(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲン。
【請求項２】
請求項１に記載のＣａｎ ｆ４アレルゲンをコードする核酸。
【請求項３】
配列番号１で示される配列を有する、請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
請求項２または３に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲン、またはＣａｎ ｆ４アレルゲンとＩｇＥ抗体に関するエピトープを共有するそのフラグメントを含む、Ｉ型アレルギーのインビトロ診断用の薬剤。
【請求項７】
アレルゲン抽出物および／または少なくとも１種の精製されたアレルゲン成分を含む組成物に、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲン、または、Ｃａｎ ｆ４アレルゲンとＩｇＥ抗体に関するエピトープを共有するそのフラグメントを添加する工程を含む、アレルゲン組成物の製造方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法によって得られたアレルゲン組成物。
【請求項９】
インビトロのＩ型アレルギーの検出方法であって、該方法は、以下の工程：
Ｉ型アレルギーを有する疑いのある患者からの体液サンプルを、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲンまたはＣａｎ ｆ４アレルゲンとＩｇＥ抗体に関するエピトープを共有するそのフラグメントと、または、請求項８に記載のアレルゲン組成物と接触させること；および、
サンプル中における、前記Ｃａｎ ｆ４アレルゲンまたはＣａｎ ｆ４アレルゲンとＩｇＥ抗体に関するエピトープを共有するそのフラグメントに特異的に結合するＩｇＥ抗体の存在を検出すること、
を含み、ここで前記Ｃａｎ ｆ４アレルゲンまたはＣａｎ ｆ４アレルゲンとＩｇＥ抗体に関するエピトープを共有するそのフラグメントに特異的に結合するＩｇＥ抗体の存在は、Ｉ型アレルギーであることを示す、上記方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法を行うための検出キットであって、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲンまたはＣａｎ ｆ４アレルゲンとＩｇＥ抗体に関するエピトープを共有するそのフラグメント、または、請求項８に記載の組成物を含む、上記キット。
【請求項１１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲンを含む、診断薬。
【請求項１２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲンを含む、治療薬。
【請求項１３】
配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する組換え生産されたＢｏｓ ｄ２３ｋアレルゲン、または、Ｂｏｓ ｄ２３ｋアレルゲンとＩｇＥ抗体に関するエピトープを共有するそのフラグメントを含む、インビトロのＩ型アレルギー診断用の薬剤。
【請求項１４】
アレルゲン抽出物および／または少なくとも１種の精製されたアレルゲン成分を含む組成物に、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する組換え生産されたＢｏｓ ｄ２３ｋアレルゲン、または、Ｂｏｓ ｄ２３ｋアレルゲンとＩｇＥ抗体に関するエピトープを共有するそのフラグメントを添加する工程を含む、アレルゲン組成物の製造方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法によって得られたアレルゲン組成物。
【請求項１６】
インビトロのＩ型アレルギーの検出方法であって、該方法は、以下の工程：
Ｉ型アレルギーを有する疑いのある患者からの体液サンプルを、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する組換え生産されたＢｏｓ ｄ２３ｋアレルゲン、または、Ｂｏｓ ｄ２３ｋアレルゲンとＩｇＥ抗体に関するエピトープを共有するそのフラグメントと、または、請求項１５に記載のアレルゲン組成物と接触させること；そして、
サンプル中の、前記Ｂｏｓ ｄ２３ｋアレルゲン、または、Ｂｏｓ ｄ２３ｋアレルゲンとＩｇＥ抗体に関するエピトープを共有するそのフラグメントに特異的に結合するＩｇＥ抗体の存在を検出すること、
を含み、ここで前記Ｂｏｓ ｄ２３ｋアレルゲンまたはＢｏｓ ｄ２３ｋアレルゲンとＩｇＥ抗体に関するエピトープを共有するそのフラグメントに特異的に結合するＩｇＥ抗体の存在は、Ｉ型アレルギーであることを示す、上記方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法を行うための検出キットであって、該キットは、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する組換え生産されたＢｏｓ ｄ２３ｋアレルゲン、または、Ｂｏｓ ｄ２３ｋアレルゲンとＩｇＥ抗体に関するエピトープを共有するそのフラグメント、または、請求項１５に記載の組成物を含む、上記キット。
【請求項１８】
配列番号２のアミノ酸残基１７−１７４に示されるアミノ酸配列を有する、組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギーの分野に関する。より具体的には、本発明は、哺乳動物からの新規のアレルゲンの同定、および、哺乳動物に対するアレルギーの診断および治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
イヌの鱗屑は、鼻炎、結膜炎、気管支炎症および喘息などの症状を伴う室内アレルギーによくある原因の一つである。イヌアレルゲンは、イヌがペットとして飼われている家の中だけではなく、日常的にはイヌが存在しない例えば学校やデイケアセンターのようなその他の場所でも検出される可能性がある［１］。
【０００３】
イヌに対するアレルギーは、イヌの毛髪および鱗屑から放出されるタンパク質に対する感作によって発症し、それらに左右されるようになる。イヌに対するアレルギーの疑いがある場合、臨床的な調査は、イヌの毛髪および／または鱗屑の抽出物を用いた皮膚プリックによる感作の評価、または、特異的ＩｇＥ抗体の測定を含む。例えばファディア（Phadia）のイムノＣＡＰ（ImmunoCAPTM）のような特異的ＩｇＥに関する実験室レベルのイムノアッセイによれば、好都合な分析条件とアレルゲンの付着に利用可能な大きい固相のために天然のイヌの鱗屑抽出物を用いてほとんどのケースのイヌへの感作を検出することができる。
【０００４】
イヌの毛髪および鱗屑抽出物は、アレルギー性タンパク質と非アレルゲンタンパク質とが複雑になったものを含む［２，３］。これまで４種のイヌアレルゲン：Ｃａｎ ｆ１、Ｃａｎ ｆ２、Ｃａｎ ｆ３、および、Ｃａｎ ｆ５が同定されており、詳細に研究されている［４〜６］。前者の２種はどちらもリポカリンタンパク質ファミリーの１種であり、すでに精製され組換えタンパク質として発現されている［４，７］。イヌ血清アルブミンＣａｎ ｆ３は、他の哺乳動物アルブミンに対して大規模な交叉反応性を示す比較的保存されたタンパク質である［８］。イヌ前立腺のカリクレインＣａｎ ｆ５は、近年、主要なイヌアレルゲンとして説明されており、ヒト前立腺特異抗原（ＰＳＡ）と交叉反応することが示されている［５］。
【０００５】
これまでに知られているイヌの鱗屑のアレルゲンのうちＣａｎ ｆ１およびＣａｎ ｆ５が最も重要なようであり、これらはそれぞれ、イヌアレルギーの被検者のおよそ５０％および７０％からのＩｇＥ抗体と結合する［５，９］。イヌアレルギーの成人個体のうち約２０〜４０％がＣａｎ ｆ２またはＣａｎ ｆ３に結合するＩｇＥ抗体を提示するが、独占的に、または、せめて優勢にこれらのアレルゲンのいずれかと反応する個体はほとんどない［５、９］。近年報告された研究によれば、ごく一部のイヌアレルギー患者において、天然のイヌの鱗屑抽出物に感作されているにもかかわらずＣａｎ ｆ１、Ｃａｎ ｆ２、Ｃａｎ ｆ３およびＣａｎ ｆ５のどれにも結合しないＩｇＥ抗体が提示されることが見出された［５］。
【０００６】
上記で考察されたアレルゲンに加えて、Ｃａｎ ｆ１およびＣａｎ ｆ２とは異なるＩｇＥ反応性の１８ｋＤａのリポカリン様タンパク質が報告されており、これはＣａｎ ｆ４と呼ばれている［９］。免疫ブロッティングにおいて、２５人のイヌアレルギー患者のうち１５人（６０％）がこの１８ｋＤａのバンドに対して血清ＩｇＥ反応性を示すことが報告されており、すなわち、このタンパク質は重要なイヌアレルゲン成分である可能性があることを示す。しかしながらこのアレルゲンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより１３個のＮ末端アミノ酸配列としてしか特徴付けられておらず、すでに知られているイヌ由来タンパク質のどの配列とも配列のマッチングが見出されていない。従って全長タンパク質の配列はわかっておらず、組換えタンパク質のクローニングも行われていない。天然型のタンパク質も精製されていないし、どのようにＣａｎ ｆ４のクローニングを達成できるかについての示唆もない。
【０００７】
２００８年４月１８日〜２０日にザルツブルクで開催された第３回分子アレルギー学国際シンポジウム（the 3rd International Symposium on Molecular Allergology）の抄録で公開されたSaarelainen等の要約において、Ｃａｎ ｆ４特異的ｍＡｂは、ウシ鱗屑抽出物中の２０ｋＤａのタンパク質を認識したことが述べられている。
【０００８】
科学ジャーナルのアレルギー（Allergy）の特集号において、２００９年６月６日〜１０日にワルシャワで開催された欧州アレルギー臨床免疫学会（the European Academy of Allergy and Clinical Immunology: EAACI）の第XXVIII回学会の抄録が公開されているが、そこに、全長Ｃａｎ ｆ４をコードするｃＤＮＡがクローニングされていることを開示する要約が記載されている［Allergy 64 (Suppl. 90): 179-538］。しかしながら、どのようにしてこのクローニングを達成できたかといったことはことは示されておらず、さらに核酸またはアミノ酸配列も示されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Custovic A, Green R, Taggart SCO, Smith A, Pickering CAC, Chapman MD, et al. Domestic allergens in public places II: dog (Can f 1) and cockroach (Bla g 2) allergens in dust and mite, cat, dog and cockroach allergens in the air in public buildings. Clinical and Experimental Allergy 1996; 26:1246-52.
【非特許文献２】Spitzauer S. Allergy to mammalian proteins: At the borderline between foreign and self? International Archives of Allergy and Immunology 1999; 120:259-69.
【非特許文献３】Spitzauer S, Schweiger C, Anrather J, Ebner C, Scheiner O, Kraft D, et al. Characterisation of dog allergens by means of immunoblotting. International Archives of Allergy and Immunology 1993; 100:60-7.
【非特許文献４】Konieczny A, Morgenstern JP, Bizinkauskas CB, Lilley CH, Brauer AW, Bond JF, et al. The major dog allergens, Can f 1 and Can f 2, are salivary lipocalin proteins: cloning and immunological characterization of the recombinant forms. Immunology 1997; 92:577-86.
【非特許文献５】Mattsson L, Lundgren T, Everberg H, Larsson H, Lidholm J. Prostatic kallikrein: a new major dog allergen. J Allergy Clin Immunol 2009; 123:362-8.
【非特許文献６】Yman L, Brandt R, Ponterius G. Serum albumin--an important allergen in dog epithelia extracts. Int Arch Allergy Appl Immunol 1973; 44:358-68.
【非特許文献７】de Groot H, Goei KGH, van Swieten P, Aalberse RC. Affinity purification of a major and a minor allergen from dog extract: Serologic activity of affinity-purified Can f I and of Can f I-depleted extract. Journal of Allergy and Clinical Immunology 1991; 87:1056-65.
【非特許文献８】Boutin Y, Hebert H, Vrancken ER, Mourad W. Allergenicity and cross-reactivity of cat and dog allergenic extracts. Clinical Allergy 1988; 18:287-93.
【非特許文献９】Saarelainen S, Taivainen A, Rytkonen-Nissinen M, Auriola S, Immonen A, Mantyjarvi R, et al. Assessment of recombinant dog allergens Can f 1 and Can f 2 for the diagnosis of dog allergy. Clinical and Experimental Allergy 2004; 34:1576-82.
【非特許文献１０】Moverare R, Everberg H, Carlsson R, Holtz A, Thunberg R, Olsson P, et al. Purification and characterization of the major oak pollen allergen Que a 1 for component-resolved diagnostics using ImmunoCAP(R). International Archives of Allergy and Immunology 2008; 146:203-11.
【非特許文献１１】2008年4月18日〜20日にザルツブルクで開催された第3回分子アレルギー学国際シンポジウム（the 3rd International Symposium on Molecular Allergology）の抄録で公開されたSaarelainen等の要約
【非特許文献１２】Allergy 64 (Suppl. 90): 179-538
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明者等は、当業界においてアレルゲンのＣａｎ ｆ４をさらに特徴付けてその重要性を確認する必要があることを認識した。
上述したように、特異的ＩｇＥに関する実験室レベルのイムノアッセイによれば、好都合な分析条件とアレルゲンの付着に利用可能な大きい固相のために天然のイヌの鱗屑抽出物を用いてほとんどのケースのイヌへの感作を検出することができる。しかしながら、例えばアレルゲンマイクロアレイまたは医師の診察室での試験のような小型化されたイムノアッセイまたは実験室以外でのイムノアッセイでは、好都合な分析条件が少ないこと、抗体結合アレルゲン試薬の能力が低いこと、および、天然アレルゲン抽出物が限られた効力しかないことが組み合わされると、不十分な診断感度しか生じないことがわかっている。また、その他の動物上皮に対する特異的ＩｇＥのためのイムノアッセイにおいても類似の状況が存在する可能性もある。従って、特異的ＩｇＥのための診断テストで十分な感度を達成するために場合によっては純粋なアレルゲンタンパク質を使用する必要がある。また、成分分解診断（component-resolved diagnostics）という概念においてもその他の組換えアレルゲン成分を使用する必要性がある［２４］。この概念によれば、アレルゲン抽出物全体ではなく個々のアレルゲン成分に対するＩｇＥ応答解析を行うため、交叉反応性アレルゲン感作と元々のアレルゲン感作とをよりよく区別することができる。従って、特定のアレルゲン源から可能性のある全てのアレルゲン成分を同定して組換えタンパク質として生産する必要がある。
【００１１】
本発明者等が当業界でよく知られている標準的な方法を用いてＣａｎ ｆ４を配列解析してクローニングしようとしたところ、問題があることに気付いた。この問題は、以下の結果の章で説明するような従来にはない方法を用いることによってのみ解決された。本発明は、イヌ鱗屑抽出物とウシ鱗屑抽出物との両方に結合するＩｇＥ抗体を予想外に発見したこと、および、Ｃａｎ ｆ４の核酸配列を同定してそのクローニングを達成するために、発明者等はＣａｎ ｆ４とその他の生物由来のタンパク質との関連を解明する必要性を認識したことに基づく。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一形態において、本発明は、組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲンに関する。
その他の形態において、本発明は、前記組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲンをコードする核酸に関する。
【００１３】
さらなる形態において、本発明は、前記核酸を含むベクター、および、前記ベクターを含む宿主細胞に関する。
さらにその他の形態において、本発明は、Ｉ型アレルギーのインビトロ診断で使用するための組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲンに関する。
【００１４】
本発明のその他の形態は、アレルゲン抽出物および／または少なくとも１種の精製されたアレルゲン成分を含む組成物に、組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲンを添加する工程を含む、アレルゲン組成物を生産する方法に関する。
【００１５】
さらなる形態において、本発明は、組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲンで「スパイクされた」アレルゲン組成物に関する。このようなアレルゲン組成物は、Ｃａｎ ｆ４アレルゲンが含まれないか、または、低いＣａｎ ｆ４アレルゲン含量しか有さないアレルゲン抽出物であってもよいし、または、精製および／または組換えアレルゲン成分の混合物であってもよく、ここでこの組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲンは、ＩｇＥが組成物中のその他のアレルゲン成分と結合しないか、または、不十分にしか結合しないと予想される患者から得られたＩｇＥと結合させるために添加される。本発明のこの形態はまた、このような組成物を生産する方法にも関し、本方法は、アレルゲン組成物、例えばアレルゲン抽出物（任意にその他の成分でスパイクされていてもよい）、または、精製された天然型または組換えアレルゲン成分の混合物に、組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲンを添加する工程を含む。
【００１６】
さらなる形態において、本発明は、患者におけるＩ型アレルギーを診断するためのインビトロの診断方法に関し、ここで本方法は、例えば患者由来の血液または血清サンプルなどの体液サンプルを、組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲンまたは前述した形態に係る組成物と接触させ、患者サンプルが組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲンに特異的に結合するＩｇＥ抗体を含むかどうかを検出するものであり、ここでこのような前記Ｃａｎ ｆ４アレルゲンに特異的に結合するＩｇＥ抗体が存在すると、Ｉ型アレルギーであることを示す。このような診断方法は当業界でよく知られているあらゆる方法で行うことができる。例えば従来の実験室レベルのイムノアッセイ、マイクロアレイまたはラテラルフロー分析において、組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲンは例えば固体支持体に固定されていてもよい。
【００１７】
さらなる形態において、本発明は、前述の形態に係る方法を行うための診断キットに関し、本キットは、組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲンを含む。
本発明はさらに、哺乳動物に対するＩ型アレルギーの治療方法に関し、本方法は、以下で説明するように、このような治療が必要な個体に、組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲン、または、それらのＩｇＥ結合応答が阻害されるかまたは弱められるように改変された形態を投与することを含む。一実施態様において、哺乳動物は、イヌである。その他の実施態様において、哺乳動物は、組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲンと相同性を示す哺乳動物アレルゲンを有するならばどのような哺乳動物であってもよく、ここでこの個体は、例えばＢｏｓ ｄ２３ｋのような前記哺乳動物アレルゲンとのＩｇＥ交叉反応性を示すものである。本発明のこの形態はまた、このような免疫療法（例えば成分分解免疫療法など）における組換え生産されたＣａｎ ｆ４の使用にも関する。改変の例としては、これらに限定されないが、細分化、分子のトランケーションまたはタンデム化（tandemerization）、内部セグメントの欠失、アミノ酸残基の置換、ジスルフィド架橋またはその他の高分子構造への結合の破壊による、または、低分子量化合物に結合するタンパク質の能力をなくすことによる、ドメインの再構成または三次構造の少なくとも一部分の破壊が挙げられる。
【００１８】
その他の形態において、本発明は、以下で説明するように、Ｉ型アレルギーの治療で使用するための、組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲン、または、それらのＩｇＥ結合応答が阻害されるかまたは弱められるように改変された形態に関する。
【００１９】
さらにその他の形態において、本発明は、組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲン、または、前記Ｃａｎ ｆ４アレルゲンのＩｇＥ結合応答が阻害されるかまたは弱められるように改変された形態を含む医薬組成物に関する。
【００２０】
上述した形態において、組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲンは、以下で定義されるように、野生型Ｃａｎ ｆ４アレルゲンと抗体に関するエピトープを共有するそれらの変異体またはフラグメントで置き換えられていてもよい。
【００２１】
上述したそれぞれの形態の一実施態様において、組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲンは、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１で示される核酸配列によってコードされている。
【００２２】
さらに本発明は、診断および治療で使用するための、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する組換え生産されたＣａｎ ｆ４アレルゲンに関する。
本発明はさらに、インビトロのＩ型アレルギー診断で使用するための組換え生産されたＢｏｓ ｄ２３ｋアレルゲンに関する。
【００２３】
本発明のその他の形態は、アレルゲン組成物を生産する方法に関し、本方法は、アレルゲン抽出物および／または少なくとも１種の精製されたアレルゲン成分を含む組成物に、組換え生産されたＢｏｓ ｄ２３ｋアレルゲンを添加する工程を含む。
【００２４】
さらなる形態において、本発明は、組換え生産されたＢｏｓ ｄ２３ｋアレルゲンで「スパイクされた」アレルゲン組成物に関する。このようなアレルゲン組成物は、Ｂｏｓ ｄ２３ｋアレルゲンが含まれないか、または、低いＢｏｓ ｄ２３ｋアレルゲン含量しか有さないアレルゲン抽出物であってもよいし、または、精製および／または組換えアレルゲン成分の混合物であってもよく、ここでこの組換え生産されたＢｏｓ ｄ２３ｋアレルゲンは、ＩｇＥが組成物中のその他のアレルゲン成分と結合しないか、または、不十分にしか結合しないと予想される患者から得られたＩｇＥと結合させるために添加される。本発明のこの形態はまた、このような組成物を生産する方法にも関し、本方法は、アレルゲン組成物、例えばアレルゲン抽出物（任意にその他の成分でスパイクされていてもよい）、または、精製された天然型または組換えアレルゲン成分の混合物に、組換え生産されたＢｏｓ ｄ２３ｋアレルゲンを添加する工程を含む。
【００２５】
さらなる形態において、本発明は、患者におけるＩ型アレルギーを診断するためのインビトロの診断方法に関し、ここで本方法は、例えば患者由来の血液または血清サンプルなどの体液サンプルを、組換え生産されたＢｏｓ ｄ２３ｋアレルゲンまたは前述した形態に係る組成物と接触させ、患者サンプルが組換え生産されたＢｏｓ ｄ２３ｋアレルゲンに特異的に結合するＩｇＥ抗体を含むかどうかを検出するものであり、ここでこのような前記Ｂｏｓ ｄ２３ｋアレルゲンに特異的に結合するＩｇＥ抗体が存在すると、Ｉ型アレルギーであることを示す。このような診断方法は当業界でよく知られているあらゆる方法で行うことができる。例えば従来の実験室レベルのイムノアッセイ、マイクロアレイまたはラテラルフロー分析において、組換え生産されたＢｏｓ ｄ２３ｋアレルゲンは例えば固体支持体に固定されていてもよい。
【００２６】
さらなる形態において、本発明は、前述の形態に係る方法を行うための診断キットに関し、本キットは、組換え生産されたＢｏｓ ｄ２３ｋアレルゲンを含む。
本発明はさらに、哺乳動物に対するＩ型アレルギーの治療方法に関し、本方法は、以下で説明するように、このような治療が必要な個体に、組換え生産されたＢｏｓ ｄ２３ｋアレルゲン、または、それらのＩｇＥ結合応答が阻害されるかまたは弱められるように改変された形態を投与することを含む。一実施態様において、哺乳動物は、ウシである。その他の実施態様において、哺乳動物は、組換え生産されたＢｏｓ ｄ２３ｋアレルゲンと相同性を示す哺乳動物アレルゲンを有するならばどのような哺乳動物であってもよく、ここでこの個体は、例えばＣａｎ ｆ４のような前記哺乳動物アレルゲンとのＩｇＥ交叉反応性を示すものである。本発明のこの形態はまた、このような免疫療法（例えば成分分解免疫療法など）における組換え生産されたＢｏｓ ｄ２３ｋの使用にも関する。改変の例としては、これらに限定されないが、細分化、分子のトランケーションまたはタンデム化（ｔａｎｄｅｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、内部セグメントの欠失、アミノ酸残基の置換、ジスルフィド架橋またはその他の高分子構造への結合の破壊による、または、低分子量化合物に結合するタンパク質の能力をなくすことによる、ドメインの再構成または三次構造の少なくとも一部分の破壊が挙げられる。
【００２７】
その他の形態において、本発明は、以下で説明するように、Ｉ型アレルギーの治療で使用するための、組換え生産されたＢｏｓ ｄ２３ｋアレルゲン、または、それらのＩｇＥ結合応答が阻害されるかまたは弱められるように改変された形態に関する。
【００２８】
さらにその他の形態において、本発明は、組換え生産されたＢｏｓ ｄ２３ｋアレルゲン、または、前記Ｂｏｓ ｄ２３ｋアレルゲンのＩｇＥ結合応答が阻害されるかまたは弱められるように改変された形態を含む医薬組成物に関する。
【００２９】
上述した形態において、組換え生産されたＢｏｓ ｄ２３ｋアレルゲンは、以下で定義されるように、野生型Ｂｏｓ ｄ２３ｋアレルゲンと抗体に関するエピトープを共有するそれらの変異体もしくはフラグメントで置き換えられていてもよい。
【００３０】
Ｂｏｓ ｄ２３ｋに関する上述したそれぞれの形態の一実施態様において、組換え生産されたＢｏｓ ｄ２３ｋアレルゲンは、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有し、配列番号３で示される核酸配列によってコードされている。
【００３１】
定義
Ｃａｎ ｆ４は、免疫学会アレルゲン命名調査会国際連合（the International Union of Immunological Societies Allergen Nomenclature Sub-Committee）（www.allergen.org）によって列挙されたイヌアレルゲンと解釈することとする。
【００３２】
リポカリンは、多様な生物に存在し、多数の機能に関与する大きく多様なタンパク質グループと解釈することとする［２５〜２７］。これらは所定の保存された構造的特徴を特徴とするが、アミノ酸配列の点では高度に保存されていない。リポカリンは、ステロイド、脂肪酸およびフェロモンのような主に疎水性の小さい分子と結合できる。哺乳動物の嗅覚器に存在するリポカリンの１つのサブグループは、嗅覚のシグナル伝達に関与する揮発性化合物を可逆的に結合し放出する能力を有することから臭気物質結合タンパク質と称される［２８］。数種の哺乳動物のリポカリンは、感作されたヒトにおいて呼吸器のアレルギー症状を引き起こすアレルゲンとして報告されている［２９］。
【００３３】
発明者等によりＢｏｓ ｄ２３ｋと命名されたタンパク質は、実施例で、ボース・タウルス（Bos taurus）のゲノム配列から推測された承認番号ＸＰ＿５８１２７７に記載された推定のウシ遺伝子産物と一致するアミノ酸配列を含むウシ鱗屑から精製された２３ｋＤａのタンパク質として説明されている。
【００３４】
用語「Ｃａｎ ｆ４」、他の規定のない限り、改変されていない無傷の全長Ｃａｎ ｆ４と解釈することとする。
また、同じ定義が、必要に応じて変更を加えてＢｏｓ ｄ２３ｋにも適用される。
【００３５】
Ｃａｎ ｆ４アレルゲンと抗体に関するエピトープを共有するＣａｎ ｆ４アレルゲンの変異体およびフラグメントは、代表的なＣａｎ ｆ４アレルゲンで感作された患者からの血清サンプル由来のＩｇＥ抗体の結合を、Ｃａｎ ｆ４アレルゲンによって有意に阻害することができるフラグメントおよび変異体と解釈することとする。このような阻害分析は、例えばＷＯ２００８／０７９０９５の実施例８で開示されたプロトコールに従って行ってもよい。このような変異体およびフラグメントはまた、Ｃａｎ ｆ４アレルゲンと類似したＩｇＥ結合特性を有するとも言われている。
【００３６】
また、同じ定義が、必要に応じて変更を加えてＢｏｓ ｄ２３ｋにも適用される。
前記Ｃａｎ ｆ４アレルゲンのＩｇＥ結合応答が阻害されるかまたは弱められるように改変された形態は、本発明の環境において、例えば上記で本発明の免疫療法の形態に関して例示されたような免疫学的な特性を変化させるように化学的または遺伝学的に組換えられたＣａｎ ｆ４アレルゲンを意味するものと解釈されることとする。
【００３７】
また、同じ定義が、必要に応じて変更を加えてＢｏｓ ｄ２３ｋにも適用される。
相同体アレルゲンは、その核酸配列がその他のアレルゲンの核酸配列とハイブリダイズすることができるアレルゲンを意味するものと解釈することとする。ハイブリダイゼーションの結果は、配列の長さ、その配列にわたりどのように相同性が分布しているか、および、例えば塩濃度、温度、洗浄のストリンジェンシー等の実験条件によって変化する場合がある。本発明に係る相同体アレルゲンにおいて、その配列全体の同一性が、相同体で多くの場合みられる同一性よりも低い場合があり、すなわち６５〜７０％の同一性である場合がある。本発明の定義によれば、相同体アレルゲンの核酸配列はその他のアレルゲンの核酸に対して比較的低い配列全体の同一性しか示さない場合があるが、より高い配列同一性を示す配列のセグメントがあるためこのその他のアレルゲンにそれでもなおハイブリダイズする。
【００３８】
アレルゲンに対する交叉反応性は、第一のアレルゲンに対する個体のＩｇＥ抗体が、第一のアレルゲンの相同体であっても相同体でなくても第二のアレルゲンに対しても反応性を有することを意味すると解釈することとする。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、還元されていないイヌの鱗屑抽出物のタンパク質に結合するＩｇＥ抗体の免疫ブロット解析を示す。解析された３７種の血清のうち１０種を示す。被検者の番号は、各レーンの上に示し、血清の希釈率は、各レーンの下に示した。分子量マーカータンパク質の位置は、左に示した。
【図２Ａ】図２は、４つの連続した工程による免疫ブロッティングで同定された１６ｋＤａのイヌの鱗屑タンパク質の精製を示す。Ａ：分取サイズ排除クロマトグラフィー。プールした分画は、垂直のバーで示される。
【図２Ｂ】Ｂ：陰イオン交換クロマトグラフィー。斜線のラインは、伝導率を示す（右のｙ軸）。さらなる精製のためにプールされた分画は、水平の括弧でマークした。
【図２Ｃ】Ｃ：逆相クロマトグラフィー。斜線のラインは、アセトニトリル濃度を示す（右のｙ軸）。さらなる精製のためにプールされた分画は、水平の括弧でマークした。
【図２Ｄ】Ｄ：陰イオン交換クロマトグラフィー、斜線のラインは、伝導率を示す（右のｙ軸）。純粋な標的タンパク質を含むピークは、矢印で示される。
【図３】図３は、精製された１６ｋＤａのイヌの鱗屑タンパク質のトリプシンフラグメントから得られたペプチド配列を示す。
【図４】図４は、Ｃａｎ ｆ４のｃＤＮＡ配列（添付の配列表において配列番号１で示される）および推測のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。予想されたシグナル切断部位は、矢印でマークした。
【図５Ａ】図５は、精製されたｎＣａｎ ｆ４およびｒＣａｎ ｆ４の比較のための生化学的および免疫学的な解析を示す。Ａ：分析ゲルろ過。斜線のライン：ｎＣａｎ ｆ４（右のｙ軸）；実線：ｒＣａｎ ｆ４（左のｙ軸）。６．５、１３．７、２９、４３および７５ｋＤａの較正用タンパク質の溶出体積は、ひし形の記号でマークした。
【図５Ｂ】Ｂ：ｎＣａｎ ｆ４およびｒＣａｎ ｆ４の還元されていない（ｏｘ）、および、還元型（ｒｅｄ）サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。関連分子量マーカータンパク質のサイズは、左側に示した。
【図５Ｃ】Ｃ：イムノＣＡＰによるＩｇＥ抗体の結合活性（ｋＵａ／Ｌ）の解析。３７人のイヌアレルギー被検者からの血清を解析した。斜線のラインは、０．１０および０．３５ｋＵＡ／Ｌのレベルを示す。
【図６】図６は、３７人のイヌアレルギー被検者のイヌの鱗屑抽出物（ＤＤＥ）、ｒＣａｎ ｆ１、ｒＣａｎ ｆ２、ｎＣａｎ ｆ３、ｒＣａｎ ｆ５およびｒＣａｎ ｆ４に対するＩｇＥ抗体の濃度を示す。水平のバーは、中央値を示す。点線は、０．３５ｋＵＡ／Ｌレベルを示す。０．１ｋＵＡ／Ｌ未満の値は０．１ｋＵＡ／Ｌにあわせた。
【図７】図７は、Ｂｏｓ ｄ２３ｋに結合するＩｇＥ抗体のｒＣａｎ ｆ４による阻害を示す。３種のＢｏｓ ｄ２３ｋ反応性血清（Ａ〜Ｃ）を１００μｇ／ｍＬのｒＣａｎ ｆ４（黒色のバー）または緩衝液（ネガティブコントロール，灰色のバー）とプレインキュベートし、その後固定されたＢｏｓ ｄ２３ｋに結合するＩｇＥを測定した。
【図８Ａ】図８は、２種のＩｇＥ抗体結合タンパク質であるウシ鱗屑由来のＢｏｓ ｄ２３ｋおよびＢｏｓ ｄ２の精製を示す。Ａ：サイズ排除クロマトグラフィーによる精留。ＡおよびＢでマークされた２つのピークからのトップ分画をプールし、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析で処理した（挿入されたグラフ）。関連分子量マーカータンパク質のサイズは、右側に示した。
【図８Ｂ】Ｂ：疎水性相互作用および陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した後の、精製されたＢｏｓ ｄ２３ｋおよびＢｏｓ ｄ２の還元型（ｒｅｄ）、および、非還元型（ｏｘ）サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。関連分子量マーカータンパク質のサイズは、各ゲルの左側に示される。
【図９】図９は、Ｃａｎ ｆ４、Ｂｏｓ ｄ２３ｋに結合するＩｇＥ抗体（上のグラフ）、および、Ｂｏｓ ｄ２に結合するＩｇＥ抗体（下のグラフ）の比較を示す。それぞれの比較ごとに相関係数（ｒ）を示す。３７人のイヌアレルギー被検者からの血清を解析した。斜線のラインは、０．１０および０．３５ｋＵＡ／Ｌのレベルを示す。
【図１０】図１０は、Ｃａｎ ｆ４のアミノ酸配列（配列番号２で示される）およびＢｏｓ ｄ２３ｋのアミノ酸配列（配列番号４で示される）のアライメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
以下の実施例で、本発明をリポカリン様タンパク質であるイヌ由来Ｃａｎ ｆ４の単離および用途によって説明する。また、Ｃａｎ ｆ４とウシアレルゲンとの交叉反応性についても説明する。この実施例は単に説明のためであり、本発明を限定するものとみなされないこととし、本発明は添付の請求項の範囲によって定義される。
【実施例】
【００４１】
材料および方法
ＩｇＥ免疫ブロット解析
免疫ブロット解析は、均一な１２．５％エクセルゲル（ExcelGel；ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス（GE Healthcare Life Sciences），スウェーデン国ウプサラ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離されてハイボンド（Hybond）ＥＣＬニトロセルロースメンブレン（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス）にエレクトロブロッティングされた還元されていないイヌの鱗屑抽出物上で行った。分子量（ＭＷ）マーカーとして、ＬＭＷキット（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス）を用いた。ブロッキング緩衝液（ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸塩，０．１％（v/v）トゥイーン（Tween）−２０、０．９％（w/v）ＮａＣｌ、０．３％（w/v）デキストランＴ１０）を用いて、タンパク質ブロットを室温で１時間ブロックし、続いてブロッキング緩衝液で１．５〜３０倍に希釈した各患者の血清それぞれと共に一晩インキュベートした。このメンブレンを０．５％（v/v）トゥイーン−２０を含むブロッキング緩衝液で洗浄した後、ブロッキング緩衝液中の１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ抗体と共に室温で４時間インキュベートし、洗浄後、貯蔵用の蛍光スクリーン、および、タイフーン（Typhoon）９４１０モード可変イメージャー（Variable Mode Imager）（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス）を用いて結合したＩｇＥを放射線撮影によって検出した。
【００４２】
イヌの鱗屑由来の１６ｋＤａのタンパク質の精製
イヌの鱗屑（アレルゴン（Allergon），スウェーデン国ヴァーリンゲ（Valinge））を２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．６）、０．５ＭのＮａＣｌ（ＭＢＳ）中で抽出し、遠心分離で透明化し、０．４５μｍの混合型セルロースエステルフィルター（ミリポア（Millipore），マサチューセッツ州ビレリカ）を通過させてろ過し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）のためにスーパーデックス（Superdex）７５カラム（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス）に適用した。アミコン（Amicon）の撹拌セル（ミリポア）中でＹＭ−３フィルターを用いて免疫ブロット解析で観察された１６ｋＤａのバンドを含む分画を濃縮し、セファデックス（Sephadex）Ｇ２５スーパーファインカラム（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス）で２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して脱塩した。続いてこの脱塩した調製物を陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＩＥＣ）用のソースＱ（Source Q）カラム（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス）に適用し、０〜０．５ＭのＮａＣｌの直線的な濃度勾配で溶出させた。ソース１５ＲＰＣカラム（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス）を用いた逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）でさらなる精製を行い、０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含むアセトニトリル水溶液０〜５４％の直線的な濃度勾配で溶出した。標的タンパク質を含む分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定し、プールした。還元、アルキル化およびトリプシン切断の後、精製タンパク質のペプチドをＲＰＣで単離し、アミノ酸配列解析で解析した。イムノＣＡＰによるＩｇＥ抗体結合の評価のために、１６ｋＤａのタンパク質を、２０ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ４．０）で平衡化したＳＰセファロースＦＦカラム（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス）を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＩＥＣ）によって最終的な仕上げ処理を行い、０〜１ＭのＮａＣｌの直線的な濃度勾配で溶出させた。
【００４３】
ウシ鱗屑由来のＩｇＥ結合タンパク質の精製
ウシ鱗屑（アレルゴン）を抽出し、上述のようにＳＥＣで画分した。優勢な２３ｋＤａのバンドを含む分画をプールし、ＮＨ４ＳＯ４で最終濃度１Ｍに調整し、および、さらにフェニルセファロースＨＰカラム（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）で精製した。分画を通過したフロー中に２３ｋＤａのバンドが溶出し、それらをセファデックスＧ２５スーパーファインカラム（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス）を用いて２０ｍＭのビストリスプロパン（ｐＨ８．５）に対して脱塩し、その後、同じ緩衝液で平衡化したソース１５Ｑカラム（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス）に適用した。０〜０．４ＭのＮａＣｌの直線的な濃度勾配で溶出を行い、２３ｋＤａのバンドを含む分画をプールした。１ｍｇ／ｍＬあたり１．０４の計算された吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度から最終的な調製物のタンパク質濃度を決定した。
【００４４】
優勢な１９ｋＤａのバンドを含む分画をプールし、さらに上述のようにＨＩＣで精製した。２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中のＮＨ４ＳＯ４の０〜１Ｍの直線的な濃度勾配で１９ｋＤａのタンパク質が溶出し、そのピーク分画をプールした。上述のようにしてソース１５Ｑカラムでの脱塩およびＡＩＥＣを行った。１ｍｇ／ｍＬあたり１．０４の計算された吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度から最終的な調製物のタンパク質濃度を決定した。
【００４５】
タンパク質解析
特に他の規定がない限り、還元された（４％β−メルカプトエタノール）および還元されていないタンパク質サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、１０％ＮｕＰＡＧＥゲル（インビトロジェン（Invitrogen），カリフォルニア州カールスバッド）および分子量マーカーとしてＭａｒｋ１２（インビトロジェン）を用いて行った。電気泳動で分離した後、タンパク質をクーマシーブリリアントブルー染色で可視化した。ヒューレット・パッカードＧ１０００Ａ装置（ヒューレット・パッカード（Hewlett-Packard），カリフォルニア州パロアルト）を用いて抽出したタンパク質バンドのＮ末端の配列解析を行った。ＭＢＳで平衡化したスーパーデックス７５ＨＲ１０／３０カラム（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス）で分析用ＳＥＣを行った。ＬＭＷゲルろ過較正キット（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス）を用いてカラムの分子量較正を行った。
【００４６】
マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）マススペクトロメトリー（ＭＳ）によるペプチドのマスフィンガープリント（ＰＭＦ）解析のために、実質的に文献１０で説明されているようにブルカーのダルトニクス・オートフレックス（Daltonics Autoflex）２装置（ブルカー・ダルトニクス（Bruker Daltonics），ドイツ国ブレーメン）を用いて、還元、アルキル化およびトリプシン消化等を含む溶液中のＲＰＣで精製したタンパク質のサンプル調製を行った。選択されたペプチドを同定するためにタンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）解析を行った。得られたＰＭＦおよびＭＳ／ＭＳの結果に合致するタンパク質を同定するために、ＭＳＤＢデータベースをマスコット・サーバー（Mascot server，マトリックスサイエンス（Matrixscience），英国ロンドン）を用いて検索した。．
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られた個々のタンパク質バンドのゲル中でのトリプシン消化を実質的にShevchenko等［１１］に従って行った。サンプル調製およびペプチドのマスフィンガープリントを上述のようにして行った。
【００４７】
組換えＣａｎ ｆ４のクローニング、発現および精製
ＲＮＡｑｕｅｏｕｓキット（アンビオン（Ambion），テキサス州オースティン）を用いてイヌの舌の外側区からトータルＲＮＡを製造した。ｍＲＮＡ精製キット（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス）を用いてトータルＲＮＡからポリアデニル化されたＲＮＡを単離し、ファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（First-Strand cDNA Synthesis kit：ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス）を用いて第一鎖のｃＤＮＡを製造した。３’ＲＡＣＥを、Ｆｒｏｈｍａｎ［１２］に従って、いずれも末端にクローニングのためのＮｄｅＩ制限部位を有するネステッドオリゴヌクレオチドフォワードプライマー５’−ＡＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＡＣＴＧＴＴＧＴＧＴＣ−３’、および、５’−ＣＡＧＣＴＡＣＣＣＣＴＴＣＣＴＡＡＴＧ−３’を用いて行った。７つの独立した３’ＲＡＣＥクローンを単離し、その全体を配列解析することによってＣａｎ ｆ４コード配列を定義した。アプライド・バイオシステムズの３１３０ジェネティック・アナライザー（3130 Genetic Analyzer，アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems），カリフォルニア州フォスターシティー）を用いてＤＮＡ配列解析を行った。ＧＣＧウィスコンシン・パッケージ（GCG Wisconsin Package）のプログラム（アクセルリス（Accelrys），米国カリフォルニア州サンディエゴ）を用いてＤＮＡおよびアミノ酸配列解析および計算を行った。シグナルＰ（SignalP）を用いてシグナルペプチド予測を行った（www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）。タンパク質を発現させる目的で、プライマー５’−ＧＴＣＡＧＣＡＴＡＴＧＣＡＧＣＴＡＣＣＣＣＴＴＣＣＴＡＡＴＧ−３’および５’−ＡＣＴＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＴＧＧＧＡＣＡＧＴＴＧＴＣ−３’を用いてＣａｎ ｆ４コード配列を増幅し、ベクターｐＥＴ−２３ａ（＋）（ノバジェン（Novagen），米国ウィスコンシン州マディソン）のＮｄｅＩ部位とＸｈｏＩ部位との間でクローニングした。３Ｌのバイオリアクター（ベラーチ・バイオテクニーク（Belach Bioteknik），スウェーデン国ソルナ）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１中で組換えＣａｎ ｆ４をＣ末端にヘキサヒスチジンタグを有するタンパク質として生産した。
【００４８】
ｒＣａｎ ｆ４精製のために、回収された細胞を２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に再懸濁し、懸濁液をエマルシフレックスＣ５（Emulsiflex C5）ホモジナイザー（アベスチン社（Avestin Inc.），カナダ）に１５０００〜１７０００ｋＰａで通過させることによって溶菌させた。遠心分離およびろ過で浄化した後、上清をＮｉＳＯ４が充填されたキレート化用セファロースＦＦカラム（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス）に適用した。２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１５ＭのＮａＣｌ中の２０ｍＭのイミダゾールでカラム洗浄を行い、同じ緩衝液中のイミダゾール２０〜５００ｍＭの直線的な濃度勾配で組換えタンパク質を溶出させた。ＱセファロースＦＦカラム（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス）を用いて２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中のＡＩＥＣで組換えタンパク質のさらなる精製を行った。０〜０．５Ｍの直線的なＮａＣｌ濃度勾配を用いてタンパク質を溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果に従って分画をプールした。１ｍｇ／ｍＬあたり０．７８の計算された吸光係数を用いて２８０ｎｍにおける吸光度から最終的な調製物のタンパク質濃度を決定した。Ｎ末端の配列解析によって組換えタンパク質が壊れていないことを確認した。
【００４９】
イヌアレルギー被検者および花粉アレルギーのコントロール
この研究にスペイン（ｎ＝２３）、スウェーデン（ｎ＝１０）、および、北米（ｎ＝４）からの３７人のイヌアレルギー被検者からの血清を用いた（表２）。全ての患者は、医師にイヌアレルギーと診断されており、例えば喘息、鼻結膜炎およびじんましんのような症状を有し、イヌの鱗屑抽出物に対する特異的ＩｇＥに関する皮膚プリックテストは陽性であり、および、イムノＣＡＰ試験（ファディア，スウェーデン国ウプサラ）も陽性であった。コントロールのために、イヌアレルギーの症状が診断されていない、または、報告されていない４４人の花粉アレルギー被検者の血清を用いた。各センターにおける地域倫理委員会の承認のもとに全てのサンプルおよび臨床データを回収した。
【００５０】
特異的ＩｇＥ抗体の測定
一般的な実験室レベルのイムノＣＡＰＴＭ試験（ファディア）を用いて精製された組換えおよび天然アレルゲンのＩｇＥ抗体の結合活性を試験した。実験室レベルのイムノＣＡＰ試験は、文献１３で説明されているようにして準備した。最終濃度が０、１０００または３０００ｋＵ／Ｌになるように骨髄腫のＩｇＥでスパイクされたネガティブコントロールの血清を用いて、実験室レベルの試験の分析特異性を評価した。血清サンプルを最終濃度１００μｇ／ｍＬの組換えＣａｎ ｆ４と共にプレインキュベートすることによってＩｇＥ阻害実験を行い、その後、イムノＣＡＰ固相に固定された２３ｋＤａのウシ鱗屑タンパク質に結合するＩｇＥ抗体を測定した。結果を二連での測定の平均値として計算した。
【００５１】
結果
イヌアレルギー被検者からの血清の免疫ブロッティング解析
１０人のイヌアレルギー被検者からの血清サンプルを、還元されていないイヌの鱗屑抽出物を用いたＩｇＥ免疫ブロット解析で処理した（図１）。同じ血清に関して、比較のためにｒＣａｎ ｆ１、ｒＣａｎ ｆ２、ｎＣａｎ ｆ３およびｒＣａｎ ｆ５に対する特異的ＩｇＥのイムノＣＡＰデータを利用した。免疫ブロット解析により、少なくとも８種の異なるタンパク質バンドに結合するＩｇＥが見出された。これらのなかでも特筆すべきは、ｒＣａｎ ｆ１およびｒＣａｎ ｆ２に結合するイムノＣＡＰのＩｇＥと相関する２３ｋＤａの領域におけるバンド（被検者５、２４、３１および３３）、ｒＣａｎ ｆ５と反応性を有する２８ｋＤａの領域におけるバンド（被検者１、３、５、１５、３１、３３および３６）、および、ｎＣａｎ ｆ３と反応性を有する約６０ｋＤにおけるバンド（被検者９、１５および３３）である。
【００５２】
４人の被検者（１、９、１４および３６）の血清を用いた免疫ブロットで１６ｋＤａのバンドに結合するＩｇＥが検出され、そのうち１人（被検者１４）の血清から特に強いシグナルが得られた。イムノＣＡＰ解析で、この血清において、ＩｇＥはｒＣａｎ ｆ１、ｒＣａｎ ｆ２、ｎＣａｎ ｆ３またはｒＣａｎ ｆ５のどれとも結合しないという事実から、１６ｋＤａのバンドは、新しいアレルゲンを示すことが示唆される。
【００５３】
免疫ブロッティングで同定された１６ｋＤａのイヌの鱗屑タンパク質の精製
ＳＥＣ、続いてＡＩＥＣおよびＲＰＣを含む３工程の精製プロセスによって、純度９０〜９５％の１６ｋＤａのタンパク質の調製物が得られた（図２）。このタンパク質のＮ末端を配列解析したところリーディング配列は得られず、従ってＮ末端はブロックされていることが示唆される。この問題を克服するために、このタンパク質を還元し、アルキル化し、トリプシン消化して、内部ペプチドを生成した。このような４種のトリプシンペプチドをＲＰＣで分離してＮ末端を配列解析したところ、図３に示される配列が得られた。これらのペプチド配列を用いてＢＬＡＳＴ検索したところ、どの既知のイヌタンパク質とも正確なマッチングが同定されなかった。しかしながら、代表的なウシおよびブタ由来の臭気物質結合タンパク質を含むデータベースのエントリーに対するペプチド１および４の不完全な一致から、精製イヌタンパク質は、このタンパク質ファミリーに関連する可能性があることが示唆される。さらに、還元されたストリンジェンシー設定を用いてペプチド４を用いてイヌゲノムデータベースをＴＢＬＡＳＴＮ検索したところ、Ｘ染色体の末端領域における３種の隣接するセグメントの概念的な翻訳（conceptual translation）に対してマッチングが得られた。精製タンパク質のＰＭＦ解析からは、既知のタンパク質配列に対する有意なマッチングはまったく得られなかった。
【００５４】
イムノＣＡＰによるイムノアッセイ、それに続いて調製物の純度をさらに高めるための最終的なCIECによる仕上げ工程によって、ＩｇＥの１６ｋＤａのイヌの鱗屑タンパク質との結合活性を評価した。３７人のイヌアレルギーの個体からの血清を解析したところ、イムノＣＡＰにおいて精製タンパク質に結合するＩｇＥは、イヌの鱗屑抽出物の免疫ブロット解析における１６ｋＤａのバンドの検出と十分な関連を示したことから、この精製タンパク質は、免疫ブロッティングで観察された１６ｋＤａのバンドの一種であることが示される。
【００５５】
イヌ由来の上皮アレルゲンとウシ由来の上皮アレルゲンとの関連
我々の実験室での実験とは別系統のその他の動物種由来の上皮アレルゲンに対して行われた実験により、１６ｋＤａのイヌアレルゲンの同定およびクローニングに対する予想外の助力が得られた。イヌアレルゲンとウシアレルゲンに関する研究とで共通に用いられた１種の血清が、イヌ鱗屑抽出物とウシ鱗屑抽出物との両方に結合する有意なＩｇＥ抗体を示すが、一方でイムノＣＡＰにおいてｒＣａｎ ｆ１、ｒＣａｎ ｆ２、ｎＣａｎ ｆ３およびｒＣａｎ ｆ５全てに反応性を示さないことから、この血清は、新規のイヌアレルゲンの存在を明らかにする可能性が出てきた。
【００５６】
ウシ鱗屑抽出物中の２３ｋＤａのタンパク質は、この血清由来のＩｇＥと結合すること、および、ＳＥＣで高度に高濃度化することができることがわかった（図８，Ａ）。ＳＥＣ分画化において隣接するピークは、主要なアレルゲンであるＢｏｓ ｄ２を含むことがわかり、これはＰＭＦ解析で確認したところ１９ｋＤａのリポカリンであった（示さず）。これらのタンパク質をＨＩＣとＡＩＥＣとでさらに精製したところ（示さず）、イムノアッセイ試薬として適切な高度に純粋調製物が得られた（図８，Ｂ）。
【００５７】
ＰＭＦデータにおいて、「臭気物質結合タンパク質に類似した」と注釈が付けられたウシリポカリンの一種である、データベースの登録番号ＸＰ＿５８１２７７（配列番号４で示される）と有意なマッチング（ｐ＜０．０５）を示したことから、２３ｋＤａのタンパク質を同定した。さらに２３ｋＤａのタンパク質のＮ末端の配列解析から、配列ＥＡＱＧＤＡＳＱＦＴが明らかになり、この配列は上記と同じデータベースのエントリーの残基１９〜２８とマッチングを示すことから、ＰＭＦのマッチングが裏付けられた。このタンパク質は、以降Ｂｏｓ ｄ２３ｋと称する。
【００５８】
Ｂｏｓ ｄ２３ｋとＢｏｓ ｄ２との両方を用いて準備された実験室レベルのイムノＣＡＰ試験を用いて、１６ｋＤａのイヌの鱗屑タンパク質に結合するＩｇＥにおける相関を評価した。３７人のイヌアレルギー被検者からの血清を解析し、その結果を図９に示す。１６ｋＤａのイヌの鱗屑タンパク質とＢｏｓ ｄ２とはＩｇＥ結合において相関を示さなかったが（ｒ＝０．０１）、Ｂｏｓ ｄ２３ｋとは有意な相関が観察されたことから（ｒ＝０．８９）、イヌアレルゲンとＢｏｓ ｄ２３ｋとの交叉反応性および構造的な類似性を示唆している。
【００５９】
１６ｋＤａのイヌの鱗屑タンパク質のクローニングおよび配列解析
１６ｋＤａのイヌの鱗屑タンパク質とＢｏｓ ｄ２３ｋとの配列類似性がある可能性があることから、イヌタンパク質またはその遺伝子配列の同定を目的としたデータベース検索を行った。ウシタンパク質（ＸＰ＿５８１２７７）の配列を用いたイヌゲノムデータベースのＢＬＡＳＴＮ検索から、イヌゲノム配列の４３１４５４ｂｐのセグメントである承認番号ＡＡＥＸ０２０２５７５８のヌクレオチド位置３３８４４１〜３３８３０７の翻訳とのマッチングが得られた［１４］。興味深いことに、このゲノム領域の理論上の翻訳は、報告されたＣａｎ ｆ４のＮ末端配列のアミノ酸残基９〜１３の５個の残基の完全なマッチングを含んでいた［９］。さらに上流（３３９００６〜３３８９２６）の、マッチングを示すＣａｎ ｆ４配列のアミノ酸残基１〜８、加えて推定上のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列も見出された。
【００６０】
Ｃａｎ ｆ４をコードすると考えられる同定されたＡＡＥＸ０２０２５７５８のセグメントに対応するｃＤＮＡをクローニングする目的で、３’ＲＡＣＥ実験を行った。第一の推定のシグナルペプチド部分、および、予想された切断部位に続くストレッチをコードするゲノム配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを、テンプレートとしてイヌの舌のポリＡのＲＮＡから製造された第一鎖ｃＤＮＡと共に用いた。別個の増幅産物を得て、これをクローニングし、解析し、その後タンパク質発現実験に用いた。
【００６１】
図４に、クローニングしたｃＤＮＡの完全なＤＮＡ配列とアミノ酸翻訳を示す。１７４個のアミノ酸残基をコードするオープンリーディングフレームを同定し、そのうち最初の１６個の残基が、シグナルＰによってシグナルペプチドを形成するものと推定された。クローニングされたｃＤＮＡから推測された成熟タンパク質は１５８個のアミノ酸残基からなり、そのなかに２個のシステインを含み、その推定の分子量は１７．６ｋＤａであり、等電点は６．５３であった。配列多様性の存在を評価するために、７個の独立した３’ＲＡＣＥクローンを単離し、配列解析した。これらのクローン間でわずかなヌクレオチド置換が見出されたが（示さず）、タンパク質のアミノ酸配列に変化を引き起こすものはなかった。解析された全てのクローンにおいて、オープンリーディングフレームを停止させる停止コドンの後に、ポリＡ領域の前に翻訳されていない２１３個のヌクレオチドセグメントが存在した。
【００６２】
残基１６と残基１７との間の推定のシグナルペプチド切断部位のために、第１７位におけるグルタミン残基が成熟タンパク質において第一の残基になると予想される。我々が無傷のタンパク質からリーディング配列を得られなかったこととも一致するが、Ｎ末端のグルタミン残基が、エドマン分解によるＮ末端の配列解析を妨害することがわかっているピログルタミン酸の環化を受けている可能性がある［１５］。さらに天然型のタンパク質に関するＰＭＦの結果を再検証したところ、ピログルタミン酸の環化によって改変された推定の一次翻訳産物の残基１７〜３２に関して推定されたフラグメントと正確に対応する１７５９．９８Ｄａの質量を有するトリプシンフラグメントが同定された。加えて、トリプシンフラグメントにマッチングするアミノ酸残基３３〜５１、５６〜６３、６６〜７３および９５〜１０４を同定した。
【００６３】
クローニングされたｃＤＮＡによってコードされたアミノ酸配列はさらに、精製された天然の１６ｋＤａのタンパク質から得られた４種全てのトリプシンペプチド配列を含み（図３）、これはペプチド２〜４と正確に一致し、ペプチド１における２種の保存的アミノ酸置換を含んでいた。合計すると、ＰＭＦで同定されたタンパク質フラグメントとペプチド配列解析から、推測のＣａｎ ｆ４のアミノ酸配列の５８％もの範囲が示された（表１）。総合すると、これらの結果から、精製された１６ｋＤａのアレルゲンとクローニングされたｃＤＮＡによってコードされたタンパク質とはいずれも、イヌアレルゲンのＣａｎ ｆ４を示すという強い証拠が得られた。
【００６４】
承認番号ＡＡＥＸ０２０２５７５８のゲノム配列を用いてクローニングされたｃＤＮＡ配列を並べることによって、合計５９１６ｂｐにわたるＣａｎ ｆ４遺伝子のコード領域の一部が見出され、および、６個のエキソンを含んでいた：３３９００６〜３３８９２９（エキソン１）、３３８４４７〜３３８３０７（エキソン２）、３３５１５０〜３３５０８２（エキソン３）、３３４５８１〜３３４４６８（エキソン４）、３３３６０９〜３３３５１１（エキソン５）、および、３３３１１４〜３３３０９１（エキソン６）。エキソン３とエキソン４の間の正確なスプライスポイントは、配列からは明確に推測できず、その代わりにこれらのエキソンの境界は、それぞれ３３５１５０〜３３５０７９および３３４５７８〜３３４４６８である可能性がある。
【００６５】
Ｃａｎ ｆ４のｃＤＮＡおよび遺伝子セグメントから推測されたアミノ酸配列は、それぞれ第５位で異なっていた。成熟Ｃａｎ ｆ４配列の第２０位において、ｃＤＮＡ翻訳中のイソロイシン残基は遺伝子から誘導された配列中においてバリン残基に相当し、第３０位においてアスパラギン酸残基はグルタミン酸残基に相当し、第３８位においてメチオニン残基はロイシン残基に相当し、第５１位においてセリン残基はロイシン残基に相当し、第８１位においてチロシン残基は、エキソン３とエキソン４との間の正確なスプライスポイントに応じてアスパラギン酸またはシステイン残基のいずれかに相当する。
【００６６】
上述のＣａｎ ｆ４遺伝子配列に加えて、データベースのエントリーＡＡＥＸ０２０２５７５８は２種のその他のＣａｎ ｆ４関連セグメントを含むことが見出され、これは、トリプシンペプチド４配列を用いたイヌゲノムのＴＢＬＡＳＴＮ検索で３つのマッチングが得られたことの説明になる。この３種のＣａｎ ｆ４関連セグメントを互いに５．４および６．７ｋｂの距離でタンデム状に配置し、上述したものの１つは最も遠くの下流に配置した。中央に配置されたＣａｎ ｆ４関連セグメントは、上述のＣａｎ ｆ４遺伝子のものと類似したエキソン／イントロン構造を有し、その推測のアミノ酸配列は、Ｃａｎ ｆ４遺伝子と比較して２４個の位置で異なっており、Ｃａｎ ｆ４のｃＤＮＡと比較して２８個の位置で異なっていた。興味深いことに、このセグメントは、ｃＤＮＡでコードされたアミノ酸配列と２つの位置で異なるトリプシンペプチド１の配列と完全に一致した。最も遠くの上流に配置されたＣａｎ ｆ４関連セグメントにおいて、エキソン４に相当する配列は同定できなかった。
【００６７】
Ｃａｎ ｆ４はリポカリンスーパーファミリーに属しており、ウシの臭気物質結合タンパク質（ＸＰ＿５８１２７７）およびブタ［１６］（ＮＰ＿９９８９６１）の臭気物質結合タンパク質と３８〜３９％の配列同一性を示す。図１０に、Ｃａｎ ｆ４およびＢｏｓ ｄ２３ｋのアミノ酸配列アライメントを示す。注目すべきことは、類似したまたは同一な残基の散乱パターンとは別に、タンパク質のＣ末端部分、加えて両方のシステイン残基（Ｃａｎ ｆ４において第６２位および１５４位）は高度に保存されていることである。リポカリンに特徴的なその他の保存された要素［１７］としては、Ｎ末端付近にあるＧｘＷモチーフ（第１３位〜１５位）、グリシン残基（第１１８位）が挙げられる。リポカリンに典型的なその他のモチーフ［１７］のＹｘｘｘＹｘＧは、Ｂｏｓ ｄ２３ｋ中に存在するが（第７４位〜８０位）、Ｃａｎ ｆ４においては部分的にしか保存されていない。興味深いことに、同じタンパク質ファミリーに属しているにもかかわらず、Ｃａｎ ｆ４は、Ｃａｎ ｆ１およびＣａｎ ｆ２それぞれに対して２４％および２６％のアミノ酸配列同一性しか示さなかった。
【００６８】
組換えＣａｎ ｆ４の生産
シグナルペプチドを排除した組換えＣａｎ ｆ４を、Ｃ末端にヘキサヒスチジンタグを有するタンパク質としてＥ．ｃｏｌｌ中で発現させた。ＩＭＡＣおよびＡＩＥＣによって可溶性細胞分画から組換えタンパク質を精製した。組換えタンパク質の凝集状態を評価するために、調製物のサンプルを、天然の精製された天然型Ｃａｎ ｆ４と同時に分析用ＳＥＣで処理した。図５Ａで示されるように、クロマトグラムによれば、いずれのケースにおいても優勢な単一の対称的なピークがみられ、このピークは、およそ１６．５ｋＤａの分子量（用いられた較正物質で定義された）に相当する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図５，Ｂ）において、天然Ｃａｎ ｆ４および組換えＣａｎ ｆ４はいずれも、還元すると移動率のシフトを示したことから、タンパク質中に存在する２つのシステイン残基がジスルフィド架橋に関わっていることが示唆される。注目すべきことに、最初の免疫ブロット解析（図１）で示されたＣａｎ ｆ４の見かけの分子量は、解析に用いられたイヌの鱗屑抽出物は還元されていない形態で分離ゲルに適用されたことによる影響を受けて、その後に行われた精製タンパク質の還元サンプルの解析によって示されたタンパク質のサイズよりも小さい値と評価された。天然タンパク質と比較してｒＣａｎ ｆ４によって示されたサイズの増加量は、組換えタンパク質におけるＣ末端のヘキサヒスチジンタグの付加分と一致し、開始因子のメチオニン残基はほぼ完全に保持されていた。
【００６９】
イヌアレルギー被検者におけるｒＣａｎ ｆ４に結合する特異的ＩｇＥ抗体の解析
組換えＣａｎ ｆ４の免疫学的な活性をイヌの鱗屑から精製された天然タンパク質と比較して評価した。各タンパク質をイムノＣＡＰＴＭ固相に固定し、３７人のイヌアレルギー被検者からの血清サンプルを用いてそれらのＩｇＥ抗体結合を試験した（図５、Ｃ）。２つのデータセットは極めて強い相関を示したことから（ｒ＝０．９９）、組換えアレルゲンは、ＩｇＥ抗体結合決定基に関してその天然のカウンターパートと非常によく類似していることが実証された。
【００７０】
図６において、その他のイヌの鱗屑のアレルゲンと比較したＩｇＥ抗体のＣａｎ ｆ４に対する反応性の頻度および規模を説明する。表２に、イヌアレルギー被検者およびそれらの感作パターンに関するより総合的なデータセットを示した。解析された３７人の血清のなかでも、１３人（３５％）が、Ｃａｎ ｆ４に結合するＩｇＥ抗体を提示した。この１３人のＣａｎ ｆ４反応性血清のうち１つが、試験されたその他のイヌアレルゲンのどれとも結合しないＩｇＥを示した。Ｃａｎ ｆ４とＣａｎ ｆ１またはＣａｎ ｆ２とのＩｇＥ結合において相関は観察できず、これは、それらの高度に変化した一次構造と一致する。Ｃａｎ ｆ４の実験室レベルのイムノＣＡＰ試験の分析特異性は、３０００ｋＵ／Ｌ以下の骨髄腫ＩｇＥでスパイクされたネガティブコントロールの血清を試験して得られた低い結果によって実証された（表３）。
【００７１】
イヌに対するアレルギーを有さないアトピーの個体におけるＣａｎ ｆ４の特異的ＩｇＥ抗体の出現を試験するために、イヌアレルギーの症状が診断または報告されていない４４人の花粉アレルギー被検者の血清を、入手可能な全てのイヌアレルゲン成分と各種の花粉抽出物とで試験した（表４）。これらの血清のうち７人（１６％）がイヌの鱗屑抽出物に対して陽性応答を示し（ただし２ｋＵＡ／Ｌまたはそれ未満のレベルのものは例外とした）、そのうちの１人はｒＣａｎ ｆ４に結合するＩｇＥ抗体も示した。イヌの鱗屑に対して陰性の血清はｒＣａｎ ｆ４に対する陽性応答を示さなかった。
【００７２】
ｒＣａｎ ｆ４とＢｏｓ ｄ２３ｋとの交叉反応性
ＩｇＥ抗体結合におけるそれらの相関によって示されるＣａｎ ｆ４とＢｏｓ ｄ２３ｋとの交叉反応性の程度を研究するために、３種の血清のウシタンパク質に対する反応性を用いてＩｇＥ阻害実験を行った。精製ウシタンパク質をイムノＣＡＰ固相に付着させ、ｒＣａｎ ｆ４または緩衝液のいずれかと共にプレインキュベートした血清からのＩｇＥ結合を測定した。図７で観察できるように、ｒＣａｎ ｆ４はほぼ完全に（≧９６％）３種全ての血清においてウシ鱗屑タンパク質に対するＩｇＥ結合を阻害しており、これにより、この実験に用いられた血清によって認識されたウシタンパク質に結合するＩｇＥの全ての決定基は、ｒＣａｎ ｆ４に共通であることが実証された。
【００７３】
考察
本願で説明したように、我々は、Ｃａｎ ｆ４と同定されたイヌの鱗屑由来のＩｇＥ結合タンパク質を単離し、クローニングし、特徴付けた。この作業の前は、このアレルゲンのＮ末端配列のうち１３残基しかしながら知られていなかった。Ｃａｎ ｆ４は、多様なリポカリンスーパーファミリーに属し、例えばウシおよびブタなどその他の種の臭気物質結合タンパク質との類似性を示すことが見出された。Ｃａｎ ｆ４は、ウシ鱗屑から精製された２３ｋＤａの臭気物質結合タンパク質と交叉反応することが見出された。
【００７４】
天然Ｃａｎ ｆ４を精製したが、鱗屑抽出物中のタンパク質不足とクロマトグラフィーの分解能の低さの両方のために極めてわずかな収量しか得られなかった。ＲＰＣにおける数々のピーク中のＣａｎ ｆ４の存在、および、ＣＩＥＣ工程における広範なＣａｎ ｆ４ピークにより、ある程度のタンパク質の不均質性が示された。この挙動に対してタンパク質修飾、部分的な分解およびアイソフォームの存在などのいくつかの解釈が可能であるが、Ｃａｎ ｆ４配列にはＮ−グリカン結合が起こり得る部位が含まれないため、Ｎ結合型の糖付加は可能性が低い。得られた４つのトリプシンペプチド配列のなかで、ｃＤＮＡクローンおよび同定されたゲノムセグメントから推測されたアミノ酸配列と比較したところ２つの位置で変化を示すものがあった。従って、７種の独立したｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列解析において配列が変化していた証拠が得られなかったとしても、アイソフォームのバリエーションが天然タンパク質の精製において観察された不均質性の一因である可能性がある。加えて、トリプシンフラグメントの配列解析およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析とから、ｃＤＮＡクローンから推測された５８％のアミノ酸配列が共に確認され、これから限定的な多型が存在することが示唆される。同定された追加のＣａｎ ｆ４関連のゲノムセグメントの少なくとも１つが発現されて、Ｃａｎ ｆ４の変異型が生じる可能性を除外できないとしても、我々が唯一指摘したいことは、トリプシンフラグメント１の２つのアミノ酸残基のマッチングがｃＤＮＡによってコードされた配列とは異なることである。本願においてヌクレオチド位置が列挙されたＣａｎ ｆ４遺伝子から誘導されたその他のＣａｎ ｆ４関連セグメントおよび全てのｃＤＮＡクローンに選択的にマッチングを示すその他のペプチド配列はまったく存在しなかった。
【００７５】
可能性のあるアイソフォームのバリエーションに関係なく、生産されたＣａｎ ｆ４の組換え型は、精製された天然タンパク質と生化学的および免疫学的に優れた一致を示した。これら２種のタンパク質は、分析用ＳＥＣで正確に同じ体積で溶出し、それらのＩｇＥ抗体の結合から極めて高い相関が示された。最も重要なことに、天然アレルゲンには結合するが組換えアレルゲンには結合しないＩｇＥのケースは観察されなかった。実際には、組換えタンパク質を用いた実験室レベルの試験でいくらか高いＩｇＥ結合が観察されたが、これは、精製の収量が悪かった影響で、天然タンパク質の最適なカップリング濃度よりも低いことに起因する可能性が最も高い。
【００７６】
３７人のイヌアレルギー被検者からの血清を試験するイムノＣＡＰによって、イヌの鱗屑のアレルゲンとしてのＣａｎ ｆ４の重要性を評価した。同じ個体群を用いた近年の研究で、我々は、４９％がＣａｎ ｆ１に結合するＩｇＥ抗体を提示し、２２％がＣａｎ ｆ２に結合するＩｇＥ抗体を提示し、１６％がＣａｎ ｆ３に結合するＩｇＥ抗体を提示し、７０％がＣａｎ ｆ５に結合するＩｇＥ抗体を提示したことをを報告した。この研究において、我々は、３７人の被検者のうち１３人（３５％）がＣａｎ ｆ４に感作されたことを見出した。従って、Ｃａｎ ｆ４は、この研究の個体群におけるにおいて主要ではないアレルゲンのようであるｒＣａｎ ｆ２およびｎＣａｎ ｆ３のどちらよりも一般的に認識された。１３人のＣａｎ ｆ４反応性血清のうち、１人は、試験されたその他のイヌアレルゲンのどれとも結合しないＩｇＥを示し、これは、Ｃａｎ ｆ４は、イヌアレルギーにおける独立した感作物質として、および、成分分解診断法における重要な添加物として適切であり得ることを示唆している。この観念は、Ｃａｎ ｆ１およびＣａｎ ｆ２と比較しても、配列およびＩｇＥ結合の両方においてＣａｎ ｆ４は独特であることからも立証される。イヌアレルギーを有さない花粉アレルギーのコントロール４４人のうち、Ｃａｎ ｆ４に多する弱いＩｇＥ抗体反応を示したのはたった１人であったことから、このアレルゲンのＩｇＥ認識は、その他の空気アレルゲン感作によってそれほど頻繁に起こらないことが示唆される。
【００７７】
イヌの鱗屑抽出物と比較して、ウシ鱗屑抽出物はより多くのアレルゲンを含むようであることから、より十分な精製結果が得られた。ウシ鱗屑抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析から判断すると、１０〜４０ｋＤａの範囲における優勢なタンパク質は、Ｂｏｓ ｄ２および本明細書で報告した２３ｋＤａのタンパク質（Ｂｏｓ ｄ２３ｋ）であり、これらは見たところ類似の量で存在するようである。Ｂｏｓ ｄ２は、ウシ鱗屑中の主要なアレルゲンとして十分に確立されており、これらは組換えアレルゲンとして生産され、構造的に特徴付けられている［１８〜２２］。それに対して、Ｂｏｓ ｄ２３ｋに関してわかっていることはかなり少ないが、これは、これまでに報告された、ウシ鱗屑抽出物の免疫ブロット解析によって解明されたＩｇＥに結合する２２ｋＤａのタンパク質バンドと同一である可能性がある［２１〜２３］。
【００７８】
Ｂｏｓ ｄ２３ｋの１５４残基のアミノ酸配列から１７．８ｋＤａの分子量が推測されたが、これはＣａｎ ｆ４の分子量とほぼまったく同じであった。この事実にもかかわらず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、Ｃａｎ ｆ４よりもかなり遅い移動率を示した。この２種のタンパク質は配列が関連しており、類似のフォールディングを有すると考えられることから、観察された電気泳動の違いは、糖付加における差によるものと説明が可能と思われる。実際に、配列を調査することによって、Ｂｏｓ ｄ２３ｋは、成熟タンパク質のアスパラギン残基４５において可能性のあるＮ−糖付加部位を含むが、それに対してＣａｎ ｆ４の配列には存在しないことが明らかになる。
【００７９】
既知のイヌおよびウシ鱗屑のアレルゲンのなかでも、その他の種のアレルゲンに対する交叉反応性がよく観察されたものの一つは血清アルブミン（それぞれＣａｎ ｆ３およびＢｏｓ ｄ６）であった。従って、Ｃａｎ ｆ４とＢｏｓ ｄ２３ｋとの交叉反応性は、イヌ鱗屑のアレルゲンとウシ鱗屑のアレルゲンとの新規の免疫学的な関連を示すものである。少々意外なことであるが、それらの比較的低レベルの配列全体の同一性（３７％）を考慮すると、これら２種のタンパク質間で大規模な交叉反応性があるようである。しかしながら、観察された交叉反応性は、全体のスコアよりも高い配列類似性を有するタンパク質の部分に起因する可能性もある。特に、これら２種のタンパク質のＣ末端の一部は、有意に保存されており、第１３６／１３３位と、第１５５／１５２位との間の２０残基のセグメントが７５％の同一性を示す。これら２種のタンパク質の間に明らかな交叉反応性があったにもかかわらず、試験された全ての血清に関してＣａｎ ｆ４に対するＩｇＥ応答はＢｏｓ ｄ２３ｋよりも高く、これは、我々の研究個体群においてＢｏｓ ｄ２３ｋではなくＣａｎ ｆ４が一次感作物質であったことを暗に示している。
【００８０】
すなわち本願は、イヌアレルゲンのＣａｎ ｆ４のクローニングおよび特徴付けを報告する。組換えＣａｎ ｆ４は、イヌアレルギーにおける成分分解診断法において重要であると予想され、さらに組換えＣａｎ ｆ４と極めて豊富なウシ鱗屑タンパク質との交叉反応性は、イヌ鱗屑に対するアレルギーとウシ鱗屑に対するアレルギーとが関連する可能性を示す。
【００８１】
【表１】
0005793138.tif 000002
【００８２】
【表２】
0005793138.tif 000003
【００８３】
【表３】
0005793138.tif 000004
【００８４】
【表４】
0005793138.tif 000005
【００８５】
【表５】
0005793138.tif 000006
【００８６】
参考文献
【００８７】
【表６】
0005793138.tif 000007
【００８８】
【表７】
0005793138.tif 000008
【００８９】
【表８】
0005793138.tif 000009
【図４】
0005793138.tif 000010
【図５Ｂ】
0005793138.tif 000011
【図６】
0005793138.tif 000012
【図８Ｂ】
0005793138.tif 000013
【図１０】
0005793138.tif 000014
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
0005793138.tif 000020
【図５Ａ】
0005793138.tif 000021
【図５Ｃ】
0005793138.tif 000022
【図７】
0005793138.tif 000023
【図８Ａ】
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【図９】
0005793138.tif 000025
【配列表】
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