(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象のアルツハイマー病の診断を補助する方法であって、前記対象由来の血清又は血漿である血液誘導体のサンプルを提供するステップと；前記サンプル中に存在するゲルゾリンの量をアッセイするステップと；前記サンプル中に存在するゲルゾリンの量を、健常な対象由来のサンプル中に存在するゲルゾリンの参照量と比較し、前記対象由来のサンプル中のゲルゾリンレベルの検出が、参照サンプル中のゲルゾリンレベルより低い場合、前記対象におけるアルツハイマー病の可能性の増大を示すステップと
を含む方法。
【請求項２】
サンプルが、血漿を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血漿が、アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、アンチトリプシン及びハプトグロビンのうち１種又は２種以上を枯渇している、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
血漿が、アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、アンチトリプシン又はハプトグロビンの各々について枯渇している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ゲルゾリンが、ウエスタンブロッティングによって検出される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ゲルゾリンが、ビーズサスペンションアレイによって検出される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ゲルゾリンが、平面アレイによって検出される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ゲルゾリンが、同重核タンパク質タギング、又は同位体タンパク質タギングによって検出される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ゲルゾリンが、質量分析に基づくアッセイによって検出される、請求項１〜４及び８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ゲルゾリンが、表Ｂの以下のペプチド：配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２のうち１種又は２種以上への参照によって検出される、請求項１〜４、８及び９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病と関連する方法及び組成物に関する。特に、本発明は、差次的に発現されるタンパク質を使用してアルツハイマー病を診断的及び予後的に測定する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ，Alzheimer's disease）は、高齢者における認知症の最も一般的な原因であり、現在のところ不治である衰弱性神経変性疾患である。脳の部分、主として、記憶の符号化に関与している領域である海馬のニューロンを破壊する。アルツハイマー病は、認知機能及び機能自律性の不可逆的な進行性の喪失を引き起こす。ＡＤの最も早期の徴候は、単純な物忘れと間違えられ得るが、最終的に疾患を有すると診断される人においては、これらの初期徴候は、精神機能低下の、より重篤な症状に容赦なく進行する。ＡＤが発症するのにかかる時間は、人によって変わるが、進行した徴候として、重篤な記憶機能障害、錯乱、言語障害、人格変化及び行動変化並びに判断力の衰えが挙げられる。ＡＤを有する人は、話し好きでなく（non-communicative）なり、非友好的になることがある。この疾患は、その進行が重度の認知症に終わるので、患者は、自身のケアができず、施設収容又は家庭環境における専門家のケアを必要とすることが多い。患者の中には、ＡＤと診断を受けた後、長年生存する人もいるが、診断後の平均余命は、８年である。
【０００３】
かつては、ＡＤは、脳の生検によって又は患者が死亡した後の剖検の際にのみ明確に診断することができた。脳中の特徴的なプラーク及び濃縮体病変の存在を実証するこれらの方法は、依然として、ＡＤの病理学的診断のゴールドスタンダードと考えられている。しかし、臨床設定では、脳の生検は、稀にしか実施されず、診断は、一連の神経学的検査、心理測定的検査、脳脊髄液及び血液中のＡｐｏＥ及びタウタンパク質又はβ−アミロイドペプチドなどの生化学的マーカーの測定をはじめとする生化学的検査に依存している。
【０００４】
ＡＤ及びその他の認知症を診断するためのより良好なバイオマーカーが必要とされている。ＡＤの診断検査のための必要条件を満たす生物学的マーカーは、いくつかの利点を有する。理想的な生物学的マーカーは、脳撮像及び神経病理学的検査において変性が観察される前の、疾患の極初期に、ＡＤの症例を同定するものであろう。バイオマーカー又はバイオマーカー群の検出は、可能な限り早期に治療を開始するための最初の指標であり、新規治療、特に、神経病理学的変化の発生を防止することに焦点が絞られているものの有効性をスクリーニングすることにおいても極めて有益であり得る。生物学的マーカーはまた、疾患の発生のフォローアップにおいても有用であろう。
【０００５】
プラーク及び濃縮体などのＡＤの病理学的特徴と関連しているマーカー（Ａβ及びタウ）は、最も広く研究されている。最も有望なことは、ＡＤにおけるＡβ（１〜４０）、Ａβ（１〜４２）及びタウ又は両タンパク質の組合せのＣＳＦ濃度の研究から得られている。多数の研究が、総Ａβタンパク質又はＡβ（１〜４０）濃度は変化しないままの、ＣＳＦ中のＡβ（１〜４２）の減少を報告している(Ida, Hartmann et al. 1996；Kanai, Matsubara et al. 1998；Andreasen, Hesse et al. 1999)。
【０００６】
Ａβ及びタウの脳脊髄液（ＣＳＦ，cerebrospinal fluid）レベルは、ＡＤの診断のための見込みのあるバイオマーカーであるが、それらは、より入手しやすい体液においてはこのような診断的有用性は示していない。脳脊髄液は、ヒト患者から得ることが困難である。その採取は、通常、鎮静下で実施される、腰椎穿刺などの深刻な侵襲的な技術を含む。これは、高度の技能を有する複雑な手順であり、資格のある、特別に訓練された医療スタッフを必要とする。さらに、多大な時間を必要とし、麻酔薬並びに、患者からの長時間の協力を必要とする場合もある。さらに、脳脊髄液の採取は、不快であり、有痛性の手順であることも多く、長期の頭痛が、よく起こる症状であり、並びに、患者に対して感染の固有のリスク及び麻痺の可能性を持っている。
【０００７】
日常の臨床サンプルとしての脳脊髄液の制限を考慮して、アルツハイマー病などの神経変性状態のバイオマーカーの供給源として相当な注目が、血漿に存在する。国際公開第ＷＯ０６／０３５２３７号パンフレットにはいくつかの差次的に発現されるタンパク質を同定し、アルツハイマー病の診断のための特定の方法を記載したプロテオミクス研究が記載されている。
【０００８】
しかし、依然として、アルツハイマー病と関連していることが当技術分野で公知のバイオマーカーは、制限された、又はわずかな予後的価値しか有さないということは事実である。一般的な神経学的症状及び不正確な認知機能検査に基づいた、アルツハイマー病の現在の臨床診断は、合理的に強固であるが、生存している患者における疾患の進行の可能性を説明、特に、予測するのに問題が残っている。したがって、予後並びに診断は、生存している患者に関連して、当技術分野で問題のままである。
【０００９】
本発明は、先行技術と関連する問題を克服しようとするものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０６／０３５２３７号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ida, Hartmann et al. 1996
【非特許文献２】Kanai, Matsubara et al. 1998
【非特許文献３】Andreasen, Hesse et al. 1999
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
概して、本発明は、アルツハイマー病のリスクがある、又はアルツハイマー病を患っている患者を診断的及び予後的にモニタリングするための方法、試薬及びキットを対象とする。より詳しくは、本発明は、血漿中のそのレベルが変わり、各タンパク質のレベルが、疾患を発生するリスクのある患者の特定の特徴に関する情報、及び／又はすべてのこのような疾患の進行の速度に関する情報も提供する３種のタンパク質マーカーを記載する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一態様では、本発明は、ヒト又は動物対象においてアルツハイマー病における認知低下の進行の性質又は程度を測定する方法を提供し、この方法は、前記対象から得た組織サンプル又は体液サンプルにおける、本明細書に記載される方法によって同定された、１種又は２種以上の差次的に発現されるタンパク質のレベルを検出することを含む。
【００１４】
別の態様では、本発明は、アルツハイマー病を発症するリスクがあるヒト又は動物対象において、アルツハイマー病を発症するおよその年齢を決定する方法を提供し、この方法は、前記対象から得た組織サンプル又は体液サンプルにおける、本明細書に記載される方法によって同定された、１種又は２種以上の差次的に発現されるタンパク質マーカーのレベルを検出することを含む。
【００１５】
別の態様では、本発明は、アルツハイマー病を発症する個人のリスクを決定する方法を提供し、この方法は、前記対象から得た組織サンプル又は体液サンプルにおける、本明細書に記載される方法によって同定された、１種又は２種以上の差次的に発現されるタンパク質マーカーのレベルを検出することを含む。
【００１６】
別の態様では、本発明は、治療に対する、ＡＤを有する対象の反応を予測及び／又はモニタリングする方法を提供し、この方法は、前記対象から得た組織サンプル又は体液サンプルにおける、本明細書に記載される方法によって同定された、１種又は２種以上の差次的に発現されるタンパク質マーカーのレベルを検出することを含む。これに関連して、対象は、ヒト対象であり得るか、又は非ヒト対象であり得るということは理解される。非ヒト対象として、遺伝子増幅、遺伝子ノックダウン及びトランスジェニックモデルをはじめとする、ＡＤの非脊椎動物及び脊椎動物モデルが挙げられる。
【００１７】
特定の実施形態では、同一患者から採取した一連の診断用サンプルにおける、本発明のバイオマーカーのレベルを測定することが好ましい。時間とのバイオマーカーのレベルの変化は、発生、進行の継続する速度及び／又はＡＤの治療に対する患者の反応についてさらなる臨床的に有用な情報を提供し得る。
【００１８】
本発明の各態様では、本方法を実施するのに有用な試薬及びキットが提供される。
【００１９】
特に、診断的及び予後的方法が、血液から得られる特定のタンパク質マーカー（バイオマーカー）のアッセイを含むことが、本発明の特別な利点である。血液は、最小の侵襲性しか伴わず、容易に、迅速に採取される。さらに、血液の採取には、脳脊髄液の採取よりも、実質的に少ない医学訓練及び資格しか必要でなく、このため、より安価且つ容易に入手することが可能になる。さらに、本発明の方法が血液中での検出に基づくことによって、患者のリスクが最小にされ得る、又は取り除かれ得ることが有利である。
【００２０】
さらに、本発明者らは、アルツハイマー病に関連して、特定の特性、特に、血液中で検出される能力及び信頼性のある診断的及び／又は予後的指標を与える能力を共有する、バイオマーカーの定義された群を同定している。したがって、本発明は、アルツハイマー病の診断を補助する方法及びアルツハイマー病を有する患者の予後の予測を補助する方法を提供することが有利である。本方法はまた、アルツハイマー病を患っている患者の治療の有効性のモニタリングにも適用することができ、これにより、バイオマーカー血漿レベルの変化が非アルツハイマー状態へと向かう、又は前記状態に戻る場合、治療が成功していることが証明される。
【００２１】
具体的には、本発明は、アルツハイマー病を有する個体の血漿中で、正常状態のその発現に対して差次的に発現されるタンパク質を同定及び記載し、特に、発症の年齢及びアルツハイマー病における認知低下の推定速度を規定することと関連しているタンパク質を同定及び記載する。さらに、本発明は、差次的に発現されるタンパク質を使用して、アルツハイマー病を診断的及び予後的に測定する方法を提供する。さらに、本発明は、アルツハイマー病の診断及び予後的モニタリングのための試薬及びキットを提供する。
【００２２】
したがって、本発明は、対象においてアルツハイマー病の診断を補助する方法を提供し、前記方法は、前記対象由来の血液のサンプルを提供するステップと；前記サンプル中に存在するゲルゾリンの量をアッセイするステップと；前記サンプル中に存在するゲルゾリンの量を、健常な対象から得た参照サンプル中に存在するゲルゾリンの参照量と比較し、前記対象から得たサンプル中のゲルゾリンレベルの検出が、参照サンプルにおけるゲルゾリンレベルより低い場合、前記対象のアルツハイマー病の可能性の増大を示すステップとを含む。参照サンプルは、無関係の健常な対象から採取されてもよいし、アルツハイマー病症状の発症の前に同一対象から得た初期サンプルであってもよいということは理解されよう。
【００２３】
別の態様では、本発明は、対象のアルツハイマー病の診断又は予後的モニタリングを補助する方法に関し、前記方法は、前記対象から得た関連組織のサンプルを提供するステップと；ゲルゾリン、Ｃ１プロテアーゼ阻害剤及びセルロプラスミンから選択される１種又は２種以上のタンパク質の量を測定するステップと；前記サンプル中に存在する前記１種又は２種以上のタンパク質の量を、健常な対象から得たサンプル中の同一タンパク質の参照量と比較し、参照サンプルにおいて観察されるレベルと異なるレベルが検出された場合、前記対象においてアルツハイマー病が存在又は発症又は進行している可能性の増大を示すステップとを含む。
【００２４】
別の態様では、本発明は、対象においてアルツハイマー病の診断又は予後的モニタリングを補助する方法に関し、前記方法は；
（ｉ）前記対象から関連組織のサンプルを提供するステップと；
（ii）ゲルゾリンの量を測定するステップと；
（iii）Ｃ１プロテアーゼ阻害剤；
セルロプラスミン；
クラステリン；
補体ｃ３；
血清アミロイドＰ成分；
α−２−マクログロブリン；
γ−フィブリノゲン；
補体因子Ｈ；及び
アポリポタンパク質Ｅ
から選択される１種又は２種以上のタンパク質の量を測定するステップと；
（iv）前記サンプル中に存在する、前記ゲルゾリン及び前記１種又は２種以上のタンパク質の量を、健常な対象から得たサンプル中の同一タンパク質の参照量と比較し、参照サンプルにおいて観察されるレベルと異なるレベルが検出された場合、前記対象においてアルツハイマー病が、存在又は発症又は進行している可能性の増大を示すステップと
を含む。
【００２５】
ステップ（iii）は、
クラステリン；
補体ｃ３；
血清アミロイドＰ成分；
α−２−マクログロブリン；
γ−フィブリノゲン；
補体因子Ｈ；及び
アポリポタンパク質Ｅ
から選択される１種又は２種以上のタンパク質の量を測定するステップを含むことが適している。
【００２６】
ステップ（iii）は、
Ｃ１プロテアーゼ阻害剤；及び
セルロプラスミン
から選択される１種又は２種以上のタンパク質の量を測定するステップを含むことが適している。
【００２７】
別の態様では、本発明は、上記のように、前記対象から得た血液のサンプル中のゲルゾリン、Ｃ１プロテアーゼ阻害剤及びセルロプラスミン各々のレベルをアッセイするステップを含む方法に関する。
【００２８】
サンプルは、血液を含むことが適している。
【００２９】
サンプルは、血漿を含むことがより適している。
【００３０】
前記血漿は、アルブミン；トランスフェリン；ＩｇＧ；ＩｇＡ；アンチトリプシン及びハプトグロビンのうち１種又は２種以上を枯渇させ得ることが適している。このような枯渇は、本発明の方法の分析ステップに先立っていることが適している。
【００３１】
前記血漿は、アルブミン；トランスフェリン；ＩｇＧ；ＩｇＡ；アンチトリプシン及びハプトグロビンの各々を枯渇していることが適している。
【００３２】
タンパク質は、ウエスタンブロッティングによって検出されることが適している。
【００３３】
タンパク質は、ビーズサスペンションアレイによって検出されることが適している。
【００３４】
タンパク質は、平面アレイによって検出されることが適している。
【００３５】
タンパク質は、同重核タンパク質タギングによって検出されることが適している。この実施形態は、同じ質量をすべて有することを含む。この実施形態では、ＴＭＴ標準物質型アプローチを使用してアッセイすることができる。
【００３６】
タンパク質は、同位体タンパク質タギングによって検出されることが適している。この実施形態は、同じ同一化学構造内に異なる質量を有することを含む。この実施形態では、ＴＭＴ−ＳＲＭ型アプローチを使用してアッセイすることができる。ＡＱＵＡなどの同位体希釈アッセイが使用され得ることが適している。
【００３７】
タンパク質は、質量分析計ベースのアッセイによって検出されることが適している。
【００３８】
タンパク質は、ゲルゾリンであり、表Ｂの以下のペプチド：配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２のうち１種又は２種以上への参照によって検出されることが適している。
【００３９】
別の態様では、本発明は、ポリペプチド又はそのバリアント又は突然変異体を認識する、結合する、又はそれに対して親和性を有する物質の、アルツハイマー病に関連する、診断的、予後的及び治療的適用のための使用に関連し、これでは、ポリペプチドは、ゲルゾリン（配列番号１）、Ｃ１プロテアーゼ阻害剤（配列番号２）及びセルロプラスミン（配列番号３）から選択される。
【００４０】
別の態様では、本発明は、物質の組合せの上記のような使用に関し、前記物質の各々がそれぞれ、前記ポリペプチド又はそのバリアント又は突然変異体のうち１種又は２種以上を認識する、結合する、又はそれに対して親和性を有する物質の組合せの上記のような使用に関する。
【００４１】
各物質が、抗体又は抗体チップであることが適している。
【００４２】
物質は、前記ポリペプチド又はその断片、それらのバリアント又は突然変異体のうち１種又は２種以上に対して特異性を有する抗体であることが適している。
【００４３】
別の態様では、本発明は、アルツハイマー病の診断において使用するためのアッセイ装置であって、ゲルゾリン（配列番号１）、Ｃ１プロテアーゼ阻害剤（配列番号２）及びセルロプラスミン（配列番号３）から選択されるポリペプチド又はその断片、それらのバリアント又は突然変異体を認識する、結合する、又はそれに対して親和性を有する物質を含有する位置を有する固体基質を含む装置に関する。
【００４４】
各位置がゲルゾリン（配列番号１）、Ｃ１プロテアーゼ阻害剤（配列番号２）及びセルロプラスミン（配列番号３）から選択されるポリペプチド又はその断片、それらのバリアント又は突然変異体を認識する、結合する、又はそれに対して親和性を有する物質を含有する複数の位置を固体基質が有することが適している。
【００４５】
物質は、抗体又は抗体チップであることが適している。
【００４６】
上記のアッセイ装置は、各抗体に対してユニークなアドレス可能な位置を有し、それによって、個々のポリペプチド、又はポリペプチドの任意の組合せのアッセイ読み取りを可能にすることが適している。
【００４７】
上記のアッセイ装置は、ゲルゾリン（配列番号１）、Ｃ１プロテアーゼ阻害剤（配列番号２）及びセルロプラスミン（配列番号３）から選択されるポリペプチドに対する抗体を含むことが適している。
【００４８】
上記のアッセイ装置は、グルタチオンＳトランスフェラーゼＰを認識する、結合する、又はそれに対して親和性を有する物質を含有する位置をさらに有することが適している。
【００４９】
物質が、抗体又は抗体チップであることが適している。
【００５０】
別の態様では、本発明は、上記のアッセイ装置及び対象から採取された体液のサンプルにおける１種又は２種以上のポリペプチドの量を検出するための手段を含む、アルツハイマー病の診断において使用するためのキットに関する。
【００５１】
別の態様では、本発明は、ゲルゾリンポリペプチドの検出において使用するためのキットに関し、前記キットは、以下の表Ｂのペプチド：配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２のうち１種又は２種以上を含む。
【００５２】
別の態様では、本発明は、以下の表Ｂのペプチド：配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２のうち１種又は２種以上を含む、アルツハイマー病の診断において使用するためのキットに関する。前記キットは、少なくとも１種のさらなる表Ｂのペプチドを含むことが適している。
【００５３】
一実施形態では、前記ペプチドのうち１種又は２種以上は、重同位体を含むことが適している。前記ペプチドのうち１種又は２種以上が、いくつかの重同位体を含むことが適している。このような同位体は、炭素−１３又は窒素−１５を含み得る。この実施形態の利点は、重同位体が、そうでなければ不変のペプチドに、異なる質量を提供し、それによって、その検出／同定を容易にするということである。
【００５４】
一実施形態では、前記ペプチドのうち１種又は２種以上は、ＴＭＴタグを含むことが適している。前記キットは、サンプルポリペプチドの標識のために、さらなる同位体ＴＭＴタグを含むことが適している。このようなタグは、ＴＭＴ−６を含み得ることが適している。
【００５５】
別の態様では、本発明は、対象のＡＰＯＥ  ε４遺伝子型を決定する方法に関し、前記方法は、前記対象から得た血液のサンプルにおけるＣ１プロテアーゼ阻害剤レベルをアッセイするステップを含む。
【００５６】
別の態様では、本発明は、対象のアルツハイマー病の発症の年齢を予測する方法に関し、前記方法は、前記対象から得た血液のサンプルにおけるセルロプラスミンレベルをアッセイするステップを含む。
【００５７】
バイオマーカー
バイオマーカーは、ゲルゾリン（例えば、配列番号１）、Ｃ１プロテアーゼ阻害剤（本明細書において「Ｃ１阻害剤」又は「Ｃ１  ｉｎｈ」とも呼ばれる）（例えば、配列番号２）及びセルロプラスミン（例えば、配列番号３）のうち１種又は２種以上であることが適している。これらのマーカーは各々、血液中で検出可能であるという利点を有する。
【００５８】
したがって、ＡＤ及びＮＤＣを識別するのに重要である、この研究において示されるバイオマーカータンパク質として、ゲルゾリン、Ｃ１阻害剤及びセルロプラスミンがある。
【００５９】
ゲルゾリンは、ＡＤにおいて低レベルで見られ、年間の認知低下と相関していた。したがって、ゲルゾリンは、本発明の好ましいバイオマーカーである。
【００６０】
ＡＤ及びＮＤＣを識別するのに重要であると、多変数解析においてわかった２種のその他のタンパク質として、Ｃ１阻害剤及びセルロプラスミンがある。Ｃ１阻害剤タンパク質及びセルロプラスミンは、その他の臨床パラメータ、すなわち、ＡＰＯＥ  ε４遺伝子型及び発症の年齢と関連している。これら後者のタンパク質は、ＡＤ及びＮＤＣ間の血漿タンパク質レベルにおいて統計的に有意な相違は示さなかったが、それらは、それぞれ、ＡＰＯＥ  ε４遺伝子型及び発症の年齢と関連しており、それによって、ＡＤの発症の個々のリスクを同定する手段及び／又は診断された疾患の期間を評価する手段を提供する。したがって、３種のバイオマーカーすべてが、アルツハイマー病診断、予後及び治療的モニタリングの共通領域において重要である。
【００６１】
ゲルゾリン
ゲルゾリンは、アクチン脱重合因子（ＡＤＦ，actin-depolymerizing factor）又はブレビンとも呼ばれ、サイトゾル及びミトコンドリア中で細胞内に、並びに、血漿中で細胞外に生じる。この８２ｋＤａの大きさのタンパク質の主な機能は、アクチンフィラメントのアセンブリーの重要なレギュレーターとしてであり、Ｃａ２＋によって調節されるとわかっている（Sun HQ, Yamamoto M, Mejillano M, Yin HL (Gelsolin, a multifunctional actin regulatory protein. The Journal of biological chemistry 274:33179-33182.1999)）。アミノ酸の交換につながる、ゲルゾリン遺伝子中の単一のヌクレオチド突然変異が、家族性アミロイドーシスフィンランド型の原因であることは興味深い（Levy E, Haltia M, Fernandez-Madrid I, Koivunen O, Ghiso J, Prelli F, Frangione B (Mutation in gelsolin gene in Finnish hereditary amyloidosis. The Journal of experimental medicine 172:1865-1867.1990、Maury CP, Kere J, Tolvanen R, de la Chapelle A (Finnish hereditary amyloidosis is caused by a single nucleotide substitution in the gelsolin gene. FEBS letters 276:75-77.1990)）。ゲルゾリンはまた、家族型の脳アミロイド血管症とも関連しており（Kiuru S, Salonen O, Haltia M (Gelsolin-related spinal and cerebral amyloid angiopathy. Annals of neurology 45:305-311.1999)）、Ａβと濃度依存的に結合することがわかった（Chauhan VP, Ray I, Chauhan A, Wisniewski HM (Binding of gelsolin, a secretory protein, to amyloid beta-protein. Biochemical and biophysical research communications 258:241-246.1999、Ji L, Chauhan A, Chauhan V (Cytoplasmic gelsolin in pheochromocytoma-12 cells forms a complex with amyloid beta-protein. Neuroreport 19:463-466.2008)）。ゲルゾリンは、Ａβペプチドの線維化を阻害し、また、予め形成されたＡβ原線維を脱線維化し得る（Ray I, Chauhan A, Wegiel J, Chauhan VP (Gelsolin inhibits the fibrillization of amyloid beta-protein, and also defibrillizes its preformed fibrils. Brain research 853:344-351.2000)）。また、ゲルゾリンは、アポトーシス性のミトコンドリア変化を阻害することによるＡβ誘導性細胞毒性の阻害において重要な役割を果たすこともわかった（Qiao H, Koya RC, Nakagawa K, Tanaka H, Fujita H, Takimoto M, Kuzumaki N (Inhibition of Alzheimer's amyloid-beta peptide-induced reduction of mitochondrial membrane potential and neurotoxicity by gelsolin. Neurobiology of aging 26:849-855.2005)）。アミロイドプラークは、ＡＤにおける２つの主な病理学的所見の１つであり、脳プラーク負荷を低減するために種々の戦略が取り組まれてきた。中枢神経系（ＣＮＳ）からのＡβのクリアランスの増大は、ヒトにおいて記憶機能を改善し（Gilman S, Koller M, Black RS, Jenkins L, Griffith SG, Fox NC, Eisner L, Kirby L, Rovira MB, Forette F, Orgogozo JM (Clinical effects of Abeta immunization (AN1792) in patients with AD in an interrupted trial. Neurology 64:1553-1562.2005)）、トランスジェニックマウスにおいて行動の欠陥を低減する（Janus C, Pearson J, McLaurin J, Mathews PM, Jiang Y, Schmidt SD, Chishti MA, Horne P, Heslin D, French J, Mount HT, Nixon RA, Mercken M, Bergeron C, Fraser PE, St George-Hyslop P, Westaway D (A beta peptide immunization reduces behavioural impairment and plaques in a model of Alzheimer's disease. Nature 408:979-982.2000)）とわかった。末梢シンク仮説とも呼ばれる、これを達成するための１つの戦略は、能動若しくは受動免疫を用いるか、又はゲルゾリンをはじめとするその他のＡβ結合タンパク質によるものであろうと（Matsuoka Y, Saito M, LaFrancois J, Saito M, Gaynor K, Olm V, Wang L, Casey E, Lu Y, Shiratori C, Lemere C, Duff K (Novel therapeutic approach for the treatment of Alzheimer's disease by peripheral administration of agents with an affinity to beta-amyloid. J Neurosci 23:29-33.2003)）、末梢に対する血漿及びＣＮＳ間のＡβ平衡を変化させることによるものである（Matsuoka Y, Saito M, LaFrancois J, Saito M, Gaynor K, Olm V, Wang L, Casey E, Lu Y, Shiratori C, Lemere C, Duff K (Novel therapeutic approach for the treatment of Alzheimer's disease by peripheral administration of agents with an affinity to beta-amyloid. J Neurosci 23:29-33.2003)）。これと一致して、血漿ゲルゾリンの末梢発現の誘導がまた、脳Ａβを低減することがわかり、ＡＤの予防又は治療のための適した遺伝子治療的アプローチとして示唆された（Hirko AC, Meyer EM, King MA, Hughes JA (Peripheral transgene expression of plasma gelsolin reduces amyloid in transgenic mouse models of Alzheimer's disease. Mol Ther 15:1623-1629.2007)）。ゲルゾリンがＡβと結合し、Ａβ原線維の毒性を低減し、ＣＮＳ中のＡβ負荷を低下させることを考慮すると、本明細書において本発明者らが示すような、ＡＤにおける血漿ゲルゾリンレベルの低下が、より早い疾患進行の一因となっているということはもっともらしい。
【００６２】
マーカーは、ゲルゾリンであることが適している。マーカーがゲルゾリンである場合には、ゲルゾリンの血液レベルが、ゲルゾリンの正常又は参照血液レベルと比較されることが適している。患者において検出されるゲルゾリンのレベルが、正常又は参照サンプルにおけるゲルゾリンのレベルよりも低いと見られる場合には、アルツハイマー病を有する患者の可能性の増大を示す。
【００６３】
ゲルゾリンレベルはまた、認知低下の速度の予測因子として使用され得ることが有利である。具体的には、低いゲルゾリンレベルは、高いレベルの年間の認知低下と相関する。言い換えれば、患者の血液において検出されるゲルゾリンレベルの、正常又は参照サンプルにおいて検出されるものよりも低い度合が、その患者について年々予想又は予測される認知低下の程度と相関する。
【００６４】
さらに、ゲルゾリンレベルがまた、疾患進行速度と相関すると示されることは驚くべきことである。言い換えれば、正常又は参照サンプルと比較される、患者から得た血液において見られるゲルゾリンレベルのレベルが低いほど、その患者について予測される疾患進行速度が速い。
【００６５】
疾患進行の血液ベースのマーカーが、本明細書に教示されることが本発明の利点である。さらに、血液ベースバイオマーカーのレベルが、その患者の疾患進行速度を予測するために使用され得ることが本発明の利点である。
【００６６】
Ｃ１プロテアーゼ阻害剤
血漿プロテアーゼＣ１阻害剤（Ｃ１  ｉｎｈ， C1 inhibitor）は、補体経路の阻害剤であり、いわゆるセルピン、セリンプロテアーゼ阻害剤のメンバーである。Ｃ１  ｉｎｈは、急性相タンパク質であり、その主な機能は、自発的活性化を防ぐための補体系の阻害である。Ｃ１  ｉｎｈの欠乏症は、後天性及び遺伝性血管浮腫（angiodema）の発症において原因として働く（Carugati A, Pappalardo E, Zingale LC, Cicardi M (C1-inhibitor deficiency and angioedema. Molecular immunology 38:161-173.2001)）。ＡＤでは、補体経路の活性化は、すでに、極初期において生じることが知られており（McGeer PL, McGeer EG (The possible role of complement activation in Alzheimer disease. Trends in molecular medicine 8:519-523.2002)）、Ｃ１  ｉｎｈをはじめとするその構成要素のいくつかは、アミロイドプラークと関連していることがわかっている（Veerhuis R, Janssen I, Hoozemans JJ, De Groot CJ, Hack CE, Eikelenboom P (Complement C1-inhibitor expression in Alzheimer's disease. Acta neuropathologica 96:287-296.1998)、Strohmeyer R, Ramirez M, Cole GJ, Mueller K, Rogers J (Association of factor H of the alternative pathway of complement with agrin and complement receptor 3 in the Alzheimer's disease brain. Journal of neuroimmunology 131:135-146.2002)）。Ｃ１  ｉｎｈは、最近、ロシグリタゾンで治療される患者におけるＡＤ血漿中のバイオマーカーとしても示唆されている（Akuffo EL, Davis JB, Fox SM, Gloger IS, Hosford D, Kinsey EE, Jones NA, Nock CM, Roses AD, Saunders AM, Skehel JM, Smith MA, Cutler P (The discovery and early validation of novel plasma biomarkers in mild-to-moderate Alzheimer's disease patients responding to treatment with rosiglitazone. Biomarkers 13:618-636.2008)）。しかし、Ｃ１  ｉｎｈ及びＣＤ５９は、ＡＤにおいて補体活性化を効果的に阻害しないことがわかったので（Yasojima K, McGeer EG, McGeer PL (Complement regulators C1 inhibitor and CD59 do not significantly inhibit complement activation in Alzheimer disease. Brain research 833:297-301.1999)）、疾患経過におけるＣ１  ｉｎｈの役割は、不明のままである。
【００６７】
Ｃ１プロテアーゼ阻害剤レベルは、ＡＰＯＥ  ε４（ＡＰＯＥイプシロン４）遺伝子型の指標として、本発明に従って有利に使用され得る。Ｃ１プロテアーゼ阻害剤のレベルは、アルツハイマー病の診断において単独で使用されないことが適しており、むしろ、その他のマーカーと組み合わせて有利であり、又はＡＰＯＥ  ε４遺伝子型の診断を補助するために単独で使用される。
【００６８】
セルロプラスミン
セルロプラスミンは、フェロキシダーゼとしても知られ、血液中の主要な銅輸送タンパク質であり、鉄代謝においてもまた役割を果たす。銅欠乏症は、ＡＤの原因の１つとして考えられており、広く研究され、概説されている（Gaggelli E, Kozlowski H, Valensin D, Valensin G (Copper homeostasis and neurodegenerative disorders (Alzheimer's, prion, and Parkinson's diseases and amyotrophic lateral sclerosis). Chemical reviews 106:1995-2044.2006)）。セルロプラスミンレベルは、血液（Giometto B, Argentiero V, Sanson F, Ongaro G, Tavolato B (Acute-phase proteins in Alzheimer's disease. European neurology 28:30-33.1988)、Hye A, Lynham S, Thambisetty M, Causevic M, Campbell J, Byers HL, Hooper C, Rijsdijk F, Tabrizi SJ, Banner S, Shaw CE, Foy C, Poppe M, Archer N, Hamilton G, Powell J, Brown RG, Sham P, Ward M, Lovestone S (Proteome-based plasma biomarkers for Alzheimer's disease. Brain 129:3042-3050.2006)、Kessler H, Pajonk FG, Meisser P, Schneider-Axmann T, Hoffmann KH, Supprian T, Herrmann W, Obeid R, Multhaup G, Falkai P, Bayer TA (Cerebrospinal fluid diagnostic markers correlate with lower plasma copper and ceruloplasmin in patients with Alzheimer's disease. J Neural Transm 113:1763-1769.2006)）、ＣＳＦ（Loeffler DA, DeMaggio AJ, Juneau PL, Brickman CM, Mashour GA, Finkelman JH, Pomara N, LeWitt PA (Ceruloplasmin is increased in cerebrospinal fluid in Alzheimer's disease but not Parkinson's disease. Alzheimer disease and associated disorders 8:190-197.1994)）及び脳組織（Connor JR, Tucker P, Johnson M, Snyder B (Ceruloplasmin levels in the human superior temporal gyrus in aging and Alzheimer's disease. Neuroscience letters 159:88-90.1993)、Loeffler DA, LeWitt PA, Juneau PL, Sima AA, Nguyen HU, DeMaggio AJ, Brickman CM, Brewer GJ, Dick RD, Troyer MD, Kanaley L (Increased regional brain concentrations of ceruloplasmin in neurodegenerative disorders. Brain research 738:265-274.1996)、Loeffler DA, Sima AA, LeWitt PA (Ceruloplasmin immunoreactivity in neurodegenerative disorders. Free radical research 35:111-118.2001)）において研究されており、異なる結果が得られている。本発明者らの研究では、セルロプラスミンレベルの、発症の年齢との有意な（正の）相関が確立された。銅輸送におけるその主な機能及び観察された発症の年齢との相関のために、銅の不均衡が、ＡＤの発症及び経過に対して主要な影響を有すると思われる。
【００６９】
本発明は、アルツハイマー病の発症の年齢の診断又は予測の補助におけるセルロプラスミンレベルの使用を提供することが有利である。特に、セルロプラスミンレベルとアルツハイマー病の発症の年齢との正の相関が、本明細書に開示されている。セルロプラスミンレベルは、アルツハイマー病の診断のために単独で使用されないことが適している。セルロプラスミンレベルは、アルツハイマー病の診断の補助においてその他のマーカーと組み合わせて使用され得ることが適しているか、又は、セルロプラスミンレベルは、特定の患者については、アルツハイマー病の発症の年齢の予測の補助のために単独で使用されることが好ましい。
【００７０】
組合せ
本発明は、より強固な診断又は予後を提供するためのバイオマーカーの群の一部として適用され得る。さらに、本発明は、所与の患者の病状又はあり得る結果のより完全な像を提供するためのバイオマーカー群の一部として提供され得る。
【００７１】
ゲルゾリン、Ｃ１プロテアーゼ阻害剤及びセルロプラスミンのうち少なくとも１種が、適したことには、本発明の広いマーカー群で、本発明に従ってアッセイされることが適している。
【００７２】
ゲルゾリン、Ｃ１プロテアーゼ阻害剤及びセルロプラスミンのうち少なくとも２種が、適したことには、本発明のマーカーの、より広い群で、本発明に従ってアッセイされることがより適している。
【００７３】
２種のマーカーがアッセイされる場合には、それらのマーカーが、ゲルゾリン及びＣ１プロテアーゼ阻害剤であることが適している。これによって、有利なことに、Ａｐｏε４についての別個の遺伝子型検査を実施することを避けながら、単一アッセイ形式などでのＡＰＯＥ  ε４（「ＡＰＯＥイプシロン４」）遺伝子型の指標とともに、疾患の診断の補助が可能となる。
【００７４】
本発明に従って２種のマーカーがアッセイされる場合には、それらのマーカーは、ゲルゾリン及びセルロプラスミンであることが適している。これは、特定の患者の発症の年齢の予測を補助するという利点及びその患者が疾患をすでに発症しているか否かの診断を補助するという利点を提供する。したがって、ゲルゾリンレベルが正常であるが、セルロプラスミンレベルが、特定の発症の年齢を示すと見られる場合には、ゲルゾリン／セルロプラスミン組合せアッセイの結果に基づいて、その患者の再検査又はモニタリングが示されることが有利であり得る。
【００７５】
本発明に従って、２種のマーカーがアッセイされる場合には、それらのマーカーは、Ｃ１プロテアーゼ阻害剤及びセルロプラスミンであり得る。この組合せは、病状の診断の直接的な指標を提供しないと予想される。この組合せは、その特定の患者のリスクの評価において有用であり得る、患者について記述的／予測的情報を提供するという利点を提供する。さらに、この組合せのマーカーが使用される場合には、アルツハイマー病の正の診断に関するカウンセリングの問題が避けられることが有利である。さらに、この組合せのマーカーは、例えば、感受性の指標又は疾患を発症する可能性を提供するために、プレスクリーニングとして有用に使用され得、セルロプラスミン／Ｃ１プロテアーゼ阻害剤を組み合わせた結果から得られた指標に応じて、患者に適当な将来の時点で最大限の診断検査が予定され得る。
【００７６】
３種以上のバイオマーカーが、本発明に従ってアッセイされる場合には、それらのバイオマーカーが、ゲルゾリンＣ１プロテアーゼ阻害剤及びセルロプラスミンを含むことが適している。この組合せは、所与の分析について、患者に提供される情報の量を最大にすることが有利である。
【００７７】
当然のことながら、熟練した読み手であれば、本発明の特定のバイオマーカーは、当技術分野で公知のその他のマーカーと組み合わされることが有利であり得るということは理解されよう。本明細書において論じられる特定のバイオマーカーを含むこのような拡張されたマーカー群は、当然、本発明によって包含されるよう意図される。このようなマーカー群の実施形態における検査のためのさらなる既知マーカーの選択は、適当な供給源に従って、熟練した読み手によって達成され得る。これに関連して、さらなるバイオマーカーが、ＡＤと、ＡＤの差次的診断が必要とされるその他の神経学的状態と、又はＡＤの患者と関連していることが多いか、若しくはその症状がＡＤのものを摸倣するその他の疾患と関連し得る。ＡＤと関連しているさらなるマーカーの１つのこのようなセットが、国際公開第ＷＯ０６／０３５２３７号パンフレットに提供されている。
【００７８】
したがって、マーカーの好ましい群は、
ゲルゾリン（Swiss prot受託番号Ｐ０６３９６；配列番号１）と、
Ｃ１プロテアーゼ阻害剤（配列番号２）
セルロプラスミン（配列番号３）
クラステリン（SwissProt受託番号Ｐ１０９０９；配列番号４）
補体ｃ３（Ｐ０１０２４；配列番号５）
血清アミロイドＰ成分（Ｐ０２７４３；ＳＡＰ；配列番号６）
α−２−マクログロブリン（Ｐ０１０２３；Ａ２Ｍ；配列番号７）
γ−フィブリノゲン（Ｐ０２６７９；配列番号８）
補体因子Ｈ（Ｐ０８６０３；ＣＦＨ；配列番号９）
アポリポタンパク質Ｅ（Ｐ０２６４９；ＡｐｏＥ；配列番号１０）
から選択される１種又は２種以上のタンパク質を含む。
【００７９】
一実施形態では、本発明は、対象においてアルツハイマー病の診断を補助する方法を提供し、前記方法は、前記対象由来の血液のサンプルにおける、ゲルゾリン、Ｃ１プロテアーゼ阻害剤及びセルロプラスミンのうち少なくとも２種をアッセイすることを含む。前記対象由来の血液のサンプルにおける、ゲルゾリン、Ｃ１プロテアーゼ阻害剤及びセルロプラスミンの各々のレベルが、アッセイされることが適している。
【００８０】
前記対象は、ヒトであることが適している。
【００８１】
前記対象は、非ヒト哺乳類であることが適している。
【００８２】
前記対象は、げっ歯類であることが適している。
【００８３】
サンプル
サンプルは、ＡＤを有する疑いがあるか、又はＡＤを発症するリスクがある対象から得ることができるいかなる組織であってもよい。ヒトに関連して、サンプルは体液であることが好ましい。サンプルは血液であることがより好ましい。サンプルは血漿であることが、さらにより好ましい。
【００８４】
特に、アッセイされているバイオマーカーが、ゲルゾリン、Ｃ１プロテアーゼ阻害剤及びセルロプラスミンのうち１種又は２種以上を含む場合には、サンプルとして、脳脊髄液が特別に排除されることが適している。当然のことながら、その他のバイオマーカーのアッセイを含む本発明のさらなる実施形態では、脳脊髄液は、より広い分析の一部として分析され得る。
【００８５】
サンプルは、血漿などの血液に由来する物質を含み得る。全血からの血漿の調製は、全血中に存在する細胞の遠心除去などによって、当業者によって容易に達成される。
【００８６】
血漿は、比較的容易に得ることができ、脳をはじめとするその他の臓器のサブプロテオームを反映し得る。可能性のあるバイオマーカーを同定するために、血漿及び血清において、候補タンパク質群及びゲルベースのプロテオミクスの両方がこれまでに使用され、幾分か成功しているが（Hye A, Lynham S, Thambisetty M, Causevic M, Campbell J, Byers HL, Hooper C, Rijsdijk F, Tabrizi SJ, Banner S, Shaw CE, Foy C, Poppe M, Archer N, Hamilton G, Powell J, Brown RG, Sham P, Ward M, Lovestone S (Proteome-based plasma biomarkers for Alzheimer's disease. Brain 129:3042-3050.2006)、Ray S, Britschgi M, Herbert C, Takeda-Uchimura Y, Boxer A, Blennow K, Friedman LF, Galasko DR, Jutel M, Karydas A, Kaye JA, Leszek J, Miller BL, Minthon L, Quinn JF, Rabinovici GD, Robinson WH, Sabbagh MN, So YT, Sparks DL, Tabaton M, Tinklenberg J, Yesavage JA, Tibshirani R, Wyss-Coray T (Classification and prediction of clinical Alzheimer's diagnosis based on plasma signaling proteins. Nature medicine 13:1359-1362.2007)、Baranowska-Bik A, Bik W, Wolinska-Witort E, Martynska L, Chmielowska M, Barcikowska M, Baranowska B (Plasma beta amyloid and cytokine profile in women with Alzheimer's disease. Neuro endocrinology letters 29:75-79.2008)）、本発明者らの知る限り、非ゲルベースのプロテオミクスは、ＡＤにおける血漿マーカーの探索においてこれまでに使用されていない。
【００８７】
質量分析を用いる血漿のプロテオーム解析に関する問題の１つは、血漿タンパク質の莫大なダイナミックレンジである。タンパク質レベルの幅は、１０桁という大きさにまで及び、これによって、少量のタンパク質の調査が不可能に近くなる（Anderson NL, Anderson NG (The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol Cell Proteomics 1:845-867.2002)、Jacobs JM, Adkins JN, Qian WJ, Liu T, Shen Y, Camp DG, 2nd, Smith RD (Utilizing human blood plasma for proteomic biomarker discovery. Journal of proteome research 4:1073-1085.2005)）。フラグメンテーションのために短期間で最も突出したピークが選択されるＬＣ／ＭＳ／ＭＳにおける機器の設定では、多量の血清アルブミン及びその他のタンパク質のために、分画されていない血漿中の少量のタンパク質の同定及び定量化が可能にならない。これは、同定される少数のタンパク質に反映される。ダイナミックレンジを低減するための１つのアプローチとして、最高量のタンパク質のサンプルを枯渇させることがあり、この場合には、本発明者らは、アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、アンチトリプシン及びハプトグロビンを除去するための免疫親和性カラムを使用してこのアプローチを例示する。同定可能な、定量可能なタンパク質の数は相当増大され得、種々のサンプル間で相対的なタンパク質レベルが比較された。
【００８８】
したがって、本発明のサンプルは、処理された血漿であり得ることがより適している。例えば、血漿は、大量のタンパク質を除去し、それによって、検出可能なタンパク質の数を増大し、低い絶対濃度で存在するタンパク質の検出性を高めるよう、処理され得る。血漿から大量のタンパク質を枯渇させるための技術は、当技術分野で周知である。特に、分析のために血漿を処理するために、複数の親和性除去システムが使用され得ることが好都合である。例示的システムは、本出願の実施例の節に記載されている。
【００８９】
さらに、サンプルは、血漿タンパク質を適宜含み得る。この実施形態では、血漿は、本明細書に記載されるように処理され得、次いで、分析機器における優れた性能などの利点を提供し得る、前記血漿に由来するタンパク質を含むサンプルに達するよう、サイズ排除クロマトグラフィー、バッファー交換又はその他のこのような処理に付すことができる。
【００９０】
いずれか特定の形態をとるとしても、サンプルの特性の基本原理は、血液である、又は血液に由来するということである。
【００９１】
参照サンプル
参照サンプルは、ＡＤを患っていないか、又は患っている疑いのない対象に由来するサンプルであることが適している。参照サンプルは、健常な対象に由来することがより適している。理想的には、これは、分析されているサンプルと同様の方法で処理及び分析される。しかし、参照サンプルが、正常な健常な個体の（例えば）ゲルゾリンの存在量又は濃度などの健常な対象についてこれまでに決定された参照値と見なされ得る場合には、これは、実際的又は望ましいものでない場合がある。理想的には、参照サンプル又は参照値は、性別を対応させ、年齢を対応させることが適しており、遺伝的若しくは民族的バックグラウンドについて対応させることがより適している。または、前記参照サンプル又は参照値は、血漿中の関連バイオマーカーのレベルがある因子に依存する限りにおいて、対照に対して臨床サンプルを対応させる際にそのような他の基準を日常的に適用する。参照サンプルは、アルツハイマー病の発症前に同一対象から採取された、より早期のサンプルであり得ることが適している。
【００９２】
検出
マーカータンパク質は、アルツハイマー病を有する患者において、調節された、すなわち、定量的に増大又は減少された、発現を有し得る。発現が、正常対病状（又は進行対初期状態）において異なる程度は、標準的な特性決定技術、例えば、２Ｄ−電気泳動ゲルの銀染色、同重核質量タギング及び質量分析を使用するそれぞれのペプチドイオンの測定又はウエスタンブロッティング、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ，enzyme-linked immunosorbent assay）又はラジオイムノアッセイをはじめとする免疫学的検出方法によって可視化され得るのに十分大きいものであることしか必要としない。発現の相違が可視化され得るその他のこのような標準的な特性決定技術は、当業者に周知である。これらとして、画分の連続クロマトグラフィーによる分離及びピークの比較、キャピラリー電気泳動、マイクロチップ上をはじめとするマイクロチャネルネットワークを使用する分離及び多重反応モニタリング（ＭＲＭ，multiple reaction monitoring）及びＴＭＴ標準物質を含めた質量分析法が挙げられる（Dayton et al 2009）。
【００９３】
クロマトグラフィーによる分離は、Pharmacia文献に記載されるように高性能液体クロマトグラフィーによって実施でき、クロマトグラムは、分離の時間に対する２８０ｎｍの光の吸光度のプロットの形態で得られる。次いで、不完全に分解されたピークを生じる物質を、再度クロマトグラフィーに付すなどする。
【００９４】
キャピラリー電気泳動は、多数の刊行物に、例えば、文献「Total CE Solutions」に記載される技術であり、Beckmanによって、そのP/ACE 5000システムとともに供給される。この技術は、小さいキャピラリーチューブ中に含有されるサンプル中に電気的ポテンシャルをかけることに依存する。チューブは、帯電した表面、例えば、負に帯電したケイ酸塩ガラスを有する。反対に帯電したイオン（この場合には、正のイオン）は、表面に引きつけられ、次いで、表面と同じ極性の適当な電極（この場合には、陽極）に移動する。サンプルのこの電気浸透流（ＥＯＦ，electroosmotic flow）では、正イオンは、最も早く移動し、帯電していない物質及び負に帯電したイオンが続く。したがって、タンパク質は、その荷電に従って本質的に分離される。
【００９５】
マイクロ−チャネルネットワークは、キャピラリーと幾分か似かよって機能し、ポリマー物質のフォトアブレーションによって形成され得る。この技術では、適したＵＶ吸収特徴を有するポリマー、例えば、ポリエチレンテレフタレート又はポリカーボネート上に一気に放たれる高エネルギー光パルスを作製するためにＵＶレーザーが使用される。入射光子が、限定された空間を有する化学結合を破壊し、内圧の上昇、切除される物質のミニ爆発及び排除につながり、マイクロ−チャネルを形成する空隙を残す。マイクロ−チャネル物質は、キャピラリー電気泳動についてと同様にＥＯＦに基づいて分離を達成する。各チップが、その自身のサンプルインジェクター、分離カラム及び電気化学検出器を有するマイクロ−チップ形式に適合できる:J.S.Rossier et al., 1999, Electrophoresis 20: pages 727-731を参照のこと。
【００９６】
その他の方法として、マーカータンパク質の結合アッセイを実施することが挙げられる。いかなる合理的に特異的な結合剤も使用できる。結合剤は、標識されることが好ましい。アッセイは、特に、バイオマーカーと、タンパク質を認識する抗体、特に、標識された抗体間のイムノアッセイであることが好ましい。マーカータンパク質の一部又はすべてに対して作製された抗体、例えば、マーカータンパク質に対して高い特異性のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗ヒト抗血清であり得る。
【００９７】
結合アッセイがイムノアッセイである場合は、タンパク質／抗体相互作用の程度を測定することによって実施してもよい。イムノアッセイのいかなる既知法も使用してよい。サンドウィッチアッセイが好ましい。一例示的サンドウィッチアッセイでは、マーカータンパク質に対する一次抗体は、プラスチックマイクロタイタープレートのウェルなどの固相と結合され、サンプルとともに、及びアッセイされるタンパク質に対して特異的である標識された二次抗体とともにインキュベートされる。あるいは、抗体捕獲アッセイを使用できる。ここで、試験サンプルは、固相と結合させられ、次いで、抗マーカータンパク質抗体が加えられ、結合させられる。結合していない物質を洗浄除去した後、固相と結合している抗体の量を、標識された二次抗体、抗−一次を使用して決定する。
【００９８】
別の実施形態では、サンプル及び標識されたマーカータンパク質又はそれに由来するペプチド間で競合アッセイを実施し、これら２種の抗原は、固相支持体と結合している制限された量の抗マーカータンパク質抗体に対して競合にある。標識されたマーカータンパク質又はそのペプチドを、固相上の抗体とともにプレインキュベートしてもよく、それによって、サンプル中のマーカータンパク質が、抗体と結合しているマーカータンパク質又はそのペプチドの一部と置き換わる。
【００９９】
さらに別の実施形態では、単一の、抗体との同時インキュベーションにおいて２種の抗原が競合させられる。洗浄によって、結合していない抗原を支持体から除去した後、支持体と結合している標識の量を求め、先に確立されている標準滴定曲線に対して参照することによってサンプル中のタンパク質の量を測定する。
【０１００】
結合アッセイにおける結合剤は、抗体又はその他の特異的結合剤であり得る、標識された特異的結合剤であり得る。結合剤は、通常、それ自体標識されるが、あるいは、例えば、別の標識された物質からシグナルが生じる二次反応によって検出されてもよい。
【０１０１】
標識は、酵素であり得る。酵素の基質は、例えば、発色、蛍光又は化学発光のものであり得る。
【０１０２】
比較的低レベルの検出されるタンパク質から増強された「シグナル」が生じる、増幅された形態のアッセイを使用してもよい。増幅されたイムノアッセイの１つの特定の形態として、増強された化学発光アッセイがある。ルミノール、過酸化物基質及び放たれた光の強度及び期間を増強する化合物、通常、４−ヨードフェノール又は４−ヒドロキシ桂皮酸を用いる化学発光反応に参加する西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて、抗体が標識されることが好都合である。
【０１０３】
別の形態の増幅されたイムノアッセイとして、イムノ−ＰＣＲがある。この技術では、抗体は、ＰＣＲプライマーを含む任意のＤＮＡの分子とも共有結合によって結合され、それによって、ポリメラーゼ連鎖反応によって、抗体が結合しているＤＮＡが増幅される。E. R. Hendrickson et al., Nucleic Acids Research 23: 522-529(1995)参照のこと。従来どおり、シグナルが読み取られる。
【０１０４】
アッセイに必要な時間は、M. Robers et al., 「Development of a rapid microparticle-enhanced turbidimetric immunoassay for plasma fatty acid-binding protein, an early marker of acute myocardial infarction」 Clin. Chem. 1998;44:1564-1567によって具体化された種類のものなどの迅速な微粒子増強比濁イムノアッセイの使用によって低減され得る。
【０１０５】
M.Robers et al.前掲によって記載される、Hoffmann-La Roche社製のCOBAS（商標）MIRA Plusシステム又はAbbott Laboratories社製のAxSYM（商標）システムなどの広く使用される臨床科学分析器において考慮されるいかなるイムノアッセイも完全自動化が可能であり、アルツハイマー病の日常的な臨床診断に適用されるべきである。
【０１０６】
また、（ｉ）その抗体と相互作用する１種又は２種以上のタンパク質を検出可能な抗体アレイ又は「チップ」又はビーズサスペンションアレイを使用することも、本発明内で考慮される。
【０１０７】
抗体チップ、抗体アレイ又は抗体マイクロアレイは、連続固体表面上のユニークなアドレス可能な要素のアレイであり、それによって、ユニークなアドレス可能な要素の各々で、抗原に対して規定の特異性を有する抗体が、標的抗原のその後の捕獲及びこのような結合の程度のその後の検出を可能にする方法で固定される。ユニークなアドレス可能な要素の各々は、固体表面上のすべてのその他のユニークなアドレス可能な要素から、特異的抗原の結合及び検出が、いかなる隣接するこのようなユニークなアドレス可能な要素も干渉しないような間隔にされる。
【０１０８】
「ビーズサスペンションアレイ」とは、１種又は２種以上の同定可能なように別個の粒子の水性懸濁液であり、それによって、各粒子が、その大きさ及び色又は蛍光サインに関するコーディング特徴を含み、このようなコーディング特徴の特定の組合せのビーズのすべてが、その後の標的抗原の捕獲及びこのような結合の程度のその後の検出を可能にする方法で、抗原に対して規定の特異性を有する抗体を用いて被覆される。このようなアレイの例は、www.luminexcorp.comに見ることができ、これでは、Luminex（登録商標）100（商標）システムでのxMAP（登録商標）ビーズサスペンションアレイの適用が記載されている。
【０１０９】
あるいは、診断用サンプルは、本明細書に記載される同重核質量タギング及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳに付すことができる。同位体タンパク質タギングを実施する好ましい方法の一例は、本出願の実施例の節に示されている。
【０１１０】
タンデム質量タグを使用する同位体タンパク質タギングは、高度に正確な方法で相対タンパク質レベルを決定することができると先に示されている（Thompson A, Schafer J, Kuhn K, Kienle S, Schwarz J, Schmidt G, Neumann T, Johnstone R, Mohammed AK, Hamon C (Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical chemistry 75:1895-1904.2003)、Dayon L, Hainard A, Licker V, Turck N, Kuhn K, Hochstrasser DF, Burkhard PR, Sanchez JC (Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6-plex isobaric tags. Analytical chemistry 80:2921-2931.2008)）。さらに、種々の組織及び体液において、タンパク質タギングのためにｉＴＲＡＱを使用する多数の報告が、この数年刊行されている（Aggarwal K, Choe LH, Lee KH (Shotgun proteomics using the iTRAQ isobaric tags. Briefings in functional genomics & proteomics 5:112-120.2006)）。特に、種々の条件におけるバイオマーカーの発見のために、ｉＴＲＡＱは、高度に適したツールであると証明されており、癌（Maurya P, Meleady P, Dowling P, Clynes M (Proteomic approaches for serum biomarker discovery in cancer. Anticancer research 27:1247-1255.2007)、Garbis SD, Tyritzis SI, Roumeliotis T, Zerefos P, Giannopoulou EG, Vlahou A, Kossida S, Diaz J, Vourekas S, Tamvakopoulos C, Pavlakis K, Sanoudou D, Constantinides CA (Search for Potential Markers for Prostate Cancer Diagnosis, Prognosis and Treatment in Clinical Tissue Specimens Using Amine-Specific Isobaric Tagging (iTRAQ) with Two-Dimensional Liquid Chromatography and Tandem Mass Spectrometry. Journal of proteome research.2008)、Matta A, DeSouza LV, Shukla NK, Gupta SD, Ralhan R, Siu KW (Prognostic significance of head-and-neck cancer biomarkers previously discovered and identified using iTRAQ-labeling and multidimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of proteome research 7:2078-2087.2008)、Ralhan R, Desouza LV, Matta A, Chandra Tripathi S, Ghanny S, Datta Gupta S, Bahadur S, Siu KW (Discovery and verification of head-and-neck cancer biomarkers by differential protein expression analysis using iTRAQ labeling, multidimensional liquid chromatography, and tandem mass spectrometry. Mol Cell Proteomics 7:1162-1173.2008)）及び糖尿病研究において（Lu H, Yang Y, Allister EM, Wijesekara N, Wheeler MB (The identification of potential factors associated with the development of type 2 diabetes: A quantitative proteomic approach. Mol Cell Proteomics.2008)）並びに、ＣＳＦ中ではあるが、神経変性疾患におけるバイオマーカーの探求において（Abdi F, Quinn JF, Jankovic J, McIntosh M, Leverenz JB, Peskind E, Nixon R, Nutt J, Chung K, Zabetian C, Samii A, Lin M, Hattan S, Pan C, Wang Y, Jin J, Zhu D, Li GJ, Liu Y, Waichunas D, Montine TJ, Zhang J (Detection of biomarkers with a multiplex quantitative proteomic platform in cerebrospinal fluid of patients with neurodegenerative disorders. J Alzheimers Dis 9:293-348.2006)）使用されている。
【０１１１】
複数の選択された反応モニタリング（ｍＳＲＭ又はＭＲＭ）
ＭＲＭは、最高のデューティーサイクルを有し、高感度で、１種又は２種以上の特定のイオン遷移をモニタリングするために使用されるスキャンの種類である。ここで、Ｑ１は、特定の親ｍ／ｚで設定され（Ｑ１は、スキャンしていない）、コリジョンエネルギーは、その親イオンの最適の診断的荷電フラグメントを生じるよう設定され、Ｑ３は、その断片の特定のｍ／ｚに設定される。この正確な遷移を有するイオンのみが検出される。薬物代謝産物などの小分子を定量するために歴史的に使用され、同様の原理を、内因性部分又はタンパク質の酵素消化から生じるもののいずれかのペプチドに適用できる。やはり歴史的に、実験は、トリプル四重極質量分析計を使用して実施されたが、四重極をイオントラップと組み合わせるハイブリッド機器設計の最近の導入によって、同様の、改善された実験が行われることが可能となる。したがって、4000QTRAP機器は、ペプチド及び生体分子定量化が、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を使用して極めて高い特異性及び感度で実施されることを可能にする。これは大部分は、LINAC（登録商標）衝突セルの使用によるものであり、これは、続いて、多数のＭＲＭスキャンが、１つの実験に一緒にループにされ、複雑な混合物中の多数の特定のイオン（最大１００種の異なるイオン）の存在を検出することを可能にする。結果として、単一のクロマトグラフィーによる分離において、多数のタンパク質から複数のペプチドを測定及び定量することが現在実現可能である。ＭＲＭ  ＬＣピーク下の面積を使用して、存在する分析物の量を定量する。通常の定量化実験では、所望の分析物について、標準濃度曲線が作製される。次いで、未知サンプルが同一条件下で流されると、ピーク面積及び標準濃度曲線を使用して未知サンプル中の分析物の濃度を決定できる。
【０１１２】
診断用サンプルを、イオントラップ質量分析計でＭＲＭによる分析に付すことができる。以下に記載されるマーカータンパク質の質量分析プロファイルに基づいて、良好なイオン化特徴を有する、特定の既知質量及びアミノ酸配列を有する単一のトリプシンペプチドが同定される。次いで、質量分析計を、特定の質量及び配列のペプチドを具体的に調査し、その相対シグナル強度を報告するようプログラムする。ＭＲＭを使用すると、単一のＬＣ−ＭＳ実施において、最大５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０又は１００種の異なるマーカータンパク質を調査することが可能である。診断用サンプル中の本発明の特定のバイオマーカーのＭＲＭペプチドの強度を、ＡＤを有さない対象から得たサンプル中に見られるものと比較し、これによってＡＤの診断又は予後が行われることが可能となる。
【０１１３】
ＭＲＭアッセイは、マーカータンパク質のＭＲＭペプチドに対応する合成絶対的定量（ＡＱＵＡ，absolute quantification）ペプチドからなる内部参照標準の使用によって、より正確に定量的に行うことができ、これでは、１種又は２種以上の原子が、炭素−１３又は窒素−１５などの安定な同位体で置換されており、このような置換が、ＡＱＵＡペプチドが、天然のもの、診断用サンプルに由来するＭＲＭペプチドのより軽い形態に対して規定の質量差を有するようにする。したがって、天然ＭＲＭ及びＡＱＵＡペプチドの相対イオン強度を比較することによって、診断用サンプル中の親タンパク質の正確な濃度が測定できる。このような同位体希釈法による絶対定量化の一般法は、Gerber, Scott A, et al.「Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS」 PNAS, June 10, 2003. Vol 100. No 12. p 6940-6945に提供されている。
【０１１４】
ＳＲＭ実験における絶対定量化を提供するために同位体がドープされた標準を使用することが望ましいが、上記のＡＱＵＡアプローチを使用することが可能でない場合がある。このような場合には、同重核質量タグの対、すなわち、同一の化学構造を有するが、各々にユニークな質量を与える異なるレベルの同位体置換を有する２種のタグを使用することが可能である。質量が５Ｄａ異なる２種の形態のTandem Mass Tag（登録商標）（ＴＭＴ（登録商標））を使用することで、標準合成参照ＳＲＭペプチドを軽いタグを用いて標識し、その後、混合して、アッセイにおいてすべての標的とされるペプチドのユニバーサル参照を形成することが可能である。次いで、各患者サンプルを、トリプシン消化に付し、得られたペプチドを重いＴＭＴタグで標識する。次いで、患者サンプルにおいて測定される標的範囲に関連している参照ペプチドの終濃度が得られるように、サンプルにＴＭＴ標識された参照ペプチドのアリコートを加える。次いで、添加されたサンプルを、標準同位体希釈ＳＲＭアッセイに付し、重い形態のイオン強度を、軽い形態の既知濃度のものに対して比較することによって、患者サンプルに由来するＳＲＭペプチドの濃度を算出する。
【０１１５】
バイオマーカー候補として同定された調節されたペプチドの相対又は絶対定量化のための別の形態のＭＳベースのアッセイとして、Proteome Sciences plcによって開発されたＴＭＴ標準物質法がある。良好なＭＳ／ＭＳ挙動を有する候補バイオマーカーのトリプシン断片を表す既知量の合成ペプチドを、同重核質量タグのＴＭＴ６セットの６種の試薬のうち４種（ＴＭＴ６−１２８〜ＴＭＴ６−１３１）を用いて標識し、特定の割合で混合する。これによって、生理学的に、及び／又は疾患によって改変された濃度を反映する多点較正曲線が設計され、迅速に実施されることが可能となる。続いて、ＡＤを患っているか、ＡＤを患っていると疑われる患者から採取した診断用サンプルを、ＴＭＴ６−１２６を用いて標識し、較正混合物を研究サンプルに加える。個々のペプチドのＭＳ／ＭＳの際に、較正物ペプチドのＴＭＴ６−リポーターイオンが生じ、較正曲線を確立するために使用される。次いで、研究サンプル中のペプチドの絶対量は、較正曲線に対するＴＭＴ６１２６イオン強度を読み取ることによって容易に導かれる。ＴＭＴ標準物質アッセイに関するさらなる情報は、Proteome Scienceウェブサイト（www.proteomics.com）から入手できる。
【０１１６】
診断の好ましい方法は、マーカータンパク質の結合アッセイを実施するステップを含む。いかなる合理的に特異的な結合パートナーも使用できる。結合パートナーが標識されることが好ましい。アッセイは、特に、マーカーと、タンパク質を認識する抗体、特に、標識された抗体間のイムノアッセイであることが好ましい。その一部又はすべてに対して作製された抗体であり得、最も好ましくは、マーカータンパク質に対して高い特異性の、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗ヒト抗血清である。
【０１１７】
したがって、上記のマーカータンパク質は、診断用サンプル中に存在するマーカータンパク質の濃度の増大又は低減を検出するために使用できる、それに対する抗体を作製することを目的として有用である。このような抗体は、免疫診断の分野において周知の方法のいずれかによって作製できる。
【０１１８】
抗体は、いかなる生物学的に関連する状態のタンパク質にも対するものであり得る。したがって、例えば、それらは、グリコシル化形態で身体中に存在するタンパク質の非グリコシル化形態に対して、前駆体タンパク質のより成熟した形態、例えば、そのシグナル配列を引いたものに対して、又はマーカータンパク質の関連エピトープを保持するペプチドに対して作製できる。
【０１１９】
サンプルは、哺乳類又は非哺乳類対象のいかなる妥当な身体組織からも、特に、体液から採取できるが、血液、血漿、血清又は尿が好ましい。その他の使用可能な体液として、脳脊髄液（ＣＳＦ）、精液及び涙が挙げられる。対象は、マウス、ラット、モルモット、イヌ又は霊長類などの哺乳類種であることが好ましい。対象はヒトであることが最も好ましい。
【０１２０】
好ましいイムノアッセイは、タンパク質／抗体相互作用の程度を測定することによって実施される。イムノアッセイのいかなる既知法も使用してよい。サンドウィッチアッセイが好ましい。この方法では、マーカータンパク質に対する一次抗体が、プラスチックマイクロタイタープレートのウェルなどの固相と結合され、サンプルとともに、及びアッセイされるタンパク質に対して特異的な標識された二次抗体とともにインキュベートされる。あるいは、抗体捕獲アッセイを使用できる。ここで、試験サンプルは、固相と結合させられ、次いで、抗マーカータンパク質抗体が加えられ、結合させられる。結合していない物質を洗浄除去した後、標識された二次抗体、抗−一次を使用して固相と結合している抗体の量を測定する。
【０１２１】
別の実施形態では、サンプルと、標識されたマーカータンパク質又はそれに由来するペプチド間で競合アッセイを実施し、これら２種の抗原は、固相支持体と結合している制限された量の抗マーカータンパク質抗体に対して競合にある。標識されたマーカータンパク質又はそのペプチドを、固相上の抗体とともにプレインキュベートしてもよく、それによって、サンプル中のマーカータンパク質が、抗体と結合しているマーカータンパク質又はそのペプチドの一部と置き換わる。
【０１２２】
さらに別の実施形態では、単一の、抗体との同時インキュベーションにおいて２種の抗原が競合させられる。洗浄によって支持体から結合していない抗原を除去した後、支持体と結合している標識の量を求め、先に確立されている標準滴定曲線に対して参照することによってサンプル中のタンパク質の量を測定する。
【０１２３】
標識は、酵素であることが好ましい。酵素の基質は、例えば、発色、蛍光又は化学発光のものであり得る。
【０１２４】
結合アッセイにおける結合パートナーは、標識された特異的な結合パートナーであることが好ましいが、必ずしも抗体ではない。結合パートナーは、通常、それ自体標識されるが、あるいは、例えば、別の標識された物質からシグナルが生じる二次反応によって検出され得る。
【０１２５】
検出される相対的に低いレベルのタンパク質から、増強された「シグナル」が生じる、増幅された形態のアッセイを使用することが高度に好ましい。増幅されたイムノアッセイの１つの特定の形態として、増強された化学発光アッセイがある。ルミノール、過酸化物基質及び放たれた光の強度及び期間を増強する化合物、通常、４−ヨードフェノール又は４−ヒドロキシ桂皮酸を用いる化学発光反応に参加する西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて抗体が標識されることが好都合である。
【０１２６】
増幅されたイムノアッセイの別の好ましい形態として、イムノ−ＰＣＲがある。この技術では、抗体は、ＰＣＲプライマーを含む任意のＤＮＡの分子とも共有結合によって結合され、それによって、ポリメラーゼ連鎖反応によって、抗体が結合しているＤＮＡが増幅される。E. R. Hendrickson et al., Nucleic Acids Research 23: 522-529(1995)を参照のこと。従来どおり、シグナルが読み取られる。
【０１２７】
M. Robers et al., 「Development of a rapid microparticle-enhanced turbidimetric immunoassay for plasma fatty acid-binding protein, an early marker of acute myocardial infarction」 Clin. Chem. 1998;44:1564-1567によって具体化された種類のものなどの迅速な微粒子増強比濁イムノアッセイの使用によって、アッセイの時間が大幅に減少する。したがって、M.Robers et al.前掲によって記載される、Hoffmann-La Roche社製のCOBAS（商標）MIRA Plusシステム又はAbbott Laboratories社製のAxSYM（商標）システムなどの広く使用される臨床化学分析器において考慮されるいかなるイムノアッセイの全自動化も可能であり、アルツハイマー病の日常的な臨床診断に適用されるべきである。
【０１２８】
あるいは、診断用サンプルを二次元ゲル電気泳動に付し、染色されたゲルを得ることができ、これでは、マーカータンパク質の位置がわかっており、デンシトメトリーによってゲル上の適当なスポットの染色の相対強度を決定し、対応する対照又は比較ゲルと比較できる。
【０１２９】
なおさらなる実施形態では、診断用サンプルを、トリプル四重極質量分析計での多重反応モニタリング（ＭＲＭ）又は特定の種類のイオントラップ質量分析計などの質量分析計ベースのアッセイによる分析に付すことができる。各々差次的に発現されるタンパク質について、特定の既知質量（親質量）及びアミノ酸配列を有し、フラグメンテーションの際には、各タンパク質にとってユニークである特定の質量（フラグメント質量）のフラグメントを放出するトリプシンペプチドのセットを同定することが可能である。規定の親質量イオンからのフラグメント質量の検出は、遷移として知られている。
【０１３０】
このようなプロテオティピック（proteotypic）ペプチドの同定は、バイオマーカー発見の際に見られる差次的に発現されるタンパク質の質量分析プロファイルに基づいて行うことができ、又は当業者に公知の予測アルゴリズムを使用してコンピュータによって設計してもよい。次いで、質量分析計を、各タンパク質について選択された特定の親質量及びフラグメント質量遷移についてのみ具体的に調査し、その相対シグナル強度を報告するようプログラムする。ＭＲＭを使用すると、単一のＬＣ−ＭＳ実施において、最大５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０又は１００種の異なるマーカータンパク質を調査することが可能である。診断用サンプル中の各マーカータンパク質のプロテオティピックペプチドの相対量を、認知症を有さない対象由来のサンプル中に見られるものと比較し、これによって、アルツハイマー病の診断が行われることが可能となる。あるいは、同じ患者からの初期のサンプルから得たタンパク質のレベルとの比較を行うことができ、したがって、前記患者におけるアルツハイマー病の段階及び／又は進行の速度の予後評価が可能となる。
【０１３１】
本発明のさらなる一実施形態では、ＭＲＭアッセイは、マーカータンパク質のプロテオティピックペプチドに対応する合成絶対的定量（ＡＱＵＡ）ペプチドからなる内部参照標準の使用によって、より正確に定量的に行うことができ、これでは、１種又は２種以上の原子が、炭素−１３又は窒素−１５などの安定な同位体で置換されており、このような置換が、ＡＱＵＡペプチドが、診断用サンプルに由来する天然のプロテオティピックペプチドに対して規定の質量差を有するようにする。ひとたび、差次的に発現されるアルツハイマー病のバイオマーカーに由来する各プロテオティピックペプチドと同等であるＡＱＵＡペプチドが生じると、それらを混合して参照標準を形成することができ、次いで、それらを患者サンプルのトリプシン消化物中に添加する。次いで、合わせたサンプルを、天然及びＡＱＵＡペプチドからの必要とされる遷移の強度が検出されるプログラムされた質量分析計ベースのアッセイに付す。サンプルに由来する天然ペプチド及び添加されたＡＱＵＡ参照ペプチドの相対イオン強度を比較することによって、診断用サンプル中の親タンパク質の正確な濃度をこのように決定できる。絶対定量化の一般法は、参照によって本明細書に組み込まれる、Gerber, Scott A, et al.「Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS」 PNAS, June 10, 2003. Vol 100. No 12. p 6940-6945に提供されている。
【０１３２】
本発明のなおさらなる実施形態では、ＴＭＴ−ＳＲＭアッセイを使用することによって絶対定量化を行うことができる。マーカータンパク質のプロトティピックペプチドに対応する標準合成参照ＳＲＭペプチドを、同位体置換を有さない軽いＴＭＴタグ（軽いタグ）を用いて標識し、その後、混合して、アッセイにおけるすべてのマーカータンパク質のユニバーサル参照を形成する。次いで、各患者サンプルをトリプシン消化に付し、得られたペプチドを、５つの同位体置換を有するＴＭＴタグ（重いタグ）を用いて標識する。次いで、患者サンプルにおいて測定される標的範囲と関連している参照ペプチドの終濃度を得るように、重いＴＭＴで標識されたサンプルに、軽いＴＭＴで標識された参照ペプチドのアリコートを加える。次いで、添加されたサンプルを、標準同位体希釈ＳＲＭアッセイに付し、重い形態の強度を、軽い形態の既知濃度のものに対して比較することによって、患者サンプルに由来するＳＲＭペプチドの濃度を算出する。
【０１３３】
マーカータンパク質の測定のために選択された方法にかかわらず、アルツハイマー病の診断及び予後は、マーカータンパク質の濃度の、対照又は参照サンプルとの比較のステップを必ずしも必要としないが、疾患の存在及び／又は段階を表すとわかっている、予め決定された参照値を参照して実施できる。
【０１３４】
本発明を使用して、必要に応じて、同一患者から先に得られた結果を参照して、又は疾患の段階又は進行の速度に特有であると考えられている標準値への参照によって、アルツハイマー病における認知症の段階及び／又は進行の速度を決定できる。このような方法で、本発明を使用して、例えば、患者の薬物又は候補薬物での治療後、疾患が進行したかどうか、又は疾患進行の速度が改変されたかどうかを決定できる。この結果は、疾患の転帰の予後につながり得る。
【０１３５】
本発明はさらに、上記で詳述されるマーカータンパク質を認識する、結合する、又はそれに対して親和性を有するパートナー物質の診断（及びひいては、場合により予後）又は治療目的の使用を含む。したがって、例えば、必要に応じて適宜ヒト化された、マーカータンパク質に対する抗体を治療に使用してもよい。パートナー物質は通常、抗体となり、いかなるアッセイ適合性形式においても、都合よくは、例えば、ビーズ又はチップのような固定された形式においても使用される。パートナー物質は標識されるか、又は標識と相互作用できるかのいずれかである。
【０１３６】
本発明は、アルツハイマー病の診断及び予後的モニタリングの方法において使用するためのキットをさらに含み、これは、診断用サンプル中に存在するマーカータンパク質との相互作用のために、上記のアッセイ適合性形式で上記のパートナー物質を含む。
【０１３７】
（ｉ）アルツハイマー病において差次的に発現される１種又は２種以上のタンパク質を検出できる、抗体チップ若しくはチップのアレイ又はビーズサスペンションアレイを使用することが本発明内にさらに考慮される。
【０１３８】
本方法は、アルツハイマー病を治療するための有効な治療を決定することをさらに含み得る。
【０１３９】
さらなる態様では、本発明は、アルツハイマー病の発症又は進行を予防するために、アルツハイマー病の病状において１種又は２種以上の差次的に発現されるタンパク質の発現を、正常な状態において見られるものに向けて回復させる薬剤の使用によって治療する方法を提供する。タンパク質の発現が、正常状態のものに回復されることが好ましい。
【０１４０】
さらなる態様では、本発明は、アルツハイマー病を有する個体の組織サンプル又は体液サンプルにおける差次的に発現されるタンパク質のパターンを使用して、アルツハイマー病を軽減するのに最も適当な、有効な治療を予測する方法を提供する。
【０１４１】
また、薬剤をスクリーニングして、アルツハイマー病の治療におけるその有用性を決定する方法が提供され、この方法は：
（ａ）スクリーニングされている薬剤を用いて治療された、アルツハイマー病の症状を有する対象から採取された、又はそれを代表する関連組織のサンプルを得るステップと；
（ｂ）治療された対象から得た、又はそれを代表する組織において、差次的に発現されるタンパク質又は複数のタンパク質の発現の有無又は程度を決定するステップと；
（ｃ）アルツハイマー病の症状を有する、治療された対象において差次的に発現されるタンパク質又は複数のタンパク質の発現、活性又は量を変更する程度に従って薬剤を選択又は排除するステップと
を含む。
【０１４２】
薬剤が、差次的に発現されるタンパク質の発現を、正常な対象のものに向けて変換する場合に、薬剤が選択されることが好ましい。薬剤が、タンパク質又は複数のタンパク質の発現を、正常な対象のものに変換する場合に、薬剤が選択されることがより好ましい。
【０１４３】
また、アルツハイマー病の治療におけるその有用性を決定するために、薬剤をスクリーニングする方法が提供され、この方法は：
（ａ）スクリーニングされている薬剤を用いて治療された、アルツハイマー病の症状を有する対象から採取した、又はそれを代表する関連組織又は体液のサンプルを経時的に得るステップと；
（ｂ）前記サンプル中の差次的に発現されるタンパク質又は複数のタンパク質の発現の有無又は程度を決定するステップと；
（ｃ）薬剤が、アルツハイマー病の症状を有する、治療された対象において、差次的に発現された（differentially expression）タンパク質の発現における経時的に変化に影響を及ぼすかどうかを決定するステップと
を含む。
【０１４４】
経時的に採取されるサンプルは、数週間、数ヶ月又は数年の間隔で採取され得る。例えば、サンプルは、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、８ヶ月又は１２ヶ月間隔で採取され得る。
【０１４５】
経時的な発現の変化は、対象から得たサンプルにおける発現の初期レベルと比較した、及び／又は正常な対象から得たサンプルにおける発現のレベルと比較した、発現の増大又は低減であり得る。薬剤は、それが発現の変化を経時的に遅くするか、停止する場合に選択される。
【０１４６】
上記のスクリーニング方法では、差次的レベルのタンパク質発現を有する対象は：
（ａ）正常な対象及びアルツハイマー病を有する対象；並びに
（ｂ）薬剤で治療されていないアルツハイマー病の症状を有する対象及び薬剤で治療されたアルツハイマー病を有する対象
を含む。
【０１４７】
診断及び予後
本明細書で用いる場合、用語「診断」とは、患者におけるＡＤの存在、非存在又は可能性に関するいかなる情報の提供も含む。それに関連して経験される、又は経験され得る、障害又は症状の種類又は分類に関する情報の提供をさらに含み、病態の医学経過の予後を包含し、発症の年齢に関する情報をさらに包含する。
【０１４８】
本明細書に記載される方法は、ＡＤの診断及び／又は予後の両方のために有用である。ＡＤは、１種又は２種以上のマーカーが、増大又は低減した濃度で存在する場合に示され得る。
【０１４９】
治療
治療が関係している場合、治療は、患者に対するＡＤの効果を軽減するために医師によってとられるいかなる手段も含むということは理解されよう。したがって、ＡＤの損傷の逆転又は損傷若しくは効果の排除が望ましい目標であるが、効果的な治療はまた、損傷の程度又は効果若しくは進行の重篤度の低減を達成できるいかなる手段も含む。
【０１５０】
一態様では、本発明は、ＡＤの発症又は進行を防ぐために、ＡＤ状態において１種又は２種以上の差次的に発現されるタンパク質の発現を、正常状態において見られるものに向かって回復させる薬剤の使用によって治療する方法を提供する。タンパク質の発現が、正常状態のものへ回復されることが好ましい。
【０１５１】
さらなる態様において、本発明は、ＡＤを有する個体から得たサンプルにおいて差次的に発現されるタンパク質のパターンを使用して、神経学的損傷及び／又は認知症を軽減するのに最も適当な、有効な治療を予測する方法を提供する。
【０１５２】
アッセイ法
また、薬剤をスクリーニングして、ＡＤの治療におけるその有用性を決定する方法が提供され、この方法は：
（ａ）スクリーニングされている薬剤を用いて治療された、ＡＤを有する対象から得た、又はそれを代表するサンプルを得るステップと；
（ｂ）治療された対象から得た、又はそれを代表するサンプルにおける、本明細書に開示されるマーカータンパク質又は複数のタンパク質の発現の有無又は程度を決定するステップと；
（ｃ）ＡＤの症状を有する治療された対象において、マーカータンパク質又は複数のタンパク質の発現、活性又は量を変更する程度に従って薬剤を選択又は排除するステップと
を含む。
【０１５３】
薬剤が、差次的に発現されるタンパク質の発現を、正常な対象のものに向かって変換する場合に、薬剤が選択されることが好ましい。薬剤が、タンパク質又は複数のタンパク質の発現を、正常な対象のものへ変換する場合に、薬剤が選択されることがより好ましい。
【０１５４】
また、ＡＤの治療におけるその有用性を調べるために、薬剤をスクリーニングする方法が提供され、この方法は：
（ａ）スクリーニングされている薬剤を用いて治療された、ＡＤ症状を有する対象から得た、又はそれを代表するサンプルを経時的に得るステップと；
（ｂ）前記サンプルにおける本明細書に開示されるマーカータンパク質又は複数のタンパク質の発現の有無又は程度を決定するステップと；
（ｃ）薬剤が、ＡＤの症状を有する治療された対象において、マーカータンパク質の発現における経時的に変化に影響を及ぼすかどうかを決定するステップと
を含む。
【０１５５】
経時的に採取されるサンプルは、数週間、数ヶ月又は数年の間隔で採取され得る。例えば、サンプルは、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、８ヶ月又は１２ヶ月間隔で採取され得る。
【０１５６】
経時的な発現の変化は、対象から得たサンプルにおける発現の初期レベルと比較した、及び／又は正常な対象から得たサンプルにおける発現のレベルと比較した発現の増大又は低減であり得る。薬剤は、それが発現の変化を経時的に遅くするか、停止する場合に選択される。
【０１５７】
上記のスクリーニング方法では、差次的レベルのタンパク質発現を有する対象は：
（ａ）正常な対象及びＡＤの症状を有する対象；並びに
（ｂ）薬剤で治療されていないＡＤの症状を有する対象及び薬剤で治療されたＡＤの症状を有する対象
を含む。
【０１５８】
抗体
本明細書に開示されるマーカータンパク質に対する抗体は、公知の方法を使用して作製できる。抗体を作製するこれらの方法は、タンパク質を用いて、哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ又はサル）を免疫化することを含む。抗体は、当技術分野で公知の種々の技術のいずれかを使用して免疫化された動物から得、好ましくは、所望の抗原との抗体の結合を使用してスクリーニングしてもよい。動物からの抗体及び／又は抗体産生細胞の単離は、動物を屠殺するステップによって達成してもよい。
【０１５９】
例えば、タンパク質を用いて哺乳類を免疫化することの代替又は補完として、機能的免疫グロブリン結合ドメインをその表面にディスプレイする、λバクテリオファージ又は糸状バクテリオファージを使用して、発現された免疫グロブリン可変ドメインの組換えによって作製されたライブラリーから、タンパク質に対して特異的な抗体を得てもよい；例えば、国際公開第ＷＯ９２／０１０４７号パンフレット参照のこと。ライブラリーは、タンパク質で免疫化されていない生物から得られた配列から構築されるナイーブであってもよく、所望の抗原に曝露された生物から得られた配列を使用して構築されるものであってもよい。
【０１６０】
抗体は、タンパク質のいかなる生物学的に関連する状態とも結合し得るか、又はそれに対するものであり得る。したがって、例えば、それらは、グリコシル化形態で身体中に存在するタンパク質の非グリコシル化形態に対して、前駆体タンパク質のより成熟した形態、例えば、そのシグナル配列を引いたものに対して、又はマーカータンパク質の関連エピトープを保持するペプチドに対して作製できる。
【０１６１】
抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであり得、多重特異性（二重特異性を含めた）、キメラ又はヒト化抗体であり得る。本発明の抗体は、いくつかの方法で改変され得る。実際、用語「抗体」は、必要とされる特異性を有する結合ドメインを有するいかなる結合物質も対象とすると解釈されるべきである。したがって、本発明は、抗体断片、抗体の誘導体、機能的同等物及び相同体、例えば、合成分子及びその形態が抗体のものを摸倣し、それが抗原又はエピトープと結合するのを可能にする分子を対象とする。
【０１６２】
抗原又はその他の結合パートナーと結合可能である抗体断片の例として、ＶＬ、ＶＨ、Ｃｌ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一のアームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片；単離されたＣＤＲ領域及びＦ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片がある。一本鎖Ｆｖ断片も含まれる。
【０１６３】
特定のエピトープを認識する抗体断片は、公知の技術によって作製できる。例えば、このような断片として、それだけには限らないが、抗体分子のペプシン消化によって作製できるＦ（ａｂ’）２断片及びＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製できるＦａｂ断片が挙げられる。所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速な、容易な同定が可能となるよう、別の、Ｆａｂ発現ライブラリーが構築され得る(Huse, et al., 1989, Science 246: 1275-1281)。
【０１６４】
本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」とは、抗体の実質的に均質な集団から得られた抗体を指す、すなわち、集団を含む個々の抗体が、少量で存在し得るあり得る天然に存在する突然変異は別として、同一である。モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature, 256:495, 1975によって最初に記載された方法によって作製でき、又は組換え法によって作製してもよい、Cabilly et al,米国特許第４，８１６，５６７号明細書又はMage and Lamoyi in Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pages 79-97, Marcel Dekker Inc, New York, 1987参照のこと。
【０１６５】
ハイブリドーマ法では、マウス又はその他の適当な宿主動物が、皮下、腹腔内又は筋肉内経路によって抗原を用いて免疫化され、免疫化に使用されるナノ粒子と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生できるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球はインビトロで免疫化されてもよい。次いで、ポリエチレングリコールなどの適した融合剤を使用してリンパ球を骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する、Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103(Academic Press, 1986)参照のこと。
【０１６６】
このように調製したハイブリドーマ細胞を、好ましくは、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する１種又は２種以上の物質を含有する適した培養培地に播種し、増殖させることができる。例えば、親の骨髄腫細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ，hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase）を欠く場合には、ハイブリドーマの培養培地は、通常、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、これらの物質が、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防ぐ。
【０１６７】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル発現を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性である。
【０１６８】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、タンパク質に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。結合特異性が、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ，enzyme-linked immunoabsorbance assay）によって決定されることが好ましい。本発明のモノクローナル抗体は、タンパク質と特異的に結合するものである。
【０１６９】
本発明の好ましい実施形態では、モノクローナル抗体は、例えば、スキャッチャード解析法によって決定される、マイクロモルを超える親和性又はより高い親和性（すなわち、１０〜６ｍｏｌを超える親和性）を有する。Munson & Pollard, Anal. Biochem., 107:220, 1980を参照のこと。
【０１７０】
所望の特異性及び親和性の中和抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、制限希釈手順によってクローンをサブクローニングし、標準法によって増殖させることができる。この目的のための適した培養培地として、ダルベッコ改変イーグル培地又はＲＰＭ１−１６４０培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させてもよい。
【０１７１】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地、腹水又は血清から適宜分離される。
【０１７２】
本発明のモノクローナル抗体をコードする核酸は、当技術分野で周知の手順を使用して、例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって、容易に単離され、配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、抗体又はその断片をコードする核酸の好ましい供給源である。ひとたび単離されると、核酸を発現又はクローニングベクターにライゲーションし、次いで、それを宿主細胞にトランスフェクトし、それを組換え宿主細胞培養物においてモノクローナル抗体が産生されるよう培養できる。
【０１７３】
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、遺伝子突然変異又はその他の変化の影響下にあり得る。さらに、モノクローナル抗体は、元の抗体の特異性を保持する、その他の抗体、ヒト化抗体又はキメラ分子を産生するよう、組換えＤＮＡ技術の技術に付され得るということは当業者によって理解されよう。このような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ，complementarily determining regions）をコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域又は定常領域及びフレームワーク領域に導入することを含み得る。例えば、欧州特許第ＥＰ０１８４１８７Ａ号明細書、独国特許第ＧＢ２１８８６３８Ａ号明細書又は欧州特許第ＥＰ０２３９４００Ａ号明細書を参照のこと。キメラ抗体のクローニング及び発現は、欧州特許第ＥＰ０１２０６９４Ａ号明細書及び欧州特許第ＥＰ０１２５０２３Ａ号明細書に記載されている。
【０１７４】
本明細書に記載されるマーカータンパク質に対する抗体は、前記タンパク質と結合する。前記抗体は、前記タンパク質と特異的に結合することが好ましい。「特異的」とは、抗体が、その他の分子に対して示すものよりも相当に高い親和性で前記タンパク質と結合することを意味する。
【０１７５】
本出願は、例としてここで記載されており、これらの例は、本来、例示であるよう意図され、添付の特許請求の範囲を制限すると理解されるべきではない。実施例では、以下の図が参照される：
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１−１】プロットを示す図である。
【図１−２】プロットを示す図である。
【図２】グラフ及びいくつかの棒グラフを示す図である。
【図３Ａ】図形及びいくつかのグラフを示す図である。特に、これは、同位体タンパク質タギングを使用するプロテオーム解析の全体的なワークフロー図を示す。示されるステップは、差次的サンプル調製、例えば、血漿サンプル；溶液中のトリプシン消化；個々の標識及び１つの単一サンプルへの組合せ；ＲＰ／ＳＣＸ精製；ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ；データを検索し、データベースと比較し；タンパク質を同定及び定量する。
【図３Ｂ】表１を示す図である。
【図４】チャート、グラフ及びブロットを示す図である。ＡＤ及びＮＤＣ対象から得たヒト血漿におけるゲルゾリンのウエスタンブロット解析。Ａ）（ゲルゾリン）ボックスプロットは、ＡＤにおけるゲルゾリンの低下を示す（ｐ＝０．００１）が、Ｂ）（感度）ゲルゾリンを用いるＲＯＣ分析は、好都合な検査の特徴を示さなかった。
【図５】ＭＲＭアッセイにおけるゲルゾリンの測定にとって有用なＭＳ遷移の表を示す図である。
【図６】ＡＤの３２種のペプチドバイオマーカーに相当する１９２遷移の総イオンクロマトグラムを示す図である。ゲルゾリンと関連する遷移は、ピーク番号２７〜３２に見られる。（Ａ）ＴＭＴｚｅｒｏ−及びＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘ標識した血漿ペプチド１〜３２のＳＲＭ  ＸＩＣ。表１に列挙されるすべての遷移を評価した。ＴＭＴｚｅｒｏ−及びＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘ標識したペプチド対が共溶出することがわかる。（Ｂ（挿入図））ＬＣ勾配の最も忙しい部分（３２分〜４２分）にわたって溶出するペプチドを示すＭＲＭ  ＸＩＣ。（Ｃ（下部の「ゲルゾリンＡＶＥＶＬＰＫ」と印のあるグラフ））ゲルゾリンのペプチドＡＶＥＶＬＰＫのＭＲＭ  ＸＩＣ。各ペプチドのＴＭＴｚｅｒｏ遷移は、青、赤及び緑で着色されているが、そのＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘ標識された対応物は、灰色（２番目に最も高い）、シアン（最も高い）及びピンク（最も低い）で着色されている。
【図７】ヒトゲルゾリンの配列を示す図である。特定のアイソフォームは、配列が極めてわずかに異なり得、例えば、Unigene受託番号ＩＰＩ０００２６３１４（ゲルゾリンのアイソフォーム１）は、７８２個のアミノ酸残基を有する（図７の配列並びに７８１及び７８２にさらに２個のアラニン残基を有する）ということは留意されるべきである。何らかの疑念のある場合には、適宜、配列番号１がゲルゾリンの参照配列ととられるべきである（Swiss ProtＰ０６３９６）。
【図８】ヒトＣ１プロテアーゼ阻害剤（配列番号２）の配列を示す図である。
【図９】ヒトセルロプラスミン（配列番号３）の配列を示す図である。
【図１０】図１０−１７はデータ及び棒グラフを示す図である。
【図１１】図１０−１７はデータ及び棒グラフを示す図である。
【図１２】図１０−１７はデータ及び棒グラフを示す図である。
【図１３】図１０−１７はデータ及び棒グラフを示す図である。
【図１４】図１０−１７はデータ及び棒グラフを示す図である。
【図１５】図１０−１７はデータ及び棒グラフを示す図である。
【図１６】図１０−１７はデータ及び棒グラフを示す図である。
【図１７】図１０−１７はデータ及び棒グラフを示す図である。
【図１８】実験の概略を示す図である。各タンパク質について１０の疾患及び１０の対照サンプルを選択した。各サンプルで３回の消化を実施し（技術的消化）、続いて、各消化の３回の分析的測定を実施した。各タンパク質は、ペプチドあたり３種の遷移対から決定した、定量化のためのおよそ３種のペプチドを有していた。これは、各個々のタンパク質に対して約３２４０の測定値をもたらした。
【図１９Ａ】軽く及び重くＴＭＴ標識された、ペプチドの抽出されたイオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を示す図である。軽く標識されたサンプルは、血漿に対して内因性のペプチドを表し、重く標識されたサンプルは、ペプチド内部標準を表す。ゲルゾリンと関連する遷移は、ピーク番号２７、２９、３０及び３１に見られる。成績が悪いこと及び血漿バックグラウンドによる干渉にしたがって、分析からペプチド３、６、１１、１８及び２７を除去した。
【図１９Ｂ】ペプチド１３の軽いＴＭＴ及び重いＴＭＴのＸＩＣを示す図である。１つの遷移が、高い血漿バックグラウンドによって影響を受け（ピンクで着色された；重いＴＭＴで標識された）、その後、この遷移及びその対応する軽いＴＭＴパートナーを、分析から除去した。
【図２０−１】図１０〜１７と関連するデータの表（９５％ＣＩ）を示す図である。
【図２０−２】図１０〜１７と関連するデータの表（９５％ＣＩ）を示す図である。
【図２０−３】図１０〜１７と関連するデータの表（９５％ＣＩ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１７７】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、確定診断は、死後にのみなされ得る、最も有望なバイオマーカーは、今までのところ、脳脊髄液（ＣＳＦ）中に見られている、進行性の神経変性障害である。ＣＳＦよりも入手しやすい血液中のバイオマーカーは、診断の補助において、並びに、集団スクリーニング適用において産業上の利用及び有用性を有する。
【０１７８】
ＡＤ患者と認知症でない対照（ＮＤＣ，non-demented controls）の間には、血漿タンパク質の相違が存在し得る。実施例では、本発明者らは、同重核質量タギングを使用し、注意深く設計されたショットガンプロテオームアプローチにおいて、緩徐及び迅速に低下するＡＤ患者における、並びにＮＤＣ対象における血漿タンパク質レベルを比較した。年齢、性別及び認知低下（年あたりのＭＭＳＥスコアにおける変化）について血漿サンプルを対応させ、次いで、分析のためにプールした。その後の相対定量化及び統計分析が、ＡＤをＮＤＣ群から区別できる候補タンパク質の一覧をもたらした。選択されたタンパク質を、合わせて９０人の推定ＡＤ及び５０人のＮＤＣ対象の大きなサンプルセットにおいて、ウエスタンブロット解析によって確認した。このコホートでは、ＡＤ患者は、ＮＤＣ対象と比較して大幅に低い血漿ゲルゾリンレベルを示した。さらに、ゲルゾリンレベルは、疾患進行速度と相関し、緩徐及び迅速に低下するＡＤ患者間で大きく異なっていた。さらに、Ｃ１プロテアーゼ阻害剤レベルは、ＡＰＯＥ  ε４遺伝子型と関連しているとわかり、低いセルロプラスミンレベルは、早い発症の年齢と相関していたのが見い出された。ゲルゾリンは、ＡＤにおける進行速度とのその関連のために、並びに、アミロイドβ（Ａβ，amyloid β）とのその報告された相互作用のために、ＡＤの頑強なマーカーである。さらに、ゲルゾリンは、例えば、治療反応のモニタリング又は薬の臨床試験において使用するためのバイオマーカー群にさらに含まれ得ることが有利である。
【０１７９】
したがって、本発明者らは、アルツハイマー病における進行についての代替マーカーとしてのゲルゾリンの検出を開示する。実施例では、これは同重核タンパク質タギングを使用して実証される。これは、例示的な一検出方法であるが、原則として、いかなる適した検出方法も使用してよい。この特定の技術の特定の利点は、以下及び実施例の節において、より完全に実証される。
【０１８０】
さらに、アルツハイマー病において、低い血漿ゲルゾリンレベルが見られ、疾患進行速度との関連を示すということは重要な教示である。
【０１８１】
本発明者らは、いくつかの実施形態において、確認のための、同重核質量タギングの、より従来的な方法とのどのような組合せが、ＡＤにおけるバイオマーカーの開発において有用な情報を提供し得るかを実証する。
【０１８２】
ＡＤの血漿において、ＮＤＣと比較して異なるレベルで生じ、疾患進行速度と相関するか、又はＡｐｏＥ遺伝子型若しくは発症の年齢のようなさらなる臨床パラメータと関連しているかのいずれかである、いくつかのタンパク質が見い出された。
【０１８３】
定義
用語「抗体」は、ポリクローナル抗血清、モノクローナル抗体、一本鎖及びＦａｂ断片などの抗体の断片及び遺伝子改変抗体を含む。抗体は、キメラである場合も、単一種のものである場合もある。
【０１８４】
用語「マーカータンパク質」又は「バイオマーカー」は、翻訳後修飾をはじめとする、同定されたタンパク質のすべての生物学的に関連する形態を含む。例えば、マーカータンパク質は、身体組織において、グリコシル化された、リン酸化された、多量体の、又は前駆体の形態で存在し得る。
【０１８５】
用語「対照」とは、正常なヒト対象、すなわち、アルツハイマー病を患っていないものを指す。
【０１８６】
技術用語「対照サンプルと比較して増大した／減少した濃度」とは、多くの場合、濃度が異常に高い又は低いということは当業者には明らかであろうから、比較するステップが、実際に行われることを暗示しない。さらに、ＡＤの段階が進行的にモニタリングされている場合又は治療の経過がモニタリングされている場合には、行われる比較は、疾患の進行のより早い段階で、又は治療の早い段階で、又は治療が開始される前に同一対象において先に見られた濃度とであり得る。
【０１８７】
本明細書で用いる場合、用語「診断」とは、患者がアルツハイマー病を有するかどうかを調べることを含み、また、進行した（又は治療の経過において退行した）段階を調べることを含み得る。診断は、患者の将来の転帰についての予後の基礎として役立ち得る。
【０１８８】
用語「妥当な身体組織」又は「関連組織」とは、マーカータンパク質が、アルツハイマー病に関連して蓄積するであろうと合理的に予想され得るいかなる組織も意味する。脳脊髄液サンプル又は血液若しくは血漿若しくは血清などの血液誘導体のサンプルであり得る。
【０１８９】
用語「抗体アレイ」又は「抗体マイクロアレイ」とは、ユニークなアドレス可能な要素の各々で、抗原に対して規定の特異性を有する抗体が、その標的抗原のその後の捕獲及びこのような結合の程度のその後の検出を可能にする方法で固定されている、連続固体表面上のユニークなアドレス可能な要素のアレイを意味する。ユニークなアドレス可能な要素の各々は、固体表面上のすべてのその他のユニークなアドレス可能な要素から、特異的抗原の結合及び検出が、いかなる隣接するこのようなユニークなアドレス可能な要素とも干渉しないような間隔にされる。
【０１９０】
用語「ビーズサスペンションアレイ」とは、それによって、各粒子が、その大きさ及び色又は蛍光サインに関するコーディング特徴を含み、このようなコーディング特徴の特定の組合せのビーズのすべてが、標的抗原のその後の捕獲及びこのような結合の程度のその後の検出を可能にする方法で、抗原に対して規定の特異性を有する抗体を用いて被覆される、１種又は２種以上の同定可能なように別個の粒子の水性懸濁液を意味する。このようなアレイの例は、www.luminexcorp.comに見ることができ、これでは、Luminex（登録商標）100（商標）システムでのxMAP（登録商標）ビーズサスペンションアレイの適用が記載されている。
【０１９１】
用語「質量分析計ベースのアッセイ」とは、トリプル四重極又はイオントラップ質量分析計での多重反応モニタリング法を使用する標的分析物の定量的測定を意味する。
【０１９２】
本発明のポリペプチドバイオマーカーなどのバイオマーカーの用語「突然変異体」は、当技術分野におけるその通常の意味を有するべきである。突然変異体は、「バリアント」又は「対立遺伝子」と呼ばれることがある。重要なことは、本明細書に示されているようなバイオマーカーを検出することである。バイオマーカーは、研究されている個々の間で突然変異体又は対立遺伝子バリアントの形態で個々の変動を有し得る。したがって、本明細書に提供される正確な配列番号からのある程度の逸脱があり得る。本明細書に提供される配列番号は、本発明のポリペプチド／バイオマーカーを用いる同定及び作業において熟練した読み手を補助するものであって、アッセイされている個々のポリペプチドの制限された、柔軟性のない定義と意図されるものではない。したがって、検出されているポリペプチドバイオマーカーの提供される配列番号と実際の配列の間のわずかな配列の相違は、対象間の通常の変動の境界内で予想される。これは本発明の作業に影響を及ぼさないはずである。
【０１９３】
用語「含む」（含む（comprise）、含んでいる（comprising））とは、当技術分野におけるその正常な意味を有する、すなわち、記載された特徴又は特徴の群が含まれるが、この用語は、同様に存在しているものから、いかなるその他の記載された特徴又は特徴の群も排除しないと理解されるべきである。
【０１９４】
断片／ペプチド
当業者には当然のことながら、本明細書に論じられるバイオマーカーの詳細及び特に、それについて示される配列は、その検出を容易にするよう与えられる。集められている重要な情報は、研究されているサンプル中のバイオマーカーの有無（又は特定のレベル）である。全長ポリペプチドがスコアされることは特に必要ではない。実際、本明細書に示される適した質量分析ベースの検出様式の多くによって、サンプル中のバイオマーカーポリペプチド全体の存在を示すと、このように解釈される、存在している所望のポリペプチドの特定の断片をアッセイすることによって検出が行われる。したがって、本発明は、ポリペプチドバイオマーカーの断片の検出を包含する。さらに、本発明のキット及びペプチドは、ポリペプチドの断片を含んでもよく、本明細書に例示される全長配列を含む必要はない。断片は、質量分析によるそのユニークな同定を可能するのに十分なほど長いことが適している。
【０１９５】
したがって、断片は、少なくとも６個のアミノ酸の長さであることが適しており、少なくとも７個のアミノ酸の長さが適しており、少なくとも８個のアミノ酸の長さが適しており、少なくとも９個のアミノ酸の長さが適しており、少なくとも１０個のアミノ酸の長さが適しており、少なくとも１５個のアミノ酸が適しており、少なくとも２５個のアミノ酸が適しており、少なくとも５０個のアミノ酸が適しており、少なくとも１００個のアミノ酸が適しており、又は所望のバイオマーカーポリペプチドの大部分が適している。断片は、同定可能な質量を保持するのに十分に長いものでありながら、所望のバイオマーカーポリペプチドの小さい断片を含むことが適している。
【０１９６】
配列相同性／同一性
配列相同性は、機能的類似性（すなわち、同様の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の点でも考慮され得るが、本文書の関連では、配列同一性の点で相同性を表すことが好ましい。配列比較は、視認によって、又はより通常は、容易に入手可能な配列比較プログラムを用いて行うことができる。これらの公的に及び市販のコンピュータプログラムは、２種以上の配列間の相同性パーセント（例えば、同一性パーセント）を算出できる。
【０１９７】
同一性パーセントは、連続配列にわたって算出でき、すなわち、一方の配列をもう一方の配列とアラインし、一方の配列中の各アミノ酸を、もう一方の配列中の対応するアミノ酸と、一度に１残基、直接比較する。これは「ギャップなし（ungapped）」アラインメントと呼ばれる。通常、このようなギャップなしアラインメントは、比較的短い数の残基にわたってのみ実施される（例えば、５０個未満の連続アミノ酸）。より長い配列にわたる比較については、互いに対して挿入又は欠落を有する関連配列において同一性レベルを正確に反映するよう、ギャップスコアリングを使用して最適アラインメントを作製する。このようなアラインメントを実施するための適したコンピュータプログラムとして、GCG Wisconsin Bestfitパッケージ（University of Wisconsin, U.S.A; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387）がある。配列比較を実施できるその他のソフトウェアの例として、それだけには限らないが、BLASTパッケージ、FASTA(Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410)及び比較ツールのGENEWORKS一式が挙げられる。
【０１９８】
本文書の関連では、相同アミノ酸配列は、少なくとも４０、５０、６０、７０、８０又は９０％同一であるアミノ酸配列を含むととられる。所望のバイオマーカーに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドは、そのバイオマーカーの存在を示すととられることが最も適しており；９５％以上であるポリペプチドがより適しており、又はアミノ酸レベルで９８％同一が、そのバイオマーカーの存在を示すととられることがより適している。所望のバイオマーカーの有無を調べるために、前記比較が、少なくとも、アッセイされているポリペプチド又は断片の長さにわたって行われることが適している。比較が、所望のポリペプチドの全長にわたって行われることが最も適している。同じ考察が、核酸ヌクレオチド配列に当てはまる。
【０１９９】
アルツハイマー病
アルツハイマー病（ＡＤ）は、最もよくある神経変性障害であり、６５歳を超える８人中２人以上が罹患している（Blennow K, de Leon MJ, Zetterberg H (Alzheimer's disease. Lancet 368:387-403.2006)）。この疾患は、国民医療制度の主要な経済的及びその他の負担を有し、初期診断又は疾患進行のモニタリングを補助するバイオマーカーは、新規治療の開発にとって、また、臨床診療において大きな価値がある。バイオマーカーの探索における相当な進歩が、周知の病理学的病変−アミロイドβ（Ａβ）プラーク（Glenner GG, Wong CW, Quaranta V, Eanes ED (The amyloid deposits in Alzheimer's disease: their nature and pathogenesis. Appl Pathol 2:357-369.1984)）及び神経原線維の濃縮体（Lee VM, Trojanowski JQ (The disordered neuronal cytoskeleton in Alzheimer's disease. Current opinion in neurobiology 2:653-656.1992)）に由来するマーカーを用い、種々の技術を使用して行われ、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液及びその他の組織及び液体における生化学的変化を調べた。ＡＤにおけるバイオマーカーの最も見込みのある供給源として、ＣＳＦ又は血漿があるが、これは、これらの液体が、脳組織と比較して、より容易に入手可能であり、ＣＳＦの場合には、重要な生化学的変化が起こる中枢神経系（ＣＮＳ）と密接に接触しているからである。しかし、腰椎穿刺によってＣＳＦを得ることは、比較的侵襲的な手順であり、目の前にある血液からバイオマーカーを有することは、相当な進歩に相当する。したがって、本発明者らは、この目的に焦点を合わせた。
【０２００】
ＡＤのバイオマーカーの同定は、高度に感度の高い方法を用い、血液及びＣＳＦサンプルのプロファイリングを使用して取り組まれ、ＡＤ対象及び対照を区別できる、又は疾患進行若しくは治療に対する反応についての情報を提供できるマーカー、すなわち、タンパク質、ペプチド又は代謝産物を同定し得る。質量分析法は高度に感度が高く、したがって、すべての種類の状態においてマーカーの同定に適しており、同重核タグとともにいわゆるショットガンプロテオミクスを使用して、ＣＳＦサンプル（Abdi F, Quinn JF, Jankovic J, McIntosh M, Leverenz JB, Peskind E, Nixon R, Nutt J, Chung K, Zabetian C, Samii A, Lin M, Hattan S, Pan C, Wang Y, Jin J, Zhu D, Li GJ, Liu Y, Waichunas D, Montine TJ, Zhang J (Detection of biomarkers with a multiplex quantitative proteomic platform in cerebrospinal fluid of patients with neurodegenerative disorders. J Alzheimers Dis 9:293-348.2006)、Choe L, D’Ascenzo M, Relkin NR, Pappin D, Ross P, Williamson B, Guertin S, Pribil P, Lee KH (8-plex quantitation of changes in cerebrospinal fruid protein expression in subjects undergoing intravenous immunoglobulin treatment for Alzheimer’s disease.Proteomics 7:3651-3660.2007)、Dayon L, Hainard A, Licker V, Turck N, Kuhn K, Hochstrasser DF, Burkhard PR, Sanchez JC (Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6-plex isobaric tags. Analytical chemistry 80:2921-2931.2008)）及び血液サンプル（Hergenroeder G, Redell JB, Moore AN, Dubinsky WP, Funk RT, Crommett J, Clifton GL, Levine R, Valadka A, Dash PK (Identification of serum biomarkers in brain-injured adults: potential for predicting elevated intracranial pressure. J Neurotrauma 25:79-93.2008)）のプロテオームを分析して、特定の疾患又は病期において変更されたタンパク質レベルを見い出すいくつかの報告が公開されている。
【０２０１】
本発明者らは、緩徐に低下する（ＳＮＤ，slow declining）及び迅速に低下する（ＦＤ，fast declining）ＡＤ患者から得た血液の、認知症でない対照（ＮＤＣ）対象との比較を実施した。本発明者らは、１）疾患進行マーカーについて、ＳＮＤ及びＦＤ患者間のタンパク質変化及び２）疾患パターンに特徴的なタンパク質を決定するための、ＡＤ患者及びＮＤＣ間の変化を同定することを目標とした。実施例の節では、同重核タンパク質タギング及び質量分析を使用して調べられたサンプルから得たデータが示されている。より大きなデータセットにおいて、変化をさらに調べ、免疫ブロット法によって確認した。
【０２０２】
代替法
熟練した読み手ならば、本明細書に例示される特定の技術は、必要に応じて、同様の効果を達成するための容易に入手可能な代替物を使用して変更してもよいということは理解されよう。例えば、血液サンプルにおけるゲルゾリンレベルのアッセイは、ウエスタンブロットによって、又は同重核タンパク質タギングによって、又はＥＬＩＳＡによって、又は当技術分野で公知のいかなるその他の適した手段によって実施してもよい。
【０２０３】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、
ａ）対象から血液のサンプル又は血液に由来するタンパク質を含むサンプルを提供するステップと、
ｂ）所望により、前記血液から血漿を抽出するステップと、
ｃ）所望により、前記血液又は血漿を処理して、前記血液又は血漿に由来するタンパク質を含むサンプルを製造するステップと、
ｄ）所望により、前記血液又は血漿から多量のタンパク質を枯渇させるステップと、
ｅ）所望により、前記血液又は血漿からタンパク質をサイズ選択するステップと、
ｆ）所望により、前記血液又は血漿からタンパク質を安定化させるステップと、
ｇ）所望により、前記血液又は血漿からタンパク質を濃縮するステップと、
ｈ）所望により、前記血液又は血漿からタンパク質の緩衝作用を調整するステップと、
ｉ）前記サンプルにおけるゲルゾリン、セルロプラスミン及びＣ１プロテアーゼ阻害剤などの１種又は２種以上のバイオマーカー、最も適切には、ゲルゾリンをアッセイするステップと
を含み、
ｊ）前記アッセイが、適切には、同重核タンパク質タギングなどによって前記バイオマーカーの濃度又は量を決定し、
ｋ）対象から得たサンプル中の前記バイオマーカーの濃度又は量を、健常な対象から得たサンプル中の前記バイオマーカーの濃度又は量と、又は参照サンプル／値と比較するステップと
を含む方法に関する。
【０２０４】
上記（ｋ）において同定されるいかなる相違も、本明細書に示される転帰を示す、例えば、健常な対象から得たサンプル又は参照サンプルと比較して低下したゲルゾリンレベルを検出することが、アルツハイマー病を有する対象の可能性の増大を示す。
【０２０５】
サンプルが、インビトロで提供されることが適している。本発明の方法が、インビトロで実施されることが適している。サンプルの採取が、本発明の方法のステップではないことが適している。このようにして、本発明は、ヒト又は動物身体で直接実施されないことが適している。
【０２０６】
あるいは、本発明の方法は、血液サンプルなどのサンプルの採取で開始してもよい。
【０２０７】
さらなる適用
ポリペプチドを認識する、結合する、又はそれに対して親和性を有する、種々のアッセイ装置、キット又は物質が記載されている。ポリペプチドは、ゲルゾリン（Swiss prot受託番号Ｐ０６３９６；配列番号１）を含み得る。ポリペプチドは、
Ｃ１プロテアーゼ阻害剤（配列番号２）
セルロプラスミン（配列番号３）
クラステリン（SwissProt受託番号Ｐ１０９０９；配列番号４）
補体ｃ３（Ｐ０１０２４；配列番号５）
血清アミロイドＰ成分（Ｐ０２７４３；ＳＡＰ；配列番号６）
α−２−マクログロブリン（Ｐ０１０２３；Ａ２Ｍ；配列番号７）
γ−フィブリノゲン（Ｐ０２６７９；配列番号８）
補体因子Ｈ（Ｐ０８６０３；ＣＦＨ；配列番号９）
アポリポタンパク質Ｅ（配列番号１０）
から選択される１種又は２種以上のタンパク質を含み得る。
【０２０８】
ペプチド
質量分析ベースのアッセイによって検出されているいかなる所与のポリペプチド又はポリペプチドのセットのためにも、本明細書に記載されるＭＲＭ技術によってアッセイを実施してもよい。この実施形態では、特定のユニークなペプチド及び特に、特定の遷移が、所望のペプチドを検出するのに特に有利である。これらは、通常、最高の提示を生じるよう選択される（又は、複数の断片／遷移が同様のレベルを生じる場合には、特定のレベルの提示を生じるありとあらゆるペプチドなどの組合せを使用してもよい）。モニタリングのために使用される特に好ましい遷移は、添付の実施例及び／又は図に記載されるものである。
【０２０９】
特に、特定のペプチドには、本発明のアッセイの実施において標準及び／又は対照として有用性がある。例えば、以下のペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチドの検出の補助において特に有用である：
【０２１０】
【表１】
0005755149.tif 000002
【０２１１】
以下が特に適している：
【０２１２】
【表２】
0005755149.tif 000003
【０２１３】
この表中のペプチドは各々、本明細書に示される質量分析アッセイにおける優れた性能という利点を有する。ゲルゾリンの検出のためのものである配列番号３０、３１及び３２が最も好ましい。
【０２１４】
［実施例］
概略
最近の研究によって、ＡＤ患者と認知症でない対照（ＮＤＣ）の間には血漿タンパク質レベルの相違が存在し得るということが示される。本発明者らは、ショットガンプロテオーム発見実験において、３０人の推定ＡＤ及び１５人のＮＤＣ対象において同重核質量タギングを使用して、血漿タンパク質レベルを比較した。血漿サンプルを、年齢、性別及び認知評価基準（ＭＭＳＥスコア）について対応させ、分析のためにプールした。その後の相対定量化及び主成分分析によって、２つの群ＡＤ及びＮＤＣを区別できる候補タンパク質の一覧が得られた。最も重要なタンパク質、すなわち、ゲルゾリン、Ｃ１プロテアーゼ阻害剤及びセルロプラスミンを、合わせて９０人の推定ＡＤ及び５０人のＮＤＣ対象のより大きなサンプルセットにおいてウエスタンブロット解析によって確認した。
【０２１５】
このコホートでは、ＡＤ患者は、ＮＤＣ対象と比較して大幅に低い血漿ゲルゾリンレベルを示した。さらに、ゲルゾリンレベルは、疾患進行速度と相関し、緩徐及び迅速に低下するＡＤ患者において大きく異なっていた。さらに、Ｃ１プロテアーゼ阻害剤レベルは、ＡＰＯＥ  ε４遺伝子型と関連しているとわかり、低いセルロプラスミンレベルは、早い発症の年齢と相関していた。ゲルゾリンは、そのレベルの変化のために、及びＡＤにおける進行速度とのその関連のために、並びに、アミロイドβ（Ａβ）とのその報告された相互作用のために、優れたマーカーである。さらに、このマーカーは、有利には、ＡＤのバイオマーカー群に含まれるべきである。
【０２１６】
以下の略語は、所与の意味を有する：ＡＤ  アルツハイマー病；Ａβ  アミロイドβ；ＦＤ  迅速に低下するもの；ＳＮＤ  緩徐に低下する／低下しないアルツハイマー患者；ＮＤＣ  認知症でない対照アルツハイマー患者；ＡＰＯＥ  アポリポタンパク質Ｅ；ＴＭＴ  タンデム質量タグ；（ＭＲＭ  多重反応モニタリング）；Ｃ１  ｉｎｈ  血漿プロテアーゼＣ１阻害剤タンパク質；ＣＮＳ  中枢神経系；ＣＳＦ  脳脊髄液；ＰＢＳ−Ｔ  ０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有する  リン酸緩衝生理食塩水；ＴＣＥＰ  トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン；ＲＴ  室温；ＴＦＡ  トリフルオロ酢酸（Trifluoracetic Acid）；ＲＰ  逆相；ＳＣＸ  強陽イオン交換；ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ  タンデム質量分析と接続している液体クロマトグラフィー；ＰＣＡ  主成分分析；ＰＬＳ−ＤＡ  部分最小二乗判別分析；ＲＯＣ  反応動作曲線（Response Operator Curve）。
【実施例１】
【０２１７】
対象及びプールの選択
主な研究の集団は、アルツハイマー病を有する対象及び高齢者の集団に基づいた大きな団体［Alzheimer’s Research Trust （ＡＲＴ）コホート］から得られたものであり、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ，mini mental state examination）スケール及びアルツハイマー病評価スケール−認知サブスケール（ＡＤＡＳ−ｃｏｇ，Alzheimer's disease assessment scale-cognitive subscale）をはじめとするいくつかの認知評価基準によって評価した。サンプルを、群間で年齢、性別及びベースラインＭＭＳＥスコアについて、群内で年齢、性別及びＭＭＳＥ低下について対応させた。サンプルを、ＥＤＴＡコートしたガラスチューブに集め、さらなる分析まで−８０℃で保存した。
【０２１８】
発見実験のために、ＦＤ及びＳＮＤ群から得た血漿サンプルを、ベースライン（１年）及び２年後（３年）に分析した；ＮＤＣ群中の各対象から単一の血漿サンプルを採取した。群あたり合計１５サンプルが入手でき（合わせて７５サンプル）、これらを各５サンプルの３セットにプールした。これによって、その後の分析のための合計１５プールが得られた。２群−迅速に低下するもの及び緩徐に低下するもの−のうち１群へのＡＤサンプルの分類を、２年にわたる年間のそのＭＭＳＥスコアの低下に従って実施した。ＭＭＳＥスケールで年間０〜３ポイントの低下を有する患者から得たサンプルを、緩徐に低下するＡＤ患者として分類したのに対し、ＭＭＳＥスケールで６ポイント以上の年間低下を有する患者から得たサンプルを、迅速に低下する群に割り当てた。プールしたサンプルを、年齢及び性別について対応させた（表１ａ）。迅速に低下するもののすべてのプールは、平均年齢７８、平均ベースラインＭＭＳＥスコア１８〜２０及びＭＭＳＥスケールで年間１１ポイントの平均低下を有していた。他方、緩徐に低下するもののプールは、平均年齢８０〜８２、平均ベースラインＭＭＳＥスコア１８〜２１及びＭＭＳＥスケールで年間２ポイントの平均低下を有していた。相対的に、ＮＤＣのプールは、平均年齢７８を有しており、性別においても対応させた。
【０２１９】
確認目的で、元のサンプルを含めたより大きなサンプルセットを使用した。合わせて９０人のＡＤ患者を、５０人の対照と比較した（表１ｂ）。研究は、関連研究倫理委員会によって承認された。
【実施例２】
【０２２０】
サンプル調製
実施例３では、同重核タンパク質標識によるタンパク質検出が示されている。この実施例は、このような分析のために、どのようにサンプルが有利に調製され得るかを説明する。もちろん、異なる分析が使用される場合には、異なるサンプル調製が選択され得る。
【０２２１】
概して、サンプル調製及びタンデム質量タグ（ＴＭＴ）を用いる標識が、これまでに記載されたように（Dayon L, Hainard A, Licker V, Turck N, Kuhn K, Hochstrasser DF, Burkhard PR, Sanchez JC (Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6-plex isobaric tags. Analytical chemistry 80:2921-2931.2008)）ではあるが、わずかに改変して実施された。検出可能なタンパク質の数を増大するために、マルチプルアフィニティー除去システム（MARS, 5188-5332, Agilent社製, Palo Alto, CA）を用いて、血漿を６種の最大に多量のタンパク質（アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、アンチトリプシン及びハプトグロビン）を枯渇させた。３０μｌのプールした血漿を、９０μｌのＭＡＲＳバッファーＡを添加することによって１：４希釈し、ボルテックス処理し、１５，５００×ｇで１分間遠心沈殿させた。上清１００μｌを４．６ｍｍ×５０ｍｍ  ＭＡＲＳカラム上に注入し、製造業者の使用説明書に従って処理した。フロースルー画分（１ｍｌ）を集め、バッファー交換及びタンパク質濃度のために、５ｋＤａ  ＭＷＣＯ遠心フィルター装置（Vivaspin 4, VS0414, Sartorius社製, Goettingen, Germany）に移した。３ｍｌの１００ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ，triethylammonium bicarbonate）ｐＨ８．２を添加した後、チューブを、４℃、２，０００×ｇで３０分間遠心分離した。その後、３ｍｌのＴＥＡＢを加え、３０分間遠心分離し、さらに３ｍｌのＴＥＡＢを加え、残存する容量が、５０〜１００μｌの間となるまで６０分間遠心分離した。容量を、１５０μｌに調整し、各血漿プールのタンパク質含量を、従来のBradfordアッセイ（Protein Assay,Bio-Rad社製, Hercules, CA）を用いて求めた。
【実施例３】
【０２２２】
タンパク質検出
原則として、タンパク質検出は、熟練した読み手に公知のいかなる適した手段によってであってもよい。同重核タンパク質タギング技術が、例としてここで記載されている。
【０２２３】
等しいタンパク質量を確実にするために、サンプルあたり１００μｇのタンパク質を、新しいチューブに移し、５μｌのＨ２Ｏ中の２％ＳＤＳ（ｗ：ｗ）を加え、１００ｍＭ  ＴＥＡＢで１００μｌまで満たした。５．３μｌのＨ２Ｏ中の、２０ｍＭ  トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ，Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride）を加え、室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。その後、アセトニトリル（ＡＣＮ，acetonitrile）中の５．５μｌの１５０ｍＭヨードアセトアミドを加え、室温、暗所で６０分間インキュベートした。続いて、１００ｍＭ  ＴＥＡＢ中、０．４μｇ／μｌの新しく調製したトリプシン（Seq. grad modified trypsin, Promega社製, V5111, Madison, WI, USA）１０μＬを加え、３７℃で一晩インキュベートした。
【０２２４】
１５種の血漿プールを分析のために３種の個々の実験（生物学的複製）に分けるが、これらの実験のうち１つを技術的複製のために３回反復する。３種の個々の実験の各々において、血漿プールを、以下のように、４０．３μｌ  ＡＣＮ中の、６０ｍＭ  ＴＭＴリポーターイオン（Proteome Sciences Plc社製, London, UK）を用いて、室温で１時間標識した：ｍ／ｚ  １２６．１：ＦＤ１年、１２７．１：ＦＤ３年、１２８．１：ＳＤ１年、１２９．１：ＳＤ３年、１３０．１：ＮＤＣ、１３１．１：Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ参照血漿。すべての実験においてＤａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ血漿を分析し、実験間比較を可能にした。インキュベートした後、各チューブにＨ２Ｏ中の、５％ヒドロキシルアミン（ｗ／ｖ）８μＬを加え、１５分間混合した。６種のサンプルを新しいチューブにプールし、ＡＣＮ含量の低減のために、Ｈ２Ｏ中の、５％  ＡＣＮ  ０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて１：６希釈した。
【実施例４】
【０２２５】
ＭＳ分析のための調製
この実施例では、タグのついたタンパク質が質量分析（ＭＳ）を使用して検出される。ＭＳ分析における過度の試薬及び高い塩含量の悪影響を避けるために、サンプルを手作業で精製し、逆相（ＲＰ，reverse phase）カラム（Waters社製, Oasis HLB cartridge, WAT094225, Milford, MA, USA）とそれに続いて、空のカートリッジ（Macherey-Nagel GmbH & Co KG社製, 732501, Dueren, Germany）及びセファロース懸濁液（Sigma-Aldrich社製, SP Sepharose Fast Flow, S1799-100ML, St. Louis, MO, USA）から調製した強陽イオン交換（ＳＣＸ，strong cation exchange）カラムを備えた真空マニホールド（Thames Restek UK社製, 26077, Saunderton, UK）で脱塩した。溶出したサンプルを、スピードバック中で凍結乾燥し、２ｍｌ  Ｈ２Ｏに溶解し、再度蒸発乾固させ、さらなる分析まで−８０℃で保存した。
【０２２６】
質量分析
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析のために、サンプルを１００μｌの５０ｍＭ重炭酸アンモニウムバッファー中、３７℃で１０分間再構成した。その後、サンプルをおよそ０．１μｇ／μｌの濃度に重炭酸アンモニウムでさらに希釈した（１：６０）。
【０２２７】
Ultimate LCシステム（Dionex社製, Camberley, UK）を使用して逆相クロマトグラフィーを実施した。ペプチドを、０〜４８％  ＡＣＮ／０．０５％ギ酸の３段階直線勾配を使用し、２００ｎＬ／分の流速で１２０分かけてＣ１８  ＰｅｐＭａｐカラム（７５μｍ  Ｉ．Ｄ．）で分離した。ペプチドを、Masslynx ｖ４．０ソフトウェア下で作動するQTof-micro(Waters社製, Elstree, UK)に取り付けたＺ−スプレイ供給源を使用してエレクトロスプレーイオン化によってイオン化した。機器を自動化切替様式で動作させ、衝突誘導フラグメンテーションによる配列決定のために、前駆体イオンをその強度及び荷電状態に基づいて選択した。ＭＳ／ＭＳを、質量／荷電（ｍ／ｚ）比に基づき、ＴＭＴ標識されたペプチドのフラグメンテーションのために最適化されたコリジョンエネルギープロファイルを使用して実施した。生データを、内部補体Ｃ３ペプチドに対して再較正し、以下のＭＳ／ＭＳ処理パラメータを用いるProteinLynx Global Server v2.2.5を使用してピークリストに処理した：Savitzky-Golay法によるスムージング、２反復、４チャネル；トップ８０％のピークセントロイド処理（centroiding）、デアイソトーピング（deisotoping）又はバックグラウンド差し引きなし。
【実施例５】
【０２２８】
タンパク質同定
Mascot（v2.2; http://www.matrixscience.com/）を使用するシングルサーチとして、ＩＰＩヒトデータベース（リリースｖ３．３２）に対してＭＳピークリストデータを検索することによって、各ＴＭＴ実験においてタンパク質を同定した。以下のパラメータ特定化を使用した：前駆体イオン質量許容誤差１５０ｐｐｍ、フラグメントイオン質量許容誤差０．６Ｄａ、最大３つの失敗した切断を含むトリプシンペプチド、可変修飾：システインのカルバミドメチル化、メチオニン酸化及びリシン残基のイプシロン−アミノ官能基及びペプチドＮ末端のＴＭＴ標識。得られたMascotファイルは、同定されたタンパク質に関する情報を含み、スペクトルの手作業での検査に使用できる。ピークリストファイルはまた、TiTRE（ｖ１．６）、社内で開発したソフトウェアを使用して処理され、リポーターイオンデータを抽出した。これは、その後、Mascot検索結果と関連していた。
【０２２９】
検索結果を処理して、ＭＳ／ＭＳイオンスコア＞２０及びランク１配列割り当てを有する割り当てのみを報告した。Ｍａｓｃｏｔ  ＭＳ／ＭＳイオン検索にとって、ランク１割り当ては、ＭＳ／ＭＳクエリーに対する最高スコア配列マッチである。これらのペプチド割り当てを、「ユニーク性」について評価し、すなわち、割り当てられた配列がそのタンパク質内でのみ生じる場合には、割り当ては「ユニーク」であり、割り当てられた配列がまた、その他のタンパク質中にも存在する場合には、割り当ては「非ユニーク」とした。偽陽性ペプチド割り当ての５％の危険性に対応する、上記のMascot同一性スコア（通常、約４０）を上回るスコアをつける２未満のユニークなペプチドを含む割り当てられたタンパク質ヒットを、割り当てられたペプチドの質量分析の手作業での検査によって確認した。
【０２３０】
リポーターイオン強度は各々、参照血漿標準に対する割合として表され、ｌｏｇ１０値に変換される。データは、正規化されたｌｏｇ１０リポーターイオン割合の中央値が０であるよう、各個々の値から、ｌｏｇ１０リポーターイオン割合の中央値（グローバルノーマライゼーション（global normalisation）因子）を差し引くことによって正規化した。
【０２３１】
これまでの実験から、Qtof micro機器を使用して、リポーターイオン強度が容易に決定され得る最小閾値は、４０カウントであった。この閾値を下回ると、観察されるタンパク質割合は、イオン統計値の不良のために実際の割合を代表しない。この理由のために、４０カウントを下回る参照血漿中のリポーターイオン強度を有するペプチドは、定量化から除外した。さらに、ＴＭＴを用いて不完全に標識されたペプチド及びメチオニンを含有するものはデータセットから除かれた。不完全なＴＭＴ標識及び／又はメチオニン残基を含有することに対応する割り当ては、割り当ての主な集団から差次的に定量化するために観察され、タンパク質量の実際の相違を代表しないことが多かった。後者の場合には、リポーターイオン割合は、サンプル間の差次的メチオニン酸化をたどると思われた。
【０２３２】
正規化されたデータセットを、異なる生物学的反復実験において同定されたタンパク質がアラインされるように合わせた。
【実施例６】
【０２３３】
多変数解析
実施例５から得たアラインされたデータセットを、ＳＩＭＣＡ−Ｐソフトウェア（バージョン１１．５）にインポートした。すべての変数（各タンパク質の平均ｌｏｇ１０リポーターイオン割合）を単位変数に対して縮尺し、値の５０％超が欠けている変数を分析から排除した。最初に、主成分分析（ＰＣＡ，principal components analysis）を使用してデータをまとめ、対応される必要があるデータセット中の強い異常値又はその他の問題の存在を調べた。続いて、部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ，partial least squares - discriminant analysis）を使用して、群間で異なったタンパク質を同定した。
【０２３４】
血漿サンプルのＴＭＴ分析
ゆっくり及び迅速に低下するＡＤ患者の、並びに、認知症でない対照の血漿プロテオームを調べるために、各３セットにプールされた群あたり１５人のサンプルを、同重核タンパク質タグを用いて標識し、質量分析によって分析した。５回の実験すべてにわたって合計２３６５のクエリーを、ペプチド配列に対応させた。これらのペプチドは、合計１５２種のユニークなタンパク質配列と関連していた。測定値の５０％超が欠けているタンパク質を除去した後、合計５２種の同定されたタンパク質が、分析に利用可能な定量的データを有していた（表２）。次いで、多変数解析（ＰＬＳ−ＤＡ）を使用して、平均相対タンパク質濃度データを使用して異なる群を区別しようとした。モデルフィッティングした後、クロス確認によって、相当な成分が、ＳＤ１年又は３年及びＮＤＣ観察結果を含有するデータセットにフィッティングされ得ないことが示された。
【０２３５】
３成分モデルが、クラスデータ（Ｒ２Ｙ）の分散の９９．５％を説明する、ＦＤ１年及びＮＤＣデータセットにフィッティングされた。図１は、さらなるパラメータと一緒にＰＬＳ−ＤＡモデルのスコア及び加重を示し、このモデルを要約する。クラスデータの分散の９９．５％を説明する同様の３成分モデルも、ＦＤ３年及びＮＤＣデータセットにフィッティングされた。
【０２３６】
ＦＤ及びＮＤＣの区別にとって最も重要なタンパク質が、表１中に強調されている。これらのタンパク質の相対的重要性は、これまでに記載されたモデルにおけるＰＬＳ回帰係数に基づいて判断された。
【実施例７】
【０２３７】
ウエスタンブロット解析
本出願を通じて記載されるように、同重核タンパク質タギングは、本発明のマーカーの検出が実行され得るたった１つの方法である。同重核タンパク質タギングによって得られたデータの確認のために、より大きなサンプルセットにおいてウエスタンブロッティングによって選択されたタンパク質を分析した。血漿サンプルを、以下のとおりに希釈し：４μｌ生血漿、９６μｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル（Complete（登録商標）,1836145, Roche Applied Science社製, Penzberg, Germany）を含有するＰＢＳ及び１００μｌの２×サンプルバッファー（Laemmli, S3401, Sigma社製）を、１００℃に５分間加熱し、１５，５００×ｇで遠心沈殿させ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（NuPAGE（登録商標） Novex 4-12% Bis-Tris Midi Gel, 26W, Invitrogen社製, Carlsbad, CA, USA）で分離した。０．２μｍのニトロセルロースメンブラン（Schleicher & Schuell社製, BA-S 83, Keene, NH, USA）にトランスファーした後、ブロットを０．１％  ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）中、５％の脱脂乳を用いてブロッキングし、セルロプラスミン（ab8813, 1:50000, Abcam社製, Cambridge, UK）Ｃ１プロテアーゼ阻害剤（ab36992, 1:2000, Abcam社製）及びゲルゾリン（ab55070, 1:500, Abcam社製）に対する抗体を用いて探索した。一次抗体を、近赤外Odysseyイメージャー（Licor社製, Lincoln, NE, USA）を使用し、７００又は８００ｎｍのいずれかの波長で発光するフルオロフォアとコンジュゲートしている適当な二次抗体（希釈：１：１００００）を用いて検出した。Odysseyソフトウェアｖ２．１を使用して、濃度測定分析を実施した。
【０２３８】
強度の調整のために、すべてのサンプルを２連で実施し、各ゲルで参照血漿サンプルを実施した。等容積の血漿を、イムノブロット及びその後の定量的デンシトメトリーに付した。ゲル間定量的比較を可能にするために、参照血漿とのサンプル毎の比を確立し、２連の実施を平均化した。２連のゲルの再現性を評価すると、ピアソン相関を実施することによって０．８４という大きな正の相関が見られた。統計ソフトウェアプログラムＳＰＳＳ  ｖ１５．０を使用して、結果をスチューデントのｔ検定によって有意性について調べた。さらに、反応動作曲線（ＲＯＣ，Response Operator Curve）分析を実施して、感度及び特異性を評価した。
【０２３９】
実施例６から得たプロテオームデータを確認するために、選択されたタンパク質を、ウエスタンブロッティングによって分析し、多変数解析において見られたＡＤ及びＮＤＣサンプル間の相違を調べた。ＰＬＳ係数の高い絶対値は、それぞれの群の分離における特定のタンパク質の高い相対的重要性を示す。したがって、本発明者らは、より大きなデータセットにおけるさらなる確認のために、最高のＰＬＳ係数値を有する（表２）、３種タンパク質−ゲルゾリン、Ｃ１プロテアーゼ阻害剤（Ｃ１  ｉｎｈ）及びセルロプラスミンを選択した。データセットは、最初の研究に使用されたサンプル及び比較される合計９０人のＡＤ及び５０人のＮＤＣサンプルを与えるためのさらなるサンプルからなっていた。
【０２４０】
結果を、スチューデントのｔ検定を使用して有意性について調べ、ＡＤ患者から得た血漿において、ゲルゾリンレベルの高度に大幅な低減（ｐ＝０．００１）を確認できた（図２ａ）。Ｃ１  ｉｎｈ及びセルロプラスミンレベルの変化は、あまり顕著ではないと思われ、統計的有意性に達しなかった。これら３種のタンパク質を、ＡＰＯＥ遺伝子型、重篤度の尺度としてのＭＭＳＥスコア、年間のＭＭＳＥ低下及びまた、発症の年齢に関してさらに分析した。ゲルゾリンレベルは、年間のＭＭＳＥ低下と相関しているとわかった（ピアソン相関−０．２０９、ｐ＝０．０５）。この知見は、最初のデータセットにおけるものと同一の分類判定基準を適用して、ＡＤ患者をゆっくり及び迅速に低下する群に割り当てた後、ゲルゾリンレベルがＳＮＤと比較してＦＤ群において有意に低いとわかった（スチューデントのｔ検定；ｐ＝０．０１９）という事実によって支持される。したがって、ＴＭＴ分析から得た結果（図２ｂ）を確認できた。さらに、Ｃ１  ｉｎｈは、ＡＰＯＥ  ε４対立遺伝子の数と弱い関連を示し（ピアソン相関−０．１７５；ｐ＝０．０４３）、セルロプラスミンは、発症の年齢と相関を示した（スピアマン相関０．２３１；ｐ＝０．０３１）。
【０２４１】
さらに、ゲルゾリンのＲＯＣ分析を実施した。曲線下面積は、高度に有意であるが（ｐ＝０．００１）、タンパク質は、都合のよい試験特徴を示さなかった：８０％の設定特異性は、４４％の感度値を与えたのに対し、感度値を８０％に設定することによって３９％の特異性値が得られた。
【０２４２】
まとめ
本発明者らは、アルツハイマー病における同重核タンパク質タグを用いる分画されていない血漿の最初の分析を開示する。
【０２４３】
さらに、本発明者らは、ショットガンプロテオミクス発見実験においてタンデム質量タグを使用して、迅速に低下するアルツハイマー病患者及び認知症でない対照を区別できるいくつかのタンパク質を同定できた。選択された候補タンパク質を、定量的ウエスタンブロッティングを用いてより大きなデータセットにおいて確認した。ゲルゾリンの血漿レベルは、対照と比較してＡＤにおいて低下すること並びにレベルはまた、迅速及びゆっくり低下するＡＤ患者間で異なることが示された。ゲルゾリンレベルが疾患進行と相関したことが最も重要である。
【０２４４】
さらに、Ｃ１プロテアーゼ阻害剤レベルは、ＡＰＯＥ  ε４遺伝子型と関連していることがわかり、低いセルロプラスミンレベルは、早い発症年齢と相関していた。
【実施例８】
【０２４５】
同重核タンパク質タギングを使用する、アルツハイマー病のマーカーの発見及び確認
アルツハイマー病（ＡＤ）のバイオマーカーは、緊急に必要とされている。最近の研究によって、ＡＤ患者及び認知症でない対照（ＮＤＣ）間には、血漿タンパク質レベルの相違が存在することが示され、このことは、ＡＤの末梢のバイオマーカーの可能性を示唆する。本研究では、本発明者らは、同重核質量タギングを使用して、ショットガンプロテオームアプローチにおいて、３０人の推定ＡＤ及び１５人のＮＤＣ対象において血漿タンパク質レベルを比較した。血漿サンプルは、年齢、性別及び認知評価基準（ＭＭＳＥスコア）について対応させ、分析のためにプールした。その後の相対定量化及び主成分分析によって、２群ＡＤ及びＮＤＣを区別できる候補タンパク質のリストを作製した。最も重要なタンパク質、すなわち、ゲルゾリン、Ｃ１プロテアーゼ阻害剤及びセルロプラスミンは、合わせて９０人の推定ＡＤ及び５０人のＮＤＣ対象のより大きなサンプルセットにおいてウエスタンブロット解析によって確認した。いくつかの知見をさらに確認するために、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、高度に特異的であるだけでなく、極めて高い感度も有する方法を使用して、サンプルのサブセットを分析した。要約すれば、ＡＤ患者は、ＮＤＣ対象と比較して大幅に低い血漿ゲルゾリンレベルを示した。さらに、Ｃ１プロテアーゼ阻害剤レベルは、ＡｐｏＥ  イプシロン４遺伝子型と関連しているとわかり、低いセルロプラスミンレベルは、早い発症年齢と相関していた。ゲルゾリンは、ＡＤにおけるその変化したレベルのために、並びに、アミロイドβ（Ａβ）とのその報告された相互作用のために、ＡＤに関して高度に興味深いタンパク質であり、さらなる評価が必要である。
【０２４６】
一般法は、図３Ａに示されている。
【０２４７】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用する同重核タンパク質タギング
すべての実験にわたって合計２３６５のクエリーを、ペプチド配列に対応させた。これらのペプチドは、合計１５２種のユニークなタンパク質配列と関連していた。実験の５０％超において検出されたタンパク質のみを含め、合計５２種の同定されたタンパク質が、分析に利用可能な定量的データを有していた。多変数解析（ＰＬＳ−ＤＡ）によって、タンパク質平均データを使用して対象の異なる群を区別できる候補タンパク質のリストを作製した（表１−図３Ｂ）。
【０２４８】
表１（図３Ｂ）：ＡＤ及びＮＤＣ対象を区別する候補タンパク質のリスト。ＰＬＳ−ＤＡ係数の高い絶対値は、群間の判別におけるそれぞれのタンパク質の高い重要性を示すが、正／負の値は、ＡＤ群におけるレベルの増大／低下を示す。Ｔ１及びＴ２とは、ベースライン及び２年のフォローアップでのサンプルの測定値を指す。
【０２４９】
ウエスタンブロッティング
プロテオームデータを確認するために、選択されたタンパク質を、ウエスタンブロッティングによって分析し、多変数解析によって抽出されたＡＤ及びＮＤＣ間の変化を調べた。したがって、本発明者らは、より大きなデータセットにおけるさらなる確認のために、ベースライン及び２年のフォローアップそれぞれで最高のＰＬＳ係数値を有する（表１；太字）３種のタンパク質−ゲルゾリン、Ｃ１プロテアーゼ阻害剤及びセルロプラスミン−を選択した。データセットは、最初の研究に使用されたサンプル及び比較される合計９０人のＡＤ及び５０人のＮＤＣサンプルを与えるためのさらなるサンプルからなっていた。結果を、独立サンプルｔ検定を使用して有意性について調べた。初めて、ＡＤ患者から得た血漿においてゲルゾリンレベルの高度に有意な低減（ｐ＝０．００１）を証明できた（図４Ａ）。Ｃ１阻害剤タンパク質及びセルロプラスミンの変化はあまり顕著ではないと思われ、統計的有意性に達しなかった。ＭＭＳＥスコア、年間のＭＭＳＥ低下及び発症の年齢などの臨床パラメータを用いて相関分析を実施し、ＡｐｏＥ  ｅ４遺伝子型との関連について調べた。要約すると、Ｃ１プロテアーゼ阻害剤は、ＡｐｏＥ  ｅ４保有者との有意な関連を示し（ｐ＝０．０３５）、セルロプラスミンは、疾患発症の年齢との相関を示し（スピアマン相関０．２３１、ｐ＝０．０３１）、それによって、多変数解析におけるその高いＰＬＳ−ＤＡ係数値についての説明が提供される。
【０２５０】
さらに、ゲルゾリンの反応動作特性（ＲＯＣ）分析を実施した（図４Ｂ）。曲線下面積は高度に有意であるが（ｐ＝０．００１）、タンパク質は、好都合な試験の特徴を示さなかった：８０％の設定特異性で４４％の感度値が得られたのに対し、８０％に感度値を設定することによって３９％の特異性値が得られた。
【０２５１】
結論：
・ＡＤ対象は、ＮＤＣ対象と比較して有意に低い血漿ゲルゾリンレベルを示した。
・Ｃ１プロテアーゼ阻害剤レベルは、ＡｐｏＥ  ｅ４遺伝子型と関連しているとわかった。
・セルロプラスミンレベルは、疾患発症の年齢と正の相関を示した。
【０２５２】
ＡＤ及び対照対象間の血漿においてその明らかな変化及びＡｂとのそのこれまでに報告された相互作用（Chauhan VP, Ray I, Chauhan A, Wisniewski HM (Binding of gelsolin, a secretory protein, to amyloid beta-protein. Biochemical and biophysical research communications 258:241-246.1999)、Ray et al., 2008）を考えると、バイオマーカーとしてのゲルゾリンの使用は当然である。
【実施例９】
【０２５３】
血漿ＡＤバイオマーカーのより大きな群の一部としてのゲルゾリンの選択的反応モニタリング
ゲルゾリンを含むいくつかの血漿タンパク質が、発見演習（exercises）から候補ＡＤバイオマーカーとして浮上した。これらの候補の確認のためにアッセイが必要である；ＳＲＭベースのアプローチが、その技術の感度及び選択性、多重化する能力及び抗体の制限された有効性のためにＥＬＩＳＡの魅力的な代替法である。ここで、所望のタンパク質にとってユニークな特徴的なペプチドが、サンプル中のそのタンパク質の定量的情報を提供するために測定される。ＳＲＭによる所望の分析物の定量化における正確度は、ＴＭＴと組み合わせることによって、これが分析への内部参照の組み込みを可能にするので、改善され得る。最初の結果は、ペプチド定量化の正確な、再現性のある方法としてのＴＭＴ  ＳＲＭを実証した。本発明者らは、ここで、ＡＤ及び対照血漿サンプル中の８種の候補バイオマーカーの評価を可能にする完全ＴＭＴ  ＳＲＭアッセイを提供することに進む。
【０２５４】
既存のＭＳ／ＭＳデータを使用して、定量化のためにタンパク質あたり少なくとも３種のペプチドを選択し、ゲルゾリンの代表的なペプチドが図５に示されている。含まれる選択のための判定基準；トリプシンでの切断不足なし、変数改変なし（インビボ又は実験的）、各々がプロテオティピック（ユニーク）であった。各ペプチドの合成版を調製し、ＴＭＴｚｅｒｏで標識し、定量化のための参照として作用した。ペプチドを4000 QTRAP(Applied Biosystems社製)に注入し、ＭＳ／ＭＳデータを獲得した。すべてのペプチドについて最適フラグメントイオンを選択し、Ｑ３における各々の最大検出を容易にした。対応するＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘ標識したフラグメントイオン質量を算出し、個々のＱ１及びＱ３遷移対に対してＭＳ機器パラメータを最適化した。プールされた血漿サンプルを消化し、ＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘを用いて標識し、ＴＭＴｚｅｒｏ標識した参照ペプチドと組み合わせた。Ultimate 3000 nano LC(Dionex社製)及び4000QTRAPを使用して、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。９０分のＡＣＮ勾配にわたる逆相クロマトグラフィーによってペプチドを分離した。各ペプチドの正確な保持時間を使用して、ＳＲＭスケジューリングを、本方法に適用した（＋／−３分検出ウィンドウ；２．５秒サイクル時間；３７．８ｍｓｅｃ  ドウェル時間及びＦＨＭＷで２１データ点）。
【０２５５】
すべてのペプチドを、変動する強度でＴＭＴ  ＳＲＭによって血漿サンプル中で観察した。各候補ペプチドの正確な定量化を達成するために、参照ペプチドが加えられなかった場合に、血漿からの非特異的シグナルの相当な貢献があるかどうかを確定することが必要であった。ＴＭＴｚｅｒｏ標識した血漿を、すべてのＴＭＴｚｅｒｏ及びＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘ遷移にわたって分析した。いかなるＴＭＴｚｅｒｏ  ＳＲＭ遷移から観察されたシグナルも、非特異的バックグラウンドを表した。続いて、相当なバックグラウンドを有していた遷移を方法から除去した。
【実施例１０】
【０２５６】
ゲルゾリン及びさらなる拡張マーカー群の確認
１．導入
アルツハイマー病（ＡＤ）の特異的及び感度の高いバイオマーカーの確立が、診断及び疾患進行のモニタリングにおいて補助するために必要である。発見演習から、クラステリン（SwissProt受託番号Ｐ１０９０９）、補体ｃ３（Ｐ０１０２４）、血清アミロイドＰ成分（Ｐ０２７４３；ＳＡＰ）、α−２−マクログロブリン（Ｐ０１０２３；Ａ２Ｍ）、ゲルゾリン（Ｐ０６３９６）、γ−フィブリノゲン（Ｐ０２６７９）及び補体因子Ｈ（Ｐ０８６０３；ＣＦＨ）が、ＡＤ対対照サンプルにおいて差次的に発現されるとわかった。さらに、アポリポタンパク質ｅ４対立遺伝子の所有が、後期発症ＡＤの今までに知られている唯一の明白な遺伝的リスク因子であり、アポリポタンパク質Ｅ（Ｐ０２６４９；ＡｐｏＥ）タンパク質の発現はＡＤにおいて変更され得る。これらのタンパク質は、疾患の進行がモニタリングされ得る可能性のある候補として存在する。この実施例は、臨床サンプルコホートへのタンデム質量タグ選択反応検出（ＴＭＴ−ＳＲＭ，Tandem MassTag Selected Reaction Monitoring）アッセイの適用を詳述する（ｎ＝２０；１０人のアルツハイマー病（ＡＤ）、１０人の対照）。この研究の目的は、第１に、直交技術（ＴＭＴ  ＳＲＭ）を使用した、タンパク質の１種、ゲルゾリン（対照に対してＡＤ患者において低減するとわかった）についてのウエスタンブロット（ＷＢ，western blot）の知見の確認であり、第２に、ＴＭＴ  ＳＲＭによってＡＤコホートにおいて残りのタンパク質の性能を評価することである。
【０２５７】
２．方法
２．１．サンプル選択
ゲルゾリンのＷＢ測定値に基づいてサンプルを選択した。ＴＭＴ−ＳＲＭによって疾患及び対照間の相違を検出する最良の機会を与えるために、ゲルゾリンの最高及び最低の濃度を示したサンプルが（群あたりｎ＝１０）、分析のために持ち越された。
【０２５８】
２．２．ＳＲＭ定量化のための候補ペプチドの選択
発見演習から得たものを含めた、ＴＭＴ標識された血漿データセットの既存のＭＳ／ＭＳスペクトルを、ＳＲＭによる候補バイオマーカー確認に最も適したペプチドを決定するためにマイニングした（mined）。定量化のためにタンパク質候補あたり少なくとも３種のペプチドが選択され（合わせて３２種）、そのうち１６種が発見演習において観察された。ＳＲＭのためのこれらのペプチドの選択のための判定基準は、以下とした：良好な高質量フラグメントイオン、トリプシンでの切断不足なし、変数改変なし（インビボ又は実験）。内因性検出の不良及び正確度、精度及び再現性の不良のために、これまでの較正曲線をプロットする場合には、いくつかのペプチドが方法から除去された。これによって、本研究のこのパートにおいて定量化される２２種のペプチドが残った。
【０２５９】
２．３．合成ペプチドのサンプル調製
各ペプチドの合成版を、定量化の参照として作用するよう社内で調製した。これまでの結果は、同一タンパク質のペプチドから回収される量の変動を示した。このような変動を最小にするために、同一タンパク質のペプチドを、等モル混合物に組み合わせ（６２ｎｍｏｌｅｓ／ペプチド；合わせて８混合物）、その後、ＴＭＴ標識した。各混合物を、還元、アルキル化、トリプシン消化及びＴＭＴを用いる個々のサンプルの化学標識からなる通常のＴＭＴ−ＳＲＭワークフローを使用して処理した。混合物を軽いＴＭＴ（血漿における逆較正曲線の作製のための内部標準として作用するための）及び重いＴＭＴ（血漿における逆較正曲線の作製のために使用される、及び実験サンプルセットの定量化のための内部標準としての使用のための）を用いて標識した。両混合物は、固相抽出及び揮発性バッファーを使用する強陽イオン交換によるその後の精製を受けた。
【０２６０】
２．４．血漿サンプルの調製
等容量の各血漿サンプル（２５μｌ）をストックから回収し、１０倍希釈した。これから、１２．５μｌを各消化に加えると、消化あたり約１００μｇのタンパク質が得られた。さらに、較正曲線の調製のために、及び品質管理目的で、すべてのサンプルのプール（サンプルあたり１００μｇ；合わせて２ｍｇのタンパク質）を調製した。ＳＤＳを用いる可溶化及び希釈に続いて、各サンプルを還元し、アルキル化し、トリプシンを用いて消化した。サンプルを軽いＴＭＴを用いて標識し、その後、固相抽出及び揮発性バッファーを使用する強陽イオン交換によって精製した。サンプルを凍結乾燥し、その後ＭＳ分析した。すべてのサンプルを３連で処理した（技術的反復）。
【０２６１】
２．５．サンプルセットのＳＲＭ分析
Ultimate3000 LC system(Dionex社製)と接続している4000QTRAP質量分析計(Applied Biosystems社製)で、ＳＲＭ分析を実施した。質量分析計に、陽イオンモードで操作される、マイクロリットル流速のためのマイクロイオンスプレイ供給源を取り付け、Ｑ１及びＱ３分離が単位に設定された（０．７ＦＷＨＭ）。ペプチドを、１００μＬ／分の流速で５〜３０％  ＡＣＮ／０．２％  ギ酸の１４分の勾配にわたって、Hypersilゴールドカラム（１ｍｍ内径×５０ｍｍ；１．９μｍ、Thermo Fisher Scientific社製）を使用する逆相クロマトグラフィーによって分離した。カラムの洗浄及び平衡化によって、総実行時間が２０分に増大した。
【０２６２】
標識されたペプチドを、ＱＴＲＡＰ  ＭＳに直接注入し、まず第一に、ＭＳ／ＭＳフラグメンテーションのために選択された。各ペプチドについて最適ＭＳ／ＭＳフラグメントイオン（３種）を選択し、Ｑ３における各遷移の最大検出及び特異性を容易にした。次いで、すべてのペプチドを、選択されたＱ３遷移を使用して、直接注入によるＳＲＭによって測定した。各ＳＲＭの検出の感度を、コリジョンエネルギー、デクラスタリングポテンシャル及びコリジョンセルエクジットポテンシャルを調整することによってさらに最適化した。ペプチドをＬＣ−ＳＲＭによって分析し、正確な保持時間を規定した。サンプルの分析に適用した最終ＳＲＭ法は、４５秒のＳＲＭスケジューリングウィンドウ、１秒のサイクル時間、＞２０ｍｓのドウェル時間／遷移及びＦＷＨＭで５〜１０のデータ点を有していた。
【０２６３】
サンプルを３３３．３３μＬの３％  ＡＣＮ／０．２％ギ酸に再懸濁した。各個々の分析のために、１００μｌをマイクロタイタープレートウェルに分注し、凍結乾燥した。すべてのサンプルを３連で処理した（分析的反復）。分析の直前に、サンプルを２５μｌの重いＴＭＴで標識されたペプチド（５ｆｍｏｌｅｓ／μｌ；カラム上で１００ｆｍ）に再懸濁した。この濃度のサンプルによって、標的分析物の良好な検出が確実となり、その後の実施に採用される持ち越しはなかった。サンプル（２３μｌ）を、フルループ注入を使用してカラム上に注入した（図１）。プールされた血漿サンプルを、２５μｌの軽いＴＭＴ及び重いＴＭＴで標識されたペプチド（５ｆｍｏｌｅｓ／μｌ；カラム上で１００ｆｍで一定の軽いＴＭＴペプチド及びカラム上で１〜６０００ｆｍで変動する重いＴＭＴペプチド）を用いて再懸濁することによって、１２点較正曲線を作製した。
【０２６４】
実験サンプルを、６０種のサンプルの３つの連続セットで分析し、３種の分析的反復を提供した。６０種の各セットにおいて、実行命令をシャッフルし、実行時間及び実行命令バイアスを排除して、特定のサンプルが、２回、同一サンプルに先行及び後続しないことを確実にした。較正曲線を、６０種のサンプルのセットを実行する直前に実行し、全サンプルセットが完了した後に２つの追加の曲線を実行した（合わせて５）。サンプルセットの分析の前に、システムチェックを受け、ＭＳ及びＬＣが最適感度、質量正確度、較正及びイオン安定性で実施されることを確実にした。サンプルセットの分析の間に、ＬＣ−ＳＲＭ性能が維持されることを確実にするよう参照サンプルを複数回獲得した。
【０２６５】
２．６．ＳＲＭデータ処理
ＳＲＭを、分析者の定量化ウィザード（Applied Biosystems社製）によって可視化した。すべてのピークのマッチングを目視で確認し、ピーク面積をMicrosoft Excelにエクスポートした。バックグラウンドシグナルに由来する不良なピーク定義がある場合には遷移を排除した。軽く標識された遷移各々（品質管理のための実験的血漿サンプル又はプールされた血漿サンプル）のピーク面積を、対応する重く標識された遷移（合成ペプチド；参照サンプル）のピーク面積に対して測定した。各遷移対のこれらの比（Ｌ／Ｈ）が定量的分析に進められた。
【０２６６】
２．７．統計分析
実験設計は、消化内に入れ子になったペプチド内に入れ子になった遷移を含む階層的（入れ子）であり、各消化に対して３回の反復測定値がとられた。本発明者らは、階層中のすべての因子に起因する分散を考慮しながら９５％信頼区間の現実的評価を与える、分析するためのアプローチを選択した。３元分散分析を使用して、変動の種々の供給源を分離し、推定し、次いで、これらを再び組み合わせて、平均の分散の推定値を得た。平均分散を使用して、標準誤差を推定し、これを、ｔ−分布から得た値と一緒にして使用して、総平均の周りの９５％信頼区間を推定した。
【０２６７】
ゲルゾリン測定値は、対応するＷＢサンプル測定値と比較すると、各サンプル中の各ゲルゾリンペプチド（Ｌ／Ｈ比）のスピアマン係数を算出することによってＷＢ結果と相関していた。
【０２６８】
３．結果
表は、疾患（ＡＤ）及び対照（ＣＴＬ）サンプルのＷＢによって決定されたゲルゾリンレベルを示す。ＴＭＴ−ＳＲＭによって相違を検出する最良の機会を与えるよう、高及び低ゲルゾリンレベルを具体的に選択した。各群の平均値から、対照と比較して、ＡＤにおいてゲルゾリンレベルの約４倍の低下があることがわかった。
【０２６９】
【表３】
0005755149.tif 000004
【０２７０】
３．１定量化において不正確さをもたらし得る遷移及びペプチドの除去
遷移が不良なピーク検出を有していた場合又は高い血漿バックグラウンドを有していた場合、それらをデータ分析から除去した（図２）。さらに、サンプルの大部分において内因性検出が不良であった（ペプチド３、６、１１及び２７）又は、すべてのサンプル中のすべての測定値について高い分散が観察された（ペプチド１８）ので、４種のペプチドを分析から除去した。したがって、定量化のために１７種のペプチドが残り、タンパク質あたり、少なくとも２種のペプチドを有していた。
【０２７１】
３．２  ゲルゾリンのＴＭＴ  ＳＲＭ及びＷＢ結果に対する比較
本方法に４種のゲルゾリンペプチドがもともと含まれていた（ペプチド２７、２９、３０及び３１）。ペプチド２７は、不良なピーク検出を有しており、そのためデータ分析から除去された。残りの３種のペプチドは同様に機能し、対照サンプルと比較して、ＡＤにおいて約３０％のゲルゾリンレベルの低下を示した（図１７参照のこと）。これは、ＷＢ結果及び発見演習と一致している。ＴＭＴ  ＳＲＭ及びＷＢプラットフォームを比較するためにスピアマン計算すると、対応するＷＢサンプル測定値と比較して、各サンプル中の各ゲルゾリンペプチドについて極めて高い相関（０．６５〜０．７３；表２）が観察された：
【０２７２】
【表４】
0005755149.tif 000005
【０２７３】
３．３残りのペプチドのＴＭＴ  ＳＲＭ
３．３．１  クラステリン
合わせて４種のペプチドから、２種のクラステリンペプチド（ペプチド３及び６）が、不良なピーク検出のためにデータ分析から除去された。２種の残りのペプチドは、クラステリンα鎖（ペプチド１）及びβ鎖（ペプチド５）の両方に及ぶ。両ペプチドは、ＡＤ及び対照サンプル間で有意な変化を示さず（図１０参照のこと）、これは、これまでの確認研究と一致する。
【０２７４】
３．３．２補体ｃ３
２種の補体ｃ３ペプチド（ペプチド８及び９）は、対照対象と比較して、ＡＤにおいて同様の増大を示した（図１１参照のこと）。この増大は、これまでの発見演習と一致する。
【０２７５】
３．３．３  補体因子Ｈ
ＣＦＨペプチド（ペプチド１１）のうち１種は、不良なピーク検出を有しており、データ分析から除去した。２種の残りのペプチド（ペプチド１２及び１３）は、対照対象と比較してＡＤにおいて同様の増大を示した（図１４参照のこと）。この増大は、これまでの発見演習と一致する。
【０２７６】
３．３．４  α−２−マクログロブリン
２種のＡ２Ｍペプチド（１４及び１５）は同様に機能し、ＡＤ及び対照対象間で有意な変化を示さなかった。これまでの発見演習は、対照と比較して、ＡＤにおいてＡ２Ｍの増大を示した（図１５参照のこと）。
【０２７７】
３．３．５  γ−フィブリノゲン
すべてのサンプル中のすべての測定値について、１種のペプチド（ペプチド１８）で高分散が観察され、そのため、データ分析から除去した。γ−フィブリノゲンペプチド１９及び２０は両方とも、対照と比較してＡＤの増大を示し（図１２参照のこと）、これは、発見結果と一致している。
【０２７８】
３．３．６  血清アミロイドＰ成分
２種のＳＡＰペプチド（ペプチド２２及び２３）は、対照対象と比較してＡＤにおいて同様の増大を示した（図１３参照のこと）。この増大は、発見結果と一致する。
【０２７９】
３．３．７  アポリポタンパク質Ｅ
２種のＡｐｏＥペプチド（２４及び２５）は同様に機能し、ＡＤ及び対照対象間に有意な変化がないことを示す（図１６参照のこと）。これは、文献に反映されており、多数のグループが、対照と比較して、ＡＤにおいてＡｐｏＥタンパク質レベルの変化がないことを示している。
【０２８０】
４．結論
結果は、ＡＤの候補バイオマーカーの相対定量化のためのツールとしてのＴＭＴ  ＳＲＭの性能を示す。不良なピーク検出を有していたペプチドを除去した結果、改善された統計値が得られた。同一タンパク質のペプチドは、ＡＤ及び対照サンプルにおいて同様の相違を示し、すべてのサンプル中で低い分散であった（９５％  ＣＩ）。大部分のペプチドのＡＤ及び対照サンプルの比較は、発見演習と一致していた。ゲルゾリンのＴＭＴ  ＳＲＭは、ＷＢ結果と高度に相関しているとわかった。これに続いて、各サンプル中の各ペプチドの内因性量を算出するために較正曲線が分析に組み込まれる。さらに、データセットを参照サンプルに対して正規化し、同一タンパク質のペプチドのＬ／Ｈ比において観察される相違を明らかにする。結果は、小さいサンプルセットの相対定量化のためのＴＭＴ  ＳＲＭの良好な性能を示す。より大きなコホートも、同様の方法で与えるよう定量化され得る。
【０２８１】
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Thompson A, Schafer J, Kuhn K, Kienle S, Schwarz J, Schmidt G, Neumann T, Johnstone R, Mohammed AK, Hamon C (Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical chemistry 75:1895-1904.2003)
Veerhuis R, Janssen I, Hoozemans JJ, De Groot CJ, Hack CE, Eikelenboom P (Complement C1-inhibitor expression in Alzheimer's disease. Acta neuropathologica 96:287-296.1998)
Yasojima K, McGeer EG, McGeer PL (Complement regulators C1 inhibitor and CD59 do not significantly inhibit complement activation in Alzheimer disease. Brain research 833:297-301.1999)
【０２８２】
上記の明細書に記載されるすべての刊行物は、本明細書において参照により組み込まれる。本発明の記載される態様及び実施形態の種々の改変及び変法は、本発明の範囲から逸脱することなく当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、特許請求される本発明は、このような特定の実施形態に過度に制限されるべきではないということは理解されるべきである。実際、当業者に明らかである、本発明を実施するための記載される様式の種々の改変は、以下の特許請求の範囲内にあるものとする。
【図１−１】
0005755149.tif 000006
【図１−２】
0005755149.tif 000007
【図２】
0005755149.tif 000008
【図３Ａ】
0005755149.tif 000009
【図３Ｂ】
0005755149.tif 000010
【図４】
0005755149.tif 000011
【図５】
0005755149.tif 000012
【図６】
0005755149.tif 000013
【図７】
0005755149.tif 000014
【図８】
0005755149.tif 000015
【図９】
0005755149.tif 000016
【図１０】
0005755149.tif 000017
【図１１】
0005755149.tif 000018
【図１２】
0005755149.tif 000019
【図１３】
0005755149.tif 000020
【図１４】
0005755149.tif 000021
【図１５】
0005755149.tif 000022
【図１６】
0005755149.tif 000023
【図１７】
0005755149.tif 000024
【図１８】
0005755149.tif 000025
【図１９Ａ】
0005755149.tif 000026
【図１９Ｂ】
0005755149.tif 000027
【図２０−１】
0005755149.tif 000028
【図２０−２】
0005755149.tif 000029
【図２０−３】
0005755149.tif 000030
【配列表】
0005755149000001.app