグリカン結合体を構成するグリコサミノグリカン分子を固定化した担体をカラムなどに詰めて被検試料を該カラムに通し、該結合体または該結合体を構成するガレクチン分子を精製、分離および／または検出する方法に用いることができる。
【００６３】
前記被検試料としては、例えば糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、非ペプチド性糖鎖含有化合物、合成化合物、発酵生産物、植物抽出物、動物などの組織抽出物、細胞抽出物などが挙げられる。被検試料に使用される試験化合物の例には、ガレクチン阻害剤、ガレクチンに対するインヒビター活性を有する化合物、特には合成化合物を含んでいてよい。
これら化合物は、新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００６４】
前記ガレクチン分子を固定化した担体に、ガレクチン分子を介して結合したグリコサミノグリカン分子または形成されたガレクチン−グリコサミノグリカン結合体の検出は、該グリコサミノグリカンに特異的に結合する物質を用いて行うことが好ましい。また、前記グリコサミノグリカンを固定化した担体に、グリコサミノグリカン分子を介して結合したガレクチン分子または形成されたガレクチン−グリコサミノグリカン結合体の検出は、該ガレクチン分子に特異的に結合する物質を用いて行うことが好ましい。当該物質としては、例えば該グリコサミノグリカン分子またはガレクチン分子に対する抗体等が親和性の強さから好ましい。
【００６５】
前記抗体としてはポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を用いることが可能であり特に限定はされない。前記検出において、上記グリコサミノグリカン分子またはガレクチン分子に対する抗体を用いる場合は、当該抗体又は当該抗体に対する二次抗体を標識物質により標識することが、より正確なグリコサミノグリカン分子またはガレクチン分子の検出が可能となるため好ましい。
【００６６】
前記標識物質としては、例えば特異的結合対（例えばビオチンとストレプトアビジン等のアビジン類、又はレクチンとそのレクチンが認識する糖鎖等）の一方の物質；ＦＩＴＣ、フィコエリトリン、ユーロピウム、フィコシアニン、ローダミン、テキサスレッド、ウンベリフェロン、トリカラー、シアニン又は７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）等の蛍光物質類；ルミノール、アクリジニウム又はルシゲニン等の発光物質類、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ又はグルコースオキシダーゼ等の酵素類；ジニトロフルオロベンゼン、ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）又は２，４−ジニトロアニリン等のハプテン類；及び125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ等のラジオアイソトープ類等を用いることができる。
【００６７】
前記標識物質の検出は、使用する標識物質に適した通常実施される方法により行うことが可能である。例えば、標識物質として上記酵素に分類されるペルオキシダーゼを用いた場合は、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などの酸素受容体と過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）などの酸素供与体を反応させることにより、溶液の着色により検出することが可能である。
【００６８】
本発明は、本発明に係るガレクチン−グリコサミノグリカン結合体または該結合体を構成するガレクチン分子を精製、分離および／または検出するための、該結合体を構成するグリコサミノグリカン分子を固定化した担体を含むキットを提供する。また、本発明は、本発明のガレクチン−グリコサミノグリカン結合体または該結合体を構成するグリコサミノグリカン分子を分離、精製および／または検出するための、該結合体を構成するガレクチン分子を固定化した担体を含むキットを提供する。
【００６９】
生体内においてガレクチン分子は、ガラクトース含有糖鎖に結合することで種々の生理機能を発揮していると考えられている。このことから、ガレクチン分子の機能は、外部から加えたグリコサミノグリカン分子により促進または阻害することができる。したがって、本発明は、本発明に係るガレクチン−グリコサミノグリカン結合体を構成するグリコサミノグリカン分子により、該結合体を構成するガレクチン分子の生物学的活性を促進または阻害する方法を提供する。また、本発明はガレクチン−グリコサミノグリカン結合体を構成するグリコサミノグリカン分子を含有する、該結合体を構成するガレクチン分子の生物学的活性を促進または阻害する組成物を提供する。当該組成物、および本発明に係るガレクチン−グリコサミノグリカン結合体は、各種疾病の予防および／または治療のための種々の医薬用材料として用いることも可能である。
【実施例】
【００７０】
以下、本発明を実施例に基づき更に詳細に説明する。
【００７１】
実施例１
各種ガレクチン分子固定化カラムの作製
各種ガレクチン分子は、独立行政法人産業技術総合研究所において、既知の手法により調製した（ガレクチン−１、８Ｎ、８Ｃ、９Ｎ、９Ｃは香川大学、ガレクチン−３は帝京大学それぞれよりプラスミドを譲り受け、常法に従ってタンパク質発現、精製された）。
【００７２】
ガレクチン分子固定化用担体としてＮＨＳセファロース（アマシャム・バイオサイエンス社）を用い、添付書記載の方法に準じて、Ｎａｋａｍｕｒａ Ｓ， Ｙａｇｉ Ｆ， Ｔｏｔａｎｉ Ｋ． Ｉｔｏ Ｙ， Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ Ｊ． ＦＥＢＳ Ｊ． ２７２：２７８４−２７９９ （２００５）に記載の方法で各種ガレクチン分子固定化カラムを作製した（括弧内は固定化濃度、mgガレクチン／mｌ担体）。
【００７３】
各ガレクチン分子は次の濃度でカラムに固定化した；ガレクチン−１（０．８ｍｇ／ｍｌ）、ガレクチン−３（０．５ｍｇ／ｍｌ）、ガレクチン−８Ｎ（３．６ｍｇ／ｍｌ）、ガレクチン−８Ｃ（４．０ｍｇ／ｍｌ）、ガレクチン−９Ｎ（３．６ｍｇ／ｍｌ）、ガレクチン−９Ｃ（３．０ｍｇ／ｍｌ）。各ガレクチンを固定化した担体は、ステンレス製ミニチュアカラム（内径２ｍｍ、長さ１０ｍｍ；島津製作所製）に充填した。
【００７４】
実施例２
蛍光標識（ピリジルアミノ化（以下「ＰＡ化」という））グリコサミノグリカン分子の調製
コンドロイチン（ＣＨ）、コンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳＡ）、デルマタン硫酸（ＣＳＢ）、コンドロイチン硫酸Ｃ（ＣＳＣ）、コンドロイチン硫酸Ｄ（ＣＳＤ）、コンドロイチン硫酸Ｅ（ＣＳＥ）、角膜型ケラタン硫酸（ＫＳ−Ｉ）は、生化学工業（株）より購入した。
【００７５】
ヒアルロナン（ＨＡ）、Ｎ−アセチルヘパロサン（ＮＡＨ）、軟骨型ケラタン硫酸（ＫＳ−II）は、それぞれ生化学工業（株）において、鶏冠、大腸菌Ｋ５株培養上清、鮫軟骨から調製された。デルマタン（ＤＮ）は、ＣＳＢを公知の化学的手法により完全脱硫酸化して調製した。
【００７６】
ケラタン硫酸構成オリゴ糖であるＧ２Ｋ１、Ｇ１Ｌ１、Ｇ４Ｌ４、Ｌ２Ｌ２、Ｌ２Ｌ４、Ｌ４Ｌ４、ＳＬ２Ｌ４のそれぞれについては、特許公開公報２００６−０４７２４０号に記載の方法により調製した。
【００７７】
以上の各糖鎖の蛍光標識は、広く公知のＰＡ化法〔Ｈａｓｅ Ｓ， Ｉｋｅｎａｋａ Ｔ， Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ Ｙ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ８５：２５７−２６３  （１９７８）〕によって行い、公知のゲル濾過ＨＰＬＣ法によって精製した。一方、コンドロイチンオリゴ糖（ＣＨ３〜ＣＨ１２）は、ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３２２８４７に記載の方法によって調製されたものを用いた。
【００７８】
実施例３
ＦＡＣ実施例（１）：結合性試験
ガレクチン分子固定化カラムを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムに装着し、Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｓ，Ｙａｇｉ  Ｆ，Ｔｏｔａｎｉ  Ｋ，Ｉｔｏ  Ｙ，Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ  Ｊ，ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２７２．，２７８４−２７９９（２００５）に記載の方法により実験を行った。
【００７９】
試料（ＰＡ化グリコサミノグリカンおよび陰性対照試料：ガレクチンと相互作用しないＰＡ化糖）の導入容量は５００μｌ、総試料量５〜５０ｐｍｏｌ程度とした。
【００８０】
陰性対照試料としては、ＰＡ化N-アセチルグルコサミン（ＰＡ−ＧｌｃＮＡｃ、タカラバイオ製、ＰＡ化グリコサミノグリカン・オリゴ糖試料対象）またはＰＡ化プルラン（Ｓｈｏｄｅｘ社製標準プルランをＰＡ化したもの、ＰＡ化グリコサミノグリカン多糖試料対照）を用い、蛍光検出によるこれらの溶出容積（Ｖ０値）と、試料、即ちＰＡ化グリコサミノグリカン糖鎖の溶出容積（Ｖ値）からＶ−Ｖ０値を算出し、これを相互作用の強さの指標とした（蛋白質  核酸  酵素、Ｖｏｌ４８、Ｎｏ．８、１２０６〜１２１２ページ、２００３年）。実施例１の結果を表３に示す。    
【００８１】
【表３】
0005704661.tif 000004
【００８２】
ＰＡ化グリコサミノグリカン（ＨＡ、ＣＨ、ＤＮ、ＮＡＨ、ＣＳＡ、ＣＳＢ、ＣＳＣ、ＣＳＤ、ＣＳＥ、ＫＳ−Ｉ、ＫＳ−II）のＶ−Ｖ０値はPA-GlcNAcに対して、ＰＡ化グリコサミノグリカン・オリゴ糖（Ｇ２Ｋ１、Ｇ１Ｌ１、Ｇ４Ｌ４、Ｌ２Ｌ２、Ｌ２Ｌ４、Ｌ４Ｌ４、ＳＬ２Ｌ４、ＣＨ３〜ＣＨ１２）のＶ−Ｖ０値はＰＡ化プルランに対して、それぞれ算出して示した。  
【００８３】
なお、本実施例においては、Ｖ−Ｖ０値が５μｌ未満の算出値については相互作用検出限界未満として扱った。すなわち、表３中において５μｌ以上のＶ−Ｖ０値が示されているガレクチン−グリコサミノグリカン糖鎖の間に、相互作用（結合）が認められたことが示されている。
【００８４】
表３に示したように、以下の結果が得られた。
（１）ガレクチン−８Ｃは、いずれのグリコサミノグリカン分子とも結合しなかった。
（２）ＫＳ−Ｉはガレクチン−１、３、９Ｎ、９Ｃと結合した。ＫＳ−IIはガレクチン−３、９Ｎ、９Ｃと結合したが、ＫＳ−Ｉとの結合よりも弱かった。これは、ＫＳ−IIの持つガラクトースのほとんどが硫酸基を持っているのに対し、ＫＳ−Ｉの持つガラクトースの多くが硫酸基を持っていないことに起因していると考えられた〔Ｆｕｎｄｅｒｂｕｒｇｈ  Ｊ．Ｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１０，９５１（２０００）〕。
（３）ケラタン硫酸構成オリゴ糖の中でも、硫酸基を持たないガラクトースを有するオリゴ糖（即ちＧ２Ｋ１、Ｇ１Ｌ１、Ｌ２Ｌ２、Ｌ２Ｌ４、ＳＬ２Ｌ４）は、種々のガレクチン分子と結合した。一方で、ガラクトースがすべて硫酸基を持つオリゴ糖（即ちＧ４Ｌ４とＬ４Ｌ４）は、いずれのガレクチン分子とも結合しなかった。
（４）ＨＡ、ＮＡＨ、およびコンドロイチン硫酸類（ＣＳＡ、ＣＳＢ、ＣＳＣ、ＣＳＤ、ＣＳＥ）は、いずれのガレクチン分子とも結合が認められなかった。
（５）ガレクチン−３と９ＮはＣＨおよびＤＮと結合し、さらにコンドロイチンオリゴ糖鎖（ＣＨ３〜ＣＨ１２）とも結合することがわかった。ＣＨおよびＣＨオリゴ糖はその構造中にガラクトースを持たないが、Ｎ−アセチルガラクトサミンを持っており、それを介して結合していると考えられた。
【００８５】
実施例４
ＦＡＣ実施例（２）：競合阻害実験
ガレクチン分子と該ガレクチン分子に結合する糖鎖との結合をグリコサミノグリカン分子により阻害する競合阻害のモデル実験をＦＡＣにより実施した。ＦＡＣの実施は、上記の実施例１に従った。また、ガレクチン分子に対して結合することが知られているモデル糖鎖として、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（以下ＬＮｎＴ、Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc、生化学工業より購入）のＰＡ化物を使用した。
【００８６】
実験は、終濃度５．０ｎＭのＰＡ−ＬＮｎＴ試料溶液に対して種々の濃度のグリコサミノグリカン分子（ＰＡ化していないもの、即ち阻害糖鎖）を混合してＦＡＣにおける溶出容積（Ｖ２値）を測定し、非混合時の溶出容積（Ｖ１値）と陰性対照試料の溶出容積（Ｖ０値）から、以下の通り阻害率（％）を算出した。
【００８７】
阻害率（％）＝ １００×（Ｖ１−Ｖ２）／（Ｖ１−Ｖ０） 
なお、本実験に用いた非標識（ＰＡ化されていない）ＣＨ４、ＣＨ６、ＣＨ１０、ＨＡ４、ＣＳＡ４は、それぞれ生化学工業（株）において公知の方法に従って調製した。ＦＡＣ実施例（２）の結果を表４および５に示す。
【００８８】
【表４】
0005704661.tif 000005
【００８９】
【表５】
0005704661.tif 000006
【００９０】
表４に示したように、ガレクチン−３とＬＮｎＴとの結合はＣＳＡ４、ＨＡ４では阻害されなかったが、ＦＡＣ実施例（１）においてガレクチン−３に結合したコンドロイチンオリゴ糖では、阻害効果が確認された。また、表５に示したように、ガレクチン−９ＮとＬＮｎＴとの結合がＣＨ４によって濃度依存的に阻害されることも確認された。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
上記に述べたように、本発明により新規物質としてのガレクチン−グリコサミノグリカン結合体が提供されるとともに、ガレクチン分子またはグリコサミノグリカン分子の分離、精製、検出ツールが提供される。また、ガレクチン分子結合性のグリコサミノグリカン分子は生体内における該ガレクチン分子の生理的機能の調節に利用できる可能性があり、医療への適用が期待される。
【００９２】
さらには、本発明により明らかとなった種々のガレクチン分子とグリコサミノグリカン分子との結合性は、国際公開公報ＷＯ ２００５／０６４３２７号等に記載のグリコサミノグリカン糖鎖の構造を推定する方法に適用することができる。