(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学上許容される担体中にＴ細胞上でプログラムセルデス−１(Programmed Cell Death-1)（ＰＤ−１）に結合する化合物および増強剤を共に含んでなり、該化合物および該増強剤が哺乳類においてＴ細胞応答を増強するのに有効な量でともに存在する、癌の治療のための治療組成物であって、
該化合物が下記からなる群から選択され：
（ａ）抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合断片、
（ｂ）第一および第二のペプチド部分を含んでなる融合タンパク質、ここで該第一のペプチド部分が、野生型Ｂ７−ＤＣ、インビトロにおいてＰＤ−１との結合に関して野生型Ｂ７−ＤＣと競合する配列番号１のアミノ酸２０〜２２１または２０〜１２１と少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列、インビトロにおいてＰＤ−１との結合に関して野生型Ｂ７−ＤＣと競合するＢ７−ＤＣの断片、並びにＢ７−ＤＣの細胞外ドメインから選択されるアミノ酸配列を含み、かつ該第二のペプチド部分が免疫グロブリン（Ｉｇ）の一部を含んでなり、
ここで、該増強剤が、シクロホスファミド、イフォスファミド（ＩＦＯ、Ｉｆｅｘ）、トロホスファミド（トロフォスファミド、Ｉｘｏｔｅｎ）、ペルホスファミド（４−ヒドロペルオキシシクロホスファミド）、マホスファミド（ＮＳＣ  ３４５８４２）、グルホスファミド（Ｄ１９５７５、β−Ｄ−グルコシルイソホスホルアミドマスタード）、Ｓ−（−）−ブロモホスファミド（ＣＢＭ−１１）、ＮＳＣ６１２５６７（アルドホスファミド ペルヒドロチアジン）、ＮＳＣ６１３０６０（アルドホスファミドチアゾリジン）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ）、抗ＴＧＦβ、イマチニブ（ＧＬＥＥＶＡＣ）、アントラサイクリン、オキサリプラチン、およびドキソルビシンからなる群から選択され、
該増強剤の用量が、直接的な抗腫瘍活性を有さないものであり、かつ
該化合物と該増強剤との組合せによって達成されるＴ細胞応答は、該化合物単独または該増強剤単独のいずれかで投与することにより達成されるＴ細胞応答よりも大きいものである。
【請求項２】
前記増強剤がシクロホスファミドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記増強剤がスニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ）、抗ＴＧＦβ、イマチニブ（ＧＬＥＥＶＡＣ）、アントラサイクリン、オキサリプラチン、またはドキソルビシンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
抗Ｂ７−Ｈ１抗体、抗Ｂ７−ＤＣ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、有糸分裂阻害剤、アロマターゼ阻害剤、および脈管形成阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの付加的薬剤をさらに含んでなる、請求項１の組成物。
【請求項５】
癌の治療のための、Ｔ細胞において阻害的シグナル伝達を低減する化合物を増強剤と組み合わせて投与するための医療用キットであり、
（ａ）Ｔ細胞において阻害的シグナル伝達を低減する化合物の投与供給源、
ここで、該化合物が下記からなる群から選択され：
(ｉ) 抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合断片、および
(ｉｉ) 第一および第二のペプチド部分を含んでなる融合タンパク質、ここで該第一のペプチド部分が、野生型Ｂ７−ＤＣ、インビトロにおいてＰＤ−１との結合に関して野生型Ｂ７−ＤＣと競合する配列番号１のアミノ酸２０〜２２１または２０〜１２１と少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列、インビトロにおいてＰＤ−１との結合に関して野生型Ｂ７−ＤＣと競合するＢ７−ＤＣの断片、並びにＢ７−ＤＣの細胞外ドメインから選択されるアミノ酸配列からなり、かつ該第二のペプチド部分が免疫グロブリン（Ｉｇ）の一部を含んでなり、
（ｂ）増強剤供給源、
ここで、該増強剤が、シクロホスファミド、イフォスファミド（ＩＦＯ、Ｉｆｅｘ）、トロホスファミド（トロフォスファミド、Ｉｘｏｔｅｎ）、ペルホスファミド（４−ヒドロペルオキシシクロホスファミド）、マホスファミド（ＮＳＣ  ３４５８４２）、グルホスファミド（Ｄ１９５７５、β−Ｄ−グルコシルイソホスホルアミドマスタード）、Ｓ−（−）−ブロモホスファミド（ＣＢＭ−１１）、ＮＳＣ６１２５６７（アルドホスファミドペルヒドロチアジン）、ＮＳＣ６１３０６０（アルドホスファミドチアゾリジン）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ）、抗ＴＧＦβ、イマチニブ（ＧＬＥＥＶＡＣ）、アントラサイクリン、オキサリプラチン、およびドキソルビシンからなる群から選択され、かつ該増強剤が直接的な抗腫瘍活性を有さない用量であり、および
（ｃ）薬学上許容される担体の供給源
を含んでなる、キット。
【請求項６】
前記化合物が第一および第二のペプチド部分を含んでなる融合タンパク質であり、該第一のペプチド部分が配列番号１のアミノ酸２０〜２２１または２０〜１２１のアミノ酸配列を含んでなり、かつ該第二のペプチド部分が免疫グロブリン（Ｉｇ）の一部を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記増強剤がシクロホスファミドの類似体であり、該シクロホスファミドの類似体が、イフォスファミド（ＩＦＯ、Ｉｆｅｘ）、トロホスファミド（トロフォスファミド、Ｉｘｏｔｅｎ）、ペルホスファミド（４−ヒドロペルオキシシクロホスファミド）、マホスファミド（ＮＳＣ  ３４５８４２）、グルホスファミド（Ｄ１９５７５、β−Ｄ−グルコシルイソホスホルアミドマスタード）、Ｓ−（−）−ブロモホスファミド（ＣＢＭ−１１）、ＮＳＣ６１２５６７（アルドホスファミドペルヒドロチアジン）、およびＮＳＣ６１３０６０（アルドホスファミドチアゾリジン）からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１〜４および６のいずれか一項の治療組成物を含み、哺乳類での免疫反応の誘導に用いるための、組成物。
【請求項９】
哺乳類において免疫応答を増強するための、請求項１〜４および６のいずれか一項に記載の治療組成物。
【請求項１０】
癌が、膀胱癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、鼻咽頭癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、および血液性癌から選択される、請求項１〜４および６のいずれか一項に記載の治療組成物。
【請求項１１】
癌が、胃癌、神経膠腫、白血病、黒色腫、多発性骨髄腫、腎細胞癌、および尿路上皮癌からなる群から選択される、請求項１〜４および６のいずれか一項に記載の治療組成物。
【請求項１２】
癌が黒色腫である、請求項１１に記載の治療組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本願は、２００９年４月２日に出願された米国仮出願番号第６１／２１１，６９７号公報、２００８年８月２５日に出願された同第６１／０９１，６９４号公報、２００８年８月２５日に出願された同第６１／０９１，７０９号公報、および２００８年８月２５日に出願された同第６１／０９１，７０５号公報の優先権を主張するものであり、これらは引用することにより本発明の開示の一部とされる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、Ｔ細胞上で阻害的シグナル伝達を妨げる化合物を増強剤と組み合わせて含む治療組成物および疾患治療に有用なＴ細胞応答の誘導のための該成分の併せた、または個別の使用に関する。
【０００３】
背景技術
癌のような感染および慢性疾患などの病態に対するＴリンパ球の応答は複雑で、細胞内相互作用および可溶性メディエーター（サイトカインまたはリンホカインと呼ばれる）の産生を含む。Ｔ細胞の活性化は通常、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）により提示される抗原ペプチドと接触した後の抗原特異的シグナルに依存するが、この反応の程度は種々の共刺激分子から発する(eminating from)正および負の抗原非依存性シグナルにより制御される。後者はＣＤ２８／Ｂ７ファミリーの一般メンバーである。これに対し、Programmed Death−１（ＰＤ−１）は、Ｔ細胞で誘導された際に負の免疫応答を送達する受容体のＣＤ２８ファミリーのメンバーである。ＰＤ−１とそのリガンドの一つ（Ｂ７−Ｈ１またはＢ７−ＤＣ）との接触は、Ｔ細胞の増殖および／またはＴ細胞応答の強度および／または持続時間を低減する阻害応答を誘導する。
【０００４】
従って、Ｔリンパ球応答は、受容体として働く細胞表面分子（ＴＣＲ複合体ならびに他の表面分子の双方を含む）を含む種々の因子によって調節される。
【０００５】
要するに、抗原特異的Ｔ細胞応答は、１）ＴＣＲと、ＭＨＣに関して提示される抗原ペプチドの結合（シグナル１）、および２）種々の受容体／リガンド対の間の接触により送達される第二の抗原非依存性シグナル（シグナル２）の二つのシグナルにより媒介される。この「第二のシグナル」は、Ｔ細胞応答の種類（活性化か阻害か）ならびにその応答の強度および持続時間の決定に極めて重要であり、Ｂ７ファミリータンパク質などの共刺激分子からの正および負のシグナルの双方によって調節される。最も詳細に特性決定されているＴ細胞共刺激経路はＢ７−ＣＤ２８であり、Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）はそれぞれ活性化ＣＤ２８受容体および阻害性ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）受容体と結合することができる。最も詳細に特性決定されているＴ細胞共刺激経路はＢ７−ＣＤ２８であり、Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）はそれぞれ刺激性ＣＤ２８受容体および阻害性ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）受容体と結合することができる。Ｔ細胞受容体を介したシグナル伝達に関して、ＣＤ２８の結合はＴ細胞の抗原特異的増殖を増大させ、サイトカインの産生を増強し、分化およびエフェクター機能を活性化し、Ｔ細胞の生存を促進する(Lenshow, et al., Annu. Rev. Immunol., 14:233-258 (1996)、 Chambers and Allison, Curr. Opin. Immunol., 9:396-404 (1997)、およびRathmell and Thompson, Annu. Rev. Immunol., 17:781-828 (1999))。これに対して、ＣＴＬＡ−４を介したシグナル伝達は、Ｔ細胞の増殖、ＩＬ−２の産生および細胞周期の進行を阻害する負のシグナルを送達すると考えられている(Krummel and Allison, J. Exp. Med., 183:2533-2540 (1996)、およびWalunas, et al., J. Exp. Med., 183:2541-2550 (1996))。共刺激分子のＢ７ファミリーの他のメンバーとしては、Ｂ７−Ｈ１(Dong, et al., Nature Med., 5:1365-1369 (1999)、およびFreeman, et al., J.
Exp. Med., 192:1-9 (2000))、Ｂ７−ＤＣ(Tseng, et al., J. Exp. Med., 193:839-846 (2001)、およびLatchman, et al., Nature Immunol., 2:261-268 (2001))、Ｂ７−Ｈ２(Wang, et al., Blood, 96:2808-2813 (2000)、 Swallow, et al., Immunity, 11:423-432 (1999)、およびYoshinaga, et al., Nature, 402:827-832 (l999))、Ｂ７−Ｈ３(Chapoval, et al., Nature Immunol., 2:269-274 (2001))、およびＢ７−Ｈ４(Choi, et al., J. Immunol., 171:4650-4654 (2003)、 Sica, et al., Immunity, 18:849-861 (2003)、 Prasad, et al., Immunity, 18:863-873 (2003)、およびZang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100:10388-10392 (2003))。Ｂ７−Ｈ５（ＷＯ２００６／０１２２３２に記載）は新しく見出されたＢ７ファミリーメンバーである。
【０００６】
Ｂ７ファミリー分子は膜近位定常ＩｇＣ（定常）ドメインと膜遠位ＩｇＶ（可変）ドメインを有する。これらのリガンドのＣＤ２８様ファミリー受容体は共通の細胞外ＩｇＶ様ドメインを有する。受容体−リガンド対の相互作用は、主としてリガンドと受容体のＩｇＶドメインの残基により媒介される(Schwartz, et al., Nature Immunol., 3:427-434 (2002))。一般に、ＩｇＶドメインは、それぞれβ鎖の層を含む２枚のシートを有することが記載されている(Williams and Barclay, Annu. Rev. Immunol., 6:381-405 (1988))。ＣＴＬＡ−４の表および裏のシートはそれぞれＡ’ＧＦＣ’Ｃ鎖およびＡＢＥＤＣ”鎖を含む(Ostrov, et al., Science, 290:816-819 (2000))が、Ｂ７  ＩｇＶドメインの表および裏のシートはそれぞれＡＧＦＣＣ’Ｃ”鎖およびＢＥＤ鎖からなる(Schwartz, et al., Nature, 410:604-608 (2001)、 Stamper, et al., Nature, 410:608-611 (2001)、およびIkemizu, et al., Immunity, 12:51-60 (2000))。結晶学的分析から、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７結合境界は、ＭＹＰＰＰＹモチーフからなる、ＣＴＬＡ−４由来のＣＤＲ３類似ループと、主としてＧ、Ｆ、Ｃ、Ｃ’およびＣ”鎖によって形成されるＢ７上の表面との相互作用により支配されることが明らかになった(Schwartz, et al., Nature, 410:604-608 (2001)、 and Stamper, et al., Nature, 410:608-611 (2001))。アミノ酸ホモロジー、突然変異、およびコンピューターモデリングからのデータは、このモチーフもＣＤ２８の主要なＢ７結合部位であるという概念に裏付けを与える(Bajorath, et al., J. Mol. Graph. Model., 15:135-139 (1997))。ＩＣＯＳではＭＹＰＰＰＹモチーフは保存されていないが、研究では、配列ＦＤＰＰＰＦを有し、同様の位置に存在する関連モチーフがＢＨ−Ｈ２の受容体であるＩＣＯＳとＢ７−Ｈ２の結合に主要な決定因子であることが示されている(Wand, et al., J. Exp. Med., 195:1033-1041 (2002))。
【０００７】
Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２またはＣＤ２７３とも呼ばれる）は比較的新しいＢ７ファミリーメンバーであり、Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１とも呼ばれる）と約３４％同一のアミノ酸配列を有する。ヒトおよびマウスＢ７−ＤＣ２相同分子種は約７０％のアミノ酸同一性を有する。Ｂ７−Ｈ１およびＢ７−ＤＣ転写物は種々の組織で見られる(Dong, et al., Nature Med., 5:1365-1369 (1999)、 Latchman, et al., Nature Immunol., 2:261-268 (2001)、およびTamura, Blood, 97:1809-1816 (2001))が、タンパク質の発現特性は全く異なっている。Ｂ７−Ｈ１は広範な組織および細胞種で広く発現されるが、Ｂ７−ＤＣの発現は主として活性化された樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージに限られる。
【０００８】
Ｂ７−Ｈ１およびＢ７−ＤＣは双方とも、その細胞質ドメインにimmunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM)を有するＣＤ２８ファミリーの遠位メンバーである(Ishida, et al., EMBO J., 11:3887-3895 (1992))ＰＤ−１と結合する(Freeman, et al., J. Exp. Med., 192:1027-1034 (2000))ことが示されている。ＣＤ２８ファミリー受容体のメンバーであるＰＤ−１は活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、ＤＣ、およびマクロファージで誘導的に発現される(Keir, et al Curr. Opin. Immunol. 19:309-314 (2007))。
【０００９】
そのリガンドによるＰＤ−１結合の主要な結果は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の下流でシグナル伝達を阻害することである。よって、ＰＤ−１を介したシグナル伝達は通常、Ｔ細胞に対して、Ｔ細胞増殖の低下またはＴ細胞活性におけるその他の低下をもたらす抑制または阻害シグナルを与える。Ｂ７−Ｈ１はＴ細胞において阻害的シグナル伝達を生じる主要なＰＤ−１リガンドである。本発明は、ＰＤ−１と結合し、従って阻害的シグナル伝達を妨げるか、あるいはまたＢ７−Ｈ１などのＰＤ−１のリガンドと結合し、それによりそのリガンドがＰＤ−１と結合して阻害シグナルを送達しないようにする薬剤を提供することにより、望ましくないＴ細胞阻害の問題を解決する。いずれの場合でも、Ｔ細胞の増殖または活性化などのＴ細胞応答が刺激される。
【００１０】
Ｂ７−Ｈ１は、そのより広い分布およびより高い発現レベルによるものと思われる主要なＰＤ−１リガンドである。ＰＤ−１阻害は、ＰＤ−１およびＴＣＲが免疫シナプスに対して互いに近接して連結される場合にのみ起こる。ＰＤ−１およびそのリガンドはいくつかの総説文献の主題となっている。
【００１１】
Ｂ７−Ｈ１はまた、多くの癌（乳癌、結腸癌、食道癌、胃癌、神経膠腫、白血病、肺癌、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌、腎細胞癌、および尿路上皮癌を含む）で過剰発現され、予後の悪さと関連づけられている。Ｂ７−Ｈ１は多くの腫瘍細胞系統により、特にインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）による刺激の後に発現され、また、腫瘍浸潤骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）でアップレギュレートされている。例えば、ＰＤ−１は腫瘍特異的ＣＤ８Ｔ細胞でアップレギュレートされ、機能不全、無応答、消耗およびアポトーシスと関連がある。ＰＤ−１のアップレギュレートはまた、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞などのさらなる細胞種での機能不全型および／または抑制型の表現型と関連づけられている。
【００１２】
本発明はＴ細胞活性の上昇による疾患、特に癌および感染性疾患を処置するための処置計画を提供することにより、このような分子機能を用いる。
【発明の概要】
【００１３】
一つの態様において、本発明は、そのような増強を必要とする哺乳類において、例えば抗原に対するＴ細胞応答を増強する方法であって、該哺乳類に、免疫細胞、特にＴ細胞において阻害的シグナル伝達を低減する化合物と増強剤を投与することを含んでなり、該処置計画が該哺乳類のＴ細胞応答の増強に有効である方法に関する。
【００１４】
本発明の処置計画において有用な化合物としては、阻害的シグナル伝達を誘発することなくＴ細胞上のＰＤ−１受容体と結合してそれを遮断するもの、ＰＤ−１リガンドと結合してそれらのＰＤ−１との結合を妨げる化合物、双方を行う化合物およびＰＤ−１またはＰＤ−１の天然リガンドのいずれかをコードする遺伝子の発現を妨げる化合物が含まれる。このような化合物は本明細書において「ＰＤ−１アンタゴニスト」と呼ばれる。ＰＤ−１の天然リガンドと結合する化合物としては、ＰＤ−１それ自体、ならびにＰＤ−１の有効断片、Ｂ７−Ｈ１リガンドの場合にはＢ７．１タンパク質および断片が含まれる。このようなアンタゴニストとしては、タンパク質、抗体、アンチセンス分子および小有機物が含まれる。好ましい実施形態では、該Ｔ細胞応答は、どちらかが他方を含まずに投与された場合に該ＰＤ−１アンタゴニストまたは該増強剤のいずれかにより生じるものよりも大きい。
【００１５】
別の実施形態では、本発明の方法において有用な化合物は、ＣＴＬＡ４などのＴ細胞表面分子と結合して、その天然リガンドの結合により誘発される阻害シグナルを妨げるものであるか、または該天然リガンドと結合するものである。このようなアンタゴニストには、タンパク質、抗体、アンチセンス分子および小有機物が含まれる。
【００１６】
一般的な実施形態では、本発明の処置計画および組成物において有用な化合物としては、ＰＤ−１とＴＣＲとの同時結合を誘発、増強、促進および／または許容することなくＰＤ−１と結合するものが含まれる。
【００１７】
ＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を妨げる、従って、ＰＤ−１アンタゴニストとして働く好ましい化合物としては、限定されるものではないが、阻害的シグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１と結合する、Ｂ７−ＤＣポリペプチド、特に、これらの可溶性部分（これらの有効断片、これらの変異体および同族体を含む）、ならびに上記のいずれかを組み込んだ融合タンパク質が含まれる。好ましい実施形態では、Ｂ７−ＤＣは配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列を含んでなる。好ましいこのような化合物は、Ｂ７−ＤＣの可溶性ドメイン（すなわち、膜貫通配列を含まない）を組み込んだものである。Ｂ７−ＤＣポリペプチドの好適な断片としては、ＩｇＶおよび／またはＩｇＣドメインを含む断片またはＩｇＶドメインのみを含む断片が含まれ、前者が好ましい実施形態であり、配列番号１のアミノ酸２０〜１２１はＩｇＶドメインの好ましい例である。
【００１８】
好ましいＰＤ−１アンタゴニストはまた、限定されるものではないが、阻害的シグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１と結合する、Ｂ７−Ｈ１ポリペプチド（引用することにより本明細書の開示の一部とされる米国特許第６，８０３，１９２号公報に開示されている）などのＰＤ−１の天然リガンドの有効断片、特に、これらの可溶性部分（これらの変異体および同族体を含む）、ならびに上記のいずれかを組み込んだ融合タンパク質が挙げられる。
【００１９】
本発明の好ましい化合物としては、限定されるものではないが、ＰＤ−１のリガンドと結合して、これがＰＤ−１と結合して阻害的シグナル伝達を誘発しないようにする、Ｂ７−Ｈ１と結合するＢ７−１の断片など、ＰＤ−１の天然リガンドと結合する有効断片、変異体および同族体、ならびに上記のいずれかを組み込んだ融合タンパク質を含む化合物が挙げられる。
【００２０】
別の実施形態では、該組成物およびその使用方法としては、ＰＤ−１受容体と結合してそれを遮断するＰＤ−１受容体アンタゴニストと、ＰＤ−１受容体リガンドと結合してそれを遮断する別個のＰＤ−１受容体アンタゴニストの組合せが含まれる。本発明の別の実施形態は、ＰＤ−１受容体を介した阻害的シグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１受容体と結合し、かつ、ＰＤ−１受容体リガンドと結合してそれと拮抗する能力を有する（Ｂ７−Ｈ１など）、そうでなければＰＤ−１受容体を介した阻害的シグナル伝達を誘発するＰＤ−１受容体アンタゴニストを提供する。意図されるその他のＰＤ−１受容体アンタゴニストとしては、ＰＤ−１受容体とＰＤ−１受容体リガンドの双方と結合することができる二重特異的抗体が含まれる。
【００２１】
本発明において有用な化合物の好ましい実施形態としてはまた、ＰＤ−１またはＣＴＬＡ４と結合し、それによりこれらの供給源により媒介される阻害的シグナル伝達を低減するまたは無くす抗体が含まれる。
【００２２】
本発明の方法で用いるための好ましい化合物としてはまた、限定されるものではないが、ＣＴＬＡ４と結合してその後の阻害シグナルを低減し、その上、ＣＤ２８と結合しないか、またはそうでなければＣＤ２８による正のシグナル伝達を阻害するＣＴＬＡ４のリガンド（Ｂ７−１およびＢ７−２など）の有効断片が挙げられる。
【００２３】
ＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を妨げる、従って、ＰＤ−１アンタゴニストとして働く好ましい化合物としては、限定されるものではないが、Ｂ７−ＤＣと結合する、Ｂ７−ＤＣアンタゴニスト、特に、これらの可溶性部分（これらの有効断片、これらの変異体および同族体を含む）、ならびに上記のいずれかを組み込んだ融合タンパク質が挙げられる。
【００２４】
一つの実施形態では、Ｂ７−ＤＣポリペプチド、その断片または変異体は他のポリペプチドとカップリングされて、ＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を生じることなくＰＤ−１受容体と結合し、それにより、リガンドとＰＤ−１の結合、特にＢ７−Ｈ１の結合を低減する、または干渉する、およびそれにより、ＰＤ−１受容体を介した阻害的シグナル伝達に干渉することによりＰＤ−１受容体と拮抗する融合タンパク質を形成する。このような融合タンパク質の例は、配列番号９、１０、１２または１３のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、ならびにその同族体である。一つの好ましい実施形態では、Ｂ７−ＤＣの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の全部またはの一部が融合タンパク質の一部となり、そこで、それは免疫グロブリンのＦｃ部分を含む第二のポリペプチドと連結されている。これの好ましい例がＢ７−ＤＣ−Ｉｇであり、特に、ここでこの構造は、二つのＢ７−ＤＣ−Ｉｇ分子がジスルフィド結合などによって互いに連結されているホモ二量体の部分である。
【００２５】
特定の実施形態では、本発明の化合物において有用な断片は、所望のアンタゴニスト活性を有するポリペプチドの少なくとも１０、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００個のまたはそれを超える連続するアミノ酸からなる。このような断片はまた、本発明で用いられる融合タンパク質の共通部分である。
【００２６】
別の態様において、本発明は、それを必要とする哺乳類においてＴ細胞応答を増強する方法であって、該哺乳類に抗ＰＤ−１抗体および増強剤を含んでなる有効な処置計画（該処置計画は該哺乳類のＴ細胞応答を増強するのに有効である）により投与することを含んでなる方法に関する。
【００２７】
別の態様において、本発明は、それを必要とする哺乳類においてＴ細胞応答を増強する方法であって、該哺乳類に免疫調節剤および増強剤を含んでなる有効な処置計画（該処置計画は該哺乳類のＴ細胞応答を増強するのに有効である）により投与することを含んでなる方法に関する。このような免疫調節剤は、Ｔ細胞応答を阻害する他のＣＤ２８ファミリー受容体（ＣＴＬＡ４など）と拮抗する分子を含む。好ましい実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体および増強剤を用いる。さらなる免疫調節剤としては、Ｔ細胞応答を活性化するＣＤ２８ファミリー受容体（ＣＤ２８およびＩＣＯＳなど）を促進する分子、Ｔ細胞応答を阻害するＢ７ファミリーリガンド（Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−ＤＣ、Ｂ７−Ｈ４など）に拮抗する分子、およびＴ細胞応答を活性化するＢ７ファミリーリガンド（Ｂ７．１およびＢ７．２など）を促進する分子が含まれる。
【００２８】
本発明の方法のいずれかのさらなる実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニスト化合物および増強剤の処置計画は、少なくとも一つの付加的治療薬をさらに含んでなる。意図される付加的治療薬としては、免疫調節剤が含まれる。このような方法のための例示的免疫調節剤としては、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ４抗体が含まれる。
【００２９】
一つの実施態様では、増強剤は、シクロホスファミドおよびシクロホスファミドの類似体、スニチニブ(Sutent)、抗ＴＧＦβおよびイマチニブ(Gleevac)、有糸分裂阻害剤（パクリタキセルなど）、アロマターゼ阻害剤（レトロゾールなど）、Ａ２ａアデノシン受容体（Ａ２ＡＲ）アンタゴニスト、脈管形成阻害剤、アントラサイクリン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、ＴＬＲ４アンタゴニスト、およびＩＬ−１８アンタゴニストから選択される。これらの薬剤のいくつかは、腫瘍微小環境内でＴｒｅｇ（すなわち、調節性Ｔリンパ球またはＴ−ｒｅｇ）の数を低減する。
【００３０】
別の実施形態では、本発明の方法および／または組成物は具体的には、前記方法および／または組成物の一部として任意の好適なアジュバントの使用を意図する。
【００３１】
本発明によれば、Ｔ細胞を、インビトロ、エクスビボまたはインビボにおいてＰＤ−１受容体アンタゴニストおよび／または増強剤を含有するその組成物と接触させることができる。ＰＤ−１受容体アンタゴニストおよび／または増強剤を含有するその組成物を用いたＴ細胞の接触は、Ｔ細胞の活性化の前、活性化の間、または活性化の後に行うことができる。
【００３２】
特定の実施形態では、ＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を回避または低減する分子および増強剤は、ＰＤ−１アンタゴニストを投与する前に増強剤を投与するなど、異なる時点で投与される。このような投与は付加的治療薬と組み合わせることができる。
【００３３】
本発明の方法のいずれかの特定の実施形態では、処置計画は、ＰＤ−１アンタゴニスト、抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、および／または付加的治療薬のいずれかまたは総てを投与する少なくとも１時間前、または少なくとも２時間前、または少なくとも３時間前、または少なくとも５時間前、または少なくとも１０時間前、または少なくとも１５時間前、または少なくとも２０時間前、または少なくとも２４時間前、または少なくとも３０時間前またはさらにはそれより前に増強剤を投与することを含む。増強剤の投与はまた、ＰＤ−１アンタゴニスト、抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体および／または付加的治療薬のいずれかまたは総てを投与した後、例えば、ＰＤ−１アンタゴニストを投与した１時間後、２時間後、３時間後、５時間後、１０時間後、１５時間後、２０時間後、２４時間後またはさらには最大３０時間後に行ってもよく、あるいはＰＤ−１アンタゴニストの投与とともに行ってもよい。
【００３４】
本発明の方法の結果として達成されるＴ細胞応答の増強は、癌、ウイルス感染、細菌感染および寄生虫感染の１以上含む疾患の処置に十分なものである。疾患が癌である場合、このような癌は膀胱癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、鼻咽頭癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌または血液性癌のいずれか１以上である。
【００３５】
別の態様において、本発明は、薬学上許容される担体中に、本発明の方法で用いられるアンタゴニストの組成物を含み、ここで、前記ＰＤ−１結合分子および増強剤はそれぞれＴ細胞刺激の増強をもたらすのに有効な量で存在する。
【００３６】
一つの好ましい実施形態では、本発明は、本発明で用いるための１以上の薬剤をその希釈のための医薬担体および投与に関する説明書とともに保持する容器を含んでなる医療用キットを含む。さらに、前記ＰＤ−１受容体アンタゴニストおよび増強剤が同時に投与される場合には、該成分の双方が薬学上許容される担体中単一の容器の成分として存在していてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、Ｂ７−ＤＣ−ＩｇがＰＤ−１と結合することを示す。標識Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇを、種々の濃度の、ＰＤ−１を構成的に発現するＣＨＯ細胞系統またはＰＤ−１を発現しない親ＣＨＯ細胞とともにインキュベートした。結合をフローサイトメトリーにより分析した。Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇの中央蛍光強度（ＭＦＩ）（ｙ軸）は、プローブ濃度（ｘ軸）の関数として示されている。Ｂ７−ＤＣ−ＩｇはＣＨＯ．ＰＤ−１細胞（黒丸）と結合するが、非トランスフェクトＣＨＯ細胞（グレーの三角）とは結合しない。
【図２】図２は、Ｂ７−ＤＣ−ＩｇはＰＤ−１との結合に関してＢ７−Ｈ１と競合することを示す。種々の濃度の非標識Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇをまず、ＰＤ−１を構成的に発現するＣＨＯ細胞系統とともにインキュベートした後、その細胞混合物に標識Ｂ７−Ｈ１−Ｉｇを加えた。Ｂ７−Ｈ１−Ｉｇの中央蛍光強度（ＭＦＩ）（ｙ軸）が、付加された非標識Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ競合物の濃度（ｘ軸）の関数として示されている。非標識Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇの濃度が増すにつれ、ＣＨＯ細胞と結合する標識Ｂ７−Ｈ１−Ｉｇの量は減り、Ｂ７−ＤＣ−ＩｇがＰＤ−１との結合に関してＢ７−Ｈ１と競合することが示される。
【図３】図３は、シクロホスファミド（ＣＴＸまたはサイトキサン（商標））と二量体ネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇの組合せがマウスにおいて定着したＣＴ２６腫瘍（結腸癌腫）の根絶をもたらしたという試験結果を示す。グラフＡは、１０日目に１００ｍｇ／ｋｇのＣＴＸで処置したマウスにおける腫瘍負荷後の日数に対する腫瘍体積（ｍｍ３）を示し、一方、グラフＢは、１０日目にＣＴＸで処置し、その１日後に最初のＢ７−ＤＣ−Ｉｇ投与を行ったマウスにおける腫瘍負荷後の日数に対する腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。各グラフの各線は１匹のマウスを表す。破線の矢印はＢ７−ＤＣ−Ｉｇの投与を示す。グラフＣは平均腫瘍体積を示す。
【図４】図４は、ＣＴＸと二量体ネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇの組合せがマウスにおいて定着したＣＴ２６腫瘍（結腸癌腫）を根絶し、ＣＴ２６の再負荷から保護したという試験結果を示す。ＣＴＸとＢ７−ＤＣ−Ｉｇで処置し、腫瘍接種後４４日目に腫瘍成長が見られなかったマウスに腫瘍を再負荷した。その後、７０日目にマウスに再負荷を行った。１００日目までに腫瘍成長を示したマウスは無かった。
【図５】図５は、ＣＴＸおよびＢ７−ＤＣ−Ｉｇ処置は腫瘍特異的メモリーＣＴＬの生成をもたらしたことを示す。ＣＴＸおよびＢ７−ＤＣ−Ｉｇ処置後に定着ＣＴ２６皮下腫瘍が根絶されたマウスにＣＴ２６細胞を再負荷した。７日後、脾細胞を単離し、無関係のペプチドであるオボアルブミンまたはＣＴ２６特異的ペプチドであるＡＨ１のいずれかでパルスした。細胞をまず抗ＣＤ８抗体で染色した後、ＦＡＣＳ分析前に抗ＩＦＮγ抗体で細胞内染色を行った。
【図６】図６は、マウスにおいて定着したＣＴ２６腫瘍の根絶に対する、種々の用量のＢ７−ＤＣ−ＩｇをＣＴＸと組み合わせた効果を示す。９〜１１週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスに１Ｅ０５  ＣＴ２６細胞を皮下移植した。９日目に、マウスに１００ｍｇ／ｋｇのＣＴＸを注射した（ＩＰ）。２４時間後の１０日目に、マウスを３０、１００、または３００μｇのＢ７−ＤＣ−Ｉｇで処置した後、最終２回の注射を全８回行った。腫瘍成長は１週間に２回測定した。
【図７】図７は、ＣＴＸと抗ＰＤ−１抗体の組合せがマウスにおいて定着したＣＴ２６腫瘍（結腸癌腫）の根絶をもたらしたという試験結果を示す。グラフＡは、非処置マウス（すなわち、ビヒクル単独で処置したマウス）における腫瘍負荷後の日数に対する腫瘍体積（ｍｍ３）を示し、グラフＢは、抗ＰＤ−１単独で処置（１１日目に注射１回当たり３００μｇで始め、１週間に３回、全１２回の注射）したマウスにおける腫瘍負荷後の日数に対する腫瘍体積（ｍｍ３）を示し、グラフＣは、１１日目にＣＴＸで処置し、１２日目に最初の抗ＰＤ−１投与（注射１回当たり３００μｇ、１週間に３回、全１２回の注射）を行ったマウスにおける腫瘍負荷後の日数に対する腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。各グラフの各線は１匹のマウスを表す。破線の矢印は抗ＰＤ−１の投与を示す。
【図８】図８は、ＣＴＸと抗ＣＴＬＡ４抗体の組合せがマウスにおいて定着したＣＴ２６腫瘍（結腸癌腫）の根絶をもたらしたという試験結果を示す。ここで、グラフＡは、１１日目に１００ｍｇ／ｋｇのＣＴＸで処置したマウスにおける腫瘍負荷後の日数に対する腫瘍体積（ｍｍ３）を示し、一方、グラフＢは、１１日目にＣＴＸで処置し、１２日目に抗ＣＴＬＡ４（注射１回当たり１００μｇ、１週間に２回、全８回の注射）で処置したマウスにおける腫瘍負荷後の日数に対する腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。各グラフの各線は１匹のマウスを表す。破線の矢印は抗ＣＴＬＡ−４の投与を示す。
【図９】図９は、９〜１１週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスに、１×１０５  ＣＴ２６細胞を皮下移植した試験結果を示す。９日目に、マウスに１００ｍｇ／ｋｇのＣＴＸを注射した（ＩＰ）。２４時間後の１０日目に、マウスを１００μｇのＢ７−ＤＣ−Ｉｇで処置した。５群があった：腫瘍細胞を負荷しなかったナイーブマウス、ビヒクル注射、ＣＴＸ単独、ＣＴＸ＋Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ、またはＢ７−ＤＣ−Ｉｇ単独。Ｔ細胞分析のため、１１日目（ＣＴＸ２日後）と１６日目（ＣＴＸ７日後）に２匹のナイーブマウスと他の群から４匹のマウスを試験から取り出した。左のパネルは、１１日目、ＣＴＸ注射２日後において、ＣＴＸ処置マウスの脾臓のＴｒｅｇが、腫瘍移植を行い、ビヒクルを注射したマウスの場合よりも有意に低かったことを示す。右のパネルは、１６日目、ＣＴＸ７日後およびＢ７−ＤＣ−Ｉｇ処置６日後において、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇが、高いＰＤ−１を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞を有意に低減したことを示す。これはＢ７−ＤＣ−Ｉｇ処置マウスとＣＴＸ＋Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ処置マウスの双方に見られた。腫瘍細胞を移植したマウスは、所属リンパ節(draining LN)中のＰＤ−１＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞がナイーブマウスに比べて多い傾向があった。
【図１０】図１０は、ＣＴＸと、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇとの組合せがマウス前立腺腫瘍細胞系統を尾静注したマウスにおける生存率を高めたという試験結果を示す。ＳＰ−１細胞はＴＲＡＭＰ前立腺腫瘍細胞注射から転移したマウス肺から単離された。Ｂ１０．Ｄ２マウスにまず、尾静注により３×１０５ＳＰ−１細胞を注射した。５日目、１２日目および１９日目に、マウスに示されているように５０ｍｇ／ｋｇのＣＴＸを注射した。６日目、１３日目および２０日目に、マウスに示されているように５ｍｇ／ｋｇのＢ７−ＤＣ−Ｉｇを投与した。ここで、「ＮＴ」は「処置せず」を意味する。
【図１１】図１１は、１１〜１３週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスに、半脾臓(hemispleen)注射法を用い、単離された肝臓転移物を与えた。麻酔マウスの脾臓を二分割し、半分を鉗子で留めた。ＣＴ２６細胞（１Ｅ０５）を半分の脾臓の一つに注射し、３０秒後に、その脾臓の半分を切除し、脾臓所属静脈を鉗子で留める。１０日目に、マウスに５０ｍｇ／ｋｇのＣＴＸを１度注射した（ＩＰ）。２４時間後の１１日目に、マウスを０．１×ＬＤ５０（１×１０７ＣＦＵ）の、ＣＴ２６の免疫優性エピトープである組換えリステリア菌担持ＡＨ１ペプチドで処置し、その後、１４日目と１７日目にも処置した。また、１１日目、その後１８日目にマウスをＢ７−ＤＣ−Ｉｇで処置した。マウスの総生存率を測定した。
【発明の具体的説明】
【００３８】
定義
特に定義しない限り、本明細書において用いられた総ての技術用語および科学用語は、開示された発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。特に、以下の用語およびフレーズは次の意味を有する。
【００３９】
「阻害的シグナル伝達」とは、Ｔ細胞の増殖を低減することによるものであれ、他のいずれかの阻害機構によるものであれ、免疫原性Ｔ細胞応答の程度または持続時間が低減される、抗原に対するＴ細胞応答を抑制する、またはそうでなければ低減する作用を有するシグナル伝達を意味するものとする。このような阻害的シグナル伝達は、ＰＤ−１とＢ７−Ｈ１またはこのリガンド種の他のいくつかのメンバーＢ７−ＤＣの結合など、ＰＤ−１と天然リガンドの結合によるものであってもよいし、あるいはＢ７−１またはＢ７−２などのＣＴＬＡ４とリガンドの結合によるものであってもよい。一般に、本発明の化合物はこのような阻害的シグナル伝達を低減し、限定されるものではないが、ＰＤ−１アンタゴニストおよびＣＴＬＡ４アンタゴニストを含む。
【００４０】
「ＰＤ−１アンタゴニスト」とは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、ＤＣおよびマクロファージの表面に見られるＰＤ−１により媒介される阻害的シグナル伝達を減衰する任意の分子を意味する。このようなアンタゴニストとしては、Ｔ細胞上のＰＤ−１分子により生じる阻害シグナルを中断させる分子が含まれる。本発明の特定の例では、ＰＤ−１アンタゴニストは、ＰＤ−１受容体シグナル伝達経路を介した阻害的シグナル伝達を阻害、低減、抑制またはそうでなければ低減する分子である。このような低減は、（ｉ）本発明のＰＤ−１アンタゴニストが、シグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１受容体と結合して阻害的シグナル伝達を低減または遮断する場合、（ｉｉ）ＰＤ−１アンタゴニストがＰＤ−１受容体のリガンド（例えば、アゴニスト）と結合して、それとの結合を妨げる場合（例えば、該アゴニストがＢ７−Ｈ１である場合）、（ｉｉｉ）ＰＤ−１アンタゴニストが、阻害されなければＰＤ−１の阻害的シグナル伝達を刺激するか、またはそうでなければ促進する結果を有する調節鎖の一部である分子と結合するか、またはそうでければその活性を阻害する場合、または（ｉｖ）ＰＤ−１アンタゴニストが、特に、ＰＤ−１をコードする１以上の遺伝子または１以上のその天然リガンドの発現を低減または抑制することにより、ＰＤ−１受容体の発現またはそのリガンドの発現を阻害する場合に起こり得る。従って、本発明のＰＤ−１アンタゴニストは、ＰＤ−１阻害的シグナル伝達の低減を果たし、それにより１以上の抗原に対するＴ細胞応答を増強する分子である。
【００４１】
本明細書において「ＣＴＬＡ４アンタゴニスト」とは、Ｔ細胞応答のＣＴＬＡ４媒介阻害を低減する化合物を意味する。例えば、Ｔ細胞において、ＣＴＬＡ４は、Ｂ７−１およびＢ７−２などのＢ７リガンドの結合の際に阻害インパルスを送達する。ＣＴＬＡ４アンタゴニストは、該リガンドの、活性化されたＴ細胞上のＣＴＬＡ４への結合を妨げるものである。一つの実施態様では、このアンタゴニストは、ＣＴＬＡ４と結合してリガンド結合を妨げる抗ＣＴＬＡ４抗体である。
【００４２】
本明細書において「有効断片」とは、天然ポリペプチドまたは天然ポリペプチドと高い配列相同性（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性）を有し、例えば、ＰＤ−１と結合するか、またはＰＤ−１のリガンドと結合することにより、ＰＤ−１アンタゴニスト活性を発揮する天然ポリペプチドの一部を意味する。好ましい実施形態では、このような断片は、配列番号３、好ましくはそのアミノ酸２０〜２２１などの、ＰＤ−１と結合するＢ７−ＤＣタンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）からなるであろう。ＰＤ−１ポリペプチドの場合、有効断片は、ＰＤ−１の天然リガンドと結合し、前記リガンドによるＰＤ−１媒介阻害的シグナル伝達の刺激を妨げる結合ドメインを含んでなる前記ポリペプチドの一部であろう。有効断片は、天然結合部位との結合に関して、それらが由来する分子と競合する能力によって同定され得る。例えば、有効断片は、ＰＤ−１との結合に関して野生型Ｂ７−ＤＣと競合する。
【００４３】
抗体に関して、「有効断片」とは、完全な免疫グロブリンよりも小さい抗体の抗原結合部分を意味する。このような断片としては、本明細書において受容体またはリガンドとして開示されるポリペプチドのいずれかと反応し、結合することができるＦａｂおよびＦ（ａｂ２）’断片が含まれる。これらのＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は完全抗体のＦｃ部分を欠き、完全抗体よりも迅速に循環から排除され、非特異的組織結合性を持ち得る(Wahl et al., J. Nuc. Med. 24:316-325 (1983))。また、Ｆｖ断片も含まれる(Hochman, J. et al. (1973) Biochemistry 12:1130-1135、 Sharon, J. et al.(1976) Biochemistry 15:1591-1594)。これらの種々の断片は、プロテアーゼ切断または化学的切断などの常法を用いて作製される（例えば、Rousseaux et al., Meth. Enzymol., 121:663-69 (1986)参照）。
【００４４】
本明細書においてＰＤ−１アンタゴニストの「可溶性部分」とは、膜貫通部分またはセグメントのいずれの部分も含まない全長ポリペプチドの一部を意味する。例えば、Ｂ７−ＤＣに関して、可溶性部分は細胞外部分（Ｎ末端シグナル配列を含むまたは含まない）を含むが、膜貫通部分のいずれの部分も含まない（または少なくとも溶解度の低減には十分でない）。従って、ヒトＢ７−ＤＣのＥＣＤは配列番号３として示され、全長分子のＩｇＶ様およびＩｇＣ様ドメインの双方、すなわち、全長配列のアミノ酸２０〜２２１（配列番号１）からなる。
【００４５】
本明細書において「共刺激ポリペプチド」とは、Ｔ細胞上の細胞表面分子と相互作用した際にＴ細胞の活性を調節するポリペプチドである。従って、Ｔ細胞の応答はエフェクター（例えば、ＣＴＬまたは抗体産生Ｂ細胞）応答、１以上のエフェクター（例えば、ＣＴＬまたは抗体産生Ｂ細胞）応答を助けるヘルパー応答または抑制的応答であり得る。
【００４６】
本明細書において「処置計画」とは、疾患の処置または抗原もしくは免疫原に対する免疫系の応答の増強もしくは低減、例えば、このような応答に関与する１以上の細胞もしくは細胞種の数もしくは活性の増大もしくは低減などの所望の生理学的変化を達成するための方法を意味する。該処置または方法は哺乳類などの動物、特にヒトに、疾患を有効に処置するまたは該生理学的変化をもたらすのに十分な量の、該計画の２以上の化学剤または成分を投与することを含んでなる。該化学剤または成分は、例えば同じ組成物の一部として一緒に投与されるか、または時にもしくは異なる時点で個別に、また単独で投与され（すなわち、各薬剤または成分の投与は１以上の薬剤または成分から有限の時間をおき）、該１以上の薬剤または成分の投与は単独または別個で投与した場合の該薬剤または成分のいずれのものよりも高い結果を達成する。
【００４７】
本明細書において「単離された」とは、その化合物が天然に存在する場合と異なる環境にある、例えば、ペプチドをそれが天然には見られない濃度まで濃縮することなどによってその天然環境から分離された目的化合物（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれか）を表すことを意味する。「単離された」とは、目的化合物が実質的に富化された、および／または目的化合物が部分的または実質的に精製されたサンプル内にある化合物を含むことを意味する。
【００４８】
本明細書において「ポリペプチド」とは、修飾（例えば、リン酸化またはグリコシル化）とは無関係に任意の長さのアミノ酸鎖を意味する。本発明のポリペプチドは組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ましくは、組換えポリペプチドであり得る。
【００４９】
本明細書において「変異体」ポリペプチドは、対応する野生型ポリペプチドのアミノ酸配列に比べて少なくとも一つのアミノ酸配列の変更を含む。
【００５０】
本明細書において「アミノ酸配列の変更」とは、例えば、１以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入であり得る。
【００５１】
本明細書において「部分」、「セグメント」および「断片」とは、ポリペプチドに関して用いられる場合、アミノ酸残基などの残基の連続的配列を意味し、このような配列はより大きな配列の一部分を形成する。例えば、ポリペプチドがトリプシンまたはキモトリプシンなどの一般的なエンドペプチダーゼのいずれかで処理を受けた場合、このような処理から得られるオリゴペプチドは最初のポリペプチドの部分、セグメントまたは断片に相当する。よって、ポリペプチドの「断片」とは、全長タンパク質のより短いポリペプチドであるポリペプチドの任意のサブセットを意味する。一般に、断片はアミノ酸５個以上の長さである。
【００５２】
本発明のポリペプチド（またはその断片）の誘導体、類似体または同族体は、（ｉ）１以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残基）で置換されているもの、このような置換アミノ酸残基は遺伝コードによってコードされているものであってもなくてもよい）、または（ｉｉ）１以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドがポリペプチドの半減期を延長するための化合物（例えば、ポリエチレングリコール）などの別の化合物と融合されているもの、または（ｉｖ）成熟ポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精製に用いられるリーダー配列または分泌配列または配列などの付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドと融合されているものであり得る。このような誘導体および類似体は本明細書での教示から当業者の範囲内であると思われる。
【００５３】
本明細書において、「価数」とは、分子当たりに利用可能な結合部位の数を意味する。
【００５４】
本発明によれば、「同一性％」または「％同一」とは、配列に関していう場合、ある配列が特許請求されるまたは記載される配列と、比較される配列「比較配列」と記載されるまたは本発明の配列（「参照配列」）が整列(alignment)された後に比較されることを意味する。その後、同一性％は下式：
同一性％＝１００［１−（Ｃ／Ｒ）］
に従って求め、ここで、式中、Ｃは参照配列と比較配列とのアライメントの長さにわたる参照配列と比較配列の間の差異［すなわち、（ｉ）参照配列中の各塩基またはアミノ酸が整列された比較配列中に対応する塩基またはアミノ酸を持たない場合、および（ｉｉ）参照配列中の各ギャップ、および（ｉｉｉ）整列された参照配列中の各塩基またはアミノ酸が整列された比較配列中の塩基またはアミノ酸と異なる場合が差異をなす］の数を表し、Ｒは、参照配列中に作り出されたギャップ（これもまた塩基またはアミノ酸として計数される）を含んだ比較配列との配列の長さにわたる参照配列中の塩基またはアミノ酸の数である。比較配列と参照配列の間に上記のように算出される同一性％が特定の最小同一性％とほぼ同じかまたはそれより大きい配列が存在する場合、上記で算出された同一性％が特定の同一性％よりも小さい配列が存在し得たとしても、その比較配列は参照配列と特定の最小同一性％を有する。
【００５５】
本明細書において、「保存的アミノ酸置換」とは、置換されたアミノ酸が類似の構造的または化学的特性を有する置換を意味し、「非保存的」アミノ酸置換は、置換されたアミノ酸の電荷、疎水性、または嵩が有意に変更されるものである。非保存的置換は、（ａ）例えば、シートまたはらせんコンフォメーションのような置換領域におけるペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性または（ｃ）側鎖の嵩の維持に対するそれらの効果がより有意に異なる。
【００５６】
保存的アミノ酸置換の例としては、置換が以下の５群のうち一つの中でのものが挙げられる：１）小さな脂肪族、非極性またはやや極性のある残基（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）、２）極性、負電荷を有する残基およびそれらのアミド（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）、極性、正電荷を有する残基（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）、大きな脂肪族、非極性残基（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ）、および大きな芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）。非保存的アミノ酸置換の例としては、１）親水性残基（例えば、セリルまたはトレオニル）が疎水性残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニル）から（またはにより）置換される場合、２）システインまたはプロリンが他の残基から（またはにより）置換される場合、３）電気的に陽性の側鎖を有する残基（例えば、リシル、アルギニルまたはヒスチジル）が電気的に陰性の残基（例えば、グルタミルまたはアスパルチル）から（またはにより）置換される場合、または４）嵩高の側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）が側鎖を持たない残基（例えば、グリシン）から（またはにより）置換される場合が挙げられる。
【００５７】
「個体」、「宿主」、「被験体」、および「患者」は、本明細書では互換的に用いられ、限定されるものではないが、霊長類、例えばヒト、ならびに齧歯類、例えばマウスおよびラット、ならびに他の実験動物を含む哺乳類を意味する。
【００５８】
本明細書において「有効量」または「治療上有効な量」とは、処置される病態の１以上の症状を処置、阻害もしくは緩和するのに、またはそうでなければ、所望の薬理学的および／または生理学的効果、特に、選択された抗原に対するＴ細胞応答の増強を提供するのに十分な用量を意味する。厳密な用量は、被験体に依存する変数（例えば、齢、免疫系の健全性）、および投じられる処置などの様々な因子によって異なる。
【００５９】
本明細書において「薬学上許容される担体」とは、任意のおよびあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤などを含む。薬学上有効な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は当該技術分野において周知である。慣例の媒体または薬剤が有効化合物と不適合である場合を除き、治療組成物でのその使用が意図される。補助的有効化合物も本組成物に配合することができる。
【００６０】
「抗体」とは、完全な分子ならびに抗原結合部位を含むその断片の双方を含むことを意味する。完全な抗体構造はしばしばＨ２Ｌ２として示され、抗体が一般に２本の軽（Ｌ）アミノ酸鎖と２本の重（Ｈ）アミノ酸鎖を含んでなることを意味する。両鎖は構造的に相補する抗原標的と相互作用することができる領域を有する。これらの標的と相互作用する領域は「可変」または「Ｖ」領域と呼ばれ、抗原特異性の異なる抗体からくるアミノ酸配列の違いにより特徴付けられる。Ｈ鎖またはＬ鎖いずれかの可変領域は、抗原標的と特異的に結合することができるアミノ酸配列を含む。これらの配列内には、特異性の異なる抗体間で極端に変動することから「超可変」と呼ばれるより小さな配列がある。このような超可変領域は「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」領域とも呼ばれる。これらのＣＤＲ領域は、特定の抗原決定基構造に対する抗体の基本的特異性を説明する。ＣＤＲは可変領域内の非連続的アミノ酸ストレッチに相当するが、種にかかわらず、これらの重要なアミノ酸配列の可変重鎖および軽鎖領域内での位置は、可変鎖のアミノ酸配列内の位置と類似性を有することが分かっている。総ての抗体の可変重鎖および軽鎖はそれぞれ、個々の軽（Ｌ）鎖および重（Ｈ）鎖について他とはそれぞれ不連続の３つの３ＣＤＲ領域（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３と呼ばれる）を有する。認知されているＣＤＲ領域がKabat et al, J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977)により記載されている。本発明により開示されている抗体はまた完全に合成されたものであってもよく、抗体のポリペプチド鎖が合成され、本明細書に受容体として開示されるポリペプチドとの結合に関して至適化することができる。このような抗体はキメラまたはヒト化抗体であってもよく、構造的に完全な四量体であってもよいし、あるいは二量体であって、１本の重鎖と１本の軽鎖だけを含んでなってもよい。
【００６１】
発明の詳細な説明
本発明は、免疫応答を増強するための増強剤とともに投与される、Ｔ細胞、好ましくはヒトＴ細胞において阻害的シグナル伝達を低減または抑制する化合物を含んでなる、哺乳類において疾患を処置するための処置計画または併用療法を提供する。
【００６２】
本発明の方法はまた、広域免疫調節剤およびこれらの組成物の使用に関する。一般に、これらの方法から生じるＴ細胞応答の増強は、同用量の前記ＰＤ−１アンタゴニストまたは前記増強剤いずれか単独を投与することから生じるＴ細胞応答の増強よりも大きい。
【００６３】
開示されている組成物および計画は、Ｔ細胞を含む免疫応答を刺激または増強するために有用である。よって、本発明の方法は、Ｔ細胞活性の増強から利益を得る病態の処置に最も有用であり、この場合、疾患がＴ細胞応答の増強は、疾患がたとえ特異的にＴ細胞応答の低減により引き起こされる、または悪化される場合でなくとも、該疾患の処置に必要または十分である。好ましい実施形態では、治療または予防される疾患の種類は、悪性腫瘍、または細菌、ウイルス、原虫、蠕虫もしくは他の細胞内微生物病原体により引き起こされる、すなわち細胞傷害性Ｔリンパ球により攻撃される慢性感染性疾患である。開示されている組成物を用いたＴ細胞の活性化はまた、免疫抑制を特徴とする症状を治療または予防するのにも有利である。
【００６４】
本発明によれば、Ｔ細胞応答は、Ｔ細胞表面の受容体と結合する分子およびそのような受容体のリガンドと結合する分子により調節され得る。ＰＤ−１の場合、ＰＤ−１と結合してその阻害作用を低減する分子および／または１以上のＰＤ−１リガンドと結合してそれらのＰＤ−１と結合する能力を低減する分子は、そのＰＤ−１の能力を低減してＴ細胞応答を阻害し、それによりこの応答およびその免疫学的作用を増強する作用を有する。
【００６５】
Ａ．ＰＤ−１受容体アンタゴニスト
ＰＤ−１受容体のアンタゴニストを含有する組成物が提供され、ＰＤ−１のリガンドと結合してそれを遮断し、ＰＤ−１受容体に対するリガンドの結合に干渉するもしくは阻害するか、またはＰＤ−１受容体を介した阻害的シグナル伝達を誘導することなくＰＤ−１受容体と直接結合してそれを遮断する化合物または薬剤を含む。別の実施形態では、ＰＤ−１受容体アンタゴニストは阻害的シグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１受容体と直接結合し、かつまた、ＰＤ−１受容体のリガンドと結合してリガンドのＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達誘発を低減または阻害する。ＰＤ−１受容体と結合し、阻害シグナルの伝達を誘発するリガンドの数および／または量を低減することにより、ＰＤ−１シグナル伝達により送達される負のシグナルにより弱まる細胞が少なくなり、より強力な免疫応答が達成され得る。
【００６６】
本発明によれば、ＰＤ−１シグナル伝達は主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）により提示されるペプチド抗原と近接してＰＤ−１リガンド（Ｂ７−Ｈ１またはＢ７−ＤＣなど）に結合することを必要とする（例えば、Freeman Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105:10275-10276 (2008)参照）。よって、Ｔ細胞膜上でのＰＤ−１およびＴＣＲの同時結合を妨げるタンパク質、抗体または小分子は、本発明により意図される有用なＰＤ−１アンタゴニストである。
【００６７】
例示的ＰＤ−１受容体アンタゴニストとしては、限定されるものではないが、Ｂ７−ＤＣポリペプチド（これらの同族体および変異体を含む）、ならびに以上のいずれかの有効断片、これらのいずれかを組み込んだ融合タンパク質が挙げられる。好ましい実施形態では、融合タンパク質はヒトＩｇＧなどの抗体のＦｃ部分と結合されたＢ７−ＤＣの可溶性部分を含んでなり、ヒトＢ７−ＤＣの膜貫通部分の全部または一部は組み込んでいない。ＰＤ−１受容体アンタゴニストはまた、ＰＤ−１のリガンドまたはＰＤ−１それ自体（そのような結合の後にＰＤ−１とＴＣＲの同時結合が起こらない場合）と結合することによりＰＤ−１受容体のシグナル伝達を低減するか、またはそれに干渉する小分子アンタゴニストまたは抗体であってもよく、それにより、ＰＤ−１受容体を介した阻害的シグナル伝達は誘発されない。
【００６８】
本明細書で提供されるＰＤ−１受容体アンタゴニストは一般にインビボおよびエクスビボにおいて免疫応答刺激治療薬として有用である。一般に、開示されているアンタゴニスト組成物は、被験体の免疫系が免疫応答を惹起する疾患または障害に対して疾病素因を有していた、または有している被験体を処置するのに有用である。
【００６９】
１．Ｂ７−ＤＣポリペプチド
ある特定の実施形態では、Ｂ７−ＤＣタンパク質はＰＤ−１受容体アンタゴニストとして使用することができる。Ｂ７−ＤＣはＰＤ−１の天然リガンドであり、Ｂ７−Ｈ１よりも高い親和性でＰＤ−１と結合し、従って、Ｂ７−Ｈ１：ＰＤ−１相互作用を阻害することができる。変異体、同族体およびその断片を含む好適なＢ７−ＤＣポリペプチドは、内因性シグナルペプチドを含む（配列番号１）または含まない（配列番号２）以下の全長ヒトＢ７−ＤＣポリペプチドから得ることができる。
【化１】
0005798919.tif 000002
（配列番号１）
【化２】
0005798919.tif 000003
（配列番号２）
【００７０】
Ｂ７−ＤＣを含むＢ７ファミリー分子は、細胞表面で発現され、膜近位定常ＩｇＣドメインと膜遠位ＩｇＶドメインを有する。これらのリガンドの受容体は共通の細胞外ＩｇＶ様ドメインを有する。受容体−リガンド対の相互作用は、主としてリガンドと受容体のＩｇＶドメインの残基により媒介される。一般に、ＩｇＶドメインは、それぞれβ鎖の層を含む２枚のシートを有することが記載されている。これらのβ鎖はＡ’、Ｂ、Ｃ、Ｃ’、Ｃ’’、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと呼ばれる。このようなポリペプチドの構造は文献に記載されている（Molnar et al., Crystal structure of the complex between programmed death-1 (PD-1) and its ligand PD-L2, PNAS, Vol. 105, pp. 10483-10488 (29 July 2008)参照）。
【００７１】
膜貫通タンパク質であるＢ７−ＤＣは、その単量体形態で、分子の細胞外部分（細胞外ドメインまたはＥＣＤ）を構成するＩｇＶドメインと、ＩｇＣドメインとを含んでなり、このＩｇＶ様ドメインはＰＤ−１結合ならびに本発明の方法に挙げられている他の機能に対して完全または部分的に応答する。ヒトタンパク質に関して、ＩｇＶドメインはＢ鎖とＦ鎖（上記参照）を結合するジスルフィド結合を有すること（これは多くのＩｇＶドメインの特徴であると思われる）、およびＢ７−１およびＢ７−２の双方のＩｇＶドメインと類似する三次元構造を有することを特徴とする（Molnar et al.(2008), 前掲参照）。
【００７２】
一つの実施態様では、Ｂ７−ＤＣ変異体ポリペプチドはこれらのβ鎖の１以上内に、あり得る任意の組合せでアミノ酸変異（すなわち、置換、欠失または挿入）を含む。別の実施形態では、Ｂ７−ＤＣ変異体は、Ａ’、Ｃ、Ｃ’、Ｃ’’、Ｄ、Ｅ、Ｆ、またはＧ  β鎖内に１以上のアミノ酸変異（すなわち、置換、欠失、または挿入）を含む。好ましい実施形態では、Ｂ７−ＤＣ変異体はＧ  β鎖内に１以上のアミノ酸変異を含む。別の実施形態では、変異体Ｂ７−ＤＣポリペプチド断片は、Ｂ７−ＤＣのＩｇＣドメインおよびＩｇＶドメインを含む。別の実施形態では、変異体Ｂ７−ＤＣポリペプチド断片は、Ｂ７−ＤＣのＩｇＶドメインを含む。
【００７３】
ヒトおよびマウスＢ７−ＤＣタンパク質は短い細胞質内ドメイン、単一の膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含む。細胞外ドメインは、膜近位ＩｇＣドメインと膜遠位ＩｇＶドメインの二つのＩｇドメインを含む。変異体Ｂ７−ＤＣポリペプチドの有用な断片は可溶性断片を含む。可溶性Ｂ７−ＤＣ断片は、産生細胞から放出、分泌またはそうでなければ抽出され得るＢ７−ＤＣの断片である。一つの実施態様では、変異体Ｂ７−ＤＣポリペプチド断片はＢ７−ＤＣの全細胞外ドメインを含む。Ｂ７−ＤＣの細胞外ドメインはネズミまたはヒトＢ７−ＤＣのアミノ酸約２０〜約２２１のアミノ酸またはその有効な断片を含む。別の実施形態では、変異体Ｂ７−ＤＣポリペプチド断片は、Ｂ７−ＤＣのＩｇＣドメインおよびＩｇＶドメインを含む。別の実施形態では、変異体Ｂ７−ＤＣポリペプチド断片はＢ７−ＤＣのＩｇＶドメインを含む。
【００７４】
ＰＤ−１のシグナル伝達には、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）により提示されるペプチド抗原と近接してＰＤ−１リガンド（一般にＢ７−Ｈ１）と結合する必要があると考えられる(Freeman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 105:10275-10276 (2008))。よって、Ｔ細胞膜でのＰＤ−１およびＴＣＲの同時結合を妨げるタンパク質、抗体または小分子は、本発明により意図される有用なＰＤ−１アンタゴニストである。
【００７５】
本発明の方法および組成物において有用なＰＤ−１アンタゴニストは、ＥＣＤを組み込んだＢ７−ＤＣタンパク質の断片を含む。あるいは、Ｂ７−ＤＣの断片は、ＰＤ−１受容体と結合してＰＤ−１受容体を介した阻害的シグナル伝達に干渉する、またはそれを妨げる、またはそうでなければ低減するのに十分な、ＩｇＶまたはＩｇＶ様ドメイン、好ましくはアミノ酸２０〜２２１、より好ましくは２０〜１２１を含んでなる細胞外ドメインの一部を含む。好ましい実施形態では、Ｂ７−ＤＣ断片はＰＤ−１受容体との結合に関してＢ７−Ｈ１と競合する。
【００７６】
一つの実施態様では、変異体Ｂ７−ＤＣポリペプチド断片は、ＰＤ−１との結合に重要なポリペプチドの領域を含み得る。これらのポリペプチド断片は、ＰＤ−１との結合に関して競合し、かつ、天然Ｂ７−ＤＣがＰＤ−１と結合しないようにするのに有用であり得る。ＰＤ−１との結合に関して競合することにより、Ｂ７−Ｈ１およびＢ７−ＤＣとＰＤ−１との相互作用の阻害が、そうでなければ生じる免疫応答の抑制を阻害するので、これらの断片は免疫応答を増強するのに有用であり得る。ＰＤ−１と競合的に結合し得るマウスまたはヒトＢ７−ＤＣのポリペプチド断片は、例えば、アミノ酸１０１〜１０８または１１０〜１１４を含み得る。野生型Ｂ７−ＤＣとＰＤ−１の結合は一般に、野生型Ｂ７−ＤＣの断片の非存在下での野生型Ｂ７−ＤＣとＰＤ−１の結合レベルに比べて少なくとも５０パーセント、６０パーセント、７０パーセント、７５パーセント、８０パーセント、９０パーセント、９５パーセント、または９５パーセントを超えて阻害される。本発明の方法および／または組成物において有用な例示的Ｂ７−ＤＣ断片は、限定されるものではないが、以下の細胞外ドメインを含む。
【００７７】
ヒトＢ７−ＤＣ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）：
【化３】
0005798919.tif 000004
（配列番号３）
およびネズミＢ７−ＤＣ  ＥＣＤ：
【化４】
0005798919.tif 000005
（配列番号４）
カニクイザルＢ７−ＤＣ  ＥＣＤ：
【化５】
0005798919.tif 000006
（配列番号１５）
【００７８】
本発明の方法および組成物において有用な他の多くの霊長類配列が、Onlamoon et al., Immunology, Vol. 124, pp. 277-293 (2008)で提供されている。
【００７９】
本発明の組成物および方法において有用なＰＤ−１アンタゴニストはまた、第一および第二のポリペプチド部分を含んでなる融合タンパク質（下記の通り）を含み、該融合タンパク質または少なくともその第一のポリペプチド部分は、特に、該融合タンパク質がＰＤ−１と結合してそれを遮断するか、またはＰＤ−１のリガンドと結合してそれを遮断する場合には、ＰＤ−１アンタゴニスト活性を有する。このような融合タンパク質の第一のポリペプチド部分は、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドまたはそのＰＤ−１結合断片、それ以外に本発明の方法においてＰＤ−１アンタゴニストとして用いるために本明細書で挙げられたもののいずれかを含んでなるか、またはそれからなる。このような融合タンパク質の好ましい実施形態では、挙げられた第一のポリペプチド部分は、挙げられた第二のポリペプチド部分のＮ末端である。別の実施形態では、挙げられた第一のポリペプチド部分は、挙げられた第一および第二のポリペプチド部分を含んでなるアミノ酸に加えて、オリゴペプチドにより挙げられた第二のポリペプチド部分に連結され、ここで、このアミノ酸連結は該融合タンパク質のＰＤ−１アンタゴニスト活性を実質的に低下させない。
【００８０】
好ましい二量体融合タンパク質では、この二量体は、二量体化された正常なＩｇ重鎖においてジスルフィド結合されている同じＣｙｓ残基である二つのＩｇ重鎖のＣＨ領域におけるＣｙｓ残基の共有結合から生じる。
【００８１】
融合タンパク質結合相手として通常用いられる多数のポリペプチド配列が当該技術分野で周知である。有用なポリペプチド結合相手の例としては、限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｍｙｃ、ヘマグルチニン、Ｆｌａｇ（商標）タグ(Kodak, New Haven, CT)、マルトースＥ結合タンパク質、およびＡタンパク質が挙げられる。
【００８２】
さらに別の実施形態は、変異体Ｂ７−ＤＣポリペプチドの細胞外ドメインと融合されているＢｉｒＡ基質を有する四量体構築物を提供する。四量体構築物を作製する方法は当該技術分野で公知である（Pertovas, et al., J. Exp. Med., 203:2281 (2006)参照）。
【００８３】
例示的ネズミＢ７−ＤＣ融合タンパク質は、ネズミＩｇＧ２のアミノ酸２３７〜４６９と融合されているネズミＢ７−ＤＣのアミノ酸２０〜２２１を含む（ＣＡＡ４９８６８）。一つの限定されない例では、ヒトＢ７−ＤＣ融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸２４５〜４７６と融合されているヒトＢ７−ＤＣのアミノ酸２０〜２２１を含む（ＡＡＡ０２９１４）。Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質に対するシグナルペプチドは、宿主からその融合タンパク質の分泌を促進する内因性シグナルペプチドまたは他のいずれかのシグナルペプチドを含む。別の実施形態では、第一のポリペプチドはＩｇＶドメインのみを含む。他の実施形態は、可変領域が存在しない、ＩｇＧ１などのＩｇＧ抗体のヒンジおよびＦｃドメインを含んでなってよい。他の実施形態は、特に、エフェクター機能を低減するＮ２９７Ｑまたは他の突然変異を有する、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のヒンジおよびＦｃ領域の使用を含む。
【００８４】
本発明の方法および組成物によれば、ＰＤ−１アンタゴニストとして有用なポリペプチド、またはＰＤ−１アンタゴニストとして有用な融合タンパク質の第一のポリペプチド部分は、配列番号１のアミノ酸１〜２２１、好ましくは配列番号１のアミノ酸２０〜２２１、または配列番号１のアミノ酸２６〜２２１、または配列番号３もしくは４のアミノ酸１〜２０２、より好ましくは配列番号１のアミノ酸２０〜１２１、または配列番号３もしくは４のアミノ酸１〜１０２と少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％に同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。
【００８５】
一つの実施態様では、ＰＤ−１アンタゴニストとして有用なポリペプチド、またはＰＤ−１アンタゴニストとして有用な融合タンパク質の第一のポリペプチド部分は、配列番号１のアミノ酸１〜２２１からなるか、または配列番号１のアミノ酸２０〜２２１からなるか、または配列番号１のアミノ酸２６〜２２１からなるか、または配列番号３もしくは４のアミノ酸１〜２０２からなる。一つの実施態様では（配列番号２）、それは配列番号１のアミノ酸１〜１９を含まない。
【００８６】
他の特定の例では、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドまたはＰＤ−１アンタゴニスト融合タンパク質の第一のポリペプチド部分は、配列番号１のアミノ酸配列２０〜１２１を含んでなり、好ましくは、ここで、それはその残基１１０〜１１４にアミノ酸配列ＷＤＹＫＹを含んでなるか、またはそれは配列番号３のアミノ酸１〜１０２を含んでなり、好ましくは、ここで、それはその残基９１〜９５にアミノ酸配列ＷＤＹＫＹを含んでなる。
【００８７】
好ましい実施形態では、このような同一性％は、本明細書の他所に定義される保存的アミノ酸置換に頼ることにより達成される。
【００８８】
このような一つの実施態様では、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチド、またはＰＤ−１アンタゴニスト融合タンパク質の第一のポリペプチド部分は配列番号１のアミノ酸１〜１９を含まないか、または膜貫通ドメインのいずれの部分も含まない（特にこのようなドメインの全部ではない）か、またはＰＤ−１リガンドまたは他のＰＤ−１アンタゴニストタンパク質の細胞内（または可溶性）ドメインの部分を含まない（特にこのようなドメインの全部ではない）。好ましい実施形態では、このようなアンタゴニストまたは第一のポリペプチド部分は配列番号１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のみを含んでなり、従って、前記配列のポリペプチドの可溶性部分または該可溶性部分の断片のみを含んでなる。
【００８９】
他のこのような実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドまたはＰＤ−１アンタゴニスト融合タンパク質の第一のポリペプチド部分は、ＰＤ−１リガンドのＩｇＶドメインもしくはＩｇＶ様ドメインもしくはそのＰＤ−１結合断片を含んでなるか、またはＰＤ−１リガンドのＩｇＶドメインもしくはＩｇＶ様ドメインもしくはそのＰＤ−１結合断片からなる。特定の例では、このようなＰＤ−１リガンドは野生型Ｂ７−ＤＣまたはＢ７−Ｈ１分子、好ましくはマウスまたは霊長類、好ましくはヒト、野生型Ｂ７−ＤＣまたはＢ７−Ｈ１分子である。
【００９０】
他のこのような実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドまたはＰＤ−１アンタゴニスト融合タンパク質の第一のポリペプチド部分は、ＰＤ−１リガンドのＩｇＶドメインまたはＩｇＶ様ドメインのＰＤ−１結合断片を含んでなり、特に、ＩｇＶドメインまたはＩｇＶ様ドメインは配列番号１のアミノ酸２０〜１２１または配列番号３のアミノ酸１〜１０２からなる。
【００９１】
本発明のＰＤ−１アンタゴニストはまた、配列番号１（ヒト全長）のアミノ酸２０〜１２１のＰＤ−１結合断片または配列番号３（細胞外ドメインまたはＥＣＤ）のアミノ酸１〜１０２を含む。
【００９２】
その特定の実施形態では、該ポリペプチドまたはＰＤ−１結合断片はまた、配列番号１の残基１１０〜１１４にアミノ酸ＷＤＹＫＹを、または配列番号３の残基９１〜９５にＷＤＹＫＹを組み込んでいる。限定されない例として、このようなＰＤ−１結合断片は、配列番号１のアミノ酸２０〜１２１の配列の少なくとも１０個または少なくとも２０個または少なくとも３０個または少なくとも４０個または少なくとも５０個または少なくとも６０個または少なくとも７０個または少なくとも７５個または少なくとも８０個または少なくとも８５個または少なくとも９０個または少なくとも９５個または少なくとも１００個の連続するアミノ酸を含んでなり、このような各ＰＤ−１結合断片の好ましい実施形態は、配列番号１の残基１１０〜１１４にアミノ酸ＷＤＹＫＹを、または配列番号３の残基９１〜９５にＷＤＹＫＹを部分断片として含んでなる。
【００９３】
本発明により具体的に意図される他の好ましいポリペプチドおよびＰＤ−１結合断片は、配列番号１（ヒト全長）のアミノ酸２０〜１２１のポリペプチド配列およびそのＰＤ−１結合断片を含んでなり、このようなポリペプチドまたはＰＤ−１結合断片では、残基４２および／または１０２にシステインが存在し（両方の位置にシステインが存在するのが好ましい）、および／または残基２１にフェニルアラニンが存在し、および／または残基２８にグルタミン酸が存在し、および／またはトレオニン、および／または残基６０にグルタミンが存在し、および／または残基１０１にグルタミン酸が存在し、および／または残基１０３にイソロイシンが存在し、および／または残基１０５にイソロイシンが存在し、および／または残基１０７にグリシンが存在し、および／または残基１０８にバリンが存在し、および／または残基１１０にトリプトファンが存在し、および／または残基１１１にアスパラギン酸が存在し、および／または残基１１２にチロシンが存在し、および／または残基１１３にリシンが存在し、および／または残基１１４にチロシンが存在する（ただし、ＰＤ−１結合断片の場合、この断片はこのようなアミノ酸位置を含むに十分長いものである）。
【００９４】
本発明により具体的に意図されるさらなる好ましいポリペプチドおよびＰＤ−１結合断片は、配列番号３（ヒトＥＣＤ）または配列番号４（ネズミＥＣＤ）のアミノ酸１〜１０２のポリペプチド配列およびそのＰＤ−１結合断片を含み、このようなポリペプチドまたはＰＤ−１結合断片では、残基２３および／または８３にシステインが存在し（両方の位置にシステインが存在するのが好ましい）、および／または残基２にフェニルアラニンが存在し、および／または残基９にグルタミン酸が存在し、および／または残基３７にトレオニンまたはアルギニンが存在し（トレオニンが好ましい）、および／または残基４１にグルタミンが存在し、および／または残基８２にアルギニンが存在し、および／または残基８４にロイシンが存在し、および／または残基８６にイソロイシンが存在し、および／または残基８８にグリシンが存在し、および／または残基８９にアラニンが存在し、および／または残基９１にトリプトファンが存在し、および／または残基９２にアスパラギン酸が存在し、および／または残基９３にチロシンが存在し、および／または残基９４にリシンが存在し、および／または残基９５にチロシンが存在する（ただし、ＰＤ−１結合断片の場合、この断片はこのようなアミノ酸位置を含むに十分長いものである）。
【００９５】
さらなる実施形態では、上記のポリペプチドはいずれも、マウスまたは霊長類、好ましくはヒトのものなどのＢ７−ＤＣまたはＢ７−Ｈ１ポリペプチドのシグナルドメイン、膜貫通ドメインまたはＣ末端ドメインに由来する例えば１〜１０個の連続するアミノ酸の部分または断片を組み込み得る。
【００９６】
このようなポリペプチドおよび／またはＰＤ−１結合断片は本発明の融合タンパク質のいずれに存在してもよく、例えば、このようなポリペプチドまたはＰＤ−１結合断片はこのような融合タンパク質の「第一のポリペプチド」に相当する。
【００９７】
特定の例では、本発明の処置計画において用いるための増強剤と組み合わせた分子は、配列番号１のアミノ酸２０〜２２１のＰＤ−１結合断片を含んでなる。このような一つの実施態様では、断片は配列番号１のアミノ酸２０〜１２１であり、好ましくは、断片は配列番号１のアミノ酸１１０〜１１４を含む。いくつかの実施形態(ebodiments)では、１を超えるこのような断片が存在し（本明細書の他所に記載さている通り）、分子はＢ７−ＤＣタンパク質の少なくとも２、３、４、５またはそれを超える断片を含んでなり、特に、断片は配列番号１のアミノ酸２０〜２２１の一部であるか、またはそれを含む。その好ましい実施形態では、少なくとも一つの前記断片は配列番号１のアミノ酸２０〜１２１であり、より好ましくは、少なくとも一つの前記断片が配列番号１のアミノ酸１１０〜１１４（すなわち、配列ＷＤＹＫＹ（配列番号１４））を含む。好ましい実施形態では、ＰＤ−１結合断片は、少なくとも１０または少なくとも２５または少なくとも５０または少なくとも７５または少なくとも１００個の長さの連続するアミノ酸を含んでなる。
【００９８】
内因性ヒトシグナルペプチドは以下の配列ＭＩＦＬＬＬＭＬＳＬＥＬＱＬＨＱＩＡＡ（配列番号５）を含み、配列番号１の最初の１９のアミノ酸に相当する。ある特定の実施形態では、Ｂ７−ＤＣのポリペプチド断片は内因性または異種シグナルペプチドの１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の連続するアミノ酸を含む（形質転換細胞で発現させ、そこから分泌させることにより、組換えＢ７−ＤＣポリペプチドの生産に使用することができる）。また、有用なＢ７−ＤＣポリペプチドは、そのＢ７−ＤＣ断片がＰＤ−１受容体に拮抗する能力を保持する限り、Ｂ７−ＤＣの膜貫通ドメインの１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の連続するアミノ酸、および／または細胞質ドメインの１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の連続するアミノ酸またはその組合せを含み得ると考えられる。
【００９９】
ＰＤ−１−／−マウスの表現型は、ＰＤ−１がインビボにおける免疫応答の負のレギュレーターであるという直接的な証拠となる。ＰＤ−１の非存在下では、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドを持つマウスは狼瘡様糸球体腎炎および進行性関節炎をゆっくり発症する(Nishimura, et al., Immunity, 11:141-151 (1999))。ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドを持つＰＤ−１−／−マウスは致死性の自己免疫拡張型心筋症を急速に発症する(Nishimura, et al., Science. 291:319-322 (2001))。しかしながら、実質的証拠は、Ｂ７−ＤＣがＴ細胞応答を共刺激する働きをし得ることを示唆している。最適に満たないＴＣＲシグナルの存在下では、Ｂ７−ＤＣはインビトロにおいて増殖およびサイトカイン産生の増大を引き起こす(Tseng, et al., J. Exp. Med. 193:839-846 (2001))。他方、インビトロ研究では、Ｔ細胞応答におけるＢ７−ＤＣの負の調節的役割が示唆されている。これらの矛盾したように見えるデータは、ＰＤ−１以外の、Ｔ細胞上のＢ７−ＤＣに対するさらなる受容体の発現により最も良く説明される。
【０１００】
よって、Ｂ７−ＤＣタンパク質、その変異体、断片および融合物は、ＰＤ−１により媒介される阻害的シグナル伝達を妨げることによりＴ細胞応答を増強することに加え、Ｔ細胞を活性化する未知の受容体と結合することによりＴ細胞応答を直接増強するという利点を持ち得る。
【０１０１】
２．Ｂ７−Ｈ１ポリペプチド
別の実施形態では、本発明の処置計画において増強剤と組み合わせて用いるための化合物は、好ましくはマウスまたは霊長類、好ましくはヒトに由来する哺乳類Ｂ７−Ｈ１の断片であるか、それを含んでなり、該断片はＰＤ−１と結合してそれを遮断するが、ＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達はもたらさず、該断片は少なくとも１０または少なくとも２０または少なくとも３０または少なくとも４０または少なくとも５０または少なくとも６０または少なくとも７０または少なくとも８０または少なくとも９０または少なくとも１００個の連続するアミノ酸の長さである。他の実施形態では、断片は、ＰＤ−１と結合する機能を有するが、Ｔ細胞の増殖の低減をもたらす阻害的シグナル伝達を生じない限り、様々な長さのものであってよい。このようなＢ７−Ｈ１断片はまた、本発明の融合タンパク質の第一のポリペプチド部分の一部としての使用が見出せる。
【０１０２】
Ｂ７−Ｈ１配列は以下の通りである。
ヒトＢ７−Ｈ１ポリペプチド（配列番号１６）：
【化５】
0005798919.tif 000007
ネズミＢ７−Ｈ１（配列番号１７）
【化６】
0005798919.tif 000008
アカゲザル(Macaca mulatta)ＰＤ−Ｌ１（配列番号１８）
【化７】
0005798919.tif 000009
Ｂ７−Ｈ１−Ｉｇタンパク質はＷＯ／２００１／０１４５５７号公報（２００１年３月１日公開）およびＷＯ／２００２／０７９４９９号公報（２００２年１０月１０日公開）に記載されている。
【０１０３】
３．ＰＤ−１および他のポリペプチド
本発明の他の有用なポリペプチドは、ＰＤ−１受容体のリガンドと結合するものを含む。これらには、Ｂ７−Ｈ１またはＢ７−ＤＣなどのＰＤ−１リガンドと結合し、内因性ＰＤ−１受容体との結合を妨げ、それにより、阻害的シグナル伝達を妨げることができるＰＤ−１受容体タンパク質またはその可溶性断片が含まれる。Ｂ７−Ｈ１はまた、タンパク質Ｂ７．１とも結合することが示されている(Butte et al., Immunity, Vol. 27, pp. 111-122, (2007))。このような断片はまた、天然リガンドとの結合を増強するＡ９９Ｌ突然変異などの突然変異を含むＰＤ−１タンパク質の可溶性ＥＣＤ部分も含む(Molnar et al., Crystal structure of the complex between programmed death-1 (PD-1) and its ligand PD-L2, PNAS, Vol. 105, pp. 10483-10488 (29 July 2008))。Ｂ７−Ｈ１リガンドと結合し、内因性ＰＤ−１受容体との結合を妨げ、それにより、阻害的シグナル伝達を妨げることができるＢ７−１またはその可溶性断片も有用である。
【０１０４】
本発明の方法において有用なＰＤ−１ポリペプチドは次の通りである。
ヒトＰＤ−１（配列番号１９）
【化８】
0005798919.tif 000010
カニクイザルＰＤ−１（配列番号２０）
【化９】
0005798919.tif 000011
本発明によれば、Ｂ７−１およびその断片もＢ７−Ｈ１と結合し、Ｂ７−Ｈ１を介してＴ細胞へ阻害的伝達を行うことができるので、この相互作用の遮断も、Ｂ７−Ｈ１を介して生じる阻害的シグナル伝達を低減することができる。本発明で用いるための化合物には、この種の相互作用を遮断する分子が含まれる。このような分子はButteら(2007)前掲に開示されており、Ｂ７−Ｈ１：Ｂ７−１およびＢ７−Ｈ１：ＰＤ−１のいずれもの相互作用を遮断する二重特異性を有する抗Ｂ７−Ｈ１抗体ならびにＰＤ−Ｌ１：Ｂ７−１相互作用を遮断する一重特異性を示す抗体を含む。Ｂ７−１を遮断することによりこの相互作用を遮断する化合物も有用であり、抗Ｂ７−１抗体を含む。
【０１０５】
４．変異体ポリペプチド
本発明において有用なポリペプチドは、記載されているように、１以上のアミノ酸置換、欠失、または挿入を含むように突然変異されたものを含む。突然変異誘発の方法は当該技術分野で公知である。突然変異型または変異型のポリペプチドは、ＰＤ−１のリガンドと結合することにより、ＰＤ−１受容体を介した阻害的シグナル伝達を阻害または低減する。あるいは、変異体（例えば、Ｂ７−ＤＣポリペプチド）はＰＤ−１受容体と結合して、ＰＤ−１受容体を介した阻害的シグナル伝達を阻害、低減、または遮断することができる。変異体ポリペプチドはいずれの起源種のものであってもよい。一つの実施態様では、変異体ポリペプチドは哺乳類種に由来する。好ましい実施形態では、変異体ポリペプチドはネズミまたは霊長類ヒト、好ましくはヒト起源のものである。
【０１０６】
一つの実施態様では、変異体ポリペプチドは、ＰＤ−１に対して野生型または非変異型Ｂ７−ＤＣと同じ結合親和性を有するが、非突然変異Ｂ７−ＤＣポリペプチドに比べてＰＤ−１受容体を介した阻害的シグナル伝達を誘発する能力を持たないか、または１０％未満であるＢ７−ＤＣポリペプチドである。他の実施形態では、該変異型Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、ＰＤ−１阻害的シグナル伝達を誘発することなく、野生型Ｂ７−ＤＣよりもＰＤ−１に対して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％の結合親和性を有する。
【０１０７】
変異型ポリペプチド（例えば、変異体Ｂ７−ＤＣポリペプチド）は、ＰＤ−１拮抗活性が野生型に比べて実質的に低減されていない限り、アミノ酸置換、欠失または挿入の任意の組合せを有するものである。しかしながら、このような低減がある場合には、これは、その変異体が野生型タンパク質のＰＤ−１アンタゴニスト活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％または９５％（少なくとも１００％であることが特に好ましい）を有するよう、野生型のせいぜい半分までであるべきである。該変異体から生じるこのような活性の増強はいっそうより望ましい。一つの実施態様では、単離されたＢ７−ＤＣ変異体ポリペプチドは、それらのアミノ酸配列が野生型Ｂ７−ＤＣポリペプチド、特に哺乳類に由来するもの、好ましくは野生型ネズミまたは野生型霊長類、好ましくはヒトＢ７−ＤＣポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９、９９．５、または１００％の同一性を有するようなアミノ酸変異を有する。
【０１０８】
ポリペプチド配列同一性は、本明細書の以上に示される同一性％の定義を用いて算出することができる。
【０１０９】
ポリペプチドにおけるアミノ酸の置換は「保存的」または「非保存的」であり得る。
【０１１０】
Ｂ７−ＤＣを含むＢ７ファミリー分子は細胞表面で発現され、膜近位定常ＩｇＣドメインと膜遠位ＩｇＶドメインを有する。これらのリガンドの受容体は共通の細胞外ＩｇＶ様ドメインを有する。受容体−リガンド対の相互作用は、主としてリガンドと受容体のＩｇＶドメインの残基により媒介される。一般に、ＩｇＶドメインは、それぞれβ鎖の層を含む２枚のシートを有することが記載されている。これらのβ鎖はＡ’、Ｂ、Ｃ、Ｃ’、Ｃ’’、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧと呼ばれる。一つの実施態様では、Ｂ７−ＤＣ変異体ポリペプチドはこれらのβ鎖の１以上内に、あり得る任意の組合せでアミノ酸変異（すなわち、置換、欠失または挿入）を含む。別の実施形態では、Ｂ７−ＤＣ変異体は、Ａ’、Ｃ、Ｃ’、Ｃ’’、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ  β鎖内に１以上のアミノ酸変異（すなわち、置換、欠失または挿入）を含む。一つの実施態様では、Ｂ７−ＤＣ変異体はＧ  β鎖内に１以上のアミノ酸変異を含む。
【０１１１】
ネズミまたは霊長類、好ましくはヒトＢ７−ＤＣに関して、変異体Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、限定されるものではないが、ＰＤ−１への結合を非突然変異Ｂ７−ＤＣの場合よりも実質的に低減しない位置での置換、欠失、または挿入を含む。
【０１１２】
しかしながら、挙げられたアミノ酸位置における置換は、任意のアミノ酸またはアミノ酸類似体を用いて行うことができると理解される。例えば、挙げられた位置における置換は、任意の天然アミノ酸（例えば、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニン、システイン、グリシン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、ロイシン、バリン、イソロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、トレオニン、セリン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはチロシン）を用いて行うことができる。
【０１１３】
本明細書に記載される置換はマウスおよび霊長類、特にヒトＢ７−ＤＣに関するものであるが、当業者ならば他種（例えば、ラット、ハムスター、モルモット、アレチネズミ、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウシまたは非ヒト霊長類）由来の相当するポリペプチドにおいても等価の変更を容易に行うことができることを注記する。
【０１１４】
好ましい断片としては、ＰＤ−１との結合に有効なＢ７−ＤＣの細胞外ドメインの全部または一部が含まれる。
【０１１５】
一つの実施態様では、変異体Ｂ７−ＤＣポリペプチド断片は、ＰＤ−１の阻害的シグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１と結合する能力を保持するものである。一つの実施態様は、全長Ｂ７−ＤＣの断片であり、一般に、全長変異体Ｂ７−ＤＣポリペプチドのＰＤ−１アンタゴニスト活性の少なくとも２０パーセント、３０パーセント、４０パーセント、５０パーセント、６０パーセント、７０パーセント、８０パーセント、９０パーセント、９５パーセント、９８パーセント、９９パーセント、１００パーセントを有する、またはさらには１００パーセントを超える変異体Ｂ７−ＤＣポリペプチドを提供する。
【０１１６】
変異体Ｂ７−ＤＣポリペプチドの有用な断片は、可溶性断片を含む。可溶性Ｂ７−ＤＣ断片は、産生細胞から放出、分泌またはそうでなければ抽出され得るＢ７−ＤＣの断片である。一つの実施態様では、変異体Ｂ７−ＤＣポリペプチド断片は、Ｂ７−ＤＣの全細胞外ドメインを含む。Ｂ７−ＤＣの細胞外ドメインは、ネズミまたは霊長類、好ましくはヒトＢ７−ＤＣのアミノ酸約２０〜約２２１のアミノ酸を含む。別の実施形態では、変異体Ｂ７−ＤＣポリペプチド断片は、Ｂ７−ＤＣのＩｇＣドメインおよびＩｇＶドメインを含む。別の実施形態では、変異体Ｂ７−ＤＣポリペプチド断片はＢ７−ＤＣのＩｇＶドメインを含む。
【０１１７】
一つの実施態様では、変異体Ｂ７−ＤＣポリペプチド断片は、ＰＤ−１に対する結合親和性に重要なポリペプチドの領域を含む。これらのポリペプチド断片は、ＰＤ−１受容体と結合してそれを遮断し、天然リガンドがＰＤ−１受容体と結合しないようにし、それにより、免疫応答を増強するのに有用である。天然Ｂ７−Ｈ１またはＢ７−ＤＣとＰＤ−１との相互作用を阻害すると、そうでなければ起こる免疫応答の抑制が阻害される。ＰＤ−１と結合するマウスまたは霊長類、好ましくはヒトＢ７−ＤＣのポリペプチド断片としては、限定されるものではないが、アミノ酸１０１〜１０５または１１１〜１１３を含む。ＰＤ−１受容体に対するＢ７−Ｈ１の結合は一般に、断片の不在下でのＰＤ−１に対するＢ７−Ｈ１の結合レベルに比べて少なくとも５０パーセントまたは少なくとも６０パーセントまたは少なくとも７０パーセントまたは少なくとも７５パーセントまたは少なくとも８０パーセントまたは少なくとも９０パーセントまたは少なくとも９５パーセントまたはそれを超えて阻害される。
【０１１８】
ヒトＰＤ−１変異体Ａ９９ＬはＢ７−ＤＣおよびＢ７−Ｈ１と、非突然変異型ヒトＰＤ−１よりも高い親和性で結合する(Lazar Molnar et al PNAS 105 p. 10483-10488 (2008))。本発明の一つの実施態様では、阻害的シグナル伝達を低減する働きをする化合物は、この突然変異を組み込んだＰＤ−１のＥＣＤなどの可溶性タンパク質である。
【０１１９】
５．修飾ポリペプチド
本発明において有用な、記載されているように変異体、同族体およびその断片を含むポリペプチドは、ポリペプチドの、例えば、リン酸化、メチル化、アミド化、硫酸化、アシル化、グリコシル化、ＳＵＭＯ化(sumoylation)およびユビキチン化など、通常の細胞環境中のポリペプチドに関連していることが分かっている化学部分により修飾することができる。
【０１２０】
このようなポリペプチドはまた、通常は細胞環境中のポリペプチドの一部ではない化学部分により修飾することもできる。このような修飾は、ポリペプチドの標的アミノ酸残基と、選択された側鎖または末端残基と反応することできる有機誘導体化剤を反応させることによって分子に導入することができる。もう一つの有用な修飾はタンパク質の環化である。このような修飾はまた、限定されるものではないが、放射性同位元素および蛍光化合物を含む、検出可能なシグナルを直接的または間接的のいずれかで提供することができる標識の導入も含む。
【０１２１】
ポリペプチドの化学誘導体の例としては、コハク酸または他の無水カルボン酸で誘導体化されたリシニルおよびアミノ末端残基が挙げられる。環状無水カルボン酸での誘導体化はリシニル残基の電荷を逆転させる効果を有する。アミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬としては、ピコリンイミド酸メチルなどのイミドエステル、リン酸ピリドキサール、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４ペンタンジオン、およびトランスアミナーゼにより触媒されるグリオキシレートとの反応が挙げられる。カルボキシル側基、アスパルチル、またはグルタミルは、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−−Ｒ’）との反応により選択的に修飾することができる。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニアとの反応により、アスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換することができる。本発明のポリペプチドはまた、１以上のＬ−アミノ酸に対して置換された１以上のＤ−アミノ酸を含むことができる。
【０１２２】
他の実施形態では、増強剤を本発明のＰＤ−１アンタゴニストに化学的に連結させるなど、ＣＴＸなどの増強剤はそれ自体、阻害的シグナル伝達を低減する化合物の一部であってもよい。
【０１２３】
６．融合タンパク質
（ｉ）第二のポリペプチドと直接融合された、または（ｉｉ）場合により、第二のポリペプチドと融合されたリンカーペプチド配列と融合された、ＰＤ−１アンタゴニストタンパク質、例えばＢ７−ＤＣポリペプチド（変異体、同族体およびその断片を含む）の全部または一部を含んでなる、第一の融合相手またはポリペプチド部分を有する融合ポリペプチドもまた提供される。この融合相手の存在は、例えば、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの溶解度、親和性および／または価数を変化させ得る。開示される融合タンパク質は、上記のようなＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドのアミノ酸変異（すなわち、置換、欠失または挿入）の任意の組合せ、断片および／または修飾を含む。一つの実施態様では、Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質は、第一の結合相手としてＢ７−ＤＣタンパク質の細胞外ドメインを含む。別の実施形態では、このようなＢ７−ＤＣ融合タンパク質は、第一の結合相手としてＢ７−ＤＣタンパク質のＩｇＶドメインとＩｇＣドメインを含む。別の実施形態では、変異体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質は、第一の結合相手としてＢ７−ＤＣタンパク質のＩｇＶドメインを含む。
【０１２４】
代表的な第一の融合相手としては、本明細書の上記に開示される、霊長類、好ましくはヒトまたはネズミＢ７−ＤＣポリペプチド、その断片およびその変異体を含む。好ましい断片としては、Ｂ７−ＤＣの細胞外ドメインを含む。挙げられているように、細胞外ドメインはシグナルペプチドの１〜１０個の連続するアミノ酸、Ｂ７−ＤＣ膜貫通ドメインまたはその双方を含み得る。
【０１２５】
一つの実施態様では、本発明の組成物および／または産物および／または方法は、ＰＤ−１受容体アンタゴニスト、特に、Ｂ７−Ｈ１などのＰＤ−１リガンドと結合することによりＰＤ−１受容体に拮抗し、それによりリガンドがＰＤ−１と相互作用するのを阻害する融合タンパク質を形成するように他のポリペプチドと結合されたポリペプチド（変異体、同族体およびその断片を含む）を用いる。別の実施形態では、ＰＤ−１受容体アンタゴニストポリペプチドまたはその変異体は、ＰＤ−１受容体と結合してそれを遮断することによりＰＤ−１受容体に拮抗し、ＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を阻害または低減する融合タンパク質を形成するように他のポリペプチドと結合される。
【０１２６】
第二のポリペプチド結合相手または第二のポリペプチド部分は、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドに対してＮ末端にあってもＣ末端にあってもよい。好ましい実施形態では、第二のポリペプチドはＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドのＣ末端である。
【０１２７】
好ましい実施形態では、本発明の方法および組成物および／または産物での使用が意図される融合タンパク質は、少なくとも抗体の一部を含んでなる。分子生物学および組換え技術の方法が登場したことにより、組換え手段によって抗体分子を作出し、それにより、抗体のポリペプチド構造中に見られる特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を生成することが可能である。このような抗体は該抗体のポリペプチド鎖をコードする遺伝子配列をクローニングするか、または該ポリペプチド鎖を直接合成し、合成された鎖をインビトロで組み立てて、特定のエピトープおよび抗原決定基に対して親和性を有する有効な四量体（Ｈ２Ｌ２）構造を形成することにより、作出することができる。これにより、種々の種および供給源に由来する中和抗体に特徴的な配列を有する抗体を容易に作出することができるようになった。
【０１２８】
抗体の供給源、あるいはそれらがインビトロまたはインビボにおいて、ウシ、ヤギおよびヒツジなどのトランスジェニック動物を用い、実験室規模もしくは商業的規模の大細胞培養を用い、バイオリアクターで、またはどの工程にも生きた生物を用いずに直接的化学的合成により、どのように組換え構築されたか、またはどのように合成されたかによらず、総ての抗体は全体的に類似の三次元構造を有する。この構造はしばしばとして示され、抗体が一般に２本の軽（Ｌ）アミノ酸鎖と２本の重（Ｈ）アミノ酸鎖を含んでなることを意味する。両鎖は構造的に相補する抗原標的と相互作用することができる領域を有する。これらの標的と相互作用する領域は「可変」または「Ｖ」領域と呼ばれ、抗原特異性の異なる抗体からくるアミノ酸配列の違いにより特徴付けられる。
【０１２９】
好ましい実施形態では、ＰＤ−１受容体アンタゴニストポリペプチド（断片、突然変異体および他の変異体を含む）は、（ｉ）第二のポリペプチドと直接融合された、または（ｉｉ）場合により、第二のポリペプチドと融合されたリンカーペプチド配列と融合されたＢ７−ＤＣタンパク質のまたはその変異体の全部または一部を有する第一の融合相手を有する。この融合相手の存在は、Ｂ７−ＤＣポリペプチドの溶解度、親和性、および／または価数を変化させ得る。より好ましい実施形態では、Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、Ｉｇ重鎖定常領域の１以上のドメイン、より好ましくは、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域に相当するか、またはネズミ免疫グロブリンＣγ２ａ鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域に相当するアミノ酸配列と融合される。好ましい実施形態では、定常領域は好ましくは、Ｆｃ受容体結合を抑制または低減する突然変異（例えば、Ｎ２９７Ｑ）を含む。
【０１３０】
ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域は以下のアミノ酸配列：
【化１０】
0005798919.tif 000012
（配列番号６）
を有する。
ネズミ免疫グロブリンＣγ２ａ鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域は以下のアミノ酸配列：
【化１１】
0005798919.tif 000013
（配列番号７）
を有する。
【０１３１】
例示的ネズミＢ７−ＤＣ融合タンパク質は、ネズミＩｇＧ２ａ（ＣＡＡ４９８６８）のアミノ酸２３７〜４６９と融合されているネズミＢ７−ＤＣのアミノ酸２０〜２２１を含む。ヒトＢ７−ＤＣ融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１（ＡＡＡ０２９１４）のアミノ酸２４５〜４７６と融合されているヒトＢ７−ＤＣのアミノ酸２０〜２２１を含み得る。Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質のシグナルペプチドは内因性シグナルペプチドであっても、または宿主からの融合タンパク質の分泌を促す他のいずれのシグナルペプチドであってもよい。
【０１３２】
代表的なネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇ融合タンパク質は配列番号８の核酸配列によりコードされる。
【０１３３】
開示されている核酸配列は、本発明の方法および組成物において有用な融合タンパク質を合成するために発現レベルを高めるようにコドンの至適化を行うことができると考えられる。コドンの至適化の方法は当該技術分野で公知である。
【０１３４】
配列番号８によりコードされるネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇ融合タンパク質は以下のアミノ酸配列：
【化１２】
0005798919.tif 000014
（配列番号９）
を有する。
【０１３５】
配列番号１０は、シグナル配列を含まないネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【化１３】
0005798919.tif 000015
（配列番号１０）
【０１３６】
一つの実施態様では、ヒトＢ７−ＤＣ−Ｉｇは、ヒトＢ７−ＤＣ−Ｉｇのアミノ酸配列をコードする配列番号１１の核酸配列によりコードされる。
【化１４】
0005798919.tif 000016
（配列番号１２）
【０１３７】
本発明は特に、本発明の方法および組成物において有用な成熟融合タンパク質のシグナル配列が除去されている実施形態を意図する。好ましい実施形態では、シグナル配列は完全に除去される。
【０１３８】
配列番号１３は、シグナル配列を含まないヒトＢ７−ＤＣ−Ｉｇのアミノ酸配列を示す。
【化１５】
0005798919.tif 000017
（配列番号１３）
【０１３９】
本発明は特に、本明細書に開示される方法および組成物において用いられる、開示されているＢ７−ＤＣ−Ｉｇ融合タンパク質が配列番号９、１０、１２、または１３と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９９％、または１００％の配列同一性を有する実施形態を意図する。
【０１４０】
本発明の別の実施形態では、融合ポリペプチドは、第一の融合相手がＢ７−Ｈ１などのＰＤ−１のリガンドと結合し、第二の融合相手がＰＤ−１受容体を介した阻害的シグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１受容体と結合する二重特異的機能を持ち得る。
【０１４１】
本発明において有用なポリペプチドは単量体であっても二量体であってもよいが、融合タンパク質自体は単量体または好ましくは二量体としてのオリゴマー形態で存在し得る。特定の実施形態では、本発明の方法および組成物においてＰＤ−１アンタゴニストとして有用な融合タンパク質はオリゴマー形態、特に、二量体形態へと自発的な組み立ても可能であるし、あるいは当該技術分野で周知の手段によってこのようなオリゴマーを形成するように化学的に結合させることできる。例えば、本発明の実施において有用な融合タンパク質はそれ自体、抗体の一部と融合されているＢ７−ＤＣポリペプチドの一部を含んでなってよく、これらを二量体へとさらに組み立てることができる。このような一つの例では、本発明で用いるためのポリペプチドは単一のアミノ酸鎖として抗体のＦｃ領に融合され（例えば、この構築物が単一の組換えポリヌクレオチドから発現される場合）、その後、このような二つの融合産物を、個々のＦｃ領域間のジスルフィド結合によるなどして互いに連結してホモ二量体を形成させる。
【０１４２】
このような二量体産物はホモ二量体（双方の単量体融合タンパク質が同じ場合）であっても、あるいはヘテロ二量体（二つの異なる融合タンパク質が互いに連結される場合）であってもよい。このような二量体の個々の単量体は、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）または非共有結合（例えば、イオン的相互作用）によるなど、当該技術分野で公知の任意の手段によって連結することができる。本発明のこれらの例で用いられるＢ７−ＤＣ−Ｉｇは、ジスルフィド結合によりともに連結された２コピーの配列番号１０を持つホモ二量体の形態で存在した。さらに、本発明のヘテロ二量体は、一方の単量体部分がＰＤ−１と結合し、他方がＰＤ−１の天然リガンドと結合する二重特異性タンパク質および融合タンパク質を含む。このようなヘテロ二量体は、本明細書の他所に十分に記載されているポリペプチドおよび融合タンパク質を結合させることにより形成される。
【０１４３】
本発明の別の有用な実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストはヘテロ二量体である（例えば、二つの融合タンパク質がともに連結されているが、同一のアミノ酸配列ではない場合）。特定の例では、各単量体はＢ７−ＤＣポリペプチドの有効断片と連結された抗体のＦｃ部分を含んでなってもよく、ここで、これらの有効断片はＢ７−ＤＣポリペプチドの異なる部分に由来するか、または全長天然Ｂ７−ＤＣポリペプチドに融合された抗体のＦｃ部分を含んでなる融合タンパク質が、抗体のＦｃ部分と全長天然Ｂ７−ＤＣポリペプチドの有効断片を含んでなる融合タンパク質と連結（例えば架橋）されている。このような各場合において、各単量体融合タンパク質を形成する際に用いられる抗体の部分は、これら二つの単量体間で異なっていてもよい。このような二量体組合せはいずれも、本発明の方法および組成物により特に意図される。
【０１４４】
好ましい二量体融合タンパク質では、二量体は、二量体を形成した通常のＩｇ重鎖においてジスルフィド結合されているものと同じＣｙｓ残基である、２本のＩｇ重鎖中のＣＨ領域のＣｙｓ残基の共有結合から生じている。
【０１４５】
さらに別の実施形態は、変異体Ｂ７−ＤＣポリペプチドの細胞外ドメインと融合されているＢｉｒＡ基質を有する四量体構築物を提供する。四量体構築物の作製方法は当該技術分野で公知である（Pertovas, et al., J. Exp. Med., 203:2281 (2006）参照。
【０１４６】
７．抗ＰＤ−１および他の抗体
本発明の方法により意図される他のＰＤ−１アンタゴニストは、ＰＤ−１またはＰＤ−１のリガンドと結合する抗体および他の抗体を含む。
【０１４７】
一つの態様において、本発明は、それを必要とする哺乳類においてＴ細胞応答を増強する方法であって、該哺乳類に抗ＰＤ−１抗体および増強剤を含んでなる有効な処置計画（該処置計画は該抗原に対する該哺乳類のＴ細胞応答を増強するのに有効である）により投与することを含んでなる方法に関する。
【０１４８】
本発明の処置計画において有用な抗ＰＤ−１抗体としては、限定されるものではないが、以下の刊行物：
ＰＣＴ／ＩＬ０３／００４２５号公報（Hardyら  ＷＯ／２００３／０９９１９６号公報）
ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３０９６０６号公報（Kormanら  ＷＯ／２００６／１２１１６８号公報）
ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００８９２５号公報（Liら  ＷＯ／２００９／０１４７０８号公報）
ＰＣＴ／ＪＰ０３／０８４２０号公報（Honjoら  ＷＯ／２００４／００４７７１号公報）
ＰＣＴ／ＪＰ０４／００５４９号公報（Honjoら  ＷＯ／２００４／０７２２８６号公報）
ＰＣＴ／ＩＢ２００３／００６３０４号公報（Collinsら  ＷＯ／２００４／０５６８７５号公報）
ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８８８５１号公報（Ahmed etら  ＷＯ／２００８／０８３１７４号公報）
ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２６０４６号公報（Kormanら  ＷＯ／２００７／００５８７４号公報）
ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８４９２３号公報（Terrettら  ＷＯ／２００９／０７３５３３号公報）
Berger et al., Clin. Cancer Res., Vol. 14, pp. 30443051 (2008)
に記載されているものが含まれる。
【０１４９】
本発明の方法において有用な抗ＰＤ−１抗体の特定の例は、好ましくは３ｍｇ／ｋｇの用量で投与されるヒト抗ＰＤ−１抗体であるＭＤＸ−１１０６（Kosak, 米国特許第２００７０１６６２８１号公報（２００７年７月１９日公開）第４２節参照）である。
【０１５０】
別の態様において、本発明は、それを必要とする哺乳類においてＴ細胞応答を増強する方法であって、該哺乳類に、抗ＰＤ−１リガンド抗体、例えば抗Ｂ７−Ｈ１抗体および増強剤を含んでなる有効な処置計画（該処置計画は該抗原に対する該哺乳類のＴ細胞応答を増強するのに有効である）により投与することを含んでなる方法に関する。
【０１５１】
本発明の処置計画において有用な抗Ｂ７−Ｈ１抗体としては、限定されるものではないが、以下の刊行物：
ＰＣＴ／ＵＳ０６／０２２４２３号公報（ＷＯ／２００６／１３３３９６号公報、２００６年１２月１４日公開）
ＰＣＴ／ＵＳ０７／０８８８５１号公報（ＷＯ／２００８／０８３１７４号公報、２００８年７月１０日公開）
米国特許第２００６／０１１０３８３号公報（２００６年５月２５日公開）
に記載されているものが含まれる。
【０１５２】
本発明の方法において有用な抗Ｂ７−Ｈ１抗体の特定の例は、ヒト抗Ｂ７−Ｈ１抗体であるＭＤＸ−１１０５（ＷＯ／２００７／００５８７４号公報、２００７年１月１１日公開）である。
【０１５３】
抗Ｂ７−ＤＣ抗体としては、７，４１１，０５１、７，０５２，６９４、７，３９０，８８８、２００６００９９２０３を参照。
【０１５４】
本発明の別の実施形態は、Ｂ７−Ｈ１などのＰＤ−１のリガンドと結合する抗体と架橋されたＰＤ−１受容体と結合する抗体を含んでなる二重特異性抗体を含む。好ましい実施形態では、ＰＤ−１結合部分はＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達を低減または阻害する。
【０１５５】
本発明で用いるための抗体は、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−１リガンド抗体である必要はなく、免疫応答におけるＴ細胞の作用を媒介するのに有用な別の抗体であってもよい。この態様において、本発明は、それを必要とする哺乳類において抗原に対するＴ細胞応答を増強する方法であって、該哺乳類に抗ＣＴＬＡ４抗体および増強剤を含んでなる有効な処置計画（該処置計画は該抗原に対する該哺乳類のＴ細胞応答を増強するのに有効である）により投与することを含んでなる方法に関する。本発明の方法での使用が意図される抗ＣＴＬＡ４抗体の例としては、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４３６９０号公報（Fischkoffら ＷＯ／２００７／０５６５３９号公報）に記載されているような抗体が含まれる。
【０１５６】
本発明の方法において有用な抗ＣＴＬＡ４抗体の特定の例は、好ましくは１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されるヒト抗ＣＴＬＡ４抗体である、ＭＤＸ−０１０またはＭＤＸ−１０としても知られるイピリムマブ、および好ましくは１５ｍｇ／ｋｇの用量で投与されるヒト抗ＣＴＬＡ４抗体であるトレメリムマブである。
【０１５７】
８．小分子ＰＤ−１アンタゴニスト
ＰＤ−１受容体アンタゴニストはまた、小分子アンタゴニストであってもよい。「小分子」とは、１００ダルトンを超え、約２，５００ダルトン未満、好ましくは１００〜２０００ダルトンの間、より好ましくは約１００〜約１２５０ダルトンの間、より好ましくは約１００〜約１０００ダルトンの間、より好ましくは約１００〜約７５０ダルトンの間、より好ましくは約２００〜約５００ダルトンの間の分子量を有する小有機化合物を意味する。これらの小分子は多くの場合、環状炭素または複素環式構造および／または１以上の官能基で置換された芳香族または多環芳香族構造を含む。これらの小分子アンタゴニストは、Ｂ７−Ｈ１およびＢ７−ＤＣなどのＰＤ−１のリガンドと結合し、そのリガンドがＰＤ−１と相互作用しないようにすることにより、またはＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１受容体と直接結合してそれを遮断することにより、ＰＤ−１受容体シグナル伝達を低減するか、またはそれと干渉する。
【０１５８】
一つの実施態様では、このような小分子は、別のＰＤ−１アンタゴニストまたはＣＴＬＡ４アンタゴニスト、例えば、ＰＤ−１もしくはそのリガンドの一つに特異的な抗体またはＣＴＬＡ４もしくはそのリガンドの一つに特異的な抗体と組み合わせて投与することができる。よって、このような小分子は本発明の１以上の方法においては化合物として投与することができ、あるいは本発明の方法において有用な他の化合物と組み合わせて投与することもできる。例えば、一連の小有機化合物はＢ７−１リガンドと結合してＣＴＬＡ４との結合を妨げることが示されている（Erbe et al., J. Biol. Chem., Vol. 277, pp. 7363-7368 (2002) 参照）。このような小有機物は、Ｔ細胞の阻害的シグナル伝達を低減するために、単独で、または抗ＣＴＬＡ４抗体とともに、ＣＴＸ投与と組み合わせて投与することができる。
【０１５９】
一つの実施態様では、本発明の方法での使用が意図されるＰＤ−１アンタゴニストまたはＣＴＬＡ４アンタゴニストは、アンチセンス核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡの双方）ならびにｓｉＲＮＡ分子が含まれる。このようなアンチセンス分子は、Ｔ細胞上でのＰＤ−１の発現ならびにＢ７−Ｈ１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２などのＴ細胞リガンドの産生を妨げる。例えば、ポリエチレンイミンなどの担体と複合体化されたｓｉＲＮＡ（例えば、ＰＤ−１をコードするかまたはＰＤ−１リガンドをコードする遺伝子に特異的であり、かつ、オリゴヌクレオチドが商業的に容易に購入できる、約２１ヌクレオチド長のもの）（Cubillos-Ruiz et al., J. Clin. Invest. 119(8): 2231-2244 (2009)参照）は、ＰＤ−１ならびにＰＤ−１のリガンドを発現する細胞によって容易に取り込まれ、これらの受容体およびリガンドの発現を低減して、Ｔ細胞における阻害的シグナル伝達の低減を達成し、それによりＴ細胞を活性化する。
【０１６０】
Ｂ．増強剤
本発明によれば、ＰＤ−１アンタゴニストの活性は、増強の存在により、好ましくは相乗的に増強される。増強剤はおそらく１を超える機構によってＰＤ−１受容体アンタゴニストの有効性を高める働きをするが、厳密な作用機序は本発明の広義の実践には重要でない。
【０１６１】
好ましい実施形態では、増強剤はシクロホスファミドである。シクロホスファミド（ＣＴＸ、Ｃｙｔｏｘａｎ（商標）またはＮｅｏｓａｒ（商標））はオキシアザホスホリン薬であり、類似体としては、イフォスファミド（ＩＦＯ、Ｉｆｅｘ）、ペルホスファミド、トロホスファミド（トロフォスファミド、Ｉｘｏｔｅｎ）およびその薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグおよび代謝産物（引用することによりそのまま本明細書の一部とされる米国特許出願２００７０２０２０７７号公報）が含まれる。イフォスファミド（ＭＩＴＯＸＡＮＡ（商標））はシクロホスファミドの構造類似体であり、その作用機序はシクロホスファミドと同じまたは実質的に類似していると考えられる。ペルホスファミド（４−ヒドロペルオキシシクロホスファミド）およびトロホスファミドもシクロホスファミドと構造的に関連のあるアルキル化剤である。例えば、ペルホスファミドはＤＮＡをアルキル化し、それにより、ＤＮＡ複製およびＲＮＡおよびタンパク質合成を阻害する。宿主毒性の軽減を伴って選択性および応答を改善する試みで、新規なオキシアザホスホリン誘導体が設計され、評価された(Liang J, Huang M, Duan W, Yu XQ, Zhou S. Design of new oxazaphosphorine anticancer drugs. Curr Pharm Des. 2007、13(9):963-78. Review)。これらにはマホスファミド（ＮＳＣ  ３４５８４２）、グルホスファミド（Ｄ１９５７５、β−Ｄ−グルコシルイソホスホルアミドマスタード）、Ｓ−（−）−ブロモホスファミド（ＣＢＭ−１１）、ＮＳＣ６１２５６７（アルドホスファミドペルヒドロチアジン）およびＮＳＣ６１３０６０（アルドホスファミドチアゾリジン）が含まれる。マホスファミドは、４−ヒドロキシ−ＣＰＡの化学的に安定な４−チオエタンスルホン酸塩であるオキシアザホスホリン類似体である。グルホスファミドは、ＩＦＯのアルキル化代謝産物であるイソホスホルアミドマスタードがβ−Ｄ−グルコース分子にグルコシド結合されたＩＦＯ誘導体である。さらなるシクロホスファミド類似体は、引用することによりそのまま本明細書の一部とされる"Cyclophosphamide analogs useful as anti-t
umor agents"と題された米国特許第５，１９０，９２９号公報に記載されている。
【０１６２】
他の実施形態では、増強剤は調節性Ｔリンパ球（Ｔ−ｒｅｇ）の活性および／または数を低減する薬剤、好ましくは、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（商標））、抗ＴＧＦβまたはイマチニブ（ＧＬＥＥＶＡＣ（商標））である。挙げられている処置計画はまた、アジュバントを投与することを含んでもよい。
【０１６３】
有用な増強剤としてはまた、有糸分裂阻害剤、例えば、パクリタキソール、アロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾール）、および脈管形成阻害剤（ＶＥＧＦ阻害剤、例えば、アバスチン、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）（例えば、Li et al., Vascular endothelial growth factor blockade reduces intratumoral regulatory T cells and enhances the efficacy of a GM-CSF-secreting cancer immunotherapy. Clin Cancer Res. 2006 Nov 15、12(22):6808-16参照）、アントラサイクリン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、ＴＬＲ４アンタゴニスト、およびＩＬ−１８アンタゴニストが含まれる。
【０１６４】
Ｃ．医薬組成物
一つの態様において、本発明は、ＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を妨げる分子またはＣＴＬＡ４アンタゴニスト、および増強剤を薬学上許容される担体中に含んでなる治療組成物に関する。該組成物の成分は哺乳類においてＴ細胞応答を増強するのに有効な量で存在する。特定の実施形態において、増強剤はシクロホスファミドまたはシクロホスファミド類似体であり、このような類似体の例は上記に挙げられている。
【０１６５】
他の特定の例において、増強剤は調節性Ｔリンパ球（Ｔ−ｒｅｇ）の活性を低減する薬剤であり、好ましくは、この活性は該Ｔ−ｒｅｇの数の減少により低減される。好ましい非限定的実施形態では、該薬剤はスニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（商標））、抗ＴＧＦβまたはイマチニブ（ＧＬＥＥＶＡＣ（商標））である。
【０１６６】
本発明の組成物の処方において有用な増強剤としてはまた、有糸分裂阻害剤、例えば、パクリタキソール、アロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾール）、脈管形成阻害剤(agniogenesis inhibitors)（ＶＥＧＦ阻害剤、例えば、アバスチン、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）、アントラサイクリン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、ＴＬＲ４アンタゴニストおよびＩＬ−１８アンタゴニストが含まれる。
【０１６７】
本発明の治療組成物はまた、場合により、抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、有糸分裂阻害剤、アロマターゼ阻害剤、Ａ２ａアデノシン受容体（Ａ２ＡＲ）アンタゴニストまたは脈管形成阻害剤の１以上であり得る少なくとも一つの付加的薬剤を含んでなる。
【０１６８】
本発明の治療組成物はいずれも、本明細書に記載の１以上のアジュバントを含んでもよい。
【０１６９】
本発明の治療組成物の成分として有用なＰＤ−１アンタゴニストは、本発明の方法のいずれかで用いるための、本明細書に挙げられているＰＤ−１アンタゴニストのいずれもを含む。例えば、このようなＰＤ−１アンタゴニストとしては、本明細書に挙げられている融合タンパク質のいずれもを含む。このようなアンタゴニストはまた、本発明の方法のいずれかでにおける使用に関して記載されている融合タンパク質のいずれかの第一のポリペプチド部分として用いるために本明細書に挙げられているポリペプチドまたはＰＤ−１結合断片のいずれであってもよい。このようなアンタゴニストはさらに、本明細書に記載されている既知の抗ＰＤ−１、抗Ｂ７−ＤＣまたは抗Ｂ７−Ｈ１抗体などの抗体であってもよい。
【０１７０】
本発明の治療組成物はまた、上述のＰＤ−１アンタゴニストに加えて、またはその代わりに、抗ＣＴＬＡ４抗体を含む。よって、このような組成物は、このような抗ＣＴＬＡ４抗体と本明細書ですでに記載されている種類の増強剤を含む。
【０１７１】
本発明の治療組成物は本明細書に開示される本発明の方法のいずれか使用が見出せる。このような組成物は、病態の有効な治療としての使用が意図されるとともに、本明細書に挙げられているいずれかの疾患を予防するための予防組成物としても使用が見出せる。
【０１７２】
一つの態様において、本発明はＰＤ−１アンタゴニストおよび増強剤を薬学上許容される担体中に含んでなる治療組成物を意図し、ここで、ＰＤ−１アンタゴニストおよび増強剤は哺乳類においてＴ細胞応答を増強するのに有効な量でともに存在する。
【０１７３】
本発明の範囲内の治療組成物は、本明細書に開示されるＰＤ−１アンタゴニストおよび／または抗体と挙げられている増強剤のいずれかの組合せのいずれか、および総てを含んでなる組成物を含む。限定されるものではないが、本発明の治療組成物は、有効量の１以上のＰＤ−１アンタゴニスト、例えば、特定の配列番号として本明細書に挙げられている全長ポリペプチドまたはその同族体（該ポリペプチドのいずれかの１以上の断片を含む）のいずれかまたは総ての組合せ（これらのいずれかまたは総てが他のタンパク質と融合されている場合、例えば、本明細書に挙げられている１以上の免疫グロブリンと融合されている場合、またはこのような融合がされていない場合を含む）を含んでなり、かつ、１以上の増強剤、例えば、シクロホスファミド単独またはシクロホスファミドおよび１以上のその類似体、またはシクロホスファミドの１以上の類似体のみを含んでなる組成物を含み、あるいは増強剤はシクロホスファミドと、組成物を受容する哺乳類においてＴｒｅｇ数を低減する薬剤からなってもよく、あるいはシクロホスファミド類似体とＴｒｅｇ数を低減する薬剤からなってもよく、あるいは増強剤はＴｒｅｇ数または他のＴｒｅｇ活性を低減する１以上の薬剤のみからなってもよい。このような組合せは総て、その組成物が少なくとも一つ一つのＰＤ−１アンタゴニスト(anatgonist)および／またはＴ細胞活性を媒介する抗体および少なくとも一つ一つの増強剤を含んでなる限り、本発明により意図される。
【０１７４】
本発明の組成物はまた、付加的な有効薬剤を含んでもよい。本発明の組成物のいずれかの好ましい実施形態では、医薬組成物または治療組成物は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、有糸分裂阻害剤（パクリタキセルなど）、アロマターゼ阻害剤（レトロゾールなど）、Ａ２ＡＲアンタゴニスト、脈管形成阻害剤、アントラサイクリン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、ＴＬＲ４アンタゴニストおよびＩＬ−１８アンタゴニストからなる群から選択される少なくとも一つの付加的薬剤をさらに含んでなる。
【０１７５】
ＰＤ−１アンタゴニストおよび／または増強剤は、好適ないずれの手段によって投与してもよい。好ましい実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストおよび／または増強剤は、水溶液中で非経口注射により投与される。処方物はまた懸濁液またはエマルションの形態であってもよい。一般に、有効量のペプチドまたはポリペプチドを含み、場合により薬学上許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体を含む医薬組成物が提供される。このような組成物は希釈剤、無菌水、様々なバッファー含量の緩衝生理食塩水（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸、リン酸）、ｐＨおよびイオン強度、ならびに場合により、洗剤および可溶化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）２０、ＴＷＥＥＮ８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、および保存剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）および増量剤（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤を含む。非水性溶媒またはビヒクルの例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油およびコーン油などの植物油、ゼラチン、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルがある。処方物は凍結乾燥させ、使用直前に再溶解／再懸濁させてもよい。処方物は例えば、細菌保持フィルターによる濾過、除菌剤の組成物への配合、組成物の照射または組成物の加熱によって除菌してもよい。
【０１７６】
本発明の医薬組成物は、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）または皮下注射）、経皮（受動的またはイオン泳動またはエレクトロポレーションを使用）または経粘膜（鼻腔、膣、直腸、または舌下）投与経路により投与することができる。本発明の方法は、ＰＤ−１アンタゴニストおよび増強剤を別個の異なる経路により（例えば、局所的に）投与することを排除するものではない。
【０１７７】
ＰＤ−１アンタゴニストおよび増強剤は同時に、またはＰＤ−１アンタゴニストの前または後に増強剤を投与するといったように異なる時点で投与してもよい。一つの実施態様では、増強剤はＰＤ−１アンタゴニストの前および後の双方に投与される。このような一つの実施態様では、ＰＤ−１アンタゴニストの前と後に同じ増強剤が投与される。別の実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストの前に増強剤が投与される。
【０１７８】
本明細書において「有効量」または「治療上有効な量」とは、処置される障害の１以上の症状を処置、阻害、または緩和するのに、またはそうでなければされる所望の薬理学的および／または生理学的作用を提供するのに十分な用量を意味する。厳密な用量は、被験体に依存する変数（例えば、年齢、免疫系の健全性など）、疾患および行われる処置などの種々の要因によって異なる。増強剤を伴うＰＤ−１受容体アンタゴニストおよび／または抗体の治療上有効な量は、免疫応答を活性化または持続させる。
【０１７９】
選択される用量は、所望の治療効果、投与経路および所望の処置の持続時間によって異なる。一般に、１日当たり０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量レベルが哺乳類に投与される。好ましくは、該用量は１〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜４０ｍｇ／ｋｇ、またはさらには１〜３０ｍｇ／ｋｇであり、２〜２０ｍｇ／ｋｇの用量も好ましい用量である。他の用量例としては、２〜１５ｍｇ／ｋｇ、２〜１０ｍｇ／ｋｇ、またはさらには３〜５ｍｇ／ｋｇが挙げられ、約４ｍｇ／ｋｇの用量が具体例である。
【０１８０】
増強剤と抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ４抗体などの抗体を用いる処置計画では、用量は一般に０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり、より狭い１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲が好ましく、１０〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲がより好ましい。ヒト被験体に適当な用量は５〜１５ｍｇ／ｋｇの間であり、１０ｍｇ／ｋｇの抗体（例えば、ＭＤＸ−１１０６のようなヒト抗ＰＤ−１抗体）が最も好ましい（これとともに抗体の最大約２４時間前に好適な用量のシクロホスファミドまたは他の増強剤を与える）。
【０１８１】
一般に、単に例としては、本発明の方法において有用なシグナル伝達アンタゴニストのいずれかの体重に基づく剤形は、５〜３００ｍｇ／ｋｇまたは５〜２９０ｍｇ／ｋｇまたは５〜２８０ｍｇ／ｋｇまたは５〜２７０ｍｇ／ｋｇまたは５〜２６０ｍｇ／ｋｇまたは５〜２５０ｍｇ／ｋｇまたは５〜２４０ｍｇ／ｋｇまたは５〜２３０ｍｇ／ｋｇまたは５〜２２０ｍｇ／ｋｇまたは５〜２１０ｍｇ／ｋｇまたは２０〜１８０ｍｇ／ｋｇまたは３０〜１７０ｍｇ／ｋｇまたは４０〜１６０ｍｇ／ｋｇまたは５０〜１５０ｍｇ／ｋｇまたは６０〜１４０ｍｇ／ｋｇまたは７０〜１３０ｍｇ／ｋｇまたは８０〜１２０ｍｇ／ｋｇまたは９０〜１１０ｍｇ／ｋｇまたは９５〜１０５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量を含み、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇの用量が好ましい用量の具体例である。このような用量は当然のことながら繰り返される。用量は当然のことながら該用量を受容する哺乳類の属性に相関する。上記に挙げたｍｇ／ｋｇ範囲の用量は、マウスおよびラットなどの齧歯類、および霊長類、特にヒトなどを含む哺乳類にとって便宜であり、ヒトの処置には、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇの用量が特に好ましい。
【０１８２】
本発明の処置計画によれば、増強剤、例えば、シクロホスファミドは、動物によって異なる無毒な用量で投与される。特定の実施形態においては、増強剤は非経口または経口（前者は静脈投与などの全身投与を含む）を含む任意の好適な投与手段により投与される。例えば、シクロホスファミドのような増強剤は通常経口投与される。このような投与は、増強剤に応じて便宜ないずれかの用量で行うことができる。各場合において用量は体重に基づき、単位剤形として投与され得る。
【０１８３】
ＣＴＸ自体は無毒であるが、その代謝産物のいくつかは、ＤＮＡの架橋を誘導し、高用量では鎖を切断する細胞傷害性アルキル化剤である。多くの細胞が高レベルの解毒酵素アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）を発現するので、ＣＴＸ耐性である。リンパ球（造血幹細胞はそうではない）は低レベルのＡＬＤＨを発現するに過ぎず、細胞周期中の細胞はＤＮＡアルキル化剤に感受性が最も高いので、ＣＴＸは増殖中のリンパ球を標的とする。
【０１８４】
低用量のＣＴＸ（＜２００ｍｇ／ｋｇ）は、ヒトおよびマウス癌モデルにおける抗腫瘍免疫応答の刺激(Brode & Cooke Crit Rev. Immunol. 28:109-126 (2008))を含む免疫刺激作用を有し得る。これらの低用量は治療には至らない、直接的な抗腫瘍活性を持たない。これに対して、高用量のＣＴＸは抗腫瘍応答を阻害する。いくつかの機構、すなわち、（ａ）ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ（具体的には、特に抑制的であり得る増殖中のＴｒｅｇ）の枯渇、（ｂ）Ｂリンパ球の枯渇、（ｃ）腫瘍細胞増殖の抑制をもたらす一酸化窒素（ＮＯ）の誘導、（ｄ）ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋ＭＤＳＣの動員および拡大で、抗腫瘍免疫応答の増強におけるＣＴＸの役割を説明することができる。これらの一次作用は、例えば、Ｔｒｅｇ枯渇の後にマクロファージのＩＦＮ−γ産生が増え、ＩＬ−１０産生が減るなどの多くの二次的作用を有する。ＣＴＸはまた、Ｉ型ＩＦＮの発現を誘導し、リンパ球の恒常的増殖を促進することも示されている。
【０１８５】
Ｔｒｅｇの枯渇は、ＣＴＸが抗腫瘍免疫応答を増強する機構として最もよく挙げられる。この結論は一つには養子免疫伝達試験の結果に基づくものである。ＡＢ１−ＨＡ腫瘍モデルでは、９日目にＣＴＸ処置を行ったところ、７５％の治癒率が得られた。１２日目に精製Ｔｒｅｇを移入したところ、ＣＴＸ応答がほぼ完全に阻害された(van der Most et al. Cancer Immunol. Immunother. 58:1219-1228 (2009)。同様の結果がＨＨＤ２腫瘍モデルでも見られ、ＣＴＸを予め処置した後にＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの養子免疫伝達を行ったところ、ワクチンに対する治療応答が排除された(Taieb,J. J. Immunol. 176:2722-2729 (2006))。
【０１８６】
多くのヒト臨床試験が、低用量ＣＴＸが安全であり、十分な許容性があり、抗腫瘍免疫応答の誘導に有効な薬剤であることを実証している(Taieb,J. J. Immunol. 176:2722-2729 (2006))。
【０１８７】
抗腫瘍免疫応答を増強するためのＣＴＸの至適用量は、Ｔｒｅｇを、通常範囲を下回るが治療には至らないレベルに引き下げることによりＴ細胞総数を減らすものである（Machiels et al. Cancer Res. 61:3689-3697 (2001)参照）。
【０１８８】
ＣＴＸを免疫増強剤として用いたヒト臨床試験では、通常、３００ｍｇ／ｍ２の用量が用いられた。平均的な男性（６フィート、１７０ポンド（７８ｋｇ）、体表面積１．９８ｍ２）では、３００ｍｇ／ｍ２は８ｍｇ／ｋｇまたは総タンパク質６２４ｍｇである。マウス癌モデルでは、１５〜１５０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量（３０ｇのマウスで総タンパク質０．４５〜４．５ｍｇに相当）で有効性が見られた(Machiels et al. Cancer Res. 61:3689-3697 (2001), Hengst et al Cancer Res. 41:2163-2167 (1981), Hengst Cancer Res. 40:2135-2141 (1980))。
【０１８９】
霊長類、好ましくはヒト患者などの大型の哺乳類では、このようなｍｇ／ｍ２用量を用いることもできるが、有限の時間間隔で投与される単位用量が好ましいものであり得る。このような単位用量は有限の時間、例えば、最大３日または最大５日または最大７日または最大１０日または最大１５日または最大２０日または最大２５日などの日単位で投与することができ、総て本発明により具体的に意図される。同じ計画が本明細書に挙げられている他の増強剤にも適用可能である。
【０１９０】
このような投与は総て、本発明のＰＤ−１結合分子の投与の前または後に行うことができる。あるいは、１以上の用量の本発明のＰＤ−１結合分子の投与を増強剤の投与と経時的に交互に行い、１以上の用量の増強剤を投与した後に１以上の用量のＰＤ−１結合化合物を投与し、その後、１以上の用量の増強剤を投与するというように、総て薬剤を投与する研究者または臨床医により選択された、または望まれたどんな計画にも従って、均一または不均一処置コースを形成することができる。
【０１９１】
他の特定の実施形態では、処置計画は１以上のＰＤ−１アンタゴニストの多回投与を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストのこのような多回投与を、同じまたは異なる増強剤の多回投与と組み合わせる。
【０１９２】
本発明の他の実施形態と同様に、ここでは、増強剤がＰＤ−１−アンタゴニスト投与の少なくとも１、２、３、５、１０、１５、２０、２４、または３０時間前または後に投与される。
【０１９３】
本明細書において有用な医薬組成物はまた、それ自体、組成物を受容する個体に有害な抗体の産生を誘導せず、過度な毒性なく投与することができる任意の製薬剤を含む、任意の好適な希釈剤または賦形剤をはじめとする薬学上許容される担体を含む。薬学上許容される担体としては、限定されるものではないが、鼻腔およびその他の呼吸器送達のため、または眼球系への送達のためのスプレーを形成するのに有用な担体を含む、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体を含む。薬学上許容される担体、希釈剤および他の賦形剤の詳細な考察はREMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. current edition)に示されている。
【０１９４】
ワクチン組成物（後述の通り）は、ｐＨの安定化のため、またはワクチンの有効性を向上させるのに役立ち得るアジュバント、湿潤剤または乳化剤として機能させるためのさらなる物質を組み込むことができる。
【０１９５】
ワクチンは一般に非経口投与用に処方され、皮下または筋肉内のいずれか注射される。このようなワクチンはまた、当該技術分野で公知の方法を用いて坐剤としてまたは経口投与用に、または鼻腔もしくは呼吸器系経路による投与用に処方することができる。
【０１９６】
Ｄ．製造方法
単離されたＰＤ−１アンタゴニストポリペプチド（野生型であれ突然変異型であれ、その変異体、同族体および断片、ならびにこれらのいずれかを含んでなる融合タンパク質を含む、総て本発明における使用に意図される）は、例えば、化学的合成または宿主細胞での組換え生産によって得ることができる。共刺激ポリペプチドを組換え生産するためには、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を用いて、細菌または真核生物宿主細胞（例えば、昆虫、酵母または哺乳類細胞）に形質転換、形質導入またはトランスフェクションを行うことができる。このヌクレオチド配列は特定の宿主細胞種においてタンパク質発現のレベルを高めるためにコドンの至適化を行うことができると考えられる。コドン至適化の方法は当該技術分野で周知である。一般に、核酸構築物は、共刺激ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された調節配列を含む。調節配列（本明細書では発現制御配列とも呼ばれる）は一般に遺伝子産物をコードしないが、それらが機能的に連結されている核酸配列の発現に影響を与える。細胞からタンパク質を分泌させるのに用いられるシグナルペプチドは内因性シグナルペプチドまたは宿主からの融合タンパク質の分泌を促す他のいずれかのシグナルペプチドであり得る。
【０１９７】
本発明の実践において有用な一般的な分子生物学の手法としては、分子生物学および遺伝子操作の技術分野で周知の手順を含むいくつかの標準的な参照を利用することができる（これらの手順は本明細書でさらに記載する必要はない）。有用な参照としては、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Wu et al, Methods in Gene Biotechnology (CRC Press, New York, NY, 1997), and Recombinant Gene Expression Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 62, (Tuan, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1997)が含まれ、これらの開示は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【０１９８】
Ｅ．疾患の処置
本発明により提供される治療組合せを投与することにより治療または予防される疾患としては、悪性腫瘍または細菌、ウイルス、原虫、蠕虫もしくは細胞内に侵入する他の微生物病原体により引き起こされる慢性感染性疾患が挙げられる。このような疾患は多くの場合、細胞傷害性Ｔリンパ球による攻撃によって対抗される。本発明は、Ｔ細胞活性の増強、Ｔ細胞増殖の増大およびＴ細胞阻害シグナルの低減によるＴ細胞応答の増強に有用な併用療法を提供するので、本発明の併用療法はこのような疾患の治療（またはさらには予防）において独特な利点を有する。
【０１９９】
一つの実施態様では、ウイルス感染は主としてＴ細胞により排除されるので、Ｔ細胞活性の増強は、動物または霊長類、好ましくはヒト被験体から感染力のあるウイルス病原体の排除の増強に治療上有用である。よって、ＰＤ−１受容体アンタゴニスト活性を有する開示されている本発明の化合物は、増強剤とともに、去基部的または全身性のウイルス感染の処置のための組合せで働く。本発明の化合物により処置される感染としては、限定されるものではないが、免疫不全（例えば、ＨＩＶ）、乳頭腫（例えば、ＨＰＶ）、ヘルペス（例えば、ＨＳＶ）、脳炎、インフルエンザ（例えば、ヒトＡ型インフルエンザウイルス）、肝炎（例えば、ＨＣＶ、ＨＢＶ）、および風邪（例えば、ヒトライノウイルス）ウイルス感染を含む。ＰＤ−１受容体アンタゴニスト組成物の医薬処方物は、限定されるものではないが、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、風邪または脳炎を含む全身性ウイルス性疾患を処置するためにも投与することができる。
【０２００】
本発明の化合物により処置可能な非ウイルス性疾患としては、限定されるものではないが、アクチノミセス属、アナベナ属、バチルス属、バクテロイデス属、デロビブリオ属、ボルデテラ属、ボレリア属、カンピロバクター属、カウロバクター属、クラミジア属、クロロビウム属、クロマチウム属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、サイトファガ属、ディノコッカス属、エシェリキア属、フランシセラ属、ハロバクテリア属、ヘリコバクター属、ヘモフィルス属、Ｂ型ヘモフィルス・インフルエンザ（ＨＩＢ）、ハイフォミクロビウム属、レジオネラ属、リーシュマニア属、リステリア属、Ａ型、Ｂ型およびＣ型髄膜炎球菌、メタノバクテリウム属、球菌属、ミオバクテリウム属(Myobacterium)、マイコプラズマ属、ミクソコッカス属、ナイセリア属、ニトロバクター属、オシラトリア属、プロクロロン属、プロテウス属、シュードモナス属、ロドスピリルム属、リケッチア属、サルモネラ菌属、赤痢菌属、スピリルム属、スピロヘータ属、ブドウ状球菌属、連鎖球菌属、ストレプトミセス属、スルフォロブス属、サーモプラズマ属、チオバチルス属およびトレポネーマ属、ビブリオ属、エルシニア属、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、ヒストプラズマ種（ヒストプラズマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)など）、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、リケッチア・リケッチイ(Rickettsia ricketsii)、発疹熱リケッチア(Rickettsia typhi)、リーシュマニア属、肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)、クラミジア・シッタシ(Chlamydial psittaci)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydial trachomatis)、プラスモジウム種（熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)など）、ブルーストリパノソーマ(Trypanosoma brucei)、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)、トキソプラズマ・ゴンディ(Toxopl
asma gondii)、膣トリコモナス(Trichomonas vaginalis)およびマンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)を含む微生物により引き起こされる感染が挙げられる。
【０２０１】
一つの実施態様では、本発明は、癌を処置するために宿主において免疫応答を誘導または増強するための方法および組成物を提供する。提供される組成物および方法で処置可能な癌の種類としては、限定されるものではないが、以下のもの：膀胱癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、鼻咽頭癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌および血液性癌が挙げられる。
【０２０２】
本明細書では処置可能な悪性腫瘍は腫瘍が由来する組織の胚起源に応じて分類される。癌腫は、皮膚または内部器官および腺の上皮下層などの内肺葉または外胚葉組織に起源する腫瘍である。発生頻度は低い肉腫は、骨、脂肪および軟骨などの中胚葉結合組織に由来する。白血病およびリンパ腫は、骨髄の造血細胞の悪性腫瘍である。白血病は単細胞として増殖するが、リンパ腫は腫瘍塊として増殖する傾向がある。悪性腫瘍は身体の多くの器官または組織で増殖し、癌を形成し得る。
【０２０３】
本発明の処置計画の価値の証明として、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇのネズミ類似体（ヒトタンパク質と７２％の配列同一性を有するマウスＢ７−ＤＣ  ＥＣＤが、マウスＩｇＧ２ａのＦｃドメインと融合されている）が、本明細書に記載されるシクロホスファミド（ＣＴＸ）前処置を組み込んだ、結腸癌、肥満細胞腫および他の腫瘍種に関する同系マウス腫瘍モデルで試験された。  
【０２０４】
これらの結果は、免疫増強剤として働く治療用量に至らない単回のＣＴＸで処置した後にネズミＢ７−ＤＣ−ＩＧで処置すると、最大８０％の動物で定着したＣＴ２６結腸癌腫瘍を根絶することを示した。さらに、ＣＴ２６結腸癌腫瘍再負荷試験において、ＣＴＸ＋ネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇ処置の日に事前に腫瘍を根絶したマウスでは、腫瘍の再増殖は検出されなかった。これらのマウスはまた、ナイーブマウスよりも腫瘍特異的ＣＴＬ集団が増えていることも示された。
【０２０５】
一つの実施態様では、本発明は、化合物が増強剤とともに投与される併用療法によりＴ細胞応答を増強するための薬剤の製造における、本明細書の他所に記載されているような、Ｔ細胞において阻害的シグナル伝達を低減する化合物の使用を意図する。さらに、Ｔ細胞において阻害的シグナル伝達を低減する該化合物および増強剤は異なる時点に投与するための別個の薬剤として提供され、好ましくは、増強剤は阻害的シグナル伝達を低減する化合物の前に、例えば阻害化合物の２４時間（または本明細書に挙げられている時間間隔）前に投与される。好ましくは、該化合物および増強剤は、本明細書の他所に挙げられている、病原体により引き起こされる疾患または癌を含む、感染性疾患または癌の処置において用いるためのものである。
【０２０６】
好ましい実施形態では、これらの方法において有用な化合物は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと融合されているヒトＢ７−ＤＣのＥＣＤからなる組換えタンパク質（本明細書ではＢ７−ＤＣ−Ｉｇと呼ばれる）である。
【０２０７】
一つの実施態様では、本発明は、本明細書に開示されるＴ細胞において阻害的シグナル伝達を低減する化合物を増強剤と組み合わせて投与するための医療用キットに関し、該キットは、
（ａ）Ｔ細胞において阻害的シグナル伝達を低減する化合物の投与供給源、
（ｂ）増強剤供給源、
（ｃ）薬学上許容される担体の供給源、および
（ｄ）上記のような使用において化合物を投与するための説明書(printed instruction)
を含んでなる。
【０２０８】
Ｆ．併用療法
ワクチンは癌細胞および感染細胞または感染性病原体を排除するために強いＴ細胞応答を必要とする。本明細書に記載されているＰＤ−１受容体アンタゴニストは、Ｔ細胞に対して共刺激シグナルを与えるためにワクチンの成分として、増強剤とともに投与することができる。本明細書に開示されるワクチンは抗原、ＰＤ−１受容体アンタゴニスト、ならびに任意選択のアジュバントおよび標的化分子を含む。
【０２０９】
本発明の方法および組成物によりＴ細胞応答が増強される抗原としては、ペプチド、タンパク質、多糖類、糖類、脂質、核酸、またはその組合せが含まれる。疾患の場合、抗原は疾患工程によって存在する。
【０２１０】
開示されているＰＤ−１受容体アンタゴニスト組成物は、その後の感染性病原体曝露に対して被験体に耐性を付与する予防用ワクチンとともに投与してもよいし、あるいは癌を有する被験体における腫瘍抗原またはウイルスに感染した被験体におけるウイルス抗原などの既存の抗原に対して被験体の免疫応答を誘導または増強するために治療用ワクチンとともに投与してもよい。
【０２１１】
予防的、治療的または脱感作免疫応答の所望の転帰は、当該技術分野でよく知られている原理に基づき、疾患によって異なり得る。例えば、感染性病原体に対する免疫応答は感染性病原体の定着および複製を完全に防ぐことができ、「無菌免疫(sterile immunity)」および疾病症状の非存在に影響を及ぼす。しかしながら、感染性病原体に対するワクチンは、それが症状の数、重篤度または持続時間を軽減するか、症状を有する集団中の個体数を少なくするか、または感染性病原体の伝染を軽減すれば、有効であると見なせる。同様に、癌、アレルゲンまたは感染性病原体に対する免疫応答は疾患を完全に治療する場合、症状を緩和する場合、または疾患に対する全体的な治療的介入の一面である場合がある。例えば、癌に対する免疫応答の刺激は、処置に影響を与えるための外科術、化学療法薬、放射線、ホルモンおよび他の免疫学的アプローチと組み合わせることができる。
【０２１２】
本発明の方法および産物は、増強剤に加えてのアジュバントの使用を排除するものではない。このようなアジュバント例えばＰＤ−１アンタゴニストとともに投与することができる。本発明の組成物および方法において有用なアジュバントは、限定されるものではないが、以下の１以上：オイルエマルション（例えば、フロイントのアジュバント）、サポニン処方物、ウィロソーム(virosomes)およびウイルス様粒子、細菌および細菌誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ＡＤＰ−リボシル化毒素および解毒誘導体、ミョウバン、ＢＣＧ、無機物含有組成物（例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩などの無機塩）、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩など）、生体接着剤および／または粘膜接着剤、微粒子、リポソーム、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物、ムラミルペプチド、ポリホスファゼン、イミダゾキノロン化合物、および界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノール）であり得る。有用なアジュバントとしてまた、サイトカイン、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロンγ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子が挙げられる。
【０２１３】
本明細書では、開示されているＰＤ−１受容体アンタゴニスト（本明細書に開示されるポリペプチド、断片、変異体、同族体および融合タンパク質のいずれもを含む）がそれを必要とする被験体に１以上の付加的治療薬（増強剤に加えて）と組み合わせて投与されることを排除するものではない。付加的治療薬は処置される症状、障害または疾患に基づいて選択される。例えば、ＰＤ−１受容体アンタゴニストは、免疫応答を増強または誘発する働きし、本明細書において有効剤とみなされる１以上の付加的薬剤とともに投与することができる。
【０２１４】
このような薬剤としては、限定されるものではないが、アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン，カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンパスターゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、リポソームドキソルビシン、リポソームダウノルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチン、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、テモゾロマイド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンまたはその組合せが挙げられる。代表的なアポトーシス誘導薬としては、限定されるものではないが、フルダラビンタウロスポリン、シクロヘキシミド、アクチノマイシンＤ、ラクトシルセラミド、１５ｄ−ＰＧＪ（２）およびその組合せが挙げられる。
【０２１５】
本発明の方法および組成物により提供される治療はまた、放射線療法、外科術などの他の種類の治療と併用してもよい。
【０２１６】
Ｇ．アンタゴニスト活性のアッセイ
本発明は、本発明の方法を実施するのに有用ないくつかの具体的構造を挙げる。ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４およびこれらのいずれかのリガンドと結合し、かつまた、Ｔ細胞において阻害的シグナル伝達を低減する能力を有する化学構造を同定するための周知のアッセイ手順を参照して、アンタゴニスト活性を有し、本発明の方法において有用である他の化合物を特定することもできる。このようなアッセイのいくつかは、選択された化学構造が受容体に結合する否かを決定するのに有用な結合アッセイであり、これらは当該技術分野で周知であり、ここで詳細に述べる必要はないであろう（例えば、それぞれＴ細胞を用いたＰＤ−１シグナル伝達モジュレーターに関するアッセイを示す、米国特許第２００８／０２７４４９０号公報（２００８年１１月６日公開）および米国特許第７，１０５，３２８号公報（２００６年９月１２日発行）参照、これらの開示は引用することにより本明細書の開示の一部とされる）。有効断片などの本発明の薬剤の、増殖および／またはサイトカイン産生の増大によりＴ細胞を活性化する作用を決定するためには、他のアッセイが用いられる。このようなアッセイもまた当該技術分野で周知である。例えば、細胞増殖の増強は３Ｈ−チミジンの組み込みの増加（細胞の倍加に必要とされるＤＮＡ合成の増加による）または培養系においてＴ細胞によるサイトカイン産生の増大を検出するためのＥＬＩＳＡおよび／またはＲＩＡにより測定することができる。
【０２１７】
このような一試験において、ヒトＢ７−ＤＣ−ＩｇのＰＤ−１結合活性を、ＥＬＩＳＡにより評価した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、ＢｕｐＨ  Ｃａｒｂｏｎａｔｅ／Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｐＨ９．４バッファー(Pierce)で希釈した０．７５μｇ／ｍＬの組換えヒトＰＤ−１／Ｆｃ(R&D Systems)１００μＬで２時間コーティングした後、ＢＳＡ溶液(Jackson ImmunoResearch)を用いて９０〜１２０分間ブロックした。連続誘導体希釈したヒトＢ７−ＤＣ−Ｉｇ（野生型ならびにＰＤ−１との結合の低減に関して選択されたＤ１１１Ｓ突然変異タンパク質およびＫ１１３Ｓ突然変異体）ならびにヒトＩｇＧ１イソ型対照を９０分間結合させた。結合したＢ７−ＤＣ−Ｉｇは、１００μＬの０．５μｇ／ｍＬビオチン結合抗ヒトＢ７−ＤＣクローンＭＩＨ１８(eBioscience)、次いで１：１０００希釈ＨＲＰ−ストレプトアビジン(BD Bioscience)およびＴＭＢ基質(BioFX)を用いて検出した。プレートリーダー(Molecular Devices)を用いて４５０ｎｍの吸光度を読み取り、データを、ＳｏｆｔＭａｘで４パラメーターロジスティック適合を用いて解析した。
【０２１８】
ネズミＢ７−ＤＣ−ＩｇのＰＤ−１結合活性を、ＥＬＩＳＡにより評価した。９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートを、ＢｕｐＨ  Ｃａｒｂｏｎａｔｅ／Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｐＨ９．４バッファー(Pierce)で希釈した０．７５μｇ／ｍＬの組換えマウスＰＤ−１／Ｆｃ(R&D Systems)１００μＬを用いて２時間コーティングし、次いでＢＳＡ溶液(Candor-Bioscience)を用いて９０分間ブロックした。連続希釈したネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇ（野生型、ならびにＰＤ−１への低減された結合のために選択されたＤ１１１ＳおよびＫ１１３Ｓ変異株）、ならびにネズミＩｇＧ２ａイソ型対照を９０分間結合させた。結合したＢ７−ＤＣ−Ｉｇは、１００μＬの０．２５μｇ／ｍＬビオチン結合抗マウスＢ７−ＤＣクローン１１２(eBioscience)、次いで１：２０００希釈ＨＲＰ−ストレプトアビジン(BD Bioscience)およびＴＭＢ基質(BioFX)を用いて検出した。プレートリーダー(Molecular Devices)を用いて４５０ｎｍの吸光度を読み取り、データを、ＳｏｆｔＭａｘで４−パラメーターロジスティック適合を用いて解析した。これらのデータは、ヒトＢ７−ＤＣ−Ｉｇ（野生型）はＰＤ−１と結合するが、Ｋ１１３ＳおよびＤ１１１Ｓ突然変異体はＰＤ−１と結合しないことを示した。
【０２１９】
本発明の手順の実施するに当たって、当然のことながら、特定のバッファー、培地、試薬、細胞、培養条件などに対する言及は限定を意図するものではなく、当業者が記述されている特定の文脈において注目に値するまたは価値があると認識する、関連のあるあらゆる材料を含むように読まれるべきであると理解される。例えば、あるバッファー系または培養培地は多くの場合、別のものに置き換えてもなお同じ、同一でなくとも類似の結果を達成することができる。当業者ならば、過度な実験を行うことなく、本明細書に開示されている方法および手順の使用において、それらの目的を最適に果たすような置換を行うことができる系および方法論に関して十分な知識を持っているであろう。
【０２２０】
本発明を以下の限定されない実施例でさらに詳しく説明する。これらの方法および例は本発明を本明細書に記載されている実施形態に何ら限定されるものではなく、他の実施形態および使用もそれ自体疑いなく当業者に示唆を与えるものと理解すべきである。
【実施例】
【０２２１】
実施例１
Ｂ７−ＤＣ−ＩｇはＰＤ０１発現ＣＨＯ細胞と結合する
Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇを、最初にアロフィコシアニン（ＡＰＣ）と結合させ、次いでＰＤ−１を構成的に発現するＣＨＯ細胞系統またはＰＤ−１を発現しない親ＣＨＯ細胞とともに種々な濃度でインキュベートした。結合は、フローサイトメトリーにより分析した。図１は、プローブ濃度の関数としての、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ−ＡＰＣの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を示す。Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ−ＡＰＣはＣＨＯ．ＰＤ−１細胞（黒円）に結合するが、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞には結合しない（灰色三角）。
【０２２２】
実施例２
Ｂ７−ＤＣ−ＩｇはＰＤ−１との結合に関してＢ７−Ｈ１と競合する
Ｂ７−Ｈ１−Ｉｇを、最初にアロフィコシアニン（ＡＰＣ）と結合させた。Ｂ７−Ｈ１−Ｉｇ−ＡＰＣをプローブおよび細胞混合物に加える前に、種々の濃度の非標識Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇを、最初に、ＰＤ−１を構成的に発現するＣＨＯ細胞系統とインキュベートした。図２は、Ｂ７−Ｈ１−Ｆｃ−ＡＰＣの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）が、加えた非標識Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇコンペティターの濃度（ｘ軸）の関数として示されることを示す。非標識Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ濃度が増加するにつれて、ＣＨＯ細胞に結合するＢ７−Ｈ１−Ｉｇ−ＡＰＣ量は減少し、このことは、ＰＤ−１への結合に関してＢ７−ＤＣ−ＩｇがＢ７−Ｈ１と競合することを実証している。
【０２２３】
実施例３
ＣＴ２６腫瘍モデル
マウス結腸直腸腫瘍細胞系統、ＣＴ２６をＡＴＣＣから入手した。ＡＴＣＣのガイドラインに従って、４代継代でマスターセルバンクを作製した。細胞を試験し、マイコプラズマおよび他の病原体が混入していないことを確認した。腫瘍細胞の一つのバイアルが低温保存株から解凍されており、接種前に２代継代増殖していた。
【０２２４】
ＣＴ２６細胞は、３０ｍＬの完全培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕ、および１×Ｐ／Ｓ）を用いて１：５希釈して分割し２日間培養、または３０ｍＬの完全培地を用いて１：１０希釈し３日間培養した。
【０２２５】
培地を吸引してＣＴ２６細胞を採取し、フラスコを５ｍＬのＰＢＳですすぎ、５ｍＬのトリプシンを加えて３７℃にて２分間インキュベートし、次いで１０ｍＬの完全培地で中和した。６００×ｇ（〜１０００ｒｐｍ）で５分間遠心分離した後、培地を吸引して(sspirated)細胞ペレット１０ｍｌのプレーンＲＰＭＩを用いてピペット操作により再懸濁させた。この洗浄工程を３回繰り返した。
【０２２６】
接種された細胞の細胞数および生存力は、適切な希釈溶液（例えば、１：５希釈、１０μＬ細胞＋４０μＬトリパンプルー）を用いるトリパンプルー色素染色により分析し、最終洗浄工程の時にＮＯＶＡ細胞計数により確認した。
【０２２７】
細胞生存力は、一般に接種に対し９５％より大きかった。
ＣＴ２６細胞は、最初の接種のためにプレーンＲＰＭＩを用いて６．７×１０５細胞／ｍＬに希釈し、氷上で保存した。通常、各マウスには、１５０ｍＬ（１×１０５細胞）を接種した。
【０２２８】
９日目に、すべての担癌マウスを最初にラット用ケージにまとめ、それらのマウスを実験群に無作為に分けた。ＣＴＸ溶液を１×ＰＢＳにより再構成して４ｍｇ／ｍＬとした。マウス腹腔内に（ＩＰ）０．５ｍＬのＣＴＸ溶液を注射し、結果として２０グラムのマウスに対して２ｍｇ、すなわち１００ｍｇ／ｋｇとなった。
【０２２９】
１０日目に、マウスに０．５ｍＬのＢ７−ＤＣ−Ｉｇ（０．２ｍｇ／ｍＬ）を腹腔内注射し、結果として２０グラムのマウスに対して０．１ｍｇ、すなわち５ｍｇ／ｋｇとなった。同じ用量を１週間に２回、４週間にわたり合計８用量を投与した。腫瘍増殖は、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇを投与した日から開始し腫瘍を週に２回、デジタルキャリパーを用いて計測することによりモニターした。腫瘍容量は、以下に示すように計算した：
腫瘍容量＝π（Ｄｓｈｏｒｔ）２×（Ｄｌｏｎｇ）／６＝〜０．５２×（Ｄｓｈｏｒｔ）２×（Ｄｌｏｎｇ）
【０２３０】
腫瘍容量が２０００ｍｍ３であるか、または腫瘍接種部位に皮膚潰瘍および感染がある場合には、マウスを安楽死させ、試験から除外した。
【０２３１】
実施例４
シクロホスファミドおよびＢ７−ＤＣ−Ｉｇの組合せは定着腫瘍を根絶し得る
９〜１１週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスの皮下に、上記のように１．０×１０５のＣＴ２６結腸直腸腫瘍細胞を移植した。腫瘍移植後１０日目に、マウスに１００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドを投与した。Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ処置は１日後である１１日目に開始した。マウスを、１００μｇのＢ７−ＤＣ−Ｉｇを用いて、１週間に２用量、４週間にわたり合計８用量で処置した。ＣＴＸ＋Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ処置投与計画を受けたマウスの７５％において４４日までに定着腫瘍が根絶され、一方、対照ＣＴＸ単独群のマウスは全例が、腫瘍増殖の結果死亡したか、または腫瘍がＩＡＣＵＣにより承認されたサイズを超えたため安楽死させた（結果は図３に示す）。これらの結果は、定着腫瘍に対する処置投与計画が単なる予防ではなく有効であることを実証している。
【０２３２】
実施例５
シクロホスファミドおよびＢ７−ＤＣ−Ｉｇの組合せは定着腫瘍を根絶し、腫瘍再負荷から保護し得る
上記実験でＣＴ２６結腸直腸定着腫瘍を根絶したマウスに、４４日目および７０日目に１×１０５個のＣＴ２６細胞を再負荷した。再負荷により腫瘍が増殖しなかったことは、シクロホスファミドおよびＢ７−ＤＣ−Ｉｇの組合せ処置が、長期にわたる抗腫瘍免疫を発展させたことを示唆している。ビヒクル対照群のマウスは全例が腫瘍を発現した（結果は図４に示す）。これらの結果は、処置投与計画の定着腫瘍に対する有効性、ならびにシクロホスファミドおよびＢ７−ＤＣＩｇの組合せ処置が腫瘍抗原に対する記憶応答をもたらしたことを示している。
【０２３３】
実施例６
シクロホスファミドおよびＢ７−ＤＣ−Ｉｇの組合せは腫瘍特異的、記憶細胞傷害性Ｔリンパ球を生じさせ得る
上記実験でＣＴ２６結腸直腸定着腫瘍を根絶したマウスに、４４日目に２．５×１０５個のＣＴ２６細胞を再負荷した。７日後、マウスの脾臓を単離した。マウス脾細胞を、Ｇｏｌｇｉ遮断薬(BD BioScience)の存在下、５または５０μｇ／ｍＬのオボアルブミン（ＯＶＡ）またはＡＨ１ペプチドとともに６時間パルス処理し、ＣＤ８＋／ＩＦＮγ＋Ｔ細胞を評価することにより記憶Ｔエフェクター細胞を分析した。図５の結果は、ＣＴ２６腫瘍根絶マウスにおいて多量のＣＴ２６特異的Ｔエフェクター細胞が存在することを示している。
【０２３４】
実施例７
腫瘍根絶に対する用量依存的なＢ７−ＤＣ−Ｉｇの作用
９〜１１週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスの皮下に、上記のように１．０×１０５のＣＴ２６結腸直腸腫瘍細胞を移植した。腫瘍移植後９日目に、マウスに単回用量のシクロホスファミド（１００ｍｇ／ｋｇ）を投与し、１０日目に３０、１００または３００μｇのＢ７−ＤＣ−Ｉｇ（１週間に２回、４週間、計８回）の処置を開始した。図６は、３００μｇで腫瘍が根絶されたマウスは７０％、１００μｇでの腫瘍根絶は４０％、３０μｇ用量では腫瘍根絶は１０％であったことを示す。
【０２３５】
実施例８
シクロホスファミドおよび抗ＰＤ−１の組合せは定着腫瘍を根絶し得る
９〜１１週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスの皮下に１．０×１０５のＣＴ２６結腸直腸腫瘍細胞を移植した。腫瘍移植後１１日目に、マウスに単回用量のシクロホスファミド（１００ｍｇ／ｋｇ）を投与し、抗ＰＤ−１抗体（２５０μｇ、クローンＧ４、Hirano F. et al., 2005 Cancer Research）による処置を開始し、１週間に３回、４週間投与した。ＣＴＸ＋抗ＰＤ−１処置計画を受けたマウスの７０％で腫瘍負荷後５０日目に定着腫瘍が根絶され、一方、対照および抗ＰＤ−１単独群のマウスは全例が、腫瘍増殖の結果死亡したか、または腫瘍がＩＡＣＵＣにより承認されたサイズを超えたため安楽死させた。これらの結果は、定着腫瘍に対する処置計画が単なる予防ではなく有効であること示す。結果を図７に示す。
【０２３６】
実施例９
シクロホスファミドおよび抗ＣＴＬＡ４の組合せは定着腫瘍を根絶し得る
９〜１１週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスの皮下に１．０×１０５のＣＴ２６結腸直腸腫瘍細胞を移植した。腫瘍移植後１１日目に、マウスに１００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドを投与した。１日後の１２日目に抗ＣＴＬＡ４（ハムスターハイブリドーマ由来の抗マウスＣＴＬＡ４−ＡＴＣＣ寄託番号ＵＣ１０−４Ｆ１０−１１）処置を開始した。マウスを１００μｇの抗ＣＴＬＡ４で、１週間に２回、４週間処置した。ＣＴＸ＋抗ＣＴＬＡ４処置計画を受けたマウスの５６％では腫瘍負荷後５０日目に腫瘍が見られず、一方、対照群のマウスは全例が、腫瘍増殖の結果死亡したか、または腫瘍がＩＡＣＵＣにより承認されたサイズを超えたため安楽死させた。結果を図８に示す。これらの結果は、定着腫瘍に対する処置計画が単なる予防ではなく有効であること示す。
【０２３７】
実施例１０
シクロホスファミドおよびＢ７−ＤＣ−Ｉｇ投与計画の組合せは腫瘍微小環境においてＴｒｅｇの低減をもたらす
図９は、９〜１１週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスの皮下に１×１０５  ＣＴ２６細胞を移植した試験結果を示す。９日目にマウスに１００ｍｇ／ｋｇのＣＴＸを注射した（ＩＰ）。２４時間後の１０日目に、マウスを１００μｇのＢ７−ＤＣ−Ｉｇで処置した。５群があった：腫瘍細胞を負荷しなかったナイーブマウス、ビヒクル注射、ＣＴＸ単独、ＣＴＸ＋Ｂ７−ＤＣ−ＩｇまたはＢ７−ＤＣ−Ｉｇ単独。Ｔ細胞分析のため、１１日目（ＣＴＸ２日後）と１６日目（ＣＴＸ７日後）に２匹のナイーブマウスと他の群から４匹のマウスを試験から取り出した。左のパネルは、１１日目、ＣＴＸ注射２日後において、ＣＴＸ処置マウスの脾臓のＴｒｅｇが、腫瘍移植を行い、ビヒクルを注射したマウスの場合よりも有意に低かったことを示す。右のパネルは、１６日目、ＣＴＸ７日後およびＢ７−ＤＣ−Ｉｇ処置６日後において、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇが、高いＰＤ−１を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞を有意に低減したことを示す。これはＢ７−ＤＣ−Ｉｇ処置マウスとＣＴＸ＋Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ処置マウスの双方に見られた。腫瘍細胞を移植したマウスは、所属リンパ節(draining LN)中のＰＤ−１＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞がナイーブマウスに比べて多い傾向があった。
【０２３８】
実施例１１
シクロホスファミドおよびＢ７−ＤＣ−Ｉｇの組合せは転移性前立腺腫瘍モデルにおいてマウスの生存を促進できる
９〜１１週齢のＢ１０．Ｄ２マウスに、肺転移後の親ＴＲＡＭＰ細胞の注射から単離された３．０×１０５  ＳＰ−１細胞を静脈内注射した。このＣＴＸマウスに、５日目、１２日目、および１９日目に３用量のＣＴＸ、５０ｍｇ／ｋｇを投与した。Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ処置マウスには６日目、１３日目および２０日目に３用量のＢ７−ＤＣ−Ｉｇ、５ｍｇ／ｋｇを投与した。１００日目に、対照群、無処置、ＣＴＸ単独、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ単独ではマウスの１７％が生存したが、ＣＴＸとＢ７−ＤＣ−Ｉｇの組合せを投与したマウスの４３％が生存した。結果を図１０に示す。
【０２３９】
実施例１２
リステリア癌ワクチンおよびＢ７−ＤＣ−Ｉｇの組合せはＣＴ２６肝臓移植後のマウスの生存を高め得る
１１〜１３週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスに、半脾臓(hemispleen)注射法(Yoshimura K et al., 2007, Cancer Research)を用い、ＣＴ２６細胞を移植した。１０日目に、マウスに５０ｍｇ／ｋｇのＣＴＸを１回注射した（ＩＰ）。２４時間後の１１日目に、マウスを０．１  ＬＤ５０（１×１０７ＣＦＵ）の、ＣＴ２６の免疫優性エピトープである組換えリステリア菌担持ＡＨ１ペプチドで処置し、その後、１４日目と１７日目にも処置した。また、１１日目、その後１８日目にマウスをＢ７−ＤＣ−Ｉｇで処置した。図１１は、処置無しまたはＣＴＸおよびロステリア癌ワクチンで処置したマウスが４５日目までに総て死に至ったことを示す。３つの組合せ、ＣＴＸ＋リステリア癌ワクチンと、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇとを投与したマウスの６０％が生き残った。
【０２４０】
参照文献
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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