(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物
【化１】
0005755821.tif 000045
［式中、
Ｒ１は水素であり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３は水素であるか：
Ｒ１は水素であり、Ｒ２は（２Ｓ）−２−アミノプロパノイルであり、Ｒ３は水素であるか；
Ｒ１は水素であり、Ｒ２は（２Ｓ）−２−アミノ−４−メチルスルファニル−ブタノイルであり、Ｒ３は水素であるか；
Ｒ１は水素であり、Ｒ２は２−アミノアセチルであり、Ｒ３は水素であるか；
Ｒ１はベンジルであり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３はベンジルであるか、または
Ｒ１は（２−フルオロフェニル）メチルであり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３は（２−フルオロフェニル）メチルである］
またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸である、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３】
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸塩酸塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸である、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項５】
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸塩酸塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸二水和物。
【請求項７】
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸；１，４−ジオキサン〔ここで、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸：１，４−ジオキサン＝１：０．５〕；塩酸塩。
【請求項８】
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノ−４−メチルスルファニル−ブタノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸である、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項９】
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノ−４−メチルスルファニル−ブタノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸塩酸塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［（２−アミノアセチル）アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸である、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１１】
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［（２−アミノアセチル）アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸塩酸塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
ジベンジル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレートである、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１３】
ジベンジル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート；１，４−ジオキサン；塩酸塩。
【請求項１４】
ビス［（２−フルオロフェニル）メチル］（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレートである、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１５】
ビス［（２−フルオロフェニル）メチル］（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート塩酸塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
式Ｉの化合物
【化２】
0005755821.tif 000046
［式中、
Ｒ１は水素であり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３は水素であるか：
Ｒ１は水素であり、Ｒ２は（２Ｓ）−２−アミノプロパノイルであり、Ｒ３は水素であるか；
Ｒ１は水素であり、Ｒ２は（２Ｓ）−２−アミノ−４−メチルスルファニル−ブタノイルであり、Ｒ３は水素であるか；
Ｒ１は水素であり、Ｒ２は２−アミノアセチルであり、Ｒ３は水素であるか；
Ｒ１はベンジルであり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３はベンジルであるか、または
Ｒ１は（２−フルオロフェニル）メチルであり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３は（２−フルオロフェニル）メチルである］
またはその薬学的に許容可能な塩と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１７】
前記化合物が、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸二水和物である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
持続痛、神経因性疼痛、慢性炎症性疼痛、および内臓痛からなる群から選択される、神経学的障害の治療に使用するための医薬組成物であって、有効量の式Ｉの化合物
【化３】
0005755821.tif 000047
［式中、
Ｒ１は水素であり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３は水素であるか：
Ｒ１は水素であり、Ｒ２は（２Ｓ）−２−アミノプロパノイルであり、Ｒ３は水素であるか；
Ｒ１は水素であり、Ｒ２は（２Ｓ）−２−アミノ−４−メチルスルファニル−ブタノイルであり、Ｒ３は水素であるか；
Ｒ１は水素であり、Ｒ２は２−アミノアセチルであり、Ｒ３は水素であるか；
Ｒ１はベンジルであり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３はベンジルであるか、または
Ｒ１は（２−フルオロフェニル）メチルであり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３は（２−フルオロフェニル）メチルである］
またはその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物。
【請求項１９】
前記神経学的障害が、持続痛である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記神経学的障害が、神経因性疼痛である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記神経学的障害が、慢性炎症性疼痛である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記神経学的障害が、内臓痛である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸二水和物を含む、持続痛の治療に使用するための医薬組成物。
【請求項２４】
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸二水和物を含む、神経因性疼痛の治療に使用するための医薬組成物。
【請求項２５】
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸二水和物を含む、慢性炎症性疼痛の治療に使用するための医薬組成物。
【請求項２６】
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸二水和物を含む、内臓痛の治療に使用するための医薬組成物。
【請求項２７】
統合失調症、双極性障害、全般性不安障害、および外傷後ストレス障害からなる群から選択される精神障害の治療に使用するための医薬組成物であって、有効量の式Ｉの化合物
【化４】
0005755821.tif 000048
［式中、
Ｒ１は水素であり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３は水素であるか：
Ｒ１は水素であり、Ｒ２は（２Ｓ）−２−アミノプロパノイルであり、Ｒ３は水素であるか；
Ｒ１は水素であり、Ｒ２は（２Ｓ）−２−アミノ−４−メチルスルファニル−ブタノイルであり、Ｒ３は水素であるか；
Ｒ１は水素であり、Ｒ２は２−アミノアセチルであり、Ｒ３は水素であるか；
Ｒ１はベンジルであり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３はベンジルであるか、または
Ｒ１は（２−フルオロフェニル）メチルであり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３は（２−フルオロフェニル）メチルである］
またはその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物。
【請求項２８】
前記精神障害が、統合失調症である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記精神障害が、双極性障害である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記精神障害が、全般性不安障害である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記精神障害が、外傷後ストレス障害である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸二水和物を含む、統合失調症の治療に使用するための医薬組成物。
【請求項３３】
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸二水和物を含む、双極性障害の治療に使用するための医薬組成物。
【請求項３４】
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸二水和物を含む、全般性不安障害の治療に使用するための医薬組成物。
【請求項３５】
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸二水和物を含む、外傷後ストレス障害の治療に使用するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｍＧｌｕ２／３アゴニスト、より具体的には、新規４−置換ビシクロ［３．１．０］ヘキサンおよびそのプロドラッグ、その医薬組成物、ならびにその治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−グルタミン酸塩は、主に中枢神経系における興奮性神経伝達物質であり、興奮性アミノ酸と称されている。代謝型グルタミン酸（ｍＧｌｕ）受容体は神経細胞の興奮性を調節するＧタンパク質共役受容体である。神経学的障害または精神障害の治療はｍＧｌｕ興奮性アミノ酸受容体の選択的活性化と関連している。より特に、研究により、ｍＧｌｕ２／３アゴニストが、鎮痛性、抗精神病性、抗不安作用、抗鬱性、および神経防護作用を有することが実証されている。したがって、ｍＧｌｕ２／３アゴニストのこれらの特性は、慢性痛状態などの神経学的障害、または統合失調症、躁鬱病障害としても知られている双極性障害、全般性不安障害、および外傷後ストレス障害などの精神障害の治療に有用であり得る。
【０００３】
特許文献１は、興奮性アミノ酸受容体アンタゴニストであると主張されている特定の４−置換ビシクロ［３．１．０］ヘキサン化合物を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第９７１７９５２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
過剰のグルタミン酸作動性傾向は中枢神経系の多くの疾患状態に関与しているが、このような病態生理学的状態を修正する有効な薬剤は臨床診療において欠如している。特に、臨床応用は適切な薬物様特性を有するｍＧｌｕ２／３アゴニストの欠如に起因して実現されていない。したがって、強力で有効なｍＧｌｕ２／３アゴニストについての必要性が依存として存在している。本発明は、強力で有効なｍＧｌｕ２／３アゴニストである、新規４−置換ビシクロ［３．１．０］ヘキサン、およびそのプロドラッグを提供する。本発明の範囲内の特定のプロドラッグは、経口投与後に十分に吸収され、続いて活性代謝産物を体循環内に放出するように加水分解されるので、臨床開発に適している。本発明のこのような新規化合物は、持続痛、神経因性疼痛、慢性炎症性疼痛、もしくは内臓痛を含む、慢性痛状態などの神経学的障害、または統合失調症、双極性障害、全般性不安障害、もしくは外傷後ストレス障害などの精神障害の強力で有効な治療についての必要性を扱うことができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、式Ｉの化合物
【化１】
0005755821.tif 000002
[式中、
Ｒ１は水素であり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３は水素であるか；
Ｒ１は水素であり、Ｒ２は（２Ｓ）−２−アミノプロパノイルであり、Ｒ３は水素であるか；
Ｒ１は水素であり、Ｒ２は（２Ｓ）−２−アミノ−４−メチルスルファニル−ブタノイルであり、Ｒ３は水素であるか；
Ｒ１は水素であり、Ｒ２は２−アミノアセチルであり、Ｒ３は水素であるか；
Ｒ１はベンジルであり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３はベンジルであるか；または
Ｒ１は（２−フルオロフェニル）メチルであり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３は（２−フルオロフェニル）メチルである]
またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【０００７】
本発明は、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【０００８】
特定の実施形態として、本発明は、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸を提供する。
【０００９】
特定の実施形態として、本発明は、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸の塩酸塩を提供する。
【００１０】
本発明は、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００１１】
特定の実施形態として、本発明は、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸塩酸塩を提供する。
【００１２】
特定の実施形態として、本発明は、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸；１，４−ジオキサン（１：０．５）；塩酸塩を提供する。
【００１３】
本発明は、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノ−４−メチルスルファニル−ブタノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００１４】
特定の実施形態として、本発明は、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノ−４−メチルスルファニル−ブタノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸塩酸塩を提供する。
【００１５】
本発明は、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［（２−アミノアセチル）アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００１６】
特定の実施形態として、本発明は、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［（２−アミノアセチル）アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸塩酸塩を提供する。
【００１７】
本発明は、ジベンジル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００１８】
特定の実施形態として、本発明は、ジベンジル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート；１，４−ジオキサン；塩酸塩を提供する。
【００１９】
本発明は、ビス［（２−フルオロフェニル）メチル］（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００２０】
特定の実施形態として、本発明は、ビス［（２−フルオロフェニル）メチル］（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート塩酸塩を提供する。
【００２１】
本発明は、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、もしくはその薬学的に許容可能な塩、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、もしくはその薬学的に許容可能な塩、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノ−４−メチルスルファニル−ブタノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、もしくはその薬学的に許容可能な塩、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［（２−アミノアセチル）アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、もしくはその薬学的に許容可能な塩、ジベンジル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート、もしくはその薬学的に許容可能な塩、またはビス［（２−フルオロフェニル）メチル］（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート、もしくはその薬学的に許容可能な塩を、薬学的に許容可能な担体および任意に他の治療成分と一緒に含む医薬組成物を提供する。
【００２２】
本発明は、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、もしくはその薬学的に許容可能な塩、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、もしくはその薬学的に許容可能な塩、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノ−４−メチルスルファニル−ブタノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、もしくはその薬学的に許容可能な塩、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［（２−アミノアセチル）アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、もしくはその薬学的に許容可能な塩、ジベンジル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート、もしくはその薬学的に許容可能な塩、またはビス［（２−フルオロフェニル）メチル］（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート、もしくはその薬学的に許容可能な塩、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、もしくは賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００２３】
本発明は、有効量の（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、もしくはその薬学的に許容可能な塩、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、もしくはその薬学的に許容可能な塩、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノ−４−メチルスルファニル−ブタノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、もしくはその薬学的に許容可能な塩、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［（２−アミノアセチル）アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、もしくはその薬学的に許容可能な塩、ジベンジル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート、もしくはその薬学的に許容可能な塩、またはビス［（２−フルオロフェニル）メチル］（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート、もしくはその薬学的に許容可能な塩を、それを必要とする患者に投与することを含む、神経学的障害または精神障害を治療する方法を提供する。
【００２４】
本発明は、神経学的障害または精神障害を治療するための医薬の製造のための（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、もしくはその薬学的に許容可能な塩、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、もしくはその薬学的に許容可能な塩、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノ−４−メチルスルファニル−ブタノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、もしくはその薬学的に許容可能な塩、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［（２−アミノアセチル）アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、もしくはその薬学的に許容可能な塩、ジベンジル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート、もしくはその薬学的に許容可能な塩、またはビス［（２−フルオロフェニル）メチル］（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート、もしくはその薬学的に許容可能な塩の使用を提供する。
【００２５】
本発明は、治療に使用するための、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、もしくはその薬学的に許容可能な塩、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、もしくはその薬学的に許容可能な塩、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノ−４−メチルスルファニル−ブタノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、もしくはその薬学的に許容可能な塩、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［（２−アミノアセチル）アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、もしくはその薬学的に許容可能な塩、ジベンジル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート、もしくはその薬学的に許容可能な塩、またはビス［（２−フルオロフェニル）メチル］（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート、もしくはその薬学的に許容可能な塩を提供する。本発明はまた、神経学的障害または精神障害の治療に使用するための、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、もしくはその薬学的に許容可能な塩、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、もしくはその薬学的に許容可能な塩、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノ−４−メチルスルファニル−ブタノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、もしくはその薬学的に許容可能な塩、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［（２−アミノアセチル）アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸、もしくはその薬学的に許容可能な塩、ジベンジル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート、もしくはその薬学的に許容可能な塩、またはビス［（２−フルオロフェニル）メチル］（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート、もしくはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００２６】
さらに、本発明は、本明細書に記載される方法および使用の好ましい実施形態を提供し、神経学的障害は、持続痛、神経因性疼痛、慢性炎症性疼痛、および内臓痛からなる群から選択され、精神障害は、統合失調症、双極性障害、全般性不安障害、および外傷後ストレス障害からなる群から選択される。
【００２７】
上記および本発明の説明全体にわたって使用する場合、他に示されない限り、以下の用語は以下の意味を有すると理解されるべきである：
「本発明の化合物」および「本発明の化合物（複数）」は、プロドラッグ、活性化合物、および／または活性代謝産物を含む。「プロドラッグ」は、最初に不活性形態であり、正常な代謝プロセスにより身体において活性形態に変換される薬物のクラスであり、式ＩにおけるＲ１、Ｒ２、およびＲ３の少なくとも１つは水素以外である（例えば、Ｒ１は水素であり、Ｒ２は（２Ｓ）−２−アミノプロパノイルであり、Ｒ３は水素である；Ｒ１は水素であり、Ｒ２は（２Ｓ）−２−アミノ−４−メチルスルファニル−ブタノイルであり、Ｒ３は水素である；Ｒ１は水素であり、Ｒ２は２−アミノアセチルであり、Ｒ３は水素である；Ｒ１はベンジルであり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３はベンジルである；またはＲ１は（２−フルオロフェニル）メチルであり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３は（２−フルオロフェニル）メチルである）。「活性化合物」または「活性」は、例えば静脈内または腹腔内で身体に投与される活性形態についての別の名称であり、式ＩにおけるＲ１、Ｒ２およびＲ３は水素である。「活性代謝産物」は、正常な代謝プロセスによって身体におけるプロドラッグのこのような変換から生じる活性形態についての別の名称であり、式ＩにおけるＲ１、Ｒ２およびＲ３は水素である。
【００２８】
「薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤」は、生物学的活性剤の哺乳動物、例えばヒトへの送達のために当該技術分野において一般的に認められている媒体である。
【００２９】
「薬学的に許容可能な塩」とは、本発明の化合物の比較的無毒性の無機および有機塩を指す。
【００３０】
「治療有効量」または「有効量」は、研究者、獣医、医師または他の臨床医により求められる組織、系、動物、哺乳動物またはヒトに対する生物学的もしくは医学的反応または所望の治療効果を引き起こす本発明の化合物、もしくはその薬学的に許容可能な塩または本発明の化合物、もしくはその薬学的に許容可能な塩を含有する医薬組成物の量を意味する。
【００３１】
「治療」、「治療する」、「治療している」などの用語は、障害の進行を遅延させることまたは反転させることを含むことを意味する。これらの用語はまた、障害または病態が実際に取り除かれていないとしても、および障害または病態の進行がそれ自体で遅延または反転していないとしても、障害または病態の１つ以上の症状を軽減すること、改善すること、減衰すること、取り除くこと、または減少させることを含む。
【００３２】
本開示全体にわたって使用される標準的な命名に基づいて、指定される側鎖の末端部が最初に記載され、続いて結合点に対して隣接する官能基が記載される。例えば、メチルスルホニル置換基はＣＨ３−ＳＯ２−と等価である。
【００３３】
本発明の化合物は、例えば、多くの無機酸および有機酸と反応して、薬学的に許容可能な酸付加塩または塩基付加塩を形成できる。このような薬学的に許容可能な塩およびそれらを調製するための一般的な方法は当該技術分野において周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら、ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ、ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＵＳＥ、（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００２）；Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｖｏｌ６６、Ｎｏ．１、１９７７年１月を参照のこと。
【００３４】
本発明の化合物は好ましくは、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を使用して医薬組成物として製剤化され、様々な経路により投与される。好ましくは、このような組成物は経口または静脈内投与のためである。このような医薬組成物およびそれらを調製するためのプロセスは当該技術分野において周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら、ｅｄｓ．、２１ｓｔ  ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、２００５）を参照のこと。
【００３５】
実際に投与される本発明の化合物は、治療される病態、選択される投与経路、投与される本発明の実際の化合物（複数も含む）、個々の患者の年齢、体重および反応、ならびに患者の症状の重症度を含む、関連する状況の下で医師により決定されるであろう。１日当たりの投薬量は、通常、約０．１〜約３００ｍｇの範囲内である。一部の場合、上述の範囲の下限値以下の投薬レベルが十分以上であってもよく、一方、他の場合、さらに多くの用量が利用されてもよい。
【００３６】
本発明の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩は、当該技術分野において公知の種々の手順ならびに以下の調製例および実施例に記載されている手順により調製され得る。記載されている経路の各々についての特定の合成工程が、本発明の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を調製するために異なる様式で組み合わされてもよい。
【００３７】
他に示されない限り、置換基は以前に定義されている通りである。試薬および開始物質は一般に当業者に容易に入手可能である。他のものは、公知の構造的に同様の活性化合物およびプロドラッグの合成と類似している技術である、有機および複素環化学の標準的な技術ならびに任意の新規の手順を含む、以下の調製例および実施例に記載されている手順により作製され得る。以下の調製例および実施例の命名はＳｙｍｙｘ  Ｄｒａｗ３．１を使用して行われる。
【００３８】
本明細書で使用される場合、以下の用語は示した意味を有する：「ＨＰＬＣ」は高圧液体クロマトグラフィーを指し；「ＬＣ」は液体クロマトグラフィーを指し；「ＭＳ（ＥＳ＋）」はエレクトロスプレーイオン化を使用した質量分析を指し；「ＭＳ」は質量分析を指し；「ＳＦＣ」は超臨界流体クロマトグラフィーを指し；「ＮＭＲ」は核磁気共鳴を指し；「ＴＬＣ」は薄層クロマトグラフィーを指し；「ＲＴ」は保持時間を指し；「ＵＶ」は紫外線を指し；「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を指し；「ＰＢＳ」はリン酸緩衝生理食塩水を指し；「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を指し；「ＳＣＸ」は強カチオン交換を指し；「ＨＬＢ」は親水性−親油性バランスを指す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
調製例１
ｄｉｔｅｒｔ−ブチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−メチレン−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート
【化２】
0005755821.tif 000003
オーブン乾燥した２５０ｍＬ丸底フラスコにメチルトリフェニルホスホニウムブロミド（５．４１ｇ、１４．９ｍｍｏｌ）及びテトラヒドロフラン（９３ｍＬ）を入れる。懸濁液を０℃まで冷却し、テトラヒドロフラン（１６．０８ｍＬ、１６．０８ｍｍｏｌ）中のナトリウムビス（トリメチルシリル）アミドの１Ｍ溶液を滴下して加える。得られた明るい黄色混合物を０℃で２０分間撹拌し、その後、テトラヒドロフラン（３１ｍＬ）中のｄｉｔｅｒｔ−ブチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−オキソ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート（５．０９ｇ、１２．４ｍｍｏｌ、合成の詳細についてはＷＯ０３／１０４２１７／Ａ２を参照のこと）の溶液を加える。反応物を室温まで温めて、１６時間撹拌する。混合物を酢酸エチル（５００ｍＬ）と水（３５０ｍＬ）の間で分離する。水溶液をデカントし、有機相をブライン（２００ｍＬ）で洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。酢酸エチル：イソ−ヘキサン（５：９５〜２０：８０）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、標題化合物を白色の固体（４．８４ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．４５（ｍ，２７Ｈ），１．８７（ｔ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ），１．９８（ｍ，１Ｈ），２．４３（ｍ，２Ｈ），３．０７（ｂｒｍ，１Ｈ），４．８６（ｂｒｓ，１Ｈ），５．０３（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ），５．１−５．３（ｂｒｓ，１Ｈ）。
【００４０】
調製例２
ｄｉｔｅｒｔ−ブチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート
【化３】
0005755821.tif 000004
ジエチルエーテル中のジアゾメタンのエタノールフリー溶液を、カルディス（ｃａｒｄｉｃｅ）およびイソ−プロパノールを３分の１満たしたＡｌｄｒｉｃｈ  ｍｉｎｉ−Ｄｉａｚａｌｄ装置のコールドフィンガー（ｃｏｌｄ−ｆｉｎｇｅｒ）に入れることで調製する。装置の反応部分中に、水（１．５ｍＬ）中の水酸化カリウム（７４０ｍｇ、１３．２ｍｍｏｌ）の溶液を入れる。この溶液に、ジエチレングリコールモノエチルエーテル（４ｍＬ）およびジエチルエーテル（２．４ｍＬ）の混合物を加える。Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（１ｇ、６．８ｍｍｏｌ）をジエチルエーテル（１３ｍＬ）およびジエチレングリコールモノエチルエーテル（４ｍＬ）の混合物中に溶解する。この溶液を滑らかなグラスジョイントを備えた滴下漏斗中に入れて、ｍｉｎｉ−Ｄｉａｚａｌｄ装置に適合する。水酸化カリウム溶液を水浴内で温めて７０℃に維持し、装置の排気口にてジエチルエーテルで満たされた回収フラスコとバブラーがカルディス／イソ−プロパノール浴中で両方とも冷却されることを確実にする。Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンの溶液を得られた蒸留物と同じ速度で加える。蒸留が完了すると、コールドフィンガー上の凝縮物が無色になるまで、追加のジエチルエーテルを滴下漏斗を介して滴下して加える。得られた溶液を必要となるまでカルディス／イソ−プロパノール浴内に保存する。酢酸パラジウム（１７．２ｍｇ、７６．５μｍｏｌ）をジエチルエーテル（１０ｍＬ）中に懸濁する。デカントし、得られた薄茶色溶液を濾過し、周囲温度に達していた、ジアゾメタン溶液、ｄｉｔｅｒｔ−ブチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−メチレン−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート（３３０ｍｇ，７６５．５μｍｏｌ）、およびジエチルエーテル（１０ｍＬ）の混合物へ慎重に加える。ガス発生が終わると、得られた懸濁物および凝縮物を減圧下で濾過して、未反応のｄｉｔｅｒｔ−ブチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−メチレン−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート及び標題化合物の混合物を２６０ｍｇ得る。
【００４１】
水（４ｍＬ）、ジエチレングリコールモノエチルエーテル（１４ｍＬ）およびジエチルエーテル（８ｍＬ）中の水酸化カリウム（２．５ｇ、４４．６ｍｍｏｌ）溶液、ならびにジエチルエーテル（３０ｍＬ）およびジエチレングリコールモノエチルエーテル（１５ｍＬ）の混合物中のＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（４ｇ、２７．２ｍｍｏｌ）から、ジエチルエーテル中のジアゾメタンのエタノールフリー溶液を調製する。得られたジアゾメタンの溶液を取得し、これを少量ずつ３０分間にわたって、予め調製したジエチルエーテル（３ｍＬ）中の未反応のｄｉｔｅｒｔ−ブチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−メチレン−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレートおよび標題化合物（２６０ｍｇ）の混合物の溶液中の酢酸パラジウム（２０ｍｇ、８９．１μｍｏｌ）の懸濁物に加える。ガス発生が終わると、一晩置き、次いで相分離フリットを介して濾過し、減圧下で濃縮して、暗色油を得る。酢酸エチル：イソ−ヘキサン（０：１００〜７５：２５）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、未反応のｄｉｔｅｒｔ−ブチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−メチレン−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレートおよび標題化合物の混合物を１８５ｍｇ得る。
【００４２】
水（５ｍＬ）、ジエチレングリコールモノエチルエーテル（４ｍＬ）およびジエチルエーテル（１０ｍＬ）中の水酸化カリウム（３．２ｇ、５７ｍｍｏｌ）溶液、ならびにジエチルエーテル（３５ｍＬ）およびジエチレングリコールモノエチルエーテル（１５ｍＬ）の混合物中のＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（５ｇ、３４ｍｍｏｌ）から、ジエチルエーテル中のジアゾメタンのエタノールフリー溶液を調製する。得られたジアゾメタンの溶液を取得し、これを少量ずつ６０分間にわたって、予め調製したジエチルエーテル（２ｍＬ）中の未反応のｄｉｔｅｒｔ−ブチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−メチレン−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレートおよび標題化合物（１８５ｍｇ）の混合物の溶液中の酢酸パラジウム（２０ｍｇ、８９．１μｍｏｌ）の懸濁物に加える。ガス発生が終わると、３０分間置き、濾過し、減圧下で濃縮して黄色の油を得る。質量誘導ＨＰＬＣ（ＲＴ＝６．４分（ＵＶ）、６．３７分（ＭＳ）；ＬＣカラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ（商標）３０ｍｍ×１００ｍｍ  ５μｍ；水  ｗ／０．１％  ギ酸；勾配：２８〜６２％  アセトニトリル  ｗ／０．１％  ギ酸、１．３５分、次いで６２〜９５％、６．６５分、次いで９５％にて３．５５分保持する。カラム温度：周囲；流速：４５ｍＬ／分）により精製して、標題化合物を無色の油（５５．３ｍｇ、１３０．６μｍｏｌ）として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４６（Ｍ＋２３）。
【００４３】
調製例３
ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−アミノ−４−オキソ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート
【化４】
0005755821.tif 000005
冷却器、窒素入口および温度計を備えた５００ｍＬ３つ口フラスコに、エタノール（３６５ｍＬ）中のｄｉｔｅｒｔ−ブチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−オキソ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート（１５ｇ、３６．４ｍｍｏｌ）を入れる。塩化チオニル（１３．３ｍＬ、１８２．３ｍｍｏｌ）を撹拌溶液に室温でシリンジを介して加え（少しの発熱）、次いで加熱して還流させる。２４時間後、反応物を室温まで冷却し、真空下で濃縮する。残渣をジクロロメタン（５０ｍＬ）中に溶解し、次いで、ロータリーエバポレーターで濃縮する（３回繰り返す）。残渣を酢酸エチル（２００ｍＬ）および飽和炭酸水素ナトリウム（１５０ｍＬ）の間で分離する。有機相をブライン（１５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、次いで濃縮乾固して、標題化合物を油（８．２４ｇ、３２．３ｍｍｏｌ）として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２５６（Ｍ＋１）。
【００４４】
調製例４
ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−アセトアミド−４−オキソ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート
【化５】
0005755821.tif 000006
無水酢酸（５ｍＬ、５０．８ｍｍｏｌ）を、乾燥ジクロロメタン（７２ｍＬ）中のジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−アミノ−４−オキソ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート（７．２ｇ、２８．２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（７．９ｍＬ、５６．４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に室温で加える。２時間後、水（１００ｍＬ）でクエンチし、２０分間激しく撹拌する。ジクロロメタン層を疎水性フリットを介して分離し、薄茶色の油（９．６ｇ）になるまで蒸発する。酢酸エチル：イソ−ヘキサン（７０：３０〜９０：１０）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、標題化合物を乾燥中に形成される淡黄色のガラス状物（６．５３ｇ、２２ｍｍｏｌ）として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２９８（Ｍ＋１）、３２０（Ｍ＋２３）、６１７（２Ｍ＋２３）。
【００４５】
調製例５
ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチレン−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート
【化６】
0005755821.tif 000007
オーブン乾燥した２５０ｍＬ丸底フラスコに、（メチル）トリフェニルホスホニウムブロリド（９．７２ｇ、２６．７ｍｍｏｌ）および乾燥テトラヒドロフラン（１２２ｍＬ）を入れる。懸濁液を０〜５℃に冷却し、テトラヒドロフラン（１３．３ｍＬ、２６．７ｍｍｏｌ）中の２Ｍナトリウムビス（トリメチルシリル）アミドを滴下して処理する。得られた明るい黄色の混合物を０℃にて２０分間撹拌し、次いでテトラヒドロフラン（３０ｍＬ）中のジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−アセトアミド−４−オキソ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート（６．１ｇ、２０．５ｍｍｏｌ）で処理する。反応物を室温にてゆっくりと３時間にわたって温める。２０時間室温にて撹拌後、氷水（２００ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（２００ｍＬ）で抽出する。抽出物を水（１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ、濾過し、暗褐色の油になるまで蒸発する。ジエチルエーテル（７０ｍＬ）およびイソ−ヘキサン（２０ｍＬ）を加え、溶液にトリフェニルホスフィンオキシドを播種する。２時間置き、溶液をデカントし、シリカを加え、真空下で濃縮する。酢酸エチル：イソ−ヘキサン（６０：４０〜８０：２０）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、トリフェニルホスフィンオキシドと混合したピンク色の油（６．８１ｇ）を得る。酢酸エチル：イソ−ヘキサン（６０：４０）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより再度精製して、標題化合物を粘性の黄色の油（３．９８ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２９６（Ｍ＋１），３１８（Ｍ＋２３），６１３（２Ｍ＋２３）。
【００４６】
調製例６
ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アセトアミドスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート
【化７】
0005755821.tif 000008
窒素下で、ジクロロメタン（１２．５ｍＬ）中のトリフルオロ酢酸（１．９ｍＬ、２５ｍｍｏｌ）の溶液を、ジクロロメタン（１２．５ｍＬ）中のジエチル亜鉛（ヘプタン中に１Ｍ）（２５ｍＬ、２５ｍｍｏｌ）の冷却された（氷浴）撹拌溶液に、非常にゆっくりと滴下して加える。１０分後、ジクロロメタン（１２．５ｍＬ）中のジヨードメタン（２．０１ｍＬ、２５ｍｍｏｌ）の溶液を加える。１０分後、ジクロロメタン（１２．５ｍＬ）中のジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチレン−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート（２．４６ｇ、８．３ｍｍｏｌ）の溶液を加える。６０分後、氷浴を除去し、反応混合物を室温にて一晩撹拌する。激しく撹拌しながら反応混合物を０．２Ｍ塩酸水溶液（２００ｍＬ）に滴下して加えることによって透明な反応溶液をクエンチする。１時間後、ジクロロメタン層を分離し、ブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮して、未反応の出発材料（４．４ｇ）と混合された要求された生成物を得る。酢酸エチル：シクロヘキサン（５０：５０〜１００：０）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、無色の油（３．１ｇ）を得る。ＳＦＣ（ＲＴ＝２．４８分（ＵＶ、２００ｎｍ）；ＨＰＬＣカラム：ＡＤ−Ｈ  ３０ｍｍ×２５０ｍｍ  ５μｍ；ＣＯ２勾配：５％イソ−プロピルアルコール  ｗ／０．２％  ジメチルエチルアミン、０．５分、次いで５％〜２７％、２．２分。カラム温度：３５℃；圧力：１０００００ｋＰａ；流速：２１０ｍＬ／分）により精製して、未反応のジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチレン−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート（５８０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）および標題化合物（１．８２ｇ、５．９ｍｍｏｌ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３１０（Ｍ＋１）、３３２（Ｍ＋２３）。
【００４７】
調製例７
ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノ−４−メチレン−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート
【化８】
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方法１：
エタノール中の約１Ｍの塩化水素の溶液を、塩化トリメチルシリル（１３．８ｍＬ、１０８ｍｍｏｌ）をエタノール（１１０ｍＬ）に滴下して加えることで調製する。ｄｉｔｅｒｔ−ブチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−メチレン−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート（７．４ｇ、１８．１ｍｍｏｌ）をこの酸性溶液に溶解し、６０℃で１６時間加熱する。粘性の黄色の油になるまで蒸発し、水（５０ｍＬ）中に再度溶解し、濁った溶液を濾過して、微量の不溶性物質を除去する。酸性溶液を炭酸水素ナトリウム（８．４ｇ、０．１ｍｏｌ）で中和し、ジクロロメタン（２×１００ｍＬ）で抽出する。合わせたジクロロメタン溶液を疎水性フリットを介して乾燥させ、淡黄色の液体（４．１４ｇ）になるまで蒸発する。酢酸エチル：イソ−ヘキサン（２０：８０〜８０：２０）で溶出するアミノ結合シリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、無色の液体（３．６ｇ）を得る。酢酸エチル：イソ−ヘキサン（２０：８０）で溶出するアミノ結合シリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、標題生成物の無色の液体（２．８１ｇ、６１％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２５４（Ｍ＋１）。
【００４８】
方法２：
ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（６．９７ｇ、３６．６ｍｍｏｌ）を真空下で５０℃にて３日間乾燥させる。エタノール（３５．５ｍＬ）中のｄｉｔｅｒｔ−ブチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−メチレン−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート（５．０ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に加え、６０℃で３日間加熱する。溶媒を減圧下で除去して残渣を得る。水（１００ｍＬ）中の残渣を取得し、炭酸水素ナトリウムを用いて塩基性にし、ジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で抽出する。抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、次いで減圧下で濃縮して、標題化合物のオレンジ色の残渣（１．５２ｇ、５１％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２５４（Ｍ＋１）。
【００４９】
調製例８
ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−４−メチレン−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート
【化９】
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固体９−フルオレニルメチルクロロホルメート（３．１５ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）を、少量ずつ５分間にわたって、０〜５℃に冷却されたテトラヒドロフラン（２８ｍＬ）および水（８．４ｍＬ）中のジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノ−４−メチレン−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート（２．８ｇ、１１．１ｍｍｏｌ）および炭酸水素ナトリウム（２．０４ｇ、２４．３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に加える。１時間後、水（１０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出する。抽出物をブライン溶液（２０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ、濾過し、淡黄色の油（６．５ｇ）になるまで蒸発する。酢酸エチル：イソ−ヘキサン（１０：９０〜２０：８０）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、粘性に無色の油（４．５８ｇ）を得る。酢酸エチル：イソ−ヘキサン（２０：８０）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより再精製して、標題化合物の白色の半固体泡状物（４．２２ｇ、８０％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４７６（Ｍ＋１）。
【００５０】
調製例９
ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート
【化１０】
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ジクロロメタン（１１．７ｍＬ）中のトリフルオロ酢酸（２．６６ｇ、２３．３ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素下で０〜５℃に冷却されたジクロロメタン（１１．７ｍＬ）中のヘプタン（２３．３ｍＬ、２３．３ｍｍｏｌ）中のジエチル亜鉛１Ｍの撹拌溶液に５分間にわたって滴下して加える（発熱反応）。１０分後、ジクロロメタン（１１．７ｍＬ）中のジヨードメタン（６．２５ｇ、２３．３ｍｍｏｌ）の溶液を加える。１０分後、ジクロロメタン（１１．７ｍＬ）中のジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−４−メチレン−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート（３．７０ｇ，７．８ｍｍｏｌ）の溶液を加える。０℃にて２時間後、室温まで温め、１６時間撹拌する。反応混合物を冷０．５Ｍ塩酸（５０ｍＬ）およびジクロロメタン（２０ｍＬ）でクエンチし、激しく撹拌する。ジクロロメタン層を疎水性フリットを介して分離し、次いで淡い黄色の油になるまで蒸発する。酢酸エチル：イソ−ヘキサン（１０：９０〜２０：８０）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、無色の油（３．４９ｇ）を得る。中央を切断した画分を得る、酢酸エチル：イソ−ヘキサン（２０：８０）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより再精製して、標題化合物（２．１２ｇ、５６％）の無色泡状物を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４９０（Ｍ＋１）。低い純度の画分からの第２のロットの生成物は、クロマトグラフィー（３６３ｍｇ、追加の９％）を繰り返すことで得られる。
【００５１】
調製例１０
ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−オキソ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート
【化１１】
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方法１：
ジベンジルジカルボネート（１８．６ｍＬ、７６．１ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（５００ｍＬ）中のジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−アミノ−４−オキソ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート（１６．２ｇ、６３．５ｍｍｏｌ）の溶液に加え、次いでトリエチルアミン（１０．６ｍＬ、７６．１ｍｍｏｌ）を滴下して加える。反応混合物を３０分間撹拌し、その後、１Ｎ塩酸（２００ｍＬ）で洗浄する。ジクロロメタン相をブラインで洗浄し、分離し、真空下で濃縮する。酢酸エチル：イソ−ヘキサン（０：１００〜７５：２５）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、標題化合物（１１．６ｇ、４７％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３８８（Ｍ＋１）、４１０（Ｍ＋２３）。
【００５２】
方法２：
丸底フラスコに、ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−アミノ−４−オキソ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート塩酸塩（２２６．８６ｇ、７７７．６５ｍｍｏｌ）、水（１．１３Ｌ）およびテトラヒドロフラン（１．１３Ｌ）を加える。炭酸水素ナトリウム（１４３．７２ｇ、１．７１ｍｏｌ）を５回に分けてゆっくりと加える（ＣＯ２発生および内部温度が３１℃から２５℃になることが観察される）。次いでテトラヒドロフラン（２２６．９ｍＬ）中のベンジルクロロホルメート（１２０．６ｍＬ、８５５．４２ｍｍｏｌ）の溶液を加え、内部温度を２８℃を下回るように維持し（１０分間）、反応物を２５℃で１時間撹拌する。混合物をメチル−ｔ−ブチルエーテル（１．２５Ｌ）へと注ぐ。層を分離し、水相を酢酸エチル（７５０ｍｌ）で抽出し、水相を捨てる。混合物をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮乾固して、標題化合物を無色の油（３０２．８２ｇ、７７７．６５ｍｍｏｌ）として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３８８（Ｍ＋１）。
【００５３】
調製例１１
ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−メチレン−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート
【化１２】
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方法１：
オーブン乾燥した５００ｍＬ丸底フラスコに、（メチル）トリフェニルホスホニウムブロミド（１５．４ｇ、４３．１ｍｍｏｌ）および乾燥テトラヒドロフラン（１１２ｍＬ）を入れる。懸濁液を０〜−５℃まで冷却し、テトラヒドロフラン（２３ｍＬ、４６ｍｍｏｌ）中の２Ｍナトリウムビス（トリメチルシリル）アミドを滴下して加えて処理する。得られた明るい黄色に懸濁液を０℃にて３０分間撹拌し、次いでテトラヒドロフラン（２２．４ｍＬ）中のジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−オキソ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート（１１．２ｇ、２８．８ｍｍｏｌ）の溶液で処理する。反応物をゆっくりと室温まで温める。４時間後、氷（１２０ｇ）、ブライン（１２０ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（２５０ｍＬ）で抽出する。抽出物をブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ、濾過し、赤色の油になるまで蒸発する。ジエチルエーテル（１００ｍＬ）中に再溶解し、イソ−ヘキサン（８０ｍＬ）を少量ずつゆっくりと加えて、赤色の半固体（５．２ｇ）としてトリフェニルホスフィンオキシドを沈殿させる。溶液を乾燥シリカ（約５０ｇ）で処理し、濃縮乾固する。酢酸エチル：イソ−ヘキサン（２０：８０）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、標題化合物を無色の粘性の油（７．３７ｇ、６６％）として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３８８（Ｍ＋１）、４１０（Ｍ＋２３）。
【００５４】
方法２：
カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１０４．７２ｇ、９３３．１８ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン（１．８２Ｌ）中の（メチル）トリフェニルホスホニウムブロミド（３４０．１６ｇ、９３３．１８ｍｍｏｌ）の懸濁液に室温で加える（内部温度の変化なし）。次いで、温度を２４℃に維持しながら、テトラヒドロフラン（１．８２Ｌ）中のジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−オキソ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート（３０２．８２ｇ、７７７．６５ｍｍｏｌ）の溶液を加える。混合物を５０℃で３時間撹拌する。反応物を酢酸エチル（１．５Ｌ）で希釈し、水（２×３Ｌ）およびブラインで洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して、暗褐色の油を得る。酢酸エチル：ヘキサン（９：１）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、標題化合物を無色の油（１８３．３５ｇ、４７３．２５ｍｍｏｌ）として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）．３８８（Ｍ＋１），４１０（Ｍ＋２３）。
【００５５】
調製例１２
ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−ベンジルオキシカルボニルアミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート
【化１３】
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方法１：
ジクロロメタン（１４．６ｍＬ）中のヘプタン（６４．１ｍＬ、６４．１ｍｍｏｌ）中の１Ｍジエチル亜鉛の溶液を、窒素下で０〜５℃に冷却されたジクロロメタン（７３ｍＬ）中のトリフルオロ酢酸（４．２７ｍＬ、５６．５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に１０分間にわたってゆっくりと滴下して加える。１０分後、ジクロロメタン（１４．６ｍＬ）中のジヨードメタン（４．６ｍＬ、５６．５ｍｍｏｌ）の溶液を加える。１０分後、ジクロロメタン（１４．６ｍＬ）中のジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−メチレン−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート（７．３ｇ、１８．８ｍｍｏｌ）の溶液を加える。１時間後、氷浴を除去し、濁った溶液を残して、２０時間室温で撹拌する。２４時間後、反応混合物を氷冷０．５Ｍ塩酸水溶液（１６０ｍＬ、８０ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン（２００ｍＬ）でクエンチし、混合物を激しく撹拌する。ジクロロメタン層を分離し、次いで２つの疎水性フリットを介して濾過したジクロロメタン相を乾燥させる。淡い黄色の油が茶色になるまで一晩蒸発する。酢酸エチル：イソ−ヘキサン（２０：８０）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、未反応のジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−メチレン−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレートを無色の油（５．１ｇ）と共に混合物として標題化合物を得る。
【００５６】
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中のトリフルオロ酢酸（２．９３ｍＬ、３８．７ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素下で０〜５℃に冷却されたジクロロメタン（５０ｍＬ）中のヘプタン（３８．７ｍＬ、３８．７ｍｍｏｌ）中のジエチル亜鉛１Ｍの撹拌溶液に、１０分間にわたってゆっくりと滴下して加える。１０分後、ジクロロメタン（１０ｍＬ）中のジヨードメタン（３．１２ｍＬ、３８．７ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物に加える。１０分後、ジクロロメタン（１０ｍＬ）中のオレフィンおよびジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−ベンジルオキシカルボニルアミノスピロ［ビシクル［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート（５ｇ、１２．９ｍｍｏｌ）の混合物の溶液を加える。１時間後、氷浴を除去し、濁った溶液を残して１６時間室温で撹拌する。２０時間後、反応混合物を氷冷０．５Ｍ塩酸（１４０ｍＬ、７０ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン（１６０ｍＬ）でクエンチし、混合物を激しく撹拌する。ジクロロメタン層を０．５Ｍ塩酸水溶液（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、次いで、２つの疎水性フリットを介して濾過する。淡い黄色の油（５．８９ｇ）になるまで蒸発する。酢酸エチル：イソ−ヘキサン（１５：８５〜２５：７５）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、標題化合物を少量の反応物と混合された無色の油（４．２８ｇ）として得る。
【００５７】
アセトン（４０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）、炭酸水素ナトリウム（０．５４ｇ、６．４５ｍｍｏｌ）および硫酸マグネシウム（０．７８ｇ、６．４５ｍｍｏｌ）中に再溶解する。０℃まで冷却し、過マンガン酸カリウム（０．２ｇ、１．２９ｍｍｏｌ）を加えて、明るい紫色の混合物を得る。室温にて３時間後、固体チオ硫酸ナトリウム五水和物（０．３２ｇ、１．２９ｍｍｏｌ）でクエンチし、懸濁液を珪藻土のパッドを介して濾過し、アセトンで洗浄する。少量になるまで蒸発させ、水（２０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（６０ｍＬ）で抽出する。抽出物をブラインで洗浄し、乾燥させ、濾過し、油になるまで蒸発する。酢酸エチル：イソ−ヘキサン（１５：８５〜２５：７５）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、標題化合物を無色の油（３．６２ｇ、７０％）として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４０２（Ｍ＋１）。
【００５８】
方法２：
ヘプタン（１．６Ｌ、１．６ｍｏｌ）中の１Ｍジエチル亜鉛の溶液を、カニューレを介してジクロロメタン（８７０．９ｍＬ）に０℃（浴温度、−５℃）にて加え、次いで、温度を３℃を下回るように維持しながら、ジクロロメタン（８７０．９ｍＬ）中のトリフルオロ酢酸（１２１．０２ｍＬ、１．６ｍｏｌ）の溶液をゆっくりと加える。１時間加えた後、混合物を５分間撹拌し、次いでジヨードメタン（１３０．３ｍＬ、１．６ｍｏｌ）を一度に加え、１５分間撹拌する。ジクロロメタン（３４８．４ｍＬ）中のジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−メチレン−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート（１８３．３５ｇ、４４９．５８ｍｍｏｌ）の溶液を１０分にわたって加え、混合物を室温で一晩撹拌する。０℃まで冷却し、０．５Ｍ塩酸（１．５Ｌ）でクエンチし、混合物を激しく撹拌する。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、濃縮乾固する。水（７３３．４ｍＬ）およびアセトン（７３３．４ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却し、次いで硫酸マグネシウム（８１．１７ｇ、６７４．３７ｍｍｏｌ）、炭酸水素ナトリウム（５６．６５ｇ，６７４．３７ｍｍｏｌ）を加え、その後、過マンガン酸カリウム（２８．４２ｇ、１７９．８３ｍｍｏｌ）を加える。混合物を室温で撹拌する。３０分後、チオ硫酸ナトリウム五水和物（１９７．１０ｇ、３１１．０３ｍｍｏｌ）を加え、その後、珪藻土（１００ｇ）を加える。３０分間撹拌し、珪藻土のパッドを介して濾過する。パッドをメチル−ｔ−ブチルエーテルで洗浄し、水層をメチル−ｔ−ブチルエーテルで抽出する。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空内で濃縮する。ヘキサン：メチル−ｔ−ブチルエーテル（１０：９０〜５０：５０）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、標題化合物を無色の油（９２．６７ｇ，５１％）として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ０．３９−０．５２（ｍ，１Ｈ），０．５５−０．７８（ｍ，３Ｈ），１．２５（ｂｒｏａｄｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，６Ｈ），１．５８（ｂｒｏａｄｄｄ，Ｊ＝２．９ａｎｄ６．３Ｈｚ，１Ｈ），１．６４−１．７３（ｍ，１Ｈ），１．９５（ｂｒｏａｄｔ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ），２．０３−２．１７（ｍ，１Ｈ），２．５２（ｄｄ，Ｊ＝２．７ａｎｄ６．３Ｈｚ，１Ｈ），４．０９（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），４．１６−４．３２（ｍ，２Ｈ），５．０８（ｂｒｏａｄｓ，２Ｈ），５．４４（ｂｒｏａｄｓ，１Ｈ），７．２８−７．４１（ｍ，５Ｈ）。
【００５９】
また、ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−（ベンジルオキシカルボニル（メチル）アミノ）スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレートを副生成物（２２．６７ｇ、５．４６ｍｍｏｌ）として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ０．３７−０．５２（ｍ，１Ｈ），０．５４−０．８０（ｍ，３Ｈ），１．２６（ｂｒｏａｄ  ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，６Ｈ），１．５５−１．６８（ｍ，１Ｈ），１．６４−１．７３（ｍ，１Ｈ），１．７０−１．８０（ｍ，１Ｈ），１．９７（ｂｒｏａｄ  ｔ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，１Ｈ），２．３０（ｄｄ，Ｊ＝３．１ａｎｄ６．３Ｈｚ，１Ｈ），３．１６（ｓ，３Ｈ），３．９９−４．２９（ｍ，４Ｈ），５．０９（ｂｒｏａｄ  ｓ，２Ｈ），７．３８−７．６２（ｍ，５Ｈ）。
【００６０】
調製例１３
ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート
【化１４】
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方法１：
ピペリジン（３．１６ｇ、３７．２ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（１０．５ｍＬ）中のジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］２，６−ジカルボキシレート（２．１０ｇ、４．２９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に室温で加える。３０分後、黄色の固体を蒸発する。酢酸エチル：イソ−ヘキサン（３０：７０〜８０：２０）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、最初に１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）−ピペリジンを溶出し、次いで標題の化合物の淡い黄色の液体（１．０７ｇ、９３％）を溶出する。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２６８（Ｍ＋１）。
【００６１】
方法２：
ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−ベンジルオキシカルボニルアミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート（３．６２ｇ、９ｍｍｏｌ）をエタノール（５４ｍＬ）中に溶解し、溶液を１０％パラジウム炭素（Ｄｅｇｕｓｓａ  ｔｙｐｅ  Ｅ１０１  ＮＥ／Ｗ、０．１８ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）に加える。Ｐａｒｒ機器で３４５ｋＰａにて４時間水素化する。反応物を珪藻土のパッドを介して濾過し、触媒を除去し、エタノールで洗浄し、標題化合物として無色の油（２．２３ｇ、９３％）になるまで蒸発する。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２６８（Ｍ＋１）。
【００６２】
調製例１４
ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート
【化１５】
0005755821.tif 000016
ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート（１．９２ｇ、７．１７ｍｍｏｌ）、（２Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパン酸（１．９２ｇ、１０ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（９ｍｇ、７１７μｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１．３６ｇ、１０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４８ｍＬ）中に合わせる。トリエチルアミン（１．５ｍＬ，１０．８ｍｍｏｌ）および１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１．９２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を加え、２時間室温にて窒素雰囲気下で撹拌する。反応物を酢酸エチル（２００ｍＬ）、水（５０ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で希釈する。激しく撹拌し、次いで酢酸エチル層を分離し、０．２Ｍ塩酸（５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム（５０ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で洗浄する。乾燥させ、濾過し、溶液を濃縮して、黄色の油（３．４８ｇ）を得る。酢酸エチル：イソ−ヘキサン（１５：８５〜２５：７５）、次いで（２５：７５〜４０：６０）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、物質を油として得る。ジクロロメタン中に再溶解し、濃縮し、真空下で乾燥させて、標題化合物を白色の泡状物質（３．０５ｇ、６．９５ｍｍｏｌ）として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４６１（Ｍ＋２３）。
【００６３】
以下の化合物を実質的に調製例１４の方法によって調製する。
【表１】
0005755821.tif 000017
【００６４】
調製例１７
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸
【化１６】
0005755821.tif 000018
方法１：
２Ｍ水酸化リチウム水溶液（２７．８ｍＬ、５５．６ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン（３６ｍＬ）中のジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート（３．０５ｇ、６．９ｍｍｏｌ）の冷却した撹拌溶液に窒素下で加える。二層溶液を室温で２０時間撹拌する。２Ｍ塩酸（２９ｍＬ）、氷（約２０ｇ）で酸性化し、酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出する。抽出物をブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、白色の半固体泡状物になるまで蒸発する。物質を高温酢酸エチル（１５ｍＬ）中に再溶解する。濾過し、物質を真空下で乾燥させて、標題化合物を白色の固体（２．０６ｇ、５．４ｍｍｏｌ）として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４０５（Ｍ＋２３）。
【００６５】
方法２：
ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−ベンジルオキシカルボニルアミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート（１５９ｇ、３９６．０５ｍｍｏｌ）をエタノール（７９２．１ｍＬ）中に溶解し、１０％パラジウム炭素（１５．９ｇ、１４．９４ｍｍｏｌ）を加え、その後３７．５％ｗｔ／ｗｔ塩酸水溶液（６．６２ｍＬ、７９．２１ｍｍｏｌ）を加える。２ＬのＰａｒｒ機器で４１３ｋＰａにて室温で水素化する。４時間後、混合物を、真空下で珪藻土およびグラスマイクロファイバーフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）を介して濾過する。粗物質をテトラヒドロフラン（３９６ｍＬ）中に溶解し、クロロジメトキシトリアジン（７４．５０ｇ、４１５．８６ｍｍｏｌ）および（２Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパン酸（７９．８８ｇ、４１５．８６ｍｍｏｌ）を加える。この混合物を０℃まで冷却し、Ｎ−メチルモルホリン（１３１．０６ｍＬ、１．１９ｍｏｌ）を加える。混合物を室温にて撹拌する。５時間後、粗物質を珪藻土を介して濾過し、ケーキをテトラヒドロフラン（２００ｍＬ）で洗浄する。溶媒を部分的に真空下で除去し、得られたオレンジ色の溶液を０℃まで冷却する。水中の２Ｍ水酸化ナトリウム（７９２．１ｍＬ、１．５８ｍｏｌ）を滴下して加える。混合物を一晩撹拌し、反応物を室温にする。ジクロロメタン（１Ｌ）を加え、層を分離する。有機層を追加の水（３００ｍＬ）で洗浄する。合わせた水層をｐＨ＝２〜３まで１Ｎ硫酸水素カリウムで酸性化し、次いで酢酸エチルで抽出する。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させる。粗物質をテトラヒドロフラン（６００ｍＬ）中に溶解し、加熱して還流させる。ヘプタン（２．１Ｌ）を加え、溶液を冷却する。固体を濾過し、真空下で乾燥させて、標題化合物を白色の固体（１４９ｇ、９８％）として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４０５（Ｍ＋２３）。
【００６６】
以下の化合物を実質的に調製例１７の方法１によって調製する。
【表２】
0005755821.tif 000019
【００６７】
調製例２０
ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート
【化１７】
0005755821.tif 000020
方法１：
ジクロロメタン（５ｍＬ）中のジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート（０．４７ｇ、７２２．３８μｍｏｌ）の溶液に、ポリマーで支持されたジイソ−プロピル−エチルアミン（１．０２ｇ、３．６１ｍｍｏｌ）を加え、その後、ジクロロメタン（６．００ｍＬ）中のジ−ｔ−ブチルジカルボネート（０．４１ｇ、１．８８ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌する。追加のジ−ｔ−ブチルジカルボネート（０．３２ｇ、１．３６ｍｍｏｌ）を加え、さらに２時間撹拌する。エタノール（２０ｍＬ）で希釈し、２カラム体積のエタノールで前処理したＳＣＸ−２イオン交換樹脂カードリッジ（１０ｇ）により精製する。負荷した後、カードリッジを４カラム体積のエタノールで洗浄し、その後、真空下で溶出物を濃縮して、粗生成物（８０８ｍｇ）を得る。粗物質を、酢酸エチル：シクロヘキサン（０：１００〜４０：６０）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、所望の物質（１００ｍｇ）を得る。カードリッジを２カラム体積のメタノール中の３Ｍアンモニアでフラッシュして、未反応の粗ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレートの黄色の固体（４３０ｍｇ）を得る。ジ−ｔ−ブチルジカルボネート（０．３２ｇ、１．４４ｍｍｏｌ）を、回収したテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中のジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレートに加え、室温で一晩撹拌する。次いで、トリエチルアミン（２０１．３７μＬ，１．４４ｍｍｏｌ）および追加のジ−ｔ−ブチルジカルボネート（０．３２ｇ、１．４４ｍｍｏｌ）を加え、７２時間撹拌し続ける。過剰のトリエチルアミン（２０１．３７μＬ，１．４４ｍｍｏｌ）、ジ−ｔ−ブチルジカルボネート（０．３２ｇ、１．４４ｍｍｏｌ）および触媒Ｎ，Ｎ−ジメチル４−アミノピリジン（４０．９３μｍｏｌ）を加え、一晩撹拌する。エタノール（３０ｍＬ）で希釈し、溶液を２カラム体積のエタノールで前処理したＳＣＸ−２イオン交換樹脂カードリッジ（１０ｇ）により精製する。４カラム体積のエタノールで洗浄し、溶液を真空下で濃縮して、所望の粗生成物を７５７ｍｇ得る。酢酸エチル：シクロヘキサン（０：１００〜４０：６０）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、所望の標題化合物の第２の画分（２４ｍｇ）を得る。両方の画分を合わせて、標題化合物（３３７．４７μｍｏｌ、４７％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３９０（Ｍ＋２３），７５７（２Ｍ＋２３）。
【００６８】
方法２：
ジ−ｔ−ブチルジカルボネート（０．８８ｇ、４．０１ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）中のジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート（１．４ｇ、５．２４ｍｍｏｌ）の溶液に加え、反応混合物を室温にて一晩窒素下で撹拌する。疎水性フリットを介して濾過し、無色のゲルを酢酸エチルで洗浄する。合わせた有機層を真空下で濃縮して、無色の油を得る。酢酸エチル：イソ−ヘキサン（０：１００〜３０：７０）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、１．８２ｇの油を得る。さらに高真空下で乾燥させて、標題化合物（１．７９ｇ、９３％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３９０（Ｍ＋２３）、７５７（２Ｍ＋２３）。
【００６９】
調製例２１
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸
【化１８】
0005755821.tif 000021
テトラヒドロフラン（２９．２ｍＬ）中のジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート（１．７９ｇ、４．８７ｍｍｏｌ）を、新たに調製した水酸化リチウム一水和物（１．６４ｇ、３８．９７ｍｍｏｌ）の水溶液（１９．５ｍＬ）に加え、６０℃にて一晩撹拌する。水（３０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で抽出する。水層および有機層を分離する。有機層を２Ｍの塩酸で洗浄する。水層を２Ｍの塩酸（２５ｍＬ）、次いで酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で洗浄する。有機層を合わせ、ブライン（１５ｍＬ）で洗浄する。硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮乾固する。ジクロロメタンに溶解し、濃縮乾固して標題化合物（１．４９ｇ、９８％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３３４（Ｍ＋２３）。
【００７０】
調製例２２
ジベンジル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート
【化１９】
0005755821.tif 000022
炭酸セシウム（０．２４ｇ、７３０．７μｍｏｌ）および臭化ベンジル（８７．１６μＬ、７３０．７μｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）中の（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸（０．０９ｇ、２９２．２９μｍｏｌ）の溶液に加える。室温にて１．５時間窒素下で撹拌する。水でクエンチし、酢酸エチルで抽出する。層を分離し、濃縮乾固する前に疎水性フリットにより有機物を濾過して粗生成物（１３４ｍｇ）を得る。酢酸エチル：イソ−ヘキサン（１：９９から２５：７５）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して透明な油を得る。酢酸エチル：イソ−ヘキサン（１：９９  １０：９０）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーによりさらに精製して、透明な油として標題生成物（１０５ｍｇ、６８％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：５１４（Ｍ＋２３）。
【００７１】
以下の化合物を実質的に調製例２２の方法によって調製する。
【表３】
0005755821.tif 000023
【実施例】
【００７２】
実施例１
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸塩酸塩
【化２０】
0005755821.tif 000024
ｄｉｔｅｒｔ−ブチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート（５５ｍｇ、１２９．８μｍｏｌ）を５ｍＬの反応バイアルに入れる。これに５Ｎの塩酸水溶液（３ｍＬ；２０．８ｍｍｏｌ）および１，４−ジオキサン（１ｍＬ）を加える。９０℃にて１時間混合物を撹拌する。反応バイアルを密閉し、９０℃にて３時間撹拌を継続する。周囲温度に冷却し、３日間静置する。減圧下で暗色の固体に濃縮する。２カラム体積のメタノール、続いて６カラム体積の水で洗浄することによってＯａｓｉｓ（登録商標）ＨＬＢ  Ｗａｔｅｒｓ（１ｇ）カートリッジを調製する。暗色の固体を水に溶解し、カートリッジ上に負荷する。カートリッジを水（２カラム体積）で洗浄し、溶出物を回収する。溶液を凍結乾燥して標題化合物（１６．１ｍｇ、６５μｍｏｌ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２１２（Ｍ＋１）。１ＨＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ０．４５（ｍ，１Ｈ），０．５３（ｍ，１Ｈ），０．６４（ｍ，１Ｈ），０．７４（ｍ，１Ｈ），１．７２−１．７８（ｍ，２Ｈ）１．８６（ｄ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ，１Ｈ），２．０７（ｍ，１Ｈ），２．３７（ｍ，１Ｈ）。
【００７３】
実施例２
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸
【化２１】
0005755821.tif 000025
ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アセトアミドスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート（１．１９ｇ、３．８ｍｍｏｌ）と共に２Ｍの水酸化ナトリウム（１１．５ｍＬ、２３．１ｍｍｏｌ）を加える。窒素で全体を覆って反応混合物をさらに加熱して還流する。２１時間後に、過剰な２Ｍ水酸化ナトリウム（５．８ｍＬ、１１．５ｍｍｏｌ）を加え、１２０時間、加熱を再開する。以下のように陽イオン交換クロマトグラフィー（Ｄｏｗｅｘ（商標）５０Ｘ８−１００）により精製する。不溶性粒子を濾過し、ＨＰＬＣグレードの水でリンスする。半分の溶液に濃縮する。樹脂上に溶液を負荷し、１〜２秒毎に約１滴の滴下速度でカラムを通して流す。最初の負荷体積を樹脂表面に滴下した後、樹脂をＨＰＬＣグレードの水（約１〜２カラム体積）でリンスし、３回繰り返す。流出物のｐＨをモニターし、追跡し、適用が完了する（ｐＨ＝７までｐＨが戻る）まで、ＨＰＬＣグレードの水でリンスする。一旦、完全なｐＨサイクルを観察し、流出物がｐＨ＝７に戻ると、少なくとも１カラム容積のＨＰＬＣグレードの水、ＨＰＬＣグレードの水：テトラヒドロフラン（１：１）、次いでＨＰＬＣグレードの水の各々でカラムを洗浄する。生成物を樹脂から１０％ピリジン：ＨＰＬＣグレードの水に移動し、さらなる生成物をＴＬＣにより検出しなくなるまで、１０％ピリジン：ＨＰＬＣグレードの水で溶出を継続する。所望の物質を含有する画分を合わせ、濃縮乾固して白色の固体を得る。凍結乾燥して標題化合物（７９５ｍｇ、３．８ｍｍｏｌ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２１２（Ｍ＋１）。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ＋５％ｄ５−ｐｙｒｉｄｉｎｅ）δ：０．３８（ｍ，１Ｈ），０．４５（ｍ，１Ｈ），０．５５（ｍ，１Ｈ），０．６９（ｍ，１Ｈ），１．５０（ｄｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ），１．６２（ｄ，Ｊ＝１３．７Ｈｚ，１Ｈ），１．７８（ｍ，２Ｈ），２．１１（ｄｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ）。
【００７４】
実施例３
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸；１，４−ジオキサン（１：０．５）；塩酸塩
【化２２】
0005755821.tif 000026
室温にて窒素下で、１，４−ジオキサン（１．５７ｍＬ、６．３ｍｍｏｌ）中の４Ｍ塩化水素の溶液を、１，４−ジオキサン（１．６ｍＬ）中の（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸（０．１６ｇ、４１８．４μｍｏｌ）の撹拌した懸濁液に加える。１６時間後、白色の固体を濾過し、１，４−ジオキサンで洗浄し、６０℃にて真空中で一晩乾燥させて標題化合物（０．１４ｇ）を得る：ＭＳ（ｍ／ｚ）：２８３（Ｍ＋１）。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ０．４６（ｍ，１Ｈ），０．６５（ｍ，１Ｈ），１．４７（ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，３Ｈ），１．７０（ｄｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ），１．８１（ｑ，Ｊ＝１５Ｈｚ，２Ｈ），１．８７（ｂｒｏａｄｔ，Ｊ＝２．７ａｎｄ２．９Ｈｚ，１Ｈ），２．６５（ｄｄ，Ｊ＝２．７ａｎｄ２．９Ｈｚ，１Ｈ），３．６８（ｓ，４Ｈ），４．００（ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ，１Ｈ），４．７０（ｍ，２Ｈ）。
【００７５】
実施例４
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸
【化２３】
0005755821.tif 000027
濃塩酸（３６．９４ｍＬ、４３０．１１ｍｍｏｌ）を、アセトン（８２２．４ｍＬ）中の（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸（８２．２４ｇ、２１５．０６ｍｍｏｌ）の溶液に加え、混合物を５０℃にて撹拌する。１．５時間後、混合物を０℃に冷却し、ｐＨ＝３．６〜３．８まで５０％水酸化ナトリウム水溶液を加える。得られた固体を１時間撹拌し、濾過し、水で洗浄する。真空下で４８時間乾燥させて、白色の固体（３６ｇ、１２７．５３ｍｍｏｌ）として標題化合物を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２８３（Ｍ＋１）。
【００７６】
実施例５
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸塩酸塩
【化２４】
0005755821.tif 000028
１，４−ジオキサン（２０ｍＬ、８０ｍｍｏｌ）中の４Ｍ塩化水素を、室温にて窒素下で、１，４−ジオキサン（２１ｍＬ）中の（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸（２．０６ｇ、５．４ｍｍｏｌ）の撹拌した懸濁液に加える。反応混合物を数分間、超音波処理し、次いで１６時間撹拌しながら維持する。固体を濾過し、１，４−ジオキサンで洗浄し、６０℃にて６時間真空中で乾燥させて、２．２ｇの白色の固体を得る。ＨＰＬＣグレードの水（２０ｍＬ）に物質を再溶解し、濾過してあらゆる不溶性粒子を除去し、濾液を凍結乾燥させて標題化合物（１．５１ｇ、４．７５ｍｍｏｌ）を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ０．４６（ｍ，１Ｈ），０．６５（ｍ，１Ｈ），１．４６（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），１．６９（ｄｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ），１．８１（ｑ，Ｊ＝１４．３Ｈｚ，２Ｈ），１．８７（ｂｒｏａｄｔ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ），２．６５（ｄｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ），４．００（ｑ，Ｊ＝７．０２Ｈｚ，１Ｈ），４．７０（ｍ，２Ｈ）。
【００７７】
以下の化合物を実質的に実施例４の方法によって調製する。
【００７８】
【表４】
0005755821.tif 000029
【００７９】
実施例８
ジベンジル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート；１，４−ジオキサン；塩酸塩
【化２５】
0005755821.tif 000030
１，４−ジオキサン（４９３．３０μＬ、１．９７ｍｍｏｌ）中の４Ｍ塩化水素を、室温にて窒素下で、１，４−ジオキサン（９７０μＬ）中のジベンジル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート（０．１ｇ、０．２ｍｍｏｌ）の撹拌した懸濁液に加え、２０時間撹拌する。１，４−ジオキサン（４９３．３０μＬ、１．９７ｍｍｏｌ）中の過剰な４Ｍ塩化水素溶液を加え、８０℃で加熱する。濃縮乾固して、アセトニトリルで粉砕し、懸濁液を凍結乾燥させて、１，４−ジオキサンとの（１：１）付加物として白色の固体（８９．９ｍｇ、８８％）として標題化合物を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３９２（Ｍ＋１）。
【００８０】
実施例９
ビス［（２−フルオロフェニル）メチル］（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート塩酸塩
【化２６】
0005755821.tif 000031
１，４−ジオキサン（４．６４ｍＬ、１８．５８ｍｍｏｌ）中の４Ｍ塩化水素溶液を、室温にて窒素下で、１，４−ジオキサン（４．６４ｍＬ）中のビス［（２−フルオロフェニル）メチル］（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート（０．９８ｇ、１．８６ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液に加え、その溶液を２０時間撹拌する。真空中で濃縮して油（０．９３ｇ）を得る。アセトニトリル（１０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）の混合物に溶解し、週末にわたって凍結乾燥させて、（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノ−２−［（２−フルオロフェニル）メトキシカルボニル］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−６−カルボン酸（約７〜１０％）と混合した標題化合物の混合物として白色の固体（８２０ｍｇ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３２０（Ｍ＋Ｈ）。白色の固体をアセトニトリル（８ｍＬ）に溶解して半透明の溶液を得る。濾過前に１時間静置させる。濾液を真空中で濃縮して粘性のある泡状物質を得る。酢酸エチルに再溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して７７４ｍｇを得る。ジエチルエーテル（１１ｍＬ）に再溶解し、ジエチルエーテル（１．８６ｍＬ、１．８６ｍｍｏｌ）中の１Ｍ塩化水素を加え、真空中で濃縮して白色の泡状物質を得る。さらに一晩５０℃にて真空中で乾燥させて標題化合物（０．７４ｇ、８５％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４２８（Ｍ＋１）、４５０（Ｍ＋２３）。
【００８１】
実施例１０
（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸二水和物
【化２７】
0005755821.tif 000032
工程１：ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−アミノ−４−オキソ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート塩酸塩
【化２８】
0005755821.tif 000033
内部反応温度を３０℃以下に維持しながら、窒素雰囲気下で、塩化アセチル（８６．５ｍＬ、１．２ｍｏｌ）を無水エタノール（１．０Ｌ、１７．２ｍｏｌ）に滴下して加える。得られた混合物を１５分間撹拌し、ジ−ｔ−ブチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−オキソ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート（１００ｇ、０．２４ｍｏｌ）を一度に加える。得られた混合物を１６〜２０時間、加熱して還流する。反応混合物を減圧下で油に濃縮する。粗生成物を塩化メチレン（２５０ｍＬ）に溶解し、真空中で濃縮する。塩化メチレン／濃縮プロセスを繰り返して白色の泡状物質を得る。酢酸エチル（１５０ｍＬ）を加え、混合物を６５℃に加熱する。メチルｔ−ブチルエーテル（１００ｍＬ）を加え、混合物を６５℃にて１５分間撹拌する。メチルｔ−ブチルエーテル（３００ｍＬ）を１５分にわたって加え、６５℃にて１５分間撹拌し、次いで加熱を停止し、スラリーを周囲温度に冷却する。混合物を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテル（１５０ｍＬ）で濾過ケーキを洗浄する。ケーキを真空オーブンに移し、２５℃にて一晩乾燥させて粗生成物（６７．５ｇ）を得る。固体を丸底フラスコに移し、酢酸エチル（１７０ｍＬ）で希釈し、混合物を６５℃に加熱する。混合物を１時間撹拌し、テトラヒドロフラン（６８ｍＬ）およびエタノール（３ｍＬ）を加える。熱源を停止し、メチルｔ−ブチルエーテル（２７２ｍＬ）を２０分にわたって加え、混合物を周囲温度に冷却する。スラリーを濾過し、ケーキを９５／５メチルｔ−ブチルエーテル／酢酸エチル（２×７５ｍＬ）で洗浄し、固体を２５℃にて一晩、真空オーブン中でさらに乾燥させて、白色の固体（６０．０ｇ、９８．０％）として標題化合物を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２５６（Ｍ＋１）。
【００８２】
工程２：ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−オキソ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート
【化２９】
0005755821.tif 000034
ジエチル−（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−アミノ−４−オキソ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート−塩酸塩（５５．０ｇ、１８８．５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２２０ｍＬ）に懸濁し、次いで水（２２０ｍＬ）および炭酸カリウム（９２．１ｇ、６５９．９ｍｍｏｌ）を加える。得られた混合物を３０分間撹拌する。クロロギ酸ベンジル（２６．７ｍＬ、１７５．３ｍｍｏｌ）を４５分にわたって混合物に加え、反応温度を２５℃以下に維持する。反応混合物を３０分間撹拌し、次いで酢酸エチル（５５０ｍＬ）および水（２７５ｍＬ）で希釈する。相を分離し、水層を酢酸エチル（２５０ｍＬ）で逆抽出する。有機物を合わせ、それをＨＣｌ水溶液（０．５Ｎ、１００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で連続して洗浄する。有機溶液をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して、透明な油（６７．６ｇ、９２．１％）として標題化合物を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．２４−１．２６（ｍ，６Ｈ），２．３６（ｂｓ，１Ｈ），２．４７（ｄｄ，１Ｈ），２．７８（ｄｄ，１Ｈ），２．９０（ｄｄ，１Ｈ），４．０９−４．１９（ｍ，４Ｈ），５．０８（ｓ，２Ｈ），５．７３（ｓ，１Ｈ），７．２４−７．３６（ｍ，５Ｈ）。
【００８３】
工程３：ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−メチレン−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート
【化３０】
0005755821.tif 000035
窒素雰囲気下で、メチル−トリフェニルホスホニウムブロリド（６７．４ｇ、１８４．９ｍｍｏｌ）およびテトラヒドロフラン（３００ｍＬ）を撹拌しながら合わせる。テトラヒドロフラン（１８４．９ｍＬ、１８４．９ｍｍｏｌ）中のカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１Ｍ）の溶液を１５分にわたって反応混合物に加え、得られたスラリーを周囲温度にて３時間撹拌する。ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−オキソ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート（１２．３ｋｇ、３１．６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１２０ｍＬ）に溶解し、反応混合物に１時間にわたって加え、反応温度を３０℃以下に維持する。得られたスラリーを周囲温度にて一晩撹拌し、次いで酢酸エチル（６００ｍＬ）で希釈し、水（３００ｍＬ）でクエンチする。二相混合物を３０分間撹拌した後、層を分離し、有機物を水（３００ｍＬ）、続いて０．２５ＭのＨＣｌ（３００ｍＬ）で洗浄する。有機物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中（４５℃）で濃縮して、暗色油（１１１．０ｇ）として粗生成物を得る。その物質をシリカゲルプラグクロマトグラフィー（１Ｋｇ  Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ−６０、ヘプタン中の４Ｌの１５％ＥｔＯＡｃ、次いでヘプタン中の１０Ｌの３０％ＥｔＯＡｃ）により精製して、透明な油（３７．３ｇ、８７．９％有効性、５４．９％）として標題化合物を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３８８（Ｍ＋１）。
【００８４】
工程４：ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−ベンジルオキシカルボニルアミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート
【化３１】
0005755821.tif 000036
冷却装置に接続したジャケット付きの反応フラスコに、ジエチル亜鉛溶液（１５７．２ｍＬ、１５７．２ｍｍｏｌ、ヘプタン中に１Ｍ）を窒素雰囲気下で加える。溶液を−１５℃に冷却し、冷（−１５℃）、乾燥ジクロロエタン（１５７．２ｍＬ）で希釈する。トリフルオロ酢酸（１１．１ｍＬ、１４６．７ｍｍｏｌ）をジクロロエタン（１１．１ｍＬ）に溶解し、反応容器に５０分にわたって加え、内部温度を−１０℃以下に維持する。得られた懸濁液を−１０〜１５℃にて３０分間撹拌する。ジヨードメタン（１２．７ｍＬ、４２．１ｇ、１５７．２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１２．７ｍＬ）に溶解し、反応混合物を５０分にわたって加え、内部温度を−１０℃以下に維持する。得られた薄い白色の懸濁液を−１０〜−１５℃にて３０分間撹拌する。ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−メチレン−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，６−ジカルボキシレート（２０．３ｇ、８７．９％有効性、４６．０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３０．４ｍＬ）に溶解し、反応混合物に１０分にわたって加え、内部温度を−１０℃以下に維持する。透明な淡黄色の溶液を−１０℃にて５分間撹拌し、潜在的発熱についてモニターする。冷却装置の設定点を０℃に変化させ、反応混合物をその温度にて４８時間撹拌する。５ＮのＨＣｌ（６２．９ｍＬ、３１４．４ｍｍｏｌ）を１５分にわたって加えることによって反応混合物をクエンチし、内部温度を６℃以下に維持する。得られた混合物を０〜５℃にて２０分間撹拌し、次いで漏斗に移し、層を分離する。有機層を１ＮのＨＣｌ（２×５０ｍＬ）、続いて１：１の飽和ＮａＨＣＯ３／Ｈ２Ｏ（６０ｍＬ）、１：１の飽和Ｎａ２ＣＯ３／Ｈ２Ｏ（６０ｍＬ）および水（５０ｍＬ）で洗浄する。有機物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮して、淡黄色の油（１９．６ｇ、６０．３％有効性、６３．９％補正収率）として標題化合物を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．３７（ｍ，２Ｈ），０．５２−０．５５（ｄｍ，２Ｈ），１．１３−１．１７（ｍ，６Ｈ），１．４９−１．５０（ｍ，１Ｈ），１．５１−１．５６（ｍ，１Ｈ），１．６０−１．７９（ｍ，２Ｈ），３．９７−４．１０（ｍ，５Ｈ），５．００（ｓ，２Ｈ），７．２９−７．３４（ｍ，５Ｈ），８．０４（ｓ，１Ｈ）。
【００８５】
工程５：ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート塩酸塩
【化３２】
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無水エタノール（１００ｍＬ、１０体積）、濃ＨＣｌ（２．１ｍＬ、１．０Ｎ）およびジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−ベンジルオキシカルボニルアミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート（９．７ｇ、２４．１６ｍｍｏｌ）をＨＥＬリアクタに入れ、続いてＰｄブラック（３．９ｇ、４０ｗｔ％）を得る。リアクタを窒素で３回パージし、続いて３回水素でパージし、４０ｐｓｉ水素に加圧する。反応の完了がＨＰＬＣによりモニターされるまで、少なくとも２時間、２０〜３０℃で反応物を撹拌する。得られたスラリーをＨｙｆｌｏ  Ｓｕｐｅｒ  Ｃｅｌ（登録商標）のパッドで濾過し、湿潤ケーキを無水エタノール（２×３０ｍＬ、３体積）で洗浄する。濾液を清浄なリアクタに移し、エタノールを、校正曲線から得たインサイチュ生成物に基づいておよそ５体積で酢酸イソプロピルと置き換える。得られたスラリーを少なくとも３時間にわたって０〜５℃に冷却する。得られたスラリーを濾過し、湿潤ケーキを冷酢酸イソプロピル（３×５ｍＬ、０．５体積）で洗浄する。３０℃にて少なくとも１２時間減圧下で乾燥させて、標題化合物（４．６６ｇ、１５．３４ｍｍｏｌ、６３．５％）を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ８．８４（ｓ，３Ｈ），４．３１−４．１５（ｍ，２Ｈ），４．０３（ｑ，Ｊ＝７．０，２Ｈ），２．４２（ｄｄ，Ｊ＝３．１，２．６，１Ｈ），２．２４（ｄｄ，Ｊ＝６．２，２．６，１Ｈ），１．９４（ｄ，Ｊ＝１４．１，１Ｈ），１．６８（ｄ，Ｊ＝１４．１，１Ｈ），１．６３（ｄｄ，Ｊ＝６．６，３．１，１Ｈ），１．２５（ｔ，Ｊ＝７．０，３Ｈ），１．１７（ｔ，Ｊ＝７．０，３Ｈ），０．７７−０．７１（ｍ，１Ｈ），０．６５−０．５９（ｍ，１Ｈ），０．５６−０．５１（ｍ，１Ｈ），０．５０−０．４４（ｍ，１Ｈ）。
【００８６】
工程６：ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート
【化３３】
0005755821.tif 000038
テトラヒドロフラン（４５ｍＬ、１０体積）および（２Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパン酸（３．４ｇ、１．２当量）をリアクタに入れ、続いてＮ−メチルモルホリン（１．９６ｍＬ、１．２当量）および２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（３．１２ｇ、１．２当量）を入れる。反応がＨＰＬＣにより完了するまで、２０〜２５℃の間の得られた薄いスラリーを少なくとも３時間撹拌する。ジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート塩酸塩（４．５５ｇ、１４．８１ｍｍｏｌ）を２０〜２５℃の間で一度に入れ、続いてＮ−メチルモルホリン（１．６３ｍＬ、１．０当量）を少なくとも１０分にわたって入れ、温度を２０〜２５℃に維持する。反応がＨＰＬＣにより完了するまで、得られたスラリーを２０〜２５℃の間で少なくとも２時間撹拌する。残存固体を濾過し、湿潤ケーキをテトラヒドロフラン（２×１０ｍＬ、２．２体積）で洗浄して、１００％収率と仮定する標題化合物を得る。１００％収率を仮定し、さらに精製せずに標題化合物の淡い琥珀色のテトラヒドロフラン溶液を使用する。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ８．４６（ｓ，１Ｈ），６．７２（ｄ，Ｊ＝７．９，１Ｈ），４．０８−３．９２（ｍ，５Ｈ），２．４２−２．３７（ｍ，１Ｈ），１．８１−１．６４（ｍ，３Ｈ），１．４７（ｄｄ，Ｊ＝６．６，３．１，１Ｈ），１．３４（ｓ，９Ｈ），１．１８−１．０８（ｍ，９Ｈ），０．６６−０．５９（ｍ，１Ｈ），０．５７−０．５２（ｍ，１Ｈ），０．４６−０．３６（ｍ，２Ｈ）。
【００８７】
工程７：（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸
【化３４】
0005755821.tif 000039
２ＮのＮａＯＨ（３７ｍＬ、５．０当量）およびジエチル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート（６．５０ｇ、１４．８１ｍｍｏｌ）をリアクタに入れ、反応がＨＰＬＣにより完了するまで、少なくとも１２時間、２０〜３０℃にて撹拌する。反応物を分離漏斗に移し、それを少なくとも１０分間静置させる。相を分離し、下の水層をリアクタに戻す。酢酸エチル（９０ｍＬ、１３．８体積）を混合物に加え、次いでｐＨが２〜２．５に到達するまで１ＮのＮａＨＳＯ４を加える。層を分離し、有機物を水（４５ｍＬ、６．９体積）で洗浄する。有機相中の水を除去し、酢酸エチルと共の常圧蒸留により残存水を除去する。得られたスラリーを少なくとも２時間にわたって２０〜３０℃に冷却し、その温度にて少なくとも９０分間、粒状にする。得られた固体を濾過し、湿潤ケーキを酢酸エチル（３×１５ｍＬ、２．３体積）で洗浄する。４５℃にて減圧下で乾燥させて、白色の固体（４．４５ｇ、１１．６４ｍｍｏｌ、７８．６％）として標題化合物を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ，５０°Ｃ）：δ１２．０１（ｓ，２Ｈ），８．２２（ｓ，１Ｈ），６．４９（ｂｓ，１Ｈ），４．００（ｂｓ，１Ｈ），２．４３（ｄｄ，Ｊ＝６．５，２．８，１Ｈ），１．８３（ｄ，Ｊ＝１４．０，１Ｈ），１．６８−１．６２（ｍ，２Ｈ），１．４２（ｄｄ，Ｊ＝６．５，２．８，１Ｈ），１．３６（ｓ，９Ｈ），１．１５（ｄ，Ｊ＝７．１，３Ｈ），０．６７−０．６１（ｍ，１Ｈ），０．５６−０．５１（ｍ，１Ｈ），０．４６−０．３６（ｍ，２Ｈ）。
【００８８】
工程８：（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸二水和物
【化３５】
0005755821.tif 000040
水（３２ｍＬ、８体積）および（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸（３．９９ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）をリアクタに入れ、続いて濃ＨＣｌ（１．８０ｍＬ、２．０当量）を入れ、次いで反応が完了するまで（ＨＰＬＣによりモニターされる）、反応物を４５〜５５℃に加熱する。反応混合物を２０〜３０℃に冷却し、ｐＨを５ＮのＮａＯＨで約３．６に調整する。無水エタノール（１５ｍＬ、３．７５体積）を２０〜３０℃にて少なくとも３０分にわたって、得られたスラリーに加える。得られたスラリーを少なくとも１２時間、２０〜３０℃で粉状にする。混合物を−５〜５℃に冷却し、それを少なくとも６０分間、粉状にする。得られた固体を濾過し、水（２×９ｍＬ、２．２５体積）中の３０％無水エタノールでケーキを洗浄する。３５℃にて少なくとも１２時間、減圧下で固体を乾燥させ、次いで得られた固体を、少なくとも２時間、さらなる重量変化がなくなるまで平衡状態にして、白色の固体（２．７１ｇ、８．５１ｍｍｏｌ、８１．６％）として標題化合物を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）：δ３．９０（ｑ，Ｊ＝７．２，１Ｈ），２．５６（ｄｄ，Ｊ＝６．５，２．９，１Ｈ），１．７４−１．６６（ｍ，２Ｈ），１．６２−１．５４（ｍ，２Ｈ），１．３９（ｄ，Ｊ＝７．１，３Ｈ），０．６１−０．５６（ｍ，１Ｈ），０．５５−０．４９（ｍ，１Ｈ），０．４０−０．３０（ｍ，２Ｈ）。
【００８９】
結晶性固体のＸ線粉末回折（ＸＲＤ）パターンは、ＣｕＫａ源（λ＝１．５４０６０Å）ならびに３５ｋＶおよび５０ｍＡで作動する、Ｖａｎｔｅｃ検出器を備えた、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄ４  Ｅｎｄｅａｖｏｒ  Ｘ線粉末回折計で得る。サンプルを、２θにおいて０．００８７°のステップサイズおよび０．５秒／ステップの走査速度、ならびに０．６ｍｍの発散、５．２８ｍｍの固定散乱防止、および９．５ｍｍの検出器スリットで、２θにおいて４から４０°で走査する。乾燥粉末を石英サンプルホルダに充填し、スライドガラスを使用して平滑な表面を得る。回折パターンは、８．８５および２６．７７°２θにてＮＩＳＴ  ６７５標準ピークに基づいて調節した。結晶学の分野において、任意の所与の結晶形態に関して、回折ピークの相対強度は、晶癖などの要因から生じる好ましい配向に起因して変化し得、角度ピーク位置はわずかに変化し得ることは周知である。例えば、ピーク位置は、サンプルが分析される温度または湿度の変動、サンプルの変位に起因して移動し得る。この場合、２θにおいて±０．２のピーク位置変動性は、識別した結晶形態の明確な識別を妨げずにこれらの可能性のある変動を考慮に入れる。結晶形態の確認は、識別ピーク（°２θの単位において）、典型的により突出したピークの任意の特有の組み合わせに基づいて行われ得る。結晶形態回折パターンは周囲温度および相対湿度にて収集される。
【００９０】
したがって、実施例１０の調製したサンプルは、以下の表１に記載した回折ピーク（２θ値）を有するとして、ＣｕＫａ放射線を使用してＸＲＤパターンにより特徴付けられる。特にパターンは、０．２°の回折角に対する許容度で、１０．４５、１１．７０、１５．７５、２１．０６および２３．５９からなる群から選択されるピークの１つ以上と組み合わせて５．２０におけるピークを含有する。
【００９１】
【表５】
0005755821.tif 000041
【００９２】
ｍＧｌｕ受容体は神経細胞の興奮性を調節するＧタンパク質共役受容体である。より特に、変化したグルタミン酸神経伝達は、持続性の痛み、神経因性疼痛、慢性炎症性疼痛、または内臓痛を含む、慢性疼痛状態などの神経学的障害；統合失調症、双極性障害、全般性不安障害、もしくは外傷後ストレス障害などの精神障害；または神経変性障害と関連している。
【００９３】
本発明の化合物はｍＧｌｕ２／３アゴニストであるので、それらは上述の病態を治療するのに好適であり得る。
【００９４】
ヒトｍＧｌｕ２およびｍＧｌｕ３アゴニストＦＬＩＰＲアッセイ
シリアンハムスターの線維芽細胞由来で、ヒトｍＧｌｕ２またはｍＧｌｕ３受容体を安定に発現し、ラットグルタミン酸輸送体ＥＡＡＴ１（興奮性アミノ酸輸送体１）およびＧα１５サブユニットを共トランスフェクトしたＡＶ−１２細胞株をこれらの研究のために使用する。Ｇα１５の発現により、Ｇｉ共役受容体がホスホリパーゼＣ経路を通してシグナル伝達でき、蛍光分析カルシウム応答アッセイにより受容体活性化を測定する能力が得られる。細胞株を、５％の透析したウシ胎仔血清、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、１ｍＭのＬ−グルタミン、および５μｇ／ｍＬのブラストサイジンを補足した高グルコースおよび塩酸ピリドキシンを有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養することによって維持する（全ての培地はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入する）。コンフルエントな培養物を、酵素を含まない解離溶液（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｓ−００４−Ｂ）を使用して隔週で継代する。アッセイの２４時間前に細胞を収集し、ウェル当たり８５，０００（ｍＧｌｕ２）または１１５，０００（ｍＧｌｕ３）細胞にてＭａｔｒｉｘ  Ｗｅｌｌ−Ｍａｔｅ細胞播種器を使用して、２５０（ｍＧｌｕ２）または１２５（ｍＧｌｕ３）μＭのＬ−グルタミン（新たに加えた）のみを含有する培地中で９６ウェル、黒壁、ポリ−Ｄ−リシンでコーティングしたプレート（ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ＃３５４６４０）内に分配する。細胞内カルシウムレベルを、蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して化合物の添加の前後でモニターする。アッセイ緩衝液は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳを補足したハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ；Ｓｉｇｍａ）からなる。培地を除去し、２５℃にて９０分（ｍＧｌｕ２）または１２０分（ｍＧｌｕ３）間、細胞を、アッセイ緩衝液中の８μＭのＦｌｕｏ−３ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｆ−１２４１；５０μＬ／ウェル）とインキュベートする。色素溶液を除去し、新たなアッセイ緩衝液（５０μＬ／ウェル）と置き換える。グルタミン酸アゴニスト（Ｆｉｓｈｅｒ  Ａ１２５−１００）についての１１点濃度反応曲線（１０μＭで開始して３倍希釈）を生成する単一添加のＦＬＩＰＲアッセイを、典型的なＥＣ５０反応を確認するために各実験前に行う。Ｐｒｉｓｍ  ｖ４．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して結果を分析する。本発明の化合物を、２５μＭの最終濃度にて開始して３倍希釈を使用した１０点濃度反応プロファイルを使用して単一添加のＦＬＩＰＲアッセイにおいて試験する。本発明の化合物は、０．１ＮのＮａＯＨ中で１０ｍＭストックにて可溶化し、−２０℃にて保存する。それらをアッセイ緩衝液中で３倍希釈系列により希釈する。最初の５秒で蛍光をＦＬＩＰＲ機器で読み取った後、本発明の化合物を細胞プレート（５０μＬ／ウェル）に加える。アゴニスト活性を検出するために、最初の３０秒間、１秒毎に、次いで合計９０秒間、３秒毎にデータを収集する。最大反応はＥＣｍａｘ（１００μＭのグルタミン酸塩）により誘導されると定義する。化合物効果を、グルタミン酸塩の非存在下���測定した基礎蛍光を補正した相対蛍光単位（ＲＦＵ）において最大−最小ピーク高さとして測定する。単一プレートを使用して決定を行う。アゴニスト効果は最大グルタミン酸反応に対して化合物のみにより誘導される刺激のパーセントと定量する。４パラメーターロジスティック曲線フィッティングプログラム（ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ  ｖ５．３．１．２２）を使用して相対ＥＣ５０値として全てのデータを計算する。
【００９５】
実施例２を、実質的に上記のように実施したｈｍＧｌｕ２  ＦＬＩＰＲアッセイにおいて、３９．０ｎＭ±５．９（ｎ＝３、誤差はＳＥＭとして計算した）のＥＣ５０を有すると測定する。実施例２をまた、実質的に上記のように実施したｈｍＧｌｕ３  ＦＬＩＰＲアッセイおいて、２８５ｎＭ±５２．５（ｎ＝８、誤差はＳＥＭとして計算した）のＥＣ５０を有すると測定する。これらの結果により、実施例２は有力なｍＧｌｕ２およびｍＧｌｕ３アゴニストであることが実証される。
【００９６】
ホルマリン注射により誘導される持続性の痛みの反転
ラットの後肢の足底面へのホルマリンの投与は、２段階の防衛行動（例えば、注射した足をなめる、かむ、および後へ下げる）を生じる：ホルマリン投与後、約５分の間、早期段階およびホルマリン注射後、約１０分〜６０分の後期段階。約５分〜１０分の休止期間が２段階を分ける。これらのホルマリンにより誘導された行動のスコア付けは、加速度計によってラットの動きを検出する刺激させるチャンバ（ＳＲ−Ｌａｂ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｍ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して自動化できる。試験化合物（活性）を、足底内ホルマリンの注射の１時間前に０．３〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内で絶食していないオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに（腹腔内経路で）投与する。次いでラットを順化のために試験チャンバ内のシリンダーに個々に入れる。試験化合物（プロドラッグ）を、足底内ホルマリンの注射の２時間前に、絶食していないオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに０．４５〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲内で経口投与する。次いでラットを順化のために試験チャンバ内のシリンダーに個々に入れる。特定の時点で、ラットをシリンダーから除去し、ホルマリン（生理食塩水中に５％溶液、５０μＬ）を右後肢の足底面に皮下に投与し、すぐにシリンダーに戻す。シリンダーを試験チャンバ内の検出システムのロードセルに配置し、それにより、反応を６０分間、１秒ｂｉｎで連続してモニターすることができる。防衛事象の数［＞２０ロード単位での１秒ｂｉｎの数］は５分間隔で合計する。２０ロード単位閾値は、呼吸または臭いを嗅ぐことなどの正常な生理学的事象の包含を取り除くのに十分に大きいが、防御事象を検出するのに有意な大きさである。データを変換して、データ収集の６０分の間、各々１秒の時間ｂｉｎにおいて閾値（２０ロード単位）を超える事象の数を決定する。早期段階スコアは０時〜５分の２０ロード単位より多い事象の合計である。後期段階スコアは、データ収集時間の１１分〜４０分の２０ロード単位より多い全ての数の事象を加えることによって得られる。ホルマリンデータを、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびＪＭＰ（ｖ６．０．２）統計的解析プログラム（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用する両側比較のためのダネットｔ検定により分析される適切な対比によって評価する。ｐ値が０．０５未満である場合、相違は有意であるとみなす。ＥＤ５０計算を、各用量について逆変換データのパーセントで非線形回帰曲線フィッティングを使用して実施する。
【００９７】
実施例２を、実質的に上記のように実施したこのアッセイにおいて、０．７ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）のＥＤ５０を有すると測定する。実施例１０を、実質的に上記のように実施したこのアッセイにおいて、４．８ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）のＥＤ５０を有すると測定する。これらの結果は、本発明の範囲内の化合物が持続性の痛みについての有用な医薬であることを実証する。
【００９８】
Ｌ５／Ｌ６神経結紮誘導性接触性アロディニアの反転
後肢領域を刺激する神経の片側結紮はラットにおいて接触性アロディニアとして現れる慢性持続痛を生じる。Ｌ５／Ｌ６神経結紮が実施される（Ｋｉｍら、Ｐａｉｎ（１９９２）５０、３５５−３６３）。神経障害性損傷は、イソフルラン（誘導のために３％および維持のために２％）と酸素の混合物を用いてガス麻酔下で左側のＬ５およびＬ６脊髄神経をきつく結紮することによって生じる。手術の最低１４日後、接触性アロディニアを、徐々に増加させる曲げ力（０．３〜１５ｇ）を用いてｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメントに対する、損傷した足の触覚感度を測定することによって評価する（Ｃｈａｐｌａｎら、Ｊ．ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９４）５３、５５−６３）。ラットは、それらが接触性アロディニアを示す場合、過敏であるとみなされる（２グラム未満の曲げ力の付与に反応して足を引っ込める）。ベースライン値は試験化合物の評価直前に決定される。試験化合物（プロドラッグ）は１５ｍｇ／ｋｇにて経口投与され、足引っ込めについての触覚閾値は投与の１、２および４時間後に測定される。データはグラム（ｇ）で反応閾値として表され、値は各時点についての標準誤差（±ＳＥ平均）である。データは、分散分析、続いてダネット事後分析（ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して分析し、痛覚閾値（Ｃｍａｘ＝最大反応ベースライン）の絶対的相違を表し、平均［ｌｏｇ（最大反応）−ｌｏｇ（投薬前スコア）］（ｇ）として表す。
【００９９】
１５ｍｇ／ｋｇにて経口投与される実施例１０（ここで、ｎ＝８；ＳＥＭとして計算した誤差）を、実質的に上記のように実施したこのアッセイにおいて、１、２および４時間のそれぞれにおけるビヒクル処置後の対応する値：１．５０±０．６０、１．３４±０．７５、および２．３５±０．６２と比較して、１、２および４時間のそれぞれにおいて顕著に高い機械的閾値：９．０６±２．２６、１２．３１±１．８６および８．６３±１．９８を有すると測定する。これらの結果により、本発明の範囲内の化合物が神経因性疼痛病態のための有用な医薬であることが実証される。
【０１００】
ＣＦＡ誘導性機械的痛覚過敏の反転
ラットの後足における局所炎症の誘導は、痛覚反応を与えるために圧刺激に対する閾値を決定することによって測定され得る持続性機械的痛覚過敏を引き起こす。ラットにおける完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）により誘導される機械的痛覚過敏についての方法は、大部分、Ｉａｄａｒｏｌａら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．（１９８８）４５５、２０５−２１２に記載されている。右足に５０μｌのＣＦＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｃ５８８１、８５％パラフィンオイル中の１ｍｇ／ｍｌのマイコバクテリウム抽出物、１５％のマンニドモノオレエート）を足底内に注射した状態でラットをイソフルラン麻酔下に置く。動物を軟らかい寝床ケージ中で回復させ、機械的痛覚過敏変化をＣＦＡ注射の２４時間後に測定する。機械的痛覚（Ｒａｎｄａｌｌ  Ｓｅｌｌｉｔｏ試験）を、ラットを穏やかに押さえ、台座と押すものとの間に足を置くことによって決定する（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ  Ａｎａｌｇｅｓｙメーター）。動物が足を引っ込める場合の力（グラム）が記録される。２５０グラム以下の最大力が付与され、ラットが足を引っ込めない場合、２５０グラムの値が記録される。
【０１０１】
ＣＦＡ注射の前にベースライン反応についてラットを試験する。ＣＦＡ後の反応を翌朝（ＣＦＡ注射の約２４時間後）試験する。１５０グラムを超えるスコアを示すあらゆるラットをさらなる試験から排除して、ＣＦＡ後の反応に基づいてラットを無作為化する。試験化合物（プロドラッグ）を１．５〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲内で経口投与し、足の引っ込めについての機械的閾値を投与の１および２時間後に測定する。各時点についての共分散分析、続いてダネット事後検定において統計的有意性をｐ値＜０．０５と定義する。以下の表２は実質的に上記のように実施した実施例１０についての統計的に有意な結果を与える。これらの結果により、本発明の範囲内の化合物が、骨関節炎または関節リウマチなどの慢性炎症性疼痛の病態のための有用な医薬であることが実証される。
【０１０２】
【表６】
0005755821.tif 000042
【０１０３】
結腸直腸拡張誘導性疼痛行動の反転
ラットにおける内臓痛は結腸直腸空洞の拡張により誘導され得、腹筋の反射収縮を利用することにより疼痛をモニターした。ラットにおける結腸直腸拡張により引き起こされる疼痛での腹筋反射収縮の測定を、実質的にＦｉｏｒａｍｏｎｔｉら、Ｎｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ  （２００３）１５、３６３−３６９およびＵｒｂａｎら、Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．（１９９９）２９０、２０７−２１３に記載されているように実施する。オスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに、腹斜筋内に筋電図（ＥＭＧ）電極を外科的に埋め込み、１週間回復させ、その間に動物を操作に対して順応させ、ストレスの効果を最小化するように部分的に拘束する。試験の間、３分の静止時間で２０秒間、２０、４０、および６０ｍｍＨｇの間の圧力を設定するために圧力モニター／調節器に取り付けられた潤滑ラテックスバルーンの直腸（８ｃｍ）内への挿入後に、ベースラインＥＭＧ測定を集め、記録する。圧力を次のレベルに段階的に上げる前に各圧力において３つの曝露のセットを記録する。圧力刺激の間、ＥＭＧ読み取り（μボルト／秒）についての曲線下面積としてデータを収集し、３回の試験を平均化する。試験化合物（プロドラッグ）を、結腸直腸拡張の開始の９０分前に１．５〜１７ｍｇ／ｋｇの範囲内で経口投与する。共分散分析、続いてダネット事後検定において統計的有意性をｐ値＜０．０５として定義する。以下の表３は実質的に上記のように実施した実施例１０についての統計的に有意な結果を与える。これらの結果により、本発明の範囲内の化合物が内臓痛病態のための有用な医薬であることが実証される。
【０１０４】
【表７】
0005755821.tif 000043
【０１０５】
ラットにおけるフェンシクリジン（ＰＣＰ）誘導性自発運動亢進（Ｈｙｐｅｒｌｏｃｏｍｏｔｏｒ）活性の反転
ケタミンまたはフェンシクリジン（ＰＣＰ）などのＮＭＤＡ受容体アンタゴニストの投与は、統合失調症を有する患者において観察されるそれらの病状と同様であるヒトにおける精神異常様作用を生じる。ＮＭＤＡアンタゴニストの運動刺激作用を反転させる薬剤の能力は、多くの場合、精神病の動物モデルとして使用され、統合失調症および双極性障害についての医薬の臨床効果を検出することに対する十分な予測妥当性を示している。
【０１０６】
個々のオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）ラットを、寝具類として１ｃｍ深さの木質チップ、およびケージの上部に金属グリルを有する、４５×２５×２０ｃｍ寸法の透明なプラスチックのシューボックス（ｓｈｏｅ−ｂｏｘ）ケージに入れることによって運動活性をモニターする。運動モニター（Ｋｉｎｄｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、１５ｃｍの高さで第２のラック（飼育行動を測定するため）を有し、５ｃｍの高さで８×４の構成、（または１５×７パターンにおける２２の高密度群）で配置される１２光束の矩形ラックから構成される。シューボックスケージは、隔離した部屋において３フィートの高さのテーブルトップ上にラックを有する、これらのラックの内側に配置される。本発明の化合物（活性）は、フェンシクリジン（ＰＣＰ）の５ｍｇ／ｋｇチャレンジ投与の３０分前に、０．３〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内で（腹腔内経路で）投与される。本発明の化合物（プロドラッグ）は、一晩絶食させたラットにおいて、ＰＣＰの５ｍｇ／ｋｇチャレンジ投与の４時間前に、０．３〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲内で経口投与される。試験日に、ラットを試験ケージに入れ、ＰＣＰチャレンジの前に３０分間順応させ、ＰＣＰ投与の後、さらに６０分間、ラットをモニターする。
【０１０７】
データ解析およびＥＤ５０算出を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ．ＵＳＡ）を用いて実施する。検出力解析により、１群あたり８〜１０匹のラットは、治療差（検出力＝０．８）を検出するために適切な統計的検出力を有することが必要とされると決定される。事後ダネット多重比較検定（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔ）を用いる一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を、合計６０分の運動活性で実施する。ＥＤ５０算出を、各用量について反転した変換データのパーセントで非線形回帰曲線フィッティングを用いて実施する。
【０１０８】
実施例２を、実質的に上記のように実施したこのアッセイおいて、１．４６ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）のＥＤ５０を有すると測定する。実施例５および６は、実質的に上記のように実施したこのアッセイにおいて、それぞれ２．９５ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ）および４．３１ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ）を有すると測定する。これらの結果は、本発明の範囲内の化合物が、統合失調症および双極性障害についての有用な医薬であることを示す。
【０１０９】
ラットにおけるストレス誘発性異常高熱の減衰
異常高熱、中核体温の上昇は、ストレスに対する反応において、ヒトを含む、多くの哺乳動物において確実に実証されている一般的現象である。多くの不安障害において、異常高熱は病状の一部として生じ、疾患の症状とみなされる。動物におけるストレス性異常高熱を減衰する化合物は、ヒトにおける不安障害を治療するのに有用であると考えられている。全般性不安障害および外傷後ストレス障害は、このような化合物を用いて治療され得るこのような障害の一例である。ストレス性異常高熱を分析するための従来の低侵襲性方法は、直腸体温計による、体温、およびストレス性による体温の増加を測定することによる。２７５〜３５０ｇの体重のオスのＦｉｓｃｈｅｒ  Ｆ−３４４ラット（Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）を試験する。全ての動物は、食物および自動化された水を自由に入手可能であるように個々に収容し、１２時間の明／暗サイクル（０６：００に点灯）で維持する。明期の間に実施する、実験の前に動物を約１２〜１８時間絶食させる。０．３、１、３および１０ｍｇ／ｋｇの範囲の本発明の化合物を用いて１ｍＬ／ｋｇの用量体積で腹腔内（ＩＰ）でラットに投与する。ビヒクルは、５〜７の間のｐＨを得るために添加される生理食塩水＋ＮａＯＨである。前臨床モデルにおいて強力な精神安定剤様活性を示している、ｍＧｌｕＲ５アンタゴニストＭＴＥＰ（３−［（２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）エチニル］ピリジン）を、コンパレータ（５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ経路、水に溶解した）として使用する。投与後すぐに、ラットをそれらのホームケージに戻し、実験者がライトを点け、部屋を出る。１時間の前処置時間の残りの間、投薬部屋は暗くする。
【０１１０】
前処置時間の後、明るく照らされた隣の部屋にラットを個々に連れていき、ベースライン体温を、鉱油で潤滑させた直腸プローブの挿入により測定する。ＰＨＹＳＩＴＥＭＰ  ＲＥＴ−２（登録商標）ラット直腸プローブ（Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）を有するＰＨＹＳＩＴＥＭＰ  ＢＡＴ−１２（登録商標）マイクロプローブ体温計を用いて体温を評価する。直腸内にプローブを約２ｃｍ挿入して、中核体温を測定する（これはベースライン体温、Ｔ１（℃）である）。１０分後、２回目の体温測定を記録する（Ｔ２）。体温の相違（Ｔ２−Ｔ１）をストレス性体温上昇反応と定義する。本発明の化合物が、ビヒクル反応と比べて、ストレス性上昇反応の３５％減少を生じる用量をＴ３５用量と定義する。
【０１１１】
実施例２は、実質的に上記のように実施したこのアッセイにおいて、０．５７ｍｇ／ｋｇのＴ３５を有すると測定される。実施例５は、実質的に上記のように実施したこのアッセイにおいて、６．４ｍｇ／ｋｇのＴ３５を有すると測定される。これらの結果は、本発明の範囲内の化合物が不安障害に有用な医薬であることを示す。より具体的には、本発明の範囲内の化合物は、全般性不安障害および／または外傷後ストレス障害に有用な医薬であり得る。
【０１１２】
インビトロでのＰｅｐＴ１  ＧｌｙＳａｒ阻害スクリーニングおよびＩＣ５０測定
ＰｅｐＴ１アッセイを、腸管吸収輸送体ＰｅｐＴ１と相互作用するプロドラッグの能力を試験するために確立する。
【０１１３】
ヒトの腸由来のＨｅＬａ細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション）を、５％ＣＯ２加湿雰囲気中で３７℃にて、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを有する１００ユニット／ｍＬペニシリンを含有するハイクローン培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＳＨ３０２４３）中で増殖させる。細胞株を４０継代まで使用し、次いで捨てる。１ｍｌバイアル中の凍結細胞を１〜２分間水浴中で解凍させ、３７℃にて５ｍＬの細胞培地に加える。Ｔフラスコの各々に、８．５ｍＬの新鮮な培地および１．５ｍＬの細胞ストックを与える。細胞を１週間の間に２回継代する。これは、１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水−エチレンジアミン四酢酸（ＰＢＳ−ＥＤＴＡ）でフラスコをリンスし、細胞を分離するために、２〜５分間、２ｍＬのトリプシンを加え、トリプシンのさらなる活性を阻害するために８ｍＬの新鮮な培地を加えることによって達成される。１：６細胞希釈を得るために、各々の新しいフラスコに、８．５ｍＬの新鮮な培地と１．５ｍＬの細胞ストックとの混合物を入れる。取込実験の準備まで、細胞を３７℃にてインキュベートする。
【０１１４】
Ｔフラスコ中の７０〜８０％コンフルエントな細胞をトランスフェクション処理の１日前に播種する。細胞ストックを有するフラスコをＰＢＳ−ＥＤＴＡおよびトリプシンで処理して、細胞を分離させ、この時点からトランスフェクション培地を使用する。トランスフェクション培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋ＮＥＡＡからなる。各ウェルに、０．５ｍＬの細胞混合物を加え（１．３×１０５が所望の細胞濃度である）、細胞を３７℃にて一晩インキュベートする。このアッセイの２４時間前に、細胞をＰＥＰＴ１でトランスフェクトする。トランスフェクション混合物を、６００μＬの無血清トランスフェクション培地、１８μＬのＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、および１１μｇのＰｅｐＴ１  ＤＮＡを混合することによって調製する。トランスフェクション試薬−ＤＮＡ複合体を２０分間インキュベートし、２４μＬの試薬−ＤＮＡ複合体を各ウェルに加える。
【０１１５】
ＰＥＰＴ１媒介性［グリシル−１−２−１４Ｃ］グリシルサルコシン（ＧｌｙＳａｒ）取込活性の阻害を、既に公開されているように（Ｚｈａｎｇら、２００４．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐｅｒ  Ｔｈｅｒ．３１０：４３７−４４５）、トランスフェクションの２４時間後、２４ウェルプレートで培養した細胞中で測定する。［１４Ｃ］Ｇｌｙ−Ｓａｒの取込を阻害する本発明の化合物の能力を測定するために、プロドラッグを、５μＭの［１４Ｃ］Ｇｌｙ−Ｓａｒ（Ｍｏｒａｖｅｋ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）および２０μＭの冷Ｇｌｙ−Ｓａｒの存在下でｐＨ６．０の取込培地中で５ｍＭにてＨｅＬａ細胞を一過性にトランスフェクトした８０〜９０％のコンフルエントなＰｅｐＴ１とインキュベートする。取込培地は、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、０．８ｍＭのＭｇＳＯ４、５ｍＭのグルコース、２５ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ＴＲＩＳ）からなる。次いで２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸を用いて溶液をｐＨ６．０にする。インキュベーション体積は５００μＬであり、室温にて３分間実施する。インキュベーション時間の終わりに取込を停止するために、取込培地を細胞単層から吸引し、５００μＬの氷冷ＰＢＳをウェルに加える。Ｃａ＋２およびＭｇ２＋を含まない５００μＬの室温ＰＢＳで細胞を３回洗浄する。次いで３００μＬの１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００Ｈ２Ｏ溶液で細胞を溶解させる。２００μＬのアリコートを除去し、液体シンチレーション計数により放射線を定量し、インキュベーションウェルの各々に存在する［１４Ｃ］Ｇｌｙ−Ｓａｒを測定する。阻害剤なしのコントロールを確立し、各プロドラッグの阻害パーセントをこのコントロールに対して算出する。ネガティブコントロール（グリシン）および２つのポジティブコントロール（セファドロキシルおよびセファレキシン）を各実験で並行して実施して、アッセイ系の実行可能性を決定する。セファレキシンと等しいか、またはそれより良いＧｌｙＳａｒ取込阻害を有するプロドラッグ化合物は許容可能とみなす。平均値±標準偏差は、グリシンについて１０．１±９．５％（ｎ＝１９）、セファドロキシルについて５３．２±１３．２％（ｎ＝１９）、およびセファレキシンについて３７．５±１４．７％（ｎ＝１８）である。
【０１１６】
ＰｅｐＴ  ＩＣ５０アッセイに関して、プロドラッグを、５μＭ［１４Ｃ］Ｇｌｙ−Ｓａｒおよび２０μＭ冷Ｇｌｙ−Ｓａｒの存在下で、種々の濃度（０．０６２５〜２５ｍＭ）でインキュベートする。インキュベーションおよびサンプリング処理は、上記のＰｅｐＴ１スクリーニングと全く同じである。［１４Ｃ］Ｇｌｙ−Ｓａｒ取込データをプロドラッグ濃度の各々について評価し、ＩＣ５０値を算出する。
【０１１７】
実施例５、６、および７は、実質的に上記のように実施したこのアッセイにおいて、それぞれ８９％、８７％、および７８％の５ｍＭにおけるｈＰｅｐＴ１［３Ｈ］Ｇｌｙ−Ｓａｒ取込阻害を有すると測定される。実施例５および６は、実質的に上記のように実施したこのアッセイにおいて、それぞれ１．９８ｍＭおよび０．２５ｍＭのｈＰｅｐＴ１［３Ｈ］Ｇｌｙ−Ｓａｒ取込阻害ＩＣ５０を有すると測定される。これらの結果は、本発明の範囲内の化合物が、ＰｅｐＴ１輸送体を介して経口吸収されることを示す。
【０１１８】
インビトロでの腸プロドラッグ加水分解アッセイ
凍結したヒト十二指腸ホモジネート（１００ｍＭリン酸トリス緩衝液、ｐＨ７．４を用いる１：２の組織：緩衝液比）をＣｅｌｓｉｕｓ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）から得、それはフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）およびＥＤＴＡの両方を含まなかった。
【０１１９】
ヒト十二指腸の各ロットを単一のドナーから得て、腸を小片にし、その部分を別個に凍結する。組織採集を全て４℃にて実施し、即座に−７０℃にて凍結する。ヒト腸ホモジネートを解凍し、インキュベーションの直前に、１００ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４中で０．５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度に希釈する。
【０１２０】
インキュベーションを９６ウェルプレート中で実施し、全てのプロドラッグを各日に２連で実施する。ストックプロドラッグ溶液を１ｍＭの濃度にて水中で調製する。２００μＬアリコートの０．５ｍｇ／ｍＬ腸ホモジネートおよび１９６μＬの１００ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液を３７℃の水浴中の９６ウェルプレートに入れる。９６ウェルピペッターを用いて、４μＬの１ｍＭプロドラッグ溶液をホモジネートに移す。プロドラッグの添加直後（０時）および１時間のインキュベーション後、インキュベーション混合物の５０μＬサンプルを、自動使い捨て同時９６ウェルピペッターを用いて除去し、１００ｎｇ／ｍＬの内部標準物を含む２００μＬのメタノールクエンチ溶液に直接加える。次いでサンプルを１０℃で５分間、３５００ｒｐｍにて遠心分離する。上清（２００μＬ）を最終９６ウェルＰＣＲプレートに移し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる分析のために密閉する。
【０１２１】
インキュベーション混合物中の加水分解活性代謝産物の濃度を、アナリストバージョン１．４．２、ターボイオンスプレー、陽イオン化、および選択反応モニタリング（ＳＲＭ）を備えるＳｃｉｅｘ  ＡＰＩ４０００四重極質量分析計でＬＣ／ＭＳ／ＭＳ検出を用いて決定する。Ｗａｔｅｒｓ  Ａｔｌａｎｔｉｓ（登録商標）Ｔ３（２０×２．１ｍｍ、５μＭ）ＨＰＬＣカラムを、１．０ｍＬ／分の流速および０．１％移動相Ａ〜９９％移動相Ａの移動相勾配を用いて周囲温度にて使用する。移動相Ａは１０００：５の水：ヘプタフルオロ酪酸であり、移動相Ｂは１：１のメタノール：氷酢酸である。
【０１２２】
腸インキュベーション混合物中の加水分解活性代謝産物の濃度を、１００ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４中で１０μＭにて開始する反復２倍希釈によって調製した標準曲線から決定し、その後、サンプルと同一のメタノール−内部標準溶液でクエンチする。平均および標準偏差を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）２００７を用いて算出する。加水分解の量を、加えたプロドラッグ濃度に対して形成した活性代謝産物のモルパーセントとして決定する。ポジティブコントロール、内部プロドラッグＡから内部活性代謝産物薬物Ａの加水分解は、各バッチにおいて実施すると、平均７５．３％になる（ｎ＝２０）。次いで最後の値を内部活性代謝産物薬物Ａの形成に対して正規化する。
【０１２３】
実施例５、６、および７は、実質的に上記のように実施したこのアッセイにおいて、内部プロドラッグＡに対するヒト腸加水分解が、それぞれ３６％（ｎ＝３、ＳＤ＝２．７）、４４％（ｎ＝３、ＳＤ＝４．１）、および３４％（ｎ＝１）と測定される。これらの結果は、本発明の範囲内の化合物がヒト腸において加水分解されることを示す。
【０１２４】
インビトロでのヒト肝臓Ｓ−９ホモジネート加水分解アッセイ
肝臓Ｓ９画分をＸｅｎｏｔｅｃｈ  ＬＬＣ（Ｌｅｎｅｘａ、ＭＯ）から得る。ロットは２人のドナー、１人は男性、１人は女性のプール由来のものである。肝臓Ｓ９画分を調製し、ＥＤＴＡを含まない４℃での５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、および１５０ｍＭ塩化カリウムからなる均一化緩衝液を用いて希釈する。プロドラッグを３７℃にて２時間、肝臓ホモジネート中でインキュベートし、その後、活性代謝産物の濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより決定する。クロピドグレルからクロピドグレルカルボン酸への加水分解をアッセイポジティブコントロールとして利用する。
【０１２５】
インキュベーションを９６ウェルフォーマット中で実施し、全てのプロドラッグを各日に２連で実施する。ストックプロドラッグ溶液を１ｍＭの濃度で水中で調製する。ヒト肝臓Ｓ９画分を、１００ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４中で０．５ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度に希釈する。
【０１２６】
２００μＬアリコートの０．５ｍｇ／ｍｌヒト肝臓Ｓ−９ホモジネートおよび１９６μＬの１００ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液を、３７℃の水浴中で９６ウェルプレートに入れる。９６ウェルピペッターを用いて、４μＬの１ｍＭプロドラッグ溶液をホモジネートに移す。加水分解が化学的不安定性に起因しないことを確実にするために、プロドラッグも肝臓Ｓ−９を含まないＰＢＳ緩衝液のみとインキュベートする。プロドラッグの添加直後（０時）、および１時間のインキュベーション後、インキュベーション混合物の５０μＬのサンプルを、自動使い捨て同時９６ウェルピペッターを用いて除去し、１００ｎｇ／ｍｌの内部標準物を含む２００μＬのメタノールクエンチ溶液に直接加える。次いでサンプルを１０℃にて５分間、３５００ｒｐｍで遠心分離する。上清（２００μＬ）を最後の９６ウェルＰＣＲプレートに移し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる解析のために密閉する。
【０１２７】
インキュベーションの間に形成した活性代謝産物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ定量化を、Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ４０００、アナリストバージョン１．４．２、ターボイオンスプレー、陽イオン化、および選択反応モニタリング（ＳＲＭ）で実施する。使用したＨＰＬＣカラムは、１．０ｍＬ／分の移動相流速を用いて周囲温度でＷａｔｅｒｓ  Ａｔｌａｎｔｉｓ（登録商標）Ｔ３（２０×２．１ｍｍ、５μＭ）である。移動相Ａは１０００：５の水：ヘプタフルオロ酪酸であり、移動相Ｂは１：１のメタノール：氷酢酸である。移動相勾配は、９９．９／０．１の開始移動相比Ａ／Ｂおよび１／９９の最終を利用する。
【０１２８】
インキュベーション混合物中の加水分解活性代謝産物の濃度を、１００ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４中の１０μＭで開始する反復２倍希釈により調製し、その後、サンプルと同一のメタノール−内部標準溶液でクエンチした標準曲線から決定する。平均および標準偏差を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）２００７を用いて算出する。最後の値を、加えたプロドラッグ化合物濃度に対して形成した活性代謝産物のモルパーセントとして示す。クロピドグレルからクロピドグレルカルボン酸への加水分解をポジティブコントロールとして使用し、平均すると７３．０％（ｎ＝２７）になる。
【０１２９】
実施例８および９は、実質的に上記のように実施したこのアッセイにおいて、それぞれ、２３％および５９．３％のヒト肝臓Ｓ９加水分解を有すると測定される。これらの結果は、本発明の範囲内の化合物がヒト肝臓において加水分解されることを示す。
【０１３０】
このデータは、例示したアミノ酸プロドラッグが、セファドロキシルおよびセファレキシン（Ｚｈａｎｇら、２００４．ＪＰＥＴ３１０：４３７−４４５）と同じ程、またはそれより良くＰｅｐＴ１基質ＧｌｙＳａｒの取込を阻害することを示し、このことから、ＰｅｐＴ１輸送体を介するヒト経口吸収が予測される。プロドラッグ吸収に加えて、体内への侵入の際に、活性代謝産物を生じさせるために、プロドラッグ加水分解は必須である。このインビトロでの加水分解研究は、例示したアミノ酸プロドラッグがヒト腸により加水分解され得ることを示す。例示したジエステルプロドラッグの加水分解はヒト肝臓ホモジネートで生じ、例示したジエステルプロドラッグが経口曝露後にヒトにおいて加水分解する可能性を示す。同時にこれらのデータは、例示したアミノ酸プロドラッグおよび例示したジエステルプロドラッグが、活性代謝産物を放出するためにヒトにおいて加水分解される可能性を示す。
【０１３１】
薬物動態アッセイ
標準的なクロスオーバーデザイン（各ラットに静脈内および経口投与の両方を与えたＮ＝３）において、絶食させたオスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに、実施例２を１ｍｇ／ｋｇにて静脈内投与するか、または実施例５を７．５ｍｇ／ｋｇの用量（５ｍｇ／ｋｇモル当量の実施例２に等しい）にて強制経口投与する。静脈内投与について、実施例２を水に溶解し、経口投与について、実施例５を、ヒドロキシエチルセルロース（１％）、ポリソルベート８０（０．２５％）および消泡剤１５１０−ＵＳ（０．０５％）の水性ビヒクル中で調製する。連続的な血液採取を容易にするためにカニューレを外科的に移植する。投与後、０〜２４時間にわたってＥＤＴＡチューブ内に血液を採取し、遠心分離し、分析の時間まで血漿を凍結保存する。
【０１３２】
血漿サンプルを解凍し、５０μＬアリコートを９６ウェルプレートに移し、５０μＬの内部標準液を加え、サンプルを混合する。次いで３００μＬのアセトニトリルを加え、サンプルを３分間ボルテックスし、遠心分離する。上清の３００μＬアリコートを別のプレートに移し、４０℃にて窒素下で蒸発する。残渣を水中の１００μＬの０．５％ヘプタフルオロ酪酸中で再構成し、ボルテックスし、遠心分離する。２０μＬアリコートを、陽イオンターボスプレーモード下でＡＢ  Ｓｃｉｅｘ４０００質量分析計に接続したＳｈｉｍａｄｚｕオートサンプラーおよびＨＰＬＣシステムを使用してＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより連続して分析する。ＭＳ／ＭＳ遷移は、プロドラッグ実施例５について２８３．２−＞４４．２ａｍｕであり、活性実施例２について２１２．１−＞１０３．１ａｍｕである。１．０ｍＬ／分の移動相流速ならびに０．８分にわたって（Ａ）水中の０．２％ギ酸および（Ｂ）アセトニトリル−水（１：１、ｖ／ｖ）および２％Ｂから９８％Ｂの勾配の２移動相にてＡｔｌａｎｔｉｓ  Ｔ３、５０×２．１ｍｍ、５ミクロンＨＰＬＣカラムを利用する。実施例２の保持時間は約０．５３分である。
【０１３３】
薬物動態パラメーターを、Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＷａｔｓｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して血漿濃度データから算出する。相対的経口バイオアベイラビリティを、静脈内投与後の活性実施例２の血漿濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ）を、プロドラッグ実施例５の経口投与後の活性代謝産物のＡＵＣと比較することによって決定する。
【０１３４】
首尾良いプロドラッグは、経口投与後に十分に吸収されなければならず、その後、活性代謝産物を体循環に放出するために加水分解されなければならない。相対的バイオアベイラビリティは、プロドラッグの経口投与後の活性代謝産物のＡＵＣを、活性化合物の静脈内投与後の活性のＡＵＣと比較することによって両方のパラメーターを含む。オスのラットにおいて、実質的に上記のように実施したこのアッセイにおいて測定した場合、プロドラッグ実施例５の経口投与後の活性代謝産物の相対的バイオアベイラビリティは６０±１４％（平均±標準偏差）であり、プロドラッグ実施例５が、十分に吸収され、広範囲に加水分解されてインビボで活性代謝産物を生じることを実証する。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］  式Ｉの化合物
【化３６】
0005755821.tif 000044

（式中、
Ｒ１は水素であり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３は水素であるか；
Ｒ１は水素であり、Ｒ２は（２Ｓ）−２−アミノプロパノイルであり、Ｒ３は水素であるか；
Ｒ１は水素であり、Ｒ２は（２Ｓ）−２−アミノ−４−メチルスルファニル−ブタノイルであり、Ｒ３は水素であるか；
Ｒ１は水素であり、Ｒ２は２−アミノアセチルであり、Ｒ３は水素であるか；
Ｒ１はベンジルであり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３はベンジルであるか、または
Ｒ１は（２−フルオロフェニル）メチルであり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３は（２−フルオロフェニル）メチルである）
またはその薬学的に許容可能な塩。
［２］  （１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸である、［１］に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
［３］  （１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸塩酸塩である、［１］に記載の化合物。
［４］  （１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸である、［１］に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
［５］  （１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸塩酸塩である、［１］に記載の化合物。
［６］  （１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸二水和物である、［１］に記載の化合物。
［７］  （１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸；１，４−ジオキサン（１：０．５）；塩酸塩である、［１］に記載の化合物。
［８］  （１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノ−４−メチルスルファニル−ブタノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸である、［１］に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
［９］  （１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−アミノ−４−メチルスルファニル−ブタノイル］アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸塩酸塩である、［１］に記載の化合物。
［１０］  （１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［（２−アミノアセチル）アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸である、［１］に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
［１１］  （１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−［（２−アミノアセチル）アミノ］スピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボン酸塩酸塩である、［１］に記載の化合物。
［１２］  ジベンジル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレートである、［１］に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
［１３］  ジベンジル（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート；１，４−ジオキサン；塩酸塩である、［１］に記載の化合物。
［１４］  ビス［（２−フルオロフェニル）メチル］（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレートである、［１］に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
［１５］  ビス［（２−フルオロフェニル）メチル］（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−アミノスピロ［ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−４，１’−シクロプロパン］−２，６−ジカルボキシレート塩酸塩である、［１］に記載の化合物。
［１６］  ［１］〜［１５］のいずれかに記載の化合物または塩と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
［１７］  治療に使用するための［１］〜［１５］のいずれかに記載の化合物または塩。
［１８］  持続痛、神経因性疼痛、慢性炎症性疼痛、および内臓痛からなる群から選択される、神経学的障害の治療に使用するための［１］〜［１５］のいずれかに記載の化合物または塩。
［１９］  前記神経学的障害が、持続痛である、［１８］に記載の使用のための化合物または塩。
［２０］  前記神経学的障害が、神経因性疼痛である、［１８］に記載の使用のための化合物または塩。
［２１］  前記神経学的障害が、慢性炎症性疼痛である、［１８］に記載の使用のための化合物または塩。
［２２］  前記神経学的障害が、内臓痛である、［１８］に記載の使用のための化合物または塩。
［２３］  統合失調症、双極性障害、全般性不安障害、および外傷後ストレス障害からなる群から選択される精神障害の治療に使用するための［１］〜［１５］のいずれかに記載の化合物または塩。
［２４］  前記精神障害が、統合失調症である、［２３］に記載の使用のための化合物または塩。
［２５］  前記精神障害が、双極性障害である、［２３］に記載の使用のための化合物または塩。
［２６］  前記精神障害が、全般性不安障害である、［２３］に記載の使用のための化合物または塩。
［２７］  前記精神障害が、外傷後ストレス障害である、［２３］に記載の使用のための化合物または塩。