(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光物質を複数集積した蛍光粒子を染色試薬として用いて特定の生体物質が染色された組織標本の蛍光情報に基づいて前記生体物質の発現レベルを評価する組織評価方法において、
前記組織標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する蛍光画像入力工程と、
前記蛍光画像から輝点領域を抽出し、前記輝点領域の輝度値を算出する第１算出工程と、
前記輝点領域の輝度値に基づいて輝度分布を作成し、当該輝度分布における所定の低輝度領域の輝度値に基づいて、予め設定された手法により一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出する第２算出工程と、
前記平均輝度値に基づいて、前記輝点領域内の前記蛍光粒子の数を算出する第３算出工程と、
を備え、
前記低輝度領域は、横軸を前記輝点領域の輝度値、縦軸を頻度とする輝度分布曲線において、接線の傾きが最大となる点の輝度値以下の輝度領域であることを特徴とする組織評価方法。
【請求項２】
前記第２算出工程において、
前記輝度分布における所定の低輝度領域及び予め計測された前記蛍光粒子の粒径分布に基づいて、前記平均輝度値を算出することを特徴とする請求項１に記載の組織評価方法。
【請求項３】
前記第２算出工程において、
前記輝度分布から、所定の方法によって導出される最も輝度が小さい前記輝点領域の輝度値を最低輝点値として算出し、
前記最低輝点値及び予め計測された前記蛍光粒子の粒径分布に基づいて、前記平均輝度値を算出することを特徴とする請求項２に記載の組織評価方法。
【請求項４】
前記輝度分布曲線の接線のうち傾きが最大である接線と横軸の交点の輝度値を、前記最低輝点値とすることを特徴とする請求項３に記載の組織評価方法。
【請求項５】
前記第２算出工程において、
前記平均輝度値Ｓ（ａ）を下記の式（１）から算出することを特徴とする請求項３又は４に記載の組織評価方法。
Ｓ（ａ）＝Ｓ（ｍ）／（１−ｋ×ｃ）３、（ただし、１．６≦ｋ≦３．３）・・・（１）
ただし、
Ｓ（ｍ）：前記最低輝点値
ｃ：予め計測された前記蛍光粒子の粒径の変動係数
ｋ：前記蛍光粒子一粒子の輝度分布において、Ｓ（ｍ）が有意水準ｐ％の輝度範囲の最小輝度値であるとした時の、ｔ分布における有意水準ｐ％、自由度∞に対応する臨界値
である。
【請求項６】
前記組織標本の前記蛍光画像と同一視野範囲を撮像して得られた、前記組織標本における細胞の形態を表す明視野画像を入力する明視野画像入力工程と、
前記蛍光画像から抽出された前記輝点領域の画像及び前記明視野画像を重ね合わせて表示部に表示させる表示制御工程と、
を備えることを特徴とする請求項１〜５の何れか一項に記載の組織評価方法。
【請求項７】
蛍光物質を複数集積した蛍光粒子を染色試薬として用いて特定の生体物質が染色された組織標本の蛍光情報に基づいて前記生体物質の発現レベルを評価する画像処理装置において、
前記組織標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する蛍光画像入力手段と、
前記蛍光画像から輝点領域を抽出し、前記輝点領域の輝度値を算出する第１算出手段と、
前記輝点領域の輝度値に基づいて輝度分布を作成し、当該輝度分布における所定の低輝度領域の輝度値に基づいて、予め設定された手法により一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出する第２算出手段と、
前記平均輝度値に基づいて、前記輝点領域内の前記蛍光粒子の数を算出する第３算出手段と、
を備え、
前記低輝度領域は、横軸を前記輝点領域の輝度値、縦軸を頻度とする輝度分布曲線において、接線の傾きが最大となる点の輝度値以下の輝度領域であることを特徴とする画像処理装置。
【請求項８】
請求項７に記載の画像処理装置と、
前記画像処理装置で使用される前記蛍光画像を取得する画像取得装置と、
を備えることを特徴とする病理診断支援システム。
【請求項９】
蛍光物質を複数集積した蛍光粒子を染色試薬として用いて特定の生体物質が染色された組織標本の蛍光情報に基づいて前記生体物質の発現レベルを評価するコンピュータを、
前記組織標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する蛍光画像入力手段、
前記蛍光画像から輝点領域を抽出し、前記輝点領域の輝度値を算出する第１算出手段、
前記輝点領域の輝度値に基づいて輝度分布を作成し、当該輝度分布における所定の低輝度領域の輝度値に基づいて、予め設定された手法により一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出する第２算出手段、
前記平均輝度値に基づいて、前記輝点領域内の前記蛍光粒子の数を算出する第３算出手段、
として機能させるプログラムであって、
前記低輝度領域は、横軸を前記輝点領域の輝度値、縦軸を頻度とする輝度分布曲線において、接線の傾きが最大となる点の輝度値以下の輝度領域であることを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光物質の輝度情報を用いた組織評価方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、抗体医薬を中心とした分子標的薬治療の広がりに伴い、分子標的薬をより効果的に設計するため、観察対象細胞上の生体物質（抗原）の定量が求められている。生体物質の存在を確認する方法として、生体物質認識部位が結合された蛍光物質と、当該生体物質認識部位に対応した生体物質の結合に基づく、組織分析方法が知られている。【０００３】
特許文献１では、蛍光色素を用いて組織サンプルを染色し、蛍光強度を求めることで、バイオマーカーの量を再現性よく定量する方法が提案されている。
しかし、当該方法では、蛍光染料を用いてバイオマーカーを染色しているため、バイオマーカー一分子に対応する蛍光強度が非常に弱く、バイオマーカーの数を正確に把握することは難しい。【０００４】
これに対して、特許文献２では、生体物質認識部位が結合された蛍光色素集積粒子を用いて組織を染色し、蛍光発光輝点の輝度分布のピークを解析することで一粒子当りの平均を求め、各輝点内の粒子数を算出する方法が提案されている（特許文献２の実施例１−２参照）。
特許文献２に記載の方法によれば、蛍光観察時の一粒子当りの輝度値が高くなるため、微量の生体物質を定量的に検出することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１２−５０３１８０号公報
【特許文献２】国際公開第２０１２／０２９３４２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、蛍光発光輝点の輝度分布のピークを解析する特許文献２に記載の従来手法では、蛍光色素集積粒子の粒径のばらつきの程度や、目的とする生体物質の種類や発現量によっては、蛍光色素集積粒子のクラスタを１つの輝点と換算して粒子数を低く見積もったり、計測された輝度分布から一粒子の輝度値に相当するピーク値を読み取り難いために一粒子当りの平均輝度値の誤差が生じて、正確な粒子数を算出できない場合があるという問題があった。【０００７】
本発明の主な目的は、組織標本内の特定の生体物質の数を正確に定量できる組織評価方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、請求項１に記載の発明は、
蛍光物質を複数集積した蛍光粒子を染色試薬として用いて特定の生体物質が染色された組織標本の蛍光情報に基づいて前記生体物質の発現レベルを評価する組織評価方法において、
前記組織標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する蛍光画像入力工程と、
前記蛍光画像から輝点領域を抽出し、前記輝点領域の輝度値を算出する第１算出工程と、
前記輝点領域の輝度値に基づいて輝度分布を作成し、当該輝度分布における所定の低輝度領域の輝度値に基づいて、予め設定された手法により一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出する第２算出工程と、
前記平均輝度値に基づいて、前記輝点領域内の前記蛍光粒子の数を算出する第３算出工程と、
を備え、
前記低輝度領域は、横軸を前記輝点領域の輝度値、縦軸を頻度とする輝度分布曲線において、接線の傾きが最大となる点の輝度値以下の輝度領域であることを特徴とする。【０００９】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の組織評価方法において、
前記第２算出工程において、
前記輝度分布における所定の低輝度領域及び予め計測された前記蛍光粒子の粒径分布に基づいて、前記平均輝度値を算出することを特徴とする。【００１０】
請求項３に記載の発明は、請求項２に記載の組織評価方法において、
前記第２算出工程において、
前記輝度分布から、所定の方法によって導出される最も輝度が小さい前記輝点領域の輝度値を最低輝点値として算出し、
前記最低輝点値及び予め計測された前記蛍光粒子の粒径分布に基づいて、前記平均輝度値を算出することを特徴とする。【００１１】
請求項４に記載の発明は、請求項３に記載の組織評価方法において、
前記輝度分布曲線の接線のうち傾きが最大である接線と横軸の交点の輝度値を、前記最低輝点値とすることを特徴とする。【００１２】
請求項５に記載の発明は、請求項３又は４に記載の組織評価方法において、
前記第２算出工程において、前記平均輝度値Ｓ（ａ）を下記の式（１）から算出することを特徴とする。
Ｓ（ａ）＝Ｓ（ｍ）／（１−ｋ×ｃ）３、（ただし、１．６≦ｋ≦３．３）・・・（１）
ただし、
Ｓ（ｍ）：前記最低輝点値
ｃ：予め計測された前記蛍光粒子の粒径の変動係数
ｋ：前記蛍光粒子一粒子の輝度分布において、Ｓ（ｍ）が有意水準ｐ％の輝度範囲の最小輝度値であるとした時の、ｔ分布における有意水準ｐ％、自由度∞に対応する臨界値
である。【００１３】
請求項６に記載の発明は、請求項１〜５の何れか一項に記載の組織評価方法において、
前記組織標本の前記蛍光画像と同一視野範囲を撮像して得られた、前記組織標本における細胞の形態を表す明視野画像を入力する明視野画像入力工程と、
前記蛍光画像から抽出された前記輝点領域の画像及び前記明視野画像を重ね合わせて表示部に表示させる表示制御工程と、
を備えることを特徴とする。【００１４】
請求項７に記載の発明は、
蛍光物質を複数集積した蛍光粒子を染色試薬として用いて特定の生体物質が染色された組織標本の蛍光情報に基づいて前記生体物質の発現レベルを評価する画像処理装置において、
前記組織標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する蛍光画像入力手段と、
前記蛍光画像から輝点領域を抽出し、前記輝点領域の輝度値を算出する第１算出手段と、
前記輝点領域の輝度値に基づいて輝度分布を作成し、当該輝度分布における所定の低輝度領域の輝度値に基づいて、予め設定された手法により一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出する第２算出手段と、
前記平均輝度値に基づいて、前記輝点領域内の前記蛍光粒子の数を算出する第３算出手段と、
を備え、
前記低輝度領域は、横軸を前記輝点領域の輝度値、縦軸を頻度とする輝度分布曲線において、接線の傾きが最大となる点の輝度値以下の輝度領域であることを特徴とする。【００１５】
請求項８に記載の発明は、病理診断支援システムであって、
請求項７に記載の画像処理装置と、
前記画像処理装置で使用される前記蛍光画像を取得する画像取得装置と、
を備えることを特徴とする。【００１６】
請求項９に記載の発明は、プログラムであって、
蛍光物質を複数集積した蛍光粒子を染色試薬として用いて特定の生体物質が染色された組織標本の蛍光情報に基づいて前記生体物質の発現レベルを評価するコンピュータを、
前記組織標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する蛍光画像入力手段、
前記蛍光画像から輝点領域を抽出し、前記輝点領域の輝度値を算出する第１算出手段、
前記輝点領域の輝度値に基づいて輝度分布を作成し、当該輝度分布における所定の低輝度領域の輝度値に基づいて、予め設定された手法により一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出する第２算出手段、
前記平均輝度値に基づいて、前記輝点領域内の前記蛍光粒子の数を算出する第３算出手段、
として機能させ、
前記低輝度領域は、横軸を前記輝点領域の輝度値、縦軸を頻度とする輝度分布曲線において、接線の傾きが最大となる点の輝度値以下の輝度領域であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、組織標本内の特定の生体物質の数を正確に定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の組織評価方法を用いた病理診断支援システムのシステム構成を示す図である。
【図２】図１の画像処理装置の機能的構成を示すブロック図である。
【図３】明視野画像の一例を示す図である。
【図４】蛍光画像の一例を示す図である。
【図５】図２の制御部により実行される画像解析処理を示すフローチャートである。
【図６】図５のステップＳ２の処理の詳細を示すフローチャートである。
【図７Ａ】明視野画像を示す図である。
【図７Ｂ】細胞核が抽出された画像を示す図である。
【図８】図５のステップＳ４の処理の詳細を示すフローチャートである。
【図９Ａ】蛍光画像を示す図である。
【図９Ｂ】輝点領域が抽出された画像を示す図である。
【図１０Ａ】輝点領域が抽出された画像の一例を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ａの□で囲まれた１つの輝点領域の拡大図である。
【図１０Ｃ】図１０Ｂの輝点領域に対応する部位の蛍光画像である。
【図１０Ｄ】図１０Ｃの画像を図１０Ｂでマスクすることにより生成された第２の蛍光画像である。
【図１０Ｅ】図１０Ｄの第２の蛍光画像の輝度分布を示す図である。
【図１１Ａ】撮影された蛍光画像から測定された輝度積算値の分布を示す図である。
【図１１Ｂ】予め測定した蛍光粒子一粒子の粒径分布を示す図である。
【図１２Ａ】生体物質の発現量が少なく、粒径の変動係数が５％の場合の輝度積算値の分布を示す図である。
【図１２Ｂ】生体物質の発現量が少なく、蛍光粒子の粒径の変動係数が１０％の場合の輝度積算値の分布を示す図である。
【図１２Ｃ】生体物質の発現量が少なく、蛍光粒子の粒径の変動係数が１５％の場合の輝度積算値の分布を示す図である。
【図１２Ｄ】生体物質の発現量が少なく、蛍光粒子の粒径の変動係数が２０％の場合の輝度積算値の分布を示す図である。
【図１２Ｅ】生体物質の発現量が少なく、蛍光粒子の粒径の変動係数が３０％の場合の輝度積算値の分布を示す図である。
【図１２Ｆ】生体物質の発現量が少なく、蛍光粒子の粒径の変動係数が３５％の場合の輝度積算値の分布を示す図である。
【図１３Ａ】生体物質の発現量が多く、蛍光粒子の粒径の変動係数が５％の場合の輝度積算値の分布を示す図である。
【図１３Ｂ】生体物質の発現量が多く、蛍光粒子の粒径の変動係数が１０％の場合の輝度積算値の分布を示す図である。
【図１３Ｃ】生体物質の発現量が多く、蛍光粒子の粒径の変動係数が１５％の場合の輝度積算値の分布を示す図である。
【図１３Ｄ】生体物質の発現量が多く、蛍光粒子の粒径の変動係数が２０％の場合の輝度積算値の分布を示す図である。
【図１３Ｅ】生体物質の発現量が多く、蛍光粒子の粒径の変動係数が３０％の場合の輝度積算値の分布を示す図である。
【図１３Ｆ】生体物質の発現量が多く、蛍光粒子の粒径の変動係数が３５％の場合の輝度積算値の分布を示す図である。
【図１４】図５のステップＳ６の処理の詳細を示すフローチャートである。
【図１５】最低輝点値を算出する方法の例を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。【００２０】
＜病理診断支援システム１００の構成＞
図１に、本発明の組織評価方法を用いた病理診断支援システム１００の全体構成例を示す。病理診断支援システム１００は、所定の染色試薬で染色された組織標本の顕微鏡画像を取得し、取得された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織標本における特定の生体物質の発現を定量的に表す特徴量を出力するシステムである。【００２１】
図１に示すように、病理診断支援システム１００は、顕微鏡画像取得装置１Ａと、画像処理装置２Ａと、がケーブル３Ａ等のインターフェースを介してデータ送受信可能に接続されて構成されている。なお、顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２Ａとの接続方式は特に限定されない。例えば、顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２ＡはＬＡＮ（Local  Area  Network）により接続されることとしてもよいし、無線により接続される構成としてもよい。【００２２】
顕微鏡画像取得装置１Ａは、公知のカメラ付き光学顕微鏡であり、スライド固定ステージ上に載置されたスライド上の組織標本の顕微鏡画像を取得し、画像処理装置２Ａに送信するものである。
顕微鏡画像取得装置１Ａは、照射手段、結像手段、撮像手段、通信Ｉ／Ｆ等を備えて構成されている。照射手段は、光源、フィルター等により構成され、スライド固定ステージに載置されたスライド上の組織標本に光を照射する。結像手段は、接眼レンズ、対物レンズ等により構成され、照射した光によりスライド上の組織標本から発せられる透過光、反射光、又は蛍光を結像する。撮像手段は、ＣＣＤ(Charge  Coupled  Device)センサー等を備え、結像手段により結像面に結像される像を撮像して顕微鏡画像のデジタル画像データを生成する顕微鏡設置カメラである。通信Ｉ／Ｆは、生成された顕微鏡画像の画像データを画像処理装置２Ａに送信する。本実施形態において、顕微鏡画像取得装置１Ａは、明視野観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた明視野ユニット、蛍光観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた蛍光ユニットが備えられており、ユニットを切り替えることにより明視野／蛍光を切り替えることが可能である。【００２３】
なお、顕微鏡画像取得装置１Ａとしては、カメラ付き顕微鏡に限定されず、例えば、顕微鏡のスライド固定ステージ上のスライドをスキャンして組織標本全体の顕微鏡画像を取得するバーチャル顕微鏡スライド作成装置（例えば、特表２００２−５１４３１９号公報参照）等を用いてもよい。バーチャル顕微鏡スライド作成装置によれば、スライド上の組織標本全体像を表示部で一度に閲覧可能な画像データを取得することができる。【００２４】
画像処理装置２Ａは、顕微鏡画像取得装置１Ａから送信された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織標本における特定の生体物質の発現分布を算出する。
図２に、画像処理装置２Ａの機能構成例を示す。図２に示すように、画像処理装置２Ａは、制御部２１、操作部２２、表示部２３、通信Ｉ／Ｆ２４、記憶部２５等を備えて構成され、各部はバス２６を介して接続されている。【００２５】
制御部２１は、ＣＰＵ（Central  Processing  Unit）、ＲＡＭ（Random  Access  Memory）等を備えて構成され、記憶部２５に記憶されている各種プログラムとの協働により各種処理を実行し、画像処理装置２Ａの動作を統括的に制御する。例えば、制御部２１は、記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により画像解析処理（図５参照）を実行し、第１算出工程、第２算出工程、及び第３算出工程、表示制御工程を実行する手段としての機能を実現する。【００２６】
操作部２２は、文字入力キー、数字入力キー、及び各種機能キー等を備えたキーボードと、マウス等のポインティングデバイスを備えて構成され、キーボードで押下操作されたキーの押下信号とマウスによる操作信号とを、入力信号として制御部２１に出力する。【００２７】
表示部２３は、例えば、ＣＲＴ（Cathode  Ray  Tube）やＬＣＤ（Liquid  Crystal  Display）等のモニタを備えて構成されており、制御部２１から入力される表示信号の指示に従って、各種画面を表示する。本実施形態において、表示部２３は、例えば、画像解析結果を出力するための出力手段として機能する。【００２８】
通信Ｉ／Ｆ２４は、顕微鏡画像取得装置１Ａをはじめとする外部機器との間でデータ送受信を行なうためのインターフェースである。通信Ｉ／Ｆ２４は、明視野画像と蛍光画像の入力手段として機能する。【００２９】
記憶部２５は、例えばＨＤＤ（Hard  Disk  Drive）や半導体の不揮発性メモリー等で構成されている。記憶部２５には、前述のように各種プログラムや各種データ等が記憶されている。
その他、画像処理装置２Ａは、ＬＡＮアダプターやルーター等を備え、ＬＡＮ等の通信ネットワークを介して外部機器と接続される構成としてもよい。【００３０】
本実施形態における画像処理装置２Ａは、顕微鏡画像取得装置１Ａから送信された明視野画像及び蛍光画像を用いて解析を行うことが好ましい。
明視野画像は、Ｈ（ヘマトキシリン）染色試薬、ＨＥ（ヘマトキシリン−エオジン）染色試薬を用いて染色された組織標本を、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて明視野で拡大結像及び撮影することにより得られる顕微鏡画像であって、当該組織標本における細胞の形態を表す細胞形態画像である。ヘマトキシリンは青紫色の色素であり、細胞核、骨組織、軟骨組織の一部、漿液成分など（好塩基性の組織等）を染色する。エオジンは赤〜ピンク色の色素であり、細胞質、軟部組織の結合組織、赤血球、線維素、内分泌顆粒など（好酸性の組織等）を染色する。図３に、ＨＥ染色を行った組織標本を撮影した明視野画像の一例を示す。
蛍光画像は、特定の生体物質と特異的に結合及び／又は反応する生体物質認識部位が結合した蛍光物質を内包したナノ粒子（蛍光物質内包ナノ粒子又は蛍光粒子と呼ぶ）を含む染色試薬を用いて染色された組織標本に対し、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて所定波長の励起光を照射して蛍光物質内包ナノ粒子を発光（蛍光）させ、この蛍光を拡大結像及び撮影することにより得られる顕微鏡画像である。即ち、蛍光画像に現れる蛍光は、組織標本における、生体物質認識部位に対応する特定の生体物質の発現を示すものである。図４に、蛍光画像の一例を示す。【００３１】
＜蛍光画像の取得＞
ここで、蛍光画像の取得方法について、この蛍光画像の取得に際して用いられる染色試薬（蛍光物質内包ナノ粒子）、染色試薬による組織標本の染色方法等も含めて詳細に説明する。【００３２】
〔蛍光物質〕
蛍光画像の取得のための染色試薬に用いられる蛍光物質としては、蛍光有機色素及び量子ドット（半導体粒子）を挙げることができる。２００〜７００ｎｍの範囲内の波長の紫外〜近赤外光により励起されたときに、４００〜１１００ｎｍの範囲内の波長の可視〜近赤外光の発光を示すことが好ましい。【００３３】
蛍光有機色素としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Alexa  Fluor（インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（インビトロジェン社製）系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、ＮＢＤ系色素分子、ピレン系色素分子、Texas  Red系色素分子、シアニン系色素分子等を挙げることができる。【００３４】
具体的には、５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、及びAlexa  Fluor  350、Alexa  Fluor  405、Alexa  Fluor  430、Alexa  Fluor  488、Alexa  Fluor  500、Alexa  Fluor  514、Alexa  Fluor  532、Alexa  Fluor  546、Alexa  Fluor  555、Alexa  Fluor  568、Alexa  Fluor  594、Alexa  Fluor  610、Alexa  Fluor  633、Alexa  Fluor  635、Alexa  Fluor  647、Alexa  Fluor  660、Alexa  Fluor  680、Alexa  Fluor  700、Alexa  Fluor  750、BODIPY  FL、BODIPY  TMR、BODIPY  493／503、BODIPY  530／550、BODIPY  558／568、BODIPY  564／570、BODIPY  576／589、BODIPY  581／591、BODIPY  630／650、BODIPY  650／665（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Cy5、Cy5.5、Cy7等を挙げることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。【００３５】
量子ドットとしては、II−VI族化合物、III−V族化合物、又はIV族元素を成分として含有する量子ドット（それぞれ、「II−VI族量子ドット」、「III−V族量子ドット」、「IV族量子ドット」ともいう。）のいずれかを用いることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。【００３６】
具体的には、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅが挙げられるが、これらに限定されない。【００３７】
上記量子ドットをコアとし、その上にシェルを設けた量子ドットを用いることもできる。以下、本明細書中シェルを有する量子ドットの表記法として、コアがＣｄＳｅ、シェルがＺｎＳの場合、ＣｄＳｅ／ＺｎＳと表記する。例えば、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ、Ｓｉ／ＳｉＯ２、Ｓｉ／ＺｎＳ、Ｇｅ／ＧｅＯ２、Ｇｅ／ＺｎＳ等を用いることができるが、これらに限定されない。
量子ドットは必要に応じて、有機ポリマー等により表面処理が施されているものを用いてもよい。例えば、表面カルボキシ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）、表面アミノ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）等が挙げられる。【００３８】
〔蛍光物質内包ナノ粒子〕
本実施形態において蛍光物質内包ナノ粒子とは、蛍光物質がナノ粒子内部に分散されたものをいい、蛍光物質とナノ粒子自体とが化学的に結合していても、結合していなくてもよい。
ナノ粒子を構成する素材は特に限定されるものではなく、ポリスチレン、ポリ乳酸、シリカ、メラミン等を挙げることができる。【００３９】
本実施形態で用いられる蛍光物質内包ナノ粒子は、公知の方法により作製することが可能である。例えば、蛍光有機色素を内包したシリカナノ粒子は、ラングミュア  ８巻  ２９２１ページ（１９９２）に記載されているＦＩＴＣ内包シリカ粒子の合成を参考に合成することができる。ＦＩＴＣの代わりに所望の蛍光有機色素を用いることで種々の蛍光有機色素内包シリカナノ粒子を合成することができる。【００４０】
量子ドットを内包したシリカナノ粒子は、ニュー・ジャーナル・オブ・ケミストリー  ３３巻  ５６１ページ（２００９）に記載されているＣｄＴｅ内包シリカナノ粒子の合成を参考に合成することができる。【００４１】
蛍光有機色素を内包したポリスチレンナノ粒子は、米国特許４３２６００８（１９８２）に記載されている重合性官能基をもつ有機色素を用いた共重合法や、米国特許５３２６６９２（１９９２）に記載されているポリスチレンナノ粒子への蛍光有機色素の含浸法を用いて作製することができる。【００４２】
量子ドットを内包したポリマーナノ粒子は、ネイチャー・バイオテクノロジー１９巻６３１ページ（２００１）に記載されているポリスチレンナノ粒子への量子ドットの含浸法を用いて作製することができる。【００４３】
本実施形態で用いられる蛍光物質内包ナノ粒子の平均粒径は特に限定されないが、粒径が大きいものは抗原にアクセスしにくく、粒径が小さく輝度値が低いものは蛍光物質内包ナノ粒子の信号がバックグラウンドノイズ（カメラのノイズや細胞の自家蛍光）に埋もれてしまうことから、５０〜３００ｎｍ程度のものが好適である。
平均粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径を粒径として求めた。本願においては、１０００個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。変動係数も、１０００個の粒子の粒径分布から算出した値とした。【００４４】
蛍光物質内包ナノ粒子では、ナノ粒子に含まれる蛍光色素の密度が一定であれば、一粒子当たりの蛍光色素の量はナノ粒子の体積に比例し、すなわち、粒径の３乗に比例する。また、輝度値と蛍光色素の量は比例するため、１粒子当たりの輝度値もまた、粒径の３乗に比例する。つまり、蛍光粒子一粒子当たりの輝度値と粒径の間には正の相関がある。また、通常、化学工業的に作られるナノ粒子の粒径分布はｔ分布となり、粒径分布から輝度分布を容易に求めることができる。この原理を利用し、蛍光粒子の粒径分布から作成された輝度分布と、蛍光画像から得られた輝度分布を比較することにより、蛍光粒子一粒子当たりの平均輝度値を算出することができる。
実際のところ、蛍光物質内包ナノ粒子一粒子の輝度値と粒径の３乗の間には正の相関があり、蛍光物質内包ナノ粒子一粒子の粒径の分布曲線の形状はほぼｔ分布となって一致した。【００４５】
〔生体物質認識部位と蛍光物質内包ナノ粒子との結合〕
本実施形態に係る生体物質認識部位とは、目的とする生体物質と特異的に結合及び／又は反応する部位である。目的とする生体物質は、それと特異的に結合する物質が存在するものであれば特に限定されるものではないが、代表的にはタンパク質（ペプチド）および核酸（オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、抗体等が挙げられる。したがって、そのような目的とする生体物質に結合する物質としては、前記タンパク質を抗原として認識する抗体やそれに特異的に結合する他のタンパク質等、および前記核酸にハイブリタイズする塩基配列を有する核酸等が挙げられる。具体的には、細胞表面に存在するタンパク質であるＨＥＲ２に特異的に結合する抗ＨＥＲ２抗体、細胞核に存在するエストロゲン受容体（ＥＲ）に特異的に結合する抗ＥＲ抗体、細胞骨格を形成するアクチンに特異的に結合する抗アクチン抗体等があげられる。中でも抗ＨＥＲ２抗体及び抗ＥＲ抗体を蛍光物質内包ナノ粒子に結合させたものは、乳癌の投薬選定に用いることができ、好ましい。【００４６】
生体物質認識部位と蛍光物質内包ナノ粒子の結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合等の結合力の強い結合が好ましい。【００４７】
また、生体物質認識部位と蛍光物質内包ナノ粒子の間を連結する有機分子があってもよい。例えば、生体物質との非特異的吸着を抑制するため、ポリエチレングリコール鎖を用いることができ、ＳＭ（ＰＥＧ）１２（succinimidyl-［（N-maleomidopropionamid）-dodecaethyleneglycol］ester：サーモサイエンティフィック社製）を用いることができる。【００４８】
蛍光物質内包シリカナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が蛍光有機色素の場合でも、量子ドットの場合でも同様の手順を適用することができる。例えば、無機物と有機物を結合させるために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基を与えるアルコキシシリル基を有し、他端に、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、アルデヒド基等の官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物と結合する。具体的には、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ポリエチレングリコール鎖をもつシランカップリング剤（例えば、Gelest社製PEG-silane  no．SIM6492.7）等が挙げられる。シランカップリング剤を用いる場合、二種以上を併用してもよい。【００４９】
蛍光有機色素内包シリカナノ粒子とシランカップリング剤との反応手順は、公知の手法を用いることができる。例えば、得られた蛍光有機色素内包シリカナノ粒子を純水中に分散させ、アミノプロピルトリエトキシシランを添加し、室温で１２時間反応させる。反応終了後、遠心分離又はろ過により表面がアミノプロピル基で修飾された蛍光有機色素内包シリカナノ粒子を得ることができる。続いてアミノ基と抗体中のカルボキシル基とを反応させることで、アミド結合を介し抗体を蛍光有機色素内包シリカナノ粒子と結合させることができる。必要に応じて、ＥＤＣ（1-Ethyl-3-［3-Dimethylaminopropyl］carbodiimide  Hydrochloride：Pierce（登録商標）社製）のような縮合剤を用いることもできる。【００５０】
必要により、有機分子で修飾された蛍光有機色素内包シリカナノ粒子と直接結合しうる部位と、分子標的物質と結合しうる部位とを有するリンカー化合物を用いることができる。具体例として、アミノ基と選択的に反応する部位とメルカプト基と選択的に反応する部位の両方をもつsulfo-SMCC（Sulfosuccinimidyl  4［N-maleimidomethyl］-cyclohexane-1-carboxylate：Pierce社製）を用いると、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した蛍光有機色素内包シリカナノ粒子のアミノ基と、抗体中のメルカプト基を結合させることで、抗体結合した蛍光有機色素内包シリカナノ粒子ができる。【００５１】
蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が蛍光有機色素の場合でも、量子ドットの場合でも同様の手順を適用することができる。すなわち、アミノ基等の官能基をもつポリスチレンナノ粒子へ蛍光有機色素、量子ドットを含浸することにより、官能基をもつ蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子を得ることができ、以降ＥＤＣ又はsulfo-SMCCを用いることで、抗体結合した蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子ができる。【００５２】
特定抗原を認識する抗体としては、M.アクチン、M.S.アクチン、S.M.アクチン、ACTH、Alk-1、α1-アンチキモトリプシン、α1-アンチトリプシン、AFP、bcl-2、bcl-6、β-カテニン、BCA  225、CA19-9、CA125、カルシトニン、カルレチニン、CD1a、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD15、CD20、CD21、CD23、CD30、CD31、CD34、CD43、CD45、CD45R、CD56、CD57、CD61、CD68、CD79a、"CD99、MIC2"、CD138、クロモグラニン、c-KIT、c-MET、コラーゲン  タイプIV、Cox-2、サイクリンD1、ケラチン、サイトケラチン（高分子量）、パンケラチン、パンケラチン、サイトケラチン5/6、サイトケラチン  7、サイトケラチン  8、サイトケラチン8/18、サイトケラチン  14、サイトケラチン  19、サイトケラチン  20、CMV、E-カドヘリン、EGFR、ER、EMA、EBV、第VIII因子関連抗原、ファッシン、FSH、ガレクチン-3、ガストリン、GFAP、グルカゴン、グリコフォリン  A、グランザイムB、hCG、hGH、ヘリコバクターピロリ、HBc  抗原、HBs  抗原、ヘパトサイト特異抗原、HER2、HSV-I、HSV-II、HHV-8、IgA、IgG、IgM、IGF-1R、インヒビン、インスリン、カッパ  L鎖、Ki67、ラムダ  L鎖、LH、リゾチーム、マクロファージ、メランA、MLH-1、MSH-2、ミエロパーオキシダーゼ、ミオゲニン、ミオグロビン、ミオシン、ニューロフィラメント、NSE、p27(Kip1)、p53、p53、P63、PAX  5、PLAP、ニューモシスティス  カリニ、ポドプラニン（D2-40）、PGR、プロラクチン、PSA、前立腺酸性フォスファターゼ、Renal  Cell  Carcinoma、S100、ソマトスタチン、スペクトリン、シナプトフィジン、TAG-72、TdT、サイログロブリン、TSH、TTF-1、TRAcP、トリプターゼ、ビリン、ビメンチン、WT1、Zap-70が挙げられる。【００５３】
〔染色方法〕
以下、組織標本の染色方法について述べる。以下に説明する染色方法は組織標本に限定せず、細胞染色にも適用可能である。
また、以下に説明する染色方法が適用できる標本の作製法は特に限定されず、公知の方法により作製されたものを用いることができる。【００５４】
１）脱パラフィン工程
まず、操作者は、キシレンを入れた容器に組織標本を浸漬させ、パラフィンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
次いで、エタノールを入れた容器に組織標本を浸漬させ、キシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
次いで、水を入れた容器に組織標本を浸漬させ、エタノールを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中で水を交換してもよい。【００５５】
２）賦活化処理
操作者は、公知の方法にならい、目的とする生体物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％  尿素、０．１Ｍ  トリス塩酸緩衝液等を用いることができる。加熱機器は、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバス等を用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は５０〜１３０℃、時間は５〜３０分で行うことができる。
次いで、ＰＢＳ（Phosphate  Buffered  Saline：リン酸緩衝生理食塩水）を入れた容器に、賦活化処理後の標本を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。【００５６】
３）生体物質認識部位が結合された蛍光物質内包ナノ粒子を用いた染色
操作者は、生体物質認識部位が結合された蛍光物質内包ナノ粒子のＰＢＳ分散液を組織標本に載せ、目的とする生体物質と反応させる。蛍光物質内包ナノ粒子と結合させる生体物質認識部位を変えることにより、さまざまな生体物質に対応した染色が可能となる。数種類の生体物質認識部位が結合された蛍光物質内包ナノ粒子を用いる場合には、それぞれの蛍光物質内包ナノ粒子ＰＢＳ分散液を予め混合しておいてもよいし、別々に順次組織標本に載せてもよい。
温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、３０分以上２４時間以下であることが好ましい。
蛍光物質内包ナノ粒子による染色を行う前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳ等、公知のブロッキング剤を滴下することが好ましい。
次いで、ＰＢＳを入れた容器に、染色後の組織標本を浸漬させ、未反応蛍光物質内包ナノ粒子の除去を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。カバーガラスを組織標本に載せ、封入する。必要に応じて市販の封入剤を使用してもよい。
なお、ＨＥ染色試薬を用いて染色を行う場合、カバーガラスによる封入の前にＨＥ染色を行う。【００５７】
〔蛍光画像の取得〕
染色した組織標本に対し顕微鏡画像取得装置１Ａを用いて、広視野の顕微鏡画像（蛍光画像）を取得する。顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて、染色試薬に用いた蛍光物質の吸収極大波長及び蛍光波長に対応した励起光源及び蛍光検出用光学フィルターを選択する。
解析に用いられる蛍光顕微鏡画像（蛍光画像）の取得条件には特に制限はないが、対物レンズの倍率は４〜１００倍が好ましく、開口数（ＮＡ）は０．６以上が好ましく、さらに好ましくは０．８以上である。また、撮像するカメラのサンプリングピッチは、４００ｎｍ以下が好ましく、さらに好ましくは１５０ｎｍ以下である。
蛍光画像の視野は、３ｍｍ２以上であることが好ましく、３０ｍｍ２以上であることがさらに好ましく、３００ｍｍ２以上であることがさらに好ましい。【００５８】
＜病理診断支援システム１００の動作（画像処理方法を含む。）＞
以下、病理診断支援システム１００において、上記説明した蛍光画像及び明視野画像を取得して解析を行う動作について説明する。ここでは、特定のタンパク質（ここでは、乳癌組織におけるＫｉ６７タンパクとする。以下、特定タンパクと呼ぶ。）を認識する生体物質認識部位が結合した蛍光粒子を含む染色試薬を用いて染色された組織標本を観察対象とする場合を例にとり説明するが、これに限定されるものではない。【００５９】
まず、操作者は、ヘマトキシリン染色試薬と、特定タンパクを認識する生体物質認識部位が結合した蛍光粒子を蛍光標識材料とした染色試薬との、２種の染色試薬を用いて組織標本を染色する。
その後、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて、（ａ１）〜（ａ５）の手順により明視野画像及び蛍光画像が取得される。
（ａ１）操作者は、ヘマトキシリン染色試薬と蛍光粒子を含む染色試薬とにより染色された組織標本をスライドに載置し、そのスライドを顕微鏡画像取得装置１Ａのスライド固定ステージに設置する。
（ａ２）明視野ユニットに設定し、撮影倍率、ピントの調整を行い、組織上の観察対象の領域を視野に納める。
（ａ３）撮像手段で撮影を行って明視野画像の画像データを生成し、画像処理装置２Ａに画像データを送信する。
（ａ４）ユニットを蛍光ユニットに変更する。
（ａ５）視野及び撮影倍率を変えずに撮像手段で撮影を行って蛍光画像の画像データを生成し、画像処理装置２Ａに画像データを送信する。【００６０】
画像処理装置２Ａにおいては、明視野画像及び蛍光画像に基づき画像解析処理が実行される。
図５に、画像処理装置２Ａにおける画像解析処理のフローチャートを示す。図５に示す画像解析処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。【００６１】
まず、通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの明視野画像が入力されると（ステップＳ１）、制御部２１により、明視野画像から細胞核の領域の抽出が行われる（ステップＳ２）。
図６に、ステップＳ２における処理の詳細フローを示す。ステップＳ２の処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。【００６２】
ステップＳ２においては、まず、明視野画像のモノクロ画像への変換が行われる（ステップＳ２０１）。図７Ａに、明視野画像の一例を示す。
次いで、モノクロ画像に対し予め定められた閾値を用いて閾値処理が施され、各画素の値が二値化される（ステップＳ２０２）。【００６３】
次いで、ノイズ処理が行われる（ステップＳ２０３）。ノイズ処理は、具体的には、二値画像にクロージング処理が施されることにより行うことができる。クロージング処理は、膨張処理を行ってから同じ回数分だけ収縮処理を行う処理である。膨張処理は、注目画素からｎ×ｎ画素（ｎは２以上の整数）の範囲内にある画素に１つでも白が含まれている場合に注目画素を白に置き換える処理である。収縮処理は、注目画素からｎ×ｎ画素の範囲内にある画素に１つでも黒が含まれている場合に注目画素を黒に置き換える処理である。クロージング処理により、ノイズ等の小さい領域を除去することができる。図７Ｂに、ノイズ処理後の画像の一例を示す。図７Ｂに示すように、ノイズ処理後には、細胞核が抽出された画像（細胞核画像）が生成される。【００６４】
次いで、ノイズ処理後の画像にラベリング処理が施され、抽出された細胞核のそれぞれにラベルが付与される（ステップＳ２０４）。ラベリング処理とは、連結している画素に同じラベル（番号）を付与していくことで画像内のオブジェクトを識別する処理である。ラベリング処理により、ノイズ処理後の画像から各細胞核を識別してラベルを付与することができる。【００６５】
一方、通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの蛍光画像が入力されると（ステップＳ３）、制御部２１により、蛍光画像から輝点領域が抽出される（ステップＳ４：第１算出工程）。
図８に、ステップＳ４における処理の詳細フローを示す。ステップＳ４の処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。【００６６】
ステップＳ４においては、まず、蛍光画像から蛍光輝点の波長に応じた色成分の抽出が行われる（ステップＳ４０１）。
図９Ａに、蛍光画像の一例を示す。
ステップＳ４０１では、たとえば、蛍光粒子の発光波長が５５０ｎｍである場合には、その波長成分を有する蛍光輝点のみが画像として抽出される。【００６７】
次いで、抽出された画像に閾値処理が施されて二値化画像が生成され、輝点領域が抽出される（ステップＳ４０２）。
なお、閾値処理の前に細胞自家蛍光や他の不要信号成分等のノイズ除去処理が施されてもよく、ガウシアンフィルタ等のローパスフィルタや二次微分等のハイパスフィルタが好ましく用いられる。
図９Ｂに、輝点領域が抽出された輝点領域画像の一例を示す。図９Ｂに示すように、かかる画像では蛍光輝点を中心とした輝点領域が抽出されている。【００６８】
次いで、輝点領域にラベリング処理が施され、抽出された輝点領域のそれぞれにラベルが付与される（ステップＳ４０３）。【００６９】
次いで、ステップＳ５において、制御部２１が輝点領域の輝度値を算出する工程（第１算出工程）を説明する。図１０Ａは、制御部２１により、ステップＳ４０２において、蛍光画像から輝点領域が抽出された画像の一例である。ステップＳ５では、輝点領域が抽出された画像に基づいて、輝点領域ごとに、輝点領域が抽出された画像と、その輝点領域に対応する部位の蛍光画像（図１０Ｃ）とが重ね合わされる。図１０Ｂは、図１０Ａ内の□で囲まれた領域の拡大図であり、１つの輝点領域を示す。図１０Ｃは、図１０Ｂの輝点領域に対応する部位の蛍光画像である。
次いで、輝点領域が抽出された画像（例えば、図１０Ｂ）をマスクとして、蛍光画像（例えば、図１０Ｃ）から、輝点領域に対応する第２の蛍光画像（図１０Ｄ）が生成される。【００７０】
その第２の蛍光画像の輝度値を画素ごとに計測し、Ｘ座標位置及びＹ座標位置に表示したものが、例えば図１０Ｅに示されるような輝度分布である。図１０Ｅに示される輝度値を輝点領域ごとに積算したものが、輝度積算値である。図１１Ａは、ステップＳ５において算出された輝度積算値に基づいて、横軸を輝度積算値、縦軸を頻度（蛍光画像内の全輝点領域数に対する比、又は輝点領域数）として作成された輝度分布曲線である。【００７１】
実際のところ、１つの輝点領域には１個または複数個の蛍光粒子が含まれ、例えば、蛍光粒子が１つ含まれる輝点領域、２つ含まれる輝点領域、３つ含まれる輝点領域、の輝度積算値は、図１１Ａに示すように、それぞれｔ分布に近い形状の分布曲線を示す。そして、これらの分布を全て加算した値をプロットした曲線（図１１Ａ太線）が、蛍光画像から実際に計測される輝度分布曲線である。【００７２】
図１２Ａ〜図１２Ｆ及び図１３Ａ〜図１３Ｆは、粒径の変動係数に応じた輝度積算値の分布曲線をシミュレーションした図である。図１２Ａ〜図１２Ｆは、目的とする生体物質が低密度で発現し、輝点領域の総数のうち８０％以上が蛍光粒子を１つ含む輝点領域である場合、図１３Ａ〜図１３Ｆは、目的とする生体物質が高密度で発現し、蛍光粒子を１つ含む輝点領域が輝点領域の総数のうち４０％以下の場合である。
蛍光粒子の粒径のばらつきが比較的小さく、例えば、粒径の変動係数が５％である時は、図１２Ａ及び図１３Ａに示すように、１つの輝点領域に含まれる蛍光粒子が１つの場合、２つの場合、３つの場合、の輝度積算値の分布がほぼ分離しているため、輝度分布曲線（太線）において、それぞれの場合のピークが明確に現れ、各ピークの輝度積算値を正確に読み取ることができる。【００７３】
つまり、輝度分布曲線に現れるピークのうち、最も輝度積算値が小さいピークは、蛍光粒子を１つ含む輝点領域の輝度積算値の分布のピークと一致する。そして、蛍光粒子一粒子当たりの輝度積算値の分布は、前述したように蛍光粒子の粒径の分布の３乗と一致しており、いずれもｔ分布となるので、ピークの輝度積算値は平均輝度値と一致する。
従来の方法（例えば、特許文献２（国際公開第２０１２／０２９３４２号）に記載された方法）においては、計測された輝度分布曲線における最も輝度積算値が小さいピークの輝度積算値を読み取り、この輝度積算値が一蛍光粒子当たりの平均輝度値であるとして、輝点領域内の蛍光粒子数を算出している。【００７４】
図１２Ｂ及び図１３Ｂに示すように、変動係数が１０％である時の輝度分布曲線においては、輝点領域に含まれる蛍光粒子数が２つ又は３つである場合のピークは不明瞭となるが、１つである場合のピークは明確に現れており、このピークの輝度積算値から一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出することができる。【００７５】
変動係数が大きくなるに従って、蛍光粒子を１つ含む輝点領域の輝度積算値の分布のピークと２つ含む輝点領域の輝度積算値の分布の重なりが大きくなるため、輝度分布曲線における最も輝度積算値が小さいピークは、蛍光粒子を１つ含む輝点領域の輝度積算値の分布のピークに対して、高輝度方向にずれる（図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１３Ｃ、及び図１３Ｄ）。特定タンパクの密度が高いほど、１つの輝点領域内に複数の蛍光粒子が含まれる確率が大きくなるため、このピークのずれは顕著になる。【００７６】
例えば、変動係数が１５％では、特に目的とする生体物質が多い場合には、輝度分布曲線における最も輝度積算値が小さいピークは、蛍光粒子を１つ含む輝点領域の輝度積算値の分布のピークに対して、高輝度方向にずれた位置に現れる（図１３Ｃ）。
変動係数が２０％では、１つの輝点領域に含まれる蛍光粒子が１つの場合、２つの場合、及び３つの場合、の輝度積算値の分布領域の重なりが大きいため、輝点領域に含まれる蛍光粒子数に対応するピークを輝度分布曲線から読み取ることはできない（図１３Ｄ）。【００７７】
このように、変動係数が１５％以上では、輝度分布曲線に現れる最も輝度積算値が小さいピークと、蛍光粒子を１つ含む輝点領域の輝度積算値の分布のピークがずれるため、従来の方法を用いて一蛍光粒子当たりの平均輝度値を正確に算出することができない場合がある。【００７８】
しかし、輝度分布曲線における最も輝度積算値が小さいピークと蛍光粒子を１つ含む輝点領域の輝度積算値の分布のピークがずれている場合であっても、図１２Ａ〜図１２Ｅ及び図１３Ａ〜図１３Ｅに示すように、低輝度領域においては、測定された輝度分布曲線と、蛍光粒子を１つ含む輝点領域輝度積算値の分布はほぼ重なる。そこで、制御部２１は、本発明のステップＳ６において、輝度分布曲線の低輝度領域の部分に基づいて一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出することとすれば、一蛍光粒子当たりの平均輝度値を正確に算出することができる。
低輝度領域とは、具体的には、例えば、図１２Ａ〜図１２Ｅ及び図１３Ａ〜図１３Ｅに示すような輝度分布曲線において接線の傾きが最大となる点の輝度積算値以下の輝度領域を指す。【００７９】
なお、変動係数が３０％を上回ると、例えば図１２Ｆ及び図１３Ｆに示すように、低輝度領域においても、測定された輝度分布曲線と、蛍光粒子を１つ含む輝点領域輝度積算値の分布にずれが生じる場合があるという観点から、本方法においては、変動係数が３０％以下の蛍光粒子を用いることが好ましく、２０％以下のものを用いると更に好適である。
なお、例えば観察対象の標本における特定タンパクの発現密度が低い場合には、変動係数が３０％以上であっても、低輝度領域部分における測定された輝度分布曲線と、蛍光粒子が１つの場合の輝度積算値の分布のずれが生じない場合もある。その場合には、本発明の方法を好適に用いて一蛍光粒子当たりの平均輝度値を正確に算出することができる。
また、蛍光粒子の粒径のばらつきが大きい場合は、蛍光粒子の粒径が大きいほど抗原に結合しにくく、抗原へのアクセスがばらつくという観点からも、変動係数が３０％以下のものを用いることが好ましく、２０％以下のものを用いると更に好適である。【００８０】
図１４に、ステップＳ６における処理の詳細フローの一例を示す。
まず、制御部２１は、ステップＳ５で算出された輝度積算値に基づいて輝度分布曲線を作成する（ステップＳ６０１）。次いで、記憶部２５に記憶されている蛍光粒子の粒径のデータに基づく粒径の分布（図１１Ｂ）及び平均値を、輝度分布曲線と照合する（ステップＳ６０２）。輝度分布曲線の低輝度領域部分は、蛍光粒子を１つ含む輝点領域の輝度積算値の分布の低輝度領域部分を反映しており、さらに、前述したように含まれる蛍光粒子が１つである輝点領域の輝度積算値の分布と粒径分布はほぼ一致するので、ステップＳ６０１で作成された輝度分布曲線の低輝度領域部分と、記憶部２５に記憶されている粒径のデータから作成された粒径分布曲線の小粒径部分の形状は、図１１Ａに示すように重ね合わせることができる。【００８１】
図１１Ａのように輝度分布曲線に粒径分布曲線を重ね合わせて照合することで、制御部２１はステップＳ３で取得された蛍光画像における一蛍光粒子当たりの平均輝度値Ｓ（ａ）を算出することができる（ステップＳ６０３：第２算出工程）。
具体的には、制御部２１は、例えば、図１１Ａに示されるように、輝度分布曲線において接線の傾きが最大となる部分よりも低輝度の領域と、粒径分布曲線において接線の傾きが最大となる部分よりも粒径が小さい領域を重ね合わせ、輝度分布曲線上での平均粒径（図１１Ｂ内の矢印）の位置を、一蛍光粒子当たりの平均輝度値Ｓ（ａ）として算出する（ステップＳ６０３）。【００８２】
次いで、制御部２１は、各輝点領域の輝度積算値を、一蛍光粒子当たりの平均輝度値Ｓ（ａ）で割ることによって、各輝点領域に含まれる蛍光粒子数を算出する（ステップＳ６０４：第３算出工程）。算出された輝点領域ごとの蛍光粒子数の情報は、ステップＳ４０３で付与した輝点領域のラベルの情報に追加され（ステップＳ６０５）、蛍光画像内の蛍光粒子数が算出可能となる。【００８３】
ステップＳ２とステップＳ６の処理の終了後、図５の処理に戻り、制御部２１により細胞核画像（図７Ｂ）と輝点領域画像（図９Ｂ）の加算処理が行われ（ステップＳ７）、細胞核上における輝点領域の分布が画像処理装置２Ａの表示部２３に表示される（表示制御工程）。これにより、操作者は蛍光粒子の分布をより詳細に知ることができるため好ましい。
表示部２３に表示される画像は、組織標本における特定タンパクの発現を示す画像と細胞の形態（本実施形態においては、例えば、細胞核の形態）を示す画像を組み合わせたものであれば任意であり、例えば、制御部２１は、輝点領域画像（図９Ｂ）と明視野画像（図７Ａ）、又は蛍光画像（図９Ａ）と細胞核画像（図７Ｂ）を加算して表示してもよい。【００８４】
また、制御部２１は、ステップＳ６０４において算出された輝点領域当たりの蛍光粒子数を蛍光画像又は輝点領域画像上に表示し、さらに細胞核画像を加算して表示しても良い。これにより、操作者は蛍光粒子の分布をさらに詳細に知ることができるため好ましい。各輝点領域に含まれる蛍光粒子数の表示方法は任意であるが、例えば、輝点領域の近傍に蛍光粒子数を文字や記号で表示しても良いし、または、含まれる蛍光粒子数に応じて、輝点領域の色や大きさ等の任意のパラメータを変化させて表示しても良い。また、各輝点領域における個々の蛍光粒子の位置を公知の任意の方法によって算出して、その位置を表示する画像を作成し、細胞核画像と加算して表示しても良い。
次いで、一細胞核当たりの蛍光粒子数が算出される（ステップＳ８）。【００８５】
以上の本発明の実施形態によれば、ステップＳ１〜Ｓ２の処理により細胞核が抽出され、ステップＳ３〜Ｓ６の処理により、各輝点領域の蛍光粒子数が算出され、ステップＳ７〜Ｓ８の処理により、細胞核上での輝点領域の分布が具体的に表示され把握されるようになっている。このように、輝度分布曲線の低輝度領域部分に基づいて一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出することによって、粒径のばらつきが大きい場合であっても、各輝点領域における蛍光粒子の数を算出し、観察対象細胞核上での特定生体物質の発現数を正確に定量することができる。【００８６】
＜変形例＞
上記実施形態のステップＳ６の第２算出工程において、一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出する方法の変形例を説明する。
前述したように、輝度分布曲線の低輝度領域部分は、含まれる蛍光粒子が１つである輝点領域の輝度積算値の分布の低輝度領域部分を反映しており、さらに、蛍光粒子を１つ含む輝点領域の輝度積算値の分布と粒径の３乗の分布はほぼ一致していずれもｔ分布となる。
ｔ分布（ここでは、横軸を輝度積算値、縦軸を頻度として説明する）の曲線において、傾きが最大となる接線を引くと、その接線と横軸（頻度＝０の直線）との交点の輝度積算値は、ｔ分布における９５％信頼区間の下側臨界値（＝平均値−２×標準偏差）に相当する。このｔ分布の性質に基づいて、以下に具体的に説明するように、一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出することができる。
本変形例の第２算出工程において、制御部２１は、まず、図１５に示されるように、輝度分布曲線の低輝度領域部分において傾きが最大となる接線と横軸（頻度＝０の直線）との交点の輝度積算値を、撮影された蛍光画像における最低輝点値（Ｓ（ｍ））とする。【００８７】
最低輝点値Ｓ（ｍ）に基づく一蛍光粒子当たりの平均輝度値Ｓ（ａ）の算出は、例えば、ｔ分布に基づいて導かれた下記の式（１）を用いる。
Ｓ（ａ）＝Ｓ（ｍ）／（１−ｋ×ｃ）３、（ただし、１．６≦ｋ≦３．３）・・・（１）
ただし、ｃは粒径の変動係数である。
また、ｋは、最低輝点値Ｓ（ｍ）の導出方法に応じて決まる値である。具体的には、導出された最低輝点値Ｓ（ｍ）が、ｔ分布である蛍光粒子一粒子の輝度分布において有意水準ｐ％の輝度範囲内の最小の輝度積算値と等しい場合、当該ｔ分布における有意水準ｐ％、自由度∞に対応する臨界値をｋとする。例えば、前述した接線を用いる方法で導出された最低輝点値Ｓ（ｍ）は、蛍光粒子一粒子の輝度分布の有意水準９５％の輝度範囲の最小値に相当するため、このときのｋは、ｔ分布における有意水準９５％、自由度∞に対応する臨界値である１．９に設定される。
検討の結果、最低輝点値Ｓ（ｍ）が有意水準９０％以上９９．９％以下の臨界値である場合に、大きな乖離なく一蛍光粒子当たりの平均輝度値Ｓ（ａ）が算出されたことから、ｋの好適な範囲は１．６≦ｋ≦３．３であった。また、最低輝点値Ｓ（ｍ）が有意水準９０％以上９９％以下の臨界値である場合には、一蛍光粒子当たりの平均輝度値Ｓ（ａ）の乖離がさらに小さかったことから、ｋのさらに好適な範囲は１．６≦ｋ≦２．６であった。
以上の本変形例において式（１）より平均輝度値Ｓ（ａ）を算出した後、上記実施形態のステップＳ６０４以降と同様の工程を実施してり、輝点領域当たりの蛍光粒子数を算出する。【００８８】
なお、上記実施形態における記述内容は、本発明の好適な一例であり、これに限定されるものではない。【００８９】
また、上記実施形態では、ステップＳ５で算出した各輝点領域の輝度積算値を、ステップＳ６において一蛍光粒子当たりの平均輝度値で割ることによって、各輝点領域に含まれる蛍光粒子の数を算出したが、ステップＳ８で表示される細胞核上の輝点領域の分布から、細胞核当たりの輝点領域の輝度積算値を加算し、一蛍光粒子当たりの平均輝度値で割ることによって、細胞核当たりの蛍光粒子の総数を算出してもよい。また、蛍光画像全体における輝点領域の輝度値を加算し、一蛍光粒子当たりの平均輝度値で割ることによって、画像当たりの蛍光粒子の総数を算出してもよい。【００９０】
また、最低輝点値Ｓ（ｍ）の算出は、輝度分布曲線の低輝度領域に引いた接線を用いる方法に限られるものではなく、例えば、蛍光画像内の細胞の自家蛍光又は細胞が写っていない部分の輝度値から算出したバックグラウンドノイズの輝度値に対する低輝度領域の輝度値の比を用いる方法、蛍光画像内に観察される最も暗い輝点領域の輝度積算値とする方法、輝度分布曲線において接線の傾きが最大となる点の輝度積算値に予め設定された所定の値ｘ％を掛けた輝度積算値（ただし、５≦ｘ≦５０）とする方法など、任意の方法により算出することができる。【００９１】
また、上記実施形態では、特定タンパクの例として乳癌におけるＫｉ６７タンパクを挙げたが、これに限定されない。診断対象となる病変（がん）種に応じて、蛍光画像を取得する際の生体物質認識部位を異なるものとすれば、病変種に応じた特定タンパクの発現量を定量的に示す特徴量を医師に提供することが可能となる。
また、上記実施形態では、１種の特定タンパクのみを対象としたが、複数の特定タンパクに対し、発光波長が互いに異なる２種以上の蛍光粒子を用いてもよい。
かかる場合、ステップＳ４０１においてフィルターワーク等を用いてそれぞれの色成分を抽出し、その抽出した色成分（波長成分）ごとにステップＳ４０２〜Ｓ６の処理を実行し、ステップＳ７において、細胞核画像と色成分ごと作成された蛍光粒子画像とを加算すればよい。【００９２】
また、蛍光粒子は、上記実施形態のように特定タンパクに結合する生体物質認識部位に直接結合されても良いが、免疫染色における公知の間接法のように、別の物質を介して間接的に結合されても良い。例えば、組織標本に特定タンパクを抗原とする一次抗体を反応させた後、一次抗体を抗原とする二次抗体に蛍光粒子を結合したものを反応させて染色しても良い。また、例えば、組織標本に特定タンパクを抗原とする一次抗体及び、一次抗体を抗原とするビオチン化二次抗体を反応させた後、ストレプトアビジンにより修飾された蛍光粒子を反応させて、ストレプトアビジンとビオチンが特異的に結合して複合体を形成することを利用して染色しても良い。【００９３】
また、上記の説明では、本発明に係るプログラムのコンピュータ読み取り可能な媒体としてＨＤＤや半導体の不揮発性メモリー等を使用した例を開示したが、この例に限定されない。その他のコンピュータ読み取り可能な媒体として、ＣＤ−ＲＯＭ等の可搬型記録媒体を適用することが可能である。また、本発明に係るプログラムのデータを、通信回線を介して提供する媒体として、キャリアウエーブ（搬送波）も適用される。【００９４】
その他、病理診断支援システム１００を構成する各装置の細部構成及び細部動作に関しても、発明の趣旨を逸脱することのない範囲で適宜変更可能である。
【実施例１】
【００９５】
（Ａ）染色試薬ａの作製
（Ａ−１）蛍光粒子の作製
蛍光色素として赤色発光色素であるSulforhodamine101（シグマアルドリッチ社製）１４．４ｍｇを水２２ｍＬに加えて溶解させた。その後、この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルジョン（登録商標）４３０（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製）の５％水溶液を２ｍＬ加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら７０℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）を０．６５ｇ加えた。
さらに、この溶液に界面活性剤としてドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）の１０％水溶液を１０００μＬ加え、７０℃で５０分間加熱撹拌した。その後、９０℃に昇温して２０分間加熱撹拌した。得られた蛍光色素結合メラミン樹脂粒子（蛍光粒子）の分散液から、余剰の樹脂原料や蛍光色素等の不純物を除くため、純水による洗浄を行った。
具体的には、遠心分離機（クボタ社製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて２００００Ｇで１５分間、遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再分散した。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による洗浄を５回繰り返した。得られた蛍光粒子はメラミン樹脂自体が骨格に多くのアミノ基を含むことから、プラス電荷となった。粒子の電荷の評価は、ＮＭＲやＩＲ等による樹脂成分分析と、ゼータ電位測定により行なった。【００９６】
得られた蛍光粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ；日立（登録商標）社製Ｓ−８００型）で観察したところ、平均粒径は１２５ｎｍ、粒径の変動係数は１０％であった。【００９７】
（Ａ−２）蛍光粒子への抗体の結合
下記工程（１）〜（１２）の方法により、蛍光粒子に対して抗Ｋｉ６７抗体を結合させた。
工程（１）：１ｍｇの蛍光粒子を純水５ｍＬに分散させた。次いで、アミノプロピルトリエトキシシラン水分散液（ＬＳ−３１５０、信越化学工業社製）１００μＬを添加し、室温で１２時間撹拌した。
工程（２）：反応混合物を１００００Ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程（３）：エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を１回ずつ行った。
得られたアミノ基修飾した蛍光粒子のＦＴ−ＩＲ測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基修飾されたことが確認できた。【００９８】
工程（４）：工程（３）で得られたアミノ基修飾した蛍光粒子を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳを用いて３ｎＭに調整した。
工程（５）：工程（４）で調整した溶液に、最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、succinimidyl-［（N-maleomidopropionamid）-dodecaethyleneglycol］ester）を混合し、１時間反応させた。
工程（６）：反応混合液を１００００Ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程（７）：ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行った。最後に５００μＬのＰＢＳを用いて再分散させ、抗体結合用マレイミド結合蛍光粒子を得た。【００９９】
工程（８）：抗Ｋｉ６７抗体１００μｇを１００μＬのＰＢＳに溶解させたところに、１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、３０分反応させた。
工程（９）：反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去し、蛍光粒子に結合可能な還元化抗Ｋｉ６７抗体溶液を得た。【０１００】
工程（１０）：蛍光粒子を出発原料として工程（７）で得られた粒子分散液と工程（９）で得られた還元化抗Ｋｉ６７抗体溶液とをＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。
工程（１１）：１０ｍＭメルカプトエタノール４μＬを添加し、反応を停止させた。
工程（１２）：反応混合物を１００００Ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行った。最後に５００μＬのＰＢＳを用いて再分散させ、抗Ｋｉ６７抗体が結合された蛍光粒子を得た。【０１０１】
以上の工程（１）〜（１２）によりナノ粒子を出発原料として得られた抗Ｋｉ６７抗体が結合された蛍光粒子を「染色試薬ａ」とする。【０１０２】
（Ｂ）蛍光粒子を用いた組織染色
下記工程（１）〜（１１）の方法により、染色試薬ａを用いて、ヒト乳房組織標本の免疫染色を行った。組織標本はコスモバイオ社製の組織アレイスライド（ＣＢ−Ａ７１２）を用いた。予めＤＡＢ染色によりＫｉ６７染色濃度を観察して、Ｋｉ６７の発現率（全細胞のうち、Ｋｉ６７を発現している細胞の割合（％））を計測した後、それぞれ染色を行った。【０１０３】
工程（１）：キシレンを入れた容器に組織標本を３０分浸漬させた。途中３回キシレンを交換した。
工程（２）：エタノールを入れた容器に組織標本を３０分浸漬させた。途中３回エタノールを交換した。
工程（３）：水を入れた容器に組織標本を３０分浸漬させた。途中３回水を交換した。
工程（４）：１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に組織標本を３０分浸漬させた。
工程（５）：１２１度で１０分オートクレーブ処理を行った。
工程（６）：ＰＢＳを入れた容器に、オートクレーブ処理後の組織標本を３０分浸漬させた。
工程（７）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを組織標本に載せて、１時間放置した。
工程（８）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．０５ｎＭに希釈した抗Ｋｉ６７抗体が結合された染色試薬ａを、組織標本に載せて３時間放置した。
工程（９）：ＰＢＳを入れた容器に、染色後の組織標本をそれぞれ３０分浸漬させた。
工程（１０）４％中性パラホルムアルデヒド溶液で１０分間固定処理した後、ヘマトキシリン染色を行った。
工程（１１）：Merck  Chemicals社製Aquatexを滴下後、カバーガラスを載せ封入した。【０１０４】
比較として、上記工程（８）において、組織標本を一次抗体である抗Ｋｉ６７モノクローナル抗体と反応させ、次いで二次抗体として０．８ｎｍ金コロイド標識２次抗体を用いて反応させた。続いて、銀増感試薬で金コロイドの粒径を増幅し、金コロイドの可視化を行なった。得られた標本を、１％四酸化オスミウムで４℃１時間後固定し、エタノール上昇系列で脱水後、ｔ−ブチルアルコールを使用して凍結乾燥装置ＪＦＤ−３００（日本電子株式会社製）で凍結乾燥し、イオンスパッタＥ−１０１０（日立ハイテクノロジーズ社製）でパラジウム蒸着を施した。【０１０５】
（Ｃ）画像解析処理
染色試薬ａを用いて染色した組織標本について、顕微鏡画像（明視野画像及び蛍光画像）を取得した。
顕微鏡として、カールツアイス社製正立顕微鏡Axio  Imager  M2を用い、画像取得撮影倍率を４０倍に設定した。蛍光画像の取得にあたっては、波長５８０ｎｍ、強度30ｍWの励起光を照射して、組織標本から発せられる６１０ｎｍの波長を有する蛍光を結像し、顕微鏡設置カメラ（モノクロ）により顕微鏡画像（画像データ）を取得した。
なお、上記カメラは画素サイズ６．４μｍ×６．４μｍ、縦画素数１０４０個、横画素数１３８８個（撮像領域８．９ｍｍ×６．７ｍｍ）を有している。【０１０６】
実施例１として、Ｋｉ６７発現率が約３０％の組織標本から得られた画像に図５の画像解析処理を実行し、上記変形例にて記載した輝度分布曲線の低輝度領域部分における傾きが最大となる接線を用いる方法によって最低輝点値Ｓ（ｍ）を算出し、一蛍光粒子当たりの平均輝度値及び、一細胞核当たりの蛍光粒子数を算出した。【０１０７】
比較例１として、実施例１と同様に作成した組織標本に対して、特許文献２（国際公開第２０１２−０２９３４２号）に記載された方法を用いて、一蛍光粒子当たりの平均輝度値及び、一細胞核当たりの蛍光粒子数を算出した。
具体的には、実施例１と同様に作成した輝度分布曲線から、最も輝度積算値が小さいピークの輝度積算値を読み取り、この輝度積算値が一蛍光粒子当たりの平均輝度値であるとして、一細胞核当たりの蛍光粒子数を算出した。【０１０８】
比較例２として、金コロイドでＫｉ６７を標識した組織標本を、日立走査型電子顕微鏡Ｓ−３０００Ｎで免疫ＳＥＭ観察を行ない、一細胞核当たりの蛍光粒子数を計測した。なお、比較例２の方法は、真値に近い値を導出することができる。【０１０９】
実施例１、比較例１及び２によって算出された一細胞核当たりの蛍光粒子数を、表１に示す。【０１１０】
【表１】
0005835536.tif 000002
【０１１１】
表１に示すように、実施例１の方法によって算出された一細胞核当たりの蛍光粒子数は、比較例２の方法で計測された一細胞核当たりの蛍光粒子数とほぼ一致した。
一方、比較例１の方法で算出された一細胞核当たりの蛍光粒子数は、実施例１及び比較例２と比べて少なく、クラスタ状の輝点領域内の輝点数を正確に算出することができなかった。
【実施例２】
【０１１２】
実施例１の（Ａ−１）と同様の材料及び方法を用いて、表２に示すように粒径の平均値及び変動係数が異なる蛍光粒子を作成した。（Ａ−２）蛍光粒子への抗体の結合、（Ｂ）蛍光粒子を用いた組織染色、の方法は、実施例１と同様である。
（Ｃ）画像解析処理
実施例２として、Ｋｉ６７低発現（発現率：１０％以下）及び高発現（発現率：６０％以上）の組織標本から、実施例１と同様の方法によって算出した最低輝点値Ｓ（ｍ）と、さらに式（１）を用いて、一蛍光粒子当たりの平均輝度値及び、一細胞核当たりの蛍光粒子数を算出した。なお、式（１）において、ｋ＝１．９として計算した。
実施例２、比較例１及び２によって算出された一細胞核当たりの蛍光粒子数を、表２に示す。【０１１３】
【表２】
0005835536.tif 000003
【０１１４】
表２に示すように、Ｋｉ６７が低発現又は高発現のいずれの場合においても、実施例２の方法によれば、比較例２の方法で計測された一細胞核当たりの蛍光粒子数と近い蛍光粒子数が算出された。
一方、比較例１の方法によれば、Ｋｉ６７が低発現であり、変動係数が１０％である組織標本３１６を除いては、実施例２及び比較例２と比べて蛍光粒子数が常に少なく算出されていた。特に、Ｋｉ６７が高発現であり、さらに変動係数が大きいほど、蛍光粒子数が少なく見積もられる傾向が見られた（組織標本３１７〜３２１）。【０１１５】
実施例２においても、蛍光粒子の粒径の変動係数が大きく、さらにＫｉ６７が高発現の場合には、算出した蛍光粒子数が比較例２と比べてやや少なくなる（組織標本３０６、３１５）が、比較例１の方法で算出された変動係数が小さい場合の蛍光粒子数（組織標本３１６〜３２１）と比較しても、高精度に算出された。
特に変動係数が３０％以下では、実施例２の方法で算出された蛍光粒子数（組織標本３０１〜３０５、３１０〜３１４）は比較例２で計測された蛍光粒子数（組織標本３２２〜３２３）と極めて近く、複数の蛍光粒子が含まれる輝点領域内の蛍光粒子数を正確に算出していると考えられる。
また、変動係数が１６％以下の場合は、Ｋｉ６７が高発現の場合であっても、実施例２の方法によれば、さらに正確に蛍光粒子数を算出可能である（組織標本３１０〜３１２）。【０１１６】
以上のように、本発明の輝度分布曲線の低輝度領域に基づいた定量方法によれば、簡易な光学顕微鏡を用いて、免疫電子顕微鏡法を用いた真値に近い値を得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明は、組織標本内での特定の生体物質の数を正確に定量できることを特徴とし、高精度な病理診断情報の生成に特に好適に利用することができる。
【符号の説明】
【０１１８】
１Ａ    顕微鏡画像取得装置
２Ａ    画像処理装置
３Ａ    ケーブル
２１    制御部（第１算出手段、第２算出手段、第３算出手段、表示制御手段）
２２    操作部
２３    表示部
２４    通信Ｉ／Ｆ（入力手段、明視野画像入力手段）
２５    記憶部
２６    バス
１００  病理診断支援システム
【要約】
蛍光物質を複数集積した蛍光粒子を染色試薬として用いて特定の生体物質が染色された組織標本の蛍光情報に基づいて前記生体物質の発現レベルを評価する組織評価方法において、前記組織標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する蛍光画像入力工程と、前記蛍光画像から輝点領域を抽出し、前記輝点領域の輝度値を算出する第１算出工程と、前記輝点領域の輝度値に基づいて輝度分布を作成し、当該輝度分布における所定の低輝度領域の輝度値に基づいて、予め設定された手法により一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出する第２算出工程と、前記平均輝度値に基づいて、前記輝点領域内の前記蛍光粒子の数を算出する第３算出工程と、を備え、前記低輝度領域は、横軸を前記輝点領域の輝度値、縦軸を頻度とする輝度分布曲線において、接線の傾きが最大となる点の輝度値以下の輝度領域であることを特徴とする。【図１】
0005835536.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0005835536.tif 000009
【図７Ａ】
0005835536.tif 000010
【図７Ｂ】
0005835536.tif 000011
【図８】
0005835536.tif 000012
【図９Ａ】
0005835536.tif 000013
【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
0005835536.tif 000015
【図１０Ｂ】
0005835536.tif 000016
【図１０Ｃ】
0005835536.tif 000017
【図１０Ｄ】
0005835536.tif 000018
【図１０Ｅ】
0005835536.tif 000019
【図１１Ａ】
0005835536.tif 000020
【図１１Ｂ】
0005835536.tif 000021
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
0005835536.tif 000023
【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
0005835536.tif 000026
【図１２Ｆ】
0005835536.tif 000027
【図１３Ａ】
0005835536.tif 000028
【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
0005835536.tif 000030
【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
0005835536.tif 000032
【図１３Ｆ】
0005835536.tif 000033
【図１４】
0005835536.tif 000034
【図１５】
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