(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルファウイルス核酸を含む、弱毒化、組換えアルファウイルスであって、
非構造タンパク質４（ｎｓＰ４）コード配列の末端及び前記アルファウイルスのサブゲノムＲＮＡコード配列の開始ＡＵＧとの間に（ｉ）不活性化したサブゲノムプロモータ、及び（ｉｉ）脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム侵入部位（ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ）の挿入を有し、
前記アルファウイルスは弱毒化していることを特徴とする弱毒化、組換えアルファウイルス。
【請求項２】
非構造タンパク質４（ｎｓＰ４）コード配列の末端及びアルファウイルス核酸のサブゲノムＲＮＡコード配列の開始ＡＵＧとの間のサブゲノムＲＮＡの５’ＵＴＲの欠損により前記サブゲノムプロモータが不活性化されていることを特徴とする請求項１に記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項３】
前記サブゲノムＲＮＡの５’ＵＴＲに配されるアルファウイルス核酸への集合点突然変異によって前記サブゲノムプロモータが不活性化されていることを特徴とする請求項１記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項４】
前記アルファウイルスがベネズエラウマ脳炎ウイルスであり、前記集合点突然変異が配列番号：１である５’ｃｃｃｃｕａｕａａｃｕｃｕｃｕａｃｇｇｃｕａａｃｃｕｇａａｕｇｇａｃｕａｃｇ３’の５、８、１１、１２、１４、１７、２０、２２、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０の位置で２以上の突然変異を含む同義の点突然変異であることを特徴とする請求項３記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項５】
サブゲノムプロモータの突然変異は、非構造タンパク質４のカルボキシ末端のアミノ酸配列を修飾しないことを特徴とする請求項３または４記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項６】
ウイルスの複製、放出及びウイルス力価を増加させるのに効果的な非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）における適応変異をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項７】
前記アルファウイルスがベネズエラウマ脳炎ウイルスであり、同義の適応変異は、ＴＣ−８３ウイルスｎｓＰ２タンパク質においてＹ３７０をＣに、Ｋ３７１をＱに、Ｐ３４９をＴに、Ｄ４１８をＡに、Ｋ４２３をＴに、又はこれらの組合せに対応する１以上のアミノ酸変化をもたらす核酸変異であることを特徴とする請求項６記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項８】
前記アルファウイルスがチクングンヤ熱ウイルスであることを特徴とする請求項１記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項９】
前記アルファウイルスが東部ウマ脳炎ウイルスであることを特徴とする請求項１記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項１０】
前記アルファウイルスがベネズエラウマ脳炎ウイルスであることを特徴とする請求項１記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項１１】
前記アルファウイルスが西部ウマ脳炎ウイルスであることを特徴とする請求項１記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項１２】
前記アルファウイルスが蚊及び蚊細胞において複製不可能であることを特徴とする請求項１記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項１３】
ａ）エンベロープ糖タンパク質遺伝子の下流と、アルファウイルスの３’ＵＴＲの上流に位置付けられるカプシド遺伝子と、
ｂ）エンベロープ糖タンパク質遺伝子の３’末端と、位置付けられたカプシド遺伝子との間に導入されたＥＭＣＶ  ＩＲＥＳと、
を含み、
これらの遺伝子が５’から３’方向へ、エンベロープ糖タンパク質遺伝子、挿入されたＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、位置づけられたカプシド遺伝子、３’ＵＴＲの順に位置づけられ、
ｃ）ＩＲＥＳの上流に位置づけられるエンベロープ糖タンパク質遺伝子がＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ非依存的な様式で翻訳される一方、位置づけられたカプシド遺伝子がＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ依存的な様式で翻訳され、
前記アルファウイルスが弱毒化していることを特徴とする弱毒化、組換えアルファウイルス。
【請求項１４】
請求項１または１３に記載の弱毒化、組換えアルファウイルスをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターを包含するとともに発現することを特徴とする宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１または１３に記載の弱毒化、組換えアルファウイルス及び薬学的に許容可能な担体を備えることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１７】
アルファウイルスへの曝露に起因する感染から被験体を保護する医薬組成物を製造するための、請求項１乃至１３いずれかに記載の弱毒化アルファウイルスの使用。
【請求項１８】
前記被験体が人、馬、又は他の家畜であることを特徴とする請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
蚊に感染することができない弱毒化、組換えアルファウイルスを作製する方法であって、
該方法は、脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム侵入部位（ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ）及び３’ＵＴＲの上流側に位置するサブゲノム領域の３’末端においてカプシド遺伝子を有するエンベロープ糖タンパク質の下流側カプシド遺伝子と、をクローニングする段階を含み、
前記エンベロープ糖タンパク質遺伝子はＣＡＰ依存的様式で翻訳され、カプシドタンパク質はＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ依存的様式で翻訳されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本国際出願は、２００８年１月２４日に出願され、現在放棄された米国仮特許出願Ｎｏ．６１／０６２、２２９号の利益を主張し、それらの内容の全ては参照として、本出願に組み込まれる。
連邦政府補助金の説明
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）／米国国立アレルギー・感染症研究所からの補助金１Ｕ５４ＡＩ０５７１５６を通じて得られた資金を一部使用してなされた。その結果として、連邦政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明の分野
本発明は、分子生物学、ウイルス学及びアルファウイルス属の免疫学に関する。更に具体的には、本発明は、弱毒化、蚊媒介感染能力を有さない組み換えアルファウイルス属を提供し、このようなアルファウイルス属を作り出す方法、及び免疫原性組成物の分野におけるこれら弱毒化アルファウイルス属の使用を開示する。
【背景技術】
【０００２】
関連分野の記述
トガウイルス科におけるアルファウイルス属は、多くの人及び動物の重要な病原体を有している。これらウイルスは、南極区を除いて広く全ての大陸に分布し、公共の健康に対する重要な脅威を示している（非特許文献１、非特許文献２）。自然状態下では、多くのアルファウイルス属は、蚊により感染し、一生の持続感染の原因となる。この持続的感染は、媒介生物である蚊において生物学的機能において殆ど影響を有さない。蚊による吸血の間に感染される脊椎動物において、アルファウイルス属は急性感染の原因となり、高感染価ウイルス血症を特徴とする。この高感染価ウイルス血症は、自然における新しい蚊の感染及び循環を前提条件としている。
【０００３】
ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）は、アルファウイルス属の最も病原性の強いウイルスの１つである。それは、南アメリカ、中央アメリカ及び北アメリカにおいて絶え間なく循環しており、人、馬及び他の家畜を含む散発的な異常発生及び動物間の流行病の原因となる。亜種ＩＣ  ＶＥＥＶを含むベネズエラ及びコロンビア（１９９５）におけるつい最近の大きな発生の間に、約１００，０００の人症例が発生し、３００を超える致命となる脳炎の症例が試算された（非特許文献３）。ＶＥＥＶによる動物間流行病の間、脳炎による馬の死亡率が８３％に達し、人における全体の死亡率が低い（＜１％）間、見当識障害、運動失調、精神的抑鬱及び痙攣を含む神経性疾患が、感染した個人の１４％まで、特に子供に（非特許文献４）見受けられた。ＶＥＥＶを原因とする人の疾患は、発熱性疾患として特徴付けられる。この発熱性疾患は、悪寒、激しい頭痛、筋肉痛、眠気及び咽頭炎を伴う。若年及び老年者は、極端なリンパの喪失を伴う網内系感染を発症し、次いで脳炎に至る。ＣＮＳ感染の結果は、急性髄膜炎であり、その急性髄膜炎が神経細胞の死滅を導くことになる（非特許文献５）。神経兆候は、病気の兆候から４−１０日以内に現れる。神経兆候としては発作、感覚異常、行動変化及び昏睡が挙げられる。
【０００４】
ＶＥＥＶの異常発生の継続的な脅威にかかわらず、このウイルスに対する安全で、効果的なワクチンが作られてこなかった。ＶＥＥＶの弱毒化ＴＣ−８３株は、モルモット心臓細胞（非特許文献６）におけるＶＥＥＶの強毒性トリニダードドンキー（ＴＲＤ）株の連続継代により４０年以上前に作成された。現在、ＴＣ−８３は、未だ実験室研究者及び軍関係者のための利用可能な唯一のワクチンである。８０００人以上の人々が予防接種され（非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）、その累積データは、全てのワクチン接種者の略４０％が発熱、全身病及び他の副作用を含む野生のＶＥＥＶの典型的な幾つかの兆候を有する疾患を発症することを明らかに示している（非特許文献７）。このＴＣ−８３株は、脳内及び皮下接種後（非特許文献１０）、一般に新生児マウスを殺すが、成体マウスを殺すことはない。従って、ウイルス病原性に関する更なる弱化及び変異株の効果の研究に対する良い出発物質である。
【０００５】
ＶＥＥＶゲノムは、略１２キロベース長であり、細胞内ｍ−ＲＮＡの構造を模倣している正極性の１本鎖のＲＮＡ分子である。そのゲノムＲＮＡは、５’メチルグアニレートキャップ及び３’ポリアデニル化された尾部（非特許文献１１）を有し、ゲノムＲＮＡのヌクレオカプシドからの放出後、直ちに宿主細胞機構によりウイルスタンパク質の翻訳をすることを特徴としている。そのゲノムの５’側３分の２が非構造タンパク質（ｎｓＰｓ）に翻訳される。この非構造タンパク質は、ウイルスゲノムの複製とサブゲノムＲＮＡの転写に必要な複製酵素複合体のウイルスの成分を含む。サブゲノムＲＮＡは、そのゲノムの３’側３分の１に対応している。サブゲノムＲＮＡは、サブゲノムプロモータから合成され、ウイルス構造タンパク質に翻訳される。ＶＥＥＶ  ＴＣ−８３株の弱毒化表現型は、その株のＴＲＤゲノム中の２つの変異の結果である。その内の１つはＥ２糖タンパク質における１２０位のアミノ酸置換であり、もう１つは５’ＵＴＲにおけるヌクレオチド３を変化させたものである（非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１１、非特許文献１４）。従って、アルファウイルスの非常に高い変異率のために、ＴＣ−８３の病原性の表現型への復帰が、適当な選択状態、例えばインビボでのウイルス継代が生じる場合において大きな懸念を残す。更には、ＶＥＥＶ  ＴＣ−８３は、蚊細胞内で複製が可能であるとともにワクチン接種の後に蚊に感染することが可能であり（非特許文献１５）、従って蚊による伝染が可能性として残る。
【０００６】
理想的には、生きたアルボウイルスは、媒介節足動物により伝染すべきではない。というのは、保有宿主の間の循環は、増大する病原性を含む予期しない変化を導くからである。復帰しやすい少数の弱毒化変異による野生型ウイルスから作り出された弱毒化株、或は予期しない方法で進化する遺伝的に修飾された株が生物媒介の循環を被る場合、これは特に当てはまる。前者リスクは、テキサスに限定されていた動物間流行病／異常発生の域外であるルイジアナにおいて、１９７１の間採取された蚊にＶＥＥＶ  ＴＣ−８３ワクチン株が検出されたことにより強調される（非特許文献１５）。
【０００７】
アルファウイルス属に対する感染性ｃＤＮＡの進歩によって、広範にウイルスゲノムを修飾することによりそれらの弱毒化を調査する機会が広がり、野生型である病原性の表現型への復帰を最小化又は排除する手法を広げた。更には、このようなアルファウイルス属のゲノムは、脊椎動物の細胞においてのみ機能し、起源である昆虫では機能しないＲＮＡ要素を含むよう設計される。従って、このような広範囲な変異は、蚊の媒介により遺伝子を修飾されたウイルスの感染を妨げることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Griffin, D.E.2001.Alphaviruses, p.917-962. In Knipe and Howley (ed.), Fields' Virology, Fourth Edition. Lippincott, Willams and Wikins, New York.
【非特許文献２】Strauss, J. H., E. G. Strauss, 1994., Microbiol.Rev. 58; 491-562.
【非特許文献３】Rivas, F. et al., 1997, J infect Dis 175:828-32
【非特許文献４】Johnson, K. and D. Martin. 1974. Adv. Vet. Sci. Comp. Med. 18:79-116.
【非特許文献５】Dal Canto, M. C., and S. G. Rabinowitz, 1981, J Neurol Sci 49: 397-418.
【非特許文献６】Berge, T. O. et al,. 1961, Am. J. Hyg. 73: 209-218.
【非特許文献７】Alevizatos, A. C. et al., 1967, Am J Trop Med Hyg 16: 762-8
【非特許文献８】Burke, D. S. et al., 1977, J Infect Dis 136: 354-9
【非特許文献９】Pittman, P. R. et al., 1996, Vaccine 14: 337-43.
【非特許文献１０】Paessler, S. et al., 2003, J Virol 77: 9278-86
【非特許文献１１】Kinney, R. M. et al., 1983, Virology 170: 19-30
【非特許文献１２】Davis, N. L. et al. 1991, Virology 183: 20-31
【非特許文献１３】Kinney, R. M. et al., 1993, J. Virol. 67: 1269-1277
【非特許文献１４】White, L. J. et al., 2001, J Virol 75: 3706-18
【非特許文献１５】Pedersen, C. E. et al., 1972, Am J Epidemiol 95: 490-6
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
人及び動物の病原体としての重要性、生物兵器としての潜在力、及び弱毒化アルファウイルス属の応用に関する問題にもかかわらず、先行技術は脊椎動物細胞においてのみ複製可能であるアルファウイルス属の弱毒化株を作り出す方法に欠けている。本発明は、この長年のニーズ及び本分野における要望を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一実施形態としては、弱毒化組換えアルファウイルスを作る出す方法を提供することである。このような方法としては、非構造タンパク質４（ｎｓＰ４）コード配列の末端及びサブゲノムＲＮＡの野生型５’ＵＴＲの代わりにアルファウイルスのサブゲノムＲＮＡコード配列の開始ＡＵＧとの間の脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ）の内部リボソーム侵入部位をクローニングする段階を含む。本発明の更なる関連実施形態としては、上記記載された方法により作る出される弱毒化組換えアルファウイルスである。
【００１１】
更に、もう一つの本発明の関連実施形態としては、弱毒化組換えアルファウイルスをコードする遺伝子配列を含むベクターと、このベクターを含むとともに発現する宿主細胞を提供することである。もう一つの更なる本発明の実施形態としては、医薬組成物を提供することである。この組成物は、上記記載された弱毒化組換えアルファウイルス及び薬学的許容可能な担体を含む。本発明の関連実施形態としては、免疫原性組成物を提供することである。この免疫原性組成物は、本明細書中で記載される弱毒化組換えアルファウイルスを含む。
【００１２】
本発明のもう一つの関連実施形態としては、アルファウイルスへの暴露に起因する感染から被験体を保護する方法を提供することである。このような方法としては、免疫学的に効果的な量の免疫原性組成物を投与する段階を含み、該免疫原性組成物は本明細書中で記載される弱毒化組換えアルファウイルスを含むことから、アルファウイルスへの暴露に起因する感染から個人を保護する段階を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｄは、ＢＨＫ−２１細胞中の組換えＥＭＣＶ  ＩＲＥＳをコードするＶＥＥＶ  ＴＣ−８３由来のウイルスの複製を示している。図１Ａは、設計されたウイルスゲノム、感染性センターアッセイ法（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｃｅｎｔｒｅ  Ａｓｓａｙ）におけるインビトロ合成ＲＮＡの感染力、インビトロ合成ＲＮＡ１ｍｇをＢＨＫ−２１細胞中へトランスフェクション後２４時間でのウイルス力価、及びトランスフェクション後４８時間でのＢＨＫ−２１細胞における指示ウイルスにより形成されたプラークのサイズの略図である。矢印は機能性サブゲノムプロモータを指す。黒箱は、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳを示す。
【図１Ｂ】図１Ａ−１Ｄは、ＢＨＫ−２１細胞中の組換えＥＭＣＶ  ＩＲＥＳをコードするＶＥＥＶ  ＴＣ−８３由来のウイルスの複製を示している。図１Bは、ＶＥＥＶ  ＴＣ−８３ゲノムのサブゲノムプロモータを含むフラグメント、及びＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳの対応するフラグメントのアライメントを示している。プロモータの位置は、開放箱により示されている。ＶＥＥＶ  ＴＣ−８３ゲノムにおけるサブゲノムＲＮＡの開始及びＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの開始は矢印により示されている。ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳゲノムに導入された変異は、小文字により示されている。
【図１Ｃ】図１Ａ−１Ｄは、ＢＨＫ−２１細胞中の組換えＥＭＣＶ  ＩＲＥＳをコードするＶＥＥＶ  ＴＣ−８３由来のウイルスの複製を示している。図１Ｃは、ウイルスによりＢＨＫ−２１細胞中に形成され、トランスフェクション後２４時間で採取されたプラークを示している。
【図１Ｄ】図１Ａ−１Ｄは、ＢＨＫ−２１細胞中の組換えＥＭＣＶ  ＩＲＥＳをコードするＶＥＥＶ  ＴＣ−８３由来のウイルスの複製を示している。図１Ｄは、ＢＨＫ−２１細胞へのインビトロ合成ＲＮＡ１ｍｇのトランスフェクション後のウイルスの複製を示している。
【図２Ａ】図２Ａ−２Ｃは、プラーク精製ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ変異株で見つかった変異を示している。これら変異株は、ＢＨＫ−２１細胞においてより効果的な複製、及びＶＥＥＶ  ＴＣ−８３及びＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳの複製の明確な適応変異の効果を示している。図２Ａは、ＶＥＥＶ  ＴＣ−８３の公開された配列と比較して、プラーク分離のゲノムにおいて見つかった変異のリストを示している。
【図２Ｂ】図２Ａ−２Ｃは、プラーク精製ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ変異株で見つかった変異を示している。これら変異株は、ＢＨＫ−２１細胞においてより効果的な複製、及びＶＥＥＶ  ＴＣ−８３及びＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳの複製の明確な適応変異の効果を示している。図２Ｂは、１又は両方の同定された変異を備えるＶＥＥＶ  ＴＣ−８３及びＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳゲノム、及び感染性センターアッセイ法におけるインビトロ合成ＲＮＡの感染力の略図である。機能的サブゲノムプロモータは矢印により示され、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳは黒箱により示されている。
【図２Ｃ】図２Ａ−２Ｃは、プラーク精製ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ変異株で見つかった変異を示している。これら変異株は、ＢＨＫ−２１細胞においてより効果的な複製、及びＶＥＥＶ  ＴＣ−８３及びＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳの複製の明確な適応変異の効果を示している。図２Ｃは、インビトロ合成ＲＮＡウイルスゲノム１ｍｇのトランスフェクション後のＢＨＫ−２１細胞における設計されたウイルスの複製を示している。
【図３Ａ】図３Ａ−３Ｂは、大きなプラークの表現型を示すＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ変異株のｎｓＰ２タンパク質において同定された変異を示す。図３Ａは、インビトロ合成ＲＮＡのトランスフェクション後２４時間で採取されたウイルスストックからプラーク精製分離株のゲノム中に同定された変異（原型）、及びベロ細胞において追加的に３回継代されたストックからの分離株のゲノム中に同定された変異（継代）のリストを示している。
【図３Ｂ】図３Ａ−３Ｂは、大きなプラークの表現型を示すＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ変異株のｎｓＰ２タンパク質において同定された変異を示す。図３Ｂは、ＶＥＥＶ  ｎｓＰ２における決定された変異の位置を示している。アルファウイルスｎｓＰ２における現在既知の機能的ドメインの位置が示されている。
【図４Ａ】図４Ａ−４Ｂは、インビトロ合成組換えウイルスＲＮＡと導入されたＢＨＫ−２１細胞におけるタンパク質及びＲＮＡ合成の分析を示している。細胞は、指示されたＲＮＡ４ｍｇでエレクトロポレーションされ、３５ｍｍ皿に播かれた。図４Ａにおいては、トランスフェクション４．５時間で、ウェル中の培地は１０％ＦＢＳ、ＡｃｔＤ（１ｇ／ｍｌ）及び［３Ｈ］ウリジン（２０Ｃｉ／ｍｌ）で補強された１ｍｌａＭＥＭにより置換された。３７℃で４時間インキュベーション後、ＲＮＡはアガロース電気泳動法により分離、解析された。ウイルスゲノム及びサブゲノムＲＮＡの位置はＧ及びＳＧにより個々に示されている。ＶＥＥＶ／ＩＲＥＳ特異的サブゲノムＲＮＡは、他のサブゲノムＲＮＡ生産ウイルスよりも大きく広がったバンドを形成する。これは、ゲル中で、ＶＥＥＶ／ＩＲＥＳ特異的サブゲノムＲＮＡが２８ＳリボソームＲＮＡと共に移動するからである。
【図４Ｂ】図４Ａ−４Ｂは、インビトロ合成組換えウイルスＲＮＡと導入されたＢＨＫ−２１細胞におけるタンパク質及びＲＮＡ合成の分析を示している。細胞は、指示されたＲＮＡ４ｍｇでエレクトロポレーションされ、３５ｍｍ皿に蒔かれた。図４Ｂにおいては、トランスフェクション後１２時間で、タンパク質が［３５Ｓ］メチオニンで代謝的に標識され、ドデシル硫酸ナトリウム１０％ポリアクリルアミドゲルにて解析された。分子量マーカ（ｋＤａ）の位置はゲルの左側に示されている。ウイルス構造タンパク質：Ｃ、Ｅ１及びｐ６２（Ｅ２の前駆体）の位置がゲルの右側に示されている。星印は、細胞タンパク質（熱ショックタンパク質）の位置を示し、ＩＲＥＳをコードするウイルスの複製により誘導される。
【図５Ａ】図５Ａ−５Ｃは、Ｃ７１０細胞における組換え体、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ含有ＶＥＥＶ変異株の継代を示す。図５Ａはウイルスの略図を示す。矢印は機能的サブゲノムプロモータの位置を示す。黒箱は、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの位置を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ−５Ｃは、Ｃ７１０細胞における組換え体、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ含有ＶＥＥＶ変異株の継代を示す。図５ＢはＣ７１０細胞における継代後、組換えウイルスの力価を示している。３５ｍｍ皿中の細胞は、インビトロ合成ＲＮＡ（Ｐ１）を用いてＢＨＫ−２１細胞のトランスフェクション後２４時間で、又はＣ７１０細胞の感染後４８時間のいずれかで採取したウイルス試料４００ｍｌを感染させられた。破線は、検出限界を示している。
【図５Ｃ】図５Ａ−５Ｃは、Ｃ７１０細胞における組換え体、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ含有ＶＥＥＶ変異株の継代を示す。図５Ｃは、プラーク精製されたＶＥＥＶ／ＩＲＥＳにおいて同定されたＩＲＥＳ含有配列の検出を示し、Ｃ７１０細胞における効率的な複製を示している。残りのＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ特異的配列は小文字により示されている。
【図６】図６はＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ／１及びＶＥＥＶ  ＴＣ−８３の複製を示している。細胞は１０ＰＦＵ／細胞のＭＯＩで感染させた。培地は指し示された時点で置換され、ウイルス力価はＢＨＫ−２１細胞のプラークアッセイにより測定された。同じ試料は、生物学的アッセイにおけるＩＦＮ−ａ／ｂ放出を測定するために使用された。放出されたＩＦＮ−ａ／ｂの濃度は、１ｍｌ当たりの国際単位（ＩＵ）で表されている。
【図７】図７はＶＥＥＶ  ＴＣ−８３及びＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ／１ウイルスで感染させたマウスの生存を示している。生後６日目のＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓマウスは、示されているウイルスの１０６ＰＦＵで脳内に接種された。動物は、２ヶ月間監視された。これらの何れの実験においても感染後９日後死亡するものはいなかった。
【図８】図８は、成体マウスのワクチン接種と暴露後の生存率を示している。５週から６週のメスＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓマウスは、１０６の用量でＶＥＥＶ株ＴＣ−８３又は組換えウイルスを用いて皮下に接種された。免疫３週間後、ＶＥＥＶ株３９０８の１０４ＰＦＵをマウスの皮下に暴露し、死亡率が記録された。
【図９】図９は蚊に感染することができない弱毒化組換えアルファウイルスを作り出す概略方法を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、アルファウイルスの弱毒化株を開発する新しい戦略を描くものである。これら弱毒化アルファウイルスは脊椎動物細胞においてのみ複製することができる。この表現型は、ウイルス構造タンパク質の翻訳及び最終的には脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ）の内部リボソーム侵入部位に依存するウイルス複製を与えることにより達成される。このような組換えウイルスは、新生児のマウスにおいて増殖可能であり、高い弱毒化の表現型を実証したにもかかわらず、ＶＥＥＶ感染に対して免疫防御を誘導した。更に、ホルマリン不活性化ワクチンは、高価であるとともに効果のないものである。これに加えて、これらワクチンは、複合的な連続ワクチン接種を必要とする。その上、ＶＥＥＶ感染に対する唯一利用可能な生弱毒化ワクチンは、ワクチン接種された馬で吸血中の蚊に感染する。明細書中で論じられる本弱毒化アルファウイルスは、不可逆であることから、現在利用可能なワクチンに勝る大きな利点を提供する。更に、遺伝子操作されたアルファウイルスは、蚊細胞で複製することができない。従って、遺伝子操作されたアルファウイルスは、蚊で複製することができないことから、自然界で循環することができない新しい生組換えウイルスを作り出す新規な手法を示唆している。
【００１５】
シンドビス・ウイルス及び他のアルファウイルスの感染性ｃＤＮＡクローンの開発は、ウイルスの生態及び発病機序の異なる側面を研究することを目的とする逆遺伝学実験だけでなく、新規な組換えワクチンの開発のための機会を広げた。組織培養又は鶏胚のいずれかで継代することによるウイルスの弱毒化は、構造及び非構造遺伝子、並びにウイルスゲノムのシス作用エレメントにおける僅かな点突然変異に起因している。例えば、ＶＥＥＶ  ＴＣ−８３ワクチン株は、この株が備える弱毒化を２つの点突然変異だけに起因しており、高い反応原性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）は、高い確率でこの弱毒化の機構の不安定さを反映している。このことは、ワクチン接種者におけるウイルス複製の間に野生株の病原性の表現型への復帰可能性についての懸念を提起している。変異の数は、化学薬品の突然変異によりさらに増加され得るが、この手法でもまた導入された変更を不可逆とすることはできない。ＲＮＡ＋ウイルスの感染性ｃＤＮＡクローンを用いた遺伝子操作は、ウイルスゲノムのより強力な組換えの大きな可能性を開くとともに、野生型ゲノム配列に復帰不可能である広範な欠損、又は変異株の免疫原生を向上する追加の遺伝子物質を導入する機会を提供する。
【００１６】
遺伝子的に変化したアルボウイルスは、蚊の媒介により自然の循環に導入され、蚊の中の場合又はウイルス血症の進行の間の脊椎動物の宿主のいずれかでの長期間の複製の間、更に進化することを示している。１つの実施例としては、馬科の動物において蚊に感染させるに十分なウイルス血症のレベルを生み出すことができるＶＥＥＶ  ＴＣ−８３の使用である。１９７１年のテキサスでの異常発生の間ルイジアナで採取された自然に感染した蚊からのＴＣ−８３の分離は弱毒化アルファウイルスの伝染の危険を強調した。従って、生ワクチン株の新しい世代を設計することにおいて、高度に弱毒化されただけでなく、脊椎動物起源の細胞においてのみ複製することができるアルボウイルスを作ることが将来に備えることである。これは、ウイルスゲノム中の細胞特異的ＲＮＡ要素をクローニングすることにより達成され得る。コオロギ麻痺ウイルス（Ｃｒｉｃｋｅｔ  ｐａｒａｌｙｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）ＩＲＥＳと対照的に、ＥＭＣＶ特異的要素は、節足動物細胞において非常に非効率的に機能すると予想された。
【００１７】
本発明において、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳは、ＩＲＥＳ従属ウイルス構造遺伝子の翻訳を構成するためにＶＥＥＶ  ＴＣ−８３ゲノムにクローン化された。ゲノムの１つは、機能性サブゲノムプロモータおよびサブゲノム ＲＮＡの５’ＵＴＲにおいてＩＲＥＳを包含した。このウイルスは、生存能力があるが、サブゲノムＲＮＡを生成するためのその能力は、更なる進化を促進し、この進化は結果として、ＩＲＥＳ欠損及び構造タンパク質のＣＡＰ依存の標準的な翻訳に対する復帰をもたらす。前者の欠損は、蚊細胞中で複製可能に行われた。サブゲノムプロモータにおける多重突然変異を備える第２の変異株は、ＣＡＰ依存の翻訳に復帰できなくする事に関して安定した。このような復帰は、ＩＲＥＳ欠損だけでなく、我々が１３の変異により不活性化にしたサブゲノムポロモータの復帰を要求することから、これら多重突然変異の直接復帰は、おそらく無視してもよいほどの危険を意味する。しかしながら、この変異株は、ｎｓＰ２遺伝子における追加の適応突然変異を蓄積することにより更なる効果的な複製表現型に進化する興味深い方法を生み出した。これらの変異は、ウイルスＲＮＡの複製、ウイルス構造タンパク質の合成、又は細胞における区画化を変化させることは全くなかった。検出された変異は、ゲノムのパッケージ化の効率を増大させ得る付加シグナルもまた生み出さなかった。従って、その機能の機構は、明らかになっていない。しかしながら、ＲＮＡ＋ウイルスのゲノムのパッケージ化が、複製複合体により強く決定されるとともに、そのゲノムが、機能性ｎｓＰｓにより粒子形成のための構造タンパク質に提供される必要があることを蓄積公開データは示唆している。本明細書中に記載の作業仮説とは、ｎｓＰ２のヘリカーゼドメイン（Ｈｅｌｉｃａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ）がヌクレオカプシド中のウイルスのパッケージ化のためのウイルスゲノムの提示部に含まれ得、これにより、同定された変異がこのプロセスの効率に関して正の効果を備えることである。
【００１８】
注目すべきは、本発明の目的が、媒介節足動物において複製不可能なＶＥＥＶ変異株を開発することであるとともに、より安定で、より弱毒化の表現型を明示することであった。ＩＦＮ−アルファ／ベータ−コンピテント細胞及びＩＦＮシグナル欠損ＢＨＫ−２１細胞の両方における設計ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ／１変異株の緩慢な増殖、組織培養中のＩＦＮ−アルファ／ベータの高いレベルを誘導する能力、脳内接種後でも新生児マウスを殺す能力を大幅に減少したこと、及び蚊細胞中で複製不可能であることは、この変異株がそれら必要条件を満たしていることを提示している。変異株の免疫原性は、異なる動物モデルで更に調査される。その上、他の脳炎アルファウイルス（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｅｎｉｃ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ）は、近年開発された他の方法と組み合わせて適用可能なＥＭＣＶ  ＩＲＥＳに基づく類似の方法を使用することにより弱毒化されると考えられる。
【００１９】
手短にいえば、本発明の目的は、弱毒化アルファウイルスの開発であり、脳炎誘発性アルファウイルスに対する新型ワクチンとしての応用である。脳炎誘発性アルファウイルスとしては、ＶＥＥＶ、ＥＥＥＶ及びＷＥＥＶ並びに人や家畜の病気の原因となるチクングンヤ熱ウイルスのような他のアルファウイルスが挙げられる。このようなアルファウイルスの複製はＥＭＣＶ  ＩＲＥＳに依存しており、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳはアルファウイルスを蚊細胞内又は媒介蚊中での複製を不可能にする。更に重要なことには、この表現型は、ウイルスゲノムに導入された大幅な組換えにより復帰しないことである。従って、これら新型変異株は、自然の媒介蚊による伝染の可能性の心配がなく予防接種に用いられる。
【００２０】
本発明は、弱毒化、組換えアルファウイルスを作製することに関し、本作製方法は非構造タンパク質４（ｎｓＰ４）コード配列の末端及び野生型５’ＵＴＲの代わりにアルファウイルスのサブゲノムＲＮＡコード配列の開始ＡＵＧとの間の脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ）の内部リボソーム侵入部位をクローニングする段階を含む。本方法は、サブゲノムＲＮＡにおける野生型５’ＵＴＲの集合点突然変異及び欠損によりアルファウイルスのサブゲノムプロモータを不活性化する段階を含む。更に、サブゲノムプロモータの不活性化は、非構造タンパク質４のカルボキシ末端を修飾することができない。加えて、本方法は、更に非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）における適応変異を導入する段階を含み、効果的にウイルスの複製、放出及びウイルス力価を増加させる。非構造タンパク質２における適応変異の実施例としては、Ｙ３７０をＣに、Ｋ３７１をＱに、Ｐ３４９をＴに、Ｄ４１８をＡに、Ｋ４２３をＴに、又はこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。更に、アルファウイルスの実施例としては、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）又はチクングンヤ熱ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
本発明は、また上記記載した方法により作製された弱毒化組換えウイルスに関する。このようなアルファウイルスは、蚊において複製せず、媒介蚊により伝染せず、ＩＦＮ−アルファ／ベータの高いレベルを誘導可能であり、ＩＦＮ−アルファ／ベータ細胞中での緩慢な増殖であり、ＩＦＮシグナル欠損ＢＨＫ−２１細胞における緩慢な増殖であり又はこれらの組合せとなり得る。
【００２２】
本発明は、更に上記記載された弱毒化組換えアルファウイルスをコードするヌクレオチド配列を備えるベクターに関し、該ベクターを包含するとともに発現する宿主細胞に関する。ベクターを構築し、細胞内で発現させることは既知であり、先行技術の標準的な技術である。従って、当該分野の当業者は、当該分野における利用可能な所定の実験及び知識に基づいてこれらベクターを構築することができる。
【００２３】
本発明は、更に、上記記載された弱毒化組換えアルファウイルスを含む医薬組成物と、薬学的に許容可能な担体に関する。本発明はまた、本明細書中に記載される弱毒化組換えアルファウイルスを備える免疫原性組成物に関する。
【００２４】
本発明は、更にアルファウイルスへの暴露に由来する感染から被験体を保護する方法に関し、該方法は上記記載された免疫原性組成物の免疫学的に効果的な量を投与する段階と、これによりアルファウイルスへの暴露に由来する感染から被験体を保護する段階とを備える。このような方法から利益を得る被験体は人或いは家畜であり得る。
【００２５】
本発明は更に、蚊に感染することができない弱毒化組換えアルファウイルスの作製方法に関し、該方法は、脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム侵入部位及び３’ＵＴＲのまさに上流側に位置するサブゲノム領域の３’末端においてカプシド遺伝子を有するエンベロープ糖タンパク質の下流側カプシド遺伝子と、をクローニングする段階を含み、該カプシドは、ＣＡＰ非依存的様式で発現されるとともにエンベロープタンパク質遺伝子はＣＡＰ依存的様式で翻訳されるが、カプシドタンパク質はＩＲＥＳ依存的様式で翻訳された。
【００２６】
明細書中で使用される用語、「ａ」又は「Ａ」は、１以上を意味する。特許請求の範囲の中で使用される単語「ａ」又は「Ａ」は、単語「包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同時に使用される場合、１又は１を超えることを意味する。明細書中で使用される「もう１つの（ａｎｏｔｈｅｒ）」又は「他の（ｏｔｈｅｒ）」は、同じ又は異なる特許請求の範囲の要素又は特許請求の範囲の構成の少なくとも第２の又はそれ以上のものを意味する。
【００２７】
明細書中に記載される組成物とは、当該分野での標準的な任意の方法、例えば、皮下に、静脈内に、非経口で、腹腔内に、皮内に、筋肉内に、局所に又は経鼻的に方法により全身的に又は局所的の何れかで独立に投与され得る。明細書中に記載される組成物の投薬量の処方は、従来の毒性のない、生理学的に又は薬学的に許容可能な担体或いは投与の方法に適した賦形剤を備え、投与量は当該分野の当業者によく知られている。
【００２８】
明細書中に記載される組成物は、治療効果に関する達成、維持又は改善を行うために１回以上個別に投与される。投薬量或いは組成物の最適な投薬量が１回投与又は複数回投与の何れを含むかを決定することは、当該分野の技術者によく知られている。適切な投薬量は、被験体の健康、アルファウイルスにより引起される免疫応答の誘導及び／又は感染の予防、処方の経路及び使用される投与法に依存する。
【００２９】
以下の実施例は本発明の様々な実施形態を例示することを目的としているが、本発明を任意の方法に限定することを意味しない。当業者は、本発明を順応させることによって本発明に記載される物、結果、及び利点と同様に目的を実行し、上記の結果及び利点を得ることを直ちに理解する。特許請求の範囲により決定される本発明の精神の中に含まれる変更及び他の使用は、当業者に思い浮かぶ。
【実施例】
【００３０】
［試験１］
細胞培養
ＢＨＫ−２１細胞は、Ｐａｕl  Ｏｌｉｖｏ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｏ）により提供され、ベロ細胞（Ｖｅｒｏ  ｃｅｌｌ）はＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｃｅ（Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  ＮＹ，  ＮＹ）により提供された。ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞は、アメリカン・タイプ・ティッシュ・カルチャー・コレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）から取得した。これら細胞株は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びビタミンで補強したアルファ最小必須培地（ａＭＥＭ）で３７℃に維持された。蚊Ｃ７１０細胞はＨｅｎｒｙ  Ｈｕａｎｇ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｏ）から取得し、１０％熱‐不活性ＦＢＳ及び１０％トリプトースリン酸ブイヨン（ＴＰＢ）で補強されたＤＭＥＭで増殖させた。
【００３１】
［試験２］
プラスミド構築
標準的な組換えＤＮＡ技術は、全てのプラスミド構築に利用された。地図及び配列は、要求により著者から入手できる。ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼプロモータの制御下にあるＶＥＥＶ  ＴＣ−８３ゲノムを有する原型プラスミド、ｐＶＥＥＶ  ＴＣ−８３は、文献に記載されている（Ｐｅｔｒａｋｏｖａ，Ｏ．  ｅｔ．ａｌ．，  ２００５，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９：７５９７−６０８）。ｐＶＥＥＶ／ＩＲＥＳは、ＥＭＣＶポリタンパク質の最初の４つのコドンを備えるＥＭＣＶ  ＩＲＥＳを包含した。この配列は、５’ＵＴＲの末端及び開始ＡＵＧの間のＶＥＥＶサブゲノムＲＮＡコード配列にクローン化された。ｐＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳは、ＶＥＥＶ  ＴＣ−８３ゲノムをコードし、ＶＥＥＶ  ＴＣ−８３ゲノム中のサブゲノムプロモータは、ｎｓＰ４のカルボキシ末端のアミノ酸配列を修飾しない集合点突然変異により、不活性化された（図１Ａ及び図１Ｂ）。このウイルスゲノムは欠損させたサブゲノムＲＮＡの５’ＵＴＲを有した。従って、ＶＥＥＶ  ＴＣ−８３の非構造タンパク質及び構造タンパク質が同じゲノムＲＮＡから合成されると期待された。適応変異は、ｐＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳをコードするｎｓＰ２に、選択された変異株の所望のフラグメントのＰＣＲ増幅、次いで原型のゲノムにおける対応するフラグメントの置換により導入された。同様のＰＣＲに基づく技術は、ｐＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳのゲノムの３’ＵＴＲにおけるＳｐｈｌ領域への異なるフラグメントのクローニング合成に使用された。全てのクローン化されたフラグメントは、レスキューウイルス（ｒｅｓｃｕｅｄ  ｖｉｒｕｓ）での更なる実験前に、配列が決定された。
【００３２】
［試験３］
ＲＮＡ転写
プラスミドはＣｓＣｌ勾配で遠心分離により精製され、Ｍｌｕｌ消化により直線化された。ＲＮＡは、キャップアナログ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）存在下で、ＳＰ６  ＲＮＡ  ポリメラーゼ（Ａｍｂｉｏｎ）により合成された。転写産物の収率及び完全性は、変性させない条件下での電気泳動により解析された。ＲＮＡ濃度は、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍイメージャー（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）で測定され、転写反応は、追加の精製なしにエレクトロポレーションに使用された。
【００３３】
［試験４］
ＲＮＡトランスフェクション
ＢＨＫ−２１細胞のエレクトロポレーションは、文献（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：４１０７−４１１３）記載の条件で実行された。ウイルスをレスキューするために、１ｇのインビトロで合成されたウイルスゲノムＲＮＡが細胞中にエレクトロポレーションされ、次いで１００ｍｍ皿に播かれ、細胞変性効果が確認されるまで、インキュベーションされた。ウイルス力価は、ＢＨＫ−２１細胞の標準的なプラークアッセイを使用して決定された。
【００３４】
ＲＮＡ感染力を評価するために、１０倍希釈のエレクトロポレーションされたＢＨＫ−２１細胞は、サブコンフルエント（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）の未感作細胞を含む６ウェルＣｏｓｔａｒプレートに播かれた。３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで１時間インキュベーション後、細胞は３％ＦＢＳで補強した０．５％超高純度アガロースを含むＭＥＭの２ｍｌで覆われた。プラークは、３７℃、２日インキュベーション後、クリスタルバイオレットで染色され、感染力は導入ＲＮＡの１ｍｇ当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ）で決定された。
【００３５】
［試験５］
ウイルスゲノムのシークエンシング
大きなプラークは、ウイルスストックの力価を測定する間に無作為に選択された（ニュートラルレッドで染色することなく）。ウイルスは、アガロースプラグからＭＥＭに抽出され、後者の培地の一定分量が使用され、３５ｍｍ皿のＢＨＫ−２１細胞に感染させた。広範なＣＰＥの進行の後、ウイルスストックは、さらなる特徴付のために採取され、ＲＮＡが、メーカ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の使用説明書に従って、ＴＲｉｚｏｌ試薬により感染細胞から単離された。〜１０００ヌクレオチド−長の重複断片は、標準的なＲＴ−ＰＣＲ技術を使用するために合成され、アガロースゲル電気泳動により精製され、配列が決定された。５’ＵＴＲのシークエンシングは、文献（Ｇｏｒｃｈａｋｏｖ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７８：６１−７５）に記載されるＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ  ＲＬＭ−ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して実行された。
【００３６】
［試験６］
ウイルス複製分析
エレクトロポレーションされた細胞の５分の１が、３５ｍｍ皿に播かれた。図に示される時間で、培地は交換され、ウイルス力価が、ＢＨＫ−２１細胞でのプラークアッセイにより決定された（Ｌｅｍｍ，  Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：３００１−３０１１）。その他に、ＢＨＫ−２１、ＮＩＨ３Ｔ３又はＣ７１０細胞が３５ｍｍ皿に播かれ、図に示されるＭＯＩで感染させた。培地は、新しい培地に置き換えられ、採取された試料におけるウイルス力価がＢＨＫ−２１細胞でのプラークアッセイにより決定された。
【００３７】
［試験７］
タンパク質合成の分析
ＢＨＫ−２１細胞は、４ｍｇの指示ＲＮＡでエレクトロポレーションされ、エレクトロポレーションされた細胞の５分の１が、６ウェルＣｏｓｔａｒプレートに播かれた。トランスフェクション後１２時間の時点で、タンパク質は、０．１％ＦＢＳ及び２０Ｃｉ／ｍｌの［３５Ｓ］メチオニンを補強したメチオニン欠如ＤＭＥＭ培地の０．８ｍｌで３０分間インキュベーションすることにより代謝的に標識された。インキュベーション後、培地に入れられ、遠心分離によりペレット状にされ、１００μｌの標準タンパク質添加液に溶解された。等量のタンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）１０％ポリアクリルアミドゲルに投入された。電気泳動後、ゲルは乾燥され、オートラジオグラフされた。
【００３８】
［試験８］
ＲＮＡ分析
ウイルス特異的ＲＮＡの合成を解析するために、細胞は、４ｍｇのインビトロ合成ウイルスＲＮＡでエレクトロポレーションされ、エレクトロポレーションされた細胞の５分の１が、同様に３５ｍｍ皿に播かれた。トランスフェクションの４．５時間後に、ウェル中の培地は、１０％ＦＢＳ、ＡｃｔＤ（１μｇ／ｍｌ）及び［３Ｈ］ウリジン（２０  Ｃｉ／ｍｌ）を補強したａＭＥＭの１ｍｌで置換した。３７℃で４時間インキュベーション後、細胞内全ＲＮＡがメーカの手引きに従ってＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により単離され、ジメチルスルホキシド中のグリオキサールで変性させ、文献に記載の条件（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３９−６４４６）を使用してアガロースゲル電気泳動により解析された。ゲルは、２，５−ジフェニルオキサゾール（ＰＰＯ）に含侵させ、乾燥され、オートラジオグラフされた。
【００３９】
［試験９］
ＩＦＮ−アルファ／ベータ−アッセイ
培地中のＩＦＮ−アルファ／ベータ−の濃度は、文献に記載された生物検定（Ｔｒｇｏｖｃｉｃｈ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，  １９９６．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２４：７３−８３）により測定された。簡潔には、Ｌ９２９細胞は、５×１０４細胞／ウェルの濃度で、９６ウェルプレートに１００μｌの完全培地に播かれ、３７℃で６時間インキュベーションされた。感染ＮＩＨ３Ｔ３細胞から採取された培地の試料は、１時間ＵＶ光で処理され、Ｌ９２９細胞を備えるウェルに直接、２倍の段階で連続希釈された。３７℃で２４時間インキュベーション後、２×１０５ＰＦＵの水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を備える追加の１００μｌの培地がウェルに添加され、インキュベーションが３６−４０時間続けられた。細胞はクリスタルバイオレットで染色され、終点はＶＳＶ誘導ＣＰＥから５０％の細胞を保護するのに要求されるＩＦＮａ／ｂの濃度として決定された。結果の正規化のＩＦＮ−ａ／ｂ基準は、ＡＴＣＣから取得し、放出されたウイルスの力価は、ＢＨＫ−２１細胞でのプラークアッセイにより決定された。
【００４０】
［試験１０］
蚊でのウイルス複製の評価
インビボによる蚊での複製能力を評価するために、１μｌ量に約１０５ＰＦＵを使用してネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（テキサス、ガルベストン由来のコロニー）の蚊の胸腔内接種が使用された。経口の感受性はかなりばらつきがあり、それほど感受性が無い一方（Ｗｅａｖｅｒ，  Ｓ．Ｃ．１９９７．Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｖｉｒａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，  ｐ．３２９−３５２．Ｉｎ  Ｎ．  Ｎａｔｈａｎｓｏｎ（ｅｄ．），  Ｖｉｒａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．）、殆どどんな蚊でも、任意のアルファウイルスによる胸腔内感染に高い感受性があることから、経口暴露を超える胸腔内接種を選択した。ガラスピペットを使用する接種に続き、蚊は、２７℃で１０日間インキュベーションし、２０％ＦＢＳ及びファンギゾンを補強したＭＥＭの１ｍｌ中で個別に用量設定した。夫々用量設定した蚊の１００μｌ量を、２４ウェル状の単層のベロ細胞に添加し、感染を検出するために細胞変性効果を５日間観察した。アッセイコントロール（Ａｓｓａｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ）は、ＴＣ−８３親ウイルス及びＩＲＥＳ変異株のいずれをも含んだ。
【００４１】
［試験１１］
免疫化及び毒性ＶＥＥＶでの抗原投与
生後６日目のＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓマウスは、脳内に、総容量２０μｌのＰＢＳに約１０６ＰＦＵの用量でＶＥＥＶ  ＴＣ−８３株又は設計変異株を接種された。感染後、８−１０動物の夫々の同齢集団を、処置することなく２ヶ月間維持した。２１日間、マウスは、疾病（被毛の乱れ、抑鬱、食欲不振及び／又は痙攣）及び／又は死の兆候を毎日観察された。
【００４２】
８週齢メスＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓマウスは、ＶＥＥＶ  ＴＣ−８３又は組換えウイルスを使用してマウス１頭当たり約１０６ＰＦＵの用量でワクチン接種され、次いで高い毒性のＶＥＥＶ株３９０８の約１０４ＰＦＵを用いて４週間後皮下に抗原投与された。２１日間、マウスは、疾病（被毛の乱れ、抑鬱、食欲不振及び／又は痙攣）及び／又は死の兆候を１日２回観察された。
【００４３】
［試験１２］
組換えＶＥＥＶ  ＴＣ−８３を基にしたウイルス
本研究の論理的根拠は、脊椎動物の細胞では効率的な複製が可能であるが、蚊由来の細胞では複製できないアルファウイルスを開発することである。従って、このようなウイルスの複製は、昆虫細胞ではなく脊椎動物でのみ機能するタンパク質又はＲＮＡ配列に依存する必要がある。これを達成るために、本発明は、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳに依存するアルファウイルスの構造タンパク質の発現を行うための方法を設計した。設計されたＩＲＥＳは、ポリＣ配列を含まず、ＥＭＣＶポリタンパク質の最初の４つのコドンを保持し、これによりＶＥＥＶ  ＴＣ−８３の構造遺伝子の最も効率的な翻訳を達成した。後者の実験において、これら付加的なアミノ酸は、ウイルスの複製に何の弊害も与えないが、ウイルス構造タンパク質の翻訳に検出可能な良好な効果が得られることが確認された（データを示さず）。
【００４４】
コンストラクトの一つにおいて、ＶＥＥＶ／ＩＲＥＳ、ＩＲＥＳ配列は、完全な５’ＵＴＲの下流サブゲノムＲＮＡにクローン化された（図１Ａ）。従って、このゲノムはサブゲノムＲＮＡ合成可能であると予測された。もう一つの組換え体、ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳにおいて、サブゲノムプロモータは、１３の同義の点突然変異（図１Ａ及び図１Ｂ）により不活性化され、この点突然変異は、活性ＳＧ  ＲＮＡプロモータに復帰することを妨げることが予測された。ＶＥＥＶ構造タンパク質の合成を促進するために、ＩＲＥＳ配列がクローン化され、２６Ｓ  ５’ＵＴＲを置換した。
【００４５】
ＶＥＥＶ／ＩＲＥＳ、ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ及び修飾されていない野生型ＶＥＥＶ  ＴＣ−８３ゲノムＲＮＡは、インビトロで合成され、ＢＨＫ−２１細胞中に導入された。感染中心アッセイにおいて、ＶＥＥＶ／ＩＲＥＳ  ＲＮＡは、ＴＣ−８３のＲＮＡと同じ感染力を示し、ＴＣ−８３のプラークの大きさと同様の均一な大きさのプラークを発現させた（図１Ａ及び図１Ｃ）。このことは、追加の適応変異が、設計ウイルスの有効な複製に必要でないことを強く示唆した。ＶＥＥＶ／ＩＲＥＳは、１０９ＰＦＵ／ｍｌを超える力価で複製したが、最終的な力価及びウイルスの複製率は、ＶＥＥＶ  ＴＣ−８３よりも大幅に緩慢であった（図１Ｄ）。ＢＨＫ−２１細胞は、もう一つの組換えウイルスゲノムＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳを導入された。この組換えウイルスゲノムＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳは、サブゲノムプロモータを欠損し、非常に非効率な感染性ウイルスを生み出した（図１Ｄ）。感染中心アッセイにおいて、このコンストラクトは、大部分はピンの先端ほどのプラークを発生させ、その数を測るのは困難であった。意外にも、このウイルスは、連続継代での更なる進化を示し、より大きなプラークを形成した変異株を速やかに生み出した（図１Ｃ及びデータを示さず）。図１Ｄで示された増殖曲線は、小さいプラーク形成ウイルス及び大きなプラーク形成ウイルスの両方の放出を示している。
【００４６】
従って、これら実験の結果は、少なくともＶＥＥＶ／ＩＲＥＳゲノムとの関連においては、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳが、ＶＥＥＶ複製に十分な水準で構造タンパク質を生み出すことができることを示唆した。突然変異させたサブゲノムプロモータを含むコンストラクト、ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳは、より効率的な複製のために進化することができる複製欠損ウイルスを作り出した。
【００４７】
［試験１３］
ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳにおける適応変異の分析
大きなプラーク表現型へのＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳの進化は、ウイルスゲノムにおける追加の変異の蓄積を示唆した。野生型ゲノム配列への復帰は、導入された多くの点突然変異により不可能な事象となり、従って適応変異の位置を予測することが困難であった。変異を同定するために、エレクトロポレーション後、２４時間で採取されたＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ試料の５つのプラークが、無作為に選択され、２つのプラーク精製された変異株のゲノム全体（３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲを含む）が配列決定された。同定された変異のリストは、図２Ａに示されている。これら変異の大部分は、同義であり、既知のシス作用ＲＮＡ領域の中に含まれていなかった。従って、ウイルス複製についてのそれらの効果は、極めて低いものであった。しかしながら、両方のプラーク分離物のゲノムは、ｎｓＰ２タンパク質での同じ変異である、Ｙ３７０からＣへの変異を含み、ゲノムの一つは、次にコードするＡＡを同様に変化させた（Ｋ３７１をＱに）。
【００４８】
ウイルス複製に与える変異の効果を試験するために、Ｙ３７０からＣへの変異、及びＹ３７０からＣへの変異とＫ３７１からＱへの変異の両方は、原型のＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳコンストラクト（図２Ｂ）にクローン化され、そのＲＮＡ感染力、ウイルス複製率及びプラークの大きさを、原型のＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ及び他のコンストラクトのＲＮＡ感染力、ウイルス複製率及びプラークの大きさと比較した。同じ変異がＶＥＥＶ  ＴＣ−８３ゲノムにもクローン化され、この親ウイルスの複製に関する効果を試験した。ゲノム中に１つの変異又は両方の変異の何れかを備えるＩＲＥＳコードゲノムＲＮＡ、ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ／１及びＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ／２は、ＶＥＥＶ  ＴＣ−８３  ＲＮＡで行った感染中心アッセイでの感染力と同じ感染力を示し、ＶＥＥＶ  ＴＣ−８３のプラークと同じ均一なプラークの大きさを形成するウイルスがレスキューされた（データを示さず）。ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ／１及びＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ／２は、また、増殖率において、力強い増加を示したが（図２Ｃ及び図１Ｄ）、第２の突然変異の効果はほとんど検出されたかった。従って、まとめると、ｎｓＰ２におけるＹ３７０からＣへの突然変異は、ウイルス複製に対して非常に良好な効果を示し、第２の突然変異は殆どその効果を改善しなかったことをデータは示した。ＶＥＥＶ  ＴＣ−８３ゲノムへの導入の場合、同様の突然変異は、ウイルス複製率又は最終的な力価に対する効果を全く検出できなかった（図２Ｃ）。このことは、複製の増強がＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳに特異的であったことを示唆している。
【００４９】
同定されたＡＡ変更（Ｙ３７０からＣ、Ｋ３７１からＱ）は、サブゲノムプロモータ欠損、ＩＲＥＳ含有ウイルスの効率的な複製をもたらす有力な突然変異のほんの僅かを示しているにすぎない。従って、並列実験において、インビトロ合成ＲＮＡのＲＮＡトランスフェクションの２４時間後に採取された試料から精製された他の３つのプラークコロニーにおけるヌクレオチド２１６１〜２９５９の配列が決定されるとともに、ベロ細胞において追加の３回連続継代後ウイルスストックから分離された５つのプラーク精製変異株のヌクレオチド２１６１〜２９５９の配列が決定された。このような継代は、最も効率的な複製ウイルスの選択をもたらすことが予測される。同定された突然変異のリストは、図３Ａに示されている。配列決定は、ＲＴ−ＰＣＲ由来ＤＮＡ断片から直接的に実行された。従って、示された突然変異はプラーク由来ウイルス集団における共通配列を示しており、ＰＣＲ由来のものではない（図３Ｂ）。
【００５０】
全ての分離株は、ｎｓＰ２のＲＮＡヘリカーゼドメインのカルボキシ末端断片に対応する配列決定された断片中に突然変異を含んでいた。全ての変化したアミノ酸は、アミノ酸３４８−４２４の間に位置していた。エレクトロポレーション後発生する原型のウイルスストックと継代されたプールの何れにおいても最も一般的な突然変異は、Ｙ３７０からＣへの変異であった。このことは、おそらく複製に対して最も顕著な影響の一つであることを指摘した。従って、この特定の突然変異、ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ、を備える上記記載された変異株は、次の節で述べる実験に使用された。
【００５１】
［試験１４］
ｎｓＰ２  Ｙ３７０からＣへの変異のウイルス複製に与える効果
ｎｓＰ２関連ＲＮＡヘリカーゼのカルボキシ末端断片における適応変異の同定は、予期しない結果であり、ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ複製における増加に対する明確な説明を全く示さなかった。この突然変異は、おそらくＲＮＡ複製、ウイルス構造タンパク質翻訳、ウイルス粒子形成、複製複合体の区画化、等の何れかに対する促進作用を備えることができた。しかしながら、最も予期される効果は、ウイルスＲＮＡ合成の増大である。従って、ＢＨＫ−２１細胞は、異なるＶＥＥＶ変異株のインビトロ合成ゲノムで導入され、エレクトロポレーション後４時間〜４．５時間で新しく合成されたウイルスＲＮＡをＡｃｔＤの存在下［３Ｈ］ウリジンで代謝的に標識し、そのＲＮＡをアガロースゲル電気泳動により解析した（図４Ａ）。
【００５２】
予想通り、ＶＥＥＶ／ＩＲＥＳは、サブゲノムＲＮＡ合成の能力がある。このことは、サブゲノムＲＮＡ５’ＵＴＲの３’末端に導入したＩＲＥＳがサブゲノムプロモータ活性を妨げないことを示唆している。ｎａＰ２における適応変異を有するＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ及びその変異株は、検出不可能なＳＧ  ＲＮＡを作り出した。従って、これらゲノムのプロモータ配列に導入された１３の変異は、サブゲノムＲＮＡの翻訳を完全に無効にした。意外にも、ｎｓＰ２における適応変異は、ＲＮＡゲノム複製に顕著な効果を示さず、ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ／１及びＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ／２ゲノムＲＮＡは、最初に設計したＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳゲノムと同様の効率で複製した。更には、全ての変異株のゲノムＲＮＡ複製は、ＶＥＥＶ  ＴＣ−８３の複製と極めて酷似していた。その上、これら変異の効果は、原型のＶＥＥＶ  ＴＣ−８３の構成には見つからなかった（ＶＥＥＶ／１及びＶＥＥＶ／２に対応する行参照）。この発見は、適応が、ＲＮＡ複製での増加をもたらさないことを強く暗示した。
【００５３】
ウイルス構造タンパク質の合成を、エレクトロポレーション後１２時間で評価した（図４Ｂ）。その時まで、ＶＥＥＶ／ＩＲＥＳ及びＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ特異的カプシド及び他の構造タンパク質は、ＶＥＥＶ  ＴＣ−８３ＲＮＡで導入された細胞中よりも〜２倍悪い効率で合成された。この納得のいく僅かな相違は、（ＶＥＥＶ  ＴＣ−８３ＲＮＡの力価と比較して）ＶＥＥＶ／ＩＲＥＳ及びＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳウイルス夫々が、４桁及び７桁以上も低い感染力価であることを説明していない。これら感染力価は、トランスフェクションの１２時間後に採取された試料から検出された。更に、原型のＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳゲノムを含むＢＨＫ−２１細胞中のウイルスタンパク質の合成と比較して、ｎｓＰ２中に適応変異を有するＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ／１と、ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ／２を含むＢＨＫ−２１細胞中とのウイルスタンパク質の合成の間の差異は、この実験及び他の実験においても検出されなかった。ＩＲＥＳ含有ウイルスで感染させた細胞中での標識されたタンパク質の際立ったパターンの特徴は、二つの追加のバンドの存在であり、これらバンドは質量分析計により熱ショックタンパク質Ｈｓｐ９０及びＨｓｐ７２として同定された。これらタンパク質の誘導の生物学的意義は、未だ明確ではないが、ＩＲＥＳから発現する構造タンパク質を備える細胞中で応力成長に至るウイルス構造タンパク質折り畳みにおいてある異常な部分に原因があると考えられる。
【００５４】
追加の実験において、ＶＥＥＶ  ＴＣ−８３、ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ及びＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ／１で感染させた細胞中のウイルス糖タンパク質の細胞内分布が評価され、細胞表面上のこれらタンパク質の存在がＶＥＥＶ特異的抗体で染色されることにより解析された。糖タンパク質の分布における顕著な相違が全く同定されなかった。適応変異はウイルスゲノム中の追加のパッケージング信号の形成の原因となるという可能性が調べられた。変異含有断片（ＶＥＥＶゲノムのヌクレオチド２５３３−２９５０に対応する）が、ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳゲノムの３’ＵＴＲにクローン化され、組換えインビトロ合成ＲＮＡが感染中心アッセイで試験された。原型のＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳのプラークの大きさ又はウイルス力価と比較して、プラークの大きさ又はウイルス力価の増加は、全く検出されなかった。
【００５５】
もう一つの変異株において、サブゲノムプロモータ及びＶＥＥＶ  カプシドコード配列は、ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳゲノムの３’ＵＴＲにクローン化され、サブゲノムＲＮＡからの追加のカプシド発現がウイルス複製の効率を増加させるかどうかを試験した。この組換えもウイルス力価に明確な効果を全くもたらさなかった。最後に、ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳが感染性ウイルスの代わりにゲノムフリーのサブウイルス粒子を生産するかどうかが解析された。ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳで導入され、代謝的に［３５Ｓ］で標識化された細胞は、ショ糖密度勾配での超遠心により検出されるサブウイルス粒子を生産しないという、事実に反することが観察された（データを示さず）。従って、まとめると、上記記載した複雑な分析は、原型のＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳの非常に効率の悪い複製又はＩＲＥＳ含有ウイルスの複製に関するＶＥＥＶ  ｎｓＰ２中の検出変異の明確な効果に対する明らかな機構的な説明を提示しなかった。しかしながら、本発明の主な目的は、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ機能に依存する複製を行うＶＥＥＶ変異株を開発することであり、ＶＥＥＶ／ＩＲＥＳ及びＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ／１の両方がこの目標を達成したと思われる。
【００５６】
［試験１５］
蚊細胞及び蚊中でのＩＲＥＳ依存ＶＥＥＶ変異株の複製
アルファウイルスの複製についての蓄積されたデータは、明確に、遺伝的不安定性及び高い進化率を示しており、これらは、特にウイルス複製において悪影響を与える際に、任意の異種遺伝子の欠損をもたらす（Ｇｏｒｃｈａｋｏｖ，Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３６６：２１２−２５、Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：５５９８−６０６）。従って、本発明の重大な争点の一つは、設計ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ挿入が安定であり、蚊細胞中でウイルスの複製を不可能な状態にするかどうかであった。これを試験するために、ＢＨＫ−２１細胞へのインビトロ合成ＲＮＡのエレクトロポレーションの２４時間後に採取されたＶＥＥＶ／ＩＲＥＳ及びＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳウイルスをＣ７１０蚊細胞に感染させた。ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳは、ｎｓＰ２にＹ３７０からＣへの適応変異を備える上記記載のＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ／１の代わりに使用され、蚊細胞中での複製を確立する能力に関して、ＲＮＡトランスフェクション後放出される変異株のライブラリーの全てを試験した。
【００５７】
第１の継代では、Ｃ７１０細胞の感染の４８時間後ＶＥＥＶ／ＩＲＥＳの力価は１．５×１０１０ＰＦＵ／ｍｌに達し、第２の継代後も同様の力価がストックにおいて検出された（図５Ａ及び５Ｂ）。対照的に、ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳの力価は、第１の継代後では１５０ＰＦＵ／ｍｌであり（第１の継代後の力価は、蚊細胞中で新生ウイルスが生産されたというよりも感染に使用した残存ウイルスを反映しているように思われる）、次ぐ第２の継代後では検出限界以下であった（図５Ａ及び５Ｂ）。追加実験において、ｎｓＰ２における適応変異を包含するＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳのプラーク精製変異株が、Ｃ７１０細胞で継代された。２回の盲目継代（ｂｌｉｎｄ  ｐａｓｓａｇｅ）後、感染性ウイルスが復帰することは全くなかった。
【００５８】
もう一つの実験において、Ａｅ．  ａｅｇｙｐｔｉ蚊は、胸腔内に、約１０５ＰＦＵのＶＥＥＶ  ＴＣ−８３及びＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ／１変異株を接種された。ＩＲＥＳ変異を接種された１７のＡｅ．  ａｅｇｙｐｔｉ蚊において検出可能に１つも複製できない一方、ＴＣ−８３親株を接種された１７の蚊のうち全ての蚊がＣＰＥアッセイにおいて検出可能なレベルで複製し、その力価は、１０６ＰＦＵ／蚊を超える平均力価であった。従って、ＩＲＥＳ含有ＶＥＥＶ変異株ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ／１は、インビトロ及びインビボの両方で、蚊細胞中で複製できなかった。
【００５９】
蚊細胞中での継代後、サブゲノムＲＮＡ変異株を生産することができるＶＥＥＶ／ＩＲＥＳの高い力価を説明するために、２つの個別のプラークが無作為に選択され、ゲノムのＩＲＥＳ含有断片の配列を決定した。両方の分離株において、ＩＲＥＳ配列は、ウイルスゲノム中に存在しておらず、原型のＩＲＥＳの１３及び１５残基が確認されるのみであった（図５Ｃ）。従って、蚊細胞中でのＶＥＥＶ／ＩＲＥＳ変異株の継代は、ＩＲＥＳマイナス変異株の蓄積を導き、サブゲノムプロモータを欠損させたＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳは、蚊細胞中で効率的な複製を可能にする変異株を生む出すことはなかった。
【００６０】
［試験１６］
ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ／１変異株は弱毒化表現型を示す。
本発明は、蚊由来の細胞及び対応する媒介蚊中での複製不可能であるが、親ＶＥＥＶ  ＴＣ−８３よりも脊椎動物中で弱毒化表現型を示すＶＥＥＶ変異株の開発を目的とした。ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ／１変異株の低複製率は、このウイルスがＩＦＮａ／ｂ生産及びシグナル伝達を備える脊椎動物細胞中で複製することができないという懸念を引き起こした。しかしながら、これは事実と異なった。図６に示された実験の結果は、ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ／１がＩＦＮ−アルファ／ベータ−分泌及びシグナル伝達において欠損を持たないＮＩＨ３Ｔ３細胞中で、１０９ＰＦＵ／ｍｌを超える力価まで複製することを示した。この複製は、より効率的なＩＦＮａ／ｂ誘導を引き起こしたが（図６）、ＩＦＮ放出は、明確に、既存のウイルス複製を無効にしていなかった。ＢＨＫ−２１細胞で示されるように（図２Ｃ）、ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ／１の複製は、ＶＥＥＶ  ＴＣ−８３の複製よりも効率が悪いが、ＩＲＥＳ依存変異がインビボで弱毒化され得ることを示唆した。実際に、生後６日目のマウス脳内に約１０６ＰＦＵを接種後、８６％が感染症を切り抜け脳炎の兆候を発症しなかった。対照的に、９２％のマウスが、ＶＥＥＶ株ＴＣ−８３の同じ用量により殺された。まとめると、これらデータは、遺伝子的に改良したＩＲＥＳ依存ＶＥＥＶが、親ＶＥＥＶ  ＴＣ−８３よりも弱毒化したことを示している。
【００６１】
にもかかわらず、ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ／１変異株は、新生児マウス及び成体マウスの両方で免疫原性を残した。ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ／１の脳内接種を生き抜いた１２頭の生後６日目のマウスの内１０頭が、投与５週間後、野生型ＶＥＥＶ株３９０８の１０４ＰＦＵを用いた皮下への暴露を生き抜いた。対照的に、同じ方法で暴露された偽（ＰＢＳ）感染マウス１２頭は、全て生存できなかった（図７）。ＶＥＥＶ／ｍｕｔＳＧ／ＩＲＥＳ／１は、また成体マウスにおいても免疫原性であった。約１０６ＰＦＵを用いた１回の皮下ワクチン接種は、３週間後、ＶＥＥＶ株３９０８の１０４ＰＦＵ（〜１０４ＬＤ５０）での皮下暴露に対してマウスの８０％を保護した（図８）。中和抗体価（ＰＲＩＮＴ８０）は、暴露直前にこれら全てのマウスで＜１：２０で検出できなかった。ここことは、１回のワクチン接種後の不完全な防御は、インビボでのＩＲＥＳ含有ウイルス複製の低いレベルの結果であることを示唆している。従って、弱毒化の高いレベルは、安全性の高い段階を与えるが、反復ワクチン接種が要求されるかもしれない。
【００６２】
［試験１７］
弱毒化を減じるが蚊の伝染力の欠損を維持する発現戦略
本発明の他の実施形態において、新規な発現戦略が設計され、弱毒化を減じるが蚊の伝染力の欠損を維持することができた。この戦略は、エンベロープ糖タンパク質遺伝子の下流にＩＲＥＳを配置することを含んだ。このエンベロープ糖タンパク質遺伝子は、３’ＵＴＲのまさに上流のサブゲノム領域の３’末端にカプシド遺伝子を備えている（図９）。従って、カプシドタンパク質はＩＲＥＳ依存様式で翻訳されるが、エンベロープ糖タンパク質遺伝子はＣＡＰ依存様式で翻訳されるサブゲノムメッセージが作られた。ＢＨＫ及びベロ細胞中のこの新規なＩＲＥＳ変異の複製は、再度効率的であったが、Ｃ７１０蚊細胞中では検出されなかった。２０匹のＡｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ生体メス蚊の胸腔内接種は、複製の証拠を示さなかった。ＩＲＥＳ２型がマウスをワクチン接種するために用いられた場合、１０個体の全ては、通常のＴＣ−８３により誘導されるよりも約２倍低い平均力価で抗体陽転するとともに、ＩＲＥＳ２型により致死的な皮下の暴露から保護された。従って、新規なＩＲＥＳ発現戦略は、より少ない弱毒化をもたらすと思われる一方、蚊機能不全表現型を保持する。
【００６３】
【表１】
0005758632.tif 000002
【００６４】
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・Ｒｕｓｓｏ，  Ａ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １４：１４４９−５８
【００６５】
本明細書中で言及されている特許文献又は公開文献は、本発明に関連する分野の当業者のレベルを指し示すものである。更に、これら特許文献及び公開文献は、あたかもこれら個々の文献が、具体的に及び個々に参考文献として組み込まれるために示されるように、同様の範囲で明細書中に参考文献として組み込まれる。
【図１Ａ】
0005758632.tif 000003
【図１Ｂ】
0005758632.tif 000004
【図１Ｃ】
0005758632.tif 000005
【図１Ｄ】
0005758632.tif 000006
【図２Ａ】
0005758632.tif 000007
【図２Ｂ】
0005758632.tif 000008
【図２Ｃ】
0005758632.tif 000009
【図３Ａ】
0005758632.tif 000010
【図３Ｂ】
0005758632.tif 000011
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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