(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
口腔粘膜の固有層から前駆細胞（ＰＣ）を得る方法であって、
ａ）対象の口腔粘膜からの試料を、脂肪組織および細胞の上皮層の除去によって処理するステップと、
ｂ）残存する固有層細胞外基質を除去して、細胞の混合懸濁物を得るステップと、
ｃ）潜在的前駆細胞を単離し、この細胞のコロニーを形成させるステップと、
ｄ）少なくともｈＴＥＲＴ、Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ−４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１０、Ｓｌｕｇ、ＳｎａｉｌおよびＴｗｉｓｔの前駆細胞に特徴的なマーカーを用いてコロニーを選択するステップとを含む方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）が、前記口腔粘膜から脂肪組織を除去すること、及び組織を酵素消化することを含み、それにより口腔粘膜の上皮層を除去する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）が酵素消化を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｃ）が、細胞結合剤に差次接着すること、次いで結合剤に結合した細胞を培養することを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｃ）が、細胞のクローン集団または不均質な集団のいずれかを生成することを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｄ）が、以下のマーカー：ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、ＣＤ３４、ＣＤ４５、Ｎｏｔｃｈ１／２／又は３、Ｄｅｌｔａ１およびＪａｇｇｅｄ２の１つまたは複数が発現されているかを決定するために細胞をアッセイすることと、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、Ｎｏｔｃｈ１／２／又は３、Ｄｅｌｔａ１およびＪａｇｇｅｄ２の１つ又は複数が検出され、かつ、ＣＤ３４およびＣＤ４５の１つまたは複数が検出されない細胞を選択することとを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記マーカーが、蛍光表示式細胞選別（ＦＡＣＳ）分析を用いて同定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｄ）において選択されたコロニーを増殖させることをさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記コロニーまたは細胞をあらかじめ選択された培養培地において培養することにより、前駆細胞が選択された表現型に分化するのを促進することをさらに含み、前記表現型が、あらかじめ選択された培養条件に依存する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記前駆細胞が培養されて、以下の表現型：軟骨細胞、筋肉細胞、脂肪細胞、骨細胞または神経細胞のいずれか１つを生成する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
口腔粘膜の固有層に由来し、さらに多分化能を有し、自己再生し、かつ免疫調節性であり、以下の前駆細胞に特徴的なマーカー：ｈＴＥＲＴ、Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ−４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１０、Ｓｌｕｇ、ＳｎａｉｌおよびＴｗｉｓｔを少なくとも発現する、単離されたヒト成体前駆細胞。
【請求項１２】
以下のマーカー：ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、Ｎｏｔｃｈ１／２／または３、Ｄｅｌｔａ１、およびＪａｇｇｅｄ２の１つまたは複数について陽性である、請求項１１に記載の単離されたヒト成体前駆細胞。
【請求項１３】
細胞マーカーＣＤ３４およびＣＤ４５について陰性である、請求項１１又は１２に記載の単離されたヒト成体前駆細胞。
【請求項１４】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法により得られる前駆細胞、あるいは請求項１１から１３のいずれか一項に記載の前駆細胞を含有する医薬。
【請求項１５】
創傷、熱傷、組織損傷、炎症、自己免疫、ＧＶＨＤ、同種造血幹細胞（ＨＳＣ）移植または糖尿病を含む免疫障害のいずれか１つまたは複数を治療するための、請求項１４に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な前駆細胞（複数可）（ＰＣ）およびそれに由来する分化細胞を含むその子孫；該前駆細胞を分化細胞に分化させることによる、該ＰＣおよび該分化細胞、特に筋肉、骨、軟骨細胞、脂肪細胞、神経またはシュワン細胞を含むその子孫を得る方法；ならびに該分化細胞を培養することにより得られる再構築（ｒｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）組織に関する。さらに、本発明は、該ＰＣおよび該分化細胞を含むその子孫の、例えば顔面熱傷または顔面損傷を受けた個体のための置換組織の生成のための使用；ならびに神経再生の可能性を有する神経細胞の提供に関する。本発明は、該ＰＣおよび得られる子孫の、それに限定されないが、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）および糖尿病などの慢性状態を含む免疫関連障害の治療のための使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
組織工学での応用のための成体幹細胞（ＡＳＣ）の単離および使用は、多能性胚性幹細胞（ＥＳＣ）の使用を取り巻く倫理的および道徳上の問題があるため、大きな関心を集めている。ＡＳＣは、皮膚、骨膜、歯髄、臍帯、腱および歯根膜などの体内の複数の部位から単離されている。しかし、骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）が、最も特徴付けられている。骨髄のものにとって代わる代替のＡＳＣ供給源を見出すための探求は、年齢とともにＢＭＳＣの数が減少することと、増殖および分化能が著しく失われることとにより、長く行われている（１）。ＡＳＣは、自己再生し、かつ多分化能を有し、したがって治療上の応用を有する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのこれらの限定された寿命はまた、それらの潜在的な腫瘍原性を低下させることにより、ＥＳＣに対する利点として働く。これらの細胞が単離される組織は、治療上の応用についてのその可能性を決定し、いくらかのＡＳＣ供給源は、例えば皮質から単離された前駆細胞のように、それらが由来する組織にのみ分化できる（２）。
【０００３】
よって、ＡＳＣが誘導によって産生できる一連の分化系統、およびそれらの増殖能力を、組織工学の目的のための理想的な生検部位の探索において考慮することが重要である。実際に、成体組織からの十分な数の幹細胞の単離は、著しく制限され得る。いくらかのＡＳＣは、活性テロメラーゼがない／低いと特徴付けられており、このことが、それらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を困難で限定されたものにしている（２、３）。
【０００４】
さらに、ＡＳＣの単離は、しばしば侵襲的であり、例えばＢＭＳＣの単離のための骨髄吸引、または皮膚由来前駆細胞の単離のための皮膚生検を必要とし、後者は瘢痕形成をもたらす。
【０００５】
口腔粘膜における創傷治癒は、炎症の低下、迅速な上皮化および最小限の瘢痕形成をもたらす異なる線維芽細胞応答；皮膚において観察されるものと比較して、より「胎児様」であると一般的に考えられるプロセスを特徴とする（４〜８）。
【０００６】
前駆細胞（ＰＣ）は、口腔粘膜上皮の基底層に存在すると報告されているが（９〜１１）、口腔粘膜固有層（ＯＭＬＰ）に存在する前駆細胞または幹細胞の集団が存在することは、現在までに報告されていない。最近の概説は、皮膚の真皮内のＰＣ集団を参照して、ＯＭＬＰでの前駆細胞または幹細胞の集団の存在の可能性を強調している（１２）。伝統的に、ＰＣは、単能性または多分化能の細胞として記載されている。この観点から、これらは、成体幹細胞と比較できる。しかし、前駆細胞は、細胞分化のさらに先の段階にあるといわれている。これらは、「中間の」幹細胞であり、十分に分化した細胞である。これらが有する能力の種類は、それらの「親」の幹細胞の型、さらにはそれらの生態的地位に依存する。ほとんどの幹細胞のように、これらは、それらにとって成長のための正しい条件を用いてコロニーとして形成され、それらの標的組織に分化する。前駆細胞と成体幹細胞とは多数の特性を共有するが、これらの細胞の組はともに、胚性幹細胞（ＥＳＣ）とは異なり、つまり、ＥＳＣは、多能性で自己再生のための限定されない能力を示す点で真の幹細胞である。これとは対照的に、成体幹細胞と命名される多くの細胞は、前駆細胞と定義されるのがよりよいであろう。なぜなら、限定されない自己再生についてのそれらの能力および可塑性は、包括的には証明されていないからである。前駆細胞は、体の修復機構として働く。これらは、特殊化された細胞を補充するが、血液、皮膚および腸の組織も維持する。
【０００７】
本発明者らは、以前に、患者適合の口腔粘膜および皮膚の線維芽細胞が、創傷環境に関わらない口腔粘膜内で観察される優先的な治癒応答をもたらす、独特の表現型および遺伝子型の差を有することを報告した（６〜８）（Ｅｎｏｃｈら、２００９印刷中）。これらの知見は、ＰＣ集団がＯＭＬＰに特異的に存在する可能性があり、この組織の創傷において観察される優先的な治癒応答に貢献し得るのはこの細胞集団であるという考えを支持する。重要なことに、ＯＭＬＰからのＰＣ集団の単離は、治療上の応用のために著しい利点を提供し、迅速に治癒されかつ患者に瘢痕を全く／ほとんど形成しない、容易に近づくことができて最小限に侵襲的である生検の部位を提供するだろう。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、本明細書において、口腔粘膜の固有層に存在する新規なＰＣ集団の存在を初めて開示する。この細胞集団は、頬粘膜生検から確実に単離でき、本発明者らは、このＰＣ集団が、治療上の応用について大きな可能性を有していることを驚くべきことに見出した。なぜなら、これは、一連の分化系統に分化でき、さらに、このＰＣ集団は、治療目的のために十分な数の細胞の生成を可能にする有利な増殖能力を有しているからである。実際に、単一ＯＭＬＰ  ＰＣを起源とするクローンは、活性テロメラーゼの驚くべき発現により援助されて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて迅速に増殖できる。多分化能を有し、間葉系および神経の両方の起源の細胞系統に分化できるのは、これらのクローン集団である。
【０００９】
本発明者らは、本明細書において、本発明の新規なＰＣ集団が、免疫調節性、より具体的には免疫抑制性の可能性を有するとの知見も初めて開示する。実際に、本発明者らは、いくつかのみの本発明のＰＣをリンパ球と共培養することにより、免疫応答を抑制できることを見出した。このことは、細胞または組織の同種移植について重要な意味を有する。なぜなら、本発明のＰＣの使用／存在が、組織拒絶に対する防衛手段になるからである。
【００１０】
このことを前後関係に当てはめると、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、適応免疫系に対して免疫調節効果を奏することが以前に示されている。ヒト歯根膜幹細胞（これもまた間葉系の起源のもの）を用いて発表された最近の研究は、リンパ球との直接の接触が、最も効果的な免疫抑制効果を生じることを示している（１３）。ＭＳＣで観察される抑制の程度は用量依存的であり、免疫抑制のレベルの低下が、存在するＭＳＣの数の低下とともに観察される。
【００１１】
対照的に、本発明のＯＭＬＰ  ＰＣは、接触非依存的および用量非依存的に働いて、同種誘導免疫応答の抑制を生じる。この抑制効果は、本発明のＯＭＬＰ  ＰＣの非常に重要な特徴であり得る。なぜなら、重篤な移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を直接の原因とする死亡率は、同種造血幹細胞（ＨＳＣ）移植における主要な障害の１つのままであるからである。ＧＶＨＤは、ＨＳＣ移植片に存在するＴ細胞による、「抗原的に外来の」宿主に対する直接の攻撃を特徴とする。ＧＶＨＤの治療において報告された臨床試験は限られている。Ｒｉｎｇｄｅｎらによる最近の研究は、ＭＳＣを注入された８名の患者において、これらの患者のうち６名が、全ての症状が解消された完全な応答を示したことを証明した（１４）。よって、本発明の前駆細胞またはその子孫を、治療剤として、それ自体で、免疫応答を調節し、それにより、同種造血幹細胞（ＨＳＣ）移植におけるＧＶＨＤなどの炎症性障害を治療するために用い得るということになる。
【００１２】
さらに、本発明の前駆細胞またはその子孫は、治療剤として、それ自体で、免疫応答を調節し、それにより、それに限定されないがＧＶＨＤなどの免疫障害を治療するために用い得るということにもなる。
【００１３】
よって、本発明者らは、迅速に治癒し、かつ最小限の瘢痕を形成する最小限に侵襲的な生検部位からの、自己再生し多分化能を有するＰＣ集団を提供することにより、ＯＭＬＰが、組織工学の応用のための好ましい細胞供給源を提供することを見出した。本発明者らは、さらに、このＯＭＬＰ  ＰＣ集団が、他のＰＣまたはＡＳＣと比較したときに有利な免疫調節活性を有することを見出した。
【００１４】
細胞が、口腔粘膜の固有層に由来し、さらに、前記細胞が、多分化能を有し、自己再生し、免疫調節性である単離ヒト成体前駆細胞（ＰＣ）およびその子孫。
【００１５】
本明細書において多分化能を有するとは、本明細書に記載されるいくつかの型の細胞へ分化する能力について用いられる。
【００１６】
本明細書において自己再生するとは、限定されない意味ではなく再生することについての言及を含む。
【００１７】
本明細書において免疫調節性とは、本発明のＰＣまたは分化細胞を含むその子孫の、接触非依存的もしくは用量非依存的に、またはＨＬＡクラスＩＩ細胞表面発現の誘導に依存せずに免疫応答を抑制する能力について用いられる。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態において、上記のＰＣは、３重の幹細胞マーカーＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１６６について陽性である。
【００１９】
さらに、理想的には、上記のＰＣは、細胞マーカーＣＤ３４およびＣＤ４５について陰性である。
【００２０】
さらに、理想的には、上記のＰＣは、以下の４つの（ｉＰＳ関連、以下を参照されたい）細胞マーカーＮａｎｏｇ、ＫＬＦ−４、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４について陽性である。
【００２１】
さらに、上記のＰＣは、以下の細胞マーカーＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＳＴＲＯ−１、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ−４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎｏｔｃｈ１／２／もしくは３、Ｄｅｌｔａ１またはＪａｇｇｅｄ２のいずれか１つまたは複数について陽性である。
【００２２】
本明細書において、明記された細胞マーカーについて細胞が陽性または陰性であるとは、該細胞が該マーカーを発現する能力について用いられ、陽性は該マーカーの発現を表し、陰性は該マーカーの発現の欠如を表す。
【００２３】
本発明のさらに好ましい実施形態において、上記のＰＣは、４５回を超える集団倍加を受け、理想的には、この倍加時間を通してまたはその一部の間のいずれかにおいてテロメラーゼも発現する。
【００２４】
上記のように、本発明の好ましい実施形態において、上記のＰＣは、ｍＲＮＡレベルにおいて転写因子Ｎａｎｏｇについて陽性であり（タンパク質レベルでは必須でないが）、このことは、胚性幹細胞における多能性を維持する鍵であると考えられる。さらに、上記のＰＣは、幹細胞の未分化自己再生に関与する転写因子Ｏｃｔ４についても陽性であり、これは、口腔粘膜固有層をコラゲナーゼで消化した後の新しく単離された細胞において発現する（しかし、これは、伝統的な間葉系幹細胞培地中での培養後に失われる）。さらに、上記のＰＣは、未分化胚性幹細胞の自己再生の調節およびＯｃｔ４発現の制御において重要な転写因子であるＳｏｘ２、ならびに幹細胞の維持に重要であると考えられる別の転写因子であるＫＬＦ−４について陽性である。本発明のＰＣは、神経堤マーカーであるＳｏｘ１０（神経堤および末梢神経系の発達に重要である）；Ｓｌｕｇ、ＳｎａｉｌおよびＴｗｉｓｔについても陽性であり、ならびに発達マーカーであるＮｏｔｃｈ１についても陽性である。
【００２５】
これらのマーカーの存在は、該ＰＣが分化できる標的細胞型について意味を有する。実際に、ｍＲＮＡまたはタンパク質のいずれかのレベルでの上記の胚性マーカー、および前駆細胞における未熟発達マーカーの発現は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）技術の将来の開発および利用のために、現在用いられている細胞型よりも少ない改変を必要とする好ましい細胞型があり得ることを示す。実際に、この観点において、本発明のＰＣが、ｉＰＳにおいて線維芽細胞を胚様幹細胞に再プログラムして戻すために用いられる４つの主な細胞因子（Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ−４、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４）を発現することが重要である。これらの４つの因子がＯＭＬＰのＰＣにおいて自然に発現されていることは、単離でき、かつｉＰＳ再プログラミングを必要とせずに胚性幹細胞のように働く細胞集団を本発明者らが有していることを示唆する。よって、本発明者らは、多能性の能力を有するＰＣ集団を有し、かつ／またはさらに本発明者らは、胚性幹細胞型の細胞を生成するために他の細胞型よりも少ない再プログラミングを必要とするＰＣ集団を有する。
【００２６】
よって、本発明のさらなる態様において、以下の４つの細胞マーカー：Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ−４、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４を発現するかまたはそれらについて陽性であるＯＭＬＰのＰＣを含むｉＰＳが提供される。
【００２７】
さらに、本発明のさらなる態様において、
ａ）対象の口腔粘膜からの試料を、脂肪組織および細胞の上皮層の除去によって処理するステップと、
ｂ）残存する固有層細胞外基質を除去して、細胞の混合懸濁物を得るステップと、
ｃ）潜在的前駆細胞を単離し、この前駆細胞のコロニーを形成させるステップと、
ｄ）前駆細胞に特徴的なマーカーを用いてコロニーを選択するステップと
を含む方法により、口腔粘膜の固有層から前駆細胞を得る方法が提供される。
【００２８】
ステップ（ａ）において、脂肪組織は、任意の簡便な手段により、例えば生検試料を解剖することにより除去してよい。プロナーゼ／ジスパーゼは、口腔粘膜の上皮層を除去するための適切な酵素である。２ｍｇ／ｍｌ、３７℃にて１晩などの処理が十分であるが、当業者は、この主題について変形を用いてよい。
【００２９】
ステップ（ｂ）において、固有層細胞外基質は、コラゲナーゼを用いる消化により除去してよい。１ｍｇ／ｍｌのクロストリジウム・ヒストリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）Ａコラゲナーゼ中での３７℃にて１晩のインキュベーションなどの処理が十分であるが、当業者は、この主題について変形を用いてよい。
【００３０】
ステップ（ｃ）において、上記の潜在的前駆細胞は、フィブロネクチン、またはＤｏｗｔｈｗａｉｔｅら、２００４ならびにＪｏｎｅｓおよびＷａｔｔ、１９９３（１０、１５）により報告されるアミノ酸のＲＧＤ配列を含むフラグメントなどの細胞結合剤への差次接着（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）により単離できる。フィブロネクチン基質へ接着する単一細胞は、次いで、培養において１２〜１４日間にわたってコロニーの形成（＞３２細胞）が可能にされ、得られるコロニーは、クローニングリング内でのトリプシン処理により単離してよい。あるいは、ＪｏｎｅｓおよびＷａｔｔの論文において論じられるように、コラーゲンおよびラミニンなどのその他の基質を、上記ステップ（ｃ）における差次接着のための細胞結合剤として用い得る。さらに、十分な細胞が単離されるならば、細胞は、フローサイトメトリーまたは磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）選択を用いて選別できる。
【００３１】
本発明者らは、この研究のために、（未選別の組織全体からの不均質な単離物よりもむしろ）細胞のクローン集団を特に用いた。なぜなら、このことにより、純粋な細胞集団の正確な規定が可能になるからである。本発明を行うより好ましくない様式として、未選別の組織全体からの不均質な単離物を、従来の技術を用いることにより用いてよい。これらの技術は、例えば、フィブロネクチン、またはＤｏｗｔｈｗａｉｔｅら（２００４）ならびにＪｏｎｅｓおよびＷａｔｔ（１９９３）（１０、１５）により報告されるアミノ酸のＲＧＤ配列、コラーゲンまたはラミニンなどの、例えば、細胞結合剤への差次接着による潜在的前駆細胞の単離を含んでよい。例えばフィブロネクチン基質へ接着する単一細胞は、集密まで成長させた後に、単層培養における不均質前駆細胞培養として継代して増殖させることができる。
【００３２】
上記のステップ（ｄ）において、前駆細胞に特徴的なマーカーは、胚性幹細胞の自己再生の維持において鍵となると考えられるテロメラーゼ；および多能性の維持において鍵となると考えられる転写因子Ｎａｎｏｇ；および幹細胞の未分化自己再生に関与する転写因子Ｏｃｔ４を含む。アッセイし得るその他のマーカーは、神経堤マーカー、例えばＳｏｘ１０（神経堤および末梢神経系の発達に重要である）；Ｓｌｕｇ、Ｓｎａｉｌ、Ｔｗｉｓｔおよびｐ７５である。別の有用なマーカーは、発達マーカーＮｏｔｃｈ１である。アッセイし得るその他のマーカーは、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＳＴＲＯ−１、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、ＣＤ３４、ＣＤ４５、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ−４、Ｎｏｔｃｈ２または３、Ｄｅｌｔａ１およびＪａｇｇｅｄ２を含む。ＣＤ３４およびＣＤ４５を除いて、上記のマーカーのいずれか１つまたは複数について陽性、これらのマーカーの好ましくは１より多く、例えば好ましさが増大する順序で少なくとも２、３、４、５または６以上について陽性である選択された細胞について探索するだろう。これらの前駆細胞が造血性の起源のものでないことを確実にするために、ＣＤ３４およびＣＤ４５陰性である選択された細胞について探索するだろう。
【００３３】
マーカーの存在または不在は、標準的な方法、好ましくは免疫細胞化学的方法または蛍光標示式細胞選別（ＦＡＣＳ）分析により決定してよい。
【００３４】
よって、本発明のさらに好ましい方法において、上記の方法は、（ｃ）の後でかつ（ｄ）を行う前に、上記の特定のマーカーのいずれか１つまたは複数の発現を、それらに限定されないが免疫細胞化学的方法または蛍光標示式細胞選別（ＦＡＣＳ）分析などの従来の方法を用いて決定することを含むさらなるステップを含む。
【００３５】
本発明のさらに好ましい方法において、方法は、
ｅ）ステップ（ｄ）で選択されたコロニーを増殖させる追加のステップ
をさらに含み得る。
【００３６】
通常、これらの選択されたコロニーは、単層培養において増殖され、これは、老化まで継続し得る。
【００３７】
当業者により知られるように、選択された表現型への前駆細胞の分化は、培養条件を変更することにより達成できる。例えば、本発明者らは、１０％胎児ウシ血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養された細胞が、線維芽細胞型の形態を示し、３重の幹細胞マーカーＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１６６と、さらに理想的には一連のＳＴＲＯ−１、ＣＤ４４、ＣＤ１４６の発現を維持し、またさらに、これらは理想的にはＣＤ３４およびＣＤ４５陰性であることを見出した。しかし、培養培地を変動させることにより、軟骨細胞、筋肉細胞、脂肪細胞、骨細胞および神経細胞を得ることが可能である。培養培地のさらなる詳細は、以下の実施例に示す。
【００３８】
しかし、簡単に、軟骨細胞は、ＰＣを、ペレット培養系において、１×インスリン、トランスフェリンおよびセレン（ＩＴＳ）サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）、５０μｇ／ｍｌ  Ｌ−アスコルベート（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）ならびに５ｎｇ／ｍｌトランスフォーミング成長因子ベータ１（ＴＧＦβ１）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ＥＣ  Ｌｔｄ．、ＵＫ）を補った基本培地（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢを補ったダルベッコの改変イーグル培地［ＤＭＥＭ］）中で培養することにより得た。
【００３９】
骨細胞は、造骨誘導培地（１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ、５０μｇ／ｍｌ  Ｌ−アスコルベート、１０μＭデキサメタゾンおよび５ｍＭベータ−グリセロホスフェート（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）を補ったアルファ改変イーグル培地（α−ＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ））を用いて得た。
【００４０】
脂肪細胞は、脂肪生成誘導培地（１０μｇ／ｍｌインスリン、１μＭデキサメタゾン、１００μＭインドメタシン、１００μＭ  ３−イソブチル−１−メチル−キサンチン［ＩＢＭＸ］（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）を補ったＳＣＭ）を３日間用い、次いで、１０μｇ／ｍｌインスリンをさらに２４時間補ったＳＣＭからなる脂肪生成維持培地に交換して得た。細胞に、次いで、誘導培地を再供給した。この培地のサイクルは、２８日間反復した。
【００４１】
神経およびシュワン細胞分化系統についてのＰＣは、０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）、１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢおよび８０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｒｈｂＦＧＦ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ＥＣ  Ｌｔｄ．、ＵＫ）を補ったＸ−ＶＩＶＯ（商標）１０培地（Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．、ＵＫ）を用いて成長させた。
【００４２】
これらの細胞を、以前に記載されたプロトコルを用いる神経分化に供した（１６、１７）。簡単に、単一細胞懸濁物を計数し、０．１％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＫ）で被覆したチャンバスライド上に、５．６×１０３細胞／ｃｍ２にて、４０ｎｇ／ｍｌ  ｈｒｂＦＧＦ、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンおよび０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢを補ったＤＭＥＭ−Ｆ１２（３：１）培地中で播種した。細胞を、培地を３日ごとに交換しながら７日間培養した。培養７日後に、ｒｈｂＦＧＦを培養培地から除去し、１０ｎｇ／ｍｌ神経成長因子（ＮＧＦ）、１０ｎｇ／ｍｌ脳由来成長因子（ＢＤＮＦ）および１０ｎｇ／ｍｌニューロトロフィン３（ＮＴ３）に置き換えた。細胞を、培地を３日ごとに交換しながらさらに７日間培養した。
【００４３】
シュワン細胞の分化は、Ｔｏｍａら、（２００５）（１８）により以前に記載されたとおりであった。コラゲナーゼ処理細胞を、神経分化について記載されたものと等しい密度にて、ポリ−Ｄ−リジンラミニン被覆チャンバスライド上に播種した（２μｇ／ｍｌ）。細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンおよび０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２（３：１）中で７日間培養した。培地を、次いで、１％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１％（ｖ／ｖ）Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）、４μＭフォルスコリン（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢおよび１０ｎｇ／ｍｌヘレグリンβ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ＥＣ  Ｌｔｄ．、ＵＫ）を含む神経基本培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）に置き換えた。細胞を、この培地中でさらに７日間維持した。５０％の馴化培地を細胞に再び与えながら、培地を３日ごとに交換した。
【００４４】
このようにして、好ましくは、上記の方法は、上記の選択されたＰＣの分化を含む最後のステップであって、本明細書に記載される選択された様式で上記のＰＣの培養条件を変更することにより分化を行って、選択された分化細胞を生成するステップをさらに含む。
【００４５】
さらに、本発明のさらなる態様において、筋肉細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、シュワン細胞および／または神経細胞を得る方法であって、口腔粘膜の固有層から得られた少なくとも１つの前駆細胞（ＰＣ）またはその子孫を分化させるステップを含む方法が提供される。
【００４６】
本発明の関係において、「筋肉細胞」とは、平滑筋および横紋筋の両方の細胞のことをいい、「骨細胞」とは、骨芽細胞および骨細胞のことをいう。
【００４７】
本発明のさらなる態様において、口腔粘膜の固有層から単離された少なくとも１つの前駆細胞を分化させることにより得られた少なくとも１つの分化細胞が提供される。
【００４８】
理想的には、上記の分化細胞は、軟骨細胞または筋肉細胞または脂肪細胞または骨細胞またはシュワン細胞および／または神経細胞である。
【００４９】
このような分化細胞の例は、軟骨を生成できる細胞（アグリカン＋、Ｓｏｘ９＋、ｃｏｌ２ａ１タイプＡ＋のマーカーにより確認される）、脂肪細胞（オイルレッドＯ染色の発現と、理想的にはリポタンパク質リパーゼ、ＣＡＡＴＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ［ＣＥＢＰα］およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ［ＰＰＡＲγ］のメッセンジャーＲＮＡレベルでの発現によっても確認される）、骨細胞（フォン・コッサ染色およびアルカリホスファターゼ染色により確認される）（図１２）、シュワン細胞（免疫細胞化学によるＳ１００およびミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の生成により確認される）および神経細胞（免疫細胞化学によるｎｅｓｔｉｎ、ベータＩＩＩチューブリン（ＴＵＪ−１）、ニューロフィラメントＭ、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）および微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）の生成により確認される；図６ａ〜ｇも参照されたい）を含む。
【００５０】
本発明のこの態様の好ましい実施形態において、上記の分化細胞は、上記の方法を用いて得られ、クローンとして導かれる細胞もそうである。
【００５１】
さらなる態様において、本発明は、上記の分化細胞を培養することにより得られる再構築組織も提供する。
【００５２】
本発明の上記のＰＣおよび再構築組織は、種々の医療上の応用において有用であり得るので、本発明のさらなる態様において、医薬品で用いるための本発明の分化細胞または再構築組織が提供される。
【００５３】
例えば、これらの細胞から形成される骨細胞、筋肉細胞、軟骨、脂肪細胞および再構築組織は全て、創傷もしくは熱傷の治療において、または疾患、例えばがんを原因とする損傷の修復において用いてよい。このことは、顔の損傷および瘢痕の治療のために特に重要である。
【００５４】
神経細胞は、パーキンソン病などの神経障害のために用いてよい。シュワン細胞は、神経損傷修復のため、および脊髄損傷の治療において用い得る。
【００５５】
有利には、上記のＰＣ（複数可）または分化細胞を含むその子孫は、治療される患者に由来してよいが、代わりに、別の個体に由来して、同種組織工学および移植において用いてよい。後者のオプションは、上記のＰＣまたはその子孫の固有の免疫調節性の性質と、特に、免疫応答を抑制するこれらの細胞能力とのおかげで、本発明を行うものが用い得る。
【００５６】
さらに、治療される個体または任意の別の人に由来する上記のＰＣまたは上記のそれらの子孫は、治療される個体とは別の個体に由来する分化組織と同時投与してよく、この場合に、上記のＰＣまたはそれらの子孫は、有利な免疫抑制性の効果を奏する。
【００５７】
よって、別の態様において、本発明は、創傷、熱傷の治療または疾患を原因とする損傷の修復の方法であって、損傷組織を、上記の分化細胞または再構築組織で置き換えるステップを含み、該分化細胞または組織が、治療される患者に由来するか、または別の個体のＯＭＬＰのＰＣに由来する方法を提供する。
【００５８】
さらに、別の態様において、本発明は、創傷、熱傷の治療または疾患を原因とする損傷の修復の方法であって、ｉ）治療される個体とは別の個体に由来し、ＯＭＬＰのＰＣに由来しない分化細胞または組織と、ｉｉ）ＯＭＬＰのＰＣまたはその子孫とを同時投与するステップを含む方法を提供する。
【００５９】
ＯＭＬＰのＰＣまたはその子孫の免疫抑制性の性質により、上記のパートｉｉ）における前記ＰＣは、任意の個体に由来してよい。本発明のこの後者の態様の例は、ＧＶＨＤに対する防衛手段のためまたは治療のための、治療される個体とは別の個体からの造血幹細胞と、本発明のＰＣとの同時注入である。
【００６０】
本発明のさらなる態様において、治療される個体に前駆細胞または分化細胞もしくは組織を含むその子孫、あるいは上記の方法により得られる前駆細胞またはその子孫を投与するステップを含む、炎症性障害または免疫障害を治療する方法が提供される。
【００６１】
本発明のさらなる態様において、上記のあるいは上記の方法により得られる前駆細胞または分化細胞もしくは組織を含むその子孫の、医薬品としての使用が提供される。
【００６２】
好ましい実施形態において、上記の使用は、以下の障害のいずれか１つまたは複数を治療するためである：創傷、熱傷、組織損傷、炎症、自己免疫、ＧＶＨＤ同種造血幹細胞（ＨＳＣ）移植、糖尿病または免疫障害。
【００６３】
本発明を、ここで、図面を参照にしてさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】フィブロネクチン上を被覆し、差次接着により単離されたｐ７５陽性細胞を示す写真である。
【図２】（ａ）ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ、（ｂ〜ｃ）Ｘ−ＶＩＶＯ１０培地で増殖させたコロニーにおける異なる形態を示す写真である。（ｂ）は、ラミニン基質に付着した典型的なニューロスフェア様構造を示し、（ｃ）は、このようなスフェアから出て遊走し、（ａ）で見られる線維芽細胞の形態とは対照的に神経様の形態を採用する細胞を示す。
【図３】ＳＹ５Ｙ神経芽腫株化細胞の典型的な形態を示す写真である。単一分化神経細胞は、培養プレートに付着する未分化細胞のクラスタから出て遊走することが観察される（ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／ＳＨＳＹ５Ｙ）。
【図４】単離コロニーを、Ｌｉら、２００５により記載されるＸ−ＶＩＶＯ１０培地条件を用いて単層培養で増殖させたときに産生されるニューロスフェアの顕微鏡写真である。バー＝５０μｍ
【図５】Ｘ−ＶＩＶＯ１０培地中で培養された未分化のＯＭＬＰ前駆細胞における、ＦＩＴＣ複合２次抗体を用いる免疫細胞化学による神経マーカー（ａ）ニューロフィラメントＭ（陰性）、（ｂ）ＴＵＪ−１（陽性）および（ｃ）ＧＦＡＰ（陽性）と、シュワン細胞マーカー（ｄ）ＭＢＰ（陰性）および（ｅ）Ｓ１００（陽性）の免疫局在化を示す写真である。バー＝５０μｍ。シグナルが観察されなかったので、ＭＡＰ２データは示していない。
【図６】分化ＯＭＬＰ前駆細胞における、ＦＩＴＣ複合２次抗体を用いる免疫細胞化学による神経マーカー（ａ）Ｎｅｓｔｉｎ、（ｂ）ＴＵＪ−１（ｃ）ニューロフィラメントＭ、（ｄ）ＧＦＡＰおよび（ｅ）ＭＡＰ２と、シュワン細胞マーカー（ｆ）ＭＢＰおよび（ｇ）Ｓ１００の免疫局在化（全て陽性）を示す写真である。バー＝１０μｍ（図６ｅにおいて５０μｍ）
【図７】ＯＭＬＰにおける胚性マーカーおよび発達マーカーの陽性の発現を示す写真である。ＯＭＬＰ消化物全体のうちの胚性マーカー（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ−４およびｈＴＥＲＴ）および発達マーカー（Ｎｏｔｃｈ１、２、３、Ｄｅｌｔａ１およびＪａｇｇｅｄ２）の陽性の発現は、ＲＴ−ＰＣＲにより決定した。ＨｕＥＳ９  ＥＳＣ  ＲＮＡを、全ての反応について陽性対照として用いた。
【図８】ＰＣがＯＭＬＰから確実に単離でき、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏで迅速に増殖することを示す図である。  ＰＣは、ＯＭＬＰ消化物から差次接着によりクローンとして増殖させた（Ａ）。複数のＰＣクローンを３名の患者から単離し、これらは線維芽細胞様の形態を示し（Ａ、Ｂ）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて迅速に増殖し、細胞老化に到達する前に合計で＞５０ＰＤになった（Ｃ、Ｄ、Ｅ）。
【図９】ＯＭＬＰ  ＰＣが、幹細胞マーカーを発現し、造血性または線維細胞の起源でないことを示すグラフである。  ＦＡＣＳ分析を、幹細胞マーカーＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６およびＣＤ４４、ならびに造血／線維細胞マーカーＣＤ３４およびＣＤ４５の発現について、増殖クローンに対して行った。３名の患者から単離したＰＣクローンは、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１６６＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ３４−およびＣＤ４５−と確認された。
【図１０】ＯＭＬＰ  ＰＣが活性テロメラーゼを発現することを示す図である。  ＰＣコロニーは、テロメラーゼの発現をＩＣＣにより示した（Ａ）。発現は、Ｑ−ＴＲＡＰによる単層増殖の後に定量した。全てのクローン（ｎ＝３）は、活性テロメラーゼについて陽性であった（Ｂ、Ｃ、Ｄ）。熱不活化（ＨＩ）を対照として用いた。アクリルアミドゲルでのＱ−ＴＲＡＰ生成物の分離により、テロメア反復「脚立」効果が確認された（Ｅ）。
【図１１】ＯＭＬＰ  ＰＣが神経堤を起源とすることを示す図である。  ２名の患者からのＰＣのＣＦＥは、Ｊａｇｇｅｄ１の存在下で著しくより高かった（Ａ、Ｂ、Ｃ）。神経堤起源は、発達中のコロニーにおける神経堤マーカー（Ｄ）Ｓｎａｉｌ、（Ｅ）Ｓｌｕｇ、（Ｆ）Ｓｏｘ１０、（Ｇ）Ｔｗｉｓｔおよび（Ｈ）Ｎｏｔｃｈ１の発現により、ＩＣＣにより確認した。
【図１２】ＯＭＬＰ  ＰＣが、間葉系細胞系統に分化できることを示す写真である。  ＰＣは、間葉系細胞系統に分化された。軟骨形成分化系統への分化は、ワンギーソン染色（Ａ）およびアグリカンＩＣＣ（Ｂ）により確認した。造骨誘導は、カルシウム沈着についてのフォン・コッサ染色（Ｃ）および脂肪滴についてのオイルレッドＯ染色による脂肪生成誘導（Ｄ）により分析した。
【図１３】ＯＭＬＰ  ＰＣ上の細胞表面（ａ、ｂ）ＨＬＡＩの発現レベルを示すグラフである。  ＯＭＬＰ−ＰＣ上での細胞表面の（ａ、ｂ）ＨＬＡＩおよび（ｃ、ｄ）ＨＬＡＩＩ発現の発現レベルと、ＩＦＮγの存在／不在での蛍光強度中央値の変化を示すヒストグラム。記号：赤はＩｇ対照を、緑は第１日を、青は第２日をおよび茶色は第７日を示す。
【図１４】非刺激ＯＭＬＰ−ＰＣでのＨＬＡＩＩタンパク質の不在を示す写真である。  非刺激ＯＭＬＰ−ＰＣでのＨＬＡＩＩタンパク質の不在、およびＩＦＮγでの刺激を用いる２４時間後のその誘導を示すウェスタンブロット。
【図１５】リンパ球増殖に対するＯＭＬＰ−ＰＣの用量非依存的な阻害効果を示すグラフである。  リンパ球増殖に対するＯＭＬＰ−ＰＣの有効な阻害効果を示す１元ＭＬＣの結果。これらのデータは、この現象が用量非依存的であり、ＩＦＮγでの予備刺激によるＨＬＡＩＩ発現の誘導に関係しないことを示す。データは、ＣＰＭ＋／−標準偏差として表す。これらのデータは、１つのＯＭＬＰ−ＰＣクローンからであるが、試験した全てのクローンの代表である。＊＊＊ボンフェローニの多重比較検定を用いる１元ＡＮＯＶＡにより決定したＰ＜０．００１。
【図１６】リンパ球増殖に対するＭＳＣの変動性の阻害効果を示すグラフである。  リンパ球増殖に対するＭＳＣの変動性の阻害効果を示す１元ＭＬＣの結果。これらのデータは、この現象が用量依存的であることを示す。データは、ＣＰＭ＋／−標準偏差として表す。
【図１７】Ｔ細胞増殖に対するＯＭＬＰ−ＰＣの用量非依存的な阻害効果を示すグラフである。  Ｔ細胞増殖に対するＯＭＬＰ−ＰＣの有効な阻害効果を示す１元ＭＬＣの結果。これらのデータは、この現象が用量非依存的であり、ＩＦＮγでの予備刺激によるＨＬＡＩＩ発現の誘導に関係しないことを示す。データは、ＣＰＭ＋／−標準偏差として表す。これらのデータは、１つのＯＭＬＰ−ＰＣクローンからであるが、試験した全てのクローンの代表である。＊＊＊ボンフェローニの多重比較検定を用いる１元ＡＮＯＶＡにより決定したＰ＜０．００１。
【図１８】リンパ球増殖に対するＯＭＬＰ−ＰＣの接触非依存的な阻害効果を示すグラフである。  接触非依存的なリンパ球増殖に対するＯＭＬＰ−ＰＣの潜在的阻害効果を示す１元ＭＬＣの結果。これらのデータは、この現象が用量非依存的であり、ＩＦＮγでの予備刺激によるＨＬＡＩＩ発現の誘導に関係しないことを示す。データは、ＣＰＭ＋／−標準偏差として表す。これらのデータは、１つのＯＭＬＰ−ＰＣクローンからであるが、試験した全てのクローンの代表である。  ＊＊＊ボンフェローニの多重比較検定を用いる１元ＡＮＯＶＡにより決定したＰ＜０．００１。
【図１９】Ｔｒｅｇ細胞数に対するＯＭＬＰ−ＰＣの効果の欠如を示すグラフである。  Ｔｒｅｇ細胞数に対するＯＭＬＰ−ＰＣの効果がないことを示すＦＡＣＳの結果。これらのデータは、この現象が用量非依存的であり、ＩＦＮγでの予備刺激によるＨＬＡＩＩ発現の誘導に関係しないことを示す。データは、平均％ＴＲｅｇ細胞＋／−標準偏差として表す。これらのデータは、３名の患者からである。
【図２０】ＣＤ３＋ＣＤ３８＋活性化Ｔ細胞に対するＯＭＬＰ−ＰＣの効果を示すグラフである。  接触させてまたはトランスウェル中でレスポンダー細胞と共培養した場合の、ＣＤ３＋ＣＤ３８＋活性化Ｔ細胞数に対するＯＭＬＰ−ＰＣの効果を示すＦＡＣＳの結果。これらのデータは、この現象が用量非依存的であり、ＩＦＮγでの予備刺激によるＨＬＡＩＩ発現の誘導に関係しないことを示す。データは、平均％ＣＤ３＋ＣＤ３８＋Ｔ細胞＋／−標準偏差として表す。これらのデータは、３名の患者からである。
【図２１】ＣＤ３＋ＣＤ２５＋活性化Ｔ細胞に対するＯＭＬＰ−ＰＣの効果を示すグラフである。  接触させてまたはトランスウェル中でレスポンダー細胞と共培養した場合の、ＣＤ３＋ＣＤ２５＋活性化Ｔ細胞数に対するＯＭＬＰ−ＰＣの効果を示すＦＡＣＳの結果。これらのデータは、この現象が用量非依存的であり、ＩＦＮγでの予備刺激によるＨＬＡＩＩ発現の誘導に関係しないことを示す。データは、平均％ＣＤ３＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞＋／−標準偏差として表す。これらのデータは、３名の患者からである。
【００６５】
材料および方法
前駆細胞の単離および培養での維持
正常で疾患がない頬粘膜生検を、Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｗａｌｅｓ、Ｃａｒｄｉｆｆ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＫにて日常的な歯科処置を受ける、同意を得た患者（ｎ＝３）から得た。この研究について、地方の倫理委員会の承認は既に得られ、提供者は、ヘルシンキ協定に従って情報提供を受けた。
【００６６】
単一細胞懸濁物を、以前に記載されたようにして（６）生検の酵素消化の後に得た。組織の表面を７０％エタノールで滅菌し（３０秒）、いずれの過剰の脂質も、組織から外して整え、これを５ｍｍ２片に切断した。組織を、次いで、４℃にて１晩、ジスパーゼ（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ；ｃａｔ．ｎｏＰ−３４１７；２ｍｇ／ｍｌ）とインキュベートして、上皮と固有層組織との分離を助けた。次の日に、上皮組織を固有層組織からはがして廃棄した。ＯＭＬＰ組織を、次いで、機械的に細かく切り刻み、３７℃にて１晩、クロストリジウム・ヒストリティカムＡコラゲナーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＫ；ｃａｔ．ｎｏ１０３５８６；１ｍｇ／ｍｌ）を用いて解離させた。ジスパーゼおよびコラゲナーゼ溶液は、血清含有培地（ＳＣＭ）［２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢおよび１０％（ｖ／ｖ）熱不活化胎児ウシ血清［ＦＣＳ］（ｃａｔ．ｎｏ１０２７０−１０６）を補ったダルベッコの改変イーグル培地［ＤＭＥＭ］（ｃａｔ．ｎｏ２１９６９−０３５）］中で作製した。培地およびサプリメントは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫから購入した。遊離された細胞を次いでペレットにし、洗浄し、再びペレットにした後に、基本培養培地（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢを補ったダルベッコ改変イーグル培地［ＤＭＥＭ］（ｃａｔ．ｎｏ２１９６９−０３５））中に再懸濁した。
【００６７】
ＰＣは、フィブロネクチンへのその後の差次接着により分離した（１０、１５）。基本培養培地中のＯＭＬＰ単一細胞懸濁物を、ウシ血漿フィブロネクチン（ＰＢＳ＋［０．１Ｍリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４、１ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ塩化カルシウムを含有］中で４℃にて１晩希釈した１０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ、ＵＫ；ｃａｔ．ｎｏＦ−４７５９）被覆６ウェルプレート上に播種し、３７℃にて２０分間インキュベートした。この時間枠内での非接着細胞を廃棄し、接着細胞に、単一細胞コロニーを（＞３２細胞、本発明者らの分析からのいずれの潜在的な推移増幅細胞も排除する）、ＳＣＭ中で３７℃にて５％ＣＯ２湿潤環境にて形成することを可能にした。所定のコロニー中の細胞を手動で計数した後に、クローニングリング内で０．０５％（ｗ／ｖ）トリプシン／０．５３ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ；ｃａｔ．ｎｏ２５３００−０５４）を用いるトリプシン処理により単離し、ＳＣＭ中に２×１０３細胞／ｃｍ２の密度にて再び播種した。
【００６８】
集密に到達すると、細胞を、０．０５％（ｗ／ｖ）トリプシン／０．５３ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ；ｃａｔ．ｎｏ２５３００−０５４）を用いるトリプシン処理により継代し、上記の密度を用いて再び播種した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞集団の集団倍加（ＰＤ）は、以前に記載されたようにして（１９）それぞれの継代の細胞数を直接計数することにより導いた。クローンＰＣ集団を、＜０．５の週あたりの定常ＰＤレベルと細胞形態の評価とにより規定される老化まで培養した。
【００６９】
クローンの不均質増殖
この方法は、「前駆細胞の単離および培養での維持」の標題の下に記載された技術の多くを伴う。しかし、フィブロネクチンへの差次接着によるＰＣの単離の後に、接着細胞を集密まで成長させた後に、単層培養上での不均質前駆細胞集団として継代して増殖させた。
【００７０】
胚性マーカーおよび発達マーカーについてのＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡを、ＯＭＬＰ消化物全体からＴｒｉｚｏｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）を用いて抽出した。ｃＤＮＡを、０．５μｇの全ＲＮＡから、ランダムヘキサマープライマーおよびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＫ）を製造者の使用説明に従って用いて得た。標準的なＰＣＲ反応を、ＧｏＴａｑ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＫ）を製造者の使用説明に従って、９４℃にて５分間の最初の変性ステップ、その後９４℃（１分）、Ｔａ（３０秒）、７２℃（１分）を４０サイクル、さらに７２℃にて１０分間の最終伸長ステップを用いて行った。ｃＤＮＡを、Ｎａｎｏｇ（１７）［Ｆ  ５’ＴＧＣ  ＴＴＡ  ＴＴＣ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＣＴ  ３’およびＲ  ５’ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＧＡＣ  Ｔ  ３’］Ｔａ  ４４℃、Ｏｃｔ４（２０）［Ｆ  ５’ＣＧＡ  ＣＣＡ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＴＴＧ  ＡＧ  ３’およびＲ  ５’ＣＣＣ  ＣＣＴ  ＧＴＣ  ＣＣＣ  ＣＡＴ  ＴＣＣ  ＴＡ  ３’］Ｔａ  ６０℃、Ｓｏｘ２［Ｆ  ５’ＡＡＣ  ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＡＴＧ  ＣＡＣ  ＡＡＣ  ＴＣ  ３’およびＲ  ５’ＣＧＧ  ＧＧＣ  ＣＧＧ  ＴＡＴ  ＴＴＡ  ＴＡＡ  ＴＣ  ３’］Ｔａ  ５５℃、ＫＬＦ−４［Ｆ  ５’ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＧＧＴ  ＧＡＧ  ＡＡＡ  ＣＣ  ３’およびＲ  ５’ＡＴＧ  ＴＧＴ  ＡＡＧ  ＧＣＧ  ＡＧＧ  ＴＧＧ  ＴＣ  ３’］、Ｔａ  ５５℃、ｈＴＥＲＴ（２１）［Ｆ  ５’ＣＧＧ  ＡＡＧ  ＡＧＴ  ＧＴＣ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＡＡ  ３’およびＲ  ５’ＧＧＡ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＧＧＡ  ＧＴＣ  ＴＧＧ  Ａ  ３’］Ｔａ  ５５℃、Ｎｏｔｃｈ  １［Ｆ  ５’ＣＴＡ  ＣＣＴ  ＧＴＣ  ＡＧＡ  ＣＧＴ  ＧＧＣ  ＣＴ  ３’およびＲ  ５’ＣＧＣ  ＡＧＡ  ＧＧＧ  ＴＴＧ  ＴＡＴ  ＴＧＧ  ＴＴＣ  Ｇ  ３’］Ｔａ  ５６℃、Ｎｏｔｃｈ  ２［Ｆ  ５’ＡＡＧ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＧＣＣ  ＴＡ  ３’およびＲ  ５’ＣＡＧ  ＧＧＧ  ＧＣＡ  ＣＴＧ  ＡＣＡ  ＧＴＡ  ＡＴ  ３’］Ｔａ  ５６℃、Ｎｏｔｃｈ  ３［Ｆ  ５’ＣＡＧ  ＴＣＧ  ＣＣＴ  ＧＡＧ  ＡＡＴ  ＧＡＴ  ＣＡＣ  ３’およびＲ  ５’ＧＡＡ  ＴＧＡ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ３’］Ｔａ  ５３℃、Ｄｅｌｔａ  １［Ｆ  ５’ＡＴＣ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＣＴＣ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴ  ３’およびＲ  ５’ＧＣＣ  ＴＴＧ  ＡＡＧ  ＣＣＡ  ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＴＣ  ３’］Ｔａ  ５３℃およびＪａｇｇｅｄ  ２  ［Ｆ  ５’ＣＴＡ  ＣＡＡ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＣＡＴ  ＣＴＧ  ＴＧ  ３’およびＲ  ５’ＧＣＧ  ＡＴＡ  ＣＣＣ  ＧＴＴ  ＧＡＴ  ＣＴＣ  ＡＴ  ３’］Ｔａ  ５３℃の発現について分析した。発表していないプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３プライマー設計ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ）を用いて設計した。ＰＣＲ生成物をアガロースゲルで分離し、０．００５％（ｖ／ｖ）臭化エチジウムで視覚化した。ＨｕＥＳ９  ＥＳＣ分化系統のｃＤＮＡの陽性対照は、全ての反応において行った。
【００７１】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーのための増殖細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）での処理により継代し、計数した後に染色した。細胞懸濁物をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄して残存血清を除去した後に、３重の幹細胞マーカーＣＤ９０−アロフィコシアニン（ＡＰＣ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ）、ＣＤ１０５−Ｒ−フィコエリスリン（ＲＰＥ）およびＣＤ１６６−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（全ての抗体の５０倍希釈；Ａｎｃｅｌｌ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を用いて４℃にて４５分間３重標識した。細胞は、同じ方法を用いて、造血および線維細胞マーカーＣＤ３４−ＦＩＴＣおよびＣＤ４５−ＲＰＥ（１：５０；Ａｎｃｅｌｌ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）について別に染色した。細胞をＰＢＳ中で２回洗浄した後に、２％パラホルムアルデヒドで５分間、氷上で固定した。固定された細胞懸濁物を１ｍｌのＰＢＳで希釈した後に検出した。
【００７２】
細胞を、４８８ｎｍおよび６３３ｎｍのレーザ励起光源を備えるＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＫ）で、試料あたり３０，０００事象を記録して分析した。フルオロフォア複合免疫グロブリンおよび単一染色物は、それぞれ対照であった。全てのデータは、補正した後にＦｌｏｗＪｏバージョン７．２．２ソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）で分析した。
【００７３】
定量的テロメア増幅プロトコル（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）（Ｑ−ＴＲＡＰ）
増殖クローン内の活性テロメラーゼの存在を、Ｗｅｇｅら２００３（２２）により以前に記載されたものに適合させたＱ−ＴＲＡＰ法を用いて分析して定量した。簡単に、細胞を、ＴＲＡＰＥＺＥ（登録商標）１×ＣＨＡＰＳ溶解バッファー（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＵＫ）中で、１０，０００細胞／μｌの濃度にて、氷上で３０分間溶解した。溶解した細胞を２０分間、２０，０００×ｇにて４℃で遠心分離した。ドライアイスを用いて可溶化液の上清を直ちに凍結させ、使用時まで−８０℃にて貯蔵した。１２．５μｌ  Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ）、１００ｎｇのＴＳプライマー［５’ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ３’］、５０ｎｇ  ＡＣＸプライマー［５’ＧＣＧＧＣＧＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＡＡＣＣ３’］（プライマー配列はＫｉｍおよびＷｕ（１９９７）（２３）により以前に発表された）および合計２０μｌまでのジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水のマスターミックスを作製し、５μｌ中の１０，０００細胞の等価物を反応あたりに加えた。熱不活化（８５℃にて３０分）可溶化液および溶解バッファーを、陰性対照として用いた。５０１ｍｅｌ細胞可溶化液（範囲１〜１０，０００細胞）の標準曲線を作製して、相対的テロメラーゼ発現を計算した。全ての反応を、３重で、ＡｂｉＰｒｉｓｍ７０００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ）を用いて行い、データを、１０，０００細胞の５０１ｍｅｌ陽性対照株化細胞に対する相対的テロメラーゼ発現のパーセンテージとして表した。
【００７４】
可溶性Ｊａｇｇｅｄ１の存在下でのコロニー形成効率
コロニー形成効率（ＣＦＥ）を、上記のようにしてフィブロネクチンへの差次接着を用いて確立した。コロニーは９日間、ＳＣＭ＋／−Ｎｏｔｃｈリガンド、組換えラットＪａｇｇｅｄ１／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ；５０ｎｇ／ｍｌ）中での培養において形成させた。培養培地およびＪａｇｇｅｄ１は３日ごとに置き換えた。
【００７５】
ＣＦＥは、形成されたコロニー（＞３２細胞）の総数の、最初の接着細胞数に対する比率として表した。
【００７６】
免疫細胞化学法（ＩＣＣ）
発達中のコロニー：フィブロネクチン被覆マルチウェルプレートに接着した、発達中のコロニー内の細胞を、氷冷メタノール：アセトン（１：１）中で２０分間、４℃にて固定した。細胞をＰＢＳ中で洗浄した後に、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）で室温にて２０分間透過にした（ｐ７５神経成長因子［ＮＧＦ］受容体、Ｔｗｉｓｔ、ＳｌｕｇおよびＳｏｘ１０抗体のみ）。テロメラーゼ染色のために固定した細胞を、抗体の製造者の使用説明に従って、２Ｎ塩酸と２０分間、室温にてインキュベートした後に、０．１Ｍホウ酸ナトリウムを５分間用いて中和した。細胞を、その後、適切な血清（Ｄａｋｏ  ＵＫ  Ｌｔｄ．、ＵＫ；２０倍希釈）中で３０分間、室温にてブロックした。細胞を、１次抗体中で、４℃にて１晩インキュベートした（ｐ７５  ＮＧＦ受容体［ＭＥ２０．４］１：１００、Ｔｗｉｓｔ［Ｈ−８１］１：５０；Ｓｌｕｇ［Ｇ−１８］１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ；Ｓｎａｉｌ［Ａｂ１７７３２］１：５０；Ｓｏｘ１０［Ａｂ２５９７８］１：５０；テロメラーゼ［Ａｂ５１８１］１：２０００；Ａｂｃａｍ  Ｐｌｃ、ＵＫ；Ｎｏｔｃｈ１［ｂＴＡＮ２０］１：５；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ、ＵＳＡ）。テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）抗ウサギ、ＦＩＴＣ抗マウス（Ｄａｋｏ  ＵＫ  Ｌｔｄ．、ＵＫ）、ＦＩＴＣ抗ヤギおよびＦＩＴＣ抗ラット（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）の２次抗体を、室温にて１時間インキュベートした。
【００７７】
後神経およびシュワン細胞分化：細胞を、以前に記載されたようにして固定し、洗浄し、ブロックした。微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）抗体とインキュベートした細胞を、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００で透過にした後にブロックした。細胞を、１次抗体中で４℃にて１晩インキュベートした（ＭＡＰ２［ＨＭ−２］１：４００；グリア線維結合タンパク質（ＧＦＡＰ）［ＧＦ−５］１：２００；ニューロン特異的β−ＩＩＩチューブリン［ＴＵＪ−１］１：１０００；ニューロフィラメントＭ（ＮＦＭ）［Ａｂ９０３４］１：５００；Ｓ１００［４Ｃ４．９］１：５０；ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）［ＥＰ１４４８Ｙ］１：１００；Ａｂｃａｍ  Ｐｌｃ、ＵＫ）。２次抗体インキュベーションは、上記のとおりであった。
【００７８】
適切であれば、核を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）含有封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＫ）を用いて対比染色し、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｐｒｏｖｉｓ  ＡＸ７０顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，ＵＫ  Ｌｔｄ．）をＮｉｋｏｎ  ＤＸＭ１２００カメラおよびＮｉｋｏｎ  ＡＣＴ−１ソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ  ＵＫ  Ｌｔｄ．）とともに用いて視覚化した。
【００７９】
軟骨形成性、造骨性および脂肪生成性の分化
増殖クローンの単一細胞懸濁物を、複数の間葉系細胞系統の分化誘導プロトコルに供した。
【００８０】
軟骨形成性分化：単一細胞懸濁物を、１分あたり１５００回転（ＲＰＭ）にて、微小遠心管中で、１ｍｌのＳＣＭ中に試験管あたり５×１０５の濃度でペレットにした。ペレットを１晩形成させた。ＳＣＭを、軟骨形成性誘導培地（１×インスリン、トランスフェリンおよびセレン（ＩＴＳ）サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）、５０μｇ／ｍｌ  Ｌ−アスコルベート（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）および５ｎｇ／ｍｌトランスフォーミング成長因子ベータ１（ＴＧＦβ１）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ＥＣ  Ｌｔｄ．、ＵＫ）を補った基本培地）に置き換えた。ペレットを遠心分離した後に馴化培地を吸引して、培地を２日ごとに交換した。ペレットを２１日まで培養で維持した。
【００８１】
造骨性分化：細胞を、６ウェル培養皿に、３×１０３細胞／ｃｍ２の濃度で播種した。細胞を、ＳＣＭ中で集密が得られるまで培養し、培地を、造骨性誘導培地（１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ、５０μｇ／ｍｌ  Ｌ−アスコルベート、１０μＭデキサメタゾンおよび５ｍＭベータ−グリセロホスフェート（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）を補ったアルファ改変イーグル培地（α−ＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ））に置き換えた。培養物に、造骨性誘導培地を３日ごとに供給して、合計で２１日間培養した。
【００８２】
脂肪生成分化：細胞を、６ウェル培養皿に、３×１０３細胞／ｃｍ２の濃度で播種した。細胞を、ＳＣＭ中で集密が得られるまで培養し、培地を、脂肪生成性誘導培地（１０μｇ／ｍｌインスリン、１μＭデキサメタゾン、１００μＭインドメタシン、１００μＭ  ３−イソブチル−１−メチル−キサンチン［ＩＢＭＸ］（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）を補ったＳＣＭ）に３日間置き換えた。細胞を、次いで、脂肪生成性維持培地（１０μｇ／ｍｌを補ったＳＣＭ）とさらに１日インキュベートした。細胞を、合計で２８日間の反復誘導および維持サイクルで培養した。
【００８３】
神経細胞およびシュワン細胞分化
単離したコロニーを培養し、限定ＥＳＣ培地中で増殖させた（２４）。コロニーを以前に記載されたようにしてトリプシン処理し、ヒトラミニン被覆マルチウェルプレート（２μｇ／ｃｍ２；Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）に播種した。細胞を、０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）、１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢおよび８０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｒｈｂＦＧＦ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ＥＣ  Ｌｔｄ．、ＵＫ）を補ったＸ−ＶＩＶＯ（商標）１０培地（Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．、ＵＫ）で維持した。
【００８４】
細胞を継代し、ニューロスフェアを、１ｍｇ／ｍｌクロストリジウム・ヒストリティカムコラゲナーゼＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）中で５〜１０分間、３７℃にてインキュベートし、その後機械的に分離することにより分離した。
【００８５】
細胞を、以前に記載されたプロトコルを用いる神経分化に供した（１６、１７）。簡単に、単一細胞懸濁物を計数し、０．１％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＫ）で被覆したチャンバスライド上に、５．６×１０３細胞／ｃｍ２にて、４０ｎｇ／ｍｌ  ｈｒｂＦＧＦ、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンおよび０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢを補ったＤＭＥＭ−Ｆ１２（３：１）培地中で播種した。細胞を、培地を３日ごとに交換しながら７日間培養した。培養７日後に、ｈｒｂＦＧＦを培養培地から除去し、１０ｎｇ／ｍｌ神経成長因子（ＮＧＦ）、１０ｎｇ／ｍｌ脳由来成長因子（ＢＤＮＦ）および１０ｎｇ／ｍｌニューロトロフィン３（ＮＴ３）に置き換えた。細胞を、培地を３日ごとに交換しながらさらに７日間培養した。
【００８６】
シュワン細胞の分化は、Ｔｏｍａら、（２００５）（１８）により以前に記載されたとおりであった。コラゲナーゼ処理細胞を、神経分化について記載されたものと等しい密度にて、ポリ−Ｄ−リジンラミニン被覆チャンバスライド上に播種した（２μｇ／ｍｌ）。細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンおよび０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２（３：１）中で７日間培養した。培地を、次いで、１％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１％（ｖ／ｖ）Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）、４μＭフォルスコリン（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢおよび１０ｎｇ／ｍｌヘレグリンβ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ＥＣ  Ｌｔｄ．、ＵＫ）を含む神経基本培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）に置き換えた。細胞を、この培地中でさらに７日間維持した。５０％の馴化培地を細胞に再び与えながら、培地を３日ごとに交換した。
【００８７】
免疫組織化学法
培養２１日後の軟骨形成分化細胞ペレットの１０μｍの凍結切片を採集した。切片をＰＢＳ中で１０分間洗浄した後に、ヤギ血清（１：２０；Ｄａｋｏ  ＵＫ  Ｌｔｄ．、ＵＫ）中で室温にて３０分間ブロックした。切片を、アグリカン抗体［１：５０；６Ｂ４］（Ｂｒｕｃｅ  Ｃａｔｅｒｓｏｎ教授、Ｃａｒｄｉｆｆ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙからの寛大な進物）中で４℃にて１晩、湿潤チャンバ中でインキュベートした。スライドを、その後、ＰＢＳで１０分間洗浄し、抗マウス２次抗体（１：５０；Ｄａｋｏ  ＵＫ  Ｌｔｄ．、ＵＫ）と室温にて１時間インキュベートした。切片をＰＢＳで洗浄した後に、蛍光マウンティング媒体（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）（Ｄａｋｏ  ＵＫ  Ｌｔｄ．、ＵＫ）とともにカバーガラスの下に戴置した。スライドを、ＩＣＣについて以前に記載したようにして視覚化した。
【００８８】
組織学
軟骨形成性ペレットのワンギーソン染色：軟骨形成分化ペレットから切断した凍結切片を、以前に記載されたようにして調製した。切片を水で洗浄した後に、セレスチンブルーで５分間染色した。切片を水ですすぎ、マイヤーヘマトキシリンでさらに５分間染色した。切片を水で洗浄し、７０％（ｖ／ｖ）エタノール中の１％（ｖ／ｖ）塩酸中で区別した。切片を流水中でさらに５分間洗浄した後に、ワンギーソン染色で３分間染色した。スライドを再び洗浄した後に、ＤＰＸ封入剤（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）とともにカバーガラスの下に戴置した。
【００８９】
造骨性分化についてのフォン・コッサ染色：分化細胞を、７０％（ｖ／ｖ）エタノール中で４℃にて１晩固定した。細胞をＰＢＳで洗浄した後に、５％（ｗ／ｖ）硝酸銀（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）と暗所にて５分間インキュベートした。洗浄後、細胞を５％（ｗ／ｖ）炭酸ナトリウム含有１０％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド溶液中で２分間インキュベートした。細胞を、水で１５〜２０分間十分に洗浄した後に、ファーマー減力液（０．１％（ｗ／ｖ）チオ硫酸ナトリウムおよび０．１％（ｗ／ｖ）フェリシアン化カリウム）中で３０秒間インキュベートした。細胞を水でさらに１５〜２０分間洗浄した後に視覚化した。
【００９０】
脂肪生成性分化についてのオイルレッドＯ染色：７０％エタノール中で固定した分化細胞を、６０％（ｖ／ｖ）イソプロピルアルコール（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）で室温にて５分間、撹拌しながらすすいだ。細胞をオイルレッドＯ（イソプロピルアルコール中の０．２５％（ｗ／ｖ）オイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ））で室温にて１０分間、撹拌しながら染色した。細胞を、６０％（ｖ／ｖ）イソプロピルアルコール中で短時間すすいだ後に、水で洗浄して視覚化した。
【００９１】
脂肪生成マーカーについてのＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡを、脂肪生成分化ＯＭＬＰ−ＰＣからＴｒｉｚｏｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）を用いて抽出した。ｃＤＮＡを、０．５μｇのトータルＲＮＡから、ランダムヘキサマープライマーおよびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＫ）を製造者の使用説明に従って用いて得た。標準的なＰＣＲ反応を、ＧｏＴａｑ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＫ）を製造者の使用説明に従って、９４℃にて５分間の最初の変性ステップ、その後、４℃（１分）、Ｔａ（３０秒）、７２℃（１分）を４０サイクル、さらに７２℃にて１０分間の最終伸長ステップを用いて行った。ｃＤＮＡを、リポタンパク質リパーゼ［Ｆ  ５’ＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＴＧＧ３’およびＲ  ５’ＣＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＡＣＣＡＧＴＴＴＧＧ３’］、ＣＡＡＴＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ［ＣＥＢＰα］［Ｆ  ５’ＣＣＧＧＣＣＴＣＴＴＣＣＣＴＴＡＣＣＡＧ３’およびＲ  ５’ＣＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＴＴＧＧＣＣＴＴＧ３’］ならびにペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ［ＰＰＡＲγ］［Ｆ  ５’ＣＣＡＣＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡ３’およびＲ  ５’ＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＧＡＡＡＧＡＴＧＣ３’］の発現について分析した。プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３プライマー設計ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ）を用いて設計した。ＰＣＲ生成物をアガロースゲルで分離し、０．００５％（ｖ／ｖ）臭化エチジウムで視覚化した。
【００９２】
免疫調節活性
ＯＭＬＰ−ＰＣの細胞培養
以前に確立したＯＭＬＰ−ＰＣクローンを、単層にて、以前に記載された血清含有培地（ＳＣＭ）中で、３７℃にて５％ＣＯ２中で成長させた。ＩＦＮγでの刺激を必要とするクローンについて、細胞を６０％集密まで成長させた後に、１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮγを補ったＳＣＭで刺激した。細胞を、上記の培地中で１、２または７日間、培養して維持した。培地を交換し、細胞を、第３日に新鮮なＩＦＮγで再び刺激した。
【００９３】
細胞外ＨＬＡＩおよびＩＩ発現についてのＯＭＬＰ−ＰＣのＦＡＣｓ分析
ＯＭＬＰ−ＰＣを、１００Ｕ／ｍｌ  ＩＦＮγの存在／不在で成長させ、ＦＡＣＳ分析により、刺激の１、２および７日後のＨＬＡＩおよびＩＩ発現についてアッセイした。
【００９４】
馴化培地を細胞から除去し、−８０℃にて将来の分析のために貯蔵した。細胞をＰＢＳで洗浄した後に、プラスチックから、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）を用いて剥離し、ＰＢＳで再び洗浄した。細胞を、１７００ＲＰＭにて５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を、ＰＢＳ中の０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に再懸濁した。このステップを１回繰り返した。細胞を、ＨＬＡ−ＩまたはＨＬＡ−ＩＩ抗体（５０倍希釈；Ｄａｋｏ、ＵＫ）と室温にて１５分間、暗所でインキュベートした。抗体とのインキュベーションの後に、細胞をもう１度スピンダウンし、ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡで洗浄した。細胞を再びペレットにし、次いで、２００ｕｌのＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡに、以前に記載されたＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＫ）での分析のために再懸濁した。
【００９５】
細胞内および細胞外のＨＬＡＩおよびＩＩ発現の分析のためのウェスタンブロッティング
ＯＭＬＰ−ＰＣを、１００Ｕ／ｍｌ  ＩＦＮγの存在／不在にて成長させ、ウェスタンブロッティングにより、刺激の１、２および７日後のＨＬＡＩおよびＩＩ発現についてアッセイした。細胞をＰＢＳで洗浄した後に、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００／０．２５Ｍスクロース含有Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＫ）に溶解した。タンパク質抽出物を超音波破砕して細胞内タンパク質を放出させた後に、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＫ）を用いて定量した。
【００９６】
タンパク質抽出物（５μｇ）を、１２％アクリルアミド分離ゲルで泳動させてタンパク質を分離し、次いで、ニトロセルロースメンブレンに、３０Ｖ、４℃にて１晩移した。メンブレンを、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０含有Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）（ＴＢＳ−Ｔ）中の５％脱脂粉乳（Ｂｉｏｒａｄ、ＵＫ）でブロックし、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）中で３回洗浄し、ＨＬＡＩＩ抗体（２％脱脂粉乳中で２５０倍希釈；Ｄａｋｏ、ＵＫ）と室温にて１時間インキュベートした。メンブレンをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後に、抗マウスセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合２次抗体（２％脱脂粉乳中で３０００倍希釈；Ｂｉｏｒａｄ、ＵＫ）と室温にて１時間インキュベートした。メンブレンを、その後、ＰＢＳ−Ｔで２回、ＰＢＳで１回洗浄した後に、ＥＣＬ（商標）検出（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）によりタンパク質を検出した。
【００９７】
混合リンパ球培養（ＭＬＣ）によるリンパ球増殖に対するＯＭＬＰ−ＰＣの影響の決定
ＯＭＬＰ−ＰＣを、１００Ｕ／ｍｌ  ＩＦＮγの存在／不在にて成長させ、刺激の７日後にＭＬＣによりアッセイした。細胞をＰＢＳで洗浄した後に、プラスチックからＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）を用いて剥離し、１０％ヒトＡＢ血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢを含むＲＰＭＩ培地で再び洗浄した。細胞を、１７００ＲＰＭにて５分間スピンし、上記のＲＰＭＩ培地に、計数のために再懸濁した。細胞を、ＭＬＣの設定のために２０Ｇｙにてガンマ線照射した。
【００９８】
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、以前に記載されたようにして調製した（２５）。簡単に、ＰＢＬを、ヘパリン処置した血液から、２０分間、６００×ｇでのＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配により精製した。レスポンダーＰＢＬ（Ａ）を、上記のＲＰＭＩ培地中の提供者のプール（Ｐｘ）または自己対照（Ａｘ）からの同数の照射刺激因子ＰＢＬとインキュベートした。照射ＯＭＬＰ−ＰＣを、培養に、１００％〜０．００１％のレスポンダーに対する比率で加え、３７℃、５％ＣＯ２にて５日間インキュベートした。培養物を、第６日に、トリチウム化チミジン取込み（１ｕＣｉ）の２４時間後に凍結させた。培養物を解凍し、増殖を第７日に記録した。細胞を、ＴｏｍＴｅｃ採集装置（Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ９６、Ｔｏｍｔｅｃ、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＴ、ＵＳＡ）を用いてガラス繊維フィルタ上に自動的に採集した。
【００９９】
混合リンパ球培養によるＴ細胞マイトジェンの存在下でのリンパ球増殖の影響の決定
標準的な混合リンパ球培養（ＭＬＣ）ＭＬＣを、１：１〜０．０１：１のレスポンダー細胞に対する比率にてＯＭＬＰ−ＰＣを加えて、上記のようにして設定した。Ｔ細胞マイトジェンであるフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を、培養に１０ｕｇ／ｍｌにて加えた。増殖を、上記のようにして第４日に記録した。
【０１００】
ＯＭＬＰ−ＰＣ誘導免疫抑制が接触依存性であるかの決定
ＭＬＣを、以前に記載されたようにして１２ウェルプレートフォーマットにて設定した。ＯＭＬＰ−ＰＣを培養に、０．１：１〜０．０１：１のレスポンダー細胞に対するいずれかの比率にて加えた。接触培養は、ＭＬＣ培養に直接加えたＯＭＬＰ−ＰＣを含んだ。トランスウェル培養は、０．４ｕｍ孔サイズのメンブレンを有する挿入物上に播種されたＯＭＬＰ−ＰＣを含んだ。これは、細胞を、レスポンダー細胞との直接接触から分けるが、これらが同じ培地を共有することを確実にする。培養を５日間維持した後に、ＰＢＬを除去し、９６ウェルプレートに再び播種し、トリチウム化チミジンを用いて３７℃にて２４時間刺激した。増殖を、以前に記載されたようにして記録した。
【０１０１】
ＰＢＬの一部を、以下に記載されるＦＡＣＳ分析のために回収した。
【０１０２】
Ｔ調節性細胞およびＴ細胞活性化マーカーについての刺激ＰＢＬのＦＡＣＳ分析
上記のトランスウェルおよび接触研究から回収したＰＢＬを、１７００ＲＰＭにて５分間スピンダウンした。上清を回収し、将来の分析のために−８０℃にて貯蔵した。細胞ペレットを再懸濁し、ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡで洗浄した。細胞を、ＨＬＡＩおよびＩＩ検出について以前に記載されたようにしてＦＡＣＳのために調製した。細胞を、ＣＤ３８、ＣＤ３、ＣＤ２５およびＣＤ４またはＣＤ２５、ＣＤ３、ＣＤ１２７およびＣＤ４について４重標識した。自己対照およびＡ＋Ｐｘ細胞インキュベーションを対照として用いた。
【０１０３】
結果
ＯＭＬＰでの胚性および発達マーカーの発現は、前駆細胞集団の存在を示唆する
ＲＴ−ＰＣＲにより、ＯＭＬＰ組織全体の消化物での胚性および多能性マーカーであるＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４の陽性の発現が確認された。ヒト逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）の発現も組織単離物で検出され、このことは、ＯＭＬＰ内に存在する細胞のテロメラーゼ陽性亜集団の存在を示唆する。ｉＰＳマーカーであるＳｏｘ２およびＫＬＦ−４（ならびにＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４）も、組織全体において存在した。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路に関連する発達マーカーであるＮｏｔｃｈ受容体１、２および３ならびにＮｏｔｃｈリガンドＤｅｌｔａ１およびＪａｇｇｅｄ２も、ＯＭＬＰ全体の消化物において陽性に発現されており、このことは、未熟型の細胞と進行中のＮｏｔｃｈシグナル伝達の存在を示唆する（図７）。
【０１０４】
ＰＣ集団は、ＯＭＬＰから確実に単離され、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏにて迅速な増殖を受け得る
ＰＣは、本発明者らの例において、フィブロネクチンへの差次接着により、ＯＭＬＰから容易に単離された。以前に報告されたように、幹細胞および前駆細胞の集団の１つの特性は、単一細胞を起源とするコロニーの形成によるそれらの自己再生能力である。このＯＭＬＰフィブロネクチン接着細胞集団は、単一接着細胞からクローンをうまく産生し、線維芽細胞様の形態、発達中のコロニーにおいて本質的な双極性、および増殖クローンを示した（図８ＡおよびＢ）。この細胞集団は、１ＰＤ／週の一定レベルを確立し、かつおよそ５０〜６０ＰＤにて細胞老化に到達する前の、高い増殖初期速度（平均＞４ＰＤ／週）を特徴とする（図８Ｃ〜Ｅ）。これらの成長動態は、全ての患者から単離され増殖させた全てのクローンを代表する。
【０１０５】
ＯＭＬＰ  ＰＣは、細胞表面幹細胞マーカーを発現する
クローンを単層培養にて増殖させた後に、一連の幹細胞マーカーＳＴＲＯ−１、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ならびに造血および線維細胞マーカーＣＤ３４およびＣＤ４５の発現を、本明細書に記載されるフローサイトメトリー法を用いて決定した。試験した全ての患者からの全てのクローンは、ＳＴＲＯ−１、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１６６の陽性の発現を示したが、ＣＤ３４およびＣＤ４５について陰性であった（図９、ＳＴＲＯ−１およびＣＤ１４６についてはデータを示さず）。
【０１０６】
ＯＭＬＰ  ＰＣは、活性テロメラーゼを発現する
テロメラーゼ活性は、通常、幹細胞およびリンパ球を除く体細胞において消滅すると考えられる。これとは対照的に、ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、それらの幹細胞の特性にもかかわらず、テロメラーゼ活性を欠くことが示されている（３）。発達中のＯＭＬＰコロニーにおけるテロメラーゼ発現をＩＣＣにより評価し、全ての患者からの増殖クローンにおいてＱ−ＴＲＡＰにより評価した。
【０１０７】
テロメラーゼの陽性の発現は、試験した発達中のコロニー全てで示され（図１０Ａ）、増殖クローンにおいて維持された（図１０Ｂ〜Ｄ）。アクリルアミドゲルでのＱ−ＴＲＡＰ生成物の分離により、テロメア反復増幅とともに観察された典型的な「脚立」効果が確認された（図１０Ｅ）。増殖クローン内のテロメラーゼの相対レベルは、患者特異的であったが、同じ患者のクローン同士では大きくは変動せず、細胞老化に到達する患者適合クローンの全集団倍加（ＰＤ）同士の小さい差と関連した（図８Ｂ）。
【０１０８】
ＯＭＬＰ  ＰＣは、神経堤を起源とする
可溶性Ｊａｇｇｅｄ１またはγ−セクレターゼ阻害剤への曝露によるＮｏｔｃｈシグナル伝達の減弱化は、ＭＳＣおよび神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）の増殖に対して異なる効果を有することが示されている。γ−セクレターゼ阻害剤であるＮ−［Ｎ−３，５−ジフルオロフェンアセチル−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）は、ＭＳＣ成長を遅くして、結局は、細胞分裂を阻害することが以前に報告されている。これとは対照的に、ＮＣＳＣを可溶性Ｊａｇｇｅｄ１に曝露すると、細胞の神経分化が阻害され、それにより、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）および増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）の増加が可能になる。
【０１０９】
可溶性Ｊａｇｇｅｄ１の存在下でのＯＭＬＰ  ＰＣのコロニー形成効率（ＣＦＥ）は、対照培地内でＣＦＥよりも著しく高い（Ｐ＜０．０５）ことが見出され（図１１Ａ〜Ｂ）、このことは、ＮＣＳＣで観察された結果を支持し、よって、このＰＣ集団についての神経堤の起源を示唆した。ＯＭＬＰ  ＰＣについての神経堤の起源をさらに確認するために、規定された神経堤マーカーおよび発達マーカーＮｏｔｃｈ１の生成を、ＩＣＣにより、発達中のコロニーにおいて調べた。転写因子であるＳｏｘ１０、Ｓｎａｉｌ、ＳｌｕｇおよびＴｗｉｓｔは、主に細胞核に陽性に局在化していたが、細胞質区画内でも見出された（図１１Ｃ〜Ｇ）。Ｎｏｔｃｈ１は、ＰＣの細胞質内で同定された。これらのデータは、このＰＣ集団についての神経堤の起源をさらに支持する。
【０１１０】
追加の神経堤マーカーであるｐ７５神経成長因子（ＮＧＦ）の発現も、フィブロネクチンへの差次接着により単離された細胞内で見出された（図１）。このマーカーの陽性の発現が、発達中のコロニーの頂部に接着する細胞内で見出された。これらの細胞は、発達中のコロニー内でのこれらの細胞と著しく異なる形態を示した。これらのデータは、本明細書で特徴付けられたｐ７５−細胞集団に加えて、まだ特徴付けられていないｐ７５＋細胞集団も存在することを示唆する。
【０１１１】
ＯＭＬＰ  ＰＣは多分化能を有し、複数の分化系統の細胞を産生できる
複数のコロニーからのＯＭＬＰ  ＰＣは、間葉系および神経の両方の起源の細胞系統に分化した。
【０１１２】
軟骨細胞分化の証拠は、ペレット培養を用いるコラーゲンおよびアグリカン生成により示された（図１２ＡおよびＢ）。ミネラル化は、造骨性の分化ＰＣ培養において観察された（図１２Ｃ）。脂質滴は、脂質生成性の刺激培養物においてオイルレッドＯ染色を用いて観察され、リポタンパク質リパーゼ、ＣＥＢＰ−αおよびＰＰＡＲγのマーカーについてのＲＴ−ＰＣＲ試験は陽性であった（図１２Ｄ；ＲＴ−ＰＣＲについてはデータを示さず）。これらのデータは、ＯＭＬＰ  ＰＣが、多分化能を有し、骨髄および歯髄などの複数の部位から単離された幹細胞について以前に示されたことと同様に、間葉系の型の細胞である骨芽細胞、軟骨細胞および脂肪細胞を産生できることを確実にする。
【０１１３】
神経およびシュワン細胞の分化は、ＳＣＭにおいて単層で連続的に増殖したＰＣを用いて可能でなかった（データは示さず）。神経およびシュワン細胞の分化を陽性に誘導するために、クローンを、限定ＥＳＣ培地の存在下、ラミニン被覆プレート上で単層にて増殖させた。ＰＣの形態は、これらの限定条件におけるインキュベーションにより変化し、ＳＹ５Ｙ神経芽腫株化細胞からの細胞を用いて観察されたことと同様に（図３）、明らかなニューロスフェア様のボディーが形成された（図２Ａおよび４）。限定誘導培地を用いて、ＩＣＣによる神経マーカーであるＮｅｓｔｉｎ、ＴＵＪ−１（β−ＩＩＩチューブリン）、ＮＦＭ、ＧＦＡＰおよびＭＡＰ２の陽性の発現により検出されるように、増殖コロニーを神経細胞系統へうまく分化させることが可能であり（図６Ｂ〜Ｆ）、シュワン細胞特異的マーカーであるＭＢＰおよびＳ１００の陽性の発現により検出されるように、シュワン細胞系統への分化も可能であった（図６ＧおよびＨ）。ＴＵＪ−１（β−ＩＩＩチューブリン）、ＧＦＡＰおよびＳ１００のみが、分化前のクローンにより発現されたが、これは、分化により観察されるレベルよりもかなり少ない程度であった（図５Ｂ、ＣおよびＥ）。
【０１１４】
ＯＭＬＰ  ＰＣは免疫調節性である
ＯＭＬＰ−ＰＣは、その細胞表面上でＨＬＡＩを発現するがＨＬＡＩＩを発現しない
ＦＡＣＳ分析により、未刺激ＯＭＬＰ−ＰＣクローンが、その細胞表面でＨＬＡＩを発現したがＨＬＡＩＩを発現しなかったことが確認された（図１３ａおよびｂ）。１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮγでの刺激は、２４時間後にＨＬＡＩ発現を上方制御したが、ＨＬＡＩＩの細胞表面発現を第７日まで誘導しなかった（図１３ｃおよびｄ）。これらの結果は、分析した３名の患者のそれぞれからの３クローンについて一貫していた。
【０１１５】
ＯＭＬＰ−ＰＣは、ＩＦＮγでの刺激の２４時間後に細胞内ＨＬＡＩＩを発現する
１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在／不在にて１、２または７日間インキュベートしたＯＭＬＰ−ＰＣクローンからの全タンパク質抽出物のウェスタンブロット分析を行った。ブロットにより、未刺激ＯＭＬＰ−ＰＣにおいて細胞外または細胞内でＨＬＡＩＩの発現が検出されなかったことが確認された（図１４）。ＩＦＮγでの刺激は、２４時間後にＨＬＡＩＩの細胞内発現を誘導したが（図１４）、上記のＦＡＣＳの結果から、本発明者らは、このタンパク質が、第７日まで細胞膜に輸送されないとみなすことができる。これらのデータは、試験した全てのクローンおよび患者の代表である。
【０１１６】
ＯＭＬＰ−ＰＣは、潜在的に免疫抑制性であり、Ｔ細胞増殖に対して直接働くことができる
標準的な混合リンパ球培養（ＭＬＣ）培養物は、その他の複数の提供者からのプールリンパ球とのインキュベーションを用いて観察されるレスポンダー細胞に対して大規模な増殖効果を示した。培養物にＯＭＬＰ−ＰＣを加えると、この増殖効果が、自己対照培養で観察される基底レベルまで阻害されて戻った。
【０１１７】
興味深いことに、この効果は、ＯＭＬＰ−ＰＣをレスポンダー細胞に対して１０％または０．００１％の比率で加えることにかかわらず、用量依存性で９８〜９９％のリンパ球増殖を阻害することが示されると観察された（図１５）。同様のレベルの阻害が、未刺激細胞と比較して、ＩＦＮγで７日間予備刺激したＯＭＬＰ−ＰＣを用いても観察され、このことは、この効果がＨＬＡＩＩ発現に依存しないことを示す（図１５）。
【０１１８】
免疫抑制性の刺激として間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を用いる培養物と直接比較したときに、リンパ球増殖に対する用量依存的な効果が示された（図１６）。１０％の比率のＭＳＣを用いて９５％のリンパ球増殖が達成されたが、細胞数が０．００１％まで低下したときに、６５％の阻害しか観察されなかった。このことは、ＯＭＬＰ−ＰＣが、レスポンダー細胞に対して０．００１％の比率にてリンパ球増殖を阻害することについて、平均で３３倍より効果があることと等しい。さらに、ＯＭＬＰ−ＰＣクローンを用いた場合に観察される正確な再現と比較して、ＭＳＣ培養物を用いて、反復間で大きい変動が観察された。
【０１１９】
Ｔ細胞マイトジェンであるＰＨＡの存在下で行ったＭＬＣ培養は、ＯＭＬＰ−ＰＣが、Ｔ細胞増殖を、ＩＦＮγでの予備刺激にかかわらず、基底レベルまで直接低減させて戻すことができることを示した（図１７）。これらの結果は、ＯＭＬＰ−ＰＣが、Ｔ細胞に対して直接働くことができることを確実にするが、このことが上記の１元ＭＬＣにおけるリンパ球の阻害において観察されるのと同じ機構によるのかは不明確なままである。
【０１２０】
ＯＭＬＰ−ＰＣは、接触非依存的機構を用いて免疫抑制性である
１元ＭＬＣを、レスポンダー細胞との直接接触またはトランスウェル培養におけるＯＭＬＰ−ＰＣを用いて行った。得られたデータは、ＯＭＬＰ−ＰＣの有効な免疫抑制作用を示し、ＰＣと直接接触する細胞を用いるリンパ球増殖を、直接接触していないものを用いたものと比較して、著しい差はなかった（図１８）。基底レベルまで戻るリンパ球増殖の完全な阻害が、処置にかかわらず観察された。この効果も、このアッセイで用いたＯＭＬＰ−ＰＣの濃度に依存せず、ＭＬＣアッセイで用いる前のＩＦＮγとの細胞の予備刺激にも関係しなかった。
【０１２１】
免疫抑制のＯＭＬＰ−ＰＣ機構は、培養法に依存し得る
ＯＭＬＰ−ＰＣとの接触およびトランスウェル共培養におけるＭＬＣの後に回収した末梢血リンパ球（ＰＢＬ）のＦＡＣＳ分析は、Ｔ細胞の亜集団のレベルを決定した。Ｔｒｅｇ細胞として知られるＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ１２７低発現Ｔ細胞は、プールした提供者リンパ球とのインキュベーションの際に数が３倍になったことが示された。これらの数は、ＩＦＮγとの予備刺激または接触にかかわらず、培養物へのＯＭＬＰ−ＰＣの添加により変化しないようであった（図１９）。
【０１２２】
活性化Ｔ細胞のレベルの変化を、Ｃ３８＋およびＣＤ３＋、ＣＤ２５＋（ＩＬ−２受容体）を発現する成熟ＣＤ３＋Ｔ細胞に下位区分して分析した。興味深いことに、細胞間接触に関して免疫抑制のレベルに差は見られなかったが、活性化ＣＤ３＋、ＣＤ３８＋Ｔ細胞のレベルの低下が、トランスウェル培養系（図２０）で観察され、ＣＤ３＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の誘導が、接触系で観察された（図２１）。これらの効果は、ＩＦＮγでの予備刺激に依存しなかった。作成した図面は、３名の患者からの平均パーセンテージであるので、統計は行わなかった。
【０１２３】
考察
ＡＳＣ集団は、多くの組織工学の応用において用いるための多分化能性未分化細胞の魅力ある供給源になっている。これらは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて迅速であるが、移植の際の潜在的な腫瘍原性の恐れを制限する限りのあるレベルまで増殖するそれらの能力により、ＥＳＣおよび誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）を超える明確な利点を有する。さらに、これらの細胞は、多分化能を有し、刺激により容易に分化し、幹細胞の成体供給源の使用に関する倫理的または道徳的な問題が現時点ではない。
【０１２４】
本研究において、本発明者らは、初めて、ＯＭＬＰに存在する新規なＰＣ集団の存在を示した。これらの細胞は、単一細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏにてクローンとして増殖し、正確な特徴付けのための均質な細胞集団を産生することができる。この濃縮プロセスにより、治療への応用のためのＡＳＣ集団の十分な細胞数を産生し、増殖することにおける明確な利点が提供される。本発明者らは、この特徴付け研究のために（未選別の組織全体からの不均質な単離物ではなく）細胞のクローン集団を特に用いた。なぜなら、このことにより、純粋な細胞集団の正確な規定が可能になるからである。このことは、また、これらの細胞が移植の際にどのように応答し、分化するかを、未選別または組織全体の単離物と比較してさらにより正確に示す。幹細胞／クローン選別の利点は、Ｋｏｔｏｂｕｋｉら（２００４）により以前に示され、彼らは、骨組織工学の応用のための選別された骨芽細胞様細胞の造骨能力の増進を示している（２６）。
【０１２５】
クローン増殖したＯＭＬＰ  ＰＣは、ＳＴＲＯ−１、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１６６の陽性の発現により理想的に特徴付けられるが、ＣＤ３４およびＣＤ４５陰性であり、造血性または線維細胞の起源を除外する。これらのデータは、骨髄間葉系幹細胞へのＯＭＬＰ  ＰＣについての同様の発現プロファイルも確実にする（２７）。単層培養での増殖により、これらの細胞が、迅速な増殖の期間を経るが、多数の集団倍加の後に（＞５０ＰＤ）複製老化に入る限定的な寿命を有することが確認された。ＭＳＣとは対照的に（３）、ＯＭＬＰ  ＰＣは、発達中のコロニー、さらには多数の継代の後の両方における活性なテロメラーゼの発現を示し、単離ＯＭＬＰ細胞の幹細胞表現型についてのさらなる支持を提供する。
【０１２６】
Ｎｏｔｃｈリガンドである可溶性Ｊａｇｇｅｄ１の存在下でのＣＦＥの増加、およびフィブロネクチンに接着性の発達中のコロニーにおける神経堤マーカーであるＳｌｕｇ、Ｓｎａｉｌ、ＴｗｉｓｔおよびＳｏｘ１０の発現は、これらの細胞の神経堤の起源を確認する。ｉｎ  ｖｉｖｏでのこれらの細胞の頭蓋顔面での所在は、この細胞集団が頭部神経堤領域から生じることを示唆し、証拠は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、ニューロンおよびシュワン細胞を含む間葉系および外胚葉の両方の起源の細胞系統を産生するこの細胞集団の可塑性により支持される。興味深いことに、ＯＭＬＰ  ＰＣが産生できる分化系統の多分化能およびプロファイルは、頭蓋顔面領域における規定されたＮＣＳＣのものと同等である。
【０１２７】
本発明者らのデータは、ＯＭＬＰ−ＰＣの有効な免疫調節能力を簡潔に示す。
【０１２８】
上記の研究において、本発明者らは、成体および胎児のＭＳＣと同様にＯＭＬＰ−ＰＣが、その細胞表面においてＨＬＡＩを発現するがＨＬＡＩＩを発現しないことを示した（２８、２９）。胎児および成体のＭＳＣにおけるＨＬＡＩおよびＩＩの発現レベル間の違いは、ＩＦＮγで細胞を刺激すると生じる。ここで、成体ＭＳＣは、ＨＬＡＩＩの細胞表面での発現を、ＩＦＮγとのインキュベーションの２４〜４８時間以内に上方制御することが示されるが（２９）、７日間の刺激が、胎児ＭＳＣにおいてＨＬＡＩＩの細胞表面発現を誘導するために必要である。ＯＭＬＰ−ＰＣにおいて、本発明者らは、ＩＦＮγ刺激に対する胎児ＭＳＣ様の応答を示し、細胞表面発現は第７日まで見られなかった。これとは対照的に、ＨＬＡＩＩの細胞内レベルは、ＯＭＬＰ−ＰＣにおける刺激の２４時間以内にウェスタンブロッティングにより検出可能であった。これは、成体および胎児のＭＳＣの両方において報告されているものと同様の応答時間である（２８、２９）。
【０１２９】
ＭＬＣ培養において、ＯＭＬＰ−ＰＣは、レスポンダーリンパ球に対する有効な免疫抑制効果を有し、リンパ球増殖を基底レベルまで阻害して戻すことが示された。細胞は、この応答において９８〜９９％有効であることが示され、この効果は、レスポンダー細胞に対して用いられたＯＭＬＰ−ＰＣの比率に依存せず、ＨＬＡＩＩの発現を誘導するためのＩＦＮγとの７日間の予備刺激にも依存しなかった。これらの結果は、これらの細胞がリンパ球増殖を阻害できる効率を示し、これらの作用機序が従来の提示経路によらないことを示す。これとは対照的に、成体ＭＳＣを用いて行った比較実験は、これらの細胞による用量依存的な免疫抑制性の作用形態と、それらのより低い効率（用いた最低の細胞：細胞比率にて３３倍より低い）とを示した。
【０１３０】
これらの結果は、臨床応用への変換のためのクローン細胞集団で作業することの明確な利点も示す。クローンおよび患者の間での反復はＯＭＬＰ−ＰＣと非常に相同であったが、細胞の不均質な集団を含むＭＳＣ培養では大きな変動が見られた（このことは、図１５と１６のデータを比較することにより観察される）。
【０１３１】
Ｔ細胞マイトジェンであるＰＨＡを用いて、本発明者らは、Ｔ細胞に対してＯＭＬＰ−ＰＣが有し得る直接の影響を示し、それらの増殖を阻害し、トランスウェル培養技術を用いて、日常的なＭＬＣ条件においてみられる免疫抑制効果が、接触非依存性であり、ＨＬＡＩＩの細胞表面発現の誘導に依存しないことを示した。接触およびトランスウェル実験において用いたレスポンダー細胞のＦＡＣＳ分析は、接触またはトランスウェル培養において免疫抑制レベルの違いは見られなかったが、２つの処置群の間で活性化Ｔ細胞のレベルの違いが見られたことを示した。接触培養におけるＣＤ３＋ＣＤ３８＋Ｔ細胞の誘導およびトランスウェル研究におけるＣＤ３＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の抑制は、レスポンダー細胞との直接接触におけるＯＭＬＰ−ＰＣと、トランスウェル系におけるものとの差次的な作用形態を示唆する。培養培地に放出され、Ｔ細胞に影響する１または複数の可溶性因子によるより遅い直接の作用。
【０１３２】
ＯＭＬＰ−ＰＣは、用量非依存的に作用でき、それらの細胞表面でのまたは細胞内でのＨＬＡＩＩ発現に依存せずに作用できる。これらの効果は、接触非依存的に生じる。
【０１３３】
成体ＯＭＬＰからの多分化能ＰＣの単離は、その他のＡＳＣ供給源を用いることと比較して、いくつかの重要な利点を提供する。口腔粘膜は、日常的な歯科処置の間に採取される生検を用いて患者にとって最小限の浸潤を必要とする容易に入手可能な生検部位であるので、ＢＭＳＣの単離のための骨髄吸引などの外科手術と比較して、患者にとって大きな利点を提供する。頬粘膜における迅速な治癒応答および最小限の瘢痕形成によっても、ＰＣの単離は、瘢痕形成をもたらす皮膚からよりも興味あるものになる。任意の年齢での自己前駆細胞の単離も、免疫適合性の再保証を提供する。（患者は、幹細胞の使用のために患者自身の骨髄吸引物をほとんど用いることができず、同種提供者に依存している。これらのことは、明らかに、免疫拒絶の高い危険性を伴い、このことが、自己ＰＣの使用を用いて克服される）。さらに、本発明者らのデータは、リンパ球増殖および同種誘導免疫応答の抑制に対するＯＭＬＰ−ＰＣの有効な影響も示し、よって、成体ＯＭＬＰ−ＰＣも、同種移植と、さらに、それらに限定されないがＧＶＨＤまたは自己免疫などの免疫関連障害の治療において用いることが示される。
【０１３４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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