(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース系原料を加水分解する方法であって、
セルロース系原料を有効量のベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼと接触させることを含み、
前記有効量のベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼが、重量：重量の比で２５％のトリコデルマ  レーシ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ)ベータ‐グルコシダーゼＢＧＬ３を含み、
前記有効量のベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼがトリコデルマ  レーシ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ)全セルラーゼを含み、及び
ここで、前記％は前記全セルラーゼと前記ベータ‐グルコシダーゼの合計に基づく
ことを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記ベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼがセロビオヒドロラーゼ類とエンドグルカナーゼ類の一以上を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記トリコデルマ  レーシ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ)全セルラーゼが全培養液製剤であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
有効量のベータ‐グルコシダーゼを含むベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼであって、前記有効量のベータ‐グルコシダーゼの量が、重量：重量の比で２５％であり、
前記ベータ‐グルコシダーゼが、トリコデルマ  レーシ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ)ベータ‐グルコシダーゼＢＧＬ３であり、
前記ベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼがトリコデルマ  レーシ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ)全セルラーゼを含み、及び
ここで、前記％は前記全セルラーゼと前記ベータ‐グルコシダーゼの合計に基づく
ことを特徴とする、前記ベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼ。
【請求項５】
全セルラーゼ調製物がセロビオヒドロラーゼ類とエンドグルカナーゼ類の一以上を含むことを特徴とする請求項４に記載のベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼ。
【請求項６】
前記トリコデルマ  レーシ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ)全セルラーゼが全培養液製剤であることを特徴とする請求項４又は５に記載のベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願
この出願は２００７年９月７日に出願の米国仮出願第６０／９７０，８４２号の優先権を主張し、その全文を本明細書に引用することにより組み込む。
【０００２】
２．分野
本開示は酵素の分野に関し、特に、セルロース系原料の酵素加水分解にかかる方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
３．前書き
非再生エネルギー源アプローチの限界により、再生エネルギー源としてセルロースの潜在性は多大である。セルロースはグルコースのような糖に転換され、産業目的の細菌、酵母、菌類を含む多くの微生物によりエネルギー源として用いられる。例えば、セルロース系原料は酵素により糖へ転換され、得られる糖はプラスチック及びエタノールのような製品を生産するための工業用微生物の原料として用いられる。
【０００４】
再生炭素源としてのセルロース系原料の利用はセルロース系原料の酵素加水分解における経済的に採算性があるセルラーゼの開発に頼っている。セルラーゼはグルコース、セロビオース、及び他のセロオリゴサッカライド類のような産物へのセルロースの加水分解を触媒する酵素である。セルラーゼ酵素はセルロースをグルコースへ加水分解するために相乗的に作用する。ＣＢＨＩ及びＣＢＨＩＩのようなエキソ‐セロビオヒドロラーゼ類（ＣＢＨｓ）は一般的にセロビオースを作るためにセルロースの末端に作用し、一方、エンドグルカナーゼ類（ＥＧｓ）はセルロース上の任意の位置に作用する。これらの酵素は共にセルロースをセロビオースのような小さなセロ‐オリゴサッカライド類へ加水分解する。セロビオースはベータ‐グルコシダーゼにより糖へ加水分解される。
【０００５】
多くの微生物がセルロースを分解できるけれども、これらの微生物のわずかしか、結晶性セルロースを完全に加水分解できる大量の酵素を生産できない。従って、産業上利用に係るセルロースを加水分解するための効率的な酵素システムを開発する必要が存在する。従って、効率的及び経済的なセルロース系原料の酵素加水分解を改良することが望まれる。
【発明の概要】
【０００６】
４．趣旨
本発明の開示はベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼ組成物及び使用方法を提供する。一般的に、ベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼ組成物は全セルラーゼ調製物単独と比較して同等以上の特異的性能を有する。幾つかの実施態様においては、ベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼ組成物は１０％から約８０％（ｗ／ｗタンパク質）のベータ‐グルコシダーゼを含む。幾つかの実施態様においては、ベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼ組成物は全セルラーゼ活性及び約０．６０から２２ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位のベータ‐グルコシダーゼ活性を含む。
【０００７】
さらに、本発明の開示は有効量のベータ‐グルコシダーゼを添加することによりセルロース系原料を加水分解するために必要とされる全セルラーゼの量を低減する方法を提供する。幾つかの実施態様においては、方法は全セルラーゼの量に対して１０％（ｗ／ｗタンパク質）より多くのベータ‐グルコシダーゼ量を添加することによりセルロース系原料を加水分解するために必要とされる全セルラーゼの量を低減する方法を提供する。幾つかの実施態様においては、方法は全セルラーゼ活性及びベータ‐グルコシダーゼ活性を含み、セルラーゼ活性に対するベータ‐グルコシダーゼ活性の比率が約０．６０から２２ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位であることを特徴とする。さらに本発明の開示は、セルロース系原料を有効量のベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼ組成物と接触することによりセルロース系原料を加水分解する方法を提供する。
【０００８】
本発明のこれら及び他の特徴は下記に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
５．図面の簡単な説明
図面が単なる説明の目的とし、決して本発明の範囲を限定することを意図しないことは当業者に理解される。
【００１０】
図１は１％ＰＡＳＣでのトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）全セルラーゼ及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ベータ‐グルコシダーゼ１を用いたマイクロタイタープレート糖化アッセイの結果を示す図である。Ａは全体の％転換及びＢは生成されるセロビオース及びグルコースの相対的量を示す。
【００１１】
図２は７％ｗ／ｗのアビセル（Ａｖｉｃｅｌ）でのトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）全セルラーゼ及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ベータ‐グルコシダーゼ１を用いたマイクロタイタープレート糖化アッセイの結果を示す図である。Ａは全体の％転換及びＢは生成されるセロビオース及びグルコースの相対量を示す。
【００１２】
図３は７％ｗ／ｗのＰＣＳにおけるトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）全セルラーゼ及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ベータ‐グルコシダーゼ１を用いたマイクロタイタープレート糖化アッセイの結果を示す図である。Ａは全体の％転換及びＢは生成されるセロビオース及びグルコースの相対量を示す。
【００１３】
図４は７％ｗ／ｗのサトウキビバガスでのトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）全セルラーゼ及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ベータ‐グルコシダーゼ１を用いたマイクロタイタープレート糖化アッセイの結果を示す図である。Ａは全体の％転換、Ｂは生成されるセロビオース及びグルコースの相対量、Ｃはベータ‐グルコシダーゼの量の増加による全体の％転換を示す。
【００１４】
図５は７％ｗ／ｗのＰＣＳでのトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）全セルラーゼＲｕｔＣ３０及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ベータ‐グルコシダーゼ１を用いたマイクロタイタープレート糖化アッセイの結果を示す図である。Ａは全体の％転換及びＢは生成されるセロビオース及びグルコースの相対量を示す。
【００１５】
図６は１％ｗ／ｗのＰＡＳＣでのトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）全セルラーゼ及び精製トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ベータ‐グルコシダーゼ１を用いたマイクロタイタープレート糖化アッセイの結果を示す図である。Ａは全体の％転換及びＢは生成されるセロビオース及びグルコースの相対量を示す。
【００１６】
図７は７％ｗ／ｗのＰＣＳでのトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）全セルラーゼ及び精製トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ベータ‐グルコシダーゼ１を用いたマイクロタイタープレート糖化アッセイの結果を示す図である。Ａは全体の％転換及びＢは生成されるセロビオース及びグルコースの相対量を示す。
【００１７】
図８は１％ｗ／ｗのＰＡＳＣでのトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）全セルラーゼ及び精製トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ベータ‐グルコシダーゼ３を用いたマイクロタイタープレート糖化アッセイの結果を示す図である。Ａは全体の％転換及びＢは生成されるセロビオース及びグルコースの相対量を示す。
【００１８】
図９は７％ｗ／ｗのＰＣＳでのトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）全セルラーゼ及び精製トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ベータ‐グルコシダーゼ３を用いたマイクロタイタープレート糖化アッセイの結果を示す図である。Ａは全体の％転換及びＢは生成されるセロビオース及びグルコースの相対量を示す。
【００１９】
図１０は７％ｗ／ｗのＰＡＳＣでのトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）全セルラーゼ及び精製トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ベータ‐グルコシダーゼ７を用いたマイクロタイタープレート糖化アッセイの結果を示す図である。全体の％転換をベータ‐グルコシダーゼ７を含む及び含まない所定量のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）全セルラーゼに対してプロットする。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
６．実施態様の詳細な説明
前述の一般的な説明及び次の詳細な説明は単なる典型的及び解説的なものであり、本発明は本明細書に記載の組成物及び方法に限定されないことは理解される。本明細書にて他に定義されない限り、本明細書に用いるすべての技術用語及び科学用語は本発明に属する当業者によって一般的に理解されるような同じ意味を有する。本出願において、特に他に言及しない限り、単数は複数を含む。他に言及しない限り、「又は」の使用は「及び／又は」を意味する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）「含める（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含めている（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含める（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は限定していることを意図していない。特許及び刊行物内に開示されるすべてのアミノ酸及びヌクレオチド配列を含む本明細書に引用されるすべての特許及び刊行物は、引用により明らかに取り込まれる。
【００２１】
本明細書に記載の見出しは、全体として本明細書を参照してもたらされる本発明の多様な態様及び実施態様を限定するものではない。従って、本明細書の用語は全体として本明細書を参照して十分に定義される。
【００２２】
６．１．ベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼ組成物
本発明はベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼ組成物を提供し、並びに、前記ベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼ組成物の製造及び使用方法を提供する。一般的に本明細書に記載のベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼ組成物は全セルラーゼ調製物単独に比較してほぼ同等以上の特異的性能を有する。幾つかの実施態様においては、本明細書に記載のベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼ組成物は全セルラーゼ調製物単独に比較してほぼ同等以上のセルロース系原料の糖化における特異的性能を有する。
【００２３】
ベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼ組成物はベータ‐グルコシダーゼ活性を有する任意のポリペプチドを含んでよい。用語「ベータ‐グルコシダーゼ（ｂｅｔａ‐ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）はＥＣ ３．２．１．２１として区分されるベータ‐Ｄ‐グルコシド グルコヒドロラーゼ、及び／又はＧＨファミリー１、３、９又は４８のものに限定されないが、これらを含む特定のＧＨファミリーのものであってベータ‐Ｄグルコースの放出を伴うセロビオースの加水分解を触媒するものとして本明細書に定義される。
【００２４】
ベータ‐グルコシダーゼを組み換え手段によって任意の適切な微生物から得ることができ、又は商業的な供給源から得られる。適切な、微生物由来ベータ‐グルコシダーゼの例は細菌及び菌類を含むがこれらに限定されない。適切な細菌はアシドサーマス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）、アセチビブリオ（Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ）、アエロモナ（Ａｅｒｏｍｏｎａ）、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、アリシクロバシルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アナエロセラム（Ａｎａｅｒｏｃｅｌｌｕｍ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アクチノバシルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルカニボラックス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ）、アルカリリムニコーラ（Ａｌｋａｌｉｌｉｍｎｉｃｏｌａ）、アルカリフィルス（Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ）、アナバエナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、アゾアルカス（Ａｚｏａｒｃｕｓ）、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、アナエロミクソバクター（Ａｎａｅｒｏｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ）、ブチリビブリオ（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ブデロビブリオ（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、ブチリビブリオ（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、カルディセルロシルプター（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ）、カウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）、セルビブリオ（Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ）、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クラビバクター（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）、コルウェリア（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ユウバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フィブロバクター（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グロエオバクター（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ハヘラ（Ｈａｈｅｌｌａ）、キネオコッカス（Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マリカウリス（Ｍａｒｉｃａｕｌｉｓ）、ミクソバクター（Ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ）、メソプラズマ（Ｍｅｓｏｐｌａｓｍａ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクロビスポラ（Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ）、オエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、パエニバシルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、ペクトバクテリウム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ロドフェラックス（Ｒｈｏｄｏｆｅｒａｘ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サッカロファガス（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ）, サリニスポラ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、 ソリバクター（Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、シューワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、サームス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、サーモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、アシドボラクス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）、デイノコッカス ゲオサーマリス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）、デスルホタレア（Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、及びエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）を含む。
【００２５】
幾つかの実施態様においては、ベータ‐グルコシダーゼを糸状菌から得る。「糸状菌（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ）」は当業者により認識される任意及びすべての糸状菌をいう。一般的に、糸状菌は真核性の微生物であり、ユウミコチニア（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）及びオオミコタ（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）亜門であるすべての糸状菌の形態を含む。これらの菌はキチン、ベータ‐グルカン及び他の多糖類複合体からなる細胞壁を有する栄養菌糸を特徴とする。幾つかの実施態様においては、本発明の糸状菌は形態学的、生理学的、遺伝学的に酵母と異にする。幾つかの実施態様においては、糸状菌は次の属を含むがこれらに限定されない。それはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、黒酵母（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ボーベリア（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、セリポリオプシス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、ケトミウム ペシロマイセス（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クラビセプス（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、コキオボラス（Ｃｏｃｈｉｏｂｏｌｕｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、シアツス（Ｃｙａｔｈｕｓ）、エンドチア（Ｅｎｄｏｔｈｉａ）、エンドチア ムコール（Ｅｎｄｏｔｈｉａ ｍｕｃｏｒ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ギロクラディウム（Ｇｉｌｏｃｌａｄｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ミロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、フェネロカエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、アオカビ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｕｍ）、スタゴノスポラ（Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、テルモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）、及びトラメテス プレウロタス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）である。幾つかの実施態様においては、糸状菌は次を含むがこれらに限定されない。Ａ．ニドゥラン（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａ．ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）、Ａ．アワモリ（Ａ． ａｗｏｍａｒｉ）、セルロース高分解糸状菌（Ａ． ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、Ａ．カワチ（Ａ． ｋａｗａｃｈｉ） 例えば、ＮＲＲＬ ３１１２、ＡＴＣＣ ２２３４２ （ＮＲＲＬ ３１１２）、 ＡＴＣＣ ４４７３３、ＡＴＣＣ １４３３１及びＵＶＫ １４３ｆ菌, Ａ．オリザエ（Ａ. ｏｒｙｚａｅ）、 例えば、ＡＴＣＣ １１４９０、ペニシリウム Ｎ． クラッサ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ Ｎ． ｃｒａ��ｓａ）、トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、例えば、ＮＲＲＬ １５７０９、ＡＴＣＣ １３６３１、 ５６７６４、５６７６５、５６４６６、５６７６７、及びトリコデルマ ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、例えばＡＴＣＣ ３２０９８及び３２０８６である。
【００２６】
用いてよいベータ‐グルコシダーゼの好ましい例はセルロース高分解糸状菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ） (Ｋａｗａｇｕｃｈｉ他、１９９６， Ｇｅｎｅ １７３： ２８７‐２８８), アスペルギルス カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉ） (Ｉｗａｓｈｉｔａ他、１９９９， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６５： ５５４６‐５５５３)、アスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）（ＷＯ ２００２／０９５０１４）、セルロモナス ビアゾテア（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｂｉａｚｏｔｅａ）(Ｗｏｎｇ他、１９９８， Ｇｅｎｅ ２０７： ７９‐８６)、ペニシリウム フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ） （ＷＯ ２００４７８９１９）、 サッカロミコプシス フィブリゲラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ） (Ｍａｃｈｉｄａ他、１９８８， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５４： ３１４７−３１５５)、シゾサッカロミセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（Ｗｏｏｄ他、２００２， Ｎａｔｕｒｅ ４１５： ８７１‐８８０）、及び、トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ベータ‐グルコシダーゼ１ (米国特許第６，０２２，７２５)、トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ベータ‐グルコシダーゼ３(米国特許第６，９８２，１５９)、トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ベータ‐グルコシダーゼ４(米国特許第７，０４５，３３２)、トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ベータ‐グルコシダーゼ５(米国特許第７，００５，２８９)、トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ベータ‐グルコシダーゼ６(ＵＳＰＮ ２００６０２５８５５４) トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ベータ‐グルコシダー７(ＵＳＰＮ ２００４０１０２６１９)を含む。
【００２７】
幾つかの実施態様においては、ベータ‐グルコシダーゼはベータ‐グルコシダーゼをコードする遺伝子を発現することにより生産できる。例えば、ベータ‐グルコシダーゼを例えばグラム陽性微生物（バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）及び放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）のような）又は真核宿主（例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）により細胞外へ分泌することができる。
【００２８】
幾つかの実施態様において、ベータ‐グルコシダーゼを組み換え微生物にて自然のレベルに比較して過剰に発現できることは理解される。幾つかの実施態様においては、宿主細胞をベータ‐グルコシダーゼの発現に用いる場合、宿主細胞は宿主細胞に内因性である一以上のタンパク質の発現を低減するように遺伝的に修飾できる。ある実施態様おいては、宿主細胞は一以上の自然の遺伝子、特に分泌タンパク質をコードする遺伝子であって、欠損又は不活化されている遺伝子を含んでよい。例えば、一以上のプロテアーゼをコードする遺伝子（例えば、アスパルチルプロテアーゼコード遺伝子、Ｂｅｒｋａ他、Ｇｅｎｅ １９９０ ８６： １５３‐１６２及びＵＳＰ ６，５０９，１７１を参照）又はセルラーゼコード遺伝子を欠損又は不活化してよい。ある実施態様においては、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）宿主細胞は、ＷＯ ０５／００１０３６記載のように、ｃｂｈｌ、ｃｂｈ２及びｅｇｌｌ、及びｅｇｌ２遺伝子において不活化する欠損を含むトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞でよい。ベータ‐グルコシダーゼをコードする核酸はトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）宿主細胞の核ゲノムに存在してよく、又は例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞に複製するプラスミドに存在してよい。
【００２９】
ベータ‐グルコシダーゼはそのままの状態で用いてよく又はベータ‐グルコシダーゼは精製してよい。本明細書にて用いる用語「そのままの状態（ａｓ ｉｓ）」は、回収及び／又は精製をしていない又は回収及び／又は精製を最小限に行う発酵により生産される酵素調製物をいう。例えば、一度ベータ‐グルコシダーゼが細胞培養培地へ細胞により分泌されたら、ベータ‐グルコシダーゼを含む細胞培養培地を用いてよい。あるいは、ベータ‐グルコシダーゼは従来の方法、例えば、沈殿、遠心分離、親和性、ろ過、又は他の周知の方法であって、Ｃｈｅｎ， Ｈ．； Ｈａｙｎ， Ｍ.； Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ， Ｈ．“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｓ ｆｒｏｍ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ”、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， １９９２， １１２１， ５４‐６０を含む方法により細胞培養培地から回収してよい。例えば、親和性クロマトグラフィー(Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ 他、（１９８４） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． １６：２１５)、高分解能を有する原料を用いるイオン交換クロマトグラフィー(Ｍｅｄｖｅ他、（１９９８） Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ ８０８： １５３)を含むイオン交換クロマトグラフィーの方法 （Ｇｏｙａｌ他（１９９１） Ｂｉｏｒｅｓ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． ３６：３７、Ｆｌｉｅｓｓ他、（１９８３) Ｅｕｒ． Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：３１４、Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉ他、(１９８４) Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６：３３６及びＥｌｌｏｕｚ他、(１９８７) Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ３９６：３０７）、疎水性相互作用クロマトグラフィー(Ｔｏｍａｚ及びＱｕｅｉｒｏｚ、(１９９９) Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ ８６５：１２３、２相分配クロマトグラフィー (Ｂｒｕｍｂａｕｅｒ他、（１９９９） Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ７：２８７)、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ樹脂又はＤＥＡＥのような陽イオン樹脂を用いるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、硫酸アンモニウム沈殿、又は例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ‐７５を用いるゲルろ過を用いてよい。
【００３０】
幾つかの実施態様においては、ベータ‐グルコシダーゼを細胞培養培地の他の成分から精製せずに用いてよい。幾つかの実施態様においては、細胞培養培地を濃縮し、それから細胞培養培地の他の成分から精製せずに用いてよく、又はさらなる修飾をせずに用いてよい。
【００３１】
ベータ‐グルコシダーゼを微生物から得る場合、酵素を周知の回収方法を用いて回収してよい。例えば、酵素を遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、又は沈殿を含み、これらに限定されない従来の方法により細胞培養培地から回収してよい。幾つかの実施態様においては、精製ベータ‐グルコシダーゼを用いてよい。本明細書にて用いる用語「精製ベータ‐グルコシダーゼ（ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｅｔａ‐ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）」はベータ‐グルコシダーゼが得られる微生物由来の成分を除去されたベータ‐グルコシダーゼをいう。ベータ‐グルコシダーゼを少量の他のタンパク質しか存在していない状態で精製してよい。また、本明細書にて用いる用語「精製される（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」は他の成分、特に本来のベータ‐グルコシダーゼの細胞に存在する他の酵素の除去をいう。幾つかの実施態様においては、ベータ‐グルコシダーゼは「実質的に純粋（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｅ）」でよく、つまりベータ‐グルコシダーゼが生産される微生物由来の他の成分がなくてよい。ベータ‐グルコシダーゼをクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動法（例えば、調製等電点電気泳動法）、異なる溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出を含み、これらに限定されない多様な周知の方法により精製してよい。幾つかの実施態様においては、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて検出する場合、ベータ‐グルコシダーゼは少なくとも２５％純度、好ましくは少なくとも５０％純度、より好ましくは少なくとも７５％純度、さらに好ましくは少なくとも９０％純度、より好ましくは少なくとも９５％純度、及び最も好ましくは少なくとも９９％純度である。
【００３２】
また、ベータ‐グルコシダーゼを商業的供給源から得てよい。本発明に用いるのに有用な商業的ベータ‐グルコシダーゼ調製物の例は、例えば、ＮＯＶＯＺＹＭ（商標）１８８（アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来ベータ‐グルコシダーゼ）、Ｍｅｇａｚｙｍｅから入手できるアグロバクテリウム種（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）及びテルモトガ マリチメ（Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍｅ）(Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｒｅｌａｎｄ Ｌｔｄ．， Ｂｒａｙ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｐａｒｋ， Ｂｒａｙ，Ｃｏ． Ｗｉｃｋｌｏｗ， Ｉｒｅｌａｎｄ)である。
【００３３】
一般的に、ベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼはベータ‐グルコシダーゼ及び全セルラーゼ調製物を含む。しかしながら、ベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼ組成物を組み換え手段により生産してよいことは理解できる。例えば、全セルラーゼを生産できる微生物におけるベータ‐グルコシダーゼの発現である。
【００３４】
幾つかの実施態様においては、ベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼ組成物は全セルラーゼ調製物及びベータ‐グルコシダーゼを含む。また、本発明は全セルラーゼ調製物及びベータ‐グルコシダーゼを含むベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼ組成物であって、１０％より多くのベータ‐グルコシダーゼを含むことを特徴とする組成物を提供する。
【００３５】
幾つかの実施態様においては、ベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼ組成物は全セルラーゼ調製物及びベータ‐グルコシダーゼを含み、セルロース系原料を可溶性糖へ加水分解するために必要な全セルラーゼ調製物の量がベータ‐グルコシダーゼにより低減されることを特徴とする。
【００３６】
一般的に、ベータ‐グルコシダーゼは全セルラーゼ調製物の量の関係で定める量にて組成物中に存在する。幾つかの実施態様においては、組成物は全セルラーゼ調製物及びベータ‐グルコシダーゼを含み、ベータ‐グルコシダーゼはタンパク質：タンパク質の比のような重量：重量の比で全セルラーゼ調製物の量の関係で定める量にて存在する。
【００３７】
幾つかの実施態様においては、組成物は全セルラーゼ調製物及びベータ‐グルコシダーゼを含み、ベータ‐グルコシダーゼの量は総タンパク質に比較して１０％から９０％までの範囲であり、例えば、総タンパク質に比較して１１％から９０％、１５％から８５％、２０％から８０％、２５％から７５％、３０％から７０％、３５％から６５％、４０％から６０％、４５％から５５％、及び５０％である。
【００３８】
幾つかの実施態様においては、組成物は全セルラーゼ調製物及びベータ‐グルコシダーゼを含み、ベータ‐グルコシダーゼの量は、例えば、総タンパク質に比較して１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％又はそれより大きい。
【００３９】
上述のように、幾つかの実施態様においては、一般的に組成物はベータ‐グルコシダーゼ及び全セルラーゼ調製物を含む。本明細書にて用いる、語句「全セルラーゼ調製物（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）」は組成物を含む自然発生的及び非自然発生的セルラーゼの両方をいう。「自然発生的（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」組成物は自然発生的な供給源により生産されるもので、一以上のセロビオヒドロラーゼ‐タイプ、一以上のエンドグルカナーゼ‐タイプ、及び一以上のベータ‐グルコシダーゼ成分を含み、これらの各成分は供給源により生産される割合を有する。自然発生的組成物はセルロース分解酵素に関して非修飾的な微生物により生産されるものであり、その結果成分酵素の比率は自然の生物により生産されるものと変わらない。「非自然発生的（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）組成物は次により生産されるそれらの組成物を含む。それは
（１）自然発生的な比率又は非自然発生的、つまり改変される比率のいずれかでセルロース分解酵素成分を組み合わすこと、又は
（２）一以上のセルロース分解酵素を過剰発現又は過少発現するように微生物を修飾すること、又は
（３）少なくとも一つのセルロース分解酵素が欠損するような微生物を修飾すること
である。従って、幾つかの実施態様においては、全セルラーゼ調製物は一以上の多様なＥＧ及び／又はＣＢＨ、及び／又はベータ‐グルコシダーゼの欠損を有してよい。例えば、ＥＧ１を単独で欠損し、又は他のＥＧ及び／又はＣＢＨと組み合わせて欠損してよい。
【００４０】
一般的に、全セルラーゼ調製物は、
（i）エンドグルカナーゼ類（ＥＧ）又は１，４‐β‐ｄ‐グルカン‐４‐グルカノヒドロラーゼ類（ＥＣ３．２．１．４）、
（i i）１，４‐β‐ｄ‐グルカン‐４‐グルカノヒドロラーゼ類（またはセロデキストリナーゼ類として知られる）（ＥＣ３．２．１．７４）及び１，４‐β‐ｄ‐グルカン‐セロビオヒドロラーゼ類（エキソ‐セロビオヒドロラーゼ、ＣＢＨ）（ＥＣ３．２．１．９１）を含むエキソグルカナーゼ類、及び
（i i i）ベータ‐グルコシダーゼ（ＢＧ）又はベータ‐グルコシド グルコヒドロラーゼ類（ＥＣ３．２．１．２１）
を含み、これらに限定されない酵素を含む。
【００４１】
本開示において、全セルラーゼ調製物はセルロース系原料の加水分解に有用な任意の微生物由来でよい。幾つかの実施態様においては、全セルラーゼ調製物は糸状菌全セルラーゼである。「糸状菌（Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ）」はユウミコチニア（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）及びオオミコタ（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）亜門のすべての糸状形態を含む。
【００４２】
幾つかの実施態様においては、全セルラーゼ調製物は、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、 エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）アオカビ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、スキタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、 チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、又はトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｅｃｉｅｓ）の全セルラーゼである。
【００４３】
幾つかの実施態様においては、全セルラーゼ調製物は、アスペルギルス アキュレイタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス ニドゥラン（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、又はアスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の全セルラーゼである。別の態様においては、全セルラーゼ調製物は、フザリウム バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム クロックウェレンズ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム レチキュラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｕ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム サムブシウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓａｕｍ）、フザリウム トリコセシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）又はフザリウム ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）の全セルラーゼである。別の態様においては、全セルラーゼ調製物は、フミコーラ インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコーラ ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、シタリジウム サーモフィルム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、又はチエラビア テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）の全セルラーゼである。別の態様においては、全セルラーゼ調製物はトリコデルマ ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ ロンジブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、例えば、ＲＬ‐Ｐ３７(Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ他、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２０ （１９８４） ｐｐ． ４６‐５３； Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ Ｂ． Ｓ．， Ｃａｎ．， １‐２０， １９８７)、ＱＭ９４１４ （ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６９２１）、ＮＲＲＬ １５７０９、ＡＴＣＣ １３６３１、５６７６４、５６４６６、５６７６７のトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）又は例えば、ＡＴＣＣ ３２０９８及び３２０８６のトリコデルマ ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）の全セルラーゼである。
【００４４】
幾つかの実施態様においては、全セルラーゼ調製物はトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＲｕｔＣ３０全セルラーゼであり、トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＡＴＣＣ５６７６５としてアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手可能である。
【００４５】
幾つかの実施態様においては、全セルラーゼはペニシリウム フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）であり、ペニシリウム フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）ＡＴＣＣ番号：１０４４６としてアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手可能である。また、全セルラーゼ調製物は商業的供給源から得てよい。本発明に用いるために有用な商業的セルラーゼ調製物の例は、例えば、ＣＥＬＬＵＣＬＡＳＴ（商標）(Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓから入手可能) 並びにＬＡＭＩＮＥＸ（商標）、ＩｎｄｉＡｇｅ（商標）及びＰｒｉｍａｆａｓｔ（商標）(Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ， Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ． Ｉｎｃ．から入手可能)である。
【００４６】
本発明における、全セルラーゼ調製物はセルロース系原料を加水分解できる酵素の発現をもたらす周知の方法による微生物の培養物由来でも良い。発酵は振盪フラスコ培養、小さい又は大きいスケールの発酵であって、適切な培地及びセルラーゼを発現又は単離できる条件下で行う実験用又は産業用発酵装置における連続式、バッチ式、流加培養法、又は固体培養発酵のような発酵を含んでよい。
【００４７】
一般的に、微生物をセルロース系原料を加水分解できる酵素の生産に有用な細胞培養培地にて培養する。培養を周知の方法を用いて、炭素、窒素供給源及び無機塩類を含む適切な培養液にて行う。適切な培養培地、温度範囲、及び増殖及びセルラーゼ生産に適切な他の条件は周知である。例に限定されないが、トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）によるセルラーゼの生産の通常温度範囲は２４℃から２８℃である。
【００４８】
一般的に、全セルラーゼ調製物は、回収及び／又は精製をせずに、又は最小限の回収及び／又は精製をして発酵により生産された「そのままの状態」で用いる。例えば、一度セルラーゼが細胞培養培地へ細胞により分泌されると、セルラーゼを含む細胞培養培地を用いてよい。幾つかの実施態様においては、細胞培養培地、細胞外酵素及び細胞を含む発酵物質の非分画物を含む。あるいは、全セルラーゼ調製物を任意の従来の方法、例えば、沈殿、遠心分離、親和性、ろ過、又は他の周知の方法より処理してよい。幾つかの実施態様においては、例えば、全セルラーゼ調製物を濃縮し、それからさらに精製することなく用いてよい。幾つかの実施態様においては、全セルラーゼ調製物は細胞の生存の減少又は細胞を死滅する化学薬品を含む。幾つかの実施態様においては、細胞を周知の方法を用いて溶解又は透過処理する。
【００４９】
幾つかの実施態様においては、ベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼは全セルラーゼ調製物及びベータ‐グルコシダーゼを含み、全セルラーゼの量が総タンパク質と比較して９０％未満から１０％までの範囲であることを特徴とする。例えば、総タンパク質と比較して８９％から１０％、８５％から１５％、８０％から２０％、７５％から２５％、６５％から３０％、６０％から３５％、６５％から４０％、６０％から４５％、５５％から５０％である。
【００５０】
幾つかの実施態様においては、ベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼは全セルラーゼ調製物及びベータ‐グルコシダーゼを含み、全セルラーゼ調製物の濃度が、例えば、総タンパク質と比較して、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、５３％、５２％、５１％、５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、２０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１３％、１１％、１０％未満であることを特徴とする。
【００５１】
幾つかの実施態様においては、ベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼ組成物は全セルラーゼ調製物及びベータ‐グルコシダーゼを含み、ベータ‐グルコシダーゼの量が総タンパク質の１０％から９０％の範囲であり、全セルラーゼが総タンパク質の９０％未満から１０％を含むことを特徴とする。例えば、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の１１％を含み全セルラーゼが総タンパク質の８９％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の１２％を含み全セルラーゼが総タンパク質の８８％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の１３％を含み全セルラーゼが総タンパク質の８７％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の１４％を含み全セルラーゼが総タンパク質の８６％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の１５％を含み全セルラーゼが総タンパク質の８５％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の１６％を含み全セルラーゼが総タンパク質の８４％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の１７％を含み全セルラーゼが総タンパク質の８３％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の１８％を含み全セルラーゼが総タンパク質の８２％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の１９％を含み全セルラーゼが総タンパク質の８１％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の２０％を含み全セルラーゼが総タンパク質の８０％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の２１％を含み全セルラーゼが総タンパク質の７９％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の２２％を含み全セルラーゼが総タンパク質の７８％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の２３％を含み全セルラーゼが総タンパク質の７７％を含む、或いはベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の２４％を含み全セルラーゼが総タンパク質の７６％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の２５％を含み全セルラーゼが総タンパク質の７５％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の２６％を含み全セルラーゼが総タンパク質の７４％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の２７％を含み全セルラーゼが総タンパク質の７３％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の２８％を含み全セルラーゼが総タンパク質の７２％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の２９％を含み全セルラーゼが総タンパク質の７１％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の３０％を含み全セルラーゼが総タンパク質の７０％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の３１％を含み全セルラーゼが総タンパク質の６９％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の３２％を含み全セルラーゼが総タンパク質の６８％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の３３％を含み全セルラーゼが総タンパク質の６７％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の３４％を含み全セルラーゼが総タンパク質の６６％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の３５％を含み全セルラーゼが総タンパク質の６５％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の３６％を含み全セルラーゼが総タンパク質の６４％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の３７％を含み全セルラーゼが総タンパク質の６３％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の３８％を含み全セルラーゼが総タンパク質の６２％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の３９％を含み全セルラーゼが総タンパク質の６１％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の４０％を含み全セルラーゼが総タンパク質の６０％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の４１％を含み全セルラーゼが総タンパク質の５９％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の４２％を含み全セルラーゼが総タンパク質の５８％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の４３％を含み全セルラーゼが総タンパク質の５７％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の４４％を含み全セルラーゼが総タンパク質の５６％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の４５％を含み全セルラーゼが総タンパク質の５５％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の４６％を含み全セルラーゼが総タンパク質の５４％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の４７％を含み全セルラーゼが総タンパク質の５３％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の４８％を含み全セルラーゼが総タンパク質の５２％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の４９％を含み全セルラーゼが総タンパク質の５１％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の５０％を含み全セルラーゼが総タンパク質の５０％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の５１％を含み全セルラーゼが総タンパク質の４９％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の５２％を含み全セルラーゼが総タンパク質の４８％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の５３％を含み全セルラーゼが総タンパク質の４７％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の５４％を含み全セルラーゼが総タンパク質の４６％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の５５％を含み全セルラーゼが総タンパク質の４５％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の５６％を含み全セルラーゼが総タンパク質の４４％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の５７％を含み全セルラーゼが総タンパク質の４３％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の５８％を含み全セルラーゼが総タンパク質の４２％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の５９％を含み全セルラーゼが総タンパク質の４１％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の６０％を含み全セルラーゼが総タンパク質の４０％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の６１％を含み全セルラーゼが総タンパク質の３９％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の６２％を含み全セルラーゼが総タンパク質の３８％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の６３％を含み全セルラーゼが総タンパク質の３７％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の６４％を含み全セルラーゼが総タンパク質の３６％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の６５％を含み全セルラーゼが総タンパク質の３５％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の６６％を含み全セルラーゼが総タンパク質の３４％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の６７％を含み全セルラーゼが総タンパク質の３３％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の６８％を含み全セルラーゼが総タンパク質の３２％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の６９％を含み全セルラーゼが総タンパク質の３１％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の７０％を含み全セルラーゼが総タンパク質の２０％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の７１％を含み全セルラーゼが総タンパク質の２９％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の７２％を含み全セルラーゼが総タンパク質の２８％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の７３％を含み全セルラーゼが総タンパク質の２７％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の７４％を含み全セルラーゼが総タンパク質の２６％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の７５％を含み全セルラーゼが総タンパク質の２５％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の７６％を含み全セルラーゼが総タンパク質の２４％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の７７％を含み全セルラーゼが総タンパク質の２３％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の７８％を含み全セルラーゼが総タンパク質の２２％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の７９％を含み全セルラーゼが総タンパク質の２１％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の８０％を含み全セルラーゼが総タンパク質の２０％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の８１％を含み全セルラーゼが総タンパク質の１９％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の８２％を含み全セルラーゼが総タンパク質の１８％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の８３％を含み全セルラーゼが総タンパク質の１７％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の８４％を含み全セルラーゼが総タンパク質の１６％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の８５％を含み全セルラーゼが総タンパク質の１５％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の８６％を含み全セルラーゼが総タンパク質の１４％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の８７％を含み全セルラーゼが総タンパク質の１３％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の８８％を含み全セルラーゼが総タンパク質の１２％を含む、ベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の８９％を含み全セルラーゼが総タンパク質の１１％を含む、或いはベータ‐グルコシダーゼが総タンパク質の９０％を含み全セルラーゼが総タンパク質の１０％を含む。
【００５２】
幾つかの実施態様においては、ベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼは全セルラーゼ調製物及びベータ‐グルコシダーゼを含み、ベータ‐グルコシダーゼは重量：重量の比で全セルラーゼ調製物の量とほぼ等しい。幾つかの実施態様においては、ベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼは全セルラーゼ調製物及びベータ‐グルコシダーゼを含み、ベータ‐グルコシダーゼの量は重量：重量の比で全セルラーゼ調製物の量に対して約５０％である。
【００５３】
上述のように、ベータ‐グルコシダーゼは一般的に全セルラーゼ調製物の量と比較した量で組成物中に存在する。幾つかの実施態様においては、組成物は全セルラーゼ調製物及びベータ‐グルコシダーゼを含み、ベータ‐グルコシダーゼは酵素活性に基づいて全セルラーゼ調製物の量に比較した量で存在する。幾つかの実施態様においては、本発明による組成物はベータ‐グルコシダーゼの活性及び全セルラーゼ調製物の活性の間の関係により特徴づけてよい。幾つかの実施態様においては、組成物は全セルラーゼ調製物及びベータ‐グルコシダーゼを含み、ベータ‐グルコシダーゼ活性及び全セルラーゼ調製物の活性は酵素活性の比として与えられる。
【００５４】
上記に記載の酵素活性の比はベータ‐グルコシダーゼ及び全セルラーゼ調製物に対する個別の標準アッセイ条件に関係する。ベータ‐グルコシダーゼの活性及び全セルラーゼ調製物の活性は周知の方法を用いて決定してよい。本明細書においては、次の条件を用いてよい。ベータ‐グルコシダーゼ活性をＣｈｅｎ， Ｈ．； Ｈａｙｎ， Ｍ．； Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ， Ｈ．“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂ‐ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｓ ｆｒｏｍ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ”， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１９９２，１１２１，５４‐６０より記載されるアッセイのような周知の方法により決定してよい。１ｐＮＰＧは５０℃（１２２°Ｆ）及びｐＨ４．８にて１０分間パラ‐ニトロフェニル‐Ｂ‐Ｄ‐グルコピラノシド（ｐａｒａ‐ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ‐Ｂ‐Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）から遊離される１μｍｏｌのニトロフェノールを示す。全セルラーゼ調製物のセルラーゼ活性は基質としてカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を用いて決定してよい。全セルラーゼ活性の決定はＣＭＣ活性を単位として測定される。この方法はＣＭＣに作用する酵素混合物により創られる還元末端の生成を測定し、１単位（ｕｎｉｔ）は１μｍｏｌの産物／分（ｐｒｏｄｕｃｔ／ｍｉｎｕｔｅ）を遊離する酵素量である(Ｇｈｏｓｅ， Ｔ． Ｋ．， Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ， Ｐｕｒｅ & Ａｐｐｌ． Ｃｈｅｍ． ５９， ｐｐ． ２５７‐２６８， １９８７)。
【００５５】
一般的に、ベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼは約０．５から０．２５ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位（ｕｎｉｔ）の範囲の酵素活性比を含む。幾つかの実施態様においては、酵素活性比は約１から２０ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位、又は約１．５から１５ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位、又は約２から１０ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位、又は約２．５から８ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位、又は約３から７ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位、又は約３．５から６．５ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位、又は約４から６ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位、又は約４．５から５．５ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位、又は約５から６ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位である。特に、例えば、５．５ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位の比が有用である。
【００５６】
６．２．方法
上述のベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼ組成物に加えて、本明細書に記載の組成物の使用方法もまた提供される。一般的な態様において、本発明はセルロース系原料を加水分解することに関する。一般的に、これらの方法はセルロース系原料をベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼと接触させること、及びセルロース系原料の加水分解をもたらすのに十分な条件下セルロース系原料及びベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼを共に維持すること、及びそれにより産物を生産することである。いくつかの実施態様においては、セルロースからグルコースへの転換の方法を提供する。
【００５７】
一般的に、ベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼ組成物は全セルラーゼ調製物単独とほぼ同等以上の特異的性能を有する。一般的に、本明細書に記載の方法は全セルラーゼを単独に用いる同様な方法より費用効率がよい。ある実施態様においては、全セルラーゼを単独に用いる他の同様な方法と比較して、本明細書記載のベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼ及び方法は、セルロース系原料を加水分解するためにより少ない全セルラーゼタンパク質を提供する。例えば、糖化アッセイを用いて、対象となる方法はセルロース系原料を加水分解するために必要な全セルラーゼの量を全セルラーゼを単独に使用する同様の方法より約半分に減少する。ある実施態様においては、全セルラーゼを単独に用いる他の同様な方法と比較して、本明細書記載のベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼ及び方法は、セルロース系原料を加水分解するためにより少ない全セルラーゼ活性を提供する。例えば、糖化アッセイを用いて測定すると、対象となる方法はセルロース系原料を加水分解するために必要な全セルラーゼ活性の量を全セルラーゼを単独に使用する同様の方法より約半分に減少する。
【００５８】
本発明は有効量のベータ‐グルコシダーゼ及びセルロース系原料を加水分解するために必要な全セルラーゼ調製物の量を添加することによりセルロース系原料を加水分解するために必要な全セルラーゼ調製物の量を低減する方法を開示する。幾つかの実施態様においては、ベータ‐グルコシダーゼ強化全セルラーゼは全セルラーゼ調製物単独と比較してほぼ同等以上の特異的性能を有する。一般的に、ベータ‐グルコシダーゼの量は重量：重量の比で１０％の全セルラーゼの量より大きい。幾つかの実施態様においては、全セルラーゼ活性に対するベータ‐グルコシダーゼ活性の比率は０．６１ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位より大きい。
【００５９】
セルロース系原料を活性するために必要な全セルラーゼの減少を測定する手段は周知であり、例えば、糖化アッセイである。幾つかの実施態様においては、有効量のベータ‐グルコシダーゼを添加することによりセルロース系原料を加水分解するために必要な全セルラーゼ調製物の量を低減する方法を提供し、ベータ‐グルコシダーゼによって約４８時間５０℃にてセルロース系原料の３０％以上を加水分解するために必要な全セルラーゼ量を減少することを特徴とする。
【００６０】
また、本発明は、セルロース系原料を有効量のベータ‐グルコシダーゼ及び全セルラーゼ組成物と接触させることを含むセルロース系原料を加水分解する方法であって、ベータ‐グルコシダーゼの量によってセルロース系原料を加水分解するために必要とする全セルラーゼ組成物の量を減少することを特徴とする方法を提供する。幾つかの実施態様においては、ベータ‐グルコシダーゼの量は重量：重量の比で全セルラーゼ量の１０％より大きい。幾つかの実施態様においては、ベータ‐グルコシダーゼの量は重量：重量の比で全セルラーゼ量の８０％未満であることを特徴とする。幾つかの実施態様においては、全セルラーゼ活性に対するベータ‐グルコシダーゼ活性の比率は０．６１ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位より大きい。
【００６１】
一般的に、ベータ‐グルコシダーゼは全セルラーゼ調製物の量の関係で定める量である。幾つかの実施態様においては、ベータ‐グルコシダーゼはタンパク質：タンパク質の比のような、重量：重量の比で全セルラーゼ調製物の量の関係で定める量で存在する。幾つかの実施態様においては、ベータ‐グルコシダーゼの量は総タンパク質に比較して１０％以上から９０％までの範囲であり、例えば、総タンパク質に比較して１１％から９０％、１５％から８５％、２０％から８０％、２５％から７５％、３０％から７０％、３５％から６５％、４０％から６０％、４５％から５５％、及び５０％である。
【００６２】
幾つかの実施態様においては、ベータ‐グルコシダーゼの量は例えば、総タンパク質に比較して１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％以上である。
【００６３】
幾つかの実施態様においては、方法におけるベータ‐グルコシダーゼ量はベータ‐グルコシダーゼの活性及び全セルラーゼ調製物の活性の間の関係により決定される。幾つかの実施態様においては、方法におけるベータ‐グルコシダーゼの量は全セルラーゼ調製物の酵素活性の関係で定める酵素活性として与えられる。一般的に、全セルラーゼ調製物に対するベータ‐グルコシダーゼの酵素活性比は約０．５から２５ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位の範囲の酵素活性比を含む。幾つかの実施態様においては、酵素活性比は約１から２０ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位、又は約１．５から１５ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位、又は約２から１０ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位、又は約２．５から８ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位、又は約３から７ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位、又は約３．５から６．５ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位、又は約４から６ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位、又は約４．５から５．５ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位、又は約５から６ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位である。特に、例えば、５．５ｐＮＰＧ／ＣＭＣ単位の比が有用である。
【００６４】
本明細書に記載の組成物に固体として約０．００１から１０．０％ｗｔ．までの有効な量を加えてよく、好ましくは、固体として約０．０２５から４．０％ｗｔ．、及びより好ましくは固体として約０．００５から５．０％ｗｔ．である。
【００６５】
本発明の方法において、セルロース系原料は任意のセルロース含有原料でもよい。セルロース系原料はセルロース、及びヘミセルロースを含んでよいが、これらに限定されない。幾つかの実施態様においては、セルロース原料はバイオマス、草本原料、農業残渣、森林廃棄物、都市固形廃棄物、紙くず、及び紙パルプ廃棄物を含むが、これらに限定されない。
【００６６】
幾つかの実施態様において、セルロース系原料は木材、木製パルプ、製紙汚泥、紙パルプ廃棄物流、パーチクルボード、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ繊維、コメ、紙パルプ処理廃棄物、木本又は草本植物、果物パルプ、野菜パルプ、軽石、蒸留穀物、草、もみ殻、サトウキビバガス、綿花、ジュート、麻、亜麻、タケ、サイザル、アバカ、麦わら（ｓｔｒａｗ）、トウモロコシ穂軸、蒸留穀物、葉、麦わら（ｗｈｅａｔ ｓｔｒａｗ）、ココナッツの毛、藻類、スイッチグラス、及びそれらの混合物を含む。
【００６７】
セルロース原料をそのままの状態で用いてよく、又は周知の従来の方法を用いて前処理してもよい。そのような前処理は化学的、物理的、及び生化学的前処理を含む。例えば、物理的前処理方法は製粉、粉砕、蒸し加熱／蒸気爆発、放射、及び熱加水分解（ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｓ）の多様なタイプを含むがこれらに限定されない。化学的前処理方法は希酸、アルカリ、有機溶剤、アンモニア、二酸化硫酸、二酸化炭素、及びｐＨ‐制御熱加水分解を含むが、これらに限定されない。生化学的前処理の方法はリグニン‐可溶化微生物を適用することを含むが、これに限定されない。
【００６８】
本発明の方法は有機製品、化学薬品と燃料、プラスチック、及び他の産物又は中間体の生産のために化学品又は微生物に対する発酵原料として単糖、二糖、及び多糖の生産に用いてよい。実際に、残渣（乾燥蒸留穀物、醸造からの使用済み穀物 サトウキビバガス等）を処理する価値はセルロース又はヘミセルロースの一部又は完全な可溶化により増加する。エタノールに加えて、セルロース又はヘミセルロースから作られる幾つかの化学薬品はアセトン、アセテート、リジン、有機酸（例えば、乳酸）、１，３‐プロパンジオール、ブタンジオール、グリセロール、エチレングリコール、フルフラール、ポリヒドロキシアルカン酸類（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ）、シス、シス‐ムコン酸、動物飼料及びキシロースを含む。
【００６９】
本発明の態様は次の実施例を踏まえてさらに理解されて良く、本発明の範囲に限定して解釈されるべきでない。材料及び方法両方への多くの改良が本発明の範囲を逸脱しないで実施されることは当業者に明らかである。
【実施例】
【００７０】
実施例７．１糖化アッセイの材料及び方法
アッセイに用いる全セルラーゼ及びベータ‐グルコシダーゼを次に示す。
【００７１】
ジェネンコー（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ，ＵＳＡ）からＬＡＭＩＮＥＸ ＢＧとして入手できるトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼ、
トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＲＵＴ−Ｃ３０全セルラーゼ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．５６７６５）、
トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＢＧＬ１（ＣＥＬ３Ａ） (米国特許第６，０２２，７２５を参照願いたい)、
トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＢＧＬ３（ＣＥＬ３Ｂ） (米国特許第６，９８２，１５９を参照願いたい)、及び
トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＢＧＬ７（ＣＥＬ３Ｅ）（ＵＳＰＮ ２００４０１０２６１９を参照願いたい)
すべての酵素を５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５にて所望の濃度に希釈した。
【００７２】
アビセル（Ａｖｉｃｅｌ）を除いて、アッセイに用いる前にすべての基質を所望の割合の固体に調整した。ＰＣＳ及びサトウキビバガスをマイクロタイタープレートへ正確なピペッティングを用いてブレンドした。基質原料は次を用いた。米国再生エネルギー研究所（Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（ＮＲＥＬ）より入手した希硫酸で前処理した前処理トウモロコシ茎葉ＰＣＳ及びサトウキビバガスを洗浄し、ｐＨ５に調整した。酸前処理トウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）は５６％セルロース、４％ヘミセルロース、２９％リグニンであった。酸前処理バガス（ＡＰＢ）は５３％セルロース、３％ヘミセルロース、３１％リグニンであった。アビセル（Ａｖｉｃｅｌ）（純正、結晶性セルロース）をプレートに加え、それから５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５で約７％（７ｍｇｓ／ｍｌ）に希釈した。ＰＡＳＣ（リン酸膨張セルロース；純正、非結晶質のセルロース）を５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５中０．５％ＰＡＳＣ、ｐＨ５に希釈した。
【００７３】
総タンパク質に基づいて検量される酵素はＢＣＡタンパク質アッセイキット、Ｐｉｅｒｃｅ カタログ番号２３２２５又はビュレット法のいずれかの方法で測定した。注入される酵素の全量は１グラムセルロース当たり２０ｍｇタンパク質であった。ベータ‐グルコシダーゼに対する全セルラーゼ調製物の幾つかの比率を用い、例えば、５０：５０の比は１０ｍｇ／ｇ全セルラーゼ調製物及び１０ｍｇ／ｇベータ‐グルコシダーゼであった。
【００７４】
ウェル当たり１５０マイクロリットルの基質をリピーターピペット（ｒｅｐｅａｔｅｒ ｐｉｐｅｔｔｅ）を用いて平底９６穴マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に注入した。２０マイクロリットルの適切に希釈した酵素溶液を上に加えた。ＰＡＳＣの場合、酵素を最初にプレートに加えた。プレートをアルミニウムプレート蓋で覆い、３７℃又は５０℃いずれかの温度にて、振盪しながら、表１に示す時間でインキュベーターに置いた。反応を各ウェルに１００μｌの１００ｍＭグリシンｐＨ１０を加えることにより停止した。混合を通して、それらの内容物をミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）９６穴フィルタープレート（０．４５μｍ、ＰＥＳ）を通してろ過した。ろ過物を１００μｌの１０ｍＭグリシンｐＨ１０を含むプレートに希釈し、生成した可溶性糖の量をＨＰＬＣにて測定した。アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ） １１００シリーズＨＰＬＣは脱塩／ガードカラム（ｄｅ−ａｓｈｉｎｇ／ｇｕａｒｄ ｃｏｌｕｍｎ）（バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）番号１２５−０１１８) 及びアミネックスカーボハイドレートカラム（Ａｍｉｎｅｘ ｌｅａｄ ｂａｓｅｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｃｏｌｕｍｎ）(Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｐ)をすべて備えた。移動相は流速０．６ｍｌ／分での水であった。
【００７５】
振盪フラスコの場合、希酸前処理トウモロコシ茎葉を５００ｍＬの振盪フラスコへ添加し、初期加水分解は７％セルロースを含んだ。４００マイクロリットルのテトラサイクリン及び３００マイクロリットルのシクロヘキサミドを添加して微生物の増殖を抑えた。最終工程の加水分解物の体積を緩衝液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．８）で１００ｍｌまで増やした。最後に、酵素を２０ｍｇタンパク質／ｇセルロースの添加になるよう一定の総タンパク質で加え、その後各フラスコを堅く蓋を閉め振盪／インキュベーターに設置した。酵素の添加を３７℃と５０℃及び７２時間２００ｒｐｍにて重複して実施した。生成した可溶性糖を上述のＨＰＬＣにて測定した。
【００７６】
実施例７．２ ＰＡＳＣ基質を用いる全セルラーゼ及びベータ‐グルコシダーゼ１糖化アッセイ
マイクロタイタープレート糖化アッセイを１％ＰＡＳＣにおけるＢＧＬ１を含む及び含まないトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼ調製物を用いて実施した。図１は１％ＰＡＳＣでのトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼＬＡＭＩＮＥＸ ＢＧ及びＢＧＬ１を用いたマイクロタイタープレート糖化アッセイを示す。図１（Ａ）はＢＧＬ１を含む及び含まない所定量の全セルラーゼに対してプロットした全体の％転換を示す。図１（Ｂ）は同じ総タンパク質添加での全セルラーゼ単独及び全セルラーゼとＢＧＬ１により生成されるセロビオース及びグルコースの相対量を示す。
【００７７】
図１（Ａ）は１０ｍｇ／ｇの全セルラーゼに１０ｍｇ／ｇのＢＧＬ１添加は２０ｍｇ／ｇ全セルラーゼの場合と同等またはそれ以上のセルロースから糖への転換を示す。言い換えると、約半分の全セルラーゼがベータ‐グルコシダーゼによって置き換えられると、その結果全セルラーゼ単独と同等又はそれより大きい特異的性能を有する酵素混合物を得た。さらに、同量のタンパク質を用いた場合、全セルラーゼ単独より全セルラーゼとベータ‐グルコシダーゼ混合物の生産物はセロビオースに対してグルコースの高い割合を有した。約半分の全セルラーゼ調製物をＢＧＬ１で変えることは総合的な糖化速度に影響しなかった。
【００７８】
周知な方法を用いてトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼ生産菌株をＣＢＨ２プロモーターの下トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＢＧＬ１をコードするポリヌクレオチドを有するエレクトロポレーションにより形質転換し、アセタミダーゼ（ａｍｄＳ）で選別した。安定な形質転換体を一週間増殖させ、ＢＧＬ１発現レベルをＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより評価した。総セルラーゼタンパク質に比較して高いＢＧＬ１発現（総タンパク質の約５０％）を示すそれらの形質転換体についてリン酸膨張セルロースにてその活性を試験した。結果はＢＧＬ１を発現するいくつかの形質転換体は、ＢＧＬ１を過剰に発現するように形質転換されていないトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼと同等又はそれ以上の特異的性能を有することを示した。
【００７９】
実施例７．３アビセル（Ａｖｉｃｅｌ）、前処理トウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）及びサトウキビバガスにおける全セルラーゼ及びベータ‐グルコシダーゼ１糖化アッセイ
図１に示すように添加ＢＧＬ１を用いて見られる効果は純セルロース及び非結晶性セルロースであるＰＡＳＣ基質を用いた場合だけではなかった。また、類似の効果が他のセルロース原料を用いて観察された。これらの原料は結晶性セルロース（アビセル（Ａｖｉｃｅｌ））、希酸前処理トウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）及び希酸前処理サトウキビバガスである。図２はＰＡＳＣ基質を用いた場合について上述したように、７％セルロース固体でアビセル（Ａｖｉｃｅｌ）を用いて実施した実験結果を示す。図２は７％アビセル（Ａｖｉｃｅｌ）におけるトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼＬＡＭＩＮＥＸ ＢＧ及びＢＧＬ１を用いたマイクロタイタープレート糖化アッセイを示す。図２（Ａ）はＢＧＬ１を含む及び含まない所定量の全セルラーゼに対してプロットした全体の％転換を示す。図２（Ｂ）は同じ総タンパク質添加での全セルラーゼ単独及び全セルラーゼとＢＧＬ１により生成されるセロビオース及びグルコースの相対量を示す。ＰＡＳＣの場合と同様に、半分の全セルラーゼ調製物をＢＧＬ１で置き換えることは全体の％転換に変化を与えなかった。ベータ‐グルコシダーゼの追加はグルコースに対するセロビオースの比率を増加させたが、全セルラーゼ単独がアビセル（Ａｖｉｃｅｌ）においてかなり高いグルコース対セロビオースの比を生産するので、その効果はＰＡＳＣを用いた場合のように明確ではない。ＰＣＳ及びバガスは両者の総合的な転換及びセロビオースに対するグルコースの比率（図３及び図４）においてアビセル（Ａｖｉｃｅｌ）にみられた結果と同様の結果を得た。図３は７％セルロースにてＰＣＳでのトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼＬＡＭＩＮＥＸ ＢＧ及びＢＧＬ１を用いたマイクロタイタープレート糖化アッセイを示す。（Ａ）はＢＧＬ１を含む及び含まない所定量の全セルラーゼに対してプロットした全体の％転換を示す。（Ｂ）は同じ総タンパク質添加での全セルラーゼ単独及び全セルラーゼとＢＧＬ１により生成されるセロビオース及びグルコースの相対量を示す。また、７％ＰＣＳでのＢＧＬ１に対する全セルラーゼの比率を振盪フラスコで試験した。振盪フラスコのデータはマイクロタイタープレートで観察されたものとよく相関していた（データ示さず）。図４は７％サトウキビバガスでのトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）全セルラーゼ及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ベータ‐グルコシダーゼ１を用いたマイクロタイタープレート糖化アッセイであって、全体の％転換（Ａ）及び生成されるセロビオースとグルコースの相対量（Ｂ）及びベータ‐グルコシダーゼの量の増加に伴う％転換（Ｃ）の結果を示す。
【００８０】
実施例７．４．前処理トウモロコシ茎葉における糸状菌全セルラーゼ及びベータ‐グルコシダーゼ糖化アッセイ
ベータ‐グルコシダーゼの添加効果が菌株トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼに対して特徴的であるか調べるために、７％セルロース固体にてＰＣＳを用いた実験をＲｕｔＣ３０（別のトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼ）で繰り返した。図５は７％セルロースにてＰＣＳでのＲｕｔＣ３０全セルラーゼ及びＢＧＬ１を用いたマイクロタイタープレート糖化アッセイを示す。（Ａ）はＢＧＬ１を含む及び含まない所定量のＲｕｔＣ３０全セルラーゼに対してプロットした全体の％転換を示す。（Ｂ）は同じ総タンパク質添加でのＲｕｔＣ３０全セルラーゼ単独及びＲｕｔＣ３０全セルラーゼとＢＧＬ１により生成されるセロビオース及びグルコースの相対量を示す。
【００８１】
同量のタンパク質の時、ＲｕｔＣ３０全セルラーゼはいずれのＬＡＭＩＮＥＸ ＢＧ（図３）ほどにもセルロースを加水分解しない。約４分の１又は２分の１のＲｕｔＣ３０全セルラーゼタンパク質がＢＧＬ１で置き換わると、％転換は同量のＲｕｔＣ３０全セルラーゼ単独より大きい（図５）。この場合、特定の転換速度に到達するために必要な総合的酵素量を低減するのにベータ‐グルコシダーゼを添加してよい。
【００８２】
実施例７．５ ＰＡＣＳ及び前処理トウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）における全セルラーゼ及び精製ベータ‐グルコシダーゼ１糖化アッセイ
図６は１％ＰＡＣＳにおけるトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼＬＡＭＩＮＥＸ ＢＧ及び精製ＢＧＬ１を用いたマイクロタイタープレート糖化アッセイである。（Ａ）はＢＧＬ１を含む及び含まない所定量のトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼ及びＢＧＬ１に対してプロットした全体の％転換を示す。（Ｂ）は同じ総タンパク質添加でのトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼ及びＢＧＬ１により生成されるセロビオース及びグルコースの相対量を示す。図７は７％セルロースにてＰＣＳでのトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）全セルラーゼＬＡＭＩＮＥＸ ＢＧ及び精製ＢＧＬ１を用いたマイクロタイタープレート糖化アッセイである。（Ａ）はＢＧＬ１を含む及び含まない所定量のトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼに対してプロットした全体の％転換を示す。（Ｂ）は同じ総タンパク質添加でのトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼ単独及びトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼとＢＧＬ１により生成されるセロビオース及びグルコースの相対量を示す。ＢＧＬ１と全セルラーゼの約５０：５０の混合物由来の％転換は基質として１％ＰＡＳＣ又は７％ＰＣＳのいずれを使用する場合でも同量の全セルラーゼ単独より高い（図６及び７）。また、ＰＣＳ及びＰＡＳＣ両方における１５ｍｇ／ｇトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼ及び５ｍｇ／ｇＢＧＬ１の混合物は２０ｍｇ／ｇトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼより高い転換を得る。未精製ＢＧＬ１を用いるように、グルコースとセロビオースの比は精製ＢＧＬ１の添加により増加し、ＰＡＳＣにおいて顕著な違いがみられる。
【００８３】
実施例７．６ アビセル（Ａｖｉｃｅｌ）、前処理トウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）及びサトウキビバガスにおける全セルラーゼ及びベータ‐グルコシダーゼ３又はベータ‐グルコシダーゼ７糖化アッセイ
上述する全セルラーゼにベータ‐グルコシダーゼを添加する利点はＢＧＬ１に限定されない。二つの他のトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）ベータ‐グルコシダーゼ、ＢＧＬ３及びＢＧＬ７についてもＰＡＳＣ及びＰＣＳにおけるマイクロタイタープレート糖化アッセイにて全セルラーゼを用いて試験した。
【００８４】
図８は１％ＰＡＣＳにおけるトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）全セルラーゼＬＡＭＩＮＥＸ ＢＧ及び精製ＢＧＬ３を用いたマイクロタイタープレート糖化アッセイを示す。（Ａ）はＢＧＬ３を含む及び含まない所定量のトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼに対してプロットした全体の％転換を示す。（Ｂ）は同じ総タンパク質添加でのトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼ単独及びトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼとＢＧＬ３により生成されるセロビオース及びグルコースの相対量を示す。全セルラーゼへの同量の精製ＢＧＬ３の添加はＰＡＣＳを用いたときＢＧＬ１（図６Ａ）でみられる効果と同様であるか、わずかに低い効果を有する。１０ｍｇ／ｇ全セルラーゼ単独に対する改善の一方、１０ｍｇ／ｇトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼ及び１０ｍｇ／ｇＢＧＬ３の混合物は、ＢＧＬ１（図６Ａ）の場合に見られるように、２０ｍｇ／ｇトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼと等しい転換を与えない。しかし、５ｍｇ／ｇＢＧＬ３を用いた１５ｍｇ／ｇトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼのブレンドはＢＧＬ１を用いてみられたような明らかな効果ではないけれども、トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼ単独の同量の総タンパク質の添加よりも優れた性能効果を有する。また、トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼ総タンパク質の約半分をＢＧＬ３で交換するとセロビオースに対するグルコースの比率を増加する。しかし、糖の総量は少し低い（図８Ｂ）。効果は７％セルロースでのＰＣＳの場合と同様である。約半分の総タンパク質をＢＧＬ３に置き換えると同様の結果が得られるが、しかし可溶性糖へのセルロースの％転換は高くない（図９Ａ）。ＢＧＬ１（図７Ａ）を用いたときと結果は同様であるが、効果はその場合ほど明らかでない。また、セロビオースに対するグルコースの比率は低いが、セロビオース濃度の低下は少ない。これは驚くべきことではない。なぜなら総セロビオースの生産はＰＡＳＣよりＰＣＳの方が低いからである。
【００８５】
別のトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）ベータ‐グルコシダーゼであるＢＧＬ７もＢＧＬ１及びＢＧＬ３と同様な方法で１％ＰＡＳＣにおいて試験した。図１０は１％ＰＡＳＣにおけるトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼＬＡＭＩＮＥＸ ＢＧ及び精製ＢＧＬ７を用いたマイクロタイタープレート糖化アッセイを示す。ＢＧＬ７を含む及び含まない所定量のトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼに対してプロットした全体の％転換を示す。大量のＢＧＬ７（図１０）の添加による改善があるけれども、ＢＧＬ１及びＢＧＬ７（図６Ａ、７Ａ）にみられる効果のように明らかでない。同量のタンパク質に基づいて、全セルラーゼ単独より高い特異的性能を有するＢＧＬ７及びトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼの混合物はない。
【００８６】
実施例７．７ 全セルラーゼ活性及びベータ‐グルコシダーゼ活性
表１はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）全セルラーゼ（ＷＣ）及びベータ‐グルコシダーゼ１の活性単位の比を示す。マイクロタイタープレート糖化アッセイに添加する酵素は活性単位／ｍｇタンパク質を乗じることによりｍｇ総タンパク質から活性単位へ変換した。トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）全セルラーゼは１４ＣＭＣ Ｕ／ｍｇ（Ｂｅｒｌｉｎ， Ａ．； Ｍａｘｉｍｅｎｋｏ， Ｖ．； Ｇｉｌｋｅｓ， Ｎ．； Ｓａｄｄｌｅｒ， Ｊ．“Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒ ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ． ２００７， ９７（２）， ２８７‐２９６）であり、一方、ＢＧＬ１の活性はｐＮＰＧアッセイ（７７ｐＮＰＧ Ｕ／ｍｇ）を用いて測定した。表１はｗｔ：ｗｔに基づくトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）全セルラーゼ対ＢＧＬ１の比とし、基質における１グラムのセルロース当たり添加した対応活性単位を示す。ｐＮＰＧ Ｕ／ｇ値をＣＭＣ Ｕ／ｇ値で割ることにより混合物に存在するｐＮＰＧ／ＣＭＣ活性の比率を与え、この比率は基質又は酵素添加量に依存しない。
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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