(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
医療専門家が対象に対して癌免疫療法を推奨することを可能とするための方法であって：
溶媒中にて前記対象から採取された第一の全血サンプルを第一の白血球活性化剤に暴露し、および前記溶媒中にて前記対象から採取された第二の全血サンプルを第二の白血球活性化剤に暴露することであって、前記暴露は、前記白血球活性化剤が３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡの発現を変化させる程度に充分な継続時間にわたって行われるものであり、ここで、前記第一および第二の白血球活性化剤は、癌免疫療法に関与する免疫機能と関連し；
前記対象から採取された第三の全血サンプルを前記第一または第二の白血球活性化剤を含まない前記溶媒に前記継続時間にわたって暴露すること；
前記第一、第二、および第三の全血サンプル中にて前記３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡの量を測定することによって、前記３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡの発現を定量すること；
癌免疫療法に対する臨床応答性が既知である複数のグループのうちの１つ以上における複数の患者を用いて前記第一または第二の白血球活性化剤に暴露した場合における前記３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡの量の変化倍数の各々を変数として多変量分析を行うことによってパラメータを予め設定すること；
前記臨床応答グループの各々について各個人に対する予測変数値を算出すること；ならびに、
前記予め設定した値を、前記予測変数値に対する比較参照値として用いて前記対象を前記臨床応答グループに分類し、前記医療専門家が前記対象のための癌免疫療法を推奨することを可能とすること、
を含む方法であって、
前記３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡが、以下のいずれかの組み合わせを含む、方法。
（１）インターフェロン−ガンマ、ＣＸＣＬケモカイン−３、およびＣＴＬ−関連タンパク質４
（２）インターフェロン−ガンマ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子スーパーファミリー−２
（３）インターフェロン−ガンマ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、およびプログラム細胞死１
（４）腫瘍壊死因子スーパーファミリー−１、腫瘍壊死因子スーパーファミリー−２、およびＣＴＬ−関連タンパク質４
【請求項２】
前記定量が、（ｉ）ＲＴ−ＰＣＲを用いて前記３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡを増幅すること、又は、（ｉｉ）ノーザンブロットを用いて前記白血球機能関連ｍＲＮＡの誘導を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記定量が、前記３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡの増幅用に特に設計されたプライマーによるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて、前記３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡを増幅することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡが、異なる機能性免疫分類に関連する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記癌免疫療法が、樹状細胞ワクチンを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記全血サンプルが、抗凝固剤で処理される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記抗凝固剤が、ヘパリンを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記暴露が、（ｉ）３０℃から４２℃の温度、又は、（ｉｉ）３７℃の温度で実施される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記継続時間が、６時間未満である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記継続時間が、１から４時間である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
癌免疫療法に対する臨床応答性が既知である前記グループが、病勢安定、部分寛解、全生存、および無退縮（regression-free）生存から成る群より選択される、請求項１〜１
０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第一及び第二の白血球活性化剤が、
（ｉ）フィトヘマグルチニン、熱凝集ＩｇＧ、ザイモサン、インターロイキン２、インターフェロンアルファ−２−ベータ、ヒトＴ細胞受容体のアルファ／ベータ鎖に対するモノクローナル抗体、およびピシバニールから成る群より選択される、
（ｉｉ）インターフェロンアルファ−２−ベータ、熱凝集ＩｇＧ、ザイモサン、およびヒトＴ細胞受容体のアルファ／ベータ鎖に対するモノクローナル抗体の１つ以上と組み合わされたフィトヘマグルチニンである、又は、
（ｉｉｉ）インターフェロンアルファ−２−ベータ、熱凝集ＩｇＧ、ザイモサン、フィトヘマグルチニン、およびヒトＴ細胞受容体のアルファ／ベータ鎖に対するモノクローナル抗体の１つ以上と組み合わされたインターロイキン−２である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記多変量分析が、多変量判別分析を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０１１年７月１８日出願の米国特許仮出願第６１／５０９，０３０号の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明の実施形態は、特定の治療剤に対する個人の応答性を特定および／または予測するための方法全般に関する。より詳細には、本明細書にて開示される実施形態は、個人が癌免疫療法に応答するか、または応答できないかの予測に関する。特定の実施形態は、個人において現在進行中の癌免疫療法の有効性をモニタリングする方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
多くの癌において、主たる治療レジメンは、外科手術、化学療法、放射線、またはこれらの組み合わせである。残念なことに、これらの技術は、特定の患者に対しては適切ではない。病状が重過ぎて、患者が外科手術または化学療法のストレスを受けることができない場合がある。手術不能であるか、または化学療法剤もしくは放射線療法に非応答性である腫瘍を患者が有する場合もある。最近、癌の免疫療法が、様々な癌に対して実行可能である治療の範囲に入ってきた。
【０００４】
診断後の癌患者が多くの場合に直面するのは、ある治療法が有効であり得る時間枠が短いということである。この時間枠が閉じられてしまうと、患者の余命および／またはクオリティオブライフが著しく低下する恐れがある。この時間枠が閉じられることはまた、いくつかの治療の選択肢を現実的に意味のないものとしてしまい、同時に、それ程望ましくなかったであろうその他の治療を、第一選択治療レジメンとしてしまう恐れもある。言い換えると、ほとんどの癌患者にとって、時間は極めて重要であり、特定の治療法または治療法の組み合わせが癌に対して有効であるかどうかが分かれば、患者の治療に成功することができる可能性が高まることになる。従って、特定の癌治療法に対してどの個人が応答性である可能性を有するかを特定する方法が求められている。さらに、継続して治療法を受けている個人において、癌治療法の現在進行中の効果をモニタリングすることも求められている。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書にて提供されるいくつかの実施形態は、癌免疫療法に対する患者の応答性を予測するための方法の必要性に対処するものである。従って、いくつかの実施形態において、医療専門家が対象に対して癌免疫療法を推奨することを可能とする方法が提供され、その方法は、対象から少なくとも第一、第二、および第三の全血サンプルを採取すること、溶媒中にて第一の全血サンプルを第一の白血球活性化剤に暴露し、および前記溶媒中にて第二の全血サンプルを第二の白血球活性化剤に暴露することであって、前記暴露は、前記白血球活性化剤が３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡの発現を変化させる程度に充分な継続時間にわたって行われるものであり、ここで、前記第一および第二の白血球活性化剤は、癌免疫療法に関与する免疫機能と関連し、第三の全血サンプルを前記第一または第二の白血球活性化剤を含まない前記溶媒に前記継続時間にわたって暴露すること、前記第一、第二、および第三の全血サンプル中にて前記３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡの量を測定することによって前記３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡの発現を定量すること、癌免疫療法に対する臨床応答性が既知である複数のグループのうちの１つ以上における複数の患者を用いて前記第一および第二の白血球活性化剤と前記３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡとの各組み合わせに対して多変量分析を行うことによってパラ
メータを予め設定すること、前記臨床応答グループの各々について各個人に対する予測変数値を算出すること、ならびに前記予め設定した値を前記予測変数値に対する比較参照値として用いて前記対象を前記臨床応答グループ分類して、前記医療専門家が前記対象のための癌免疫療法を推奨することを可能とすること、を含む。
【０００６】
また、いくつかの実施形態において、医療専門家が対象に対して癌免疫療法を推奨することを可能とする方法がさらに提供され、その方法は、対象から採取した第一の全血サンプルの溶媒中における第一の白血球活性化剤への暴露および対象から採取した第二の全血サンプルの溶媒中における第二の白血球活性化剤への暴露を、これらの白血球活性化剤が癌免疫療法に関与する免疫機能と関連する３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡの発現を変化させる程度に充分な継続時間にわたって行うこと、対象から採取した第三の全血サンプルを第一または第二の白血球活性化剤を含まない溶媒にその継続時間にわたって暴露すること、ならびに第一、第二、および第三の全血サンプル中にてこの３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡの量を測定することによってこの３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡの発現を定量すること、を含む。いくつかの実施形態では、癌免疫療法に対する臨床応答性が既知である複数のグループのうちの１つ以上における複数の患者を用い、第一および第二の白血球活性化剤と３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡとの各組み合わせに対して数学的分析を行うことによって、パラメータが設定される。加えて、臨床応答グループの各々について各個人に対して予測変数値が算出され、この予測変数値は、対象を臨床応答グループに分類して、医療専門家が対象のための癌免疫療法を推奨することを可能とすることを目的として、予め設定された値と比較される。
【０００７】
また、いくつかの実施形態において、医療専門家が対象に対して癌免疫療法を推奨することを可能とする方法がさらに提供され、その方法は、対象から少なくとも第一、第二、および第三の全血サンプルを採取すること、溶媒中にて第一の全血サンプルを第一の白血球活性化剤に暴露し、およびその溶媒中にて第二の全血サンプルを第二の白血球活性化剤に暴露することであって、この暴露は、白血球活性化剤が３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡの発現を変化させる程度に充分な継続時間にわたって行われるものであり、ここで、第一および第二の白血球活性化剤は、癌免疫療法に関与する免疫機能と関連し、第三の全血サンプルを第一または第二の白血球活性化剤を含まない溶媒にその継続時間にわたって暴露すること、第一、第二、および第三の全血サンプル中にて３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡの量を測定することによって３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡの発現を定量すること、癌免疫療法に対する臨床応答性が既知である複数のグループのうちの１つ以上における複数の患者を用いて第一および第二の白血球活性化剤と３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡとの各組み合わせに対して多変量分析を行うことによってパラメータを予め設定すること、臨床応答グループの各々について各個人に対する予測変数値を算出すること、ならびに対象が臨床応答グループのいずれかに分類される場合に医療専門家に通知し、それによって、医療専門家が対象のための癌免疫療法を推奨することを可能とすること、を含む。
【０００８】
また、癌免疫療法に対する個人の潜在的応答性を特定するための生体外での方法も提供され、その方法は、溶媒中にて第一の全血サンプルを第一の白血球活性化剤に暴露し、およびその溶媒中にて第二の全血サンプルを第二の白血球活性化剤に暴露することであって、この暴露は、白血球活性化剤が３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡの発現を変化させる程度に充分な継続時間にわたって行われるものであり、第三の全血サンプルを第一または第二の白血球活性化剤を含まない溶媒にその継続時間にわたって暴露すること、第一、第二、および第三の全血サンプル中にて３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡの量を測定することによって３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡの発現を定量すること、ならびに、癌免疫療法に対する臨床応答性が既知である複数のグループのうちの１つ以上における複数の患者を用いた第一および第二の白血球活性化剤と３つ以上の白血球
機能関連ｍＲＮＡとの各組み合わせに対する多変量分析によりパラメータを予め設定し、臨床応答グループの各々について各個人に対する予測変数値を算出し、個人を臨床応答グループに分類する目的で、予測変数値を予め設定された値と比較し、および個人が臨床応答グループのいずれかに分類される場合に、個人を癌免疫療法に対する潜在的応答者として特定することによって免疫療法に対する個人の潜在的応答性を特定すること、を含む。いくつかの実施形態では、ここで、第一および第二の白血球活性化剤は、癌免疫療法に関与する免疫機能と関連する。
【０００９】
加えて、対象に癌免疫療法レジメンを受けるようアドバイスするための方法が提供され、その方法は、対象の血液試験を指示することであって、その試験は、対象から少なくとも第一および第二の全血サンプルを採取すること、溶媒中にて第一の全血サンプルを第一の白血球活性化剤に暴露し、およびその溶媒中にて第二の全血サンプルを第二の白血球活性化剤に暴露することであって、この暴露は、白血球活性化剤が３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡの発現を変化させる程度に充分な継続時間にわたって行われるものであり、ここで、第一および第二の白血球活性化剤は、癌免疫療法に関与する免疫機能と関連する、暴露、第三の全血サンプルを第一または第二の白血球活性化剤を含まない溶媒にその継続時間にわたって暴露すること、第一、第二、および第三の全血サンプル中にて３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡの量を測定することによって３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡの発現を定量すること、を含む指示、癌免疫療法に対する臨床応答性が既知である複数のグループのうちの１つ以上における複数の患者を用いて第一および第二の白血球活性化剤と３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡとの各組み合わせに対して多変量分析を行うことによってパラメータを予め設定すること、臨床応答グループの各々について各個人に対する予測変数値を算出すること、個人を臨床応答グループに分類する目的で、予測変数値を予め設定した値と比較すること、ならびに対象が臨床応答グループのいずれかに分類される場合に、癌免疫療法を受けるよう対象にアドバイスすること、を含む。
【００１０】
また、癌を有する対象を、癌免疫療法レジメンに対する対象の診断された応答性に基づいて治療するための方法も提供され、その方法は、対象の血液試験を指示することであって、その試験は、対象から少なくとも第一および第二の全血サンプルを採取すること、溶媒中にて第一の全血サンプルを第一の白血球活性化剤に暴露し、およびその溶媒中にて第二の全血サンプルを第二の白血球活性化剤に暴露することであって、この暴露は、白血球活性化剤が３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡの発現を変化させる程度に充分な継続時間にわたって行われるものであり、ここで、第一および第二の白血球活性化剤は、癌免疫療法に関与する免疫機能と関連し、第三の全血サンプルを第一または第二の白血球活性化剤を含まない溶媒にその継続時間にわたって暴露すること、第一、第二、および第三の全血サンプル中にて３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡの量を測定することによって３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡの発現を定量すること、を含む指示、癌免疫療法に対する臨床応答性が既知である複数のグループのうちの１つ以上における複数の患者を用いて第一および第二の白血球活性化剤と３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡとの各組み合わせに対して多変量分析を行うことによってパラメータを予め設定すること、臨床応答グループの各々について各個人に対する予測変数値を算出すること、個人を臨床応答グループに分類する目的で予測変数値を予め設定した値と比較すること、ならびに対象が臨床応答グループのいずれかに分類される場合に癌免疫療法を対象に施すこと、を含む。
【００１１】
加えて、癌患者を治療する方法が提供され、その方法は、ａ）患者からの少なくとも第一、第二、および第三の全血サンプルの採取、ｂ）患者からの全血サンプルに対するアッセイの実施であって、このアッセイは、ｉ）溶媒中における第一の全血サンプルの第一の白血球活性化剤への暴露、およびその溶媒中における第二の全血サンプルの第二の白血球
活性化剤への暴露を、白血球活性化剤が３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡの発現を変化させる程度に充分な継続時間にわたって行うことであって、ここで、第一および第二の白血球活性化剤は、癌免疫療法に関与する免疫機能と関連し、ｉｉ）第三の全血サンプルを第一または第二の白血球活性化剤を含まない溶媒にその継続時間にわたって暴露すること、ｉｉｉ）第一、第二、および第三の全血サンプル中にて３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡの量を測定することによって３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡの発現を定量すること、ｉｖ）癌免疫療法に対する臨床応答性が既知である複数のグループのうちの１つ以上における複数の患者を用いて第一および第二の白血球活性化剤と３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡとの各組み合わせに対して多変量分析を行うことによって値を予め設定すること、およびｖ）臨床応答グループの各々について各個人に対する予測変数値を算出すること、を含むアッセイの実施、ｃ）予測変数値および予め設定した値の入手、ｄ）癌免疫療法に対する臨床応答性が既知であるグループのいずれかに個人を分類する目的での、予測変数値と予め設定した値との比較、ならびに、ｅ）この比較から患者が臨床応答グループのいずれかに分類されるという結果が得られる場合における、患者への癌免疫療法の実施、を含む。いくつかの実施形態では、臨床応答グループ外に分類されるという結果が得られる場合には、患者に対して、非免疫学的癌治療が実施される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、また、癌免疫療法に対する個人の潜在的応答性を特定するための生体外での方法も提供され、その方法は、溶媒中にて第一の全血サンプルを第一の白血球活性化剤に暴露し、およびその溶媒中にて第二の全血サンプルを第二の白血球活性化剤に暴露することであって、この暴露は、白血球活性化剤が３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡの発現を変化させる程度に充分な継続時間にわたって行われるものであり、ここで、第一および第二の白血球活性化剤は、癌免疫療法に関与する免疫機能と関連し、第三の全血サンプルを第一または第二の白血球活性化剤を含まない溶媒にその継続時間にわたって暴露すること、第一、第二、および第三の全血サンプル中にて３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡの量を測定することによって３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡの発現を定量すること、免疫療法に対する個人の潜在的応答性を特定することであって、ここで、この特定は、癌免疫療法に対する臨床応答性が既知である複数のグループのうちの１つ以上における複数の患者を用いた第一および第二の白血球活性化剤と３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡとの各組み合わせに対する多変量分析によるパラメータの予めの設定、臨床応答グループの各々についての各個人に対する予測変数値の算出、および個人を臨床応答グループに分類する目的での予測変数値と予め設定された値との比較を含み、ここで、臨床応答グループのいずれかへの分類が、個人を癌免疫療法に対する応答者として特定する結果となる、特定、を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、定量は、ＲＴ−ＰＣＲを用いて３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡを増幅することを含む。いくつかの実施形態では、定量は、３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡの増幅用に特に設計されたプライマーによるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて、３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡを増幅することを含む。いくつかの実施形態では、定量は、ノーザンブロットを用いて白血球機能関連ｍＲＮＡの誘導を測定することを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡは、異なる機能性免疫分類に関連する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、癌免疫療法は、樹状細胞ワクチンを含む。いくつかの実施形態では、癌免疫療法は、１つ以上の治療抗体を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、全血サンプルは、抗凝固剤で処理され、それは、ある実施形態では、ヘパリンを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、暴露は、約３０℃から約４２℃の温度で実施される。ある実施形態では、その他の温度（温度範囲を含む）が用いられる。１つの実施形態では、暴露は、約３７℃の温度で実施される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、暴露の継続時間は、約６時間未満であるが、ある実施形態では、それよりも長い時間が用いられてよい。ある実施形態では、継続時間は、約１から約４時間である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、癌免疫療法に対する臨床応答性が既知であるグループは、病勢安定、部分寛解、全生存、および無退縮（regression-free）生存から成る群より選択
される。ある実施形態では、その他の中間的なグループが含まれる（例：低悪性度（low-grade）の進行、高悪性度（high-grade）の進行、など）。
【００２０】
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの異なる白血球活性化剤は、フィトヘマグルチニン、熱凝集ＩｇＧ、ザイモサン、インターロイキン２、インターフェロンアルファ−２−ベータ、ヒトＴ細胞受容体のアルファ／ベータ鎖に対するモノクローナル抗体、およびピシバニールから成る群より選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの異なる白血球活性化剤は、インターフェロンアルファ−２−ベータ、熱凝集ＩｇＧ、ザイモサン、およびヒトＴ細胞受容体のアルファ／ベータ鎖に対するモノクローナル抗体の１つ以上と組み合わされたフィトヘマグルチニンを含む。なおさらなる実施形態では、少なくとも２つの異なる白血球活性化剤は、インターフェロンアルファ−２−ベータ、熱凝集ＩｇＧ、ザイモサン、フィトヘマグルチニン、およびヒトＴ細胞受容体のアルファ／ベータ鎖に対するモノクローナル抗体の１つ以上と組み合わされたインターロイキン−２を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、白血球機能関連ｍＲＮＡは、インターフェロン−ガンマ、腫瘍壊死因子スーパーファミリー−１、腫瘍壊死因子スーパーファミリー−２、腫瘍壊死因子スーパーファミリー−５、インターロイキン−１０、トランスフォーミング増殖因子−ベータ、ＣＴＬ−関連タンパク質４、プログラム細胞死１、フォークヘッドボックスＰ３、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、血管内皮増殖因子、インターロイキン−８、ＣＣＬケモカイン−８、ＣＸＣＬケモカイン−３、およびインターロイキン２から成る群より選択される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、多変量分析は、多変量判別分析を含む。対象の潜在的応答性が特定されるいくつかの実施形態では、その方法はさらに、対象の予測された応答性によって適切であることが示される場合に、対象に癌免疫療法を施すことを含む。
【００２３】
さらに、本明細書にて、癌免疫療法に対する個人の潜在的応答性を特定するための生体外での方法が提供され、その方法は、溶媒中にて第一の全血サンプルを第一の白血球活性化剤に暴露し、およびその溶媒中にて第二の全血サンプルを第二の白血球活性化剤に暴露することであって、この暴露は、白血球活性化剤が３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡの発現を変化させる程度に充分な継続時間にわたって行われるものであり、ここで、第一および第二の白血球活性化剤は、癌免疫療法に関与する免疫機能と関連し、第三の全血サンプルを第一または第二の白血球活性化剤を含まない溶媒にその継続時間にわたって暴露すること、第一、第二、および第三の全血サンプル中にて３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡの量を測定することによって３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡの発現を定量すること、ならびに免疫療法に対する個人の潜在的応答性を特定すること、を含む。いくつかの実施形態では、この特定は、癌免疫療法に対する臨床応答性が既知である複数のグループのうちの１つ以上における複数の患者を用いた第一および第二の白血
球活性化剤と３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡとの各組み合わせに対する多変量判別分析によりパラメータを予め設定すること、臨床応答グループの各々について各個人に対する予測変数値を算出すること、および個人を臨床応答グループに分類する目的で予測変数値と予め設定された値とを比較することを含み、ここで、臨床応答グループのいずれかへの分類が、個人を癌免疫療法に対する応答者として特定する結果となる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、３つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡは、異なる機能免疫分類と関連する。１つの実施形態では、癌免疫療法は、樹状細胞ワクチンを含むが、他の実施形態では、その他の免疫療法に対する応答性も予測される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、全血サンプルは、抗凝固剤で処理される。１つの実施形態では、抗凝固剤は、ヘパリンを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、暴露は、約３０℃から約４２℃の温度で実施される。いくつかの実施形態では、暴露は、約３７℃の温度で実施される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、継続時間は、約６時間未満である。１つの実施形態では、継続時間は、約１から約４時間である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、癌免疫療法に対する臨床応答性が既知であるグループは、病勢安定、部分寛解、全生存、および無退縮（regression-free）生存から成る群より選択
される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの異なる白血球活性化剤は、フィトヘマグルチニン、熱凝集ＩｇＧ、ザイモサン、インターロイキン２、インターフェロンアルファ−２−ベータ、ヒトＴ細胞受容体のアルファ／ベータ鎖に対するモノクローナル抗体、およびピシバニールから成る群より選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの異なる白血球活性化剤は、インターフェロンアルファ−２−ベータ、熱凝集ＩｇＧ、ザイモサン、およびヒトＴ細胞受容体のアルファ／ベータ鎖に対するモノクローナル抗体の１つ以上と組み合わされたフィトヘマグルチニンを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの異なる白血球活性化剤は、インターフェロンアルファ−２−ベータ、熱凝集ＩｇＧ、ザイモサン、フィトヘマグルチニン、およびヒトＴ細胞受容体のアルファ／ベータ鎖に対するモノクローナル抗体の１つ以上と組み合わされたインターロイキン−２を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、白血球機能関連ｍＲＮＡは、インターフェロン−ガンマ、腫瘍壊死因子スーパーファミリー−１、腫瘍壊死因子スーパーファミリー−２、腫瘍壊死因子スーパーファミリー−５、インターロイキン−１０、トランスフォーミング増殖因子−ベータ、ＣＴＬ−関連タンパク質４、プログラム細胞死１、フォークヘッドボックスＰ３、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、血管内皮増殖因子、インターロイキン−８、ＣＣＬケモカイン−８、ＣＸＣＬケモカイン−３、およびインターロイキン２から成る群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｋは、生体外でのｍＲＮＡの誘導、および臨床結果を示す。それぞれ、Ａ−Ｄ：ザイモサン誘導ＡＣＴＢ（Ａ）、Ｂ２Ｍ（Ｂ）、ＩＦＮＧ（Ｃ）、およびＩＬ１０（Ｄ）、Ｅ−Ｈ：ＰＨＡ誘導ＡＣＴＢ（Ｅ）、Ｂ２Ｍ（Ｆ）、ＴＮＦＳＦ２（Ｇ）、およびＩＬ１０（Ｈ）。Ｉ−Ｋ：ｒＩ２誘導ＡＣＴＢ（Ｉ）、Ｂ２Ｍ（Ｊ）、およびＴＮＦＳＦ２（Ｋ）。変化倍数（Ｙ軸）は、ＰＢＳの値をベースラインとして用いて算出した。治療後、臨床結果（ＰＤ、ＳＤ、およびＰＲ）（ｘ軸）を以下で述べるようにして判定した。統計分析は、変化倍数の対数値を用いたスチューデントｔ検定によって行った。矢印は、グラフ間（Ａ〜Ｈ）での比較のために、同じ患者を示したものである。
【図１Ｂ】図１Ａ−１Ｋは、生体外でのｍＲＮＡの誘導、および臨床結果を示す。それぞれ、Ａ−Ｄ：ザイモサン誘導ＡＣＴＢ（Ａ）、Ｂ２Ｍ（Ｂ）、ＩＦＮＧ（Ｃ）、およびＩＬ１０（Ｄ）、Ｅ−Ｈ：ＰＨＡ誘導ＡＣＴＢ（Ｅ）、Ｂ２Ｍ（Ｆ）、ＴＮＦＳＦ２（Ｇ）、およびＩＬ１０（Ｈ）。Ｉ−Ｋ：ｒＩ２誘導ＡＣＴＢ（Ｉ）、Ｂ２Ｍ（Ｊ）、およびＴＮＦＳＦ２（Ｋ）。変化倍数（Ｙ軸）は、ＰＢＳの値をベースラインとして用いて算出した。治療後、臨床結果（ＰＤ、ＳＤ、およびＰＲ）（ｘ軸）を以下で述べるようにして判定した。統計分析は、変化倍数の対数値を用いたスチューデントｔ検定によって行った。矢印は、グラフ間（Ａ〜Ｈ）での比較のために、同じ患者を示したものである。
【図１Ｃ】図１Ａ−１Ｋは、生体外でのｍＲＮＡの誘導、および臨床結果を示す。それぞれ、Ａ−Ｄ：ザイモサン誘導ＡＣＴＢ（Ａ）、Ｂ２Ｍ（Ｂ）、ＩＦＮＧ（Ｃ）、およびＩＬ１０（Ｄ）、Ｅ−Ｈ：ＰＨＡ誘導ＡＣＴＢ（Ｅ）、Ｂ２Ｍ（Ｆ）、ＴＮＦＳＦ２（Ｇ）、およびＩＬ１０（Ｈ）。Ｉ−Ｋ：ｒＩ２誘導ＡＣＴＢ（Ｉ）、Ｂ２Ｍ（Ｊ）、およびＴＮＦＳＦ２（Ｋ）。変化倍数（Ｙ軸）は、ＰＢＳの値をベースラインとして用いて算出した。治療後、臨床結果（ＰＤ、ＳＤ、およびＰＲ）（ｘ軸）を以下で述べるようにして判定した。統計分析は、変化倍数の対数値を用いたスチューデントｔ検定によって行った。矢印は、グラフ間（Ａ〜Ｈ）での比較のために、同じ患者を示したものである。
【図１Ｄ】図１Ａ−１Ｋは、生体外でのｍＲＮＡの誘導、および臨床結果を示す。それぞれ、Ａ−Ｄ：ザイモサン誘導ＡＣＴＢ（Ａ）、Ｂ２Ｍ（Ｂ）、ＩＦＮＧ（Ｃ）、およびＩＬ１０（Ｄ）、Ｅ−Ｈ：ＰＨＡ誘導ＡＣＴＢ（Ｅ）、Ｂ２Ｍ（Ｆ）、ＴＮＦＳＦ２（Ｇ）、およびＩＬ１０（Ｈ）。Ｉ−Ｋ：ｒＩ２誘導ＡＣＴＢ（Ｉ）、Ｂ２Ｍ（Ｊ）、およびＴＮＦＳＦ２（Ｋ）。変化倍数（Ｙ軸）は、ＰＢＳの値をベースラインとして用いて算出した。治療後、臨床結果（ＰＤ、ＳＤ、およびＰＲ）（ｘ軸）を以下で述べるようにして判定した。統計分析は、変化倍数の対数値を用いたスチューデントｔ検定によって行った。矢印は、グラフ間（Ａ〜Ｈ）での比較のために、同じ患者を示したものである。
【図１Ｅ】図１Ａ−１Ｋは、生体外でのｍＲＮＡの誘導、および臨床結果を示す。それぞれ、Ａ−Ｄ：ザイモサン誘導ＡＣＴＢ（Ａ）、Ｂ２Ｍ（Ｂ）、ＩＦＮＧ（Ｃ）、およびＩＬ１０（Ｄ）、Ｅ−Ｈ：ＰＨＡ誘導ＡＣＴＢ（Ｅ）、Ｂ２Ｍ（Ｆ）、ＴＮＦＳＦ２（Ｇ）、およびＩＬ１０（Ｈ）。Ｉ−Ｋ：ｒＩ２誘導ＡＣＴＢ（Ｉ）、Ｂ２Ｍ（Ｊ）、およびＴＮＦＳＦ２（Ｋ）。変化倍数（Ｙ軸）は、ＰＢＳの値をベースラインとして用いて算出した。治療後、臨床結果（ＰＤ、ＳＤ、およびＰＲ）（ｘ軸）を以下で述べるようにして判定した。統計分析は、変化倍数の対数値を用いたスチューデントｔ検定によって行った。矢印は、グラフ間（Ａ〜Ｈ）での比較のために、同じ患者を示したものである。
【図１Ｆ】図１Ａ−１Ｋは、生体外でのｍＲＮＡの誘導、および臨床結果を示す。それぞれ、Ａ−Ｄ：ザイモサン誘導ＡＣＴＢ（Ａ）、Ｂ２Ｍ（Ｂ）、ＩＦＮＧ（Ｃ）、およびＩＬ１０（Ｄ）、Ｅ−Ｈ：ＰＨＡ誘導ＡＣＴＢ（Ｅ）、Ｂ２Ｍ（Ｆ）、ＴＮＦＳＦ２（Ｇ）、およびＩＬ１０（Ｈ）。Ｉ−Ｋ：ｒＩ２誘導ＡＣＴＢ（Ｉ）、Ｂ２Ｍ（Ｊ）、およびＴＮＦＳＦ２（Ｋ）。変化倍数（Ｙ軸）は、ＰＢＳの値をベースラインとして用いて算出した。治療後、臨床結果（ＰＤ、ＳＤ、およびＰＲ）（ｘ軸）を以下で述べるようにして判定した。統計分析は、変化倍数の対数値を用いたスチューデントｔ検定によって行った。矢印は、グラフ間（Ａ〜Ｈ）での比較のために、同じ患者を示したものである。
【図１Ｇ】図１Ａ−１Ｋは、生体外でのｍＲＮＡの誘導、および臨床結果を示す。それぞれ、Ａ−Ｄ：ザイモサン誘導ＡＣＴＢ（Ａ）、Ｂ２Ｍ（Ｂ）、ＩＦＮＧ（Ｃ）、およびＩＬ１０（Ｄ）、Ｅ−Ｈ：ＰＨＡ誘導ＡＣＴＢ（Ｅ）、Ｂ２Ｍ（Ｆ）、ＴＮＦＳＦ２（Ｇ）、およびＩＬ１０（Ｈ）。Ｉ−Ｋ：ｒＩ２誘導ＡＣＴＢ（Ｉ）、Ｂ２Ｍ（Ｊ）、およびＴＮＦＳＦ２（Ｋ）。変化倍数（Ｙ軸）は、ＰＢＳの値をベースラインとして用いて算出した。治療後、臨床結果（ＰＤ、ＳＤ、およびＰＲ）（ｘ軸）を以下で述べるようにして判定した。統計分析は、変化倍数の対数値を用いたスチューデントｔ検定によって行った。矢印は、グラフ間（Ａ〜Ｈ）での比較のために、同じ患者を示したものである。
【図１Ｈ】図１Ａ−１Ｋは、生体外でのｍＲＮＡの誘導、および臨床結果を示す。それぞれ、Ａ−Ｄ：ザイモサン誘導ＡＣＴＢ（Ａ）、Ｂ２Ｍ（Ｂ）、ＩＦＮＧ（Ｃ）、およびＩＬ１０（Ｄ）、Ｅ−Ｈ：ＰＨＡ誘導ＡＣＴＢ（Ｅ）、Ｂ２Ｍ（Ｆ）、ＴＮＦＳＦ２（Ｇ）、およびＩＬ１０（Ｈ）。Ｉ−Ｋ：ｒＩ２誘導ＡＣＴＢ（Ｉ）、Ｂ２Ｍ（Ｊ）、およびＴＮＦＳＦ２（Ｋ）。変化倍数（Ｙ軸）は、ＰＢＳの値をベースラインとして用いて算出した。治療後、臨床結果（ＰＤ、ＳＤ、およびＰＲ）（ｘ軸）を以下で述べるようにして判定した。統計分析は、変化倍数の対数値を用いたスチューデントｔ検定によって行った。矢印は、グラフ間（Ａ〜Ｈ）での比較のために、同じ患者を示したものである。
【図１Ｉ】図１Ａ−１Ｋは、生体外でのｍＲＮＡの誘導、および臨床結果を示す。それぞれ、Ａ−Ｄ：ザイモサン誘導ＡＣＴＢ（Ａ）、Ｂ２Ｍ（Ｂ）、ＩＦＮＧ（Ｃ）、およびＩＬ１０（Ｄ）、Ｅ−Ｈ：ＰＨＡ誘導ＡＣＴＢ（Ｅ）、Ｂ２Ｍ（Ｆ）、ＴＮＦＳＦ２（Ｇ）、およびＩＬ１０（Ｈ）。Ｉ−Ｋ：ｒＩ２誘導ＡＣＴＢ（Ｉ）、Ｂ２Ｍ（Ｊ）、およびＴＮＦＳＦ２（Ｋ）。変化倍数（Ｙ軸）は、ＰＢＳの値をベースラインとして用いて算出した。治療後、臨床結果（ＰＤ、ＳＤ、およびＰＲ）（ｘ軸）を以下で述べるようにして判定した。統計分析は、変化倍数の対数値を用いたスチューデントｔ検定によって行った。矢印は、グラフ間（Ａ〜Ｈ）での比較のために、同じ患者を示したものである。
【図１Ｊ】図１Ａ−１Ｋは、生体外でのｍＲＮＡの誘導、および臨床結果を示す。それぞれ、Ａ−Ｄ：ザイモサン誘導ＡＣＴＢ（Ａ）、Ｂ２Ｍ（Ｂ）、ＩＦＮＧ（Ｃ）、およびＩＬ１０（Ｄ）、Ｅ−Ｈ：ＰＨＡ誘導ＡＣＴＢ（Ｅ）、Ｂ２Ｍ（Ｆ）、ＴＮＦＳＦ２（Ｇ）、およびＩＬ１０（Ｈ）。Ｉ−Ｋ：ｒＩ２誘導ＡＣＴＢ（Ｉ）、Ｂ２Ｍ（Ｊ）、およびＴＮＦＳＦ２（Ｋ）。変化倍数（Ｙ軸）は、ＰＢＳの値をベースラインとして用いて算出した。治療後、臨床結果（ＰＤ、ＳＤ、およびＰＲ）（ｘ軸）を以下で述べるようにして判定した。統計分析は、変化倍数の対数値を用いたスチューデントｔ検定によって行った。矢印は、グラフ間（Ａ〜Ｈ）での比較のために、同じ患者を示したものである。
【図１Ｋ】図１Ａ−１Ｋは、生体外でのｍＲＮＡの誘導、および臨床結果を示す。それぞれ、Ａ−Ｄ：ザイモサン誘導ＡＣＴＢ（Ａ）、Ｂ２Ｍ（Ｂ）、ＩＦＮＧ（Ｃ）、およびＩＬ１０（Ｄ）、Ｅ−Ｈ：ＰＨＡ誘導ＡＣＴＢ（Ｅ）、Ｂ２Ｍ（Ｆ）、ＴＮＦＳＦ２（Ｇ）、およびＩＬ１０（Ｈ）。Ｉ−Ｋ：ｒＩ２誘導ＡＣＴＢ（Ｉ）、Ｂ２Ｍ（Ｊ）、およびＴＮＦＳＦ２（Ｋ）。変化倍数（Ｙ軸）は、ＰＢＳの値をベースラインとして用いて算出した。治療後、臨床結果（ＰＤ、ＳＤ、およびＰＲ）（ｘ軸）を以下で述べるようにして判定した。統計分析は、変化倍数の対数値を用いたスチューデントｔ検定によって行った。矢印は、グラフ間（Ａ〜Ｈ）での比較のために、同じ患者を示したものである。
【図２Ａ】図２Ａ−２Ｆは、ｍＲＮＡ対ｍＲＮＡの相互作用を示す。２６人の患者から得られたＰＨＡ誘導ＩＬ１０（ｘ軸）の増加倍数を、それぞれ、ＣＴＬＡ４（Ａ）、ＰＤ−１（Ｂ）、ＦＯＸＰ３（Ｃ）、ＩＦＮＧ（Ｄ）、ＩＬ２（Ｅ）、およびＴＮＦＳＦ２（Ｆ）のそれと比較した。各パネルには、回帰直線（点線）を示し、ｒ２を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ−２Ｆは、ｍＲＮＡ対ｍＲＮＡの相互作用を示す。２６人の患者から得られたＰＨＡ誘導ＩＬ１０（ｘ軸）の増加倍数を、それぞれ、ＣＴＬＡ４（Ａ）、ＰＤ−１（Ｂ）、ＦＯＸＰ３（Ｃ）、ＩＦＮＧ（Ｄ）、ＩＬ２（Ｅ）、およびＴＮＦＳＦ２（Ｆ）のそれと比較した。各パネルには、回帰直線（点線）を示し、ｒ２を示す。
【図２Ｃ】図２Ａ−２Ｆは、ｍＲＮＡ対ｍＲＮＡの相互作用を示す。２６人の患者から得られたＰＨＡ誘導ＩＬ１０（ｘ軸）の増加倍数を、それぞれ、ＣＴＬＡ４（Ａ）、ＰＤ−１（Ｂ）、ＦＯＸＰ３（Ｃ）、ＩＦＮＧ（Ｄ）、ＩＬ２（Ｅ）、およびＴＮＦＳＦ２（Ｆ）のそれと比較した。各パネルには、回帰直線（点線）を示し、ｒ２を示す。
【図２Ｄ】図２Ａ−２Ｆは、ｍＲＮＡ対ｍＲＮＡの相互作用を示す。２６人の患者から得られたＰＨＡ誘導ＩＬ１０（ｘ軸）の増加倍数を、それぞれ、ＣＴＬＡ４（Ａ）、ＰＤ−１（Ｂ）、ＦＯＸＰ３（Ｃ）、ＩＦＮＧ（Ｄ）、ＩＬ２（Ｅ）、およびＴＮＦＳＦ２（Ｆ）のそれと比較した。各パネルには、回帰直線（点線）を示し、ｒ２を示す。
【図２Ｅ】図２Ａ−２Ｆは、ｍＲＮＡ対ｍＲＮＡの相互作用を示す。２６人の患者から得られたＰＨＡ誘導ＩＬ１０（ｘ軸）の増加倍数を、それぞれ、ＣＴＬＡ４（Ａ）、ＰＤ−１（Ｂ）、ＦＯＸＰ３（Ｃ）、ＩＦＮＧ（Ｄ）、ＩＬ２（Ｅ）、およびＴＮＦＳＦ２（Ｆ）のそれと比較した。各パネルには、回帰直線（点線）を示し、ｒ２を示す。
【図２Ｆ】図２Ａ−２Ｆは、ｍＲＮＡ対ｍＲＮＡの相互作用を示す。２６人の患者から得られたＰＨＡ誘導ＩＬ１０（ｘ軸）の増加倍数を、それぞれ、ＣＴＬＡ４（Ａ）、ＰＤ−１（Ｂ）、ＦＯＸＰ３（Ｃ）、ＩＦＮＧ（Ｄ）、ＩＬ２（Ｅ）、およびＴＮＦＳＦ２（Ｆ）のそれと比較した。各パネルには、回帰直線（点線）を示し、ｒ２を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
上記で考察したように、外科手術、放射線、および化学療法は、ほとんどの癌に対する典型的な第一選択治療である。従って、癌免疫療法は、通常、第二選択治療である。癌免疫療法は、癌患者の免疫系を用いて癌を阻止するものであり、患者の免疫系を刺激して悪性腫瘍細胞を攻撃（患者の正常細胞は温存）することによる。癌免疫療法の１つのモードでは、腫瘍細胞を認識して破壊するように患者の免疫系を訓練するための患者の免疫化が用いられる（例：癌ワクチンの投与による）。別の手法では、治療抗体の投与が用いられ、それによって、患者の免疫系を動員し、腫瘍細胞を破壊する。細胞免疫療法は、別の手法であり、これには、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、樹状細胞（ＤＣ）などの免疫細胞が関与しており、これらは、（１）特定のサイトカイン（例：インターロイキン）の投与によって生体内にて活性化されるか、または２）単離、濃縮され、癌と戦うために患者に注入される。
【００３４】
免疫系の機能の根本原理は、自己と非自己とを区別する能力である。しかし、多くの種類の腫瘍細胞は、それが患者自身の細胞であって（例：それらは「自己」である）、偶然適切な調節制御なしに増殖、分裂したものであることから、患者自身の免疫系によってある程度は許容される。
【００３５】
腫瘍細胞の「自己」の性質にも関わらず、多くの種類の腫瘍細胞は、特定の細胞型および／もしくはその環境にとって不適切であるか、または通常は有機体発生の特定の期間にのみ存在するものである（例：成人組織中の胎児抗原）、異常または独特である抗原を提示する。そのような抗原の例としては、通常は神経細胞の外表面膜上でのみ高いレベルで発現されるスフィンゴ糖脂質ＧＤ２が挙げられる。しかし、ＧＤ２は、神経芽細胞腫、髄芽腫、星細胞腫、メラノーマ、小細胞肺癌、骨肉腫、およびその他の軟部肉腫を含む広範囲に及ぶ腫瘍細胞の表面で発現される。従って、ＧＤ２のそれに類似する異所性発現パターンを有するマーカーは、免疫療法に好都合である腫瘍特異的ターゲットを提供し得る。その他の種類の腫瘍細胞は、健康な細胞の表面上には稀であるかまたは存在しない細胞表面受容体を提示し、それは、腫瘍細胞の制御されない増殖および分裂を引き起こす細胞シグナル伝達経路の活性化を担っている。そのような受容体も、癌免疫療法のための魅力的なターゲットを提供し得る。
【００３６】
現行技術の癌免疫療法（例：癌抗原に対する抗体、樹状細胞（ＤＣ）ワクチン、生体外活性化細胞の注入、および／または免疫抑制因子機能の阻害など）は、顕著な効力が実証されていると考えられるが、そのような治療法は、必ずしもすべての患者に対して有益であるわけではない。これは、治療の開始前には、どの患者が治療に応答し、どの患者が応答しないのかが明らかではないからである。免疫療法に対する陽性応答を正確に、信頼性を持って予測することが可能であれば、例え治療が実験的であり、高価なものであっても、患者は免疫療法を選択することができる。
【００３７】
実際、適切な免疫学的バイオマーカーを発見する目的で、国際タスクフォースは、２０カ国を代表する１０の組織と共同して、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）、米国国立癌研究所
（ＮＣＩ）と共に癌免疫療法学会（Society for Immunotherapy of Cancer）（ＳＩＴＣ
）が主催した会議からまとめられた推奨事項を最近公開した。
【００３８】
現在、癌治療法における予測的戦略の開発のために、４つの主な手法が行われている。第一は、一塩基多型（ＳＮＰ）の識別または突然変異を用いて、患者の各細胞の遺伝子構成を特定することである。これは、オーダーメイド医療という意味では有望であるが、患者の免疫学的機能が、化学療法および放射線によって変化され得ることから、オーダーメイドの癌治療法におけるその適用性は価値が限られたものであり得る。第二は、白血球の独特のサブセットを特定する目的で、免疫組織化学染色およびフローサイトメトリーを用いて、差異的に発現された表面マーカーを識別することである。第三は、マイクロアレイチップ技術を用いて、疾患特異的遺伝子発現プロファイルを、全血または単離された白血球中にて広く調べることである。しかし、上述の第二および第三の手法で用いられた末梢血白血球は、一般的に、休止状態である。対照的に、白血球は、癌の部位に誘引（例：動員）されると、完全に、および特異的に活性化される。この活性化は、白血球の種類、癌抗原の種類、および癌の局所的環境にも依存する。従って、休止期の白血球をその表面マーカーまたは遺伝子発現シグネチャーによって特定することは、癌部位での機能に直接繋がるものではない可能性がある。第四は、細胞機能の評価を目的として、白血球をまず末梢血液から単離し、特定の刺激有りまたは無しにて、ある期間にわたって（通常は、２日間から数週間の範囲）培養して、機能の変化を識別することである（タンパク質合成および分泌、アポトーシス、細胞増殖、表面マーカーの変化など）。しかし、そのようなアッセイは、複雑であり、時間を要し、高価であり、従って、日常的な診断試験として広く適用可能なものではない。従って、上記の方法の各々は、それらを診断での使用において理想的ではないものとする何らかの制限を有する。上記の手法とは対照的に、本明細書で開示されるいくつかの実施形態は、対象が癌免疫療法に応答する可能性を予測するための、簡便で、効率的で、正確な診断アッセイを提供する。
【００３９】
全般事項およびサンプルタイプ
本明細書で述べるいくつかの実施形態では、癌免疫療法の実施に対する対象（例：癌患者）の応答性を生体外で特定するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、応答する可能性のある個人から末梢全血を採取し、この全血を１つ以上の白血球活性化剤で刺激することを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの異なる白血球活性化剤が用いられる。いくつかの実施形態では、１つ以上の白血球機能関連ｍＲＮＡ（例：白血球機能のマーカー）をコードするｍＲＮＡにおける変化の検出が、その剤の投与に対する個人の潜在的応答性に関連付けられる。ある実施形態では、１つのマーカー（または１つのマーカークラス）の応答の変動では、正確に応答性を予測するのに不十分である。そのような実施形態では、応答性を特定するために、２、３、または４つ以上のマーカーが定量され、分析される。
【００４０】
他の実施形態では、癌免疫療法の実施に対する個人の現在進行中の応答性をモニタリングするための方法が提供される。ある実施形態では、末梢全血が、癌免疫療法レジメンの実施の前後で個人から採取され、一連の白血球機能関連ｍＲＮＡの発現の変化について評価される。次に、この発現の変化を用いて、癌免疫療法に対する個人の現在進行中の応答性およびその効力が評価される。
【００４１】
いくつかの実施形態では、血液は、哺乳類、好ましくはヒトから採取される。いくつかの実施形態では、対象からの全血サンプルがアッセイで用いられる。薬物に応答するマーカーの発現スクリーニングの特定に関する複数の実験プロトコルが、単離された白血球製剤で行われた。そのような単離された集団は、全血におけるリンパ球の多様性がリンパ球の小サブセットにおける特定のｍＲＮＡの誘導の検出を妨げる場合があることから、好ましい場合が多い。さらに、複数のリンパ球タイプ間での数多くの複雑な生化学的相互作用
により、全血製剤の使用が、誘導および測定反応の阻害または改変を起こし得る可能性がある。さらに、いくつかの実施形態で用いられる特定の刺激剤（例：白血球活性化剤）は、血漿タンパク質または血漿因子と相互作用を起こす場合があり、それによって活性の低下または減少が示され得る。しかし、本明細書で述べるいくつかの実施形態で示されるように用いられる場合、全血は、意外なことに、癌免疫療法に対する個人の今後の、または現在進行中の応答性の特定を可能とする、再現性、正確性、および生理学的妥当性を有する結果をもたらす。しかし、好ましい実施形態が全血を用いる一方で、他の実施形態では、血漿から分離された血液細胞、ならびに単離された白血球製剤を用いてもよい。ある実施形態では、全血は、ヘパリン処理されている。全血の使用により、手順が、簡便で（例：最小限の侵襲性）、再現性があり（一貫した実験条件および設備が用いられる）、生理学的であり、および標準化された方法への変換が容易であるものとなる。いくつかの実施形態では、採取された全血は、刺激プロトコルまで４℃にて保存される。
【００４２】
いくつかの実施形態では、白血球活性化剤の一連の複数の種類を試験する目的で、複数の全血サンプルが採取される。いくつかの実施形態では、異なる溶媒が用いられ、従って、サンプルは、コントロールサンプルと処理サンプルとのバランスを適切に保つ目的で、さらに分割される（または追加のサンプルが採取される）。いくつかの実施形態では、全血サンプルは、種々の刺激に暴露され、続いて白血球機能関連ｍＲＮＡの定量が行われる。定量に関する方法は、以下でより詳細に考察される。
【００４３】
方法
いくつかの実施形態では、採取された血液サンプルは、１、２、３、または４つ以上の白血球活性化剤と組み合わされる。いくつかの実施形態では、２つの反復実験サンプルが、コントロール剤（例：血液サンプル中にてほとんど、またはまったく応答を誘導しないもの）とも組み合わされる。特定の実施形態では、コントロール剤は、（１もしくは複数の）白血球活性化剤を含ませるのに用いられたものと同じ溶媒である。特定の実施形態では、コントロール剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。他の実施形態では、ＤＭＳＯなど、その他の不活性コントロール剤が用いられてよい。
【００４４】
いくつかの実施形態では、血液採取と同じ日に、少量の全血が、１、２、３、または４つ以上の白血球活性化剤と組み合わされる。ある実施形態では、対応する体積の各全血サンプルが、適切なコントロール剤と組み合わされる。
【００４５】
ある実施形態では、サンプルは、生理学的温度に近似する温度の範囲内にて、剤（例：白血球活性化剤またはコントロール剤）と共にインキュベートされる。例えば、いくつかの実施形態では、インキュベーションは、約３０℃から約４２℃の範囲の温度で実施され、約３０℃から約３２℃、約３２℃から約３４℃、約３４℃から約３６℃、約３６℃から約３８℃、約３８℃から約４０℃、約４０℃から約４２℃、およびこれらをオーバーラップする範囲を含む。ある実施形態では、インキュベーションは、約３７℃にてある継続時間にわたって行われる。
【００４６】
インキュベーションが行われる継続時間は、評価される特定のマーカー、および用いられる特定の白血球活性化剤に応じて様々となる。しかし、いくつかの実施形態は、約６時間のインキュベーション時間を用いる。ある実施形態では、５、４、３、２、および１時間を含む、６時間未満のインキュベーション時間が用いられる。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は、約１から約４時間の範囲である。他の実施形態では、所望に応じて、これよりも長い時間が用いられてよい。インキュベーション後、血液サンプルはすべて、分析まで−８０℃にて凍結保存される。有利には、２、３時間以内に誘導される早期応答ｍＲＮＡ（early responder mRNAs）を定量することにより、その他の方法で
用いられる時間が掛かる複雑な培養工程が省略される。
【００４７】
マーカーおよび定量
いくつかの実施形態では、特定のマーカーが評価される。本明細書で用いられる場合、「マーカー」の用語は、分子生物学で用いられる通りのその通常の意味が与えられるものとし、また、機能の特定のタイプまたはクラスと、特に白血球機能と関連する（１もしくは複数の）ｍＲＮＡも意味するものとする。例えば、特定のＲＮＡは、化学遊走の機能と関連する可能性があり、一方、別のＲＮＡは、抗原提示と関連する可能性がある。いくつかの実施形態では、マーカーは、その一般的に認められる機能に基づいて評価されるが、ある実施形態では、単一のマーカーが、２つ以上のクラスまたは機能を代表するものであり得る。特定の免疫機能と関連するマーカーの限定されない例を、表２に示す。他の実施形態では、免疫機能の同じ（または追加の）分類からの追加のマーカーが用いられる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、白血球の特定のサブセットが、白血球の特定のサブセットと反応することが既知である剤を添加することによって、血液サンプル中で刺激される。従って、抗原提示、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性、免疫抑制因子機能、化学遊走、血管新生、血管外遊走などの多様な様々な免疫機能が、本明細書にて開示される方法に従って刺激された血液サンプルから対応するｍＲＮＡを測定することによって評価可能である。いくつかの実施形態では、開示される方法は、進行癌に対する免疫療法についての応答者および非応答者を予測することができる。
【００４９】
ｍＲＮＡレベルを測定するために、いくつかの実施形態では、赤血球、および白血球以外の血液成分が、全血サンプルから除去される。他の実施形態では、全血は、特定のいかなる細胞型の除去または単離も行うことなく用いられる。好ましい実施形態では、白血球は、ｍＲＮＡを単離し、増幅するための装置を用いて単離される。この装置の実施形態は、各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，７４５，１８０号、同第７，９６８，２８８号、および同第７，９３９，３００号、ならびに米国特許出願第１１／３７６，０１８号、同第１１／８０３，５９４号、および同第１１／８０３，６６３号に、より詳細に記載されている。
【００５０】
簡潔に述べると、この装置の特定の実施形態は、複数のサンプル供給ウェル、ウェルの下にある白血球捕捉フィルター、およびフィルターの下にある固定されたオリゴ（ｄＴ）を含有するｍＲＮＡ捕捉ゾーンを有するマルチウェルプレートを含む。特定の実施形態では、この装置はまた、プレートとボックスとの間に密封状態を作り出すためにフィルタープレートを受けるように適合された真空ボックスも含有しており、従って、真空圧が適用されると、血液が白血球捕捉フィルターを通ってサンプル供給ウェルから引き出され、それによって白血球が捕捉され、フィルターの洗浄によって白血球以外の血液成分を除去することができる。他の実施形態では、遠心分離または陽圧など、血液サンプルをサンプルウェルから白血球捕捉フィルターを通して引き出すその他の手段が用いられる。この装置の好ましい実施形態では、白血球は、一緒に層構造とされた複数のフィルター膜上に捕捉される。いくつかの実施形態では、捕捉された白血球は、次に、溶解バッファーによって溶解され、それによって、捕捉された白血球からｍＲＮＡが放出される。次に、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ捕捉ゾーンに固定化されたオリゴ（ｄＴ）とハイブリダイズされる。いくつかの実施形態にて用いてよい溶解バッファーの組成に関するさらなる詳細は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１１／３７６，０１８号に見出すことができる。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、オリゴ（ｄＴ）に固定されたｍＲＮＡから合成される。好ましい実施形態では、ｃＤＮＡは次に、感染関連マーカーの増幅用に特に設計されたプライマーによるリアルタイムＰＣＲを用いて増幅される。そのような実施形態で用いられるプライマーを、表２に示す。ある実施形態で用いられるＰＣＲ反応についてのさらなる詳細も、米国特許出願第１１／３７６，０１８号に見出される。
【００５１】
ＰＣＲ反応の完了後、１つ以上の白血球機能関連マーカーのための種々のｍＲＮＡ（検出されたＰＣＲ増幅ｃＤＮＡの量で表される）が定量される。特定の実施形態では、定量は、１つ以上のマーカーをコードするｍＲＮＡの量を、レファレンス値と比較することによって算出される。他の実施形態では、レファレンス値は、ハウスキーピング遺伝子を例とする、刺激剤によって誘導されない遺伝子の発現レベルである。特定のそのような実施形態では、ベータ−アクチンがレファレンス値として用いられる。本技術分野で公知である数多くのその他のハウスキーピング遺伝子も、レファレンス値として用いてよい。他の実施形態では、ハウスキーピング遺伝子は、補正因子として用いられ、それによって、最終的な比較は、１つ以上の白血球機能関連マーカーの誘導発現レベルを、非誘導（コントロール）サンプルからの同一のマーカーと比較するものとなる。さらに他の実施形態では、レファレンス値はゼロであり、それによって、１つ以上の白血球機能関連マーカーの定量は、絶対値で表される。いくつかの実施形態では、２、３、または４つ以上の白血球機能関連マーカーが定量される。いくつかの実施形態では、定量は、リアルタイムＰＣＲを用いて実施され、データは、増加倍数（適切なコントロールに対する）として表される。
【００５２】
いくつかの実施形態では、数学的分析を用いて、白血球機能関連マーカーの定量に関するデータが評価される。ある実施形態では、多変量分析が用いられる。ある実施形態では、多変量判別分析が用いられる。いくつかの実施形態では、定量データを評価するために、その他のタイプの分析が用いられてよい。ある実施形態では、この評価によって、癌免疫療法レジメンに対する個人の潜在的応答性の特定（例：予測）が可能となる。多変量分析は、癌の発生、進行、および治療に関わる複雑な免疫相互作用のために、特に有利である。本明細書で考察されるように、癌免疫療法を有効なものとするには、複数のクラスまたは分類の機能が必要とされる。例えば、細胞傷害性機能が上昇した個人では、その個人が化学遊走機能をほとんどまたはまったく持たない場合、細胞傷害性細胞は癌病変部位に向けられないことから、免疫療法による治療に対して非応答性である可能性が高い。
【００５３】
従って、いくつかの実施形態では、種々の機能上のクラスが多変量分析に用いられて、個人を特定の予測グループにグループ化（例：分類）することが可能となる。ある実施形態では、グループは、実質的に二元性であってよく、例えば、生存者対非生存者である。しかし、いくつかの実施形態では、グループは、癌免疫療法に対する応答性と相関している。ある実施形態では、グループは、部分寛解（完全寛解を含む）、病勢安定、および病勢進行である。
【００５４】
血液サンプルの刺激、および各対象とする刺激に対する暴露後の各対象とする遺伝子の定量（例：変化倍数の算出による）の後、結果は、癌免疫療法に対する各個人の応答性を特定（例：予測）する目的で、分類される。限定されない例として、応答性の特定には、グループ（例えば、ＰＲ、ＳＤ、ＰＤ）を用いてよい。
【００５５】
定量されたデータ（例：個々の各刺激による個々の各遺伝子の変化倍数）は、さらなる分析の前にデータ分布を標準化する目的で、例えば変化倍数のｌｏｇ（１０）を採ることにより、所望に応じて変換されてよい。別の選択肢として、ＲＮＡ発現の増加倍数の特定のレベルに値を割り当てることによって、ノンパラメトリック分析を実施してよい。例えば、ある実施形態では、ゼロの値は、ｍＲＮＡの誘導がないこと（例：増加倍数＜３）を表してよく、１の値は、ｍＲＮＡの誘導（増加倍数≧３）を表してよい。ある実施形態では、別の選択肢としての数値、または上記で挙げた数値の間の数値が用いられてもよい。
【００５６】
ある実施形態では、定量されたデータは次に、判別分析で処理され、それによって、変数の組み合わせ（特定の白血球機能関連ｍＲＮＡの量の変化および刺激剤）に基づいて、個人のグループへの帰属（例：応答性）の予測が可能となる。実施例１で考察されるように、各個人について臨床的進行が既知であったことから（表１参照）、ｍＲＮＡの定量デ
ータのみが既知である場合に、本明細書で開示される方法によるグループへの帰属（例：応答性）の予測が可能である。判別分析についての標準的な本技術分野で受け入れられている方法を用いて、各グループ（例：ＰＤ、ＳＤ、ＰＲ）、ならびに対象とするｍＲＮＡと刺激剤との各組み合わせに対するパラメータを発生させた。しかし、上記で考察したように、ある実施形態では、その他のタイプの多変量分析が用いられる（例：非判別分析（non-discriminant analysis））。これの限定されない例は、表３に示される（パラメー
タは表３Ａに示される）。その後、対象とする各遺伝子および各刺激剤に対するこれらのパラメータならびに変化倍数データを用いて、グループへの帰属の予測を行うことができる。この計算の限定されない例を以下に示す：
予測変数値＝グループ１に対するパラメータ定数＋［パラメータ値（遺伝子Ｘおよび刺激剤Ａ）］＋［パラメータ値（遺伝子Ｘおよび刺激剤Ｂ）］＋［パラメータ値（遺伝子Ｙおよび刺激剤Ａ）］＋［パラメータ値（遺伝子Ｙおよび刺激剤Ｂ）］＋［．．．］
【００５７】
上記の例としての式のパターンの繰り返しは、このように、対象とする遺伝子と各刺激剤との各組み合わせが算入されるまで行われ、各グループに対して繰り返される。その後、算出された予測変数値を次に用いて、その個人に対するグループへの帰属の予測が行われる。この例では（および実施例１）、３つの各グループのうちの最大予測変数値を用いて、個人のそのグループへの帰属が予測される。例えば、予測変数値が、ＰＲに対しては１３、ＳＤに対しては１０、およびＰＤに対しては５である場合、その個人は、ＰＲグループのメンバーとして分類されることになり、それによって、癌免疫療法に対して応答性を有する可能性が高いとして特定されることになる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本明細書で述べる方法を用いて、現在進行中の癌免疫療法に対する個人の応答性がモニタリングされる。そのようなある実施形態では、第一の血液サンプルが個人から採取される。ある実施形態では、第一の血液サンプルは、個人へ何らかの免疫療法治療が実施される前に採取される。他の実施形態では、個人は、過去に治療を受けたことがあり、今後も再度受けることになる。ある実施形態では、第一の血液サンプルは、免疫療法を２回実施する間のある時間に、好ましくは実施の直前に採取される。第二の血液サンプルは、免疫療法の実施後のある時間に個人から採取される。特定の実施形態では、この時間は、数時間であるが、他の実施形態では、この時間は、数週間であり、ある実施形態では、数ヶ月までである。他の実施形態では、数ヶ月の期間にわたって、追加のサンプルが連続的に採取される。個人から採取された血液サンプルは、次に、上述のようにして実施される発現分析まで凍結される。このようにして白血球機能関連マーカーの発現レベルの評価を用いて、上記で考察するように、免疫療法の進行（すなわち、効力）をモニタリングすることができる。ある実施形態では、患者の疾患状態分類が経時で維持されることは（例：時間１でＰＲであり、時間２でもＰＲ）、患者が治療法に対して応答性を有することを示している。分類の変化は（例：ＰＲからＳＤ、ＰＲからＰＤ、またはＳＤからＰＤ）、患者の治療法に対する応答性が減少していることを示している。
【００５９】
本明細書で開示される方法のいくつかの実施形態では、分析自体によって導入される人為的影響が可能な限り排除され、そのことは、各個人における複雑な免疫機能のより正確な特定の手助けとなる。本明細書で開示される生体外アッセイシステムおよび方法は、血液の操作、ｍＲＮＡ精製、ｃＤＮＡ合成、およびＰＣＲに付随する技術的な変動を最小限に抑える。特定の免疫機能の刺激剤の組み合わせに基づく分析および特定の機能に関連する白血球機能関連マーカーの分析の手法を例とする本明細書で示される分析手法により、この予測方法は、様々な異なる癌のタイプおよび異なる治療様式に広く適用可能である。例えば、樹状細胞療法は、利用可能である免疫療法の多くのタイプのうちの単なる一例である（その他は上記で開示される）。本明細書で開示される方法は、広範囲の様々なクラスの免疫機能、ならびに各クラス内の複数の特定のｍＲＮＡを分析するものであることから、この予測方法の効力は、実質的にすべてのタイプの癌、および実質的にすべてのタイ
プの免疫療法にまで拡張される。その理由は、この評価が、各患者における複数の免疫機能の複数のマーカーの分析を用いているからであり、従って、これは、すべてのタイプの癌に対して適切である。
【００６０】
開示される方法の用途
本明細書にて開示される方法および手順は、様々な用途に有用である。例えば、この方法は、癌免疫療法に対する個人の潜在的応答性を特定するための生体外での方法として用いることができる。提供される方法はまた、算出された癌免疫療法に対する応答の可能性に基づいて、医療専門家が対象に対して癌免疫療法を推奨することを可能とすることもできる。加えて、この方法は、対象に対して癌免疫療法レジメンを受けるようアドバイスするために用いることもできる。さらに、この方法は、癌患者を治療するために用いることもできる。代替の方法（機能性白血球アッセイ、サイトカインプロファイリング、タンパク質分析など）を、潜在的応答者の特定、データに裏付けされた臨床的推奨、および／または癌患者の治療を実施するための試みに用いることも可能であるが、本明細書で開示される方法は、潜在的免疫療法応答者の識別に、予想外の高い精度を提供するものである。従って、本明細書で開示される方法は、潜在的免疫療法応答者を識別することだけでなく、医療専門家が特定の治療法を推奨することを可能とすること、免疫療法の成功の可能性が高いということに関して癌患者にアドバイスすること、および／または癌患者の治療を進めることについても特に有利である。本明細書で開示される方法は、従って、個人に対して特定の治療法を提供する新たな機会を開くものであり、このことは、治療法の効力の改善、患者の治療成績の改善、および医療コストの低減を補助するものとなる。上記で挙げたものは限定されない例であることから、本明細書で開示される方法は、その他の用途にも用いることができる。
【実施例】
【００６１】
限定的な意味ではなく例示的に見なされるべきである以下の実施例を参照して、具体的な実施形態について述べる。
【００６２】
実施例１−白血球機能関連ｍＲＮＡの生体外での刺激
表１に示すように、様々なタイプの癌を有する２６人の患者を募集した。これらの対象は、癌免疫療法のタイプとして、樹状細胞療法を受けた。しかし、上述のように、開示される方法は、その他のタイプの免疫療法にも適用可能である。
【００６３】
サンプルの調製および刺激
ワクチン治療（そのプロトコルは以下で述べる）の前に、末梢血液を採取し、３つの反復サンプルとして、フィトヘマグルチニン−Ｌ（ＰＨＡ、一般的Ｔ細胞活性化剤）、熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ、Ｆｃγ受容体を活性化するための免疫複合体の古典的モデル）、ザイモサン（自然免疫活性化剤としてのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）−２アゴニスト）、組換えヒトインターロイキン２（ｒＩＬ２）、組換えヒトインターフェロンα２β（ｒＩＦＮ）、ヒトＴ細胞受容体のα／β鎖（抗原認識ユニット）に対するマウスモノクローナル抗体（ａＴＣＲ、ＴＣＲアゴニスト）、ピシバニール（ＯＫ４３２、日本で臨床的に承認された免疫活性化剤）、およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により３７℃にて４時間刺激した。
【００６４】
具体的には、血液は、４ｍＬのヘパリン容器に採取し、全血の６０μＬずつを、１．２μＬのＰＨＡ（２ｍｇ／ｍＬ）（シグマ−アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州）、ＨＡＧ（１０ｍｇ／ｍＬ）（シグマ−アルドリッチ）、ザイモサン（７５ｍｇ／ｍＬ）（シグマ−アルドリッチ）、ｒＩＬ２（５μｇ／ｍＬ）（バイオレジェンド、サンディエゴ、カリフォルニア州）、ｒＩＦＮ（１０５ユニット／ｍＬ）（ＭＤＳ、東京、日本）、ａＴＣＲ（５０μｇ／ｍＬ）（バイオレジェンド）、ピシバニール（０．０５ＫＥ／ｍＬ）
（中外製薬株式会社、東京、日本）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）を入れた８ウェルのストリップ３つ（合計２４ウェル、全部で１．４４ｍＬ）に直ちに適用した。３７℃にて４時間インキュベートした後、分析までストリップを−８０℃で凍結しておいた。
【００６５】
１７の異なるｍＲＮＡを定量した：（コントロールとしてのβ−アクチン（ＡＣＴＢ）およびβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）；細胞傷害活性のマーカーとしてのインターフェロンγ（ＩＦＮＧ）、腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）−１、２、および５；抑制因子機能についてのインターロイキン（ＩＬ）−１０、トランスフォーミング増殖因子−β１（ＴＧＦＢ）、ＣＴＬ−関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、プログラム細胞死１（ＰＤＣＤ１またはＰＤ−１）、およびフォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）；抗原提示についての顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、血管新生についての血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、化学遊走についてのＩＬ８、ＣＣＬケモカイン−８（ＣＣＬ８）、およびＣＸＣＬケモカイン−３（ＣＸＣＬ３）、ならびにＩＬ２（Ｔ細胞プロモーター）。
【００６６】
定量のために、まずは凍結血液サンプルを解凍した（３７℃にて１分間）。同一条件下にて複数のサンプルを解凍することで、９６のウェル間で条件を均一とする手助けになる）。白血球除去膜をオリゴ（ｄＴ）固定回収プレート上に配置した９６ウェルフィルタープレートを作製し、１５０μＬの５ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス（ｐＨ７．４）を適用してフィルター膜を湿潤した。１２０ｇでの遠心分離を４℃にて１分間行ってトリス溶液を膜から除去した後、５０μＬの刺激した全血サンプルを各ウェルに適用し、直ちに１２０ｇでの遠心分離を４℃にて２分間行った。次に、ウェルを３００μＬのリン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄した。２０００ｇでの遠心分離を４℃にて５分間行って生理食塩水溶液を除去した後、１０ｍＬ／Ｌ  ２−メルカプトエタノール（バイオ−ラッド）、０．５ｇ／Ｌ  プロテイナーゼＫ（ピアス）、０．１ｇ／Ｌ  サケ精子ＤＮＡ（５プライムエッペンドルフ／ブリンクマン）、０．１ｇ／Ｌ  大腸菌ｔＲＮＡ（シグマ）、各５ｎｍｏｌ／Ｌの特定のリバースプライマー、および１０１０分子／Ｌ  合成ＲＮＡ３４（外部コントロールとして）を添加した６０μＬのストック溶解バッファー［５ｇ／Ｌ  Ｎ−ラウロイルザルコシン、４×標準クエン酸含有生理食塩水、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、１ｍＬ／Ｌ  ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０（ＮＰ−４０の代用品）、１．７９ｍｏｌ／Ｌ  グアニジンチオシアネート（すべてシグマより）］をフィルタープレートの各ウェルに添加した。次に、プレートを３７℃にて１０分間インキュベートし、オリゴ（ｄＴ）固定回収マイクロプレート（ジーンプレート；ＲＮＡｔｕｒｅ）上に配置し、２０００ｇでの遠心分離を４℃にて５分間行った。４℃にて一晩保存後、マイクロプレートを、１００μＬの純粋溶解バッファーで３回、続いて１５０μＬの洗浄バッファー［０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス（ｐＨ７．４）  １ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ］で３回、４℃にて洗浄した。
【００６７】
ｃＤＮＡは、１×逆転写バッファー［５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｎＬ／μＬ  Ｔｗｅｅｎ２０］、各１．２５ｍＭのデオキシヌクレオシド三リン酸、４ユニットのｒＲＮａｓｉｎ、および８０ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素（プロメガ；プライマーなし）を含有するバッファー３０μＬを各ウェルに添加し、３７℃にて２時間インキュベートすることによって直接合成した。各３０μＬの反応液から、４μＬのｃＤＮＡを３８４ウェルＰＣＲプレートへ直接移し、５μＬのＴａｑＭａｎユニバーサルマスターミックスチャ（アプライドバイオシステムズ）および１μＬの５μΜ  フォワードプライマーを添加した。
【００６８】
ＩＬ２、ＩＦＮＧ、およびＧＭＣＳＦについては、２μＬの未希釈ｃＤＮＡを、３８４ウェルプレートでの最終体積５μＬにおけるＳＹＢＲグリーン（ｉＴａｑ、バイオラッド
、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を用いたリアルタイムＰＣＲに用いた。その他のｍＲＮＡについては、ｃＤＮＡは、ヌクレアーゼフリー水で１：１に希釈し、２μＬをＰＣＲに用いた。プライマー配列は表２に示す。各遺伝子は、個別に増幅した。出発物質として３つの反復サンプルの全血アリコートを用いたため、各ｃＤＮＡについて単一のＰＣＲ反応を行った。誤った増幅を最小限に抑える目的で、ＰＣＲ条件を高いストリンジェンシーに最適化した：ＰＲＩＳＭ７９００（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州）により、９５℃１０分間を１サイクル、続いて１分間の９５℃での変性、および１分間の６５℃でのアニーリング／伸長を５０サイクル。ある実施形態では、対象とするマーカーに応じて、その他の条件を用いてよい。プライマー配列は、同一のストリンジェンシーで設計し、従って、ＰＣＲプロトコルは、すべてのｍＲＮＡに適用可能なものであった。融解曲線分析を毎回行って、増幅が単一のピークから得られていることを確認した。サイクル閾値（Ｃｔ）は、分析ソフトウェア（ＳＤＳ、アプライドバイオシステムズ）によって決定した。
【００６９】
患者数は２６人であったが、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ製剤の数は６２４（患者２６×刺激８×３（３つの反復サンプル））であり、ＰＣＲ数は５９２８（＝ｍＲＮＡ／刺激７６×患者２６×刺激８×３（３つの反復サンプル））であった（表４）。
【００７０】
ワクチン治療法
ｍＲＮＡ分析とは独立してＤＣワクチン治療法を実施した。簡潔に述べると、末梢血単核白血球を白血球アフェレーシス（ＣＯＭ．ＴＥＣ、フレセニウスヘモケア社、バートホンブルク、ドイツ）によって回収し（５０００ｍＬの血液体積から平均２．８×１０９細胞を回収）、ＡＩＭ−Ｖ（ギブコ−ＢＲＬ、グランドアイランド、ニューヨーク州）に懸濁し、５％ＣＯ２：９５％空気のインキュベーター中、滅菌培養皿にて２時間インキュベートした。非接着細胞を吸引で除去し、接着細胞を、ｒＧＭＣＳＦ（最終５０ｎｇ／ｍＬ）（ゲンタウア、神戸、日本）およびｒＩＬ４（５０ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）を添加したＡＩＭ−Ｖに再懸濁した。確立された方法に従って、培養を６日間継続した。未熟ＤＣを、各患者のＨＬＡ分類に応じてＷＴ１ペプチド（ＨＬＡ−Ａ２４０２（ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ）もしくはＨＬＡ−Ａ０２０１（ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ）（ネオンプス社、サンディエゴ、カリフォルニア州）、および／またはＭＵＣ−１ペプチド（ＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰ）（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ブレーメン、ドイツ）を添加したｒＴＮＦα（５０ｎｇ／ｍＬ）（セルジェニックステクノロジートランスファー社、フライブルグ、ドイツ）と共にさらに４日間インキュベートした。
【００７１】
成熟ＤＣ（１×１０８細胞）を回収し、腋窩または鼠径リンパ節のいずれかに注射した。投与は、隔週で実施し、合計で５回行った。治療の効果は、固形癌の治療効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ、バージョン１．１）の基準に従い、治療の前、および治療完了の２ヵ月後に撮影したＣＴスキャン画像を用いて、部分寛解またはやや寛解（minor response）（完全寛解（ＣＲ）を含む）（ＰＲ）、病勢安定（ＳＤ）、および病勢進行（ＰＤ）として判定した。ＣＴスキャンは、２、３ヶ月ごとに行って、癌の状態をモニタリングした。
【００７２】
結果
個々のｍＲＮＡデータをＰＤ、ＳＤ、およびＰＲ（ＣＲのケース１つを含む）の間で比較すると、ザイモサン誘導ＩＦＮＧ（図１Ｃ）およびＩＬ１０（図１Ｄ）は、ＳＤ（ｐ＝０．０４）またはＰＤとＳＤを合わせたもの（ｐ＝０．０２）よりも、ＰＲにて有意に高かった。対照的に、ＰＨＡ−（図１Ｇ）およびｒＩＬ２−誘導ＴＮＦＳＦ２（＝ＴＮＦα）（図１Ｋ）は、ＰＲまたはＳＤとＰＲを合わせたものよりも、ＰＤにて有意に高かった（ＰＨＡについてはｐ＝０．００６、ｒＩＬ２についてはｐ＝０．０４）。ＳＤにおけるＰＨＡ誘導ＩＬ１０（図１Ｈ）は、それぞれＰＤ（ｐ＝０．０４）またはＰＲ（ｐ＝０．
０２）よりも有意に低かった。２つのコントロール遺伝子（ＡＣＴＢおよびＢ２Ｍ）の増加倍数は、３つのグループ間で異なっていなかった（図１Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｊ）。その他のｍＲＮＡの誘導の評価は、３つのグループ間にて有意な相違を示さなかった（表４参照）。図１にてある程度の統計的有意差が見られはするが、ＰＤ、ＳＤ、およびＰＲの間にて数値が大きく重複していることから、この結果を診断に適用することは困難である。
【００７３】
興味深いことに、ＰＲのザイモサン誘導ＩＦＮＧにおいて非応答性である（変化倍数＝１）１人の個人は（図１Ｃ、矢印）、ＰＨＡ誘導ＴＮＦＳＦ２において二番目に高い応答者でもある（変化倍数＝８．７６）（図１Ｇ、矢印）。同様に、すべての患者は、少なくとも１つのｍＲＮＡの誘導を示しており（表４）、このことにより、血液サンプル中の白血球は、生存状態であっただけでなく、生理学的機能性も有していたことが確認される。図１Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｊに示されるように、ＡＣＴＢおよびＢ２Ｍのコントロール遺伝子は、刺激の存在下または非存在下であった。有利には、このことによって、コントロール遺伝子が実験の変数に応答してのばらつきを示す場合に問題となり得る標準化（標準的なＲＴ−ＰＣＲでは必要）の必要性が排除される。しかし、ある実施形態では、個人が特定の治療法に対して応答する可能性を特定する過程にて、所望に応じて標準化を用いてもよい。従って、開示される方法およびコントロール遺伝子（ＡＣＴＢおよびＢ２Ｍ）の一貫性に伴う最小限に抑えられた技術的変動、図１および表４に示す様々な刺激に対する高および低応答者（ｍＲＮＡ誘導に基づく）は、技術的な人為的影響に起因するものではない白血球機能の変動を有する個人を代表するものである。
【００７４】
２つのｍＲＮＡの分析
ＣＴＬＡ４、ＦＯＸＰ３、ＰＤ−１、およびＩＬ１０は、免疫抑制のマーカーであり、これらを刺激後に分析した。図２に示すように、ＰＨＡ誘導ＩＬ１０は、２６人の患者の中で、ＰＨＡ誘導ＣＴＬＡ４（図２Ａ）、ＰＤ−１（図２Ｂ）、およびＦＯＸＰ３（図２Ｃ）の結果と相関していた。しかし、結果には個人間での比較的大きい変動が存在し、それによって、応答者の最終的な予測が困難となっている。さらに、血液サンプルの刺激は、白血球機能関連遺伝子のすべての組み合わせの間に相関を示すというものではない。例えば、ＰＨＡ誘導ＩＬ１０を、ＩＦＮＧ（図２Ｄ）、ＩＬ２（図２Ｅ）、およびＴＮＦＳＦ２（図２Ｆ）などのその他の免疫機能マーカーと比較すると、相関は識別されなかった。２つのｍＲＮＡのその他のすべての組み合わせについては、表５にまとめて示しており、これは、続いての多変量分析に用いた。この複雑性は、異なるマーカーの機能が様々であることに起因するものと考えられる（例：特定のマーカーは、特定の種類の刺激剤に対してより強く応答する可能性が高い）。
【００７５】
多変量分析
健康状態に、または疾患状態に対処する場合であっても、様々な免疫機能（上記で考察したものなど）が互いに相互作用を起こす。例えば、ＣＴＬ活性が強く維持されたとしても、免疫抑制因子機能がこれらの殺傷機能を中和する（例：上回る）場合、癌を根絶することはできない。同様に、化学遊走活性が弱いためにＣＴＬが癌病変部位に蓄積することができない場合も、癌が根絶される可能性は高くない。癌免疫療法に対する応答性をより高度に予測可能とするために、多変量分析を行うことによってこれらの複数の免疫機能を考慮に入れた。
【００７６】
当業者であれば理解されるように、多変量分析は、一式の予測変数に基づいてグループへの帰属が予測されるように設計される。本明細書で開示される方法に関して、分類は、癌免疫療法後の患者の癌の状態に基づく（例：ＰＤ、ＳＤ、およびＰＲ）。図１に示し表４に報告するｍＲＮＡレベルの変化倍数の値は、６つのウェルの全血に由来した（刺激剤の３ウェルおよびＰＢＳの３ウェル）。各増加倍数は、２＾−（ＰＢＳの平均Ｃｔ−刺激
剤の各Ｃｔ）として算出した。平均値を図１および表４に報告した。
【００７７】
プールしたｃＤＮＡの段階希釈を用いた別の実行可能性実験において、評価したすべての遺伝子に対するＣｔ値は、３２サイクルまでは比例していたが、３３以上でのＣｔは、増幅を示さないか、または許容範囲を超えた大きさの変動を示した。従って、Ｃｔ＝３２を、増加倍数の算出のためのベースラインとして用いた。増加倍数をスチューデントｔ検定（図１）および多変量判別分析（ミニタブ１６、ステートカレッジ、ペンシルベニア州）によって分析する際、増加倍数の値をｌｏｇ（１０）に変換して、分布を正規とした。
【００７８】
予測計算については上記で詳細に記述したが、簡潔に述べると、対象とする各遺伝子および各刺激剤について変化倍数を算出した後、判別分析を用いて、疾患状態グループ（ＰＲ、ＳＤ、ＰＤ）の各々に対する対象とする遺伝子と刺激剤との各組み合わせについてのパラメータを発生させた。その後、予測変数値を、そのパラメータ値および変化倍数データに基づいて、各個人について算出した。予測変数値の算出例は上述した。次に、この予測変数値を用い、最大の予測変数値を有する疾患状態グループを決定することにより、癌免疫療法に対する各個人の潜在的応答性を特定する。
【００７９】
この多変量による手法は、応答性の予測に有利であり、それは、各刺激剤単独の分析では、すべてのｍＲＮＡを一緒に分析した場合であっても、ＰＲ、ＳＤ、およびＰＤの予測が１００％未満（例：偽陽性および／または偽陰性が存在）という結果になったからである（表６および６Ａ参照）。しかし、これは、疾患進行／退縮の自然の経過と比較すれば、高い予測の精度である。言い換えると、癌免疫療法の効力の予測がまったく行われない場合、各患者についてのＳＤおよびＰＲの確率は、それぞれ３５％および１５％である。しかし、以下で考察するように、開示される予測法が用いられる場合、ＳＤまたはＰＲの確率は、１００％となる。
【００８０】
表６に示されるように、ａＴＣＲ、ＰＨＡ、またはザイモサンによる刺激では、ＨＡＧ、ｒＩＦＮ、またはピシバニールよりも良好な癌免疫療法に対する応答性の予測結果が得られる（実際の臨床結果に対する相関によって判定）（表６）。例えば、ｒＩＬ２とその他のいずれかの刺激剤（ピシバニール以外）との組み合わせでは、ＰＤ、ＳＤ、およびＰＲのすべてのグループについて、偽および陰性反応がなく、１００％の正しい予測率が得られる（表６および６Ａ）。同様に、ＰＨＡとその他のいずれかの刺激剤（ピシバニール以外）との組み合わせでは、ＰＤ、ＳＤ、およびＰＲのすべてのグループについて、偽および陰性反応がなく、１００％の正しい予測率が得られる（表６）。最後に、ａＴＣＲおよびザイモサンの組み合わせも、１００％の予測を示した（表６）。
【００８１】
同様に、すべての刺激剤が組み合わされ、各ｍＲＮＡが個々に分析された場合、１００％の予測精度を示す特定のｍＲＮＡはなかった（表５）。２つの異なるｍＲＮＡが組み合わされた場合であっても、１００％の予測精度は得られなかった（表５）。
【００８２】
しかし、６種類の組み合わせ（ＩＦＮＧ＋ＧＭＣＳＦ、ＩＦＮＧ＋ＣＸＣＬ３、ＩＦＮＧ＋ＣＴＬＡ４、ＴＮＦＳＦ１＋ＩＬ１０、ＴＮＦＳＦ１＋ＴＮＦＳＦ２、およびＣＣＬ８＋ＧＭＣＳＦ）は、ＰＤ、ＳＤ、およびＰＲにおいて偽陽性および陰性反応が３０％未満であることに示されるように、治療法に対する応答性の予測という点で、より優れた精度を示した（表７、囲み内）。これらの組み合わせをさらに分析すると、ＩＦＮＧ＋ＣＸＣＬ３＋ＣＴＬＡ４、ＩＦＮＧ＋ＧＭＣＳＦ＋ＴＮＦＳＦ２、ＩＦＮＧ＋ＧＭＣＳＦ＋ＰＤＣＤ１、およびＴＮＦＳＦ１＋ＴＮＦＳＦ２＋ＣＴＬＡ４などの３つのｍＲＮＡの組み合わせが、ＰＤ、ＳＤ、およびＰＲの３つすべてのグループにおいて偽陽性および陰性反応がまったくなく、１００％の予測精度を示した（例：予測は臨床結果と一致していた）
。特筆すべきは、ｍＲＮＡのこれらの組み合わせは、各々、異なる機能性マーカー群から得られたものであるということである。従って、いくつかの実施形態では、評価されるｍＲＮＡが多様となる程、より良好な予測精度が得られる。
【００８３】
癌抗原特異的ＣＴＬまたは免疫グロブリンはこれまでに研究されてきたが、そのような免疫性は、免疫療法の後に初めて獲得されるものであり、そのために、予測方法に有用である情報としてのそのような研究の価値は否定されてしまう。上記の実施例では、各患者が免疫療法に対して応答性であるかどうか（言い換えると、患者が、必要とされる免疫プロファイルを持つ細胞を充分な数発生させ、その細胞を癌部位まで送達し、癌細胞を根絶することができるかどうか）を予測するために、ＧＭＣＳＦについての抗原提示機能、Ｔ細胞活性化および成熟（ＩＬ２）、化学遊走活性（ＣＣＬ８、ＣＸＣＬ３、ＩＬ８）、免疫抑制（ＣＴＬＡ４、ＴＧＦＢ、ＦＯＸＰ３、ＩＬ１０、ＰＤ−１）、血管新生（ＶＥＧＦ）、ならびに細胞傷害性機能（ＩＦＮＧ、ＴＮＦＳＦ１、２、５）について分析を行った。
【００８４】
上記で考察した結果は、免疫療法の最も正確な予測には、免疫学的機能の異なる機能分類の組み合わせが必要であったことを示している。免疫学は非常に複雑であり、様々な因子が互いに相互に作用することから、本研究で示す多変量分析の使用は、理解されることであり、それによって、癌免疫療法に対する個人の潜在的応答性の正確で、迅速な、侵襲が最小限である予測が可能となる。
【００８５】
実施例２−追加の臨床対象および白血球機能関連ｍＲＮＡの生体外での刺激
上記で考察したように、癌免疫療法は高価であり、すべての癌患者に有効というわけではない場合がある。さらに、特定の免疫療法は、労力のかかる調製が必要であり、時間および追加のコストが加わることになる。従って、対象が治療法に応答する可能性が高いかどうかを特定することは、特に有利である。本明細書で開示される方法を用いて、追加の対象について試験を行い、その対象は、様々なタイプの癌による進行癌患者であった（２１人の新たな対象、合計４７人の患者）。臨床結果（ＰＤ、ＳＤ、およびＰＲ）を、ＲＥＣＩＳＴ基準によって判定した。ｍＲＮＡ調製／ｃＤＮＡ合成の数は、１１２８（刺激８×３（３つの反復サンプル）×４７（患者））であり、ＰＣＲの数は、１８０４８（ｃＤＮＡ１１２８×ｍＲＮＡ１６）であった。増加倍数（ＦＩ）は、ＰＢＳの値を用いて算出した。コントロール遺伝子ＡＣＴＢおよびＢ２Ｍの増加倍数は、３つの臨床グループ間で相違しなかった。すべての対象は、少なくとも１つのｍＲＮＡの誘導を示し、このことは、アッセイ条件が妥当であり、血液サンプルが誘導する能力を有していたことを示す。ＰＨＡ−誘導ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＩＬ８、ＨＡＧ−誘導ＩＬ８、ＣＸＣＬ３、ピシバニール−誘導ＩＦＮＧ、抗ＴＣＲ−誘導ＩＬ８、およびｒＩＦＮγ２ｂ−誘導ＩＬ１０に関して、ＰＤ（ｎ＝２１）およびＰＲ（ｎ＝１１）のグループ間にて有意差が検出された（ｐ＜０．０５）。ＳＤおよびＰＲグループを組み合わせた場合、ＰＨＡ−およびＨＡＧ−誘導ＩＬ８のみが有意であった（それぞれ、ｐ＝０．０３、０．０４）。加えて、多変量判別分析を用いて、種々の予測式を導き出した。１３のＰＨＡ−、５のＺＡ−、３のＨＡＧ−、１のｒＩＬ２−、および２のＴＣＲ−誘導ｍＲＮＡの増加倍数から得られた２４のパラメータを用いた場合、ＰＤおよびＳＤ＋ＰＲの予測率は、２６人の第一の患者群では、１００％および９６％であり、本実施例で報告する第二の患者群（ｎ＝２１）では、１００％および９５％であった。この予想外に高度の予測は、本明細書で開示される方法に起因するものであり、これは、有利には、癌免疫療法に応答する可能性に関して癌患者をスクリーニングすることを可能とするものである。開示される方法では、臨床結果が各個人における種々の免疫機能間のバランスに依存するという事実を正確に反映する、多様なタイプの免疫機能の組み合わせの分析が可能である。従って、開示される方法および手順は、可能性のある癌免疫療法応答者の識別を可能とし、医療専門家がこの知識を身につけて癌免疫療法を推奨すること（該当する場合）を可能とし、および／または成功が予測
される免疫療法レジメンで癌患者を治療することを可能とするものである。
【００８６】
【表１】
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【００８７】
【表２】
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【００８８】
【表３−１】
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【００８９】
【表３−２】
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【００９０】
【表３−３】
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【表３−４】
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【００９２】
【表３−５】
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【００９３】
【表４−１】
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【００９４】
【表４−２】
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【表４−４】
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【００９７】
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【００９８】
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【表４−７】
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【０１００】
【表４−８】
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【０１０１】
【表４−９】
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【０１０２】
【表４−１０】
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【０１０３】
【表４−１１】
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【０１０４】
【表４−１２】
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【表４−１３】
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【表４−１５】
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【表５−１】
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【表５−２】
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【０１１０】
【表５−３】
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【０１１３】
【表５−６】
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【０１１４】
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【０１１６】
【表５−９】
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【表５−１２】
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【表５−１３】
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【表５−１４】
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【表５−１７】
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【表５−１９】
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【０１２７】
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【０１３０】
【表５−２３】
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【０１３１】
【表５−２４】
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【表５−２７】
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【表５−３０】
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【表５−３２】
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【表５−３６】
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【０１４４】
【表５−３７】
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【０１４５】
【表５−３８】
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【０１４６】
【表５−３９】
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【０１４７】
【表５−４０】
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【０１４８】
【表６】
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【０１４９】
【表６Ａ】
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【０１５０】
【表７−１】
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【０１５１】
【表７−２】
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【０１５２】
【表７−３】
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【０１５３】
【表７−４】
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【０１５４】
【表７−５】
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【０１５５】
【表７−６】
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【０１５６】
【表７−７】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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