(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療または診断における使用のための組成物の製造における、ハプテンおよび標的タンパク質に対して特異的な二重特異性抗体の使用であって、ジゴキシゲニンに結合した核酸が標的細胞または標的組織に送達され、該二重特異性抗体が、
（a）（i）SEQ ID NO.3、変異S49A、I57A、およびA60Pを有するSEQ ID NO.3、またはSEQ ID NO.2より選択される重鎖可変ドメイン、および
（ii）SEQ ID NO.5またはSEQ ID NO.1より選択される軽鎖可変ドメイン
を含む、ジゴキシゲニンに結合する第1の抗原結合部位；ならびに
（b）標的タンパク質に結合する第2の抗原結合部位
を含む、前記使用。
【請求項２】
前記二重特異性抗体が、重鎖Fd断片(VHおよびCH1)としてSEQ.ID NO.4またはSEQ.ID NO.36、ならびにL鎖としてSEQ.ID NO.6またはSEQ.ID NO.37を含む、請求項1記載の使用。
【請求項３】
標的タンパク質が細胞表面抗原である、請求項1または2記載の使用。
【請求項４】
細胞表面抗原が腫瘍抗原である、請求項3記載の使用。
【請求項５】
標的タンパク質がHer2、IGF1R、CD22、CD33、LeY、VEGFR1、Her2(Lieberman)からなる群より選択される、請求項1または2記載の使用。
【請求項６】
核酸が治療剤または診断剤である、請求項1〜5のいずれか一項記載の使用。
【請求項７】
核酸が二本鎖RNAである、請求項1〜6のいずれか一項記載の使用。
【請求項８】
核酸がトランスフェクション試薬と結合体化される、請求項1〜7のいずれか一項記載の使用。
【請求項９】
トランスフェクション試薬がリポソームトランスフェクション試薬またはトランスフェクションペプチドである、請求項8記載の使用。
【請求項１０】
核酸がエンドソームエスケープモジュールまたはエンドソーム破壊モジュールとカップリングされる、請求項1〜9のいずれか一項記載の使用。
【請求項１１】
核酸が、エンドソームエスケープまたはエンドソーム破壊を媒介するペプチドとカップリングされる、請求項10記載の使用。
【請求項１２】
エンドソームエスケープモジュールまたはエンドソーム破壊モジュールが動的ポリ結合体(DPC)を含む、請求項10記載の使用。
【請求項１３】
標的細胞または標的組織に核酸を送達するための、ジゴキシゲニンおよび標的タンパク質に特異的な二重特異性抗体を含む、薬学的組成物であって、該二重特異性抗体が、
（a）（i）SEQ ID NO.3、変異S49A、I57A、およびA60Pを有するSEQ ID NO.3、またはSEQ ID NO.2より選択される重鎖可変ドメイン、および
（ii）SEQ ID NO.5またはSEQ ID NO.1より選択される軽鎖可変ドメイン
を含む、ジゴキシゲニンに結合する第1の抗原結合部位；ならびに
（b）標的タンパク質に結合する第2の抗原結合部位
を含み、かつジゴキシゲニン化した治療用核酸または診断用核酸とカップリングされる、前記薬学的組成物。
【請求項１４】
標的遺伝子療法のための製剤の製造における、請求項13記載の薬学的組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的タンパク質およびハプテンに対する二重特異性抗体および抗体断片、これらを生成するための方法、核酸を含む治療剤用または診断剤用の送達プラットフォームとしてのこれらの使用、前記抗体を含有する薬学的組成物、ならびにその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子薬は、標的細胞と特異的および効率的に相互作用する薬剤を必要とする。インビボで、機能的な治療剤または診断剤を標的組織または標的細胞に効率的に送達することは依然として創薬における最も大きな障害の1つである。1つのアプローチは、ペイロード(payload)と、細胞を特異的な標的とする送達ビヒクル、例えば、抗体とのカップリングである。ペイロードの特異的標的化を保証し、非特異的な全身放出を避けるために、良好な安定性を伴ってペイロードをカップリングしなければならない。しかしながら、細胞内に進入できるようにするために、ペイロードは理想的には標的細胞で、または標的細胞内で放出される。循環内での良好な安定性と標的における効果的な放出を組み合わせることは結合体開発における大きなボトルネックである。ほとんどの最新技術の結合体は1種類の特定の分子タイプからならず、様々な種類のペイロードが様々な位置でカップリングしている分子のカクテルである。これらの結合体の大きな欠点は、抗体ごとに、およびペイロードごとに結合体化手順を合わせる必要があることである。従って、ペイロードは簡単に交換することができず、共有結合によって免疫原性が引き起こされることもある。
【０００３】
近年になって多種多様な組換え抗体形式、例えば、融合、例えば、IgG抗体形式および単鎖ドメインの融合による四価二重特異性抗体(例えば、Coloma, M.J., et al., Nature Biotech 15(1997)159-163(非特許文献1);WO2001/077342(特許文献1);およびMorrison, S.L., Nature Biotech 25(2007)1233-1234(非特許文献2)を参照されたい)が開発されている。抗体コア構造(IgA、IgD、IgE、IgG、またはIgM)がもはや保たれていない他の新しいいくつかの形式、例えば、ダイアボディ、トリアボディ、またはテトラボディ、ミニボディ、いくつかの単鎖形式(scFv、Bis-scFv)も開発されており、これらは2種類以上の抗原を結合することができる(Holliger P, et al, Nature Biotech 23(2005)1126-1136(非特許文献3); Fischer N., Leger O., Pathobiology 74(2007)3-14(非特許文献4); Shen J, et al., Journal of Immunological Methods 318(2007)65-74(非特許文献5); Wu , C. et al., Nature Biotech. 25(2007)1290-1297(非特許文献6))。
【０００４】
二重特異性抗体は2種類の標的を同時に結合することができ、従って、多種多様なペイロードを標的組織または標的細胞に送達することもできる。現在までに、ある特定の細胞標的に特異的な二重特異性抗体が述べられている。しかしながら、診断用途および治療用途に望ましい全ての薬剤に対して抗体を作製する必要があるので、この方法論には大きな欠点がある。
【０００５】
US7'429'381(特許文献2)は、最初に、HSGハプテンおよび細胞表面タンパク質に特異的な二重特異性抗体が細胞に投与され、次いで、治療用カチオンもしくは診断用カチオンまたは治療剤もしくは診断剤とキレート化しているHSGハプテンを捕捉するために用いられる二段階プレターゲティング法を開示している。ハプテンは、タンパク質などの高分子とカップリングしなければ通常、免疫原性をもたない、殺虫剤、薬物、ホルモン、および毒素などの低分子である。しかしながら、二段階プレターゲティング法における二重特異性抗HSG-ハプテン抗体の使用には、いくつかの制限がある。
【０００６】
大きな欠点はこのアプローチが複雑なことであり、2種類の試薬の調製および投薬とその結果として生じるタイミングおよび比の問題が関与する。さらに、結果として得られた二重特異性抗体および治療剤または診断剤の複合体を分析することはできない。従って、薬理学的特性、化学量論、および二重特異性抗体によって捕捉される治療剤または診断剤の起こり得る分解産物を予測することは難しい。
【０００７】
さらに、現在用いられている結合体化は大部分の治療剤に適用することができない。なぜなら、多くの場合、結合体化によって治療剤の活性が低下または消失するか、抗体結合能の望ましくない変化が起こるからである。
【０００８】
従って、広範囲に適用可能な標的においてペイロードを効果的に放出する、詳細に明らかにされ、効率的で、かつ特異的な治療剤用および診断剤用の送達プラットフォームが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】WO2001/077342
【特許文献２】US7'429'381
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Coloma, M.J., et al., Nature Biotech 15(1997)159-163
【非特許文献２】Morrison, S.L., Nature Biotech 25(2007)1233-1234
【非特許文献３】Holliger P, et al, Nature Biotech 23(2005)1126-1136
【非特許文献４】Fischer N., Leger O., Pathobiology 74(2007)3-14
【非特許文献５】Shen J, et al., Journal of Immunological Methods 318(2007)65-74
【非特許文献６】Wu , C. et al., Nature Biotech. 25(2007)1290-1297
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、ハプテンおよび標的タンパク質に対して特異的な二重特異性抗体であって、ハプテンに結合する第1の抗原結合部位および標的タンパク質に結合する第2の抗原結合部位を含み、ハプテンは核酸と結合体化されている、二重特異性抗体に関する。好ましいハプテンはジゴキシゲニン、ビオチン、およびポリエチレングリコール(PEG)である。
【００１２】
本発明は、二重特異性抗体または抗体断片を生成するための方法、ならびにこれらを使用するための方法、特に、治療剤用および診断剤用の送達プラットフォームとしてのこれらの使用、ならびに前記抗体を含む薬学的組成物および診断用ツールを提供する。
【００１３】
好ましい態様は、ジゴキシゲニン(「Dig」または「DIG」と呼ぶ)に結合する第1の抗原結合部位および標的タンパク質に結合する第2の抗原結合部位を含む、標的タンパク質およびジゴキシゲニンに対する二重特異性抗体または抗体断片を含む。二重特異性抗体または抗体断片の前記結合部位を、それぞれ、「<標的タンパク質>」(または簡単に「<標的>」)および「<Dig>」と呼ぶ。
【００１４】
他の態様において、標的タンパク質およびジゴキシゲニンとは異なるハプテンに対する二重特異性抗体および抗体断片が想定される。好ましいハプテンはビオチンおよびPEGである。
【００１５】
標的タンパク質およびジゴキシゲニンに対する二重特異性抗体または抗体断片、ならびにこれらを使用するための方法、特に、送達プラットフォームとしてのこれらの適用について以下の態様が例示される。ジゴキシゲニンが本発明において想定される最も好ましいハプテンであるが、これらの態様はビオチンおよびPEGにも適用することができる。
【００１６】
さらに、本発明は、ジゴキシゲニンに結合する第1の抗原結合部位および標的タンパク質に結合する第2の抗原結合部位を含むモノクローナル二重特異性抗体および抗体断片、このような抗体および抗体断片をコードするDNA、ならびにDNAを発現するためのベクターに関する。好ましくは、前記二重特異性抗体はヒト化抗体およびキメラ抗体である。
【００１７】
本発明の1つの態様は、ジゴキシゲニンに結合する第1の抗原結合部位および標的タンパク質に結合する第2の抗原結合部位を含む、ジゴキシゲニンおよび標的タンパク質に結合する二重特異性抗体であって、
a)2つの完全長抗体重鎖および2つの完全長抗体軽鎖からなる単一特異性二価抗体であって、それぞれの鎖は可変ドメインを1つしか含まない、単一特異性二価抗体、
b)2つのペプチドリンカー、
c)2つの単一特異性一価単鎖抗体であって、それぞれが、抗体重鎖可変ドメイン、抗体軽鎖可変ドメイン、および前記抗体重鎖可変ドメインと前記抗体軽鎖可変ドメインとの間の単鎖リンカーからなる、2つの単一特異性一価単鎖抗体を含む、二重特異性抗体である。好ましくは、前記単鎖抗体は、単一特異性二価抗体重鎖の同じ末端(C末端およびN末端)、または単一特異性二価抗体軽鎖の同じ末端(好ましくは、C末端)と連結しており、より好ましくは、単一特異性二価抗体重鎖の同じ末端(C末端およびN末端)と連結している。
【００１８】
1つの態様において、a)の前記単一特異性二価親抗体は、ヒト抗体、好ましくは、組換えヒト抗体である。
【００１９】
好ましくは、b)の前記ペプチドリンカーは、長さが少なくとも10アミノ酸のアミノ酸配列を有するペプチドである。1つの態様において、前記ペプチドリンカーは(GxS)nであり、G=グリシン、S=セリン(x=3およびn=3、4、5、もしくは6)または(x=4およびn=2、3、4、もしくは5)、好ましくは、x=4およびn=2または3、より好ましくは、x=4、n=2である。
【００２０】
好ましくは、c)の前記単鎖リンカーは、長さが少なくとも15アミノ酸、より好ましくは、長さが少なくとも20アミノ酸のアミノ酸配列を有するペプチドである。1つの態様において、前記単鎖リンカーは(GxS)nであり、G=グリシン、S=セリン(x=3およびn=4、5、もしくは6)または(x=4およびn=3、4、もしくは5)、好ましくは、x=4、n=4または5、より好ましくはx=4、n=4である。
【００２１】
好ましくは、c)の前記2つの単一特異性一価単鎖抗体は、抗体重鎖可変ドメインSEQ ID NO.3、変異S49A、I57A、およびA60Pを有するSEQ ID NO 3、またはSEQ.ID NO.2、抗体軽鎖可変ドメインSEQ ID NO 5またはSEQ.ID NO.1、および前記抗体重鎖可変ドメインと前記抗体軽鎖可変ドメインとの間の単鎖リンカーを含む。好ましくは、c)の前記2つの単一特異性一価単鎖抗体は、重鎖Fd断片(VHおよびCH1)としてSEQ.ID NO.4またはSEQ.ID NO.36を含み、L鎖としてSEQ.ID NO.6を含む。
【００２２】
本発明の1つの態様において、本発明による二重特異性抗体は、DIGに特異的に結合する前記抗原結合部位が、重鎖可変ドメインとしてSEQ ID NO.3、変異S49A、I57A、およびA60Pを有するSEQ ID NO 3、またはSEQ.ID NO.2を含み、軽鎖可変ドメインとしてSEQ ID NO 5またはSEQ.ID NO.1を含むことを特徴とする。別の態様において、DIGに特異的に結合する前記抗原結合部位は、重鎖Fd断片(VHおよびCH1)としてSEQ.ID NO.4またはSEQ.ID NO.36を含み、L鎖としてSEQ.ID NO.6を含む。
[本発明1001]
ハプテンおよび標的タンパク質に対して特異的な二重特異性抗体であって、ハプテンに結合する第1の抗原結合部位および標的タンパク質に結合する第2の抗原結合部位を含み、ハプテンは核酸と結合体化される、二重特異性抗体。
[本発明1002]
ハプテンがビオチンおよびポリエチレングリコール(PEG)からなる群より選択される、本発明1001の二重特異性抗体。
[本発明1003]
ハプテンがジゴキシゲニンである、本発明1002の二重特異性抗体。
[本発明1004]
a)2つの完全長抗体重鎖および2つの完全長抗体軽鎖からなる単一特異性二価抗体であって、それぞれの鎖は可変ドメインを1つしか含まない、単一特異性二価抗体、
b)2つのペプチドリンカー、
c)2つの単一特異性一価単鎖抗体であって、それぞれが、抗体重鎖可変ドメイン、抗体軽鎖可変ドメイン、および該抗体重鎖可変ドメインと該抗体軽鎖可変ドメインとの間の単鎖リンカーからなる、2つの単一特異性一価単鎖抗体
を含む、本発明1001〜1003のいずれかの二重特異性抗体。
[本発明1005]
DIGに特異的に結合する抗原結合部位が、SEQ ID NO.3、変異S49A、I57A、およびA60Pを有するSEQ ID NO 3、またはSEQ.ID NO.2より選択される重鎖可変ドメイン、ならびにSEQ ID NO 5またはSEQ.ID NO.1より選択される軽鎖可変ドメインを含む、本発明1003または1004の二重特異性抗体。
[本発明1006]
DIGに特異的に結合する抗原結合部位が、重鎖Fd断片(VHおよびCH1)としてSEQ.ID NO.4またはSEQ.ID NO.36、ならびにL鎖としてSEQ.ID NO.6またはSEQ.ID NO.37を含む、本発明1003〜1005の二重特異性抗体。
[本発明1007]
抗体がヒト化されている、本発明1001〜1006のいずれかの二重特異性抗体。
[本発明1008]
標的タンパク質が細胞表面抗原である、本発明1001〜1007のいずれかの二重特異性抗体。
[本発明1009]
細胞表面抗原が腫瘍抗原である、本発明1008の二重特異性抗体。
[本発明1010]
標的タンパク質がHer2、IGF1R、CD22、CD33、LeY、VEGFR1、Her2(Lieberman)からなる群より選択される、本発明1001〜1008のいずれかの二重特異性抗体。
[本発明1011]
核酸が治療剤または診断剤である、本発明1001〜1010のいずれかの二重特異性抗体。
[本発明1012]
核酸が二本鎖RNAである、本発明1001〜1011のいずれかの二重特異性抗体。
[本発明1013]
核酸がトランスフェクション試薬と結合体化される、本発明1001〜1012のいずれかの二重特異性抗体。
[本発明1014]
トランスフェクション試薬がリポソームトランスフェクション試薬またはトランスフェクションペプチドである、本発明1013の二重特異性抗体。
[本発明1015]
核酸がエンドソームエスケープモジュールまたはエンドソーム破壊モジュールとカップリングされる、本発明1001〜1014のいずれかの二重特異性抗体。
[本発明1016]
核酸が、エンドソームエスケープまたはエンドソーム破壊を媒介するペプチドとカップリングされる、本発明1015の二重特異性抗体。
[本発明1017]
エンドソームエスケープモジュールまたはエンドソーム破壊モジュールが動的ポリ結合体(DPC)を含む、本発明1015の二重特異性抗体。
[本発明1018]
標的細胞または標的組織に核酸を送達するための、本発明1001〜1017のいずれかの二重特異性抗体の使用。
[本発明1019]
標的遺伝子療法のための本発明1001〜1018のいずれかの二重特異性抗体の使用。
[本発明1020]
ジゴキシゲニン化した治療用核酸または診断用核酸とカップリングされた本発明1001〜1019のいずれかの二重特異性抗体を含む、薬学的組成物。
[本発明1021]
標的遺伝子療法における本発明1020の薬学的組成物の使用。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書で使用する「変異」という用語は、本発明による抗体のCDRおよび/または可変領域における1つまたは複数のアミノ酸置換を指す。「変異S49A、I57A、およびA60Pを有する」という用語は、SEQ ID NO.3の重鎖可変ドメインにおける3つの置換に関する(Kabatに準じたナンバリング)。
【００２４】
さらに、好ましくは、前記単鎖抗体はジスルフィドが安定化されている。単鎖抗体のこのようなさらなるジスルフィド安定化は、単鎖抗体の可変ドメインの間にジスルフィド結合を導入することによって達成され、例えば、WO 94/029350, Rajagopal, V., et al., Prot. Engin. Vol. 10(12)1453-59(1997); Kobayashi, H., et al., Nuclear Medicine & Biology, Vol. 25, 387-393(1998);またはSchmidt, M., et al., Oncogene 18, 1711-1721(1999)に記載されている。
【００２５】
さらなる態様において、本発明の抗体は、少なくとも、ジゴキシゲニンに結合することができる単鎖可変断片(scFv)を含む、ヒト化ジゴキシゲニン結合モジュールを含む。前記scFvは、好ましくは、リンカーによって繋ぎ止められた1本のヒト化VL鎖および1本のヒト化VH鎖を含む。別の態様において、前記抗体は、2つまたは3つの定常ドメインをもたらす2本の重鎖からなるFc領域をさらに含む。
【００２６】
好ましい態様において、本発明の二重特異性抗体は、標的タンパク質に結合する完全長抗体に基づく構造を含み、これにペプチドリンカーを介して、ジゴキシゲニンに結合する2つの(任意で、ジスルフィドが安定化されている)単鎖可変断片(scFv)が連結されている。さらなる態様において、前記抗体は、2つのジゴキシゲニン結合部位を有するヒト化IgGを含む。
【００２７】
ジゴキシゲニン結合モジュールは様々な形式で細胞標的化実体と接続することができる。例えば、このために、FabまたはFvなどの「古典的な」抗体断片および抗体由来モジュールだけでなく、文献に以前に記載されている単一ドメイン抗体様実体も適用することができる。H鎖とのC末端融合に加えて、実施例に記載したさらなる形式が本発明の一部である。
【００２８】
本発明の1つの態様において、前記標的タンパク質は細胞表面抗原または細胞内抗原であり、好ましくは、前記標的タンパク質は細胞表面腫瘍関連抗原または細胞内腫瘍関連抗原である。
【００２９】
1つの好ましい態様において、前記二重特異性抗体は、ジゴキシゲニンに結合する第1の抗原結合部位およびHer2に結合する第2の抗原結合部位を含む。好ましくは、Her2およびジゴキシゲニンに特異的に結合する前記二重特異性抗体は、SEQ.ID NO.7またはSEQ.ID NO.8の重鎖 およびSEQ.ID NO.9の軽鎖を含む。
【００３０】
1つの好ましい態様において、前記二重特異性抗体は、ジゴキシゲニンに結合する第1の抗原結合部位およびIGF1Rに結合する第2の抗原結合部位を含む。好ましくは、IGF1Rおよびジゴキシゲニンに特異的に結合する前記二重特異性抗体は、SEQ.ID NO.10またはSEQ.ID NO.11の重鎖およびSEQ.ID NO.12の軽鎖を含む。
【００３１】
1つの好ましい態様において、前記二重特異性抗体は、ジゴキシゲニンに結合する第1の抗原結合部位およびCD22に結合する第2の抗原結合部位を含む。好ましくは、CD22およびジゴキシゲニンに特異的に結合する前記二重特異性抗体は、SEQ.ID NO.13または55の重鎖およびSEQ.ID NO.14または56の軽鎖を含む。
【００３２】
1つの好ましい態様において、前記二重特異性抗体は、ジゴキシゲニンに結合する第1の抗原結合部位およびCD33に結合する第2の抗原結合部位を含む。好ましくは、CD33およびジゴキシゲニンに特異的に結合する前記二重特異性抗体は、SEQ.ID NO.59の重鎖およびSEQ.ID NO.60の軽鎖を含む。
【００３３】
1つの好ましい態様において、前記二重特異性抗体は、ジゴキシゲニンに結合する第1の抗原結合部位およびVEGFR1に結合する第2の抗原結合部位を含む。好ましくは、VEGFR1およびジゴキシゲニンに特異的に結合する前記二重特異性抗体は、SEQ.ID NO.51の重鎖およびSEQ.ID NO.52の軽鎖を含む。
【００３４】
1つの好ましい態様において、前記二重特異性抗体は、ジゴキシゲニンに結合する第1の抗原結合部位およびHer2(Lieberman)に結合する第2の抗原結合部位を含む。好ましくは、Her2(Lieberman)およびジゴキシゲニンに特異的に結合する前記二重特異性抗体は、SEQ.ID NO.53の重鎖およびSEQ.ID NO.54の軽鎖を含む。
【００３５】
1つの好ましい態様において、前記二重特異性抗体は、ジゴキシゲニンに結合する第1の抗原結合部位およびLeYに結合する第2の抗原結合部位を含む。好ましくは、LeYおよびジゴキシゲニンに特異的に結合する前記二重特異性抗体は、SEQ.ID NO.57の重鎖およびSEQ.ID NO.58の軽鎖を含む。
【００３６】
本発明の1つの好ましい態様において、前記二重特異性抗体は、治療剤用または診断剤用のペイロード送達ビヒクルとして用いられる。治療剤または診断剤はジゴキシゲニンと結合体化され、従って、本発明の二重特異性抗体の抗原結合部位とカップリングする。この複合体は規定されており、安定であり、ペイロードを標的細胞または標的組織に特異的に送達する。ジゴキシゲニン化治療剤または診断剤は非共有結合によって二重特異性抗体とカップリングするので、ペイロードは循環中には、その送達ビヒクルに安定結合しているが、内部移行後には効率的に放出される。ジゴキシゲニンと結合体化しても、ほとんどの治療剤または診断剤の活性は影響を受けない。二重特異性抗体は、普通にはない、共有結合による付加を含有せず、従って、免疫原性のリスクを無くす。従って、この簡単な結合体化手順は、多種多様なペイロード分子;例えば、下記の具体的な態様および例の説明において詳述されるようなペプチド、タンパク質、低分子、画像化試薬、および核酸と1種類のみの抗体の組み合わせに使用することができる。ジゴキシゲニン化された診断剤または治療剤と、Dig結合モジュールを含有する二重特異性抗体誘導体の複合体は、温和な生物物理学的挙動および改善したPKパラメータを診断剤または治療剤、例えば、診断用または治療用のタンパク質、ペプチド、または低分子に付与し得る。さらに、このような複合体は、二重特異性抗体変種によって認識される抗原を示す細胞に送達ロードを標的化することができる。
【００３７】
ジゴキシゲニン化した治療用ペイロード分子または診断用ペイロード分子の運命は、一般的に用いられるジゴキシゲニン特異的診断剤を用いて、例えば、ジゴキシン検出およびジゴキシン過量治療のためのTina-quant Digoxin法(Roche/Hitachi, No.12218623001およびUS#7100001)などのアッセイを用いて患者において容易にモニタリングすることができる。遊離ジゴキシゲニン、または二重特異性抗体とカップリングされた過量のジゴキシゲニン化治療用ペイロード分子もしくはジゴキシゲニン化診断用ペイロード分子は、臨床認可されたポリクローナル抗ジゴキシゲニン抗体によって取り除くことができる(このような抗体は、例えば、前述のアッセイに含まれている)。
【００３８】
1つの態様において、ペイロードが細胞特異的に送達された後に、二重特異性抗体はインビボで再装填(recharge)される。
【００３９】
好ましい態様において、二重特異性抗体は、ジゴキシゲニンに特異的な第1の抗原結合部位、および細胞表面腫瘍関連抗原または細胞内腫瘍関連抗原に特異的に結合する第2の抗原結合部位を含む。従って、治療剤または診断剤が装填されている二重特異性抗体は、標的細胞または標的組織、好ましくは、腫瘍に特異的に送達される。
【００４０】
標的細胞/標的組織に特異的な送達プラットフォームとしての二重特異性抗体の前述の使用は、多種多様なペイロード、特に、下記で詳述するペイロードに適用することができる。
【００４１】
1つの態様において、前記二重特異性抗体は、治療用および/または診断用のペプチドまたはタンパク質のためのペイロード送達ビヒクルとして用いられる。ペプチド性ペイロードまたはタンパク質性ペイロードのカップリングによって、癌療法における抗体、例えば、毒素結合体の治療効力を高めることができる。治療用および/または診断用のペプチドまたはタンパク質はジゴキシゲニンと結合体化され、それによって、抗体-ハプテン相互作用を介して前記の二重特異性抗体にカップリングされる。この規定され、かつ安定な複合体は、ペプチドペイロードまたはタンパク質ペイロードを標的細胞または標的組織に特異的に送達し、次いで、ペプチドペイロードまたはタンパク質ペイロードは標的細胞内に放出される。
【００４２】
1つの好ましい態様において、ジゴキシゲニン化ペプチドまたはジゴキシゲニン化タンパク質は、ジゴキシゲニンに特異的な第1の抗原結合部位、および標的タンパク質、好ましくは、細胞表面抗原または細胞内抗原に特異的な第2の抗原結合部位を有する二重特異性抗体にカップリングされる。好ましくは、前記の細胞表面抗原または細胞内抗原は腫瘍関連抗原である。1つの好ましい態様において、これらの複合体は1つのヒト化<標的タンパク質>-<Dig>IgGからなり、このヒト化<標的タンパク質>-<Dig>IgGは、2つの高親和性Dig結合部位において2つのジゴキシゲニン化ペプチドが結合する(部位ごとに1つのジゴキシゲニン化ペプチドが結合する)。このペプチドは、ジゴキシゲニン化されているのにもかかわらず、ならびに抗体と複合体化している間に良好な生物学的活性を保持している。さらに、ジゴキシゲニン化ペプチドが取り付けられることによって、本発明の二重特異性抗体の特異性および活性は影響を受けない。二重特異性抗体誘導体の細胞表面標的結合部位は、複合体化したジゴキシゲニン化ペプチドの存在下で、その結合特異性および親和性を保持している。好ましくは、前記標的タンパク質はHer2である。別の好ましい態様において、前記標的タンパク質はIGFR1である。別の好ましい態様において、前記標的タンパク質はCD22である。
【００４３】
ジゴキシゲニン化されたペプチドまたはタンパク質と本発明の二重特異性抗体が結合しても、ペプチドまたはタンパク質はその完全な生物学的活性を保持している。驚いたことに、本発明の組換えヒト化二重特異性抗体および抗体断片は治療用ペプチドのPKおよび安定性を改善することが見出された。
【００４４】
好ましいジゴキシゲニン化ペプチドの非限定的な例は、Dig-メリチン、Dig-Fam5B、Dig-INF7、Dig-FallV1、およびDigFallV2である。
【００４５】
本発明の1つの局面において、二重特異性抗体は、細胞傷害性ペプチドを抗原発現腫瘍細胞に送達するのに用いられる。従って、本発明は、標的癌療法のための特異的な送達プラットフォームを提供する。
【００４６】
1つの好ましい態様において、二重特異性抗体は、治療用低分子または診断用低分子のためのペイロード送達ビヒクルとして用いられる。1つの好ましい態様において、これらの複合体は1つのヒト化<標的タンパク質>-<Dig>IgGからなり、このヒト化<標的タンパク質>-<Dig>IgGは、2つの高親和性Dig結合部位において2つのジゴキシゲニン化化合物が結合する(部位ごとに1つのジゴキシゲニン化化合物が結合する)。化合物は、ジゴキシゲニン化されているのにもかかわらず、ならびに抗体と複合体化している間に良好な生物学的活性を保持している。二重特異性抗体誘導体の細胞表面標的結合部位は、複合体化したDig化合物の存在下で、その結合特異性および親和性を保持している。
【００４７】
1つの好ましい態様において、ジゴキシゲニン化低分子は二重特異性<標的タンパク質>-<Dig>抗体誘導体にカップリングされる。これによって、標的細胞内でペイロードを放出する、既定された安定した分子複合体が作製される。
【００４８】
1つの好ましい態様において、前記低分子はジゴキシゲニン化され、ジゴキシゲニンに結合する第1の抗原結合部位および標的タンパク質に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体にカップリングされる。好ましくは、前記標的タンパク質は腫瘍細胞マーカーである。1つの好ましい態様において、前記標的タンパク質はHer2である。別の好ましい態様において、前記標的タンパク質はIGF1Rである。さらに別の好ましい態様において、前記標的タンパク質はCD22である。
【００４９】
1つの好ましい態様において、前記二重特異性抗体は、ジゴキシゲニン化細胞傷害性分子のためのペイロード送達ビヒクルとして用いられる。従って、好ましくは、前記細胞傷害性分子は抗原発現腫瘍細胞に特異的に送達される。従って、本発明は、標的癌療法のための特異的な送達プラットフォームを提供する。
【００５０】
1つの好ましい態様において、二重特異性抗体は、ジゴキシゲニン化低分子に取り付けられたジゴキシゲニン化放射性同位体用のペイロード送達体として用いられる。従って、本発明は、放射線療法のための特異的な送達プラットフォームを提供する。ジゴキシゲニン化低分子に取り付けられたジゴキシゲニン化放射性同位体は効果的な組織浸透、迅速なクリアランスを示し、<標的>-<Dig>二重特異性抗体によって覆われた細胞(標的組織/標的腫瘍)にしか保持されない。これにより特異的な標的化が可能になり、治療用放射性同位体の非特異的な全身放出が避けられる。1つの好ましい態様において、標的細胞または標的組織に結合した二重特異性抗体には、インビボで、ジゴキシゲニン化低分子に取り付けられたジゴキシゲニン化放射性同位体が「再装填」される。1つの好ましい態様において、本発明の二重特異性抗体は、罹患組織への、ジゴキシゲニン化低分子に取り付けられたジゴキシゲニン化放射性同位体の送達に用いられる。好ましくは、前記の罹患組織は腫瘍である。
【００５１】
1つの好ましい態様において、二重特異性抗体は、画像化試薬用のペイロード送達ビヒクルとして用いられる。画像化のために、良好な組織浸透ならびに良好な組織標的化を必要とする良好なシグナル対バックグラウンド比が望ましい。抗体は良好な安定性および良好な標的化を示すが、中等度の組織浸透しか示さない。これらの欠点は現在は克服されている。
【００５２】
好ましい態様において、標的抗原を有する組織または細胞を特異的に画像化するために、ジゴキシゲニン化蛍光基質と、組換えDig結合モジュールを含有する二重特異性抗体誘導体との複合体が適用される。好ましい態様において、これらの組織または細胞はインビボで画像化される。これらの複合体は1つのヒト化<標的>-<Dig>IgGからなり、このヒト化<標的>-<Dig>IgGは、2つの高親和性Dig結合部位において、画像化技術によって視覚化可能な2つのジゴキシゲニン化基質が結合する(部位ごとに1つのジゴキシゲニン化基質が結合する)。1つの好ましい態様において、画像化化合物はフルオロフォアである。別の好ましい態様において、前記画像化化合物は放射性標識化合物である。画像化化合物は、ジゴキシゲニン化されているのにもかかわらず、ならびに抗体と複合体化している間にその特性を保持している。1つの好ましい態様において、前記画像化化合物はCy5である。二重特異性抗体誘導体の細胞表面標的結合部位は、複合体化したDig化合物の存在下で、その結合特異性および親和性を保持している。1つの好ましい態様において、前記二重特異性抗体は、ジゴキシゲニンに結合する第1の抗原結合部位および標的タンパク質に結合する第2の抗原結合部位を含む。好ましくは、前記標的タンパク質は腫瘍細胞マーカーである。1つの好ましい態様において、前記標的タンパク質はHer2である。別の好ましい態様において、前記標的タンパク質はIGF1Rである。さらに別の好ましい態様において、前記標的タンパク質はCD22である。
【００５３】
ジゴキシゲニン化された画像化化合物は効果的な組織浸透、迅速なクリアランスを示し、<標的>-<Dig>二重特異性抗体によって覆われた細胞(標的組織/標的腫瘍)にしか保持されない。これにより、効果的な時間分解画像化および腫瘍血管新生または腫瘍血管新生の変化の評価が可能になる。1つの好ましい態様において、標的細胞または標的組織に結合した二重特異性抗体には、インビボでジゴキシゲニン化色素が「再装填」される。1つの好ましい態様において、本発明の二重特異性抗体は罹患組織の画像化に用いられる。好ましくは、前記の罹患組織は腫瘍である。
【００５４】
標的組織および標的細胞への、ならびに標的組織内および標的細胞内への核酸の特異的な標的化および送達は、現在の技術では満足に解決されていない主要なボトルネックである。今までに述べられた大部分の核酸送達実体は1種類の規定された分子からならず、分子または粒子のカクテルである。しかしながら、治療用途のためには、均一の規定された実体が望ましい。ある例では、抗体または抗体断片を介した核酸送達が示されているが(例えば、Lieberman et al, Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors, Nature Biotechnology [1087-0156] Song yr:2005 vol:23 pg:709)、重大な技術的障害に直面している。特に興味の対象となるのは、標的組織および標的細胞への、ならびに標的組織内および標的細胞内への二本鎖RNA分子(dsRNA)の特異的な標的化および送達である。二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子は、RNA干渉(RNAi)として知られる高度に保存された調節機構において遺伝子発現をブロックすることが示されている。特異的な標的化を保証し、非特異的な全身放出を避けるために、dsRNAと抗体を良好な安定性で結合体化することができる。他方で、細胞内に進入できるようにするために、dsRNAを標的細胞でまたは標的細胞内で放出されなければならない。標的dsRNAはエンドソーム内に頻繁に蓄積し、活性になるためにはエンドソームから逃げ出す必要がある。しかしながら、標的dsRNAのための効果的な無毒で非免疫原性のエンドソームエスケープ機構を発見しななければならない。
【００５５】
これらの欠点は現在は、核酸用のペイロード送達ビヒクルとして本発明の二重特異性抗体を用いて克服されている。従って、本発明は、標的遺伝子療法および標的RNAi送達のための特異的な送達プラットフォームを提供する。
【００５６】
1つの好ましい態様において、核酸を抗原発現細胞に特異的に標的化するために、ジゴキシゲニン化核酸と、組換えDig結合モジュールを含有する二重特異性抗体誘導体の複合体が適用される。このような複合体は、ペプチドを、二重特異性抗体変種によって認識される抗原を示す細胞に標的化することができる。これらの複合体は1つのヒト化<標的>-<Dig>IgGからなり、このヒト化<標的>-<Dig>IgGは、2つの高親和性Dig結合部位において2つの(部位ごとに1つの)ジゴキシゲニン化核酸が結合する。核酸は、ジゴキシゲニン化されているのにもかかわらず、ならびに抗体と複合体化している間にその機能を保持している。さらに、二重特異性抗体誘導体の細胞表面標的結合部位は、複合体化したジゴキシゲニン化核酸の存在下で、その結合特異性および親和性を保持している。好ましくは、標的抗原を発現する細胞に核酸を特異的に標的化するために、ジゴキシゲニン化核酸と二重特異性<標的>-<DIG>抗体変種の複合体を適用することができる。それによって、表面抗原によって認識される細胞は核酸によって選択的に扱われ、従って、抗原発現細胞において、核酸によって引き起こされる活性(例えば、RNAiまたは核酸を介した細胞傷害性)が増大する。1つの態様において、これらの活性は、標的化エンドソーム調節剤をさらに適用することによってさらに増大する。好ましくは、核酸は抗原発現細胞に特異的に送達されるだけでなく、標的細胞の内部に取り入れられる。ジゴキシゲニン化核酸は非共有結合によって本発明の二重特異性抗体とカップリングされるので、内部移行後にペイロード(すなわち、核酸)は放出される。好ましい態様において、このような標的抗原は腫瘍細胞マーカーである。1つの好ましい態様において、前記標的抗原はHer2である。別の好ましい態様において、前記標的抗原はIGF1Rである。さらに別の好ましい態様において、前記標的抗原はCD22である。
【００５７】
好ましい態様において、核酸はDNAであり、別の好ましい態様において、前記核酸はdsRNAである。1つの好ましい態様において、前記二本鎖RNAは標的遺伝子の発現阻害に用いられる。
【００５８】
ジゴキシゲニンを核酸にカップリングするための方法およびこれらを特徴付けるための分析方法は本発明の一部である。
【００５９】
これらの活性(例えば、siRNAによるmRNAの特異的破壊)を媒介するために、治療用核酸または診断用核酸は標的細胞の細胞質に進入しなければならない。特異的な核酸活性を送達するための重要な要因の1つは、分子が細胞に送達されるだけでなく、十分な量の核酸がこれらの細胞の細胞質に導入されなければならないことである。このために、これらの分子は少なくとも1回、生体膜に浸透しなければならない。生物製剤は容易に膜を通過しないので、このプロセスは、効果的な核酸活性送達のために克服しなければならないボトルネックである。このボトルネックを克服する手段は、膜浸透、膜を通過するタンパク質移動、または膜破壊プロセスが関与し得るエンドソームエスケープ機構もしくは小胞エスケープ(vesicular-escape)機構でもよい。
【００６０】
1つの好ましい態様において、本発明の二重特異性抗体は、エンドソーム機能モジュレーターまたはエンドソームエスケープ/破壊モジュールと連結している核酸のペイロード送達モジュールとして用いられる。好ましくは、前記エンドソームエスケープモジュールはペプチドを含む。
【００６１】
1つの好ましい態様において、このようなエンドソームエスケープモジュールは、動的ポリ結合体(Dynamic Poly Conjugate)(DPC)を含む。DPCは、細胞に結合し、内部移行するとsiRNAのエンドソームエスケープを引き起こす化学的実体である(Rozema DB et. al., Dynamic PolyConjugates for targeted in vivo delivery of siRNA to hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America; 2007 Aug 7;104(32):12982-7 PMID:17652171)。このようなDPCはPBAVE(ブチル-アミノビニルエーテルポリマー)スキャフォールドからなり、PBAVEには、PEG分子が二官能性マレアマート結合を用いて可逆的に取り付けられている。後者の場合、カルボキシル化ジメチルマレイン酸(CDM)を適用することができる。PEG単位は、PBAVEのエンドソーム溶解性正電荷を保護するために用いられる。PBAVEには、(例えば、可逆的なジスルフィド結合を介して)siRNAカーゴも連結される。siRNA、保護基(およびさらなる標的化リガンド)が可逆的にポリマーと結合体化されるので、結果として生じる送達ビヒクルはsiRNA動的ポリ結合体と呼ばれる。siRNAを細胞質に送達する、このようなDPCのエンドソーム溶解性は、その化学的環境によって誘導される。すなわち、成熟中のエンドリソーム(endolysome)の中でのpH低下によってCDM-PEGの放出が誘導され、PBAVEの正電荷が曝露されることによって、エンドソーム溶解が媒介される。
【００６２】
従って、1つの好ましい態様において、DPCのエンドソーム溶解性と二重特異性ジゴキシゲニン送達系の特異的標的性が組み合わされる。好ましくは、これらの複合体は1つのヒト化<標的>-<Dig>IgGからなり、このヒト化<標的>-<Dig>IgGは、2つの高親和性Dig結合部位において2つの(部位ごとに1つの)DPC結合体化ジゴキシゲニン化核酸が結合する。
【００６３】
1つの態様において、ジゴキシゲニン化核酸と複合体化した二重特異性抗体は画像化分析に用いられる。この態様において、核酸は、ジゴキシゲニンおよび検出可能な標識によって同時に標識される。それによって、顕微鏡観察または他の画像化技術によって、抗原発現細胞に標的化された核酸の局在を視覚化することができる。好ましくは、前記検出可能な標識は蛍光標識である。1つの態様において、核酸の局在は、細胞内で、すなわち、インビトロで視覚化される。別の好ましい態様において、核酸の局在はインビボで視覚化される。
【００６４】
ジゴキシゲニン特異的ポリクローナル抗体は診断アッセイにおいて広く用いられている。しかしながら、小さな安定した断片および融合タンパク質が望ましいが、これらのハイブリドーマ由来抗体から作製することができない。従って、診断試薬として組換えのヒト化<Dig>もしくは<Dig>融合タンパク質またはキメラ<Dig>もしくは<Dig>融合タンパク質が必要とされている。本発明の1つの態様において、本発明の二重特異性抗体または断片は診断ツールおよび診断試薬として用いられる。これらには、ジゴキシゲニンに特異的な、機能的な組換えヒトIgG、Fab断片、scFv、およびジスルフィド安定化Fvが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、二重特異性抗体または抗体断片は、ジゴキシゲニン化したタンパク質、ペプチド、または核酸などがあるが、これらに限定されない、ジゴキシゲニン化した化合物または分子を認識する。好ましい態様において、前記二重特異性抗体または断片は、診断アッセイにおいて使用するための、酵素、プロテインA、(ストレプト)アビジン、または融合タンパク質と結合体化される。
【００６５】
ジギトキシン(Digitoxin)過量に対抗するために、ポリクローナル<Dig>(Fab)が治療に適用される。既存の製品は規定されておらず、免疫原性がある可能性が高い。本発明の二重特異性抗体または抗体断片はジゴキシゲニンに特異的に結合し、免疫原性が低いか、免疫原性が全く無く、詳細に明らかにされている。1つの態様において、組換えヒト化<Dig>もしくは<Dig>断片またはキメラ<Dig>もしくは<Dig>断片がジギトキシン解毒剤として用いられる。
【００６６】
本明細書で使用する「抗体」は、抗原結合部位を含む結合タンパク質を指す。本明細書で使用する「結合部位」または「抗原結合部位」という用語は、リガンドが実際に結合する抗体分子領域を指す。本発明の1つの態様において、結合部位はそれぞれ抗体重鎖可変ドメイン(VH)および/または抗体軽鎖可変ドメイン(VL)を含み、好ましくは、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体重鎖可変ドメイン(VH)からなるペアによって形成される。
【００６７】
本発明の1つの態様において、前記抗体は単鎖可変断片(scFv)を含む。
【００６８】
抗体特異性は、抗体が抗原のある特定のエピトープを選択的に認識することを指す。天然の抗体は、例えば、単一特異性である。本発明による「二重特異性抗体」は2種類の抗原結合特異性を有する抗体である。抗体に複数の特異性がある場合、認識されるエピトープは1種類の抗原と関連してもよく、複数の種類の抗原と関連してもよい。本発明の抗体は2種類の抗原、すなわち、第1の抗原であるジゴキシゲニンおよび第2の抗原である標的タンパク質に特異的である。
【００６９】
本明細書で使用する「単一特異性」抗体という用語は、1つまたは複数の結合部位を有し、それぞれが同じ抗原の同じエピトープに結合する、抗体を指す。
【００７０】
本願の中で用いられる「価」という用語は、抗体分子の中に指定された数の結合部位が存在することを指す。従って、「二価」、「四価」、および「六価」という用語は、抗体分子の中にそれぞれ、2つの結合部位、4つの結合部位、6つの結合部位が存在することを指す。本発明による二重特異性抗体は少なくとも「二価」であり、「三価」または「多価」(例えば、(「四価」または「六価」)でもよい。
【００７１】
本発明の抗体は2つ以上の結合部位を有し、二重特異性である。すなわち、結合部位が3つ以上の場合(すなわち、抗体が三価または多価の場合)であっても、抗体は二重特異性であり得る。本発明の二重特異性抗体には、例えば、多価単鎖抗体、ダイアボディおよびトリアボディ、ならびに、完全長抗体の定常ドメイン構造を有する抗体が含まれ、これらには、1つまたは複数のペプチドリンカーを介して、さらなる抗原結合部位(例えば、単鎖Fv、VHドメインおよび/もしくはVLドメイン、Fab、または(Fab)2)が連結される。抗体は1つの種に由来する完全長でもよく、キメラ化またはヒト化されていてもよい。3つ以上の抗原結合部位を有する抗体の場合、このタンパク質に2種類の抗原に対する結合部位がある限り、結合部位の中に同一のものがあってもよい。すなわち、第1の結合部位がジゴキシゲニンに特異的であるのに対して、第2の結合部位は標的タンパク質に特異的である。
【００７２】
天然抗体と同様に、本発明の抗体の抗原結合部位は、典型的には、抗原に対する結合部位の親和性に様々な程度で寄与する6つの相補性決定領域(CDR)を含有する。3つの重鎖可変ドメインCDR(CDRH1、CDRH2、およびCDRH3)ならびに3つの軽鎖可変ドメインCDR(CDRL1、CDRL2、およびCDRL3)がある。CDRおよびフレームワーク領域(FR)の程度は、編集済のアミノ酸配列データベースと比較することによって決定され、データベース内で、これらの領域は配列間のばらつきに従って規定されている。さらに少ないCDRからなる(すなわち、結合特異性が3つ、4つ、または5つのCDRによって決まる)機能的な抗原結合部位も本発明の範囲内に含まれる。例えば、6つ一組の完全なCDRより少ないCDRで結合に十分な場合がある。場合によっては、1つのVHドメインまたは1つのVLドメインで十分であろう。
【００７３】
ある特定の態様において、本発明の抗体は、1種類または複数の種類の免疫グロブリンクラスの免疫グロブリン定常領域をさらに含む。免疫グロブリンクラスには、IgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEアイソタイプ、IgGおよびIgAの場合にはこれらのサブタイプが含まれる。好ましい態様において、本発明の抗体はIgG型抗体の定常ドメイン構造を有するが、4つの抗原結合部位を有する。これは、DIGに特異的に結合する2つの完全な抗原結合部位(例えば、単鎖Fv)と、標的タンパク質に特異的に結合する完全抗体のN末端またはC末端の重鎖または軽鎖いずれかを連結することによって達成される。4つの抗原結合部位は、好ましくは、それぞれが2つの異なる結合特異性をもつ2種類の結合部位からなる。
【００７４】
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、1種類のアミノ酸組成物からなる抗体分子の調製物を指す。
【００７５】
「キメラ抗体」という用語は、1種類の供給源または種に由来する可変領域、すなわち、結合領域と、異なる供給源または種に由来する定常領域の少なくとも一部を含み、通常、組換えDNA法によって調製された抗体を指す。マウス可変領域およびヒト定常領域を含むキメラ抗体が好ましい。本発明に含まれる他の好ましい形の「キメラ抗体」は、定常領域が、本発明による特性、特に、C1q結合および/またはFc受容体(FcR)結合に関する特性を生じるように最初の抗体の定常領域から改変または変更されている抗体である。このようなキメラ抗体は「クラススイッチ抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするDNAセグメントおよび免疫グロブリン定常領域をコードするDNAセグメントを含む免疫グロブリン遺伝子が発現した産物である。キメラ抗体を生成するための方法は従来の組換えDNAを伴い、遺伝子トランスフェクション法は当技術分野において周知である。例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(1984)6851-6855;US5,202,238およびUS5,204,244を参照されたい。
【００７６】
「ヒト化抗体」という用語は、フレームワークまたは「相補性決定領域」(CDR)が、免疫グロブリンCDRと比較して特異性の異なる免疫グロブリンCDRを含むように改変されている抗体を指す。好ましい態様では、「ヒト化抗体」を調製するためにマウスCDRがヒト抗体のフレームワーク領域に移植されている。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332(1988)323-327;およびNeuberger, M.S., et al., Nature 314(1985)268-270を参照されたい。特に好ましいCDRは、キメラ抗体について前述された抗原認識配列に相当するものに一致する。本発明に含まれる他の形の「ヒト化抗体」は、定常領域が、本発明による特性、特に、C1q結合および/またはFc受容体(FcR)結合に関する特性を生じるように最初の抗体の定常領域からさらに改変または変更されているものである。
【００７７】
本明細書で使用する「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことが意図される。ヒト抗体は最新技術において周知である(van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5(2001)368-374)。ヒト抗体はまた、免疫されると内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の全レパートリーまたは選択されたものを産生することができるトランスジェニック動物(例えば、マウス)において産生することもできる。このような生殖細胞系列変異マウスにヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子アレイを導入すると、抗原曝露によってヒト抗体が産生される(例えば、Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(1993)2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362(1993)255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7(1993)33-40を参照されたい)。ヒト抗体はまたファージディスプレイライブラリーにおいて産生することもできる(Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227(1992)381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597)。ヒトモノクローナル抗体を調製するために、Cole et al.およびBoerner, et al.の技法も利用することができる(Cole, P. J., et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985);およびBoerner, P., et al., J. Immunol. 147(1991)86-95)。本発明によるキメラおよびヒト化抗体について既に述べたように、本明細書で使用する「ヒト抗体」という用語はまた、本発明による特性、特に、C1q結合および/またはFcR結合に関する特性を生じるように定常領域が改変されている、例えば、「クラススイッチ」、すなわち、Fc部の変化または変異(例えば、IgG1からIgG4への変異および/またはIgG1/IgG4変異)によって定常領域が改変されているヒト抗体を含む。
【００７８】
本明細書で使用する「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段によって調製されたか、発現されたか、作り出されたか、または単離された全てのヒト抗体、例えば、NSO細胞もしくはCHO細胞などの宿主細胞から単離された抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子が導入された動物(例えば、マウス)から単離された抗体、または宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体を含むことが意図される。このような組換えヒト抗体は、再編成された形で可変領域および定常領域を有する。本発明による組換えヒト抗体はインビボ体細胞超変異に供されている。従って、組換え抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列VH配列およびVL配列に由来する配列ならびにヒト生殖細胞系列VH配列およびVL配列に関連する配列であるが、天然ではインビボでヒト抗体生殖細胞系列レパートリーの中に存在しない場合がある。
【００７９】
本明細書で使用する「可変ドメイン」(軽鎖の可変ドメイン(VL)、重鎖の可変領域(VH))は、抗体と抗原との結合に直接関与する、軽鎖および重鎖の各ペアを指す。ヒト軽鎖および重鎖の可変ドメインは同じ一般構造を有し、それぞれのドメインは、広く保存されている配列を有し、3つの「超可変領域」(または相補性決定領域、CDR)によってつながれている4つのフレームワーク(FR)領域を含む。フレームワーク領域はβシートコンホメーションをとり、CDRは、βシート構造をつなぐループを形成することがある。各鎖にあるCDRは、このフレームワーク領域によって三次元構造に保たれ、他の鎖に由来するCDRと一緒になって抗原結合部位を形成する。抗体重鎖および軽鎖のCDR3領域は、本発明による抗体の結合特異性/親和性において特に重要な役割を果たしており、従って、本発明のさらなる目的を提供する。
【００８０】
「超可変領域」または「抗体の抗原結合部分」という用語は本明細書において用いられる時に、抗原結合を担う抗体アミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」に由来するアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」または「FR」領域は、本明細書において定義された超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。従って、抗体の軽鎖および重鎖は、N末端からC末端にかけてドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4を含む。各鎖にあるCDRは、このようなフレームワークアミノ酸によって分けられている。特に、重鎖のCDR3は抗原結合に最も寄与する領域である。CDRおよびFR領域は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)の標準的な定義に従って決められている。
【００８１】
本明細書で使用する「結合」または「特異的に結合する」という用語は、インビトロアッセイ、好ましくは、野生型抗原を発現するCHO細胞を用いた細胞をベースとするELISAにおける、抗体と抗原エピトープとの結合を指す。結合は、10-8M以下、好ましくは、10-13M〜10-9Mの結合親和性(KD)を意味する。抗体と抗原またはFcγRIIIとの結合はBIAcoreアッセイ(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)によって調べることができる。結合親和性は、ka(抗体/抗原複合体からの抗体の会合速度定数)、kD(解離定数)、およびKD(kD/ka)という用語で定義される。
【００８２】
本明細書で使用する「カップリングされた」という用語は、具体的には、ジゴキシゲニン化された治療用ペイロードまたは診断用ペイロードと本発明の二重特異性抗体とが非共有結合する抗体-ハプテン相互作用を指す。
【００８３】
本明細書で使用する「低分子」または「低分子化合物」という用語は、合成された、または天然に見られる、分子量が一般的に10,000グラム/モル未満、任意で5,000グラム/モル未満、および任意で2,000グラム/モル未満の有機分子または無機分子を指す。
【００８４】
本明細書で使用する「ペプチド」という用語は、あるアミノ酸のα-カルボキシル基と別の基のα-アミノ基とのアミド形成によって生成された任意のポリマー化合物を指す。本明細書で使用する「タンパク質」という用語は、約50超の残基からなる特定の配列のポリペプチドを指す。
【００８５】
本明細書で使用する「核酸」という用語は、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなるオリゴマーもしくはポリマー、または2つの天然核酸と同様に配列特異的に天然核酸とハイブリダイズすることができる、例えば、ワトソン-クリック塩基対相互作用に関与することができる合成化合物(例えば、米国特許第5,948,902号およびその中で引用された参考文献に記載のPNA)を意味する。非天然核酸は、天然では生じない核酸塩基配列を含有するオリゴマーもしくはポリマー、またはペプチド核酸(PNA)、トレオース核酸(TNA)、ロックド核酸(LNA)、もしくはグリセロール核酸(GNA)のような天然核酸塩基、糖、もしくは糖内結合の機能的等価物を含有する種である。この用語は、天然核酸の核酸塩基アデニン(A)、グアニン(G)、チミン(T)、シトシン(C)、およびウラシル(U)を含有するオリゴマー、ならびに塩基類似体または修飾核酸塩基を含有するオリゴマーを含有する。核酸は、様々な天然供給源、例えば、ウイルス、細菌、および真核生物のDNAおよびRNAに由来してもよい。他の核酸が合成源から得られてもよく、研究試薬、診断剤、または潜在的な治療剤および明確な治療剤として使用するために製造されている複数のオリゴヌクレオチドのうちいずれを含んでもよい。この用語は、一本鎖核酸または二本鎖核酸からなるオリゴマーを含む。
【００８６】
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができる任意のポリペプチド決定基を含む。ある特定の態様において、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの分子の化学的に活性のある表面グループを含み、ある特定の態様において、特定の三次元構造特徴および/または特定の電荷特徴を有することがある。エピトープは、抗体が結合する抗原領域である。ある特定の態様において、抗体は、タンパク質および/または高分子の複合混合物中で標的抗原を優先的に認識する時に抗原に特異的に結合すると言われる。
【００８７】
本発明の1つの態様において、二重特異性抗体はスキャフォールドとして完全長抗体を含む。「完全長抗体」という用語は、2つの「完全長抗体重鎖」および2つの「完全長抗体軽鎖」からなる抗体を指す。「完全長抗体重鎖」は、サブクラスIgEの抗体の場合、N末端からC末端の方向にかけて、抗体重鎖可変ドメイン(VH)、抗体定常ドメイン1(CH1)、抗体ヒンジ領域、抗体定常ドメイン2(CH2)、抗体定常ドメイン3(CH3)、任意で、抗体定常ドメイン4(CH4)からなるポリペプチドである。「完全長抗体軽鎖」は、N末端からC末端の方向にかけて、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL)からなるポリペプチドである。完全長抗体鎖は、CLドメインとCH1ドメインとの間のポリペプチド間ジスルフィド結合および完全長抗体重鎖のヒンジ領域間のポリペプチド間ジスルフィド結合を介して一緒に連結される。
【００８８】
本発明による抗体における結合部位はそれぞれ、2つの可変ドメイン、すなわち、1つの重鎖可変ドメインおよび1つの軽鎖可変ドメインのペアによって形成されてもよい。抗体の最小結合部位決定基は重鎖CDR3領域である。
【００８９】
ジスルフィドが安定化された単鎖抗体の1つの態様において、それぞれの単鎖抗体について、本発明による抗体に含まれる単鎖抗体の可変ドメイン間のジスルフィド結合は、独立して、
i)重鎖可変ドメイン位置44と軽鎖可変ドメイン位置100、
ii)重鎖可変ドメイン位置105と軽鎖可変ドメイン位置43、または
iii)重鎖可変ドメイン位置101と軽鎖可変ドメイン位置100
より選択される。
【００９０】
1つの態様において、本発明による抗体に含まれる単鎖抗体の可変ドメイン間のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメイン位置44と軽鎖可変ドメイン位置100との間にある。
【００９１】
1つの態様において、本発明による抗体に含まれる単鎖抗体の可変ドメイン間のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメイン位置105と軽鎖可変ドメイン位置43との間にある。
【００９２】
さらなる態様において、前記四価二重特異性抗体は、前記単一特異性二価抗体がヒトIgG1サブクラスまたは変異L234AおよびL235Aを有するヒトIgG1サブクラスの単一特異性二価抗体であることを特徴とする。
【００９３】
さらなる態様において、前記四価二重特異性抗体は、前記単一特異性二価抗体がヒトIgG2サブクラスの単一特異性二価抗体であることを特徴とする。
【００９４】
さらなる態様において、前記四価二重特異性抗体は、前記単一特異性二価抗体がヒトIgG3サブクラスの単一特異性二価抗体であることを特徴とする。
【００９５】
さらなる態様において、前記四価二重特異性抗体は、前記単一特異性二価抗体がヒトIgG4サブクラスまたはさらなる変異S228Pを有するIgG4サブクラスの単一特異性二価抗体であることを特徴とする。
【００９６】
さらなる態様において、二重特異性抗体は、
-2つの抗原結合部位がそれぞれ単一特異性二価抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの2つのペアによって形成されて、両方とも同じエピトープに結合する、
-さらなる2つの抗原結合部位がそれぞれ1つの単鎖抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインによって形成される、
-単鎖抗体はそれぞれペプチドリンカーを介して1本の重鎖または1本の軽鎖に連結され、それにより、それぞれの抗体鎖末端は単鎖抗体にのみ連結している
ことを特徴とする。
【００９７】
本発明の中で用いられる「ペプチドリンカー」という用語は、アミノ酸配列、好ましくは、合成由来のアミノ酸配列を有するペプチドを指す。本発明による、これらのペプチドリンカーは、異なる抗原結合部位および/または抗体断片を連結し、最終的に、異なる抗原結合部位(例えば、単鎖Fv、完全長抗体、VHドメインおよび/またはVLドメイン、Fab、(Fab)2、Fc部)を一緒に含めて、本発明による二重特異性抗体を形成するのに用いられる。ペプチドリンカーは、表1に列挙した以下のアミノ酸配列ならびにさらに任意に選択されたアミノ酸の1つまたは複数を含んでもよい。
【００９８】
（表１）ペプチドリンカーアミノ酸配列
0005758888.tif 000002
【００９９】
本発明の中で用いられる「単鎖リンカー」という用語は、アミノ酸配列、好ましくは、合成由来のアミノ酸配列を有するペプチドを指す。本発明による、これらのペプチドリンカーは、VHドメインおよびVLドメインを連結して単鎖Fvを形成するのに用いられる。単鎖リンカーは、表2に列挙した以下のアミノ酸配列ならびにさらに任意に選択されたアミノ酸の1つまたは複数を含んでもよい。
【０１００】
（表２）単鎖リンカーアミノ酸配列
0005758888.tif 000003
0005758888.tif 000004
0005758888.tif 000005
【０１０１】
抗体の化学的性質および物理的性質、例えば、分子量および二次修飾を含むドメイン構造のために、抗体の下流処理は非常に複雑である。例えば、経済的な取扱いおよび適用保管のために少量にすることが、処方された薬物だけでなく下流処理(DSP)濃縮液中の中間体にも必要とされる。しかし、抗体濃度が上昇するにつれて、凝集物を形成する傾向が観察されることがある。これらの凝集した抗体は、単離された抗体と比較して特徴が損なわれている。単一特異性二価親抗体と接続している単鎖抗体の重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの間にジスルフィド結合を導入することによって、本発明による抗体の凝集が弱められることが見出されている。この改善した安定性は生産プロセスの間に有用なだけでなく、抗体の保管にも有用である。1つの態様において、それぞれの単鎖抗体について、本発明による抗体に含まれる単鎖抗体の可変ドメイン間のジスルフィド結合は、独立して、
i)重鎖可変ドメイン位置44と軽鎖可変ドメイン位置100、
ii)重鎖可変ドメイン位置105と軽鎖可変ドメイン位置43、または
iii)重鎖可変ドメイン位置101と軽鎖可変ドメイン位置100
より選択される。
【０１０２】
1つの態様において、本発明による抗体に含まれる単鎖抗体の可変ドメイン間のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメイン位置44と軽鎖可変ドメイン位置100との間にある。
【０１０３】
1つの態様において、本発明による抗体に含まれる単鎖抗体の可変ドメイン間のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメイン位置105と軽鎖可変ドメイン位置43との間にある。
【０１０４】
本願の中で用いられる「定常領域」という用語は、可変領域以外の抗体ドメインの和を指す。定常領域は抗原結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能を示す。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体は以下のクラス:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMに分けられ、これらのうちいくつかは、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4、IgA1およびIgA2などのサブクラスにさらに分けられることがある。抗体の様々なクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。5種類全ての抗体クラスに見られる軽鎖定常領域はκ(カッパ)およびλ(ラムダ)と呼ばれる。
【０１０５】
本願において用いられる「ヒト由来定常領域」という用語は、サブクラスIgG1、IgG2、IgG3、もしくはIgG4のヒト抗体の重鎖定常領域、および/または軽鎖κもしくはλ定常領域を指す。このような定常領域は最新技術において周知であり、例えば、Kabat, E. A.,に記載されている(例えば、Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28(2000)214-218; Kabat, E.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72(1975)2785-2788を参照されたい)。IgG4サブクラスの抗体はFc受容体(FcγRIIIa)結合が弱く、他のIgGサブクラスの抗体は結合が強い。しかしながら、Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(Fc炭水化物が失われる)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、およびHis435はもし変化すれば、Fc受容体結合が弱くなる残基である(Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276(2001)6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9(1995)115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86(1995)319-324; EP0307434)。1つの態様において、本発明による抗体は、IgG1抗体と比較してFcR結合が低下している。従って、単一特異性二価親抗体は、FcR結合については、IgG4サブクラス、またはS228、L234、L235および/もしくはD265に変異を有する、ならびに/またはPVA236変異を含有するIgG1もしくはIgG2サブクラスの抗体である。1つの態様において、単一特異性二価親抗体の変異は、S228P、L234A、L235A、L235E、および/またはPVA236である。
【０１０６】
本発明による抗体は組換え手段によって産生される。従って、本発明の1つの局面は、本発明による抗体をコードする核酸であり、さらなる局面は、本発明による抗体をコードする前記核酸を含む細胞である。組換え産生する方法は最新技術において広く知られており、原核細胞および真核細胞におけるタンパク質発現とその後の抗体単離、通常は、薬学的に許容される純度までの精製を含む。宿主細胞において上述したように抗体を発現させるために、それぞれの改変軽鎖および改変重鎖をコードする核酸が標準的な方法によって発現ベクターに挿入される。発現は、適切な原核宿主細胞または真核宿主細胞、例えば、CHO細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母、または大腸菌(E.coli)細胞において行われ、抗体は細胞(上清または溶解後の細胞)から回収される。抗体を組換え産生するための一般的方法は最新技術において周知であり、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 183-202(1999); Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 271-282(1996); Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 151-161 (2000); Werner, R.G., Drug Res. 48 870-880(1998)の総説に記載されている。
【０１０７】
二重特異性抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインA-Sepharose、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィーによって培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするDNAおよびRNAは容易に単離され、従来手順を用いて配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNAおよびRNAの供給源として役立つことができる。DNAは単離されたら発現ベクターに挿入されることがあり、次いで、宿主細胞において組換えモノクローナル抗体の合成を得るために、発現ベクターは、免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えば、HEK293細胞、CHO細胞、または骨髄腫細胞に導入される。
【０１０８】
二重特異性抗体のアミノ酸配列変種(または変異体)は、適切なヌクレオチド変化を抗体DNAに導入することによって、またはヌクレオチド合成によって調製される。しかしながら、このような改変は、例えば、前記のように非常に限られた範囲でしか行うことができない。例えば、改変によって、IgGアイソタイプおよび抗原結合などの前述した抗体の特徴は変わらないが、組換え産生の収率、タンパク質安定性が改善するか、または精製が容易になることがある。
【０１０９】
本願において用いられる「宿主細胞」という用語は、本発明による抗体を作製するために操作することができる任意の種類の細胞系を指す。1つの態様において、HEK293細胞およびCHO細胞は宿主細胞として用いられる。本明細書で使用する「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」という表現は同義に用いられ、このような全ての名称は子孫を含む。従って、「形質転換体」および「形質転換細胞」という言葉は、最初の対象細胞および導入の回数に関係なく、これに由来する培養物を含む。全ての子孫は、故意または偶然の変異のためにDNA内容物が全く同じでなくてもよいことも理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫が含まれる。
【０１１０】
NSO細胞における発現は、例えば、Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 109-123(2000); Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 261-270(2001)に記載されている。一過的な発現は、例えば、Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 E9(2002)に記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 3833-3837 (1989); Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 4285-4289(1992);およびNorderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 77-87(1997)に記載されている。好ましい一過的な発現系(HEK293)は、Schlaeger, E. -J., and Christensen, K., in Cytotechnology 30 71-83(1999)およびSchlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 191-199(1996)に記載されている。
【０１１１】
原核生物に適した制御配列には、例えば、プロモーター、任意で、オペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、およびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
【０１１２】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係を持って配置されている時に「機能的に連結されている」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのDNAがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されれば、ポリペプチドDNAに機能的に連結されている。プロモーターまたはエンハンサーが配列転写に影響を及ぼすのであれば、コード配列に機能的に連結されている。または、リボソーム結合部位が翻訳を容易にするような位置にあれば、コード配列に機能的に連結されている。一般的に、「機能的に連結された」とは、連結されているDNA配列は連続しており、分泌リーダーの場合、連続しかつインフレームであることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続している必要はない。連結は、便利な制限部位における連結によって達成される。このような部位が存在しなければ、従来の実施に従って合成のオリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが用いられる。
【０１１３】
抗体の精製は、アルカリ/SDS処理、CsCl バンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野において周知のその他の技法を含む標準的な技法によって、細胞成分または他の汚染物質、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質を排除するために行われる。Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York(1987)を参照されたい。タンパク質精製には、微生物タンパク質を用いたアフィニティクロマトグラフィー(例えば、プロテインAアフィニティクロマトグラフィーまたはプロテインGアフィニティクロマトグラフィー)、イオン交換クロマトグラフィー(例えば、陽イオン交換(カルボキシメチル樹脂)、陰イオン交換(アミノエチル樹脂)、および混合モード交換)、チオフィリック吸着(例えば、βメルカプトエタノールおよび他のSHリガンドを用いる)、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー(例えば、フェニル-セファロース、アザアレノフィリック(aza-arenophilic)樹脂、またはm-アミノフェニルボロン酸を用いる)、金属キレートアフィニティクロマトグラフィー(例えば、Ni(II)親和性材料およびCu(II)親和性材料を用いる)、サイズ排除クロマトグラフィー、ならびに電気泳動法(例えば、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動)(Vijayalakshmi, M. A. Appl. Biochem. Biotech. 75 93-102(1998))などの様々な方法が十分に確立されており、広範囲に用いられている。
【０１１４】
本発明の1つの局面は、本発明による抗体を含む薬学的組成物である。本発明の別の局面は、ジゴキシゲニン化された治療剤または診断剤とカップリングしている本発明による抗体を含む薬学的組成物である。別の局面において、本発明は、薬学的担体と共に処方された、本発明によるジゴキシゲニン化された治療剤または診断剤とカップリングしている抗体を含有する組成物、例えば、薬学的組成物を提供する。
【０１１５】
本発明の別の局面は、癌を治療するための前記薬学的組成物である。
【０１１６】
本発明の別の局面は、癌を治療するための医用薬剤を製造するための本発明による抗体の使用である。
【０１１７】
本発明の別の局面は、本発明によるジゴキシゲニン化された治療剤または診断剤とカップリングしている抗体を、治療を必要とする患者に投与することによって、癌に罹患している患者を治療する方法である。
【０１１８】
本明細書で使用する「薬学的担体」は、生理学的に適合する、任意のかつ全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、(例えば、注射または注入による)静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、または表皮投与に適している。
【０１１９】
本発明の組成物は、当技術分野において公知の様々な方法によって投与することができる。当業者に理解されるように、投与経路および/または投与方法は望ましい結果に応じて異なるだろう。本発明の化合物をある特定の投与経路によって投与するために、化合物を化合物の不活性化を防ぐ材料でコーティングするか、または化合物と化合物の不活性化を防ぐ材料を同時投与することが必要な場合がある。例えば、化合物は、適切な担体、例えば、リポソーム、または希釈剤に溶解して被験体に投与されてもよい。薬学的に許容される希釈剤には、食塩水および水性緩衝溶液が含まれる。薬学的担体には、滅菌した水溶液または分散液、および滅菌した注射液または分散液を即時調製するための滅菌した散剤が含まれる。薬学的に活性な物質のための、このような媒体および薬剤の使用は当技術分野において公知である。
【０１２０】
本明細書で使用する「非経口投与」および「非経口的に投与される」という句は、経腸投与および局部投与以外の投与方法、通常、注射による投与方法を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内への注射および注入を含むが、それに限定されるわけではない。
【０１２１】
これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの補助剤を含有してもよい。前記の滅菌法によって、ならびに様々な抗菌性剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含めることによって、微生物の存在を確実に阻止することができる。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを組成物に含めることが望ましい場合もある。さらに、 モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤を含めることによって、注射可能な剤形を長期間吸収させることができる。
【０１２２】
選択された投与経路に関係なく、本発明の化合物は適切な水和型および/または本発明の薬学的組成物の状態で用いられてもよく、当業者に公知の従来法によって薬学的に許容される剤形に処方される。
【０１２３】
本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投与量レベルは、患者への毒性が無く、特定の患者、組成物、および投与方法に対して望ましい治療反応を達成するのに有効な活性成分量を得るように変更することができる。選択された投与量レベルは、使用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排出速度、治療期間、使用される特定の組成物と併用される他の薬物、化合物、および/または材料、治療を受けている患者の年齢、性別、体重、状態、身体全体の健康、および以前の病歴、ならびに医学分野において周知の同様の要因を含む様々な薬物動態学的要因によって決まるだろう。
【０１２４】
組成物は無菌でなければならず、組成物が注射器によって送達できる程度まで液状でなければならない。担体は水に加えて、好ましくは、等張性緩衝生理食塩溶液である。
【０１２５】
適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンを使用することによって、分散液の場合、必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトール、および塩化ナトリウムを含めることが好ましい。
【０１２６】
本明細書で使用する癌という用語は、増殖性疾患、例えば、リンパ腫、リンパ球性白血病、肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、気管支肺胞上皮細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚黒色腫または眼球内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌または尿管癌、腎細胞癌、腎盂腫、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系(CNS)の新生物、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性神経膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫およびユーイング肉腫を、前記の癌のいずれかの難治型または前記の癌の1つもしくは複数の組み合わせを含めて指す。
【０１２７】
本明細書で使用する「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」という表現は同義に用いられ、このような全ての名称は子孫を含む。従って、「形質転換体」および「形質転換細胞」という言葉は、最初の対象細胞および導入の回数に関係なく、これに由来する培養物を含む。全ての子孫は、故意または偶然の変異のためにDNA内容物が全く同じでなくてもよいことも理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫が含まれる。異なる名称が意図された場合、文脈から明らかであろう。
【０１２８】
本明細書で使用する「形質転換」という用語は、ベクター/核酸を宿主細胞に導入するプロセスを指す。手ごわい細胞壁という障壁を有さない細胞が宿主細胞として用いられるのであれば、トランスフェクションは、例えば、Graham and Van der Eh, Virology 52 546ff(1978)に記載のようにリン酸カルシウム沈殿法によって行われる。しかしながら、核注射またはプロトプラスト融合などの、DNAを細胞に導入する他の方法も使用することができる。原核細胞またはかなりの細胞壁構造を含有する細胞が用いられるのであれば、例えば、トランスフェクション法の1つは、Cohen, F. N, et al., PNAS. 69(1972)7110ffに記載のような塩化カルシウムを用いたカルシウム処理である。
【０１２９】
本明細書で使用する、「発現」は、核酸がmRNAに転写されるプロセス、および/またはその後に、転写されたmRNA(転写物とも呼ばれる)がペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされるポリペプチドは総称して遺伝子産物と呼ばれる。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来するのであれば、真核細胞における発現はmRNAのスプライシングを含むことがある。
【０１３０】
「ベクター」は、挿入されている核酸分子を宿主細胞におよび/または宿主細胞間に導入する核酸分子、特に、自己複製性の核酸分子である。この用語は、主に、DNAまたはRNAを細胞に挿入(例えば、染色体組込み)するために機能するベクター、主にDNA複製またはRNA複製のために機能する複製ベクター、ならびにDNAまたはRNAの転写および/または翻訳のために機能する発現ベクターを含む。説明された複数の機能を提供するベクターも含まれる。
【０１３１】
「発現ベクター」は、適切な宿主細胞に導入された時に、転写およびポリペプチドへの翻訳が可能なポリヌクレオチドである。「発現系」は、通常、望ましい発現産物を生じるように機能することができる発現ベクターからなる適切な宿主細胞を指す。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】<DIG>ハイブリドーマ19-11から単離されたmRNA。
【図２】19-11 mRNAから作製されたPCR断片。
【図３】マウス<DIG>Fvの予測された構造。
【図４】ヒト化<DIG>Fvの予測された構造。
【図５】ヒト化<Dig>IgGの精製。a)ヒト化<Dig>IgGの模式化モデル、b):還元SDS-PAGE、c):HP-サイズ排除クロマトグラフィー。
【図６】ヒト化<IGF1R><Dig>二重特異性変種の精製。a):ヒト化<IGF1R><Dig>二重特異性抗体の模式化モデル、b):還元SDS-PAGE、c):HP-サイズ排除クロマトグラフィー(1mg/ml)。
【図７】ヒト化<Her2><Dig>二重特異性変種の精製。a):ヒト化<Her2><Dig>二重特異性抗体の模式化モデル、b):還元SDS-PAGE、c):HP-サイズ排除クロマトグラフィー(1mg/ml)。
【図８】a)ヒト化<Dig>IgGの模式化モデル、(b)ヒト化<IGF1R><Dig>二重特異性抗体の模式化モデル、(c)ヒト化<Her2><Dig>二重特異性抗体の模式化モデル、d)発現レベルはタンパク質収率で示した(このような非最適化一過的発現実験における細胞培養上清1L当たりの精製タンパク質mg)。
【図９】ジスルフィド安定化前およびジスルフィド安定化後のヒト化<Her2><Dig>二重特異性抗体の発現レベル、凝集、および安定性。a)<Her2><Dig>-2320(安定化なし)の模式化モデル、b)<Her2><Dig>-2321(ジスルフィド安定化)の模式化モデル、c)ジスルフィド安定化前およびジスルフィド安定化後のヒト化<Her2><Dig>二重特異性抗体の発現レベル、凝集、および安定性。
【図１０】組換えヒト化<Dig>IgG抗体およびハイブリドーマ由来マウス<Dig>19-11抗体とジゴキシゲニン化抗原との結合。結合特性は、BiacoreT100またはBiacore3000機器を用いて表面プラズモン共鳴(SPR)技術によって分析した。a)ヒト化<Dig>IgG抗体。DIG-BP4とhu<DIG>IgGとの結合、KD=<76pM、b)ヒト化<Dig>IgG抗体。Eg5-siRNA-DIGとhu<DIG>IgGとの結合、KD=12nM、c)ヒト化<Dig>IgG抗体。Eg5-siRNA-(2x)DIGとhu<DIG>IgGとの結合、KD=8pM。d)ハイブリドーマ由来マウス<Dig>19-11抗体。DIG-BP4の結合、KD=33nM、e)ハイブリドーマ由来マウス<Dig>19-11抗体。Eg5-siRNA-DIGの結合、KD=269pM、f)ハイブリドーマ由来マウス<Dig>19-11抗体。Eg5-siRNA-(2x)DIGの結合、KD=17pM。
【図１１】組換えヒト化<Her2><Dig>二重特異性抗体とジゴキシゲニン化抗原との結合。結合特性は、BiacoreT100またはBiacore3000機器を用いて表面プラズモン共鳴(SPR)技術によって分析した。a)DIG-BP4の結合、KD=68pM、b)Eg5-siRNA-DIGの結合、KD=35nM、c)Eg5-siRNA-(2x)DIGの結合、KD=162pM。
【図１２】組換えヒト化<Dig>ジスルフィド安定化scFV融合タンパク質とDIG-RNAse(ヒトおよびウシ)との結合。結合特性は、BiacoreT100またはBiacore3000機器を用いて表面プラズモン共鳴(SPR)技術によって分析した。
【図１３】組換えマウス44-100安定化<Her2><Dig>二重特異性抗体とジゴキシゲニン化抗原との結合。結合特性は、BiacoreT100またはBiacore3000機器を用いて表面プラズモン共鳴(SPR)技術によって分析した。a)Eg5-siRNA-DIGの結合、KD=467pM、c)Eg5-siRNA-(2x)DIGの結合、KD=40pM。
【図１４】ペプチド-ジゴキシゲニン複合体の構造。
【図１５】メリチン、Fallv1、およびFallv2ペプチド、ならびにこれらのDIG改変変種の生物学的活性。a)Dig-メリチンで処理したH322M、b)メリチンで処理したH322M、c)FALLv1で処理したH322M、d)Dig-FALLv1で処理したH322M、e)FALLv2で処理したH322M、f)Dig-FALLv2で処理したH322M。
【図１６】ジゴキシゲニン化ペプチドとのIgG複合体は、結合の順序とは無関係に細胞表面抗原に対する結合特異性および親和性を保持している。a)DIG-INF7およびIGF1Rと<IGF1R><Dig>との相加的結合、b)DIG-FALLおよびIGF1Rと<IGF1R><Dig>との相加的結合。
【図１７】二重特異性抗体誘導体とジゴキシゲニン化ペプチドとの複合体の適用による抗原発現細胞へのペプチドの特異的送達。a)模式的な構造、b)FALLv1、b)Fam5b。
【図１８】ジゴキシゲニン化ドキソルビシンの作製および組成。
【図１９】ジゴキシゲニン化ドキソルビシン-<Her2>-<Dig>二重特異性抗体複合体のサイズ排除クロマトグラフィーから、ジゴキシゲニン化ドキソルビシンが装填され、装填された分子が均一であることが分かる。a)クロマトグラム:1:Her2 Dig Doxo(1:0)、2:Her2 Dig Doxo(1:0.5)、3:Her2 Dig Doxo(1:1)、4:Her2 Dig Doxo(1:2)、5:Her2 Dig Doxo(1:3)、6:Her2 Dig Doxo(1:5)、7:Her2 Dig Doxo(0:1)、b)分析。
【図２０】IGF1R陽性細胞へのジゴキシゲニン化ドキソルビシン-<IGF1R>-<DIG>二重特異性抗体複合体の特異的標的化。a)ドキソルビシンで処理したH322M、b)DIG-ドキソルビシンで処理したH322M、c)DIG-ドキソルビシンが装填された<IGF1R><Dig>2321で処理したH322M。
【図２１】Her2陽性細胞へのジゴキシゲニン化ドキソルビシン-<Her2>-<DIG>二重特異性抗体複合体の特異的標的化。a)ドキソルビシンで処理したKPL4、b)DIG-ドキソルビシンで処理したKPL4、c)DIG-ドキソルビシンが装填された<Her2><Dig>2321で処理したKPL4。
【図２２】ジゴキシゲニン化ドキソルビシンの特異的標的化およびエンドソーム蓄積。5.0μg/ml で120分間のインキュベーション。a)ドキソルビシンのみ、b)Dig-ドキソルビシン。c)<IGF-1R>-Dig>Dig-ドキソルビシン。
【図２３】ジゴキシゲニン化Cy5の構造。
【図２４】ジゴキシゲニン化Cy5<Her2>-<Dig>二重特異性抗体複合体のサイズ排除クロマトグラフィーから、ジゴキシゲニン化Cy5が装填され、装填された分子が均一であることが分かる。a)クロマトグラム:1:Her2 Dig Cy5(1:0)、2:Her2 Dig Cy5(1:0.5)、3:Her2 Dig Cy5(1:1)、4:Her2 Dig Cy5(1:2)、5:Her2 Dig Cy5(1:3)、6:Her2 Dig Cy5(1:5)。7:Her2 Dig Cy5(0:1)、b)分析。
【図２５】ジゴキシゲニン化Cy5とカップリングされた<CD22>-<Dig>抗体とインキュベートしたRaji細胞またはRamos細胞のFACS分析。a)CD22陽性Raji細胞。DIG-Cy％の組み合わせは二重特異性<CD22>-WT<Dig>一次抗体に非常によく結合する(シングルピーク)。複数のピーク:Raji Cy5DIG、Raji細胞のみ、b)CD22陽性Ramos細胞。二次的な実体のみ(Cy5DIG)がごくわずかなバックグラウンドを示し、CD22 WT-DIGとの組み合わせは、細胞に特異的に結合したことを示す強いシフト(シングルピーク)を有する。
【図２６】ジゴキシゲニン化Cy5とカップリングされた二重特異性<Her2>-<Dig>抗体による腫瘍画像化。a)二重特異性<Her2>-<Dig>抗体の模式的な構造、b)<Her2Dig>digCy5、iv注射して24時間後のNIRF。
【図２７】ジゴキシゲニン化Cy5とカップリングされた二重特異性<IGF1R>-<Dig>抗体による腫瘍画像化。a)二重特異性<IGF1R>-<Dig>抗体の模式的な構造、b)<IGF1R-DIG-hu2>+DIG-Cy5、c)DIG-Cy5。
【図２８】ジゴキシゲニン化Cy5とカップリングされた二重特異性<Her2>-<Dig>抗体による腫瘍画像化。a)模式的な構造、b)<Her2>-<Dig>抗体2321を注射して48時間後のジゴキシゲニン化Cy5注射。y軸:平均NIRFシグナル強度/実験時間(1/ms)。
【図２９】ジゴキシゲニン化核酸の模式的な構造。B:アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、デオキシチミジン;X:OH、H;Y:O、S;R:RNA配列。
【図３０】二重特異性標的化モジュールおよび蛍光標識核酸を用いたサイズ排除クロマトグラフィー分析。a)模式的な構造、b)クロマトグラム。
【図３１】ジゴキシゲニン化siRNAの生物学的活性。a)Eg5-siRNAを介したEg5 mRNAノックダウン、IC50=0.016nM。y軸:％発現、x軸:siRNA濃度(nM);b)DIG-Eg5-siRNAを介したEg5 mRNAノックダウン、IC50=0.035nM。y軸:％発現、x軸:siRNA濃度(nM);c)DIG-Eg5-Cy5-siRNAを介したEg5 mRNAノックダウン、IC50=0.013nM。y軸:％発現、x軸:siRNA濃度(nM);d)Eg5 siRNAでトランスフェクトされたKPL-4において測定した、Eg5 siRNAを介した細胞傷害性、IC50=28nM、y軸:生細胞の数、x軸:siRNA濃度(nM);e)DIG Eg5 siRNAでトランスフェクトされたKPL-4において測定した、DIG Eg5 siRNAを介した細胞傷害性、IC50=4nM、y軸:生細胞の数、x軸:siRNA濃度(nM)、f)DIG-Eg5-Cy5 siRNAでトランスフェクトされたKPL-4において測定した、DIG-Eg5-Cy5 siRNAを介した細胞傷害性、IC50=215nM、y軸:生細胞の数、x軸:siRNA濃度(nM)、g)KPL4細胞に対する、Eg5 siRNAを介した細胞傷害性;KPL4細胞を、それぞれのsiRNA 50ngでトランスフェクトした。左カラム:処理なし、真ん中のカラム:Eg5-siRNA、右カラム:DIG-Eg5-siRNA。生細胞のパーセントを示した。
【図３２】ジゴキシゲニン化siRNAおよび標的抗原と二重特異性<Her2>-<Dig>抗体との同時結合。Biacore分析。
【図３３】a)ジゴキシゲニン化し、かつCy5標識したsiRNAとカップリングされた<CD22>-<Dig>抗体とインキュベートしたRaji細胞のFACS分析。DIG-siRNA-Cy5のみ/Raji細胞のみと比較して(102におけるダブルピーク)、Raji細胞上のCD22 WT-DIG抗体とDIG-siRNA-Cy5との組み合わせは非常にはっきりとした陽性シグナル(5x103におけるシングルピーク)を示す。b)ジゴキシゲニン化し、かつCy5標識したsiRNAとカップリングされた<CD22>-<Dig>抗体とインキュベートしたRamos細胞のFACS分析。二次的な実体(DIG-siRNA-Cy5)はバックグラウンドを示さないのに対して(細胞のみとのダブルピーク)、CD22 WT DIGは陽性である(シングルピーク)。
【図３４】二重特異性<Her2>-<Dig>抗体とカップリングされたsiRNAの特異的インビトロ標的化。上:37℃で30分間のインキュベーション後のKPL4細胞における、表面に結合したAb-siRNA複合体の例。a)Eg5 siRNA_CY5、b)ハーセプチン抗kappa Alexa488、c)オーバーレイ;真ん中:37℃で30分間のインキュベーション後のMDAMB468細胞における、表面に結合したAb-siRNA複合体の例、d)Eg5 siRNA_CY5、e)ハーセプチン抗kappa Alexa488、f)オーバーレイ;下:37℃で一晩インキュベーション後のKPL4細胞における、表面に結合したAb-siRNA複合体の例、g)Eg5 siRNA_CY5、h)ハーセプチン-DIG_hu2-SS、i)トランスフェリン、j)オーバーレイ。
【図３５】二重特異性<IGFR1>-<Dig>抗体とカップリングされたsiRNAの特異的インビトロ標的化。a)〜d):37℃で10分間インキュベーションしたH322Mにおける、表面に結合したAb-siRNA複合体。a)Eg5 siRNA検出(cy5)、b)<IGF1R>-<DIG>検出(alexa)、c)トランスフェリン、d)細胞核;e)〜h):37℃で1時間インキュベーションしたH322Mにおける内部移行Ab-siRNA複合体。e)Eg5 siRNA検出(cy5)、f)<IGF1R>-<DIG>検出(alexa)、g)トランスフェリン、h)細胞核。
【図３６】二重特異性<Her2>-<Dig>抗体とカップリングされたsiRNAの特異的インビボ標的化。a)二重特異性抗体の模式的な構造、b)注射して24時間後のNIRF画像。<Her2Dig>digdsDNACy5。
【図３７】二重特異性<IGFR1>-<Dig>抗体とカップリングされたsiRNAの特異的インビボ標的化。a)二重特異性抗体の模式的な構造、b)NIRF画像。
【図３８】a)内部移行後の標的化モジュールからのsiRNAの分離。A:<IgG>-<DIG>、B:Eg5 siRNA_CY5、C:オーバーレイ。b)内部移行後の標的化モジュールからのDIG標識eGFPの分離。上列:氷上で2時間、下列:37℃で一晩。A:eGFP、B:IgG、C:オーバーレイ。c)内部移行後に標的化モジュールから共有結合siRNAは分離しない。上列:氷上で1時間、下列:37℃で一晩。A:siRNA、B:IgG、C: オーバーレイ。d) 内部移行後に標的化モジュールから共有結合シトリンは分離しない。上列:氷上で2時間、下列:37℃で一晩。A: シトリン、B:IgG、C: オーバーレイ。
【図３９】二重特異性<IGFR1>-<Dig>抗体-ジゴキシゲニン化siRNA複合体による標的細胞へのsiRNA活性の特異的標的化。IGF1R発現H322M細胞におけるEg5 mRNAレベル(％およびEg5/GAPHD比)。A:50nM<IGF1R-Dig>Dig-Eg5 siRNA XnM<IGF1R-Dig>Dig-INF7ペプチド、B:50nM<IGF1R-Dig>Dig-Eg5 siRNA XnM<IGF1R-Dig>Dig-INF7ペプチド、C:50nM<IGF1R-Dig>Dig-LUCsiRNA XnM<IGF1R-Dig>Dig-INF7ペプチド、D:50nM<IGF1R-Dig>XnM<IGF1R-Dig>Dig-INF7ペプチド。
【図４０】<IGFR1>-<Dig>/<CD22>-<Dig>抗体-ジゴキシゲニン化DPC複合体の抗原機能性、a):H322M、Igf1R陽性。H322M結合体だけが約2*102においてピークを示す。101において複数のピーク:<IGFR1>-<Dig>抗体、H322M二次のみ、H322<DIG>、H322Mアイソタイプ、およびH322M細胞のみ。b):Raji、CD22陽性。Raji結合体(<CD22>-<Dig>-ジゴキシゲニン化DPC複合体)だけが約2*101においてピークを示す。複数のピーク:<CD22>-<Dig>抗体、Raji二次のみ、Raji<DIG>、Rajiアイソタイプ、およびRaji細胞のみ。
【図４１】<IGFR1>-<Dig>抗体-ジゴキシゲニン化DPC複合体と標的細胞との特異的標的化。1:Dig-DPC+<IGFR1>-<Dig>二重特異性。2:DPC(DIGなし)+<IGFR1>-<Dig>二重特異性。3:Dig-DPC+<IGFR1>-<Dig>二重特異性。A:DPC、B:抗体、C:抗体DPC核。
【図４２】<Her2>-<Dig>抗体-ジゴキシゲニン化DPC複合体と標的細胞との特異的標的化。KPL4を有するSCIDベージュマウスにDIG-DPC Cy3<Her2>-<Dig>をi.v.注射した(上列)、抗体なしでDIG-DPC Cy3をi.v.注射した(下列)。24時間後のNIRFを示した。
【図４３】二重特異性抗体と複合体を形成したDIG-eGFPは、コグネイト抗原を発現する腫瘍に特異的に標的化される。a)シングルピーク:LeY-DIG二重特異性抗体、複数のピーク:DIGのみ、二次のみ、アイソタイプのみ、および細胞のみ。b)シングルピーク:LeY-DIG二重特異性抗体、複数のピーク:1:3 LeY/DIG-GFP、1:2 LeY/DIG-GFP、および細胞のみ。
【図４４】DIG標識タンパク質eGFPを用いて、標的細胞に結合した二重特異性抗体のエンドサイトーシスをモニタリングすることができる。a)MCF7 1:2 LeY/DIG-GFP灰色のピーク:37℃、黒色のピーク:4℃、b)MCF7 1:3 LeY/DIG-GFP灰色のピーク:37℃、黒色のピーク:4℃。
【図４５】<Dig>Fab断片の結晶およびマウス親抗体のジゴキシゲニン結合領域の実験により決定された構造。(a)結晶学データ収集およびモデル精密化統計値、(b)抗原の存在下でのマウス抗DIG Fab(リボン図、L鎖青色、H鎖緑色)と結合DIG部分(色分けしたスティックモデル)との複合体。CDRにおけるズーム(パネルB)。CDRループを標識した。DIG部分の周りの最終的な2FoFc電子密度地図を、1σで反対になる青色メッシュとして示した。破線はCy5とのリンカーの方向を示す。パネルCは、DIGが結合しているマウスFabの表面静電ポテンシャルを示す。(c)結合ポケットを裏打ちしている残基はスティックモデルとして描いた。DIGとの水素結合相互作用に関与する残基はスティックモデルとして表した。水素結合のある表はパートナーおよび距離Åを列挙している。
【図４６】a)マウス抗DIG Fabの表面図、b)マウス抗DIG Fabのリボン図、c)およびd)表面プラズモン共鳴(BiaCore)実験は、配列が最適化されたヒト化抗Digモジュールの結合特異性および改善した親和性を示す。c):最適化前の<DIG>、KD=12nM、d):VH49、57、60(Kabat)において最適化された<DIG>。KD=1nM。
【図４７】a)「マスター」分子としての完全長IgGに基づく二重特異性形式および多重特異性形式。b)より小さな抗体断片およびタンパク質ドメインからなる二重特異性形式および多重特異性形式。合成コラーゲン様ペプチド(GPP)x10はコラーゲン三重らせん(CTH)コンホメーションをとり、システインknot配列(NCI)は、コラーゲン三量体構築物を共有結合ために使用することができる。c)標的-ストレプトアビジンDig融合タンパク質。d)〜x):表面プラズモン共鳴(BiaCore)およびFACS実験は、様々な形式をしたジゴキシゲニン結合モジュールを含有する実体の結合特異性が完全に保持されていることを示す。d)およびe)IGF-1R結合のBiaCore分析:濃度、シリーズ1,5625;3,125;6,25;12,5;25;50nM。d):<IGF1R-DIG>4421(30nM)KD=5nM。e)<IGF1R-DIG-DIG>2321_4421(16nM)KD=2nM。f)二重特異性<DIG>抗体の結合および親和性のまとめ。g)〜i)<IGF1R>scFv-(G4s)3-G4T-<DIG>scFv-His6 25nMの結合のBiaCore分析。g)模式的な構造、h):AKH-61 10nM+DIGsiRNA 50nM+sIGF1R 25nM、i):DIGsiRNA 50nM+sIGF1R 25nM+AKH-61 10nM、j)IGF1R結合のFACS分析、灰色のピーク:H322MAKH60+抗His+抗マウス、黒色のピーク:H322MAKH60+抗マウス、k)DIG結合のFACS分析、l)〜m)<IGF1R>scFv-His6-<IGF1R>scFv-His6--<DIG>scFv-CTH 25nMの結合のBiaCore分析。1)模式的な構造、n)AKH-68/66 10nM+DIGsiRNA 50nM+sIGF1R 25nM、m):DIGsiRNA 50nM+sIGF1R 25nM+AKH-68/66 10nM、o)IGF1R結合のFACS分析。シングルピーク:AKH-68/66+抗His+抗マウス、複数のピーク:AKH-68/66+抗マウス、抗His(+抗マウス)、マウスアイソタイプy軸:最大に対する％、p)DIG結合のFACS分析、薄い灰色のピーク:DIG-Cy5、濃い灰色のピーク:AKH-68/66+DIG-Cy5、黒色のピーク:ヒトアイソタイプy軸:最大に対する％、q)〜s)標的ストレプトアビジンDig融合タンパク質の結合のBiaCore分析、q)模式的な構造、r)AKH-42 10nM+sIGF1R 25nM+ビオチン-siRNA 50nM。s):AKH-42 10nMに対するsIGF1R 25nM+DIGsiRNA 50nM+ビオチン-siRNA 50nM、(t)IGF1R結合のFACS分析。シングルピーク:AKH-42+抗His+抗マウス、複数のピーク:AKH-42+抗マウス、抗His(+抗マウス)、マウス二次y軸:最大に対する％、u)DIG結合のFACS分析。シングルピーク:AKH-42+抗His+DIG-Cy5、複数のピーク:DIG-Cy5、細胞のみ、v)〜x)<HER2>scFv-PExII-<DIG>scFv-His6 25nMの結合のBiaCore分析、v)模式的な構造、w)BiaCore分析、x)BiaCore分析、ズーム。
【図４８】ジゴキシゲニン化ドキソルビシンと<Dig>二重特異性抗体との標的化実験。a)およびb):MDA-MB-468(Her2+/-)細胞を、示された濃度のドキソルビシン(図48a))またはジゴキシゲニン化ドキソルビシン(図48b))で48時間処理した。c)〜e):H322M(IGF1R+++)(図48c))、KPL-4(Her2+++)(図48d))、およびMDA-MB-468(Her2+/-)(図48e))細胞を、<Her2>-<Dig>-Dig-Doxまたは<IGF1R>-<Dig>-Dig-Dox複合体で48時間処理した。細胞生存は、CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega, Madison, WI)を適用することによって評価した。
【図４９】a)およびb)ジゴキシゲニン化Cy5/<Her2>-<Dig>二重特異性抗体複合体のサイズ排除クロマトグラフィーは2:1(DIG-Cy5:<Her2>-<Dig>)の装填比を示す。c)およびd)SECの評価。
【図５０】a)ビヒクルとペイロードとの装填比を確かめるための、実験セットアップおよびデコンボリューションされていないネイティブな質量スペクトルへのズーム。Eg5-siRNA-(2x)Dig(上パネル)およびEg5-siRNA-(1x)Dig(下パネル)と<Her2-Dig>との結合。b)ネイティブ質量分析は、標的化ビヒクル1つにつき2以下のペイロードが装填されることを示す。一ジゴキシゲニン化核酸を適用すると、ビヒクル1つにつき複数あるが2以下のペイロードを含有する、装填された標的化ビヒクルが観察された。二ジゴキシゲニン化核酸を適用すると、装填比がさらに小さな分子の検出が増大する。すなわち、ほとんどのビヒクルには1つのペイロードが装填されている。これは、Dig結合実体1つにつき1つのDigの装填比を示している。
【図５１】a)およびb)様々な細胞表面抗原への、ハプテンを介したペイロード送達のためのビヒクル。c) VEGFR2を標的とするビヒクル、d)〜g):表面プラズモン共鳴実験は、細胞表面標的化およびジゴキシゲニン結合モジュールの結合特異性および親和性が完全に保持されていることを示す。d)Her2およびsiRNAと<Her2-DIG-hu2>との結合、e)<CD33>-<DIG>とヒトCD33-Fc融合(リガンド)との結合およびDIG-siRNAの相加的結合、f)抗CD22抗体と固定化CD22/Fcとの結合、g)DIG-siRNAおよびLeY-HASと<LeY>-<DIG>との相加的結合、h)<CDCP1>-<DIG>の結合。
【図５２】a)およびb)a)複合体DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5およびCD22-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5で処理したMCF7細胞、b)複合体DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5で処理したMCF7細胞およびLeY-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5(下パネル)で処理したMCF7細胞のFACS分析の結果を示した。LeY-DIGは、標的細胞におけるDharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5の強力な蓄積につながる。c)示された時点にわたって、DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5、CD22-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5、またはLeY-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5で処理したMCF7細胞のEg5/GAPDH mRNAレベルを示した。RNAiは全ての群において見られたが、DharmaFECTの非特異的粘着性はLeY-DIGの特異性に影響を及ぼす。
【図５３】漸増濃度のDIG-DPC-siRNA-Cy3(25 nM、50 nM、100 nM、150nM、図53a)で処理したMCF7細胞、または漸増濃度の複合体LeY-DIG/DIG-DPC-siRNA-Cy3(25 nM、50 nM、100 nM、150nM 図53b)で処理したMCF7細胞のFACS分析の結果を示した。LeY-DIGは、標的細胞におけるDIG-DPC-siRNA-Cy3の強力な蓄積につながる。c)漸増濃度のDIG-DPC-AhaIまたは複合体CD22-DIG/DIG-DPC-AhaIで処理したMCF7細胞のAhaI/GAPDH mRNAレベルを示した。d)漸増濃度の複合体CD22-DIG/DIG-DPC-AhaI、VEGFR2-DIG/DIG-DPC-AhaI、またはLeY-DIG/DIG-DPC-AhaIで処理したMCF7細胞のAhaI/GAPDH mRNAレベルを示した。e)漸増濃度のDIG-DPC-AhaIまたは複合体CD22-DIG/DIG-DPC-AhaIもしくはLeY-DIG/DIG-DPC-AhaIで処理したMCF7細胞のAhaI/GAPDH mRNAレベルを、DIG-DPC-GL3または複合体CD22-DIG/DIG-DPC-GL3もしくはLeY-DIG/DIG-DPC-GL3と比較して示した。f)標的化特異性率を時間に対してプロットした。このことから、MCF7細胞をLeY-DIG/DIG-DPC-AhaIで4〜8時間処理した時に最も高い特異性に達することが分かる。
【図５４】a)およびb):SEC-MALLSによって測定したDIG-DPC-siRNA AHAI(図54a)およびLeY-DIG/DIG-DPC-siRNA AHAI(図54b)の分子量範囲。黒色曲線:LS検出器が発生したシグナル;灰色の線:LSおよびRI検出器のシグナルから作成した分子量;作成した分子量は近似値にすぎない。なぜなら、DIG-DPC-siRNA AHAIの正確なdn/dc値は未知であり、PEGのdn/dc値である0.146と推定されたからである。c)およびd):SEC-MALLSによって測定したDIG-DPC-siRNA AHAI(図54c)およびLeY-DIG/DIG-DPC-siRNA AHAI(図54d)の流体力学半径。黒色曲線:LS検出器が発生したシグナル;点線:QELS検出器のシグナルから作成した流体力学半径。LeY-DIGを添加すると、LeY-DIGおよびDIG-DPC-siRNA AHAIの複合体が形成する。
【図５５】(a)ペイロード複合体形成のために様々な実体を含有する、ハプテンを介したペイロード送達のためのビヒクル。b)〜d)表面プラズモン共鳴実験から、細胞表面標的化の結合特異性および親和性ならびにビオチン結合モジュールの機能が保持されていることが分かる。
【図５６】(a)<Dig>二重特異性抗体、ジゴキシゲニン化siRNA、およびsiRNA結合モジュールを含有するトランスフェクション促進実体からなる複合体。(b)ゲルシフトアッセイは、siRNA結合モジュールを含有するトランスフェクション促進実体とジゴキシゲニン化siRNAとの複合体形成、および二重特異性標的化実体との「超複合体(supercomplex)」の形成を証明している。(c)siRNAに結合し、トランスフェクション機能を有するペプチド/タンパク質モジュールによって促進される標的送達を用いたAha1 mRNAの特異的な減少。
【図５７】<標的-Dig>二重特異性抗体と複合体を形成したDIG標識siRNA-脂質ナノ粒子によって処理した後のMCF-7細胞におけるsiRNAを介したmRNAノックダウン。AHA1 mRNAレベル(GAPDHを基準とする)は、LeY抗原を発現するが、CD22を発現しないMCF-7乳癌細胞において、<標的-DIG>二重特異性抗体とプレとインキュベートしたDIG標識siRNA-脂質ナノ粒子と12時間インキュベーションした後に確かめられた。y軸:相対AHA1-mRNA濃度/[％]。
【実施例】
【０１３３】
実施例1:マウスハイブリドーマクローン19-11に由来するマウス<Dig>IgG1κのVHドメインおよびVLドメインをコードするcDNAの単離および特徴付け
組換え<Dig>抗体、抗体断片、および融合タンパク質を設計、作製、最適化、および特徴付けするのに必要な条件は、タンパク質配列および(DNA)配列の情報が入手可能なことである。従って、ハイブリドーマクローン19-11に由来する「最初の」マウス<Dig>抗体のVHドメインおよびVLドメインについて、この情報が得られなければならない。この後に行う必要のある実験工程は、(i)<Dig>産生19-11ハイブリドーマ細胞からRNAを単離すること、(ii)このRNAをcDNAに変換し、次いで、cDNAをVHを有するPCR断片およびVLを有するPCR断片に変換すること、ならびに(iii)大腸菌において増やすために、これらのPCR断片をプラスミドベクターに組込み、これらのDNA(および推定タンパク質)配列を決定することである。
【０１３４】
19-11ハイブリドーマ細胞からのRNA調製:
Rneasy-Kit(Qiagen)を適用することによって、RNAを5x10e6個の抗体発現ハイブリドーマ細胞(クローン19-11)から調製した。簡単に述べると、沈殿させた細胞をPBSで1回洗浄し、沈殿させ、その後に、溶解のために500μl RLT-Puffer(+β-ME)に再懸濁した。細胞をQiashredder(Qiagen)に通すことによって完全に溶解し、次いで、製造業者のマニュアルに記載のようにマトリックスを介した精製手順(ETOH, RNeasyカラム)に供した。最後の洗浄工程の後に、RNAを50ul RNaseフリー水に溶解してカラムから回収した。回収したRNAの濃度は、1:20に希釈した試料のA260およびA280を定量することによって求めた。単離したRNA試料の完全性(質、分解の程度)は、ホルムアミド-アガロースゲル上での変性RNAゲル電気泳動によって分析した(Maniatis Manualを参照されたい)。これらのRNAゲル電気泳動の例を図1に示した。個々のバンドはインタクトな18sおよび28sリボソームRNAに相当する。これらのバンドが損なわれていない(強度比が約2:1)ことからRNA調製物の質が良好であることが分かる。19-11ハイブリドーマから単離したRNAを凍結し、分注して-80Cで保管した。
【０１３５】
RACE PCRによる19-11 VHおよびVHをコードするDNA断片の作製
標準的な5'-RLM RACEプロトコールについて述べられた反応を用いて、FirstChoice Kit(Ambion)試薬キットを適用することによって、後の(RACE-)PCR反応のためのcDNAを19-11 RNA調製物から調製した。PCR反応にはPwo DNAポリメラーゼを使用した。このために、10ugの19-11 RNAまたは対照RNA(マウス胸腺由来)を適用し、5'RACEアダプターを組込むために述べられたように処理した。本発明者らは「アウターPCR」反応を適用する必要がなく、「インナーPCR」に直接取りかかった。すなわち、これは、5'RACE Inner Primer(キット由来)およびC-κ特異的プライマーまたはCH1特異的プライマーのいずれかからなるプライマーペアを組み合わせることを伴った。VL領域を増幅するためのcκプライマー配列は、
0005758888.tif 000006
であった。VH領域を増幅するためのCH1プライマー配列は、
0005758888.tif 000007
であった。これらのプライマーの組み合わせの場合、PCRを行うために60℃のアニーリング温度が適しており、55〜65C/(グラジエントPCR)の温度が適用されてきた(94C 0.5分、55〜65C 1分〜72C 1分、35サイクル、72Cで10分の伸長により完了)。抗体VH領域を含有するDNA断片またはVL領域を含有するDNA断片の特異的増幅の成功は、600bp〜800bpのDNA断片が別個に出現することによって反映される。図2は、これらの規定されたDNA断片が19-11 RNAから得られたことを示している。これらのDNA断片は、<Dig>ハイブリドーマ19-11のVHコード配列およびVLコード配列を含有する。
【０１３６】
プラスミドへの19-11 VHおよびVHをコードするDNA断片のクローニングならびにこれらのDNA配列およびタンパク質配列の決定
標準的な分子生物学的技法(Maniatis Manual)によるアガロースゲル抽出および後の精製によって、VHコードPCR断片およびVLコードPCR断片を単離した。正確に製造業者の説明書に従ってpCR bluntII topo Kit(Invitrogen)を適用することによって、Pwoによって作製された精製PCR断片をベクターpCR bluntII topoに挿入した。Topo連結反応物を形質転換によって大腸菌Topo10-one-shotコンピテント細胞に導入した。その後に、VLを含有するインサートまたはVHを含有するインサートを有するベクターを含有する大腸菌クローンを、LB-カナマイシン寒天プレート上にあるコロニーとして特定した。その後に、これらのコロニーからプラスミドを調製し、EcoRIを用いた制限消化によって、ベクターに望ましいインサートが存在することを確認した。ベクターバックボーンは、インサートの両側に隣接するEcoRI制限認識部位を含有するので、EcoRiによって遊離可能な、約800bp(VLの場合)または600bp(VHの場合)のインサートによって、インサートを有するプラスミドが判明した。VHおよびVLの複数のクローンに対する自動DNA配列決定によって、19-11 VLおよびVHのDNA配列および推定タンパク質配列を決定した。<Dig>クローン19-11のVL配列をSeq.ID NO.1に示し、<Dig>クローン19-11のVH配列をSeq.ID NO.2に示した。
【０１３７】
実施例2:mu<Dig>19-11のVHドメインおよびVLドメインのヒト化
抗体配列をヒト化する目的は、マウス由来の最初の抗体の全機能を保持しているが、ヒト免疫系が「異物」と認識する配列もしくは構造が全く無い(またはごくわずかしかない、または無関係な配列もしくは構造を有する)分子を作製することである。この難題に対処することができる様々な手順が利用可能であり、公開されている(Almagro JC, Fransson J Humanization of antibodies. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library; 2008 Jan 1;13:1619-33, Hwang WY, Foote J Immunogenicity of engineered antibodies. Methods (San Diego, Calif.); 2005 May;36(1):3-10)。
【０１３８】
抗体の可変領域の機能は二次および三次(ならびに四次)構造によって決まるが、これらの構造の形成はVHおよびVLの一次配列(ならびに隣接および相互作用する実体)に基づいている。このために、ヒト化の大きな難題は、タンパク質一次配列のある位置を変える必要があっても、構造によって規定される機能を(完全に)保持することにある。従って、抗体の機能上重要な領域(CDR領域)の構造についての知識は、ヒト化を支援するのに非常に重要である。ヒト化したmu<Dig>19-11由来変種を作製するために、本発明者らは、以下のウェットラボならびにインシリコでの実験手順を組み合わせた。本発明者らは、(i)mu<Dig>19-11の抗原結合部位のインシリコ予測から始まり、(ii)ヒトと高度に類似し、全機能を保持している確率が高いhu<Dig>変種をインシリコ予測することができた。最後に、(iii)本発明者らは、本発明者らのインシリコモデルを検証および改善するために、抗原を含む<Dig>抗体(断片)および抗原を含まない<Dig>抗体(断片)の(X線)構造を実験により求めた。
【０１３９】
mu<Dig>19-11の抗原結合部位のインシリコモデリング
mu<Dig>19-11 Fv領域の本発明者らのインシリコ構造モデルの基礎は、実験により決定されたVH mRNA配列およびVL mRNA配列から推定されたタンパク質配列である(実施例1に記載、Seq.ID NO.1およびSeq.ID NO.2)。これらの配列によってコードされるタンパク質の構造モデルを、マウス抗体のFvドメインのホモロジーモデリングとエネルギー最小化によってインシリコで作製した。このために、ホモロジーモデリングのために適用するCDRおよびフレームワーク配列を別々に、PDB(Protein DataBank)上でホモロジー検索した。それぞれのCDRおよびフレームワークについて、さらに多くのホモログ構造が重ね合わされた。その後に、軽鎖および重鎖の異なる部分からモデルを構築した後に、複合体の(エネルギー)最小化を行った。本発明者らのホモロジーモデリング手順に起因するmu<Dig>19-11 Fv領域の構造モデルを図3に示した。予想された構造のかなり特殊な特徴の1つは、VH-VL境界面に深く入り込んでいるように見えるよく目につく空洞である。この狭い空洞が形成する主な決定要因は、VHの長いCDR3ループである。空洞の内部は、1個のメチオニン(深部にある残基)、2個のセリン、2個のプロリン、数個のチロシン(壁に隣接する)によって裏打ちされている。この抗体が認識する抗原ジゴキシゲニンは、深い空洞に入り込んでハプテンのように結合すると考えるのが理にかなっている。
【０１４０】
抗原の存在下でのマウス抗Dig Fv領域の結合領域の結晶化およびX線構造決定
抗ジゴキシゲニン抗体のヒト化したVH配列およびVL配列をさらに最適化するために、本発明者らは実験により親(マウス)抗体の構造を決定した。このために、周知の最新法(パパイン消化)を適用して、精製IgGのプロテアーゼ消化によってFab断片を作製した。(Fcを除去する)プロテインAクロマトグラフィーによって、残りのFc断片からFab断片を分離し、その後に、タンパク質断片を除去するためにサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex200 HiLoad 120ml 16/60ゲル濾過カラム, GE Healthcare, Sewden)に供した。
【０１４１】
結晶化のために、20mM His-HCl、140mM NaCl、pH6.0に溶解した精製FabおよびCy5標識ジゴキシゲニン(DIG-3-cme-dea-Cy5=DIG-Cy5/粉末)と、ジゴキシゲニン化蛍光色素Cy5(Dig-Cy5)との複合体を形成した。結晶セットアップの前に、タンパク質溶液を濃縮した。複合体形成のために、DIG-Cy5を20mM His-HCl、140mM NaCl、pH6.0に溶解し、5:1の最終モル比まで濃縮タンパク質溶液に添加した。DIG-Cy5と複合体を形成したマウスFabの結晶は、タンパク質溶液(24mg/ml)1μlと60％(v/v)2-メチル-1,3-プロパンジオール (MPD)/0.1M酢酸ナトリウムpH4.6/5mM CaCl2を含有するリザーバー溶液1μlを混合した後に、25℃での懸垂滴蒸気拡散法を用いて得られた。結晶をさらに凍結保護する必要なく、液体窒素で急速冷凍した。
【０１４２】
DIG-Cy5と複合体を形成したマウスFabの回折データを、2009年9月11日にX06SA(SLS, Villingen, Switzerland)において収集した。データは、XDS[Kabsch, W., Automatic processing of rotation diffraction data from crystals of initially unknown symmetry and cell constants. J Appl Cryst, 1993. 21:p.916-24.]を用いて統合およびスケール変更した。複合体の結晶は、a=b=138.01Å、c=123.696、α=β=γ=90°で空間群P42212に属し、2.8Åの分解能まで解析された。
【０１４３】
PDB ID 3cfd, 2a6d, 2a6jを有する構造に基づく検索モデルを作製することによって[Debler, E.W., et al., Deeply inverted electron-hole recombination in a luminescent antibody-stilbene complex. Science, 2008. 319(5867):p.1232-5., Sethi, D.K., et al., Differential epitope positioning within the germline antibody paratope enhances promiscuity in the primary immune response. Immunity, 2006. 24(Sethi, D. K., et al., Differential epitope positioning within the germline antibody paratope enhances promiscuity in the primary immune response. Immunity, 2006. 24(4):p.429-38):p.429-38.]、プログラムBALBES[Long, F., et al., BALBES: a molecular-replacement pipeline. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2008. 64(Pt 1):p.125-32.]を用いた分子置換によって、構造を解析した。非対称単位の中に合計2個のFab分子を配置することができた。初期モデルを完了し、プログラムCOOT[Emsley, P. and K. Cowtan, Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2004. 60(Pt 12 Pt1):p.2126-32.]を用いた手作業のモデル構築およびプログラムPHENIX[Zwart, P. H., et al., Automated structure solution with the PHENIX suite. Methods Mol Biol, 2008. 426:p.419-35.]を用いた精密化によって精密化した。初回の精密化の後に、DIG-Cy5のDIG部分の差電子密度(difference electron density)が現われた。DIGモデルはPDB ID 1lkeから入手し[ Korndorfer, I.P., S. Schlehuber, and A. Skerra, Structural mechanism of specific ligand recognition by a lipocalin tailored for the complexation of digoxigenin. J Mol Biol, 2003. 330(2):p.385-96.]、DIGの精密化パラメータはオンラインツールPRODRG [ Schuttelkopf, A.W. and D.M. van Aalten, PRODRG: a tool for high-throughput crystallography of protein-ligand complexes. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2004. 60(Pt8):p.1355-63.]によって作成した。最後の精密化工程のために電子密度の中にDIGモデルを配置した。精密化の統計値については、図45aを参照されたい。図はプログラムPYMOL[ DeLano, W. L., The PyMOL Molecular Graphics System.2008.]を用いて作成した。
【０１４４】
実験的構造決定の結果を図45bに示した。すなわち、得られた結晶型は、非対称単位の中に2つの独立したDIG-Cy5:抗DIG Fab複合体を含有し、両複合体の原子モデルを構築することができた。DIG-Cy5のDIG部分は非対称単位の中の両Fab分子において秩序立っているが、非対称単位の一方の分子に、他方の分子より密接に結合しているように見える。DIGは、L鎖およびH鎖の境界面にあり、CDR中央に位置するポケットの中に結合する。DIGの原子O32はポケットの底部に向いており、Cy5とのリンカーは外側にあり、溶媒の中に向いている。DIGに加えて、Cy5とのリンカーの最初のC原子について、はっきりした2Fo-Fc電子密度が見える(図45bのパネルB)。リンカーの可動性のために、リンカーの残部もCy5も電子密度地図には目に見えない。この障害から、リンカーはタンパク質に取り付けられておらず、抗体によるDIGの認識に影響を及ぼすことなく、異なる性質およびサイズの分子、例えば、色素、siRNA、およびその他をDIGに取り付けるのに十分な長さがあることが分かる。
【０１４５】
興味深いことに、結合ポケットは、DIGのような疎水性分子について予想されるように完全に疎水性でなく、いくらかの正電荷ポテンシャルを含んでいる(図45bのパネルC)。結合ポケットは、重鎖の4つのチロシン残基(57、59、109、110)、ならびにA33、W47、P61、P99、およびM112によって裏打ちされている。軽鎖からは、残基Q89、S91、L94、P96、およびF98がポケット形成に関与している。軽鎖の可能性のある水素結合パートナーN35およびY36がポケットの底部を形成するが、DIGに到達しない(図45cのパネルA)。
【０１４６】
DIG結合には直接的な水素結合が1つしか関与せず、DIGのO32と軽鎖のQ89との間で形成する。もう2つの水素結合は直接的でないが、水分子によって媒介される。O12は、重鎖のY109のカルボニル酸素およびS35の側鎖と相互作用している(図45cのパネルB)。4番目の水素結合は、O14とS91のバックボーンカルボニル酸素(L鎖)との間で形成するが、これも水分子によって媒介される。非対称単位の両分子にある水素結合の数および長さの比較から、2番目の複合体において、DIGはポケットに完全に入ることができないことが分かる。一方の分子では、DIG部分はポケットの中にかなり深く入り込み、4つの水素結合を形成する。2番目のDIGはゆるく結合しており、他方の分子ほど深くポケットに入らず、他方の分子より弱い水素結合を3つしか形成しない (図45cのパネルC)。
【０１４７】
結合領域を2.8Åの分解能で実験により決定した結果から、リガンドとその抗体の結合モードを特徴付けることができる。これは、構造が一次配列のインシリコ分析によって本発明者らが予測した構造モデルとおおむね似ていることをさらに裏付けている(前記を参照されたい)。親抗体の可変領域のインシリコでモデル化された構造ならびに実験で決定された「リアルな」構造を利用できることが、組換えジゴキシゲニン結合モジュールの詳細なモデリングおよびタンパク質工学を介したさらなる改善に必要な条件である。
【０１４８】
全機能を保持しているmu<Dig>19-11ヒト化変種の規定
望ましいヒト化VHドメインおよびヒト化VLドメインに相当するアミノ酸配列が、CDRグラフティングならびに結合特異性および親和性を調節するさらなる変異の導入に基づく手順を適用することによって規定された。この手順の基礎となる基本原理は、ヒト生殖系列の中での、マウス配列と異なる各アミノ酸配列の「スコア値」の帰属(attribution)である。このスコアは、抗原認識能力または複合体安定性に及ぼすアミノ酸電荷の推定上の影響によって規定される。低いスコアおよび相対的な高い使用頻度に基づいて、ヒト生殖系列が選択される。結果として生じるヒト化分子にt細胞エピトープがごくわずかしか無いように、または全く無いようにするために、このヒト化手順にはTEPITOPE分析(T細胞エピトープを予測する)が含まれる。最初に、この手順によって規定された「ヒト」配列は、スコアが高すぎる場合(負の干渉の高い可能性を示す)、(最初の)マウス配列と交換する必要がある場合がある。これは、CDRまたはCDR配列の周囲領域におけるアミノ酸変化に最も頻繁に必要とされる。場合によっては、安定性および機能性を保持するために、マウス残基への「逆突然変異」がCDRだけでなくフレームワークの中でも必要とされる。
【０１４９】
本発明者らが選択した、結果として生じたhu<Dig>変種は、ヒトフレームワークVH3 11およびVL1 39の組み合わせに基づいており、ヒトと高度の類似性を有する。VLの場合、VK1 39のフレームワークおよびIGKJ4-01/02生殖系列のヒトj要素において逆突然変異を組込む必要はなかった。これは、高いヒト特徴および比較的少ない数のTEPITOPEアラートにつながった。VH変種は、ヒトVH3 23生殖系列およびヒトJ IGHJ6-01-2に由来する。変種JはVH3 11生殖系列において構築された。さらに、本発明者らのスコアリング法を用いて、本発明者らは、ヒト特徴を高め、TEPITOPEアラートの数を減らすためにCDRの中に1つのヒトアミノ酸を導入することができた。ヒト化VH(およびFd断片)のタンパク質配列をSeq.ID NO.3およびSeq.ID NO.4に示し、ヒト化VL(およびL鎖)のタンパク質配列をSeq.ID NO.5およびSeq.ID NO.6に示した。本発明者らの確立した手順を注意深く適用したにもかかわらず、依然として、ヒト化VHおよびヒト化VLの一部である配列変化がFv領域の構造完全性を妨害し得るという可能性が存在する。このために、本発明者らは、前記と同じインシリコ手順をヒト化Fv配列に適用することによって、さらなる<Dig>構造形式を作製した。この構造を図4に示した。mu<Dig>構造(図3)およびhu<Dig>構造(図4)の比較から、抗原結合部位は、ヒト化の間に導入されたアミノ酸変化の影響を受けないことが分かる。
【０１５０】
親和性が増大したジゴキシゲニン結合モジュールの作製
抗ジゴキシゲニン抗体のヒト化VH配列およびヒト化VL配列のさらなる最適化を適用して、ジゴキシゲニンに対する親和性がさらに高いモジュールを作製した。実験により決定された予測構造、ならびにインシリコで計算された予測構造(前記を参照されたい、実験による構造決定のない構造モデリングに基づく)に基づいて、本発明者らは、変化すると親和性に影響し得る3つの位置を特定した。これらは、VHドメインの(Kabat位置)Ser49、Ile57、およびAla60に位置した(図46)。アミノ酸VHSer49とAlaを交換、VHIle57とAlaを交換、およびVHAla60とProを交換することによって、SEQ ID NO 36およびSEQ ID NO 37として列挙した配列を有する抗体誘導体が作製された。この配列からなる結合実体を発現させ、標準的なプロテインAおよびサイズ排除技術を用いて精製することができた(実施例3の「組換えヒト化<Dig>抗体、断片、および二重特異性融合タンパク質の組成、発現、および精製」を参照されたい)。結果として生じた分子は完全に機能し、ヒト化親分子と比較してジゴキシゲニンに対する改善した親和性を示した。これは表面プラズモン共鳴(BiaCore)実験によって証明された(詳細については、実施例4の「組換え<Dig>抗体、断片、および二重特異性融合タンパク質とジゴキシゲニン化抗原との結合」を参照されたい)。これらの実験の結果を図46に示し、VH49、VH57、およびVH60変異を導入することによって、ジゴキシゲニンに対する親和性が約10倍改善したと判明した。この後に、dig結合可変領域の実験により決定された構造を検査することによって、これらの位置の関係が確かめられた。親和性が改善したジゴキシゲニン結合モジュールは、様々な二重特異性抗体誘導体用および多重特異性抗体誘導体用のハプテン結合実体として適用することができる。
【０１５１】
実施例3:組換えヒト化<Dig>抗体、断片、および二重特異性融合タンパク質の組成、発現、および精製
さらに詳細な特徴付けのために、ヒト化IgGを形成するために、または他の抗体配列との二重特異性融合タンパク質を作製するために、マウス<Dig>モジュールおよびヒト化<Dig>モジュールをヒト抗体の定常領域と組み合わせた。ヒト化<Dig>IgG、ならびにDigおよび他の標的(例えば、受容体型チロシンキナーゼHer2またはIGF1R)に結合する二重特異性誘導体の作製には、(i)このような分子のアミノ配列およびヌクレオチド配列を設計および規定すること、(ii)これらの分子を、トランスフェクトされた哺乳動物培養細胞において発現させること、ならびに(iii) これらの分子を、トランスフェクトされた細胞の上清から精製することが必要であった。
【０１５２】
<Dig>IgGならびにジゴキシゲニンおよびHer2またはIGF1Rに結合する二重特異性抗体誘導体のアミノ配列およびヌクレオチド配列の設計および規定
(最初の)マウスmu<Dig>19-11 Fv領域の結合特異性を有するヒト化IgGを作製するために、本発明者らは、前記で規定されたヒト化VH配列とIgG1のCH1-CH2-CH3のN末端をインフレームで融合した。同様に、本発明者らは、前記で規定されたヒト化VL配列とCκのN末端をインフレームで融合した。結果として生じたhu<her2><Dig>IgG H鎖およびL鎖のアミノ酸配列を、Seq.ID NO.7、 Seq.ID NO.8、およびSeq.ID NO.9に示した。hu<Dig>の結合特異性ならびに受容体型チロシンキナーゼHer2に対する特異性を含む二重特異性抗体誘導体を作製するために、本発明者らは、ヒト化したVH配列およびVL配列によって規定される<Dig>単鎖Fvモジュールと、以前に述べられた<Her2>抗体(例えば、米国特許第5,772,997号)のH鎖のC末端をインフレームで融合した。以前に述べられているVH44-VL100ジスルフィド結合を導入することによって、この<Dig>scFvモジュールをさらに安定化した(例えば、Reiter Y, Brinkmann U, Lee B, Pastan I Engineering antibody Fv fragments, for cancer detection and therapy: disulfide-stabilized Fv fragments. Nature biotechnology; 1996 Oct; 14(10):1239-45)。Her2ならびにジゴキシゲニンに結合する、結果として生じた二重特異性抗体誘導体のアミノ酸配列を、Seq.ID NO.7、 Seq.ID NO.8、およびSeq.ID NO.9に示した。
【０１５３】
hu<Dig>の結合特異性ならびに受容体型チロシンキナーゼIGF1Rに対する特異性を含む二重特異性抗体誘導体を作製するために、本発明者らは、ヒト化したVH配列およびVL配列によって規定された<Dig>単鎖Fvモジュールと、以前に述べられた<IGF1R>抗体のH鎖のC末端をインフレームで融合した。以前に述べられているVH44-VL100ジスルフィド結合を導入することによって、この<Dig>scFvモジュールをさらに安定化した(例えば、Reiter Y, Brinkmann U, Lee B, Pastan I Engineering antibody Fv fragments. for cancer detection and therapy: disulfide-stabilized Fv fragments. Nature biotechnology; 1996 Oct;14(10):1239-45)。IGF1Rおよびジゴキシゲニンに結合する、結果として生じた二重特異性抗体誘導体のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を、Seq.ID NO.10、 Seq.ID NO.11、およびSeq.ID NO.12に列挙した。
【０１５４】
<Dig>IgGならびにジゴキシゲニンおよびHer2またはIGF1Rに結合する二重特異性抗体誘導体の発現
FreeStyle(商標)293発現系を用いて製造業者の説明書(Invitrogen, USA)に従って、ヒト胚腎臓293-F細胞の一過的トランスフェクションによって、<Dig>IgGおよび二重特異性抗体誘導体を発現させた。このために、対応する二重特異性抗体の軽鎖および重鎖を、原核生物選択マーカーおよび真核生物選択マーカーを有する発現ベクターの中に構築した。これらのプラスミドを大腸菌において増幅し、精製し、その後に、一過的トランスフェクションに適用した。細胞を取り扱うために、Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M.(eds.), John Wiley & Sons, Incに記載のように、標準的な細胞培養法を使用した。懸濁FreeStyle(商標)293-F細胞をFreeStyle(商標)293 Expression培地に入れて37℃/8％CO2で培養し、トランスフェクションの日に、細胞を1〜2x106生細胞/mlの密度で新鮮培地に播種した。250ml最終トランスフェクション体積のために333μlの293fectin(商標)(Invitrogen, Germany)ならびに250μgの1:1モル比の重鎖プラスミドDNAおよび軽鎖プラスミドDNAを用いて、DNA-293fectin(商標)複合体をOpti-MEMI培地(Invitrogen, USA)に溶解して調製した。トランスフェクションの7日後に、IgGまたは二重特異性抗体を含有する細胞培養上清を、14000gで30分の遠心分離および滅菌フィルター(0.22μm)に通す濾過によって清澄化した。精製まで上清を-20℃で保管した。
【０１５５】
細胞培養上清中の抗体および誘導体の濃度を求めるために、アフィニティHPLCクロマトグラフィーを適用した。このために、プロテインAに結合する抗体および誘導体を含有する細胞培養上清を200mM KH2PO4、100mMクエン酸ナトリウム、pH7.4に溶解してApplied Biosystems Poros A/20カラムにアプライし、UltiMate 3000 HPLCシステム(Dionex)によって200mM NaCl、100mMクエン酸、pH2,5を用いてマトリックスから溶出させた。溶出したタンパク質をUV吸光度およびピーク面積の積分によって定量した。精製された標準IgG1抗体は標準として役立った。
【０１５６】
<Dig>IgGならびにジゴキシゲニンおよびHer2またはIGF1Rに結合する二重特異性抗体誘導体の精製
発現プラスミドトランスフェクションの7日後に、HEK293細胞上清を収集した。この中に含まれる組換え抗体(誘導体)を上清から、プロテインA-Sepharose(商標)(GE Healthcare, Sweden)を用いたアフィニティクロマトグラフィーおよびSuperdex200サイズ排除クロマトグラフィーによって二段階で精製した。簡単に述べると、二重特異性抗体および三重特異性抗体を含有する清澄化培養上清を、PBS緩衝液(10mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、137mM NaCl、および2.7mM KCl、pH7.4)で平衡化したHiTrap ProteinA HP(5ml)カラムにアプライした。結合しなかったタンパク質を平衡化緩衝液によって洗い流した。二重特異性抗体を0.1Mクエン酸緩衝液、pH2.8によって溶出させ、タンパク質含有画分を0.1ml 1M Tris、pH8.5によって中和した。次いで、溶出したタンパク質画分をプールし、Amicon Ultra遠心フィルター装置(MWCO:30K, Millipore)によって3mlの体積まで濃縮し、20mM ヒスチジン(Histidin)、140mM NaCl、pH6.0で平衡化したSuperdex200 HiLoad 120 ml 16/60ゲル濾過カラム(GE Healthcare, Sweden)にロードした。精製された抗体および誘導体のタンパク質濃度は、Pace et. al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423に従ってアミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、280nmでの光学密度(OD)とバックグラウンド補正として320nmでのODを測定することによって求めた。単量体抗体画分をプールし、瞬間冷凍し、-80℃で保管した。後のタンパク質分析および特徴付けのために、試料の一部を用意した。
【０１５７】
DIGHu2抗体構築物および二重特異性DIG構築物の均一性を、還元剤(5mM 1,4-ジチオトレイトール)の存在下および非存在下のSDS-PAGEならびにクーマシーブリリアントブルー染色によって確認した。NuPAGE(登録商標)Pre-Castゲルシステム(Invitrogen, USA)を製造業者の説明書に従って使用した(4〜20％Tris-グリシンゲル)。
【０１５８】
還元条件下で(図5〜7)、IgGに関連し、C末端scFv融合にも関連するポリペプチド鎖は、SDS-PAGEの際に、計算分子量と類似する見かけの分子サイズを示した。構築物の発現レベルは全てプロテインA  HPLCによって分析され、「標準」IgGの発現収率と類似していたか、IGF-1RDIGHu2-2321の場合は低かった。平均タンパク質収率は、このような非最適化一過的発現実験において6〜35mg精製タンパク質/L細胞培養上清であった(図8)。
【０１５９】
二重特異性抗体試料の凝集物内容物を、高速SECによって、Superdex200分析用サイズ排除カラム(GE Healthcare, Sweden)を用いたUltiMate 3000 HPLCシステム(Dionex)において200mM KH2PO4、250mM KCl、pH7.0ランニング緩衝液に溶解して25℃で分析した。25μgのタンパク質を0.5ml/minの流速でカラムに注入し、50分にわたって均一濃度で溶出させた。安定性分析のために、0.1mg/ml、1mg/ml、および3mg/mlの精製タンパク質の濃度を調製し、4℃、37℃で7日間インキュベートし、次いで、高速SECによって評価した。Peptide-N-GlycosidaseF(Roche Molecular Biochemicals)による酵素処理によってN-グリカンを除去した後に、還元された二重特異性抗体軽鎖および重鎖のアミノ酸バックボーンの完全性をNanoElectrospray Q-TOF質量分析によって確認した。精製タンパク質のHP-サイズ排除クロマトグラフィー分析による凝集物分析から、(「正常」IgGと比較して)VHとVLとの間の鎖間ジスルフィドによって安定化されていないscFvを含有する分子は凝集傾向が著しく大きくなることが分かった。このような二重特異性抗体の凝集に関する問題に対処するために、scFv部分のジスルフィド安定化を適用した。このために、本発明者らは、scFvのVHおよびVLの中にある規定された位置(Kabatナンバリング法によれば位置VH44/VL100)に1個のシステイン交換を導入した。これらの変異によって、VHとVLとの間に安定した鎖間ジスルフィドの形成が可能になり、その結果として、結果として生じたジスルフィド安定化scFvモジュールが安定化する。scFvの中にあるFvのN末端およびC末端にVH44/VL100ジスルフィドを導入すると、全ての構築物についてタンパク質発現レベルがかなり改善した(図9)。Her2DIGHu2-2320の最終収率は精製後に1mgであったのに対して、Her2DIGHu2-2321の最終収率は約32mgであった。
【０１６０】
実施例4:組換えヒト化<Dig>抗体、断片、および融合タンパク質とジゴキシゲニン化抗原との結合
以下で述べる分析は、ヒト化手順によって完全な結合活性を保持している<Dig>誘導体が得られたかどうか評価するために行った。このために、Biacore T100またはBiacore 3000機器(GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala)を用いて表面プラズモン共鳴(SPR)技術によって、組換え<Dig>誘導体の結合特性を分析した。このシステムは分子相互作用研究用に十分に確立している。これは、リガンド/分析物結合を連続リアルタイムモニタリングし、従って、様々なアッセイ設定において会合速度定数(ka)、解離速度定数(kd)、および平衡定数(KD)を求めることができる。SPR技術は、金でコーティングされたバイオセンサーチップ表面近くの屈折率を測定することに基づく。屈折率の変化から、固定化されたリガンドと、溶解状態で注入された分析物の相互作用によって引き起こされる表面の質量変化が分かる。分子が、表面にある固定化リガンドに結合すれば質量が増大し、解離すれば質量が減少する。結合研究を行うために、捕捉用の抗ヒトIgG抗体を、アミンカップリング化学を用いてCM5バイオセンサーチップ表面に固定化した。フローセルを、0.1M N-ヒドロキシスクシンイミドおよび0.1M 3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル-N-エチルカルボジイミドの1:1混合物によって5μl/minの流速で活性化した。特に断りのない限り、10μg/mlの抗ヒトIgG抗体を酢酸ナトリウム、pH5.0に溶解して注入した。これによって、約12000RUの表面密度が得られた。参照対照フローセルを同様に処理したが、捕捉用抗体の代わりにビヒクル緩衝液のみで処理した。1Mエタノールアミン/HCl pH8.5を注入することによって表面をブロックした。ヒト化タンパク質変種の結合と、最初のハイブリドーマ19-11に由来するマウス<Dig>IgGの結合を比較するために、抗ヒトIgG抗体について前記で述べられたのと同様に、捕捉用抗マウスIgG抗体をCM5バイオセンサーチップ表面に固定化した。組換え<Dig>誘導体の機能を評価するために、(i)ヒト化IgG、(ii)hu<Dig>scFvを有する融合タンパク質、または(iii)ジスルフィド安定化scFvを含む組換えhu<Dig>モジュールの結合を、様々なジゴキシゲニン化抗原を用いてアッセイした。結果として生じた結合親和性を、組換えヒト化モジュールが得られたマウス「野生型」DIG-IgGの結合と比較した。
【０１６１】
ハイブリドーマ由来マウス<Dig>19-11とヒト化<Dig>IgGとの比較
抗マウスIgG抗体を、前記と同様にCM5バイオセンサーチップ表面に固定化した。2μg/mlの抗ヒトIgG抗体を注入し、これによって約600RUの表面密度が得られた。それぞれの結合サイクルの後に共有結合していないタンパク質を除去するために、0.85％H3PO4を60秒間、5μl/minで注入し、次いで、5mM NaOHを60秒間、5μl/minで注入することによって、再生を行った。分析しようとする試料をHBS-P(10mM HEPES、pH7.4、150mM NaCl、0.005％Surfactant P20)で希釈し、5μl/minの流速で注入した。接触時間(会合相)は1〜5nMの濃度の抗体の場合、3分であった。結合親和性を測定するために、様々なジゴキシゲニン化抗原を漸増濃度にして注入した。漸増濃度は、DIG-BP4については0.3125、0.625、1.25、2.5、5、および10nMであり、DIG-siRNAについては0.018〜300nMであった。接触時間(会合相)は3分であり、解離時間(ランニング緩衝液による洗浄)は30μl/minの流速で各分子について5分であった。全ての相互作用を25℃(標準温度)で行った。マウス<DIG>19-11の場合、それぞれの結合サイクルの後に共有結合していないタンパク質を除去するために、10mMグリシン/HCl pH1.5の再生溶液を30μl/minの流速で60秒間注入した。ヒト化<DIG>IgGの場合、0.85％H3PO4を60秒間5μl/minで注入し、次いで、5mM NaOHを60秒間5μl/minで注入することによって、再生を行った。シグナルは1シグナル/秒の割合で検出した。
【０１６２】
これらの分析の結果を図10に例として示し、表3にまとめた。これから、組換えヒト化<Dig>は、マウス親抗体と同じ機能および高親和性で、ジゴキシゲニン化したタンパク質および核酸に結合することが分かる。ジゴキシゲニン化タンパク質(Dig-BP4、欧州特許EP1545623B1)に対するマウス抗体のKdは33pMであることが判明し、ヒト化抗体のKdは<76pMであった。同様に、ジゴキシゲニン化核酸(siRNA-Dig、実施例11を参照されたい)に対するマウス抗体のKdは269pMであることが判明し、ヒト化抗体のKdは12nMであった。従って、本発明者らは、<Dig>抗体の機能は、(Seq.ID NO.3、 Seq.ID NO.4、 Seq.ID NO.5、およびSeq.ID NO.6に示した配列によって規定された)そのヒト化変種において保持されていると結論付けた。
【０１６３】
ハイブリドーマ由来マウス<Dig>19-11と組換えヒト化<Dig>-単鎖Fv-融合タンパク質との比較
抗マウスIgG抗体および抗ヒトIgG抗体を、実施例4の序文において述べられたのと同様にCM5バイオセンサーチップ表面に固定化した。分析しようとする試料をHBS-Pで希釈し、5μl/minの流速で注入した。接触時間(会合相)は1〜5nMの濃度の抗体の場合、3分であった。結合親和性を測定するために、様々なジゴキシゲニン化抗原を漸増濃度にして注入した。漸増濃度は、DIG-BP4については0.3125、0.625、1.25、2.5、5、および10nMであり、DIG-siRNAについては0.018〜120nMであった。接触時間(会合相)は3分であり、解離時間(ランニング緩衝液による洗浄)は30μl/minの流速で各分子について5分であった。全ての相互作用を25℃(標準温度)で行った。それぞれの結合サイクルの後に共有結合していないタンパク質を除去するために、10mMグリシン/HCl pH1.5の再生溶液を30μl/minの流速で60秒間注入した。RNAseがリガンドとして用いられる時には、0.85％H3PO4を60秒間、5μl/minで注入し、次いで、5mM NaOHを60秒間、5μl/minで注入することによって、再生を行った。シグナルは1シグナル/秒の割合で検出した。
【０１６４】
これらの分析の結果を図11に例として示し(図10におけるマウス<Dig>19-11の結果)、表3にまとめた。これから、適用された二重特異性融合タンパク質(Her2-Dig、実施例3を参照されたい)に存在する組換えヒト化<Dig>scFvモジュールは、マウス親抗体と同じ機能および高親和性で、ジゴキシゲニン化したタンパク質および核酸に結合することが分かる。ジゴキシゲニン化タンパク質(Dig-BP4)に対するマウス抗体のKdは33pMであることが判明し、ヒト化単鎖FvのKdは68pMであった。同様に、ジゴキシゲニン化核酸(siRNA-Dig、実施例11を参照されたい)に対するマウス抗体のKdは269pMであることが判明し、ヒト化単鎖FvのKdは35nMであった。従って、本発明者らは、野生型抗体の機能は、二重特異性融合タンパク質(Her2-Dig、実施例3を参照されたい)に存在する組換えヒト化<Dig>scFvモジュールにおいても保持されていると結論付けた。
【０１６５】
ハイブリドーマ由来マウス<Dig>19-11と組換えヒト化<Dig>-ジスルフィド安定化単鎖Fv-融合タンパク質との比較
抗マウスIgG抗体および抗ヒトIgG抗体を、実施例4の序文において述べられたのを同様にCM5バイオセンサーチップ表面に固定化した。DIG-RNAseをリガンドとして添加したアッセイでは、2μg/mlを注入することによって、抗ヒトIgG抗体をチップ表面に固定化した。これによって、約600RUの表面密度が得られた。分析しようとする試料をHBS-Pで希釈し、5μl/minの流速で注入した。接触時間(会合相)は1〜10nMの濃度の抗体の場合、3分であった。結合親和性を測定するために、様々なジゴキシゲニン化抗原を漸増濃度にして注入した。漸増濃度は、DIG-siRNAについては0.018nM〜120nMであった。結合を視覚化するために、様々なジゴキシゲニン化RNAse(ヒトおよびウシ)を各Razeについて50nMの濃度で2回繰り返して注入した。接触時間(会合相)は3分であり、解離時間(ランニング緩衝液による洗浄)は30μl/minの流速で各分子について5分であった。全ての相互作用を25℃(標準温度)で行った。それぞれの結合サイクルの後に共有結合していないタンパク質を除去するために、10mMグリシン/HCl pH1.5の再生溶液を30μl/minの流速で60秒間注入した。シグナルは1シグナル/秒の割合で検出した。
【０１６６】
これらの分析の結果を図12に例として示し(図10におけるマウス<Dig>19-11の結果)、表3にまとめた。これから、適用された二重特異性融合タンパク質(Her2-Dig、実施例3を参照されたい)に存在する組換えジスルフィド安定化ヒト化<Dig>scFvモジュールは、マウス親抗体と同じ機能および高親和性でジゴキシゲニン化核酸に結合することが分かる。ジゴキシゲニン化核酸(siRNA-Dig、実施例11を参照されたい)に対するマウス抗体のKdは269pMであることが判明し、ジスルフィド安定化ヒト化<Dig>scFvモジュールのKdは32nMであった。従って、本発明者らは、野生型抗体の機能は、二重特異性融合タンパク質(Her2-Dig、実施例3を参照されたい)に存在する組換えジスルフィド安定化ヒト化<Dig>scFvモジュールにおいても保持されていると結論付けた。
【０１６７】
ハイブリドーマ由来マウス<Dig>19-11と組換えマウス<Dig>-ジスルフィド安定化単鎖Fv-融合タンパク質との比較
分析しようとする試料をHBS-Pで希釈し、5μl/minの流速で注入した。接触時間(会合相)は1〜5nMの濃度の抗体の場合、3分であった。結合親和性を測定するために、様々なジゴキシゲニン化抗原を漸増濃度にして注入した。漸増濃度は、DIG-BP4については0.3125、0.625、1.25、2.5、5、および10nMであり、DIG-siRNAについては0.018nM〜120nMであった。接触時間(会合相)は3分であり、解離時間(ランニング緩衝液による洗浄)は30μl/minの流速で各分子について5分であった。全ての相互作用を25℃(標準温度)で行った。それぞれの結合サイクルの後に共有結合していないタンパク質を除去するために、10mMグリシン/HCl pH1.5の再生溶液を30μl/minの流速で60秒間注入した。シグナルは1シグナル/秒の割合で検出した。
【０１６８】
これらの分析の結果を図13に例として示し(図10におけるマウス<Dig>19-11の結果)、表3にまとめた。これから、適用された二重特異性融合タンパク質(Her2-Dig、実施例3を参照されたい)に存在する組換えマウスジスルフィド安定化<Dig>scFvモジュールは、マウス親抗体と同じ機能および高親和性でジゴキシゲニン化核酸に結合することが分かる。ジゴキシゲニン化核酸(siRNA-Dig、実施例11を参照されたい)に対するマウス抗体のKdは269pMであることが判明し、ジスルフィド安定化マウス<Dig>scFvモジュールのKdは467pMであった。従って、本発明者らは、野生型抗体の機能は、二重特異性融合タンパク質(Her2-Dig、実施例3を参照されたい)に存在する組換えマウスジスルフィド安定化<Dig>scFvモジュールにおいても保持されていると結論付けた。
【０１６９】
（表３）様々なジゴキシゲニン化抗原に対するマウス「野生型」DIG-IgGおよび組換え<Dig>誘導体の結合親和性
0005758888.tif 000008
【０１７０】
一ジゴキシゲニン化タンパク質であるDIG-ミオグロビンとの結合の点で<DIG>-hu2、IGF1R-DIG、および<DIG>M-19-11の結合親和性を比較した別のSPR研究を行った。DIG-Myoに対する<DIG>-hu2およびジスルフィド安定化<DIG>scFvの結合親和性は同等であり(約15〜25nM)、マウス<DIG>M-19-11の親和性は、一ジゴキシゲニン化核酸の結合についても述べられていたように(前記を参照されたい)ほぼ100倍優れていた。DIG-BP4に対する<DIG>-hu2の親和性(<76pM、表3を参照されたい)およびDIG-BP4に対するジスルフィド安定化<DIG>scFvの親和性(68pM、表3を参照されたい)がDIG-ミオグロビンに対する親和性(表3aを参照されたい)と比較してかなり高いことは、DIG-BP4に対する結合のアビディティ作用による可能性が最も高い。なぜなら、タンパク質DIG-BP4はその表面に複数のDIG分子を有するからである。
【０１７１】
（表３ａ）
0005758888.tif 000009
【０１７２】
様々な形式を用いて二重特異性ジゴキシゲニン結合実体および多重特異性ジゴキシゲニン結合実体を作製することができる
様々な形式でジゴキシゲニン結合モジュールを細胞標的化実体に接続することができる。例えば、このために、「古典的な」抗体断片およびFabまたはFvなどの抗体由来モジュールを適用できるだけでなく、文献に以前に記載されたことのある単一ドメイン抗体様実体も適用することができる。(図6に例示され、多くの分析の例として用いられる)H鎖とのC末端融合に加えて、さらなる形式が本発明者らの研究室において作製されており、機能が評価された。図47aは、マスター分子として完全長IgGをベースとする選ばれた分子を示す。これらは、抗原発現標的細胞への、ハプテンを介したペイロード送達を成し遂げるために作製された。これらは、例として、(ジスルフィド安定化)scFvとIgGのL鎖のC末端との融合、単鎖FabとCH3またはC-κいずれかのC末端との融合、六価分子を作製するようなscFv(および/またはscFab)とL鎖ならびにH鎖との融合を含む。さらに、単鎖リンカーのないジスルフィド安定化Fvを含有する三価実体を含めて三価実体が首尾良く作製され、ハプテンを介したペイロード送達のために適用することができる。融合蛍光タンパク質を含有する二重特異性実体も作製した。様々な形式を作製するために適用されたアミノ酸配列をSEQ ID NO 38〜SEQ ID NO 45として列挙した。全ての分子を哺乳動物細胞において発現させ、標準的なプロテインAおよびサイズ排除技術を用いて良好な収率で精製することができた(実施例3の「組換えヒト化<Dig>抗体、断片、および二重特異性融合タンパク質の組成、発現、および精製」を参照されたい)。
【０１７３】
図47bおよびcは、マスター分子として完全長IgGをベースとする分子より小さなサイズの選ばれた分子を示す。これらの分子は小さな抗体断片からなるが、これらの分子も、抗原発現標的細胞への、ハプテンを介したペイロード送達を成し遂げるために作製された。小さなモジュールは組織浸透性および腫瘍浸透性が優れている場合があり、IgG由来実体と比較して異なる薬物動態を有する。さらに、小さな分子からなるモジュール組成物は、さらなるモジュール、例えば、ビオチン結合のためのモジュール(例えば、ストレプトアビジンもしくはアビジン)または細胞への進入を容易にし得る実体(例えば、病原体の移行ドメイン)の付加および組換え発現を可能にする。様々な形式を作製するために適用されたアミノ酸配列をSEQ ID NO 46〜SEQ ID NO 50として列挙した。さらなる特徴付けのために、これらの全ての分子を発現させ、アフィニティクロマトグラフィーおよびサイズ排除技術を介して精製することができた。
【０１７４】
図47c)〜47o)から、様々な形式のこれらの全ての分子が、ペイロード送達に必要な条件である標的化特異性ならびにジゴキシゲニン結合能力を完全に保持していたことが分かる。すなわち、これは、表面プラズモン共鳴(BiaCore)実験(詳細については、実施例4の「組換え<Dig>抗体、断片、および二重特異性融合タンパク質とジゴキシゲニン化抗原との結合」を参照されたい)、ならびにFACS分析(詳細については、実施例10の「ジゴキシゲニン化Cy5および<標的>-<Dig>二重特異性抗体との複合体は、インビトロ画像化およびインビボ画像化のために使用することができる標的特異的結合および蛍光特徴を保持している」を参照されたい)によって証明された。これらの実験の結果を図47c)〜47o)に示した。これらから、ジゴキシゲニンに対する結合能力は、組換えモジュールとして適用された親ジゴキシゲニン結合部分と同等であることが判明した。さらに、標的化抗原認識のための特異性も様々な形式において損なわれていなかった。従って、ハプテンを介した標的化ペイロード送達用のビヒクルとして、多くの異なる形式を適用することができる。
【０１７５】
実施例5:ジゴキシゲニン化ペプチドと二重特異性<Her2>-<Dig>および<IGF1R>-<Dig>との規定された複合体の作製
ジゴキシゲニン化ペプチドと、組換えDig結合モジュールを含有する二重特異性抗体誘導体との複合体は、ペプチドに温和な生物物理学的挙動および改善したPKパラメータを付与し得る。さらに、このような複合体は、ペプチドを、二重特異性抗体変種によって認識される抗原を示す細胞に標的化することができる。これらの複合体は、2つの高親和性Dig結合部位において、2つのジゴキシゲニン化ペプチドが結合する(部位ごとに1つのジゴキシゲニン化ペプチドが結合する)1本のヒト化<標的>-<Dig>IgGからなる。このペプチドは、ジゴキシゲニン化されているのにもかかわらず、ならびに抗体と複合体化している間に良好な生物学的活性を保持していることが望ましい。また、二重特異性抗体誘導体の細胞表面標的結合部位は、複合体を形成したジゴキシゲニン化ペプチドの存在下で、その結合特異性および親和性を保持していることが望ましい。
【０１７６】
本技術を評価するために本発明者らが例として使用したペプチドは、メリチン、INF7、FALLLv1、FALLv2、およびFam5bである。後ろの3つのペプチドは、(別々に説明するために)ヒト由来生理活性ペプチドのスクリーニングにおいて同定された。ペプチドの生物学的活性は、インビトロでヒト腫瘍細胞株に対する細胞傷害作用を確かめることによってインビトロで評価することができる。
【０１７７】
これらのペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである:
0005758888.tif 000010
【０１７８】
ジゴキシゲニン化ペプチドと二重特異性<標的>-<Dig>抗体変種との二重特異性複合体は、標的抗原を発現する細胞にペプチドを特異的に標的化するために適用することができる。それによって、表面抗原によって認識される細胞はペプチドによって選択的に扱われ、ペプチドを介した細胞傷害性が抗原発現細胞において増大するはずである。
【０１７９】
選択的標的化用に、このような二重特異性抗体複合体を作製するために、(i)ペプチドの活性が保持されるように、適切なリンカーを介してジゴキシゲニンをペプチドにカップリングすること;(ii)ジゴキシゲニン化ペプチドと二重特異性<標的>-<Dig>IgGとの複合体を作製および特徴付けることが必要である。これらの複合体は決まったやり方で形成されるものとする(2個のDig-ペプチドが1個の<Dig>IgGに結合する)。(iii)標的化抗原を発現する細胞に対する、ペプチドを介した増大した(特異的な)生物学的活性を媒介するために、これらの複合体がペプチドの活性ならびに標的化抗体の特異性および親和性を保持していることを保証する。
【０１８０】
ジゴキシゲニン結合体化のためにアミノ末端システインを有するペプチドの作製
確立したプロトコール(FastMoc 0.25mmol)に従って、Fmoc化学を用いる自動化Applied Biosystems ABI 433Aペプチド合成機において、ペプチド合成を行った。反復サイクルにおいて、対応するFmocアミノ酸を連続してカップリングすることによって、ペプチド配列を組み立てた。カップリング工程ごとに、樹脂(3x2.5min)を、N-メチルピロリドンに溶解した20％ピペリジンで処理することによって、N末端Fmoc基を除去した。カップリングは、DMFに溶解したHBTU/HOBt(各1mmol)およびDIPEA(2mmol)によって活性化されたFmoc保護アミノ酸(1mmol)を用いて行った(45〜60分間ボルテックスする)。カップリング工程ごとに、NMPに溶解したAc2O(0.5M)、DIPEA(0.125M)、およびHOBt(0.015M)の混合物で処理する(10分間ボルテックスする)ことによって、未反応アミノ基をキャップした。各工程の間に、樹脂をN-メチルピロリドンおよびDMFによって大規模に洗浄した。立体障害アミノ酸を自動化二重カップリングに組込んだ。このために、カップリングサイクルの間にキャッピング工程なく、樹脂を1mmolの活性化基本要素によって2回処理した。標的配列が完了したら、標準的なアミノ酸カップリング条件を用いて、Fmoc-12-アミノ-4,7,10-トリオキサドデカン酸(TEG-スペーサー)をFAM5BおよびINF7ペプチドとカップリングした。その後に、全てのペプチド配列(スペーサーを有するFAM5BおよびINF7、スペーサーを有さないメリチン、FALLv1、およびFALLv2)のアミノ末端にFmoc-Cys(Trt)-OHを取り付けた。最後のFmoc脱保護の後に、ペプチド樹脂をフィルターフリットに入れ、トリフルオロ酢酸、水、およびトリイソプロピルシラン(19mL:0.5mL:0.5mL)の混合物によって2.5時間処理した。切断溶液を濾過し、冷(0℃)ジイソプロピルエーテル(300mL)を添加してペプチドを沈殿させて、無色の固体を得た。無色の固体をジイソプロピルエーテルによってくりかえし洗浄した。粗生成物を酢酸/水混合物に再溶解し、凍結乾燥し、その後に、0.1％TFAを含有するアセトニトリル/水勾配を用いた調製用逆相HPLC(Merck Cromolith prep RP-18e カラム, 100x25mm)によって精製した。
【０１８１】
アミノ末端システインを有するペプチドとジゴキシゲニンとのカップリング
対応するシステイン改変ペプチド(6〜20mg)を0.1M KPO4緩衝液(1mL)に溶解した溶液に、100μLのDMFに溶解した等モル量のジゴキシゲニン-3-カルボキシ-メチル-エチルアミドマレイミドを添加した。反応混合物を周囲温度で2〜20時間、穏やかに混合し、濾過し、標的化合物を、0.1％TFAを含有するアセトニトリル/水勾配を用いた調製用逆相HPLC(Merck Cromolith prep RP-18eカラム, 100x25mm)によって単離した。凍結乾燥の後に、ジゴキシゲニン-ペプチド結合体を無色の固体として得た。
【０１８２】
ペプチドメリチンの分子量は2949.64であり、結果として生じたペプチド-Dig結合体の分子量は3520.33である。ペプチドFALLv1の分子量は4710.59であり、結果として生じたペプチド-Dig結合体の分子量は5384.43である。ペプチドFALLv2の分子量は4791.76であり、結果として生じたペプチド-Dig結合体の分子量は5465.59である。ペプチドFam5bの分子量は3634.37であり、結果として生じたペプチド-Dig結合体の分子量は5410.47である。ペプチドINF7の分子量は2896.25であり、結果として生じたペプチド-Dig結合体の分子量は3466.94である。抗体との複合体形成の時点まで、本発明者らは、H2Oに溶解した結合体を分注して-20℃で保管した。図14は、ペプチド-ジゴキシゲニン複合体の組成を模式的に示す。
【０１８３】
ジゴキシゲニン化ペプチドと組換え<標的>-<Dig>二重特異性抗体との複合体形成
組換え<IGF1R>-<Dig>二重特異性抗体および<Her2>-<Dig>二重特異性抗体をカップリング反応のタンパク質成分として使用した。これらの分子の組成および精製は実施例1に記載されている。
【０１８４】
ジゴキシゲニン化ペプチドと<IGF1R>-<Dig>および<Her2>-<Dig>二重特異性抗体との複合体を作製するために、本発明者らは、(メリチン、INF7、FALLv1、FALLv2、Fam5b)ペプチド-Dig結合体を1mg/mlの最終濃度までH2Oに溶解した。二重特異性抗体を、20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH=6.0緩衝液に溶解して1mg/ml(4.85μM)の濃度にした。上下にピペッティングすることによってペプチドおよび二重特異性抗体を2:1モル比(ペプチド:抗体)まで混合し、RTで15分間インキュベートした。次いで、複合体をさらに改変することなくインビトロアッセイに使用した。これらのアッセイのために、複合体をOpti-MEM1(Invitrogen Madison, WI)で希釈した。
【０１８５】
結果として生じた複合体は、1個の抗体誘導体につき2個のDig-ペプチドを有する単量体IgG様分子と規定された。これらの二重特異性ペプチド複合体の規定された組成(および2:1のペプチド:タンパク質比)は、サイズ排除クロマトグラフィーおよび装填(charging)/競合実験によって確かめられた。
【０１８６】
実施例6:ジゴキシゲニン化ペプチドおよび<標的>-<Dig>二重特異性抗体との複合体は標的特異的結合および生物学的活性を保持している
生理活性化合物の特異的標的化を目的としたどの技術でも対処する必要のある非常に重要なトピックの1つは、化合物の生物学的活性を保持しなければならないことである。さらに、標的化モジュールの特異性および活性はペイロードの取り付けによる影響を受けてはならない。本発明者らが説明する二重特異性抗体技術は、生理活性ペプチドに対して2つの調整工程を有する。このうち1つは標的化モジュールの改変である。第1の工程において、本発明者らは、ジゴキシゲニンと生理活性ペプチドを共有結合によりカップリングする。第2の工程において、このジゴキシゲニン化ペプチドは、大きなタンパク質である二重特異性抗体誘導体と複合体を形成する。ペプチド活性を保持するために、両工程について改変ペプチドの活性を保証することが重要である。すなわち、活性アッセイによって、(i)ジゴキシゲニン化(digoxygenation)の後にペプチドの機能が保持されていること、(ii)ジゴキシゲニン化ペプチドとマウス<Dig>またはヒト化<Dig>との複合体形成の後に機能が保持されていることが示される必要がある。最後に、(iii)最終複合体において標的化モジュールの結合特異性および親和性がなお保持されていることが示される必要がある。
【０１８７】
非改変細胞傷害性ペプチドおよびジゴキシゲニン化細胞傷害性ペプチドの生物学的活性の比較
ジゴキシゲニンによるペプチドメリチン、FALLv1、およびFALLv2の付加または変化によって生物学的活性が変化するかどうか評価するために、本発明者らはインビトロアッセイを行った。これらのペプチドは細胞傷害性であるので、これらの生物学的活性は死細胞数をモニタリングすることによって容易に分析することができる。この数を測定するために、CytoTox-Gloアッセイ(Promega Madison, WI)を使用した。
【０１８８】
図15は、メリチン、Fallv1、およびFallv2ペプチド、ならびにこれらのDIG改変変種の生物学的活性を評価するために行った、これらのCytoTox-Glo-アッセイの結果を示している。これらのアッセイのために、H322M細胞を96ウェルプレート1ウェルにつき15,000個の細胞の密度で播種した。細胞を、10％FCS、ピルビン酸Na+、L-グルタミン、およびNEAAミックスを含むRPMIに入れて、37℃、5％CO2、および85％湿度で24時間インキュベートした。次いで、ペプチドおよびそのDIG改変変種を、示された濃度で細胞に添加した。細胞をさらに48時間インキュベートした。この期間の後に、細胞を、製造業者の説明書に従ってCytoTox-Glo-アッセイ試薬で処理した。手短に述べると、このアッセイは、試薬中の蛍光発生ペプチドを切断するプロテアーゼが培地に存在することによって死細胞を検出する。従って、このアッセイの発光は死細胞を表している。次いで、96ウェルプレートをInfiniteF200ルミネッセンスリーダー(luminescence reader)(Tecan Austria, Groding)において分析した。
【０１８９】
これらのアッセイの結果(図15、表4にまとめた)から、ジゴキシゲニン化ペプチドは非改変ペプチドと比較した時に生物学的活性を保持していることが分かる。CytoTox-GloアッセイのIC50値は非改変ペプチドについては3.28μMであり、ジゴキシゲニン化ペプチドメリチンについては3.98μMであった。Fallv1およびFallv2の活性は、ジゴキシゲニンと結合体化されても同様に保持されていた(表4)。従って、ジゴキシゲニン化は生物学的活性を妨害しなかった。本発明者らは、メリチン、FALLv1、およびFALLv2ペプチドのジゴキシゲニン化が生物学的活性を妨害しないと結論付けた。
【０１９０】
抗原発現腫瘍細胞への、抗体と複合体を形成したジゴキシゲニン化ペプチドの生物学的活性の特異的標的化
ハプテンとの共有結合だけでなく、ペプチドと大きな二重特異性抗体分子との複合体形成もこれらの生物学的活性が影響を及ぼすことがある。IgGに由来する二重特異性分子は大きなタンパク質であるので(ペプチドサイズの10〜40倍)、このような分子がペプチドの到達を立体的に妨げ、従って、生物学的活性を妨害し得ることをアプリオリに排除することができない。逆もまた同じであり、ペプチド複合体形成が、二重特異性抗体誘導体の中にある標的化モジュールの特異的な抗原結合機能を妨害し得る可能性がある。これらのトピックに対処するために、本発明者らは、抗体-ペプチド複合体の特異的な抗原結合機能ならびに抗原発現腫瘍細胞株に対するペプチド-抗体複合体のインビトロ活性を分析した。
【０１９１】
複合体の抗原結合機能を確かめるために、本発明者らは表面プラズモン共鳴を適用した。ペプチドは低分子量であるために、結合間に価値のあるシグナル高さ(signal height)に達するためには高い表面密度が必要とされる。従って、組換え<Dig>誘導体とDig-ペプチドの機能を評価するために、特殊なチップ表面を作り出した。フローセルを、1:1混合物の0.1M N-ヒドロキシスクシンイミドおよび0.1M 3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル-N-エチルカルボジイミドによって5μl/minの流速で活性化した。約2000RUの表面密度とするために、5μg/mlの抗ヒトIgG抗体を酢酸ナトリウム、pH5.0に溶解して注入した。参照対照フローセルは、捕捉用抗体を省略して等しく処理した。1Mエタノールアミン/HCl pH8.5を注入することによって表面をブロックした。
【０１９２】
抗原およびジゴキシゲニン化ペプチドと<標的><DIG>二重特異性抗体との付加的結合
これらのBiacore実験のために、組換えにより産生されたRTK IGF1R可溶性細胞外ドメインを適用して、<IGF1R>-<Dig>-Dig-ペプチド複合体を特徴付けた。ジゴキシゲニン化ペプチドとの相加的結合を示すために、ジゴキシゲニン化INF7(SEQ. ID. NO.21)およびFALLv1(SEQ. ID. NO.18)を使用した。抗体を、0.1％BSAを含むHBS-P(10mM HEPES、pH7.4、150mM NaCl、0.005％Surfactant P20)で希釈し、10μl/minの流速で注入した。接触時間(会合相)は、50nMの濃度の抗体の場合、1分であった。DIG-INF7の場合、50nMの濃度のジゴキシゲニン化INF7を使用し、90nMの濃度のジゴキシゲニン化FALLv1を使用した。50nMの濃度の可溶性IGF1R断片を使用した。ジゴキシゲニン化ペプチドおよびsIGF1RをHBS-P(10mM HEPES、pH7.4、150mM NaCl、0.005％Surfactant P20)で希釈し、10μl/minの流速で相加的に注入した。接触時間(会合相)は3分であり、解離時間(ランニング緩衝液による洗浄)は各分子について3分であった。0.85％H3PO4の再生溶液を10μl/minの流速で120秒間注入した後に、各結合サイクルの後に、共有結合しなかったタンパク質を除去するために、10mM NaOHを10μl/minの流速で120秒間注入した。シグナルは1シグナル/秒の割合で検出した。全ての相互作用を25℃で行った。これらのアッセイの結果(図16)から、結合の順番に関係なく、ジゴキシゲニン化ペプチドとのIgG複合体は細胞表面抗原に対する結合特異性および親和性を保持していることが分かる。
【０１９３】
<Her2>-<Dig>-Dig-ペプチド複合体および<IGF1R>-<Dig>-Dig-ペプチド複合体が抗原発現細胞へのペイロードの特異的標的化を媒介するかどうか分析するために、本発明者らは、FALLv1およびFam5bペプチド細胞傷害性であるという事実を利用した。従って、死細胞数をモニタリングすることによって、本発明者らは、DIG-ペプチドおよび標的化DIG-ペプチド-<Her2>-<Dig>複合体の生物学的活性を比較することができた。死細胞数を測定するために、CytoTox-Gloアッセイ(Promega Madison,WI)を使用した。標的化の特異性を分析するために、2種類の細胞株:低レベルの表面Her2を有するH322Mおよび高レベルの表面Her2を有するKPL4を使用した。
【０１９４】
これらのアッセイのために、H322M細胞を96ウェルプレート1ウェルにつき15,000個の細胞の密度で播種した。細胞を、10％FCS、ピルビン酸Na+、L-グルタミン、およびNEAAミックスを含むRPMIに入れて、37℃、5％CO2、および85％湿度で24時間インキュベートした。KPL4細胞は96ウェルプレート1ウェルにつき7,000個の細胞の密度で播種した。細胞を、10％FCSおよびL-グルタミンを含むRPMIに入れて、37℃、5％CO2、および85％湿度で24時間インキュベートした。次いで、DIG-ペプチドおよびDIG-ペプチド-<Her2>-<Dig>複合体を、示された濃度で細胞に添加した。細胞をさらに48時間インキュベートした。この期間の後に、細胞を、製造業者の説明書に従ってCytoTox-Glo-アッセイ試薬で処理した。手短に述べると、このアッセイは、試薬中の蛍光発生ペプチドを切断するプロテアーゼが培地に存在することによって死細胞を検出する。従って、このアッセイの発光は死細胞を表している。次いで、96ウェルプレートをInfiniteF200ルミネッセンスリーダー(Tecan Austria, Groding)において分析した。
【０１９５】
これらのアッセイの結果(図17)から、ジゴキシゲニン化ペプチドとのIgG複合体は抗原発現細胞に細胞傷害性を付与することが分かる。すなわち、<Her2>-<Dig>二重特異性抗体によってH322M細胞およびKPL4細胞に送達されたDIG-FALLv1の細胞傷害性を比較した時に、一貫して、高レベルの表面抗原を発現する細胞に対して毒性が強いことが見出された。<Her2>-<Dig>二重特異性抗体によって送達されたDIG-Fam5bペプチドの細胞傷害性も表面抗原レベルと相関している。これらの知見から、細胞傷害性ペプチドは適切な二重特異性抗体によって送達された時に、特異的に抗原発現細胞に豊富にあることが分かる。
【０１９６】
DIGペプチドの細胞傷害性を、適切なDIG二重特異性ABによって抗原発現細胞に送達されたDIGペプチドの細胞傷害性と比較した時に(図18)、送達されたペプチドは一貫して高い毒性を付与することが見出された。すなわち、抗原発現標的細胞に対する<Her2>-<Dig>複合体の細胞傷害性は、FALLv1ペプチドの場合、複合体化しなかったペプチドの適用と比較して高い。Fam5bペプチドの細胞傷害性も、抗原陽性標的細胞に送達された時に、送達されなかった対照ペプチドと比較して高い。このことから、ペプチド複合体は特異的に抗原発現標的細胞に豊富にある(従って、抗原発現標的細胞に対して高い生物学的活性を媒介する)ことが分かる。
【０１９７】
（表４）
0005758888.tif 000011
【０１９８】
実施例7:ジゴキシゲニン化低分子化合物と二重特異性<Her2>-<Dig>および<IGF1R>-<Dig>との規定された複合体の作製
ジゴキシゲニン化低分子化合物と、組換えDig結合モジュールを含有する二重特異性抗体誘導体との複合体は、温和な生物物理学的挙動および改善したPKパラメータを低分子化合物に付与し得る。さらに、このような複合体は、化合物を、二重特異性抗体変種によって認識される抗原を示す細胞に標的化することができる。これらの複合体は、2つの高親和性Dig結合部位において、2つの(部位ごとに1つの)ジゴキシゲニン化ペプチドが結合する1本のヒト化<標的>-<Dig>IgGからなる。化合物は、ジゴキシゲニン化されているのにもかかわらず、ならびに抗体と複合体化している間に生物学的活性を保持していることが望ましい。また、二重特異性抗体誘導体の細胞表面標的結合部位は、複合体を形成したDig化合物の存在下で、その結合特異性および親和性を保持していることが望ましい。本技術を評価するために本発明者らが例として使用した低分子化合物はドキソルビシンである。ドキソルビシンおよびジゴキシゲニン化ドキソルビシン(=Dig-Dox)の生物学的活性は、インビトロでヒト腫瘍細胞株に対する細胞傷害作用を確かめることによって評価することができる。
【０１９９】
標的抗原を発現する細胞にドキソルビシンを特異的に標的化するために、ジゴキシゲニン化ドキソルビシンと二重特異性<標的>-<Dig>抗体変種との二重特異性複合体を適用することができる。それによって、表面抗原によって認識される細胞はドキソルビシンよって扱われる。このために、抗原発現細胞において、ドキソルビシンを介した細胞傷害性が増大するはずである。
【０２００】
選択的標的化用に、このような二重特異性抗体複合体を作製するために、(i)ドキソルビシンの活性が保持されるように、適切なリンカーを介してジゴキシゲニンをドキソルビシンにカップリングすること;(ii)ジゴキシゲニン化ドキソルビシンと二重特異性<標的>-<Dig>IgGとの複合体を作製および特徴付けることが必要である。これらの複合体は決まったやり方で形成されるものとする(2個のDig-ドキソルビシンが1個の<Dig>IgGに結合する)。(iii)標的化抗原を発現する細胞に対する、ドキソルビシンを介した特異的な生物学的活性を媒介するために、これらの複合体はドキソルビシンの活性ならびに標的化抗体の特異性および親和性を保持していることを保証する。
【０２０１】
ジゴキシゲニン化ドキソルビシンの作製
ドキソルビシンをSigma-Aldrichから入手した。ジゴキシゲニンとドキソルビシンをカップリングするために、本発明者らは以下の手順を行った。すなわち、ジゴキシゲニン-3-O-メチルカルボニル-ε-アミノカプロン酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(20mg, 30.4μmol)をDMF(500μL)に溶解した溶液に、トリエチルアミン(8.4μL, 60.8μmol)を添加し、結果として生じた混合物をすぐに、ドキソルビシン-HCl(16.6mg, 30.4μmol)をDMF(500μL)に溶解した溶液に移した。反応混合物を周囲温度で2時間混合し、濾過し、標的化合物を、0.1％TFAを含有するアセトニトリル/水勾配を用いた調製用逆相HPLC(Merck Cromolith prep RP-18eカラム, 100x25mm)によって単離した。凍結乾燥の後に、ドキソルビシン-ジゴキシゲニン結合体を無色の固体(25.2mg, 76％)として得た。分析用HPLC:tR=13.9分(Merck Chromolith Performance RP-18e、100x4.6mm、水+0.1％TFAアセトニトリル/水+0.1％TFA 80:20, 25分);ESI-MS(陽イオンモード):m/z:C58H75N2O18の計算値:1087.5;測定値:1087.6[M+H]+。ドキソルビシンの分子量は579.98Daである。結果として生じたドキソルビシン-Dig結合体の分子量は1087.24Daである。抗体との複合体形成の時点まで、本発明者らは、DMSOに溶解した結合体を分注して-20℃で保管した。図18はドキソルビシン-ジゴキシゲニン結合体の構造を示す。
【０２０２】
ジゴキシゲニン化ドキソルビシンと組換え<標的-Dig>二重特異性抗体との複合体形成
組換え<IGF1R>-<Dig>二重特異性抗体および<Her2>-<Dig>二重特異性抗体をカップリング反応のタンパク質成分として使用した。これらの分子の組成および精製は実施例1に記載されている。
【０２０３】
ジゴキシゲニン化ドキソルビシンと<IGF1R>-<Dig>および<Her2>-<Dig>二重特異性抗体との複合体を作製するために、本発明者らは、ドキソルビシン-Dig結合体を0.1mg/mlの最終濃度まで、1％アセトニトリルおよび0.1％DMSOを含有するOptiMEM(Invitrogen)に溶解した。二重特異性抗体は、20mMヒスチジンおよび140mM NaCl、pH6からなる緩衝液に溶解して1mg/ml(5μM)の濃度で使用した。ジゴキシゲニン化ドキソルビシンおよび二重特異性抗体を2:1モル比(ジゴキシゲニン化ドキソルビシン:抗体)まで混合した。この手順によって、規定された組成物からなる複合体の均一な調製物が得られた。この後に、この調製物を、下記で説明する細胞生存アッセイにおいて適用した。
【０２０４】
図19は、ジゴキシゲニン化ドキソルビシンと<Her2>-<Dig>との複合体のサイズ排除プロファイルを示す。装填の増大(タンパク質複合体のサイズのシグナル)は、タンパク質分子1つあたり少なくとも1つのDIG-dox分子の比まで蛍光シグナルが増えることで明らかである。その後に、さらに多くのDIG-dox分子を添加しても、タンパク質の位置にあるシグナルは直線的に増えず、結合しなかったDIG-doxが、カラム材料と非特異的に会合したことによるものだと予想されるシグナルは現われない。本発明者らは、これらの実験から、Dig-doxおよび二重特異性抗体の複合体は、タンパク質1つあたり少なくとも1つのLMW化合物を含有する分子からなったと結論付けた。
【０２０５】
表面プラズモン共鳴研究(Biacore, 前記の実施例4を参照されたい)を適用することによって複合体をさらに特徴付けることで、複合体形成反応から、二重特異性抗体モジュールの特異的な結合親和性を完全に保持している規定された分子が生じたというさらなる証拠が得られた。
【０２０６】
実施例8:ジゴキシゲニン化ドキソルビシンおよび<標的-Dig>二重特異性抗体との複合体は標的特異的結合および生物学的活性を保持している
生理活性化合物の特異的標的化を目的としたどの技術でも対処する必要のある非常に重要なトピックの1つは、化合物の生物学的活性を保持しなければならないことである。さらに、標的化モジュールの特異性および活性はペイロードの取り付けによる影響を受けてはならない。本発明者らが説明する二重特異性抗体技術は生理活性化合物に対して2つの調整工程を有する。このうち1つは標的化モジュールの改変である。第1の工程において、本発明者らは、ジゴキシゲニンとドキソルビシンを共有結合によりカップリングする。第2の工程において、このジゴキシゲニン化ドキソルビシンは、大きなタンパク質である二重特異性抗体誘導体と複合体を形成する。ドキソルビシン活性を保持するために、両工程について改変ドキソルビシンの活性を保証することが重要である。すなわち、活性アッセイによって、(i)ジゴキシゲニン化の後にドキソルビシンの機能が保持されていること、(ii)最終複合体において標的化モジュールの結合特異性および親和性がなお保持されていることが示される必要がある。
【０２０７】
非改変ドキソルビシンおよびジゴキシゲニン化ドキソルビシンの生物学的活性の比較
ドキソルビシンのジゴキシゲニン化によって生物学的活性が変化するかどうか評価するために、本発明者らは、ドキソルビシンまたはジゴキシゲニン化ドキソルビシンの存在下で増殖させた様々な細胞株を用いてバイオアッセイを行った。その後に、細胞生存を分析した。図20、21、および48aは、ドキソルビシンおよびジゴキシゲニン化ドキソルビシンの生物学的活性を評価するために行ったこれらの細胞生存アッセイの結果を示す。これらのアッセイのために、本発明者らはKPL-4細胞、H322M細胞、またはMDA-MB-468細胞を播種し、プレートに一晩付着させた。翌日、細胞を、示された濃度のドキソルビシンまたはジゴキシゲニン化ドキソルビシンで48時間処理した。次いで、細胞を溶解し、CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega, Madison, WI)を適用することによって、細胞生存を評価した。これらのアッセイの結果(図20、21、および48a)から、H322M細胞上でインキュベートした時に、ジゴキシゲニン化ドキソルビシンは生物学的活性の一部を保持していることが分かる。KPL-4細胞は、使用した濃度のジゴキシゲニン化ドキソルビシンとの曝露後に影響を全く示さない。細胞生存アッセイのIC50値は、H322M細胞とインキュベートした時に、非改変ドキソルビシンについては25μMであり、ジゴキシゲニン化ドキソルビシンについては>1000μMであった。KPL-4細胞の場合、細胞生存アッセイのIC50値は、非改変ドキソルビシンについては2.6μMであり、ジゴキシゲニン化ドキソルビシンについては>1000μMであった。細胞生存アッセイのIC50値は、MDA-MB-468細胞とインキュベートした時に、非改変ドキソルビシンについては17μMであり、ジゴキシゲニン化ドキソルビシンについては>1000μMであった。このことから、ジゴキシゲニンによって改変されるとドキソルビシンの活性が大幅に失われることが分かる。この活性低下の理由は、ジゴキシゲニン化ドキソルビシンの機能は失われないが、細胞膜浸透が限定されるからである。この分子は、元々のドキソルビシンより非常に大きく、従って、生体膜に容易に浸透することができない。この限定を実験的に図22に示した。すなわち、免疫蛍光から、ドキソルビシンは膜に浸透し、核にある作用部位に蓄積することが分かる。対照的に、ジゴキシゲニン化ドキソルビシンの大半は細胞に曝露されるとエンドソームの中に蓄積し、従って、細胞内の作用部位に到達しない。それにもかかわらず、ジゴキシゲニン化ドキソルビシンの分子機能は依然として保持されている。これは、エンドソームエスケープ試薬を同時適用することによって証明することができる。エンドソームエスケープ試薬はジゴキシゲニン化ドキソルビシンを細胞質および核に入らせ、結果として、細胞傷害性を大幅に高める(以下を参照されたい)。
【０２０８】
抗原発現腫瘍細胞への、抗体と複合体を形成したジゴキシゲニン化ドキソルビシンの生物学的活性の特異的標的化
ペイロード活性を腫瘍細胞に特異的に送達するために抗体-複合体の特異的な抗原結合機能を利用できるかどうか分析するために、本発明者らは、免疫蛍光研究の後に、標的化ドキソルビシンの生物学的活性を確かめるインビトロ細胞傷害アッセイを行った。Dig-Doxは、514nmレーザーを用いた励起による免疫蛍光によって視覚化できるのに対して、発光は520〜560nmの波長の間で検出される。このために、本発明者らは、細胞上での、<IGF1R>-<DIG>と複合体を形成したdig-doxの標的化および蓄積を光学的に視覚化することができた。図22はIGF1R発現MCF7細胞のIF分析を示し、IGF1R-DIGおよびDig-Doxの複合体は細胞表面に蓄積した。これらの研究の結果から、dig-doxは二重特異性抗体の標的化部分によって標的細胞に特異的に送達されることが分かる。
【０２０９】
<Her2>-<Dig>-Dig-Dox複合体および<IGF1R>-<Dig>-Dig-Dox複合体が、抗原発現細胞への(細胞傷害性)ペイロードの特異的標的化を媒介するかどうかさらに分析するために、本発明者らは、規定された数のKPL-4(Her2+++)、H322M(IGF1R+++)、およびMDA-MB-468(Her2+/-)細胞を播種し、プレートに一晩付着させた。翌日、細胞を、示された濃度の<Her2>-<Dig>-Dig-Doxまたは<IGF1R>-<Dig>-Dig-Dox複合体で48時間処理した。次いで、CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega, Madison, WI)を適用することによって、細胞生存を評価した。
【０２１０】
これらのアッセイの結果(図20、21、および48b)から、ジゴキシゲニン化ドキソルビシンとのIgG複合体は抗原発現細胞に細胞傷害性を付与することが分かる。Her2発現Kpl-4標的細胞に対するDig-Dox/<Her2>-<Dig>複合体のIC50値は5.9μMであるのに対して、標的陰性のMDA-MB-468細胞の場合、Dig-Doxおよび<Her2>-<Dig>の複合体は、ペイロードが全くない<Her2>-<Dig>より大きな細胞傷害性を付与しなかった。同様に、IGF1R発現H322M標的細胞に対するDig-Dox/<IGF1R>-<Dig>複合体のIC50値は5.8μMであった。両標的細胞株(KPL-4およびH322M)とも、Dig-Doxが装填されている標的化抗体の細胞傷害性は、同じ濃度で適用された非装填抗体より強いことが示された。本発明者らは、<標的>-<Dig>二重特異性抗体誘導体が細胞傷害性ペイロードを、標的化モジュールによって認識される細胞に特異的に送達できると結論付けた。
【０２１１】
図48は、ジゴキシゲニン化ドキソルビシンと>Dig>二重特異性抗体とのさらなる標的化実験の結果を示す。これらの実験は、さらなる乳腺腫瘍細胞株MDA-MB-468を含んだ。これらのアッセイのために、本発明者らは、前記のようにKPL-4細胞、H322M細胞、またはMDA-MB-468細胞を増殖およびプレートし、示された濃度のドキソルビシンまたはジゴキシゲニン化ドキソルビシンによって細胞を48時間処理した。CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega, Madison, WI)を用いて細胞生存が求められたことによって(図48aおよびb)、ジゴキシゲニン化ドキソルビシンは、MDA-MB468細胞上でインキュベートされた時に生物学的活性の大半を失ったことが確かめられた。この表現型は、KPL-4細胞およびH322M細胞について観察された表現型と非常に似ている(前記を参照されたい)。MDA-MB-468細胞におけるIC50値は、非改変ドキソルビシンについては17μMであり、ジゴキシゲニン化ドキソルビシンについては>1000μMであった。二重特異性標的化モジュールと複合体を形成したジゴキシゲニン化ドキソルビシンを送達する可能性を扱ったさらなる実験を図48c〜eに示した。すなわち、KPL-4(Her2+++)、H322M(IGF1R+++)、およびMDA-MB-468(Her2+/-)細胞を、前記のように、<Her2>-<Dig>-Dig-Doxまたは<IGF1R>-<Dig>-Dig-Dox複合体によって48時間処理した。その後に、CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega, Madison, WI)を適用することによって、細胞生存を評価した。これらのアッセイの結果から、ジゴキシゲニン化ドキソルビシンとのIgG複合体は抗原発現細胞に細胞傷害性を付与することが確かめられた。her2またはIGF1Rのいずれかを発現する標的細胞株(KPL-4およびH322M)について、Dig-Doxが装填されている標的化抗体の細胞傷害性は、同じ濃度で適用された非装填抗体より強いことが示された。対照的に、標的陰性のMDA-MB-468細胞の場合、Dig-Doxおよび<Her2>-<Dig>の複合体は、ペイロードが全くない<Her2>-<Dig>よりかなり大きな細胞傷害性を付与しなかった。本発明者らは、<標的>-<Dig>二重特異性抗体誘導体は細胞傷害性ペイロードを、標的化モジュールによって認識される細胞に特異的に送達することができると結論付けた。
【０２１２】
実施例9:ジゴキシゲニン化蛍光基質と二重特異性<Her2>-<Dig>および<IGF1R>-<Dig>との規定された複合体の作製
標的抗原を有する組織または細胞を特異的に画像化するために、ジゴキシゲニン化蛍光基質と、組換えDig結合モジュールを含有する二重特異性抗体誘導体との複合体を適用することができる。これらの複合体は、2つの高親和性Dig結合部位において、画像化技術によって視覚化可能な2つのジゴキシゲニン化基質が結合する(部位ごとに1つのジゴキシゲニン化基質が結合する)1本のヒト化<標的>-<Dig>IgGからなる。画像化化合物は、ジゴキシゲニン化されているのにもかかわらず、ならびに抗体と複合体化している間にその特性(蛍光)を保持していることが必要である。また、二重特異性抗体誘導体の細胞表面標的結合部位は、複合体を形成したDig化合物の存在下で、その結合特異性および親和性を保持していることが望ましい。
【０２１３】
本技術を評価するために本発明者らが例として使用した画像化化合物はCy5である。Cy5は、575〜633nmの波長によって励起される蛍光基質であり、励起されると、近赤外スペクトルにある670nMの波長の光を発する。このために、Cy5およびジゴキシゲニン化Cy5(=Dig-Cy5)の存在は蛍光顕微鏡ならびにインビボ画像化技術によって評価することができる。標的抗原を発現する細胞にCy5を特異的に標的化するために、ジゴキシゲニン化Cy5と二重特異性<標的>-<Dig>抗体変種との二重特異性複合体を適用することができる。それによって、表面抗原によって認識される細胞はCy5によって視覚化することができ、従って、標的抗原を有さない細胞と区別することができる。
【０２１４】
画像化試薬の選択的標的化用に、このような二重特異性抗体複合体を作製するために、(i)Cy5の蛍光特性が保持されるように、適切なリンカーを介してジゴキシゲニンをCy5にカップリングすること;(ii)ジゴキシゲニン化Cy5と二重特異性<標的>-<Dig>IgGとの複合体を作製および特徴付けることが必要である。これらの複合体は決まったやり方で形成されるものとする(2個のDig-Cy5が1個の<Dig>IgGに結合する)。(iii)標的化抗原を発現する細胞の特異的なCy5視覚化を媒介するために、これらの複合体はCy5の活性ならびに標的化抗体の特異性および親和性を保持していることを保証する。
【０２１５】
ジゴキシゲニン化Cy5の作製
ジゴキシゲニン化Cy5を作製するために、モノボックエチレンジアミンを用いて、DIG-カルボキシメチル-NHSエステル(DE3836656)を変換した。その後に、bocを除去し、遊離したアミンをCy5-NHSエステル(GE Healthcare, PA15106)と反応させた。DIG-Cy5を精製するために、RP18カラムを用いたHPLCを行った。溶出剤Aは、0.1％TFAを含有するH2Oであり、溶出剤Bは、0.1％TFAを含有するアセトニトリルであった。60分にわたって行った溶出の間に、溶出剤Bの濃度を0％から100％に上げた。
【０２１６】
Cy5の分子量は791.99Daである。結果として生じたCy5-Dig結合体の分子量は1167.55Daである。抗体との複合体形成の時点まで、本発明者らは、PBSに溶解した結合体を分注して-20℃で保管した。図23はCy5-ジゴキシゲニン結合体の構造を示す。
【０２１７】
ジゴキシゲニン化Cy5と組換え<標的-Dig>二重特異性抗体との複合体形成
組換え<IGF1R>-<Dig>二重特異性抗体および<Her2>-<Dig>二重特異性抗体をカップリング反応のタンパク質成分として使用した。これらの分子の組成および精製は実施例1に記載されている。
【０２１８】
ジゴキシゲニン化Cy5と<IGF1R>-<Dig>および<Her2>-<Dig>二重特異性抗体との複合体を作製するために、本発明者らは、Cy5-Dig結合体をPBSに0.5mg/mlの最終濃度まで溶解した。1mg/ml(5μM)の濃度の二重特異性抗体を、20mMヒスチジンおよび140mM NaCl、pH6からなる緩衝液に溶解して使用した。ジゴキシゲニン化Cy5および二重特異性抗体を2:1モル比(ジゴキシゲニン化Cy5:抗体)まで混合した。この手順によって、規定された組成物からなる複合体の均一な調製物が得られた。この後に、この調製物を、下記で説明するインビトロおよびインビボでの画像化研究において適用した。
【０２１９】
図24は、ジゴキシゲニン化Cy5と<Her2>-<Dig>との複合体のサイズ排除プロファイルを示す。装填の増大(タンパク質複合体のサイズのシグナル)は、タンパク質分子1つあたり2つのDIG-Cy5分子の比まで蛍光シグナルが増えることで明らかになった。装填がタンパク質分子1つあたり5つのDIG-Cy5分子の比まで増加するのであれば、蛍光シグナルはこれ以上増えない。このことから、2つのDIG結合部位は2:1(DIG-Cy5:<Her2>-<Dig>)の比で飽和することが分かる。対照的に、<Dig>結合部分のない<Her2>または<IGF1R>に対する抗体はDIG-Cy5に全く結合しない(図49b)。このことから、DIG-Cy5は非特異的にこれらの抗体に結合しないことが分かる。本発明者らは、これらの実験から、Dig-Cy5および二重特異性抗体の複合体は、タンパク質1つあたり2つのDig-Cy5化合物を含む分子からなると結論付けた。
【０２２０】
表面プラズモン共鳴研究(Biacore、前記実施例を参照されたい)を適用することによって複合体を特徴付けることで、複合体形成反応から、二重特異性抗体モジュールの特異的な結合親和性を完全に保持している規定された分子が生じたというさらなる証拠が得られた。
【０２２１】
実験条件をさらに改善することによって、<Her2>-<Dig>とDIG-Cy5との結合比は1:2であることがさらにはっきりと示された。図49aおよびbは、実験セットアップの改善後の、ジゴキシゲニン化Cy5と<Her2>-<Dig>との複合体のサイズ排除プロファイルおよびSECの評価を示す。装填の増大(タンパク質複合体のサイズのシグナル)は、タンパク質分子1つあたり2つのDIG-Cy5分子の比まで蛍光シグナルが増えることで明らかになった。装填がタンパク質1つあたり5つのDIG-Cy5分子の比まで増加するのであれば、蛍光シグナルはこれ以上増えない。このことから、2つのDIG結合部位は2:1(DIG-Cy5:<Her2>-<Dig>)の比で飽和することが分かる。対照的に、<Dig>結合部分のない<Her2>または<IGF1R>に対する抗体はDIG-Cy5に全く結合しない(図49b)。このことから、DIG-Cy5は非特異的にこれらの抗体に結合しないことが分かる。本発明者らは、これらの実験から、Dig-Cy5および二重特異性抗体の複合体は、タンパク質1つあたり2つのDig-Cy5化合物を含む分子からなると結論付けた。
【０２２２】
実施例10:ジゴキシゲニン化Cy5および<標的>-<Dig>二重特異性抗体との複合体は、インビトロ画像化およびインビボ画像化のために使用することができる標的特異的結合および蛍光特徴を保持している
生理活性化合物の特異的標的化を目的としたどの技術でも対処する必要のある非常に重要なトピックの1つは、化合物の生物学的活性を保持しなければならないことである。さらに、標的化モジュールの特異性および活性はペイロードの取り付けによる影響を受けてはならない。本発明者らが説明する二重特異性抗体技術は生理活性化合物に対して2つの調整工程を有する。このうち1つは標的化モジュールの改変である。第1の工程において、本発明者らは、ジゴキシゲニンとCy5を共有結合によりカップリングする。第2の工程において、このジゴキシゲニン化Cy5は、大きなタンパク質である二重特異性抗体誘導体と複合体を形成する。Cy5活性を保持するために、両工程について改変Cy5の活性を保証することが重要である。すなわち、 (i)ジゴキシゲニン化の後にCy5の蛍光機能が保持されていること、(ii)最終複合体において標的化モジュールの結合特異性および親和性がなお保持されていることが示される必要がある。
【０２２３】
非改変Cy5およびジゴキシゲニン化Cy5の蛍光活性
Cy5のジゴキシゲニン化によってCy5の蛍光特徴が変化するかどうか評価するために、本発明者らはCy5の励起スペクトルおよび発光スペクトルを比較し、これと、新しく作製したDig-Cy5のスペクトルおよび二重特異性抗体との複合体の中にあるDig-Cy5のスペクトルを比較した。表4は、これらの分析の結果をまとめている。すなわち、Cy5とジゴキシゲニンとの結合体化ならびにDig-Cy5と抗体との複合体形成はCy5の蛍光特徴を妨害しない。本発明者らは、抗体を介した標的化およびインビボ画像化のために、Dig-Cy5およびDig-Cy5-複合体を適用できると結論付けた。
【０２２４】
Dig-Cy5と複合体を形成した標的化モジュールの結合活性
ジゴキシゲニン化Cy5の複合体形成が二重特異性標的化モジュールの結合特徴を変えるかどうか評価するために、本発明者らは表面共鳴分析を適用した。抗体親和性を確かめるために、Her2(ならびにIGF1R)の細胞外ドメインを抗原として使用した。これらの分析は実施例4に詳述されている。表5はこれらの分析の結果をまとめている。すなわち、Dig-Cy5と抗体との複合体形成は標的化モジュールの結合親和性を妨害しない。
【０２２５】
（表５）
0005758888.tif 000012
【０２２６】
FACS分析を適用することによって複合体をさらに特徴付けることで、Dig-Cy5と抗体との複合体形成は標的化モジュールの結合を妨害しないというさらなる証拠が得られた。これらの分析のために、本発明者らは、CD22陽性のRaji細胞およびRamos細胞ならびに二重特異性<CD22>-<DIG>抗体を使用した。96ウェルプレート1ウェルにつき3x105個の細胞を、FACS緩衝液(5％FCSを含有するPBS)中で5μg/mlの<CD22>-<DIG>抗体とインキュベートした。洗浄後、細胞を66.4nMの最終濃度のDIG-Cy5とインキュベートした。もう1回洗浄工程を行った後に、細胞をFACS canto II(BD Biosciences)によって分析した。
【０２２７】
この分析の結果を図25に示した。<CD22>-<DIG>およびDIG-Cy5の複合体はRaji細胞またはRamos細胞にはっきりと結合するのに対して、DIG-Cy5のみではほとんど結合を示さない。従って、本発明者らは、抗体を介した標的化およびインビボ画像化のために、二重特異性抗体とのDig-Cy5複合体を適用できると結論付けた。
【０２２８】
インビボでの抗原発現腫瘍細胞への、抗体と複合体化したジゴキシゲニン化Cy5の特異的標的化
画像化試薬を腫瘍細胞に特異的に送達するために抗体-複合体の特異的な抗原結合機能を利用できるかどうか分析するために、本発明者らはインビボで近赤外蛍光画像化研究(NIRF)を行った。これらの研究のために、50μgの<Her2>-<Dig>-Dig-Cy5または<IGF1R>-<Dig>Dig-Cy5複合体を、皮下腫瘍異種移植片を有する免疫不全マウスに静脈内注射した。これらの異種移植片は、抗原Her2(KPL4細胞)または抗原IGF1R(H322M細胞)を発現していた。その後に、CRIのMaestroシステムを用いてNIRF画像化を行った。動物を測定用チャンバーに入れ、色素に応じて規定されたスペクトル波長アレイにわたって蛍光を測定した。様々な既定のスペクトル、例えば、自己蛍光および色素シグナルの分離を可能にする特殊なソフトウェアによって、得られた画像の各ピクセルのスペクトル情報を解析した。様々な試料を比較するために、これらの分離した特異的なシグナルをMaestroソフトウェアによって定量した。
【０２２９】
これらのアッセイの結果(図26および27)から、二重特異性抗体と複合体を形成したDig-Cy5は、コグネイト抗原を発現する腫瘍に特異的に標的化されることが分かる。Her2発現KPL4腫瘍は、注射して24時間後に、<Her2>-<Dig>Dig-Cy5複合体を用いたNIRFによって視覚化することができる。同様に、IGF1R発現腫瘍は、二重特異性抗体誘導体<IGF1R>-<Dig>とDig-Cy5との複合体を適用した30分後にNIRFによって特異的に視覚化することができる。標的腫瘍の蛍光を示す抗体複合体とは対照的に、抗体と複合体を形成していないDig-Cyは腫瘍特異的な蛍光を示さない(が、図29の丸に示したように、肝臓において、ある程度の蓄積を示す)。
【０２３０】
<標的>-<Dig>二重特異性抗体とジゴキシゲニン化画像化基質の組み合わせを利用したさらなる画像化アプローチの1つを図28に示した。すなわち、本実験において、本発明者らは、腫瘍を有する動物に注射する前に、タンパク質性の標的化モジュールとジゴキシゲニン化ペイロードとの複合体を前もって形成しなかった。その代わりに、本発明者らは二重特異性抗体を注射し、48時間待った後に、ジゴキシゲニン化画像化基質を注射した。この手順によって、標的化モジュールが腫瘍/組織に浸透し、腫瘍上に蓄積するための時間が得られる。その後に、画像化試薬を与える。画像化試薬はサイズが小さいために腫瘍に迅速に浸透し、標的組織に蓄積し、標的組織においてインビボで<標的>-<Dig>Dig-Cy5複合体を形成する。この方法は、複合体を形成しなかった画像化試薬が迅速に一掃されるので、イメージングウィンドウ(imaging window)を開ける時間がかなり短いという利点を有する。さらに、このアプローチは、患者への全身曝露をごくわずかにしなければならない、放射性の画像化剤(または治療剤)に特に有用な場合がある。
【０２３１】
本発明者らは、これらの実験から、二重特異性<標的>-<Dig>抗体とジゴキシゲニン化画像化試薬との複合体が特異的なインビボ画像化に使用できると結論付けた。
【０２３２】
実施例11:ジゴキシゲニン化核酸と二重特異性<Her2>-<Dig>および<IGF1R>-<Dig>との規定された複合体の作製
抗原発現細胞に核酸を特異的に標的化するために、siRNAなどのジゴキシゲニン化核酸と、組換えDig結合モジュールを含有する二重特異性抗体誘導体との複合体を適用することができる。このような複合体は、ペプチドを、二重特異性抗体変種によって認識される抗原を示す細胞に標的化することができる。これらの複合体は、2つの高親和性Dig結合部位において、2つの(部位ごとに1つの)ジゴキシゲニン化核酸が結合する1本のヒト化<標的>-<Dig>IgGからなる。核酸は、ジゴキシゲニン化されているのにもかかわらず、ならびに抗体と複合体化している間に機能を保持していることが望ましい。また、二重特異性抗体誘導体の細胞表面標的結合部位は、複合体を形成したジゴキシゲニン化核酸の存在下で、その結合特異性および親和性を保持していることが望ましい。
【０２３３】
本技術を評価するために本発明者らが例として使用した核酸はDNA断片またはsiRNAである。本発明者らは、細胞DNAの細胞質内にあるそれぞれのmRNAを不活性化する一例として、Eg5またはルシフェラーゼを標的とするsiRNAを適用し、ジゴキシゲニン化核酸としてsiRNAを作製した。さらに、選択された分子をジゴキシゲニン化し、蛍光色素とカップリングした(Cy5を含む。実施例9および10を参照されたい)。蛍光核酸の特異的標的化および局在は、前記のように画像化技術によって視覚化することができる。さらに、siRNAの生物学的活性は、インビトロでヒト腫瘍細胞株におけるmRNAダウンレギュレーション作用を確かめることによってインビトロで評価することができる。
【０２３４】
（表６）スモールキャップ:cuu=2'O-メチル修飾、2'F:リボース上に2'OHではなく2'Fがある
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【０２３５】
これらの実施例のために本発明者らが適用した核酸の組成を表6に示した。
【０２３６】
ジゴキシゲニン化核酸と二重特異性<標的-Dig>抗体変種との二重特異性複合体は、標的抗原を発現する細胞に核酸を特異的に標的化するために適用することができる。それによって、表面抗原によって認識される細胞は核酸によって選択的に扱われ、核酸によって引き起こされる活性、例えば、RNAiまたは他の核酸を介した細胞傷害性が抗原発現細胞において増大するはずである。
【０２３７】
選択的標的化用に、このような二重特異性抗体複合体を作製するために、(i)核酸の活性が保持されるように、適切なリンカーを介してジゴキシゲニンを核酸にカップリングすること;(ii)ジゴキシゲニン化核酸と二重特異性<標的>-<Dig>IgGとの複合体を作製および特徴付けることが必要である。これらの複合体は決まったやり方で形成されるものとする(2個のDig-核酸が1個の<Dig>IgGに結合する)。(iii)標的化抗原を発現する細胞に対する、核酸を介した増大した(特異的な)生物学的活性を媒介するために、これらの複合体が核酸の活性ならびに標的化抗体の特異性および親和性を保持していることを保証する。
【０２３８】
ジゴキシゲニン化核酸の作製
1.オリゴリボヌクレオチドの合成および精製:
ABI394合成機(Applied Biosystems)を用いた固相上でのホスホルアミダイト技術に従って、10μmolスケールでオリゴリボヌクレオチドを合成した。合成は、多孔性ガラスで作られた固体支持体(CPG, 520Å, 75μmol/gのローディング、Prime Synthesis, Aston, PA, USAから入手、または3'-PT-アミノ-Mod. C6 CPG、37μmol/gのローディング、Glen Research, Sterling, Virgina, USAから入手)上で行った。通常のRNAホスホルアミダイト、2'-O-メチルホスホルアミダイト、および2'-Fホスホルアミダイト、ならびに補助試薬はProligo(Hamburg, Germany)から購入した。合成サイクルを変更することなく、対応するホスホルアミダイト(GE Healthcare, Munich Germanyから入手)を用いて、Cy5蛍光色素を5'末端に取り付けた。固相合成が完了した後に、支持体に結合しているオリゴマーの切断および脱保護を行った。次いで、AKTA Explorerシステム(GE Healthcare)においてSource 15Q, SPSC-150, 150x8mmカラム(Bischoff, Leonberg, Germany)を用いた陰イオン交換(AEX)HPLCによって、粗オリゴマーを精製した。
【０２３９】
2.アミノ改変RNAのDIG標識
ジゴキシゲニン-3-O-メチルカルボニル-ε-アミノカプロン酸-N-ヒドロキシ-スクシンイミド(Roche, Basel, Switzerland)をジメチルスルホキシド(DMSO)(Fluka, Buchs, Switzerland)に溶解した。この溶液を、緩衝液(0.1Mホウ酸Naを含む0.1M KCl、pH8.5)に溶解した精製アミノ改変RNAに添加した。反応はAEX HPLCによって管理した。定量反応の場合には、3M NaOAc、pH=5.2およびエタノール(1:32)を用いた沈殿によって、結合体化RNAを単離した。反応が定量反応でなければ、精製工程を行った。この場合、AKTA Explorerシステム(GE Healthcare)においてDNAPac PA-100 22x250mm(Dionex, Idstein, Germany)を用いたAEX HPLCによって、オリゴマーを精製した。緩衝液Aは、6M尿素、10mM NaClO4、20mM Tris、1mM EDTA;pH7.4、20％ACNであり、緩衝液Bは、6M尿素、500mM NaClO4、20mM Tris、1mM EDTA;pH7.4、20％ACNであった。4.5mL/min(60℃)の流速を使用した。260nm、280nmでUVをトレースし、Cy5の場合は643nmを記録した。55分以内に25％B〜55％Bの勾配を使用した。適切な画分をプールし、3M NaOAc、pH=5.2およびエタノール(1:32)によって沈殿させた。遠心分離後に、ペレットを水に溶解した。
【０２４０】
溶液の濃度は、UV光度計(Beckman Coulter, Krefeld, Germany)において260nmで吸光度を測定することによって求めた。アニーリングまで、個々の鎖を-20℃で凍結溶液として保管した。
【０２４１】
3.オリゴリボヌクレオチドをアニーリングしてsiRNAを作製する
等モルのRNA溶液を組み合わせることによって相補鎖をアニーリングした。混合物を凍結乾燥し、望ましい濃度となるように適量のアニーリング緩衝液(100mM NaCl、20mMリン酸ナトリウム、pH6.8)を用いて再構成した。この溶液を95℃の水浴に入れ、3時間以内に室温まで冷却した。
【０２４２】
核酸の分子量ならびにsiRNAヘテロ二重鎖の分子量を表6に列挙した。抗体との複合体形成の時点まで、本発明者らは、0.1M NaCl、20mM NaH2PO4xH2O/Na2HPO4x2H2O, pH6.8に溶解した核酸結合体を分注して-20℃で保管した。図29は、ジゴキシゲニンとカップリングした核酸の組成を模式的に示す。
【０２４３】
ジゴキシゲニン化核酸と組換え<標的-Dig>二重特異性抗体との複合体形成
組換え<IGF1R>-<Dig>二重特異性抗体および<Her2>-<Dig>二重特異性抗体をカップリング反応のタンパク質成分として使用した。これらの分子の組成および精製は実施例1に記載されている。
【０２４４】
ジゴキシゲニン化核酸と<IGF1R>-<Dig>および<Her2>-<Dig>二重特異性抗体の複合体を作製するために、本発明者らは、核酸-Dig結合体を100μMの最終濃度まで0.1M NaCl、20mM NaH2PO4xH2O/Na2HPO4x2H2O、pH6.8に溶解した。二重特異性抗体を20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH=6.0緩衝液に溶解して1mg/ml(5μM)の濃度にした。上下にピペッティングすることによって核酸および二重特異性抗体を2:1モル比(核酸:抗体)まで混合し、RTで15分間インキュベートした。次いで、複合体をさらに改変することなくインビトロアッセイまたはインビボ用途に使用した。これらのアッセイのために、複合体をOpti-MEM1(Invitrogen Madison, WI)で希釈した。結果として生じた複合体は、抗体誘導体1つあたり2つのDig-siRNAを有する単量体IgG様分子と規定された。これらの二重特異性複合体の規定された組成(および2:1のペプチド:タンパク質比)は、サイズ排除クロマトグラフィーおよび装填/競合実験によって確かめられた。二重特異性標的化モジュールおよび蛍光標識核酸を用いた、これらのサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果を図30に示した。すなわち、装填の増大(大きなタンパク質複合体のサイズのシグナル)は、タンパク質分子1つあたり2つの核酸の比まで蛍光シグナルが増えることで明らかになる。その後に、さらに多くの標識核酸を添加しても、このタンパク質位置にあるシグナルは増えず、その代わりに、核酸サイズの低分子量分子を反映する位置にあるシグナルは増える。2:1のsiRNA-タンパク質複合体は解離の証拠を示さない。本発明者らは、これらの実験から、タンパク質-Dig-siRNA複合体は、タンパク質1つあたり2つのsiRNAを有する規定された分子からなると結論付けた。
【０２４５】
送達ビヒクルのペイロード装填を分析するためのネイティブ質量分析の適用
ネイティブ質量分析を適用して、タンパク質複合体の分子量を求めることができる。本技術は、変性質量分析とは対照的に中性pHの水性揮発性溶媒を用いて行われ、質量分析中の非共有結合タンパク質複合体の解離または破壊を最小限にするように最適化されている(Sharon M, Robinson CV (2007), The role of mass spectrometry in structure elucidation of dynamic protein complexes, Annu Rev Biochem. 2007 ;76: 167-93.; Heck AJ (2008), Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and structural biology, Nat Methods. 5(11):927-33.)。それにもかかわらず、試料調製中および質量スペクトル取得中の複合体解離を阻止するためには、分析されるタンパク質複合体はある程度安定していることが依然としてネイティブ質量分析に必要な条件である。
【０２４６】
ジゴキシゲニン化ペイロード、特に、Dig-siRNAまたはDig-ペプチドによる<Dig>二重特異性抗体のペイロード装填を確かめるために、本発明者らは、<Her2-Dig>二重特異性抗体ならびに親二価<Dig>抗体をネイティブ質量分析に供した。これらの結合モジュールに取り付けられたペイロードは、一ジゴキシゲニン化siRNAおよび二ジゴキシゲニン化siRNAならびに一ジゴキシゲニン化ペプチドであった。
【０２４７】
質量分析の前に、スペクトルの複雑さを小さくし、データ解釈を容易にするために、PNGase-Fを用いて抗体を脱グリコシルした。ネイティブMSと適合する溶液に分子を入れるために、カットオフが10kDaの遠心フィルターユニット(Millipore, England)を用いて、初期試料緩衝液を50mM酢酸アンモニウム水溶液(pH7.5)と連続して交換した。その後に、抗体をそれぞれのペイロードと1:2(mol/mol)の比で混合し、質量分析測定に使用する最終試料濃度を約10μMに調整した。その後に、混合試料をLCTエレクトロスプレー飛行時間型機器(Waters, Manchester, UK)によって分析した。ナノスプレーガラスキャピラリーを用いて、試料をZスプレー供給源に導入した。衝突冷却(collisional cooling)を高めるために、供給源の圧力を約9mbarまで上げた。供給源の温度を80℃に設定した。試料のコーン電圧は125Vから175Vまで変化した。ニードル電圧を約1200Vに設定して、タンパク質およびペイロード分子を断片化することなく、安定したスプレーおよび適切な脱溶媒和を得た。最適分解能に到達するために、コーン電圧は100Vから200Vまで変化した。質量スペクトルを2秒のスキャン期間で取得し、Mass Lynxソフトウェア(Waters, Manchester, UK)を用いて解釈した。
【０２４８】
図50aに例示した、これらの分析の結果から、<Dig>ビヒクルおよびジゴキシゲニン化siRNAまたはジゴキシゲニン化ペプチドの複合体はネイティブ質量分析によって検出できることが分かる。1つまたは2つのdig-siRNAまたはdig-ペプチドを含有する抗体複合体を検出することができる。このことから、ペイロード複合体がネイティブ質量分析に使用した水性緩衝液中で形成し、共有結合していなくてもインタクトな複合体として前処理、脱溶媒和、および質量分析手順から「生き残る」のに十分な安定性を有することが判明した。
【０２４９】
図50bは、手順が完了した時に検出可能な複合体の組成をまとめ、比較している。すなわち、全てのスペクトルは、複合体を形成しなかった遊離抗体、スペクトルの低いm/z範囲では、複合体を形成しなかった遊離ペイロード分子(図示したズームスペクトルには示されていない)を示すシグナルを含んだ。しかしながら、ジゴキシゲニン化ペイロードを含む全ての試料において、シグナルの大半は、1つまたは2つのペイロードを含む複合体に割り当てることができた。ビヒクル1つあたりの観察されたペイロードの最大数は2以下であった。これは、タンパク質1つあたり2つのDig捕捉モジュールが存在することと完全に一致している。
【０２５０】
二重特異性Dig-標的化ビヒクルとの複合体形成反応に、1つのジゴキシゲニンを含むsiRNAまたはペプチドを適用した時に、複合体の優勢な画分は、抗体1つあたり2つのペイロードを含んでいた。これは、一ジゴキシゲニン化siRNAおよび一ジゴキシゲニン化ペプチドについて同程度に観察された。この観察は、2(ペイロード):1(ビヒクル)の複合体化学量論と一致している。
【０２５１】
対照的に、二重特異性Dig-標的化ビヒクルとの複合体形成反応に、2つのジゴキシゲニンを含むsiRNAを適用した時に、(二重Dig)ペイロードとdig-二重特異性抗体との1:1複合体が優勢なシグナルとして現われた。このことは、1つのペイロードが両端にあるジゴキシゲニンを介して1つの<Dig>モジュールに結合することを示しているのかもしれない。この場合、ペイロードは2つのジゴキシゲニンを含むので、2:1のDig:ビヒクル化学量論は1:1の化学量論に変換される。これらの実験データから、ジゴキシゲニン化ペイロードと<Dig>含有標的化ビヒクルとの間に、規定され、かつかなり安定した複合体が形成されたことが分かる。さらに、本発明者らの結果から、ネイティブ質量分析は、ビヒクル-ペイロード複合体の装填化学量論および組成を分析する価値のあるツールであり得ることが分かる。
【０２５２】
実施例12:ジゴキシゲニン化siRNAおよび<標的>-<Dig>二重特異性抗体との複合体はsiRNAの生物学的活性およびタンパク質モジュールの標的特異的結合を保持している
生理活性化合物の特異的標的化を目的としたどの技術でも対処する必要のある非常に重要なトピックの1つは、化合物の生物学的活性を保持しなければならないことである。さらに、標的化モジュールの特異性および活性はペイロードの取り付けによる影響を受けてはならない。本発明者らが説明する二重特異性抗体技術は、生理活性核酸に対して2つの調整工程を有する。このうち1つは標的化モジュールの改変である。第1の工程において、本発明者らは、ジゴキシゲニンと生理活性核酸、例えば、siRNAを共有結合によりカップリングする。第2の工程において、このジゴキシゲニン化核酸(siRNA)は、大きなタンパク質である二重特異性抗体誘導体と複合体を形成する。核酸の活性を保持するために、両工程について改変核酸の活性を保証することが重要である。すなわち、活性アッセイによって、(i)ジゴキシゲニン化の後に核酸の機能が保持されていること、(ii)ジゴキシゲニン化核酸と、標的化モジュールを含有する<Dig>との複合体形成後に機能が保持されていることが示される必要がある。最後に、(iii)最終複合体において標的化モジュールの結合特異性および親和性がなお保持されていることが示される必要がある。
【０２５３】
非改変siRNAおよびジゴキシゲニン化siRNAの生物学的活性の比較
ジゴキシゲニンによるsiRNAの付加または変化によって生物学的活性が変化するかどうか評価するために、本発明者らはインビトロアッセイを細胞培養において行った。このために、本発明者らは、Eg5 mRNAを不活性化するsiRNAの活性を評価することにした。Eg5 siRNA活性の直接的な作用は、そのコグネイトmRNAのダウンレギュレーションである。これは、bDNA(分枝DNA)アッセイによって定量することができる。bDNA(分枝DNA)アッセイは、細胞内の特異的なmRNAの量を検出する(Burns et al., 1999, Molecular Endocrinology)。これらのアッセイを行うために、本発明者らは、規定された数のそれぞれの細胞タイプを96ウェルプレートに播種し、一晩付着させた。翌日、細胞を望ましい量のある特定のsiRNAでトランスフェクトするか、mRNAレベルに対する分析しなければならない作用のある薬剤で処理した。24時間後に、mRNAレベルを定量するために、製造業者(Affymetrix)の説明書に従って、QuantiGeneキットプロトコールを行った。簡単に述べると、細胞溶解産物を遺伝子特異的プローブセットの存在下で捕捉プレートに移し、次いで、53℃で一晩インキュベートした。ウェルを洗浄した。次いで、ウェルをAmplifierおよびアルカリホスファターゼ連結標識プローブと連続して53℃でインキュベートし、インキュベーションの間に洗浄を行った。最後の洗浄の後に、発光アルカリホスファターゼ基質ジオキシタン(dioxitane)を添加し、53℃で30分間インキュベートした。InfiniteF200ルミネッセンスリーダー(Tecan Austria, Groding)を用いて、発光を検出した。Eg5を標的とするsiRNAの生物学的活性はbDNA分析によって確かめることができるだけでなく、成長細胞におけるEg5 mRNA枯渇によって引き起こされる表現型によっても確かめることができる。Eg5は、キネシン様タンパク質ファミリーに属するモータータンパク質である。Eg5はKSP(キネシン紡錘体タンパク質)とも知られ、二極性紡錘体の形成に必須であり、紡錘極の適切な分離に必要とされる。Eg5が枯渇すると特徴的な単極紡錘体が形成し、紡錘体チェックポイントが活性化する。これにより有糸分裂停止が引き起こされ、最終的にアポトーシスへとつながる(Tao et.al., Molecular and cellular biology. 2007 Jan; 27(2):689-98)( Tao W. et.al., Cancer Cell. 2005;8:49-59)。このために、 siRNAによってEg5が不活性化すると、多くの場合、培養細胞への細胞傷害性表現型が媒介される。従って、Eg5 siRNAの生物学的活性は、生細胞の数をモニタリングすることによって分析することができる。
【０２５４】
生細胞の数を測定するために、CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega, Madison, WI)アッセイを、製造業者によって供給されたプロトコールに従って適用した。このアッセイでは、細胞を溶解し、ATP量と比例する発光シグナルを発生させる。ATP量は生細胞の数に正比例する。次いで、96ウェルプレートをInfiniteF200ルミネッセンスリーダー(Tecan Austria, Groding)において分析する。
【０２５５】
表7は、トランスフェクトされたsiRNAの生物学的活性と、これらのトランスフェクトされたジゴキシゲニン化対応物の生物学的活性を比較するために本発明者らが行ったbDNAおよびcytotoxアッセイの結果をまとめている。bDNAアッセイの場合、本発明者らはHeLa-S3細胞を96ウェルプレートに播種し、一晩付着させた。翌日、細胞を、LipofectamineTM 2000トランスフェクション試薬を用いて製造業者(Invitrogen)の説明書に従って、示された量のsiRNAでトランスフェクトした。24時間後に、Eg5 mRNAのmRNAレベルを定量するために、製造業者(Affymetrix)の説明書に従って、QuantiGeneキットプロトコールを行った。これらのアッセイの結果を図31に示した。
【０２５６】
cytotoxアッセイの場合、KPL-4細胞を96ウェルプレート1ウェルにつき7000個の細胞の密度で播種した。細胞を、10％FCSおよびL-グルタミンを含むRPMIに入れて、37℃、5％CO2、および85％湿度で24時間インキュベートした。翌日、細胞を、Dharmafectトランスフェクション試薬を用いて製造業者(Dharmacon)の説明書に従って、示された量のsiRNAでトランスフェクトした。48時間後に、細胞を、CellTiter-Gloアッセイ試薬で製造業者の説明書に従って処理した。これらのアッセイの結果を図33に示した。
【０２５７】
（表７）
0005758888.tif 000014
【０２５８】
CellTiter-GloアッセイのIC50値は非改変Eg5 siRNAについては28nMであり、ジゴキシゲニン化siRNAについては4nMであった。bDNAアッセイの対応するIC50値は非改変Eg5 siRNAについては0.016nMであり、ジゴキシゲニン化siRNAについては0.035nMであった。
【０２５９】
非改変Eg5 siRNAおよびDig改変Eg5 siRNAを用いた本発明者らのcytotoxアッセイの結果のさらなる例を図31に示した。本発明者らは、これらの分析から、siRNAの生物学的活性を妨害することなく、siRNAをジゴキシゲニン化できると結論付けた。
【０２６０】
様々な標的抗原を認識する、二重特異性ジゴキシゲニン結合実体および多重特異性ジゴキシゲニン結合実体を作製することができる
様々な形式でジゴキシゲニン結合モジュールを様々な細胞標的化実体に接続することができる。ヒトIGF1受容体またはHer2を認識する抗体とのC末端融合に加えて、様々な細胞表面抗原を認識する様々な他の抗体を、ハプテンを介したペイロード送達のためのビヒクルに変換した。作製され、精製され、および特徴付けられた例には、ヒトCD22抗原、ヒトCD33抗原、Lewis Y癌関連炭水化物抗原、ヒトおよびマウスのVEGF受容体2または受容体CDCP1を認識する<Dig>含有送達ビヒクルが含まれる。図47に記載の形式の組み合わせを適用して、1つの表面標的分子にある2つ(またはそれより多い)別々の標的または別々のエピトープを認識する分子でさえもDig標的化実体と組み合わせることができる。図51aおよびbは、様々な表面標的分子を発現する抗原発現標的細胞への、ハプテンを介したペイロード送達を実現するために作製された選択された分子を示す。様々な細胞表面抗原を取り扱う標的ペイロード送達用のビヒクルを作製するために適用されたアミノ酸配列をSEQ ID NO 51〜SEQ ID NO 60として列挙した。CDCP1を認識する二重特異性標的化実体を作製するために用いられたアミノ酸配列は、出願EP09011046.1に記載されている。全ての分子を哺乳動物細胞において発現させ、標準的なプロテインAおよびサイズ排除技術を用いて良好な収率で精製することができた(実施例3の「組換えヒト化<Dig>抗体、断片、および二重特異性融合タンパク質の組成、発現、および精製」を参照されたい)。図51c〜gは、様々な標的抗原を認識する様々な形式のこれらの全ての分子が、ペイロード送達の必要条件である標的化特異性ならびにジゴキシゲニン結合能力および親和性を完全に保持していたことを示す。すなわち、これは、表面プラズモン共鳴(BiaCore)実験(詳細については、実施例4の「組換え<Dig>抗体、断片、および二重特異性融合タンパク質とジゴキシゲニン化抗原との結合」を参照されたい)、ならびにFACS分析(データは示さず)によって証明された。FACS分析の場合、標的-Dig二重特異性抗体を細胞とインキュベートし、その後に、蛍光標識ジゴキシゲニンと別々にインキュベートした。これらの実験の結果を図51c〜gにまとめた。データから、細胞表面標的抗原ならびにジゴキシゲニンに対する結合特異性および親和性は、親抗体またはジゴキシゲニン結合部分と比較して変化しないことが判明した。従って、ハプテンを介した標的ペイロード送達のビヒクルとして、多くの異なる標的抗原を認識する多くの異なる形式およびモジュールを適用することができる。これらの標的化ビヒクルの一部、特に、腫瘍細胞上に高密度にある、内部移行される抗原を認識する標的化ビヒクルは、標的ペイロード送達に特に適しているかもしれない。例えば、腫瘍細胞に豊富にあるLeY炭水化物抗原を認識する二重特異性分子は、核酸および他のペイロードを腫瘍細胞に送達するのに非常に効果的な担体である(下記の実施例15、Leyを介したDPC標的化を参照されたい)。
【０２６１】
実施例13  抗原発現腫瘍細胞への、抗体と複合体を形成したジゴキシゲニン化siRNAの特異的標的化
siRNAはかなり大きなサイズがあり、高度に荷電しているので、二重特異性標的化モジュールとsiRNAとの複合体形成は標的化モジュールの特異的な抗原結合機能を妨害し得る可能性がある。これらのトピックに対処するために、本発明者らは、(i)抗体-siRNA複合体の特異的な抗原結合機能ならびに(ii)これらの複合体がsiRNAを抗原発現標的細胞にインビトロで標的化する能力を分析した。最後に、本発明者らは、(iii)インビボでの腫瘍異種移植片モデルにおけるsiRNA標的化のNIRF画像化によって、抗体-siRNA複合体の機能を確かめた。
【０２６２】
抗体-siRNA-複合体の特異的な抗原結合
<標的>-<Dig>Dig-siRNA複合体の抗原結合機能を確かめるために、本発明者らは、<Her2>-<Dig>について実施例4に述べられたのと同じ実験設定を用いて表面プラズモン共鳴を適用した。<IGF1R>-<Dig>の場合、実施例4に記載の方法の以下の変更を適用した。すなわち、2μg/mlの抗ヒトIgG抗体を、酢酸ナトリウム、pH5.0に溶解して注入した。これによって、約600RUの表面密度が得られた。それぞれの結合サイクルの後に共有結合していないタンパク質を除去するために、0.85％H3PO4を5μl/minで60秒間注入し、次いで、5mM NaOHを5μl/minで60秒間注入することによって、再生を行った。これらのBiacore実験のために、組換えにより産生されたRTK Her2可溶性細胞外ドメインを用いて、<Her2>-<Dig>-Dig-siRNA複合体を特徴付け、組換えにより産生されたRTK IGF1R可溶性細胞外ドメインを適用して、<IGF1R>-<Dig>-Dig-siRNA複合体を適用した。これらのアッセイの結果(表8にまとめた)から、ジゴキシゲニン化siRNAとのIgG複合体は細胞表面抗原に対して結合特異性および親和性を保持していることが分かる。この表は、<Her2>-<Dig>または<IGF1R>-<Dig>二重特異性標的化モジュールに対するジゴキシゲニン化siRNAの親和性も示している。
【０２６３】
（表８）
0005758888.tif 000015
【０２６４】
細胞表面抗原ならびにジゴキシゲニン化siRNAと二重特異性分子との同時結合を証明するさらなる例を図32に示した。すなわち、この実験のために、本発明者らは、実施例4に記載のBiacore実験を適用したが、以下の変更を加えた。すなわち、分析しようとする試料をHBS-Pで希釈し、5μl/minの流速で注入した。抗体<Her2>-<Dig>、Her2-ECD、およびDIG-siRNAをそれぞれ5μg/mlの濃度で連続して注入した。接触時間(会合相)は各分子について3分であった。
【０２６５】
本発明者らは、本発明者らの結合研究の結果(表8および図32)から、二重特異性モジュールがDig-siRNAならびに標的抗原に同時に結合すると結論付けた。さらに、本発明者らは、抗体複合体におけるsiRNAの存在が標的抗原結合に影響を及ぼさないと結論付けた。
【０２６６】
インビトロでの抗原発現腫瘍細胞への、抗体と複合体を形成したジゴキシゲニン化siRNAの特異的標的化
<Her2>-<Dig>-Dig-siRNA複合体および<IGF1R>-<Dig>-Dig-siRNA複合体が抗原発現細胞へのペイロードの特異的標的化を媒介するかどうか分析するために、本発明者らは、siRNAをDigならびに蛍光標識によって同時に標識できるという事実を利用した。それによって、顕微鏡観察または他の画像化技術によってsiRNAの局在を視覚化することが可能になる。
【０２６７】
FACS分析による特徴付けから、Dig-siRNA-Cy5と抗体の複合体形成は標的化モジュールの結合を妨害しないという証拠が得られた。これらの分析のために、本発明者らは、CD22陽性のRaji細胞およびRamos細胞ならびに二重特異性<CD22>-<DIG>抗体を使用した。96ウェルプレート1ウェルにつき3x105個の細胞を、FACS緩衝液(5％FCSを含有するPBS)中で5μg/mlの<CD22>-<DIG>抗体とインキュベートした。洗浄後に、細胞を、66.4nMの最終濃度のDIG-siRNA-Cy5とインキュベートした。もう1回の洗浄工程後に、細胞をFACS canto II(BD Biosciences)によって分析した。
【０２６８】
この分析の結果を図35に示した。<CD22>-<DIG>およびDIG-siRNA-Cy5の複合体はRaji細胞またはRamos細胞にはっきりと結合するのに対して、DIG-siRNA-Cy5のみでは結合をほとんど示さない。従って、本発明者らは、Dig-siRNA-Cy5と二重特異性抗体との複合体形成は標的化モジュールの結合を妨害しないと結論付けた。図34は、共焦点顕微鏡観察によるインビトロ画像化分析の結果を示す。このために、本発明者らは、抗原発現細胞ならびに抗原発現がない細胞(または弱い抗原発現しかない細胞)を、<Her2>-<Dig>モジュールとジゴキシゲニン化Cy5標識siRNAの複合体に曝露した。図35は、共焦点顕微鏡観察によるインビトロ画像化分析結果を示す。このために、本発明者らは、抗原発現細胞ならびに抗原発現がない細胞(または弱い抗原発現しかない細胞)を、<IGF1R>-<Dig>モジュールとジゴキシゲニン化Cy5標識siRNAの複合体に曝露した。
【０２６９】
これらの実験のために、KPL-4細胞、MDA-MB-468細胞、またはH322M細胞をカバーガラス上で約50〜70％の密度まで増殖させた。次いで、これらを、示された時間にわたって5nMの濃度の<Her2>-<Dig>-Dig-siRNA-Cy5または<IGF1R>-<Dig>-Dig-siRNA-Cy5複合体によって処理した。その後に、細胞をパラホルムアルデヒドで固定した。二重特異性抗体染色のために、固定細胞を洗浄し、ブロッキング試薬GSDBとインキュベートし、恒湿器(humidity chamber)の中で6.5μg/mlの濃度のウサギ抗ヒトκ軽鎖抗体(DAKO)と1.5〜2時間インキュベートした。もう1回洗浄した後に、細胞を、恒湿器の中で28.6μg/mlの濃度のAlexa-fluor488-標識ヤギ抗ウサギ抗体(Molecular Probes)と1.5時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄した。次に、DNAを、10μg/mlの濃度のDAPI(Roche)によって2〜3分間標識し、再洗浄し、封入剤で覆った。細胞をLeica SP20共焦点顕微鏡によって分析した。
【０２７０】
これらの分析の結果(図34および35、表9にまとめた)から、Dig-siRNAの複合体は二重特異性<Her2>-<Dig>または<IGF1R>-<Dig>標的化モジュールによって抗原発現細胞に特異的に送達されることが証明された。この送達は、複合体によって認識される標的化抗原に特異的であり、かつ依存する。なぜなら、siRNAは抗原陰性細胞に送達されないからである。抗原結合モジュールによって媒介される特異的送達のさらなる証拠は、siRNA送達が、二重特異性モジュールの一部である(がsiRNAに結合しない)同じ抗体の過剰な(競合)IgGの適用と競合できるという事実である。細胞と抗体siRNA複合体を37℃でインキュベートすると、抗体ならびにカップリングされたDig-siRNAが内部移行するという明らかな証拠が得られる(図34および図35)。本発明者らは、siRNAが抗原発現細胞に特異的に送達されるだけでなく、これらの細胞の内部に移行すると結論付けた。
【０２７１】
（表９）
0005758888.tif 000016
【０２７２】
インビボでの抗原発現腫瘍細胞への、抗体と複合体を形成したジゴキシゲニン化siRNAの特異的標的化
<Her2>-<Dig>-Dig-siRNA複合体および<IGF1R>-<Dig>-Dig-siRNA複合体が、細胞培養実験だけでなく生きている動物でも抗原発現細胞へのペイロードの特異的標的化を媒介するかどうか分析するために、本発明者らは、siRNAをDigならびに蛍光標識によって同時に標識できるという事実を利用した。それによって、画像化技術によって、生きている動物におけるsiRNAの局在を視覚化することが可能になる。このタスクのために本発明者ら適用した技術はインビボでの近赤外蛍光画像化(NIRF)である。これらの研究のために、50ugの<Her2>-<Dig>-Dig-siRNA-Cy5または<IGF1R>-<Dig>Dig-siRNA-Cy5複合体を、皮下腫瘍異種移植片を有する免疫不全マウスに静脈内注射した。これらの異種移植片は、抗原Her2(KPL4細胞)または抗原IGF1R(H322M細胞)を発現していた。その後に、実施例10に記載のようにMaestroシステムを用いてNIRF画像化を行った。
【０２７３】
（表１０）
0005758888.tif 000017
【０２７４】
これらのアッセイの結果(図36および37)から、二重特異性抗体と複合体を形成したDig-siRNAは、コグネイト抗原を発現する腫瘍に特異的に標的化されることが分かる。これらのデータを表10にまとめた。すなわち、Her2発現KPL4腫瘍は、<Her2>-<Dig>Dig-siRNA複合体を用いたNIRFによって視覚化することができる(図36)。同様に、IGF1R発現腫瘍は、二重特異性抗体誘導体<IGF1R>-<Dig>とDig-siRNAとの複合体を適用した時にNIRFによって特異的に視覚化することができる(図37)。本発明者らは、これらの実験から、二重特異性<標的-Dig>抗体とジゴキシゲニン化siRNAとの複合体は、標的抗原をインビボで発現する組織または細胞において特異的に蓄積すると結論付けた。
【０２７５】
実施例14:抗体と複合体を形成したジゴキシゲニン化siRNAにより標的化された抗原発現腫瘍細胞におけるsiRNA活性
mRNAの特異的破壊を媒介するために、siRNAは標的細胞の細胞質に到達しなければならない。従って、特異的siRNA活性を送達するための重要な要因の1つは、分子が細胞に送達されるだけでなく(これは実施例12および実施例13において証明されている)、十分な量のsiRNAがこれらの細胞の細胞質に導入されなければならないことである。このために、これらの分子は、少なくとも1回、生体膜に浸透しなければならない。生物製剤は膜を容易に通過しないので、このプロセスは、siRNA活性を効果的に送達するために克服しなければならないボトルネックである。このボトルネックを克服する手段は、膜浸透、膜を通るタンパク質移行、または膜破壊プロセスが関与し得るエンドソームエスケープ機構もしくは小胞エスケープ機構でもよい。siRNAを細胞質に送るプロセスの助けとなり得る要因の1つは、(i)内部移行後に二重特異性標的化部分からsiRNAペイロードを放出する能力(siRNAペイロードの内部移行は実施例13に示されている)である。これによって細胞質内への進入が容易になり得る。なぜなら、導入される必要のある実体はsiRNA標的化複合体全体より小さい(Dig-siRNAのみである)からである。標的細胞の細胞質へのsiRNAの導入を容易にし得る別の原理は、(ii)標的化複合体と、エンドソーム機能モジュレーターまたはエンドソームエスケープ/破壊モジュールとの組み合わせである。
【０２７６】
内部移行後に二重特異性抗体部分からDig-siRNAペイロードが放出される
ジゴキシゲニン化siRNAと<標的>-<Dig>二重特異性標的化モジュールとの複合体は規定されており、<Dig>モジュールの親和性が十分なために安定している。他方で、Dig-siRNAとタンパク質との結びつきは共有結合でなく、抗体-ハプテン相互作用からなる。複合体の非共有結合カップリング方式が内部移行後のペイロード放出を媒介できるか分析するために、本発明者ら二重標識siRNA複合体を用いた蛍光顕微鏡実験を行った。これらの実験のために、本発明者らは、Cy5標識Dig-siRNAを適用して、細胞内のsiRNAの位置を突き止めた。標的化複合体のタンパク質部分を視覚化するために、ウサギ抗ヒトκ軽鎖抗体を適用した後に、Alexa-fluor488標識ヤギ抗ウサギ抗体とインキュベーションした。両実体も、異なる励起チャンネルおよび発光チャンネルで顕微鏡によって視覚化することができた。両チャンネルからシグナルを視覚化したものを重ね合わせると、抗原発現細胞への適用後にタンパク質およびsiRNAの経路を同時に追跡する機会が得られる。視覚化技術および顕微鏡観察技術の実験上の詳細は実施例12に記載されている。図33および図34は、これらの共染色実験の結果を示す。Her2発現KPL4細胞を<Her2>-<Dig>Dig-siRNA-Cy5複合体に37℃で曝露し、その後に、顕微鏡によって分析した(図37)。同様に、IGF1R発現H322M細胞を<IGF1R>-<Dig>Dig-siRNA-Cy5複合体に37℃で曝露し、その後に、顕微鏡によって分析した(図40)。どちらの例も、複合体と細胞表面との結合およびその後の内部移行が観察された。初期には、タンパク質およびsiRNAシグナルは細胞表面およびエンドソーム内に共存した。このことから、完全複合体と標的細胞が結合し、完全複合体が標的細胞に内部移行したことが分かる。後期には、本発明者らは、siRNA関連シグナルからのタンパク質関連シグナルの分離を観察した。この分離は、<Her2>-<Dig>Dig-siRNA-Cy5を用いたKPL4細胞において、ならびに<IGF1R>-<Dig>Dig-siRNA-Cy5に曝露されたH322M細胞において観察された。
【０２７７】
DIG二重特異性ABからのDIG標識ペイロードの分離についての本発明者らの結果を確認するために、DIG標識組換えeGFPが装填されている<LeY>-<DIG>を、LeY発現MCF7細胞に曝露した。複合体と細胞表面との結合およびその後の内部移行が観察された。これらのデータを図38c〜dに示した。初期には、抗体およびeGFPシグナルは細胞表面に、およびエンドソーム内に共存した。このことから、完全複合体と標的細胞が結合し、完全複合体が標的細胞に内部移行したことが分かる。後期には、本発明者らは、eGFP関連シグナルからの抗体関連シグナルの分離を観察した。この知見から、様々なカーゴ分子が標的化DIG二重特異性抗体から分離されることが分かる。観察された分離がDIGシステムに基づくことを示すために、SMCCリンカーを介して<IGF1R>抗体に共有結合させたNu457標識siRNA、または<IGF1R>抗体と蛍光タンパク質シトリンの一列に並んだ融合タンパク質を用いて、比較可能な実験を行った。これらの事例はどちらも、標的化抗体からのペイロードの有意な分離は観察されなかった。
【０２７８】
本発明者らは、これらの実験から、インタクトな<標的>-<Dig>Dig-siRNA複合体は標的細胞表面に結合し、内部移行し、その後に、抗体実体からsiRNAペイロードを放出すると結論付けた。
【０２７９】
抗原発現細胞における標的化siRNA活性
mRNAの特異的破壊を媒介するためには、十分な量のsiRNAを、これらの細胞の細胞質内に導入しなければならない。細胞質においてRNAi機構の成分はsiRNA二重鎖を特異的に認識し、アンチセンスsiRNA鎖を、RNA誘導性サイレンシング複合体と呼ばれるタンパク質複合体に組込む。次いで、アンチセンス鎖はそれぞれのmRNAと対になるとRISCによってmRNAが切断され、それによって、特異的なmRNA破壊が媒介される。
【０２８０】
標的化Dig-siRNAがエンドソームからエスケープし、その後にmRNAノックダウンを媒介できるか分析するために、本発明者らは、<IGF1R>-<Dig>Dig-siRNA複合体をIGF1R発現H322M腫瘍細胞に適用した。さらに、本発明者らは<Her2>-<Dig>Dig-siRNA複合体をHer2発現腫瘍細胞に適用した。標的siRNAのエンドソームエスケープを容易にするために、本発明者らは標的化エンドソームエスケープモジュールも同時に適用した。これらの実験に使用したモジュールは、実施例5に記載のジゴキシゲニン化INF7ペプチドである。
【０２８１】
標的化siRNAおよび標的化ペプチドを細胞に適用した際に、siRNAを介したmRNAノックダウンならびにsiRNAを介した表現型をアッセイした。これらの実験のために本発明者らが適用した分子はEg5-siRNAであった。十分なEg5ノックダウンを実現できるのであれば、Eg5-siRNAは細胞に対して細胞傷害性表現型を媒介する。Eg5  siRNAならびにEg5 mRNAレベルを定量するアッセイ(bDNAアッセイ)および表現型を定量するアッセイ(cytotoxアッセイ)は実施例12および表7に詳述されている。
【０２８２】
これらの分析の結果を図34に示し、表11にまとめた。これらの実験のために、H322M細胞を96ウェルプレート1ウェルにつき15,000個の細胞の密度で播種した。細胞を、10％FCS、ピルビン酸Na+、L-グルタミン、およびNEAAミックスを含むRPMIに入れて、37℃、5％CO2、および85％湿度で24時間インキュベートした(KPL4細胞は96ウェルプレート1ウェルにつき7,000個の細胞の密度で播種した)。細胞を、10％FCSおよびL-グルタミンを含むRPMIに入れて、37℃、5％CO2、および85％湿度で24時間インキュベートした。ジゴキシゲニン化ペプチドと<IGF1R>-<Dig>および<Her2>-<Dig>二重特異性抗体との複合体を作製するために、本発明者らは、ペプチド-Dig結合体を1mg/mlの最終濃度までH2Oに溶解した。二重特異性抗体を20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH=6.0緩衝液に溶解して、1mg/ml(4.85μM)の濃度にした。上下にピペッティングすることによってペプチドおよび二重特異性抗体を2:1モル比(ペプチド:抗体)まで混合し、RTで15分間インキュベートした。Eg5およびルシフェラーゼ対照siRNA分子を独立して1:2(AB:siRNA)の比で二重特異性抗体に添加し、上下にピペッティングすることによって混合した。3つの混合物をRTで15分間インキュベートした。次いで、複合体を、示された濃度で細胞に添加した。細胞をさらに24時間インキュベートし、前記のようにbDNA分析のために溶解した。
【０２８３】
<標的>-<Dig>-Dig-siRNAと<標的-Dig>-Dig-INF7(エンドソームエスケープ媒介ペプチド(Esbjorner et al., 2007, Biochemistry)を同時適用することによって、本発明者らは、siRNA-タンパク質複合体によって標的化された細胞においてmRNAノックダウンを観察することができた。IGF1R発現細胞は、<IGF1R>-<Dig>-Dig siRNAモジュールによって用量依存的にEg5 mRNAの低下を示した(図35にINFペプチドの用量依存性を示した)。本発明者らが標的化モジュールなくDig-siRNAを適用した、またはsiRNAなく標的化INF7-ペプチドを適用した対照実験では、mRNAは全く枯渇しなかった。このことから、siRNAノックダウンを媒介するには、細胞表面抗原を認識する完全なsiRNA-標的化複合体が必要とされることが分かる。siRNA活性と標的化INF7ペプチドとの用量依存的な相関関係から、添加されたエンドソームモジュレーターは<標的>-<Dig>二重特異性抗体誘導体によるsiRNAの特異的標的化の効力を増大できることが分かる。
【０２８４】
本発明者らは、これらの実験から、<標的>-<Dig>二重特異性分子はsiRNA活性を抗原発現細胞に特異的に標的化できると結論付けた。さらに、本発明者らは、標的化エンドソーム調節剤をさらに適用することによって、この活性を増大できると結論付けた。
【０２８５】
（表１１）
0005758888.tif 000018
【０２８６】
DharmaFECT-DIG-siRNAと複合体を形成した<DIG>二重特異性抗体はRNAiを媒介する
脂質をベースとするトランスフェクション試薬が、<DIG>二重特異性抗体によって特異的に標的化されたsiRNAのエンドソームエスケープを助ける能力を調べた。従って、脂質をベースとする市販のトランスフェクション試薬であるDharmaFECT(Dharmaconにより提供)を使用した。
【０２８７】
DIG-siRNA、DharmaFECT、および二重特異性<DIG>抗体の複合体形成ならびに標的細胞における蓄積を分析するために、MCF7細胞(LeY陽性、CD22陰性)を用いてFACS分析を行った。LeY-DIGを標的化抗体として使用し、CD22-DIGを非標的化対照抗体として使用し、さらに、Cy5標識DIG-siRNAを使用した。複合体が形成するように、製造業者の説明書に従ってDharmaFECTをDIG-siRNA-Cy5とインキュベートした。その後に、DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5複合体をLeY-DIGまたはCD22-DIG抗体とインキュベートした。MCF7細胞をPBSに懸濁し、DIG-siRNA-CyおよびDharmaFECTの複合体またはLeY-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5もしくはCD22-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5の複合体と氷上で30分間インキュベートした。BD FACS Canto IIによって試料を測定する前に、細胞を洗浄した。Cy5の検出に適した波長においてシグナルを検出した。
【０２８８】
図52aおよびbは、このFACS分析の結果を示す。上パネルには、DharmaFECT/DIG-siRNA-CyおよびCD22-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5とMCF7との類似した結合挙動が見える。両複合体とも、トランスフェクション試薬の固有の特性であるDharmaFECT非特異的粘着性によりMCF7細胞に結合する。対照的に、下パネルには、DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5と比較してLeY-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5複合体の方が強く蓄積していることがはっきりと見える。このことから、DharmaFECT/DIG-siRNA-Cy5はLeY-DIGによってMCF7細胞に特異的に標的化されたことが分かる。
【０２８９】
次に、複合体DharmaFECT/DIG-siRNA、CD22-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNA、およびLeY-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNAがMCF7細胞において特異的RNAiを媒介する能力を分析した。従って、EG5を標的とするsiRNAを使用した。規定された数のMCF7細胞を96ウェルプレートに播種し、一晩付着させた。翌日、細胞を、望ましい量のDharmaFECT/DIG-siRNA、CD22-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNA、およびLeY-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNAで24時間処理した。Eg5-mRNAレベルのダウンレギュレーションをbDNAアッセイによって分析し(説明については実施例12を参照されたい)、GAPDH mRNAレベルに対して基準化した。
【０２９０】
図52cは、このbDNAアッセイの結果を示す。LeY-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNAとLeY-DIGおよびCD22-DIGの複合体を形成した時に、DharmaFECT/DIG-siRNAのトランスフェクション活性は保持されている。Eg5-mRNAのダウンレギュレーションは、これらの細胞に標的化された複合体LeY-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNAによって媒介される(図52aを参照されたい)。しかしながら、複合体CD22-DIG/DharmaFECT/DIG-siRNAによってもダウンレギュレーションは観察される。LeY-DIGのみによって媒介される、MCF7細胞上でのDharmaFECT/DIG-siRNAの標的蓄積はRNAiをわずかに増大させる。トランスフェクションおよびその後のRNAiを得るには、DharmaFECTの粘着性によって媒介されるDharmaFECT/DIG-siRNAの蓄積で既に十分である。結論として、エンドソームエスケープモジュールとして、siRNAと複合体を形成した脂質をベースとするトランスフェクション試薬を標的化することは可能である。しかしながら、トランスフェクション試薬がそれ自体で強力な細胞付着能力を有する場合には、抗体を介した標的化特異性に影響を及ぼすかもしれない。
【０２９１】
実施例15:<標的>-<Dig>二重特異性抗体と複合体を形成したジゴキシゲニン化DPCを利用して、標的化エンドソーム溶解活性と共にsiRNA送達を標的化することができる
siRNAの特異的標的化を目的としたどの技術でも対処する必要のある非常に重要なトピックの1つは、生物学的活性のために核酸が標的細胞の細胞質に到達しなければならないことである。核酸は高度に荷電しており、それ自体では膜を容易に通過しないので、標的化された(および内部移行した)siRNAが細胞の細胞質に放出されることがsiRNA送達の大きなボトルネックである。
【０２９２】
ボトルネックである「siRNAのエンドソームエスケープ」は、細胞結合および内部移行によってsiRNAのエンドソームエスケープを引き起こす動的ポリ結合体(DPC)を適用することによって克服することができる(Rozema DB et. al., Dynamic PolyConjugates for targeted in vivo delivery of siRNA to hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America; 2007 Aug 7;104(32): 12982-7 PMID:17652171、特に、WO2008/0022309、米国特許出願公開第US2008-0152661A1号、同第US2008-0287630号、同第US2008-0281074A1号、同第US2008-0287628A1号、同第US2008-0269450A1号、米国特許第7,098,032号、同第7,019,113号、同第6,919,091号)。このようなDPCはPBAVEスキャフォールドからなり、PBAVEには、PEG分子が二官能性マレアマート結合を用いて可逆的に取り付けられている。後者の場合、カルボキシル化ジメチルマレイン酸(CDM)を適用することができる。PEG単位は、PBAVEのエンドソーム溶解性正電荷を保護するために用いられる。PBAVEには、(例えば、可逆的なジスルフィド結合を介して)siRNAカーゴも連結される。結果として生じた送達ビヒクルはsiRNA動的ポリ結合体と呼ばれる。なぜなら、siRNA、保護基(およびさらなる標的化リガンド)がポリマーと可逆的に結合体化しているからである。siRNAの細胞質送達を引き起こす、このようなDPCのエンドソーム溶解性は、その化学環境によって誘導される。すなわち、成熟中のエンドリソーム(endolysome)内でのpH低下によってCDM-PEG放出が誘導されて、PBAVEの正電荷が曝露され、その結果、エンドソーム溶解が媒介される。
【０２９３】
DPCのエンドソーム溶解特徴と二重特異性のジゴキシゲニンまたはハプテン系の特異的標的化特性を組み合わせるために、以下の手順を適用した。第1の工程において、(i)ジゴキシゲニンが抗Dig抗体に接近できるように、ジゴキシゲニンと結合体化したDPCを作製する必要がある。さらに、(ii)二重特異性抗体の細胞表面標的化部分の結合特異性および親和性が保持されるように、Dig-DPCは標的-Dig二重特異性抗体と複合体を形成する必要がある。最後に、(iii)Dig-ハプテンによって一緒になった抗体-DPC複合体は、インビトロならびにインビボで特異的標的化を付与するのに十分な安定性のある規定された組成物を形成することを示す必要がある。
【０２９４】
ジゴキシゲニン化DPCおよび二重特異性DPC複合体の作製
ジゴキシゲニン化DPCを作製するために、NHS-ジゴキシゲニンを様々な比でPBAVE-CDM-PEG反応ミックスに添加するという変更を加えて、他に記された手順を適用した(Rozema DB et. al., Dynamic PolyConjugates for targeted in vivo delivery of siRNA to hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America; 2007 Aug 7; 104(32): 12982-7 PMID:17652171、特に、WO2008/0022309、米国特許出願公開第US2008-0152661A1号、同第US2008-0287630号、同第US2008-0281074A1号、同第US2008-0287628A1号、同第US2008-0269450A1号、米国特許第7,098,032号、同第7,019,113号、同第6,919,091号)。簡単に述べると、ジゴキシゲニン化DPCを作製するために、Hepes緩衝液(500mM, pH8)に溶解した2.5μMのポリブチルアミノビニルエーテル(PBAVE)溶液を、(等張性グルコース緩衝液または1xリン酸緩衝食塩水PBSに溶解した)0.07M N-ヒドロキシスクシンイミドNHS-DIG溶液と混合する。混合物を室温で30分間インキュベートする。このために適用することができるPBAVE:NHS-Dig比にはモル比1:1または様々な他の比が含まれる。30分間のインキュベーション工程の後に、CDM-PEG550溶液(0.11M)をPBAVE-DIG複合体に1:35の比(Dig-PBAVE:CDM-PEG)で添加し、もう60分間室温でインキュベートする。その後に、1.3ml Sephadex G-50スピンカラムを適用することによって、カップリングされていない過剰なCDM-PEGを除去する。NHS-DigおよびCDM-PEGをPBAVEスキャフォールドに取り付けると、pH感受性のカルボキシジメチルマレイン酸無水物CDM結合が形成する。
【０２９５】
これらのジゴキシゲニン化DPCに、Dig-二重特異性抗体と複合体を形成できるほど十分に露出したジゴキシゲニンがあるかどうか分析するために、SEC-MALLS分析を行った。この技術では、タンパク質またはタンパク質複合体のサイズを分析するだけでなく、分子の半径、すなわち、形状についての証拠も得られる。二重特異性抗体およびジゴキシゲニン化DPCの複合体を用いて行われたSEC-MALLS分析の結果から、ジゴキシゲニン化DPCはかなり安定して二重特異性Dig標的化モジュールに結合することが分かる。本発明者らは、Dig結合単位を有する二重特異性抗体モジュールとの安定複合体を形成するためにジゴキシゲニン化DPCを適用できると結論付けた。
【０２９６】
二重特異性抗Dig抗体-ジゴキシゲニン化DPC複合体はDPCを標的培養細胞に送達し、DPCを内部移行させる
<標的>-<Dig>Dig-DPC複合体の抗原結合機能を確かめるために、本発明者らはFACSアッセイを適用した。これらのアッセイのために、<IGF1R-Dig>-DPC複合体を、IGF1Rを発現するH322M細胞に適用した。図40に示したように、FACS分析をH322M細胞株およびRaji細胞株に対して行った。7.5nMのモル濃度の抗体または複合体および30nMの濃度の二次抗体(必要な場合、すなわち、対照)を与えた細胞をPBS+5％FCSに懸濁した。一次抗体を氷上で30分間インキュベートし、洗浄工程の後に、二次抗体を氷上で30分間添加した。BD FACS Canto IIによって試料を測定する前に、細胞を洗浄した。APC(対照)またはCy3(DPCを含有する試料)を検出するのに適した適切な波長で、シグナルを検出した。H322Mの場合、IGF1Rが発現しており、結合体とカップリングされたIGF1R-DIG二重特異性抗体のシグナルが得られる。Raji細胞株はCD22を発現し、この細胞株にはCD22-DIG+結合体の陽性シグナルがある。両細胞株とも、かなり高い二次抗体濃度によって引き起こされる中等度のバックグラウンドシグナルを示す。しかしながら、結合体とカップリングされた二重特異性抗体には二次抗体がアッセイに無いので、これらの試料において検出されるシグナルは全て特異的な抗原結合によるものである。本発明者らの実験分析から、IGF1R.Dig::Dig-DPC複合体は、IGF1Rを発現するH322M細胞に結合することが証明された。対照的に、この分子は、IGF1Rを発現しないRaji細胞またはRamos細胞に結合しない。これにより、DPCとカップリングされた二重特異性抗体について結合および特異性は保持されていることが判明した。さらなる実験から、CD22抗原を発現するRamos細胞およびRaji細胞は、CD22抗原を認識するDig二重特異性抗体と複合体を形成したDPCに結合することが証明された。このことは、DPCとカップリングされた二重特異性抗体について結合および特異性が保持されていることを裏付けている。
【０２９７】
さらに、標的化DPCの特異的結合およびその後の内部移行を証明するために、共焦点顕微鏡観察を適用した。これらの実験のために、IGF1Rを発現するH322M細胞を<IGF1R-Dig>-Dig DPC複合体で処理した。抗原結合後のDPCの場所を視覚化するために、これらの複合体のDPC部分を蛍光基質Cy3で標識した。図41は、標的化DPCが抗原発現H322M細胞の表面に結合し、内部移行することを示している。初期には、結合および内部移行後、抗体およびDPCはエンドソーム内で共存する。その後に、抗体検出およびDPC検出から、複合体は細胞内で分離されることが分かる。このことから、制限されていないエンドソーム溶解活性を媒介するために、Digと複合体化したDPCは細胞内で抗体標的化部分から解離することが分かる。
【０２９８】
二重特異性抗Dig抗体-ジゴキシゲニン化DPC複合体はインビボで腫瘍異種移植片にDPVを送達する
抗体-DPC複合体がインビボでDPCを腫瘍に標的化するのに十分な安定性があるかどうかという問題に対処するために、動物実験を行った。これらの実験のために、Cy3標識ジゴキシゲニン化DPCと複合体を形成したCy3標識Her2-Dig二重特異性抗体を、Her2発現KPL4腫瘍異種移植片を有する動物に注射した。腫瘍におけるDPCの蓄積は近赤外蛍光画像化(NIRF)によって様々な時点で検出され、(二重特異性抗体と複合体を形成していない)非標的化Cy3標識Dig-DPCの蓄積と比較された。図42は、この分析の結果を示す。すなわち、標的化されていないDPCは抗原陽性細胞において蓄積がほとんどないか、または蓄積を全く示さない。対照的に、二重特異性Dig-抗体によって標的化されたDPCは腫瘍に蓄積した明らかな証拠を示す。本発明者らは、DPCをインビボで望ましい標的部位に標的化するためにDig.二重特異性抗体を使用できると結論付けた。
【０２９９】
LeY-DIGおよびDIG-DPCを用いたsiRNA標的化
LeYは、結腸、胃、卵巣、乳房、および肺の多くの粘液性癌ならびに一部の表皮癌の表面に見られるLeYファミリーの炭水化物抗原である。この抗原を標的化するために、二重特異性LeY-DIG抗体を構築した。<LeY>配列は、LeY抗原に対するマウス抗体であるモノクローナル抗体B3に由来した(Pastan, et al., 1991, Cancer research)。B3は限られた数の正常組織としか反応しないので、癌を治療するための理想的な候補である(Brinkmann et al., 1991, PNAS)。さらに、LeY抗原は、前述した癌腫に由来する細胞に非常に高密度にあるので、この抗原と結合するとLeYおよび<LeY>の複合体は高い内部移行率を示す。
【０３００】
LeY-DIGがDIG-DPC-siRNAをLeY発現MCF7乳癌細胞に標的化する能力を調べるために、FACS分析を行った(図53aおよびb)。FACS分析は前記のように行った。図53aでは、漸増濃度(25nM、50nM、100nM、および150nM)のDIG-DPC-siRNAをMCF7細胞に添加して、DIG-DPC-siRNAがMCF7細胞表面に濃度依存的、非特異的に結合した。図53bでは、漸増濃度(25nM、50nM、100nM、および150nM)のLeY-DIGおよびDIG-DPC-siRNAの複合体を細胞上でインキュベートした。MCF7細胞へのLeY-DIGの濃度依存的な標的化が観察された。これは、DIG-DPC-siRNAのみの非特異的な結合の程度をかなり超えている。まとめると、LeY-DIGは、DIG-DPC-siRNAをLeY発現MCF7細胞に強く標的化することができる。
【０３０１】
次に、LeY-DIGによるDIG-DPC-siRNAの標的化によってコグネイトmRNAがダウンレギュレーションされるかどうか、このダウンレギュレーションが、DIG-DPC-siRNAのみまたは非標的化抗体と複合体を形成したDIG-DPC-siRNAで処理した細胞におけるmRNAダウンレギュレーションより高くなるかどうか分析するために、MCF7細胞を用いたバイオアッセイを行った。
【０３０２】
図53c)は、漸増濃度のDIG-DPC-siRNAのみまたは非標的化抗体CD22-DIGと複合体を形成したDIG-DPC-siRNAによって24時間処理したMCF7細胞のbDNAアッセイ(前記)の結果を示す。本実験では、AhaIを標的とするsiRNAをDPCに結合させた。AhaI(Hsp90 ATPaseアクチベーター)はHsp90シャペロンの制御因子である(Panaretou et al., 2002, Molecular Cell)。MCF7細胞をDIG-DPC-AhaIだけで処理するとAhaI/GAPDH mRNAの比が濃度依存的に減少する。このことから、DIG-DPC-AhaIとMCF7細胞が非特異的に結合しても、ある程度の標的mRNAのmRNAノックダウンが起こることが分かる。さらに、さらに高い濃度のDIG-DPC-AhaIを使用した時には、ハウスキーパーGAPDHのmRNAもわずかに減少した。しかしながら、驚いたことに、MCF7細胞とCD22-DIG/DIG-DPC-AhaI複合体を濃度依存的にインキュベートすると、DPCを介した非特異的なAhaI-mRNAノックダウンが部分的に戻る。これは、恐らく、Dig-siRNA DPC複合体と接続した時の非標的化抗体の保護作用を反映している。
【０３０３】
図53d)には、別の非標的化抗体であるVEGFR2-DIGと複合体を形成したDIG-DPC-AHAIで濃度依存的に処理したMCF7細胞のmRNA分析を示した。VEGFR2-DIGと結合しても、DIG-DPC-AhaIの非特異的トランスフェクションが減少する。結論として、非標的化抗体と複合体を形成したDIG-DPC-AhaIはDIG-DPC-AhaIのみより非特異的活性が少ない。
【０３０４】
MCF7細胞をLeY-DIGおよびDIG-DPC-AhaIの複合体で濃度依存的に標的処理すると、AhaIのmRNAダウンレギュレーションが強く増大する(GAPDHに対して基準化した)。このことから、LeY-DIGの特異的標的化(図54a)によってDIG-DPC-AhaIの生理活性も増大することが分かる。
【０３０５】
図53eは、DIG-DPC-AHAIのみ、またはLeY-DIGもしくはCD22-DIGと複合体を形成したDIG-DPC-AHAIで処理したMCF7細胞のmRNA分析を、DIG-DPC-GL3のみ、またはLeY-DIGもしくはCD22-DIGと複合体を形成したDIG-DPC-GL3で処理した細胞と比較して示す。siRNA GL3は、癌細胞に通常存在しない標的mRNAであるルシフェラーゼに向けられる。DIG-DPC-AhaIのみ、またはLeY-DIGもしくはCD22-DIGと複合体を形成したDIG-DPC-AhaIによる処理とは対照的に、DIG-DPC-GL3のみ、またはLeY-DIGもしくはCD22-DIGと複合体を形成したDIG-DPC-GL3によって処理してもAhaI/GAPDH比は低下しない。この結果から、DIG-DPC-AhaIによって誘導されるAhaI/GAPDH比の低下は特異的なsiRNAを介した作用であることが分かる。
【０３０６】
次に、MCF7細胞を、LeY-DIG/DIG-DPC-AhaIおよびCD22-DIG/DIG-DPC-AHAIによって時間依存的(1時間、4時間、8時間、24時間、または48時間)に処理した。これも、GAPDHとのAhaI mRNAレベルの比をbDNAアッセイによって評価した。これらの実験から、IC40値を計算し、LeY-DIG/DIG-DPC-AhaIによって処理したMCF7細胞のIC40値を、CD22-DIG/DIG-DPC-AhaIによって処理したMCF7細胞のIC40値(IC40 LeY/CD22と略す)で割ることによって、標的化特異性率を得た。図53fにおいて、標的化特異性率を時間に対してプロットした。このことから、LeY-DIG/DIG-DPC-AhaIによってMCF7細胞を4〜8時間処理した時に、最も高い特異性に達することが分かる。
【０３０７】
DIG-PBAVE-siRNAおよびLeY-DIG DIG-PBAVE-siRNA複合体の分析にSEC-MALLSを使用することができる
SEC-MALLS(サイズ排除クロマトグラフィーマルチアングルレーザー光散乱)は、生体分子をゲル濾過カラムによって分離し、3種類の検出システム:UV/可視光、屈折率(RI)、および光散乱(LS)に送る分析法である。UV/可視光およびRIの検出器から試料濃度の情報が得られる。LSは、溶解状態にある高分子および広範囲の粒子を特徴付けるための非侵襲的な技法である。ほとんどの特徴付け法とは対照的に、LSは外部の較正標準を必要としない。この意味では、LSは絶対的な技法である。ここで使用したWyatt Technology機器は、絶対的な分子特徴付けのために、以下の2種類の光散乱測定を行う。
・古典的光散乱/静的光散乱:ここでは、散乱光の強度は角度の関数として測定され、モル質量、rms半径、および第2ビリアル係数(A2)を得ることができる。ある種の粒子の場合、古典的光散乱からサイズ、形状、および構造を得ることができる。
・準弾性光散乱(QELS)または動的光散乱(DLS):QELS測定では、高速フォトンカウンター(fast photon counter)を用いて散乱光シグナルの時間依存的な変動を測定する。QELS測定値から、高分子または粒子の流体力学半径(hydrodynamic radius)を求めることができる。
【０３０８】
静的光散乱法および動的光散乱法は異なるタイプの情報を集めて、生体分子をより完全に特徴付けるための補完的なデータを得る。
【０３０９】
DIG-DPC-siRNA AHAIならびにLeY-DIGおよびDIG-DPC-siRNA AHAIの複合体を、サイズ排除クロマトグラフィーとマルチアングルレーザー光散乱(SEC-MALLS)の組み合わせと準弾性光散乱(QELS)によって分析した。SEC部分は、Dionex Ultimate 3000-SeriesのHPLCポンプ、デガッサー、およびオートサンプラーからなった。5mg/mlのDIG-DPC-siRNA AHAI溶液190μlまたはLeY-DIGおよびDIG-DPC-siRNA AHAIの複合体の3.3mg/mlの溶液190μlをGE Healthcare Bio-Sciences(Uppsala, Sweden)のSuperose 6 10/300 GL SECカラムにアプライした。溶出液として1xPBSおよび流速0.25mL/minを使用した。試料は、Wyatt Technology(Santa Barbara, CA, USA)の示差屈折率(RI)検出器(Optilab rEx)、3アングルレーザー光散乱検出器(miniDAWN Treos, GaAsレーザー658nm, 50mW, K5セル)、および動的光散乱検出器(WyattQELS)によって検出した。Zimmプロットおよび流体力学半径を用いた分子量の計算は、ASTRA for Windows Software, Version 5.3.4.13によって行った。
【０３１０】
DIG-DPC-siRNA AHAIならびにLeY-DIGおよびDIG-DPC-siRNA AHAIの複合体のSEC-MALLS分析の結果を図54に示した。
【０３１１】
図54aおよびbに、DIG-DPC-siRNA AHAI(左パネル)およびLeY-DIG/DIG-DPC-siRNA AHAI(右パネル)の分子量の分析を示した。黒色の曲線は、LS検出器によって発生したシグナルを示すのに対して、赤色の線は、LSおよびRI検出器のシグナルから作製した分子量を示す。得られた分子量は近似値にすぎない。なぜなら、DIG-DPC-siRNA AHAIの正確なdn/dc値は未知であり、PEGのdn/dc値である0.146と推定したからである。図54aに示したように、DIG-DPC-siRNA AHAIは、推定分子量が約300〜約720kDの分子を含む多分散溶液を示す。LeY-DIGを添加しても多分散溶液が得られるが、推定分子量が約500〜約1100kDの分子を含む溶液が得られる。サイズが増大したことから、LeY-DIGとDIG-DPC-siRNA AHAIとの間に複合体が形成したことが分かる。
【０３１２】
図54c)およびd)に、DIG-DPC-siRNA AHAI(左パネル)およびLeY-DIG/DIG-DPC-siRNA AHAI(右パネル)の流体力学半径の分析を示した。黒色の曲線は、LS検出器によって発生したシグナルを示したのに対して、青色の点線は、QELS検出器のシグナルから作製した流体力学半径を示す。DIG-DPC-siRNA AHAIは流体力学半径が約7nm〜約10nmの分子を含有し、LeY-DIG/DIG-DPC-siRNA AHAIは、流体力学半径が約9nm〜約12.5nmの分子を含有する。これも、LeY-DIGを添加するとサイズが増大し、LeY-DIGおよびDIG-DPC-siRNA AHAIの複合体が形成したことが分かる。
【０３１３】
実施例16:DIG標識GFPを用いた<LeY><DIG>二重特異性抗体の内部移行の測定
<標的>-<Dig>二重特異性抗体を用いて、DIG標識カーゴを細胞に特異的に送達することができる(実施例6)。持ち上がった問題の1つは、<標的>-<Dig>二重特異性抗体を用いてDIG標識タンパク質も細胞に標的化できるかということである。この問題に答えるために、本発明者らは、DIG部分を、前記のように高感度緑色蛍光タンパク質(eGFP)と結合体化した。eGFPは、スペクトル特徴が改善され、蛍光、光安定性が増大し、主励起が488nmにシフトしている、オワンクラゲ(Aequorea Victoria)に由来するGFPの変異体である(Heim R, Cubitt A, Tsien R (1995). Nature 373(6516):663-4.)。
【０３１４】
<LeY>-<DIG>二重特異性抗体を用いて、DIG標識タンパク質eGFPを標的細胞に標的化することができる
<LeY>-<DIG>二重特異性抗体を用いて、DIG標識タンパク質eGFPを標的細胞に向けることができるかどうか分析するために、本発明者らはFACS分析を使用した。eGFPは蛍光を発するので(主励起488nm、主発光509nm)、このタンパク質の存在は、一般的に用いられるFITCフィルターセットによって検出することができる。本発明者らは、2つの[1:2]DIG部分または3つの[1:3]DIG部分とカップリングされた2種類のeGFP変種を作製した。
【０３１５】
これらの分析のために、本発明者らは、LeY陽性MCF7細胞および二重特異性<LeY>-<DIG>抗体を使用した。96ウェルプレート1ウェルにつき3x105個の細胞を播種し、すぐに使用した。3.43nMの<LeY>-<DIG>二重特異性抗体を含むFACS緩衝液(5％FCSを含有するPBS)をウェルに添加した。同じ濃度の<DIG>抗体を非標的化対照として使用した。結合した抗体を検出するために、二次Cy5標識抗体(Jackson Immunoresearch 709-176-1490; Cy5 F(ab')2ロバ抗ヒトIgG(H+L))を3.43nMの最終濃度まで添加した。FACS緩衝液で洗浄した後に、細胞を4℃で1時間インキュベートし、次いで、FACS canto II(BD Biosciences)によって分析した。<LeY>-<DIG>二重特異性抗体を介した、細胞へのeGFP送達を示すために、2倍モル量の[1:2]DIG-eGFPおよび[1:3]DIG-eGFPとプレインキュベートした、3.43nMの<LeY>-<DIG>二重特異性抗体を含むFACS緩衝液(5％FCSを含有するPBS)をウェルに添加した。FACS緩衝液で洗浄した後に、細胞をFACS canto II(BD Biosciences)によって分析した。
【０３１６】
これらのアッセイの結果(図43)から、二重特異性抗体と複合体を形成したDIG-eGFPは、コグネイト抗原を発現する腫瘍に特異的に標的化されることが分かる。<DIG>対照抗体の弱いバックグラウンド結合が観察された。このシグナルはまた二次抗体を用いた時にしか観察されず、この二次抗体のアーチファクトである。他方で、<LeY>-<DIG>二重特異性抗体は特異的二次抗体によって検出された時にLeY発現MCF7細胞とはっきりと結合することを示す。これらの抗体はどれも、FITCチャンネルにおいて有意なシグナルを生じなかった。<LeY>-<DIG>二重特異性抗体に[1:2]DIG-eGFPまたは[1:3]DIG-eGFPが装填された時、これらの複合体はCy5シグナルについて分析された時に、Cy5とカップリングされた二次抗体を用いて検出された非装填抗体と比較して有意なシグナルを生じなかった(図43)。同じ複合体をFITCチャンネルにおいて分析した時に、[1:2]DIG-eGFPおよび[1:3]DIG-eGFPの有意なシグナルが観察されたが、<LeY>-<DIG>二重特異性抗体のシグナルは観察されなかった(図43,4)。これらのデータから、モデルタンパク質であるDIGカップリングeGFPを、<標的>-<DIG>二重特異性抗体によって標的陽性細胞に特異的に動員できることが分かる。
【０３１７】
DIG標識タンパク質eGFPを用いて、標的細胞に結合した二重特異性抗体のエンドサイトーシスをモニタリングすることができる
細胞表面結合受容体を標的とする抗体は、多くの場合、結合すると内部移行する。内部移行後に、標的に結合した抗体はエンドソーム区画に輸送される。これらの区画は連続的に酸性化される。eGFPなどのpH依存性フルオロフォアの助けを借りると、抗体の内部移行をモニタリングすることができる。
【０３１８】
吸収および蛍光を担うeGFPの発色団は、bシートの円柱内部にあるp-ヒドロキシベンジリデンイミダゾリジノンからなる。発色団は中性フェノール型または陰イオン性のフェノラート型で存在することができる。どちらの型も特異な吸光度および蛍光特徴を示す。これらの型の間の平衡は周囲の培地のpHに依存する(Nakabayashi T, Wang HP, Kinjo M, Ohta N. Photochemical & photobiological sciences : Official journal of the European Photochemistry Association and the European Society for Photobiology; 2008 Jun;7(6):668-70.)。両方の発色団型の異なる蛍光特徴が様々な アッセイにおいて用いられている(Puckett LG, Lewis JC, Bachas LG, Daunert S. Analytical biochemistry; 2002 Oct 15;309(2):224-31) (Kneen M, Farinas J, Li Y, Verkman AS. Biophysical journal; 1998 Mar;74(3):1591-9)。
【０３１９】
DIG-eGFPが内部移行をモニタリングする能力を分析するために、本発明者らはFACS実験を行った。これらの分析のために、本発明者らは、LeY陽性MCF7細胞および二重特異性<LeY>-<DIG>抗体を使用した。96ウェルプレート1ウェルにつき3x105個の細胞を播種し、すぐに使用した。2倍モル量の[1:2]DIG-eGFPおよび[1:3]DIG-eGFPとプレインキュベートした、3.43nMの<LeY>-<DIG>二重特異性抗体を含むFACS緩衝液(5％FCSを含有するPBS)をウェルに添加した。FACS緩衝液で洗浄した後に、細胞を4℃または37℃で1時間インキュベートした。次いで、FACS canto II(BD Biosciences)によって細胞を分析した。
【０３２０】
これらの実験(図44)の結果から、<LeY>-<DIG>二重特異性抗体が内部移行した後に、DIG-eGFPの蛍光は有意に低下することが分かる。4℃では、複合体は、細胞表面に局在しているLeY抗原に結合することができるが、内部移行することができない。1時間後、蛍光は完全に保持されている(図44)。しかしながら、DIG-eGFP<LeY>-<DIG>二重特異性抗体複合体の内部移行を開始するためには、37℃で1時間のインキュベーションで十分である。測定されたシグナルから、これらの細胞には依然としてeGFPがあるが、4℃対照細胞と比較して、有意な蛍光シグナル低下が観察されたことが分かる(図44,1,2)。これらのデータから、pH依存性フルオロフォアを用いてエンドサイトーシス依存性エンドソーム酸性化を測定し、従って、エンドサイトーシスされた二重特異性抗体の輸送を追跡できることが分かる。
【０３２１】
様々なハプテンに結合する二重特異性標的化実体および多重特異性標的化実体を作製することができる
ジゴキシゲニン化ペイロードを標的化ビヒクルにカップリングするためにジゴキシゲニン結合モジュールを適用することは、ハプテンを介したペイロード送達を実現する技術的可能性の1つである。しかしながら、この考えは、ペイロードを捕捉し、標的化モジュールに接続する様々なハプテンまたは他の実体に発展することができる。例えば、siRNA送達のために、核酸に結合する二重特異性抗体および抗体誘導体を適用して、siRNAを標的化ビヒクルに接続することができる。
【０３２２】
ペイロード捕捉モジュールとして適用するのに必要な条件は、(i)ペイロードとハプテンとのカップリングがペイロード活性を妨害しないこと、および(ii)標的化ビヒクルと「ハプテン化(haptenylated)」ペイロードとが効果的に結合/複合体形成する可能性があることである。本実施例は、ペイロード送達に利用可能なさらに2種類のモジュール:ビオチン結合実体(抗体)およびPEG結合実体について述べる。
【０３２３】
ビオチンは、ロバストな最新カップリング技術を広範囲に利用できる安定した低分子である。ビオチンは、タンパク質、ペプチド、低分子量化合物または核酸、および他の物質にカップリングすることができる。ジゴキシゲニンと同様に、カップリングは、ペイロードの活性に影響を及ぼすことなく標準的な方法によって行うことができる。
【０３２４】
ポリエチレングリコール(PEG)を認識する抗体は、標準的な「ハプテン」結合剤とは全く異なる。PEGはポリマーであり、それ故に、標準的な「ハプテン」とみなされない。それにもかかわらず、PEG結合実体はペイロード捕捉実体として使用するのに良い選択であり得る。なぜなら、PEGは組換えタンパク質の付着物として既に用いられているからである。タンパク質、ペプチド、および他の物質をペグ化するためのロバストな技術および最適化された手順は利用可能である。さらに、PEGは、ナノ粒子などの多くのsiRNA送達ビヒクルの成分である。従って、標的化ビヒクルの中にペイロード捕捉用のPEG結合部分があると、既存のモジュールと単純に組み合わせることによって複合体形成が可能になる。これらは、ペグ化化合物、ペグ化タンパク質もしくはペグ化核酸、PEG-リポソーム、または他のペグ化ナノ粒子を含んでもよい。
【０３２５】
ペイロード複合体形成のためにビオチン結合部分またはPEG結合部分を利用する送達ビヒクルは、図47に記載の同じ形式または形式の組み合わせに基づいて作製することができる。これらの分子は図55に示されており、二重特異性抗体のジゴキシゲニン結合実体を、ビオチンまたはポリエチレングリコールに結合する抗体誘導体と交換することによって作製することができる。本実施例においてビオチン結合二重特異性抗体を作製するために本発明者らが適用した細胞表面標的化部分は、ヒトIGF1受容体を認識する抗体に由来した。ビオチン結合配列は、(抗Digモジュールについて実施例1において述べたように)抗ビオチン抗体を産生するマウスハイブリドーマに由来するmRNAから単離することができる。同様に、PEG結合配列は、(抗Digモジュールについて実施例1において述べたように)抗PEG抗体を産生するハイブリドーマに由来するmRNAから単離した。このために適用することができる抗PEG抗体は以前に述べられている(Wunderlich et al., Hybridoma 26(3): 168-172, 2007; Chenget al., Bioconj. Chem. 16:1225-31, 2005; Tsai et al., Biotechniques 30: 396-402, 2001)。
【０３２６】
抗ビオチンモジュールを含有する標的ペイロード送達用のビヒクルを作製するために適用されたアミノ酸配列をSEQ ID NO 61およびSEQ ID NO 62として列挙した。Roche Hybridoma<IGF1R-Biotin>を哺乳動物細胞において発現させ、標準的なプロテインAおよびサイズ排除技術によって均一になるまで精製することができた(実施例3の「組換えヒト化<Dig>抗体、断片、および二重特異性融合タンパク質の組成、発現、および精製」を参照されたい)。図55b〜d)は、抗ビオチン含有分子が、ペイロード送達に必要な条件である標的化特異性ならびにビオチン結合能力を完全に保持していたことを示す。すなわち、これは、表面プラズモン共鳴(BiaCore)実験によって証明された(詳細については、実施例4の「組換え<Dig>抗体、断片、および二重特異性融合タンパク質とジゴキシゲニン化抗原との結合」を参照されたい)。この図に示したデータから、細胞表面標的抗原ならびにビオチンに対する結合特異性および親和性は保持されていることが判明した。従って、ジゴキシゲニンに加えて、ハプテン(様)特性または直接的なペイロード結合能力を有する他の物質を利用して、標的ペイロード送達用のビヒクルを作製することができる。
【０３２７】
二重特異性ジゴキシゲニン結合実体を用いて、タンパク質またはペプチドをベースとするsiRNAトランスフェクションモジュールを送達することができる
様々なペプチド配列、いわゆる細胞浸透ペプチド(CPP)を用いて、siRNA分子をヒト癌細胞に移入できることが示されている。TATペプチドは、CPP機能を有するペプチドを用いてトランスフェクション能力を得るための公開された一例である。しかしながら、今までに、siRNAとCPP由来モジュールのトランスフェクションと、標的化特異性を容易に組み合わせることはできなかった。DIG-siRNAを様々な標的細胞に標的化する能力が示されたジゴキシゲニン結合二重特異性抗体(実施例13を参照されたい)を適用して、DIG-siRNAおよびsiRNA結合CPPの複合体を抗原発現標的細胞に標的化することができる。これを実現するために、CPPはsiRNA-抗体標的化複合体に取り付けられる必要がある。CPPは、ある場合には、核酸と複合体を自発的に形成することができる。CPP様機能を有するペプチドを核酸結合実体に接続することによって、ペプチドとsiRNAをさらに安定して結合することができる。このような実体は、負に荷電したリン酸バックボーンと正に荷電したアルギニンアミノ基とがイオン相互作用するために二本鎖siRNA分子に結合するオリゴアルギニン配列またはポリアルギニン配列でもよい。CPPをsiRNAに接続するために、さらに構造化されたペプチドドメインまたはタンパク質ドメイン、例えば、一本鎖または二本鎖の核酸および核酸誘導体に結合するドメインも適用することができる。
【０３２８】
図56aは、<Dig>二重特異性抗体を用いてsiRNA-CPP複合体を標的細胞に送達できることを証明するために本発明者らが適用した実験設定を示す。すなわち、これらの分析のために本発明者らが適用した、CPP機能を有するペプチドモジュールは、ヒトNRTN遺伝子に由来する30マーペプチドである。このペプチドは、CPP様の機能およびsiRNAトランスフェクション機能を有することが本発明者らによって最近、突き止められた。siRNAに効率的に取り付くためのペプチド誘導体を作製するために、本発明者らは、このペプチドと複数のアルギニンを融合した。siRNA結合モジュールおよびCPPの結果として生じた融合の配列は、
0005758888.tif 000019
であった。
【０３２９】
図56bは、CPP様NRTNペプチドは、(ジゴキシゲニン化)siRNAとのsiRNA結合実体複合体と極めて安定して融合できることを証明する。これによって、ゲル電気泳動実験において、複合体形成siRNAのタンパク質を介した強力な保持が引き起こされる。本発明者らが観察したゲルシフトの程度から、複数のsiRNA結合ペプチド融合が、それぞれのsiRNAと複合体を形成することが分かる。
【０３３０】
このことから、<Dig>siRNAを含有する複合体が形成されたことが分かる。この後に、二重特異性<Dig>標的化ビヒクルと「超複合体」を形成することによって、これらを標的化することができる(図56aを参照されたい)。
【０３３１】
これらの複合体が標的細胞においてmRNAサイレンシングを特異的に誘導する能力を分析するために、本発明者らは、<LeY>-<DIG>および<CD22>-<DIG>二重特異性抗体を含む複合体の標的化siRNAトランスフェクションを比較した。これらの二重特異性抗体には、Aha1を標的とする、または対照としてルシフェラーゼを標的とするDIG標識siRNAが装填される。これらの複合体は、Dig-siRNAを<Dig>二重特異性抗体と室温で30分間のプレインキュベートし、CPP-ポリArg(siRNA結合)実体に添加して、トランスフェクション能力のある完全な複合体を作製することによって形成された。複合体全体を室温でさらに30分間インキュベートした後に、LeY陽性MCF7細胞を含むOptimem培地に3時間にわたって添加した。その後に、増殖培地中でさらに21時間インキュベートした後に、細胞を溶解し、bDNAアッセイを用いてmRNA含有率を分析した。これらの分析の結果を図56cに示した。これらは、二重特異性抗体と、siRNAおよびsiRNAと複合体を形成したトランスフェクショニングペプチドまたはトランスフェクショニングドメインとの複合体を適用して、特異的に標的化されたsiRNA送達およびその後の標的化RNAiを実現できることを証明している。これらの複合体を用いて、<Ley-Dig>二重特異性抗体によって標的化されたLeY発現MCF-7細胞において、Aha1 mRNAの低下が観察された。他の同一の条件下で二重特異性モジュールとして<CD22-Dig>を適用すると、<LeY-Dig>二重特異性抗体を用いて到達できた作用と比較して低いRNAiが示された。<Ley>-<DIG>を用いたRNAi作用は、Ley陽性およびCD22陰性であるMCF7細胞への<CD22>-<DIG>送達より有意に強かったことから、siRNA CPP複合体が標的細胞に抗体を介して標的化されたことが分かる。
【０３３２】
実施例17:ジゴキシゲニン(DIG)標識siRNA-脂質ナノ粒子と、特異的標的およびDIGに対する二重特異性抗体(<標的-DIG>)との組み合わせは、インビトロで特異的細胞標的化、取り込み、および特異的RNAiを媒介する
本発明者らは、<標的-DIG>二重特異性抗体が、DIG標識siRNA-脂質ナノ粒子の送達機構を妨害することなくDIG標識siRNA-脂質ナノ粒子を細胞に誘導できるかどうかという問題を調べた。この問題に対処するために、本発明者らは、
(i)siRNA-脂質ナノ粒子のDIGカップリング脂質成分を合成し、
(ii)これらのDIG標識siRNA-脂質ナノ粒子を用いて処方し、
(iii)DIG標識siRNA-脂質ナノ粒子と<標的-DIG>二重特異性抗体との複合体を作製し、
(iv)<標的-DIG>二重特異性抗体と組み合わせたDIG標識siRNA-脂質ナノ粒子の標的化特性およびmRNAサイレンシング特性をインビトロで評価した。
【０３３３】
(i)DIGとカップリングされた1,2-ジステアロイル-ホスファチジルエタノールアミン[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](DSPE-PEG2000-DIG)の合成
NHS活性化DIG(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)をアミン官能化DSPE-PEG2000(Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AB)とカップリングすることによって、DSPE-PEG2000-DIGを合成した。
【０３３４】
(ii)DIG標識siRNA-脂質ナノ粒子の製造
DIG標識siRNA-脂質ナノ粒子は、(7.1mol％、57.1mol％、34.4mol％、および1.4mol％)の比の1,2-ジステアロイル-3-ホスファチジルコリン(DPPC)(Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AB)、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(社内で合成)、コレステロール(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munich, Germany)、およびポリエチレングリコール(PEG) 2000-脂質からなった。総含有率(1.4mol％)のPEG2000-脂質は、Sunbright GM-020CE、1.4％、1.36％、1％、または0.4％のα[3'-(1,2-ジミリストイル-3-プロパノキシ)-カルボキサミド-プロピル]-ω-メトキシ-ポリオキシエチレン(NOF Europe, Grobbendonk, Belgium)、および0％、0.04％、0.4％、または1％のDSPE-PEG2000-DIG(前記を参照されたい)からなった。脂質およびコレステロールをエタノールに溶解した。AHA1-siRNA、DIGとカップリングされたAHA1-siRNAまたはルシフェラーゼ(LUC)-siRNAをクエン酸塩緩衝液、pH4に溶解した。適量のエタノール脂質混合物をsiRNA緩衝水溶液に素速く注入することによって、siRNA-脂質ナノ粒子を形成した。その後に、10kD MWCO Slide-A-Lyzer(登録商標)カセット(Thermo Scientific, Rockford. IL)を用いて、siRNA-脂質ナノ粒子をリン酸緩衝食塩水(PBS)に対して透析した。siRNA-脂質ナノ粒子調製物のpH値を確認し、siRNA-脂質ナノ粒子のサイズ分布およびゼータ電位を、Zetasizer Nano-ZS(Malvern Instruments LTD, Malvern, UK)における動的光散乱によって求めた。siRNA捕捉の程度を定量するために、変更を加えたRiboGreenアッセイ(Invitrogen GmbH, Darmstadt, Germany)を行った。siRNAの総含有率は、siRNA-脂質複合体をメタノール:クロロホルム(10:1、vol:vol)に溶解した後に分光測定によって求めた。siRNA-脂質ナノ粒子(RLX-107-RLX-115)の平均粒径は119nm〜128nm(zaverage値)であり、多分散指数は0.02〜0.1であった。PBS中でのゼータ電位は-3〜-4mVであった。カプセル化効率は95％〜96％であり、siRNAの最終濃度は0.4mg/ml〜0.5mg/mlであった。
【０３３５】
(iii)DIG標識siRNA-脂質ナノ粒子と<標的-DIG>二重特異性抗体との複合体形成
1pmolのAHA1-siRNA、DIGとカップリングされたAha1-siRNA、またはルシフェラーゼ(LUC)-siRNAを含有するDIG標識siRNA-脂質ナノ粒子を、腫瘍関連LewisYオリゴ糖およびDIGに対する3.24pmolの二重特異性抗体<LeY-DIG>、もしくはシアル酸結合膜貫通タンパク質CD22およびDIGに対する3.24pmolの二重特異性抗体<CD22-DIG>、またはダルベッコリン酸緩衝食塩水(D-PBS)(Invitrogen, Carlsbad, CA)と、最終体積200μl のOpti-MEM(登録商標)(Invitrogen GmbH, Darmstadt, Germany)中で室温で30分間インキュベートした。
【０３３６】
(iv)<標的-DIG>二重特異性抗体と組み合わせたDIG標識siRNA-脂質ナノ粒子の標的化特性およびmRNAサイレンシング特性のインビトロでの評価
MCF-7細胞を80μlの培地(RPMI1640 Medium、10％ウシ胎児血清、100U/mlペニシリン/ストレプトマイシン; Biochrom AG, Berlin, Germany)に溶解して、96ウェルプレートに15,000個の細胞/ウェルの密度で播種し、細胞インキュベーター(37℃、95％H2O、5％CO2)に入れて一晩インキュベートした。DIG標識siRNA-脂質ナノ粒子を<標的-DIG>二重特異性抗体とプレインキュベーションした後に(前記を参照されたい)、20μlの混合物をMCF-7細胞に添加して、1nM siRNAを含有し、抗体を含有しない最終体積100μl(ABなし)、または1nM siRNAおよび3.24nMの<LeY-DIG>(LeY)もしくは<CD22-DIG>(CD22)抗体を含有する最終体積100μlにした。細胞を細胞インキュベーターに入れて12時間インキュベートした。対照として、細胞を、同じ抗体濃度であるが、siRNAまたはsiRNA脂質ナノ粒子なしでインキュベートもした(ABのみ)。さらなる対照として、細胞を、製造業者の説明書に従って、市販のトランスフェクション試薬Dharmafect2(Dh2)(Dharmacon Inc., Lafayette, CO)と複合体を形成した50nMのAHA1-siRNAまたはルシフェラーゼ-siRNAによってトランスフェクトした。インキュベーション後に細胞を溶解し、市販のbDNA-定量システム(Affymetrix Inc., Fremont, CA)を用いてAHA1-mRNA濃度およびGAPDH-mRNA濃度を定量した。AHA1-mRNAシグナルをGAPDH-mRNAシグナルに対して基準化し、Dh2を用いたルシフェラーゼ-siRNAトランスフェクション後(100％になるように設定した)と比較して、AHA1/GAPDH-mRNA比を報告した。
【０３３７】
<LeY-DIG>二重特異性抗体を使用しない場合、DSPE-PEG2000-DIG濃度が増加するにつれてsiRNA-脂質ナノ粒子の効力が減少し、1％DSPE-PEG2000-DIG(RLX-107)を含有するsiRNA-脂質ナノ粒子は標的AHA1-mRNAノックダウンを媒介しなかった。対照的に、MCF-7細胞を、DSPE-PEG2000-DIG(RLX-110およびRLX-115)を含有しない製剤と12時間インキュベートすると、AHA1-mRNAはそれぞれ43％または41％ノックダウンされた。より重要なことに、<LeY-DIG>二重特異性抗体をインキュベーション培地に添加した後に、1％(RLX-110)、0.4％(RLX-108)、または0.04％(RLX-109)DSPE-PEG2000-DIGを含有するリポソーム製剤のAHA1-mRNAノックダウン効力は、それぞれ、14％、45％、または31％有意に増大した。<LeY-DIG>二重特異性抗体も<CD22-DIG>二重特異性抗体も、DSPE-PEG2000-DIGを含有しないsiRNA-脂質ナノ粒子の効力に影響を及ぼさなかった。同様に、非標的化<CD22-DIG>二重特異性抗体を、DSPE-PEG2000-DIGを含有するsiRNA-脂質ナノ粒子に添加してもAHA1-mRNAノックダウンに影響を及ぼさなかった。また、ルシフェラーゼ-siRNA(RLX-111-RLX-114)を含有するsiRNA-脂質ナノ粒子は、使用した二重特異性抗体に関係なくAHA1-mRNAレベルに影響を及ぼさなかった。<LeY-DIG>二重特異性抗体を、DSPE-PEG2000-DIGを含有しないが、DIG改変AHA1-siRNAを含有するsiRNA-脂質ナノ粒子に添加した時に、効力は、<CD22-DIG>抗体(RLX-115)を添加した時と比較して5％しか増えなかった(図57)。
【０３３８】
表12および図57にまとめた結果は、<標的-Dig>二重特異性抗体を用いることによって、DIG標識siRNA-脂質ナノ粒子を、細胞表面に標的抗原を発現する細胞に効率的かつ特異的に送達できることを意味している。それによって、DIG標識siRNA-脂質ナノ粒子の効力は、標的抗原を発現する細胞において特異的に大幅に高めることができる。<CD22-DIG>二重特異性抗体は、DIG標識siRNA-脂質ナノ粒子にあるこの作用を運ばず、<LeY-DIG>二重特異性抗体は、組成が同一であるが標的化部分を含有しないsiRNA-脂質ナノ粒子にあるこの作用を運ばなかったので、抗体、抗原、およびsiRNAに対するこのアプローチの特異性は説得力をもって示すことができた。さらに、Luc siRNAを含有するsiRNA-脂質ナノ粒子によってMCF-7細胞を処理した後でも、AHA1 mRNAレベルは影響を受けなかった。
【０３３９】
（表１２）<標的-Dig>二重特異性抗体と複合体を形成したDIG標識siRNA-脂質ナノ粒子で処理した後の、MCF-7細胞におけるsiRNAを介したmRNAノックダウン。<標的-DIG>二重特異性抗体とプレインキュベートしたDIG標識siRNA-脂質ナノ粒子と12時間インキュベーションした後に、LeY抗原を発現するがCD22を発現しないMCF-7乳癌細胞において、AHA1 mRNAレベル(GAPDHを基準とする)が確かめられた。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１０ｅ】
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【図１０ｆ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１５ｄ】
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【図１５ｅ】
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【図１５ｆ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２０ｃ】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図２１ｃ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
0005758888.tif 000065
【図３０】
0005758888.tif 000066
【図３１ａ】
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【図３１ｂ】
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【図３１ｃ】
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【図３１ｄ】
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【図３１ｅ】
0005758888.tif 000071
【図３１ｆ】
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【図３１ｇ】
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【図３２】
0005758888.tif 000074
【図３３】
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【図３４】
0005758888.tif 000076
【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８ａ】
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【図３８ｂ】
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【図３８ｃ】
0005758888.tif 000082
【図３８ｄ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５ａ】
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【図４５ｂ】
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【図４５ｃ】
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【図４６ａ】
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【図４６ｂ】
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【図４６ｃ】
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【図４６ｄ】
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【図４７ａ】
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【図４７ｂ】
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【図４７ｃ】
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【図４７ｄ】
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【図４７ｅ】
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【図４７ｆ】
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【図４７ｇ】
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【図４７ｈ】
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【図４７ｉ】
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【図４７ｊ】
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【図４７ｋ】
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【図４７ｌ】
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【図４７ｍ】
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【図４７ｎ】
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【図４７ｏ】
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【図４７ｐ】
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【図４７ｑ】
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【図４７ｒ】
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【図４７ｓ】
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【図４７ｔ】
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【図４７ｕ】
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【図４７ｖ】
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【図４７ｗ】
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【図４７ｘ】
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【図４８ａ】
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【図４８ｂ】
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【図４８ｃ】
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【図４８ｄ】
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【図４８ｅ】
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【図４９ａ】
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【図４９ｂ】
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【図４９ｃ】
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【図４９ｄ】
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【図５０ａ】
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【図５０ｂ】
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【図５１ａ】
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【図５１ｂ】
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【図５１ｃ】
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【図５１ｄ】
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【図５１ｅ】
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【図５１ｆ】
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【図５１ｇ】
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【図５１ｈ】
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【図５２ａ】
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【図５２ｂ】
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【図５２ｃ】
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【図５３ａ】
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【図５３ｂ】
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【図５３ｃ】
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【図５３ｄ】
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【図５３ｅ】
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【図５３ｆ】
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【図５４ａ】
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【図５４ｂ】
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【図５４ｃ】
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【図５４ｄ】
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【図５５ａ】
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【図５５ｂ】
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【図５５ｃ】
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【図５５ｄ】
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【図５６ａ】
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【図５６ｂ】
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【図５６ｃ】
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【図５７】
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【配列表】
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