(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
接合体であって、
リンカーＬを介して式（１）：
【化２６】
0005837486.tif 000031
［式中、
−  破線は、存在するか又は存在しない結合を表し、
−  Ｘは、ホスファート基の類似体を表し、
−  Ｒは、Ｈ及びＯＨからなる群より選択され、
−  Ａは、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２からなる群より選択される］を有する化合物と接合している、糖タンパク質、ナノ粒子及び医用画像のための標識からなる群より選択される、対象Ｙの生成物であり、
そしてここで、
−  該式（１）を有する化合物は、Ａ部分を介してリンカーと結合しており、
−  該対象Ｙの生成物は、
【化３５】
0005837486.tif 000032
からなる群より選択される化学部分Ｔを介してリンカーＬに結合しており、該化学部分Ｔは、リンカーＬの部分であり、
−  該リンカーＬは、４〜１５個の連続した原子鎖によりＡ及びＹを分離しており、
該破線により表される結合が存在しない場合、Ｘは、下記：
式（Ｘ１）：
【化２７】
0005837486.tif 000033
を有する飽和ホスホナート基、
式（Ｘ２）：
【化２８】
0005837486.tif 000034
を有するビス−フルオロホスホナート基、
式（Ｘ３）：
【化２９】
0005837486.tif 000035
を有するフルオロホスホナート基、
式（Ｘ４）：
【化３０】
0005837486.tif 000036
を有する飽和カルボキシラート基、及び
式（Ｘ５）：
【化３１】
0005837486.tif 000037
を有するマロナート基からなる群より選択され、
−  該破線により表される結合が存在する場合、Ｘは、下記：
式（Ｘ６）：
【化３２】
0005837486.tif 000038
を有する不飽和ホスホナート基、及び
式（Ｘ７）：
【化３３】
0005837486.tif 000039
を有する不飽和カルボキシラート基からなる群より選択される、
接合体。
【請求項２】
前記接合体が、多くても１００μMの、カチオン非依存性マンノース６−リン酸受容体（ＣＩ−Ｍ６ＰＲ）に対するＩＣ５０を有する、請求項１記載の接合体。
【請求項３】
Ｙが、少なくとも１又はそれ以上の、式（１）を有する化合物とリンカーＬを介して接合している、請求項１又は２記載の接合体。
【請求項４】
前記接合体が、少なくとも２個の式（１）を有する化合物とリンカーＬを介して接合している、対象Ｙの生成物であり、前記少なくとも２個の化合物の２個のマンノース−６−リン酸の類似体が、同じＣＩ−Ｍ６ＰＲの２個のマンノース６−リン酸結合部位によるか、又はＣＩ−Ｍ６ＰＲダイマーの２個のマンノース６−リン酸結合部位により認識することができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の接合体。
【請求項５】
前記接合体が、多くても１００nMの、カチオン非依存性マンノース６−リン酸受容体に対するＩＣ５０を有する、請求項４に記載の接合体。
【請求項６】
前記リンカーＬの前記原子鎖が、置換されているか又は非置換の、直鎖状又は分枝鎖状のＣ１−Ｃ３０アルキル又はアルケニル鎖であり、ここで該鎖の１個以上の炭素原子は、エーテル（−Ｏ−）、アミン（−ＮＨ）、チオエーテル（−Ｓ−）、アミド（−ＣＯ−ＮＨ−）、ウレア（−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−）、カルバマート（−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−）及び環式又はヘテロ環式の系からなる群より選択される化学基で置き換えられているか又は置き換えられておらず、該環式又はヘテロ環式系は、飽和又は不飽和であり、そして置換又は非置換であり、ただし該鎖は、Ａ及びＹ部分を４〜１５個の連続した原子で分離している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の接合体。
【請求項７】
部分−Ａ−Ｌ−Ｙ−が、下記：
【化３４】
0005837486.tif 000040
［式中、
「−−−−−Ｙ」は、
−Ｔ−Ｙ（ここでＴは、リンカーの部分であり、下記：
【化３５】
0005837486.tif 000041
からなる群より選択される化学部分を表す）を表し、そして
「Ａ−」は、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２からなる群より選択される］を含む群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の接合体。
【請求項８】
Ｙが、リソソーム酵素である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の接合体。
【請求項９】
ヒト又は動物の体のリソソーム貯蔵障害の処置のための方法に使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の接合体。
【請求項１０】
式（Ｉ）：
【化３６】
0005837486.tif 000042
［式中、
−  破線は、存在するか又は存在しない結合を表し、
−  Ｘは、ホスホファート基の類似体を表し、
−  Ｒは、Ｈ及びＯＨからなる群より選択され、
−  Ａは、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２からなる群より選択され、
−  Ｌは、カルボニル基を有する対象Ｙの生成物と反応することができ、接合体を形成する、ヒドラジド及びＯ−アルキルヒドロキシルアミンから選択される末端のカルボニル反応性基Ｚを含むリンカーを表し、ここで、Ａ及びＹ部分は、４〜１５個の連続した原子により分離されており、
そしてここで、
−前記破線により表される結合が存在しない場合、Ｘは、下記：
式（Ｘ１）：
【化３７】
0005837486.tif 000043
を有する飽和ホスホナート基、
式（Ｘ２）：
【化３８】
0005837486.tif 000044
を有するビス−フルオロホスホナート基、
式（Ｘ３）：
【化３９】
0005837486.tif 000045
を有するフルオロホスホナート基、
式（Ｘ４）：
【化４０】
0005837486.tif 000046
を有する飽和カルボキシラート基、及び
式（Ｘ５）：
【化４１】
0005837486.tif 000047
を有するマロナート基からなる群より選択され、
−前記破線により表される結合が存在する場合、Ｘは、下記：
式（Ｘ６）：
【化４２】
0005837486.tif 000048
を有する不飽和ホスホナート基、及び
式（Ｘ７）：
【化４３】
0005837486.tif 000049
を有する不飽和カルボキシラート基からなる群より選択される］を有する化合物。
【請求項１１】
接合体を製造するための方法であって、該方法が、糖タンパク質、ナノ粒子及び医用画像のための標識からなる群より選択されるカルボニル基を有する対象Ｙの生成物と、式（Ｉ）：
【化４４】
0005837486.tif 000050
［式中、
−  破線は、存在するか又は存在しない結合を表し、
−  Ｘは、ホスファート基の類似体を表し、
−  Ｒは、Ｈ及びＯＨからなる群より選択され、
−  Ａは、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２からなる群より選択され、
−  Ｌは、対象Ｙの生成物のカルボニル基と反応することができ、接合体を形成する、ヒドラジド及びＯ−アルキルヒドロキシルアミンから選択される末端のカルボニル反応性基Ｚを含むリンカーを表し、ここで、Ａ及びＹ部分は、４〜１５個の連続した原子により分離されており、
そしてここで、
−  前記破線により表される結合が存在しないとき、Ｘは、下記：
式（Ｘ１）：
【化４５】
0005837486.tif 000051
を有する飽和ホスホナート基、
式（Ｘ２）：
【化４６】
0005837486.tif 000052
を有するビス−フルオロホスホナート基、
式（Ｘ３）：
【化４７】
0005837486.tif 000053
を有するフルオロホスホナート基、
式（Ｘ４）：
【化４８】
0005837486.tif 000054
を有する飽和カルボキシラート基、及び
式（Ｘ５）：
【化４９】
0005837486.tif 000055
を有するマロナート基からなる群より選択され、
−  前記破線により表される結合が存在するとき、Ｘは、下記：
式（Ｘ６）：
【化５０】
0005837486.tif 000056
を有する不飽和ホスホナート基、及び
式（Ｘ７）：
【化５１】
0005837486.tif 000057
を有する不飽和カルボキシラート基からなる群より選択される］を有する化合物とを反応させる工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、カチオン非依存性マンノース６−リン酸受容体を標的とする化合物に関する。
【０００２】
発明の背景
３００kDaの膜貫通糖タンパク質であるカチオン非依存性マンノース６−リン酸受容体（ＣＩ−Ｍ６ＰＲ）は、多くの生物学的過程において非常に重要な役割を果たす。ＣＩ−Ｍ６ＰＲの主要な役割は、構造中にマンノース６−リン酸（Ｍ６Ｐ）認識標識を含むリソソーム酵素を、トランスゴルジネットワークからリソソームまで輸送すること及び選別することである。ＣＩ−Ｍ６ＰＲはまた、細胞外Ｍ６Ｐ含有リガンドのエンドサイトーシスを媒介する。Ｍ６Ｐ含有タンパク質（リソソーム酵素と異なり、ＣＩ−Ｍ６ＰＲ輸送で内在化される）は、細胞毒性Ｔ細胞によって誘発されたアポトーシスに関係しているプロテアーゼであるグランザイムＢ；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）７；ならびにニューロン、血小板及び骨形成において重要な役割を果たす多機能性タンパク質である白血病抑制因子（ＬＩＦ）をも含む。レニンもまたＣＩ−Ｍ６ＰＲによって内在化され、そのクリアランスを可能にする。ＣＩ−Ｍ６ＰＲはまた、トランスフォーミング成長因子β（Ｌ−ＴＧＦβ）の不顕性前駆体、細胞成長を調整するホルモンのプレフォームのような細胞に深く入りこまない分子にも作用し、Ｌ−ＴＧＦβ活性化、セリンプロテアーゼによるプラスミノーゲン／プラスミン転換、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）に関与する他の過程に作用する。プロｕＰＡは、タンパク分解的に切断され、その結果ＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する親和性を示す特定のｕＰＡ受容体（ｕＰＡＲ）に細胞表面で結合したときに活性化される。更に、ＣＩ−Ｍ６ＰＲが、マイトジェンインスリン様成長因子II（ＩＧＦ２）の局所レベルを調整するにつれて腫瘍サプレッサーとして作用しうること、及びＣＩ−Ｍ６ＰＲ機能の喪失は肝癌の大部分の進行と関係していることを、研究は示唆している。ＣＩ−Ｍ６ＰＲは、ＩＧＦ２をリソソームコンパートメントで分解するためにそれと結合して取り込むため、この受容体はまた、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ２受容体とも呼ばれている。この受容体の他のリガンドはレチノイン酸であり、これはアポトーシス及び成長抑制に関与している。これら３種のリガンド（Ｍ６Ｐ、ＩＧＦ２、レチノイン酸）は、ＣＩ−Ｍ６ＰＲに位置する異なる細胞外結合部位によって認識され、これらは１５の繰り返し領域を含む。Ｍ６Ｐのマンノピラノシド環上のホスファート部分及びヒドロキシル基は、ＣＩ−Ｍ６ＰＲの領域３及び９にある２個の結合部位との水素結合ネットワークに寄与する。２個のＭ６Ｐ残基を認識するこの能力は、ＣＩ−Ｍ６ＰＲがリソソーム酵素と高い親和性（Ｋｄ＝２nM）で結合することを可能にする。
【０００３】
Ｍ６ＰとＣＩ−Ｍ６ＰＲ間のこの強い親和性の使用は、特にリソソーム酵素欠乏症の、酵素補充療法を開発するために提案されてきた。
【０００４】
しかしながら、必要な酵素の供給は制限され、そして、治療投与のための充分な量の酵素の大規模製造は困難である。加えて、組換え発現系から精製されるリソソーム酵素はしばしばかなりリン酸化されず、そしてＭ６Ｐリン酸化の程度は異なる酵素によって相当に変化する。Ｍ６Ｐリン酸化が不足しているリソソーム酵素は、標的細胞により受容体が媒介するエンドサイトーシスの取り込みを十分に競争せず、したがって酵素補充療法における有効性は限られている。
【０００５】
Zhu（米国特許第７，００１，９９４号）は、それらの生物活性を保持しながら、Ｍ６Ｐを含有する高度にリン酸化されたマンノピラノシルオリゴ糖を、リソソーム酵素のグリコシド部分に発生するカルボニル基に導入する方法を提案している。Ｍ６Ｐを含有するこれらのマンノピラノシルオリゴ糖は、典型的にはホスホペンタマンノースであり、そして化学的に処理されて、糖骨格のヒドロキシル基の代わりにカルボニル反応性基を含む。次に、このカルボニル反応性基は、酸化した糖タンパク質と反応して、Ｍ６Ｐ−糖タンパク質を形成する。米国特許第７，００１，９９４号の実験の項に示されているように、これらの化合物は、良好な酵素活性を保存する一方、ＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する親和性は低い。Zhuによれば、この低い親和性は、近接のアルデヒド基の立体障害に起因する。
【０００６】
したがって、これらの化合物は、満足な酵素補充療法に適しておらず、そして、ＣＩ−Ｍ６ＰＲに高親和性を有し（その結果、化合物のリソソームへの特定のアドレシングを可能にする）、かつ良好な生物活性を保全している新しい化合物の必要がある。
【０００７】
発明の概要
本発明は、高い親和性を有する、対象生成物及びカチオン非依存性マンノース６−リン酸受容体を標的としている化合物の接合体に関する。これらの対象生成物、例えば糖タンパク質及びナノ粒子はしたがって、特にリソソームを対象にする。本発明による接合体は、したがって、診断及び治療の分野の、及び特にヒト又は動物の体のリソソーム貯蔵障害を処置するための酵素補充療法の多数の適用を有する。
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明は、接合体に関し、該接合体は、リンカーＬを介して式（１）：
【化１】
0005837486.tif 000002
［式中、
−  破線は、存在するか又は存在しない結合を表し、
−  Ｘは、ホスファート基の類似体を表し、
−  Ｒは、Ｈ及びＯＨからなる群より選択され、
−  Ａは、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２からなる群より選択される］を有する化合物と接合している、糖タンパク質、ナノ粒子及び医用画像のための標識からなる群より選択される、対象Ｙの生成物であり、
そしてここで、
−  該式（１）を有する化合物は、Ａ部分を介してリンカーと結合しており、
−  該リンカーＬは、４〜１５個の連続した原子鎖によりＡ及びＹを分離しており、
−  該破線により表される結合が存在しない場合、Ｘは、下記：
式（Ｘ１）：
【化２】
0005837486.tif 000003
を有する飽和ホスホナート基、
式（Ｘ２）：
【化３】
0005837486.tif 000004
を有するビス−フルオロホスホナート基、
式（Ｘ３）：
【化４】
0005837486.tif 000005
を有するフルオロホスホナート基、
式（Ｘ４）：
【化５】
0005837486.tif 000006
を有する飽和カルボキシラート基、及び
式（Ｘ５）：
【化６】
0005837486.tif 000007
を有するマロナート基からなる群より選択され、
−  該破線により表される結合が存在する場合、Ｘは、下記：
式（Ｘ６）：
【化７】
0005837486.tif 000008
を有する不飽和ホスホナート基、及び
式（Ｘ７）：
【化８】
0005837486.tif 000009
を有する不飽和カルボキシラート基からなる群より選択される、接合体である。
【０００９】
本明細書で使用する「接合体」は、互いに共有結合的に結合した、２個の生成物／化合物を指す。
【００１０】
本明細書で使用する「接合する」は、２種の生成物／化合物が互いに結合することを意味する。
【００１１】
本明細書で使用する「Ｍ６Ｐ」は、マンノース６−リン酸を意味する。
【００１２】
本明細書で使用する「ＣＩ−Ｍ６ＰＲ」は、カチオン非依存性マンノース６−リン酸受容体を意味する。
【００１３】
本発明によれば、「連続した原子」の数は、リンカーの第一の原子からリンカーの最後の原子まで連続した原子のより短い鎖に従って算出されなければならない。実際に、リンカーが環式又はヘテロ環式系を含むとき、原子の数は、Ａ及びＹの間の、より短い鎖に従い算出されなければならない。
【００１４】
本発明による数え方の例は、以下の式：
【化９】
0005837486.tif 000010
で与えられる。この式に示されるように、このリンカーはＡ及びＹを６個の連続した原子で分離する。
【００１５】
特定の末端Ｍ６Ｐ類似体を含む本発明による接合体は、現在まで決して得られていない、高い親和性でＣＩ−Ｍ６ＰＲを特に標的とする。
【００１６】
加えて、それらの研究を通じて、本発明者らはまた、Ｍ６Ｐ類似体とリソソームに向けられるべき対象生成物の間に特定の長さを有するリンカーを導入することによって、ＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する末端Ｍ６Ｐ類似体を含有する生成物の親和性を増加させることができることを示した。理論に束縛されることなく、例えば、ＵＳ７，００１，９９４に開示されている生成物のような、現在知られているＭ６Ｐ含有生成物は、ＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する親和性は悪く、そしてしたがって、ＣＩ−Ｍ６ＰＲのＭ６Ｐ結合部位に近接した生成物自体により誘発される立体障害のため、アドレシング特性に劣る。本発明によるリンカーのため、ＣＩ−Ｍ６ＰＲのＭ６Ｐ結合部位周辺の立体障害は減少するか又は抹消され（本発明の図１を参照されたい）、したがって、従来技術における公知の生成物と比較して、本発明による接合体のＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する親和性の劇的な増加を説明する。
【００１７】
よって、本発明の接合体は、リソソーム疾患の酵素補充療法に対する非常に有望な候補となる。
【００１８】
上記したように、本発明による接合体は、ＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する高い親和性（ＩＣ５０）を有する。特に、本発明による接合体は、Jeanjean A. et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry, 14(2006) 3575-3582に記載されている受容体結合アッセイによって測定されたものとして、１００μMの最低限のＩＣ５０、すなわち多くても１００μMのＩＣ５０を有する。
【００１９】
本発明によれば、本発明による化合物に結合されるＭ６Ｐ類似体部分と生成物の間の充分な間隔を保障する任意のタイプのリンカーＬが適切である。本発明者らは、リンカーが４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個の連続した原子によって、Ａ及びＹを分離するときに、Ｍ６Ｐ類似体部分と生成物間の「充分な間隔」が得られることを明らかにした。リンカーのこの長さが、ＣＩ−Ｍ６ＰＲの結合ポケットへのＭ６Ｐ類似体の最適な浸透を可能にすることが明らかとなり、それによって、本発明による化合物のＣＩ−Ｍ６ＰＲとの最大の親和性を確実にした。
【００２０】
本発明によれば、リンカーの選択は、式（１）の化合物と接合される、対象生成物の性質に依存するであろう。実際、当業者は、リンカーの長さは結合される生成物と関連する立体障害によって増加することを容易に理解する。例えば、生成物がＣＩ−Ｍ６ＰＲのＭ６Ｐ結合部位の近傍で重大な立体障害を生じないタンパク質である場合、４個の連続した原子のリンカーはＣＩ−Ｍ６ＰＲとタンパク質に申し分のない親和性を確実にするのに十分である。対照的に、生成物がＣＩ−Ｍ６ＰＲのＭ６Ｐ結合部位の近傍で重大な立体障害を生じさせる、タンパク質、ナノ粒子又は任意の対象の生成物である場合、４個超の連続的な原子のリンカーが、ＣＩ−Ｍ６ＰＲと生成物の申し分のない親和性を確実にするのに必要である。
【００２１】
典型的には、本発明による化合物において、前記リンカーＬの前記原子鎖は、置換又は非置換の、直鎖状又は分枝鎖状のアルキル又はアルケニル鎖、特に置換されているか非置換の、直鎖状又は分枝鎖状のＣ１−Ｃ３０アルキル又はアルケニル鎖であり、ここで前記鎖の１個以上の炭素原子は、場合により、エーテル（−Ｏ−）、アミン（−ＮＨ）、チオエーテル（−Ｓ−）、アミド（−ＣＯ−ＮＨ−）、ウレア（−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−）、カルバマート（−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−）及び環式又はヘテロ環式系からなる群より選択される化学基により置き換えられており、前記環式又はヘテロ環式系は飽和又は不飽和であり、そして置換又は非置換であり、ただし前記鎖は、少なくとも４個の連続的な原子によってＡ及びＹ部分を分離している。
【００２２】
典型的には、本発明による前記Ｃ１−Ｃ３０アルキル又はアルケニル鎖は、Ｃ１−Ｃ２５アルキル又はアルケニル鎖、特にＣ１−Ｃ２０アルキル又はアルケニル鎖、更に特にはＣ１−Ｃ１５アルキル又はアルケニル鎖である。前記Ｃ１−Ｃ１５アルキル又はアルケニル鎖は、典型的には、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４又はＣ１５アルキル又はアルケニル鎖である。
【００２３】
特定の実施態様において、前記環式又はヘテロ環式系は、アゼチジン、オキセタン、チエタン、ピロール、ピラノース、フラノース、フラン、ピロリン、テトラヒドロフラン、チオフェン、テトラヒドロチオフェン、ピラゾール、イミダゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピラゾリン、イミダゾリン、ピラゾリジン、イミダゾリジン、ジオキソラン、チアゾール、イソチアゾール、チアゾリジン、イソオキサゾリジン、トリアゾール、オキサジアゾール、フラザン、チアジアゾール、テトラゾール、ピリジン、ナフチリジン、ピラン、ジヒドロピラン、ピペリジン、ピリダジン、ピリミジン、プリン、ピラジン、プテリジン、オキサジン、ジオキシン、ピペラジン、モルホリン、ジオキサン、チアジン、チオモルホリン、オキサチアン、ジチアン、トリアジン、トリオキサン、チアジアジン、ジチアジン、トリチアン、シクロブタン、シクロブテン、シクロペンタン、シクロペンテン、シクロヘキサン、シクロヘキセン、シクロヘプタン、シクロヘプテン及びベンゼンならびにその誘導体を含む群より選択される。
【００２４】
前述のように、前記アルキル又はアルケニル鎖及び前記環式又はヘテロ環式系は、例えばＣ１−Ｃ１０アルキル（すなわち、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９又はＣ１０アルキル）により、例えばメチル、エチル、プロピル又はイソプロピルにより、又は例えばアルコール、アミン、アミド、ケトン、エステル、エーテル又は酸官能基などのような官能基により、置換されていてもよい。
【００２５】
本発明による、置換されている環式系の特定の例は、シクロブタ−３−エン−１，２−ジオンである。
【００２６】
ベンゼンの誘導体の例は、インデン、インダン、インドリジン、インドール、ベンゾフラン、インドリン、ベンゾチオフェン、インダゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール、ナフタレン、テトラリン、キノリン、クロメン、クロマン、シンノリン、キナゾリン、キノキサリン及びフタラジンである。
【００２７】
特定の実施態様において、本発明によるリンカーＬは、下記：
【化１０】
0005837486.tif 000011
［式中、
「−−−−−Ｙ」は、
（ａ）−Ｙ、又は
（ｂ）−Ｔ−Ｙ（ここでＴは、リンカーの部分であり、下記：
【化１１】
0005837486.tif 000012
からなる群より選択される化学部分を表す）のいずれかを表し、そして
「Ａ−」は、式（１）で定義されたとおりの、本発明による化合物の残りを表す］からなる群より選択される化学構造を有する。
【００２８】
本発明の接合体において、Ｙは、式（１）を有する化合物の少なくとも１個と接合する。特定の実施態様において、本発明による接合体において、Ｙは、式（１）を有する化合物の１個以上と接合する。典型的には、前記対象Ｙの生成物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１００、１０００又はそれ以上の本発明による式（１）を有する化合物と、本発明によるリンカーＬを介して接合する。この数は、接合する生成物Ｙの特性に依存するであろう。例えば、この生成物Ｙがナノ粒子である場合、前記ナノ粒子は、式（１）を有する１０００超の化合物と、特に式（１）を有する２００，０００〜４００，０００の化合物と、本発明によるリンカーＬを介して接合しうる。
【００２９】
本発明によれば、Ｙが１個超の式（１）の化合物と接合するとき、各々の化合物は、同一であるか又は異なることができるリンカーＬを介してＹに結合する（換言すれば、例えばＹが式（１）を有する５個の化合物と接合する場合、各々の式（１）を有する化合物は、リンカーＬを介してＹに接合され、各々のリンカーＬは、同一であるか又は異なることができる）。
【００３０】
加えて、ＣＩ−Ｍ６ＰＲはＭ６Ｐに対する２個の結合部位を含むので、前記ＣＩ−Ｍ６ＰＲの両方の結合部位が同じ接合体の２個のＭ６Ｐ類似体によって占められる場合、本発明による接合体のＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する親和性は、５０〜１００倍のオーダーでより良好である。同様に、２個のＣＩ−Ｍ６ＰＲが二量体形であるとき、前記ＣＩ−Ｍ６ＰＲダイマーの４個の結合部位の少なくとも２個の結合部位が接合体のＭ６Ｐ類似体によって占められる場合、本発明による接合体のＣＩ−Ｍ６ＰＲダイマーに対する親和性はより良好である。
【００３１】
したがって、一つの実施態様において、本発明による接合体は、少なくとも２個の式（１）を有する化合物とリンカーＬを介して接合される対象Ｙの生成物であり、ここで、前記少なくとも２個の化合物の２個のＭ６Ｐ類似体は、同じＣＩ−Ｍ６ＰＲの２個のＭ６Ｐ結合部位によって、又はＣＩ−Ｍ６ＰＲダイマーの２個のＭ６Ｐ結合部位によって認識可能である。
【００３２】
更に他の実施態様において、本発明による接合体は、式（１）を有する少なくとも４個の化合物とリンカーＬを介して接合される対象Ｙの生成物であり、ここで、前記少なくとも４個の化合物の４個のＭ６Ｐ類似体は、ＣＩ−Ｍ６ＰＲダイマーの４個のＭ６Ｐ結合部位によって認識可能である。
【００３３】
当業者は、Ｙと接合してＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する高い親和性を有する化合物を得るために必要である、式（１）を有する化合物の数を算出することが可能である。当業者には容易に理解できるように、同じＣＩ−Ｍ６ＰＲの２個の結合部位又はＣＩ−Ｍ６ＰＲダイマーの２個の結合部位により、それらの認識を可能にする方法で空間的に配置される、２個のＭ６Ｐ類似体を有する確率は、化合物Ｙに結合する、式（１）を有する化合物の数に伴い増加する。Ｙと接合する式（１）を有する化合物の数が大きくなるにつれ、ＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する高い親和性を有する接合体を有する確率は高くなる。選択されたＹの構造に従い、当業者は、ＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する高い親和性に到達し、式（１）の化合物の間の近接近による立体障害を回避するための、式（１）の化合物の最適濃度を算出することが可能である。
【００３４】
それ故、本発明による接合体の親和性は概して、Ｙと接合する式（１）を有する化合物の数によって増加する。したがって、接合体の少なくとも２個の化合物の２個のＭ６Ｐ類似体が、同じＣＩ−Ｍ６ＰＲの２個のＭ６Ｐ結合部位で認識可能であるとき、又は接合体の少なくとも２個の化合物の２個のＭ６Ｐ類似体が、ＣＩ−Ｍ６ＰＲダイマーの２個のＭ６Ｐ結合部位で認識可能であるとき、又は接合体の少なくとも４個の化合物の４個のＭ６Ｐ類似体が、ＣＩ−Ｍ６ＰＲダイマーの４個のＭ６Ｐ結合部位で認識可能であるとき、本発明による接合体は、多くても１００nMの、特に多くても５０nMの、より特には多くても２５nMの、最も特には多くても２nMのＩＣ５０を有する。
【００３５】
もう一つの実施態様では、前記本発明の接合体において、前記式（１）の化合物は、式（１）：［式中、
−  破線で表される結合は、存在せず、そして
−  Ｘは、式：
【化１２】
0005837486.tif 000013
を有する飽和ホスホナート基であり、そして
−  Ａは、先に定義されたとおりである］を有する。
【００３６】
特定の実施態様において、本発明は、接合体に関し、ここで該接合体は、
−  リンカーＬを介して、式（１）：
【化１３】
0005837486.tif 000014
［式中、
−  破線は、存在するか又は存在しない結合を表し、
−  前記結合が存在しないとき、Ｘは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５からなる群より選択され、
−  前記結合が存在するとき、Ｘは、Ｘ６及びＸ７からなる群より選択され、
−  Ｒは、Ｈ及びＯＨからなる群より選択され、
−  Ａは、Ｏである］を有する化合物と接合している、糖タンパク質、ナノ粒子及び医用画像のための標識からなる群より選択される対象Ｙの生成物であり、
そしてここで、
−  該式（１）を有する化合物は、Ａ部分を介してリンカーと結合しており、そして
−  該リンカーＬは、４〜１５個の連続した原子鎖によりＡ及びＹを分離し、前記リンカーＬは、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６からなる群より選択される式を有するか又は含む、生成物である。
【００３７】
本発明の特定の実施態様において、本発明の接合体は、下記：
【化１４】
0005837486.tif 000015
0005837486.tif 000016
［式中、「−−−−−Ｙ」は、
（ａ）−Ｙ、又は
（ｂ）−Ｔ−Ｙ（ここでＴは、リンカーの部分であり、下記：
【化１５】
0005837486.tif 000017
からなる群より選択される化学部分を表す）のいずれかを表す］からなる群より選択される。
【００３８】
本発明による対象生成物は、糖タンパク質、ナノ粒子及び医用画像のための標識（例えば放射性同位元素、蛍光標識など）からなる群より選択される。
【００３９】
ナノ粒子は、異なる種類でありえる：ナノ粒子の例は、デンドリマーナノ粒子、ミセルナノ粒子、リポソームナノ粒子、メソポーラスシリカナノ粒子及び磁気ナノ粒子である。これらのナノ粒子は、例えばLiong M. et al., ACS Nano. 2: 889-96, 2008に記載されているように、例えばドラッグデリバリー（治療的又は細胞毒性薬）、癌治療、磁気共鳴、蛍光イメージング、磁気操作又は細胞ターゲティングのための、さまざまな適用を有する。
【００４０】
一つの実施態様において、前記対象Ｙの生成物は、糖タンパク質である。
【００４１】
したがって、一つの実施態様において、本発明は接合体に関し、前記接合体は、本発明によるリンカーＬを介して、本発明による式（１）を有する化合物と接合している糖タンパク質である。
【００４２】
典型的には、糖タンパク質は、リンカーＬを介して本発明による式（１）を有する化合物に接合し、該リンカーは、前記糖タンパク質のオリゴサッカライド鎖を式（１）を有する化合物に結合している。換言すれば、Ｍ６Ｐの類似体は、リンカーＬを介して糖タンパク質のオリゴサッカライド鎖と接合する。
【００４３】
したがって、特定の実施態様において、本発明は接合体に関し、ここで、前記接合体は、少なくとも２個の本発明による式（１）を有する化合物と、本発明によるリンカーＬを介して接合する糖タンパク質であり、前記化合物は、前記糖タンパク質の同じオリゴサッカライド鎖又は２個の異なるオリゴサッカライド鎖と結合しており、そして前記少なくとも２個の化合物の２個のＭ６Ｐ類似体は、同じＣＩ−Ｍ６ＰＲの２個のＭ６Ｐ結合部位によって、又はＣＩ−Ｍ６ＰＲダイマーの２個のＭ６Ｐ結合部位によって認識可能である。
【００４４】
更に他の実施態様において、本発明は接合体に関し、ここで、前記接合体は、少なくとも４個の本発明による式（１）を有する化合物と、本発明によるリンカーＬを介して接合する糖タンパク質であり、前記化合物は、前記糖タンパク質の同じオリゴサッカライド鎖又は２個の異なるオリゴサッカライド鎖と結合しており、そして前記少なくとも２個の化合物の４個のＭ６Ｐ類似体は、ＣＩ−Ｍ６ＰＲダイマーの４個のＭ６Ｐ結合部位で認識可能である。
【００４５】
本発明によれば、前記糖タンパク質が１個超の式（１）の化合物と接合するとき、各々の化合物は同一であるか又は異なることができるリンカーＬを介して、前記糖タンパク質に結合する。
【００４６】
典型的には、Ｙが糖タンパク質である本発明による接合体は、Jeanjean et al Bioorg Med Chem (2006) 14:3575-82に記載されている方法で測定される、最大で１００nMのＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する結合親和性（ＩＣ５０）を有する。特に、本発明による前記接合体は、最大で５０nMのＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する結合親和性（ＩＣ５０）を有する。より具体的には、本発明による前記接合体は、多くても２５nMのＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する結合親和性（ＩＣ５０）を有する。最も特には、本発明による前記接合体は、多くても２nMのＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する結合親和性（ＩＣ５０）を有する。
【００４７】
一つの実施態様において、前記糖タンパク質は、リソソーム酵素である。
【００４８】
特定の実施態様において、前記リソソーム酵素は、酸性β−ガラクトシダーゼ−１、酸性スフィンゴミエリナーゼ、α−Ｄ−マンノシダーゼ、α−フコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、α−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ、α−グルコシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、α−ノイラミニダーゼ、アリールスルファターゼＡ、アリールスルファターゼＢ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−マンノシダーゼ、カテプシンＤ、カテプシンＫ、セラミダーゼ、シスチノシン、ガラクトセレブロシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ＧＭ２ ガングリオシドアクチベーター、ヘパランスルファターゼ、ヘキソサミニダーゼＡ及びヘキソサミニダーゼＢ、ヒアルロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、ＬＡＭＰ２、リンクリン（Linclin）、リソソーム酸性リパーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ、Ｎ−アスパルチル−β−グルコサミニダーゼ、パルミトイル−プロテインチオエステラーゼ−１、保護タンパク質／カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、シアリン、ＴＰＰ１酵素からなる群より選択される。
【００４９】
典型的には、本発明による化合物に結合する糖タンパク質は、組み替え発現システムを用いた遺伝子工学によって製造される。典型的には、前記糖タンパク質は、適切に翻訳後修飾（折りたたみ、ジスルフィド結合形成、オリゴマー形成、グリコシル化、アシル化、タンパク質分解切断）され、生物学的に活性かつ機能的な組み換え型タンパク質の、高水準（最高１０００mg/L）での生産を可能にする、発現系を用いて製造される。本発明による典型的な発現システムは、バキュロウイルス発現ベクターシステムである。バキュロウイルス発現ベクターシステムは、標的遺伝子を含む導入ベクターでの相同組み換えを介しての、ウイルス複製に非本質的なゲノム領域への外部遺伝子の導入に基づく。得られる組み換えバキュロウイルスは、異種タンパク質をコード化している外部遺伝子と置き換えられる非本質的な遺伝子（例えばpolh、v-cath、chiAなど）の１つを欠いている。前記タンパク質、典型的には糖タンパク質は、培養昆虫細胞及び昆虫の幼虫において発現することができる。典型的には、糖タンパク質の発現は昆虫細胞において実施され、それはタンパク質の満足なグリコシル化に至る。より具体的には、発現は細胞株Ｓｆ９（Spodoptera frugiperda）の細胞において実施され、それはタンパク質の満足なグリコシル化を可能にし、前記グリコシル化は、ヒトの免疫原であるα−１，３−フコース残基を含まない。
【００５０】
本発明の他の目的は、ヒト又は動物の体に行われる診断法に使用するための、本発明による接合体に関する。実際、本発明による接合体はＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する高い親和性を有するので、それらはＣＩ−Ｍ６ＰＲ発現の増加又は減少と関連した疾患又は病状の診断に役立つことができる。
【００５１】
本発明の別の目的は、ヒト又は動物の体の処置の方法に使用するための、本発明による接合体に関する。実際、本発明による接合体は、医学の分野において多数の適用を有する。
【００５２】
例えば、一部の前立腺癌において、ＣＩ−Ｍ６ＰＲが過剰発現し、そして抗ＣＩ−Ｍ６ＰＲ自己抗体が血液循環に放出されることが示された（Huang YY, et al. Clinical Immunology 2004;111 (2):202-9）：例えば蛍光標識又は放射性標識を含む本発明による接合体を用いることにより、ＣＩ−Ｍ６ＰＲが過剰発現している体の領域を識別して、その結果非常に正確に、処置を必要とする領域においてだけ患者を照射することができる。
【００５３】
本発明による接合体で処置することができる疾患の他の例は、リソソーム中の生成物Ｙの欠乏によって生じる疾患である。この欠乏症は本発明による接合体の投与によって補うことができ、それは特に不十分な生成物Ｙをリソソームに供給することができる。
【００５４】
本発明はまた特に、ヒト又は動物の体のリソソーム貯蔵障害の処置のための方法に用いるための、本発明による接合体にも関する。実際、Ｙがリソソーム酵素であるとき、本発明による接合体は、前記リソソーム酵素Ｙが失われているか欠乏しているリソソーム貯蔵障害の処置のための方法に用いることができる。
【００５５】
本発明はまた、リソソーム貯蔵障害を患っている患者を処置する方法に関し、前記方法は、Ｙが前記リソソーム貯蔵障害において失われているか欠乏しているリソソーム酵素である、治療有効量の本発明による接合体を前記患者に投与する工程を含む。
【００５６】
本明細書において、「失われている」とは、前記リソソーム疾患を患っている患者によって、前記リソソーム酵素が生産されないことを意味する。
【００５７】
本明細書において、「欠乏している」とは、前記リソソーム疾患を患っている前記患者によって、前記リソソーム酵素が充分でない量か又は不活性型で生産されることを意味する。
【００５８】
治療されるリソソーム貯蔵障害ごとに、当業者は前記疾患の処置のために投与される適切なリソソーム酵素を選択することが可能である。実際、リソソーム貯蔵障害の分子基盤は周知であり、例えばWinchester Bらにより、Biochem Soc Trans. 2000 Feb;28(2):150-4に開示されている。
【００５９】
本発明により処置されるリソソーム貯蔵障害の例は、非限定的に、アクチベータ欠乏症／ＧＭ２ ガングリオシドーシス、α−マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステリルエステル貯蔵障害、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠乏症、シスチン貯蔵障害、ダノン病、ファブリ病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病（Ｉ型、II型及びIII型）、ＧＭ１ ガングリオシドーシス（小児性、遅発型小児性／若年性、成人型／慢性）、Ｉ−細胞病／ムコリピドーシスII、小児性遊離シアル酸貯蔵障害／ＩＳＳＤ、若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠乏症、クラッベ病（小児期発症、遅発性発症）、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症障害（擬ハーラー多発性ジストロフィー／ムコリピドーシスIIIＡ、ＭＰＳ Ｉハーラー症候群、ＭＰＳ Ｉシャイエ症候群、ＭＰＳ Ｉハーラー−シャイエ症候群、ＭＰＳ IIハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ型／ＭＰＳ IIIＡ、サンフィリポ症候群Ｂ型／ＭＰＳ IIIＢ、サンフィリポ症候群Ｃ型／ＭＰＳ IIIＣ、サンフィリポ症候群Ｄ型／ＭＰＳ IIIＤ、モルキオＡ型／ＭＰＳ IVＡ、モルキオＢ型／ＭＰＳ IVＢ、ＭＰＳ IXヒアルロニダーゼ欠乏症、ＭＰＳ VIマロトー−ラミー、ＭＰＳ VIIスライ症候群、ムコリピドーシスＩ／シアリドーシス、ムコリピドーシスIIIＣ、ムコリピドーシスIV型）、多種スルファターゼ欠損症、ニーマン−ピック病（Ａ、Ｂ、Ｃ型）、神経セロイドリポフスチノーシス（ＣＬＮ６病−非定型遅発型小児性、遅発性発症異形、早期若年性−、バッテン−シュピーレマイヤー−フォクト／若年性ＮＣＬ／ＣＬＮ３病、フィンランド型遅発型小児性ＣＬＮ５、ヤンスキー−ビールショースキー病／遅発型若年性ＣＬＮ２／ＴＰＰ１病、クッフス／成人発症ＮＣＬ／ＣＬＮ４病、ノーザンエピレプシー／遅発型小児性型ＣＬＮ８、サンタヴォリ−ハルティア／小児性ＣＬＮ１／ＰＰＴ病、β−マンノシドーシス）、ポンペ病／グリコーゲン貯蔵症II型、濃縮性骨異形成症（Pycnodysostosis）、サンドホフ病／成人発症／ＧＭ２ ガングリオシドーシス、サンドホフ病／ＧＭ２ ガングリオシドーシス−小児性、サンドホフ病／ＧＭ２ ガングリオシドーシス−若年性、シンドラー病、サラ病／シアル酸貯蔵障害、テイ−サックス／ＧＭ２ ガングリオシドーシス及びウォルマン病である。
【００６０】
本発明の文脈において、本明細書で用いられる用語「処置すること」又は「処置」は、そのような用語があてはまる障害又は状態の進行を逆転させ、軽減させ、抑制するか、又は予防することを意味する。
【００６１】
本明細書で用いられる、「対象」又は「患者」は、本明細書において参照された生成物の投与から利益を得ることができる、ヒト又は動物を表す。
【００６２】
上記したとおりの生成物の「治療上有効量」は、任意の医療に適用できる妥当な便益／危険率で、疾患を処置するために十分な量を意味する。
【００６３】
本発明の他の態様は、式（Ｉ）：
【化１６】
0005837486.tif 000018
［式中、
−  破線は、存在するか又は存在しない結合を表し、
−  Ｘは、ホスファート基の類似体を表し、
−  Ｒは、Ｈ及びＯＨからなる群より選択され、
−  Ａは、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２からなる群より選択され、
−  Ｌは、対象Ｙの生成物と反応することができ、接合体を形成する末端の化学反応性基Ｚを含むリンカーを表し、ここで、Ａ及びＹ部分は、４〜１５個の連続した原子により分離されており、
そしてここで、
−  前記破線により表される結合が存在しない場合、Ｘは、下記：
式（Ｘ１）：
【化１７】
0005837486.tif 000019
を有する飽和ホスホナート基、
式（Ｘ２）：
【化１８】
0005837486.tif 000020
を有するビス−フルオロホスホナート基、
式（Ｘ３）：
【化１９】
0005837486.tif 000021
を有するフルオロホスホナート基、
式（Ｘ４）：
【化２０】
0005837486.tif 000022
を有する飽和カルボキシラート基、及び
式（Ｘ５）：
【化２１】
0005837486.tif 000023
を有するマロナート基からなる群より選択され、
−  前記破線により表される結合が存在する場合、Ｘは、下記：
式（Ｘ６）：
【化２２】
0005837486.tif 000024
を有する不飽和ホスホナート基、及び
式（Ｘ７）：
【化２３】
0005837486.tif 000025
を有する不飽和カルボキシラート酸基からなる群より選択される］を有する化合物に関する。
【００６４】
式（１）として先に開示された全ての特定の実施態様は式（Ｉ）に準用され、従って、本明細書において繰り返されない。
【００６５】
特に、前記リンカーＬは、式（１）にて先に定義されたとおりであり、そして更に末端の化学反応基Ｚを含む。
【００６６】
典型的には、前記化学反応性基Ｚは、Ｙ上に自然に存在するか又は人為的に導入された少なくとも一つの官能基に、直接又は活性化後に共有結合により結合することができる、任意の官能基からなる群より選択される。本発明の目的に適した反応性官能基の非限定的な例として、特に、カルボン酸及びその塩、スルホン酸及びその塩、酸無水物、酸クロリド、エステル（アルキルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステルなど）、アジド（アシルアジド、アジドニトロフェニルなど）、ヒドラジド、３−アシル−１，３−チアゾリジン−２−チオン、アミン、置換アミン、Ｏ−アルキルヒドロキシルアミン、第四級アンモニウム、イソシアナート、イソチオシアナート、ヒドラジン、フタルイミド、マレイミド、ハロアセトアミド、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、モノ−又はジハロゲン化ピリジン、モノ−又はジハロゲン化ジアジン、アジリジン、チオール、スルホニルクロリド、ビニルスルホン、ジスルフィド、メタンチオスルホナート、ヒドロキシル、ホスホラミダイト、エポキシ、アルデヒド、カルボナート、グリオキサル、イミダゾリル官能基を挙げることができる。
【００６７】
特定の実施態様において、前記化学反応性基Ｚは、カルボニル反応性基である。より具体的には、前記カルボニル反応性基は、ヒドラジド及びＯ−アルキルヒドロキシルアミンからなる群より選択される。前記ヒドラジド又はＯ−アルキルヒドロキシルアミン基とＹのカルボニル基との反応は、それぞれアシルヒドラゾン又はオキシム結合を形成する。この種の化学基は、糖タンパク質を結合することに典型的に有用である：糖タンパク質のオリゴサッカライド部分で利用可能なカルボニル基（自然に存在するか又は糖タンパク質のグリコシル鎖のヒドロキシ基の酸化により誘導されるかのいずれか）は、本発明による化合物のカルボニル反応性基と反応する。
【００６８】
本発明の特定の実施態様において、本発明による式（Ｉ）の化合物は、下記：
【化２４】
0005837486.tif 000026
0005837486.tif 000027
からなる群より選択される。
【００６９】
本発明の他の目的は、本発明による接合体を製造する方法に関し、前記方法は、糖タンパク質、ナノ粒子及び医用画像のための標識からなる群より選択される対象Ｙの生成物を式（Ｉ）：
【化２５】
0005837486.tif 000028
［ここで、式（Ｉ）を有する前記化合物は先に定義されたとおりである］を有する化合物と反応させる工程を含む。
【００７０】
一旦Ｙ及び式（Ｉ）を有する化合物が一緒に反応すると、本発明による接合体が形成され、ここで前記接合体は、本発明によるリンカーＬを介して式（Ｉ）の前記化合物と接合した対象Ｙの生成物であり、前記リンカーＬは、Ｙと反応した化学反応性基の残りを含む。この化学反応性基Ｚの残りは、典型的には本発明によるＴ部分である。
【００７１】
特定の実施態様において、本発明による接合体を製造するための前記方法は更に、前記反応させる工程の前に、Ｙの化学官能基を活性化させる工程を含み、前記活性化の工程は、リンカーＬの化学反応性基ＺがＹの化学反応性基と反応できるようにする。例えば、糖タンパク質の化学官能基の活性化は、グリコシル鎖のヒドロキシ官能基を酸化してカルボニル基を得ること（例えば、糖タンパク質をＮａＩＯ４で処理することによる）からなってもよい。
【００７２】
本発明は更に、本発明による接合体を製造する方法によって得ることができる接合体、及び先に記載されたとおりのそれらの応用に関する。
【００７３】
本発明の、及び分子の表現を単純化するための説明の全体にわたって、Ｍ６Ｐ及びＭ６Ｐ類似体のリン酸基の類似体は、それらの水素添加した形において表される。しかしながら、本発明はこれらの分子の塩にも関する。
【００７４】
本発明の更なる態様及び利点は、以下の図及び実施例において開示され、それは例示であり本出願の範囲を制限しないと考えられるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】Ｍ６Ｐ類似体の分子構造。
【図２】ＣＩ−Ｍ６ＰＲリガンド結合ポケットにドッキングしたＭ６Ｐの潜在的な水素結合。
【図３】ヒト血清中におけるＭ６Ｐ及びホスホナート１の低下の動力学。
【図４】ヒトの正常な細胞株中における、Ｍ６Ｐ及びホスホナート１の特異的な結合。
【図５】ヒトの正常な線維芽細胞ＩＭＲ−９０細胞株（Ａ）及び２種の乳癌細胞株（Ｂ）における、Ｍ６Ｐ及びホスホナート１の非細胞毒性。
【図６】ＣＩ−Ｍ６ＰＲ結合ポケットにドッキングした、リンカーを伴うか又は伴わないマロナート３の分子モデリング。
【図７】スペーサーアームのグラフト後のカルボキシラート４の結合親和性の向上。
【図８】ホスホナート１にグラフトしたスペーサーアームの例（ＡＭＦＡ−１、ＡＭＦＡ−２）。
【図９】ＡＭＦＡ−１の合成。
【図１０】ＡＭＦＡ−２の合成。
【図１１】ＡＭＦＡ−３の合成。
【図１２】ＡＭＦＡ−５の合成。
【図１３】Ｍ６Ｐ−ヘキサンヒドラジドの合成。
【図１４】ＡＭＦＡ−１の薬理特性の解析。（Ａ）ＩＣ５０；（Ｂ）ヒト血清中でのＣＩ−Ｍ６ＰＲの結合親和性及び安定性、（Ｃ）ヒト線維芽細胞中での毒性。
【図１５】Ｍ６Ｐ及びＭ６Ｐ−ヘキサンヒドラジドと比較した、ＡＭＦＡ−１、ＡＭＦＡ−２、ＡＭＦＡ−３及びＡＭＦＡ−５の薬理特性の解析：２０℃（Ａ）及びヒト血清（Ｂ）でのＣＩ−Ｍ６ＰＲの結合親和性。
【図１６】ヒト組み換え酵素のオリゴマンノシド鎖上にグラフトしたＡＭＦＡ−１の効果。（Ａ）結合親和性；（Ｂ）触媒活性。
【図１７】シャイエ及びハーラー線維芽細胞中における、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）精製（Ａ）、ネオＩＤＵＡの免疫組織化学的取り込み検出（Ｂ〜Ｅ）及び細胞内ネオＩＤＵＡのＳＤＳポリアクリルアミドゲル検出（Ｆ）。
【図１８】異なる投与量のネオＩＤＵＡで処置したハーラー線維芽細胞の生存度。
【００７６】
実施例
１．１．  極めて強力なＭ６Ｐ類似体の合成及び特性評価
極めて強力なＭ６Ｐ類似体（Ｍ６Ｐａ）の合成及び特性評価は、ホスファート基をホスホナート、マロナート又はカルボキシラート基により置き換えることにより実現した［Vidal S et al., Bioorg Med Chem. 10, 4051, 2002；Jeanjean A et al., Bioorg Med Chem. 14, 2575, 2006；Jeanjean A et al., Bioorg Med Chem Lett. 18, 6240, 2008］。
【００７７】
１．２．  Ｍ６Ｐ類似体のＣＩ−Ｍ６ＰＲへの結合アッセイ
Ｍ６Ｐａの結合アッセイは、ビオチン化ＣＩ−Ｍ６ＰＲを用いて実施した。端的に言うと、ホスホマンナン−セファロースアフィニティカラムで精製したＣＩ−Ｍ６ＰＲを、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンによりビオチン化した。ビオチン化ＣＩ−Ｍ６ＰＲ（ＣＩ−Ｍ６ＰＲｂ）の、先にマイクロタイタープレートに吸着したペンタマンノース６−リン酸（ＰＭＰ）への結合は、Ｍ６Ｐａの濃度の増加により置き換えた。結合したＣＩ−Ｍ６ＰＲｂは、次にストレプトアビジン／ペルオキシダーゼ対及びＯＰＤ基質を用いて、光学密度測定により測定した。対照実験において、該方法は、マイクロタイタープレートに吸着されるＰＭＰの最大濃度及び吸着ＰＭＰを飽和させることを必要とするＣＩ−Ｍ６ＰＲｂ濃度を決定することによって標準化された［Jeanjean A et al., Bioorg Med Chem 14: 3575-82, 2006］。
【００７８】
図１は、Ｍ６Ｐの２種の等電子性類似体であるホスホナート１及びマロナート３が、天然のＭ６Ｐのそれより高いＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する結合親和性を有することを示している。対照的に、ホスホナート２のような非等電子性類似体は、ＣＩ−Ｍ６ＰＲによっては認識されない。一方、カルボキシラート４は、マロナート３より低い、ＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する結合親和性を示した。これらの結果は、ホスホナート１及びマロナート３がＣＩ−Ｍ６ＰＲを発現する標的細胞に対して高いポテンシャルを示すことを明らかにしている。
【００７９】
１．３．  ＣＩ−Ｍ６ＰＲ結合ポケットにドッキングしたＭ６Ｐ類似体のモデリング
対応する天然のリガンドとのＣＩ−Ｍ６ＰＲの複合体の結晶構造は、結晶学データファイル（タンパク質構造データバンク、http://www.rcsb.org/、ＩＤコード１ＳＺ０）から得た。本発明者らは、リガンド設計モジュールソフトウェアを用いて、重Ｍ６Ｐ構造（ヘテロ原子Ｍ６Ｐ５００）に基づいてＭ６Ｐ類似体を構築した。リガンドのドッキングは、まず初めにＭ６Ｐアゴニスト構造上へのＭ６Ｐ類似体構造の重ね合わせで行われた。複合体を平衡化するために、リガンド−受容体複合体は次に、３００°Ｋで２０００工程の複合勾配を用いたエネルギー極小化に付され、そして、最大の誘導体が０．０７kcal/Åより小さくなるまで、調和ポテンシャルを結合エネルギーに対して用いた。ディスカバーモジュールを使用している分子動的シミュレーションを次に実施した。本発明者らは、２５Åのカット−オフ距離を用いて、一定の力場及び複合勾配アルゴリズムを適用した。範囲の制約は、受容体骨格に適用された［Jeanjean A. et al. Curr Med Chem. 14: 2945-53, 2007］。
【００８０】
図２は、天然のＭ６Ｐが１１個の潜在的水素結合及び６つのみの異なる固定位置を示すのに対して、ホスホナート１類似体はリガンド結合領域に主要残基を有する１２個の潜在的水素結合を呈し、そして８つの異なる位置でＣＩ−Ｍ６ＰＲに固定されることを示している。加えて、ホスファート部分の代わりに２個のカルボキシラート部分によって特徴づけられるマロナート３は、１３個の潜在的水素結合を形成して、８つの固定位置を有する（データは示されていない）。
【００８１】
対照的に、Ｍ６Ｐ対照より低い結合親和性を示すカルボキシラート４について、残基Ｙ３２４及びマンノースの直接的な相互作用は失われていた。先の研究［Hancock, M. K. et al, J Biol Chem, 277, 11255-64, 2002］もまた、単一アミノ酸置換がリガンド安定性に関係していることを示した。
【００８２】
１．４．  極めて強力なＭ６Ｐ類似体の生物学的特性
極めて強力な類似体、ホスホナート１の薬理学的性質をＭ６Ｐと比較した。
−  第一に、本発明者らは、７５％（v/v）のヒト血清中でのホスホナート１の安定性を分析した。結果は、ホスホナート１が血清において天然のＭ６Ｐより１０倍安定であることを示している（図３）。
−  第二に、ＣＩ−Ｍ６ＰＲを介してエンドサイトーシスに影響するホスホナート１を、天然のＭ６Ｐのそれと比較した。先の結果は、複合カテプシンＤ／抗カテプシンＤ抗体が通常のヒト線維芽細胞のＣＩ−Ｍ６ＰＲによって特に内在化されたことを示した［Laurent-Matha V et al., J Cell Sci. 111: 2539-49, 1998］。複合体は、ここで免疫蛍光染色によって検出された。
図４Ａは、対照細胞の８０％がカテプシンＤ／抗カテプシンＤ抗体複合体を内在化した一方、１０mMのＭ６Ｐ又はホスホナート１とプレインキュベートした細胞はそれぞれわずか３０％及び１０％を内在化したことを示す。この結果は、ホスホナート１がＭ６Ｐのそれより高い結合親和性を有することを示している。図４Ｂは、細胞の染色強度がＭ６Ｐの存在下よりホスホナート１の存在下の方が低いことを示している。これら全ての結果は、ターゲティングＣＩ−Ｍ６ＰＲにおけるホスホナート１の高いポテンシャルを示す。
−  第三に、本発明者らは、インビトロでのホスホナート１の細胞毒性を研究した。正常の又は癌細胞株を、ホスホナート１の用量の増加と共に、４日間処理した。棒グラフは、ヒトの正常な線維芽細胞の細胞株（図５Ａ）のみでなく、ＭＣＦ７又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１のような乳癌細胞株（図５Ｂ）上でも、高い濃度（０．１mM）でさえ、この化合物が全く細胞毒性を誘発しなかったことを示す。
【００８３】
１．５．  リンカー（ヘキサンヒドラジド）との結合前（図６Ａ）及び結合後（図６Ｂ）の、ＣＩ−Ｍ６ＰＲの結合ポケットにおけるＭ６Ｐのマロナート３類似体の分子モデリング
Ｍ６Ｐ類似体への巨大分子上のグラフトを原因とする、ＣＩ−Ｍ６ＰＲの結合ポケットの近傍の立体障害を排除するか又は減らすために、分離リンカーの付加が提案された。図６は、ヘキサノイルヒドラジドリンカーが、ＣＩ−Ｍ６ＰＲのＭ６Ｐに対する結合部位及びヒドラジド基に結合しなければならない生成物の間に、充分な間隔を可能にすることを示している。分子モデリングの研究は、６〜７Åのスペーサーが、Ｍ６Ｐ類似体とグラフトされる巨大分子間のＣＩ−Ｍ６ＰＲの結合ポケットにおいて必要であることを示している。スペーサーアームは、Ｙ３２４、Ｅ３２３、Ｋ３５０、Ｑ３５６のようなリガンド結合ポケットのいくつかの残基と水素結合を形成することができる窒素又は酸素原子によって、異なる位置で置換することができる。このリンカーは、置換フェニル又はトリアゾールのような脂肪族の鎖又は環でありえる。したがって、この方法によって、Ｍ６Ｐ類似体のＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する結合親和性は、リソソーム酵素のような巨大分子のグラフトによっては変化しない。
【００８４】
１．６．  リンカーの合成及び特性解析
図７は、ＣＩ−Ｍ６ＰＲに対するカルボキシラート４（Ａ）の結合親和性において、ＯＰｈＮＨ２のアグリコン位置のグラフト後１．７倍（Ｂ）への、及びクロランブシルの付加的なグラフト後２倍（Ｃ）への向上を示している。
【００８５】
図８は、異なるリンカー、ヘキサンヒドラジド（ＡＭＦＡ−１）、トリアゾール（ＡＭＦＡ−２）及びアミノキシ（ＡＭＦＡ−３）に結合したホスホナート１の構造を記載している。これらの化合物（ＡＭＦＡ、アグリコン上でのＭ６Ｐ官能基化類似体）は、本発明による式（Ｉ）を有する化合物の例である。ヘキサンヒドラジドアームに結合するマロナート３（ＡＭＦＡ−５）及びＭ６Ｐの構造はまた、図８においても与えられる。
【００８６】
１．７  ＡＭＦＡ−１、ＡＭＦＡ−２、ＡＭＦＡ−３、ＡＭＦＡ−５及びＭ６Ｐ−ヘキサンヒドラジドの合成（図９〜１３）
１．７．１．  ＡＭＦＡ−１の合成（図９）
５−エトキシカルボニルペンチル ２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシド  １：
ＣＨ２Ｃｌ２ ６０mLに溶解したマンノース五酢酸（１０．００ｇ、２５．６４mmol）に、６−ヒドロキシヘキサン酸エチル（８．３mL、５１．２８mmol）を室温で、そして次にＢＦ３.Ｅｔ２Ｏを０℃で加えた。室温で４日間撹拌した後、反応混合物を、ＮａＨＣＯ３（２×２０mL）で２回、そして次にブライン（２０mL）で洗浄した。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、そして減圧下で濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ；６：４）の後、化合物１（７．１４ｇ、５７％）を得た。
Rf = 0.58 [ヘキサン /AcOEt (6:4)]
SM, ESI+m/z: 513 [M+Na]+, 529 [M+K]+
【００８７】
５−メトキシカルボニルペンチル α−Ｄ−マンノピラノシド  ２：
無水メタノール３５mLに溶解した化合物１（３．７ｇ、７．５５mmol）に、ナトリウムメトキシド（１．６ｇ、３０．２０mmol）を加えた。撹拌下３０分後、陽イオン交換樹脂（Dowex（登録商標）50WX2、Ｈ＋形、１３ｇ）を加えた。１時間後、樹脂を濾過し、そしてメタノールで洗浄した。濾液を減圧下で濃縮して、２（２．１ｇ、１００％）を得た。
Rf = 0.35 [AcOEt / MeOH (9:1)]
MS, ESI+m/z: 331 [M+ Na] +, 347 [M+ K]+
【００８８】
５−メトキシカルボニルペンチル ２，３，４，６−テトラ−Ｏ−トリメチルシリル−α−Ｄ−マンノピラノシド  ３：
Ｅｔ３Ｎ（８．８５mL、６３．４０mmol）、次にトリメチルシリルクロリド（７．１mL、５４．４８mmol）及び触媒量のＤＭＡＰを、ＴＨＦ ３０mLに溶解した化合物２（２．１０ｇ、６．８１mmol）に、０℃で連続して加えた。反応混合物を３０時間撹拌し、次に溶媒を蒸発させ、そして粗製物をＣＨ２Ｃｌ２１５０mLに溶解した。有機層をブライン（１００mL）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で蒸発させて、３（１．６２ｇ、４０％）を得た。
Rf  =  0.7 [EP/Et2O (9:1)]
MS, ESI+m/z: 619 [M+Na] +, 635 [M+K]
【００８９】
５−メトキシカルボニルペンチル ２，３，４−トリ−Ｏ−トリメチルシリル−α−Ｄ−マンノピラノシド  ４：
メタノール２mL中の３（２．４５ｇ、４．１１mmol）に、Ｋ２ＣＯ３のメタノール溶液（３６mL、０．１１mM）を０℃で加えた。０℃で３０分間撹拌した後、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２１７０mLで希釈した。有機層をブライン１７０mLで洗浄した。水層をＣＨ２Ｃｌ２１５０mLで抽出した。有機層を合わせ、次にＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、そしてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して（ヘキサン／Ｅｔ２Ｏ、８：２＋Ｅｔ３Ｎ（１％））、４（１．２９ｇ、６０％）を得た。
Rf  = 0.37  [EP/Et2O (7:3)]
MS, ESI+m/z: 547 [M+Na] +, 563 [M+K]+
【００９０】
５−メトキシカルボニルペンチル（Ｅ）−２，３，４−トリ−Ｏ−トリメチルシリル−６−デオキシ−６−ジエトキシホスフィニルメチレン−α−Ｄ−マンノピラノシド  ６：
ＴＨＦ １mLに希釈した塩化オキサリル（７３  １０−３mL、０．８４mmol）に、ＤＭＳＯ（１３５  １０−３mL、１．９mmol）を−７８℃で加えた。１０分後、ＴＨＦ ２mL中の４（０．４００ｇ、０．７６mmol）を−７８℃で滴下した。２０分後、Ｅｔ３Ｎ（５３３  １０−３mL、３．８mmol）を加えた。反応混合物を−７８℃で１０分間撹拌し、次に室温で３０分間静置した。溶媒を蒸発させることで除去し、そして残留物をＣＨ２Ｃｌ２（２０mL）に溶解した。有機層をブライン（２０mL）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、そして減圧下で濃縮した。粗製のアルデヒド５を、次の工程に更に精製しないで用いた。
ＴＨＦ １０mLに懸濁させたＮａＨ（８０％、０．０４５ｇ、１．５５mmol）に、メチレンジホスホン酸テトラエチル（３８５  １０−３mL、１．５５mmol）を室温で滴下した。撹拌下で１時間後、粗製のアルデヒド５のＴＨＦ（５mL）溶液を室温で加えた。１ｈ１５後、ＴＨＦを蒸発させ、そして残留物をＣＨ２Ｃｌ２（４０mL）に溶解した。有機層をブライン（２×１０mL）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で蒸発させ、そしてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して（ＡｃＯＥｔ／ＰＥ、８：２）、６（０．１３０ｇ、３０％）を得た。
Rf = 0.72 [AcOEt/EP, (8:2)]
MS, ESI+m/z: 657 [M+H]+, 679 [M+Na] +, 695 [M+K]+
【００９１】
５−メトキシカルボニルペンチル（Ｅ）−６−デオキシ−６−ジヒドロキシホスフィニルメチレン−α−Ｄ−マンノピラノシド  ７：
ＣＨ３ＣＮ（３mL）に溶解した化合物６（０．２９ｇ、０．４４mmol）に、ピリジン（８９  １０−３mL、１．１mmol）そして次にトリメチルシリルブロミド（７００  １０−３mL、４．４mmol）を加えた。反応混合物を室温で６時間撹拌し、そして溶媒を蒸発させた。残留物をＭｅＯＨに溶解し、そして過剰量のピリジニウム塩を濾過により除去した。濾液を陽イオン交換樹脂（Dowex（登録商標）50WX2、Ｈ＋形、０．５ｇ）で処理し、そして次にシリカゲル１００ Ｃ１８−逆相（Fluka）でのカラムクロマトグラフィーにより精製して（溶離剤：水、次にメタノール）、化合物７（０．１０ｇ、５９％）を得た。
Rf = 0.33  [AcOEt/MeOH, (6:4)]
SM, ESI+m/z: 385 [M +H]+, 407 [M+Na] + 
【００９２】
５−メトキシカルボニルペンチル ６−デオキシ−６−ジヒドロキシホスフィニルメチル−α−Ｄ−マンノピラノシド  ８：
メタノール／Ｈ２Ｏ（２：１）３mL中の７（０．０４８ｇ、０．１２４mmol）を、水素雰囲気下、Ｐｄ／Ｃ（１０％、８mg）の存在下で１８時間撹拌した。反応混合物をセライトパッドを通して濾過し、そして減圧下で蒸発させて、８（０．０４６ｇ、１００％）を得た。
Rf = 0.51 [AcOEt/MeOH, (9:1)]
MS, ESI+m/z: 387 [M +H]+, 409 [M+Na] +, 425 [M+K]+ 
【００９３】
５−ヒドラジノカルボニルペンチル ６−デオキシ−６−ジヒドロキシホスフィニルメチル−α−Ｄ−マンノピラノシドジナトリウム塩  ９又はＡＭＦＡ−１
ＭｅＯＨ ２mL中の８（０．０４５ｇ、０．１２mmol）に、ヒドラジン一水和物（２８  １０−３mL、０．５８mmol）を加えた。１８時間後、溶媒を蒸発させ、そして残留ヒドラジンを、エタノールで４回共蒸発させた。粗製物をシリカゲル１００ Ｃ１８−逆相（Fluka）でのクロマトグラフィーにより精製し（溶離剤：Ｈ２Ｏ）、そして次に陽イオン交換樹脂（Dowex（登録商標）50WX2、Ｎａ＋形、０．２００ｇ）により処理した。樹脂を濾過して、凍結乾燥の後、９（０．０３５ｇ、６８％）を得た。
Rf =  0.44 [MeOH]
[α] D20  = + 69,12° (c1 / D2O)
MS,  ESI- m/z: 385 [M - 2Na++ H]+ 
【００９４】
１．７．２．  ＡＭＦＡ−２の合成（図１０）
プロパルギル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−トリメチルシリル−α−Ｄ−マンノピラノシド  １０
１０を、３についてと同様の手順に従って調製した。
Rf =  0.95  [EP/Et2O  (7:3)] 
収率= 95%
MS, ESI+m/z: 529 [M+Na] +
【００９５】
プロパルギル２，３，４−トリ−Ｏ−トリメチルシリル−α−Ｄ−マンノピラノシド  １１
化合物１１を、４についてと同様の手順に従って調製した。
Rf =  0.37 [EP/Et2O  (9:1)] 
収率= 57 %
MS, ESI+ m/z: 457 [M+Na]+
【００９６】
プロパルギル（Ｅ）−２，３，４−トリ−Ｏ−トリメチルシリル−６，７−ジデオキシ−７−ジベンジルオキシホスフィニル−α−Ｄ−マンノ−ヘプタ−６−エノピラノシド  １３
ホスホナート１３を、６についてと同様の手順に従って調製したアルデヒド１２の調製を介して、７についてと同様の手順に従って調製した。ジベンジルホスホナート１３を得るために、メチレンジホスホン酸テトラベンジルを、メチレンジホスホン酸テトラエチルに代えて用いた。
Rf =  0.83 [Et2O/EP (8:2)] 
収率= 63 %
MS, ESI+m/z: 691 [M+H] +, 713 [M+Na] +
【００９７】
（メトキシカルボニルエチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル−メチル （Ｅ）−２，３，４−トリ−Ｏ−トリメチルシリル−６，７−ジデオキシ−７−ジベンジルオキシホスフィニル−α−Ｄ−マンノ−ヘプタ−６−エノピラノシド  １４
ＣＨ２Ｃｌ２（２mL）中のホスホナート１３（２５０mg、０．３６２mmol）及び３−アジドプロピオン酸メチル（３７μL、０．４３５mmol）に、Ｃｕ（ＣＨ３ＣＮ）４ＰＦ６（１３５mg、０．３６２mmol）及び２，６−ルチジン（５μL、０．０３６２mmol）を連続して加えた。混合物を室温で２０時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後、粗製物を直接シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して（溶離剤：ＣＨ２Ｃｌ２、次にＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９９：１及び９８：２）、１４（２３６mg、８０％）を得た。
Rf = 0.65 [CH2Cl2/MeOH, (98:2)]
MS, ESI+m/z: 820 [M+H] +
【００９８】
（メトキシカルボニルエチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル−メチル ６−デオキシ−６−ジヒドロキシホスフィニルメチレン−α−Ｄ−マンノピラノシド  １５
ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ（５：１）６mL中のホスホナート１４（１３０mg、０．１５９mmol）及びＰｄ／Ｃ（１０％）２０mgの混合物を、水素雰囲気下（２０bars）で撹拌した。１６時間後、触媒をセライトパッド上での濾過により除去し、そして濾液を減圧下で濃縮して、１５（６５mg、９６％）を得た。
Rf = 0.17 [AcOEt/MeOH, (7:3)] 
MS, ESI- m/z: 424  [M-H] -
【００９９】
（ヒドラジノカルボニルエチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル−メチル ６−デオキシ−６−ジヒドロキシホスフィニルメチレン−α−Ｄ−マンノピラノシドのジナトリウム塩  １６又はＡＭＦＡ−２
ＡＭＦＡ−２を、ＡＭＦＡ−１に適用した手順に従って調製した。
Rf = 0.23 [MeOH/AcOEt, (7:3)]
収率 = 30%
MS, ESI- m/z: 424 [M- 2Na + H] -
【０１００】
１．７．３．  ＡＭＦＡ−３の合成（図１１）
２−ブロモエチル ２，３，４，６−テトラ−Ｏ−トリメチルシリル−α−Ｄ−マンノピラノシド  １７
１７を、３についてと同様の手順に従って調製した。
Rf  = 0.88 [EP/Et2O  (9:1)]
収率 = 87%
MS, ESI+m/z: 597 [M+Na] +
【０１０１】
２−ブロモエチル ２，３，４−トリ−Ｏ−トリメチルシリル−α−Ｄ−マンノピラノシド  １８
化合物１８を、４についてと同様の手順に従って調製した。
Rf = 0.46 [EP/Et2O  (6:4)] 
収率 = 48%
MS, ESI+ m/z: 525 [M+Na]+
【０１０２】
２−ブロモエチル （Ｅ）−２，３，４−トリ−Ｏ−トリメチルシリル−６，７−ジデオキシ−７−ジエチルオキシホスフィニル−α−Ｄ−マンノ−ヘプタ−６−エノピラノシド  ２０
ホスホナート２０を、６についてと同様の手順に従って調製したアルデヒド１９の調製を介して、７についてと同様の手順に従って調製した。
Rf = 0.53 [Et2O] 
収率 = 60 %
MS, ESI+m/z: 635 [M+H] +
【０１０３】
２−（フタルイミドキシ）エチル （Ｅ）−２，３，４−トリ−Ｏ−トリメチルシリル−６，７−ジデオキシ−７−ジエチルオキシホスフィニル−α−Ｄ−マンノ−ヘプタ−６−エノピラノシド  ２１
Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（４６８mg、２．９mmol）を、無水ＤＭＦ ５０mL中のＮａＨ（１０９mg、３．３mmol）に加えた。撹拌下１時間後、ＤＭＦ １０mLに溶解したホスホナート２０（１．２１ｇ、１．９mmol）を、前記溶液に滴下した。赤色溶液を２６時間４０℃で撹拌し、次にＥｔ２Ｏ（３００mL）でクエンチした。有機層をブライン（１５０mL）で洗浄し、次に乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮し、そしてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して（Ｅｔ２Ｏ／ＥＰ  ８／２、９／１、次にＥｔ２Ｏ）、２１（８３５mg、６１％）を得た。
Rf = 0.55 [AcOEt/MeOH, (8:2)] 
収率 = 61 %
MS, ESI+m/z: 718 [M+H] + , 740 [M+Na] +
【０１０４】
２−（フタルイミドキシ）エチル （Ｅ）−６，７−ジデオキシ−７−ジエチルオキシホスフィニル−α−Ｄ−マンノ−ヘプタ−６−エノピラノシド  ２２
２２を、７についてと同様の手順に従って調製した。
Rf = 0.63 [AcOEt/MeOH, (5:5)] 
収率 = 45 %
MS, ESI- m/z: 444 [M-H]-
【０１０５】
２−（フタルイミドキシ）エチル ６−デオキシ−６−ジヒドロキシホスフィニルメチレン−α−Ｄ−マンノピラノシド  ２３
８についてと同様の条件下で、２２の二重結合の還元を行った。
Rf = 0.61 [AcOEt/MeOH, (5:5)]
収率  = 98%
MS, ESI- m/z: 446 [M-H]-
【０１０６】
２−（アミノキシ）エチル ６−デオキシ−６−ジヒドロキシホスフィニルメチレン−α−Ｄ−マンノピラノシドのジナトリウム塩  ２４又はＡＭＦＡ−３
ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）５mL中の２３（０．０６５ｇ、０．１４５mmol）に、ヒドラジン一水和物（２１．２  １０−３mL、０．４３６mmol）を加えた。３時間後、溶媒を蒸発させた。粗製物をシリカゲル１００ Ｃ１８−逆相（Fluka）でのクロマトグラフィー（溶離剤：Ｈ２Ｏ）により精製し、そして次に陽イオン交換樹脂（Dowex（登録商標）50WX2、Ｎａ＋形、０．２００ｇ）により処理した。樹脂を濾過し、凍結乾燥の後、２４（０．０３５ｇ、４０％）を得た。
Rf = 0.42 [MeOH]
収率  = 40%
MS, ESI- m/z: 316 [M- 2Na + H]-
【０１０７】
１．７．４．  ＡＭＦＡ−５の合成（図１２）
［５−メトキシカルボニルペンチル ６，７−ジデオキシ−７−（ベンジルオキシカルボニル）−α−Ｄ−マンノ−オクトピラノシド］ベンジルウロナート  ３７
トリフルオロメタンスルホン酸無水物（１０６  １０−３mL、０．６９７mmol）を、ＣＨ２Ｃｌ２（３mL）中に溶解した４（３００mg、０．５７mmol）及び２，６−ジ−tert−ブチル−４−メチルピリジン（１５３mg、０．７４４mmol）に−４０℃で滴下した。混合物を３０分間撹拌し、次にＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、そして有機層を水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、そして減圧下で濃縮した。過剰量の２，６−ジ−tert−ブチル−４−メチルピリジンをヘキサン中での沈殿反応により除去した。粗製のトリフラート３５を、次の工程に更に精製しないで用いた。
ＴＨＦ（３mL）中のトリフラート３５（３２８mg、０．５０mmol）の溶液に、ＴＨＦ（１５mL）中で希釈したマロン酸ジベンジルのナトリウム塩（０．７２０mmol）を室温で加えた。反応の完了後、マロナート３６を脱シリル化するために、３６を含む混合物をＨＣｌ １Nで処理した。１０分後、混合物をＮａＨＣＯ３水溶液により中和した。水層をＣＨ２Ｃｌ２で２回抽出した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して（ＣＨ２Ｃｌ２、次にＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９：１）３７（０．０７５ｇ、２３％）を得た。
Rf = 0.52 [CH2Cl2/MeOH, (9:1)]
SM,  ESI+ m/z : 597 [M+Na] +
【０１０８】
［５−メトキシカルボニルペンチル ６，７−ジデオキシ−７−（カルボキシ）−α−Ｄ−マンノ−オクトピラノシド］ウロン酸  ３８
ホスホナート１５の調製についてと同様の手順に従って、３７の脱ベンジル化を達成した。
Rf = 0.34 [AcOEt/MeOH, (8:2)]
収率 = 93%
SM,  ESI+ m/z : 395 [M+H] +
SM,  ESI+ m/z : 393 [M-H] -
【０１０９】
［５−メトキシカルボニルペンチル ６，７−ジデオキシ−７−（カルボキシ）−α−Ｄ−マンノ−オクトピラノシド］ウロン酸ジナトリウム塩  ３９又はＡＭＦＡ−５
３８から出発して、マロナート３９をＡＭＦＡ−１に適用した手順に従って調製した。
Rf  = 0.55 [MeOH]
収率= 56%
MS, ESI- m/z: 393 [M- 2Na + H]-
【０１１０】
１．７．５．  Ｍ６Ｐ−ヘキサンヒドラジド（すなわち化合物３４）の合成（図１３）
５−メトキシカルボニルペンチル ２，３，４−トリ−Ｏ−トリメチルシリル−６−ジフェノキシホスフィニル−α−Ｄ−マンノピラノシド  ３２
クロロリン酸ジフェニル（１４３  １０−３mL、０．６９mmol）、Ｅｔ３Ｎ（１１２  １０−３mL、０．８mmol）及び触媒量のＤＭＡＰを、ＣＨ２Ｃｌ２（５mL）に溶解した４（３００mg、０．５７mmol）に加えた。混合物を５時間撹拌し、次に溶媒を蒸発させ、粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して（ＰＥ／Ｅｔ２Ｏ、６：４次に５：５）、６（０．４２ｇ、９５％）を得た。
Rf = 0.63 [ヘキサン/AcOEt, (5:5)]
SM,  ESI+ m/z  :  779[M+Na] + 
【０１１１】
５−メトキシカルボニルペンチル ６−ホスファート−α−Ｄ−マンノピラノシド  ３３
ＰｔＯ２（７０mg）を、エタノール（１５mL）に溶解した３２（０．４１０ｇ、０．５４mmol）に加え、そして反応混合物をＨ２雰囲気下、室温で６時間撹拌した。反応混合物をセライトパッドを通して濾過し、そして減圧下で蒸発させて、３３（０．２０７ｇ、９７％）を得た。
Rf  = 0,12 [AcOEt/MeOH (8:2)]
SM,  ESI- m/z  :  387 [M-H]- ,  775 [2M-H] -
【０１１２】
５−ヒドラジノカルボニルペンチル ６−ホスファート−α−Ｄ−マンノピラノシド ジナトリウム塩  ３４
３３から出発して、ホスファート３４を、ＡＭＦＡ−１に適用した手順に従って調製した。
Rf  = 0.28 [イソプロパノール/NH4OH, (5:5)]
収率 = 25%
MS, ESI- m/z: 387 [M- 2Na + H]-
【０１１３】
１．８．  ＡＭＦＡ−１の薬理学的性質解析
図１４に示すように、ＡＭＦＡ−１の結合親和性、７５％（v/v）のヒト血清中での安定性及びヒト線維芽細胞中での毒性の欠如は、ホスホナート１単独でのそれらと同等であった。同様に、ＡＭＦＡ−１は、ヒト乳癌細胞株、ＭＣＦ７及びＭＤＡに毒性を示さなかった（データは示していない）。これは、アノマー位におけるヘキサンヒドラジドリンカーの添加がＭ６Ｐ−類似体の薬理学的性質を変えないことを示す。
【０１１４】
１．９．  ＡＭＦＡ−１、ＡＭＦＡ−２、ＡＭＦＡ−３、ＡＭＦＡ−５、Ｍ６Ｐ及びＭ６Ｐ−ヘキサンヒドラジドの薬理学的性質
ＡＭＦＡ−１、ＡＭＦＡ−２、ＡＭＦＡ−３及びＡＭＦＡ−５の、ＣＩ−Ｍ６ＰＲへの結合親和性を、２０℃で（Ａ）又は３７℃、７５％ヒト血清の存在下（Ｂ）で測定し、Ｍ６Ｐ及びＭ６Ｐ−ヘキサンヒドラジドと比較した。方法は１．８節と同一である。ＡＭＦＡ−１、ＡＭＦＡ−２、ＡＭＦＡ−３及びＡＭＦＡ−５は、ＣＩ−Ｍ６ＰＲと高い結合親和性で結合するため、標的ＣＩ−Ｍ６ＰＲに対して高いポテンシャルを示し、かつ血液培養中で安定である（図１５）。Ｍ６Ｐ−ヘキサンヒドラジド及びＭ６Ｐは、緩衝液中では安定した親和性を示したが、ヒト血清中では加水分解され、それぞれ７〜８時間後には〜５０％、そして１６時間後には８４〜１００％の、親和性の減少を伴った。ＡＭＦＡ−１、ＡＭＦＡ−２、ＡＭＦＡ−３及びＡＭＦＡ−５は、ヒト血清中での１６時間の培養後８５％を凌ぐ結合能を保持しているように見える。これは、血清中でのより高い安定性及びＣＩ−Ｍ６ＰＲ親和性が、一部のＭ６Ｐ類似体によってのみ得られることを示す。
【０１１５】
１．１０．  ｃａｔｈＤ−ＡＭＦＡ−１（本発明による接合体）の合成
ＡＭＦＡ−１カップリングの実施例は、ヒトリソソーム酵素、カテプシンＤで実施された。カテプシンＤ−ＫＤＥＬ変異体は、ｃＤＮＡ誘導された突然変異生成によるＣ末端ＫＤＥＬ拡張子（小胞体保持のための）を加えることによって得られ、それからラット癌細胞中での安定発現の後精製した［Liaudet E. et al., Oncogene 9: 1145-54, 1994］。事実、ＫＤＥＬシグナルは、ゴルジ装置のＭ６Ｐシグナルの添加を部分的に防止する。このタンパク質が、バキュロウイルス／昆虫細胞系により生産されるそれらと類似のそのオリゴマンノシド鎖であるモデルとして用いられた［Liaudet E. et al., Oncogene 9: 1145-54, 1994］。
【０１１６】
ＡＭＦＡとリソソーム酵素間のカップリングを達成するために、本発明者らは実験プロトコルを作成した：
−第一に、ホスホナート類似体−１は、ＡＭＦＡ−１を得るために、ヒドラジド基を含むヘキサンヒドラジドスペーサーアームによってアノマー位で官能化される。
−第二に、グラフト化を実施するために、０．５mg/mlのヒト組み換え酵素（ここではｃａｔｈＤ−ＫＤＥＬ）及び１０mMのメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液（ＮａＩＯ４）を、暗所、４℃で３０分間、０．１Mの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で反応させる。グリセロール（最終濃度１５mM）を０℃で５分間加え、反応を停止し、そしてサンプルを、０．１M 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に対して終夜透析する。
−第三に、ＡＭＦＡ−１を加え、室温で２時間、撹拌下で反応する。最後に、サンプルをＰＢＳ緩衝液に対して終夜透析する。このプロトコルは、バキュロウイルスから極めて強力なＡＭＦＡにわたるヒト組み換え酵素のグラフトに容易に適応することができる。さまざまなリソソーム酵素の糖側鎖の数は異なっているため、各酵素が高いＣＩ−Ｍ６ＰＲ親和性及び新糖酵素活性に達成するために、タンパク質／ＡＭＦＡ相対比及び反応条件（時間、温度、ｐＨ）は、各々の酵素に対して最適化されなければならない。
【０１１７】
この種の反応は、オリゴマンノシド部分の酸化を誘導し、古典的アシルヒドラゾン官能基を形成するための共有結合方式におけるＡＭＦＡ−１のヒドラジド官能基と反応するアルデヒド官能基を得ることを可能にする。ヒドラジドは、副生成物又は潜在的に有毒な試薬を含まないため、アルデヒドと選択的に反応して、痕跡量のない接合条件によるアシルヒドラゾンを形成する。同様に、アミノキシ基（ＡＭＦＡ−３を参照されたい）は、アルデヒドと反応して、オキシム官能基を形成する。更に、オリゴマンノシド部分のみが再構築され、そして、酵素のペプチド部分はＡＭＦＡのグラフトに使用する条件には影響を受けない。
ここで、酵素はアシルヒドラゾン又はオキシム結合を介してＡＭＦＡにグラフトする。
【０１１８】
１．１１．  ｃａｔｈＤ−ＡＭＦＡ−１の結合アッセイ及び触媒活性
１．２節において詳述したように、ｃａｔｈＤ−ＡＭＦＡ−１の結合アッセイは、ＡＭＦＡ−１結合アッセイに使用したものと同じプロトコルにビオチン化ＣＩ−Ｍ６ＰＲを使用して実施された。
【０１１９】
ＡＭＦＡ−１修飾カテプシンＤ−ＫＤＥＬのＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する親和性（Ｋｄ＝３nM）は、天然のカテプシンＤ−ＫＤＥＬのもの（Ｋｄ＝３０nM）より１０倍高い（図１６Ａ）。興味深いことに、その親和性は、受容体の２個のＭ６Ｐ結合部位を占めることが可能なビスホスホリル化鎖の存在のため、ＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する高親和性の配位子である天然カテプシンＤ（Ｋｄ＝１５nM）のそれと比較して５倍増加している。これらのデータは、ＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する最も高い親和性を示している天然鎖であるビスホスホリル化鎖（Ｋｄ＝２nM）のそれに、ＡＭＦＡ−１接合鎖の親和性が非常に近いことを示す［Tong PY et al., J Biol Chem. 264, 7962-9, 1989］。
【０１２０】
同時に、天然カテプシンＤ、カテプシンＤ−ＫＤＥＬ及びＡＭＦＡ−１にグラフトされたカテプシンＤ−ＫＤＥＬの触媒活性を、ＵＭＲ５２４７により合成される消光蛍光基質Edans-Arg-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Gln-Dabcylを使用して測定した（図１６Ｂ）。ペプチド主鎖のタンパク質分解切断の後、放出されたEdansは、光励起（励起３５５nm；蛍光５３８nm）の下で、その蛍光特性を回復する。カテプシンＤ−ＫＤＥＬの活性は、ＡＭＦＡ−１カップリングの後完全に維持されることが見出され、炭水化物を再構築する反応がその触媒部位の構造に影響を及ぼさないことを示した。
【０１２１】
したがって、本発明者らは、ＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する高い親和性を有し、触媒活性を維持している新糖酵素を得るための再現可能なプロトコルを定めた。
【０１２２】
１．１２  シャイエ又はハーラー リソソーム障害患者の線維芽細胞中のイズロニダーゼ−ＡＭＦＡ−１のインビボのターゲティング及びグリコサミノグリカン分泌の活性
この研究のために選択される酵素は、ムコ多糖貯蔵障害であるムコ多糖体症Ｉ（ＭＰＳＩ）に関係するα−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）[EC 3.2.1.76]である（Neufeld, E.F. and Muenzer, J. 1995, In The metabolic basis of inherited disease, Scriver, C.R., Beaudet, A.L., Sly, W.S. and Valle, D., eds., 7th ed. New York: McGraw-Hill, pp. 2465-2494）。ＩＤＵＡ活性の減少又は欠如は、異なる組織において酵素基質、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の蓄積をもたらす。ＭＰＳＩは多臓器障害で、外観、精神発達及び可動性に影響を及ぼす場合があり、その臨床症状は最も穏やかな形、すなわちシャイエのものから最も重篤なもの、ハーラーまで変化する（Kakkis, N Engl J Med 2001, 344, 3:182-188）。ヨーロッパでの有病率は、１０，０００人あたり約０．０２５である。
【０１２３】
ＩＤＵＡは６個のＮで結合したオリゴ糖によってグリコシル化され、７４kDaの前駆体分子を生産する６５３ＡＡタンパク質であり、それは成熟形態に処理される。
【０１２４】
酵素ＩＤＵＡの製造及び精製は、バキュロウイルス／鱗翅類細胞発現系において実施された。簡潔には、フラグシークエンス（Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）はＩＤＵＡ ｃＤＮＡのＮ末端基に導入され、そして、これらのシークエンスは最後期Ｐ１０プロモータの下流である、特定のバキュロウイルス導入ベクターに挿入された。組み換えウイルスは、精製されたウイルスＤＮＡ及び酵素ｃＤＮＡを運んでいる導入ベクターを用いてＳｆ９細胞をコトランスフェクトすることによって発生する。その後で、バキュロウイルスは、プラークアッセイによってクローニングされる。１０種の単離されたウイルスクローンは増幅され、そして、タンパク質の発現は抗ＦＬＡＧ抗体を用いたＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロッティングによって制御される。酵素産生のための１種のクローンを選択した後、Ｓｆ９細胞は、２ＰＦＵ（プラーク形成ユニット）／細胞の感染多重度で、選択された組み換えウイルスに感染していた。２８℃で４日のインキュベーションの後、上澄みを集め、透析濾過（diafiltrated）し、そしてコンカナバリンＡアフィニティーカラム（ＣｏｎＡセファロース、GE Healthcare）に付した。タンパク質は、α−メチルマンノースによって溶出される。続いて、組み換えＩＤＵＡは、（ｉ）His選択的ニッケルアフィニティークロマトグラフィ（Sigma）によって精製され、His選択的溶離緩衝剤（Sigma、イミダゾール２５０mM）によって溶出された。一旦溶出し、酵素をＮａＣｌ １００mM、酢酸１００mMの緩衝液（ｐＨ５．８）によって透析した。
【０１２５】
ネオＩＤＵＡは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルによって分析され、銀染色によってその純度を決定した（図１７Ａ）。酵素の識別は、特定のモノクローナル抗ＩＤＵＡ抗体（R&D Systems）を用いたウエスタンブロッティングによって得られた。
【０１２６】
１．１０節にて説明したようにＡＭＦＡ−１に連結した後に、ネオＩＤＵＡ細胞内在化、毒性及び基質還元をＭＰＳＩ線維芽細胞において評価した。光学顕微鏡で観察されるように、１００ng/mLのネオＩＤＵＡは既に３時間の培養の後シャイエ患者からのＭＰＳＩ線維芽細胞によって内在化されていた（図１７Ｂ〜Ｅ）。細胞によるネオＩＤＵＡの取り込みは、１０mMのＭ６Ｐを用いたプレインキュベーションによって強く減少し（図１７Ｄ）、１０mMのＡＭＦＡ−１によって、完全に防止された（図１７Ｅ）。これらのデータは、ネオＩＤＵＡ取り込みがＣＩ−Ｍ６ＰＲに関与することを示している。更に、ネオＩＤＵＡの内在化は、２４時間の培養の後、細胞抽出物のウエスタンブロットによっても示された（図１７Ｆ）。グリセルアルデヒド ３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の免疫検出は、総タンパク質導入の内部制御として用いた。
【０１２７】
Blyscanキット（Tebu-Bio）でハーラー患者線維芽細胞の培地において分泌される酵素の基質（ＧＡＧ）のレベルを測定することによって、ｎｅｏＩＤＵＡは、２４〜７２時間で最高５０％のＧＡＧ分泌を有意に減らすことが認められた（表１）。これは、ｎｅｏＩＤＵＡが細胞中で７２時間まで、依然として活性であったことを示している。
【０１２８】
【表１】
0005837486.tif 000029
【０１２９】
図１８に示すように、１００〜５００ng/mLのネオＩＤＵＡによるハーラー線維芽細胞の処置は、７２時間で有毒ではなく、かつ細胞生存度を幾分強化する。細胞生存度は、ＭＴＴアッセイによって評価した［Maynadier et al. FASEB J, 22: 671-81, 2008］。
【０１３０】
１．１３．  ムコ多糖体症Ｉ（ＭＰＳＩ）マウスモデルにおけるＩＤＵＡ−ＡＭＦＡ−１の治療有効性
ホモ接合性ＩＤＵＡ −／− マウス（６〜８週齢）を、ビヒクル単独（対照）又は０．１６mgネオＩＤＵＡ／kg体重／週によって６週間、静注で処置した。分泌されたＧＡＧは、６回の注射の後で尿においてアッセイし、先に述べた方法［Barbosa et al., Glycobiology Adv. Access 13: 647-53, 2003］を用いて尿クレアチニン濃度に正規化した。
【０１３１】
分泌されたＧＡＧ濃度は、この処置によって、尿中で５９．８％まで有意に低下した（表２を参照されたい）。これは、ＭＰＳ−Ｉ治療に対するＩＤＵＡ−ＭＦＡ−１の有効性を示す。このデータは、バキュロウイルス発現系での製造及び続いてのＣＩ−Ｍ６ＰＲターゲティングのためのＡＭＦＡグラフトによって得られるＩＤＵＡ−ＡＭＦＡ−１酵素の治療有効性を示す。
【０１３２】
【表２】
0005837486.tif 000030
【図２】
0005837486.tif 000058
【図６Ａ】
0005837486.tif 000059
【図６Ｂ】
0005837486.tif 000060
【図１２】
0005837486.tif 000061
【図１３】
0005837486.tif 000062
【図１】
0005837486.tif 000063
【図３】
0005837486.tif 000064
【図４】
0005837486.tif 000065
【図５】
0005837486.tif 000066
【図７】
0005837486.tif 000067
【図８】
0005837486.tif 000068
【図９】
0005837486.tif 000069
【図１０】
0005837486.tif 000070
【図１１】
0005837486.tif 000071
【図１４】
0005837486.tif 000072
【図１５】
0005837486.tif 000073
【図１６】
0005837486.tif 000074
【図１７】
0005837486.tif 000075
【図１８】
0005837486.tif 000076