(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ’）の化合物：
【化１】
0005837419.tif 000088
［式中、
Ｂは、以下の式（ＩＩ’）又は（ＩＩＩ’）の基であり：
【化２】
0005837419.tif 000089
（式中、
点線は式（Ｉ’）の酸素との結合を表し、
Ｒ1はＨ、ＮＨ2及びＯＨ基から選択され、
Ｒ2はＮＨ2又はＯＨであり、
Ｒ3は、Ｈ又はＣＨ3基である）；
Ｌ2は、以下の基：
【化３】
0005837419.tif 000090
［式中、ｑ、ｕ、ｔは１〜１０の整数である］
から選択され；
Ｍは、
アビジン、ストレプトアビジン若しくはビオチン；
発光性化合物；又は
フルオロフォア
であるか、あるいは、
アクリルアミド、活性化アミン、活性化エステル、アルデヒド、アルキルハライド、無水物、アニリン、アジド、アジリジン、カルボン酸、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、ヒドラジン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、スルホニルハライド、又はチオール、ケトン、アミン、酸ハライド、ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、アジドニトロフェニル、アジドフェニル、３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド、及びグリオキサールから選択される反応性基であり；
Ａは、以下の二価の基：
【化４】
0005837419.tif 000091
から選択される。］
【請求項２】
Ｂが、Ｒ1がＮＨ2基である式（ＩＩ’）の基であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｂが、Ｒ2がＮＨ2基であり、及びＲ3がＨである、式（ＩＩＩ’）の基であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｍが、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチンから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｍが、以下の発光性化合物又はフルオロフォア：
有機化合物フルオロフォア；
タンパク質フルオロフォア；及び
蛍光性ランタニド錯体
から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
前記有機化合物フルオロフォアが、シアニン、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、カルボピロニン、オキサジン、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ、Ｃｒｙｓｔａｌ Ｖｉｏｌｅｔ、ペリレンビスイミド、スクアレン、ＢＯＤＩＰＹ、ＮＢＤ（ニトロベンズオキサジアゾール）、及びＤＡＢＣＹＬ（４−（（４−（ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸）から選択される、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記タンパク質フルオロフォアが、ＧＦＰ、サンゴから抽出された蛍光性タンパク質、及びフィコビリタンパク質から選択される、請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
蛍光性ランタニド錯体が、ランタニドクリプテート又はランタニドキレートである、請求項５に記載の化合物。
【請求項９】
Ｍが、以下の式の基：
【化５】
0005837419.tif 000092
［式中、
ｗは０〜８であり、ｖは０又は１であり、及びＡｒは１〜３個のヘテロ原子を含む、５又は６員環の飽和又は不飽和ヘテロ環であって、場合によりハロゲン原子によって置換される前記ヘテロ環である］
から選択される反応性基であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｍが、以下の基：カルボン酸、アミン、カルボン酸のスクシンイミジルエステル、ハロアセトアミド、ヒドラジン、イソチオシアネート、マレイミド基、脂肪族アミン、から選択される反応性基であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
以下の式：
【化６】
0005837419.tif 000093
【化７】
0005837419.tif 000094
の一つに該当することを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
以下の式：
【化８】
0005837419.tif 000095
の一つに該当することを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
ＡＧＴ酵素との融合タンパク質の形態で発現される対象タンパク質を標識化する方法であって、前記融合タンパク質を、請求項１〜８、１１又は１２のいずれか１項に記載の化合物と接触させる工程を含むことを特徴とする、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素のような求電子化合物の変異原性及び発癌性効果は、大部分がＤＮＡのグアニン残基のＯ6−アルキル化が原因である。ＤＮＡのアルキル化に対する防御機構が哺乳動物及び細菌に存在し、並びに、Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）は特に、これらの損傷を修復することが可能である。ＡＧＴは、アルキル化されたグアニンのＯ6位のアルキル基を、それ自体のシステインの一つのチオール基へと移動させ、それによりＡＧＴの不可逆なアルキル化がなされる。この置換基移動は、二分子求核置換反応を経由して行われ、そしてそれは、アルキル基の移動に加えて、ベンジル基の移動も可能である理由を説明する。
【０００２】
腫瘍細胞中におけるＡＧＴの過剰発現が、その作用がＤＮＡのアルキル化に基づく医薬、例えばプロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロマイド、及びビス（２−クロロエチル）−Ｎ−ニトロソ尿素に対する抵抗性の主な理由である場合、化学療法における増感剤としてのＡＧＴ阻害剤の使用が提案された（Ｐｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５１：１６７−２２３，１９９５）。米国特許第５６９１３０７号明細書には、ベンジル基上に種々の置換基を有するＯ6−ベンジルグアニン誘導体、及び、腫瘍細胞中のＡＧＴレベルを減少させ、その結果アルキル化剤の使用に基づく処置への感受性を増大させる、当該誘導体の使用について記載されている。同様に、国際公開第９７／２０８４３号には、Ｏ6−ベンジル及びＯ6−ヘテロアリールメチルピリミジン誘導体の形態である、この使用のための他の化合物について開示されている。
【０００３】
ＤＥ１９９０３８９５には、ＡＧＴをビオチン化し、それにより、ストレプトアビジンで覆われたプレート上におけるその分離及びその検出を、例えばＥＬＩＳＡアッセイを用いて可能する、ビオチン化されたＯ6−アルキルグアニン誘導体とＡＧＴとの間の反応に基づく、ＡＧＴ用アッセイについて開示されている。この技術は、癌組織におけるＡＧＴレベルを測定するために、及びＡＧＴ阻害剤を強調するために提案される。
【０００４】
国際公開第０１／８５２２１号は、ＡＧＴを検出するために、Ｏ6−ベンジルグアニンのフルオロ又はヨード放射活性誘導体を使用することを提案している。
【０００５】
Ｄａｍｏｉｓｅａｕｘ他，ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ．４：２８５−２８７，２００１は、オリゴデオキシリボヌクレオチドへ組み込まれるＯ6−アルキルグアニン誘導体、及び、化学療法の有効性を改善するために、癌細胞中のＡＧＴの発現レベルを測定することを目的とした、ＡＧＴを標識することを意図されたプローブとしてのそれらの使用について開示している。
【０００６】
国際公開第０２／０８３９３７号には、ＡＧＴと融合した対象タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）を検出及び操作するための方法であって、この融合タンパク質を、標識を有するＡＧＴ基質と接触させ、それにより、ＡＧＴへの対象分子の移動後に、この対象タンパク質を検出又は操作することを可能とすることから成る前記方法について記載されている。この出願はまた、ＡＧＴを含む種々の融合タンパク質、ＡＧＴ基質の構造に関する一般的原則、並びに、種々の標識及び前記標識を検出する方法を開示している。
【０００７】
国際公開第２００４／０３１４０４号には、先に記載された方法で使用され得る、ＡＧＴを含む特定の融合タンパク質、及び対象タンパク質、この方法によって得られる標識化された融合タンパク質、及び前記融合タンパク質を使用する方法が記載されている。
【０００８】
国際公開第２００４／０３１４０５号、及び第２００５／０８５４７０号には、１又は２以上の標識を有する特定のＡＧＴ基質、及びそれらの製造方法について記載されており、ここでこれらの基質は、国際公開第０２／０８３９３７号に記載された方法において使用され得る。
【０００９】
ＡＧＴ基質の例は、以下のベンジルベンジルグアニン誘導体及びベンジルシトシン誘導体である：
【００１０】
【化１】
0005837419.tif 000002
【００１１】
【化２】
0005837419.tif 000003
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、５個又は６個の原子を有する環を含むリンカーを通じて、対象分子と共有結合されたベンジルヌクレオチドから構成される、ＡＧＴ酵素又はその変異体の新規基質に関する。これらの基質は、国際公開第０２／０８３９３７号に記載されたような、ＡＧＴと融合された対象タンパク質を検出及び操作するための方法の実施のために特に好適である。この技術は現在、商品名「ＳＮＡＰ−ｔａｇ」及び「ＣＬＩＰ−ｔａｇ」として知られる酵素を使用して、Ｃｏｖａｌｙｓによって利用されている。
【００１３】
ＡＧＴ（Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ）は、本明細書において、その由来（ヒト、マウス、ラットなど）に関係なく、野生型ＡＧＴを、及び、ベンジルヌクレオチド基質と結合された対象分子を当該酵素のチオール基へと移動させることができるその機能的変異体を意味するものとして理解される。Ｃｏｖａｌｙｓから販売されている、ＳＮＡＰ−ｔａｇ酵素（Ｊｕｉｌｌｅｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０，３１３−３１７，Ａｐｒｉｌ  ２００３）、及びＣＬＩＰ−ｔａｇ酵素（Ｇａｕｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５，１２８−１３６，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００８）は、ヒトＡＧＴの変異体であり、その基質は各々、Ｏ6−ベンジルグアニン（以下、本明細書でＢＧと記載される）及びＯ2−ベンジルシトシン（以下、本明細書でＢＣと記載される）である。Ｎ−ＡＧＴ酵素（Ｇｒｏｎｅｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．７，ｐｐ．３０９−３１６，２００６）が、この酵素の別の変異体であり、Ｏ6−ベンジルグアニンとの当該酵素の反応性は、ＳＮＡＰ−ｔａｇ酵素の反応性よりも高い。
【００１４】
全く予想外なことに、本発明のＡＧＴの基質とこのＡＧＴ酵素との、特にそのＳＮＡＰ−ｔａｇ、ＣＬＩＰ−ｔａｇ、及びＮ−ＡＧＴ変異体との反応性は、これらの酵素の従来の基質との反応性よりも極めて高く、そしてそれは、極めてより速いＡＧＴ標識化カイネティクスによって表わされる。したがって、本発明のＡＧＴ基質によって、ＡＧＴ及びその変異体の適用を、基質濃度及び標識化時間が現時点で限定的である分野（ハイスループット・スクリーニング、診断、医学的画像など）へと拡張することが可能となる。
【００１５】
本発明のＡＧＴ基質は、式（Ｉ）の化合物：
【００１６】
【化３】
0005837419.tif 000004
【００１７】
［式中、
Ｙ−Ｏは、一緒になって、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、キサンチン、ヒポキサンチンから選択されるヌクレオチドを形成し；
Ｌ1及びＬ2はリンカーであり；
Ｍは対象分子又は反応性基であり；
Ａは、炭素環（ｃａｒｂｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｒｉｎｇ）又は窒素原子を１つ含むヘテロ環を示し、ここで前記炭素環又はヘテロ環は芳香族であるか又は飽和されており、無置換であるか又はカルボキシル基によって置換されており、及び５又は６個の原子を含む］
である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１Ａは、幾つかの官能基化された（反応性基、例えばＮＨＳ基を有する）フルオロフォアの式であり、それらの合成は、既知であるか、又はそれらは市販品であり、並びにそれらは本発明の化合物の製造のための中間体として使用され得る。
【図１Ｂ】図１Ｂは、幾つかの官能基化された（反応性基、例えばＮＨＳ基を有する）フルオロフォアの式であり、それらの合成は、既知であるか、又はそれらは市販品であり、並びにそれらは本発明の化合物の製造のための中間体として使用され得る。
【図２】図２は、ＢＧ−ＤＹ６４７及びＢＧ−メチルベンズアミド−ＤＹ６４７、並びにＳＮＡＰ−ｔａｇ酵素との間の反応性の比較を示す。
【図３】図３は、細胞モデルにおいてＳＮＡＰ−ｔａｇＳＴ２６酵素を用いて得られた結果を示す。
【図４】図４は、ＳＮＡＰ−ｔａｇよりも反応性のある変異体であるＮ−ＡＧＴ酵素を用いて得られた結果を示す。
【図５】図５は、ＳＮＡＰ−ｔａｇ酵素との、ＢＧ−ＡＴＴＯ６４７Ｎ／ＢＧ−メチルベンズアミド−ＡＴＴＯ６４７Ｎの反応性の比較を示す。
【図６】図６は、ＳＮＡＰ−ｔａｇ酵素との、ＢＧ−フルオレセイン−５−ＥＸ／ＢＧ−メチルベンズアミド−フルオレセイン−５−ＥＸの反応性の比較を示す。
【図７】図７は、ＳＮＡＰ−ｔａｇ酵素との、ＢＧ−Ｔｂ（ＫＲ）／ＢＧ−メチルベンズアミド−Ｔｂ（ＫＲ）の反応性の比較を示す。
【図８】図８は、細胞モデルにおいて、ＢＧ−メチルベンズアミド−Ｔｂ（ＫＲ）基質を使用して得られた結果を示す。
【図９】図９は、ＳＮＡＰ−ｔａｇ酵素との、ＢＧ−ＤＹ６４７／ＢＧ−アミノメチルニコチンアミド−ＤＹ６４７の反応性の比較を示す。
【図１０】図１０は、細胞モデルにおいて、ＢＣ−Ｔｂ（ＫＲ）／ＢＣ−メチルベンズアミド−Ｔｂ（ＫＲ）基質を使用して得られた結果を示す。
【図１１】図１１は、細胞モデルにおいて、ＢＣ−ＤＹ６４７／ＢＣ−メチルベンズアミド−ＤＹ６４７基質を使用して得られた結果を示す。
【図１２】図１２は、ＳＮＡＰ−ｔａｇ酵素との、ＢＧ−ＤＹ６４７／ＢＧ−シス−シクロヘキサン−ＤＹ６４７の反応性の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ヌクレオチドがグアニン、キサンチン、又はヒポキサンチンである式（Ｉ）の基質は、式（ＩＩ）：
【００２０】
【化４】
0005837419.tif 000005
【００２１】
［式中、
Ｌ1、Ａ、Ｌ2及びＭは、上記と同一の意味を有し、並びにＲ1は水素、ＮＨ2基、又はＯＨ基及びオキソ基から選択される］
に相当する。Ｒ1がＮＨ2基又はＯＨ基であるとき、Ｙ−Ｏ基は各々グアニン又はキサンチンである点に留意のこと。
【００２２】
Ｒ1がＯＨ基であるとき、優勢な形態は、Ｒ1がオキソ基であり、且つプリンの２位の炭素と３位の窒素との間の結合が単結合である互変異性体である。
【００２３】
Ｒ1がＮＨ2基である式（ＩＩ）の基質が好ましい。これらの好ましい基質は、ベンジルグアニンの誘導体である。
【００２４】
ヌクレオチドがシトシン、チミン、又はウラシルである、式（Ｉ）の基質は、式（ＩＩＩ)：
【００２５】
【化５】
0005837419.tif 000006
【００２６】
［式中、
Ｌ1、Ａ、Ｌ2及びＭは、上記と同一の意味を有し；
Ｒ2は水素、ＮＨ2、ＯＨ基及びオキソ基から選択され；並びに
Ｒ3は水素、及びＣＨ3基から選択される］
に相当する。
【００２７】
Ｒ2がＯＨ基であるとき、優勢な形態は、Ｒ2がオキソ基であり、且つピリミジンの４位の炭素と３位の窒素との間の結合が単結合である互変異性体である。
【００２８】
Ｒ2がＮＨ2基であり、且つＲ3が水素原子である、式（ＩＩＩ）の基質が好ましい。これらの好ましい基質は、シトシン誘導体である。
【００２９】
置換基Ａ
置換基Ａは、炭素環、又は窒素原子を１個含むヘテロ環であって、ここで前記炭素環又はヘテロ環は芳香族であるか又は飽和されており、無置換であるか又はカルボキシル基によって置換されており、５又は６個の原子を含む。
【００３０】
好ましくは、Ａ基は、以下の群から選択される二価の基である：
【００３１】
【化６】
0005837419.tif 000007
【００３２】
リンカー
リンカーＬ1及びＬ2はそれぞれ、ベンジルヌクレオチド及び対象分子をＡ基へとつないでいる。これらのリンカーの構造は、Ａ基を、一方でベンジルヌクレオチドと結合させ、及び他方で対象分子と結合させるために選択される化学合成経路によって決定される。
【００３３】
一般的に、リンカーは、共有結合性の単結合によって、又は以下の基から選択される二価の有機基によって構成される：１又は２以上の二重結合又は三重結合を場合により含む、直鎖又は分岐鎖のＣ1−Ｃ20アルキレン基；Ｃ5−Ｃ8シクロアルキレン基、及びＣ6−Ｃ14アリーレン基（前記アルキレン、シクロアルキレン又はアリーレン基は、１若しくは２以上のヘテロ原子、例えば酸素、窒素、硫黄、若しくはリンを、又は１若しくは２以上のカルバモイル若しくはカルボキサミド基を場合により含み、及び前記アルキレン、シクロアルキレン又はアリーレン基は、Ｃ1−Ｃ8アルキル、Ｃ6−Ｃ14アリール、スルホネート若しくはオキソ基によって場合により置換される）。
【００３４】
特に、リンカーは以下の二価の基から選択され得る：
【００３５】
【化７】
0005837419.tif 000008
【００３６】
【化８】
0005837419.tif 000009
【００３７】
［式中、ｎ、ｍ、ｐ、ｒは１〜１６の整数、好ましくは１〜５の整数である。］
【００３８】
Ｌ1について、以下の式の二価の基が好ましい：
【００３９】
【化９】
0005837419.tif 000010
【００４０】
Ｌ2について、以下の式の二価の基が好ましい：
【００４１】
【化１０】
0005837419.tif 000011
【００４２】
［式中、ｑ、ｕ、ｔは１〜１０の整数である。］
【００４３】
対象分子
上記の通り、本発明のＡＧＴ基質は、対象分子を用いてＡＧＴ酵素を標識するために使用されることが特に意図されている。この酵素が対象タンパク質との融合タンパク質の形態で発現されるとき、ＡＧＴ基質が有する対象分子を用いて、前記タンパク質を、その後標識化することが可能である。
【００４４】
対象分子は、ＳＮＡＰ−ｔａｇ技術に関する文献に示されるように、非常に多様な性質及び機能を有し得、そしてそれは想定される適用に依存する。特に、対象分子は：発光性化合物又はフルオロフォア、放射性分子、１対の結合パートナーの一員、他の生体分子と相互作用することができる分子、他の分子と共有結合又は非共有結合することができる分子、Ｈ2Ｏ2及びアスコルビン酸に曝露されたときにヒドロキシルラジカルを発生することができる分子、光への曝露後に活性ラジカルを発生することができる分子、固相担体に共有結合される分子、脂質、又は、それ自体が細胞膜へ挿入され得る任意の他の分子、並びに対象とする酵素特性、化学的特性若しくは物理学的特性を有する生体分子から選択され得る。
【００４５】
１つの具体的な実施形態において、対象分子は：アビジン、ストレプトアビジン、ビオチンから選択される。
【００４６】
別の実施形態において、対象分子は、測定可能なシグナル、特に発光性化合物又はフルオロフォアを発生又は調節することができる標識である。
【００４７】
この場合において、及び非限定の例として、対象分子は以下の発光性化合物又はフルオロフォアから選択され得る：
−有機化合物フルオロフォア、例えばシアニン及びその誘導体（特に、商品名ＤＹ６４７、Ｃｙ５、ＤＹ４９０として知られているもの）、フルオレセイン及びその誘導体、クマリン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、カルボピロニン及びその誘導体、オキサジン及びその誘導体、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ、Ｃｒｙｓｔａｌ Ｖｉｏｌｅｔ及びその誘導体、ペリレンビスイミド及びその誘導体、スクアレン、ＢＯＤＩＰＹ、ＮＢＤ（ニトロベンズオキサジアゾール）及びその誘導体、ＤＡＢＣＹＬ（４−（（４−（ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸）及びその誘導体；
−タンパク質フルオロフォア、例えばＧＦＰ及びそのバリアント、サンゴから抽出された蛍光性タンパク質、フィコビリタンパク質、例えばＢ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、Ｃ−フィコシアニン、アロフィコシアニン、特にＸＬ６６５の名前で知られているもの；
−蛍光性ランタニド錯体、例えばランタニドクリプテート、ランタニドキレート（特に、ユウロピウム、テルビウム、サマリウム、ジスプロシウム、ネオジミウムのキレート及びクリプテート）。
【００４８】
対象分子はまた、非蛍光性エネルギーアクセプターであり得、例えば以下の商品名で知られる製品から選択され得る：Ａｎａｓｐｅｃ製の製品ＱＸＬ、特に製品ＱＸＬ５７０、ＱＸＬ６１０、ＱＸＬ６７０及びＱＸＬ６８０；Ｄｙｏｍｉｃｓ製の製品ＤＹＱ６６０及びＤＹＱ６６１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製の製品ＱＳＹ７、ＱＳＹ９及びＱＳＹ２１；ＡＴＴＯ−ＴＥＣ製の製品ＡＴＴＯ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ５８０Ｑ、ＡＴＴＯ６２１Ｑ。
【００４９】
好ましくは、対象分子は、以下の商品名で知られる製品から選択される：
ＤＹ６４７；ｄ２；ＡＴＴＯ６４７Ｎ；ＡＴＴＯ４６５；フルオレセイン−５−ＥＸ；５，６−カルボキシフルオレセイン；ユウロピウムＰｙ−ｂｉｐｙクリプテート；テルビウムＤＯＴＡ−ＴＡＴＰ錯体；ユウロピウムｐｙ−ｂｉｐｙ−テトラ酸クリプテート、ユウロピウムトリス−ｂｉｐｙクリプテート、テルビウムクリプテートＴｂ（ＫＲ）、ユウロピウムトリス−ｂｉｐｙ−ペンタ酸クリプテート、ユウロピウムＰｙ−ｂｉＴＡＴＰクリプテート。
【００５０】
さらにより好ましくは、フルオロフォアは、以下のフルオロフォアから選択される：ＤＹ６４７、ＡＴＴＯ６４７Ｎ、フルオレセイン−５−ｅｘ、Ｔｂ（ＫＲ）、及びＡＴＴＯ４６５。
【００５１】
図１Ａ及び１Ｂは、幾つかの官能基化された（反応性基、例えばＮＨＳ基を有する）フルオロフォアの式であり、それらの合成は、既知であるか、又はそれらは市販品であり、並びにそれらは本発明の化合物の製造のための中間体として使用され得る。
【００５２】
他の分子とのカップリングを促進する反応性基を有する多くのフルオロフォアは市販されている。例えば、以下のフルオロフォアは、市販のフルオロフォアである：ＤＹ６４７−ＮＨＳ、ＤＹ４９０−ＮＨＳ（Ｄｙｏｍｉｃｓ）、５，６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン−５−ＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＡＴＴＯ６４７Ｎ−ＮＨＳ及びＡＴＴＯ４６５−ＮＨＳ（ＡＴＴＯＴＥＣ）、ユウロピウム トリスビピリジンクリプテート（Ｃｉｓｂｉｏ）。
【００５３】
種々の置換基を有するシアニンの合成は、文献中で広く開示されている。特に、シアニン及びそれらの合成方法は、ＵＳ５，２６８，４８６、及びＵＳ５，６２７，０２７、並びにＥＰ１，３２２，７７０に記載されている。
【００５４】
希土類錯体は、例えば、ＵＳ４７６１４８１、ＵＳ５０３２６７７、ＵＳ５０５５５７８、ＵＳ５１０６９５７、ＵＳ５１１６９８９、ＵＳ４７６１４８１、ＵＳ４８０１７２２、ＵＳ４７９４１９１、ＵＳ４６３７９８８、ＵＳ４６７０５７２、ＵＳ４８３７１６９、ＵＳ４８５９７７７に記載されている既知の化合物である。他のキレートは９座配位子、例えばターピリジン（ＥＰ４０３５９３、ＵＳ５３２４８２５、ＵＳ５２０２４２３、ＵＳ５３１６９０９）から成る。希土類は、好ましくはユウロピウム又はテルビウムである。
【００５５】
希土類クリプテート及びその製造は特に、ＥＰ０１８０４９２、ＥＰ０６０１１１３、及び国際公開第０１／９６８７７号に記載されている。
【００５６】
Ｔｂ（ＫＲ）−ＮＨＳフルオロフォアの合成は、国際公開第２００８／０６３７２１号に記載されている。
【００５７】
ＤＯＴＡ−ＴＡＴＰ−Ｔｂ及びその合成は、Ｒ．Ａ．Ｐｏｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．ＢｉｏｍｏｌＣｈｅｍ．，２００５，３，１０１３−１０２４に記載されている。
【００５８】
反応性基
通常、反応性基は各々、求電子性又は求核性基であって、それらは好適な求核性基又は求電子性基の存在下で共有結合を形成し得る。反応性基を含む本発明の化合物と官能基を有する対象分子との間の結合反応により、反応性基由来の１又は２以上の原子を含む共有結合を形成する。好ましくは、反応性基は、以下の化合物：アクリルアミド、活性化アミン（例えばカダベリン又はエチレンジアミン）、活性化エステル、アルデヒド、アルキルハライド、無水物、アニリン、アジド、アジリジン、カルボン酸、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、例えばモノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、ヒドラジン（ヒドラジドを含む）、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、スルホニルハライド、又はチオール、ケトン、アミン、酸ハライド、ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、アジドニトロフェニル、アジドフェニル、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド、グリオキサール、及び、具体的に以下の式の基：
【００５９】
【化１１】
0005837419.tif 000012
【００６０】
［式中、
ｗは０〜８であり、ｖは０又は１であり、及びＡｒは１〜３個のヘテロ原子を含む、５又は６員環の飽和又は不飽和ヘテロ環であって、場合によりハロゲン原子によって置換される前記ヘテロ環である。］
の内の１つ由来の基である。
【００６１】
好ましくは、反応性基は、カルボン酸、アミン、カルボン酸のスクシンイミジルエステル、ハロアセトアミド、ヒドラジン、イソチオシアネート、マレイミド基、脂肪族アミンである。
【００６２】
Ｍ基が反応性基である、本発明の式（Ｉ）の化合物は、Ｍが対象分子である式（Ｉ）の化合物を得るために有用な合成中間体である。
【００６３】
好ましい化合物
式（Ｉ’）の化合物が好ましい：
【００６４】
【化１２】
0005837419.tif 000013
【００６５】
［式中、
Ｂは、以下の式（ＩＩ’）又は（ＩＩＩ’）の基であり：
【００６６】
【化１３】
0005837419.tif 000014
【００６７】
（式中、
点線は式（Ｉ’）の酸素との結合を表し、
Ｒ1はＨ、ＮＨ2、ＯＨ基又はオキソ基から選択され、
Ｒ2はＮＨ2、ＯＨ又はオキソから選択され、
Ｒ3は、Ｈ又はＣＨ3基から選択される）；
Ｌ2はリンカーであり；
Ｍは対象分子又は反応性基であり；
Ａは、以下の二価の基：
【００６８】
【化１４】
0005837419.tif 000015
【００６９】
から選択される。］
【００７０】
Ｒ2がＮＨ2基であり、及び、Ｒ3がＨである、式（ＩＩＩ’）の化合物の基を含む式（Ｉ’）の化合物、並びにＲ1がＮＨ2基である式（ＩＩ’）の化合物の基を含む式（Ｉ’）の化合物が、好ましいサブファミリーを構成する。
【００７１】
式（Ｉ’）は、Ｍ及びＬ2が先に定義された通りである、以下の式の化合物を含む。各々の式において、Ｌ1−Ａ基の意味は以下に示される。
【００７２】
Ｌ1−Ａ基は、ベンズアミド基を形成する：
【００７３】
【化１５】
0005837419.tif 000016
【００７４】
Ｌ1−Ａ基は、ニコチンアミド基を形成する：
【００７５】
【化１６】
0005837419.tif 000017
【００７６】
Ｌ1−Ａ基は、イソニコチンアミド基を形成する：
【００７７】
【化１７】
0005837419.tif 000018
【００７８】
Ｌ1−Ａ基は、トランス−シクロヘキシルアミド基を形成する：
【００７９】
【化１８】
0005837419.tif 000019
【００８０】
Ｌ1−Ａ基は、シス−シクロヘキシルアミド基を形成する：
【００８１】
【化１９】
0005837419.tif 000020
【００８２】
Ｌ1−Ａ基は、ピペリジニルアミド基を形成する：
【００８３】
【化２０】
0005837419.tif 000021
【００８４】
Ｌ1−Ａ基は、カルボキシベンズアミド基を形成する：
【００８５】
【化２１】
0005837419.tif 000022
【００８６】
以降の本明細書において、以下の略語が使用され得る：
ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＴＴ：ジチオトレイトール
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＤＭＦ：無水ジメチルホルムアミド
ＴＢＴＵ：Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＥＡＢ：重炭酸トリエチルアンモニウム
ＳＰＤＰ：Ｎ−スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート
ＴＣＥＰ：トリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン塩酸塩
ＤＭＳＯ：無水ジメチルスルホキシド
ＤＩＰＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＢＧ：Ｏ6−ベンジルグアニン
ＢＣ：Ｏ2−ベンジルシトシン
【００８７】
ＤＭＥＭ培地：「Ｄｕｌｂｅｃｃｏ変法イーグル培地」細胞培養培地、市販されており、且つ多くの適用において使用されている。
ＦＣＳ：ウシ胎仔血清
ＮＨＳのエステル：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのエステル
ＦＲＢ：ＦＫＢＰ−ラパマイシン複合体との、ＦＲＡＰタンパク質の結合ドメイン（「ＦＲＡＰの、ＦＫＢＰ-ラパマイシン結合ドメイン」）
ＦＲＡＰ：ＦＫＢＰ−ラパマイシン複合体に結合するタンパク質（「ＦＫＢＰ-ラパマイシン結合タンパク質」）
ＦＫＢＰ：ＦＫ５０６に結合するタンパク質（「ＦＫ５０６結合タンパク質」）
ＧＳＴ：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼラーゼ
ＴＢＰ：トリスビピリジン。表現「ユウロピウムＴＢＰクリプテート」又は頭字語ＫＴＢＰは、Ｃｉｓｂｉｏから市販されている、図１Ａで示される式の化合物を示す。
【００８８】
以下のフルオロフォアは市販されている：ＤＹ−６４７−ＮＨＳ（Ｄｙｏｍｉｃｓ）、５，６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン−５−ＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＡＴＴＯ６４７Ｎ−ＮＨＳ（ＡＴＴＯＴＥＣ）及びユウロピウムトリスビピリジンクリプテート（Ｃｉｓｂｉｏ）。
【００８９】
Ｔｂ（ＫＲ）−ＮＨＳフルオロフォアの合成は、国際公開第２００８／０６３７２１号に記載されている。
【００９０】
合成：
Ｉ）ベンジルグアニン−フルオロフォア型の化合物の合成
これらの化合物は、実験編にて参考化合物として示される化合物である：それらはベンジルグアニンとフルオロフォアとの間にＬ1−Ａ−Ｌ2基を含まない。
【００９１】
これらの化合物の製造は、文献中に記載されており、そしてそれは、反応性基を有するフルオロフォアと反応できる、別の反応性基を有するＢＧ誘導体を接触させることにある。以下の合成スキームは、ＢＧ−ＮＨ2又はＢＧ−ＳＨ誘導体の使用に基づき、そしてそれらは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はマレイミド基のエステルを有するフルオロフォアと接触され得る。かかるフルオロフォアは市販されている。
【００９２】
ＢＧ−ＮＨ2は、Ａｎｔｊｅ  Ｋｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００３，２１，８６−８９に記載されたプロトコールに従って合成された。
【００９３】
ＢＧ−ＳＨの合成
ＢＧ−ＳＨを、スキーム１に記載された順番に従って合成した。ＢＧ−ＳＨとＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート）との反応の後、ジスルフィド架橋をＴＣＥＰ（トリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン）塩酸塩又はＤＴＴで還元して、当業者に周知の操作条件にて、高収率で所望のＢＧ−ＳＨを得た。
【００９４】
【化２２】
0005837419.tif 000023
【００９５】
ＢＧ−フルオロフォア及びＢＧ−Ｓ−フルオロフォアの合成
ＢＧ−フルオロフォア及びＢＧ−Ｓ−フルオロフォアを、この種のカップリングで一般的に使用される方法に従って製造した。ＢＧ−ＮＨ2を、ＮＨＳエステル基を含むフルオロフォアと速やかに反応させ、分取ＨＰＬＣによる精製後に、対応するＢＧ−フルオロフォアを得た。フルオロフォアがマレイミド基を有する場合、ＢＧ−ＳＨが使用され、ＢＧ−Ｓ−フルオロフォアを得た（スキーム２）。
【００９６】
【化２３】
0005837419.tif 000024
【００９７】
ＩＩ）ベンジルグアニン−Ｌ1−Ａ−Ｌ2−フルオロフォア型の、本発明の化合物の合成：
以下の合成スキームは、Ｂ基がグアニンである化合物に関し、そして対象分子はフルオロフォアである；グアニン以外の基、又はフルオロフォア以外の対象分子を含む化合物の合成は、同一の工程又は実質的に類似のステップを使用する。
【００９８】
これらの化合物の製造はまた、種々の反応性基を使用する従来の結合技術の使用に基づく。これらの従来技術は、例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６，ｐ．１３７−１６６に記載されている。
【００９９】
特に、これらの化合物の合成は、以下の必須工程を含む：
（ａ）それらの１つが従来の保護基によって保護されている、２つの反応性基を有するＡ基の合成；
（ｂ）保護された反応性基及び活性化された反応性基を有するＡ基を得るための、無保護の反応性基の活性化；
（ｃ）Ａ基中の活性化された反応性基と反応することができる、反応性基を有するＢＧの誘導体と、先の工程で得られた製造物とを接触させ、ＢＧ−Ｌ1−Ａ−［保護された反応性基］を形成させること；
（ｄ）Ａ基中の保護された反応性基の脱保護；並びに
（ｅ）先の工程で得られた製造物中のものと反応することができる、反応性基を有するフルオロフォアと、先の工程で得られた製造物とを接触させて、製造物であるＢＧ−Ｌ1−Ａ−Ｌ2−フルオロフォアを得ること。
【０１００】
この非常に一般的な手順の使用は、スキーム及び以下のプロトコール中に、並びに実験編中により詳細に記載されている。
【０１０１】
保護されたアミン及びカルボキシル基を有する好ましいＡ基の合成
１）メチルベンズアミドの前駆体
【０１０２】
【化２４】
0005837419.tif 000025
【０１０３】
４−アミノメチル安息香酸をトリフルオロアセテート体で保護し、後の合成において微かに塩基性の媒体中で穏和に脱保護を行う。
【０１０４】
２）メチルニコチンアミド及びメチルイソニコチンアミドの前駆体
【０１０５】
【化２５】
0005837419.tif 000026
【０１０６】
市販のシアノニコチニル誘導体から、対応するアミノメチルニコチニル化合物を水素化により得る。アミノ基をその後、トリフルオロアセテート基により保護する。
【０１０７】
３）トランス-シクロヘキシルアミド、シス-シクロヘキシルアミド、及びピペリジニルアミドの前駆体
【０１０８】
【化２６】
0005837419.tif 000027
【０１０９】
上の化合物は市販されているか、又は当業者に周知の手順により合成され得る。
４）カルボキシメチルアジドベンズアミドの前駆体
【０１１０】
【化２７】
0005837419.tif 000028
【０１１１】
一般的に使用される標準的条件を用いて、３−ブロモ−４−メチル安息香酸は、対応する３−カルボキシメチル−４−メチル安息香酸へと変換される：求電子種（炭酸ジメチル又はＣｌＣＯ2Ｍｅ）と反応するリチオ化種の、ハロゲン-リチウム交換による形成。遊離のカルボン酸基をその後、オルソゴナルな脱保護系を得ることが可能な、ｔｅｒｔ−ブチルエステル形態で保護する。アジドの導入を２工程で行う：芳香族メチルのラジカル臭素化の後、アジ化ナトリウムによる臭素原子の置換。最終的に、ｔｅｒｔ−ブチルエステルを、ＴＦＡ存在下で脱保護して、所望の前駆体を得る。
【０１１２】
反応性基を有するＡ基と、ベンジルグアニン及びフルオロフォアとのカップリング
１）ＮＨＳフルオロフォア
フルオロフォアがＮＨＳのエステルの形態で使用されるときの、ベンジルグアニン及びフルオロフォアを含む、本発明の製造物の一般的合成計画をスキーム３に示す。Ｎ−保護されたＡ基（合成又は出所は先に示された通りである）を無水物の形態（ＤＣＣの使用）か、又はＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルの形態（ＴＢＴＵの使用）のいずれかで活性化する。これらの中間体をＢＧ−ＮＨ2と速やかに反応させ、式ＢＧ−Ｌ1−Ａ（Ｎ−保護）の製造物を得る。
【０１１３】
Ａ基の窒素原子における保護基の機能として、使用される脱保護条件が、化合物ＢＧ−Ｌ1−Ａ−ＮＨ2を得ることを可能とする。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル基を含むフルオロフォアの存在下、この化合物は穏和な条件下で反応して、化合物ＢＧ−Ｌ1−Ａ−Ｌ2−フルオロフォアを得る。
【０１１４】
２）マレイミドフルオロフォア
マレイミド官能基を有するフルオロフォアを使用することも可能である。Ｌ1−Ａ基を有するＢＧ誘導体は、ＢＧ−Ｌ1−Ａ−ＮＨ2からのＢＧ−ＳＨの合成で記載したものと同一の計画に従って製造され得る。したがって、ＢＧ−Ｌ1−Ａ−ＮＨ2をＳＰＤＰと反応させ、その後ＴＣＥＰで還元することで、化合物ＢＧ−Ｌ1−Ａ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）2−ＳＨを得ることができる（スキーム４）。その後、マレイミド基を有するフルオロフォアの存在下でＢＧ−Ｌ1−Ａ−Ｌ2−フルオロフォアを得る。
【０１１５】
本発明の化合物は、対象分子及びＡＧＴ酵素を含む融合タンパク質を標識化するためにもちろん特に好適である。したがって、本発明はまた、ＡＧＴ酵素を有する融合タンパク質の形態で発現される対象タンパク質を、置換基Ｍを用いて標識化する方法に関し、この方法は、前記融合タンパク質を本発明の化合物と接触させる工程を含む。インビトロにおける、及び細胞モデル中における、種々のＡＧＴバリアントとの本発明の化合物の酵素反応性を試験するために、この方法は、本明細書の以下の実施例において実施される。
【０１１６】
【化２８】
0005837419.tif 000029
【０１１７】
【化２９】
0005837419.tif 000030
【０１１８】
酵素反応性試験
以下の実施例の目的は、参考基質（ベンジルヌクレオチド−フルオロフォア型）から出発して、又は本発明の化合物（ベンジルヌクレオチド−Ｌ1−Ａ−Ｌ2−フルオロフォア）から出発して、ＡＧＴ酵素を含む融合タンパク質（ＳＮＡＰ−ｔａｇ、Ｎ−ＡＧＴ、又はＣＬＩＰ−ｔａｇ）への、フルオロフォアの移動カイネティクスを測定することである。
【０１１９】
これらの実施例から、先行技術の基質と比較して、本発明の基質の、ＳＮＡＰ−ｔａｇ酵素及びこれらのバリアントの一つとのより高い反応性を実証することが可能となる。
【０１２０】
ＳＮＡＰ−ｔａｇ酵素との当該基質の反応性の測定は、インビトロでのモデルか、又は生細胞モデルのいずれかで行われる。
【０１２１】
インビトロ・モデルにおける、酵素反応性の手順：
ＳＮＡＰ−ｔａｇ酵素との本発明の基質の反応性試験は、組み換えタンパク質を標識化するインビトロ試験に基づく。この標識化は、１対のＦＲＥＴパートナーのフルオロフォアメンバーによって各々標識化される、２つのタンパク質の間のＦＲＥＴシグナルの検出により実証される。
【０１２２】
この場合において、ラパマイシンの存在下で相互作用するＦＲＢ及びＦＫＢＰが使用される。
【０１２３】
ＦＫＢＰタンパク質は、ＳＮＡＰ−ｔａｇ技術を用いて、第一のフルオロフォアによって標識化される：このために、ＧＳＴ−ＳＮＡＰｔａｇ−ＦＫＢＰ融合タンパク質が、市販のキット（ＳＮＡＰ発現ｐＳＴＥ７−２６ｂキット，Ｃｏｖａｌｙｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＧ，Ｗｉｔｔｅｒｓｗｉｌ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のプロトコールに従って、ｐＳＥＴ７−２６ｂプラスミドから製造される。この融合タンパク質をその後、参考ＢＧ誘導体と結合した第一のフルオロフォアと、又は本発明のＢＧ誘導体と結合した第一のフルオロフォアと接触させる。
【０１２４】
ＦＲＢタンパク質自体は、場合に応じて、ドナー蛍光性化合物（ユウロピウムＴＢＰクリプテート（ＫＴＢＰ），Ｃｉｓｂｉｏ  Ｂｉｏａｓｓａｙ）との、又はアクセプター蛍光性化合物（ＤＹ６４７，Ｄｙｏｍｉｃｓ）との従来の結合技術によって、これらの化合物で提供されるプロトコールに従って、カップリングされる。
【０１２５】
以下の表は、以下の実施例１〜４の各々における、フルオロフォア対の性質を説明する：
【０１２６】
【表１】
0005837419.tif 000031
【０１２７】
各々の実施例において、２ｎｍｏｌの、ユウロピウムクリプテート又はＤＹ６４７（第二のフルオロフォア）で標識されたＦＲＢ組み換えタンパク質を、２ｎｍｏｌのＧＳＴ−ＳＮＡＰ−ｔａｇ−ＦＫＢＰ組み換えタンパク質、及び増加する濃度の第一のフルオロフォア（先行技術のＢＧ−フルオロフォア、又は本発明のＢＧ−Ｌ1−Ａ−Ｌ2−フルオロフォア）によって標識化されたＢＧと、常温で共インキュベート（ｃｏ−ｉｎｃｕｂａｔｅ）した。
【０１２８】
蛍光の読み取りは、３３７ｎｍでの励起後、ＲｕｂｙＳｔａｒマシーン（ＢＭＧ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）にて、６２０ｎｍ及び６６５ｎｍで行った。１００ｎＭのラパマイシンによる、ＦＲＢ／ＦＫＢＰタンパク質相互作用の誘導の前及び後に読み取りを行った。この相互作用は、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルの放出により示された。ＳＮＡＰ−ｔａｇ酵素は、単一の蛍光性基に付着し得るため、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルの増大は、反応媒体中の標識化されたタンパク質のパーセンテージと直接的に比例する。このインビトロのモデルにより、当該反応に関与する過剰の基質の関数としての酵素標識カイネティクスを定めることが可能となる。
【０１２９】
当該結果は、以下の式に従って、ｄ６６５としてか、又は％標識かのいずれかで示される：
ｄ６６５＝（ＧＳＴ−ＳＴ−ＦＫＢＰタンパク質有りの場合の、６６５ｎｍでのシグナル）−（ＧＳＴ−ＳＴ−ＦＫＢＰタンパク質無しの場合の、６６５ｎｍでのシグナル）
【０１３０】
％標識は、１８時間のインキュベーション後に得られる最大標識に相当するシグナルと比較して得られる。
％標識＝（測定時間ｔでのｄ６６５／１８時間インキュベーション後のｄ６６５）×１００
【０１３１】
細胞モデルにおける、酵素反応性試験の手順
この手順により、タイプ２膜貫通型グルタメート受容体（ｍＧｌｕＲ２）との融合タンパク質の形態である、ＣＯＳ７細胞により発現されるＡＧＴと、本発明の基質との反応性を試験することが可能となる。
【０１３２】
種々のＡＧＴ変異体がこの試験で分析された：Ｃｏｖａｌｙｓ製の  ＳＮＡＰ−ｔａｇ−ＳＴ２６若しくはＣＬＩＰ−ｔａｇ、又はＧｒｏｎｅｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．７，ｐｐ．３０９−３１６，２００６）に記載されているＮ−ＡＧＴ変異体。
【０１３３】
プラスミド：
−市販のキット（ＳＮＡＰ発現ｐＳＴＥ７−２６ｂキット，Ｃｏｖａｌｙｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のプロトコールに従って、ｐＳＥＴ７−２６ｂプラスミドから製造された、ＳＮＡＰ−ｔａｇ−ｍＧｌｕＲ２プラスミド。
−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｐｃｄｎａ３．１プラスミド。このプラスミドは、ネガティブ・コントロールとして使用される；このプラスミドをトランスフェクトされた細胞は、「ｍｏｃｋ」と表示され、そしてそれは、非特異的標識のレベルを決定することを可能とする。
【０１３４】
プロトコール：
細胞の一過性トランスフェクションを、Ｂｉｏｒａｄエレクトロポレーターを使用するエレクトロポレーションにより行った：１０００万個の細胞が、１μｇのＳＮＡＰ−ｔａｇ−ｍＧｌｕＲ２＋３μｇのｐｃｄｎａ３．１により最終体積３００μｌでトランスフェクトされた。エレクトロポレーション・パラメーターは、２８０Ｖ及び１０００μＦである。
【０１３５】
細胞をその後、ポリオルニチンと共に３０分間３７℃でインキュベートし、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｐｌａｔｅｓ（不透明黒底）に、１ウェル当たり１５００００細胞で播いた。
【０１３６】
ＤＭＥＭ＋フェノール・レッド＋１０％ＦＣＳ＋ペニシリン／ストレプトマイシン＋非必須アミノ酸培地中、３７℃、５％ＣＯ2で細胞を培養した。２４時間の発現後、第一の洗浄操作を、これと同一の１００μｌの培地を用いて行った。
【０１３７】
ＡＧＴ−ｍＧｌｕＲ2融合タンパク質の標識を、１００μｌの完全培地中、本発明のＢＧ−フルオロフォア又はＢＧ−Ｌ1−Ａ−Ｌ2−フルオロフォアの濃度を増加させながら、１時間、３７℃で行った。読み取り前に、４回の洗浄操作を、１００μｌのＴｒｉｓ−Ｋｒｅｂｓを用いて行った。
【０１３８】
フルオロフォアとしてＡＴＴＯ６４７（実施例２）、ＤＹ６４７（実施例１及び５）、並びにフルオレセイン−５−ＥＸ（実施例３）を有する基質について、１００μｌのＴｒｉｓ−Ｋｒｅｂｓ中にて、Ｒｕｂｙｓｔａｒマシーンにて、６８２ｎｍの直接的蛍光を、及びフルオレセイン−５−ＥＸ（実施例３）を有するものについては５２０ｎｍにおける直接的蛍光を読み取った。
【０１３９】
テルビウムＫＲ錯体を有する基質（実施例４及び６）について、１００μｌのＴｒｉｓ−Ｋｒｅｂｓ中にて、Ｒｕｂｙｓｔａｒマシーンにて、６２０ｎｍの時間分解蛍光を読み取った。
【実施例】
【０１４０】
実施例１：ＢＧ−メチルベンズアミド−ＤＹ６４７
ＢＧ−ＤＹ６４７及びＢＧ−メチルベンズアミド−ＤＹ６４７、並びにＳＮＡＰ−ｔａｇ酵素との間の反応性の比較
参考基質ＢＧ−ＤＹ６４７の構造：
【０１４１】
【化３０】
0005837419.tif 000032
【０１４２】
基質ＢＧ−メチルベンズアミド−ＤＹ６４７の構造：
【０１４３】
【化３１】
0005837419.tif 000033
【０１４４】
・インビトロにおける、酵素反応性及びタンパク質標識の結果
図２は、ＳＮＡＰ−ｔａｇ酵素の標識のパーセンテージ変化を、基質濃度の関数として示す。これらの結果は、メチルベンズアミド・ユニットを含む本発明の基質との３０分間のインキュベーション後に、標識が著しく改善されることを示しており、これは試験される基質の濃度に無関係であった。
【０１４５】
・細胞モデルにおいて得られた結果
ＳＮＡＰ−ｔａｇ  ＳＴ２６酵素を用いた効果
酵素の半飽和濃度は、参考化合物を用いた場合において１６８ｎＭであったが、本発明の基質を用いた場合において、たった９１．３ｎＭであった（図３）。生細胞で得られたこれらの結果は、インビトロ・モデルにおいて得られた結果を裏付けている。本発明の化合物における、この低い半飽和濃度は、低い基質濃度で、ここにおいて１００ｎＭ未満で作用することを可能とする。
【０１４６】
ＡＧＴの別の変異体に対する本発明の基質の効果を確認するために、Ｎ−ＡＧＴ変異体を用いた細胞外標識のキャラクタリゼーションを行った。
【０１４７】
Ｎ−ＡＧＴ酵素を用いた効果
図４は、ＳＮＡＰ−ｔａｇよりも反応性のある変異体であるＮ−ＡＧＴ酵素を用いて得られた結果を示し、半飽和濃度が、参考基質と比較して（４３ｎｍ）、本発明の化合物において（２２．３ｎｍ）約２倍低かった。この実施例は、本発明の基質のより大きな反応性は、ＳＮＡＰ−ｔａｇ  ＳＴ−２６酵素に特異的なものではなく、この酵素の変異体が使用されるときにおいても観察されることを示している。
【０１４８】
実施例２：ＢＧ−メチルベンズアミド−ＡＴＴＯ６４７
ＳＮＡＰ−ｔａｇ酵素との、ＢＧ−ＡＴＴＯ６４７Ｎ／ＢＧ−メチルベンズアミド−ＡＴＴＯ６４７Ｎの反応性の比較
参考基質ＢＧ−ＡＴＴＯ６４７Ｎの構造：
【０１４９】
【化３２】
0005837419.tif 000034
【０１５０】
基質ＢＧ−メチルベンズアミド−ＡＴＴＯ６４７Ｎの構造：
【０１５１】
【化３３】
0005837419.tif 000035
【０１５２】
・インビトロにおける、酵素反応性及びタンパク質標識の結果
図５は、ＳＮＡＰ−ｔａｇ酵素の標識のパーセンテージ変化を、３０分間のインキュベーション後における基質濃度の関数として示す：ここにおいても、ＡＴＴＯ６４７Ｎによって標識化された酵素のパーセンテージは、本発明の基質が使用されたときに著しく優れていることが観察され、これは試験される基質の濃度に無関係であった。
【０１５３】
同様の結果が、２つの異なるフルオロフォア、ＤＹ６４７（実施例１）及びＡＴＴＯ６４７で得られているため、この実施例は、本発明の基質の効果が、対象分子の性質に依存しないことを示している。
【０１５４】
実施例３：ＢＧ−メチルベンズアミド−フルオレセイン−５−ＥＸ
ＳＮＡＰ−ｔａｇ酵素との、ＢＧ−フルオレセイン−５−ＥＸ／ＢＧ−メチルベンズアミド−フルオレセイン−５−ＥＸの反応性の比較。
参考基質ＢＧ−フルオレセイン−５−ＥＸの構造：
【０１５５】
【化３４】
0005837419.tif 000036
【０１５６】
基質ＢＧ−メチルベンズアミド−フルオレセイン−５−ＥＸの構造：
【０１５７】
【化３５】
0005837419.tif 000037
【０１５８】
・インビトロにおける、酵素反応性及びタンパク質標識の結果
図６において示された結果は、ここにおいても、ＳＮＡＰ−ｔａｇ  ＳＴ−２６酵素との本発明の基質の反応性が、参考基質の反応性よりも優れていることを示しており、そしてこれは、参考基質であるＢＧ−フルオレセイン−５−ＥＸの反応性が十分であると考えられ得るとしてもである。これらの結果はまた、本発明の基質の効果が、それに結合される対象分子の性質に依存しないことを裏付けている。
【０１５９】
実施例４：ＢＧ−メチルベンズアミド−Ｔｂ（ＫＲ）
ＳＮＡＰ−ｔａｇ酵素との、ＢＧ−Ｔｂ（ＫＲ）／ＢＧ−メチルベンズアミド−Ｔｂ（ＫＲ）の反応性の比較。
参考基質ＢＧ−Ｔｂ（ＫＲ）の構造：
【０１６０】
【化３６】
0005837419.tif 000038
【０１６１】
基質ＢＧ−メチルベンズアミド−Ｔｂ（ＫＲ）の構造：
【０１６２】
【化３７】
0005837419.tif 000039
【０１６３】
・インビトロにおける、酵素反応性及びタンパク質標識の結果
図７の結果は、参考基質と比較して、ＳＮＡＰ−ｔａｇ酵素との、本発明の基質のより優れた反応性を示す。結合された分子は先の実施例のような有機化合物フルオロフォアではなく、ポリ大員環と希土類元素から成る錯体であり、そしてそれは先の実施例において試験されたフルオロフォアよりもずっと嵩高い点が特徴である。
【０１６４】
この実施例は、種々の分子と結合し得る、本発明の基質の普遍的性質を再度示している。
【０１６５】
・細胞モデルにおいて得られた結果
ＢＧ−メチルベンズアミド−Ｔｂ（ＫＲ）基質を使用して、生細胞の表面において発現された膜貫通タンパク質を標識した時に、インビトロ・モデルにて得られた結果は裏付けられた。本発明の基質を用いて測定された半飽和濃度は、ＳＮＡＰ−ｔａｇ−ＳＴ２６酵素において１５．４ｎＭ、Ｎ−ＡＧＴ変異体において６．４ｎＭであったが（図８）、参考基質であるＢＧ−Ｔｂ（ＫＲ）（ＳＮＡＰ−ｔａｇ）を用いた時は６０ｎＭであった。
【０１６６】
実施例５：ＢＧ−アミノニコチンアミド−ＤＹ６４７
ＳＮＡＰ−ｔａｇ酵素との、ＢＧ−ＤＹ６４７／ＢＧ−アミノメチルニコチンアミド−ＤＹ６４７の反応性の比較。
参考基質ＢＧ−ＤＹ６４７の構造：
【０１６７】
【化３８】
0005837419.tif 000040
【０１６８】
基質ＢＧ−アミノメチルニコチンアミド−ＤＹ６４７の構造：
【０１６９】
【化３９】
0005837419.tif 000041
【０１７０】
・インビトロにおける、酵素反応性及びタンパク質標識の結果
図９の曲線は、アミノメチルニコチンアミド・ユニットを含む基質との３０分間のインキュベーション後に標識化された酵素のパーセンテージはまた、参考基質で観察されたものよりもずっと優れていることを示し、これは基質の濃度に無関係であった。
【０１７１】
さらに、アミノメチルニコチンアミド・ユニットを含む基質で観察された反応性の増加は、メチルベンズアミド・ユニットを含む基質で観察されたものと同一桁の大きさであった。
【０１７２】
これらの結果は、特定の可変性が、本発明の基質の芳香族ユニット（式ＩのユニットＡ）において可能であることを示唆している。
【０１７３】
実施例６：ＢＧ−アミノニコチンアミド−Ｔｂ（ＫＲ）
ＳＮＡＰ−ｔａｇ酵素との、ＢＧ−Ｔｂ（ＫＲ）／ＢＧ−アミノニコチンアミド−Ｔｂ（ＫＲ）の反応性の比較。
参考基質ＢＧ−Ｔｂ（ＫＲ）の構造：
【０１７４】
【化４０】
0005837419.tif 000042
【０１７５】
基質ＢＧ−アミノメチルニコチンアミド−Ｔｂ（ＫＲ）の構造：
【０１７６】
【化４１】
0005837419.tif 000043
【０１７７】
先の実施例の化合物で得られた結果と同様の結果が得られた。
【０１７８】
実施例７：ＢＣ−メチルベンズアミド−Ｔｂ（ＫＲ）
ＣＬＩＰ−ｔａｇ酵素との、ＢＣ−Ｔｂ（ＫＲ）／ＢＣ−メチルベンズアミド−Ｔｂ（ＫＲ）の反応性の比較。
【０１７９】
先に記載された通り、ＣＬＩＰ−ｔａｇ酵素は、ベンジルシトシン誘導体と反応するＡＧＴ変異体であって、ＳＮＡＰ−ｔａｇ酵素と同様、Ｃｏｖａｌｙｓから市販されている。
参考基質ＢＣ−Ｔｂ（ＫＲ）の構造：
【０１８０】
【化４２】
0005837419.tif 000044
【０１８１】
基質ＢＣ−メチルベンズアミド−Ｔｂ（ＫＲ）の構造：
【０１８２】
【化４３】
0005837419.tif 000045
【０１８３】
・細胞モデルにおいて得られた結果
本実施例において使用された細胞モデルは、先の実施例において使用されたものとは異なる：融合タンパク質ＣＬＩＰｔａｇ−ｍＧｌｕＲ２をコードするプラスミド、及び融合タンパク質ＳＮＡＰｔａｇ−ｍＧｌｕＲ２をコードする別のプラスミドを用いて細胞がコトランスフェクトされるか、又は融合タンパク質ＳＮＡＰｔａｇ−ｍＧｌｕＲ２をコードする単一のプラスミドを用いて細胞がトランスフェクトされた。
【０１８４】
各々の細胞群を、３００ｎＭのＢＧ−メチルベンズアミド−ＤＹ６４７、及び、増加する濃度の参考基質（ＢＣ−Ｔｂ（ＫＲ））又は本発明の基質（ＢＣ−メチルベンズアミド−Ｔｂ（ＫＲ））の存在下でインキュベートした。Ｒｕｂｙｓｔａｒマシーンにおいて、ＴＲ−ＦＲＥＴモードで６６５ｎｍにて蛍光を測定した。測定されたシグナルは、ＤＹ６４７及びＴｂ（ＫＲ）の各々により標識化されたｍＧｌｕＲ２の２つの単量体の二量化の後における、エネルギー移動の指標である。
【０１８５】
本発明のベンジルシトシン誘導体による、ＣＬＩＰｔａｇの半飽和濃度は１３１ｎＭであって、一方、参考化合物においては８２０ｎＭであることが図１０で観察された（ＳＮＡＰｔａｇ−ｍＧｌｕＲ２を発現する細胞において観察されるシグナルは、ＣＬＩＰｔａｇによるＢＧ−ＤＹ６４７の非特異的固定化のシグナルにのみ対応する）。
【０１８６】
この実施例は、本発明の基質の予想外の効果が、ＳＮＡＰｔａｇ／ベンジルグアニンに限定されるものではなく、ＣＬＩＰｔａｇ／ベンジルシトシンにおいても観察されることを裏付けている。
【０１８７】
実施例８：ＢＣ−メチルベンズアミド−ＤＹ６４７
ＣＬＩＰ−ｔａｇ酵素との、ＢＣ−ＤＹ６４７／ＢＣ−メチルベンズアミド−ＤＹ６４７の反応性の比較。
【０１８８】
本実施例は、実施例７と同一の方法で行われたが、３００ｎＭのＢＧ−メチルベンズアミド−Ｔｂ（ＫＲ）、及び増加する濃度の参考基質（ＢＣ−ＤＹ６４７）又は本発明の基質（ＢＣ−メチルベンズアミド−ＤＹ６４７）の存在下において細胞がインキュベートされた。それらの式は以下の通りである：
【０１８９】
参考基質（ＢＣ−ＤＹ６４７）
【０１９０】
【化４４】
0005837419.tif 000046
【０１９１】
基質ＢＣ−メチルベンズアミド−ＤＹ６４７：
【０１９２】
【化４５】
0005837419.tif 000047
【０１９３】
図１１に示された結果は、本参考基質に対して（半飽和：１５７９ｎＭ）に対して、本発明の基質のより優れた反応性を裏付けている（半飽和：２４０ｎＭ）。
【０１９４】
実施例９：ＢＧ−シス−シクロヘキサン−ＤＹ６４７
ＳＮＡＰ−ｔａｇ酵素との、ＢＧ−ＤＹ６４７／ＢＧ−シス−シクロヘキサン−ＤＹ６４７の反応性の比較。
参考基質ＢＧ−ＤＹ６４７（化合物１）の構造：
【０１９５】
【化４６】
0005837419.tif 000048
【０１９６】
基質ＢＧ−シス−シクロヘキサン−ＤＹ６４７（化合物２９）の構造：
【０１９７】
【化４７】
0005837419.tif 000049
【０１９８】
・インビトロにおける、酵素反応性及びタンパク質標識の結果
図１２の曲線は、シス−シクロヘキサン・ユニットを含む基質との１時間のインキュベーション後に標識化された酵素のパーセンテージは、参考基質で観察されたものよりもずっと優れていることを示し、これは基質の濃度に無関係であった。
【０１９９】
実施例１０：ＢＧ−メチルベンズアミド−Ａｔｔｏ４６５
ＳＮＡＰ−ｔａｇ酵素との、ＢＧ−Ａｔｔｏ４６５／Ｂｇ−メチルベンズアミド−Ａｔｔｏ４６５の反応性の比較。
参考基質ＢＧ−Ａｔｔｏ４６５（化合物３５）の構造：
【０２００】
【化４８】
0005837419.tif 000050
【０２０１】
基質ＢＧ−メチルベンズアミド−Ａｔｔｏ４６５（化合物３６）の構造：
【０２０２】
【化４９】
0005837419.tif 000051
【０２０３】
・細胞モデルにおいて得られた結果
生細胞の表面において発現された膜貫通タンパク質の標識化は、ＢＧ−メチルベンズアミド−Ａｔｔｏ４６５基質が、参考基質よりも、ずっと優れたＳＮＡＰ−ｔａｇとの反応性を有することを示した。ＢＧ−メチルベンズアミド−Ａｔｔｏ４６５を用いて測定された半飽和濃度は２１３ｎＭであったが、ＢＧ−Ａｔｔｏ４６５基質を用いた時は１９８３ｎＭであった。
【０２０４】
以下の化合物の合成を以下において説明する：
化合物１：ベンジルグアニン−Ｄｙ６４７
化合物２：ベンジルグアニン−５，６−カルボキシフルオレセイン
化合物３：ベンジルグアニン−フルオレセイン−５−ＥＸ
化合物４：ベンジルグアニン−ＡＴＴＯ６４７Ｎ
化合物５：ベンジルグアニン−Ｔｂ（ＫＲ）
化合物６：４−（（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）メチル）安息香酸
化合物７：トリフルオロアセトアミドメチルベンズアミド−ＢＧ
化合物８：アミノメチルベンズアミド−ＢＧ
化合物９：Ｄｙ６４７−メチルベンズアミド−ＢＧ
化合物１０：ＡＴＴＯ６４７Ｎ−メチルベンズアミド−ＢＧ
化合物１１：５，６−カルボキシフルオレセイン−メチルベンズアミド−ＢＧ
化合物１２：フルオレセイン−５−ＥＸ−ベンジルアミド−ＢＧ
化合物１３：Ｔｂ（ＫＲ）−メチルベンズアミド−ＢＧ
化合物１４：ＢＧ−ＳＨ
化合物１５：ＢＧ−メチルベンズアミド−ＳＨ
化合物１６：２−（トリフルオロアセトアミドメチル）ニコチン酸
化合物１７：２−（トリフルオロアセトアミドメチル）イソニコチン酸
化合物１８：ＤＹ６４７−アミノメチルイソニコチンアミド−ベンジルグアニン
化合物１９：ＤＹ６４７−アミノメチルニコチンアミド−ベンジルグアニン
化合物２０：Ｔｂ（ＫＲ）−アミノメチルニコチンアミド−ベンジルグアニン
化合物２１：ベンジルグアニン−Ｎ−Ｆｍｏｃ−ピペリジン
化合物２２：ベンジルグアニン−ピペリジン
化合物２３：ＤＹ６４７−ピペリジン−ベンジルグアニン
化合物２４：ベンジルグアニン−トランス−４−（Ｆｍｏｃ−アミノ）シクロヘキサン
化合物２５：ベンジルグアニン−トランス−４−アミノシクロヘキサン
化合物２６：ＤＹ６４７−トランス−シクロヘキサン−ベンジルグアニン
化合物２７：ベンジルグアニン−シス−４−（Ｆｍｏｃ−アミノ）シクロヘキサン
化合物２８：ベンジルグアニン−シス−４−アミノシクロヘキサン
化合物２９：ＤＹ６４７−シス−シクロヘキサン−ベンジルグアニン
化合物３０：ベンジルシトシン−ＤＹ６４７
化合物３１：ベンジルシトシン−Ｔｂ（ＫＲ）
化合物３２：アミノメチルベンズアミド−ＢＣ
化合物３３：ＤＹ６４７−メチルベンズアミド−ＢＣ：
化合物３４：Ｔｂ（ＫＲ）−メチルベンズアミド−ＢＣ：
化合物３５：Ａｔｔｏ４６５−ＢＧ：
化合物３６：Ａｔｔｏ４６５−メチルベンズアミン−ＢＧ：
【０２０５】
化合物１：ベンジルグアニン−ＤＹ６４７
【０２０６】
【化５０】
0005837419.tif 000052
【０２０７】
１０ｍｌの丸底フラスコに４．２ｍｇ（１５．５μｍｏｌ）の６−アミノメチルベンジルグアニン、及び１１．８ｍｇ（１５．５μｍｏｌ）のＤＹ６４７−ＮＨＳを導入した。製造物を４ｍｌの無水ジメチルスルホキシドに部分的に溶解した。
【０２０８】
当該混合物を１時間撹拌した。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０２０９】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０２１０】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する青色固体を得た（光学密度測定８．５μｍｏｌ、５５％）。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］８９５．３
【０２１１】
化合物２：ベンジルグアニン−５，６−カルボキシフルオレセイン
【０２１２】
【化５１】
0005837419.tif 000053
【０２１３】
１．５ｍｌのエッペンドルフチューブへ、１０ｍｍｏｌ／ｌの６−アミノメチルベンジルグアニン（１μｍｏｌ）を含有する１００μｌの無水ジメチルスルホキシド溶液、及び１０ｍｍｏｌ／ｌの５，６−カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳ（１μｍｏｌ）を含有する１００μｌの無水ジメチルスルホキシド溶液を導入した。
【０２１４】
当該混合物を１時間撹拌した。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０２１５】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０２１６】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する黄色固体を得た（光学密度測定９００ｎｍｏｌ、９０％）。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］６２９．１．
【０２１７】
化合物３：ベンジルグアニン−フルオレセイン５−Ｅｘ
【０２１８】
【化５２】
0005837419.tif 000054
【０２１９】
１．５ｍｌのエッペンドルフチューブへ、１０ｍｍｏｌ／ｌの６−アミノメチルベンジルグアニン（１μｍｏｌ）を含有する１００μｌの無水ジメチルスルホキシド溶液、及び１０ｍｍｏｌ／ｌのフルオレセイン−５−ＥＸ−ＮＨＳ（１μｍｏｌ）を含有する１００μｌの無水ジメチルスルホキシド溶液を導入した。
【０２２０】
当該混合物を１時間撹拌した。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０２２１】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０２２２】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する黄色固体を得た（光学密度測定６５０ｎｍｏｌ、６５％）。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］７４６．１．
【０２２３】
化合物４：ベンジルグアニン−ＡＴＴＯ６４７Ｎ
【０２２４】
【化５３】
0005837419.tif 000055
【０２２５】
１０ｍｌの丸底フラスコに１．８ｍｇ（６．７μｍｏｌ）の６−アミノメチルベンジルグアニン、及び５ｍｇ（６．６μｍｏｌ）のＡＴＴＯ６４７−ＮＨＳを導入した。製造物を４ｍｌの無水ジメチルスルホキシドに部分的に溶解した。
【０２２６】
当該混合物を１時間撹拌した。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０２２７】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０２２８】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する青色固体を得た（光学密度測定３．６μｍｏｌ、５４．５％）。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］８９８
【０２２９】
化合物５：ベンジルグアニン−Ｔｂ（ＫＲ）
【０２３０】
【化５４】
0005837419.tif 000056
【０２３１】
１．５ｍｌのエッペンドルフチューブへ、１０ｍｍｏｌ／ｌの６−アミノメチルベンジルグアニン（１μｍｏｌ）を含有する１００μｌの無水ジメチルスルホキシド溶液、及び１０ｍｍｏｌ／ｌのＴｂ（ＫＲ）−ＮＨＳ（１μｍｏｌ）を含有する１００μｌの無水ジメチルスルホキシド溶液を導入した。
【０２３２】
当該混合物を１時間撹拌した。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、２５ｍＭのトリエチルアンモニウムアセテートを含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０２３３】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、２５ｍＭのトリエチルアンモニウムアセテートを含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０２３４】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する白色固体を得た（光学密度測定６５０ｎｍｏｌ、６５％）。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］１６８５．６
【０２３５】
化合物６：４−（（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）メチル）安息香酸
【０２３６】
【化５５】
0005837419.tif 000057
【０２３７】
１００ｍｌの丸底フラスコへ、２．３８ｇ（１５．７ｍｍｏｌ）の４−（アミノメチル）安息香酸を量り取った。丸底フラスコを氷浴へ入れ、５．６ｍｌ（５９ｍｍｏｌ）のトリフルオロ酢酸無水物をゆっくりと添加した。添加終了後、反応混合物を常温に戻し、そして当該混合物を２時間撹拌した。
【０２３８】
４℃、１６．５ｍｌの水を加えた。沈殿物を、フリットを通じてろ過し、４℃の２×３ｍｌの水を用いて洗浄し、五酸化リンの存在下、真空で４８時間乾燥した。
【０２３９】
所望の製造物に相当する白色固体（３．２７ｇ、１３．２ｍｍｏｌ、８４％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ-）ｍ／ｚ：［Ｍ−Ｈ+］２４６．２
【０２４０】
化合物７：トリフルオロアセトアミドメチルベンズアミド−ＢＧ
【０２４１】
【化５６】
0005837419.tif 000058
【０２４２】
１０ｍｌの丸底フラスコへ、５９３ｇ（２．４ｍｍｏｌ）のトリフルオロアセトアミドメチル安息香酸を量り取った。この酸を４ｍｌの無水テトラヒドロフランに溶解し、３２４．４ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）の１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドを加えた。それを常温で２時間撹拌した。得られるジシクロヘキシル尿素の白色沈殿物を、フリットを通じてろ過した。
【０２４３】
２５ｍｌの丸底フラスコへ、１６２．２ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）の６−アミノベンジルグアニンを量り取り、２ｍｌの無水ジメチルホルムアミドを加えた。次に、トリフルオロアセトアミドメチル安息香酸無水物のＴＨＦ溶液、及び２００μｌのジイソプロピルエチルアミンを加えた。反応混合物を常温で、２時間撹拌した。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０２４４】
反応混合物を、黄色固体が生じるまで、減圧下にて溶媒を蒸発乾固させた。５ｍｌのアセトニトリル中でそれを砕き、フリットを通じてろ過した。その後、２×１ｍｌのアセトニトリルで洗浄し、４８時間真空乾燥した。
【０２４５】
所望の製造物に相当するベージュ色固体（２８９ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ、９６％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］５００．１
【０２４６】
化合物８：アミノメチルベンズアミド−ＢＧ
【０２４７】
【化５７】
0005837419.tif 000059
【０２４８】
５０ｍｌの丸底フラスコへ、２５ｍｇ（５０μｍｏｌ）のＮ−（４−（（２−アミノ−９Ｈ−プリン−６−イルオキシ）メチル）ベンジル）−４−（（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）メチル）ベンズアミドを量り取った。１０ｍｌのメタノール、２ｍｌの飽和Ｎａ2ＣＯ3水溶液、及び４ｍｌの水を加えた。常温で一晩撹拌した。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、脱保護を観測した。
【０２４９】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０２５０】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する白色固体（１７．５ｍｇ、４３μｍｏｌ、８７％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］４０４．３．
【０２５１】
化合物９：ＤＹ６４７−メチルベンズアミド−ＢＧ
【０２５２】
【化５８】
0005837419.tif 000060
【０２５３】
２μｍｏｌのアミノメチルベンズアミド−ＢＧを１００μｌの無水ジメチルスルホキシドに溶解した。２μｍｏｌのＤＹ６４７−ＮＨＳの、３００μｌ無水ジメチルスルホキシド溶液、及び２μｌのジイソプロピルエチルアミンを加えた。常温で２時間撹拌した。
【０２５４】
Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０２５５】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０２５６】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する青色固体（光学密度測定１μｍｏｌ、５０％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］１０２８．４．
【０２５７】
化合物１０：ＡＴＴＯ６４７Ｎ−メチルベンズアミド−ＢＧ
【０２５８】
【化５９】
0005837419.tif 000061
【０２５９】
２００ｎｍｏｌのアミノメチルベンズアミド−ＢＧを１００μｌの無水ジメチルスルホキシドに溶解した。２００ｎｍｏｌのＡＴＴＯ６４７Ｎ−ＮＨＳの、２０μｌ無水ジメチルスルホキシド溶液、及び１μｌのジイソプロピルエチルアミンを加えた。反応混合物を常温で２時間撹拌した。
【０２６０】
Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０２６１】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０２６２】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する青色固体（光学密度測定１４９ｎｍｏｌ、７４％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：［Ｍ+］１０３１．５．
【０２６３】
化合物１１：５，６−カルボキシフルオレセイン−メチルベンズアミド−ＢＧ
【０２６４】
【化６０】
0005837419.tif 000062
【０２６５】
１μｍｏｌのアミノメチルベンズアミド−ＢＧを１００μｌの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。１μｍｏｌの５，６−カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳの、５０μｌ無水ジメチルスルホキシド溶液、及び２μｌのジイソプロピルエチルアミンを加えた。反応混合物を常温で２時間撹拌した。
【０２６６】
Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０２６７】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０２６８】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する黄色固体（光学密度測定６００ｎｍｏｌ、６０％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］７６２．１
【０２６９】
化合物１２：フルオレセイン−５−ＥＸ−ベンジルアミド−ＢＧ
【０２７０】
【化６１】
0005837419.tif 000063
【０２７１】
１μｍｏｌのアミノメチルベンズアミド−ＢＧを１００μｌの無水ジメチルスルホキシドに溶解した。１μｍｏｌのフルオレセイン−５−ＥＸ−ＮＨＳの、４０μｌ無水ジメチルスルホキシド溶液、及び２μｌのジイソプロピルエチルアミンを加えた。反応混合物を常温で１時間撹拌した。
【０２７２】
Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０２７３】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０２７４】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する黄色固体（光学密度測定４００ｎｍｏｌ、４０％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］８７９．３
【０２７５】
化合物１３：Ｔｂ（ＫＲ）−メチルベンズアミド−ＢＧ
【０２７６】
【化６２】
0005837419.tif 000064
【０２７７】
１０ｍｌの丸底フラスコに２．３ｍｇ（８．５μｍｏｌ）のアミノメチルベンズアミド−ＢＧの２ｍｌ無水ジメチルホルムアミド溶液を量り取った。６μｍｏｌのＴｂ（ＫＲ）−ＮＨＳの、２ｍｌ無水ジメチルホルムアミド溶液、及び、２０μｌのジイソプロピルアミンを加えた。反応混合物を常温で２時間撹拌した。
【０２７８】
Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、２５ｍＭのトリエチルアンモニウムアセテート含有する水（ｐＨ６）中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０２７９】
ＤＭＦを減圧下留去し、残渣を水に溶解した。分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、２５ｍＭのトリエチルアンモニウムアセテートを含有する水（ｐＨ６）中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する白色固体（光学密度測定２．２μｍｏｌ、３６％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］１８１９．３
【０２８０】
化合物１４：ＢＧ−ＳＨの製造
【０２８１】
【化６３】
0005837419.tif 000065
【０２８２】
２００μｌの無水ジメチルホルムアミド、及び１．５ｍｌの０．０５Ｍ，ｐＨ７，ＭＯＰＳ緩衝液に溶解された、０．８ｍｇ（３μｍｏｌ）の６−アミノメチルベンジルグアニンを、１０ｍｌの丸底フラスコに量り取った。１．１ｍｇ（３．６μｍｏｌ）のＳＰＤＰを加えた。反応混合物を１時間撹拌した。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０２８３】
反応混合物に２．２ｍｇ（１４．４μｍｏｌ）のＤＴＴを加え、２時間撹拌した。反応をＨＰＬＣで観測した。
【０２８４】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０２８５】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する白色固体（光学密度測定２．１μｍｏｌ、７０％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］３５８．９
【０２８６】
化合物１５：ＢＧ−メチルベンズアミド−ＳＨ
【０２８７】
【化６４】
0005837419.tif 000066
【０２８８】
１０ｍｌ丸底フラスコ中で，４．５μｍｏｌのアミノメチルベンズアミド−ベンジルグアニンを、２００μｌの無水ジメチルホルムアミド及び１．５ｍｌの０．０５Ｍ，ｐＨ７，ＭＯＰＳ緩衝液に溶解させた。１．７ｍｇ（５．４μｍｏｌ）のＳＰＤＰを加えた。反応混合物を１時間撹拌した。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０２８９】
反応混合物に２．５ｍｇ（１６．２μｍｏｌ）のＤＴＴを加え、２時間撹拌した。反応をＨＰＬＣで観測した。
【０２９０】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０２９１】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する白色固体（光学密度測定３μｍｏｌ、６６％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］４９２．２
【０２９２】
化合物１６：２−（トリフルオロアセトアミドメチル）ニコチン酸
【０２９３】
【化６５】
0005837419.tif 000067
【０２９４】
５００ｍｇ（３．５８ｍｍｏｌ）の６−シアノピリジン−３−カルボン酸の、５０ｍｌメタノール溶液を、１００ｍｌの丸底フラスコに量り取った。次に３０ｍｇの１０％パラジウム炭素を加え、１気圧の水素を４時間添加した。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。形成される製造物が沈殿した。
【０２９５】
４０ｍｌの脱塩水を反応混合物に加え、その後パラジウムを、セライトを通じてろ過し、反応混合物を５０ｍｌの丸底フラスコ中、減圧下濃縮した。当該丸底フラスコを氷／水浴に置き、４ｍｌのトリフルオロ酢酸無水物をゆっくりと加えた。反応混合物を２時間撹拌しながら常温に戻した。当該反応をＨＰＬＣで観測した。
【０２９６】
２０ｍｌのエーテルを反応混合物に加え、氷／水浴に２０分間置いた。沈殿を、フリットを通じてろ過し、そして４８時間真空乾燥した。所望の製造物に相当する白色固体（４５０ｍｇ、１．８１ｍｍｏｌ、５４％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］２４９
【０２９７】
化合物１７：２−（トリフルオロアセトアミドメチル）イソニコチン酸
【０２９８】
【化６６】
0005837419.tif 000068
【０２９９】
１００ｍｇ（６７５μｍｏｌ）の６−シアノピリジン−４−カルボン酸の、３０ｍｌメタノール溶液を、１００ｍｌの丸底フラスコに量り取った。次に１０ｍｇの１０％パラジウム炭素を加え、１気圧の水素を４時間添加した。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。形成される製造物が沈殿した。
【０３００】
２０ｍｌの脱塩水を反応沈殿物に加え、パラジウムを、セライトを通じてろ過し、反応混合物を５０ｍｌの丸底フラスコ中、減圧下濃縮した。当該丸底フラスコを氷／水浴に置き、３ｍｌのトリフルオロ酢酸無水物をゆっくりと加えた。反応混合物を常温に戻し、その後２時間撹拌を継続した。当該反応をＨＰＬＣで観測した。
【０３０１】
１０ｍｌのエーテルを反応混合物に加え、氷／水浴に２０分間置いた。沈殿を、フリットを通じてろ過し、そして４８時間真空乾燥した。所望の製造物に相当する白色固体（１１０ｍｇ、４４３ｍｍｏｌ、６７％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］２４９
【０３０２】
化合物１８：ＤＹ６４７−アミノメチルイソニコチンアミド  −ベンジルグアニン
【０３０３】
【化６７】
0005837419.tif 000069
【０３０４】
１μｍｏｌのアミノメチルイソニコチンアミド−ベンジルグアニンを含む１．５ｍｌのエッペンドルフチューブへ、１μｍｏｌのＤｙ６４７−ＮＨＳの１００μｌ無水ジメチルスルホキシド溶液、及び２μｌのジイソプロピルエチルアミンを加えた。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０３０５】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０３０６】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する青色固体（光学密度測定４７０ｎｍｏｌ、４７％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］１０２９．３
【０３０７】
化合物１９：ＤＹ６４７−アミノメチルニコチンアミド−ベンジルグアニン
【０３０８】
【化６８】
0005837419.tif 000070
【０３０９】
１μｍｏｌのアミノメチルニコチンアミド−ベンジルグアニンを含む１．５ｍｌのエッペンドルフチューブへ、１μｍｏｌのＤｙ６４７−ＮＨＳの１００μｌ無水ジメチルスルホキシド溶液、及び２μｌのジイソプロピルエチルアミンを加えた。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０３１０】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０３１１】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する青色固体（光学密度測定５４０ｎｍｏｌ、５４％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］１０２９．３
【０３１２】
化合物２０：Ｔｂ（ＫＲ）−アミノメチルニコチンアミド−ベンジルグアニン：
【０３１３】
【化６９】
0005837419.tif 000071
【０３１４】
１μｍｏｌのアミノメチルニコチンアミド−ベンジルグアニンを含む１．５ｍｌのエッペンドルフチューブへ、１μｍｏｌのＴｂ（ＫＲ）−ＮＨＳの１００μｌ無水ジメチルスルホキシド溶液、及び２μｌのジイソプロピルエチルアミンを加えた。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、２５ｍＭのトリエチルアンモニウムアセテート、ｐＨ６を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０３１５】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、２５ｍＭのトリエチルアンモニウムアセテート、ｐＨ６を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０３１６】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する青色固体（光学密度測定４００ｎｍｏｌ、４０％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］１８２０．３−［Ｍ＋２Ｈ+］／２＝９１０．５
【０３１７】
化合物２１：ベンジルグアニン−Ｎ−Ｆｍｏｃ−ピペリジン
【０３１８】
【化７０】
0005837419.tif 000072
【０３１９】
１０ｍｌの無水ジメチルホルムアミドに部分的に溶解された４８．１ｍｇ（１７８μｍｏｌ）の６−アミノメチルベンジルグアニンを、５０ｍｌの丸底フラスコに量り取った。６２．５ｍｇ（１７８μｍｏｌ）の４−カルボキシ−Ｎ−Ｆｍｏｃ−ピペリジン、及び５７．１ｍｇ（１７８μｍｏｌ）のＴＢＴＵを加えた。反応混合物を２時間撹拌した。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０３２０】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０３２１】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する白色固体（３８ｍｇ、３５％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］６０４．５
【０３２２】
化合物２２：ベンジルグアニン−ピペリジン
【０３２３】
【化７１】
0005837419.tif 000073
【０３２４】
１９０μｌの無水ジメチルホルムアミドに溶解された１．８ｍｇ（３μｍｏｌ）のベンジルグアニン−Ｎ−Ｆｍｏｃ−ピペリジンを、１．５ｍｌエッペンドルフチューブへ量り取った。１０μｌのピペリジンを加え、反応混合物を１時間撹拌した。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０３２５】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０３２６】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する白色固体を得た。当該製造物を、収率を測定することなく、次の反応に直接使用した。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：３８２．３
【０３２７】
化合物２３：ＤＹ６４７−ピペリジン−ベンジルグアニン
【０３２８】
【化７２】
0005837419.tif 000074
【０３２９】
１．８μｍｏｌのベンジルグアニン−ピペリジンを含有する２５ｍｌ丸底フラスコに、８００μｌの無水ジメチルスルホキシド、４μｌのジイソプロピルエチルアミン、及び０．１４ｍｇ（１．８μｍｏｌ）のＤｙ６４７−ＮＨＳを加えた。反応混合物を１時間撹拌した。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０３３０】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０３３１】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する青色固体（光学密度測定７００ｎｍｏｌ、４０％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：１００６．７５
【０３３２】
化合物２４：ベンジルグアニン−トランス−４−（Ｆｍｏｃ−アミノ）シクロヘキサン：
【０３３３】
【化７３】
0005837419.tif 000075
【０３３４】
２０ｍｌの無水ジメチルホルムアミドに部分的に溶解された５１ｍｇ（１８９μｍｏｌ）の６−アミノメチルベンジルグアニンを、５０ｍｌの丸底フラスコに量り取った。６９ｍｇ（１８９μｍｏｌ）のトランス−４−（Ｆｍｏｃ−アミノ）カルボキシシクロヘキサン、及び６０．７ｍｇ（１８９μｍｏｌ）のＴＢＴＵを加えた。反応混合物を２時間撹拌した。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０３３５】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０３３６】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する白色固体（１６ｍｇ、１３．７％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］６１８．６
【０３３７】
化合物２５：ベンジルグアニン−トランス−４−アミノシクロヘキサン
【０３３８】
【化７４】
0005837419.tif 000076
【０３３９】
１９０μｌの無水ジメチルホルムアミドに溶解された１．２ｍｇ（２μｍｏｌ）のベンジルグアニン−トランス−４−（Ｆｍｏｃ−アミノ）シクロヘキサンを、１．５ｍｌエッペンドルフチューブへ量り取った。１０μｌのピペリジンを加え、反応混合物を１時間撹拌した。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０３４０】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０３４１】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する白色固体を得た。当該製造物を、収率を測定することなく、次の反応に直接使用した。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：３９６．３
【０３４２】
化合物２６：ＤＹ６４７−トランス−シクロヘキサン−ベンジルグアニン
【０３４３】
【化７５】
0005837419.tif 000077
【０３４４】
２μｍｏｌのベンジルグアニン−トランス−４−アミノシクロヘキサンを含む２５ｍｌの丸底フラスコに、８００μｌの無水ジメチルスルホキシド、４μｌのジイソプロピルエチルアミン、及び０．１４ｍｇ（１．８μｍｏｌ）のＤＹ６４７−ＮＨＳを加えた。反応混合物を１時間撹拌した。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０３４５】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０３４６】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する青色固体（光学密度測定６００ｎｍｏｌ、３３％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：１０２０．８
【０３４７】
化合物２７：ベンジルグアニン−シス−４−（Ｆｍｏｃ−アミノ）シクロヘキサン
【０３４８】
【化７６】
0005837419.tif 000078
【０３４９】
２０ｍｌの無水ジメチルホルムアミドに部分的に溶解された６１．３ｍｇ（２２６μｍｏｌ）の６−アミノメチルベンジルグアニンを、５０ｍｌの丸底フラスコに量り取った。８２．７ｍｇ（２２６μｍｏｌ）のシス−４−（Ｆｍｏｃ−アミノ）カルボキシシクロヘキサン、及び７２．８ｍｇ（２２６μｍｏｌ）のＴＢＴＵを加えた。反応混合物を２時間撹拌した。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０３５０】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０３５１】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する白色固体（２８ｍｇ、２０％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］６１８．６
【０３５２】
化合物２８：ベンジルグアニン-シス-4-アミノシクロヘキサン
【０３５３】
【化７７】
0005837419.tif 000079
【０３５４】
１９０μｌの無水ジメチルホルムアミドに溶解された０．７ｍｇ（１．１μｍｏｌ）のベンジルグアニン−シス−４−（Ｆｍｏｃ−アミノ）シクロヘキサンを、１．５ｍｌエッペンドルフチューブへ量り取った。１０μｌのピペリジンを加え、反応混合物を１時間撹拌した。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０３５５】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０３５６】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する白色固体を得た。当該製造物を、収率を測定することなく、次の反応に直接使用した。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：３９６．３
【０３５７】
化合物２９：ＤＹ６４７−シス−シクロヘキサン−ベンジルグアニン
【０３５８】
【化７８】
0005837419.tif 000080
【０３５９】
１μｍｏｌのベンジルグアニン−シス−４−アミノシクロヘキサンを含む２５ｍｌの丸底フラスコに、８００μｌの無水ジメチルスルホキシド、４μｌのジイソプロピルエチルアミン、及び０．７ｍｇ（１μｍｏｌ）のＤＹ６４７−ＮＨＳを加えた。反応混合物を１時間撹拌した。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０３６０】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０３６１】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する青色固体（光学密度測定４００ｎｍｏｌ、４０％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ+）ｍ／ｚ：１０２０．８
【０３６２】
化合物３０：ベンジルシトシン−ＤＹ６４７
【０３６３】
【化７９】
0005837419.tif 000081
【０３６４】
１．５ｍｌエッペンドルフチューブに、１μｍｏｌのアミノメチルベンジルシトシンの２６μｌ無水ジメチルスルホキシド溶液、１μｍｏｌのＤＹ６４７−ＮＨＳの７６μｌ無水ジメチルスルホキシド溶液、及び４μｌのジイソプロピルエチルアミンを加えた。
【０３６５】
反応混合物を１時間撹拌した。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０３６６】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０３６７】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する青色固体（光学密度測定６００ｎｍｏｌ、６０％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］８５５．６［Ｍ＋Ｎａ+］８７７．６
【０３６８】
化合物３１：ベンジルシトシン−Ｔｂ（ＫＲ）
【０３６９】
【化８０】
0005837419.tif 000082
【０３７０】
１．５ｍｌエッペンドルフチューブに、１μｍｏｌのアミノメチルベンジルシトシンの２６μｌ無水ジメチルスルホキシド溶液、１μｍｏｌのＴｂ（ＫＲ）−ＮＨＳの１１０μｌ無水ジメチルスルホキシド溶液、及び４μｌのジイソプロピルエチルアミンを加えた。
【０３７１】
反応混合物を２時間撹拌した。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、２５ｍＭのトリエチルアンモニウムアセテートを含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０３７２】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、２５ｍＭのトリエチルアンモニウムアセテートを含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０３７３】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する白色固体（光学密度測定３５０ｎｍｏｌ、３５％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］１６４５．２［Ｍ＋２Ｈ+］／２  ８２３．４．
【０３７４】
化合物３２：アミノメチルベンズアミド−ＢＣ
【０３７５】
【化８１】
0005837419.tif 000083
【０３７６】
２ｍｌエッペンドルフチューブに、６ｍｇ（２６μｍｏｌ）のアミノメチルベンジルシトシン、及び６．４ｍｇ（２６μｍｏｌ）のトリフルオロアセトアミドメチル安息香酸を量り取った。当該混合物を６００μｌの無水ジメチルスルホキシドに溶解し、９．２ｍｇ（２８．６μｍｏｌ）のＴＢＴＵ、及び８μｌのジイソプロピルエチルアミンを加えた。当該反応混合物を２時間撹拌した。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０３７７】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０３７８】
白色固体が得られるまで、反応混合物を減圧下濃縮した。２ｍｌのメタノールに溶解し、２ｍｌの飽和Ｎａ2ＣＯ3水溶液、及び４ｍｌの水を加えた。混合物を一晩撹拌した。脱保護をＨＰＬＣにて観測した。
【０３７９】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０３８０】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する白色固体（光学密度測定８．５μｍｏｌ、３２％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］３６４．４
【０３８１】
化合物３３：ＤＹ６４７−メチルベンズアミド−ＢＣ：
【０３８２】
【化８２】
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【０３８３】
１μｍｏｌのアミノメチルベンズアミド−ＢＣを含む１．５ｍｌエッペンドルフチューブに、１μｍｏｌのＤＹ６４７−ＮＨＳの１４０μｌ無水ジメチルスルホキシド溶液、及び４μｌのジイソプロピルエチルアミンを加えた。
【０３８４】
反応混合物を１時間撹拌した。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０３８５】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０３８６】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する青色固体（光学密度測定４００ｎｍｏｌ、４０％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］９８８．６［Ｍ＋Ｎａ+］１０１０．６［Ｍ＋Ｋ+］１０２６．６．
【０３８７】
化合物３４：Ｔｂ（ＫＲ）−メチルベンズアミド−ＢＣ：
【０３８８】
【化８３】
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【０３８９】
１μｍｏｌのアミノメチルベンズアミド−ＢＣを含む１．５ｍｌエッペンドルフチューブに、１μｍｏｌのＴｂ（ＫＲ）−ＮＨＳの１２０μｌ無水ジメチルスルホキシド溶液、及び４μｌのジイソプロピルエチルアミンを加えた。
【０３９０】
反応混合物を１時間撹拌した。Ｍｅｒｃｋ  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ°１８，５μｍｏｌ，１２５×４．６カラムを用いたＨＰＬＣにて、２５ｍＭのトリエチルアンモニウムアセテートを含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０３９１】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８，１０μｍ，２５０×２２カラムを用いて、２５ｍＭのトリエチルアンモニウムアセテートを含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０３９２】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する白色固体（光学密度測定２７０ｎｍｏｌ、２７％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］１７７９．３  ［Ｍ＋２Ｈ+］／２  ８９０．
【０３９３】
化合物３５：Ａｔｔｏ４６５−ＢＧ
【０３９４】
【化８４】
0005837419.tif 000086
【０３９５】
１．５ｍｌエッペンドルフチューブへ、ＢＧ−ＮＨ２の溶液（０．３μｍｏｌを１００μｌの無水ＤＭＳＯに溶解），ＡＴＴＯ−４６５−ＮＨＳの溶液（０．２５４μｍｏｌを１００μｌの無水ＤＭＳＯに溶解），及び３μｌのＤＩＰＥＡを導入した。反応混合物を常温で１．５時間撹拌した。Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８，３．５μｍ，４．６×１００ｍｍカラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０３９６】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８，ＯＢＤＴＭ，１９×１００ｍｍカラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０３９７】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する黄橙色固体（光学密度測定０．１２８μｍｏｌ、収率５０％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］５４８
【０３９８】
化合物３６：Ａｔｔｏ４６５−メチルベンズアミン−ＢＧ：
【０３９９】
【化８５】
0005837419.tif 000087
【０４００】
１．５ｍｌエッペンドルフチューブへ、ＢＧ−ＭＢＡ−ＮＨ２の溶液（０．３μｍｏｌの化合物８を１００μｌの無水ＤＭＳＯに溶解）、ＡＴＴＯ−４６５−ＮＨＳの溶液（０．２５４μｍｏｌを１００μｌの無水ＤＭＳＯに溶解）、及び３μｌのＤＩＰＥＡを導入した。反応混合物を常温で１．５時間撹拌した。Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８，３．５μｍ，４．６×１００ｍｍカラムを用いたＨＰＬＣにて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて、反応を観測した。
【０４０１】
分取ＨＰＬＣによる精製を、Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８，ＯＢＤＴＭ，１９×１００ｍｍカラムを用いて、０．２％のトリフルオロ酢酸を含有する水中、アセトニトリルのグラジエントをかけて行った。
【０４０２】
フラクションを回収し、減圧下濃縮した。所望の製造物に相当する黄橙色固体（光学密度測定０．２０５μｍｏｌ、収率８０％）を得た。
ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ+］６８１
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
0005837419.tif 000100
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0005837419.tif 000104
【図９】
0005837419.tif 000105
【図１０】
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【図１１】
0005837419.tif 000107
【図１２】
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