(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）コモウイルス科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）の２分節ＲＮＡウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメント由来の発現エンハンサー配列であって、前記ＲＮＡ−２ゲノムセグメントの開始部位が変異され、
前記コモウイルス科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスの前記ＲＮＡ−２ゲノムセグメントは、同じトリプレットリーディングフレームに位置する２つの異なる翻訳開始部位を介して２つのカルボキシ共末端タンパク質をコードし、
変異された前記開始部位は、前記２つの開始部位のうちの第１であり、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）の野生型ＲＮＡ−２セグメントの１６１位の開始部位に相当する、発現エンハンサー配列と、
（ｂ）目的のタンパク質をコードする遺伝子の、遺伝子発現系への挿入を促進するための異種配列であって、前記エンハンサー配列内の変異された前記開始部位の下流に位置する異種配列と、必要に応じて
（ｃ）３’ＵＴＲと、
を含む、遺伝子発現構築物を含む、遺伝子発現系。
【請求項２】
（ａ）コモウイルス科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）の２分節ＲＮＡウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメント由来の発現エンハンサー配列であって、前記ＲＮＡ−２ゲノムセグメントの開始部位が変異され、
前記コモウイルス科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスの前記ＲＮＡ−２ゲノムセグメントは、同じトリプレットリーディングフレームに位置する２つの異なる翻訳開始部位を介して２つのカルボキシ共末端タンパク質をコードし、
変異された前記開始部位は、前記２つの開始部位のうちの第１であり、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）の野生型ＲＮＡ−２セグメントの１６１位の開始部位に相当する、発現エンハンサー配列と、
（ｂ）目的のタンパク質をコードする異種の遺伝子であって、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子は、前記エンハンサー配列の下流に位置し、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子は、プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結される、目的のタンパク質をコードする遺伝子と、
を含む、遺伝子発現系。
【請求項３】
３’ＵＴＲを含むか、またはさらに含み、前記３’ＵＴＲは必要に応じて、同じ２分節ＲＮＡウイルス由来である、請求項２に記載の遺伝子発現系。
【請求項４】
前記２分節ＲＮＡウイルスがコモウイルスである、請求項２または３に記載の遺伝子発現系。
【請求項５】
前記コモウイルスがササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）である、請求項４に記載の遺伝子発現系。
【請求項６】
前記エンハンサー配列が、変異された前記開始部位を有するコモウイルスＲＮＡ−２ゲノムセグメント配列の少なくとも２００のヌクレオチドを含む請求項４または５に記載の遺伝子発現系。
【請求項７】
前記エンハンサー配列が、変異された前記開始部位を有するコモウイルスＲＮＡ−２ゲノムセグメント配列の少なくともヌクレオチド１０〜５１２、２０〜５１２、３０〜５１２、４０〜５１２、５０〜５１２、１００〜５１２、１５０〜５１２、１〜５１４、１０〜５１４、２０〜５１４、３０〜５１４、４０〜５１４、５０〜５１４、１００〜５１４、１５０〜５１４、１〜５１１、１０〜５１１、２０〜５１１、３０〜５１１、４０〜５１１、５０〜５１１、１００〜５１１、１５０〜５１１、１〜５０９、１０〜５０９、２０〜５０９、３０〜５０９、４０〜５０９、５０〜５０９、１００〜５０９、１５０〜５０９、１〜５０７、１０〜５０７、２０〜５０７、３０〜５０７、４０〜５０７、５０〜５０７、１００〜５０７、または１５０〜５０７を含む、請求項６に記載の遺伝子発現系。
【請求項８】
前記エンハンサー配列が、表１に示されるササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ＲＮＡ−２ゲノムセグメント配列のヌクレオチド１０〜５１２、２０〜５１２、３０〜５１２、４０〜５１２、５０〜５１２、１００〜５１２、１５０〜５１２、１〜５１４、１０〜５１４、２０〜５１４、３０〜５１４、４０〜５１４、５０〜５１４、１００〜５１４、１５０〜５１４、１〜５１１、１０〜５１１、２０〜５１１、３０〜５１１、４０〜５１１、５０〜５１１、１００〜５１１、１５０〜５１１、１〜５０９、１０〜５０９、２０〜５０９、３０〜５０９、４０〜５０９、５０〜５０９、１００〜５０９、１５０〜５０９、１〜５０７、１０〜５０７、２０〜５０７、３０〜５０７、４０〜５０７、５０〜５０７、１００〜５０７、または１５０〜５０７を含み、野生型ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ＲＮＡ−２ゲノム配列の１６１位の開始部位が変異されている、請求項７に記載の遺伝子発現系。
【請求項９】
前記エンハンサー配列が、表１に示されるササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）  ＲＮＡ−２ゲノムセグメント配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、または９０％の同一性を有し、野生型ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）  ＲＮＡ−２ゲノムセグメントの１６１位の開始部位が変異されている、請求項４または請求項５に記載の遺伝子発現系。
【請求項１０】
さらに、プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結された、遺伝子サイレンシングの異種の抑制因子をコードする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の遺伝子発現系。
【請求項１１】
（ａ）プロモーターと、
（ｂ）１６１位のＡＵＧが表２に示されるように変異され、前記プロモーターの下流に位置する、表１に示されるササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ＲＮＡ−２ゲノムセグメント配列のヌクレオチド１〜５０７と、
（ｃ）（ｂ）に規定される配列の下流に位置する目的のタンパク質をコードする遺伝子と、
（ｄ）表１に示され、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子の下流に位置する、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ＲＮＡ−２ゲノムセグメント配列のヌクレオチド３３０２〜３４８１と、
（ｅ）（ｄ）に規定される配列の下流に位置するノパリン合成ターミネーターと、
を含むか、または
（ａ）プロモーターと、
（ｂ）表１に示されるササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ＲＮＡ−２ゲノムセグメント配列のヌクレオチド１〜５０７と少なくとも９０％の同一性を有する発現エンハンサー配列であって、１６１位のＡＵＧは変異され、前記プロモーターの下流に位置する、発現エンハンサー配列と、
（ｃ）（ｂ）に規定される配列の下流に位置する目的のタンパク質をコードする遺伝子と、
（ｄ）表１に示され、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子の下流に位置する、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ＲＮＡ−２ゲノムセグメント配列のヌクレオチド３３０２〜３４８１と、
（ｅ）（ｄ）に規定される配列の下流に位置するノパリン合成ターミネーターと、
を含む、遺伝子発現系。
【請求項１２】
（ａ）プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結された目的の異種タンパク質をコードする少なくとも１つの外来性遺伝子を保有するコモウイルス科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）の２分節ウイルスゲノムの切断されたＲＮＡ−２由来の配列を含む第１の遺伝子構築物であって、前記遺伝子構築物は前記外来性遺伝子の上流に変異された開始部位を含み、
前記コモウイルス科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスの前記ＲＮＡ−２ゲノムセグメントは、同じトリプレットリーディングフレームに位置する２つの異なる翻訳開始部位を介して２つのカルボキシ共末端タンパク質をコードし、
変異された前記開始部位は、前記２つの開始部位のうちの第１であり、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）の野生型ＲＮＡ−２セグメントの１６１位の開始部位に相当する、第１の遺伝子構築物と、必要に応じて、
（ｂ）プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結された遺伝子サイレンシングの抑制因子をコードする、前記第１の遺伝子構築物内に必要に応じて組み込まれる第２の遺伝子構築物と、
を含む、遺伝子発現系。
【請求項１３】
前記２分節ＲＮＡウイルスはササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）であり、１１５位のＡＵＧも変異される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子発現系。
【請求項１４】
ＤＮＡバイナリーベクターである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の遺伝子発現系。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の遺伝子発現系を用いて、宿主生物（ただし、ヒトを除く。）内で目的のタンパク質を発現させるための方法。
【請求項１６】
前記宿主生物は真核性宿主であり、前記真核性宿主は植物または昆虫である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
コモウイルス科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）の２分節ウイルスのＲＮＡ２ゲノムセグメント由来の配列に作動可能に連結される、目的の異種タンパク質をコードする遺伝子またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から前記目的の異種タンパク質の翻訳を増強する方法であって、
前記コモウイルス科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスの前記ＲＮＡ２ゲノムセグメントは、同じトリプレットリーディングフレームに位置する２つの異なる翻訳開始部位を介して２つのカルボキシ共末端タンパク質をコードし、
前記ＲＮＡ２由来の配列内の２つの開始部位のうちの第１を変異させることを含み、変異された前記開始部位は、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）の野生型ＲＮＡ−２セグメントの１６１位の開始部位に相当する、方法。
【請求項１８】
以下の工程：
（ａ）プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結された目的の異種タンパク質をコードする少なくとも１つの外来性遺伝子を保有するコモウイルス科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）の２分節ウイルスゲノムの切断されたＲＮＡ−２由来の配列を含む第１の遺伝子構築物を含む遺伝子発現構築物を導入する工程であって、
前記遺伝子構築物は、植物細胞内に前記外来性遺伝子の上流に変異された開始部位を含み、
前記コモウイルス科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスの前記ＲＮＡ−２ゲノムセグメントは、同じトリプレットリーディングフレームに位置する２つの異なる翻訳開始部位を介して２つのカルボキシ共末端タンパク質をコードし、
変異された前記開始部位は、前記２つの開始部位のうちの第１であり、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）の野生型ＲＮＡ−２セグメントの１６１位の開始部位に相当する、工程と、必要に応じて、
（ｂ）植物細胞内にプロモーターおよび終結配列に作動可能に連結された遺伝子サイレンシングの抑制因子をコードする、前記第１の遺伝子構築物内に必要に応じて組み込まれる第２の遺伝子構築物を導入する工程と、
を含む、植物においてタンパク質を発現させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項２〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子発現系を宿主生物（ただし、ヒトを除く。）に導入することによって得たか、または得られる宿主生物（ただし、ヒトを除く。）であって、目的のタンパク質をコードする遺伝子が、向上したレベルで発現される、宿主生物。
【請求項２０】
請求項２〜１２のいずれか１項に記載の遺伝子発現系で一過性または安定にトランスフェクトされる宿主生物（ただし、ヒトを除く。）。
【請求項２１】
前記宿主生物は植物または植物細胞である、請求項１９または２０に記載の宿主生物。
【請求項２２】
請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の宿主生物を使用することと、必要に応じて、目的のタンパク質が発現される組織を収集することと、前記組織から前記目的のタンパク質を単離することと、を含む、目的のタンパク質を産生するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、植物および他の真核細胞において遺伝子発現を増加させるための方法および物質、特に、ウイルス由来の配列、例えば、目的のタンパク質をコードする異種遺伝子の配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
コモウイルス（ＣＰＭＶ）
コモウイルスは、２分節ゲノムを有するＲＮＡウイルスである。コモウイルスＲＮＡゲノムのセグメントは、ＲＮＡ−１およびＲＮＡ−２と呼ばれている。ＲＮＡ−１は、ＶＰｇ、レプリカーゼおよびプロテアーゼタンパク質をコードする（非特許文献１）。レプリカーゼは、ウイルスゲノムの複製のためにウイルスによって必要とされる。コモウイルスのササゲモザイクウイルス（ｃｏｗｐｅａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＣＰＭＶ）のＲＮＡ−２は、５８Ｋおよび４８Ｋのタンパク質、ならびに２つのウイルスコートタンパク質ＬおよびＳをコードする。
【０００３】
全てのコモウイルスのＲＮＡ−２の翻訳の開始は、２つのカルボキシ共末端（ｃｏｔｅｒｍｉｎａｌ）タンパク質の合成を生じる、同じトリプレットリーディングフレームに位置する２つの異なる開始部位で起こる。この二重の開始現象は、翻訳の間のリボソームによる「漏出スキャニング（ｌｅａｋｙ  ｓｃａｎｎｉｎｇ）」の結果として生じる。
【０００４】
ＣＰＭＶのＲＮＡ−２における５’末端開始コドン（ＡＵＧ）は、１１５位、１６１位、５１２位および５２４位で生じる。１６１位および５１２位における開始コドンは、同じトリプレットリーディングフレーム内にある。１６１位での開始コドンにおける開始は、１０５Ｋのポリタンパク質の合成を生じるが、一方、５１２位での開始コドンにおける開始は、９５Ｋのポリタンパク質の合成に関する。両方のポリタンパク質の合成は３２９９位での同じ終止コドンで停止されるため、１０５Ｋおよび９５Ｋのタンパク質は、カルボキシ共末端である。５２４位におけるＡＵＧコドンは、５１２位におけるＡＵＧが欠失される場合、イニシエーターとして役立ち得る。しかしながら、ＡＵＧ５１２の存在下において、これは機能せず、単にアミノ酸メチオニンをコードするだけである（非特許文献２；特許文献３）。１１５位での開始コドンは、ウイルス複製に必須ではない（非特許文献３）。
【０００５】
ＣＰＭＶのＲＮＡ−２ゲノムセグメントによってコードされる１０５Ｋおよび９５Ｋのタンパク質は、後にＲＮＡ−１にコードされるタンパク質分解活性によって分解されて、プロセシングされる１０５Ｋまたは９５Ｋのポリタンパク質であるかどうかに依存する、５８Ｋまたは４８Ｋのタンパク質のいずれか、および２つのウイルスコートタンパク質ＬおよびＳを生じる一次翻訳産物である。ＣＰＭＶにおける５１２位での開始コドンにおける翻訳の開始は、１６１位での開始より効果的であり、１０５Ｋのポリタンパク質より多い９５Ｋのポリタンパク質の産生を生じる。
【０００６】
ＣＰＭＶのＲＮＡ−２における１１５位の開始コドンは、１６１位および５１２位における開始部位の上流に存在し、異なるリーディングフレーム内にある。この開始コドンは、１７５位における停止コドンと同相であるため、この部位での開始は、２０アミノ酸のペプチドの産生を生じ得る。しかしながら、このようなペプチドの産生は、今までに検出されていなかった。
【０００７】
ＡＵＧ間のフレームを維持する必要性
突然変異誘発実験により、ＣＰＭＶのＲＮＡ−２における１６１位および５１２位での開始部位の間のフレームの維持が、ＲＮＡ−１にコードされるレプリカーゼによって、ＲＮＡ−２の効果的な複製に必須であることが示された（非特許文献２；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献３）。この条件は、ＣＰＭＶのＲＮＡ−２（以下に示す）に基づく発現ベクターにおける５１２位の開始コドンの上流に挿入され得る配列の長さを制限し、そのようなベクターに外因性遺伝子をクローニングすることを、理想的なものよりも困難にさせる。例えば、それらの使用がしばしば、それらの開始部位の間のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を変化させるため、ポリリンカーの使用を妨げる。
【０００８】
ＣＰＭＶベクター
ＣＰＭＶは、植物における異種ポリペプチドの産生に適切なベクター系の開発のための基礎として役立っている（非特許文献６；非特許文献７）。これらの系は、ＲＮＡ−２の修飾に基づくが、完全長か欠失した型を使用するか否かにより異なる。しかしながら、両方の場合において、修飾したＲＮＡ−２の複製は、ＲＮＡ−１との共接種によりなされる。ＲＮＡ−２の完全長型に基づいた発現系は、ＲＮＡ２由来のポリペプチドのＣ末端に対する外来性タンパク質の融合に関与する。Ｎ末端ポリペプチドの解放は、口蹄疫ウイルス由来の２Ａ触媒ペプチド配列の作用により媒介される（非特許文献８）。得られるＲＮＡ−２分子は、植物内および植物間の両方で分離できる。この戦略は、ｃｏｗｐｅａ植物において、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂコア抗原（ＨＢｃＡｇ）および小さな免疫タンパク質（ＳＩＰ）などの多くの組み換えタンパク質を発現するために使用されている（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。成功的ではあるが、完全長のウイルスベクターの使用は、挿入される配列のサイズ制限の点で不都合であり、生物学的封じこめについての問題がある。
【０００９】
これらに対処するために、ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２の欠失した型に基づく系が最近開発されている（非特許文献１２）。この系において、移動タンパク質およびコートタンパク質の両方をコードするＲＮＡ−２の領域は除去される。しかしながら、欠失した分子はさらに、ＲＮＡ−１にコードされるレプリカーゼによる複製に必要なｃｉｓ作動性の配列を有し、それにより、高レベルの遺伝子増幅が、環境を汚染する修飾されたウイルスの可能性を付随することなく、維持される。ＲＮＡ−１に加えて接種材料において、ＰＶＹ由来のＨｃＰｒｏ（非特許文献１３）などの遺伝子サイレンシングの抑制因子の封入とともに、欠失したＣＰＭＶベクターが、一過性の発現系（特許文献１、Ｂｉｐａｒｔｉｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｅｔｈｏｄ  Ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  Ａｎｄ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｌｅｖｅｌｓ  Ｏｆ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ；非特許文献１４）として使用され得る。しかしながら、完全長のＲＮＡ−２に基づいたベクターを用いる状況と対照的に、複製は接種レベルに制限される。これらのＣＰＭＶベクターは、単一のタイプのポリペプチドからなる複数の鎖の複合体を発現するのに使用されている。
【００１０】
ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２の完全長または欠失した型のいずれかに基づいたベクターの複数のコピーはまた、植物における異種タンパク質の産生に適切であることが示されている（非特許文献１５）。ＲＮＡ−１の存在下においてＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ内への異なるマーカー遺伝子を含む２つの完全長のＲＮＡ−２構築物の同時浸潤は、２つの外来性タンパク質が、接種組織において同じ細胞内で効果的に発現され得ることを示すために使用される。さらに、タンパク質は、ヘテロマー形成に必須条件である、同じサブ細胞区画に同時に局在化され得る。
【００１１】
植物におけるヘテロマータンパク質の発現のための異なるＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ベクターの適合性も研究されている。ＲＮＡ−２の完全長および欠失した型内へのＩｇＧの重鎖および軽鎖の挿入により、接種した組織において完全なサイズのＩｇＧ分子を蓄積するための両方のアプローチが示されたが、欠失したＲＮＡ−２ベクターが使用された場合、そのレベルは顕著に高かった。従って、浸透して広がる完全長のＲＮＡ−２構築物の能力は、ヘテロマータンパク質の産生に重要ではないように見られ、ＲＮＡ−２の欠失した型の使用が、明らかに利点がある。特に、それらはまた、生物学的封じ込めの利点を与える。
【００１２】
従って、ベクター系に基づく公知のＣＰＭＶは、植物において目的のタンパク質をコードする異種遺伝子の発現に有用な手段であることを表す。しかしながら、改良を必要とする最適化されるベクター系のための当該分野における必要性、例えば発現される異種タンパク質の収率およびベクターの使用の容易さが依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２００７／１３５４８０号パンフレット
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．Ｐ．＆  Ｓｈａｎｋｓ，Ｍ．（１９８３），Ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｏｗｐｅａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  Ｂ  ＲＮＡ．ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２，２２５３−２２５８
【非特許文献２】Ｈｏｌｎｅｓｓ，Ｃ．Ｌ．，Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．Ｐ．，Ｅｖａｎｓ，Ｄ．およびＭａｕｌｅ，Ａ．Ｊ．（１９８９）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｃｏｄｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｃｏｗｐｅａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｍｉｄｄｌｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＲＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７２，３１１  ３２０
【非特許文献３】Ｗｅｌｌｉｎｋ  Ｊ，Ｖｅｒｖｅｒ  Ｊ，ｖａｎ  Ｋａｍｍｅｎ  Ａ．（１９９３）．Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＡＵＧ  ｃｏｄｏｎｓ  ｏｆ  ｃｏｗｐｅａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  Ｍ  ＲＮＡ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．７５（８）：７４１−７
【非特許文献４】ｖａｎ  Ｂｏｋｈｏｖｅｎ，Ｈ．，Ｌｅ  Ｇａｌｌ，Ｏ，Ｋａｓｔｅｅｌ，Ｄ．，Ｖｅｒｖｅｒ，Ｊ．，Ｗｅｌｌｉｎｋ，Ｊ．およびｖａｎ  Ｋａｍｍｅｎ，Ａ．（１９９３）．Ｃｉｓ−ａｎｄ  Ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｃｏｗｐｅａ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９５，３７７−３８６
【非特許文献５】Ｒｏｈｌｌ，Ｊ．Ｂ．，Ｈｏｌｎｅｓｓ，Ｃ．Ｌ．，Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．Ｐ．およびＭａｕｌｅ，Ａ．Ｊ．（１９９３）．３’ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｗｐｅａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  Ｍ−ＲＮＡ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９３，６７２−６７９
【非特許文献６】Ｌｉｕ，Ｌ．，Ｃａｎｉｚａｒｅｓ，Ｍ．Ｃ．，Ｍｏｎｇｅｒ，Ｗ．，Ｐｅｒｒｉｎ，Ｙ．，Ｔｓａｋｉｒｉｓ，Ｅ．，Ｐｏｒｔａ，Ｃ．，Ｓｈａｒｉａｔ，Ｎ．，Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｌ．およびＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．Ｐ．（２００５）．Ｃｏｗｐｅａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３，１７８８−１７９２
【非特許文献７】Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｆ．，Ｃａｎｉｚａｒｅｓ，Ｍ．Ｃ．およびＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．Ｐ．（２００７）Ｃｏｗｐｅａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｈｅｆｆｅｒｏｎ，Ｋ．ｅｄ），ｐｐ．３３９−５５５．Ｋｅｒａｌａ，Ｉｎｄｉａ：Ｔｒａｎｓｗｏｒｌｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ．
【非特許文献８】Ｇｏｐｉｎａｔｈ，Ｋ．，Ｗｅｌｌｉｎｋ，Ｊ．，Ｐｏｒｔａ，Ｃ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｍ．，Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．Ｐ．およびｖａｎ  Ｋａｍｍｅｎ，Ａ．（２０００）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｃｏｗｐｅａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ−２  ｉｎｔｏ  ａ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｏ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６７：１５９−１７３
【非特許文献９】Ｍｅｃｈｔｃｈｅｒｉａｋｏｖａ，Ｉ．Ａ．，Ｅｌｄａｒｏｖ，Ｍ．Ａ．，Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｌ．，Ｓｈａｎｋｓ，Ｍ．，Ｓｋｒｙａｂｉｎ，Ｋ．Ｇ．およびＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．Ｐ．（２００６）Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｃｏｒｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３１，１０−１５
【非特許文献１０】Ｍｏｎｇｅｒ，Ｗ．，Ａｌａｍｉｌｌｏ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｏｌａ，Ｉ．，Ｐｅｒｒｉｎ，Ｙ．，Ｂｅｓｔａｇｎｏ，Ｍ．，Ｂｕｒｒｏｎｅ，Ｏ．Ｒ．，Ｓａｂｅｌｌａ，Ｐ．，Ｐｌａｎａ−Ｄｕｒａｎ，Ｊ．，Ｅｎｊｕａｎｅｓ，Ｌ．，Ｇａｒｃｉａ，Ｊ．Ａ．およびＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．Ｐ．（２００６）Ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｆｒｏｍ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｐａｓｓｉｖｅｌｙ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｓ  ｐｉｇｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｈｅｎ  ｓｕｐｐｌｉｅｄ  ｏｒａｌｌｙ  ｉｎ  ｃｒｕｄｅ  ｐｌａｎｔ  ｅｘｔｒａｎｃｔｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．４，６２３−６３１
【非特許文献１１】Ａｌａｍｉｌｌｏ，Ｊ．Ｍ．，Ｍｏｎｇｅｒ，Ｗ．，Ｓｏｌａ，Ｉ．，Ｇａｒｃｉａ，Ｂ．，Ｐｅｒｒｉｎ，Ｙ．，Ｂｅｓｔａｇｎｏ，Ｍ．，Ｂｕｒｒｏｎｅ，Ｏ．Ｒ．，Ｐｌａｎａ−Ｄｕｒａｎ，Ｊ．，Ｅｎｊｕａｎｅｓ，Ｌ．，Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｐ．Ｇ．およびＧａｒｃｉａ，Ｊ．Ａ．（２００６）Ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ａｎｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．１，１１０３−１１１１
【非特許文献１２】Ｃａｎｉｚａｒｅｓ，Ｍ．Ｃ．，Ｌｉｕ，Ｌ．，Ｐｅｒｒｉｎ，Ｙ．，Ｔｓａｋｉｒｉｓ，Ｅ．およびＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．Ｐ．（２００６）．Ａ  ｂｉｐａｒｔｉｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．４，１８３−１９３
【非特許文献１３】Ｂｒｉｇｎｅｔｉ，Ｇ．，Ｖｏｉｎｎｅｔ，Ｏ．，Ｌｉ，Ｗ．Ｘ．，Ｊｉ，Ｌ．Ｈ．，Ｄｉｎｇ，Ｓ．ＷおよびＢａｕｌｃｏｍｂｅ，Ｄ．Ｃ．（１９９８）Ｖｉｒａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ａｒｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ．ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １７：６７３９−６７４６
【非特許文献１４】Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｆ．，Ｌｉｕ，Ｌ．およびＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ  Ｇ．Ｐ．（２００９）Ｃｏｗｐｅａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．４８３：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｌａｎｔｓ（Ｆａｙｅ，Ｌ．およびＧｏｍｏｒｄ，Ｖ．ｅｄｓ），ｐｐ２５−３９，ＮＹ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献１５】Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｆ．およびＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．Ｐ．（２００８）．Ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ａｎｄ  ｒａｐｉｄ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １４８，１２１２−１２１８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、驚くべきことに、ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ベクターにおける１６１位での開始コドンの変異が、５１２位での開始コドンの後に挿入される遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルを著しく増加させることを見出した。タンパク質発現のレベルは、１６１位での開始コドンがインタクトである（ＳａｉｎｓｂｕｒｙおよびＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，２００８）ことのみが異なる、ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ベクター由来の同じタンパク質の発現と比較して、約２０〜３０倍増加した。本発明は、ウイルス複製を必要とせず、外来性タンパク質の高レベルの産生を可能にする。
【００１６】
本発明者らはまた、１６１位での開始コドンの変異が、１６１での変異された開始コドンと、５１２での開始コドンの位置の間のフレームを維持するための必要性を無効にし、これにより、１６１位での変異された開始コドンの後の任意の長さの配列の挿入を可能にすることを見出した。このことは特に、任意の長さのポリリンカーを、変異された開始コドンの後にＲＮＡ−２ベクター内に挿入することを可能にし、次いで、ベクター内に目的の遺伝子のクローニングを容易にするのに使用できるという利点がある。
【００１７】
さらに、本発明者らは、タンパク質発現の増加にもかかわらず、１６１位での変異した開始コドンを含むＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ベクターで形質転換した植物が健康的であるように見えることを見出した。すなわち、公知のＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ベクターで形質転換した植物より壊死をほとんど示さなかった。植物の健康は、長期間生存する健康的な植物として植物由来のタンパク質の発現に重要な因子である。さらに、植物の健康はまた、タンパク質精製を妨げ得る壊死の結果として放出されるタンニンなどの植物由来のタンパク質の精製に重要である（ＳａｉｎｓｂｕｒｙおよびＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，２００８）。
【００１８】
従って、本発明は、修飾された２分節のウイルス配列に基づいた改良されたタンパク質産生系および方法に関連する。
【００１９】
従って、本発明の種々の態様において、発現エンハンサー配列が与えられるか、または利用され、その配列は、コモウイルスなどの２分節ＲＮＡウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメント由来（またはそれらと相同性を共有する）であり、その配列において、標的開始部位は変異されている。
【００２０】
本発明はさらに、２分節ウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメント由来の配列の発現または翻訳を増強する活性を増加させるためのプロセスを与え、そのプロセスは、配列内の標的開始部位を変異させることを含む。
【００２１】
本発明の一部の特定の定義および実施形態は、ここでより詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ＣＰＭＶ発現ベクター００、１０、０１および１１の概略図を示す。００発現ベクターにおいて、１１５位および１６１位の開始部位はインタクトである。１０発現ベクターにおいて、１１５位の開始部位は変異されているが、１６１位の開始部位はインタクトである。０１発現ベクターにおいて、１６１位の開始部位は変異されているが、１１５位の開始部位はインタクトである。１１発現ベクターにおいて、１１５位および１６１位の開始部位は両方変異されている。ＣＰＭＶ発現ベクター００、１０、０１および１１はまた、５１２（ＦＳＣ２−１５２）、５１３（ＦＳＣ２−５１３）または５１４（ＦＳＣ２−５１４）のいずれかの位置に開始部位を含む。バーは、タンパク質の発現が起こる開始部位を示すために使用される。
【図２】図２は、図１に概略的に示されるＣＰＭＶ発現ベクターでトランスフェクトされた植物で発現される可溶性の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のレベルを示す。発現ベクターＦＳＣ２−５１２、ＦＳＣ２−５１３、およびＦＳＣ２−５１４において、ＧＦＰをコードする遺伝子を、それぞれ、５１２位、５１３位および５１４位の開始コドンの後に挿入した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーンに、００、１０、０１および１１をマークし、１１５位および１６１位でのＣＰＭＶベクターにおける開始部位のものに応じて、インタクトまたは変異される。「５００ｎｇ」とマークしたレーンは、５００ｎｇのＧＦＰタンパク質に対応するバンドの位置を示し、それによって、ＣＰＭＶ発現ベクターから発現されるＧＦＰタンパク質の予想される位置を示す。各ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの左側のレーンは、タンパク質のサイズマーカーの位置を示す。
【図３】図３は、図２に示される実験で使用される同じＣＰＭＶ発現ベクターでトランスフェクトされたＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉におけるＧＦＰ発現のレベルを示す。葉の先端の薄い領域はＧＦＰ発現の領域に対応した。発現ベクター１０、０１および１１における１１５位および／または１６１位の開始部位を不活性化するために変異が行われ、それも示す。
【図４】図４は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、およびＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）を一過性発現するためのＤｅｌ−ＲＮＡ−２（図１における発現ベクター００［ＦＳＣ２−５１２］）およびＨＴ（図１における発現ベクター０１［ＦＳＣ２−５１２］）の比較を示す。各タンパク質についてのｄｅｌＲＮＡ−２またはＨＴクローンに、サイレンシング抑制因子Ｐ１９を浸潤させた。（Ａ）ＤｓＲｅｄまたはＨＢｃＡｇが発現された場合、ｄｅｌＲＮＡ−２構築物での浸潤後７日の組織は壊死したが、これはＨＴにより駆動された発現についての場合ではない。実際に、ＨＴによってＤｓＲｅｄを発現する組織は、昼間の明かりの条件下で明白に赤く見える。（Ｂ）タンパク質発現のＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。示したように組み換えタンパク質に対応する突出したバンドが、ウェスタンブロッティングによって確認された。１−マーカー、２−浸潤されていない組織、３−ｄｅｌＲＮＡ−２構築物、４−ＨＴ構築物、５−利用可能な場合、市販の標準物質。約５ｍｇの浸潤した組織のからの粗抽出物を、レーンごとに負荷し、同様に２μｇのＧＦＰ標準物質および２μｇのＨＢｃＡｇ標準物質を負荷した。ＤｓＲｅｄについての標準物質は今回、利用可能ではなかった。
【図５】図５は、ヒトの抗ヒト免疫不全ウイルス抗体２Ｇ１２を一過性発現するためのＤｅｌ−ＲＮＡ−２（図１における発現ベクター００［ＦＳＣ２−５１２］）およびＨＴ（図１における発現ベクター０１［ＦＳＣ２−５１２］）の初期の比較を示す。ＩｇＧ重鎖は、天然形態（ＨＬ）またはＥＲ保有（ＨＥＬ）のいずれかであり、軽鎖およびＰ１９を浸潤させた。（Ａ）ｄｅｌ−ＲＮＡ−２による２Ｇ１２−ＨＥＬの発現により、浸潤された組織の壊死が導かれるが、これはＨＴ発現については生じない。（Ｂ）抗体重鎖（ｄｅｌＲＮＡ−２またはＨＴ）とＰ１９が浸潤した組織の粗抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。各試料について、５ｍｇの浸潤した組織からの粗抽出物を１μｇの標準ヒトＩｇＧとして負荷した。２Ｇ１２に対応するバンドは、ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色後、容易に目に見える。（Ｃ）５日後に抗体２Ｇ１２の蓄積を、プロテインＡに対する捕捉および表面プラズモン共鳴分光法により測定し、２容量の緩衝液（ＰＢＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）での抽出後の濃度を表す。従って、本発明者らは、植物インキュベーションまたは抽出を１つも最適化せずに、１５０ｍｇ／ｋｇ（ＨＴ  ＨＥＬについて）に近づく初期の重量濃度を導くことができる。３つの試料を各処置について測定した。
【図６】図６は、集合したＨＢｃＡｇ粒子の電子顕微鏡写真を示し、これは、本明細書に記載されるＨＴ（図１における発現ベクター０１［ＦＳＣ２−５１２］）発現系を用いて発現された。集合したＨＢｃＡｇ粒子は、直径約３０ｎｍの中空球のように見える。ＨＢｃＡｇ粒子を含む樹液（ｓａｐ）は、電子顕微鏡写真を撮る前に濃縮されなかったが、望ましくない塩は除去した。従って、電子顕微鏡写真は樹液（ｓａｐ）中のＨＢｃＡｇ粒子の濃度を表す。
【図７】図７は、ベクターｐＭ８１−ＦＳＣ１を示す。
【図８】図８は、ベクターｐＭ８１−ＦＳＣ２を示す。
【図９】図９は、ｐＥＡＱの構築物の概略図を示す。（Ａ）灰色で示された外来配列を有する開始ｐＢＩＮＰＬＵＳベースのプラスミド。（Ｂ）バイナリーベクターの必須エレメントを含むＰＣＲ産物。（Ｃ）末端を合わせた（ｅｎｄ−ｔａｉｌｏｒｅｄ）ＰＣＲ産物の３部のライゲーション後の中間体プラスミド。（Ｄ）増幅およびその後の中間体からの２つのフラグメントのライゲーション後の最終プラスミド。
【図１０】図１０は、主なｐＥＡＱ誘導体のＴ−ＤＮＡの概略図を示す。Ｔ−ＤＮＡは、示した制限部位内に起こり得るクローニングを残す、示したＰ１９およびＮＰＴＩＩカセットのいずれかまたは両方を含む。
【図１１】図１１は、その親プラスミドＰＢＢ−ＦＳＣ２−５１２−ＨＴと比較したｐＥＡＱベクターによって産生したＧＦＰの発現レベルを示す。組織を、ｐＥＡＱｅｘｐｒｅｓｓを除いて、Ｐ１９および示したベクターでの浸潤後、６日に分析し、それを、標準的なＯＤまたは２倍の希釈で単独で浸潤させた。（Ａ）ＵＶ照射下で視覚化した葉、（Ｂ）ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色した１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および（Ｃ）蛍光分光分析。
【図１２】図１２は、野生型Ｐ１９と比較したＧＦＰ発現を向上させるＰ１９（Ｒ４３Ｗ）の能力を示す。組織は、２倍希釈でのｐＥＡＱｓｅｌｅｃｔＫ（ｓｅｌＫ−Ｐ１９）、ｐＥＡＱｓｅｌｅｃｔＫおよびＰ１９（ｓｅｌＫ）、ｐＥＡＱｓｐｅｃｉａｌＫ（ｓｐＫ）、２倍希釈でのｐＥＡＱｓｐｅｃｉａｌＫ（ｓｐＫ１：２）、ｐＥＡＱｓｐｅｃｉａｌＫｍ（ｓｐＫｍ）、２倍希釈でのｐＥＡＱｓｐｅｃｉａｌＫｍ（ｓｐＫｍ１：２）、ｐＥＡＱｅｘｐｒｅｓｓ（ｅｘ）、および２倍希釈でのｐＥＡＱｅｘｐｒｅｓｓ（ｅｘ１：２）での浸潤後６日に分析した。（Ａ）ＵＶ照射下で視覚化した葉および（Ｂ）蛍光分光分析。
【図１３】図１３は、単一のｐＥＡＱプラスミドを有する完全なサイズのＩｇＧ、２Ｇ１２の発現を示す。（Ａ）２Ｇ１２を発現するために構築された２つのｐＥＡＱｅｘｐｒｅｓｓ由来プラスミドの概略図。（Ｂ）希釈物を示す浸潤スキームおよび各プラスミドの組み合わせについてのそれらの代表的なＯＤ、ならびに各ＯＤでの侵潤後に作製されたタンパク質抽出物の濃度（±ＳＤ）。（Ｃ）Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色した１２〜４％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および（Ｄ）２Ｇ１２重鎖（γ）の免疫学的検出および（Ｅ）浸潤後８日の２Ｇ１２Ｆａｂ領域（Ｆａｂ）鎖の免疫学的検出。Ｍ、示したサイズを有するマーカー；Ｃ、コントロール抽出物；Ｓｔｄ、ＣＨＯ産生２Ｇ１２。ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色に関して、３ｍｇの浸潤組織の等価物からのタンパク質は、１μｇのＣＨＯ２Ｇ１２を有する各レーンに位置し、２５０ｎｇのＣＨＯ２Ｇ１２の各レーンにおけるウェスタンブロッティングについて０．７５ｍｇの組織の等価物。推測した集合／分解産物を示す。
【図１４】図１４は、ネイティブおよびｈｉｓ−タグ化変異体におけるｐＥＡＱ−ＨＴ由来のＧＦＰのクローニングおよび発現を示す。（Ａ）ポリリンカーの詳細を有するｐＥＡＱ−ＨＴ  Ｔ−ＤＮＡの概略図。（Ｂ）ＧＦＰ発現の蛍光分光分析。ｓｐＫ＝ｐＥＡＱｓｐｅｃｉａｌＫ−ＧＦＰ−ＨＴ、ＧＦＰ、ＨｉｓＧＦＰ、およびＧＦＰＨｉｓ＝ｐＥＡＱ−ＨＴクローン。（Ｃ）１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＧＦＰ発現のウェスタン分析。Ｃ＝コントロール抽出物。
【図１５】図１５は、バキュロウイルスベクターの一部としての昆虫細胞における使用に適切な本発明の核酸構築物を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書中で言及する場合、「エンハンサー」配列（またはエンハンサー要素）とは、コモウイルスなどの２分節のＲＮＡウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメント由来の（またはそれらと相同性を共有する）配列であり、その配列において、標的開始部位は変異される。そのような配列は、それらが結合される異種ＯＲＦの下流の発現を向上できる。限定せずに、転写ＲＮＡに存在する場合、そのような配列は、それらが結合される異種ＯＲＦの翻訳を向上できると考えられる。
【００２４】
本明細書中で言及する場合、「標的開始部位」とは、野生型ＲＮＡ−２ゲノムセグメントによってコードされる２つのカルボキシ共末端タンパク質のより長い方の産生（翻訳）のための開始部位として役立つ、問題のあるエンハンサー配列が由来する２分節のウイルス（例えばコモウイルス）の野生型ＲＮＡ−２ゲノムセグメントにおける開始部位（開始コドン）である。
【００２５】
上記のように、ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２によってコードされる２つのカルボキシ共末端タンパク質のより長い方である、１０５Ｋのタンパク質の産生は、野生型ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメント内の１６１位での開始部位で開始される。従って、ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメント由来のエンハンサー配列における標的開始部位は、野生型ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２における１６１位での開始部位である。
【００２６】
１６１位の開始コドン付近の変異は、１６１位の開始コドン自体を変異することと同じ（または同様の）効果を有することができる。例えば、この開始コドン付近の状態を破壊することは、開始コドンがより頻繁にバイパスされることを意味し得る。
【００２７】
本発明の一態様において、従って、標的開始部位は、標的開始部位の上流および／または下流の１つ以上のヌクレオチドを変異することによって、間接的に「変異され」得るが、野生型標的開始部位は残ったままであり、これらのヌクレオチドを変異させる効果は、標的開始部位自体が変異される場合に観測される効果と同じまたは類似である。
【００２８】
標的開始部位は、野生型ＲＮＡ−２ゲノムセグメントによってコードされる２つのカルボキシ共末端タンパク質のより長い方の産生のための開始部位として役立つため、標的開始部位が、野生型ＲＮＡ−２によってコードされる２つのカルボキシ共末端タンパク質のより短い方の産生のための開始部位として役立つ、同じ野生型ＲＮＡ−２ゲノムセグメント上の第２の開始部位を有するフレーム内（同相）にあるという結果となる。２つの開始部位は、それらが同じトリプレットリーディングフレーム内にある場合、フレーム内にある。
【００２９】
野生型ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメント由来のエンハンサー配列における標的開始部位、すなわち１６１位の開始部位は、野生型ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメントにおけるＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２によってコードされる２つのカルボキシ共末端タンパク質のより短い方（９５Ｋのタンパク質）の産生のための開始部位として役立つ、５１２位に開始部位を有するフレーム内にある。
【００３０】
従って、標的開始部位は、野生型ＲＮＡ−２ゲノムセグメントによってコードされる２つのカルボキシ共末端ポリタンパク質のより短い方の産生のための開始部位として役立つ、エンハンサー配列が由来する野生型ＲＮＡ−２ゲノムセグメントにおける第２の開始部位の上流（５’）に位置する。さらに、標的開始部位はまた、エンハンサー配列が由来する野生型ＲＮＡ−２ゲノムの第３の開始部位の下流（３’）に位置し得る。ＣＰＭＶにおいて、標的開始部位、すなわち、１６１位の開始部位は、９５Ｋのタンパク質の産生のための開始部位として役立つ５１２位の第２の開始部位の上流、および１１５位の第３の開始部位の下流に位置する。
【００３１】
従って、２分節のウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメント由来のエンハンサー配列における標的開始部位は、野生型ＲＮＡ−２によってコードされる２つのカルボキシ共末端タンパク質の産生のための２つの開始部位のうちの第１である。この文脈において「第１の」とは、野生型ＲＮＡ−２ゲノムセグメントの５’末端近くに位置する開始部位を指す。
【００３２】
所望の場合、配列中の１つより多い開始部位が変異されてもよい。例えば、１１５位（またはそれに相当する）「第３の」開始部位が、欠失または変更されてもよい。ＡＵＧ１６１の除去に加えてＡＵＧ１１５の除去が、発現をさらに向上させることが示されている（ＳａｉｎｓｂｕｒｙおよびＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，２００８）。
【００３３】
本発明のエンハンサー配列は、２分節のＲＮＡウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメント由来の修飾された配列に基づく。
【００３４】
本明細書中で言及される場合、２分節のウイルス、または２分節のゲノムを有するウイルスは、Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅファミリーのメンバーであってもよい。Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅファミリーの全ての属は、２つのカルボキシ共末端タンパク質をコードするようである。Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅファミリーの属としては、コモウイルス、ネポウイルス、ファバウイルス、ケラウイルス（Ｃｈｅｒａｖｉｒｕｓ）、およびサドワウイルスが挙げられる。コモウイルスとしては、Ｃｏｗｐｅａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（ＣＰＭＶ）、Ｃｏｗｐｅａ  ｓｅｖｅｒｅ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（ＣＰＳＭＶ）、Ｓｑｕａｓｈ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（ＳｑＭＶ）、Ｒｅｄ  ｃｌｏｖｅｒ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ（ＲＣＭＶ）、Ｂｅａｎ  ｐｏｄ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ（ＢＰＭＶ）が挙げられる。好ましくは、２分節のウイルス（またはコモウイルス）はＣＰＭＶである。
【００３５】
これらのコモウイルスおよびいくつかの特定の株のＲＮＡ−２ゲノムセグメントの配列は、括弧に記載される受託番号の下でＮＣＢＩデータベースから利用可能である：ｃｏｗｐｅａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ−２（ＮＣ＿００３５５０）、ｃｏｗｐｅａ  ｓｅｖｅｒｅ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ−２（ＮＣ＿００３５４４）、ｓｑｕａｓｈ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ−２（ＮＣ＿００３８００）、ｓｑｕａｓｈ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  Ｋｉｍｂｌｅ  ＲＮＡ−２（ＡＦ０５９５３３）、ｓｑｕａｓｈ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  Ａｒｉｚｏｎａ  ＲＮＡ−２（ＡＦ０５９５３２）、ｒｅｄ  ｃｌｏｖｅｒ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ−２（ＮＣ＿００３７３８）、ｂｅａｎ  ｐｏｄ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ−２（ＮＣ＿００３４９５）、ｂｅａｎ  ｐｏｄ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  Ｋ−Ｈｏｐｋｉｎｓ１  ＲＮＡ−２（ＡＦ３９４６０９）、ｂｅａｎ  ｐｏｄ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  Ｋ−Ｈａｎｃｏｃｋ１  ＲＮＡ−２（ＡＦ３９４６０７）、Ａｎｄｅａｎ  ｐｏｔａｔｏ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ（ＡＰＭｏＶ：Ｌ１６２３９）およびＲａｄｉｓｈ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（ＲａＭＶ；ＡＢ２９５６４４）。同様に、ｂｅａｎ  ｒｕｇｏｓｅ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（ＢＲＭＶ；ＡＦ２６３５４８）およびコモウイルス属、ｔｕｒｎｉｐ  ｒｉｎｇｓｐｏｔ  ｖｉｒｕｓ（ＥＦ１９１０１５）の暫定的なメンバーから利用可能な部分的なＲＮＡ−２配列も存在する。Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅファミリーにおける他の属由来の多数の配列も利用可能である。
【００３６】
今まで、研究されてきた全てのコモウイルスは、それらのＲＮＡ−２ゲノムセグメント由来の２つのカルボキシ共末端ポリタンパク質を発現するための２つの別の開始コドンを有することが示されている。特に、ＣＰＭＶ、ＣＰＳＭＶ、ＢＰＭＶ、ＳｑＭＶおよびＲＣＭＶのＲＮＡ−２ゲノムセグメントは、２つのカルボキシ共末端ポリタンパク質を発現するための２つの別の開始コドンを含むことが知られている。
【００３７】
従って、ＣＰＭＶ（すなわち、それに対応する）の野生型ＲＮＡ−２セグメントにおける１６１位の開始部位と同等である、他のコモウイルスにおける標的開始部位は、当該分野において公知の方法によって同定され得る。例えば、標的開始部位は、ＣＰＭＶの野生型ＲＮＡ−２ゲノムセグメント配列と、別のコモウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメント配列との間の配列アラインメントによって同定され得る。次いで、このような配列アラインメントは、少なくともそのアラインメントにおいて、野生型ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２における１６１位の標的開始部位と近いか、または同じ位置である、開始部位を同定することによって、コモウイルスＲＮＡ−２ゲノムセグメント配列における標的開始部位を同定するために使用され得る。
【００３８】
他のコモウイルスにおける標的開始部位もまた、野生型コモウイルスＲＮＡ−２ゲノムセグメントによってコードされる２つのカルボキシ共末端タンパク質のより長い方の合成のための開始部位として役立つ開始コドンを決定することによって同定され得る。このアプローチはまた、上記のアラインメントと合わせて使用され得る。すなわち、このアプローチは、ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２を有するアラインメントによって同定されるコモウイルス開始部位が標的開始部位であることを確認するために使用され得る。
【００３９】
もちろん、上記の方法はまた、野生型ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメントにおける５１２位の開始部位と同等である、他のコモウイルスＲＮＡ−２ゲノムセグメントにおける開始部位を同定するために使用され得る。しかしながら、野生型コモウイルスＲＮＡ−２ゲノムセグメントによってコードされる２つのカルボキシ共末端タンパク質のより長い方を合成するための開始部位として役立つ開始コドンを同定する代わりに、野生型コモウイルスＲＮＡ−２ゲノムセグメントによってコードされる２つのカルボキシ共末端タンパク質のより短い方を合成するための開始部位として役立つ開始コドンが同定される。
【００４０】
一旦、ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２における１６１位および５１２位の開始部位と同等である可能性がある２つのコモウイルスＲＮＡ−２開始部位が同定されると、その標的開始部位の同定は、２つの開始部位が同じフレーム内、すなわち、同じトリプレットリーディングフレーム内にあることを調べることによって確認され得る。なぜなら、この場合、それらは、２つのカルボキシ共末端タンパク質を産生するための開始部位としてのみ機能するからである。
【００４１】
本発明の一実施形態において、エンハンサー配列は、ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメントのヌクレオチド１〜５１２を含み（表１を参照のこと）、１６１位の標的開始部位は変異される。本発明の別の実施形態において、エンハンサー配列は、別のコモウイルス由来の等価配列を含み、ＣＰＭＶの１６１位の開始コドンと同等の標的開始部位は変異される。その標的開始部位は、置換、欠失または挿入によって変異されてもよい。好ましくは、その標的開始部位は、点突然変異によって変異される。
【００４２】
本発明の代替の実施形態において、エンハンサー配列は、変異標的開始部位を有するコモウイルスＲＮＡ−２ゲノムセグメント配列のヌクレオチド１０〜５１２、２０〜５１２、３０〜５１２、４０〜５１２、５０〜５１２、１００〜５１２、１５０〜５１２、１〜５１４、１０〜５１４、２０〜５１４、３０〜５１４、４０〜５１４、５０〜５１４、１００〜５１４、１５０〜５１４、１〜５１１、１０〜５１１、２０〜５１１、３０〜５１１、４０〜５１１、５０〜５１１、１００〜５１１、１５０〜５１１、１〜５０９、１０〜５０９、２０〜５０９、３０〜５０９、４０〜５０９、５０〜５０９、１００〜５０９、１５０〜５０９、１〜５０７、１０〜５０７、２０〜５０７、３０〜５０７、４０〜５０７、５０〜５０７、１００〜５０７、または１５０〜５０７を含む。本発明の他の実施形態において、エンハンサー配列は、表１に示すＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメント配列のヌクレオチド１０〜５１２、２０〜５１２、３０〜５１２、４０〜５１２、５０〜５１２、１００〜５１２、１５０〜５１２、１〜５１４、１０〜５１４、２０〜５１４、３０〜５１４、４０〜５１４、５０〜５１４、１００〜５１４、１５０〜５１４、１〜５１１、１０〜５１１、２０〜５１１、３０〜５１１、４０〜５１１、５０〜５１１、１００〜５１１、１５０〜５１１、１〜５０９、１０〜５０９、２０〜５０９、３０〜５０９、４０〜５０９、５０〜５０９、１００〜５０９、１５０〜５０９、１〜５０７、１０〜５０７、２０〜５０７、３０〜５０７、４０〜５０７、５０〜５０７、１００〜５０７、または１５０〜５０７を含み、野生型ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメントにおける１６１位の標的開始部位は変異される。
【００４３】
本発明のさらなる実施形態において、エンハンサー配列は、変異標的開始部位を有するコモウイルスＲＮＡ−２ゲノムセグメント配列のヌクレオチド１〜５００、１〜４９０、１〜４８０、１〜４７０、１〜４６０、１〜４５０、１〜４００、１〜３５０、１〜３００、１〜２５０、または１〜２００を含む。
【００４４】
本発明の代替の実施形態において、エンハンサー配列は、表１に示すＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメント配列のヌクレオチド１〜５００、１〜４９０、１〜４８０、１〜４７０、１〜４６０、１〜４５０、１〜４００、１〜３５０、１〜３００、１〜２５０、または１〜２００を含み、野生型ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメントにおける１６１位の標的開始部位は変異される。
【００４５】
変異標的開始部位を有するコモウイルスＲＮＡ−２ゲノムセグメントの少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも４６０、少なくとも４７０、少なくとも４８０、少なくとも４９０、あるいは少なくとも５００のヌクレオチドを含むエンハンサー配列もまた、本発明の実施形態である。
【００４６】
さらに、野生型ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメントにおける１６１位の標的開始部位が変異される、表１に示すＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメント配列の少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも４６０、少なくとも４７０、少なくとも４８０、少なくとも４９０あるいは少なくとも５００のヌクレオチドを含むエンハンサー配列もまた、本発明の実施形態である。
【００４７】
本発明の代替の実施形態は、野生型ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメントにおける１６１位の標的開始部位が変異される、表１に示すＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメント配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、または９０％の同一性を有するエンハンサー配列である。
【００４８】
特定の配列に対して言及する場合、用語「％の類似性」、「％の同一性」および「％の相同性」は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＧＣＧソフトウェアプログラムに記載されるように使用される。従って、エンハンサー配列は、表１に示すＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメント配列の相補的配列と特異的にハイブリダイズする。ただし、野生型ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメントにおける１６１位に対応する標的開始部位は変異される。
【００４９】
用語「特異的にハイブリダイズする」とは、当該分野において一般に使用される予め決定された条件下で、そのようなハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な相補的配列（時々、「実質的に相補的な」といわれる）の２つの一本鎖核酸分子の間の会合を指す。特に、この用語は、本発明の１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に含まれる実質的に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを指し、非相補的配列の一本鎖核酸を有するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの実質的な排除を指す。「相補的な」とは、塩基対合（相補的配列Ｔ−Ｃ−ＡとのＡ−Ｇ−Ｔ対）による核酸配列の天然の会合を指す。２つの一本鎖分子間の相補性は、核酸対の一部のみが相補的である場合、部分的であってもよいか、または全ての塩基対が相補的である場合、完全であってもよい。相補性の程度は、ハイブリダイゼーションおよび増幅反応の効果および強度に影響を与える。
【００５０】
本発明のエンハンサー配列における標的開部位は、翻訳開始部位としてもはや機能しなくなるように、欠失、挿入または置換によって変異されてもよい。例えば、点突然変異が、エンハンサー配列における標的開始部位の位置でなされてもよい。あるいは、エンハンサー配列における標的開始部位は、部分的または完全のいずれかで欠失されてもよい。例えば、エンハンサー配列における標的開始部位にわたる欠失がなされてもよい。
【００５１】
理論に束縛されることを望まないなら、ＣＰＭＶにおける１６１位の開始コドンの変異は、不活化翻訳抑制因子の下流に位置する開始コドンからの翻訳の向上した開始を生じる、翻訳抑制因子の不活化を導くと考えられる。
【００５２】
従って、本発明はさらに、２分節ウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメント由来のエンハンサー配列を提供し、そのエンハンサー配列は、不活化翻訳抑制因子配列を含む。
【００５３】
本発明はさらに、２分節ウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメント由来の配列の発現または翻訳を増強する活性を増加させるためのプロセスを提供し、そのプロセスは、配列内の翻訳抑制因子配列を不活化する工程を含む。
【００５４】
既に上で述べたように、ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメントにおける１６１位の開始部位の変異は、ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２に通常存在する翻訳抑制因子の不活化を導くと考えられる。
【００５５】
本明細書中で言及する場合、翻訳抑制因子配列とは、問題のあるエンハンサー配列が由来する２分節のウイルス（例えばコモウイルス）の野生型ＲＮＡ−２ゲノムセグメントにおける配列であり、野生型ＲＮＡ−２ゲノムセグメントによってコードされる２つのカボキシ共末端タンパク質のより長い方を産生（翻訳）するための制限部位を含むか、それから構成される。
【００５６】
ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメント由来のエンハンサー配列における翻訳抑制因子配列は、上記の標的開始部位を含むか、またはそれから構成される配列である。従って、翻訳抑制因子配列は、上記の標的開始部位を含むか、それから構成され、上記の変異誘発によって不活性化され得る。
【００５７】
上記のエンハンサー配列は、以下のような本発明の種々の態様および実施形態において使用されてもよい。
【００５８】
従って、本発明の一態様において、上記の発現エンハンサー配列から構成されるか、またはそれから実質的に構成される単離された核酸が提供または利用される。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、「核酸」または「核酸分子」とは、一本鎖または二本鎖のいずれかである任意のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指し、一本鎖の場合、その相補的配列の分子は、直線状または環状の形態のいずれかである。核酸分子を考慮する際に、特定の核酸分子の配列または構造が、通常の従来の５’から３’方向における配列を与えることによって本明細書中に記載され得る。本発明の核酸に関して、用語「単離された核酸」が時々使用される。ＤＮＡに当てはめる場合、この用語は、起源となる生物の天然のゲノムにすぐに隣接する配列から分離されるＤＮＡ分子を指す。
【００６０】
例えば、「単離された核酸」は、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターに挿入されるか、あるいは原核細胞もしくは真核細胞または宿主生物のゲノムＤＮＡに組み込まれるＤＮＡ分子を含んでもよい。
【００６１】
ＲＮＡに当てはめる場合、この用語「単離された核酸」とは主に、上記の単離されたＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子を指す。あるいは、この用語は、天然の状態（すなわち、細胞または組織中）で会合する他の核酸から十分に分離されているＲＮＡ分子を指す場合もある。「単離された核酸」（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）はさらに、生物学的または合成的手段によって直接産生され、その産生の間に存在する他の化合物から分離される分子を表す場合もある。
【００６２】
従って、核酸は、エンハンサーが由来する２分節のＲＮＡウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメントの一部またはそのフラグメントを含むか、または実質的に含んでもよい。例えば、一実施形態において、核酸は、由来するＲＮＡ−２ゲノムセグメントのコード領域の少なくとも一部を含まない。コード領域は、２つのカルボキシ共末端タンパク質のより短い方をコードするＲＮＡ−２ゲノムセグメントの領域であり得る。核酸は、野生型ＲＮＡ−２ゲノムセグメントの５’末端から、野生型ＲＮＡ−２ゲノムセグメントによってコードされる２つのカルボキシ共末端タンパク質のより短い方の産生（翻訳）が開始される開始部位まで伸長する２分節のウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメントの一部から構成されてもよいか、またはそれから実質的に構成されてもよい。
【００６３】
特定のヌクレオチドまたはアミノ酸を言及する場合、用語「から実質的に構成される」とは、所定の配列番号の特性を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸配列に関して使用される場合、この用語は、配列の基本的かつ新規の特徴に影響を及ぼさない配列それ自体および分子修飾を含む。例えば、核酸に対して使用される場合、この用語は、配列のエンハンサー機能に影響を及ぼさないか、またはさらなる（追加的な）機能を与えない配列それ自体ならびに少しの変化および／または伸長物を含む。
【００６４】
本発明はさらに、本発明のエンハンサー配列を含む遺伝子発現系に関する。
【００６５】
従って、別の態様において、本発明は、上記のエンハンサー配列を含む遺伝子発現系を提供する。
【００６６】
遺伝子発現系はまた、エンハンサー配列の下流に挿入される目的のタンパク質をコードする遺伝子を含んでもよい。目的のタンパク質をコードする挿入される配列は、任意のサイズであってもよい。
【００６７】
従って、さらなる態様において、本発明は、
（ａ）上記のエンハンサー配列、および（ｂ）目的のタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子発現系を提供し、ここで、その遺伝子はエンハンサー配列の下流に位置する。
【００６８】
目的の遺伝子およびタンパク質は異種であってもよい。すなわち、エンハンサー配列が由来する野生型の２分節のＲＮＡウイルスによってコードされない。
【００６９】
遺伝子発現系は、宿主生物において目的のタンパク質を発現するために使用され得る。この場合、目的のタンパク質はまた、問題の宿主細胞に対して異種であってもよい。すなわち遺伝子操作を用いて、すなわちヒトの介入によって、問題の細胞（例えば、植物またはその原種）に組み込まれる。生物内の異種遺伝子は、内因性の等価遺伝子（すなわち、同じまたは類似の機能を正常に果たすもの）と置き換えられてもよいか、または挿入される配列は内因性遺伝子もしくは他の配列に対して付加的であってもよい。
【００７０】
当業者は、目的の遺伝子の発現が、発現される遺伝子の上流に位置する開始部位（ＡＵＧ）の存在を必要とすることを理解するだろう。そのような開始部位は、エンハンサー配列の一部または目的のタンパク質をコードする遺伝子の一部のいずれかとして与えられてもよい。
【００７１】
宿主生物は植物であってもよい。しかしながら、翻訳機構が真核生物にわたって十分に保存されているため、遺伝子発現系はまた、植物以外の真核宿主生物、例えば修飾されたバキュロウイルスベクターなどの昆虫細胞、または酵母もしくは哺乳動物細胞において目的のタンパク質を発現するために使用されてもよい。
【００７２】
遺伝子発現系は、プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結されてもよい。
【００７３】
従って、遺伝子発現系はさらに、終止配列を含んでもよく、目的のタンパク質をコードする遺伝子は、エンハンサー配列と終止配列との間、すなわちエンハンサー配列の下流（３’）および終止配列の上流（５’）に位置してもよい。
【００７４】
従って、本発明はさらに、
（ｉ）作動可能に連結されるプロモーター
（ｉｉ）上記のエンハンサー配列
（ｉｉｉ）発現することが所望される目的の遺伝子
（ｉｖ）終結配列
を含む、発現カセットを提供する。
【００７５】
好ましくは、目的の遺伝子を駆動するのに使用されるプロモーターは、強力なプロモーターである。植物に使用するための強力なプロモーターの例としては、
（１）ｐ３５Ｓ：Ｏｄｅｌｌら、１９８５
（２）Ｃａｓｓａｖａ  Ｖｅｉｎ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓプロモーター、ｐＣＡＳ、Ｖｅｒｄａｇｕｅｒら、１９９６
（３）リブロース二リン酸カルボキシラーザの小さいサブユニットのプロモーター、ｐＲｂｃＳ：Ｏｕｔｃｈｋｏｕｒｏｖら、２００３
が挙げられる。
【００７６】
他の強力なプロモーターとしては、ｐＵｂｉ（単子葉植物および双子葉植物について）およびｐＡｃｔｉｎが挙げられる。
【００７７】
好ましい実施形態において、プロモーターは、誘導プロモーターである。
【００７８】
プロモーターに適用される場合、用語「誘導」は当業者に十分に理解されている。本質的に、誘導プロモーターの制御下での発現は、与えられた刺激に応答して「スイッチオン」または増加される。刺激の性質はプロモーター間で変化する。一部の誘導プロモーターは、適切な刺激の非存在下において、少し、または検出できないレベルの発現（または発現なし）を生じる。他の誘導プロモーターは、刺激の非存在下において、検出可能な構成的発現を生じる。発現レベルは刺激の非存在下にかかわらず、任意の誘導プロモーター由来の発現は、適切な刺激の存在下において増加する。
【００７９】
終止（終結）配列は、２分節ＲＮＡウイルス、例えばコモウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメント由来の終止配列であり得る。一実施形態において、終止配列は、エンハンサー配列が由来する同じ２分節ＲＮＡウイルス由来であってもよい。終止配列は、停止コドンを含んでもよい。終止配列はまた、ポリアデニル化信号を伴ってもよい。
【００８０】
本発明の遺伝子発現カセット、遺伝子発現構築物および遺伝子発現系はまた、非翻訳領域（ＵＴＲ）を含んでもよい。ＵＴＲは、遺伝子発現カセット、遺伝子発現構築物または遺伝子発現系に存在する終結配列の上流に位置してもよい。遺伝子発現カセット、遺伝子発現構築物または遺伝子発現系が、目的のタンパク質をコードする遺伝子を含む場合、ＵＴＲは前記遺伝子の下流に位置してもよい。
【００８１】
従って、ＵＴＲは、目的のタンパク質をコードする遺伝子と終結配列との間に位置してもよい。ＵＴＲは、２分節ＲＮＡウイルス由来、例えば２分節ＲＮＡウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメント由来であってもよい。ＵＴＲは、遺伝子発現カセット、遺伝子発現構築物または遺伝子発現系に存在するエンハンサー配列が由来する同じＲＮＡ−２ゲノムセグメントの３’ＵＴＲであってもよい。好ましくは、ＵＴＲは、コモウイルスＲＮＡ−２ゲノムセグメントの３’ＵＴＲ、例えばＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメントの３’ＵＴＲである。
【００８２】
上記のように、ＲＮＡ−２における１６１位および５１２位の開始部位の間のフレームが維持されること、すなわち、２つの開始部位が同じトリプルリーディングフレームに残っていることは、ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−１にコードされるレプリカーゼによるＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２の効率的な複製のために必須であることが以前に示されている（Ｈｏｌｎｅｓｓら，１９８９；ｖａｎ  Ｂｏｋｈｏｖｅｎら，１９９３；Ｒｏｈｌｌら，１９９３）。この条件は、ＣＰＭＶに基づいた発現ベクターにおける５１２位の開始部位の上流に挿入できる配列の長さを制限した。特に、ポリリンカーの使用がしばしば、２つの開始部位の間のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を変化させるため、それらの使用が妨げられる。
【００８３】
本発明は、ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２における１６１位および５１２位の開始部位の間のリーディングフレームの維持がまた、５１２位の開始部位における翻訳の効率的な開始に必要とされること、すなわち、ＣＰＭＶによってコードされる２つのカルボキシ共末端タンパク質より短い方（９５Ｋタンパク質）の効率的な発現に必要とされることも示す。
【００８４】
しかしながら、本発明はまた、ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２における１６１位の開始部位の変異が、９５Ｋタンパク質の発現レベルに対していかなる負の影響も与えずに、変異された開始コドンと５１２位の開始部位との間のフレームを変化させる、５１２位の開始部位の上流の配列の挿入を可能にすることも示す。従って、１６１位の開始部位の変異は、５１２位の開始部位の上流に挿入できる配列の長さをもはや制限しないことを意味する。
【００８５】
２つのカルボキシ共末端タンパク質をコードする開始部位の間のリーディングフレームの維持もまた、他の２分節ウイルスに必要とされる場合、この条件はまた、ウイルスＲＮＡ−２ゲノムセグメントによってコードされるより２つのカルボキシ共末端タンパク質のより長い方を産生するための開始部位として役立つＡＵＧを変異させることによって克服され得る。従って、別の態様において、本発明は、
（ａ）上記のエンハンサー配列、および
（ｂ）遺伝子発現系に目的のタンパク質をコードする遺伝子の挿入を促進するための異種配列を含む遺伝子発現構築物を提供し、ここで、その異種配列は、エンハンサー配列における変異された標的開始部位の下流に位置する。
【００８６】
異種配列は開始コドンの上流に位置してもよく、その開始コドンから２つのカルボキシ共末端タンパク質のうちのより短い方の産生が、遺伝子発現系のエンハンサー配列が由来する野生型ＲＮＡ−２ゲノムにおいて開始される。あるいは、異種配列は、開始コドンの部位付近に与えられてもよいか、または開始コドンと置換されてもよく、その開始コドンから２つのカルボキシ共末端タンパク質のより短い方が、遺伝子発現系のエンハンサー配列が由来する野生型ＲＮＡ−２ゲノムセグメントにおいて開始される。ＣＰＭＶのＲＮＡ−２由来のエンハンサー配列を有する遺伝子発現系において、異種配列は、開始コドンの部位の上流、その付近に与えられてもよいか、または開始コドンと置換されてもよく、その開始コドンは、野生型ＲＮＡ−２  ＣＰＭＶゲノムセグメントにおける５１２位にある。
【００８７】
異種配列は、ポリリンカーまたは複数のクローニング部位、すなわち、発現系に目的のタンパク質をコードする遺伝子のクローニングを促進する配列であってもよい。
【００８８】
例えば、以下に記載するように、本発明は、ＣＰＭＶに基づいた発現カセットの５’リーダーと３’ＵＴＲとの間にポリリンカーを含む構築物を与える。以下に記載するように、任意のポリリンカーは、必要に応じて、タンパク質の精製を促進するためにＮまたはＣ末端Ｈｉｓ−タグの融合を可能にするように複数のｘヒスチジン残基の１つ以上のセットをコードしてもよい。
【００８９】
好ましくは、上記の発現構築物はベクターに存在し、好ましくは、それは、生物ゲノムへの発現カセットの転写および組み込みを可能にする境界配列を含む。
【００９０】
好ましくは、構築物は植物のバイナリーベクターである。好ましくは、バイナリー形質転換ベクターはｐＰＺＰに基づく（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚら，１９９４）。他の例示的な構築物としては、ｐＢｉｎ１９が挙げられる（Ｆｒｉｓｃｈ，Ｄ．Ａ．，Ｌ．Ｗ．Ｈａｒｒｉｓ−Ｈａｌｌｅｒら，（１９９５）．「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｎａｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｉｎ１９．」Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２７：４０５−４０９を参照のこと）。
【００９１】
本明細書に記載するように、本発明は、存在するｐＢｉｎ発現カセットに必須の要素を有する発現カセットを移動させることによって実施されてもよいか、または他の実施形態において、ｐＢｉｎ発現ベクターの直接クローニングが利用されてもよい。
【００９２】
例えば、以下に記載するように、本発明は、本明細書に記載されるエンハンサー配列とともに使用する（それらに制限されないが）ために設計されたモジュラーバイナリーベクターを有する。それらは、ｐＢＩＮＰＬＵＳベクターに対する改良に基づき、従って、複製およびＴＤＮＡ転写についての機能を妥協することなしに、ベクターのサイズを劇的に減少させることが可能であることが示されている。さらに、（いわゆる「ＣＰＭＶ−ＨＴ」系によって例示されるように）エンハンサー系の要素が、複数のタンパク質が単一のＴ−ＤＮＡから発現され得るように、モジュラー方式で、得られるベクター内に組み込まれてもよい。それらの改良は、外来性遺伝子の効率的な直接クローニングを可能にする多用途の高レベル発現ベクターの産生を導く。
【００９３】
これらの例は好ましいバイナリー植物ベクターを表す。好ましくは、それらには、ＣｏｌＥＩ複製起点が含まれるが、高コピー数も生じる他の複製起点を含むプラスミド（例えば、ｐＲｉに基づくプラスミド、ＬｅｅおよびＧｅｌｖｉｎ，２００８）、特に一過性発現系も好ましい。
【００９４】
所望の場合、選択可能な遺伝子マーカーは、抗生物質または除草剤（例えば、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノトリシン、クロルスルフロン、メトトレキサート、ゲンタマイシン、スペクチノマイシン、イミダゾリノンおよびグリホサート）に対する耐性などの選択可能な表現型を与えるものなどの構築物に含まれてもよい。
【００９５】
最も好ましいベクターは以下に記載するｐＥＡＱベクターであり、遺伝子サイレンシングの抑制因子およびＮＰＴＩＩカセットも含むＴ−ＤＮＡに配置される、本発明の翻訳エンハンサーを含む発現カセットの５’リーダーと３’ＵＴＲとの間のポリリンカーの使用による直接クローニング型を可能にする。ポリリンカーはまた、ＮまたはＣ末端Ｈｉｓ−タグの融合により、タンパク質精製を促進できる１つまたは２つのセットの６ｘヒスチジン残基をコードする。
【００９６】
ｐＥＡＱ由来ベクターの利点は、ＩｇＧなどの複数鎖タンパク質の各要素が、各感染細胞に自動的に送達され得ることである。
【００９７】
本発明はまた、植物、酵母、昆虫または哺乳動物細胞などの宿主生物において、本発明の遺伝子発現系を用いて、タンパク質、例えば異種タンパク質を発現する方法を提供する。
【００９８】
本発明はさらに、上記のＲＮＡ２由来の配列に作動可能に連結される、目的の異種タンパク質をコードする遺伝子またはＯＲＦからその目的の異種タンパク質の翻訳を向上させる方法を提供し、その方法は、ＲＮＡ２由来の配列における標的開始部位を変異させることを含む。
【００９９】
本明細書に記載されるエンハンサー配列はまた、ＷＯ／２００７／１３５４８０に記載される２分節の発現系に使用され得る。従って、本発明は、切断されたＲＮＡ２−遺伝子セグメントに基づいた遺伝子発現系にも関連し、必要に応じてさらに、プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結された遺伝子サイレンシングの抑制因子をコードする第２の遺伝子構築物を含む。
【０１００】
従って、さらなる態様において、本発明は、
（ａ）プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結される目的の異種タンパク質をコードする少なくとも１つの外来性遺伝子を保有する２分節のウイルスゲノムの切断されたＲＮＡ−２を含む第１の遺伝子構築物であって、その第１の遺伝子構築物は、外来性遺伝子の上流に変異された標的開始部位を含む、第１の遺伝子構築物と、必要に応じて、
（ｂ）プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結される、前記２分節のウイルスゲノムのＲＮＡ−１を含む第２の遺伝子構築物と、必要に応じて、
（ｃ）前記第１の遺伝子構築物、前記第２の遺伝子構築物またはその両方内に必要に応じて組み込まれる第３の遺伝子構築物であって、プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結される遺伝子サイレンシングの抑制因子を含む、第３の遺伝子構築物と、
を含む遺伝子発現系に関連する。
【０１０１】
本発明の遺伝子発現系（上記のもののいずれかを含む）における遺伝子サイレンシングの抑制因子の存在は好ましいが、必須ではない。従って、上記の遺伝子発現系は、好ましくは、前記第１の遺伝子構築物、前記第２の遺伝子構築物、またはその両方内に必要に応じて組み込まれる第３の遺伝子構築物であって、プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結される遺伝子サイレンシングの抑制因子を含む、第３の遺伝子構築物を含む。
【０１０２】
従って、別の態様において、本発明は、以下の工程
（ａ）本発明の遺伝子発現構築物を植物細胞に導入する工程と、必要に応じて、
（ｂ）プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結される、前記２分節のウイルスゲノムのＲＮＡ−１を含む第２の遺伝子構築物を植物細胞に導入する工程と、必要に応じて、
（ｃ）前記第１の遺伝子構築物、前記第２の遺伝子構築物、またはその両方内に必要に応じて組み込まれる第３の遺伝子構築物であって、プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結される遺伝子サイレンシングの抑制因子を含む第３の遺伝子構築物を植物細胞に組み込む工程と、
を含む植物においてタンパク質を発現する方法を提供する。
【０１０３】
好ましくは、上記の植物においてタンパク質を発現する方法は、
前記第１の遺伝子構築物、前記第２の遺伝子構築物、またはその両方内に必要に応じて組み込まれる第３の遺伝子構築物であって、プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結される遺伝子サイレンシングの抑制因子を含む第３の遺伝子構築物を植物細胞に導入する工程を含む。
【０１０４】
本発明はまた、このような構築物を植物細胞に導入することを含む方法を提供する。
【０１０５】
本発明は、翻訳エンハンサーとして同じＴ−ＤＮＡに目的の遺伝子およびサイレンシングの抑制因子を組み込むことによって非常に高い発現レベルを示す。従って、好ましい実施形態は、同じＴ−ＤＮＡに存在する全てのこれらの要素を利用することであり得る。
【０１０６】
さらに、ＲＮＡ−１が、本明細書に記載される系において、高レベルの発現を必要とされず、実際には、本明細書に記載される「ＣＰＭＶ−ＨＴ」系はＲＮＡ−１の作用によってではないことは理解されるべきである。
【０１０７】
従って、さらなる態様において、本発明は、
（ａ）プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結される目的の異種タンパク質をコードする少なくとも１つの外来性遺伝子を保有する２分節のウイルスゲノムの切断されたＲＮＡ−２を含む第１の遺伝子構築物であって、その遺伝子構築物は、外因性遺伝子の上流に変異された標的開始部位を含む、第１の遺伝子構築物と、必要に応じて、
（ｂ）前記第１の遺伝子構築物内に必要に応じて組み込まれる第２の遺伝子構築物、プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結される遺伝子サイレンシングの抑制因子と、
を含む遺伝子発現系に関する。
【０１０８】
従って、別の態様において、本発明は、以下の工程
（ａ）本発明の遺伝子発現構築物を植物細胞に導入する工程と、必要に応じて、
（ｂ）前記第１の遺伝子構築物内に必要に応じて第２の遺伝子構築物を導入する工程であって、前記第２の遺伝子構築物は、植物細胞内のプロモーターおよび終結配列に作動可能に連結される遺伝子サイレンシングの抑制因子を含む、工程と、
を含む植物においてタンパク質を発現する方法を提供する。
【０１０９】
これらの態様において有用な遺伝子サイレンシングの抑制因子は、当該分野において公知であり、ＷＯ／２００７／１３５４８０に記載される。それらとしては、ジャガイモウイルス（Ｐｏｔａｔｏ  ｖｉｒｕｓ）Ｙ由来のＨｃＰｒｏ、ＴＥＶ由来のＨｅ−Ｐｒｏ、ＴＢＳＶ由来のＰ１９、ｒｇｓＣａｍ、ＦＨＶ由来のＢ２タンパク質、ＣＰＭＶの小コートタンパク質、およびＴＣＶ由来のコートタンパク質が挙げられる。最も好ましくは、この系のＲＮＡ−２は、感染ウイルスが産生されないように切断されている。
【０１１０】
安定なトランスジェニック植物を産生する場合、好ましい抑制因子は、Ｒ４３Ｗ変異を組み込んでいるＰ１９抑制因子である。
【０１１１】
本発明のさらなる態様において、本発明による異種構築物を含む宿主細胞が開示される。
【０１１２】
本発明の遺伝子発現ベクターは、植物細胞内に一過性または安定に組み込まれてもよい。
【０１１３】
スモールスケールの産生に関しては、本発明の構築物を有する葉の機械的アグロ浸潤法（ａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）である。スケールアップは、例えば減圧浸潤の使用により達成される。
【０１１４】
他の実施形態において、本発明の発現ベクターは、トランスジェニック植物または植物細胞のゲノム内に安定に組み込まれてもよい。
【０１１５】
一態様において、本発明は、形質転換した植物細胞から植物を再生する工程をさらに含んでもよい。
【０１１６】
植物で広範に成功している以前に使用されている特定の手順およびベクターは、ＧｕｅｒｉｎｅａｕおよびＭｕｌｌｉｎｅａｕｘ（１９９３）（Ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｆａｘ（Ｃｒｏｙ  ＲＲＤ  ｅｄ）Ｏｘｆｏｒｄ，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ｐｐ１２１−１４８）に記載されている。適切なベクターは、植物ウイルス由来のベクターを含んでもよい（例えば欧州特許ＥＰ−Ａ−１９４８０９を参照のこと）。所望の場合、選択可能な遺伝子マーカーは、抗生物質または除草剤（例えば、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノトリシン、クロルスルフロン、メトトレキサート、ゲンタマイシン、スペクチノマイシン、イミダゾリノンおよびグリホサート）に対する耐性などの選択可能な表現型を与えるものなどの構築物に含まれてもよい。
【０１１７】
核酸は、その天然の遺伝子導入の能力を利用するアグロバクテリウムによって運搬される安全化されたＴｉ−プラスミドベクター（欧州特許ＥＰ−Ａ−２７０３５５、欧州特許ＥＰ−Ａ−０１１６７１８、ＮＡＲ１２（２２）８７１１−８７２１５  １９８４；ｔｈｅ  ｆｌｏｒａｌ  ｄｉｐ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｃｌｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｂｅｎｔ，１９９８）、粒子衝突または微粒子銃（米国特許第５１００７９２号、ＥＰ−Ａ−４４４８８２、ＥＰ−Ａ−４３４６１６）、微量注入法（ＷＯ９２／０９６９６、ＷＯ９４／００５８３、欧州特許ＥＰ３３１０８３、欧州特許ＥＰ１７５９６６、Ｇｒｅｅｎら（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、エレクトロポレーション（欧州特許ＥＰ２９０３９５、ＷＯ８７０６６１４  Ｇｅｌｖｉｎ  Ｄｅｂｅｙｓｅｒ）、直接的なＤＮＡ取り込みの他の形態（独国特許第４００５１５２号、ＷＯ９０１２０９６、米国特許第４６８４６１１号）、リポソームを介したＤＮＡ取り込み（例えば、Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９：１３５３（１９８４））、または渦法（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）（例えば、Ｋｉｎｄｌｅ，ＰＮＡＳ  Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１２２８（１９９０ｄ）Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ  Ｏａｒｄ，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｄｖ．９：１−１１）などの任意の適切な技術を用いて植物細胞内に組み込むことができる。Ｔｉ−プラスミド、特に２分節のベクターは、以下により詳細に記載される。
【０１１８】
アグロバクテリウム形質転換は、双子葉植物の種を形質転換するために、当業者によって広範に使用されている。しかしながら、ほとんど全ての経済的に関係のある単子葉植物における安定で、繁殖性のトランスジェニック植物の所定の産生にもかなり成功している（例えば、Ｈｉｅｉら（１９９４）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６，２７１−２８２を参照のこと）。アグロバクテリウム単独が、非効率かまたは効果がない場合、微粒子銃、エレクトロポレーション、および直接的なＤＮＡ取り込みが好ましい。あるいは、異なる技術の組み合わせ、例えば、アグロバクテリウムでコートされた微小粒子での照射（欧州特許ＥＰ−Ａ−４８６２３４）または損傷後のアグロバクテリウムとの共培養を誘発する微粒子銃（欧州特許ＥＰ−Ａ−４８６２３３）が、形質転換プロセスの効率を向上させるために利用されてもよい。
【０１１９】
形質転換技術の特定の選択は、特定の植物種を形質転換するその効率性ならびに特定の方法を選択する本発明を実施する人の経験および好みによって決定される。
【０１２０】
核酸を植物細胞に導入する形質転換系の特定の選択は、本発明に必須ではなく、または本発明の限定ではなく、植物再生についての技術の選択も本発明に必須ではなく、または本発明の限定でもないことは当業者には明らかであろう。本発明者らによって実施される実験において、向上した発現の効果は、Ｔ−ＤＮＡの種々の組み込みパターンにおいて見られる。
【０１２１】
従って、本発明の種々の態様は、植物組織（例えば植物細胞）への本発明の構築物の導入、ならびに本発明による核酸をゲノムへ導入するためにベクターと植物細胞ゲノムとの間の組み換えを生じることまたは可能にすること、を含む植物細胞を形質転換する方法を提供する。これは、一過性発現をもたらすように行われ得る。
【０１２２】
あるいは、植物組織の形質転換後、植物は、当該分野において標準的な例えば、単一の細胞、カルス組織または葉片から再生されてもよい。ほとんどのあらゆる植物は、植物の細胞、組織および器官から完全に再生され得る。利用可能な技術は、Ｖａｓｉｌら，Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ  Ｉ，ＩＩおよびＩＩＩ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８４，ならびにＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に概説されている。
【０１２３】
繁殖性のトランスジェニック植物の産生は、コメ、トウモロコシ、コムギ、カラスムギ、およびオオムギなどの穀物、さらに多くの他の植物種においてなされている（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｋ．（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５，１５８−１６２；Ｖａｓｉｌら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，６６７−６７４；Ｖａｉｎら，１９９５，Ｂｉｏｔｅｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  １３（４）：６５３−６７１；Ｖａｓｉｌ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，７０２ページに概説されている）。
【０１２４】
再生された植物またはその一部は、クローン、種子、自己またはハイブリッド子孫（ｐｒｏｇｅｎｙおよびｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ）（例えば、Ｆ１およびＦ２子孫）、挿し木（例えば、食用部分）、栄養繁殖体などを提供するために使用されてもよい。
【０１２５】
本発明はさらに、トランスジェニック生物（例えば、本明細書に記載される方法によって得たか、または得られる）を提供し、このトランスジェニック生物に発現ベクターまたはカセットが導入され、そのカセットにおける異種遺伝子が向上したレベルで発現される。
【０１２６】
本発明はさらに、目的のタンパク質を産生する方法を含み、その方法は、上記の方法を実施する（または生物を使用する）工程と、必要に応じて少なくとも、目的のタンパク質が発現される組織を収集する工程と、その組織から目的のタンパク質を単離する工程を含む。
【０１２７】
従って、具体的には、本発明は、トランスジェニック植物または本発明の発現ベクターで一過性にトランスフェクトされた植物細胞を提供する。
【０１２８】
さらなる態様において、本発明はまた、トランスジェニック植物または本発明の発現ベクターで安定に形質転換された植物細胞を提供する。
【０１２９】
本発明はまた、挿し木、種子などを含む、複製または増殖、有性または無性に使用され得る任意の部分である、そのような植物由来の植物栄養繁殖体を提供する。本発明はまた、上記の植物細胞または異種ＤＮＡを含むそれらの植物の任意の部分を提供する。
【０１３０】
従って、種々の態様において、（限定されないが）本発明は以下を提供する。
・本発明のエンハンサー配列から構成されるか、またはエンハンサー配列から実質的に構成される核酸（そのエンハンサー配列は、（例えば）ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメントのヌクレオチド１〜５１２から構成されるか、あるいはそれら由来であるか、または２分節のＲＮＡウイルスの別のＲＮＡ−２ゲノムセグメント由来であり、各々の場合において、ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２の１６１位に対応する標的開始部位が変位される）。
・例えば、目的のタンパク質、またはポリリンカー、および必要に応じてターミネーターをコードするＯＲＦの上流にそのようなエンハンサー配列を含む遺伝子発現系。
・本明細書に記載されるエンハンサー配列を使用するために本発明に従って修飾されたＷＯ／２００７／１３５４８０に記載される２分節の発現系。
・（ｉ）作動可能に連結されるプロモーター、（ｉｉ）上記のエンハンサー配列、（ｉｉｉ）発現することが望まれる目的のポリリンカーまたは遺伝子、（ｉｖ）同系の３’ＵＴＲ（すなわち、ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメントの３’ＵＴＲ由来）、（ｖ）終結配列を含む、発現カセット。
・本発明の遺伝子発現系またはベクターを用いる植物などの宿主生物におけるタンパク質、例えば異種タンパク質を発現する方法。
・本発明の遺伝子発現系またはベクター由来のタンパク質を発現する宿主細胞および生物（例えば、植物または酵母）ならびにそれらを産生する方法。
【０１３１】
文脈が他に要求しない限り、「遺伝子」とは、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質への翻訳のための遺伝情報をコードする任意の核酸を指す。従って、文脈が他に要求しない限り、それは「ＯＲＦ」と交換可能に用いられる。
【０１３２】
発現することが所望され得る遺伝子は、導入遺伝子または内因性であってもよい。
【０１３３】
目的の遺伝子には、農業形質、虫害抵抗性、病害抵抗性、除草剤抵抗性、無菌性、粒子特性などをコードする遺伝子が含まれる。この遺伝子は、油、デンプン、炭水化物、栄養素などの代謝に関与してもよい。従って、目的の遺伝子または特徴としては、限定されないが、環境またはストレス関連の形質、疾患関連の形質、および農業生産力に影響を与える形質が挙げられる。標的配列にはまた、タンパク質、ペプチド、脂肪酸、脂質、ワックス、油、デンプン、糖、炭水化物、香味料、香気、毒素、カロテノイド、ホルモン、ポリマー、フラボノイド、貯蔵タンパク質、フェノール酸、アルカロイド、リグニン、タンニン、セルロース、糖タンパク質、糖脂質などの合成に関与する遺伝子が含まれる。
【０１３４】
最も好ましくは、単子葉植物および／または双子葉植物における標的遺伝子としては、セイヨウアブラナ、ヒマワリ、ダイズおよびトウモロコシなどの植物中の油産生に関与する酵素；ジャガイモ、トウモロコシ、穀物などの植物中のデンプン合成に関与する酵素；医薬製剤または獣医用製剤などの天然の薬剤を合成する酵素、またはそれらのタンパク質自体をコードする遺伝子が挙げられる。
【０１３５】
異種核酸は、とりわけ、細菌、真菌、植物または動物起源の遺伝子をコードすることができる。ポリペプチドは、（例えば、害虫感受性、活力、組織分化、繁殖性、栄養価などに関連する植物の特徴を修飾するために）植物体で利用されてもよいか、または植物は、他に使用するためにその植物から精製できるポリペプチドを産生するための中間体であってもよい。そのようなタンパク質としては、限定されないが、網膜芽細胞腫タンパク質、ｐ５３、アンギオスタチン、およびレプチンが挙げられる。同様に、本発明の方法は、哺乳動物の調節タンパク質を産生するために使用されてもよい。目的の他の配列としては、タンパク質、ホルモン、成長因子、サイトカイン、血清アルブミン、ヘモグロビン、コラーゲンなどが挙げられる。
【０１３６】
従って、標的遺伝子またはヌクレオチド配列は、好ましくは、目的のタンパク質：虫害抵抗性タンパク質；病害抵抗性タンパク質；除草剤抵抗性タンパク質；哺乳動物タンパク質をコードする。
【０１３７】
「ベクター」は、とりわけ、二本鎖または一本鎖の直線状または環状形態で任意のプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたはアグロバクテリウムバイナリーベクターを含むと定義され、それは、自己感染性または可動性であってもなくてもよく、細胞ゲノムまたは存在する染色体外への組み込みによって原核生物または真核生物宿主のいずれかを形質転換できる（例えば、複製起点を有するプラスミドの自立的複製）。使用される構築物は、完全または部分的に合成される。特にそれらは、天然に一緒に見出されない（隣接しない）核酸配列が連結されるか、またはそうでなければ人工的に合成される組み換え体である。他に指定されない限り、本発明によるベクターは、特に、ベクターが、ゲノムへの組み込みのために核酸を細胞に組み込むために使用される場合、必ずしも、プロモーターまたは他の調節配列を含まなくてもよい。
【０１３８】
「バイナリーベクター」は当業者に周知であり、バイナリーベクター系には、（ａ）所望のヌクレオチド配列の植物細胞ゲノムへの移入を可能にする境界配列；（ｂ）（ｉ）作動可能に連結される植物活性プロモーターと、（ｉｉ）適切な場合、標的配列および／またはエンハンサーの発現カセットと、を一般的に含む所望のヌクレオチド配列自体、が含まれる。所望のヌクレオチド配列は境界配列の間に位置し、適切な条件下で植物ゲノム内に挿入できる。バイナリーベクター系は、通常、組み込みをもたらすために他の配列（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来）を必要とする。通常、このことは、アグロバクテリウムによって媒介される一過性形質転換を使用する、いわゆる「アグロ浸潤法」の使用によりなされ得る。つまり、この技術は、核ＤＮＡに組み込む場合、そのＤＮＡ（「Ｔ−ＤＮＡ」）の一部を宿主細胞へ移入するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの性質に基づく。Ｔ−ＤＮＡは、２１〜２３ヌクレオチド長付近の左および右の境界配列によって定義される。浸潤は、例えば、シリンジ（葉）または真空（完全植物）によってなされ得る。本発明において、境界配列は、通常、アグロ浸潤法によって植物物質へ組み込まれる１つ以上のベクターを有する所望のヌクレオチド配列（Ｔ−ＤＮＡ）に含まれる。
【０１３９】
「発現カセット」とは、核酸が、微生物または植物細胞などの宿主細胞内の転写のための適切なプロモーターまたは他の調節エレメントの制御下であり、作動可能に連結される状態を指す。
【０１４０】
「プロモーター」は、下流に（すなわち、二本鎖ＤＮＡのセンス鎖の３’方向において）作動可能に連結されるＤＮＡの転写が開始され得るヌクレオチド配列である。
【０１４１】
「作動可能に連結される」とは、同じ核酸分子の一部として、プロモーターから開始される転写のための安定な位置および方向に結合されることを意味する。
【０１４２】
目的の「植物」種としては、限定されないが、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．（例えば、Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｒａｐａ、Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）特に種油の源として有用なそれらのＢｒａｓｓｉｃａ種、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ヒエ（例えば、トウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ））、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、アワ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ）、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ））、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）、綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ  ｓｐｐ．）、ココナツ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）、シトラスの木（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｐ．）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ  ｓｐｐ．）、アボガド（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、サトウダイコン（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐ．）、オートムギ、オオムギ、野菜、観賞植物、および針葉樹が挙げられる。当業者は、本明細書に記載されるウイルスベクターの向性が変化することは理解するだろう。しかしながら、そのようなウイルスに対する感受性を決定することは、当業者に周知である。さらに、植物細胞内へのウイルス浸入を促進するレセプターを組み換え発現することによってそのような特異性を変更することは可能であり得る。
【０１４３】
本発明は、ここで、以下の非限定的な図および実施例を参照して詳細に記載される。本発明の他の実施形態は、これらの観点から当業者が想到するだろう。
【０１４４】
本発明を実施する当業者に使用され得る限り、本明細書に引用される全ての参考文献の開示は、相互参照として本明細書に具体的に援用される。
【実施例】
【０１４５】
（実施例１）
１．１方法
発現ベクターＦＳＣ２およびその誘導体の作製
ｐＢｉｎＰ−１−ＧＦＰベースのプラスミド（Ｃａｎｉｚａｒｅｓら，２００６）由来の外来性タンパク質の発現のために有用なクローニングベクターを、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５ＳプロモーターおよびｐＢｉｎＰ−Ｓ２ＮＴ（ＬｉｕおよびＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，２００２）由来のノパリン合成（ｎｏｓ）ターミネーターに隣接するＲＮＡ−２の完全な配列を切断し、それを、Ａｓｃｌ／Ｐａｃｌ断片として変異誘発プラスミドｐＭ８１Ｗ（ＬｉｕおよびＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，２００６）に挿入することによって作製した。得られたプラスミド、ｐＭ８１Ｗ−Ｓ２ＮＴに、４つの変更を同時に導入する単一ラウンドの変異誘発（ＬｉｕおよびＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，２００６における方法を参照のこと）を行って、ｐＭ８１Ｂ−Ｓ２ＮＴ−１を得た。変異誘発により、ベクターバックボーンから２つのＢｓｐＨＩ部位を除去し、ＡＵＧ５１２付近にＢｓｐＨＩ部位（Ｔ／ＣＡＴＧＡ）およびＵＡＡ３２９９後にＳｔｕＩ部位（ＡＧＧ／ＣＣＴ）、ＲＮＡ−２によりコードされるポリタンパク質についての終止コドンを導入した。続いて、ＢａｍＨＩ／Ａｓｃｌ断片を、ｐＢｉｎＰ−ＮＳ−１（Ｌｉｕら，２００５）から切断し、同様に消化したｐＭ８１Ｂ−Ｓ２ＮＴ−１にライゲーションして、ｐＭ８１−ＦＳＣ−１を得た。このベクターにより、ＡＵＧ５１２の下流のＲＮＡ−２  ＯＲＦの全てを、ＢｓｐＨＩおよびＳｔｕＩでの消化により切断でき、ＢｓｐＨＩおよびＳｔｕＩ（平滑）適合性末端（（ｂｌｕｎｔ）−ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｅｎｄ）を有する任意の配列と置換できる。ＢｓｐＨＩ部位の使用は重要である。なぜなら、それは、５１２位のＡＵＧを保存し、このイニシエーターは、挿入した遺伝子の翻訳を駆動するために使用されるからである。植物において外来性遺伝子を発現するために、ｐＭ８１−ＦＳＣ−１由来プラスミドはＡｓｃｌおよびＰａｃｌで消化され、同様に消化されたｐＢＩＮＰＬＵＳに移入された外来性配列を含む発現カセットを有する断片および得られるプラスミドは、最終的に、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに形質転換される。
【０１４６】
クローニングの容易さを向上させ、適切な制限酵素の選択を広げ、外来性遺伝子発現に対するリーディングフレームの効果を調べるために、全てのＲＮＡ−２  ＯＲＦを短いポリリンカーと置換した。オリゴヌクレオチド挿入およびｐＭ８１−ＦＳＣ−２を生じる部位特異的突然変異誘発法の組み合わせにより、ＮｒｕＩ（ＴＣＧ／ＣＧＡ）およびＸｈｏＩ（Ｃ／ＴＣＧＡＧ）またはＳｔｕＩのいずれかでのクローニングが可能となる。ＮｒｕＩ部位の末端のアデニンは５１２位に存在するので、ここに見られるＡＵＧを保存する。この修飾により、５’から５１２位のＡＵＧまで即座にヌクレオチドを変更させるが、十分な状況が維持される。翻訳が、５１２位、５１３位、５１４位または５１５位のＡＵＧから開始されるようにｐＭ８１−ＦＳＣ−２内にＧＦＰをクローニングすることにより、ｐＭ８１−ＦＳＣ−１由来の構築物であるｐＭ８１−ＦＳＣ２−５１２、ｐＭ８１−ＦＳＣ２−５１３、ｐＭ８１−ＦＳＣ２−５１４、およびｐＭ８１−ＦＳＣ２−５１５を得た。これらのｐＭ８１ベースのプラスミドは、発現カセットを含むクローニングベクターであり、次いで、これをバイナリーベクターに移入して、図２および３に示す実験に使用する発現ベクターＦＳＣ２−５１２、ＦＳＣ２−５１３およびＦＳＣ２−５１４を産生した。ＣＰＭＶの野生型ＲＮＡ−２ゲノムセグメントならびにｐＭ８１−ＦＳＣ１およびｐＭ８１−ＦＳＣ２ベクターの配列間の差異は表３に示す。野生型ＣＰＭＶ配列と比較したベクター内でのヌクレオチドの変更は大文字として示す。
【０１４７】
（ｐＭ８１−ＦＳＣ−１について上で概説したように）ｐＢＩＮＰＬＵＳ内の動員後のアグロバクテリウムによって媒介される一過性形質転換により、ＡＵＧ１６１と下流のＡＵＧとの間のフレーム連続性が維持されない場合、より低いタンパク質レベルが得られることが示された。ＡＵＧ１６１および５１２に対して＋１位および＋２位から翻訳したＧＦＰの量は著しく減少したが、＋３位からの翻訳（つまり、５１５からでフレーム内の後方）は、５１２位のＡＵＧからの翻訳と同じ効率であった。このことが、５１３位および（より少ない程度の）５１４位の弱まった状況に起因していないことを示すために、ＦＳＣ２−５１３のような同じ不十分な状況ではなく、ＦＳＣ２−５１５＋を＋３位から開始するために作製した。ＦＳＣ２−５１５＋からの発現は、ＦＳＣ２−５１２または５１５から達成したものと同じ高さであり、これは、低い状況がＦＳＣ２−５１３および５１４からの発現の減少ではないことを示す。
【０１４８】
公知の機構によって、翻訳が第１のＡＵＧルールを逃れることができることを考慮すると、フレーム連続性を必要とすることが知られておらず、欠失したＲＮＡ−２ベースのベクターからの効果的な翻訳が、ＡＵＧ１６１と下流のＡＵＧとの間のフレーム連続性に依存することは興味をそそられる。この減少を理解して、望ましくは克服するために、一連の変異体を、ＲＮＡ−２の５’配列に対する修飾を用いて作製した。オリゴヌクレオチドの相補対（表２を参照のこと）を、ｐＭ８１−ＦＳＣ２−５１２、５１３および５１４の部位特異的突然変異誘発法に使用した。それらの変異体のＡＵＧ１１５（ｕＯＲＦについての開始コドン）、ＡＵＧ１６１（ｕＯＲＦのアミノ酸配列の変更なし）のいずれか、またはそれらの上流の開始部位の両方を除去した。２つの変異を、Ｕ１６２Ｃオリゴを用いてＡ１１５Ｇ変異体を変異誘発することによって作製した（表２）。
【０１４９】
これらの変異体転写産物からの一過性発現を、以前のｐＭ８１−ＦＳＣ−２構築物について記載したように行った。ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２）または葉の全てを視覚化するためにＵＶ照射（図３）を用いるこれらの変異体からのＧＦＰの発現の分析により、１６１位のＡＵＧの非存在下において発現の強力な増加が示される。さらに、ＡＵＧ１６１単独またはＡＵＧ１１５および１６１の両方の除去は、ＡＵＧ１６１と下流のＡＵＧとの間のフレーム連続性に対する依存性を軽減する。対照的に、単なるＡＵＧ１１５の除去はこの依存性を高め、そして全体的に翻訳を抑制するように見える。結論として、ｕＯＲＦは、ＡＵＧ１６１からの翻訳を下方制御するために機能するように見え、それは全体的に抑制性があり、フレーム連続性に対する依存性を与える。
【０１５０】
ＨＢｃＡＧ粒子を含む樹液（ｓａｐ）の電子顕微鏡法
図６に示した集合したＨＢｃＡｇ粒子の電子顕微鏡写真に使用した樹液（ｓａｐ）は以下のように調製した。葉組織を、２容量のＴｒｉｓ／ＮａＣｌ緩衝液中に抽出し、１００ｋＤａ  ＭＷＣＯカラムで濃縮せずにＴＥと交換した。ＨＢｃＡｇの最終濃度は、ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの標準物との比較により判断した場合、約０．２ｍｇ／ｍｌであった。
【０１５１】
１．２結果
（１）１６１位（ＡＵＧ１６１）および５１２位（ＡＵＧ５１２）における開始部位の相対位相を変化させる効果
これを達成するために、余分なヌクレオチドを、ＡＵＧ５１２（ＦＳＣ２−５１２）のすぐ上流に挿入して、ＡＵＧを５１３位（ＦＳＣ２−５１３）、５１４位（ＦＳＣ２−５１４）および５１５位（ＦＳＣ２−５１５）に移動させた（図１）。ＡＵＧ１６１と位相をずらしてＡＵＧ５１２（ＦＳＣ２−５１３およびＦＳＣ２−５１４）を配置すると、蛍光（図３）およびＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色したゲル（図２）によって判断した場合、ＧＦＰ発現は低かった。位相（ＦＳＣ２−５１５）を元に戻すと、天然の状態（ＦＳＣ２−５１２）で見られたレベルの発現に戻った。結論としては、ＡＵＧ１６１が存在し、１６１位のＡＵＧと位相が一致する場合、下流のＡＵＧでの開始が最も効率的である。
【０１５２】
（２）１６１位（ＡＵＧ１６１）および５１２位（ＡＵＧ５１２）の開始部位の相対位相を変化させることに加えて１１５位（ＡＵＧ１１５）の開始部位の除去
ＧＦＰ発現がＡＵＧ５１２から駆動される場合、すなわち、この第２のＡＵＧがＡＵＧ１６１と位相が一致する場合、ＡＵＧ１１５の除去は、ほとんどまたは全く影響を与えない（図２および図３の標識した１０のレーンを参照のこと）。しかしながら、第２のＡＵＧがＡＵＧ１６１（５１３、５１４）と位相がずれる場合、ＡＵＧ１１５の欠失は、実質的にＧＦＰ発現を生じない（図２および図３の標識した１０のレーンを参照のこと）。結論：ＡＵＧ１１５は、何らかの形で、ＡＵＧ１６１を回避し、ＡＵＧ５１２に到達することによってリボソームの能力に関与する。しかしながら、このことは、正確な位相に存在する下流のＡＵＧを必要とする。
【０１５３】
（３）１６１位（ＡＵＧ１６１）における開始部位の除去の効果
この変異の効果は信じられないほど劇的であり、ＧＦＰ発現レベルが、ＡＵＧ１６１が存在する場合に見られる量の２０〜３０倍に到達する（図２および図３における標識した０１のレーンを参照のこと）。さらに、ＡＵＧ１６１の非存在にもかかわらず、位相ＡＵＧ５１２はもはや問題ではないように見え、位相の考えは大して重要ではない。さらに、ＡＵＧ１１５の存在または非存在に差異はない（図２および図３における標識した１１のレーンを参照のこと）。ＤｓＲｅｄおよびＨＢｃＡｇ発現についてのｄｅｌＲＮＡ−２（図１における発現ベクター００［ＦＳＣ２−５１２］）構築物を用いる場合、５日以内に、浸潤したパッチは膨圧を失い、クロロティック（ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ）（薄い）になった。７日までに、組織は灰色のように見え、完全に死んだ。ＨＴ（図１における発現ベクター０１［ＦＳＣ２−５１２］）を用いる場合、組織は７日後に膨張し、ストレスのサインのみが、ＨＢｃＡｇ発現組織をわずかに白化する。２Ｇ１２  ＩｇＧの重鎖が、ｄｅｌＲＮＡ−２によって発現され、ＥＲに残存する場合、白化は７日後に明らかであるが、ＨＴについては、これは観測されない。従って、異種タンパク質を発現するためにＨＴを用いる場合、植物に見られる壊死のレベルは、より高いレベルの異種タンパク質発現が達成されるにもかかわらず、異種タンパク質を発現するためにｄｅｌＲＮＡ−２を用いる場合より非常に低い。
【０１５４】
考察
非常に高レベルの外来性遺伝子発現が、ＡＵＧ１６１を欠失することによってｄｅｌＲＮＡ−２構築物から発現され得る。現在のところ、ＧＦＰを用いて、本発明者らは、全可溶性タンパク質（ＴＳＰ）のうちの２５〜３０％または１Ｋｇの葉あたり約１ｇの発現されたタンパク質のレベルと測定する。これは非常に高いレベルであり、かつ、本発明者らが用いるアプローチは非常に簡単である。本発明者らがもはやリーディングフレームを保存する必要がないという事実は、ポリリンカーを有する、使用者によって使いやすいベクターが産生され得るということを意味する。
【０１５５】
（実施例２）
２．１背景
実施例１に記載したように、効果的な発現に必要なＣＰＭＣ  ＲＮＡ−２の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に必要な特徴を調べるために、本発明者らは、主要な開始部位の上流の５’リーダー配列内に見られる２つのＡＵＧコドンの役割について扱った。本発明者らは、フレーム内の主要な翻訳開始部位（５１２）の上流の開始コドン（１６１）の欠失が、外来性タンパク質蓄積の大幅な増加をもたらすことを実証した。
【０１５６】
この系を用いて、本発明者らは、浸潤後６日によって、完全なサイズのＩｇＧおよび自己集合性ウイルス様粒子を含む、多くの関係のないタンパク質が、それぞれ、全抽出タンパク質のうちの１０％より多く、および２０％発現されたことを示した。従って、この系は、転写産物のウイルス複製に頼らない高レベルの発現のための理想的な媒体を提供する。
【０１５７】
この新規の系（図１における発現ベクター０１［ＦＳＣ−５１２］によって例示される）を、高翻訳可能（ｈｙｐｅｒ−ｔｒａｎｓｌａｔａｂｌｅ）なササゲモザイクウイルス（Ｃｏｗ  Ｐｅａ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ）タンパク質発現系のための「ＣＰＭＶ−ＨＴ」と呼ぶ。
【０１５８】
ＨＴ−ＣＰＭＶ系は、タンパク質レベルの劇的な増加を示すので、植物における外来性タンパク質の迅速で、高レベル発現のための優れた方法である。
【０１５９】
バイナリーベクターの増殖アレイは、過去２５年にわたって植物形質転換のために開発されている（Ｈｅｌｌｅｎｓら，２０００ｂ；Ｖｅｌｕｔｈａｍｂｉら，２００３；ＬｅｅおよびＧｅｌｖｉｎ，２００８）。従って、これらの開発の主な目的は、例えば、アグロバクテリウムのための宿主範囲を拡大すること（Ｈｉｅｉら、１９９４）、選択マーカー、発現カセットおよび融合タンパク質の選択を可能にする一連のベクターを作製すること（オープンソースバイナリーベクターのｐＣＡＭＢＩＡ範囲；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｍｂｉａ．ｏｒｇ／ｄａｉｓｙ／ｂｉｏｆｏｒｇｅ＿ｌｅｇａｃｙ／３７２５．ｈｔｍｌによって例示される）、または外来性ＤＮＡ組み込みおよびマーカーフリーの形質転換を最小化するための系を開発すること（例えばｐＣＬＥＡＮ；Ｔｈｏｌｅら、２００７）によって、安定な組み込みを向上させることにかなり焦点をあてられている。
【０１６０】
バイナリーベクターはまた、同じ導入遺伝子の複数の組み込み事象の頻度を低減させるために、低コピー数で複製するために操作される。なぜならこれにより、遺伝子サイレンシングが導かれ得るからである（ＪｏｈａｎｓｅｎおよびＣａｒｒｉｎｇｔｏｎ、２００１）。
【０１６１】
しかしながら、一過性発現に関して、宿主核への効果的な組み込みを確実にすることおよび植物体選択におけるマーカーの存在は厳格に必要とされていない。さらに、アグロ浸潤法（ａｇｒｏ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）の際に、各細胞は、ゲノムを組み込まなくても核において転写に適合すると考えられるＴ−ＤＮＡ分子で満たされる（ＪａｎｓｓｅｎおよびＧａｒｄｎｅｒ，１９８９；Ｎａｒａｓｉｍｈｕｌｕら，１９９６）。このことは、一過性発現が、より高いコピー数のバイナリープラスミドから利益を受けることができることを示唆する。
【０１６２】
バイナリーベクターの改良の別の領域は、ベクターバックボーンのサイズの減少である。より小さなプラスミドの利点を実証し続けている２つの優れた例は、ｐＰＺＰ（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚら、１９９４）およびｐＧＲＥＥＮ（Ｈｅｌｅｎｓら、２０００ａ）である。クローニング手順および細菌形質転換の効率を向上させることに加えて、これらのベクターは、単一のＴ−ＤＡＮに存在する複数のカセットに頼る発現系のための鋳型を提供している（Ｔｚｆｉｒａら，２００５；Ｔｈｏｌｅら，２００７）。
【０１６３】
本実施例は、クローニングベクター（例えばｐＭ８１−ＦＳＣ２）と、発現系（例えばＰＢＩＮＰＬＵＳ）との間の発現カセットのサブクローニングを必要とするよりむしろ、単一の工程でなされるクローニングを可能にすることによって、このベクターの実用的用途を容易にするそのベクターの進歩性のある改良を開示する。より具体的には、本明細書の結果は、複製およびＴＤＮＡ移入に関する実施を妥協することなく、ｐＢＩＮＰＬＵＳのサイズを劇的に減少させることが可能であったことを示す。さらに、ＣＰＭＶ−ＨＴ系の要素は、モジュール方式で、得られるベクターに組み込まれるので、複数のタンパク質が単一のＴ−ＤＮＡから発現され得る。これらの改良により、外来性遺伝子の効率的な直接クローニングを可能にする多用で、高レベルの発現ベクターの作製がもたらされる。
【０１６４】
２．２材料および方法
ｐＢＤ−ＦＳＣ２−５１２−Ｕ１６２Ｃ（ＨＴ）は、ｐＢＩＮＰＬＵＳのＰａｃＩ／ＡｓｃＩ部位に挿入されるＦＳＣ２−５１２−Ｕ１６２Ｃカセット（実施例１を参照のこと）を含む（ｖａｎ  Ｅｎｇｅｌｅｎら、１９９５）。このプラスミドの本質的なセグメント（以下を参照のこと）を、再ライゲーションのための特有の制限酵素部位をコードするオリゴヌクレオチドを用いて、高忠実度のポリメラーゼ、ＰＨＵＳＩＯＮ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で増幅させた（表４．１）。Ｔ−ＤＮＡ領域を、特有のＡｈｄＩ部位（ｐＢＤ−ＬＢ−Ｆ）の上流の配列と相同のセンスプライマーおよびＡｐａＩ部位（ｐＢＤ−ＲＢ−ＡｐａＩ−Ｒ）を含むアンチセンスプライマーで増幅させた。ＣｏｌＥＩ複製起点、ＮＰＴＩＩＩ遺伝子、およびＴｒｆＡ遺伝子座を含む領域を、ＡｐａＩ部位（ｐＢＤ−ＣｏｌＥＩ−ＡｐａＩ−Ｆ）を含むセンスプライマー、およびＳｐｅＩ部位（ｐＢＤ−ＴｒｆＡ−ＳｐｅＩ−Ｒ）を含むアンチセンスプライマーで増幅させた。ＲＫ２複製起点（ＯｒｉＶ）を、ＳｐｅＩ部位（ｐＢＤ−ｏｒｉＶＳｐｅＩ−Ｆ）を含むセンスプライマーおよびＡｈｄＩ部位（ｐＢＤ−ｏｒｉＶ−ＡｈｄＩ−Ｒ）を含むアンチセンスプライマーで増幅させた。精製後、それらの産物を、それらの末端でコードされ、３点のライゲーションのために混合した特有の制限部位に従って消化した。これにより、プラスミドｐＥＡＱｂｅｔａが得られ、そのためのライゲーション結合を、シークエンシングにより確認した。ＣＰＭＶ−ＧＦＰ−ＨＴカセットのｎｏｓターミネーターの一部を除去したＴ−ＤＮＡからの約１．２ｋｂの欠失を検出した。従って、プライマーｐＢＤ−ＣｏｌＥＩ−ＡｐａＩ−ＦおよびｐＭｉｎｉ＞ｐＭｉｃｒｏＢＩＮ−Ｒを用いて、右側の境界を含むｐＥＡＱｂｅｔａバックボーンのように、ｐＢＤ−ＦＳＣ２−ＧＦＰ−ＨＴからの右側の境界を含むターミネーターの一部を、プライマーｐＭｉｎｉ＞ｐＭｉｃｒｏＢＩＮ−Ｆ２およびｐＢＤ−ＲＢ−ＡｐａＩ−Ｒで再び増幅させた（表４．１）。精製した産物を、ＡｐａＩおよびＦｓｅＩで消化して、ｐＥＡＱを得るためにライゲーションした（図９）。
【０１６５】
３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーターに隣接するＰ１９遺伝子を、プライマーとして３５ＳＰ１９−ＰａｃＩ−Ｆおよび３５ＳＰ１９−ＡｓｃｌＲ、または３５ＳＰ１９−ＦｓｅＩ−Ｆおよび３５Ｓ−Ｐ１９−ＦｓｅＩ−Ｒのいずれかを用いてｐＢＩＮ６１−Ｐ１９（Ｖｏｉｎｎｅｔら、２００３）から増幅させた（表４．１）。ｎｏｓプロモーターおよびターミネーターに隣接するＮＰＴＩＩ遺伝子を、プライマーｐＢＤ−ＮＰＴＩＩ−ＦｓｅＩ−ＦおよびｐＢＤ−ＮＰＴＩＩ−ＦｓｅＩ−Ｒを用いてｐＢＤ−ＦＳＣ２−ＧＦＰＨＴから増幅させた（表４．１）。Ａ−テイリング（ｔａｉｌｉｎｇ）後、増幅させたカセットを、ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にライゲーションした。ＦｓｅＩを用いてｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙから切断したＰ１９カセットを、ＦｓｅＩで消化したｐＥＡＱ−ＧＦＰ−ＨＴにライゲーションして、ｐＥＡＱｅｘｐｒｅｓｓ−ＧＦＰ−ＨＴを得た。ＦｓｅＩで切断したＮＰＴＩＩカセットを、両方向においてＦｓｅＩで消化したｐＥＡＱ−ＧＦＰ−ＨＴにライゲーションして、ｐＥＡＱｓｅｌｅｃｔＫ−ＧＦＰ−ＨＴおよびｐＥＡＱｓｅｌｅｃｔＫ（ｒｅｖ）−ＧＦＰ−ＨＴを得た。ＮＰＴＩＩカセットをまたＰａｃｌ／Ａｓｃｌで切断し、ｐＥＡＱｓｅｌｅｃｔＫ−ＧＦＰ−ＨＴのＡｓｉＳＩ／Ｍｌｕｌ部位にライゲーションして、ｐＥＡＱｓｐｅｃｉａｌＫ−ＧＦＰ−ＨＴを得た。ｐＧＥＭ−Ｔ中のＰ１９を、ＱＵＩＣＫＣＨＡＮＧＥ法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により部位特異的突然変異誘発し、プライマーＰ１９−Ｒ４３Ｗ−ＦおよびＰ１９−Ｒ４３Ｗ−Ｒを用いてアルギニン４３をトリプトファン残基に変換した。変異Ｐ１９カセットをＰａｃｌ／Ａｓｃｌ消化で解放し、ｐＥＡＱｓｅｌｅｃｔＫ−ＧＦＰ−ＨＴのＡｓｉＳＩ／Ｍｌｕｌ部位に挿入して、ｐＥＡＱｓｐｅｃｉａｌＫｍ−ＧＦＰ−ＨＴを得た。
【０１６６】
短いポリリンカーのセンスおよびアンチセンス鎖をコードするオリゴヌクレオチド（表４．１）をアニールし、５’末端におけるＮｒｕＩ部位の下流の半分および３’末端におけるＸｈｏＩのものと適合するオーバーハングを残した。アニールしたオリゴを、ＮｒｕＩ／ＸｈｏＩで消化したｐＭ８１−ＦＳＣ２−Ａ１１５Ｇ−Ｕ１６２Ｃ（上記を参照）とライゲーションして、ｐＭ８１−ＦＳＣ２−ＰＯＷを得た。ＮｒｕＩ部位を、プライマーＰ１９−ΔＮｒｕＩ−ＦおよびＰ１９−ΔＮｒｕＩ−Ｒを用いて部位特異的突然変異誘発（ＱＵＩＣＫＣＨＡＮＧＥ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によりｐＧＥＭ−Ｔ中のＰ１９カセットから除去し、ｐＥＡＱｓｅｌｅｃｔＫ−ＧＦＰ−ＨＴのＡｓｉＳＩ／Ｍｌｕｌ部位に再挿入して、ｐＥＡＱｓｐｅｃｉａｌＫ−ＧＦＰ−ＨＴと比べて発現の減少を示さないｐＥＡＱｓｐｅｃｉａｌＫΔＮｒｕＩ−ＧＦＰ−ＨＴを得た（データは示さず）。次いで、ｐＭ８１−ＦＳＣ２−ＰＯＷ由来のＰａｃｌ／Ａｓｃｌ断片を解放し、同様に消化したｐＥＡＱｓｐｅｃｉａｌＫΔＮｒｕＩ−ＧＦＰ−ＨＴに挿入し、それにより、ＧＦＰ  ＨＴ発現カセットを置換し、ｐＥＡＱ−ＨＴを得た。ＧＦＰを、ｐＥＡＱ−ＨＴ：ＧＦＰ−ＡｇｅＩ−ＦおよびＧＦＰ−ＸｈｏＩ−Ｒ；ＧＦＰ−ＡｇｅＩ−ＦおよびＧＦＰ−ＸｍａＩ−Ｒ；ならびにＧＦＰ−ＸｍａＩ−ＦおよびＧＦＰ−ＸｈｏＩ−Ｒに挿入するために３つの組み合わせで４つのプライマーセット（表４．１）を用いてｐＢＤ−ＦＳＣ２−ＧＦＰ−ＨＴから増幅させた。精製したＰＣＲ産物を、それらのプライマーに特有の酵素で消化し、適切に消化したｐＥＡＱ−ＨＴに挿入して、ｐＥＡＱ−ＨＴ−ＧＦＰ、ｐＥＡＱ−ＨＴ−ＧＦＰＨｉｓおよびｐＥＡＱ−ＨＴ−ＨｉｓＧＦＰを得た。
【０１６７】
表４．１．増幅および変異誘発に使用したオリゴヌクレオチド。制限酵素部位またはその部分は、下の例で示し、変異はイタリックで下線をひいた。
【表１−１】
0005745857.tif 000002
【０１６８】
【表１−２】
0005745857.tif 000003
【０１６９】
【表１−３】
0005745857.tif 000004
【０１７０】
２．３  結果
２．３．１  ｐＢＩＮＰＬＵＳは、少なくとも７．４ｋｂの外来性配列を含む
ＣＰＭＶ−ＨＴからの発現は、非常に高レベルの組み換えタンパク質の産生を可能にする。それにも関わらず、一過性形質転換のための系およびその使用をさらに改良することが望まれた。
【０１７１】
改良の第１の領域は、小さいプラスミドが、ライゲーション反応および細菌形質転換手順において大きいものより効果的であるという事実に関する。小さいバイナリーベクターの構造との比較により、ｐＢＩＮＰＬＵＳが、外来性配列の有意な量を含む可能性があることが示された。ｐＢＩＮＰＬＵＳの４つの要素は、バイナリーベクターとしての適切な機能：Ｔ−ＤＮＡ、ＲＫ２（ＯｒｉＶ）広範な宿主範囲の複製起点、カナマイシン耐性を与えるＮＰＴＩＩＩ遺伝子（Ｔｒｉｅｕ−ＣｕｏｔおよびＣｏｕｒｖａｌｉｎ，１９８３）、および複製を促進するＲＫ２由来のＴｒｆＡに必須であると決定した（図９）。残存しているバックボーン部分のバイオインフォマティクス分析により、それらが、親プラスミド内の適切な制限部位の存在で信頼される、ｐＢＩＮ１９の構築物の人工物であることが示される（Ｂｅｖａｎ，１９８４）。これらの観測は、ｐＢＩＮ１９の完全なシークエンシングでの報告により確認される（Ｆｒｉｓｃｈら、１９９５）。ｐＢＩＮＰＬＵＳは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるより高いコピー数のための必須でないＣｏｌＥＩ複製起点を含む。約２．６ｋｂの余分なＤＮＡを、Ｔ−ＤＮＡ内に見出すことができる。これは、一過性発現に必要ではない植物形質転換のためのＮＰＴＩＩ選択マーカーを含む。全体として、ｐＢＩＮＰＬＵＳ内の外因性配列の全量は、７．２ｋｂを超えているようである。
【０１７２】
２．３．２  ｐＥＡＱシリーズの構築物
ベクターに対する修飾を生じる発現の効果をモニターするために、本発明者らは、ｐＢＩＮＰＬＵＳ由来プラスミド、ｐＢＤ−ＦＳＣ２−５１２−Ｕ１６２Ｃ（ＨＴ）で開始することを選択した。Ｔ−ＤＮＡ、ＲＫ２（ＯｒｉＶ）複製起点、ならびにＣｏｌＥＩ起点、ＮＰＴＩＩＩおよびＴｒｆＡを含むセグメントからなる３つの領域を、ｐＢＤ−ＦＳＣ２−ＧＦＰ−ＨＴからＰＣＲによって増幅させた。これらの３つのフラグメントのライゲーションにより、プラスミドｐＥＡＱｂｅｔａ（図９）が得られ、それは、その親プラスミドより４５８４ｂｐ小さい。ｐＥＡＱｂｅｔａのＰＣＲ増幅のさらなるラウンドにより、Ｔ−ＤＮＡ領域由来の２６３９ｂｐの必須でない配列を除去し、３つの特有の制限部位、ＡｓｉＳＩ、ＭｌｕｌおよびＦｓｅＩを挿入した。ＡｓｉＳＩ／Ｍｌｕｌ消化は、Ｐａｃｌ／Ａｓｃｌ断片の挿入と適合するので、全ての以前のＣＰＭＶクローニングベクターから複数のカセットをクローニングするのに非常に有用である。ＦｓｅＩは、異なる選択マーカーまたはサイレンシング抑制因子カセットを置き換えるのに有用な特有の８塩基の認識部位を提供する。得られるｐＥＡＱＧＦＰ−ＨＴプラスミドは、ｐＢＩＮＰＬＵＳのサイズの半分より小さく、ＣＰＭＶＨＴ発現カセットを有さず、５１３７ｂｐのみで、最も小さい公知のバイナリーベクターの１つである（図９）。ｐＥＡＱプラスミド全体の配列を決定し、ＲＫ２複製起点が以前に報告されたもの（Ｆｒｉｓｃｈら、１９９５）と逆方向であることを発見したので、ｐＥＡＱ−ＧＦＰ−ＨＴの正確な方向を示す。
【０１７３】
ｐＥＡＱ−ＧＦＰ−ＨＴを、Ｔ−ＤＮＡ内に種々のさらなる特徴を包含するための開始点として用いた（図１０）。ｐＢＩＮＰＬＵＳ由来のＮＰＴＩＩカセットを、ＧＦＰ−ＨＴカセットに対して順方向および逆方向の両方においてｐＥＡＱのＦｓｅＩ部位に再挿入して、ｐＥＡＱｓｅｌｅｃｔＫ−ＧＦＰ−ＨＴおよびｐＥＡＱｓｅｌｅｃｔＫ（ｒｅｖ）−ＧＦＰ−ＨＴを得た。
【０１７４】
３５Ｓ−Ｐ１９カセットをＦｓｅＩ部位に挿入して、ｐＥＡＱｅｘｐｒｅｓｓ−ＧＦＰ−ＨＴを得た。最終的に、３５Ｓ−Ｐ１９カセットを、ｐＥＡＱｓｅｌｅｃｔＫ−ＧＦＰ−ＨＴのＭｌｕ／ＡｓｉＳＩ部位に挿入して、ｐＥＡＱｓｐｅｃｉａｌＫ−ＧＦＰ−ＨＴを得た。このように、一過性発現を容易かつ迅速にするための一連の小さなバイナリーベクターを構築した。
【０１７５】
２．３．３  サイズの減少は、ｐＥＡＱからの一過性発現を妥協しない
ｐＥＡＱシリーズのベクターのアグロ浸潤法（ａｇｒｏ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により、サイズの大幅な減少が一過性アッセイにおいて発現レベルをほとんど妥協しないことが示される。ｐＥＡＱ−ＧＦＰ−ＨＴ、およびｐＢＩＮ６１−Ｐ１９によって提供されるＰ１９を有するｐＥＡＱｓｅｌｅｃｔＫ（ｒｅｖ）−ＧＦＰ−ＨＴの同時浸潤は、ｐＢＤ−ＦＳＣ２−５１２−ＨＴおよびＰ１９の同時浸潤とほとんど変わらない発現レベルを生じる。これは、ＵＶ照射下（図１１Ａ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１１Ｂ）、およびタンパク質抽出物におけるＧＦＰのスペクトル蛍光測定（図１１Ｃ）で見られ得る。興味深いことに、Ｔ−ＤＮＡ内のＮＰＴＩＩカセットの方向は、発現レベルに影響を与えるようである。ｐＥＡＱｓｅｌｅｃｔＫは、ＧＦＰ蓄積の減少を生じる他の同等のｐＥＡＱｓｅｌｅｃｔＫ（ｒｅｖ）と比べて著しい向上を示す。
【０１７６】
理論的には、ｐＥＡＱへのサイレンシングカセットの抑制因子の組み込みは、同じＴ−ＤＮＡから発現される外因性遺伝子からの一過性発現レベルを向上させるその能力に影響を与えるはずはない。実際には、ｐＥＡＱｅｘｐｒｅｓｓ−ＧＦＰ−ＨＴ単独の浸潤はまた、ｐＢＤ−ＦＳＣ２−ＧＦＰ−ＨＴと同様、またはそれより高い発現レベルを生じる（図７．３）。さらに、ｐＥＡＱｅｘｐｒｅｓｓの効果を試験するために、アグロバクテリウム培養物を２倍希釈し、それにより、最終的な吸光度（ＯＤ）は、同時浸潤の各々の個々の培養物のものであった。
【０１７７】
予想されるように、これは、同様の高い発現レベルを生じ、同じＴ−ＤＮＡ上の目的の遺伝子およびサイレンシングの抑制因子の両方の組み込みが、アグロバクテリウムの半分の量の使用を可能にすることを示す（図１１）。従って、全ての要素が同じＴ−ＤＮＡに存在する場合、ＣＰＭＶ−ＨＴは、高レベルの外来性タンパク質を発現させるために使用できる。
【０１７８】
２．３．４  変異Ｐ１９は一過性アッセイにおける導入遺伝子のサイレンシングを抑制できる
Ｔ−ＤＮＡ内のＮＰＴＩＩカセットの順方向によって得られる発現の増加を利用するために、Ｐ１９カセットを、ｐＥＡＱｓｅｌｅｃｔＫ−ＧＦＰ−ＨＴにおけるＡｓｉＳＩとＭｌｕｌ部位との間に挿入して、ｐＥＡＱｓｐｅｃｉａｌＫ−ＧＦＰ−ＨＴを得た（図１０）。ＧＦＰの配列として同じＴ−ＤＮＡ上のＰ１９の存在により、Ｐ１９で同時浸潤したｐＥＡＱｓｅｌｅｃｔＫ−ＧＦＰＨＴと同様のレベルの発現が生じる（図１２）。これは、ｐＥＡＱｅｘｐｒｅｓｓ−ＧＦＰ−ＨＴによって産生される発現より多く、ＮＰＴＩＩカセットの存在に起因するように見える（図１２）。対照的に、ｐＥＡＱｅｘｐｒｅｓｓからの低い発現は、Ｔ−ＤＮＡ内のＰ１９カセットの異なる位置および方向に起因し得る。それにも関わらず、ｐＥＡＱｅｘｐｒｅｓｓと同様に、ｐＥＡＱｓｐｅｃｉａｌＫベクターは、２つの培養物が同時浸潤されなければならない場合に使用されるものの最終的なＯＤの半分のアグロバクテリウムの懸濁液で高レベルの発現を与える。
【０１７９】
外来性遺伝子発現カセットと、Ｐ１９カセットおよび選択マーカーを組み合わせることにより、トランスジェニック植物におけるＣＰＭＶ−ＨＴの機能を試験することが可能となる。しかしながら、Ｐ１９などのサイレンシングの抑制因子の構成的発現は、発生プロセスに関連する内因性遺伝子サイレンシングとのそれらの干渉に起因する厳しい表現型を生じ得る（ＳｉｌｈａｖｙおよびＢｕｒｇｙａｎ，２００４）。最近、特徴付けられたＰ１９の変異（Ｒ４３Ｗ）は、内因性遺伝子サイレンシングに対して減少した活性を有することが提案されているので、安定な形質転換における導入遺伝子サイレンシングの抑制のためのより良い候補となり得る（Ｓｃｈｏｌｔｈｏｆ、２００７）。ＣＰＭＶ−ＨＴ系を用いる安定な形質転換の実行可能性を調べるために、野生型および変異型の両方のＰ１９を、ｐＥＡＱｓｅｌｅｃｔＫ−ＧＦＰ−ＨＴのＴ−ＤＮＡに挿入して、一過性に変異体をアッセイした。示すように、浸潤した葉のＵＶ照射、タンパク質抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびＧＦＰレベルの蛍光分光測定によって、ｐＥＡＱｓｐｅｃｉａｌＫｍの変異体Ｐ１９は、ｐＥＡＱｓｐｅｃｉａｌＫの野生型Ｐ１９の外来性遺伝子の発現の向上の効率の約半分である（図１２）。これは、導入遺伝子のサイレンシングを抑制する能力に対するＰ１９におけるＲ４３Ｗ変異の効果の第１の研究を表す。
【０１８０】
（実施例３）
単一のプラスミドからの高レベルＩｇＧ発現
ｐＥＡＱシリーズ、ヒト抗ＨＩＶ  ＩｇＧのＥＲを保有する重鎖（ＨＥ）および軽鎖（Ｌ）を含むＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセットのモジュールの性質を利用するために、２Ｇ１２を、ｐＥＡＱｅｘｐｒｅｓｓのＰａｃｌ／ＡｓｃｌおよびＡｓｉＳＩ／Ｍｌｕｌ部位に挿入した。挿入部位が発現レベルに影響を与えるか否かを決定するために、ＬおよびＨＥ鎖を、ｐＥＡＱｅｘ−２Ｇ１２ＨＥＬおよびｐＥＡＱｅｘ−２Ｇ１２ＬＨＥを生じる両方の位置に挿入した（図１３Ａ）。上記のプラスミドを含む単一のアグロバクテリウム培養物でのＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの浸潤により、各々が個々の要素、Ｌ、ＨＥおよびＰ１９を発現する３つのアグロバクテリウム培養物を混合することにより産生された２Ｇ１２とサイズが同一の完全に集合した２Ｇ１２抗体の形成が生じた（図１３Ｃ）。各レーンに負荷したタンパク質は、９０ｍｇの浸潤した組織から得た抽出物の１／３０または１ｇの組織から潜在的に得られるタンパク質の１／３３３を示す。３つの株の混合物から産生された集合したＩｇＧの最大量は、ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色した減少していないＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの１μｇのＣＨＯにより産生された２Ｇ１２に相当する。このことは、３２５ｍｇ／ｋｇの新鮮な重量の組織を超える２Ｇ１２の発現レベルを示唆し、ＳＰＲにより測定された濃度と一致する。ｐＥＡＱｅｘ−２Ｇ１２ＨＥＬの使用は、このすでに高レベルの抗体の蓄積を抑制するように見える。
【０１８１】
ＩｇＧなどの複数鎖タンパク質の各要素であるｐＥＡＱ由来のベクターの利点は、自動的に各感染細胞に送達され得ることである。従って、複数の培養物が使用されなければならない場合より、高発現レベルが、より高い希釈のアグロバクテリウム懸濁液で維持されなければならない。実際にこれが起こる場合を試験するために、最初にＯＤ１．２に再懸濁し、必要な場合、混合した培養物を、２回連続して３倍希釈した（図１３Ｂ）。これにより、３つの培養混合物において、各々最終ＯＤが０．４、０．１３および０．０４である個々の培養物が得られた。ｐＥＡＱｅｘｐｒｅｓｓ構築物を有する単一の培養物を、１．２、０．４および０．１３のＯＤで浸潤した。３つの別の培養物を使用した場合、集合した２Ｇ１２のレベルは連続希釈で顕著に減少する。対照的に、ｐＥＡＱｅｘ−２Ｇ１２ＨＥＬおよびｐＥＡＱｅｘ−２Ｇ１２ＬＨＥからの２Ｇ１２発現を、非常に少しの希釈でいくらか減少させて、常に高レベルに維持した（図１３Ｃ〜Ｅ）。希釈に対する感受性の欠如により、同じＴ−ＤＮＡに全ての３つの発現カセットを配置することにより得られる向上した効果を確認する。興味深いことに、浸潤組織から抽出した全タンパク質の量は、浸潤物のＯＤが１．２〜０．４まで減少した場合、ほとんど半分であった。これは、より高いＯＤの懸濁液が浸潤される組織由来の抽出物中のタンパク質の有意な画分が、より高い濃度のアグロバクテリウムに対して産生されるアグロバクテリウム由来のタンパク質または植物タンパク質から構成され得ることを示唆する。
【０１８２】
図１３Ｃの検査は、Ｔ−ＤＮＡ内のカセットの相対位置が発現レベルに影響を与え得ることを示唆する。ｐＥＡＱｅｘ−２Ｇ１２ＬＨＥからの全発現は、ｐＥＡＱｅｘ−２Ｇ１２ＨＥＬからのものよりわずかに低い。このことは、減少していない試料のウェスタンブロッティングにより確認し、また、分解産物および組み込まれていない免疫グロブリン鎖の量においていくらかの差異が示された（図１３Ｃ〜Ｅ）。ｐＥＡＱｅｘ−２Ｇ１２ＬＨＥで浸潤した組織は、約７０〜８０ｋＤａの重鎖に特異的な分解産物を欠いているように見える（図１３Ｄ）。また、ＨＬ２集合中間体および十分に遊離している軽鎖がほとんどないように見える（図１３Ｅ）。重鎖は、植物中の２Ｇ１２集合において制限されることが知られており（Ｍａｒｋｕｓ  Ｓａｃｋ，ｐｅｒｓ．ｃｏｍｍ．，ＲＷＴＨ，Ａａｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、これは、全ての試料における認識可能な遊離重鎖の欠如によって確認されているため、これらの結果は、ｐＥＡＱｅｘ−２Ｇ１２ＬＨＥが、ｐＥＡＱｅｘ−２Ｇ１２ＨＥＬより少ない重鎖を産生することを示す。これは、Ｔ−ＤＮＡの左側の境界に近いＣＰＭＶ−ＨＴカセットからの減少した発現に起因し得る。
【０１８３】
他の実施形態において（データは示さず）、ＣＰＭＶ−ＨＴ系はまた、以下を発現するために、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの一過性形態において首尾よく使用される。
・ブルータングウイルス（Ｂｌｕｅｔｏｎｇｕｅ  Ｖｉｒｕｓ）（血清型１０）ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ５、ＶＰ７およびＮＳ１。
・ロタウイルスＮＳＰ５
・Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ由来のカルモジュリン（これは後で精製された）
・発現するのが困難なヒトＦｃγ受容体１（ＣＤ６４）の細胞外ドメイン−これは精製され、抗体結合研究において機能的であることが示されている。
・ＣＰＭＶ小（Ｓ）および大（Ｌ）コートタンパク質が同時発現され、ウイルス様粒子内で集合することが示されている（データは示さず）。
【０１８４】
（実施例４）
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現ベクターへの直接クローニング
単一のプラスミド上に系の要素を組み合わせるが、上記のベクターはなお、バイナリープラスミドに発現される配列を組み込むために２段階のクローニング手順を必要とした。本実施例は、目的の遺伝子が直接挿入され得るバイナリープラスミドを提供する。そのプラスミドはｐＥＡＱベースのプラスミドへ直接挿入できないポリリンカーを組み込むが、所望の場合、ＣまたはＮ末端ヒスチジンタグの融合も可能にする（ｐＥＡＱ−ＨＴ；図１４Ａ）。ポリリンカーをまず、アニールしたオリゴヌクレオチドとしてｐＭ８１−ＦＳＣ２−５１２（Ａ１１５Ｇ）（Ｕ１６２Ｃ）に挿入し、ｐＭ８１−ＦＳＣ−ＰＯＷを得た。この構築物はなお、複数のポリペプチドを発現させるためのｐＥＡＱベースの構築物を発生させるための標準的な２段階クローニング手順に使用できる。さらに、二重変異した５’リーダーの使用は、単一の変異で得られるよりも、さらに高発現レベルを得ることができる。次いで、ＣＰＭＶ−ＨＴカセットを、Ｐａｃｌ／Ａｓｃｌ部位を介してｐＥＡＱｓｐｅｃｉａｌＫに移して、ｐＥＡＱ−ＨＴを得た。ｐＥＡＱ−ＨＴのポリリンカー内の全ての３つの位置へのＧＦＰの挿入により、非標識ＧＦＰ、および５’（ＨｉｓＧＦＰ）および３’（ＧＦＰＨｉｓ）Ｈｉｓ−タグ融合を得た。
【０１８５】
予想されるように、非標識ＧＦＰは、ｐＥＡＱｓｐｅｃｉａｌＫ−ＧＦＰ−ＨＴで得られるものより高いレベルまで発現し、１．６ｇ／ｋｇ  ＦＷ組織を超えた（図１４Ｂ）。これは、ｐＥＡＱ−ＨＴのＣＰＭＶ５’リーダーが、ＡＵＧ１６１に加えて除去される場合、ＡＵＧ１１５を除去する余分な変異を含み、さらに発現を向上するという事実に起因するようである。
【０１８６】
ウェスタンブロッティングによって検出される場合、Ｈｉｓ−タグの存在により、ポリリンカーによってコードされるアミノ酸残基のＮおよびＣ末端の両方において正確な融合を確認した。全ての３つのＧＦＰ変異体は抗ＧＦＰ抗体で検出可能であるが、ＨｉｓＧＦＰおよびＧＦＰＨｉｓのみが抗Ｈｉｓ抗体で検出可能であり（図１４Ｃ）、Ｈｉｓ−タグの存在により、予想された量でＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてＧＦＰバンドの流動性が減少した。この標識はまた、蛍光の分析によって検出されるＧＦＰの量を減少させた（図１４Ｂ）。この効果はＮ末端Ｈｉｓタグについてより顕著であった。ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色したバンドの強度により、これは、ＧＦＰの蛍光特性を干渉するというよりむしろ、標識されたＧＦＰ蓄積（図１４Ｃ）の減少を表すことが示唆される。それにも関わらず、Ｈｉｓタグしたタンパク質のレベルは依然として非常に高く、１ｋｇのＦＷ組織あたり０．６および１．０のＧＦＰを超えた。
【０１８７】
実施例２〜４の考察
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現系の使用の容易さおよび機能を改良するために、ベクターのモジュラーセットが、容易かつ迅速な植物発現のために作製される。
【０１８８】
バイナリーベクター、ｐＢＩＮＰＬＵＳ由来のプラスミドバックボーンの半分より多く、および一過性発現に必須ではないＴ−ＤＮＡ領域の一部を除去することにより、発現レベルで妥協しない公知の最も小さいバイナリーＴｉプラスミドが得られる。
【０１８９】
バックボーンの同様の割合は、機能を損失せずにｐＢＩＮ１９から以前に除去されている（Ｘｉａｎｇら、１９９９）。しかしながら、ｐＢＩＮＰＬＵＳは、ｐＢＩＮ１９に対して２つの有意な改良点を有し（ｖａｎ  Ｅｎｇｅｌｅｎら、１９９５）；Ｅ．ｃｏｌｉにおける増加したコピー数はＣｏｌＥＩ複製起点の添加のおかげであり、目的の遺伝子を確保する再構築したＴ−ＤＮＡはさらに、植物体における広範な欠失を受け得る左側の境界に由来する（Ｒｏｓｓｉら、１９９６）。同様のサイズのｐＥＡＱプラスミドは、それらのコピー数に対する顕著な効果を有さないが、それらは、１０ｋｂ未満のプラスミドに最も効果的であるため（データは示さず）、市販のプラスミド抽出キットを用いてクローニング手順の間に非常に向上した収率を与える。
【０１９０】
ｐＥＡＱバイナリーベクターのモジュールの性質は、必要な場合、任意のサイレンシング抑制因子および／またはマーカー遺伝子を、１つまたは２つのＣＰＭＶ−ＨＴカセットで同時発現させることによって、ＣＰＭＶ−ＨＴ発現に対する機能性を加える。例えば、ｐＥＡＱｅｘｐｒｅｓｓ−ＧＦＰ−ＨＴのＡｓｉＳＩ／Ｍｌｕｌ部位への異種配列を含む第２のＨＴカセットの挿入は、ＧＦＰ蛍光での発現の追跡を可能にする。
【０１９１】
さらに、ベクターの柔軟性は、単一のアグロバクテリウム構築物の浸潤を必要とすることのみによって、一過性発現のための系を単純化し、Ｔ−ＤＮＡ内に存在する発現カセットの数に比例して必要とされる浸潤の量を減少させることによって、効果を向上させる。ＦｓｅＩ部位を占めるＰ１９とともに、クローニングベクター（例えばｐＭ８１−ＦＳＣ２−Ｕ１６２Ｃ）からＨＴカセットを受容するための２つのクローニング部位の存在はまた、完全なサイズの抗体などの複数のサブユニットタンパク質のさらにより効果的な発現を可能にする。
【０１９２】
導入遺伝子の発現レベルを向上させることに対するＰ１９の効果は十分に特徴付けられている（Ｖｏｉｎｎｅｔら、２００３）。しかしながら、この研究は、同じＴＤＮＡ上の各細胞に同時送達される場合、その有効性の第１の実証を示す。以前の研究により、導入遺伝子を含むＴ−ＤＮＡとして同じアグロバクテリウム内の別のＴＤＮＡからのＰ１９の同時送達が報告されている（Ｈｅｌｌｅｎｓら、２００５）。しかしながら、浸潤後６日までＰ１９の効果はなく、Ｔ−ＤＮＡの非効率の移入が示唆される。本研究はまた、導入遺伝子の発現を向上させるためのＲ４３Ｗ変異体１９の第１の使用を実証する。その変異体が、野生型Ｐ１９のＧＦＰの発現を増加させる効果の約半分であるという発見は、活性のその公知の減少を満たし、ＴＢＳＶの感染性（Ｃｈｕら、２０００）、および短い干渉ＲＮＡのより小さいクラス（２１〜２２ｎｔｓ）に結合するタンパク質の能力（Ｏｍａｒｏｖら、２００６）の両方を妥協する。しかしながら、この特徴は潜在的に、Ｒ４３Ｗ変異体を、安定な形質転換に関する適用に、より適切にすることを可能にする。発達に関連するマイクロＲＮＡはまた、より小さいサイズのクラスであり（Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ，２００６；Ｚｈａｎｇら、２００６）、従って、発達プロセスは、野生型によってほど、変異体Ｐ１９の存在によってそんなに影響を受けない（Ｓｃｈｏｌｔｈｏｆ，２００７）。さらに、この変異体は、潜在的に細胞毒性の外来性タンパク質の一過性発現を制御する方法を提供することができる。
【０１９３】
単一のプラスミドからの２Ｇ１２の発現は、単一のアグロバクテリウム培養物で浸潤された植物組織からの抗体の最も高い報告された収率を表す。ＣＰＭＶ−ＨＴ発現のための３つのアグロバクテリウム培養物を用いることとは別に、別の系を用いて同様のレベルを達成する唯一の方法は、６つの別の培養物の浸潤およびウイルスベクターのアプローチに関連した（Ｇｉｒｉｔｃｈら、２００６）。さらに、単一のプラスミドの使用により、複数の発現カセットの同時送達を確実にするのに必要とされる細菌の量の減少が得られ、これは、工業生産レベルで著しいコスト節約を与える。この浸潤プロセスはまた、葉組織の細胞間隙の少ない詰まりに起因して、より希釈された培養物を用いて実施するのに物理的に容易である。さらに、全ＯＤの０．４までの希釈により、浸潤により誘導されるタンパク質汚染の量が減少した。各ＯＤでの９つの別の浸潤の分析により、培養物のＯＤが１．２〜０．４まで減少した場合、２．７±０．２〜１．５±０．１ｍｇ／ｍｌからの抽出物のタンパク質濃度の減少が示された。ｐＥＡＱｅｘｐｒｅｓｓの使用は、ＯＤ０．４において、１．２の浸潤ＯＤでの３つの培養物系と同じ量の２Ｇ１２を産生するため、組み換え標的タンパク質は、ｐＥＡＱｅｘｐｒｅｓｓを用いる汚染タンパク質の量の半分のみから精製されなければならない。このことは、下流のプロセシングについての非常に有用かつ予想されない利点を与える。ｐＥＡＱｅｘｐｒｅｓｓからの２Ｇ１２の発現はまた、得られる発現レベルでｐＥＡＱベクターのＴ−ＤＮＡ内の発現カセットの位置の効果を示す。ｐＥＡＱｅｘ−２Ｇ１２ＬＨＥからの遊離軽鎖蓄積の増加により、少ない重鎖がこの構築物を用いて発現されることが示唆され、少ない集合した抗体を生じるように見える。これは、Ｔ−ＤＮＡ上の発現カセットの配置に起因し得る。代替的に、一定の割合のＴ−ＤＮＡは、左側の境界で核酸分解しやすい（Ｒｏｓｓｉら、１９９６）。Ｔ−ＤＮＡ内のＮＰＴＩＩカセットの再挿入は、その配向に依存する発現に対する注目すべき効果を有するように見えた。クローニング操作の間、ｐＥＡＱｓｅｌｅｃｔＫ−ＧＦＰ−ＨＴは、ｐＥＡＱｓｅｌｅｃｔＫ（ｒｅｖ）−ＧＦＰ−ＨＴの約１．５倍のＥ．ｃｏｌｉのプラスミドコピー数に到達したようであった（ＱＩＡｐｒｅｐキット、ＱＩＡＧＥＮを用いて実施した３つの別のプラスミド調製物の収率測定から決定した）。これは大まかに、２つのベクター間で観測された発現レベルの差異と相互関連する。プラスミドがアグロバクテリウムに移入される場合、増加したコピー数に起因するか、または実際に差異も存在するか否かは知られていない。しかしながら、これらの観測は、プラスミドコピー数が、効果的なアグロバクテリウム媒介性一過性発現に重要であり得ることを示唆する。これに関して、ｐＢＩＮ１９およびその誘導体によるＲＫ２オリジン（図９におけるｏｒｉＶ）の使用により、一過性発現のための良い選択が行われる。なぜなら、ＲＫ２プラスミドは、アグロバクテリウムにおいて７〜１０コピーまで蓄積することが知られているからである（Ｖｅｌｕｔｈａｍｂｉら、１９８７）。これは、ｐＰＺＰによって利用されるｐＶＳ１オリジンと同様であり��ｐＳａオリジン（ＬｅｅおよびＧｅｌｖｉｎ、２００８）によって生成されるより約２〜５倍高く、広範に使用されるｐＧＲＥＥＮバイナリーベクターに存在する（Ｈｅｌｅｎｓら、２０００）。ｐＲｉベースのプラスミドなどのより高いコピー数を生じる複製起点を含むプラスミド（ＬｅｅおよびＧｅｌｖｉｎ、２００８）は、一過性発現にさらにより適切であり得る。
【０１９４】
ＣＰＭＶベースの発現、または実際に一般の植物ベースの発現を以前に経験していない実験室用に容易に入手可能なｐＥＡＱベクターを用いる高レベルの発現を行うために、ｐＥＡＱの直接クローニング型を作製した。これは、Ｐ１９およびＮＰＴＩＩカセットを同様に含むＴ−ＤＮＡ上に位置するＣＰＭＶＨＴ発現カセットの５’リーダーと３’ＵＴＲとの間にポリリンカーを挿入することにより達成された。ＮＰＴＩＩカセットの存在が感知できるほどに発現を向上させるように見えるため（上記を参照のこと）、そのＮＰＴＩＩカセットが含まれた。ポリリンカーはまた、タンパク質精製を促進するために、ＮまたはＣ末端Ｈｉｓタグの融合を可能にするために、２セットの６×ヒスチジン残基をコードする。得られた構築物はまた、ＨＴに対して発現を向上させる５’リーダーにおいて第２の変異体からの利点を有する。
【０１９５】
これらの向上した発現カセットはまた、任意のｐＥＡＱプラスミド内にクローニングベクター、ｐＭ８１−ＦＳＣ−ＰＯＷからサブクローニングされてもよい。ｐＥＡＱＨＴの使用により、ただ単一の変異体（Ｕ１６２Ｃ）を含む、ｐＥＡＱｓｐｅｃｉａｌＫと比較して増加したＧＦＰ発現を生じた。さらに、ポリリンカー設計はまた、１段階のクローニング手順を用いるＨｉｓタグした変異体の発現を可能にした。本明細書に示したモジュールバイナリーベクターは、制限されないが、ＣＰＭＶ−ＨＴ発現での使用のために特別に設計される。非常に高レベルの発現は、向上したクローニング効果および使用の容易さと関連する。この系は、ウイルス増幅の複雑化がされることなく、植物における付加価値タンパク質の一過性発現のための最も効果的かつ容易な方法を提供する。これにより、植物成長施設で利用可能な任意の分子生物学実験と同一の配列の２週間以内のミリグラム量の組み換えタンパク質が可能となる。従って、大学および工業的環境の両方において非常に有益な手段を与えることが予想される。
【０１９６】
（実施例５）
ｐＥＡＱプラスミドおよびトランスジェニック植物での安定な組み込み
ｐＥＡＱベクターシリーズを、一過性発現を考慮して設計したが、Ｔ−ＤＮＡ内にＮＰＴＩＩカセットの再挿入をして、ゲノム組み込みのための選択マーカーを与えた。これは、それらのより小さく、安定な植物および植物細胞培養形質転換に使用するための、より有用なバイナリーベクターを潜在的に可能にする。Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉片を形質転換するために使用する場合、Ｔ−ＤＮＡ内にＮＰＴＩＩカセットを含むｐＥＡＱベクターは、ｐＢＩＮＰＬＵＳベースの構築物と同じ効率を有する選択下でカルス形成を誘導できた。さらに、ＧＦＰ発現は、ＵＶ光下でこれらの組織において検出可能であった（データは示さず）。これは、ｐＥＡＱベクター由来のマルチカセットＴ−ＤＮＡ分子が、植物ゲノム内に安定して組み込み、外来性遺伝子の発現を駆動することができることを実証する。
【０１９７】
蛍光植物もまた再生される。一次形質転換体（Ｔ０）の葉はＵＶ光下で蛍光を発し、高レベルのＧＦＰ発現を示した。自家受粉したＴ０植物からの種子は成長でき、導入遺伝子を保有する得られたＴ１苗もまた、蛍光を発する（結果は示さず）。
【０１９８】
（実施例６）
バキュロウイルスベクターを用いるＣＰＭＶベースのＨＴ系の使用
図１５は、昆虫細胞におけるバキュロウイルスベクターを用いるＣＰＭＶベースのＨＴ系を利用するのに適切な構築物を示す。ｐ１０プロモーターの制御下で、ＨｙｐｅｒＴｒａｎｓ  ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２  ＵＴＲもまた、バキュロウイルス発現系を用いる昆虫細胞におけるＧＦＰの発現を向上させる。フローサイトメトリーによって測定される場合、バキュロウイルス感染ｓｆ２１細胞の蛍光レベルの約５倍の向上を、ＣＰＭＶ−ＨＴカセットを有さない構築物と比較して得た。
【０１９９】
（参考文献）
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Ｇｏｐｉｎａｔｈ，Ｋ．，Ｗｅｌｌｉｎｋ，Ｊ．，Ｐｏｒｔａ，Ｃ，Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｍ．，Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．Ｐ．  ａｎｄ  ｖａｎ  Ｋａｍｍｅｎ，Ａ．（２０００）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｃｏｗｐｅａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ−２  ｉｎｔｏ  ａ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｏ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６７：１５９−１７３．
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Ｌｉｕ，  Ｌ．  ａｎｄ  Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．Ｐ．（２００２）Ａｇｒｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ  Ｃｏｗｐｅａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０５，３４３−３４８．
Ｌｉｕ，Ｌ．  ａｎｄ  Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．Ｐ．（２００６）  Ａ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｔｉｌｉｓｉｎｇ  ｌａｒｇｅ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｍｐｌａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｈａｎｇｅｓ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｏｕｎｄｓ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｗｈｏｌｅ  ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３７，６３−７１．
Ｌｉｕ，Ｌ．，Ｃａｎｉｚａｒｅｓ，Ｍ．Ｃ．，Ｍｏｎｇｅｒ，Ｗ．，Ｐｅｒｒｉｎ，Ｙ．，Ｔｓａｋｉｒｉｓ，Ｅ．，Ｐｏｒｔａ，Ｃ，Ｓｈａｒｉａｔ，Ｎ．，Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｌ．  ａｎｄ  Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．Ｐ．（２００５）．Ｃｏｗｐｅａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３，１７８８−１７９２．
Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．Ｐ．  ＆  Ｓｈａｎｋｓ，Ｍ．（１９８３）．Ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｏｗｐｅａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  Ｂ  ＲＮＡ．ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２，２２５３−２２５８．
Ｍｅｃｈｔｃｈｅｒｉａｋｏｖａ，Ｉ．Ａ．，Ｅｌｄａｒｏｖ，Ｍ．Ａ．，Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｌ．，Ｓｈａｎｋｓ，Ｍ．，Ｓｋｒｙａｂｉｎ，Ｋ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．Ｐ．（２００６）  Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｃｏｒｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３１，１０−１５．
Ｍｏｎｇｅｒ，Ｗ．，Ａｌａｍｉｌｌｏ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｏｌａ，Ｉ．，Ｐｅｒｒｉｎ，Ｙ．，Ｂｅｓｔａｇｎｏ，Ｍ．，Ｂｕｒｒｏｎｅ，Ｏ．Ｒ．，Ｓａｂｅｌｌａ，Ｐ．，Ｐｌａｎａ−Ｄｕｒａｎ，Ｊ．，Ｅｎｊｕａｎｅｓ，Ｌ．，Ｇａｒｃｉａ，Ｊ．Ａ．  ａｎｄ  Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．Ｐ．（２００６）  Ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｆｒｏｍ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｐａｓｓｉｖｅｌｙ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｓ  ｐｉｇｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｈｅｎ  ｓｕｐｐｌｉｅｄ  ｏｒａｌｌｙ  ｉｎ  ｃｒｕｄｅ  ｐｌａｎｔ  ｅｘｔｒａｃｔｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．４，  ６２３−６３１．
Ｒｏｈｌｌ，Ｊ．Ｂ．，Ｈｏｌｎｅｓｓ，Ｃ．Ｌ．，Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．Ｐ．  ａｎｄ  Ｍａｕｌｅ，Ａ．Ｊ．（１９９３）．３’  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｗｐｅａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  Ｍ−ＲＮＡ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９３，  ６７２−６７９．
Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｆ．，Ｌａｖｏｉｅ，Ｐ−Ｏ．，Ｄ’Ａｏｕｓｔ，Ｍ−Ａ．，Ｖｅｚｉｎａ，Ｌ−Ｐ．  ａｎｄ  Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．Ｐ．（２００８）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｆｕｌｌ−Ｌｅｎｇｔｈ  ａｎｄ  Ｄｅｌｅｔｅｄ  Ｖｅｒｓｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｗｐｅａ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ−２．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，６：８２−９２．
Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｆ．，Ｃａｎｉｚａｒｅｓ，Ｍ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．Ｐ．（２００７）  Ｃｏｗｐｅａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ｉｎ：Ｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｈｅｆｆｅｒｏｎ，  Ｋ．  ｅｄ），ｐｐ．３３９−５５５．  Ｋｅｒａｌａ，Ｉｎｄｉａ：Ｔｒａｎｓｗｏｒｌｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ．
Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｆ．  ａｎｄ  Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．Ｐ．（２００８）．  Ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ａｎｄ  ｒａｐｉｄ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １４８，１２１２−１２１８．
Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｆ．，Ｌｉｕ，Ｌ．  ａｎｄ  Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ  Ｇ．Ｐ．（２００９）  Ｃｏｗｐｅａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．  Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．４８３：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｌａｎｔｓ（Ｆａｙｅ，Ｌ．  ａｎｄ  Ｇｏｍｏｒｄ，Ｖ．  ｅｄｓ），ｐｐ２５−３９，ＮＹ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ．
ｖａｎ  Ｂｏｋｈｏｖｅｎ，Ｈ．，Ｌｅ  Ｇａｌｌ，Ｏ，Ｋａｓｔｅｅｌ，Ｄ．，Ｖｅｒｖｅｒ，Ｊ．，Ｗｅｌｌｉｎｋ，Ｊ．  ａｎｄ  ｖａｎ  Ｋａｍｍｅｎ，Ａ．（１９９３）．Ｃｉｓ−  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｃｏｗｐｅａ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９５，３７７−３８６．
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さらなる参考文献：
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Ｎａｒａｓｉｍｈｕｌｕ  ＳＢ，Ｄｅｎｇ  Ｘ，Ｓａｒｒｉａ  Ｒ，Ｇｅｌｖｉｎ  ＳＢ（１９９６）Ｅａｒｌｙ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｔ−ＤＮＡ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｏｂａｃｃｏ  ａｎｄ  ｍａｉｚｅ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８：８７３−８８６
Ｈｅｌｌｅｎｓ  ＲＰ，Ｅｄｗａｒｄｓ  ＥＡ，Ｌｅｙｌａｎｄ  ＮＲ，Ｂｅａｎ  Ｓ，Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ  ＰＭ（２０００ａ）ｐＧｒｅｅｎ：ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ａｎｄ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｂｉｎａｒｙ  Ｔｉ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４２：８１９−８３２
Ｔｚｆｉｒａ  Ｔ，Ｔｉａｎ  ＧＷ，Ｌａｃｒｏｉｘ  Ｂ，Ｖｙａｓ  Ｓ，Ｌｉ  ＪＸ，Ｌｅｉｔｎｅｒ−Ｄａｇａｎ  Ｙ，  Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙ  Ａ，Ｔａｙｌｏｒ  Ｔ，Ｖａｉｎｓｔｅｉｎ  Ａ，Ｃｉｔｏｖｓｋｙ  Ｖ（２００５）ｐＳＡＴ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔａｇｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５７：  ５０３−５１６
Ｖｏｉｎｎｅｔ  Ｏ，Ｒｉｖａｓ  Ｓ，Ｍｅｓｔｒｅ  Ｐ，Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ  Ｄ（２００３）  Ａｎ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐ１９  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｔｏｍａｔｏ  ｂｕｓｈｙ  ｓｔｕｎｔ  ｖｉｒｕｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３３：９４９−９５６
Ｆｒｉｓｃｈ  ＤＡ，Ｈａｒｒｉｓｈａｌｌｅｒ  ＬＷ，Ｙｏｋｕｂａｉｔｉｓ  ＮＴ，Ｔｈｏｍａｓ  ＴＬ，Ｈａｒｄｉｎ  ＳＨ，Ｈａｌｌ  ＴＣ（１９９５）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｎａｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ＢＩＮ−１９．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２７：４０５−４０９
Ｔｒｉｅｕ−ｃｕｏｔ  Ｐ，Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ  Ｐ（１９８３）Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ−ｆａｅｃａｌｉｓ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ３’５’’−Ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｔｙｐｅ−Ｉｌｌ．Ｇｅｎｅ  ２３：３３１−３４１
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Ｓｉｌｈａｖｙ  Ｄ，Ｂｕｒｇｙａｎ  Ｊ（２００４）Ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｓｉｄｅ−ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｏｎ  ｓｈｏｒｔ  ＲＮＡｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９：７６−８３
Ｓｃｈｏｌｔｈｏｆ  ＨＢ（２００７）Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ：ＲＩＳＣ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １４５：１１１０−１１１７
ｖａｎ  Ｅｎｇｅｌｅｎ  ＦＡ，Ｍｏｌｔｈｏｆｆ  ＪＷ，Ｃｏｎｎｅｒ  ＡＪ，Ｎａｐ  ＪＰ，Ｐｅｒｅｉｒａ  Ａ，Ｓｔｉｅｋｅｍａ  ＷＪ（１９９５）ｐＢＩＮＰＬＵＳ−ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｐＢＩＮ１９．  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４：２８８−２９０
Ｒｏｓｓｉ  Ｌ，Ｈｏｈｎ  Ｂ，Ｔｉｎｌａｎｄ  Ｂ（１９９６）Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ＤＮＡ  ｕｎｉｔｓ  ｉｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  Ｅ２  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ．
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９３：１２６−１３０
Ｘｉａｎｇ  ＣＢ，Ｈａｎ  Ｐ，Ｌｕｔｚｉｇｅｒ  Ｉ，Ｗａｎｇ  Ｋ，Ｏｌｉｖｅｒ  ＤＪ（１９９９）Ａ  ｍｉｎｉ  ｂｉｎａｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｅｒｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４０：７１１−７１７
Ｈｅｌｌｅｎｓ  ＲＰ，Ａｌｌａｎ  ＡＣ，Ｆｒｉｅｌ  ＥＮ，Ｂｏｌｉｔｈｏ  Ｋ，Ｇｒａｆｔｏｎ  Ｋ，Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ  ＭＤ，Ｋａｒｕｎａｉｒｅｔｎａｍ  Ｓ，Ｇｌｅａｖｅ  ＡＰ，Ｌａｉｎｇ  ＷＡ（２００５）Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １：１３
Ｃｈｕ  Ｍ，Ｄｅｓｖｏｙｅｓ  Ｂ，Ｔｕｒｉｎａ  Ｍ，Ｎｏａｄ  Ｒ，Ｓｃｈｏｌｔｈｏｆ  ＨＢ（２０００）Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｍａｔｏ  ｂｕｓｈｙ  ｓｔｕｎｔ  ｖｉｒｕｓ  ｐ１９−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｈｏｓｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｙｍｐｔｏｍ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｖａｓｉｏｎ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６６：７９−８７
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【０２００】
【表２−１】
0005745857.tif 000005
【０２０１】
【表２−２】
0005745857.tif 000006
【０２０２】
ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメントの１１５位、１６１位、５１２位および５２４位の開始コドンを太字および下線で示す。
【０２０３】
【表３】
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【０２０４】
ｐＭ８１−ＦＳＣ−２クローンの５’領域の変異誘発に使用されるオリゴヌクレオチドの変異ヌクレオチドを太字で示す。
【０２０５】
【表４】
0005745857.tif 000008
【０２０６】
ｐＭ８１−ＦＳＣ−１およびｐＭ８１−ＦＳＣ−２ベクターの配列と、表１からのＣＰＭＶ野生型配列との間のヌクレオチドの相違を大文字として示す。
【０２０７】
【表５】
0005745857.tif 000009
【０２０８】
【表６】
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【０２０９】
【表７】
0005745857.tif 000011
【０２１０】
【表８】
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【０２１１】
【表９】
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【０２１２】
【表１０】
0005745857.tif 000014
【０２１３】
【表１１】
0005745857.tif 000015
【０２１４】
【表１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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