(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のもの：
（ｉ）モノクローナルヒト抗体又はその抗原結合断片であってヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なもの、その際、前記モノクローナル抗体は少なくとも１の重鎖可変領域及び少なくとも１の軽鎖可変領域を含み、その際、この重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のアミノ酸配列は次のとおりである：
（ａ1）ＣＤＲ  Ｈ１：Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ（配列番号１３）、
（ｂ1）ＣＤＲ  Ｈ２：Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ（配列番号１５）、
（ｃ1）ＣＤＲ  Ｈ３：Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ（配列番号１７）、
かつ、この軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のアミノ酸配列は次のとおりである：
（ａ3）ＣＤＲ  Ｌ１：Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ａｌａ（配列番号１９）、
（ｂ3）ＣＤＲ  Ｌ２：Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｔｈｒ（配列番号２０）、
（ｃ3）ＣＤＲ  Ｌ３：Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ（配列番号２１）
を、ケラチノサイト棘融解の予防及び／又は治療のための医薬品の製造のために用いる使用。
【請求項２】
前記抗体又はその抗原結合断片が、部分的に又は完全にヒト化した抗体、完全にヒト化した単鎖抗体の部分又はその断片から選択される請求項１記載の使用。
【請求項３】
ケラチノサイト棘融解が天疱瘡において生じ、前記天疱瘡がアポトーシス経路の活性化及び／又はデスモグレインの開裂に関連している請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
ケラチノサイト棘融解に対して有効な少なくとも１の更なる療法との併用療法にある請求項１から３のいずれか１項記載の使用。
【請求項５】
少なくとも１の更なる免疫抑制薬剤療法と組み合わせた請求項４記載の使用。
【請求項６】
前記免疫抑制薬剤として少なくとも１の更なるステロイドを使用する請求項５記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の詳細な説明
本発明は、ケラチノサイト棘融解に関連した皮膚疾病の予防及び／又は治療のための、特に天疱瘡の予防及び／又は治療のための、ヒトＦａｓリガンド（ＣＤ９５Ｌ又はＡｐｏ１Ｌとも呼ばれる、以下ではＦａｓＬと略称する）のアンタゴニストの使用、特にＦａｓＬに対するヒト化抗体の使用に関する。
【０００２】
天疱瘡は、自己免疫水疱性皮膚状態であり、デスモソームタンパク質（デスモグレイン、ｄｓｇ）に対して指向した自己抗体のために、ケラチノサイト付着の損失により特徴付けられる。天疱瘡は、１年あたり１０００００人につき約１〜５人の発症率でもって、そして女性に多い、世界的分布を有する。
【０００３】
天疱瘡は、棘融解として知られるプロセスにおいてまとめられる基底上ケラチノサイト（suprabasal keratinocyte）の付着の損失により特徴付けられる。天疱瘡の病原論について大きな修正が進行中であり、その原因の大半は、抗デスモグレイン抗体に加えて、新規な一群の抗コリン作動性レセプター抗体が棘融解を誘発できることにある（Kalish, 2000）。さらに、立体障害単独では、抗原−抗体結合の場合に水疱形成を担うことができないことが実証されている（Kitajima, 2002）。さらに、デスモソーム形成は、天疱瘡に結合する天疱瘡自己抗体（ＰＶＩｇＧ）により阻害されることはないが、その一方で、このデスモソーム連結はＰｖＩｇＧでの処置２４〜３６時間後に解離することが示されている。この期間の間に、ＰＶＩｇＧにより引き起こされる一連のシグナル伝達段階が生じる。
【０００４】
これら観察は、天疱瘡におけるアポトーシスの役割を示唆する。確かに、天疱瘡は、細胞付着の欠失のために生じる疾病であり（Payne AS et al, 1978）、アポトーシスは、細胞剥離と関連して生じることができる（Marconi et al, 2004）。これらコンセプトは、病変性天疱瘡皮膚中のアポトーシスの検出により十分に確認されている。特に、棘融解性細胞は、アポトーシスの主要マーカーを発現する（Wang X et al, 2004）。より興味深いことに、ＴＵＮＥＬラベル化核もまた、水疱上部（blister roof）に取り付けられていることが見出され、このことは、剥離前の病変周辺皮膚中のアポトーシス細胞の存在を示唆する。さらに、Ｉｇ及び活性化したカスパーゼ８を発現するアポトーシス細胞が、この病変の端で検出され、この領域中では細胞−細胞接触の破壊は可視可能でない（Wang X et I, 2004）。これらデータは確かに、天疱瘡において棘融解前にケラチノサイト中でアポトーシスが生じることを実証する。
【０００５】
アポトーシスは、細胞性ホメオスタシスの調節において根本的な役割を果たし、かつ、多くの病態生理学的プロセスにおいて関連している。アポトーシスは、細胞から細胞への（cell to cell）剥離（Rezgui et al, 2000; Bergin et al, 2000）と、細胞−マトリックス相互作用の損失（Giancotti and Ruoslahti, 1999）の両者に続くことができる。
【０００６】
Ｆａｓ（又はＦａｓＲ）は、ＴＮＦ−レセプタースーパーファミリーの一員であり、これは、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）と結合すると、多くの細胞システム中でアポトーシスを引き起こす（Sharma et al, 2000）。Ｆａｓ−ＦａｓＬ−誘発されたアポトーシスの細胞内シグナリングは、多数のアダプター分子、例えばＦＡＤＤ（Ｆａｓ関連デスドメイン）及びＦＬＩＣＥ（ＦＡＤＤ様ＩＣＥ、カスパーゼ８）の動員を介して作動し、これは次に、ＦＬＩＰ（ＦＬＩＣＥ阻害性タンパク質）により阻害される（Juo et al, 1998）。Ｆａｓ−ＦａｓＬ相互作用は、幾つかの免疫炎症性及び感染性状態、例えばＡＩＤＳ（Bahr et al, 1997）及び全身性エリトマトーデス（Kovacs et al, 1997）の病理機構（pathomechanism）において関連している。Ｆａｓ−ＦａｓＬ経路の影響により特徴付けられる皮膚病は、急性移植片対宿主疾病、毒性表皮壊死病及びメラノーマを含む（Wehrli et al, 2000）。さらに、棘融解様病変（acantholytic-like lesion）が、ＰＶＩｇＧ及び抗ＦａｓＲの両者で処置された培養したケラチノサイト中で観察されるが、その一方で、この病変形成数時間前に、この細胞膜上でＦａｓＲ、ＦａｓＬ、及びカスパーゼ−８のクラスター化をＰｖＩｇＧが誘発することが報告された（Wang X et al, 2004）。さらに、カスパーゼ−１様阻害剤が、天疱瘡マウスモデル中でこの水疱形成を有意に遮断することが報告された（Li et al, 2006）。まとめると、これらデータは、ＦａｓＬ及びこの外因性アポトーシス経路が、棘融解の根底をなす機構において決定的な役割を果たすことを示唆する。
【０００７】
天疱瘡自己抗体の性質がなんであれ、ＰＶＩｇＧに対する曝露は、棘融解の数時間前に、ＦａｓＬを含めた幾つかのアポトーシス促進性遺伝子の発現を上方制御する。さらに、静脈性ＩｇＧ（ＩＶＩｇＧ）は、ケラチノサイト中で、ＰｖＩｇＧ誘発されたＦａｓＬの上方制御及びアポトーシスを妨げる。ＩＶＩｇＧもまた、棘融解及びアポトーシスをｉｎ  ｖｉｖｏで妨げる（Arredondo J et al, 2005）。
【０００８】
処置なしでは、尋常性天疱瘡の致死率は１００％に達する。初期の全身性療法が天疱瘡の制御には必要とされるが、しかし、全身性療法からの副作用は主要な合併症である。処置は、コルチコステロイド、金を含む医薬、抗炎症性薬剤ダプゾン、又は免疫システムを抑制する医薬（例えば、アザチオプリン、メトトレキサート、サイクロスポリン、サイクロホスファミド、又はミコフェノール酸モフェチル）の投与を含む。天疱瘡のための最も一般的な処置は、現在では、生涯投与される必要があり、かつ、深刻な副作用を生じることがあるステロイドである。大抵の天疱瘡患者は、この副作用により死亡する。幾つかの抗体もまた有効であり、特にミノサイクリン及びドキシサイクリンである。静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）は、時に使用される。プレスマフェレシスは、抗体含有血漿が血液から取り除かれ、静脈液体又は供与された血漿で置き換えられるプロセスである。プレスマフェレシスは、血流中の抗体の量を減少させるため全身性医薬に加えて使用されてよい。数々の新規分子もまた開発されている：ミコフェノール酸モフェチル、ＰＩ−０８２４、ＰＲＴＸ−１００、抗ＣＤ２０は、Ｔ細胞及びＢ細胞に対して作用する免疫抑制薬剤である。
【０００９】
現在の致死率は未だ５〜２５％の範囲内にある；感染は最も頻繁な死の原因であり、かつ、長期間の免疫抑制療法（主としてコルチコステロイド）は、未だに高い致死率を惹起する重大な因子の１つである。免疫グロブリンは、いくばくかの短期間改善を生じることができるが、しかし、持続的な緩解を誘発するようには見えず、そして、そのコストのために長期使用のためには実際的でない。
【００１０】
幾つかの警告もまたプラスマフェレシスの使用に存在する。プレドニゾン又は他の免疫抑制薬剤で抑制され、プラスマフェレシスを受ける患者は、敗血症からの突然死のより高いリスクを有する。さらに、この処置は極めて高価であり、２週間の入院期間がこの療法を投与するために必要である。したがって、敗血症からの突然死のリスク及び高コストのために、プラスマフェレシスは、患者が明らかにこの疾病自体のために死ぬリスクを有する、極めて手に負えない場合にだけ指示される。
【００１１】
本発明の課題は、天疱瘡のための治療的薬剤を提供することにある。ＦａｓＬを遮断する新規薬剤の開発は、細胞剥離及び皮膚病変の形成を完全に妨げることを可能にするはずである。
【００１２】
一般的に、本発明は、ＦａｓＬアンタゴニストの投与によるケラチノサイト棘融解に関連する皮膚疾病の治療に関する。ＦａｓＬアンタゴニストは、抗ＦａｓＬ抗体、特にヒト化したか又はヒトの抗ＦａｓＬ抗体、Ｆａｓ発現の核酸エフェクター分子、例えばアンチセンス分子又はＲＮＡ干渉可能な分子、例えばｓｉＲＮＡ分子、溶解性Ｆａｓレセプター分子、アンタゴニスト性ＦａｓＬムテイン、及び低分子量化学化合物であってＦａｓ−ＦａｓＬ相互作用を阻害するものから選択されてよい。ＦａｓＬアンタゴニストは、ケラチノサイトアポトーシス及び引き続く細胞−細胞剥離（棘融解）を妨げる。このようにして、ＦａｓＬアンタゴニストは、天疱瘡の予防及び／又は治療のために、例えば、粘膜皮膚天疱瘡の予防及び／又は治療のために特に適している。
【００１３】
本発明は、ＦａｓＬの生物学的作用を阻害する少なくとも１の化合物を含有する医薬品に関する。「ＦａｓＬの生物学的作用を阻害する化合物」との表現は、本願で使用される場合に、完全に又は少なくとも大幅に、ＦａｓＬの生物学的作用を阻害又は中和できる全ての化合物を指す。例えば、この阻害性又は中和性の作用は、その天然のレセプターへのＦａｓＬへの結合の抑制、ひいてはこのように引き起こされるシグナル伝達の抑制を基礎としてよい。これは、例えば、ＦａｓＬ自体に結合する抗体又はＦａｓを模倣する溶解性レセプター又はアンタゴニスト性ＦａｓＬムテインの使用により達成されてよく、このようにして、この細胞レセプターに対するＦａｓＬの結合を遮断する。Ｆａｓ又はＦａｓＬ発現をｓｉＲＮＡで干渉することは、Ｆａｓ／ＦａｓＬシステムを遮断するはずである。
【００１４】
ＦａｓＬアンタゴニスト療法は、単独療法であるか、又は、天疱瘡又は他の皮膚疾病の治療のために適した他の医薬との組み合わせにおいて与えられ、これは特に上で説明したとおりである。例えば、ＦａｓＬアンタゴニストとステロイドの併用療法は、ステロイド用量の劇的な減少を可能にする可能性がある。
【００１５】
本発明の好ましい一実施態様において、ヒトＦａｓリガンドに対する抗体、又はその活性断片を活性成分として含有する、天疱瘡のための治療的薬剤が提供される。この抗体は好ましくは、キメラの、ヒト化した又はヒトの抗ＦａｓＬ抗体又は抗原結合断片又は誘導体、例えば組み換え単鎖抗体である。所望される場合には、この抗体はエフェクター分子、例えば、細胞分裂抑制性、細胞毒性及び／又は放射性化合物にコンジュゲートされていてよい。
【００１６】
ケラチノサイト棘融解と関連した皮膚疾病、特に本発明によれば天疱瘡の治療に適した好ましいヒト化抗体は、WO 1997/002290A1（「抗Ｆａｓリガンド抗体及びこの抗体を使用するアッセイ法」）又はWO1998/010070 A1（「Ｆａｓリガンド又はその活性断片と特異的に反応するヒト化免疫グロブリン及びＦａｓリガンドヒト化抗体中で発生するアポトーシスを誘導する領域」）に説明され、この内容は参照することにより本願に組み込まれる。ケラチノサイト棘融解と関連した皮膚疾病、特に本発明によれば天疱瘡の治療に適した更に好ましいヒト抗体は、US 7,262,277（「アンタゴニスト性抗ｈＦａｓリガンドヒト抗体及びその断片」）に説明され、この内容も参照することにより本願に組み込まれる。
【００１７】
ヒトの又はヒト化した抗体は、ヒト療法における使用のためにマウス及び幾つかの場合にはキメラ抗体に対して少なくとも３つの潜在的利点を有する：１）エフェクター部分がヒトであるために、これはヒトシステムの他の部分とより良好に相互作用してよい；２）ヒト免疫システムは、外来物としてのヒト化抗体のフレームワーク又はＣ領域を認識すべきでなく、したがって、このような注射された抗体に対する抗体応答は、完全に外来性のマウス抗体又は部分的に外来性のキメラ抗体に対してより低いはずである；３）注射されたヒト化抗体は推論によれば天然に生じるヒト抗体のものに近い半減期を有し、これにより、より少量の及びより頻度の少ない用量を与えられることが可能になる。
【００１８】
更に好ましいＦａｓＬアンタゴニストは、溶解性ＦａｓＲ分子であってＦａｓレセプターの細胞外溶解性部分を有するもの又は改変されたアンタゴニスト性ＦａｓＬ分子であって競合的又は非競合的アンタゴニスト性活性を有するものである。これら分子は、ＦａｓＬがこの溶解性レセプターアナログに結合するか又はアンタゴニスト性ＦａｓＬ分子が天然のレセプターに結合し、これにより、この天然のレセプターに対する生物学的に活性のあるＦａｓＬの結合を減少又は完全になくすことにより、ＦａｓＬ／ＦａｓＲ相互作用を阻害する。ｓｉＲＮＡでの処置の間に、Ｆａｓ及び／又はＦａｓＬタンパク質又はＲＮＡレベルの分析が、処置のタイプ及び被験体の処置における療法の経路を決定するために使用されることができる。Ｆａｓ及び／又はＦａｓＬタンパク質又はＲＮＡレベルのモニタリングは、処置の結果を予想するために、そして、化合物及び組成物であって、トレイト、状態又は疾病と関連した特定のＦａｓ及び／又はＦａｓＬタンパク質のレベル及び／又は活性を調節するものの効力を決定するために使用されることができる。
【００１９】
特に好ましい一観点において、本発明は次のもの：
（ｉ）モノクローナルヒト抗体又はその抗原結合断片であってヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なもの、その際、前記モノクローナル抗体は少なくとも１の重鎖可変領域及び少なくとも１の軽鎖可変領域を含み、その際、この重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のアミノ酸配列は次のとおりである：
（ａ1）ＣＤＲ  Ｈ１：Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ（配列番号１）、
（ｂ1）ＣＤＲ  Ｈ２：Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  （配列番号２）、
（ｃ1）ＣＤＲ  Ｈ３：Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ（配列番号３）又は
（ｄ1）配列番号１、２及び／又は３のアミノ酸１、２又は３個を置換することにより得られる配列
かつ／又は、この軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のアミノ酸配列は次のとおりである：
（ａ2）ＣＤＲ  Ｌ１：Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ（配列番号４）、
（ｂ2）ＣＤＲ  Ｌ２：Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ（配列番号５）、
（ｃ2）ＣＤＲ  Ｌ３：Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ（配列番号６）又は
（ｄ2）配列番号４、５及び／又は６のアミノ酸１、２又は３個を置換することにより得られる配列
又は
（ｉｉ）抗体又はその抗原結合断片であって抗体（ｉ）と同じヒトＦａｓＬ上のエピトープを認識するもの、
を、ケラチノサイト棘融解と関連した皮膚疾病、特に天疱瘡の予防及び／又は治療のための医薬品の製造のために用いる使用に関する。
【００２０】
第２の特に好ましい一観点において、本発明は次のもの：
（ｉ）モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であってヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なもの、その際、前記モノクローナル抗体は、アクセッション番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５０４５のハイブリドーマ細胞により生産されるか又はこれに由来する抗体又は抗体断片である、又は
（ｉｉ）モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって抗体（ｉ）と同じヒトＦａｓＬ上のエピトープを認識するもの、
を、ケラチノサイト棘融解と関連した皮膚疾病、特に天疱瘡の予防及び／又は治療のための医薬品の製造のために用いる使用に関する。
【００２１】
第３の特に好ましい一観点において、本発明は次のもの：
（ｉ）モノクローナルヒト抗体又はその抗原結合断片であってヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なもの、その際、前記モノクローナル抗体は少なくとも１の重鎖可変領域及び少なくとも１の軽鎖可変領域を含み、その際、この重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のアミノ酸配列は次のとおりである：
（ａ1）ＣＤＲ  Ｈ１：Ｇｌｕ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ（配列番号７）、
（ｂ1）ＣＤＲ  Ｈ２：Ｍｅｔ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ（配列番号８）、
（ｃ1）ＣＤＲ  Ｈ３：Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ（配列番号９）又は
（ｄ1）配列番号７、８及び／又は９のアミノ酸１、２又は３個を置換することにより得られる配列
かつ／又は、この軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のアミノ酸配列は次のとおりである：
（ａ2）ＣＤＲ  Ｌ１：Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ（配列番号１０）、
（ｂ2）ＣＤＲ  Ｌ２：Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ（配列番号１１）、
（ｃ2）ＣＤＲ  Ｌ３：Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ（配列番号１２）又は
（ｄ2）配列番号１０、１１及び／又は１２のアミノ酸１、２又は３個を置換することにより得られる配列
又は
（ｉｉ）抗体又はその抗原結合断片であって抗体（ｉ）と同じヒトＦａｓＬ上のエピトープを認識するもの、
を、ケラチノサイト棘融解と関連した皮膚疾病、特に天疱瘡の予防及び／又は治療のための医薬品の製造のために用いる使用に関する。
【００２２】
第４の好ましい一観点において、本発明は次のもの：
（ｉ）モノクローナル抗体又はその抗体結合断片であってヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なもの、その際、前記モノクローナル抗体は、アクセッション番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５３３、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５３４及び／又はＦＥＲＭ  ＢＰ−５５３５のハイブリドーマ細胞により生産されるか又はこれに由来する抗体又は抗体断片である、又は
（ｉｉ）モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって（ｉ）の抗体と同じヒトＦａｓＬ上のエピトープを認識するもの、
を、ケラチノサイト棘融解と関連した皮膚疾病、特に天疱瘡の予防及び／又は治療のための医薬品の製造のために用いる使用に関する。
【００２３】
特に好ましい一実施態様において、本発明は、抗ＦａｓＬヒト抗体、又はその抗原結合部分であって、軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を含むものの使用に関し、これはUS 7,262,277に説明されており、この内容は、参照することにより本願に組み込まれる。特に、本発明によりケラチノサイト棘融解と関連した皮膚疾病の治療のために適した好ましい抗ＦａｓＬヒト抗体は、軽鎖可変領域を含み、これはUS 7,262,277の配列番号２に示される配列を有するポリペプチドを含み（これは参照により組み込まれる）、かつ、さらに重鎖改変領域を含み、これはUS 7,262,277の配列番号１０又は１８に示される配列を有するポリペプチドを含む（これは参照により組み込まれる）。特に、本発明は、抗ｈＦａｓヒト抗体３Ｅ１（アクセッション番号ATCC PTA-4017を有するハイブリドーマ細胞により生産される）及び／又は４Ｇ１１（アクセッション番号ATCC PTA-4018を有するハイブリドーマ細胞により生産される）（これはUS 7,262,277に説明される（参照により本願に組み込まれる））の、ケラチノサイト棘融解と関連した皮膚疾病、特に天疱瘡の予防及び／又は治療のための医薬品の製造のための使用に関する。
【００２４】
更なる好ましい一観点において、本発明は次のもの：
（ｉ）モノクローナルヒト抗体又はその抗原結合断片であってヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なもの、その際、前記モノクローナル抗体は少なくとも１の重鎖可変領域及び少なくとも１の軽鎖可変領域を含み、その際、この重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のアミノ酸配列は次のとおりである：
（ａ1）ＣＤＲ  Ｈ１：Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ（配列番号１３）又は
（ａ2）ＣＤＲ  Ｈ１：Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ（配列番号１４）、
（ｂ1）ＣＤＲ  Ｈ２：Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  （配列番号１５）又は
（ｂ2）ＣＤＲ  Ｈ２：Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  ＧＩｙ（配列番号１６）、
（ｃ1）ＣＤＲ  Ｈ３：Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ（配列番号１７）又は
（ｃ2）ＣＤＲ  Ｈ３：Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ（配列番号１８）又は
（ｄ1）配列番号１３、１４、１５、１６、１７及び／又は１８のアミノ酸１、２又は３個を置換することにより得られる配列
かつ／又は、この軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のアミノ酸配列は次のとおりである：
（ａ3）ＣＤＲ  Ｌ１：Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ａｌａ（配列番号１９）、
（ｂ3）ＣＤＲ  Ｌ２：Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｔｈｒ（配列番号２０）、
（ｃ3）ＣＤＲ  Ｌ３：Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ（配列番号２１）又は
（ｄ3）配列番号１９、２０及び／又は２１のアミノ酸１、２又は３個を置換することにより得られる配列
又は
（ｉｉ）抗体又はその抗原結合断片であって抗体（ｉ）と同じヒトＦａｓＬ上のエピトープを認識するもの、
を、ケラチノサイト棘融解と関連した皮膚疾病、特に天疱瘡の予防及び／又は治療のための医薬品の製造のために用いる使用に関する。
【００２５】
最後に更に好ましい一観点において、本発明は次のもの：
（ｉ）モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であってヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なもの、その際、前記モノクローナル抗体は、アクセッション番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４０１７及び／又はＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４０１８のハイブリドーマにより生産されるか又はこれに由来する抗体又は抗体断片である、又は
（ｉｉ）モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって抗体（ｉ）と同じヒトＦａｓＬ上のエピトープを認識するもの、
を、ケラチノサイト棘融解と関連した皮膚疾病、特に天疱瘡の予防及び／又は治療のための医薬品の製造のために用いる使用に関する。
【００２６】
アクセッション番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４０１７及びＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４０１８のハイブリドーマ細胞は、２００２年１月２９日付けで、the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virgina 20110-2209（USA）に寄託されている。
【００２７】
本発明の医薬品は、製薬学的に許容可能なキャリアーと一緒に製薬学的組成物として提供されてよい。好ましくは、この製薬学的組成物は、注射又は輸液により投与され、例えば静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は他の適した手段により投与される。この組成物は、局所的に又は全身的に投与されてよい。好ましくは、この組成物は全身的に投与される。
【００２８】
本発明における使用のために適している製薬学的組成物は、この活性成分を、この意図される目的を達成するための有効量で含有する。本発明の医薬品の有効用量は、０．１μｇ〜１００ｍｇの範囲内にあってよく、投与経路に依存して約１ｇの全用量までであってよい。この製薬学的組成物は、毎日、例えば１回又は複数回、又は２〜４日毎、毎週、又は２週間に１回投与されてよい。この医薬品は、１又は複数の医薬品投与からなる単独治療サイクルで又はそれぞれ１又は複数の医薬品投与からなる複数の治療サイクルで投与されてよい。各治療サイクルは、１日間から数週、数月又は数年までの期間を有してよい。
【００２９】
このようにして、本発明によれば、この医薬品は、ケラチノサイト棘融解と関連した皮膚疾病に対して、特に天疱瘡に対して有効な、少なくとも１の更なる療法との併用療法において使用されてもよい。この医薬品は、単独で又は他の免疫抑制薬剤と、特にステロイドと組み合わせて、その用量を減少するために及び／又はその慢性副作用を最小限にするために使用される。組み合わせて使用される場合には、この医薬品は好ましくは月ベースで投与される。単独で使用される場合には、この医薬品は好ましくは、個々人の場合に応じて時間枠内で連続的に投与される。
【００３０】
さらに、本発明は、以下の実施例によってより詳細に説明されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、病変周辺表皮からの基底上の層において、正常皮膚と比較して、大抵のケラチノサイトはアポトーシス性であったことを示す図である。
【図２】図２は、カスパーゼ−３断片がこの水疱の上部及び下部の両者に局在し、この場合に幾つかの細胞は病変周辺表皮中でポジティブであったことを示す図である。
【図３】図３は、健康な被験体又はステロイド処置を受ける患者からのでなく、天疱瘡からの血清が、ヒトケラチノサイト中でアポトーシスを誘発したことを示す図である。
【図４】図４は、ＦａｓＬレベルは未処置患者からの血清中で極めて高く、かつ、コルチコステロイドで処置した患者からの血清中又は健康な被験体からの血清中で検出限度の下であったこと（図４Ａ）、ＦａｓＬレベルは、全身性ステロイド療法とともに連続的に減少したこと（図４Ｂ）を示す図である。
【図５】図５は、粘膜皮膚天疱瘡（ＰＭＣ）ＦａｓＲは、この表皮層を通じて、そして水疱形成前にさえも、発現しているように見えることを示す図である。
【図６】図６は、抗ＦａｓＬ中和抗体又はカスパーゼ−８阻害剤の添加は部分的に、天疱瘡血清誘発したケラチノサイトアポトーシスを妨げたことを示す図である。
【図７】図７は、未処置細胞に比較して、天疱瘡血清で処置したケラチノサイト中でカスパーゼ−８が顕著に活性化しているが、その一方で、カスパーゼ開裂は、抗ＦａｓＬ抗体を用いた前処置により部分的に阻害されたことを示す図である。
【図８】図８は、ステロイド療法下にある患者からの血清でなく、未処置患者からの血清は、Ｄｓｇ１及びＤｓｇ３を著しく開裂したことを示す図である。
【図９】図９は、増加する量のＦａｓＬ（０．１、１０、１００ｎｇ／ｍｌ）でのケラチノサイトの処置は、用量依存的にｄｓｇｓを開裂したことを示す図である。
【図１０】図１０は、抗ＦａｓＬ  Ａｂ（ＮＯＫ２）がＦａｓＬ誘発したｄｓｇ開裂及びカスパーゼ−８誘発されたアポトーシスを妨げること（図１０Ａ）、抗ＦａｓＬ（ＮＯＫ２）Ａｂが、ＦａｓＬ誘発した細胞から細胞への剥離、すなわち、棘融解を妨げること（図１０Ｂ）を示す図である。
【図１１】図１１は、抗ＦａｓＬ抗体が、用量依存的にＦａｓＬ誘発したｄｓｇ３開裂を妨げることを示す図である。
【図１２】図１２は、ＦａｓＬ又はカスパーゼ−８活性化したアポトーシス経路を阻害することが、カスパーゼ−８活性化及びｄｓｇ開裂の両者を妨げ、このようにして棘融解を遮断することを示すことを示す図である。
【図１３】図１３は、ＦａｓＬ単独がＤｓｇ３を開裂しかつカスパーゼ−８を活性化する一方で、両者のヒト抗体ＰＴＡ−４０１７及びＰＴＡ−４０１８及びヒト化抗体ＢＰ−５０３５及びＢＰ−５０４５がこの作用を妨げること（図１３Ａ）、ＦａｓＬ単独が細胞から細胞への剥離及び棘融解を誘発する一方で、異なる濃度のヒト抗ＦａｓＬ抗体ＰＴＡ−４０１７及びＰＴＡ−４０１８がこの作用を妨げること（図１３Ｂ）を示す図である。
【図１４】図１４は、正常ヒトＩｇＧで処置したマウス中でなくＰＶＩｇＧで処置したマウス中でだけ水疱が発達すること（図１４Ａ）、アポトーシスをＴＵＮＥＬ又はカスパーゼ−３活性化のいずれかによってＰＶＩｇＧで処置したマウス中でだけ検出したこと（図１４Ｂ）を示す図である。
【図１５】図１５は、抗ＦａｓＬ処置したマウス中の裂の長さは顕著に減少したことを示す図である。
【００３２】
実施例
我々は最初に、ＴＵＮＥＬ染色により未処置の天疱瘡患者からの凍結切片における病変周囲皮膚（perilesional skin）からの表皮におけるアポトーシスの存在を評価した。蛍光試験片を、共焦点走査型レーザー顕微鏡により分析した。病変周辺表皮からの基底上の層において、正常皮膚と比較して、大抵のケラチノサイトはアポトーシス性であった（図１）。
【００３３】
天疱瘡病変中のアポトーシスを確認するために、我々は、ホルマリン固定しかつパラフィン包理したバイオプシーを使用し、かつ、活性形態のカスパーゼ−３を検出した。染色プロトコルをUltraVision LP Detection System AP Polymer and Fast Red Chromogen（Lab Vision Corporation, CA, USA）により、製造者指示に応じて実施した。可視化をナフトールホスファート基質中のFast Redタブレットでもって獲得した。天疱瘡試料中で、我々は、カスパーゼ−３断片がこの水疱の上部（roof）及び下部（floor）の両者に局在することを見出し、この場合に幾つかの細胞は病変周辺表皮中でポジティブであった（図２）。この結果は、ケラチノサイト細胞死が、棘融解を生じるケラチノサイトの剥離前に生じることを示唆するようである。
【００３４】
アポトーシス性ケラチノサイトは天疱瘡中に豊富に発現しているので、我々は、天疱瘡血清は正常なヒトのケラチノサイト中でアポトーシスを誘導できるかどうかを調査したかった。この目的のために、ケラチノサイトをチャンバースライド中に配置し、かつ、プレコンフルエンス（preconfluence）まで血清不含培地（ＫＧＭ）中で培養した。次いで細胞をケラチノサイト基礎培地中で培養し、未処置患者又は全身性コルチコステロイドで処置した患者のいずれかからの２５％の血清の添加とともに４８時間処置した。健康な被験体からの血清をコントロールとして使用した。アポトーシスをＴＵＮＥＬ染色によりｉｎ  ｓｉｔｕで評価した。ランダムに選択した領域中の約１００個の細胞を評価し、このＴＵＮＥＬポジティブ細胞のパーセンテージをカウントした。健康な被験体又はステロイド処置を受ける患者からのでなく、天疱瘡からの血清が、ヒトケラチノサイト中でアポトーシスを誘発した（図３Ａ−Ｂ）。
【００３５】
Ｆａｓ／ＦａｓＬシステムは多くのアポトーシス性プロセスにおいて皮膚レベルでも影響するので（Wehrli et al, 2000）、我々は２箇所の酵素免疫アッセイ（two-site enzyme immunoassay）（ＥＬＩＳＡ）により天疱瘡患者からの血清中のＦａｓＬレベルを測定した。血清濃度を、組み換えヒトＦａｓＬ標準タンパク質に対して４５０ｎｍでの吸収により決定した。ＦａｓＬレベルは未処置患者からの血清中で極めて高く、かつ、コルチコステロイドで処置した患者からの血清中又は健康な被験体からの血清中で検出限度の下であった。ＨＢＶ患者からの血清をポジティブコントロールとして使用した（図４Ａ）。１人の患者中で、ＦａｓＬレベルは、全身性ステロイド療法とともに連続的に減少した（図４Ｂ）。
【００３６】
ＦａｓＬは多量に天疱瘡血清中に含まれているので、我々は、その同族（cognate）レセプターＦａｓＲの発現を観察した。この目的のために、我々はホルマリン固定しかつパラフィン包理したバイオプシーを使用した。染色プロトコルを、製造者指示に従ってUltraVision LP Detection System AP Polymer and Fast Red Chromogen（Lab Vision Corporation, CA, USA）により実施した。可視化をナフトールホスファート基質中のFast Redタブレットでもって獲得した。ＦａｓＲが正常な皮膚中の基底ケラチノサイトにのみ発現している一方で、活性のある天疱瘡病変中では、ＦａｓＲは、基底及び基底上（suprabasal）の両者の細胞中で検出される。更に一層興味深いことに、粘膜皮膚天疱瘡（ＰＭＣ）ＦａｓＲは、この表皮層を通じて、そして水疱形成前にさえも、発現しているように見える（図５）。
【００３７】
ＦａｓＬは、カスパーゼ−８活性化した外因性アポトーシス経路の主要なトリガーの１つである。したがって、我々は、天疱瘡アポトーシスにおいてこの経路が役割を果たすかどうか評価したかった。この目的のために、患者の血清を、抗ＦａｓＬ中和抗体又はカスパーゼ−８阻害剤で前処置し、かつケラチノサイト培養に添加した。ケラチノサイトをＫＧＭ中で培養し、天疱瘡血清で又は未処置患者からの血清で処置した。血清を、抗ＦａｓＬ中和抗体（２．５ｍｇ／ｍｌ、３０分間）又はカスパーゼ−８阻害剤Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ（１００μＭ、３０分間）で前処置した。アポトーシスをＴＵＮＥＬ染色により評価した。抗ＦａｓＬ中和抗体又はカスパーゼ−８阻害剤の添加は部分的に、天疱瘡血清誘発したケラチノサイトアポトーシスを妨げた（図６）。
【００３８】
加えて、ケラチノサイトを図６に示したように処置し、かつ、抗ＦａｓＬ抗体又は無関係な免疫グロブリンのいずれかを提供した。細胞を次に、ＲＩＰＡ緩衝液中で、ウェスタンブロット分析のためにホモジェナイズした。膜を、抗ヒトカスパーゼ−８又は抗−ｂ−アクチン抗体でインキュベーションした。オートラジオグラフ上のバンドの相対強度を、走査型レーザーデンシメトリーにより定量化した。この結果は、未処置細胞に比較して、天疱瘡血清で処置したケラチノサイト中でカスパーゼ−８が顕著に活性化しているが、その一方で、カスパーゼ開裂は、抗ＦａｓＬ抗体を用いた前処置により部分的に阻害されたことを示している（図７）。
【００３９】
まとめると、これらデータは、天疱瘡血清が、Ｆａｓ／ＦａｓＬシステムにより引き起こされる外因性アポトーシス経路を通じてケラチノサイトアポトーシスを誘発することを示唆する。
【００４０】
最近の研究は、上皮アドヘレンスジャンクション中のカドヘリン−カテニン付着複合体の成分が、アポトーシスの間にカスパーゼにより標的化されることを示している（Weiske et al, 2001）。Ｆａｓ／ＦａｓＬ−誘発したアポトーシス経路がデスモソーム分離も担うのかどうかを評価するために、我々は、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ2の存在下でＫＧＭ中で培養した、コンフルエントなケラチノサイトを７２時間、天疱瘡血清を用いて、療法あり又はなしで処置した。この培養からのタンパク質抽出物を抗Ｄｓｇ−１及び抗Ｄｓｇ３抗体を用いてウェスタンブロットにより分析した。β−アクチンを内部標準として使用した。我々は、天疱瘡血清がＤｓｇ１及びＤｓｇ３を開裂できることを見出した。特に、ステロイド療法下にある患者からの血清でなく、未処置患者からの血清は、Ｄｓｇ１及びＤｓｇ３を著しく開裂した（図８）。
【００４１】
最も重要なことに、７２時間にわたる、増加する量のＦａｓＬ（０．１、１０、１００ｎｇ／ｍｌ）でのケラチノサイトの処置は、用量依存的にｄｓｇｓを開裂した。この培養からのタンパク質抽出物を抗Ｄｓｇ１及び抗Ｄｓｇ３抗体を用いてウェスタンブロットにより分析した。β−アクチンを内部標準として使用した。これら用量は、天疱瘡血清中で検出されたものと一致していた（図９）。
【００４２】
ＦａｓＬが天疱瘡の病原論において重要な役割を発揮することを考慮して、我々は抗ＦａｓＬ抗体（ＮＯＫ２、ハイブリドーマ細胞株ＮＯＫ２、アクセッション番号FERM BP-5045、により生産された抗体）を試験した。コンフルエントなケラチノサイト、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ2を有するＫＧＭ中で培養したもの、を７２時間以下を用いて処置した：１．ＫＧＭ単独；２．抗ＦａｓＬ（ＮＯＫ２、１５μｇ／ｍｌ）Ａｂ；３．ＦａｓＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）；４．ＦａｓＬ＋抗ＦａＬ  Ａｂ。我々は、抗ＦａｓＬ  Ａｂ（ＮＯＫ２）がＦａｓＬ誘発したｄｓｇ開裂を妨げる証拠を提示する。我々は、抗ＦａｓＬ  Ａｂ（ＮＯＫ２）がカスパーゼ−８誘発されたアポトーシスを阻害することも示す（図１０Ａ）。図１０Ｂは、抗ＦａｓＬ（ＮＯＫ２）Ａｂが、ＦａｓＬ誘発した細胞から細胞への剥離、すなわち、棘融解を妨げることを示す。
【００４３】
さらにＦａｓＬの中心的役割を確認するために、我々は、他の抗ＦａｓＬ抗体（F918-7-3  アクセッション番号FERM BP-5533を有するハイブリドーマ細胞株により生産された抗体;F918-7-4  アクセッション番号FERM BP-5534を有するハイブリドーマ細胞株により生産された抗体;F919-9-18  アクセッション番号FERM BP-5535を有するハイブリドーマ細胞株により生産された抗体）を試験した。コンフルエントなケラチノサイト、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ2を有するＫＧＭ中で培養したもの、を７２時間以下を用いて処置した：ＫＧＭ単独；組み換えＦａｓＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）；ハイブリドーマ媒体、１：１にＫＧＭ中で希釈；ＦａｓＬ＋ハイブリドーマ媒体、ＫＧＭ中で異なる希釈にある。我々は、抗ＦａｓＬ抗体が、用量依存的にＦａｓＬ誘発したｄｓｇ３開裂を妨げる（図１１Ａ及び図１１Ｂ）との証拠を提示し、この場合にカスパーゼ−８誘発したアポトーシス活性化を阻害する（図１１Ａ）。図１１Ｃは、ハイブリドーマ細胞株FERM BP-5535由来の、この培地中に含有されるＦａｓＬ  Ａｂが、ＦａｓＬ−誘発した細胞から細胞への剥離、すなわち、棘融解を妨げることを示す。
【００４４】
外因性アポトーシス経路がｄｓｇ開裂を担うかどうかを検査するために、我々はコンフルエントなケラチノサイトをカスパーゼ−８阻害剤Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ（１００μＭ、３０分間）又は抗ＦａｓＬ（ＮＯＫ２、１５μｇ／ｍｌ）Ａｂで前処置した。次いで、細胞を７２時間にわたり健康な又は未処置の天疱瘡血清でインキュベーションした。この培養からのタンパク質抽出物を抗Ｄｓｇ３抗体及び抗−カスパーゼ−８−Ａｂを用いたウェスタンブロットにより分析した。ビンキュリンを内部標準として使用した（図１２Ａ）。図１２Ｂは、細胞剥離（すなわち、棘融解）が抗ＦａｓＬ  Ａｂ又はカスパーゼ−８阻害剤により妨げられることを示す。これら結果は、ＦａｓＬ又はカスパーゼ−８活性化したアポトーシス経路を阻害することが、カスパーゼ−８活性化及びｄｓｇ開裂の両者を妨げ、このようにして棘融解を遮断することを示す。
【００４５】
ヒト抗ＦａｓＬ抗体（ヒト抗体３Ｅ１、アクセッション番号ATCC PTA-4017を有するハイブリドーマ細胞株により生産（抗体PTA-4017）及びヒト抗体４Ｇ１１、アクセッション番号ATCC PTA-4018を有するハイブリドーマ細胞株により生産（抗体PTA-4018））の役割も評価するために、ヒトのケラチノサイトをＫＧＭ（１．８ｎＭ  ＣａＣｌ2）中で培養し、組み換えＦａｓＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）単独又はＰＴＡ−４０１７及びＰＴＡ−４０１８抗体との組み合わせにおいて異なる希釈で処置した。図１０〜１２において既に試験した抗ＦａｓＬヒト化抗体ＢＰ−５０３５及びＢＰ−５０４５をコントロールとして使用した。図１３Ａは、ＦａｓＬ単独がＤｓｇ３を開裂しかつカスパーゼ−８を活性化する一方で、両者のヒト抗体ＰＴＡ−４０１７及びＰＴＡ−４０１８及びヒト化抗体ＢＰ−５０３５及びＢＰ−５０４５がこの作用を妨げることを示す（ウェスタンブロット）。図１３Ｂは、ＦａｓＬ単独が細胞から細胞への剥離及び棘融解を誘発する一方で、異なる濃度のヒト抗ＦａｓＬ抗体ＰＴＡ−４０１７及びＰＴＡ−４０１８がこの作用を妨げることを実証する。
【００４６】
結論として、我々は、ＦａｓＬが、カスパーゼ−８媒介した外因性アポトーシス経路及びＤｓｇ開裂の両者を活性化することにより、二重の活性を発揮することを示した。我々の研究と一致して、Wang及び共同研究者（Wang et al, 2004）は、アポトーシスが棘融解現象の原因となりえることを示唆している。彼らは、ＰＶ−ＩｇＧ及びＦａｓレセプターに対する抗体（抗ＦａｓＲ）が、同様にｉｎ  ｖｉｔｒｏで病変を誘発することを示し、これは次のことを引き起こす：（１）溶解性ＦａｓＬの分泌；（２）高められた細胞量のＦａｓＲ、ＦａｓＬ（溶解性かつ膜性）、Ｂａｘ及びｐ５３タンパク質；（３）細胞性Ｂｃｌ−２レベルの減少；（４）カスパーゼ８の濃縮及びカスパーゼ１及び３の活性化；（５）膜性死誘発シグナリング複合体（membranal deathinducing signaling complex）（ＤＩＳＣ）における、ＦａｓＬ及びＦａｓＲの、カスパーゼ８との共凝集。このように、このＦａｓ媒介デスシグナリング経路は、病変形成に関連しているように見える。
【００４７】
十分に確立した動物モデルは、天疱瘡の研究のために長い間かつ広範囲に使用されている。新生マウス中へのＰＶＩｇＧの受動輸送は、細胞剥離及び水疱の形成を誘発する。このモデルは、天疱瘡の病原論におけるアポトーシス及びＦａｓＬの関与を評価するために使用されてきている。我々は、新しく生まれたＣ５７ＢＬ／６Ｎ  Ｃｒｌマウス中に患者血清から精製したＰＶＩｇＧ（５ｍｇ／ｇ／ＢＷ）を皮下注射した。健康な個体の血清から精製されたＩｇＧ（ＮＩｇＧ）で処置した正常な新しく生まれたマウスはコントロールとして使用される。動物を、注射２０時間後に屠殺した。
【００４８】
ヘマトキシリン及びエオシン染色は、正常ヒトＩｇＧで処置したマウス中でなく、ＰＶＩｇＧで処置したマウス中でだけ水疱が発達することを示す（図１４Ａ）。アポトーシスを、ＴＵＮＥＬ又はカスパーゼ−３活性化のいずれかによって、ＰＶＩｇＧで処置したマウス中でだけ検出した（図１４Ｂ）。
【００４９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦａｓＬの役割を評価するために、マウスをＰＶＩｇＧ又はＰＶＩｇＧ＋抗ＦａｓＬ抗体（ＭＦＬ３クローン、マウスに特異的）で処置した。抗ＦａｓＬ（４０μｇ／マウス）を、ＰＶＩｇＧ注射３時間後に投与し、これはマウス中で水疱形成を妨げ、Ｈ＆Ｅ染色により示されるとおりである。加えて、抗ＦａｓＬ処置したマウス中の裂（cleft）の長さは顕著に減少した（図１５）。
【００５０】
結論として、我々は、ＦａｓＬが、カスパーゼ−８媒介した外因性アポトーシス経路及びＤｓｇ開裂の両者を活性化することにより、二重の活性を発揮することを示した。最も重要なことに、ＦａｓＬの遮断は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて棘融解から保護する。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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