(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含む、二本鎖核酸標的分子の等温増幅法：
（ａ）上流プライマー、下流プライマー、鎖侵入系、およびオリゴヌクレオチドを準備する工程であって、前記上流プライマーおよび前記下流プライマーは、前記増幅法の際の前記鎖侵入系の基質ではなく、前記鎖侵入系と無関係には前記標的分子を増幅せず、前記オリゴヌクレオチドは前記鎖侵入系の基質であり、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分が、前記上流プライマーおよび前記下流プライマーに介在する前記標的配列の一部分に相補的であり、前記鎖侵入系がリコンビナーゼ系を含む工程；
（ｂ）前記標的分子に前記オリゴヌクレオチドを適用し、当該オリゴヌクレオチドを二重鎖に侵入させて、これにより前記標的分子を部分的にまたは完全に一本鎖にする工程；
（ｃ）前記二本鎖核酸標的分子における一本鎖に前記上流プライマーを適用し、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて前記上流プライマーの３’末端を伸長させて、二本鎖核酸標的分子を産生する工程；
（ｄ）前記下流プライマーを前記二本鎖核酸標的分子における一本鎖に適用し、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて前記下流プライマーの３’末端を伸長させて、さらなる二本鎖核酸標的分子を産生する工程であって、下流プライマーは上流プライマーが結合する反対鎖に結合する；
（ｅ）工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返して反応を継続する工程。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくともヌクレオチド３０個からなる一本鎖ＤＮＡ分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
二本鎖核酸標的分子の等温増幅法であって、
（ａ）（ｉ）少なくとも一部分が前記標的分子の配列に相補的である、ヌクレオチド３０個未満の一本鎖ＤＮＡ分子をそれぞれ含む上流プライマーおよび下流プライマー、
（ｉｉ）少なくとも一部分が、前記上流および前記下流プライマーに介在する前記標的分子の配列に相補的である、少なくともヌクレオチド３０個の一本鎖ＤＮＡ分子を含むオリゴヌクレオチド、を準備する工程；
（ｂ）前記オリゴヌクレオチド（ｉｉ）をリコンビナーゼと接触させて、前記オリゴヌクレオチドが前記標的分子の相補領域に侵入することを可能にし、これにより前記標的分子の相補領域および隣接領域を一本鎖にする工程；
（ｃ）前記二本鎖核酸標的分子における一本鎖に前記上流プライマーを適用し、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて前記上流プライマーの３’末端を伸長させて、二本鎖核酸標的分子を産生する工程；
（ｄ）前記下流プライマーを前記二本鎖核酸標的分子における一本鎖に適用し、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて前記下流プライマーの３’末端を伸長させて、さらなる二本鎖核酸標的分子を産生する工程であって、下流プライマーは上流プライマーが結合する反対鎖に結合する；
（ｅ）工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返して反応を継続する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが、伸長性のない３’末端を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記リコンビナーゼ系が、Ｔ４ ｇｐ３２、ＵｖｓＸ、およびＵｖｓＹを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記鎖侵入系の基質が、前記標的テンプレート二重鎖の分離または前記標的核酸上へのプライマー伸長の産物の分離を促進する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
１つ以上のさらなるオリゴヌクレオチドが、前記介在するオリゴヌクレオチドによる前記標的二重鎖の分離を促進する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記さらなるオリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドにより放出される鎖に結合し、近位の二重鎖核酸へ分岐点移動する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドが、前記標的配列に相補的であり、ポリメラーゼ基質ではない下流要素をその３’末端に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
鎖置換ポリメラーゼを使用する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記上流プライマーが、前記オリゴヌクレオチドと重複する配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記下流プライマーが、前記下流要素の配列に相補的な配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
検出可能なシグナルを測定することにより前記増幅をモニタリングすることをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
二本鎖核酸標的分子の等温増幅法であって、
（ａ）（ｉ）少なくとも一部分が前記標的分子の配列に相補的である、ヌクレオチド３０個未満の一本鎖ＤＮＡ分子をそれぞれ含む上流プライマーおよび下流プライマー、
（ｉｉ）少なくとも一部分が、前記上流プライマーおよび前記下流プライマーに介在する前記標的分子の配列に相補的である、少なくともヌクレオチド３０個の一本鎖ＤＮＡ分子を含み、さらに、前記標的分子の配列に相補的でありポリメラーゼ基質ではない下流要素を３’末端に含むオリゴヌクレオチド、を準備する工程；
（ｂ）前記オリゴヌクレオチド（ｉｉ）をリコンビナーゼと接触させて、当該オリゴヌクレオチドが前記標的分子の相補領域に侵入することを可能にし、これにより前記標的分子の相補領域および隣接領域を一本鎖にする工程；
（ｃ）前記二本鎖核酸標的分子における一本鎖に前記上流プライマーを適用し、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて前記上流プライマーの３’末端を伸長させて、二本鎖核酸標的分子を産生する工程；
（ｄ）前記下流プライマーを二本鎖核酸標的分子における一本鎖に適用し、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて前記下流プライマーの３’末端を伸長させて、さらなる二本鎖核酸標的分子を産生する工程であって、下流プライマーは上流プライマーが結合する反対鎖に結合する；
（ｅ）工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返して反応を継続する工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
上流プライマー、下流プライマー、鎖侵入系、およびオリゴヌクレオチドを含む、核酸標的分子の等温増幅キットであって、
前記上流プライマーおよび下流プライマーは前記増幅法の際の前記鎖侵入系の基質ではなく、前記鎖侵入系と無関係には前記標的分子を増幅せず、
前記オリゴヌクレオチドは前記鎖侵入系の基質であり、
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分が、前記上流プライマーおよび前記下流プライマーに介在する前記標的配列の一部分に相補的であり、前記鎖侵入系がリコンビナーゼ系を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は、核酸の増幅、特に、二本鎖核酸標的分子を増幅するための等温法に関する。
【０００２】
背景技術
核酸技術および遺伝物質技術において、遺伝子、遺伝子の一部、またはヌクレオチド配列が、生体、この生体の細胞抽出物、または生体試料中に存在するかどうかを判断することがしばしば必要である。遺伝子または遺伝子の一部のいずれもヌクレオチド塩基の特異的配列によって特性決定されるので、ポリヌクレオチドの混合物を含む試料中の当該特異的配列のすべてまたは一部の存在を直接検索することのみ必要である。
【０００３】
この特異的なポリヌクレオチド配列の検索に対して（特に病原性生物の検出、対立遺伝子の存在の判定、宿主ゲノムにおける損傷の存在の検出、あるいは細胞宿主の特定のＲＮＡまたは修飾の存在の検出において）大きな関心がある。ハンチントン病、デュシェーヌ病、フェニルケトン尿症、およびβサラセミアなどの遺伝病は、したがって、個体からの核酸を分析することによって診断することができる。また、核酸プローブを使用する試験により、ウイルス、ウイロイド、細菌、菌類、原生動物、または任意の他の形態の植物もしくは動物を診断あるいは同定することが可能である。
【０００４】
生体または病気の特異的配列が分かると、試料から核酸が抽出され、この配列が存在するかどうかについて判定が行われる。様々な核酸検出法が文献に記載されている。これらの方法は、ＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖（duplexes）、ＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖、およびＲＮＡ−ＲＮＡ二重鎖における相補的核酸鎖のプリン・ピリミジン対合（pairing）の特性に基づいている。この対合法は、二本鎖(double-stranded)ＤＮＡのアデニン・チミン（Ａ−Ｔ）塩基およびグアニン・シトシン（Ｇ−Ｃ）塩基の間に水素結合を確立することにより達成され、アデニン・ウラシル（Ａ−Ｕ）塩基対もまた、ＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖またはＲＮＡ−ＲＮＡ二重鎖における水素結合により形成することができる。所与の核酸分子の存在または欠如を判定するための核酸鎖の対合は、一般に「核酸ハイブリッド形成」または単に「ハイブリダイゼーション」と呼ばれる。
【０００５】
核酸試料中の標的配列の存在を検出するための最も直接的な方法は、標的核酸とハイブリダイズするために標的核酸の一部に対して十分に相補的な配列を有する「プローブ」を得ることである。前もって合成されたプローブは、核酸を含む試料に適用することができる。標的配列が存在すれば、プローブは標的とハイブリダイゼーション産物を形成することになる。標的配列が存在しなければ、ハイブリダイゼーション産物は生じない。プローブハイブリダイゼーションは、当該分野において公知の多くの方法により検出され得る。一般に、検出可能なマーカーにプローブを接合（conjugated）させてもよい。蛍光マーカーまたは酵素マーカーは、均質系において分子標識、Ｔａｑｍａｎ、および他の切断可能なプローブの基盤を形成する。あるいは、プローブは、増幅された物質を捕捉するために使用されてもよく、またはプローブは、単位複製配列にハイブリダイズしたプローブをハイブリダイズしていない物質から分離した後に単位複製配列が検出されるように標識化されてもよい。
【０００６】
しかしながら、この手法における主な問題点は、試料中に存在する標的配列のコピー数が小さい（約１０７コピー未満）場合に、当該手法を直接適用できないということである。これらの状況下では、標的配列に対するプローブの特異的な付着と、標的配列とは異なる配列へのプローブの非特異的な付着とを区別するのは難しい。この問題に対する解決策の１つは、増幅技術を使用することであり、これは、標的核酸断片が試料中に存在する場合、標的核酸断片のコピー数を特異的かつ大幅に増加させるように設計された予備的な技術により検出シグナルを増大させることからなる。
【０００７】
ルイス（Lewis）（１９９２年、「ジネティックエンジニアリングニュース（Genetic Engineering News）」１２：１〜９）による論文、ならびにエイブラムソン（Abramson）およびマイヤーズ（Myers）（１９９３年、「カレントオピニオン・イン・バイオテクノロジー（Curr. Opin. Biotechnol．）」４：４１〜４７）は、増幅技術の好適で一般的な概説である。これらの技術は、増幅法の際に複数のサイクルを必要とするもの、あるいは単一の温度で行われるものに主に基づいている。
【０００８】
サイクリング技術の例としては、熱サイクルを必要とする方法が挙げられ、この種の技術のうち最も広く使用されるものは、ＤＮＡまたはＲＮＡからの関心領域の増幅を可能にするＰＣＲである（ポリメラーゼ連鎖反応、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号；欧州特許第０２０１１８４号）。当該方法は、通常３つの工程から成る。
【０００９】
（ｉ）熱変性／融解により二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離（変性）させる工程（図１Ｂ）；
（ｉｉ）一本鎖ＤＮＡにプライマーオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程（図１Ｂ）；および
（ｉｉｉ）関心のあるＤＮＡの領域をコピーするためにプライマーから相補鎖を合成する（伸長させる）工程（図１Ｃ）。
【００１０】
この方法の完了後、系を加熱すると相補鎖が分離し、この方法が繰り返される。典型的には、ゲノムＤＮＡがさらに分析できる程度まで、ゲノムＤＮＡを増幅するように２０〜４０サイクル実施される。
【００１１】
大多数の指数関数的核酸増幅法は、図１Ａ〜Ｃに示すように、研究中の標的核酸テンプレートの３’末端先端と５’末端先端の相補体とに結合する、上流プライマーおよび下流プライマーの過剰分に依拠する。
【００１２】
等温技術として知られる２つ目の種類の増幅技術は、単一の温度で、または増幅法の重要な局面が単一の温度で行われるものである。ＰＣＲ法とは対照的に（ＰＣＲ法では、さらなるプライマーがテンプレートに結合することができＰＣＲ法が繰り返されるように反応産物を加熱して２つの鎖を分離する）、等温技術は、二重鎖の２つの鎖を分離／置換しテンプレートを再コピーするために、鎖置換ポリメラーゼに依拠する。この周知の特性は、多数の科学論文の主題となっている（例えば、Ｙ．マサムテ（Masamute）およびＣ．Ｃ．リチャードソン（Richardson）、１９７１年、「ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）」２４６、２６９２〜２７０１；Ｒ．Ｌ．レチナー（Lechner）ら、１９８３年、「ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）」２５８、１１１７４〜１１１８４；またはＲ．Ｃ．ルンドクヴィスト（Lundquist）およびＢ．Ｍ．オリベラ（Olivera）、１９８２年、「セル（Cell）」３１、５３〜６０を参照のこと）。等温技術が他のものとは異なる重要な特徴は、反復プロセスを開始するために適用される方法である。
【００１３】
大まかには、等温技術は、反復テンプレート複製を開始するためにプライマーの置換に依拠する方法（例としては、ＨＤＡ（ヘリカーゼ依存的増幅）、エキソヌクレアーゼ依存的増幅（ＥＰ１８６６４３４）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、およびループ仲介増幅（ＬＡＭＰ）が挙げられる）ならびに単一のプライマー分子の継続的な再利用または新規合成に依拠するもの（例としては、ＳＤＡ（鎖置換増幅および核酸を利用した増幅（ＮＡＳＢＡおよびＴＭＡ））が挙げられる）に細分することができる。
【００１４】
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）は、リコンビナーゼが仲介するオリゴヌクレオチドのＤＮＡ標的に対する標的化が、ポリメラーゼによるＤＮＡ合成と連動した方法である（モリカル（Morrical）ＳＷら、「ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）」１９９１年７月２５日、２６６（２１）：１４０３１〜８；ならびにアームズ（Armes）およびステンプル（Stemple）、米国出願番号第１０／３７１，６４１号）。ＷＯ２００８／０３５２０５は、二本鎖標的核酸分子の増幅のＲＰＡ法を記載しており、同方法は次の工程を含む。（ａ）ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹ、およびｇｐ３２タンパク質を、当該二本鎖標的核酸分子に特異的な第１および第２の一本鎖核酸プライマーと接触させ、第１および第２の核タンパク質プライマーを形成させる工程；（ｂ）第１の核酸プライマーおよび第２の核酸プライマーの３’末端が、同一の二本鎖標的核酸分子上で標的核酸分子を完全に変性させないで互いに向かって配向するように、第１の核タンパク質プライマーを当該二本鎖標的核酸分子と接触させて、当該二本鎖標的核酸分子の第１の部分において第１のＤループ構造を作成し、かつ第２の核タンパク質プライマーを当該二本鎖標的核酸分子と接触させて、当該二本鎖標的核酸分子の第２の部分において第２のＤループ構造を作成する工程；
（ｃ）鎖置換合成が可能な１つ以上のポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて当該第１および第２の核タンパク質プライマーの３’末端を伸長させて、第１および第２の二本鎖標的核酸分子ならびに核酸の第１および第２の置換鎖を生成する工程；ならびに、
（ｄ）所望の程度の増幅が達成されるまで（ｂ）および（ｃ）を繰り返して反応を継続する工程。
【００１５】
標的の増幅を、アーチファクトを産生する無駄な増幅と識別するために、研究中の単位複製配列の配列であって系に供給されるプライマー中に存在しない配列を検出する、プローブに基づいた系を使用してもよい。
【００１６】
これらの方法はいずれも、２つのプライマーの最も末端に対する結合部位を含むテンプレートにのみ依拠する。図１Ｄ〜Ｅに示すように、これら特質を有するテンプレートは、上流プライマーおよび下流プライマー間のみの非特異的な相互作用により産生することができ、産物（プライマー二量体）は研究中のテンプレートとは無関係に効率的な増幅ができる可能性がある。この無駄な増幅の結果として、アッセイ成分は、非生産的な事象により消費されるようになり、アッセイ法の感受性が制限される。
【００１７】
本発明の目的は、代替の等温核酸増幅技術を提供することである。本発明のさらなる目的は、指数関数的増幅技術を提供することである。さらなる目的は、増幅アーチファクトを最小限にすること、または解消することであり、したがって、特異性および／または感受性が増加した、核酸の増幅方法を提供することである。
【発明の概要】
【００１８】
本発明は、上流プライマー、下流プライマー、鎖侵入系、およびオリゴヌクレオチドに依拠する、核酸標的分子の等温増幅法を提供し、上流プライマーおよび下流プライマーは増幅法の際の鎖侵入系の基質ではなく、鎖侵入系と無関係には標的分子を増幅せず、オリゴヌクレオチドは鎖侵入系の基質である。
【００１９】
一実施形態では、本発明は、下記の工程を含む等温法を提供する：
（ａ）上流プライマー、下流プライマー、鎖侵入系、およびオリゴヌクレオチドを準備する工程であって、上流プライマーおよび下流プライマーは増幅プロセスの際の鎖侵入系の基質ではなく、鎖侵入系と無関係には標的分子を増幅せず、オリゴヌクレオチドは鎖侵入系の基質である工程；
（ｂ）標的分子にオリゴヌクレオチドを適用し、オリゴヌクレオチドを二重鎖に侵入させて、これにより標的分子を部分的にまたは完全に一本鎖にする工程；
（ｃ）標的分子の一本鎖領域に上流プライマーを適用し、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて上流プライマーの３’末端を伸長させて、二本鎖核酸標的分子を産生する工程；
（ｄ）下流プライマーを一本鎖標的分子に適用し、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて下流プライマーの３’末端を伸長させて、さらなる二本鎖核酸標的分子を産生する工程；
（ｅ）工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返して反応を継続する工程。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、下記の工程を含む等温法を提供する：
（ａ）（ｉ）少なくとも一部分が標的分子の配列に相補的である、ヌクレオチド３０個未満の一本鎖ＤＮＡ分子をそれぞれ含む上流プライマーおよび下流プライマー；（ｉｉ）少なくとも一部分が、上流プライマーおよび下流プライマーに介在する標的分子の配列に相補的である、少なくともヌクレオチド３０個の一本鎖ＤＮＡ分子を含み、場合によって、標的分子の配列に相補的でありポリメラーゼ基質ではない下流要素を３’末端に含むオリゴヌクレオチド、を準備する工程；
（ｂ）オリゴヌクレオチド（ｉｉ）をリコンビナーゼと接触させて、オリゴヌクレオチドが標的分子の相補領域に侵入することを可能にし、これにより標的分子の相補領域および隣接領域を一本鎖にする工程；
（ｃ）標的分子の一本鎖領域に上流プライマーを適用し、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて上流プライマーの３’末端を伸長させて、二本鎖核酸標的分子を産生する工程；
（ｄ）下流プライマーを一本鎖標的分子に適用し、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて下流プライマーの３’末端を伸長させて、さらなる二本鎖核酸標的分子を産生する工程；（ｅ）工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返して反応を継続する工程。
【００２１】
有利には、これらの方法は、標的核酸分子の等温かつ指数関数的な増幅をもたらす。上記増幅方法は、公知の方法よりも特異的で感受性があり、アーチファクトが最小限であるかまたは無い。
【００２２】
好ましくは、鎖侵入系は、Ｔ４ ＵｖｓＸ／ｇｐ３２／ＵｖｓＹ系などのリコンビナーゼ系を含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、上流プライマーおよび下流プライマーに介在する標的配列の一部分に相補的である。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、伸長性のない３’末端を有していてもよい少なくとも３０個のヌクレオチドからなる一本鎖ＤＮＡ分子を含む。
【００２３】
好ましくは、鎖侵入系の基質は、標的テンプレート二重鎖の分離または標的核酸上へのプライマー伸長の産物の分離を促進する。１つ以上のさらなるオリゴヌクレオチドが、介在するオリゴヌクレオチドによる標的二重鎖の分離を促進させてもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、標的配列に相補的であり、効率的なポリメラーゼ基質ではない下流要素をその３’末端に含む。これは、オリゴヌクレオチドにより放出される標的鎖へ結合しかつ近位の二重鎖核酸へ分岐点移動し得、さらに二重鎖が分離される。
【００２４】
他の実施形態では、本発明は、核酸標的分子の等温増幅キットを提供し、このキットは上流プライマー、下流プライマー、鎖侵入系、およびオリゴヌクレオチドを含み、上流プライマーおよび下流プライマーは増幅プロセスの際の鎖侵入系の基質ではなく、鎖侵入系と無関係には標的分子を増幅せず、オリゴヌクレオチドは鎖侵入系の基質である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、プライマーに依存する増幅反応におけるプライマー二量体の形成を示す。１Ａ：上流プライマーおよび下流プライマーは二重鎖テンプレートで培養される。テンプレートはその最末端においてプライマーに対して同族（cognate）である。テンプレートの一方の鎖は、上流プライマーと同族であり、他方の鎖は下流プライマーと同族である。１Ｂ：テンプレート鎖は分離されて、上流プライマーと下流プライマーが結合する。１Ｃ：テンプレートが結合したプライマーが伸長すると、２つの同一の二重鎖が産生する。テンプレートが指数関数的に増幅するようにそれぞれの二重鎖は反応におけるそれ以前の工程に関与する場合がある。１Ｄ〜Ｅ：テンプレートの非存在下では上流プライマーおよび下流プライマーは、互いに対してコピーする。これらは、研究中のテンプレートと置換する可能性があり、また指数関数的に増幅し得、アーチファクトの原因となる。
【図２】図２は、プローブを利用した任意の検出系と共に、本発明の基本的な増幅系を示す。
【図３】図３は、非特異的増幅産物から保護するために下流要素が使用される増幅方法を示す。
【図４】図４は、非特異的産物が形成できないように逆相補的オリゴヌクレオチドを利用する増幅方法を示す。
【図５】図５は、三成分系におけるプライマーアーチファクトをもたらし得る一連の事象を示す。
【図６】図６Ａは、テンプレート／プライマー構成を示す。図６Ｂは、２つのプライマーを用いた系（2-primer system）における増幅を示す（Ｓｙｂｒグリーン蛍光により測定した）。
【図７】図７Ａは、テンプレート／プライマー／オリゴヌクレオチド構成を示す。図７Ｂは、三成分系における増幅を示す（Ｓｙｂｒグリーン蛍光により測定した）。
【図８】図８は、三成分系におけるプライマー長の影響を示す。
【図９】図９Ａは、下流２−Ｏ−メチル化オリゴヌクレオチドおよびプローブを含むテンプレート／プライマー／オリゴヌクレオチド構成を示す。図９Ｂは、メチル化下流要素を有する中間オリゴヌクレオチドの使用の影響を示す。
【図１０】図１０は、三成分系が生物学的に誘導されたＤＮＡから増幅できることを示す。
【図１１】図１１Ａは、７５ｎＭの下流メチル化中間オリゴヌクレオチドを使用した三成分系による増幅の結果を示す。図１１Ｂは、下流メチル化中間物（downstream methylate intermediate）を使用した三成分系の感受性が、単一分子のレベルであり得ることを示す。
【図１２】図１２は、三成分系におけるクラウディング剤の使用を示す。
【図１３】図１３は、プローブにより識別される三成分系における増幅を示す。
【発明の具体的説明】
【００２６】
本発明は、標的核酸の等温かつ指数関数的な増幅を可能にする方法を記載している。核酸配列は、ＤＮＡ、逆転写ＲＮＡ（ｃＤＮＡ）、またはゲノムＤＮＡを含んでもよい。核酸はまた、ポリメラーゼの作用によりコピーされ得る修飾された、すなわち非天然のヌクレオシドを含んでもよい。
【００２７】
他の核酸増幅法とは対照的に、核酸の最末端に結合する上流プライマーおよび下流プライマー（端末プライマー）は、単独では、標的核酸の指数関数的な増幅を誘発できない。増幅の指数関数的な側面は、上流プライマーおよび下流プライマーに介在するテンプレート配列の一部と同族である１つ以上のオリゴヌクレオチド（中間の、すなわち介在するオリゴヌクレオチド（ＩＯ））によって可能となる。上流プライマーおよび下流プライマーと同族であるテンプレートは、単独では生存可能な増幅単位ではないので、系は、図１に示すプライマー二量体アーチファクトおよび他のミスプライミングしたアーチファクトによる感受性の喪失に影響されないように設計してもよい。
【００２８】
プライマーは、ＩＯ配列の非存在下では増幅できず、好ましくはこのＩＯは伸長性がない。その結果、ＩＯはそれ自身ではアーチファクト的な増幅をもたらすことができないので、アーチファクトの増幅は無くなるか著しく減少される。さらに本発明のいくつかの態様では、ＩＯは、ポリメラーゼの基質ではない配列を含み、それゆえ、研究中の標的の非存在下で、増幅可能な配列を複製し得るアーチファクト的な事象が存在しない。
【００２９】
１つの態様では、本発明は、上流プライマー、下流プライマー、鎖侵入系、およびオリゴヌクレオチドに依拠する、核酸標的分子の等温増幅法を提供し、上流プライマーおよび下流プライマーは増幅プロセスの際の鎖侵入系の基質ではなく、鎖侵入系と無関係には標的分子を増幅せず、オリゴヌクレオチドは鎖侵入系の基質である。
【００３０】
さらなる実施形態では、本発明は、下記の工程を含む二本鎖核酸標的分子の等温増幅法を提供する：
（ａ）上流プライマー、下流プライマー、鎖侵入系、およびオリゴヌクレオチドを準備する工程であって、上流プライマーおよび下流プライマーは増幅法の際の鎖侵入系の基質ではなく、鎖侵入系と無関係には標的分子を増幅せず、オリゴヌクレオチドは鎖侵入系の基質である工程；
（ｂ）標的分子にオリゴヌクレオチドを適用し、オリゴヌクレオチドを二重鎖に侵入させて、これにより標的分子を部分的にまたは完全に一本鎖にする工程；
（ｃ）標的分子の一本鎖領域に上流プライマーを適用し、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて上流プライマーの３’末端を伸長させて、二本鎖核酸標的分子を産生する工程；
（ｄ）下流プライマーを一本鎖標的分子に適用し、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて下流プライマーの３’末端を伸長させて、さらなる二本鎖核酸標的分子を産生する工程；
（ｅ）工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返して反応を継続する工程。
【００３１】
二本鎖核酸標的分子の好ましい等温増幅法は、下記の工程を含む：
（ａ）（ｉ）少なくとも一部分が標的分子の配列に相補的である、ヌクレオチド３０個未満の一本鎖ＤＮＡ分子をそれぞれ含む上流プライマーおよび下流プライマー、（ｉｉ）少なくとも一部分が、上流プライマーおよび下流プライマーに介在する標的分子の配列に相補的である、少なくともヌクレオチド３０個の非伸長性一本鎖ＤＮＡ分子を含むオリゴヌクレオチド、を準備する工程；
（ｂ）オリゴヌクレオチド（ｉｉ）をリコンビナーゼと接触させて、オリゴヌクレオチドが標的分子の相補領域に侵入することを可能にし、これにより標的分子の相補領域および隣接領域を一本鎖にする工程；
（ｃ）標的分子の一本鎖領域に上流プライマーを適用し、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて上流プライマーの３’末端を伸長させて、二本鎖核酸標的分子を産生する工程；
（ｄ）下流プライマーを一本鎖標的分子に適用し、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて下流プライマーの３’末端を伸長させて、さらなる二本鎖核酸標的分子を産生する工程；（ｅ）工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返して反応を継続する工程。
【００３２】
本発明の方法は、下記の成分に依拠する。
【００３３】
上流プライマー（すなわち上流プライマー）
上流プライマーは、介在するオリゴヌクレオチド（ＩＯ）の５’領域においてまたはその近位において標的核酸分子の一方の鎖と結合する。
【００３４】
下流プライマー（すなわち下流プライマー）
下流プライマーは、ＩＯの３’末端においてまたはその近位において標的核酸分子の一方の鎖と結合する。上流プライマーが結合する鎖と反対の鎖へ結合する。
【００３５】
本質的には、プライマーはテンプレートに結合し、ポリメラーゼの作用により伸長する。上流プライマーおよび下流プライマーは、効率的なポリメラーゼ基質でなければならない。いくつかの態様では、リコンビナーゼ系と共に使用された場合、プライマーはコンピテントなリコンビナーゼ基質でないのがよい。これは、プライマーがヌクレオチド３０個未満の長さであるのがよいことを意味する。好ましくは、プライマーはヌクレオチド２５個未満である。最も好ましくは、プライマーはヌクレオチド約１５〜２３個である。プライマーはそれぞれ、標的核酸分子の反対の鎖へ結合することができる。プライマー全体が標的配列に結合する（相補的である）ことは必須ではない。
【００３６】
介在する、すなわち中間のオリゴヌクレオチド（ＩＯ）
介在する、すなわち中間のオリゴヌクレオチド（ＩＯ）は、鎖侵入系（ＳＩＳ）の基質である。鎖侵入系の基質は、標的テンプレート二重鎖の分離または標的核酸上へのプライマー伸長の産物の分離を促進し、これにより、標的分子上の相補的一本鎖ＤＮＡへのプライマーのアクセスが可能になる。
【００３７】
１つの実施形態では、ＩＯは、リコンビナーゼを用いずに二本鎖ＤＮＡ分子に侵入することができるペプチド核酸（ＰＮＡ）を含んでもよい。この実施形態では、ＰＮＡは、オリゴヌクレオチドおよび鎖侵入系の両方の役割を果たす。
【００３８】
好ましい実施形態では、鎖侵入系はリコンビナーゼ系を含む。この実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分が、上流プライマーおよび下流プライマーに介在する標的配列の一部分と相補的であるのがよい。介在するオリゴヌクレオチドは、リコンビナーゼ基質である領域を含むのがよい。リコンビナーゼは、ヌクレオチド約３０個を超える基質オリゴヌクレオチドを優先的に生じさせるので（フォルモサ（Formosa）Ｔ．およびアルバーツ（Alberts）Ｂ、「ＪＢＣ」（２６１）６１０７〜６１１８、１９８６年；ガンパー（Gamper）Ｂら、「バイオケミストリー（Biochemistry）」（４２）２６４３〜２６５５、２００３年）、好ましくは、オリゴヌクレオチドは、少なくともヌクレオチド約３０個の一本鎖ＤＮＡ分子、または合わせてヌクレオチド塩基が３０個を超えるＤＮＡ配列と修飾配列とを含む。さらに、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、テンプレートに効率的に侵入するのに十分な長さの同族区域（cognate area）を有しているのがよく、したがって、ＩＯの少なくとも一部分は、上流プライマーおよび下流プライマーに介在する標的配列に相補的であるのがよい。一般に、これは、塩基が最低２４個、そして最適には塩基が約３８個である。相補配列の５’部分は、好ましくは、二重鎖末端に対して十分に近く、残存する二重鎖の融解温度によって、結合後の残存する二重鎖の解離が生じる。通常、これは、相補配列の５’末端が二重鎖末端からヌクレオチド１５〜２０個以下であるのがよいということを意味する。
【００３９】
同族区域をリコンビナーゼで効率的にシーディングするため、ＩＯはまた、テンプレートに同族でない５’末端を含んでもよい。典型的には、これは、塩基１２個よりも多いことになる。したがって、ＩＯの全長は、好ましくは、同族領域(cognate region)を含めて、少なくとも塩基３６個、より好ましくは少なくとも塩基５０個である。また、テンプレートと同族でない３’末端を含んでもよい。
【００４０】
ＩＯは非伸長性の３’末端を有することが好ましい。これは、いくつかの修飾ヌクレオチドの１つ以上を組み込むことにより達成され得る。典型的には、これら修飾ヌクレオチドは、端末ヌクレオチドの３’修飾を組み込むことになる。これら修飾ヌクレオチドの例としては、ジデオキシヌクレオチドヌクレオチド、３’アミノ−アリル、様々な長さの３’−炭素スペーサー、逆向きに組み込まれたヌクレオチド（３’−３’結合）、３’リン酸、３’ビオチン、３’サリル、３’−チオールがある。あるいは、末端は、基質としての能力が低いためにポリメラーゼによる伸長に適合性がないヌクレオチドを含んでもよく、例えば、ＰＮＡまたはＬＮＡまたは２’−５’結合ＤＮＡまたは２’−Ｏ−メチルＲＮＡなどがある。
【００４１】
リコンビナーゼ系
上記のように、好ましくは鎖侵入系はリコンビナーゼ系を含む。リコンビナーゼは、ヌクレオチド約３０個より長いＤＮＡ分子と結合するのがよい。好ましくは、リコンビナーゼは、一本鎖ＤＮＡに対して高い選択性（preference）を有し、二本鎖ＤＮＡに対しては選択性が比較的低い。本発明の方法では、これにより上流プライマーまたは下流プライマーではなくＩＯにリコンビナーゼが結合することが可能になる。
【００４２】
様々なリコンビナーゼ系が当業者に公知であり、色々と検討されている（例えば、ピエロ Ｒ．ビアンコ（Piero R. Bianco）ら、「フロンティアズ・イン・バイオサイエンス（Frontiers in Bioscience）」３、ｄ５７０〜６０３、１９９８年、５７０、ＤＮＡ鎖交換タンパク質：生化学的および物理的比較（DNA Strand Exchange Proteins: A Biochemical and Physical Comparison））。任意のリコンビナーゼ系が本発明の方法に使用されてもよく、核酸二重鎖の侵入のためのリコンビナーゼの詳細な応用が当業者に公知である（コダデック（Kodadek）Ｔら、「ＪＢＣ」２６４、１９８９年；およびリュウ（Liu）Ｊ、「ＪＢＣ」ナチャン（Na Qian）１、２８１、２６３０８〜２６３１９、２００６年）。
【００４３】
リコンビナーゼ系は、酵母、バクテリオファージ、または哺乳類もしくは他の真核生物に由来の成分を含んでもよい。リコンビナーゼ系は、中温性でも好熱性でもよい。例えば、リコンビナーゼはミオウイルスファージに由来してもよい。ミオウイルスファージは、例えば、Ｔ４、Ｔ２、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈｌ、ＫＶＰ４０、アシネトバクターファージ１３３、アエロモナスファージ６５、シアノファージＰ−ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、シアノファージＳ−ＰＭ２、Ｒｂｌ４、Ｒｂ３２、アエロモナスファージ２５、ビブリオファージｎｔ−１、ｐｈｉ−１、Ｒｂｌ６、Ｒｂ４３、ファージ３１、ファージ４４ＲＲ２．８ｔ、Ｒｂ４９、ファージＲｂ３、またはファージＬＺ２であってもよい。好ましい実施形態では、Ｔ４リコンビナーゼＵｖｓＸが使用されてもよい。真核生物のＲａｄ系または大腸菌のｒｅｃＡ−Ｒｅｃｏ系もしくは他の原核生物の系を使用してもよい。
【００４４】
通常、リコンビナーゼは、５’−３’方向で一本鎖オリゴヌクレオチド上に重合することになる。本明細書に記載の発明は、このようなリコンビナーゼに関する。しかしながら、リコンビナーゼは、３’−５’方向で重合してもよく、このようなリコンビナーゼも本発明の方法で使用されてもよい。この場合そして記載の成分の方向性に関しては、逆方向にて適用される。
【００４５】
一本鎖結合タンパク質（例えば、ｇｐ３２）およびリコンビナーゼ導入剤（例えば、ＵｖｓＹ）などのリコンビナーゼ付属タンパク質が系に含まれてもよい。好ましい実施形態では、リコンビナーゼ系は、Ｔ４ ｇｐ３２、ＵｖｓＸ、およびＵｖｓＹを含む。このような系を使用すると、一本鎖要素（すなわち、プライマーおよびＩＯ）はすべて、一本鎖結合タンパク質（例えば、ｇｐ３２）でコーティングされる。リコンビナーゼ導入剤（例えば、ＵｖｓＹ）は、リコンビナーゼの補因子として働き、ＩＯをコーティングする。リコンビナーゼ（例えば、ＵｖｓＸ）のみが上記方法を誘導するのに十分な長さを有するので、リコンビナーゼはコンピテントにＩＯのみをコーティングする。
【００４６】
リコンビナーゼ（例えば、ＵｖｓＸ）、ならびにリコンビナーゼ導入剤（例えば、ＵｖｓＹ）および一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ｇｐ３２）が使用される場合は、それぞれは、同一かまたは異なるミオウイルスファージ源からの未変性タンパク質、ハイブリッドタンパク質、または変異タンパク質であり得る。未変性タンパク質は、タンパク質の野生型または天然のバリアントであってもよい。変異タンパク質（遺伝子組換えタンパク質とも呼ばれる）は、Ｎ末端、Ｃ末端、または内部（Ｎ末端とＣ末端との間）に挿入、欠失、置換、またはこれらの組み合わせなどの天然または人工の変異を有する未変性タンパク質である。ハイブリッドタンパク質（キメラタンパク質とも呼ばれる）は、少なくとも２種の異なる生体からの配列を含む。例えば、ハイブリッドＵｖｓＸタンパク質は、一方の種（例えば、Ｔ４）からのアミノ酸と、他方の種（例えば、Ｔ６）からのＤＮＡ結合ループを含んでもよい。ハイブリッドタンパク質は、未変性タンパク質に比べ、向上した特性を有し得る。向上した特性とは、増加したもしくはより迅速な増幅速度、または減少したもしくはより制御可能な増幅速度であってもよい。
【００４７】
リコンビナーゼ系の有効性を向上させるために使用される他の要素としては、ＤＮＡ相互作用を制御するために使用する化合物、例えば、プロリン、ＤＭＳＯ、またはクラウディング剤を挙げることができ、これらはＤＮＡへのリコンビナーゼの導入量を向上させることが知られている（ラベリー（Lavery）Ｐら、「ＪＢＣ」１９９２年、２６７１３、９３０７〜９３１４；ＷＯ２００８／０３５２０５）。ＰＶＡ、ゼラチン、またはアルブミンなどのクラウディング剤は、体積占有によって試薬の有効濃度を増加させることにより酵素反応動力学に影響を及ぼすことが知られているが（レディ（Reddy）ＭＫら．「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol）」１９９５年；２６２：４６６〜７６；ハリソン（Harrison）Ｂ、ジマーマン（Zimmerman）ＳＢ．「アナリティカルバイオケミストリー（Anal Biochem．）」１９８６年１１月１日；１５８（２）：３０７〜１５；レディ（Reddy）ＭＫ、ウェイツェル（Weitzel）ＳＥ、フォンヒッペル（von Hippel）ＰＨ．「米国科学アカデミー紀要（Proc Natl Acad Sci USA）」１９９３年４月１５日；９０（８）：３２１１〜５；ストンメル（Stommel）ＪＲら．「バイオテクニクス（Biotechniques）」１９９７年６月；２２（６）：１０６４〜６）、ＤＭＳＯ、ベタイン、プロリン、および界面活性剤は、アッセイ中のオリゴヌクレオチドのＴｍまたは二次構造を変更することにより系を向上し得る。
【００４８】
ポリメラーゼ
本発明の方法で使用されるポリメラーゼは、好ましくは、鎖置換活性を有するものである。この活性は特定のＤＮＡポリメラーゼの周知の特性である（サムブルック（Sambrook）ら、１９８９年、「モレキュラークローニング：ラボラトリーマニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第２版、５．３３〜５．３５ページ、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー）。ＤＮＡポリメラーゼの特性（特に、ＤＮＡポリメラーゼのうちのいくつかの鎖置換活性）は、コーンバーグ（Kornberg）およびベイカー（Baker）、「ＤＮＡリプリケーション（DNA Replication）」、第２版、１１３〜２２５ページ、フリーマン、ニューヨーク州（１９９２年）により詳細に記載されている。ＤＮＡポリメラーゼのうちのいくらか（例えば、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ）は、鎖置換を単独で達成することができないので、鎖置換は、すべてのＤＮＡポリメラーゼに共通の特性ではない。鎖置換は、これらの場合には、ポリメラーゼ付属タンパク質の付加により付与されてもよい。鎖置換活性は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントに関して最初に示され（マサムネ（Masamune）およびリチャードソン（Richardson）、１９７１年、「ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）」、２４６：２６９２〜２７０１）、これは、この酵素上で二本鎖ＤＮＡにおける切断部位の３’ＯＨ末端から核酸の複製を開始する能力を与える。この鎖置換活性はまた、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにおいて示されている（コング（Kong）ら、１９９３年、「ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）」２６８：１９６５〜１９７５）。この場合、この酵素の変異形態は、より高い鎖置換能を有するエキソヌクレアーゼ５’−３’活性を有さないことも示されている。この鎖置換活性は、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（レチナー（Lechner）ら、１９８３年．「ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）」２５８：１１１７４〜１１１８４）およびＨＩＶ逆転写酵素（フーバー（Huber）ら、１９８９年、「ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）」２６４：４６６９〜４６７８）に関しても示されている。
【００４９】
好ましくは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性のないＤＮＡポリメラーゼが、本発明による増幅サイクルを達成するために使用され、これは、鎖置換活性の効果は、そのようなエキソヌクレアーゼ活性のない酵素においてより大きいためである。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性のないポリメラーゼの例であり、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼまたはシークエナーゼ（US Biochemical社）などのポリメラーゼも同様である。Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼまたはＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼもまた使用することができる。しかしながら、増幅法を行うのが阻害されないのであれば、この５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用することもできる。この場合、増幅反応の収率は、使用する反応条件下でのＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の特異的な阻害により向上させることができる。
【００５０】
鎖置換はまた、二重鎖ＤＮＡではなくむしろ一本鎖ＤＮＡを安定化させる酵素系または他の要素を適用することにより増強される場合もある。このような系の例としては、ＤＮＡヘリカーゼの適用、一本鎖結合タンパク質による安定化、ならびに系において使用される特定のポリメラーゼの影響が挙げられる。鎖置換の増強方法が、鎖侵入系と干渉しないことが重要である。
【００５１】
適切なポリメラーゼとしては、大腸菌、バチルス・サブティリス、ステアロサーモフィルス、またはＴ７ポリメラーゼからのものなどの、ｐｏｌＩまたはｐｏｌＩのフラグメントまたはバリアントが挙げられる。同様に、ファージＴ４に関して記載のものなどのポリメラーゼホロ酵素複合体を使用することができる。好ましいポリメラーゼは、クレノー、エキソ−、Ｔ７ポリメラーゼ、またはＢＳＴ ｐｈｉ２９、またはバチルス・サブティリスのｐｏｌ−Ｉ、またはホロ酵素である。いくつかの実施形態では、特に下流要素または逆相補体が使用される場合には、大腸菌ｐｏｌＩのクレノーフラグメントの場合のようにポリメラーゼは強い鎖置換活性を有さないことが好ましい場合がある。他の実施形態では、ポリメラーゼの強い鎖置換活性は有利である場合がある。
【００５２】
ＡＴＰ再生系
リコンビナーゼが鎖侵入工程に利用される場合、系はエネルギー源を必要とする場合がある。これらの酵素の大多数はエネルギー源としてＡＴＰを利用するが、ＡＴＰは酵素活性に必要なマグネシウムイオンを照合（collate）するので、ＡＴＰの濃度を上げるのではなくむしろさらなるＡＴＰ再生系を供給するのが賢明である。ＡＴＰ生成系は、解糖経路または他の生化学的経路において様々な酵素を伴う可能性があり、ＡＴＰ消費と共に、ＳＩＳ酵素と一緒にこれらの酵素は、ＡＭＰおよびＡＤＰの産生と同時にオルトリン酸および／またはピロリン酸の蓄積を引き起こす。無機リン酸の蓄積はまた、マグネシウムをキレート化し得、多くの点で系に害がある可能性がある。オルトリン酸へのピロリン酸の変換は、ピロホスファターゼにより達成されてもよく、より害が少ない有機リン酸へのオルトリン酸の変換も種々報告されている。
【００５３】
好ましくは、有機リン酸への無機リン酸またはオルトリン酸の変換は、ショ糖およびスクロースホスホリラーゼまたは他の糖ホスホリラーゼを利用する。あるいは、ニコチン酸アミドリボシドおよびプリンホスホリラーゼを使用してもよい。
【００５４】
いくつかのＡＴＰ再生系は、基質としてＡＤＰのみを利用するので、ミオキナーゼを使用して、いくつかのリコンビナーゼによって産生されたＡＭＰをＡＤＰに変換することは有利である場合がある。これによって、ＡＴＰ源の尚早な枯渇も回避される。実施例に記載の標準的な操作条件下では、Ｔ４リコンビナーゼはＡＭＰを産生せず、この工程は省略することができる。
【００５５】
ＡＴＰ再生系はそれ自体、一般に、ホスホクレアチンとクレアチンキナーゼとを、またはホスホ−フェニル−ピルベートとピルビン酸キナーゼとを使用する。ＵＶＳＸリコンビナーゼは、１分間に３００個のＡＴＰ分子を燃焼し得、また３μＭのＵＶＳＸが使用され得るので、４０〜１００ｍＭのホスホクレアチンを有する系を使用することが有利である。
【００５６】
実際には、反応液中において１つ以上の上記のエネルギー源、例えば、ＡＴＰ、ホスホクレアチン、クレアチンキナーゼ、ミオキナーゼ、ピロホスファターゼ、ショ糖、スクロースホスホリラーゼの１つ以上を含むことが有利である場合がある。
【００５７】
系の最適化に関する一般的な検討
実際には、本発明の方法を行う場合、標準的な操作手順において示される系の様々な成分の標準的な滴定が、最適な増幅を確保するために必要とされる場合がある。成分の滴定としては、タンパク性金属イオン滴定および塩滴定が挙げられる。塩の場合、最適な増幅を達成するため、カチオンおよびアニオンの性質や最適な濃度を評価してもよい。
【００５８】
したがって、例えば次のような様々な成分が含まれてもよい。マグネシウムイオン；ホスホクレアチンおよびその対イオン、ｐＨ調節剤、ＤＴＴまたは他の還元剤、様々な分子量分布のＢＳＡ／ＰＥＧまたは他のクラウディング剤、ＡＴＰおよびその対イオン、ｄＮＴＰ、ショ糖、クレアチンキナーゼ、ミオキナーゼ、ピロホスファターゼ、スクロースホスホリラーゼ、ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹ、ｇｐ３２（ＮＥＢ、１０ｍｇ／ｍｌ）、クレノー、エキソ−、または他のポリメラーゼ。
【００５９】
増幅プロトコルにおいて利用される緩衝系は、系に供給されるすべての要素と適合性があるのがよい。明白ではあるが、すべての成分に対する最適な条件が、単一の緩衝系内で達成されるものではない。系が効率的に作用するように、実験条件のバランスを取るために利用できる多くの機会がある。
【００６０】
様々なプライマーおよびオリゴヌクレオチドの長さおよび融解温度の変化ならびに選択される単位複製配列の長さが、二重鎖の分離およびプライマー伸長のバランスを変化させ得るので、プライマーおよびオリゴヌクレオチドの設計もまた、系のバランスに影響する。
【００６１】
融解温度（Ｔｍ）は、同一の二重鎖の集団の半数が分離される温度である。二重鎖の長さおよび配列はＴｍに関連し、より長い二重鎖はより高いＴｍを有する傾向がある。同様に、様々な塩や他の成分がテンプレートとプライマーとの親和性を変化させる可能性があるので、増幅の際に利用される緩衝液はＴｍを変化させる可能性がある（チャダラバダ（Chadalavada）Ｓ．Ｖ．、「ＦＥＢＳレターズ（FEBS Letters）」４１０（１９９７年）、２０１〜２０５）。本発明の文脈においては、Ｔｍは、ＩＯにより侵入されていない二重鎖の区域に関連する。本明細書の詳細は、約４０℃で作用するように開発された系に関連するが、例えば、約２１〜５０℃、好ましくは約２５〜４５℃、最も好ましくは約３７〜４０℃までの異なる温度で機能する系を開発することが可能である。したがって、標的およびプライマーの長さおよび配列は、適宜調整されてもよい。研究中のテンプレートが負の超らせん化されている場合、負の超らせん化されたＤＮＡはあたかも一本鎖ＤＮＡであるかのように扱うことができるので、これらの傾向は初期のテンプレートには当てはまらない。１回目の増幅では、増幅法を開始するために、標的を加熱する、さもなくば化学的／酵素的に変性または切断する必要がある場合がある。従来報告されているように、１回目の増幅を開始するために、バンパープライマーと呼ばれるさらなるプライマーを使用してもよい（ヌオボ（Nuovo）Ｇ．Ｊ；「ダイアグノスティックモレキュラーパソロジー（Diagn Mol Pathol.）」２０００年（４）：１９５〜２０２）。さらに、１回目の増幅において、系が上流プライマーまたは下流プライマーをゆっくりと伸長させる場合、追加の特徴は必要ではないが、初期の増幅事象に対する抵抗性が原因となった遅滞期が存在することになる。
【００６２】
増幅方法
明細書の以下の部分は、本発明の一実施形態を記載し、ここで方法はリコンビナーゼにより誘導される鎖侵入系（ＳＩＳ）に基づく。リコンビナーゼは一本鎖オリゴヌクレオチド基質と反応し、当該オリゴヌクレオチド基質が二重鎖核酸内の相補鎖に侵入することを可能にし、二重鎖の他方の放出鎖（outgoing strand）（ＯＳ）と置換する。
【００６３】
本発明の重要な原理（principal）は、二重鎖核酸標的に侵入するオリゴヌクレオチド（ＩＯ）が提供されるということである。この事象の結果として、標的二重鎖の鎖が分離され、侵入するオリゴヌクレオチドと同族のテンプレート領域中だけでなく侵入部位の外側であるが近位な区域中においても解離し、これは端末プライマーが成分鎖へ結合し伸長することを可能にし、２つの二重鎖コピーをもたらす。本方法は、結果として起こる標的の指数関数的な増幅によって再帰的に繰り返される。
【００６４】
本発明の一実施形態では、二重鎖標的核酸は、リコンビナーゼの作用により、伸長性のない一本鎖オリゴヌクレオチド（ＩＯ）によって、その中央の領域において侵入される。オリゴヌクレオチドによる侵入は、二重鎖がばらばらになって一本鎖になる程度に二重鎖の安定性をかく乱する。これは、上流プライマーおよび下流プライマー（リコンビナーゼ基質ではない）の結合部位を露出させ、これらは、分離した鎖上に伸長し、二重鎖の２つのコピーを生成する（図２）。
【００６５】
図２は、本発明の基本的な増幅系を、任意のプローブに基づいた検出系と共に示す。この系は、非特異的な増幅からある程度まで保護されているが、図５に示すように、長時間の培養後に非特異的な産物が形成し得る（下に記載）。図２〜４は、Ｔ４ ｇｐ３２、ＵｖｓＸ、およびＵｖｓＹリコンビナーゼ系に関して記載しているが、任意のリコンビナーゼ系または他の鎖侵入系が使用されてもよい。
【００６６】
２Ａ：この系の要素は、Ｉ〜ＩＶとして示されている。二重鎖テンプレートは、点線で示されている。Ｉは、記載のように、ＳＩＳの基質ではないかまたは最小限の基質である上流プライマーを表す（すなわち、リコンビナーゼに結合しない）。ＩＩは、系の中心的な成分であるＩＯを示し、これはポリメラーゼの作用により伸長性があるか、または伸長性がない。この核酸要素は、リコンビナーゼに結合し標的二重鎖に侵入するという点でＳＩＳの基質である。この要素にはポリメラーゼが作用する必要はない。この要素はまた、場合によって、侵入される配列と同族ではない伸長した３’または５’尾部（tail）を含んでもよい。残存する二重鎖の融解温度が系の周囲温度未満であり、結合後に、残存する上流二重鎖の解離をもたらすように、侵入するオリゴヌクレオチドの同族区域の５’領域は、二重鎖の末端に十分に近接している。ＩＩＩは、Ｔ７エキソヌクレアーゼに感受性のあるプローブまたは分子指標などの任意のプローブ系であってもよい部位を示す。ＩＶは、ＳＩＳの基質ではないかまたは最小限の基質である下流プライマーを表す。
【００６７】
系の一本鎖要素はいずれも、一本鎖結合タンパク質ＧＰ３２でコーティングされる。ＵＶＳＸの補因子であるＵＶＳＹもまた、ＩＯをコーティングする。ＧＰ３２でコーティングされた要素は、分枝点移動能が減少している。ＵＶＳＸは、この要素のみが本方法を誘導するのに十分な長さを有するので、コンピテントにＩＯのみをコーティングする。
【００６８】
２Ｂ：リコンビナーゼでＩＯ（ＩＩ）をコーティング後、ＩＯは二重鎖に侵入することができる。二重鎖は分離し、侵入領域においてそして隣接する領域においても、長さが通常ヌクレオチド約１５〜２０個の一本鎖となる。これは、二重鎖核酸の上流末端端部を放出する。
【００６９】
２Ｃ：上流プライマー（Ｉ）は放出された鎖へ結合することができる。プライマー濃度、温度、および変性体などの他の系成分は、プライマーが、その融解温度に近接しているにもかかわらず、効率的に結合するように最適化される。
【００７０】
２Ｄ：上流プライマー（Ｉ）は伸長し、これは産物を安定化し、ＩＯ（ＩＩ）と置換する。これにより、本来の二重鎖が再生成される。任意のプローブ（ＩＩＩ）と一緒になって、下流プライマー（ＩＶ）は、置換された下流領域へ結合することができる。上流プライマー濃度または下流プライマー濃度が非対称であるように系は最適化され得、このメカニズムにより、過剰の下流プライマーが、一本鎖が過剰の下流産物が反応終了時に誘導されることと、プローブの結合部位が利用可能になることが確実になる。
【００７１】
２Ｅ：下流プライマーが伸長して、二重鎖の数が倍になる。
【００７２】
通常、２つの相補的なオリゴヌクレオチドは、同族領域の長さおよび配列に応じた親和性で、互いに結合する。二本の鎖は、特定の温度より上でのみばらばらになる傾向があり、これは融解温度（Ｔｍ）と呼ばれる。同族領域の長さはＴｍに比例する。Ｔｍはまた、マグネシウム濃度および１価の塩濃度により影響を受け、一本鎖結合タンパク質の存在下でも低下する。オリゴヌクレオチド上のリコンビナーゼの一時的な存在は、そのＴｍを上昇させることになる。したがって、関連する融解温度パラメーターは、一般に実験的に決定される。
【００７３】
二重鎖は、リコンビナーゼでコーティングされたオリゴヌクレオチドにより侵入されてもよく、これは、侵入された二重鎖の一方の鎖にオリゴヌクレオチドが同族であることに依存する。二重鎖のもう一方の鎖は、放出鎖（ＯＳ）として選択され、二重鎖の同族鎖から本質的に分離され、一本鎖になる。結果として、侵入された領域の外側の残存する二重鎖が、Ｔｍが周囲温度未満であるような長さおよび配列を有する場合、完全な二重鎖は解離することになり、端末プライマーに結合することができる２つの一本鎖末端を産生する。
【００７４】
大部分のリコンビナーゼは、オリゴヌクレオチド上にその５’領域から３’領域に向かって重合し、一旦コーティングされたオリゴヌクレオチドが二重鎖に侵入すると、ＳＩＳは、二重鎖３’上に、侵入するオリゴヌクレオチド（下流）まで重合を継続する。侵入された系のコーティングされた要素は、コーティングされていない領域よりも堅くまとまっている。リコンビナーゼでコーティングされたテンプレートに結合したプライマーは、リコンビナーゼが解重合し除去されるまで伸長できないことも、特筆すべきである。
【００７５】
上記の所見の結果として、ＩＯの上流にあるテンプレート二重鎖末端が侵入領域に近い場合、テンプレート二重鎖末端はリコンビナーゼでコーティングされていないので、末端は分離することになり、プライマーが結合および伸長する可能性があり、系により再利用することができるようにＩＯが置換される。同じ状況下では、下流末端は、リコンビナーゼが解重合する／ばらばらになるまで（これはまた５’から３’の方向である）まとまっていることになる。下流末端のＴｍが周囲温度より高い場合、その鎖は、リコンビナーゼの解重合の後でも結合したままとなるが、上流プライマーが伸長し、本来の二重鎖の鎖と置換するにつれて鎖が分離することになる。これにより、下流プライマーが結果として結合し、伸長することができる（図２）。
【００７６】
上流末端が、侵入された領域に近くはないが、下流末端の近位が、融解が可能になるのほどに十分近い場合は、リコンビナーゼの解重合後に下流末端が分離することが予想される。意外ではあるが、この分離は起こらない。これは、リコンビナーゼが解重合するにつれて二重鎖の閉じた上流末端が分岐点移動して、侵入するオリゴヌクレオチドを置換し、放出鎖をそのパートナー上に再配置し、本来の二重鎖を再形成して、下流プライマーに結合する機会を与えないからである。この場合、放出鎖はらせん構造の複合体に巻き付いたままであり、置換された場合でもその同族鎖と高度に結びついたまま（associated）であるので、分枝点移動は迅速である。
【００７７】
これらの事象の結果は、ＳＩＳによって二重鎖が分離可能となるように系が実現可能であるためには、鎖侵入事象の際に標的二重鎖の上流末端が分離されなければならないということである。これは、侵入部位に近位の二重鎖の上流領域が周囲温度に近いかまたは周囲温度より低い融解温度を有していることを確実にすることによって達成される。これは、標準的な方法を使用することによって当業者に容易に決定されるが、一本鎖結合タンパク質、金属イオン濃度、および塩濃度などの系成分によって影響を受けることになる。
【００７８】
したがって、ＩＯは、好ましくは、標的分子に相補的であり、同族領域の両側に塩基約１０〜２０個、好ましくは塩基約１５〜１７個のみが残るように設計されるのがよい。したがって、例えば、４０℃で適用される場合、同族領域の両側に二重鎖の塩基１０〜１７個を残すように非伸長性のＩＯが系に供給される。ＩＯによる侵入の際に、二重鎖の上流末端（侵入するオリゴヌクレオチドに対して）は融解するが、３’末端は、リコンビナーゼの侵入に依存する下流二重鎖上への重合によってまとまっている。上流プライマーは、二重鎖の融解した上流末端に結合して伸長され、これによりＩＯと置換する。二重鎖の下流末端は、上流プライマーの継続した伸張により分離され得るか、または十分に短い可能性があり、リコンビナーゼが解重合すると、下流末端も融解する。
【００７９】
上記の場合は、５’−３’方向に（上流から下流へ）重合するリコンビナーゼの結果を示している。本明細書の記載は、この種のリコンビナーゼを用いた増幅を記載している。反対方向に重合するリコンビナーゼが利用される場合、系の構成は逆になる。大部分のリコンビナーゼは、リコンビナーゼのシーディングを促進するために、ＩＯの上流末端における塩基１２〜１５個の領域を好み、この特徴は、ＩＯが上流の非同族領域を含むように組み込まれてもよい。
【００８０】
上記方法では、増幅アーチファクトは最小限になるが、プライマーがＩＯ上に非特異的にコピーし得、この伸張の産物が置換され得ると考えられ、図５に示すようにさらなるプライマー上へコピーする。
【００８１】
図５は、プライマーアーチファクトが、下流要素を含まない三成分系で起こり得るメカニズムを示す。
５Ａ：アーチファクト的な増幅を誘導する系成分は、上流プライマー（Ｉ）、中間オリゴヌクレオチド（ＩＩ）、および下流プライマー（ＩＩＩ）を含む。
５Ｂ：下流プライマーは、時として中間オリゴ上にコピーし得る。
５Ｃ：任意のさらなるオリゴヌクレオチドプライマーが、下流プライマーが占める位置の上流にある中間物上にコピーし得る。
５Ｄ：上記さらなるオリゴヌクレオチドプライマーの伸長は、下流プライマー伸張の産物の置換をもたらすことになる。
５Ｅ：最後に、上流プライマーが、置換された産物上へコピーする場合、増幅可能な単位が製造され得る。
【００８２】
これらの事象は、図１に記載の２つのプライマーを用いた系に関連するプライマー二量体アーチファクトの産生に伴う事象よりも複雑であり、結果として、試験テンプレートの存在を決定する系の感受性が、２つのプライマーのみに依存する系と比べて向上する。
【００８３】
このような事象はまれであるが、得られるオリゴヌクレオチド配列は、増幅可能な単位となる可能性がある。しかしながら、この不測の事態は、下記に記載する本発明の実施形態によって回避される。非特異的な増幅の可能性を完全に排除するため、次の現象を利用してもよい。
【００８４】
二重鎖の一方の末端のみがＩＯによる侵入よって分離される場合、同族のプライマーは解離した末端へ結合することができるが、部分的に繋がった（tethered）放出鎖はごく近位に残る。放出鎖はまた、プライマーの領域と同一の領域を含むので、入ってくるプライマーと、テンプレートへの結合をめぐって競合することができる。さらに、繋がった末端はまた、リコンビナーゼの解重合後に分岐し得、分離した末端に結合したプライマーが伸長する機会を有する前に、本来の二重鎖を回復する。これらの状況下では、また上流末端のみが融解する場合、上流プライマーの伸長は損なわれ得、二重鎖の鎖がもはや繋がっておらず脱落するほどに下流末端の分離に依存するようになり得る。本方法により、放出鎖による競合は無くなる。したがって、二重鎖の上流部分の分離にかかわらず、下流末端も分離された場合に上流プライマーがコンピテントであるのみであるように系を設計することができる。両末端の分離に対する系の依存性は、系に特異性を付与し、この依存性は、放出鎖を回復するように上流プライマーのコンピテンシーを変更させることにより、または低濃度のポリメラーゼもしくは鎖置換活性（クレノー、エキソ−活性）が低いポリメラーゼを使用することにより（これはまたプライマー伸長と二重鎖回復とのバランスに影響することになるので）達成することができる。どのような状況下であっても、二重鎖の２つの鎖が分離されている場合には増幅がはるかに速いことが分かっている。したがって、特定の標的の増幅が鎖分離を誘導する場合、この特性を付与しないアーチファクト的な増幅よりも速度が勝る。
【００８５】
上流プライマーのコンピテンスは、いくつかのメカニズムにより変更することができる。例えば、下記のものがある：
（ｉ）上流プライマーは、侵入するＩＯと重複するように設計してもよい。重複する領域は、好ましくは、ヌクレオチド約５〜１０個である。重複するプライマーの伸長は、ＩＯを置換するテンプレート上へのプライマーの予備的分枝点移動に依拠することになる。ある状況下では、また一本鎖結合タンパク質が存在する場合は特に、分枝点移動は遅く、プライマー伸長を休止させるので、プライマーの結合および伸長と本来の二重鎖への回復との競合では、回復が優先されるようになり得る。この実施形態の他の利点としては、ＩＯに近位の末端は、長さが塩基１８〜２３個より長い場合は分離しないということである。それゆえ、融解温度は、反応の周囲温度（これは約４０℃である）よりも高い。このコンストラクト（construct）において記載のプライマーは、この数字を超えるＴｍを有するが、周囲温度より低いＴｍを有する末端を生成する。このようなプライマーが使用される場合、これは融解した二重鎖の同族末端へ結合することができ、その３’領域が同族であり、ポリメラーゼの作用によって後に伸長する場合、侵入された二重鎖の部分上に分岐鎖移動することになる。プライマーが、非特異性／テンプレート非依存性産物の一部分になる場合、ＩＯ領域と完璧に位置合わせされなければ、生存可能な増幅単位にならない場合がある。
【００８６】
（ｉｉ）上流プライマーは一時的にブロックされてもよく、伸長前の酵素切断に依拠してもよい。例としては、ＲＮＡｓｅＨと共に３’末端に近位のＲＮＡ塩基を含む３’ブロックプライマーが挙げられる。代替となるエンドヌクレアーゼを使用する類似の系を、プライマーの進展を遅らせる任意のメカニズムと同様に、使用してもよい。
【００８７】
上に記載の実施形態では、増幅は、下流末端および上流末端の融解に依存することになる。下流末端の融解に依拠するように設計された系は、増幅に対して絶対的な特異性を付与することができる。下流プライマーのＴｍが周囲温度より高い場合、下流末端は融解せず、さらに、非特異性のアーチファクト的な産物が増幅しない。このようなプライマーを使用することは有利であるが、反応の周囲温度を超えるＴｍを有するプライマーが、分離することになる末端をどのように誘導することができるかということに関する問題が残る。これは、下流末端を融解させるために他のさらなる配列依存要素を利用することにより達成される。
【００８８】
例えば、下流の繋がった（tethered）末端は、介在するオリゴヌクレオチドにより標的二本鎖の分離を促進しかつその機能がＩＯ侵入工程に依存する１つ以上のさらなるオリゴヌクレオチドの結合により分離されてもよい。この手法の意義は、このようなオリゴヌクレオチドは二重鎖を結合および分離させるように設計されているが、ポリメラーゼでもリコンビナーゼ基質でもないということである。このようなオリゴヌクレオチドは、図５に示すように重要なポリメラーゼ基質ではないので、プライマーアーチファクトの産生に関与することができない。好ましくは、上記さらなるオリゴヌクレオチドがＩＯにより放出された鎖へ結合し、近位の二重鎖核酸へ分岐点移動する。重要なことには、その機能が分枝点移動を要求し、分枝点移動が一本鎖結合タンパク質により阻害されることが分かっている場合には、さらなるオリゴヌクレオチドは、一本鎖結合タンパク質に著しく結合しないように設計され得る。この手法は、例えば、下記に示すものである：
（ｉ）図３に示し、下に記載のように、ＩＯは、標的末端領域と同族であるその３’末端の伸長である配列（下流要素、ＤＥ）を含んでもよい。
【００８９】
この実施形態では、ＤＥは、ポリメラーゼ基質でもなく、場合によってはリコンビナーゼ基質でもＳＳＢ基質でもない要素を含む。典型的には、これは２’修飾ヌクレオチドの使用により付与され得る。２’位の典型的な修飾としては、ヒドロキシル化、メチル化、およびアルキル化が挙げられる。あるいは、これは、テンプレートおよび／またはプライマーとしてコンピテントではない特質をもたらす塩基、糖、またはリン酸成分の修飾により誘導されてもよい。適切な要素としては、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびハイブリダイゼーションを可能にする他の核酸修飾物などの、ＲＮＡおよびＲＮＡアナログが挙げられる。これらのオリゴヌクレオチドは、異なる骨格糖を有しているので異なるが、ワトソン・クリックペアリングにしたがってＲＮＡまたはＤＮＡと結合する、しかしポリメラーゼはそれらを認識することができないので増幅することはできない。要素がその標的配列にハイブリダイズできることが重要である。
【００９０】
ＤＥは、ＩＯの伸長であってもよく、侵入する部分の下流に分岐点移動することができ、残存する二重鎖をかく乱しかつ周囲温度より低いＴｍを有する二重鎖のインタクトな区域を残して、プライマーが結合し伸長できるように二重鎖が分離される。下流プライマーおよびＤＥの間に同族の重複がある。ＤＥと下流プライマーとが互いに対してコピーすることができないことが重要であり、それゆえＤＥはプライマーでもポリメラーゼのテンプレート基質でもないのがよい、すなわち、ＤＥは、プライマーにこの領域上で、ＩＯとの結合部分を超えそしてＩＯ上に、結合および伸長させないのがよい。ＤＥの３’末端は、これを促進するために、場合によって、例えば、伸長可能ではない単位を３’末端に配置することにより、もしくはこの領域において非同族塩基を付加することによりさらなる偽塩基を有しかつ／または伸長からブロックされてもよい。典型的には、３’末端の伸長は、いくつかの修飾ヌクレオチドの１つ以上を組み込むことによりブロックされる。典型的には、これら修飾ヌクレオチドは、端末ヌクレオチドの３’修飾を組み込むことになる。これら修飾ヌクレオチドの例としては、ジデオキシヌクレオチドヌクレオチド、３’アミノ−アリル、様々な長さの３’−炭素スペーサー、逆向きに組み込まれたヌクレオチド（３’−３’結合）、３’リン酸、３’ビオチン、３’サリル、３’−チオールがある。あるいは、末端は、基質としての能力が低いためにポリメラーゼによる伸長に適合性がないヌクレオチドを含んでもよく、例えば、ＰＮＡまたはＬＮＡまたは２’−５’結合ＤＮＡまたは２’−Ｏ−メチルＲＮＡなどがある。
【００９１】
（ｉｉ）図４に示し下記に記載のように、ＩＯの３’領域と同族の３’領域および標的末端と同族の５’領域を有するさらなるオリゴヌクレオチド（逆相補体、ＲＣ）が供給されてもよい。
【００９２】
逆相補体は、ＩＯの３’領域と同族の３’領域を有し、この領域における放出テンプレート鎖に結合する。ＲＣの５’末端は、ＩＯ領域に近位でありかつ放出鎖上にある標的二重鎖と同族である。３’領域は放出鎖に結合するのに十分に長く、かつ近位の二重鎖へその５’部分の分枝点移動を誘導するのに十分に安定しているのがよい。典型的には、この３’領域は、長さが塩基１０〜２０個、好ましくは１０〜１４個となる。
【００９３】
３’領域は、ＩＯの機能に著しく干渉しないことが重要であり、３’領域は、このオリゴヌクレオチドと同族であるので、２’修飾要素、ＲＮＡもしくは２−Ｏ−メチルＲＮＡ、またはＰＮＡまたはＬＮＡなどのリコンビナーゼ基質でない塩基を含むのが好ましい場合がある。さらに、このオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼのテンプレートでないことが有益である。５’領域は、系構成要素の存在下で、下流要素と同様の様式で近位の二本鎖へ分岐点移動できるのがよい。この目的のため、この区域は、一本鎖結合タンパク質の基質でない修飾を含むことが好ましい。
【００９４】
ＲＣは下流プライマーと同じ方角を向いており、それゆえこの要素とのＲＣの相互作用は重要ではない。下流要素と比較して、ＲＣは二重鎖の反対の鎖に結合し、それゆえ下流プライマーはＲＣと重複することになるが、ＲＣと同族とはならない。ＲＣはＩＯの一部分に同族であるので、ＩＯが伸張からブロックされ（例えば、偽３’塩基を用いて、または上に記載のように）かつ／またはＩＯがその３’末端においてテンプレートと同族ではないいくつかのさらなる塩基を有しているのが有利である場合がある。これは、増幅可能な単位をＩＯが形成するのを防ぐことになる。ＲＣの３’末端に関しても同じことが言え、この目的のために、伸長をさらに避けるためＲＣはその３’末端においてブロックされてもよく、その３’末端においてテンプレートと同族ではないいくつかのさらなる塩基を含んでもよい。
【００９５】
図３は、非特異的な増幅産物から保護するために下流要素を使用する増幅方法を示す。
【００９６】
３Ａ：この系の要素は、Ｉ〜ＩＶとして示されている。二重鎖テンプレートは、点線で示されている。Ｉは、上流プライマーを表す；ＩＩは、介在するオリゴヌクレオチド（ＩＯ）である；ＩＩＩは、ＩＯの３’伸長である下流要素（ＤＥ）であり、その３’末端先端に非同族塩基を含んでもよい。ＩＯとは対照的に、この下流要素はポリメラーゼの基質ではなく、またリコンビナーゼの基質でなくてもよい。ＩＶは下流プライマーを表す。
【００９７】
増幅の原理は、図２に示す原理と類似しているが、この系では、両方の端末プライマーが、系の周囲温度を超える融解温度を有しており、したがって、この系の制約条件が満たされなければ増幅しない。
【００９８】
上流プライマーはＩＯと重複し、下流プライマーはＤＥと重複し、したがってこの要素と部分的に同族である。
【００９９】
系の一本鎖要素はいずれも、一本鎖結合タンパク質ＧＰ３２でコーティングされるが、これはＤＥに関しては必ずしも必要ではない。ＵＶＳＸの補因子であるＵＶＳＹもまたＩＯをコーティングする。ＧＰ３２でコーティングされた要素は、分枝点移動能が減少している。ＵＶＳＸは、この要素のみが本方法を誘導するのに十分な長さを有するので、コンピテントにＩＯのみをコーティングする。
【０１００】
３Ｂ：リコンビナーゼでコーティングされたＩＯは、二本鎖に侵入し、上流末端が融解する。Ｔｍが周囲温度より高く、またＵＶＳＸが下流末端の区域に重合して二重鎖を互いに締め付けるので、下流末端は融解されない。上流プライマーは、その３’領域がＩＯと重複し、まず分岐点移動しないといけないので、結合するがすぐには伸長しない。これは、結合ではプライマーをしのぐ繋がった放出テンプレート鎖と競合し、系がコンピテントではないままになる。繋がった下流末端は、後方に分岐鎖移動する可能性もあり、リコンビナーゼが解重合した後に本来の二重鎖が閉じられるが、どちらにせよ、系は十分に増幅しない。
【０１０１】
３Ｃ：ＤＥは、下流二重鎖へ分岐点移動する、そして残存する下流二重鎖のＴｍは周囲温度未満であるので、ＤＥは分離される。ＵＶＳＸは解重合し、そして上流末端がプライマーに結合するので、二重鎖は完全に分離される。
【０１０２】
３Ｄ：これにより下流プライマーを結合させ伸長させることが可能になり、また上流プライマーに分岐点移動し伸長する機会を与え、二重鎖の２つのコピーが生成される。
【０１０３】
特に、どのようなプライマーアーチファクトもＤＥに対する結合配列を含む必要がある。ＤＥは、ポリメラーゼの基質ではない要素からなるので、これは起こらない。
【０１０４】
図４は、非特異的産物が形成できないように逆相補オリゴヌクレオチドを利用する増幅方法を示す。
【０１０５】
４Ａ：この系の要素は、Ｉ〜ＩＶとして示されている。二重鎖テンプレートは、点線で示されている。Ｉは、上流プライマーを表し；ＩＩは、その３’末端に非同族塩基を有する介在するオリゴヌクレオチドであり；ＩＩＩは、その３’末端に非同族塩基を有する逆相補体であり、ＩＶは、下流プライマーである。
【０１０６】
この系においては、端末プライマーはいずれも、系の臨界融解温度を超える長さを有し、したがって、非特異的なアーチファクトが標的テンプレートと同一でなければ非特異的なアーチファクトを形成しないことになる。
【０１０７】
上流プライマーは、同じ方向でＩＯと重複する。下流プライマーはＩＯと重複しないが、付加的な要素であるＲＣと重複する。ＲＣはポリメラーゼでもリコンビナーゼ基質でもなく、下流プライマーおよびＩＯの両方と重複する。そのため、下流プライマーは、ＲＣの５’区域の領域と同一の配列を有する３’末端を含む。ＲＣは、下流プライマーの配列に類似する５’配列およびＩＯに相補的な３’配列を含む。
【０１０８】
ＤＥを除いて系の一本鎖要素はすべてＧＰ３２でコーティングされる。ＵＶＳＸの補因子であるＵＶＳＹもまたこれら要素をコーティングする。コーティングされた要素は、分枝点移動能が減少している。ＵＶＳＸは、コンピテントにＩＯのみをコーティングする。これは、ＩＯのみが本方法を誘導するのに十分な長さを有するからである。
【０１０９】
４Ｂ：リコンビナーゼでコーティングされたＩＯは、二本鎖に侵入し、上流末端が臨界温度未満であるので上流末端は融解される。下流末端は臨界温度より高く、またＵＶＳＸはこの区域に重合して二重鎖を互いに締め付けるので、下流末端は融解されない。上流プライマーは、その３’領域がＩＯと重複し、まず分岐点移動しないといけないので、結合するがすぐには伸長しない。これは、結合ではプライマーをしのぐ繋がった放出テンプレート鎖と競合し、系がコンピテントではないままになる。
【０１１０】
４Ｃ：ＵＶＳＸは解重合するが、二重鎖は部分的に融解したままになる。これにより、ＲＣをＩＯに結合させることができ、次いで下流二重鎖へ分岐点移動させることができる。
【０１１１】
４Ｄ：残存する二重鎖は臨界温度未満なので、分離されてばらばらになる。これにより、下流プライマーを結合させ伸長させることができ、また下流プライマーおよび上流プライマーの両方に分岐点移動し伸長する機会を与え、二重鎖の２つのコピーが生成される。
【０１１２】
プローブ
上に記載の方法はいずれも、検出可能なシグナルを測定することにより増幅をモニタリングする工程をさらに含んでもよい。検出系は、増幅系の一部である１つ以上のオリゴヌクレオチドに結合されてもよい。検出系は、蛍光性であってもよい。シグナル発生系と同族の配列が増幅の際に生成されてもよい。
【０１１３】
プローブを利用した多数の検出系が当技術分野で公知であり、例えば、ＷＯ２００６／０８７５７４などに記載されている。これらの系は、通常、フルオロフォアとフルオロフォアまたは蛍光クエンチャーであってもよいアクセプター部分とのＦＲＥＴ対を含む二重標識蛍光性オリゴヌクレオチドからなる。プローブ結合配列は、図２に示すようにＩＯの下流の単位複製配列の一部であってもよいし、プライマー、ＩＯ、ＲＣ、および／またはＤＥの一部であってもよい。これらの要素はいずれも非同族の塩基を含んでもよく、これらは、外因性の要素により捕捉されて増幅単位を局在化するように設計されてもよい。これは側方流動系に共通である。
【０１１４】
ＳｙｂｒグリーンＩやチアゾールオレンジなどの挿入染料は、ＤＮＡ増幅の一般的なプロセスを示すことができる。あるいはまたはさらに、特定の単位複製配列の増幅を示すプローブが使用されてもよい。そのため、プローブを利用する系が、単一のチューブにおいていくつかの増幅法を多重化するために使用されてもよい。これは、異なる種類の出力を有するプローブをそれぞれの系に対して利用することにより達成される。この例としては、それぞれのプローブ用の、異なる波長の蛍光発光が挙げられる。多重化はまた、負および正の内部実験対照を含む方法の重要な部分である。
【０１１５】
プローブ系の例としては以下のものが挙げられる：
（ａ）フルオロフォアは、プライマーに結合されてもよく、これは、系が一般的な挿入染料を含む場合、Ｆｒｅｔアクセプターとして使用されてもよい。
（ｂ）プライマーが増幅産物に組み込まれると検出可能な蛍光変化が生じるように、フルオロフォアはプライマーに結合されてもよい。これは、フルオロフォアが増幅産物に組み込まれるまで自己消光するか基底状態消光するように、ごく近位に２つ以上のフルオロフォアを配置することにより達成することができる。
（ｃ）ＩＯが増幅産物に組み込まれると検出可能な蛍光変化が生じるように、フルオロフォアとクエンチャーまたはアクセプターフルオロフォアとがＩＯまたはそのＤＥに組み込まれてもよい。
（ｄ）フルオロフォアアクセプター／クエンチャー（ＦＲＥＴ）対が切断可能要素により分離されるように、そしてＦＲＥＴ対が部分的に切断可能要素により分離される場合、および切断可能要素が二重鎖特異的ヌクレアーゼにより作用される場合は、ＦＲＥＴ対は増幅系の要素に挿入されてもよい。この要素が増幅産物に組み込まれている場合、この要素の切断は、ＦＲＥＴ対の完全な分離を誘導することになり、結果として系の蛍光を増強する。切断可能要素は、ＩＯの一部であってもよいし、プライマー系の一部または系の単位複製配列に付加され単位複製配列に同族な付加的な要素であってもよい。切断可能要素がプライマー系の一部である場合、切断可能要素は、プライマー結合部位の５’末端またはプライマー結合部位の３’末端にあってもよい。切断可能要素が部分結合領域の３’末端に配置される場合、非同族塩基３’末端を切断可能要素に配置することが有利である場合があり、これらの塩基は、フルオロフォアまたはクエンチャー／アクセプターのいずれかの付着を含んでもよい。これらの特質を有するプライマーは、それがテンプレート増幅系の一部ではないが、任意のアーチファクト的な増幅に含まれるように設計されてもよい。これらの特質を有するプライマーは、例えば、プライマーがその３’末端においてまたはその近傍でＩＯに同族の区域を有する場合に、陰性対照として使用することができ、図５に記載のアーチファクトをもたらす。
【０１１６】
切断酵素の例としては、ＲＮＡＳＥ−Ｈまたは８−オキソグアニンまたは非塩基エンドヌクレアーゼが挙げられる。典型的には、切断可能要素は、ＲＮＡ、８−オキソグアニン、または非塩基部位を含むことになる。酵素のＲＮＡＳＥ−ＨＩＩファミリー（超好熱始原菌のものを含む）は、ＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖における単一のＲＮＡ基質を認識し、単一のＲＮＡ塩基がその同族要素に挿入されることが可能になる。さらに、切断酵素は、Ｔ７ ｇｅｎｅ６などの５’−３’エキソヌクレアーゼであってもよく、この場合、切断されたフルオロフォアを含むオリゴヌクレオチドの５’部分を除く、ホスホロチオエート要素の適用により系はこの酵素の作用から保護される。
【０１１７】
切断可能要素がプライマーに挿入されている場合、切断可能要素は、プライマーテンプレート結合部位の５’側であっても、この部位の３’側であってもよい。切断可能塩基がプライマー結合部位の３’末端にある場合、最後の同族塩基上またはこの塩基のいずれの側に配置されてもよい。この要素に対する塩基３’末端はいずれもテンプレートと非同族であってもよく、ＲＮＡＳＥ−Ｈまたは他のエンドヌクレアーゼにより作用されるまで、３’末端は伸長がブロックされていてもよい。明らかではあるが、切断後、フルオロフォアドナーまたはアクセプターのいずれかは、その相手の近位から除去されることが重要であり、これは、切断単位の一方の側の融解温度が系の周囲温度未満であることを確実にすることにより達成される。
【０１１８】
（ｅ）増幅単位に組み込まれると、検出可能な蛍光変化が生じるように、フルオロフォアとクエンチャーまたはアクセプターフルオロフォアとは、異なる要素に組み込まれてもよい。
【０１１９】
さらなる実施形態では、本発明は、核酸標的分子の等温増幅キットを提供し、当該キットは上流プライマー、下流プライマー、鎖侵入系、およびオリゴヌクレオチドを含み、ここで上流プライマーおよび下流プライマーは増幅プロセスの際の鎖侵入系の基質ではなく、鎖侵入系と無関係には標的分子を増幅せず、ここでオリゴヌクレオチドは鎖侵入系の基質である。このキットの各要素、含まれる好ましい特徴は上に詳細に記載されている。例えば、好ましい特徴としては、鎖侵入系がリコンビナーゼ系を含むということ、および／またはオリゴヌクレオチドがその３’末端に下流要素を含むということを挙げることができる。
【実施例】
【０１２０】
プロトコル
試薬および溶液：
ＵＶＳＸおよびＵＶＳＹを先に記載のように精製した（ティモシー・フォルモサ（Timothy Formosa）およびブルース・Ｍ・アルバーツ（Bruce M.Alberts）、「ＪＢＣ」第２６１巻、６１０７〜６１１８、１９８６年）。
【０１２１】
ＲＮＡＳＥＨＩＩ−ＫＯＤ−Ｉを過去に記載のように精製した（ハルキ（Haruki）Ｍら、「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J Bacteriol.）」１９９８年１２月；１８０（２３）：６２０７〜１４）。
【０１２２】
以下の濃縮物からアッセイを構築した。
マグネシウム緩衝液。トリス（１００ｍＭ）；酢酸マグネシウム（１００ｍＭ）；ＤＴＴ（２０ｍＭ）；ｐＨ８．０
（ジ−トリス−）ホスホクレアチン（５００ｍＭ）（シグマ社）（水酸化アンモニウムを用いてｐＨ７．８まで）
Ｈ２Ｏ中のＤＴＴ（２００ｍＭ）
Ｈ２Ｏ中のＢＳＡ（１００倍）（１０ｍｇ／ｍｌ）
Ｈ２Ｏ中のＡＴＰ−ジナトリウム塩（１００ｍＭ）（イエナバイオサイエンス社）
ｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ）（シグマ社Ｄ７２９５）
Ｈ２Ｏ中の５０％ＰＥＧ１０００（ｗ／ｖ）（フルカ社）
Ｈ２Ｏ中のショ糖（２Ｍ）（フルカ社）
クレアチンキナーゼ（ウサギ筋肉由来Ｔｙｐｅ Ｉ）（シグマ社Ｃ３７５５）４０％グリセロール／ＫＡｃ（５０ｍＭ）（ｐＨ８）中で１０ｕ／μｌまで溶解
ミオキナーゼ（ニワトリ筋肉由来）(シグマ社Ｍ３００３）
４０％グリセロール／Ｈ２０中で９ｕ／μｌ（２００倍）まで溶解
ピロホスファターゼ(シグマ社Ｉ１６４３)４０％グリセロール／Ｈ２Ｏ中で０．４ｕ／μｌ（２００倍）まで溶解
スクロースホスホリラーゼ(シグマ社Ｓ０９３７)４０％グリセロール／Ｈ２Ｏ中で０．４ｕ／μｌまで溶解
ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹ；酢酸カリウム（３００ｍＭ）中１００μＭ；５０％グリセロール
ｇｐ３２（ＮＥＢ、１０ｍｇ／ｍｌ）
クレノー、エキソ−（イエナバイオサイエンス社、５０ｕ／μｌ）最終濃度０．０５ｕ／μｌで使用
【表１】
0005798917.tif 000002
【０１２３】
ＵＶＳＸおよびクレノーを除く反応成分の混合物に試験テンプレートを加えた。反応成分を、試験サンプルを用いて使用温度（４０℃）にて５分間培養し、ＵＶＳＸおよびクレノーを加えた。総サンプル量２０ｕｌを低容量の３８４ウェルマイクロタイタープレートに入れた。ＢＭＧ−ｆｌｕｏｓｔａｒ−ＩＩ上で蛍光を評価した。４８０ｎｍにて励起し、Ｓｙｂｒグリーン蛍光（特に明記しない限り）について５２０ｎｍでの発光を読み取ることにより、蛍光を１分間隔でモニタリングした。
【０１２４】
実施例１
２つのプライマーを用いた系（中間オリゴヌクレオチドは使用せず）（従来技術による系）
使用したプロトコルは、特に明記しない限り上述のものと同様である。オリゴヌクレオチド構成要素は、テンプレートＡと共に、最終濃度１５０ｎＭの２つのプライマーを含んでいた。テンプレート／プライマー構成を図６Ａに示す。テンプレートＡの濃度は、特に明記しない限り１ｎＭであり、増幅に続いてＳｙｂｒグリーン蛍光をモニタリングした。
【０１２５】
結果を図６Ｂに示す。この２つのプライマーを用いた系では、増幅は、プライマー長が塩基３２個に等しいかまたはこれを超える（Ｕ３２＋Ｄ３２；Ｕ３５＋Ｄ３５およびＵ４０＋Ｄ４０）場合に起こった。塩基２３個および２０個のプライマー（Ｕ２３＋Ｄ２３およびＵ２０＋Ｄ２０）では増幅は起こらなかった。塩基４０個のプライマー（テンプレート無し）に関して示されるようなプライマー二量体アーチファクトが生じた。当該アーチファクトは、一般に、テンプレートの濃度が１０ｐＭになると同時に現れ、これにより、当該技術の感受性がこのレベルに限定された。
【０１２６】
実施例２
３つのプライマーを用いた系（２つのプライマーおよび非伸長性の中間オリゴヌクレオチドを使用)
使用したプロトコルは、特に明記しない限り上述のものと同様である。テンプレート／オリゴヌクレオチド／プライマー構成を図７Ａに示す。プライマーは、それぞれ濃度２００ｎＭで使用されたＵ１６およびＤ１６であった。中間オリゴヌクレオチドの濃度は１５０ｎＭであり、テンプレートの濃度は１００ｆＭであった。シグナルは、Ｓｙｂｒグリーン蛍光によって発生させた。
【０１２７】
図７Ｂは、Ｕ１６およびＤ１６をそれぞれ上流プライマーおよび下流プライマーに用いて図７Ａに示すように構成された、３つのオリゴヌクレオチドを用いた系の増幅を示す。増幅は、長さが塩基１６個のプライマーを用いて行い、また非伸長性オリゴヌクレオチド（ＩＯ）に基づく。この系は、アーチファクトを生じさせる傾向が低い。１６ＢＰのプライマーは、中間オリゴが同族である場合に増幅することができる（ＩＯ１＋プライマー＋テンプレート１；ＩＯ２＋プライマー＋テンプレート２）。プライマーは、単独（プライマーのみ）では増幅することはなく、中間物単独（プライマー無し）でも増幅することはない。いくつかの系では、アーチファクトがテンプレートの非存在下で生じる場合があり、感受性が１〜１０ｆＭの範囲に限定され、２つのプライマーを用いた系に比べて１０００倍高い感受性が得られる。
【０１２８】
実施例３
三成分系におけるプライマーは、使用した条件下では、長さが塩基２０個未満でなければならない（プライマーの融解温度および周囲温度ならびに変性剤による）
使用したプロトコルは、特に明記しない限り上述のものと同様である。種々の長さを有するプライマーを、それぞれ濃度２００ｎＭで使用した。中間オリゴヌクレオチド（ＩＯ１）は１５０ｎＭで使用し、テンプレートの濃度は１００ｆＭであった。シグナルは、Ｓｙｂｒグリーン蛍光によって発生させた。
【０１２９】
結果を図８に示す。塩基１２個、１４個および１６個のプライマーは、効率よく増幅した。塩基１８個のプライマーセットの増幅の効率は低く、塩基２０個のプライマーセットは増幅せず、したがってアーチファクトを形成しなかった。
【０１３０】
実施例４
アーチファクトは、中間オリゴヌクレオチドにおいてメチル化下流要素を使用することによって回避することができる
使用したプロトコルは、特に明記しない限り上述のものと同様である。テンプレート／オリゴヌクレオチド／プライマー構成を図９Ａに示す。プライマーは、それぞれ、濃度３００ｎＭで使用した。中間オリゴヌクレオチド（ＩＯ１）は１５０ｎＭで使用し、テンプレートの濃度は１０ｐＭであった。シグナルは、Ｓｙｂｒグリーン蛍光によって発生させた。
【０１３１】
３つのプライマーを用いた系では、侵入する中間オリゴヌクレオチドの上流および下流にある領域が長すぎて、分離しかつプライマーを結合させることができないため、より長いプライマー（２０ＢＰ）は増幅することができない（ＩＯ１＋Ｕ２０＋Ｄ２０およびＩＯ１ｍｅｔ＋Ｕ２０＋Ｄ２０）。さらに、中間オリゴヌクレオチド結合事象が完了し、リコンビナーゼが解重合した(オリゴヌクレオチドからばらばらになった)後、完全に分離していない二重鎖は、分岐点移動によって再び閉じる傾向がある。
【０１３２】
下流プライマーが長く、上流プライマーが短い場合、増幅は遅いが、見ることができる（ＩＯ１＋Ｕ１６＋Ｄ２０）。これは、ＩＯが侵入すると上流領域が分離し、これによって上流プライマーは結合が可能となるが、部分的に繋がった（tethered）二重鎖と伸長の際に競合しなければならないからである。
【０１３３】
上流プライマーが長いが、中間物と重複する場合、長い下流プライマーでも若干の遅い増幅が観察される（ＩＯ１＋Ｕ２０ｏｖｅｒ＋Ｄ２０）。これは、プライマーは長いが、ＩＯの上流にある増幅されたテンプレート領域は短いままであるからである（図９Ａを参照)。
【０１３４】
下流プライマーが長く、メチル化した下流要素が中間物に組み込まれる場合（ＩＯ１ｍｅｔｈ＋Ｕ１６＋Ｄ２０およびＩＯ１ｍｅｔｈ＋Ｕ２０ｏｖｅｒ＋Ｄ２０）、増幅速度は、短い下流プライマーと同様の速度まで増加する。これは、ＩＯのメチル化領域が二重鎖の下流領域中に分岐点移動して、残存する二重鎖を短くし、二重鎖の鎖が分離し、これにより、プライマーを結合可能にし、上流プライマーの伸長を部分的に繋がった（tethered）テンプレートとの競合から解放するからである。ＩＯ１Ｍｅｔ２＋Ｕ２０ｏｖｅｒ＋Ｄ２０は加速した増幅を示さないので、メチル化要素は、同族であるはずであり、したがって、分岐点移動することができるはずである。これは、当該上流プライマーが中間物と重複する場合、上流プライマーが長くても当てはまる（ＩＯ１ｍｅｔｈ＋Ｕ２０ｏｖｅｒ＋Ｄ２０）。
【０１３５】
長いプライマーおよびメチル化中間物を用いた高速増幅にも関わらず、長い上流プライマーが中間物と重複しない場合、増幅は起こらず、アーチファクトも生じない（ＩＯ１ｍｅｔｈ＋Ｕ２０＋Ｄ２０）。これは、上流領域がインタクトなままである場合、増幅は下流プライマーによって開始されなければならないという原理によるものと思われる。中間物の下流にある領域は、リコンビナーゼが解重合するまでリコンビナーゼで覆われる傾向があり、結果として、リコンビナーゼが解重合してしまうまでプライマーと結合することができず、その時点までには、二重鎖は、分岐点移動によって閉じてしまっている。これらの観察は、メチル化中間オリゴヌクレオチドおよび長いプライマーを用いた高速増幅は可能であり、中間物の同族のメチル化領域に依拠することを示している。メチル化部分の同族領域はポリメラーゼの基質ではないため、アーチファクトは生じ得ない。
【０１３６】
実施例５
３つのオリゴヌクレオチドを用いた系は、生物学的に誘導されたＤＮＡから増幅できる
使用したプロトコルは、特に明記しない限り上述のものと同様である。オリゴヌクレオチドは、凡例に示す通りであり、図９Ａに示すように構成した。プライマーは、それぞれ濃度３００ｎＭで使用した。中間オリゴヌクレオチド（ＩＯ１）は、１５０ｎＭで使用し、テンプレートの濃度は１ｆＭであって。オリゴヌクレオチドの直ぐ上流に、ＡＬＵ１に感受性のあるさらなるａｇｃｔ配列を有するテンプレート１を、ＩＤＴ−ＤＮＡ社（サンディエゴ）によるプラスミドベクターＰＸｅｒｏ−２に挿入した。シグナルは、Ｓｙｂｒグリーン蛍光によって発生させた。１００ｕｌ（１ｎＭ）のプラスミド０．１ｕｇを用いてＡＬＵ１でプラスミドを切断し、ＮＥＢ緩衝液４中のＡＬＵ１(ニュー・イングランド・バイオラボ社)５単位で３７℃にて３０分消化した。続いて、プラスミドテンプレートを標準的な操作手順に記載の通りに水で希釈した。
【０１３７】
プラスミドに挿入したこのテンプレート１の増幅を、合成テンプレートの増幅およびテンプレート配列の直ぐ上流で切断されたプラスミドの増幅と比較した。上述の通り(実施例４)、中間オリゴヌクレオチドの上流にあるテンプレートの領域は、効率的な増幅のためには短い必要がある。生物学的な系において、標的テンプレートは、通常、長いＤＮＡ配列の一部であり、中間オリゴヌクレオチドの上流にある二重鎖の長さは、効率的な増幅のために所望されるものよりも長い場合がある。このことは、増幅の前にテンプレートを加熱して当該テンプレートを一本鎖にしない限り、このような系における増幅の第１サイクルに影響を及ぼす可能性がある。この問題の重要性をプラスミドＤＮＡを用いて評価した。
【０１３８】
結果を図１０に示す。プラスミドの増幅に関しては数分の遅延があり、また、プラスミドをテンプレートの上流で切断した場合には遅延は小さかった。プラスミドの負の超らせんにより、第１回目の増幅が促進されたが、テンプレートの下流で切断されたプラスミドもまた、同様の遅延の後に増幅をもたらしたのではないかと考えられる。あるいは、二重鎖の偶発的なブリ―ジングが、遅延の後に増幅を可能にした可能性がある。テンプレート無しの実験対照の増幅も観察されたが、これは、テンプレートの１個の分子が検出された後のことである。ＩＯ１のメチル化部分が非常に遅い速度でポリメラーゼによってコピーされ、最終的にアーチファクトを形成したと考えられる。プライマー末端と中間物のメチル化領域との重複と、中間物のＤＮＡ部分との間には１つのメチル化塩基しか存在せず、これが、この領域における最終的な読み過ごし（read-through）を可能にした可能性がある。その後の実験において、あらゆるアーチファクト的な増幅を回避するためにプライマーと中間物のＤＮＡ部分との間の塩基数を増加した。
【０１３９】
実施例６
メチル化中間物を用いた系の感受性は、単一分子レベルで有り得る
使用したプロトコルは、特に明記しない限り上述のものと同様である。使用したオリゴヌクレオチドは、Ｕ２０ｏｖｅｒ、テンプレート１、ＩＯ１ｍｅｔｈｅｘｔｒａ、およびＤ２０ｂａｃｋであった。あらゆるアーチファクト的な増幅事象を回避するためにこの構成を用いた。なぜなら、ＩＯｍｅｔｈｅｘｔｒａは、ＩＯ１ｍｅｔｈと比較してさらなる２’メチル化ＲＮＡ塩基を含み、下流プライマーがさらなる２’−メチル化塩基によって許容できない程度までコピーする機会をさらに低減するからである。オリゴヌクレオチド構成を図９Ａに示す。シグナルは、Ｓｙｂｒグリーン蛍光によって発生させた。
【０１４０】
結果を図１１Ａおよび１１Ｂに示す。図１１Ａでは、中間物は７５ｎＭで使用した一方、図１１Ｂでは、中間物は１５０ｎＭで使用した。プライマーの濃度は２００ｎＭであった。図１１Ａでは、１００万個、１０００個および１００個の分子を加えた。図１１Ｂでは、アッセイは、０．５個の分子が１個の分子を含む確率が２分の１となるように各試験に対してテンプレート１の分子を１０個、５個、０．５個、０．０５個および０個加える工程を含んでいた。各濃度につき３つのサンプルが調製され、その結果が示されている。１０個および５個の分子を有するすべてのサンプルが増幅した。１個の分子を含む確率が２分の１であった３つのサンプルのうち１つは増幅した(増幅が遅延したサンプル)。その他のサンプルは増幅しなかった。
【０１４１】
実施例７
クラウディング剤は、系の動力学を改善することができる
使用したプロトコルは、特に明記しない限り実施例１に記載したものと同様である。オリゴヌクレオチドは、凡例に示す通りであり、図９Ａに示すように構成した。プライマーは、それぞれ濃度２００ｎＭで使用されたＵ１６およびＤ１６であった。中間オリゴヌクレオチド（ＩＯ１）の濃度は１５０ｎＭであり、テンプレート１の濃度は１００ｐＭであった。シグナルは、Ｓｙｂｒグリーン蛍光によって発生させた。
【０１４２】
結果を図１２に示す。系は、クラウディング剤を使用せずに成長可能であったが、先に報告されているように異なる種類のＰＥＧまたはアルブミンの存在下でより効率的に増幅した（レディ（Reddy）ＭＫら、「メソッズ・オブ・エンザイモロジー(Methods Enzymol)」、１９９５年；２６２：４６６〜７６；ラベリー（Lavery）Ｐら、「ＪＢＣ」１９９２年、２６７１３、９３０７〜９３１４；ＷＯ２００８／０３５２０５）。
【０１４３】
実施例８
増幅は、反応を多重化するため、あるいは正および負の実験対照を組む込む目的で、Ｓｙｂｒグリーンの代わりにプローブによって識別できる
使用したプロトコルは、特に明記しない限り実施例１に記載したものと同様である。使用したオリゴヌクレオチドは、Ｕ２０ｏｖｅｒ（２００ｎＭ）、テンプレート１、ＩＯ１ｍｅｔｈ（７５ｎＭ）、ならびにそれぞれ濃度が１００ｎＭであるＤ２０およびＤ２０プローブの混合物である。テンプレートの濃度は、１００ｆＭであった。オリゴヌクレオチド構成を図９Ａに示す。超好熱始原菌（T．kodakaraensis）由来のＲＮＡＳＥＨを最終濃度１ｎＭでその他の成分と共に加えた。系を励起し、増幅を評価するために４８０／５２０ｎｍで読み取りを行うか、あるいはプローブの切断を識別するために５４０／６００ｎｍでの読取を行った。プローブは、下流プライマー系の一部として組み込んだ。プライマーは、テンプレートと同族の領域、ＲＮＡ塩基およびブロックされた非同族領域をその３’末端に含んでいた。ＲＮＡ塩基を、プライマーがテンプレートに結合した際にＲＮＡＳＥＨＩＩによって切断し、プライマーを伸長させた。プライマーは、クエンチャーおよびフルオロフォアをＲＮＡ塩基の両側に含んでいたため、ＲＮＡ塩基の切断時に分離され、シグナルが発生した。図１３は、Ｓｙｂｒグリーンによって発生したシグナルおよびプローブによって誘導されたシグナルを示す。
【０１４４】
テンプレートの存在を評価するように設計されたプローブプライマーを、別のフルオロフォアを組み込んださらなるプローブプライマーと共に用いることが可能である。このような系は、実験対照テンプレートが既知の濃度にて系の一部として加えられる場合に正および負の実験対照のために構成され得る。あるいは、そして、系がアーチファクト的な増幅を誘導する可能性がある場合、早期のアーチファクト的な増幅を誘導するプローブプライマーを加えてもよく、シグナルがこのようなプローブの増幅によって発生する場合は、試験を終了する。これは、Ｄ２０ｃｏｎｔｒｏｌが中間物のＤＮＡ塩基へのその近接度の高さゆえに早期のアーチファクト的な増幅を誘導する、図９ａのＤ２０ｃｏｎｔｒｏｌｐｒｏｂｅおよびＤ２０ｂａｃｋの使用によって例示される。
【０１４５】
配列
Ｕ４０  ＧＴＴＡＣＧＡＴＴＧＴＣＣＴＡＡＴＧＧＡＧＡＧＴＧＡＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴＣ
Ｕ３５  ＧＡＴＴＧＴＣＣＴＡＡＴＧＧＡＧＡＧＴＧＡＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴＣ
Ｕ３２  ＴＧＴＣＣＴＡＡＴＧＧＡＧＡＧＴＧＡＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴＣ
Ｕ２３−ｏｖｅｒｌａｐ  ＧＡＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴＣ  ＡＴＴＣＧＣＡ
Ｕ２３  ＣＧＡＧＡＧＴＧＡＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴＣ
Ｕ２０  ＧＡＧＴＧＡＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴＣ
Ｕ１８  ＧＴＧＡＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴＣ
Ｕ１５  ＡＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴＣ
Ｕ１２  ＴＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴＣ
Ｄ４０  ＴＣＴＧＧＣＡＴＧＴＴＡＣＡＡＧＧＴＣＡＡＧＡＴＧＡＡＣＣＡＡＣＣＡＣＴＴＡＴＡ
Ｄ３５  ＣＡＴＧＴＴＡＣＡＡＧＧＴＣＡＡＧＡＴＧＡＡＣＣＡＡＣＣＡＣＴＴＡＴＡ
Ｄ３２  ＧＴＴＡＣＡＡＧＧＴＣＡＡＧＡＴＧＡＡＣＣＡＡＣＣＡＣＴＴＡＴＡ
Ｄ２３  ＴＣＡＡＧＡＴＧＡＡＣＣＡＡＣＣＡＣＴＴＡＴＡ
Ｄ２０  ＡＧＡＴＧＡＡＣＣＡＡＣＣＡＣＴＴＡＴＡ
Ｄ１８  ＡＴＧＡＡＣＣＡＡＣＣＡＣＴＴＡＴＡ
Ｄ１６  ＧＡＡＣＣＡＡＣＣＡＣＴＴＡＴＡ
Ｄ１４  ＡＣＣＡＡＣＣＡＣＴＴＡＴＡ
Ｄ１２  ＣＡＡＣＣＡＣＴＴＡＴＡ
Ｄ２０ｂａｃｋ  ＧＧＴＣＡＡＧＡＴＧＡＡＣＣＡＡＣＣＡＣ
Ｘ＝３’アミノ−６炭素−スペーサーを含むブロック塩基
Ｘ＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ
Ｘ＝ＲＮＡ塩基
ＴＱは、ＢＨＱ２に付着したＴである
ＴＦは、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）に付着したＴである
ＩＯ１      ＴＧＡＧＣＡＴＡＧＡＣＧＧＣ
ＡＴＴＣＧＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＣＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＣＴＣＡＣＴＣＴＴＣＡＡ
ＩＯ２      ＧＡＧＧＣＴＡＡＧＧＡＡＴ
ＡＣＡＣＧＣＡＡＡＧＧＣＧＧＣＴＴＧＧＴＧＴＴＣＴＴＴＣＡＧＴＴＣＴＴＣＡＡ
ＩＯ１ｍｅｔ      ＴＧＡＧＣＡＴＡＧＡＣＧＧＣ
ＡＴＴＣＧＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＣＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＣＴＣＡＣＴＣＴＴＣＡＡ  ＧＴＡＴＡＧ
ＩＯ１ｍｅｔ  ｅｘｔｒａ      ＴＧＡＧＣＡＴＡＧＡＣＧＧＣ
ＡＴＴＣＧＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＣＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＣＴＣＡＣＴＣＴＴＣＡＡ  ＧＴＡＴＡＡＧＴＧＧＡ
ＩＯ１ｍｅｔ２      ＴＧＡＧＣＡＴＡＧＡＣＧＧＣ
ＡＴＴＣＧＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＣＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＣＴＣＡＣＴＣＴＴＣＡＡ  ＴＴＣＴＡＧ
テンプレートＡ      ＧＴＴＡＣＧＡＴＴＧＴＣＣＴＡＡＴＧＧＡＧＡＧＴＧＡＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴＣ
ＣＴＧＴＡＴＡＡＧＴＧＧＴＴＧＧＴＴＣＡＴＣＴＴＧＡＣＣＴＴＧＴＡＡＣＡＴＧＣＣＡＧ
テンプレート１      ＧＴＴＡＣＧＡＴＴＧＴＣＣＴＡＡＴＧＧＡＧＡＧＴＧＡＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴＣ
ＡＴＴＣＧＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＣＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＣＴＣＡＣＴＣＴＴＣＡＡ
ＧＴＡＴＡＡＧＴＧＧＴＴＧＧＴＴＣＡＴＣＴＴＧＡＣＣＴＴＧＴＡＡＣＡＴＧＣＣＡＧ
テンプレート２      ＧＴＴＡＣＧＡＴＴＧＴＣＣＴＡＡＴＧＧＡＧＡＧＴＧＡＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴＣ
ＡＣＡＣＧＣＡＡＡＧＧＣＧＧＣＴＴＧＧＴＧＴＴＣＴＴＴＣＡＧＴＴＣＴＴＣＡＡ
ＧＴＡＴＡＡＧＴＧＧＴＴＧＧＴＴＣＡＴＣＴＴＧＡＣＣＴＴＧＴＡＡＣＡＴＧＣＣＡＧ
Ｄ２０ｐｒｏｂｅ      ＡＧＡＴＧＡＡＣＣＡＡＣＣＡＣ（ＴＱ）ＴＡＴＡＴＴＴ（ＴＦ）ＴＴＴ
Ｄ２０ｐｒｏｂｅ２      Ｔ（ＴＦ）ＴＴＴＴＴＡＧＡ（ＴＱ）ＧＡＡＣＣＡＡＣＣＡＣＴＴＡＴＡ
【図１】
0005798917.tif 000003
【図２】
0005798917.tif 000004
【図３】
0005798917.tif 000005
【図４】
0005798917.tif 000006
【図５】
0005798917.tif 000007
【図８】
0005798917.tif 000008
【図６】
0005798917.tif 000009
【図７】
0005798917.tif 000010
【図９】
0005798917.tif 000011
【図１０】
0005798917.tif 000012
【図１１】
0005798917.tif 000013
【図１２】
0005798917.tif 000014
【図１３】
0005798917.tif 000015
【配列表】
0005798917000001.app