(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の乳癌、肺癌、または、卵巣癌が、メトトレキサート、メトトレキサート誘導体、タキサン、または、タキサン誘導体を用いる処置を包含する化学療法に対して応答する見込みを予測するための判断基準を得る方法であって、該方法は、インビトロでの以下のステップ：
該癌患者由来の癌サンプルを提供するステップと、
該癌サンプル中でＴＬＥ３が発現されるか否かを測定するステップと、
該測定するステップの結果に基づいて、該患者の癌が化学療法に対して応答する見込みを予測するための判断基準を得るステップと
を含み、
ここで、該予測するための判断基準を得るステップにおいて、該癌サンプル中のＴＬＥ３発現の存在が、該患者の癌が、化学療法に対して応答する可能性が高いと予測するための判断基準を与え、該癌サンプル中にＴＬＥ３発現がないことが、該患者の癌が、化学療法に対して応答する可能性が低いと予測するための判断基準を与える、方法。
【請求項２】
前記測定するステップが、
陰性対照サンプルを提供するステップと、
該陰性対照サンプル中のＴＬＥ３発現のレベルを検出するステップと、
前記癌サンプル中のＴＬＥ３発現のレベルを検出するステップと、
該癌サンプル中のＴＬＥ３発現のレベルを、該陰性対照サンプル中のＴＬＥ３発現のレベルと比較するステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記測定するステップが、
陽性対照サンプルを提供するステップと、
該陽性対照サンプル中のＴＬＥ３発現のレベルを検出するステップと、
前記癌サンプル中のＴＬＥ３発現のレベルを検出するステップと、
該癌サンプル中のＴＬＥ３発現のレベルを、該陽性対照サンプル中のＴＬＥ３発現のレベルと比較するステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記測定するステップが、前記癌サンプルを、ＴＬＥ３ポリペプチドと結合する相互作用パートナーと接触させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記相互作用パートナーが抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記測定するステップが、前記癌サンプルを、ＴＬＥ３ポリヌクレオチドとハイブリダイズする１種以上のプライマーと接触させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記患者の癌が化学療法に対して応答する予測された見込みが、該癌患者に化学療法を投与するべきか否かの指標である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記癌サンプル中のＴＬＥ３発現の存在が、前記癌患者に化学療法を投与すべきであることを示す、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記癌サンプル中にＴＬＥ３発現がないことが、前記癌患者に化学療法を投与すべきではないことを示す、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記タキサンがパクリタキセルである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記タキサンがドセタキセルである、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記化学療法が、ネオアジュバント設定の投与である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化学療法が、アジュバント設定の投与である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌患者が、ステージＩＩ＋の癌を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記癌患者が、ステージＩＩｂ＋の癌を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記癌患者が、ステージＩＩＩ＋の癌を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
乳癌、肺癌、または、卵巣癌の患者のために、メトトレキサート、メトトレキサート誘導体、タキサン、または、タキサン誘導体を用いる処置を包含する化学療法を選択すべきか否かの判断基準を得る方法であって、該方法は、インビトロでの以下のステップ：
該癌患者由来の癌サンプルを提供するステップと、
該癌サンプル中でＴＬＥ３が発現されるか否かを測定するステップと、
該測定するステップの結果に基づいて、該癌患者のための化学療法を選択かすべきか否かの判断基準を得るステップと
を含み、ここで、該選択するステップにおいて、該癌サンプル中のＴＬＥ３発現の存在が化学療法を選択すべきとの判断基準を与える、方法。
【請求項１８】
前記測定するステップが、
陰性対照サンプルを提供するステップと、
該陰性対照サンプル中のＴＬＥ３発現のレベルを検出するステップと、
前記癌サンプル中のＴＬＥ３発現のレベルを検出するステップと、
該癌サンプル中のＴＬＥ３発現のレベルを、該陰性対照サンプル中のＴＬＥ３発現のレベルと比較するステップと
を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記測定するステップが、
陽性対照サンプルを提供するステップと、
該陽性対照サンプル中のＴＬＥ３発現のレベルを検出するステップと、
前記癌サンプル中のＴＬＥ３発現のレベルを検出するステップと、
該癌サンプル中のＴＬＥ３発現のレベルを、該陽性対照サンプル中のＴＬＥ３発現のレベルと比較するステップと
を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記測定するステップが、前記癌サンプルを、ＴＬＥ３ポリペプチドと結合する相互作用パートナーと接触させるステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記相互作用パートナーが抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記測定するステップが、前記癌サンプルを、ＴＬＥ３ポリヌクレオチドとハイブリダイズする１種以上のプライマーと接触させるステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記タキサンがパクリタキセルである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記タキサンがドセタキセルである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記化学療法が、ネオアジュバント設定での投与である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
前記化学療法が、アジュバント設定の投与である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
前記癌患者が、ステージＩＩ＋の癌を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
前記癌患者が、ステージＩＩｂ＋の癌を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
前記癌患者が、ステージＩＩＩ＋の癌を有する、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
癌治療の大きな課題は、任意の患者にとって、有効性を最大にし、毒性を最小にする化学療法の選択である。例えば、免疫組織化学（ＩＨＣ）を使用する細胞表面マーカーのアッセイは、特定の癌をサブクラスに分けるための手段を提供した。例えば、乳癌の予後および治療法の決定において考慮される１つの因子として、エストロゲン受容体（ＥＲ）の有無がある。ＥＲ陽性乳癌は、通常、ＥＲ陰性癌よりも、乳房組織において抗エストロゲンとして作用するタモキシフェンなどのホルモン療法に対して、かなり容易に応答する。有用であっても、これらの分析は、乳癌の臨床的挙動を一部しか予測しない。現在の診断ツールで検出できない、癌に存在する表現型の多様性がある。結果として、転帰を最適にするために、可能性ある治療の間で患者をどのように層別化するかをめぐって、依然、多くの議論がある。（例えば、乳癌については、「ＮＩＨ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ：Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ、２０００年１１月１〜３日」、非特許文献１および非特許文献２参照のこと）。特に、現在、パクリタキセル、特に有害な副作用を伴う化学療法薬を用いる治療に対する、患者の起こり得る応答を予測するためのツールがない。癌を分類し、それによって、任意の患者にとって、有効性を最大にし、毒性を最小にする治療計画を選択するための改善法および試薬の必要性が存在することは明らかである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００２】
【非特許文献１】Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ、（２００１）３０：５−１５
【非特許文献２】Ｄｉ  Ｌｅｏら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．（２００２）７：２４５−２５３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明者らは、ＴＬＥ３（スプリット３のトランスデューシン様エンハンサー、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ７０９０）の発現と、化学療法に対する癌の応答の間の相関を同定した。この相関は、ＴＬＥ３抗体と、既知の転帰を有する、治療された患者および治療されていない患者の両方を含む乳癌コホートから得たサンプルを使用して実証された。本発明者らはまた、治療された卵巣癌患者から得たサンプル中のＴＬＥ３抗体の結合が、予後の改善と相関すると観察した。したがって、一態様では、本発明は、ＴＬＥ３を、患者の癌が、化学療法に対して応答する見込みを予測するためのマーカーとして使用する方法を提供する。別の態様では、本発明は、ＴＬＥ３を、癌患者に化学療法を投与するか否かを決定するためのマーカーとして使用する方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は、ＴＬＥ３を、癌患者のための化学療法を選択するためのマーカーとして使用する方法を提供する。
【０００４】
ＴＬＥ３の発現は、任意の既知法を使用して検出できる。したがって、本発明の方法は、抗体を使用してＴＬＥ３ポリペプチドを検出することによって例示されているが、特定の実施形態では、当技術分野で周知であるような１種以上のプライマーを使用してＴＬＥ３ポリヌクレオチドを検出してもよい。
【０００５】
一般に、ＴＬＥ３は、本発明の方法の予測力をさらに改善するために、その他のマーカーまたは臨床因子（例えば、ステージ、腫瘍の大きさ、結節の特徴、年齢など）とともに使用してよい。
【０００６】
付属書類の簡単な説明
本特許出願は、付属書類Ａとして提示される表およびデータを含む構成要素を指す。詳しくは、付属書類Ａは、本発明の方法においてＴＬＥ３マーカーとともにパネルにおいて使用できる種々のマーカーを列挙する表である。この表は、抗体ＩＤ、親遺伝子名、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ、親遺伝子の既知仮名、抗体の調製において使用され得るペプチドおよび染色のための例示的抗体力価を含む。当業者ならば、親遺伝子名、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤおよび／または親遺伝子の既知仮名を使用して、付属書類Ａに列挙されている親遺伝子１つ１つのヌクレオチド（および対応するアミノ酸）配列を、公共データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔまたは任意のこれらの次世代の派生物）から容易に得ることができる。付属書類Ａに列挙されている親遺伝子１つ１つのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は、これらの公共データベースから参照により本明細書に組み込まれる。Ｓ５またはＳ６ではじまるＩＤを有する抗体は、示される商業的供給源から得てもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】乳癌患者から得たＴＬＥ３陰性（Ｓ０６４３−）およびＴＬＥ３陽性（Ｓ０６４３＋）サンプルのＩＨＣ像を比較する図である。
【図２】ＴＬＥ３マーカーに対して作製した抗体を用いる染色に基づいて分類した後に、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＨＨ）乳癌コホート中のすべての患者を使用して作成したカプラン−マイヤー再発曲線を示す図である。ＴＬＥ３陽性およびＴＬＥ３陰性患者から得た再発データを使用して、上の曲線および下の曲線をそれぞれ作成した。図に示されるように、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合は、この乳癌コホートの全域で予後の改善と相関する（ＨＲ＝０．５７３、ｐ＜０．００４）。
【図３】ＴＬＥ３マーカーに対して作製した抗体を用いる染色に基づいて分類した後に、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰ）乳癌コホート中のすべての患者を使用して作成したカプラン−マイヤー再発曲線を示す図である。ＲＰコホート中の選択された患者は、ＥＲ（エストロゲン受容体、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ２０９９）、ＰＲ（プロゲステロン受容体、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ５２４１）およびＨＥＲ−２マーカー（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２  赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ２、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ２０６４）についてすべて三重陰性であった。ＴＬＥ３陽性およびＴＬＥ３陰性患者から得た再発データを使用して、上の曲線および下の曲線をそれぞれ作成した。図に示されるように、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合は、この乳癌コホートの全域で予後の改善と相関する（ＨＲ＝０．２４、ｐ＜０．０１１）。
【図４】化学療法を受けなかった、図１のＨＨ乳癌コホート中の患者を使用して作成したカプラン−マイヤー再発曲線を示す図である。このサブセット中のＴＬＥ３陽性およびＴＬＥ３陰性患者から得た再発データを使用して、上の曲線および下の曲線をそれぞれ作成した。図に示されるように、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合は、化学療法を受けなかった乳癌患者における予後とのその相関を失う（ＨＲ＝０．７８８、ｐ＝０．４９）。
【図５】化学療法を受けた、図１のＨＨ乳癌コホート中の患者を使用して作成したカプラン−マイヤー再発曲線を示す図である。このサブセット中のＴＬＥ３陽性およびＴＬＥ３陰性患者から得た再発データを使用して、上の曲線および下の曲線をそれぞれ作成した。図に示されるように、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合と、予後の間の相関は、化学療法を受けた患者では回復された（ＨＲ＝０．５３９、ｐ＜０．０１３）。
【図６】化学療法を受けた、図２のＲＰ乳癌コホート中の患者を使用して作成したカプラン−マイヤー再発曲線を示す図である。このサブセット中のＴＬＥ３陽性およびＴＬＥ３陰性患者から得た再発データを使用して、上の曲線および下の曲線をそれぞれ作成した。図に示されるように、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合は、このサブセットの乳癌患者の全域で、予後の改善と相関する（ＨＲ＝０．１９４、ｐ＝０．０１０）。これらの結果は、ＨＨコホートを用いた図５において得られたものと同様である。
【図７】ＣＭＦ（シクロホスファミド、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル）化学療法を受けた、図５のＨＨ乳癌コホート中の患者を使用して作成したカプラン−マイヤー再発曲線を示す図である。このサブセット中のＴＬＥ３陽性およびＴＬＥ３陰性患者から得た再発データを使用して、上の曲線および下の曲線をそれぞれ作成した。図に示されるように、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合は、このサブセットの治療された患者の全域で、予後の改善と相関する（ＨＲ＝０．３９８、ｐ＜０．０１９）。
【図８】ＣＡ（シクロホスファミドおよびアドリアマイシン）またはＣＡＦ（シクロホスファミド、アドリアマイシンおよび５−フルオロウラシル）化学療法（タキサンを伴うか、伴わない）を受けた、図５のＨＨ乳癌コホート中の患者を使用して作成したカプラン−マイヤー再発曲線を示す図である。このサブセット中のＴＬＥ３陽性およびＴＬＥ３陰性患者から得た再発データを使用して、上の曲線および下の曲線をそれぞれ作成した。図に示されるように、このサブセットの治療された患者では、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合と予後の間の相関は、有意性を失う（ＨＲ＝０．６６６、ｐ＝０．２２）。
【図９】ＣＡまたはＣＡＦ化学療法のみを受けた（すなわち、タキサンを伴わない）、図８のＨＨ乳癌コホート中の患者を使用して作成したカプラン−マイヤー再発曲線を示す図である。このサブセット中のＴＬＥ３陽性およびＴＬＥ３陰性患者から得た再発データを使用して、上の曲線および下の曲線をそれぞれ作成した。図に示されるように、このサブセットの治療された患者では、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合と予後の間には相関はない（ＨＲ＝１．０３、ｐ＝０．９５）。
【図１０】ＣＡまたはＣＡＦを、タキサンと組み合わせて受けた、図８のＨＨ乳癌コホート中の患者を使用して作成したカプラン−マイヤー再発曲線を示す図である。このサブセット中のＴＬＥ３陽性およびＴＬＥ３陰性患者から得た再発データを使用して、上の曲線および下の曲線をそれぞれ作成した。図に示されるように、このサブセットの治療された患者では、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合と予後の間の相関は回復された（ＨＲ＝０．１１４、ｐ＝０．０３８）。
【図１１】ＣＡ化学療法のみを受けた（すなわち、タキサンを伴わない）、図６のＲＰ乳癌コホート中の患者を使用して作成したカプラン−マイヤー再発曲線を示す図である。このサブセット中のＴＬＥ３陽性およびＴＬＥ３陰性患者から得た再発データを使用して、上の曲線および下の曲線をそれぞれ作成した。図に示されるように、このサブセットの治療された患者では、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合と予後の間に相関はない（ＨＲ＝０．７５９、ｐ＝０．８１）。
【図１２】ＣＡを、タキサンと組み合わせて受けた、図６のＲＰ乳癌コホート中の患者を使用して作成したカプラン−マイヤー再発曲線を示す図である。このサブセット中のＴＬＥ３陽性およびＴＬＥ３陰性患者から得た再発データを使用して、上の曲線および下の曲線をそれぞれ作成した。図に示されるように、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合は、このサブセットの治療された患者の全域で、予後の改善と相関する（ＨＲ＝０．１４２、ｐ＝０．０１１）。
【図１３】タキサンまたはＣＭＦを受けた、図６のＲＰ乳癌コホート中の患者を使用して作成したカプラン−マイヤー再発曲線を示す図である。タキサンを受けた一部の患者は、ＣＡも受けた。このサブセット中のＴＬＥ３陽性およびＴＬＥ３陰性患者から得た再発データを使用して、上の曲線および下の曲線をそれぞれ作成した。図に示されるように、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合は、このサブセットの治療された患者の全域で、予後の改善と相関する（ＨＲ＝０．１３７、ｐ＝０．０１１）。
【図１４】ネオアジュバント化学療法を受けた、図６のＲＰ乳癌コホート中の患者を使用して作成したカプラン−マイヤー再発曲線を示す図である。このサブセット中のＴＬＥ３陽性およびＴＬＥ３陰性患者から得た再発データを使用して、上の曲線および下の曲線をそれぞれ作成した。サンプルサイズは小さかったが（Ｎ＝１２）、図に示されるように、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合は、フィッシャーの正確確率検定を使用して測定した場合に、このサブセットの治療された患者の全域で、予後の改善と有意な相関を示した（ｐ＝０．００５）。
【図１５】化学療法を受けた、図６のＲＰ乳癌コホート中の患者を使用して作成したカプラン−マイヤー再発曲線を示す図である。ステージＩＩ＋（図１５）、ステージＩＩｂ＋（図１６）およびステージＩＩＩ＋（図１７）癌のＴＬＥ３陽性およびＴＬＥ３陰性患者から得た再発データを使用して、上の曲線および下の曲線をそれぞれ作成した。各場合において、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合は、これらのサブセットの治療された患者の全域で、予後の改善と相関した。図１７のサブセットでは、サンプルサイズは小さかったが（Ｎ＝１９）、フィッシャーの正確確率検定を使用して測定した場合に、有意性が得られた（ｐ＝０．０２０）。
【図１６】化学療法を受けた、図６のＲＰ乳癌コホート中の患者を使用して作成したカプラン−マイヤー再発曲線を示す図である。ステージＩＩ＋（図１５）、ステージＩＩｂ＋（図１６）およびステージＩＩＩ＋（図１７）癌のＴＬＥ３陽性およびＴＬＥ３陰性患者から得た再発データを使用して、上の曲線および下の曲線をそれぞれ作成した。各場合において、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合は、これらのサブセットの治療された患者の全域で、予後の改善と相関した。図１７のサブセットでは、サンプルサイズは小さかったが（Ｎ＝１９）、フィッシャーの正確確率検定を使用して測定した場合に、有意性が得られた（ｐ＝０．０２０）。
【図１７】化学療法を受けた、図６のＲＰ乳癌コホート中の患者を使用して作成したカプラン−マイヤー再発曲線を示す図である。ステージＩＩ＋（図１５）、ステージＩＩｂ＋（図１６）およびステージＩＩＩ＋（図１７）癌のＴＬＥ３陽性およびＴＬＥ３陰性患者から得た再発データを使用して、上の曲線および下の曲線をそれぞれ作成した。各場合において、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合は、これらのサブセットの治療された患者の全域で、予後の改善と相関した。図１７のサブセットでは、サンプルサイズは小さかったが（Ｎ＝１９）、フィッシャーの正確確率検定を使用して測定した場合に、有意性が得られた（ｐ＝０．０２０）。
【図１８】バーミンガムのアラバマ大学（ＵＡＢ）卵巣癌コホート中の患者を使用して作成したカプラン−マイヤー再発曲線を示す図である。すべての患者は、パクリタキセルを受けた。ほとんどの患者は、白金化学療法（カルボプラチンまたはシスプラチン）も受けた。このサブセット中のＴＬＥ３陽性およびＴＬＥ３陰性患者から得た再発データを使用して、上の曲線および下の曲線をそれぞれ作成した。図に示されるように、これらの治療された患者では、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合は、予後と相関した（ＨＲ＝０．６４、ｐ＜０．０４９）。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
定義
結合する−相互作用パートナーがマーカーと「結合する」場合、直接非共有結合性相互作用によって連結される。
【０００９】
癌マーカー−「癌マーカー」または「マーカー」は、癌サンプル中の検出可能である分子成分である。通常、マーカーは、遺伝子（例えば、ＴＬＥ３遺伝子）の発現を示し、癌サンプル内、例えば、癌性細胞の細胞質または膜内に存在する、および／またはこのような細胞から分泌されるポリペプチド（例えば、ＴＬＥ３タンパク質）またはポリヌクレオチド（例えば、ＴＬＥ３  ｍＲＮＡ）であり得る。
【００１０】
癌サンプル−本明細書において、用語「癌サンプル」または「サンプル」は、癌患者から（例えば、腫瘍から、血流からなど）採取された細胞または組織サンプル、身体のどこに位置していてもよい腫瘍に由来する細胞（例えば、血流中の、または転移部位の細胞）またはこのようなサンプルに由来する任意の物質を含むよう広くとられる。由来する物質は、例えば、サンプル、細胞後代などから抽出された核酸またはタンパク質を含み得る。一実施形態では、癌サンプルは、腫瘍サンプルであり得る。
【００１１】
相関−「相関」とは、ある変数が、別の変数から予測され得る程度、例えば、治療に対する癌の応答が、癌サンプル中のマーカーの発現から予測され得る程度を指す。さまざまな統計的手法、例えば、限定するものではないが、スチューデントのｔ検定、フィッシャーの正確確率検定、ピアソン相関係数、スピアマン相関係数、カイ二乗検定などを使用して、２つの変数の間の相関を測定してよい。結果は、従来、相関が偶然に起きたという尤度の尺度を提供するｐ値を有する、測定された相関係数として与えられる。０．０５未満のｐ値を有する相関は、通常、統計的に有意であると考えられる。好ましい相関は、０．０１未満、特に、０．００１未満であるｐ値を有する。
【００１２】
ハイブリダイズされた−本明細書において記載されるように、プライマーおよびマーカーが、互いに物理的に「ハイブリダイズされる」場合、それらは、塩基対相互作用によって非共有結合的に連結している。
【００１３】
相互作用パートナー−「相互作用パートナー」とは、ポリペプチドマーカーを結合する成分である。例えば、限定するものではないが、相互作用パートナーは、マーカーを結合する抗体またはその断片であり得る。一般に、相互作用パートナーは、検出可能なレベルでマーカーと結合し、同様の条件下では、無関係の分子成分（例えば、その他のマーカー）と検出可能には結合しない場合に、マーカーと「特異的に結合する」といわれる。マーカーと相互作用パートナーの間の特異的会合は、通常、相互作用パートナーによって認識される抗原決定基またはエピトープなどの標的マーカーの特定の構造的特徴の存在に応じて変わる。一般に、特異性は、絶対的なものである必要はないということは理解されるべきである。例えば、抗体は、標的エピトープの他に、その他のエピトープと頻繁に交差反応するということは当技術分野では周知である。このような交差反応性は、相互作用パートナーが使用される予定である適用に応じて、許容され得る。したがって、相互作用パートナーの特異性の程度は、使用されている状況に応じて変わる。一般に、相互作用パートナーは、そのパートナーとの結合を、その他の可能性あるパートナー、例えば、その他のマーカーとの結合を上回って好む場合に、特定のマーカーに対して特異性を示す。当業者ならば、任意の所与の適用（例えば、標的マーカーの検出のために、治療目的のためなど）において、適宜機能するのに十分な程度の特異性を有する相互作用パートナーを選択できるであろう。また、特異性は、標的マーカーに対する相互作用パートナーの親和性対その他の可能性あるパートナー、例えば、その他のマーカーに対する相互作用パートナーの親和性など、さらなる因子の関連で評価され得るということも理解されるべきである。相互作用パートナーが、標的マーカーに対して高親和性を、非標的分子に対して低親和性を示す場合には、相互作用パートナーは、特異性を欠く場合であっても、診断目的のための許容される試薬である可能性が高い。
【００１４】
プライマー−「プライマー」とは、ポリヌクレオチドマーカーと物理的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド成分である。一般に、プライマーは、検出可能なレベルでマーカーとハイブリダイズし、同様の条件下では、無関係の分子成分（例えば、その他のマーカー）と検出可能にはハイブリダイズしない場合に、マーカーと「特異的にハイブリダイズする」といわれる。マーカーとプライマー間の特定のハイブリダイゼーションは、通常、プライマーのヌクレオチド配列と相補的である、標的マーカーの特定のヌクレオチド配列の存在に応じて変わる。一般に、特異性は、絶対的なものである必要はないということは理解されるべきである。プライマーの特異性の程度は、使用されている状況に応じて変わる。一般に、プライマーは、そのパートナーとのハイブリダイゼーションを、その他の可能性あるパートナー、例えば、その他のマーカーとのハイブリダイゼーションを上回って好む場合に、特定のマーカーに対して特異性を示す。当業者ならば、任意の所与の適用において、適宜機能するのに十分な程度の特異性を有するプライマーを選択できるであろう。また、特異性は、標的マーカーに対するプライマーの親和性対その他の可能性あるパートナー、例えば、その他のマーカーに対するプライマーの親和性など、さらなる因子の関連で評価され得るということも理解されるべきである。プライマーが、標的マーカーに対して高親和性を、非標的分子に対して低親和性を示す場合に、プライマーは、特異性を欠く場合であっても、診断目的のための許容される試薬である可能性が高い。
【００１５】
応答−治療に対する癌の「応答」は、例えば、分子、細胞、オルガネラまたは生物レベルで任意の検出可能な変化を表し得る。例えば、腫瘍の大きさ、患者平均余命、再発または患者が生存する時間の長さなどは、すべて応答である。応答は、例えば、腫瘍の大きさの非侵襲性の測定（例えば、ＣＴスキャン、画像強調可視化など）、腫瘍の大きさの侵襲性の測定（例えば、残存腫瘍切除など）、代理マーカー測定（例えば、血清ＰＳＡなど）、臨床経過の変動（例えば、患者の生活の質の測定、再発までの時間、生存時間など）をはじめ、さまざまな方法のいずれで測定してもよい。
【００１６】
小分子−「小分子」は、非ポリマー分子である。小分子は、実験室で合成でき（例えば、コンビナトリアル合成によって）、または天然に見出され得る（例えば、天然物）。小分子は、通常、いくつかの炭素−炭素結合を含み、約１５００Ｄａ未満の分子量を有することを特徴とするが、この特徴は、本発明の目的にとって制限であると意図されるものではない。
【００１７】
本発明の特定の好ましい実施形態の詳細な説明
上記のように、本発明者らは、癌サンプル中のＴＬＥ３（スプリット３のトランスデューシン様エンハンサー、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ７０９０）の発現と、化学療法に対する癌の応答の間の相関を同定した。実施例に記載のとおり、この相関は、ＴＬＥ３抗体と、既知の転帰を有する、治療された患者および治療されていない患者の両方を含む２つの乳癌コホートから得たサンプルを使用して実証された。本発明者らはまた、この予測モデルが、治療された卵巣癌患者のコホートから得たサンプルに適用した場合にも一致することを示した。本発明者らはまた、特定の種類の化学療法、例えば、細胞周期特異的化学療法薬、例えば、メトトレキサートおよびタキサンの投与を含む治療に対する応答を予測するためのＴＬＥ３の有用性を実証した。これらの化学療法薬は、種々の癌の種類の全域で既知有用性を有するので、これらの結果は、本発明の方法はまた、種々の癌の種類の全域で、それらの有効性を予測することにおいて有用であろうと示唆する。
【００１８】
化学療法に対する応答を予測することおよび化学療法を選択すること
一態様では、本発明は、ＴＬＥ３を、患者の癌が、化学療法に対して応答する見込みを予測するためのマーカーとして使用する方法を提供する。概して、これらの方法は、癌患者由来の癌サンプルを提供すること、癌サンプル中でＴＬＥ３が発現されるか否かを測定すること、および測定するステップの結果に基づいて、患者の癌が化学療法に対して応答する見込みを予測することを含む。一実施形態では、予測するステップは、癌サンプル中のＴＬＥ３発現の存在に基づいて、患者の癌が化学療法に対して応答する可能性が高いと予測することを含む。一実施形態では、予測するステップは、癌サンプル中にＴＬＥ３発現がないことに基づいて、患者の癌が化学療法に対して応答する可能性が低いと予測することを含む。
【００１９】
特定の実施形態では、陰性対照サンプルが提供され、測定するステップは、癌サンプルおよび陰性対照サンプル中のＴＬＥ３発現のレベルを検出することならびに癌サンプルおよび陰性対照サンプル中のＴＬＥ３の発現のレベルを比較することを含む。一般に、陰性対照サンプルは、ＴＬＥ３を再現性よく発現しない任意のサンプルであり得る。一実施形態では、陰性対照サンプルは、ＴＬＥ３抗体を再現性よく結合しないサンプルであり得る。一実施形態では、陰性対照サンプルは、検出可能なレベルのＴＬＥ３  ｍＲＮＡを再現性よく産生しないサンプルであり得る。一実施形態では、陰性対照サンプルは、ＴＬＥ３陰性癌を有する患者から得られる。一実施形態では、陰性対照サンプルは、癌を有さない患者から得られる。特定の実施形態では、陰性対照サンプルは、問題の癌と同じ組織種（例えば、乳癌を考慮する場合には、乳房組織）が起源であり得る。その他の実施形態では、陰性対照サンプルは、異なる組織種、または異なる生物でさえ、または細胞株が起源であり得る。
【００２０】
さらに、またはあるいは、特定の実施形態では、陽性対照サンプルが提供され、測定するステップは、癌サンプルおよび陽性対照サンプル中のＴＬＥ３発現のレベルを検出することならびに癌サンプルおよび陽性対照サンプル中のＴＬＥ３の発現のレベルを比較することを含む。一般に、陽性対照サンプルは、ＴＬＥ３を再現性よく発現する任意のサンプルであり得る。一実施形態では、陰性対照サンプルは、ＴＬＥ３抗体を再現性よく結合する任意のサンプルであり得る。一実施形態では、陰性対照サンプルは、検出可能なレベルのＴＬＥ３ｍＲＮＡを再現性よく産生するサンプルであり得る。一実施形態では、陽性対照サンプルは、ＴＬＥ３陽性癌を有する患者から得られる。特定の実施形態では、陽性対照サンプルは、問題の癌と同じ組織種（例えば、乳癌を考慮する場合には、乳房組織）が起源であり得る。その他の実施形態では、陽性対照サンプルは、異なる組織種、または異なる生物でさえ、または細胞株が起源であり得る。
【００２１】
ＴＬＥ３の発現は、任意の既知法を使用して調べることができる。
【００２２】
一実施形態では、ＴＬＥ３ポリペプチドは、ＴＬＥ３ポリペプチド（例えば、ＴＬＥ３タンパク質またはその抗原性断片）を結合する相互作用パートナーを使用して検出できる。例えば、以下に記載されるように、ＴＬＥ３抗体を、相互作用パートナーとして使用し、癌サンプルを、ＴＬＥ３抗体と接触させることによってＴＬＥ３発現を検出し得る。このような実施形態では、本発明の方法は、癌患者由来の癌サンプルを提供すること、癌サンプルをＴＬＥ３に向けられた抗体と接触させることおよび抗体の癌サンプルとの結合に基づいて、患者の癌が化学療法に対して応答する見込みを予測することを含み得る。一実施形態では、予測するステップは、抗体の癌サンプルとの結合に基づいて、患者の癌が化学療法に対して応答する可能性が高いと予測することを含み得る。別の実施形態では、予測するステップは、抗体の癌サンプルとの結合がないことに基づいて、患者の癌が化学療法に対して応答する可能性が低いと予測することを含み得る。
【００２３】
別の実施形態では、ＴＬＥ３ポリヌクレオチドは、ＴＬＥ３ポリヌクレオチド（例えば、ＴＬＥ３  ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ）とハイブリダイズする、１種以上のプライマーを使用して検出できる。このような実施形態では、本発明の方法は、癌患者由来の癌サンプルを提供すること、癌サンプルを、ＴＬＥ３とハイブリダイズする、１種以上のプライマーと接触させること、および１種以上のプライマーの癌サンプルとのハイブリダイゼーションに基づいて、患者の癌が化学療法に対して応答する見込みを予測することを含み得る。一実施形態では、予測するステップは、１種以上のプライマーの癌サンプルとのハイブリダイゼーションに基づいて、患者の癌が化学療法に対して応答する可能性が高いと予測することを含み得る。別の実施形態では、予測するステップは、１種以上のプライマーの癌サンプルとのハイブリダイゼーションがないことに基づいて、患者の癌が化学療法に対して応答する可能性が低いと予測することを含み得る。
【００２４】
別の態様では、本発明は、患者の癌が化学療法に対して応答するという見込みに基づいて、癌患者に、化学療法を投与するか否かを決定する方法を提供する。一実施形態では、決定するステップは、癌サンプル中のＴＬＥ３発現の存在に基づいて、癌患者に、化学療法を投与すると決定することを含む。一実施形態では、決定するステップは、癌サンプル中にＴＬＥ３発現がないことに基づいて、癌患者に、化学療法を投与しないと決定することを含む。
【００２５】
さらに別の態様では、本発明は、癌患者のための化学療法を選択するための方法を提供する。概して、これらの方法は、癌患者由来の癌サンプルを提供すること、癌サンプル中でＴＬＥ３が発現されるか否かを測定することおよび測定するステップの結果に基づいて、癌患者のための化学療法を選択することを含む。一実施形態では、選択するステップは、癌サンプル中のＴＬＥ３発現の存在に基づいて化学療法を選択することを含む。
【００２６】
実施例に記載されるように、本発明者らは、ＴＬＥ３発現がメトトレキサート（図７参照のこと）およびタキサン（図１０、１２および１３参照のこと）を用いる化学療法に対する応答と相関することを実証した。メトトレキサートおよびタキサンは、細胞周期特異的化学療法薬であると考えられている（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＩＸ．  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ第５１章。Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ、第１１版、編集主幹Ｌａｕｒｅｎｃｅ  Ｌ．Ｂｒｕｎｔｏｎ、編集者Ｊｏｈｎ  Ｓ．Ｌａｚｏおよび共同編集者Ｋｅｉｔｈ  Ｌ．Ｐａｒｋｅｒ参照のこと）。細胞周期特異的化学療法薬は、静止相（Ｇ０）を含めたすべての相について等しく働く非細胞周期特異的化学療法薬とは対照的に、細胞周期の特定の相内でその作用機序を示す。メトトレキサートの他に、その他の代謝拮抗薬が分類されているのと同じように、タキサンの他に、その他の植物アルカロイドも文献で細胞周期特異的化学療法薬として分類されている。対照的に、シスプラチンおよびシクロホサミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓａｍｉｄｅ）などの多数のアルキル化剤は、非細胞周期特異的化学療法薬として分類されている。本発明者らの結果は、ＴＬＥ３の予測力は、メトトレキサートおよびタキサンの他に、その他の細胞周期特異的化学療法薬に及び得ることを示唆する。
【００２７】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法を使用して細胞周期特異的化学療法薬を選択してよい、または投与するか否かを決定してよい。一実施形態では、本発明の方法を使用して、代謝拮抗物質を選択してよい、または投与するか否かを決定してよい。一実施形態では、本発明の方法を使用して、植物アルカロイドを選択してよい、または投与するか否かを決定してよい。一実施形態では、本発明の方法を使用して、メトトレキサートを選択してよい、または投与するか否かを決定してよい。別の実施形態では、本発明の方法を使用して、タキサンを選択してよい、または投与するか否かを決定してよい。一実施形態では、タキサンはパクリタキセルである。一実施形態では、タキサンはドセタキセルである。
【００２８】
各場合において、当然のことではあるが、これらの化学療法薬は、単独で、または当技術分野で公知であり、以下に論じられるようなその他の化学療法薬と組み合わせて投与してよい。また、当然のことながら、本発明は、選択された化学療法薬が、メトトレキサートまたはタキサン誘導体、すなわち、メトトレキサートまたはタキサンから誘導される構造を有する化合物である方法を包含する。誘導体は、通常、親化合物の構造のほとんどを共有するが、異なる置換基、ヘテロ原子、環融合物、飽和レベル、異性、立体異性などを親化合物内の１以上の位置に含み得る。制限するものではないが、以下の米国特許は、本発明の方法に従って使用できる例示的メトトレキサート誘導体の調製を記載している：米国特許第６，５５９，１４９号および同４，３７４，９８７号。制限するものではないが、以下の米国特許は、本発明の方法に従って使用できる例示的タキサン誘導体の調製を記載している：米国特許第７，０７４，９４５号、同７，０６３，９７７号、同６，９０６，１０１号、同６，６４９，７７８号、同６，５９６，８８０号、同６，５５２，２０５号、同６，５３１，６１１号、同６，４８２，９６３号、同６，４８２，８５０号、同６，４６２，２０８号、同６，４５５，５７５号、同６，４４１，０２６号、同６，４３３，１８０号、同６，３９２，０６３号、同６，３６９，２４４号、同６，３３９，１６４号、同６，２９１，６９０号、同６，２６８，３８１号、同６，２３９，１６７号、同６，２１８，５５３号、同６，２１４，８６３号、同６，２０１，１４０号、同６，１９１，２９０号、同６，１８７，９１６号、同６，１６２，９２０号、同６，１４７，２３４号、同６，１３６，８０８号、同６，１１４，５５０号、同６，１０７，３３２号、同６，０５１，６００号、同６，０２５，３８５号、同６，０１１，０５６号、同５，９５５，４８９号、同５，９３９，５６７号、同５，９１２，２６３号、同５，９０８，８３５号、同５，８６９，６８０号、同５，８６１，５１５号、同５，８２１，２６３号、同５，７６３，４７７号、同５，７５０，５６１号、同５，７２８，６８７号、同５，７２６，３４６号、同５，７２６，３１８号、同５，７２１，２６８号、同５，７１９，１７７号、同５，７１４，５１３号、同５，７１４，５１２号、同５，７０３，１１７号、同５，６９８，５８２号、同５，６８６，６２３号、同５，６７７，４６２号、同５，６４６，１７６号、同５，６３７，７２３号、同５，６２１，１２１号、同５，６１６，７３９号、同５，６０６，０８３号、同５，５８０，８９９号、同５，４７６，９５４号、同５，４０３，８５８号、同５，３８０，９１６号、同５，２５４，７０３号および同５，２５０，７２２号。前記の特許の各々および本明細書に列挙される任意のその他の参考文献の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２９】
メトトレキサートは、葉酸の代謝を阻害することによって作用し、膀胱癌、乳癌、胃癌、絨毛癌、頭頸部癌、軟膜癌、白血病（急性髄膜性、急性リンパ芽球性、急性リンパ性）、リンパ腫（バーキット、小児、非ホジキン）、菌状息肉腫、原発不明癌およびリンパ肉腫の治療のために承認されている（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ  ｉｎ  ＢＣ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｃｙ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｍａｎｕａｌ、２００７）。メトトレキサートはまた、食道癌、肺癌および精巣癌を治療するために有用であるとわかっている（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ  ｉｎ  ＵｐＴｏＤａｔｅ、２００７）。特定の実施形態では、本発明の方法は、１種以上のさらなる化学療法薬と組み合わせたメトトレキサートを選択するか、または投与するか否かを決定するステップを含む。例えば、メトトレキサートは、癌患者に、シクロホスファミドおよび５−フルオロウラシルも含むＣＭＦと呼ばれる組合せとしてよく投与される。
【００３０】
タキサンは、イチイ属の植物によって産生されるジテルペンである。タキサンは、天然供給源から得られ場合も、合成によって製造される場合もある。タキサンとして、パクリタキセル（タキソール（商標））およびドセタキセル（タキソテール（商標））が挙げられる。タキサンは、細胞分裂の間の正常な微小管成長を干渉することによって働く。特定の実施形態では、本発明の方法は、１種以上のさらなる化学療法薬と組み合わせたタキサン（例えば、パクリタキセルまたはドセタキセル）を選択するか、または投与するか否かを決定するステップを含む。例えば、タキサンは、癌患者に、シクロホスファミドおよびアドリアマイシン（ドキソルビシン）および場合により５−フルオロウラシルと組み合わせて（すなわち、ＣＡまたはＣＡＦとともに）よく投与される。
【００３１】
パクリタキセルは、乳癌、カポジ肉腫、肺癌および卵巣癌の治療のために承認されている（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｉｎ  ＢＣ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｃｙ  ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｍａｎｕａｌ、２００７ならびにＭｅｋｈａｉｌおよびＭａｒｋｍａｎ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．３：７５５−６６、２００２）。パクリタキセルはまた、子宮頸癌（ＡＨＦＳ  ２００５  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ−Ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ、２００５中、ｐｐ．１１２４−３４）、子宮内膜癌（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｉｎ  ＢＣ  ＣａｎｃｅｒＡｇｅｎｃｙ  ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇ  Ｍａｎｕａｌ、２００７）、膀胱癌（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｉｎ  ＵｐＴｏＤａｔｅ、２００７）、頭頸部癌（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｉｎ  ＵｐＴｏＤａｔｅ、２００７）、白血病（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｉｎ  ＵｐＴｏＤａｔｅ、２００７）および悪性黒色腫（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｉｎ  ＵｐＴｏＤａｔｅ、２００７）の治療において有用であるとわかっている。パクリタキセルの副作用として、顔の紅潮、皮疹または息切れなどの過敏症反応が挙げられる。患者は、過敏症反応を防ぐよう投薬を受け、その後、パクリタキセルを摂取することが多い。パクリタキセルはまた、骨髄に対する一時的な損傷を引き起こし得る。骨髄損傷により、人は、感染、貧血および挫傷または容易に出血することに対して感受性がより高くなる。その他の副作用として、上肢または下肢における関節または筋肉痛、下痢、悪心および嘔吐、しびれ、灼熱または手もしくは足における刺痛および脱毛を挙げることができる。
【００３２】
ドセタキセルは、乳癌（Ａａｐｒｏ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２５（５  Ｓｕｐｐｌ  １２）：７−１１、１９９８、Ｎａｂｈｏｌｔｚら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １７（５）：１４１３−２４、１９９９、Ｓｊｏｓｔｒｏｍら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ３５（８）：１１９４−２０１、１９９９およびＢｕｒｓｔｅｉｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １８（６）：１２１２−９、２０００）、非小細胞肺癌（Ｆｏｓｓｅｌｌａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １８（１２）：２３５４−６２、２０００およびＨａｉｎｓｗｏｒｔｈら、Ｃａｎｃｅｒ  ８９（２）：３２８−３３、２０００）および卵巣癌（Ｋａｙｅら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ３３（１３）：２１６７−７０、１９９７）の治療のために承認されている。ドセタキセルはまた、エソテリオーマ（ｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ）（Ｖｏｒｏｂｉｏｆら、Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９：５７８ａ、２０００）、前立腺癌（Ｐｉｃｕｓら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２６（５  Ｓｕｐｐｌ  １７）：１４−８、１９９９およびＰｅｔｒｙｌａｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １７（３）：９５８−６７、１９９９）、尿路上皮移行上皮癌（Ｄｉｍｏｐｏｕｌｏｓら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １０（１１）：１３８５−８、１９９９およびＰｅｃｔａｓｉｄｅｓら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ３６（１）：７４−９、２０００）、頭頸部癌（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ  ｉｎ  ＵＳＰ  ＤＩ、２０００およびＣｏｕｔｅａｕら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ８１（３）：４５７−６２、１９９９）および小細胞肺癌（Ｓｍｙｔｈら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ３０Ａ（８）：１０５８−６０、１９９４）の治療において有用であることがわかっている。
【００３３】
ＴＬＥ３陽性である乳癌および卵巣癌患者の両方について化学療法に対する応答の改善が観察されるという本発明者らの観察結果は、本発明の方法は、種々の癌の種類の全域で有用であり得るということを示唆する。ＴＬＥ３発現は、メトトレキサートおよびタキサンを用いた治療に対する応答の改善と関係しているという本発明者らの観察結果は、本発明の方法は、これらの化学療法薬に応答した癌全体に適用可能であるということをさらに示唆する。上記で論じたように、このようなものとして、制限するものではないが、乳癌、卵巣癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、頭頸部癌および白血病が挙げられる。
【００３４】
一実施形態では、本発明の方法を、乳癌を有する癌患者とともに使用してよい。一実施形態では、本発明の方法を、卵巣癌を有する癌患者とともに使用してよい。一実施形態では、本発明の方法を、肺癌を有する癌患者とともに使用してよい。一実施形態では、本発明の方法を、膀胱癌を有する癌患者とともに使用してよい。一実施形態では、本発明の方法を、胃癌を有する癌患者とともに使用してよい。一実施形態では、本発明の方法を、頭頸部癌を有する癌患者とともに使用してよい。一実施形態では、本発明の方法を、白血病を有する癌患者とともに使用してよい。
【００３５】
実施例において実証されるように、一実施形態では、ＥＲ（エストロゲン受容体、Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤ  ２０９９）、ＰＲ（プロゲステロン受容体、Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤ  ５２４１）およびＨＥＲ−２マーカー（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ２、Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤ  ２０６４）について三重陰性である乳癌患者を用いて、ＴＬＥ３発現と化学療法に対する応答の間の相関が観察された。したがって、特定の実施形態では、本発明の方法を、このクラスに属する乳癌患者とともに使用してよい。
【００３６】
実施例において実証されるように、治療が、ネオアジュバント設定において投与される場合に、ＴＬＥ３発現と化学療法に対する応答の間の相関が同様に存在するとわかった。したがって、特定の実施形態では、本発明の方法を、ネオアジュバント設定で化学療法を投与されている患者とともに使用してよい。その他の実施形態では、アジュバント設定で化学療法を投与してよい。
【００３７】
実施例において実証されるように、ＴＬＥ３発現と化学療法に対する応答の間の相関はまた、ステージとは無関係であるとわかった。したがって、特定の実施形態では、本発明の方法を、ステージＩＩ＋（すなわち、ステージＩＩ以上）の癌を有する患者とともに使用してよい。特定の実施形態では、本発明の方法を、ステージＩＩｂ＋またはステージＩＩＩ＋の癌を有する患者とともに使用してよい。
【００３８】
ＴＬＥ３発現の検出
上記のように、ＴＬＥ３の発現は、任意の既知法を使用して調べることができる。一実施形態では、ＴＬＥ３発現は、相互作用パートナー（例えば、抗体）を使用してＴＬＥ３ポリペプチドマーカーを検出することによって調べてもよい。別の実施形態では、ＴＬＥ３発現は、プライマーを用いてＴＬＥ３ポリヌクレオチドマーカーを検出することによって調べてもよい。
【００３９】
ＴＬＥ３ポリペプチドマーカーを検出すること
ＴＬＥ３ポリペプチドマーカーは、ＴＬＥ３ポリペプチドマーカー（ＴＬＥ３タンパク質またはその抗原性断片であり得る）を結合する任意の相互作用パートナーを使用して検出してもよい。したがって、本発明に従って、親和性および特異性の適当な組み合わせでマーカーを結合する限り、相互作用パートナーとして、ＴＬＥ３マーカーを検出可能に結合する任意の成分を利用してよい。
【００４０】
特に好ましい相互作用パートナーは、抗体または断片（例えば、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片またはｓＦｖ断片などであり、例えば、参照により各々本明細書に組み込まれる、Ｉｎｂａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２６５９、１９７２、Ｈｏｃｈｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １５：２７０６、１９７６およびＥｈｒｌｉｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９：４０９１、１９８０、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９、１９９８、Ｈｕｓｔｏｎらの米国特許第５，０９１，５１３号および同５，１３２，４０５号ならびにＬａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。特定の実施形態では、相互作用パートナーは、変異株抗体（またはその断片）のライブラリーから選択され得る。例えば、各々、種々の点突然変異を含む抗体の収集物を、その注目するマーカーとの関係についてスクリーニングすればよい。なおさらに、キメラ抗体、例えば、以下により詳細に記載される「ヒト化」または「ベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）」抗体を相互作用パートナーとして使用してもよい。
【００４１】
相互作用パートナーとして抗体が使用される場合には、これらは、当業者に公知のさまざまな技術のいずれによって調製してもよい（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８参照のこと、また、実施例も参照のこと）。例えば、抗体は、モノクローナル抗体の作製をはじめとする細胞培養技術によって、または組換え抗体の製造を見越した、適した細菌または哺乳類細胞宿主への抗体遺伝子のトランスフェクションを介して製造してもよい。一技術では、注目するマーカーの抗原性部分（またはマーカー自体）を含む「免疫原」を、さまざまな哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギ）のいずれかに最初に注射する。このステップでは、マーカー（またはその抗原性部分）は、修飾を伴わずに免疫原として働く。あるいは、特に、比較的短いマーカーについては、マーカーが、担体タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と連結される場合に、優れた免疫応答が誘発され得る。免疫原を、動物宿主中に、好ましくは、１回以上のブースター免役化を組み込む所定のスケジュールに従って注射し、動物を定期的に出血させる。次いで、例えば、適した固体支持体にカップリングされたマーカー（またはその抗原性部分）を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、このような抗血清から、マーカーに特異的なポリクローナル抗体を精製してもよい。実施例に例示的方法が記載されている。
【００４２】
必要に応じて、診断または治療目的のために、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１、１９７６の技術およびその改善物を使用して、ＴＬＥ３に特異的なモノクローナル抗体を調製してもよい。要するに、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、注目するマーカーとの反応性）を有する抗体を産生できる不死細胞株の調製を含む。このような細胞株は、例えば、上記のように免役化された動物から得られた脾臓細胞から製造してもよい。次いで、例えば、骨髄腫細胞融合パートナー、好ましくは、免役化された動物と同系であるものとの融合によって脾臓細胞を不死化する。さまざまな融合技術を使用してよい。例えば、脾臓細胞および骨髄腫細胞を、非イオン性界面活性剤と数分間組み合わせ、次いで、ハイブリッド細胞の増殖を支援するが、骨髄細胞は支援しない、選択培地に低密度でプレーティングしてもよい。好ましい選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間、通常、約１〜２週間の後、ハイブリッドのコロニーを観察する。単一コロニーを選択し、それらの培養上清を、マーカーに対する結合活性について調べる。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
【００４３】
モノクローナル抗体は、増殖しているハイブリドーマコロニーの上清から単離してもよい。さらに、収率を高めるために、適した脊椎動物宿主、例えば、マウスの腹膜腔中へのハイブリドーマ細胞株の注射など種々の技術を用いてもよい。次いで、モノクローナル抗体を、腹水または血液から回収すればよい。汚染物質は、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿および抽出などの従来技術によって抗体から除去すればよい。ＴＬＥ３は、精製工程において、例えば、アフィニティークロマトグラフィーステップにおいて使用してよい。
【００４４】
本発明は、相互作用パートナーとして抗体または抗体断片を使用することに限定されないということは理解されるべきである。特に、本発明はまた、抗体の機能を模倣する合成相互作用パートナーの使用を包含する。抗体模倣物を設計および／または同定するいくつかのアプローチが提案され、実証されている（例えば、Ｈｓｉｅｈ−Ｗｉｌｓｏｎらによる総説、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．  ２９：１６４、２０００ならびにＰｅｃｚｕｈおよびＨａｍｉｌｔｏｎ、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１００：２４７９、２０００参照のこと）。例えば、天然タンパク質のものと同様の様式でタンパク質表面と結合する小分子が、小分子の合成ライブラリーまたは天然物単離物をスクリーニングすることによって同定されている（例えば、Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３、１９９４、Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１３８５、１９９４、ＤｅＷｉｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９、１９９３、Ｂｕｎｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：４７０８、１９９４、ＶｉｒｇｉｌｉｏおよびＥｌｌｍａｎ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：１１５８０、１９９４、Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：２９９５、１９９５ならびにＫｉｃｋおよびＥｌｌｍａｎ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：１４２７、１９９５参照のこと）。同様に、コンビナトリアルアプローチが、ペプチドおよびタンパク質のライブラリーを、その幅広いタンパク質と結合する能力についてスクリーニングするために成功裏に適用されている（例えば、Ｃｕｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１８６５、１９９２、Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：９０２２、１９９４、ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６、１９９０、Ｄｅｖｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４、１９９０、Ｃｏｒｅｙら、Ｇｅｎｅ  １２８：１２９、１９９３、Ｂｒａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３１：５８１１、１９９０、Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７、１９９１、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４、１９９１、Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２、１９９１、ＢｌａｋｅおよびＬｉｔｚｉ−Ｄａｖｉｓ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：５１０、１９９２、Ｎｅｅｄｅｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：１０７００、１９９３ならびにＯｈｌｍｅｙｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：１０９２２、１９９３参照のこと）。同様のアプローチがまた、炭水化物−タンパク質相互作用（例えば、Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：５３９３、１９９２参照のこと）およびポリヌクレオチド−タンパク質相互作用（例えば、ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：８１８、１９９０ならびにＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：５０５、１９９０参照のこと）を研究するために使用されてきた。これらのアプローチは��た、タンパク質と、オリゴカルバメート、オリゴ尿素、オリゴスルホンなどといった天然バイオポリマーの間の相互作用を研究するために拡張されてきた（例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１０６４６、１９９２、Ｓｉｍｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：９３６７、１９９２、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８、１９９４、Ｂｕｒｇｅｓｓら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．、Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３４：９０７、１９９５およびＣｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３、１９９３参照のこと）。なおさらに、抗体分子の基礎フォールドに大まかに基づいている代替タンパク質足場が示唆されており、本発明の相互作用パートナーの調製において使用してもよい（例えば、ＫｕおよびＳｃｈｕｌｔｚ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：６５５２、１９９５参照のこと）。３−アミノメチル安息香酸などの小分子と、単一ペプチドループからなる置換基の足場を含む抗体模倣物も構築されている。ペプチドループは、これらの模倣物において結合機能を遂行する（例えば、Ｓｍｙｔｈｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２７２５、１９９４参照のこと）。カリックスアレーンユニットを中心に構築された、多数のペプチドループを含む合成抗体模倣物も記載されている（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎらの米国特許第５，７７０，３８０号参照のこと）。
【００４５】
相互作用パートナーとＴＬＥ３マーカー間の関係を検出するために、任意の利用可能な戦略またはシステムを利用してよい。特定の実施形態では、会合は、相互作用パートナーに検出可能な標識を加えることによって検出してもよい。その他の実施形態では、会合は、抗原／抗体検出の技術分野では周知であるように、一次相互作用パートナーと特異的に結合する、標識された二次相互作用パートナーを使用することによって検出してもよい。検出可能な標識は、直接的に検出可能であってもよく、例えば、シグナル生成システムの１種以上のさらなるメンバーとの組み合わせ作用によって間接的に検出可能であってもよい。直接的に検出可能な標識の例として、放射活性、常磁性、蛍光、光散乱、吸収性および比色標識が挙げられる。間接的に検出可能な例として、化学発光標識、例えば、基質を発色性生成物に変換することができる酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼなどが挙げられる。
【００４６】
標識された相互作用パートナーがＴＬＥ３マーカーと結合すると、さまざまな方法で複合体を可視化または検出してよく、特定の検出様式が、特定の検出可能な標識に基づいて選択され、ここで、代表的な検出手段として、例えば、シンチレーション計数、オートラジオグラフィー、常磁性の測定、蛍光測定、光吸収測定、光散乱の測定などが挙げられる。
【００４７】
一般に、相互作用パートナーとＴＬＥ３マーカーの間の関係は、相互作用パートナーを、マーカーを含む癌サンプルと接触させることによってアッセイしてもよい。サンプルの性質に応じて、適当な方法として、それだけには限らないが、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ラジオイムノアッセイ、放射性免疫測定法、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット法および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。組織サンプル、例えば、生検サンプルにおいて、タンパク質が検出される予定である場合には、ＩＨＣが特に適当な検出方法である。組織および細胞サンプルを得、ＩＨＣおよびＦＡＣＳを遂行するための技術は、当技術分野で周知である。
【００４８】
多数のサンプルが取り扱われる予定である場合は（例えば、同一の患者から得たいくつかのサンプルまたは異なる患者から得たサンプルを同時に分析する場合には）、配列された、および／または自動化された形式を利用することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、実施例に記載される組織アレイを使用してよい。組織アレイは、さまざまな技術に従って構築してよい。一手順によれば、市販の機械装置（例えば、Ｂｅｅｃｈｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｕｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ、ＷＩ製の手動組織アレイヤーＭＴＡ１）を使用して、各患者から調製したパラフィンブロック（ドナーブロック）から、０．６ミクロンの直径の、全層「コア」を採取し、このコアを、グリッド上の設計された位置の別個のパラフィンブロック（レシピエントブロック）に挿入する。好ましい実施形態では、約４００人もの数の患者から得たコア（または同一の患者から得た複数のコア）を、単一のレシピエントブロック中に挿入してもよく、コア間間隔は約１ｍｍであることが好ましい。得られた組織アレイを、パラフィン包埋材料に適用可能な標準法に従って、相互作用パートナーでの染色のために薄切片に加工してもよい。
【００４９】
どんな形式であれ、どんな検出戦略であれ、識別力価の同定は、相互作用パートナーを使用することの望ましさを評価するための結合研究を簡略化できる。このような研究では、相互作用パートナーを、好ましくは、少なくとも１つの共通の特色（例えば、起源の組織）を有し、複数の共通の特色（例えば、起源の組織、ステージ、顕微鏡的特徴など）を有することが多い複数の異なるサンプルと接触させる。いくつかの場合には、異なる特色を識別する力価が決定されるよう、少なくとも１つの共通の特色および少なくとも１つの異なる特色を有するサンプルの群を選択することが望ましい。その他の場合には、これまでは識別不可能なサンプル間を識別する力価が決定されるよう、検出可能な異なる特色を有さないサンプルの群を選択することが望ましい。しかし、当業者ならば、本発明は、さまざまな程度の類似性および相違を有するサンプル収集物の研究においてでさえ、これらの目標の両方が達成されることを可能にすることが多いということを理解するであろう。
【００５０】
上記で、および実施例において論じられるように、本発明者らは、これらの技術を乳癌および卵巣癌患者から得たサンプルに適用した。本発明はまた、それらが産生される細胞から分泌されるマーカーが、血清中に存在し得、それによって、生検組織を必要とするのではなく血液検査によってそれらの検出が可能になるという認識を包含する。このようなマーカーと結合する相互作用パートナーは、本発明の特に好ましい実施形態に相当する。
【００５１】
一般に、このようなアッセイの結果は、さまざまな形式のいずれかで提示され得る。結果は、定性的な様式で提示され得る。例えば、試験報告は、ＴＬＥ３マーカーが検出されるか否かだけを、ことによると、検出限界を示すものも示し得る。さらに、試験報告は、結合の細胞内局在、例えば、核対細胞質および／またはこれらの異なる細胞内局在における結合の相対レベルを示し得る。結果は、半定量的様式で提示され得る。例えば、種々の範囲を定義してよく、範囲に、特定の程度の量的情報を提供するスコア（例えば、０〜５）を割り当ててもよい。このようなスコアは、種々の因子、例えば、マーカーが検出される細胞の数、シグナルの強度（マーカーの発現のレベルを示し得る）などを反映し得る。結果は、例えば、マーカーが検出される細胞のパーセンテージとして、濃度としてなど、量的様式で提示され得る。当業者には当然のことであろうが、試験によって提供される結果の種類は、試験の技術的な限界およびマーカーの検出に伴われる生物学的重要性に応じて変わる。例えば、特定の状況では、純粋に定性的結果（例えば、特定の検出レベルでマーカーが検出されるか否か）が、重要な情報を提供する。その他の場合には、より定量的結果（例えば、２種のサンプル中のマーカーの発現のレベルの比）が必要である。
【００５２】
ＴＬＥ３ポリヌクレオチドマーカーを検出すること
多くの場合で、抗体などの相互作用パートナーを使用するポリペプチドマーカーの検出は、特定のサンプル中でＴＬＥ３が発現されるか否かを測定する最も好都合な手段に相当し得るが、本発明の方法はまた、ポリヌクレオチドマーカーの検出のためのプライマーの使用も包含する。特定のポリヌクレオチドマーカーの存在を検出するためのさまざまな方法が、当技術分野で公知であり、本発明の方法において使用してもよい。通常、これらの方法は、１種以上のプライマーと、ポリヌクレオチドマーカー間のハイブリダイゼーションに頼るものである。
【００５３】
プライマーと、ＴＬＥ３ポリヌクレオチド（ＴＬＥ３  ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって製造されるｃＤＮＡ、このようなｃＤＮＡから製造されるＲＮＡなどであり得る）の間のハイブリダイゼーションを検出するために、任意の利用可能な戦略またはシステムを利用してよい。特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、簡単に、プライマーに検出可能な標識を加えることによって検出してもよい。その他の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、一次プライマーと特異的にハイブリダイズする、標識された二次プライマー（例えば、ＴＬＥ３マーカーとハイブリダイズしない一次プライマーの領域）を使用することによって検出してもよい。さらにその他の実施形態では、ＴＬＥ３遺伝子の領域を増幅するよう設計されたプライマーの１セットを使用するＰＣＲによって癌サンプル内のＴＬＥ３マーカーを増幅することが、有利であり得る。次いで、例えば、増幅産物とハイブリダイズする、標識された二次プライマーを使用して、得られた産物を検出してもよい。当業者ならば、これらの実施形態の変法を理解するであろう。
【００５４】
プライマー設計についての検討事項は、当技術分野では周知であり、例えば、Ｎｅｗｔｏｎら（編）ＰＣＲ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｄａｔａ  Ｓｅｒｉｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９９５、Ｗｈｉｔｅら（編）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、１９９３に記載されている。さらに、当技術分野で公知のさまざまなコンピュータプログラムを使用して、適当なプライマーを選択してもよい。
【００５５】
一般に、検出可能な標識は、直接的に検出可能である場合も、例えば、シグナル生成システムの１以上のさらなるメンバーとの組み合わせ作用によって間接的に検出可能である場合もある。直接的に検出可能な標識の例として、放射活性、常磁性、蛍光、光散乱、吸収性および比色標識が挙げられる。間接的に検出可能な例として、化学発光標識、例えば、基質を発色性生成物に変換できる酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼなどが挙げられる。
【００５６】
標識されたプライマーが、ＴＬＥ３マーカーとハイブリダイズすると、さまざまな方法で複合体を可視化または検出してよく、特定の検出様式が、特定の検出可能な標識に基づいて選択され、これでは、代表的な検出手段として、例えば、シンチレーション計数、オートラジオグラフィー、常磁性の測定、蛍光測定、光吸収測定、光散乱の測定などが挙げられる。
【００５７】
一般に、プライマーと、ＴＬＥ３マーカー間のハイブリダイゼーションは、プライマーを、マーカーを含む癌サンプルと接触させることによってアッセイしてもよい。癌サンプルの性質に応じて、適当な方法として、それだけには限らないが、マイクロアレイ分析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロットおよび種々の核酸増幅技術、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応などが挙げられる。
【００５８】
新規治療法の同定
本発明に従って、ＴＬＥ３の予測力は、癌を、既知治療法に対するその応答性の可能性に関して分類するためだけでなく、癌の治療において有用であり得る、可能性ある新規治療法または治療薬を同定するためにも有用である。
【００５９】
実際、ＴＬＥ３は、新規治療薬の同定（例えば、マーカーと、好ましくは、特定の親和性および／または特異性で、結合またはハイブリダイズする化合物もしくは成分を検出するためのスクリーニング、および／またはマーカーの発現、局在性、修飾または活性を調節する（すなわち、増大または減少させる）化合物もしくは成分を検出するためのスクリーニングによる）のための魅力的な候補に相当する。したがって、一実施形態では、本発明は、試験化合物を、ＴＬＥ３マーカーを発現する細胞（例えば、個々の操作された細胞または組織との関連でなど）と接触させるステップと、試験化合物が、ＴＬＥ３マーカーの発現、局在性、修飾または活性を調節するかどうかを測定するステップとを含む方法を提供する。多くの例では、相互作用パートナーまたはプライマー（例えば、アンチセンスまたはＲＮＡｉプライマー）自体が有用な治療薬であると判明し得る。
【００６０】
したがって、本発明は、自体が有用な治療薬である、相互作用パートナーおよびプライマーを提供する。例えば、癌性細胞との、ＴＬＥ３に対して作製した抗体による結合は、それらの細胞の増殖を阻害し得る。あるいは、またはさらに、本発明に従って定義または調製された相互作用パートナーを用いて、癌細胞に治療薬を送達できる。特に、相互作用パートナー（例えば、ＴＬＥ３に対して作成された抗体）を、１種以上の治療薬とカップリングしてもよい。これに関連して適した薬剤として、放射性核種および薬物が挙げられる。好ましい放射性核種として、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔおよび２１２Ｂｉが挙げられる。好ましい薬物として、クロラムブシル、イフォスファミド、メクロレタミン、シクロホスファミド、カルボプラチン、シスプラチン、プロカルバジン、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、カルムスチン、シタラビン、ヒドロキシ尿素、メルカプトプリン、メトトレキサート、パクリタキセル、ドセタキセル、チオグアニン、５−フルオロウラシル、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エトポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、Ｌ−アスパルギナーゼ（ａｓｐａｒｇｉｎａｓｅ）、アドレノコルチコステロイド、カンシクロビルトリホスフェート（ｃａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アデニンアラビノヌクレオシドトリホスフェート（ａｒａｂｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、５−アジリジニル−４−ヒドロキシルアミノ−２−ニトロベンズアミド、アクロレイン、ホスホラミドマスタード、６−メチルプリン、エトポシド、安息香酸マスタード、シアン化物およびナイトロジェンマスタードが挙げられる。
【００６１】
このような実施形態によれば、治療薬を、直接または間接共有結合性または非共有結合性相互作用によって相互作用パートナーとカップリングしてもよい。治療薬と、相互作用パートナー間の直接相互作用は、各々が、他方と反応できる置換基を有する場合に起こり得る。例えば、一方上のアミノまたはスルフヒドリル基などの求核基が、もう一方上の、無水物もしくは酸ハロゲン化物などのカルボニル含有基と、または良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含有するアルキル基と反応できる可能性がある。間接的相互作用は、それ自体が非共有結合的に治療薬および相互作用パートナーの両方と結合しているリンカー基を含み得る。リンカー基は、会合能への干渉を避けるために、相互作用パートナーを薬剤から距離を置かせるスペーサーの役を果たし得る。リンカー基はまた、薬剤または相互作用パートナー上の置換基の化学反応性を高め、ひいては、カップリング効率を高めるよう働き得る。反応性の増大はまた、そうでなければあり得ない、薬剤または薬剤上の官能基の使用を促進し得る。
【００６２】
さまざまな二官能性または多官能性試薬、ホモおよびヘテロ官能基の両方（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌのカタログに記載されるもの）を、リンカー基として使用してもよいということは、当業者には明らかであろう。カップリングは、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフィドリル（ｓｕｌｆｙｄｒｙｌ）基または酸化炭水化物残基を介して達成され得る。このような方法論を記載する多数の参考文献がある、例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらの米国特許第４，６７１，９５８号。さらに、当然のことながら、治療薬および相互作用パートナーを、非共有結合性相互作用、例えば、リガンド／受容体型相互作用によってカップリングしてもよい。本発明との関連で作動させるのに十分な安定性および特異性を有する任意のリガンド／受容体対を使用して、治療薬および相互作用パートナーをカップリングしてもよい。ほんの一例を挙げれば、治療薬を共有結合によってビオチンと、相互作用パートナーをアビジンと連結してもよい。次いで、ビオチンの、アビジンとの強力な非共有結合によって、治療薬と相互作用パートナーのカップリングが可能となる。通常のリガンド／受容体対として、タンパク質／補因子および酵素／基質対が挙げられる。よく使用されるビオチン／アビジン対の他に、これらとして、限定するものではないが、ビオチン／ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、ＦＫ５０６／ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、ラパマイシン／ＦＫＢＰ、シクロフィリン／シクロスポリンおよびグルタチオン／グルタチオントランスフェラーゼ対が挙げられる。その他の適したリガンド／受容体対は、当業者によって認識されているであろう。例えば、限定されるものではないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ（登録商標）およびマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）およびさらにＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｋｅｓｓｌｅｒ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９０のＫｅｓｓｌｅｒ  １０５−１５２ページ、「Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｐａｓｃａｌ  Ｂａｉｌｌｏｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２０００および「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９２に記載されるものなどのエピトープタグと対形成されるモノクローナル抗体がある。
【００６３】
治療薬が、相互作用パートナーを含まない場合に、より強力である場合には、細胞へのインターナリゼーションの間またはインターナリゼーション時に切断可能であるリンカー基を使用することが望ましい。いくつかの異なる切断可能なリンカー基が記載されている。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出の機序として、ジスルフィド結合の還元による切断（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒの米国特許第４，４８９，７１０号）、感光性結合の照射による切断（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらの米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化アミノ酸側鎖の加水分解による切断（例えば、Ｋｏｈｎらの米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体媒介性加水分解による切断（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌｔらの米国特許第４，６７１，９５８号）および酸触媒加水分解による切断（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらの米国特許第４，５６９，７８９号）が挙げられる。
【００６４】
特定の実施形態では、２種以上の治療薬を相互作用パートナーとカップリングすること望ましいものであり得る。一実施形態では、１つの相互作用パートナー分子に、薬剤の複数の分子がカップリングされる。別の実施形態では、１つの相互作用パートナー分子に、２種以上の治療薬がカップリングされ得る。特定の実施形態にかかわらず、２種以上の薬剤を含む調製物は、さまざまな方法で調製してもよい。例えば、２種以上の薬剤を、相互作用パートナー分子に直接的にカップリングしてもよく、付着のための複数の部位を提供するリンカーを使用してもよい。
【００６５】
あるいは、担体を使用してもよい。担体は、直接的な、またはリンカー基を介してのいずれかの共有結合をはじめとするさまざまな方法で薬剤を保持し得る。適した担体として、アルブミンなどのタンパク質（例えば、Ｋａｔｏらの米国特許第４，５０７，２３４号）、ペプチド、およびアミノデキストランなどの多糖（例えば、Ｓｈｉｈらの米国特許第４，６９９，７８４号）が挙げられる。担体はまた、非共有結合性結合によって、またはリポソーム小胞内などのカプセル封入によって、薬剤を保持し得る（例えば、Ｍａｒｔｉｎらの米国特許第４，４２９，００８号およびＭａｙｈｅｗらの同４，８７３，０８８号）。放射性核種薬剤に特異的な担体として、放射ハロゲン化小分子およびキレート化合物が挙げられる。例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａの米国特許第４，７３５，７９２号には、代表的な放射ハロゲン化小分子およびその合成が開示されている。放射性核種キレートは、金属、または金属酸化物、放射性核種を結合するためのドナー原子として窒素および硫黄原子を含有するものを含むキレート化合物から形成してもよい。例えば、Ｄａｖｉｓｏｎらの米国特許第４，６７３，５６２号には、代表的なキレート化合物およびその合成が開示されている。
【００６６】
相互作用パートナーが、それ自体治療薬である場合、多くの場合、同じマーカーと結合する任意の相互作用パートナーをそのように使用してもよいということは理解されよう。
【００６７】
本発明の好ましい一実施形態では、治療薬（相互作用パートナーか、そうでないかにかかわらず）は、抗体、例えば、ＴＬＥ３マーカーに対する抗体である。当技術分野では周知であるように、治療目的のために抗体またはその断片を使用する場合、注目する「ヒト化」または「ベニヤ化」型の抗体を使用して、任意のあり得る免疫原性反応を低減することが有利であるとわかり得る。一般に、「ヒト化」または「ベニヤ化」抗体分子およびその断片は、ヒトレシピエントにおけるそれらの部分の治療適用の期間および有効性を制限し得る、抗ヒト抗体分子に対する不要な免疫学的応答を最小にする。
【００６８】
げっ歯類可変領域と、ヒト定常ドメインと融合している、その関連相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するキメラ抗体（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３、１９９１、Ｌｏｂｕｇｌｉｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４２２０、１９８９、Ｓｈａｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４、１９８７およびＢｒｏｗｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：３５７７、１９８７）、適当なヒト抗体定常ドメインとの融合に先立ってヒト支持フレームワーク領域（ＦＲ）にグラフトされたげっ歯類ＣＤＲ（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３、１９８８、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４、１９８８、およびＪｏｎｅｓらＮａｔｕｒｅ  ３２１：５２２、１９８６参照のこと）および組換えによってベニヤ化されたげっ歯類ＦＲによって支持されるげっ歯類ＣＤＲ（例えば、１９９２年１２月２３日に公開された欧州特許公報第５１９，５９６号参照のこと）をはじめ、非ヒト免疫グロブリン由来の抗原結合部分を含む、たくさんの「ヒト化」抗体分子が、当技術分野で記載されているということは理解されるべきである。本発明はまた、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）技術（ＡｂＧｅｎｉｘ  Ｃｏｒｐ．、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）を、米国特許第６，０７５，１８１号に記載される技術に従って使用して作製される「完全ヒト」抗体を包含する。
【００６９】
なおさらに、「ベニヤ化ＦＲ」を含む、いわゆる「ベニヤ化」抗体を使用してもよい。ベニヤ化の工程は、例えば、ネズミ重鎖または軽鎖可変領域に由来するＦＲ残基を、ヒトＦＲ残基と選択的に置換して、天然ＦＲタンパク質フォールディング構造の実質的にすべてを保持する抗原結合部分を含む異種分子を提供することを含む。ベニヤ化技術は、抗原結合部分の抗原結合特徴は、主に、抗原会合表面内の重鎖および軽鎖ＣＤＲセットの構造および関連配置によって決定されるという理解に基づいている（例えば、Ｄａｖｉｅｓら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９、１９９０参照のこと）。したがって、抗原会合特異性は、ＣＤＲ構造、それらの互いの相互作用およびそれらの可変領域ドメインの残りとの相互作用が、注意深く維持される場合にのみ、ヒト化抗体中で保存され得る。ベニヤ化技術を使用することによって、免疫系が容易に遭遇する外部（例えば、溶媒が接近可能な）ＦＲ残基を、ヒト残基と選択的に置換して、弱い免役原性、または実質的に非免役原性のベニヤ化表面のいずれかを含むハイブリッド分子を提供する。
【００７０】
治療薬（または治療薬担体）として使用するのに適した相互作用パートナーは、標的マーカー（例えば、ＴＬＥ３）に対する高い特異性およびその他のマーカーとの低いバックグラウンド結合を示すことが好ましい。特定の実施形態では、治療目的には、モノクローナル抗体が好ましい。
【００７１】
薬剤組成物
上記のように、本発明は、新規治療法およびこれらを同定する方法を提供する。特定の実施形態では、相互作用パートナーまたはプライマーは、有用な治療薬であり得る。あるいは、またはさらに、本発明に従って定義されるか、調製される相互作用パートナーは、治療薬の標的として働くマーカー（例えば、ＴＬＥ３）と結合する。また、本発明の相互作用パートナーを使用して、癌細胞に治療薬を送達してもよい。例えば、本発明に従って提供される相互作用パートナーを、１種以上の治療薬とカップリングしてもよい。
【００７２】
本発明は、これらの発明の治療薬を含む薬剤組成物を含む。一般に、薬剤組成物は、１種以上の不活性薬剤、例えば、滅菌、生体適合性担体、例えば、それだけには限らないが、滅菌水、生理食塩水、緩衝生理食塩水またはデキストロース溶液に加えて、治療薬を含む。薬剤組成物は、単独またはその他の治療薬、例えば、その他の化学療法薬、ホルモン、ワクチンおよび／または放射線療法と組み合わせて投与してよい。本明細書において、ここでおよび他の場所で「と組み合わせて」とは、薬剤が同時に投与されなければならない、または一緒の送達のために製剤されなければならないことを意味するものではないが、これらの送達方法は本発明の範囲内にある。一般に、各薬剤は、その薬剤のために決定された用量で、タイムスケジュールで投与される。さらに、本発明は、そのバイオアベイラビリティーを改善、その代謝を低減または改変、その排出を阻害し得るか、または身体内のその分布を改変し得る薬剤と組み合わせた、本発明の薬剤組成物の送達を包含する。本発明の薬剤組成物を、それを必要とする任意の被験体（例えば、任意の動物）の治療のために使用してよいが、それらは、ヒトの治療において使用されることが最も好ましい。
【００７３】
本発明の薬剤組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、皮下、脳室内、経皮、直腸、膣内、腹腔内、局所（散剤、軟膏または液滴によってのように）、頬側（ｂｕｃａｌ）、または経口もしくは鼻腔スプレーまたはエアゾールとしてをはじめ、さまざまな経路によってヒトおよびその他の動物に投与してもよい。一般に、最も適当な投与経路は、薬剤の性質（例えば、消化管の環境におけるその安定性、患者の状態（例えば、患者が経口投与に耐容できるかどうか）などをはじめとする、さまざまな因子に応じて変わる。現在のところ、治療用抗体を送達するためには、静脈内経路が最もよく使用される。しかし、本発明は、薬物送達の科学における起こり得る進歩を考慮して、任意の適当な経路による本発明の薬剤組成物の送達を包含する。
【００７４】
医薬品の製剤および製造における概論は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９５に見い出すことができる。
【実施例】
【００７５】
例証
実施例１：抗体を作製すること
この実施例は、これらの実施例において使用されたＴＬＥ３抗体を作製するために使用した方法を記載する。同様の方法を使用して、注目する任意のマーカーと（例えば、付属書類Ａに列挙されるその他のマーカーであるか、その他のマーカーに由来するタンパク質と）結合する抗体を作製してもよい。いくつかの場合には、抗体は、商業的供給源（例えば、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｄａｋｏ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓなど）またはその他の公共の利用可能な供給源（例えば、Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙなど）から得てもよい。
【００７６】
材料および溶液
・アニソール（カタログ番号Ａ４４０５、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）
・２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンゾチアゾリン−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）（カタログ番号Ａ６４９９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）
・活性化型マレイミドキーホールリンペットヘモシアニン（カタログ番号７７１０６、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）
・キーホールリンペットヘモシアニン（カタログ番号７７６００、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）  
・リン酸（Ｈ３ＰＯ４）（カタログ番号Ｐ６５６０、Ｓｉｇｍａ）
・氷酢酸（カタログ番号ＢＰ１１８５−５００、Ｆｉｓｈｅｒ）
・ＥＤＣ（ＥＤＡＣ）（カタログ番号３４１００６、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）
・２５％グルタルアルデヒド（カタログ番号Ｇ−５８８２、Ｓｉｇｍａ）
・グリシン（カタログ番号Ｇ−８８９８、Ｓｉｇｍａ）
・ビオチン（カタログ番号Ｂ２６４３、Ｓｉｇｍａ）
・ホウ酸（カタログ番号Ｂ０２５２、Ｓｉｇｍａ）
・セファロース４Ｂ（カタログ番号１７−０１２０−０１、ＬＫＢ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）
・ウシ血清アルブミン（ＬＰ）（カタログ番号１００  ３５０、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）
・臭化シアン（カタログ番号Ｃ６３８８、Ｓｉｇｍａ）
・透析チューブスペクトル／細孔膜ＭＷＣＯ：６−８，０００（カタログ番号１３２６６５、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｌａｇｕｎａ  Ｈｉｌｌｓ、ＣＡ）
・ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（カタログ番号２２７０５−６、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）
・ＤＩＣ（カタログ番号ＢＰ  ５９２−５００、Ｆｉｓｈｅｒ）
・エタンジチオール（カタログ番号３９，８０２−０、Ａｌｄｒｉｃｈ）
・エーテル（カタログ番号ＴＸ  １２７５−３、ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）
・エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（カタログ番号ＢＰ  １２０−１、Ｆｉｓｈｅｒ、Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、ＮＪ）
・１−エチル−３−（３’ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、ＨＣＬ（ＥＤＣ）（カタログ番号３４１−００６、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）
・フロイントのアジュバント、完全（カタログ番号Ｍ−０６３８−５０Ｂ、Ｌｅｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｒａｙｓｏｎ、ＧＡ）
・フロイントのアジュバント、不完全（カタログ番号Ｍ−０６３９−５０Ｂ、Ｌｅｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
・フリット付きクロマトグラフィーカラム（カラム部分番号１２１３１０１１、フリット部分番号１２１３１０２９、Ｖａｒｉａｎ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｈａｒｂｏｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）
・ウシ皮膚由来のゼラチン（カタログ番号Ｇ９３８２、Ｓｉｇｍａ）
・ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ビオチン化（カタログ番号Ａ  ０４１８、Ｓｉｇｍａ）
・ＨＯＢｔ（カタログ番号０１−６２−０００８、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）
・西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（カタログ番号８１４  ３９３、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）
・ＨＲＰ−ストレプトアビジン（カタログ番号Ｓ  ５５１２、Ｓｉｇｍａ）
・塩酸（カタログ番号７１４４５−５００、Ｆｉｓｈｅｒ）
・過酸化水素３０％  ｗ／ｗ（カタログ番号Ｈ１００９、Ｓｉｇｍａ）
・メタノール（カタログ番号Ａ４１２−２０、Ｆｉｓｈｅｒ）
・マイクロタイタープレート、９６ウェル（カタログ番号２５９５、Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）
・Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製のＮ−α−Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸。’９７〜’９８カタログ１〜４５ページ。
【００７７】
・Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製の、Ｗａｎｇ樹脂と付着しているＮ−α−Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸。’９７〜’９８カタログ１６１〜１６４ページ。
【００７８】
・ＮＭＰ（カタログ番号ＣＡＳ  ８７２−５０−４、Ｂｕｒｄｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｍｕｓｋｅｇｏｎ、ＭＩ）
・ペプチド（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓによって合成された。詳細は以下に示される）
・ピペリジン（カタログ番号８０６４０、Ｆｌｕｋａ、Ｓｉｇｍａから入手可能）
・炭酸水素ナトリウム（カタログ番号ＢＰ３２８−１、Ｆｉｓｈｅｒ）
・ホウ酸ナトリウム（カタログ番号Ｂ９８７６、Ｓｉｇｍａ）
・炭酸ナトリウム（カタログ番号ＢＰ３５７−１、Ｆｉｓｈｅｒ）
・塩化ナトリウム（カタログ番号ＢＰ  ３５８−１０、Ｆｉｓｈｅｒ）
・水酸化ナトリウム（カタログ番号ＳＳ  ２５５−１、Ｆｉｓｈｅｒ）
・ストレプトアビジン（カタログ番号１  ５２０、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）
・チオアニソール（カタログ番号Ｔ−２７６５、Ｓｉｇｍａ）
・トリフルオロ酢酸（カタログ番号ＴＸ  １２７５−３、ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）
・Ｔｗｅｅｎ−２０（カタログ番号ＢＰ  ３３７−５００、Ｆｉｓｈｅｒ）  
・ウェットボックス（Ｒｅｃｔａｎｇｕｌａｒ  Ｓｅｒｖｉｎ’Ｓａｖｅｒ（商標）部分番号３８６２、Ｒｕｂｂｅｒｍａｉｄ、Ｗｏｏｓｔｅｒ、ＯＨ）
・蒸留水に溶解したＥＤＴＡを含むＢＢＳ−ホウ酸緩衝生理食塩水（ＨＣｌまたはＮａＯＨを用いてｐＨ８．２〜８．４）、２５ｍＭホウ酸ナトリウム（Ｂｏｒａｘ）、１００ｍＭホウ酸、７５ｍＭ  ＮａＣｌおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡ。
【００７９】
・以下のような生理食塩水中の０．１Ｎ  ＨＣｌ：濃ＨＣｌ（８．３ｍｌ／０．９１７ｌ蒸留水）および０．１５４Ｍ  ＮａＣｌ
・蒸留水に溶解し、所望のｐＨに調整したグリシン（ｐＨ２．０およびｐＨ３．０）、０．１Ｍグリシンおよび０．１５４Ｍ  ＮａＣｌ。
【００８０】
・蒸留水に溶解した５×ホウ酸塩１×塩化ナトリウム、０．１１Ｍ  ＮａＣｌ、６０ｍＭ  ホウ酸ナトリウムおよび２５０ｍＭ  ホウ酸。
【００８１】
・水酸化ナトリウム、５０〜１００ｍＭクエン酸を用いてｐＨ４．０に調整した、蒸留水中の基質バッファー。
【００８２】
・ＡＡ溶液：ＨＯＢｔは、ＮＭＰに溶解する（１リットルのＮＭＰに対して８．８ｇＨＯＢｔ）。０．５３Ｍの濃度のＦｍｏｃ−Ｎ−ａ−アミノ。
【００８３】
・ＤＩＣ溶液：３部のＮＭＰに対して１部のＤＩＣ。
【００８４】
・脱保護溶液：３部のＤＭＦに対して１部のピペリジン。
【００８５】
・試薬Ｒ：２部のアニソール、３部のエタンジチオール、５部のチオアニソールおよび９０部のトリフルオロ酢酸。
【００８６】
機器
・ＭＲＸプレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）
・Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｒｅｎｏ、ＮＶ）
・Ｂｅｃｋｍａｎ  ＴＪ−６遠心機（モデル番号ＴＪ−６、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）
・チャートレコーダー（Ｒｅｃｏｒｄｅｒ１部分番号１８−１００１−４０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
・ＵＶモニター（Ｕｖｉｃｏｒｄ  ＳＩＩ部分番号１８−１００４−５０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
・Ａｍｉｃｏｎ撹拌細胞濃縮器（Ｓｔｉｒｒｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）（モデル８４００、Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）
・３０ｋＤ  ＭＷカットオフフィルター（カタログ番号ＹＭ−３０  メンブランカタログ番号１３７４２、Ａｍｉｃｏｎ）
・マルチチャネル自動化ピペッター（カタログ番号４８８０、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）
・ｐＨメータＣｏｒｎｉｎｇ  ２４０（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｇｌａｓｓｗｏｒｋｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）
・ＡＣＴ３９６ペプチドシンセサイザー（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＫＹ）  
・真空乾燥機（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ、ＭＯ製のボックスおよびＡｌｃａｔｅｌ、Ｌａｕｒｅｌ、ＭＤ製のポンプ）。
【００８７】
・凍結乾燥機（Ｆｒｅｅｚｅｍｏｂｉｌｅ  １２とタンデムのＵｎｉｔｏｐ  ６００ｓｌ、両方ともＶｉｒｔｉｓ、Ｇａｒｄｉｎｅｒ、ＮＹ製）
ペプチド選択
それに対して抗体が作製されるペプチドまたは複数のペプチドを、Ｈｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法（ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４８３、１９８３ならびにＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７８：３８２４、１９８１に記載される）を使用するプログラムを使用して注目するタンパク質配列内から選択した。このプログラムは、低い溶媒到達性によって予測される、いくつかの推定抗原エピトープを含有する１５〜２０個のアミノ酸のペプチド配列を同定するスキャンニングウィンドウを使用する。これは、単一の短い（約６アミノ酸）の推定的抗原エピトープを同定するＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法のほとんどの実行とは対照的である。場合により、予測された溶媒到達性を、ループ構造のＰＨＤ予測によってさらに評価する（ＲｏｓｔおよびＳａｎｄｅｒ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２０：２１６、１９９４に記載される）。好ましいペプチド配列は、さらなる既知ヒトタンパク質と最小の類似性しか示さない。類似性は、ワードサイズ２を使用してＢＬＡＳＴＰアラインメントを実施することによって決定した（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３、１９９０に記載される）。１０００未満のＥＸＰＥＣＴ値を与えられたすべてのアラインメントを調べ、正確な近接するギャップのないアラインメント中、６０％を超えるまたは５残基以上の類似性を有するアラインメントは、それらのペプチドが退けられるようにした。細胞膜の外側の露出されたタンパク質の領域を標的とすることが望ましい場合には、文献から、または隠れＭａｒｋｏｖモデルを使用する予測膜貫通ドメインによって定義される、注目するタンパク質の細胞外領域を決定した（Ｋｒｏｇｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０５：５６７、２００１）。ペプチド配列が細胞外ドメイン中にあった場合には、ペプチドは、Ｎ結合型グリコシル化部位を含んでいた場合には退けられた。付属書類Ａに示されるように、ＴＬＥ３抗体の調製のためには、アミノ酸配列ＫＮＨＨＥＬＤＨＲＥＲＥＳＳＡＮ（配列番号３８３）を有する単一ペプチドを使用した。付属書類Ａは、その他のマーカーに対する抗体の調製において使用してもよい１〜３のペプチド配列を提供する。
【００８８】
ペプチド合成
所望のペプチドの配列を、ペプチドシンセサイザーに提供した。Ｃ末端残基を決定し、適当なＷａｎｇ樹脂を反応容器と付着させた。ペプチドまたは複数のペプチドを、合成サイクルを使用する時点で１個のアミノ酸を加えることによってＣ末端からＮ末端に合成した。どのアミノ酸が加えられるかは、ペプチドシンセサイザーによって制御され、ペプチドシンセサイザーは、データベースに入力されたペプチドの配列を頼りにする。合成ステップは、以下の通りに実施した：
ステップ１−樹脂膨潤：２ｍｌのＤＭＦを加え、３０分間インキュベートし、ＤＭＦを排出した。
【００８９】
ステップ２−合成サイクル（ペプチドの長さにわたって繰り返した）
２ａ−脱保護：反応溶液に１ｍｌの脱保護溶液を加え、２０分間インキュベートした。
【００９０】
２ｂ−洗浄サイクル
２ｃ−カップリング：反応槽に７５０ｍｌのアミノ酸溶液（ペプチドシンセサイザー中に列挙される配列が決定されると変更される）および２５０ｍｌのＤＩＣ溶液を加えた。反応槽を３０分間インキュベートし、１回洗浄した。カップリングステップを１回繰り返した。
【００９１】
２ｄ−洗浄サイクル
ステップ３−最終脱保護：最後にもう一度、ステップ２ａおよび２ｂを実施した。
【００９２】
樹脂をメタノール中で脱膨潤させ（５ｍｌメタノール中で２回すすぎ、５ｍｌメタノール中で５分間インキュベートし、５ｍｌメタノールですすいだ）、次いで、真空乾燥させた。
【００９３】
試薬Ｒ中で２時間インキュベートし、次いで、エーテル中に沈殿させることによって、樹脂からペプチドを回収した。ペプチドをエーテルで洗浄し、次いで、真空乾燥させた。ペプチドをｄｉＨ２Ｏに再可溶化させ、凍結し、一晩凍結乾燥させた。
【００９４】
ペプチドの、キーホールリンペットヘモシアニンとのコンジュゲーション
ペプチド（６ｍｇ）を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）とコンジュゲートした。選択されたペプチドが、少なくとも１個のシステインを含む場合には、総容量４ｍｌについて、３アリコート（２ｍｇ）をＰＢＳ（２ｍｌ）に溶解し、ＰＢＳ２ｍｌ中のグルタルアルデヒド、ＥＤＣまたはマレイミド活性化ＫＬＨ（２ｍｇ）によってＫＬＨとカップリングしてもよい。ペプチドが、システインを欠く場合には（ＴＬＥ３ペプチドにおけるように）、２アリコート（３ｍｇ）を、グルタルアルデヒドおよびＥＤＣ法によってカップリングしてもよい
マレイミドカップリングは、２ｍｇのペプチドを、ＰＢＳ（４ｍｌ）中に溶解した２ｍｇのマレイミド活性化ＫＬＨと混合し、４時間インキュベートすることによって達成できる。
【００９５】
ＥＤＣカップリングは、ＰＢＳ（リン酸の添加によってｐＨ５に低下させた）４ｍｌ中で、２ｍｇのペプチド、２ｍｇ未修飾ＫＬＨおよび２０ｍｇのＥＤＣを混合し、４時間インキュベートすることによって達成できる。次いで、酢酸（ｐＨ４．２）１．３３ｍｌをゆっくり加えることによって反応を停止させる。ＥＤＣを使用して、３ｍｇのペプチドをカップリングする場合には、上記で列挙された量を１．５倍に増大させる。
【００９６】
グルタルアルデヒドカップリングは、ＰＢＳ０．９ｍｌ中で、２ｍｇのペプチドを、２ｍｇのＫＬＨと混合すると起こる。０．２％グルタルアルデヒド０．９ｍｌを加え、１時間混合する。ＰＢＳ中、１Ｍグリシン０．４６ｍｌを加え、１時間混合する。グルタルアルデヒドを使用して、３ｍｇのペプチドをカップリングする場合には、上記の量を１．５倍に増大する。
【００９７】
続いて、コンジュゲートしているアリコートを再プールし、２時間混合し、１ｌのＰＢＳ中で透析し、凍結乾燥した。
【００９８】
ウサギの免役化
２匹のニュージランドホワイトウサギに、総容量１ｍｌ中、等容量の完全フロイントアジュバントおよび生理食塩水中、２５０μｇ（合計）のＫＬＨがコンジュゲートしているペプチドを注射した。次いで、最初の免役化の２、６、８および１２週間後に、総容量１ｍｌについて、等容量の不完全フロイントアジュバントおよび生理食塩水中の、ＫＬＨがコンジュゲートしているペプチド１００μｇを、３〜４箇所の皮下背側部位に注射した。免役化スケジュールは以下の通りとした：
０日目    免役前出血、一次免役
１５日目  最初の追加免役
２７日目  最初の出血
４４日目  ２回目の追加免役
５７日目  ２回目の出血および３回目の追加免役
６９日目  ３回目の出血
８４日目  ４回目の追加免役
９８日目  ４回目の出血
ウサギ血清の採取
ウサギを、耳介動脈から出血させた（３０〜５０ｍｌ）。血液を室温で１５分間凝血させ、ＩＥＣ  ＤＰＲ−６０００遠心機を５０００ｇで使用して血清を血餅から分離した。細胞を含まない血清を、穏やかにデカントして、清潔な試験管に入れ、アフィニティー精製のために−２０℃で保存した。
【００９９】
抗体力価の決定
洗浄溶液を除くすべての溶液は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ、液体処理ディスペンサーによって加えた。固相上のペプチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ウサギにおいて抗体力価を求めた。柔軟な高結合ＥＬＩＳＡプレートを、ＢＢＳで希釈されたペプチド（１００mｌ、１mｇ／ウェル）を用いて受動的にコーティングし、ウェットボックス中、４℃で一晩インキュベートした（湿らせた綿ボールを含む気密容器）。プレートを空にし、次いで、半自動化プレートウォッシャーを使用して、満たすことおよび空にすることの反復によって、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＢＢＳ（ＢＢＳ−ＴＷ）で３回洗浄した。各ウェルを、１％ＢＳＡおよび０．１％ゼラチンを含有するＢＢＳ−ＴＷ（ＢＢＳ−ＴＷ−ＢＧ）で完全に満たすことおよび室温で２時間インキュベートすることによってプレートをブロッキングした。このプレートを空にし、ウェルに免疫前および免疫後両方の血清を加えた。最初のウェルは、血清をＢＢＳ中１：５０で含んでいた。次いで、１：２０４，８００の最後の（１２回目の）希釈の間、１：１の割合で、プレート中で血清を１２回以上連続的に力価測定した。プレートを４℃で一晩インキュベートした。このプレートを空にし、記載されるように３回洗浄した。
【０１００】
各マイクロタイタープレート試験ウェルに、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１００mｌ）を加え、室温で４時間インキュベートした。プレートを空にし、３回洗浄した。各ウェルに、西洋ワサビペルオキシダーゼがコンジュゲートしているストレプトアビジン（ＢＢＳ−ＴＷ−ＢＧで１：１０，０００希釈した１００μｌ）を加え、室温で２時間インキュベートした。このプレートを空にし、３回洗浄した。ＡＢＴＳを、クエン酸バッファー（ｐＨ４．０で０．１Ｍ）１０ｍｌ、保存溶液（水中、１５ｍｇ／ｍｌ）０．２ｍｌおよび３０％過酸化水素１０μｌを組み合わせることによって、保存溶液から新たに調製した。各ウェルに、ＡＢＴＳ溶液（１００μｌ）を加え、室温でインキュベートした。基質の添加の２０分後に、プレートを４１４ｎｍで読み取った。
【０１０１】
ペプチドアフィニティー精製カラムの調製：
１０ｍｌの臭化シアン活性化セファロース４Ｂに５ｍｇのペプチドを、ヒドラジン−セファロース４Ｂに５ｍｇのペプチドをコンジュゲートすることによって親和性カラムを調製した。手短には、ペプチド（５ｍｇ）にＤＭＦ１００μｌを加え、混合物を、内容物が完全に湿潤するまでボルテックス処理した。次いで、水を加え（９００mｌ）、内容物を、ペプチドが溶解するまでボルテックス処理した。溶解したペプチドの半分（５００μｌ）を、ｐＨ８．４のホウ酸緩衝生理食塩水（ＢＢＳ）０．１ｍｌ中、１０ｍｌの臭化シアン活性化セファロース４Ｂおよびクエン酸バッファーｐＨ６．０中の過剰のＥＤＣを使用してｐＨ４．５に調整した０．１Ｍ炭酸バッファー中、１０ｍｌのヒドラジン−セファロース４Ｂを含有する別個の試験管に加えた。コンジュゲーション反応は、室温で一晩進行させた。コンジュゲートされたセファロースをプールし、フリット付きカラムにロードし、１０ｍｌのＢＢＳで洗浄し、１０ｍｌの１Ｍグリシンでブロッキングし、ＨＣｌを用いてｐＨ２．５に調整した０．１Ｍグリシン１０ｍｌで洗浄し、ＢＢＳ中で再中和した。２８０ｎｍの光学濃度がベースラインに達するのに十分な容量でカラムを洗浄した。
【０１０２】
抗体のアフィニティー精製
ペプチド親和性カラムを、ＵＶモニターおよびチャートレコーダーに取り付けた。力価測定したウサギ抗血清を、解凍し、プールした。血清を、１容量のＢＢＳで希釈し、１分あたり１０ｍｌでカラムを通して流した。非ペプチド免疫グロブリンおよびその他のタンパク質を、過剰のＢＢＳを用いて、２８０ｎｍの光学密度がベースラインに達するまで、カラムから洗浄除去した。カラムを外し、親和性精製されたカラムを、ｐＨ７．０〜１．０の段階的なｐＨ勾配を使用して溶出した。溶出を２８０ｎｍでモニターし、抗体を含有する画分（ｐＨ３．０〜１．０）を、過剰の０．５Ｍ  ＢＢＳに直接的に回収した。回収試験管中の過剰のバッファー（０．５Ｍ  ＢＢＳ）は、ｐＨ勾配の酸性画分中に回収された抗体を中和するよう働いた。
【０１０３】
全手順を、抗体の最大回収を確実にするよう、血清を「枯渇させて」反復した。溶出した材料を、撹拌細胞装置および３０ｋＤの分子量カットオフを有するメンブランを使用して濃縮した。最終調製物の濃度は、２８０ｎｍでの光学密度読み取りを使用して決定した。濃度は、以下の式を使用して決定した：ｍｇ／ｍｌ＝ＯＤ２８０／１．４。
【０１０４】
当然のことではあるが、特定の実施形態では、さらなるステップを使用して本発明の抗体を精製してもよい。特に、抗体を、例えば、抗体の作製において使用されたペプチドの１種に対して再精製することが有利であるとわかり得る。本発明は、このようなさらなる精製または再精製ステップを用いて調製されている抗体を包含するということは理解されるべきである。また、当然のことではあるが、精製工程は、サンプルと本発明の抗体間の結合に影響を及ぼし得る。
【０１０５】
実施例２：組織アレイの調製および染色
この実施例には、実施例に使用された組織アレイを調製するために使用された方法が記載されている。この実施例はまた、どのように抗体染色を実施したかを記載している。
【０１０６】
組織アレイは、多数の異なる患者に由来する組織の断片および／または単一の患者から得た異なる組織もしくは組織の断片を含む、多数のパラフィンブロック（ドナーブロック）から得た全層コアを、グリッドパターンで、グリッド中の設計された位置の、未使用のパラフィンブロック（レシピエントブロック）に挿入することによって調製した。次いで、パラフィン包埋された組織（ドナーブロック）の標準スライドを作製し、これは、Ｈ＆Ｅ染色に適している試料の薄切片を含んでいた。訓練を受けた病理学者または同等の人は、腫瘍および正常組織の評価に精通しており、組織アレイ上のサンプリングのための注目する領域を設計した（例えば、胃に対立させて腫瘍領域）。次いで、Ｂｅｅｃｈｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製の市販の組織アレイヤーを使用して、ドナーブロックからコアを採取し、次いで、これをレシピエントブロック中、設計された位置に挿入した。この工程を、すべてのドナーブロックがレシピエントブロック中に挿入されるまで反復した。次いで、レシピエントブロックを薄切片にすると、ブロック中に挿入されたすべての症例から得たコアを含有する５０〜３００スライドが得られた。
【０１０７】
次いで、選択された抗体を使用して、ＤＡＫＯ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋、ペルオキシダーゼＩＨＣキット（ＤＡＫＯ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）およびＤＡＢ基質を、製造業者の使用説明書に従って使用する免役組織化学的染色を実施した。図１は、ＴＬＥ３陰性（Ｓ０６４３−）およびＴＬＥ３陽性（Ｓ０６４３＋）であるサンプルの例示的ＩＨＣ染色像を示す。
【０１０８】
実施例３：癌患者における化学療法に対する応答とのＴＬＥ３発現相関
２種の異なる乳癌コホートから得た腫瘍サンプル−Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＨＨ）およびＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰ）を、実施例１のＴＬＥ３抗体を用いて染色した。両コホート中のすべての患者について、治療および再発データを入手した。図２は、ＴＬＥ３抗体を用いる染色に基づいて分類した後のＨＨコホート中のすべての患者を使用して作成したカプラン−マイヤー再発曲線を示す。ＴＬＥ３陽性およびＴＬＥ３陰性患者から得た再発データを使用して、上の曲線および下の曲線をそれぞれ作成した。図に示されるように、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合は、この乳癌コホートの全域で予後の改善と相関する（ＨＲ＝０．５７３、ｐ＝０．００４）。図３は、ＲＰコホート中のすべての患者を使用して、同様の様式で作成したカプラン−マイヤー再発曲線を示す。ＨＨコホートと同様に、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合は、予後の改善と相関するとわかった（ＨＲ＝０．２３９、ｐ＝０．０１１）。
【０１０９】
ＴＬＥ３発現が、化学療法に対する応答と相関しているかどうかを調べるために、化学療法を受けたか、受けなかったＨＨコホート患者を使用して、別個のカプラン−マイヤー再発曲線を作成した（それぞれ、図４および５）。図４に示されるように、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合は、予後との、その相関を失う（ＨＲ＝０．７８８、ｐ＝０．４９０）。しかし、図５に示されるように、化学療法を受けた患者では、相関は保存された（ＨＲ＝０．５３９、ｐ＝０．０１３）。これらの結果は、ＴＬＥ３発現が化学療法に対する応答の改善と相関していることを実証する（すなわち、ＴＬＥ３陽性癌は、ＴＬＥ３陰性癌よりも化学療法に対して応答する可能性がより高い）。化学療法を受けたＲＰ乳癌コホート中の患者を使用して作成されたカプラン−マイヤー再発曲線は、この予測モデルと一致する（図６を参照のこと、ＨＲ＝０．１９４、ｐ＝０．０１０）。化学療法を受けたＵＡＢ卵巣癌コホート中の患者を使用して作成したカプラン−マイヤー再発曲線もまた、この予測モデルと一致している（図１８参照のこと、ＨＲ＝０．６４、ｐ＝０．０４９）。
【０１１０】
実施例４：特定の化学療法薬の相関
ＨＨおよびＲＰコホート中の種々の患者が、種々の種類の化学療法を受けたので、本発明者らは、ＴＬＥ３発現が、特定の種類の化学療法に対する応答と相関するかどうかを調べることができた。
【０１１１】
図７は、ＣＭＦ（シクロホスファミド、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル）化学療法を受けた図５のＨＨ乳癌コホート中の患者を使用して作成したカプラン−マイヤー再発曲線を示す。このサブセットでは、ＴＬＥ３陽性およびＴＬＥ３陰性患者から得た再発データを使用して、上の曲線および下の曲線をそれぞれ作成した。図７に示されるように、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合は、このサブセットの治療された患者を通して予後の改善と相関する（ＨＲ＝０．３９８、ｐ＝０．０１９）。ＣＡ（シクロホスファミドおよびアドリアマイシン、ＨＲ＝１．０００）またはＣＡＦ（シクロホスファミド、アドリアマイシンおよび５−フルオロウラシル、ＨＲ＝１．０００）を用いて治療されたＨＨコホート中の患者についての、相関の喪失を実証する以下の結果に基づいて、本発明者らは、図７における予測相関は、ＴＬＥ３結合と、メトトレキサートを用いた治療の間である（ＣＡおよびＣＡＦ治療されたサブセットを組み合わせる図９も参照のこと、ＨＲ＝１．０３０）ことを確立することができた。
【０１１２】
図８は、ＣＡまたはＣＡＦ化学療法を受けた（タキサンを伴うか伴わない）、図５のＨＨ乳癌コホート中の患者を使用して作成したカプラン−マイヤー再発曲線を示す。図に示されるように、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合と、予後の間の相関は、このサブセットの治療された患者では有意性を失う（ＨＲ＝０．６６６、ｐ＝０．２２）。曲線が、ＣＡまたはＣＡＦ化学療法のみを受けた（すなわち、タキサンを伴わない）患者を使用して作成された場合には、有意性はさらに減少した（図９参照のこと、ＨＲ＝１．０３０、ｐ＝０．９５）。しかし、相関は、ＣＡまたはＣＡＦを、タキサンと組み合わせて受けた患者では回復された（図１０参照のこと、ＨＲ＝０．１１４、ｐ＝０．０３８）。これらの結果は、ＴＬＥ３結合と、タキサンを用いる治療の間の相関を実証する。
【０１１３】
図１１は、ＣＡ化学療法のみを受けた（すなわち、タキサンを伴わない）図６のＲＰ乳癌コホート中の患者を使用して作成したカプラン−マイヤー再発曲線を示す。このサブセットでは、ＴＬＥ３陽性およびＴＬＥ３陰性患者から得た再発データを使用して、上の曲線および下の曲線を、それぞれ作成した。図に示されるように、このサブセットの治療された患者では、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合と、予後の間に相関はない（ＨＲ＝０．７５９、ｐ＝０．８１）。相関は、曲線が、ＣＡ化学療法を、タキサンと組み合わせて受けた患者を使用して作成された場合には回復された（図１２参照のこと、ＨＲ＝０．１５３、ｐ＝０．０１８）。これらの結果は、ＨＨコホートから得たサンプルを使用して得られた図８および９の結果を支持する。
【０１１４】
図１３は、タキサンまたはＣＭＦを受けた、図６のＲＰ乳癌コホート中の患者を使用して作成したカプラン−マイヤー再発曲線を示す。タキサンを受けた患者の一部は、ＣＡも受けた。このサブセット中のＴＬＥ３陽性およびＴＬＥ３陰性患者から得た再発データを使用して、上の曲線および下の曲線をそれぞれ作成した。図で示されるように、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合は、このサブセットの治療された患者の全域で、予後の改善と相関する（ＨＲ＝０．１３７、ｐ＝０．０１１）。
【０１１５】
図１４は、ネオアジュバント化学療法を受けた、図６のＲＰ乳癌コホート中の患者を使用して作成したカプラン−マイヤー再発曲線を示す。このサブセット中のＴＬＥ３陽性およびＴＬＥ３陰性患者から得た再発データを使用して、上の曲線および下の曲線をそれぞれ作成した。サンプルサイズは小さかったが（Ｎ＝１２）、図で示されるように、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合は、フィッシャーの正確確率検定を使用して測定した場合に、このサブセットの治療された患者を通して、予後の改善と有意な相関を示した（ｐ＝０．００５）。さらに、ネオアジュバント化学療法を受けている１２人の患者のうち、２人はＣＡを受けた（両方とも再発を示した）が、１０人は、タキサンとともにＣＡを受けた（７人が再発を示し、３人は示さなかった）。再発を全く示さなかった３人の患者が、ＴＬＥ３陽性サンプルを有する患者のみであったことは顕著なことである。これらの結果は重要であるが、これは、ＴＬＥ３結合と、化学療法に対する応答の間の相関が、治療が、アジュバントまたはネオアジュバント設定で投与されているかにかかわらず当てはまることをそれらが示すからである。
【０１１６】
図１５〜１７は、化学療法を受けた、図６のＲＰ乳癌コホート中の患者を使用して作成したカプラン−マイヤー再発曲線を示す。ステージＩＩ＋（図１５）、ステージＩＩｂ＋（図１６）およびステージＩＩＩ＋（図１７）癌のＴＬＥ３陽性およびＴＬＥ３陰性患者から得た再発データを使用して、上の曲線および下の曲線をそれぞれ作成した。各場合において、ＴＬＥ３マーカーとの抗体結合は、これらのサブセットの治療された患者を通して、予後の改善と相関した。図１７のサブセットでは、サンプルサイズは小さかったが（Ｎ＝１９）、フィッシャーの正確確率検定を使用して測定した場合に、有意性が得られた（ｐ＝０．０２０）。これらの結果は、臨床上重要であるが、これは、それらが、ＴＬＥ３マーカーの予測力が、ステージと無関係であり、最も悪い予後を有する患者においてでさえ有意性が残っていることを実証するからである（例えば、ステージＩＩＩ＋患者）。
【０１１７】
実施例５：二変数分析
ＴＬＥ３の予測力が、その他の臨床因子（例えば、年齢、腫瘍の大きさ、結節の状態、壊死など）と無関係であることを確認するために、本発明者らは、ＲＰ乳房コホートから得た結果を使用して二変数統計分析を実施した。結果は、以下の表１に要約されている。表に示されるように、ＴＬＥ３を使用する予測は、すべての二変数分析において有意性を残しており、このことは、そのその他の臨床因子の非依存を実証する。
【０１１８】
【表１】
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その他の実施形態
本発明のその他の実施形態は、明細書の考察または本明細書に開示される本発明の実施から当業者には明らかであろう。明細書および実施例は、単に例示と考えられ、本発明の真の範囲は、以下の特許請求の範囲によって示されると意図される。
【０１１９】
【表２−１】
0005745273.tif 000003
【０１２０】
【表２−２】
0005745273.tif 000004
【０１２１】
【表２−３】
0005745273.tif 000005
【０１２２】
【表２−４】
0005745273.tif 000006
【０１２３】
【表２−５】
0005745273.tif 000007
【０１２４】
【表２−６】
0005745273.tif 000008
【０１２５】
【表２−７】
0005745273.tif 000009
【０１２６】
【表２−８】
0005745273.tif 000010
【０１２７】
【表２−９】
0005745273.tif 000011
【０１２８】
【表２−１０】
0005745273.tif 000012
【０１２９】
【表２−１１】
0005745273.tif 000013
【０１３０】
【表２−１２】
0005745273.tif 000014
【０１３１】
【表２−１３】
0005745273.tif 000015
【０１３２】
【表２−１４】
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【０１３３】
【表２−１５】
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【０１３４】
【表２−１６】
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【０１３５】
【表２−１７】
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【０１３６】
【表２−１８】
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【０１３７】
【表２−１９】
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【０１３８】
【表２−２０】
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【０１３９】
【表２−２１】
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【０１４０】
【表２−２２】
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【０１４１】
【表２−２３】
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【０１４２】
【表２−２４】
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【０１４３】
【表２−２５】
0005745273.tif 000027
【０１４４】
【表２−２６】
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【０１４５】
【表２−２７】
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【０１４６】
【表２−２８】
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【０１４７】
【表２−２９】
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【０１４８】
【表２−３０】
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【０１４９】
【表２−３１】
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【０１５０】
【表２−３２】
0005745273.tif 000034
【０１５１】
【表２−３３】
0005745273.tif 000035
【０１５２】
【表２−３４】
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【０１５３】
【表２−３５】
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【０１５４】
【表２−３６】
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【０１５５】
【表２−３７】
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【０１５６】
【表２−３８】
0005745273.tif 000040
【０１５７】
【表２−３９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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