(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
C末端の最後の3〜7個のアミノ酸を除いた配列番号1の全てを含み、O-ホスホセリンスルフヒドリラーゼ(OPSS)活性を有する、単離されたタンパク質。
【請求項２】
C末端の5個のアミノ酸残基が欠失している、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項３】
配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の単離されたタンパク質。
【請求項４】
77番目のプロリン残基(Pro)が、セリン残基(Ser)に置換されている、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項５】
配列番号3に記載のアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の単離されたタンパク質。
【請求項６】
131番目のトレオニン残基(Thr)がアラニン残基(Ala）に、137番目のリジン残基(Lys)がアスパラギン酸残基(Asp)に、および238番目のトレオニン残基(Thr)がセリン残基(Ser)にそれぞれ置換されている、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項７】
配列番号4に記載のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の単離されたタンパク質。
【請求項８】
i）補助因子(cofactor)としての0.001〜2mMのPLP(ピリドキサール-5'-リン酸)又は0.001〜100mMのDTT(ジチオスレイトール)の添加、
ii）25〜60℃の反応温度範囲、及び
iii) 6.0〜10.0のpH範囲
を含む条件下で最適活性を示す、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項９】
請求項1〜8のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項１０】
請求項1〜8のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質をコードする核酸分子を保有する、発現ベクター。
【請求項１１】
請求項10に記載の発現ベクターによって形質転換された、形質転換体。
【請求項１２】
O-ホスホ-L-セリン(O-phospho-L-serine、OPS)と硫化物とを、請求項1〜8のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質の存在下で反応させる段階を含む、システイン生成方法。
【請求項１３】
前記OPSが、精製された形態であるか、又はOPSを含有する発酵培養液の形態である、請求項12に記載のシステイン生成方法。
【請求項１４】
気体又は液体状態であるNa2S、NaSH、(NH4)2SH、H2S、及びS2O3からなる群から選択される硫化物を含む、請求項12に記載のシステイン生成方法。
【請求項１５】
前記硫化物が、OPSのモル濃度の0.1〜3倍の量で使用される、請求項12に記載のシステイン生成方法。
【請求項１６】
請求項1〜8のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質の、OPSからのシステインの生合成における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列番号1に記載のアミノ酸配列に対応し、C末端の3〜7個のアミノ酸残基が欠失しているマイコバクテリウム・スメグマチス(Mycobacterium smegmatis)由来のアミノ酸配列を有するO-ホスホセリンスルフヒドリラーゼ(O-phosphoserine sulfhydrylase;以下「OPSS」とも称する)変異体に関する。また、本発明は前記OPSS変異体をコードする核酸分子、該核酸分子を保有する発現ベクター、及び該発現ベクターで形質転換された形質転換体に関する。さらに、本発明は、上記OPSS変異体の存在下で硫化物とO-ホスホセリン-L-セリン(O-phospho-L-serine、OPS)とを反応させることによるシステインの生成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
L−システインは、あらゆる生物体の硫黄代謝に重要なアミノ酸として、毛髪のケラチン、グルタチオン、ビオチン、メチオニン、及びその他の硫黄含有代謝産物など生体内タンパク質の合成に使用されるだけでなく、コエンザイムAの前駆物質として使用される。また、システイン生合成は、L-セリン、L-グリシン、L-メチオニンなどの他のアミノ酸の生合成と密接な関係があることが知られている。産業的には、L-システイン及びその誘導体は、製薬産業(気管支疾患の治療)、化粧品産業(ヘアシャンプー及びパーマウェーブローションの成分など)並びに食品産業(抗酸化剤、風味増進剤、及び生地用補助剤)を含む様々な分野で応用されている。
【０００３】
従来、L-システインは、主にヒトの毛髪や、動物の羽毛などを酸加水分解して取得されてきた。(非特許文献1)。しかし、髪から抽出されるシステインの収率は7〜8％にしか及ばないだけでなく、抽出過程で使用される塩酸と硫酸により環境汚染廃棄物が相当量生成される。また、原材料としての毛髪や羽毛から抽出されるため、消費者が嫌悪感を抱くこともある。このような問題により、環境に優しいL-システインの生成プロセスの開発に対する要求が高まってきた。よって、微生物を利用してL-システインを生産する方法が開発されるに至った。
【０００４】
微生物を利用してL−システイン生産する方法としては、D、L-ATCに微生物を利用して生物学的に変換する方法が知られている(非特許文献2)。しかし、この方法は、前駆体であるD、L-ATCの溶解度が低く、工業化が困難である。また、別の方法として、大腸菌(E. coli)を用いた直接発酵法でL-システインを生産する方法が知られている(特許文献1、非特許文献3)。この方法は、微生物内のL-システインが過量蓄積された場合、細胞内毒性を示すことがあり、微生物を利用して、高濃度のL-システインを生産する際に限界がある。このような点を克服するためにL-システインを細胞外に排出するタンパク質が利用されて来たが、依然として生産性がそれほど改善されないという欠点がある。
【０００５】
微生物及び植物のL-システイン生合成の経路を調べてみると、O-アセチル-セリン（O-acetyl-serine、OAS)は、L-システインの炭素骨格の中間前駆物質として作用する(非特許文献4)。O-アセチルセリンは、硫黄供与体として硫化水素を用いて、O-アセチルセリンスルフヒドリラーゼ(O-acetylserine sulfhydrylase、OASS)によってS-スルホシステイン(S-sulfocysteine)となり、これはシステインに変換され得る。また、硫化供与体としてSO4を還元させてチオ硫酸塩(thiosulfate)を製造し、それを用いてシステインを製造することができる(非特許文献5)。このような OASを用いたシステイン生合成経路の場合、セリンからOASを変換する活性を有する2種の酵素であるセリンアセチルトランスフェラーゼ(CysE、serine acetyltransferase)及びOASからシステインを変換する活性を有する酵素であるシステインシンターゼ(CysK、cysteine synthase K)を使用するが、それらの酵素のうち、特にセリンアセチルトランスフェラーゼ(CysE)は、最終産物であるシステインによるフィードバック阻害に対して感受性がより高い(非特許文献3)。フィードバック阻害に非感受性である変異酵素が必要とされているが、開発は困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許登録番号 EP0885962B
【特許文献２】大韓民国公開10-2006-0068505号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Biotechnology of the Amino Acids Production edited by Ko Aida、pp 217-223、(1986)
【非特許文献２】Ryu OH、Ju JY and Shin CS、Process Biochem.、32： 201-209、(1997)
【非特許文献３】Wada M and Takagi H、Appl．Microbiol.Biochem.、73:48-54、(2006)
【非特許文献４】Kredich NM and Tomkins GM、J. Biol.Chem.、241：4955-4965、(1966)
【非特許文献５】Nakamura T、Kon Y、Iwahashi H and Eguchi Y、J. Bacteriol.、156：656-662、(1983)
【非特許文献６】Mino K and Ishikawa K、FEBS letters、551：133-138、(2003)
【非特許文献７】Burns KE、Baumgart S、Dorrestein PC、Zhai H、McLafferty FW and Begley TP、J. Am.Chem.Soc.、127：11602-11603、(2005)
【非特許文献８】Westrop GD、 Goodall G、Mottram JC and Coombs GH、J. Biol.Chem.、281：25062-25075、(2006)
【非特許文献９】Agren D、Schnell R and Schneider G、FEBS letters、583：330-336、(2009)
【非特許文献１０】Scheit、Nucleotide Analogs、John Wiley、New York(1980)
【非特許文献１１】Uhlman and Peyman、Chemical Reviews、90:543-584(1990)
【非特許文献１２】Ehrhardt、A. et al.(2003)Hum Gene Ther 10：215-25
【非特許文献１３】Yet、N.S(2002)MoI Ther 5: 731-38
【非特許文献１４】Chen、Z.Y.et al.(2004)Gene Ther 11：856-64
【非特許文献１５】Izsvak et al.J. MoI.Biol.302:93-102(2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、当該技術分野のこのような課題を克服し、高収率のL-システインを生成する方法を開発するために様々な方法を模索する中で、アエロピュルム・ペルニクス(Aeropyrum pernix)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、及びトリコモナス・バギナリス(Trichomonas vaginalis)において、OAS特異的経路とは異なるO-ホスホ-L-セリン(OPS)経路を用いてL-システインを合成するO-ホスホセリンスルフヒドリラーゼ(OPSS)が存在することを発見し(非特許文献6、非特許文献7、非特許文献8)、さらに、追加的な酵素であるmec+及びcysOとともにOPSからシステインへの変換を触媒するM. ツベルクローシスのOPSSは、C末端の5個のアミノ酸残基を除去した場合、追加的な酵素の非存在下でさえも、硫化供与体としてNa2Sを用いてOPSをシステインに転換することができるという事実を発見したことにより(非特許文献9)、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、配列番号1に記載のアミノ酸配列に対応し、C末端の3〜7個のアミノ酸残基が欠失しているマイコバクテリウム・スメグマチス由来のアミノ酸配列を有するO-ホスホセリンスルフヒドリラーゼ(以下「OPPS」とも称する)変異体を提供することを目的とする。
【００１０】
本発明は、前記OPSS変異体をコードする核酸分子を提供することを別の目的とする。
【００１１】
本発明は、前記核酸分子を保有する発現ベクターを提供することをさらなる目的とする。
【００１２】
さらに、本発明は、前記発現ベクターによって形質転換された形質転換体を提供することをさらなる目的とする。
【００１３】
本発明は、OPSS変異体の存在下、硫化物を用いて、O-ホスホ-L-セリンをシステインに変換するための方法を提供することをさらなる別の目的とする。
[本発明1001]
配列番号1に記載のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有し、野生型O-ホスホセリンスルフヒドリラーゼ(OPSS)アミノ酸配列のC末端の3〜7個のアミノ酸残基が欠失している、マイコバクテリウム・スメグマチス(Mycobacterium smegmatis)由来O-ホスホセリンスルフヒドリラーゼ(OPSS)変異体。
[本発明1002]
C末端の5個のアミノ酸残基が欠失している、本発明1001のマイコバクテリウム・スメグマチス由来OPSS変異体。
[本発明1003]
配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する、本発明1002のマイコバクテリウム・スメグマチス由来OPSS変異体。
[本発明1004]
77番目のプロリン残基(Pro)が、セリン残基(Ser)に置換されている、本発明1001のマイコバクテリウム・スメグマチス由来OPSS変異体。
[本発明1005]
配列番号3に記載のアミノ酸配列を有する、本発明1004のマイコバクテリウム・スメグマチス由来OPSS変異体。
[本発明1006]
131番目のトレオニン残基(Thr)がアラニン残基(Ala）に、137番目のリジン残基(Lys)がアスパラギン残基(Asp)に、および238番目のトレオニン残基(Thr)がセリン残基(Ser)にそれぞれ置換されている、本発明1001のマイコバクテリウム・スメグマチス由来OPSS変異体。
[本発明1007]
配列番号4に記載のアミノ酸配列を有する、本発明1006のマイコバクテリウム・スメグマチス由来OPSS変異体。
[本発明1008]
i）補助因子(cofactor)としての約0.001〜約2mMのPLP(ピリドキサール-5'-リン酸)又は約0.001〜約100mMのDTT(ジチオスレイトール)の添加、
ii）25〜60℃の反応温度範囲、及び
iii) 6.0〜10.0のpH範囲
を含む条件下で最適活性を示す、本発明1001のマイコバクテリウム・スメグマチス由来OPSS変異体。
[本発明1009]
本発明1001〜1008のいずれかのOPSS変異体をコードする、核酸分子。
[本発明1010]
本発明1001〜1008のいずれかのOPSS変異体をコードする核酸分子を保有する、発現ベクター。
[本発明1011]
本発明1010の発現ベクターによって形質転換された、形質転換体。
[本発明1012]
O-ホスホ-L-セリン(O-phospho-L-serine、OPS)と硫化物とを、本発明1001〜1008のいずれかのOPSS変異体の存在下で反応させる段階を含む、システイン生成方法。
[本発明1013]
前記OPSが、精製された形態であるか、又はOPSを含有する発酵培養液の形態である、本発明1012のシステイン生成方法。
[本発明1014]
気体又は液体状態であるNa2S、NaSH、(NH4)2SH、H2S、及びS2O3からなる群から選択される硫化物を含む、本発明1012のシステイン生成方法。
[本発明1015]
前記硫化物が、OPSのモル濃度の0.1〜3倍の量で使用される、本発明1012のシステイン生成方法。
[本発明1016]
本発明1001〜1008のいずれかのOPSS変異体の、OPSからのシステインの生合成における使用。
【発明の効果】
【００１４】
前述のように、O-ホスホセリンをL-システインに酵素変換するために必須である、 酵素活性が改善されたOPSS変異体を用いて、単純な方法で、しかも高収率でOPSからL-システインを大量に生成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】温度によるOPSS活性を示すグラフである。
【図２】OPSSのpH感受性を示す一連のグラフである。
【図３】SDS PAGE分析によるpETシステム及びpCL-Pcj1システムでの酵素発現レベルを示す写真である。
【図４】精製OPS発酵ブロスをシステインに変換するOPSS酵素活性を示すグラフである。
【図５】OPS発酵ブロスをシステインに変換するOPSS活性を示すグラフである。
【図６】1LのジャースケールでOPSを基質として使用して、OPSSにより変換された、OPSのシステイン生成を示すグラフである。
【図７】OPSS変異体をコードする核酸分子を保有するpCL-Pcj1発現ベクターのマップを示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
上記目的を達成するための一つの態様として、本発明は、野生型O-ホスホセリンスルフヒドリラーゼのアミノ酸配列のC末端の3〜7個のアミノ酸残基が欠失している以外は配列番号1に記載のアミノ酸配列と同じであるアミノ酸配列を有するマイコバクテリウム・スメグマチス由来のOPSS変異体を提供する。
【００１７】
本発明の一実施形態によれば、本発明のOPSS変異体は、配列番号2、3及び4に記載のアミノ酸配列のうちの一つを有することができる。 配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するOPSS変異体は、77番目のプロリン残基(Pro)からセリン残基(Ser)への置換を有するよう、さらに改変され得る。また、配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するOPSS変異体は、131番目のトレオニン(Thr)残基からアラニン(Ala)残基への、137番目のリジン(Lys)残基からアスパラギン(Asp)残基への、および238番目のトレオニン(Thr)残基からセリン(Ser)残基への置換を有するよう、さらに改変されてもよい。また、上記の変異体と少なくとも50％の相同性を有する、好ましくは60％、70％、75％、及び80％、さらに好ましくは85％、90％、及び95％、最も好ましくは97％〜99％の相同性を有するアミノ酸配列は、本発明の範囲内である。
【００１８】
本明細書において使用される用語、「マイコバクテリウム・スメグマチス」とは、放線菌門(Actinobacteria)に属するものであり、細くて直線状であるか、又はわずかに湾曲した桿菌で不規則な分枝を有し、塩基性試薬であるアニリンで染色が可能な菌株である。本発明では、この菌株に由来するO−ホスホセリンスルフヒドリラーゼが、そのアミノ酸を改変した場合にL-システインの生合成を高効率で触媒し得ることを見出した。
【００１９】
本明細書において使用される用語、「O−ホスホセリンスルフヒドリラーゼ(OPSS)」とは、OPSからシステインへの合成を触媒する酵素のこという。この酵素はアエロピュルム・ペルニクス(Aeropyrum pernix)から初めて見出され、命名されたものである(非特許文献6、配列番号6)。
【００２０】
OPSSを得るためには、公知の様々な方法が使用され得る。その方法の典型的な例としては、これらに限定されるものではないが、関心対象の酵素を高効率に得られるようにするコドン最適化に基づく遺伝子合成技術、そして、微生物の遺伝子情報の大量な蓄積に基づくバイオインフォマティクスによる有用な酵素資源のスクリーニング方法が挙げられる。本発明の一実施形態では、システインを合成するためにOPSを基質として利用するOPSS酵素を、様々な微生物から選択した。これに関し、当該技術分野で公知の適当な培地及び培養条件を用いて得た細胞ペレット(溶解したもの)は、次に、OPSS酵素を含む上清を精製して、OPSS酵素を得た。
【００２１】
本明細書において使用される用語、「変異体」とは、遺伝的又は非遺伝的に一つの安定した表現型変化を示す培養物や個体を意味する。用語「変異体」は、OPSS(O-ホスホセリンスルフヒドリラーゼ)に関連して使用される場合は、その活性が野生型と比較して効率的に向上し得るように遺伝的に変化したOPSS酵素を意味する。
【００２２】
本発明者らは、C末端の5個のアミノ酸残基が欠失しているマイコバクテリウム・ツベルクローシスH37Rv由来OPSS変異体が、追加的な酵素の非存在下でさえ、S2-基を含有する硫黄供給源に対する増加した親和性を示すという結果に基づいて、マイコバクテリウム・スメグマチスのOPSSからC末端の5個のアミノ酸残基を欠失させることによりOPSS変異体を調製した。本発明によるOPSS変異体は、配列番号1に記載のアミノ酸配列に対応し、C末端の3〜7個のアミノ酸残基、好ましくは5個のアミノ酸残基が欠失しているマイコバクテリウム・スメグマチス由来のアミノ酸配列を有する。
【００２３】
本発明の一実施形態では、配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する変異体は、OPSからシステインへの変換に適用した後1時間以内で100％の変換率を示すことが観察された（表5）。
【００２４】
アミノ酸の置換により、本発明のOPSS変異体の酵素活性をさらに増加させることができる。当該技術分野で公知の方法であれば、酵素を改善するために如何なる方法を用いてもよい。好ましくは、本発明では、酵素活性が改善されたOPSS変異体を得るために、ランダム変異誘発(random mutagenesis)を使用した。具体的には、OPSSにランダム変異誘発を起こすようにした後、発明者らはHTS(high-throughput-screening)に基づいて開発したスクリーニングシステムを利用して、酵素活性が改善された変異体を選択した。これにより、酵素活性が改善されたOPSS変異体Msm-T-HA2及びMsm-T-EP3を、Msm-T遺伝子についてのHTSスクリーニングを行うことにより得た。Msm-T-HA2は、77番目のプロリン残基(Pro)をセリン残基(Ser)に置換した以外は配列番号2に記載のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有するOPSS変異体である。Msm-T-EP3は、131番目のトレオニン残基(Thr)からアラニン残基(Ala)への、137番目のリジン残基(Lys)からアスパラギン残基(Asp)への、238番目のトレオニン残基(Thr)からセリン残基(Ser)への置換変異が起きている以外は配列番号2に記載のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有するOPSS変異体である。好ましくは、OPSS変異体Msm-T-HA2及びMsm-T-EP3はそれぞれ、配列番号3及び配列番号4に記載のアミノ酸配列を有する。
【００２５】
本発明の一実施形態では、Msm-T-HA2及びMsm-T-EP3はいずれも、配列番号2に記載のアミノ酸残基を有するMsm-Tよりも高い酵素活性を示すことが見出された(表5及び表6)。具体的には、OPSS変異体Msm-T-HA2及びMsm-T-EP3は、変換反応の初期に、対照Msm-Tと比べてそれぞれ5倍及び1.2倍増加した変換率を示すことが測定された。また、Msm-T酵素と比べてシステイン合成活性が4倍高いMsm-T-HA2変異体は、Msm-Tの40％に対応する量で使用した場合でさえ、最終的なシステイン変換率はほぼ同等であった。
【００２６】
本明細書において使用される用語、「相同性」とは、二つのポリペプチド間の同一性の割合を意味する。一配列と別の一配列との配列間の相関性は当該技術分野で公知の技術により決定され得る。例えば、配列情報を整列させて容易に入手可能なコンピュータプログラムを利用し、2つのポリペプチド分子間の配列情報を直接比較することによって相同性を決定することができる。または、相同性は相同領域間の安定した二重鎖を構成する条件下において、ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションした後、一本鎖特異的ヌクレアーゼで分解させ、分解した断片の大きさを決めることにより決定できる。
【００２７】
本明細書において使用される用語、「相同」とは、あらゆる文法的形態又はスペリングのバリエーションにおいて、スーパーファミリー由来タンパク質(例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー)及び他の種由来の相同タンパク質(例えば、ミオシン軽鎖など）を含み、「共通の進化的起源」を有するタンパク質間の関係を意味する。そのようなタンパク質(及びそれらのコード遺伝子)は、配列類似性によって反映される配列相同性を有する。しかし、一般的に使用される場合と、本発明における場合とで「相同」との用語は、「非常に高い」のように修飾された場合には、配列の類似性を意味するものであり、共通の進化的起源を意味するものではない。
【００２８】
本明細書において使用される用語、「配列類似性」とは、あらゆる文法的形態において、共通の進化的起源を共有していても又は共有していなくてもよい核酸配列間又はアミノ酸配列間のタンパク質の同一性又は相関性の程度を意味する。一つの具体例では、2個のアミノ酸配列が、アミノ酸配列の所定の長さに対して少なくとも21％（好ましくは少なくとも約50％、最も好ましくは約75％、90％、95％、96％、97％、又は99％)のアミノ酸が一致する場合、「実質的に相同」又は「実質的に類似」である。実質的に相同である配列は、配列データバンクで利用可能な標準のソフトウェアを使用して配列を比較することによって、又は例えば特定のシステムのために定義された厳密な条件の下でのサザンハイブリダイゼーション実験において、同定することができる。定義されるハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野の範囲内のものである（例、Sambrook et al.、1989、infraを参照）。
【００２９】
本発明のOPSS変異体は、OPSへの硫化物のチオール基(SH基)の転移を触媒して、システインを生成することができる。好ましくは、本発明のOPSS変異体が、最適な活性を示すことができる条件は、i)補助因子(cofactor)としての0〜2mMのPLP(ピリドキサール-5'-リン酸)又は0〜100 mMのDTT(ジチオスレイトール)の存在、ii) 25〜60℃の反応温度、およびiii）6.0〜10.0のpHである。
【００３０】
OPS基質へとチオール基を転移させることによるシステイン合成を触媒するOPSS酵素活性のアッセイは、Ape-OPSS(Ape-O-ホスホセリンスルフヒドラーゼ)が命名されるとともに明らかになった。特に、Ape-OPSSは、チオール基の転移によりOASをシステインに変換する活性を有しているため、アッセイは、大腸菌システイン合成酵素(OASS、O-アセチルセリンスルフヒドリラーゼ、(EC 4.2.99.8))の活性測定方法に基づいている(非特許文献6)。
【００３１】
本発明の一実施形態によるアッセイでは、OAS(O-アセチルセリン)又はOPSにチオール基を提供してシステイン変換反応時にOASS又はOPSSの補助因子として作用するPLPを、0.2mMの濃度で添加する。また、空気中に露出してシステインがシスチンに酸化することを防止し、かつ既に酸化されたシステインの量を定量するために、DTTを添加し、還元力を付与した。好ましくは、25mMのDTT又は0.2mMのPLPが添加された場合、システインの変換率が2.3倍増加した。即ち、PLP及びDTTは、OPSからシステインへの変換に対して正の影響を有する。
【００３２】
Ape-OPSS、Mtb-OPSS、及びMtb-T酵素の最適反応温度は、60℃若しくは37℃であり、最適pHが7.4であることは以前に報告されている(非特許文献6、非特許文献9)。上記文献の報告に基づき、酵素活性が改善されたOPSS変異体のための変換反応条件を最適化することができる。
【００３３】
本発明の一実施形態では、OPSS変異体は、37℃〜80℃の温度で変換を触媒することができる。具体的には、高温でも増殖が可能な古細菌(Archea)菌種に属するApe-OPSS酵素は、37℃に比べて60℃の温度でより高い酵素活性を示す。また、酵素自体の熱安定性も優れているため、最適な酵素反応の温度は60℃である。一方、Msm-Tは、37℃の温度で最適酵素活性を示し、60℃の熱処理に脆弱である。OPSS酵素は、pH6.0〜10.0の範囲で変換活性を維持することが分かった。Ape-OPSSはpH 7.4で最適酵素活性が検出され、Msm-TはpH8.0〜9.0で最適酵素活性が検出された。したがって、 Msm-TはApe-OPSSと比べて、より広い範囲のpHで安定である。
【００３４】
また、別の態様として、本発明はOPSS変異体をコードする核酸分子を提供する。
【００３５】
本明細書において使用される用語、「核酸分子」とは、DNA及びRNA分子を包括的に含むことを意味する。核酸分子の基本的な構成単位であるヌクレオチドは、天然のヌクレオチドだけでなく、糖又は塩基部位が修飾された類似体(analogue)も含む(非特許文献10、 非特許文献11)。
【００３６】
また、別の態様として、本発明は上記の核酸分子を保有する発現ベクターを提供する。
【００３７】
「ベクター」とは、宿主細胞への、核酸のクローニング及び/又は転移のための任意の媒介物を意味する。ベクターは、別のDNAセグメントが結合して、結合したセグメントの複製をもたらすことができる複製単位(replicon)であってもよい。「複製単位」とは、インビボでDNA複製の自律的単位として機能する、即ち、自らの調整によって複製可能な、任意の遺伝的エレメント(例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス)を意味する。上記の用語「ベクター」は、宿主細胞にインビトロ、エクスビボ、又はインビボで核酸を導入するためのウイルス性及び非ウイルス性のいずれの媒介物も含む。用語「ベクター」は、ミニサークルDNAを含んでもよい。例えば、上記ベクターは、細菌DNA配列を持たないプラスミドであってもよい。CpG領域において豊富な細菌DNA配列の除去は、導入遺伝子の発現のサイレンシングを減少させ、それによってプラスミドDNAベクターから、より持続的な発現が得られることが示されている(例えば、非特許文献12、非特許文献13、非特許文献14参照) 用語「ベクター」は、眠れる森の美女(Sleeping Beauty)のようなトランスポゾン(非特許文献15)、または人工染色体を含むことができる。
【００３８】
ベクターとしては、T7プロモーターを利用するpETシステム(Novagen)が当該技術分野でよく知られている。本発明では、当該技術分野で公知の様々な発現システムを使用することができ、これに限定されない。
【００３９】
本発明の一実施形態では、CJ1プロモーターを利用する、本発明者らが開発した外因性遺伝子発現システム(特許文献2、図7参照)を使用した。
【００４０】
本発明の一実施形態では、T7プロモーターを使用するpETシステムと、CJ1プロモーターを使用するCJ1発現システムとの間で、同様の条件の下でOPSSの発現レベルを比較した。その結果、pETシステムに比べてCJ1システムは、より高いOPSS発現レベルを示した(図3)。さらに、OPSSの過剰発現のためには、pETシステムでは低温(18℃)で長時間必要としたのに対し、CJ1システムでは、高温(37℃)で短時間であった。したがって、CJ1プロモーターを利用してOPSSを効率的に得ることが好ましいが、本発明はそれに限定されない。
【００４１】
さらに別の一態様として、本発明は、上記発現ベクターで形質転換された形質転換体を提供する。
【００４２】
本明細書において使用される用語、「形質転換」とは、あらゆる文法的形態又はスペリングのバリエーションにおいて、導入された遺伝子が自己複製するかまたは因子として染色体に組み入れられるような、外来遺伝子の宿主細胞への導入から得られる細胞の人工的遺伝的変化を意味する。
【００４３】
本発明のベクターは、当該技術分野で公知の適切な標準的な技術により宿主細胞内に導入することができる。この例としては、エレクトロポレーション(electroporation)、リン酸カルシウム共沈殿法(calcium phosphate co-precipitation)、レトロウイルス感染(retroviral infection)、微量注入法(microinjection)、DEAE-デキストラン(DEAE-dextran)、陽イオンリポソーム(cationic liposome)カルシウム法などがあるが、これに限定されない。
【００４４】
本明細書において使用される用語、「組換えベクターによって形質転換された宿主細胞」は、関心対象の遺伝子を保有する組換えベクターをもつ宿主細胞を意味する。本発明での使用に適切な宿主細胞は、原核細胞であっても又は真核細胞であってもよい。例には、腸内細菌及びコリネ型細菌が含まれ、エシェリキア属の菌種、セラチア属の菌種が好ましく、大腸菌が最も好ましい。
【００４５】
さらに、別の態様として、本発明は、本発明のOPSS変異体の存在下、硫化物とともにOPSを変換する段階を含む、システインの生成方法を提供する。
【００４６】
本発明の変異体を用いてシステインを大量に生成することができる。変異体を発現する形質転換体を用いる場合、当該技術分野で公知の最適化された培養条件において、システインの大量生成が達成され得る。したがって、システインを大量に生成する方法は、形質変換体を、当該技術分野で公知の最適化された条件で培養する段階を含む。
【００４７】
基質として使用するために、OPSは、純粋な形態であっても、又はOPSを含有する発酵培養液の形態であってもよい。純粋なOPSは、Sigma-Aldrich社の製品番号P0878又はWako社の製品番号CAS407-41-0を購入し用いることができる。しかし、一般的に、微生物発酵から得たOPS含有培養液のほうが、市販の純粋なOPSに比べて、OPS含有培養液がさらなる精製なしに使用できる点および変換に必要な補助因子であるPLPが発酵培養液から得ることができる点で、経済的に有利である。
【００４８】
本発明では、チオール基(SH)へと変換することができる限り、いかなる硫化化合物も利用可能である。好ましくは、Na2S、H2S、又はS2O3を液体又は気体のいずれかの形態で用いることができる。
【００４９】
本発明の一実施形態では、Na2Sを硫黄供給源として使用した。Na2Sは、酵素変換に用いられるOPSのモル濃度の0.1〜3倍のモル濃度で添加することができる。具体的には、Msm-Tと同等の80％のシステイン変換率を有するMsm-T-HA2は、50mMのOPS発酵ブロス若しくは60mMの精製OPS発酵ブロス、100mMのNa2S又は120mMのNa2S、及び0.2mMのPLPを含む反応条件において、50μg/mL濃度で用いられる。
【００５０】
また、当業者であれば、高い酵素活性により、酵素変換プロセスを最適化し、スケールアップすることができることは自明のことで容易に理解するであろう。本発明の一実施形態では、19.317g/LのOPS発酵ブロスを、50mgのMsm-T-HA2の存在下インキュベートした場合、最大9.075g/Lの濃度でシステインが生成された。1Lのジャーでは、変異体の存在下、OPSはシステインに71.83％の率で変換された(図6)。
【００５１】
略語と技術用語
本発明のより詳しい説明と、当業者らが本発明を実施するにあったての案内として、下記の技術用語および方法などについての解説を提供する。明細書および特許請求の範囲において、別途に規定しない限り、「含む(comprise、comprising）」などの用語は、排他的または網羅的な意味とは対照的に包括的な意味で解釈される。換言すると、「含むが、これに限定されない」との意味である。単数形の「一つ(a)」又は「一つ(an)」又は「その(the)」は、別途に規定しない限り複数への言及を含む。例えば、「一つの細胞を含んでいる(comprising a cell)」は、「そのような細胞の1つ又は複数を含むが、これに限定されない」ことを意味する。
【００５２】
二つ以上の要素のリストに関連して使用される単語の「または(or)」は、下記の単語の解釈の全て、すなわちリストにおける要素のいずれか一方、リストにおける要素の全て、及びリストにおける任意の要素の組み合わせを含む。
【００５３】
別途の説明がなければ、本発明に使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明の技術が属する当業者に一般的に理解される意味と同様の意味を持つ。 適切な方法及び材料が下記に開示されるが、類似又は同等の方法、及び材料が本発明の実施又は試験に用いられる。また、下記に記述される材料、方法及び実施例は本発明を限定するためのものではなく単に説明のために示されたものであり、また本発明の特徴及び利点は下記の詳細な説明及び添付の特許請求範囲において明らかになるであろう。
【００５４】
欠失(Deletion)：核酸分子から一個以上のヌクレオチドが除去される、又はタンパク質からの一個以上のアミノ酸が除去される変異を意味する。
【実施例】
【００５５】
発明の形態
以下、本発明を下記の実施例によってさらに詳しく説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５６】
実施例1：OPSS酵素の開発
アエロピュルム・ペルニクス(Aeropyrum pernix)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、トリコモナス・バギナリス(Trichomonas vaginalis)は、システイン合成の基質として、大腸菌におけるOASとは異なりOPSを用いる酵素であるOPSSを有すると報告されている(非特許文献6、非特許文献7、非特許文献8)。上記文献の報告をもとに、本発明者らは、OPSをシステインに変換する2種のOPSS酵素をアエロピュルム・ペルニクス、マイコバクテリウム・ツベルクローシスH37Rvから見出した。上記の2種の酵素のうち、マイコバクテリウム・ツベルクローシスH37Rv由来OPSS酵素をアミノ酸相同性検索に用いた。その結果、マイコバクテリウム・スメグマチスMC2 155株、ロドコッカス・ジョスティ(Rhodococcus jostii)RHA1、及びノカルジア・ファルシニカ(Nocardia farcinica)IFM10152からそれぞれ、3種のOPSS変異体、Msm-OPSS、Rjo-OPSS、及びNfa-OPSSを確保した。
【００５７】
各々の菌株からOPSSを得るために、通常酵素発現のために使用されるpET28aベクターシステム(Novagen)を構築した。5種の異なるOPSスルフヒドリラーゼ酵素のクローニングに使用した各々の鋳型及びプライマーならびに得られた組換えプラスミドは、下記の表1にまとめている。表1に提示した鋳型とプライマーの適切な組合せは、PCR法により各々のOPSS遺伝子を増幅するために用いた。PCR産物およびpET28aベクターをNdeI及びHindIIIで消化した(37℃、3時間）。消化したpET28aベクター(Novagen)に各々の遺伝子の断片をライゲーションした。各々のOPSS酵素を保有する発現ベクターの構築は、塩基のシーケンシングにより確認した。構築された上記酵素発現ベクターを大腸菌（DE3）に導入し、5種のOPSS酵素を発現することができる菌株を作製した。酵素名は下記の表1に提示している。
【００５８】
（表１）
0005789670.tif 000002
【００５９】
酵素の発現は、pET システム製造者(Novagen)の指示書に従って行った。平板LB培地からの各々の菌株の単一コロニーを、5mLのLBブロスに接種し、200rpmで振盪しながら37℃で16時間培養した。この培養物を新しい25mLのLBブロス(250mL容量のフラスコ)に移して、OD600が0.5〜0.6となるまで(2〜3時間)同様の条件で培養し、その直後に1mMのIPTGを培地に添加して120rpmで振盪しながら18℃で18時間培養する間に酵素の発現を誘導した。酵素は、His SpinTrap(GE Healthcare)を用いてHis-tagについてNi-NTA カラムで精製した。単離した5種のOPSS酵素は、14％のSDS PAGE電気泳動で分析したところ、1種(Rjo-OPSS)は封入体(inclusion body)であり、4種は可溶性の形態で見出された。
【００６０】
実施例2：OPSSのシステイン合成活性アッセイ
OPSからシステインへの変換を触媒する能力について、様々な微生物株から得られた4種のOPSSの酵素活性をアッセイした。アッセイ条件および方法(cysM酵素アッセイ)については、以前の文献報告(非特許文献6、非特許文献7、非特許文献8）を採用した。用いた基質の量はml単位で表す。酵素活性のアッセイ条件は、下記の表2にまとめている。
【００６１】
（表２）
0005789670.tif 000003
【００６２】
酵素以外の反応液を37℃で5分間インキュベートし、その後、その反応液に精製OPSS 50mgを添加した。37℃でインキュベートする間、所定の時間で酵素反応液100mLを取り出し、33.2％TCA 100mLと混合して反応を停止させた。反応液中のシステインの濃度は、Gaitondeの方法に従って吸光度(OD560)を測定することにより定量した。4種の異なるOPSスルフヒドリラーゼ酵素のシステイン合成活性を下記の表3にまとめている。OPSS酵素のシステイン合成力価を、反応時間でのシステイン変換率として表す。
【００６３】
（表３）
0005789670.tif 000004
【００６４】
表3に示されるように、アエロピュルム・ペルニクス及びマイコバクテリウム・ツベルクローシスH37Rv由来のOPSS酵素が、OPSを基質として用いてシステインを合成する活性を有することを確認した。Mtb-OPSS酵素を用いてアミノ酸相同性検索により取得した新規マイコバクテリウム・スメグマチスMC2 155株由来OPSSのシステイン合成活性を初めて見出した。一方、相同性検索により得た新規ノカルジア・ファルシニカIFM 10152由来OPSSは、O-ホスホセリンをシステインに変換する活性は不十分であった。
【００６５】
表3のデータに示されるように、Ape-OPSS酵素の、OPSからシステインへの変換率は、1時間で100％近くまで達した。
【００６６】
また、既存の文献で報告されているマイコバクテリウム・ツベルクローシスH37Rv由来OPSSに基づく酵素スクリーニング法によって新たに選択されたMsm-OPSS酵素の最終的な変換率は、Mtb-OPSSと比べて4.3倍高い43.7％であった。
【００６７】
実施例3：Mtb-OPSS及びMsm-OPSSのC末端の5個のアミノ酸を欠失させたMtb-T及びMsm-T変異体の調製
マイコバクテリウム・ツベルクローシスH37Rv由来OPSS(Mtb-OPSS)は、追加的な酵素であるmec+及びcysOの助けを借りてOPSからシステインへの変換を触媒するが、C末端の5個のアミノ酸残基が除去されている場合、このような追加的な酵素の非存在下でさえも、S2-を含有する硫黄供給源を用いてOPSをシステインに変換させることができる。この事実に基づいて、硫黄供給源としてのS2-存在下、OPSを迅速に変換するMtb-T(配列番号24)を得た。また、Mtb-OPSSとの高いアミノ酸相同性を共有するMsm-OPSSからは、C末端の5個のアミノ酸残基を欠失させることによりMsm-Tを得た。2種の酵素変異体を保有する発現ベクターを構築した。これについては、マイコバクテリウム・ツベルクローシスH37Rv及びマイコバクテリウム・スメグマチスMC2 155株のゲノムDNAにおいて、配列番号17と18及び配列番号19と20の各々のプライマー対の存在下、pfu PCRを行った。得られたOPSS遺伝子断片は、NdeI及びHindIIIで処理し、同じ制限酵素で消化したpET28aベクターにクローニングして、pET28a-Mtb-T及びpET28a-Msm-Tと称する組換え発現ベクターを構築した。この組換え発現ベクターを大腸菌(DE)に導入した。上記実施例1と同じ条件で得られた2種のOPSS変異体の発現は、14％SDS PAGEにより確認した。その結果、Mtb-T(配列番号5)及びMsm-T(配列番号2)を得た。
【００６８】
実施例4：Mtb-T及びMsm-Tのシステイン合成活性アッセイ
上記で得られたMtb-T及びMsm-Tは、最終的なシステイン変換率を測定することにより酵素活性について評価した。実施例2と同様の方法で酵素活性をアッセイした。変換されたシステインはGaitondeの方法を用いて定量した。結果を下記の表4にまとめている。
【００６９】
（表４）
0005789670.tif 000005
【００７０】
表4に示されるように、Msm-T変異体は、1時間で100％の変換率で、基質からシステインへの変換を可能にした。
【００７１】
実施例5：Msm-T由来の変異体Msm-T-HA2及びMsm-T-EP3のシステイン合成活性アッセイ
100％の変換率OPSをシステインに変換することができるMsm-Tに基づいて、Msm-T-HA2(配列番号25)及びMsm-T-EP3(配列番号26)と称する、活性が改善された2種の酵素変異体を酵素進化法(enzyme evolutionary method)により得た。ヒドロキシアミン処理(hydroxyamine treatment)及びエラープローンPCRキット (Clontech. Diversity PCR random mutagenesis kit)を用いてランダム変異誘発(Random mutagenesis)をMsm-Tに導入し、Msm-T変異体のライブラリを構築し、これをスクリーニングして、酵素活性が改善されたOPSS変異体を選択した。
【００７２】
Msm-T遺伝子におけるHTSスクリーニングにより取得したMsm-T-HA2及びMsm-T-EP3のOPSS変異体は、塩基のシーケンシングにより分析すると、各々、配列番号3に記載のアミノ酸配列及び配列番号4に記載のアミノ酸配列を有することが見出された。
【００７３】
Msm-T-HA2及びMsm-T-EP3変異体と対照Msm-Tとを、酵素活性についてアッセイした。結果を表5及び6にまとめている。酵素活性アッセイは実施例2と同様の方法で行った。
【００７４】
（表５）
0005789670.tif 000006
【００７５】
（表６）
0005789670.tif 000007
【００７６】
表5及び6に示されるように、酵素進化法で得られたOPSS変異体Msm-T-HA2及びMsm-T-EP3はそれぞれ、反応開始10分後に、対照Msm-Tと比べて5倍及び1.2倍の変換率の増加を示すことが測定された。また、酵素の活性を決定する際に広く用いられる比活性(specific activity：生成物の濃度/時間/酵素量)に関して比較した。Msm-HA2の比活性は、対照Msm-Tと比べて3倍増加していた。これは、OPSS変異体が、酵素活性が改善され、時間あたり、単位酵素量あたり、システインをより高い量で合成することができることを示す。
【００７７】
実施例6：OPSS活性のための補助因子の要求性
OPSSのシステイン変換に対する補助因子の効果を調べるために、PLP及びDTTの存在下または非存在下においてMsm-Tのシステイン変換率を測定した。ここでは、50mM OPSブロス及び100mM Na2Sを基質として、25mM DTT又は0.2mM PLPの存在下において、37℃で30分間反応させた。生成されたシステインはGaitondeの方法を用いて定量した。結果を下記の表7にまとめている。
【００７８】
（表７）
0005789670.tif 000008
【００７９】
表7に示されるように、PLP及びDTTがいずれも存在しない場合と比べて、PLP及びDTTがいずれも存在する場合は、システイン変換率が2.3倍高かった。つまり、PLP及びDTTの両方が、変換に対して正の影響を有することが観察された。
【００８０】
実施例7：温度によるOPSS活性
Ape-OPSS及びMsm-Tの、温度によるシステイン変換率を調べた。 37℃及び60℃における酵素活性を、反応から2分、5分、10分、30分、及び60分後に測定した。反応は100mM HEPES(pH 7.4)、5mM OPS、10mM Na2S、0.2mM PLP、50μg/mL CysMの条件で行った。生成されたシステインの量はGaitondeの方法を用いて決定した。結果を図1に示す。
【００８１】
バッファーのこの条件では、図1に示されるように、37℃でのApe-OPSSが、最も速い初期酵素反応速度を示しただけでなく、60℃でのMsm-Tよりも高い反応性を示した。
【００８２】
実施例8：OPSSの熱安定性
Ape-OPSS及びMsm-Tの熱安定性を分析した。これらの酵素をそれぞれ、OPSブロスで2mg/mLの濃度に希釈し、37℃及び60℃で10分、30分、60分、120分、及び240分間熱処理した。その後、5mMのOPS、10mMのNa2S、0.2mMのPLP、及び100mMのHEPES(pH7.4)の条件下、37℃で30分間反応させた。この反応では、10μg/mL Ape-OPSS及び50μg/mL Msm-Tを使用した。生成されたシステインの量はGaitondeの方法を用いて測定した。これを下記の表8にまとめている。
【００８３】
（表８）
0005789670.tif 000009
【００８４】
表8に示されるように、Ape-OPSSは、60℃で4時間熱処理したにもかかわらず、活性をそのまま保持していることが確認された。その反面、Msm-Tの活性は、37℃では保持されたが、60℃で30分間熱処理した場合は50％減少した。
【００８５】
また、OPSブロス中の実際の濃度である50μg/mLでMsm-Tを使用した場合の、37℃で保持される酵素活性について調べた。Na2Sの非存在下で、50mMのOPSブロス及び0.2mMのPLPとともに50μg/mLのMsm-Tを、37℃で30分、1時間、2時間、4時間、及び6時間処理した後、Na2Sを加えて酵素反応を誘導した。30分間の反応ののち、Msm-Tの活性を測定した。生成されたシステインの量はGaitondeの方法を用いて決定した。これを下記の表9に示す。
【００８６】
（表９）
0005789670.tif 000010
【００８７】
表9に示されるように、OPSブロスにおいて、Msm-Tの活性が、37℃で反応2時間後には50％を下回るまで減少した。
【００８８】
実施例9：OPSS酵素のpH感受性
Ape-OPSS及びMsm-Tの、pHによるシステイン変換率を測定した。100mMのバッファーにおいて、それぞれ50μg/mLの濃度を有するApe-OPSS及びMsm-Tを、37℃で10分間反応に供した。これに関し、pH6.4/7.0/7.4/8.0のリン酸カリウムバッファー、pH7.0/7.4/8.0/8.5/8.8のTris-HClバッファー、及びpH8.0/8.5/9.0/10.0の炭酸ナトリウムバッファーを使用した。生成されたシステインの定量分析はGaitondeの方法を用いて行った。その結果を図2にまとめている。
【００８９】
図2に示されるように、Msm-Tは、バッファーに関係なく、pH8.0〜9.0の範囲で最も高い活性を示した。また、Ape-OPSSの場合、最も高い活性は、リン酸カリウムバッファー(pH7.4)で検出され、バッファーごとに最適なpHは異なっていた。
【００９０】
実施例10：OPSS活性に対するイオンの影響
OPSS酵素活性に対するイオンの影響を以下の通りに調べた。5mMのOPS、10mMのNa2S、0.2mMのPLP、及び100mMのHEPES(pH 7.4)を含有する反応混合液において、(NH4)2SO4 [1g、3g、5g、10g、20g/L]、KH2PO4 [0.5g、1g、2g、4g、8g/L]、又はNH4Cl[0.2g、0.5g、1g、2g/L]の存在下、酵素を37℃で30分間反応に供した。Ape-OPSS及びMsm-Tをそれぞれ10μg/mLおよび50μg/mLの濃度で使用した。生成されたシステインの量はGaitondeの方法を用いて決定した。これを下記の表10に示まとめている。
【００９１】
（表１０）
0005789670.tif 000011
【００９２】
反応混合液に(NH4)2SO4又はKH2PO4を加えた時のシステイン変換率に変化はなかった。一方、表10に示されるように、NH4Clの濃度が増すにつれてシステインの変換率は減少した。特に、2g/LのNH4が添加された場合、最大酵素活性は70％超減少した。つまり、NH4Cl及びNH4は、OPSSの変換活性に対して負の影響を有することが観察された。
【００９３】
実施例11：OPSSのシステイン合成活性に対する硫黄供給源の影響
各酵素のシステイン合成活性に対する硫黄供給源の影響を調べるために実験を行った。5mMのOPS、0.2mMのPLP、及び100mMのHEPESを含有する反応混合液において、各酵素(50μg/mLのApe-OPSS、50μg/mLのMsm-T)を、10mMのNa2S、NaSH、又はNa2S2O3の存在下で37℃で1時間反応に供した。生成されたシステインの量はGaitondeの方法を用いて測定した。Ape-OPSSは、硫黄供給源としてNa2S2O3を選び、Msm-TはNa2Sを選ぶことが観察された。その結果を下記の表11にまとめている。
【００９４】
（表１１）
0005789670.tif 000012
【００９５】
実施例12：OPSSを保有する発現ベクター(pCL-Pcj1システム)の構築および酵素の発現
pET28a-Msm-Tベクターを鋳型とし、配列番号21及び配列番号22のプライマーを用いてPCRを行った。得られたPCR産物をEcoRV及びHindIIIで処理し、クローニングして、pCL-P(CJ1)-Msm-Tと称するベクター(pCJ1-MsmT CysM、図7)を構築した。pETシステムとpCL-Pcj1システムのMsm-tc発現レベルの差を調べるために、酵素発現用の菌株を調製した。pETシステムは、Rosetta(DE3)に導入し、pCL-Pcj1システムは、K12G菌株を使用した。平板LB培地からの単一コロニーを、5mLのLBブロスに接種し、200rpmで振盪しながら37℃にて16時間培養した。これらの培養物を、カナマイシンまたはスペクチノマイシンと0.2％グルコースとを含有する新しい25mLのLBブロス(250mL容量のフラスコ)に移して、OD600が0.5〜0.6になるまで培養した。その後直ちに1mMのIPTGを培地に添加して酵素の発現を誘導した。37℃での培養中、200rpmで振盪しながら、様々な培養時間(8時間、16時間、24時間)で酵素の発現レベルを測定した。二つのシステムの酵素の発現レベルは、14％SDS PAGEで分析した。これを図3に示す。
【００９６】
図3に示されるように、同じ培養条件では、pETシステムに比べてpCL-Pcj1システムは、より高い酵素発現レベルを確実にする。加えて、このシステムは、37℃もの高い温度で、かつ0.1mMもの低いIPTG濃度で、酵素発現が可能であるため、培養条件が改善されている。つまり、pCL-Pcj1システムは、pETシステムの代わりに十分に機能し得る。
【００９７】
実施例13：精製OPS発酵ブロスを基質として用いたOPSSのシステイン合成
Msm-T及びApe-OPSSの、精製OPSからのシステイン変換率を調べた。75μg/mLの各酵素及び0.2mMのPLPの存在下、OPS発酵ブロスから精製した60mMのOPSを、120mMのNa2Sとともに、37℃又は70℃で30分、60分、90分、及び120分間反応に供した。反応は、Msm-Tに対しては37℃でのみ行い、Ape-OPSSに対しては37℃及び70℃の両方で行った。生成されたシステインの量をGaitondeの方法を用いて測定した。結果を図4に示す。
【００９８】
図4に示されるように、精製OPS発酵ブロスは、システインへの酵素変換のための基質として十分に役に立った。特にApe-OPSSのシステインの変換率は、70℃でさえ、精製OPS発酵ブロスを使用した時に増加した。
【００９９】
実施例14：OPS発酵ブロスを基質として用いたOPSSのシステイン合成
OPS発酵ブロスを基質として用いた場合の、酵素の濃度によるMsm-T及びApe-OPSSのシステイン変換率を測定した。5μg/mL又は50μg/mLの各Msm-T及びApe-OPSSならびに0.2mMのPLPの存在下、50MmのOPS発酵ブロスを、100mMのNa2Sとともに、37℃で反応させた。生成されたシステインの量をGaitondeの方法を用いて測定した。結果を図5に示す。
【０１００】
図5に示されるように、50μg/mLのMsm-Tにおいて、最も高い変換率が検出された。加えて、OPS発酵ブロスを基質として使用した時には、Msm-Tの活性がApe-OPSSの活性よりも高かった。
【０１０１】
実施例15：OPSS濃度によるシステイン変換率
OPSを9.76g/Lの濃度で含有するOPSブロスに、Na2SをOPSモル数の2倍量添加し、37℃で5分間インキュベートした。その後、精製されたMsm-T 50mgを添加し、一方で、精製されたMsm-T-HA2を5μg、10μg、20μg、及び50μg添加した。37℃でインキュベートする間、所定の時間で酵素反応混合液100mLを取り出し、33.2％TCA 100mLと混合して酵素反応を停止させた。酵素反応液中のシステインの濃度は、Gaitondeの方法に従って吸光度(OD560)を測定することにより定量した。酵素濃度によるOPSS酵素のシステイン合成活性を、下記の表12にまとめている。
【０１０２】
（表１２）システイン変換率（％）
0005789670.tif 000013
【０１０３】
表12に示されるように、システイン合成活性が改善されたMsm-T-HA2変異体を、Msm-Tの量の40％に対応する量で使用した場合でさえも、最終的なシステイン変換率(％)はほぼ同等であった。加えて、同一量で用いた場合、Msm-T-HA2変異体は、Msm-Tと比べてより速い初期反応活性を示した。
【０１０４】
実施例16：OPS濃度によるシステイン変換率
Msm-T及びMsm-T-HA2の変換率に対するOPS濃度の影響を調べるために、OPS発酵ブロスに既定量の精製OPSを添加して、変換反応を誘導した。酵素は、Msm-Tの場合は50μg、及びMsm-T-HA2の場合は20μgの量を使用した。反応液中のシステインの濃度をGaitondeの方法を用いて測定した。その結果を表13〜15にまとめている。
【０１０５】
（表１３）システイン変換率（測定されたOPS 10.65g/l）
0005789670.tif 000014
【０１０６】
（表１４）システイン変換率（測定されたOPS 36.09g/l）
0005789670.tif 000015
【０１０７】
（表１５）システイン変換率（測定されたOPS 55.6g /l）
0005789670.tif 000016
【０１０８】
上記表13〜15に示されるように、OPSの濃度が約30g/Lの場合、最も高い変換率は、Msm-Tで100％、及びMsm-T-HA2で80％であった。OPSの濃度が50g/Lを超えると変換速度と変換率の両方が減少することが見出された。
【０１０９】
高濃度のOPSを用いた変換プロセスにとっての、OPSとMsm-T-HA2の最適濃度比を選択し、Msm-Tと比べてMsm-T-HA2の反応時間を短縮するために、表13〜15のデータを使用した。
【０１１０】
実施例17：Na2S濃度によるシステイン変換率
システイン変換率に対する、硫黄供給源として使用されるNa2Sの量の影響を調べるために、20μgのMsm-T-HA2の存在下、Na2SをOPSのモル数の1倍、2倍、3倍量にそれぞれ対応する160mM、320mM、及び480mMの濃度で用いてOPS変換反応を行った。得られたシステイン変換率を下記の表16にまとめている。
【０１１１】
（表１６）システイン変換率（OPS 29.76g/l）
0005789670.tif 000017
【０１１２】
表16に示されるように、システイン変換率は、Na2Sのモル数がOPSのモル数の2倍量で使用された時に最も高かった。この結果から、OPSに対してNa2Sのモル比が2である時に最適条件となることが分かる。
【０１１３】
実施例18：pHによるシステイン変換率
OPSからシステインへの酵素変換に対するpHの影響を調べるために、20μgのMsm-T-HA2の存在下、様々なpHで変換反応を行った。その結果を下記の表17にまとめている。
【０１１４】
（表１７）システイン変換率（％）
0005789670.tif 000018
【０１１５】
示されるように、変換反応に対する最適pHは、8.5〜9.5であると測定された。
【０１１６】
実施例19：1Lのジャースケールでのシステイン変換反応プロセス
OPSブロスをシステインに変換する反応プロセスを、1Lのジャーまでスケールアップした。1mLチューブ条件下でのOPSSの特性及び変換反応のデータセットをもとに、Msm-T-HA2について、変換反応プロセスを確立した。
【０１１７】
1Lのジャースケールでの変換プロセスに先立って、1Lのジャーで得たOPS発酵ブロスの遠心分離(10,000rpm、4℃で10分間)を行い、上清を膜(0.45μm)に通して細胞を除去した。濾過したOPSブロス(19.317g/L)に72gのNa2Sを添加し、沈殿物はワットマン濾紙(6μm)を通して除去した。10mMのPLPを添加した後、反応混合液を200rpmで振盪しながら37℃で5分間プレインキュベートした。最終的に、50mgのMsm-T-HA2の存在下、1Lのジャースケールで変換反応を行った。37℃でインキュベートする間、0分、10分、30分、60分、120分、及び180分の時点で酵素反応液100μLを取り出し、33.2％TCA 100μLと混合して反応を停止させた。上記のサンプルは、0.1N HClで希釈し、LCを用いて、システイン及びシスチン含量を分析した。また、Gaitonde方法を介してシステインを定量した。変換反応プロセスで用いた基質及び酵素の濃度は、下記の表18にまとめている。用いた基質の量はmL単位で表す。
【０１１８】
（表１８）
0005789670.tif 000019
【０１１９】
表18の条件で行った変換反応後に得た反応混合液中のシステイン濃度はGaitondeの方法及びLCにより定量した。結果を図6に示す。
【０１２０】
図6に示されるように、19.317g/LのOPSブロスを、50mgのMsm-T-HA2の存在下で2時間インキュベートした場合、生成されたシステイン又はシスチンの量は9.075g/Lが最も多い量であった。これは、1Lのジャースケールでの酵素変換プロセスによってOPSから71.83％の変換率でシステインとシスチンが生成可能であることを示す。
【０１２１】
（表１９）システイン/シスチン変換率（％）
0005789670.tif 000020
【０１２２】
（表２０）システイン/シスチン（g/L）
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【産業上の利用可能性】
【０１２３】
本明細書に記載した通り、本発明のOPSS変異体は、L-システインの大量生成に有用であり得、このようにして生成されたL-システイン及びその誘導体は、医薬産業(気管支疾患の治療)、化粧品産業(ヘアシャンプー、パーマウェーブローションの成分)及び食品産業(抗酸化剤、風味増進剤、及び生地用補助剤)を含む様々な分野に適用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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