(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）〜（ｅ）に示すポリヌクレオチドからなる群から選択される、胃がん被験者由来の検体試料中のｍｉＲ−１４８ａ及びｍｉＲ−４２５の発現若しくは発現量を測定するための２以上のポリヌクレオチドを含む、胃がんの補助化学療法感受性判定用組成物であって、胃がんの補助化学療法が、該被験者に対しフルオロウラシル又はフルオロウラシル系プロドラッグを投与するものである、前記組成物。
（ａ）配列番号１及び２で表されるそれぞれの塩基配列からなるポリヌクレオチド、或いは、配列番号１及び２で表されるそれぞれの塩基配列において１若しくは２個のヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）に示すポリヌクレオチドのそれぞれの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｄ）（ａ）及び（ｂ）に示すポリヌクレオチドのそれぞれの塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のそれぞれのポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ
【請求項２】
下記の（ｆ）〜（ｊ）に示すポリヌクレオチドからなる群から選択される、前記検体試料中のｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−９２ａ−２＊、ｍｉＲ−１５１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−６６４、ｍｉＲ−１９０８、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−７６９−３ｐ、ｍｉＲ−１９７８、ｍｉＲ−６０５、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−１９１５、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４５＊、ｍｉＲ−５００＊、ｍｉＲ−２９ｂ−２＊及びｍｉＲ−１５５の１以上のｍｉＲＮＡの発現若しくは発現量を測定するための１以上のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
（ｆ）配列番号３〜２２で表されるそれぞれの塩基配列からなるポリヌクレオチド、或いは、配列番号３〜２２で表されるそれぞれの塩基配列において１若しくは２個のヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入を含むポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号３〜２２で表されるそれぞれの塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｈ）（ｆ）及び（ｇ）に示すポリヌクレオチドのそれぞれの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｉ）（ｆ）及び（ｇ）に示すポリヌクレオチドのそれぞれの塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｊ）前記（ｆ）〜（ｉ）のそれぞれのポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ
【請求項３】
胃がん被験者由来の検体試料中のｍｉＲ−１４８ａ及びｍｉＲ−４２５の発現若しくは発現量を測定するための請求項１に記載の（ａ）〜（ｅ）に示すポリヌクレオチドの２以上を含む、胃がんの補助化学療法感受性判定用キットであって、胃がんの補助化学療法が、胃がん被験者に対しフルオロウラシル又はフルオロウラシル系プロドラッグを投与するものである、前記キット。
【請求項４】
ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−９２ａ−２＊、ｍｉＲ−１５１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−６６４、ｍｉＲ−１９０８、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−７６９−３ｐ、ｍｉＲ−１９７８、ｍｉＲ−６０５、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−１９１５、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４５＊、ｍｉＲ−５００＊、ｍｉＲ−２９ｂ−２＊及びｍｉＲ−１５５の発現若しくは発現量を測定するための請求項２に記載の（ｆ）〜（ｊ）に示すポリヌクレオチドの１以上をさらに含む、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１〜２２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号１〜２２で表される塩基配列において１若しくは２個のヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入を含むポリヌクレオチド、それらの相補的配列からなるポリヌクレオチド、或いは、それらのポリヌクレオチドをコードするＤＮＡである、請求項３又は４に記載のキット。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、別個に又は任意に組み合わせて容器に包装されている、請求項３〜５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７】
胃がん被験者由来の検体試料中のｍｉＲ−１４８ａ及びｍｉＲ−４２５の発現若しくは発現量を測定するための請求項１に記載の（ａ）〜（ｅ）に示すポリヌクレオチドの２以上を含む、胃がんの補助化学療法感受性判定用核酸アレイであって、胃がんの補助化学療法が、胃がん被験者に対しフルオロウラシル又はフルオロウラシル系プロドラッグを投与するものである、前記核酸アレイ。
【請求項８】
ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−９２ａ−２＊、ｍｉＲ−１５１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−６６４、ｍｉＲ−１９０８、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−７６９−３ｐ、ｍｉＲ−１９７８、ｍｉＲ−６０５、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−１９１５、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４５＊、ｍｉＲ−５００＊、ｍｉＲ−２９ｂ−２＊及びｍｉＲ−１５５の発現若しくは発現量を測定するための請求項２に記載の（ｆ）〜（ｊ）に示すポリヌクレオチドの１以上をさらに含む、請求項７に記載の核酸アレイ。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の組成物、請求項３〜６のいずれかに記載のキット、請求項７又は８に記載の核酸アレイ、又はそれらの組み合わせを用いて、胃がん被験者由来の生体試料における標的核酸としてのｍｉＲ−１４８ａ及びｍｉＲ−４２５の発現若しくは発現量並びに、必要であればｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−９２ａ−２＊、ｍｉＲ−１５１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−６６４、ｍｉＲ−１９０８、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−７６９−３ｐ、ｍｉＲ−１９７８、ｍｉＲ−６０５、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−１９１５、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４５＊、ｍｉＲ−５００＊、ｍｉＲ−２９ｂ−２＊、及びｍｉＲ−１５５の１以上のｍｉＲＮＡの発現若しくは発現量、を測定し、被験者の胃がんの補助化学療法感受性の有無をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価することを含む、被験者の胃がんの補助化学療法感受性を判定する方法。
【請求項１０】
核酸アレイを用いる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載の組成物、請求項３〜６のいずれかに記載のキット、請求項７又は８に記載の核酸アレイ、又はそれらの組み合わせを用いて、胃がんの手術患者由来の検体試料であることが既知の複数の生体試料中の標的核酸の発現量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する第１の工程、前記第１の工程で得られた該標的核酸の発現量の測定値を教師とした判別式（ニューラルネットワークモデル）を作成する第２の工程、被験者由来の検体試料中の該標的核酸の発現量を第１の工程と同様にｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する第３の工程、前記第２の工程で得られた判別式に第３の工程で得られた該標的核酸の発現量の測定値を代入し、該判別式から得られた結果に基づいて、被験者の胃がんの補助化学療法感受性の有無を評価する第４の工程を含む、但し該標的核酸が、ｍｉＲ−１４８ａ及びｍｉＲ−４２５、並びに、必要であればｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−９２ａ−２＊、ｍｉＲ−１５１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−６６４、ｍｉＲ−１９０８、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−７６９−３ｐ、ｍｉＲ−１９７８、ｍｉＲ−６０５、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−１９１５、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４５＊、ｍｉＲ−５００＊、ｍｉＲ−２９ｂ−２＊、及びｍｉＲ−１５５の１以上のｍｉＲＮＡである、被験者の胃がんの補助化学療法感受性を判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃がんの補助化学療法感受性の判定に有用な判定用組成物、該組成物を利用した胃がんの補助化学療法感受性の判定方法、及び該組成物を利用した胃がんの補助化学療法感受性の判定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの手術において、肉眼的には腫瘍を取り切ったと見られた場合でも、目に見えない微小な転移が残る可能性があることから、手術後に抗癌剤を投与する、術後補助化学療法が施されることがある。これは、補助化学療法を行うことで、微小な転移から癌が増殖して再発するのを未然に防止することを目的としている。胃がんの手術後に行われる術後補助化学療法においては、主に数種類の抗癌剤が用いられるが、どの抗癌剤が効果を示すのかは、患者毎で個人差がみられる。そこで、各種薬剤の感受性を判定する手段として、抗癌剤感受性試験を行うことがある。これは、手術で摘出した腫瘍細胞をインビトロで初代培養し、そこに各種抗がん剤を投与して細胞の生存率を対照と比較することで、抗がん剤に対する感受性を判定しようとするものである。
【０００３】
胃がんの抗癌剤感受性試験は、特定非営利活動法人日本がん臨床試験推進機構（ＪＡＣＣＲＯ）においては、継続中のものを含めて５つのプロトコールにて実施されている（例えば非特許文献１）。特許文献１には、腫瘍細胞のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の代理マーカーとして患者の血中グルタチオン（ＧＳＨ）のレベルを測定することで、胃がんの治療に用いられるシスプラチン等の白金錯体の感受性を判定することが記載されている。非特許文献２〜５には、ＤＮＡ合成において重要な酵素であるチミジル酸合成酵素（Ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＴＳ））、フルオロウラシル（５−ＦＵ）の分解酵素であるジヒドロピリミジン脱水素酵素（Ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＤＰＤ））などの酵素活性、及び血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ））などの発現量とフルオロウラシル系薬剤の感受性との関連について、免疫染色や定量ＲＴ−ＰＣＲにより検討したことが報告されている。非特許文献６、非特許文献７には、胃がんの補助化学療法において使用されるフルオロウラシル系プロドラッグである、ウラシル・テガフール（商品名：ユーエフティ（ＵＦＴ））、オテラシルカリウム・ギメラシル・テガフール（商品名：ティーエスワン（ＴＳ−１））の有効性がそれぞれ示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００５−５０４３２２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】久保田哲朗、週刊医学のあゆみ  ２１７巻９号、８６９−８７３頁（２００７年）
【非特許文献２】入野田崇ら、日本消化器外科学会誌  ３２巻７号、１９５５−１９６１頁（１９９９年）
【非特許文献３】Ｆａｋｈｒｅｊａｈａｎｉ  Ｅ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，６０，４３７−４４６（２００７）
【非特許文献４】Ｈｕａ  Ｄ．ら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｒｏｌｏｇｙ，１３（３７），５０３０−５０３４（２００７）
【非特許文献５】Ｂｏｋｕ  Ｎ．ら、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３７（４），２７５−２８１（２００７）
【非特許文献６】Ｎａｋａｊｉｍａ  Ｔ．ら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，９４（１２），１４６８−１４７６（２００７）
【非特許文献７】Ｓａｋｕｒａｍｏｔｏ  Ｓ．ら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３５７，１８１０−１８２０（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記の抗癌剤感受性試験は、効果のない抗癌剤を判定する確率はおよそ９０％と高い一方、効果のある抗癌剤を特定できる確率は４０〜５０％程度と低いことが課題である。また、非特許文献２〜５の方法は、医療現場で実施するのは困難であると想定される手法であり、実際にも行われていない。したがって、効果がある抗癌剤を高い確率で判定できる方法がないのが現状であり、抗癌剤の効果そのものを正しく判定できる方法の開発が求められている。また、非特許文献７にあるように、現在補助化学療法の第一選択薬となっているオテラシルカリウム・ギメラシル・テガフール（ＴＳ−１）の出現により、その有用性が示されたものの、ＴＳ−１が奏効しない患者が存在することも事実であり、そのような患者に対しても、早い段階で効果の高い薬剤を選択し、効果的な化学療法を実施することが切望されている。
【０００７】
本発明は、胃がんの補助化学療法感受性の判定に有用となる判定用組成物、該組成物を用いた胃がんの補助化学療法感受性の判定方法、及び該組成物を利用した胃がんの補助化学療法感受性の判定用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
胃がんの補助化学療法感受性を判定するためのマーカー探索の方法としては、手術時に摘出された胃組織において、補助化学療法感受性である患者由来の胃がん細胞と感受性でない患者由来の胃がん細胞における遺伝子発現やタンパク質発現、又は細胞の代謝産物などの量を何らかの手段によって比較する方法や、補助化学療法感受性である胃がん患者と感受性でない胃がん患者の体液中に含まれる遺伝子、タンパク質、代謝産物などの量を測定して比較する方法が挙げられる。
【０００９】
ＤＮＡアレイ等の核酸アレイを用いた発現遺伝子量解析は、近年、このようなマーカー探索の手法として特に汎用されている。核酸アレイには数百から数万種の遺伝子に対応した塩基配列を利用したプローブが固定されている。被検試料を核酸アレイに添加することによって試料中の遺伝子がプローブと結合し、この結合量を何らかの手段によって測定することにより、被検試料中の遺伝子量を知ることができる。核酸アレイ上に固定化するプローブに対応した遺伝子の選択は自由であり、また手術時又は内視鏡検査時に摘出される胃がん患者由来の腫瘍部、非腫瘍部それぞれの細胞を用いて、試料中の発現遺伝子量を比較することにより、胃がんの補助化学療法感受性に関連する遺伝子群を推定することが可能である。
【００１０】
上記の課題を解決するために、本発明者らは、胃がんの補助化学療法感受性である患者の遺伝子発現と感受性でない患者の遺伝子発現をそれぞれ核酸アレイによって解析し、胃がんの補助化学療法感受性に関連するマーカーとして使用可能な遺伝子を見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
１．発明の概要
本発明は、以下の特徴を有する。
本発明は第１の態様において、下記の（ａ）〜（ｆ）に示すポリヌクレオチドからなる群から選択される２以上のポリヌクレオチドを含む、胃がんの補助化学療法に対する感受性を判定するための組成物（以下、「胃がんの補助化学療法感受性判定用組成物」と称する。）である。
【００１２】
（ａ）配列番号１〜２２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、その前駆体ポリヌクレオチド、その変異体ポリヌクレオチド、又はその修飾ポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１〜２２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１〜２２で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体ポリヌクレオチド、又はその修飾ポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号１〜２２で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｆ）上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかのポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ
またその実施形態において、胃がんの補助化学療法がフルオロウラシル（５−ＦＵ）又はフルオロウラシル（５−ＦＵ）系プロドラッグを投与するものである、上記の組成物である。
【００１３】
本発明の第２の態様として、上記の（ａ）〜（ｆ）に示すポリヌクレオチドの２以上を含む、胃がんの補助化学療法感受性判定用キットである。
【００１４】
またその実施形態において、前記ポリヌクレオチドが、配列番号１〜２２のいずれかで表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相補的配列からなるポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ、又はそれらの修飾ポリヌクレオチドである、上記のキットである。
【００１５】
また別の実施形態において、上記ポリヌクレオチドが、別個に又は任意に組み合わせて容器に包装されている、上記のキットである。
【００１６】
本発明の第３の態様として、上記の（ａ）〜（ｆ）に示すポリヌクレオチドの２以上を含む、胃がんの補助化学療法感受性判定用核酸アレイである。
【００１７】
第４の態様として、上記の組成物、上記のキット、上記の核酸アレイ、又はそれらの組み合わせを用いて、被験者由来の生体試料における標的核酸の発現レベルを測定することによって、被験者由来の検体試料中において胃がんの補助化学療法感受性の有無をｉｎ  ｖｉｔｒｏで判定する方法である。
またその実施形態において、核酸アレイを用いる上記の判定方法である。
【００１８】
また別の実施形態において、上記の組成物、上記のキット、上記の核酸アレイ、又はそれらの組み合わせを用いて、胃がんの手術患者由来の検体試料であることが既知の複数の生体試料中の標的核酸の発現量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する第１の工程、前記第１の工程で得られた該標的核酸の発現量の測定値を教師とした判別式（ニューラルネットワークモデル）を作成する第２の工程、被験者由来の検体試料中の該標的核酸の発現量を第１の工程と同様にｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する第３の工程、前記第２の工程で得られた判別式に第３の工程で得られた該標的核酸の発現量の測定値を代入し、該判別式から得られた結果に基づいて、被験者由来の検体試料中において胃がんの補助化学療法感受性の有無を判定する第４の工程を含む、胃がんの補助化学療法感受性を判定する方法である。
【００１９】
２．定義
本明細書中で使用する用語は、以下の定義を有する。
本明細書において、「胃がんの補助化学療法」とは、胃がんの治癒切除後の微小残存腫瘍による再発予防を目的として行われる化学療法であり、抗癌剤を投与することで、術後の再発抑制、生存率の改善を目的として行われる治療のことをいう。ここで再発とは、画像診断、生検などの組織診断や手術などにより、確実に腫瘍の再出現が確認された場合を指す。ここで、本発明において、抗癌剤はフルオロウラシル（５−ＦＵ）又はフルオロウラシル系プロドラッグである。現在までの臨床試験において、体表面積当たり定められた量の５−ＦＵ製剤を術後１年間（オテラシルカリウム・ギメラシル・テガフール（商品名：ティーエスワン）の場合）又は１６ヶ月間（ウラシル・テガフール（商品名：ユーエフティ）の場合）投与することで、投与しない症例より生存期間が延長することが示されており（上記の非特許文献６、非特許文献７参照）、それを基にガイドライン（胃癌治療ガイドライン改訂第３版（案））が定められている。現在、第一選択薬とされる抗癌剤のオテラシルカリウム・ギメラシル・テガフール（商品名：ティーエスワン（ＴＳ−１））を使用する場合、通常、手術からの回復を待って、術後６週間以内に投与を開始する。１日の標準量は体表面積１ｍ２あたり８０ｍｇであり、それを４週間投与、２週間休薬を１コースとして、術後１年間継続する。
【００２０】
本明細書において「感受性」とは、補助化学療法が奏効したか否かを表すものであり、胃がん患者に対してフルオロウラシル又はフルオロウラシル系プロドラッグの投与による術後補助化学療法を行い、再発が認められず術後３年以上生存した場合（無再発症例）を「感受性である」又は「感受性が有る」、再発が認められた場合（再発症例）を「感受性でない」又は「感受性が無い」と示す。
【００２１】
本明細書において「５−ＦＵ」とは、胃がんをはじめとする消化器がんや、その他のがんの治療に古くから用いられている抗癌剤（商品名）であり、一般名は「フルオロウラシル」である。ピリミジン系代謝拮抗剤に分類され、細胞が分裂、増殖する際に必要な代謝物質に似た構造を持っているのが特徴であり、本来の代謝物質の代わりにがん細胞に取り込まれることで、そのＤＮＡの合成を阻害する。体内で分解されやすく、効果の持続時間が短いため、他の薬剤との併用や、点滴による静脈内への持続注射などが多く行われている。
【００２２】
本明細書において「フルオロウラシル系プロドラッグ（５−ＦＵ系プロドラッグ）」とは、活性のない構造で生体内に投与され、生体内で代謝されることにより５−ＦＵの構造となり、薬理活性を示す抗癌剤のことを指し、通常、経口投与剤として用いられる。上述の通り、５−ＦＵは体内での分解が早く、効果の持続時間が短いことから、より長い時間体内に留めて効果を高めたり、副作用を軽減したりすることを目的に改良されたものである。製剤としては、オテラシルカリウム・ギメラシル・テガフール配合剤（商品名：ティーエスワン（ＴＳ−１））、ウラシル・テガフール配合剤（商品名：ユーエフティ（ＵＦＴ））、ドキシフルリジン（商品名：フルツロン）、テガフール（商品名：フトラフール、サンフラール、ルナシン、テフシールなど）、カペシタビン（商品名：ゼローダ）などが挙げられる。
【００２３】
本明細書において、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの略号による表示は、三極共通のガイドラインである「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）及び当技術分野における慣用に従うものとする。
【００２４】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、それらの修飾ポリヌクレオチドのいずれも包含する核酸として用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、及び合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。また上記修飾ポリヌクレオチドには、核酸の天然の糖部分、塩基部分又はホスホジエステル結合を非天然構造に変換したポリヌクレオチドが含まれ、例えばＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ホスホロチオエート結合を有するポリヌクレオチド、２'−Ｏ−アルキルリボース基を有する人工的ポリヌクレオチドなどが含まれる。また、本明細書では、ポリヌクレオチドは核酸と互換的に使用される。
【００２５】
本明細書において「遺伝子」とは、ＲＮＡ、及び２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成する正鎖（又はセンス鎖）又は相補鎖（又はアンチセンス鎖）などの各１本鎖ＤＮＡを包含することを意図して用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。
【００２６】
従って、本明細書において「遺伝子」は、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及びこれらの断片、及びヒトゲノムのいずれも含む。また該「遺伝子」は特定の塩基配列（又は配列番号）で示される「遺伝子」だけではなく、これらによってコードされるＲＮＡと生物学的機能が同等であるＲＮＡ、例えば同族体（すなわち、ホモログ）、遺伝子多型などの変異体、及び誘導体をコードする「遺伝子」が包含される。かかる同族体、変異体又は誘導体をコードする「遺伝子」としては、具体的には、後に記載したストリンジェントな条件下で、上記の配列番号１〜２２で示されるいずれかの特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「遺伝子」を挙げることができる。なお、「遺伝子」は、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン又はイントロンを含むことができる。また、「遺伝子」は細胞に含まれていてもよく、細胞外に放出されて単独で存在していてもよく、またエキソソームと呼ばれる脂質二重膜に包まれた小胞に内包された状態にあってもよい。
【００２７】
エキソソームとは、細胞から分泌される小さな小胞である。エキソソームは、多胞エンドソームに由来し、細胞膜と融合することによって内部の小胞を細胞外環境に放出するが、その際に小胞中にＲＮＡ、ＤＮＡ等の「遺伝子」又は「核酸」を含むことがある。エキソソームは血液、血清、血漿、尿、リンパ液等の体液に含まれることが知られている。
【００２８】
本明細書において「転写産物」とは、遺伝子のＤＮＡ配列を鋳型にして合成されたＲＮＡのことをいう。ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子の上流にあるプロモーターと呼ばれる部位に結合し、ＤＮＡの塩基配列に相補的になるように３'末端にリボヌクレオチドを結合させていく形でＲＮＡが合成される。このＲＮＡには遺伝子そのもののみならず、発現制御領域、コード領域、エキソン又はイントロンをはじめとする転写開始点からポリＡ配列の末端にいたるまでの全配列が含まれる。
【００２９】
また、本明細書において「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」は、特に言及しない限り、ヘアピン様構造のＲＮＡ前駆体として転写され、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ切断活性を有するｄｓＲＮＡ切断酵素により切断され、ＲＩＳＣと称するタンパク質複合体に取り込まれ、ｍＲＮＡの翻訳抑制に関与する１５〜２５塩基のＲＮＡを意図して用いられる。また該「ｍｉＲＮＡ」は特定の塩基配列（又は配列番号）で示される「ｍｉＲＮＡ」だけではなく、該「ｍｉＲＮＡ」の前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）を含有し、これらによってコードされるｍｉＲＮＡと生物学的機能が同等であるｍｉＲＮＡ、例えば同族体（すなわち、ホモログ）、遺伝子多型などの変異体、及び誘導体をコードする「ｍｉＲＮＡ」も包含する。かかる前駆体、同族体、変異体又は誘導体をコードする「ｍｉＲＮＡ」としては、具体的には、ｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）により同定することができ、後に記載したストリンジェントな条件下で、上記の配列番号１〜２２で示されるいずれかの特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「ｍｉＲＮＡ」を挙げることができる。
【００３０】
本明細書において「プローブ」とは、遺伝子の発現によって生じたＲＮＡ又はそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するために使用されるポリヌクレオチド及び／又はそれに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００３１】
本明細書において「プライマー」とは、遺伝子の発現によって生じたＲＮＡ又はそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し、増幅する、連続するポリヌクレオチド及び／又はそれに相補的なポリヌクレオチドを包含する。
【００３２】
ここで相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド（相補鎖若しくは逆鎖）とは、配列番号によって定義される塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、又はその部分配列、（ここでは便宜上、これを正鎖と呼ぶ）に対してＡ：Ｔ（Ｕ）、Ｇ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味する。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズできる程度の相補関係を有するものであってもよい。
【００３３】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、プローブが他の配列に対するよりも、検出可能により大きな程度（例えばバックグラウンドよりも少なくとも２倍）で、その標的配列に対してハイブリダイズする条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、ハイブリダイゼーションが行われる環境によって異なる。ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに対して１００％相補的である標的配列が同定され得る。
【００３４】
本明細書において「変異体」とは、核酸の場合、多型性、突然変異、転写時の選択的スプライシングなどに起因した天然の変異体、或いは配列番号１〜２２で表される塩基配列若しくはその相補的塩基配列において１又は２個のヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入、好ましくは置換、を含む変異体、或いは該塩基配列又はその部分配列と約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の％同一性を示す変異体、或いは該塩基配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと上記定義のストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸を意味する。
【００３５】
本明細書において「％同一性」は、上記のＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによるタンパク質又は遺伝子の検索システムを用いて、ギャップを導入して、又はギャップを導入しないで、決定することができる（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら、１９９３年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第９０巻、ｐ.５８７３-５８７７；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２１５巻、ｐ．４０３−４１０；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、１９８８年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８５巻、ｐ.２４４４-２４４８）。
【００３６】
本明細書において「誘導体」とは、蛍光団などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド（例えばハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど）を含む誘導体、人工的ポリヌクレオチド(例えばＬＮＡ、ＰＮＡなど)などの修飾ポリヌクレオチドを意味する。
【００３７】
本明細書において「（判定用）組成物」とは、胃がん患者の手術後に行われる補助化学療法の感受性を判定するために、直接又は間接的に利用されるものをいう。これには胃がんの補助化学療法感受性に関連して生体内、特に胃の腫瘍組織において発現が変動する遺伝子を特異的に認識し、また結合することのできるヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドが包含される。これらのヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、上記性質に基づいて生体内、組織や細胞内などで発現した上記遺伝子を検出するためのプローブとして、また生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。
【００３８】
本明細書において検出・診断対象となる「検体試料」とは、胃がんの発生にともない本発明の遺伝子が発現変化する生体組織及びそれら生体組織由来の物質、生体組織と接触する物質を指し、具体的には胃の手術組織や生検組織などを指す。
【００３９】
本明細書において「Ｓｅｎｃｉｔｉｖｉｔｙ」及び「Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」とは、臨床検査の信頼度を評価する場合の後述の計算によって表される指標を意味する。具体的には、胃がんの補助化学療法感受性である集団に対して検査を行ったとき、陽性すなわち補助化学療法感受性であることを示す割合（真の陽性率）がＳｅｎｃｉｔｉｖｉｔｙである。逆に、胃がんの補助化学療法感受性でない集団に対して検査を行ったとき、陰性すなわち補助化学療法感受性でないことを示す割合（真の陰性率）がＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙである。
【００４０】
本明細書において、「Ａｃｃｕｒａｃｙ」は「無再発症例を化学療法感受性であると正しく予測した回数」と「再発症例を化学療法感受性でないと正しく予測した回数」の和に対する全症例数の除数を意味する。
【００４１】
本明細書において、「ＰＰＶ」は（無再発症例を補助化学療法感受性であると正しく予測した回数）／（補助化学療法感受性であると予測した回数）を意味する。
【００４２】
本明細書において、「ＮＰＶ」は（再発症例を正しく補助化学療法感受性でないと予測した回数）／（補助化学療法感受性でないと予測した回数）を意味する。
【００４３】
本明細書において、「Ｅｆｆｉｃａｃｙ」はＰＰＶとＮＰＶの積を意味する。したがって、この指標は胃がんの補助化学療法感受性の検査において、補助化学療法感受性である患者でも補助化学療法感受性でない患者でも正しい診断が成立した場合に高くなる。
【００４４】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−１４８ａ遺伝子」又は「ｍｉＲ−１４８ａ」という用語は、配列番号４に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００００２４３）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【００４５】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−４２５遺伝子」又は「ｍｉＲ−４２５」という用語は、配列番号１に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−４２５遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００３３９３）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【００４６】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−１４６ａ遺伝子」又は「ｍｉＲ−１４６ａ」という用語は、配列番号５に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００００４４９）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【００４７】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−１９３ｂ＊遺伝子」又は「ｍｉＲ−１９３ｂ＊」という用語は、配列番号６に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ｂ＊遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００４７６７）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【００４８】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−１４１遺伝子」又は「ｍｉＲ−１４１」という用語は、配列番号２に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−１４１遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００００４３２）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【００４９】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−２２遺伝子」又は「ｍｉＲ−２２」という用語は、配列番号７に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−２２遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００００７７）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【００５０】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−９２ａ−２＊遺伝子」又は「ｍｉＲ−９２ａ−２＊」という用語は、配列番号８に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−２＊遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００４５０８）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【００５１】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−１５１−３ｐ遺伝子」又は「ｍｉＲ−１５１−３ｐ」という用語は、配列番号１４に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−３ｐ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００００７５７）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【００５２】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−３０ｄ遺伝子」又は「ｍｉＲ−３０ｄ」という用語は、配列番号１５に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００００２４５）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【００５３】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−６６４遺伝子」又は「ｍｉＲ−６６４」という用語は、配列番号９に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−６６４遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００５９４９）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【００５４】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−１９０８遺伝子」又は「ｍｉＲ−１９０８」という用語は、配列番号１６に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−１９０８遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００７８８１）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【００５５】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−２００ｂ遺伝子」又は「ｍｉＲ−２００ｂ」という用語は、配列番号１７に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００００３１８）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【００５６】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−７６９−３ｐ遺伝子」又は「ｍｉＲ−７６９−３ｐ」という用語は、配列番号１０に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−７６９−３ｐ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００３８８７）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【００５７】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−１９７８遺伝子」又は「ｍｉＲ−１９７８」という用語は、配列番号３に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−１９７８遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００９４５３）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【００５８】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−６０５遺伝子」又は「ｍｉＲ−６０５」という用語は、配列番号１１に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−６０５遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００３２７３）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【００５９】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−２００ｃ遺伝子」又は「ｍｉＲ−２００ｃ」という用語は、配列番号１８に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００００６１７）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【００６０】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−１９１５遺伝子」又は「ｍｉＲ−１９１５」という用語は、配列番号１９に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−１９１５遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００７８９２）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【００６１】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ遺伝子」又は「ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ」という用語は、配列番号２０に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００００２６３）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【００６２】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−１４５＊遺伝子」又は「ｍｉＲ−１４５＊」という用語は、配列番号１２に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−１４５＊遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００４６０１）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【００６３】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−５００＊遺伝子」又は「ｍｉＲ−５００＊」という用語は、配列番号１３に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−５００＊遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００２８７１）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【００６４】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−２９ｂ−２＊遺伝子」又は「ｍｉＲ−２９ｂ−２＊」という用語は、配列番号２１に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−２＊遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００４５１５）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【００６５】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−１５５遺伝子」又は「ｍｉＲ−１５５」という用語は、配列番号２２に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−１５５遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００００６４６）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【発明の効果】
【００６６】
本発明は、胃がんの補助化学療法感受性の有無の判定に有用な組成物及び該組成物を用いた胃がんの補助化学療法感受性の判定方法を提供するものであり、これによって、胃がんの補助化学療法感受性に対して特異的かつ高予測率の、及び迅速でかつ簡便な、判定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】ニューラルネットワークモデルの模式図を示す。
【図２】表１に記載の遺伝子を決定するための解析の流れを示す。
【図３】表１に記載の遺伝子に対応する配列番号１〜２２のポリヌクレオチドを組み合わせて用いた場合の補助化学療法感受性の判定精度を示す。縦軸は、胃がんの補助化学療法感受性の有無を判定できる確率、横軸は、表１に記載の配列番号の順に組み合わせを１ずつ増やした、胃がんの補助化学療法感受性の有無の判定に必要なポリヌクレオチド数をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
以下に本発明をさらに具体的に説明する
１．胃がんの補助化学療法感受性判定に用いられる標的核酸
本発明の上記定義の胃がんの補助化学療法感受性判定用組成物及びキットを使用して胃がん又は胃がん細胞の補助化学療法感受性を判定するためのマーカーとしての標的核酸には、例えば、配列番号１〜２２で表される塩基配列を含むヒトｍｉＲＮＡ遺伝子（すなわち、それぞれ、ｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−９２ａ−２＊、ｍｉＲ−１５１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−６６４、ｍｉＲ−１９０８、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−７６９−３ｐ、ｍｉＲ−１９７８、ｍｉＲ−６０５、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−１９１５、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４５＊、ｍｉＲ−５００＊、ｍｉＲ−２９ｂ−２＊、及びｍｉＲ−１５５）、それらの同族体、それらの転写産物、或いはそれらの変異体又は誘導体が含まれる。ここで、遺伝子、同族体、転写産物、変異体及び誘導体は、上記定義のとおりである。好ましい標的核酸は、配列番号１〜２２で表される塩基配列を含むヒトｍｉＲＮＡ遺伝子、それらの転写産物、より好ましくは該転写産物である。
【００６９】
本発明において胃がんの標的となる上記遺伝子はいずれも、健常な被験者と比べて胃がんに罹患した被験者において発現レベルが増加又は低下しているものである（後述の実施例の表１参照）。
【００７０】
第１の標的核酸は、ｍｉＲ−１４８ａ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−１４８ａ遺伝子又はその転写産物の発現の増加が胃がんの補助化学療法感受性のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７１】
第２の標的核酸は、ｍｉＲ−４２５遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−４２５遺伝子又はその転写産物の発現の増加が胃がんの補助化学療法感受性のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７２】
第３の標的核酸は、ｍｉＲ−１４６ａ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−１４６ａ遺伝子又はその転写産物の発現の増加が胃がんの補助化学療法感受性のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７３】
第４の標的核酸は、ｍｉＲ−１９３ｂ＊遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−１９３ｂ＊遺伝子又はその転写産物の発現の増加が胃がんの補助化学療法感受性のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７４】
第５の標的核酸は、ｍｉＲ−１４１遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−１４１遺伝子又はその転写産物の発現の増加が胃がんの補助化学療法感受性のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７５】
第６の標的核酸は、ｍｉＲ−２２遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−２２遺伝子又はその転写産物の発現の増加が胃がんの補助化学療法感受性のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７６】
第７の標的核酸は、ｍｉＲ−９２ａ−２＊遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−９２ａ−２＊遺伝子又はその転写産物の発現の増加が胃がんの補助化学療法感受性のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７７】
第８の標的核酸は、ｍｉＲ−１５１−３ｐ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−１５１−３ｐ遺伝子又はその転写産物の発現の増加が胃がんの補助化学療法感受性のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７８】
第９の標的核酸は、ｍｉＲ−３０ｄ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−３０ｄ遺伝子又はその転写産物の発現の増加が胃がんの補助化学療法感受性のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７９】
第１０の標的核酸は、ｍｉＲ−６６４遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−６６４遺伝子又はその転写産物の発現の増加が胃がんの補助化学療法感受性のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００８０】
第１１の標的核酸は、ｍｉＲ−１９０８遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−１９０８遺伝子又はその転写産物の発現の増加が胃がんの補助化学療法感受性のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００８１】
第１２の標的核酸は、ｍｉＲ−２００ｂ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−２００ｂ遺伝子又はその転写産物の発現の増加が胃がんの補助化学療法感受性のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００８２】
第１３の標的核酸は、ｍｉＲ−７６９−３ｐ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−７６９−３ｐ遺伝子又はその転写産物の発現の増加が胃がんの補助化学療法感受性のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００８３】
第１４の標的核酸は、ｍｉＲ−１９７８遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−１９７８遺伝子又はその転写産物の発現の増加が胃がんの補助化学療法感受性のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００８４】
第１５の標的核酸は、ｍｉＲ−６０５遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−６０５遺伝子又はその転写産物の発現の増加が胃がんの補助化学療法感受性のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００８５】
第１６の標的核酸は、ｍｉＲ−２００ｃ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−２００ｃ遺伝子又はその転写産物の発現の増加が胃がんの補助化学療法感受性のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００８６】
第１７の標的核酸は、ｍｉＲ−１９１５遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−１９１５遺伝子又はその転写産物の発現の増加が胃がんの補助化学療法感受性のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００８７】
第１８の標的核酸は、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ遺伝子又はその転写産物の発現の増加が胃がんの補助化学療法感受性のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００８８】
第１９の標的核酸は、ｍｉＲ−１４５＊遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−１４５＊遺伝子又はその転写産物の発現の増加が胃がんの補助化学療法感受性のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００８９】
第２０の標的核酸は、ｍｉＲ−５００＊遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−５００＊遺伝子又はその転写産物の発現の増加が胃がんの補助化学療法感受性のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００９０】
第２１の標的核酸は、ｍｉＲ−２９ｂ−２＊遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−２９ｂ−２＊遺伝子又はその転写産物の発現の増加が胃がんの補助化学療法感受性のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００９１】
第２２の標的核酸は、ｍｉＲ−１５５遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−１５５遺伝子又はその転写産物の発現の増加が胃がんの補助化学療法感受性のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００９２】
２．胃がんの補助化学療法感受性判定用組成物
本発明において、胃がんの補助化学療法感受性を判定するための、或いは胃がんの補助化学療法感受性を診断するために使用可能な核酸組成物は、胃がんの補助化学療法感受性の標的核酸としての、ヒト由来のｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−９２ａ−２＊、ｍｉＲ−１５１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−６６４、ｍｉＲ−１９０８、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−７６９−３ｐ、ｍｉＲ−１９７８、ｍｉＲ−６０５、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−１９１５、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４５＊、ｍｉＲ−５００＊、ｍｉＲ−２９ｂ−２＊、及びｍｉＲ−１５５、それらの同族体、それらの転写産物、或いはそれらの変異体又は誘導体の存在、発現レベル又は存在量を定性的及び／又は定量的に測定することを可能にする。
【００９３】
上記の標的核酸は、胃がんの補助化学療法感受性である被験者と比べて補助化学療法感受性でない被験者においてその発現レベルが増加又は低下する。それゆえ、本発明の組成物は、胃がん組織について標的核酸の発現レベルを測定し、それらを比較するために有効に使用することができる。
【００９４】
本発明で使用可能な組成物は、胃がんに罹患した患者の生体組織において配列番号１〜２２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド群、その前駆体ポリヌクレオチド群、及びそれらの相補的ポリヌクレオチド群、それらの変異体ポリヌクレオチド群、それらのポリヌクレオチド群の塩基配列とストリンジェントな条件でそれぞれハイブリダイズするポリヌクレオチド群、それらの修飾ポリヌクレオチド群、並びに、それらのポリヌクレオチド群の塩基配列において１５以上、好ましくは２０以上、２１以上、より好ましくは２２以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド群から選ばれた１又は複数（２以上、例えば２から２２のいずれかの数、又はそれ以上）のポリヌクレオチドの組み合わせを含む。
【００９５】
具体的には、本発明の組成物は、以下の１又は複数のポリヌクレオチドを含むことができる。
（１）配列番号１〜２２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、それらの前駆体ポリヌクレオチド、それらの変異体ポリヌクレオチド、又はそれらの修飾ポリヌクレオチド。
（２）配列番号１〜２２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（３）配列番号１〜２２で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、それらの変異体ポリヌクレオチド、又はそれらの修飾ポリヌクレオチド。
（４）配列番号１〜２２で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（５）上記（１）〜（４）に記載のポリヌクレオチドの塩基配列の各々とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、或いは、配列番号１〜２２で表される塩基配列又はその相補的塩基配列の各々からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかのポリヌクレオチドの各々をコードするＤＮＡ。
【００９６】
上記前駆体ポリヌクレオチド又はその相補的ポリヌクレオチドの場合には、各ポリヌクレオチドの塩基配列において、非限定的に例えば、連続する１５〜配列の全塩基数、１５〜２０塩基、１５〜２１塩基、１５〜２２塩基、１５〜２３塩基、１８〜２５塩基、１８〜３０塩基、１８〜５０塩基などの範囲の塩基数の断片を含むことができるが、この断片の塩基配列には少なくとも配列番号１〜２２で表される各々の塩基配列又はその相補的塩基配列を含む。
【００９７】
本発明で使用される上記ポリヌクレオチド類又はその断片類はいずれもＤＮＡでもよいし、ＲＮＡでもよいし、修飾ポリヌクレオチドでもよい。
【００９８】
本発明の組成物としてのポリヌクレオチドは、ＤＮＡ組換え技術、ＰＣＲ法、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機による方法などの一般的な技術を用いて作製することができる。
【００９９】
ＤＮＡ組換え技術及びＰＣＲ法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌら、  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、  ＵＳ  （１９９３）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ    Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、  ＵＳ  （１９８９）などに記載される技術を使用することができる。
【０１００】
ヒト由来の、ｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−９２ａ−２＊、ｍｉＲ−１５１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−６６４、ｍｉＲ−１９０８、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−７６９−３ｐ、ｍｉＲ−１９７８、ｍｉＲ−６０５、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−１９１５、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４５＊、ｍｉＲ−５００＊、ｍｉＲ−２９ｂ−２＊、及びｍｉＲ−１５５は公知であり、前述のようにその取得方法も知られている。このため、これらの遺伝子をクローニングすることによって、本発明の組成物としてのポリヌクレオチド類を作製することができる。
【０１０１】
本発明の組成物を構成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ自動合成装置を用いて化学的に合成することができる。この合成には一般にホスホアミダイト法が使用され、この方法によって約１００塩基までの一本鎖ＤＮＡを自動合成することができる。ＤＮＡ自動合成装置は、例えばＰｏｌｙｇｅｎ社、ＡＢＩ社、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社などから市販されている。
【０１０２】
或いは、本発明のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡクローニング法によって作製することもできる。ｃＤＮＡクローニング技術は、例えばｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｗａｋｏなどを利用できる。
【０１０３】
３．胃がんの補助化学療法感受性判定用キット
本発明はまた、本発明の組成物に含まれるものと同じ上記のポリヌクレオチド類(及び場合により、その断片)の１つ又は複数（２以上、例えば２から２２のいずれかの数、又はそれ以上）を含む胃がんの補助化学療法感受性判定用キットを提供する。
【０１０４】
本発明のキットは、好ましくは、上記１に記載したポリヌクレオチド類から選択される１又は複数のポリヌクレオチドを含む。
【０１０５】
本発明のキットは、配列番号１〜２２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、その前駆体ポリヌクレオチド、その相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらの変異体ポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ、又はそれらの修飾ポリヌクレオチドを、２以上含むことができる。
【０１０６】
本発明のキットに含むことができるポリヌクレオチド断片は、例えば配列番号１〜２２で表されるポリヌクレオチドの前駆体ポリヌクレオチド（すなわち、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）の塩基配列又はその相補的配列において、１５以上の、又は２０以上の連続した塩基を含むＤＮＡである。
【０１０７】
好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドが、配列番号１〜２２のいずれかで表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相補的配列からなるポリヌクレオチド、それらの変異体ポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ、又はそれらの修飾ポリヌクレオチドである。
【０１０８】
変異体ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１〜２２のいずれかで表される塩基配列又は相補的配列において１個又は２個のヌクレオチドが別の塩基に置換されたポリヌクレオチドであるが、目的のマーカーｍｉＲＮＡの塩基配列とハイブリダイゼーション可能である限り、上記のような変異に限定されない。変異には、例えばヌクレオチドの欠失又は付加も含まれる。
【０１０９】
修飾ポリヌクレオチドは、核酸の天然の糖部分、塩基部分又はホスホジエステル結合を非天然構造に変換したポリヌクレオチドが含まれ、例えばＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ホスホロチオエート結合を有するポリヌクレオチド、２'−Ｏ−アルキルリボース基を有する人工的ポリヌクレオチドなどが含まれる。好ましい修飾ポリヌクレオチドは、ＬＮＡ及びＰＮＡである。
【０１１０】
ＬＮＡは、修飾ＲＮＡであり、天然型ＲＮＡの２'位と４'位とがメチレン基を介して架橋結合した構造をもつ人工的ポリヌクレオチドである（Ａ．Ａ．  Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５４：３６０７，  １９９８；  Ｓ．  Ｏｂｉｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３９：５４０１，  １９９８）。これはＰＮＡと同様に酵素に対する安定性に優れ、かつ、ＤＮＡやＲＮＡとハイブリダイズ可能である。本発明方法で使用可能な修飾ポリヌクレオチドはＬＮＡとＤＮＡのハイブリッド型でもよく、この場合ＬＮＡの含量率は０％〜１００％の間で変化しうる。
【０１１１】
ＰＮＡは、主鎖が２−アミノエチルグリシル骨格からなる（ポリ）ペプチドであり、その側鎖に核酸塩基を有する人工的ポリヌクレオチド又は人工核酸である（Ｐ．Ｅ．  Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５４：１４９７，  １９９１；  Ｍ．  Ｃａｓｔｏｌｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＲＮＡ，  １２：９１３，  ２００６；大槻高史及び北松瑞生，未来材料,９巻，５号，１６−２１頁，２００９年（エヌ・ティー・エス））。主鎖に電荷を有さないのでＲＮＡやＤＮＡと安定なハイブリッドを形成することができる。
【０１１２】
好ましい実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、１５以上、好ましくは２０以上、２１以上、より好ましくは２２以上、３０以下、好ましくは２５以下、より好ましくは２４以下の連続した塩基を含むポリヌクレオチドであることができる。
【０１１３】
上記の組み合わせの例は、配列番号１〜２２に示した塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオド、それらの変異体ポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ、及び修飾ポリヌクレオチドについて、後述の表１に示すようにポリヌクレオチドの優先順位（第１番目から第２２番目まで）の高い方から順番（配列番号の順番）にポリヌクレオチドを組み合わせることである。この仕方で２２種のポリヌクレオチドを順番に組み合わせたときの、胃がんの補助化学療法感受性を正しく判定した確率（Ａｃｃｕｒａｃｙ；％）を、胃がんの補助化学療法感受性の判定に必要なポリヌクレオチド数に対してプロットすると、確率は、例えば、ｍｉＲ−１４８ａ（配列番号１）及びｍｉＲ−４２５（配列番号２）の組み合わせで７５％となり、及びｍｉＲ−１４６ａ（配列番号３）、ｍｉＲ−１９３ｂ＊（配列番号４）の組み合わせ（配列番号１〜４のポリヌクレオチドの組み合わせ）で８０％となった。さらにｍｉＲＮＡを組み合わせていったとき、ｍｉＲ−７６９−３ｐ（配列番号１３）までの組み合わせ（配列番号１〜１３のポリヌクレオチドの組み合わせ）により、確率は９０％となった（後述の図３参照）。
【０１１４】
本発明のキットを構成する上記の組み合わせは、あくまでも例示であり、他の種々の可能な組み合わせのすべてが本発明に包含されるものとする。
【０１１５】
本発明のキットには、上で説明した本発明におけるポリヌクレオチド類に加えて、胃がんの補助化学療法感受性の判定を可能とする既知の又は将来見出されるポリヌクレオチドも包含させることができる。
【０１１６】
本発明のキットに含まれるポリヌクレオチド類は、個別に又は任意に組み合わせて容器に包装される。
【０１１７】
本発明のキットは、ウエルプレート、ポリマーメンブレンなどの固相に上記ポリヌクレオチド類を結合した形態のものでもよい。結合は、共有結合又は非共有結合(例えばイオン結合、物理的又は疎水的結合など)のいずれでもよい。プレート表面はポリＬリジンコートなどの表面処理を施されていてもよい。
【０１１８】
上記キットには、ハイブリダイゼーションを実施するために必要なバッファー類、ウエルプレート又はメンブレン、使用説明書などが含まれてもよい。
【０１１９】
４．核酸アレイ
本発明はさらに、本発明の組成物及び／又はキットに含まれるものと同じポリヌクレオチド類（或いは、上記の２節の組成物及び／又は３節のキットに記載されたポリヌクレオチド類）からの複数（２以上、例えば２から２２のいずれかの数、又はそれ以上）のポリヌクレオチドの組み合わせを含む胃がんの補助化学療法感受性判定用核酸アレイを提供する。
【０１２０】
ポリヌクレオチドを固定化する核酸アレイの基板（担体）としては、ポリヌクレオチドを固定化できるものであれば特に制限はなく、スライドガラス、シリコン製チップ、ポリマー製チップ及びナイロンメンブレンなどを例示することができる。またこれらの基板にはポリＬリジンコート、アミノ基、カルボキシル基などの官能基導入などの表面処理がされていてもよい。
【０１２１】
また固定化法については一般に用いられる方法であれば特に制限はなく、スポッター又はアレイヤーと呼ばれる高密度分注機を用いて核酸をスポットする方法や、ノズルより微少な液滴を圧電素子などにより噴射する装置を用いてＤＮＡを基板に吹き付ける方法（インクジェット法）、又は基板上で順次ヌクレオチド合成を行う方法を例示することができる。高密度分注機を用いる場合には、例えば多数のウエルを持つプレートのおのおののウエルに異なった遺伝子溶液を入れておき、この溶液をピン（針）で取り上げて基板上に順番にスポットすることによる。インクジェット法では、ノズルより遺伝子を噴射し、基板上に高速度で遺伝子を整列配置することによる。基板上でのＤＮＡ合成は、基板上に結合した塩基を光又は熱によって脱離する官能基で保護し、マスクを用いることにより特定部位の塩基だけに光又は熱を当て、官能基を脱離させる。その後、塩基を反応液に加えて、基板上の塩基とカップリングさせる工程を繰り返すことによって行われる。
【０１２２】
例えば、東レ株式会社の３Ｄ‐Ｇｅｎｅ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏ  ｃｈｉｐ、Ａｇｉｌｅｎｔ社のＨｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｋｉｔ（Ｖ２）、ＥＸＩＱＯＮ社のｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡ（登録商標）  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ＡＲＲＡＹなど、標的遺伝子、ＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現レベルを検出、測定することができる既存の核酸アレイのプラットフォーム（基板等）を利用し、これに本発明のポリヌクレオチドを搭載して、本発明の胃がんの補助化学療法感受性判定に用いることもできる。
【０１２３】
核酸アレイに固定化されるポリヌクレオチドは、上記で説明した本発明の全て又は一部のポリヌクレオチドを用いることができる。好ましい実施形態によれば、本発明の核酸アレイは、配列番号１〜２２で表される塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、或いは該ポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ、或いは該ポリヌクレオチド又はＤＮＡに対応するＬＮＡ又はＰＮＡからなる人工的ポリヌクレオチド、の２以上から全部又はそれ以上を含むことができる。
【０１２４】
本発明において、固定化されるポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、人工的ポリヌクレオチドのいずれでもよいし、或いは１本鎖でもよいし又は２本鎖でもよい。
【０１２５】
核酸アレイは、例えば予め調製したプローブを基板表面に固定化する方法により作製することができる。予め調製したポリヌクレオチドプローブを基板表面に固定化する方法では、官能基を導入したポリヌクレオチドを合成し、表面処理した基板の表面にオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを点着し、共有結合させる（例えば、Ｊ．Ｂ．Ｌａｍｔｕｒｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４年、第２２巻、ｐ．２１２１−２１２５、Ｚ．Ｇｕｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４年、第２２巻、ｐ．５４５６−５４６５）。ポリヌクレオチドは、一般的には、表面処理した基板にスペーサーやクロスリンカーを介して共有結合される。ガラス製基板の表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこに合成ポリヌクレオチドを共有結合させる方法も知られている（Ｇ．Ｙｅｒｓｈｏｖら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９６年、第９４巻、ｐ．４９１３）。また、シリカ核酸アレイ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレプトアビジンを含むアガロースの浸透層を設けて反応部位とし、この部位をプラスに荷電させることでビオチン化ポリヌクレオチドを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密なハイブリダイゼーションを可能にする方法も知られている（Ｒ．Ｇ．Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９７年、第９４巻、ｐ．１１１９―１１２３）。
【０１２６】
５．胃がんの補助化学療法感受性判定法
本発明は、本発明の組成物、キット、核酸アレイ、又はそれらの組み合わせを用いて、検体試料中に胃がんの補助化学療法感受性に関連するｍｉＲＮＡ遺伝子の発現挙動をｉｎ  ｖｉｔｒｏで判定する方法であって、胃がん患者の検体試料を用いて、試料中のｍｉＲＮＡ遺伝子の発現レベルを比較し、該検体試料中における胃がん補助化学療法感受性に関連する遺伝子の発現挙動を判定することを含み、ここで、該標的核酸が該組成物、キット又は核酸アレイに含まれる上記ポリヌクレオチド類によって検出可能なものである、方法を提供する。
【０１２７】
本発明の上記方法にて、検体試料から胃がんの補助化学療法感受性に関連するｍｉＲＮＡ又はその前駆体（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）の検出、判定又は診断を行うことにより、感度及び特異度の高い、補助化学療法感受性の判定が可能になるだけでなく、患者に合った抗癌剤を正しく選定できることから、早期の治療及び予後の改善をもたらし、さらに、疾病憎悪のモニターや外科的、放射線療法的、及び化学療法的な治療の有効性のモニターを可能にする方法を提供する。
【０１２８】
本発明の検体試料から胃がんの補助化学療法感受性に関連するｍｉＲＮＡ遺伝子転写産物を抽出する方法としては、Ｔｒｉｚｏｌ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）やＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社）などの酸性フェノールを含むＲＮＡ抽出用試薬を使用してもよい。また、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）検体を用いる場合は、ＦＦＰＥからＲＮＡを抽出するための試薬、例えばＲＮｅａｓｙ  ＦＦＰＥ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（ＴＭ）  Ｔｏｔａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ＦＦＰＥ（Ａｍｂｉｏｎ）、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＦｏｒｍａＰｕｒｅ  Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＦＦＰＥ  ＲＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）などを用いることができるが、この方法に限定されない。
【０１２９】
本発明はまた、本発明の組成物、キット又は核酸アレイの、被験者由来の検体試料中の胃がん由来のｍｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出のための使用を提供する。
【０１３０】
本発明の上記方法において、組成物、キット又は核酸アレイは、上で説明したような、本発明のポリヌクレオチド類を単一で或いはあらゆる可能な組み合わせで含むものが使用される。
【０１３１】
本発明の胃がんの検出、判定又は診断において、本発明の組成物、キット又は核酸アレイに含まれるポリヌクレオチド類は、プライマーとして又はプローブとして用いることができる。プライマーとして用いる場合には、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓなどを利用できるが、この方法に限定されない。
【０１３２】
本発明の組成物又はキットに含まれるポリヌクレオチド類は、ノーザンブロット法、サザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ｉｎ  ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法などの、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、定法に従ってプライマー又はプローブとして利用することができる。測定対象試料としては、使用する検出方法の種類に応じて、被験者の胃がん病変部、及び正常組織部の一部又は全部をバイオプシーなどで採取するか、もしくは手術によって摘出した生体組織から回収する。さらにそこから常法に従って調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いてもよいし、さらに該ＲＮＡをもとにして調製される、ｃＤＮＡを含む各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。
【０１３３】
或いは、生体組織における本発明における標的であるｍｉＲＮＡの発現量は、核酸アレイ（ＤＮＡマクロアレイ又はＤＮＡチップを含む）を用いて検出或いは定量することができる。この場合、本発明の組成物又はキットは核酸アレイのプローブとして使用することができる。かかる核酸アレイを生体組織から採取したＲＮＡをもとに調製されるｍｉＲＮＡ又はそれらをコードするＤＮＡを標識した核酸とハイブリダイズさせ、該ハイブリダイズによって形成された上記プローブと標識ＤＮＡ又はＲＮＡとの複合体を、該標識ＤＮＡ又はＲＮＡの標識を指標として検出することにより、生体組織中での本発明の胃がんの補助化学療法感受性に関連するｍｉＲＮＡ遺伝子の発現の有無又は発現レベル（発現量）を評価することができる。本発明の方法では、核酸アレイを好ましく使用できるが、これは、ひとつの生体試料について同時に複数のｍｉＲＮＡ遺伝子の発現の有無又は発現レベルの評価が可能である。
【０１３４】
本発明の組成物、キット又は核酸アレイは、胃がんの補助化学療法感受性の判定のために有用である。具体的には、該組成物、キット又は核酸アレイを使用した胃がん補助化学療法感受性の判定は、手術時又は内視鏡検査時に採取した胃がんの補助化学療法感受性である細胞と感受性でない細胞を用いて、試料中のｍｉＲＮＡの発現量を比較、又は手術時又は内視鏡検査時に採取した胃がん組織において、該診断用組成物で検出されるｍｉＲＮＡ遺伝子の発現レベルの違いを判定することによって行うことができる。この場合、ｍｉＲＮＡ遺伝子発現レベルの違いには、発現の有無だけではなく、胃がんの補助化学療法感受性である患者の生体組織と補助化学療法感受性でない患者の生体組織の両者ともに発現がある場合でも、両者間の発現量を比較した時の差がある場合が含まれる。
【０１３５】
本発明の組成物、キット又は核酸アレイを利用して、検体試料中における胃がんの補助化学療法感受性であること／又は補助化学療法感受性でないことの判定方法は、被験者の生体組織の一部又は全部をバイオプシーなどで採取するか、手術によって摘出した生体組織から回収するかして、そこに含まれる遺伝子を、本発明のポリヌクレオチド群から選ばれた単数又は複数、好ましくは複数、のポリヌクレオチドを用いて検出し、その遺伝子発現量を測定することにより判定することを含む。このとき、再発の有無等の情報が付随したＦＦＰＥ検体を用いても良い。また本発明の胃がんの補助化学療法感受性の判定方法は、例えば胃がん患者において、該疾患の再発を防ぐために治療薬を投与した場合における、該疾患の再発の有無を検出、判定又は診断することもできる。
【０１３６】
本発明の方法は、例えば以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の工程：
（ａ）被験者由来の検体試料を、本発明の組成物、キット又は核酸アレイのポリヌクレオチドと接触させる工程、
（ｂ）生体試料中の標的核酸の発現レベルを、上記ポリヌクレオチドをプローブとして用いて測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の結果をもとに、該検体試料中の胃がんの補助化学療法感受性を判定する工程、を含むことができる。
【０１３７】
本発明方法で用いられる検体試料としては、被験者の生体組織、例えば胃組織及びその周辺組織を挙げることができる。具体的には該組織から調製されるＲＮＡ含有試料、或いはそれからさらに調製されるポリヌクレオチドを含む試料は、被験者の生体組織の一部又は全部をバイオプシーなどで採取するか、手術によって摘出した生体組織から回収し、そこから常法に従って調製することができる。
【０１３８】
ここで被験者とは、哺乳動物、例えば非限定的にヒト、サル、マウス、ラットなどを指し、好ましくはヒトである。
【０１３９】
本発明の方法は、測定対象として用いる生体試料の種類に応じて工程を変更することができる。
【０１４０】
測定対象物としてＲＮＡを利用する場合、胃がん（細胞）の検出は、例えば下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡ又はそれから逆転写された相補的ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）を、本発明の組成物、キット又は核酸アレイのポリヌクレオチドと結合させる工程、
（ｂ） 該ポリヌクレオチドに結合した生体試料由来のＲＮＡ又は該ＲＮＡから逆転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記ポリヌクレオチドをプローブとして用いて測定する工程、
（ｃ） 上記（ｂ）の測定結果に基づいて、胃がんの補助化学療法感受性を判定する工程、
を含むことができる。
【０１４１】
本発明によって胃がんの補助化学療法感受性を判定するために、例えば種々のハイブリダイゼーション法を使用することができる。かようなハイブリダイゼーション法には、例えばノーザンブロット法、サザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法などを使用することができる。
【０１４２】
ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明の診断用組成物をプローブとして用いることによって、ＲＮＡ中の各ｍｉＲＮＡ遺伝子発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、本発明の判定用組成物（相補鎖）を放射性同位元素（３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓなど）や蛍光物質などで標識し、それを常法にしたがってナイロンメンブレンなどにトランスファーした被検者の生体組織由来のＲＮＡとハイブリダイズさせたのち、形成された判定用組成物（ＤＮＡ）とＲＮＡとの二重鎖を判定用組成物の標識物（放射性同位元素又は蛍光物質）に由来するシグナルを放射線検出器（ＢＡＳ-１８００ＩＩ、富士写真フィルム株式会社、などを例示できる）又は蛍光検出器（ＳＴＯＲＭ８６０、ＧＥヘルスケア社、などを例示できる）により検出、測定する方法を例示することができる。
【０１４３】
定量ＲＴ―ＰＣＲ法を利用する場合には、本発明の上記判定用組成物をプライマーとして用いることによって、ＲＮＡ中のｍｉＲＮＡ遺伝子発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、被検者の生体組織由来のＲＮＡから市販の逆転写反応用試薬を用いて常法にしたがってｃＤＮＡを調製し、これを鋳型として標的の各ｍｉＲＮＡ又はその前駆体ＲＮＡを増幅できるように、本発明の判定用組成物から調製した１対のプライマー（上記ｃＤＮＡに結合する正鎖と逆鎖からなる）をｃＤＮＡとハイブリダイズさせて常法によりＰＣＲ法を行い、得られた二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。上述の逆転写用試薬としては、例えばｍｉｒＶａｎａ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  ｍｉＲＮＡ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ＲＴ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ｍｉＳｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）等が好適に用いられる。なお、二本鎖ＤＮＡの検出法としては、上記ＰＣＲをあらかじめ放射性同位元素や蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行う方法、ＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドなどで二本鎖ＤＮＡを染色して検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法にしたがってナイロンメンブレンなどにトランスファーさせて標識した判定用組成物をプローブとしてこれとハイブリダイズさせて検出する方法をとることができる。
【０１４４】
核酸アレイ解析を利用する場合は、本発明の上記判定用組成物を核酸プローブ（一本鎖又は二本鎖）として基板に貼り付けた核酸アレイを用いる。核酸を基板に固相化したものには、一般に核酸アレイ、ＤＮＡチップ又はＤＮＡアレイという名称があり、ＤＮＡアレイにはＤＮＡマクロアレイとＤＮＡマイクロアレイが包含されるが、本明細書ではＤＮＡチップといった場合、該ＤＮＡアレイを含むものとする。
【０１４５】
ハイブリダイゼーション条件は限定されないが、例えば３０℃〜６０℃で、ＳＳＣと界面活性剤を含む溶液中で１〜２４時間の条件とする。ここで、１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む水溶液（ｐＨ７．２）であり、界面活性剤はＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ、もしくはＴｗｅｅｎなどを含む。ハイブリダイゼーション条件としては、より好ましくは３〜４×ＳＳＣ、０．１〜０．５％ ＳＤＳを含む。ハイブリダイゼーション後の洗浄条件としては、例えば、３０℃の０．５×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、及び３０℃の０．２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、及び３０℃の０．０５×ＳＳＣ溶液による連続した洗浄などの条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが望ましい。具体的にはこのような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
【０１４６】
本発明の組成物又はキットのポリヌクレオチド断片をプライマーとしてＰＣＲを実施する際のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、例えば１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１〜２ｍＭ  ＭｇＣｌ２などの組成のＰＣＲバッファーを用い、当該プライマーの配列から計算されたＴｍ＋５〜１０℃において１５秒から１分程度処理することなどが挙げられる。かかるＴｍの計算方法として、Ｔｍ＝２×（アデニン残基数＋チミン残基数）＋４×（グアニン残基数＋シトシン残基数）などが挙げられる。
【０１４７】
これらのハイブリダイゼーションにおける「ストリンジェントな条件」の他の例については、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、 Ｊ． & Ｒｕｓｓｅｌ、 Ｄ． 著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年１月１５日発行、の 第１巻７．４２〜７．４５、第２巻８．９〜８．１７などに記載されており、本発明において利用できる。
【０１４８】
本発明はまた、本発明の組成物、キット、核酸アレイ、又はそれらの組み合わせを用いて、被験者由来の検体試料中の標的ｍｉＲＮＡ遺伝子の発現量を測定し、胃がんの補助化学療法感受性である患者由来の生体試料と感受性でない患者由来の生体試料のｍｉＲＮＡ遺伝子の発現量を教師サンプルとしたニューラルネットワークモデルを判別式として、検体試料が胃がんの補助化学療法感受性に関連するｍｉＲＮＡを含むこと及び／又は含まないことを判定する方法を提供する。
【０１４９】
すなわち、本発明はさらに、本発明の組成物、キット、核酸アレイ、又はそれらの組み合わせを用いて、検体試料が胃がんの補助化学療法感受性であること／又は胃がんの補助化学療法感受性でないことを判定することが既知の複数の生体試料中の標的核酸の発現量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する第１の工程、前記第１の工程で得られた該標的ｍｉＲＮＡ遺伝子の発現量の測定値を教師サンプルとしたニューラルネットワークモデルによる判別式を作成する第２の工程、被験者由来の検体試料中の該標的ｍｉＲＮＡ遺伝子の発現量を第１の工程と同様にｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する第３の工程、前記第２の工程で得られた判別式に第３の工程で得られた該標的ｍｉＲＮＡ遺伝子の発現量の測定値を代入し、該判別式から得られた結果に基づいて、検体試料が胃がんの補助化学療法感受性の有無を判定する第４の工程を含む、ここで、該標的ｍｉＲＮＡが該組成物、キット又は核酸アレイに含まれるポリヌクレオチド類によって検出可能なものである、上記方法を提供する。
【０１５０】
或いは、本発明の方法は、例えば下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）：
（ａ）胃がんの補助化学療法感受性である組織及び／又は胃がんの補助化学療法感受性でない組織であることが既知の組織中の標的ｍｉＲＮＡ遺伝子の発現量を、本発明による判定用組成物、キット又は核酸アレイを用いて測定する工程、
（ｂ）（ａ）で測定された発現量の測定値を、下記の数１〜数４の式に代入して、ニューラルネットワークモデルと呼ばれる判別式を作成する工程、
（ｃ）被験者由来の検体試料中の該標的ｍｉＲＮＡ遺伝子の発現量を、本発明による判定用組成物、キット又は核酸アレイを用いて測定し、（ｂ）で作成した判別式にそれらを代入して、得られた結果に基づいて、検体試料が胃がんの補助化学療法感受性であること／又は胃がんの補助化学療法感受性でないこと（有無）を判定する工程、
を含むことができる。
【０１５１】
ニューラルネットワークモデルとはＭｃＣｕｌｌｏｃｈ、ＷとＰｉｔｔｓ、Ｗにより提案された（ＭｃＣｕｌｌｏｃｈ、Ｗ  ＡＮＤ  Ｐｉｔｔｓ、Ｗ、１９４３年、Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｓｃｓ、第７号、ｐ．１１５−１３３）、神経細胞が多数並列に結ばれた神経回路を数理的にモデル化したものであり、非線形回帰分析及び非線形判別分析（パターン認識）の有力な学習機械である。
【０１５２】
本発明の方法で使用可能な判別式の算出例を以下に示す。
ニューラルネットワークモデルを決めるためには検体試料が胃がんの補助化学療法感受性由来遺伝子を含むこと／又は胃がんの補助化学療法感受性由来ｍｉＲＮＡを含まないことが既知の生体試料中の標的ｍｉＲＮＡ遺伝子の発現量を教師サンプルとして用意し、以下の手順によって識別関数の定数を決定することができる。
【０１５３】
被験者が、胃がんの補助化学療法感受性である患者群、又は感受性でない患者群のいずれかに属しており、胃がんの補助化学療法感受性である患者群に属することを＋１、感受性でない患者群に属することを−１にクラス分けする。これらのサンプルを教師サンプルとしたとき、教師サンプルが図１で示すニューラルネットワークモデルで分類できるとき、検体試料が胃がんの補助化学療法感受性であること及び／又は感受性でないことを判定する識別関数は例えば次式となる。
【０１５４】
検体試料が胃がんの補助化学療法感受性由来ｍｉＲＮＡを含むこと及び／又は含まないことを決定するｍｉＲＮＡ遺伝子の発現量を共変量Ｘｎで定義し、その共変量Ｘｎがｐ個存在する場合、検体試料Ｘの遺伝子発現、及び各ニューロンを構成する関数はそれぞれ
【０１５５】
【数１】
0005755849.tif 000002
【数２】
0005755849.tif 000003
と標記でき、結合する各ニューロンの識別関数は出力信号である共変量Ｘｎと結合荷重Ｗｎの積の和で標記できる。このときに各識別関数は閾値（θ）をもち、閾値を基準にして各ニューロンを構成する関数は次式で標記できる一義的な識別関数（ｙ）を得ることができる。
【０１５６】
【数３】
0005755849.tif 000004
【０１５７】
【数４】
0005755849.tif 000005
【０１５８】
この関数に新たに与えられる胃がんの補助化学療法感受性由来ｍｉＲＮＡを含むこと及び／又は含まないことが未知の検体試料についての共変量Ｘを代入することによって、ｆ（Ｓｊ）をクラス分け（すなわち、＋１又は−１）することができ、検体試料が胃がんの補助化学療法感受性由来ｍｉＲＮＡを含むこと及び／又は含まないことを識別する。
【０１５９】
以上に示すように、未知試料のクラス分けを行うためのニューラルネットワークモデルによる判別式の作成には２群の教師サンプルが必要となる。この教師サンプルは例えば今回の発明の場合、「胃がんの補助化学療法感受性である患者の組織から得られた発現ｍｉＲＮＡ遺伝子（遺伝子  Ｘ１、Ｘ２、．．Ｘｉ、．．．Ｘｎ）」の各患者に対応したセット、及び「胃がんの補助化学療法感受性でない患者の組織から得られた発現ｍｉＲＮＡ遺伝子（遺伝子  Ｘ１、Ｘ２、．．Ｘｉ、．．．Ｘｎ）」の各患者に対応したセット、の２群である。これらのセットについてそれぞれ測定される発現ｍｉＲＮＡ遺伝子数（ｎ）は実験のデザインによって様々ではあるが、個々の遺伝子については、どのような実験においても２群間で大きく差がある場合と、比較的差が少ない、或いは差がない場合が観察される。ニューラルネットワークモデルによる判別式の精度を上げるためには、訓練サンプルとなる２群に、明確な差があることが条件となるため、遺伝子セットの中から２群間で発現量に差がある遺伝子のみを抽出して利用することが必要である。
【０１６０】
また、ニューラルネットワークモデルによる判別式に用いるｍｉＲＮＡセットに属する核酸の抽出は、次のように行うことが好ましい。まず、検体試料が胃がんの補助化学療法感受性であること／又は胃がんの補助化学療法感受性でないことが既知の複数の生体試料について、群内発現量の中央値、群内発現量の平均値、平均値の差を検出するパラメトリック解析であるｔ検定、ノンパラメトリック解析であるＷｉｌｃｏｘｏｎ検定などを利用して、各ｍｉＲＮＡ遺伝子の２群間の発現量の差を求める。次に、ここで求めた２群間の発現量の差が大きいと認められる順にｍｉＲＮＡを１個ずつセットに組み込み、その都度、Ａｃｃｕｒａｃｙ、Ｅｆｆｉｃａｃｙ、ＰＰＶ、ＮＰＶを算出する。このとき、「Ａｃｃｕｒａｃｙ」は「胃がんが再発しなかった症例を化学療法感受性であると正しく予測した回数」と「胃がんが再発して死亡した症例を化学療法感受性でないと正しく予測した回数」の和に対する全症例数の除数を意味する。「Ｅｆｆｉｃａｃｙ」は「（無再発症例を化学療法感受性であると正しく予測した回数）／（化学療法感受性であると予測した回数）」と「（再発症例を化学療法感受性でないと正しく予測した回数）／（化学療法感受性でないと予測した回数）」の積、「ＰＰＶ」は「（無再発症例を化学療法感受性であると正しく予測した回数）／（化学療法感受性であると予測した回数）」、「ＮＰＶ」は「（再発症例を化学療法感受性でないと正しく予測した回数）／（化学療法感受性でないと予測した回数）」で算出でき、この遺伝子セットへの遺伝子の組み入れは、補助化学療法感受性である症例数と感受性でない症例数の和と一致するまで、もしくは測定したｍｉＲＮＡ数の上限に達するまでのいずれか小さい方に組み入れたｍｉＲＮＡ数が到達するまで繰り返す。無再発症例を化学療法感受性であると判定する確率のＰＰＶと再発症例を化学療法感受性でないと判定する確率のＮＰＶの両者が高くなる条件として、Ｅｆｆｉｃａｃｙが最大となる遺伝子のセットを採用する。
【０１６１】
なお、このＥｆｆｉｃａｃｙが最大となる遺伝子セットを決定するときの方法として、全サンプルから1つのサンプルを除き、残りのサンプルで遺伝子セットを作製したときに、あらかじめ抜いていたサンプルに対する判定を行い、全サンプル分のＥｆｆｉｃａｃｙの平均が最高となるｍｉＲＮＡセットを採用する、Ｌｅａｖｅ  ｏｎｅ  ｃｒｏｓｓ  ｏｕｔ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ法を実施することで、繰り返しの解析によるｍｉＲＮＡセット選定の精度をあげることができる。
【０１６２】
さらに、ここで選ばれるｍｉＲＮＡは、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定においてｐ値が小さい順に並べたときに繰り返し選択される回数であるｍｉＲＮＡであり、また同じ回数である場合はp値が小さいものが選択される。
【実施例】
【０１６３】
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。しかし、本発明は、この実施例によって制限されないものとする。
【０１６４】
１．実験者の臨床病理学的所見
インフォームドコンセントを得た２０例の胃がんＦＦＰＥ検体を用いた。内訳は、無再発症例、すなわち補助化学療法感受性である症例が１１例、再発症例、すなわち補助化学療法感受性でない症例が９例であった。なお、補助化学療法は、５−ＦＵ系プロドラッグ（ＴＳ−１、ＵＦＴ、フルツロン）のいずれかにより行われた。
【０１６５】
２．ｔｏｔａｌＲＮＡの抽出
試料として上の１．で得た胃がんＦＦＰＥ検体より、厚さ１０μｍの切片を作製し、チューブに入れた。キシレンを加えてパラフィンを溶解させ、遠心してキシレンを除いて、組織を回収した。組織にエタノールを加えて残存キシレンを溶解させ、遠心してエタノールを除いた。この操作を２回繰り返した。組織を風乾させた後、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ溶液（２μｇ／μＬ）を１００μＬ加えて、３７℃で一晩インキュベートした。シリカカラムを用いてタンパク質等の夾雑物を除き、ＤＮａｓｅＩ処理によりＤＮＡを除くことで、精製されたｔｏｔａｌ  ＲＮＡを得た。
【０１６６】
３．遺伝子発現量の測定
オリゴＤＮＡ核酸アレイは、東レ株式会社の３Ｄ‐Ｇｅｎｅ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏ  ｃｈｉｐを用いた。東レ株式会社の３Ｄ‐Ｇｅｎｅ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏ  ｃｈｉｐは、同社の定める手順に基づいて操作した。ハイブリダイゼーションを行ったＤＮＡチップをＤＮＡアレイスキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙＬｉｔｅ、パーキンエルマージャパン）を用いてスキャンし、画像を取得してＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ５．０（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ）にて蛍光強度を数値化した。統計学的処理はＳｐｅｅｄ Ｔ．著「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｄａｔａ」Ｃｈａｐｍａｎ & Ｈａｌｌ／ＣＲＣ、及びＣａｕｓｔｏｎ Ｈ．Ｃ．ら著「Ａ ｂｅｇｉｎｎｅｒ’ｓ ｇｕｉｄｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ」Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参考にし、ハイブリダイズ後の画像解析から得られたデータの対数値を用いて解析した。その結果、胃がんの補助化学療法感受性である患者と感受性でない患者とで、発現量が減少、低減もしくは増加、増大しているｍｉＲＮＡ（ポリヌクレオチド）を見出すことができた。その一覧を表１に示す。これらの遺伝子を、検体試料が胃がんの補助化学療法感受性であること／又は感受性でないことを判定するのに利用できると考えられる。
【０１６７】
【表１】
0005755849.tif 000006
【０１６８】
４．予測スコアリングシステム
１１症例の胃がんの補助化学療法感受性であった症例の検体試料及び９症例の感受性でなかった症例の検体試料の合計２０症例を教師サンプルとして、Ｒ（ｈｔｔｐ：／／ｃｒａｎ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）を用いて判別式を作成した。ｍｉＲＮＡ（ポリヌクレオチド）は図２に示すような流れで決定した。すなわち、まず２０症例の教師サンプルを１９症例の学習セットと１症例のテストセットに分け、学習セットにおいて胃がんの補助化学療法感受性であった群から得た検体試料を用いて測定したｍｉＲＮＡ遺伝子発現量と感受性でなかった患者群から得た検体試料を用いて測定したｍｉＲＮＡ遺伝子発現量の間で、各々の遺伝子発現量についてＷｉｌｃｏｘｏｎ検定のｐ値を算出した。次に、ここで求めたＷｉｌｃｏｘｏｎ検定のｐ値が小さい順に遺伝子の１個ずつを組み入れたデータセットを用いたニューラルネットワークモデルを構築し、その都度、テストセットの検体試料が胃がんの補助化学療法感受性であること／又は感受性でないことを判定した。この検体試料が胃がんの補助化学療法感受性であること／又は感受性でないことの判定を２０症例の教師サンプルから分けることができる２０通りの学習セットとテストセットの組合せに対して行い、２０症例を正しく予測できたＡｃｃｕｒａｃｙ、Ｅｆｆｉｃａｃｙ、Ｓｅｎｃｉｔｉｖｉｔｙ、Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ、ＰＰＶ、及びＮＰＶの割合を算出した。その結果を表２に示す。
【０１６９】
【表２】
0005755849.tif 000007
【０１７０】
このｍｉＲＮＡセットへのｍｉＲＮＡの組み入れは、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定のｐ値が小さい順に繰り返し、最大のＥｆｆｉｃａｃｙを得られた時点の遺伝子（ポリヌクレオチド）のセットを求めた。その結果を図３に示す。図３の縦軸は胃がんの補助化学療法感受性を判定できる確率を、横軸は表１に記載の配列番号の順に増やした、胃がんの補助化学療法感受性の有無の判定に必要なｍｉＲＮＡ（ポリヌクレオチド）の合計数をそれぞれ示す。例えば、横軸の数字が５のときは表１の配列番号１〜５のｍｉＲＮＡ（ポリヌクレオチド）の組み合わせで予測した結果を、２０のときは配列番号１〜２０のｍｉＲＮＡ（ポリヌクレオチド）の組み合わせで予測した結果がそれぞれ示されている。１３種類のｍｉＲＮＡ（ポリヌクレオチド）のセットの場合にＥｆｆｉｃａｃｙが最大であり、８１％であった。以上のとおり、５−ＦＵ系プロドラッグによる補助化学療法感受性の有無を非常に高い確率で判定できるｍｉＲＮＡ（ポリヌクレオチド）のセットが見出された。
【産業上の利用可能性】
【０１７１】
本発明により、特異性、感受性に優れた胃がんの補助化学療法感受性判定用組成物を提供することができるため、胃がんの手術時に摘出した胃組織や、胃生検サンプルを用いて、感度及び特異度の高い、補助化学療法感受性の判定が可能になるだけでなく、患者に合った抗癌剤を正しく選定できることから、早期の治療及び予後の改善をもたらし、患者の負担を大きく軽減できるほか、医療費の削減にも寄与する。
【図１】
0005755849.tif 000008
【図２】
0005755849.tif 000009
【図３】
0005755849.tif 000010
【配列表】
0005755849000001.app