(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞支持材と、細胞と、アガロース及びアガラーゼの均質な混合物とを含み、
輸送培地における上記アガラーゼの濃度が、１％アガロース１ｍｌあたり６０〜８０ユニットであり、
輸送培地における上記アガロースの最終濃度が０．２〜０．６％であることを特徴とする細胞輸送システム。
【請求項２】
上記細胞が任意の細胞タイプに属することを特徴とする請求項１に記載の細胞輸送システム。
【請求項３】
上記細胞が、接着細胞、半接着細胞および非接着細胞の群より選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞輸送システム。
【請求項４】
上記細胞が動物由来であることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の細胞輸送システム。
【請求項５】
上記細胞が、ヒト、ネズミ、イヌ、ウシ及び／又はヒツジの細胞の群より選択されることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の細胞輸送システム。
【請求項６】
上記細胞が、神経細胞、中枢神経系細胞、末梢神経系細胞、真皮−上皮系細胞、骨関節系細胞、多能性胚前駆細胞、多能性成人前駆細胞、多分化能胚前駆細胞、多分化能成人前駆細胞、造血系細胞、免疫系細胞及び／又は筋肉系細胞の群より選択されることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の細胞輸送システム。
【請求項７】
上記細胞が、神経細胞，グリア細胞，非グリア細胞，骨芽細胞，骨細胞，破骨細胞，軟骨芽細胞，軟骨細胞，線維芽細胞，ケラチノサイト，メラニン形成細胞，腺細胞，角膜細胞，網膜細胞，間葉系幹細胞，造血幹細胞，胚性幹細胞，上皮細胞，血小板，胸腺細胞，リンパ球，単球，マクロファージ，筋細胞，肝細胞，腎細胞，尿道細胞，心筋細胞，筋芽細胞及び／又は生殖細胞の群より選択されることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の細胞輸送システム。
【請求項８】
上記細胞が、前述した任意の種類の細胞から確立された腫瘍細胞又は細胞株であることを特徴とする請求項６または７に記載の細胞輸送システム。
【請求項９】
上記細胞が遺伝的に改変されていることを特徴とする請求項１〜８の何れか１項に記載の細胞輸送システム。
【請求項１０】
上記細胞が神経細胞であることを特徴とする請求項１〜９の何れか１項に記載の細胞輸送システム。
【請求項１１】
上記細胞が遺伝的に改変された神経細胞であることを特徴とする請求項１〜１０の何れか１項に記載の細胞輸送システム。
【請求項１２】
上記細胞は、上記アガロース及びアガラーゼの混合物が添加された単層形態中で培養されていることを特徴とする請求項１〜１１の何れか１項に記載の細胞輸送システム。
【請求項１３】
細胞を含む細胞輸送システムであって、
上記細胞は、アガロース及びアガラーゼの混合物に埋め込まれた懸濁液中で培養されていることを特徴とする請求項１〜１２の何れか１項に記載の細胞輸送システム。
【請求項１４】
上記細胞支持材が、任意の細胞培養形式を有することを特徴とする請求項１〜１３の何れか１項に記載の細胞輸送システム。
【請求項１５】
上記形式は、プレート、フラスコ、チューブ、培養チャンバー、瓶又はトランスウェル型非対称システム（三次元培養）を含む群より選択されることを特徴とする請求項１４に記載の細胞輸送システム。
【請求項１６】
上記細胞支持材の表面は、上記細胞の上記細胞支持材への接着能を高める細胞外マトリクス成分を含み、単層の細胞培養を可能にすることを特徴とする請求項１２〜１５の何れか１項に記載の細胞輸送システム。
【請求項１７】
上記細胞の上記細胞支持材への接着能を高める上記細胞外マトリクス成分が１０〜７５μｇ／ｍｌの濃度のポリ−Ｌ−リジンであることを特徴とする請求項１６に記載の細胞輸送システム。
【請求項１８】
上記細胞支持材における上記ポリ−Ｌ−リジンの濃度が５０〜７０μｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１７に記載の細胞輸送システム。
【請求項１９】
上記細胞支持材における上記ポリ−Ｌ−リジンの濃度が６０μｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１８に記載の細胞輸送システム。
【請求項２０】
輸送培地における上記アガラーゼの濃度が、１％アガロース１ｍｌあたり８０ユニットであることを特徴とする請求項１に記載の細胞輸送システム。
【請求項２１】
使用される上記アガロースが低融点アガロースであることを特徴とする請求項１〜２０の何れか１項に記載の細胞輸送システム。
【請求項２２】
上記アガロースの融点がほぼ４２℃であることを特徴とする請求項２１に記載の細胞輸送システム。
【請求項２３】
輸送培地における上記アガロースの最終濃度が０．５％であることを特徴とする請求項１〜２２の何れか１項に記載の細胞輸送システム。
【請求項２４】
０．５％の濃度の低融点アガロース、及び１％アガロース１ｍｌあたり８０ユニットの濃度のアガラーゼの混合物を含むことを特徴とする請求項２３に記載の細胞輸送システム。
【請求項２５】
アガロース及びアガラーゼの混合物を含む輸送システムであって、
上記アガロース及びアガラーゼの混合物は、２５℃以下の温度において半固体状態のままであることを特徴とする請求項１〜２４の何れか１項に記載の細胞輸送システム。
【請求項２６】
上記アガロース及びアガラーゼの混合物は、上記アガロースが上記アガラーゼによって消化されるときに液体状態を保つことを特徴とする請求項１〜２５の何れか１項に記載の細胞輸送システム。
【請求項２７】
上記アガロース及びアガラーゼの混合物が上記細胞支持材から取り除かれることにより、種々の用途に使用するために準備された細胞培養物が残されることを特徴とする請求項１〜２６の何れか１項に記載の細胞輸送システム。
【請求項２８】
基本的な細胞培養技術によって、上記細胞輸送システムから上記細胞を抽出することが可能であることを特徴とする請求項１〜２７の何れか１項に記載の細胞輸送システム。
【請求項２９】
請求項１〜２４の何れか１項に記載の細胞輸送システムを準備するステップと、
細胞を輸送するステップと、
細胞を回復させるステップとを含み、
輸送するステップは、２５℃以下の温度にて行なわれ、上記輸送の時間は６０時間以内であり、
上記細胞の回復は、上記アガロース及びアガラーゼの混合物を消化するステップｆを含み、
上記アガロース及びアガラーゼの混合物を消化するステップは、輸送システムを３７℃でインキュベートするステップを含む、細胞を輸送する方法。
【請求項３０】
上記細胞輸送システムは、請求項１、２０〜２４の何れか１項に記載の細胞輸送システムであり、
細胞輸送システムを準備するステップは、以下のステップを含むことを特徴とする請求項２９に記載の細胞を輸送する方法：
細胞培養物を接種するステップａ、
アガロース及びアガラーゼの混合物を調製するステップｂ、
ステップｂにおける上記混合物を上記細胞培養物に添加するステップｃ、
上記アガロース及びアガラーゼの混合物を固化させるステップｄ、
上記細胞輸送システムを密閉するステップｅ。
【請求項３１】
ステップｂは、以下のステップを含むことを特徴とする請求項３０に記載の細胞を輸送する方法：
輸送しようとする上記細胞培養物の種類に特異的な培養培地の中に、請求項１または２３にしたがって確立された濃度にてアガロース溶液を混合させるステップｉ、
ステップｉのアガロース溶液に、請求項１または２０にしたがって確立された濃度にてアガラーゼを添加するステップii、
上記混合物をホモジナイズし、かつこれを３７℃に調整するステップiii。
【請求項３２】
ステップｃは、単層培養された細胞を、請求項３１にしたがって調製されたステップｂにおける混合物で覆うステップを含むことを特徴とする請求項２９〜３１の何れか１項に記載の細胞を輸送する方法。
【請求項３３】
ステップｃは、懸濁液中の細胞と、請求項３１にしたがって調製されたステップｂにおける混合物との均質な混合物を含むことを特徴とする請求項２９〜３１の何れか１項に記載の細胞を輸送する方法。
【請求項３４】
ステップｄは、１５〜３０分間、３７℃より低い温度にて行なわれることを特徴とする請求項２９〜３１の何れか１項に記載の細胞を輸送する方法。
【請求項３５】
上記輸送は１８℃〜２３℃の範囲の温度にて行なわれ、上記輸送の時間は４８時間以内であることを特徴とする請求項２９に記載の細胞を輸送する方法。
【請求項３６】
上記輸送は２２℃の温度にて行なわれることを特徴とする請求項３５に記載の細胞を輸送する方法。
【請求項３７】
上記輸送は、室温に関係なく、適切な時間において温度範囲を維持することができる携帯型の状態調節型デバイスの中で行なわれることを特徴とする請求項２９〜３６の何れか１項に記載の細胞を輸送する方法。
【請求項３８】
輸送される細胞の生存度が８５％以上であることを特徴とする請求項２９〜３６の何れか１項に記載の細胞を輸送する方法。
【請求項３９】
上記細胞の回復が以下のステップを更に含むことを特徴とする請求項２９〜３８の何れか１項に記載の細胞を輸送する方法：
輸送培地を除去した後、これを培養培地と交換するステップｇ、
細胞培養物を回復させるステップｈ。
【請求項４０】
ステップｆが以下のステップを含むことを特徴とする請求項２９に記載の細胞を輸送する方法：
上記細胞輸送システムを３７℃で１．５〜２時間インキュベートするステップ１、
調整した培養培地を添加するステップ２、
上記細胞輸送システムを、３７℃でさらに１時間インキュベートするステップ３。
【請求項４１】
上記細胞が懸濁液中にあるとき、ステップｆは、上記細胞輸送システムを８００〜１０００ｇで遠心分離することを含む、さらなるステップ４を含むことを特徴とする請求項３９に記載の細胞を輸送する方法。
【請求項４２】
上記細胞培養物を回復させるステップは、上記細胞を３７℃及び５％ＣＯ２にてインキュベートするステップを含むことを特徴とする請求項３９に記載の細胞を輸送する方法。
【請求項４３】
上記細胞が、これらを輸送する支持材から抽出されることを特徴とする請求項３９に記載の細胞を輸送する方法。
【請求項４４】
上記細胞が、これらを輸送する支持材の中に残存することを特徴とする請求項３９に記載の細胞を輸送する方法。
【請求項４５】
細胞及び／又は分子生物学アッセイを実施するための、請求項１〜２８の何れか１項に記載の細胞輸送システムの使用。
【請求項４６】
薬剤、生体材料及びナノ粒子の試験、機能別アッセイ、形態学的研究、遺伝子発現を特徴づけるための研究、タンパク質発現を特徴づけるための研究を含む群より選択されるアッセイを実施するための、請求項４５に記載の細胞輸送システムの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔本発明の技術分野〕
本発明は、細胞輸送のためのシステムに関する。このシステムは、細胞を輸送し、全輸送プロセスにおけるこれらの整合性及び生存度を保証する。このシステムは、このシステムの広範な技術的適用を可能にする多種多様な形式に好適なシステムからなる。本発明のシステムは、細胞生物学の技術的な専門家によって使用前に細胞を操作することなしに、すぐに使用できる細胞を提供することを可能にする。本発明は、特に、選択した輸送システムの形式に依存して細胞培養物をカバーし、もしくは被覆し、輸送プロセスの間に細胞培養物を保護するアガロース及びアガラーゼの混合物、ならびにシステム中で輸送される細胞の細胞回復の方法に関する。
【０００２】
〔本発明の背景〕
従来技術においては、細胞の輸送中及び目的地での細胞の回復プロセス中の両方において、細胞の整合性及び生存度を維持し、複雑な方法を取り扱うことを要しない輸送システムを得ることに関心があった。
【０００３】
細胞輸送は、現在、低温保存状態において細胞を輸送する方法、又は培養状態において細胞を輸送する方法の２つの異なる方法により行なわれている。
【０００４】
培養物中の細胞を輸送する技術は、細胞を接着させておくこと、又はフラスコの液体培養培地中に懸濁させておくことを可能にする。この方法では、輸送中に長時間持続する小さい動きが整合性及び細胞の接着能に影響を与え、その結果目的地での細胞の生存度に影響を与えるため、輸送条件について極めて注意深くなる必要がある。これは、このようにして輸送される培養物の多くが、種々の研究計画に使用するために適した生存度、つまり細胞の形態的変化及び／又は機能的変化のない細胞生存度では、目的地に到達しないことを意味する。
【０００５】
このような理由により、効率的な細胞培養輸送システムは、全輸送プロセス及びその使用のための細胞の回復プロセスの間、細胞の整合性が好ましく維持されること、すなわち、細胞の生存度が全プロセス中で影響されないことを、保証しなければならない（参考文献１５〜１９）。
【０００６】
低温保存状態での輸送は、バイアルに入った冷凍状態の細胞の輸送を含む。このことは、細胞を再度使用するために、必要とされる細胞の培養、細胞増殖及び維持を含む単調な操作、ならびに試験の方法を実施するために要求される形式に細胞を準備することを専門とする設備及び人員を、目的地が備えていなければならないことを意味する。
【０００７】
多くの細胞株及び細胞タイプが温度変化に敏感であることにより、温度が細胞の整合性の維持に直接的に影響するため、細胞輸送において注意すべき点の１つは、細胞が輸送される温度である。
【０００８】
低温保存は、輸送温度が非常に低くかつ一定であり、全輸送期間中維持するのは困難である。これは、輸送が非常に特別な条件下で行なわれなければならないことを意味する。すなわち、バイアルは、全輸送プロセスにおいて−８０℃より低い温度に保持すべきであり、さもなければ細胞の生存度が深刻な影響を受ける可能性がある。
【０００９】
動物細胞培養にとって最適な生育温度は、３６〜３８℃である。この温度範囲を超えると（高温条件）細胞の生存度が影響され、培養物の細胞の整合性が不可逆的に損傷を受け、そして細胞死を引き起こす。
【００１０】
至適温度範囲より低い温度（低温条件）は、高温の場合よりも細胞培養によりよく許容される。推奨される至適温度より低い温度の適用は、細胞の代謝を減少させ、すなわち細胞の反応（増殖、代謝、生育など）を減速させるが細胞は自身の整合性を維持し、そして生育のための至適温度条件が回復したときに細胞はその細胞活性を回復させる。
【００１１】
従来技術では、低温法は、微生物及び腫瘍細胞の成育を減速させるために広く使用される方法である。本発明において記載されるシステムはこの特徴を利用するため、細胞は輸送中に代謝が減速され、細胞の整合性の維持に役立つ。
【００１２】
従来技術は、培養物中の細胞を輸送するためのいくつかのシステムを含む。ある文献では、細胞培養物は１〜２０％の液体のゼラチンを含む培地で覆い、固化した後、細胞を損傷させないように輸送され得る。しかしながら、他の文献には、培養、保管及び細胞培養物の輸送のための特別な装置が記載される。
【００１３】
特許出願第Ｐ２００３０１５２６号明細書には、２次元細胞培養物を保管及び輸送するための方法が記載され、この方法では、細胞をトランスウェル型非対称サポート上に固定化し、１〜５％の濃度のゼラチン溶液で覆い、冷却することにより固化し、このように培養物の細胞整合性を維持しながらシステムを輸送し得ることを容易にする。プレートは、目的地の実験室において３７℃で４時間インキュベートすることにより、ゼラチンを液化させて、細胞培養物、すなわち適切な転移アッセイを行なうために準備された細胞から取り除くことができる。しかし、このシステムは、トランスウェル型非対称サポート内のアッセイ以外に適用するために細胞培養物を使用することができない。
【００１４】
その一方、本明細書で提案する発明は、輸送システムそれ自体の中での適用、又はいったんそれから抽出される適用の両方の特定の適用において要求される、どのような細胞培養形式にも好適であり、また、３時間以内の時間で細胞を回復させることができ、これはスペイン特許出願第Ｐ２００３０１５２６号明細書に記載される方法（４時間）よりも短い時間である。
【００１５】
欧州特許出願第ＥＰ０７０２０８１号明細書には、３次元組織を保管し、かつ輸送するための方法が記載されている。この文献に記載される発明は、１〜２０％（好ましくは５〜１０％）のゼラチン溶液に覆われた２種類のスポンジ上に固定された皮膚の３次元培養の配置からなり、したがって冷却によって溶液が半固体化し、これによりその輸送及び保管を容易にする。上述したスペイン特許出願のように、この文献には、この３次元培養からゼラチンを取り除くために使用される方法が記載されている。この方法は、システムにおける細胞整合性を保存しながら、ゼラチンを液化するために温度を最大３７℃まで上昇させる工程からなる。この文献は、アガロースの融点が約６０℃であり、すなわちこの温度よりももっと高い温度が細胞の生存を可能にするため、アガロースの使用がこのシステムに好適であり得ることを明示する。この文献に記載されるシステムは、外部で同様に使用するための細胞培養物の回復をさらに可能にしない。
【００１６】
国際特許出願公開第２００７／０８０６００号パンフレットには、生きている接着細胞の培養及び／又は保管ならびに輸送のための使い捨ての装置が記載される。この装置では、細胞は装置にくっついたメンブレン、ゲル又は微小孔性基板上に接種され、その後その上に細胞が生育を維持するために必要な栄養物を細胞に提供する培地が添加され得る。細胞が培養されるコンパートメント内に液体の損失及び空気が入ることを防ぐため、装置はしっかり封される。その装置が目的地に到達した後、細胞が接種されたメンブレン、ゲル又は基板が抽出され、そして洗浄されて、その後移植され得る。しかし、この文献は、メンブレン上で培養された細胞をメンブレンから分離する場合については何も示していないため、このような細胞を単独で使用することができない。この文献に記載された装置ではさらに、接着していない細胞培養物の輸送を行なうことができない。
【００１７】
したがって、本発明は、輸送培地として、室温でゲル化し、かついったんその目的地にサンプルが到達したら、システムを３７℃に加熱した後、アガロースの消化を容易にする温度でアガラーゼが活性化する結果、取り除くことができる、アガロース及びアガラーゼ溶液を提供する。さらにこのシステムは、プレート、培養チャンバー、瓶、チューブ、トランスウェル型非対称サポートなどを含むどのような培養形式にも好適である。
【００１８】
本発明で述べられる輸送システムは、輸送に由来する動きが細胞の整合性に障害を与えることを防ぎ、それゆえ輸送された細胞の回復、又はこれらを用いた種々のアッセイの実行を可能にする最適な細胞生存度を維持しながら、接着された状態及び懸濁された状態の両方の培養物における細胞が、輸送され得ることを保証する。
【００１９】
アガロースは、（１−３）結合β−Ｄ−ガラクトース及び（１−４）結合（３−６）−アンヒドロ−α−Ｌ−ガラクトースの交互コポリマーからなり、熱的に可逆的な多糖である。すなわちアガロースは、影響を受ける温度の変化を通して融解又はゲル化することができ、細胞封入に広く使用される。
【００２０】
アガロース中の細胞封入は、例えばバイオセンサーとしての細胞の使用、治療的な使用などの多種多様な適用を実行するための従来技術において知られている（参考文献１１、１２）。さらに、インビボ移植技術を用いて生体適合性であるアガロースが提供される（参考文献１、２、１３）。さらに、アガロースヒドロゲル中に封入された細胞が、その自分の細胞外マトリクスを分泌する能力を有することが観察されており（参考文献１４）、このことは、この培地中で細胞の機能的態様が変化しないことを示す。しかし、アガロースは、このタイプの細胞培養において細胞増殖を誘導するとは思われないため、三次元培養物の形成によく使用される培地ではない。
【００２１】
アガラーゼは、アガロースにおけるＤ−ガラクトース残基と３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース残基との間の［１−３］結合を加水分解する、分子量３２ｋＤＡの酵素である。
【００２２】
従来技術には、培養物に添加されたアガラーゼ溶液を用いた処理によってアガロースに封入された培養物をどのように回復し得るかもまた記載される。これらの場合には、受け取った実験室がアガラーゼを所有し、必要な濃度で混合物を調製し、システムに添加しなければならない。しかし、アガラーゼは全てのアガロースゲルに直接接触しないため、この方法にしたがったアガロース消化は均質ではなく、そのため回復期間が長くなり、最終的に細胞生存度を減少させる。
【００２３】
１．５％アガロース溶液中に封入された細胞培養物の回復を示す参考文献１及び２において、一例を見ることができる。この回復を実施するために、独立して加えられたアガラーゼ溶液を用いて三次元構造が処理される。国際公開第２００１／４０４４５号パンフレットでは、細胞又は細胞群を処理し、この細胞が分泌する物質を捕獲するために２％アガロース溶液が使用される。使用されるアガロースは、事前にその中にサイトカイン及びホルモン特異的な結合部位を組み込むように処理される。アガロースマトリクスを除去するために、アガロースの酵素的消化を起こすアガラーゼ溶液が添加される。
【００２４】
対照的に、本発明のシステムは、輸送培地として均質的なアガロース−アガラーゼ混合物の使用を含むため、受け取る実験室がアガラーゼを所有し、必要な濃度で混合物を調製し、そしてそれをシステムに添加する必要がない。さらに、本発明のシステムは、回復した細胞培養物の最適な生存度を達成するために、細胞培養物全体にわたる均質的な消化を好む。
【００２５】
本発明のシステムのさらなる利点は、低濃度のアガロースを使用することであり、細胞回復中におけるアガロースの完全な消化のために必要なアガラーゼの量がより少なくなる。したがってそのため、細胞がその酵素的作用に影響されにくく、その生存度及び増殖能に関して変化を示さない。
【００２６】
従来技術を考慮すれば、接着及び非接着の細胞培養物の両方について標準的な細胞輸送システムであって、どのような細胞培養形式及びシステム適用にも好適であり、輸送プロセスにおける細胞培養物の整合性及び生存度を保証し、そのため細胞回復プロセスにおいて細胞培養に特化した設備又は人員を必要としない、細胞輸送システムを提供する必要があることは明らかである。本発明に記載される輸送システムは、最高品質の基準及び生存度において、接着された状態、及び懸濁された状態の両方の培養物における細胞を輸送することを可能にし、そしてさらに、輸送された細胞の最終的な適用において必要とされない場合には細胞培養物の回復及び使用のための特別な基本的設備を全く必要としない、単純な細胞輸送システムを提供する。
【００２７】
本発明により記載される本システムに求められる輸送条件は、冷却された輸送温度を要求するものでなく、また、輸送時間が危険要素とはならない。本発明の細胞輸送システムによれば、細胞培養物の生存度に影響を与えずに、細胞を長時間２５℃以下の温度で輸送することができる。
【００２８】
〔本発明の目的〕
本発明は、細胞輸送のためのシステムを提供する。このシステムは、細胞を輸送し、そのプロセス中の整合性及び生存度を保証し、多種多様なフォーマットに適用可能であり、このシステムの広範囲の適用をカバーする。
【００２９】
このシステムでは、細胞は、均質なアガロース及びアガラーゼ混合物によって覆われ、もしくは埋め込まれ、固化された後、細胞輸送が可能になる。システムは、２５℃以下の範囲、好ましくは１８〜２３℃、より好ましくは２２℃の温度にて輸送されるため、アガラーゼが不活性のままである。細胞回復は、３７℃にてシステムをインキュベートする方法により簡単に行なわれ、この方法はアガラーゼを活性化し、アガロースを消化して液化しやすくし、使用前に培養支持材からこれを除去することを含む。
【００３０】
回復した細胞培養物はその整合性及び生存度を維持しているため、輸送システムの有効性が保証される、すなわち、本発明において記述される輸送システムは、輸送条件における細胞培養物の生存度を実質的に向上させる。
【００３１】
このように、このシステムは、すぐに使用できる細胞を提供することができ、その細胞の回復プロセスは、細胞生物学技術における最小限の操作及び知識しか必要としない。
【００３２】
本発明において：
細胞輸送は、細胞培養物の輸送に関する。
【００３３】
品質基準は、本発明のシステムにより輸送される細胞の８５％以上、好ましくは１００％が、その生存度及び整合性に関して影響を受けていないことを意味する。
【００３４】
細胞の生存度及び整合性は、細胞接着能などの形態学的な、及び機能的な細胞の性質、ならびに増殖及び代謝活性などの基本的な細胞のパラメータの維持に関する。
【００３５】
輸送培地の粘度は半固体の粘度に関し、いったんアガロース−アガラーゼ混合物がゲル化すると、その輸送中に生じる持続性の動きが、最終的に細胞の生存度及び整合性に影響を与えることを防ぎ、本発明のシステムについて定められる品質基準ならびに細胞培養物の容易な回復を保証する。
【００３６】
輸送培地は、培養物中の細胞を輸送するために使用されるアガロース−アガラーゼ混合物に関する。この混合物において、使用されるアガロースの割合は０．２〜０．６％、好ましくは０．５％であり、またアガラーゼの濃度は１％アガロース１ｍｌあたり６０〜９０ユニット、好ましくは８０ユニットである。
【００３７】
培養物中の細胞は、細胞培養条件における細胞集団に関し、懸濁液中の細胞、及び接着して成育し、表面上に単層を形成している細胞の両方に適用され、この表面は、所定の半接着性細胞タイプにおける細胞接着を増強させる細胞外マトリクスの構成要素（ラミニン、コラーゲン、ポリ−Ｌ−リジンなど）を用いて予め任意に処理されていてもよい。
【００３８】
細胞培養物は、三次元（３Ｄ）システムにおける、又は懸濁液における、任意のタイプの単層の細胞培養物に関し、あらゆる起源、好ましくは動物細胞、例えば：ヒト、ネズミ（マウス、ラット、ハムスター）、イヌ、ウシ、ヒツジなどの、遺伝的に改変された細胞又は改変されていない細胞を含む。この細胞培養物は、神経細胞、中枢神経系細胞、末梢神経系細胞、真皮−上皮系細胞、骨関節系細胞、多能性胚前駆細胞、多能性成人前駆細胞、多分化能胚前駆細胞、多分化能成人前駆細胞、造血系細胞、免疫系細胞及び／又は筋肉系細胞を含む。細胞は好ましくは以下から選択される：
−確立された細胞株及び主要な非病理学的な動物培養物であり，ヒトを含み，例えば以下である：神経細胞，グリア細胞，非グリア細胞，骨芽細胞，骨細胞，破骨細胞，軟骨芽細胞，軟骨細胞，線維芽細胞，ケラチノサイト，メラニン形成細胞，腺細胞，角膜細胞，網膜細胞，間葉系幹細胞，造血幹細胞，胚性幹細胞，上皮細胞，血小板，胸腺細胞，リンパ球，単球，マクロファージ，筋細胞，肝細胞，腎細胞，尿道細胞，心筋細胞，筋芽細胞及び／又は生殖細胞。
【００３９】
−確立された細胞株及び主要な病理学的なヒト培養物であり、例えば：急性骨髄性白血病（ＴＨＰ−Ｉ），乳癌，（Ｔ４７Ｄ，ＭＣＦ−７，ＭＤＡ−ＭＢ−４３８），前立腺癌（ＤＵＩ４５，Ｌｎｃａｐ，ＰＣ３），結腸癌（Ｈｓ６７５．Ｔ），神経膠腫（Ｕ８７），骨癌（Ｓａｏｓ−２），主要な腫瘍黒色腫（Ａ３７５），転移性黒色腫（ＨＳ２９４），腺癌（ＨｅＬａ，ＴＡＣ−Ｉ），腎癌（ＨｓＩ９５．Ｔ），細胞腫（Ｃ−４Ｉ），軟骨肉腫（Ｈｓ８Ｉ９．Ｔ），線維肉腫（ＨＴ−１０８０），神経膠芽腫（Ａ１７２，ＯＲ−１３８ＭＧ，ＬＮ−１８），白血病（ＳＵＰ−Ｂ１５），リンパ腫（１Ａ２），神経芽細胞腫（ＣＨＰ−２１２，ＩＭＲ−３２，ＳＨＳＹ５Ｙ，ＳＫ−Ｎ−ＭＣ），骨肉腫（ＭＧ−６３），横紋筋肉腫（ＴＥ４４１．Ｔ）など。
【００４０】
−主要な／確立された病理学的な非ヒト細胞株：転移性黒色腫（Ｂ１６Ｆ１０），主要な腫瘍黒色腫（Ｃ３２ＴＧ），骨髄腫，結合組織癌（ＭＭ３７Ｔ），乳癌（ＭＭ２ＭＴ），前立腺癌（Ｒ３３２７−Ｇ），細胞腫（ＣＴ２６．ＷＴ），線維肉腫（ＭＭ４７Ｔ），神経膠腫（Ｆ９８），白血病（ＢＢ８８），リンパ腫（ＷＥＨＩ−２３１），神経芽細胞腫（ＮＢ４１Ａ３），骨肉腫（ＵＭＲ−１０６）など。
【００４１】
細胞回復は、代謝が減少している細胞培養物における細胞活性の回復に関する。
【００４２】
本発明の目的は、細胞支持材、細胞ならびにアガロース及びアガラーゼ混合物を含むことを特徴とする細胞輸送システムに関し、これは輸送プロセス中における細胞の整合性及び生存度を保証する。このシステムでは、輸送される細胞は、接着細胞、半接着細胞及び非接着細胞からなる群より選択される、どの細胞タイプに属していてもよい。
【００４３】
この細胞は、好ましくはヒト，ネズミ，イヌ，ウシ及び／又はヒツジの細胞からなる群より選択される動物細胞である。細胞タイプに関し、本発明の輸送システムにおける細胞は、以下からなる群より選択される：中枢神経系細胞，末梢神経系細胞，真皮−上皮系細胞，骨関節系細胞，多能性胚前駆細胞，多能性成人前駆細胞，多分化能胚前駆細胞，多分化能成人前駆細胞，造血系細胞，免疫系細胞及び／又は筋肉系細胞。細胞は、好ましくは以下からなる群より選択される：神経細胞，グリア細胞，非グリア細胞，骨芽細胞，骨細胞，破骨細胞，軟骨芽細胞，軟骨細胞，線維芽細胞，ケラチノサイト，メラニン形成細胞，腺細胞，角膜細胞，網膜細胞，間葉系幹細胞，造血幹細胞，胚性幹細胞，上皮細胞，血小板，胸腺細胞，リンパ球，単球，マクロファージ，筋細胞，肝細胞，腎細胞，尿道細胞及び／又は生殖細胞。主要な細胞タイプに由来する大腸菌株、安定な癌細胞株及びＣａｃｏ２，ＭＤＣＫ，ジャーカット（Jurkats）タイプなどの標準的な細胞株もまた含まれる。
【００４４】
好ましい実施形態において、細胞は神経細胞である。
【００４５】
別の好ましい実施形態において、本発明の第１の目的を構成する細胞は遺伝的に改変されている。
【００４６】
別の好ましい実施形態において、本発明の第１の目的を構成する細胞は、遺伝的に改変された神経細胞である。
【００４７】
この本発明の第１の目的を構成するシステムでは、細胞は、アガロース及びアガラーゼの混合物が添加された単層形態中で培養されている状態、ならびにアガロース及びアガラーゼの混合物に埋め込まれた懸濁液中で培養されている状態の両方において、輸送され得る。
【００４８】
細胞支持材は、任意の細胞培養形式を有することができ、好ましくはプレート、フラスコ、培養チャンバー、チューブ、瓶及び／又はトランスウェル型非対称サポートを含む群より選択される。好ましい態様において、支持材の表面は、細胞の支持材への接着能を高める細胞外マトリクス成分を含む。
【００４９】
アガラーゼ濃度は、１％アガロース１ｍｌあたり６０〜９０ユニットであり、好ましくは１％アガロース１ｍｌあたり８０ユニットである。
【００５０】
使用されるアガロースは、低融点アガロースであり、その融点は好ましくはほぼ４２℃である。この輸送システムにおいて、使用されるアガロースの最終濃度は、０．２〜０．６％であり、好ましくは０．５％である。
【００５１】
特定の態様において、この本発明の第１の目的を構成する輸送システムは、０．２〜０．６％の濃度の低融点アガロース、及び１％アガロース１ｍｌあたり８０ユニットの濃度のアガラーゼを含む。好ましい態様において、このアガロース及びアガラーゼの混合物は、２５℃以下の温度において半固体状態のままである。別の好ましい態様において、この混合物は、アガロースがアガラーゼによって消化されるときに液体状態を保つ。アガロース及びアガラーゼの混合物が、細胞支持材から取り除かれることにより、種々の用途に使用するために準備された細胞培養物が残る。
【００５２】
この本発明の第１の目的を構成する細胞輸送システムは、基本的な細胞培養技術を用いて輸送システムにおける細胞を抽出することを可能にする。
【００５３】
同様に、この本発明の第１の目的を構成する輸送システムは、培養される細胞の８５％以上の細胞の生存度及び整合性を保証する。
【００５４】
本発明の第２の目的は、細胞を輸送する方法に関し、上述した輸送システムの使用を含む。この方法は、本発明の第１の目的を構成する輸送システムを準備するステップと、細胞を輸送するステップと、細胞を回復させるステップとを含む。
【００５５】
この方法において、細胞輸送システムを準備するステップは、以下のステップを含む：
細胞培養物を接種するステップａ、
アガロース−アガラーゼの混合物を調製するステップｂ、
ステップｂにおける混合物を細胞培養物に添加するステップｃ、
アガロース−アガラーゼの混合物を固化させるステップｄ、
輸送システムを密閉するステップｅ。
【００５６】
この本発明の第２の目的において、先のステップｂにおいて使用されるアガロース及びアガラーゼの混合物を調製するステップは、言い換えれば以下のステップを含む：
輸送しようとする細胞培養物の種類に特異的な培養培地の中に、本発明の第１の目的において記載されたように確立された濃度にてアガロース溶液を混合させるステップｉ、
ステップｉのアガロース溶液に、本発明の第１の目的において確立された濃度にてアガラーゼを添加するステップii、
混合物をホモジナイズするステップiii。
【００５７】
一つの態様において、ステップｂにおける混合物を細胞培養物に添加するステップは、単層培養された細胞を、アガロース−アガラーゼの混合物で覆うステップを含む。また、別の態様において、ステップｂにおける混合物を細胞培養物に添加するステップは、懸濁液中の細胞と、アガロース−アガラーゼの混合物との均質な混合物を含む。
【００５８】
アガロース及びアガラーゼの混合物を固化させるステップは、特定の態様において、１５〜３０分間、３７℃より低い温度にて行なわれる。
【００５９】
この本発明の第２の目的を構成する方法において、輸送は、特定の態様において２５℃以下の温度にて行なわれ、輸送の時間は好ましくは１８〜２３℃の温度範囲において６０時間以内であり、より好ましくは２２℃において、７２時間以内の時間行なわれる。細胞の生存度は８５％以上である。
【００６０】
この本発明の第２の目的を構成する方法において、細胞を回復させるステップは、言い換えれば以下のステップを含む：
アガロース及びアガラーゼの混合物を消化するステップｆ、
輸送培地を除去した後、これを培養培地と交換するステップｇ、
細胞培養物を回復させるステップｈ。
【００６１】
具体的に、アガロース−アガラーゼ混合物を消化するステップは、以下を含む：輸送システムを３７℃で１．５〜２時間インキュベートするステップ、調整した培養培地を添加するステップ、及びシステムを、３７℃でさらに１時間インキュベートするステップ。特定の態様において、細胞が懸濁液中にあるとき、アガロース及びアガラーゼの混合物を消化するステップは、システムを８００〜１０００ｇで遠心分離することを含む、さらなるステップを含む。
【００６２】
一態様において、ステップｈは、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２にてインキュベートするステップを含む。
【００６３】
この本発明の第２の目的における特定の態様において、細胞は、これらを輸送する支持材から抽出される；別の特定の態様において、細胞は、これらを輸送する支持材の中に残存する。
【００６４】
本発明の別の目的は、細胞を輸送するための、本発明の第１の目的を構成する輸送システムの使用に関する。
【００６５】
本発明の別の目的は、細胞及び／又は分子生物学アッセイを実施するための、本発明の第１の目的を構成する輸送システムの使用に関する。特定の態様において、このアッセイは、薬剤、生体材料及びナノ粒子の試験、機能別アッセイ、形態学的研究、遺伝子発現を特徴づけるための研究、タンパク質発現を特徴づけるための研究からなる群より選択される。
【００６６】
本適用における本発明の別の目的は、輸送ボックスへの輸送システムの取り込み、及びこの取り込みによって生成される輸送システム−輸送ボックスの組立体である。
【００６７】
輸送ボックス又は支持材は、７５時間以上において、輸送される細胞システムを２２℃の一定の温度に維持することができる任意の構造により構成され得、また輸送ボックス又は支持材はさらに、システムに、輸送期間中に生じる機械的な動き及び振動に対して必要な保護を提供する。
【００６８】
〔図面の説明〕
図１：最終的な輸送混合物におけるアガロース濃度。
【００６９】
図１は、混合物の最終的な粘度及び調製された混合物からの細胞の回復の困難性度合いに基づき、輸送のために決定された、アガロース濃度範囲を示す。実線は、輸送混合物の強度を表す；輸送混合物のアガロース濃度が高いほど、混合物もまた高い強度を本システムに提供し得、そしてそれゆえ、輸送がより信頼性ある条件下で行なわれる。点線は、細胞回復の実施についての困難性の度合いを表す；アガロースの割合／濃度が高いほど、本システムの高い剛性のために細胞回復がより困難になる。したがって、信頼性ある様式で輸送を保証し、そして同時に輸送後の培養物の回復を円滑にする、アガロースの最終濃度範囲を確立することが必要である。種々のアガロース濃度（％）について実行されるアッセイに基づいて、輸送のための最適なアガロース濃度範囲が、図面において陰影のついたボックスによって示される０．２〜０．６％であることが確立された。
【００７０】
図２：アガロース及びアガラーゼの混合物に露出した後の培養物の細胞形態を分析することによる、本システム中のアガラーゼ最終濃度の測定。
【００７１】
図２の画像は、輸送培地（アガロース−アガラーゼ混合物）に露出した後のＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞の培養物における細胞形態を示す。輸送培地（アガロース−アガラーゼ混合物）は、細胞形態に対するアッセイ濃度のそれぞれの効果を測定する目的で、後者について種々の濃度を用いた。画像に現れている細胞は、推定される輸送時間（２４時間）、０．３％アガロース及びその細胞タイプに特異的な培地の混合物に、そしてそれぞれの場合に示されるアガラーゼ濃度に露出された。輸送培地とともにインキュベートした後、本明細書に記載のプロセスにしたがって細胞回復が行なわれ、そして培養（３７℃、５％ＣＯ２）２４時間後に、培養物の整合性及び形態を顕微鏡によって分析した。
【００７２】
画像によって、このアッセイに用いたどの濃度のアガロース及びアガラーゼ混合物も、混合物に接触しなかった培養物（コントロール）と比較した場合に、細胞の整合性及び形態に影響を与えないことが、明らかに示される。輸送培地中のアガロース及びアガラーゼの組み合わせは、細胞の最適な回復を保証する。
【００７３】
図３：輸送時間の決定。
【００７４】
図３は、アガロース及びアガラーゼ混合物に長時間露出した場合の、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞の培養物における細胞の生存度を示す。輸送のために決定された条件において混合物と接触して最初の４８時間、培養物の生存度は影響を受けない；しかしながら、４８時間後、細胞の生存度は減少し始め、そしてこの記述された条件において７２時間後、示される細胞の生存度は６０％である。培養９６時間後、細胞の生存度は著しく影響を受け、生存率はほぼ３０％である。
【００７５】
図４：最適な輸送温度の決定。
【００７６】
図４は、記載される基準に基づく最適な輸送温度の決定を図示する：細胞生存度、輸送培地の粘度及びアガラーゼ酵素の活性。実線は、培養物の温度に関する細胞生存度を表す；培養物におけるヒト細胞を維持するための最適な温度は３６〜３８℃である；しかしながら、細胞の生存度は、２０〜４０℃の範囲内では劇的に影響を受けない。点線は、アガラーゼ及び培地を含むアガロースの混合物の粘度又は固体性を表す；２５℃以降、ゲル状の輸送培地は粘性を失い、そして信頼性ある細胞輸送を保証しない；したがって、輸送培地の粘度を考慮すれば、温度は２５℃に達しないことが好ましい。縦の線は、アガラーゼ酵素の最適な作用温度を表し、そしてこの線の両側に見られる影つきの領域は、酵素が活性のままでいる温度範囲に対応する。したがって、最適な輸送温度は、アガロース−アガラーゼ混合物が堅い粘度を維持し、かつさらに、アガラーゼ酵素が活性でないことを考慮すれば、細胞の生存度が１００％にできるだけ近い温度であってもよい。この温度は、この図において規定される縞模様の領域によって示されるように、１８〜２３℃である。
【００７７】
図５：細胞輸送システムの設計を表す図。
【００７８】
図５ａは、接着細胞のためのプレート／フラスコ輸送モデルに関する。この場合には、細胞を、培養物の最終的な適用に適したプレート又はフラスコ内で培養する。そして細胞が正確に接着し、かつ正常な形態を示したら、培養培地を取り除く。その後輸送期間中に細胞の保護培地として作用し得るアガロース及びアガラーゼの混合物を、これらに適用する。
【００７９】
図５ｂは、懸濁液中の細胞及び接着細胞のためのプレート／フラスコモデルの模式図を示し、これらの輸送は、アガロース及びアガラーゼ混合物に包含された状態で行なわれる。
【００８０】
最後に、図５ｃは、チューブ輸送モデルを示し、これは、接着性であろうとなかろうと、どのような種類の細胞の輸送をも可能にする。なぜなら細胞は、図５ｂにおいて示したように、アガロース及びアガラーゼの混合物中に埋め込まれているためである。
【００８１】
これらのモデルのそれぞれの選択は、輸送の対象である細胞タイプの特徴、及び生産物の最終適用に依存し得、すなわち、細胞について行なわれる予定の解析の種類に依存し得る。
【００８２】
図６：アガロース及びアガラーゼの混合物に供される細胞の毒性調査。
【００８３】
これらのグラフは、アガロース及びアガラーゼの混合物に接触後の、ＡＭＳＣ（adipose tissue-derived mesenchymal stem cells）細胞、ＣＨＯ細胞，ＭＤＣＫ−ＩＩ細胞，ＭＤＣＫ−ＩＩ−ＭＤＲ１細胞，線維芽細胞，ケラチノサイト及びＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経芽細胞腫細胞における細胞毒性カーブを示す。
【００８４】
アッセイに含まれる群は、以下である：培養物：標準的な培養条件、すなわち３７℃、５％ＣＯ２及び通常の培養培地の条件で維持される細胞；コントロール：輸送条件、すなわちインキュベータの外側において、２０〜２２℃に供されるが、通常の培養培地中にある細胞；ならびにアガロース及びアガラーゼの混合物：輸送条件、すなわちインキュベータの外側において、２０〜２２℃に供されるが、本発明のシステム中にある細胞。
【００８５】
グラフにおいて見ることができるように、輸送システムに供される細胞は、コントロール及び培養物に関して増殖能の点で違いを示さなかった。これは、細胞が、本発明の輸送システム中で維持される時間において細胞毒性効果を受けなかったことを示す。
【００８６】
図７：アガラーゼを含むアガロースの被覆又は包膜に露出した後の細胞形態調査。
【００８７】
これらの図は、アガロース及びアガラーゼの混合物に露出した後の、ＡＭＳＣ（adipose tissue-derived mesenchymal stem cells）細胞、ＣＨＯ細胞，ＭＤＣＫ−ＩＩ細胞，ＭＤＣＫ−ＩＩ−ＭＤＲ１細胞，線維芽細胞，ケラチノサイト及びＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経芽細胞腫細胞における写真を示す。
【００８８】
図７ａは、アガロース及びアガラーゼの混合物に供される前の細胞の形態を示す。
【００８９】
図７ｂは、アガロース及びアガラーゼの被覆を単層培養物上に有する細胞の画像を示し、これらは培養培地のみを含むものと比較される。
【００９０】
最後に、図７ｃにおいて、標準の培養条件で生育した細胞（培養物）、コントロール細胞（インキュベータの外側において、２０〜２２℃である輸送条件に供されたが、通常の培養培地中で培養された）、及び輸送条件（２０〜２２℃、インキュベータの外側）においてアガロース及びアガラーゼの被覆に供された細胞の、２４時間後の形態を比較することが可能である。
【００９１】
図において示されるように、種々の種類の細胞の細胞形態は、アガロース及びアガラーゼの混合物の被覆又は包膜によって影響されない。輸送システムの混合物に露出した細胞の形態は、混合物に露出している間も、それが取り除かれた後でさえも変化しない。
【００９２】
図８：ラミニンを用いた細胞接着の増加。
【００９３】
図８は、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞の増殖及び形態に対する、ラミニンで処理された支持材の使用の効果を示す。図８ａは、標準的な２４ウェルプレート（コントロール）及びラミニン（ラミニン）で処理された２４ウェルプレートで培養したＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞の増殖能解析に相当する。培養２４時間後、プレート中で生育した細胞の増殖速度は、コントロール細胞により示される増殖速度よりも大きい。培養４８時間後、増殖速度はほぼ一致する。これはおそらく培養物の密度が高くなり、増殖が最大レベルに達するためである。ラミニンを用いた培養における細胞増殖の増加は、多数の細胞が支持材に接着し、これにより増殖する細胞の数が増加したためである。図８ｂは、細胞接着に対するラミニンの正の効果を明白に示す；始めに接種される細胞数はコントロールプレートとラミニンで処理されたプレートとは等しいにもかかわらず、ラミニンで処理されたプレート中に多数の細胞が観察される。
【００９４】
図９：ラミニンを有する支持材における輸送システムの増殖能の調査。
【００９５】
本図面は、標準的な培養プレート及びラミニンで処理されたプレートにおいて培養された後のＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞の増殖能を示す。アッセイされたどのグループにおいても、増殖に違いが観察されない、すなわちラミニンを用いて、又はラミニンなしで輸送システム内で培養される細胞において、またコントロールに関しても、違いが観察されない。
【００９６】
アッセイされたグループは、以下である：コントロールグループ：標準的な培養条件である３７℃、５％ＣＯ２にて、通常の培地において培養される細胞；標準的なＡ＋Ａプレートグループ：アガロース及びアガラーゼ混合物とともに、しかしラミニンなしで、輸送条件（２０〜２２℃、インキュベータの外側）に供される細胞；ならびにＡ＋Ａラミニンプレートグループ：アガロース及びアガラーゼ混合物とともに、ラミニンとともに、輸送条件（２０〜２２℃、インキュベータの外側）に供される細胞。
【００９７】
図１０：輸送システムにおけるポリ−Ｌ−リジンを用いた細胞接着の増加。
【００９８】
図１０のグラフは、種々の濃度のポリ−Ｎ−リジンで処理された表面に接触した後のＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞の細胞毒性カーブを示す。
【００９９】
図１０ａは、高いポリ−Ｌ−リジン濃度範囲（１００〜２００μｇ／ｍｌ）のアッセイを示す。これに対し、図１０ｂは、より低いポリ−Ｌ−リジン濃度範囲（１０−７５μｇ／ｍｌ）のアッセイを示す。
【０１００】
図１０ａのグラフにおいて観察できるように、ポリ−Ｌ−リジン濃度の増加により、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞の増殖能の減少が見られる。図１０ｂは、より低いポリ−Ｌ−リジン濃度に露出した培養物が、ポリ−Ｌ−リジンに露出しなかった細胞において観察される増殖キネティクスに関して実質的に変わらない増殖キネティクスを示すことを示す。
【０１０１】
これらの結果から、いずれの濃度も、培養物の整合性又は増殖能に劇的に影響を与えないにもかかわらず、７５μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジン濃度以降、７２時間において細胞増殖が減少するように見える。したがって、輸送システムにおけるポリ−Ｌ−リジン濃度範囲は１０〜７５μｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜７０μｇ／ｍｌであり、最終的な好ましい濃度を考慮すれば６０μｇ／ｍｌである。
【０１０２】
図１１：種々のポリ−Ｌ−リジン濃度で処理された表面に接触した後の、細胞培養物の形態確認。
【０１０３】
図１１は、ポリ−Ｌ−リジンに露出している間の培養物のそれぞれの様子を示す。コントロールは、処理していないプレートで培養され、かつポリ−Ｌ−リジンに接触した細胞と同じ条件において維持されたが、アッセイされたどの分子との接触もしなかった細胞に相当する。解析は、９６時間実施された。
【０１０４】
図１１ａは、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞培養物に相当する画像を示し、図１１ｂは、ＭＤＣＫ−ＩＩ−ＭＤＲ１細胞を示し、図１１ｃに示される細胞はヒト間葉系細胞であり、そして最後に、ヒト関節軟骨細胞の形態が図１１ｄに示される。
【０１０５】
このアッセイに相当する画像において、ポリ−Ｌ−リジンに露出した培養物における細胞形態と、この分子に接触するよう露出していない細胞の形態との間の全てにおいて、違いがないことが観察され得る。
【０１０６】
図１２：輸送システムの機械的撹拌からの保護。
【０１０７】
図１２は、撹拌時間（時）中の、培地（コントロール）を含むウェル及び輸送培地（アガロース＋アガラーゼ）を含むウェルにおける細胞数を示す。全てのカウントは、３通り行なった。
【０１０８】
図１２は、撹拌時間中に培養物表面に接着して残存している細胞数を示す。この図において、撹拌中に被覆（アガロース＋アガラーゼ）が適用されたウェルから回復した細胞数は、培養培地のみを含む（アガロース及びアガラーゼの被覆を含まない）、完全に撹拌されたウェルから回収された細胞数よりも多い。
【０１０９】
図１３：三次元培養システムに対する細胞輸送システムの適用：被覆を取り除いた後の細胞単層の整合性の解析。
【０１１０】
図１３ａは、混合物に露出したコントロールウェルの測定によって得られる抵抗値（ＴＥＥＲ）を示す。これは、アガロース及びアガラーゼの被覆を培養物上に添加する前の時点（処理前）、被覆を取り除いた直後の時点（０ｈ）、並びにアガロース及びアガラーゼを取り除いた２４時間後（２４ｈ）の３回の異なる測定を示す。読み取りは、２つの異なる条件；コントロールウェル、ならびにアガロース及びアガラーゼ被覆を加えたウェル、のそれぞれについて１２ウェルにて行なった。
【０１１１】
図１３ｂは、ウェルの基底位置において検出されたデキストランの割合、すなわち細胞単層を通過したデキストランの割合を示す。２回の読み取りが行なわれた。最初の１回は、被覆が取り除かれた直後の時点（０ｈ）であり、そして２回目はアガロース及びアガラーゼ混合物が取り除かれて２４時間後（２４ｈ）であった。解析は、２つの異なる条件：培地を含むコントロールウェル、ならびにアガロース及びアガラーゼ被覆を含むウェル、のそれぞれについて１２ウェルにて行なった。
【０１１２】
〔本発明の詳細な説明〕
本発明に記載される輸送システムは、接着されているか、懸濁液中の、培養中の細胞を、最大の品質基準及び生存度にて輸送することを可能にする細胞輸送システムを提案する。そして、このシステムは、受け取る研究室に、輸送された細胞の最終的な適用がこれを要求しない場合には、細胞培養物の回復のための設備及び熟練した人材を有することを必ずしも要求しない。
【０１１３】
本発明の輸送培地は、単層、３Ｄ、又は懸濁液中のいずれかにおいて培養される、任意の種類の細胞培養物に適用可能な特定のアガロース及びアガラーゼの混合物で構成される。したがって、システムは、ヒト、ネズミ（ラット、ハムスター、マウス）、イヌ、ウシ、ヒツジなどの、異なる起源における任意の種類の細胞に適用し得る。このシステムによって輸送される細胞は、遺伝的に改変された細胞であってもよい。
【０１１４】
本発明の輸送システムは、室温にかかわらず、輸送期間中に温度範囲を維持することができる任意の携帯型の状態調節型デバイスに組み込まれ得る。
【０１１５】
この携帯型の状態調節型デバイスは、輸送ボックスとして当業者に公知であり、輸送される細胞システムを２２℃の一定の温度に７５時間以上維持することができる任意の構造により構成され、さらに、システムに、輸送期間中に生じる機械的な動き及び振動に対して必要な保護を提供する。本発明の目的で従来において存在する輸送ボックスの例は、以下を含む：Ｋｅｒｎ  Ｆｒｉｏ  Ｓ．Ａ．により市販されている「Ｉｎｓｕｌａｔｅｄ  ｂｏｘ  Ｐ６５０」及び「ＫＦ  ＴｅｒｍｏＣｅｌｌ  ２２」。
【０１１６】
両方の例は、断熱された輸送システムにより構成され、これらのシステムは所望の温度（２０〜２２℃）を最小限の変化（±２℃）にて常に維持する。
【０１１７】
輸送された細胞がその目的地に達した後、ゲル中のアガロース及びアガラーゼの混合物が取り除かれ、細胞は、これらを輸送した支持材から抽出され得、又はこれらを輸送した支持材中で使用され得る。同様に、本発明の輸送システムは、例えば以下のような任意の種類の細胞培養物形式又は支持材に適用され得る：培養プレート（６，１２，２４，９６，３８４ウェルなど）、培養フラスコ（２５，７５，１７５ｃｍ２など）、培養チャンバー又はチューブ（１．５，１５，５０ｍｌなど）、瓶など。そのため、輸送システムの可能な用途として以下が考えられる。
【０１１８】
機能別アッセイ：新規な分子、薬剤、生体材料及びナノ粒子の解析のための細胞毒性アッセイ；増殖アッセイ；アポトーシスアッセイ；分子、タンパク質、成長因子、プロテオグリカン、ムコ多糖の分泌研究；細胞分化及び応答アッセイ、メンブレンマーカー発現研究；など。
【０１１９】
形態学的研究：組織学的アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、ＳＥＭ及びＴＥＭ解析。
【０１２０】
遺伝子及びタンパク質の発現を特徴付けるための研究：本システムに供給された細胞における直接的な核酸の抽出、本システムに供給された細胞における直接的なタンパク質の抽出、など。
【０１２１】
すなわち、受け取る研究室において行なわれる予定の細胞培養物のその後の使用に基づいて、輸送システムは、任意の輸送形式又は支持材（プレート、チューブ、フラスコ、培養チャンバー、瓶、トランスウェル型非対称サポートなど）に適応可能である。また、輸送システムは、それぞれの種類の細胞が、輸送システムの形式及びその後に行なわれるアッセイの種類に依存して特定の密度で培養されることを要求するため、培養物の細胞密度に適応可能である。
【０１２２】
一態様において、輸送システムは神経系の細胞を含む。この細胞は、遺伝的に改変された細胞であってもよい。遺伝的な改変は、神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、多発性硬化症など）、てんかん、末梢神経系の疾患（ギラン・バレー症候群、シャルコー・マリー・トゥース病など）などに関連し得る。
【０１２３】
特定の態様において、輸送システムは、遺伝的に改変された神経細胞を含む。この神経細胞における変異は、アルツハイマー病に関連する。
【０１２４】
本発明の細胞輸送システムが言及された効果を提供するために、この輸送が行なわれる培地は、細胞を接種する際に扱い易いことが好ましい。同様に、輸送培地は、輸送中においてシステムに、輸送が続く時間中ずっと最適な条件において細胞生存度を維持するために十分な強度を提供することが好ましい、すなわち、輸送される細胞における形態的性質及び機能的性質の両方について、変化が起こることを抑制する。
【０１２５】
結果として、システムは、例えば温度変化などに応じて物理的性質を単純かつ制御可能な様式で変えることができる、輸送培地に組み込まれることが理想的である。つまり、輸送が行なわれる温度である１８〜２３℃において、この材料はシステムの強度を維持するために固体又は半固体のように振る舞い、輸送中に生じる持続性の動きが最終的に整合性に影響を与えることを妨げ、またこの固体又は半固体の状態が温度変化によって反転され得ることを妨げ、３７℃において、細胞培養物の取り扱い、及び８５％を超える細胞生存度の状態における回復を促進する。
【０１２６】
前述したように、アガロースは、（１−３）結合β−Ｄ−ガラクトース及び（１−４）結合（３−６）−アンヒドロ−α−Ｌ−ガラクトースの交互コポリマーからなり、熱的に可逆的な多糖である。すなわちアガロースは、供される温度によって融解又はゲル化することができ、また細胞封入に広く使用される。
【０１２７】
従来技術には、培養物の支持材として、三次元細胞培養のために一般的にアガロースを使用する方法（参考文献１及び２）が記載される。培養物の支持材として使用されるアガロース中に含まれる細胞の回復を実施するために、この三次元構造は、アガラーゼ溶液によって処理される。アガラーゼ溶液は、いったん支持材に添加されると、中で細胞が成育しているアガロースを消化し、その結果細胞の回復を可能にする。
【０１２８】
これに対し、本発明のシステムは、使用されるために準備ができているシステム中の細胞輸送を可能にし、また適切な場合、簡単な方法を用いて輸送された細胞をその後回復させることが可能である。
【０１２９】
従来では、一般的に三次元培養システムに適用されるアガロースの使用は、アガロースの除去を促進するために、輸送される細胞を６５℃より高い温度に供するステップを必ず含むため、輸送される培養物を形成する細胞を放出させてしまう。
【０１３０】
しかしながら、培養物が必ず供される６５℃の温度は、あまりに攻撃的であり、細胞培養物の死を引き起こし得る。なぜなら動物細胞の最適な生育温度は３６〜３８℃だからである。この最適な温度より高い温度（高温条件）では、細胞生存度が影響を受け、培養物における細胞の整合性が不可逆的に損傷を受ける。これに対し、最適な温度より低い温度、すなわち低温は、高温よりも細胞により良く許容される。最適な推奨される温度より低い温度が適用される場合には、細胞の代謝の減少が生じ、細胞応答（増殖、代謝、生育など）が減速するが、細胞はその整合性を維持する。そして生育に最適な温度条件が回復したときには、細胞はその正常な細胞活性を回復させる。したがって、低温は、微生物及び腫瘍細胞の成育を減速させるために広く使用される手法である。
【０１３１】
本発明に記載されるシステムにおいて、輸送培地は、細胞の回復を促進させるアガラーゼ及びアガロースの混合物を含む。このことは、細胞の回復のプロセスが、輸送される細胞を含む支持材により形成される輸送システムを、アガラーゼ酵素が活性である温度においてインキュベートするという、より単純な様式で行なわれることを意味する。これによりアガロースが消化され、細胞の回復を可能にする。
【０１３２】
本発明のシステムの利点の一つは、アガラーゼもまた均質にアガロース溶液に組み込まれているため、消化が均質に行なわれることである。これにより消化は、アガラーゼ酵素が作用するために最適な温度でインキュベートされる際に、アガロース溶液内で均質に開始する。これは、回復期間をより短くさせ、かつ回復する細胞培養物の生存度をより高くさせる。
【０１３３】
さらに、アガラーゼが輸送システムに組み込まれていることにより、細胞タイプ及び形式又は細胞支持材にしたがった輸送システムの準備、ならびに細胞の回復の画一化が容易になる。
【０１３４】
同様に、輸送システム内へのアガラーゼの取り込みは、受け取る研究室が独立して酵素を使用する必要を回避させ、このことは細胞回復プロセスを単純化し、かつ相当する技術における特別な知識を有さない多種多様な研究室におけるシステムの使用を可能にする。
【０１３５】
本発明に使用されるアガロースは、ほぼ４２℃の低融解温度を有する低融点アガロースである。これは細胞培養に一般に使用されるアガロース（およそ６５℃の融点を有する）を使用することに対し、アガロースの融点が細胞培養物の生育のための至適温度に近い温度であるため、かなり有利である。
【０１３６】
低融点アガロースは市販されており、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって市販されているＵｌｔｒａ  Ｐｕｒｅ（登録商標）低融点アガロース、Ｌｏｎｚａによって市販されているＮｕＳｉｅｖｅ（登録商標）  ＧＴＧ（登録商標）  Ａｇａｒｏｓｅ、Ｐｒｏｎａｄｉｓａによって市販されているＬＭ  Ａｇａｒｏｓｅ及びＬＭ  Ｓｉｅｖｅ，Ｓｅｒｖａによって市販されているＡｇａｒｏｓｅ  ＳＥＲＶＡ  Ｐｒｅｍｉｕｍ  ｌｏｗ  ｍｅｌｔｉｎｇ，Ａｇａｒｏｓｅ  ＳＥＲＶＡ  ｆｏｒ  ＰＣＲ  ｌｏｗ  ｍｅｌｔｉｎｇ及びＡｇａｒｏｓｅ  ＳＥＲＶＡ  ｌｏｗ  ｍｅｌｔｉｎｇなどである。
【０１３７】
上述した従来技術にしたがって、その仕様書に記載されるように４２℃において低融点アガロースを融解させると、細胞に供給されたアガロースの融解が完全になされず、むしろ部分的に融解するという問題をもたらす。このことは、アガロースを細胞から分離することを困難にさせ、細胞の正しい回復に負の影響を与える。これらの場合、アガロースを完全に融解させるために高温を適用すると、使用される温度（＞４５℃）が、細胞がその整合性を維持したままでいる範囲を超えるため、細胞の生存に顕著に影響を与える。
【０１３８】
したがって、輸送された細胞の回復を促進し、システムを最大限に最適化するために、培養物における細胞からアガロースを完全に分離させることを促進することが必要である。これは、本発明により提供されるシステムを使用することで達成される。
【０１３９】
アガラーゼは、分子量３２ｋＤａの酵素であり、アガロースにおけるＤ−ガラクトース残基と３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース残基との間の（１−３）結合を加水分解する。アガラーゼが前述した加水分解を行なえるようにするために、これを活性化することが必要である。アガラーゼ酵素がその最大活性を示す温度は４３℃である。しかし多くの酵素に存在するように、この至適温度の上下に、やはり酵素により示される活性が有力である範囲が存在する。アガラーゼ酵素の場合には、この活性は３７℃の温度では検出可能であるが、３０℃では検出されないことが観察される。最終的に、アガラーゼが実質的な活性を有する温度範囲は３７〜４２℃である。
【０１４０】
本発明の輸送培地は、最終的な混合物におけるアガロース濃度が０．２〜０．６％、好ましくは０．５％であり、アガラーゼ濃度が１％アガロース１ｍｌあたり９０ユニット以下、好ましくは１％アガロース１ｍｌあたり８０ユニットであるように構成される。
【０１４１】
したがって、本発明により提供される輸送システムの発展において、以下の側面が熟考される：（ｉ）選択した形式において状態調節され、かつ接着されている、選択した細胞の培養、（ｉｉ）輸送システムを作り出すためのアガロース−アガラーゼ混合物の供給、(ｉｉｉ）輸送条件、（ｉｖ）輸送プロセス後の細胞回復、（ｖ）細胞毒性及び細胞形態の測定による、本発明に記載のシステム中で輸送した後の細胞の整合性の維持の確認。
【０１４２】
（ｉ．選択した形式において状態調節され、かつ接着されている、選択した細胞の培養）
前述したように、システムは、遺伝的に改変されている、または非遺伝的に改変されている細胞を含む、任意の種類の細胞の輸送を可能にする。この細胞は、単層において、３Ｄで、接着されて、又はアガロース及びアガラーゼ混合物の中に埋め込まれて、培養されながら輸送され得る（図５）。細胞は、これらの選択のそれぞれについて特異的に準備され得る。
【０１４３】
［１．単層における細胞］
選択された細胞タイプにおける細胞は、最終的な適用を行なうために最適な形式を有するプレート又はフラスコ内に接種される。これらは特異的な温度条件、湿度条件、大気条件及び最適な生育のための培養培地において培養され、細胞がプラスチックに接着し、最適な細胞形態を獲得するのに十分な時間、培養物中で維持される。通常、一晩のインキュベーションが十分であろう。
【０１４４】
一般的な細胞培養支持材に対してわずかな接着能を示す一般的特徴を有する半接着性の細胞タイプ、例えばＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞などがある。このタイプの細胞が、輸送後の細胞回復プロセスにおいて、これらの細胞の支持材への低い接着性のために失われることを妨げるため、本発明はまた、低接着性を有する細胞タイプへのシステムの適用を熟考する。このために、培養支持材への細胞の接着を高めるために広く使用される細胞外マトリクスの成分であるラミニン、ポリ−Ｌ−リジン、コラーゲンなどの、支持材への細胞の接着能を高める細胞外マトリクスにおける種々の分子又は成分で処理されたプレート又はフラスコを用いることの可能性が考えられる。本発明の輸送システムにおける、培養支持材への細胞接着を高める目的でのポリ−Ｌ−リジンの使用は、これに露出する細胞の形態学的性質および生理学的性質を変えることなく、培養物表面により強く固定させるため、特に有利であることが観察された。
【０１４５】
本発明の輸送システムにおいて好適なポリ−Ｌ−リジン濃度を確立するために、アッセイ２．４．１において記載したようにポリ−Ｌ−リジン濃度を増加させていったシステムに露出した後の細胞の整合性を解析した。
【０１４６】
このアッセイの結果は、図１０に示され、１０〜７５μｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜７０μｇ／ｍｌ、より好ましくは６０μｇ／ｍｌに、輸送システムにおける好適なポリ−Ｌ−リジン濃度を規定することを可能にする。このプロセスに続くステップは、細胞がすでにプレート又はフラスコの表面に接着される翌日まで実施されない。
【０１４７】
［２．アガロース及びアガラーゼ材料に埋め込まれる細胞］
細胞は、標準的な培養条件においてステップｉｉに達するまで維持される。
【０１４８】
（ｉｉ．輸送システムを作り出すためのアガロース及びアガラーゼ混合物の供給）
細胞輸送に使用される形式に依存して、添加すべき混合物の量が異なる。例えば、２４ウェルプレートのウェルの場合には、各ウェルにおいて使用する混合物の量は１ｍｌであり、他方、９６ウェルプレートの場合には１ウェルあたり１５０μｌである。懸濁液中の細胞については、混合物１ｍｌあたり１〜２×１０６細胞の釣り合いを維持するために、添加すべき混合物の量はフラスコに比例し、また支持材中に配置される細胞数に比例し得る。したがって、５０ｍｌチューブでは、使用すべき混合物の量は２０ｍｌであってもよく、また１５ｍｌチューブでは、６ｍｌであってもよい。
【０１４９】
［１．単層における細胞］
実施例２に記載されるように、細胞を接種した翌日、及び所望の単層が作製された後に、培地を培養物から取り除き、そしてアガロース−アガラーゼ混合物の被覆を細胞上に添加する。
【０１５０】
アガラーゼ酵素の至適作用温度が３７〜４２℃であるため、アガラーゼ酵素がアガロースに対してすぐに作用することを妨げるために氷上に配置した、細胞を含むプレート／フラスコ内の細胞培養物の単層を覆うように、３７℃に調整された輸送培地を添加する。混合物が所望の粘度を獲得するための積算時間は１５〜３０分であり、この後に支持材は、システムが輸送中に開いて、培養物が外部の培地と接触することを妨げるため、その全ての端上をパラフィルムでシールされてもよい。これにより、輸送中の汚染のリスクを排除する。
【０１５１】
［２．アガロース及びアガラーゼ材料に埋め込まれた細胞］
この第２のケースでは、これらの細胞は直接的にアガロース及びアガラーゼ混合物中に配置され、完全に輸送システムと混合されるため、輸送より前に細胞を接種する必要がない。
【０１５２】
アガロース混合物は、実施例２に記載のように、単層の細胞の場合と厳密に同じ様式で準備され、融解したアガロース、及び次にアガラーゼを、選択した形式に依存して変化し得る容積の培地に添加する。輸送培地が３７℃である同一のチューブ中で成分が均質に混合された後、輸送のために選択された細胞の量を添加し、その後チューブを氷上に置いてアガラーゼ酵素がアガロースに対してすぐに作用することを防ぐ。１５〜３０分において、アガロース−アガラーゼ混合物が好適な粘度を獲得し得、その後使用するシステム（チューブ、フラスコ、培養チャンバーなど）を、前述した点において明記したようにシールし得る。
【０１５３】
本発明のケース１は、単層の細胞培養物の輸送のために閉鎖的であり得るが、他方のケース２は、懸濁液中で輸送される接着性の細胞タイプ及び非接着性の細胞タイプのいずれもに適用し得る（図５）。
【０１５４】
（ｉｉｉ．輸送条件）
［１．輸送温度］
本発明における別の重要な側面は、システムの輸送が実施され得る温度範囲を決定することである。なぜならば、あまりにも低い温度は細胞の生存度を損なう可能性があり、一方あまりにも高い温度は輸送のためのシステムの整合性を危うくし、その結果細胞の生存度を危うくし得るためである。
【０１５５】
本発明の細胞輸送システムに使用される、細胞輸送に最適な温度範囲（図４）は、細胞整合性、アガロース−アガラーゼ混合物及び培地の整合性、及びアガラーゼ酵素が不活性のままでいる温度などの、３つの制限パラメータの解析に基づいて決定した。
【０１５６】
ａ．細胞整合性：前述したように、細胞培養物の生育に最適な温度は３６〜３８℃であるが、細胞がその生存度及び整合性を維持する温度範囲は２０〜４２℃である。
【０１５７】
ｂ．アガロース−アガラーゼ混合物及び培地の整合性：本発明のシステムに使用される細胞輸送が最適であるために、アガロース−アガラーゼ混合物が固体又は半固体の粘度であることが必要であり、この粘度は輸送中に生じる連続的な動きに対する細胞の保護を保証する。したがって、混合物の固体状態を維持することができる温度範囲内で輸送が行なわれることは重要である。
【０１５８】
混合物の粘度は、それがさらされる温度に反比例し、より高い温度に混合物がさらされると、その整合性又は固体性が低下する。広い温度範囲において混合物の整合性を解析することにより、混合物が所望の粘度を失う変曲点が約２５℃であることを決定した。
ｃ．アガラーゼ酵素が不活性のままでいる温度：本発明の輸送支持混合物中にアガラーゼ酵素を含むことの利点は、輸送された細胞が所望の目的地に到達した後に細胞の回復を促進することからなるが、酵素が輸送中に作用することは望ましくない。アガラーゼ酵素がその最大の活性を示す温度は４３℃であるが、多くの酵素に起こるように、この至適温度の上下に、酵素による活性が示される範囲が存在することもまた重要である。アガラーゼ酵素の場合には、この活性は３７℃の温度では検出可能であるが、３０℃では検出されないことが観察された。したがって、輸送支持材は、これ以降はその作用が活性化されてしまう３０℃の温度を超えないことが望ましく、そしてこれにより、酵素は、作用することが期待されるより前に作用してしまうことを妨げられる。
【０１５９】
したがって、１８〜２８℃の範囲の種々の温度に対するシステムのふるまいを試験し、かつ細胞の整合性、支持材の混合物の粘度及びアガラーゼ酵素の活性を考慮した後、最適な輸送温度は、図４に示すように、２５℃以下であり、好ましくは１８〜２３℃であり、より好ましくは２２℃である。
【０１６０】
［輸送時間］
最大輸送時間は、輸送培地に覆われ、又は埋め込まれた細胞の露出を輸送時間続けることによって決定する。図３に示すように、本発明の輸送システムにおいて４８時間輸送され、輸送プロセス後にいったん回復された細胞は、１００％の生存度を有する。６０時間後、細胞生存度は８５％より高いままであり、すなわち要求される最適な生存度の範囲内である。システムを供給して７２時間後、細胞生存度は６０％に減少する。この値は、６０％の細胞生存度が効率的に培養物の回復を可能にすることにより、特定の場合には容認可能である。培養９６時間後、細胞生存度はここで極めて影響を受け、生存割合がほぼ３０％である。
【０１６１】
したがって、本発明の好ましい態様において、このシステムは、輸送温度が２５℃より低く、好ましくは１８〜２３℃であり、より好ましくは２２℃であり、また最大輸送温度は６０時間を超えず、より好ましくは４８時間を越えない、所望の特性基準を維持する。
【０１６２】
（ｉｖ．輸送プロセス後の細胞回復）
本発明の輸送システムの特徴の一つは、輸送した細胞の細胞回復を可能にすることである。細胞培養物の回復を実行するために使用する方法は、細胞輸送に使用する形式又は支持材に依存して変化する：
細胞が表面上に単層にて接種された後、アガロース−アガラーゼ混合物で被覆された場合（図５ａにしたがって）、細胞回復プロセスは、以下の指示を固守することが好ましい：
・細胞が目的地の研究室で受け取られた後、これらを３７℃及び５％ＣＯ２のインキュベータに１．５〜２時間導入する。
【０１６３】
・３７℃のインキュベート後、プレートをインキュベータ内から回収した後、アガロースの消化を促進するために、３７℃に調整した培養培地をアガロース−アガラーゼ被覆に添加する。
【０１６４】
・新たな１時間の長さの３７℃でのインキュベーションを行なう。
【０１６５】
・この最後のインキュベーション後、ウェル／フラスコの内容物を注意深く混合し、消化されなかったであろうアガロースの残渣を培地と混合し、そしてこの培地をウェル／フラスコから取り除く。
【０１６６】
・その後、新鮮な培養培地を細胞上に添加する。
【０１６７】
・細胞を３７℃及び５％ＣＯ２の培養オーブンに翌日まで導入し、輸送期間における回復を改善することを可能にする。この後すぐに、細胞は、所望のプロセスを行なうための準備ができている。
【０１６８】
細胞は、所望のプロセスを行なうために、これらが培養されかつ輸送された細胞支持材から、基本的な細胞培養技術を用いて任意に抽出し得る。
【０１６９】
細胞がアガロース及びアガラーゼ混合物中に配置されていた場合（図５ｂ及び図５ｃにしたがって）、すなわち、混合物中に埋め込まれた細胞の場合、細胞回復プロセスのために、以下の指示を固守することが好ましい：
上述した最初の３つのステップの後、以下が行なわれる：
・インキュベーション後、チューブの内容物をよくホモジナイズし、消化されたアガロースの混合物、培地及びアガラーゼの残渣から細胞を分離する目的で、穏やかな遠心（８００〜１０００ｇ）を行ない、チューブの底で細胞を回復させることを可能にする。
【０１７０】
・遠心後、細胞を新鮮な培養培地中に再懸濁し、生細胞を数えた後、標準的な培養条件において接種を行なう。
【０１７１】
細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２の培養オーブンに翌日まで導入し、輸送期間における回復を改善することを可能にする。この後すぐに、細胞は、所望のプロセスを行なうための準備ができている。
【０１７２】
（ｖ．細胞毒性及び細胞形態の試験による、本発明のシステムを用いた輸送期間後の細胞の整合性の確認）
輸送及び細胞回復後、記載される全てのプロセスにより細胞が回復可能な時間が経過した後、細胞整合性を、細胞毒性アッセイ及び細胞形態試験を実行することによって特徴づけする。
【０１７３】
輸送された細胞において、８５％以上が無傷の細胞の生存度及び整合性であることは、最適な特性基準であると考えられる。
【０１７４】
この確認を行なうために、増殖及び細胞毒性アッセイが同等に考慮され、組み入れたＭＴＴによって細胞の増殖能をアッセイする。ＭＴＴは輸送システムに露出した細胞の代謝能の直接測定であり、混合物への露出が細胞にとって毒性である場合にはその代謝が影響を受ける可能性があり、そしてこれは細胞の増殖能の減少に直接的に反映され得る。
【０１７５】
従来において公知であるように、ＭＴＴ試験は、生細胞におけるミトコンドリアの酵素が有する、ある基質から他の二次代謝産物へと変換する能力に基づいている。ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼの活性に依存して形成される化合物の量は、培養物に存在する生細胞の数の明らかな指標である。
【０１７６】
図６で観察されるように、輸送培地は、コントロール（２３℃）及び培養物（３７℃、５％ＣＯ２）と比較して細胞の増殖速度の変化が生じないことにより、細胞生存度に顕著に影響を与えないことが結論づけられる。これは、細胞が本発明のシステム中で維持されていた時間に、細胞毒性効果を受けなかったことを示す。
【０１７７】
同様に、図７は、先の段落において記載した条件と同一条件下でアッセイされた培養物の細胞形態における違いがどの程度観察されないかを示す。
【０１７８】
前述の図において、細胞培養物の輸送のための、本発明に記載される輸送システムの使用は、その中で輸送される細胞培養物の細胞生存度又は細胞形態を改変も変更もしないことが結論付けられる。
【０１７９】
本発明の明細書に提供される以下の特定の実施例は、本発明の本質を説明するためのものである。これらの実施例は、説明する目的でのみ含まれ、本明細書において主張される本発明に対する限定として解釈されてはならない。
【０１８０】
以下の細胞タイプは、本発明に記載の実施例を行なうために使用された：ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞，ＭＤＣＫ−ＩＩ及びＭＤＣＫ−ＩＩ−ＭＤＲ１細胞，ネズミ由来のＣＨＯ細胞，間葉系細胞，ケラチノサイトならびに繊維芽細胞。これらの培養条件及び培養特性は、当業者に公知である。
【０１８１】
これらの細胞タイプの選択は、多様な特徴を有する細胞タイプを使用する輸送システムを評価し、広い範囲の培養物を有するシステムの有効性を証明することの重要性のため、各細胞タイプの典型的な特徴に依存して行なわれた。第２の選択の基準は、輸送される細胞の最終的な適用に基づいており、薬剤、遺伝子ターゲットなどを同定するために一般に使用される細胞タイプの選択を評価する。
【０１８２】
したがって、以下の実施例を鑑みれば、アガロース−アガラーゼ混合物が、種々の細胞タイプの生存度に影響を与えないことを結論付けることができる。そのため、細胞が支持材の表面に接着して生育するか、又はその一方、特異的な培養培地中に懸濁されて生育するかにかかわらず、輸送培地が任意の細胞タイプに適用され得ることを確信することができる。
【０１８３】
〔実施例〕
（実施例１：本輸送システムにおけるアガロース及びアガラーゼの範囲の決定）
［１．１：本システムにおける最終アガロース濃度の決定］
それぞれの種類の細胞株が異なった特定の培養培地の使用を要求すること、ならびに異なる培地の性質が互いに異なることを考慮すれば、そして多くの場合に商業的に調製された培地は、その培地特有の特徴を確認するために必要な情報を提供しないため、本発明の輸送システムを適用するために必要な最終アガロース濃度を、輸送されるそれぞれの培地において経験的に検証する必要がある。
【０１８４】
本システムにおいて使用され得る最終アガロース濃度の範囲を決定するために、低融点アガロースの保存液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、生理食塩水溶液（１×ＰＢＳ）中に２％アガロースの最終濃度で調製する。この溶液から、種々の特徴を示す種々の培地においてアガロースの最終割合が０．１％〜１％となるように、種々の希釈液を調製する。
【０１８５】
これらの試験に使用される培地は、ＤＭＥＭ培地（１０％ウシ胎児血清及び１％抗生物質）、Ｈａｎ’ｓ  Ｆ１２培地（１０％ウシ胎児血清及び１％抗生物質が補充された）、ＭＥＭ培地（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン，１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム，０．１ｍＭ  非必須アミノ酸、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン及び１％抗生物質が補充された）、ＥｐｉＬｉｆｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）（ヒトケラチノサイト成長補助剤Ｖ２（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）が補充された）、ならびに１０６培地（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）（成長補助剤ＬＳＧＳ（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）が補充された）である。
【０１８６】
図１に見られるように、最終濃度が０．２％未満のアガロースを含む混合物では、本システムは、選択される指示材中に接種された細胞の信頼性ある輸送を保証する所望の強度及び粘度を有さない。
【０１８７】
本発明において記載されるように、本システムの目的は、信頼性ある条件下で輸送され、かつ輸送中に細胞が動いたりばらついたりすることがない培地のために充分に一貫性ある混合物を生成することである；そして一方では、培地がその目的地に到達した後、細胞が、最適な回復割合で単純かつ簡単な様式において、その使用（経験豊富な使用者による使用、又は細胞培養技術及び方法に慣れていない使用者による使用の両方）のために回復され得ることが必要である。そのためには、最適に確立される混合物中のアガロースの割合は、混合物が、いくらかのタイプの滑動に直面する支持材なしで輸送される細胞のために充分に強い割合であって、しかし同時に、簡単かつ効率的な様式で培地から分離され得る割合であった。
【０１８８】
したがって、混合物中のアガロースの最終割合は、混合物を調製するために使用される培養培地に関係なく０．２％より高いことが好ましい。
【０１８９】
【表１】
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【０１９０】
０．２％の濃度の後、及び０．３％より高い濃度の全てにおいて、混合物は輸送のために理想的な粘度を有する。最大濃度である１％アガロースは、細胞の輸送を確実に保証する、完全に固体の粘度を示す。
【０１９１】
しかしながら、輸送のための最終的な混合物中に用いるアガロース濃度が高いほど、この輸送がより確実となるにもかかわらず、輸送後の細胞培養物の単純かつ簡単な回復に関する本発明のシステムの特徴を考慮することもまた必要である。したがって、最終的な混合物におけるアガロース濃度が高いほど、培養物を回復させるときにはその高い剛性のためにより困難になり得る。
【０１９２】
この意味では、本システムにおいて最も高い最適な濃度を決定するために、種々の培地について０．３％〜１％において、混合物中のアガロースの種々の割合が試験された（図１）。それぞれの培地について混合物の固化の度合いを検証した後、本システムに使用するアガロース濃度の上限は０．６％であることが確立された。
【０１９３】
混合物中の最終アガロース濃度が、最適な推奨される濃度よりも高い場合、輸送される培養物を形成する細胞の回復が困難となり得、細胞の回復率を減少させ、かつ培養物からの混合物の完全な除去を妨げる。
【０１９４】
したがって、生理食塩水溶液（１×ＰＢＳ）中に２％にて調製され、その後に滅菌された、より濃縮されたアガロース溶液に基づく培養培地において、最終的な輸送混合物中のアガロース濃度の範囲は０．２〜０．６％、好ましくは０．５％である。
【０１９５】
［１．２：本システムにおける最終アガラーゼ濃度］
アガロース混合物において用いられるアガラーゼの割合を決定するために、確立された最終割合を得るために必要なアガロースの量を、１％アガロースの１ｍｌあたり８０ユニットであるアガラーゼの最終濃度範囲を達成する種々の量のアガラーゼと混合させた。混合物中の最終アガラーゼ濃度の決定は、混合物の強度についての視覚的観察、ならびに細胞の整合性及び形態についての顕微鏡観察に基づいた（図２及び図７）。
【０１９６】
輸送培地を調製するためのアガラーゼの割合を決定する際に考慮すべきことの１つは、アガラーゼ及びその対応する容量の特定の培養培地を含むアガロースの混合物の粘度である。
【０１９７】
細胞が本発明のシステムによって確実に輸送されるために、アガロース−アガラーゼ混合物が、このプロセスの間の細胞を保護するのに充分な強度であることが必要である。したがって、アガロース−アガラーゼ混合物は、所望の状態を確保する粘度を示すことが必要であり、また同時に、アガロース及びアガラーゼ混合物に接触した後に細胞の整合性及び形態が維持されていることを確認することが必要である。
【０１９８】
１％アガロース１ｍｌあたり９０ユニットのアガラーゼの濃度では、アガロース−アガラーゼ混合物は、輸送混合物が確実な輸送を行なうには高い液化性を示す粘度となるため、最適な細胞輸送を保証するために必要な粘度を示さない。
【０１９９】
したがって、本システム中の最終的なアガロース及びアガラーゼ混合物におけるアガラーゼ濃度は、好ましくは、１％アガロース１ｍｌあたりアガラーゼ８０ユニットであってもよい。
【０２００】
図２に示すように、種々の最終アガラーゼ濃度を有するアガロース混合物に露出した培養物における細胞の整合性及び形態は、この混合物に露出した培養物に関して差異が見られなかった。最も高いアガラーゼ濃度（１％アガロース１ｍｌあたりアガラーゼ８５ユニット）と接触した細胞でさえ、細胞の生存度又は形態に差異が見られなかった。
【０２０１】
（実施例２：本発明に記載のシステムの有効性を確認するために行なうアッセイ）
［２．１：細胞毒性アッセイを用いた、アガラーゼ及び培地を含むアガロースの混合物に露出した後の細胞整合性の特徴付け］
選択される細胞タイプに依存して、細胞を適切な濃度で適切な培地に接種し、プレートを３７℃及び５％ＣＯ２にて培養する。
【０２０２】
培養物表面は、細胞を接種する前に、以下に記載するように、任意にポリ−Ｌ−リジンによって処理してもよい。
【０２０３】
ポリ−Ｌ−リジンの保存液は、５００μｇ／ｍｌの濃度において、濾過により滅菌する。選択されるポリ−Ｌ−リジンの最終濃度は６０μｇ／ｍｌである。ウェル中に添加する溶液を調製するために、好適な容量のポリ−Ｌ−リジン保存液は、培養物表面を処理する際に所望の濃度を得るように、Ｈ２Ｏ中に調製する。
【０２０４】
８０μｌの好適な溶液を９６ウェルプレートのウェル中に添加した後、１時間作動させた層流キャビネットの中でフタをせず開けたまま、プレートを室温でインキュベートする。
【０２０５】
インキュベーションの後、ウェルのそれぞれを、調整された生理食塩水溶液（１×ＰＢＳ）を用いて３回洗浄する。プレートを対応するフタで覆い、１時間以上、紫外線照射（ＵＶ）にさらし、培養物表面を殺菌する。
【０２０６】
これらのプレートを、調製した後１週間以内に使用する。
【０２０７】
［細胞の接種］
ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルにおける培地２００μｌの中に、１ウェルあたり４０，０００細胞の濃度にて接種する。これらの細胞は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、及び１％抗生物質を添加したＭＥＭ培地にて培養する。
【０２０８】
次に、ＣＨＯ細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルにおける培地２００μｌの中に、１ウェルあたり２０，０００細胞の濃度にて接種する。ＣＨＯ細胞の培養培地は、１０％ウシ胎児血清及び１％抗生物質を添加したＨａｎ’ｓ  Ｆ１２培地からなる。
【０２０９】
ＭＤＣＫ−ＩＩ及びＭＤＣＫ−ＩＩ−ＭＤＲ１細胞株に使用される接種濃度は、９６ウェルプレートの１ウェルあたり２００μｌ培地に１５，０００細胞である。これらの細胞を培養するための特定の培地は、１０％ウシ胎児血清及び１％抗生物質を添加したＤＭＥＭ培地である。
【０２１０】
ヒト間葉細胞は、９６ウェルプレートの１ウェルあたり２００μｌ中に５，０００細胞の濃度で接種する。これらの細胞を培養する特定の培養培地は、ＭｅｓｅｎＰｒｏ培地（Ｇｉｂｃｏ）である。ＭｅｓｅｎＰｒｏ培地は、血清量が減少されている（２％）培地であり、間葉細胞の成育のために特別に作り出されたものである。
【０２１１】
成人のケラチノサイトは、９６ウェルプレートの１ウェルあたり２００μｌ培地中に１０，０００細胞の細胞濃度にて培養する。この場合、細胞増殖に使用する培地は、組換えヒトインシュリン様成長因子（ILGF）、組換えヒト上皮成長因子、プロスタグランジンＥ−２及びヒドロコルチゾンを含むヒトケラチノサイト成長補助剤Ｖ２（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を添加したＥｐｉＬｉｆｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）からなる。
【０２１２】
繊維芽細胞の場合に接種する細胞の数は、９６ウェルプレートの１ウェルあたり２００μｌ培地中に５，０００細胞である。繊維芽細胞を培養するために使用する培地は、ウシ胎児血清，ヒドロコルチゾン，ヒト上皮成長因子，繊維芽細胞に対する基本的成長因子及びヘパリンを含むＬＳＧＳ成長補助剤（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を添加した１０６培地（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）からなる。
【０２１３】
翌日にプレートをインキュベータから取り出し、冷却面上、例えばアイスボックス上に置き、滅菌条件下、種々の培養物を、以下に記載のように調製された本発明の輸送培地で覆う。
【０２１４】
［輸送培地の調製］
１×ＰＢＳ中で調製した２％アガロース溶液を、電子レンジ中で融解させ、各細胞培養に特有の培養培地におけるアガロースの最終濃度が０．３％である溶液を調製するために、好適な容量を用いる。リン酸カリウムバッファーｐＨ６．０又は１×ＰＢＳ中０．２〜２ｍｇ／ｍｌ（２５５．６〜２，５５６Ｕ／ｍｌ）の濃度にて調製し、混合物におけるアガラーゼの最終濃度が１％アガロース１ｍｌあたり６０〜８０ユニット、すなわち使用する０．３％濃度のために１８Ｕ／ｍｌであってもよいアガラーゼを、アガロース溶液に添加する。２％アガロース１５０μｌ及び０．２〜２ｍｇ／ｍｌ（２５５．６〜２，５５６Ｕ／ｍｌ）のアガラーゼ７〜９５μｌを、輸送培地１ｍｌにつき添加する。
【０２１５】
［細胞培養における輸送培地の添加］
輸送培地をよく混合させ、３７℃に調整した後、９６ウェルプレートのウェルから培地の容量を取り除き、混合物を添加して細胞培養物を覆う。
【０２１６】
したがって、混合物１５０μｌを、各ウェルに接種した細胞の上に添加し、プレートに添加した後約１５〜３０分、混合物が所望の粘度となるまでプレートを氷上に保持する。
【０２１７】
［輸送及び輸送条件のためのプレートの準備］
その後プレートは、パラフィルムで完全にシールし、輸送温度１８〜２３℃、好ましくは２２℃に保持する。
【０２１８】
［プレートの受け取り、輸送培地の除去］
目的地に到達するために必要な輸送期間経過後、この場合２４時間の輸送が試験され、プレートは、アガロース−アガラーゼ被層を消化した後に細胞回復させ始めるために３７℃の細胞培養インキュベータの中に導入する前に、注意深く包装から取り出し、その表面をエタノールで殺菌することが好ましい。
【０２１９】
その結果、プレートを、３７℃及び５％ＣＯ２にてインキュベータ内に導入する。これらの条件におけるインキュベーションは、約２時間とすべきである。最初のインキュベーションの２時間が経過直後、プレートをインキュベータから出し、３７℃に調整された１００μｌの細胞培養培地をそれぞれのウェルに添加し、プレートをもう１時間インキュベータに戻す。
【０２２０】
アガラーゼを添加したアガロースの被層は、インキュベーションの最後の１時間の後に取り除く。ウェルの中身を、Ｐ１００又はＰ２００のピペットを用いて非常にやさしく、かつ注意深く混合させ、培養培地と混合させた培養培地を、ウェルの底に接着している細胞が同調し、かつ浮かないように注意深く除去する。その後、調整した新鮮な培地を添加する。このとき、培養物を失うことがないように、アガロースを有する培地の最大量を取り除こうとすることが必要である。
【０２２１】
プレートの全てのウェルが、全てが新鮮な培地を含むように完了した後、輸送及び細胞回復プロセス後に細胞を回復させるために、プレートを翌日までインキュベータに戻す。
【０２２２】
［増殖アッセイ］
回復期間が経過した後、細胞は、関連するアッセイ、この特定の場合には増殖アッセイ、を行なうための準備ができている。前述した条件下でアガロース及びアガラーゼ混合物とともに保持される細胞の増殖能を決定するのと平行して、以下の条件下で保持された全ての細胞株及び一次培養物の増殖能を調節する方法もまた試験される。
【０２２３】
培養物：アガロース及びアガラーゼ混合物に露出したものと同一の細胞株及び一次培養物であり、ただし通常の培養条件（３７℃、５％ＣＯ２）でインキュベートされ、かつその増殖率が参照コントロールとして考慮され得る。
【０２２４】
コントロール：アガロース及びアガラーゼ混合物に露出したものと同一の細胞株及び一次培養物であり、かつこの混合物に露出したものと同一の温度条件、パッケージング条件等において保持されたが、特定の培養培地に接触されたのみである。これらの細胞は、これらのアッセイにおける細胞増殖を示す図６のグラフにおいてコントロールと称される。アッセイにおいてこのコントロールを含むことの目的は、細胞の生存度及び増殖に対する輸送条件（温度、パッケージング、時間など）の効果の決定；またはこれらが輸送される条件とは対照的に、この輸送の効果が混合物との接触によるものかどうかの決定、からなる。
【０２２５】
アッセイにおいてコントロールを含む目的は、輸送条件（温度、パッケージング、時間など）の細胞生存度及び増殖に対する効果を決定すること；輸送の効果が、混合物との接触によるものかどうか、又はこれと対照的にこれらが輸送される条件によるものかどうか、を決定すること、からなる。
【０２２６】
細胞の整合性は、ＭＴＴ試験を用いて細胞の増殖を測定することにより決定した。
【０２２７】
ＭＴＴ試験は、生細胞におけるミトコンドリアの酵素が有する、ある基質を他の二次代謝物に変換する能力に基づいている。ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼの活性に依存して形成される化合物の量は、培養物に存在する生細胞の数の明らかな指標である。
【０２２８】
具体的に、このミトコンドリア試験では、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｉ（ＭＴＴ），Ｃａｔ．Ｎｏ．１  ４６５  ００７  Ｒｏｃｈｅにより、細胞のミトコンドリアのコハク酸デヒドロゲナーゼにより行なわれる、テトラゾリウム塩（黄色）から不溶性のホルマザン結晶（青色）への変換を決定する。その後細胞を透過化処理し、形成された結晶を可溶化し、着色溶液とさせる。この着色溶液について、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーにおいて５５０ｎｍの波長にて吸光度を測定することにより、定量化することができる。
【０２２９】
固守されるべきプロセスは、以下である：
増殖能又は細胞整合性をアッセイしようとする際、各ウェルの培養物に対し、培地１００μｌごとに１０μｌのＭＴＴ溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、これをインキュベータ内で３７℃にて４時間インキュベートする。
【０２３０】
インキュベーションが終了する際、ホルマザン結晶が細胞内部に観察され得る。１００μｌの可溶化溶液を各培養物又はウェルに添加し、一晩インキュベータ内で３７℃にてインキュベートする。これにより細胞は透過化処理され、その後結晶が可溶化し、容易に定量化可能な着色溶液とさせる。
【０２３１】
結晶が可溶化した後、ＥＬＩＳＡマルチプレートリーダーを用いて５５０ｎｍにて培養プレートを直接的に読み取る。読み取りの前に、プレートの下の表面をエタノールで洗浄することが望ましい。
【０２３２】
ミトコンドリア活性を、細胞の回復期間後の０時間目、２４時間目及び７２時間目に読み取る。図６は、アッセイされた全ての細胞タイプ及び一次培養物においてＭＴＴ法により増殖を測定することによって得られる、長期にわたる吸光値の表示を示す。
【０２３３】
図６に示されるＳＫ−Ｎ−ＭＣ，ＣＨＯ，ＭＤＣＫ−ＩＩ及びＭＤＣＫ−ＩＩ−ＭＤＲ１細胞株の増殖速度の解析は、培地において、かつ細胞輸送のために規定された条件でアッセイされたこれらの細胞タイプの細胞の成育に対し、負の効果を全く示さない。さらに、混合物に露出した後の、細胞輸送のために規定された条件でのこれらの細胞の増殖速度においては、増加を示す。
【０２３４】
間葉系細胞（ＡＭＳＣ）、ケラチノサイト及び繊維芽細胞の一次培養物における生育を解析した後に、これらもまた図６に示されるが、これらの細胞のアガロース−アガラーゼ混合物への露出、及び選択した輸送条件におけるこれらの細胞の維持は、これらの細胞の増殖速度に有意な影響を与えない。これらの場合において、混合物に露出した培養物の増殖能におけるわずかな増加もまた観察される。
【０２３５】
これらの結果から、輸送培地（アガロース−アガラーゼ）は、細胞整合性に有意に影響を与えないことが結論付けられる。混合物に露出した、輸送条件下の細胞の増殖速度は、混合物に露出しなかった細胞の増殖速度及び同じ温度条件（２３℃）下で培養された細胞の増殖速度と同様であるためである。したがって、培地に露出した、輸送条件下の細胞培養物は、さらに標準的な培養条件（３７℃、５％ＣＯ２）下で維持された細胞と同様の様式において増殖することが結論付けられる。
【０２３６】
したがって、アガロースの最終割合が０．３％、本システムの混合物における１％アガロース１ｍｌあたりのアガラーゼが８０ユニット、及び輸送のための特定の温度条件（２２℃）に対応する本発明の特定の態様は、上述した条件でアッセイされる細胞の整合性に影響を及ぼさない。
【０２３７】
［２．２  細胞培養物の形態確認による、アガロース及びアガラーゼ混合物及び培地に露出した後の細胞整合性の特徴付け］
［細胞の接種］
細胞を、２４ウェルプレートに、関連する細胞タイプに依存した種々の細胞密度で接種する。そして、これらの細胞を、先のアッセイに記載したような各細胞タイプに特有の培養培地中で培養し得る。
【０２３８】
この特別なアッセイにおける特定の態様において、細胞を、その特有の培養培地に３７℃及び５％ＣＯ２にて以下の密度で接種した：ＳＫ−Ｎ−ＭＣは１ｍｌのウェルあたり３００，０００細胞；ＣＨＯは培地１ｍｌを含むウェルあたり１００，０００細胞；ＭＤＣＫ−ＩＩ及びＭＤＣＫ−ＩＩ−ＭＤＲ１は培地１ｍｌを含むウェルあたり６５，０００細胞；ヒト間葉系細胞は培地１ｍｌを含むウェルあたり５０，０００細胞；成人のケラチノサイトは培地１ｍｌを含むウェルあたり１１０，０００細胞；繊維芽細胞は培地１ｍｌを含むウェルあたり９０，０００細胞。
【０２３９】
細胞培養物は、先の実施例に記載のように輸送培地で処理される。
【０２４０】
先の実施例に記載のように輸送培地を細胞から取り除き、細胞が回復した後、このアッセイに含まれる各細胞株の培養物及び一次培養物の細胞形態を解析する。また、輸送混合物で維持した細胞の顕微鏡による細胞形態解析と並行して、対照とするために、先の実施例で使用したものと同一の条件における全ての細胞株及び一次培養物（培養物及びコントロール）の細胞形態をも解析する。
【０２４１】
細胞形態は、全てヒト由来であるＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経芽細胞腫細胞，ＣＨＯ細胞，ＭＤＣＫ−ＩＩ及びＭＤＣＫ−ＩＩ−ＭＤＲ１細胞の細胞培養物について、ならびにまた、間葉系細胞，繊維芽細胞及びケラチノサイトの一次培養物について、顕微鏡観察により解析する。
【０２４２】
解析は、細胞操作プロセス全体において行なった。図７は、この形態学的解析から得られる画像を示す。図７ａは、アガラーゼを加えたアガロース及び培地の混合物に取り込まれる前にアッセイした全ての細胞の培養物の様子を示す。ここでは、各細胞タイプの通常の様子を見ることができる。
【０２４３】
図７ｂは、アガラーゼを加えたアガロース及び培地の混合物を取り除く前の時期における各培養物の様子を示す。言い換えれば、これらの画像に現れている細胞は、この画像が撮られた瞬間に、アガロース及びアガラーゼ混合物に覆われている。コントロールは、アガラーゼを加えたアガロース及び培地の混合物に露出した細胞と同一プレートに残っており、混合物が加えられた細胞と同一条件下で維持されたが、しかしながら、アッセイした混合物と全く接触しなかった細胞に該当する。２３℃で維持され、ＣＯ２の外部供給がなく、パッケージング条件下である培養物について、これらが輸送培地と接触した場合、及びこれらがその特定の培養培地において維持されたのみである場合、標準的な培養条件（３７℃、５％ＣＯ２）で維持された細胞の形態と比較したとき、この培養物の細胞形態に全く違いがないことは、この点に対応する画像において見ることができる。
【０２４４】
図７ｃは、細胞において推奨される回復期間後、アガラーゼを加えたアガロース及び培地の混合物を取り除いた翌日の細胞培養物に対応する画像を示す。図７ｃは、通常の培養条件におけるこれら全ての細胞株及び一次培養物（通常の様式の培養物中で維持されたコントロール細胞）の通常の形態の画像を示し、またこれらは図７ｃにおいて培養物として示される。さらに、図７ｃは、アガラーゼを加えたアガロース及び培地の混合物でアッセイされた細胞とともに輸送条件において維持されたが、混合物と接触しない、コントロールと呼ばれる細胞の形態学的解析の画像を示す。最後に、この図は、アガロース＋アガラーゼで示される、方法において記載される条件でアガラーゼを加えたアガロース及び培地の混合物で処理されかつ露出した、全ての細胞の細胞培養物に対応する形態を示す。
【０２４５】
これらの画像から、培養物、コントロール及びアガロース＋アガラーゼと称される、輸送条件においてアッセイされた培養物の細胞形態に違いが見られないことを確信し得る。したがって、決定した条件におけるアガラーゼを加えたアガロース及び培地の混合物の供給は、全てヒト由来であるＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経芽細胞腫細胞，ＣＨＯ細胞，ＭＤＣＫ−ＩＩ及びＭＤＣＫ−ＩＩ−ＭＤＲ１細胞の培養物、ならびにまた、間葉系細胞、繊維芽細胞及びケラチノサイトの一次培養物の、正常な細胞形態を改変も変更もさせないことを、結論付けることができる。
【０２４６】
［２．３  ＭＴＴでの増殖アッセイならびに顕微鏡による形態及び細胞密度の確認を用いた、ラミニンで処理したプレート上のＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞における細胞接着能の増加の特徴付け］
本発明のシステムを用いた輸送アッセイにおいて選択された全ての接着性細胞株において、上皮性神経細胞であるＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞は、最も低い接着能を有していた。したがって、細胞接着性を高めるために特に処理したプレートにおける本システムのアッセイのために、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を選択した。
【０２４７】
いくつかの科学文献、参考文献には、ラミニンが、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞の場合のように、神経細胞の接着性の向上のために最も一般的に使用される細胞外マトリクス成分として記載される（１０）。
【０２４８】
結果として、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を、標準的な２４ウェルプレート及びラミニンであらかじめ処理した２４ウェルプレート（Ｌａｍｉｎｉｎ  ２４−ｗｅｌｌ  Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅｓ，ＢＤ）において、ウェルあたり３００，０００細胞の細胞密度で、１ｍｌの特定の培地にて、３７℃及び５％ＣＯ２にて培養する。特定の培地は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン，１ｍＭピルビン酸ナトリウム，０．１ｍＭ非必須アミノ酸，５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン及び１％抗生物質を添加したＭＥＭ培地からなる。
【０２４９】
ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を標準的な２４ウェルプレート及びラミニンで処理した２４ウェルプレートに接種した翌日、先の実施例に記載の詳述にしたがって輸送条件を擬態する。
【０２５０】
細胞が輸送状態から回復するために必要な時間が経過した後、先の実施例に記載したＭＴＴ試験を用いて２４時間の時点及び４８時間の時点において細胞増殖を測定する方法により、両方の培養物の増殖速度を決定する。
【０２５１】
図８ａは、通常の様式で培養された細胞、及びラミニンで処理された表面上で培養された細胞におけるＭＴＴ試験による増殖の測定によって得られる、長時間の吸光値の表示を示す。
【０２５２】
図８ａで表されるＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞の増殖速度の解析において、培養２４時間後に、ラミニンで処理されたプレートの細胞増殖が向上することが示される。これは、ラミニンで覆うことが、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞に、支持材の基材へのより高い接着性を提供し、多数の細胞の確立、及びその結果培養における生細胞数の増加を可能にすることによる。培養４８時間後、両方の培養物の増殖速度は同等である；しかしながら、細胞培養物の画像（図８ｂ）では、ラミニンを有する培養プレートにおいて、より高い細胞密度がやはり観察される。
【０２５３】
同様に、図８ｂに示される、通常の２４ウェルプレート及びラミニンで処理された２４ウェルプレートにおける、ＳＫ−Ｎ−ＭＣの培養物の細胞形態解析は、両方の最初の細胞数は同じであるにもかかわらず、ラミニンを有するプレートで培養した細胞の数が、通常のプレートで培養した細胞の数よりも多いことを示す。これは、ＭＴＴによる増殖の測定から得られる結果を再確認する。ＭＴＴによる増殖アッセイによって細胞密度に違いが検出されなかったことは、両方の培養物において細胞密度が高いことに起因し得る。
【０２５４】
したがって、ラミニンで処理されたプレートが、培養初期における細胞形態を維持し、また基材への細胞接着に有利に働き、細胞接着がラミニンで支持材を処理することにより促進されることが結論付けられる。
【０２５５】
［２．４．ＭＴＴを用いた増殖アッセイならびに顕微鏡を用いた形態及び細胞密度の確認による、ポリ−Ｌ−リジンで処理されたプレート上におけるＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞の細胞接着能の向上の特徴付け］
［２．４．１  ポリ−Ｌ−リジンへの露出を増やした後の輸送システムにおける細胞整合性の試験、及び輸送システムにおけるポリ−Ｌ−リジン濃度範囲の決定］
［ポリ−Ｌ−リジンを用いた培養物表面の処理］
ポリ−Ｌ−リジンストック溶液は５００μｇ／ｍｌであり、フィルター滅菌する。ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞についてアッセイした最終ポリ−Ｌ−リジン濃度は、１０〜２００μｇ／ｍｌであった。
【０２５６】
アッセイに使用すべきポリ−Ｌ−リジン濃度を規定した後、最終濃度を所望の濃度に対応させるために、それぞれの場合に添加すべきポリ−Ｌ−リジンの量を決定する。
【０２５７】
適切な溶液８０μｌを、９６ウェルプレートのウェルに添加した後、このプレートを、層流キャビネット内で１時間、フタなしで暴露した状態で、室温でインキュベートする。
【０２５８】
インキュベーション後、調整した生理食塩水溶液（１×ＰＢＳ）で各ウェルを３回洗浄する。プレートを、これに対応するフタで覆い、培養物表面を殺菌するために少なくとも１時間の間、紫外線照射（ＵＶ）にさらす。
【０２５９】
これらのプレートを、準備した後１週間以内に使用する。
【０２６０】
［ポリ−Ｌ−リジンで処理したプレートにおけるＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞の接種］
ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を、ポリ−Ｌ−リジンで処理したプレートに、９６ウェルプレートの各ウェルに、培地２００μｌを含むウェルあたり１５，０００細胞の密度にて接種する。これらの細胞を、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン，１ｍＭピルビン酸ナトリウム，０．１ｍＭ非必須アミノ酸，５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン及び１％抗生物質が添加されたＭＥＭ培地で培養する。
【０２６１】
［増加するポリ−Ｌ−リジン濃度に露出した後の細胞整合性試験］
細胞整合性を、ＭＴＴ試験による細胞増殖の測定によって、決定した。
【０２６２】
プレート表面への細胞の短時間（約４時間）の露出後、初期値又は０時間目を決定するため、対応するＭＴＴを追加することで、最初の細胞整合性測定を行なう。
【０２６３】
ＭＴＴ試験は、生細胞におけるミトコンドリアの酵素が有する、ある基質を他の二次代謝産物に変換する能力に基づく。ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ活性に依存して形成される化合物量は、培養物中に存在する生細胞数の明らかな指標である。
【０２６４】
具体的に、このミトコンドリア試験では、Cell Proliferation kit I (MTT) Cat. No. 1 465 007 Rocheにより、細胞のミトコンドリアのコハク酸デヒドロゲナーゼにより行なわれる、テトラゾリウム塩から不溶性のホルマザン結晶への変換を決定する。その後細胞を透過化処理し、形成された結晶を可溶化し、着色溶液とさせる。この着色溶液について、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーにおいて５５０ｎｍの波長にて吸光度を測定することにより、定量化することができる。
【０２６５】
固守されるべきプロセスは、以下である：
１．増殖能又は細胞整合性をアッセイしようとする際、各ウェルの培養物に対し、培地１００μｌごとに１０μｌのＭＴＴ溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、これをインキュベータ内で３７℃にて４時間インキュベートする。
【０２６６】
２．インキュベーションが終了する際、ホルマザン結晶が細胞内部に観察され得る。１００μｌの可溶化溶液を各培養物又はウェルに添加し、一晩インキュベータ内で３７℃にてインキュベートする。これにより細胞は透過化処理され、その後結晶が可溶化し、容易に定量化可能な着色溶液とさせる。
【０２６７】
３．結晶が可溶化した後、ＥＬＩＳＡマルチプレートリーダーを用いて５５０ｎｍにて培養プレートを直接的に読み取る。読み取りの前に、プレートの下の表面をエタノールで洗浄することが望ましい。
【０２６８】
［輸送システムにおけるポリ−Ｌ−リジン濃度］
図１０のグラフは、種々の濃度のポリ−Ｌ−リジンで処理された表面に接触した後のＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞の細胞毒性カーブを示す。
【０２６９】
図１０ａは、高いポリ−Ｌ−リジン濃度範囲（１００〜２００μｇ／ｍｌ）のアッセイを示す。これに対し、図１０ｂは、より低いポリ−Ｌ−リジン濃度範囲（１０−７５μｇ／ｍｌ）のアッセイを示す。
【０２７０】
図１０ａのグラフに見られるように、ポリ−Ｌ−リジン濃度を増加させると、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞の増殖能が減少する。図１０ｂでは、より低いポリ−Ｌ−リジン濃度にさらされた培養物が、ポリ−Ｌ−リジンにさらされていない細胞に観察される増殖速度とほとんど変わらない増殖速度を示すことが観察される。
【０２７１】
前述したアッセイによって、どの濃度も培養物の整合性又は増殖能に対して劇的に影響を与えないにもかかわらず、７５μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジン濃度以降では、７２時間において細胞増殖が減少しそうであることが推論され得る。したがって、輸送システムにおけるポリ−Ｌ−リジン濃度範囲は１０〜７５μｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜７０μｇ／ｍｌであり、最終的に好ましい濃度は６０μｇ／ｍｌであることが考慮される。
【０２７２】
［２．４．２  細胞培養物の形態学的確認による、種々のポリ−Ｌ−リジン濃度で処理された表面と接触した後の細胞整合性の特徴付け］
［ポリ−Ｌ−リジンによる培養物表面の処理］
ポリ−Ｌ−リジンのストック溶液は濃度５００μｇ／ｍｌであり、フィルター滅菌する。ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞についてアッセイした最終ポリ−Ｌ−リジン濃度は、１０〜５０μｇ／ｍｌであった。
【０２７３】
アッセイに使用すべきポリ−Ｌ−リジン濃度を規定した後、アッセイに使用すべきポリ−Ｌ−リジン濃度を規定した後、最終濃度を所望の濃度に対応させるために、それぞれの場合に添加すべきポリ−Ｌ−リジンの量を決定する。
【０２７４】
適切な溶液３００μｌを、２４ウェルプレートのウェルに添加した後、このプレートを、層流キャビネット内で１時間、フタなしで暴露した状態で、室温でインキュベートする。
【０２７５】
インキュベーション後、調整した生理食塩水溶液（１×ＰＢＳ）で各ウェルを３回洗浄する。プレートを、これに対応するフタで覆い、培養物表面を殺菌するために少なくとも１時間の間、紫外線照射（ＵＶ）にさらす。
【０２７６】
これらのプレートを、準備した後１週間以内に使用する。
【０２７７】
［細胞の接種］
細胞を、２４ウェルプレートに、関連する細胞タイプに依存した種々の細胞密度で接種し、これらの細胞を上述した実施例に記載したような各細胞タイプに特有の培養培地中で培養し得る。
【０２７８】
この特別な態様における特定の態様において、細胞を、その特有の培養培地に３７℃及び５％ＣＯ２にて以下の密度で接種した：ＳＫ−Ｎ−ＭＣは培地１ｍｌを含むウェルあたり１５０，０００細胞；ＭＤＣＫ−ＩＩ−ＭＤＲ１は培地１ｍｌを含むウェルあたり６５，０００細胞；ヒト間葉系細胞は培地１ｍｌを含むウェルあたり５０，０００細胞；ヒト関節軟骨細胞は培地１ｍｌを含むウェルあたり６５，０００細胞。
【０２７９】
［ポリ−Ｌ−リジンにさらされた培養物の細胞形態の解析］
細胞をポリ−Ｌ−リジンで処理した培養物表面に接種した後、このアッセイに含まれる各細胞株及び一次培養物の培養物の細胞形態を解析する。また、ポリ−Ｌ−リジンにさらされた細胞の顕微鏡による細胞形態解析と並行して、対照とするために、処理してない培養物表面中の全ての細胞株及び一次培養物（コントロール）の細胞形態をも解析する。
【０２８０】
細胞形態は、全てヒト由来であるＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経芽細胞腫及びＭＤＣＫ−ＩＩ−ＭＤＲ１細胞の細胞培養物について、ならびにまた、間葉系細胞及び関節軟骨細胞の一次培養物について、ポリ−Ｌ−リジンで処理した培養物表面にさらされた後２４、４８及び９６時間、顕微鏡観察により解析する。
【０２８１】
図１１は、ポリ−Ｌ−リジンへの露出において使用される各培養物の様子を示す。コントロールは、処理していないプレート中で培養され、かつポリ−Ｌ−リジンに接触した細胞と同一の条件で維持されたが、しかしアッセイした分子のいずれにも接触しなかった細胞に対応する。解析は９６時間行なった。このアッセイに対応する画像において、ポリ−Ｌ−リジンに露出した培養物の細胞形態は、この分子に接触しなかった細胞の形態に対し、どのような差異も全くないことがわかる。
【０２８２】
図１１ａは、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞の培養物に対応する画像を示す；図１１ｂは、ＭＤＣＫ−ＩＩ−ＭＤＲ１細胞を示す；図１１ｃに示される細胞は、ヒト間葉系細胞である；そして最後に、ヒト関節軟骨細胞の形態を図１１ｄに見ることができる。
【０２８３】
これらの画像から、ポリ−Ｌ−リジンと接触した後にアッセイされた培養物の細胞形態に差異が見られないことを確信することができる。したがって、処理された表面への接触は、全てヒト由来であるＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経芽細胞腫細胞，ＭＤＣＫ−ＩＩ−ＭＤＲ１細胞の培養物、ならびにまた、間葉系細胞及び軟骨細胞の一次培養物の、正常な細胞形態を改変も変更もさせないことを、結論付けることができる。
【０２８４】
（実施例３：薬剤スクリーニングのための９６ウェルプレートにおける細胞輸送）
ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を９６ウェルプレートに、培地２００μｌを含むウェルあたり４０，０００細胞の濃度にて接種する。これらの細胞を、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン，１ピルビン酸ナトリウム，０．１ｍＭ非必須アミノ酸，５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン及び１％抗生物質を添加したＭＥＭ培地からなる特有の培地中で培養する。これらを３７℃及び５％ＣＯ２で培養する。
【０２８５】
接種した翌日、輸送培地を被覆し、そしてプレートの輸送条件を前述した実施例に記載のものと同様にする。
【０２８６】
輸送された細胞の回復期間が経過後、この細胞は種々の分子又は薬剤で処理されるために準備ができており、これらの化合物が、このプレートに接種された細胞の細胞増殖又は細胞毒性に対し効果があるかを、前述した実施例に記載のＭＴＴ試験によって解析することができる。
【０２８７】
（実施例４：細胞分化プロセスにおけるメンブレンマーカー発現を解析するための、１２ウェルプレート中のＡＭＳＣ細胞の輸送）
ＡＭＳＣ細胞を１２ウェルプレートに、ウェルあたり８０，０００細胞の濃度で接種し、特有のＭｅｓｅｎＰｒｏ培養培地で３７℃、５％ＣＯ２にて培養する。
【０２８８】
接種した翌日、実施例２に記載のように準備したアガロース濃度０．５％及び最終アガラーゼ濃度３０Ｕ／ｍｌで輸送培地を被覆し、そしてプレートの輸送条件を前述した実施例に記載のものと同様にする。
【０２８９】
回復期間が経過後、間葉系細胞に、脂質生成を誘導する特有の処理を施す。脂質生成は、細胞増殖を促進させる。推定される処理及び時間の後に、特定マーカーを解析し得、またその分化を調査する。
【０２９０】
本発明のシステムにより輸送された間葉系細胞における脂質生成の誘導プロセスは、以下のステップを含む：
・細胞を、単層の形成に必要な時間、ＭｅｓｅｎＰｒｏ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍを有する培養物中で維持する。
【０２９１】
・単層が形成されたら、０．５ｍＭイソブチルメチルキサンチン，１μＭデキサメタゾン，１０μｇ／ｍｌインスリン（Ｓｉｇｍａ  Ｉ−２７６７），２００μインドメタシン及び１％抗生物質を添加したＭｅｓｅｎＰｒｏ生育培地からなる特定の分化（脂質生成）培地を、培養物に適用する。培地は３〜４日毎に交換する。
【０２９２】
・脂質生成分化培地での３回目の処理の後、処理した間葉系細胞内で液胞が形成し始める。これらの液胞は、オイルレッドＯ染色によって検出される。
【０２９３】
したがって、脂質生成を誘導するために特有の区別された培地と用いた間葉系細胞のインキュベーション期間後、特定マーカーを解析し、間葉系細胞から脂肪細胞への分化を調査する。
【０２９４】
オイルレッドＯで標識するプロセスは、以下からなる：
・細胞を同調させないように慎重に各ウェルから培地を除去する。
【０２９５】
・室温で４０分間、４％パラホルムアルデヒド溶液で細胞を固定する。
【０２９６】
・固定液を慎重に吸引し、細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄する（１回の洗浄につき５分）。
【０２９７】
・１×ＰＢＳを吸引し、細胞を蒸留水で２回すすぐ。
【０２９８】
・水を吸引し、各ウェルに十分な量の２％オイルレッドＯ溶液（ウェルあたり５００μｌ〜１ｍｌ）を加え、その後室温で５０分間インキュベートする。
【０２９９】
・５０分経過後、細胞を含むウェルからオイルレッドＯを除去し、その後細胞を１ｍｌの水で３回洗浄する。
【０３００】
・室温で５〜１５分、ヘマトキシリン溶液（５００μｌ）で細胞核を染色する。
【０３０１】
・液胞の存在を顕微鏡下で解析する。脂肪細胞は、オイルレッドＯ色素の結果として赤い油滴又は塊を有するのに対し、細胞核はヘマトキシリンによって黒又は青に染色され得る。
【０３０２】
（実施例５：遺伝子発現を解析するための、チューブ中のＣＨＯ細胞の輸送）
チューブ中で輸送するために、任意の支持体、プレート、フラスコ、培養チャンバーなどのもう一つのタイプの上に細胞を接種する必要がなく、むしろ輸送培地（アガロース−アガラーゼ）が直接的に調製される。
【０３０３】
ＣＨＯ細胞を培養する培地は、１０％ウシ胎児血清及び１％抗生物質を添加したＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地である。
【０３０４】
１×ＰＢＳ中で調製した２％アガロース溶液は、電子レンジを用いて融解させ、その適量を、最終アガロース濃度０．４％の溶液を調製するために用い、そしてこれをＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地と混合させる。アガロースの後に、リン酸カリウムバッファーｐＨ６．０中で濃度０．２〜２ｍｇ／ｍｌ（２５５．６〜２５５６Ｕ／ｍｌ）にて調製したアガラーゼを、混合物中の最終濃度が２４Ｕ／ｍｌとなるように加える；チューブの中身をよく混合し、これを３７℃に調整し、そして次に混合物１ｍｌあたり０．５〜１×１０６のＣＨＯ細胞を含む少量の培地を加える。
【０３０５】
次に、混合物が望ましい粘度となるまで、チューブを氷の入った容器に入れる。氷中のインキュベート１５〜３０分後に、混合物が望ましい粘度となり得る。チューブをパラフィルムでシールした後、輸送のために送る。
【０３０６】
チューブが目的地に着いた後、慎重に包装から取り出した後、取り扱いを継続する前に少量の７０％エタノールで殺菌することが好ましい。
【０３０７】
輸送培地の消化、及びその後の細胞回復を始めるために、チューブを３７〜４０℃のオーブン又はインキュベータ内に導入することが好ましい。これらの条件でのインキュベーションを、およそ２時間行なう。最初の２時間のインキュベーションが経過した後、チューブをオーブン又はインキュベータから取り出し、各チューブの容積に３７℃に調整した１ｍｌの培地又はＰＢＳ（１×）を加え、その後、まだ消化していないであろうアガロース残渣を撹拌するためにチューブの中身をｐ１０００ピペットによって混合する。さらに１時間、混合物のアガラーゼによりアガロースを完全に消化するため、チューブを３７〜４０℃のオーブン又はインキュベータに戻す。
【０３０８】
最後の１時間のインキュベーション後、チューブを３７〜４０℃のオーブン又はインキュベータから取り除き、その中身をｐ１０００ピペットにより混合する。輸送を行なった同じチューブにおいてサンプルを穏やかに遠心（８００〜１０００ｇ）し、遠心により生じた上清を除去する。その結果生じる、ＣＨＯ細胞を含むペレットを、１〜２ｍｌの冷却した１×ＰＢＳ（４℃）で洗浄し、そしてさらに遠心した後、細胞のペレットを得る。このペレットはきれいであり、かつ、ペレットに加えるべき、核酸抽出のために選択される試薬であるＴＲＩＺＯＬのために準備ができている。
【０３０９】
Ｔｒｉｚｏｌ  ＬＳは、ＲＮＡ抽出に使用する、フェノール及びグアニジンイソチオシアネートの単相溶液である。サンプルをホモジナイズ又は溶解する際、Ｔｒｉｚｏｌ  ＬＳは、ＲＮＡの整合性を維持しながら、細胞を破裂させ、かつ細胞成分を溶解させる。クロロホルムを添加した後遠心すると、溶液が上層の水相と下層の有機相とに分離する。ＲＮＡはもっぱら水相に残る。単離された全ＲＮＡは、ＤＮＡ及びタンパク質の混入がない。
【０３１０】
ＴＲＩＺＯＬを用いたＲＮＡの単離プロセスは、以下である：
・遠心により細胞ペレットを得る。上清を捨て、液体残留物をピペットで完全に除去する。ドラフト内で、５〜１０．１０６細胞ごとに７５０μｌのＴｒｉｚｏｌを加える。マイクロチューブに移し、繰り返しピペッティングすることによってＴｒｉｚｏｌに細胞を溶解させる。この時点において、サンプルは−８０℃に保存可能である。
【０３１１】
・サンプルを室温で５分間インキュベートし、核タンパク質混合体を完全に分離させる。ドラフト内で、添加したＴｒｉｚｏｌ  ７５０μｌあたり２００μｌのクロロホルムを加える。チューブを１５秒間激しく振盪させた後、室温で１５分間インキュベートする。
【０３１２】
・マイクロ遠心機により、４℃、１５分間、１２０００ｇにてサンプルを遠心する。遠心後、異なる相が観察され得る：ＲＮＡは、もっぱら上層の水相に残る。この相の量は、細胞溶解を行なうために使用したＴｒｉｚｏｌ量のおよそ７５％であることが好ましい。
【０３１３】
・ドラフト内で、水相を別のマイクロチューブに移し、使用したＴｒｉｚｏｌ  ７５０μｌあたり５００μｌのイソプロピルアルコールを加えることによりＲＮＡを沈殿させる。混合し、室温で１０分間インキュベートする。この時間が経過後、４℃で１０分間、１２０００ｇにて遠心する。遠心後、マイクロチューブの底にＲＮＡの沈殿又はペレットを観察し得る。
【０３１４】
・マイクロチューブをひっくり返すことにより上清を除去した後、ＤＥＰＣ処理したＨ２Ｏ中の７５％エタノールでＲＮＡペレットを洗浄する。ホモジナイズした後、４℃で５分間、７５００ｇにてサンプルを遠心する。
【０３１５】
・チューブをひっくり返すことにより、一度エタノールを捨てる；エタノールを完全に除去することが重要であり、もしその残余が残っていた場合、これはその後の反応、例えばＰＣＲを妨害し得る。マイクロチューブの底に似こされたエタノールの残余を、１０μｌのピペットで除去する。エタノールを完全に除去した後、氷中で２０分以上、ＲＮＡペレットを乾燥させる。ペレットは、その溶解性を妨げるため、完全に乾燥させてはならず、また、部分的に溶解したＲＮＡは、吸光度比Ａ２６０／Ａ２８０＜１．６を有する。１２μｌのＤＥＰＣ処理したＨ２Ｏに溶解させた後、６５℃で１０分間インキュベートする。その後これをスピンさせ、そしてその定量化を行なう前に１２時間以上−８０℃で保存する。
【０３１６】
ＲＮＡを抽出した後、定量化を行ない、次にこのＲＮＡの一部を、逆転写によってｃＤＮＡに変換させる。この逆転写プロセスは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて行なう。
【０３１７】
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍは、精製されたポリＡ  ＲＮＡ又は全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成するために最適化されている。１００ｂｐ〜１２ｋｂ以上のＲＮＡ分子は、このシステムによって検出され得る。最初の全ＲＮＡの量は、全ＲＮＡにおける１ｐｇ〜５μｇの範囲であってもよい。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅは、ＲＮａｓｅＨ活性が減少し、かつより高い熱安定性が保証されるよう改良されたＭ−ＭＬＶ  ＲＴの１つの種類である。この酵素は、４２〜５５℃の温度範囲においてｃＤＮＡを合成するために使用され、これは最大の特異性を保証し、他の逆転写酵素と比較して、より多量のｃＤＮＡ及びその全体の伸長によるさらなるｃＤＮＡ産物を取得する。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅが、リボソームＲＮＡ及び転写ＲＮＡの存在によって阻害されないことを考えれば、これは、全ＲＮＡの調製物から一本鎖ｃＤＮＡを合成するために使用し得る。
【０３１８】
ＴＲＩＺＯＬプロセスによって抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを得るために固守するプロセスは、以下である：
・プライマー混合液と混ぜた５μｇ以下の全ＲＮＡと、ヌクレオチドとを、ＰＣＲクリオチューブ内で混合させる。具体的には、ＲＮＡ１マイクロリットルあたり、５０μＭ（最終濃度）オリゴｄＴプライマー及び２μＭ遺伝子特異的プライマー１μｌ及び５０ｎｇ／μｌランダムヘキサマー及び１０μｌの最終量を達成するために必要なＤＥＰＣ処理したＨ２Ｏを、クリオチューブに加え、全量を１０μｌとする。
【０３１９】
・６５℃で５分間インキュベートする。この時間が経過した後、１分以上氷中に置く。
【０３２０】
・以下を含むｃＤＮＡ合成混合液を調製する：２μｌの１０Ｘバッファー，４μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ，１μｌのＲＮａｓｅＯＵＴＴＭ（４０Ｕ／μｌ）及び１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩＩ  ＲＴ（２００Ｕ／μｌ）。
【０３２１】
・１０μｌのｃＤＮＡ合成混合液を、ＲＮＡ及びプライマーを用いて予め調製した１０μｌの混合液に加える。回転させることにより混合し、以下のようにインキュベートする：
オリゴｄＴ又は遺伝子特異的なプライマー：５０℃で５０分。
【０３２２】
ランダムヘキサマー：２５℃で１０分、次いで５０℃で５０分。
【０３２３】
・５分間８５℃にし、反応を終了させる。この時間が経過した後、氷中で冷やす。
【０３２４】
・スピンさせた後、１μｌのＲＮａｓｅＨを各チューブに加え、３７℃で２０分間インキュベートする。
【０３２５】
・合成したｃＤＮＡは、すぐに使用してもよいし、−２０℃で保存してもよい。
【０３２６】
キットは、コントロールＲＮＡ：ＨｅＬａ  ＲＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）、およびこのＲＮＡからβ−アクチン遺伝子を増幅するためのプライマーを含む。キットが適切に機能したことを保証するためのコントロール反応のために、以下を行なうことが好ましい：
・ＨｅＬａ  ＲＮＡを、ＤＥＰＣ処理したＨ２Ｏで１００ｐｇ／μｌに希釈する。
【０３２７】
・ＲＮＡ及びプライマーの混合液を、ＰＣＲマイクロチューブ内で調製する。
【０３２８】
【表２】
0005679986.tif 000003
【０３２９】
・サンプルを、６５℃で５分間インキュベートする。この時間が経過した後、１分以上氷中でインキュベートする。スピンさせた後、以下を加える：
【０３３０】
【表３】
0005679986.tif 000004
【０３３１】
・サンプルをスピンさせた後、５０℃で５０分間インキュベートする。
【０３３２】
・５分間８５℃にし、反応を終了させる。この時間が経過した後、氷中で冷やす。
【０３３３】
・スピンさせる。１μｌのＲＮａｓｅＨを各チューブに加え、３７℃で２０分間インキュベートする。
【０３３４】
・以下を加えることにより、各コントロール反応のためのＰＣＲマイクロチューブを調製する：３８．１μｌのＤＥＰＣ処理したＨ２Ｏ，５μｌの１０ＸＰＣＲバッファー（Ｍｇを含まない），１．５μｌの５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１μｌのｄＮＴＰ  ｍｉｘ，１μｌのフォワードβ−アクチン（１０μＭ），１μｌのリバースβ−アクチン（１０μＭ），２μｌのｃＤＮＡ，０．４μｌのＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）。反応における最終的な量は５０μｌである。
【０３３５】
・スピンさせた後、ＰＣＲマイクロチューブをサーマルサイクラーに導入する。以下のプログラムにしたがってＰＣＲを行なう：９４℃で２分、ならびに９４℃で１５秒、５５℃で３０秒及び７２℃で６０秒の３つのステップにより構成されるサイクルを４０回。
【０３３６】
・ＰＣＲが終了した後、マイクロチューブを４℃に保つ。
【０３３７】
・アガロースゲル電気泳動によって各サンプル１０μｌを解析する。＋ＲＴコントロールでは、３５３ｂｐの高さに少なくとも２５ｎｇの産物に対応するバンドが見られるはずである。−ＲＴコントロールでは、全くバンドが見られないはずである。
【０３３８】
このｃＤＮＡサンプルは、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）による任意の遺伝子の遺伝子発現の解析を可能にし、この遺伝子のためにオリゴ又は特異的なプライマーが設計される。
【０３３９】
ＰＣＲプロセスは、以下に記載される：
・ＰＣＲを行なうために必要な全ての試薬を解凍し、解凍後、それらを氷中に保つ。
【０３４０】
・ＰＣＲ  ＭＩＸを調製する：（増幅しようとするサンプルの総数＋ポジティブコントロール＋ネガティブコントロール＋１を考慮する）
【０３４１】
【表４】
0005679986.tif 000005
【０３４２】
使用したＰＣＲプログラムは以下であった：９４℃で２分のサイクル１回に続いて、増幅する各遺伝子に特有の多数のサイクルを行ない、このサイクルは、９４℃で３０秒、増幅する遺伝子に特有のアニーリング温度で３０秒、及び７２℃で６０秒のステップからなってもよく、そして７２℃で１０分の最後のサイクル。
【０３４３】
ＰＣＲによる特定の遺伝子の増幅結果は、アガロースゲル電気泳動によって検出される。
【０３４４】
（実施例６：機械的な撹拌に対する輸送システムの保護）
本発明のアガロース−アガラーゼ輸送混合物のシステムが、輸送される培養物を輸送中の振動及び動きから保護することを証明するために、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞の培養物に、一定の時間間隔：２、４、６及び８時間において誘導される機械的な動きを与えた。
【０３４５】
［細胞の接種］
ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞は、２４ウェルプレートにおいて、それぞれのウェルに２００，０００細胞が配置するように、対応する培養培地中に接種した。
【０３４６】
［細胞培養物への輸送培地の添加］
培養物が好適な集密状態（６０〜７０％、２日後）に達したとき、ウェルの一部の培養培地を、アガロース及びアガラーゼの被覆と交換し、残りのウェルについては、輸送混合物を含まない新鮮な培地と交換する。
【０３４７】
輸送培地をよく混合した後３７℃に調整し、２４ウェルプレートのウェルから培地の容量を除去し、このウェルに混合物を徐々に添加し、細胞培養物を被覆する。また、培養培地のみを交換する予定のウェル中の培地を、新鮮な培地と交換する。
【０３４８】
したがって、それぞれのウェルに接種した細胞の上に混合物１ｍｌを加えた後、混合物を所望の粘度にさせるために、プレートに加えてから約１５〜３０分、このプレートを氷上で保つ。
【０３４９】
［輸送のためのプレートの調製及び輸送条件］
その後、プレートをパラフィルムで完全にシールし、１８〜２３℃、好ましくは２２℃の輸送温度で２４時間維持する。
【０３５０】
プレートを調製後２４時間が経過した後、プレートを撹拌機に移し、動きに露出させる期間が開始する。細胞を撹拌する前に、ウェルの一部をカウントして最初の細胞数／ウェルを算出する（ｔ＝０ｈ）。細胞を、２、４、６及び８時間、撹拌し続ける。これらの時間が終了した後、対応するプレートを撹拌機から取り出し、その後接着している細胞を取り出してカウントする。その後、細胞をカウントした後、アガロース及びアガラーゼの被覆が存在する場合と存在しない場合とにおける、細胞の接着度を決定する。
【０３５１】
図１２は、撹拌時間（時）中に培地を含むウェル（コントロール）、及び輸送混合物（アガロース＋アガラーゼ）を含むウェルから回収した細胞の数を示す。全てのカウントは３回行なった。
【０３５２】
図１２は、撹拌時間中に培養物表面に接着し続けた細胞の数を示す。この図は、撹拌が終了したときに、撹拌中に被覆が適用されたウェルから回復した細胞の数（アガロース＋アガラーゼ）が、培養培地のみを含むウェルから回収された細胞の数（アガロース及びアガラーゼ被覆なし）よりもどのくらい多かったかを示す。
【０３５３】
このアッセイにおけるこれらの結果は、アガロース及びアガラーゼの被覆が、輸送期間中に生じ得る機械的な動き及び振動に対する保護を培養物に提供することを証明する。
【０３５４】
（実施例７：被覆を除去した後の細胞単層における整合性の解析）
このアッセイの目的は、培養物がアガロース及びアガラーゼの混合物に露出した後に、細胞単層の整合性が影響を受けないこと、また特に、被覆の除去が培養物における単層の配置を変更しないことを、確認／証明することからなる。このアッセイは、三次元（３Ｄ）培養システムとしての適用におけるシステムの有効性を補強する。
【０３５５】
ここでは、ＭＤＣＫ−ＩＩ−ＭＤＲ１細胞株を使用する。その特徴及び性質によって、この細胞は、強い極性を示す単層を短時間（２〜３日）で形成するため、単層の整合性を決定するためのインビトロモデルとして使用する。
【０３５６】
［細胞の接種］
ＭＤＣＫ−ＩＩ−ＭＤＲ１細胞は、２４ウェルのマルチウェルトランスウェルプレートに３００，０００細胞／ウェルの濃度にて接種する。基底位置におけるウェルの容積は８００μｌであり、一方、先端位置におけるウェルの容積（この中に細胞を接種した）は４００μｌである。プレートは、３７℃及び５％ＣＯ２のインキュベータ内で維持する。
【０３５７】
［単層形成の測定］
接種した翌日、単層形成を常にモニタリングし始めるために、ＭｉｌｌｉＣｅｌｌ  ＲＳ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）装置で単層の抵抗（ＴＥＥＲ、単位Ω）を測定し；抵抗値を記録する。その後、培養物表面に接着しなかった細胞を取り除くために、ウェルの先端位置及び基底位置の両方における培地を交換する。
【０３５８】
完全な単層の指標として表される値（４０〜８０Ω×ｃｍ２）を得るために、単層の抵抗を日々測定する。この値には、培養２、３日後に到達する。
【０３５９】
［細胞培養物への輸送培地の添加］
単層が形成されたことを示すＴＥＥＲ値が得られたら、プレートの先端位置におけるウェルの半分の培地を、培養物をコートするためのアガロース及びアガラーゼ被覆と交換する。輸送被覆の組成は、０．５％アガロース及び１％アガラーゼ（アガロース１ｍｌあたり６０〜８０Ｕ）の混合物からなる。混合物が固化したら、プレートを、輸送期間を擬態するために２２℃で２４時間維持する。
【０３６０】
［輸送のためのプレートの調製及び輸送条件］
その後、プレートをパラフィルムで完全にシールし、１８〜２３℃、好ましくは２２℃の輸送温度で２４時間維持する。
【０３６１】
［プレートの受け取り、輸送培地の除去］
目的地に到達するために必要な輸送期間（この場合には２４時間の輸送についてアッセイした）後、プレートを慎重に包装から取り出し、その表面をエタノールで殺菌した後、アガロース及びアガラーゼ被覆を消化し始めるために３７℃の細胞培養インキュベータに導入し、その後単層の整合性の確認をする。
【０３６２】
そのために、プレートを３７℃及び５％ＣＯ２のインキュベータに導入する。これらの条件でのインキュベーションは、約２時間であることが好ましい。最初の２時間のインキュベーションが経過した後、プレートをインキュベータから取り出し、３７℃に調整した４００μｌの細胞培養培地を各ウェルに加え、そしてプレートをもう１時間、インキュベータに戻す。
【０３６３】
最後の１時間のインキュベーション後、アガロース及びアガラーゼの被覆を取り除く。ウェルの内容物を、ｐ１０００ピペットを用いて極めて穏やかにかつ慎重に混合した後、培養培地と混合したこの培養培地を、ウェルの底に接着している細胞が同調して持ち上げられないように慎重に取り除く。その後、調整した新鮮な培地を加える。この時点で、培養物の損失なしに、アガロースを含む培地を最大限取り除く努力をすることが必要である。
【０３６４】
［アガロース及びアガラーゼの被覆を除去した後の単層における整合性の解析］
プレートの全てのウェルが完成した後、これら全てが新鮮な培地を含む場合に、単層の状態を確認する。そのために、まず単層の抵抗をＴＥＥＲによって測定してもよく、その後細胞の単層を通った４ＫＤａデキストランの割合の測定をアッセイする。
【０３６５】
［輸送後のプレートのＴＥＥＲ測定］
輸送中にアガロース及びアガラーゼの被覆が添加されていたウェル、及び全てのプロセス中に培養培地によってのみ維持されていたウェルの両方において、ＴＥＥＲ測定を行なう。
【０３６６】
混合物に露出していたウェルにおいて得られる抵抗値を、培地によってのみアッセイされたウェルにおいて得られる抵抗値と比較した。さらに、これらを、培養物部分にアガロース及びアガラーゼ混合物を配置する前の抵抗値と比較した。
【０３６７】
［輸送後のデキストランの割合を解析することによる、単層における細胞の結合力及び整合性の確認］
デキストランアッセイは、トランスウェルプレートに接種した培養物における細胞結合力の度合いを測定するために使用し、これは、単層の状態における直接の指標である。デキストランポリマーは、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）分子と結合するため、蛍光を測定することにより検出される。細胞の単層がより完全であれば、デキストラン溶液の通過をより少なくさせ、基底位置において検出される蛍光がより少なくなり得る；対照的に、単層が適切に結合していない場合には、デキストランはこれを容易に横切り、基底位置において検出される蛍光がより多くなり得る。したがって、輸送のアガロース及びアガラーゼ混合物が供されたウェル、及び被覆に露出しなかった（培地のみ）ウェルの両方において、デキストランの通過アッセイを輸送期間後に行なった。
【０３６８】
この解析を行なうために、ウェルの基底位置における培養培地を、１ｍｌの新鮮な培地に交換し、ウェルの先端位置における培地を、培養培地中で調製した１ｍｇ／ｍｌのデキストラン溶液と交換する。
【０３６９】
３７℃で３時間、暗所でインキュベートした後、ウェルの先端位置と基底位置との両方からサンプルを取り出し、そしてそれぞれの溶液の蛍光を適切に測定する（λｅｘ＝４８５，λｅｍ＝５３８）。
【０３７０】
この解析によって、アガロース及びアガラーゼ混合物で処理した細胞を含むウェルの基底位置における蛍光値と、培養培地のみで培養した細胞を含むウェルの基底位置における蛍光値とを比較した。
【０３７１】
デキストランの蛍光測定を行なった後、解析したウェルに含まれるデキストラン溶液を新鮮な培地に交換し、さらに２４時間の培養を可能にし、そしてこの期間の後に単層の整合性を再度解析した。
【０３７２】
［アガロース及びアガラーゼ被覆を除去して２４時間後の単層の整合性］
アガロース及びアガラーゼ被覆を除去して２４時間後、培養物がまだ安定であることを保証するために、単層の整合性を再度確認する。このコントロールは、被覆を除去した翌日の前に行なわれる、ＴＥＥＲによる単層の抵抗の測定と、デキストランの通過による細胞の結合性の解析とを含む。
【０３７３】
図１３ａは、混合物に露出したコントロールウェルの測定により得られる抵抗値（ＴＥＥＲ）を示す。図１３ａは、アガロース及びアガラーゼの被覆を培養物に加える前の時点（処理前）、被覆を除去した直後の時点（０ｈ）ならびにアガロース及びアガラーゼを除去して２４時間後（２４ｈ）に対応する３回の異なる測定を示す。読み取りは、２つの異なる条件：培地を含むコントロールウェル、ならびにアガロース及びアガラーゼ被覆を含むウェル、のそれぞれについて１２ウェルにて行なった。
【０３７４】
図１３ｂは、ウェルの基底位置にて検出されるデキストランの割合、すなわち細胞の単層を通過したデキストランの割合を示す。２回の読み取りが行なわれ、最初の１回は、被覆が取り除かれた直後の時点（０ｈ）であり、そして２回目はアガロース及びアガラーゼ混合物が取り除かれて２４時間後（２４ｈ）であった。解析は、２つの異なる条件：培地を含むコントロールウェル、ならびにアガロース及びアガラーゼ被覆を含むウェル、のそれぞれについて１２ウェルにて行なった。
【０３７５】
図１３ａ及び図１３ｂに示すような結果から、混合物及び輸送条件によって処理したウェルから得られたＴＥＥＲ値は、培養培地のみが添加されたコントロールウェルについて記録されたＴＥＥＲ値に対して差異が見られない。
【０３７６】
混合物及び輸送条件にさらされたウェルについて検出された、単層を通ったデキストランの通過割合は、コントロールウェルについて検出された割合に対して、変化が見られなかった。
【０３７７】
これらの結果は、アガロース及びアガラーゼによって形成される輸送混合物を適用することは、単層の整合性に影響を与えないことを証明する。
【０３７８】
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【図面の簡単な説明】
【０３７９】
【図１】最終的な輸送混合物におけるアガロース濃度。
【図２】アガロース及びアガラーゼの混合物に露出した後の培養物の細胞形態を分析することによる、本システム中のアガラーゼ最終濃度の測定。
【図３】輸送時間の決定。
【図４】最適な輸送温度の決定。
【図５】細胞輸送システムの設計を表す図。
【図６】アガロース及びアガラーゼの混合物に供される細胞の毒性調査。
【図７ａ】アガラーゼを含むアガロースの被覆又は包膜に露出した後の細胞形態調査。
【図７ｂ】アガラーゼを含むアガロースの被覆又は包膜に露出した後の細胞形態調査。
【図７ｃ】アガラーゼを含むアガロースの被覆又は包膜に露出した後の細胞形態調査。
【図８ａ】ラミニンを用いた細胞接着の増加。
【図８ｂ】ラミニンを用いた細胞接着の増加。
【図９】ラミニンを有する支持材における輸送システムの増殖能の調査。
【図１０ａ】輸送システムにおけるポリ−Ｌ−リジンを用いた細胞接着の増加。
【図１０ｂ】輸送システムにおけるポリ−Ｌ−リジンを用いた細胞接着の増加。
【図１１ａ】種々のポリ−Ｌ−リジン濃度で処理された表面に接触した後の、細胞培養物の形態確認。
【図１１ｂ】種々のポリ−Ｌ−リジン濃度で処理された表面に接触した後の、細胞培養物の形態確認。
【図１１ｃ】種々のポリ−Ｌ−リジン濃度で処理された表面に接触した後の、細胞培養物の形態確認。
【図１１ｄ】種々のポリ−Ｌ−リジン濃度で処理された表面に接触した後の、細胞培養物の形態確認。
【図１２】輸送システムの機械的撹拌からの保護。
【図１３ａ】三次元培養システムに対する細胞輸送システムの適用：被覆を取り除いた後の細胞単層の整合性の解析。
【図１３ｂ】三次元培養システムに対する細胞輸送システムの適用：被覆を取り除いた後の細胞単層の整合性の解析。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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