(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
膀胱癌を罹患していると推定される患者において膀胱癌の検出を補助する方法であって、
オーロラキナーゼＡ遺伝子の少なくとも一部分を認識する標識ＤＮＡプローブを、該患者の尿から単離された膀胱細胞とハイブリダイズさせ、該標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズした膀胱細胞のサンプルを得る工程、並びに
該サンプル中の膀胱細胞の数、該サンプル中の各膀胱細胞内の該オーロラキナーゼＡ遺伝子のコピー数及び少なくとも第１の閾コピー数の該オーロラキナーゼＡ遺伝子を有する該サンプル中の膀胱細胞の数を計数する工程であって、第１の閾割合以上の膀胱細胞が少なくとも該第１の閾コピー数の該オーロラキナーゼＡ遺伝子を有する場合、該患者が膀胱癌に罹患していると推定され、該オーロラキナーゼＡ遺伝子の該第１の閾コピー数が３であり、該第１の閾割合が１５％である、工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記サンプル中の少なくとも第２の閾コピー数の前記オーロラキナーゼＡ遺伝子を有する膀胱細胞の数がさらに計数され得る請求項１に記載の方法であって、ここで該第２の閾コピー数が、前記第１の閾コピー数よりも大きい、方法。
【請求項３】
前記オーロラキナーゼＡ遺伝子の前記第２の閾コピー数が５である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第２の閾割合以上の膀胱細胞が少なくとも前記第１の閾コピー数の前記オーロラキナーゼＡ遺伝子を有し、該第２の閾割合は前記第１の閾割合よりも大きいとする場合、前記患者が侵襲性の強い膀胱癌に罹患していると推定される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の閾割合が２０％である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記標識ＤＮＡプローブが、２０番染色体の領域２０ｑ１３にあるオーロラキナーゼＡ遺伝子のコピー数を検出するための、二つの蛍光体を含むプローブを含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記オーロラキナーゼＡ遺伝子が配列番号１及び配列番号２からなる群から選ばれるＤＮＡ配列を含む請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、国立癌研究所により授与された補助金第Ｕ０１ＣＡ８５０７８号のもとに米国政府の支援でなされた。米国政府は、本発明における特定の権利を有する。
【０００２】
本発明は全般的には、癌検出の分野に関する。特に、本発明は膀胱癌の検出に関する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
一実施態様において、本発明は、患者における膀胱癌を検出する方法であって、患者の尿から膀胱細胞を単離し、この膀胱細胞を標識したＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ、このプローブはオーロラキナーゼＡ遺伝子の少なくとも一部分を認識するものとし、この標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズした膀胱細胞のサンプルを得、このサンプル中の膀胱細胞の数、このサンプル中の各膀胱細胞内のオーロラキナーゼＡ遺伝子のコピー数及び少なくとも第１の閾コピー数のオーロラキナーゼＡ遺伝子を有するサンプル中の膀胱細胞の数を計数することを含む方法に関する。
【０００４】
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
患者において膀胱癌を検出する方法であって、
該患者の尿から膀胱細胞を単離し、
該膀胱細胞を標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ、ここで該プローブはオーロラキナーゼＡ遺伝子の少なくとも一部分を認識するものとし、該標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズした膀胱細胞のサンプルを得、
該サンプル中の膀胱細胞の数、該サンプル中の各膀胱細胞内の該オーロラキナーゼＡ遺伝子のコピー数及び少なくとも第１の閾コピー数の該オーロラキナーゼＡ遺伝子を有する該サンプル中の膀胱細胞の数を計数する
ことを含む方法。
（項目２）
前記オーロラキナーゼＡ遺伝子の前記第１の閾コピー数が３である項目１に記載の方法。
（項目３）
計数が、少なくとも第２の閾コピー数の該オーロラキナーゼＡ遺伝子を有する膀胱細胞の数を計数することをさらに含む項目１に記載の方法であって、ここで該第２の閾コピー数が、前記第１の閾コピー数よりも大きい、方法。
（項目４）
前記オーロラキナーゼＡ遺伝子の前記第２の閾コピー数が５である項目３に記載の方法。
（項目５）
第１の閾割合以上の膀胱細胞が少なくとも前記第１の閾コピー数の前記オーロラキナーゼＡ遺伝子を有する場合、前記患者が膀胱癌に罹患していると推定することをさらに含む項目１に記載の方法。
（項目６）
前記第１の閾割合が１５％である項目５に記載の方法。
（項目７）
第２の閾割合以上の膀胱細胞が少なくとも前記第１の閾コピー数の前記オーロラキナーゼＡ遺伝子を有し、該第２の閾割合は前記第１の閾割合よりも大きいとする場合、該患者が侵襲性の強い膀胱癌に罹患していると推定することをさらに含む項目５に記載の方法。
（項目８）
前記第１の閾割合が１５％であり、前記第２の閾割合が２０％である項目７に記載の方法。
（項目９）
前記標識ＤＮＡプローブがＡＵＲＫＡ  ２０ｑ１３を含む項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記オーロラキナーゼＡ遺伝子が配列番号１及び配列番号２からなる群から選ばれるＤＮＡ配列を含む項目１に記載の方法。
以下の図面は本明細書の一部を構成し、さらに本発明の特定の態様を明示するために含まれている。本発明は、本明細書に提示した特定の実施態様の詳細な説明と併せてこれらの図面の１つ以上を参照することによってさらに理解を深めることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】移行上皮癌（ＴＣＣ：ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）におけるオーロラキナーゼＡの発現及びそのＤＮＡ倍数性との関係を示す図である。図１Ａは、隣接尿路上皮とＴＣＣの対応の対になったサンプル中の、定量ＲＴ−ＰＣＲにより明らかになったオーロラキナーゼＡのレベルを示す。図１Ｂは、近二倍体（２ｃ）ＤＮＡ含量を示す腫瘍核の画像解析により得られたＤＮＡヒストグラムを示す。図１Ｃは、顕著な異数性（６ｃ）を示す腫瘍核の画像解析により得られたＤＮＡヒストグラムを示す。図１Ｄは、低グレード（グレード１乃至２）表在性（Ｔａ乃至Ｔ１ａ）及び高グレード（グレード３）侵襲性（Ｔ１ｂ以上）ＴＣＣ並びに近二倍体及び異数性ＴＣＣにおけるオーロラキナーゼＡの平均発現レベルを示す。
【図２】図２は、膀胱癌細胞株におけるオーロラキナーゼＡの発現およびコピー数を示す図である。図２Ａは、膀胱癌細胞株におけるオーロラキナーゼＡの発現を、定量ＲＴ−ＰＣＲにより培養尿路上皮細胞（ＮＵ２０４）と比較したものである。図２Ｂは、３、７及び１７番染色体のセントロメアプローブを用いた定量的ＦＩＳＨにより明らかになった染色体コピー数を示す。図２Ｃは、３群の膀胱癌細胞株におけるオーロラキナーゼＡの平均発現レベルを示す。図２Ｄは、図２Ｃに示した３群の膀胱癌細胞株において３、７及び１７番染色体のセントロメアプローブを用いたＦＩＳＨにより明らかになった膀胱癌細胞株の平均染色体コピー数を示す。
【図３】抗ＧＦＰ抗体を用いた、野生型オーロラキナーゼＡ挿入断片を含むアデノウイルスベクターで形質移入したＳＶ４０尿路上皮細胞におけるオーロラキナーゼＡ−ＧＦＰ融合蛋白質の異所性発現を示す図である。図３Ａは、オーロラキナーゼＡ−ＧＦＰ融合蛋白質の発現を示すウエスタンブロット分析（上段パネル）。ＤＡＰＩを核対比染色としてオーロラキナーゼＡ−ＧＦＰ融合蛋白質の異所性発現を示す免疫蛍光分析（下段パネル）。オーロラキナーゼＡ挿入物を含まないアデノウイルスベクターを感染させた細胞の免疫蛍光画像（ａ、ｂ）。赤色フィルターを用いて得られた画像では２つの中心体が認められる（ａ）。緑色フィルターを用いて得られた画像ではオーロラキナーゼＡ−ＧＦＰ融合蛋白質の異所性発現は認められない（ｂ）。オーロラキナーゼＡ挿入物を含むアデノウイルスベクターを感染させた細胞の免疫蛍光画像（ｃ、ｄ）。赤色フィルターを用いて得られた画像は、抗ｙチューブリン抗体（ｙ  ｔｕｂｕｌｉｎ）（赤色）で明らかになった中心体の倍化を示す（ｃ）。緑色フィルターを用いて得られた画像は、中心体における異所性に発現されたオーロラキナーゼＡ−ＧＦＰ蛋白質の発現を示す（ｄ）。図３Ｂは、異所性に発現されたオーロラキナーゼＡによって誘導された中心体及び染色体コピー数の定量的評価を示す。図３Ｃは、ＰＩ対比染色で明らかにされたＤＮＡ含量（赤色蛍光）に対する異所性発現オーロラキナーゼＡ−ＧＦＰ蛋白質（緑色蛍光）の二重蛍光ＦＡＣＳ分析の結果を示す。野生型オーロラキナーゼＡ挿入物を含有するアデノウイルスベクター感染後の二重蛍光散布図（右パネル）。空のアデノウイルスベクターを感染させた細胞の対照散布図（右パネル）。Ａ及びＢで表した散布図プロット範囲（ｓｃａｔｔｅｒｇｒａｍ  ｐｌｏｔ  ａｒｅａ）において対照（左パネル）に比し、異数性細胞（右パネル）が増加していることに注目されたい。図３Ｄは、図３Ｃに示した二重蛍光ＦＡＣＳ分析により明らかになった異数性細胞と軟寒天上のコロニー形成との定量的評価を示す。Ａｄ／対照：オーロラキナーゼＡ挿入断片を含有しないアデノウイルスベクターを感染させた細胞。Ａｄ／オーロラキナーゼＡ  ＧＦＰ：野生型オーロラキナーゼＡ含有アデノウイルスベクターを感染させた細胞。ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）：感染の多重度。
【図４】図４は、オーロラキナーゼＡ  ＦＩＳＨプローブによる排泄尿中の癌細胞の検出を示す図である。図４Ａは、オーロラキナーゼＡ遺伝子コピー数（赤色）及び染色体短腕特異的プローブ（緑色）を示す二重蛍光ＦＩＳＨである。正常尿路上皮細胞におけるオーロラキナーゼＡの二倍体コピー数（ａ）。低グレード（グレード１乃至２）ＴＣＣにおける低レベルのオーロラキナーゼＡ遺伝子増幅（３コピー）（ｂ）。高グレード（グレード３）侵襲性ＴＣＣにおける高レベルのオーロラキナーゼＡ遺伝子増幅（４コピー超）（ｃ）。オーロラキナーゼＡの多数のコピー及び染色体２０ｐプローブを含有する高グレード（グレード３）侵襲性ＴＣＣにおける２０番染色体の多染色体性（ｄ）。図４Ｂは、膀胱のＴＣＣを有する２３名の患者からの排泄尿標本におけるオーロラキナーゼＡ遺伝子コピー数の定量的ＦＩＳＨ分析（トレーニングセット）。個々の患者におけるオーロラキナーゼＡの低（３乃至４コピー）及び高（４コピー超）増幅レベルを示す細胞の割合を示す。図４Ｃは、膀胱癌患者からの２３検体の尿サンプル及び７名の健康な非罹患対照からの７検体の尿サンプルからなるトレーニングセットにおけるオーロラキナーゼＡ  ＦＩＳＨ試験についてのＲＯＣ曲線（ｎ＝３０）を示す。図４Ｄは、膀胱癌患者からの５１検体の尿サンプル及び健康な非罹患対照からの３０検体の尿サンプルからなるテストセットにおけるオーロラキナーゼＡ  ＦＩＳＨ試験についてのＲＯＣ曲線（ｎ＝８１）を示す。図４Ｅは、組織学的グレードによるオーロラキナーゼＡスコアを示す。
【図５】膀胱のＴＣＣを有する７４名の患者及び３７名の健康な対照からの排泄尿サンプルにおけるオーロラキナーゼＡ遺伝子コピー数の定量的ＦＩＳＨ分析の結果を示す図である（トレーニングセット及びテストセットの組合せ）。個々の患者におけるオーロラキナーゼＡの低（３乃至４コピー）及び高（４コピー超）増幅レベルを示す細胞の割合を示す。
【図６】ＡＵＲＫＡ  ２０ｑ１３プローブのマップを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
異数性の形で染色体不安定性を示す悪性細胞は過剰な中心体及び多極紡錘体を示すことが多く、このことから有糸分裂時の染色体の分離を制御する細胞小器官の異常が異数性の発生に関与していることが示唆される１−３。
【０００７】
オーロラキナーゼＡは、ＳＴＫ１５又はＢＴＡＫとしても知られ;Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａオーロラ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅ  ＩＰＬ１キナーゼを含むセリンスレオニンキナーゼファミリーのメンバーである４−６。これらのキナーゼは、ヒト細胞において中心体の分離及び成熟の調節を含む正常な染色体の分離並びに中心体の機能の重要な調節因子とみなされている７。さらに、染色体２０ｑ１３に位置するオーロラキナーゼＡ遺伝子の過剰発現は、哺乳動物細胞及び尿路上皮癌を含む数種のヒト腫瘍において腫瘍化及び腫瘍進行を促進する異数性及び染色体不安定性と関連づけられることが分かっている４、８。
【０００８】
興味深いことに、インビトロで形質転換されるように誘導されたヒトの初代尿路上皮細胞は染色体２０ｑ１３．２の増幅を示し、このことからこの染色体上の遺伝子（群）の過剰発現が膀胱癌の発症に重要な役割を果たしているらしいことが示唆される９。こうした観察は、染色体２０ｑ１３上のオーロラキナーゼＡをコードしている遺伝子がマウス及びヒトにおいて腫瘍感受性遺伝子座としても同定されており１０、また、オーロラキナーゼＡがｐ５３腫瘍抑制遺伝子の機能的不活化を誘導する５という事実と相俟って、オーロラキナーゼＡの発現増大がヒト尿路上皮細胞の染色体不安定性及び形質転換の重要な遺伝的決定要因であるらしいことを示唆している。
【０００９】
一実施態様において、本発明は、患者において膀胱癌を検出する方法であって、患者の尿から膀胱細胞を単離し、この膀胱細胞を標識したＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ、このプローブはオーロラキナーゼＡ遺伝子の少なくとも一部分を認識するものとし、この標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズした膀胱細胞のサンプルを得、このサンプル中の膀胱細胞の数、このサンプル中の各膀胱細胞内のオーロラキナーゼＡ遺伝子のコピー数及び少なくとも第１の閾コピー数のオーロラキナーゼＡ遺伝子を有するサンプル中の膀胱細胞の数を計数することを含む方法に関する。
【００１０】
上記患者の尿からの膀胱細胞（通常、尿路上皮細胞）の単離は、当該分野の任意の公知技術によって実施することができる。一実施態様において、膀胱細胞の単離は、患者から排泄尿標本（約１００乃至２００ｍｌ）を採取し、この尿から膀胱細胞をペレット化するのに十分な回転速度及び時間により遠心分離し、貯蔵又は使用のための適切な溶液にこのペレット化膀胱細胞を再懸濁することによって実施することができる。一実施態様において、遠心分離の時間及び回転速度は約１，０００ｒｐｍで約１５分である。一実施態様において、上記のペレット化した膀胱細胞は、１０％のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含有するＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ／Ｖｏｇｔ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）２ｍｌに再懸濁し、この方法の後の工程で使用するに先だって、この再懸濁膀胱細胞を解凍する時が来るまで−７０℃で貯蔵する。
【００１１】
解凍後、ハイブリダイゼーションに先だって、膀胱細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）又は他の膀胱細胞の洗浄に適した緩衝液中で一回以上、例えば３回洗浄した後、遠心分離して洗浄膀胱細胞をペレット化することができる。このペレット化した洗浄膀胱細胞は、メタノール／酢酸（３：１）中で固定化し、２×ＳＳＣ／０．５％  ＮＰ−４０中、ｐＨ７、３７℃で３０分間前処理した後、エタノール中、９０℃で５分間脱水することができる。当業者には明らかなように、日常の実験のために、標識ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションのための膀胱細胞の調製に適した他のプロセシング技術を実施することができる。
【００１２】
膀胱細胞の標識ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションは当該分野で公知の任意の技術によって実施することができる。標識ＤＮＡプローブは、このプローブがオーロラキナーゼＡ遺伝子の少なくとも一部分を認識するものであれば、任意のＤＮＡ配列及び任意の検出可能部分を含むことができる。一実施態様において、この検出可能部分は蛍光体を含む。一実施態様において、この検出可能部分は放射性同位元素を含む。
【００１３】
Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓからのオーロラキナーゼＡのｃＤＮＡ配列は配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ００１２８０）で示され、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓからのオーロラキナーゼＡのゲノム配列は配列番号２で示される。これら２つの配列は３０１番目の位置が異なり、ｃＤＮＡ配列はゲノム配列にはない１６マーのアデノシンテールを含むが、その他の点ではこれらの配列は同じである。
【００１４】
「プローブがオーロラキナーゼＡ遺伝子の少なくとも一部を認識する」とは、このプローブがオーロラキナーゼＡ遺伝子のその部分の少なくとも一本のＤＮＡ鎖の配列に対して実質的に十分相補性（即ち、少なくとも約９５％相補性、少なくとも約９６％相補性、少なくとも約９７％相補性、少なくとも約９８％相補性、少なくとも約９９％相補性、少なくとも約９９．５％相補性又は少なくとも約９９．９％相補性といった少なくとも約９０％相補性）である配列を有するＤＮＡ分子を含むこと、さらには、このプローブのＤＮＡ分子が十分に長く、これが実質的にオーロラキナーゼＡ遺伝子とのみハイブリダイズし、この膀胱細胞の任意の他の遺伝子又は発現されないゲノムエレメントとは実質的にハイブリダイズしないような配列を有することを意味する。さらに、このプローブのＤＮＡ分子はオーロラキナーゼＡ遺伝子とハイブリダイズするのに長時間を要するほど長くはないことが望ましい。一実施態様において、この標識ＤＮＡプローブはＡＵＲＫＡ  ２０ｑ１３（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ／Ｑｂｉｏｇｅｎｅ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）を含む。ＡＵＲＫＡ  ２０ｑ１３特異的ＤＮＡプローブは、中期／中間期のスプレッド、血液塗抹標本及びパラフィン包埋組織切片において２０番染色体の領域２０ｑ１３にあるオーロラキナーゼＡ遺伝子のコピー数を最大限検出する。
【００１５】
プローブのＤＮＡ分子に結合させることができる任意の蛍光体を使用することができる。一実施態様において、この蛍光体はローダミン及びフルオレセインからなる群から選ばれる。一実施態様では、ＡＵＲＫＡ  ２０ｑ１３プローブはＲｈｏｄａｍｉｎｅ（赤）で直接標識され、第２０染色体α−サテライトプローブはＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（緑）で直接標識される。この二色オーロラキナーゼＡ  ＦＩＳＨプローブを用いることにより排泄尿沈渣の剥脱した細胞においてオーロラキナーゼＡ遺伝子のコピー数を検出することができる。
【００１６】
一実施態様において、このハイブリダイゼーション技術は、脱水した膀胱細胞を１０μｌのＡＵＲＫＡ  ２０ｑ１３プローブと共に３７℃で約１６時間（例えば、一夜）インキュベートするものであり得る。ハイブリダイズしていないプローブを除去するためには、細胞を、例えば、０．５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中５分間６５℃で洗浄することができる。細胞は、計数に先立ってＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）で対比染色して退色防止溶液中に封入することができる。
【００１７】
別の実施態様では、オーロラキナーゼＡ遺伝子に特異的ではない第２の標識ＤＮＡプローブを上記膀胱細胞にハイブリダイズさせることによって、当業者にとって重要であるかもしれない他のＤＮＡ領域の計数を可能にすることができる。
【００１８】
このハイブリダイズさせる工程によってその標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた膀胱細胞のサンプルが得られる。
【００１９】
サンプル中の膀胱細胞数、サンプル中の各膀胱細胞内のオーロラキナーゼＡ遺伝子のコピー数及び少なくとも第１の閾コピー数のオーロラキナーゼＡ遺伝子を有するサンプル中の膀胱細胞の数の計数は、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡検査法又は放射性同位元素検出法のうちの当業者に公知の任意の適切な方法によって行うことができる。フローサイトメータ又は蛍光活性化セルソータの使用については当該分野で周知である。検出可能部分が蛍光体である場合、蛍光シグナルは、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ  ＧｍｂＨ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）などの任意の適切な顕微鏡を用いて計数し、捕捉することができる。
【００２０】
計数によってサンプル中の膀胱細胞数、サンプル中の各膀胱細胞内のオーロラキナーゼＡ遺伝子のコピー数及び少なくとも第１の閾コピー数のオーロラキナーゼＡ遺伝子を有するサンプル中の膀胱細胞の数が得られる。第１の閾コピー数は、膀胱癌細胞に通常存在するオーロラキナーゼＡ遺伝子の最小コピー数に等しいように選択することができる。一実施態様において、このオーロラキナーゼＡ遺伝子の第１の閾コピー数は３である。
【００２１】
別の実施態様では、計数は、上記第１の閾コピー数よりも大きな、少なくとも第２の閾コピー数のオーロラキナーゼＡ遺伝子を有する膀胱細胞の数を計数することをさらに含む。この第２の閾コピー数は、侵襲性の強い膀胱癌の細胞に通常存在するオーロラキナーゼＡ遺伝子の最小コピー数に等しいように選択することができる。一実施態様では、このオーロラキナーゼＡ遺伝子の第２の閾コピー数は５である。
【００２２】
サンプル中の膀胱細胞の数及び少なくとも第１の閾コピー数のオーロラキナーゼＡ遺伝子を有するサンプル中の膀胱細胞の数を計数して、後者の数を膀胱細胞数で割り算することにより、少なくとも第１の閾コピー数のオーロラキナーゼＡ遺伝子を有する膀胱細胞の割合を算出することができる。
【００２３】
一実施態様において、この方法は、第１の閾割合以上の膀胱細胞が少なくとも第１の閾コピー数のオーロラキナーゼＡ遺伝子を有する場合、この患者が膀胱癌に罹患していると推定する工程をさらに含む。少なくとも第１の閾コピー数のオーロラキナーゼＡ遺伝子を有する膀胱細胞の割合の任意の値を第１の閾割合として用いることができる。一実施態様において、この第１の閾割合は１５％である。
【００２４】
別の実施態様では、この方法は、第２の閾割合以上の膀胱細胞が少なくとも第１の閾コピー数のオーロラキナーゼＡ遺伝子を有し、この第２の閾割合は第１の閾割合よりも大きいとする場合、この患者が侵襲性の強い膀胱癌に罹患していると推定する工程をさらに含む。「侵襲性の強い」膀胱癌とは、浸潤性腫瘍、非乳頭型腫瘍又は組織学的グレード３の腫瘍のうちの１種以上を呈することを特徴とする膀胱癌のことをいう。一実施態様において、この第１の閾割合は１５％であり、第２の閾割合は２０％である。
【００２５】
この方法を実施することによって、患者が膀胱癌に罹患しているかどうか、もしそうであれば侵襲性はどの程度強いのかを推定するのに有用な要素を医師が非侵襲的な手技により定量化することができる。こうした要素を定量化することによって、医師は、膀胱鏡検査、外科的アブレーション、膀胱へのＢＣＧ液の注入、他の化学療法剤分子の膀胱への注入、放射線治療又は膀胱切除などの他の診断的又は治療的方法を実施すべきか、あるいは実施を考慮すべきかについて決定することができる。化学療法又は放射線療法などで現在膀胱癌の治療を受けている患者に対して再発を念頭においてこの方法を実施することにより、その治療の有効性を把握することができる。以前に膀胱癌の治療を受けた患者に対して再発を念頭においてこの方法を実施することにより、再発が認められたとしたら、その程度を把握することができる。
【００２６】
本発明者らは、この方法は特異性が高く（下記の実施例では、ｎ＝８１で特異性は１．０であり、これは擬陽性率が０％であることを意味した）、感度も高い（下記の実施例では、感度は０．８６であり、これは擬陽性率が１４％であることを意味した）ことを見出している。本発明者らが知る限りでは、非侵襲的な膀胱癌スクリーニング方法で、少なくとも８０例のサンプルサイズで試験して特異性が０．８５超で感度が０．８５超、それどころか特異性が１．０、感度が少なくとも０．８６である方法を報告した研究者は他にいない。
【００２７】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を示すために記載されたものである。以下の実施例に開示した技術が、本発明の実施においてよく機能するものであると本発明者らにより見出されたものであり、従って、その実施のための好ましい方法を構成するものと考えることができることは、当業者には明らかである。しかしながら、本開示内容を踏まえて、開示されている特定の実施態様に多くの変更を加えることができ、それでもなお、それによって、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく類似又は同様の結果が得られることは、当業者であれば、理解されるはずである。
【実施例】
【００２８】
（実施例１）
要旨
背景：異数性をもたらす染色体誤分離は、新形成における共通した体細胞遺伝子変化であり、染色体の分離を調節する遺伝子は癌検出マーカとなる可能性があると考えられる。有糸分裂の重要な調節因子であるオーロラキナーゼＡの増幅／過剰発現が膀胱癌を含むヒトの癌において検出されることが多く、その増幅の程度は異数性の程度と相関する。
【００２９】
方法：本発明者らは、膀胱癌細胞中のオーロラキナーゼＡ発現のレベルを測定し、これが３つの特定の染色体のコピー数及び全核ＤＮＡ含量と関連があることを明らかにした。中心体の倍化及び染色体コピー数に対するオーロラキナーゼＡの影響をアデノウイルス発現構築物を用いてインビトロで測定した。この遺伝子の膀胱癌に対する生体指標としての利用可能性を評価するために、膀胱癌患者の排泄尿からの剥脱した細胞において蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を用いてオーロラキナーゼＡ遺伝子コピー数をも調べた。
【００３０】
知見：ヒトの尿路上皮細胞においてオーロラキナーゼＡが過剰発現すると、中心体の増幅、染色体誤分離及び異数性が誘導された。さらに、オーロラキナーゼＡ遺伝子の過剰発現は腫瘍発生の初期相に生じ、膀胱癌患者のインサイツの病変部及び排泄尿において検出することができた。膀胱癌患者からの排泄尿サンプル５１検体及び健康な非罹患対照３０検体からなる盲検化妥当性確認試験において実施したオーロラキナーゼＡ遺伝子コピー数についてのＦＩＳＨ試験によって特異性１．０及び感度０．８６で膀胱癌が検出された。
【００３１】
解釈：本発明者らの知見から、オーロラキナーゼＡの過剰発現は、尿路上皮細胞において異数性を生じさせることができ、膀胱癌の検出の有望な生体指標であることが分かる。
【００３２】
緒言
ヒト膀胱癌は、これが、侵襲性の強さと異数性の程度との間の強い相関を示す乳頭及び非乳頭経路を介してインサイツの新生物発生前の状態から発生するので、染色体の不安定性の機構を研究する理想的な系である１１。尿路上皮過形成に由来する最も低グレードで表在性の乳頭状腫瘍は近二倍体性である。こうした腫瘍は再発することが多いが、膀胱壁へ侵入して転移することはまずないであろう。これに対して、重症の異形性上皮内癌からの進行によって生じる事実上すべての高グレード非乳頭状腫瘍は顕著な異数性を示し、膀胱壁へ侵入して転移する性向が強い。
【００３３】
本研究では、インサイツの尿路上皮新形成から膀胱癌が発生する際のオーロラキナーゼＡの役割を評価した。ヒト膀胱腫瘍サンプル及び膀胱癌細胞株におけるオーロラキナーゼＡの増幅及び過剰発現のレベルを調べ、こうしたレベルが異数性の程度と関連があることを明らかにした。オーロラキナーゼＡ過剰発現の機能的意味についてはインビトロの形質移入研究によって確認した。最終的に、本発明者らは、オーロラキナーゼＡを尿における膀胱癌の非侵襲的検出の生体指標となる可能性があるものとみなした。
【００３４】
材料及び方法
腫瘍のサンプル及び細胞株：以前に報告された１２ようにして、ヒト膀胱切除標本２１検体から、膀胱及び隣接の尿路上皮の移行上皮癌（ＴＣＣ）の対応のあるサンプルからの細胞懸濁液を得た。簡単にいえば、腫瘍に隣接する粘膜表面を掻取り、細胞をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を含む円錐管に移した。凍結塊から腫瘍を切り取って非腫瘍細胞による汚染をできるだけ少なくして、同様に、ＰＢＳを含む円錐管に移した。組織断片を機械的に攪拌することによって腫瘍細胞をＰＢＳ溶液中に放出させた。これらのサンプルのうち、顕微鏡的に認識可能な腫瘍細胞又は完全な状態の尿路上皮が９０％超得られるサンプルのみをこの研究に利用した。膀胱鏡的に明らかな膀胱癌を有する患者７４名からの排泄尿標本（約１００乃至２００ｍｌ）を腫瘍の経尿道的電気切除術の前に採取し、１，０００ＲＰＩで１５分間遠心分離した。得られた尿沈渣を１０％のＤＭＳＯを含む２ｍｌのＤＭＥＭに再懸濁して−７０℃で貯蔵した。尿路上皮内の前癌病変を軽度、中等度及び重度異形成又は上皮内癌に分類した。こうした腫瘍は、３階層の世界保健機関組織学的等級付けシステム及び増殖パターン（乳頭型対非乳頭型）に従って分類した。浸潤の深さは、ＴＮＭ（腫瘍−リンパ節−遠隔転移）病期分類システムに従って記録した。膀胱癌の証拠のない３７名の非罹患健常人からの排泄尿標本を対照とした。ヒト膀胱癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−１、ＵＭ−ＵＣ−２、ＵＭ−ＵＣ３、ＵＭ−ＵＣ−６、ＵＭ−ＵＣ−９、ＵＭ−ＵＣ−１０、ＵＭ−ＵＣ−１２、ＵＭ−ＵＣ−１３、ＵＭ−ＵＣ−１５、ＵＭ−ＵＣ−１６及びＵＭ−ＵＣ−１７並びに正常ヒト尿路上皮細胞は本発明者らが樹立したものであり、ＳＶ４０不死化ヒト尿路上皮細胞株ＳＶＨＵＣはＣ．Ａ．Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ博士より入手して以前に報告された１３ようにして培養したものである。
【００３５】
オーロラキナーゼＡの発現アッセイ：定量ＲＴ−ＰＣＲを用い、以前に報告された１２ようにして、隣接する尿路上皮／膀胱腫瘍及び細胞株の対応のあるサンプルにおいてオーロラキナーゼＡの発現レベルを分析した。簡単にいえば、ＲＴ−ＰＣＲのために、ＴａｑＭａｎ  ＲＴ試薬をメーカーのプロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）に従って用い、２μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。各遺伝子のプライマー及び蛍光プローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社提供のＡｓｓａｙｓ−ｂｙ−Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅに従って設計した。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、内部正規化標準としてハウスキーピング遺伝子１８Ｓを用い、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７７００  Ｐｒｉｓｍ装置を用いて実施した。尿路上皮新形成のない腎摘出標本の尿管から調製した尿路上皮懸濁液を、隣接する尿路上皮及び膀胱腫瘍からのオーロラキナーゼＡの相対発現量を算出するための標準として用いた。ＮＵ２０４ヒト尿路上皮細胞を、以前に報告された１４ようにしてインビトロで増殖させ、これを基準にしてインビトロで増殖させた膀胱癌細胞株におけるオーロラキナーゼＡの相対発現レベルを算出した。
【００３６】
オーロラキナーゼＡ遺伝子コピー数分析：ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ／Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社（Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入した二色オーロラキナーゼＡ  ＦＩＳＨプローブ（ＡＵＲＫＡ  ２０ｇ１３／ａ−サテライト２０  ＤＮＡプローブ）を用いて排泄尿沈渣の剥脱した細胞におけるオーロラキナーゼＡ遺伝子のコピー数を検出した。ＡＵＲＫＡ２０８１３プローブはＲｈｏｄａｍｉｎｅ（赤）で直接標識し、２０番染色体α−サテライトプローブはＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（緑）で直接標識した。ハイブリダイゼーション条件はメーカーの推奨事項１５に従った。手短に言えば、排泄尿沈渣を解凍し、ＰＢＳ中で３回洗浄した後、遠心分離した。サイストスピン試料をメタノール／酢酸（３：１）で固定し、２×ＳＳＣ／０．５％ＮＰ−４０中、ｐＨ７、３７℃３０分間前処理した後、エタノールの濃度勾配を漸増させて脱水した。この細胞を、９０℃で５分間変性させた後、１０μｌのＡＵＲＫＡ  ２０ｑ１３プローブと３７℃で一夜ハイブリダイズさせた。０．５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中５分間６５℃で５分間洗浄した後、細胞をＤＡＰＩで対比染色し、退色防止溶液中に封入した。蛍光シグナルは、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２顕微鏡を用いて計数し、捕捉した。
【００３７】
ＤＮＡ倍数性分析：間期核の倍数性について、３、７及び１７番染色体のセントロメアＦＩＳＨプローブ（Ｖｙｓｉｓ  Ａｂｂｏｔｔ社、Ｐａｒｋ、ＩＬ）を用い、以前に報告された６ようにしてＳＡＭＢＡ４０００システム（Ａｍｐｅｒｓａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ社、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）による画像解析により全核ＤＮＡを測定することによって分析した。切除した腎摘出標本からの正常ヒト尿路上皮細胞を用いて正常ヒト二倍体組織におけるＦＩＳＨプローブの性能を試験すると共に陰性対照とした。
【００３８】
ＤＮＡ倍数性の測定は、Ｆｅｕｌｇｅｎ反応で染色した隣接する尿路上皮／膀胱腫瘍及び膀胱細胞株の対応のあるサンプルのサイトスピン試料で実施した。ＤＮＡ指数は、二倍体標準（ヒト末梢血リンパ球）の平均核ＤＮＡ含量に対する腫瘍細胞の平均核ＤＮＡ含量の比として算出した。ＤＮＡ指数が０．９乃至１．２の範囲にある腫瘍は二倍性／近二倍性に分類し、一方、ヒストグラムで明確なピークを示す細胞の２０％超においてＤＮＡ指数が１．２を超える腫瘍は異数性に分類した。
【００３９】
インビトロ形質移入アッセイ：ｐｃＤＮＡ３−野生型オーロラキナーゼＡ及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）不死化ヒト尿路上皮細胞を用い、以前に報告された４ようにしてインビトロ形質移入研究を実施した。手短に言えば、オーロラキナーゼＡを含有しないアデノウイルスＧＦＰベクターを感染させた細胞を対照とした。８０％以上の形質移入率を示した実験のみを分析に採用した。オーロラキナーゼＡ−ＧＦＰ異所性発現の程度は、抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロット分析及びオーロラキナーゼＡ−ＧＦＰ融合配列を標的とするプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって検証した。次いで、形質移入の１乃至４日後に細胞を採取して以下の実験に用いた：中心体コピー数の分析、全ＤＮＡ含量及びオーロラキナーゼＡ発現レベルの同時フローサイトメトリー測定、３、７及び１７番染色体のセントロメアＦＩＳＨプローブによる染色体コピー数、並びに軟寒天コロニー形成アッセイ。
【００４０】
中心体コピー数の場合、以前に報告された４ようにして、メタノール固定細胞に抗ｙ−チューブリンマウス抗体（２，０００倍希釈、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を１時間作用させた。手短に言えば、この結合一次抗体をＤＡＰＩを対比染色液としてＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ結合抗マウス抗体（５００倍希釈、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）で検出した。
【００４１】
ＤＮＡ含量（ヨウ化プロピジウム（ＰＩ：ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）の赤色蛍光）及びオーロラキナーゼＡの発現レベル（ＧＦＰの緑色蛍光）の同時フローサイトメトリー分析は、蛍光活性化セルソータ（ＥＰＩＣＳ  ＸＬ−ＭＣＬ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社、Ｍｉａｍｉ、ＦＬ．）を用いて行った。アブノイイナル（ａｂｎｏｉｉｎａｌ）ＤＮＡ含量を有する細胞の集団は、ＤＮＡ指数が２ｃ未満及び４ｃ超であるＧＦＰ陽性細胞の数として計算した。
【００４２】
軟寒天コロニー形成アッセイの場合、ＳＶ４０不死化尿路上皮細胞に、ＧＦＰで標識した野生型オーロラキナーゼＡを含有するアデノウイルスベクター又はＧＦＰのみを含有する対照アデノウイルスを感染させた。ウイルス感染の１日後に、ＵＭ−ＵＣ−３馴化培地を含有する軟寒天上、１０，０００個／プレートの濃度でこの細胞を平板培養した。平板培養後２週目にプレート当たりのコロニー数を記録した。
【００４３】
統計的解析：ＦＩＳＨの定量分析の場合、緑色及び赤色シグナルを各尿サンプルからの少なくとも２０個の細胞において計数し、各細胞の緑色及び赤色シグナルの数を記録した。異常なオーロラキナーゼＡシグナルを含む細胞は、低（３乃至４コピー）及び高（４コピー超）レベルのオーロラキナーゼＡ遺伝子増幅を示す細胞からなる２つの亜群に分類した。各サンプルについて、より高いレベル（３コピー以上）を示す細胞の数を調べた細胞の総数で割り算することによりオーロラキナーゼＡスコアを算出した。０．１５を超えるオーロラキナーゼＡスコアはより高いと考えられ、少なくとも３の赤色ＦＩＳＨシグナルを有する１組２０個の中から３個超の細胞に相当した。このスコアを用いてトレーニングセットの７つの対照及び２３の膀胱癌尿サンプルのＲＯＣ曲線を作製した（ｎ＝３０）。さらに、オーロラキナーゼＡ  ＦＩＳＨ試験の性能をテストセットの３０の対照及び５１の膀胱癌尿サンプルで確認した（ｎ＝８１）。この曲線下の面積（ＡＵＣ）を用いてそのマーカの性能を評価した。このＡＵＣは、症例群と対照群とを比較するＷｉｌｃｏｘｏｎ−Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙの順位和検定と等価であり１６、後者の検定を用いてｐ値を誘導した。癌サンプルからのデータに対してカイ二乗検定を用い、オーロラキナーゼＡスコアと組織学的グレード、増殖パターン、病期などの腫瘍の病理学的特徴との関連を評価した。分割表カウントが小さい場合には、ｐ値は、限界数を固定したシミュレーションにより評価した（ｐ＜‐‐０．０５を有意とみなした）。
【００４４】
結果
先ず、膀胱のＴＣＣ及びそれに隣接するインサイツの新生物発生前の尿路上皮のサンプルにおけるオーロラキナーゼＡの発現レベルを調べた。定量ＲＴ−ＰＣＲによって明らかとなったオーロラキナーゼＡのｍＲＮＡのレベルは隣接尿路上皮及びＴＣＣのいずれにおいても高かった（図１Ａ）。オーロラキナーゼＡの発現レベルは腫瘍のグレード、病期及び異数性と相互に関連があった（図１Ｂ乃至図１Ｄ）。全核ＤＮＡ含量が正常二倍体からの最小のずれを示し、近二倍性と分類した低グレードの表在性ＴＣＣは、正常尿路上皮に比し、オーロラキナーゼＡ発現の軽度上昇（約２倍）を示した。これに対して、顕著な異数性を示した高グレード浸潤性ＴＣＣにおけるオーロラキナーゼＡの発現は著しく上昇した（約７倍）。
【００４５】
染色体不安定性の程度がオーロラキナーゼＡの過剰発現の程度と関連しているかどうかを明らかにするために、膀胱癌細胞株においてオーロラキナーゼＡ発現レベル及び染色体コピー数を分析した（図２Ａ及び図２Ｂ）。オーロラキナーゼＡの発現レベルを利用して膀胱癌細胞株を３群に分類した（図２Ｃ）。第１群はオーロラキナーゼＡ発現の上昇を示さなかった６株の細胞からなった。第２群はオーロラキナーゼＡの軽度上昇（２乃至５倍）を示した４株の細胞からなった。残る３株の細胞はオーロラキナーゼＡレベルの顕著な上昇（６乃至１４倍）を示した。特定の染色体（３、７及び１７番）に対するセントロメアＦＩＳＨプローブを用いた染色体コピー数の分析から、オーロラキナーゼＡレベルの顕著な上昇を示した細胞株では染色体数が格段に増加することが分かった（図２Ｄ）。
【００４６】
こうした相関的研究から、増幅及び過剰発現によるオーロラキナーゼＡの機能獲得は膀胱癌発生過程で異数性の細胞表現型をもたらすことが示唆された。本発明者らは、この仮説をＳＶ４０不死化尿路上皮細胞及び野生型オーロラキナーゼＡ−ＧＦＰ挿入断片を含有するアデノウイルス構築物を用いたインビトロ形質移入研究によって検証した。形質移入した尿路上皮細胞はオーロラキナーゼＡの異所性発現の著しい上昇を示し、これは中心体の増幅及び異数性の発生並びに中心体シグナル数、染色体コピー数、全ＤＮＡ含量の増加、軟寒天上でのコロニー形成能の獲得の存在によって示される細胞表現型の転換と関連づけられた（図３Ａ乃至図３Ｄ）。
【００４７】
オーロラキナーゼＡを膀胱癌検出のマーカとして用いることができるかどうかを明らかにするために、上記ＦＩＳＨ技術を用い、オーロラキナーゼＡの増幅について膀胱癌患者の排泄尿沈渣を分析した（図４）。この分析は盲検法で行った。即ち、ＦＩＳＨの結果を採点する観察者はサンプルが膀胱癌患者のものか、非罹患対照のものか知らなかった。最初の試験は膀胱癌患者２３名及び健康な対照７名からの排泄尿沈渣のトレーニングセットで実施した。これにより、膀胱癌患者の２３名全てにおいて遺伝子増幅は少なくとも低レベル（３乃至４コピー）であることが明らかになった。低グレードＴＣＣの患者からの排泄尿沈渣はオーロラキナーゼＡの３乃至４コピーを有する細胞を主に含有したが、高グレードＴＣＣの患者からの細胞はそのかなりの割合（＞２０％）がオーロラキナーゼＡの４コピー超を有した（図４Ｂ）。１名の対照ではオーロラキナーゼＡシグナルの３コピーを有する細胞が２個検出された。残る６名の対照の尿沈渣にはオーロラキナーゼＡの異常なコピー数は検出されなかった。オーロラキナーゼＡの少なくとも３コピーを有する細胞の１５％超を試験が陽性であるためのカットオフ値として用いるトレーニングセットからのデータの解析によって特異性１．０、感度０．９１及びＲＯＣ  ＡＵＣ  ０．９９７（ｐ＝１×１０−４）が得られた。
【００４８】
膀胱癌に対するオーロラキナーゼＡ  ＦＩＳＨ試験の性能について、５１名の膀胱癌患者及び３０名の健康対照からの排泄尿サンプルからなる別の盲検化テストセットで確認した。データは試験が陽性であるための同じカットオフ点、即ち、オーロラキナーゼＡの少なくとも３コピーを有する細胞の１５％超を用いて解析した。試験は膀胱癌患者の４４サンプルで陽性であった。膀胱癌患者７名ではオーロラキナーゼＡの異常なコピー数は認められなかった。対照サンプルの３０検体のうち５検体で３コピーのオーロラキナーゼＡ遺伝子を有する細胞が１乃至３個確認された。テストセットの解析によって特異性１．０、感度０．８４及びＲＯＣ  ＡＵＣ  ０．９２５（ｐ＝６．７９×１０−１１）が得られた。７４名の膀胱癌患者及び３７名の健康な対照全員における排泄尿中細胞の定量的ＦＩＳＨ分析の結果を図５にまとめた。オーロラスコアにより評価したオーロラキナーゼＡ増幅の程度は腫瘍の組織学的グレードと強く相関した。組織学的グレードの高い（グレード３）膀胱癌は低グレード（グレード１乃至２）の腫瘍のオーロラキナーゼＡスコア（０．１３±０．１５）よりも有意に高いスコア（０．６０±０．２９）を示した。このスコアと腫瘍増殖パターン（乳頭型対非乳頭型）又は病期（表在性対侵襲性）との間には有意な相関は認められなかった（データは図に示されていない）。
【００４９】
考察
今回の知見は、これまでに公表されたものを考慮すると、オーロラキナーゼＡ増幅、過剰発現が中心体増幅及び異数性ゲノム含量の発生と関連づけられる膀胱癌発症の初期事象であることを支持する強力な証拠となる。こうした観察結果は、オーロラキナーゼＡが腫瘍抑制蛋白質ｐ５３の分解を促進し、オーロラキナーゼＡ発現の上昇を示すヒト膀胱腫瘍サンプルは極めて低い細胞ｐ５３含量を示し、重要な腫瘍抑制経路のロスに似ているとの本発明者らが以前に報告した知見１７を考慮すると、重要な生物学的意義を帯びている。
【００５０】
これに関連して、ｐ５３を初めとする特定の腫瘍抑制蛋白質の減少又は不活化突然変異が中心体の増幅を引き起こすこと１８、ｐ５３突然変異及びサイクリンＥ過剰発現の同時発生が膀胱癌における染色体不安定性及び中心体増幅と強く関連づけられること１９に言及することは重要である。オーロラキナーゼＡと接着斑足場蛋白質ＨＥＦ１との間の相互作用及びフィードバック調節の最近の発見から、オーロラキナーゼＡの発現の上昇は、異数性として示される染色体の不安定性を誘導すると共に、細胞の接着、移動及び細胞生存を制御するインテグリン依存性シグナル伝達プロセスを協調的に乱す場合があることが分かる２０。こうした観察結果は、尿路上皮細胞の悪性形質転換においてオーロラキナーゼＡが重要な役割を果たしていることの強力な証拠となるばかりでなく、これが膀胱癌の新規な生体指標となり得ることを示唆している。
【００５１】
本発明者らのデータをまとめると、尿路上皮細胞で過剰発現された時のオーロラキナーゼＡは中心体の増幅及び染色体の誤分離を引き起こし、異数性及び表現型の転換がもたらされることが分かる。今回の膀胱癌患者の排泄尿サンプルにおけるＦＩＳＨ研究は、以前に公表されたデータと相俟って、オーロラキナーゼＡの過剰発現及び増幅は膀胱癌ではよく起こり、排泄尿沈渣からの剥脱した尿路上皮細胞において検出できることが分かる。オーロラキナーゼＡ遺伝子及び２０番染色体α−サテライトセントロメアＤＮＡに対する二色ＦＩＳＨプローブは高い特異性及び感度で膀胱癌を検出した。さらに、オーロラキナーゼＡ増幅の程度は高グレードで臨床的に侵襲性の強い膀胱癌と相互に関連があった。このことは、尿においてＦＩＳＨ技術によりこのオーロラキナーゼコピー数について試験することが膀胱癌の有望な非侵襲的試験となることを示唆している。
【００５２】
さらに、本発明者らが知っていえる限りでは、我々の研究は、増幅及び過剰発現によるオーロラキナーゼＡの機能獲得が膀胱癌発生過程で異数性の細胞表現型をもたらすことを示唆した相関的研究を越えて、尿路上皮細胞におけるオーロラキナーゼＡの過剰発現が中心体の増幅及び染色体の誤分離を引き起こし、その結果、異数性及び表現型の転換がもたらされることを示した最初のものである。
【００５３】
本明細書に開示し、特許請求した方法は全て、本明細書の開示内容と照らし合わせて不当に負担の厳しい実験を行わなくても、構成し、実施することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施態様によって説明してきたが、本発明の概念、意義および範囲から逸脱することなしに、本明細書に開示した方法に対して、及び方法の工程又は方法の工程の順序において変更を加えることができることは、当業者に明瞭に理解されよう。より詳細には、化学的のみならず生理学的にも関連する特定の物質により本明細書に記載した物質を置き換えることができ、その際、同一もしくは同様な結果が得られるであろうことは、明瞭に理解されよう。当業者には明白なこのような類似の代替および修正は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の意義、範囲および概念に含まれると判断される。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書中に記載したものを補足する例示的な手順上またはその他の詳細を提供する範囲で、参照として明確に本明細書に組み入れられる。
【００５４】
【化１】
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【００５５】
【化２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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