(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ又はII：
【化１】
0005745417.tif 000037
［式中：
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4は、独立して水素原子又は以下の式：
−Ｌ−Ｒ1−Ｎ+（Ｒ2）（Ｒ3）Ｒ4
のカチオン性基を表し、
ここにおいて：
Ｌはフェノキシ連結部分であり；
Ｒ1は、低級アルキレン；そして
Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、独立してＨ、アリール、低級アルキル、低級アルケニル又は低級アルキニルを表し、そのうちの最後の３つは、場合により低級アルキル、低級アルキレン（場合により、酸素で中断される）、アリール、ＯＲ5、Ｃ（Ｏ）Ｒ6、Ｃ（Ｏ）ＯＲ7、Ｃ（Ｏ）ＮＲ8Ｒ9、ＮＲ10Ｒ11及びＮ+Ｒ12Ｒ13Ｒ14から選ばれる１つ又はそれ以上の置換基によって置換され、但し、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4がすべてＨであることはなく、
Ｚは、−ＣＨであり、
Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3及びＹ4は、存在しない、
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13及びＲ14は、独立してＨ又は低級アルキルを表し、
そして、
Ｍは、金属元素又はメタロイド元素であり、
そしてＸ1及びＸ3は水素原子であり、Ｘ2及びＸ4はカチオン性基である。］の化合物を含む、生きている哺乳動物の身体上又は体内での微生物バイオフィルムの治療又は予防において使用するための医薬組成物。
【請求項２】
Ｒ1が非置換低級アルキレン基である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
Ｒ2、Ｒ3及び／又はＲ4が非置換低級アルキル基である請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
化合物が５,１５−ビス−［４−（３−トリメチルアンモニオ−プロピルオキシ）−フェニル］−ポルフィリン（「ＸＦ−７３」）若しくは５,１５−ビス−［３−（３−トリメチルアンモニオ−プロピルオキシ）−フェニル］−ポルフィリン（「ＸＦ−７０」）、又はそれらの二塩化物塩である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
化合物が中心金属イオンを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
微生物バイオフィルムが細菌を含む又は細菌からなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
バイオフィルムが口腔、尿路、洞、耳、心臓、前立腺、骨、肺、腎臓又は皮膚にある、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
バイオフィルムが生きている哺乳類の体内にある請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
バイオフィルムが体内の不活性支持体に付着している請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
緩慢増殖期又は静止期の細菌の増殖を死滅、抑制又は予防するための請求項１〜５のいずれか１項に定義された医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項に記載された医薬組成物で含浸、コーティング又は別の方法で処理された植込み型医療用デバイス。
【請求項１２】
血管内デバイス、カテーテル、シャント、挿管及び気管切開チューブ、眼科用デバイス、関節補綴、人工心臓弁及び乳房インプラントからなる群より選ばれる請求項１１に記載の植込み型医療用デバイス。
【請求項１３】
式Ｉ又はII：
【化２】
0005745417.tif 000038
［式中：
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4は、独立して水素原子又は以下の式：
−Ｌ−Ｒ1−Ｎ+（Ｒ2）（Ｒ3）Ｒ4
のカチオン性基を表し、
ここにおいて：
Ｌはフェノキシ連結部分であり；
Ｒ1は、低級アルキレン；そして
Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、独立してＨ、アリール、低級アルキル、低級アルケニル又は低級アルキニルを表し、そのうちの最後の３つは、場合により低級アルキル、低級アルキレン（場合により、酸素で中断される）、アリール、ＯＲ5、Ｃ（Ｏ）Ｒ6、Ｃ（Ｏ）ＯＲ7、Ｃ（Ｏ）ＮＲ8Ｒ9、ＮＲ10Ｒ11及びＮ+Ｒ12Ｒ13Ｒ14から選ばれる１つ又はそれ以上の置換基によって置換され、但し、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4がすべてＨであることはなく、
Ｚは、−ＣＨであり、
Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3及びＹ4は、存在しない、
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13及びＲ14は、独立してＨ又は低級アルキルを表し、
そして、
Ｍは、金属元素又はメタロイド元素であり、
そしてＸ1及びＸ3は水素原子であり、Ｘ2及びＸ4はカチオン性基である。］の化合物とバイオフィルムを接触させることを含む、微生物バイオフィルムの増殖を死滅、抑制又は予防するための、インビトロの方法。
【請求項１４】
Ｒ1が非置換低級アルキレン基である、請求項１３に記載のインビトロの方法。
【請求項１５】
Ｒ2、Ｒ3及び／又はＲ4が非置換低級アルキル基である請求項１３又は１４に記載のインビトロの方法。
【請求項１６】
化合物が５,１５−ビス−［４−（３−トリメチルアンモニオ−プロピルオキシ）−フェニル］−ポルフィリン（「ＸＦ−７３」）若しくは５,１５−ビス−［３−（３−トリメチルアンモニオ−プロピルオキシ）−フェニル］−ポルフィリン（「ＸＦ−７０」）、又はそれらの二塩化物塩である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項１７】
化合物が中心金属イオンを含む、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項１８】
バイオフィルムが、家庭環境、商業的又は工業的環境にある、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポルフィリン化合物の新規な使用、そして、特に（薬剤中並びに家庭内、商業的、及び工業的環境での）微生物バイオフィルムの死滅、抑制又は予防におけるこのような化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオフィルムの形成は、普遍的な細菌生存戦略である。バイオフィルムは、自然環境及び工業設備における不活性な及び生きている支持体（inert and living supports）の両方に生じる。
【０００３】
バイオフィルムは、自己発生した（self-developed）ポリマーマトリックス内に閉じ込められた、生きている又は不活性な表面に付着した微生物の構築されたコミュニティである。また、バイオフィルムは、表面付着、構造不均質性、遺伝的多様性、複合的コミュニティ相互作用（complex community interactions）、及びポリマー物質の細胞外マトリックスを特徴とすることが多い。
【０００４】
単細胞生物は、一般に２つの異なる行動様式を示す。第１は、単細胞がなんらかの液体媒体中で自由に浮く又は泳ぐ、よく知られた自由遊走性の又は浮遊の形態である。第２は、細胞が密に詰まって相互にしっかりと付着し、通常、固形物表面を形成する付着状態である。行動における変化は、クオラムセンシングの他に種の間で変化する他の機構を含む多くの要因によって誘発される。細胞が様式を切り替えるとき、細胞は行動における表現型のシフトを受け、その際、多くの遺伝子組（suites of genes）は、上方制御及び下方制御される。
【０００５】
形成
バイオフィルムの形成は、表面に浮遊性（free-floating）の微生物が付着することにより開始される。これらの第１の外来種（colonists）は、まず弱い可逆性のファンデルワールス力により表面に付着する。外来種が表面から直ちに分離されない場合、それは、線毛のような細胞付着構造を用いてそれ自体でより恒久的に固着する（anchor）ことができる。第１の外来種は、より多様な付着部位を提供し、そして共にバイオフィルムを保持するマトリックスの構築を開始することによって他の細胞の到着を促進する。いくつかの種は、それ自体で表面に付着することができないが、多くの場合、それ自体でマトリックスに又は直接的により早期の外来種に固着することができる。このコロニー形成中に、細胞は、クオラムセンシングにより情報交換することができる。コロニー形成が開始したら、バイオフィルムは、細胞分裂及び補充の組み合わせにより成長する。バイオフィルム形成の最終段階は、成熟（development）として知られており、バイオフィルムが確立されて、形状及びサイズにおいてのみ変化しうる段階である。このバイオフィルムの成熟により細胞はより抗生物質耐性になることができる。細菌性バイオフィルムは、少なくとも２つの理由で抗生物質作用に対して不応性（refractive）であると考えられる；バイオフィルムは、抗生物質が細菌に侵入するのを予防する物理的障壁を形成し、そして第二にバイオフィルム内の細菌は、より緩慢に増殖する傾向があり、そのため、抗生物質の標的に対するより低い代謝プロフィールが提供される。
【０００６】
性質
バイオフィルムは、通常、少量の水溶液中に沈められた又は曝露された固体基質（solid substrates）上に見出されるが、特に湿度の高い環境では、液体表面上に、そしてまた葉の表面上に移動性マット（floating mats）を形成することができる。増殖にとって十分な物資が与えられると、バイオフィルムは、急速に成長して肉眼で見えるようになる。バイオフィルムは、多くの異なるタイプの微生物、例えば細菌、古細菌、原生動物、真菌及び藻類を含むことができ；各群は、分化した代謝機能を果たしている。しかしながら、一部の生物は、ある種の条件下で単種フイルム（monospecies films）を形成する。
バイオフィルムは、消毒薬及び抗生物質、食細胞並びにヒト免疫系に対してそれ自体で防御することができると考えられる。
【０００７】
細胞外マトリックス
バイオフィルムは、ＥＰＳと称する分泌されたポリマー化合物のマトリックスと共に保持され、そして保護されている。ＥＰＳは、細胞外ポリマー物質又はエキソポリサッカライドの各々についての略語である。このマトリックスは、その中で細胞を保護し、そして生化学的シグナルを通してそれらの間でコミュニケーションを促進する。いくつかのバイオフィルムは、栄養分及びシグナル伝達分子の分配を助ける水チャネルを含むことがわかっている。このマトリックスは、ある種の条件下でバイオフィルムが固着化（fossilized）できるほど十分に強い。
【０００８】
バイオフィルム中で生きている細菌は、密集して保護されたフィルム環境により、細菌が種々のやり方で協同し、相互作用するのが可能になるため、通常、同種の浮遊性細菌とはかなり異なる性質を有する。この環境の１つの利点は、密集した細胞外マトリックスとして洗剤及び抗生物質に対する耐性が増すことであり、細胞の外層は、コミュニティ内部を保護している。場合により、抗生物質耐性を、１０００倍増強することができる（非特許文献１参照）。
【０００９】
実例
バイオフィルムはいたる所にある。細菌及び古細菌だけでなく微生物のほとんどすべての種は、表面及び相互に付着することができる機構を有している。
・バイオフィルムは、ほとんどの小川又は川の底の岩石及び小石上に見出すことができ、そして淀んだ水たまりの表面上に形成されることが多い。実際、バイオフィルムは、川及び小川における食物連鎖の重要な成分であり、そして多くの魚が食べる水生無脊椎動物によって食される。
・バイオフィルムは、イエローストーン国立公園（Yellowstone National Park）（米国）の熱い酸性の水たまりの中で、そして南極大陸の氷河上で成長する。
・シャワー室では、バイオフィルムが成長するための湿った暖かい環境が与えられるため、バイオフィルムはきわめて容易に成長することができる。
・バイオフィルムは、管の内部で成熟して目詰まり及び腐食に至ることがある。床及び流し台上のバイオフィルムは、調理区域で衛生を困難にすることがある。冷却水系中のバイオフィルムは、熱伝達を低下させることが知られている（非特許文献２参照）。
・船体への細菌付着は、航洋船の生物付着の土台として作用する。細菌フィルムが形成されたら、フジツボのような他の海洋生物が付着することがより容易になる。このような付着物は、船の速度を最大２０％抑制することがあり、航海がより長期化し、そしてさらなる燃料が必要になる。乾ドックにおける改装及び再塗装の時間により資産輸送の生産性が低下し、そしてまた、腐食及び船体からの海洋生物の機械的除去（削り落とす）のため船の耐用年数が減る。
・また、バイオフィルムは、構造的用途にも利用することができる。例えば、多くの下水処理場は、処理段階を含んでおり、その際、排水は、有機化合物を抽出して分解するフィルター上に成長したバイオフィルムの上を通過する。このようなバイオフィルムでは、細菌は、主に有機物質（ＢＯＤ）を除去する役割を果たしているのに対して；原生動物及びワムシは、主に病原体及び他の微生物を含む浮遊物質（ＳＳ）を除去する役割を果たしている。緩速濾過器は、飲用目的で湖、泉又は川の水源から地表水を濾過するのと同じやり方でバイオフィルム成熟に依存している。精製水からはさらなる栄養を全く抽出することができないため、本発明者らがきれいな水とみなすものは、これらの微小細胞生物にとって無益な物質である。
・バイオフィルムは、汚染された海又は海洋系から石油を除去するのに役立てることができる。油は、微生物コミュニティの炭化水素分解活性（hydrocarbon-degrading activities）、特に専門家の注目すべき最近発見された群、いわゆる炭化水素分解性細菌（hydrocarbonoclastic bacteria）（ＨＣＢ）によって除去される。
・また、バイオフィルムは、歯垢としてほとんどの動物の歯の上に存在し、そこでは、虫歯及び歯周病の原因となることがある。
・バイオフィルムは、植物の表面及び内部に見出される。それらは、作物疾患の原因となることもあり、又は根の窒素固定根瘤菌の場合のように、植物と共生的に存在することもできる［６］。バイオフィルムに関連した作物疾患の例としては、柑橘類潰瘍病、ブドウのピアス病、及びコショウ及びトマトのような植物の斑点細菌病が含まれる。
【００１０】
バイオフィルム及び感染性疾患
バイオフィルムは、体内の多種多様な微生物感染症、ある概算によればすべての感染症の８０％に関与することがわかっている（非特許文献３参照）。バイオフィルムが関与する感染プロセスには、一般的な問題、例えば尿路感染症、カテーテル感染症、中耳感染症、歯垢の形成、歯肉炎、コーティングコンタクトレンズ、並びにあまり一般的でないがより致死性のプロセス、例えば心内膜炎、嚢胞性線維症における感染症、及び関節補綴及び心臓弁のような永続的留置器具の感染症が含まれる。
【００１１】
最近、慢性副鼻腔炎の手術を受けた患者の摘出組織の８０％においてバイオフィルムが存在することがわかった。バイオフィルムを有する患者は、正常な線毛及び杯細胞形態を有するバイオフィルムのない対照と異なり、線毛及び杯細胞が露出していることがわかった。バイオフィルムは、前述の１０人の健康な対照のうちの２人のサンプルからも見出された。手術中の培養物からの細菌種は、各患者の組織上のバイオフィルム中の細菌種と一致しなかった。つまり、細菌は存在したが、培養物は陰性であった。
【００１２】
緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）バイオフィルム
工業化社会における医療ケアの成果は、免疫不全の患者及び老年人口において明らかに増加している慢性日和見感染症により著しく損なわれている。従来の抗生物質療法は、通常、これらの感染症を根絶するのに十分でないため、慢性感染症は医療専門家にとって大きな課題のままであり、そして経済的関連性が大きい。持続（persistence）の１つの主な理由は、有害な環境要因から細菌を保護するバイオフィルム内で成長する細菌の能力であると考えられる。緑膿菌は、重要な日和見病原体及び院内感染症が発症する原因物質であるだけでなく、細菌持続に関与する多様な細菌機構の研究のためのモデル生物と考えることもできる。これに関して、プランクトン様の成長からバイオフィルム表現型へのスイッチ及び持続性疾患における細菌間コミュニケーションの役割の原因となる分子機構の解明により、緑膿菌病原性における新しい病識が得られ、慢性的な感染患者のより良好な臨床管理に寄与するはずであり、そして別の抗感染性治療戦略を開発するための新しい薬物標的の同定に至るにちがいない。
【００１３】
歯垢
歯垢は、歯に付着した細菌細胞（主にミュータンス連鎖球菌（Streptococcus mutans）及びサングイス連鎖球菌（Streptococcus sanguis））、唾液ポリマー及び細菌性細胞外生成物からなる物質である。歯垢は、歯の表面上のバイオフィルムである。微生物のこの蓄積により歯及び歯肉組織が高濃度の細菌代謝物にさらされ、その結果、歯科疾患が生じる。
【００１４】
レジオネラ症
レジオネラ菌（Legionella bacteria）は、バイオフィルム中のある種の条件下で増殖することが知られており、その中では消毒薬から保護されている。冷却搭の研究者、空調室の作業員及びシャワーを浴びている人は、系の構成及び設計が十分でなく、そして維持が適切でない場合、吸入によってレジオネラ菌に曝露されることがある。
【００１５】
興味深いことに、表面に付着してバイオフィルムとして成長する細菌のような微生物は、従来の抗生物質治療に対してあまり影響を受けない。低下した抗生物質感受性は、植込まれた機器に関連するもののようなバイオフィルム感染症の持続に寄与する。バイオフィルム中で作用する保護機構は、従来の抗生物質耐性の原因となるものとは異なると考えられる。バイオフィルムでは、不十分な抗生物質浸透、栄養分の制限、遅い成長、適応可能なストレス応答、及び存続生物細胞の形成が多層性の防御を構成していると仮説として取り上げられている。
【００１６】
さらにまた、バイオフィルム培養物は、遺伝子型の耐性の発現なしに、化学療法による根絶に対して典型的に高度に不応性（refractory）である。
結果的に、治療選択肢の数は制限され、そして抗バイオフィルム活性を有する新規抗菌剤を開発する重要性が高まっている。
【００１７】
従って、（医学的及び非医学的環境において）微生物バイオフィルムの成長を死滅、抑制又は予防する新しい方法が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Stewart P, Costerton J, 2001, Lancet 358 (9276):135-8
【非特許文献２】G. Characklis, et al., 1981, Heat Trans. Eng. 3:23-37
【非特許文献３】“Research on microbial biofilms (PA-03-047)” NIH, National Heart, Lung, and Blood Institute, 2002-12-20
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の第１の態様によれば、微生物バイオフィルムの成長を死滅、抑制又は予防するための式Ｉ：
【化１】
0005745417.tif 000002
［式中：
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4は、独立して水素原子、親油性部分、フェニル基、低級アルキル、アルカリール若しくはアラルキル基、又は以下の式；
−Ｌ−Ｒ1−Ｎ+（Ｒ2）（Ｒ3）Ｒ4
ここにおいて：
Ｌは連結部分であるか又は存在せず；
Ｒ1は、低級アルキレン、低級アルケニレン又は低級アルキニレンを表し、これは、場合により低級アルキル、低級アルキレン（場合により、酸素で中断される）、フルオロ、ＯＲ5、Ｃ（Ｏ）Ｒ6、Ｃ（Ｏ）ＯＲ7、Ｃ（Ｏ）ＮＲ8Ｒ9、ＮＲ10Ｒ11及びＮ+Ｒ12Ｒ13Ｒ14から選ばれる１つ又はそれ以上の置換基によって置換され；そして
Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、独立してＨ、アリール、低級アルキル、低級アルケニル又は低級アルキニルを表し、そのうちの最後の３つは、場合により低級アルキル、低級アルキレン（場合により、酸素で中断される）、アリール、ＯＲ5、Ｃ（Ｏ）Ｒ6、Ｃ（Ｏ）ＯＲ7、Ｃ（Ｏ）ＮＲ8Ｒ9、ＮＲ10Ｒ11及びＮ+Ｒ12Ｒ13Ｒ14から選ばれる１つ又はそれ以上の置換基によって置換され、
Ｚは、−ＣＨ又はＮである；
のカチオン性基を表し、
Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3及びＹ4は、存在しないか、又は独立してアリール、低級アルキル、低級アルケニル若しくは低級アルキニルを表し、そのうちの最後の３つは、場合により低級アルキル、低級アルキレン（場合により、酸素で中断される）、アリール、ＯＲ5、Ｃ（Ｏ）Ｒ6、Ｃ（Ｏ）ＯＲ7、Ｃ（Ｏ）ＮＲ8Ｒ9、ＮＲ10Ｒ11、Ｎ+Ｒ12Ｒ13Ｒ14から選ばれる１つ若しくはそれ以上の置換基によって置換されるか、又はそれらが結合しているピロール環と共に環式基を形成してもよく；そして
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13及びＲ14は、独立してＨ又は低級アルキルを表すが、
但し、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4の少なくとも１つは、先に定義されたカチオン性基であり、そしてＸ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4の少なくとも１つは、水素原子、フェニル基、親油性部分、又は低級アルキル、アルカリール若しくはアラルキル基である］の化合物の使用が提供される。
【００２０】
「バイオフィルム」には、液体の界面及び表面（例えば、体内の粘膜、あらゆる宿主組織若しくは器官上、又は永久若しくは半永久植込み型の医療用デバイス（例えば静脈カテーテル）の表面上）に付着することができる微生物細胞により産生された細胞外マトリックスによって典型的に包囲された微生物（例えば細菌、真菌、藻類）コミュニティが含まれる。
【００２１】
「低級アルキル」という用語は、酸素によって中断されていてもよい直鎖又は分枝状、環式又は非環式Ｃ1−Ｃ20アルキルを含むものとする（各アルキル鎖中には５個を超えない酸素原子が存在することが好ましい）。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13及びＲ14が表しうる低級アルキル基としては、Ｃ1−Ｃ18アルキル、Ｃ1−Ｃ16アルキル、Ｃ1−Ｃ14アルキル、Ｃ1−Ｃ12アルキル、Ｃ1−Ｃ10アルキル、Ｃ1−Ｃ9アルキル、Ｃ1−Ｃ8アルキル、Ｃ1−Ｃ7アルキル、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ5アルキル、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ1−Ｃ3アルキル及びＣ1−Ｃ2アルキルが含まれる。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13及びＲ14が表しうる好ましい低級アルキル基としては、Ｃ1、Ｃ2、Ｃ3、Ｃ4、Ｃ5、Ｃ6、Ｃ7、Ｃ8、Ｃ9、Ｃ10、Ｃ11、Ｃ12、Ｃ13、Ｃ14、Ｃ15及びＣ16アルキルが含まれる。
【００２２】
従って、Ｎ+Ｒ2Ｒ3Ｒ4及び／又はＮ+Ｒ12Ｒ13Ｒ14のいずれか１つ又はそれ以上は、環式アミン／アンモニウム基、例えば：
【化２】
0005745417.tif 000003
（式中、基は、上記構造の下の部分に示したようにＮ＋原子からの不確定な結合によって化合物に結合している）を表してもよい。
【００２３】
また、環式アミン／アンモニウム基が６個よりも少ない又は多いメンバーを含んでもよく、例えば、このような基が４、５、７、８、９又は１０員環を含んでもよいことは理解される。
【００２４】
「低級アルキレン」という用語は、それに応じて解釈されることになっている。
【００２５】
「低級アルケニル」及び「低級アルキニル」という用語は、それぞれ、直鎖又は分枝状、環式又は非環式Ｃ2−Ｃ20アルケニル及びアルキニルを含むものとし、それらはそれぞれ酸素によって中断されてもよい（各アルケニル又はアルキニル鎖中には５個を超えない酸素原子が存在することが好ましい）。
【００２６】
また、「低級アルケニル」という用語には、シス型及びトランス型幾何異性体の両方が含まれる。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13及びＲ14が表しうる低級アルケニル基としては、Ｃ2−Ｃ18アルケニル、Ｃ2−Ｃ17アルケニル、Ｃ2−Ｃ16アルケニル、Ｃ2−Ｃ14アルケニル、Ｃ2−Ｃ12アルケニル、Ｃ2−Ｃ10アルケニル、Ｃ2−Ｃ8アルケニル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ5アルケニル、Ｃ2−Ｃ4アルケニル、Ｃ2−Ｃ3アルケニル及びＣ3−Ｃ4アルケニルが含まれる。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13及びＲ14が表しうる好ましい低級アルケニル基としては、Ｃ2、Ｃ3、Ｃ4、Ｃ5、Ｃ6、Ｃ7、Ｃ8、Ｃ9、Ｃ10、Ｃ11、Ｃ12、Ｃ13及びＣ14アルケニルが含まれる。
【００２７】
「低級アルケニレン」という用語は、それに応じて解釈されることになっている。
【００２８】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13及びＲ14が表しうる「低級アルキニル」基としては、Ｃ2−Ｃ18アルキニル、Ｃ2−Ｃ16アルキニル、Ｃ2−Ｃ14アルキニル、Ｃ2−Ｃ12アルキニル、Ｃ2−Ｃ10アルキニル、Ｃ2−Ｃ9アルキニル、Ｃ2−Ｃ8アルキニル、Ｃ2−Ｃ7アルキニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニル、Ｃ2−Ｃ5アルキニル、Ｃ2−Ｃ4アルキニル、Ｃ2−Ｃ3アルキニル及びＣ3−Ｃ4アルキニルが含まれる。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13及びＲ14が表しうる好ましい低級アルケニル基としては、Ｃ2、Ｃ3、Ｃ4、Ｃ5、Ｃ6、Ｃ7、Ｃ8、Ｃ9、Ｃ10、Ｃ11、Ｃ12、Ｃ13及びＣ14アルキニルが含まれる。
【００２９】
「低級アルキニレン」という用語は、それに応じて解釈されることになっている。
【００３０】
「アリール」という用語は、フェニル及びナフチルのような６〜１０員炭素環式芳香族基を含み、これらの基は、フルオロ、シアノ、ニトロ、低級アルキル（すなわちアルカリール）、ＯＲ5、Ｃ（Ｏ）Ｒ6、Ｃ（Ｏ）ＯＲ7、Ｃ（Ｏ）ＮＲ8Ｒ9及びＮＲ10Ｒ11から選ばれる１つ又はそれ以上の置換基によって場合により置換されている。
【００３１】
「アラルキル」という用語は、低級アルキル基を介してポルフィリン環に結合したアリール基を含む。
【００３２】
本発明の第２の態様は、微生物バイオフィルムの成長を死滅、抑制又は予防するための式ＩＩ：
【化３】
0005745417.tif 000004
（式中、
Ｍは、金属元素又はメタロイド元素であり、そしてＸ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3、Ｙ4及びＺは、上記定義された通りである）
の化合物の使用を提供する。
【００３３】
「金属元素」という用語は、二価体又は三価の金属元素を含むものとする。好ましくは、金属元素は反磁性体である。別法として、金属元素は、常磁性体でもよい。
【００３４】
より好ましくは、金属元素は、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｌａ（ＩＩＩ）、Ｌｕ（ＩＩＩ）、Ｙ（ＩＩＩ）、Ｉｎ（ＩＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ａｌ（ＩＩＩ）、Ｒｕ、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）及びＰｄ（ＩＩ）から選ばれる。最も好ましくは、金属元素は、Ｃｕ（ＩＩ）又はＦｅ（ＩＩＩ）である。
【００３５】
「メタロイド」という用語は、金属及び非金属の両方のものに対して中間となる、電気伝導性のような物理的及び化学的性質を有する元素を含むものとする。「メタロイド元素」という用語には、ケイ素（Ｓｉ）及びゲルマニウム（Ｇｅ）原子が含まれ、これらは１つ又はそれ以上のリガンドで場合により置換される。
【００３６】
金属元素及びメタロイド元素という用語には、正の酸化状態を有する金属元素又はメタロイド元素が含まれ、それらの全ては、フルオロ、ＯＨ、ＯＲ15から選ばれる１つ又はそれ以上のリガンドによって置換されてもよく、その際、Ｒ15は、上記定義されたような低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、アラルキル、アリール又はアルカリールである（ここにおいて、アリール及びアルカリールは一置換されている）ことが理解される。
【００３７】
式Ｉ及びＩＩの化合物は、少なくとも１つのカチオン性基を含む。従って、本発明の化合物は、正味の正電荷、例えば＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６又はそれ以上の電荷を担持してもよい。好ましい実施態様において、化合物は、＋４より少ない、例えば＋１、＋２又は＋３の正味の電荷を担持する。特に好ましい実施態様において、化合物は＋２の正味の電荷を担持する。
【００３８】
式Ｉ及びＩＩの化合物は、カウンターアニオンによって平衡化されてもよいことは、当業者にとって理解される。典型的なカウンターアニオンとしては、ハライド（例えばフルオリド、クロリド及びブロミド）、サルフェート（例えばデシルサルフェート）、ニトラート、ペルクロラート、スルホナート（例えばメタンスルホナート）及びトリフルオロアセテートが含まれるが、これらに制限されるわけではない。他の適切なカウンターアニオンは、当業者によく知られている。従って、塩及び溶媒和物のような式Ｉ及びＩＩの化合物の薬学的及び／又は獣医学的に許容しうる誘導体も、また本発明の範囲内に含まれる。記載しうる塩としては、酸付加塩、例えば、無機酸、例えば塩酸、臭化水素、硫酸及びリン酸、カルボン酸又は有機スルホン酸で形成された塩；塩基付加塩；塩基により形成された金属塩、例えば、ナトリウム及びカリウム塩が含まれる。
【００３９】
さらに、式Ｉの化合物が互変異性を示しうることは、当業者によって理解される。すべての互変異性形態及びそれらの混合物は、本発明の範囲内に含まれる。
【００４０】
式Ｉ及びＩＩの化合物は、１つ又はそれ以上の不斉炭素原子を含んでもよく、そのため光学及び／又はジアステレオ異性を示すことがある。ジアステレオ異性体は、慣用の技術、例えばクロマトグラフィー又は分別結晶を用いて分離することができる。種々の立体異性体は、慣用の、例えば分別結晶又はＨＰＬＣ技術を用いて化合物のラセミ体又は他の混合物を分離するによって単離することができる。別法として、所望の光学異性体は、ラセミ化若しくはエピマー化を生じない条件下で適切な光学活性出発物質の反応によって、又は、例えばホモキラル酸を用いて誘導体化し、続いてジアステレオマーエステルを慣用の手段（例えばＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー）で分離することによって製造することができる。すべての立体異性体は、本発明の範囲内に含まれる。
【００４１】
本発明の第１及び２の態様の好ましい実施態様において、Ｚは−ＣＨである。
【００４２】
本発明の第１及び第２の態様の特性を表わす特徴は、置換基Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4の少なくとも１つが、上記定義されたような式−Ｌ−Ｒ1−Ｎ+（Ｒ2）（Ｒ3）Ｒ4の第四級アンモニウムカチオン性基であるということである。好ましくは、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4は、いずれもアニリニウム又はピリジニウムカチオン性基ではない。
【００４３】
好ましい実施態様において、Ｒ1は、非置換の低級アルキレン、低級アルケニレン又は低級アルキニレン基である。
【００４４】
都合よくは、Ｒ1は、式：
−（ＣＨ2）m−
の直鎖低級アルキレン基である。
【００４５】
好ましくは、「ｍ」は１から２０の間の整数である。より好ましくは、「ｍ」は１から１０の間、例えば１から６の間、１から５の間、１から４の間、又は１から３の間の整数である。Ｒ1が表しうる好ましい直鎖低級アルキレン基は、ｍが２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である上式の基を含む。最も好ましくは、「ｍ」は２又は３である。
【００４６】
第四級アンモニウム部分の残りの３つの置換基、すなわちＲ2、Ｒ3及びＲ4は、同一又は異なってもよく、そしてＨ、低級アルキル、低級アルケニル又は低級アルキニルから選ばれ、そのうちの最後の３つは、低級アルキル、ＯＲ5、Ｃ（Ｏ）Ｒ6、Ｃ（Ｏ）ＯＲ7、Ｃ（Ｏ）ＮＲ8Ｒ9、ＮＲ10Ｒ11及びＮ+Ｒ12Ｒ13Ｒ14から選ばれる１つ又はそれ以上の置換基によって場合により置換されている。
【００４７】
好ましい実施態様において、Ｒ2、Ｒ3及び／又はＲ4は、低級アルキル、低級アルケニル又は低級アルキニル基である。
【００４８】
好ましくは、Ｒ2、Ｒ3及び／又はＲ4は、非置換の低級アルキル基である。
【００４９】
場合により、少なくとも１つのＲ2、Ｒ3及びＲ4は、第一級、第二級若しくは第三級アミン基又は第四級アンモニウム基で置換されたアルキル基である。
【００５０】
本発明の第１及び第２の態様の好ましい実施態様において、Ｒ1は−（ＣＨ2）3−であり、Ｒ2及びＲ3はＣＨ3であり、そしてＲ4は−（ＣＨ2）3−Ｎ（ＣＨ3）2である。
【００５１】
本発明の第１及び第２の態様の別の好ましい実施態様において、Ｒ1は−（ＣＨ2）3−であり、そしてＲ2、Ｒ3及びＲ4は、それぞれＣＨ3である。
【００５２】
本発明の第１及び第２の態様のさらに別の好ましい実施態様において、Ｒ1は−（ＣＨ2）3−であり、そしてＲ2、Ｒ3及びＲ4は、それぞれＣ2Ｈ5である。
【００５３】
都合よくは、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4の少なくとも１つは、上記定義されたようなカチオン性基であり、そしてＸ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4の少なくとも１つは、水素原子である。
【００５４】
好ましくは、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4のそれぞれは、水素原子又は上記定義されたようなカチオン性基である。
【００５５】
都合よくは、すべての第一級、第二級又は第三級アミン基のｐＫ値は、本発明の化合物中に存在する場合、８よりも大きく、生理環境中にあるときに基がプロトン化されるようになっている。
【００５６】
第四級アンモニウムカチオン性基は、結合部分Ｌを介してポルフィリン環に場合により結合している。
【００５７】
好ましい結合部分Ｌとしては、フェノキシ、フェニレン、スルホニルアミド、アミノスルホニル、スルホニルイミノ、フェニルスルホニルアミド、フェニル−アミノスルホニル、尿素、ウレタン及びカルバメート連結部分が含まれる。
【００５８】
好ましい実施態様において、第四級アンモニウムカチオン性基は、フェノキシリンカーを介してポルフィリン環に結合している。
【００５９】
従って、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及び／又はＸ4は、以下：
【化４】
0005745417.tif 000005
［式中、Ｒは、上記定義されたようなＲ1−Ｎ+（Ｒ2）（Ｒ3）Ｒ4であり、そして「ｎ」は、１から３の間の整数である（そして、ここにおいて、基は左の遊離価標を介してポルフィリン環に結合している）］の式を有してもよい。
【００６０】
別の好ましい実施態様において、第四級アンモニウムカチオン性基は、フェニレンリンカーを介してポルフィリン環に結合している。
【００６１】
従って、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及び／又はＸ4は、以下：
【化５】
0005745417.tif 000006
［式中、Ｒは、上記定義されたようなＲ1−Ｎ+（Ｒ2）（Ｒ3）Ｒ4であり、そして「ｍ」は１から３の間の整数である（そして、ここにおいて、基は左の遊離価標を介してポルフィリン環に結合している）］の式を有してもよい。
【００６２】
好ましくは、「ｍ」は２であり、そして最も好ましくは１である。
【００６３】
別の好ましい実施態様において、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及び／又はＸ4は、以下：
【化６】
0005745417.tif 000007
［式中、各Ｒは、Ｒ1−Ｎ+（Ｒ2）（Ｒ3）Ｒ4であり、「ｎ」及び「ｍ」は上記定義された通りであり、そして、「ｎ＋ｍ」は１から３の間である（そして、ここにおいて、基は左の遊離価標を介してポルフィリン環に結合している）］の式を有してもよい。
【００６４】
都合よくは、Ｌは、ポルフィリン大員環が結合しているベンゼン環の位置に対してパラ位で一置換されたベンゼン環（例えばフェノキシ、フェニレン、フェニルスルホニルアミド又はフェニルアミノ−スルホニル）を含む。別法として、Ｌは、ポルフィリン大員環が結合しているベンゼン環の位置に対してメタ位又はオルト位で一置換又は二置換されていてもよい。また、Ｌは、パラ及びオルトのいずれで置換されてもよい。
【００６５】
別の好ましい実施態様において、第四級アンモニウムカチオン性基は、ポルフィリン環に直接結合しており、すなわち、Ｌは存在しない。
【００６６】
本発明の第１及び第２の態様の好ましい実施態様において、化合物は、ポルフィリン環の相対する側において、すなわち環位置５と１５又は環位置１０と２０で上記定義されたような２つのカチオン性基を含む。例えば、Ｘ1及びＸ3は、水素原子、親油性部分、フェニル基、低級アルキル、アルカリール又はアラルキル基でもよく、そしてＸ2及びＸ4は、カチオン性基でもよく、又はその逆も同じである。好ましくは、Ｘ1及びＸ3は、いずれも水素原子であり、そしてＸ2及びＸ4は、いずれもカチオン性基であり、又はその逆も同じである。
【００６７】
別法として、化合物は、ポルフィリン環の隣接した位置において、すなわち環位置５と１０、又は環位置１０と１５、又は環位置１５と２０又は環位置２０と５で上記定義されたような２つのカチオン性基を含んでもよい。例えば、Ｘ1及びＸ2は、水素でもよく、そしてＸ3及びＸ4は、カチオン性基でもよく、又はＸ2及びＸ3は、水素でもよく、そしてＸ4及びＸ1はカチオン性基などでもよい。
【００６８】
Ｚが窒素を表すとき、さらなる異性構造の可能性が生じることは当業者によって理解される。このような可能性は、本発明の範囲内に含まれる。
【００６９】
本発明の第１及び第２の態様のさらなる好ましい実施態様において、化合物は、その構成要素ピロール環の１つ又はそれ以上において置換される。従って、Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3及び
Ｙ4は、存在しないか又は独立してアリール、低級アルキル、低級アルケニル又は低級アルキニルを表してもよく、そのうちの最後の３つは、低級アルキル、低級アルキレン（場合により、酸素で中断される）、アリール、ＯＲ5、Ｃ（Ｏ）Ｒ6、Ｃ（Ｏ）ＯＲ7、Ｃ（Ｏ）ＮＲ8Ｒ9、ＮＲ10Ｒ11及びＮ+Ｒ12Ｒ13Ｒ14から選ばれる１つ又はそれ以上の置換基によって場合により置換されている。Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3及び／又はＹ4が飽和又は芳香族でありうる環式基を含んでもよいことは、当業者によって理解される。例えば、１つ又はそれ以上のピロール環は、置換されてイソインドール基を形成してもよく、すなわちＹ1、Ｙ2、Ｙ3及び／又はＹ4は、それらが結合しているピロール環と一緒になって環式であってもよい。
【００７０】
本発明の第１及び第２の態様の別の好ましい実施態様において、Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3及びＹ4は、存在しない。従って、ポルフィリン環は、位置５、１０、１５又は２０の１つ又はそれ以上でのみ置換されることが好ましい。
【００７１】
本発明の第１及び第２の態様のさらなる好ましい実施態様において、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4の少なくとも１つは、親油性部分であるか又はそれを含む。
【００７２】
「親油性部分」としては、生理学的ｐＨ及び２５℃で１．０を超えるｌｏｇＰとして表わされる、１−ｎ−オクタノールと水との間の分配係数を有する部分が含まれる。
【００７３】
都合よくは、親油性部分は、式−（ＣＨ2）pＣＨ3の飽和直鎖アルキル基、又は式−（ＣＨ2）p−の同等のアルキレン基−であり、ここにおいて、「ｐ」は１から２２の間、例えば１から１８の間の整数である。好ましくは、「ｐ」は１から１８の間、より好ましくは２から１６の間、４から１６の間、６から１８の間、８から１６の間又は４から１２の間である。最も好ましくは、「ｐ」は１０から１２の間である。
【００７４】
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及び／又はＸ4は、親油性部分も含む、上記定義されたようなカチオン性基でもよいことは、明らかである。
【００７５】
本発明の第１及び第２の態様の別の好ましい実施態様において、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4のいずれもが親油性部分でない。
【００７６】
都合よくは、本発明の第１及び第２の態様に用いられる化合物は、水に可溶性である。好ましくは、化合物は、少なくとも５μｇ／ｌ、例えば少なくとも１０μｇ／ｌ、１５μｇ／ｌ、又は２０μｇ／ｌの濃度まで水に溶解することができる。より好ましくは、化合物は、少なくとも１００μｇ／ｌ、例えば２００μｇ／ｌ、３００μｇ／ｌ、４００μｇ／ｌ、５００μｇ／ｌ、１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ又は１００ｍｇ／ｍｌの濃度まで水に溶解することができる。
【００７７】
都合よくは、本発明の第１及び第２の態様に用いられる化合物は、微生物因子に対して選択的毒性を示す。「選択的」とは、化合物が、哺乳動物、例えばヒト、宿主細胞と比較して１つ又はそれ以上の微生物（例えば細菌、マイコプラズマ、酵母、真菌及び／又はウイルス）に対して優先的に毒性であることを意味する。好ましくは、標的微生物に対する化合物の毒性は、哺乳動物細胞に対するその化合物の毒性よりも少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍又は少なくとも２０倍大きい。最も好ましくは、本発明の化合物は、哺乳動物細胞に対して実質的に非毒性である。
【００７８】
このように、化合物を細菌感染の治療に用いるとき、例えば、投与計画は、健康な宿主組織に対して最小限の損傷で細菌細胞が破壊されるように選ぶことができる。従って、本発明の第１及び第２の態様に使用するための化合物は、「治療域」を示すことが好ましい。
【００７９】
好ましい実施態様において、化合物は、低用量で標的微生物（例えば細菌細胞）に対して毒性である。好ましくは、化合物は、１０μＭ未満、例えば１μＭ、０．１μＭ未満、０．０１μＭ未満、０．００５μＭ未満又は０．００１μＭ未満の濃度で標的微生物に対して毒性である（実施例Ｂ参照）。
【００８０】
本発明の第１及び第２の態様に使用するための好ましい化合物としては、以下が含まれる：
【００８１】
（ａ）５,１５−ビス（４−｛３−［（３−ジメチルアミノプロピル）−ジメチル−アンモニオ］−プロピルオキシ｝−フェニル）−ポルフィリン（「化合物８」）
【化７】
0005745417.tif 000008
好ましくは、この化合物は、二塩化物又は四塩化物塩として得られる。
【００８２】
（ｂ）５,１５−ビス−［４−（３−トリエチルアンモニオ−プロピルオキシ）−フェニル］−ポルフィリン（「化合物９」）；
【化８】
0005745417.tif 000009
好ましくは、この化合物は、二塩化物塩として得られる。
【００８３】
（ｃ）５,１５−ビス−［３−（３−トリメチルアンモニオ−プロピルオキシ）−フェニル］−ポルフィリン
【化９】
0005745417.tif 000010
（また、本明細書においては「化合物１２」又は「ＸＦ−７０」と称する）；
好ましくは、この化合物は、二塩化物塩として得られる。
【００８４】
（ｄ）５,１５−ビス−［４−（３−トリメチルアンモニオ−プロピルオキシ）−フェニル］−ポルフィリン
【化１０】
0005745417.tif 000011
（また、本明細書においては「化合物１０」又は「ＸＦ−７３」と称する）；
好ましくは、この化合物は、二塩化物塩として得られる。
【００８５】
（ｅ）５−［３,５−ビス−（３−トリメチルアンモニオ−プロピルオキシ）−フェニル］−１５−ウンデシル−ポルフィリン（「化合物６」）；
【化１１】
0005745417.tif 000012
好ましくは、この化合物は、二塩化物塩として得られる。
【００８６】
（ｆ）５−｛４−［３−ジメチル−（３−ジメチルアミノプロピル）−アンモニオ−プロピルオキシ］フェニル｝−１５−（４−ドデシルオキシフェニル）−ポルフィリン（「化合物２３」）；
【化１２】
0005745417.tif 000013
好ましくは、この化合物は、塩化物又は二塩化物塩として得られる。
【００８７】
（ｇ）３−［（｛３−［（３−｛４−［１５−（４−ドデシルオキシ−フェニル）−ポルフィリン−５−イル］−フェノキシ｝−プロピル）−ジメチルアンモニオ］−プロピル｝−ジメチルアンモニオ）−プロピル］−トリメチル−アンモニウム（「化合物２５」）；
【化１３】
0005745417.tif 000014
好ましくは、この化合物は、三塩化塩として得られる。
【００８８】
（ｈ）５,１５−ビス−［３−（３−トリメチルアンモニオ−プロピルオキシ）−フェニル］−１０−ウンデシル−ポルフィリン（「化合物２８」）；
【化１４】
0005745417.tif 000015
好ましくは、この化合物は、二塩化物塩として得られる。
【００８９】
（ｉ）５−｛４−［３−ジメチル−（３−トリメチルアンモニオ−プロピル）−アンモニオ−プロピルオキシ］−フェニル｝−１５−（４−ドデシルオキシ−フェニル）−ポルフィリン（「化合物３１」）；及び
【化１５】
0005745417.tif 000016
好ましくは、この化合物は、二塩化物塩として得られる。
【００９０】
（ｊ）５−［４−（３−ジメチルデシルアンモニオプロピルオキシ）−フェニル］−１５−｛４−［３−ジメチル−（３−ジメチルアミノプロピル）−アンモニオプロピルオキシ］−フェニル｝−ポルフィリン（「化合物３２」）
【化１６】
0005745417.tif 000017
好ましくは、この化合物は、二塩化物塩として得られる。
【００９１】
特に好ましい実施態様において、化合物は、上記の化合物１０又は化合物１２の二塩化物塩である。
【００９２】
上記の化合物が別法としてメタル化された形態であってもよく、すなわち、それらはポルフィリン環内にキレート化された金属元素又はメタロイド元素を含んでもよいことは理解される。
【００９３】
好ましいキレート化された金属元素としては、Ｃｕ（ＩＩ）及びＦｅ（ＩＩＩ）が含まれる。
【００９４】
特に好ましい実施態様において、化合物は、Ｆｅ（ＩＩＩ）−化合物１０の二塩化物塩である。
【００９５】
本発明の第１又は第２の態様に従って製造された化合物は、使用する化合物の有効性／毒性及びそれを用いる目的に応じて種々の濃度で処方することができる。好ましくは、化合物は０．１μＭから１ｍＭの間、より好ましくは１μＭから１００μＭの間、５μＭから５０μＭの間、１０μＭから５０μＭの間、２０μＭから４０μＭの間、そして最も好ましくは３０μＭの濃度で処方される。インビトロ適用では、製剤は、例えば０．００２５μＭから１μＭの間のより低い濃度の化合物を含んでもよい。
【００９６】
薬剤中に用いる際、化合物は、一般に、意図する投与経路及び標準薬務に関して選ばれた適切な薬学的賦形剤、希釈剤又は担体との混合物で投与されることは、当業者によって理解される（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995,  Alfonso Gennaro編, Mack Publishing Company, Pennsylvania, 米国参照）。適切な投与経路は、以下に議論した通りであり、そして局所、静脈内、経口、経肺、鼻内、耳内、眼内、膀胱及びＣＮＳ送達が含まれる。
【００９７】
例えば皮膚又は創傷部位に局所適用するには、例えば、化合物を、ローション剤、液剤、乳剤、ゲ剤ル、軟膏剤又は散粉剤の形態で投与することができる（例えば、Remington, 前出, 第1586頁〜第1597頁参照）。従って、化合物は、例えば、以下：鉱物油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ロウ及び水の１つ又はそれ以上との混合物中に懸濁又は溶解された活性化合物を含む適切な軟膏剤として処方することができる。別法として、化合物は、例えば、以下：鉱物油、ソルビタンモノステアレート、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルロウ、ｅ−ラウリルサルフェート、アルコール（例えばエタノール、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール）及び水の１つ又はそれ以上の混合物中に懸濁又は溶解された適切なローション剤又は乳剤として処方することができる。
【００９８】
好ましい実施態様において、薬剤（例えばローション剤、液剤、乳剤、ゲル剤又は軟膏剤）は、水をベースとする。
【００９９】
さらに、口中の局所投与に適した製剤としては、風味をつけたベース、通常スクロース及びアカシア又はトラガカント中に活性成分を含むロゼンジ（lozenges）；ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシアのような不活性ベース中に活性成分を含むパステル（pastilles）；並びに適切な液体担体中に活性成分を含む口内洗浄剤が含まれる。
【０１００】
また、本発明の第１の又は第２の態様に使用するための薬剤は、鼻腔内に又は吸入によって投与することができ、そして乾燥粉末吸入器の形態で、又は適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルカン、例えば１,１,１,２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ １３４Ａ3又は１,１,１,２,３,３,３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ ２２７ＥＡ3）、二酸化炭素又は他の適切なガスを用いて加圧容器、ポンプ、スプレー若しくはネブライザーからのエアゾールスプレーの体裁で送達するのが好都合である。加圧エアゾール剤の場合、用量単位は、計量された量を送達するためのバルブを設けることによって測定することができる。加圧容器、ポンプ、スプレー又はネブライザーは、例えば溶媒としてエタノール及び噴射剤の混合物を用いて、活性化合物の溶液又は懸濁液を含んでもよく、これは滑沢剤、例えばトリオレイン酸ソルビタンをさらに含んでもよい。吸入器又は注入器に使用するためのカプセル及びカートリッジ（例えば、ゼラチンから作られる）は、本発明の化合物及びラクトース又はデンプンのような適切な粉末基剤の混合粉体を含んで処方することができる。
【０１０１】
エアゾール剤又は乾燥粉末製剤は、それぞれの計量された用量又は「パフ」が、患者に送達する化合物少なくとも１ｍｇを含むように準備することが好ましい。エアゾール剤による全用量は、患者ごとに、そして適応症ごとに変化し、そして一回量で又はより一般には一日を通して分割された用量で投与することができることは理解される。
【０１０２】
また、別法として、当分野で知られている他の慣用の投与経路を使用することもできる；例えば、本発明の第１又は第２の態様に使用するための薬剤は、即時、遅延又は制御放出適用のため、矯味矯臭剤又は着色剤を含みうる錠剤、カプセル剤、腔坐剤、エリキシル剤、液剤又は懸濁剤の形態で経口的に、口腔に又は舌下的に送達することができる。また、薬剤は、眼内に（下記参照）、耳内に、又は海綿体内注射により投与することができる。
【０１０３】
また、薬剤は、非経口的に、例えば、静脈内、動脈内、腹膜内、クモ膜下腔内、脳室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内若しくは皮下に投与することもでき（細針のアレイ（array）によるか又は無針Powderject(R)技術の使用を含む）、又は注入技術によって投与することもできる。薬剤は、他の物質、例えば、溶液を血液と等張性にするのに十分な塩又はグルコースを含んでもよい無菌水溶液の形態で使用するのが最良である。水溶液は、必要に応じて適切に（好ましくは３から９までのｐＨに）緩衝化しなければならない。無菌条件下での適切な非経口製剤の製造は、当業者によく知られた標準調剤技術によって容易に実施される。
【０１０４】
非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び製剤を対象となるレシピエントの血液と等張性にする溶質を含んでもよい水性及び非水性の無菌注射液；並びに懸濁化剤及び増粘剤を含んでもよい水性及び非水性の無菌懸濁液が含まれる。製剤は、単位用量又は複数回用量容器、例えば密封アンプル及びバイアル中に存在してもよく、そして使用直前に無菌液体担体、例えば注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件で貯蔵してもよい。即時注射液（extemporaneous injection solutions）及び懸濁液は、前記種類の無菌粉末、顆粒剤及び錠剤から製造することができる。
【０１０５】
薬剤は、特に眼の疾患を治療するためには眼内経路によって投与することができる。眼科的使用では、化合物を場合によりベンジルアルコニウムクロリドのような保存剤と組み合わせて、等張性のｐＨ調整された無菌生理食塩水中の微粉懸濁液として又は、好ましくは、等張性のｐＨ調整された無菌生理食塩水中の溶液として処方することができる。別法として、ワセリンのような軟膏中に処方してもよい。
【０１０６】
獣医学的使用では、通常の獣医学的診療に従って適切に許容しうる製剤として化合物を投与し、そして獣医は、特定の動物にとって最適となる投与計画及び投与経路を決定する。
【０１０７】
薬剤は、当分野で知られているあらゆる適切な容器又は器中に貯蔵することができる。容器又は器は気密性であり及び／又は滅菌されていることが好ましいことは、当業者によって理解される。都合よくは、容器又は器は、ポリエチレンのようなプラスチック材料でできている。
【０１０８】
本発明の第１又は第２の態様に使用するための化合物は、細菌、古細菌、原生動物、真菌及び藻類を含む多くのタイプのバイオフィルム形成微生物を死滅するために使用することができることが理解される。このような微生物は、一つ又はそれ以上の従来の抗生物質、例えばメチシリン（例えばＭＲＳＡ）耐性であってもよい。
【０１０９】
一実施態様において、微生物は、静止期（static phase）又は緩慢増殖期（slow-growing phase）にある。
【０１１０】
さらに、化合物は、このような微生物による感染症を予防及び／又は治療するために使用することができる、すなわち、化合物は予防的な及び／又は治療的処置に適していることは当業者によって理解される。例えば、化合物は、他の対象、例えば患者、医療従事者などへの病原体の伝播又は移動を予防又は軽減するために使用することができる。
【０１１１】
本発明の第１及び第２の態様の一実施態様において、微生物は細菌である。
【０１１２】
細菌は、グラム陽性菌（Gram positive bacteria）、例えばブドウ球菌（Staphylococci）又は連鎖球菌（Streptococci）からなる群より選ばれるものであってもよい。
【０１１３】
例えば、細菌は、ブドウ球菌、例えば黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（例えばメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus）、ＭＲＳＡ）であってもよい。
【０１１４】
別法として、細菌は、連鎖球菌、例えばストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）及び／又はストレプトコッカス・サングイス（Streptococcus sanguis）であってもよい。
【０１１５】
細菌は、グラム陰性菌（Gram negative bacteria）、例えばレジオネラ（Legionella）であってもよい。
【０１１６】
本発明の第１及び第２の態様の別の実施態様において、微生物は、真菌（例えばカンジダ種（Candida spp））である。
【０１１７】
本発明の第１及び第２の態様のさらなる実施態様において、微生物は、古細菌である。
【０１１８】
本発明の第１及び第２の態様のなおさらなる実施態様において、微生物は、原生動物である。
【０１１９】
本発明の第１及び第２の態様のなおさらなる実施態様において、微生物は、藻類である。
【０１２０】
本発明の第１又は第２の態様に使用するための化合物の投与量は、使用する特定の化合物、製剤、投与経路及び化合物が使用される適応症を含むいくつかの要因に左右される。しかしながら、典型的に、投与量は、体重キログラム当たり０．０１〜２０ｍｇの化合物、好ましくは０．１〜１５ｍｇ／ｋｇ、例えば１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
【０１２１】
このようなバイオフィルムが見出されうるあらゆる環境において本明細書に記載された化合物が、微生物バイオフィルムの成長を死滅、抑制又は予防するために使用することができることは、当業者によって理解される。従って、バイオフィルムは、不活性支持体又は生きている支持体のいずれに関連していてもよい。
【０１２２】
一実施態様において、バイオフィルムは、生きている支持体に関連している。例えば、バイオフィルムは、ヒト又は動物の体内の表面上で成長しうるか又は成長しやすい。
【０１２３】
従って、本発明は、バイオフィルムの存在又は成長と関連する状態を治療又は予防に使用するための上記定義されたような化合物を提供する。例えば、本明細書に記載された化合物は、体内に設置された以下の一つにおける微生物バイオフィルムの成長に関連する障害又は状態を治療又は予防するために使用することができる：
（ａ）歯及び歯肉の表面を含む口腔（例えば、歯垢、歯肉炎、歯内感染症、口腔カンジダ症、口腔アスペルギルス症、歯周炎）。
しかし、一実施態様において、化合物は、歯周炎又は他の歯科感染症の治癒的及び／又は予防的処置には使用されない。
（ｂ）尿路（例えば、膀胱炎）。
（ｃ）洞（例えば、慢性静脈洞炎）。
（ｄ）耳（例えば、中耳感染症）。
しかし、一実施態様において、化合物は、耳炎の治癒的及び／又は予防的処置には使用されない。
（ｅ）心臓（例えば、心内膜炎）。
（ｆ）前立腺（例えば、慢性細菌性前立腺炎）。
（ｇ）骨（例えば、骨髄炎）
しかし、化合物は、骨髄炎の治癒的及び／又は予防的処置には使用されない。
（ｈ）肺（例えば、肺炎のような嚢胞性線維症における感染症）
しかし、一実施態様において、化合物は、嚢胞性線維症患者におけるシュードモナス感染症の治癒的及び／又は予防的処置には使用されない。
（ｉ）腎臓（例えば、感染性腎臓結石及び腹膜透析において）。
（ｊ）皮膚。
しかし、一実施態様において、化合物は、アトピー性皮膚炎の治癒的及び／又は予防的処置には使用されない。
【０１２４】
さらなる実施態様において、バイオフィルムは、不活性支持体に関連している。従って、バイオフィルムは、ヒト又は動物の体内に植込まれた又は別な方法で挿入された機器の表面上で成長しうるか又は成長しやすい。
【０１２５】
例えば、本明細書に記載された化合物は、体内の以下の不活性表面の１つにおける微生物バイオフィルムの成長に関連する感染症を治療又は予防するために使用することができる：
（ａ）カテーテル（例えば、血管内又は尿路使用のため）。
（ｂ）ステント（例えば、冠状動脈ステント）。
（ｃ）シャント（例えば、脳脊髄シャント）。
（ｄ）挿管又は気管切開チューブ。
（ｅ）眼科用デバイス（例えば、コンタクトレンズ、強膜バックル及び眼内レンズ）。
（ｆ）関節補綴（すなわち関節形成及び他の整形外科用機器の移植）。
（ｇ）人工心臓弁。
（ｈ）乳房インプラント。
【０１２６】
従って、本明細書に記載された化合物は、院内感染症の治療及び予防に特に適していることが理解される。
【０１２７】
好ましい実施態様において、本発明の第１又は第２の態様に使用するための化合物は、慣用の抗菌剤と組み合わせて使用される。例えば、化合物は、以下の従来の抗生物質の１つ又はそれ以上と組み合わせて使用することができる：抗菌剤、例えば天然及び合成ペニシリン及びセファロスポリン、スルホンアミド、エリスロマイシン、カノマイシン（kanomycin）、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、リファンピシン、さらにゲンタマイシン、アンピシリン、ベンジルペニシリン、ベネタミンペニシリン、ベンザチンペニシリン、フェネチシリン、フェノキシメチルペニシリン、プロカインペニシリン、クロキサシリン、フルクロキサシリン、メチシリンナトリウム、アモキシシリン、塩酸バカンピシリン、シクラシリン、メズロシリン、ピバンピシリン、塩酸タランピシリン、カルフェシリンナトリウム、ピペラシリン、チカルシリン、メシリナム、ピルメシリナン（pirmecillinan）、セファクロル、セファドロキシル、セフォタキシム、セフォキシチン、セフスロジンナトリウム、セフタジジム、セフチゾキシム、セフロキシム、セファレキシン、セファロチン、セファマンドール、セファゾリン、セフラジン、ラタモキセフ二ナトリウム、アズトレオナム、塩酸クロルテトラサイクリン、クロモサイクリンナトリウム、塩酸塩デメクロシジン（demeclocydine hydrochloride）、ドキシサイクリン、リメサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、アミカシン、硫酸フラミセチン、硫酸ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、コリスチン、フシジン酸ナトリウム、硫酸ポリミキシンＢ、スペクチノマイシン、バンコマイシン、カルシウムスルファロキサート（calcium sulphaloxate）、スルファメトピラジン、スルファジアジン、スルファジミジン、スルファグアニジン、スルファ尿素（sulphaurea）、カプレオマイシン、メトロニダゾール、チニダゾール、シノキサシン、シプロフロキサシン、ニトロフラントイン、ヘキサミン、ストレプトマイシン、カルベニシリン、コリスチメタート、ポリミキシンＢ、フラゾリドン、ナリジクス酸、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、クリンダマイシン、リンコマイシン、サイクロセリン、イソニアジド、エタンブトール、エチオナミド、ピラジナミド及び同様のもの；抗真菌剤、例えばミコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール、フルコナゾール、アンホテリシン、フルシトシン、グリセオフルビン、ナタマイシン、ナイスタチン、及び同様のもの；並びに抗ウイルス剤、例えばアシクロビル、AZT、ｄｄＩ、塩酸アマンタジン、イノシンプラノベクス、ビダラビン、及び同様のものを含む。
【０１２８】
さらなる好ましい実施態様において、薬剤は、浸透促進剤（penetration enhancing agents）、例えばポリ−（エチレンイミン）、又はこのような浸透促進力を示す抗生物質製剤（antibiotic agents）（例えばポリミキシン又はコリスチン）を含む及び／又はそれらと共に併用投与される。
【０１２９】
また、本発明の第１及び第２の態様に使用するための化合物は、インビトロで微生物バイオフィルムの成長を死滅、抑制又は予防するために使用することができる。また、例えば、化合物は、家庭環境（例えば台所作業面、シャワー、管、床、など）又は商業的若しくは工業的環境（例えば冷却系、管、床表面、などの中）環境におけるような表面又は基体（substrate）上の微生物バイオフィルムの成長を予防するために滅菌溶液又は洗浄液の形態で使用することができる。
【０１３０】
好ましくは、このような薬剤は、１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で溶液中に抗菌性化合物を含む。
【０１３１】
好ましくは、溶液は、表面活性剤又は界面活性剤を更に含む。適切な界面活性剤としては、アニオン性界面活性剤（例えば脂肪族スルホナート）、両性及び／又は双極性界面活性剤（例えば、脂肪族第四級アンモニウム、ホスホニウム及びスルホニウム化合物の誘導体）並びに非イオン性界面活性剤（例えばアルキレンオキシド入りの脂肪族アルコール、酸、アミド又はアルキルフェノール）が含まれる。
【０１３２】
都合よくは、表面活性剤は、０．５〜５質量パーセントの濃度で存在する。
【０１３３】
インビトロ及びインビボ使用の両方において、本発明の第１及び第２の態様に使用するための化合物は、少なくとも５分間標的表面に曝露することが好ましい。例えば、曝露時間は、少なくとも１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、１時間、２時間、３時間、５時間、１２時間及び２４時間であってもよい。
【０１３４】
本発明の第３の態様は、緩慢増殖期（slow-growing phase）で細菌の増殖を死滅、抑制又は予防するための本明細書に記載された化合物の使用を提供する。
【０１３５】
本発明の第４の態様は、静止期（static phase）で細菌の増殖を死滅、抑制又は予防するための本明細書に記載された化合物の使用を提供する。
【０１３６】
従って、本発明は、緩慢増殖期又は静止期で細菌の存在又は増殖に関連する状態の治療又は予防に使用するための上記定義されたような化合物を提供する。
【０１３７】
添付の実施例に示したように、本発明の化合物は、緩慢増殖期又は静止期で細菌の増殖を死滅、抑制又は予防するために使用することができる。
【０１３８】
ある種の条件（例えば環境及び／又は生理学的条件）下で、細菌が緩慢増殖期（ここでは、細菌の増殖速度が低下する）及び／又は静止期（ここでは、細菌の増殖を検出することができない）に入ることがあることは、当業者によって理解される。「増殖」とは、細菌細胞（又はこのような細胞集団）の複製及び／又は再生及び／又は分裂、並びにまた細菌細胞（又はこのような細胞集団）内の細胞成分及び／又は化学物質の再生及び／又は複製を含む。
【０１３９】
細菌の属、種、タイプ及び系統が異なれば増殖速度が異なることがあるように増殖速度が細菌の間で変化することはよく知られている。また、増殖速度は、興味の細菌がさらされる特定の環境条件によって決まり、そして周囲の培地中の栄養分の含量及び組成、並びに温度、通気、撹拌、光及びｐＨといったような他の要因に応じて変化する。
【０１４０】
細菌にとっての最適な増殖速度は、標準条件（すなわち所定の培地並びに温度、通気、撹拌、光及びｐＨ）下で指数増殖期の間に増殖速度を測定することによってインビトロで（例えば実験室の試験管又はフラスコ培養において）測定することができる。
【０１４１】
細菌細胞が分裂して個体群のサイズが２倍になるのに必要な時間（「世代時間」）は、細菌に応じて約１２分から２４時間まで又はそれ以上で変化する。細菌の世代時間の算出方法は、当分野でよく知られている（例えば、Brock et al., Biology of Microorganisms, 6th Ed, 1991, Prentice Hall, and http://www.textbookofbacteriology.net/growth.html参照）。
【０１４２】
実験室における大腸菌（E. coli）の世代時間は、１５〜２０分であるが、腸管中では１２〜２４時間と推定される。培養することができるほとんどの知られている細菌について、世代時間は、約１５分から１時間までの範囲である（しかし、根粒菌（Rhizobium）のような共生生物及び硝化菌のような無機栄養生物は、より長い世代時間を有する傾向がある）。ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）及び梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）のような病原体であるいくつかの細菌は、特に長い世代時間を有する。いくつかの細菌についての世代時間を次頁に示す：
【０１４３】
【表１】
0005745417.tif 000018
【０１４４】
緩慢増殖期又は静止期の細菌は、インビトロでの（例えば（例えば培地、温度、通気、撹拌、光及びｐＨの標準条件下、実験室の試験管又はフラスコ培養において）その細菌の最適増殖速度と比較することによって確定できることが理解される。
【０１４５】
例えば、緩慢な増殖速度とは、その細菌の最適増殖速度の５０％未満、例えばインビトロでのその細菌の最適増殖速度の６０％又は７０％又は８０％又は９０％又は９５％未満であってもよい。
【０１４６】
好ましい実施態様において、本発明の第３又は第４の態様による細菌は、（本発明の第１の態様に関して）上に記載した通りである。好ましくは、本発明の第３又はさらなる態様による細菌は、例えば（本発明の第１の態様に関して）上に記載したような、生きている哺乳動物、例えばヒトの身体上又は体内にいる。
【０１４７】
感染症（例えば哺乳動物における感染症）は、以下からなる又は含む群から選ばれる緩慢増殖又は静止期の細菌によって生じうることは知られている：
マイコバクテリア（Laboratory diagnosis of bacterial infections；Nevoi Cimolaiによって編集され、そしてInforma Healthcareによって出版された, 2001, p384-5中）；
放線菌（Laboratory diagnosis of bacterial infections；Nevoi Cimolaiによって編集され、そしてInforma Healthcareによって出版された, 2001, p384-5中）；
黄色ブドウ球菌小型コロニー変種（small colony variants）（Vaudaux P et al. Difficult to diagnose and difficult to treat, Clinical Infectious Diseases (2006);
43: 968-70）；及び
ブルセラ菌（Guerra H. The brucellae and their success as pathogens. Crit. Rev. Microbiol. (2007); 33(4): 325-31）。
【０１４８】
従って、好ましい実施態様において、本発明の第３及び第４の態様は、緩慢増殖期又は静止期の細菌がマイコバクテリア；放線菌；黄色ブドウ球菌小型コロニー変種；ブルセラ菌からなる又はそれらを含むリストから選ばれる使用を含む。
【０１４９】
本発明の第５の態様は、微生物バイオフィルムに関連する又はそれによって引き起こされる疾患又は状態に罹患しているか又は罹患しやすい患者の治療方法であって、患者に本明細書に記載された化合物を投与することを含む方法を提供する。
【０１５０】
本発明の第６の態様は、緩慢増殖期の細菌に関連する又はそれによって引き起こされる疾患又は状態に罹患しているか又は罹患しやすい患者の治療方法であって、
患者に本明細書に記載された化合物を投与することを含む方法を提供する。
【０１５１】
上に議論したように、感染症（例えば哺乳動物における感染症）は、マイコバクテリア；放線菌；黄色ブドウ球菌小型コロニー変種；及びブルセラ菌からなる又はそれらを含む群から選ばれる緩慢増殖又は静止期の細菌によって生じうることが知られている。
【０１５２】
従って、好ましい実施態様において、本発明の第５の態様は、緩慢増殖期又は静止期の細菌がマイコバクテリア；放線菌；黄色ブドウ球菌小型コロニー変種；ブルセラ菌からなる又はそれらを含むリストから選ばれる方法を含む。
【０１５３】
本発明の第７の態様は、静止期の細菌に関連する又はそれによって引き起こされる疾患又は状態に罹患しているか又は罹患しやすい患者の治療方法であって、患者に本明細書に記載された化合物を投与することを含む方法を提供する。
【０１５４】
化合物は、光線力学療法の形で使用することができ、又は、別法として、その固有の抗菌活性を利用することができることは当業者によって理解される（国際特許出願番号：ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００５６４９［ＷＯ ２００４／０５６８２８］及びＰＣＴ／ＧＢ２００５／００２４５７［ＷＯ ２００６／０００７６５］に記載されており、これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１５５】
化合物は、当分野でよく知られている方法を用いて処方し、そして投与することができる。例えば、化合物は、経口的に、非経口的に又は局所的に投与することができる。
【０１５６】
上で議論したように、バイオフィルムは、口腔、尿路、洞、耳、心臓、前立腺、骨、肺、腎臓及び／又は皮膚中の生きている支持体上にあってもよい。
【０１５７】
別法として、バイオフィルムは、体内の不活性支持体、例えばカテーテル、ステント、シャント、挿管又は気管切開チューブ、眼科用デバイス、関節補綴、人工心臓弁及び／又は乳房インプラント上にあってもよい。
【０１５８】
本発明の第８の態様は、本明細書に記載された化合物で含浸、コーティング又は別の方法で処理された植込み型医療用デバイスを提供する。
【０１５９】
例えば、植込み型医療用デバイスは、血管内デバイス、カテーテル、シャント、挿管及び気管切開チューブ、眼科用デバイス、関節補綴、人工心臓弁並びに乳房インプラントからなる群より選ぶことができる。「植込み型デバイス」には、体の表面に取り付けられる機器、例えばコンタクトレンズが含まれる。
【０１６０】
好ましくは、植込み型医療用デバイスは、使用前に密封された無菌容器中に包装されている。
【０１６１】
さらに、本発明は、本発明の第８の態様による植込み型医療用デバイスの製造方法であって、未処理の植込み型医療用デバイス、又はその部品若しくは構成要素を本明細書に記載された化合物で処理することを含む方法を提供する。
【０１６２】
本発明のこの態様に関する「処理」とは、化合物を未処理の植込み型医療用デバイス又はその部品若しくは構成要素にコーティングする、含浸させる、共有結合させる、又は別の方法でそれと混合することを意味する。
【０１６３】
好ましくは、植込み型医療用デバイスは、化合物でコーティングされる。「コーティングされた」とは、化合物が植込み型医療用デバイスの表面に適用されたことを意味する。従って、植込み型医療用デバイスに、化合物を含む溶液を塗布又は噴霧することができる。別法として、植込み型医療用デバイスを溶液中の化合物のリザーバーに浸漬してもよい。
【０１６４】
例えば、植込み型医療用デバイスを本明細書に記載された化合物を含む溶液中に４℃で一夜、定温放置することができる。別法として、蒸着によって又は室温での定温放置によって化合物を植込み型医療用デバイス上に固定することができる。
【０１６５】
別法として、植込み型医療用デバイスを化合物で含浸させる。「含浸された」とは、構成機器中に化合物が分布するように、製造中に植込み型医療用デバイスの部品又は構成要素に化合物を組み込む又は別の方法で混合すること意味する。
【０１６６】
さて、本発明の好ましい非限定的な実施態様を、添付の図面を参照して例として説明するが、ここで：
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】皮膚の構造の概略図を示す。
【図２】化合物１０と共にインキュベートした５分、１時間及び４時間後の正常ヒト皮膚線維芽細胞の細胞毒性を示す図である。  ＮＨＤＦを、異なる濃度（０μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１．０μＭ、１０μＭ）の化合物１０と共に５分間、１時間及び４時間インキュベートした。次いで、細胞を暗所で２４時間インキュベートした。標準ＭＴＴ−アッセイによって毒性を試験した。細胞生存性（cell viablity）を１に正規化したが、これは、対照細胞の値を１に正規化したことを意味する。灰色の点線：５分間インキュベーション；黒色の点線：１時間インキュベーション；黒色の線：４時間インキュベーション；（ｎ＝３，平均±ＳＤ）。
【図３】化合物１０と共にインキュベーションした５分、１時間及び４時間後の正常ヒト表皮角化細胞の細胞毒性を示す図である。  ＮＨＥＫを、異なる濃度（０μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１．０μＭ、１０μＭ）の化合物１０と共に５分間、１時間及び４時間インキュベートした。次いで、細胞を暗所で２４時間インキュベートした。標準ＭＴＴ−アッセイによって毒性を試験した。細胞生存性を１に正規化したが、これは、対照細胞の値を１に正規化したことを意味する。赤色の点線：５分間インキュベーション；黒色の点線：１時間インキュベーション；青色の点線：４時間インキュベーションのみ；（ｎ＝３，平均±ＳＤ）。
【図４Ａ】固形物として処方された化合物１０の化学的安定性を示す図である。
【図４Ｂ】水中に処方された化合物１０の化学的安定性を示す図である。
【図４Ｃ】ＰＢＳ中に処方された化合物１０の化学的安定性を示す図である。
【図５】ＰＢＳ緩衝液中２１日後の化合物１０の安定性（ＨＰＬＣで測定）の３Ｄプロットを示す図である。
【図６Ａ】化合物１の種々の製剤の８週間にわたる安定性を示す図である。
【図６Ｂ】化合物８の種々の製剤の８週間にわたる安定性を示す図である。
【図６Ｃ】化合物１２の種々の製剤の８週間にわたる安定性を示す図である。
【図６Ｄ】化合物１０の種々の製剤の８週間にわたる安定性を示す図である。
【図７Ａ】化合物１０の種々の製剤の１７週間にわたる延長した安定性を示す図である。
【図７Ｂ】化合物８の種々の製剤の１７週間にわたる延長した安定性を示す図である。
【図８】黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００寒冷培養物（cold-cultere）に対する４×ＭＩＣでの化合物１０（「ＸＦ−７３）及び対照薬剤の効果を示す図である。
【図９】緊縮（stringent†）黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００培養物に対する４×ＭＩＣでの化合物１０（「ＸＦ−７３）及び対照薬剤の効果を示す図である。
【図１０】緊縮黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００培養物の生存率に対する化合物１２（「ＸＦ−７０）及び化合物１０（「ＸＦ−７３」）及び比較薬剤（comparator agents）（４×ＭＩＣで）の効果を示す図である。ムピロシン（５μｇ／ｍｌ）を時間−３０分で加えて緊縮応答（stringent response）を誘発し、続いて他の阻害剤及び薬物を時間０で加える。
【図１１】ミュラーヒントンブイヨン（Mueller-Hinton Broth）中４℃に保持した黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００の生存率に対する化合物１２（「ＸＦ−７０」）及び化合物１０（「ＸＦ−７３」）及び比較薬剤（４×ＭＩＣで）の効果を示す図である。
【図１２】緊縮応答を発現する黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００細胞に対する化合物１０（「ＸＦ−７３」）、化合物１２（「ＸＦ−７０」）及び多くの抗菌剤の死滅キネティクスを示す図である。示された値は、３回の独立した実験からの３つ組み（three replicates）の平均及び標準偏差である。
【図１３】寒冷培養物中の黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００細胞に対する化合物１０（「ＸＦ−７３」）、化合物１２（「ＸＦ−７０」）及び多くの抗菌剤の死滅キネティクスを示す図である。示された値は、３回の独立した実験からの３つ組みの平均及び標準偏差である。
【図１４】初期静止期（early stationary phase）における黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００細胞に対する化合物１０（「ＸＦ−７３」）、化合物１２（「ＸＦ−７０」）及び多くの抗菌剤の死滅キネティクスを示す図である。示された値は、３回の独立した実験からの３つ組みの平均及び標準偏差である。
【図１５】中期静止期（mid stationary phase）における黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００細胞に対する化合物１０（「ＸＦ−７３」）、化合物１２（「ＸＦ−７０」）及び多くの抗菌剤の死滅キネティクスを示す図である。示された値は、３回の独立した実験からの３つ組みの平均及び標準偏差である。
【図１６】後期静止期（late stationary phase）における黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００細胞に対する化合物１０（「ＸＦ−７３」）、化合物１２（「ＸＦ−７０」）及び多くの抗菌剤の死滅キネティクスを示す図である。示された値は、３回の独立した実験からの３つ組みの平均及び標準偏差である。
【実施例】
【０１６８】
実施例Ａ：
典型的な化合物の合成
物質及び方法
ＮＭＲ測定
プロトンＮＭＲスペクトルは、内部標準としてＴＭＳを用いてBruker B-ACS60 (300MHz)機器で記録した。化学シフトは、記載された溶媒中のｐｐｍ及びＨｚの結合定数で得た。ＮＭＲのいくつかの略語：一重線（ｓ）、ブロードな一重線（ｂｓ）、二重線（ｄ）、三重線（ｔ）、四重線（ｑ）、五重線（quint）、多重線（ｍ）。
【０１６９】
化学物質
すべての溶媒及び試薬は、アルドリッチ（Aldrich）、フルカ（Fluka）、メルク（Merck）及びランカスター（Lancaster）から購入し、そしてさらに精製することなく使用した。
ジピロールメタンは、C. Brucker et al., J. Porphyrins Phthalocyanines, 2 455 (1998)によって記載された通り製造した。
【０１７０】
クロマトグラフィー
カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル(Merck Silicagel 60, Fluka 60, 0.040-0.063mm) 及び Sephadex LH-20 (Pharmacia)を用いて行なった。クロマトグラフィー用のすべての溶媒(Synopharm)は、工業用純度グレードであった。
【０１７１】
略語
ＤＤＱ：２,３−ジクロロ−５,６−ジシアノ−ｐ−ベンゾキノン
ＤＭＦ：Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
【０１７２】
試験化合物の合成経路
以下の試験化合物は、ＷＯ ２００４／０５６８２８、ＷＯ ２００６／０００７６５及びＷＯ ２００７／０７４３４０に記載された通り合成した（それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれている）：
本発明の使用のための典型的な化合物
化合物６、８〜１０、１２、２３、２５、２８、３１及び３２。
参照化合物（比較対照として使用するため）
化合物１、３、１６、１９、２６、２９、３３、３６、３７、３９、４１及び４６〜５１。
化学中間体
化合物２、４、５、７、１１、１３〜１５、１７、１８、２０〜２２、２４、２７、３０、３４、３５、３８、４０及び４２〜４５。
【０１７３】
化合物６
５−［３,５−ビス−（３−トリメチルアンモニオ−プロピルオキシ）−フェニル］−１５−ウンデシル−ポルフィリン二塩化物
【化１７】
0005745417.tif 000019
ＤＭＦ（３０ｍＬ）中の化合物５（８０ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）及びＫ2ＣＯ3（２３０ｍｇ，１．７ｍｍｏｌ）の激しく撹拌した懸濁液に５０℃で（１−ブロモプロピル）−トリメチルアンモニウムブロミド（０．３ｇ，１６．６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物をこの温度で１８時間撹拌した。減圧下でＤＭＦを除去した後、得られた残留物をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、そしてスチールフリット（直径３．５ｃｍ）上に支持されたシリカゲルのパッド（深さ２ｃｍ）を通して濾過した。メタノール（約１Ｌ）でパッドを洗浄した後、粗生成物を酢酸：メタノール：水（３：２：１，体積による）で溶離した。適切な画分を集め、そして減圧下で溶媒を蒸発させた後、得られた残留物をｎ−ブタノール：水：酢酸（５：４：１，体積による，上部相（upper phase））で溶離するセファデックスＬＨ−２０カラム（２．５×４０ｃｍ）上のクロマトグラフィーによって精製した。適切な画分から減圧下で溶媒を除去した後、得られた残留物をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、そして溶液を陰イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ ４００，塩化物型）のショートカラム（３．５×２０ｃｍ）を通過させた。溶出液を集めた後、減圧下で溶媒を除去し、そして得られた残留物を高真空下で乾燥して紫色の固形物として二塩化物塩を得た。
1H-NMR: δH (300Mz, CD3OD): 0.75 (t, 3J 7.5 Hz, 3 H), 1.05-1.20 (m, 14 H), 1.45-1.50 (m, 2 H), 2.05-2.15 (m, 4 H), 2.15-2.20 (m, 2 H), 2.95 (s, 18 H), 3.35-3.45
(m, 4 H), 3.95 (t, 3J 7.5 Hz, 4 H), 4.55 (t, 3J 7.5 Hz, 2 H), 6.85 (m, 1 H), 7.35 (m, 2 H), 8.85-8.90, 9.15-9.20, (3 x m, 8 H), 10.10 (s, 2 H).
【０１７４】
化合物８
５,１５−ビス−（４−｛３−［（３−ジメチルアミノプロピル）−ジメチルアンモニオ］−プロピルオキシ｝−フェニル）−ポルフィリン二塩化物
【化１８】
0005745417.tif 000020
化合物７（２００ｍｇ，０．２７ｍｍｏｌ）をＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチル−１、３−プロパンジアミン（５ｍＬ，１３．９ｍｍｏｌ）と共に無水ＤＭＦ（４０ｍＬ）に溶解し、そして溶液をアルゴン下、５０℃で一夜撹拌した。減圧下で溶媒を蒸発させた後、得られた残留物をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、そして溶液をスチールフリット（直径３．５ｃｍ）上に支持されたシリカゲルのパッド（深さ２ｃｍ）を通して濾過した。パッドをメタノール（約１Ｌ）、続いて酢酸：メタノール：水（３：２：１，体積による）で溶離した。適切な画分から溶媒を蒸発させた後、得られた粗生成物をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、そして展開相（developing phase）としてｎ−ブタノール：水：酢酸（４：５：１，体積による，上部相）を用いてセファデックスＬＨ−２０のカラム（２．５×４０ｃｍ）上のクロマトグラフィーによってさらに精製した。溶離した最初の画分が所望の生成物である。減圧下で溶媒を除去した後、得られた残留物をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、そして陰イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ ４００，塩化物型）のショートカラム（３．５×２０ｃｍ）を通過させた。溶出液から減圧下で溶媒を除去した後、残留物をジエチルエーテルで処理し、そして高真空下で乾燥して紫色の固形物として生成物を得た。
1H-NMR: δH (300MHz, CD3OD): 2.20-2.35 (m, 4 H), 2.40-2.50 (m, 4 H), 2.80 (s, 12
H), 3.05 (4 H, t, 3J 7.8, 2 H), 3.25 (s, 12 H), 3.45-3.55 (bs, 4 H), 3.65-3.75 (m, 4 H), 4.30 (t, 3J 4.2 Hz, 4 H), 7.40, 8,10 (2 x d, 3J 7.5 Hz, 2 x 4 H), 8.95, 9.45 (2x d, 3J 4.2 Hz , 8 H), 10.40 (s, 2 H).
【０１７５】
化合物９
５,１５−ビス−［４−（３−トリエチルアンモニオ−プロピルオキシ）−フェニル］−ポルフィリン二塩化物
【化１９】
0005745417.tif 000021
無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の化合物７（５０ｍｇ，０．０６８ｍｍｏｌ）の溶液にトリエチルアミン（４．７ｍＬ，０．０３４ｍｏｌ，５００当量）を加えた。混合物を６０℃で２４時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、そして得られた残留物をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、そしてスチールフリット（直径３．５ｃｍ）上に支持されたシリカゲルパッド（深さ２ｃｍ）を通して濾過した。メタノール（約１Ｌ）で洗浄した後、パッドを酢酸：メタノール：水（３：２：１，体積による）で溶離した。溶離した画分から溶媒を蒸発させた後、得られた粗生成物をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、そしてｎ−ブタノール：水：酢酸（４：５：１，体積による，上部相）で溶離するセファデックスＬＨ−２０カラム（２．５×４０ｃｍ）上のクロマトグラフィーによって精製した。減圧下で適切な画分から溶媒を除去し、得られた残留物をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、そして溶液を陰イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ ４００，塩化物型）のショートカラム（３．５×２０ｃｍ）に通過させて、溶媒を蒸発させた後、紫色の固形物として生成物を得た。
1H-NMR: δH (300Mz, CD3OD): 1.25 (m, 18H), 2.13 (m, 4H),
-CH2NCH2 (16H)のシグナルは、溶媒シグナルがカバーする多重線の一部として領域3.00-3.40にある、4.15 (t, 4H, 3J = 7.5 Hz), 7.36 (d, 4H, 3J = 7.5 Hz ), 8.15 (d, 4H, 3J = 7.5 Hz), 9.05 (d, 4H, 3J = 7.5 Hz), 9.54 (d, 4H, 3J = 7.5 Hz), 10.45 (s, 2H)
【０１７６】
化合物１０
５,１５−ビス−［４−（３−トリメチルアンモニオ−プロピルオキシ）−フェニル］−ポルフィリン二塩化物
【化２０】
0005745417.tif 000022
無水ＤＭＦ（５０ｍＬ）中の化合物７（３００ｍｇ，０．４１ｍｍｏｌ）の溶液を１００ｍＬオートクレーブに移した。トリメチルアミン（４．５ｇ）を加えた後、混合物を５０℃で１６時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後、得られた残留物をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、そして溶液をスチールフリット（直径３．５ｃｍ）上に支持されたシリカゲルのパッド（深さ２ｃｍ）を通して濾過した。メタノール（約１Ｌ）で洗浄した後、パッドを酢酸：メタノール：水（３：２：１，体積による）で溶離した。適切な画分から溶媒を蒸発させた後、得られた残留物をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、そしてｎ−ブタノール：水：酢酸（４：５：１，体積による，上部相）で溶離するセファデックスＬＨ−２０カラム（２．５×４０ｃｍ）上のクロマトグラフィーによって精製した。２つの画分を得、そのうちの最初に溶離したのが、所望の生成物である。溶媒を減圧下で除去し、そして得られた残留物をメタノール（５ｍＬ）に再溶解し、そして溶液を陰イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ ４００，塩化物型）のショートカラム（３．５×２０ｃｍ）を通過させた。減圧下で溶媒を蒸発させた後、残留物をメタノール：ジエチルエーテルで処理し、そして高真空下で乾燥して紫色の固形物として生成物を得た。
1H-NMR: δH (300Mz, CD3OD): 2.40-2.60 (m, 4 H), 3.30-3.25 (bs, 18 H), 3.75-3.80 (m, 4 H), 4.40(t, 3J 7.5 Hz, 4 H), 7.40, 8.20 (2 x d, 3J 8.5 Hz, 8 H), 9.05, 9.50 (2 x d, 3J 4.5 Hz, 8 H), 10.45 (s, 2 H).
【０１７７】
化合物１０の代りの合成経路
化合物４２（１００ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ；下記参照）を溶解し、そして炭酸カリウム（２３０ｍｇ，１．７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３０ｍＬ）中に懸濁し、そして激しく撹拌した混合物に、５０℃で３０分の間にＤＭＦ（５ｍＬ）中の（１−ブロモプロピル）−トリメチルアンモニウムブロミド（３５０ｍｇ，１．３ｍｍｏｌ）の溶液を滴加した。混合物を１５時間加熱した。回転蒸発によってＤＭＦを除去し、そして得られた残留物をメタノールに溶解し、そして溶液をスチールフリット（直径３．５ｃｍ）上に支持されたシリカゲルのパッド（深さ２ｃｍ）を通して濾過した。メタノール（約１Ｌ）で洗浄した後、パッドを酢酸：メタノール：水（３：２：１，体積による）で溶離した。適切な画分から溶媒を蒸発させた後、得られた残留物をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、そしてｎ−ブタノール：水：酢酸（４：５：１，体積による，上部相）で溶離するセファデックスＬＨ−２０カラム（２．５×４０ｃｍ）上のクロマトグラフィーによって精製した。２つの画分を得、そのうちの最初に溶離したのが所望の生成物である。溶媒を減圧下で除去し、そして得られた残留物をメタノール（５ｍＬ）に再溶解し、そして溶液を陰イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ ４００，塩化物型）のショートカラム（３．５×２０ｃｍ）を通過させた。減圧下で溶媒を蒸発させた後、残留物をメタノール：ジエチルエーテルで処理し、そして高真空下で乾燥して紫色の固形物として生成物を得た。
【０１７８】
化合物１２
５,１５−ビス−［３−（３−トリメチルアンモニオ−プロピルオキシ）−フェニル］−ポルフィリン二塩化物
【化２１】
0005745417.tif 000023
ＤＭＦ（５０ｍＬ）中の化合物１１（４００ｍｇ，０．５４３ｍｍｏｌ）の溶液を１００ｍＬオートクレーブに移した。トリメチルアミン（６．３ｇ）を加えた後、混合物を５０℃で８時間撹拌した。減圧下で溶媒を蒸発させた後、得られた残留物をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、そして溶液をスチールフリット（直径３．５ｃｍ）上に支持されたシリカゲルのパッド（深さ２ｃｍ）を通して濾過した。メタノール（約１Ｌ）でパッドを洗浄した後、酢酸：メタノール：水（３：２：１，体積による）で溶離して画分を得、減圧下で溶媒を蒸発させた後、固形残留物を得た。これをメタノール（５ｍＬ）に溶解し、そしてｎ−ブタノール：水：酢酸（４：５：１，体積による，上部相）で溶離するセファデックスＬＨ−２０カラム（２．５×４０ｃｍ）上のクロマトグラフィーによって精製した。カラムから２つの画分が溶離され、そのうちの最初のものが所望の生成物である。減圧下で溶媒を除去した後、得られた残留物をメタノール（５ｍＬ）に溶解した。溶液を陰イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ ４００，塩化物型）のショートカラム（３．５×２０ｃｍ）に通過させ、溶媒を減圧下で除去し、そして粗生成物をメタノール：ジエチルエーテルで処理して紫色の固形物を得、それを高真空下で乾燥した。
1H-NMR: δH (300Mz, CD3OD): 2.30-2.35 (m, 4 H), 3.15 (s, 18 H), 3.95-4.05 (m, 4 H), 4.20-4.25 (m, 4 H), 7.40-7.45, 7.65-7.70, 7.80-7.85 (3 x m, 8 H), 9.00-9.05,
9.40-9.45,(2 x m, 8 H), 10.40 (m, 2 H).
【０１７９】
化合物２３
５−｛４−［３−ジメチル−（３−ジメチルアミノプロピル）−アンモニオ−プロピルオキシ］フェニル｝−１５−（４−ドデシルオキシ−フェニル）−ポルフィリン塩化物
【化２２】
0005745417.tif 000024
化合物２０（３０ｍｇ，０．０３８ｍｍｏｌ）をＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチル−１，３−プロパンジアミン（１５６ｍｇ，１．２ｍｍｏｌ）と共にＴＨＦ：ＤＭＦ（１：１，体積による，２０ｍＬ）に溶解し、そして５０℃で１８時間撹拌した。減圧下で溶媒を蒸発させた後、残留物をジクロロメタンに溶解し、そして酢酸：メタノール：水（３：２：１，体積による）で溶離するカラムクロマトグラフィー（シリカゲル  メルク６０）によって精製した。適切な画分を合わせて減圧下で溶媒を除去した後、残留物をジクロロメタン：ヘキサンで処理して紫色の固形物として生成物を得た。
1H-NMR:δH (300Mz, CDCl3+1％ 酢酸 ): 0.85 (m, 3 H), 1.20-1.40 (m, 18 H), 1.55-1.60 (m, 2 H), 1.60-1.65 (m, 4H), 2.10-2.20 (bs, 8 H), 3.15-3.25 (m, 8 H), 3.75 (bs, 2 H), 4.20 (bs, 2 H), 4.35 (bs, 2 H), 7.15-7.20, 8.10-8.15 (2 x m, 8 H), 8.95-9.00, 9.10-9.15, 9.25-9.30 (3 x bs, 8 H), 10.20 (s, 2H).
【０１８０】
化合物２５
３−［（｛３−［（３−｛４−［１５−（４−ドデシルオキシ−フェニル）−ポルフィリン−５−イル］−フェノキシ｝−プロピル）−ジメチルアンモニオ］−プロピル｝−ジメチルアンモニオ）−プロピル］−トリメチル−アンモニウム三塩化物
【化２３】
0005745417.tif 000025
化合物２３（２０ｍｇ，０．０２２ｍｍｏｌ）及び（１−ブロモプロピル）−トリメチルアンモニウムブロミド（２６ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５ｍｌ）に溶解し、そして５０℃で一夜撹拌した。減圧下で溶媒を蒸発させた後、残留物をメタノール（５ｍｌ）に溶解し、そしてシリカゲルのパッド（深さ３ｃｍ）に適用し、それをメタノール（５００ｍｌ）、続いて酢酸：メタノール：水（体積により３：２：１）で洗浄した。溶媒を蒸発させた後、最初に酢酸：メタノール：水（体積により３：２：１）、次いでピリジン：酢酸（体積により１：１）を用いてカラムクロマトグラフィー（シリカゲル  メルク６０）によって残留物を精製した。溶離した第２の画分を集め、そして真空下で乾燥させた。残留物をメタノール（２ｍｌ）に溶解し、そしてセファデックスＬＨ−２０のカラム（２．５×４０ｃｍ）上のクロマトグラフィーによって精製し、それをｎ−ブタノール：酢酸：水（体積により５：１：４，上部相）で溶離した。減圧下で溶媒を除去した後、残留物を真空下、８０℃で乾燥した。ＮＭＲ分光法は、生成物に少量の脱離生成物が混入していたことを示した。
【０１８１】
化合物２８
５,１５−ビス−［３−（３−トリメチルアンモニオ−プロピルオキシ）−フェニル］−１０−ウンデシル−ポルフィリン二塩化物
【化２４】
0005745417.tif 000026
アルゴン雰囲気下のＤＭＦ（２０ｍＬ）中の化合物２７（５０ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ2ＣＯ3（１００ｍｇ，０．７２ｍｍｏｌ）及び（３−ブロモプロピル）−トリメチルアンモニウムブロミド（３００ｍｇ，１．２ｍｍｏｌ）を加え、そして混合物を５０℃で１８時間撹拌した。高真空下で溶媒を除去した後、得られた残留物をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、そしてスチールフリット（直径３．５ｃｍ）上に支持されたシリカゲルパッド（深さ２ｃｍ）を通して濾過した。パッドをメタノール（５００ｍＬ）で洗浄した後、それを酢酸：メタノール：水（３：２：１，ｖ：ｖ）で溶離した。合わせた適切な画分を高真空下で乾燥した後、残留物をメタノールに溶解し、そしてｎ−ブタノール：酢酸：水（５：１：４，体積による，上部相）で溶離するセファデックスＬＨ−２０上のカラムクロマトグラフィーによって精製した。溶媒を蒸発させた後、溶離した第１の画分から得られた残留物をメタノールに溶解し、そして陰イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ４００，塩化物型）のショートカラムを通過させ、溶媒を蒸発させた後、純粋な生成物を得た。
1H-NMR:δH (300Mz, CD3OD): 0.85 (t, 3J 7.5 Hz, 3 H), 1.20-1.40 (m, 12 H), 1.50 (m, 2 H), 1.80 (m, 2 H), 2.40 (bs, 4 H), 2.55 (m, 2 H), 3.20 (bs, 18 H), 3.65 (bs, 4 H), 4.35 (bs, 4 H), 5.10 (m, 2 H), 7.50-7.55, 7.70-7.85 (2 x m, 8 H), 8.95-9.00, 9.25-9.24, 9.50-9.70 (3 x bs, 8 H), 10.15 (bs, 1H).
【０１８２】
化合物３１
５−｛４−［３−ジメチル−（３−トリメチルアンモニオ−プロピル）−アンモニオ−プロピルオキシ］−フェニル｝−１５−（４−ドデシルオキシ−フェニル）−ポルフィリン二塩化物
【化２５】
0005745417.tif 000027
化合物２３（５０ｍｇ，０．０５５ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（３０ｍＬ）にヨウ化メチル（５ｍＬ，８０ｍｍｏｌ）と共に溶解し、そして混合物を４０℃で３時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後、得られた残留物をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、そしてスチールフリット（直径３．５ｃｍ）上に支持されたシリカゲルパッド（深さ２ｃｍ）を通して濾過した。パッドをメタノール（約１Ｌ）で洗浄した後、それをジクロロメタン：メタノール（体積により２：３，５００ｍＬ）、次いで酢酸：水：メタノール（３：１：２，体積による）で溶離した。適切に貯めた画分から溶媒を除去した後、得られた残留物を酢酸に溶解し、そして酢酸で溶離するセファデックスＬＨ−２０上のカラムクロマトグラフィーによって精製した。適切な貯めた画分から溶媒を蒸発させ、そして高真空下で得られた残留物を乾燥した後、残留物をメタノールに溶解し、そして陰イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ ４００，塩化物型）のスモールカラム（３．５×２０  ｃｍ）を通過させた。溶出液から溶媒を蒸発させた後、生成物を高真空下で乾燥した。
【０１８３】
化合物３２
５−［４−（３−ジメチルデシルアンモニオプロピルオキシ）−フェニル］−１５−｛４−［３−ジメチル−（３−ジメチルアミノプロピル）−アンモニオプロピルオキシ］−フェニル｝−ポルフィリン二塩化物
【化２６】
0005745417.tif 000028
化合物２３（５０ｍｇ，０．０６８ｍｍｏｌ）をＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチル−１,３−プロパンジアミン（３５４ｍｇ，１．３６ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジメチルデシルアミン（１ｇ，２．７２ｍｍｏｌ）と共にＤＭＦ：ＴＨＦ（３０ｍＬ，１：１，体積による）に溶解し、そして混合物を５０℃で一夜撹拌した。減圧下で溶媒を蒸発させた後、得られた残留物をメタノール（１０ｍＬ）に溶解し、そしてスチールフリット（直径３．５ｃｍ）上に支持されたシリカゲルパッド（深さ２ｃｍ）を通して濾過した。パッドをメタノール（約５００ｍＬ）で洗浄した後、それを酢酸：メタノール：水（３：２：１，体積による）で溶離した。溶離した最初の２つの画分を合わせ、そして減圧下で溶媒を蒸発させた後、得られた残留物をメタノールに溶解し、そしてｎ−ブタノール：水：酢酸（４：５：１，体積による）で溶離するセファデックスＬＨ−２０のカラム（２．５×４０ｃｍ）上のクロマトグラフィーによって精製した。溶離した第２画分から減圧下で溶媒の除去した後、残留物をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、そして陰イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ ４００，塩化物型）のショートカラム（３．５×２０ｃｍ）を通過させた。溶出液を蒸発乾固し、そして得られた残留物を高真空下で乾燥して生成物を得た。
1H-NMR: δH (300MHz, CD3OD): 0.80 (m, 3 H), 1.05-1.25 (m, 10 H), 1.25-1.40 (bs, 
2 H), 1.80-1.90 (bs, 4 H), 2.15-2.30 (bs, 2 H), 2.80-3.60 (m, 20 H), 3.80-3.95 (bs, 4 H), 7.05-7.15, 7.85-8.00 (2 x m, 2 x 4 H), 8.75-8.90, 9.20-9.35 (2 x bs, 2 x 4 H), 10.15 (bs, 2 H).
【０１８４】
実施例Ｂ：
化合物１０の固有抗菌活性−最小阻止濃度（ＭＩＣ）及び最小殺菌濃度（ＭＢＣ）の測定
特異的な微生物に対する抗菌剤の最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、明確に目視できる生物の増殖が観察されない抗菌剤の最小濃度として定義される（最小阻止濃度のＦＤＡ定義）。ＭＩＣ（MIC's）は、典型的に、従来から連続２倍希釈から得られた濃度を用いて測定した（米国臨床検査標準委員会（ＮＣＣＬＳ）ハンドブックＭ７−Ａ５：「好気的に増殖する細菌についての希釈抗菌物質感受性試験方法；認可基準−第５版」第２０巻 第２号 ２０００年１月）(National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) Handbook M7-A5: “Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically; Approved Standard - 5th Edition” Volume 20 Number 2. January 2000)。光がない場合の化合物１０についてのＭＩＣは、ＮＣＣＬＳ（米国臨床検査標準委員会（ＮＣＣＬＳ）ハンドブックＭ７−Ａ５、前出）によって作成されたＭＩＣプロトコールに基づくプロトコールを用いて調査した。
最小殺菌濃度（ＭＢＣ）は、所定の設定条件下で一定期間（一般に２４時間）インキュベーション後、生存可能な生物のほとんど（９９．９％）を死滅させるために必要な薬物の最小限の濃度として定義される（米国臨床検査標準委員会（ＮＣＣＬＳ）ハンドブックＭ２６−Ａ；「抗菌剤の殺菌活性の測定方法；認可されたガイドライン」第１９巻 第１８号、１９９９年９月（"Methods for determining Bactericidal Activity of Antimicrobial Agents; Approved Guidelines" Volume 19 number 18, September 1999））。
【０１８５】
方法
黄色ブドウ球菌ＢＡＡ−４４、ＡＴＣＣカタログから入手した多剤耐性メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）株を、本研究に用いた。以下の濃度の化合物１０を調べた：０．７６４；０．３８２；０．１９１；０．０９５５；０．０４７８；０．０２３９、０．０１１９、０．００５９７、０．００２９８、０．００１４９、０．０００７５及び０．０００３７ｇ／ｍＬ。蒸留水で保存液を調製し、そしてこれを系列希釈して使用直前に必要な濃度にした。
【０１８６】
同じ形態学的タイプの少なくとも３〜５つの十分に孤立したコロニーを寒天平板培養物から選び、そして増殖物（the growth）をアイソセンシテストブイヨン（Isosensitest Broth）１００ｍＬを含む管に移し、そしてブイヨン培養物を３７℃で一夜インキュベートした。次いで、培養物を新たなアイソセンシテストブイヨンで１０4細胞／ｍＬの最終密度に希釈し、そして細胞が指数増殖に入るまで３７℃で振盪しながらインキュベートした。
【０１８７】
調整した接種物０．０９ｍＬをポリスチレン９６ウェルマイクロタイタープレートの２４ウェルのそれぞれに移した。増殖培地のみの存在下で細菌単独の対照ウェルを（陽性対照として）含めた。
【０１８８】
希釈系列からの化合物１０の保存液０．０９ｍＬをマイクロタイタープレートの適当なウェル中へピペットで入れ、そして暗所中３７℃でインキュベートし、そして２４時間インキュベーション後、プレートを検査して各ウェル中の濁度を測定した。これらのデータをＭＩＣの測定に用いた。
【０１８９】
３７℃で２４時間インキュベーション後、目に見える細菌増殖のないウェル（４つのウェルまで）からの液体サンプル２５□Ｌをスポットとして栄養寒天プレート上へ接種し、そして３７℃でさらに２４時間インキュベートしてＭＢＣを測定した。
【０１９０】
結果
結果は、光のない場合の化合物１０についてのＭＩＣが０．０９５５ｇ／ｍＬであり、そしてＭＢＣが０．３８２ｇ／ｍＬであることを示した（表１）。
【表２】
0005745417.tif 000029
【０１９１】
結論
結果は、光がない場合、化合物１０が低いＭＩＣ及びＭＢＣ値を有することを示している。これらのデータは、化合物１０が、抗生物質として、いくつかの従来の抗生物質よりかなり強力であることを示している（表２参照）：
【表３】
0005745417.tif 000030
【０１９２】
実施例Ｃ：化合物１０の固有抗菌活性−一連の参照株及び臨床分離株にわたる活性
一連の参照株及び臨床分離株にわたる化合物１０の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を、アイソセンシテストブイヨンを用いて測定し、そして最小殺菌濃度（ＭＢＣ（MBC's））をコロンビア血液寒天上への継代培養によって測定した。
【０１９３】
方法
１．化合物１０の５ｍｇ／ｍｌ保存液を水で調製した。
２．希釈系列を行って一連の３２〜０．００１ｍｇ／Ｌの濃度を作った
３．試験微生物をアイソセンシテストブイヨン中で一夜増殖させた。
４．次いで、培養物を新たなブイヨンで１０4生物／ｍｌの最終濃度に希釈し、そして３７℃で９０分間振盪機にかけた。
５．微生物を含むブイヨン培養物９０μｌをマイクロタイタートレー中の列の１２ウェルのそれぞれに移し、そして対照トレー−トレー当たり４生物で繰り返した。
６．次いで、適切な化合物１０の希釈液９０μＬを、生物を含む各ウェルに加えて１６ｍｇ／Ｌから０．０００５ｍｇ／Ｌまでの最終的な希釈系列を得た。
７．溶液をよく混合し、そして暗所で２４時間インキュベートした。
８．ＭＩＣを記録し、そして増殖を示していないウェルからの２５μＬをＭＢＣ測定のため血液寒天培地上に継代培養した。
９．継代培養で一夜インキュベーション後、ＭＢＣ値を記録した。
１０．非接種ブイヨンの対照及びブイヨン＋接種物を各トレー中の各生物について行った。
【０１９４】
結果
結果を表３に示す。
【０１９５】
【表４】
0005745417.tif 000031
【０１９６】
【表５】
0005745417.tif 000032
【０１９７】
結論
結果は、化合物１０がグラム陽性細菌株の範囲についてきわめて低いＭＩＣ及びＭＢＣ値を有することを示している。ＭＩＣ及びＭＢＣ値は、方法の限度内ではほとんど同じであり、静菌剤とは対照的に抗菌活性の様式が殺菌性であることを示唆している。
【０１９８】
実施例Ｄ：ヒト細胞に対する化合物１０の毒性試験
方法
セルシステムズ・バイオテクノロジー社、独国（CellSystems Biotechnologie GmbH, Germany）から購入した正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）及び正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を用いて培養したヒト皮膚細胞に対する毒性について試験化合物をスクリーニングした。
ＮＨＥＫ及びＮＨＤＦ細胞は、継代３から１０の間で用いた。細胞を７．５及び／又は１５×１０4の細胞／ウェル（マイクロタイタープレート）で播種し、そしてインキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）中で一夜付着させた。異なる濃度の選ばれた光増感剤と共に種々の時間インキュベートした後、細胞を暗所で２４時間インキュベートした。
標準のＭＴＴ−アッセイによって毒性を試験した（Mossman et al., 1983 J. Immunological Methods 65: 55-63）。ＭＴＴは、代謝活性細胞のインジケーターである。ミトコンドリア中の酵素活性に依存して呈色反応を視覚化することができ、それはＥＬＩＳＡリーダー（５４０ｎｍ）で測定することができる。細胞生存性を１つに正規化し、これは、試験化合物がない場合のインキュベーション後の細胞のＯＤ値を１に正規化したことを意味する。各実験を３回繰り返した。
【０１９９】
結果
角化細胞及び線維芽細胞における毒性試験の結果を図２及び３に示す。データは、化合物１０が、抗菌効果を有することが知られている用量で正常なヒト表皮角化細胞又は正常なヒト皮膚の線維芽細胞に対して固有の毒性を示さないことを示している。
【０２００】
実施例Ｅ：典型的な化合物と細菌細胞との結合
化合物８、１０及び１２との大腸菌との結合
大腸菌細胞を、種々の濃度（１〜７．５μＭ）の化合物８、１０又は１２と共に５分間インキュベートした。培養期間の終了後、細胞を遠心分離によって沈殿させて結合していない試験化合物の画分を除去し、そして細胞ペレットを２％ＳＤＳ２ｍｌに再懸濁して細胞溶解物を得た。ＳＤＳで一夜インキュベーション後、細胞に結合した試験化合物の量を細胞溶解物の蛍光分光分析によって評価した。細胞溶解物中の化合物の濃度は、発光蛍光スペクトルの最大で強度を測定し、較正プロット上でデータを補間することによって算出した。細胞に結合した試験化合物の量は、細胞タンパク質１ｍｇ当たり化合物のナノモルとして示した。タンパク質濃度はローリー法（Lowry et al., 1951, J. Biol. Chem. 193:265-275）によって決定した。
すべての実験は三つ組で行い、そして結果は標準偏差と共に３つの測定の平均値を表す。
細胞から回収されたポルフィリンの量を表４に示す。
【０２０１】
【表６】
0005745417.tif 000033
【０２０２】
表３に示された結果は、３つの試験化合物が同様の効率で大腸菌と結合し、インキュベーション期間（５分間）の終了後、細胞に結合した化合物の約５０％がＰＢＳを用いた３回の洗浄によって除去されたことを示している。
【０２０３】
実施例Ｆ：安定性試験
化学安定性
本発明の典型的な化合物を分析するため、以下のＨＰＬＣ方法を確立した。方法には、これらの化合物にとってきわめて特異的な波長４２０ｎｍのＵＶによる検出が含まれる。ポルフィリン構造と関係のない（そのため４２０ｎｍで吸収がない）不純物をモニターするため、幾つかの実験ではＤＡＤ（ダイオードアレイ検出器）によって２００ｎｍから７００ｎｍの間で全クロマトグラムのＵＶスペクトルも記録した。
カラム：Zorbax Phenyl，２５０×４．６ｍｍ，５□ｍ
溶離液Ａ：水１０００ｍＬ中のドデシル硫酸ナトリウム１．５ｇ＋ギ酸１ｍＬ
溶離液Ｂ：水２００ｍＬ＋テトラヒドロフラン８００ｍＬ中のドデシル硫酸ナトリウム１．５ｇ＋ギ酸１ｍＬ
勾配：
【表７】
0005745417.tif 000034
流量：０．４ｍＬ／分
検出：４２０ｎｍ
カラム温度：２５℃
注入体積：１０μl
溶液：ポルフィリン誘導体を溶離液Ａに溶解して約０．３ｍｇ／ｍｌの最終濃度にした。
【０２０４】
典型的な化合物の典型的な保持時間は、約８分（実行時間１８分）であった。
【０２０５】
定性的なストレス試験（qualitative stress tests）を本発明の典型的な化合物に関して行った。ＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳによって分析を行った。固体形態、水溶液、及びリン酸緩衝化生理食塩水緩衝液に調製した溶液で、化合物をストレス試験にかけた。最初にサンプルを５０℃で７日間インキュベートし、そして試験のためサンプルを取り出した。次いで、サンプルを７０℃でさらに７日間インキュベートし、先のようにサンプルを取り出し、そしてサンプルを９０℃でさらに７日間インキュベートした。新たに調製した溶液のＨＰＬＣ分析を行い、そして７、１４及び２１日のインキュベーション後のサンプルと比較した。次いで、クロマトグラムの視覚による比較を行い、そして主要生成物及び副生物の含量を面積百分率値として定めた（図４参照）。
【０２０６】
クロマトグラムの３Ｄプロットは、断片のさらなる形成の兆候を示さなかった（より低い波長でシグナルなし）。
【０２０７】
図５中のプロットは、最も大きい分解作用を示した、ＰＢＳ緩衝液中の２１日後のサンプルを示す。結果は、８０℃に数週間加熱した固形薬物及び溶液中の薬物の分析に関して最小の分解を示した。
【０２０８】
結論
化合物１０及び１２は、いずれも良好な安定性を示すことがわかり、そして試験プロトコールのストレス条件下でも非常に安定であった。化合物８は化合物１０及び１２よりも安定でなかったが、示された安定性は、実際の使用には十分であることがわかった。
【０２０９】
製剤中の典型的な化合物の安定性
種々の水性基剤製剤においてポリエチレンバイアルで８週間にわたり暗所中４０℃で保存した３つの典型的な化合物（化合物８、１０及び１２）及び１つの参照化合物（化合物１）の安定性を、以下のように評価した：
・ラウレス硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）＋水
・９：１の水：エタノール
・ＳＬＥＳ＋９：１の水：エタノール
【０２１０】
ＵＶスペクトルを７週間にわたって３５０〜７００ｎｍの範囲にわたり記録し、そして８週にサンプルの視覚による評価を行った。
結果から、試験したすべての化合物は、８週間の期間にわたって良好な安定性を示したことがわかった（図６参照）。
化合物８及び１０については、安定性試験を１７週まで延長した（図７参照）。
【０２１１】
実施例Ｇ：化合物１０の急性毒性試験
標準の急性皮膚毒性試験において化合物１０を局所製剤中３．２ｍＭで試験して化合物についてもしあるとすれば臨床的又は組織学的毒性が検出されうるどうかを測定した。
急性毒性プロトコールは、化学物質の試験のためのＯＥＣＤガイドライン／第４節 − 健康影響試験第４０２号：急性皮膚毒性（OECD Guidelines for the testing of chemicals /Section 4 - Health Effects Test Number 402: Acute Dermal Toxicity）に基づく。
【０２１２】
結果及び結論
臨床的な肉眼、及び顕微鏡観察の後、臨床毒性は観察されなかった。いずれの主要な器官（皮膚を含む）について組織学的毒性は、観察されなかった。
結論として、化合物１０は、いずれの急性毒性影響をもたらさない：実際、物質又はそのビヒクル適用に関連する有意な臨床的又は病理学的徴候は、観察されなかった。
【０２１３】
実施例Ｈ：黄色ブドウ球菌のバイオフィルム及び緩慢増殖培養物に対する化合物１０の有効性
要約
背景：バイオフィルム形成の重要な特徴は、抗生物質の活性に抵抗する細菌の能力である。バイオフィルム中の細菌のより緩慢な増殖速度は、増強された耐性における重要な因子でありうる。本発明者らは、黄色ブドウ球菌のバイオフィルム及び緩慢増殖培養物に対する、抗菌剤のまったく新しい種類のリード化合物である化合物１０の活性を調べた。
方法：英国抗菌化学療法学会（British Society for Antimicrobial Chemotherapy）（ＢＳＡＣ）ガイドラインに従った微量液体希釈法（broth microdilution）によって浮遊培養物（planktonic cultere）についてＭＩＣを測定した。バイオフィルムＭＩＣ（ｂＭＩＣ）及び最小バイオフィルム形成阻止濃度（minimum biofilm eradication concentration）（ＭＢＥＣ）は、カルガリー（Calgary）バイオフィルムデバイスを用いて測定した。寒冷培養細胞（cold culture cells）の生存能力に対する化合物１０の効果は、黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００を３７℃で初期指数期（early exponential phase）まで増殖させ、そして予め冷却した培地に細胞を再懸濁し、ここで、化合物１０及び対照薬剤の存在下及び非存在下でそれを維持することによって測定した。また、緊縮応答を発現する緩慢増殖細胞に対する化合物１０の効果は、初期対数期（early log phase）まで培養物を増殖させ、そしてイソロイシルｔＲＮＡシンテターゼ阻害剤ムピロシンの添加により緊縮応答を誘発することによって測定した。次いで、化合物１０及び対照薬剤を加え、そして生存細胞測定のためサンプルを回収した。
結果：化合物１０は、シプロフロキサシン、フシジン酸、テトラサイクリン及びリファンピンについてのそれぞれ４、０．５、０．５及び０．０３μｇ／ｍＬのｂＭＩＣ及び＞２５６、＞２５６、＞２５６及び１２８μｇ／ｍＬのＭＢＥＣと比較して黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００に対する１μｇ／ｍＬのｂＭＩＣ及び２μｇ／ｍＬのＭＢＥＣという強力な抗バイオフィルム活性を有した。寒冷培養物及び緊縮応答培養物は、ホスホマイシン、バンコマイシン及びダプトマイシンで処理した培養物の生存能力の喪失がなかったのと比較して、１時間以内に生存能力における５対数降下（5 log drop）が観察され、化合物１０に対して感受性のままであった。
結論：黄色ブドウ球菌バイオフィルム及び緩慢増殖黄色ブドウ球菌培養物に対する化合物１０の強力な活性は、その抗菌活性が細菌の増殖状態に依存せず、そしてバイオフィルム関連の黄色ブドウ球菌感染症の治療における化合物１０の有用性を示唆していることを示している。
【０２１４】
序論
バイオフィルムの形成は、広範囲の細菌感染症における主要な因子として益々認識されている。異物関連感染症、嚢胞性線維症患者における肺の慢性感染症及び歯牙感染は、バイオフィルムが介在する感染症のほんの２、３の例である。実際、最近では、先進国におけるヒト感染症の８０％は、バイオフィルム形成の直接の結果であると報告されている1。
さらにまた、バイオフィルム培養物は、遺伝子型の耐性の発現なしに、化学療法によって根絶することに対して典型的に高度に不応性である。結果的に、治療選択肢の数は限られ、そして抗バイオフィルム活性を有する新規抗菌剤を開発する重要性が高まっている。
化合物１０は、新しい種類の抗菌剤の例であり、そして抗菌療法に対する新しいアプローチを表している。化合物１０は、殺菌性（ＭＢＣ５０ １μｇ／ｍＬ）であり、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）、医療関連型メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（healthcare-associated methicillin-resistant S. aureus）、及び市中感染型メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（community-associated methicillin-resistant S. aureus）を含む一連の黄色ブドウ球菌株に対して活性（ＭＩＣ５０ １μｇ／ｍＬ）であることはこれまで示されている2。本試験の目的は、バイオフィルム及び他の緩慢増殖細菌培養物に対する化合物１０の活性を示すことである。
【０２１５】
方法
・ＢＳＡＣガイドライン3に従って浮遊のＭＩＣを測定した。
・標準の方法4に従ってカルガリーデバイスにおいてｂＭＩＣ及びＭＢＥＣを測定した。
・培養物を４℃に保つことを除いて標準の時間−死滅プロトコール（time-kill protocols）を用いて、寒冷培養物中の黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００（ＭＳＳＡ）に対する化合物１０の死滅速度を測定した。
・ムピロシンで誘導された黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００の緊縮培養物に対する化合物１０の死滅速度をOliva et al. (2003)5の方法に従って測定した。
【０２１６】
結果
・化合物１０は、シプロフロキサシン、フシジン酸、テトラサイクリン及びリファンピンについてのそれぞれ４、０．５、０．５及び０．０３μｇ／ｍＬのｂＭＩＣ及び＞２５６、＞２５６、＞２５６及び１２８μｇ／ｍＬのＭＢＥＣと比較して、黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００に対する１μｇ／ｍＬのｂＭＩＣ及び２μｇ／ｍＬのＭＢＥＣという抗バイオフィルム活性を有した（表５）
・ホスホマイシンで処理した培養物について生存能力の喪失がなかったのと比較して、寒冷培養物及び緊縮応答培養物では、１時間以内に生存能力における５対数降下（5 log drop）が観察され、化合物１０に対して感受性のままであった（図８及び９）。
【０２１７】
【表８】
0005745417.tif 000035
【０２１８】
結論
・化合物１０は、シプロフロキサシン、フシジン酸、テトラサイクリン及びリファンピンと比較した場合、より高い黄色ブドウ球菌抗バイオフィルム活性を有する。
・化合物１０は、他の抗菌剤の殺菌活性が有意に低下する寒冷培養物及び緊縮応答培養物に対して強力に殺菌性のままである。
・これらのデータは、化合物１０の殺菌活性が、処理される細菌の増殖状態に依存しないことを示している。
・化合物１０の強力な黄色ブドウ球菌抗バイオフィルム活性は、緩慢増殖培養物に対するその保持された殺菌活性と合わせて化合物１０をこのような感染症の予防及び治療のための有用な薬剤にしている。
【０２１９】
文献
１．アメリカ国立衛生研究所（National Institute of Health）［インターネット］［２００８年９月１７日に引用］；http://grants.nih.gov/grants/guide/pa-files/PA-03-047.htmlから入手可能
２．Love WG, Rhys-Williams W, Hayter I et al. 2008 ECCMID Barcelona. Abstract P5
59.
３．Andrews JM. J Antimicrob Chemother. 2001;48 (Suppl. S1):5-16.
４．Ceri H, Olson ME, Stremick C, et al. J Clin Microbiol. 1999;37(6):1771-1776.５．Oliva B, Miller K, Caggiano N, et al. Antimicrob Agents Chemother. 2003;47(2):458-466.
【０２２０】
実施例Ｉ：黄色ブドウ球菌のバイオフィルム及び緩慢増殖培養物に対する化合物１０及び化合物１２の有効性
以下の実施例は、黄色ブドウ球菌のバイオフィルム及び緩慢増殖培養物に対する化合物１０（ＸＦ−７３）及び化合物１２（ＸＦ−７０）の有効性に関し、そしてそれらの化合物と種々の対照薬剤の比較を提供する。
【０２２１】
細胞分裂しないブドウ球菌に対するＸＦ薬物の効果
感染中、細菌が最適な増殖条件に遭遇することはめったになく、そして実際は長期間の限られた増殖又は増殖停止が普通であり、ここで、生物は休止状態に入り（Kolter et al, 1993）、それは持続細菌感染を作り出す一因となりうる（Nataro et al., 2000）。黄色ブドウ球菌は、最適以下の増殖条件に耐えるために遺伝子発現を調節することが知られており（Somerville et al., 2002）、そしてブドウ球菌心内膜炎及び骨髄炎では細胞分裂しない細菌が存在する可能性がある（Mascio et al., 2007）。従って、増殖停止条件下で殺菌性である抗菌薬物は、このような活性を示さないものよりも臨床的な利点を有することができる（Mascio et al., 2007）。
【０２２２】
増殖のための栄養素が限られるようになると、細菌は、増殖を支えるものから、栄養素が不存在の長い生き残りに備えるものにその代謝を調節する。多くの細菌では、緊縮応答として知られているこの生理学的スイッチの重要な促進因子（facilitator）は、グアノシンピロリン酸塩及び五リン酸塩の蓄積である（Traxler et al., 2008）。抗生物質ムピロシンは、黄色ブドウ球菌における緊縮応答の強い誘導剤であり、そしてイソロイシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＩＲＳ）の強力な阻害によって、荷電イソロイシルｔＲＮＡ（charged isoleucyl tRNA）の欠乏を効果的に引き起こす（Oliva et al., 2003）。従って、ムピロシンの添加により増殖を妨げた黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００に対するＸＦ薬物の活性を試験した（図１０）。増殖を停止させる別法として、細菌を寒冷増殖培地に懸濁して（Mascio et al., 2007）、ＸＦ薬物の殺菌活性をこれらの条件下でも測定した（図１１）。
【０２２３】
これまでの研究から、緊縮応答は、黄色ブドウ球菌８３２５−４に対するホスホマイシン、サイクロセリン、β−ラクタム及びバンコマイシンの殺菌活性を完全に無効にすることが示されている（Oliva et al., 2003）。菌株ＳＨ１０００を用いる本試験では、ホスホマイシンを対照として含め（図１０）、そして結果は、ある程度予期できたことだが、ホスホマイシンの殺菌活性が緊縮条件下で完全に弱められていることを示し、それによって菌株ＳＨ１０００中の緊縮応答の誘導物質としてのムピロシンの使用を確認した。ＸＦ−７０及びＸＦ−７３は、緊縮応答の誘導によって増殖が妨げられたＳＨ１０００の非増殖培養物に対して強力な殺菌活性を保持していた（図１０）。ナイシンは、緊縮条件下で若干の殺菌活性を保持していたが、これは、ＸＦ−７０及びＸＦ−７３が示したほど顕著ではなかった（図１０）。
【０２２４】
寒冷培養細胞の生存能力に対するＸＦ薬物の効果は、黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００を３７℃で初期指数相まで増殖させ、遠心分離（５，０００×ｇ，１０分）によって細胞を採取し、そして予め冷却した培地にそれらを再懸濁し、ここで、それをＸＦ薬物及び対照薬剤の存在下及び非存在下で５時間維持することによって測定した。ＸＦ−７０及びＸＦ−７３は、温度を４℃に下げることによって増殖が停止されている黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００に対して強力な殺菌活性を保持していた（図１１）。この条件下で、ダプトマイシン及びナイシンは、いずれも若干の殺菌活性を保持していたが、バンコマイシンの生物を死滅させる能力は消失していた（図１１）。
【０２２５】
黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００のバイオフィルムに対するＸＦ薬物の活性
バイオフィルムは、表面と不可逆的に結合し、生物によって分泌された多糖類物質のマトリックスに包まれた微生物細胞のコミュニティである（Costerton 2001; Donlan, 2002; Hall-Stoodley et al., 2004）。病原性グラム陽性菌によってカテーテル及び他の留置医療用デバイス上に形成されたバイオフィルムは、病院環境における重要な問題を提示している（Costerton 2001; Donlan, 2002; Hall-Stoodley et al., 2004; Toney 2007）。バイオフィルムは、抗生物質療法に対して不応性であることは有名で、一般に宿主免疫応答によって排除を受けない。細菌バイオフィルム形成を妨げる、又は一度形成されたそれを根絶する能力を備えた抗菌剤を同定することのニーズの存在は明らかである（Toney 2007）。バイオフィルム中の細菌のより緩慢な増殖速度が、従来の抗生物質に対する増強した耐性の重要な因子でありうる。また、非増殖性ブドウ球菌に対して殺菌活性を保持するＸＦ−７０及びＸＦ−７３の能力に鑑み（上記参照）、本発明者らは、黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００のバイオフィルムに対するこれらの薬物の活性も調査した。
【０２２６】
バイオフィルムＭＩＣ及び最小バイオフィルム形成阻止濃度（ＭＢＥＣ）は、カルガリーバイオフィルムデバイス（Nunc Inc, Roskilde, デンマーク）においてMiller et al., 2005.によって記載されたように測定した。これは、以下の工程を含む。菌株ＳＨ１０００の指数期培養物のアリコート（２００μＬ）を９６ウェルマイクロタイタートレーの各ウェルに加えた。次いで、各ウェルに対応する９６個のポリスチレン栓（pegs）を有する蓋アセンブリ（lid assembly）に取り替えて、系をシーソー式シェーカー（rocking platform）上３７℃で２４時間インキュベートした。この後、各栓上に約１０7ｃｆｕのバイオフィルムが成熟した。次いで蓋をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄して残りの浮遊増殖物を除去し、次いで、試験抗生物質の倍加希釈物を含む新たな培地と共にマイクロタイタートレーに入れた。次いで、系をシーソー式シェーカー上３７℃で２４時間インキュベートした。ＭＩＣは、このインキュベーション後、抗生物質が目に見える増殖を完全に阻害する最も低い濃度として定義した。ＭＩＣを記録した後、蓋アセンブリを再びＰＢＳで２回洗浄して浮遊細胞及び残りの抗生物質を除去し、次いで、新たな薬物なしの培地に入れた。系をさらに２４時間インキュベートし、そしてＭＢＥＣは、抗生物質が浮遊増殖の回復を完全に阻害する最も低い濃度として定義した。
【０２２７】
ＸＦ化合物は、多くの他の抗菌剤と比較して黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００バイオフィルムに対する優れた活性を示す（表６）。これは、低いｂＭＩＣ値に反映されており、そして対照として用いた他の抗菌剤によって示されない性質、強力なバイオフィルム形成阻止活性（ＭＢＥＣ）にまで拡張される（表６）。
【０２２８】
【表９】
0005745417.tif 000036
【０２２９】
文献
Costerton, J.W. (2001).  Cystic fibrosis pathogenesis and the role of biofilms in persistent infection.  Trends in Microbiology 9: 50-52.
Donlan, R.M.. (2002).  Biofilms: microbial life on surfaces.  Emerging Infectious Diseases 8: 881-890.
Hall-Stoodley, L., Costerton, J.W., & Stoodley, P. (2004).  Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases.  Nature Reviews Microbiology 2: 95-108.
Kolter, R.D., Siegele, D.A., & Tormo, A. (1993).  The stationary phase of the bacterial life cycle.  Annual Review of Microbiology 47: 855-874.
Mascio, C.T.M., Alder, J.D. & Silverman, J.A. (2007).  Bactericidal action of daptomycin against stationary-phase and nondividing Staphylococcus aureus cells.  Antimicrobial Agents and Chemotherapy 51: 4255-4260.
Nataro, J.P., Blaser, M.J., & Cunningham-Rundles, S. (2000).  Persistent bacterial infections: commensalism gone awry or adaptive niche?  In, Persistent Bacterial Infections (J.P. Nataro, M.J. Blaser & S. Cunningham-Rundles, eds.), American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.
Oliva, B., Miller, K., Caggiano, N., O'Neill, A.J.,  Cuny, G.D., Hoemann, M.Z., Hauske, J.R. & Chopra, I. (2003).  Biological properties of novel antistaphyloco
ccal quinoline-indole agents.  Antimicrobial Agents and Chemotherapy 47: 458-466Somerville, G.A., Chaussee, M.S., Morgan, C.I., Fitzgerald, J.R., Dorward, D.W., Reitzer, L.J. & Musser, J.M. (2002).  Staphylococcus aureus aconitase inactivation unexpectedly inhibits exponential-phase growth and enhances stationary-phase survival.
Traxler, M.F., Summers, S.M., Nguyen, H-T., Zacharia, V.M., Hightower, G.A., Smith, J.T., & Conway, T. (2008).  The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli.  Molecular Microbiology 68: 1128-1148.
Toney, J.H. (2007).  Biofilms- a neglected antibacterial target?  Current Opinion in Investigational Drugs 8: 598-599.
【０２３０】
実施例Ｊ：黄色ブドウ球菌の緩慢増殖培養物に対する化合物１０及び化合物１２の有効性方法
標準の時間−死滅方法を用いて、黄色ブドウ球菌の緩慢増殖培養物に対する化合物１０、化合物１２及びさまざまな比較薬剤の抗ブドウ球菌活性を試験した（Oliva et al. 2003, Hobbs et al. 2008）。黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００培養物をミュラーヒントンブイヨン（ＭＨＢ）中で初期指数期（ＯＤ６００ｎｍ ０．２）まで増殖させた後、４×ＭＩＣで抗菌剤に曝露した。未処理の培養物は、陰性対照として機能した。実験は、三つ組で行った。
【０２３１】
緊縮応答を発現する培養物
抗生物質ムピロシンは、黄色ブドウ球菌における緊縮応答の強力な誘導剤であり、そしてイソロイシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＩＲＳ）の強力な阻害によって荷電した（charged）イソロイシルｔＲＮＡの飢餓を引き起こした（Oliva et al. 2003, Cassels et al. 1995）。初期指数増殖期（ＯＤ６００ｎｍ ０．２）においてムピロシン（４ｍｇ／Ｌ）を細胞に加えることによってＳＨ１０００培養物に緊縮（Stringency）を誘導した（Oliva et al. 2003, Cassels et al. 1995）。培養物をムピロシンと共に３０分間インキュベートした後、サンプリングを開始した。培養物を３７℃に維持し、そしてサンプルを３０分間隔で３００分間採取し、順次、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、そして希釈した培養物をミュラー−ヒントン寒天培地上に広げ、そして３７℃で１８〜２４時間インキュベートした後、ＣＦＵの数をカウントした。
【０２３２】
寒冷培養物
ＳＨ１０００細胞を３７℃で初期指数期（ＯＤ600nm ０．２）まで増殖させることによって寒冷培養物を準備した。次いで、培養物を遠心分離し、そして細胞沈殿物を、４℃に予冷却したＭＨＢに再懸濁した。５時間のサンプリング期間にわたって培養物を４℃に維持したことを除いて上節で記載したように、抗菌剤の死滅速度を試験した。
【０２３３】
結果
緊縮応答を発現する黄色ブドウ球菌における化合物１０及び化合物１２の効果
ムピロシンの添加によって増殖を妨げられる黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００に対する化合物１０及び化合物１２の活性を試験した。これまでの研究は、緊縮応答が黄色ブドウ球菌に対するβ−ラクタム抗生物質及びホスホマイシンの殺菌活性を完全に無効にしたことを示している（Oliva et al. 2003）。ホスホマイシンを本試験における対照として含めた。４×ＭＩＣで、ホスホマイシン活性は、緊縮条件下で完全に弱められた（図１２）。同様の効果は、リファンピシンについて観察された（図１２）。対照的に、化合物１０及び化合物１２は、緊縮応答の誘導によって増殖を妨げられたＳＨ１０００の培養物に対する強力な殺菌活性を保持していた（図１２）。
【０２３４】
寒冷培養物における化合物１０及び化合物１２の効果
寒冷培養物細胞の生存能力における化合物１０及び化合物１２の効果を５時間の期間にわたって測定した（図１３）。低い温度は、化合物１０及び化合物１２の活性に対して効果がなく、これらは増殖がその温度変化によって停止している黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００に対して強力な殺菌活性を保持していた（図１３）。これらの条件下で、ダプトマイシン及びナイシンは、いずれも限られた殺菌活性を保持していたが、生物を死滅させる他の薬剤の能力は、消失していた（図１３）。
【０２３５】
結論
化合物１０及び化合物１２は、緩慢増殖又は細胞分裂しない黄色ブドウ球菌の種々の形態に対して高度に活性を保持していた。
【０２３６】
文献
Cassels R, Oliva B, Knowles D.  Occurrence of the regulatory nucleotides ppGpp and pppGpp following induction of the stringent response in staphylococci. J Bacteriol 1995; 177: 5161-65. 
Hobbs JK, Miller K, O'Neill AJ et al. Consequences of daptomycin mediated membrane damage in Staphylococcus aureus.  J Antimicrob Chemother 2008; 62: 1003-8.
Oliva B, Miller K, Caggiano N, et al. Biological properties of novel antistaphylococcal quinoline-indole agents. Antimicrob Agents Chemother  2003 47: 458-466.
【０２３７】
実施例Ｋ：黄色ブドウ球菌の静止期培養物に対する化合物１０及び化合物１２の有効性
方法
標準の時間−死滅方法（Oliva et al. 2003, Hobbs et al. 2008）を用いて黄色ブドウ球菌の静止期培養物に対する化合物１０、化合物１２及び一連の比較薬剤の抗ブドウ球菌活性を試験した。増殖曲線を構築してＳＨ１０００培養物が静止期に入る及び出るときを同定した。ミュラーヒントンブイヨン（ＭＨＢ）５０ｍＬを黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００一夜培養物５００μＬと共に接種し、そして撹拌しながら３７℃で８日間維持した。光路１ｃｍのJenway 6300分光光度計（Jenway, Essex, UK）を用いてＯＤ600nmでの培養物濁度を一定の間隔で測定した。
黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００培養物をそれぞれ２４、４８及び７２時間のインキュベーションによって３７℃で初期、中期及び後期静止期まで増殖させた。培養物を遠心分離し、上清を除去し、次いで細胞ペレットの一部を対応する上清中でＯＤ600nm ０．２（１０8細菌／ｍＬ）に再懸濁した。次いで、これらの静止期懸濁液において時間−死滅アッセイを行なって細菌細胞生存性に対する抗菌剤の効果を試験した。未処理の培養物は、陰性対照として機能した。実験は、三つ組で行った。
【０２３８】
結果
黄色ブドウ球菌の静止期培養物における化合物１０及び化合物１２の効果
ＭＨＢ中３７℃で培養した黄色ブドウ球菌ＳＨ１０００について延長期間にわたる生物の増殖曲線を検討することによって静止期の開始及び終了を確立した。細胞は、増殖２４時間後に静止期に入り、そして９６時間で出ることが明らかになり、その後、培養物濁度が低下し、細菌溶解及び死滅を示す。従って、初期静止期は、接種の２４時間後、中期静止期は４８時間で、そして後期静止期は７２時間で開始すると考えられる。静止期培養物で達成された高い細胞密度に関連する感受性試験についての接種物効果を回避するために、２４時間、４８時間及び７２時間の時点で生物を回収し、そしてこれらの培養物から使用済みの増殖培地中で１０8細菌／ｍＬにこれを希釈した後、阻害剤の殺菌活性を測定した。化合物１０及び化合物１２は、静止期のすべての時点から回収された細胞に対して強力な殺菌活性を保持していた（図１４〜１６）。化合物１０及び化合物１２と対照的に、静止期培養物に対する比較薬剤の活性は劣っていた（図１４〜１６）。
【０２３９】
結論
化合物１０及び化合物１２は、静止期の初期、中期及び後期段階において黄色ブドウ球菌の培養物に対して高度に活性のままであった。
【０２４０】
文献
Hobbs JK, Miller K, O fNeill AJ et al. Consequences of daptomycin mediated membrane damage in Staphylococcus aureus. J Antimicrob Chemother 2008; 62: 1003-8.
Oliva B, Miller K, Caggiano N, et al. Biological properties of novel antistaphylococcal quinoline-indole agents. Antimicrob Agents Chemother 2003 47: 458-466.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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