(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスパラギン酸、アルギニン、リシン、グルタミン酸、シトルリン、オルニチンおよびカナバニンから選択される２種のアミノ酸から構成される１種もしくは複数のβ−ジペプチド単位を本質的に含むペプチド構造であるシアノフィシン（ＣＧＰ）またはＣＧＰ様ポリマーの調製品からのβ−ジペプチド組成物の酵素的製造のための方法であって、前記方法は、分子量４５ｋＤａ、至適温度５０℃および至適ｐＨ範囲７から８．５を有しＣＧＰをβ−Ａｓｐ−Ａｒｇにしてβ−ジペプチドに分解するシュードモナス・アルカリジェネス由来のＣＧＰａｓｅで、前記ＣＧＰもしくはＣＧＰ様ポリマーの調製品を分解するステップを含む方法。
【請求項２】
前記ＣＧＰａｓｅが、シュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株に由来するＣＧＰａｓｅである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＧＰａｓｅが、ＤＳＭＺにＤＳＭ２１５３３として寄託されているシュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１のＣＧＰａｓｅ  ＣｐｈＥａｌである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）前記β−ジペプチド組成物が、単一のβ−ジペプチドまたはβ−ジペプチドの混合物から構成され；および／または
（ｉｉ）前記β−ジペプチド組成物が、アスパラギン酸、アルギニン、リシンおよびＣＧＰ様ポリマー中に存在する他のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基を含むβ−ジペプチドから構成される、
請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記β−ジペプチドまたはβ−ジペプチド単位が、β−アスパラギン酸−アルギニンおよびβ−アスパラギン酸−リシンから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＧＰまたはＣＧＰ様ポリマー調製品を、原核生物または真核生物産生細胞系を培養することによって調製するステップをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記産生細胞系が、大腸菌、ラルストニア・ユートロファ、アシネトバクター・ベイリー、コリネバクテリウム・グルタミクム、シュードモナス・プチダ、酵母株および植物バイオマスから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記産生細胞系が、ラルストニア・ユートロファＨ１６−ＰＨＢ−４−Δｅｄａ（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ｃｐｈＡ６３０８／ｅｄａＨ１６）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記産生細胞系を培養することによって得られたＣＧＰ産物を、単離するステップ、精製するステップ、および／または、化学的に修飾するステップを更に含む、請求項６、７または８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記産生細胞系を培養することによって得られた前記ＣＧＰ産物を、単離または精製せずに、直接ＣＧＰａｓｅを用いた分解に供する、請求項６、７または８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記分解産物を精製するステップまたは分離するステップをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記分解産物を化学的に修飾するステップをさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から３のいずれか一項に記載のＣＧＰａｓｅ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シアノフィシン（ＣＧＰ）またはＣＧＰ様ポリマー調製品からの、ＣＧＰａｓｅを用いたポリマー調製品の分解によるジペプチド組成物の酵素的製造方法、本方法に特に適合したＣＧＰａｓｅ、およびシアノフィシン（ＣＧＰ）もしくはＣＧＰ様ポリマーまたはそれらの断片、とりわけ、上に定義された方法により得られるジペプチド組成物の、医薬組成物、医薬品または食品もしくは代用食品としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
３種の異なるポリ（アミノ酸）：ポリ（ε−Ｌ−リシン）（ε−ＰＬ）、ポリ（γ−グルタミン酸）（γ−ＰＧＡ）およびシアノフィシン（ＣＧＰ）が天然に存在することが公知である。ポリ（アミノ酸）は、さまざまな環境に存在し、生物の生産においてさまざまな機能を果たしている（Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ５：１１６６〜１１７６（２００４年））。例えば、シアノフィシン顆粒ポリペプチド（ＣＧＰ）として公知であり、１００年以上前にシアノバクテリアにおいて発見された（Ｂｏｒｚｉ，Ａ．、Ｍａｌｐｉｇｈｉａ  １：２８〜７４（１８８７年））シアノフィシン（マルチ−Ｌ−アルギニル−ポリ−［Ｌ−アスパラギン酸］）は、生物に窒素、炭素およびエネルギーを提供する。シアノフィシンは、個々のビルディングブロックに５個の窒素原子を含有し、その結果理想的な細胞内窒素貯蔵となっている（Ｍａｃｋｅｒｒａｓ，Ａ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３６：２０５７〜２０６５（１９９０年））。ポリ（アミノ酸）の生体適合性および完全な生分解性は、生体臨床医学、農業、農芸化学、パーソナルケアおよび薬学の分野において人生のさまざまな利用にとって理想的な候補にする（Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ５：１１６６〜１１７６（２００４年））。
【０００３】
藍藻のスピルリナを含むシアノバクテリアのいくつかの種は、ヒトおよび動物にとっての栄養源として奨励されてきた（Ｋｉｈｌｂｅｒｇ，Ｒ．、Ａ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２６：４２７〜４６６（１９７２年））。ＣＧＰそれ自体は、シアノバクテリアにおいて１８８７年に発見された。シアノバクテリアの大部分の属は、機能性のシアノフィシン合成酵素遺伝子（ｃｐｈＡ）を有し、ＣＧＰを合成する（Ｍａｃｋｅｒｒａｓ，Ａ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３６：２０５７〜２０６５（１９９０年））。ＣｐｈＡをコードする遺伝子は、従属栄養細菌においても同定されている（Ｋｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋ，Ｍ．ら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７７：３７１〜３８０（２００２年）；Ｆｕｓｅｒ，Ｇ．ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．７：２７８〜２９６（２００７年））。分岐ポリマーは、細胞質において、膜のない不溶性細胞内顆粒として存在する（Ａｌｌｅｎ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１４８０〜１４８４（１９８３年））。分岐ポリマーは、個々のアスパラギン酸のβ−カルボキシル基に、そのα−アミノ基により連結したアルギニン部分を有する、ポリ（アスパラギン酸）（ＰＡＡ）骨格の形態で配列された、当モル量のアルギニンおよびアスパラギン酸からなる（Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．Ｄ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４２０：１６５〜１７６（１９７６年））。大規模製造のために、シアノバクテリアのｃｐｈＡ遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｉｌ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）に、異種的にクローニングされた。組換え細菌由来のＣＧＰは少量のリシンを含有する（Ｖｏｓｓ、Ｉ．ら、Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｅｎｇ．８：６６〜７８（２００６年））。ＣＧＰはさまざまな自然の生息環境に広範囲に広がっており、細胞内または細胞外のＣＧＰａｓｅ（それぞれ、ＣｐｈＢ、ＣｐｈＥ）により分解される。ＣｐｈＥを保有する細菌は、さまざまな生息環境において発見され、ＣｐｈＥＰａおよびＣｐｈＥＢｍがそれぞれ、シュードモナス・アンギリセプチカ（Ｐ．ａｎｇｕｌｌｉｓｅｐｔｉｃａ）ＢＩおよび巨大菌（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＢＡＣ１９から単離され、特徴付けられた（Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２５０９６〜２５１０５（２００２年）；Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ５：１５３〜１６１（２００４年））。ＣＧＰの分解は、偏性嫌気性菌または通性嫌気性菌、例えばそれぞれ、セディメンチバクター・ホンコンエンシス（Ｓｅｄｉｍｅｎｔｉｂａｃｔｅｒ  ｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ）ＫＩまたはシュードモナス・アルカリジェネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）ＤＩＰ１により、嫌気性の生息環境においても起こる（Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：３６４２〜３６５２（２００５年）；Ｓａｌｌａｍ，Ａ．ら、公開用に提出（２００８年））。公知のすべてのＣＧＰａｓｅは、ＣＧＰ由来の水溶性β−ジペプチドを産生し、これらはその後細胞に輸送され、さらに分解される（Ｓａｌｌａｍ，Ａ．ら、公開用に提出（２００８））。
【０００４】
タンパク質の分解および輸送は、生命にとって不可欠である。例えば反芻動物において、食物タンパク質の大部分は第１胃の細菌叢により、アミノ酸およびペプチドに分解される。アミノ酸は、微生物タンパク質に組み込まれるか、または消化管の次の部分へ通過するか、または胃壁を通過し直接血液に吸収されるかである（Ｆａｉｘ，Ｓ.ら、Ａｃｔａ  Ｖｅｔ．Ｂｒｎｏ．７０：２４３〜２４６（２００１年））。しかし、トリペプチドおよびジペプチドは、遊離のアミノ酸より効率的に利用され、より優れた栄養価を有し、より多く吸収され（遊離のアミノ酸より最大１８５％）（Ａｄｉｂｉ，Ｓ．Ａ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５０：２２６６〜２２７５（１９７１年））、体重増加の強化に寄与する完全なタンパク質より多くの窒素を保有する（Ｄｏｃｋ，Ｄ．Ｂ．ら、Ｂｉｏｃｅｌｌ  ２８：１４３〜１５０（２００４年））。特定のアミノ酸の輸送に遺伝的な損傷を有する患者における吸収の研究により、ジペプチドとして投与した場合、これらのアミノ酸の正常な吸収が示された。このことは、ジペプチドに関する特殊化された、有効な輸送系の存在を示した（Ａｄｉｂｉ，Ｓ．Ａ．、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１３：３３２〜３４０（１９９７年））。したがって、加水分解タンパク質食は、飼料添加物として頻繁に適用され、栄養失調の症例を回復させる（Ｄｏｃｋ，Ｄ．Ｂ．ら、Ｂｉｏｃｅｌｌ  ２８：１４３〜１５０（２００４年））。
【０００５】
半必須アミノ酸のアルギニンは、細胞生理においていくつかの極めて重要な役割を果たし、したがって多くの心臓血管、泌尿生殖器、胃腸または免疫の障害のための治療計画に適用される（総説には、（Ａｐｐｌｅｔｏｎ，Ｊ．、Ａｌｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．７：５１２〜５２２（２００２年）を参照されたい）。必須アミノ酸のリシンは人および動物の食品添加物として公知であり、単純ヘルペスウィルスに対する抗ウィルス活性を有し、小腸におけるカルシウムの吸収を改善し、したがって骨粗しょう症に対して作用する（Ｃｙｎｏｂｅｒ，Ｌ．Ａ．、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、第２版、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＵＳＡ（２００３年））。非必須アミノ酸のアスパラギン酸は、特に、エネルギー代謝のためにＬ−アルギニンの前駆体として機能し（Ｖｏｅｔ，Ｄ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．第３版Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００４年））、陽イオンまたは他のアミノ酸の薬剤送達に使用される（Ｃｙｎｏｂｅｒ，Ｌ．Ａ．、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．第２版、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＵＳＡ（２００３年））。アミノ酸は、ジペプチド形態でより高い生体利用効率を有するので、ジペプチドとしてのそれらの投与は臨床的に承認されており、市販の製品で利用可能である（Ｄｕｒｕｙ，Ａ．ら、Ｖｉｅ．Ｍｅｄ．Ｉｎｔ．９：１５８９（１９６５年）；Ｄｕｒｕｙ，Ａ．、Ｍｅｄ．Ｉｎｔ．１：２０３（１９６６年）；Ｓｅｌｌｉｅｒ，Ｊ．，Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｔｏｕｌｏｕｓｅ  ５：８７９（１９７９年）；Ｄｅ−Ａｌｏｙｓｉｏ，Ｄ．ら、Ａｃｔａ  Ｅｕｒ．Ｆｅｒｔｉｌ．１３：１３３〜１６７（１９８２年）；Ｒｏｈｄｅｗａｌｄ，Ｐ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．４０：１５８〜１６８（２００２年）；Ｌａｍｍ，Ｓ．ら、Ｅｕｒ．Ｂｕｌｌ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１１：２９〜３７（２００３年））。
【０００６】
現在までに、ＣＧＰそれ自体の直接適用は知られていない。ＣＧＰについての先行する研究は、生分解性ＰＡＡの潜在的供給源としてのＣＧＰにより動機付けられていた（Ｍｏｏｉｂｒｏｅｋ，Ｈ．ら、Ａｐｐｉ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７：２５７〜２６７（２００７年））。後者は、透析膜、人工皮膚および整形外科用インプラントにおける成分として、または薬剤の担体として、多くの適用可能性を有する（Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ５：１１６６〜１１７６（２００４年））。ＰＡＡもまた、非生分解性ポリアクリル酸塩の代わりにでき、そのための多くの工業的応用が記載されている。これは、哺乳動物、鳥類および魚類の腸管内菌叢によるＣＧＰの生分解、ならびにその後の栄養添加物および／または治療添加物としてのＣＧＰおよびそのジペプチドの適用可能性についての最初の研究である。
【０００７】
哺乳動物、鳥類および魚類の腸管内菌叢のいくつかのサンプルは、シアノフィシンの分解に関して調査された。すべてのサンプルは、３７℃において１２〜４８時間のインキュベーションにわたって、嫌気的にＣＧＰを完全に分解した。ＣＧＰ分解性細菌は、すべてのサンプルにおいて発見され、ウサギおよびヒツジ由来の盲腸菌叢ならびにコイの消化管菌叢において高度に濃縮されていた。総計６２の純粋培養が、単離され、嫌気的にＣＧＰを分解し、そのうちの４６は、２４時間から７日間に及ぶ期間のインキュベーションを通したＣＧＰの嫌気的分解も行った。ＨＰＬＣ分析により、すべての単離株がＣＧＰをその構成要素となるジペプチドに分解したことが明らかになった。８株が１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列決定により同定され、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）の各属に関連付けられた。ＣＧＰは、０．０６〜０．１５％（ｗｔ／ｗｔ）のＣＧＰを含有する、３種の異なるスピルリナ・プラテンシス（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）の市販の製品において見出すことができる。ＣＧＰが細胞外のＣＧＰ分解で分解できること、消化管におけるＣＧＰの生分解性についての最初の証拠、続いて、ＣＧＰおよびそのジペプチドの、アルギニン、リシン、アスパラギン酸および他のアミノ酸候補の生物学的に高度に利用可能な供給源として、栄養および治療における適用の可能性が現在見出されている。
【０００８】
対数増殖期から定常期の移行期の間に、シアノバクテリア中にＣＧＰが蓄積する（Ｍａｃｋｅｒｒａｓ，Ａ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３６：２０５７〜２０６５（１９９０年）；Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．３６：９３２〜９４１（２０００年））。シアノバクテリアの大部分の属は、機能性シアノフィシン合成酵素遺伝子（ｃｐｈＡ）を有し、ＣＧＰを合成する（Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．Ｄ．１９８７年。Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ：ｃｙａｎｏｐｈｙｃｈｉｎ，ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐｏｌｙｈｅｄｒａｌ  ｂｏｄｉｅｓ，１９９〜２２５。Ｐ．ＦａｙおよびＣ．ｖａｎ  Ｂａａｌｅｎ（編）、Ｔｈｅ  Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；Ａｌｌｅｎ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１６７：２０７〜２１３（１９８８年）；Ｍａｃｋｅｒｒａｓ，Ａ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３６：２０５７〜２０６５（１９９０年）；Ｌｉｏｔｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４２：６１１〜６２２（１９９６年）；Ｗｉｎｇａｒｄ，Ｌ．Ｌ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：１７７２〜１７７７（２００２年））。ｃｐｈＡ遺伝子は、さらに従属栄養細菌においても同定された（Ｋｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋ，Ｍ．ら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７７：３７１〜３８０（２００２年）；Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．５７ｃ：５２２〜５２９（２００２年））。ポリマーは、細胞質において細胞内膜のない顆粒として存在し、中性ｐＨおよび生理的イオン強度において不溶性である（Ａｌｌｅｎ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４１：６８７〜６９３（１９８０年））。ＣＧＰは、低温、低光度、リンまたはイオウの制限を含む制限条件下で蓄積される（Ｓｔｅｐｈａｎら、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．５５：９２７〜９４２（２０００年））。シアノバクテリアにおいて、ポリマー鎖の分子量は、２５から１００ｋＤａに及び（Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．Ｄ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ４２２：４０７〜４１８（１９７６年））、一方組換え鎖由来のポリマーは、低い範囲（２５から３０ｋＤａ）および多分散性を示す。さらに、組換え鎖由来のポリマーが、さらなるアミノ酸成分としてリシンを含有したことが発見された（Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｋ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４：１５４〜１５９（１９９８年）；Ａｂｏｕｌｍａｇｄ，Ｅ．ら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２：１３３８〜１３４２（２００１年））。ＣＧＰは、一時的な窒素、エネルギーおよびおそらく炭素の貯蔵として機能する（Ｌｉ，Ｈ．ら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７６：９〜１８（２００１年）；Ｅｌｂａｈｌｏｕｌ，Ｙ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：７７５９〜７７６７（２００５年））。ＣＧＰは５個の窒素原子を個々のビルディングブロックに含有するので、完全な細胞内窒素貯蔵としての基準を満たしている（Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．Ｄ．１９８７．Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｉｅ��  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ：ｃｙａｎｏｐｈｙｃｈｉｎ，ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐｏｌｙｈｅｄｒａｌ  ｂｏｄｉｅｓ、１９９〜２２５ページ。Ｐ．ＦａｙおよびＣ．ｖａｎ  Ｂａａｌｅｎ（編）、Ｔｈｅ  Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。
【０００９】
ＣＧＰの細胞内分解は、細胞質に存在する高度に特異的なシアノフィシナーゼ（ＣｐｈＢ）により触媒され、β−ジペプチドの形成をもたらすα−切断機構を介して進行する（Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｒ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６３：１６３〜１６９（１９９９年））。ＣＧＰは、ＣＧＰを蓄積できない細菌に対しても有益な基質となっている（Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：３６４２〜３６５２（２００５年）；Ｓａｌｌａｍ，Ａ．およびＡ．Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ．２００７ａ）。湖沼堆積物から単離された新規な中温性、タンパク質分解性細菌である新種クロストリジウム・スルフォティレデュセンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）は、チオ硫酸塩、イオウを還元でき、一時的に硫酸塩を還元でき、このような細菌の多くはＣＧＰをその利用可能なジペプチドに分解する、細胞外シアノフィシナーゼの保有を示し、これらのジペプチドは細胞に輸送され、さらに利用される得る（Ｓａｌｌａｍ，Ａ．およびＡ．Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ．２００７ｂ。Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ａｎｄ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙａｎｏｐｈｙｃｉｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＤＩＰ１−Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｏｔｈｅｒ  ｔｈｒｅｅ  ｃｏ−ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｉｘｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．公開用に提出。）。グラム陰性細菌のシュードモナス・アンギリセプチカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｎｇｕｌｌｉｓｅｐｔｉｃａ）、ＢＩ株由来のＣｐｈＥＰａなど、これらの酵素のいくつかの例が単離され、特徴付けられた。この細胞外酵素は、ＣｐｈＢと同様にＣＧＰ分解のためのα−切断機構を示す（Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２５０９６〜２５１０５（２００２年））。
【００１０】
細胞外ＣｐｈＥＢｍが巨大菌ＢＡＣ１９株から単離された時、さらにグラム陽性細菌もまたＣＧＰａｓｅを分泌することが発見され（Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ５：１５３〜１６１（２００４年））、ＣｐｈＥＰａおよびＣｐｈＥＢｍは双方ともセリン型の加水分解酵素として同定された。最近の研究により、細胞外ＣＧＰの分解は偏性嫌気性細菌および通性嫌気性細菌（例えば、それぞれセディメンチバクター・ホンコンエンシス（Ｓｅｄｉｍｅｎｔｉｂａｃｔｅｒ  ｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ）、ＫＩ株（Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：３６４２〜３６５２（２００５年））およびシュードモナス・アルカリジェネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、ＤＩＰ１株など）由来のＣＧＰａｓｅにより触媒されうることが明らかになった（Ｓａｌｌａｍ，Ａ．およびＡ．Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ．２００７ｂ。Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ａｎｄ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙａｎｏｐｈｙｃｉｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＤＩＰ１−Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｏｔｈｅｒ  ｔｈｒｅｅ  ｃｏ−ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｉｘｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．公開用に提出。）。すべての調査されたＣＧＰａｓｅは、切断産物としてβ−Ａｓｐ−Ａｒｇジペプチドをもたらしたが、ＣｐｈＥＢｍの場合（Ａｓｐ−Ａｒｇ）２テトラペプチドもさらに検出された（Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ５：１５３〜１６１（２００４年））。
【００１１】
最近まで、ＣＧＰそれ自体またはジペプチドそれら自体に関する実用的応用は知られていなかった。対照的に、ＣＧＰの構造要素である（ポリマー骨格）であるポリ（アスパラギン酸）（ＰＡＡ）に関しては、非生分解性ポリアクリル酸塩の代替として経済的に重要な応用が確立されている、（Ｓｃｈｗａｍｂｏｒｎ，Ｍ．，Ｐｏｌｙｍ．Ｄｅｇｒａｄ．Ｓｔａｂ．５９：３９〜４５（１９９８年））。ＰＡＡは、製紙産業、塗料産業および石油産業を含む多くの分野において、さらに用いることができる（Ｊｏｅｎｔｇｅｎ，Ｗ．ら、２００３年。Ｐｏｌｙａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄｓ．１７５〜１９９ページ。：Ｓ．Ｒ．ＦａｈｎｅｓｔｏｃｋおよびＡ．Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ（編）、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、７巻。Ｗｉｌｅｙ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍによる総説）。ＰＡＡに関する生物医学的応用もまた記載されている（Ｌｅｏｐｏｌｄ，Ｃ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．４：３９７〜４０６（１９９５年）；Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６：１６９３〜１７００（１９９０年））。つい最近、ＣＧＰジペプチドに関する生物医学的応用およびＣＧＰそれ自体の可能性が明らかにされ、これらの応用は、第１に、多数の調査された哺乳動物、鳥類および魚類の菌叢における驚くほど広範囲なＣＧＰ分解細菌に依存しており、このことは、それぞれの消化管内においてＣＧＰがおそらく分解可能であろうことを示し、一方、ジペプチドまたはトリペプチドの形態で投与された場合、アミノ酸の生体利用効率が上昇することは周知の理論であり、いくつかの治療分野において有効に応用されている。したがって、ＣＧＰおよび／またはそのβ−ジペプチドは、近い将来天然の食品添加物および／または治療添加物候補として考えることができる（Ｓａｌｌａｍ，Ａ．およびＡ．Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ．２００７ｃ。Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｃｙａｎｏｐｈｙｃｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  β−ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ，ｆｏｏｄ  ａｎｄ  ｆｅｅｄ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）。
【００１２】
準工業的な量でのＣＧＰの製造および効率的な単離は、わずか最近数年の間に確立された。大腸菌、ラルストニア・ユートロファ、シュードモナス・プチダおよびアシネトバクター・ベイリー（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１株のいくつかの細菌株を用い、後者は、約４６％（ｗｔ／ｗｔ）の最大ＣＧＰ収率を示した（Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、１６７〜１９４ページ。Ｊ．Ｍ．Ｓｈｉｖｅｌｙ（編）、Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ、１巻、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（２００６年））。しかし、所要の基質および培養条件は、経済的に適切なＣＧＰ産生を選択するための重要な因子でもある。
【００１３】
純粋なＣＧＰ−ジペプチドは、ＣＧＰ含有バイオマスから出発し、純粋なＣＧＰ−ジペプチドで終わる経済的な大規模方法で調製できる。なぜならば、シュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株は、単純な発育要求で高度の酵素生産性を示すことができるからである。この株は、このような工業的方法にとって理想的であることが見出された。
【００１４】
シアノフィシンは個々のビルディングブロックに５個の窒素原子を含有し、したがって、完全な動的細胞内窒素貯蔵の基準を、確実に達成する（Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．Ｄ．１９８７．Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ：ｃｙａｎｏｐｈｙｃｉｎ，ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐｏｌｙｈｅｄｒａｌ  ｂｏｄｉｅｓ、１９９〜２２５ページ。Ｐ．ＦａｙおよびＣ．ｖａｎ  Ｂａａｌｅｎ（編）、Ｔｈｅ  Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）；その量的変動は、細胞の要求に従う（Ｃａｒｒ，Ｎ．Ｇ．１９８８年。Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｓｅｒｖｅｓ  ａｎｄ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒｓ  ｉｎ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、１３〜２１。Ｌ．Ｊ．ＲｏｇｅｒｓおよびＪ．Ｒ．Ｇａｌｌｏｎ（編）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｇａｅ  ａｎｄ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｎｎｕａｌ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｅｕｒｏｐｅ、Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ．）。ポリマーは、タンパク質合成が、対数増殖期から定常期へと移行する間に自然に減少する時（Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．Ｄ．、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９２：１１５〜１２２（１９７３ａ））またはタンパク質生合成の阻害剤（例えばクロラムフェニコール）の添加により減少する時のどちらかにおいて、（Ｉｎｇｒａｍ，Ｌ．Ｏ．ら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８１：１〜１２（１９７２年）；Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．Ｄ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１４：１２１３〜１２１６（１９７３ｂ））シアノバクテリア中に蓄積され、ポリマーは、バランスの取れた成長が再開する時消失する（Ｍａｃｋｅｒｒａｓ，Ａ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３６：２０５７〜２０６５（１９９０年））。ＣＧＰの蓄積は、リンの制限（Ｓｔｅｐｈａｎら、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．５５：９２７〜９４２（２０００年））、イオウの制限（Ａｒｉｎｏ，Ｘ．ら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６３：４４７〜４５３（１９９５年））、低温、低光度またはこれらの因子の組み合わせによってもさらに促進される（Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ５：１１６６〜１１７６（２００４年））。
【００１５】
精製されたＣＧＰまたはその細胞内含有量のどちらかの決定および定量化に関する異なる方法が開発された。ＣＧＰのアルギニン含有量は、加水分解ポリマーまたは非加水分解ポリマーのどちらかにおいて、Ｓａｋａｇｕｓｈｉ試薬により比色分析的に定量化された（Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．Ｄ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１４：１２１３〜１２１６（１９７３ｂ））。精製シアノフィシンのアミノ酸成分は、ＨＰＬＣにより決定できた（Ａｂｏｕｌｍａｇｄ，Ｅ．ら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７４：２９７〜３０６（２０００年））。シアノフィシンの高速かつ高感度な決定のために１Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）に基づく方法が開発された（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｎ．Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１５３６：５〜９（２００１年））。
【００１６】
ＣＧＰ分解（細胞内または細胞外）は、その利用可能なジペプチドの放出を主にもたらし、その後これらは細胞内で、細胞代謝に携わるその構成アミノ酸に分割される。シアノフィシンの細胞内分解は、シアノフィシナーゼ（ＣｐｈＢ）により触媒される。第１のシアノフィシナーゼは、Ｇｕｐｔａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２５：１７〜２３（１９８１年）により、アナベナ・シンドリカ（Ａｎａｂａｅｎａ  ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）の異質細胞および栄養細胞中にあることが記載された。この酵素は、単量体２９．４ｋＤａ、セリン型であり、シアノフィシン特異的エクソペプチダーゼであり、その主要分解産物は、α−切断機構を介したアスパラギン酸・アルギニン・ジペプチドであった（Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｒ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６３：１６３〜１６９（１９９９年））。最近数年で、細胞外シアノフィシナーゼ（ＣｐｈＥ）によりシアノフィシンを分解できる好気性菌および嫌気性菌が単離された（Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２５０９６〜２５１０５（２００２年））；Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ５：１５３〜１６１（２００４年）；Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：３６４２〜３６５２（２００５年）；Ｓａｌｌａｍ，Ａ．およびＡ．Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ．２００７ｂ。Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ａｎｄ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙａｎｏｐｈｙｃｉｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＤＩＰ１−Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｏｔｈｅｒ  ｔｈｒｅｅ  ｃｏ−ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｉｘｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．公開用に提出。）。ＣｐｈＢと同様に、すでに細胞外ＣＧＰａｓｅと特徴付けられた、それぞれシュードモナス・アンギリセプチカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａ）Ｂ１株および巨大菌ＢＡＣ１９株に由来するＣｐｈＥＰａおよびＣｐｈＥＢｍが、セリン型のシアノフィシン特異的酵素として同定され、ＣＧＰ−ジペプチドを分解産物として産生するが、ＣｐｈＥＢｍの場合、（Ａｓｐ−Ａｒｇ）２テトラペプチドがさらに検出される。ＣｐｈＥＰａ標識研究により、この酵素はカルボキシル末端においてＣＧＰを加水分解し、分解されたポリマー鎖の末端からβ−Ａｓｐ−Ａｒｇジペプチドを連続的に放出することが示された（総説には、Ｏｂｓｔ，Ｍら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ５：１１６６〜１１７６（２００４年）を参照されたい）。さらに、シュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１由来の第３の細胞外シアノフィシナーゼ（ＣｐｈＥａｌ）は、近年、ＣＧＰ−ジペプチドの工業的製造のために粗形態で用いられた（Ｓａｌｌａｍ，Ａ．およびＡ．Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ．２００８ｂ。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  β−ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｙａｎｏｐｈｙｃｉｎ。準備中）。
【００１７】
準工業的な量でのＣＧＰの製造および効率的な単離は、わずか最近数年の間に確立された。大腸菌、ラルストニア・ユートロファ、シュードモナス・プチダおよびアシネトバクター・ベイリーのいくつかの細菌株を用いることに成功した（Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ５：１１６６〜１１７６（２００４年））。しかし、ＣＧＰのバイオテクノロジー関連は、工業的応用［例えば水処理；製紙工業および皮革工業に分散剤として（Ｒｏｗｅｔｏｎ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｐｏｌｙｍ．Ｄｅｇｒａｄ．５：１７５〜１８１（１９９７年）；Ｍｏｏｉｂｒｏｅｋ，Ｈ．ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７：２５７〜２６７（２００７年））またはポリアクリル酸塩の生分解性代替として（Ｓｃｈｗａｍｂｏｒｎ，Ｍ．、Ｐｏｌｙｍ．Ｄｅｇｒａｄ．Ｓｔａｂ．５９：３９〜４５（１９９８年））の高い可能性を有するポリ（アスパラギン酸）の供給源であることに理論的に基づいている。ＰＡＡは、透析膜、人工皮膚、整形外科用インプラントの成分として、または薬剤の担体として、生物医学的応用可能性をさらに有する（Ｌｅｏｐｏｌｄ，Ｃ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．４：３９７〜４０６（１９９５年））。
【００１８】
上に説明したように、ＣＧＰ−ジペプチドの生物医学的応用およびＣＧＰそれ自体の可能性が明らかになり、このことは、哺乳動物および魚類の消化管内においてＣＧＰがおそらく分解可能であろうことを示し、ポリマーおよびそれらのジペプチドは、近い将来天然の食品添加物および／または治療添加物の候補であることを表した。したがって、シュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株由来の粗ＣｐｈＥａｌを使用する、ＣＧＰからジペプチドを製造する大規模な方法が最近構築された。この独自の方法は、３相；第Ｉ相：ＣＧＰの大規模抽出および精製、第ＩＩ相：粗ＣｐｈＥａｌの粉末の大規模製造、第ＩＩＩ相：ＣＧＰのそのジペプチドへの分解を含み、前記のように構成された。この独自の方法の、後期の２つの相は将来の応用のために大きく最適化することができることが、現在発見されている。さらに、ＣｐｈＥａｌは、粗粉末から工業的に精製され、その生化学的特徴が明らかにされた。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
したがって、本発明は、
（１）ＣＧＰａｓｅを用いたポリマー調製品の分解を含む、シアノフィシン（ＣＧＰ）またはＣＧＰ様ポリマー調製品からのジペプチド組成物の酵素的製造の方法、
（２）上記（１）の方法の好ましい実施形態であって、ＣＧＰａｓｅが、
（ｉ）分子量４５ｋＤａ、至適温度５０°Ｃ、至適ｐＨ範囲７〜８．５であり、ＣＧＰをβ−Ａｓｐ−Ａｒｇに分解する、および／または
（ｉｉ）ＤＳＭ２１５３３としてＤＳＭＺに寄託されたシュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株のＣＧＰａｓｅのＣｐｈＥａｌ、またはＣＧｐまたはＣＧＰ様ポリマーをジペプチドに切断できるそれらの突然変異体、誘導体もしくは断片である実施形態、
（３）上記の（２）に定義されたＣＧＰａｓｅ、ならびに
（４）シアノフィシン（ＣＧＰ）またはＣＧＰ様ポリマーまたはそれらの断片を含む、組成物、医薬組成物、医薬品、食品補助剤または飼料補助剤、
（５）栄養療法のための医薬品を調製するため、または食品補助剤もしくは飼料補助剤としての、シアノフィシン（ＣＧＰ）またはＣＧＰ様ポリマーまたはそれらの断片の使用、
（６）治療を必要とする患者の栄養療法のための方法であって、適切な量のシアノフィシン（ＣＧＰ）もしくはＣＧＰ様ポリマーまたはそれらの断片を含む組成物を患者に投与するステップを含む方法、
（７）組成物、医薬組成物、医薬品、食品補助剤または飼料補助剤が、ＣＧＰもしくはＣＧＰ様ポリマーが、酵素的タンパク質分解により生じるジペプチドまたはジペプチド混合物を含む、好ましくはこのジペプチド混合物が、β−アスパラギン酸−アルギニンおよびβ−アスパラギン酸−リシンから構成される、および／または上記の（１）または（２）の方法により得ることができる、上記の（４）から（６）の好ましい実施形態
を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列に基づく近隣結合系統樹が、すでに単離された、およびこの研究の期間に単離されたＣＧＰ分解細菌中に確立された系統関係を示す図である。太字の株は本研究期間中に単離された。下線を引いた株はＣＧＰ分解に関してすでに調査されていた。（Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２５０９６〜２５１０５（２００２年）；Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ５：１５３〜１６１（２００４年）；Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：３６４２〜３６５２（２００５年）；Ｓａｌｌａｍ，Ａ．ら、公開のために出版（２００８年））。大腸菌Ｋ１２は、外集団として使用した。受託番号を括弧に入れて示す。ブートストラップ値を、１００反復のパーセントとして示す。バーは２％配列分岐である。
【図１Ｂ】１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列に基づく近隣結合系統樹が、すでに単離された、およびこの研究の期間に単離されたＣＧＰ分解細菌中に確立された系統関係を示す図である。太字の株は本研究期間中に単離された。下線を引いた株はＣＧＰ分解に関してすでに調査されていた。（Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２５０９６〜２５１０５（２００２年）；Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ５：１５３〜１６１（２００４年）；Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：３６４２〜３６５２（２００５年）；Ｓａｌｌａｍ，Ａ．ら、公開のために出版（２００８年））。大腸菌Ｋ１２は、外集団として使用した。受託番号を括弧に入れて示す。ブートストラップ値を、１００反復のパーセントとして示す。バーは２％配列分岐である。
【図２】シュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株由来の細胞外ＣＧＰａｓｅにより、ＣＧＰ重層寒天プレート上に発生した分解ハローの図である。ＣｐｈＥ：分解相（第ＩＩＩ相）前の粗粉末、ＣｐｈＥ  Ｒ：分解相後の回収粉末。
【図３】異なる基質についてのシュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株の成長の図である。１００ｍｌのバッフル付きＫｌｅｔｔフラスコにおいて培養を行った；個々のフラスコは、１０ｍｌのＳＭ培地および１ｇｌ−１の被検基質を含有した。実験は、同じ試験条件下で成長した前培養から接種し、二重に実施した。成長は、３０℃において２４時間インキュベート後、ＯＤ５７８ｎｍの増加によって観察した。
【図４】さまざまな粗ＣｐｈＥ濃度（１〜１０ｇ／ｌ）の触媒効果の下での、さまざまなＣＧＰ濃度（１０〜５０ｇ／ｌ）の完全な分解のための所要インキュベーション期間の図である。反応チューブを、３０℃で、回転速度３ｒｐｍのチューブローテーターにおいてインキュベートした。最も高いＣＧＰの被検濃度（５０ｇ／ｌ）は、２ｇ／ｌの粗ＣｐｈＥ粉末の存在下で１０時間以内に分解できた。
【図５】４２０ｌのＳＭ培地およびｇ／ｌのクエン酸ナトリウムを含有し、４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の前培養を接種した、Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｄ６５０攪拌式タンク型反応器におけるシュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１のバッチ醗酵の図である。前培養は、１ｌの同じ培地を含有する２ｌのバッフル付きフラスコにおいて培養し、３０℃において１２時間インキュベートした。ＢｉｏｓｔａｔＤ６５０反応器の醗酵パラメーターおよび培養条件は、ｐＨ６．９〜７．５、温度３０℃および０．２ｖｖｍにおける通気であった。ｐＯ２は最小４０％に設定し、攪拌を１００ｒｐｍに維持する以外は攪拌することによって自動的に調製した。矢印は、誘導時間を示す。＊６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）、◆）。＊ｐＨ、⊥）。＊攪拌速度（ｒｐｍ）、▲）。＊ｐＯ２（飽和の％）、−）。＊気流（ｌ  分−１）、・）。
【図６】シュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株の醗酵上清におけるタンパク質の取得、濃縮および脱塩に関する連続系の図である（第ＩＩ相）。取得には、ＣＥＰＡ  Ｚ４１連続遠心分離機を使用して細胞を分離し、上清を中央の１００ｌタンクに回収した。濃縮には、３０ｋＤａのカセットを有するクロスフローユニットを中央タンクに連結し、ろ過液を直接廃棄しながら、濃縮された残留物をタンクに再度ポンプ注入した。クロスフローの流速は、タンクに５０ｌだけ保持するように調整した。最終濃縮の５ｌを５倍のベッドボリュームのＨ２Ｏを用いて脱塩し、−３０℃において凍結し、凍結乾燥した。
【図７】製造したＣＧＰ−ジペプチドの品質管理のためのＴＬＣプレートの図である。Ｉ：標準アミノ酸および被検ろ過系の後に採取した直接ジペプチドサンプル；１：３０ｋＤａ．−ＣＯＰ．クロスフローカセット。２：ろ過膜（１０ｋＤａ．−ＣＯＰ）。３：ろ過膜（５ｋＤａ．−ＣＯＰ）。４：ろ過膜（１ｋＤａ．−ＣＯＰ）。５：ろ過膜（０．５ｋＤａ．−ＣＯＰ）。６：ＣＧＰ−ジペプチド（クロスフローおよび凍結乾燥後の最終チャージ）。ＩＩ：標準アミノ酸および加水分解サンプル；ａ：ＣＧＰ−ジペプチド（クロスフローおよび凍結乾燥後の最終チャージ）。ｂ：Ａｓｐ−Ａｒｇジペプチド。ｃ：Ａｓｐ−Ｌｙｓジペプチド。（ｂ、ｃ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）。すべての直接サンプルに関して１つのスポットだけを示し（Ｉ）、一方加水分解サンプルは、標準アミノ酸のアルパラギン酸、アルギニンおよびリシンに関して典型的なスポットを示した（ＩＩ）。
【図８】４００ｌの７％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）プロタミラス(protamylase)培地および１００ｍｇ  ｌ−１のアンピシリンを含有する、Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｄ６５０攪拌式タンク型反応器における大腸菌ＤＨ１（ｐＭａ／ｃ５−９１４：：ｃｐｈＡｐｃｃ６８０３）のバッチ醗酵の図である。前培養（４％、ｖｏｌ／ｖｏｌ）を、個々に１ｌの醗酵用の培地と同じ培地を含有する２ｌフラスコに調製し、３０℃において２０時間インキュベートした。ＢｉｏｓｔａｔＤ６５０反応器の醗酵パラメーターおよび培養条件は、ｐＨ７．５、０．１７ｖｖｍにおける通気、ｐＯ２は２０％に一定に保ち、攪拌することによって自動的に調製した。醗酵を１５時間、最初の６時間は３０℃、その後３７℃で実施し、ＣＧＰ合成酵素の発現を誘導した。濁度（ＯＤ８５０）（◆）、ｐＯ２（飽和の％）（▼）、通気（ｌ／ｍｉｎ）（▲）、攪拌速度（ｒｐｍ）（  ・）、温度（℃）（■）。
【図９】７％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のプロタミラス(protamylasse)培地でＢｉｏｓｔａｔ  Ｄ６５０反応器において１５時間醗酵させた、大腸菌ＤＨ１（ｐＭＡ／ｃ５．９１４：：ｃｐｈＡｐｃｃ６８０３）の細胞の位相差顕微鏡写真の図である。ＣＧＰのグラナが細胞内に光を反射する蓄積として現れている。バー；１０μｍ。
【図１０】ＣＧＰに対する特異的結合を介した、シュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株由来のＣｐｈＥａｌの精製ステップのＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。ゲルＡ：硝酸銀法により染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ；Ｍ：分子量標準タンパク質、Ｃ：粗ＣｐｈＥａｌの対照、Ｓ１：ＣＧＰおよび粗ＣｐｈＥａｌを一緒に混合した直後の上清サンプル、Ｓ２：６分の結合時間後の上清サンプル、Ｓ２’：１０倍濃縮後のＳ１と同じ、Ｗ１、Ｗ２：双方の洗浄ステップ後の上清サンプル。ゲルＢ：Ａ中の精製ＣｐｈＥａｌを３倍量用い、硝酸銀でより長く染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ。４５ｋＤａにおけるＣｐｈＥａｌの他には、低濃縮タンパク質のバンドはほとんど観察できない。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の態様（１）の方法において、ジペプチド組成物は、単一のジペプチドまたはジペプチドの混合物で構成されていてよい。しかし、ジペプチドは、アスパラギン酸、アルギニン、リシンおよびＣＧＰ様ポリマー中に存在する他のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基を含むことが好ましい。ジペプチドが、β−アスパラギン酸−アルギニンおよびβ−アスパラギン酸−リシンから選択されることが特に好ましい。
【００２２】
本発明に従った「ＣＧＰ」および「ＣＧＰ様ポリマー」は、基本的に１つまたは複数のジペプチド単位で構成されるペプチド構造であり、前記ジペプチド単位が、以下のアミノ酸残基、アスパラギン酸、アルギニン、リシン、グルタミン酸、シトルリン、オルニチン、カネバニン(canevanine)などのうちの２つから構成されることが好ましい。
【００２３】
当分野において公知の非常に種類豊富なＣＧＰａｓｅが、ＣＧＰ分解のために利用できる（表２および４を参照されたい）。しかし、ＣＧＰａｓｅは、シュードモナス・アルカリジェネス由来のＣＧＰａｓｅ、特にシュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株由来のＣＧＰａｓｅであることが好ましい。本発明の態様（２）に従って、ＣＧＰａｓｅは、（ｉ）分子量４５ｋＤａ、至適温度５０°Ｃおよび至適ｐＨ範囲７〜８．５であり、ＣＧＰをβ−Ａｓｐ−Ａｒｇに分解する；および／または（ｉｉ）ＤＳＭ２１５３３としてＤＳＭＺに寄託されたシュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株のＣＧＰａｓｅのＣｐｈＥａｌ、またはＣＧＰまたはＣＧＰ様ポリマーをジペプチドに切断できるそれらの突然変異体、誘導体もしくは断片である。前述の天然のＣＧＰａｓｅの突然変異体、誘導体もしくは断片は、（天然配列の少なくとも５０の連続したアミノ酸残基、好ましくは最大５０、最大３０または最大１０の末端アミノ酸残基が除去された、Ｎおよび／またはＣ末端の切断産物を有する）断片、誘導体（特に、分泌ペプチド、リーダー配列などの機能性タンパク質およびペプチドを有する融合産物およびＰＥＧ、アルコール、アミンなどの化学的部分を有する反応産物）および突然変異体（特に、アミノ酸ベースの天然酵素と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する付加、置換、反転および欠失した突然変異体、または１から２０、好ましくは１から１０の、連続した、または個別のアミノ酸残基が、付加、置換、反転および／または欠失された突然変異体、置換突然変異体に関しては、保存的置換が特に好ましい）を含むが、前記修飾ＣＧＰａｓｅは、天然ＣＧＰａｓｅの酵素活性を有する。
【００２４】
本発明の態様（１）および（２）の方法は、原核性または真核性の産生細胞系を培養することによってＣＧＰまたはＣＧＰ様ポリマー調製品を調製するステップをさらに含むことができる。産生細胞系は、ＣＧＰまたはＣＧＰ様ポリマーを産生できる任意の細胞系であってよい。産生細胞系が、大腸菌、ラルストニア・ユートロファ、アシネトバクター・ベイリー、コリネバクテリウム・グルタミクム、シュードモナス・プチダ、酵母株および植物バイオマスから選択されることが好ましい。特に好ましい産生細胞系は、ラルストニア・ユートロファＨ１６−ＰＨＢ−４−Δｅｄａ（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ｃｐｈＡ６３０８／ｅｄａＨ１６）および大腸菌ＤＨ１（ｐＭａ／ｃ５−９１４：：ｃｐｈＡＰＣＣ６８０３）である。
【００２５】
上記の方法は、産生細胞系を培養することによって得られるＣＧＰ産物を単離、精製および／または化学的修飾するステップをさらに含むことができる。このような単離、精製および化学的修飾分離は、当分野において十分確立された方法によって得ることができる。
【００２６】
しかし、産生細胞系を培養することによって得られるＣＧＰ産物を直接、すなわち、単離または精製せずにＣＧＰａｓｅによる分解に供することが、態様（１）および（２）の方法にとって好ましい。
【００２７】
別の好ましい実施形態において、態様（１）および（２）の方法は、分解産物を精製または分離するステップおよび／または分解産物を化学的修飾するステップをさらに含む。先と同様に、このような精製、分離または化学的修飾は、当分野において十分確立された方法によって得ることができる。
【００２８】
本発明の態様（３）は、
（ｉ）分子量４５ｋＤａ、至適温度５０°Ｃ、至適ｐＨ範囲７〜８．５であり、ＣＧＰをβ−Ａｓｐ−Ａｒｇに分解する、および／または
（ｉｉ）ＤＳＭ２１５３３としてＤＳＭＺに寄託されたシュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１のＣＧＰａｓｅのＣｐｈＥａｌ、またはＣＧｐまたはＣＧＰ様ポリマーをジペプチドに切断できるそれらの突然変異体、誘導体もしくは断片である、
ＣＧＰａｓｅに関する。突然変異体、誘導体および断片に関しては、上記の定義で言及している。
【００２９】
本発明の態様（４）、（５）および（６）に従った医薬組成物、医薬品、食品補助剤または飼料補助剤は、医薬としてまたは食物として許容可能な適切な担体、結合剤などを、さらに含有できる。それらは、それぞれの医薬的目的のための、さらなる活性化合物をさらに含有することができる。
【００３０】
この医薬組成物は、栄養療法に特に適している。栄養療法の型は、下記から明らかになるように、当然ながら組成物／医薬品内に存在するアミノ酸に依存する。重病患者の栄養療法における最近の進歩は、病気の期間の組織タンパク質の恒常性を維持するための、特定のアミノ酸の必要性の十分な理解を提供する（Ｗｉｔｔｅ，Ｍ．Ｂ．およびＢａｒｂｕｌ  Ａ．、Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐ．Ｒｅｇ．１１：４１９〜４２３（２００３年））。すでに、アミノ酸は、非必須（可欠）または必須（不可欠）のどちらかとして分類されていた。しかし、アミノ酸に関するインビボ生理学のより優れた理解により、特定のアミノ酸の要求は条件つきで不可欠であるとして再定義する、代替の分類が提唱された（Ｌａｉｄｌａｗ，Ｓ．Ａ．およびＫｏｐｐｌｅ，Ｊ．Ｄ．、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．４６：５９３〜６０５（１９８７年））。このことは、このようなアミノ酸の使用を、単独または完全な栄養計画の一部として魅力的にし、栄養転帰、免疫応答および組織回復を改善する。以下の項において、いずれもＣＧＰを構築する３種のアミノ酸の生理および作用機構に関する発見を論じる。これらのアミノ酸は、非必須のＬ−アスパラギン酸、半必須のＬ−アルギニンおよび必須アミノ酸のＬ−リシンである。その生理作用の多さから、アルギニンに特に重点が置かれる。
【００３１】
Ｌ−アスパラギン酸：非必須のＬ−アスパラギン酸は、分子量１３３．１０ｇ／モルを有し、ジカルボン酸アミノ酸である。大部分のＬ−アスパラギン酸は、タンパク質中に発見することができ、一方、それらの少量は体液および植物中に遊離の形態で発見することができる（Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｇ．Ｃ．およびＥｌｍｏｒｅ  Ｄ．Ｔ．Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ（１９９８年））。Ｌ−アスパラギン酸は、天然バイオポリマーのＣＧＰおよび合成甘味料のアスパルテームの成分である。アスパラギン酸は、水に溶けにくく、塩の形態でより水溶性である。食物アスパラギン酸は、能動輸送により小腸で吸収され脈循環に進入し、その後、その大部分がタンパク質、プリン、ピリミジンプラントに代謝される肝臓に輸送される（Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｇ．Ｃ．およびＥｌｍｏｒｅ  Ｄ．Ｔ．Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ（１９９８年））。Ｌ−アスパラギン酸は、クエン酸サイクル中のエネルギー供給源として機能でき、したがって疲労に対して有効であることが推定される（さらに以下を参照されたい：Ａｓｐ−Ａｒｇ）。アスパラギン酸は、Ｍｇ２＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋などの陽イオンまたはそれらの生体利用効率の増加のための他のアミノ酸の薬剤送達に使用される（Ｃｙｎｏｂｅｒ，Ｌ．Ａ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．第２版。ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＵＳＡ（２００３年））。
【００３２】
Ｌ−アルギニン：Ｌ−アルギニンは、分子量１７４．２ｇ／ｍｏｌの強塩基性アミノ酸であり、大部分のタンパク質中に発見される。Ｌ−アルギニンは、分子あたり４個の窒素原子を含有し、したがってヒトおよび動物において、最も豊富な窒素担体である（Ａｐｐｌｅｔｏｎ，Ｊ．、Ａｌｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．７：５１２〜５２２（２００２年））。アルギニンは、魚にとって必須であるが（Ａｈｍｅｄ，Ｉ．およびＫｈａｎ，Ｍ．Ａ．、Ａｑｕａｃｕｌｔ．Ｎｕｔｒ．１０：２１７〜２２５（２００４年））、一方で哺乳動物において、アルギニンは栄養摂取を介して、または新たな合成（内因性）を介して補われ得るので、半必須であると考えられる。腎臓において、大部分の内因性アルギニンは、腸または肝臓におけるグルタミン代謝の副産物であるシトルリンに由来する。しかし、アルギニンの生合成は、喪失または不適切な供給の補正を強化しないので、食物摂取（平均的なヒトにとって、およそ５〜６ｇ／日、Ｗｉｔｔｅ，Ｍ．Ｂ．およびＢａｒｂｕｌ．Ａ．、Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐ．Ｒｅｇ．１１：４１９〜４２３（２００３年））は依然として血漿アルギニンレベルの主要な決定因子のままである。
【００３３】
摂取したアルギニンの約５０％は小腸において直接利用され、一方残りは門脈循環に放出される。一般的に、摂取アルギニンの約半分は、主に酵素のアルギナーゼにより急速にオルニチンに転換される（Ｍｏｄｏｌｅｌｌ，Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１１０１〜１１０４（１９９５年）；Ｗｉｔｔｅ，Ｍ．Ｂ．およびＢａｒｂｕｌ．Ａ．、Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐ．Ｒｅｇ．１１：４１９〜４２３（２００３年））。オルニチンは、順にグルタミン酸塩およびプロリンに、または酵素のオルニチンデカルボキシラーゼを介してポリアミンに代謝され得る（Ｂｏｕｔａｒｄ，Ｖ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：２０７７〜２０８４（１９９５年））。残りのアルギニンは、４種の他の酵素：一酸化窒素合成酵素（一酸化窒素になる）、アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（クレアチンになる）、アルギニンデカルボキシラーゼ（アグマチンになる）またはアルギニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（タンパク質合成のための前駆体であるアルギニル−ｔＲＮＡになる）のうちの１種により処理される（Ｖｏｄｏｖｏｔｚ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：６０５〜６１３（１９９３年））。
【００３４】
アルギニンは、ヒトおよび動物において内分泌機能、特に副腎および下垂体の分泌機能に関して有意な効果を有する。しかし、アルギニンがこれらの効果を発揮する正確な機序についてはほとんど知られていない。アルギニンは、心臓血管系においてさまざまな内皮依存性生理効果に関与する内因性メッセンジャー分子である、一酸化窒素（ＮＯ）の生物前駆体である。（Ｗｉｔｔｅ，Ｍ．Ｂ．およびＢａｒｂｕｌ．Ａ．、Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐ．Ｒｅｇ．１１：４１９〜４２３（２００３年））。したがって、アルギニンの臨床効果の多くは、内皮由来弛緩因子についてのその効果を仲介すると考えられる。ＮＯ合成酵素は２種の変異体；構造的（ｃＮＯＳ）およびそのアイソフォームのｅＮＯＳ（血管内皮内膜中）とｎＮＯＳ（ニューロン中）ならびにマクロファージ、白血球、繊維芽細胞、内皮細胞およびケラチノサイトにおいて見出される誘導性変異体（ｉＮＯＳ）を有する（Ｒｏｈｄｅｗａｌｄ，Ｐ．およびＦｅｒｒａｒｉ  Ｖ．、特許出願  ＵＳ２００４１３７０８１（２００４年）。ＮＯの機能は、その細胞供給源とは異なることがあり、繊維芽細胞ＮＯはコラーゲン合成を支持し、一方、内皮ＮＯは血管形成に影響を及ぼし、マクロファージＮＯは細菌に対して細胞増殖抑制性である（Ｒｏｈｄｅｗａｌｄ，Ｐ．およびＦｅｒｒａｒｉ  Ｖ．、特許出願  ＵＳ２００４１３７０８１（２００４年）。他方、アルギナーゼは、ＮＯＳの天然基質、すなわちＬ−アルギニンを共有し競合する。それぞれＮＯ経路の中間産物および最終産物であるＬ−ヒドロキシアルギニンおよび亜硝酸塩は、双方との強力なアルギナーゼ阻害剤である（Ｈｒａｂａｋ，Ａ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３９０：２０３〜２０６（１９９６年））。反対に、アルギナーゼ活性の最終産物である尿素は、ＮＯの形成およびＮＯ依存性の過程を阻害する（Ｗｉｔｔｅ，Ｍ．Ｂ．およびＢａｒｂｕｌ．Ａ．、Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐ．Ｒｅｇ．１１：４１９〜４２３（２００３年））。
【００３５】
心臓血管病態におけるアルギニン：アルギニンは、多くの臨床検査において、心臓血管病態を有する患者に投与する場合、有益であることが証明された（Ａｐｐｌｅｔｏｎ，Ｊ．、Ａｌｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．７：５１２〜５２２（２００２年）により総説された）。例えば、経口によるアルギニン補給は、狭心症の患者の運動能力および耐性を劇的に改善し（Ｂｅｄｎａｒｚ，Ｂ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．７５：２０５〜２１０（２０００年））、うっ血性心不全（ＣＨＦ）の症例において、彼らの血流、動脈コンプライアンスおよび腎機能を有意に改善した（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｇ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１８：２２９〜２３４（２０００年））。動物の研究により、血管拡張の改善、プラーク形成の阻害、大動脈内膜の肥厚化の減少および高コレステロール血症のヒト成人の血小板凝集の正常化を含む、補足アルギニンの抗動脈硬化作用が示された（Ｎａｋａｋｉ，Ｔ．およびＫａｔｏ  Ｒ．、Ｊｐｎ  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６６：１６７〜１７１（１９９４年））。さらに、アルギニンの早期供給はラットおよびヒトにおいて高血圧を改善し、腎不全を予防し（Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｐ．Ｗ．、Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．２８：７７５〜７８２（１９９６年））、エナラプリルなどの医薬品に対する高血圧患者の応答を強化した（Ｐｅｚｚａ，Ｖ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１１：１２６７〜１２７０（１９９８年））。その上、アルギニンは、間欠性跛行（Ｂｏｇｅｒ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．３２：１３３６〜１３４４（１９９８年））および子癇前症（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｍ．，Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．３３：９９２〜９９７（１９９９年））の症状を、有意に改善した。
【００３６】
成長ホルモン（ＧＨ）の分泌および運動能力におけるアルギニン：成長ホルモンは、筋肉の成長、脂肪燃焼および免疫系の維持に関与するが、その分泌は、ヒト体内において、３０歳から下降し始める（Ｄｅａｎ，Ｗ．およびＰｒｙｏｒ，Ｋ．、Ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ：ａｍｉｎｏ  ａｃｈｉｄｓ  ａｓ  ＧＨ  ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅｓにより総説された−文献総説。Ｖｉｔ．Ｒｅｓ．Ｎｅｗｓ；ｗｗｗ．ｖｒｐ．ｃｏｍにおいて利用可能（２００１年））。この機序は十分理解されていないが、アルギニンがＧＨの分泌を強化することは公知である。さらに、臨床医は、アルギニン注入試験を日常的に使用し、ヒトにおいてＧＨ放出に対する下垂体の反応性を決定する（Ｐｅｎｎｙ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２９：１４９９〜１５０１（１９６９年））。アルギニンの低用量の静脈内（ＩＶ）注入は、血清中アルギニンを５２％上昇させ、血清中ＧＨレベルを有意に増大させる。他方、ＩＶアルギニンとは異なり、経口アルギニンは、ＧＨ分泌の強化の効果の無い方法であることを示唆した（Ｍａｒｃｅｌｌ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．５４：３９５〜３９９（１９９９年））、一方、高用量の経口アルギニン・アスパラギン酸は、夜においてのみ、成長ホルモン分泌促進剤として作用することを示唆する（Ｂｅｓｓｅｔ，Ａ．ら、Ａｃｔａ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．９９：１８〜２３（１９８２年））。魚類において、アルギニンは必須アミノ酸であり、したがって、食物アルギニンは、最適な成長および有効な飼料利用に必須であり、その欠乏は成長率の減少、免疫応答の低下および死亡率の増加を起こす（Ａｈｍｅｄ，Ｉ．およびＫｈａｎ，Ｍ．Ａ．、Ａｑｕａｃｕｌｔ．Ｎｕｔｒ．１０：２１７〜２２５（２００４年））。
【００３７】
創傷、火傷、重篤な外傷および老年性認知症におけるアルギニン：アルギニンは、一酸化窒素の製造を介した細胞のシグナル伝達およびアルギニンのオルニチンと他のポリアミンとへの代謝を介した細胞増殖に密接に関与するので、多くの研究により、アルギニンの補給が治癒にとって必須であることが示された。この効果は、投与経路に依存せず、コラーゲン、ＮＯ、オルニチンおよびポリアミンの合成経路と関係があると推定されている（Ｗｉｔｔｅ，Ｍ．Ｂ．およびＢａｒｂｕｌ．Ａ．、Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐ．Ｒｅｇ．１１：４１９〜４２３（２００３年））。
【００３８】
コラーゲンの合成は瘢痕形成にとって必須であり、瘢痕形成は大部分の哺乳動物の治癒にとって基盤である。ラットにアルギニン非含有食餌を与えることにより、創傷治癒が低下し、一方、ヒトおよび動物にアルギニンに富んだ食餌を与えることにより、コラーゲンの沈着および創傷破壊強度が改善されたことが示された（Ｂａｒｂｕｌ，Ａ．ら、Ｓｕｒｇｅｒｙ１０８：３３１〜３３６（１９９０年））。ｉＮＯＳ阻害剤はコラーゲン沈着を減少させ、切開創傷の治癒を遅らせるのに対してアルギニン補給後の創傷液中には高レベルのＮＯ代謝産物が発見されるので、コラーゲン合成についてのアルギニンの効果は一部ＮＯ合成を介して仲介されることが推定される（Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｇ．Ａ．Ｃ．ら、Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．４６：１９〜２７（１９９７年）；Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．１６５：２６２〜２６７（１９９９年））。創傷治癒についてのＮＯの効果は、：１）アルギニン非含有栄養が、創傷部位だけでなくいくつかの臓器においてＮＯ合成の誘導を阻害する；２）ＮＯは、炎症誘導性浮腫を仲介し、細胞が肉芽腫に浸潤することを阻害する；３）創傷治癒についてのＮＯの効果は、ｅＮＯＳノックアウトマウスもまた治癒障害を示すので、ｉＮＯＳ仲介性だけではない；および４）ｉＮＯＳ阻害剤は高濃度において高致死率を有するので、全身に仲介されることがさらに示唆される（Ｗｉｔｔｅ，Ｍ．Ｂ．およびＢａｒｂｕｌ．Ａ．、Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐ．Ｒｅｇ．１１：４１９〜４２３（２００３年））。さらに、創傷縮小は開放創の閉合に大きく寄与すると同時に、切除創の閉合はｉＮＯＳの阻害により遅れ（Ｓｔａｌｌｍｅｙｅｒ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１３：１０９０〜１０９８（１９９９年））、ｉＮＯＳノックアウトマウスは、ｉＮＯＳ−ｃＤＮＡを用いた形質移入により回復可能な切除創の閉合の遅れを示す（Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：９６７〜９７１（１９９８年））。このデータはすべて、ＮＯＳを介したアルギニンの代謝が、治癒についてのアルギニンの陽性効果にとって必須であることの信憑性をもたらす（Ｓｈｉ，Ｈ．Ｐ．ら、Ｓｕｒｇｅｒｙ１２８：３７４〜３７８（２０００年））。
【００３９】
ポリアミンの生合成において第１のステップを意味する、アルギナーゼの誘導または過剰発現が、内皮細胞の増殖を強化する（Ｗｅｉ，Ｌ．Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：９２６０〜９２６４（２００１年）；Ｗｉｔｔｅ，Ｍ．Ｂ．およびＢａｒｂｕｌ．Ａ．、Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐ．Ｒｅｇ．１１：４１９〜４２３（２００３年））。アルギニンは、宿主および創傷Ｔ細胞の応答を刺激し、その後線維芽細胞の応答を増加することによって創傷治癒を強化することが公知である（Ｂａｒｂｕｌ，Ａ．ら、Ｓｕｒｇｅｒｙ１０８：３３１〜３３６（１９９０年））。健康なヒトにおいて、アルギニンは末梢血リンパ球のマイトジェン活性を強化し、リンパ球の芽球化において外傷後機能障害を大きく減少する（Ｄａｌｙ，Ｊ．Ｍ．ら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２０８：５１２〜２３（１９８８年））。アルギニンは、骨髄リンパ球の分化にとって重要であることが示されている。Ｔ−リンパ球は正常な創傷治癒にとって必須であるので、Ｔ細胞欠損マウスおよびラットは、創傷治癒が有意に低下する。他の研究により、創傷治癒についての補給アルギニンの有益な効果は、傷付いた動物または火傷した子供にＧＨを投与する効果と同様であることが示され（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｐ．ＨおよびＡｎｄｒｅａｓｓｅｎ，Ｔ．Ｔ．、Ａｃｔａ  Ｃｈｉｒ．Ｓｃａｎｄ．１５４：６２３〜６２６（１９８８年）；Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｄ．Ｎ．ら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２１２：４２４〜９（１９９０年））、このことは、下垂体および膵腺についてのアルギニンの周知の高い分泌促進活性による。このことは、アルギニンが創傷治癒に影響を及ぼさなかった、下垂体摘出動物に関する試験により確認された（Ｗｅｉ，Ｌ．Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：９２６０〜９２６４（２００１年）；Ｗｉｔｔｅ，Ｍ．Ｂ．およびＢａｒｂｕｌ．Ａ．、Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐ．Ｒｅｇ．１１：４１９〜４２３（２００３年））。
【００４０】
Ｓｅｉｆｔｅｒ，Ｅ．ら、Ｓｕｒｇｅｒｙ８４：２２４〜２３０（１９７８年）は、アルギニンが外傷後の状況において必須であることを示し、軽度の外傷を受けたアルギニン欠乏ラットは体重減少および死亡率が有意に多かったことを示した。火傷もまた、その回復においてアルギニンの酸化および変動を有意に増加する。しばしば使用される完全静脈栄養（ＴＰＮ）は、アルギニンのオルニチンへの転換を増加し、不可逆なアルギニンの酸化を比例的に増加する。新たな合成に限定して、アルギニン酸化の上昇は、ＴＰＮを受けている重篤な火傷の患者において、アルギニンを条件付で必須にする（Ｙｕ，Ｙ．Ｍ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２８０：Ｅ５０９〜Ｅ５１７（２００１年））。いくつかの他の研究は、アルギニンが、火傷および外傷の患者の入院の長さ、後天性感染、免疫障害（Ａｐｐｌｅｔｏｎ，Ｊ．、Ａｌｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．７：５１２〜５２２（２００２年））ならびに老年性認知症の高齢患者の脂質過酸化反応（Ｏｈｔｓｕｋａ，Ｙ．およびＮａｋａｙａＪ．、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１：１０８〜４３９（２０００年））を減らすことを実証した。相対的な安全性を加味して、これらの多数の観察により、アルギニンの使用は、外傷、火傷または重篤な病気の患者の世話にとって非常に魅力的となる（Ｗｉｔｔｅ，Ｍ．Ｂ．およびＢａｒｂｕｌ．Ａ．、Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐ．Ｒｅｇ．１１：４１９〜４２３（２００３年））。
【００４１】
免疫調節およびがんにおけるアルギニン：アルギニンは、強力な免疫調節因子であり、異化作用状態、例えば敗血症および術後のストレスにおいて有益な効果を有することが示された（Ｅｖｏｙ，Ｄ．ら、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ１４：６１１〜６１７（１９９８年）；Ａｐｐｌｅｔｏｎ，Ｊ．、Ａｌｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．７：５１２〜５２２（２００２年））。アルギニンは、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの個体においてもまた有益であり得る。グルタミン、アルギニンおよびＨＭＢ（ヒドロキシメチル酪酸）の組み合わせは、ＡＩＤＳの個体において除脂肪体重の減少を防ぐ（Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｂ．、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ１８：６８８〜６９０（２００２年））。動物およびヒトの試験は、大用量のアルギニンが腫瘍の誘導を妨げることができ、大用量のアルギニンの短期補給が化学療法期間の免疫機能の維持を支援することを示した（Ａｐｐｌｅｔｏｎ，Ｊ．、Ａｌｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．７：５１２〜５２２（２００２年））。糖尿病およびインスリン耐性におけるアルギニン：血漿中アルギニンレベルの低下および内皮依存性弛緩の障害が、糖尿病（ＤＭ）のヒトおよび動物において観察される。内皮のＮＯ欠乏は、このことのありそうな理由であると推定された。したがって、アルギニン補給は、これらの病態を改善することが示唆される；ＩＶアルギニンは、１型ＤＭの患者において血圧および血小板の凝集を低下させ（Ｇｉｕｇｌｉａｎｏ，Ｄ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７３：Ｅ６０６〜Ｅ６１２（１９９７年））、一方、低用量のＩＶアルギニンは、肥満および２型ＤＭの患者ならびに健康な対象においてインスリン感受性を改善した（Ｗａｓｃｈｅｒ，Ｔ．Ｃ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２７：６９０〜６９５（１９９７年））。アルギニンはさらに脂質過酸化反応を無効にし、その結果ＤＭの微小血管症の長期合併症を減少し得る。さらに、二重盲検により、経口アルギニン補給が、２型ＤＭ患者の末梢および肝臓のインスリン感受性を有意に改善することが示された（Ａｐｐｌｅｔｏｎ，Ｊ．、Ａｌｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．７：５１２〜５２２（２００２年））。
【００４２】
胃腸の病態におけるアルギニン：その充血、血管形成および成長促進の効果を発揮する、ＮＯ、ガストリンおよびポリアミンに関するアルギニンの作用は、予備研究期間の潰瘍治癒の加速に関与する（Ｂｒｚｏｚｏｗｓｋｉ，Ｔ．、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．３２：４４２〜４５２（１９９７年））。加えて、ＮＯは、胃腸の運動の制御において重要な役割を果たす。経口アルギニン補給は、食道運動障害の患者において肺の疼痛発作の頻度および強度を有意に減少させる（Ａｐｐｌｅｔｏｎ，Ｊ．、Ａｌｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．７：５１２〜５２２（２００２年））。同様に、Ｌ−アルギニン−ＮＯ経路は胆嚢運動の制御に関与し、Ｌ−アルギニンの摂取は、空腹および残留胆嚢の体積を増加する（Ｌｕｉｋｉｎｇ，Ｙ．Ｃ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７４：９８４〜９９１（１９９８年））。
【００４３】
泌尿生殖器の病態におけるアルギニン：米国で実施された調査（１９９９年）は、１８から５９歳の男性の３１％および女性の４３％が、多かれ少なかれ性機能障害を有していることを示した（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３８：１９１〜２０１（２００５年））。この問題は、生理的もしくは精神的な理由または双方を有しうる。男性において、性機能障害は勃起障害（インポテンスまたはＥＤ）として簡単に記載されるが、一方、女性において性機能障害は、４種の主要なカテゴリー：性的欲求低下、オルガスムス障害、性交痛障害および性的興奮障害に分類される（Ｂａｓｓｏｎ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６３：８８８〜８９３（２０００年））。陰核勃起および生殖器の充血を含む、十分な性的興奮の達成または維持の不能として定義される後者は、生殖器の血液循環の欠乏により起こるという点で男性のＥＤと類似している。このことは、双方の性別において、勃起したペニスまたは陰核内の血液で拡張可能な組織の筋肉性チャンバーである海綿体の中への血流および外への血流を管理する酵素触媒反応における生理的欠陥からもたらされ得る（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３８：１９１〜２０１（２００５年））。
【００４４】
特にペニス勃起は、中枢または末梢の性的刺激に従った動脈血流入の増加および静脈血流出の制限に関与する血行動態過程である（Ｍｕｓｉｃｋｉ，Ｂ．ら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．７０：２８２〜２８９（２００４年））。内皮性ＮＯ合成酵素（ｅＮＯＳ）およびニューロン性ペニスＮＯ合成酵素（ＰｎＮＯＳ）の双方により発生するＮＯの関与は、ペニス勃起の主要メディエーターとして十分立証されている。ＮＯはグアニリルサイクラーゼを刺激する、隣接する標的の平滑筋組織に拡散し、海綿体の弛緩をもたらす環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）を発生する（Ｆｅｒｒｉｎｉ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６４：９７４〜９８２（２００１年））。反対に、勃起は、ｃＧＭＰ−特異的ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）がｃＧＭＰを、平滑筋の収縮をもたらす５’−ＧＭＰに加水分解した時に終了する（Ｆｉｒｏｏｚｉ，Ｆ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｕｒｏｌ．Ｉｎｔ．９６：１６４〜１６８（２００５年））。したがって、Ｌ−アルギニンおよびＬ−アルギニン−ＮＯ経路に作用する薬剤は、ＥＤの治療薬として魅力的である。さらに、ｃＧＭＰの分解を阻害し、その結果勃起を延長するクエン酸シルディナフィル（Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ  ｃｉｔｒａｔｅ）（バイアグラ（Ｖｉａｇｒａ）（登録商標））のような、ＰＤＥの選択的阻害剤が広く用いられている。しかしシルディナフィルは、頭痛から出発する、広範囲の副作用をもたらす全身の血管拡張および降圧効果を有し、さらに死に達することもあり得る（Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｓ．、Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏ．Ｔｈｅｒ．３５：３３７〜３４２（２００１年））。
【００４５】
Ｌ−アルギニンの「栄養食品補助剤」は、男性および女性の性的興奮のための治療薬として多くの場合調査される。例えば、食物Ｌ−アルギニンの超生理学的用量を長期または補給することにより、ラット（Ｍｏｏｄｙら、１９９７年）および男性において、それぞれ陰茎海綿体圧および勃起機能が強化された。長期Ｌ−アルギニン補給は、一酸化窒素代謝が異常な男性においてＥＤを改善し（ＺｏｒｇｎｉｏｔｔｉおよびＬｉｚｚａ  １９９４年）、一方、女性に関する別の研究において、Ｌ−アルギニンの栄養補助剤は、被検対象の７３．５％において性生活全体の満足が改善された（Ｉｔｏ，Ｔ．Ｙ．ら、Ｊ．Ｓｅｘ  Ｍａｒｉｔａｌ  Ｔｈｅｒ．２７：５４１〜５４９（２００１年））。他方ＮＯＳは、ペニスの勃起に影響を及ぼすたった１つの酵素ではなく、アルギナーゼはその唯一の基質のアルギニンを共有し、男性および女性の生殖器において平滑筋組織でＮＯＳと同時発現する。したがってアルギナーゼの阻害は、性的興奮に必要なＮＯ依存性の生理的過程を強化することができる。多くのアルギナーゼ阻害剤が、全身の動脈圧に明らかな効果を有さないので、性機能障害治療のための別の潜在的標的になった（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３８：１９１〜２０１（２００５年））。
【００４６】
不妊および妊娠におけるアルギニン：アルギニンは、男性において正常な精子形成にとって必要である（Ａｐｐｌｅｔｏｎ，Ｊ．、Ａｌｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．７：５１２〜５２２（２００２年））。５０年以上前、研究者は、成人男性にアルギニン欠乏食を９日間与えたところ、精子数が９０％減少し、非運動性精子のパーセントがおよそ１０倍に増加したことを発見した（Ｈｏｌｔ，Ｌ．Ｅ．Ｊｒ．およびＡｌｂａｎｅｓｅ，Ａ．Ａ．、Ｔｒａｎｓ．Ａｓｓｏｃ．Ａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  ５８：１４３〜１５６（１９４４年））。０．５ｇアルギニン−ＨＣｌ／日を不妊男性に数週間経口投与すると、被検患者の過半数において精子数および運動性が著しく増加し、妊娠の成功をもたらした（Ｔａｎｉｍｕｒａ，Ｊ．、Ｂｕｌｌ．Ｏｓａｋａ  Ｍｅｄ．Ｓｃｈｏｏｌ  １３：８４〜８９（１９６７年））。精子減少症および受胎率（Ｔａｎｉｍｕｒａ，Ｊ．、Ｂｕｌｌ．Ｏｓａｋａ  Ｍｅｄ．Ｓｃｈｏｏｌ  １３：８４〜８９（１９６７年）；Ｄｅ−Ａｌｏｙｓｉｏ，Ｄ．ら、Ａｃｔａ  Ｅｕｒ．Ｆｅｒｔｉｌ．１３：１３３〜１６７（１９８２年））ならびに不妊の改善に関して同様の効果が、他の予備試験において報告されている。しかし、精子数のベースラインが１０００万／ｍｌ未満であった場合、アルギニン補給は役に立たなかった（Ｍｒｏｕｅｈ，Ａ．、Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．２１：２１７〜２１９（１９７０年）；Ａｐｐｌｅｔｏｎ，Ｊ．、Ａｌｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．７：５１２〜５２２（２００２年））。
【００４７】
一研究において、インビトロの受精にほとんど応答しない女性に対する経口アルギニン補給は、卵巣の反応、子宮内膜の受容性および妊娠率を改善した（Ｂａｔｔａｇｌｉａ，Ｃ．ら、Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．１４：１６９０〜１６９７（１９９９年））。加えて、子宮収縮の早すぎる女性に対する静脈内アルギニン注入（３０分にわたって３０ｇ）は、一時的に子宮収縮を減少した（Ｆａｃｃｈｉｎｅｔｔｉ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｐｅｒｉｎａｔ．Ｍｅｄ．２４：２８３〜２８５（１９９６年））。さらに、ヒトおよび動物の研究からの証拠は、一酸化窒素が妊娠中に子宮収縮を阻害し、その結果早期陣痛および早産に対して役に立ち、作用することができることを示した（Ａｐｐｌｅｔｏｎ，Ｊ．、Ａｌｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．７：５１２〜５２２（２００２年））。
【００４８】
間質性膀胱炎（ＩＣ）の患者において、６ヶ月にわたる経口アルギニンは、排尿不快感、腹痛および膣／尿道の痛みを有意に減少した。昼夜の頻尿もまた有意に減少した（Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５８：７０３〜７０８（１９９７年）；Ａｐｐｌｅｔｏｎ，Ｊ．、Ａｌｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．７：５１２〜５２２（２００２年））。
【００４９】
Ｌ−リシン：Ｌ−リシンは、必須の塩基性アミノ酸であり、分子量１４６．１９ｇ／モルを有し、生理的ｐＨにおいて正電荷を担持する。リシンのＤ−立体異性体は生物学的に活性でないが、一方Ｌ−リシンは、ヒトおよび動物にとって公知の食品添加物である（Ｃｙｎｏｂｅｒ，Ｌ．Ａ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．第２版。ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＵＳＡ（２００３年））。摂取されたＬ−リシンは、能動輸送により小腸の内腔から腸細胞に吸収される。その一部は腸細胞内で代謝され、残りは門脈循環を介して肝臓に輸送され、タンパク質の生合成に加わる、またはＬ−α−アミノアジピン酸セミアルデヒドに代謝され、これがさらにアセトアセチル−ＣｏＡに代謝される。肝臓において代謝されないＬ−リシンは、身体のさまざまな組織に輸送される（Ｃｙｎｏｂｅｒ，Ｌ．Ａ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ。第２版。ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＵＳＡ（２００３年））。
【００５０】
リシンは多くの機能を有する。リシンは、グリコーゲン、グルコースおよび脂質の前駆体として機能し、またはリシンはエネルギー生産のために直接機能する。リシンは筋肉におい濃縮され、骨の成長を促進し、コラーゲンの形成を強化する（Ｖｏｅｔ，Ｄ．およびＶｏｅｔ，Ｊ．Ｇ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。第３版。Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００４年））。コラーゲンは、結合組織（前を参照されたい）、皮膚、軟骨および骨の基礎となるマトリックスである。リシンの欠乏は、成長および免疫力の低下、精子の健康の損傷ならびに尿中カルシウムの増加に寄与し得る。この最後の事実は、適切なリシンが、より多くのカルシウムの吸収および沈着を介して骨粗しょう症の予防に役立ち得ることを示唆した（Ｆｌｏｄｉｎ，Ｎ．Ｗ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｎｕｔｒ．１６：７〜２１（１９９７年））。いくつかの研究が、Ｌ−リシンが、単純ヘルペス感染の再発率を減少させ、成長ホルモン分泌を刺激できることを示してから、Ｌ−リシンは栄養食品補助剤として普及した(下記を参照されたい)。
【００５１】
推奨用量、副作用および禁忌：上で論じたアミノ酸の補給用量は、治療される病態に依存して大きく変化しうる。しかし、平均的なヒトのための必須アミノ酸のリシンの正常な食物の必要量は、欠乏の問題を避けるために０．７５〜１ｇ／日であると推定される。臨床研究に使用するアルギニンの用量は、精子減少症のために０．５ｇ／日のような少量から、がん、子癇前症および早すぎる子宮収縮のための３０ｇ／日のような大量まで大幅に変化する。有意な悪影響は、この論文を通して述べたアミノ酸の補給に関して報告されていない。しかし、言及した臨床応用の多くは、より調節された、長期の研究により確認される必要がある。この論文はこれらのアミノ酸の効果についての、肯定的な報告だけを要約したが、これらの効果の多くが確認されなかった、反対の報告もまた存在する（完全な総説のために、Ｆｌｏｄｉｎ，Ｎ．Ｗ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｎｕｔｒ．１６：７〜２１（１９９７年）；Ａｐｐｌｅｔｏｎ，Ｊ．、Ａｌｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．７：５１２〜５２２（２００２年）；ならびにＤｅａｎ，Ｗ．およびＰｒｙｏｒ，Ｋ．、Ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ：ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｓ  ＧＨ  ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅｓ文献の総説。Ｖｉｔ．Ｒｅｓ．Ｎｅｗｓ；ｗｗｗ．ｖｒｐ．ｃｏｍで利用可能（２００１年）を参照されたい）。
【００５２】
臨床治療におけるアスパラギン酸、アルギニンおよびリシンのジペプチドならびに混合物：アスパラギン酸およびアルギニンは、ジペプチドまたは混合物として好んで一緒に投与され、アミノ酸双方のより高い生体利用効率を提供し、その結果低用量におけるそれらの有効性を増加する。双方のアミノ酸の投与は、さまざまな生理的障害の治療のためのいくつかの研究において調査された。一般的に、双方のアミノ酸は、遊離のアミノ酸に関する上記すべての応用のために、ジペプチド形態で投与することができる。以下の項は、併用投与形態について具体的に報告された調査結果を要約する。これらの報告は、創傷治療、ＧＨ分泌障害および運動能力の強化としての内分泌の病態または勃起障害ならびに男性および女性の不妊を含む泌尿生殖器の病態に関する研究から明らかになった。
【００５３】
アルギニン−アスパラギン酸は、身体的および精神的無力症に対して、１９６５年に初めて臨床的に試験され（Ｄｕｒｕｙ，Ａ．およびＢａｕｊａｔ，Ｊ．Ｐ．，Ｖｉｅ．Ｍｅｄ．Ｉｎｔ．９：１５８９（１９６５年））、陽性効果が後に確認された（Ｄｕｒｕｙ，Ａ．、Ｍｅｄ．Ｉｎｔ．１：２０３（１９６６年））。他の研究は、アルギニン−アスパラギン酸の長期投与が、好気的エネルギー代謝および能力を改善することを示した（Ｓｅｌｌｉｅｒ，Ｊ．、Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｔｏｕｌｏｕｓｅ５：８７９（１９７９年）；Ｓｃｈｍｉｄ，Ｐ．ら、Ｌｅｉｓｔｕｎｇｓｓｐｏｒｔ  １０：４８６〜４９５（１９８０年））。アルギニン−アスパラギン酸の補給は、創傷治癒およびＴ細胞の免疫機能を強化した（Ｂａｒｂｕｌ，Ａ．ら、Ｓｕｒｇｅｒｙ１０８：３３１〜３３６（１９９０年））。運動能力についての他の陽性効果も報告されており、例えば脂質代謝に関してわずか２週間のアルギニンの取り込みが、総コレステロール濃度の低下を起こした（Ｈｕｒｓｏｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒ．Ｅｎｔｅｒａｌ  Ｎｕｔｒ．１９：２２７〜２３０（１９９５年））。したがって、Ｌ−アルギニン−Ｌ−アスパラギン酸（Ｓａｒｇｅｎｏｒ（登録商標））は、運動選手および患者により広く使用され、トレーニング効果および運動耐容能を増加する。この分野において運動の持続に関する印象的な効果が、Ｌ−アルギニン−Ｌ−アスパラギン酸の長期にわたる取り込みの後に報告されており、最大下運動における血中乳酸濃度および心拍の低下ならびに作業負荷の増大による酸素摂取量の増加を起こす（Ｓｃｈｍｉｄ，Ｐ．ら、Ｌｅｉｓｔｕｎｇｓｓｐｏｒｔ  １０：４８６〜４９５（１９８０年）；Ｓｅｌｌｉｅｒ，Ｊ．、Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｔｏｕｌｏｕｓｅ  ５：８７９（１９７９年）；Ｂｕｒｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｓｐｏｒｔｓ．Ｓｃｉ．Ｍｅｄ．４：３１４〜３２２（２００５年））。
【００５４】
健康な高齢のボランティアに、２週間、３０ｇ／日のアルギニン・アスパラギン酸を食物補給すると、創傷のコラーゲン蓄積が有意に強化された（Ｗｉｔｔｅ，Ｍ．Ｂ．およびＢａｒｂｕｌ．Ａ．、Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐ．Ｒｅｇ．１１：４１９〜４２３（２００３年））。２５０ｍｇ／ｋｇ／日の経口アルギニン・アスパラギン酸を、２０から３５歳の５例の健康な対象に７日間投与した場合、徐波睡眠中にＧＨの６０％の上昇が起こった（Ｂｅｓｓｅｔ，Ａ．ら、Ａｃｔａ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．９９：１８〜２３（１９８２年））。別のグループの研究者は、１２例の正常な成人を、経口アルギニン・アスパラギン酸の単回の大用量（３７．５ｇ）を用いて処理した後で、血清ｈＧＨの少量だが有意な放出を起こす、期待できる結果を得た（Ｅｌｓａｉｒ  １９８７年）。このことは、アルギニン・アスパラギン酸を、ｈＧＨの同化作用を巧みに利用したいボディビルダーにとって興味深いものとした（Ｍａｃｉｎｔｙｒｅ，Ｊ．Ｇ．、Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．４：１２９〜１４２（１９８７年））。
【００５５】
経口投与されたＬ−アルギニン−Ｌ−アスパラギン酸は、がんの一部の型の治療において陽性効果を誘導することも報告された。例えば、経口投与されたＬ−アルギニン−Ｌ−アスパラギン酸は、マウスにおいて唾液腺の腺様嚢胞癌に対して、肺の転移巣形成の阻害および生存期間の延長を伴う抗転移効果を誘導した。さらに、インビトロおよびインビボ実験において、これらの結果は確認された（Ｌｉ，Ｆ．ら、Ｃｈｉｎ．Ｊ．Ｓｔｏｍａｔｏｌ．３６：４６４〜４６６（２００１年）；Ｌｉ，Ｆ．ら、Ｃｈｉｎ．Ｊ．Ｓｔｏｍａｔｏｌ．３７：８７〜８９（２００２年）；Ａｐｐｌｅｔｏｎ，Ｊ．、Ａｌｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．７：５１２〜５２２（２００２年））。
【００５６】
歯科衛生の分野において、歯の表面に密に付着するスポンジ状の有機材料であるプラークが、そのマトリックス内に特定のサイズおよび形状のペプチドを受容することが発見された。さらに、１つまたは複数がアルギニンである２−４アミノ酸単位のペプチドは、希釈から保護されてプラーク内に保存され、口内ｐＨを非齲蝕レベル（６．１またはそれ以上）に有効に回復することが示された。さらに、これらのオリゴマーは、糖質と同時に提供された場合でさえ、有効である。このことは、歯磨きペーストおよびチューイングガムなどの一般的なデンタルケア製品中へのこのようなペプチドの包含を示唆した（Ｋｌｅｉｎｂｅｒｇ，Ｉ．、特許出願  ＵＳ４２２５５７９（１９８０年））。
【００５７】
Ｌ−アルギニン−Ｌ−アスパラギン酸は、さらに泌尿生殖器の障害の治療にも用いられた。ＥＤは、中程度の勃起障害を有する４５から７０歳の男性の２５％および重篤な勃起障害の１０％において一般的である（Ｋｅｒｎｏｈａｎ，Ａ．Ｆ．Ｂ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５９：８５〜９３（２００４年））。近年、「Ｌ−アルギニルアスパラギン酸」が、男性のＥＤの治療用のいくつかの医薬品、例えばＰｒｅｌｏｘ（登録商標）の成分として使用された（Ｌａｍｍ，Ｓ．ら、Ｅｕｒ．Ｂｕｌｌ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１１：２９〜３７（２００３年））。Ｐｒｅｌｏｘ（登録商標）の成分に関する臨床研究は、１ｇの「Ｌ−アルギニルアスパラギン酸」（Ｓａｒｇｅｎｏｒ（登録商標））を単独で、またはＰｙｃｎｏｇｅｎｏｌ（登録商標）（ＮＯＳの分泌を刺激する）と一緒に、３回の投与後（毎日１．７ｇのアルギニン）、それぞれＥＤの４０例の男性の５％および９２％が勃起機能を改善したことを示した（Ｓｔａｎｉｓｌａｖｏｖ，Ｒ．およびＮｉｋｏｌｏｖａ，Ｖ．、Ｊ．Ｓｅｘ  Ｍａｒｉｔ．Ｔｈｅｒ．２９：２０７〜２１３（２００３年））。長期研究の期間、ＥＤを有し、精液の量が低下し、精子の運動性が減少し、精子の形態異常を有する、４５から６０歳の５０例の男性を、まずＳａｒｇｅｎｏｒ（登録商標）単独で１ヶ月治療した。これらの男性の１０％が正常な勃起を経験した。２ヶ月の治療にＰｙｃｎｏｇｅｎｏｌ（登録商標）を加えた後で、正常に勃起した男性のパーセントは８０％に上昇した。治療を１年の間継続し、その間精子の質が有意に改善され、カップルの４２％が妊娠を達成した（Ｓｔａｎｉｓｌａｖｏｖ，Ｒ．およびＮｉｋｏｌｏｖａ，Ｖ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｐｏｔ．Ｒｅｓ．１４（４）：Ｓ６５（２００２年）；Ｌａｍｍ，Ｓ．ら、Ｅｕｒ．Ｂｕｌｌ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１１：２９〜３７（２００３年））。その後の観察により、アルギニン−アスパラギン酸の使用に関する、数ヶ月の補給により精子の数および質が上がる（Ｔａｎｉｍｕｒａ，Ｊ．、Ｂｕｌｌ．Ｏｓａｋａ  Ｍｅｄ．Ｓｃｈｏｏｌ  １３：８４〜８９（１９６７年）；Ｓｃｈｅｌｌｅｎ，Ｔ．Ｍ．およびＤｅｃｌｅｒｑ，Ｊ．Ａ．、Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｍｏｎａｔｓｓｃｈｒ，１６４：５７８〜８０（１９７８年）；Ｄｅ−Ａｌｏｙｓｉｏ，Ｄ．ら、Ａｃｔａ  Ｅｕｒ．Ｆｅｒｔｉｌ．１３：１３３〜１６７（１９８２年））ならびに不妊が改善される（Ｓｃｈａｃｔｅｒ，Ａ．ら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１１０：３１１〜１３（１９７３年）；Ｓｃｈａｃｔｅｒ，Ａ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．Ｏｂｓｔｅｔ．１１：２０６〜２０９（１９７３年））という先行する研究が確認された。
【００５８】
アスパラギン酸およびリシンからなるジペプチドに関する臨床報告は、このジペプチドが大量に利用できないためほとんど存在しない。しかし、リシンのこのジペプチド形態は、遊離のリシンもしくはその塩に関して公知の応用分野(前を参照されたい)において、または単に遊離のリシンより高い生体利用効率のヒトおよび動物用の食品添加物として、遺伝的にリシン輸送体が欠乏したヒトにおいて有効であり得る。
【００５９】
アルギニンおよびリシンは、成長ホルモン（ＧＨ）の放出のために相乗的に作用し（Ｓｕｍｉｎｓｋｉ，Ｒ．Ｒ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｐｏｒｔ  Ｎｕｔｒ．７：４８〜６０（１９９７年））、ヒトおよび動物の栄養においてそれらの濃度は非常に重要である（Ａｈｍｅｄ，Ｉ．およびＫｈａｎ，Ｍ．Ａ．、Ａｑｕａｃｕｌｔ．Ｎｕｔｒ．１０：２１７〜２２５（２００４年））。リシン：アルギニン比が低いと、コレステロール低下効果を有し（Ｓａｎｃｈｅｚ，Ａ．ら、Ｎｕｔｒ．３８：２２９〜２３８（１９９８年））、したがって特許は、心臓血管疾患を有する患者に使用するタンパク質混合物のＡｒｇ：Ｌｙｓ比が少なくとも５．５：１で実施された（Ｒａｄｈａ，Ｃ．ら、特許出願  ７０９１００１（２００６年））。対照的に、単純ヘルペスウィルスのタンパク質はＬ−アルギニンに富んでいるので、食物中でアルギニンに対するリシンの比が高いと、ウィルスの複製、治癒時間および発生期間の細胞病原性の低下に役立つことが公知である（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｒ．Ｓ．ら、Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  １５６（５）：２５７〜２６７（１９７８年））。したがって、ヘルペスの予防および治療において、アルギニンに富んだ食品を避け、リシンに富んだ食品をより多く食べることが役立つことが示唆される。
【００６０】
近年の調査は、ｈＧＨの刺激およびその結果の筋肉の構築、体重増加および免疫の支援の改善において、Ｌ−リシンおよびＬ−アルギニンを一緒に使用する療法が有用であり、おそらくアルギニン／オルニチンの併用よりもさらに優れていることを示唆している。１５例の１５から２０歳の健康な男性対象において、１．２ｇのアルギニンピログルタミン酸とＬ−リシン塩酸塩との併用は、アミノ酸混合物の消費後、ＧＨレベルが２から８倍、有意に上昇した（Ｉｓｉｄｏｒｉ，Ａ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｏｐｉｎ．７：４７５〜４８１（１９８１年））。別の研究は、静止状態下で摂取した１．５ｇのアルギニンおよび１．５ｇのリシンの摂取が、ＧＨの分泌の急激な増加を起こすことを示した（Ｓｕｍｉｎｓｋｉ，Ｒ．Ｒ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｐｏｒｔ  Ｎｕｔｒ．７：４８〜６０（１９９７年））。
【００６１】
消化管内部の自然状態を刺激するために、調製された腸「液」を、ＣＧＰを含有する嫌気性フンゲート（Ｈｕｎｇａｔｅ）チューブ中の接種材料としておよび栄養食品補助剤として使用した。すべてのチューブにおいてＣＧＰが完全に分解されたことは、ＣＧＰが消化管の嫌気性環境のような、このような嫌気性環境において容易に分解され得ることを示す。このことは、偏性嫌気性および通性嫌気性のＣＧＰ分解細菌に関する先に観察された短期分解期間に類似した短期分解期間によってもさらに確認された（Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：３６４２〜３６５２（２００５年）；Ｓａｌｌａｍ，Ａ．ら、公開用に提出（２００８年））。
【００６２】
本研究の期間中に、動物、鳥類および魚類の消化管においてＣＧＰ分解細菌が広範囲に分布していることが、初めて実証された（表１、２）。精製手順において観察されたＣＧＰ分解コロニー間、およびその後得られた純粋培養間の形態的多様性もまた、環境サンプルについての先行研究により示され、これにより原核生物中のＣＧＰ分解菌の広範囲の分布が示された（表２）。他方、ＣＧＰを分解する能力は、特定の属の種においてより多く分布しているように思われ、；今日までの細胞外ＣＧＰ分解についての調査は、ＣＧＰ分解菌が、シュードモナス属およびバチルス属に広範囲に分布していることを示す（Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２５０９６〜２５１０５（２００２年）；Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ５：１５３〜１６１（２００４年）；Ｓａｌｌａｍ，Ａ．ら、公開用に提出（２００８年）、本研究）。しかし、このことは、これらの細菌に有利にされた、用いられた実験室条件に関係する、または単純に自然におけるこれらの細菌属の優勢のためと思われる。加えて、シュードモナス属およびバチルス属の菌株とは異なる多くのＣＧＰ分解細菌は、ＣＧＰ分解能を損なうことなく純粋培養することが非常に難しく（Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：３６４２〜３６５２（２００５年）；Ｋｒｕｇ，Ａ．、Ｄｉｐｌｏｍ  ｔｈｅｓｉｓ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｆｕｒ  Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ  Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ，Ｗｅｓｔｆａｌｉｓｃｈｅ  Ｗｉｌｈｅｌｍｓ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ、Ｍｕｎｓｔｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ（２００１年））、普通は無視される。
【００６３】
部分的ＣＧＰ分解は、嫌気条件下の純粋培養に関して、嫌気的にＣＧＰを分解した４６株のうち８株のみに観察された。このことに関する妥当な理由は、それらの天然環境におけるようなこれらの菌株と他の菌株との間の、それぞれ、多くの場合制限されたまたは必要な物質の蓄積または枯渇をもたらす天然の相互作用の欠落である。このことは、成長およびＣＧＰ利用がその同時単離されたシトロバクター・アマロナティクス（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ）Ｇ株の存在下で大幅に強化された、偏性嫌気性芽胞形成菌のセディメンチバクター・ホンコンエンシスＫＩ株に関する先行する観察に一致する（Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：３６４２〜３６５２（２００５年））。
【００６４】
同定された８種の単離株のうち、いくつかの菌株は嫌気的ＣＧＰ分解能を示したが、それらはバチルスまたはシュードモナスなどの、好気性であることが公知の属に属する。しかし、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）および巨大菌（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）の菌株は、嫌気的に成長することが公知であり、一部は硝酸塩を還元することが公知である（Ｇｌａｓｅｒ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：１１１２〜１１１５（１９９５年））。同様に、シュードモナス属のメンバーの嫌気的成長および硝酸塩還元も十分調査されている（Ｓａｌｌａｍ，Ａ．ら、Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ  ｆｏｒ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ（２００８年））。ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の種もまた通性嫌気性であることが公知である（Ｃｏｃｈｒａｎｅ，Ｖ．Ｗ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５：１〜２６（１９６１年）；Ｂｏｒｏｄｉｎａ，Ｉ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１５：８２０〜８２９（２００５年）；Ｂａｅｋ，Ｓ．Ｈ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６：２６６５〜２６６９（２００６年））。一般的に、ＣＧＰ分解に関する最近の調査は、通性嫌気性菌の中にＣＧＰ分解細菌が広範囲に分布していることを指摘している。
【００６５】
ＣＧＰおよびそのジペプチドは、天然起源の単純なタンパク質性物質であるが、臨床研究は、これらの物質を市場にもたらすことを要求される。本研究において試験した個々の哺乳動物、鳥類または魚類の腸内細菌叢のおけるＣＧＰ分解細菌の広範囲な分布は、経口投与されたＣＧＰが少なくとも微生物的に高速で容易に分解されるであろうという第１の証拠を提供する。さまざまな動物および鳥類の下部消化管に由来するこのような細菌（表１）の単離は、ＣＧＰの分解が上部消化管で完了しなかった場合、下部において継続される可能性があることを示す。
【００６６】
ＨＰＬＣ分析により、ジペプチドが、６２種すべての単離菌によるＣＧＰの分解産物であったことが明らかになった。（β−Ａｓｐ−Ａｒｇ）２テトラペプチドなどの高次のジペプチドオリゴマーは、ＣＧＰから作製されなかった。このことは、シュードモナス・アンギリセプチカＢＩ株（Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２５０９６〜２５１０５（２００２年））、セディメンチバクター・ホンコンエンシスＫＩ株（Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：３６４２〜３６５２（２００５年））およびシュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株（Ｓａｌｌａｍ，Ａ．ら、公開用に提出（２００８年））由来のＣＧＰａｓｅの効果と一致する。巨大菌ＢＡＣ１９株の場合だけ、高次のこのようなオリゴマーが検出された（Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ５：１５３〜１６１（２００４年））。スピルリナは、何世紀にもわたってその栄養効果および治療効果が公知であり、今日まで、多くの国において食品として消費されている。スピルリナのタンパク質含有量は、６０％以上に達することが公知である（Ｎａｒａｓｉｍｈａ，Ｄ．Ｌ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．３３：４５６〜４６０（１９８２年））。スピルリナ・プラテンシス（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）の市販の製品中のＣＧＰの存在は、ＣＧＰが、スピルリナの定期的な消費のウェルビーイング効果に加わることができることを示す。しかし、分析されたサンプル中の決定されたＣＧＰ含有量は、大きく変動し、相対的に低かった。このことは、シアノバクテリアにおけるＣＧＰの蓄積についての先行する研究と一致し、ＣＧＰの蓄積が多くの因子により影響され、したがって変動することは公知である（Ｅｌｂａｈｌｏｕｌ，Ｙ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：７７５９〜７７６７（２００５年））。さらに、市販のスピルリナ製品は、商業化が許可される前に、多くの臨床試験および毒性試験を確実に通過してきた。このことは、抽出されたＣＧＰおよびＣＧＰ−ジペプチドが、経口摂取した場合毒性効果を誘導しないことを示す。さらに、ＣＧＰジペプチドは、細菌において成長のために普通に取り込まれ、利用され、標的調査の間に静菌効果または殺菌効果を全く示さなかった（データ非掲載）。一般的に、スピルリナの公知の効果および応用はアルギニンに関して証明された効果および応用と非常に類似しており、このことは、実際にこれらの効果の一部が、ＣＧＰの含有量を含む、そのアルギニン含有量（約６％）によると思われることを示唆している。
【００６７】
細菌は３種のペプチド輸送系を保有しており、２種がＡＢＣ（ＡＴＰ結合カセット）輸送体の大型のファミリーに属するオリゴペプチド透過酵素（Ｏｐｐ）およびジペプチド透過酵素（Ｄｐｐ）、ならびにＰＴＲ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＴＲａｎｓｐｏｒｔｅｒ）ファミリーに属するジペプチドおよびトリペプチドのための輸送体である。最後の系だけが、酵母から出発する高等真核生物において保存されている（Ｄａｎｉｅｌ，Ｈ．ら、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２１：９３〜１０２（２００６年））。哺乳動物において、ジペプチドおよびトリペプチドＰＥＰＴ（ＳＬＣ１５ファミリー）のための輸送系は２種の変異体：腸内ＰＥＰＴ１（ＳＬＣ１５Ａ１）および腎性イソ型ＰＥＰＴ２（ＳＬＣ１５Ａ２）を含む。それらは、Ｌ−αアミノ酸およびそれらの誘導体を優先する立体選択的手段で、ほぼすべての可能なジペプチドおよびトリペプチドを輸送する。Ｄ−アミノ酸だけ、または４個以上のアミノ酸を含むペプチドは受容されない。ＰＥＰＴ１は、小腸を通し、その高い輸送能力により優勢な発現を有するので、ＰＥＰＴ１のすべての薬剤基質は優れた経口利用の可能性を有し、したがってＰＥＰＴ１は薬剤送達の第１の標的となっている（Ｄａｎｉｅｌ，Ｈ．ら、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２１：９３〜１０２（２００６年））。ＣＧＰジペプチドの構成Ｌ−アミノ酸である、Ａｓｐ−ＡｒｇおよびＡｓｐ−Ｌｙｓ（組換えＣＧＰ）は、α−βペプチド結合を介して連結される。この型の結合およびＣＧＰジペプチドの立体構造は、ＰＥＰＴ系の基質として作用し、摂取された場合、哺乳動物の腸内腔から輸送され得ることが、強く想定される。したがって、ＣＧＰおよび／またはそのジペプチドの使用は、治療薬および／または栄養剤としての構成アミノ酸の経口投与にとって理想的な取り組みであると思われる。
【００６８】
ＣＧＰを構成するアミノ酸、例えばアスパラギン酸、アルギニンおよびリシンならびにその構造にさらに統合することが可能な、シトルリン、オルニチン、カナバニンまたはグルタミン酸塩などのアミノ酸を含むアミノ酸の栄養的価値および臨床的価値は、何世紀にもわたって公知である。これらのアミノ酸の合成オリゴマーの組み合わせは、遊離のアミノ酸より高い生体利用効率を有することが証明されており、したがって、頻繁に調査され、栄養および治療に用いられていた（前を参照されたい）。ＣＧＰは、遊離の形態のその構成アミノ酸より低用量でより有効であることが期待できる、このようなオリゴマーの理想的な天然供給源を表す。したがって、ＣＧＰおよびそのジペプチドの吸収、安全性および効果は、現在調査中である。さらに、ＣＧＰに統合する他のアミノ酸に関する研究により、期待できる結果が示された（データ非掲載）。得られたジペプチドは、いくつかの治療分野、例えばアスパラギン酸−オルニチンを肝臓疾患の治療において用いることができる（Ｋｉｒｃｈｅｉｓ，Ｇ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２５：１３５１〜１３６０（１９９７年））。その結果として、ＣＧＰ構造における任意の将来の改変が、ＣＧＰジペプチドの範囲を広げ、その後、治療薬および／または栄養食品補助剤などのそれらの応用範囲を拡大すると思われる。
【００６９】
三相性の方法が、シアノフィシン（ＣＧＰ）からのβ−ジペプチドの大規模製造のために確立された。第Ｉ相は、バイオマスからＣＧＰを工業的に単離するための、最適化された酸抽出方法に基づき、総計７０４ｇの純粋ＣＧＰを得、アスパラギン酸、アルギニンおよび少量のリシンが構造的に含有された。第ＩＩ相は、細胞外ＣＧＰａｓｅ（ＣｐｈＥ）の醗酵性製造を表し、シュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株から、５００ｌ規模で、単一基質として１ｇ／ｌのクエン酸塩を使用して酵素を生産し、１７．５ｇの粗タンパク質粉末を得、ＣＧＰに対して高い分解活性を示した。第ＩＩＩ相は、ＣｐｈＥを介したＣＧＰの分解を含み、２５０ｇのＣＧＰを、９９％以上の純度（ＴＬＣ、ＨＰＬＣ）のβ−アスパラギン酸−アルギニンおよびβ−アスパラギン酸−リシンのジペプチドに分解した。第ＩＩＩ相の全体の効率は、９１％であり、使用したＣｐｈＥ粉末の７８％（ｗｔ／ｗｔ）が回収され、ＣＧＰに対する持続性の活性を示した。確立された方法は、工業基準の材料および設備に依存し、あらゆる所望の規模に適用可能である。
【００７０】
ＤＩＰ１株を含むシュードモナス・アルカリジェネスの菌株は、広範囲の基質において成長し、それらの最小量を必要とすることが公知である。このような菌株の高い酵素産生力も、細胞外リパーゼの醗酵性製造にそれらを用いる主な理由である（ＷＯ９５／３０７４４；Ｇｅｒｒｉｔｓｅ、Ｇ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：２６４４〜２６５１（１９９８年）；Ｍｏｏｒｅ，Ｅ．Ｒ．Ｂ．ら、Ｍａｉ１９９９年。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ：Ｎｏｎｍｅｄｉｃａｌ．Ｍｏｏｒｅら、（編）、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ：Ａｎ  Ｅｖｏｌｖｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ、第３版、ｒｅｌｅａｓｅ  ３．０、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ））。ＤＩＰ１株由来のＣＧＰａｓｅの高い安定性および活性（Ｓａｌｌａｍ，Ａ．およびＡ．Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ．２００７ｂ。Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ａｎｄ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙａｎｏｐｈｙｃｉｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＤＩＰ１−Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｏｔｈｅｒ  ｔｈｒｅｅ  ｃｏ−ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｉｘｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ。公開用に提出。）に加えて、これらの特徴は、この菌株を設計した工業的方法にとって理想的であると考える主要な因子であった。
【００７１】
最終的な三相性方法を創製する前に、ＣＧＰに対して直接ＤＩＰ１株を培養することによって、同じ目標を達成するためにいくつかの試験を実施したが、その戦略は成長細胞によってＣＧＰ−ジペプチドが急速に消費されるためあまり有効ではなく、この問題を、ＤＩＰ１株の細胞を排除して定義した三相性方法の手順において避けた。さらに、直接培養により得られたジペプチド溶液は大量であり、したがって、操作が非常に困難であり、さらに得られたジペプチド溶液中の少量のタンパク質および塩の存在が、その戦略の別の欠点を表した。対照的に、三相方法によるＣＧＰの分解濃度および分解時間は完全に調節可能である。その結果、得られたジペプチド溶液は少量に制限され容量を操作しやすい。最も高い試験濃度（５０ｇ／ｌ）は、将来の応用のためにさらに最適化でき、本方法を経済的により有効にする態様の１つである。
【００７２】
経済的因子は、一般的に工業的方法にとって非常に重要であり、したがって、培地の最適化および基質利用において得られた結果は満足のいくものであり、工業的な量において安価な基質であり、単一基質として、用いられる菌株にとって理想的であったクエン酸塩は、細胞外リパーゼの醗酵性製造にすでに用いられていた（Ｇｅｒｒｉｔｓｅ，Ｇ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：２６４４〜２６５１（１９９８年））、しかし、粗ＣｐｈＥ（第ＩＩ相）の製造相のために最適化された培地の必要が、醗酵期間、特に誘導および分解相の期間の濁度グレードの正確なモニタリングの必要を介して浮上する。実験的ＣＧＰ分解による先の経験により、不透明な培地および細胞の力強い成長は誤解を招く恐れがあり得、加えて、細胞のより望ましい成長は細胞外ＣＧＰａｓｅのより多い製造を本質的に意味しなかった（非公開データ）ことを示した。
【００７３】
先行する研究において適用に成功した、Ｆｒｅｙ，Ｋ．Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：３３７７〜３３８４（２００２年）のＣＧＰ酸抽出方法は、バイオマスの任意の工業的な量から純粋なＣＧＰを単離するために適切になるように最適化された。もともとの方法の最も有効な変化は、溶解したＣＧＰの滅菌ろ過ステップであり、この手順は、希ＨＣｌに溶解しないいかなる細胞デブリも完全に除去することを保証した。対照的に、希釈酸および水を用いる増加した精製ステップは、ＣＧＰの損失を不必要に増加する恐れがあり、このことは、得られたＣＧＰと抽出量との差を説明する。ＣＧＰの損失およびその抽出に必要な時間は、ＣＧＰを４℃に静置する代わりに、ＣＧＰを遠心分離機にかけることによって最小化できる。
【００７４】
または、この抽出方法の全体の生産力は、有効な機器、例えばクロスフローを用いた場合、大幅に増加でき、この場合、単離するＣＧＰの分子サイズより、一方は大きく他方は小さい、２つの異なるＣＯＰを備えた２つのカセットが必要であり、この２つのカセットは、それぞれ、溶解状態および沈殿状態のＣＧＰにおいてＣＧＰの交互のろ過に用いることができる。しかし、このような限外ろ過カセットの比較的高い価格およびさらに限られた寿命により、それらの適用はコストの問題となる。
【００７５】
粗ＣｐｈＥの醗酵性製造（第ＩＩ相）の期間中、ＣＧＰによる誘導は、ＣｐｈＥの最大の製造を保証し、濁度変化と培地中のＣＧＰ量とを排他的に参照するために定常期に用いる。
【００７６】
培地のｐＨは、許容範囲（ｐＨ６．９〜７．５）を超えて上昇し、ＨＣｌの添加により調節したが、これは、シュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株の細胞によるアンモニアの放出のためである可能性が最も高い。この菌株に関する類似の生理的挙動が、ＣＧＰ分解についての先行調査に記録されていた（Ｓａｌｌａｍ，Ａ．およびＡ．Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ．２００７ｂ。Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ａｎｄ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙａｎｏｐｈｙｃｉｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＤＩＰ１−Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｏｔｈｅｒ  ｔｈｒｅｅ  ｃｏ−ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｉｘｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．公開用に提出。）。
【００７７】
さまざまな被検ろ過系の前後に得られたＣＧＰ−ジペプチドの理想的な純度は、明らかに、もともとのジペプチド溶液中の不純物の最初の欠乏による。このことは、細菌細胞を用いた直接培養戦略と比較した、定義された酵素的方法の適用に関する別の有利性を表す。他方、ろ過によるジペプチドの量的損失が予想され、不運なことに避けられない；ろ過材料、カットオフ点、および／またはろ過する物質それ自体の特徴を含む、いくつかの一般因子がこのような損失を起こすことが公知である。このことは、分解相期間（第ＩＩＩ相）のＣＧＰの９％および粗ＣｐｈＥの２２％の損失も説明する。その上、新しいろ過膜（０．５−１０ｋＤａ、ＣＯＰ）だけを試験し、その結果ＣＧＰ−ジペプチドの損失量は、飽和まで膜表面に付着する可能性が最も高い。
【００７８】
９１％のプロセス効果は極めて高いにもかかわらず、いくつかの態様は、さらに改善可能であり、したがって最適化の途中であり、これらの態様は、粗ＣｐｈＥのより高い生産力、ＣｐｈＥの工業的精製戦略の可能性および分解相のより有効な条件を含む（非公開データ）。ＣＧＰ−ジペプチドの商業的価値は、ＣＧＰそれ自体の製造コストに直接関係するが、この数年にわたって、ＣＧＰの製造は、いくつかの細菌株を使用して重点的に調査され、最適化され、その結果、ＣＧＰ含有量の増大が、新規のより適した経済的な基質を使用して達成され、これらの進歩は商業的ＣＧＰ製造の方向に移動したと思われ（上を参照されたい）、この方法はさらに、他の公知な細菌性ポリ（アミノ酸）例えばポリ（グルタミン酸）およびポリ（ε−リシン）により、技術および食品応用のために商業化されることが必要であった（Ｏｐｐｅｒｍａｎｎ−Ｓａｎｉｏ  Ｆ．Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ  ８９：１１〜２２（２００２年）；Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ５：１１６６〜１１７６（２００４年）により総説された）。その時まで、ＣＧＰ−ジペプチドの生物医学的価値は、ＣＧＰの実際の製造コストとのバランスの取れた関係を実際に提供できるであろう。したがって、ＣＧＰ−ジペプチドの生物医学的効果は現在調査中であるＳａｌｌａｍ，Ａ．およびＡ．Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ．２００７ｃ。Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｃｙａｎｏｐｈｙｃｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  β−ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ，ｆｏｏｄ  ａｎｄ  ｆｅｅｄ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）。
【００７９】
シアノフィシン（ＣＧＰ）からのβ−ジペプチドの大規模製造のための以前に適用されたバイオテクノロジー的方法を最適化した；もともとの方法は、３相：第Ｉ相：バイオマスからの純粋ＣＧＰの大規模抽出；第ＩＩ相：シュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株からの粗シアノフィシナーゼ（ＣｐｈＥａｌ）の大規模製造、第ＩＩＩ相：ＣＧＰのそのジペプチドへの分解からなった。最適な培養条件は、第ＩＩ相のために決定した；２ｇ  ｌ−１のクエン酸塩、ｐＨ６．５および培養温度３７℃。ＣｐｈＥａｌのインデューサーとしてのＣＧＰの最適濃度は５０ｇ  ｌ−１であり、これは以前に適用した濃度の１／５を表す。最大酵素濃度は誘導５時間後に得た。ＣＧＰ−ジペプチドの同じ濃度は、わずか３時間後に同様の誘導効率を示した。さらに、最適条件の４ｇ  ｌ−１のＬ−アスパラギン酸はＣｐｈＥａｌを誘導したが、ＣＧＰと比較して１／３の効率であった。ＣｐｈＥａｌは、ＣＧＰに対する基質特異的結合を介して精製した。精製された酵素を特徴付け、５０℃およびｐＨ７〜８．５において最大活性を有するセリンプロテアーゼであるという結果になった。もともとの方法の第ＩＩＩ相の条件（ＣＧＰ分解）；５０ｇ  ｌ−１のＣＧＰ、１０ｇ  ｌ−１の粗ＣｐｈＥａｌおよびインキュベーションは３０℃において１０時間を、１００ｇ  ｌ−１のＣＧＰ、１０ｇ  ｌ−１の粗ＣｐｈＥａｌおよびインキュベーションは５０℃においてわずか４時間に最適化できた。ＣＧＰは、純度９９％以上（ＨＰＬＣ）のβ−アスパラギン酸−アルギニンおよびβ−アスパラギン酸−リシンジペプチドに分解された。これらの最適化により、コスト、時間および労力がより有効な工業的方法が得られた。
【００８０】
５００ｌ規模の醗酵におけるプロタミラスでのＣＧＰの製造に先立って、プロタミラスの利用可能なチャージについての予備試験により、ＣＧＰ製造にとって７％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）が最適であることが明らかになったが、プロタミラスの前のチャージについてのＥｌｂａｈｌｏｕｌ，Ｙ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：７７５９〜７７６７（２００５年）の先行する研究において、最適濃度が６％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）であることが見出された。このことは、工業的デンプン製造の残留化合物であるプロタミラスは、チャージごとに変動しうる組成物を含む複合培地であり、したがって培養培地として適用前に調整されなければならない。
【００８１】
醗酵期間中および最初の６時間の後、温度感受性λ−リプレッサー（ｃＩ８５７）を不活性化するために温度を３７℃に上昇させ、その結果ＣＧＰ−シンテターゼ（ＣｐｈＡ）遺伝子の誘導を可能にした。この時点で、組換え大腸菌株の細胞は、すでに２時間対数増殖期であった。この醗酵経過が、ＣＧＰ−シンテターゼの誘導およびＣＧＰの最大の細胞内蓄積に最適であることが証明された（Ｆｒｅｙ，Ｋ．Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：３３７７〜３３８４（２００２年））。
【００８２】
さらに醗酵の６時間後、培地の濁度が、自動調節攪拌の増加と平行して急上昇を示した。このことは、３７℃への温度上昇に加えて強力な細胞成長のための培地中の酸素の減少により説明できる。明らかに、培地中の酸素含有量はあらかじめ調整した最小値より低下し、攪拌の自動増加を起こし、これが順に泡および気泡の高度の形成をもたらし、その後ＯＤ８５０ｎｍ値が不正確になった。消泡剤の手動の添加は、濁度の急速な低下を起こし、正常なレベルに達した。
【００８３】
ＣＧＰが細胞内に最大に蓄積したことが顕微鏡的に予測された時（１５時間後）に、醗酵を終了させた。しかし、醗酵サンプルの後の分析により、より良い取得時間が１３時間のインキュベーション後であったことが示された。その時点において、ＣＧＰ含有量は約１３％（ＣＤＭのｗｔ／ｗｔ）であり、一方１５時間後に１０％（ＣＤＭのｗｔ／ｗｔ）に下降した。この損失は、明らかに、ＣＧＰ含有量の、醗酵期間中に唯一可能な方法であった顕微鏡予測の不正確さのためであった。さらに、ＣＧＰ含有量の減少は、インキュベーション中の時間に発生するプラスミドの損失の可能性が最も高い（Ｅｌｂａｈｌｏｕｌ，Ｙ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：７７５９〜７７６７（２００５年））。ポリマーの抽出および精製後、ＨＰＬＣ分析により、ＣＧＰの高純度および３種のアミノ酸：アスパラギン酸（４７．７ｍｏｌ％）、アルギニン（４５．６ｍｏｌ％）およびリシン（６．８ｍｏｌ％）からなることが明らかになった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＣＧＰが２５〜３０ｋＤａの分子サイズを有することが示された。これらの特徴は、いくつかの培地上の同じ菌株により以前に産生されたＣＧＰの特徴と非常に一致する（Ｆｒｅｙ，Ｋ．Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：３３７７〜３３８４（２００２年）；Ｅｌｂａｈｌｏｕｌ，Ｙ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：７７５９〜７７６７（２００５年））。
【００８４】
近年、１ｇ  ｌ−１のクエン酸塩を含む単純な無機塩培地（ＳＭ−培地）が、シュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株からの、ＣｐｈＥａｌの大規模製造に適用された。この培地は、その単純でコストのかからない組成物のため、ならびに使用する菌株に対して適切であるため好ましい（Ｓａｌｌａｍ，Ａ．およびＡ．Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ．２００８ｂ。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  β−ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｙａｎｏｐｈｙｃｉｎ。準備中）。しかし本研究の期間中、成長に最適なクエン酸塩濃度は６ｇ  ｌ−１にもかかわらず、このような培養においてＣｐｈＥａｌは産生されなかった。ＣｐｈＥａｌの最大の製造は２ｇ  ｌ−１のクエン酸塩で成長する培養において起こった；このことは、この酵素が基質の制限下においてのみ誘導されることを示した。温度およびｐＨの最適条件に関する他の実験は、３７℃および５．５〜７．５のｐＨ範囲を示し、ＤＩＰ１株およびＣｐｈＥａｌの製造にとって最適な最適条件は６．５であった。これは、はじめに１ｇ  ｌ−１のクエン酸塩、ｐＨ７．５およびインキュベーション温度３０℃を適用した製造方法の効率を強化した（Ｓａｌｌａｍ，Ａ．およびＡ．Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ．２００８ｂ。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  β−ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｙａｎｏｐｈｙｃｉｎ。準備中）。
【００８５】
ＣｐｈＥａｌの誘導についての延長調査は、以前に用いられたＣＧＰ濃度（２５０ｍｇ  ｌ−１）のわずか１／５（５０ｍｇ  ｌ−１）が、同じ効果をもたらすために十分であったことを明らかにした。さらに、ＣＧＰ−ジペプチドは、同じ効率でＣｐｈＥａｌを誘導するためには同じ濃度（５０ｍｇ  ｌ−１）で十分であった。しかし、ジペプチドにより誘導される培養液を取得するまでに必要な短時間のインキュベーション期間（３時間）は、ＣＧＰ−ジペプチドが、ＣｐｈＥａｌの実際のインデューサーであり、ＣＧＰそれ自体ではないことを示す。加えて、アスパラギン酸は、ＣＧＰ−ジペプチド以外のＣｐｈＥａｌの良好なインデューサーであり、４ｇ  ｌ−１の濃度および５時間のさらなるインキュベーション期間がＣｐｈＥａｌの最大の製造に必要であり、これは、ＣＧＰまたはそのジペプチドの製造効率のわずか１／３のＣｐｈＥａｌの製造効率であったことを表した。したがって、将来の適用におけるインデューサーの選択は、依然として状況およびコスト依存性のままである。
【００８６】
もともとの方法の第ＩＩＩ相（粗ＣｐｈＥａｌを介したＣＧＰの大規模分解）は、３０℃の代わりに５０℃においてより有効であることが見出された。この最適化は、３０℃において１／４の分解時間で容易に分解可能にするために、ＣＧＰ濃度をはるかに高くする（最大１００ｇ  ｌ−１）。このことは、温度が１０ケルビン（１０℃）上昇すると反応速度が２倍になるというＶａｎ’ｔ  Ｈｏｆｆの方程式に一致する。さらに、分解混合物の体積および分解混合物の汚染の危険性がこのような温度上昇において最小化される。インキュベーション温度３０℃および５０℃の双方において、分解時間は、粗ＣｐｈＥａｌ濃度の減少およびＣＧＰ濃度の増加と共線性増加を示した。したがって、得られた式は、将来の方法適用において最適な分解パラメーターの適用に役立ち得る。分解相の効率は５０℃において非常に高いので、式は５０℃における適用に関して計算し、その結果、最大１００ｇ  ｌ−１のＣＧＰ濃度に適している。
【００８７】
有機溶媒または硫酸アンモニウムによる沈殿により、弱い精製効果および低い酵素回復率が提供された。逆に、ＣＧＰに対する特異的結合による開発された手順は、高度に有効であることが証明され、単一の基質（ＣＧＰ）を使用する粗溶液中の他のタンパク質から、ＣｐｈＥａｌを分離する有利性を有する。精製方法は、ＣＧＰマトリックスをそのジペプチドに分解することで終了し、これらは同時にこの方法の価値のある最終産物であり、したがってさらに主要な製造流に向かうことができる（材料の損失はない）。精製方法は、容易に規模を拡大でき、所望であれば将来の方法の適用に統合される。
【００８８】
もともとの方法（粗ＣｐｈＥａｌの大規模製造）の第ＩＩ相の効率およびその精製の可能性を上げるために、２つの式を作り出した。第１の式（ｓ．ａ．）は、ＣｐｈＥａｌの測光分析に基づき、粗上清中のＣｐｈＥａｌ含有量の高速決定を可能にする。ＣｐｈＥａｌの決定された濃度は、その後第２の式に統合することができ、結合するＣＧＰの必要量を評価し、その結果純度、上清中のＣｐｈＥａｌの完全な含有量を評価する。このスキームは、それらのタンパク質組成が大きく異なり得る粗ＣｐｈＥａｌの将来の製造チャージのための信頼できる道具を提供する。
【００８９】
精製ＣｐｈＥａｌの基質特異性に関する実験中に、ＣＧＰだけでなく、ＢＳＡもまた分解されたが、含有量は低かった。このことは、シュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株由来のＣＧＰａｓｅが、それぞれ、以前に特徴付けられた、シュードモナス・アンギリセプチカＢ１株および巨大菌ＢＡＣ１９株由来のＣｐｈＥＰａおよびＣｐｈＥＢｍほど特異的ではないと思われることを示している。この非特異的効果に関するより妥当な説明は、精製酵素溶液中にわずかな他のタンパク質が存在することである。これらのタンパク質が、高度に濃縮されたサンプルにおいてのみ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて集中的な硝酸銀染色により可視化されたにもかかわらず、非特異的プロテアーゼの最少量は、ＣＧＰ以外の被検基質にこのような効果を生み出すと思われる。
【００９０】
シュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株由来のＣｐｈＥａｌは、セリン−プロテアーゼ阻害剤のペファブロック（Ｐｅｆａｂｌｏｃ）（登録商標）およびＰＭＳＦ双方により大きく阻害された。このことは、このＣＧＰａｓｅがセリン型のプロテアーゼに属する可能性が最も高いことを示す。このことは、以前に特徴付けられたＣＧＰａｓｅ；ＣｐｈＢ、ＣｐｈＥＰａおよびＣｐｈＥＢｍに関する結果と一致する。さらに、ＣｐｈＥａｌはトリプトファン酸化剤のＮ−ブロモコハク酸イミドにより完全に阻害され、トリプトファン残基が酵素の触媒機序に関連していると思われることを示す。また、このことは、ＣｐｈＥａｌおよび細胞外ＣｐｈＥＰａおよびＣｐｈＥＢｍの間の高い類似性を指摘する。ロイペプチンまたはＥＤＴＡを用いて処理されたＣｐｈＥａｌサンプルは、ＣＧＰ重層寒天プレートにおいて阻害活性を示さなかったが、ＥＤＴＡを用いて処理されたサンプルのＨＰＬＣ分析は、約７５％のＣＧＰａｓｅの阻害を示した。このことは、ＯＰＡ誘導体化の間に大量の沈殿が形成されたためであり、酵素が阻害されたためではない。（Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２５０９６〜２５１０５（２００２年）；Ｏｂｓｔ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ５：１５３〜１６１（２００４年））。以前に特徴付けられた、それぞれ、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）種ＰＣＣ６８０３、シュードモナス・アンギリセプチカＢ１株および巨大菌ＢＡＣ１９株由来のＣｐｈＢ、ＣｐｈＥＰａおよびＣｐｈＥＢｍと比較した、シュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株のＣｐｈＥａｌの生化学的特徴を、表３に表示した。精製ＣｐｈＥａｌのいくつかの特徴はＣｐｈＥＰａおよびＣｐｈＥＢｍの特徴と比較的類似していたが、関連する違い、例えば分子サイズおよび至適温度を観察することができる。後者はＣｐｈＥａｌに関して５０℃であり、これは公知のＣＧＰａｓｅすべてに関して最も高い至適温度であり、その結果、純粋および粗形態でこの酵素を適用することの大きな利益を提供する。精製酵素は、至適ｐＨ範囲７〜８．５、最適は８．５を示し、これは粗酵素（５．５〜７．５、最適は６．５）に関して決定された至適ｐＨ範囲から移行する。このことは、複合環境を表す粗抽出物中に多くの他のタンパク質が存在し、このような環境内の相互作用が、順に、ＣＧＰａｓｅの構造および／または特性に影響を及ぼし得ることによる可能性が最も高い。細胞系、シュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１は、２００８年６月１０日に、ＤＭＳＺ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ、３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙに受託番号ＤＳＭ  ２１５３３として寄託された。
【００９１】
本発明を、以下の実施例においてさらに説明するが、これらは本発明を限定するものと解釈するべきではない。
【実施例】
【００９２】
材料および方法
サンプリングおよびサンプルの調製：腸内細菌叢のサンプルを、新鮮に解体された健康な標本から採取した（表１）。反芻動物を除いて（授乳歴が決定できない）、選択されたすべての動物、鳥類および魚類は、少なくとも部分的に自由に生活し、自由に食餌をしていた。サンプルは、個々の供給源の動物の消化管に沿って、完全に満たされた５０ｍｌの滅菌ファルコンチューブにより、いくつかの部位から採取され（表１）、使用まで４℃に維持された。サンプルを滅菌標準生理食塩水で希釈し（表１）、その後滅菌条件下で固体材料からろ過した（ひだ折フィルター(folded filter)、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。糞サンプルを滅菌食塩水中で刻み、上記のようにろ過した。
【００９３】
培地：嫌気条件下でＣＧＰ分解可能な細菌に富むために、以下の基礎培地（ＢＭ）を適用した：１．０ｇのＮＨ４Ｃｌ、３．０ｇのＫＨ２ＰＯ４、３．０ｇのＫ２ＨＰＯ４、０．１ｇのＫＣｌ、０．５ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．５ｇのＮａＣｌ、０．５ｇのシステイン−ＨＣｌ、０．５ｇの酵母エキス（テキストに指示がない限り）、１０ｍｌのＳＬ１０の微量成分溶液および１ｍｇのレザズリン／ｌ蒸留水。ｐＨを、ＫＯＨを用いて７．０に調整した。培地を沸騰させ、Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏを、最終濃度０．０４％（ｗｔ／ｖｏｌ）になるように加えた後で、早急にフォルミエガス（Formier gas）（Ｎ２：Ｈ２、９５：５％、ｖｏｌ／ｖｏｌ）雰囲気を含有する嫌気性チャンバー（Ａ型−手動気密室；Ｃｏｙ  Ｉｎｃ．、Ｇｒａｓｓ  Ｌａｋｅ、ＭＩ、ＵＳＡ）に移した。室温に冷却後、１０ｍｌのアリコートをフンゲイトチューブに分注し、密閉し、嫌気性チャンバーから取り出し、その後、オートクレーブで１２１℃において２０分間滅菌した。好気培養を、還元剤のシステイン−ＨＣｌおよびＮａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏを欠いたＢＭ培地を含有する１００ｍｌのＫｌｅｔｔフラスコにおいて実施した。
【００９４】
ルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版。Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９年））を、ＣＧＰ分解細菌の精製および生存培養の維持のために使用した。
【００９５】
シュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株の単離のために、Ｄｕｆｒｅｓｎｅ，Ａ．ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ３１：６４２６〜６４３３（１９９８年）の変法無機培地（ＳＭ培地）を使用した；１．０ｇのＮＨ４Ｃｌ、５．０ｇのＫＨ２ＰＯ４、１ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（個別に滅菌および添加）、および１０ｍｌの微量成分ストーク（stalk）溶液／ｌ水道水。微量成分ストック溶液は、ニトリロ三酢酸（７０ｍＭ、ｐＨ６．５）、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（５ｇ／ｌ）、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（０．８５ｇ／ｌ）、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（０．１４ｇ／ｌ）、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（０．０８５ｇ／ｌ）、Ｈ３ＢＯ３（０．１７ｇ／ｌ）、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．９ｇ／ｌ）およびＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（０．０９ｇ／ｌ）を含有した。培地のｐＨを７・０に調整し、その後オートクレーブで１２１℃において２０分間滅菌した。
【００９６】
バッフル付きエレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）フラスコにおいて液体培養を適用し、Ｐｉｌｏｔｓｈａｋｅ  ＲＣ−４／６−Ｗ  水平振とう機（Ｋｕｈｎｅｒ  ＡＧ、Ｂｉｒｓｆｅｌｄｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）において１５０ｒｐｍでインキュベートした。ＣＧＰ重層寒天プレートを調製するために、１．２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のバクトアガー（ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ）をＣＧＰ懸濁液（１〜２ｇ／ｌ）に加え、この混合物をその後、オートクレーブで１２１℃において２０分間滅菌し、４５℃に冷却後、すでに調製されたＳＭ寒天プレート上に薄層として注いだ。
【００９７】
ＣＧＰ重層寒天プレートを調製するために、１．２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のバクトアガーをＣＧＰ懸濁液（１〜２ｇ  ｌ−１）に加え、この混合物をその後、オートクレーブで１２１℃において２０分間滅菌し、４５℃に冷却後、すでに調製されたＳＭ寒天プレート上に薄層として注いだ。
【００９８】
ＣＧＰの供給源および単離：「組換え」ＣＧＰを、ラルストニア・ユートロファＨ１６−ＰＨＢ−４−Δｅｄａ（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ｃｐｈＡ６３０８／ｅｄａＨ１６）（Ｖｏｓｓ，Ｉ．ら、Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｅｎｇ．８：６６〜７８（２００６年））の凍結乾燥細胞から単離し、改良酸抽出方法（Ｆｒｅｙ，Ｋ．Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：３３７７〜３３８４（２００２年））に従って精製した。ＣＧＰを、スピルリナの市販の製品から、先にシアノバクテリアに関して記載した方法（Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．Ｄ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ４２０：１６５〜１７６（１９７６年））に従って単離した。
【００９９】
大規模にＣＧＰを単離および精製するために、酸抽出法を以下のように最適化した（Ｆｒｅｙ，Ｋ．Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：３３７７〜３３８４（２００２年））；ＣＧＰ含有乾燥質量を水道水に懸濁し、最終濃度０．１ｇ／ｍｌとした。ｐＨを、濃ＨＣｌ（３２％）を用いて１まで下げ、一晩攪拌した。懸濁液を、ＣＥＰＡ  Ｚ６１連続遠心分離機（ＣＥＰＡ、Ｃａｒｌ  Ｐａｄｂｅｒｇ  Ｚｅｎｔｒｉｆｕｇｅｎｂａｕ  ＧｍｂＨ、Ｌａｈｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて１７０００ｒｐｍにおいて遠心分離し、ペレットを２０ｌのＨＣｌ  ０．１Ｎに再懸濁し、１時間攪拌し、再度遠心分離し、上清を第１のチャージに加え、一方ペレットは廃棄した。ＣＧＰ含有上清を、ＣＧＰが沈殿するように３０ｌのガラス瓶においてＮａＯＨ（５０％）を用いて中和（ｐＨ７．３）した。上清を廃棄する前に、乳状懸濁液を４℃において一晩放置した。希ＨＣＬに不溶なすべての不純物を取り除くために、３回以上ＣＧＰを繰り返し溶解し、中和した。得られたＣＧＰを３０ｌのＨＣＬ  ０．１Ｎに溶解し、０．２μｍのＳａｒｔｏｂｒａｎ−Ｐフィルターユニット００型（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を通した。溶液を、ＮａＯＨを用いて再度中和し（ｐＨ７．３）、一晩放置し、上清を廃棄した。あらゆる水溶性の不純物および脱塩ＣＧＰを除去するために、ペレットを、５倍のベッドボリュームの蒸留水を用いて３回連続して洗浄した。最終的に、ＣＧＰのペレットを２００００ｒｐｍにおいて遠心分離し（ＣＥＰＡ  Ｚ４１  連続遠心分離機）、−３０℃において凍結し、ＢＥＴＡ１−１６型凍結乾燥機（Ｃｈｒｉｓｔ  Ｇｅｆｒｉｅｒｔｒｏｃｋｎｕｎｇｓａｎｌａｇｅｎ、Ｏｓｔｅｒｏｄｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において凍結乾燥した。
【０１００】
ＣＧＰの滅菌：ＣＧＰの滅菌ストック懸濁液を調製するために、ジエチルエーテルを３：１（ｖｏｌ／ｗｔ）の割合でＣＧＰに加えた。１５分後、溶媒を廃棄し、完全に蒸発した後、ＣＧＰを滅菌０．１ＮのＨＣｌに溶解することで微粒子の懸濁液を得、その後、ｐＨ７．３において、等量の滅菌０．１ＮのＮａＯＨを加えることによりポリマーを沈殿させた。または、ＣＧＰをまず０．１ＮのＨＣｌに溶解し、フィルターを通し（細孔径０．２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＧｍｂＨ、Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、最終的に上記のように再沈殿させた。ストック溶液中のＣＧＰの濃度を、短時間の遠心分離（３５００×ｇ、２分間）でＣＧＰを沈降させることによって、もしくは単純に、ＣＧＰを４℃において一晩沈降させることによって調整した。双方の場合において、その後上清を部分的に廃棄し、最終的に所望のＣＧＰ濃度を得た。嫌気性のＣＧＰ分解に関する実験を、嫌気的に調製した、０．５ｇｌ−１の酵母抽出物を含む、または含まない１０ｍｌのＢＭを含有するフンゲートチューブにおいて実施した。滅菌ＣＧＰ懸濁液を、嫌気的に調製したＢＭフンゲートチューブに、最終濃度１ｇ  ｌ−１になるように直接注入した。チューブ内のＣＧＰの視覚的消失は、その分解を示した。ＣＧＰ重層寒天プレートの調製のために、１．２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のバクトアガー（ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ）をＣＧＰ懸濁液に加え、この混合物をその後、オートクレーブで１２１℃において２０分間滅菌し、４５℃に冷却後、すでに調製されたＢＭ寒天プレート上に薄層として注いだ。
【０１０１】
哺乳動物、鳥類および魚類の腸内細菌叢のサンプルによるＣＧＰの嫌気性分解：菌叢サンプルを得た場所の生息環境の自然条件を刺激するために、調製サンプルを、接種材料および栄養食品補助剤として、同時に使用した。ＢＭ培地（酵母抽出物非含有）中の１ｇ  ｌ−１のＣＧＰを含有する滅菌嫌気性フンゲートチューブに、最終濃度１０％になるように接種し、３７℃においてＣＧＰ分解が起こるまでインキュベートした。
【０１０２】
腸内菌叢中のＣＧＰ分解細菌のスクリーニング：ＣＧＰ分解細菌を単離するために、調製菌叢サンプルの１００μｌのアリコートを、好気的に調製された、ＣＧＰを重層したＢＭ寒天プレートにスプレッドした。３７℃において数日間インキュベートした間に、プレートを、ＣＧＰ分解細菌のコロニーにより起こるハローの出現に関して検査した。さらに、インキュベーションの間、コロニー計測手順を用い、ＣＧＰ分解細菌のコロニーと非分解細菌のコロニーとの割合を決定した。
【０１０３】
ＣＧＰ分解の純粋培養の単離：形態的に異なるＣＧＰ分解細菌のコロニーを、分解ハローを示すコロニーから、新鮮なＣＧＰ重層寒天プレートに、連続３世代の間材料を移すことによって選択し、さらに精製した。純粋培養をＣＧＰ重層寒天プレートにおいて試験し、それらがＣＧＰ分解能を保有していたことを確認する前に、さらに、３ステップの精製をＬＢ寒天プレートにおいて適用した。
【０１０４】
純度管理：単離した純粋培養の純度を、顕微鏡によって、さらに嫌気条件および好気条件下で異なる培地において培養することによって、定期的に確認した。
【０１０５】
分析技術：遊離のアミノ酸および低分子ペプチド（ＣＧＰ−ジペプチド）を、上記のようなｏ−フタルジアルデヒド(phtaldialdehyde)（ＯＰＡ）試薬を用いた、それらの遊離のアミノ基の予備カラム誘導体化（Ａｂｏｕｌｍａｇｄ，Ｅ．ら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７４：２９７〜３０６（２０００年））後に、逆相ＨＰＬＣ（Ｋｏｎｔｒｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｅｕｆａｈｒｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって検出した。ＣＧＰサンプルの分析のために、ポリマーをあらかじめ酸加水分解に供した（６Ｎ  ＨＣｌ、９５℃、一晩）。同様に、酸加水分解をジペプチド構成アミノ酸の定性的確認および定量的確認に適用した。ＨＰＬＣ系はＢ８０１カラム（Ｐｒｅｐ  Ｎｏｖａ−Ｐａｋ  ＨＲ  ３．９×３００）（Ｋｎａｕｅｒ  ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えており、初期溶出剤（８１％、ｖｏｌ／ｖｏｌ、酢酸ナトリウム（５０ｍＭ）：１９％、ｖｏｌ／ｖｏｌ、メタノール）を用いて平衡化した。アミノ酸のＯＰＡ誘導体を、４０℃において流速１．０ｍｌ／分でメタノール勾配（１９〜７５％、ｖｏｌ／ｖｏｌ）により溶出し、その後３３０／４５０ｎｍ（励起／発光）において、モデル１０４６Ａ  蛍光検出器（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて蛍光分析的に検出した。較正のために、クロマトグラフィー的に純粋なアミノ酸を使用した（Ｓｅｒｖａ  Ｆｅｉｎｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ＧｅｒｍａｎｙによるＫｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＡＳ−１０）またはシュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１（ＣｐｈＥａｌ）の細胞外ＣＧＰａｓｅを用いるＣＧＰの総酵素的加水分解によって作製されたジペプチドを使用した（Ｓａｌｌａｍ，Ａ．ら、公開用に提出（２００８年））。
【０１０６】
細菌の成長を、ＫｌｅｔｔフラスコをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  １１０１Ｍ  分光光度計（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に挿入後、５７８ｎｍにおける濁度の増加を測定することによってモニターした。
【０１０７】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析をＳｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０プレート（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に適用し、ＨＰＬＣの初期溶出をＴＬＣにもラン(rum)バッファーとして使用し、染色のために、アセトン中２０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ニンヒドリン溶液を適用した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を、Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ．Ｋ．、Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０〜６８５（１９７０年）に倣って、１１．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のゲルにおいて実施した。タンパク質およびシアノフィシンを、クマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色方法（Ｗｅｂｅｒ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４：４４０６〜４４１２（１９６９年））により染色し、その後銀染色法（Ｈｅｕｋｅｓｈｏｖｅｎ，Ｊ．ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ６：１０３〜１１２（１９８５年））により染色し、タンパク質を低濃度で可視化する。
【０１０８】
ＤＮＡの抽出および１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の分析：上記のように、純粋培養から全ゲノムＤＮＡの単離を実施した（Ｒａｏ，Ｒ．Ｎ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：１６６〜１９８（１９８７年））。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を、全ＤＮＡから標準オリゴヌクレオチドプライマー（ＭＷＧ−ＢＩＯＴＥＣＨ  ＡＧ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物をＮｕｃｌｅｏ−ｔｒａｐ  ＣＲキットを使用して精製し（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、その後直接配列決定した。ＤＮＡの配列決定を、臨床科学および医学的検査のための機関（Ｗ．Ｗ．Ｕ．Ｍｕｎｓｔｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において、キャピラリーシーケンサー（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７３０  ＤＮＡ  アナライザー）において通常通り実施し、配列を、データ収集ソフトウェアｖ３．０（双方ともＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙによる）により分析した。配列反応を製造業者により示された手順に従って、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ターミネーターｖ３．１サイクル配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および以下の配列決定プライマーを使用して、調製した：
27f (5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'; 配列番号１），
343r (5'-CTGCTGCCTCCCGTA-3'; 配列番号２），
357f (5'-TACGGGAGGCAGCAG-3'; 配列番号３），
519r (5'-G(T/A)-ATTACCGCGGC(T/G)GCTG-3'; 配列番号４），
536f (5'-CAGC(C/A)GCCGCGGTAAT(T/A)C-3'; 配列番号５），
803f (5'-ATTAGATACCCTGGTAG-3'; 配列番号６），
907r (5'-CCGTCAATTCATTTGAGTTT-3'; 配列番号７），
1114f (5'-GCAACGAGCGCAACCC-3'; 配列番号８），
1385r (5'-CGGTGTGT(A/G)CAAGGCCC-3'; 配列番号９）および
1525r (5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3'; 配列番号１０）
（ＭＷＧ−ＢＩＯＴＥＣＨ  ＡＧ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０１０９】
配列の分析およびアライメントならびに系統樹の構築を、前記のように適用した（Ｓａｌｌａｍ，Ａ．ら、公開用に提出（２００８年））：核酸配列データを、Ｃｏｎｔｉｇ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＣＡＰ）オンラインソフトウェアを用いて分析した。配列を、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）のデータベースにおいて利用可能なブラスト機能を使用して、代表的菌株および他の細菌のすでに公開された配列とアライメントした。参照配列を、ＣｌｕｓｔａＩＸ  １．８ソフトウェアを使用してアライメントし、系統樹をＴｒｅｅＶｉｅｗ  １．６．５およびＮＪｐｌｏｔプログラムを使用して構築した。ブートストラップを、１００回のリゼンブリング（resemblings）を実施することによって、樹のトポロジーを評価するために適用した。
【０１１０】
５００ｌ規模の培養：５００ｌ規模での培養を、総体積６５０ｌ（内径６４ｃｍおよび高さ１９８ｃｍ）を有し、ｄ／Ｄ値の関係（攪拌器の直径対攪拌槽の直径との関係）が０．３７５である、Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｄ６５０ステンレススチールのバイオリアクター（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において実施した。このバイオリアクターは、３つの攪拌器を装備しており、それぞれが６個のパドルおよびＦｕｎｄａ−Ｆｏａｍの機械的破泡装置（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む。さらに、ポートを滅菌可能なプローブとして使用し、溶解酸素（ｐＯ２）（モデル２５；Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ｐＨ（モデルＰａ／２５；Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ  ＧｍｂＨ）、泡（モデルＬ３００／Ｒｄ．２８；Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、温度（ｐｔ１００電極；Ｍ．Ｋ．Ｊｕｃｈｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ、  Ｆｕｌｄａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および８５０ｎｍにおける吸光度（モデルＣＴ６；Ｓｅｎｔｅｘ／Ｍｏｎｉｔｅｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）を測定した。操作を、デジタル調節ユニットとＭＦＣＳ／ｗｉｎソフトウェアパッケージ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）との併用によって調節し、記録した。培養は３０℃において実施し、ｐＯ２を倍地中で飽和の４０％を超えるように調整し、攪拌によって自動的に調節され、通気速度は０．７ｖｖｍ（体積／体積×分）で一定であった。培地の最初のｐＨは６．９であり、成長が耐えられるｐＨの上昇は最大７．５であり、そうでない場合、４ＮのＨＣｌを添加することによってｐＨを調節した。
【０１１１】
細胞分離、上清タンパク質の濃度および脱塩：ＣＥＰＡ  Ｚ４１型またはＺ６１型の連続遠心分離機（Ｃａｒｌ  Ｐａｄｂｅｒｇ  Ｚｅｎｔｒｉｆｕｇｅｎｂａｕ  ＧｍｂＨ、Ｌａｈｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて遠心分離により細胞を取得した。分子サイズ３０ｋＤａを超えるタンパク質を濃縮し、その後、３０ｋＤａのＣＯＰ（カットオフポイント）およびＳａｒｔｏｃｏｎ（登録商標）２Ｐｌｕｓ型（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のステンレススチールホルダーを有するクロスフローＳａｒｔｏｃｏｎ（登録商標）ポリエーテルスルホン・カセットを使用して、脱塩した（５倍のベッドボリュームのＨ２Ｏ）。
【０１１２】
さまざまな基質における成長：基質利用を、１００ｍｌのバッフル付きＫｌｅｔｔフラスコにおいて調査し、個々のフラスコは、１０ｍｌのＳＭ培地および以下の基質の１種を１ｇ  ｌ−１で含有した：乳酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、グルコン酸塩、グルコース、フルクトース、スクロースおよびグリセリン。すべての基質のストック溶液を、ろ過（細孔径０．２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＧｍｂＨ、Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって滅菌した。実験は２重に実施し、同じ試験条件下で成長した前培養から接種した。成長を、３０℃において２４時間のインキュベーション期間後、ＯＤ５７８ｎｍにおける増加によってモニターした。
【０１１３】
シアノフィシンの醗酵性製造：ＣＧＰを、プラスミドｐＭａ／ｃ５−９１４：：ｃｐｈＡｐｃｃ６８０３を有する組換え大腸菌ＤＨ１株を使用して５００ｌ規模の醗酵で生産した（Ｆｒｅｙ，Ｋ．Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：３３７７〜３３８４（２００２年））。基質および培地として、すでに適用したプロタミラス（Ａｖｅｂｅ，Ｖｅｅｎｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）培地を使用し、（Ｅｌｂａｈｌｏｕｌ，Ｙ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：７７５９〜７７６７（２００５年））により記載されたように希釈し、篩過し、遠心分離することによって調製した。
【０１１４】
ＣＧＰ製造のために使用可能なプロタミラスのチャージの最適濃度を決定するために、４〜８％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の間の濃度のプロタミラス培地における１００ｍｌの培養を、２００ｍｌのバッフル付きフラスコにおいて試験した；培地のｐＨは７．５であり、１００ｍｇ  ｌ−１のアンピシリンを含有した。接種後、フラスコを、３７℃において１５時間、振とう（１２０ｒｐｍ）しながらインキュベートした（振とう器Ｇ２５型、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＧｍｂＨ、Ｎｕｒｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。最終的に、ＣＧＰ含有量を、個々のフラスコからの５０ｍｌのサンプルにおいて測定した。
【０１１５】
醗酵前に、１６ｌの前培養を、それぞれ、１ｌのプロタミラス培地（７％；ｖｏｌ／ｖｏｌ、ｐＨ７．５）、１００ｍｇ  ｌ−１のアンピシリンおよび０．１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のシリコン系消泡剤（５０％；ｖｏｌ／ｖｏｌ、Ｗａｃｋｅｒ  Ｓｉｌｉｃｏｎｅｓ、Ｂｕｒｇｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有する２ｌのバッフル付きフラスコにおいて培養し、３０℃において２０時間、振とう（１１０ｒｐｍ、振とう器ＲＣ−６−Ｗ型、Ａｄｏｌｆ  Ｋｕｈｎｅｒ  ＡＧ、Ｂｉｒｓｆｅｌｄｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）しながらインキュベートした。
【０１１６】
本培養を、総体積６５０ｌ（内径６４ｃｍおよび高さ１９８ｃｍ）を有し、ｄ／Ｄ値（攪拌器の直径対攪拌槽の直径）が０．３７５である、Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｄ６５０ステンレススチールのバイオリアクター（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において実施した。このバイオリアクターは、３つの攪拌器を装備しており、それぞれが６個のパドルおよびＦｕｎｄａ−Ｆｏａｍの機械的消泡装置（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む。さらに、ポートを滅菌可能なプローブとして使用し、溶解酸素（ｐＯ２）（モデル２５；  Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ｐＨ（モデルＰａ／２５；  Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ  ＧｍｂＨ）、泡（モデルＬ３００／Ｒｄ．２８；Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、温度（ｐｔ１００電極；Ｍ．Ｋ．Ｊｕｃｈｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ、  Ｆｕｌｄａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および８５０ｎｍの吸光度（モデルＣＴ６；Ｓｅｎｔｅｘ／Ｍｏｎｉｔｅｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）を測定した。操作を、デジタル調節ユニットとＭＦＣＳ／ｗｉｎソフトウェアパッケージ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）との併用によって調節し、記録した。
【０１１７】
このバイオリアクターを、４００ｌの７％プロタミラス培地（ｐＨ７．５）および７５ｍｌの消泡剤溶液で満たし、インサイツで滅菌し、３０℃に冷却後、１００ｍｇ  ｌ−１の滅菌アンピシリン溶液を添加し、その後４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の前培養を接種した。培養を最初の６時間は３０℃において実施し、培地のｐＨを、６ＭのＮａＯＨまたは６ＭのＨＣｌを添加することによって７．５に維持した。ｐＯ２は、２０％に一定に維持し、攪拌によって自動的に調整し、通気速度は０．１７ｖｖｍ（体積／体積×分）で一定であった。発泡は、機械的破泡装置によって、または消泡剤（５０％、ｖｏｌ／ｖｏｌ）の滅菌溶液の添加によって自動的に調節した。インキュベーション６時間後、醗酵が終了するまで温度を３７℃に上昇させた。細胞を、ＣＥＰＡ  Ｚ６１型連続遠心分離機（Ｃａｒｌ  Ｐａｄｂｅｒｇ  Ｚｅｎｔｒｉｆｕｇｅｎｂａｕ  ＧｍｂＨ、Ｌａｈｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、遠心分離により取得した。
【０１１８】
ＣＧＰの大規模抽出および精製：得られたウェットバイオマスから純粋なＣＧＰを得るために、ＣＧＰの大規模抽出および精製のためにすでに最適化された酸抽出方法を適用した（Ｓａｌｌａｍ，Ａ．およびＡ．Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ．２００８ｂ。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  β−ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｙａｎｏｐｈｙｃｉｎ。準備中）。最終的に、抽出ＣＧＰを−３０℃において凍結し、ＢＥＴＡ  １−１６型凍結乾燥機（Ｃｈｒｉｓｔ  Ｇｅｆｒｉｅｒｔｒｏｃｋｎｕｎｇｓａｎｌａｇｅｎ、Ｏｓｔｅｒｏｄｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において凍結乾燥した。
【０１１９】
ＣＧＰの滅菌：ＣＧＰを、上記のように、ジエチルエーテルによって、または０．１ＮのＨＣｌに溶解し、滅菌ろ過することによって滅菌した（Ｓａｌｌａｍ，Ａ．およびＡ．Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ．２００７ｂ。Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ａｎｄ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙａｎｏｐｈｙｃｉｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＤＩＰ１−Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｏｔｈｅｒ  ｔｈｒｅｅ  ｃｏ−ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｉｘｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．公開用に提出。）。ストック溶液中のＣＧＰの所望の濃度を、短時間の遠心分離（２８００×ｇ、２分間）でＣＧＰを沈降させることによって、もしくは、ＣＧＰを４℃において一晩静置することによって沈降させることによって調整し、その後上清を部分的に廃棄し、所望のＣＧＰ濃度を得た。
【０１２０】
分析技術：細菌成長およびＣＧＰ分解を、ＫｌｅｔｔフラスコをＫｌｅｔｔ光度計（Ｍａｎｏｓｔａｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）に挿入後、濁度の増加を測定することによって、または６００ｎｍにおいて１ｍｌのサンプルのＯＤを、Ｌｉｂｒａ  Ｓ５光度計（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｌｔｄ．、Ｃａｍｅｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いて測定することによってモニターした。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を、Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ．Ｋ．、Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０〜６８５（１９７０年）に倣って、１１．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のゲルにおいて実施した。タンパク質のゲルにおける復元を、（Ｌａｃｋｓ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２５：７４６７〜７４７３（１９８０年））に倣って適用した。タンパク質およびシアノフィシンを、クマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色方法（Ｗｅｂｅｒ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４：４４０６〜４４１２（１９６９年））により染色し、または銀染色法（タンパク質に関してのみ）（Ｎｅｓｔｅｒｅｎｋｏ，Ｍ．Ｖ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３：２３９〜２４２（１９９４年））により染色した。総タンパク質およびＣＧＰの濃度を、（Ｅｌｂａｈｌｏｕｌ，Ｙ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：７７５９〜７７６７（２００５年））により記載のように、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）試薬を使用して決定した。培養サンプル中の高サイズタンパク質を、濃縮し、脱塩し、１０ｋＤａの膜のビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）チューブ（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ  ＡＧ、Ｈａｎｎｏｖｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、または大容量のために、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）チャンバー（Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＵＳＡ）および１０ｋＤａの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＵＳＡ）を使用して、限外ろ過によってＣＧＰ−ジペプチドから分離した。
【０１２１】
遊離のアミノ酸およびジペプチドを、上記のようなオルトフタルジアルデヒド（ＯＰＡ）試薬を用いた、それらの遊離のアミノ基の予備カラム誘導体化（Ａｂｏｕｌｍａｇｄ，Ｅ．ら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７４：２９７〜３０６（２０００年））後に、逆相ＨＰＬＣ（Ｋｏｎｔｒｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｅｕｆａｈｒｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって検出した。ＣＧＰまたはＣＧＰ−ジペプチドの構成アミノ酸の分析のために、サンプルをあらかじめ酸加水分解に供した（６Ｎ  ＨＣｌ、９５℃、一晩）。ＨＰＬＣ系はＢ８０１カラム（Ｐｒｅｐ  Ｎｏｖａ−Ｐａｋ  ＨＲ  ３．９×３００）（Ｋｎａｕｅｒ  ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えており、初期溶出剤（８１％、ｖｏｌ／ｖｏｌ、酢酸ナトリウム（５０ｍＭ）：１９％、ｖｏｌ／ｖｏｌ、メタノール）を用いて平衡化した。アミノ酸のＯＰＡ誘導体を、４０℃において流速１．０ｍｌ  分−１でメタノール勾配（１９〜７５％、ｖｏｌ／ｖｏｌ）により溶出し、その後３３０／４５０ｎｍ（励起／発光）において、モデル１０４６Ａ  蛍光検出器（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて蛍光分析的に検出した。
【０１２２】
ＣＤｈＥａｌの活性および濃度の決定：シアノフィシナーゼ（ＣｐｈＥａｌ）の活性を、濃縮酵素溶液の少量のアリコートによるＣＧＰ重層寒天プレートにおける分解ハローの形成によって検査し、このために、５ｍｌの培養サンプルを、２８００×ｇにおいて３０分間遠心分離し（Ｍｅｇａｆｕｇｅ  １．０Ｒ、Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｓｅｐａｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ、Ｏｓｔｅｒｏｄｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、得られた上清の４ｍｌを限外ろ過によって１００倍に濃縮した。培養サンプル中の酵素の定量的決定のために、以下のように測光的方法を開発した；２μｌの濃縮した培養上清を、１ｍｌのＣＧＰ懸濁液（１００ｍｇ  ｌ−１）に加え、３０℃において３０分間チューブローテーターにおいてインキュベートした（３ｒｐｍ、５０２Ｓ型、Ｗａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ  ＧｍｂＨ、Ｒｏｍｍｅｒｓｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。最終的に、サンプルのＯＤ６００ｎｍを測定し、分解によるＣＧＰ量の減少を示し、順に、これを使用し、溶液中のＣｐｈＥａｌの濃度を、それぞれの較正曲線を介して示した。
【０１２３】
ＣＧＰ分解のための最適な濃度および条件：シュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株（Ｓａｌｌａｍ，Ａ．およびＡ．Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ．２００８ｂ。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  β−ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｙａｎｏｐｈｙｃｉｎ。準備中）を用いた、上記の５００ｌの醗酵期間に得られた粗ＣｐｈＥａｌ粉末を使用して、必要な分解時間と関係したＣＧＰ濃度と粗ＣｐｈＥａｌとの間の最適な割合を決定するために、純粋ＣＧＰ懸濁液（水中、ｐＨ７．３）の段階希釈（５０〜１００ｇ  ｌ−１）を、それぞれ全体積１ｍｌのエッペンドルフチューブに調製し、さまざまな量の粗ＣｐｈＥａｌ粉末［ＣｐｈＥａｌ含有量４．６％（ｗｔ／ｗｔ）］を個々に調製されたＣＧＰ濃度に加え、反応チューブをチューブローテーター（３ｒｐｍ）において３０℃でインキュベートし、ＣＧＰの完全な分解に必要なインキュベーション期間を明らかにした。
【０１２４】
ＣＧＰ分解のための最適ｐＨを決定するための実験を、ｐＨ値が５．０から９．０の間である１ｍｌのＣＧＰ懸濁液（１００ｇ  ｌ−１）を含有するエッペンドルフチューブにおいて実施し反応チューブはさらに１０ｇ  ｌ−１の粗ＣｐｈＥａｌを含有し、３０℃において３０分間インキュベートした。最適な分解温度のための反応混合物は、同様の濃度のＣＧＰ（ｐＨ７．０）およびＣｐｈＥａｌを含有し、１５、２０、２５、３０、３５、３７、４０、５０、６０または７０℃において３０分間インキュベートされた。双方の実験後、すべてのチューブにおけるＣＧＰの分解を、パーセントで計算し、一緒に比較した。
【０１２５】
有機溶媒および硫酸アンモニウム沈殿によるＣＤｈＥａｌの精製：濃度１０〜１００％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の間の冷エタノール、アセトンまたはメタノールの１ｍｌを、エッペンドルフチューブ中の５０μｌの濃縮粗ＣｐｈＥａｌ溶液（１４ｇ  ｌ−１）に加え、反応混合物を、−２０℃において６０分間インキュベートした。反応チューブを１６０００×ｇにおいて５分間遠心分離した後で、ペレットを乾燥させ、５０μｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に再懸濁した。硫酸アンモニウム分画を、１０ｍｌの粗ＣｐｈＥａｌ溶液（３．５ｇ  ｌ−１）における硫酸アンモニウムの飽和に対するパーセントの段階的増加（１０〜１００％）により適用し、各ステップにおいてチューブを室温で３０分間インキュベートし、１６０００×ｇにおいて１０分間遠心分離し、ペレットをリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に再懸濁し、その後、限外ろ過によって脱塩した。すべてのタンパク質ペレットを、ＣＧＰ重層寒天プレートにおけるＣＧＰ分解に関して、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるタンパク質含有量に関して分析した。
【０１２６】
ＣｐｈＥａｌの特異的基質精製：ＣｐｈＥａｌの精製方法を、粗抽出物中の酵素のその不溶性基質（ＣＧＰ）に対する強力な親和性によって開発し、ＣｐｈＥａｌはＣＧＰにだけ結合し、したがって沈降により取得できる。ｐＨ７．０において、酵素がＣＧＰに完全に結合するために必要な時間を決定するために、０．５ｍｌの濃縮粗ＣｐｈＥａｌ溶液（１４ｇ  ｌ−１）を、０．５ｍｌのＣＧＰ懸濁液（１００ｇ  ｌ−１）に加えた。最初の１０分のインキュベーションごとに、（短時間の遠心分離の）反応上清からの２μｌのアリコートを、ＣＧＰ重層寒天プレートにおける分解活性に関して試験し、分解ハローの減少が、ＣｐｈＥａｌのＣＧＰに対する完全な結合を示した。実際の精製方法を、類似の１ｍｌの反応混合物において実施し、以下のように進めた：ＣｐｈＥａｌのＣＧＰに対する完全な結合後、混合物を３０秒間（１６０００×ｇ）遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを１０ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ）を用いて５回洗浄した。その後、ペレットを１ｍｌのリン酸緩衝液に懸濁し、回転させながら（３ｒｐｍ）、ＣＧＰの完全な分解が起こるまで、３０℃において一晩インキュベートした。混合物を遠心分離し（５分、１６０００×ｇ）、その後、ＣＧＰ−ジペプチドを限外ろ過により取り出し、上清の濃縮タンパク質分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度に関して分析した。
【０１２７】
シュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株由来のＣｐｈＥａｌの特徴付け：精製ＣｐｈＥａｌの温度安定性を決定するために、１０μｌアリコートを、さまざまな温度（１０〜８０℃）において２０分間インキュベートし、その後その３μｌを、３０℃におけるＣＧＰ重層寒天プレートでの分解活性に関して試験した。最適分解温度のために、３μｌアリコートの精製ＣｐｈＥａｌ溶液を、１ｍｌのＣＧＰ懸濁液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０中に１００ｇ  ｌ−１）に加え、さまざまな温度（１０、２０、３０、４０、４５、５０および６０℃）において２０分間インキュベートした。精製ＣｐｈＥａｌによるＣＧＰの最適分解ｐＨのために、精製ＣｐｈＥａｌストーク（stalk）溶液の３μｌアリコートを、さまざまなｐＨ値（５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５または９）の１ｍｌのＣＧＰ懸濁液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中に１００ｇ  ｌ−１）に加え、３０℃において３０分間インキュベートした。最終的に、ＣＧＰ分解を、上記のような双方の実験の反応チューブにおいて測光的に決定した。精製ＣｐｈＥａｌの基質特異性を、以下のポリペプチド基質について、前記のように試験した（Ｏｂｓｔ、Ｍ．ら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ５：１５３〜１６１（２００４年））：ＣＧＰ、ウシカゼイン（Ｈａｍｍｅｒｓｔｅｎ−ｇｒａｄｅ）（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｒｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびポリ（α，β−Ｄ／Ｌ−アスパラギン酸）（Ｂａｙｅｒ  ＡＧ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０１２８】
精製ＣｐｈＥａｌについての酵素阻害剤の効果を明らかにするために、５０μｌアリコートの精製酵素ストーク（stalk）溶液を、４５０μｌのＮａ−リン酸緩衝液（５０ｍＭ）に加え、以下の基特異的阻害剤の１つの存在下で３０℃において２時間インキュベートした；ロイペプチン（チオール−プロテアーゼ）、ＥＤＴＡ（メタロプロテアーゼ）、ペファブロック（Ｐｅｆａｂｌｏｃ）（セリン−プロテアーゼ）、ＰＭＳＦ（セリン−プロテアーゼ）またはＮ−ブロモコハク酸イミド（トリプトファン残基）。個々の反応混合物の５μｌのサンプルを、ＣＧＰ重層寒天プレートにおける活性に関して分析した。その後、５μｌアリコートのＣＧＰストーク（stalk）懸濁液（５０ｇ  ｌ−１）を反応チューブに加え、さらに１５分間インキュベートし、遠心分離し、ＨＰＬＣを介して分解産物に関してスクリーニングした。
【実施例１】
【０１２９】
哺乳動物、鳥類および魚類の腸内細菌叢由来のサンプルによるＣＧＰの嫌気性分解：ろ過した菌叢サンプルは、多くのさまざまな細菌および高含有量の基質を含有した。これらのサンプルを得た消化管内部の自然条件を刺激するために、菌叢溶液を接種材料として、および栄養食品補助剤として同時に使用した。ＢＭ培地および１ｇ  ｌ−１のＣＧＰを単一基質として含有する滅菌嫌気性フンゲートチューブに、１０％濃度で接種した。すべての接種嫌気性チューブは、これらの条件下で完全なＣＧＰ分解を示した。チューブ内でＣＧＰの完全な分解に必要なインキュベート期間は、１２から４８時間に及んだ。
【０１３０】
腸内細菌叢中のＣＧＰ分解細菌のスクリーニング：ＣＧＰ分解細菌の単離のために、１００μｌアリコートの調製菌叢サンプルを、ＣＧＰ重層寒天プレート上にスプレッドした。３７℃において数日間インキュベーションの間、プレートは、ＣＧＰ分解細菌の出現が、さまざまな菌叢の中で大きく変化したことを示した（表１）。最も高い発生は、ウサギ（エジプト）、ヒツジ（ドイツ）の盲腸の菌叢およびコイの消化管の菌叢（ドイツ）の場合であった。さらに、分解コロニーの形態的特徴、必要なインキュベーション期間、ＣＧＰの分解により起こるハローの形態および強度もまた、さまざまな菌叢サンプルの中で、および個々のサンプル内のコロニーの中で大きく変化した。このことは、ＣＧＰ分解の多様な能力を有する独特の細菌種の存在を示した。
【０１３１】
ＣＧＰ分解菌株の単離および精製：形態的に異なるＣＧＰ分解細菌のコロニーを選択し、分解ハローを示すコロニーを、新鮮なＣＧＰ重層寒天プレートに移すことによって、さらに精製した。精製作業の間、多くのＣＧＰ分解コロニーが、それらの純粋培養として分解ハローを誘導する能力を失い、したがって無視された。同様に、いくつかのＣＧＰ分解コンソーシアは、純粋培養を得ることが非常に困難であり、さらなる精製手順からも省かれた。他方、精製相は、形態的に異なる特徴を示し、ＣＧＰ分解の能力を保有する６２種の純粋培養をもたらした。表１に実証されるように、ＣＧＰ分解細菌は、個々の動物の消化管に沿ったさまざまな部位から単離された。このことは、例えば反芻動物における食物タンパク質の分解について公知の事実と一致する；第１胃は食物タンパク質の主要な分解部位であるが、未消化のタンパク質（バイパスタンパク質またはエスケープタンパク質）は消化物と一緒に下部消化管に移動し、そこでそれらの一部は、動物の酵素によって、または下部腸内細菌叢によって破壊され、その後、残りが排泄される前に吸収される。バイパスタンパク質の分解は、ミルク製造などの特定の生理的機能にとって重要である（Ｈｏｌｔｅｒ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｄａｉｒｙ．Ｓｃｉ．７６：１３４２〜１３５２（１９９３年））。
【０１３２】
嫌気条件および好気条件下の純粋培養によるＣＧＰの分解：６２種の純粋培養を、好気条件下で液体培地においてＣＧＰを分解する能力に関して試験した。これを、１ｇ  ｌ−１のＣＧＰおよび０．５ｇ  ｌ−１の酵母抽出物を含有するＢＭ培地に適用し、すべての純粋培養のＣＧＰを分解する能力を表した（表１）。還元剤に加えて同様の培地を含有するフンゲートチューブにおける嫌気性ＣＧＰ分解実験により、６２種の単離株のうち、４６種は、同様に嫌気的にＣＧＰを分解できることを明らかにした。当然のことながら、３８種はＣＧＰを完全に分解したが、残りは部分的にＣＧＰの分解を示した。純粋培養による嫌気的ＣＧＰ分解に必要なインキュベーション期間は、３７℃において２４時間から７日間に及んだ。
【０１３３】
ＣＧＰの分解産物：好気培養および嫌気培養において６２種の純粋な単離株によりＣＧＰが完全に分解された直後、培養上清中のＣＧＰの分解産物を、方法の項に述べたようにＯＰＡ試薬を用いたカラムの予備誘導体化の後で、ＨＰＬＣにより決定した。期待したように、ＨＰＬＣ分析により、すべての単離株ＣＧＰをその構成ジペプチドに分解することが明らかされた。酸加水分解の前に供された上清サンプルに関する同様の分析により、３種のＣＧＰ構成アミノ酸；アスパラギン酸、アルギニンおよびリシンの存在が明らかになった。終わりの３種のアミノ酸の検出は、これらの実験に適用された、アルギニン部分のおよそ６Ｍｏｌ％がリシンで置き換えられた組換えＣＧＰの公知の組成に一致する（Ｖｏｓｓ，Ｉ．ら、Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｅｎｇ．８：６６〜７８（２００６年））。
【０１３４】
ＣＧＰ分解純粋培養の分類学上の立場：単離純粋培養の形態的特徴は、単離株のおよそ５０％がバチルス属およびシュードモナス属に属し、一方残りの単離株は、ストレプトマイセス属およびミクロモノスポラ属を含む他の属に属することを示唆した。試験した腸内細菌叢におけるＣＧＰ分解細菌の系統発生についてのより明確な洞察を提供するために、６２種から８種の菌株を、１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列決定によりさらに同定した。表１に示すように、３種の単離株；それぞれ、ヒツジの第１胃の細菌叢（ドイツ）、七面鳥の盲腸の細菌叢（エジプト）およびテラピアの消化管の細菌叢（エジプト）に由来する１７、３５、４９は、バチルス属のメンバーとして同定され、それぞれ巨大菌ＡＣ４６ｂ１、巨大菌ＭＰＦ−９０６およびバチルス・コグリョ（Ｂ．Ｋｏｇｕｒｙｏａｅ）ＳＭＣ４３５２−２Ｔと９９％を超える１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列類似性を有した。２種の単離株；牝牛の結腸の細菌叢（ドイツ）およびハトの盲腸の細菌叢（エジプト）由来の１５および４７は、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属することが発見され、それぞれ、ブレビバチルス・レウスゼリ（Ｂ．ｒｅｕｓｚｅｒｉ）ＤＳＭ９８８７Ｔおよびブレビバチルス属種ＳＥ００４と、９８％を超える１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列類似性を有した。ウサギの盲腸から単離された菌株３１（ドイツ）は、ストレプトマイセス属に所属し、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）ＮＣＩＭＢ  １２８０４Ｔと９８％を超える配列類似性を有した。１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列分析は、アヒルの盲腸由来の菌株３８（ドイツ）は、ミクロモノスポラ属に属し、ミクロモノスポラ属種０１３８と、９９％を超える配列類似性を有することをさらに示した。最終的に、シュードモナス属の代表もまた、同定された単離株の中に発見された；コイ由来の菌株５２（ドイツ）ＣＧＰ分解細菌のシュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１と９９％を超える１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列類似性を示した。
【０１３５】
構築された系統樹（図１）は、多様な動物、鳥類および魚類の細菌叢に由来する８種の同定株間と、それらの密接に関連する菌株および他の細菌との関係を示す。さらに、細胞外ＣＧＰ分解が可能なすべての公知の細菌の分類学的位置が、系統樹において実証される。さらに表２は、細胞外ＣＧＰの分解が可能な細菌の、広範囲な生息環境および系統発生についての要約を提供する。
【０１３６】
スピルリナ・プラテンシスの市販の製品中のＣＧＰ：商品名スピルリナ、これは多くの場合いくつかの栄養的利益を伴い、したがってヒトおよび動物のための添加物として使用される（Ｎａｒａｓｉｍｈａ，Ｄ．Ｌ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．３３：４５６〜４６０（１９８２年）；Ｋｉｈｌｂｅｒｇ，Ｒ．、Ａ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２６：４２７〜４６６（１９７２年）；Ｌｕ，Ｊ．ら、Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ  ２５４：６８６〜６９２（２００４年）；Ｒｏｓｓ，Ｅ．、Ｐｏｕｌｔ−Ｓｃｉ．６９：７９４〜８００（１９９０年）））。これは、ＣＧＰの存在を伴うかどうかを調査するために、ドイツの市場で利用可能な３種のスピルリナ製品を、ＣＧＰの存在に関して検査した。；ｆｒｏｍ  Ｓａｎａｔｕｒ  ＧｍｂＨ（Ｓｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＧｒｅｅｎｖａｌｌｙ  ＧｍｂＨ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）による２種の製品は１００％スピルリナ・プラテンシスからなり、一方、Ａｕｒｉｃａ  ＧｍｂＨ（Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ−Ｅｌｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）による第３の変異体は、それらの４０％を含有する。通常の日用量のおよそ２倍に相当する、３種の製品それぞれの１０ｇのＣＤＭを、ＣＧＰの単離前に微粉に挽くことによって調製した。３種の市販の変異体は、それぞれ、０．０６％、０．１３％および０．１５％のＣＧＰ含有量を示した。単離ＣＧＰの加水分解サンプルの確認ＨＰＬＣ分析は、期待したように、シアノバクテリアのＣＧＰの典型的な構成アミノ酸；アスパラギン酸およびアルギニンを明らかにした。
【実施例２】
【０１３７】
ＣＧＰ由来のβ−ジペプチドの製造のための最適な方法の開発：いくつかの因子；例えば要求される適切かつ経済的な培地、分解のために実用的に調製できる高度に濃縮されたＣＧＰの懸濁液および比較的短時間のインキュベーションにおいて完全なＣＧＰ分解を達成するための細胞外酵素の必要量の規定、をまず小規模に最適化した。
【０１３８】
インデューサー（ＣＧＰ）の添加およびそのその後の分解によるＣｐｈＥの製造の間のＯＤ６００ｎｍにおける変化は、ＣｐｈＥの放出の明確な兆候を表し、したがって、透き通った培地および細胞の調節された成長が必要であり、このことは、材料と方法の項において述べた最終的培地組成物を介して達成された。さらに、被検基質の中で、シュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株は、クエン酸塩において最も優れた成長を示し（図３）、単一基質としてのクエン酸塩の適用濃度（１ｇ／ｌ）は、誘導および分解相中妥当な培養物の成長濁度を保証したが、同時に培養物の成長濁度を調節した。
【０１３９】
大規模方法の分解相（第ＩＩＩ相、下記を参照されたい）のための、ＣＧＰおよび粗ＣｐｈＥ濃度の間のバランスの取れた比率を決定するために、以下の小規模実験を実施した；純粋ＣＧＰ懸濁液（水中、ｐＨ７．３）の段階希釈（１０〜５０ｇ／ｌ）を、個々に全体積１ｍｌのエッペンドルフチューブに調製し、さらに、粗ＣｐｈＥの段階希釈（１〜１０ｇ／ｌ）を、個々の調製ＣＧＰ濃度について試験し、反応チューブを、回転速度３ｒｐｍで、チューブローテーター中で３０℃においてインキュベートした。実験により、低濃度の粗ＣｐｈＥを使用した場合、ＣＧＰの分解は比較的一定な増加を示した。ＣＧＰの最も高い被検濃度（５０ｇ／ｌ）は、２ｇ／ｌの粗ＣｐｈＥ粉末の存在下で１０時間以内に分解できた（図４）。
【０１４０】
ＣＧＰ−ジペプチド大規模製造：純粋ＣＧＰ−ジペプチドの大量の日常的製造を可能にするために、三相性の方法を実施した；第Ｉ相：ＣＧＰの大規模単離および精製、第ＩＩ相：粗ＣｐｈＥ粉末の大規模製造、第ＩＩＩ相：ＣＧＰのそのジペプチドへの分解。
【０１４１】
第Ｉ相（ＣＧＰの大規模単離および精製）：大量のＣＧＰを得るために、ＣＧＰ含有細胞の４７７６ｇの細胞の乾燥質量を使用し、この量は、ラルストニア・ユートロファＨ１６−ＰＨＢ−４−Δｅｄａ（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ｃｐｈＡ６３０８／ｅｄａＨ１６）を用いた、一回の５００ｌ醗酵の間にすでに製造された。このバイオマスチャージのＣＧＰ含有量は、３２％（ｗｔ／ｗｔ）であった（Ｖｏｓｓ，Ｉ．ら、Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｅｎｇ．８：６６〜７８（２００６年））。加えて、ラルストニア・ユートロファＨ１６−ＰＨＢ−４−Δ／ｄｈ／Ωｋｍ−ｃｐｈＡ６３０８を用いた、実験室規模の醗酵由来のいくつかの他の乾燥バイオマスチャージを混合し（総計２４９０ｇ）、第２のチャージと考えた。ＣＧＰを、材料と方法の項において述べた改良酸抽出法に従って個々のチャージから別々に抽出および精製した。得られたＣＧＰの湿潤質量は、主要細胞チャージに関しては１９４８ｇおよび第２のチャージに関しては２９５ｇであり、精製ＣＧＰの乾燥凍結後、双方のチャージから得られた純粋ＣＧＰはそれぞれ６２１．８３ｇおよび８２．１７ｇであった。
【０１４２】
双方の細胞チャージから単離されたＣＧＰの個々のアミノ酸成分のＨＰＬＣ分析により、このポリマーが主にアスパラギン酸およびアルギニンで構成されており、リシンはわずか４．５％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）含有されることが明らかになった。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、双方のチャージ中の単離ＣＧＰが分子量約２０〜３０ｋＤａを有することが明らかになった。さらに、ＨＰＬＣ分析およびＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の双方により、得られたＣＧＰ中にはいかなる不純物も無いことが示された。したがって、双方のＣＧＰチャージは一緒に混合でき、純粋ＣＧＰの最終量は７０４ｇであった。
【０１４３】
第ＩＩ相（粗ＣｐｈＥ粉末の大規模製造）：ＣＧＰ−ジペプチドの商業的製造方法の開発を継続するために、シュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１からの粗ＣｐｈＥの十分量の製造が必要であり、したがって、この菌株を、Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｄ６５０バイオリアクターにおいて５００ｌ規模で培養した。シュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１の前培養を、１ｌのＳＭ培地および１ｇ／ｌのクエン酸ナトリウムを含有する、２ｌのバッフル付きフラスコにおいて培養した；このフラスコを振とうしながら３０℃に置いて１２時間インキュベートした。バイオリアクターを、１ｇ／ｌのクエン酸ナトリウムを含有する４２０ｌのＳＭ培地で満たし、滅菌し、４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の前培養を接種した。最初のｐＨは６．９に調整した。醗酵中、シュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株の細胞は、最初の醗酵時間の直後に成長し始め、ＯＤ６００ｎｍ値が０．４に達し、ほぼ９時間後に定常期に入った。ＣｐｈＥの排出は、０．２５ｇ／ｌ滅菌ＣＧＰ懸濁液を、定常期の最初の２時間後に添加することによって誘導され、インデューサー（不溶性ＣＧＰ）の添加によりＯＤ６００ｎｍは急速に０．５５から０．９８に増加し、加えたＣＧＰの完全な分解には２時間を要し、それは、ＯＤ６００ｎｍの減少を示し、誘導前の値に近い値に達した。１時間後、細胞はわずかに成長し始め、これは、培地中のＣＧＰ−ジペプチドの存在による可能性が最も高い。醗酵は、全培養期間が１４時間で終了した（図５）。
【０１４４】
排出された細胞外シアノフィシナーゼを含む上清中のタンパク質の取得、濃縮および脱塩のために、醗酵を実行しながら連続系を調製した（図６）；取得のために、中央の１００ｌタンクにおいて上清を回収しながら、ＣＥＰＡ  Ｚ４１連続遠心分離を使用して、細胞を分離した。同時に回収した上清を濃縮するために、３０ｋＤａのカセットを有するクロスフローユニットを中央タンクに連結した；フィルターカセット（３０ｋＤａ）のＣＯＰより分子サイズの大きいタンパク質を含有する濃縮保持液を、タンクに再度ポンプで送り、一方透過液は直接廃棄した。クロスフローの流速を調整し、タンク中の体積を約５０ｌに維持した。冷却のために、中央タンクにアイスバッグを導入し、溶液の温度を２０℃以下に維持した。取得終了後、濃縮過程を、５ｌの濃縮液だけがタンク内に残るまで継続した。脱塩のために、濃縮液を５倍のベッドボリュームのＨ２Ｏを用いて洗浄した。先のステップの個々の間に、サンプルを回収し、ＣＧＰ重層寒天プレートにおけるＣＧＰ分解活性に関して確認した（図２）。最終的に、濃縮液を−３０℃において凍結し、凍結乾燥し、最終乾燥重量１７．５ｇの粗タンパク質粉末を得た。
【０１４５】
第ＩＩＩ相（純粋ＣＧＰのそのジペプチドへの分解）：ＣＧＰからジペプチドへの大規模分解を２５０ｇの純粋ＣＧＰおよび１０ｇの粗ＣｐｈＥ粉末を使用して適用し、これらの量は最も高い、調製しやすいＣＧＰ濃度（５０ｇ／ｌ）および小規模実験により決定された１２時間以内の完全な分解を確実にするために十分な粗ＣｐｈＥ（２ｇ／ｌ）の濃度を表す。２５０ｇのＣＧＰ粉末を、５ｌの０．１Ｍ  ＨＣＬに溶解し、ｐＨ７．３に中和し、４℃において沈殿させ、最終的に水道水を用いて３回洗浄することによって脱塩し、所望の濃度の全体積５ｌを得た。その後、１０ｇの粗ＣｐｈＥ粉末を、ＣＧＰ懸濁液に加え、ゆっくり攪拌しながら、３０℃において１２時間インキュベートした。ＣＧＰの完全な分解後、ジペプチド溶液を滅菌ろ過し、第ＩＩ相中に使用した同じクロスフロー系を用いて、粗タンパク質成分から分離し、−３０℃において凍結し、最終的に凍結乾燥し、２２７．５ｇのＣＧＰジペプチドを得た。
【０１４６】
ＣＧＰジペプチドの精製のためにさらなるろ過ステップが必要かどうかを決定するために、いくつかの２０ｍｌアリコート（後の凍結ステップおよび凍結乾燥ステップの前に採取した）を、以下のＣＯＰを有するさまざまな膜を用いてろ過した；１０、５、１および０．５ｋＤａ。ろ過後、ＣＧＰ−ジペプチドを、ろ過前後の凍結乾燥の１ｍｌアリコートの乾燥重量を決定することによって、並びにＨＰＬＣ分析によって評価した。もともとのジペプチド溶液と比較して、ろ過中の乾燥重量の最大損失は、最もＣＯＰが小さい（０．５ｋＤａ）膜の場合７８．５％（ｗｔ／ｗｔ）であり、１ｋＤａの膜では４７．８％（ｗｔ／ｗｔ）の損失が生じ、一方、５ｋＤａの膜では１１．６％（ｗｔ／ｗｔ）の損失が生じ、より大きいＣＯＰ（１０ｋＤａ）を有するろ過膜は、最小の損失である７．４％（ｗｔ／ｗｔ）を示した。
【０１４７】
すべてのろ過系から得られたジペプチドの純度を、ＴＬＣおよびＨＰＬＣ分析によりモニターし、すべてのろ過したジペプチドサンプルは、同じ高グレードの純度を示した（図７、Ｉ）。したがって、主要ジペプチドチャージにはさらなるろ過系ステップは必要なかった。３０ｋＤａのカセットを有するクロスフローは、明らかに分解されたＣＧＰ溶液のタンパク質部分を回収するためにも最も実践的な道具であった。回収されたタンパク質溶液を、再度凍結し、凍結乾燥した。ＣＧＰ重層寒天プレートにおける回収した粉末に関する活性試験は、前述のすべての手順においてＣｐｈＥが生存しており、その活性を保有していたことを示した（図２）。粗粉末の回復率は７８％であった。
【０１４８】
得られたジペプチド粉末の最終品質の調節のために、直接サンプルおよび酸加水分解サンプルを、ＴＬＣにより試験した；直接サンプルでは１つのスポットだけが示され、（図７、Ｉ）、一方加水分解サンプルは、標準アミノ酸のアスパラギン酸、アルギニンおよびリシンに関する典型的なスポットが示された（図７、ＩＩ）。さらに、酸加水分解サンプルに関する確認ＨＰＬＣ分析は、これらの３種の構成アミノ酸に関する典型的なピークだけを明らかにした。これらの結果を手がかりに、ジペプチド粉末の純度は９９％を超えると評価された。２５０ｇのＣＧＰの分解からの最終結果（２２７．５ｇの純粋ジペプチド）は、全方法の全体の効率は９１％を示し、これは将来の最適化を介してさらに増加させることができる。
【実施例３】
【０１４９】
５００ｌ規模でのシアノフィシンの醗酵性製造：本研究のために十分な量のＣＧＰを、（Ｅｌｂａｈｌｏｕｌ，Ｙ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：７７５９〜７７６７（２００５年））に従って５００ｌ規模の醗酵で製造した。しかし、組換え大腸菌ＤＨ１株（ｐＭａ／ｃ５−９１４：：ｃｐｈＡｐｃｃ６８０３）を、７％のプロタミラス（ｖｏｌ／ｖｏｌ）；において培養した。この濃度は、プロタミラスの利用可能なチャージに関する予備実験中に、ＣＧＰ製造のために最適であることが証明された。
【０１５０】
醗酵中（図８）およびインキュベーションの最初の６時間後、温度を３７℃に上昇させ、ＣＧＰ−シンテターゼ（ＣｐｈＡ）遺伝子の誘導を可能にした（Ｆｒｅｙ，Ｋ．Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：３３７７〜３３８４（２００２年））。各々の時間に採取したサンプルは、期待通りにポリマーの漸進的な細胞内蓄積を示し、１３時間後に最大に達し（顕微鏡的に評価）、その後も一定のままであった（図９）。ＯＤ６００ｎｍは、１５時間後に１８．３に達し、その後醗酵は終了したが、その後の分析により醗酵１３時間後に最大のＣＧＰ蓄積は１３％（ＣＤＭのｗｔ／ｗｔ）であり、取得時間（１５時間）には１０％に低下した（ＣＤＭのｗｔ／ｗｔ）ことが明らかになった。得られた４６２６ｇの湿潤細胞塊（１３７２ｇのＣＤＭ）からのＣＧＰの抽出後、１３５ｇの純粋ＣＧＰ粉末を得た。ＣＧＰのＨＰＬＣ分析は、構成アミノ酸のポリマーの６．８Ｍｏｌ％を表すリシンに加えてアスパラギン酸、アルギニンだけを示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＣＧＰの純度が確認され、分子量２５〜３０ｋＤａが示された。
【０１５１】
シュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株のための最適成長条件：ＤＩＰ１株にとって最適な基質であることがすでに証明された（Ｓａｌｌａｍ，Ａ．およびＡ．Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ．２００８ｂ。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  β−ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｙａｎｏｐｈｙｃｉｎ。準備中）クエン酸塩をさまざまな濃度（０．５〜１０ｇ  ｌ−１）で含むＳＭ−培地を試験することにより、６ｇ  １−１が最大の成長を起こすことが示された（３０℃において１３時間後、４７５  Ｋｌｅｔｔ単位）。ｐＨ値が異なる（５．５〜８．５）以外は同じ条件下で、６ｇ  ｌ−１のクエン酸塩において培養されたＤＩＰ１株の培養は、ＤＩＰ１株はｐＨ６．５において最適成長を示し、一方さまざまなインキュベーション温度（１５〜４５℃）における培養により、成長のための最適温度が３７℃であることが明らかにされた。
【０１５２】
シュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株による最大のＣｐｈＥａｌ製造のための最適培養条件：ＤＩＰ１株によるＣｐｈＥａｌの最大製造のための最適培養条件を結論付けるために、細胞を、最適成長条件下でさまざまな濃度のクエン酸塩において培養した；細胞が定常期に達したときに、０．２５ｇ  ｌ−１のＣＧＰの添加によりＣｐｈＥａｌ製造を誘導した。
【０１５３】
５時間後、上清サンプルを濃縮し（１００倍）、ＣＧＰ重層寒天プレートにおける分解活性および測光的にスクリーニングした。クエン酸塩濃度が０．５ｇ  １−１未満または４ｇ  １−１を超える培養物からの上清サンプルは、分解活性を全く示さず、一方、最大活性およびその後の最大ＣｐｈＥａｌ製造は、２ｇ  ｌ−１のクエン酸塩において成長した培養物を誘導してから５時間後にモニターされた。最適製造条件下のさらなる培養実験により、ＤＩＰ１株の細胞はインキュベーションの約１３時間後に定常期に達することが確認され、この時点がＣｐｈＥａｌの誘導にとって最適であることが証明された。したがって、以下の条件がＣｐｈＥａｌ製造にとって最適であると考えられた；２ｇ  ｌ−１クエン酸を含むＳＭ−培地、ｐＨ６．５、３７℃、１３時間後の誘導および、インキュベーション１６時間目の取得。
【０１５４】
ＣＧＰおよび別のインデューサーによるＣｐｈＥａｌの最適な誘導：ＣＧＰ以外の、他のインデューサー候補を、ＤＩＰ１株の培養物において試験した；（ＣＧＰ由来β−ジペプチド、合成ジペプチド（α−アルギニン−アスパラギン酸、α−リシン−アスパラギン酸、α−オルニチンアスパラギン酸）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）、α−ポリアスパラギン酸（Ｂａｙｅｒ  ＡＧ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ポリ−ε−リシン（Ｃｈｉｓｓｏ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リシン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−オルニチンならびにアスパラギン酸類似体［Ｎ−アセチル−アスパラギン酸、ウレイドコハク酸（Ｎ−カルバモイル−アスパラギン酸）］。すべてのインデューサーを、まず、０．２５ｇ  ｌ−１の濃度において試験し、ＣｐｈＥａｌ製造を、ＣＧＰ重層寒天プレートにおいて、およびさらに測光的に分析した。ＣＧＰ、そのジペプチドおよびアスパラギン酸だけが、有意な量のＣｐｈＥａｌを誘導した。その後、最適濃度および最適ＣｐｈＥａｌ取得時間を、これらの３種のインデューサーを用いて誘導した培養物において調査した；ＣＧＰに関しては、０．００１〜３．０ｇ  ｌ−１の濃度で試験し、０．０５ｇ  ｌ−１までの濃度は誘導効果が増加したが、それ以上の濃度になると同じ効率を示した。最大ＣｐｈＥａｌ製造は、０．０５ｇ  ｌ−１のＣＧＰにより、誘導から５時間後に得られた。
【０１５５】
ＣＧＰに関して試験した同じ濃度範囲内でＣＧＰ−ジペプチドにより誘導した以外は同様の条件下で培養した培養物は、インデューサーの濃度に関しては同様の結果を示したが、最大ＣｐｈＥａｌ製造は、誘導のわずか３時間後に得られた。さらに、アスパラギン酸は、４ｇ  ｌ−１のアスパラギン酸により誘導５時間後に最大ＣｐｈＥａｌ製造が得られたので、適切なインデューサーであることを証明したが、最適なＣＧＰ濃度（０．０５ｇ  ｌ−１）により誘導した培養物と比較して、アスパラギン酸による誘導後のＣｐｈＥａｌ製造は３番目でしかなかった。
【０１５６】
粗ＣｐｈＥａｌを介した、ＣＧＰのジペプチドへの分解にとっての最適条件：処理する反応体積およびもともとの方法の第ＩＩＩ相（ＣＧＰの分解）に必要な時間を減少させるために、より高いＣＧＰ濃度（５０〜１００ｇ／ｌ）の分解時間を３０℃において試験し、これは、分解時間と粗ＣｐｈＥａｌ濃度の減少、および分解時間とＣＧＰ濃度の増加とが共線的増加を示した。１０ｇ  ｌ−１の粗ＣｐｈＥａｌの存在下で、最も短い分解期間（４時間）が、ＣＧＰの最も低い被検濃度（５０ｇ  ｌ−１）に関してモニターされ、一方最も高いＣＧＰの被検濃度（１００ｇ  ｌ−１）を分解するためには１６時間が必要であった。
【０１５７】
粗ＣｐｈＥａｌ粉末によるＣＧＰ分解にとって最適なｐＨおよび温度を評価するための実験を、材料および方法の項に記載のように、別々に実施した。反応チューブにおける残留ＣＧＰの測光的決定により、最大ＣＧＰ分解（４５％）は、ｐＨ６．５において起こることが示されるが、ｐＨ範囲５．５から７．５では、結果が近いことが明らかになった。他方、５０℃において最大の９０％に達するまでは温度の上昇に伴って、ＣＧＰ分解が増加する。したがって、ＣＧＰの濃度とＣｐｈＥａｌとの間の最適な関係に関する実験を、最適なパラメーター（５０  ℃、ｐＨ  ６．５）のもとで反復した。これにより、ＣＧＰ濃度５０および１００ｇ  １−１に関する必要な分解時間（１０ｇ  ｌ−１の粗ＣｐｈＥａｌの存在下）は、それぞれ１および４時間に減少した。さらに、最適条件下で、分解時間は、粗ＣｐｈＥａｌの濃度の減少およびＣＧＰ濃度の増加と共線的増加を示した。この共線的関係は、将来の方法適用において、最適分解パラメーターを適用するために役立ち得る。それぞれの式を、１００ｇ  ｌ−１までのＣＧＰ濃度に関して計算し、純粋ＣｐｈＥａｌ（Ｅ）の濃度に基づき、粗抽出物適用のために、ＣｐｈＥａｌ含有量は式を使用する前に決定されるべきである（ｓ．ｕ．）；
Ｐ５０℃における分解時間＝１７．５５−２９．８９１Ｅ［純粋ＣｐｈＥａｌの所望の濃度（ｇ／ｌ）］
【０１５８】
粗上清粉末からのＣｐｈＥａｌの精製：より効率的な方法をさらに前進させるために、およびシュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株由来のＣＧＰａｓｅの特徴についてのより優れた知見を得るために、いくつかの、工業的に適用可能な方法を、粗粉末からＣｐｈＥａｌを生成するために試験した。溶媒、例えば、エタノール、メタノールまたはアセトンを使用する酵素の沈降および精製は、低い回収率および低い精製効果のため満足のいく結果を提供できなかった。しかし、硫酸アンモニウムによる沈降は、飽和濃度の７０％の比較的優れた結果を提供したが、純度はいまだ低すぎた。
【０１５９】
特異的基質結合を介したＣｐｈＥａｌの精製：シュードモナス・アルカリジェネスＤＩＰ１株からＣＧＰａｓｅを精製するための単純な方法を開発した。このために、不溶性ＣＧＰそれ自体を、材料および方法の項に記載のように、ＣｐｈＥａｌを特異的に結合するための結合マトリックスとして使用した。予備試験は、最初の５分後にＣｐｈＥａｌがＣＧＰに完全に結合することを示し、したがって、これは、さらなる適用において最小の結合時間と考えられる。すべての精製ステップにおいて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、酵素の段階的精製（図１０Ａ）および最初の２回の洗浄ステップは、ＣＧＰに結合しなかった他のタンパク質を除去するために必要であることを示した。ＣＧＰマトリックスの分解および限外ろ過によるジペプチドの除去後、高純度のＣｐｈＥａｌを得た。ＣＧＰ重層寒天プレートは、精製ＣｐｈＥａｌの高い活性を示し、精製タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、４５ｋＤａの見かけの分子量を示した。ＣｐｈＥａｌの同一性を、ゲル内再生（ｉｎ−ｇｅｌ−ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）により確認し、ＣｐｈＥａｌは活性を回復し、ＣＧＰ重層寒天プレートにおける分解ハローを形成した。精製ＣｐｈＥａｌ濃度は、４３．２μｇ  ｍｌ−１であり、一方、最初の粗タンパク質溶液中の全タンパク質含有量は９４４μｇ  ｍｌ−１であった。精製酵素の純度をより正確に検出するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、より大量のサンプル（３倍量）に関して反復し、銀染色によりより長い時間染色した；このことにより、比較できるほどの非常に低濃度の、少数の他のタンパク質のバンドの存在が明らかになった（図１０Ｂ）。
【０１６０】
醗酵上清中のＣｐｈＥａｌ含有量の決定：将来の方法適用において純粋ＣｐｈＥａｌの適用が望まれる場合、ＣＧＰａｓｅの濃度は、まず製造された上清中で評価されなければならず、したがって、１ｍｌの、ＯＤ６００ｎｍが０．２１５である固定濃度（１００ｍｇ  ｌ−１）のＣＧＰ懸濁液を使用する高速試験を開発した。この溶液に、３μｌのさまざまな濃度（２．７〜４３．２μｇ  ｍｌ−１）の精製酵素を含む溶液を加えた。反応液を、低速（３ｒｐｍ）で回転しながら３０℃において６０分間インキュベートした。最終的に、ＣＧＰ分解の範囲を、６００ｎｍにおいて測光的に決定した。試験の再現性およびその式（ｓ．ｕ．）の正確性を保証するために、試験パラメーターおよびＯＤ６００における測定範囲（０．１５−０．２１５）を順守しなければならない。
Ｅ［粗抽出物中のＣｐｈＥａｌ含有量（μｇ／ｍｌ）］＝［０．２４０４−Ｄ（６０分後のＯＤ６００ｎｍ］／０．００１７
【０１６１】
ＣｐｈＥａｌの工業的精製に必要なＣＧＰ量：酵素精製の手順を主要な製造方法に統合するために、（既知のＣｐｈＥａｌ含有量を含む上清中の）全ＣｐｈＥａｌに結合するために必要なＣＧＰ量もまた、決定されなければならない。全反応体積の０．５ｍｌにおいて、さまざまな濃度の（１．４〜１９μｇ  ｍｌ−１）  ５０μｌの精製ＣｐｈＥａｌ溶液を、さまざまな濃度（０．１〜６ｇ  ｌ−１）のＣＧＰに加えた。反応混合物を、低速（３ｒｐｍ）で回転しながら３０℃において１０分間インキュベートした。遠心分離（１６０００×ｇ、２分）後、反応チューブを遠心分離にかけ、上清を、ＣＧＰ重層寒天プレートにおける活性に関してスクリーニングした。すべての被検ＣｐｈＥａｌ濃度に関して、分解ハローを誘導しなかった最小ＣＧＰ濃度を、安全のために３回掛け、その後較正曲線に統合した。得られた式は以下のようであった：
Ｃ［必要なＣＧＰ濃度（ｇ／ｌ）］−［Ｅ［粗抽出物中のＣｐｈＥａｌ含有量（μｇ／ｍｌ）］−２．４３９２］／０．９４３２
【０１６２】
精製ＣｐｈＥａｌの生化学的特徴：精製ＣｐｈＥａｌは、５０℃において最大ＣＧＰ分解活性を示し、一方、６８℃において酵素の完全な不活性化が発生した。ＣＧＰ分解にとっての最適ｐＨ範囲は７〜８．５であり、８．５において最適であった。ＣＧＰ、ＢＳＡ、ウシカゼインおよびポリ（アスパラギン酸）に対する精製ＣｐｈＥａｌの基質特異性を試験すると、ＣＧＰに対して最も高い分解活性を示した。しかし、ＢＳＡもまた、部分的に分解された（ＣＧＰと比較して６５％）。ウシカゼインおよびポリ（アスパラギン酸）は、精製ＣｐｈＥａｌの酵素活性によりごくわずかしか影響を受けなかった。
【０１６３】
ＣｐｈＥａｌの触媒機序についての情報を得るために、さまざまな基特異的阻害剤を用いた阻害剤実験を実施した（表１）。ＣＧＰａｓｅの阻害は、ＣＧＰ重層寒天プレートにおいて、およびＣＧＰ分解産物のＨＰＬＣ分析によって分析した。このことは、細胞外ＣｐｈＥａｌは、セリンプロテアーゼ阻害剤のペファブロックおよびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）により強く阻害されることが明らかにされた。さらに、Ｎ−ブロモコハク酸イミド（トリプトファン酸化剤）は、酵素の全阻害をもたらした。対照的に、ＣｐｈＥａｌによる分解ハローの形成は、チオールプロテアーゼ阻害剤のロイペプチンによって、またはメタロプロテアーゼ阻害剤のＥＤＴＡによって影響されなかった。ＨＰＬＣ分析により、ＣｐｈＥａｌの阻害を示したＥＤＴＡにより処理したサンプルを除いて、これらの結果が確認された。
【実施例４】
【０１６４】
Ｃａｃｏ２細胞の培養物によるＣＧＰジペプチドの吸収：栄養および治療におけるＣＧＰジペプチドの適用可能性を証明するために、これらの高度に可溶性のジペプチドの吸収を、予備研究においてＣａｃｏ２細胞（ヒト結腸上皮腺がん細胞）の細胞培養物を使用して試験した。２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）および１％の２ｍＭグルタミン溶液を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を培養培地として使用した。約７０００のＣａｃｏ２細胞／ウェルを、２４−ウェルプレートに播種し、５％ＣＯ２雰囲気および約９８％の湿度下で、３７℃においてインキュベートした。細胞を、ほぼ５０時間後に単層が形成されるまで毎日顕微鏡的に確認した。インキュベーション培地を、３５０μｇ／ｍｌのＣＧＰジペプチド（９０％Ａｓｐ−Ａｒｇ：１０％Ａｓｐ−Ｌｙｓ）または遊離のＬ−アスパラギン酸、Ｌ−アルギニンおよびＬ−リシンの等量混合物を補給した新鮮な７００μｌ／ウェルの同じ培地に、完全に置き換えた。ウェルの列に後の添加剤を含まない新鮮な７００μｌのインキュベーション培地を補給し、対照として考えた。サンプルを、０、１３、２２、６７および１１３時間のインキュベーション期間後に採取し、ＳａｌｌａｍおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌにより記載のように（Ｊ．Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ＤＯＩ：１０．１１１１／ｊ．１３６５−２６７２．２００９．０４２２１．ｘ）、ＨＰＬＣにより分析し、被検ジペプチドおよびアミノ酸の濃度の変更を決定した。
【０１６５】
培地サンプルのＨＰＬＣ分析は、１１３時間のインキュベーション後、約６０％のシアノフィシンＡｓｐ−Ａｒｇジペプチドおよび６８％のシアノフィシンＡｓｐ−Ｌｙｓジペプチドの吸収が明らかになった。他方、わずか４１％の遊離のアルギニンおよび５１％の遊離のＬ−リシンは、同じインキュベーション期間にわたって吸収された。例外的に、Ｌ−アスパラギン酸は、Ｃａｃｏ２細胞により遊離の形態で吸収され、約６７時間の短いインキュベーション期間内に完全に吸収されたと思われる。対照的に、遊離のアルギニンおよび遊離のリシンの吸収量と比較して、３１．６％のより多くのアルギニンおよび２４．４％のより多くのリシンが、ＣＧＰジペプチドの形態で細胞より吸収された。したがって、ＣＧＰジペプチドは、双方のアミノ酸、アルギニンおよびリシンの、より高い生体利用可能な供給源を表す。これらの結果は、栄養および治療におけるＣＧＰジペプチドの適用可能性についての第１の直接の証拠であり、腸内細菌叢によるＣＧＰの分解についての先の結果を確認する（ＳａｌｌａｍおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ  Ｊ．Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ＤＯＩ：１０．１１１１／ｊ．１３６５−２６７２．２００９．０４２２１．ｘ）。結果は、一般的に、オリゴペプチドは、遊離の形態のそれらの構成アミノ酸より高い生体利用効率を有するという、以前のインビトロおよびインビボの研究とも一致する（Ａｄｉｂｉ，Ｓ．Ａ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５０：２２６６〜２２７５（１９７１年）；Ａｄｉｂｉ，Ｓ．Ａ．、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１３：３３２〜３４０（１９９７年）；Ｄｏｃｋ，Ｄ．Ｂ．ら、Ｂｉｏｃｅｌｌ  ２８：１４３〜１５０（２００４年））。
【０１６６】
【表１】
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【０１６７】
【表２】
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【０１６８】
【表３】
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【０１６９】
【表４】
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【０１７０】
【表５】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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