(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アナベナ バリアビリスフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(AvPAL)変異体であって、１以上のシステイン残基がセリン残基によって置換されており、該１以上のシステイン残基が位置64、318、503及び565のシステイン残基からなる群から選択され、該AvPAL変異体が、野生型AvPAL（配列番号４）と比較して、高いフェニルアラニン変換活性、及び／又は、低減された免疫原性を有し、かつ、該AvPAL変異体がペグ化されている、前記AvPAL変異体。
【請求項２】
AvPALの位置503のシステイン残基が、セリン残基によって置換されている、請求項１記載のAvPAL変異体（配列番号９）。
【請求項３】
AvPALの位置565のシステイン残基が、セリン残基によって置換されている、請求項１記載のAvPAL変異体（配列番号１０）。
【請求項４】
位置503及び565のシステイン残基が、セリン残基によって置換されている、請求項１記載のAvPAL変異体（配列番号１１）。
【請求項５】
前記ペグ化が、AvPAL変異体とNHS活性化ポリエチレングリコールとを、AvPAL変異体のリジン残基当たり3のポリエチレングリコールの比で反応させることにより達成される、請求項１記載のAvPAL変異体。
【請求項６】
前記ペグ化が、AvPAL変異体とNHS活性化ポリエチレングリコールとを、AvPAL変異体のリジン残基当たり少なくとも１．６のポリエチレングリコールの比で反応させることにより達成される、請求項４記載のAvPAL変異体。
【請求項７】
前記ペグ化が、AvPAL変異体とNHS活性化ポリエチレングリコールとを、AvPAL変異体のリジン残基当たり少なくとも２．４のポリエチレングリコールの比で反応させることにより達成される、請求項４記載のAvPAL変異体。
【請求項８】
前記ペグ化が、AvPAL変異体とNHS活性化ポリエチレングリコールとを、AvPAL変異体のリジン残基当たり3のポリエチレングリコールの比で反応させることにより達成される、請求項４記載のAvPAL変異体。
【請求項９】
前記AvPAL変異体の位置2、10、32、145、195、301、413、493及び522のリジン残基の少なくとも28％がペグ化されている、請求項４記載のAvPAL変異体。
【請求項１０】
前記AvPALの位置2、10、195、413、493及び522のリジン残基の少なくとも51％がペグ化されている、請求項４記載のAvPAL変異体。
【請求項１１】
前記AvPALの位置2、10、195、493及び522のリジン残基の少なくとも75％がペグ化されている、請求項４記載のAvPAL変異体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項記載のAvPAL変異体を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
被験者のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)の欠乏によってすべて又は一部が生じる疾病を治療するための薬剤の調製における、請求項１〜１１のいずれか１項記載のAvPAL変異体の使用。
【請求項１４】
前記疾病が、上昇したフェニルアラニン量によって特徴付けられる、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
前記被験者が、正常PAH活性の10％以下を有する、請求項１３又は１４記載の使用。
【請求項１６】
被験者の上昇した血漿フェニルアラニン量を治療するための薬剤の調製における、請求項１〜１１のいずれか１項記載のAvPAL変異体の使用。
【請求項１７】
被験者の上昇した血漿フェニルアラニン量を低減させるための薬剤の調製における、請求項１〜１１のいずれか１項記載のAvPAL変異体の使用。
【請求項１８】
前記被験者の血漿フェニルアラニン濃度が、前記AvPAL変異体の投与前において、200μMよりも高い、請求項１４〜１７のいずれか１項記載の使用。
【請求項１９】
前記薬剤が、前記被験者の血漿フェニルアラニン濃度を10％以上低減させるように調製されている、請求項１４〜１８のいずれか１項記載の使用。
【請求項２０】
被験者のフェニルケトン尿症(PKU)を治療するための薬剤の調製における、請求項１〜１１のいずれか１項記載のAvPAL変異体の使用。
【請求項２１】
前記PKUが古典的重症型PKUである、請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
前記被験者がPAH活性の欠乏を有する、請求項１３〜２１のいずれか１項記載の使用。
【請求項２３】
前記被験者が突然変異体PAHを有する、請求項１３〜２２のいずれか１項記載の使用。
【請求項２４】
前記突然変異体PAHが、PAHの触媒ドメインでの突然変異を含む、請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
前記突然変異が、F39L、L48S、I65T、R68S、A104D、S11OC、D129G、E178G、V190A、P211T、R241C、R261Q、A300S、L308F、A313T、K320N、A373T、V388M E390G、A395P、P407S、及びY414Cからなる群より選択される１以上の突然変異を含む、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
前記被験者が妊婦である、請求項１３〜２５のいずれか１項記載の使用。
【請求項２７】
前記薬剤が、タンパク質制限食と併用して被験者に投与されるように調製されている、請求項１３〜２６のいずれか１項記載の使用。
【請求項２８】
前記被験者が０〜３歳の幼児である、請求項１３、２５又は２７のいずれか１項記載の使用。
【請求項２９】
前記幼児の血漿フェニルアラニン濃度が、360μM〜4800μMである、請求項２８記載の使用。
【請求項３０】
前記被験者がヒトである、請求項１３〜２９のいずれか１項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、2007年5月25日に出願された米国特許出願第11/807,227号の一部継続出願であり、それらの全体において本明細書中に引用により組み込まれる。
【０００２】
（発明の技術分野）
原核生物フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)及びその組成物、並びに、PALの免疫原性及び／又はタンパク質分解感受性を低減させつつ、PALの触媒活性及び安定性を向上させるそのような組成物の最適化を提供する。また、治療及び産業目的のPALのそのような最適な組成物の使用を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
PALは、植物［Koukolら, J. Biol. Chem. 236:2692-2698 (1961); Hansonら, The Enzymes 7:75-166 (1972); Poppeら, Curr. Org. Chem. 7:1297-1315 (2003)］、ある真菌類［Raoら, Can. J. Biochem. 4512:1863-1872 (1967); Abellら, Methods Enzymol. 142:242-253 (1987)］、及び、細菌［Bezansonら, Can. J. Microbiol. 16:147-151 (1970); Xiangら, J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002); Hillら, Chem. Commun. 1358-1359 (2003)］に広く分布している非哺乳動物酵素であり、大腸菌(Escherichia coli)において組換えにより生産される。
【０００４】
代表的なPALには次のものを含む：Q9ATN7 アガスタシェ・ルゴサ(Agastache rugosa); 093967 アマニタ・ムスカリア（Amanita muscaria）（ベニテングダケ）; P35510, P45724, P45725, Q9SS45, Q8RWP4アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)（シロイヌナズナ）; Q6ST23 バンブサ・オルドハミイ(Bambusa oldhamii)（ニガタケ）; Q42609 ブロムへアジア・フィンライソニアナ(Bromheadia finlaysoniana)（ラン）; P45726 カメリア・シネンシス(Camellia sinensis)(チャ); Q9MAX1カサランツス・ロセウス(Catharanthus roseus)（ニチニチソウ）（マダガスカルニチニチソウ）; Q9SMK9 シセル・アリエチヌム(Cicer arietinum)（ヒヨコマメ）; Q9XFX5, Q9XFX6 シトラス・クレメンチナ x  シトラス・レティキュレート(Citrus Clementina x Citrus reticulate); Q42667 シトラス・レモン(Citrus limon)（レモン）; Q8H6V9, Q8H6W0 コフェア・カネホラ(Coffea canephora)（ロブスタ種コーヒーノキ）; Q852S1 ダウカス・カロタ(Daucus carota)（ニンジン）; 023924 ジギタリス・ラナータ(Digitalis lanata)（キツネノテブクロ）; 023865 ダウカス・カロタ(Daucus carota)（ニンジン）; P27991 グリシン・マックス(Glycine max)（ダイズ）; 004058 ヘリアンサス・アンヌース(Helianthus annuus)（ヒマワリ）; P14166, Q42858 イポモエア・バタタス(Ipomoea batatas)（サツマイモ）; Q8GZR8, Q8W2E4 ラクツカ・セチバ(Lactuca sativa)（チシャ）; 049835, 049836 リトスペルマム・エリスロリゾン(Lithospermum erythrorhizon); P3551 1, P26600 リコペルシコン エクスレンタム(Lycopersicon esculentum)（トマト）; P35512 マルス・ドメスティカ(Malus domestica)（リンゴ）(マルス・シルベストリス(Malus sylvestris)); Q94C45, Q94F89 マニホット・エスクレンタ(Manihot esculenta)（キャッサバ）（マニオク）; P27990 メディカゴ・サティバ(Medicago sativa)（アルファルファ）; P25872, P35513, P45733 ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)（タバコ）; Q6T1C9 クエルカス・サバー(Quercus suber)（コルクガシ）; P14717, P53443, Q7M1Q5, Q84VE0, Q84VE0 オリザ・サティバ(Oryza sativa)（コメ）; P45727 ペルセア・アメリカナ(Persea Americana)（アボガド）; Q9AXI5 ファービチス・ニル(Pharbitis nil)（バイオレット）（アサガオ）; P52777 ピヌス・タエダ(Pinus taeda)（タエダマツ）; Q01861, Q04593 ピスム・サティブム(Pisum sativum)（エンドウ）; P24481, P45728, P45729 ペトロセリウム・クリスプム(Petroselinum crispum)（パセリ）(ペトロセリナム・ホルテンス(Petroselinum hortense)); Q84LI2 ファナラエノプシス x ドリタエノプシス・ハイブリッド品種（Phalaenopsis x Doritaenopsis hybrid cultivar）; P07218, P191 42, P19143 ファセオルス・ヴルガリス(Phaseolus vulgaris)（インゲンマメ）（フレンチビーン）; Q7XJC3, Q7XJC4 ピヌス・ピナステル(Pinus pinaster)（カイガンショウ）; Q6UD65 ポピュラス・バルサミフェラ亜種トリコカルパ x ポピュラス・デルトイデス(Populus balsamifera subsp. trichocarpa x Populus deltoides); P45731, Q43052, 024266 ポピュラス・キタカミエンシス(Populus kitakamiensis)（ヤマナラシ）; Q8H6V5, Q8H6V6 ポピュラス・トレムロイデス(Populus tremuloides)（アメリカヤマナラシ）; P45730 ポピュラス・トリコカルパ(Populus trichocarpa)（ハコヤナギ）; 064963  プルヌス アビウム(Prunus avium)（サクラ）; Q94EN0 レーマニア・グルチノサ(Rehmannia glutinosa); P11544 ロドスポリディウム・トルロイデス(Rhodosporidium toruloides)（酵母）(ロドトルラ・グラシリス（Rhodotorula gracilis）); P10248 ロドトルラ・ルブラ(Rhodotorula rubra)（酵母）(ロドトルラ・ムシラギノサ(Rhodotorula mucilaginosa)); Q9M568, Q9M567 ルブス・イダエウス(Rubus idaeus)（ラズベリー）; P31425, P31426 ソラヌム・ツベロスム(Solanum tuberosum)（ジャガイモ）; Q6SPE8 ステラリア・ロンギペス(Stellaria longipes)(Longstalk starwort); P45732 スチロサンテス・フミリス(Stylosanthes humilis)(Townsville stylo); P45734 トリフォリウム・サブテラネウム(Trifolium subterraneum)（サブタレニアンクローバ）; Q43210, Q43664 トリチカム・アエスチバム(Triticum aestivum)（コムギ）; Q96V77 ウスチラゴ・マイデス(Ustilago maydis)（黒穂菌）; P45735 ビチス・ビニフェラ(Vitis vinifera)（ブドウ）;及びQ8VXG7 ゼア・マイズ(Zea mays)（トウモロコシ）。
【０００５】
多くの研究は、フェニルケトン尿症(PKU)の酵素置換処理のための酵素フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL, EC 4.3.1.5)の利用の焦点を置いていた［Hoskinsら, Lancet l(8165):392-394 (1980); Gilbertら, Biochem. J. 199(3):715-723 (1981); Hoskins, J.A.ら, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 35(2):275-282 (1982); Sarkissianら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(5):2339-2344 (1999); Liuら, Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 30(4):243-257 (2002); Wiederら, J. Biol. Chem. 254(24): 12579-12587 (1979); Gamezら, Mol. Ther. 11(6):986-989 (2005); Ambrusら, J. Pharmacol. Exp. Ther. 224(3):598-602 (1983); Ambrusら, Science 201(4358):837-839 (1978); Kalghatgi, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 27(3):551-561 (1980); Ambrus, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 37(l):105-lll (1982); Gilbertら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 131(2):557-563 (1985); Pedersen, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 20(3):559-569 (1978); Marconiら, Biochimie 62(8-9):575-580 (1980); Larueら, Dev. Pharmacol. Ther. 9(2):73-81 (1986); Ambrusら, Ann. Intern. Med. 106(4):531-537 (1987); Bourgetら, Appl. Biochem. Biotechnol. 10:57-59 (1984); Bourgetら, FEBS Lett. 180(l):5-8 (1985); Bourgetら, Biochim. Biophys. Acta 883(3):432-438 (1986); Changら, Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 23(1):1-21 (1995); Changら MoI. Biotechnol. 17(3):249-260 (2001); 米国特許第5,753,487号］。
【０００６】
PKUは、肝臓のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)（フェニルアラニンの代謝に関与する酵素）の低下された活性に起因するアミノ酸代謝の先天異常である。PKU及び高フェニルアラニン血症(HPA)を生じるPAH突然変異を有する患者は、上昇したフェニルアラニン量、低下された神経生理学的機能、及び、低減された認知発達を示す。食事制限によってフェニルアラニン量を低レベルで維持しなければ、重度のPKUの患者には、不可逆的な精神障害の可能性がある。PALは、フェニルアラニンを、馬尿酸塩として尿中で更に代謝され排泄される無害な代謝物質である、アンモニア及びtrans−桂皮酸に変換する［Hoskinsら, (1980) 前述の箇所; Hoskinsら, Biomed Mass Spectrom 11(6): 296-300 (1984)］。
【０００７】
現在のPKUの治療は、アミノ酸フェニルアラニンの低い食事を順守する生涯に関連する［Levy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(5):181 1-1813 (1999)］。このような食事療法は、維持するのが困難であり［Matalonら, Genet. Med. 6(1): 27-32 (2004); Woolfら, Arch. Dis. Child. 33(167):31-45 (1958); Kim, MoI Ther. 10(2):220-224 (2004)］、必ずしも、上昇したフェニルアラニン量によって生じる有害な神経学的影響を排除するとは限らない［Sarkissianら, MoI. Genet. Metab. 69:188-194 (2000)］。妊娠中において理想的な食事制御をしなければ、先天異常を招く［Levy, (1999) 前述の箇所］。また、PKU/HPA患者が、食事制限によって正常な生活を送ることは非常に困難であり、食事療法は、ある栄養素の欠乏に関係しており、そのうちの幾つかは、脳発達に有害である［Levy, (1999) 前述の箇所］。最も低いフェニルアラニンの食品は、このような療法へのコンプライアンスを損なう、非常に不十分な官能的性質を有する。したがって、治療的処置の開発は、現在の食事療法に置き換わるか又はこれを補足し、PKUの個体、特に疾病の最も深刻な形態を有する患者に負わせられた神経障害を防ぐ。
【０００８】
1999年には、Scriverらが、PKU酵素置換に適用するRhodosporidium toruloides（ロドスポリディウム トルロイデス）［Sarkissianら, (1999) 前述の箇所］からの酵素PALの利用に関する初めての研究を報告した。マウスPKU及びHPAモデルでの研究では、PAL投与（PALとアプロチニンプロテアーゼインヒビターの組み合わせ、又は、組換えにより発現され大腸菌細胞内部存在するPALを用いた腹腔内注射又は経口によって）が、非常に低い血漿フェニルアラニン量に関係していることが実証された。また、PKU患者でのPALの使用について報告されている予備的研究では、腸溶性のコーティングゼラチンカプセルで投与されたPAL、又は、体外酵素工場を用いた、フェニルアラニン量の低減が示されている［Ambrusら, Ann. Intern. Med. 106(4):531-537 (1987)］。これらの研究は、PALがタンパク質分解による劣化に対して保護される場合、経口投与により血漿Pheの有意な低減が達成することができることを示唆する。
【０００９】
また、癌治療のためのPALの利用は、癌細胞へのフェニルアラニンの栄養供給の制限、及び、それによる腫瘍の成長を抑制する能力に基づいて示唆されていた［Fritzら, J Biol Chem. 251(15):726 (1976); Robertsら, Cancer Treat Rep. 60(3):261-263 (1976); Shenら, Cancer Res. 37(4):1051-1056 (1977); Shenら, Cancer Treat Rep. 63(6):1063-1068 (1979); Wiederら, J Biol Chem. 254(24): 12579-12587 (1979)］。しかしながら、静脈内注射されたペグ化(pegylated)PALは、13回目の注射後に循環血液から急速に消去された。また、PALを媒介とするフェニルアラニンの低減は、マウスの白血病及び転移性黒色腫の増加を妨いだ［Abellら, Cancer Res. 33:2529-2532 (1973); Robertsら, (1976), 前述の箇所; Shenら, (1977), 前述の箇所］。
【００１０】
海洋細菌ストレプトマイセス マリチムス(Streptomyces maritimus)からの細菌PALは、静菌剤のエンテロシンの重要なソースとしての役割を果たすことができる。ストレプトマイセス マリチムスPALのEncPは、フェニルアラニンをtrans−桂皮酸に変換するエンテロシン合成の初期段階を触媒する［Xiangら, J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002)］。
【００１１】
PALは、L−フェニルアラニンメチルエステルの産業的合成（アスパルテームの生成）［D'Cunhaら, Enzyme and Microbial Technology 19(6):421-427 (1996); Hamiltonら, Trends in Biotechnol. 3(3):64-68 (1985)］、及び、医薬先駆体として用いられる他の置換L−フェニルアラニン誘導体の産業的合成（米国特許出願第20020102712号）に用いることができる。
【００１２】
また、PALには農業へ適用することができ、植物、菌類及び細菌で、リグニン、クマリン及びフラボノイドを生産するフェニルプロパノイドを生じる初期の酵素過程に関与する。したがって、PAL活性の制御は、果実の褐変化等の多くの農業的現象に影響を及ぼすことがある。また、活性部位PALインヒビターの構造に基づく薬剤の開発により、有効な除草剤を生み出すことができた［Poppeら, (2003) 前述の箇所］。
【００１３】
PALには、滞在的にさまざまな産業及び治療への適用があるが、PALの利用は、低減された比活性及びタンパク質分解不安定性により制限されることがある。他の治療的用タンパク質と同様に、酵素治療としてのPALの利用は、免疫原性及びタンパク質分解感受性等の幾つかの不都合が伴う。さらに、高フェニルアラニン血症で特徴付けられる疾患における幾分狭い正常範囲の血漿フェニルアラニン量の制御を達成及び維持するために、基質親和性と酵素活性との間には細心のバランスが必要である。これらのパラメーターの改善に向けた取り組みは、このタンパク質に関する構造及び生化学についての知識の不足により、未だ行われていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、強力な触媒活性、長い生物学的半減期、高い生化学的安定性、及び／又は、低減された免疫原性を含む、最適な動力学特性を具備するPAL分子の必要性が残されている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の概要）
幾つかの細菌PALは、ストレプトマイセス マリチムスからのPAL（EncPとしても公知、配列番号５、図４）、ノストック パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)からのPAL/HAL（Nostoc punctiforme ATCC 29133からのアクセッション番号ZP_00105927、2004年10月１日提出、NCBI Microbial Genomes Annotation Project）（配列番号２、図４）、アナベナ バリアビリス（Anabaena variabilis）からのPAL/HAL（遺伝子ID 3679622, Ava_3988フェニルアラニン／ヒスチジンアンモニアリアーゼ、Anabaena variabilis ATCC 29413、2006年3月31日）（配列番号４、図４）、光合成原核生物のアナシィスティス ニダランス（Anacystis nidulans）［Lofflehardt, Z. Naturforsch. 31(1 1-12):693-9 (1976)］、エンテロバクテリア科ファミリーからのグラム陰性細菌、フォトラブダス ルミネセンス(Photorabdus luminescens) TT01［Williamsら, Microbiology 151 :2543-2550 (2005)］、及び、ストレプトマイセス バルチチラタス(Streptomyces verticillatus)［Bezansonら, Can. J. Microbiol. 16(3): 147-51 (1970)］を含むが、これらに限定されない、HAL/PALファミリーの一部として既に同定されている。また、PALの活性は、ストレプトマイセス マリチムスで評価されている［Xiangら, J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002)］。アナベナ及びノストック等のシアノバクテリアは、混合ポリケチド−ペプチド生合成経路経由で生成する、それらの生物活性のある天然物の生産に関して研究されている［Moore, Nat. Prod. Rep. 22(5):580-593 (2005); Beckerら, Gene 325:35-42 (2004); Hoffmanら, Gene 3 11:171-180 (2003)］。本発明は、原核生物PAL又は細菌PALがPKU及び他の疾患の有効な治療に寄与し得るという知見に基づくものである。本発明は、非常に強力な触媒活性、高い生化学的安定性、並びに、治療への適用のための、低減された免疫原性、及び、長い生物学的半減期等の向上された特性を具備する、細菌PALの組成物、及び、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体又は類縁体を意図するものである。また、本発明は、細菌PAL、及び、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体又は類縁体の製造方法及び精製方法、並びに、治療及び産業目的のそのような組成物の使用方法を提供する。
【００１６】
本明細書中で用いられる“細菌PAL”及び“原核生物PAL”は、(1)ストレプトマイセス マリチムス(Streptomyces maritimus)［EncP（配列番号５、図４）としても公知である］、ノストック パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)［配列番号２（図４）］、アナベナ バリアビリス(Anabaena variabilis)［配列番号４（図４）］、アナシィスティス ニダランス(Anacystis nidulans)［Lofflehardt, (1976) 前述の箇所］、フォトラブダス ルミネセンス(Photorabdus luminescens) TT01［Williamsら, (2005) 前述の箇所］、及びストレプトマイセス バルチチラタス(Streptomyces verticillatus)［Bezansonら, (1970) 前述の箇所］を含むが、これらに限定されない、原核生物からの野生型PAL；(2)同様の（すなわち、少なくとも50％）フェニルアラニンの触媒活性を保持し、いくつかの実施態様においては、増加された触媒活性、及び／又は増大された半減期、及び／又は低減された免疫原性を示す、そのような野生型PAL酵素のフラグメント、突然変異体、変異体及び類縁体；及び、(3)増大された半減期等の他の有利な効果を奏する他の化学的部位(chemical moieties)に結合している、そのような野生型PAL酵素、そのフラグメント、突然変異体、変異体及び類縁体の化学修飾物；と互換的に用いられる。例えば、治療又は産業目的の、原核生物PAL、そのフラグメント、突然変異体、変異体、類縁体又はその化学修飾物の製造方法及び使用方法に関する文献は、すべてのそのような野生型PAL、そのフラグメント、突然変異体、変異体、類縁体又はその化学修飾物の製造方法、使用方法、又は配合方法を言及することを意味するものである。
【００１７】
第一の態様において、本発明は、細菌PAL、及び、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体又は類縁体を提供する。ある実施態様は、ノストック パンクチフォルメからの細菌PAL（配列番号２）、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類縁体である。他の実施態様は、アナベナ バリアビリスからの細菌PAL（配列番号４）、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類縁体である。ある実施態様においては、該変異体は、ロドスポリディウム トルロイデスからのPALにおけるSer210、Ala−Ser−Gly三成分系(211−213)、Asp214、Leu215、Asn270、Val269、Leu266、Leu134、His137、Lys468、Glu496、Gln500に対応する位置、又は、これらの活性部位残基の保存的置換で野生型の活性部位を保持し、該211−213のAla−Ser−Gly三成分系が、フェニルアラニンの結合部位であるとされている。
【００１８】
望ましい変異体は、タンパク質を含むことができ、１以上のシステイン残基が、他のアミノ酸（セリン）残基によって置換されており、インビボにおいて、低減された酵素活性、増大された免疫原性、及び／又は、他の不利な影響と関連するタンパク質凝集を低減させ得る。
【００１９】
望ましい変異体は、融合タンパク質を含むことができ、該酵素は、半減期を増大させることで当技術分野において公知であるサルベージエピトープ(salvage epitope)を保持する、イムノグロブリン又はそのフラグメントの天然の又は改変された定常領域等の他の異種ポリペプチドに融合されている。
【００２０】
また、本発明は、他の有利な効果を奏する化学的部位に結合している、そのようなポリペプチドの化学修飾物を意図するものである。また、例えば、半減期を改善することが当技術分野において公知であるポリペプチドとの水溶性ポリマーの非特異的又は部位特異的な（例えばN末端）結合、及び、化学的部位の結合は、免疫原性を低減させ、及び、プロテアーゼ耐性を改善し得る。
【００２１】
そのような細菌PALは、本発明の方法に従って分離及び精製され、そのために、該酵素を治療で用いることが可能な量存在する。ある実施態様においては、完全な又は野生型細菌PALのcDNAコード化が用いられる。しかし、他の実施態様においては、生物学的に活性のあるフラグメント、又はその突然変異体のcDNAコード化を用いることができる。また、本発明は、構造に基づく分子設計技術のアプローチ、及び／又は、PALの化学的に修飾された（例えばペグ化）形態によって得られる最適化された細菌PALの組成物を提供する。特定の実施態様は、治療用途に適切な、改善された比活性、増大された安定性、低減された免疫原性、及び／又はタンパク質分解感受性を有するPALの最適な組成物を意図するものである。ある実施態様は、改善された比活性を有するノストック パンクチフォルメPALのペグ化された形態である。他の実施態様は、改善された比活性を有するアナベナ バリアビリスPALのペグ化された形態である。
【００２２】
さまざまな実施態様においては、PAL変異体のペグ化は、PAL:PEG又はPEG:PALの比によって説明される。本明細書中で用いられるように、特に示さなければ、“PAL:PEG”の比とは、ペグ化反応におけるPAL変異体のリジン残基とPEG分子の比をいう。同様に、本明細書中で用いられるように、特に示さなければ、“PEG:PAL”の比とは、ペグ化反応におけるPEG分子とPAL変異体のリジン残基の比をいう。
【００２３】
ある実施態様においては、本発明は、低減された免疫原性を有するペグ化PAL変異体を意図するものである。他の実施態様は、低減された免疫原性を有するノストック パンクチフォルメPAL(NpPAL)変異体のペグ化された形態である。他の実施態様は、低減された免疫原性を有するアナベナ バリアビリスPAL(AvPAL)変異体のペグ化された形態である。特定の実施態様は、ペグ化が、NpPAL又はAvPAL変異体と水溶性ポリマー［例えば、ポリエチレングリコール(PEG)］を反応させることによって達成される、NpPAL又はAvPAL変異体を意図するものである。ある実施態様においては、ペグ化は、NpPAL又はAvPAL変異体とPEGを、少なくとも1:1、少なくとも1:1.5、少なくとも1:2、少なくとも1:3、又は、少なくとも1:4のPAL:PEGで１回反応させることによって達成される。ある実施態様においては、PAL変異体は、AvPAL変異体であり、ペグ化は、1:3のPAL:PEG比で達成される。
【００２４】
また、本発明は、低減された免疫原性のためのペグ化PAL変異体の再ペグ化(re-pegylating)を意図するものである。ある実施態様においては、ペグ化は、NpPAL又はAvPAL変異体とPEGを２回以上それぞれ、少なくとも1:1、少なくとも1:1.5、少なくとも1:2、少なくとも1:3、又は、少なくとも1:4のPAL:PEGで反応させることによって達成される。ある実施態様においては、ペグ化は、NpPAL又はAvPAL変異体とPEGを２回、３回、４回、５回以上それぞれ、少なくとも1:1、少なくとも1:1.5、少なくとも1:2、少なくとも1:3、又は、少なくとも1:4のPAL:PEGで反応させることによって達成される。ある実施態様においては、PAL変異体はAvPAL変異体であり、ペグ化は、１回目及び２回目のペグ化反応において、1:3のPAL:PEGで反応させることによって達成される。
【００２５】
ある実施態様においては、本発明による野生型PALの生物学的に活性のある部位は、PALの動力学特性を最適化することが望まれているように改質することができる。ある実施態様においては、改質されたPALは、約120μM〜約240μMの最適範囲内の血漿フェニルアラニン量に低減するだけでなく、維持するのに十分な活性を有する。他の実施態様においては、生物学的に活性のある改質されたPALは、少なくとも約0.1s-1、又は約0.5s-1より高いkcatである。ある実施態様においては、生物学的に活性のある改質されたPALは、少なくとも約0.2s-1、又は約1.0s-1より高いkcatである。他の実施態様においては、生物学的に活性のある改質されたPALは、約10μM〜約1000μMのKmである。他の実施態様においては、生物学的に活性のある改質されたPALは、約100μM〜約1000μMのKmである。他の実施態様においては、生物学的に活性のある改質されたPALは、野生型PALの約２倍から約1000倍の酵素活性を示す。他の実施態様においては、生物学的に活性のある改質されたPALは、野生型PALよりも約10％から約100％大きい酵素活性を示す。そのような生物学的に活性のある改質されたPALタンパク質は、部位特異的突然変異誘発等の当技術分野において周知の方法を用いて形成することができる。更なる実施態様においては、本発明は、哺乳動物（特に、ヒト）におけるPAH活性の欠乏の治療のための薬剤の調製においてフェニルアラニンを代謝する（すなわち、フェニルアラニンを他の物質に変換する）細菌PALの使用、及び、PAH活性の欠乏の治療での使用のための細菌PALを含む医薬組成物を意図するものである。ある実施態様においては、医薬組成物は、高度に精製された細菌由来のPAL、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類縁体の単独、あるいは、医薬として適切なキャリアとの組み合わせを含む。ある実施態様においては、調製物は、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％又は99.9％より高い純度を有する、細菌PALを含む。他の実施態様においては、本発明に係る細菌PALの相対的比活性は、野生型細菌PALの比活性の約110％超である。
【００２６】
第二の態様においては、本発明は、治療及び産業目的におけるPALの組成物を用いる新規の方法を特徴とする。ある実施態様においては、本発明は、細菌PALを含む医薬組成物の治療有効量をそのような治療を必要とする被験者に投与することによる、PAHの欠乏によってすべて又は一部が生じる疾患の治療方法を意図するものである。PAH活性の欠乏は、例えば、正常なPAH活性のレベルと比較して、50％以下、25％以下、10％以下、又は１％以下の活性が観察され、例えば、高フェニルアラニン血症、軽症型フェニルケトン尿症、又は、古典的重症型フェニルケトン尿症における上昇したフェニルアラニン量として明示することができる。ある実施態様においては、疾病は、フェニルケトン尿症(PKU)である。
【００２７】
特定の実施態様においては、被験者は、突然変異体フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)を有すると診断された人である。該突然変異体PAHは、PAHの触媒ドメインにおいて突然変異を含むことができる。そのような突然変異の例は、F39L、L48S、I65T、R68S、A104D、S11OC、D129G、E178G、V190A、P211T、R241C、R261Q、A300S、L308F、A313T、K320N、A373T、V388M E390G、A395P、P407S及びY414Cを含むが、これらに限定されない。
【００２８】
また、被験者の血漿フェニルアラニン濃度を低減させるために、細菌PALの組成物の有効量を被験者に投与することを含む、正常な血漿フェニルアラニン濃度を超える（例えば、180μM又は360μMより高い）被験者の治療方法が意図される。該細菌PALの投与前において、該被験者の血漿フェニルアラニン濃度は、180μMよりも高い。より好ましくは、被験者の血漿フェニルアラニン濃度は、120μM〜200μMである。他の実施態様においては、被験者の血漿フェニルアラニン濃度は、200μM〜600μMである。更なる別の実施態様においては、被験者の血漿フェニルアラニン濃度は、600μM〜1200μMである。しかし、治療される別の階層の被験者の血漿フェニルアラニン濃度は、1200μMより高く無制限である。
【００２９】
特定の実施態様においては、被験者は、幼児であり、特に好ましくは、血漿フェニルアラニン濃度が1200μMよりも高い幼児である。本発明は、幼児の血漿フェニルアラニン濃度を低減させるするために、細菌PALの組成物の有効量を被験者に投与することを含む、フェニルケトン尿症の幼児の治療方法であって、該幼児が０〜３歳であり、かつ、該幼児の血漿フェニルアラニン濃度が、約360μM〜約4800μMである方法を意図するものである。細菌PALの投与前において、幼児の血漿フェニルアラニン濃度は約1200μMであり、細菌PALの投与により、血漿フェニルアラニン濃度は約1000μMに低減される。他の実施態様においては、細菌PALの投与前において、幼児の血漿フェニルアラニン濃度は約800μMであり、細菌PALの投与により、血漿フェニルアラニン濃度は約600μMに低減される。更なる別の実施態様においては、細菌PALの投与前において、幼児の血漿フェニルアラニン濃度は約400μMであり、細菌PALの投与により、血漿フェニルアラニン濃度は約300μMに低減される。ある実施態様においては、本明細書中で意図される治療方法は、幼児の血漿フェニルアラニン濃度が、約120μM〜約360μMの範囲、又は、約120μM〜約240μMの範囲に低減されるべきである。
【００３０】
また、本明細書中においては、細菌PAL単独、又はタンパク質制限食と併用して被験者に投与することを含む、高フェニルアラニン血症(HPA)の妊婦を治療するための方法であって、細菌PAL単独、又はタンパク質制限食との併用投与することが、併用投与をしない状態の血漿フェニルアラニン濃度と比較して、被験者の血漿フェニルアラニン濃度を低減させるのに有効である方法が意図される。特定の実施態様においては、被験者の血漿フェニルアラニン濃度は、180μMより高く600μMより低く、無制限である。他の実施態様においては、被験者の血漿フェニルアラニン濃度は、500μMより高く1200μMより低く、無制限である。更なる別の実施態様においては、被験者の血漿フェニルアラニン濃度は、1200μMより高く無制限である。血漿フェニルアラニン濃度が1200μMより高い妊娠している被験者は、特に、このタイプの治療に関心を惹く候補者であり、また、妊娠を意図している出産適齢期の女性の被験者である。そのような実施態様においては、被験者の血漿フェニルアラニン濃度は、1200μMより高く、該方法は、更にタンパク質制限食を被験者に投与することを含む。
【００３１】
本発明は、細菌PAL、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類縁体を被験者に投与することを含む、古典的重症型フェニルケトン尿症(PKU)を治療するための方法であって、該細菌PALを投与することが、細菌PALの投与をしない状態の血漿フェニルアラニン濃度と比較して、被験者の血漿フェニルアラニン濃度を低減させるのに有効である方法を説明する。本発明の方法による治療に選択される被験者は、上昇した血漿Phe濃度を有し、そのような濃度は、治療をしない状態の1800μMよりも高いことがある。他の実施態様は、被験者の血漿フェニルアラニン濃度は、治療規制をしない状態の1000μMよりも高いことを意図するものである。ある実施態様においては、本発明の併用投与方法は、被験者の血漿フェニルアラニン濃度を600μM未満に低減させる。ある実施態様においては、500μM未満に低減される。他の実施態様においては、併用投与は、被験者の血漿フェニルアラニン濃度を約120μM〜約360μMの範囲に低減させる。他の実施態様においては、被験者の血漿フェニルアラニン濃度は、約120μM〜約240μMの範囲に低減される。
【００３２】
特定の実施態様は、治療する生物体（例えば、哺乳動物又はヒト）が、病徴を効果的に改善するために必要な用量を最適化することを含む。PALは、毎日１回投与、毎日複数回投与、毎週１回投与、又は、毎週複数回投与で投与することができる。ある実施態様においては、PAL治療は、連続的でなく、むしろ、PALは、被験者の血漿フェニルアラニン濃度が360μM未満に低減されるまで毎日投与される。ある実施態様においては、当該被験者の血漿フェニルアラニン濃度は、毎日監視され、かつ、血漿フェニルアラニン濃度において10％の増加が観察された場合に、PALが投与される。他の実施態様においては、週に１回その用量で実行される。本発明は、週当たり、少なくとも0.001mg/kg、0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.05mg/kgの用量を意図するものであり、0.1mg/kg以下、0.5mg/kg、1.0mg/kg以上であってもよい。ある実施態様においては、用量は１mg／kg／週、0.1mg／kg／週、又は0.01mg／kg／週である。
【００３３】
等価用量を実行する、口腔、経皮的、口腔粘膜、肺内（エアゾル化を含む）、筋肉内、皮下、又は、静脈内を含む、さまざまな非経口又は非侵襲的投与経路を意図するものである。また、関節又はCSFへの直接的な急速注入又は静注による投与を特に意図するものであり、鞘内、大脳内、脳室内、腰椎穿刺経由、又は大槽経由等が特に意図される。ある実施態様においては、皮下又は経口的にその用量で実行される。
【００３４】
また、遺伝子治療を含む、ヒト被験者におけるPAL活性を増加させる他の手段を意図するものである。PAL遺伝子の送達は、ウイルスベクター、相同組換、又は直接的なDNA注入を含む、当技術分野において公知のさまざまな手段により可能である。この態様の範囲は、PAH欠乏で影響を受けた細胞へインビボで投与することができる、すべての又は一部の細菌PAL、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類縁体をコードする核酸配列を特徴とする実施態様である。
【００３５】
また、他の実施態様においては、細菌PALは、タンパク制限食と併用投与することができる。本明細書中の方法において投与される当該タンパク制限食は、フェニルアラニン制限食であり、該被験者の全フェニルアラニン摂取が、１日当たり600mg未満に制限されるものである。他の実施態様においては、タンパク制限食は、フェニルアラニン制限食であり、その全フェニルアラニンが、１日当たり300mg未満に制限されるものである。更なる別の実施態様においては、タンパク制限食は、アミノ酸（チロシン、バリン、イソロイシン、及びロイシン等）で補われる。また、細菌PAL、及び、医薬として許容し得るキャリア、希釈剤又は賦形剤を含む組成物を意図するものである。該組成物は、医療的なタンパク質補給物(medical protein supplement)を更に含んでもよい。他の実施態様においては、PALの組成物は、乳児用調合乳の一部である。更なる別の実施態様においては、タンパク質補給物は、フェニルアラニンを含まない。当該タンパク質補給物は、20mg/100g補給物の濃度のL−チロシン、L−グルタミン、L−カルニチン、40mg/100g補給物の濃度のL−タウリン、及び、セレンで強化されてもよい。さらに、当該タンパク質補給物は、ミネラル（例えば、カルシウム、リン及びマグネシウム）の推奨される一日量を含んでもよい。さらにまた、当該タンパク質補給物は、L−ロイシン、L−プロリン、L−リジン酢酸塩、L−バリン、L−イソロイシン、L−アルギニン、L−アラニン、グリシン、L−アスパラギン一水和物、L−トリプトファン、L−セリン、L−スレオニン、L−ヒスチジン、L−メチオニン、L−グルタミン酸、及びL−アスパラギン酸からなる群より選択される１以上のアミノ酸の推奨される一日量を含んでもよい。また、当該タンパク質補給物は、ビタミンA、D及びEの推奨される一日量で強化されてもよい。当該タンパク質補給物は、当該補給物の少なくとも40％のエネルギーを提供する脂肪含量を含んでもよい。そのような補給物は、粉末状補給物、又はプロテインバーの形態で提供されてもよい。
【００３６】
本発明は、リンパ芽球性白血病、乳腺腫瘍及び黒色腫を含む、これらには限定されない、さまざまな形態の腫瘍成長及び癌の治療方法を意図するものである。
【００３７】
本発明は、アンモニア及びtrans−桂皮酸からのフェニルアラニンの商業生産のための細菌PALの使用方法を意図するものである。フェニルアラニンは、アスパルテーム、甘味料、並びに、飲料、穀類、ケーキ、デザート、卵及びチーズディッシュ、脂肪、魚及び他の魚介類、肉類及び他の肉製品、乳及び乳製品、ナッツ、ソース及び調味料、スープ、砂糖、ジャム及びスプレッド、及び、野菜等の他の食品で用いられる。
【００３８】
また、細菌PALを、エンテロシン及びエリスロマイシンを含む除草剤及び抗菌物質の製造に用いることができることが意図される。
【００３９】
第三の態様において、本発明は、酵素治療に用いることができる量の原核生物PAL、及び、その生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体又は類縁体の製造方法を特徴とする。本発明は、ストレプトマイセス(Streptomyces)、ソランギウム(Sorangium)、シュードモナス(Pseudomonas)、並びに、ノストック(Nostoc)及びアナベナ(Anabaena)等のシアノバクテリアを含むが、これらに限定されない、細菌によって生産されるPALを意図するものである。ある実施態様においては、PALは、細菌種ストレプトマイセス マリチムス(Streptomyces maritimus)、ストレプトマイセス ウェルティキラツス(S. verticillatus)、ソランギウム セルロサム(Soragium cellulosum)、ノストック パンクチフォルメ、ノストク トバカム(Nostoc tobacum)、アナベナ バリアビリス、及び、シュードモナス プチダ(Pseudomonas putida)によって生産される。他の実施態様においては、原核生物PAL酵素活性は、HAL活性又はPAL−HALモチーフをコードするともされるが、HALとは異なる重要なPAL残基を有する、配列からのcDNA又はDNA配列を用いて生じさせる。
【００４０】
広い実施態様においては、本方法は、すべての又は一部の原核生物PAL、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類縁体をコードするcDNA又はDNAを、その発現に適切な細胞に形質転換する工程を含む。ある実施態様においては、発現ベクターを用いて、DNAをその発現に適切な細胞又は細胞系に移す。ある実施態様においては、cDNAは、大腸菌に形質転換され、組換え細菌PALが、融合タンパク質として過剰発現する。更なる実施態様においては、原核生物PALの製造方法は、次の工程を含む：(a)種培養物(seed culture)を生産するのに適切な密度の適切な増殖培地において、原核生物PALのcDNA又は生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類縁体をコードする、又は、これらのすべてをコードするcDNAで形質転換された細胞を増殖させる工程、(b)バイオリアクターに形質転換された細胞を導入する工程、(c)バイオリアクターに適切な増殖培地を供給する工程、及び、(d)酵素を含む培地からトランスフェクトされた細胞を分離する工程。
【００４１】
ある実施態様においては、組換え原核生物PALは、IPTG（イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド）等の誘導プロモーターを用い、大腸菌BL21(DE3)/pLyseS（Invitrogen社製）等のベクターにおいて、N末端オクタヒスチジル標識融合タンパク質として、過剰発現される。他の実施態様においては、組換えPALは、N末端標識なしで、大腸菌BL21(DE3)/pLysS細胞において過剰発現される。他の実施態様においては、原核生物PALの製造方法は、次の工程を含む：(1)バイオリアクター／発酵槽において、振盪フラスコのグリセロールストックからの種培養物を増殖させる工程；(2)供給バッチモードの制御されたバイオリアクターへそのような種培養物を導入する工程；(3)当該培養物を、70〜100（〜22−25時間）のOD600の細胞密度になるまで、グルコース補足培地で、pH7.8、20％より高い溶存酸素、1200rpm以内の攪拌、30℃で増殖させる工程；(4)当該培養物を0.4mM IPTGで誘導する工程；(5)活性の変化が0.1 IU/mLより低くなるまで（約40〜48時間、及び一般に200のOD600）、22〜26℃の低減された温度で、当該培養物を増殖させる工程；及び、(6)連続遠心分離で細菌を回収する工程。ある実施態様においては、一般に、細胞培養培地は、酵母エキスタンパク質、ペプトン−トリプトン、グルコース、グリセロール、カザミノ酸、トレース塩類及びリン酸緩衝塩類と定義され、これらから構成される。
【００４２】
第四の態様においては、本発明は、細菌PAL、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類縁体を精製する方法を特徴とする。第一の実施態様によれば、形質転換された細胞群を増殖させ、残りの粗組換え酵素は破壊される。異物は、カラムの汚損を防止するために、通常粗バルクから分離される。クロマトグラフィー精製は、１又は幾つかのクロマトグラフィー樹脂を用いて行われる。その後、精製されたタンパク質は、長期間にわたって安定した活性を提供するために、設計された緩衝液で調製される。他の好ましい実施態様においては、細菌PALの精製方法は、次の工程を含む：(a)組換えPALを含む細菌を溶解する工程；(b)ウィルスを不活性化するために、熱で溶解物を処理する工程；(c)第二の連続遠心分離工程、及び／又は深層ろ過によりこの溶解物を浄化する工程；(d)炭ろ過工程により、浄化された溶解物を通過させる工程；(e)最終的なろ過工程（Sartorious Sartopore 0.2μmフィルターで）により、工程(d)におけるろ液を通過させる工程；(f)ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィー等の疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂で、最終的なろ液を通過させる工程；(g)Qイオン交換カラム等の陰イオンのクロマトグラフィー樹脂で、工程(f)における溶出液を通過させる工程；(h)タンジェンシャルフローろ過での緩衝液交換により最終生産物を回収する工程；及び、(i)最終生産物を滅菌する工程。当業者であれば、１以上のクロマトグラフィー工程を省略若しくは置き換えること、又は、本発明の範囲内でクロマトグラフィー工程の順序を変更することができるということを容易に認識する。そして、必要であれば、適切な滅菌工程を行ってもよい。
【００４３】
第五の態様において、本発明は、上昇したフェニルアラニン量を有する細胞を細菌PALと接触することによりフェニルアラニンの上昇した量を改善又は処置することができる、細菌PALの同定、及び、細菌PALが、そのような上昇したフェニルアラニン量を低減させるか否かを判断するためのスクリーニング分析を意図するものである。また、そのようなスクリーニング分析は、インビトロでの変異体のフェニルアラニン変換活性を試験する前に、活性部位［例えば、ロドスポリディウム トルロイデスからのPALにおけるSer 210、Ala−Ser−Gly三成分系(211-213)、Asp214、Leu215、Asn270、Val269、Leu266、Leu134、His137、Lys468、Glu496、Gln500残基と等価である、ストレプトマイセス マリチムスからのEncPにおけるGlyl42、Thr−Ser−Gly三成分系(143-145)、Asp146、Leu147、Asn196、Ile195、Leu192、Leu76、Asn79、Met400、Thr428、Gln432］、該活性部位に隣接する領域、又は該ポリペプチド配列全体に隣接する領域において、保存的又は非保存的置換を含んだ変異体を作製する工程を含む。特定の実施態様においては、当該方法は、高スループット分析である。ある実施態様においては、細菌種の完全なゲノムは、バイオインフォマティクスによるアプローチを用いて、PAL相同体の存在についてシーケンス及びスクリーニングされる。他の実施態様においては、そのような相同性のタンパク質生産物のPAL触媒活性が、インビトロでのフェニルアラニンからtrans−桂皮酸への変換能の試験等によって確認される。
【００４４】
第六の態様において、本発明は、PAH活性の欠乏によってすべて又は一部が生じる疾患を含むが、これに限定されない、疾病の診断のための細菌PALの組成物の使用方法を提供する。ある実施態様においては、細菌PALを用いて血液試料のフェニルアラニン量を測定する。更なる実施態様においては、本発明は、上昇したフェニルアラニン量を有する被験者の血液試料のフェニルアラニン量の監視に使用するための細菌PALを含む診断キットを意図するものである。
【００４５】
本発明の他の特徴及び利点は、次の詳細な説明から明らかとなる。しかしながら、詳細な説明及び具体例は、本発明の特定の実施態様を示しながらも、説明のためだけに示されるものであることは理解されるべきである。なぜならば、本発明の精神及び範囲内の種々の変更及び改良は、この詳細な説明から当業者に明らかとなるからである。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
（図面の詳細な説明）
【図１Ａ】図１Ａは、ノストック パンクチフォルメPALの遺伝子配列である（配列番号１）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ノストック パンクチフォルメPALのタンパク質配列である（配列番号：２）。
【００４７】
【図２Ａ】図２Ａは、アナベナ バリアビリス PALの遺伝子配列である（配列番号３）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、アナベナ バリアビリス PALのタンパク質配列である（配列番号４）。
【００４８】
【図３】図３は、原核生物及び真核生物からの芳香族アミノ酸アンモニアリアーゼの相関図である。配列は、GenBankから検索され（アクセッション番号は括弧内に記載）、近隣結合法を用いて、ClustalX(1.83)で整列した。
【００４９】
【図４】図４は、ノストック パンクチフォルメPAL（配列番号２）及びアナベナ バリアビリスPAL（配列番号４）のシアノバクテリアの、EncP PAL（配列番号５）及びシュードモナス プチダHAL（配列番号６）とのタンパク質配列の整列である。PAL又はHAL活性に対応する活性部位残基を強調している。
【００５０】
【図５Ａ】図５Ａは、12日間におけるフェニルアラニン量(μM)に対する、ペグ化されていないNpPAL(1.0 IU/mL)の影響を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、12日間におけるフェニルアラニン量(μM)に対する、ペグ化NpPAL 1:3 PAL:PEG（日油株式会社製）(1.0 IU/mL)の影響を示す。
【００５１】
【図６Ａ】図６Ａは、12日間におけるフェニルアラニン量(μM)に対する、ペグ化されていないAvPAL(1.0 IU/mL)の影響を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、12日間におけるフェニルアラニン量(μM)に対する、ペグ化AvPAL 1:3 PAL:PEG（日油株式会社製）(1.0 IU/mL)の影響を示す。
【００５２】
【図７】図７は、90日間の慢性耐性試験におけるフェニルアラニン量(μM)に対する、ペグ化AvPAL 1:3 PAL:PEG（日油株式会社製）(1.0 IU/mL)の影響を示す。
【００５３】
【図８Ａ】図８Ａは、位置64でシステインからセリンへの置換を有する、アナベナ バリアビリスのフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)のタンパク質配列である（AvPAL_C64S、配列番号７）。
【図８Ｂ】図８Ｂは、位置318でシステインからセリンへの置換を有する、アナベナ バリアビリス PALのタンパク質配列である（AvPAL_C318S、配列番号８）。
【図８Ｃ】図８Ｃは、位置503でシステインからセリンへの置換を有する、アナベナ バリアビリス PALのタンパク質配列である（AvPAL_C503S、配列番号９）。
【図８Ｄ】図８Ｄは、位置565でシステインからセリンへの置換を有する、アナベナ バリアビリス PALのタンパク質配列である（AvPAL_C565S、配列番号10）。
【図８Ｅ】図８Ｅは、位置503及び565でシステインからセリンへの置換を有する、アナベナ バリアビリスPALのタンパク質配列であり（AvPAL_C565SC503S、配列番号11）、システインからセリンへの置換を太字で強調している。
【００５４】
【図９Ａ】図９Ａは、37℃でのさまざまな長さでのインキュベーション後のインビトロでのPAL比酵素活性に対する、ペグ化されていないAvPALの位置565での又は位置565及び503でのシステインからセリンへの置換の影響を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、37℃でのさまざまな長さでのインキュベーション後のインビトロでのPAL比酵素活性に対する、ペグ化AvPALの位置565での又は位置565及び503でのシステインからセリンへの置換の影響を示す。
【００５５】
【図１０Ａ】図１０Ａは、変性条件下（左側パネル）又は非変性条件下（右側パネル）でのゲル電気泳動で分析された、溶液におけるタンパク質凝集体の形成に対する、AvPALのシステインからセリンへの置換の影響を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、SEC−HPLCで分析された、溶液におけるタンパク質凝集体の形成に対する、AvPALのシステインからセリンへの置換の影響を示す。
【００５６】
【図１１】図１１は、さまざまなPEG濃度での部位特異的ペグ化に対する、AvPALの位置565及び503（dbl突然変異体）のシステインからセリンへの置換の影響を示す。
【００５７】
【図１２】図１２は、SEC−HPLCで分析された、溶液におけるタンパク質凝集体の形成に対する、0.05％ Tween 80又は10mM EDTAでのAvPALの処理の影響を示す。
【００５８】
【図１３Ａ】図１３Ａは、SEC−HPLCで分析された、溶液におけるタンパク質凝集体の形成に対する、ジチオトレイトール(DTT)でのAvPALの処理の影響を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、SEC−HPLCで分析された、溶液におけるタンパク質凝集体の形成に対する、DTT及びN−エチルマレイミド(NEM)によるAvPALの処理の影響を示す。
【００５９】
【図１４】図１４は、ビヒクル又は4.0 IUの野生型ペグ化AvPALが投与されたENU2マウスと比較した、0.25 IU（上段のパネル）、1.0 IU（中段のパネル）又は4.0 IU（下段のパネル）の酵素が投与されたENU2マウスのインビボにおけるフェニルアラニン(Phe)量に対する、ペグ化AvPALの位置565及び503でのシステインからセリンへの置換(AvPAL_C565SC503S)の影響を示す。
【００６０】
【図１５】図１５は、ビヒクル又は4.0 IUの野生型ペグ化AvPALが投与されたENU2マウスと比較した、0.25 IU、1.0 IU又は4.0 IUの酵素が投与されたENU2マウスの体重に対する、ペグ化AvPALの位置565及び503でのシステインからセリンへの置換(AvPAL_C565SC503S)の影響を示す。
【００６１】
【図１６】図１６は、ビヒクル又は4.0 IUの野生型ペグ化AvPALを1:3のAvPAL:PEG比で投与されたENU2マウスと比較した、さまざまなAvPAL:PEG比［1:1.6（上段のパネル）、1:2.4（中段のパネル）、又は1:3（下段のパネル）］の4 IUの酵素が投与されたENU2マウスのインビボにおけるフェニルアラニン(Phe)量に対する、ペグ化AvPALの位置565及び503でのシステインからセリンへの置換(AvPAL_C503S/565S)の影響を示す。
【００６２】
【図１７】図１７は、ビヒクル又は4.0 IUの野生型ペグ化AvPALを1:3のAvPAL:PEG比で投与されたENU2マウスと比較した、さまざまなAvPAL:PEG比（1:1.6、1:2.4、又は1:3）の4 IUの酵素が投与されたENU2マウスの体重に対する、ペグ化AvPALの位置565及び503でのシステインからセリンへの置換(AvPAL_C565SC503S)の影響を示す。
【００６３】
【図１８】図１８は、インビトロにおけるAvPAL比活性に対する、ペグ化AvPAL_C565SC503Sの再ペグ化の影響を示す。（上段）さまざまなPAL:PEG比、リジン残基の濃度、及びPEG分子における再ペグ化後の1:3のPAL:PEG比［2mMリジン残基：6mM PEG（●）］で最初にペグ化されたrAvPAL−PEGの比活性の回復を示す。（下段）さまざまなPAL:PEG比、リジン残基の濃度、及びPEG分子における再ペグ化後の1:1のPAL:PEG比［2mMリジン残基：2mM PEG（■）］、又は、1:3のPAL:PEG比［2mMリジン残基：6mM PEG（●）］で最初にペグ化されたrAvPAL−PEGの比活性の回復を示す。
【００６４】
【図１９Ａ】図１９Ａは、キャピラリーゲル電気泳動(CGE)分析によって判断される、1:3のPAL:PEG比（2mMリジン残基：6mM PEG）で最初にペグ化されたrAvPAL−PEGのペグ化全体に対する、再ペグ化反応におけるPAL:PEG比の増加の影響を示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、CGE分析によって判断され、再ペグ化反応が、1:3のPAL:PEG比（2mMリジン残基：6mM PEG）で固定されて行われる、rAvPAL−PEGのペグ化全体に対する、最初のペグ化反応におけるPAL:PEG比の増加の影響を示す。
【００６５】
【図２０】図２０は、さまざまなPAL:PEG比、リジン残基の濃度、及びPEG分子における再ペグ化後の特定のリジン残基のペグ化割合に対する、1:3のPAL:PEG比（2mMリジン残基：6mM PEG）で最初にペグ化されたAvPAL_C565SC503Sの再ペグ化の影響を示す。位置２(K2)のリジン残基は、すべての試験条件下で100％ペグ化された（データは示さない）。
【００６６】
【図２１】図２１は、表１４に示すような皮下に投与されたENU2マウスのインビボにおける血漿フェニルアラニン(Phe)量に対する、1:3のPAL:PEG比（2mMリジン残基：6mM PEG）で最初にペグ化された、及び、同一のPAL:PEG比、リジン残基の濃度及びPEG分子で再ペグ化されたAvPAL_C565SC503Sの再ペグ化の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
（発明の詳細な説明）
PALは、フェニルプロパノイド代謝物質への関与段階における桂皮酸へのフェニルアラニンの非酸化的脱アミノ化を触媒する、遍在の高等植物酵素であるが［Hahlbrockら, Annu. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 40:347-369 (1989)］、PALは、"ストレプトマイセス マリチムス"［Xiangら, J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002)］及びソランギウム セルロサム［Hillら, Chem. Commun. 1358-1359 (2003)］におけるベンゾイル−CoA生合成、並びに、ストレプトマイセス バルチチラタス［Bezansonら, Can. J. Microbiol. 16:147-151 (1970)］におけるシンナムアミドの生合成に関係する少数の細菌でしかみられていない。静菌剤のエンテロシンは、その生合成が多くの独特の機能を含む生合成海洋細菌"ストレプトマイセス マリチムス"の天然生産物である［Hertweckら, Chem. Biol. 11:461-468 (2004); Pielら, Chem. Biol.7:943-955 (2000); Pielら, J. Am. Chem. Soc. 122:5415-5416 (2000); Xiangら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:15609-15614 (2004)］。これらのうち、ポリケチド合成酵素(PKS)スターターユニットベンゾイル−コエンザイムA(CoA)の形成が希少である［Mooreら, Nat. Prod. Rep. 19:70-99 (2002)］。初期の生化学反応は、新規のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL, EC 4.3.1.5)EncP［Xiangら, J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002)］によるアミノ酸L−フェニルアラニンからtrans−桂皮酸への変換を含む。単一の一連のβ酸化前の桂皮酸のそのCoAチオエステルへの活性化は、マロニル−CoAの７つの分子を有する鎖延長のエンテロシンII型PKSを準備する、ベンゾイルCoAを産生する［Hertweckら, Chem. Bio. Chem. 2:784-786 (2001); Hertweckら, Tetrahedron 56:9115-9120 (2000); Xiangら, J. Bacteriol. 185:399-404 (2003)］。
【００６８】
最初の原核生物PALコード遺伝子(encP)（配列番号５）が特徴付けられ、"ストレプトマイセス マリチムス"のデノボ桂皮酸及びエンテロシン合成の停止によって生じるその不活性が明らかにされた［Kalaitzisら, J. Am. Chem. Soc. 125:9290-9291 (2003); Xiangら, J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002)］。エンテロシン生合成は、プラスミド媒介性encP(plasmid-borne encP)の補完と共に、桂皮酸又は安息香酸の補足によってencP不活性化突然変異体で普及することができる。また、ストレプトマイセス セリカラー(Streptomyces coelicolor)のermE*プロモーターの制御下で、encP遺伝子の異種発現は、発酵培地中で桂皮酸が生産された［Xiangら, J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002)］。encP遺伝子は、522アミノ酸タンパク質をコードし、これは原核生物PALよりも200アミノ酸残基程度大幅に小さい。パセリ(Petroselinum crispum)等の植物PALに相同性のある配列であるが［Rtherら, Eur. J. Biochem. 269:3065-3075 (2002)；CAA57056, 30％が同一、48％が類似］、むしろ、シュードモナス プチダ等の細菌ヒスチジンアンモニアリアーゼ(HALs, EC 4.3.1.3)［Schwedeら, Biochemistry 27:5355-5361 (1999)；A35251, 36％が同一、54％が類似、配列番号６、図４］、及びロドバクター カプスラータ(Rhodobacter capsulatus)のチロシンアンモニアリアーゼ(TAL)［Kyndtら, FEBS Lett. 512:240-244 (2002)、図３］により高い相同性がある。相同性は、4−メチリデンイミダゾール−5−オン(MIO)補欠分子団における改質されたデヒドロアラニン残基の可能的前駆物質である、フェニルアラニン／ヒスチジン／チロシンファミリーのアンモニアリアーゼの保護された活性部位である位置143のセリン残基を含む［Langerら, Adv. Prot. Chem. 58:175-188 (2001); Poppe, Curr. Opin. Chem. Biol. 5:512-524 (2001); Schwedeら, Biochemistry 27:5355-5361 (1999)］。EncPは、パントエア アグロメランス(Pantoea agglomerans)のアンドリミド生合成に関係する推定されるフェニルアラニンアミノムターゼであり、かつ、ストレプトマイセス グロウビスポラス(Streptomyces globisporus)のチロシンアミノムターゼSgc4［Christensonら, J. Am. Chem. Soc. 125:6062-6063 (2003); Christensonら, Biochemistry 42:12708-12718 (2003)］に関連性がある、AdmH（AAO39102、63％が同一、76％が類似）に最も高い配列相同性を有する。特に、encPがヒトタンパク質(HAL)に対して非常に近い相同性を有するので、encPは、潜在的にそれほど免疫原性がないと考えられる。また、それらは非常に類似しているので、encPをヒトHALのようなヒト化されたencPに突然変異させることが可能となり得る。
【００６９】
HAL及びPALは、ヒスチジン及びフェニルアラニンからのアンモニアの化学的に困難な除去のメカニズムを共通してそれぞれ分担することが明らかになった。両酵素での、超求電子補欠分子団である5−メチレン−3,5−ジヒドロイミダゾール−4−オン(MIO)は、芳香環でのフリーデルクラフツ型(Friedel−Crafts−type)反応によって、それぞれの基質の非酸性β水素原子を活性化させる。生成されるシグマ錯体は、酵素の結合ポケットへのアクセスから塩基を排除することによって、芳香環からプロトンの排出を妨ぐ。環外二重結合の形成は、アンモニア、再芳香族化及びフラグメンテーションの排除において重要である。MIO超求電子補欠分子団は、再生成され、ウロカニン酸塩又は桂皮酸塩が形成する[Poppeら, Angew. Chem. Int. Ed.44:3668-3688 (2005)]。
【００７０】
HALとPAL間の高い相同性のため、HAL及びPALの保護された領域は、HAL/PAL保護領域と呼ばれる。この高い相同性により、ノストック パンクチフォルメ及びアナベナ バリアビリスのNCBIデータベースに一覧化されたタンパク質配列などの誤った表示がされた"PAL−HAL"タンパク質の潜在的な酵素活性について、NCBIのようなデータベースで不明瞭となることがある。したがって、PAL酵素の中には、誤った表示をされたHAL酵素がある。PAL及びHALの活性部位は非常に類似しているが、それらは、いくつかの主要な残基が異なると推測されている[Calabreseら, Biochemistry 43(36):11403-1 1416 (2004); Xiangら, (2002), 前述の箇所; Williamsら, (2005), 前述の箇所]。特に、HALにおいて、シュードモナス プチダからのメチオニン382及びグルタミン414[配列番号：６]は、すべてのHALにおいて高度に保護されているが、リジン及びグルタミンによってそれぞれ、常にこれまでに記載されたすべてのPAL（真核生物又は原核生物）で置換されている（図４）。そのため、"PAL−HAL"領域があり、かつ、リジン382及びグルタミン414との相同性を有するすべてのタンパク質は、PAL活性のあるタンパク質の配列特性を有すると言える。このような比較的新しいPALの特性[Williamsら, (2005), 前述の箇所]は、HALからPALへいくつかの酵素を適切に分類させ、既存の遺伝子及びタンパク質のデータベースからいくつかの新規のPAL酵素を識別するのに利用することができた。
【００７１】
本発明は、そのような原核生物PAL、及び生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、及び変異体の組成物、並びに、治療及び産業目的のためのそれらの使用に関する。
【００７２】
[Ａ.定義]
特に断りのない限り、本明細書及び特許請求の範囲を含めた本出願で用いる次の用語は、以下に示す定義を有する。本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる、単数形「ある(a)」、「ある(an)」及び「該(the)」は、文脈が明らかに他のことを示さなければ、複数の対象を含むことに注意する必要がある。標準的な化学用語の定義は、CareyとSundberg, 上級有機化学(Advanced Organic Chemistry)第３版, A及びB巻(Plenum Press, New York 1992)を含む参考書籍で見出すことができる。本発明の実施には、特に示さなければ、当業者での、合成有機化学、質量分析、クロマトグラフィーの分取及び分析方法、タンパク質化学、生化学、組換えDNA技術、及び薬理学についての従来の方法を用いる。例えば、T.E. Creighton, タンパク質：構造と分子特性(Proteins: Structures and Molecular Properties)(W.H. Freeman and Company, 1993)；A.L. Lehninger, 生化学(Biochemistry)(Worth Publishers, Inc., 第４版, 2004)；Sambrookら, 分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)(第２版, 1989)；酵素学における方法(Methods In Enzymology)(S. ColowickとN. Kaplan編集, Academic Press, Inc.)；Remingtonの薬学(Remington's Pharmaceutical Sciences), 第18版(Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)を参照されたい。
【００７３】
本明細書で以前に又は以下に引用されたすべての出版物、特許及び特許出願は、前後にかかわらず、それらの全体において本明細書中に引用により組み込まれる。
【００７４】
次のアミノ酸の略語は、本明細書の全体にわたって用いられる。
【表１】
0005670183.tif 000002
【００７５】
“ポリヌクレオチド”とは、ヌクレオチド単位からなるポリマーをいう。ポリヌクレオチドは、核酸類縁体の他に、デオキシリボ核酸("DNA")及びリボ核酸("RNA")等の自然発生の核酸を含む。核酸類縁体は、非自然発生の塩基、自然発生のリン酸ジエステル結合以外の他のヌクレオチドと結合するヌクレオチド、又は、リン酸ジエステル結合以外の結合に接続された塩基を含んだものを含む。したがって、核酸類縁体、例えば、ホスホロチオエート(phosphorothioate)、ホスホロジチオエート(phosphorodithioate)、ホスホロトリエステル(phosphorotriester)、ホスホロアミダート(phosphoramidate)、ボラノホスフェート(boranophosphate)、メチルホスホナート(methylphosphonate)、キラルなメチルホスホナート(chiral-methyl phosphonate)、2−O−メチルリボヌクレオチド(2-O-methyl ribonucleotides)、ペプチド核酸(PNA)等であるが、これらに限定されない。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、自動DNA合成装置を利用して合成することができる。用語“核酸”とは、一般に、大きいポリヌクレオチドをいう。用語“オリゴヌクレオチド”とは、一般に、約50以下のヌクレオチドである、短いポリヌクレオチドをいう。ヌクレオチド配列は、DNA配列（すなわちA, T, G, C）により表される場合、"T"が"U"で置換されたRNA配列（すなわちA, U, G, C）もこれに含まれることが理解される。
【００７６】
"cDNA"とは、一本鎖又は二本鎖の形態での、mRNAに相補的か同一であるDNAをいう。
【００７７】
従来の表記法は、ポリヌクレオチド配列について説明するために本明細書中で用いられる。一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は、5'−端末であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左端方向は、5'−方向と呼ばれる。初期RNA転写物への5'から3'のヌクレオチドの追加の方向は、転写方向と呼ばれる。mRNAと同じ配列を有するDNA鎖は、"コード鎖"と呼ばれる。RNA転写物の5'−端末へ位置する5'である、そのDNAから転写されたmRNAと同じ配列を有するDNA鎖における配列は、“上流の配列”をいう。コードするRNA転写物の3'−端末へ位置する3'である、RNAと同じ配列を有するDNA鎖における配列は、“下流の配列”をいう。
【００７８】
“相補的”とは、トポロジー適合性、又は２つのポリヌクレオチドの相互作用する表面がともに一致することをいう。したがって、２つの分子は、相補的と説明することができ、さらに、接触表面特性は、互いに相補的である。第一のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、第二のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド結合パートナーのヌクレオチド配列と同一の場合は、第一のポリヌクレオチドは、第二のポリヌクレオチドに相補的である。したがって、配列が5'−TATAC−3'のポリヌクレオチドは、配列が5'−GTATA−3'のポリヌクレオチドに相補的である。
【００７９】
対象のヌクレオチド配列に相補的な配列が、基準ヌクレオチド配列に実質的に同一である場合は、ヌクレオチド配列は、基準ヌクレオチド配列に“実質的に相補的”である。
【００８０】
“コードする”とは、明確なヌクレオチド配列（すなわち、rRNA、tRNA及びmRNA）又は、明確なアミノ酸配列を有する生物学的プロセスでの他のポリマー及び巨大分子の合成のテンプレートとして提供される、遺伝子、cDNA又はmRNA等のポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特定配列の固有特性、並びに、そこから生じる生物特性をいう。したがって、遺伝子により生じるmRNAの転写及び翻訳が、細胞又は他の生物系でタンパク質を生成する場合は、その遺伝子は、タンパク質をコードする。mRNA配列に同一で、配列表に通常提供されるヌクレオチド配列である、コード鎖、及び、遺伝子又はcDNAの転写のテンプレートとして用いられる、非コード鎖は、コードする遺伝子若しくはcDNAのタンパク質、又は他の生産物をいう。特段の定めがない限り、“アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列”は、互いの退化したもので、同じアミノ酸配列をコードする、すべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質及びRNAをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含んでもよい。
【００８１】
“組換えポリヌクレオチド”とは、共に自然に連結されない配列を有するポリヌクレオチドをいう。増幅された又は組み立てられた組換えポリヌクレオチドは、適切なベクターに含まれる。また、ベクターは、適切な宿主細胞を形質転換するのに用いることができる。組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞とは、“組換え宿主細胞”と呼ばれる。遺伝子は、宿主細胞で発現され、例えば“組換えポリヌクレオチド”が産生される。また、組換えポリヌクレオチドは、コードしない機能（例えば、プロモーター、複製開始点、リボソーム結合部位等）を提供することができる。
【００８２】
“発現制御配列”とは、動作可能に結合されたヌクレオチド配列の発現（転写及び／又は翻訳）を制御するポリヌクレオチドのヌクレオチド配列をいう。“動作可能に結合された”とは、ある部分の活性（例えば、転写を制御する能力）が、他の部分に対する作用（例えば、配列の転写）で生じる、２つの部分の間の機能的な関係をいう。発現制御配列は、例えば、プロモーターの配列（例えば、誘導性又は構成性）、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン（すなわちATG）、イントロンのためのスプライシングシグナル、及び終止コドンを含むが、これらに限定されない。
【００８３】
“発現ベクター”とは、発現するヌクレオチド配列に動作可能に結合された発現制御配列を含んだ組換えポリヌクレオチドを含むベクターをいう。発現ベクターは、発現のためのシス作用エレメントを十分に含み、他の発現のためのエレメントは、宿主細胞によって、又はインビトロ発現系において供給することができる。発現ベクターは、コスミド、プラスミド（例えば、裸の又はリポソームに含まれた）、及び、組換えポリヌクレオチドを組み込むウイルス等の当技術分野で公知のものを含む。
【００８４】
“増幅”とは、ポリヌクレオチド配列が複製され、多くのポリヌクレオチド分子に拡散される（例えば、逆転写、複製連鎖反応及びリガーゼ連鎖反応による）手段をいう。
【００８５】
“プライマー”とは、設計されたポリヌクレオチドテンプレートに特異的にハイブリダイズすることができ、相補的なポリヌクレオチドの合成の開始点を提供することができるポリヌクレオチドをいう。そのような合成は、ポリヌクレオチドプライマーが、合成が行われる条件下（すなわち、ヌクレオチド、相補的なポリヌクレオチドテンプレート、及びDNAポリメラーゼ等の重合のための薬剤の存在下で）で供される場合に生じる。プライマーは、一般に、一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。プライマーは、一般に、デオキシリボ核酸であるが、広範囲の合成の及び自然発生のプライマーは多くの適用で有用である。プライマーは、ハイブリダイズされ、合成開始のための部位として提供されるように設計されている、テンプレートに相補的であるが、そのテンプレートの完全な配列を反映する必要はない。そのような場合においては、テンプレートへのプライマーの特異的なハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に依存する。プライマーは、例えば、色素部位、放射性部位又は蛍光性部位で標識化され、検出可能な部位を用いることができる。
【００８６】
ポリヌクレオチドに関連して用いられる場合、“プローブ”とは、特異的に他のポリヌクレオチドの指定された配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。プローブは、ターゲットの相補的なポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするが、テンプレートの完全な相補配列を反映する必要はない。そのような場合では、ターゲットへのプローブの特異的なハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に依存する。プローブは、例えば、色素部位、放射性部位又は蛍光性部位で標識化され、検出可能な部位を用いることができる。
【００８７】
その配列が第一のシーケンスであるポリヌクレオチドが、その配列が第二のシーケンスであるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする場合、第一の配列は、第二の配列に対して“アンチセンス配列”である。
【００８８】
“に特異的なハイブリダイゼーション”、“特異的なハイブリダイゼーション”又は“に特異的にハイブリダイズする”とは、その配列が複合混合物（例えば、細胞内のすべての）DNA又はRNAに存在する場合、ストリンジェントな条件下で、特定のヌクレオチド配列に核酸分子を優先的に結合する、組み合わせる、又はハイブリダイズすることをいう。
【００８９】
用語“ストリンジェントな条件”とは、プローブが、優先的にそのターゲット配列に、及び、他の配列により少ない程度に、又は他の配列とはまったく無しに、ハイブリダイズする条件をいう。サザン及びノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーションの文脈での“ストリンジェントなハイブリダイゼーション”及び“ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件(stringent hybridization wash conditions)”は、配列依存性であり、さまざまな環境パラメーターで異なる。核酸のハイブリダイゼーションの広範囲な手引きは、Tijssen (1993) 生化学と分子生物学における実験技術−核酸プローブでのハイブリダイゼーション第I部第２章(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2) 「ハイブリダイゼーションの原理と核酸プローブ分析の戦略の概観(Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays)」, Elsevier, New Yorkで見出される。一般に、高いストリンジェントな条件、及び洗浄条件は、明確なイオン強度及びpHでの特異的配列において熱融解点(Tm)より低い約5℃となるように選択される。当該Tmは、ターゲット配列の50％が完全に一致したプローブにハイブリダイズする温度（明確なイオン強度及びpHにおける）である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブにおけるTmと等しくなるように選択される。
【００９０】
サザン又はノーザンブロットでのフィルターにおいて100より高い相補的な残留物を有する相補的な核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、一晩行われる、42℃の1mgヘパリン添加50％ホルマリンによるハイブリダイゼーションである。非常にストリンジェントな洗浄条件の一例は、72℃、約15分間の0.15M NaClである。ストリンジェントな洗浄条件の一例は、65℃、15分間の0.2X SSC洗浄である［Sambrookら, (1989) SSC緩衝液の記載についての前述の箇所参照］。非常にストリンジェントな洗浄は、バックグラウンドプローブシグナルを除去する弱いストリンジェントな洗浄に先行することが多い。100のヌクレオチドより多い二重螺旋のストリンジェントな洗浄の媒体の一例は、45℃、15分間の1x SSCである。100のヌクレオチドより多い二重螺旋の弱いストリンジェントな洗浄の媒体の一例は、40℃、15分間の4−6x SSCである。一般に、特定のハイブリダイゼーション分析での無関係なプローブにおいて観察された2x（又はこれより高い）の信号雑音比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。
【００９１】
“ポリペプチド”とは、自然発生の構造変異体、及び、ペプチド結合により結合される合成的非自然発生のその類縁体に関連する、並びに、自然発生の構造変異体、及び合成で非自然発生のその類縁体に関連する、アミノ酸残基を含むポリマーをいう。合成ポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成装置を利用して合成することができる。用語“タンパク質”とは、一般に、大きいポリペプチドをいう。用語“ペプチド”とは、一般に、短いポリペプチドをいう。
【００９２】
従来の表記法は、ポリペプチド配列を図示するために本明細書中で用いられ、ポリペプチド配列の左端は、アミノ末端であり、ポリペプチド配列の右端は、カルボキシル末端である。
【００９３】
“保存的置換”とは、アミノ酸のポリペプチドにおける機能的に類似するアミノ酸への置換をいう。次の６つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む。
1)アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)；
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；
4)アルギニン(R)、リジン(K)；
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)；及び、
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)
また、アミノ酸は、次のように分類することができる。
(1)疎水性:Met, Ala, Val, Leu, Ile；
(2)中性親水性：Cys, Ser, Thr；
(3)酸性：Asp, Glu；
(4)塩基性：Asn, Gln, His, Lys, Arg；
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基：Gly, Pro；及び、
(6)芳香族：Trp, Tyr, Phe
【００９４】
“対立遺伝子変異体”とは、同一の遺伝子座を占める遺伝子の２以上の多形体をいう。対立遺伝子変異は、突然変異によって自然発生し、集団内の表現型多型を生じることがある。遺伝子突然変異は、行わない（コード化されたポリペプチドの変化がない）か、又は、アミノ酸配列を変更したポリペプチドをコード化してもよい。また、“対立遺伝子変異体”とは、それらによってコード化されたタンパク質と同様に、遺伝子対立変異体のmRNAの転写によって誘導されたcDNAをいう。
【００９５】
２つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の文脈での用語“同一の”又は割合の“同一性”とは、次の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いて、又は、目視検査によって測定され、最大の一致において比較及び整列される場合、同一である若しくは特定の割合のヌクレオチド、又は、同一であるアミノ酸残基を有する２以上の配列又は部分列をいう。
【００９６】
２つ以上の核酸又はポリペプチドの文脈での語句“実質的に相同性がある”又は“実質的に同一の”とは、一般的に、次の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いて、又は目視検査で測定され、最大の一致において比較及び整列される場合、少なくとも40％、60％、80％、90％、95％、98％核酸又はアミノ酸残基と同一である２以上の配列又は部分列をいう。ある実施態様においては、実質的な同一性は、長さにおいて少なくとも約50残基である配列の領域にわたって、少なくとも約100残基である配列の領域にわたって、又は、少なくとも約150残基において実質的に同一である配列の領域にわたって存在することが好ましい。他の実施態様においては、配列は、比較生体高分子の一方又は両方のすべての長さにわたって実質的に同一である。
【００９７】
配列比較においては、一般に、1つの配列は、試験配列と比較される基準配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び基準配列は、コンピューターに入力され、必要に応じて、部分列座標が設計され、また、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが設計される。その後、該配列比較アルゴリズムは、設計されたプログラムパラメーターに基づく基準配列に対する試験配列の配列同一性の割合を算出する。
【００９８】
比較のための配列の最適な整列が、例えば、SmithとWatermanの文献Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所的相同性アルゴリズム、NeedlemanとWunschの文献J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性整列アルゴリズム、PearsonとLipmanの文献Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似法における検索、これらのコンピューター化による実施［GAP, BESTFIT, FASTA、及び、TFASTA（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）］、又は、目視検査によって行なうことができる。
【００９９】
有用なアルゴニズムの一例は、PILEUPである。PILEUPは、進行性の対整列を用いて一群の関連配列から多重配列整列を作成して、関係及び配列同一性の割合を示す。また、整列を作成するのに使用されたクラスター化する関係を示す系図又はデンドグラム(dendogram)をプロットする。PILEUPは、FengとDoolittleの文献J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987)の進行性の整列法の単純化を使用する。当該方法は、HigginsとSharpの文献CABIOS 5:151-153 (1989)に記載の方法に類似する。プログラムは、300以内の配列、5,000のヌクレオチド又はアミノ酸の最大長さの各々を整列させることができる。多重整列操作は、２つの最も類似する配列の対の整列から始まり、２つの整列した配列のクラスターを作成する。次いで、このクラスターは、整列した配列の次に関連する配列又はクラスターに整列する。配列の２つのクラスターが、２つの個々の配列の対整列の単純な拡張によって整列する。最終的な整列は、一連の進行性の対整列によって達成される。プログラムは、特異的配列及び配列比較の領域のためのそれらのアミノ酸又はヌクレオチドの座標を設計することによって、並びに、プログラムパラメーターを設計することによって実行される。例えば、基準配列は、次のパラメーターを使用して、配列同一性の割合の関係を決定するために、他の試験配列と比較することができる：デフォルトギャップ重み(default gap weight)(3.00)、デフォルトギャップ重み(0.10)、及び重み付けエンドギャップ(weighted end gap)。配列の多重整列を作成するのに有用な他のアルゴリズムは、Clustal Wである［Thompsonら, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680 (1994)］。
【０１００】
配列同一性の割合及び配列相同性を決定するのに適切なアルゴリズムの他の例は、Altschulらの文献J. Mol.Biol. 215:403-410 (1990)に記載されている、BLASTアルゴリズムである。BLAST解析を行なうためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)によって公衆に利用可能である。このアルゴリズムは、不明な配列での長さWのショートワードを同定することによって高スコアのシーケンス対(HSP)を最初に同定することを含み、データベースの配列における同じ長さのワードで配列される場合に、幾つかのポジティブに評価される閾値Tに一致するか、又は、それを満たす。Tは、近隣ワードスコア閾値［Altschulら(1990)、上記参照］と呼ばれる。これらの最初の近隣ワードは、それらを含む非常に長いHSPを見出す探索を始めるためのシーズとしてヒットする。次いで、当該ワードのヒットは、累積的な整列スコアが増加する限りにおいて、それぞれの配列に沿って両方向に拡張される。累積的なスコアは、ヌクレオチド配列のために、パラメーターM（一組の一致する残基における報酬スコア；常に＞0）、及びパラメーターN（残基をミスマッチする罰スコア；常に＜0）を使用して算出される。アミノ酸配列において、スコアリングマトリクスは、累積的なスコアを算出するために使用される。それぞれの方向のワードヒットの拡張は、累積的な整列スコアが、その最大に達した値から量Xで減少する場合、当該累積的なスコアが、１以上の否定的なスコアリング残基整列の蓄積により０以下になる場合、又は、一方の配列の端末に到達する場合に、停止される。BLASTアルゴリズムパラメーターW、T及びXは、整列の感度及び速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）を、両方の鎖の比較、及び、11のワード長(W)、10の期待値(E)、M=5、N=-4のデフォルトとして用いる。BLASTPプログラムを、アミノ酸配列においては、3のワード長(W)、10の期待値(E)及びBLOSUM62スコアリングマトリクスのデフォルトとして用いる［HenikoffとHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)参照］。
【０１０１】
配列同一性の割合の算出に加え、BLASTアルゴリズムは、更に２つの配列間の相同性の統計分析を行う［例えば、KarlinとAltschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)参照］。BLASTアルゴリズムによって提供される相同性の１つの基準は、最小合計確率(smallest sum probability)(P(N))であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、基準核酸と試験核酸の比較における最小合計確率が、約0.1未満、約0.01未満、又は約0.001未満である場合、核酸は、基準配列に類似すると考えられる。
【０１０２】
２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であるという更なる指標は、次に記載するように、最初の核酸によってコード化されたポリペプチドが、第二の核酸によってコード化されたポリペプチドと免疫学的に交差反応性であるということである。したがって、ポリペプチドは、一般に、第二のポリペプチド（例えば、２つのペプチドが、保存的置換によってのみ異なる）と実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、本明細書中に記載されるように、２つの分子が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするということである。
【０１０３】
“実質的に純粋”又は“単離された”とは、対象種が優勢種で存在すること（すなわち、モル基準で、組成物での他の個々の巨大分子種よりも豊富である）、及び、実質的に精製された画分が、対象種がすべての存在する巨大分子種の少なくとも約50％（モル基準で）含む組成物であることを意味する。一般的に、実質的に純粋な組成物とは、組成物に存在する巨大分子種の約80％〜90％又はそれより多くが関心を惹く精製された種であることを意味する。対象種は、組成物が単一の巨大分子種から実質的に構成される場合は、実質的に均質に精製される（従来の検出方法では、組成物で汚染種が検出されない）。溶媒種、小分子（＜500ダルトン）、安定化剤（例えばBSA）、及び成分のイオン種は、本定義の目的においては、巨大分子種に考慮されない。ある実施態様においては、本発明の化合物又は複合体は、実質的に純粋であり、あるいは単離される。ある実施態様においては、本発明の化合物又は複合体は、それらの合成に用いる巨大分子の出発物質に関連して、実質的に純粋であり、あるいは単離される。ある実施態様においては、本発明の医薬組成物は、１以上の医薬として許容し得る賦形剤と混合された、実質的に精製又は単離されたPALポリペプチドの複合体及び活性剤を含む。
【０１０４】
対象に適用される“自然発生の”とは、対象が自然界で発見することができる事実をいう。例えば、天然資源から分離される生物体（ウイルスを含む）に存在し、研究室で、人間によって故意に改変されていない、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列が、自然発生するというものである。
【０１０５】
“野生型”(wt)は、生物体の自然な遺伝型を指す用語である。野生型は、突然変異型（遺伝子突然変異を有する生物体）と区別される。
【０１０６】
用語“ポリペプチド”及び“タンパク質”とは、アミノ酸残基のポリマーであり、生産物の最小長が限定されないことをいう。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体等がその定義に含まれる。完全長タンパク質及びそのフラグメントが共にその定義に包含される。また、その用語は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等のポリペプチドの発現後修飾を含む。さらに、本発明の目的において、“ポリペプチド”とは、タンパク質が所望の活性を維持する限りにおいて、固有の配列に対する欠失、付加及び置換等の修飾（一般的に、自然界で保存的）を含むタンパク質をいう。そのようなポリペプチドは、本明細書中では“突然変異体”と呼ばれる。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発でのように、意図的であってもよいし、又は、タンパク質を産生する宿主で若しくはPCR増幅によるエラーで生じる突然変異のように、偶発的であってもよい。
【０１０７】
本明細書中で用いられる、“類縁体”、又は“誘導体”は、例えば、ペプチドなどの所定化合物と約70％より高く100％未満の配列相同性を有する化合物、例えばペプチドである。そのような類縁体、又は誘導体は、自然発生のアミノ酸残基の他に、例えば、ホモアルギニン、オルニチン、ペニシラミン及びノルバリンのこれらに限定されない代替として含有する非自然発生のアミノ酸残基からなる化合物であってもよい。また、そのような類縁体、又は誘導体は、１以上のD−アミノ酸残基からなっていてもよく、２以上のアミノ酸残基間の非ペプチドインターリンケージ(non-peptide interlinkage)を含んでもよい。
【０１０８】
用語“有効量”は、被検者の健康状態、病状及び疾病に関する、又は診断目的の所望の結果を生じるのに十分な用量を意味する。当該所望の結果は、当該用量の受容者における主観的又は客観的な改良を含む。“治療有効量”とは、健康に対して意図される有益な効果を奏するのに有効である薬剤の量をいう。個々の場合における適切な“有効”量は、ルーチン試験で、当業者によって決定することができる。
【０１０９】
本明細書中で用いられる“治療”とは、予防的処置、治療的処置、又は診断処置をいう。
【０１１０】
“予防的”処置は、疾病の兆候を示さない、又は、病状の進行の危険性を低減させる目的で、初期兆候のみを示す、被験者に施される処置である。本発明の化合物又は複合体は、病状の進行の可能性を低減させるために、又は、病状が進行した場合に、病状の重症度を最小限にするために、予防的処置として提供することが可能である。
【０１１１】
“治療的”処置は、疾病の兆候又は症状を低減させる又は除去する目的で、疾病の兆候又は症状を示す被験者に施される処置である。当該兆候又は症状は、生化学的、細胞的、組織学的、機能的、主観的、又は客観的であり得る。本発明の化合物又は複合体は、治療的処置又は診断のために提供することが可能である。
【０１１２】
“診断”とは、病状の存在又は性質を識別することを意味する。診断方法は、病状の特異性及び選択性で異なる。特定の診断方法は、病状の確定診断を提供し得ないが、当該方法が診断で補助する肯定的な指示を提供する場合は、当該方法で事足りる。
【０１１３】
“医薬組成物”とは、ヒト及び哺乳動物を含む被験体動物での医薬的用途に適切な組成物である。医薬組成物は、薬理学的に有効量のPALポリペプチドを含み、また、医薬として許容し得るキャリアも含む。医薬組成物は、２以上の成分の組み合わせ、複合若しくは凝集から、又は、１以上の成分の分離から、又は、他の型の１以上の成分の反応若しくは相互作用から、直接的若しくは間接的に生じる生成物の他に、キャリアからなる活性成分及び不活性成分を含んだ組成物を包含する。したがって、本発明の医薬組成物は、本発明の化合物又は複合体と医薬として許容し得るキャリアとを混合して製造される組成物を包含する。
【０１１４】
“医薬として許容し得るキャリア”とは、リン酸塩緩衝食塩水溶液、デキストロースの５％水溶液等の標準的な医薬キャリア、緩衝剤、及び賦形剤、油／水又は水／油エマルジョン等のエマルジョン、並びに、さまざまな湿潤剤及び／又は佐剤をいう。適切な医薬キャリア及び配合物は、Remingtonの薬学(Remington's Pharmaceutical Sciences)第19版(Mack Publishing Co., Easton, 1995)に記載されている。医薬キャリアは、活性剤の意図される投与形式に依存する。一般的な投与形式は、腸内投与（例えば経口）、非経口投与（例えば、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、又は腹腔内注射；局所的投与、経皮的投与、又は口腔粘膜投与）を含む。“医薬として許容し得る塩”は、例えば、金属塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等）、及びアンモニア又は有機アミンの塩類を含む、医薬用途の化合物又は複合体に配合することができる塩である。
【０１１５】
“医薬として許容し得る”又は“薬理学的に許容し得る”とは、生物学的又は有害でない物質を意味する。すなわち、当該物質は、有害な生物学的作用を生じること、又は、それが含まれる組成物の成分と有害な様式において相互作用することなしに、個体に投与することができる。
【０１１６】
本明細書中で用いられる用語“単位剤形”とは、ヒト及び動物の被験者（被験体）の単一用量として適切な物理的に分離したユニットをいい、それぞれのユニットは、医薬として許容し得る希釈剤、キャリア又はビヒクルと関連する所望の効果を奏するのに十分な量で計算された所定量の本発明の化合物又は複合体を含む。本発明の新規の単位剤形の仕様は、用いられる特定の化合物又は複合体、その達成される効果、及び、宿主のそれぞれの化合物又は複合体と関連する薬力学に依存する。
【０１１７】
“生理学的なpH”、又は“生理学的な範囲のpH”とは、約7.2〜8.0の包括的な範囲、より一般には、約7.2〜7.6の包括的な範囲のpHを意味する。
【０１１８】
本明細書中で用いられる用語“被験者（被験体）”は、哺乳動物及び非哺乳動物を包含する。哺乳動物の例は、限定されず、哺乳類の種類のメンバーを含む：ヒト、チンパンジー等のヒト以外の霊長動物、並びに、他の類人猿及び猿類；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の家畜；ウサギ、イヌ及びネコ等の家庭動物；ラット、マウス及びモルモット等のげっ歯動物などを含む実験動物。非哺乳動物の例は、鳥類、魚類等を含むが、これらに限定されない。当該用語は、特別の年齢や性別を示すものではない。
【０１１９】
さまざまな実施態様においては、PAL変異体のペグ化は、PAL:PEG又はPEG:PALの比に関連して説明される。本明細書中で用いられるように、特に示さなければ、“PAL:PEG”の比とは、ペグ化反応におけるPAL変異体のリジン残基とPEG分子の比をいう。同様に、本明細書中で用いられるように、特に示さなければ、“PEG:PAL”の比とは、ペグ化反応におけるPEG分子とPAL変異体のリジン残基の比をいう。
【０１２０】
［Ｂ．構造に基づくプロテインエンジニアリング］
多くの方法は、主としてタンパク質構造情報に基づく合理的な最適化を利用するプロテインエンジニアリングで知られている［Branniganら, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3(12):964-970 (2002); Marshallら, Drug Discov. Today 8(5):212-221 (2003)］。構造的特徴の系統的な置換により、改善されたタンパク質特性及び／又は基質特異性の設計変更を生じることがある。ある遺伝子ファミリーのメンバーから他の相同メンバーへの機能の補強は、直接の基質結合付近の限定数のアミノ酸置換の導入によって実行することができる［Bocanegraら, Biochemistry 32(11):2737-2740 (1993); Faillaら, Fold Des. 1(1):35-42 (1996); Hayesら, Proc Natl Acad Sci USA 99(25): 15926-15931 (2002); Voigtら, Nat. Struct. Biol. 9(7):553-558 (2002); Malashkevichら, Nat Struct Biol. 2(7):548-553 (1995); Wellsら, Proc Natl Acad Sci USA 84(15):5167-5171 (1987); Wilksら, Science 242(4885): 1541-1544 (1988)］。
【０１２１】
［Ｃ．PALの構造］
野生型原核生物PALの三次元構造は、X線結晶構造解析を用いて決定することができる。PALタンパク質は、主としてα−ヘリックスからなるそれぞれの単量体を有するホモ四量体であり、中央の触媒ドメイン、N末端ドメイン、シュードモナス プチダのヒスチジンアンモニアリアーゼ［HAL、Schwedeら, Biochemistry 38(17):5355-5361 (1999)］と相同性のある小さなC末端ドメイン、及び、完全な四量体分子の端から突出するC末端ドメイン領域に挿入された付加的なドメインの４つのドメインへ細分化することができる。N末端の最初の25残基は、四量体の４つのすべての単量体においては視認することができず、この領域は、不規則であると考えられる。残基109−123と350−353との間のループ領域は、PAL四量体の単量体A、C及びDにおいて不規則な領域103−123及び350−353と共に、単量体Bにおいて不規則である。ロドスポリディウム トルロイデス PALの２つのX線構造が、2.1Åの分解能（P3221空間群）で、及び2.7Åの分解能［P21空間群；Calabreseら, Biochemistry 43(36):11403-11416 (2004)］で、結晶化プロセス時におけるtrans−桂皮酸及びNH4イオンの添加により決定されている。結晶化に利用された非常に低いpH、及びこれらの構造の非常に低い分解能は、構造（特に、N末端領域における）に固有の不規則、及び、NH2付加物に与えるMIO補助因子に存在する付加的な電子密度の明確な欠如を生じた。
【０１２２】
アンモニアリアーゼ［PAL、HAL、及びアスパラギン酸アンモニアリアーゼ(AAL)］、フマラーゼ、及びアルギニノコハク酸リアーゼ［Schwedeら, Biochemistry 38(17):5355-5361 (1999)］を含む、カルボン酸からのさまざまな基の除去を触媒する四量体酵素のこのファミリーに、多くの関連した構造［DALIを利用、Holmら, J. Mol. Biol. 233:123-138 (1993)］がある。また、δ−結晶性鳥眼レンズタンパク質は、相似褶曲であるが、この構造ファミリーの非酵素型である［Schwedeら, (1999) 前述の箇所］。
【０１２３】
シュードモナス プチダのPALの三次元X腺構造［Rotherら, Eur. J. Biochem. 268:6011-6019 (2001); Schwedeら, Biochemistry 27:5355-5361 (1999)］、及び、ロドスポリディウム トルロイデスのPALの最近の三次元X腺構造［Calabreseら, Biochemistry 43:11403-11416 (2004)］は、基質結合、触媒作用及びMIO形成に重要なこれらの四量体酵素の活性部位残基を明らかにした。HALのすべての活性部位残基は、それぞれバリン及びグルタミン残基で置換されているH83及びE414を除いて、EncPに存在する［Xiang, L.ら, J. Biol. Chem. 277:32505-3250924 (2002)］。HALのH83は、活性部位でL−ヒスチジンのイミダゾール部位を結合し適応させ、かつ、酵素に結合したカチオン中間体を安定させるために提案されており、E414のカルボキシラート基は、触媒の塩基として作用することができる。
【０１２４】
PALの高分解能三次元タンパク質結晶構造は、PALの生化学及び生物物理学特性を改善し、インビボでのPALの治療有効量を増加させるために、プロテインエンジニアリングに関する方法で用いてもよい。また、当該構造は、構造の領域が最も柔軟であり（非常にコンパクトで安定した形態のPALを除去及び生成すること）、残基は、活性部位付近に位置し（構造に基づくインヒビターの設計についての情報を提供すると共に、活性を増強させるため、及び／又はタンパク質のサイズを最小化するために突然変異すること）、表面配置は、免疫原（例えば、マッピング研究で同定された線状エピトープ）及び／又は原核生物感受性部位（プロテアーゼマッピングからの）に近く、問題部位の直接的な破壊のための、又は代替的に表面ペグ化若しくは他の化学誘導体化のための部位特異性突然変異体の導入により、野生型PALに存在する感受性部位を保護することができるという情報を提供する。
【０１２５】
［Ｄ．PALの構造座標の利用］
PALの高分解能三次元結晶構造は、突然変異、改良、又は突然変異と改良の組み合わせのタンパク質の領域を選択するコンピューター化された方法で用いてもよい。例えば、市販のプログラムGETAREAは、X線の結晶学的座標に基づくアミノ酸残基の外面露光を算出する。
【０１２６】
さらに、当該高分解能三次元結晶構造は、酵素の活性部位のリガンドを設計するインシリコでの方法で用いることができる。例えば、構造に基づく小さな分子のドッキング及び設計のための市販ソフトウエアプログラムは、PALインヒビターの設計に用いることができる［Billettら, Biochim Biophys Acta 524(l):219-230 (1978); Janasら, Acta Biochim Pol. 32(2):131-143 (1985); Zonら, Phytochemistry 59(1): 9-21 (2002); Alunniら, Arch Biochem Biophys. 412(2):170-175 (2003)］。
【０１２７】
（構造に基づくPALエンジニアリング）
特定の巨大分子の信頼できる三次元構造又は構造モデルの解明は、合理的設計が、特異的構造の最適化、及び／又は該巨大分子の機能のための生産的な方法になることを可能にする［Penningら, Chem Rev. 101(10): 3027-3046 (2001)］。最適化アプローチは、コエンザイム特異性の再エンジニアリング［Bocanegraら, Biochemistry 32(11):2737-2740 (1993)］、タンパク質安定性の改善［Malakauskasら, Nat Struct Biol. 5(6):470-475 (1998); Jiangら, Protein Sci. 10(7):1454-1465 (2001); Luo, Protein Sci. 11(5):1218-1226 (2002); Filikovら, Protein Sci. 11(6):1452-1461 (2002); O'Fagain, Enz Microb Technol. 33:137-149 (2003); Cammettら, J Mol Biol. 327(l):285-297 (2003)］、基質特異性の設計変更［Hedstromら, Science 255(5049): 1249-1253 (1992); Faillaら, Fold Des. l(l):35-42 (1996); Malashkevichら, Nat Struct Biol. 2(7):548-553 (1995); Wilksら, Biochemistry 3 1(34):7802-7806 (1992); Feilら, Protein Eng. 10(3):255-262 (1997); Whittleら, 3 Biol Chem. 276(24):21500-21505 (2001)］、リガンド又は受容体結合特異性の変質［Cunninghamら, Proc Natl Acad Sci USA 88(8):3407-3411 (1991); Reddyら, Nat Biotechnol. 14(13):1696-1699 (1996); Doyleら, Curr Opin Chem Biol. 4(l):60-63 (2000)］、及び、生物活性の再エンジニアリング［Chenら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12):5618-5622 (1993); Sarkarら, Nat Biotechnol. 20:908-913 (2002); Blattら, 3 Interferon Cytokine Res. 16(7):489-499 (1996)］を含むが、これらに限定されない。
【０１２８】
構造に基づくエンジニアリングは、確率的に誘導された突然変異体（指向進化誘導突然変異体単独、又はこれと合理的に高度に開発された突然変異体の組合せを含む）と共に、トランケーション、欠失、挿入、結合変異体、点突然変異、置換、キメラ、ループ再設計突然変異体(loop re-engineered mutant)、ループ交換突然変異体(loop swapping mutant)、表面ベニアリング変異体(surface veneering mutant)等の合理的な変異体を含むPAL変異体を生成するのに用いることができる。また、PAL変異体は、突然変異が、部位特異性ペグ化、及び／又は他の化学誘導体化で導入されているPAL突然変異体を含んで作製することができる。そのような方法で用いるPAL突然変異体は、野生型ロドスポリディウム トルロイデス PAL（親のPALタンパク質の変異体、フラグメント及び化学誘導体を含む）と実質的に同様の機能的活性を有するPAL変異体を含む。
【０１２９】
（指向進化タンパク質の最適化）
指向進化方法は、タンパク質の突然変異のスペースの十分に大きな領域を調査するために、関心を惹く遺伝子を無作為に突然変異させる。多数の指向進化方法は、誤りを生じがちなPCR、ランダム挿入、DNA配列の全体にわたって多様性を導入する欠失(RID)突然変異誘発、並びに、部位飽和突然変異誘発、及び他のオリゴヌクレオチド系突然変異誘発法［Branniganら, (2002) 前述の箇所］等の非常に集中された又は“指向された”方法を含んで存在する。また、DNA配列再結合の方法は、突然変異の有利な部位を組み合わせ、同時に、新規のDNA配列を生成する（例えば、DNAシャフリング方法、StEP、RACHITT、ITCHY）有害突然変異を除去するのに使用されている。そして、構造に基づく指向進化技術は、治療の利点（構造に基づく組み合わせのエンジニアリング、SCOPE、及びプロテインデザインオートメーション、PDA、方法）のタンパク質の設計を変更するために使用されている。SCOPE法は、DNA操作技術と結び付けられたタンパク質構造情報を利用して、非相同遺伝子からの多重交差タンパク質変異体ライブラリーを設計し作製する、半合理的なプロテインエンジニアリングアプローチに基づく［O'Mailleら, J Mol Biol. 321(4):677-691 (2002)］。PDAでは、突然変異のスペースのコンピューター上のプレスクリーニングによって、特定のタンパク質の折り畳みと適合する突然変異だけ包含させ、実験的なスクリーニングに適用可能なサイズに配列変異体の数を減らすことができる［米国特許第6,403,312号; Dahiyatら, Proc Natl Acad Sci USA 94(19):10172-10177 (1997); Dahiyatら, Protein Sci. 6(6):1333-1337 (1997); Hayesら, Proc Natl Acad Sci USA 99(25): 15926-15931 (2002) Orenciaら, Nature Struct Biol. 8:238-242 (2001)］。
【０１３０】
多くの例には、指向進化の利用（有効な選択、又はスクリーニングプロトコールに結び付いた）によって、改善された触媒機能及び生物物理学特性（例えば、低減された免疫原性、増加された安定性）、初期酵素種からの開始、及び、変更及び／又は改善された機能の種に突然変異されることが存在する。例えば、成功した突然変異体は、多くの異なるタンパク質で指向進化、及び他の“ランダム”突然変異誘発方法を用いて得られている［トリオースリン酸イソメラーゼ、Hermesら, Proc Natl Acad Sci USA 87(2):696-700 (1990); β−ラクタマーゼ、Stemmer, W.P., Nature 370(6488):389-391 (1994), Orencia, M.C.ら, Nature Struct Biol 8:238-242 (2001), Voigt, C. A.ら, (2002) 前述の箇所; パラニトロベンジルエステラーゼ、Mooreら, Nature Biotechnol. 14:458-467 (1996); ガラクトシダーゼからフコシダーゼ、Zhangら, Proc Natl Acad Sci USA 94(9):4504-4509 (1997); アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Yanoら, Proc Natl Acad Sci USA 95(10):551 1-5515 (1998); 緑色蛍光タンパク質、Crameriら, Nat Biotechnol 14(3):315-319 (1996); ワサビペルオキシダーゼ、Linら, Biotechnol Prog 15:467-471 (1999); シトクロムP450、Jooら, Nature 399(6737):670-673 (1999); ビフェニルジオキシゲナーゼ、Kumamaruら, Nat Biotechnol 16(7):663-666 (1998); ヒ酸塩解毒経路、Crameriら, Nat Biotechnol 15(5):436-438 (1997); セファロスポリナーゼ、Crameriら, Nature 391(6664):288-291 (1998); さまざまなタンパク質、Shaoら, Curr Opin Struct Biol 6(4):513-518 (1996), さまざまなタンパク質、Skandalisら, Chem Biol 4:889-898 (1997); ズブチリシン、Cunninghamら, Protein Eng. 1(4):319-325 (1987); ニトリラーゼ、DeSantisら, J Am Chem Soc. 125(38):11476-11477 (2003); α−アスパルチルジペプチターゼ、Kongら, Biochem Biophys Res Commun. 289(1):137-142 (2001); アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Rothmanら, Protein Science 13(3):763-772 (2004); L−アスパルターゼ、Wangら, Biochem Biophys Res Commun. 276(l):346-349 (2000); 及び、乳酸脱水素酵素、Wilksら, Biochemistry 31(34):7802-7806 (1992)］。
【０１３１】
これらの研究は、増加された安定性、活性、及び分解経路に対する抵抗を有する改善された変異型酵素の開発への“ランダム”突然変異誘発技術の適用を繰り返し実証した。進化タンパク質クローンの構造解析によって、得られる改善された物理的及び化学特性と関連する分子変化が洞察される［Orenciaら, 「タンパク質化学の発展(Advances in Protein Chemistry)」: 「進化的なタンパク質設計(Evolutionary protein design)」, F.H. Arnold, Editor, Academic Press: San Diego, pp.227-259 (2001)］。指向進化技術で得られる利益は、有益な効果を有する酵素活性部位領域からの15〜20Åでの突然変異のある部位と共に、非活性部位残基を含む、有用な突然変異の繰り返された発生に照らして特に明白である［Oueら, J. Biol. Chem. 274(4):2344-2349 (1999)］。選択とスクリーニング法に結び付いた指向進化及び他のランダム変異導入法技術は、産業適用で、又は酵素置換療法（例えばPKUのために）のために用いられるPALのタンパク質安定性、及び化学的ロバスト形態を改善するために用いることができる。
【０１３２】
［Ｅ．改質されたPAL］
既報の実験では、PAL突然変異体［Schusterら, FEBS Lett. 349(2):252-254 (1994); Schusterら, Proc Natl Acad Sci USA 92(18):8433-8437 (1995); Langerら, Biochemistry 36:10867-10871 (1997); El-Batalら, Acta Microbiol Pol. 49(1):51-61 (2000); Rotherら, Eur. J. Biochem.269:3065-3075 (2002)］、及びHAL突然変異体［Taylorら, J. Biol. Chem. 269(44):27473- 27477 (1994); Baedekerら, Eur. J. Biochem. 269(6): 1790-1797 (2002)］等の改質されたPALが述べられている。
【０１３３】
（PAL動力学特性の最適化−増大された触媒活性を有する原核生物突然変異体）
本発明による野生型PALの生物学的に活性のある部位は、PAL動力学特性を最適化することが望まれるように改質することができる。最大半量活性を提供する基質の濃度であるKmは、許容範囲内（すなわち、120μM〜240μM）でのPhe量を維持するPALの治療有効性と密接に関連している。Kmは、基質における酵素の親和性である。親和性を制御することにより、さまざまな濃度で基質に対する酵素の有効性を制限又は制御することができる。例えば、Kmが1000μM（ロドスポリディウム トルロイデス）である場合、酵素活性は、240μMの血液Phe量で約12.5％、及び60μMの血液Phe量で約3％に低減される。Kmが240μMであれば、酵素活性は、240μMの血液Phe量で約50％、及び60μMの血液Phe量で約12％に低減される。Kmが120μMであれば、酵素活性は、240μMの血液Phe量で約70％、及び60μMの血液Phe量で約35％に低減される。最適には、治療対象は、Pheを低減させるのに十分な活性を有するだけでなく、約120μM〜約240μMの最適範囲内でPheを維持する酵素を有する。高いKm（すなわち1000μM）を有する酵素は、Phe量が正常な範囲に低下し、急速に活性を失い、また、非常に高い濃度又は多い用量である実際的でない投与を必要とする。一方、非常に低いKmを有する酵素は、急速にPhe量を消費し、高フェニルアラニン貧血症(hyperphenylanemias)に致命的であるが、癌の処置には有用であり得る。
【０１３４】
ある実施態様においては、生物学的に活性のある改質されたPALは、少なくとも約0.1s-1、又は約0.5s-1より高いkcatを有する。他の実施態様においては、生物学的に活性のある改質されたPALは、少なくとも約0.2s-1、又は約1.0s-1より高いkcatを有する。他の実施態様においては、生物学的に活性のある改質されたPALは、約10μM〜約1000μMのKmを有する。他の実施態様においては、生物学的に活性のある改質されたPALは、約100μM〜約1000μMのKmを有する。他の実施態様においては、生物学的に活性のある改質されたPALは、野生型の約２倍から約1000倍の酵素活性を示す。他の実施態様においては、生物学的に活性のある改質されたPALは、野生型の約10％から約100％の酵素活性を示す。そのような生物学的に活性のある改質されたPALタンパク質は、部位特異的突然変異誘発等の当技術分野で周知の方法を用いて形成することができる。
【０１３５】
HALのすべての活性部位残基は、それぞれバリン及びグルタミン残基で置換されているH83及びE414を除いて、EncPに存在することが明らかになった［Xiang, L.ら, J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002)］。活性部位でL−ヒスチジンのイミダゾール部位を結合し適応させ、かつ、酵素に結合したカチオン中間体を安定させることにおけるHALのH83の役割が検討された［Xiangら, J. Bacteriology 187(12):4286-4289 (2005); Xiangら, J. Bacteriology 188(14):5331 (2006)］。E414のカルボキシラト基が、触媒の塩基として作用することができることが提案された。当該研究では、EncP突然変異体を部位特異的突然変異誘発により生成し、EncPによる桂皮酸形成へのV83の寄与を評価した。バリンのヒスチジンへの置換により、PAL活性の損失で特徴付けられる突然変異体(V83H)が生成した。バリンのアラニンへの置換により、野生型EncP V83Aよりも活性のある突然変異体(V83A)を生じ、これは、野生型酵素の23μMのKmに対して、120μMのKmである僅かに低いL−フェニルアラニンへの親和性を有していた。しかしながら、野生型EncPと比較して、V83Aは、野生型酵素よりも高いkcatを有し、活性があった。
【０１３６】
（特定のタンパク質変異体：低減された免疫原性を有する変異体）
多くの戦略は、一般にタンパク質免疫原性を低減させるために利用される。ある実施態様においては、免疫反応を最小限にするために導入される改良は、巨大分子の構造、機能又は安定性を損なわない。用いられる有効な戦略は、ヒト配列含量を増加させること（キメラ及び／又は他の‘ヒト化’アプローチ）、溶液物性を改良すること、抗体エピトープを除去すること、化学誘導体化（ペグ化など）を導入すること、及び／又は、MHCアグリトープを識別及び除去することを含む。注入による治療においては、インビボでの免疫反応性は、改良される合理的な突然変異誘発が生じる及び／又は免疫原性のこれらの部位を突然変異させる前に、単独で、及び、部位特異的ペグ化［Hershfieldら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7185-7189 (1991); Leongら, Cytokine 16(3): 106-119 (2001); Leeら, Pharm. Res. 20(5):818-825 (2003)］、又は、タンパク質免疫原性を許容されるレベルに低減させる他の化学誘導体化方法を組み合わせ、エピトープマッピングをすることで解消することができる。抗原表面タンパク質領域の改良は、免疫原性を低減させる［Chirinoら, Drug Discov. Today 9(2):82-90 (2004)］。ある改良方法は、触媒活性（例えば、吸光度分析が活性測定に用いられる）を保持する、非常に小さなサイズのタンパク質の構造を含む。また、第二の改良方法である、ELISAスクリーニングに結び付くプロテインエンジニアリングにより、低減された免疫反応性を有する突然変異体の同定をすることができる。他の方法は、ペグ化誘導体化のための追加的な表面リジン部位における点突然変異を導入する。試験酵素プリンヌクレオシドホスホリラーゼで免疫原性を低減させる方法が示されている［Hershfieldら(1991), 前述の箇所］。代替的な経路は、タンパク質エピトープ領域に位置する残基の突然変異を用いて、免疫原部位を除去する［Yeungら, J. Immunol. 172(11):6658-6665 (2004)］。抗体のヒト化(antibody humanization)と類似しているアプローチでは、相同ループ領域、及び／又はヒト抗体からの残基は、相同タンパク質の対応するループ領域に置換される。
【０１３７】
タンパク質の溶液物性の改良は、特異的酵素活性を増加させ、及び／又は、免疫原性を低減させることができる。細菌で発現された組換えタンパク質の一般的な溶液物性は、例えば、鎖間ジスルフィド結合の形成、疎水性相互作用、及び／又は、２価カチオンによるタンパク質凝集体の形成である［Chiら, Pharm.Res.20(9):1325-1336 (2003)］。組換え発現タンパク質の凝集は、免疫反応を高める［Hermelingら, Pharm. Res. 21(6):897-903 (2994); Schellekens, Nephrol. Dial. Transplant 20(suppl 6):vi3-9 (2005)］。ある改良方法は、他のアミノ酸（例えばセリン）残基を有する表面システイン残基を置換して、鎖間ジスルフィド結合の形成の可能性を最小限にすることを含む。例えば、セリン残基を有する２つの表面システイン残基の置換は、酵素活性に対して若干の影響があるコリスミン酸リアーゼの凝集を低減させた［Holdenら, Biochim. Biophys. Acta 1594(l):160-167 (2002)］。
【０１３８】
また、タンパク質治療上のタンパク質分解処理部位の除去は、プロテアソーム処理を防止し、抗原提示細胞結合のためのペプチドフラグメントへの切り取り及び処理を防止することによって免疫原性の低減を提供する。同様の現象は、MHCクラスII抗原決定基のフランキング領域で観察され、自己反応性のT細胞への提示を防止する［Maverakisら, Proc Natl Acad Sci, USA 100(9):5342-5347 (2003)］。
【０１３９】
（エピトープマッピング）
タンパク質治療上のエピトープは、多くのアルゴリズムを用いて算出され、又は、実験的にインビトロ若しくはインビボで決定することができる。DNAStarからのLasergeneプログラムパッケージでの“Peptide Companion”及び“Protean”等のコンピュータープログラムが、タンパク質の化学組成及び配座に基づくタンパク質の表面エピトープ領域の評価に一般に使用される。タンパク質配列の免疫原領域は、親水性保持係数(hydrophilicity index)に基づく最も高い算出された親水性、並びに、算出された表面タンパク質領域の両親媒性及び他の配座パラメーターに基づく抗原性の領域である。あるいは、タンパク質配列のアグリトープは、潜在的なHLA結合のコンピューターにモデル化された予測に基づいて位置することができる［Robinsonら, Nucleic Acids Res. 31(1):311-314 (2003); De Grootら, Novartis Found. Symp. 254:57-72 (2003)］。また、エピトープは、インビトロで生化学的に［Tangriら, Curr. Med. Chem. 9(24):2191-2199 (2002)］、及びインビトロで細胞系の方法で［Sticklerら, J Immunother. 23(6):654-660 (2000); Sticklerら, J Immunol Methods 281(l-2):95-108 (2003)］、同定することができる。プロテインエンジニアリングにおいては、免疫原性の相対的な低減は、Sticklerらの文献［Toxicol Sci. 77(2):280-289 (2004)］のインビトロでの細胞系分析と同様の分析を用いて監視することができる。
【０１４０】
Pepscan分析（エピトープマッピング）は、酵素配列のペプチド被覆領域をオーバーラップさせて、酵素タンパク質配列全体を被覆するペプチドをオーバーラップさせることに対するウサギポリクローナル抗体で調査することで、酵素に存在する線状エピトープを示す、ライブラリーの利用に関連する。酵素の三次元構造に基づいて、抗原性の実験的に同定された部位は、エピトープ認識部位を除去するために無作為にエピトープ領域残基を突然変異させる、又は、部位特異的突然変異を用い、これらのエピトープ部位付近の表面のリジン若しくはシステイン残基を導入して、ペグ化がこれらの部位を免疫原の認識から遮蔽及び保護する場所を提供することで、突然変異させられる。これらの潜在的に非免疫原の酵素突然変異体（又は、これらの酵素突然変異体のペグ化された形態）のELISAスクリーニングは、低減された免疫反応性を示す酵素突然変異体のサブセットのインビトロでの同定を提供する。
【０１４１】
（表面残基の同定及び突然変異）
酵素の免疫原領域の、又は付近の表面露出残基は、同定することができる。これらの配置は、タンパク質に存在する溶媒露出表面配置の総数のサブセットであり、免疫原性／抗原性の領域への近接、及び表面への近接に依存する。X線結晶解析、NMR、又は相同モデリングを用いて決定されたタンパク質の三次元構造は、巨大分子溶媒露出表面積を算出する市販のソフトウェアプログラムで使用することができる。プログラムGETAREA 1.1［Fraczkiewiczら, J. Comp. Chem. 19:319-333 (1998)］を用いて提供される出力は、ロドスポリディウム トルロイデス PALの表面露出の信頼できる評価を提供する。GETAREA、PARAREA及び同様のプログラムは、ガウスボンネの定理に基づくパラメーターのアプローチを具備する連続方法を用いて、溶媒露出表面積を算出する。PARAREAは、それぞれの原子の隣接するすべての原子対を用いてガウスボンネ経路で潜在的な交差地点を見出し、GETAREAは、非常に効率的に、二球面交差の平板によって定義された交差半空間を用いて、溶媒露出頂点を算出する。
【０１４２】
野生型PALにおいては、GETAREAは、１つの部分的に露出した表面システイン残基(Cys140)と共に、四量体のPALタンパク質表面の至る所に分布した12の表面露出リジン残基を同定した。これらの位置は、ペグ化誘導に直接利用可能である。また、PALの三次元構造は、部位特異的突然変異誘発に利用可能な新たな表面残基を同定するために用いることができる。これらの付加的な部位は、低減された免疫原性、改善されたタンパク質分解抵抗性、及び／又は改善された安定性／活性を有する非常に好ましいPAL突然変異体を生成するために、標準プロテインエンジニアリング技術を用いて突然変異させることができる。
【０１４３】
低減された免疫原性等の改善された特性を有するタンパク質の突然変異体を提供する、タンパク質の突然変異の戦略は、当技術分野で公知である。１つの一般的な経路は、Alaへのエピトープのすべての非アラニン残基を突然変異させ、Glyへのエピトープのすべてのアラニン残基を突然変異させる。他の方法は、突然変異又は欠失によってエピトープ領域からの荷電された疎水性残基を除去する。付加的突然変異戦略は、部位特異性化学誘導体化によって部位特異的突然変異を導入する。
【０１４４】
また、トランケーションも、タンパク質改良に使用することができる。ヒスチジンアンモニア−リアーゼ(HAL)に関するPALのバイオインフォマティクス解析においては、トランケーション突然変異体（残基23−716及び1−564）が示唆された。さらに、PALの三次元構造の解析においては、高い相同性のHALタンパク質の構造におけるC末端ドメイン領域の欠如に基づいて、トランケーションに代替領域を提供する。HALからの対応するループ領域が、PAL構造（主なエピトープ領域を有することが意図された）のC末端ドメインが突出する領域の代わりにPAL配列に融合される突然変異体を含む、C末端ドメイン欠失突然変異体は、非常に小さく、丈夫で、予想された免疫原でないPALの変異体を形成する。
【０１４５】
他の方法においては、指向進化と組み合わせて合理的な突然変異誘発を利用するプロテインエンジニアリングは、PALの突然変異型を得るために使用することができる。例えば、実験及び組み合わせの設計に沿った合理的設計の実行によって、コンプスタチンの活性が改善した［Morikisら, Biochem. Soc. Trans. 32(l):28-32 (2004)］。また、合理的な突然変異誘発及び指向進化の組み合わせは、有望であることが明らかとなった［Bornscheuerら, Curr. Opin. Chem. Biol. 5(2):137-143 (2001); Dwyerら, Science 304(5679): 1967-1971 (2004)］。
【０１４６】
最適な酵素活性より低い活性を示すPALの突然変異型は、指向された分子進化のプロテインエンジニアリング法を用いて活性を進化することができ、ランダム変異導入法工程は、活性があり、活性のあるクローンのみの新規のタンパク質突然変異体プールを生じる突然変異体の選択操作の前に行われる。例えば、特定の突然変異PAL（構造のエピトープ含有領域付近の表面リジン残基に導入されるように設計される）は、不活性である場合、それぞれの活性クローンに活性を回復させる構造全体にわたって位置した付加的な無作為の突然変異体のサブセットに加えて、この突然変異体で指向進化を行なって（不活性突然変異体を突然変異させて、形質転換体のために選択する）、この有益な突然変異体を含む新規の突然変異体プールを生じる。また、さまざまな種の同一のタンパク質、又はさまざまなタンパク質の類似の配列を交差することができる分子育種の当該指向進化方法［Crameriら, Nature, 391:288-291 (1998); Minshullら, Curr. Opin. Chem. Biol. 3(3):284-290 (1999)］は、ヒトヒスチジンアンモニアリアーゼの配列を代用して、PALの幾つかの最も強い免疫原領域を免疫系で認識されないヒトの配列に置換することができる。
【０１４７】
PALの突然変異型は、半合理的なアプローチに基づくハイブリッドタンパク質変異体の作製によって得ることができ、純粋な指向進化に基づく方法に関するタンパク質設計の非常に高い指向レベルにすることができ、また、そのような偏ったプロテインエンジニアリングアプローチを用いて同定されたタンパク質構造の領域における非常にランダムなレベルの突然変異操作を提供させる。例えば、PDA法は、タンパク質変異体のコンピューターによるプレスクリーニングされたライブラリーを生じ、純粋にランダムに、又は偏っていないプロテインエンジニアリング法において、タンパク質特性を非常に迅速に最適化させる［米国特許第6,403,312号; Dahiyat, Curr Opin Biotechnol. 10(4):387-390 (1999); Filikovら, (2002) 前述の箇所 ; Hayesら, (2002) 前述の箇所 ; Luo, P.ら, (2002) 前述の箇所］。同様に、SCOPE法は、構造の“等価な”サブドメインに基づいてハイブリッド酵素変異体を構築し、非相同性遺伝子から開始する多重交差タンパク質変異体ライブラリーを生じる［O'Mailleら, (2002) 前述の箇所］。同様の方法で、Voigtらによって開発された方法は、タンパク質のフラグメント、又はタンパク質の三次元構造の完全性を破壊せずに組み合わせられる‘スキーマ’を同定する計算アルゴリズムの適用に基づくハイブリッドを構築する［Voigtら, (2002) 前述の箇所］。また、コンピューター解析は、二次的な構造的要素の指定に基づいて、タンパク質の折り畳みの構造的及び機能的に重要な位置の保存コア領域を同定することができる［Mizuguchiら, Bioinformatics 16(12):1111-1119 (2000)］。PALの突然変異型は、当技術分野の方法の操作に従って得ることができる。
【０１４８】
（代替的な酵素基質としてのHAL）
ストレプトマイセス マリチムスのencPの構造は、シュードモナス プチダの構造に基づいて相同モデル化された。PALより小さいにも関わらず、ストレプトマイセス マリチムスの構造は、ヒトPALよりも小さく、恐らくencPをPALプロテインエンジニアリングに用いるアンモニアリアーゼの免疫原でない形態にする。非免疫原性PAL変異体を得るための代替的な方法は、“ヒト化”encP、又は、活性のための突然変異及び選択工程の前に更にペグ化することができる他の原核生物PALタンパク質を得るための、encP、又はPAL活性を有する他の原核生物突然変異体の選択による突然変異を用いる、ストレプトマイセス マリチムスencP、又は免疫原配列をヒトヒスチジンアンモニアリアーゼ配列［HAL、Suchiら, Biochim. Biophys. Acta 1216(2):293-295 (1993)］に置換する他の原核生物PALの突然変異体を含む。
【０１４９】
（特定のタンパク質変異体：低減されたプロテアーゼ感受性を有する変異体）
多くの戦略は、タンパク質プロテアーゼ感受性を低減させるために一般に利用される。ある実施態様においては、タンパク質分解感受性を最小限にするために導入された改良は、巨大分子の構造、機能又は安定性を損なわない。有効な戦略は、競合インヒビター［Gilbertら, (1981) 前述の箇所; 米国特許第6,548,644号; 米国特許第6,451,986号; 米国特許第6,433,158号; 米国特許第6,461,849号］等の種を安定化させる活性部位を有する酵素の提供、感受性のあるLys及び／又はArg部位でトリプシン結合部位をブロッキングするためにアミノ基を化学的に改質すること、切断感受性を停止、PALを他の保護巨大分子（Fc抗体ドメイン、又はボツリヌス神経毒素の無毒成分等）に連結又は結合するために小さい中性アミノ酸にキモトリプシン感受性Tyr、Phe及び又はTrp残基を突然変異させること、及び／又は、PEG又は他の化学的保護基及び安定化基でのその後の化学誘導体化のためにプロテアーゼ感受性部位付近のLys又はCys部位を導入することを含む。
【０１５０】
［Ｆ．化学的に修飾されたPAL変異体］
巨大分子の化学修飾は、非特異的な方法（誘導化された種を混合させる)、部位特異的な方法（野生型巨大分子の反応性誘導体化、及び／又は、部位特異的突然変異誘発と化学修飾を組み合わせて用いる部位選択性変性）、又は、発現タンパク質ライゲーション法［Hofmannら, Curr. Opin.Biotechnol. 13(4):297-303 (2002)］で行うことが可能である。ある実施態様においては、化学修飾は、免疫原性を低減させるために用いられる。ペグ化は、タンパク質の免疫原性を低減させる実証された方法である［Bhadraら, Pharmazie 57(l):5-29 (2002)］が、リン酸化、アミド化、カルボキシル化、アセチル化、メチル化、酸付加塩類、アミド、エステル、及び、N−アシル誘導体の形成を用いた修飾により、グリコシル化及び他の化学誘導体化方法も可能である［Davis, Science 303:480-482 (2004)］。
【０１５１】
［ペグ化タンパク質］
PEG化学試薬とPALタンパク質の比の範囲を用いるPALにおける一連のさまざまなペグ化反応は、それぞれの改良方法のためのPEG−PAL誘導体を提供する。最適なペグ化の程度は、PEG誘導化の範囲を決定するためにPAGEと天然ゲル分析を組み合わせて吸光度分析を用い、それぞれの誘導化PAL種で得られる残存活性に基づいて決定することができる。最適な改良の初期範囲が決定された後、相対的な動力学的解析（Vmax及びKmの測定、基質の結合定数、タンパク質分解安定性、活性のpH依存性、活性の温度依存性を含む）、及び最適なPEG−PAL種の免疫反応性を、ELISA、免疫沈降及びウェスタンブロットで決定することができる。また、プロテインエンジニアリングは、最適な誘導条件を用いて、ペグ化のための最も好ましいPAL突然変異体を生成するために利用することができる。PALタンパク質のサイズを最小限にし、PAL表面の最も強い抗原性領域を改良することのみにより、PEG修飾のコストは、最大の酵素活性及び最低の免疫原性を同時に維持して、低減される。同様に、部位特異性ペグ化は、酵素誘導体を提供するために用いることができる。
【０１５２】
リン酸化等の他の化学的改質、又はLys、Arg及びCys残基の他の化学的改質は、免疫原領域及び／又はタンパク質分解感受性領域を覆うために使用することができる。そのような化学的改質は、代表的な例である、Bednarsakiのポリマー添加法、並びに、PAL安定性を改善するための、免疫原性を低減させるための、及びプロテアーゼ抵抗性を改善するためのAltus Corporation社の架橋法を含む。Bednarsakiは、ポリマーの添加がタンパク質の温度安定性［Wangら, J. Am. Chem. Soc. 114(l):378-380 (1992)］を改善することを実証し、Altus Corporation社は、グルタルアルデヒド架橋が酵素安定性を改善することを見出した。
【０１５３】
インビボでのPAL等のタンパク質の治療半減期が、ペグ化から利益を受けるか否かを見出すために、さまざまなPEG:PAL複合体が合成され、L−Phe低減のために、インビトロで特徴付けられ、インビボで試験される。ペグ化の潜在的な効果を最適化し、かつPEG付加の好ましい部位を同定するために、ポリマー長さ、配座及びPEG付加の程度が変更される設計戦略が行われる。
【０１５４】
本発明のペグ化PALを調製する方法は、一般に、(a)PALが１以上のPEGグループに付加されるようになる条件下で、PALをポリエチレングリコールと反応させる工程、及び、(b)反応生成物を得る工程を含む。PAL改質の特定部位が複合体の固有活性を変化させることがあるので、さまざまな種及び量のPEGが調査された。PALのペグ化に用いられる化学作用は、メトキシ−PEG(O−[(N−スクシンイミジルオキシカルボニル)−メチル]−O'−メチルポリエチレングリコール)のNHSエステルを用いる、PALの第一級アミンのアシル化であった。メトキシ−PEG−NHS又はメトキシ−PEG−SPAでのアシル化によって、元の第一級アミンから電荷を除去するアミド結合が生じる。
【０１５５】
本発明の方法は、ポリマー：タンパク質複合体の実質的に均質な混合物を提供する。本明細書中で用いられる“実質的に均質な”は、ポリマー：タンパク質複合体のみがみられることを意味する。ポリマー:タンパク複合体は、生物学的に活性があり、本明細書中で提供される本発明の“実質的に均質な”ペグ化PAL調製物は、均質な調製物の利点（例えば、ロット間の薬動力学の予測性における臨床適用での容易さ）を示すのに十分に均質である調製物である。
【０１５６】
本明細書中で説明されるペグ化アプローチで使用するために意図された高分子は、水溶性高分子又はその混合物から選択することができる。当該水溶性高分子は、例えば、ポリエチレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ−(N−ビニルピロリドン)、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えばグリセロール）、HPMA、Fleximer（商標）、ポリビニルアルコール、モノ−(Cl−C10)アルコキシ−PEG、アリールオキシ−PEG、トレシルモノメトキシPEG、PEGプロピオンアルデヒド、ビス−スクシンイミジルカルボネートPEG、セルロース、又は、他の炭水化物系ポリマーからなる群より選択することができる。選択されるポリマーに付加したタンパク質が、生理環境等の水性環境で沈殿しないように、選択されるポリマーは、水溶性であるべきである。当該ポリマーは、分枝しても分枝してなくてもよい。ある実施態様においては、最終生成物の調製物の治療用途のために、ポリマーは、医薬として許容し得る。
【０１５７】
ある実施態様においては、本明細書中での使用のための水溶性高分子は、ポリエチレングリコール（略はPEG）である。本明細書中で用いられるように、ポリエチレングリコールは、モノ−(C1−C10)アルコキシ−又はアリールオキシ−ポリエチレングリコール等の他のタンパク質を誘導化するのに用いられているPEGの形態を包含することを意味する。
【０１５８】
ポリエチレングリコール分子とタンパク質分子の比率は、反応混合物のそれらの濃度と同様に変動する。一般に、最適比率（未反応の過剰なタンパク質又はポリマーがない反応効率の点で）は、選択されるポリエチレングリコールの分子量によって、及び、存在する利用可能な反応性基（一般にεアミノ基）で決定される。分子量に関しては、一般に、タンパク質に付加することができる使用されるポリマーの非常に大きい分子量、ポリマー分子の少ない数に関係がある。同様に、これらのパラメーターを最適化する場合、ポリマーの分枝を考慮に入れるべきである。一般に、分子量が高ければ（又は分枝が多ければ）、ポリマー：タンパク質の比は高い。本発明は、5kDa及び20kDaを含むが、これらに限定されない、幾つかの異なる線状PEGポリマー長さ、10kDa及び40kDaを含むが、これらに限定されない、２つのアームで分枝したPEGポリマーの複合体を包含する。ある実施態様においては、本明細書中で意図されるペグ化反応は、平均分子量は、約2kDa〜約100kDaである（用語“約”は、+/-1kDaを示す）。他の実施態様においては、平均分子量は、約5kDa〜約40kDaである。水溶性ポリマーとPALの比は、一般に、モノPEGにおいて1:1、ジPEGにおいて2:1等の範囲である。
【０１５９】
実施例６〜８は、12日間にわたるENU2又はBTBRenu2マウスにおけるフェニルアラニン量に対する、ロドスポリディウム トルロイデスからのリジン突然変異体R91K PAL、シアノバクテリア種のノストック パンクチフォルメにより生産されたPAL(NpPAL)、及び、シアノバクテリア種のアナベナ バリアビリスにより生産されたPAL(AvPAL)のペグ化された及びペグ化されていない形態の影響が記載されている。この動物モデルは、動物で重度の高フェニルアラニン血症によって生じる、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子(PAH)の遺伝子座のホモ接合突然変異体である。したがって、高い血漿フェニルアラニン(Phe)量は、この動物を、血漿Pheを低減させるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)の能力を評価するための適切なモデルにする。また、このPKU動物モデルのフェニルアラニン量に対する、ペグ化された及びペグ化されていない形態のリジン突然変異体R91K PAL及びNpPALの影響が、90日間にわたって評価された。結果では、ペグ化された形態のNpPAL及びAvPALは、ペグ化されていないNpPAL及びAvPALと比較してそれぞれ、PKU動物モデルのフェニルアラニン量が大きく低減されることが示された。また、そのようなペグ化NpPALの上昇したフェニルアラニン量を低減させる効果は、10週間にわたって維持された。これらの結果は、シアノバクテリア種である、ノストック パンクチフォルメ及びアナベナ バリアビリスからのPALのペグ化が、PKUの影響を受けたマウスのフェニルアラニン量を低減させるのに不可欠であることを示すものである。当該知見は、細菌PALのペグ化変異体が、PKUの処置における有効な治療に寄与し得ることを示唆するものである。
【０１６０】
本発明は、免疫原性が低減されたペグ化PAL変異体を意図するものである。ある実施態様は、ペグ化された形態のノストック パンクチフォルメ PAL(NpPAL)変異体である。他の実施態様は、ペグ化された形態のアナベナ バリアビリス PAL(AvPAL)変異体である。特定の実施態様は、NpPAL又はAvPAL変異体を水溶性ポリマー［例えば、ポリエチレングリコール(PEG)］と反応させることによってペグ化されたNpPAL又はAvPAL変異体を意図するものである。ある実施態様においては、ペグ化は、NpPAL又はAvPAL変異体をPEGと、少なくとも1:1、少なくとも1:1.5、少なくとも1:2、少なくとも1:3、又は少なくとも1:4のPAL:PEGで反応させることによって達成される。ある実施態様においては、AvPAL変異体はAvPAL変異体であり、ペグ化は、1:3のPAL:PEGにより達成される。本発明のペグ化PAL変異体の調製方法は、上述されている。
【０１６１】
また、本発明は、免疫原性が低減されたペグ化PAL変異体を再ペグ化することを意図するものである。ある実施態様においては、ペグ化は、NpPAL又はAvPAL変異体とPEGを２回以上それぞれ、少なくとも1:1、少なくとも1:1.5、少なくとも1:2、少なくとも1:3、又は、少なくとも1:4のPAL:PEGで反応させることによって達成される。ある実施態様においては、ペグ化は、NpPAL又はAvPAL変異体とPEGを２回、３回、４回、５回以上それぞれ、少なくとも1:1、少なくとも1:1.5、少なくとも1:2、少なくとも1:3、又は、少なくとも1:4のPAL:PEGで反応させることによって達成される。他の実施態様においては、PAL変異体はAvPAL変異体であり、ペグ化は、１回目及び２回目のペグ化反応において、1:3のPAL:PEGで反応させることによって達成される。
【０１６２】
本発明の再ペグ化PAL変異体の調製方法は、一般に、(a)PAL変異体が１以上のPEGグループに付加されるようになる条件下で、PAL変異体をポリエチレングリコールと反応させる工程、(b)反応生成物を得る工程、(c)ペグ化PAL変異体が、工程(a)からのPEGにより占められない位置で１以上のPEGグループに付加されるようになる条件下で、ペグ化PAL変異体をポリエチレングリコールと反応させる工程、及び、(d)反応生成物を得る工程を含む。PAL改質の特定部位が複合体の固有活性を変化させることがあるので、さまざまな種及び量のPEGが調査された。PALのペグ化に用いられる化学作用は、メトキシ−PEG［O−[(N−スクシンイミジルオキシカルボニル)−メチル]−O'−メチルポリエチレングリコール］のNHSエステルを用いる、PALの第一級アミンのアシル化であった。メトキシ−PEG−NHS又はメトキシ−PEG−SPAでのアシル化によって、元の第一級アミンから電荷を除去するアミド結合が生じる。
【０１６３】
［Ｇ．選択及びスクリーニング分析］
活性のあるPAL又はHAL変異体の生成及びスクリーニングにおいては、初期突然変異体クローンの発現は、His標識ベクター発現系等の公知の発現系を利用することができ、タンパク質変異体の単離のための高スループット金属キレート精製工程を促進することができる。三層スクリーニング系は、好ましいタンパク質変異体を同定するために使用することができる。初期ポジティブクローンの同定は、フェニルアラニン栄養要求性の大腸菌の増殖における形質転換及び選択を用いることができる。スクリーニングの第二ラウンドは、高スループット処理に適用可能なOD290吸光測定［Hodgins, Biochem. Biophys. Res. Commun., 32:246-253 (1968)］を利用することができる。そして、タンパク質分解抵抗性（プロテアーゼ反応混液の存在下でインキュベーションを用いて）、あるいは免疫原性の低減（拮抗的なELISA測定を用いて）のスクリーニングは、好ましいタンパク質変異体を同定するために用いることができる。
【０１６４】
［Ｈ．治療用途及び最適化されたPALタンパク質の投与］
（１．さまざまな形態の高フェニルアラニン血症(HPA)）
本発明は、PALの組成物単独、又はHPA及び／又はPKUの処置のための他の治療規制と併用しての使用を含む方法によるさまざまなHPA患者集団の治療に関する。特に、PALの組成物が、食事療法を通常利用しない程度に十分に低いフェニルアラニン濃度の患者集団（すなわち、軽症型HPAの患者）、中程度のPKUの患者、古典的重症型PKUの患者、及びその下位個体群の治療のために使用することができることを意図するものである。軽症型HPAの影響を改善するPALの組成物で治療することが可能なそのような患者は、200μM未満の血清濃度の妊婦及び幼児を含む。さまざまな患者集団、及びそのさまざまな治療の必要性は、本項で更に詳細に考察される。
【０１６５】
本発明の特定の実施態様は、PAL又は生物学的に活性のあるその変異体、突然変異体若しくはフラグメントを含む組成物と併用してタンパク質制限食を被験者に投与することによる古典的重症型PKUの治療であって、該タンパク質制限食とPALの併用投与が、該併用投与をしない状態の被験者の血漿中のフェニルアラニン濃度と比較して、被験者の血漿中のフェニルアラニン濃度を低減させるのに有効である治療に関する。また、本発明は、PAL又は生物学的に活性のあるその誘導体と併用してタンパク質制限食を投与することによってHPAの妊婦を治療することであって、該タンパク質制限食とPALの併用が、該併用投与をしない状態の血漿中のフェニルアラニン濃度と比較して、妊婦の血漿中のフェニルアラニン濃度を低減させるのに有効であることを意図するものである。特定の実施態様においては、治療は、420μMより高いPhe量を示す患者のために意図される。
【０１６６】
本発明の他の実施態様は、PAL投与前における血漿Phe濃度が180μMより高いことで特徴付けられるPALの組成物を患者の血漿Phe濃度を低減させるのに有効な量でHPAの個体に投与することを必要とする。本発明の方法は、300μMより高い上昇したPhe濃度で特徴付けられるPKUの幼児を、本明細書中で記載されるPALの組成物で治療するのに有用である。本願の“幼児”とは、０〜約36月の年齢である患者をいう。
【０１６７】
（古典的重症型PKUの特性及びその治療方法）
重度のPKUは、1200μMより高い血漿Phe濃度を示し、4800μM程度の高い濃度であることがある。この疾患の患者は、血漿Phe濃度を臨床的に許容し得る量（一般に、600μM未満、又は300μM未満）までにするために、Pheが無い食事で治療する必要がある。これらの患者は、１日当たり最大250〜350mgの食事Pheを許容できるのみである［Spaapenら, Mol. Genet Metab. 78:93-99 (2003)］。そのため、これらの患者は、誕生後７〜10日間のPhe制限食から始めて、残りの生涯においてこの食事制限が負担させられる。これらの個体が負担させられる厳密な食事制限の緩和が有益である。
【０１６８】
典型的なPheの個体の診断に用いられる試験は、下に更に詳細に説明される。これらの試験は、古典的重症型PKUの患者が低いフェニルアラニン食事を必要とすることを明らかにした［Luckeら, Pediatr. Neurol. 28:228-230 (2003)］。したがって、本発明の方法は、個体の血漿Phe濃度の監視により、患者が古典的PKUに罹患していることを決定することを必要とすることを意図するものである。患者は、血漿Phe濃度を少なくとも25％低減させるように、原核生物PALの組成物を単独、又は少量のタンパク質制限食と併用して投与することによって治療される。ある実施態様においては、当該方法は、血漿Phe濃度を30％低減させる。他の実施態様においては、当該方法は、個体の血漿Phe濃度を40％、50％、60％、70％、80％、90％、又はそれより多く低減させる（例えば、4800μMのPhe濃度である古典的重症型PKUの患者の場合、Phe濃度が90％低減され、食事制限をほとんど必要としない程度に十分に低い濃度である480μMの血漿Phe濃度となる）。当然、本発明の治療方法（古典的重症型PKU、又は本明細書中で記載される他のHPA）は、患者の血漿Phe濃度を、約120μM〜約360μM±15μMにできる限り近い範囲、又は約120μM〜約240μMの最適な範囲に低減させようと試みるものであることは理解されるべきである。
【０１６９】
ある実施態様においては、治療される古典的PKU患者の血漿Phe濃度は、1000μMより高い無制限の血漿Phe濃度から600μM未満の血漿Phe量に低減される。当然、PALとタンパク質制限食との併用治療により血漿Phe濃度の低減が少ない（例えば、800μM〜約1200μM）場合は、この範囲の血漿Phe濃度である患者が、Phe制限食を摂食することに対して食事中のタンパク質の量を単に制限することにより、その疾病を処置することができ、個体の生活の質を顕著に向上させ、食事制限への患者のコンプライアンスを高くするので、これは、治療の臨床的に有用な結果とみなされる。
【０１７０】
治療の結果としての患者によって許容することができる食事Phe量の増加は、治療上有効な結果であると考えられる。例えば、PAL治療を実施する結果として、患者が食事Pheの摂取を250〜350mg／日から350〜400mg／日に増加させる（すなわち、患者のPhe許容表現型は、古典的PKU患者のものから中程度のPKU患者まで変更される）ことができることを意図するものである。当然、本明細書中で教示される治療的介入は、患者が食事Pheの摂取を250〜350mg／日から400〜600mg／日に増加させる（すなわち、患者のPhe許容表現型は、古典的PKU患者のものから軽症型PKU患者まで変更される）、又は600mg Phe／日より多く患者に摂取させる（すなわち、通常の食事摂取）ことが望まれる。
【０１７１】
（BH4非反応性PKU患者の特性及びその治療方法）
本発明の方法で治療することができる患者の第二のグループは、上昇した血漿Phe濃度を有する［すなわち、200μMより高い濃度であるが、BH4治療（下記のBH4負荷試験で決定される）に非反応性であると診断されている］個体である。そのような患者は、軽症型PKUの個体（すなわち、600μM以内の血漿Phe濃度）である個体、中程度のPKUの個体（すなわち、600μM〜約1200μMの血漿Phe濃度）、及び古典的重症型PKUの患者（すなわち、1200μMより高い血漿Phe濃度）を含み得る。
【０１７２】
BH4治療に非反応性である患者は、該患者の血漿Phe濃度を低減させるために、食事に低減された量のタンパク質と併用してPALが提供される。本発明の方法は、PAL治療をしない状態で処置された同じ食事のプロトコールによる低減と比較して、PALの投与が、患者の血漿Phe濃度を大きく低減させるものである。食事制限は、低減された量のPheを有する合成医用タンパク質処方を提供することによってPhe摂取を制限する食事であり、あるいは、食事制限は、患者がすべてのタンパク質摂取を制限するが、制限された量の通常の食事をすることは許容されることを単に要求されるものであってもよい。
【０１７３】
古典的PKU患者のために考察された治療結果は、引用により本項に組み込まれる。中程度のPKU患者の治療結果（すなわち、600μM〜1200μM無制限の血漿Phe濃度である患者）は、患者の血漿Phe濃度の少なくとも25％の低減を含む。ある実施態様においては、当該方法は、血漿Phe濃度を30％低減させる。他の実施態様においては、当該方法は、個体の血漿Phe濃度を40％、50％、60％、70％、80％、90％、又はそれより多く低減させる（例えば、1000μMのPhe濃度である中程度の古典的PKUの患者の場合、Phe濃度が90％低減され、食事制限をほとんど又はまったく必要としない程度に十分に低い濃度である100μMの血漿Phe濃度となる）。
【０１７４】
ある実施態様においては、治療される中程度のPKU患者の血漿Phe濃度は、600μM〜1200μMの無制限の血漿Phe濃度から300μM未満の血漿Phe量に低減される。ある実施態様においては、PAL（単独、又は制限食との併用）での治療は、血漿Phe濃度の低減を少なくし（例えば、200μM〜約400μM）、これは、この範囲の血漿Phe濃度である患者が、Phe制限食を摂食することに対して食事中のタンパク質の量を単に制限することにより、その疾病を処置することができるので、治療の臨床的に有用な結果とみなされる。確かに、多くの研究においては、そのような患者が更に通常の食事を摂ってもよいことが教示されている。
【０１７５】
治療の結果としての患者によって許容することができる食事Phe量の増加は、治療上有効な結果であると考えられる。例えば、PAL治療（単独、又は他の治療的介入を併用して）を実施する結果として、患者が食事Pheの摂取を350〜400mg／日から400〜600mg／日に増加させる（すなわち、患者のPhe許容表現型は、中程度のPKU患者のものから軽症型PKU患者まで変更される）ことができることを意図するものである。当然、本明細書中で教示される治療的介入は、患者が食事Pheの摂取を350〜400mg／日から600mg Phe／日より多く患者に摂取させる（すなわち、通常の食事摂取）ことが望まれる。
【０１７６】
治療される患者が、軽症型PKU（すなわち、400〜600mg Phe摂取／日の栄養所要量である）のみを示す場合、360μM±15μMに可能な限り近い正常化された血漿Phe濃度にすることが望まれるため、本発明のPALに基づく治療から利益を受ける。そのような患者においては、有利な治療結果は、患者の血漿Phe濃度の少なくとも25%の低減を含む。ある実施態様においては、当該方法は、血漿Phe濃度を30％低減させる。他の実施態様においては、当該方法は、個体の血漿Phe濃度を40％、50％、60％、又はそれより多く低減させる［例えば、600μMのPhe濃度である軽症型PKUの患者の場合、Phe濃度が60％低減され、360μMの血漿Phe濃度（すなわち、血漿Pheの許容し得る正常濃度）となる］。
【０１７７】
ある実施態様においては、治療される軽症型PKU患者の血漿Phe濃度は、400μM〜600μMである無制限の血漿Phe濃度から100μM未満の血漿Phe量に低減される。当然、PALでの治療（単独、又は食事制限と併用して）が、血漿Phe濃度の低減が少ない（例えば、200μM〜約400μM）場合であっても、これは、治療の臨床的に有用な結果とみなされる。
【０１７８】
治療の結果としての患者によって許容することができる食事Phe量の増加は、治療上有効な結果であると考えられる。例えば、PALでの治療（単独、又は他の治療的介入と併用して）の結果として、患者が食事Pheの摂取を400〜600mg／日（すなわち、患者のPhe許容表現型は、軽症型PKU患者のものから軽症型HPA患者まで変更される）から増加させて、600mg Phe／日より多く患者に摂取させる（すなわち、通常の食事摂取）ことを意図するものである。
【０１７９】
また、PKU、HPAの症状を示さないのみの患者（すなわち、600μM以内の上昇した血漿Phe濃度である）である場合、上昇した血漿Phe濃度が、そのような個体のIQに対して有意な効果を有することが示されているため、通常の食事を摂ることが許容されなければ、本発明のPAL治療から利益を受けることができる。さらに、下で考察されるように、特別な要求のある被験者（例えば、妊婦及び幼児）のPALの治療的介入は、たとえ、患者の血漿Phe量が200μM未満の知られた“安全な”量であっても、特に重要である。
【０１８０】
（妊婦のPKU及びその治療方法）
妊娠を計画する及び妊娠しているPKU女性の血漿Phe量の代謝制御は、胎児のPAH状態に関わらず、子宮内の適度に上昇したPhe量で暴露された胎児への深刻な影響のために重要である。適切な制御を達成しないと、小頭症、精神薄弱及び先天性心疾患を含む疾患を生じるため、血漿Phe濃度の治療による制御は、妊娠第一期で特に重要である。
【０１８１】
例えば、フェニルケトン尿症に関するNIHコンセンサス声明(NIH Consensus Statement)（第17巻 #3 2000年10月）は、3〜10mg/dLの妊婦のPhe量への胎児の暴露が、小頭症の24%を発生させ、20mg/dLより高い（すなわち、1200μMより高い）Phe量が、小頭症の73%を発生させることを報告した。同様に、先天性心疾患は、20mg/dLより高い妊婦のPhe量に暴露された子供の10％超でみられた。重要なことに、6mg/dLより高いPhe量は、子供のIQを顕著に減少させることを示した。したがって、すべての形態のフェニルケトン尿症の女性の血漿Phe濃度は、最も軽症型のHPAを示していても、妊婦のPKU症候群の罹患を回避するために、確実に厳格に制御される必要がある。しかしながら、米国の病院で用いられているPKU女性の血漿Phe濃度の許容し得る目標水準は、10mg/dL〜15mg/dLの範囲であり、これは、英国及びドイツの病院で用いられる、妊婦のPKU症候群の進行の危険性を低減させるための、妊婦に推奨される2〜6mg/dL、又は1〜4mg/dLよりも高い。
【０１８２】
妊婦への他の重要な配慮は、すべてのタンパク質の摂取である。妊娠中において、低タンパク質食が、腎臓発生障害及びその後の腎単位数の低減を発生させ、滞在的に成年期での高血圧症に誘導させると示唆された［D'Agostino, N. Engl. J. Med. 348(17)1723-1724, (2003)］ので、女性は、十分にタンパク質を摂ることが重要である。次の表は、さまざまな個体の推奨される合計の食事性タンパク質摂取の例示的なガイドラインである。
【０１８３】
【表２】
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【０１８４】
上の例示のガイドラインのとおり、米国では、出産適齢期（例えば51歳未満）の女性の推奨されるタンパク質摂取は、約44〜50g／日であるが、妊婦は、約60g／日の摂取が推奨される。カナダと英国では、妊婦の推奨されるタンパク質摂取は、約70g／日及び52g／日の順である。したがって、妊婦の血漿Phe濃度レベルを確実に厳格に制御する必要は、更にPKU患者のこのグループが、比較可能な年齢の妊娠していないPKU女性より多くのタンパク質を必要とするという事実によって複雑化される。
【０１８５】
上記を考慮して、本発明のPAL治療は、妊婦に特に有用であることを意図するものである。妊娠している又は妊娠を意図している任意の形態のHPAに罹患している女性は、PAL治療の過程に置かれ、血漿Phe濃度レベルは、可能な限り180μM〜約360μM近くに確実に維持されることを意図するものである。治療のそのような過程は、当該女性が正常なタンパク質摂取量を増加させることを可能にする。
【０１８６】
血漿Phe濃度レベル、及び本明細書中の上記で考察される低減されるべきそのようなPhe濃度の程度の考察は、妊婦についての本項に組み込まれる。
【０１８７】
（幼児のPKUの処置及びその治療方法）
本明細書全体で考察されるように、幼児（0〜3歳）の血漿Phe濃度の上昇が、子供のIQを顕著に低下させることが判断されている。しかしながら、本明細書の他の箇所で考察されたように、400μMまで血漿Phe濃度が上昇した患者は、通常食事療法を受けない。したがって、0〜3歳の幼児は、本治療から深刻な悪影響を受ける。幼児への適用は、被験者の血漿Phe濃度の有益な低減のために、PALを含む治療組成物で、360μM15μMより高い無制限の血漿Phe濃度の幼児を治療することを意図するものである。
【０１８８】
ある実施態様においては、幼児は、0〜3歳の年齢であり、PAL投与前の無制限の血漿Phe濃度が約1200μMであり、該投与により血漿Phe濃度を低減される。ある実施態様においては、血漿Phe濃度は、投与において、1800から、約1500μM、約1200μM、約1100μM、約1000μM、約900μM、約800μM、約700μM、約600μM、約550μM、約500μM、約450μM、約400μM、約350μM、約300μM、約275μM、約250μMに低減される。他の実施態様においては、幼児は、0〜3歳の年齢であり、無制限の血漿Phe濃度が1200μMより高く、この血漿Phe濃度が、PAL単独投与、又は食事との併用投与において、約800μM、約500μM、又は約360μMに低減される。当業者は、本発明は、PALで血漿Phe濃度を低減させるための、360μMより高い無制限の血漿Phe濃度の幼児を治療することを意図するものであることを理解する。上の血漿Phe濃度の低減治療の考察は、引用により本明細書中に組み込まれる。また、初期の無制限の血漿Phe濃度の10％超の低減は、幼児の治療規制における治療結果と考えられる。PAL治療は、そのような幼児の血漿Phe濃度の治療的低減を達成するために、食事制限と組み合わせることができると理解されるべきである。
【０１８９】
表２は、治療有効量のPALの投与が有益である多くの疾病の症状を一覧化した。口腔、経口、他の投与の標準的な経路、及び用量は、標準的な方法によって決定することができる。
【０１９０】
【表３】
0005670183.tif 000004
【０１９１】
（２．治療において使用する組成物）
本発明は、PKU/HPAの治療的介入を意図するものである。そのような介入は、PALの使用の初期に基づくものであり、PAL単独、又は食事制限と組み合わせて用いることができる。また、PAL及び／又は食事制限は、設計される他の治療的組成物［例えば、脳のPhe蓄積を防止する大きい中性アミノ酸等の他のPKUの治療を意図するもの（Kochら, Mol. Genet. Metabol. 79:110-113 (2003)参照）、又はチロシン補給］と更に組み合わせてもよい。本項は、本明細書中で意図される治療で用いられ得る組成物についての考察を提供する。
【０１９２】
（PAL組成物）
一般に、本発明は、本発明に係る有効量のタンパク質又はその誘導生成物と、１以上の医薬として許容し得る希釈剤、安定化剤、保存剤、溶解剤、乳化剤、佐剤、及び／又はキャリアを含む医薬組成物を意図するものである。そのような医薬組成物は、さまざまな緩衝液内容物（例えば、Tris−HCl、リン酸塩）、pH及びイオン強度の希釈剤；洗剤及び可溶化剤（例えば、ポリソルベート20、ポリソルベート80）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）、及び充填物質(bulking substance)（例えば、ラクトース、マンニトール）等の添加剤を含む。例えば、Remingtonの薬学(Remington's Pharmaceutical Sciences), 第18版 (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa.) ページ1435:1712（本明細書中に引用により組み込まれる）を参照されたい。活性成分の有効量は、当業者により、体重、年齢及び治療目的等の要因を考慮して容易に決定することができる、治療上、予防上、又は診断上有効な量である。
【０１９３】
また、本発明のPEG:PALの組成物は、溶液のpHを所望の範囲に維持する緩衝剤を含んでもよい。例示的な緩衝剤は、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、及び、クエン酸ナトリウムを含む。また、これらの緩衝剤の混合物を用いてもよい。当該組成物に有用な緩衝剤の量は、用いる特定の緩衝剤、及び溶液のpHに非常に依存する。例えば、酢酸塩類は、より少ない量で、pH６よりもpH５で溶液において用いられ得るので、pH６よりも、pH５で効果的な緩衝剤である。ある実施態様においては、本発明の組成物におけるpHの範囲は、pH3.0〜7.5である。
【０１９４】
本発明の組成物は、溶液を等張にして、注入に適合させるために、更に等張性調節剤(isotonicity-adjusting agent)を含んでもよい。一例は、0〜150mMの範囲の濃度である塩化ナトリウムである。
【０１９５】
本明細書中で用いられるように、PEG:PAL複合体が意図される場合、用語“治療有効量”とは、血清中のL−フェニルアラニン量を低減させ、患者に有益な効果を奏する量をいう。当該治療有効量は、ある個体から他の個体で変動し、患者の全体的な健康状態を含む多くの因子に依存する。治療に用いる原核生物PALの量は、血清中のL−フェニルアラニン量の許容し得る割合の低減を提供し、有益な量（通常は約30％、一般には10〜50％の範囲）のPAL治療時においてこの値を維持する。本発明の組成物の治療有効量は、公的に利用可能な物品及び方法を用いて、当業者が容易に確認することができる。
【０１９６】
本発明は、野生型PALよりも頻度が少ない、PEG:PAL複合体の投与を提供する。投与頻度は、治療される症状に依存して変動するが、一般には、週約１回である。正確に用いられる投与頻度は、さまざまな個体によるPEG:PAL複合体に対する反応の変動により、本明細書中で開示される頻度から多少変動してもよいと理解され、用語“約”は、そのような変動を反映することを意図する。
【０１９７】
したがって、本発明は、血清のL−フェニルアラニン量を低減させるために使用することができる。最も一般には、血清のL−フェニルアラニン量は、高フェニルアラニン血症により上昇する。本発明によって治療可能な症状には、フェニルケトン尿症に関連する高フェニルアラニン血症が含まれる。また、治療可能な症状は、チロシン血症でみられるように、血清のL−フェニルアラニン量を増加させる。さらに、血清のL−フェニルアラニン量及び／又は血清のL−チロシンの欠乏が有益とされる、多数の癌に関連する病状は、本発明のPEG:PAL複合体で治療することができる。
【０１９８】
ある実施態様においては、本発明により調製されるPEG:PAL複合体は、腹腔内で、皮下に、又は筋肉内注入により投与される。しかし、本発明の組成物を用いて、他の送達経路も有効に利用可能であることは、当業者に明らかである。
【０１９９】
本明細書で記載される方法は、上述の分子と、１以上の医薬として許容し得る賦形剤、ビヒクル、及び、任意に他の治療及び／又は予防成分とを含む医薬組成物を用いる。そのような賦形剤は、水、食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノール、シクロデキストリン、改質シクロデキストリン（すなわち、スルホブチルエーテルシクロデキストリン）等の液体を含む。また、非液体配合物に適切な賦形剤も、当業者に公知である。
【０２００】
医薬として許容し得る塩は、本発明の組成物で用いることができ、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の無機酸塩；及び、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等の有機酸塩を含む。医薬として許容し得る賦形剤及び塩類の充分な考察は、Remingtonの薬学(Remington's Pharmaceutical Sciences), 第18版(Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)において有効である。
【０２０１】
また、湿潤剤又は乳化剤等の補助剤、生理的緩衝剤、界面活性剤等が、そのようなビヒクルに含まれてもよい。生理的緩衝液は、実質的に、医薬として許容し得、所望のpH（すなわち、生理学的に許容し得る範囲）の配合を提供する溶液である。緩衝液の例は、食塩水、リン酸塩緩衝食塩水、トリス緩衝食塩水、ハンクの緩衝食塩水(Hank's buffered saline)等を含む。
【０２０２】
意図される投与形式によって、医薬組成物は、例えば、タブレット、坐剤、ピル、カプセル剤、パウダー、液体、懸濁剤、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤等の個体、半個体又は液体剤形であってもよく、ある実施態様においては、正確な用量の１回投与に適している単位剤形である。当該組成物は、有効量の選択される薬剤と医薬として許容し得るキャリアを含み、これに加えて、医薬的薬剤、佐剤、希釈剤、緩衝剤等を含んでもよい。
【０２０３】
一般に、本発明の化合物又は複合体は、経口（口腔内及び舌下を含む）、直腸、鼻、局所、肺、膣、非経口（筋肉内、動脈内、鞘内、皮下及び静脈内）投与、又は、吸入若しくは注入による投与に適している形態に適しているそれらを含む医薬配合物として投与される。例示的な投与方式は、苦痛の程度によって調整することが可能な都合のよい毎日の投与計画を用いた静脈内である。
【０２０４】
固形組成物においては、従来の無毒な固体キャリアは、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を含む。液体医薬として投与し得る組成物は、例えば、本明細書に記載されている活性のある化合物又は複合体、及び、例えば、水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノール等の賦形剤中の任意の補助薬を溶解、分散すること等で溶液又は懸濁液を形成することにより調製することができる。また、必要であれば、投与される医薬組成物は、少量の無毒な補助剤［湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝剤、張度調整剤（tonicifying agent）等で、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレアート等］を含んでもよい。そのような剤形の実際の調製方法は、公知であるか、当業者に明らかである（例えば、上述のRemingtonの薬学を参照）。
【０２０５】
経口投与においては、当該組成物は、一般に、タブレット、カプセル、又はソフトカプセルの形態をとるか、あるいは、水性若しくは非水性の溶液、懸濁液又はシロップでもよい。タブレット及びカプセルは、経口投与の形式である。経口用のタブレット及びカプセルは、一般に、１以上の一般的に用いられるラクトース及びコーンスターチ等のキャリアを含む。また、ステアリン酸マグネシウム等の平滑剤も一般に添加される。液体懸濁液が使用される場合、活性剤を乳化剤及び懸濁剤と組み合わせてもよい。必要であれば、香味料、着色剤及び／又は甘味剤も同様に添加してもよい。本明細書中における経口製剤への導入のための他の任意成分は、保存剤、懸濁剤、増粘剤等を含むが、これらに限定されない。
【０２０６】
非経口製剤は、液体溶液又は懸濁液、注入に先駆けて液体において可溶化若しくは懸濁するのに適切な固体、あるいは、エマルジョンの従来の形態において調製することができる。ある実施態様においては、キャリア、分散剤又は湿潤剤、及び懸濁剤を用いる当技術分野において公知の方法によって、無菌注入懸濁剤が製剤化される。また、当該無菌注入懸濁剤は、無毒の非経口的に許容し得る希釈剤又は溶剤における無菌注入溶液、又は懸濁液であってもよい。利用可能な許容し得るビヒクル及び溶剤は、水、リンゲル液、及び等張食塩水である。また、無菌の、不揮発性油、脂肪酸エステル、又は多価アルコールが、溶剤又は懸濁溶媒として従来どおり用いられる。さらに、非経口投与は、一定の用量が維持される持続放出又は徐放システムの使用を含んでもよい。
【０２０７】
上記の同定されたPEG:PAL複合体は、心疾患を治療又は改善するのに治療有効用量で患者に投与することができる。そのような複合体の毒性及び治療有効性は、例えば、LD50（母集団の50％までの致死用量）及びED50（母集団の50％までの治療有効用量）を測定すること等の細胞培養物、又は実験動物において、標準的な薬学的方法によって測定することができる。毒性と治療効果との間の用量の比は、治療指数であり、比LD50/ED50として表すことができる。ある実施態様においては、高い治療指数を示す複合体が用いられる。
【０２０８】
細胞培養分析及び動物実験から得られるデータは、ヒトで使用される一連の用量を公式化するのに用いることができる。ある実施態様においては、用量は、少量又は最小限毒性のED50を含む一連の血中濃度以内である。当該用量は、用いられる剤形、及び利用される投与経路に依存してこの範囲内で変動する。治療有効用量は、細胞培養分析及び動物モデルから測定することができる。
【０２０９】
（食事性タンパク質）
HPA/PKU患者へのPAL及びその類縁体の投与に加えて、患者の食事性タンパク質もまた、限定又は変更可能であることが意図される。当業者は、PKUの治療に用いるさまざまな市販のタンパク質配合物を認知している。そのような配合は、MAXIMAID, PHENEX 1, PHENEX 2（Ross Laboratories社製, Liverpool, UK）、LOFENALAC、PHENYL−FREE（Mead-Johnson社製)等を含む。
【０２１０】
当業者は、一般に、Phe濃度が存在しない参照されたタンパク質配合物を用い得る。当該タンパク質配合物は、PKU患者に不足しているアミノ酸が補給されている。そのようなアミノ酸は、例えば、L−チロシン及びL−グルタミンを含む。PKU患者の食事に、バリン、イソロイシン及びロイシンを補給するのが望ましいことが提案されている（米国特許第4,252,822号参照）。特定の臨床症状においては、PKUの毒性効果は、チロシン及びトリプトファン等の他のアミノ酸の脳摂取を阻害するPheによって生じる。PKU患者の食事にそのような過剰量の大きな中性アミノ酸を補給すると、脳へのPhe摂取が阻害され、脳のPhe量を低減させることが明らかになった。したがって、本発明の方法においては、食事療法は、更に１以上のこれらのアミノ酸を含む組成物で補給することができると考えられる［Kochら, Mol. Genet. Metabol. 79:110-113 (2003)］。
【０２１１】
また、ヒトの乳及び他の食料で一般に見出される、L−カルニチン及びタウリンは、タンパク質制限に加えて、補給されるべきものであることが知られている。特定の実施態様においては、L−カルニチンは、100gのタンパク質補給で20mg補給することができる。また、タウリンは、ヒトの乳及び動物起源の食品で一般に見出される十分な量のこれらの因子を補助するために、100gのタンパク質補給で40mg補給することができる。
【０２１２】
また、当業者は、食事性タンパク質制限に関わらず、他の補給物が提供されるように患者に補給されるべきである、必須ビタミン及びミネラル等の他の成分について、2000年全米科学アカデミー全米研究評議会の食事摂取基準(2000 National Academy of Sciences-National Research Council Dietary Reference Intakes)を参照する。
【０２１３】
全タンパク質量及び望ましい血漿Phe濃度に関する上述の考察を参照して、当業者であれば、要求される食事性タンパク質制限の量を決定し、それに従って患者の食事を調整することができる。例えば、約11〜14歳の男性を考慮すると、その個体は、45gタンパク質／日を摂取すべきである。該個体が古典的重症型PKUである場合には、無制限の血漿Phe濃度は、恐らく1200μMよりも高く、その個体についての食事性タンパク質源のすべてが、血漿Phe濃度を600μM未満に低減させる、粉末状タンパク質補給物からのものでないようであれば、ほとんど同様である。PALを被験者に投与することによって、治療結果は、患者の血漿Phe濃度において大きく低減させるものであり、あるいは、治療結果は、個体の血漿Phe濃度が同程度に低減されるものであるが、その個体は、食事処方からというよりはむしろ通常の食事からのタンパク質を許容することができる。
【０２１４】
同様に、約11〜14歳の男性は、中程度のPKUであり、本発明の方法を用いて、制限された処方よりはむしろ通常のタンパク質摂取において割当られた45gタンパク質／日を与えることが可能である。本発明の方法が効果的であるか否かを決定することは、定期的に患者の血漿Phe濃度を測定し、血漿Phe濃度を少なくとも400μM未満に確実に維持することを必要とする。そのような濃度を測定するための試験は、以下に記載されている。ある実施態様においては、約360μM以下の濃度が達成される。
【０２１５】
（３．患者集団の確認及び監視）
本明細書の全体にわたって考察されるように、所定の患者が、PAL治療に感受性があるか否かを決定すること、及び、治療規制の効果を監視するために、治療されるPKU患者の種類を確認する初期と治療規制の実行時の両方で、当該患者のフェニルアラニン濃度を測定することが本発明のさまざまな実施態様において必要である。そのような方法の例は、以下に記載されている。
【０２１６】
（BH4負荷試験）
BH4負荷試験は、BH4の欠乏による、又はPAHの欠乏を通じて、HPA患者間の識別を可能とする。
【０２１７】
最も単純なBH4負荷試験は、内因性BH4を投与し、血漿Phe濃度の低減に対する該投与の効果を判断する試験である。2mg/kgのBH4静脈内負荷は、Danksらの文献、Lancet 1:1236 (1976)によって初めて提案され、高純度のBH4が利用可能となるに従って、約2.5mg/kg体重のBH4の経口投与で試験を行うことが可能になった。結局、ある研究所は依然として、20mg BH4/kg体重まで用いているが、7.5mg/kgのBH4の１回経口用量が投与される標準化されたアプローチが、Niederwieserらによって提案された［Niederwieserら, Eur. J. Pediatr. 138:441 (1982)］。
【０２１８】
単純なBH4負荷試験が信頼性のある結果を生じるために、患者の血液Phe量は、400μMよりも高いことを必要とする。したがって、患者にとって、負荷試験を行う前に、２日間でPKU食から除去されることが慣習的によくある。BH4試験キットは、市販されており、Dr. Schircks Laboratories社(Jona, Switzerland)によって配給されている。このキットは、通常の食事の摂取から約30分後における20mg BH4/kg体重の投与を推奨する。
【０２１９】
（Phe濃度の測定）
血液中のPheの測定方法は、多数存在する［Shawら, 「フェニルケトン尿症における分析方法−臨床生化学 (Analytical Methods in Phenylketonuria-Clinical Biochemistry)」、Bickettら, Eds., 「フェニルケトン尿症及び他のアミノ酸代謝の先天異常(Phenylketonuria and Some Other Inborn Errors of Amino Acid Metabolism)」 Stuttgart, Georg Thiem Verlag, 47-56 (1971)］。一般に、フェニルアラニン及びチロシン濃度は、蛍光分析を用いて患者の血清から測定される。この分析は、ロイシルアラニンの存在下でニンヒドリンと共にフェニルアラニンを加熱した場合の蛍光物質の形成に依拠する［McCamanら, J. Lab. Clin. Med. 59:885-890 (1962)］。
【０２２０】
Phe濃度を測定するための最も一般的な方法は、ガスリー試験であり、患者からの血液試料で飽和されているろ紙からディスクを打ち抜く。均一なディスクを、バチルス スブチリス(Bacillus subtilis)を接種され、バチルス スブチリス増殖の特異的阻害剤を含有する寒天のトレイ中でインキュベートする。フェニルアラニンが均一なディスクから寒天へ移動するに従って、Pheは、細菌増殖阻害を逆にし、既知量のPheを含有するディスクを用いて行った同様の分析と比較することによって、フェニルアラニン濃度に相関させることができる細菌増殖の領域を生じる。
【０２２１】
Phe濃度を定量する他の方法は、HPLC、質量分析、薄層クロマトグラフィー等を含む。そのような方法を用いて、治療の前に患者の血漿Phe濃度を測定し、治療規制時にPhe濃度を監視して、その有効性を判断することができる。
【０２２２】
患者の血漿Phe量を、治療規制の時間的経過の全体にわたって一定の間隔（例えば、毎日、一日おきに、又は毎週）で監視することが意図される。そのような規則性で血漿Phe量を監視することにより、臨床医は、治療の有効性を評価し、PAL及び／又は食事性タンパク質必要物を調節することができる。
【０２２３】
（４．併用療法）
本発明の特定の方法は、さまざまな形態のHPAの患者に治療結果をもたらすためのPALと食事性タンパク質制限の併用を含む。本明細書で意図される併用療法での適切な治療結果を達成するために、一般に、被験者に、PALの組成物、及び、所望の治療結果をもたらす（すなわち、血漿Phe濃度を低減させること、及び／又は、血漿Phe濃度の同時増加を生じることなく、多量のPhe／タンパク質摂取を許容する能力）のに有効な併用量の制限食を投与する。このプロセスは、PALの組成物、及び食事性タンパク質の治療用組成物を同時に投与することを含んでもよい。  これは、食事性タンパク質の必要物をすべて含み、また、当該タンパク質配合物でPALを含む、単一の組成物、又は薬理学的タンパク質配合物を投与することにより達成することができる。あるいは、食事性タンパク質（補給物、又は一般のタンパク質食品）を、PALの薬理学的タンパク質配合物（タブレット、注射又は飲料）とほぼ同時に摂取する。また、原核生物PALは、プロテインバー、又は、摂取に適しているブラウニー、パンケーキ、ケーキ等の他の食品に配合してもよい。
【０２２４】
他の代替においては、PAL治療は、分から時間に及ぶ間隔による食事性タンパク質治療に先行するか後続することができる。タンパク質及びPALの組成物が別々に投与される実施態様においては、PALが常に患者に対して有利な効果を奏することができるように、一般に、重要な期間が、それぞれの送達時間の間に失効しないことが保証されている。そのような場合においては、食事性タンパク質の摂取の約２〜６時間以内（前後）に（約１時間のみの遅延時間が最も好ましい）PALを投与することを意図するものである。特定の実施態様においては、PAL治療は、患者にPALを無期限で毎日投与する、連続的な治療である。他の状況においては、例えば、軽度の形態のPKU及びHPAのみである妊婦においては、PAL治療は、該女性が妊娠している、及び／又は授乳させている限りは、継続させるに過ぎない。
【０２２５】
また、PAL及び食事性タンパク質制御の送達のみに基づく治療に加えて、本発明の方法は、HPAの症状の１以上を特異的に標的とする第三の組成物との併用療法も意図される。例えば、HPAで生じたチロシンの欠乏により、神経伝達物質ドーパミン及びセロトニンが欠乏することが知られている。したがって、本発明の関係においては、PAL及び食事性タンパク質に基づく方法は、Ｌ−ドーパ、カルビドーパ及び5−ヒドロキシトリプトファン神経伝達物質の投与を更に組み合わせて、食事におけるチロシンの低減された量によって生じる欠乏を調整することができる。
【０２２６】
PALの投与は、（PAHの投与とは異なり）チロシンを生成しないので、そのような治療は、依然として、そのような患者にとっては、チロシンは必須アミノ酸である。したがって、チロシンでの食事補給は、BH4治療と併用して、PALを摂取する患者にとって望ましい。
【０２２７】
［Ｉ．PAL相同体のスクリーニング及び特性］
本発明の別の態様は、上昇したフェニルアラニン量を有する細胞を細菌PALと接触することによりフェニルアラニンの上昇した量を防止、改善又は低減させることができる、細菌PALの同定、及び、細菌PALが、そのような上昇したフェニルアラニン量を低減させるか否かを判断するためのスクリーニング分析である。特定の実施態様においては、当該方法は、高スループット分析である。ある実施態様においては、細菌種の完全なゲノムは、バイオインフォマティクスによるアプローチを用いて、PAL相同体の存在についてシーケンス及びスクリーニングされる。他の実施態様においては、encPと相同性のある遺伝子が同定され、関連するタンパク質配列のBLAST解析が行われ、同一性の割合が決定される。そのようなタンパク質の一次配列整列は、PAL活性にとって不可欠な保存残基の存在のために評価される。すべてのHAL酵素の位置83（シュードモナス プチダのHAL）は、ヒスチジンであるが、それは、脂肪族アミノ酸（例えば、PAL活性を有する酵素におけるロイシン又はバリン）である。位置83の解析は、酵素であるHALが誤って示されるか否かについて解明し、PAL活性を実証する。例えば、位置413は、大部分のHAL酵素においてグルタミン(Q)であり、すべてのHAL酵素のグルタミン酸(E)が位置414に続く。それに比べて、位置414は、これまでに同定された大部分のPAL酵素のアスパラギン酸(D)又はアスパラギン(N)が位置415に続くグルタミン(Q)である。原核生物PAL酵素としてよく誤って示されがちなこのバイオインフォマティック法で決定される代表的なHAL酵素は、ロドバクター スフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides) 2.4.1 (ZP 00005404)、ルブロバクター キシラノフィラス(Rubrobacter xylanophilus) DSM9941 (ZP 00188602)、フォトラブダス ルミネッセンス亜種ラウモンディイ(Photorhhabdus luminescens subsp. Laumondii) TT01 (NP 930421)、及び、サーモアナエロバクター テングコンゲンシス(Thermoanaerobacter tengcongensis) (AA051415)のHAL酵素を含む。
【０２２８】
更なる実施態様においては、そのような相同体のタンパク質生成物のPAL触媒活性が確認される。他の実施態様においては、PAL相同体の遺伝子は、PCR増幅されて、pHIS8又は同様のベクターにクローン化される。推定上のPALタンパク質は、His標識化タンパク質として大腸菌で異種発現され、精製されて、PAL活性の分析がされる。PAL活性の分析は、インビトロでのフェニルアラニンから桂皮酸への変換能、インビボでのチロシンからp−クマレート(p-coumarate)への変換不能、HAL活性の試験のための分析、及び、酵素動力学を特徴付けるための解析を含むが、これらに限定されない。
【０２２９】
［Ｊ．原核生物PALの製造］
本発明の他の態様は、原核生物PALの製造方法である。ある実施態様においては、IPTG（イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド）等の誘導プロモーターを用いて、ベクター［例えば、大腸菌BL21(DE3)/pLysS（Invitrogen社製）］において、N末端オクタヒスチジル標識融合タンパク質として過剰発現される。他の実施態様においては、組換えPALは、N末端標識なしで、大腸菌BL21(DE3)/pLysS細胞において過剰発現される。バイオリアクター／発酵槽において、振盪フラスコのグリセロールストックから、種培養物を増殖させる。その後、そのような種培養物を、供給バッチモードの制御されたバイオリアクターへ導入する。グルコースを補充し、pHを塩基（NH4OH）で調整し、1200rpm以下で攪拌する。O2供給は、20％より高くなるように溶存酸素を維持する。当該細胞を、30℃の温度で、70〜100（〜22〜25時間）のOD600になるまで増殖させ、その後、0.4mM IPTGで誘導する。温度を22〜26℃まで低下させ、0.1 IU/mLより低く（約40〜48時間、及び一般に200のOD600）なるまで増殖させる。細胞培養培地は、一般に、酵母エキスタンパク質、ペプトン−トリプトン、グルコース、グリセロール、カザミノ酸、トレース塩類及びリン酸緩衝塩類と定義され、これらから構成される。組換えPAL生産物は、細胞内で生産され、分泌されない。細菌は、連続遠心分離（αLaval, Carr, Ceba、又はこれらの等価物）により回収される。
【０２３０】
［Ｋ．原核生物PALの精製］
本発明の更なる態様は、細菌PAL、又は生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体若しくは類縁体の精製方法を特徴とする。第一の実施態様によれば、形質転換された細胞群を増殖させ、残りの粗組換え酵素は破壊される。異物は、カラムの汚損を防止するために、通常粗バルクから分離される。クロマトグラフィー精製は、１つ又は幾つかのクロマトグラフィー樹脂を用いて行われる。次いで、精製されたタンパク質は、長期間にわたって安定した活性を提供するために、設計された緩衝液で調製される。他の実施態様においては、細菌PALの精製方法は、(a)圧力ホモジナイザー（但し、滞在的には、ガラスビーズ溶解などの他の物理的手段による）を用いて、組換えPALを含む細菌を溶解する工程；(b)熱処理をする工程；(c)第二の連続遠心分離工程、及び／又は深層ろ過（Cuono Zeta Plus、Maximizer、Pall Filtron、Millipore Millistak、又はOpticaoフィルターで）によりこの溶解物を浄化する工程；(d)炭ろ過工程に通過させる工程（Millipore Millistak 40ACで）；(e)最終的なろ過工程に通過させる工程（Sartorious Sartopore 0.2μmフィルターで）；(f)ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーに通過させる工程（Tosoh Biosciences社製のToyopearl Butyl 650Mで）；(g)Qイオン交換カラムに通過させる工程（BioRad社製のMacroprep High Qで）；及び、(h)タンジェンシャルフローろ過での緩衝液交換により最終生産物を回収する工程（Sartorious Hydrosart又はPES 100kDa膜で）。当業者であれば、１以上のクロマトグラフィー工程を省略若しくは置き換えること、又は、本発明の範囲内でクロマトグラフィー工程の順序を変更することができるということを容易に認識する。そして、必要であれば、適切な滅菌工程を行ってもよい。
【０２３１】
さて、本発明を一般的に記載してきたが、それは次の実施例を参照して、より容易に理解することができる。実施例は、説明目的のためだけに提示されるものであり、決して、本発明の範囲を限定する意図のものではない。用いた数値（例えば、量、温度等）に関しては、正確性を担保するように努力をしたが、いくらかの実験誤差又は偏差は、当然のことながら許容されるべきである。
【実施例】
【０２３２】
［実施例１  ノストック パンクチフォルメ及びアナベナ バリアビリスPALのクローニング］
（DNA操作）
ノストック パンクチフォルメのゲノムDNAをATCC(29133D)から入手した。また、PAL遺伝子(ZP_00105927)を、プライマー
【化１】
0005670183.tif 000005
(配列番号:12)
及び
【化２】
0005670183.tif 000006
(配列番号:13)
からPCR増幅した。得られたPCR産物をNdel及びNotlで消化した。また、1.7kbのフラグメントを、N−His標識化又は非標識のためのpET−28a(+)及びpET−30a(+)（Novagen社製）にそれぞれライゲーションした。
【０２３３】
アナベナ バリアビリスの細胞をATCC(29413)から入手した。ゲノムDNAを抽出し(Qiagen社製)、PAL遺伝子(YP_324488)を、NheI部位を除去するために、SOE−PCRで増幅した。プライマー１
【化３】
0005670183.tif 000007
(配列番号:14)
及びプライマー２
【化４】
0005670183.tif 000008
(配列番号:15)
を用いて、ヌクレオチド1−1190を増幅した。また、プライマー３
【化５】
0005670183.tif 000009
(配列番号:16)
及びプライマー４
【化６】
0005670183.tif 000010
(配列番号:17)
を用いて、ヌクレオチド1142−1771を増幅した。これらの２つのPCR産物を組み合わせて、プライマー１及び４を有する完全長遺伝子を増幅した。得られたPCR産物をNheIで消化し、Klenow(NEB)で鈍化した後、NheIで消化した。1.7kbのフラグメントをpET−28a(+)及びpET−30a(+)（Novagen社製）にライゲーションした。
【０２３４】
（細菌株及び培養条件）
大腸菌BL21(DE3)細胞（Stratagene社製）をpGro7（Takara社製）で形質転換した。また、適切なBL21(DE3)pGro7細胞をInoue法［Sambrook及びRussell, 「分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」, 第３版 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001)］により調製した。これらの細胞を、pET−28−NpPALで形質転換し、50mg/Lカナマイシン及び20mg/Lクロラムフェニコール添加25ml LB培地において、37℃で一晩培養した。20mLのこの培養物を、カナマイシン、クロラムフェニコール、及び500mg/L L−アラビノース添加１L LB培地に播き、37℃で増殖させた。0.6のOD600で、当該培養物を氷で冷却した。５分後、当該培養物を0.3mM IPTGで誘導し、20℃で16時間増殖させた。細胞を遠心分離により回収した。
【０２３５】
BL21(DE3)pLysS細胞（Stratagene社製）をAvPALで形質転換し、アラビノース誘導をすることなしに、NpPALと同様に培養した。
【０２３６】
［実施例２  NpPAL及びAvPALの精製］
培養物を卓上型遠心分離機(bench-top centrifuge)において、5,000gで20分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞のペレットを、更なる処理に先駆けて、通常は、-70℃で凍結した。解凍において、当該細胞のペレットを、TBS(25mM Tris, 150mM NaCl, pH7.8)中で約80光学濃度ユニット(600nm)に懸濁した。細胞を、APV圧力ホモジナイザーに12〜14,000psiで２回通過させて溶解した。次いで、粗溶解物を55℃で２時間加熱処理した。当該溶解物を10,000gで30分間遠心分離し、上清を保存し、0.2μm真空フィルター（コーニング社製）でろ過した。
【０２３７】
PALを、ブチル650Mカラム（Tosoh BioSciences社製）及びMacroPrep High Qカラム（BioRad社製）に連続的に通して、浄化された溶解物から精製した。溶出生産物は、SDS−PAGE及び逆相HPLCにより高純度を示した。
【０２３８】
［実施例３  ペグ化PAL変異体の生成］
（タンパク質のペグ化）
ペグ化は、文献の方法［Hershfieldら, (1991), 前述の箇所; U.S. Patent No. 6,057,292; Luら, Biochemistry 40(44):13288-13301 (2001); Nektar Therapeutics, 2003 catalog］の改良を用いる。活性化PEGは、線状PEGスクシンイミジルスクシナート（mPEG-SPA、分子量５kDa又は分子量20kDa）及び分岐PEGヒドロスクシンイミド（mPEG2−NHSエステル、分子量10kDa又は分子量40kDa）を含む。両者は、メトキシ基で一端が覆われており、Nektar Therapeutics社から市販されている。また、最適ペグ化タンパク質の試験的測定が一般に求められている［Veronese, F.M.ら, J. Bioactive Compatible Polymers 12:196-207 (1997)］。最適ペグ化条件は、さまざまなPAL:PEG比（タンパク質単量体当たりのリジンの数に沿ったタンパク質のモル比を考慮する）、さまざまなpH、さまざまな緩衝液、さまざまな温度、及びインキュベーション時間を用いて決定された。野生型PALは、リジンの数が多く［ロドスポリディウム トルロイデス(Rt)及びアナベナ バリアビリス(Av)単量体当たりそれぞれ29及び18］、非変性PALは、マウスでの反復注射に対し免疫反応性を示し、裸の野生型PALは、プロテアーゼへの暴露で急速に不活性化されるので、高いPALタンパク質：PEG誘導体化の比が必要である。ペグ化反応は、-20℃で凍結することで停止され、試料は、SDS−PAGE、MALDI−TOF質量分析、活性評価、タンパク質分解感受性、及び免疫反応性により分析される。
【０２３９】
活性、タンパク質分解、及び免疫評価に先駆けて、過剰な未反応PEGを除去するために、反応を、0.05Mリン酸カリウム(pH8.5)に対して、Tube−O−Dialyzer（GenoTechnology社製）を用いて４℃で一晩透析する。NIタンパク質分析キット（GenoTechnology社製）を用いてタンパク質濃度を測定した後、前述したとおり、標準反応条件で未誘導体化及びPEG誘導体化PAL試料のPAL活性測定を行う。インビトロの特性評価に続いて、PKUマウスモデルを用いて、最も有望なペグ化治療候補物でインビボ試験を行う。
【０２４０】
（特性評価）
非変性タンパク質試料及びペグ化タンパク質試料において、280nmのPAL吸光係数（RtPAL及びAvPALにおいてそれぞれ、0.5及び0.83mg mL-1cm-1）を用いて、タンパク質濃度を測定した。また、当該濃度は、正確なタンパク質濃度の測定を妨害する非タンパク質汚染物質を除去する試料処理を含む、NIタンパク質分析キット（GenoTechnology社製）を用いて算出される。
【０２４１】
それぞれのPAL単量体に付加されたPEG分子の数を測定するために、PEG−PAL生成物は、MALDI−TOF MSで特徴付けられた。また、活性の保持、完全な誘導体化、及び四量体PALの形成の損失のないことをそれぞれ評価するために、活性評価、SDS−PAGE及び天然ゲル分析を用いて特徴付けられた。PAL及びPEG−PAL試料においては、MALDI−TOF質量分光分析は、サブユニットの解離及び種検出の再現性を改善するために、0.5M 尿素又は0.025M グアニジン−HClの使用を必要とした。
【０２４２】
（PAL活性分析）
動力学的モードのCary UV分光光度計(Cary 50)を用いて、PALの活性測定を行う。290nmでの吸光度の増加によってモニターされたtrans−桂皮酸の生成を測定することにより［Hodgins, (1968), 前述の箇所］、L−フェニルアラニン基質でのPALの活性を室温(25℃)で評価した。290nmのtrans−桂皮酸のモル吸光係数は、10,238リットルM-1cm-1である。反応混合物は、100mM Tris−HCl緩衝液(pH8.5)中22.5mMのフェニルアラニンを含んでいた。標準測定においては、最終酵素濃度が0.0035mg/mLであるが、動力学的試験においては、分析での酵素濃度は、分当たりの290nmでの勾配が0.005〜0.02の範囲にあるように、調節される。活性データは比活性(μmol×min-1mg-1)で表される。１ユニットのPALは、室温で分当たり１μモルのtrans−桂皮酸を生成する酵素量と定義される。
【０２４３】
[実施例４  インビトロ半減期及び免疫原性の試験]
生化学的特性評価の後、最も有望なPEG−PAL候補物を、３つの異なる補足的方法（ウェスタンブロット、ELISA及び免疫沈降(IP)）を用いて、野生型PAL（ペグ化されていない）を注入したPKUマウスにより産生された抗体に対する免疫反応性のスクリーニングを行った。
【０２４４】
ウエスタンブロット分析においては、PAL抗血清（野生型PALを注入したマウスからの)を１:10,000の希釈で用いた。また、陰性対照として、緩衝液で処置されたマウスからの血清も同様の希釈で用いた。二次抗体である、アルカリホスファターゼを結合したヤギ抗マウスIgG（Promega社製）を１:5,000に希釈し、AP基質ウエスタンブルー（Promega社製）を用いて着色した。Nunc/Immuno Maxisorpプレート（Nalge Nunc International社製）を用いて、次いで、リン酸緩衝液中１mg/mLのPALを用い、リン酸緩衝液、0.05％ Tween 20、2％ BSAでブロキングをする標準操作により、ELISA試験を行った。マウス抗血清（野生型PAL暴露マウス）をEBブロック溶液（リン酸緩衝液、0.05％ Tween 20、２％ BSA）で１:10,000に希釈し、HRPヤギ抗マウスIgGを、450nmで検出するのに用いられるTMBと共に、二次抗体として用いた。
【０２４５】
免疫沈降をPAL抗体結合試験に用いた。タンパク質試料（PAL又はペグ化PAL）をTTBS緩衝液（0.1％ Tween添加トリス緩衝食塩水）中でインキュベートし、抗体試料添加前のPAL活性を測定した。免疫性がないマウス血清を用いて、それぞれの試料を、陽性対照の抗PAL血清の8倍超で、及び、複製陰性対照反応でインキュベートした。インキュベーション後、ビーズのマウスIgG結合能を考慮して、プロテインGセファロース４(50%, v/v)を過剰に添加し、再度試料を４℃で一晩、回転しながらインキュベートした。遠心分離により上清を回収し、それぞれの試料のPAL活性を当該上清で分析した。ビーズペレットは廃棄せず、ウェスタンブロットによる更なる解析を行った。抗体−ビーズ結合が生じるか確認するために、ウェスタンブロットを用いてビーズのPAL抗原を検出した。PAL結合工程の後に遠心分離により回収されたビーズを、TTBS及びTBS緩衝液で数回洗浄した。これらの洗浄に続き、SDS−PAGEローディングバッファーをビーズに添加し、試料を95℃で５分間加熱した。その後、PAL抗血清を用いてウェスタンブロットにより試料を分析した。弱い抗体結合を示す酵素変異体は、ウェスタンブロットで検出されたペレット化ビーズ画分で対応する小さなPALを有しており、高い抗体結合を示す野生型の非改質PALと比較して、上清に高い活性が残存することを示した。
【０２４６】
［実施例５  プロテアーゼ感受性試験］
ロドスポリディウム トルロイデスからの野生型PALに関するプロテアーゼマッピング試験では、タンパク質分解性の主要部位が示された。そのような部位の除去は、タンパク質分解感受性を低減させ又は除去させ、有用なPKU酵素基質の開発に寄与した。しかしながら、タンパク質分解感受性のためのそのような部位の除去により、酵素活性低減又は失活となるものと考えられた。
【０２４７】
プロテインエンジニアリングにより、活性を保持する改良されたPAL（及びPEG−PAL）突然変異体が作製された後、活性の保持（OD290測定による）及び低減されたタンパク質分解（PAGEゲル分析による）のモニタリングの前の、トリプシン／キモトリプシンプロテアーゼ反応混液でのインキュベーションを用いるスクリーニングは、適切なインビトロ特性を有する突然変異体の同定をインビボ試験で用いることを可能にする。
【０２４８】
腸内環境に近く、2.3mMトリプシン、3.5mMキモトリプシン、3.05mMカルボキシペプチダーゼA、及び3.65mM カルボキシペプチダーゼBを含むプロテアーゼ反応混液でのインキュベーションによりタンパク質分解の安定性を評価した。タンパク質分解試験は、酵素のインキュベーション、PAL溶液へのプロテアーゼの添加、試験されるさまざまなタンパク質変異体（ペグ化された、ペグ化されていない若しくは他の化学的改質による野生型又は突然変異タンパク質）のタンパク質分解感受性の測定、プロテアーゼ暴露後の活性保持及び安定性保持の時間的経過を含む。SDS−PAGE及びMALDI−TOF質量分析マッピング試験を用いて、プロテアーゼ感受性部位の位置を決定した［Kriwacki, R.W.ら, J. Biomol. Tech. 9(3):5-15 (1980)］。これらのマッピング結果は、プロテアーゼ感受性の主要部位（既に同定されている２つの主要部位等）を決定するのに重要であり、すべての主要な感受性部位は、ペグ化の保護、及び／又は、PALアーキテクチャーから感受性領域を除去及び／又は保護する突然変異体を用いて除去することができた。
【０２４９】
［実施例６  ペグ化NpPAL及びAvPALの生成］
一般に、NpPAL及びAvPALのペグ化は、タンパク質とSUNBRIGHT ME−200HS 20kDa NHS活性化PEG(NOF)を混合することを含むものであった。
【０２５０】
ペグ化のプロトコールである、NHS活性化20kDa線状PEGを用いる標準"HC"方法は、次のとおりである。
【０２５１】
1)タンパク質をエンドトキシンの存在のために評価した。
タンパク質溶液(0.1mL)を0.9mLの新鮮なMQ水で希釈し、0.5EU/mlの感受性レベルでエンドトキシンのために携帯型のCharles River社の装置(EndoPTS)で試験した。エンドトキシンが0.5EU/mlより高い場合、エンドトキシンをMustang Eろ過で最初に、次いで、Sterogene Etox樹脂で、任意に更にクロマトグラフィー精製により低減させた。低減は制限されるが、pH7.8でDEAE FF（Amersham社製）に通すことで十分に有用であった。
【０２５２】
2)タンパク質の濃縮及び緩衝液交換
タンパク質を25mg/mLより高く75mg/mL以下に濃縮し、50mM KPO4(pH8.5)に緩衝液交換した。スピンフィルターを用いてこの濃縮物を調製する場合、最初に、当該フィルターを、緩衝液単独で、低減された速度と時間で（3000rpm、３分）回転することでエンドトキシンの試験をし、次いで、工程1)のタンパク質と同様の方法で、エンドトキシンのために保持された緩衝液を試験した。50mM KPO4(pH8.5)の緩衝液バッチの履歴／配合は、水（QS〜１L）、リン酸カリウム（48.75mM、8.4913g/l）、及びリン酸二水素カリウム(1.25mM、0.17011g/L)であった。溶液を0.2μmフィルターでろ過し、室温で保存した。濃縮生産物をMustang Eフィルターアクロディスクでゆっくりろ過した（１〜２mL／分）。滅菌TBS(pH7.5)で希釈及びブランクとされた試料を、タンパク質濃度をA280で測定した。吸光係数は、NpPALで0.83、AvPALで0.75であった。
【０２５３】
3)NpPAL及びAvPALのペグ化
通常-80℃で保存されたPEGを室温になるまで加温した。KPO4緩衝液をPEGに加え、大きな塊がすべて懸濁されるために、最大速度で攪拌すること、及び、試験管を手で激しく振盪することで再懸濁した。最初に湿らせたPEGのあるよく懸濁されたPEG溶液に、タンパク質を１分以内に加え、非常に穏やかな転移によって混合した。アルミニウムホイルで包まれた試験管を選鉱機の軸に載置し、室温で３時間、非常に穏やかに振動させた。当該試験管をTBS(pH7.5)で充填し、ろ過滅菌した。懸濁液をすぐに配合し、あるいは、配合されるまで４℃で保存した。
【０２５４】
4)配合
配合緩衝液の配合／バッチの履歴は、水（QS〜１L）、トリス系(3.2mM)、Tris−HCl(16.8mM)及び塩化ナトリウムからなり；緩衝溶液を0.2μmフィルターでろ過し、室温で保存した。当該緩衝溶液を、100MWCO再生化セルロース膜で、Vivaflow 50（小さなロット）又はVivafiow 200（大きなロット）を用いてタンジェンシャルフローろ過にかけた。当該溶液を、MQ水、0.1N NaOH及び200mLの水で再度フラッシングした。当該溶液を50mL／分の直交流でTBS(pH7.5)により平衡化した。透過液のpHを7.5となるようにした。
【０２５５】
当該溶液を最初にTBSで約３倍に希釈して緩衝液交換し、少なくとも４時間で元の容積に戻した。直交流は、一般に、Vivaflow 50及び200で180〜200mL／分であった。
【０２５６】
最終生産物をMustang Eでろ過した。エンドトキシンの存在は、1.9mlの無菌新鮮水で0.1mLに希釈した後に評価した。エンドトキシンが１EU/mLより高い場合、Sterogene Etoxゲルで低減した。配合された無菌ペグ化NpPAL又はAvPALをバイアルで密封し、-70℃でインビボ試験に供するまで保存した。
【０２５７】
［実施例７  PKUに冒されたマウスにおけるノストック パンクチフォルメPAL(NpPAL)及びそのペグ化された形態の影響］
本研究の目的は、次のNpPAL又はペグ化NpPALの皮下投与の血漿フェニルアラニン(Phe)量を決定することであった。
【０２５８】
(1)ロドスポリディウム トルロイデスからのリジン突然変異体R91K PAL及びそのペグ化形態(1:3 PAL:PEG)［日油株式会社(NOF)製のPEG］の3.0 IU/mLの用量での影響；(2)NpPAL及びそのペグ化形態(1:3 PAL:PEG)(NOF)の0.6IU/mL〜3.0 IU/mLの範囲の用量での影響；及び、(3)ビヒクルを、ホモ接合体ENU2マウス（BTBRenu2としても知られている）で試験した。R91K PALは、以前に、野生型ロドスポリディウム トルロイデスPALと比べて、活性が改善されたことが明らかとなっていた。R91Kは、タンパク質表面付近のAsp86からLeu101にわたるヘリックスに位置する。すべての溶液は、1.0EU/mL未満のエンドトキシンであり、-75〜80℃で保存された。ENU2又はBTBRenu2マウスは、重度の高フェニルアラニン血症の動物で生じるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子(PAH)座のホモ接合突然変異体である。高い血漿フェニルアラニン(Phe)量は、この動物を、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)が血漿Pheを低減させる能力を評価するための適切なモデルにする。
【０２５９】
（試験計画）
【表４】
0005670183.tif 000011
【０２６０】
溶液を、１日目に肩甲骨間に、４日目に右腹に、そして、８日目に左腹に、皮下急速注入により投与した。25ゲージ針、及び1cc又は3ccのシリンジを用いて、当該溶液を皮下スペースに投与した。各々の動物に、上の表に記載されている投与容量で、0.2、0.4、0.6又は1.0 IUの被験物質を投与した。当該動物に、ハロセン（1〜3％ mg/kg）の吸入によって軽く麻酔をかけ、手で押さえた。投与は、それぞれの投与日にほぼ同時に行なわれた。
【０２６１】
動物の罹患率、死亡率及び健康状態を毎日観察した。特に、充血又は浮腫の兆候のために、注入部位を観察した。体重を、-３、８及び12日目で測定及び記録し、臨床的パラメーターに用いたが、投与容量を決定するためには用いなかった。血液採取（Pは血漿、Sは血清）は、-３日目(P,S)、２日目(P)、４日目の前投与(P)、５日目(P)、８日目の前投与(P,S)、９日目(P,S)、12日目(P)、及び23日目(S)に行った。全血液の約50〜100μLを各時点で採取した（25〜50μLの血漿又は血清）。血液は、尾静脈から採取された。上記のスケジュールに示すとおりに、血漿又は血清を採取した。尾静脈を穿刺し、血液滴をRAM Scientific Green-Top Capillary Blood Collection Tube (#07 7250)を用いて回収した。血清回収においては、血液滴を添加剤のないチューブに回収した。血漿／血清を回収し、-20℃（血漿）又は-80℃（血清）で保存される保存チューブに移した。
【０２６２】
（結果）
NpPALの短期間投与についての研究の結果では、過剰のフェニルアラニン量の低減において、ペグ化酵素の有効性が実証された。特に、ペグ化されていないNpPALでは、注入後（免疫原性反応がある前であっても）フェニルアラニン量は低減されなかった。したがって、ペグ化は、NpPALによるPKUの潜在的な治療のために絶対的に必要であった（図５）。
【０２６３】
［実施例８  PKUに冒されたマウスにおけるアナベナ バリアビリスPAL(AvPAL)及びそのペグ化された形態の影響］
本研究の目的は、次のAvPAL又はペグ化AvPALの皮下投与の血漿フェニルアラニン(Phe)量を決定することであった。
【０２６４】
(1)ロドスポリディウム トルロイデスからのリジン突然変異体R91K PAL及びそのペグ化形態(1:3 PAL:PEG)［日油株式会社(NOF)製のPEG］の3.0 IU/mLの用量での影響；(2)AvPAL及びそのペグ化形態(1:3 PAL:PEG)(NOF)の0.6IU/mL及び3.0 IU/mLの用量での影響；及び、(3)ビヒクルを、ホモ接合体ENU2マウス（BTBRenu2としても知られている）で試験した。R91K PALは、以前に、野生型ロドスポリディウム トルロイデスPALと比べて、活性が改善されたことが明らかとなっていた。R91Kは、タンパク質表面付近のAsp86からLeu101にわたるヘリックスに位置する。すべての溶液は、1.0EU/mL未満のエンドトキシンであり、-75〜80℃で保存された。ENU2又はBTBRenu2マウスは、重度の高フェニルアラニン血症の動物で生じるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子(PAH)座のホモ接合突然変異体である。高い血漿フェニルアラニン(Phe)量は、この動物を、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)が血漿Pheを低減させる能力を評価するための適切なモデルにする。
【０２６５】
（試験計画）
【表５】
0005670183.tif 000012
【０２６６】
溶液を、１日目、４日目、８日目に動物の後背部に、皮下急速注入により投与した。25ゲージ針、及び1cc又は3ccのシリンジを用いて、当該溶液を皮下スペースに投与した。各々の動物に、上の表に記載されている投与容量で、0.2、0.4、0.6又は1.0 IUの被験物質を投与した。当該動物に、ハロセン（1〜3％ mg/kg）の吸入によって軽く麻酔をかけ、手で押さえた。投与は、それぞれの投与日にほぼ同時に行なわれた。
【０２６７】
動物の罹患率、死亡率及び健康状態を毎日観察した。特に、充血又は浮腫の兆候のために、注入部位を観察した。体重を、-３、８及び12日目で測定及び記録し、臨床的パラメーターに用いたが、投与容量を決定するためには用いなかった。血液採取（Pは血漿、Sは血清）は、-３日目(P,S)、２日目(P)、４日目の前投与(P)、５日目(P)、８日目の前投与(P,S)、９日目(P,S)、12日目(P)、及び22日目(S)に行った。全血液の約50〜100μLを各時点で採取した（25〜50μLの血漿又は血清）。血液は、尾静脈から採取された。上記のスケジュールに示すとおりに、血漿又は血清を採取した。尾静脈を穿刺し、血液滴をRAM Scientific Green-Top Capillary Blood Collection Tube (#07 7250)を用いて回収した。血清回収においては、血液滴を添加剤のないチューブに回収した。血漿／血清を回収し、-20℃（血漿）又は-80℃（血清）で保存される保存チューブに移した。
【０２６８】
（結果）
AvPALの短期間投与についての研究の結果では、過剰のフェニルアラニン量の低減において、ペグ化酵素の有効性が実証された。特に、ペグ化されていないAvPALでは、注入後（免疫原性反応がある前であっても）フェニルアラニン量は低減されなかった。したがって、ペグ化は、AvPALによるPKUの潜在的な治療のために絶対的に必要であることを示した（図６）。
【０２６９】
［実施例９  PKUに冒されたマウスにおけるペグ化されていないR91K PAL及びペグ化R91K PALとペグ化NpPALの慢性（90日間）耐性試験］
本研究の目的は、フェニルケトン尿症の疾病モデルであるENUマウスにおける、ペグ化された及びペグ化されていないR91K PALとペグ化NpPALの投与での慢性（90日間）の薬力学的パラメーター及び免疫原性の影響を評価することであった。
【０２７０】
各被験物質（R91K及びそのペグ化形態R91K PAL:PEG 1:3、NpPAL及びそのペグ化形態NpPAL:PEG 1:3 NOF、並びに、ビヒクルTris−HCl）の２つのバッチを作製し、一つを本研究の第一の半分に、及び本研究の第二の半分に用いた。試験溶液を-70〜-80℃で保存した。非野生型の（以前にPALを注入したマウス）動物を使用しない条件下で、全55匹（投与グループ当たりn=3〜7）のホモ接合体ENU2マウス(aka BTBRenu2)を使用した。
【０２７１】
（試験計画）
【表６】
0005670183.tif 000013
【０２７２】
【表７】
0005670183.tif 000014
【０２７３】
投与をグループ１、４、５、８及び９では毎日行った。グループ２及び６(b.i.w.)は、１日目及び４日目（例えば、毎月曜日及び木曜日）で週２回投与した。グループ３及び７（b.i.w. 3週間後）は、１日目及び８日目に投与した後、22日目では、グループ２及び６のスケジュールと一致したスケジュール（毎月曜日及び木曜日）で再度投与した。グループ10は、週１回投与した。試験溶液を、25又は26ゲージ針及び1ccのシリンジを用いて、肩甲骨間の皮下スペースに皮下注射（急速注入）して投与した。各々の動物に、試験溶液活性(IU/mL)及び投与量（IU／マウス）を用いて算出した所定量を投与した。投与は、それぞれの投与日にほぼ同時に行なわれた。
【０２７４】
動物の罹患率、死亡率及び健康状態を毎日観察した。特に、充血又は浮腫の兆候のために、注入部位を観察した。体重を週１回（-３、５、12日目…、例えば、毎金曜日）及び試験終了時に測定及び記録した。瀕死状態による死又は予定外の試験の中止があった場合、その時の体重を記録した。全血液の約100μLを各時点で採取した（25μLの血漿、25μLの血清）。血液は、意識のある動物から尾静脈の穿刺を介して採取された。血漿用の血液滴をRAM Scientific Green-Top Capillary Blood Collection Tube (#07 7250)を用いて回収した。血清回収においては、血液滴を添加剤のないチューブに回収した。血漿／血清への遠心分離による分離前に、血液試料を湿った氷で最大２時間保存し、分析の評価まで-70〜-80℃で保存した。次の日の血液をフェニルアラニン及び抗体力価の測定における血漿及び血清のために回収した：-３（前試験開始）、９、24、31、38、45、52、59、66、73、80、87及び91日目。89日目で、グループ１、５、９及び10の動物から血液及び血漿をまた回収した。毎週単一時点は、投与に対する血液Pheの反応についての正確な見解を提供するものではない。追加的な時点は、Phe量が投与量で変動するか否かを示した。９日目の試料は、PDの効果が日付を定めようとしたすべての投与計画で失った時間を識別するため、完全性を検討するのに非常に重要であった。最終的に100μLの血液試料を回収した。
【０２７５】
（結果）
図７に示す長期間の投与試験では、10週間にわたる多数の毎週の注入（NpPAL−PEGでの）後の継続的な有効性が明らかとなった。
【０２７６】
［実施例１０  AvPAL変異体（システイン変異体）の生成］
細菌で発現され組換えタンパク質に生じる凝集を低減させるために、AvPALポリペプチドにおいてアミノ酸置換を行った。タンパク質凝集は、酵素活性を低減させた、及び／又は、インビボでの免疫原性を増加させた。凝集のそのような形成が鎖間ジスルフィド結合の形成を生じさせた。このような可能性を最小限にするために、さまざまなAvPALのシステイン残基を単独で、あるいは組み合わせて、セリン残基と置換した。
【０２７７】
AvPALポリペプチドは、位置64、235、318、424、503及び565の、６個のシステイン残基を有していた（配列番号４）。次のAvPAL単一システイン突然変異体を生成した：AvPAL_C64S（配列番号７）、AvPAL_C318S（配列番号８）、AvPAL_C503S（配列番号９）、及びAvPAL_C565S（配列番号10）。また、AvPAL二重システイン突然変異体である、AvPAL_S565SC503S（配列番号11）も生成した。図８は、これらのAvPALシステイン突然変異体のアミノ酸配列を示す。
【０２７８】
（クローニング）
フォワードプライマーAvarPALfor
【化７】
0005670183.tif 000015
(配列番号:18)
及び、リバースプライマーAvarPALrev
【化８】
0005670183.tif 000016
(配列番号:19)
を有する、アナベナ バリアビリスゲノムDNA（ATCC 29413-U、Qiagen DNeasyキット）からAvPAL遺伝子を増幅した。得られたPCR産物をTaqで処理した後、pCR2.1 TOPO TA（Invitrogen社製）にライゲーションした。得られたプラスミドを1p40と命名した。
【０２７９】
5'NheIサイトを加え、内部NheIサイトをSOE−PCRで除去した。上流AvPALフラグメントをフォワードプライマーN−Nhe−AvPAL
【化９】
0005670183.tif 000017
(配列番号:20)
及び、リバースプライマーNhe−AvPALrev
【化１０】
0005670183.tif 000018
(配列番号:21)
を有する1p40から増幅した。また、下流AvPALフラグメントをフォワードプライマーNhe−AvPALfor
【化１１】
0005670183.tif 000019
(配列番号:22)
及び、リバースプライマーAvPALrev−r
【化１２】
0005670183.tif 000020
(配列番号:23)
を有する1p40から増幅した。１回のPCR反応において、２つのPCR産物をDNAポリメラーゼでアニール化し増長して、完全長のAvPAL遺伝子を生産した後、プライマーN−Nhe−AvPAL及びAvPALrev−rで増幅した。得られたPCR産物をNheIで消化し、Klenow(NEB)で鈍化し、NotIで消化し、pET−28a(+)ベクター（NdeIでの消化、Klenowでの鈍化、及びNotIでの消化により調製した）にライゲーションした。このプラスミドを3p86−23と命名した。
【０２８０】
新規の制限サイトをPCRにより加えた。AvPALを、フォワードプライマーAvEcoRIfor
【化１３】
0005670183.tif 000021
(配列番号:24)
及び、リバースプライマーAvSmaIrev
【化１４】
0005670183.tif 000022
(配列番号:25)
を有するプラスミド3p86−23で増幅した。得られたPCR産物をEcoRI及びSmaIで消化し、EcoRI及びSmaI消化pIBX7ベクターにライゲーションした。得られたプラスミドを7p56 Av3と命名した。
【０２８１】
（システイン突然変異体）
AvPALポリペプチド位置503及び565に対応する、AvPAL遺伝子の２つのシステインコドンを部位特異的突然変異誘発(QuickChange XL II、Stratagene社製)によってセリンコドンと置換した。位置503のシステインコドンを、フォワードプライマーAv_C503S
【化１５】
0005670183.tif 000023
(配列番号:26)
及び、リバースプライマーAv_C503Srev
【化１６】
0005670183.tif 000024
(配列番号:27)
でPCRによってプラスミド7p56 Av3のセリンコドンに変換した。セリンコドンに下線を付した。また、コード鎖のGからCの突然変異（非コード鎖のCからGの突然変異）を太字で示した。得られたプラスミドをj282と命名した。位置565のシステインコドンを、フォワードプライマーAv_C565S
【化１７】
0005670183.tif 000025
(配列番号:28)
及び、リバースプライマーAv_C565Srev
【化１８】
0005670183.tif 000026
(配列番号:29)
でプラスミドj282のセリンコドンに変換した。セリンコドンに下線を付した。また、コード鎖のGからCの突然変異（非コード鎖のCからGの突然変異）を太字で示した。得られたプラスミドをj298aと命名した。
【０２８２】
AvPALポリペプチドの位置64、318及び565のAvPAL遺伝子のシステインコドンを、次のプライマーのペアを用いて同様にセリンコドンと置換した：C64S、フォワードプライマーAv_C64S
【化１９】
0005670183.tif 000027
(配列番号:30)
及び、リバースプライマーAv_C64Srev
【化２０】
0005670183.tif 000028
(配列番号:31)
；C318S、フォワードプライマーAv_C318S
【化２１】
0005670183.tif 000029
(配列番号:32)
及び、リバースプライマーAv_C318Srev
【化２２】
0005670183.tif 000030
(配列番号:33)
；並びに、C565S、フォワードプライマーAv_C565S（配列番号28）、及び、リバースプライマーAv_C565Srev（配列番号29）。セリンコドンに下線を付し、コード鎖のGからCの突然変異、及び非コード鎖のCからGの突然変異を太字で示した。
【０２８３】
［実施例１１  AvPAL変異体（システイン突然変異体）のインビトロでの酵素活性］
本研究の目的は、インビトロでのフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)酵素活性に対するAvPALポリペプチドのさまざまなシステイン残基のセリンによる置換の影響を判断することであった。
【０２８４】
AvPAL変異体（すなわち、システイン変異体）を、実施例１０に記載したとおりにクローニングした。AvPALシステイン突然変異体の発現プラスミドを細菌に形質転換した。また、AvPALシステイン突然変異体ポリペプチドを、実施例１に記載したとおりに発現し、実施例２に記載したとおりに精製した。
【０２８５】
実施例３に記載したとおりに、野生型(WT)AvPAL及びAvPALシステイン突然変異体をインビトロでのPAL酵素活性のために試験した。表７は、ペグ化されていないWT AvPALと比較して、インビトロでのペグ化されていない精製AvPALシステイン突然変異体タンパク質のPAL比活性が、位置64(AvPAL_C64S)のシステイン残基のセリンによる置換によって低減されたが、位置503若しくは565、又は、位置503及び565（それぞれ、AvPAL_C503S、AvPAL_C565S、及びAvPAL_C565SC503S）のシステイン残基のセリンによる置換によって悪影響を受けなかったことを示す。
【０２８６】
【表８】
0005670183.tif 000031
【０２８７】
セリン残基の導入が、ペグ化AvPALタンパク質の酵素活性に影響を及ぼすか否かを判断するために、WT AvPAL及び二重システイン突然変異体であるAvPAL_C565SC503Sを実施例６に記載したとおりにペグ化した。表７は、ペグ化AvPALタンパク質のインビトロでのPALの比活性が、位置503及び565のシステイン残基のセリンによる置換によって悪影響を受けなかったことを示す。
【０２８８】
［実施例１２  AvPAL変異体（システイン突然変異体）のインビトロでの生化学特性］
本研究の目的は、(1)促進された安定性、(2)凝集体の形成、及び(3)部位特異的ペグ化に対する、AvPALポリペプチドでのさまざまなシステイン残基のセリンによる置換の影響を判断することであった。
【０２８９】
（促進された安定性）
インビトロでの安定性に対する、AvPALのシステイン残基のセリンによる置換の影響を、精製AvPALシステイン突然変異体（ペグ化されている又はペグ化されていない）を37℃でさまざまな期間保存した後、実施例３に記載したとおりに、これらのタンパク質のインビトロでのPAL比活性を測定することにより判断した。
【０２９０】
野生型AvPAL及びAvPALシステイン突然変異体（ペグ化されている又はペグ化されていない）を実施例１１に記載したとおりに調製した。
【０２９１】
図９Ａに示すとおり、ペグ化されていないAvPALタンパク質の比活性は、37℃で少なくとも５日間安定しており、また、位置565、又は位置503及び565のシステイン残基のセリンによる置換によって悪影響を受けなかった。同様に、図９Ｂに示すとおり、ペグ化AvPALタンパク質の比活性は、37℃で少なくとも６日間安定していた。単一のシステインAvPAL突然変異体であるAvPAL_C565Sは、37℃で６日後に、野生型AvPAL及び二重システインAvPAL突然変異体であるAvPAL_C565SC503Sと比較して、多少低減された安定性を示した。
【０２９２】
（凝集体の形成）
溶液中のタンパク質凝集体の形成に対する、AvPALにおけるシステイン残基のセリンによる置換の影響を、ペグ化されていない精製野生型AvPAL及びAvPALシステイン突然変異体を、変性及び天然ゲル電気泳動又はSEC−HPLCのいずれかによって分離することにより判断した。
【０２９３】
精製AvPAL調製物を、変性条件（４〜12％ NuPAGE Bis−Tris）又は非変性条件［８％ Tris−Gly(pH8.3)］下でゲル電気泳動によって分離した。分離されたAvPALタンパク質をクマシーブルーで染色した。
【０２９４】
精製AvPAL調製物をSEC−HPLCによって分離した。AvPALタンパク質を、20mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl(pH6.9)においてTSKゲルカラム［G3000SW×l, 7.8mm×30 cm, 5μm (Tosoh Bioscience社製, LLC)］にロードし、0.5mL／分の流速で溶出した。分離されたAvPALタンパク質をAgilent series 1100分光器で分析した。
【０２９５】
凝集体は、ゲル電気泳動（図１０Ａ）又はSEC−HPLC（図１０Ｂ）で判断されたように、野生型AvPAL調製物、並びにAvPAL_C503S及びAvPAL_C64S調製物に含まれていたが、AvPAL_C565S及びAvPAL_C565SC503S調製物には含まれていなかった。
【０２９６】
（部位特異的ペグ化）
部位特異的ペグ化に対する、AvPALにおけるシステイン残基のセリンによる置換の影響を、実施例６に記載したとおりに、野生型AvPAL、及び二重システイン突然変異体AvPAL_C503SC565Sをペグ化し、AvPALリジン残基：K2、KlO、K32、Kl15、K145、K195、K301、K335、K413、K419、K493、K494及びK522での相対的ペグ化を比較することにより判断した。
【０２９７】
ペグ化されていない又はペグ化されたAvPALタンパク質の約100μg（10μg/μLで10μL）を８M尿素で変性した。その後、変性タンパク質を、37℃でpH8.2の0.8M 尿素中のトリプシンとの100μLの反応体積で、一晩（〜20時間）消化した。トリプシンに消化されたタンパク質を、１μLの１M DTTと37℃で１時間処理することにより還元し、3μLの15% TFAでクエンチさせた。消化されたタンパク質をCl8逆相カラムで分離した。それぞれのペグ化AvPALペプチドのペグ化の割合を対応するペグ化されていないペプチドのペプチドマッピングを減じるによって算出した。
【０２９８】
図１１にAvPALタンパク質：PEGの1:3の比で示すとおり、可能性のあるK419を除いて、いずれのリジン(K)残基のペグ化の割合において有意な相違はなかった。また、二重システイン突然変異体C565SC503Sのペグ化の割合は、野生型AvPALと比較して低かった。しかしながら、AvPALタンパク質：PEGの比を増加することでの二重システイン突然変異体を用いて得られた結果においては、用量反応相関はみられず、比較的小さなペグ化割合であり、これは、K1419の観察された相違が重要でないようであることを示す。したがって、位置503及び565のシステイン残基のセリンによる置換は、AvPALの部位特異的ペグ化に影響を受けていないと思われた。
【０２９９】
［実施例１３  AvPALタンパク質の凝集メカニズム］
本研究は、細菌で発現されたAvPALタンパク質の凝集メカニズムを調査するために行なわれた。
【０３００】
精製AvPAL生産物を濃縮し、37℃で２時間、濃縮タンパク質溶液をインキュベートし、溶液中で精製AvPALタンパク質の凝集を促進させた。凝集を、SEC−HPLCでAvPALタンパク質を分離することにより検出した。ジスルフィド架橋が凝集の原因であるか否かを判断するために、50mMジチオトレイトール(DTT)を濃縮タンパク溶液に添加し、37℃で２時間、インキュベートした。
【０３０１】
実施例２に記載したとおりに、細菌で発現されたAvPALタンパク質を精製し、スピンフィルター(Millipore Biomax−10K NMWL)を用いて濃縮した。タンパク質を、エッペンドルフ遠心分離機5415Cで、約15,000gで数分間回転させた。凝集体を意図するシステイン突然変異体（例えば、AvPAL_C503S及びAvPAL_C64S）においては、タンパク質を約20mg/mLまで濃縮し、37℃で２時間、インキュベートした。凝集に抵抗性のあるシステイン突然変異体（例えば、AvPAL_C565S及びAvPAL_C565SC503S）においては、タンパク質を約40mg/mLまで濃縮し、37℃で２時間、インキュベートした。
【０３０２】
表８に示すとおり、精製AvPALシステイン突然変異体AvPAL_C64S及びAvPAL_C503Sの調製物は、37℃で２時間のインキュベーションで凝集体を形成した。予想どおり、この凝集は、AvPALタンパク質を37℃で２時間のインキュベーションの前に濃縮した場合、悪影響を及ぼした。凝集は、DTTへの濃縮タンパクの暴露によって阻害され、これは、凝集がジスルフィド架橋によるものであることを示すものである。これに対して、精製AvPALシステイン突然変異体AvPAL_C565S及びAvPAL_C565SC503Sの調製物は、37℃で２時間のインキュベーションで凝集体を形成せず、これは、位置565のシステイン残基が、ジスルフィド架橋によってAvPALの凝集に関係することを示すものであった。
【０３０３】
【表９】
0005670183.tif 000032
【０３０４】
システイン残基が遊離スルフヒドリル基として存在するか否かを判断するために、精製AvPAL調製物を8M 尿素の存在下で変性し、ヨードアセトアミドによってアルキル化し、トリプシンで消化し、そして、LC/MSで分析した。AvPALシステイン残基はすべて、ヨードアセトアミドで標識化され、これは、細菌で発現されたAvPALのシステイン残基がすべて、遊離スルフヒドリル基として存在することを示すものであった。
【０３０５】
システイン残基が天然タンパク質の表面で存在するか否かを判断するために、精製AvPAL調製物を最初にN−エチルマレイミド(NEM)で処理し、次いで、8M 尿素の存在下で変性し、ヨードアセトアミドによってアルキル化し、トリプシンで消化し、そして、LC/MSで分析した。位置235及び424のシステイン残基は、NEMによってアルキル化されなかった。また、位置318のシステイン残基は、NEMによって単に部分的にアルキル化されただけであった。これらは、位置64、503及び565のシステイン残基が、天然AvPALの表面にあり、位置318のシステイン残基が、天然AvPALの表面で部分的に暴露されたことを示すものであった。
【０３０６】
システイン残基が鎖間ジスルフィド架橋に関係するか否かを判断するために、精製したペグ化されていない野生型AvPAL調製物の0.7mg/mL溶液の67μLを8M尿素で37℃で１時間変性し、次いで、トリプシンで、25℃、pH8.2で一晩（〜17.5時間）、100μLの反応体積において消化した。トリプシンに消化されたタンパク質を分離し、質量分析で分析した。また、推定されたジスルフィドペアに対応するペプチドを、同定し、全イオン数(TIC)として定量した。
【０３０７】
表９は、C503−C503、C503−C565、C565−C318及びC565−C565においてジスルフィドペアが検出されたことを示す。位置565の、及び、位置503の少ない程度までの、システイン残基は、精製AvPAL調製物において、ジスルフィドペアでみられた。
【０３０８】
【表１０】
0005670183.tif 000033
【０３０９】
本研究は、ジスルフィド架橋に加え、付加的メカニズムがAvPALタンパク質の凝集に関係し得るか否かを判断するために行なわれた。
【０３１０】
精製AvPAL調製物を0.05% Tween又は10mM EDTAでインキュベートし、次いで、実施例１２に記載したとおりに、SEC−HPLCで分離した。Tweenは、疎水的相互作用によりタンパク質凝集を低減させる。また、EDTAは、２価カチオンの存在によりタンパク質凝集を低減させる。図１２に示すように、0.05% Tween又は10mM EDTAへの暴露は、AvPALタンパク質凝集に影響を与えなかった。10mM EDTA処理AvPALにおける10分での追加的なピークは、210nmのEDTAの吸光度によるものであった。
【０３１１】
さらにAvPALタンパク質凝集におけるジスルフィド架橋の役割を調査するために、精製AvPALをDTTで処理した後、SEC−HPLCによる分離の前に脱塩した。図１３Ａに示すとおり、AvPALタンパク質凝集は、DTTでの処理により最小限となり、凝集体は、37℃で18時間のインキュベーションの後に再形成された。これに対して、図１３Ｂに示すとおり、AvPAL表面のシステインが、DTT暴露後に（但し、脱塩、及び37℃で18時間のインキュベーション前に）N−メチルマレイミド(NEM)での処理により変性される（すなわち、アルキル化される）と、凝集体は再形成しなかった。
【０３１２】
上述に基づくと、細菌で発現されたAvPALの凝集は、疎水性効果、又は２価カチオンの存在によるものではなく、鎖間ジスルフィド結合の形成単独によるものであると思われる。位置565及び503のシステイン残基は、AvPAL調製物における鎖間ジスルフィド結合の形成に関係している。
【０３１３】
［実施例１４  マウスにおけるAvPAL変異体（システイン突然変異体）及びそれらのペグ化形態の影響］
本研究の目的は、インビボでのマウスのフェニルアラニン(Phe)量に対する、AvPALポリペプチドの位置503及び565のシステイン残基のセリンによる置換の影響を判断することであった。
【０３１４】
AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sのペグ化形態を、基本的に実施例８に記載のとおりに、ホモ接合体ENU2マウス（BTBRenu2としても知られている）でインビボでの活性について試験した。当該ENU2マウスは、動物で重度のHPAによって生じる、PAHの遺伝子座のホモ接合突然変異体である。高い血漿フェニルアラニン(Phe)量は、この動物を、血漿Pheを低減させるPALの能力を評価するための適切なモデルにする。
【０３１５】
第一の研究においては、AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sをさまざまな投与量で試験した。ENU2マウス（雄及び雌）を５つの投与グループ［４つの試験グループ(n=4)及び１つのビヒクルのグループ(n=2)］に分けた。それぞれのマウスに毎週８回、低投与量のペグ化二重システイン突然変異体AvPAL(0.25 IU)、中程度の投与量のペグ化二重システイン突然変異体AvPAL(1.0 IU)、高投与量のペグ化二重システイン突然変異体AvPAL(4.0 IU)、又はペグ化野生型AvPAL(4.0 IU)を皮下注射した。血漿を、前投与、48時間の後投与（57日目まで）で回収し、Phe量を分析した。また、血清を、抗AvPAL抗体レベルの分析のために、前投与、48時間の後投与（57日目まで）で回収した。さらに、初期投与前（40日目まで）に、週の始めの２日に１回マウスの体重を測定した。
【０３１６】
当該研究中において、１匹のビヒクルで処置されたマウスと、１匹の低投与量のペグ化二重システイン突然変異体AvPALで処置されたマウスの２匹のマウスが死んだ。図１４に示すとおり、それぞれのペグ化二重システイン突然変異体AvPALの皮下注入後48時間で、血漿中で投与量に依存したPhe量の低減がみられた。等価投与量で、ペグ化野生型AvPAL又はペグ化二重システイン突然変異体AvPALで処置されたマウス間の血漿Phe量に差異はなかった。また、図１５に示すとおり、ビヒクル、ペグ化野生型AvPAL又はペグ化二重システイン突然変異体AvPALで処置されたマウス間の体重に有意な差はなかった。雄及び雌のマウスを研究で用いたため、体重の有意差がみられなかったと思われた。
【０３１７】
これらのマウスの抗AvPAL抗体力価を間接ELISA分析で分析した。この分析では、マイクロタイタープレートは、AvPALで被覆されてブロッキングされ、次いで、各マウス出血からの適切に希釈された血清に露出された。マイクロタイタープレートの表面に結合したAvPALは、血清試料中に存在するAvPAL特異抗体によって認識され、結合された。検出可能に標識化されたヤギ抗マウスIgG抗体は、結合された抗AvPAL抗体を検出した。血清試料を最初に1:50に希釈し、プールされた1:50希釈マウス血清からの“カットポイント”と比較分析した。カットポイントより低いシグナルを有する試料を＜50又は“陰性”として報告した。“陽性”とされた残りの試料を、シグナルがカットポイント未満に低下した希釈物にタイターする1:3に更に希釈した。ポジティブなシグナル（すなわち、カットポイントより高い）を提供した最も高い希釈比をその試料の力価として報告した。この一連の力価において、差異は、カットポイントレベルのシグナルの微少変化の結果であり得るので、３倍の力価の変化は、検出された抗体の有意差に反映していないと考えられる。
【０３１８】
表１０に示すとおり、抗AvPAL抗体力価は、ペグ化野生型AvPALの等価投与量(4.0 IU)で処置されたマウスと比較して、ペグ化二重システイン突然変異体AvPALで処置されたマウスでは低かった。明確な用量依存性はみられなかったが、ペグ化二重システイン突然変異体AvPALの高投与量(4.0 IU)で処置されたマウスは、ペグ化二重システイン突然変異体AvPALの低投与量(0.25 IU)で処置されたマウスよりも高い抗AvPAL抗体力価であった。
【０３１９】
【表１１】
0005670183.tif 000034
【０３２０】
ペグ化野生型AvPAL(4.0 IU)と比較して、4.0 IUのペグ化二重システイン突然変異体AvPALが投与されたマウスでの低減された抗AvPAL IgG力価は、当該研究において終始維持された。
【０３２１】
第二の研究においては、AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sをさまざなまペグ化比率で試験した。雄のENU2マウスを５つの投与グループ［４つの試験グループ(n=4)及び１つのビヒクルのグループ(n=2)］に分けた。それぞれのマウスに毎週８回、ビヒクル、低投与量のペグ化二重システイン突然変異体AvPAL(4 IU、1:1.6 AvPAL:PEG比)、中程度の投与量ペグ化二重システイン突然変異体AvPAL(4 IU、1:2.4 AvPAL:PEG比)、高投与量のペグ化二重システイン突然変異体AvPAL(4 IU、1:3 AvPAL:PEG比)、又はペグ化野生型AvPAL(4 IU、1:3 AvPAL:PEG比)を皮下注射した。血漿を、前投与、４日間の後投与（61日目まで）で回収し、Phe量を分析した。また、血清を、抗AvPAL抗体レベルの分析のために、前投与、４日間の後投与（57日目まで）で回収した。さらに、初期投与前（40日目まで）に、週の始めの２日に１回マウスの体重を測定した。
【０３２２】
研究中、１匹のビヒクルで処置されたマウスが死んだ。図１６に示すとおり、それぞれのペグ化二重システイン突然変異体AvPALの皮下注入後４日で、血漿中でPEG比に依存した血漿Phe量の低減がみられた。等価PEG比で、ペグ化野生型AvPAL又はペグ化二重システイン突然変異体AvPALで処置されたマウス間の血漿Phe量に差異はなかった。また、図１７に示すとおり、ペグ化野生型AvPAL又はペグ化二重システイン突然変異体AvPALで処置されたマウスの体重は、ビヒクル処置マウスよりも有意に重かった。
【０３２３】
これらのマウスの抗AvPAL抗体力価を、上述したとおりに、間接ELISA分析で分析した。
【０３２４】
表１１に示すとおり、抗AvPAL抗体力価は、同じAvPALとPEGの比(1:3)であるペグ化野生型AvPALの等価投与量で処置されたマウスと比較して、ペグ化二重システイン突然変異体AvPALで処置されたマウスでは低かった。抗AvPAL抗体力価と、AvPALとPEGの比の間に逆用量依存性がみられ、AvPAL等のタンパク質のペグ化が、インビボでの低減された免疫原性に関係しているという予想に一致するものであった。
【０３２５】
【表１２】
0005670183.tif 000035
【０３２６】
上の結果は、ペグ化二重システイン突然変異体AvPALが、ペグ化野生型AvPALと同等のインビボ酵素活性を有することを示す。ペグ化されていない野生型AvPALは、インビボ酵素活性が検出されなかった（実施例８参照）ので、ペグ化二重システイン突然変異体AvPALであるAvPAL_C565SC503S及びペグ化野生型AvPALを含むAvPAL変異体は、野生型AvPALよりも高いフェニルアラニン変換活性を有すると結論付けられる。
【０３２７】
また、上の結果は、位置503及び565のシステインからセリンへの置換によってインビトロでのタンパク質凝集を低減させるペグ化AvPAL変異体が、ペグ化野生型AvPALと比較して、低減された免疫原性を有することを示す。ペグ化自体が低減された免疫原性と関係しているので、AvPAL変異体は、野生型AvPALと比較して、インビボで低減された免疫原性を有すると結論付けられる。
【０３２８】
［実施例１５  AvPAL変異体の再ペグ化形態の生成］
AvPAL変異体のペグ化形態を再ペグ化させてペグ化（すなわち、AvPALリジン残基のPEG分子の割合）を増加させることができるか否か、並びに、再ペグ化形態のAvPAL変異体がインビトロで酵素活性を維持するか、及びインビボでの改善された特性（すなわち、低減された免疫原性）を有するか否かを判断するために研究を行った。
【０３２９】
（AvPAL変異体のペグ化）
二重システイン突然変異体AvPALであるAvPAL_C565SC503Sを、基本的に実施例６に記載したとおりに、さまざまなPAL:PEG比［すなわち、AvPAL_C565SC503S：SUNBRIGHT ME-200HS 20kDaのNHS活性化PEG(NOF)］でペグ化した。
【０３３０】
簡潔には、標準反応混合物は、7mg/ml（2mMのリジン残基に相当）AvPAL_C565SC503S、及び、50mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.5)中2、3、4又は6mMのmPEG20K−NHS（メトキシポリエチレングリコール−カルボキシメチル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、20kDa、SUNBRIGHT ME-200HS, NOF）をそれぞれ、1:1、1:1.5、1:2又は1:3の全AvPALリジン残基とPEG分子のモル比に相当するものであった（表１２参照）。３時間室温でのインキュベーションの後に、当該反応混合物を200mM リン酸カリウムに緩衝液交換し、その後の再ペグ化工程の準備で、タンジェンシャルフローろ過（Vivaflow 50又は200、ポリエーテルスルフォン又は再生セルロース膜、100kDa MWCO、Sartorius）を用いて20mg/mlよりも高濃度で濃縮した。
【０３３１】
【表１３】
0005670183.tif 000036
【０３３２】
（ペグ化AvPAL変異体の再ペグ化）
さまざまなPAL:PEG比でペグ化されたAvPAL_C565SC503Sを、基本的には、実施例６で記載したとおりに、さまざまな濃度のペグ化酵素、AvPAL酵素のさまざまな量及び比のリジン残基、及びSUNBRIGHT ME-200HS 20kDa NHS活性化PEG(NOF)分子を用いて再ペグ化した。
【０３３３】
それぞれの再ペグ化反応においては、出発物質は、200mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.5)中で20mg/mLより高濃度に濃縮されたペグ化AvPAL_C565SC503S(rAvPAL−PEG)であった。mPEG20K−NHSを各再ペグ化反応のために別々に秤量し、最小容積の水で再懸濁した。必要時に緩衝液で希釈されたrAvPAL−PEGを当該再懸濁されたmPEG20K−NHS溶液に直接加え、表１２に示す最終濃度にした。再ペグ化反応は、３時間室温で進行し、25mM Tris−HCl(pH7.3)で２倍に希釈することでクエンチした。タンジェンシャルフローろ過（Vivaflow 50又は200、ポリエーテルスルフォン又は再生セルロース膜、100kDa MWCO、Sartorius）を用いて緩衝液交換をし、10mM Tris−HCl、135mM NaCl、1mM L−Phe(pH7.3)で再ペグ化rAvPAL−PEG試料を濃縮した。必要に応じて、遠心濃縮を用いて最終的な再ペグ化rAvPAL−PEG試料を更に濃縮した。
【０３３４】
（インビトロでの特性評価方法）
全タンパク質分析：
ペグ化及び再ペグ化rAvPAL−PEG試料の濃縮物を、基準としてのウシ血清アルブミンと共に、Pierce社(cat#23227)から市販されている分析キットを用いて、ビシンコニン酸(BCA)分析によって判断した。簡潔には、25μLの試料と基準を37℃で30分間、200μLのBCA試薬とインキュベートした。562nmの吸光度をSPECTRAmax PLUSマイクロプレート分光光度計（Molecular Devices Corporation社製）で読み取った。
【０３３５】
rAvPAL活性の分析：
ペグ化及び再ペグ化rAvPAL−PEG試料の比活性を、実施例３に記載した確立されたPAL活性分析プロトコールに基づいて測定した。簡潔には、1mL分析反応液にタンパク質試料(25〜50μL)の添加において、L−Pheがtrans−桂皮酸に変換されると、OD290の増加がモニターされる。必要に応じて、分析前に、分析希釈緩衝液(10mM Tris−HCl、135mM NaCl, pH7.3)で試料を希釈した。測定点はそれぞれ、３つの独立した測定の平均値を表わした。
【０３３６】
キャピラリーゲル電気泳動(CGE)：
CGE分析をBeckman-Coulter社(cat # 390953)のProteomeLab SDS−MW分析キットを用いて行った。ペグ化及び再ペグ化rAvPAL−PEG試料、並びにびrAvPAL−PEG−RP1試料を95℃で５分間SDS及びβ−メルカプトエタノールの存在下で加熱した後、Beckman-Coulter社のP/ACE MDQキャピラリー電気泳動システムのキャピラリー（PA800 CE, 23cm 溶融シリカ）にロードした。CGEプロファイルは、214nmのUV吸光度を示す。それぞれのCGE試料は、分析のための基準としての10kDaの移動マーカーを含んでいた。キャピラリーは、rAvPAL−PEG試料間で再度調整された。
【０３３７】
TNBS分析：
トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)分析を用いて、ペグ化及び再ペグ化rAvPAL−PEG試料に存在する遊離アミン基を推定した。
【０３３８】
ペプチドマッピング：
実施例１０に記載のrAvPAL−PEG及びrAvPAL−PEG試料のトリプシンペプチドマッピングを行って、AvPAL変異体タンパク質におけるリジン残基のペグ化割合を測定した。ペグ化の量、すなわち、再ペグ化AvPAL_C565SC503SのAvPALのリジン残基K10、K32、K115、K145、K195、K301、K335、K413、K493/K494及びK522のPEG分子の割合を測定した。
【０３３９】
（ペグ化及び再ペグ化AvPAL変異体のインビトロでの特性）
rAvPAL酵素活性：
図１８（上段）に示すとおり、ペグ化及び再ペグ化は、インビトロでのrAvPAL酵素活性を一時的に低減させた。これは、触媒活性部位付近の特定のチロシン残基の可逆的なペグ化によるものと思われた。単一のペグ化と比較して、再ペグ化は、rAvPAL酵素活性（すなわち、その比活性が一時的に低減され、徐々に時間の経過で回復した）に及ぼすペグ化反応の効果が向上するものと思われた。ペグ化反応におけるPEGの高い濃度は、比活性の大きな一時的低減と関連していた。しかしながら、４℃で数週後に、さまざまなPAL:PEG比並びに酵素及びPEG分子の濃度（AvPAL及びPEGのリジン残基のmM濃度で表される）で最初に生成された再ペグ化rAvPAL−PEGの比活性は、1:3のPAL:PEG比（2mMリジン残基：6mM PEG、●）で生成された単一のペグ化AvPAL−PEGの約80％となった。また、ペグ化及び再ペグ化AvPAL-PEG酵素は、ペグ化後に同程度の活性回復を示した。
【０３４０】
図１８（下段）に示すとおり、1:1のPAL:PEG比（2mMリジン残基：2mM PEG、■）でペグ化rAvPAL−PEGが最初に生成した場合、同様の傾向がみられた。全体的に、再ペグ化は、一時的にAvPAL活性に影響を及ぼしたが、結果として生じた再ペグ化rAvPAL−PEGの比活性は、1:3のPAL:PEG比で生成された単一ペグ化rAvPAL−PEGと比較して、許容し得る範囲内であった。
【０３４１】
ペグ化及び再ペグ化rAvPALのCGE分析：
CGE分析は、再ペグ化が、単一のペグ化と比べて、全体的な範囲を増加させることを示した。図１９Ａに示すとおり、再ペグ化により、付加的なPEG分子の付加により増加した分子の大きさを意味する、rAvPAL−PEGの電気泳動移動度が低減された。また、ペグ化の程度は、再ペグ化工程時のPEGの濃度に非常に関連していた。図１９Ｂに示すように、最初のペグ化工程時の反応条件に関係なく、6mM以上の高濃度のmPEG20K−NHSは、rAVPAL−PEGのペグ化を増加させるのに同様に有効であった。要約すると、単一ペグ化rAvPALと比較して、再ペグ化rAvPAL−PEGは、低減されたCGE移動度、したがって増加された分子量を明確に示した。
【０３４２】
再ペグ化におけるrAvPAL−PEGの遊離アミン：
TNBS分析を行い、単一ペグ化rAvPAL−PEGと比較して、再ペグ化rAvPAL−PEGに存在する遊離アミン基の量を推定した。表１３に示すとおり、6mMのような高濃度のPEGの存在下における再ペグ化は、rAvPALタンパク質の遊離アミンが最も有意に低減され、これは、ペグ化の全体的な増加を示すものであった。本明細書中に用いられる条件下においては、化学的改質に利用される再ペグ化されていないrAvPALの大部分の遊離アミンは、再ペグ化後に効果的にペグ化される。
【０３４３】
【表１４】
0005670183.tif 000037
【０３４４】
再ペグ化におけるリジン残基のペグ化の割合：
図２０に示すとおり、トリプシンペプチドマッピングは、再ペグ化がrAvPAL−PEGのリジン残基のペグ化の割合を改善することを示した。単一のペグ化工程時に既に100％ペグ化されているAvPALの位置10のリジン残基を除いて、残りの結合していないリジン残基は、再ペグ化におけるペグ化の標的とされた。特に、AvPALの位置301のリジン残基のペグ化は、再ペグ化において、500％も増加した。6mMのような高濃度の活性化mPEG20K−NHS存在下での再ペグ化条件は、2mMのような低いPEG濃度より、rAvPAL−PEGのペグ化の程度が非常に効果的に増大すると思われた。
【０３４５】
［実施例１６  マウスにおけるAvPAL−PEG変異体の再ペグ化の影響］
実施例１５に記載したとおりに１回及び２回のペグ化反応で1:3のPAL:PEG比で生成された再PEG化AvPAL_C565SC503S(rAvPAL−PEG−RP1)を、PKUのマウスモデルの血漿Phe量を低減させる及びインビボでの抗体反応を誘発する能力に関して、実施例６及び１５に記載に記載したとおりに1:3のPAL:PEG比で生成された単一ペグ化AvPAL_C565SC503S(rAvPAL−PEG)と比較した。
【０３４６】
２つのペグ化及び再ペグ化AvPAL変異体酵素の比活性を実施例３に記載したとおりに測定した。rAvPAL−PEG−RP1は、比活性(1.17 U/mg)があり、rAvPAL−PEGの比活性(1.47 U/mg)より約20％低かった。
【０３４７】
ペグ化及び再ペグ化形態のAvPAL_C565SC503S、rAvPAL−PEG及びrAvPAL−PEG−RP1をそれぞれ、ホモ接合体ENU2マウス（BTBRenu2としても知られている）においてインビボでの活性について試験した。研究計画を下の表１４に示す。
【０３４８】
【表１５】
0005670183.tif 000038
【０３４９】
グループ１及び２の２つのマウスのグループに、高投与量(80mg/kg)のrAvPAL−PEG又はrAvPAL−PEG−RP1のいずれかを８週間毎週、次いで、低投与量(20mg/kg)のrAvPAL−PEG又はrAvPAL−PEG−RP1を６週間毎週皮下投与した。マウスの１つのグループ（グループ３）に高投与量のrAvPAL−PEG、次いで、低投与量のrAvPAL−PEG−RP1を投与した。血漿を前投与及びさまざまな日の後投与で回収し、Phe量を分析した。実施例８に記載したとおりに、血漿Phe量を測定した。得られたデータを図２１に示す。また、抗AvPAL抗体レベルの分析のために、血清を前投与及びさまざまな日の後投与で回収した。実施例１４に記載したとおりに、血清抗AvPAL IgG力価を測定した。得られたデータを表１５に示す。
【０３５０】
図２１に示すとおり、全３グループにおいて、７〜８週の毎週80mg/kgのrAvPAL−PEG（DP、●若しくは▼）の皮下投与、又はrAvPAL−PEG−RP1（2xPEG、○）は、血漿Phe量を＜200μMに安定化させた。安定化後、毎週20mg/kgのrAvPAL−PEGの皮下投与は、血漿Phe量を４日間＜200μMにさせた。20mg/kgのrAvPAL−PEG（DP、●）で処置されたENU2マウスの血漿Phe量は、20mg/kgのrAvPAL−PEG−RP1（2xPEG、○又は▼）で処置されたマウスよりも低く、これは、二重ペグ化rAvPAL−PEG−RP1と比較した単一ペグ化rAvPAL−PEGの高い比活性によるものであった。
【０３５１】
表１５に示すとおり、抗AvPAL IgG力価は、rAvPAL−PEG（グループ１及び３）を注入したものよりもrAvPAL−PEG−RP1（グループ２）を注入したENU2マウスで低かった。これは、特に、20kDaの線状PEG分子での、増加されたペグ化の量であるAvPAL変異体の再ペグ化は、インビボでの低減された免疫原性に関係していることを示すものであった。
【０３５２】
【表１６】
0005670183.tif 000039
【０３５３】
要約すると、AvPALのさまざまなリジン残基のペグ化の割合を増加させる20kDaの線状PEGでのAvPAL−PEG変異体の再ペグ化は、インビボでの僅かな酵素活性の低減だけでなく、重要なことに、インビボでの免疫原性と関係していた。
【０３５４】
［実施例１７  原核生物PAL組成物での臨床的評価］
次の実施例は、本発明の治療方法における、原核生物PAL、又は、生物学的に活性のあるその変異体、突然変異体、及びそのフラグメント("PAL")を含む組成物の臨床的評価に用いられるパラメーターに関する手引きを提供するものである。本明細書の全体にわたって考察されるとおり、PALを、HPA、軽症型のフェニルケトン尿症(PKU)及び古典的PKUを含むHPAの治療に用いる。臨床試験が行われ、安全性、薬動力学、並びに、代用薬及び明確な臨床的エンドポイントの初期反応におけるPALの経口又は皮下用量の評価を提供する。当該臨床試験は、最小限で行われ、100人の評価可能な患者の十分な安全性情報を収集するのに24週必要であるが、必ずしもこれに限定されない。当該臨床試験の初期用量は、約0.001〜約1.0mg/kg/週で変動する。この用量が、患者の過剰な血漿フェニルアラニン(Phe)量の低減がなされない、又は血漿Phe量の増加のない毎日の経口によるPhe摂取を増加させる能力として測定された重要な直接的な臨床的利益を生まない場合は、当該用量は、必要に応じて増加され、安全性を確立し、更なる有効性を評価するのに24週の、必ずしもこれに限定されない追加的な最小期間維持される。
【０３５５】
安全性の判断は、相違のある、有害事象、アレルギー反応、完全な臨床化学パネル（腎臓及び肝機能）、尿検査、及びCBCを含む。また、血液Phe量の低減、神経心理及び認識機能検査、並びに包括的評価を含む他のパラメーターがモニターされる。さらに、本実施例は、流通における薬剤の薬動力学パラメーター、並びに、一般的な流通及び血液中のPALの半減期の判断を意図するものである。これらの手段は、臨床反応に対する用量に関して支援するものと予想される。
【０３５６】
（方法）
上昇した血漿Phe量を有する患者は、病歴及び健康診断、神経心理及び認識機能検査、臨床検査（CBC、Panel 20、CH50、UA）の標準セット、尿のプテリン量、ジヒドロプテリジン還元酵素(DHPR)量、並びに、血清アミノ酸の血液（血漿）パネルの絶食という、ベースラインを経験する。患者は、病院への毎週の通院で緊密に続く。患者は、治療期間の終了１週間後、完全な評価のために病院に戻る。用量増加が必要であれば、患者は、上述に概説された同様のスケジュールに従う。安全性が試験全体にわたってモニターされる。
【０３５７】
（診断、及び包含物／除外基準）
患者は、男性か女性であり、血液中の上昇したPhe量の遺伝子検査及び証拠によって確認されたHPA又は軽症型PKUの裏付けのある診断を受けることができる。本研究は、厳格な食事制限をしないHPA又はPKUの患者を含むものである。出産の可能性のある女性患者は、それぞれの投与直前に、陰性の妊娠テスト（尿β−hCG）をしている必要があり、本研究の全体にわたって、医学的に許容し得る避妊方法を利用するようにアドバイスする必要がある。患者が妊娠している若しくは乳を分泌している、研究登録前30日以内に臨床試験用医薬品を使用している、又は、研究コンプライアンスを顕著に減少させる病状、重大な併発性の疾病若しくは他の軽減する状況がある場合、患者は、この研究から除外される。
【０３５８】
（食事療法）
初期のランダム化及び２週間の治療期間に従って、研究参加者は全員、食事のカウンセリングを経験し、標準食事及び／又は合計４〜６週のPhe特効性医学的食品で補足された標準Phe制限食が続く。食事は、患者の自宅で管理され、食事摂取は、日誌に記録される。栄養素及び医学的食品の摂取及び推奨食事摂取(RDI)の割合の分析は、治療グループ間で比較される。
【０３５９】
（PALの安全性）
PAL治療は、深刻な急性又は慢性の薬物反応が研究時に生じない場合には、安全であると判断される。薬剤の非常に長期的の投与は、深刻な異常が臨床検査、臨床研究所、又は他の適切な研究でみられない場合には、安全であると判断される。
【０３６０】
［実施例１８  ペグ化AvPAL変異体の臨床的評価］
ペグ化二重システイン突然変異体AvPALであるAvPAL_C565SC503Sは、ヒトで臨床的に評価される。本臨床的評価の目的は、安全性、耐用性、薬動力学(PK)及びPKU患者における有効性を判断することである。血液フェニルアラニン(Phe)量は、臨床的なエンドポイントとして有用である。
【０３６１】
（フェーズ１）
フェーズ１は、16〜50歳の35人のPKU患者での非盲検の１回投与の上昇試験である。主な目的は、ペグ化二重システイン突然変異体AvPALであるAvPAL_C565SC503Sの安全性及び耐用性を評価することであり、第二の目的は、ペグ化酵素のPK及びPhe低減を評価することである。５人の被験者の７つの集団に、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3及び1mg/kgの上昇する投与量で、ペグ化AvPAL_C565SC503Sを連続的に投与する。それぞれの集団の当該被験者は、１回投与であり、その後、合計６週間まで継続する。包含基準は、スクリーニングでの血液Phe量及び過去３年にわたる平均血液Phe量が、≧600μMである。
【０３６２】
（フェーズ２）
フェーズ２の検討は、割り込みのない２部に分けられる：
○第１部は、16週、８週の投与後、投与量の最適化
○第２部は、40週に拡大して投与する。
【０３６３】
フェーズ２は、２部であり、PKUの35人における被験者非盲検の投与最適化の検討である。16週の期間にわたって行われた第１部は、８週の週１回のペグ化AvPAL_C565SC503Sの投与と、その後の投与量最適化の期間を含む。それぞれの患者の投与量を、600μM未満の血液Phe濃度になるように調整する。主な目的は、ペグ化AvPAL_C565SC503Sの複数回投与の安全性及び耐用性を評価することであり、第二の目的は、血液Phe濃度、免疫反応（例えば、抗体AvPAL抗体力価）及び定常状態PKに対するペグ化酵素の影響を評価することである。第２部においては、個々に区別され最適化された投与量及び投与頻度で、ペグ化AvPAL_C565SC503Sを被験者に40週間投与する。
【０３６４】
（フェーズ３）
フェーズ１及び２の試験が完了すれば、付加的な検討は、フェーズ３を滞在的に含んでもよい。当該フェーズ３は、特別の集団［例えば、非PKU高フェニルアラニン血症(HPA)患者、BH4反応性PKU患者及び非BH4反応性PHU患者］での付加的な試験である非常に多数の被験者における６ヶ月の二重盲検試験である。
【図１Ａ】
0005670183.tif 000040
【図１Ｂ】
0005670183.tif 000041
【図２Ａ】
0005670183.tif 000042
【図２Ｂ】
0005670183.tif 000043
【図３】
0005670183.tif 000044
【図４−１】
0005670183.tif 000045
【図４−２】
0005670183.tif 000046
【図５Ａ】
0005670183.tif 000047
【図５Ｂ】
0005670183.tif 000048
【図６Ａ】
0005670183.tif 000049
【図６Ｂ】
0005670183.tif 000050
【図７】
0005670183.tif 000051
【図８Ａ−Ｅ】
0005670183.tif 000052
【図９Ａ】
0005670183.tif 000053
【図９Ｂ】
0005670183.tif 000054
【図１０Ａ】
0005670183.tif 000055
【図１０Ｂ】
0005670183.tif 000056
【図１１】
0005670183.tif 000057
【図１２】
0005670183.tif 000058
【図１３Ａ】
0005670183.tif 000059
【図１３Ｂ】
0005670183.tif 000060
【図１４】
0005670183.tif 000061
【図１５】
0005670183.tif 000062
【図１６】
0005670183.tif 000063
【図１７】
0005670183.tif 000064
【図１８】
0005670183.tif 000065
【図１９Ａ−Ｂ】
0005670183.tif 000066
【図２０】
0005670183.tif 000067
【図２１】
0005670183.tif 000068
【配列表】
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