(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型植物と比較して改善された渇水および塩の耐性を有する植物を作製する方法であって、前記方法は、
（１）植物細胞、植物組織、または、植物器官を、転写因子の非保存的な突然変異体をコードするポリヌクレオチドを含有する構築物で形質転換させるステップ、ここで前記転写因子は配列番号２の配列を含み、前記転写因子の非保存的な突然変異体が、配列番号２の配列中のＡｓｎ６９Ａｓｐ（Ｎ６９Ｄ）突然変異およびＡｌａ１６２Ｔｈｒ（Ａ１６２Ｔ）突然変異を含む配列を有するタンパク質である；
（２）前記ポリヌクレオチドによって形質転換させた植物細胞、植物組織または植物器官を選択するステップ、ここで前記植物における転写因子の機能は、野生型植物の植物に比較して低下している；および
（３）ステップ（２）からの前記植物細胞、前記植物組織、または、前記植物器官から植物を再生させるステップ、
を含み、前記植物は、イネ科である
ことを特徴とする、方法。
【請求項２】
野生型植物と比較して改善された渇水および塩の耐性を有する植物を作製する方法であって、前記方法は、
（１）植物細胞、植物組織、または、植物器官を、転写因子をコードする配列に対するＲＮＡｉまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する構築物で形質転換させるステップ、ここで前記転写因子は配列番号２の配列を含むものである；
（２）前記オリヌクレオチドによって形質転換させた植物細胞、植物組織または植物器官を選択するステップ、ここで前記植物における転写因子の発現は、野生型植物の植物に比較して低下している；および
（３）ステップ（２）からの前記植物細胞、前記植物組織、または、前記植物器官から植物を再生させるステップ、
を含み、前記植物は、イネ科である
ことを特徴とする、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の野生型植物と比較して改善された渇水および塩の耐性を有する植物を作製する方法であって、
前記ＲＮＡｉまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号１の配列に対するものである、
方法。
【請求項４】
野生型植物と比較して改善された渇水および塩の耐性を有する植物であって、
前記植物は請求項１に記載の方法によって作製されたものであり、
前記転写因子の非保存的な突然変異体を含んでいる、
植物。
【請求項５】
請求項４に記載の植物であって、
前記植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、サトウキビ、またはソルガムから選択される、
植物。
【請求項６】
野生型植物と比較して改善された渇水および塩の耐性を有する植物であって、
前記植物は請求項２に記載の方法によって作製されたものであり、
前記ＲＮＡｉまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでいる、
植物。
【請求項７】
請求項６に記載の植物であって、
前記植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、サトウキビ、またはソルガムから選択される、
植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物を改善するための植物生物工学および遺伝子工学の分野に関する。より詳細には、本発明は、植物における渇水および塩の耐性を増加させるための、新規イネジンクフィンガータンパク質転写因子の遺伝子およびそのコードされているタンパク質またはポリペプチドの使用、上述の遺伝子またはその発現されるタンパク質を阻害することによる、植物における塩耐性および／または渇水の耐性を改善させる方法、ならびにトランスジェニック植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
食糧に対する世界的な要求の増加および縮小され続ける耕地が、国家的な食糧安全保障に対する恒常的な圧力を与えている。食物生産において、渇水および塩は主要な生物学的でない（非生物的）ストレスであり、毎年、作物の量および質の顕著な低下を引き起こしている。さらに、渇水は多くの場合に塩を伴う。たとえば、土壌の塩類化が渇水地域における土壌の劣化の一般的な現象である。
【０００３】
入手可能なデータにより、中国における渇水が原因の年間のイネの損失は少なくとも２０億ドルの費用がかかっており、また、耕地の塩類化が生産の低下および低い収量の主な原因であることが示されている。渇水および塩は、中国の農業が直面している２つの深刻な問題を表している。
【０００４】
したがって、どのようにして作物における渇水および／または塩の耐性を改善させて収量を増加させ、中国および世界の食糧問題を解決するかが、非常に重要である。非生物的ストレスの研究は、植物研究における最も緊急かつやりがいのある分野のうちの１つである。
【０００５】
現在までに、いくつかの転写因子を含めた一部の渇水および塩の耐性関連の遺伝子がクローニングされており、植物または作物の一部のストレス耐性株が、遺伝子工学技法を用いることによって得られている。ストレス耐性遺伝子工学の目的は、転写因子が主要な役割を果たす遺伝子の転写および発現を変調させることによって、植物のストレス耐性を改善させることである。
【０００６】
現在、ストレス応答性の遺伝子発現に関与している一部の転写因子がクローニングされている。しかし、植物におけるこれらの複雑なストレス応答プロセスに関与している転写因子が非常に多いため、これらの転写因子は氷山の一角を表すのみでしかない。はるかに多くの転写因子が、ストレス耐性を有する作物の育種において、未だ発見、調査、および使用されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、当分野では、ストレス応答性の遺伝子発現に関与している転写因子を調査すること、ストレス耐性作物を育種するための新しい方法を開発すること、およびそのような新しい作物を開発することで、作物の量および質を改善させる、緊急の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の１つの目的は、植物（特に作物）における塩および渇水の耐性に密に関連している新規遺伝子、イネジンクフィンガータンパク質転写因子ＤＳＴを提供すること、ならびにこの転写因子が植物における塩および渇水の耐性の陰性調節因子であることを確認することである。本発明の別の目的は、植物における塩および／または渇水のストレス耐性を増強させるための新規方法を提供することである。本発明の別の目的は、増強された渇水および塩の耐性を有するトランスジェニック植物を作製する方法、ならびにこれらの方法によって作製したトランスジェニック植物を提供することである。本発明の別の目的は、増強された渇水および塩の耐性を有する植物をスクリーニングする方法、ならびにこれらのスクリーニング方法によって得られた植物を提供することである。
【０００９】
第１態様では、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、前述のポリペプチド中に保存的な突然変異を有するポリペプチド、または前述のポリペプチドの相同体を含めた、単離したジンクフィンガータンパク質転写因子を提供する。
【００１０】
好ましい一実施形態では、上記ポリペプチドにはＣｙｓ−２／Ｈｉｓ−２型ジンクフィンガー構造的ドメインが含まれる。
【００１１】
別の好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、ペルオキシドに作用する酵素に関連する遺伝子の調節、過酸化水素の蓄積の制御および／または気孔開口部の調節に関与しており、それによりイネにおける渇水および塩の耐性に影響が与えられる。
【００１２】
本発明の一実施形態では、前記ポリペプチドは、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）１つもしくは複数のアミノ酸残基の置換、欠失、もしくは挿入を有し、かつ、植物における渇水および塩の感受性を増加させることができる、（ａ）に由来するポリペプチド、または
（ｃ）Ｃｙｓ−２／Ｈｉｓ−２型ジンクフィンガー構造的ドメインを有しており、植物における渇水および塩の感受性を増加させることができる、（ａ）もしくは（ｂ）のポリペプチドのポリペプチド相同体
の群から選択される。
【００１３】
好ましい実施形態では、前記植物は、双子葉の植物または単子葉の植物、好ましくは作物である。
【００１４】
別の好ましい実施形態では、前記植物は、イネ科、アオイ科ワタ属、アブラナ科アブラナ属、キク科、ナス科、シソ科、またはセリ科、好ましくはイネ科から選択される。
【００１５】
別の好ましい実施形態では、前記植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、サトウキビ、ソルガム、シロイヌナズナ属、綿またはアブラナ、より好ましくはイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、サトウキビまたはソルガムから選択される。
【００１６】
別の好ましい実施形態では、前記塩とは、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウムをいう。
【００１７】
第２態様では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列が含まれる、単離したポリヌクレオチドを提供する。
【００１８】
好ましい一実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列またはそのポリペプチド相同体をコードしている。
【００１９】
本発明の一実施形態では、前記ポリヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１の配列を含むヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号１中のヌクレオチド１〜４３５を含むヌクレオチド配列、または
（ｃ）（ａ）〜（ｂ）のヌクレオチド配列のうちの一方に相補的なポリヌクレオチド配列
から選択されるものである。
【００２０】
第３態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。
【００２１】
好ましい実施形態では、前記ベクターは、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物ウイルス、または哺乳動物ウイルス、好ましくはｐＣＡＭＢＩＡ１３０１、ｐＥＧＦＰ−１、ｐＢＩ１２１、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００、ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１またはｐＨＢ、より好ましくはｐＣＡＭＢＩＡ１３０１から選択される。
【００２２】
第４態様では、本発明は、本発明のベクターを含有する、または本発明のポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた、遺伝子操作した宿主細胞を提供する。
【００２３】
好ましい実施形態では、前記宿主細胞は、原核細胞、下等真核細胞または高等真核細胞、好ましくは細菌細胞、酵母細胞または植物細胞、より好ましくは大腸菌、ストレプトマイセス属、アグロバクテリウム属、酵母、最も好ましくはアグロバクテリウム属から選択される。前記アグロバクテリウム属には、それだけには限定されないが、ＥＨＡ１０５、ＳＯＵＰ１３０１またはＣ５８、好ましくはＥＨＡ１０５が含まれる。
【００２４】
第５態様では、本発明は、本発明の転写因子と結合することができる、配列番号３の配列が含まれるシス作用性要素を提供する。
【００２５】
好ましい実施形態では、前記シス作用性要素はＴＧＣＴＡＮＮ（Ａ／Ｔ）ＴＴＧの配列を有しており、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴから選択される。
【００２６】
別の好ましい実施形態では、前記シス作用性要素は、本発明の転写因子のジンクフィンガー構造的ドメインと結合する。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、前記シス作用性要素と本発明の転写因子との結合は、植物における渇水および塩に対する感受性を増加させることができる。
【００２８】
第６態様では、本発明は、ジンクフィンガー転写因子タンパク質またはポリヌクレオチドの拮抗剤を提供する。
【００２９】
好ましい実施形態では、拮抗剤は、低分子干渉ＲＮＡ、抗体またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００３０】
第７態様では、本発明は、本発明のジンクフィンガー転写因子を阻害すること、本発明のポリヌクレオチドの発現を阻害すること、またはシス作用性要素と本発明のジンクフィンガータンパク質転写因子との結合を阻害することが含まれる、植物における渇水および塩の耐性を改善させる方法を提供する。
【００３１】
好ましい一実施形態では、前記阻害は、欠失、突然変異、ＲＮＡｉ、アンチセンスまたはドミナントネガティブ調節の方法によって実施する。
【００３２】
別の好ましい実施形態では、前記阻害には、１つまたは複数のアミノ酸またはヌクレオチドの置換、欠失、または挿入を本発明の転写因子または本発明のポリヌクレオチドに導入することが含まれ、それにより、改善された渇水および塩の耐性を有する前記植物がもたらされる。
【００３３】
配列番号２のアミノ酸配列による別の好ましい実施形態では、前記阻害は、アミノ酸６９でアスパラギンをアスパラギン酸に突然変異させること、アミノ酸１６２でアラニンをスレオニンに突然変異させることを含み、それにより、これらの突然変異配列を有する植物が改善された渇水および塩の耐性を有することとなる。
【００３４】
別の好ましい実施形態では、前記方法には、本発明の拮抗剤を植物に施用することが含まれる。
【００３５】
別の好ましい実施形態では、前記阻害には、本発明のジンクフィンガータンパク質転写因子を標的とする低分子干渉ＲＮＡを含有するベクターを用いて植物を形質転換させること、または前記ベクターを含有する宿主細胞を用いて植物を形質転換させることが含まれる。
【００３６】
別の好ましい実施形態では、前記方法には、上述の方法によって得られた、増強された渇水および塩の耐性を有する植物を、非トランスジェニック植物または他のトランスジェニック植物と交雑させることがさらに含まれる。
【００３７】
別の好ましい実施形態では、前記塩とは、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウムをいう。
【００３８】
第８態様では、本発明は、
（ｉ）候補植物における、本発明のジンクフィンガータンパク質転写因子のレベル、本発明のポリヌクレオチドの発現レベル、および／または本発明のシス作用性要素と本発明のジンクフィンガータンパク質転写因子との結合レベルを検出するステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で検出された候補植物におけるレベルを、対照植物におけるレベルと比較し、候補植物におけるレベルが対照植物におけるそれよりも低い場合は、前記候補植物が渇水および塩に耐性の植物であるステップと
が含まれる、渇水および塩の耐性を有する植物をスクリーニングする方法を提供する。
【００３９】
好ましい実施形態では、前記塩とは、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウムをいう。
【００４０】
第９態様では、本発明は、
（ａ）本発明の宿主細胞を発現に適した条件下で培養するステップと、
（ｂ）ジンクフィンガータンパク質転写因子を培養培地から単離するステップと
が含まれることを特徴とする、ジンクフィンガータンパク質転写因子を調製する方法を提供する。
【００４１】
別の態様では、本発明は、植物における渇水および塩の耐性を改善させるための、本発明のジンクフィンガータンパク質転写因子またはヌクレオチド配列の阻害剤または非保存的な突然変異配列の使用を提供する。
【００４２】
好ましい一実施形態では、前記阻害剤は、前記転写因子またはヌクレオチド配列を標的とする、低分子干渉ＲＮＡ、抗体、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００４３】
別の好ましい実施形態では、前記非保存的な突然変異配列は、前記非保存的な突然変異配列を含有する植物において本発明のジンクフィンガータンパク質転写因子またはヌクレオチド配列の翻訳または発現を阻害し、それにより、非保存的な突然変異配列を含有しない野生型植物のそれよりも良好な渇水および塩の耐性をもたらす。
【００４４】
別の好ましい実施形態では、前記非保存的な突然変異配列は、２つの突然変異、すなわち、位置２０５のＡからＧへの突然変異および位置４８４のＧからＡへの突然変異を有する配列番号１のポリヌクレオチド配列、または、２つの突然変異、すなわち、位置６９のアスパラギンからアスパラギン酸への突然変異および位置１６２のアラニンからスレオニンへの突然変異を有する配列番号２のアミノ酸配列である。
【００４５】
本発明の一実施形態では、前記植物における渇水および塩の耐性の改善には、
（ｉ）上述の阻害剤（拮抗剤）を植物に直接施用すること、
（ｉｉ）上述の非保存的な突然変異配列を植物内に導入すること、または
（ｉｉｉ）非保存的な突然変異配列に特異的な分子マーカーを設計し、前記分子マーカーを用いて、非保存的な突然変異配列を有する突然変異植物を別のイネ種と交雑させることで導いた子孫をスクリーニングし、非保存的な突然変異配列を含有する個々の子孫を選択すること
が含まれる。
【００４６】
本発明の好ましい一実施形態では、前記分子マーカーは、配列番号１０および配列番号１１に示す配列を有するプライマー対、ならびに／または配列番号１２および配列番号１３に示す配列を有するプライマー対を含む。
【００４７】
別の態様では、本発明は、（Ａ）本発明のジンクフィンガータンパク質転写因子またはポリヌクレオチド配列の阻害剤または非保存的な突然変異配列を提供するステップと、（Ｂ）植物を、（ｉ）前記阻害剤を植物に直接施用すること、（ｉｉ）非保存的な突然変異配列を植物内に導入すること、（ｉｉｉ）非保存的な突然変異配列に特異的な分子マーカーを設計し、前記分子マーカーを用いて、非保存的な突然変異配列を有する突然変異植物を別のイネ株と交雑させることからの子孫をスクリーニングし、非保存的な突然変異配列を含有する個々の子孫を選択することから選択される、１つまたは複数の処理に供するステップとが含まれる、植物における渇水および塩の耐性を改善させる方法を提供する。
【００４８】
本発明の好ましい一実施形態では、前記分子マーカーは、配列番号１０および配列番号１１に示す配列を有するプライマー対、ならびに／または配列番号１２および配列番号１３に示す配列を有するプライマー対である。
【００４９】
別の態様では、本発明は、
（１）植物細胞、植物組織または植物器官を、本発明のジンクフィンガータンパク質転写因子の非保存的な突然変異配列を含有する構築体または本発明のポリヌクレオチドの非保存的な突然変異配列を含有する構築体で形質移入するステップと；
（２）非保存的な突然変異配列を含有する植物細胞、植物組織、または植物器官を選択するステップと、
（３）植物をステップ（２）で得られた植物細胞、植物組織または植物器官から再生するステップと
が含まれ、得られたトランスジェニック植物が非トランスジェニック植物よりも高い渇水および塩の耐性を有する、トランスジェニック植物を調製する方法を提供する。
【００５０】
別の好ましい実施形態では、前記方法には、得られたトランスジェニック植物を非トランスジェニック植物または別のトランスジェニック植物と交雑させることで、非保存的な突然変異配列を含有するハイブリッド子孫を得ることも含まれ、前記ハイブリッド子孫は非トランスジェニック植物よりも高い渇水および塩の耐性を有しており、好ましくは、前記ハイブリッド子孫は安定した遺伝形質を有する。
【００５１】
別の好ましい実施形態では、前記方法には、非保存的な突然変異配列に特異的な分子マーカーを設計し、トランスジェニック植物の交雑から得られた子孫をスクリーニングして、改善された渇水および塩の耐性を有する植物を得ることも含まれる。
【００５２】
本説明に基づいて、本発明の他の態様が当業者に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、イネＤＳＴ遺伝子配列（図１Ａ）およびそのコードされているアミノ酸配列（図１Ｂ）を示す図である。
【図２】図２は、渇水および塩の条件下における、イネＤＳＴ遺伝子突然変異体ｄｓｔの表現型および野生型イネの表現型の比較を示す図である。それぞれのパネルにおいて、野生型（Ｚｈｏｎｇｈｕａ１１、ＺＨ１１）を左側に示し、ｄｓｔ突然変異体を右側に示す。
【図３】図３は、渇水および塩の条件下における、野生型、ＤＳＴ遺伝子相補作用によって得られたｄｓｔ突然変異体、およびＲＮＡｉによって低下したＤＳＴ機能を有する植物の表現型の比較を示す図である。
【図４】図４は、Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ（商標）ＧＡＬ４酵母二重ハイブリッド系３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いたＤＳＴ転写活性化の分析を示す図である。
【図５】図５は、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）の結果を示す図である。
【図６】図６は、イネ科作物間の相同ＤＳＴジンクフィンガータンパク質ドメインの配列アラインメント分析を示す図である。
【発明の態様】
【００５４】
長期かつ徹底的な調査の後、本発明者らは新規イネジンクフィンガータンパク質転写因子遺伝子ＤＳＴ（渇水および塩の耐性の遺伝子）を発見し、この遺伝子が、植物における渇水および塩の耐性を制御することができる、渇水および塩の耐性の陰性調節因子であること、ならびに、この遺伝子の発現を阻害することで、植物における塩または渇水のストレスに対する耐性を増加させることができることを確認した。したがって、この遺伝子は、渇水および塩に対して耐性である植物の育種において重要な役割を果たす。これらに基づいて、本発明者らは本発明を実施した。
【００５５】
具体的には、イネ突然変異体ライブラリ（ＥＭＳ突然変異誘発）およびマップに基づくクローニング技法を用いて、本発明者らは塩ストレス条件下で大スケールのスクリーニングを行って、イネにおいて渇水および塩の耐性を制御する新規遺伝子ＤＳＴを得た。ゲノムＤＳＴ遺伝子の長さは９０６ｂｐであり、これにはイントロンがまったく含まれない。したがって、完全長ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）は９０６ｂｐである。この遺伝子は、３０１個のアミノ酸である、保存的なジンクフィンガードメインが含まれる約２９ＫＤａのタンパク質をコードしている。このタンパク質は転写因子である。
【００５６】
表現型の同定の結果は、この遺伝子の突然変異体（たとえば、２つのヌクレオチド突然変異を有するＤＳＴ遺伝子の結果、２つのアミノ酸置換がもたらされる）が、渇水および塩の耐性をどちらも示すことを示している。また、この遺伝子の発現をダウンレギュレーションするためにＲＮＡｉを使用することでも、増強された渇水および塩の耐性が生じた。
【００５７】
生化学的研究の結果は、ＤＳＴが、転写活性化ドメインだけでなく、ＤＮＡ結合ドメインも含む転写因子であることを示している。遺伝子チップ分析は、ＤＳＴが一連の下流遺伝子を調節する転写因子として機能することを示している。
【００５８】
機能的研究は、野生型と比較して、突然変異体は、より多くの過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が気孔の周りに蓄積されており、より小さな気孔開口部を有しており、渇水ストレス下で葉が比較的より高い含水量を維持することを可能にすることを示している。したがって、突然変異体はより高い渇水耐性を有する。さらに、突然変異体において気孔開口部がより小さいため、気孔コンダクタンスがより低く、水分蒸発速度がより遅い。その結果、根から地上部（葉など）へのＮａ＋イオンの輸送が低下し、したがってＮａ＋毒性がより低く、それにより塩耐性が増強される。この研究は、ＤＳＴが、ペルオキシダーゼ関連遺伝子の調節に関与しており、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の蓄積を制御し、気孔開口部を調節し、それによりイネにおける渇水および塩の耐性に影響が与えられることを示している。
【００５９】
上記研究は、ＤＳＴ遺伝子が渇水耐性および塩耐性の陰性調節因子であり、その発現を阻害することで、植物における塩または渇水のストレスに対する耐性を増強させることができることを示している。この特性を使用して、塩ストレスおよび渇水に対して顕著により高い耐性を有するトランスジェニック植物を生じることができる。したがって、ＤＳＴ遺伝子は、作物が塩ストレスおよび渇水などの有害なストレスに耐性する能力を改善させることにおいて、大きな潜在性を有する。
【００６０】
さらに、データベース検索により、ソルガム（モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ））ゲノムにおける１個のＤＳＴ相同遺伝子（タンパク質類似度は５４．３％）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）ゲノムにおける３個のＤＳＴ相同遺伝子（タンパク質類似度は５１．７％、３６．１％、および３３．５％）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）ゲノムにおける１個のＤＳＴ相同遺伝子（タンパク質類似度は３８．４％）、ならびにサトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）ゲノムにおける３個のＤＳＴ相同遺伝子（タンパク質類似度は３８．２％、３８．２％および３４．５％）が明らかとなる。これらの相同遺伝子はすべて、Ｎ末端で高い類似度を有する保存的なＣ２Ｈ２型ジンクフィンガー構造的ドメインを有しており、他の植物（好ましくはイネ科）中のＤＳＴ相同遺伝子がイネＤＳＴ遺伝子のそれと同様の機能を有することを示唆している。
【００６１】
ＤＳＴタンパク質またはポリペプチドおよびそのコード配列
本発明では、用語「ＤＳＴタンパク質またはポリペプチド」、「ＤＳＴ遺伝子にコードされるタンパク質またはポリペプチド」、または「ジンクフィンガータンパク質転写因子」とは、本発明のＤＳＴ遺伝子によってコードされているタンパク質またはポリペプチドをいう。これらの定義には、保存的な突然変異を有する上述のタンパク質またはポリペプチドの突然変異体、またはその相同ポリペプチドが含まれる。これらはすべてＣｙｓ−２／Ｈｉｓ−２型ジンクフィンガー構造的ドメインを有しており、前記タンパク質またはポリペプチドの発現を阻害した場合に、植物における渇水または塩のストレスに対する耐性を増加させることができる。
【００６２】
本発明の一実施形態では、前記転写因子は、ペルオキシダーゼ関連遺伝子の調節に関与する、過酸化水素の蓄積を制御する、および／または気孔開口部を調節し、それによりイネにおける渇水および塩の耐性に影響が与えられる。
【００６３】
前記ＤＳＴタンパク質またはポリペプチド配列は、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列中に１つもしくは複数のアミノ酸残基の置換、欠失もしくは挿入を有しており、植物における渇水および塩の感受性を増加させることができる、（ａ）に由来するポリペプチド、または（ｃ）Ｃｙｓ−２／Ｈｉｓ−２型ジンクフィンガー構造的ドメインを有しており、植物における渇水および塩の感受性を増加させることができる、（ａ）もしくは（ｂ）のポリペプチドのポリペプチド相同体から選択される。好ましくは、前記タンパク質またはポリペプチドはＴＧＣＴＡＮＮ（Ａ／Ｔ）ＴＴＧと結合することができ、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴを表す。
【００６４】
本発明のタンパク質およびポリペプチドは、精製した天然物もしくは化学合成生成物であるか、または、組換え技術を用いて、原核もしくは真核宿主細胞（たとえば、細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞）から産生させることができる。本発明のＤＳＴタンパク質またはポリペプチドは、好ましくは、イネ科（好ましくはイネ）のＤＳＴ遺伝子またはその相同遺伝子もしくはファミリー遺伝子によってコードされている。
【００６５】
本発明のタンパク質またはポリペプチドの突然変異の種類には、それだけには限定されないが、１個または複数（通常は１〜５０、好ましくは１〜３０、より好ましくは１〜２０、最も好ましくは１〜１０、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、ならびに１個またはいくつか（通常は２０個以下、好ましくは１０個未満、最も好ましくは５個未満）のアミノ酸のＣ末端および／またはＮ末端での付加が含まれる。たとえば、関連するまたは同様の特性を有するアミノ酸を置換する場合、タンパク質またはポリペプチドの機能は通常は変化しないことが当分野で知られている。別の例として、Ｃ末端および／またはＮ末端での１個またはいくつかのアミノ酸の付加は、通常はタンパク質またはポリペプチドの機能を変化させない。たとえば、本発明のＤＳＴタンパク質またはポリペプチドには、開始メチオニン残基が含まれていても、含まれていなくてもよく、それでも植物における重金属または塩のストレスに対する耐性を増加させる活性を有する。当業者は、当分野の一般的知識および／または日常的な実験に基づいて、タンパク質およびポリペプチドの活性に影響を与えない、これらの様々な種類の突然変異を容易に同定することができる。
【００６６】
本発明では、用語「保存的な突然変異ポリペプチド」とは、配列番号２のアミノ酸配列と比較して、２０個まで、好ましくは１０個まで、より好ましくは５個まで、最も好ましくは３個までのアミノ酸が、関連するまたは同様の特性を有するアミノ酸で置換されたポリペプチドをいう。これらの保存的な突然変異ポリペプチドは、アミノ酸置換の以下の表に従って最良に作製することができる。
【００６７】
【表１】
0005758376.tif 000002
【００６８】
前記（ｂ）からのタンパク質およびポリペプチドは、ランダム突然変異誘発を生じさせるために放射線照射もしくは突然変異原に曝露させることによって、または部位特異的突然変異誘発もしくは他の知られている分子生物学技法によって、得ることができる。タンパク質またはポリペプチドをコードしている配列を用いて、トランスジェニック植物を構築して、トランスジェニック植物が変更された特徴を有するかどうかに基づいてタンパク質またはポリペプチドをスクリーニングおよび同定することができる。
【００６９】
前記ポリペプチドの突然変異体には、相同配列、保存的な突然変異体、対立遺伝子突然変異体、天然の突然変異体、誘導突然変異体、高または低ストリンジェシーの条件下でＤＳＴタンパク質のコード配列とハイブリダイズすることができる配列によってコードされているタンパク質、および抗ＤＳＴタンパク質抗血清を用いて得られるポリペプチドまたはタンパク質が含まれる。また、ＤＳＴタンパク質またはその断片を含有する融合タンパク質などの他のポリペプチドも、本発明において使用することができる。また、ほぼ完全長のポリペプチドに加えて、本発明にはＤＳＴタンパク質の可溶性断片も含まれる。一般に、前記可溶性断片は、ＤＳＴタンパク質配列中の少なくとも約１０個の連続したアミノ酸、通常は少なくとも約３０個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも約５０個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約８０個の連続したアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約１００個の連続したアミノ酸を含有する。
【００７０】
組換え体を産生させるために使用する宿主に応じて、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、グリコシル化されていても、またはグリコシル化されていなくてもよい。また、この用語には、ＤＳＴタンパク質の活性断片および活性誘導体も含まれる。
【００７１】
本説明中、用語「ＤＳＴ遺伝子」、「植物ＤＳＴ遺伝子」、または「本発明の転写因子のコード配列」は互換性がある。これらはすべて、本発明のＤＳＴタンパク質またはポリペプチドをコードしている配列をいう。これらはイネＤＳＴ遺伝子配列（配列番号１を参照）に高度に相同的であるか、ストリンジェントな条件下で前記遺伝子配列とハイブリダイズすることができる分子であるか、または前記分子に高度に相同的なファミリー遺伝子分子である。前記遺伝子発現を阻害することにより、植物における渇水または塩のストレスに対する耐性の明確な改善がもたらされる。
【００７２】
本発明の一実施形態では、前記ポリヌクレオチドには、（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号１のヌクレオチド１〜４３５を有するヌクレオチド配列、または（ｃ）（ａ）〜（ｂ）のヌクレオチド配列のうちの一方に相補的なポリヌクレオチドが含まれる。
【００７３】
本説明中、用語「ストリンジェントな条件」とは、（１）０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６０℃などの低イオン強度および高温下でのハイブリダイゼーションおよび洗浄、または（２）５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド、０．１％の仔ウシ血清／０．１％のＦｉｃｏｌｌ、４２℃などの変性剤の存在下におけるハイブリダイゼーション、または（３）２つの配列間の相同性が少なくとも５０％、好ましくは５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、もしくは９０％以上、より好ましくは９５％以上に達する場合にのみ起こるハイブリダイゼーションをいう。たとえば、前記配列は、（ａ）に定義した配列に相補的な配列であることができる。
【００７４】
本発明のＤＳＴ遺伝子ヌクレオチド配列の完全長または断片は、通常、ＰＣＲ増幅、組換えまたは合成方法によって得ることができる。ＰＣＲ増幅では、関連配列は、本発明中に開示されている関連ヌクレオチド配列、具体的にはオープンリーディングフレームに基づいてプライマーを設計し、市販のｃＤＮＡライブラリまたは当業者によって知られている一般的方法を用いて作製したｃＤＮＡライブラリを鋳型として使用することによって得ることができる。長い配列を取り扱う場合、通常は２回以上のＰＣＲ増幅が必要であり、その後、増幅から得られた断片を正しい順序に従ってアセンブルする。
【００７５】
本発明のＤＳＴ遺伝子は、好ましくはイネに由来することを理解されたい。また、イネＤＳＴ遺伝子と高い相同性（たとえば、５０％以上、好ましくは５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、より好ましくは８５％以上、たとえば、８５％、９０％、９５％またはさらには９８％の配列同一性）を共有する他の植物から得られた他の遺伝子も、本発明の範囲内にあるとみなされる。また、ＢＬＡＳＴなどの配列同一性を比較するための方法およびツールも当分野で周知である。
【００７６】
植物ならびに塩および／または渇水のストレスに対するその耐性
本説明中で使用する前記「植物」には、（それだけには限定されないが）イネ科、アオイ科ワタ属植物、アブラナ科アブラナ属、キク科、ナス科、シソ科植物またはセリ科などが含まれる。好ましくは、前記植物はイネ科植物、より好ましくはイネ科作物である。たとえば、前記植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、サトウキビ、ソルガム、シロイヌナズナ属、綿またはアブラナ、より好ましくはイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、サトウキビまたはソルガムから選択され得る。
【００７７】
本説明中で使用する用語「作物」とは、穀物、綿、油などの農業および工業において経済的価値のある植物をいう。経済的価値は、植物の種子、果実、根、茎、葉および他の有用な部分によって反映される場合がある。作物には、それだけには限定されないが、双子葉植物または単子葉植物などが含まれる。好ましい単子葉植物は、イネ科植物、より好ましくはイネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、ソルガムなどである。好ましい双子葉植物には、それだけには限定されないが、アオイ科の綿植物、アブラナ属などのアブラナ科植物、より好ましくは綿およびアブラナが含まれる。
【００７８】
本説明中で使用する用語「塩ストレス」とは、植物が高濃度の塩を含有する土壌または水中で成長した場合、その成長が阻害される、またはさらにはそれらが死滅するという現象をいう。塩ストレスを引き起こす塩には、（それだけには限定されないが）塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウムが含まれる。本発明のＤＳＴ遺伝子またはそのコードされているタンパク質もしくはポリペプチドは、植物における塩ストレスに対する耐性を増加させることができる。増加した耐性は、前記遺伝子、タンパク質、またはポリペプチドで処理していない対照植物との比較によって観察することができる。前記植物の成長および発達は高い塩濃度によって影響を受けないもしくは影響がより少ない、または、前記植物はより高い塩濃度を生き延びることができる。
【００７９】
本説明中で使用する用語「渇水ストレス」とは、植物が乾燥土壌または他の渇水環境中で成長した場合、その成長が阻害される、またはさらにはそれらが死滅するという現象をいう。本発明のＤＳＴ遺伝子またはそのコードされているタンパク質もしくはポリペプチドは、渇水ストレスに対する植物の耐性を増加させることができ、増加した耐性は、前記遺伝子、タンパク質、またはポリペプチドで処理していない対照植物との比較によって観察することができる。前記植物の成長および発達は水不足によって影響を受けないもしくは影響がより少ない、または、前記植物はより厳しい渇水条件を生き延びることができる。
【００８０】
ベクター、宿主、およびトランスジェニック植物
また、本発明は、ＤＳＴ遺伝子を含有するベクター、および遺伝子工学によって作製した前記ベクターを含有する宿主細胞、および遺伝子形質移入によって作製し、高レベルのＤＳＴを発現するトランスジェニック植物にも関する。
【００８１】
慣用の組換えＤＮＡ技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８４、２２４：１４３１）を用いて、本発明のコード配列を使用して組換えＤＳＴタンパク質を発現または産生させることができる。一般に、これらには、
（１）適切な宿主細胞を、本発明のＤＳＴタンパク質をコードしているポリヌクレオチド（もしくは突然変異体）、または前記ポリヌクレオチドを含有する組換え発現ベクターで形質移入または形質転換させるステップと、
（２）宿主細胞を適切な培養培地中で培養するステップと、
（３）タンパク質またはポリペプチドを培養培地または細胞から単離および精製するステップと
が含まれる。
【００８２】
本発明では、用語「ベクター」および「組換え発現ベクター」は互換性があるように使用することができ、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物細胞ウイルスまたは当分野で周知の他のベクターをいう。手短に述べると、宿主細胞内で複製されることができ、かつ安定である限りは、任意のプラスミドおよびベクターを使用することができる。発現ベクターの１つの重要な特長は、これらが通常は複製起点、プロモーター、マーカー遺伝子および翻訳制御要素を含有することである。
【００８３】
当業者に周知の方法を用いて、ＤＳＴコード配列および適切な転写／翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術、およびｉｎ  ｖｉｖｏ組換え技術などが含まれる。前記ＤＮＡ配列を発現ベクター中で適切なプロモーターと有効に連結させて、ｍＲＮＡの合成を指示することができる。また、発現ベクターには、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結部位も含まれる。本発明では、ｐＥＧＦＰ−１、ｐＢＩ１２１、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１、ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１またはｐＨＢを使用することが好ましい。
【００８４】
さらに、発現ベクターには、好ましくは、真核細胞培養物において使用するためのジヒドロ葉酸還元酵素、ネオマイシン耐性および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または大腸菌において使用するためのテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性などの、形質移入した宿主細胞を選択するための表現型を提供する１つまたは複数の選択マーカー遺伝子が含まれる。
【００８５】
上述のＤＮＡ配列および適切なプロモーターまたは制御要素を含有するベクターを用いて適切な宿主細胞を形質転換させ、これらがタンパク質またはポリペプチドを発現することを可能にすることができる。宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞、または酵母細胞などの下等真核細胞、または植物細胞などの高等真核細胞であることができる。代表的な例には、大腸菌、ストレプトマイセス属、アグロバクテリウム属、酵母などの真菌細胞、植物細胞等が含まれる。本発明では、宿主細胞は、好ましくはアグロバクテリウム属である。
【００８６】
本発明のポリヌクレオチドを高等真核細胞中で発現させるために、エンハンサー配列がベクター内に挿入されている場合は転写を増強させることができる。エンハンサーは、ＤＮＡシス作用性因子であり、通常は約１０〜３００ｂｐであり、プロモーターに作用して遺伝子転写を増強させる。当業者は、適切なベクター、プロモーター、エンハンサーおよび宿主細胞をどのように選択するかを知っているであろう。
【００８７】
得られた形質転換体を、慣用の方法を用いて培養し、本発明の遺伝子によってコードされているポリペプチドを発現させることができる。宿主細胞に応じて、培養に使用する培養培地は任意の慣用の培地から選択され得る。培養は、宿主細胞の成長に適した条件下で実施することができる。宿主細胞が適切な細胞密度まで成長した際、適切な方法（温度シフトまたは化学誘導など）を用いて選択したプロモーターを誘導し、その後、培養をさらなる期間の間続ける。
【００８８】
上記方法から得られた組換えポリペプチドは、細胞中で発現、細胞膜上で発現、または細胞から外分泌されることができる。必要な場合は、組換えタンパク質は、その物理的、化学的、および他の特性に基づいて、様々な単離方法を用いて単離および精製することができる。これらの方法は当業者に周知である。これらの方法の例には、それだけには限定されないが、慣用の再生処理、タンパク質沈降剤を用いた処理（塩析方法）、遠心分離、細菌の浸透圧溶解、超音波処理、超遠心、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および様々な他の液体クロマトグラフィー技術ならびにその組合せが含まれる。
【００８９】
植物の形質転換は、葉ディスクのアグロバクテリウム属媒介形質転換などの、アグロバクテリウム属形質転換または遺伝子銃形質転換等を用いて達成し得る。形質転換させた植物細胞、組織または器官は、慣用の方法を用いて植物へと再生することができ、それにより、疾患に対する耐性が改善された植物がもたらされる。
【００９０】
シス作用性要素
本説明中で使用する用語「シス作用性要素」とは、遺伝子の隣接領域に位置し、遺伝子発現に影響を与えることができる配列をいう。その機能は、遺伝子発現の調節に関与することである。シス作用性要素自体はどのようなタンパク質もコードしておらず、これは作用部位を提供するのみである。これは、トランス作用性因子と相互作用することでその機能がもたらされる。
【００９１】
研究により、本発明者らは、本発明のＤＳＴタンパク質がＤＮＡ結合能力を有することを見出した。その核心的な結合要素は、シス作用性要素ＴＧＣＴＡＮＮ（Ａ／Ｔ）ＴＴＧであり、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴを表す。本発明のシス作用性要素は、ＤＳＴ転写因子と結合し、植物における渇水および塩に対する感受性を増加させ、それにより植物における渇水および塩の耐性を低下させる。前記シス作用性要素は、好ましくはＤＳＴのジンクフィンガードメインと相互作用する。
【００９２】
逆に、シス作用性要素と本発明のＤＳＴ転写因子との間の相互作用を阻害した場合、これは、植物における増強された渇水および塩の耐性をもたらすであろう。
【００９３】
植物における渇水および塩の耐性を増強させる方法
本説明中に記載のように、本発明のＤＳＴタンパク質、そのコード配列またはＤＳＴタンパク質とシス作用性要素との結合は、植物における渇水および塩の耐性と密な関係性を有する。ＤＳＴタンパク質、そのコード配列またはＤＳＴタンパク質とシス作用性要素との結合を阻害することは、植物において増強された渇水および塩の耐性をもたらすであろう。
【００９４】
したがって、本発明は、ＤＳＴタンパク質、そのコード配列、またはＤＳＴタンパク質とシス作用性要素との結合を阻害することによって植物における渇水および塩の耐性を増強させる方法も提供する。
【００９５】
本発明の一実施形態では、ＤＳＴタンパク質またはそのコード配列の拮抗剤を用いて、その発現を阻害することができる。前記拮抗剤には、それだけには限定されないが、低分子干渉ＲＮＡ、抗体、ドミナントネガティブ調節因子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。当業者には、ＤＳＴタンパク質またはそのコード配列が分かれば、前記拮抗剤をスクリーニングおよび得るために、慣用の方法および試験をどのように使用するかが分かるであろう。
【００９６】
本発明中で使用する用語「非保存的な突然変異」または「非保存的突然変異」とは、ＤＳＴタンパク質またはそのコード配列中の１つまたは複数のアミノ酸またはヌクレオチドの置換、欠失または挿入（好ましくは非保存的）をいい、それにより、植物における増強された渇水および塩の耐性がもたらされる。
【００９７】
本発明の別の実施形態では、当分野で知られている方法を用いて、本発明のＤＳＴタンパク質またはそのコード配列中に非保存的な突然変異を導入し得る。たとえば、ＤＳＴタンパク質コード配列中のヌクレオチド突然変異を用いて、配列番号２を含有するＤＳＴタンパク質のアミノ酸配列中に非保存的な突然変異を導入し、突然変異配列を含有する植物に増強された渇水および塩の耐性を与え得る。たとえば、アミノ酸６９でのアスパラギンからアスパラギン酸への突然変異、またはアミノ酸１６２でのアラニンからスレオニンへの突然変異である。
【００９８】
本発明の別の実施形態では、ＤＳＴ遺伝子またはタンパク質の発現が阻害されたトランスジェニック植物を調製することができ、これらのトランスジェニック植物を、非トランスジェニック植物または他のトランスジェニック植物と任意選択で交雑させ得る。たとえば、植物を、ＤＳＴタンパク質もしくはそのコードされているタンパク質または前記ベクターを保有する宿主細胞を特異的に標的とする、低分子干渉ＲＮＡを含有するベクター、アンチセンスベクター、ドミナントネガティブ調節ベクターで形質転換させることができる。
【００９９】
渇水および塩に耐性の植物をスクリーニングする方法
本発明のＤＳＴ遺伝子およびそのコードされているタンパク質の独特の特性によれば、本発明には、渇水および塩に耐性の植物をスクリーニングする方法がさらに含まれる。
【０１００】
一実施形態では、本発明のスクリーニング方法には、（ｉ）候補植物における、本発明のＤＳＴジンクフィンガータンパク質転写因子のレベル、それをコードしているポリヌクレオチドの発現レベル、および／または本発明のシス作用性要素とＤＳＴジンクフィンガータンパク質転写因子との結合のレベルを評価するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）で候補植物において検出されたレベルを、対照植物における対応するレベルと比較し、候補植物におけるレベルが対照植物におけるそれよりも低い場合は、候補植物が渇水および塩に耐性の植物であるステップとが含まれる。
【０１０１】
別の実施形態では、当分野で知られている分子マーカー選択技法を用いて、渇水および塩の耐性のＤＳＴ遺伝子を他の変異体内に導入し、渇水および塩に耐性のある新しい変異体をスクリーニングおよび培養し得る。前記方法では、慣用の交雑方法を使用し得る。その利点は、遺伝子移入が必要ないため、遺伝子移入の安全性の懸念が回避されることである。前記方法には、非保存的な突然変異配列に特異的な分子マーカーを設計すること、前記分子マーカーを用いて、非保存的な突然変異配列を有する突然変異体を他のイネ変異体と交雑させることからの子孫をスクリーニングし、それにより、前記非保存的な突然変異配列を保有する個々の植物を選択することが含まれ得る。
【０１０２】
本発明の主な利点
本発明の主な利点には、
（１）ＤＳＴ遺伝子およびそのコードされているタンパク質またはポリペプチドを同定し、植物における渇水および塩の耐性とのその関係性を確認し、それにより、植物における渇水および塩の耐性を研究するための新しい方法を提供すること、
（２）増強された塩または渇水のストレス耐性を有するトランスジェニック植物を提供し、それにより、穀物、綿および油を生産および加工するための優れた原材料および生成物を提供すること、ならびに
（３）慣用の交雑方法を用いて、遺伝子移入を必要とせずに実現することができる、分子マーカーを用いて渇水および塩に耐性の子孫をスクリーニングする方法を提供し、それにより、遺伝子移入の安全性の懸念が回避されること
が含まれる。
【０１０３】
本発明は、応用に大きな潜在性を有する、植物における塩または渇水のストレスに対する耐性を改善させる新しい手法を提供する。
【実施例】
【０１０４】
以下の説明は、具体的な実施例と組み合わせて本発明をさらに例示する。これらの実施例は、本発明を説明するために使用し、本発明の範囲を限定するために使用されるべきではないことを理解されたい。
【０１０５】
以下の実施例では、実験方法中に条件が指定されていない場合は、これらは通常は慣用の条件（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、２００１、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）または製造者の提案に従った条件に基づく。別段に指定しない限りは、百分率および比は重量に基づいて計算する。
【０１０６】
別段に定義しない限りは、本説明中で使用するすべての専門用語および科学用語は、当業者に周知のものと同じ意味を持つ。さらに、本説明中に記載したものと同様または均等の任意の方法および材料を、本発明で使用し得る。本説明中に記載した好ましい方法および材料は、例示のためのみに使用する。
【０１０７】
実施例中で使用する様々な培地（ＹＥＢ液体培養培地、ＡＢ液体培養培地、ＡＡＭ液体培養培地、Ｎ６Ｄ２培養培地、Ｎ６Ｄ２Ｃ培養培地、同時培養培地、選択培養培地Ｎ６Ｄ２Ｓ１、Ｎ６Ｄ２Ｓ２、分化前培養培地、分化培養培地、１／２ＭＳ０Ｈ培養培地、イネ培養培地、ＳＤ培養培地など）は、関連文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９、Ｈｉｅｉ，Ｙ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１９９４、６、２７１〜２８２）中の説明に従って調製する。
【０１０８】
（実施例１）
イネＤＳＴ遺伝子移入実験
１．高い渇水および塩の耐性を有するＤＳＴ突然変異体の作製、その特徴および細胞内局在化
イネ種子を０．６％のＥＭＳ（エチルメタンスルホン酸）で処理して、約９，０００個のイネ突然変異体系を含有するイネ突然変異体ライブラリを構築する。１４０ｍＭの塩化ナトリウムの塩ストレス下で、イネ突然変異体ライブラリの大スケールスクリーニングを実施した。候補突然変異体を１４０ｍＭの塩化ナトリウムの塩ストレスおよび２０％のＰＥＧ４０００の模擬渇水ストレスに繰り返し供することによって、塩および渇水の耐性の表現型を確認した。高度に渇水および塩に耐性の突然変異体（ｄｓｔ）が得られる。
【０１０９】
分子マーカーを用いて、ＤＳＴ遺伝子をイネ染色体３上に予め配置する。ｄｓｔ突然変異体を塩感受性株と交雑させることによって、大スケールのＦ２子孫が構築される。分子マーカーを用いて交雑した子孫を群からスクリーニングし、交雑した子孫の遺伝子型および表現型と組み合わせて、マップに基づくクローニングを行った。これにより、ＤＳＴ遺伝子のクローニングの成功がもたらされた。前記ＤＳＴ遺伝子は、保存的なＣ２Ｈ２型ジンクフィンガードメインを有する未知の機能のジンクフィンガータンパク質（転写因子）をコードしている。他のＤＳＴ相同コピーはイネゲノム中に見つからず、シロイヌナズナ属ゲノム中に相同遺伝子は見つからない。前記ゲノム遺伝子の長さは９０６ｂｐであり、イントロンを含まない。完全長ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の長さは９０６ｂｐであり、３０１個のアミノ酸をコードしている。タンパク質産物の分子量は２９ＫＤａであると推定される（図１）。配列比較分析は、この突然変異体中のＤＳＴ遺伝子は２つのヌクレオチド突然変異を含有しており、これが２つのアミノ酸置換（アミノ酸６９はアスパラギンからアスパラギン酸へと突然変異しており、アミノ酸１６２はアラニンからスレオニンへと突然変異している）をもたらし、その結果、渇水および塩の耐性の表現型がもたらされることを示している。この観察は、ＤＳＴが渇水および塩の耐性の陰性調節因子であることを示している。
【０１１０】
ＤＳＴの細胞内局在化を決定するために、ＤＳＴおよびＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の融合構築体を生成し、一過性発現のために遺伝子銃方法を用いてタマネギ表皮細胞内に移す。蛍光共焦点顕微鏡を用いて、細胞内の蛍光の位置を調査する。この細胞内局在化研究によって、ＤＳＴは核中に特異的に位置することが見出される。
【０１１１】
２．ＤＳＴゲノム断片を含有する導入遺伝子プラスミドの構築：
野生型イネＢＡＣクローンをＡｐａＬＩ制限酵素で消化し、次いでＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端を生じさせ、その後、これをＳａｌＩ制限酵素で消化する。したがって、４．６ｋｂの野生型ゲノム断片（ＤＳＴ、プロモーター領域、およびストップコドンと共に下流領域を有する完全長ＯＲＦを含有する）が回収される。植物発現バイナリーベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３０１（ＣＡＭＢＩＡから購入）をＥｃｏＲＩで消化し、次いでＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端を生じさせ、その後、これをＳａｌＩで消化し、その後、上述の回収した断片とライゲーションさせて、ｐ−ＤＳＴプラスミドの構築を成功させ、これを突然変異体の形質転換および相補性実験の実施に使用する。すべての酵素はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入する。
【０１１２】
３．ＤＳＴ−ＲＮＡｉ発現プラスミドの構築：
５’および３’末端のオリゴヌクレオチドをプライマー（配列番号４および５）として使用して、独特のコード領域（５３５ｂｐ）を有するＤＳＴ断片をＰＣＲによって増幅する。この断片をｐ１３００ＲＮＡｉベクター（カタラーゼイントロンをリンカーとして挿入し、両末端をポリＡおよびポリＴによって隣接させることで、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００を改変することによって得られる）とライゲーションさせて、ＤＳＴ−ＲＮＡｉプラスミドを構築する。
【０１１３】
５’オリゴヌクレオチドプライマー配列は５’−ＡＡＧＣＴＴＴＣＣＴＴＧＣＧＡＡＧＣＣＡＡＡＴＡＧＣ−３’（配列番号４）であり、３’プライマー配列は５’−ＧＧＡＴＣＣＣＧＡＧＧＣＴＣＡＡＧＴＴＧＡＧＧＴＣＧＡ−３’（配列番号５）である。
【０１１４】
４．ＤＳＴトランスジェニックイネ：
上述の２つの組換えプラスミドを、凍結溶融方法を用いてアグロバクテリウム属株ＥＨＡ１０５内に移す。０．５〜１μｇ（約１０μｌ）のプラスミドＤＮＡをそれぞれ２００μｌのＥＨＡ１０５コンピテント細胞に加え、混合し、その後、氷上、液体窒素中および３７℃の水浴中に次々、それぞれ５分間ずつ入れる。反応混合物を新鮮なＹＥＢ液体培養培地で１ｍｌまで希釈し、その後、振盪しながら２８℃で２〜４時間インキュベーションする。２００μｌのアリコートをとり、カナマイシン（Ｋａｎ）抗生物質（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＹＥＢプレート上に薄く塗る。プレートを２８℃で２〜３日間インキュベーションする。得られたコロニーを、Ｋａｎ（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＹＥＢプレート上に３回画線して、単一コロニーを選択する。
【０１１５】
単一のアグロバクテリウム属コロニーをＹＥＢプレートから拾い、５０μｇ／ｍｌのＫａｎ抗生物質を含有する３ｍｌのＹＥＢ液体培養培地に接種し、振盪しながら２８℃で終夜インキュベーションする。２日目に、１％の接種液を、５０μｇ／ｍｌのＫａｎ抗生物質を含有する５０ｍｌのＡＢ液体培地に移し、振盪しながら２００ｒｐｍで、ＯＤ６００が約０．６〜０．８に達するまでインキュベーションを続ける。新鮮なアグロバクテリウム属培養物を５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離する。ペレットを収集し、１／３倍体積のＡＡＭ液体培養培地に再懸濁させる。この懸濁液を用いて、様々なイネレシピエント物質を形質転換させることができる。
【０１１６】
この実験では、慣用のアグロバクテリウム属媒介形質転換方法を使用して、イネＺｈｏｎｇｈｕａ１１（またはその突然変異体）の胚カルスを形質転換させる。Ｚｈｏｎｇｈｕａ１１の未成熟種子（受粉後１２〜１５日間）を７０％のエタノールに１分間浸し、ＮａＣｌＯ溶液（水と１：３で混合、２〜３滴のＴｗｅｅｎ２０を加える）中で９０分間以上滅菌し、種子を滅菌水で４〜５回すすぐ。その後、メスおよびピンセットを用いて種子からの胚を拾い出し、Ｎ６Ｄ２培養培地上にプレートし、２６±１℃、暗所で培養することによってカルス組織の形成を誘導する。４日間後、形質転換の準備が整う。
【０１１７】
得られた胚カルス組織を、新鮮なＡＡＭアグロバクテリウム属液体培地中に、頻繁に振盪しながら浸す。２０分後にイネ物質を除去し、無菌的濾紙を用いて過剰の細菌溶液を除去し、その後、無菌的濾紙で覆ったＮ６Ｄ２Ｃ培養培地上に移し、２６℃で３日間同時培養する。アセトシリンゴンを、アグロバクテリウム属Ｖｉｒ遺伝子活性化剤として１００μｍｏｌ／Ｌの濃度で同時培養培地に加える。
【０１１８】
３日後、カルス組織を同時培養培地から取り出し、胚芽を切り離し、選択のためにＮ６Ｄ２Ｓ１選択培地（２５ｍｇ／ｌのＨｙｇを含有するＮ６Ｄ２培地）に移す。７〜１２日後、耐性カルス組織をＮ６Ｄ２Ｓ２（５０ｍｇ／ｌのＨｙｇを含有するＮ６Ｄ２培地）選択培地に移し、選択を続ける。
【０１１９】
１０〜１２日後、活発に成長中の耐性カルス組織を分化前培養培地に移し、約１週間インキュベーションする。その後、これらを分化培養培地に移して分化させる（１２時間の光／日）。再生した実生が１／２ＭＳ０Ｈ培養培地中で根を伸ばした後、これらをポットの土壌に移し、気候制御したチャンバ中で成長させる。
【０１２０】
再生した植物が移植を生き延びた後、当分野で知られている方法を用いて、β−グルコシダーゼ（ベータ−グルクロニダーゼ、ＧＵＳ、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、６、３９０１〜３９０７、１９８７を参照）を検出することによって、または葉に０．１％の除草剤をスメアすることによって、陽性トランスジェニック植物を同定する。全ＤＮＡを陽性トランスジェニック植物の葉から抽出し、ＰＣＲを用いてこれらのトランスジェニック植物をさらに検証する。
【０１２１】
続く実験では、上記方法によって得られたＴ２世代のトランスジェニック植物を用い、渇水および塩のストレス（１４０ｍＭのＮａＣｌ）処理下で渇水および塩の耐性の表現型を調査して、ＤＳＴ遺伝子の機能を確認する。
【０１２２】
（実施例２）
トランスジェニック植物の栽培ならびに渇水および塩のストレスの試験
実施例１で得られたトランスジェニックイネの種子をとり、４５℃のオーブン中で１週間インキュベーションして、休眠状態を中断させる。その後、これらを水道水に室温で３日間浸し、刺激して３７℃で２日間発芽させる。発芽後、これらを９６ウェルプレート中にスポット播種する。その後、これらを光インキュベーターに移し、３０℃でインキュベーションし、１日１３時間露光させた。１日後、温度を２８℃および２６℃まで徐々に下げ、これらをそれぞれ１日間インキュベーションし、２０℃で夜に培養する。実生がすべて成長した後、水道水をイネ培養培地に置き換え、培養を続ける。
【０１２３】
約１４日間の培養後、実生は２枚の葉および１つのハート（ｈｅａｒｔ）の状態まで成長する。これらを、１４０ｍＭのＮａＣｌを含有するイネ培養培地中での塩処理に１２日間、または渇水（ｄｒａｕｇｈｔ）ストレスを模倣するために２０％（ｍ／ｖ）のＰＥＧ−４０００を含有するイネ培養培地中でのＰＥＧ処理に７日間供する。
【０１２４】
ＰＶＰパイプ（ポリビニルピロリドン製パイプ、高さ１．２ｍ、直径２０ｃｍ、パイプの底部に２つの排水穴）中での渇水処理に関して、水インキュベーター中で２５日間成長させた実生を、土壌を含有するＰＶＰパイプ内に移植し、実生を気候制御したチャンバ中で培養する。温度は２４℃〜３０℃であり、湿度は５０％〜６０％である。移植の３０日後に排水し、底部の排水穴を開いて排水し、渇水処理を１２日間行う。
【０１２５】
図２および図３は実験結果を示す。図２に示すように、イネ突然変異体ｄｓｔは、野生型（Ｚｈｏｎｇｈｕａ１１、ＺＨ１１）よりも顕著に高い渇水および塩の耐性を有する。観察および比較により、野生型と比較して、突然変異体は、より多くの過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が気孔の周りに蓄積されており、より小さな気孔開口部を有しており、渇水ストレス下で葉中に比較的より高い含水量を有することも判明した。したがって、突然変異体はより高い渇水耐性を有する。さらに、突然変異体は、より小さな気孔開口部、より低い気孔コンダクタンス、およびより遅い水分蒸発速度を有することが理由で、根から地上部（葉など）へのＮａ＋イオンの輸送が低下され、Ｎａ＋毒性が軽減されるため、増加した塩耐性を有する。
【０１２６】
図３に示すように、野生型イネ（Ｚｈｏｎｇｈｕａ１１、ＺＨ１１）からのＤＳＴゲノム断片をｄｓｔ突然変異体内に形質移入することで、トランスジェニック補完植物において野生型の渇水および塩の感受性の表現型が回復する一方で、ＤＳＴの発現レベルをＲＮＡｉ（Ｚｈｏｎｇｈｕａ１１の形質転換させる）によって低下させた場合は、Ｚｈｏｎｇｈｕａ１１のける渇水および塩の耐性は顕著に増強される。
【０１２７】
これらの結果は、ＤＳＴ遺伝子のクローニングが成功し、ＤＳＴに関与する遺伝子工学を用いて、イネにおけるストレス耐性を顕著に増加させることができることを示している。
【０１２８】
（実施例３）
ＤＳＴ転写活性化の活性の分析
Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ  ＧＡＬ４酵母二重ハイブリッド系３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＤＳＴ転写活性化を分析する。陽性対照ベクターｐＡＤを構築するために、ＮＬＳおよびＧＡＬ４活性化ドメイン（ＡＤ）配列をＰＣＲによって増幅し、ｐＧＢＫＴ７（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入）のＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ切断部位内に挿入して（プライマーは配列番号６および７である）、ｐＧＢＫＴ７中のＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（ＢＤ）と融合させる。
【０１２９】
その後、ＰＣＲを用いてＤＳＴ完全長ＯＲＦを増幅する（プライマーは配列番号８および９である）。配列決定による確認の後、ＰＣＲ産物をｐＧＢＫＴ７ベクター内にＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ部位で構築し、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインと融合させて、ｐＧＢＫＴ７−ＤＳＴベクターが得られる。その後、様々なベクターを酵母ＡＨ１０９内に形質転換させる。終夜成長させた後、培養物を希釈し、Ｔｒｐを含まないまたは３つのアミノ酸を含まない（−Ｔｒｐ／−Ｈｉｓ／−Ａｄｅ）ＳＤ培養培地上にプレートする。その後、酵母の成長を観察し、ＤＳＴ転写活性化の活性を決定する。
【０１３０】
オリゴヌクレオチドプライマー配列は、
５’−ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＧＧＡＡＴＴＡＡＴＴＣＣＣＧＡＧ−３’（配列番号６）、
５’−ＡＡＡＧＴＣＧＡＣＣＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＴＧＧ−３’（配列番号７）、
５’−ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＴＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＣＣＴ−３’（配列番号８）、
５’−ＡＡＡＧＴＣＧＡＣＣＧＡＧＧＣＴＣＡＡＧＴＴＧＡＧＧＴＣＧＡＧ−３’（配列番号９）
である。
【０１３１】
結果を図４に示す。図に示すように、イネＤＳＴタンパク質は転写活性化の活性を有する一方で、突然変異体ＤＳＴタンパク質およびＮ末端欠失を有するタンパク質は転写活性化の活性を失う。
【０１３２】
結果は、ｐＧＢＫＴ７−ＤＳＴがより強力な転写活性化の活性を有しており、転写活性化ドメインがＮ末端に位置することを示しており、ＤＳＴが転写活性化の活性を有する転写因子であることを示している。
【０１３３】
（実施例４）
ＤＳＴタンパク質の分析および電気泳動移動度シフトアッセイ
１．原核タンパク質発現：
ｐＧＢＫＴ７−ＤＳＴベクターをＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化してＤＳＴ完全長ｃＤＮＡを得て、その後、これをｐＥＴ３２ａ（＋）内に再構築する。組換えＤＳＴを含有する原核発現ベクターｐＥＴ３２ａ（＋）をＢＬ２１内に形質移入し、ＩＰＴＧを用いて原核発現を誘導し、その後、Ｈｉｓタグカラム（ビーズ）を用いてタンパク質を精製する。
【０１３４】
２．抗体の産生：
慣用の方法を用いてウサギを上述の精製したタンパク質で免疫化して、抗ＤＳＴ抗体を産生させる。
【０１３５】
３．プローブを合成し、ビオチンで標識し、ＰＡＧＥゲル上で精製し、標識したプローブを電気溶出によって回収する。
【０１３６】
４．標識したプローブを精製した原核発現させたＤＳＴタンパク質と反応させた。その後、複合体をネイティブＰＡＧＥ電気泳動に供し、セミドライ転写法（ｓｅｍｉ−ｄｒｙ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｒａｎｓｇｅｒ  ｍｅｔｈｏｄｓ）を用いてナイロン膜上に移す。その後、オートラジオグラフィーのためにナイロン膜をＸ線フィルムに曝露させて、シフトバンドを観察する。
【０１３７】
図５は実験結果を示す。図５に示すように、ＤＳＴはＤＮＡ結合能力を有する。ＤＳＴ結合の核心的な要素は、シス作用性要素ＴＧＣＴＡＮＮ（Ａ／Ｔ）ＴＴＧ（配列番号３）である。
【０１３８】
本研究は、ＤＳＴと前記シス作用性要素との結合が下流遺伝子の発現を調節し、それにより植物における渇水および塩の耐性に影響が与えられることを示している。したがって、ＤＳＴとシス作用性要素との結合は、渇水および塩の耐性の陰性調節において重要な役割を果たす。
【０１３９】
（実施例５）
様々な植物におけるＤＳＴ遺伝子相同体の存在
データベース検索（ｈｔｔｐ：／／ｐｌａｎｔｔａ．ｊｃｖｉ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）により、ソルガム（モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ））ゲノムにおける１個のＤＳＴ遺伝子相同体（５４．３％のタンパク質類似度）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）ゲノムにおける３個の遺伝子相同体（５１．７％、３６．１％、および３３．５％のタンパク質類似度）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）ゲノムにおける１個のＤＳＴ遺伝子相同体（３８．４％のタンパク質類似度）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）ゲノムにおける３個の遺伝子相同体（３８．２％、３８．２％および３４．５％のタンパク質類似度）が明らかとなる。
【０１４０】
これらの遺伝子相同体はすべて保存的なＣ２Ｈ２型ジンクフィンガードメインを有する。これらは同一のジンクフィンガードメインを共有する。同時に、類似度はＮ末端ドメイン中で高い（図６はこれらの遺伝子相同体の共有配列を示す。共有配列は、ＤＧＫＤＶＲＬＦＰＣＬＦＣＮＫＫＦＬＫＳＱＡＬＧＧＨＱＮＡＨＫＫＥＲＳＩＧＷＮＰＹＦＹＭ、すなわち配列番号２中の位置４２〜８５である）。Ｃ２Ｈ２型ジンクフィンガータンパク質は、ジンクフィンガードメインを介してシス作用性要素と結合する。したがって、これらの遺伝子相同体とシス作用性要素との間に対応する関係性が存在し、他のイネ科作物のＤＳＴ遺伝子相同体がイネＤＳＴ遺伝子のそれと同様の機能を共有し得ることを示している。
【０１４１】
（実施例６）
イネおよび他の作物のＤＳＴ遺伝子分子マーカーの応用−作物における耐性を改善させるための、作物育種における補助的選択技法
化学的突然変異誘発（ＥＭＳ）によって、ＤＳＴ遺伝子中の２つのヌクレオチド突然変異を生じさせ（ヌクレオチド２０５でＡがＧに突然変異しており、ヌクレオチド４８４でＧがＡに突然変異している）、２つのアミノ酸置換を生じさせ（位置６９でアスパラギンがアスパラギン酸に突然変異しており、位置１６２でアラニンがスレオニンに突然変異している）、それにより、渇水耐性および塩耐性の表現型がもたらされる。増幅産物に第１の点突然変異および第２の点突然変異がそれぞれ含まれるように、以下の２つのプライマー対、ＳＮＰ５およびＳＮＰ３を前記遺伝子中で設計する。
ＳＮＰ−５Ｓ：ＡＴＧＧＡＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＣＣＴ（配列番号１０）
ＳＮＰ−５Ａ：ＧＴＧＣＧＣＣＧＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣ（配列番号１１）
ＳＮＰ−３Ｓ：ＧＣＧＧＴＧＣＣＧＡＣＧＴＣＧＴＴＣＣＣ（配列番号１２）
ＳＮＰ−３Ａ：ＧＣＣＧＣＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＴＴＣ（配列番号１３）
【０１４２】
第１の点突然変異はＳｃｒＦＩ制限酵素の切断部位を生じる一方で、第２の点突然変異はＢｓｔＵＩ制限酵素の切断部位を破壊する。プライマーＳＮＰ５を用いて得られた増幅産物をＳｃｒＦＩで消化することで、野生型では３１１ｂｐ、８５ｂｐ、および３１ｂｐの断片が得られる一方で、突然変異体の増幅産物では２０２ｂｐ、１０９ｂｐ、８５ｂｐ、および３１ｂｐの断片が得られ、それにより多型性が生じる。ＳＮＰ３プライマーを用いて得られた増幅産物をＢｓｔＵＩで消化することで、野生型では６６ｂｐ、４０ｂｐ、および２５ｂｐの断片が得られる一方で、突然変異体の増幅産物では９１ｂｐおよび４０ｂｐの断片が得られ、それによりやはり多型性が生じる。したがって、これら２つのプライマー対、ＳＮＰ５およびＳＮＰ３は、分子マーカー補助の選択的育種で使用するための分子マーカーとして使用することができる。
【０１４３】
渇水および塩に耐性のｄｓｔ突然変異体を用いてイネ変異体と交雑させ、子孫を１つの分子マーカーまたは２つの分子マーカーについてスクリーニングして、ＤＳＴ突然変異体遺伝子を保有する個体を選択する。その後、渇水および塩の耐性が増加した新しい変異体（系）を培養する。
【０１４４】
前記方法では、慣用の交雑方法を、遺伝子移入を用いずに使用し、それにより、遺伝子移入に関連する安全性の懸念が回避される。したがって、そのような方法が有利である。
【０１４５】
本発明中で引用したすべての文献は、それぞれの文献を単独で参照した場合と同様に、本出願の参考文献として使用する。さらに、当業者は、上述の本発明の説明を読んだ上で、本発明の様々な態様を変化または変更できることを理解されたい。これらの均等物は、本出願中の添付の特許請求の範囲の範囲内にある。
【図１Ａ】
0005758376.tif 000003
【図１Ｂ】
0005758376.tif 000004
【図６】
0005758376.tif 000005
【図２】
0005758376.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
0005758376.tif 000009
【配列表】
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