(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
破傷風トキソイドのワクチン接種に対する、生物活性物質における免疫応答補助用の調合剤であって、ビタミンＥを含み、ここで、
当該ビタミンＥが、約３２％のα−トコフェロール、約２５％のα−トコトリエノール、約２９％のγ−トコトリエノール、及び約１４％のδトコトリエノールを含む富トコトリエノール分画（ＴＲＦ）を含む調合剤。
【請求項２】
破傷風トキソイドのワクチン接種に対する免疫応答に関する補助用の薬物を製造するための請求項１に記載の調合剤の使用。
【請求項３】
哺乳動物における破傷風トキソイドのワクチン接種に対する免疫応答を強化するための薬物を製造するための請求項２に記載の使用。
【請求項４】
破傷風トキソイドのワクチン接種に対する、個人における免疫応答の活性化に有効な調合剤を含有する包装材を含む製品であって、包装材は、該調合剤が破傷風トキソイドのワクチン接種に対する免疫応答の強化に使用できることを示すラベルを含み、前記調合剤が請求項１に記載の調合剤である製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的物質に対する免疫応答に関する補給用調合剤に関する。より特定すれば、該調合剤は、破傷風トキソイドに対する免疫応答に関して補給を行う１種又は複数種のビタミンＥからなる。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＥは、現在、トコフェロール及びトコトリエノールの両誘導体の生物活性について記述する属名と考えられている。ビタミンＥは、正常な繁殖、筋肉の正常な発達、赤血球の溶血耐性、その他の多様な生化学的機能のために、多くの生物種の食事中に必要な脂溶性ビタミンである。ビタミンＥの最も広く認識されている機能は、抗酸化剤としてである。粗製のパーム油中でのビタミンＥ含量は、百万分の６００〜１０００（ｐｐｍ）の間に亘り、トコフェロール（１８〜２２％）とトコトリエノール（７８〜８２％）の混合物である。
【０００３】
ビタミンＥは、８種の化合物：トコフェロールの異性体４種（α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、δ−トコフェロール）及びトコトリエノールの異性体４種（α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノール、δ−トコトリエノール）からなる部類に対する一般名である。構造的には、トコフェロール及びトコトリエノールは、共通のクロマノール頭部及びＣ−２位における側鎖からなる、ある程度の類似性を共有している。トコフェロール及びトコトリエノールは、トコールと総称されることもある。
【０００４】
しかし、トコフェロールとトコトリエノールはその側鎖で識別される。トコフェロールは飽和したフィチル側鎖を有するが、トコトリエノールは不飽和なイソプレノイド側鎖を有する。トコフェロールは、キャノーラ、綿実、オリーブ、ピーナッツ、ヒマワリ、大豆及びヒマワリ;特に種子油などからのベジタブル(vegetable)油に見出される。トコトリエノールの主要源はプラント(plant)油であり、最も豊富な供給源はパーム油、米ぬか油、パーム核油及びココナッツ油である。
【０００５】
トコトリエノールは、オートムギ、オオムギ、ライムギなどの穀物にも見出される。世界市場における第２の食用油としてパーム油が出現すると共に、パーム油からのトコトリエノールの抽出を可能とする、現在商業的に利用できる技術的進歩がなされてきた。パーム油のトコトリエノールは、抗酸化剤としてトコフェロールの何倍も効力がある。トコトリエノールは、弱いが皮膚に吸収もされるので、ビタミンＥクリームとしての使用に良く適合する。
【０００６】
抗酸化剤としての機能以外に、トコトリエノールは、トコフェロールとは対照的に独特の機能性を有することが示された。トコトリエノールは、血漿コレステロール濃度及び心血管疾患に対する他の脂質関連や非脂質関連危険因子を低下させることが示された（Ｈｏｏｄ、１９９６年）。トコトリエノールは、抗高コレステロール血症作用を有することも報告された（Ｑｕｒｅｓｈｉ等、１９９１年）。この化合物は、トコフェロールより良好な抗腫瘍活性を発揮することも示された（Ｃａｒｒｏｌｌ等、１９９６年）。広く信じられていることとは反対に、トコトリエノールは、生物系においてトコフェロールより脂質過酸化に対して著しく高い抗酸化活性を有することが、インビトロで観察された（Ｓｅｒｂｉｎｏｖａ等、１９９１年）。パーム油に主として見出されるトコトリエノールは、濃厚トコトリエノール（ＥＴ）として現在商業的に抽出されている。
【０００７】
トコフェロール及びトコトリエノールは、共に抗酸化作用が良く認識されており、多くの局所製剤、特に化粧品に使用されている。こうした局所製剤中に配合されるトコフェロール又はトコトリエノールの比率（％）は、非常に低く、しばしば０．１％未満である。
【０００８】
トコトリエノール、トコフェロールの双方は構造がほぼ類似しており、トコフェロール（ビタミンＥ）は、長年の間局所製剤中に存在している。したがって、低濃度のトコトリエノールの使用は、有害な皮膚反応の危険性を何ら引き起こさない。
【０００９】
破傷風トキソイドは、人間における長期持続的な免疫を誘発する効力ある免疫原である（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ等、１９８６年）。破傷風ワクチンの接種は、成人、新生児の双方において破傷風感染症の発症率に劇的な影響を世界的に及ぼしてきた。破傷風に対するワクチンによる免疫は、破傷風トキソイドに対する中和ＩｇＧ抗体の産生を伴う（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ等、１９８６年）。こうした抗体のレベルは、国際規格の使用により定量することができ、したがってトコトリエノール補給後のワクチンの保護効果を調べる有用なモデルとなる。
【００１０】
ビタミンＥは主要な脂溶性抗酸化剤であり、生体膜中で遊離ラジカルを除去し、酸化損傷から細胞構造を保護する。幾つかの研究によれば、トコフェロール、トコトリエノールいずれのビタミンＥの補給も、動物や人間の免疫系に好ましい効果を誘発し、幾つかの免疫疾患及び炎症性疾患の危険性低下に関与していることが示された。本発明における発明者等は、免疫原を接種した際のマウス・モデルにおける、経口投与したトコトリエノールとトコフェロールの免疫調節作用を調べ、次いで破傷風トキソイド（ＴＴ）のブースター・ワクチンで免疫系を刺激した正常な健常志願者における、免疫調節に対する富トコトリエノール分画（ＴＲＦ）の補給の効果を調べた。
【非特許文献１】Ｎｕｒｓｉｎｇ  Ｓｔａｎｄａｒｄ、１９９９年、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｐ−ｔｒａｉｎｉｎｇ．ｎｅｔ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ／ｎｕｒｓｅ／ｖｅｎｅｐｕｎｃ．ｈｔｍｌ、２００５年
【非特許文献２】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｏｖｉｄ．ｃｏｍ／ｃｎ／ｉｎｄｅｘ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐ  ｄｉｅｔａｒｙ．ｈｔｍｌ、２００６年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、破傷風に対する免疫応答に関する補給物質をビタミンＥの使用により開発することによって、当技術分野における問題を克服した。本発明の目的は、哺乳動物がそれにより破傷風トキソイドでワクチン接種されるビタミンＥ補給が、哺乳動物における免疫調節に及ぼす効果を開示することである。
【００１２】
加えて、本発明は、富トコトリエノール分画、δトコトリエノール、α−トコフェロールなどの異種ビタミンＥの補給が、破傷風トキソイドのワクチン接種に対する免疫応答に及ぼす効果にも関する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
したがって、本発明の対象は、生物活性物質における免疫応答補助用のビタミンＥ［好ましくは富トコトリエノール分画（ＴＲＦ）］を含む調合剤に関する。該調合剤は、破傷風トキソイドのワクチン接種に対する免疫応答の補助剤として使用する性能を有すると言える。その上、富トコトリエノール分画（ＴＲＦ）は、α−トコトリエノール、δ−トコトリエノール、γ−トコトリエノール及びα−トコフェロールからなる群から選択するのが好ましい。
【００１４】
本発明の別の態様は、免疫応答に関する補助用薬物を製造するための調合剤であって、哺乳動物における免疫応答の強化に使用される調合剤の使用を対象とする。
【００１５】
更に別の実施態様では、本発明は、個人における免疫応答を強化する方法であって、それを必要とする前記個人に活性量の調合剤を投与することを含む方法について記載する。
【００１６】
更に、本発明は、破傷風トキソイドのワクチン接種に対する、個人における免疫応答の活性化に有効な調合剤を含有する包装材を含む製品であって、包装材は、該調合剤が免疫応答の強化に使用できることを示すラベルを含み、該調合剤は、好ましくは医薬組成物として使用される、前記製品に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
定義
本発明を詳細に説明する前に、この発明が、特定の調合剤タイプ、製造法などに限定されず、したがって変化し得ることを理解されたい。本明細書に使用される用語は、特定の実施形態を説明するだけのためであり、限定的なものであることを意図していないことも理解される。
【００１８】
活性剤の「有効量」という用語は、所望の有益な効果を示すために、無毒ではあるが十分な活性剤の量を意味する。より特定すれば、「治療有効」量とは、所望の治療効果又は薬用化粧効果を示すために、無毒ではあるが十分な有益作用剤の量を意味する。
【００１９】
「免疫系の活性化」という用語は、個人の免疫系が、その個人の免疫系強化及びその期間の減少を含め、高性能化を実現すると考えられる、あらゆる種類の状況の改善を意味する。
【００２０】
本明細書及び特許請求の範囲で使用する場合の用語「含む(comprising)」とは、「少なくとも部分的に、からなる(consisting at least in part-of)」ことを意味する。ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）、ｃｏｍｐｒｉｓｅｄなどの関連用語は、同様に解釈すべきである。
【００２１】
以下の図及び実施例を参照することにより、本発明をより詳細に今から説明する。以下の実施例は、例示目的だけに提示しており、本発明を限定することを意図していない。
（実施例１）
【００２２】
マウスに対するビタミンＥ補給
富トコトリエノール分画（ＴＲＦ）濃縮物、α−トコフェロール（ａ−Ｔ）（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｈｏｐｅ  Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、マレーシア）及びδ−トコトリエノール（δ−Ｔ3）（Ｉｓｅｉ、日本）、２５ゲージ栄養補給針（Ｉｎｔｅｒｆｏｃｕｓ、英国）、大豆油（Ｍａｚｏｌａ、マレーシア）。
【００２３】
マウスにおける採血及び免疫
ミクロヘマトクリット用ヘパリン処理キャピラリ・チューブ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、米国）、１．５ｍＬミクロ遠心チューブ（Ａｘｙｇｅｎ、米国）、ヘパリンナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）、ジエチルエーテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）、ミョウバン吸着破傷風トキソイドワクチン（Ｂｉｏｆａｒｍａ，Ｂａｎｄｕｎｇ、インドネシア）、１ｍＬツベルクリン・シリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＮＪ、米国）、２６ゲージ滅菌針（Ｔｅｒｕｍｏ  Ｃｏｒｐ、フィリピン）。
【００２４】
メチルチアゾールテトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイ
ＭＴＴキット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、米国）、９６ウェル平底組織培養皿（Ｎｕｎｃ、米国）、多チャンネル・ピペッター（ＬａｂＭａｔｅ、米国）。
【００２５】
人志願者の身体検査
血圧計（Ｓｐｉｒｉｔ、台湾）、Ｌｉｔｔｍａｎ（登録商標）聴診器（３Ｍ、英国）、デジタル式体重計（ＳＥＣＡ，Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）。
【００２６】
人志願者からの採血
１０ｍＬ及び５ｍＬの滅菌シリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、シンガポール）、２５、２３、２１ゲージの滅菌針（Ｔｅｒｕｍｏ  Ｃｏｒｐ、フィリピン）、綿ボール、止血帯、滅菌アルコール・ワイプ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＮＪ、米国）、滅菌エラストプラスト、検査用使い捨てゴム手袋（ＳＥＳｄｎ  Ｂｈｄ、マレーシア）、５ｍＬヘパリン・チューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＮＪ、米国）、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ血塊活性化剤用チューブ、３ｍＬ  ＥＤＴＡ用チューブ、３ｍＬフッ化ナトリウム用チューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＮＪ、米国）、試料用バッグ、記入用紙（ＰＡＴＨＬＡＢから供給）。
【００２７】
破傷風トキソイドのワクチン接種
１ｍＬ滅菌ツベルクリン針（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、シンガポール）、破傷風トキソイド（ＴＴ）ワクチン（Ｂｉｏｆａｒｍａ、インドネシア；バッチ番号ＡＴＴ０７３ＢＡ２００６／２００７）。
【００２８】
フロー・サイトメトリー
５ｍＬポリスチレン丸底チューブＦａｌｃｏｎ２０５４（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＮＪ、米国）、ＦＡＣＳ溶解液（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＮＪ、米国）、ＴｒｉＴＥＳＴ試薬としてＴｒｉＴＥＳＴ  ＣＤ３  ＦＩＴＣ／ＣＤ４  ＰＥ／ＣＤ４５  ＰｅｒＣＰ、ＴｒｉＴＥＳＴ  ＣＤ３  ＦＩＴＣ／ＣＤ８  ＰＥ／ＣＤ４５  ＰｅｒＣＰ、ＴｒｉＴＥＳＴ  ＣＤ３  ＦＩＴＣ／ＣＤ１９  ＰＥ／ＣＤ４５  ＰｅｒＣＰ、ＴｒｉＴＥＳＴ  ＣＤ３  ＦＩＴＣ／ＣＤ１６＋ＣＤ５６  ＰＥ／ＣＤ４５  ＰｅｒＣＰなど（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＮＪ、米国）。
【００２９】
リンパ球培養
ＲＢＣ溶解バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）、１５ｍＬ及び５０ｍＬのポリプロピレン・コニカル・チューブＦａｌｃｏｎ２０９７（Ｇｒｅｉｎｅｒ、米国）、Ｌ−グルタミン入りＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、ニュージーランド）、凍結乾燥コンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、米国）、凍結乾燥リポ多糖体（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、米国）、凍結乾燥破傷風トキソイド（ＴＴ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ドイツ）、０．４％トリパン・ブルー色素（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、ニュージーランド）、ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、ニュージーランド）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、ニュージーランド）、９６ウェル平底組織培養皿（Ｎｕｎｃ、米国）、Ｎｅｕｂａｕｅｒ血球計数器（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、ドイツ）、携帯計数器（Ｔｏｇｏｓｈｉ、日本）。
【００３０】
酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）表面の９６ウェル平底ＮＵＮＣ（商標）高結合性免疫プレート（Ｎｕｎｃ、米国）、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）用錠剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、米国）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｏｈｉｏ、米国）、ヒトＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−６及びＩＬ−１０用ＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＣＡ、米国）、マウスＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＴＮＦ−α用ＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＣＡ、米国）、ＨＲＰ−ヤギ抗マウスＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ（Ｈ＋Ｌ）とＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｚｙｍｅｄ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ、米国）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＮＪ、米国）、２Ｍ硫酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、米国）、ヒトＩｇＧ検出キット（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）。
【００３１】
ＨＰＬＣ分析
ヘキサン、エタノール、イソプロピルアルコール及び０．９％塩化ナトリウム（分子生物学用等級、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、米国）、１５ｍＬポリプロピレン・コニカル・チューブＦａｌｃｏｎ２０９７（Ｇｒｅｉｎｅｒ、米国）。
【００３２】
方法（動物試験）
ビタミンＥ
富トコトリエノール分画（ＴＲＦ）及びα−トコフェロール（ａ−Ｔ）の濃縮物は、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｈｏｐｅ  Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、マレーシアから入手した。δ−トコトリエノール（δ−Ｔ3）は、Ｉｓｅｉ、日本から購入した。各異性体の純度は約９７％であった。ＴＲＦ成分の比率は、α−トコフェロール３２％、α−トコトリエノール２５％、γ−トコトリエノール２９％、δ−トコトリエノール１４％を含む。次いで、異性体の濃縮物を大豆油による乳濁液として調製し、最終濃度２０ｍｇ／ｍｌを得た。大豆油は、トコトリエノールを欠いており、ヒマワリ油、サフラワー油、コーン油などの他の油と比較して低いビタミンＥ活性を有する（Ｇｒｅｌａ  ａｎｄ  Ｇｕｎｔｅｒ、１９９５年）ので、ａ−Ｔ、δ−Ｔ3、ＴＲＦ各濃縮物用の溶剤として使用した。この試験では、トコトリエノールの純粋な他形態（即ちａ−Ｔ3及びγ−Ｔ3）が試験時に入手できなかったので、ビタミンＥの基礎標準であるａ−Ｔと、ＴＲＦ、δ−Ｔ3の効果を比較できただけであった。
【００３３】
マウス
雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢）を医学研究所（ＩＭＲ）（Ｋｕａｌａ  Ｌｕｍｐｕｒ、マレーシア）から購入し、マレーシア・パーム油庁（ＭＰＯＢ）（Ｂａｎｇｉ、マレーシア）の動物小屋中に気候及び食餌が安定した条件下で収容した。マウスの週齢、性別、系統の影響を受けることが知られている（Ｓｈａｉｋｈ等、１９９３年）免疫応答の変動を低下させる必要から、この動物試験には若い雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスだけを使用した。雌性ＢＡＬＢ／ｃ系統を選定した理由は、単に、これらのマウスが動物試験において最も頻繁に使用される近交系のマウスである（Ｉｗａｔａ等、２００７年）からである。
【００３４】
試験設計
雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス２０匹を各群５匹のマウスの４群に区分した。各群のマウスは、ＴＲＦ、ａ−Ｔ又はδ−Ｔ3５０μＬ（１ｍｇ）で毎日２カ月間、経口で栄養補給を受けた。この試験では、対照群のマウスは、栄養補給食品を全く受けず、大豆油媒体を補給されなかった。予備試験の知見に基づいて、大豆油の短期（２カ月）経口補給は、非補給動物と比較して、免疫パラメーターや脂肪組織中のビタミンＥ総蓄積量を変化させなかった。これは、大豆油が低ビタミンＥ活性を有することが示されていた（Ｇｒｅｌａ及びＧｕｎｔｅｒ、１９９５年）ことと、該動物が、毎日８週（２カ月）の期間非常に少量の油（大豆油５０μＬ）しか補給されなかったことによると考えられる。栄養補給食品もワクチン接種も全く受けなかった追加の未処置マウス４匹を陰性対照として群別し、試験開始前の基準値免疫パラメーターを確立するために、０日目に犠牲にした。この試験は、国際医学大学（ＩＭＵ）の研究倫理委員会の認可を受けた。動物の世話及び扱いは、国際医学大学倫理委員会が示した指針に厳格に従った。
【００３５】
破傷風トキソイドのワクチン接種
全ての動物を、１４日目にミョウバン吸着破傷風トキソイド（ＴＴ）ワクチン（Ｂｉｏｆａｒｍａ、インドネシア）の１００μＬ即ち４Ｌｆ／ｍＬで免疫した（表１を参照されたい）。各マウスの左後脚の大腿四頭筋に、ＴＴワクチンの筋肉内投与を行った。ブースター用量のＴＴワクチンを２８日目と４２日目に投与した。Ｇｉｌｅａｄｉ等（２００２年）が報告したような動物試験の標準的免疫計画に従って、全ての動物に対して、１４日目にＴＴワクチンで初回刺激を行い、２週間毎の間隔で２回追加刺激を行った。全ての免疫用接種のために、マウスをジエチルエーテルで軽度に麻酔した。血清試料は、０日目（基準）、２８日目（第１回免疫用接種から２週後）、５６日目（第３回免疫用接種から２週後）に眼窩後の出血により取得された。免疫用接種を完了した後、全実験動物に栄養補給食品を更に２週間補給した後、５６日目に犠牲にした。犠牲動物の血液、脾臓及び脂肪組織を各種試験のために採集した。
【００３６】
【表１】
0005798708.tif 000002
【００３７】
脾細胞増殖アッセイ
培地（５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、３００μｇ／ｍＬのＬ−グルタミン、及び１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン並びに１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有する完全ＲＰＭＩ−１６４０）を含んだペトリ皿中に、犠牲マウスからの脾臓を無菌的に取り出した。脾臓被膜の穏やかな破壊により、脾細胞を脾臓から遊離させた。この後、脾細胞を脾臓から穏やかに引き出した。脾臓懸濁液を室温で約１分間放置することにより、チューブ底に塊を沈ませた。次いで、脾細胞の単個細胞浮遊液を含有する上清を新しいチューブに移した。その脾細胞を遠心分離（４℃で１２００ｒｐｍ×１０分）により回収した。
【００３８】
製造業者が推奨する手順に従って、脾臓赤血球を溶解緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で溶解させた。その白血球を遠心分離（４℃で１２００ｒｐｍ×１０分）によりもう１度回収した。次いで、白血球をＲＰＭＩ−１６４０完全培地中に再浮遊させた。血球計数器を用いて細胞を計数した。トリパン・ブルー色素排除法を用いて計数過程における死細胞の排除を促進した。この後、その脾細胞浮遊液を、１×１０7細胞／ｍＬを含有するように培地で調整した。次いで細胞浮遊液を３本のチューブ中に分けた。これらのチューブ各々に、マイトジェン、特異抗原のいずれかを添加した。使用したマイトジェンは、各濃度１μｇ／ｍＬのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）及びリポ多糖体（ＬＰＳ）であり、使用した特異抗原は１０μｇ／ｍＬの純粋な破傷風トキソイド（ＴＴ）であった。これらの脾細胞浮遊液１００μＬを５％ＣＯ2加湿インキュベーター中、３７℃、７２時間、９６ウェル・プレート中で培養した。脾細胞の増殖はＭＴＴアッセイで測定し、これらの細胞によるサイトカイン産生はＥＬＩＳＡで測定した。
【００３９】
メチルチアゾールテトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイ
脾細胞の増殖は、ＭＴＴアッセイ（Ｈａｎｓｅｎ等、１９８９年）を用いて測定したが、このアッセイでは、臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムのホルマザン結晶への還元を測定する。このアッセイでは、ＭＴＴ黄色溶液が、生細胞のミトコンドリア・デヒドロゲナーゼにより紫色のホルマザン生成物へ変換される。脾細胞１００μＬ（１×１０7細胞／ｍＬ）を平底９６ウェル・プレート中に播種したものを３点用意し、１μｇ／ｍＬのＣｏｎＡ若しくはＬＰＳ又は１０μｇ／ｍＬのＴＴの存在下又は非存在下で培養した。５％ＣＯ2中３７℃、７２時間後、細胞を５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ試薬と４時間インキュベートした。次いで、ホルマザン沈殿をイソプロパノール中のＨＣｌ  ０．１ｍＬの添加で溶解し、ヒペット操作を繰り返すことにより完全に混合した。ＥＬＩＳＡリーダーを用いて５７０ｎｍで細胞増殖を定量した。
【００４０】
サイトカイン分析
７２時間の培養後、脾細胞培養物の上清４ウェル分を１．５ｍＬミクロ遠心チューブ中にプールした。このチューブを遠心（４℃で１２０００ｒｐｍ×１０分）して細胞屑を除いた。培養上清を新しい滅菌ミクロ遠心チューブに移し、−８０℃で保存してＥＬＩＳＡによる分析に備えた。無細胞培養上清中の各種サイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α）の濃度を、製造業者の手順（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に従い、市販のマウス・サイトカインＥＬＩＳＡキットを用いて決定した。手短に言うと、滅菌９６ウェル・プレート（Ｎｕｎｃ、米国）を該当する捕捉抗体（例えば、抗ＩＦＮ−γ、抗ＩＬ−４、抗ＴＮＦ−α）１００μＬ／ウェルでコーティングした。そのプレートを密封し、４℃で終夜インキュベートした。この後、プレート内容物を捨て、ウェルを洗浄緩衝液（ＰＢＳ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。３回目の洗浄後、プレートを逆さにし、吸水紙上で拭き取って、残っていた洗浄緩衝液を除いた。次いで、製造業者から得たアッセイ希釈液２００μＬ／ウェルで、ウェルをブロッキングした。
【００４１】
そのプレートにカバーをし、室温で１時間、暗所でインキュベートした。インキュベーション期間の後、ブロッキング緩衝液を吸引し、既述のように洗浄した。−８０℃で保存していた脾細胞培養上清を融解した。次いで、この培養上清１００μＬを試験ウェル中に添加し、二重に試料を用意した。陰性対照ウェルはアッセイ希釈液１００μＬ／ウェルを含んでいたが、陽性対照は、製造業者から得た純粋な標準サイトカインの一定力価からなる。濃度既知の純粋なサイトカインの試料には、各ＥＬＩＳＡキットが備わっていた。当該サイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４又はＴＮＦ−α）の標準原液１００μＬ／ウェルを、アッセイ希釈液を用いて連続的に希釈した。次いで、プレートにカバーをし、室温で２時間インキュベートした。この後プレートの内容物を捨て、プレートを洗浄した。
【００４２】
検出抗と、アビジン−セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）試薬（製造業者から入手）とを、製造業者推奨のようにアッセイ希釈液中に希釈した。次いで、こうした溶液１００μＬを全てのウェル中に添加した。プレートにカバーをし、暗所で１時間インキュベートした。この後、プレート内容物を吸引し、プレートを７回洗浄した。最後の洗浄サイクル中、ウェルを洗浄緩衝液中で１分間浸漬した後、緩衝液を吸引した。次いで、ＴＭＢ基質溶液１００μＬを全ての９６ウェルに添加した。プレートを室温で１０分間インキュベートして発色させ、全ての９６ウェルに２Ｍ硫酸４０μＬを添加することにより、その反応を停止させた。ＥＬＩＳＡマイクロプレート・リーダーを用いて４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
【００４３】
産生したサイトカイン量はｐｇ／ｍＬで表わされ、サイトカインＥＬＩＳＡキット各々の検出限界は８ｐｇ／ｍＬであった。陰性対照ウェル中のサイトカイン量は、殆ど検出できなかった。陰性対照ウェル中のサイトカイン値は、実験ウェル中のその値から差し引かれた。
【００４４】
血清の抗ＴＴ抗体力価の決定
ＥＬＩＳＡを用いたエンドポイント滴定によりマウス血清中の抗ＴＴ抗体を検出し、定量した。手短に言うと、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．２）中３μｇ／ｍＬのＴＴ溶液で１００μＬ／ウェル用いてコーティングし、４℃で終夜インキュベートした。その後、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０入りＰＢＳ）を用いてプレートを３回洗浄した。洗浄後、プレートをＥＬＩＳＡブロッキング・バッファー（１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン入りＰＢＳ）２００μＬ／ウェルで室温、１時間ブロッキングした。次いで、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄した。次いで、試験試料１００μＬをこのプレートに添加し、二重に試料を用意した。ビタミンＥを補給した動物の血清試料、及び対照を、１：２００に始まる血清の２倍連続希釈を用いてブロッキング・バッファー中で連続的に希釈した。０日目に未処理動物から得た血清をこのアッセイ用の陰性対照として利用した。プレートを室温で２時間インキュベートした。
【００４５】
２時間後、プレートを５回洗浄し、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼと結合した抗マウスＩｇ（１：４０００希釈）１００μＬを全てのウェルに添加した。３７℃で６０分間のインキュベーション及び５回の洗浄後、３，３‘，５，５‘−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質１００μＬを全てのウェルに添加した。発色が起こった後、全てのウェルに２Ｍ硫酸５０μＬを添加することにより、反応を停止させた。ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を読み取った。以前に記載（Ｓｎｅａｔｈ等、１９８７）のように、吸光度の値＝０．４５を示す希釈率の逆数としてＩｇ力価を表した。
【００４６】
マウス脂肪組織からのビタミンＥの抽出
マウス脂肪組織約０．５ｇを１５ｍＬ遠心チューブ中に入れ、組織ホモジナイザーを用いて５分間又は組織が液状になるまで、１００００ｒｐｍで（比４：１：１の）ヘキサン、エタノール、０．９％塩化ナトリウムの混合物により均質化した。次いで、ホモジェネートを２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。脂質含有上清相を５ｍＬバイアルへ移し、窒素ガス下で乾燥させた。その試料を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析のために、使用する直前に適量のヘキサン（５００μＬ対２ｍＬ）中に再懸濁した。
【００４７】
ＨＰＬＣ分析
島津モデルＲＦ−１０ＡＸＬ蛍光分光計、カラム室、島津クラスＶＰデータ収集ソフトからなるＬＣ−１０ＡＴ  ＨＰＬＣ装置を用いて、分析ＨＰＬＣを行った。ＨＰＬＣカラムは、ＹＭＣ  Ａ−０１２、５μｍの１５０ｍｍ×６ｍｍシリカ・カラムであった。蛍光検出器の励起波長と発光波長を、それぞれ２９５ｎｍと３２５ｎｍに設定した。移動相は、流速２ｍＬ／分のヘキサン−イソプロピルアルコール（９９．５／０．５ｖ／ｖ）であった。試料注入容量は１０μＬに設定し、それに従ってα−トコフェロール、α、γ及びδ−トコトリエノールの標準混合溶液も装置内に注入した。試料中の成分のピーク面積を標準物質の対応面積と比較し、定量計算に使用した。
【００４８】
統計的分析
データは平均値±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）として提示され、その際ｎは使用したマウスの数である。全ての実験で脾細胞を個別に（即ち、プールした細胞ではなく）評価した。同様に、各マウスの血清も個別に試験した。ＳＰＡＮＯＶＡ、一元配置ＡＮＯＶＡ、（その後、事後的なＴｕｋｅｙの対比較）又はスチューデントのｔ検定のいずれかを用いて、Ｐ＜０．０５を許容できる統計的有意差の水準と設定した場合に、対照と実験動物（ａ−Ｔ、δ−Ｔ3、ＴＲＦ）の間の有意性を判定した。
【００４９】
方法（臨床試験）
試験設計
臨床試験は、国際医学大学の研究倫理委員会により認可され、臨床試験基準（ＧＣＰ）に関するマレーシア国家ガイドラインに従った。この試験は、無作為化した二重盲検プラセボ対照試験であった。志願者は、マレーシア・プトラ大学（ＵＰＭ）工学部の第１１学寮から募集した。志願者は、年齢層が理想的なため（１８〜２５歳）この学寮から選択された。
【００５０】
動物試験では、試験の開始以前に破傷風抗原に曝されていなかった（即ち、ＴＴワクチン接種の投与３回を全くしていなかった）ので、全てのマウスに破傷風トキソイド免疫付与の投与を３回行い、したがって標準的なワクチン接種計画の一部としてＴＴワクチンの投与を３回施した（各投与を２週間隔毎に）。
【００５１】
志願者の選別
総合健康診断と問診の後、各志願者から血液７ｍＬを採取し、各種の生化学試験として空腹時血糖値、血清クレアチニン、総コレステロール、高密度リポタンパク（ＨＤＬ）コレステロール、低密度リポタンパク（ＬＤＬ）コレステロール、トリグリセリド、総ＨＤＬ比を含めた総脂質プロファイル、肝機能試験、即ち血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＳＧＯＴ）及び血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＳＧＰＴ）、総ビリルビンなどのために、認可臨床検査センター（ＰＡＴＨＬＡＢ、マレーシア）にその試料を送付した。血液は、試験の０日、２８日及び５６日に標準的静脈穿刺法（Ｎｕｒｓｉｎｇ  Ｓｔａｎｄａｒｄ、１９９９年、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｐ−ｔｒａｉｎｉｎｇ．ｎｅｔ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ／ｎｕｒｓｅ／ｖｅｎｅｐｕｎｃ．ｈｔｍｌ、２００５年）を用いて採取された。妊娠検査のために志願者から尿試料も得た。志願者は、生化学試験のために採血する前夜、１０〜１２時間絶食するように求められた。
【００５２】
腎臓と肝臓の機能が、栄養補給後の全ての志願者において正常であることを主として保証するために、試験終了時（５６日目）に同じ生化学パラメーターを再度測定した。
【００５３】
志願者の募集
選定された志願者は、プラセボ（対照群）又はＴＲＦ（試験群）４００ｍｇの栄養補給を毎日受けるように無作為に割り当てられた。この試験では乱塊方式を使用した。
【００５４】
試験参加者１０８名全員をＴＲＦ、プラセボいずれかのカプセルを満たした瓶に１：１の比で等しく割り当てた。１番と２番のラベルを付けた同一の瓶２本を試験期間中用いた。各参加者に対し、試験担当者は２本の瓶の一方を交互に選択し（即ち、第１の参加者が１番瓶を受け取り、第２の参加者が２番瓶を受け取ったという具合）、試験参加者のファイル中に選定瓶の番号を記録した。本発明を実施する期間中に、志願者間でカロリー摂取量を一定にし、ビタミンＥの吸収総量に対する食事の効果を最小限にするために、志願者は、推奨される食事の標準スケジュールにより１日３食を与えられた。週日には、参加者は施設内で朝食を取り、午後の食事を持参した。夕食は、学寮のカフェテリアで毎日取った。全ての食事は学寮のカフェテリアで用意された。
【００５５】
最初の１カ月間中に、処置群の志願者６名とプラセボ群の志願者２名が試験から抜けた。全志願者は、基準日（０日目）、２８日目、５６日目に採血された。コンプライアンスを各来所時の丸薬数により調べた。図１は、本発明を通した参加者の割当及び保持人数を表す。
【００５６】
試験終了時に、各志願者の血液試料の分析から収集したデータを計算してデータベース（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）２００３）とし、ウィンドウズ（登録商標）用のＳＰＳＳ（ｖｅｒｓｉｏｎ  １１．０；ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を用いて統計的分析を行った。
【００５７】
栄養補給食品
この試験に用いたＴＲＦ栄養補給食品は、Ｈｏｖｉｄ  Ｓｄｎ  Ｂｈｄ（Ｉｐｏｈ、マレーシア）製造のＴｏｃｏｖｉｄ  ＳｕｐｒａＢｉｏであった。Ｔｏｃｏｖｉｄ軟質ゲルカプセルの組成物には、トコトリエノールとα−トコフェロールの混合物が含まれる（表２を参照されたい）。この混合トコトリエノール（ＴＲＦ）カプセルは栄養補給食品２００ｍｇを各々含有しているのに対し、プラセボ・カプセルは、ビタミンＥを全く欠いたパーム・オレイン（料理油）で出来ていた。
【００５８】
【表２】
0005798708.tif 000003
【００５９】
栄養補給食品の投与
志願者は、８週間ビタミンＥ又はプラセボの栄養補給食品を毎日摂取することを、この試験の０日目に開始するように求められた。志願者は、コンプライアンスを促進するために、好ましくは昼食又は夕食と共に毎日カプセル２個を摂取するように教示された。試験群用栄養補給食品の経口摂取量は、毎日混合トコトリエノール４００ｍｇであった。
【００６０】
破傷風トキソイド（ＴＴ）のワクチン接種
ＴＴワクチン（Ｂｉｏｆａｒｍａ、バッチ番号ＡＴＴ０７３ＢＡ２００６／２００７）を、登録看護婦による非利き腕の三角筋中への筋肉内注射を介して投与した。使用した用量は、最終容量０．５ｍＬ中にＴＴワクチンが２０凝集単位（Ｌｆ）であった。免疫用接種期間中及び試験過程中に、ワクチン関連の重大な有害事象は起こらなかった。
【００６１】
血液試料の採取
血液試料は、選別日及び０、２８、５６日目に登録した看護婦又は医師により健常志願者から抜き取られた。静脈穿刺のために、減圧チューブ・ホルダーに接続した蝶形又は１０ｍＬプラスチック・シリンジを使用した。血液試料に関して実施しようとする試験に基づいて、各種の採血チューブ中に血液試料を採取し、そのチューブの最大容量まで満たした。採血後、血塊活性化剤又は抗凝固剤との血液の適切な混合を確実にするため、そのチューブを３回倒立させた。この試験に使用した採血チューブの型を表３に表記する。全ての採血チューブは有効期限日の前に使用した。
【００６２】
【表３】
0005798708.tif 000004
【００６３】
末梢血白血球の分離
末梢血白血球（ＰＢＬ）は、赤血球（ＲＢＣ）溶解法を用いて健常志願者から得たヘパリン処理血液より分離された。既に実施した最適化試験から、血液１ｍＬの白血球が、この試験のために行う予定の増殖や、サイトカイン・アッセイにとって十分であると判定した。志願者から採取したヘパリン処理血液約１ｍＬを、適当にラベル表示した１５ｍＬコニカル・チューブ中に分取した。次いで、血液試料を含有する各チューブ中にＲＢＣ溶解緩衝液約３ｍＬを添加した。チューブに栓を付け、混合物が均質になるまで４回倒立させ、室温で３分間インキュベートすることにより、ＲＢＣ溶解反応を起こした。氷冷したＰＢＳの添加により反応を停止させ、チューブを４０００ｒｐｍで４℃、１０分遠心した。遠心後、上部の透明赤色上清を捨て、細胞を氷冷ＰＢＳ中で１回洗浄した。
【００６４】
遠心ステップを繰り返し、白血球を含有するペレットを、５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％のペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンを含有する５ｍＬの完全ＲＰＭＩ−１６４０中に再浮遊させた。チューブの底から細胞を解き放つため、チューブを軽く叩き、チューブを静かに倒立させることにより、細胞浮遊液を形成させた。チューブを氷上に維持し、血球計数器を用いて細胞計数を行った。血中白血球の培養を０、２８、５６日目に実施した。
【００６５】
末梢血白血球の計数及び増殖
血球計数器を用いて全試料について個別に血液中生存白血球の計数を行った。死細胞を特定するために、トリパン・ブルー排除法を用いた。細胞浮遊液１００μＬを完全ＲＰＭＩ９００μＬ中に添加することにより、白血球浮遊液の１０倍希釈液を滅菌した１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中に作製した。次いで、トリパン・ブルー色素（０．４％）４０μＬをチューブに添加し、チューブを数回倒立させることにより溶液を混合した。細胞浮遊液約１０μＬを血球計数器用スライド・ガラスの計数室中にピペットで添加し、非染色生存細胞の個数を数えた。生存白血球の個数を計算し、最終細胞濃度１×１０7細胞／ｍＬを得るために、培地（ＲＰＭＩ１６４０）で細胞浮遊液の容量を調整した。白血球を９６ウェル・プレート中に１×１０6細胞／ウェルで播種し、これらの細胞をＣｏｎＡ若しくはＬＰＳ１μｇ／ｍＬ又はＴＴ１０μｇ／ｍＬで個別に刺激した。細胞を５％ＣＯ2の加湿雰囲気中で３７℃、７２時間培養した。末梢血白血球の培養物を３日後に採集した。
【００６６】
ＥＬＩＳＡ
７２時間の培養後、末梢血白血球の培養物のウェルから得た上清を１．５ｍＬミクロ遠心チューブ中にプールした。チューブを遠心する（４℃で１２０００ｒｐｍ×１０分）ことにより、細胞屑を除いた。この培養上清を新しい滅菌ミクロ遠心チューブに移し、−８０℃で保存してＥＬＩＳＡに備えた。ヒトＰＢＬの培養上清からのＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０の見積りは、市販のＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用い、該製造業者の使用説明書に従って行った。ＩＦＮ−γとＩＬ−６の検出感度の限界は、それぞれ８ｐｇ／ｍＬと１ｐｇ／ｍＬであった。ＩＬ−４、ＩＬ−１０双方の検出限界は４ｐｇ／ｍＬであった。０、２８、５６日目に採取した血漿中の抗ＴＴ総Ｉｇ力価も、ＥＬＩＳＡを用いて決定した。ヘパリン処理チューブ中に採取した血液試料を、２０００ｒｐｍで室温、１０分間遠心した。沈積した赤血球から血漿を分離し、滅菌した１．５ｍＬ遠心チューブ中に移した。血漿試料は、１：４００に始まる２倍連続希釈を用いてアッセイ希釈液中で連続希釈を行った。非免疫用接種志願者から得た血清を、血清総Ｉｇ滴定の陰性対照として使用した。
【００６７】
血漿試料を２時間インキュベーションした後、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇを結合したＨＲＰを、１：５０００の希釈度で添加した。６０分のインキュベーションと５回の洗浄後、ＴＭＢ基質１００μＬを添加し、発色したとき、２Ｍ硫酸の添加（５０μＬ／ウェル）により反応を停止させた。ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍでプレートを読み取り、吸光度の値≦０．４５を示す希釈率の逆数として総Ｉｇ力価を表した。
【００６８】
次いで、抗破傷風ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡキット（ＩＢＬ，Ｈａｍｂｕｒｇ）を用いて、Ｉｇ力価既知の血漿試料をアッセイし、その試料中のＩｇＧ（ＩＵ／ｍＬ）の濃度を定量した。ＩｇＧマイクロウェル・プレートを不活性化した破傷風トキソイド抗原でコーティングした。製造業者の較正物質（濃度範囲が５〜４０ＩＵ／ｍＬ）と陰性対照を各プレートに対して二重に操作した。較正物質の標準曲線を用いて試料中のＩｇＧの濃度を計算した。
【００６９】
血中白血球の染色
フロー・サイトメトリー分析のために、０、２８、５６日目に志願者から抜き取った血液約１ｍＬを、滅菌したＫ３  ＥＤＴＡ  ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（登録商標）採血チューブ中に採取した。異なる４種類のＴｒｉＴＥＳＴ試薬（表４を参照されたい）、即ちＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１６＋ＣＤ５６の各抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＮＪ、米国）を用いて、製造業者推奨の方法に従って血液試料を染色した。全４抗体は、免疫蛍光試薬、具体的にはフルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ＣＤ３抗体と、ペリジニン・クロロフィル・タンパク（ＰｅｒＣＰ）標識ＣＤ４５抗体とを含有する。ＣＤ３抗体は、成熟ヒトＴリンパ球（ＣＤ３＋）とＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）複合体とを特定し（Ｂｒｅｎｎｅｒ等、１９８６年）、一方ＣＤ４５抗体はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を認識する（Ｓｃｈｍｉｄｔ、１９８９年）。各血液試料のために滅菌した丸底Ｆａｌｃｏｎチューブ４本を用意した。次いで、異なるＴｒｉＴＥＳＴ試薬２０μＬを各チューブの底にヒペットで注いだ（表４を参照されたい）。この後、良く混合した抗凝固剤入り全血５０μＬを各血液試料用のチューブ全４本の底にヒペットで注いだ。
【００７０】
チューブに栓を付け、底を軽く叩くことにより、抗体を血液細胞と十分に混合した。次いで、チューブを暗所、室温で１５分インキュベートした。インキュベーションは、試料が冷温の温度変化を受けると起こることが報告された（Ｆｏｒｓｙｔｈ及びＬｅｖｉｎｓｋｙ、１９９０年；Ｒｅｐｏ等、１９９５年）、白血球の表面抗原発現量の変動を減少させるために、室温で行われた。インキュベーション後、１Ｘ  ＦＡＣＳ溶解液４５０μＬを各チューブ中に添加した。チューブに栓を付け、底を軽く叩くことにより、混合を確実にした。
【００７１】
チューブを暗所で更に１５分インキュベートした。この後、フロー・サイトメーターを用いて試料を直ちに分析した。
【００７２】
【表４】
0005798708.tif 000005
【００７３】
フロー・サイトメトリー分析
Ｔｒｉ−ｔｅｓｔ抗体染色試料のデータを、フロー・サイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）により、該製造業者提供のＭｕｌｔｉｓｅｔソフトを用いて収集した。フロー・サイトメーターの較正を、該製造業者提供のＣａｌｉｂｒｉｔｅ  Ｂｅａｄｓを用いて各操作前に毎日行った。Ｍｕｌｔｉｓｅｔソフトを用いて測定したパラメーターには、Ｔリンパ球、Ｔヘルパー細胞、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞の個数と比率（％）、さらにＣＤ４：ＣＤ８  Ｔ細胞比が含まれる。
【００７４】
血漿からのビタミンＥ抽出とＨＰＬＣ分析
ヘパリン処理チューブ中に採取した血液試料を、２０００ｒｐｍで室温、１０分遠心した。沈積した赤血球から血漿を分離し、滅菌した１．５ｍＬ遠心チューブ中に移した。この後、０．５％ＮａＣｌとエタノールを０．５ｍＬ含んだチューブに血漿５００μＬを次いで添加した。次いで、ヘキサン４００μＬを各チューブ中に添加した。
【００７５】
ミニシェーカーを用いて該混合物を１時間激しく振とうした。次いで、そのチューブを３０００ｒｐｍで室温、１０分遠心した。遠心後、透明なヘキサン相を清浄なバイアル中に注意深く移し、窒素ガス下で送風乾燥した。その脂質試料の一定分量をヘキサン５００μＬ中に液戻しした。次いで、その溶液１０μＬをＨＰＬＣ装置に注入した。
【００７６】
統計的分析
試験で得たデータを、ウィンドウズ用ＳＰＳＳ（Ｖｅｒｓｉｏｎ１０．０；ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を用いて処理した。分割区画ＡＮＯＶＡ（ＳＰＡＮＯＶＡ）、一元配置ＡＮＯＶＡのいずれかを用いて、異なる３時点、即ち０、２８、５６日目における対照（プラセボ）群と実験（ＴＲＦ）群との間の有意性を決定した。データは平均値±Ｓ．Ｄ．として提示してある。
【００７７】
結果
（動物試験）
マウスの脂肪組織におけるビタミンＥレベル
異なるビタミンＥ異性体、主にａ−Ｔ、ＴＲＦ、δ−Ｔ3を給餌された実験群の動物は、非栄養補給対照マウスと比較して、脂肪組織における有意（Ｐ＜０．０５）な総ビタミンＥ蓄積レベルを示した（図２を参照されたい）。総ビタミンＥレベルは、δ−Ｔ3を給餌された動物の脂肪組織で最高であり、次いでＴＲＦとａ−Ｔとを給餌された場合であった。異種のビタミンＥを給餌されたマウスでは、ａ−Ｔとα−トコトリエノール（ａ−Ｔ3）異性体が全ての動物の脂肪組織に存在していた。しかし、その他の動物群と比較した場合、ａ−Ｔ給餌動物は有意に（Ｐ＜０．０５）高い濃度のトコフェロールを有し、同様にＴＲＦ補給動物は、脂肪組織中に蓄積した非常に有意な（Ｐ＜０．０１）量のａ−Ｔ3を示した（図３を参照されたい）。脂肪組織中のδ−Ｔ3の濃度はδ−Ｔ3給餌動物で最高であり、そのレベルはその他の動物群と比較して非常に有意（Ｐ＜０．０１）であった（図３を参照されたい）。対照及びａ−Ｔ補給動物の脂肪組織には、検出可能量のδ−Ｔ3もγ−Ｔ3も全くなかった。ＴＲＦ補給動物だけが、脂肪組織中に全４異性体の存在を示し、γ−トコトリエノール（γ−Ｔ3）の濃度は、その他の動物と比較してこの群では非常に有意（Ｐ＜０．０１）であった。実験群は、ビタミンＥの異なるアイソフォーム、即ちＴＲＦ、ａ−Ｔ又はδ−Ｔ3を１ｍｇ給餌された。
【００７８】
対照マウスは、ビタミンＥのいずれの異性体も補給されなかった。対照群と実験群との有意差を、aＰ＜０．０５（ＡＮＯＶＡ）と指定した。（訳注：Ｐの前のａにはその下に「．」がつく）
【００７９】
ａ−Ｔ給餌マウスとその他の動物群との有意差を、脂肪組織中のａ−Ｔ濃度についてaＰ＜０．０１（ＡＮＯＶＡ）と指定した。脂肪組織中のδ−Ｔ3濃度については、δ−Ｔ3給餌マウスと対照群、ａ−Ｔ群及びＴＲＦ群からの動物との差異を、cＰ＜０．０１（ＡＮＯＶＡ）（訳注Ｐの前のｃにはその上に「＾」がつく）と指定した。脂肪組織におけるａ−Ｔ3及びγ−Ｔ3の蓄積は、対照群、ａ−Ｔ群及びδ−Ｔ3群からの動物と比較して、ＴＲＦ補給マウスにおいて有意差を示し、各々eＰ＜０．０１（ＡＮＯＶＡ）（訳注：Ｐの前のｅにはその下に「．」がつく）及びuＰ＜０．０１（ＡＮＯＶＡ）と指定した（訳注：Ｐの前のｕの上に記号が書かれているが不明）。
【００８０】
ビタミンＥを補給されたマウスにおける抗破傷風トキソイド抗体の産生
ＢＡＬＢ／ｃマウスを４群、即ち３実験群と１対照群に分けた。実験群のマウスは、異種のビタミンＥを経口で補給された。全ての動物は、破傷風トキソイド（ＴＴ）ワクチンの投薬を３回受けた。対照動物と実験動物の血清におけるＴＴ特異抗体の力価は、ＥＬＩＳＡを用いて０日目（基準）、２８日目、５６日目に測定された。図４に示すように、ＴＴ免疫用接種マウスにおける抗ＴＴ  Ｉｇ力価は、ビタミンＥ、即ちδ−Ｔ3、ａ−Ｔ又はＴＲＦの毎日の栄養補給後に有意に（Ｐ＜０．０５）増強された。抗ＴＴ  Ｉｇ力価の増強は、対照動物と比較して、２８日目の第１回ワクチン接種後に全てのビタミンＥ補給群において統計的に有意（Ｐ＜０．０５）であった。しかし、抗ＴＴ力価の増強は、第１回ワクチン接種後の実験群同士の間では有意差がなかった（図４を参照されたい）。第３回のＴＴワクチン接種後、ビタミンＥの異なる異性体を５６日間補給されたマウスは、非処置マウスと比較した場合、有意に（Ｐ＜０．０５）高い抗ＴＴ抗体力価を有していた（図４を参照されたい）。
【００８１】
図４に示すように、δ−Ｔ3異性体を補給されたマウスは、第３回ワクチン接種後に最高の抗ＴＴ抗体力価を有していた。これに続くのは、ＴＲＦとａ−Ｔを給餌されたマウスであった。δ−Ｔ3とＴＲＦを補給されたマウスにおける抗ＴＴ抗体力価は、ａ−Ｔ処置マウスの場合より有意に（Ｐ＜０．０１）高かった。
【００８２】
加えて、δ−Ｔ3補給とＴＲＦ補給マウスは、第１回免疫用接種と比較して、第３回免疫用接種後に有意に（Ｐ＜０．０１）高い抗抗体力価も示した。血清抗ＴＴ抗体の基準（０日目）力価は全動物において低く、対照群と実験群においてほぼ同じであり（図４を参照されたい）、動物の免疫状態は試験開始時に類似していたことを示す。こうした知見は、トコトリエノール、主にδ−Ｔ3とＴＲＦが、ＴＴワクチン接種マウスにおいて抗ＴＴ抗体の産生を有意に増強したことを示している。２８、５６日目での対照群と実験群との有意差を、それぞれaＰ＜０．０５（ＳＰＡＮＯＶＡ）及びeＰ＜０．０５（ＳＰＡＮＯＶＡ）と指定した。５６日目でのδ−Ｔ3給餌とａ−Ｔ給餌動物との有意差を、uＰ＜０．０１（ＡＮＯＶＡ）と指定し、５６日目でのＴＲＦ補給群とａ−Ｔ補給群との差異はcＰ＜０．０１（ＡＮＯＶＡ）と指定した。ＴＲＦ給餌及びδ−Ｔ3給餌動物における５６日目と２８日目との有意差を、sＰ＜０．０１（ＳＰＡＮＯＶＡ）と指定した。（訳注；Ｐの前のｓはその上に「’」がつく）
【００８３】
ビタミンＥを補給されたＴＴワクチン接種マウスからの脾細胞の増殖
ＢＡＬＢ／ｃマウスを４群、即ち３実験群と１対照群に分割した。実験群のマウスは、ビタミンＥの異なる異性体を経口で補給された。全ての動物は、破傷風トキソイド（ＴＴ）ワクチンの投薬を３回受けた。５６日目に、犠牲にしたマウスの脾臓を取り出し、ＣｏｎＡ、ＬＰＳ又は純粋ＴＴの存在下で培養した。
【００８４】
図５は、対照及びビタミンＥ補給マウス由来の脾細胞のマイトジェン誘発又は抗原誘発増殖に対する、異なるビタミンＥ異性体の補給の効果を示す。δ−Ｔ3、ＴＲＦ、ａ−Ｔのいずれかで補給されたＴＴ免疫用接種マウスの脾細胞は、対照マウスと比較して、ＣｏｎＡ（１μｇ／ｍＬ）又はＴＴ（１０μｇ／ｍＬ）に対する有意に（Ｐ＜０．０５）大きな応答を示した（図５を参照されたい）。細胞増殖は、δ−Ｔ3補給群においてやや増加し、これにＴＲＦとａ−Ｔ補給群が続いた。しかし、ＣｏｎＡ又はＴＴ刺激後のビタミンＥ処置群同士の間に脾細胞増殖の有意な（Ｐ＜０．０５）差はなかった。加えて、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）は、対照群と比較して、ビタミンＥ処置群に有意な（Ｐ＜０．０５）脾細胞増殖を誘発しなかった。こうした結果は、トコトリエノール、トコフェロールいずれの補給もＣｏｎＡ又はＴＴ刺激マウス脾細胞の増殖を強化できることを示している。雌性マウス５匹の各群を、１４日、２８日、４２日目にＴＴワクチン（４ＬＦ／ｍＬ）で免疫用に接種した。マウスを、最後のワクチン接種から２週後（５６日目）に犠牲にした。
【００８５】
ＣｏｎＡ刺激培養物における対照群と実験群との有意差を、aＰ＜０．０５（ＡＮＯＶＡ）と指定し、一方ＴＴ刺激培養物における対照群と実験群との有意差を、eＰ＜０．０５（ＡＮＯＶＡ）と指定した。ＬＰＳ刺激後では、脾細胞増殖の有意差が対照群と実験群との間に認められなかった（ＡＮＯＶＡ）。
【００８６】
ＴＴ免疫用接種マウスからのマイトジェン又は抗原刺激脾細胞によるサイトカインの産生に対する、ビタミンＥ補給の効果
ＢＡＬＢ／ｃマウスを４群、即ち３実験群と１対照群に分けた。実験群のマウスは、異なるビタミンＥ異性体を経口で補給された。全ての動物は、破傷風トキソイド（ＴＴ）ワクチンの投薬を３回受けた。対照及び実験のマウスは、５６日目に犠牲にされた。犠牲マウスの脾臓を取り出し、ＣｏｎＡ又は純粋ＴＴの存在下で培養した。培養７２時間後に培養上清を採集し、産生されたサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α）の量を、ＥＬＩＳＡを用いて定量した。
【００８７】
ＣｏｎＡ又はＴＴ刺激脾細胞によるＩＦＮ−γの産生に対するビタミンＥ補給の効果
図６に示すように、異なるビタミンＥ異性体を給餌されたＴＴワクチン接種マウスから採集したＣｏｎＡ刺激脾細胞からのＩＦＮ−γ濃度は、対照マウスの濃度より有意に（Ｐ＜０．０５）高かった。ａ−Ｔ処置マウスに比較して、δ−Ｔ3を補給された動物は、ＣｏｎＡ刺激後のサイトカイン産生の有意な（Ｐ＜０．０５）増加を示した。しかし、ａ−Ｔ給餌マウスとＴＲＦ給餌マウスの間には、ＩＦＮ−γのレベルに有意差が認められなかった。
【００８８】
ＴＴ刺激脾細胞では、対照動物と比較して、全てのビタミンＥ補給群においてＩＦＮ−γレベルが有意に増大した（図６を参照されたい）。しかし、処置群同士の中ではサイトカイン・レベルに有意差がなかった。加えて、ナイーブ（非処置マウスでワクチン接種もしていない）マウスからのＣｏｎＡで刺激された脾細胞は、対照動物と比較してかなり低い量のＩＦＮ−γを産生した。
【００８９】
ＣｏｎＡ又はＴＴ刺激脾細胞によるＩＬ−４の産生に対するビタミンＥ補給の効果
図７は、ＴＴワクチン接種を３回した後の対照マウスとビタミンＥ処置マウスからの脾細胞によるＩＬ−４の産生を示す。対照マウスと比較して、ビタミンＥ処置動物は、脾細胞のＣｏｎＡ誘発、ＴＴ誘発いずれの増殖においてもＩＬ−４産生の有意な（Ｐ＜０．０５）向上を示した。しかし、ビタミンＥ補給群同士の中ではＩＬ−４レベルに有意差が認められなかった。ナイーブ動物（非処置マウスでワクチン接種もしていない）からの脾細胞は、対照動物と比較して相対的に非常に低い量のＩＬ−４を産生した。
【００９０】
ＬＰＳ刺激脾細胞によるＴＮＦ−αの産生に対するビタミンＥ補給の効果
ＬＰＳ誘発ＴＮＦ−α産生は、異なるビタミンＥ異性体を補給され、ＴＴでワクチン接種されたマウスにおいて、有意に（Ｐ＜０．０５）減少することが判明した（図８を参照されたい）。ＴＮＦ−αの産生は、全てのビタミンＥ処置動物においてほぼ同じであり、こうした群同士の間で差が認められなかった。雌性マウス５匹の各群は、１４日、２８日、４２日目にＴＴワクチン（４Ｌｆ／ｍＬ）で免疫用に接種された。マウスは、５６日目、即ち最後のワクチン接種から２週間後に犠牲にされた。犠牲マウスの脾臓から脾細胞を調製し、ＣｏｎＡ（１μｇ／ｍＬ）又はＴＴ（１０μｇ／ｍＬ）の存在下で培養した。結果は濃度（ｐｇ／ｍＬ）で表されている。
【００９１】
培養上清を、培養７２時間後に採集し、産生されたＩＦＮ−γの量を、ＥＬＩＳＡを用いて定量した。ＣｏｎＡ刺激脾細胞における対照群と実験群との有意差を、aＰ＜０．０５（ＡＮＯＶＡ）と指定し、ＴＴ刺激脾細胞における対照群と実験群との差異を、eＰ＜０．０５（ＡＮＯＶＡ）と指定した。ＣｏｎＡ刺激脾細胞におけるδ−Ｔ3補給とａ−Ｔ補給動物との差異を、uＰ＜０．０５と指定した（スチューデントのｔ検定）。ＣｏｎＡ刺激脾細胞においては、ＴＲＦ補給とａ−Ｔ補給動物との間に差異が認められなかった。ＣｏｎＡ刺激脾細胞におけるナイーブ動物と対照動物との有意差を、sＰ＜０．０５（スチューデントのｔ検定）と指定した。雌性マウス５匹の各群は、１４日、２８日、４２日目にＴＴワクチン（４Ｌｆ／ｍＬ）で免疫用に接種された。マウスは、最後のワクチン接種から２週間（５６日）後に犠牲にされた。犠牲マウスの脾臓から脾細胞を調製し、ＣｏｎＡ（１μｇ／ｍＬ）又はＴＴ（１０μｇ／ｍＬ）の存在下で培養した。結果は濃度（ｐｇ／ｍＬ）で表されている。培養上清を、培養７２時間後に採集し、産生されたＩＬ−４の量を、ＥＬＩＳＡを用いて定量した。ＣｏｎＡ刺激脾細胞における対照群と実験群との有意差を、aＰ＜０．０５（ＡＮＯＶＡ）と指定し、ＴＴ刺激脾細胞における対照群と実験群との差異を、eＰ＜０．０５（ＡＮＯＶＡ）と指定した。ＣｏｎＡ刺激脾細胞におけるナイーブ動物と対照動物との有意差を、sＰ＜０．０５（スチューデントのｔ検定）と指定した。雌性マウス５匹の各群は、１４日、２８日、４２日目にＴＴワクチン（４Ｌｆ／ｍＬ）で免疫用に接種された。マウスは、最後のワクチン接種から２週間（５６日）後に犠牲にされた。犠牲マウスの脾臓から脾細胞を調製し、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）の存在下で７２時間培養した。結果は濃度（ｐｇ／ｍＬ）で表されている。培養上清を、培養７２時間後に採集し、産生されたＴＮＦ−αの量を、ＥＬＩＳＡを用いて定量した。対照群と実験群との有意差を、ＬＰＳ刺激脾細胞においてaＰ＜０．０５と指定した（ＡＮＯＶＡ）。
【００９２】
ＴＲＦで補給された志願者の血漿における高レベルのビタミン
ＨＰＬＣを用いて志願者から得た血漿試料を分析し、トコフェロール及びトコトリエノール全体の濃度を定量した。図９に示すように、総ビタミンＥ（トコフェロール及びトコトリエノール）の血漿濃度は、実験群においてＴＲＦ補給をした４週（２８日）後及び８週（５６日）後に有意に（Ｐ＜０．０５）増加した。対照的に、プラセボ群の血漿中の総ビタミンＥ濃度は、両時点で一定のままであった（図９を参照されたい）。しかし、ＴＲＦ補給群の血漿における総ビタミンＥ濃度の２８日目及び５６日目の間の差異は、統計的に有意性がなく（図９を参照されたい）、恐らくは体内の除去過程が、何らかの最適なビタミンＥレベルの維持に有効であることが示唆される。
【００９３】
健常志願者の血中の内因性α−トコフェロール量は、０日目と比較して２８日目及び５６日目に有意に（Ｐ＜０．０５）増加した（図１０を参照されたい）。α−トコフェロール濃度は、プラセボ群と比較してＴＲＦ補給群において、２８日目及び５６日目に有意に（Ｐ＜０．０５）増大した。α、γ、δ−トコトリエノールの平均血漿濃度も、プラセボと比較すると、ＴＲＦを摂取した志願者において２８日目及び５６日目に有意に（Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．０５）増加した（図１１を参照されたい）。ＴＲＦ補給群における２８日目及び５６日目のトコトリエノール異性体の濃度のうち、α−トコトリエノールが最高であり、これに続いてγ−トコトリエノールとδ−トコトリエノールであった（図１１を参照されたい）。プラセボ群における２８日目及び５６日目の各トコトリエノールの濃度は、同じままであり、その量は０日目と比較して有意差がなかった（Ｐ＜０．０５）。１００名の志願者を、２群、即ち対照群（プラセボを摂取）又は実験群（毎日ＴＲＦ４００ｍｇを摂取）に無作為に割り当てた。両群より血液を０日目、２８日目、５６日目に抜き取った。
【００９４】
血漿を、方法の項に記載のように、ＨＰＬＣ分析のために血液から分離した。この分析で得た総ビタミンＥの血漿濃度はμｇ／ｍＬで報告している。
【００９５】
２８日目における対照群と実験群との血漿ビタミンＥレベルの有意差をuＰ＜０．０５（ＡＮＯＶＡ）と指定する。５６日目における対照群と実験群との血漿ビタミンＥレベルの有意差をnＰ＜０．０５（ＡＮＯＶＡ）と示す（訳注：Ｐの前のｎはその上に「．」がつく）。０日目及び２８日目における実験群同士間の血漿ビタミンＥレベルの有意差をaＰ＜０．０５（ＳＰＡＮＯＶＡ）と指定する。０日目及び５６日目における実験群同士間の血漿ビタミンＥレベルの有意差をcＰ＜０．０５（ＳＰＡＮＯＶＡ）と指定する。
【００９６】
１００名の志願者を、２群、即ち対照群（プラセボを摂取）又は実験群（毎日ＴＲＦ４００ｍｇを摂取）に無作為に割り当てた。両群より血液を０日目、２８日目、５６日目に抜き取った。血漿を、方法の項に記載のように、ＨＰＬＣ分析のために血液から分離した。この分析で得たα−トコフェロールの血漿濃度はμｇ／ｍＬで報告している。
【００９７】
２８日目における対照群と実験群との血漿α−トコフェロール濃度の有意差をaＰ＜０．０５（ＡＮＯＶＡ）と示し、５６日目における対照群と実験群との差異をcＰ＜０．０５（ＡＮＯＶＡ）と示す。０日目と２８日目における実験群同士間の血漿α−トコフェロール・レベルの有意差をuＰ＜０．０５（ＳＰＡＮＯＶＡ）と指定し、０日目と５６日目における実験群同士間のレベル差をnＰ＜０．０５（ＳＰＡＮＯＶＡ）と指定する。
【００９８】
図１１：対照及び実験志願者の血漿中のトコトリエノールの濃度
１００名の志願者を、２群、即ち対照群（プラセボを摂取）又は実験群（毎日ＴＲＦ４００ｍｇを摂取）に無作為に割り当てた。両群より血液を０日目、２８日目、５６日目に抜き取った。血漿を、方法の項に記載のように、ＨＰＬＣ分析のために血液から分離し、準備した。この分析で得たトコトリエノールの血漿濃度はμｇ／ｍＬで報告している。
【００９９】
２８日目における対照群と実験群との血漿α−トコトリエノール濃度の有意差をaＰ＜０．０１（ＡＮＯＶＡ）と示し、５６日目における対照群と実験群との差異をnＰ＜０．０  １（ＡＮＯＶＡ）と示す。０日目と２８日目における実験群同士間の血漿α−トコトリエノール・レベルの有意差をeＰ＜０．０１（ＳＰＡＮＯＶＡ）と指定し、０日目と５６日目における実験群同士間のレベル差をcＰ＜０．０１（ＳＰＡＮＯＶＡ）と指定する。
【０１００】
２８日目における対照群と実験群との血漿γ−トコトリエノール濃度の有意差をuＰ＜０．０５（ＡＮＯＶＡ）と示し、５６日目における対照群と実験群との差異をtＰ＜０．０５（ＡＮＯＶＡ）と示す（訳注：Ｐの前のｔには「＋」がつく）。０日目及び２８日目における実験群同士間の血漿γ−トコトリエノール・レベルの有意差をsＰ＜０．０５（ＳＰＡＮＯＶＡ）と指定し、０日目と５６日目における実験群同士間のレベル差をνＰ＜０．０５（ＳＰＡＮＯＶＡ）と示す（訳注：Ｐの前のυの上に「’」がつく）。
【０１０１】
２８日目における対照群と実験群との血漿δ−トコトリエノール濃度の有意差をYＰ＜０．０５（ＡＮＯＶＡ）と示し、５６日目における対照群と実験群との差異をzＰ＜０．０５（ＡＮＯＶＡ）と示す（訳注：Ｐの前のｚの上に「＾の反対向きの記号」がつく）。０日目と２８日目における実験群同士間の血漿δ−トコトリエノール・レベルの有意差をXＰ＜０．０５（ＳＰＡＮＯＶＡ）と指定し、０日目と５６日目における実験群同士間のレベル差をWＰ＜０．０５（ＳＰＡＮＯＶＡ）と示す（訳注：Ｐの前のＷの上に「＾」がつく）。
【０１０２】
マイトジェン又は抗原刺激ＰＢＭＣによるサイトカインの産生に対するＴＲＦ補給の効果
方法の項に記載のように、血液を０日、２８日、５６日目に全志願者から抜き取った。３．４．８項に記載したように末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離し、その白血球をＣｏｎＡ、ＬＰＳ又は純粋ＴＴの存在下で培養した。培養７２時間後に培養上清を採集し、ＥＬＩＳＡを用いて産生したサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０）の量を定量した。本発明では、ＴＴ刺激後のＰＢＭＣによるサイトカイン産生を、２８日目、５６日目、即ちＭｅｙｄａｎｉ等（１９９７年）が報告したＴＴワクチンの投与前後にだけ測定した。ＴＴ刺激後のサイトカインの基準（０日目）レベルは、志願者における、ＴＴワクチンの投与前である２８日目のレベルと類似していると報告された（Ｍｅｙｄａｎｉ等、１９９７年）。しかし、ＣｏｎＡ、ＬＰＳ双方による刺激（非特異的マイトジェン）後のＰＢＭＣによるサイトカイン産生を、０日目、２８日目、５６日目に測定した。
【０１０３】
ＣｏｎＡ又はＴＴ刺激ＰＢＭＣによるＩＦＮ−γの産生に対するＴＲＦ補給の効果
図１２は、対照群と実験群における志願者のＰＢＭＣによるＩＦＮ−γの産生を示す。ＩＦＮ−γの産生量は、０日目又は２８日目に産生した量と比較して、５６日目、即ちＴＴワクチンの接種後に、ＣｏｎＡ刺激ＰＢＭＣによって有意に（Ｐ＜０．０５）増強された。ＩＦＮ−γレベルは、０日目と比較して２８日目に僅かしか高くならなかった。加えて、２８日目にＴＲＦ群とプラセボ群との間に認められた差異は、統計的に有意ではなかった（Ｐ＞０．０５）。５６日目、即ちＴＴワクチンの投与から２８日後に、ＩＦＮ−γの産生量は、ＴＲＦ補給を受けた志願者のＰＢＭＣにおいて、対応するプラセボ群と比較して有意に（Ｐ＜０．０２）増強された。
【０１０４】
特異抗原、即ちＴＴにより刺激されたＰＢＭＣが産生するＩＦＮ−γの量も決定された（図１３を参照されたい）。志願者からのＰＢＭＣの大部分は、２８日目、即ちブースターＴＴによる免疫用接種前にＴＴによる刺激に応答した。これは、子供時の免疫用接種プログラム中にこの抗原に既に曝されたためであろう。５６日目のＴＴワクチン接種後には、インビトロでのＴＴ刺激後のＩＦＮ−γの産生が、ＴＲＦ補給群、プラセボ補給群の双方で増大した。しかし、そのサイトカイン・レベルは、プラセボ補給と比較して、ＴＲＦ補給を受けた志願者において非常に有意であった（Ｐ＜０．０１）。
【０１０５】
ＣｏｎＡ又はＴＴ刺激ＰＢＭＣによるＩＬ−４の産生に対するＴＲＦ補給の効果
図１４に示すように、ＴＴワクチン接種の前では、志願者のＰＢＭＣは、ＣｏｎＡ刺激培養物におけるＩＦＮ−γと比較して、非常に低レベルのＩＬ−４を産生した。ＴＴワクチン接種から１カ月後（５６日目）では、ＩＬ−４のレベルは、試験の０日目及び２８日目と比較して、ＴＲＦ補給群、プラセボ補給群の双方で有意に（Ｐ＜０．０５）上昇した。しかし、５６日目におけるＩＬ−４の濃度は、対照群と実験群との間で有意差がなかった（Ｐ＞０．０５）。
【０１０６】
ＴＴ刺激ＰＢＭＣ培養物におけるＩＬ−４レベルを、２つの時点、即ちＴＴワクチン接種の前後に４週間を置いてアッセイした。ＴＴにより刺激したＰＢＭＣは、ＣｏｎＡ刺激ＰＢＭＣと比較して低い量のＩＬ−４を産生した（図１４及び１５を参照されたい）。ＴＴワクチン接種前、即ち２８日目では、ＴＲＦ補給及びプラセボ補給志願者からのＴＴ刺激ヒトＰＢＭＣが産生するＩＬ−４量に、統計的有意差がなかった（Ｐ＞０．０５）（図１５を参照されたい）。対照的に、５６日目のＴＴワクチン接種後では、プラセボと比較してＴＲＦを受けた志願者において、ＩＬ−４レベルが有意に（Ｐ＜０．０５）増大した（図１５を参照されたい）。
【０１０７】
ＬＰＳ刺激ＰＢＭＣによるＩＬ−６の産生に対するＴＲＦ補給の効果
ＩＬ−６、ＴＮＦ−αなどの炎症促進性サイトカインが、病原体侵入後に急性期タンパク質を誘導するために、マクロファージにより産生されることは十分に認められている（Ｌｅｖｉ等、２００３年）。志願者からのＬＰＳ刺激ＰＢＭＣは、志願者の対照群、実験群双方において、試験の０日目と２８日目に高いレベルのＩＬ−６を産生した（図１６を参照されたい）。しかし、ＴＲＦを補給された志願者は、プラセボを受けた志願者と比較して、５６日目、即ちＴＴ免疫用接種から１カ月後に有意に（Ｐ＜０．０５）低いＩＬ−６産生を示した（図１６を参照されたい）。
【０１０８】
対照群及び実験群の末梢血から分離したＣｏｎＡ刺激ＰＢＭＣにより産生されるＩＦＮ−γの量を決定した。０日目（基準）、２８日目（プラセボ又はＴＲＦ補給から４週後で、ＴＴワクチン接種の前）、及び５６日目（プラセボ又はＴＲＦ補給から８週後で、ＴＴワクチン接種から４週後）に産生されたＩＦＮ−γの量を決定した。対照と実験志願者からのＣｏｎＡ刺激ＰＢＭＣにより、５６日目に産生されたＩＦＮ−γレベルに統計的有意差が認められた。対照群と実験群との有意差を、eＰ＜０．０２（ＡＮＯＶＡ）として示す。０日目及び２８日目と比較した５６日目における対照群内の統計的差異を、aＰ＜０．０５（ＳＰＡＮＯＶＡ）と指定し、０日目及び２８日目と比較した５６日目における実験群内のレベル差を、uＰ＜０．０５（ＳＰＡＮＯＶＡ）として示す。
【０１０９】
対照群（プラセボ処置）及び実験群に属する志願者の末梢血から分離した、ＴＴ刺激ＰＢＭＣにより産生されるＩＦＮ−γの量を、方法の項に記載したように決定した。２８日目（プラセボ又はＴＲＦ補給から４週後で、ＴＴワクチン接種の前）、及び５６日目（プラセボ又はＴＲＦ補給から８週後で、ＴＴワクチン接種から４週後）に産生されたＩＦＮ−γの量を決定した。
【０１１０】
２８日目における対照群と実験群とのＴＴ特異的ＩＦＮ−γレベルの有意差を、eＰ＜０．０５（ＡＮＯＶＡ）として示し、５６日目における対照群と実験群との差異を、aＰ＜０．０１（ＡＮＯＶＡ）として示す。対照群の２８日目と５６日目との有意差を、ＸＰ＜０．０５（ＳＰＡＮＯＶＡ）と指定し、実験群の２８日目と５６日目とのレベル差を、uＰ＜０．０１（ＳＰＡＮＯＶＡ）として示す。
【０１１１】
対照群（プラセボ処置）及び実験群の志願者の末梢血から分離したＣｏｎＡ刺激ＰＢＭＣにより産生されるＩＬ−４の量。０日目（基準）、２８日目（プラセボ又はＴＲＦ補給から４週後で、ＴＴワクチン接種の前）、５６日目（プラセボ又はＴＲＦ補給から８週後で、ＴＴワクチン接種から４週後）に産生されたＩＬ−４の量を決定した。
【０１１２】
０日目及び２８日目と比較した５６日目における対照群内の有意差を、eＰ＜０．０５（ＳＰＡＮＯＶＡ）と指定し、０日目及び２８日目と比較した５６日目における実験群内のレベル差を、aＰ＜０．０５（ＳＰＡＮＯＶＡ）として示す。
【０１１３】
ＣｏｎＡ又はＴＴ刺激ＰＢＭＣによるＩＬ−１０の産生に対するＴＲＦ補給の効果
インターロイキン−１０は、抗原提示細胞上での副刺激分子の発現を低下させ（Ｃｏｒｉｎｔｉ等、２００１年）、それにより樹状細胞（ＤＣ）の抗原提示能を抑制できる（Ｔｈｏｍｓｓｅｎ等、１９９５年）、十分に立証された免疫抑制サイトカインである。この本発明では、全志願者が、０日、２８日、５６日目にＣｏｎＡ刺激ＰＢＭＣよる検出可能なレベルのＩＬ−１０産生を示した（図１７を参照されたい）。
【０１１４】
産生されるＩＬ−１０のレベルは、試験の基準日から５６日目まで僅かに増加したが、そのレベルは有意ではなく（Ｐ＞０．０５）、ＴＲＦ群とプラセボ群との間にもＩＬ−１０産生の有意な変化が認められなかった（Ｐ＞０．０５）（図１７を参照されたい）。図１８に示すように、ＴＴにより刺激されたＰＢＭＣも、２８日目、５６日目に、プラセボ群と比較した場合、ＴＲＦ補給群においてＩＬ−１０の僅かな産生増加を示した。しかし、サイトカイン・レベルの変化は有意ではなかった（Ｐ＞０．０５）。
【０１１５】
対照群（プラセボ処置）及び実験群の志願者の末梢血から分離したＣｏｎＡ刺激ＰＢＭＣにより産生されるＩＬ−１０の量。０日目（基準）、２８日目（プラセボ又はＴＲＦ補給から４週後で、ＴＴワクチン接種の前）、及び５６日目（プラセボ又はＴＲＦ補給から８週後で、ＴＴワクチン接種から４週後）に産生されたＩＬ−１０の量を決定した。０日目、２８日目、５６日目におけるＴＲＦ補給群とプラセボ補給群とのＩＬ−１０産生のレベル差は、統計的に有意ではなかった（ＳＰＡＮＯＶＡ）。
【０１１６】
対照群（プラセボ処置）及び実験群の志願者の末梢血から分離したＴＴ刺激ＰＢＭＣにより産生されるＩＬ−１０の量は、方法の項に記載したように決定された。２８日目（プラセボ又はＴＲＦ補給から４週後で、ＴＴワクチン接種の前）、及び５６日目（プラセボ又はＴＲＦ補給から８週後で、ＴＴワクチン接種から４週後）に産生されたＩＬ−１０の量を決定した。
【０１１７】
２８、５６日目におけるＴＲＦ補給群とプラセボ補給群とのＴＴ特異的ＩＬ−１０産生のレベル差は、統計的に有意ではなかった（ＳＰＡＮＯＶＡ）。
【０１１８】
ＴＲＦ補給及びＴＴワクチン接種後の血漿中の抗破傷風抗体レベル
ＴＴでワクチン接種したヒト志願者の血漿中総Ｉｇの産生に対するＴＲＦ補給の効果を調べた。産生される抗ＴＴ抗体の量が、免疫応答の体液性防備用マーカーとして使用される。抗ＴＴ抗体の検出可能な総Ｉｇ量が、試験の０日目及び２８日目に存在していたが、その力価は、ＴＴワクチン接種後、即ち５６日目に認められる力価と比較して、相対的に低かった（図１９を参照されたい）。抗ＴＴ  Ｉｇ力価は、ＴＲＦ群、プラセボ群の双方でＴＴワクチン接種から１カ月後に有意に増加した（図１９を参照されたい）。
【０１１９】
５６日目に認められた両群の抗ＴＴ  Ｉｇ力価は、０日目及び２８日目と比較して有意に（Ｐ＜０．０５）高かった。ＴＲＦで補給された志願者は、プラセボで補給された志願者と比較して、５６日目において有意に（Ｐ＜０．０５）高い抗ＴＴ  Ｉｇ産生を示した。
【０１２０】
ＴＴワクチン接種後、即ち５６日目のＴＲＦ補給群では、抗ＴＴ  ＩｇＧ産生の増加も認められた（図２０を参照されたい）。ＴＴワクチン接種前の試験集団における抗ＴＴ  ＩｇＧの平均レベルは、０．７９ＩＵ／ｍＬであり、そのレベルは、ＴＲＦ補給、プラセボ補給両志願者において、ＴＴワクチン接種から１カ月後に有意に（Ｐ＜０．０５）上昇した。５６日目に、プラセボ補給群及びＴＲＦ補給群における抗ＴＴ  ＩｇＧ平均レベルは、それぞれ１．３０ＩＵ／ｍＬと１．９３ＩＵ／ｍＬであり、そのレベルは、プラセボと比較して、ＴＲＦ群において有意に（Ｐ＜０．０５）高かった（図２０を参照されたい）。両群の志願者は、ワクチン接種後の保護的抗ＴＴ応答を実現しており、この応答は、０．８５ＩＵ／ｍＬの抗破傷風抗体レベルと定義される（Ｋｉｌｉａｎ及びＮｉｅｌｓｅｎ、１９８９年）。血液を、０、２８、５６日目に対照群（プラセボ補給）及び実験群（ＴＲＦ補給）の志願者から抜き取った。
【０１２１】
ＴＴワクチンのブースター用量を、２８日目に筋肉内に投与した。総Ｉｇ  抗ＴＴの血漿レベルを、ＥＬＩＳＡにより決定した。０日目及び２８日目と比較した際の５６日目における、プラセボ群（対照）内での抗ＴＴ  Ｉｇ力価の有意差をcＰ＜０．０５（ＳＰＡＮＯＶＡ）と指定し、０日目及び２８日目と比較した際の５６日目における、実験群（ＴＲＦ）内での力価の差異をuＰ＜０．０５（ＳＰＡＮＯＶＡ）として示す。
【０１２２】
５６日目における対照群と実験群との抗ＴＴ  Ｉｇ力価の有意差を、aＰ＜０．０５（ＡＮＯＶＡ）として示す。
【０１２３】
血液を、０日目、２８日目、５６日目に対照群（プラセボ補給）及び実験群（ＴＲＦ補給）の志願者から抜き取った。ＴＴワクチンのブースター用量を、２８日目に筋肉内に投与した。抗ＴＴ  ＩｇＧの血漿レベルを、ＥＬＩＳＡにより決定した。０日目及び２８日目と比較した際の５６日目における、プラセボ（対照）群内でのＩｇＧ濃度の有意差をeＰ＜０．０５（ＳＰＡＮＯＶＡ）と指定し、０日目及び２８日目と比較した際の５６日目における、実験（ＴＲＦ）群内でのＩｇＧレベルの差異をaＰ＜０．０５（ＳＰＡＮＯＶＡ）として示す。５６日目における対照群と実験群との有意なレベル差を、uＰ＜０．０５（ＡＮＯＶＡ）として示す。
【０１２４】
図２１：ＴＲＦ、プラセボのいずれかを補給された健常志願者間の総Ｔリンパ球比率（％）を比較した散布図。血液を、０日目（Ａ）、２８日目（Ｂ）、５６日目（Ｃ）に志願者から抜き取った。該リンパ球をＣＤ３抗原に対する抗体で染色し、フロー・サイトメトリーで分析した。ＴＲＦ群とプラセボ群との総Ｔ細胞比率（％）の差異は、各時点、即ち０日目、２８日目、５６日目に有意ではなかった（ＳＰＡＮＯＶＡ）。ｘ軸は、ＴＲＦ群のｎ＝５０及びプラセボ群のｎ＝５０を示し、合計でｎ＝１００となる。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】試験を通した参加者の割当及び保持人数を例示するフロー図である。
【図２】毎日５６日間ビタミンＥの異なる異性体を補給したマウスの脂肪組織中の総ビタミンＥ濃度を表す図である。
【図３】毎日５６日間ビタミンＥの異なる異性体を補給したマウスの脂肪組織中のα−トコフェロール及びトコトリエノールの濃度を表す図である。
【図４】対照及びビタミンＥ補給マウスの間の抗ＴＴ総Ｉｇ力価を比較したヒストグラムである。
【図５】ＴＴ免疫マウスにおけるマイトジェン刺激（ＣｏｎＡ及びＬＰＳ）並びに抗原刺激（ＴＴ）脾細胞増殖に対するビタミンＥ補給の効果を表す図である。
【図６】ＣｏｎＡ刺激又はＴＴ刺激脾細胞によるＩＦＮ−γの産生に対するビタミンＥ補給の効果を表す図である。
【図７】ＣｏｎＡ刺激又はＴＴ刺激脾細胞によるＩＬ−４の産生に対するビタミンＥ補給の効果を表す図である。
【図８】ＬＰＳ刺激脾細胞によるＴＮＦ−αの産生に対するビタミンＥ補給の効果を表す図である。
【図９】対照及び実験志願者の血漿中の総ビタミンＥ濃度を表す図である。
【図１０】対照と実験志願者の血漿中の総α−トコフェロール濃度を表す図である。
【図１１】対照及び実験志願者の血漿中のトコトリエノール濃度を表す図である。
【図１２】ＣｏｎＡ刺激ＰＢＭＣによるＩＦＮ−γの産生に対するＴＲＦ補給の効果を表す図である。
【図１３】ＴＴ刺激ＰＢＭＣによるＩＦＮ−γの産生に対するＴＲＦ補給の効果を表す図である。
【図１４】ＣｏｎＡ刺激ＰＢＭＣによるＩＬ−４の産生に対するＴＲＦ補給の効果を表す図である。
【図１５】ＴＴ刺激ＰＢＭＣによるＩＬ−４の産生に対するＴＲＦ補給の効果を表す図である。
【図１６】ＬＰＳ刺激ＰＢＭＣによるＩＬ−６の産生に対するＴＲＦ補給の効果を表す図である。
【図１７】ＣｏｎＡ刺激ＰＢＭＣによるＩＬ−１０の産生に対するＴＲＦ補給の効果を表す図である。
【図１８】ＴＴ刺激ＰＢＭＣによるＩＬ−１０の産生に対するＴＲＦ補給の効果を表す図である。
【図１９】プラセボ補給及びＴＲＦ補給志願者の間の抗ＴＴ総Ｉｇ力価を比較したヒストグラムである。
【図２０】プラセボ補給及びＴＲＦ補給志願者の間の抗ＴＴ  ＩｇＧ力価を比較したヒストグラムである。
【図２１】ＴＲＦ、プラセボのいずれかを補給された健常志願者間の総Ｔリンパ球比率（％）を比較した散布図である。
【図１】
0005798708.tif 000006
【図２】
0005798708.tif 000007
【図３】
0005798708.tif 000008
【図４】
0005798708.tif 000009
【図５】
0005798708.tif 000010
【図６】
0005798708.tif 000011
【図７】
0005798708.tif 000012
【図８】
0005798708.tif 000013
【図９】
0005798708.tif 000014
【図１０】
0005798708.tif 000015
【図１１】
0005798708.tif 000016
【図１２】
0005798708.tif 000017
【図１３】
0005798708.tif 000018
【図１４】
0005798708.tif 000019
【図１５】
0005798708.tif 000020
【図１６】
0005798708.tif 000021
【図１７】
0005798708.tif 000022
【図１８】
0005798708.tif 000023
【図１９】
0005798708.tif 000024
【図２０】
0005798708.tif 000025
【図２１】
0005798708.tif 000026